(57)【要約】  本発明は、癌を治療するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、抗腫瘍免疫をもたらすために、腫瘍細胞を特異的に溶解し、かつ腫瘍細胞及び細胞細片を抗原提示細胞に能動的にターゲティングする、癌を有する対象への投与のための操作された腫瘍溶解性ウイルスの組成物に関する。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
前記酵素が、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素である、請求項1記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
前記酵素が、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素である、請求項1又は請求項2記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
腫瘍幹細胞マーカーに特異的な組換え結合ドメインを含む、請求項1から3のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
複製制限されている、請求項1から4のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、自律性パルボウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、又はレオウイルスなどの、ヒト又は非ヒト起源のRNA又はDNAベースのウイルスである、請求項1から5のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
アデノウイルスである、請求項6記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
条件付き複製型アデノウイルス(CRAd)である、請求項7記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
Ad5/3キメラウイルスである、請求項8記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記Ad5/3キメラウイルスが、ウイルス前初期(E1a)遺伝子の定常領域2(CR2)内の24塩基対欠失(Δ24)をさらに含む(Ad5/3-Δ24 CRAd)、請求項9記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む、請求項1から10のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
Ad5/3-Δ24-αGT CRAd(CRAd-αGT)である、請求項11記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
医薬として許容し得る担体と組み合わせて、請求項1から12のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
静脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮下、経口、直腸内、膣内、鼻腔内、経粘膜、又は経皮投与のために製剤化される、請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１５】
新生物を有する個体を治療する方法であって、
i)少なくとも1つの癌細胞中で、請求項1から12のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルスによって送達される内因性酵素を発現させて、細胞膜糖鎖付加を改変するステップと;
ii)前記腫瘍溶解性ウイルスの投与により、前記少なくとも1つの癌細胞の溶解を誘導するステップと
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、前記個体における少なくとも1つの癌細胞に感染するのに有効な量で投与される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
癌を有する個体又は腫瘍を有する個体を治療することを目的とする、請求項15又は請求項16記載の方法。
【請求項１８】
治療を必要とする、癌を患う又は新生物もしくは腫瘍を有する患者に、請求項1から12のいずれか1項記載の治療有効量の腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項１９】
癌の治療における使用のための、請求項1から12のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルス、又は請求項13又は請求項14記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記癌が、白血病(例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性骨髄性(顆粒球)白血病、及び慢性リンパ性白血病)、リンパ腫(例えば、ホジキン病及び非ホジキン病)、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、異形成、及び過形成から選択される、請求項15から18のいずれか1項記載の方法、又は請求項19記載の腫瘍溶解性ウイルスもしくは医薬組成物。
【請求項２１】
ヘキソシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を、前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに組み込むステップを含む、請求項1から12のいずれか1項記載の腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法。
【請求項２２】
前記組み込むステップが、クローニングを含む、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、癌を治療するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、抗腫瘍免疫をもたらすために、腫瘍細胞を特異的に溶解し、かつ腫瘍細胞及び細胞細片を抗原提示細胞に能動的にターゲティングさせる、癌を有する対象への投与のための操作された腫瘍溶解性ウイルスの組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
免疫系が、腫瘍細胞を、破壊されるべき細胞として検出し損なうことから、癌患者において腫瘍が発生する可能性がある。腫瘍細胞は、大部分の癌患者において、自己腫瘍抗原を発現する。「新生抗原」とも呼ばれるこれらの自己腫瘍抗原は、防御的な抗腫瘍免疫応答を誘発する可能性がある。抗腫瘍免疫応答の発達を誘導するために、腫瘍細胞又は腫瘍細胞膜は、抗原提示細胞によって内在化される必要がある。しかし、多くの癌患者における免疫系は、腫瘍の「密かな」初期発生に伴う腫瘍抗原に対して、「無知」を呈し、その結果、腫瘍は、抗原提示細胞には事実上「不可視」である(Pardollの文献, 2000; Clin Immunol. 95:S44-49、及びDunnらの文献, 2002; Nat Immunol; 3: 991-8)。
【０００３】
さらに、腫瘍微小環境及び局所的サイトカイン環境は、免疫機能に対してしばしば抑制的であり、免疫細胞アネルギー及び細胞死を能動的に誘導する可能性がある(Malmbergの文献、Cancer Immunol Immunother., 53: 879-92; Lugadeらの文献; J Immunol. 2005; 174: 7516-23(2004); Schreiberらの文献、Science(New York、N.Y.), 331(6024), 1565-70(2011))。腫瘍病変の有効な治療は、２つの要素を必要とする:1.目視で又は画像化技術によって検出するのに十分に大きい病変の破壊、及び2.腫瘍抗原に対する防御的な全身性の抗腫瘍免疫応答の誘導。こうした免疫応答は、治療されないあらゆる病変(例えば、治療のために接触することも手術によって除去することもできないもの)を破壊し、目視で検出することができない又は画像化によって検出可能ではない、微小転移の免疫介在性の検出、退縮、及び/又は破壊をもたらすこととなる。しばしば、腫瘍のサイズによって、循環性の抗腫瘍免疫応答の有効性が、時間的に遅らせられる。腫瘍のサイズを縮小させるために、能動的抗腫瘍免疫を利用することに加えて、外科的切除、又は組成物の腫瘍内注射などの他の手段が、しばしば必要である。
【０００４】
近年、溶解性複製によって腫瘍細胞を選択的に殺し、それによって腫瘍サイズを縮小させるのに有用である、腫瘍溶解性ウイルスが開発されている(Liuらの文献、World J Gastroenterol. 2013 Aug 21;19(31):5138-43)。有用なウイルスは、それがもはや病原性ではない、すなわち非腫瘍細胞内で複製せずこれを殺さないように、ただし、腫瘍細胞には依然として入り込みこれを殺すことができるように無力化される。ある例示的なウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)は、癌の腫瘍溶解性治療のために有用であると示唆されている。培養下で又はインビボで活発に分裂する細胞において(例えば腫瘍において)、ウイルスが複製するのを依然として可能にするが、正常組織における顕著な複製を防止する、HSVに対するいくつかの変異が特定されている。
【０００５】
癌の腫瘍溶解性治療のために、HSVに加えて、様々な追加のウイルスの有望性が示されている。腫瘍溶解性HSVと、免疫調節性タンパク質、すなわち無力化されたウイルスゲノムにおいてコードされる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする遺伝子の送達との併用は、特に、HSVに対する免疫応答を通常低下させる、ウイルス機能の不活化後の、治療されるべき腫瘍に対する免疫刺激特性を有することが示されている。したがって、こうした使用では、腫瘍溶解性HSV変異体は、腫瘍の複製及び腫瘍溶解性破壊が起こるであろう原発性又は続発性腫瘍に接種されるであろう。この手法に関する問題は、GM-CSFが、抗原提示細胞を病変部に動員するために使用されるが、その後のこれらの細胞による腫瘍物質の取り込みはランダムであることである。抗原提示細胞は、小さい粒子性材料及び可溶性抗原の取り込みにかなり有効であるが、細胞又はより大きな細胞断片を内在化するのには非効率的である。
【０００６】
防御的な抗腫瘍免疫応答の誘導は、抗原提示細胞による腫瘍細胞及び細胞成分の取り込み、それに続く腫瘍抗原のプロセシング、及び抗原提示細胞による流入領域リンパ節へのその運搬を必要とする。該リンパ節では、免疫原性の腫瘍抗原ペプチドが、それぞれ腫瘍特異的なCD8+及びCD4+T細胞の活性化のためのクラスI又はクラスII MHC分子を伴う抗原提示細胞によって提示される。これらのT細胞が、プロセシング及び提示された腫瘍抗原ペプチドによって活性化されて初めて、これらのリンパ球は、増殖し、リンパ節を離れ、体内を循環して、関連腫瘍抗原を発現している転移性腫瘍細胞を探し、これを破壊する。したがって、有効な抗腫瘍免疫応答を誘発することは、腫瘍細胞の抗原提示細胞への有効かつ能動的なターゲティングを必要とする。
【０００７】
したがって、必要とされるのは、細胞溶解、並びに、抗原提示細胞動員及び以後の免疫応答のための腫瘍細胞、細胞細片、及び膜断片の能動的ターゲティングを通して、腫瘍サイズを非外科的に縮小させるための組成物及び方法である。必要とされるのはまた、腫瘍微小環境内の、抗原提示細胞による腫瘍細胞及び細胞断片内在化の効率を上昇させるための様式である。
【発明の概要】
【０００８】
(発明の概要)
本発明の第1の態様によれば、ヘキソシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、医薬として許容し得る担体と組み合わせて、本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルスを含む、医薬組成物が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、新生物を有する個体を治療する方法であって、
i)少なくとも1つの癌細胞中で、本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルスによって送達される内因性酵素を発現させて、細胞膜糖鎖付加を改変するステップと;
ii)該腫瘍溶解性ウイルスの投与により、該少なくとも1つの癌細胞の溶解を誘導するステップと
を含む前記方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様によれば、治療を必要とする、癌を患う又は新生物もしくは腫瘍を有する患者に、本明細書で定義する通りの治療有効量の腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法に関する一連の細胞事象を示す模式図を提供する。これらの事象は、A)操作されたウイルス組成物の投与、B)感染、複製、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα-galエピトープの発現、並びにC)腫瘍溶解、及び腫瘍部位での抗原提示細胞の動員を含む。
【図２】α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを含有し、かつ溶解前にその細胞表面上にα-galエピトープを発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞を示す模式図を提供する。α-gal標識された膜断片は、抗原提示細胞によって内在化される。(1)腫瘍細胞は、細胞質中に、また、細胞膜上に、腫瘍関連抗原(TAA)を含有し、これは、腫瘍に、またそれぞれ個々の患者に特有である。これらのTAAは、
【化１】
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として、また細胞内部のタンパク質分子(渦巻及び波線)として、細胞膜上に提示される。腫瘍病変に導入された腫瘍溶解性ウイルス(11の放射状突起を伴う黒丸)は、そのゲノムに挿入されたα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。(2)腫瘍細胞に感染する腫瘍溶解性ウイルスは、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を腫瘍細胞に導入する。この遺伝子は、感染した細胞内で転写及び翻訳され、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GT)酵素の産生がもたらされる。この酵素は、細胞表面糖タンパク質、糖脂質、及びプロテオグリカン上でα-galエピトープを合成する。天然の抗Gal抗体の、これらのα-galエピトープへの結合は、補体系を活性化し、したがって、補体切断ペプチドの形態の走化性因子を産生し、これが、抗原提示細胞を、治療される腫瘍病変に動員する。(3)腫瘍細胞は、腫瘍溶解性ウイルスによって、また、細胞膜上のα-galエピトープに結合される抗Galによって、補体依存性細胞傷害性によって及び抗体依存性細胞性細胞傷害性(ADCC)機構によって、溶解される。抗Gal抗体(これは、α-galエピトープに結合される)で被覆された死細胞及び断片化された細胞膜は、細胞又は細胞膜を被覆している抗Gal抗体のFc部分と、APC上のFcγ受容体との間の相互作用を介して、抗原提示細胞(APC)によって内在化される。この取り込みの結果として内在化されたTAAは、APCによってプロセシングされ、次いで、このTAAペプチドは、MHC分子を伴うAPC細胞膜上に提示される。APCは、流入領域リンパ節に移動し、流入領域リンパ節では、提示されたTAAペプチドが、腫瘍特異的なT細胞のT細胞受容体と結合する。この相互作用の結果として、これらのT細胞が活性化される。活性化された腫瘍特異的なT細胞は、循環し、転移性腫瘍細胞を検出し、これを破壊するために、増殖してリンパ節を離れる。
【図３】α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GT)遺伝子を含有するアデノウイルス(AdαGT)によって形質導入されたHeLa細胞における、α1,3GT及びα-galエピトープの出現に関する、タイムライン概略図を提供する。
【図４】バンディラ・シンプリシフォリア(Bandeiraea simplicifolia)IB4(BS)レクチン(A)とマウス抗Gal IgG(B)との結合によって示される、AdαGTを形質導入されたマウスB16メラノーマ細胞上でのα-galエピトープの発現を示すグラフを提供する。A. BSレクチンで染色された細胞のフローサイトメトリーによって測定される、B16AdαGT細胞(すなわち、AdαGT[1×1010感染単位(IU)/ml]によって形質導入されたB16細胞)上でのα-galエピトープの発現。レクチンは、フルオレセイン(FITC)と結合させる。点模様の領域を含む細線のヒストグラム-B16Adcont細胞(すなわち、挿入遺伝子を含有しないアデノウイルスを形質導入されたメラノーマ細胞); 太線のヒストグラム-B16AdαGT細胞。B. ELISAによって決定される、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウス血清における抗Galの、BL6AdαGT細胞上の(●)又はB16Adcont細胞上(○)のα-galエピトープへの結合。データは、類似の結果を有する6匹のマウスからの代表する3匹のマウスのものである。
【図５】B16AdαGTワクチンを使用するB16腫瘍負荷からの、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスの防御を示すグラフを提供する。抗Galを産生するα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスに、α-galエピトープを発現する2×106個の放射線照射されたB16細胞(B16AdαGT)(●)を、又は対照アデノウイルスを形質導入された放射線照射されたB16細胞(B16Adcont)(○)を、ワクチン接種した。この免疫化を、1週後に繰り返した。これらのマウスに、1週後、0.2×106個のB16生細胞(A)又は0.5×106個のB16生細胞(B)を負荷した。マウスを、腫瘍成長について、2か月間、毎日観察した。結果は、腫瘍負荷後の様々な日数での、腫瘍がないままであるマウスの割合として提示する。結果は、(A)における実験群の22匹のマウスと対照群の21匹のマウスのもの、及び(B)における実験群の21匹のマウスと対照群の18匹のマウスの別の実験におけるものである。
【図６】CRAd-αGT(A)及びCRAd-GFP(B)のゲノム構造を提供する図である。Ad5ゲノム配列は、Ad3のファイバーノブ(fiber knob)を発現するように改変した。E3又はE1配列は、欠失、又はそれぞれα1,3GT又はGFP遺伝子のヌクレオチド配列での置き換えによって改変した。
【図７】CRAd-αGTでの感染後のヒト癌細胞生存率の定量化を示す図である。A549及びA375細胞を、96ウェルプレートに播種し、1.2×1011ウイルス粒子(VP)/mlのCRAd-αGT又は9.7×1010VP/mlのCRAd-GFP対照ウイルスから開始する連続漸増のウイルスに感染させ、72時間インキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイCell Titre Glo(Promega社)を使用して定量化した。
【図８】CRAd-αGTでの感染後のヒト癌細胞生存率の可視化を示す図である。A549(肺癌)及びA375(メラノーマ)細胞を、24ウェルプレートに播種し、3.6×107ウイルス粒子(VP)/mlのCRAd-αGT又は1.9×1010VP/mlのCRAd-GFP対照ウイルスに感染させ、72時間インキュベートした。光学顕微鏡を拡大率10×で使用して可視化を実施した。
【図９】CRAd-αGTでの感染後のヒト癌細胞に対する抗Gal結合の分析。A549及びA375細胞を、1.44×106ウイルス粒子(VP)/mlのCRAd-αGT又は1.16×106VP/mlのCRAd-GFP対照ウイルスに感染させた。これらの細胞を、フローサイトメトリーによって、抗Gal結合及びGFP発現について分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様によれば、ヘキソシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。
【００１４】
本発明は、腫瘍細胞の腫瘍溶解性ウイルス誘導性の溶解を、能動的免疫介在性のターゲティング、及び抗原提示細胞(APC)の腫瘍部位への動員と組み合わせるための組成物及び方法に関する。α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼなどのヘキソシルトランスフェラーゼを発現する操作された腫瘍溶解性ウイルスは、感染した細胞の糖鎖付加を、ウイルス誘導性の溶解前に細胞膜上のα-galエピトープを発現するように改変することとなる。続いて、腫瘍細胞が、ウイルスによって溶解されると、細胞膜断片は、α-galエピトープと結合する天然の抗Gal抗体によってオプソニン化されて免疫複合体を形成することとなる。抗Gal抗体は、抗Gal抗体のFc領域とAPC上のFcγ受容体(FcγR)との間の相互作用を通して、APCによる腫瘍細胞断片の食作用を増強することとなる。同様に、ウイルス感染後にα-galエピトープを発現する無傷腫瘍細胞も、抗Galによってオプソニン化され、FcγRを介してAPCによって取り込まれることとなる。FcγRを介する抗原の取り込みは、APCの活性化及び成熟をもたらし、このAPCは腫瘍抗原をMHC分子上の提示のためにプロセシングし、流入領域リンパ節に移動し、流入領域リンパ節で腫瘍抗原をT細胞に提示する。このプロセスによって、患者自らの腫瘍抗原に対する防御的免疫応答がもたらされる。
【００１５】
先述のことに加えて、細胞表面上でのα-galエピトープの発現、及びα-galエピトープの抗Gal抗体とのその後の複合体形成は、補体の活性化を引き起こすこととなる。補体の活性化は、APCを腫瘍に動員する走化性ペプチドの放出;補体C3b分子を伴う無傷腫瘍細胞及び腫瘍細胞膜断片のオプソニン化; 無傷腫瘍細胞の補体介在性の溶解をもたらす。補体C3b分子を伴うオプソニン化された無傷腫瘍細胞及び腫瘍細胞断片は、C3bと、APC上の補体受容体との間の相互作用を介して、APCによって結合及び内在化される。
【００１６】
したがって、感染した腫瘍細胞の腫瘍溶解性ウイルス誘導性の溶解に加えて、抗Gal抗体を伴う腫瘍細胞及び細胞断片のオプソニン化、及び補体のその後の活性化、及び免疫複合体(これは、APCによって貪食される)の形成は、防御的な抗腫瘍免疫応答をもたらす。したがって、ウイルス誘導性の腫瘍溶解と免疫活性化との組み合わせによって腫瘍塊を破壊することは、非複製α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ発現ウイルス、又は複製可能な非α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ発現腫瘍溶解性ウイルス単独の別個の投与よりも改良されている。
【００１７】
したがって、本発明は、様々な種類の癌の改良された治療を提供し、さらには、今のところ治療可能ではないと考えられているこうした種類の治療が可能である。
【００１８】
本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を送達するように改変されている腫瘍溶解性ウイルスを使用する組成物及び方法を対象とする。前提は、該ウイルスが、腫瘍細胞に特異的に感染し、その後、機能性のα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を生成及び発現することである。続いて、このα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は、腫瘍細胞の表面上にα-galエピトープを産生する及び組み込む。腫瘍細胞膜上のα-galエピトープの組み込みは、腫瘍溶解性ウイルスによって誘導される細胞溶解前に起こり、その結果、その後の細胞膜細片は、α-galエピトープで標識されている。いかなる特定の機構に拘泥されることも望まないが、天然の抗Gal抗体による、α-gal標識された腫瘍細胞断片の結合は、(大抵の抗原/抗体相互作用がするように)補体系を活性化し、治療される腫瘍にAPCを動員する補体切断走化性因子をもたらすと考えられる。α-galエピトープを発現する腫瘍細胞及び腫瘍細胞膜断片は、抗Galによってオプソニン化され、腫瘍に動員されるAPCによる食作用のために能動的にターゲティングされる。本明細書に記載する手法は、GM-CSFを発現させる、以前の腫瘍溶解性ウイルス手法(ここでは、APCは、粒子性材料の最小限の食作用をもつ飲作用により、その近くにある可溶性分子をランダムに内在化する)とは機構的に異なると考えられる。本発明の手法では、腫瘍細胞断片又は無傷腫瘍細胞が、α-galエピトープを発現し、続いて抗Gal抗体と結合するので、腫瘍細胞膜は、APCによって、より効率的に貪食される。腫瘍細胞断片/無傷腫瘍細胞を被覆する抗Gal抗体のFc部分と、APC上のFcγRとの間の相互作用は、APCを刺激して抗原を内在化、プロセシング、及びT細胞に提示させる。さらに、補体の活性化、及び補体タンパク質C3bによる腫瘍細胞断片及び無傷腫瘍細胞のその後のオプソニン化は、補体受容体を有するAPCが、腫瘍抗原を効率的に内在化、プロセシング、及びT細胞に提示できるようにする。
【００１９】
本発明の方法は、誰も、おそらく、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを用いて腫瘍細胞表面糖鎖付加を改変して、APCによる取り込みのために細胞膜断片及び無傷細胞をターゲティングしようとすることを試みなかったであろうから、経験にそぐわないものである。
【００２０】
ウイルス誘導性の細胞溶解前のα-galエピトープの発現及び細胞膜組み込みは、以前に記載されているそれほど効率的でない方法と比較して防御的な抗腫瘍免疫応答を誘導する、APC動員及びAPCによる能動的取り込みのために腫瘍細胞膜断片を標識するための方法を提供する。いかなる特定の機構によっても制限されるべきではないが、主張する組成物及び方法が、その機構によって治療作用を有すると考えられる、ある可能な機構を示す模式図を、図1及び2に提供する。
【００２１】
本開示の実施態様は、他に指示されない限り、当業者の技術の範囲内である、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技術を用いることとなる。こうした技術は、文献において十分に説明されている。
【００２２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈によってそうではないと明らかに決定付けられない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」には、複数の指示物が含まれることに留意しなければならない。本明細書では、また、後続する特許請求の範囲では、いくつかの用語について言及するつもりであり、これらの用語は、そうではないという意図が明らかでない限り、以下の意味を有するように定義されるものとする。
【００２３】
種々の実施態様を説明する前に、以下の定義を提供し、他に指示されない限り、これらの定義が使用されるべきである。
【００２４】
一実施態様では、酵素は、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素である。さらなる実施態様では、酵素は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素である。
【００２５】
(Ι.組成物)
本明細書で有用な組成物は、腫瘍溶解性ウイルスと、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列と、任意に、投与のために有用な医薬として許容し得る担体とを含む。したがって、本発明のさらなる態様によれば、医薬として許容し得る担体と組み合わせて本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物が提供される。
【００２６】
(A.ウイルス)
一実施態様では、ウイルスは、腫瘍溶解性となるように操作される。代替実施態様では、ウイルスは、天然の状態で腫瘍溶解性である。
【００２７】
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍幹細胞マーカーに特異的な組換え結合ドメインを含む。
【００２８】
一実施態様では、ウイルスは、複製制限されており、非癌細胞を残しながら癌細胞のみを溶解する。
【００２９】
複製制限腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載する組成物及び方法のために特に有用である。こうしたウイルスは、癌細胞でのみ複製し、これを殺す。これらのウイルスは、さらに、追加的な抗腫瘍特性を有するタンパク質をコードする異種遺伝子(1又は複数)をコードすることができる。用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、癌細胞に感染し/入り込み、溶解する、あらゆるウイルスを含むことが意図される。理想的な腫瘍溶解性ウイルスは、非腫瘍性組織の破壊を最小限にしながら直接の細胞溶解によって、患者の臨床的に意義のある割合の癌細胞を効率的に殺す。
【００３０】
腫瘍溶解性ウイルスは、天然の状態で病原性ではない(例えば、天然の状態でヒトに感染しない)、又はヒトにおいて軽度の疾患しか引き起こさない(例えば、アデノウイルスは、インフルエンザ様症状を引き起こす)ならば、(安全上の観点から)好ましい。この理由から、承認されたワクチンにおいて成功裏に使用されており、かつ、何千又は何百万もの人々に投与されているウイルス(例えば天然痘ワクチン)も好ましい。ウイルスが、ヒトにおいて病原性であり、かつ重大な疾患と関連しているならば(例えば、いくつかのヘルペスウイルス株に関連する神経毒性)、ウイルスゲノム内に複数の欠失又は変異を入れ、これを癌細胞に特異的にし、また、内因性ウイルスでの単一の遺伝子組換え事象が十分に病原性の株を引き起こすリスクを低下させることが好ましい。標的化された腫瘍細胞侵入及び複製の特異性が望まれる。さらに、患者に適用される場合、ウイルスは、安全かつ非病原性であるべきである。多くの異なる種類のウイルスに由来する腫瘍溶解性ウイルスが、Liuら(Liuらの文献、Nature Clinical Practice Oncology 4:(2) 101-117, 2007)によって記載されている。これらの中では、限定はされないが、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ワクシニアウイルス(VV)、及びパラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス(MeV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、又は水疱性口内炎ウイルス(VSV)のようなラブドウイルスなどの、エンベロープウイルスが、最も知名度が高い。改変されていない野生型ウイルスを適用すること以外に、遺伝子操作によって、腫瘍溶解性ウイルスの安全性及び有効性をさらに向上させることができる。
【００３１】
異種遺伝子をコードする複製制限腫瘍溶解性ウイルスベクターの主要な特徴は、初期量の異種遺伝子を、注射された病変(1又は複数)内の癌細胞中で複製によってインビボで何倍にも増幅させ、かつ癌細胞から放出できることである。これは、例えば、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする変異単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)ベクターの特徴を記載しているLiuら(Liuらの文献、2003)によって教示されている。まとめて、これらの癌療法は、「武装化された(armed)治療用ワクチン」と称されている(Bauzon及びHermistonの文献、2014)。エンベロープタンパク質を操作することは、ウイルス感染を腫瘍細胞に限定することができ、また、自殺遺伝子の挿入は、治療効果を増強することができる(Nakamuraらの文献、Expert Opin. Bio. Ther. 4:(10): 1685-1692, 2004); Liuらの文献、Nature Clinical Practice Oncology 4:(2) 101-117, 2007; Liuらの文献、Gene Therapy, 10(4), 292-303, 2003)。
【００３２】
ウイルスは、組織培養における不死化された細胞株を通した複数回の連続継代によって維持されている、十分に特徴付けられた実験室適応株から得ることができる。しかし、患者におけるヒト腫瘍は、最適化された培養条件では、不死化された細胞株よりもゆっくりと成長し、また、代謝及び細胞分裂の速度を制限する他の環境的及び発生的因子(大きい腫瘍塊の中心に存在する可能性がある低酸素環境、不十分な栄養供給の結果など)を有する可能性がある。したがって、組織培養におけるその成長特性に基づくのではなく、インビボ(インサイチュ)での最適成長のために、ウイルスを選択することが好ましい。例えば、(患者から得られ、組織培養において短時間の増殖しか経ていない)臨床分離株JS1由来のHSV-1株を使用して、癌患者の治療のための腫瘍溶解性ウイルスが産生されている(Liuの文献、2003)。臨床分離株を選択することにおける重要な考慮事項は、臨床材料のスケールアップ及び製造のために必要である最適条件を、臨床分離株がインビトロで増殖できるように特定できることである。インビボでの腫瘍におけるその成長を損なわずに組織培養におけるウイルスの複製を改良する、ゲノムに対する変異が想定される。
【００３３】
患者における腫瘍組織内で複製し、これを溶解するその能力に基づいてウイルスベクターを選択することに加えて、インビボで複製するその能力をさらに向上させる、ゲノムに対する追加的な変異が想定される。例えば、臨床HSV-1株、JS1から、2つの遺伝子を欠失させる(Liuの文献、2003)。第1の欠失、ICP34.5は、ウイルス複製を癌細胞に限定し;第2の欠失、ICP47は、宿主のタンパク質、PKRのリン酸化をブロックするウイルスタンパク質をコードするUS11の早期発現をもたらす。PKRは、ウイルス感染に対する自然免疫応答の主要成分である-これは、リン酸化されると、感染した細胞におけるタンパク質翻訳を停止させ、ウイルス複製を制限する。したがって、変異体JS1 ICP34.5-/ICP47-株のインビボ複製は、野生型(非変異)株と比較して増強される。
【００３４】
種々の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性複製可能アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、又はニューカッスル病ウイルスである。
【００３５】
別の実施態様では、該ウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、自律性パルボウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、又はレオウイルスなどの、ヒト又は非ヒト起源のRNA又はDNAベースのウイルスである。
【００３６】
表1に示す例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、現在、臨床試験中であり、提供される治療法における使用のために、本明細書に記載する通りに改変することができる。種々の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ラブドウイルス科、又はパラミクソウイルス科のウイルスに由来する、好ましくはパラミクソウイルス科、モルビリウイルス属に由来する、エンベロープウイルスである。
【００３７】
表1:臨床的に評価された腫瘍溶解性ウイルス
【表１】
2018512150.tif 000004
Bauzon及びHermistonの文献（2014年）より
【００３８】
いくつかの腫瘍溶解性ウイルスが、遺伝子改変されて、腫瘍特異的な複製(アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス)を与えるのに対して、他のものは、天然の状態で腫瘍特異的なウイルス(レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、自律性パルボウイルス、ある種の麻疹株、及び水疱性口内炎ウイルス(VSV))である。
【００３９】
(i)アデノウイルス)
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルスである。α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ含有アデノウイルスを使用して達成された肯定的結果を示すデータを、本明細書の実施例1〜3及び8、並びに図4〜9に提示する。ヒトアデノウイルスは、約30〜38kBの、非エンベロープ型の二本鎖DNAウイルスである。アデノウイルスの主要な特徴は、重要な宿主調節タンパク質を阻害する、いくつかのウイルスタンパク質をコードすることである。これらの宿主調節タンパク質のいくつか(p53など)は、多くの癌では欠損している。したがって、該ウイルス遺伝子の欠失は、変異体ウイルスを、調節性の宿主タンパク質が欠損した癌における複製に対して選択的にする。
【００４０】
したがって、アデノウイルスE1B-55kD遺伝子、p53抑制タンパク質(例えば、ウイルスdl1520中)の変異は、p53機能が制限された又はp53機能を有しない腫瘍に対して選択的である。p53機能は、大抵のヒト癌では、遺伝子変異、p53結合阻害剤(例えばmdm2、ヒトパピローマウイルスE6)の過剰発現、及びp14ARFによって調節されるp53阻害経路の喪失を含めた、様々な機構を通して失われる。
【００４１】
同様に、E1a保存領域2内の欠失は、網膜芽細胞腫(RB)タンパク質結合の欠損を有し、これらの変異体は、RB経路異常を伴う腫瘍に対する使用について(例えばウイルスdl922/947において)評価されている。
【００４２】
アデノウイルスの癌細胞選択的な複製を得るための別の手法は、対象の組織又は癌に特異的なプロモーターを使用して、ウイルスE1a遺伝子産物の発現を制御することである。例えば、これは、E1a遺伝子の上流に前立腺特異的な抗原(PSA)プロモーター/エンハンサーを導入するためのゲノムの遺伝子改変によって、前立腺癌を標的にする腫瘍溶解性アデノウイルスに適用されている。
【００４３】
一実施態様では、ウイルスは、複製が腫瘍細胞に限定される、条件付き複製型(conditionally replicating)アデノウイルス(CRAd)である。CRAdは、癌細胞内で選択的に複製し、その溶解及び死を引き起こすことが実証されている(Fueyoらの文献、2000; Kannoらの文献、2012; Bramanteらの文献、2015)。CRAdは、Ad5/3キメラウイルスを作り出すために、アデノウイルス3(Ad3)のファイバーノブを発現するように遺伝子改変されているアデノウイルス5(Ad5)を使用して産生されている(Kanervaらの文献、2003; Kimらの文献、2013)。
【００４４】
したがって、一実施態様では、CRAdは、Ad5/3キメラウイルスである。キメラAd5/3ウイルスは、Ad5によって結合されるコクサッキー-アデノウイルス受容体(CAR)ではなく、Ad3受容体であるCD46を使用して細胞と結合し、中に入ることが可能である。多くの腫瘍は、CARの発現にばらつきがあるのに対して、すべての有核細胞は、CD46を発現するので、これは、好都合である(Ulasovらの文献、2006)。ウイルスは、ウイルス前初期(immediately early)(E1a)遺伝子の定常領域2(CR2)内に24塩基対欠失(Δ24)を導入することによって条件付き複製型にされる(Kanervaらの文献、2003)。
【００４５】
したがって、一実施態様では、Ad5/3キメラウイルスは、ウイルス前初期(E1a)遺伝子の定常領域2(CR2)内に24塩基対欠失(Δ24)をさらに含み、本明細書ではAd5/3-Δ24 CRAdとして知られる。この変異は、細胞内のS期の誘導に関する網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質と結合することができない、ウイルスE1aタンパク質をもたらす(Fueyoらの文献、2000)。したがって、このウイルスは、非分裂正常細胞では複製することができないが、不活性なRb/p16経路、すなわち、すべての癌に共有されることが示されている表現型を有する細胞では効率的に複製する(Sherrの文献、1996)。キメラの条件付き複製型Ad5/3-Δ24 CRAdは、導入遺伝子でのアデノウイルス初期領域(E3)遺伝子の置換によってさらに改変することができ、これは、複製中に導入遺伝子を特異的に産生するAd5/3-Δ24 CRAdをもたらす(Koskiらの文献、2010; Kanervaらの文献、2013; Bramanteらの文献、2015)。キメラの条件付き複製型Ad5/3-Δ24 CRAdは、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ導入遺伝子でのアデノウイルス初期領域(E3)遺伝子の置換によってさらに改変されており、これは、複製中にα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを特異的に産生するAd5/3-Δ24 CRAdをもたらす。したがって、一実施態様では、Ad5/3-Δ24 CRAdは、本明細書ではCRAd-αGTとして知られるα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ導入遺伝子をさらに含む。データを、本明細書に、実施例8及び図6〜9において提示し、これは、CRAd-αGTに感染したヒト肺癌及びメラノーマ細胞が、細胞表面上にα-galエピトープを発現し、ウイルス誘導性の溶解の前に抗Gal抗体によって結合されることを実証する。
【００４６】
(ii)ヘルペスウイルス)
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスである。方法論を、本明細書に、実施例4〜7において提示し、これは、α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ含有ヘルペスウイルスを使用して、どのようにして肯定的結果を得ることができるのかを実証する。ヘルペスウイルス(HSV)は、約152kbpのエンベロープ型二本鎖DNAウイルスであり、神経及び粘膜細胞に対する天然の指向性を有する。HSVは、神経系及び他の場所における遺伝子送達ベクターとしても、癌の腫瘍溶解性治療のための遺伝子送達ベクターとしても有用であることが示唆されている。しかし、どちらの用途でも、ウイルスは、それがもはや病原性ではないように、ただし、細胞には依然として入り込み所望の機能を果たすことができるように、無力化されなければならない。したがって、HSVを使用した標的細胞への非毒性の遺伝子送達については、大抵の場合、ウイルスからの前初期遺伝子発現が阻止/最小限にされなければならないことが明らかになっている。治療効果を増強する遺伝子(1又は複数)の送達も含むことができる癌の腫瘍溶解性治療については、培養下で又はインビボで活発に分裂する細胞において(例えば腫瘍において)、ウイルスが複製するのを依然として可能にするが、正常組織における顕著な複製を防止する、HSVに対するいくつかの変異が特定されている。こうした変異には、ICP34.5、ICP6、及びチミジンキナーゼをコードする遺伝子の破壊が含まれる。これらのうち、ICP34.5に対する変異、又は例えばICP6の変異に加えてICP34.5に対する変異を伴うウイルスは、今までのところ、最も好都合な安全プロフィールを示している。ICP34.5についてのみ欠失されたウイルスは、多くの腫瘍細胞型においてインビトロで複製すること、また、マウスにおいて人為的に誘導した脳腫瘍において、周囲の組織には危害を加えずに、選択的に複製することが示されている。初期段階の臨床試験は、ヒトにおけるその安全性も示されている。こうしたウイルス及び使用の例は、PCT公報WO 2001/053506、WO 98/004726、WO 98/051809、及びWO 99/060145に記載されている。
【００４７】
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、HSV1ウイルスである。ある例示的な腫瘍溶解性ウイルス株は、2001年1月2日に、受託番号01010209で欧州培養細胞保存機関(European Collection of Cell Cultures)(ECACC)、CAMR, Sailsbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdomに寄託されたHSV1株JS 1である。このような腫瘍溶解性ウイルス株は、提供される方法における使用のためのガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を発現させるために、本明細書に記載する通りに改変することができる。
【００４８】
(iii)ワクシニアウイルス)
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルスは、約200kBのエンベロープ型二本鎖DNAウイルスである。このウイルスは、細胞質において複製し、その感染粒子と共に、DNA複製及びその遺伝子の転写のために必要とされる酵素をもたらす。ワクシニアウイルスは、これを優れた腫瘍溶解性ウイルスにする多くの特質を有する。ワクシニアウイルスは、複数の外来遺伝子を収容する能力をもつ大きなゲノムを有し、広い宿主範囲を有し、迅速に複製し、ウイルス変異体を作製するために容易に組換えることができる。天然痘ワクチンとしてのワクシニアウイルスの使用を通した、良好な安全記録が確立されている。
【００４９】
(iv)麻疹ウイルス)
一実施態様では、ウイルスは、麻疹ウイルス(MeV)、又はエドモンストン(Edmonston)株(MeVEdm)などのMeVのワクチン株である。MeVは、2種のエンベロープ糖タンパク質(融合タンパク質(F)及びヘマグルチニンタンパク質(H))を利用して、標的細胞に入る。タンパク質Fが、I型膜貫通タンパク質であるのに対し、タンパク質Hは、II型膜貫通ドメインである、すなわちそのアミノ末端が、細胞質領域に直接的に曝露されている。したがって、どちらのタンパク質も、膜貫通領域と細胞質領域を含む。Fタンパク質の、ある公知の機能は、ウイルス膜と宿主細胞の細胞膜との融合を仲介することである。Hタンパク質に起因する機能としては、標的膜上の受容体を認識すること、及び、Fタンパク質を、その膜融合作用において補助することが挙げられる。細胞表面膜での直接的かつ非常に効率的な膜融合が、麻疹ウイルス及びモルビリウイルスの特有の性質であり、それゆえに、エンドサイトーシスされるようになるとエンドサイトーシス時のpH低下時にのみ融合することとなる、多くの他のエンベロープウイルスと区別される。どちらのタンパク質も、ウイルス表面上で、密集したスパイク、H四量体、及びF三量体の規則的配列で組織化されている(Russellらの文献、Virology 199:160-168, 1994)。
【００５０】
MeV(MeVEdm)のエドモンストン株は、その主要な受容体として単一のタンパク質、すなわち、補体活性化因子の調節因子であることが公知のタンパク質、CD46を使用する(Gerlierらの文献、Trends Microbiol. 3:338-345, 1995)。CD46は、すべてのヒト有核細胞上で発現される。しかし、麻疹ウイルスの大抵の臨床分離株は、CD46を受容体として効率的に使用することができない。ヒトSLAM(シグナル伝達リンパ球活性化分子; CDw150としても公知である)は、いくつかのT及びB細胞上で発現される近年発見され、エドモンストン株を含めたMeVに対する細胞受容体として働くことも判明している、膜糖タンパク質である(Tatsuoらの文献、Nature 406(6798):893-7, 2000)。MeV H及びFタンパク質の厳密な生体機能及び相互作用は、大部分は不明確なままである。
【００５１】
α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼなどの核酸配列をコードするヘキソシルトランスフェラーゼを含むように改変することができる、癌のための臨床開発におけるいくつかの腫瘍溶解性ウイルスが存在する。こうした腫瘍溶解性ウイルスの例としては、Ad-mda7(p53 社)、Ad-p53(p53 社)、CG-0070(Cold Genesys社)、DNX-2401(DNAtrix社)、DWP-418(Daewoong Pharmaceutical社)、huIL-12を発現するHSV(アラバマ大学バーミングハム校(Univ. Alabama Birmingham))、G-47 Delta(東京大学医学部付属病院)、ガンシクロビル/ADV-TK(Shenzhen Tiandakang)、GLONC-1(Genelux社)、GLONC-2(Genelux社)、GLONC-3(Genelux社)、HF-10(宝ホールディングス株式会社)、HSV-1716(Virttu Biologics社)、JX-929(Jennerex Bioterapeutics社)、KH-901(Chengdu Kanghong Pharmaceuticals社)、MV-NISワクチン(メイヨー・クリニック(Mayo Clinic))、NDV-HUJ腫瘍溶解性(ハダサー・メディカル(Hadassah medical))、OBP-301(オンコリスバイオファーマ(Oncolys BioPharma)社)、腫瘍溶解性AdV(エラスムス医療センター(Erasmus MC))、ONCOS-102(Oncos Therapeutics社)、ORCA-010(Orca Therapeutics社)、パルボウイルスH-1(Oryx社)、ペキサスチモジンデバシレプベク(pexastimogene devacirepvec)(Jennerex Bioterapeutics社)、PV-701(Wellstat Biologics)、タリモジーン・ラハーパレプベック(talimogene laherparepvec)(Amgen社)、TG-1042(Ascend Biopharmaceuticals社)、VCN-01(VCN Biosciences社)、及びVirRx-007(p53 社)が挙げられる。
【００５２】
本発明のウイルスは、腫瘍細胞において感染及び複製し、その後腫瘍細胞を殺す。したがって、こうしたウイルスは、複製可能である。好ましくは、こうしたウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製可能である。これは、こうしたウイルスが、腫瘍細胞では複製するが非腫瘍細胞では複製しない、又は、こうしたウイルスが、腫瘍細胞では、非腫瘍細胞におけるよりも効率的に複製することを意味する。ウイルスが複製することが可能な細胞は、許容細胞である。
【００５３】
選択的複製能力の測定は、複製及び腫瘍細胞殺傷能力の測定のための、本明細書に記載する試験によって実施し、また、所望される場合本明細書に言及する統計技術によって分析することができる。
【００５４】
本発明のウイルスは、改変されていない親株よりも優れた、腫瘍細胞において感染若しくは複製し、腫瘍細胞を殺傷し、又は組織内の細胞間に広がる能力を有することが好ましい。好ましくは、この能力は、統計的に有意な、より優れた能力である。例えば、本発明によるウイルスは、試験される性質に関して、改変されていない親株の、最大1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、又は100倍の能力を有することができる。
【００５５】
腫瘍細胞に関するウイルス株の性質は、当技術分野で公知のいかなる方式でも測定することができる。例えば、ウイルスが腫瘍細胞に感染する能力は、所与の割合の細胞、例えば50%又は80%の細胞を感染させるのに必要とされるウイルスの用量を測定することによって定量化することができる。腫瘍細胞において複製する能力は、実施例において実施されるものなどの成長測定によって、例えば、6、12、24、36、48、又は72時間又はそれ以上の期間にわたって、細胞におけるウイルス成長を測定することによって、測定することができる。同様に、ウイルスが腫瘍細胞を溶解する能力は、所与の用量のウイルスと共に、6、12、24、36、48、又は72時間又はそれ以上の期間にわたってインキュベートされた培養株における(死細胞に対する)生細胞の割合を測定することによって定量化することができる。
【００５６】
(B)異種核酸配列及びプロモーター)
本発明のウイルスは、異種核酸配列を保持するように改変することができる。一実施態様では、異種核酸は、ヘキソシルトランスフェラーゼをコードする。一実施態様では、核酸配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。ある特定の実施態様では、核酸配列は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。用語「α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ」、「α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ」、「α1,3GT」、「α1,3GT」、「糖タンパク質α-ガラクトシルトランスフェラーゼ1」、及び「GGTA1」とは、本明細書で使用する場合、α-galエピトープを合成する能力があるあらゆる酵素をいう。この酵素は、ヒト、類人猿、及び旧世界ザルを除く大抵の哺乳類において産生される。この酵素によって産生される炭水化物構造は、ヒトにおいて免疫原性であり、大抵の健康な人々は、「抗Gal」抗体とも称される、高い力価の天然の抗α-gal抗体を有する。いくつかの実施態様では、用語「α1,3GT」とは、マウスα1,3GT(例えば、GenBank受託番号NM_010283のハツカネズミ-ヌクレオチド460から1680)、及びその遺伝子産物、並びにその機能性の哺乳類対応物(例えば、他の新世界ザル、原猿類、及び非霊長類哺乳類(ただし、旧世界ザル、類人猿、及びヒトではない)をいう。いくつかの実施態様では、用語「α1,3GT」は、共通のマーモセット遺伝子(例えば、マーモセット(Callithrix jacchus)-GenBank受託番号S71333)、ウシα1,3GT(例えば、ウシ(Bos taurus)-GenBank受託番号NM_177511)、ネコα1,3GT(例えば、ネコ(Felis catus)-GenBank受託番号NM_001009308)、ヒツジα1,3GT(例えば、ヒツジ(Ovis aries)-GenBank受託番号NM_001009764)、ラットα1,3GT(例えば、ラット(Rattus norvegicus)-GenBank受託番号NM_145674)、及びブタα1,3GT(例えば、イノシシ(Sus scrofa)-GenBank受託番号NM_213810)をいう。本発明のいくつかの実施態様は、例えば1〜5%よりも少ない残基において野生型の哺乳類α1,3GT配列と異なる、哺乳類α1,3GTの機能性バリアントを含む。具体的には、α1,3GTバリアントとしては、限定はされないが、天然に存在する機能性の哺乳類α1,3GTバリアント、並びに、組換え又は他の手段(例えば、好ましくは機能性の哺乳類α1,3GT相同体からの残基に相当する、1、2、3、4、若しくは5アミノ酸の置換、欠失、又は付加)によってもたらされる天然に存在しないバリアントが挙げられ、本発明の組成物及び方法における用途が見出されることが期待される。他の実施態様では、触媒活性を保持する哺乳類α1,3GTの切断型(例えば、90アミノ酸N末端ステム領域を欠くGGTA1)が用いられる。しかし、この酵素のC末端からの3アミノ酸の欠失は、その完全な不活化をもたらす(Henion, T.R.、B.A. Macher、F. Anaraki、及びU. Galiliらの文献、Glycobiology 4:193-201, 1994)。
【００５７】
α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼは、アデノウイルスにおいて以前に操作され、細胞移動のために使用されている(Deriyらの文献、Glycobiology, 12(2), 135-44 2002; Deriyらの文献、Cancer Gene Therapy, 12(6)、528-39, 2005)。α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼは、本明細書に記載する溶解/免疫化の組み合わせ方法のために腫瘍溶解性ウイルスによって発現されるように操作されたことがない。
【００５８】
本明細書に記載する実施態様では、異種核酸配列は、インビボで細胞内で前記遺伝子の発現を可能にする制御配列に、作動可能に連結されることが好ましい。したがって、本発明のウイルスを使用して、その発現の場となるインビボの細胞に異種核酸配列を送達することができる。
【００５９】
本発明のさらなる態様によれば、ヘキソシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに導入するステップを含む、本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法が提供される。
【００６０】
異種核酸配列は、例えばHSV配列に隣接して配置される遺伝子を保持するプラスミドベクターを用いるHSV株の相同組換えなどの、あらゆる適切な技術によって、ウイルスゲノムに挿入することができる。
【００６１】
異種核酸配列は、当技術分野で周知のクローニング技術を使用して、ヘルペスウイルス配列を含む適切なプラスミドベクターに導入することができる。したがって、一実施態様では、前記導入ステップは、クローニングを含む。異種核酸配列は、腫瘍溶解特性が引き続き保持されるという条件で、ウイルスゲノムのあらゆる位置に挿入することができる。異種核酸配列は、ウイルスゲノム内の複数の部位に挿入することができる。例えば、2から5遺伝子を、ゲノムに挿入することができる。
【００６２】
異種核酸配列の転写される配列は、腫瘍細胞内で遺伝子の発現を可能にする制御配列に、作動可能に連結されることが好ましい。用語「作動可能に連結される」とは、並置(ここでは、記載された構成要素が、その意図される方式で作用することを可能にする関係である)をいう。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、制御配列と適合性のある条件下でコード配列の発現が実現されるような方式で連結される。
【００６３】
制御配列は、異種核酸配列の発現を可能にするプロモーター、及び転写の終結のためのシグナルを含む。プロモーターは、哺乳類、好ましくはヒト腫瘍細胞において機能性であるプロモーターから選択される。プロモーターは、真核生物遺伝子のプロモーター配列から得ることができる。例えば、プロモーターは、異種遺伝子の発現が起こることとなる細胞、好ましくは哺乳類、好ましくはヒト腫瘍細胞のゲノムから得ることができる。真核生物プロモーターについては、プロモーターは、組織非特異的(ubiquitous)方式で(β-アクチン、チューブリンのプロモーターなど)、或いは腫瘍特異的な方式で作用するプロモーターであり得る。特定の刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体と結合するプロモーターも存在し得る。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列(MMLV LTR)プロモーター又は他のレトロウイルスプロモーター、ヒト若しくはマウスサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーター、又はヘルペスウイル遺伝子のプロモーター(潜伏関連転写物の発現を駆動するものを含む)も使用することができる。
【００６４】
異種核酸配列及び制御配列を含む発現カセット及び他の適切な構築物は、当業者に公知の通例のクローニング技術を使用して作製することができる(例えば、Sambrookらの文献、1989、「分子クローニング--実験マニュアル(Molecular Cloning -- A laboratory manual)」; Cold Spring Harbor Pressを参照のこと)。
プロモーターが、腫瘍細胞の寿命内に異種核酸配列の発現のレベルを調節できるように誘導可能であることも好都合である。「誘導可能な」は、プロモーターを使用して得られる発現のレベルを、調節できることを意味する。例えば、本発明のウイルスは、強力なプロモーター(例えばCMV IEプロモーター)の制御下でtetリプレッサー/VP16転写活性化因子-融合タンパク質をコードする異種核酸配列を、さらに含むことができ、かつ、この異種核酸配列は、以前に報告されているtetリプレッサーVP 16転写活性化因子-融合タンパク質に応答するプロモーターの制御下であり得る(Gossen及びBujardの文献、1992、Gossenらの文献、1995)。したがって、この例では、異種核酸配列の発現は、テトラサイクリンの有無に依存するであろう。
【００６５】
複数の異種遺伝子を、ヘルペスウイルスゲノムに入れることができる。したがって、本発明のウイルスは、2以上の異種核酸配列、例えば2から3、4、又は5つの異種核酸配列を含むことができる。2以上の遺伝子及び随伴する制御配列が、ある特定の腫瘍溶解性ウイルス株のウイルスゲノム内の単一の部位に又は複数の部位に導入される可能性がある。或いは、それぞれが異種核酸配列の発現を駆動する、互いに離れている逆方向で向かい合うプロモーター対(同じ又は異なるプロモーター)を使用することができる。
【００６６】
別の実施態様では、免疫調節性タンパク質が、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素と共発現される。好ましくは、免疫調節性タンパク質は、ウイルスの抗腫瘍活性を増強することとなる。より好ましくは、該タンパク質は、GM-CSF若しくは別のサイトカイン、ケモカイン(例えばRANTES)、又は別の免疫調節性分子、例えばB7.1、B7.2、若しくはCD40Lである。最も好ましくは、免疫調節性分子は、GM-CSFである。したがって、一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、GM-CSFをコードする核酸配列を含む。免疫調節性遺伝子は、野生型遺伝子の任意の対立遺伝子バリアントであってもよいし、変異体遺伝子であってもよい。免疫調節性遺伝子は、哺乳類、好ましくは齧歯類又は霊長類、より好ましくはヒトに由来することとなる。
【００６７】
(C)医薬組成物)
本発明の腫瘍溶解性ウイルスの医薬組成物は、1以上の生理的に許容し得る担体又は賦形剤を使用する、あらゆる従来の方式で製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、全身、局所、又は局在型投与を含めた様々な様式の投与のために製剤化することができる。技術及び製剤は、例えば、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、Meade Publishing Co., Easton, Pa.中で参照することができる。
【００６８】
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルス組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、皮下投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、経粘膜投与、又は経皮投与のために製剤化することができる。
【００６９】
さらなる実施態様では、腫瘍溶解性ウイルス組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、経粘膜投与、又は経皮投与のために製剤化することができる。
【００７０】
適切な腫瘍溶解性ウイルスの、治療されるべき癌性細胞への送達は、裸のウイルスを使用して、又は担体への、例えばナノ粒子、リポソーム、若しくは他の小胞へのウイルスの封入によって、実施することができる。
【００７１】
投与は、「治療有効量」(これは、個体にとっての利益を示すのに十分である)であることが好ましい。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療される腫瘍の性質及び重症度に依存することとなる。治療の処方、例えば投薬量に関する決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、一般的に、治療されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、及び開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。先に言及した技術及びプロトコルの例は、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins中で参照することができる。
【００７２】
腫瘍溶解性ウイルスは、あらゆる治療上有効な投薬量で投与することができる。治療上有効な投薬量は、限定はされないが、約103、約104、約105、約106、約107、約108、又は約109プラーク形成単位(pfu)であり得る。
【００７３】
全身投与については、腫瘍内、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下を含めた注射が好ましい。注射の目的では、本発明の医薬組成物は、溶液中に、好ましくは、ハンクス液又はリンゲル液などの生理的に適合性のある緩衝液中に製剤化することができる。さらに、該医薬組成物は、固体形態で製剤化し、使用の直前に再溶解又は懸濁させることができる。該医薬組成物の凍結乾燥形態も、適切である。
【００７４】
全身投与はまた、経粘膜又は経皮的手段によるものであり得る。経粘膜又は経皮投与については、浸透されるべき障壁に適した浸透剤が、製剤内に使用される。こうした浸透剤は、当技術分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、浸透を容易にするために、界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与は、点鼻薬又は座剤を使用して行うことができる。局所投与については、本発明のベクター粒子を、当技術分野で一般に公知である通りの、軟膏、膏薬(salve)、ゲル、又はクリーム剤に製剤化することができる。治癒を加速するために、外傷又は炎症を処置するために、洗浄液も局所的に使用することができる。
【００７５】
該医薬組成物は、注射による、例えば、ボーラス注入又は持続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、任意に保存剤が添加されるアンプル又は複数回投与用容器で提示することができる。該医薬組成物はさらに、懸濁剤、液剤、又は乳剤(油性又は水性ビヒクル中)として製剤化することができ、また、懸濁剤、安定化剤、及び/又は分散剤を含めた他の薬剤を含有することができる。
【００７６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物と、該組成物を対象に送達するための送達装置とを含むキットを含む。例としては、送達装置は、スクイーズ可能スプレーボトル、定量噴霧スプレーボトル、エアロゾルスプレー装置、噴霧器、ドライパウダー送達装置、自己推進溶媒/粉末-分注装置、シリンジ、針、タンポン、又は投薬量計量容器であり得る。キットは、本明細書に記載する通りの説明資料をさらに含むことができる。
【００７７】
(II)方法)
本発明のウイルス組成物は、ヒト又は動物の体の癌治療の方法において使用することができる。特に、本発明のウイルスは、追加のプロドラッグ療法又は抗腫瘍免疫応答の刺激を伴う又は伴わずに、癌の腫瘍溶解性治療において使用することができる。本発明のウイルス組成物は、哺乳類における、好ましくはヒトにおける、あらゆる固形腫瘍の治療的処置において使用することができる。
【００７８】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、新生物を有する個体を治療する方法であって、次のステップを含む前記方法が提供される:
i)少なくとも1つの癌細胞中で、本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルスによって送達される内因性酵素を発現させて、細胞膜糖鎖付加を改変するステップと;
ii)該腫瘍溶解性ウイルスの投与により、該少なくとも1つの癌細胞の溶解を誘導するステップ。
【００７９】
一実施態様では、該方法は、有効量の腫瘍溶解性ウイルス組成物を投与することによって、癌を有する個体を治療することを目的とする。ここでは、ウイルス感染は、溶解前にヘキソシルトランスフェラーゼの発現を引き起こす。
【００８０】
一実施態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、個体における少なくとも1つの癌細胞に感染するのに有効な量で投与される。
【００８１】
別の実施態様では、α-galエピトープは、感染から10時間以内に、感染した細胞膜に挿入される。
【００８２】
別の実施態様では、α-galエピトープは、感染した細胞の溶解前に、感染した細胞膜に挿入される。
【００８３】
一実施態様では、該方法は、癌を有する個体を治療することを目的とする。
【００８４】
別の実施態様では、該方法は、腫瘍を有する個体を治療することを目的とする。
【００８５】
別の実施態様では、該方法は、癌を有する個体を治療することを目的とする。
【００８６】
一実施態様では、改変された細胞膜は、抗原提示細胞動員のために膜断片を能動的にターゲティングさせる。
【００８７】
別の実施態様では、酵素は、溶解前の感染した細胞膜上にα-galエピトープを発現させるのに十分である。
【００８８】
別の実施態様では、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ発現は、溶解後の感染した細胞に対する有効な免疫応答を誘導するのに十分である。
【００８９】
別の実施態様では、α-galエピトープは、抗原提示細胞を腫瘍部位に引きつけるのに十分である。
【００９０】
別の実施態様では、酵素は、感染から4時間以内に発現される。
【００９１】
別の実施態様では、α-galエピトープは、腫瘍部位における抗gal抗体と結合するのに十分である。
【００９２】
この方法において記載される腫瘍の抗Gal介在性の破壊は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する遺伝子治療ベクターの注射によって実現することができる。一実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する複製可能な腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射を含む、多発転移を伴うメラノーマ患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、ウイルス組成物の腫瘍内注射は、α-galエピトープを発現する形質導入された腫瘍細胞をもたらし、ここでは、これらの腫瘍細胞は、腫瘍内炎症、その後の溶解を誘導する。腫瘍内炎症は、樹状細胞、マクロファージ、及びある種のB細胞などの抗原提示細胞を動員する。感染した細胞は、本明細書に記載する操作された複製可能なウイルス組成物によって溶解させることもできるし、あるいは補体依存性細胞傷害(CDC)又は抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)機構を介して、形質導入された細胞上のα-galエピトープに結合される天然の抗Gal抗体によって破壊することもできる。発明の機構を理解する必要はないが、抗Galによってオプソニン化された腫瘍膜が、腫瘍細胞膜断片又は無傷腫瘍細胞を、抗原提示細胞に能動的にターゲティングさせ、したがって、防御的抗腫瘍免疫を促進することとなると考えられる。
【００９３】
別の実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射を含む、結腸内と肝臓内に多発転移を有する結腸直腸癌患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、該注射は、ウイルスベクターを腫瘍病変に送達する手段として結腸内視鏡検査又は腹腔鏡検査を含む。
【００９４】
さらに別の実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射を含む、肺内に多発転移を有する肺癌患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、該注射は、気管支鏡検査を含む。
【００９５】
別の実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ウイルスベクターを含有する腫瘍溶解性ウイルスを含む、膀胱癌を有する患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、該ベクターは、膀胱鏡検査によって投与される。
【００９６】
別の実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ウイルスベクターを含有する腫瘍溶解性ウイルスを含む、膵臓腺癌を有する患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、ベクターは、内視鏡検査又は腹腔鏡検査によって投与される。
【００９７】
別の実施態様では、本発明は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ウイルスベクターを含有する腫瘍溶解性ウイルスを含む、乳癌を有する患者を治療する方法を企図する。一実施態様では、該ベクターは、腫瘍への直接的注射によって投与される。
【００９８】
α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ウイルスベクターを含有する腫瘍溶解性ウイルスの投与は、α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の腫瘍内送達を利用可能であるあらゆる固形腫瘍又はリンパ腫において実施することができる。例えば、腫瘍内送達は、US 7,820,628に記載されている。
【００９９】
α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を送達するための代替方法は、遺伝子を送達することができる任意の種類のウイルス及び非ウイルスベクターを用いて実施することもできる。例えば、これらの方法には、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノウイルスヘルパーウイルス、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、裸のDNAベクター、ヘルペスウイルス、又は裸のRNAベクター若しくはDNAベクターが含まれる。
【０１００】
別の実施態様では、本発明は、メラノーマ病変又は他のあらゆる腫瘍病変への注射によって、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するベクターを投与し、それによってエピトープを腫瘍細胞膜に挿入するための方法を企図する。α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する腫瘍溶解性ウイルスを形質導入された腫瘍細胞の場合と同様に、抗Gal IgGは、α-galエピトープを発現している腫瘍細胞膜に結合することとなり、また、腫瘍細胞膜を、腫瘍抗原を発現する治療されていない腫瘍病変に対する全身性の免疫応答も誘発するための抗原提示細胞にターゲティングすることとなる。当業者は、本発明が、腫瘍塊に導入されるいずれかの組成物(これは、抗Gal抗体の、腫瘍細胞へのインサイチュ結合をもたらす)による、この天然の抗体による抗原提示細胞へのターゲティングによって駆動される抗腫瘍性の適応免疫の発生を企図することを認識するべきである。
【０１０１】
(A)投与)
本発明のウイルスは、治療を必要とする患者、好ましくはヒト患者において使用することができる。治療を必要とする患者は、癌を患う個体、好ましくは固形腫瘍を有する個体である。治療的処置の目的は、患者の状態を改善することである。一般的に、本発明のウイルスを使用する治療的処置は、癌の症状を軽減する。
【０１０２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の治療有効量のウイルスを、治療を必要とする、癌を患う又は新生物若しくは腫瘍を有する患者に投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
【０１０３】
本発明のさらなる態様によれば、癌の治療における使用のための、本明細書で定義する通りの腫瘍溶解性ウイルス、又は本明細書で定義する通りの医薬組成物が提供される。
【０１０４】
本発明の腫瘍溶解性ウイルスの、腫瘍を患う個体への投与は、典型的には、腫瘍の細胞を殺し、したがって、腫瘍のサイズを低下させる、及び/又は、腫瘍からの悪性細胞の広がりを防止する、一方でまた、抗原提示細胞(APC)を腫瘍部位に動員し、防御的な抗腫瘍免疫応答を誘導することとなる。
【０１０５】
治療法を施すある方法は、ウイルスを、医薬として許容し得る担体又は希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を生成することを含む。
【０１０６】
適切な担体及び希釈剤としては、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。本明細書に記載する組成物は、腫瘍部位でのウイルス感染を促進ための従来の投与経路を使用して投与することができる。
【０１０７】
一実施態様では、該組成物は、注射(例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下)、吸入、若しくはインシュレーション(insulation)(例えば、経粘膜的に若しくは鼻腔内に、口若しくは鼻を通して)を介して、又は経口、頬側、非経口、又は直腸内投与経路によって投与される。
【０１０８】
一実施態様では、該組成物は、腫瘍又は腫瘍に供給する血管であり得る標的組織への直接的注射によって投与される。投与されるウイルスの量は、HSVの場合、104から1010プラーク形成単位(pfu)、好ましくは105から108pfu、より好ましくは約106から108pfuの範囲内である。一般的に、ウイルスと、医薬として許容し得る適切な担体又は希釈剤との、最大500μ1まで、一般的には1から200μ1、好ましくは1から10μ1の医薬組成物が、注射のために使用されるであろう。しかし、いくつかの腫瘍溶解性治療用途については、腫瘍及び接種部位に応じて、限定はされないが最大10mlまでの、より大きな体積も、使用することができる。
【０１０９】
当業者は、最適投与経路及び投薬量を容易に決定することができるので、記載した投与の経路及び投薬量は、指針とすることを意図するに過ぎない。投薬量は、種々のパラメータに従って、特に、腫瘍の位置、腫瘍のサイズ、治療されることとなる患者の年齢、体重、及び状態、並びに投与経路に従って決定することができる。投薬量及び投薬頻度は、組織培養における、また、適切な動物モデルにおける、ウイルスの性質を研究することによって初めて、臨床前に最適化することができる。
【０１１０】
ウイルスを、医薬として許容し得る担体又は希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を生成することができる。大抵のウイルスに適した担体は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの緩衝生理食塩水溶液であろう。この医薬組成物は、理想的には、最大1mlまでの体積の適切な用量のウイルスの投与を可能にするように製剤化されることとなるが、最大10mlまでの体積が投与される場合も存在し得る。個々の腫瘍病変体積が、至適用量を用いて治療するには小さ過ぎると考えられる場合、それぞれが全至適用量の部分量で投与される、複数の病変の治療によって、至適用量が投与されることが可能である。有効な抗腫瘍応答を誘発するために、複数の用量が必要である可能性があることも想定される。投与の間隔は、前臨床モデルにおいて得られる有効性データに基づいて、又は類似のウイルス株を用いて得られる臨床経験から、決定することができる。
【０１１１】
好ましくは、ウイルスは、腫瘍への直接的注射によって投与される。ウイルスはまた、全身的に、又は腫瘍に供給する血管に注射によって投与することもできる。ウイルスは、膀胱内治療として投与することができる;例えば、膀胱の癌の治療のために使用される可能性がある。最適投与経路は、腫瘍の位置及びサイズに依存することとなる。
【０１１２】
一実施態様では、該方法は、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を含む有効量の改変された腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む、新生物を有する個体を治療する方法である。
【０１１３】
したがって、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、例えば注射、吸入、若しくはインシュレーション(insulation)(例えば、口若しくは鼻を通して)による、又は経口、頬側、非経口、又は直腸内投与による投与のために製剤化することができる。
【０１１４】
(B)適応症)
具体的実施態様では、本発明の方法に有用な腫瘍溶解性ウイルスは、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、子宮内膜癌、膀胱癌、結腸癌、若しくは子宮頸癌;腺癌;メラノーマ;リンパ腫;神経膠腫;又は肉腫(軟部組織及び骨肉腫など)を有する対象に投与することができる。
【０１１５】
さらなる実施態様では、本発明は、限定はされないが、新生物、腫瘍、転移、又は無制御の細胞増殖を特徴とするあらゆる疾患若しくは障害、及び、特にその多剤耐性形態を含めた癌の治療又は予防のための、本発明の操作された腫瘍溶解性ウイルスを対象とする。癌は、多巣性の腫瘍であり得る。本発明の治療法で治療されることとなる癌及び増殖性障害のタイプの例としては、限定はされないが、白血病(例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性骨髄性(顆粒球)白血病、及び慢性リンパ性白血病)、リンパ腫(例えば、ホジキン病及び非ホジキン病)、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、異形成、及び過形成が挙げられる。特定の実施態様では、本発明の治療用化合物は、前立腺癌(例えば、前立腺炎、前立腺肥大症(benign prostatic hypertrophy)、前立腺肥大症(benign prostatic hyperplasia)(BPH)、前立腺パラガングリオーマ、前立腺腺癌、前立腺上皮内腫瘍、前立腺-直腸瘻、及び非定型の前立腺の間質病変)を有する患者に投与される。特に好ましい実施態様では、本発明の医薬品は、癌、神経膠腫、肝癌及び/又は結腸癌の治療のために使用される。癌の治療及び/又は予防としては、限定はされないが、癌に伴う症状を軽減すること、癌の進行の抑制、癌の退縮の促進、及び免疫応答の促進が挙げられる。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「新生物」とは、組織の異常成長をいう。新生物は、良性又は悪性であり得る。一般に、悪性新生物を、癌という。癌は、悪性細胞が、浸潤による隣接組織への直接的成長によって、又は転移による遠隔部位への移植(すなわち、血液又はリンパ系を通した輸送)によって他の組織に浸潤する能力の点で、良性新生物と異なる。
【０１１７】
本発明の方法は、良性及び悪性新生物(癌)の治療に適している。
【０１１８】
本明細書で定義する通り、表在性新生物は、それ自体が限局されており、かつ周囲の組織又は体の他の部分に広がらない、体の外表面に位置する新生物である。内部新生物は、内臓又は体の他の内部部分に位置する。浸潤性新生物は、正常な組織壁を打ち破り、周囲の領域に浸潤し始めている新生物、例えば、乳管及び小葉を越えて広がっている浸潤性乳癌である。
【０１１９】
本明細書に開示される方法による治療のために企図される新生物の種類の非排他的なリストには、以下のカテゴリーが含まれる:(a)腹部新生物(腹膜新生物及び後腹膜新生物を含む);(b)骨新生物(大腿新生物、頭蓋新生物、顎新生物、下顎新生物、上顎新生物、口蓋新生物、鼻新生物、眼窩新生物、頭蓋底新生物、及び脊髄新生物を含む);c)乳房新生物(男性乳房新生物、乳管癌、及び葉状腫瘍を含む);(d)消化器系新生物(胆道新生物、胆管新生物、総胆管新生物、胆嚢新生物、胃腸新生物、食道新生物、腸新生物、盲腸新生物、虫垂新生物、結腸直腸新生物、結腸直腸大腸腺腫症、結腸直腸ガードナー症候群、大腸新生物、大腸大腸腺腫症、大腸ガードナー症候群、S状結腸新生物、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸新生物、直腸新生物、肛門新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、空腸新生物、胃新生物、肝臓新生物、肝細胞腺腫、肝細胞癌、膵臓新生物、膵島細胞腺腫、インスリノーマ、膵島細胞癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ソマトスタチノーマ、VIP産生腫瘍、膵管癌、及び腹膜新生物を含む);(e)内分泌腺新生物(副腎新生物、副腎皮質新生物、副腎皮質腺腫、副腎皮質癌、多発性内分泌腫瘍症、多発性内分泌腫瘍症1型、多発性内分泌腫瘍症2a型、多発性内分泌腫瘍症2b型、卵巣新生物、顆粒膜細胞腫、黄体腫、メグズ症候群、卵巣のセルトリ・ライディッヒ細胞腫、莢膜細胞腫、膵臓新生物、腫瘍随伴内分泌症候群、副甲状腺新生物、下垂体新生物、ネルソン症候群、精巣新生物、精巣のセルトリ・ライディッヒ細胞腫、及び甲状腺新生物を含む)(f)眼新生物(結膜新生物、眼窩新生物、網膜新生物、網膜芽細胞腫、ブドウ膜新生物、脈絡膜新生物、及び虹彩新生物を含む);(g)脳、頭部、及び頸部新生物(食道新生物、顔面新生物、眼瞼新生物、口腔新生物、歯肉新生物、口腔白板症、毛状白板症、口唇新生物、口蓋新生物、唾液腺新生物、耳下腺新生物、舌下腺新生物、顎下腺新生物、舌新生物、耳鼻咽喉腫瘍新生物、耳新生物、咽頭新生物、鼻新生物、副鼻腔新生物、上顎洞新生物、咽頭新生物、下咽頭新生物、鼻咽頭新生物、鼻咽頭新生物、中咽頭新生物、扁桃腺新生物、副甲状腺新生物、甲状腺新生物、及び気管新生物を含む);(h)血液新生物(骨髄新生物を含む);(i)神経系新生物(中枢神経系新生物、脳新生物、脳室新生物、脈絡叢新生物、脈絡叢乳頭腫、テント下新生物、脳幹新生物、小脳新生物、神経細胞腫、松果体腫、テント上新生物、視床下部新生物、下垂体新生物、ネルソン症候群、脳神経新生物、視神経新生物、視神経膠腫、聴神経腫瘍、神経線維腫症2、神経系腫瘍随伴症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、辺縁系脳炎、横断性脊髄炎、傍腫瘍性小脳変性症、傍腫瘍性末梢性ニューロパチー、末梢神経系新生物、脳神経新生物、聴神経腫瘍、及び視神経新生物を含む);(j)骨盤新生物;(k)皮膚新生物(棘細胞腫、脂腺新生物、汗腺新生物、及び基底細胞癌を含む);(l)軟部組織新生物(筋新生物及び血管新生物を含む);(m)脾臓新生物;(n)胸部新生物(心臓新生物、縦隔新生物、気道新生物、気管支新生物、肺新生物、気管支原性肺癌、非小細胞肺癌、肺野コイン状陰影、パンコースト症候群、肺芽腫、肺硬化性血管腫、胸膜新生物、悪性胸水、気管新生物、胸腺新生物、及び胸腺腫を含む);(o)泌尿生殖器新生物(女性生殖器新生物、卵管新生物、子宮新生物、子宮頸部新生物、子宮内膜新生物、類内膜癌、子宮内膜間質腫瘍、子宮内膜間質肉腫、膣新生物、外陰新生物、男性生殖器新生物、陰茎新生物、前立腺新生物、精巣新生物、泌尿器新生物、膀胱新生物、腎臓新生物、腎細胞癌、腎芽腫、デニス・ドラッシュ症候群、WAGR症候群、中胚葉性腎腫、尿管新生物、及び尿道新生物を含む);並びに(p)追加的な癌(腎癌、肺癌、メラノーマ、白血病、バレット食道、異形成前癌細胞を含む)。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の種類の癌治療戦略(例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、及び抗腫瘍剤)と組み合わせて投与することができる。抗腫瘍剤の例としては、限定はされないが、シスプラチン、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、トポイソメラーゼI(例えば、CPT-11、トポテカン、9-AC、及びGG-211)、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、及びタキソ(taxo)が挙げられる。
【実施例】
【０１２１】
本発明をさらに例示するために、以下の非限定的な例を提供する。
【０１２２】
(実施例１:α1,3GT遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを用いる形質導入による腫瘍細胞上でのα-galエピトープの発現に関する予備研究の説明)
ヒト腫瘍細胞上でのα-galエピトープ(Gal-α1-3Gal-β1-4GlcNAc-R)の発現の誘導を、Deriyらの文献、Glycobiology 2002, 12: 135-144に詳述されている通りに、α1,3GT遺伝子を含有する複製欠損型アデノウイルスベクターを用いる形質導入によって、あらかじめ研究した。この目的のために、マウスα1,3GT cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を、初期遺伝子E1及びE3遺伝子を欠失させた複製欠損型アデノウイルスベクターに挿入した。これは、複製欠損型アデノウイルスベクターへのcDNAの相同組換えを可能にするα1,3GT cDNAを含有するpAdシャトルプラスミドの使用によって実現した。このプラスミドにおいては、α1,3GT遺伝子を、哺乳類細胞における非常に有効なプロモーターであるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの下流に挿入した。CMVプロモーター下の挿入されたマウスα1,3GT遺伝子を含有する産生されたアデノウイルスベクターを、E1補完ウイルス遺伝子を含有するヒト腎臓細胞株293(ATCC)において増殖させた。単離されたウイルスクローンを、293細胞の形質導入、及びバンディラ・シンプリシフォリアIB4(BSレクチン)結合後のフローサイトメトリーによる24時間後のα-galエピトープ発現の分析によって、触媒的に活性な酵素を産生するα1,3GT cDNAの存在について分析した。BSレクチンは、α-galエピトープに特異的に結合する。
【０１２３】
α1,3GT遺伝子を含有する複製欠損型アデノウイルスを、AdαGTと称し、これを、E1補完ウイルス遺伝子を含有する293細胞株においてさらに増殖させた。AdαGTの濃度を、感染多重度(MOI)単位と決定し、また、感染の6日後に293細胞において細胞変性効果を示す最大希釈のアデノウイルスベクターと定義した。AdαGTがヒト腫瘍細胞上でのα-galエピトープの合成及び発現を誘導する能力を、他の悪性又は正常なヒト細胞のようにα-galエピトープを欠く、ヒト子宮頸癌HeLa細胞株を用いて研究した。
【０１２４】
HeLa細胞の形質導入は、各細胞への〜20 AdαGTコピーの即時侵入をもたらした。AdαGTを起源とするα1,3GT mRNAの出現は、マウスα1,3GT遺伝子
【化２】
2018512150.tif 000005
に特異的な上流及び下流プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって決定した。この分析に基づくと、α1,3GT mRNAは、形質導入の4時間後、HeLa細胞の細胞質中に見られた。細胞質中のα1,3GT酵素の実際の出現は、この酵素の触媒活性によって決定した。α1,3GTは、ガラクトースを、糖供与体UDP-Galから、タンパク質アシアロフェツインコーティングELISAウェルのN結合型炭水化物鎖上の9つの末端N-アセチルラクトサミン残基に転移させる。新規に合成されたα-galエピトープを、モノクローナル抗Gal抗体M86を用いるELISAによって特定した(Galiliらの文献、Transplantation, 65:1129-1132, 1998)。この分析を使用することによって、α1,3GTの触媒活性を、6時間後に、形質導入されたHeLa細胞において、最初に検出した(図3内のタイムラインを参照のこと)。α-galエピトープの初期出現を、細胞あたりのα-galエピトープの数を測定する、ELISA阻害分析と呼ばれる、高感度のモノクローナル抗Gal M86抗体結合分析によって検出した(Galiliらの文献、上記)。この分析を使用することによって、HeLa細胞表面複合糖質上でのα-galエピトープの発現を、形質導入の10時間後に、6×104/細胞のレベルで検出した。形質導入後48時間以内に、発現されたα-galエピトープの数は、2×106エピトープ/細胞に増加した(図3)。
【０１２５】
AdαGTは、複製欠損型であり、分裂している細胞では増殖できないので、形質導入されたHeLa細胞のそれぞれの細胞分裂は、α1,3GTコピー数の50%減少をもたらす。したがって、α-galエピトープの発現は、細胞の表面上で減少し、その結果、形質導入後2週以内に、細胞上にはα-galエピトープは検出されず、かつ細胞内にはα1,3GT遺伝子は検出されない。
【０１２６】
(実施例２：α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを形質導入されたB16-BL6メラノーマ細胞上のα-galエピトープの発現)
細胞へのα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の導入を達成するために、この遺伝子を、以前に記載した通りの複製不能アデノウイルスベクターに挿入した(Deriyらの文献、Glycobiology 2002, 12: 135)。得られたベクターは、AdαGTと呼ばれ、ヒト腫瘍細胞上のα-galエピトープの発現を誘導するのに非常に有効である(Deriy Lらの文献、上記)。α-galエピトープの発現を、AdαGTを形質導入されたB16-BL6メラノーマ細胞上で決定した。これらの細胞は、B16メラノーマのサブクローンであり、BL6細胞と称される。AdαGTでのBL6細胞の形質導入は、形質導入するAdαGT内のα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子によってコードされるα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの細胞内産生をもたらす。α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼによる、このエピトープの合成後の、細胞表面複合糖質上のα-galエピトープの新規の発現を、形質導入の48時間後に評価した。フローサイトメトリーによって測定されるバンディラ(グリフォニア(Griffonia))・シンプリシフォリアIB4レクチン(BSレクチン-α-galエピトープに特異的なレクチン)の結合によって、及び、ELISAによって測定される抗Gal抗体の、形質導入された細胞への結合によって、α-galエピトープを検出した。AdαGTを形質導入されたBL6細胞(BL6AdαGT細胞と称される)は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子挿入を欠く対照「空の」アデノウイルスを形質導入されたB16細胞(BL6Adcont細胞と称される)と比較して、フローサイトメトリーによって測定される通り、BSレクチン結合後に、有意なシフトを示した(図4A)。さらに、BL6AdαGT細胞の〜15%は、残りの集団よりもかなり高い度合いのレクチン結合を示し、これは、これらの細胞が、α-galエピトープを、細胞あたり多数のエピトープで発現することを示していた。
【０１２７】
マウス抗Gal IgGがBL6AdαGT細胞上のα-galエピトープに結合する能力を、ELISAによって実証した(図4B)。BL6cont細胞又はBL6AdαGT細胞を、乾燥によって、ELISAウェルに付着させた。続いて、抗Gal IgGを含有する血清を、2倍連続希釈でウェルに添加し、抗Gal IgG 結合を、ヤギ抗-マウスIgG抗体と複合体形成させた西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の結合によって決定した。形質導入されていないBL6細胞でコーティングされたウェルに対するIgG結合の並行する測定によって、非特異的なIgG結合値を引いた。抗Galは、1:128の血清希釈であっても、BL6AdαGT細胞に容易に結合したのに対し、BL6Adcont細胞でコーティングされたウェルでは、いずれの血清希釈においても結合は観察されなかった(図4B)。
【０１２８】
(実施例３：防御的な抗腫瘍免疫応答の誘発におけるBL6AdαGT細胞の有効性)
ワクチンとしてのAdαGT形質導入された腫瘍細胞の有効性を、Deriyらの文献、Cancer Gene Therapy 12: 528-539、2005)に詳述されている通りにα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスにおいて研究した。B16-BL6細胞は、腫瘍モデルとして働いた。抗Gal産生マウスに、2×106個の放射線照射されたBL6AdαGT細胞を、又はα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く対照の親アデノウイルスベクターを形質導入された2×106個の放射線照射されたBL6細胞を、ワクチン接種した。BL6Adcontと称される後者の細胞は、α-galエピトープを発現せず、対照マウスの免疫化には役立たなかった。1週間後に、免疫化を繰り返した。2回目の免疫化の1週間後に、マウスの皮下に、0.2×106又は0.5×106個の生BL6細胞を負荷した。腫瘍発生を、2か月間観察した。BL6AdαGT細胞で免疫化し、かつ0.2×106個の形質導入されていない親BL6細胞を負荷したマウスの3分の2が、負荷から防御されたのに対し、対照群の20%のみが、腫瘍を発生しなかった(図5A)。マウスにより高い用量の0.5×106個の生BL6細胞を負荷した場合、BL6AdαGT細胞で免疫化したマウスの3分の1が、腫瘍負荷からの防御を発達させたのに対し、対照ウイルスAdcontを形質導入されたBL6細胞をワクチン接種した対照マウスはすべて、BL6細胞の負荷後25日以内に腫瘍を発生した(図5B)。これらの結果は、α-galエピトープを発現する、AdαGT形質導入された腫瘍細胞が、抗原提示細胞に効率的にターゲティングされる腫瘍ワクチンとして働くことができ、したがって、α-galエピトープを欠く同じ腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導することができることを暗示する。
【０１２９】
(実施例４：α1,3GT遺伝子を含有するヘルペスウイルス(HSVαGT)に感染した腫瘍細胞における、α-galエピトープ発現対細胞溶解の動態)
この実験の目的は、α1,3GT遺伝子を含有する腫瘍溶解性ヘルペスウイルス(HSVαGT)での細胞の感染後の、ヒト及びマウス腫瘍細胞上のα-galエピトープの発現についてのタイムラインを、インビトロで決定することである。この分析は、感染した細胞上のα-galエピトープの発現が、この腫瘍溶解性ウイルスによる細胞の細胞溶解の前に起こることを確認するために必要とされる。α-galエピトープは、細胞膜上でいったん発現されると、腫瘍溶解性ウイルスHSVαGTによって細胞が溶解された後でも、天然の抗Gal抗体と結合することとなることが想定される。抗Galと、(細胞溶解が原因の)断片化された腫瘍細胞膜との間に形成される免疫複合体は、免疫複合体化された抗Gal抗体のFc部分とAPC上のFcγ受容体(FcγR)との間の相互作用の結果としての、樹状細胞及びマクロファージなどのAPCによる取り込みのために効率的にターゲティングされることとなる(図1及び2参照)。HSVαGTを調製するために、CMVプロモーター下のα1,3GT遺伝子を、先に記載した、(Deriyらの文献、2002、上記)に記載されている複製欠損型ウイルスAdαGTから、PCRによって増幅する。CMVプロモーター下の遺伝子を、腫瘍溶解性HSVに挿入し、得られるHSVαGTの懸濁液を、当業者に公知の方法に従って、HeLa細胞における増殖によって調製する。
【０１３０】
α-galエピトープの発現を、HSVαGT感染したB16F10(B16)マウスメラノーマ細胞上で、また、ヒトHeLa子宮頸癌細胞上で決定する。マウスメラノーマ細胞を用いる研究は、この後のマウスにおいてこれらの細胞を用いるインビボ研究の実現可能性を決定するために必要とされる。B16メラノーマは、α-galエピトープを欠く唯一の公知のマウス腫瘍細胞株であり、したがって、これは、この炭水化物エピトープの欠如という点でヒト腫瘍細胞を刺激する。HeLa細胞を用いる研究は、HSVαGT感染したヒト腫瘍細胞におけるα-galエピトープ発現が、このウイルスによる細胞の細胞溶解前に起こるという仮定を確認するために必要とされる。この研究は、B16細胞について記載するが、HeLa細胞についても同一である。
【０１３１】
HSVαGTウイルスの懸濁液を、1×106〜2×107pfu(プラーク形成単位)/mlの濃度で、B16細胞の単層に添加する。感染した細胞を、2時間おきに剥離させ、ウイルスのα1,3GT遺伝子の発現を、α1,3GT mRNAの出現によって決定する。このmRNAは、先にAdαGTについて記載した通りに、マウスα1,3GT遺伝子
【化３】
2018512150.tif 000006
に特異的な上流及び下流プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって検出される。感染した細胞の細胞質中のα1,3GT酵素の実際の出現は、酵素のための受容体としてアシアロフェツインを使用し、かつUDP-Galが糖供与体として使用されるELISAにおいて、この酵素の触媒活性によって決定される。アシアロフェツインは、さらに、ELISAウェルをコーティングする固相抗原として機能する。新規に合成されたα-galエピトープを、モノクローナル抗Gal抗体M86を用いるELISAによって特定する(Galiliの文献、1998、上記)。α-galエピトープのその後の出現を、フローサイトメトリーによって測定されるバンディラ(グリフォニア)・シンプリシフォリアIB4レクチン(BSレクチン-α-galエピトープに特異的なレクチン)の結合によって、また、ELISAウェル内の細胞を乾燥させることによってELISAをコーティングするために処理された感染細胞への、抗Gal抗体の結合によって検出する。α-galエピトープ発現を、細胞あたりのα-galエピトープの数を測定する、ELISA阻害分析と呼ばれる、高感度のモノクローナル抗Gal M86抗体結合分析によって、さらに定量化する(Galiliらの文献、1998、上記)。「空の」HSV(すなわちα1,3GT遺伝子を欠くウイルス)を、ウイルス感染についての対照として使用する。
【０１３２】
細胞が細胞溶解を受ける感染後の期間を決定するために、細胞培養物を、細胞溶解について、顕微鏡で観察し続ける。
【０１３３】
(実施例５：インサイチュ腫瘍溶解性ウイルスとしてのHSVαGTの有効性)
腫瘍溶解性ウイルスとしての、また、様々な腫瘍関連抗原(TAA)に対する防御的抗腫瘍免疫をもたらすための手段としての、HSVαGTの有効性を、研究に従って決定する(Galiliらの文献、J Immunol.; 178: 4676-87, 2007; Abdel-Motalらの文献、Cancer Immunol Immunother; 58: 1545-55, 2009)。これらの研究は、抗Gal抗体を産生するα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスにおいて実施する。B16細胞は、腫瘍モデルとして働く。抗Galを産生するα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスの右の側腹部に、1×106 B16細胞を皮下注射する。この注射の結果として、B16細胞は、5〜6日以内に、4〜5mmの直径を有するメラノーマ腫瘍病変に発達する。0.1mlの体積の103〜106pfu範囲の量のHSVαGTを、腫瘍に注射する。挿入されるα1,3GT遺伝子を欠く腫瘍溶解性HSV(「空の」HSV)を、α-galエピトープの発現を誘導する能力がない対照ウイルスとして使用する。これらのマウスを、腫瘍病変の消失について、2か月間観察する。20mmの直径に到達する腫瘍を有するマウスは、安楽死させる。腫瘍の完全消失(すなわち100%腫瘍溶解)を示す量の2倍であるHSVαGTの量を決定し、この治療によって誘発される防御的な抗腫瘍免疫応答を評価するさらなる研究のために使用する。α1,3GT遺伝子を欠く対照HSVとの比較は、HSVαGTが、腫瘍溶解の誘導において対照ウイルスよりも有効であるか有効でないかを判断する。
【０１３４】
(実施例６：遠隔転移に対する、防御的な抗腫瘍免疫応答の誘発における、HSVαGT感染した病変の有効性)
抗Galを産生するα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスの、右の側腹部の皮下に1×106 B16細胞を、左の側腹部の皮下に1×104、1×105、又は1×106 B16細胞を注射する。左の側腹部において発生する腫瘍は、右側腹部病変へのHSVαGTの注射が、これを、全身性の防御的抗腫瘍応答を誘発するワクチンに変換する場合に、腫瘍病変に発達しない可能性がある、遠隔転移を表す。右側腹部腫瘍が、(5〜6日以内に)4〜5mmのサイズ(直径)に到達した時、メラノーマ病変の100%細胞溶解を誘導する量の2倍である量のHSVαGTを、0.1ml懸濁液で注射する。挿入されるα1,3GT遺伝子を欠く腫瘍溶解性HSVを、α-galエピトープの発現を誘導する能力がない対照ウイルスとして使用する。左側腹部における腫瘍の成長を、2か月間観察する。HSVαGTを注射した腫瘍の、ワクチンへの変換は、左側腹部に1×104、1×105、又は1×106 B16細胞が注射された場合、左側腹部における遠隔転移が、検出可能な病変に成長するのを予防する。腫瘍成長の予防は、右側腹部における腫瘍に、HSVαGTが注射された場合に、α1,3GT遺伝子を欠くHSVが注射されるよりも有効である(すなわち、より多い数の腫瘍細胞が、左側腹部における病変に発達するのを予防する)と考えられる。
【０１３５】
(実施例７：負荷した腫瘍細胞に対する、防御的な抗腫瘍免疫応答の誘発における、HSVαGT感染した病変の有効性)
抗Galを産生するα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスの右の側腹部に、1×106 B16細胞を皮下注射する。腫瘍が、(5〜6日以内に)4〜5mmのサイズ(直径)に到達した時、メラノーマ病変の100%細胞溶解を誘導する量の2倍である量のHSVαGTを、0.1ml懸濁液で注射する。挿入されるα1,3GT遺伝子を欠く腫瘍溶解性HSVを、α-galエピトープの発現を誘導する能力がない対照ウイルスとして使用する。右側腹部病変への腫瘍溶解性ウイルスの注射の3週後に、左側腹部に、腫瘍負荷として、0.3×106、1×106、3×106、又は10×106 B16細胞を注射する。右側腹部腫瘍へのHSVαGTの注射の結果としての(腫瘍をワクチンに変換する)防御的な抗腫瘍免疫応答の誘導は、左側腹部における負荷した腫瘍細胞が、腫瘍病変に発達するのを予防する。腫瘍成長の予防は、右側腹部における腫瘍に、α1,3GT遺伝子を欠くHSVよりもHSVαGTが注射された場合に、より有効である(すなわち、より多い数の負荷した腫瘍細胞が、病変に発達するのを予防する)。
【０１３６】
(実施例８：機能性α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルスの産生及び有効性)
本研究は、E3遺伝子がマウスα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GT)遺伝子と置き換えられた、Ad5/3-Δ24-αGT CRAd(CRAd-αGT)の産生を記載する。α1,3GTは、炭水化物抗原ガラクトース-α-1,3-ガラクトシル-β-1,4-N-アセチル-グルコサミン-R(α-gal)を合成する。このウイルスが複製する時に、ウイルスタンパク質と共にα1,3GTタンパク質が産生され、続いて、このαGTタンパク質が、α-galの産生を触媒する。細胞表面α-galは、抗Gal抗体によって複合体化され、免疫活性化、及び抗原提示細胞による免疫複合体の取り込みが促進される。
【０１３７】
(材料及び方法)
(細胞株)
A549(ヒト肺癌)及びA375(ヒトメラノーマ)細胞株は、欧州真正培養細胞保存機関(European Collection of Authenticated Cell Cultures)(ECCAC)から購入した。A549細胞は、F-12K+10%ウシ胎児血清(FBS)中で維持した。A375細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎児血清中で維持した。どちらの細胞株も、37℃かつ5% CO2でインキュベートした。
【０１３８】
(ウイルス産生)
ウイルス産生は、Imanis Life Sciences(Rochester, Minneapolis, US)社による契約に従って実施した。ウイルス構築は、まさに詳細に記載されている通りに(Danthinne及びWerthの文献、2000; Danthinneの文献、2001)、確立されている大きいアデノウイルスシャトルプラスミド及び組換えDNA方法を使用して実施した。CRAd-αGTを作り出すために、1.1Kbマウスα1,3GT遺伝子(GenBank受託番号M85153)は、Integrated DNA Technologies(IDT)社によって合成され、α1,3GT配列のCMVプロモーター5’と共に、Ad5 E3シャトルベクターにクローン化した。Ad3の配列で置き換えられたファイバーノブ配列を有する、Ad5ゲノムをコードするコスミドにおいて、
【化４】
2018512150.tif 000007
アミノ酸配列をコードする24bp配列を、領域E1aから欠失させた。E3配列を、Ad5/3コスミドから欠失させ、シャトルベクターからサブクローン化したCMV-αGT配列で置き換えた。対照のCRAdを作り出すために、緑色蛍光タンパク質(GFP)コード配列が、IDT社によって合成され、GFP配列のCMVプロモーター5’と共に、Ad5 E1シャトルベクターにクローン化した。E1配列を、Ad5/3コスミドから欠失させ、シャトルベクターからサブクローン化したCMV-GFP配列で置き換えた。E3領域を欠失させた。このキメラウイルス構造を、図6に示す。
【０１３９】
HEK293細胞に、キメラウイルスコスミドを形質移入し、48時間のインキュベーション後、未精製ライセートを調製した。ウイルス増幅のために、HEK293細胞を15cmディッシュに播種し、37℃、5% CO2で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、ウイルス感染した細胞からの未精製ライセートに感染させ、37℃、5% CO2で48時間インキュベートし、その時間の後、細胞及び上清を収集した。
【０１４０】
ウイルス粒子は、感染した細胞から、3回の凍結-解凍サイクルによって放出させ、硫酸アンモニウム沈殿によって細胞上清から回収した(Schagenらの文献、2000)。ウイルス精製は、塩化セシウム(CsCl)密度勾配遠心分離によって実施した。簡単に言うと、未精製のウイルス調製物を、SW28 Beckman遠心管に入れて2ステップCsCl勾配にかけ、20,000rpmで２時間遠心分離した。ウイルスバンドを収集し、継続的CsCl勾配にかけ、再び遠心分離した。最終のウイルスバンドを収集し、直ちに、4℃で18時間、4×0.5L GTS緩衝液(2.5%グリセロール、25mM NaCl、20mM Tris-HCl pH8.0)に対して透析した。約1mlの透析されたウイルス懸濁液を収集し、0.22μm Suporメンブレン(Pall社)を通して濾過し、次いで、-70℃で凍結させた。
【０１４１】
ウイルス濃度は、SDSの存在下で、OD260-SDS方法、及び吸光度260単位につき1.1×1012ウイルス粒子(VP)の吸光係数を使用して決定した。ウイルス濃度は、CRAd-αGTについて3.6×1012VP/ml、及びCRAd-GFPについて2.9×1012VP/mlであることが判明した。ウイルス調製物の純度を、A260/A280及びA320/A260比率によって決定し、どちらのウイルスについても、純粋なウイルスに関連する範囲内(それぞれ1.2から1.4及び0.22から0.27)であることが判明した。
【０１４２】
ウイルス力価を、十分に確立されたReed-Muench法を使用するエンドポイント希釈アッセイ(TCID50)によって決定した(Reed及びMuenchの文献、1938)。簡単に言うと、HEK293細胞を、24ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、この播種されたHEK293細胞に、10倍希釈系列のCsCl-精製されたウイルスストックを添加し、細胞を、37℃、5% CO2で14日間インキュベートした。ウェルを、顕微鏡下での視覚的評価によって、細胞変性効果(CPE)の存在について点数化し、Reed-Muench方程式を使用してTCID50を算出した(Reed及びMuenchの文献、1938)。ウイルス力価は、CRAd-αGTについて6.8×1011TCID50/mL、また、CRAd-GFPについて2.7×1011TCID50/mlであることが決定された。
【０１４３】
(CRAd-αGTによる細胞殺傷の決定)
A549及びA375細胞のサブコンフルエントな単層を、細胞解離溶液(CDS、Sigma-Aldrich社)を使用して、組織培養フラスコから収集した。これらの細胞を、血球計数器を使用して計数し、トリパンブルー色素排除によって、生細胞を死細胞から区別した。これらの細胞を、培養培地で希釈し、滅菌した96ウェル白色組織培養プレートに、90μl/ウェルで添加して、 5×103又は1×104細胞/ウェルを与えた。
【０１４４】
各ウイルスを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+10% FBSで1:3希釈し、CRAd-αGTについては1.2×1012VP/ml、CRAd-GFPについては9.67×1011VP/mlの作業用ストック溶液を提供した。これらの作業用ストックを、PBS+10% FBSで1/5連続希釈し、CRAd-αGTについては1.2×1012〜1.2×105 VP/ml、CRAd-GFPについては9.67×1011〜9.9×104の漸増系列(titration series)を作製した。これらの漸増系列を、アッセイプレートに1:10希釈し(90μlの播種された細胞に対して、ウェルあたり10μlのウイルス)、プレートを、37℃/5% CO2で72時間インキュベートした。細胞生存率を、製造業者の指示書に従ってCell Titre Glo発光細胞生存性試薬(Promega社)を使用して決定し、プレートをEnVision 2102プレートリーダー(Perkin Elmer社)で読み取った。生の発光単位(RLU)を、ウイルス粒子(対数)/mlに対してプロットした。
【０１４５】
CRAd-αGTウイルスの細胞溶解効果を可視化するために、A549及びA375細胞を、上及び下に詳述する通りに、透明な96ウェル又は24ウェルプレートに播種し、やはり上及び下に詳述されるCRAd-αGT及びCRAd-GFPの種々の希釈物に感染させ、光学顕微鏡下で評価した。細胞の画像は、YenCam 10(Yenway社)及び補助ソフトウェアを用いて撮影した。
【０１４６】
(Ad5/3-Δ24-αGT CRAd感染したヒト癌細胞への抗Gal結合の決定)
A549及びA375細胞を、先に記載した通りに組織培養フラスコから収集した。計数後、細胞を、培養培地で希釈し、540μl/ウェルの体積(これは3×104細胞/ウェルと等しい)で、24ウェル組織培養プレートに添加した。
【０１４７】
各ウイルスを、PBS+10% FBSで1:10,000(1:100、次いで1:100)希釈し、CRAd-αGTについては3.6×108VP/ml、CRAd-GFPについては2.9×108の溶液を提供した。これらの溶液を、PBS+10% FBSで、2回、1:25希釈して、CRAd-αGTについては1.44×107及び5.8×105VP/ml、CRAd-GFPについては1.16×107及び4.6×105VP/mlのウイルス濃度を与えた。3つのウイルス希釈物を、播種された細胞で、さらに1:10希釈した(ウェルあたり540μlの細胞に対して、60μlのウイルス)。ウイルス無しの対照としての役割を果たす、等しい体積のPBS+10% FBS単独をウェルに添加した。
【０１４８】
プレートを、72時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、フローサイトメトリーによって、感染した細胞の表面上のα-gal抗原の存在を決定した。感染した及び感染していない(ウイルス無しの対照)細胞を、CDSを使用して、24ウェルプレートから収集し、PBS+0.5% BSAで洗浄し、PBS+0.5% BSAで希釈した40μg/mlモノクローナルM86ヒトIgG1抗Gal抗体(Absolute Antibody社)と共に4℃で1時間インキュベートした。細胞を、再びPBS+0.5% BSAで洗浄し、次いで、PBS+0.5% BSAで希釈した、アロフィコシアニン(APC)を結合させた抗ヒトIgG(Biolegend社)と共に、4℃で30分間、暗所でインキュベートした。細胞を、PBS+0.5% BSAで洗浄し、Beckman Coulter FC500フローサイトメーターで分析した。未染色細胞を使用して、前方散乱、側方散乱、及び蛍光チャンネル1及び4について電圧を設定した。試験試料について、GFP(チャンネル1)及びAPC(チャンネル4)シグナルを記録した。単色対照を使用して、コンペンセーションを設定した。
【０１４９】
(結果)
(CRAd-αGTはヒト癌細胞を溶解する)
CRAd-αGT及び対照CRAd-GFPの、A549及びA375細胞に対する細胞溶解効果を、プレートに基づく細胞生存率アッセイ(図7)を使用して定量化した。細胞がCRAd-αGT又はCRAd-GFPに感染したウェルにおいて観察される細胞生存率の低下は、ウイルスの濃度に依存していた。細胞生存率を50%低下させるために必要とされるCRAd-αGTウイルス粒子の数は、対照CRAd-GFPウイルスよりも少なかった。これは、TCID50分析によって測定されるウイルス力価と一致している(先の材料及び方法セクションを参照のこと)。
【０１５０】
A549及びA375ヒト癌細胞におけるCRAd-αGTの細胞溶解効果を、光学顕微鏡によって可視化し、CRAd-GFPと比較した(図8)。CRAd-αGT又はCRAd-GFPに感染し、その後72時間インキュベートした細胞は、両方のウイルスによって殺された。感染していない細胞は健康であり、溶解の兆候は見られなかった。
【０１５１】
(CRAd-αGT感染した細胞は抗Gal抗体と結合する)
CRAd-αGTでの細胞の感染が、触媒的に活性なα1,3GTタンパク質の発現、及びその後の細胞表面でのα-galの発現をもたらすかどうかを検討するために、α-gal特異的抗Gal抗体の、CRAd-αGT感染した細胞への結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、抗Gal抗体の、CRAd-GFP及び感染していない細胞への結合と比較した(図9)。CRAd-αGTに感染した細胞には、抗Galが強力に結合したが、GFP発現については陰性であった。逆に、CRAd-GFPに感染した細胞は、抗Gal結合については陰性であったが、GFP発現については陽性であった。感染していない細胞は、抗Gal結合とGFP発現のどちらについても陰性であった。
【０１５２】
(結論)
CRAd-αGTでのヒト非小細胞肺癌(A549)及びメラノーマ(A375)細胞の感染は、細胞溶解及び細胞死をもたらした。細胞溶解は、ウイルスE1a遺伝子からの24bp領域の欠失が原因で、癌細胞に選択的であるCRAd-αGT複製の結果として起こる(Fueyoらの文献、2000)。
【０１５３】
細胞溶解に加えた、CRAd-αGTでの癌細胞の感染は、抗Gal抗体の、細胞表面への特異的な結合をもたらしたのに対して、抗Galは、感染しなかった又はCRAd-GFP感染した細胞に結合しなかった。抗Galは、α-galエピトープに特異的に結合するので、本発明者らは、癌細胞におけるCRAd-αGTの複製が、触媒的に活性なα1,3GT酵素の発現をもたらし、続いてこれがα-galの合成を触媒すると結論付けることができる。
【０１５４】
ウイルスの腫瘍溶解性効果によって生み出される、抗Gal抗体の、α-galを発現する死亡する腫瘍細胞及び腫瘍細胞細片への結合は、腫瘍新生抗原に対する適応免疫応答を増強することとなる。活性化しているFcγ受容体を有する抗原提示細胞(APC)は、活性化しているFcγ受容体を介して、抗Gal IgGと複合体化された腫瘍細胞細片及び死細胞を貪食する。APC上のFcγ受容体の活性化は、APC活性化、成熟、及び抗原のT細胞への増強された提示を引き起こす(Regnaultらの文献、1999; Rafiqらの文献、2002; Platzerらの文献、2014)。
【０１５５】
(参考文献)
【化５】
2018512150.tif 000008
【図１−１】
2018512150.tif 000009
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月21日(2017.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512150000001.app
【国際調査報告】
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2018512150.tif 000021
2018512150.tif 000022