(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の発症リスクのインビトロ決定方法、軽度認知機能障害に罹患している対象における個別化療法のインビトロ設計方法、ならびに対象由来のサンプルにおいてＥ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルを決定することに基づき、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法による処置に感受性のある患者のインビトロ選択方法に関する。本発明はまた、スレオニンでリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての使用に関する。最後に、本発明はまた、Ｅ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬を含んでなるキット、および前記キットの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の発症リスクのインビトロ決定方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する高いリスクを有することを示す、方法。
【請求項２】
前記対象が軽度認知機能障害に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象がヒトであって、神経変性疾患がアルツハイマー病であるか、または前記対象がイヌであって、前記アルツハイマー病に類似する認知障害が認知機能障害症候群である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
軽度認知機能障害に罹患している対象における個別化療法のインビトロ設計方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する感受性を持つことを示す、方法。
【請求項５】
前記対象がヒトであって、前記療法がアルツハイマー病の予防および／もしくは治療のためのものであるか、または前記対象がイヌであって、前記療法が認知機能障害症候群の予防および／もしくは治療のためのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法による処置に感受性のある患者のインビトロ選択方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化合物のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する候補であることを示す、方法。
【請求項７】
前記対象がヒトであって、前記療法がアルツハイマー病の予防および／もしくは治療のためのものであるか、または前記対象がイヌであって、前記療法が認知機能障害症候群の予防および／もしくは治療のためのものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｅ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定することが、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）、２５０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５０）、１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）、１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）、２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）および３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がイヌであって、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質、または機能的に等価な変異体の３１１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１１）、３１３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１３）、７６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ７６）、２２５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２５）、２８６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２８６）、３９１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３９１）、４０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ４０）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニン残基のリン酸化が決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが脳脊髄液、血清、血漿、血液および末梢血単核細胞の群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リン酸化のレベルがＥＬＩＳＡの手段により決定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スレオニンにおいてリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての使用。
【請求項１３】
前記Ｅ２Ｆ４がヒト起源であり、２４８番のスレオニン（Ｔｈｒ２４８）、２５０番のスレオニン（Ｔｈｒ２５０）、１４番のスレオニン（Ｔｈｒ１４）、１６３番のスレオニン（Ｔｈｒ１６３）、２２４番のスレオニン（Ｔｈｒ２２４）、３３３番のスレオニン（Ｔｈｒ３３３）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニンにおいてリン酸化されており、前記疾患がアルツハイマー病である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記Ｅ２Ｆ４がＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４であり、３１１番のスレオニン（Ｔｈｒ３１１）、３１３番のスレオニン（Ｔｈｒ３１３）、７６番のスレオニン（Ｔｈｒ７６）、２２５番のスレオニン（Ｔｈｒ２２５）、２８６番のスレオニン（Ｔｈｒ２８６）、３９１番のスレオニン（Ｔｈｒ３９１）、４０番のスレオニン（Ｔｈｒ４０）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニンにおいてリン酸化されており、前記アルツハイマー病に類似する認知障害が認知機能障害症候群である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
Ｅ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定し得る試薬を含んでなるキット。
【請求項１６】
Ｅ２Ｆ４タンパク質のリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、
ａ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｂ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２５０番（Ｔｈｒ２５０）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｃ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｄ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｅ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｆ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｇ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のＴｈｒ、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｈ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３１１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｉ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の残基番のスレオニン３１３（Ｔｈｒ３１３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｊ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の７６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ７６）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｋ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２２５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２５）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｌ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２８６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２８６）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｍ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３９１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３９１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｎ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の４０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ４０）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｏ）イヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のＴｈｒ、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬
からなる群から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ａ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、２４８番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｂ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２５０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５０）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、２５０番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｃ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、１４番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｄ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、１６３番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｅ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、２２４番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｆ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、３３３番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｇ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒにおけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、抗ホスホスレオニン抗体である、
ｈ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３１１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、３１１番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｉ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３１３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、３１３番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｊ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の７６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ７６）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、７６番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｋ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２２５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２５）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、２２５番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｌ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２８６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２８６）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、２８６番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｍ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３９１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３９１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、３９１番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｎ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の４０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ４０）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が、４０番を含んでなる、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている、
ｏ）イヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒにおけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬が抗ホスホスレオニン抗体である、
請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
Ｅ２Ｆ４タンパク質に特異的に結合し得る試薬をさらに含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
Ｅ２Ｆ４タンパク質に特異的に結合し得る試薬が抗体である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
Ｅ２Ｆ４タンパク質に特異的に結合し得る試薬が支持体に固定化されている、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
対象においてその対象がアルツハイマー病もしくは前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクを決定するための、軽度認知機能障害に罹患している対象において個別化療法を設計するための、またはアルツハイマー病もしくは前記疾患に類似する認知障害の予防および／もしくは治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するための、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマーを発症するリスクを決定する方法、個別化療法を設計する方法、および患者を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、西洋社会で有病率が極めて高い神経変性疾患の１つである。これまでに、この病態を止める療法は知られておらず、これまでに計画されたほとんどの治験はβ−アミロイドペプチドまたは高リン酸化タウタンパク質の生産および／または活性の阻害を目的とするものであった。これまでに実施された治験の不成功、特に、ソラネズマブおよびバピネオズマブ抗体による処置の後に認知改善を得ることができなかったために、これらの処置を神経変性プロセスが不可逆的となる前のこの疾病の初期に持ってくる必要が考えられている。
【０００３】
この種のアプローチは、神経変性プロセスを加速化する突然変異の存在を特徴とする稀な形態のアルツハイマー病である、家族性アルツハイマー病の患者で現在行われている。しかしながらやはり、最も高いパーセンテージの患者が、現時点で予測できない種の病状である散発性アルツハイマー病に罹患している。
【０００４】
これまでに記載されているバイオマーカーは、主として、神経イメージング技術（例えば、脳の種々の領域での老人斑密度および萎縮の定量、脳グルコース代謝分析）ならびに患者の脳脊髄液または血清中の可溶性β−アミロイドおよびタウ形態の定量のための技術に基づく(Kang et al., 2014 Korean J Physiol Pharmacol. 18: 447-456)。従って、これらの技術は総て、この病状の後期産物を分析することに基づく。
【発明の概要】
【０００５】
よって、疾病の可能な最も早い段階で診断を行う、従って、アルツハイマーを発症するリスクを決定することを可能とするアルツハイマー病の非侵襲的早期マーカーを同定する必要がある。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の発症リスクのインビトロ決定方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する高いリスクを有することを示す方法に関する。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、軽度認知機能障害に罹患している対象における個別化療法のインビトロ設計方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する感受性を持つことを示す方法に関する。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法による処置に感受性のある患者のインビトロ選択方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化合物のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する候補であることを示す方法に関する。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、スレオニンでリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての使用に関する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、対象がアルツハイマー病もしくはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクを決定するための、対象における個別化療法を設計するための、またはアルツハイマー病もしくはアルツハイマー病に類似する認知障害の予防および／もしくは治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するための、Ｅ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬を含んでなるキットに関する。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、対象においてその対象がアルツハイマー病もしくは前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクを決定するための、軽度認知機能障害に罹患している対象における個別化療法を設計するための、またはアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／もしくは治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するための、本発明によるキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ニューロン特異的ＮｅｕＮ抗原陽性の新鮮な細胞核でフローサイトメトリーの手段により評価されたヒト前頭および前頂皮質のニューロン四倍性のレベルを示す。患者がＡＤの症状を呈する本病状の最終段階であるブラークステージ(Braak Stage)Ｖ〜ＶＩまでは新皮質に検出されない神経原線維錯綜が存在する前に、四倍体ニューロンのパーセンテージの増加が見られる。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定）。
【図２】図２は、８週齢の野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質抽出物中に存在するＥ２Ｆ４（Ｅ２Ｆ４）およびＴｈｒ残基でリン酸化されたＥ２Ｆ４（ｐＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４）のレベルのＥＬＩＳＡ定量（正規化した任意単位）を示す。＊ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図３】図３は、ニューロン特異的ＮｅｕＮ抗原陽性の新鮮な細胞核でフローサイトメトリーの手段により評価された、示された齢の対照マウスまたはＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ＡＰＰ／ＰＳ１）の前頭および前頂皮質におけるニューロン四倍性のレベルを示す。２ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、β−アミロイド斑が存在する前に四倍体ニューロンのパーセンテージの増加が見られる(Zhang et al., 2012 Neurobiol. Aging 33, 2661-2677)。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定）。
【図４】図４は、２ヶ月齢（Ａ）および５ヶ月齢（Ｂ）の野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの血清中に存在するＴｈｒ残基でリン酸化されたＥ２Ｆ４（ｐＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４）と全Ｅ２Ｆ４（Ｅ２Ｆ４）との比のＥＬＩＳＡ定量を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の発明者らは、スレオニン残基でリン酸化された転写因子Ｅ２Ｆ４をアルツハイマー病の早期のバイオマーカーとして同定し、従って、前記マーカーは、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の発症の予測を可能とする。
【００１４】
本発明の方法
第１の態様において、本発明は、対象においてアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクを決定するためのインビトロ方法（本発明の第１の方法）であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する高いリスクを有することを示す方法に関する。
【００１５】
特定の実施形態では、対象は、軽度認知機能障害に罹患している。
【００１６】
本明細書で使用される場合、初期認知症または孤立性認知機能障害としても知られる「軽度認知機能障害」は、認知症の発症前の症候を表そうとする疾病分類学的範疇を意味する。罹患者は、その年齢および教育水準に対して予想されるものよりも進行した機能障害を受けるが、これらの機能障害は彼らの日常の活動を有意に妨げるものではない。軽度認知機能障害は、通常の加齢と認知症の間の境界と考えられる。
【００１７】
当業者は、例えば、医師が診断を行うことができる、精神障害の診断と統計の手引き(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)（ＤＳＭ）および国際疾病分類に示されている診断基準に基づき、対象が軽度認知機能障を有するかどうかを鑑別することができる。
【００１８】
本発明の第１の方法の特定の実施形態では、対象はヒトであって、神経変性疾患はアルツハイマー病であるか、または対象はイヌであって、アルツハイマー病に類似する認知障害は認知機能障害症候群である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の発症リスク」という表現は、対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する素因、感受性、傾向または尤度を意味する。神経変性疾患、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクは一般に、高もしくは低リスクまたはより高いもしくはより低いリスクが存在することを意味する。従って、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する高いリスクを有する対象は、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の前記疾患を発症する尤度を有する。同様に、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する低いリスクを有する対象は、少なくとも０％、または少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも４９％の前記疾患を発症する尤度を少なくとも有する対象である。
【００２０】
一般に、「リスクを予測する」または「リスクの予測」などの表現は、それが高くても低くても、患者がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクを意味する。当業者により理解されているように、予測（またはリスク）は好ましいが、評価される対象の総てに対して正確であることが、好ましくはあるが、そうでなければならないというわけではない。しかしながら、この用語は、それらの対象の統計的に有意な部分が、特定の結果を有するより高い尤度を示すと特定されることを必要とする。当業者は、大きな困難なく、種々の周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、分類指標の交差検証などを用いて、ある部分が統計的に有意かどうかを決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は好ましくは、０．１、０．０５、０．０２、０．０１またはそれ未満である。
【００２１】
用語「アルツハイマー病またはＡＤ」は、進行性の記憶欠損、錯乱、行動問題、自分の世話ができない、段階的な身体の衰え、最終的には死として臨床的に顕在化する老人斑、神経原線維錯綜および進行性のニューロン欠損の出現を特徴とする特定の変性的脳疾患に関連する精神障害を意味する。好ましい実施形態では、アルツハイマー病は、Ｂｒａａｋスケールに従うステージのいずれかにある疾患である。
・ステージＩ〜ＩＩ：神経原線維錯綜の存在により影響を受けた脳部位が、脳の内側嗅領域(transentorhinal region)に相当する。
・ステージＩＩＩ〜ＩＶ：影響を受けた脳部位が、海馬などの辺縁領域の部位にも拡大する。
・ステージＶ〜ＶＩ：影響を受けた脳部位が新皮質領域も含む。
【００２２】
この神経病理学的ステージによる分類はこの疾病の臨床進行と相関し、神経原線維変化を伴う記憶低下と内側嗅領皮質および海馬における老人斑の形成（ステージＩ〜ＩＶ）の間には平行現象が存在する。同様に、等皮質でのこれらの変化の存在（ステージＶおよびＶＩ）は、臨床上重篤な変化と相関している。内側嗅領ステージ（Ｉ〜ＩＩ）は、この疾患の臨床上、沈黙期に相当する。辺縁ステージ（ＩＩＩ〜ＩＶ）は、臨床上初期のＡＤに相当する。新皮質ステージは、完全に発症したＡＤに相当する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「認知機能障害症候群またはＳＤＣ」は、いずれのペットも有し得る、認知プロセスが損なわれた認知症の状態に相当する症候群を意味し、運動または感覚的症候または獣医学的問題を伴って生じ得る。イヌにおける認知機能障害症候群（ＣＤＳ）は、脳機能の低下を特徴とする加齢関連の神経変性疾患である。アルツハイマー病同様、細胞外β−アミロイド（ＰＢＡ）タンパク質沈着物が産生されるが、細胞内タウタンパク質沈着物は産生されない。このＰＢＡ沈着物は、極度の酸化ストレスおよび不溶形態のＰＢＡ  １−４２の形成増加の最終的結果であり、遺伝子と環境の相互作用によって決定される。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、軽度認知機能障害に罹患している対象における個別化療法を設計するためのインビトロ方法（本発明の第２の方法）であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する感受性を持つことを示す方法に関する。
【００２５】
本発明の第２の方法の特定の実施形態では、対象はヒトであって、療法はアルツハイマー病の予防および／または治療のためのものであるか、または対象はイヌであって、療法は認知機能障害症候群の予防および／または治療のためのものである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「予防的療法」は、疾病の症候の発症を回避するまたは遅延させるための疾病の予防、または疾病を予防するための一連の予防的手段を意味する。特に、前記用語は、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害に関連する臨床症候の予防、またはその発症を回避するまたは遅延させるための一連の手段を意味する。対象に対する前記処置の投与に関連する望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、その疾患の病的状態を安定化させること、その疾病の進行を遅延させること、または対象の生理学的状態を改善することが含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「治療のための療法」は、一般に診断後の、健康問題、具体的には、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の一時的回復を意味する。従って、それは必ずしも治癒、すなわち、疾患の完全な回復ではない。よって、本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患、障害または病態のいずれの治療も包含し、疾患もしくは病態を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること；あるいは疾患もしくは病態を緩和すること、すなわち、疾患もしくは病態を退縮させること、または疾患もしくは病態の１以上の症状を改善することを含む。本方法の手段により治療される対象の集団には、望ましくない病態または疾患に罹患している対象、ならびに病態または疾患を発症するリスクのある対象が含まれる。従って、当業者は、治療は患者の病態を改善することができるが、それはその疾患に関する完全な治癒でなくてもよいと理解している。
【００２８】
アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害において好適な予防的または治癒的処置としては、限定されるものではないが、コリン−エステラーゼ阻害剤、例えば、塩酸ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）およびガランタミン（レミニール）、Ｄ−アスパラギン酸Ｎ−メチル（ＮＭＤＡ）受容体拮抗薬、またはモノクローナル抗体、例えば、ソラネズマブおよびバピネオズマブが含まれる。
【００２９】
第３の態様では、本発明は、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するためのインビトロ方法（本発明の第３の方法）であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいて、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定すること、および
ｂ）ａ）で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較すること
を含んでなり、参照値と比較した、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化合物のレベルの上昇が、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する候補であることを示す方法に関する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「選択する」は、対象をアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防的または治癒的処置下に置くためにその対象を選択する行為を意味する。
【００３１】
本発明の第３の方法の特定の実施形態では、対象はヒトであって、療法はアルツハイマー病の予防および／または治療のためのものであるか、または対象はイヌであって、療法は認知機能障害症候群の予防および／または治療のためのものである。
【００３２】
本発明の第１、第２および第３の方法は、第１の工程において、対象由来のサンプルにおいてＥ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化のレベルを決定することを含んでなる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「サンプル」は、対象から単離された生体材料を意味する。このサンプルは、例証となる限定されない例として、脳脊髄液、血清、血漿、涙、汗、唾液、尿および糞便を含むいずれの好適な体液または組織から単離されてもよい。
【００３４】
本発明の方法の特定の実施形態では、サンプルは、脳脊髄液、血清、血漿、血液および末梢血単核細胞からなる群から選択される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物種のメンバーを意味し、限定されるものではないが、飼い動物、霊長類およびヒトを含む。特定の実施形態では、対象は好ましくは、年齢または人種を問わず男性または女性である。別の特定の実施形態では、対象はイヌである。より詳しい実施形態では、対象は、軽度認知機能障害に罹患している。
【００３６】
ヒト「Ｅ２Ｆ４」タンパク質は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースでＱ１６２５４（２０１５年５月２７日）として特定されるタンパク質と一致する。イヌのＥ２Ｆ４タンパク質は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースでＪ９ＮＳＪ４（２０１５年５月２７日）として特定されるタンパク質と一致し、そのアイソフォームはＵｎｉｐｒｏｔデータベースでＦ１Ｐ６Ｙ０（２０１５年４月１日）として特定される。
【００３７】
本発明に関して、用語「Ｅ２Ｆ４タンパク質の機能的に等価な変異体」は、（ｉ）アミノ酸残基の１以上が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されており、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされている残基であってもなくてもよい、Ｅ２Ｆ４タンパク質の変異体、ならびに（ｉｉ）１以上のアミノ酸の挿入または欠失を含んでなり、かつ、Ｅ２Ｆ４タンパク質と同じ機能を果たす、すなわち、遺伝子、具体的には、ＤＮＡ複製および細胞周期の調節に関与する遺伝子の発現を阻害することができる変異体を含む。
【００３８】
本発明による変異体は、好ましくは、Ｅ２Ｆ４アミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。変異体と上記で定義されたＥ２Ｆ４タンパク質の特定の配列の間の一致の程度は、当業者に周知のアルゴリズムおよびコンピューター法を用いて決定することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム[BLAST Manual, Altschul, S., et. al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et. al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]を用いて決定される。
【００３９】
タンパク質のリン酸化の程度は、当業者に公知のいずれの従来法を用いて決定されてもよい。タンパク質のリン酸化の状態、または特定のタンパク質においてリン酸化されているアミノ酸残基を決定するために、例えば、放射性標識ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼ活性アッセイ；このようにリン酸化され、標識されたタンパク質の二次元電気泳動（あるタンパク質においてどのくらいのアミノ酸残基がリン酸化されているか分析することを可能とする）；そのリン酸化状態が測定される予め精製されたタンパク質の質量分析；定方向突然変異誘発とその後の精製タンパク質を用いたインビトロキナーゼ活性アッセイ；トリプシン消化後のリン酸化タンパク質の二次元分離、またはリン酸化されたタンパク質のアミノ酸残基もしくはエピトープを特異的に認識する前記タンパク質に対する抗体を用いることを企図する、あまり技術的に複雑でないウエスタンブロットを含むホスホペプチド分析をはじめとする、種々のアッセイが知られている。タンパク質においてリン酸化された残基を検出するための技術は当業者に周知であり、現況技術に記載されている。あるいは、Ｅ２Ｆ４タンパク質を免疫沈降させることができ、対象とするスレオニンまたはスレオニン残基の総リン酸化のレベルをウエスタンブロットの手段により決定することができる。
【００４０】
好ましい実施形態では、リン酸化の決定は、ＥＬＩＳＡ技術の手段により行われる。
【００４１】
ＥＬＩＳＡとして知られるイムノアッセイは、酵素標識された抗体または抗原の使用に基づき、これにより、標的抗原と標識抗体の間で形成された結合が酵素的に活性な複合体の形成をもたらす。成分のうちの一方（標識抗体または抗原）が支持体に固定化されているということにより、抗体−抗原複合体が支持体に固定化され、従って、その酵素により、例えば分光光度測定法または蛍光測定法により検出可能な生成物に変換される基質の添加によって検出され得る。好ましくは、本発明の方法で使用されるＥＬＩＳＡアッセイは、固相支持体に吸着されかつ検出される抗原に特異的であり、これによりその抗原が前記支持体上で検出されることを可能とする第１の抗体（捕捉抗体）が使用されるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである。このサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、それもまた検出される抗原に特異的であり、先に形成された抗原と捕捉抗体の間の複合体に加えられる第２の抗体（検出抗体）を必要とする。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、キメラまたは組換え抗体ならびにモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体またはそれらのタンパク質分解フラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどを含むものとする。さらに、抗体の可変領域をコードするＤＮＡは、それによりキメラ抗体を作製するために他の抗体に挿入することができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗原結合抗体の特徴的な能力を有し、かつ、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域と相同または類似（ＶＨ−ＶＬまたはｓｃＦｖ結合性）のアミノ酸配列対を含んでなる一本鎖により形成されるポリペプチドであり得る。抗体の軽鎖および重鎖の可変領域に類似のポリペプチドは、場合により、結合ポリペプチドを介して結合することができる。抗体を生産する方法は周知であり、現況技術に記載されている。
【００４３】
当業者により理解されているように、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルが決定されるべきであることを考えれば、ＥＬＩＳＡアッセイは、捕捉抗体がＥ２Ｆ４タンパク質に対して特異的な抗体であり、かつ、検出抗体がホスホスレオニンに対してまたはＥ２Ｆ４タンパク質に存在する特定のホスホスレオニン残基に対して特異的な抗体であるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイの手段により行うことができる。あるいは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、ホスホスレオニン残基にリン酸化を有する総てのタンパク質を固定化する目的で抗ホスホスレオニン抗体または１以上の特定のホスホスレオニン残基に対して特異的な抗体を捕捉抗体として用い、また、抗Ｅ２Ｆ４抗体と検出抗体として用いて行うことができる。
【００４４】
当業者により理解されているように、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルが決定されるべきであることを考えれば、スレオニンにおいてリン酸化されたＥ２Ｆ４の値が正規化できるように、Ｅ２Ｆ４タンパク質の総レベルを定量することが推奨される。Ｅ２Ｆ４のレベルは、例えば、市販の抗体など、Ｅ２Ｆ４を認識する抗体を使用する手段により決定することができる。加えて、Ｅ２Ｆ４タンパク質のリン酸化のレベルが決定されるべきであることを考えれば、リン酸化レベルが変更されないように、アッセイにホスファターゼ阻害剤を含むことが推奨される。
【００４５】
本発明の方法の特定の実施形態では、第１の工程は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）、２５０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５０）、１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）、１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）、２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）および３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「位置的に等価な」は、Ｅ２Ｆ４タンパク質の多重アミノ酸配列アラインメントの手段により、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４および／またはＴｈｒ３３３に相当するＥ２Ｆ４タンパク質のアミノ酸の位置を意味する。
【００４７】
多重配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ２プログラムに実装されているアルゴリズム（標準パラメーター（アラインメントタイプ：低速；マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔ；ギャップオープン：１０；ギャップエクステンション：０．１；ＫＴＵＰ：１；ウインドウレングス：５；スコアタイプ：パーセント；Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｓ：５およびペアギャップ：３））の手段により行うことができる。別の実施形態では、多重配列アラインメントは、標準パラメーター（デフォルトパラメーターを用いるＨＨａｌｉｇｎアルゴリズム、デフォルトトランジションマトリックスは、６ビットギャップオープニングペナルティおよび１ビットギャップエクステンションのＧｏｎｎｅｔである）を用い、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡプログラムに実装されているアルゴリズムの手段により行うことができる。
【００４８】
別のより詳しい実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１以上のスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４および／もしくはＴｈｒ３３３、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の、１以上のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００４９】
より詳しい実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のうち１つのみのリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５０】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２４８およびＴｈｒ２５０；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される２つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な２つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される３つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な３つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される４つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な４つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される５つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な５つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の６つのスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な６つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５５】
別の実施形態では、本発明の方法は、抗ホスホスレオニン抗体を使用する手段により検出されるヒトＥ２Ｆ４タンパク質のスレオニンにおけるリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５６】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基における平均のリン酸化を決定することを含んでなる。例示として、この決定は、例えば、ヒト抗Ｅ２Ｆ４抗体を用いる手段によるヒトＥ２Ｆ４の単離とその後のそのためのホスホスレオニンに対して特異的な抗体を用いる定量的または半定量的免疫検出により行うことができる。
【００５７】
本発明の方法の特定の実施形態では、対象はイヌであって、リン酸化は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３１１番のスレオニン（Ｔｈｒ３１１）、３１３番のスレオニン（Ｔｈｒ３１３）、７６番のスレオニン（Ｔｈｒ７６）、２２５番のスレオニン（Ｔｈｒ２２５）、２８６番のスレオニン（Ｔｈｒ２８６）、３９１番のスレオニン（Ｔｈｒ３９１）、４０番のスレオニン（Ｔｈｒ４０）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基に関して決定される。
【００５８】
別のより詳しい実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の１以上のスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な１以上のアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００５９】
より詳しい実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４のＴｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択されるスレオニン残基の１つのみ、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のうち１つのみのリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ３１１およびＴｈｒ３１３；Ｔｈｒ３１１およびＴｈｒ７６；Ｔｈｒ３１１およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１１およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ７６；Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；ならびにＴｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択される２つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な２つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６１】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ７６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；およびＴｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択される３つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な３つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２２５；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；ならびにＴｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択される４つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な４つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６３】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ２８６；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；ならびにＴｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択される５つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な５つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ３９１；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０；ならびにＴｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択される６つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な６つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の７つのスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な７つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６６】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、対象はイヌであって、リン酸化は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２５１番（Ｔｈｒ２５１）、２５３番（Ｔｈｒ２５３）、１４番（Ｔｈｒ１４）、１６５番（Ｔｈｒ１６５）、２２６番（Ｔｈｒ２２６）、３３２番（Ｔｈｒ３３２）および２４１番（Ｔｈｒ２４１）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基に関して決定される。
【００６７】
より詳しい実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択されるスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基のうち１つのみのリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１およびＴｈｒ２５３；Ｔｈｒ２５１およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２５１およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５１およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；ならびにＴｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択される２つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な２つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００６９】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；ならびにＴｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択される３つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な３つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６５；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；ならびにＴｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択される４つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な４つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７１】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２２６；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；ならびにＴｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択される５つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な５つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ３３２；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１；ならびにＴｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２、Ｔｈｒ２４１からなる群から選択される６つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な６つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７３】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択される７つのスレオニン残基、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のリン酸化可能で位置的に等価な７つのアミノ酸残基のリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７４】
別の実施形態では、本発明の方法は、そのために抗ホスホスレオニン抗体を用いてイヌＥ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基における平均のリン酸化を決定することを含んでなる。例示として、この決定は、例えば、抗イヌＥ２Ｆ４抗体を用いる手段によるイヌＥ２Ｆ４の単離とその後のそのためのホスホスレオニンに対して特異的な抗体を用いる定量的または半定量的免疫検出により行うことができる。
【００７５】
別の実施形態では、本発明の方法は、抗ホスホスレオニン抗体を用いる手段により検出されるイヌＥ２Ｆ４タンパク質のスレオニンにおけるリン酸化を決定することを含んでなる。
【００７６】
本発明の方法の第２の工程は、本方法の第１の工程で得られたリン酸化のレベルを参照値と比較することを含んでなる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「参照値」は、対象から採取されたサンプルから得られた値またはデータを評価するために参照として使用される、予め決定された基準を意味する。参照値または参照レベルは、絶対値、相対値、上限もしくは下限を有する値、値の範囲、平均値(average value)、中央値、平均値(mean value)、または特定の対照もしくはベースライン値と比較した値であり得る。参照値は、例えば、被分析対象由来のサンプルから早期の時点で得られた値など、一個のサンプルの値に基づいてもよい。参照値は、適合する暦年齢の対象集団などの多数のサンプルに基づいてもよいし、または被分析サンプルを包含もしくは除外するサンプルのプールに基づいてもよい。特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４タンパク質におけるリン酸化されたアミノ酸残基に関する参照値は、対象または対照対象の集団、すなわち、神経変性疾患を呈していないもの、具体的には、アルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を呈していないもの由来のサンプル中のタンパク質の前記残基のリン酸化のレベルである。典型的な参照サンプルは、一般に、臨床上十分に報告されている対象から得られる。
【００７８】
第２の比較工程の後、本発明の第１の方法によれば、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルの上昇は、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害を発症する高いリスクを有することを示す。
【００７９】
本発明の第２の方法によれば、参照値と比較した、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化合物のレベルの上昇は、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する感受性を持つことを示す。
【００８０】
本発明の第３の方法によれば、参照値と比較した場合の、Ｅ２Ｆ４タンパク質または機能的に等価な変異体のスレオニン残基のリン酸化合物のレベルの上昇は、前記対象がアルツハイマー病または前記疾患に類似する認知障害の予防および／または治療のための療法を受容する候補であることを示す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「リン酸化のレベルの上昇」は、Ｅ２Ｆ４の少なくとも１つのスレオニン残基におけるリン酸化のレベルが参照値よりも高いということを意味する。リン酸化のレベルは、それらが参照値よりも少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％またはそれを超えて高い場合に、それらの参照値より高いと見なされる。
【００８２】
同様に、本発明に関して、リン酸化のレベルは、サンプルにおけるリン酸化のレベルが参照値より低い場合に低下する。リン酸化のレベルは、それらが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％またはそれを超えて低い場合に、それらの参照値より低いと見なされる。
【００８３】
リスクマーカーとしての使用
別の態様において、本発明は、スレオニンでリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての使用に関する。
【００８４】
特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、２４８番のスレオニン（Ｔｈｒ２４８）、２５０番のスレオニン（Ｔｈｒ２５０）、１４番のスレオニン（Ｔｈｒ１４）、１６３番のスレオニン（Ｔｈｒ１６３）、２２４番のスレオニン（Ｔｈｒ２２４）、３３３番のスレオニン（Ｔｈｒ３３３）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニンにおいてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００８５】
別のより詳しい実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１以上のスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４および／またはＴｈｒ３３３においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００８６】
より詳しい実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択されるスレオニン残基のうち１つのみにおいてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００８７】
別の特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ２５０；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される２つのスレオニン残基においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００８８】
別の特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される３つのスレオニン残基においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００８９】
別の特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１６３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される４つのスレオニン残基においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００９０】
別の特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ２２４；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３；ならびにＴｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３からなる群から選択される５つのスレオニン残基においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００９１】
別の特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はヒト起源のものであり、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の６つのスレオニン残基、すなわち、Ｔｈｒ２４８、Ｔｈｒ２５０、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６３、Ｔｈｒ２２４およびＴｈｒ３３３においてリン酸化されており、疾患はアルツハイマー病である。
【００９２】
スレオニンにおいてリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての使用の別の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４であり、３１１番のスレオニン（Ｔｈｒ３１１）、３１３番のスレオニン（Ｔｈｒ３１３）、７６番のスレオニン（Ｔｈｒ７６）、２２５番のスレオニン（Ｔｈｒ２２５）、２８６番のスレオニン（Ｔｈｒ２８６）、３９１番のスレオニン（Ｔｈｒ３９１）、４０番のスレオニン（Ｔｈｒ４０）およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニンにおいてリン酸化されており、アルツハイマー病に類似する認知障害は認知機能障害症候群である。
【００９３】
別のより詳しい実施形態では、Ｅ２Ｆ４はＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４であり、Ｔｈｒ３１１、Ｔｈｒ３１３、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ２２５、Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３９１およびＴｈｒ４０からなる群から選択されるスレオニン残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは７つ総てにおいてリン酸化されている。
【００９４】
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４のリン酸化されたスレオニン残基の可能性のある組合せは、本発明の方法に関して上記されており、同様に本態様に適用可能である。
【００９５】
スレオニンにおいてリン酸化されているＥ２Ｆ４またはその機能的に等価な変異体の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクのマーカーとしての別の実施形態では、Ｅ２Ｆ４はＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４であり、２５１番のスレオニン（Ｔｈｒ２５１）、２５３番のスレオニン（Ｔｈｒ２５３）、１４番のスレオニン（Ｔｈｒ１４）、１６５番のスレオニン（Ｔｈｒ１６５）、２２６番のスレオニン（Ｔｈｒ２２６）、３３２番のスレオニン（Ｔｈｒ３３２）および２４１番のスレオニン（Ｔｈｒ２４１）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるスレオニンにおいてリン酸化されており、アルツハイマー病に類似する認知障害は認知機能障害症候群である。
【００９６】
別のより詳しい実施形態では、Ｅ２Ｆ４はＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４であり、Ｔｈｒ２５１、Ｔｈｒ２５３、Ｔｈｒ１４、Ｔｈｒ１６５、Ｔｈｒ２２６、Ｔｈｒ３３２およびＴｈｒ２４１からなる群から選択されるスレオニン残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは７つ総てにおいてリン酸化されている。
【００９７】
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４のリン酸化されたスレオニン残基の可能性のある組合せは、本発明の方法に関して上記されており、同様に本態様に適用可能である。
【００９８】
上記の用語は同様に本態様にも適用可能である。
【００９９】
本発明のキット
別の態様において、本発明は、対象がアルツハイマー病またはアルツハイマー病に類似する認知障害を発症するリスクを決定するための、対象における個別化療法を設計するための、またはアルツハイマー病もしくはアルツハイマー病に類似する認知障害の予防および／もしくは治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するための、Ｅ２Ｆ４タンパク質のスレオニン残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬を含んでなるキットに関する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「キット」は、輸送および保存を可能とするために包装された、本発明の方法を実施するために必要とされる種々の試薬を含有する製品を意味する。キットの成分を包装するために好適な材料としては、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、およびサシェなどが含まれる。加えて、本発明のキットは、キット内の種々の成分の同時使用、逐次使用または個別使用に関する説明書を含み得る。前記説明書は、印刷書類の形態または電子保存媒体（磁気ディスクおよび、テープなど）、および光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）などの、対象により読み取りが可能なように説明書を保存し得る電子支援の形態で見出し得るものである。それに加えて、またはその代わりに、媒体は、前記説明書を提供するインターネットアドレスも含み得る。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「リン酸化のレベルを決定し得る試薬」は、タンパク質のリン酸化された残基を検出し得る化合物であると理解される。
【０１０２】
特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４タンパク質のリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、
ａ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｂ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２５０番（Ｔｈｒ２５０）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｃ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｄ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｅ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｆ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｇ）ヒトＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のＴｈｒ、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｈ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３１１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｉ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の残基番のスレオニン３１３（Ｔｈｒ３１３）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｊ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の７６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ７６）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｋ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２２５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２５）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｌ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２８６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２８６）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｍ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３９１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３９１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｎ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の４０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ４０）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｏ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体のＴｈｒ、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬
からなる群から選択される。
【０１０３】
特定の実施形態では、Ｅ２Ｆ４タンパク質のリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、
ａ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２５１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｂ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２５３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｃ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｄ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の１６５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６５）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｅ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２２６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２６）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｆ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の３３２番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３２）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｇ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体の２４１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４１）、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬、
ｈ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質もしくは機能的に等価な変異体、または多重アミノ酸配列アラインメントにより定義される別のＥ２Ｆ４タンパク質のリン酸化可能で位置的に等価なアミノ酸残基におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬
からなる群から選択される。
【０１０４】
より詳しくは、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２４８番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４８）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２４８番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１０５】
別のより詳しい実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２５０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５０）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２５０番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１０６】
別の特定の実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、１４番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１０７】
別のより詳しい実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の１６３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、１６３番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１０８】
別のより詳しい実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の２２４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２４）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２２４番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１０９】
別のより詳しい実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の３３３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、３３３番を含んでなるヒトＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１０】
別のより詳しい実施形態では、ヒトＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒにおけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、抗ホスホスレオニン抗体である。
【０１１１】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３１１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、３１１番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１２】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３１３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３１３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、３１３番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１３】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の７６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ７６）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、７６番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１４】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２２５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２５）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２２５番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１５】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２８６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２８６）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２８６番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１６】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３９１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３９１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、３９１番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１７】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｊ９ＮＳＪ４を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の４０番のスレオニン残基（Ｔｈｒ４０）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、４０番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１１８】
別のより詳しい実施形態では、イヌＥ２Ｆ４タンパク質のＴｈｒにおけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、抗ホスホスレオニン抗体である。
【０１１９】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２５１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２５１番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２０】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２５３番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２５３）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２５３番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２１】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の１４番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１４）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、１４番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２２】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の１６５番のスレオニン残基（Ｔｈｒ１６５）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、１６５番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２３】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２２６番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２２６）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２２６番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２４】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の３３２番のスレオニン残基（Ｔｈｒ３３２）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、３３２番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２５】
別のより詳しい実施形態では、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｆ１Ｐ６Ｙ０を有するイヌＥ２Ｆ４タンパク質の２４１番のスレオニン残基（Ｔｈｒ２４１）におけるリン酸化のレベルを決定し得る試薬は、２４１番を含んでなるイヌＥ２Ｆ４配列を含んでなるホスホペプチドを特異的に認識する抗体であり、前記Ｔｈｒ残基はリン酸化されている。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明のキットは、上述の１以上の試薬を含んでなる。
【０１２７】
加えて、本発明のキットは、Ｅ２Ｆ４タンパク質に特異的に結合し得る試薬を含んでなる。より詳しい実施形態では、前記試薬は抗体である。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「特異的認識または特異的結合」は、リン酸化された残基を有するペプチドまたはタンパク質という場合、前記試薬は、対象とする残基においてリン酸化されている場合にのみそのペプチドまたはタンパク質を認識し、それがリン酸化されていない場合には反応を示さないということを意味する。そのリン酸化のレベルに関わらずペプチドまたはタンパク質という場合には、それは、前記試薬が、非特異的相互作用とは対照的に、そのペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのエピトープと反応し得るということを意味する。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、天然ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または非天然抗体、例えば、シングルドメイン抗体、単鎖可変フラグメント抗体、マイクロ抗体などであり得る。このような抗体を生産するための方法は当技術分野で周知である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される特異的抗体は、検出可能なマーカー（例えば、蛍光色素もしくは検出可能な酵素）で標識されるか、または検出をより容易とするように修飾される（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンによる検出を可能とするようにビオチンで）。他の実施形態では、試薬は、直接標識または修飾されない。
【０１３１】
特定の実施形態では、本キットは、試薬をアレイの形式で含む。このアレイは、所定のパターン（例えば、格子）で基質に結合された、対象とする１以上の残基におけるリン酸化のレベルを決定するのに好適な少なくとも２つの異なる試薬を含む。よって、本発明は、本発明において述べられた１以上のアミノ酸残基のリン酸化のレベルを決定するのに好適な試薬を含んでなるアレイを提供する。
【０１３２】
異なる試薬（「捕捉試薬」）を配置することで、同じ反応でいくつかの異なるアミノ酸残基のリン酸化のレベルを測定することができる。アレイ形態で試薬を含むキットは通常サンドイッチ形式で見られ、従って、このようなキットは検出試薬も含有し得る。異なる検出試薬が通常キットに含められ、各検出試薬は異なる抗体に特異的である。このような実施形態における検出試薬は通常、基質に結合された試薬と同じタンパク質に特異的な試薬であり（しかしながら検出試薬は一般には、基質結合試薬の異なる部分またはタンパク質部位に結合される）、一般に親和性アフィニティー型の検出試薬である。他の任意のアッセイ形式の検出試薬と同様に、検出試薬は、検出可能な残基で修飾するか、検出可能な残基の個別の結合を可能とするように修飾することができ、またはそれらは修飾されなくてもよい。検出可能な残基の結合を可能とするように修飾されたまたは非修飾の検出試薬を含むアレイ型キットはまた、付加的な検出可能残基（例えば、検出試薬と結合する検出可能残基、例えば、検出試薬を修飾することなく結合する標識抗体またはビオチン検出のために検出可能な残基で修飾されたストレプトアビジン、修飾された検出試薬）も含有し得る。
【０１３３】
これらの抗体は当技術分野で周知の方法によって達成できる。例えば、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、特定のスレオニン残基でリン酸化された免疫原性形態のＥ２Ｆ４タンパク質（例えば、抗体応答を達成し得る抗原性フラグメント、例えば、リン酸化されたアミノ酸を含有する合成ペプチド）で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術には、ビヒクルコンジュゲーションまたは当技術分野で極めてよく知られている他の技術が含まれる。例えば、ポリペプチドのペプチジル部分を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫誘導の進行は血漿または血清抗体力価を検出することによりモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用することができる。
【０１３４】
免疫誘導後、ポリペプチドと反応性のある抗血清を得ることができ、所望によりポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生産するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物から採取し、体細胞を融合させるための標準法を用いて骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成することができる。このような技術は当技術分野で極めてよく知られており、例えば、ハイブリドーマ技術、例えば、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＶＢハイブリドーマ技術が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、そのポリペプチドと特異的に反応する抗体を生産するかどうか免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１３５】
別のより詳しい実施形態では、Ｅ２Ｆ４タンパク質に特異的に結合し得る試薬が、支持体に固定化される。
【０１３６】
上記の用語は同様に本態様にも適用可能である。
【０１３７】
本発明のキットの使用
別の態様において、本発明は、対象において対象がアルツハイマー病もしくは前記疾患に類似する認知障害を発症するリスクを決定するための、軽度認知機能障害に罹患している対象において個別化療法を設計するための、またはアルツハイマー病もしくは前記疾患に類似する認知障害の予防および／もしくは治療のための療法による処置に感受性のある患者を選択するための、本発明のキットの使用に関する。
【０１３８】
上記の用語は同様に本態様にも適用可能である。
【実施例】
【０１３９】
以下、本発明を、本発明の範囲を限定せず単に例示のために示される以下の実施例により詳細に説明する。
【０１４０】
材料および方法
マウス
二重トランスジェニックマウスＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄｅｌｔａＥ９（ＡＰＰ／ＰＳ１）[Fernandez et al., 2012 Mol. Psychiatry 17, 705-718]を使用した。
【０１４１】
血清の取得
マウスをペントバルビタール（２ｍｇ／１０ｇ体重）で麻酔し、０．２〜０．５ｍｌの血液を前記マウスの右心室から皮下針（２５Ｇ）に手段により抜き取り、その後、マウスを断頭により犠牲にした。血液サンプルをヘパリン不含試験管で保存し、血餅を得るために３７℃で１時間インキュベートした。次に、血餅を退縮させるために、これらのサンプルを４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。その後、赤血球溶解を起こさないように注意しながら血餅を取り出し、サンプルを４℃で１５分間遠心分離し（４０００ｒｐｍ）し、可能性のある凝固残渣を除去した。上清（血清）を取り出し、後の使用のために−８０℃で冷凍した。
【０１４２】
組織サンプル
出生直後の０日目（Ｐ０）または２ヶ月齢および５ヶ月齢（それぞれ２ｍおよび５ｍ）時に犠牲に、−８０℃で維持していたＢＬ６／Ｃ５７マウス（対照）およびＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄｅｌｔａＥ９マウス（ＡＰＰ／ＰＳ１）[Fernandez et al., 2012 Mol. Psychiatry. 17: 705-718]の脳の半球皮質を用いた。
【０１４３】
Ｂａｎｃｏ  ｄｅ  Ｔｅｊｉｄｏｓ  Ｆｕｎｄａｃｉｏｎ  Ｃｉｅｎ（ＢＴ−ＣＩＥＮ、マドリッド）およびＢａｎｃｏ  ｄｅ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｒｇｅｎ  ｄｅ  ｌａ  Ａｒｒｉｘａｃａ、ムルシア）から入手し、−８０℃で維持したヒト前頭および前頂皮質サンプルも使用した。これらのサンプルを得るための方法は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｓａｌｕｄ  Ｃａｒｌｏｓ  ＩＩＩの倫理委員会およびＣｏｎｓｅｊｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｓ（マドリッド、スペイン）の生命倫理分科委員会に承認されたものであった。
【０１４４】
細胞核懸濁液の調製
３０〜４０ｍｇのヒト皮質またはマウス脳半球皮質を、製造者の説明書に従い、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ８７８７）（ＰＢＳ−Ｔ）およびｃＯｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１  ８３６  １７０  ００１）を含有する３ｍｌのＤＮアーゼ不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてダウンス型ホモジナイザーで破砕した。このようにして得たホモジネートを４℃で２分間、２００ｇで遠心分離した。このようにして得た上清の容量をＰＢＳ−Ｔで１２ｍｌに調整し、４℃にて４分間４００ｇで遠心分離した。このようにして得られたペレットを氷中、総容量９００μｌのＰＢＳ−Ｔで２０分間維持した後、ピペット操作の手段により穏やかに再懸濁させた。
【０１４５】
核懸濁液の免疫蛍光標識
核懸濁液の核をニューロン特異的抗ＮｅｕＮ抗体（クローンＡ６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｍａｂ３７７）で免疫標識した。０．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ４５０３）および１０％ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１６１７０−０８６）を組み込んだ４００μｌアリコートの核懸濁液（上記参照）を、１：８００希釈の一次抗ＮｅｕＮ抗体および１：５００希釈の二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８とともに４℃で１２時間インキュベートした。別のアリコートを、一次抗体を含まない同じ条件下でインキュベートし、このアリコートを陰性対照とする。抗体とのインキュベーションの後、サンプルを濾過し（孔径３０μｍのナイロンフィルター）、その容量をヨウ化プロピジウムおよびＲＮアーゼをそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬで含有するＰＢＳで６００μｌに調製した。
【０１４６】
フローサイトメトリー
４Ｃニューロンのパーセンテージの定量は、ＦＡＣＳＡｒｉａサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびそのアルゴン励起レーザー（４８８）を用いてフローサイトメトリーの手段により行った。ＤＮＡに組み込まれたヨウ化プロピジウムの発光および抗ＮｅｕＮ標識に関連した蛍光団Ａｌｅｘａ−４８８のシグナルを、それぞれＢＰ５３０／３０およびＢＰ６１６／２３発光フィルターを用いて検出した。種々の分析集団の選択はLopez-Sanchez and Frade J. Neurosci. 33: 7488-7500, 2013に記載されている方法に従った。
【０１４７】
統計分析
サイトメトリー分析は、各群から少なくとも４個体を用い、マウスでは少なくとも３反復、ヒトでは２反復で行った。統計的有意性はスチューデントのｔ検定の手段により分析した。
【０１４８】
ＥＬＩＳＡの手段によるＴｈｒにおいてリン酸化されたＥ２Ｆ４およびＥ２Ｆ４の定量
ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、２０μｇ／ｍｌのウサギ抗Ｅ２Ｆ４ポリクローナル抗体（Ｒｅｆ．ＡＰ０９９８６ＰＵ−Ｎ；Ａｃｒｉｓ）の溶液を調製した。５０マイクロリットルの上記溶液をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）９６ウェルプレート（Ｒｅｆ．３５１１７７；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の各ウェルの底部に加えた。各実験点について少なくとも６ウェルを用い、そのうち３つをＥ２Ｆ４の相対レベルの定量のため、残りの３つをホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４形態の定量のために用いた。並行して、バックグラウンド分析値を得るために、５０μｌのＴＢＳを他の６つのウェルの底部に加えた。最後に、このプレートを接着性プラスチックで覆い、４℃で一晩インキュベートした。翌日、これらのウェルから溶液を除去し、ウェルを、各２００μｌのＴＢＳを用いて２回洗浄した。次に、３％ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ（ブロッキングバッファー）１５０μｌを各ウェルの底部に加え、プレートを接着性プラスチックで覆った。その後、プレートを室温で少なくとも２時間インキュベートした。このインキュベーションの後、溶液をウェルから除去し、各２００μｌのＴＢＳを用いて２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーで血清の希釈液（１／１０希釈）を調製し、５０μｌの各希釈液を、ウサギ抗Ｅ２Ｆ４ポリクローナル抗体でコーティングしたウェル、ならびにＴＢＳとともにインキュベートしたウェルの底部に加えた。次に、プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で少なくとも４時間インキュベートした。ウェルから血清希釈液を除去した後、それらのウェルを各２００μｌのＴＢＳを用いて４回洗浄した。次に、マウス抗Ｅ２Ｆ４モノクローナル抗体、クローンＬＬＦ４−２（Ｒｅｆ．ＭＡＢＥ１６０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の１／１０００希釈液（ブロッキングバッファー）を調製した。この溶液は、血清Ｅ２Ｆ４のレベルを評価するために使用した。別の、マウス抗ホスホＴｈｒモノクローナル抗体（クローン２０Ｈ６．１）（Ｒｅｆ．０５−１９２３；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１／１０００希釈液（ブロッキングバッファー）も調製した。この溶液は、血清ホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４の相対レベルを評価するために使用した。５０μｌのこれらの溶液を対応するウェルの底部に加えた後（Ｅ２Ｆ４またはホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４を定量するため）、プレートを接着性プラスチックで覆い、４℃で一晩インキュベートした。この期間が経過した後、溶液をウェルから除去し、それらのウェルを２００μｌのＴＢＳを用いて４回洗浄した。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｒｅｆ．１７０−６５１６；ＢｉｏＲａｄ）の１／２０００希釈液（ブロッキングバッファーで）を調製し、５０μｌのこの溶液を分析ウェルの総ての各ウェルの底部に加えた。次に、このプレートを接着性プラスチックで覆い、室温で少なくとも２時間インキュベートした。その後、ウェルから溶液を除去し、ウェルを２００μｌのＴＢＳを用いて８回洗浄した。次に、ＡＢＴＳ錠剤（Ｒｅｆ．１１  １１２  ４２２  ００１；Ｒｏｃｈｅ）を５０ｍｌのＡＢＴＳバッファー（Ｒｅｆ．１１  １１２  ５９７  ００１；Ｒｏｃｈｅ）に溶かし、��５０μｌのこの溶液を分析ウェルの総ての各ウェル、ならびにブランクの値を評価するための３つの非処理ウェルの底部に加えた。その後、このプレートを約１５〜４５分間室温でインキュベートし、４０５ｎｍでの光学密度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて種々のウェルで定量した。ブランクを差し引いた後、ウサギ抗Ｅ２Ｆ４ポリクローナル抗体で処理したウェルで得られた値を、最初にＴＢＳとともにインキュベートしたウェルで得られたものから減算した。このようにして得られたホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４値を最終的に、Ｅ２Ｆ４に関して得られた値で割った。
【０１４９】
実施例１：ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの血清Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ残基におけるリン酸化のレベルの分析
アルツハイマー病患者の脳は、胚発生の際にニューロンに本来見られるものと同じ４倍体形成プロセスを受け、病状を定義する神経病理学的傷害に先行する（図１）。
【０１５０】
トランスジェニックマウスＡＰＰ／ＰＳ１の大脳皮質を調べると、これらのマウスの大脳皮質は、対照マウスに比べてＥ２Ｆ４のＴｈｒ残基におけるリン酸化のレベルに有意な増加を示す（図２）。この現象は、８週齢のマウスで、すなわち、β−アミロイドペプチド蓄積およびこのマウス系統における他の神経病理学的変化（３．５ヶ月齢を起点に起こる）のずっと前にすでに見られ、検出される(Zhang et al., 2012 Neurobiol. Aging 33: 2661-2677)。さらに、このリン酸化の上昇は、これらのマウスの大脳皮質に見られるニューロン四倍体形成プロセスと並行している（図３）。従って、Ｅ２Ｆ４のリン酸化とニューロン四倍体形成は、ＡＤに先立つ既知の最初期イベントといえる。
【０１５１】
まさにニューロンの四倍性の実質的増大が見られた際に（図３）、２ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの血清でホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４のレベルがどのくらい有意に上昇しているかが観察できる（図４Ａ）。対照的に、これらのマウスが５ヶ月齢となり（図４Ｂ）、四倍体形成プロセスが大きく減少する際に（図３）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの血清におけるホスホＴｈｒ−Ｅ２Ｆ４のレベルは有意に低下する。
【０１５２】
従って、患者由来のサンプルにおけるＴｈｒでリン酸化されたＥ２Ｆ４のレベルの上昇は、ＡＤ（アルツハイマー病）の診断に使用可能である。さらに、Ｔｈｒでリン酸化されたＥ２Ｆ４のレベルの上昇が症状の発現前の疾患のある時点で見られること考えれば、このマーカーは、対象がアルツハイマー病を発症するリスクを決定するための予後目的に使用可能である。これはさらに、Ｔｈｒでリン酸化されたＥ２Ｆ４のレベルが血漿および末梢組織で検出され得ることを考えれば、最小限の侵襲様式で行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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