(57)【要約】  新規なグリコピロニウム脂肪酸塩が開発されている。二相性反応条件は、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成する方法において、アルカリ金属とアルカリ土類金属の脂肪酸塩と臭化グリコピロニウムとの間の所望の対イオン交換反応を可能にする。好ましい実施形態では、反応混合物中の過剰な遊離脂肪酸は、グリコピロニウム脂肪酸塩を安定させて、不純物である酸Ａの形成を減少させる。いくつかの好ましい実施形態では、０．２−１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。別の実施形態では、およそ１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。【選択図】図７
2018519289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臭化グリコピロニウムを二相性の反応混合物中の脂肪酸塩と混合する工程を含む、少なくとも１つのグリコピロニウム脂肪酸塩生成物を合成する方法であって、
少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、方法。
【請求項２】
混合する工程は、以下の下位工程：
ｉ）水、２−メチル−テトラヒドロフラン、およびアルカリ金属水酸化物ならびにアルカリ土類金属水酸化物からなる群から選択される金属水酸化物と、脂肪酸を、すべての固形物が溶解して脂肪酸塩を形成するまで、混合する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合する工程はさらに、以下の下位工程：
ｉｉ）固形物が溶解するまで臭化グリコピロニウムを加えて混合する工程；
ｉｉｉ）反応混合物の下方の水相を除去し、上方の有機相を保持する工程；
ｉｖ）上方の有機相を水で洗浄する工程；
ｖ）工程ｉｉｉ）とｉｖ）を少なくとも１回繰り返す工程；
ｖｉ）上方の有機相で減圧蒸留を行う工程；
ｖｉｉ）新しい２−メチル−テトラヒドロフランを加える工程；
ｖｉｉｉ）蒸留物が観察されなくなるまで、工程ｖｉ）を繰り返す工程；
ｉｘ）無極性の炭化水素溶媒を加え、任意の懸濁固形物を取り除くために結果として生じた混合物をろ過する工程；および、
ｘ）生成物を得るために、工程ｉｘ）からのろ液の減圧蒸留を行う工程
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
下位工程ｖ）において、下位工程ｉｉｉ）とｉｖ）は少なくとも２回繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
無極性の炭化水素溶媒は、ｎ−ヘプタン、ヘプタン異性体の混合物、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、および石油エーテルからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
生成物は、油、油状の固形物、およびワックス状の固形物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
脂肪酸塩のカチオンはＮａ、Ｋ、およびＣａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
脂肪酸は、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、エルカ酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、カプリン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
脂肪酸は少なくとも８つの炭素分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離されたグリコピロニウム脂肪酸塩混合物は、投入比率と比較して、グリコピロニウムに対して脂肪酸が豊富である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも０．６モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
およそ０．６モル当量の過剰な遊離脂肪酸〜１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１．１モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
およそ１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
単離されたグリコピロニウム脂肪酸塩混合物の脂肪酸のグリコピロニウムに対する比率は、およそ２．２５：１−３．００：１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離されたグリコピロニウム脂肪酸塩混合物の脂肪酸のグリコピロニウムに対する比率は、およそ２．２９：１−２．８７：１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
二相性の反応混合物は水と２−メチル−テトラヒドロフランを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
グリコピロニウム脂肪酸塩生成物を分析する工程をさらに含み、
分析する工程は、以下の下位工程：
ｉ）生成物中に存在するグリコピロニウム成分と加水分解分解物である酸Ａを定量化するために高圧液体クロマトグラフィーを行う工程；
ｉｉ）生成物中の全脂肪酸成分を定量化するためにガスクロマトグラフィーを行う工程；
ｉｉｉ）生成物中の臭化物成分を定量化するためにアニオンモードイオンクロマトグラフィーを行う工程；
ｉｖ）生成物中のカリウム成分を定量化するためにカチオンモードイオンクロマトグラフィーを行う工程；
ｖ）過剰な遊離脂肪酸の量と四級アミノアルコール分解物の量を決定するために、下位工程ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、およびｉｖ）からの結果を組み合わせる化学量計算を行う工程；および、
ｖｉ）生成物中のグリコピロニウム対全脂肪酸のモル比を決定するために、核磁気共鳴を行う工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１の方法によって作られ、以下の化学式を有するグリコピロニウム脂肪酸塩であって、
【化１】
2018519289.tif 000058
ここで、Ｒは少なくとも８つの炭素分子を含む脂肪酸鎖である、グリコピロニウム脂肪酸塩。
【請求項２０】
Ｒは以下からなる群：
Ｃ１１Ｈ２３（ラウリン酸）；
Ｃ１７Ｈ３５（ステアリン酸）；
Ｃ１７Ｈ３３（オレイン酸）；
Ｃ１５Ｈ３１（パルミチン酸）；
Ｃ９Ｈ１９（カプリン酸）；
Ｃ１９Ｈ３１（アラキドン酸）；
Ｃ１９Ｈ３９（アラキジン酸）；
Ｃ２１Ｈ４１（エルカ酸）；
Ｃ１７Ｈ３１（リノール酸）；
Ｃ１７Ｈ２９（リノレン酸）；および、
Ｃ１３Ｈ２７（ミリスチン酸）
から選択される、請求項１９に記載のグリコピロニウム脂肪酸塩。
【請求項２１】
塩化トロスピウムを二相性の反応混合物中の脂肪酸塩と混合する工程を含む、トロスピウム脂肪酸塩を合成する方法であって、
少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる、方法。
【請求項２２】
混合する工程は、以下の下位工程：
ｉ）水、２−メチル−テトラヒドロフラン、およびアルカリ金属水酸化物ならびにアルカリ土類金属水酸化物からなる群から選択される金属水酸化物と、脂肪酸を、すべての固形物が溶解して脂肪酸塩を形成するまで、混合する工程を含む、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
以下の化学式を備えた化合物であって、
【化２】
2018519289.tif 000059
ここで、Ｒは少なくとも８つの炭素分子を含む脂肪酸鎖である、化合物。
【請求項２４】
Ｒは以下からなる群：
Ｃ１１Ｈ２３（ラウリン酸）；
Ｃ１７Ｈ３５（ステアリン酸）；
Ｃ１７Ｈ３３（オレイン酸）；
Ｃ１５Ｈ３１（パルミチン酸）；
Ｃ９Ｈ１９（カプリン酸）；
Ｃ１９Ｈ３１（アラキドン酸）；
Ｃ１９Ｈ３９（アラキジン酸）；
Ｃ２１Ｈ４１（エルカ酸）；
Ｃ１７Ｈ３１（リノール酸）；
Ｃ１７Ｈ２９（リノレン酸）；および、
Ｃ１３Ｈ２７（ミリスチン酸）
から選択される、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
グリコピロニウム脂肪酸塩生成物を分析する方法であって、
ａ）生成物中に存在するグリコピロニウム成分と加水分解分解物である酸Ａを定量化するために、高圧液体クロマトグラフィーを行う工程；
ｂ）生成物中の全脂肪酸成分を定量化するためにガスクロマトグラフィーを行う工程；
ｃ）生成物中の臭化物成分を定量化するためにアニオンモードイオンクロマトグラフィーを行う工程；
ｄ）生成物中のカリウム成分を定量化するためにカチオンモードイオンクロマトグラフィーを行う工程；
ｅ）過剰な遊離脂肪酸の量と四級アミノアルコール分解物の量を決定するために、工程ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）からの結果を組み合わせる化学量計算を行う工程；および、
ｆ）生成物中のグリコピロニウム対全脂肪酸のモル比を決定するために、核磁気共鳴を行う工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への言及
本出願は、「ＧＬＹＣＯＰＹＲＲＯＮＩＵＭ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤ  ＳＡＬＴＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＳＡＭＥ」という表題で２０１５年６月１５日に出願された仮出願第６２／１７５，７３７号に開示された１つ以上の発明を主張する。米国仮出願の３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）下の利益は本出願により主張され、前述の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はグリコピロニウム塩の分野に関する。より具体的には、本発明は新規な親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩に関する。
【背景技術】
【０００３】
グリコピロレート（臭化グリコピロニウムとしても知られている）は、Ｃ１９Ｈ２８ＢｒＮＯ３の分子式および３９８．３４の分子量の３−［シクロペンチル（ヒドロキシ）フェニルアセトキシ］−１，１−ジメチルピロリジニウム臭化物という化学名の四級アンモニウム対イオンを有する臭化物塩である。その化学構造は、後の表２で示される。
【０００４】
塩化トロスピウムは、３（２ヒドロキシ−２，２ジフェニルアセトキシ）スピロ［ビシクロ［３．２．１］オクタン−８，１’ピロリジン］−１’−イウムクロライドという化学名の四級アンモニウム塩である。塩化トロスピウムの分子式はＣ２５Ｈ３０ＣｌＮＯ３であり、その分子量は４２７．９７である。塩化トロスピウムの化学構造は次のとおりである：
【０００５】
【化１】
2018519289.tif 000003
【０００６】
四級アンモニウム抗ムスカリン薬（ＱＡＡＭ）は、過度のアセチルコリン産生の期間に内因性のアセチルコリンに拮抗するその能力、あるいは生理学的および薬理学的な理由による長期的なアセチルコリン効果ゆえにとりわけ有用である。こうした化合物は、中枢神経系（ＣＮＳ）にあまり浸透しないという特性を共有しており、グリコピロレートと塩化トロスピウムは、抗ムスカリン受容体に対する周辺の抗コリン作用性効果を必要とする患者を治療する際にとりわけ有用であった。
【０００７】
ＣＮＳの分布を防ぐ際に有利である同じ生化学的な特性はさらに腸吸収を制限し、こうした薬物の現在入手可能な製剤を食物がない状態で摂取することを必要として、患者のバイオアベイラビリティを不完全かつ可変なものとする。
【発明の概要】
【０００８】
二相性反応条件は、臭化グリコピロニウムと、脂肪酸のアルカリおよびアルカリ土類金属塩との間で所望の対イオン交換反応を可能にする。グリコピロニウム部分の有機相（脂肪酸に加えて）への好ましい分割と、臭化物の水相への分割は、好ましくは水とメチルテトラヒドロフランを使用する。グリコピロニウム脂肪酸塩は反応条件下の加水分解に対して不安定であり、油状の生成物として単離するが、反応混合物中の過剰な脂肪酸はグリコピロニウム脂肪酸塩を安定させ、加水分解副産物の不純物、酸Ａの形成を減らす。
【０００９】
グリコピロニウム脂肪酸塩を製造する方法は好ましくはモル過剰な脂肪酸の使用を含む。いくつかの実施形態において、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成するために、少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。いくつかの好ましい実施形態では、０．２−１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。別の好ましい実施形態では、少なくとも０．６モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。さらに別の好ましい実施形態では、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成するために、０．６−１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が混合物に加えられる。別の実施形態では、およそ１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。別の実施形態では、少なくとも１．１モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。
【００１０】
過剰な遊離脂肪酸が本明細書に記載される製剤を安定させるので、これはグリコピロニウム部分のバイオアベイラビリティを増強させる結果をもたらすこともある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】臭化物ピークによる臭化グリコピロニウムのＨＰＬＣ較正曲線を示す。
【図２】「グリコピロニウム」ピークによる臭化グリコピロニウムのＨＰＬＣ較正曲線を示す。
【図３】臭化グリコピロニウムのステアリン酸カリウムとの交換反応のＨＰＬＣ結果を示す。
【図４】臭化グリコピロニウムのパルミチン酸カリウムとの交換反応のＨＰＬＣ結果を示す。
【図５】炭酸ジメチルを用いるグリコピロレート塩基のメチル化を示す。
【図６】グリコピロレート塩基のＨＰＬＣ較正曲線を示す。
【図７】グリコピロニウムステアラートＥＥ−００８−００８のＨＰＬＣデータを示す。
【図８】グリコピロニウムステアラートＥＥ−００８−００１−３ＢのＨＰＬＣデータを示す。
【図９】グリコピロニウムステアラートサンプルＥＥ−００８−００８のガスクロマトグラフィー・データを示す。
【図１０】グリコピロニウムステアラートサンプルＥＥ−００８−００１−３Ｂのガスクロマトグラフィー・データを示す。
【図１１】グリコピロニウムステアラートサンプルＥＥ−００８−００８のスペクトル全体のＮＭＲデータを示す。
【図１２Ａ】図１１のスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１２Ｂ】図１１のスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１２Ｃ】図１１のスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１３Ａ】副産物である酸Ａのスペクトル全体のＮＭＲデータを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａのスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａのスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１４Ａ】グリコピロニウム加水分解副産物である四級アミノアルコール（ＱＡＡ）、ＤＭＳＯ−ｄ６（４．７ｐｐｍ．ｓ）中の残留水のＮＭＲデータを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａのスペクトルの一部のＮＭＲデータを示す。
【図１４Ｃ】四級アミノアルコールの炭素ＮＭＲデータを示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｃのスペクトルの一部の炭素ＮＭＲデータを示す。
【図１５Ａ】グリコピロニウムラウレートのＨＰＬＣデータを示す。
【図１５Ｂ】領域パーセント報告書を添えた、図１５Ａのデータの拡大図を示す。
【図１５Ｃ】グリコピロニウムラウレート・サンプルの別の実行回のＨＰＬＣデータを示す。
【図１５Ｄ】領域パーセント報告書を添えた、図１５Ｃのデータの拡大図を示す。
【図１６Ａ】グリコピロニウムパルミタートのＨＰＬＣデータを示す。
【図１６Ｂ】領域パーセント報告書を添えた、図１６Ａのデータの拡大図を示す。
【図１６Ｃ】グリコピロニウムパルミタートサンプルの別の実行回のＨＰＬＣデータを示す。
【図１６Ｄ】領域パーセント報告書を添えた、図１６Ｃのデータの拡大図を示す。
【図１７Ａ】グリコピロニウムリノレートのＨＰＬＣデータを示す。
【図１７Ｂ】領域パーセント報告書を添えた、図１７Ａのデータの拡大図を示す。
【図１７Ｃ】グリコピロニウムリノレートサンプルの別の実行回のＨＰＬＣデータを示す。
【図１７Ｄ】領域パーセント報告書を添えた、図１７Ｃのデータの拡大図を示す。
【図１８】臭化グリコピロニウム、３．３３ｐｐｍ、一重項のＤＭＳＯ−ｄ６中の残留水のＮＭＲデータを示す。
【図１９】グリコピロニウムラウレートのＮＭＲデータを示す。
【図２０】グリコピロニウムパルミタートのＮＭＲデータを示す。
【図２１】グリコピロニウムリノレートのＮＭＲデータを示す。
【図２２】グリコピロニウム濃度対グリコピロニウムピーク面積を示す。
【図２３】ブランククロマトグラムを示す。
【図２４】分解溶液クロマトグラムを示す。
【図２５】臭化物標準のイオンクロマトグラフィー・データを示す。
【図２６】グリコピロニウムステアラート中の臭化物のイオンクロマトグラフィー・データを示す。
【図２７】グリコピロニウムステアラート中のカリウムのイオンクロマトグラフィー・データを示す。
【図２８】ステアリン酸の標準的なガスクロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。
【図２９】グリコピロレート・ステアラート中のステアリン酸分析のためのサンプルガス・クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
現在利用可能な四級アンモニウムコリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニスト組成物は、四級アンモニウムカチオンと無機アニオンを含んで塩として発生する。
【００１３】
「Ｕｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｂｅｉｎｇ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｄｅｌｉｒｉｕｍ」という表題で２０１２年１月１７日に発行されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ８，０９７，６３３と、「Ｎｅｗ  Ｕｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｂｅｉｎｇ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｄｅｌｉｒｉｕｍ」という表題で２０１２年４月１２日に公開されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１２／００８８７８５は、両方とも参照により本明細書に組み込まれるが、グリコピロレートまたはトロスピウムなどの四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニストを用いて、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の副作用を処置する方法を開示している。
【００１４】
「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｎｔｉｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  Ａｌｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」という表題で２０１５年３月３日に発行されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ８，９６９，４０２と、「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｎｔｉｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  Ａｌｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」という表題で２０１３年７月４日に公開されたＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１３／０１７２３９８は、両方とも参照により本明細書に組み込まれるが、認知障害あるいは急性せん妄のいずれかを処置するためにアセチルコリンエステラーゼ阻害薬と組み合わせて四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニストを投与することを開示している。この治療は、認知障害または疾患の修飾、すなわち、疾患進行を遅らせる。四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニスト向けの新しい製剤も開示される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニストは、塩のアニオン成分として有機的な親油性のアニオンを含む塩を含んでいる。いくつかの好ましい実施形態において、四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニストの親油性のアニオンは、少なくとも８つの炭素分子を含む脂肪酸を好ましくは含んでいる。いくつかの好ましい実施形態において、四級アンモニウム抗コリン作用性ムスカリン受容体アンタゴニストは、グリコピロレートまたはトロスピウムである。
【００１６】
四級アンモニウム抗ムスカリン薬（ＱＡＡＭ）は、過度のアセチルコリン産生の期間に内因性のアセチルコリンに拮抗するその能力、あるいは生理学的および薬理学的な理由による長期的なアセチルコリン効果ゆえにとりわけ有用である。こうした化合物は、中枢神経系（ＣＮＳ）にあまり浸透しないという特性を共有しており、臭化グリコピロニウムと塩化トロスピウムは、抗ムスカリン受容体に対する周辺の抗コリン作用性効果を必要とする患者を治療する際にとりわけ有用であった。
【００１７】
ＣＮＳの分布を防ぐ際に有利である同じ生化学的な特性はさらに腸吸収を制限し、こうした薬物の現在入手可能な製剤を食物がない状態で摂取することを必要として、患者のバイオアベイラビリティを不完全かつ可変なものとする。
【００１８】
グリコピロレート、トロスピウム、および他のＱＡＡＭの経口バイオアベイラビリティを増強することにより、食物を考慮することなく、ことによると他の薬物を考慮することなく、薬物の投与が可能となる。それはさらに、薬物の効果の被験体間のばらつきを減らし、薬物吸収時の胃腸運動の変動の影響を抑える。なぜなら患者間の変動の程度は薬物を吸収するのにかかる時間と正比例するからである。食物に近接して摂取できるようになることにより薬物を摂取することに対する患者の順守を改善させることもある。
【００１９】
ＱＡＡＭは塩のアニオン成分として親油性のアニオンを含んで生成される。構造活動分析（ＳＡＲ）は、最適な親油性のアニオンが少なくとも８つの炭素分子の脂肪酸になり、その結果、分子の疎水性の尾部は脂質溶解度を増強させて、イオン化されたカチオンのＱＡＡＭ分子の正電荷を中和するということを示唆している。いくつかの好ましい実施形態において、適切な塩は、媒体と、限定されないが、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、エルカ酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、カプリン酸、リノレン酸、あるいはミリスチン酸を含む長鎖脂肪酸とのファミリーに由来する。
【００２０】
ＱＡＡＭ（カチオン）と脂肪酸（アニオン）の塩は、「イオン取り替え」、「対イオン交換」、あるいは「塩の複分解」と呼ばれる有機化学反応により生成可能である。こうした反応では、現在の基本的な塩（グリコピロレート臭化水素酸塩、塩化トロスピウム）としてのＱＡＡＭ化合物は、α−リノレン酸などのω−３脂肪酸の基本的な塩を備えた二相性の水溶液中に入れられる。溶液を様々な温度、ｐＨ、および撹拌に晒すことで塩が得られ、塩は有機相へと選択的に抽出される。溶媒を取り除くために減圧下で抽出物を濃縮し、塩を単離して質的および量的に識別し、その後、化学量的に動物に投与する。定量的な血清および／または尿のアッセイを用いて、食物のある状態とない状態の両方でＱＡＡＭの基本的な塩と比較する。定量的な血清および／または尿のアッセイを用いたＱＡＡＭ（例：グリコピロレート）の静脈内投与を標準品として１００％のバイオアベイラビリティに使用することができ、天然の化合物と合成された塩の両方をこれと比較して、食物と他の一般に同時投与される薬物のある状態とない状態の相対的なバイオアベイラビリティを確立する。
【００２１】
上記のバイオアベイラビリティ研究に加えて、プロセスにおいてＱＡＡＭ分子の加水分解が行われないことを確かめるために、プロセス中に品質研究を行う必要がある。
【００２２】
合成された脂肪酸／ＱＡＡＭ塩は、病理学のプロセスによって生成されるにせよ、あるいは薬物の使用によって生成されるにせよ、ヒトと動物において過剰なアセチルコリン活性を伴う各種疾患（限定されないが、過活動性膀胱、流涎症、下痢、徐脈、多汗症、過活動性の胃液分泌、ダンピング症候群、気管支痙攣、血管運動性鼻炎を含む）の処置のための個々の生成物として有用である。増強されたバイオアベイラビリティのＱＡＡＭは中枢神経系に深刻な抗コリン作用性の毒性を引き起こすことなく、症状を改善することができはずである。増強されたバイオアベイラビリティにより、食物とは無関係の投与が可能となり、この生成物の経皮的な製剤が実用的になるレベルにまで経皮吸収を増強させることも可能になることがある。これはさらに、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、あるいはアセチルコリン緊張度を増加させる他の薬と組み合わせて使用可能である。
【００２３】
二相性反応条件によって、アルカリ金属とアルカリ土類金属の脂肪酸塩と臭化グリコピロニウムとの間の望ましい交換反応が可能となり、グリコピロニウム脂肪酸塩が生成され得る。グリコピロニウム部分の有機相への好ましい分割（脂肪酸とともに）と、臭化物の水相への分割は、水とメチルテトラヒドロフランを使用する。グリコピロニウム脂肪酸塩は反応条件下の加水分解に関して適度に不安定であり、油状の生成物として単離されるが、反応混合物中の過剰な脂肪酸はグリコピロニウム脂肪酸塩を安定させて、加水分解副産物、酸Ａと四級アンモニウム分解物（ＱＡＡ）の形成を減らす。
【００２４】
グリコピロニウム脂肪酸塩と過剰な遊離脂肪酸の混合物が互いから単離されることで、一貫したよく定義された生成物が得られることもある。本明細書に記載されるグリコピロニウム脂肪酸塩は潜在的に、グリコピロニウムのバイオアベイラビリティの望ましい増加をもたらす。過剰な遊離脂肪酸が本明細書に記載される製剤を安定させるので、これはグリコピロニウム部分のバイオアベイラビリティを増強させる結果をもたらすこともある。
【００２５】
親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩の調製のための実用的かつスケーラブルの合成プロセスが開発された。最初に、臭化グリコピロニウムと脂肪酸カリウム塩からの親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩の調製は、有機溶媒（無水条件）あるいは二相性（水／有機的）条件で行われた。なぜなら、これが適切な調製手順の識別に迅速に成功する機会を与えるものだったからである。出発物質と生成物の溶解性はこうしたオプションに影響を与え、二相性の（溶媒／水）系に対するアプローチを結果的に制限する。親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩の調製は主としてラウリン酸、パルミチン酸、リノール酸およびステアリン酸（ステアリン酸カリウム）を利用した。このプロセスは、脂肪酸のＮａ、ＫおよびＣａの塩を含む様々な塩を利用した。他の実施形態では、脂肪酸のＭｇまたはＢａの塩が使用される。
【００２６】
その評価は複数のステップを含んでいた。最初のステップはラウリン酸を用いる親油性の塩調製オプションのスクリーニングと評価であった。次のプロセス開発と分析法開発は、ステアリン酸を使用する調製物を使用して行われた。その後、ステアリン酸を用いる少なくとも５ｇの親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩が作成された。少なくとも３ｇの親油性のグリコピロニウム塩の３つの追加のおよび異なるサンプルを、追加の脂肪酸（パルミチン酸、ラウリン酸、リノール酸、およびステアリン酸−以下の表２３Ｂを参照）と合成させた。結果として生じる４つのサンプルをその後、特徴付けした。
【００２７】
グリコピロニウム脂肪酸塩のための分析方法も開発した。これらの方法は、将来のグリコピロニウム脂肪酸塩の開発サンプルの品質を適切かつ正確に評価する。グリコピロニウム脂肪酸塩の一般的な合成のさらに洗練されたプロセスも開発されている。
【００２８】
分析方法適用のいくつかは、限定されないが、無機臭化物塩（副産物）を取り除くために水による洗浄の最適な回数と量を決定することによって＞９５％の変換まで反応を確実に推し進めるための塩交換の有効性の評価、医薬品有効成分（ＡＰＩ）を安定させるために必要とされる最適な量の過剰な遊離脂肪酸の決定（モル当量の適切な範囲を評価する）、および、反応生成物の純度を評価することによる反応生成物の単離と精製（例えば、適切な溶媒／抗溶媒の組み合わせを用いる析出による）の改善を含む。いくつかの好ましい実施形態において、水による洗浄の最適な回数は３−４回の洗浄である。他の実施形態では、洗浄の好ましい回数は少なくとも３回の洗浄である。
【００２９】
分析方法の開発はさらに好ましくは、発色団の出発物質、生成物および分解物の定量化のための方法、弱または非発色団の出発物質と分解物（脂肪酸と派生した塩、ジメチルヒドロキシピロリジニウム分解物）の定量化のための方法、出発物質および生成物中の臭化物イオンの定量化のための方法、および生成物中のカリウム（あるいはナトリウム）イオンの定量化のための方法を含んでいる。個々に、これらの方法のいずれかだけでは塩交換プロセスの有効性と派生する生成物の純度とを評価するには十分ではないが、一体的に、こうした直交解析方法を組み合わせることで上記の目的が両方とも達成される。
【００３０】
本明細書全体にわたって使用されるいくつかの略語が表１に示され、化学構造が表２に示される。
【００３１】
【表１】
2018519289.tif 000004
【００３２】
【表２】
2018519289.tif 000005
【００３３】
標的とされた親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩１の一般的な化学構造が以下の表３Ａで示される。
【００３４】
【表３】
2018519289.tif 000006
【００３５】
Ｒ＝Ｃ１１Ｈ２３（ラウリン酸）
【００３６】
【化２】
2018519289.tif 000007
Ｒ＝Ｃ１７Ｈ３５（ステアリン酸）
【００３７】
【化３】
2018519289.tif 000008
Ｒ＝Ｃ１７Ｈ３３（オレイン酸）
【００３８】
【化４】
2018519289.tif 000009
Ｒ＝Ｃ１５Ｈ３１（パルミチン酸）
【００３９】
【化５】
2018519289.tif 000010
Ｒ＝Ｃ９Ｈ１９（カプリン酸）
【００４０】
【化６】
2018519289.tif 000011
Ｒ＝Ｃ１９Ｈ３１（アラキドン酸）
【００４１】
【化７】
2018519289.tif 000012
Ｒ＝Ｃ１９Ｈ３９（アラキジン酸）
【００４２】
【化８】
2018519289.tif 000013
Ｒ＝Ｃ２１Ｈ４１（エルカ酸）
【００４３】
【化９】
2018519289.tif 000014
Ｒ＝Ｃ１７Ｈ３１（リノール酸）
【００４４】
【化１０】
2018519289.tif 000015
Ｒ＝Ｃ１３Ｈ２７（ミリスチン酸）
【００４５】
【化１１】
2018519289.tif 000016
Ｒ＝Ｃ１７Ｈ２９（α−リノレン酸）
【００４６】
【化１２】
2018519289.tif 000017
Ｒ＝Ｃ１７Ｈ２９（γ−リノレン酸）
【００４７】
【化１３】
2018519289.tif 000018
【００４８】
以下の表３Ｂで示されるように、２つの好ましい出発物質（臭化グリコピロニウム２とグリコピロレート塩基３）があった。
【００４９】
【表４】
2018519289.tif 000019
【００５０】
グリコピロニウム塩の合成
脂肪酸のグリコピロニウム塩の実用的でスケーラブルな合成が開発された。脂肪酸のグリコピロニウム塩の一般的な化学構造は、表３Ａでは化合物１として示されている。臭化グリコピロニウム（「グリコピロレート」としても知られる表３Ｂの化合物２）から、あるいはグリコピロレート塩基（表３Ｂの化合物３）として本明細書で指定された合成前駆体から出発する、３つの異なるアプローチが検討された。３つのアプローチは、ａ）臭化グリコピロニウム（表３Ｂの化合物２）から出発する、イオン交換樹脂を使用する塩複分解、ｂ）臭化グリコピロニウム（表３Ｂの化合物２）から出発する、直接の塩複分解、および、ｃ）出発物質としてグリコピロレート塩基（表３Ｂの化合物３）を使用する、グリコピロニウムメチル炭酸塩による合成であった。
【００５１】
水／Ｍｅ−ＴＨＦ系において脂肪酸塩と臭化グリコピロニウムを用いる調製物へ少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を加えることによって、反応混合物を安定させ、グリコピロニウム脂肪酸塩の形成が可能となった。
【００５２】
本明細書に定義されるような「遊離脂肪酸」とはその遊離型の脂肪酸であり、その電離型（塩形態）の脂肪酸とは異なる。
【００５３】
好ましい実施形態では、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成するために、少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸の反応混合物が加えられる。いくつかの好ましい実施形態では、０．２−１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。別の好ましい実施形態では、少なくとも０．６モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。さらに別の好ましい実施形態では、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成するために、０．６−１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が混合物に加えられる。別の実施形態では、およそ１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。別の実施形態では、少なくとも１．１モル当量の過剰な遊離脂肪酸が反応混合物に加えられる。
【００５４】
好ましい実施形態では、単離されたグリコピロニウム脂肪酸塩混合物は、投入比率と比較して（グリコピロニウムに対して）脂肪酸が豊富である。１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を使用する実施形態では、単離された生成物は好ましくは２．２：１を超えるＦＡ：ＧＰ投入比率を有する。これらの実施形態のいくつかでは、比率はおよそ２．２５：１−３．００：１の間である。これらの実施形態のいくつかでは、比率はおよそ２．２９：１−２．８７：１の間である。
【００５５】
一例において、カリウム・ラウレートとの臭化グリコピロニウムの反応混合物は、過剰な遊離ラウリン酸を加えることにより、副産物（酸Ａ）の形成に関して安定している。いくつかの好ましい脂肪酸としては、限定されないが、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、エルカ酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、カプリン酸、リノレン酸、あるいはミリスチン酸が挙げられる。脂肪酸塩のためのいくつかの好ましい塩としては、限定されないが、Ｎａ、Ｋ、あるいはＣａの塩が挙げられる。他の実施形態では、ＭｇまたはＢａの塩が使用されてもよい。
【００５６】
本明細書に記載されるように、過剰な遊離脂肪酸は使用される臭化グリコピロニウムおよび脂肪酸塩に関連する。例えば、カリウムを用いるラウリン酸反応の場合、それは、使用される臭化グリコピロニウムとラウリン酸カリウムに関して過剰な遊離ラウリン酸である。
【００５７】
過剰な遊離脂肪酸は反応混合物を安定させる。大過剰の遊離脂肪酸（０．６−１．２モル過剰）は二相分離を改善し、有機抽出物溶液の安定性を改善し、単離した生成物の安定性を改善した。
【００５８】
一貫した十分に定義された生成物を保証するためにグリコピロニウム脂肪酸塩と過剰な遊離脂肪酸の混合物を単離する可能性はある。
【００５９】
イオン交換
初めから、イオン交換樹脂を使用する合成手法には、ｐＨ５．６を超えるｐＨ値での臭化グリコピロニウムの既知の加水分解の不安定性（例えば、Ｇ  Ｇｕｐｔａ，  Ｖ．Ｄ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｙｒｒｏｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｏｗｄｅｒ”，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ，  ２００３，  ７（５），  ３８６−３８８を参照。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）と、必要とされる技術の複雑さおよびコストとによって、課題が山積していた。臭化グリコピロニウムの水溶液はｐＨ５．６以下の周囲温度で合理的に安定しているが、臭化グリコピロニウムは、樹脂を使用する塩交換プロセスで要求されるｐＨ値でのエステル結合において急速に加水分解することが予想される。
【００６０】
市販の臭化グリコピロニウム（表３Ｂの構造２）から出発して、対応する脂肪酸塩（表３Ａの構造１）は、原則としてアニオンのイオン交換樹脂の使用に由来することがある。表４はイオン交換のフローチャートを提供しており、イオン交換がどのように遂行され得るかという概略を示している。
【００６１】
【表５】
2018519289.tif 000020
【００６２】
しかしながら、樹脂を使用するイオン交換手法は、標準的な合成方法を超える専門知識を必要とする。適切な樹脂の選択に加えて、このプロセスの有効性を最大限にするために多くのパラメーターを慎重に選択する必要がある。イオン交換において吸脱着等温線に影響を与える因子としては、限定されないが、基質対樹脂の相対的な比率、溶媒系（溶出剤）、温度および基質濃度が挙げられる。樹脂と脂肪酸骨格との間の疎水的相互作用は、結合効率（極性基の静電気引力に加えて）において同様に重要な役割を果たすことがある。このため、樹脂の選択自体が重要な考慮の対象であることもある（例えば、Ｉｈａｒａ，  Ｙ．  “Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ  ｏｎ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８６，  ３２（６），  ５６６５−５６６７を参照。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｉｈａｒａでは、ポリマー中の疎水性のフェニル基を含む弱塩基性樹脂（ＩＲＡ９４）は、疎水性のより弱い樹脂（ＩＲＡ６８）よりも優れたパフォーマンスを示した。脂肪酸ナトリウム塩の吸着効率は、Ｃ−６からＣ−１２の脂肪酸塩に行く際に劇的に増加した。
【００６３】
イオン交換方法に係るさらなる問題は、エステル加水分解による水溶液中の高いｐＨのグリコピロレートの不安定性である。この化合物は、ｐＨ５．６以下の周囲温度で合理的に安定している（Ｇｕｐｔａ  ２００３）が、（ｐＨ値がｐＨ５．６よりも実質的に高くなるにつれて）処理条件下でエステルの加水分解に弱いと予想される。
【００６４】
他の２つのアプローチが親油性のグリコピロニウム脂肪酸塩の調製について評価された。
【００６５】
ラウリン酸は初期の作業のためのモデル脂肪酸として選択された。ラウリン酸カリウムの臭化グリコピロニウムの交換反応は様々な溶媒系でスクリーニングされた。
【００６６】
最良の溶媒系は、所望の生成物であるグリコピロニウムラウレートをもたらした、水／メチルテトラヒドロフラン（ＭｅＴＨＦ）であった。残念ながら、単離した油状の生成物は不安定であり、副産物である酸Ａへ分解された。炭酸ジメチルを用いるグリコピロレート塩基のメチル化の試みからの分解生成物（酸Ａと酸Ａのメチルエステルを含む）が表５に示される。
【００６７】
【表６】
2018519289.tif 000021
【００６８】
標的の塩の安定性を改善し、かつ固形形態の標的材料を得ようとする試みの中で、ステアリン酸カリウムとパルミチン酸カリウムもＭｅＴＨＦ／水系において調査した。このような反応は固形の生成物を作り出すことに失敗し、プロセス中に酸Ａに対する部分的な加水分解を示した。
【００６９】
直接の塩複分解（対イオン交換）
脂肪酸塩を用いる臭化グリコピロニウムの反応は、有機溶媒（無水条件）と二相性（水／有機的）の条件で行われた。有機溶媒中の反応はいかなる生成物の形成ももたらさなかったが、二相性の条件を使用することで反応混合物中の所望の生成物が得られた。このプロセスの化学反応は以下のように示される：
【００７０】
【化１４】
2018519289.tif 000022
このプロセスでの化学反応の一例は以下のように示される：
【００７１】
【化１５】
2018519289.tif 000023
【００７２】
臭化グリコピロニウムと代表的な脂肪酸のナトリウム塩またはカリウム塩との間の、抽出するプロセスを使用する直接の塩複分解（「イオン交換」）の開発が成功した。このプロセスでは、脂肪酸のカルボキシラート共役塩基を用いる臭化物交換に由来する水溶性の無機塩を水相で分割し、反応媒体から取り除くことで、交換プロセスを推進する。
【００７３】
その後、臭化グリコピロニウムと適切な脂肪酸塩との間の直接の対イオン交換が評価された。典型的な塩複分解反応の推進力は溶液から析出する不溶性塩の生成である。脂肪酸塩の場合には、最も有望な出発物質は対応する銀塩となる。例えば、２０１１年１２月１５日に公開され、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１１／０３０６６５０を参照する。当該文献は、グリコピロニウム酢酸塩（臭化銀が析出する）を生成するために、臭化グリコピロニウムを酢酸銀と反応させることによる、グリコピロニウム塩化物の調製を記載している。その後、グリコピロニウム塩化物（酢酸とともに）を生成するために、酢酸塩塩をＨＣｌと反応させる。グリコピロニウム硫酸塩は、硫酸銀を使用する塩複分解によって同様に生成される。このような出発物質は、望ましいグリコピロニウム脂肪酸塩から完全に除去することが困難であることが予想され、かつ析出した銀塩に対する（好ましくは金属回復による）大規模な特別な廃棄物投棄の考慮を必要とすることから、薬物原料中の重金属残留物に対する懸念があるため望ましいものではなかった。
【００７４】
それにもかかわらず、ナトリウム、カリウム、あるいはカルシウムなどの無害な金属の脂肪酸塩と組み合わせた適切な溶媒の選択は、派生した臭化物塩（臭化ナトリウム、臭化カリウム、あるいは臭化カルシウム）の沈澱反応を介した対イオン交換の評価のために考慮された。代替的に、高溶解性の無機塩を水相へと抽出することにより、対イオン交換反応を推し進めることができる。
【００７５】
反応溶媒を選択するために、様々な溶媒中の臭化グリコピロニウム（ＧＰＢｒ−表３Ｂの構造２）の溶解性は、ＨＰＬＣ較正曲線を使用して決定された（図１と２を参照）。室温の様々な溶媒中での臭化グリコピロニウム溶解性の結果が以下の表６にまとめられている。実験は、ほとんどの場合、５０ｍｇの臭化グリコピロニウムと１ｍＬの溶媒で行われた。混合物を２４時間室温で撹拌して、その後、ろ過して透明なろ液を得た。ろ液をアセトニトリルで稀釈して、ＨＰＬＣによってチェックした。
【００７６】
【表７】
2018519289.tif 000024
【００７７】
３つのラウリン酸塩（Ｎａ、Ｋ、およびＣａ）をモデル塩として調製した。
【００７８】
これらの塩は、Ｚａｃｈａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ（「Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌ  Ｓａｌｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ」，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００９，１３，５８１−５８３）中の手順に従って調製された。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
ラウリン酸ナトリウムの調製
ラウリン酸（５０．０８ｇ、１．０当量）を室温においてエタノール（５００ｍＬ、１０ｖｏｌ．，９５％変性）中に溶かし、還流温度においてエタノール（５００ｍＬ、１０ｖｏｌ．９５％変性）中でＮａＨＣＯ３（１８．９ｇ、０．９当量）と反応させた。反応混合物（懸濁液）は、温度（〜７７°Ｃ）の還流で夜通し撹拌された。いくつかの固体が一晩で析出し（文献で報告された溶液に対して）、混合物を追加のエタノール（〜１．５Ｌ）で稀釈した。溶液をデカントして４時間かけて室温に冷ました（固形の生成物は〜５５°Ｃで析出した）。スラリーをろ過して、生成物をＭＴＢＥ（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄することで、過剰な未反応の遊離ラウリン酸を取り除いた。白いウェットケーキを週末にかけて大気中で、および５０±５°Ｃで一晩中乾燥させることで、２７．２ｇの白色固形物（５４．４％の収率）を得た。収率は先行技術の文献にあるよりも低いが、収率をより良くするために手順を最適化することができる。収率を改善するいくつかの方法としては、限定されないが、晶析工程の間に濃度を最適化すること、あるいは、生成物の溶解性を減少させて収率を改善するために抗溶媒を使用することが挙げられる。
【００８０】
ラウリン酸カリウムの調製
第２の実験は、還流でエタノール（２５０ｍＬ）中の２５ｇのラウリン酸（１．０当量）と１１．２５ｇのＫＨＣＯ３（０．９当量）を用いて行われた。週末にかけて大気中で、および５０±５°Ｃにおいて真空オーブン中で一晩生成物を乾燥させた後に、生成物をエタノール／ＭＴＢＥ（１／１）から結晶化することで、２２．１ｇのラウリン酸カリウム（８２．５％の収率）を得た。
【００８１】
反応溶媒とその最適化された量を選択するために、様々な溶媒中のラウリン酸カリウムの溶解性は、超音波処理下で固体を溶かすための溶媒を加えることによってチェックされた。バイアルをラウリン酸カリウム（〜１００ｍｇ）で充填し、その後、溶媒を超音波処理下において液滴で加えた。ほとんどの溶媒（２００ｖｏｌ．）ではラウリン酸カリウムを溶かすことができない。様々な溶媒中のラウリン酸カリウム溶解性の結果を以下の表７にまとめる：
【００８２】
【表８】
2018519289.tif 000025
【００８３】
ラウリン酸カルシウムの調製
第３の実験は、４時間にわたって還流でエタノール（４５０ｍＬ）中の１５．６ｇのラウリン酸（１．０当量）と２．６ｇのＣａ（ＯＨ）２（０．９当量）を用いて行われた。生成物は還流温度で析出した。反応混合物は還流温度でメタノール（５００ｍＬ）を用いてさらに稀釈された。スラリーを室温に冷まして、ろ過し、その後、ＭＴＢＥ洗浄剤ですすいだ。固形物を夜通し大気中で、かつ５０±５°Ｃにおいて真空オーブン中で一晩乾燥させることで、１０．４ｇの白色固形物（６７．７％の収率）を得た。収率を増加させるために手順を最適化することができる。収率を改善するいくつかの方法としては、限定されないが、晶析工程の間に濃度を最適化すること、あるいは、生成物の溶解性を減少させて収率を改善するために抗溶媒を使用することが挙げられる。
【００８４】
有機溶媒中の反応
溶媒としてアセトン、メタノール、及びジクロロメタンと組み合わせて、ラウリン酸カリウム、ラウリン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウム、及びパルミチン酸カリウムを使用して、析出による塩複分解を試みた。
【００８５】
ラウリン酸カリウムを、この手法のために脂肪酸塩モデルとして選択した。最初に試みた反応を、無水アセトン中で行った。臭化グリコピロニウム（０．５０８ｇ、１．０当量）を２５０ｍＬのフラスコに加え、その後アセトン（５０ｍＬ）を加えた。ラウリン酸カリウム（１．１当量）を混合物に加えた。混合物を撹拌し、追加のアセトン（１００ｍＬ）を加えて、固形物の溶解を試みた。固形物は完全に溶解しなかった。混合物を一晩撹拌し、次いで濃縮して、残留物を得た。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、１００ｍＬ）を使用して、粗製残留物を抽出した。抽出物を濃縮し、わずか４８ｍｇの油状の残留物（１０％  ｗｔ未満の回復）を得た。残留物のＨＰＬＣ分析は、様々なピークが存在したことを示した。プロトンＮＭＲ分析は、複合混合物の獲得を示した。
【００８６】
おそらく共に低溶解度の臭化グリコピロニウムとラウリン酸カリウムが原因で、この反応により所望の生成物をもたらすことはできなかった。
【００８７】
両方の出発化合物はメタノール中で可溶性であるため、次の反応をメタノール中で試みた。臭化グリコピロニウム（１．０３６ｇ、１．０当量）を２０ｍＬのバイアルに加え、その後メタノール（５ｍＬ）を加えて、全ての固形物を溶解した。メタノール中のラウリン酸カリウム溶液（０．６９１ｇ、１．１当量、メタノールの１０ｍＬ）を、混合物に加えた。混合物を周囲温度で週末にかけて撹拌し、次いでＨＰＬＣにより溶液を確認し、これにより新たなピーク（ＲＲＴ＝１．３７）が〜４７％  ＨＰＬＣ  ＡＵＣで形成されたことが示された。溶液を濃縮してメタノールを取り除き、次いでＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を組み合わせて濃縮することで、油状の残留物（０．８ｇ）を得た。ＨＰＬＣ分析は、新たなピークが６１％のＡＵＣに豊富化されたことを示した。プロトンＮＭＲ分析は、３．７７ｐｐｍでメチルエステルのピークが形成されたことを示した。この副産物のために提唱された構造は以下の通りである：
【００８８】
【化１６】
2018519289.tif 000026
【００８９】
ＥｔＯＡｃ抽出後に残る固形物（０．８７ｇ）をＨＰＬＣにより確認し、それにより主要なピークはＡＵＣが〜９１％である「臭化物」であったことが示された。しかし、プロトンのＮＭＲ分析は、固形物が、以下の表８に列挙された少なくとも３つの可能な化合物の混合物であったことを示唆した。
【００９０】
【表９】
2018519289.tif 000027
【００９１】
グリコピロニウム脂肪酸塩は、メタノール反応混合物中では不安定であった。しかし、出発物質である臭化グリコピロニウム（表３Ｂの構造２）は、他の成分が無い状態でもメタノール中で安定していることを確認した。
【００９２】
無水条件下での交換反応を調査するために、４つの脂肪酸塩（ラウリン酸カリウム、ラウリン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウム、及びパルミチン酸カリウム）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で反応物を懸濁し、そして室温で９０時間撹拌することにより試験した。臭化カリウム（又は臭化ナトリウム）の析出は、濾過されたＤＣＭ溶液のＨＰＬＣ分析において臭化物のピークに比べてグリコピロニウムのピークの豊富化をもたらすと予測された。反応混合物（ＤＣＭ、１．０ｍＬ）をシリンジフィルターに通して濾過し、濃縮し、結果として生じる固形残留物を移動相に溶解し、ＨＰＬＣにより分析した。無水ＤＣＭ系における交換反応のＨＰＬＣの結果を、以下の表９に示す。
【００９３】
【表１０】
2018519289.tif 000028
【００９４】
臭化物／グリコピロニウムの比率は、臭化物に比べてグリコピロニウムの豊富化が生じなかったことを明確に示した。ラウリン酸カリウム、ラウリン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウム、又はパルミチン酸カリウムと共に無水条件（ＤＣＭ）を使用しても、所望の生成物は観察されなかった。
【００９５】
溶解度の問題（アセトン中の低溶解度の臭化グリコピロニウム）、不安定性（メタノール中のエステル交換反応）、及び不十分な溶解度の差異（ジクロロメタン中）が原因で、試みは全て成功しなかった。
【００９６】
二相性条件における反応
交換プロセスが二相性溶媒混合物中で達成される代替的な手法が、より上手くいった。選択的抽出による対イオン交換を、表１０に示す。
【００９７】
【表１１】
2018519289.tif 000029
【００９８】
次の６つの溶媒を、抽出手順において評価した：２−メチルテトラヒドロフラン（ＭｅＴＨＦ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、酢酸イソプロピル（ＩＰＡｃ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、トルエン、及びジクロロメタン（ＤＣＭ）。脂肪酸塩モデルとしてラウリン酸ナトリウムを使用して、ＭｅＴＨＦを、グリコピロニウムラウレート中で非常に豊富化された有機相をもたらす最良の溶媒であると判定した。
【００９９】
ラウリン酸カリウム、パルミチン酸カリウム、及びステアリン酸カリウムを使用した追加実験により、この方法論の一般性を実証した。反応生成物を、プロトンのＮＭＲ分析により特徴化し、脂肪酸塩と一致していると確認した。進行的なＨＰＬＣ方法を使用したＨＰＬＣ分析は、ＭｅＴＨＦ抽出物の３−４回の水による洗浄後に最大９６％の面積／面積の豊富化を示した。
【０１００】
加水分解の副反応は、現行の（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）ｐＨ（８．０−８．３）での対イオン交換プロセスにおいて著しい問題であると観察された。この問題は、培地を「緩衝化し」且つ加水分解反応を最小限にするために過剰な遊離脂肪酸を使用することにより、及び、周囲温度で物質の交換及び更なる処理を行うことにより解決された。
【０１０１】
両方の出発化合物は水中で非常に可溶性であるため、反応を水／ＭｅＬ−ＴＨＦの中で試みた。臭化グリコピロニウム（表３Ｂの構造３）（１．０当量）を２０ｍＬのバイアルに加え、その後水（２ｍＬ）を加えて、全ての固形物を溶解した。臭化グリコピロニウム溶液を、２０ｍＬのバイアルにおいて水中のラウリン酸カリウムの溶液（１．１当量、５ｍＬの水）に移した。臭化グリコピロニウムのバイアルを水（３×１ｍＬ）ですすぎ、すすぎ液を反応バイアルに移した。ＨＰＬＣ分析は、「グリコピロニウム」のピークに対する「臭化物」のピークの面積比が２０／８０であったことを示した。Ｍｅ−ＴＨＦ（１０ｍＬ）を反応溶液に加えた。混合物を１時間撹拌し、次いで相分離のために沈殿させた。両方の層をＨＰＬＣにより確認し、「グリコピロニウム」のピークに対する「臭化物」のピークの面積比が２つの層（ＸＬ−００７−０７１−１とＸＬ−００７−０７１−２、以下の表１１）の間で著しく異なっていたことを見出した。その後、反応混合物を１時間再混合し、次いで１時間沈殿させて、２つの層（ＸＬ−００７−０７１−３とＸＬ−００７−０７１−４）を得た。ＨＰＬＣ分析は、２つのピークの比率が不変だったことを示した。結果として、より多くの「臭化物」が水層に含まれており、「グリコピロニウム」がＭｅ−ＴＨＦ層へと抽出されたことが示された。水層を取り除き、真水と置き換え、混合し、次いで沈殿させることで、２つの層（ＸＬ−００７−０７１−５とＸＬ−００７−０７１−６）を得た。ＨＰＬＣ分析は、Ｍｅ−ＴＨＦ層が９３面積％の「グリコピロニウム」を含んでいたことを示した。Ｍｅ−ＴＨＦ層を水で更に２回洗浄し、Ｍｅ−ＴＨＦ層中の生成物を９６面積％（ＸＬ−００７−０７１−１０）にまで豊富化した。反応混合物の水層及び有機層のＨＰＬＣの結果を表１１に示す。
【０１０２】
【表１２】
2018519289.tif 000030
【０１０３】
洗浄されたＭｅ−ＴＨＦ層の１つのアリコートサンプル（ＸＬ−００７−０７１−１０）を得て、濃縮することで油を得て、これを出発物質との比較のために異なる溶媒（ＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯ−ｄ６、及びＤ２Ｏ）においてプロトンＮＭＲにより分析した。プロトンＮＭＲスペクトルは、所望の生成物の予測されたスペクトルと一致していた：
【０１０４】
【化１７】
2018519289.tif 000031
【０１０５】
選択的な溶解度、及び、水層と溶媒層との間での臭化物及び脂肪酸塩の分割を改善するために、ラウリン酸ナトリウムとの臭化グリコピロニウム（表３Ｂの構造２）の反応を、水と共に以下の６つの溶媒においてスクリーニングした：メチルテトラヒドロフラン（Ｍｅ−ＴＨＦ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、酢酸イソプロピル（ＩＰＡｃ）、４−メチル−２−ペンタノン（ＭＩＢＫ）、トルエン、及びジクロロメタン（ＤＣＭ）。
【０１０６】
室温で、水７ｍＬと有機溶媒７ｍＬと共に臭化グリコピロニウム（１００ｍｇ、１．０当量）とラウリン酸ナトリウム（６１ｍｇ、１．１当量）をもって、反応を行った。反応混合物を４日かけて撹拌し、次いで沈殿させた。両方の層をＨＰＬＣにより確認し、ラウリン酸ナトリウム／臭化グリコピロニウムの交換の分析結果を、以下の表１２に要約する：
【０１０７】
【表１３】
2018519289.tif 000032
【０１０８】
これら６つの実験から、Ｍｅ−ＴＨＦは選択的な生成物の分割と抽出のために最良の溶媒であった。残念ながら、分解生成物（酸Ａ、ＲＲＴ＝０．７４）を、有機質層と水層の両方で観察した。
【０１０９】
【化１８】
2018519289.tif 000033
【０１１０】
Ｍｅ−ＴＨＦを、溶媒のスクリーニングの結果に基づく更なる調査のために選択した。ラウリン酸カリウムとＭｅ−ＴＨＦを使用した反応を、室温で水２５ｍＬとメチルＴＨＦ５３ｍＬにおいて、ラウリン酸カリウム（３．０７ｇ、１．０５当量）と共に４．８９ｇの臭化グリコピロニウムにまでスケールアップした（ｓｃａｌｅｄ  ｕｐ）。混合物を１時間撹拌し、次いで相分離のために沈殿させた。３つの層を形成し、各々をＨＰＬＣにより確認し、水／Ｍｅ−ＴＨＦにおけるスケールアップ反応の結果を、表１３に要約する。追加のピーク（ｔＲ＝５．２９ｍｉｎ、ＲＲＴ＝０．７４）の検出、及びこのピークが経時的に増大したことを確認した。このピークは、副産物である酸Ａの別個の調製及び分離との比較により、酸Ａであることを確認した。酸Ａである、グリコピロレート塩基の加水分解生成物（表３Ｂの構造３）を分離し、ＨＰＬＣとＮＭＲ（１Ｈと１３Ｃ）により特徴化した。
【０１１１】
下層（水性）を取り除き、上の２つの層を水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。最初の相分離後に２つの層のみが形成されたことを観察した。最終的な有機質層（ＸＬ−００７−０８０−４Ａ）を、ロータリーエバポレーター上で６０℃で濃縮し、残留物を得て、これをメチルＴＨＦ（１００ｍＬ）で再溶解した。不溶性固形物（ＫＢｒ及びラウリン酸カリウム）を濾過し、水で溶解し、次いでＨＰＬＣ（ＸＬ−００７−０８０−Ｐ１）により確認した。濾液を濃縮し乾燥することで油（６．１２ｇ、ＸＬ−００７−０８０−Ｐ２）を得て、ＨＰＬＣ分析は、臭化物ピークが１．３４面積％に減少したことを示した。生成物を週末にかけて５０℃で、真空オーブンの中で乾燥させた。乾燥した生成物のＮＭＲ分析は、幾つかの分解を示した。乾燥した油状の生成物をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で溶解し、ｎ−ヘプタンの追加により析出を試み、その結果２つの液体層を得た。両方の層をＨＰＬＣ（上層：ＸＬ−００７−０８２−１、及び下層：ＸＬ−００７−０８２−２）により確認し、高レベルの副産物である酸Ａを示した。
【０１１２】
【表１４】
2018519289.tif 000034
【０１１３】
分離した油状の生成物が部分的に分解したことを確認した。最も可能性が高いことに、この分解は、高温及び高ｐＨで促進される加水分解反応と一致している。提唱された分解反応の模式図を以下に示す：
【０１１４】
【化１９】
2018519289.tif 000035
【０１１５】
（「ＵＶ不活性」と標識化される、本明細書中の全ての意図と目的のために）強い発色団を備えた成分、及び弱い発色団を備えた他の成分を含んでいた、反応混合物の性質は、混合物中の全ての成分の正確な分析と定量化を、非常に困難なものにした。この理由により、直交的且つ相補的な分析法は、反応の製造過程の分析、及び、分離した反応生成物の純度と組成の両方の評価を、共に促進するように進行された。
【０１１６】
所望の生成物であるグリコピロニウムラウレートを、臭化グリコピロニウムとラウリン酸カリウムの水溶液からのＭｅ−ＴＨＦ抽出により分離した。残念なことに、分離した生成物は分離プロセス中では不安定であり、酸Ａのレベルは経時的に増大した。分離した生成物は週末にかけて、〜９４面積％から８３−８６面積％まで、５０℃で分解した。臭化グリコピロニウム自体は、（ＨＰＬＣにより）２週間にわたり周囲温度で、ＨＰＬＣ希釈剤溶液（ＡＣＮ／水）の中で安定していた。
【０１１７】
グリコピロニウムラウレートの調製を５．０ｇの規模（ＧＰＢｒ）で繰り返した。水／ＭＥ−ＴＨＦ中で繰り返されたスケールアップ反応のＨＰＬＣ結果を、以下の表１４に要約する。ＨＰＬＣにより、分解生成物である酸Ａはワークアップ及び分離の間に形成されたことを確認した。
【０１１８】
【表１５】
2018519289.tif 000036
【０１１９】
過剰な遊離ラウリン酸を加えて、及びそれを加えることなく、週末にわたり室温及び５０℃で、Ｍｅ−ＴＨＦ溶液のストレス試験を行った。ストレス試験の結果を表１５に列挙する。室温の溶液は加熱したサンプルよりもはるかに少ない分解を示したが、分解は未だに著しいものであった。過剰な遊離ラウリン酸で生成物を安定させる試みの結果、過剰な遊離ラウリン酸無しの対応するサンプルにおいて観察されたほど分解は生じなかった。Ｍｅ−ＴＨＦ溶液は、５０℃で２層に分かれたことに注意されたい。これは恐らく、加熱後に混合物中の水の溶解限度の減少によるものであった。
【０１２０】
過剰な遊離ラウリン酸が無い状態では、生成物はＭｅ−ＴＨＦ溶液において、９０．６７面積％から８７．７２面積％の生成物含有量へと周囲温度でゆっくり分解された。５０℃で生成物は、上層では５７面積％にしか分解せず、及び下層では〜５０％に著しく分解した。周囲温度での過剰な遊離ラウリン酸の存在下で、生成物は僅かな分解しか示さなかった一方（実験２Ａ）、５０℃で生成物は、過剰な遊離ラウリン酸が存在していても分解し、〜６５−７０面積％のみを残した。
【０１２１】
【表１６】
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【０１２２】
Ｍｅ−ＴＨＦ中の所望の生成物は経時的に分解した（ｄｅｇｒａｄｅｄ）。生成物は５０℃で著しく速く分解した。過剰な遊離ラウリン酸（およそ１．０モル当量の過剰）の存在で、生成物の分解は特に周囲温度ではより遅くなった。
【０１２３】
臭化グリコピロニウムとラウリン酸カリウムの水溶液のＭｅ−ＴＨＦ抽出により所望の生成物を生成したが、所望の生成物は室温での抽出プロセス中は不安定であった。観察された分解生成物を、独立した調製と分離により、加水分解生成物（酸Ａ）であると確認した。生成物は５０℃で著しく速く分解したことを確認した。分離された粗製生成物は油性であり、ヘプタン及び他の溶媒（ＭＴＢＥ、ＩＰＡｃ、及びＥｔＯＡｃ）からは析出しなかった。
【０１２４】
ラウリン酸カリウムから得た油状の生成物が不安定であったため、より長い鎖を持つ脂肪酸を試験することで、潜在的に改善された安定性を持つ固形生成物を得ようと試みた。
【０１２５】
ステアリン酸カリウムとパルミチン酸カリウムを調製し、Ｍｅ−ＴＨＦ／水の系において臭化グリコピロニウムで試験した。ステアリン酸とパルミチン酸をカリウム塩として使用した。ステアリン酸カリウムとパルミチン酸カリウムの調製を、以下に要約されるＺａｃｈａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（“Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌ  Ｓａｌｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ”，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００９，  １３，  ５８１−５８３）の手順に従い行った。
【０１２６】
ステアリン酸カリウムの調製のために、ステアリン酸（２５．０ｇ、１．０当量）を、２Ｌの丸底フラスコ中４５℃で、エタノール（５００ｍＬ、２０ｖｏｌ．、９５％変性）に溶解した。ＫＨＣＯ３（７．８８ｇ、０．９当量）を溶液に加え、次いで反応混合物を加熱還流（〜７７℃）した。反応物を還流で一晩（２１時間）撹拌した。ＭＴＢＥ（５００ｍＬ）を６５℃で溶液に加えた。幾つか気泡が生じ、この気泡を壊すために激しい撹拌を必要とした。その後、ＭＴＢＥ（５００ｍＬ）の第２部分を５０℃で加え、結果として生じるスラリーをおよそ３時間にわたり室温に冷却した。スラリーを濾過し、ウェットケーキをＭＴＢＥ（３×１２５ｍＬ）で洗浄した。白色のウェットケーキを、〜５０℃で真空オーブン中で一晩乾燥させて、白色固形物生成物（２５．４ｇ、定量的収率）を得た。
【０１２７】
パルミチン酸カリウムの調製のために、パルミチン酸（１５．０ｇ、１．０当量）を、１Ｌの丸底フラスコ中４０℃で、エタノール（２００ｍＬ、９５％変性）に溶解した。固形ＫＨＣＯ３（５．２７ｇ、０．９当量）を溶液に加え、次いで反応混合物を加熱還流（〜７７℃）した。反応物を還流で一晩（２０時間）撹拌した。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を６５℃で溶液に加え、固形生成物を析出させた。その後、ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）の第２部分を加え、結果として生じるスラリーをおよそ３時間にわたり室温に冷却した。スラリーを濾過し、ウェットケーキをＭＴＢＥ（３×１００ｍＬ）で洗浄した。白色のウェットケーキを、〜５０℃で真空オーブン中で一晩乾燥させて、白色固形物生成物（１４．７ｇ、９４．８％の収率）を得た。
【０１２８】
Ｍｅ−ＴＨＦ／水において臭化グリコピロニウムと共に脂肪酸塩を溶解し、室温で５．０時間撹拌し、次いで相を分離し、水で有機相を洗浄することより、交換反応を行った。Ｍｅ−ＴＨＦ層と水層の両方のＨＰＬＣ分析結果を、図３（ステアリン酸カリウム）と図４（パルミチン酸カリウム）に示す。ステアリン酸カリウムとパルミチン酸カリウムの交換反応は、酸Ａの不純物が無い所望の生成物をもたらさなかった。抽出物の濃縮後、両方の反応は、分離が困難な粘着性で油性の残留物をもたらした。何れも、ラウリン酸カリウムからの結果に対する利点をもたらさなかった。
【０１２９】
過剰な遊離脂肪酸の添加による交換反応の安定化
グリコピロニウムラウレート生成物を安定させ、且つ酸Ａへのグリコピロニウムの分解を回避する試みにおいて、Ｍｅ−ＴＨＦ／水の反応系を、過剰な遊離ラウリン酸（臭化グリコピロニウムに対して１．１モル当量の過剰）で試験した。室温で一晩、水（５ｍＬ）中の臭化グリコピロニウム（１．０４ｇ、１．０当量）及び水（５ｍＬ）中のラウリン酸カリウム（１．１当量）の２つの溶液を、過剰なラウリン酸（１．１当量）を含む及び含んでいないＭｅ−ＴＨＦ（２０ｍＬ）と混合することにより、過剰な遊離ラウリン酸有り及び無しの２つの実験を行った。各反応のために、両方の層をＨＰＬＣにより確認し、過剰な遊離ラウリン酸との交換反応についてのＨＰＬＣの結果を以下の表１６に要約する。過剰な遊離ラウリン酸との反応は、一晩での混合後に副産物である酸Ａが形成されないことを示したが、過剰な遊離ラウリン酸無しの実験では、両方の層に酸Ａがあった。
【０１３０】
【表１７】
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【０１３１】
１．１モル当量の過剰な遊離ラウリン酸を、水／Ｍｅ−ＴＨＦの系においてラウリン酸カリウムと臭化グリコピロニウムを含む調製物に加えることで、反応混合物を安定させた。
【０１３２】
二相性の反応条件により、臭化グリコピロニウムと脂肪酸のアルカリ及びアルカリ土類金属塩との間の所望の交換反応が可能になった。（脂肪酸と共に）グリコピロニウム部分の有機相への好ましい分割、及び臭化物の水相への分割を、水とメチルテトラヒドロフランにより達成した。グリコピロニウム脂肪酸塩は、反応条件下の加水分解に関しては不安定であり、分離された油状の生成物のように不安定であった。不純物である酸Ａの形成を経時的に注目した。反応混合物中の過剰な遊離脂肪酸は、グリコピロニウム脂肪酸塩を安定させ、不純物である酸Ａの形成を低減した。
【０１３３】
炭酸メチルとの反応
先行技術において、炭酸ジメチルの化学は、界面活性剤と洗剤の産業に加え、ハロゲン化物とは異なる対イオンを持つイオン性液体の製造においても大半が利用されてきた。
【０１３４】
グリコピロレート塩基の炭酸メチルとの反応、及び後の脂肪酸での処理では、所望の生成物の何れももたらすことができず、グリコピロレート塩基から分解生成物をもたらしただけであった。
【０１３５】
このプロセスに関与する化学の１つの例を以下に示す：
【０１３６】
【化２０】
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【０１３７】
炭酸ジメチルとの四級化反応の成功に必要な高温及び圧力の条件下で、最初のグリコピロレート塩基（表１７の化合物３）及びその四級化反応生成物（グリコピロニウム炭酸メチル、表１７の化合物４）の不安定性が原因で、炭酸メチルにより進行する合成手法は成功しなかった。
【０１３８】
グリコピロニウムの必要とされた炭酸メチル塩の完全な合成を達成することができなかったため、この手法を中止し、臭化グリコピロニウムを使用して直接的な塩複分解に後の労力を集中させた。
【０１３９】
三級アミンを炭酸ジメチルでアルキル化することにより、好ましい収率から高い収率で、対応する四級メチル炭酸アンモニウム塩を生成することができる。プロトン源との後の反応により、ＣＯ２及びメタノールへの炭酸メチルの対イオンの分解を介した完全なイオン複分解反応が引き起こされ、これは、反応混合物から容易に取り除かれることで高純度の生成物をもたらす。
【０１４０】
【表１８】
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【０１４１】
表１７は、グリコピロレート塩基からの炭酸メチル塩を介した脂肪酸のグリコピロニウム塩の合成の工程のシーケンスを示す。
【０１４２】
炭酸ジメチルに９０℃の沸点があるため、アルキル化反応は高温（三級アミンの反応性に依存して、典型的に８０−１５０℃）を必要とし、且つ圧力下で実行される。複素環式三級アミンは、立体的に密集した脂肪族三級アミンよりも速く且つ比較的低い温度で反応すると報告される。例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．の１９９０年１月９日発行の米国特許第４，８９２，９４４号は、Ｎ−メチルピロリジン（グリコピロレート塩基３に対し最も近い構造モチーフ）を１２０℃で四級化することにより、６時間の反応後に９７％の単離収率で対応する炭酸メチル塩を得ることができると報告している。橋頭に窒素原子を有する二環式アミンは、より更に求核性であると知られており、還流条件（８０−９０℃）下において大気圧で容易に反応することで、高収率の炭酸メチル塩をもたらす。（引用により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の２０１２年１２月２０日公開の米国特許公開第２０１２／０３２１９６９号を参照）。
【０１４３】
四級化反応は、純粋な炭酸ジメチル、及び２つの非求核性の溶媒であるｔ−アミルアルコールとジメチルアセトアミドにおいて評価され、これは、最初のグリコピロレート塩基に対して反応しないと予想された。グリコピロレート塩基（化合物３）を、公開された手順に基づいて、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ（中国）により特注した（引用により本明細書に組み込まれる、Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃａｒｒｙ  Ｏｖｅｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ：  Ａ  Ｄｅｔａｉｌｅｄ  Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｐｙｒｒｏｌａｔｅ  （ＮＶＡ２３７）”，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１２，  １６，  １７５４−１７６９を参照）。
【０１４４】
グリコピロレート塩基（表３Ｂの構造３）の炭酸ジメチル（表１８に示される）との４つの反応を試みた。基本手順のために、グリコピロレート塩基（表３Ｂの構造３）をＦｉｓｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒの耐圧ボトルに入れ、その後炭酸メチルと溶媒を入れた。溶液を僅かな真空下で、窒素で３回パージし、次いで反応器を密封した。反応混合物を撹拌し、油浴で加熱した。詳細な反応条件と結果を図５に要約する。
【０１４５】
【表１９】
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【０１４６】
４つ全ての実験（図５を参照）において、グリコピロレート塩基３は、反応条件下で分解して、シクロペンチルマンデル酸誘導体（「酸Ａ」）及び対応するメチルエステル（表５）をもたらすことを観察した。分析結果は、所望の生成物がどの反応混合物にも観察されなかったことを示した。
【０１４７】
最初のグリコピロレート塩基の不安定性のため、グリコピロニウム炭酸メチル塩を介した塩複分解手法を放棄した。
【０１４８】
グリコピロレート塩基及び臭化グリコピロニウムのためのＨＰＬＣ較正曲線の調製
原材料に関する分析結果報告に基づいて、ＨＰＬＣ方法を用意し、臭化グリコピロニウム（表３Ｂの構造２）と同様にグリコピロレート塩基（表３Ｂの構造３）のための３つのＨＰＬＣ較正曲線を調製した。これらを、表１９、図１−２、及び図６に要約する。
【０１４９】
【表２０】
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【０１５０】
更なる合成と分析
分析法は、グリコピロニウム脂肪酸塩のためにも進行された。これらの方法は、グリコピロニウム脂肪酸塩サンプルの性質を適切且つ正確に評価する。グリコピロニウム脂肪酸塩の一般的な合成のための、更に洗練されたプロセスも進行させた。
【０１５１】
この分析は、グリコピロニウム脂肪酸塩の合成の改善、及びそのような塩を分析する方法の進行の両方を含む。
【０１５２】
別個の工程で調製される脂肪酸のナトリウム塩又はカリウム塩を使用するのではなく、（水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムでの脂肪酸の処置を介した）インサイツでの脂肪酸の必要とされるナトリウム塩又はカリウム塩の生成により、合成プロセスを改善且つ単純化した。実質的な労力は、加水分解を最小限にすることにより生成物を安定させ、その一方で幾つかの例においてかなりひどいエマルジョンの形成を最小限にすることにより抽出プロセスを促進する、過剰な遊離脂肪酸の適切な量を定める際に費やされた。この計画の第２段階の進行作業の大半を、ステアリン酸で行った。また、全て飽和脂肪酸であるラウリン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸に加えて、リノール酸（Ｃ−１８不飽和脂肪酸；シス，シス−９，１２の二重結合を持つ）も、グリコピロニウム塩へと上手く変換され、方法の一般性を更に実証した。
【０１５３】
分析法の進行は、反応混合物の成分の性質から生じる困難に対処するものであり、これは、塩複分解プロセス及び生成物の性質を評価するための相補的な分析法の使用を必要とした。進行された方法により、塩複分解プロセスを現時点で十分にモニタリングすることができ、得られた脂肪酸塩の性質は確実に評価される。進行されたプロセスを最適化し、大規模生産を可能にしてもよい。
【０１５４】
分析法の適用の一部は、限定されないが、無機臭化物塩（副産物）を取り除くために水による洗浄の最適な数と量を決定することにより＞９５％の変換まで反応を推し進めることを確実にするための塩交換の有効性の評価、医薬品活性成分（ＡＰＩ）を安定させるのに必要とされる過剰な遊離脂肪酸の最適な量の決定（モル当量の適切な範囲を評価する）、及び、反応生成物の純度を評価することによる（例えば、適切な溶媒／抗溶媒の組み合わせによる析出を介した）反応生成物の分離と精製の改善を含む。幾つかの好ましい実施形態において、水による洗浄の最適な数は３−４回の洗浄である。他の実施形態において、洗浄の好ましい数は、少なくとも３回の洗浄である。
【０１５５】
分析法の進行はまた、好ましくは、発色団の出発物質、生成物、及び分解物の定量化の方法、弱い発色団又は非発色団の出発物質と分解物（脂肪酸及びそれに由来する塩、ジメチルヒドロキシピロリジウム分解物）の定量化の方法、出発物質と生成物における臭化物イオンの定量化の方法、及び、生成物中のカリウム（又はナトリウム）イオンの定量化の方法を含む。
【０１５６】
無機塩を水相へと選択的に分割するために二相性の（有機／水性）系を使用して、分離された有機相から親油性有機塩（グリコピロニウム脂肪酸塩）を分離することで、グリコピロニウム脂肪酸塩（ＧＰＦＡ）を臭化グリコピロニウムと脂肪酸塩から上手く調製した。しかし、上述のように、反応混合物は加水分解に対して不安定であり、脂肪酸塩もメタノール溶液の中では不安定であった（エステル転移反応の副産物形成）。分離されたグリコピロニウム脂肪酸塩（ＧＰＦＡ）はまた、本質的に不安定であると証明され、分解物である「酸Ａ」（ＣＡＳ  ４２７−４９−６，α−シクロペンチル−α−ヒドロキシ−ベンゼン酢酸）のレベルの増大が経時的に生じる。過剰な遊離脂肪酸は反応混合物を安定させ、加水分解の速度を著しく低減した（「酸Ａ」の形成を制限する）。正確に合成効率を評価するために、反応混合物から全ての成分を正確に定量化することも、困難であった。
【０１５７】
更なる実験により、過剰な遊離脂肪酸を持つグリコピロニウム脂肪酸塩（ＧＰＦＡ）の分離を調べて、分離された生成物の改善された安定性を確認し、また、分離された材料を特徴化するための適切な分析法を進行させた。これらの実験は、分析法の進行のためのサンプルの調製、グリコピロニウム脂肪酸生成物を特徴化するための分析法の進行、分離された生成物の適切な調製手順と特徴化の画定、及び様々なＧＰＦＡサンプルの調製を含んでいた。これらの労力は成功し、結果として分離された生成物を分析し且つ特徴化するための適切な調製手順と分析法をもたらした。
【０１５８】
進行した分析法は信頼できるものであり、（利用される各脂肪酸のためのＧＣ方法条件の予期された小規模の修飾を伴う）脂肪酸の個々のグリコピロニウム塩に合わせられるほど十分に単純なものである。
【０１５９】
上述のように、ほんの１つの手法（対イオン交換、又は二相性の水性／有機溶媒系における選択的な分割を介した塩複分解）が、グリコピロニウム脂肪酸塩の調製において有効であると証明された。高温での炭酸メチル塩による四級化、及びその後の予期される四級メチル炭酸アンモニウム塩の脂肪酸による処理を介した、グリコピロレート塩基から試みられた合成は、メチル化条件下でのグリコピロレート塩基の分解が原因で成功しなかった。無水条件下での有機溶媒における塩交換は、評価された有機溶媒（アセトン及びジクロロメタン）における臭化グリコピロニウムと脂肪酸塩の難溶性が原因で失敗した。グリコピロニウム部分の観察された加水分解の不安定性は、イオン交換樹脂との水性イオン交換の考慮を排除した。
【０１６０】
選択的な二相性の分割手法でさえ、ひどいエマルジョン形成と不十分な分割が、試験された大半の系に観察された。臭化物の水相への選択的な分割、及びグリコピロニウムの有機相への選択的な分割は、容易に達成されなかった。スクリーンされた溶媒系（２−Ｍｅ−ＴＨＦ、ＭＴＢＥ、ＩＰＡｃ、トルエン、ＭＩＢＫ、及びＤＣＭ）の中で、２−Ｍｅ−ＴＨＦだけが所望の分割に適切な選択性をもたらした。また、加水分解の不安定性は、抽出溶液と分離された生成物両方における経時的な「酸Ａ」の形成と共に、ワークアップと分離にわたって注目された。分離されたグリコピロニウム脂肪酸混合物は、粘着性の油から、ペースト、そして堅いワックス状の固形物までの堅さに及んでいた。
【０１６１】
初期の合成実験は、ラウリン酸（Ｃ−１２鎖）、ステアリン酸（Ｃ−１８鎖）、及びパルミチン酸（Ｃ−１５鎖）を試験した。更なる合成と分析の実験は、ステアリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、及びリノール酸（Ｃ−１８ポリ不飽和、シス，シス−９，１２−オクタデカジエン酸）を試験した。
【０１６２】
前記方法は、臭化グリコピロニウムを二相性反応混合物中で脂肪酸塩と反応させ、少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に含ませることにより、グリコピロニウム脂肪酸塩を合成した。好ましい実施形態において、少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加えることで、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成する。幾つかの好ましい実施形態において、０．２〜１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加える。別の好ましい実施形態において、少なくとも０．６モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加える。また別の好ましい実施形態において、０．６〜１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を混合物に加えることで、グリコピロニウム脂肪酸塩を形成する。別の実施形態において、およそ１．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加える。別の実施形態において、少なくとも１．１モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加える。
【０１６３】
本明細書に記載されるように、過剰な遊離脂肪酸は、使用される臭化グリコピロニウムと脂肪酸塩に関連する。例えば、ラウリン酸反応について、過剰な遊離脂肪酸は、臭化グリコピロニウムとラウリン酸カリウムに関して、過剰な遊離ラウリン酸である。
【０１６４】
過剰な遊離脂肪酸は反応混合物を安定させる。大過剰の遊離脂肪酸（０．６−１．２モルの過剰）は相分離を改善し、有機抽出物溶液の安定性を改善し、且つ分離された生成物の安定性を改善した。
【０１６５】
好ましい実施形態において、脂肪酸の必要とされるナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩は、ナトリウム、カリウム、又はカルシウムを使用するのではなく金属水酸化物を用いて脂肪酸を処理することにより、インサイツで生成される。この工程において、固形物が全て溶解して脂肪酸塩を形成するまで、脂肪酸を、二相性反応混合物（好ましくは水と２−メチル−テトラヒドロフラン）において金属水酸化物と混合させる。金属水酸化物は好ましくは、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又は水酸化カルシウム）の何れかである。
【０１６６】
前記方法はまた、臭化グリコピロニウムの追加、及び固形物が溶解するまでの混合を含むことが好ましい。上方の有機相が保持される一方、反応混合物の下方の水相が取り除かれる。その後、上方の有機相を水で洗浄する。上方の有機相を保持する工程、及び下方の水相を取り除く工程は、繰り返されることが好ましい。好ましい実施形態において、これら２つの工程は、グリコピロニウム脂肪酸塩の純度を増大させるために少なくとも３回繰り返される。他の好ましい実施形態において、これら２つの工程は３−４回繰り返される。
【０１６７】
真空蒸留は好ましくは上方の有機相上で行われ、新たな２−メチル−テトラヒドロフランが加えられる。真空蒸留の工程は、留出物が観察されなくなるまで、微量の残留水を取り除くために少なくとも１回（合計２回）繰り返されるのが好ましい。好ましい実施形態において、無極性の炭化水素溶媒を加え、不溶性成分を析出させて、それを濾去する。その後、濾液を減圧下で更に希釈して、固形物を得る。好ましい実施形態において、無極性の炭化水素溶媒は、ｎ−ヘプタン、又はヘプタン異性体の混合物である。代替的な実施形態において、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、又は石油エーテルを、ヘプタンの代わりに使用することができる。
【０１６８】
単離した生成物の組成および純度を特徴づけ、さらなる進行を可能にするのに十分な分析法が必要であった。単一の方法はすべての成分に適しておらず、相補的な（直交的な（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ））方法が、単離した生成物を適切に特徴づけるために必要とされた。
【０１６９】
純度法およびアッセイ法の進行は、脂肪酸成分および任意の３−ヒドロキシ−１、１−ジメチルピロリジニウムの分解物のための発色団の欠如によって妨げられた。ＨＰＬＣによる、臭化物と３−ヒドロキシ−１、１−ジメチルピロリジニウムの分解物との間の保持／分離も欠けていた。課題である、グリコピロレート混合物の溶解度特性、サンプルの析出、カラムの目詰まり、およびカラム性能の加速的低下をすることにも、方法の進行が妨げられた。結局、これらの課題は、グリコピロニウム脂肪酸塩の特性付けに関して以下に記載された方法の進行によって克服された。
【０１７０】
このような課題に直面すると、標的のグリコピロニウム脂肪酸塩の調製はより困難になり、ＡＰＩ生成物としてのさらなる進行に適切で安定な、よく特徴づけられた生成物の調製を達成するために、進歩性を必要とした。
【０１７１】
グリコピロニウム脂肪酸塩を調製する方法
二相性の反応条件は、臭化グリコピロニウムと、脂肪酸のナトリウムおよびカリウム塩との間の望ましい交換反応を可能にする。有機相へのグリコピロニウム部分の好ましい分配（脂肪酸と共に）、および水相への臭化物の分配を、水および２−メチルテトラヒドロフランを用いて達成した。グリコピロニウム脂肪酸塩は、反応条件の下で、および過剰な量の遊離脂肪酸がない状態における単離された油状の生成物としては、加水分解に対して不安定だった。不純物「酸Ａ」の形成を、経時的に注視した。反応混合物における過剰な遊離脂肪酸は、グリコピロニウム脂肪酸塩を安定させて、不純物「酸Ａ」の形成を減少させた。安定化の１つの理由は、グリコピロニウム脂肪酸塩と過剰な遊離脂肪酸との間の凝集である可能性があり、疎水性の脂肪酸鎖が、エステル結合を防ぎ、それと水との接触を保護してもよい。十分に定義された生成物の単離を、困難ではあったが、達成した。
【０１７２】
準備手順をさらに定義し、単離した生成物を複数の分析方法を使用して特徴づけた。加えて、グリコピロニウムラウレート、グリコピロニウムステアラート、グリコピロニウムパルミタート、およびグリコピロニウムリノレートを含む、様々なグリコピロニウム脂肪酸のサンプルを調製した。
【０１７３】
最初に、グリコピロニウム脂肪酸混合物の調製における使用前に、アルカリ金属脂肪酸塩を調製し分離した。脂肪酸金属塩の単離をしないグリコピロニウム脂肪酸混合物に対するより簡易な調製方法が好まれる。脂肪酸金属塩、過剰な遊離脂肪酸および臭化グリコピロニウムを、２−Ｍｅ−ＴＨＦ／水の混合物で混合したため、変更した処置を用いて溶液中で脂肪酸金属塩を調製した。脂肪酸および金属水酸化物の目標量を、脂肪酸塩および過剰な遊離脂肪酸の望ましい溶液を直接提供するために、水および２−Ｍｅ−ＴＨＦの混合物中で即座に溶解した。
【０１７４】
この手法を以下の例において詳述する。ステアリン酸（６．２６ｇ、２２ｍｍｏｌ、２．２当量）および水酸化カリウム（０．７２６ｇ、１１ｍｍｏｌ、１．１当量）を、水（５０ｍＬ）および２−Ｍｅ−ＴＨＦ（５０ｍＬ）の混合物中に溶解した。この例におけるモル過剰な遊離ステアリン酸は、水酸化カリウムの純度が１００％であると仮定すると（非常にまれである）、（臭化グリコピロニウムに対する）１．２モル当量の過剰な遊離ステアリン酸、および水酸化カリウムに対する１．１モル当量の過剰な遊離ステアリン酸であった。およそ３０分以上の機械的な撹拌で、完全に溶解させた。撹拌することなく、混合物を、およそ３０分後にほとんどもしくは全くエマルジョンが残っていない２つの透明な位相へと安定させた。臭化グリコピロニウム（３．９８ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えて、混合し、溶解した（即時で完全な溶解）。混合を止め、３０分以内で相分離を完了させた。下の方の水相（ｐＨ＝７）を取り除き、２０ｍＬの水を用いて上の方の有機相を３回洗浄した。各相分離に、１時間未満必要であった。最後の水洗浄を取り除いた後に、豊かな有機相を、２０−２５℃／２５−３０Ｔｏｒｒでどろどろのペーストへと減圧濃縮した。２−Ｍｅ−ＴＨＦ（３０ｍＬ）を加えて、減圧濃縮を繰り返した。ヘプタン（５０ｍＬ）を加え、結果として稀薄なスラリーをもたらした。臭化グリコピロニウムおよびステアリン酸カリウムの両方がヘプタンにおいて不溶性であるので、ヘプタンにおける溶解でよって、グリコピロニウムステアラートの親油性を確認した。氷浴中でヘプタン溶液を冷却したとき、濃密なスラリーが形成されたが、これを周囲温度へ再度暖めると稀薄なスラリーになった。およそ３０分間氷浴中で冷却した後に、ガラスフリット漏斗上で冷却したスラリーをろ過したが、ろ過が非常に遅く、含有物がろ過中に室温へと暖まった。ステアリン酸であることが確認された単離した固体を、窒素ブランケット下で吸収乾燥し、その乾燥した固体は、重さ０．９ｇであった。ろ液を、２０−２５℃／２５−３０Ｔｏｒｒで、油状のペーストへと減圧濃縮した。ろ液がグリコピロニウムステアラートおよび過剰な遊離ステアリン酸であることを確認した。
【０１７５】
分析法の進行のためにこれらのサンプルを活用した。分析法の進行過程中に、グリコピロニウムステアラートのサンプル（ＥＥ−００８−００１−３Ｂ）が、初期の実施可能性の作業段階に調製された先のサンプルよりも顕著に安定していた（「酸Ａ」の形成よりもはるかに遅い速度であった）ことが観察された。しかしながら、サンプルがなお徐々に経時的に、および方法の進行を完了させる時間前まで（〜４か月）に分解することが観察され、そのサンプルを、最終的な方法を用いて分析し、「酸Ａ」の形成を注視した（グリコピロニウム含有率に対して２．４４％ｗ／ｗ、９．２９％ＡＵＣ  ＨＰＬＣの酸Ａ）。
【０１７６】
さらなる実験で、グリコピロニウムステアラートを調製するために使用される過剰な遊離ステアリン酸の変化を試験した。これらの実験では、上記のグリコピロニウムステアラートの例（ＥＥ−００８−００１−３Ｂ）において論じられるような同様な基本手順を使用した。より詳細には、異なるモル当量のステアリン酸を、０．２モル当量の増加で、１．２から２．０モル当量（０．２から１．０過剰なモル当量）まで試験した。試験された過剰な遊離脂肪酸の異なる変化を、表２０に示す。３度の水洗浄後、サンプルは、メチル−ＴＨＦ／ＧＰＢｒ／ステアリン酸／ステアリン酸カリウムの混合物からのワックス状の固体であった。
【０１７７】
【表２１】
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【０１７８】
サンプルＡおよびＢは、反応混合物の初期の相分離の後、水洗浄するには難しい（非常に遅い）相分離を有していた。対照的に、サンプルＣ、Ｄ、およびＥの全ての相分離はおよそ１時間以内に終わった。２．２モル当量のステアリン酸を用いたＥＥ−００８−００１−３Ｂの初期の調製とは対照的に、ろ過可能な固体は、最後のヘプタンによる溶解からは観察されず；油状の一部の相の分離のみしか注視せずに、これを単離中に保持した。サンプルを分析し、変更可能な脂肪酸投入量からのその比較分析の結果を、表２１に要約する。比較のためにサンプルＥＥ−００８−００１−３Ｂを含めた。
【０１７９】
【表２２】
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【０１８０】
臭化物の効果的なパージが実証され、剰余のカリウムが少なかった一方、サンプルにわたって、グリコピロニウムまたはステアラートの含有量に関する結果における明白な傾向はなかった。２．２モル当量未満のステアリン酸（グリコピロニウムに対して）の使用が有利性を示さなかったので、次の実験では、ＥＥ−００８−００１−３Ｂ（２．２当量のステアリン酸）の条件を繰り返した。
【０１８１】
２．２当量のステアリン酸を使用してグリコピロニウムステアラートの調製を繰り返した結果得られたサンプル、ＥＥ−００８−００８を分析し、ＥＥ−００８−００１−３Ｂと比較した。その結果を表２２に示す。
【０１８２】
【表２３】
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【０１８３】
分解物「酸Ａ」のレベルが新たに単離した生成物中で典型的に低かった一方、この不純物は周囲条件で経時的（およそ４カ月）に増大した。
【０１８４】
ＥＥ−００８−００８に関して、臭化グリコピロニウム（２２ｍｍｏｌのステアリン酸および１１ｍｍｏｌのＫＯＨを含む）の投入量は、３．９８ｇ（１０ｍｍｏｌ）であった。グリコピロニウムステアラート混合物の排出量は、５．３５ｇであった。質量回収率は５６．７％であった。グリコピロニウムの回収率は、５４．２％（Ｈ１ＮＭＲによる）および５２．８％（ＨＰＬＣアッセイによる）であった。
【０１８５】
グリコピロニウムステアラートＥＥ−００８−００８に関するＨＰＬＣデータを図７に示す。グリコピロニウムステアラートＥＥ−００８−００１−３Ｂに関するＨＰＬＣデータを図８に示す。ＥＥ−００８−００１−３Ｂの８７．６４８２パーセントの領域、およびＥＥ−００８−００８の９６．０３６０パーセントの領域を含む、最大のピークであるピーク１は、グリコピロニウムステアラートである。酸Ａのピークが、およそ１７．６分の保持時間で生じる（図７のピーク５および図８のピーク８）。
【０１８６】
グリコピロニウムステアラートのサンプルＥＥ−００８−００８に関するガスクロマトグラフィーのデータを、図９に示す。グリコピロニウムステアラートのサンプルＥＥ−００８−００１−３Ｂに関するガスクロマトグラフィーのデータを、図１０に示す。図９および図１０の左端のピークは、ガスクロマトグラフィーのトレースにおける溶媒である。このデータは、サンプル中のステアリン酸（ＥＥ−００８−００８の１９．８２７のピーク、およびＥＥ−００８−００１−３Ｂの１９．８３６のピーク）の合計量を示す。ステアリン酸の合計量は、サンプル中になお存在するあらゆる過剰な遊離ステアリン酸だけでなく、グリコピロニウムステアラート中のステアリン酸も含む。ステアリン酸が化学量的にどれだけのグリコピロニウムステアラートへと取り込まれたのかを判定することにより、過剰な遊離ステアリン酸の量を算出することができる。
【０１８７】
全てのＮＭＲ化学シフトを、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対して、ｐｐｍで提供する。グリコピロニウムステアラートのサンプルＥＥ−００８−００８に関するＮＭＲデータを、図１１および図１２Ａ−１２Ｃに示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８８（３Ｈ、ｔ、ＣＨ３−）、１．２０−１．７０（３０Ｈ、ｍ、脂肪酸鎖由来の１５の―ＣＨ２基、および８Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来の４つの―ＣＨ２基）、２．０−２．２５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．２４（２Ｈ、ｔ、―ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．７−２．９（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋、および１Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来のＣＨ基）、２．９３、３．１１、３．３３、３．３７（６Ｈ、４セットの一重線、２つの―ＣＨ３−Ｎ＋；恐らく脂肪酸塩の異なる凝集状態に起因する帯電した界面における化学シフトの差）、３．６−３．８（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋）、３．８−４．０（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、４．１−４．３（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、５．４０−５．５５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨＯＨ、メチンプロトン）、７．２−７．７（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）．
【０１８８】
酸Ａの副産物に関するＮＭＲデータを、図１３Ａ−１３Ｃに示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）１．２−１．８（８Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来の４つのＣＨ２基）、２．９−３．０（１Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来のＣＨ基）、６．２（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＯＨ／第３級アルコール）、７．２−７．７（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）．
【０１８９】
グリコピロニウムの加水分解における副産物、四級アミノアルコール（ＱＡＡ）に関するＮＭＲデータを、図１４Ａ−１４Ｄに示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）２．１−２．３（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．５−２．７（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、３．２（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−Ｎ＋）、３．３（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−Ｎ＋）、３．５−３．７（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋）、３．７−３．９（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋）、４．７５−４．８５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−ＯＨ、メチンプロトン）．
【０１９０】
グリコピロニウムステアラートが加水分解するとき、酸ＡおよびＱＡＡが結果として生じる。ＱＡＡは、強い発色団を持たず、ＨＰＬＣ解析において非常に早く抜け出るので、ＨＰＬＣを使用して分析することは非常に難しかった。
【０１９１】
水による洗浄に対するグリコピロニウム脂肪酸塩の損失は、望ましい値よりも大きいが、その手順は、サンプルを調製するためには使用可能である。塩の回収率を向上させるいくつかの方法は、限定されないが、逆抽出を実行すること、塩析させること、または代替的な抽出溶媒を選択することを含む。水による洗浄でグリコピロニウム部分およびステアリン酸の両方が失われるが、投入量のレベルと比較して、単離した生成物におけるステアリン酸のグリコピロニウムに対する比率は高まる（投入時２．２：１、単離時２．３５：１）。さらに最終的な比率は、遊離脂肪酸の投入量を調節することにより調節してもよい。
【０１９２】
ワークアップおよび単離中に臭化物が効果的にパージされた。より詳細には、ワークアップおよび単離の手順は、一貫して非常に低いレベルの臭化物（＜０．１％）しかもたらさなかった。このことが、プロセスにおける向上したグリコピロニウムの回収率のための洗浄を最適化することを可能にする可能性があるが、合格水準に対してなお剰余な臭化物の制御も提供する。
【０１９３】
結果として生じるグリコピロニウムステアラートのサンプルは、ＨＰＬＣおよびＧＣにより特徴づけられ、ＮＭＲの結果と一貫していた。別個の相補的な分析法により確認された結果が、上記結果を立証した。サンプルの安定性は初期の研究よりも向上した。大過剰な遊離脂肪酸により単離されたサンプルは安定性を向上させ、分解は周囲条件で数カ月後にのみ観察された。過剰な遊離脂肪酸は望ましい脂肪酸塩の分解を遅くするために、バッファーとして作用するように見える。
【０１９４】
グリコピロニウム脂肪酸塩の調製
グリコピロニウム脂肪酸塩を調製するためのより一般的な説明として、脂肪酸（ＦＡ）の算出された目標量を、水（およそ８ｍＬ／ｇＦＡ投入量）と、２−メチルテトラヒドロフラン（２−Ｍｅ−ＴＨＦ、およそ８ｍＬ／ｇＦＡ投入量）と、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物などの金属水酸化物（例えば、水酸化カリウム、ＫＯＨ、１．１モル当量）と混合する。好ましい実施形態では、算出された目標量は２．２モル当量（１．２モル当量の超過）である。他の実施形態では、計算量は、１．２モル当量以上（０．２モル当量の超過）である。その混合物を、固体がすべて溶解されるまで撹拌する。固体が溶解されるまで、臭化グリコピロニウム（「ＧＰＢｒ」、１．０モル当量）を加えて混合する。混合を止め、相を分離させる。下の方の水相（およそｐＨ７）を取り除き、上の方の有機相を保持する。水を用いて上の方の有機相を３回洗浄する（各洗浄、〜３．２ｍＬ／ｇ脂肪酸投入量）。下の方の水相（〜ｐＨ７）の各々を取り除き、上の方の有機相を保持する。
【０１９５】
どろどろのペーストを得るために、上の方の豊かな有機相を、最小限の加熱（２０−２５℃／２５−３０Ｔｏｒｒ）を用いる減圧蒸留によって濃縮する。新たな２−Ｍｅ−ＴＨＦ（およそ４．８ｍＬ／ｇのＦＡ投入量）を加えて、それ以上蒸留液が観察されなくなるまで減圧濃縮を行う（２０−２５℃／２５−３０Ｔｏｒｒ）。
【０１９６】
ヘプタン（およそ８ｍＬ／ｇの脂肪酸投入量）を加えて、ほとんどの固体が溶解するまで、混合物を撹拌する。いくらかの過剰な遊離脂肪酸は、残りの固体を取り除くためのフィルタを通過する稀薄なスラリーとして残る可能性がある。濃厚なろ過されたヘプタン溶液を、ワックス状の固体を得るために、最小限の加熱（２０−２５℃／２５−３０Ｔｏｒｒ）を用いる減圧蒸留によって濃縮する。
【０１９７】
本明細書に記載された方法を用いて、グリコピロニウム脂肪酸塩を調製するために付加的な脂肪酸を使用した。より詳細には、出発物質としてラウリン酸（サンプルＰＳＧ−００８−００２）、パルミチン酸（サンプルＰＳＧ−００８−２０４）およびリノール酸（サンプルＰＳＧ−００８−２０６）が使用され、加えて、上記されたステアリン酸（サンプルＥＥ−００８−００８）サンプルも使用された。結果を表２３Ａおよび２３Ｂに示す。理論的な最大の回収量を、グリコピロニウム脂肪酸および過剰な遊離脂肪酸の回収量の合計として算出した。
【０１９８】
【表２４】
2018519289.tif 000046
【０１９９】
【表２５】
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【０２００】
グリコピロニウムステアラートに関するＨＰＬＣデータを図７および８に示す。グリコピロニウムラウレートに関するＨＰＬＣデータを図１５Ａ−１５Ｄに示す。それぞれ、ピーク１はグリコピロニウムラウレートを示し、２回の実行においてそれぞれ、９０．８６５２および９０．８６６２の領域％を含む。ピーク７は副産物である酸Ａを示し、２回の実行において、５．７５０８％の領域および５．７５８％の領域を含む。他の小さなピークは、未確認の不純物またはアーティファクトである。
【０２０１】
グリコピロニウムパルミタートに関するＨＰＬＣデータを、図１６Ａ−１６Ｄに示す。ピーク１はグリコピロニウムパルミタートを示し、２回の実行においてそれぞれ、９１．２５２５および９１．３８９０の領域％を含む。ピーク５は副産物である酸Ａを示し、２回の実行においてそれぞれ、４．１１８０％の領域および４．０１００％の領域を含む。他の小さなピークは、未確認の不純物またはアーティファクトである。
【０２０２】
グリコピロニウムリノレートに関するＨＰＬＣデータを、図１７Ａ−１７Ｄに示す。ピーク１はグリコピロニウムリノレートを示し、２回の実行に関してそれぞれ、３９．７８８９および３９．５６２０の領域％を含む。ピーク４は、第１の実行（図１７Ａ−１７Ｂ）における副産物酸Ａを示し、ピーク５は、第２の実行（図１７Ｃ−１７Ｄ）における副産物酸Ａを示し、それぞれ２回の実行に関して、２．４１２６％の領域および２．４１７１％の領域を含む。ピーク１５（図１７Ａ−１７Ｂ）およびピーク１７（図１７Ｃおよび１７Ｄ）は、最も高い面積率（それぞれ５５．１９７４および５５．４３１８）を実際に有した。これらのピークは反応に使用される過剰な遊離リノール酸と一致しており、そのことは、共役Ｃ＝Ｃ二重結合発色団により、このＨＰＬＣにおいて検出された。試験された脂肪酸のうち、リノール酸のみが、ＵＶ検出器に対して著しい反応を示す。他の小さなピークは、未確認の不純物またはアーティファクトである。遊離リノール酸の量のより正確な評価は、ステアリン酸の解析に使用されるパラメーターの細かな最適化とともに、ガスクロマトグラフィーによって実施可能である。
【０２０３】
分析ツールとして、ＨＰＬＣは、サンプル中の所望の生成物（グリコピロニウムステアラート、グリコピロニウムラウレート、グリコピロニウムパルミタートおよびグリコピロニウムリノレート）および酸Ａのみ特定することができた。試薬および生成物の複雑性を考慮すると、他の方法が、サンプルにおける、脂肪酸（ガスクロマトグラフィー）、所望の生成物および副産物（ＮＭＲ）、および剰余の臭化物およびカリウム（イオンクロマトグラフィー）を特定するために必要であった。
【０２０４】
全てのＮＭＲ化学シフトを、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対して、ｐｐｍで提供する。臭化グリコピロニウムに関するＮＭＲデータを図１８に示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）１．１−１．７（８Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来の４つのＣＨ２基）、２．０−２．２（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．６−２．８（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．８−３．０（１Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来のＣＨ基）、３．１（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−Ｎ＋）、３．２（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−Ｎ＋）、３．４５−３．６５（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋）、３．６５−３．８５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、３．８５−３．９５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、７．２０−７．６５（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）．グリコピロニウムステアラートに関するＮＭＲデータを上記し、図１１および１２Ａ−１２Ｃに示す。
【０２０５】
グリコピロニウムラウレートに関するＮＭＲデータを図１９に示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８７（３Ｈ、ｔ、ＣＨ３−）、１．２０−１．７０（１８Ｈ、ｍ、脂肪酸鎖由来の９つの―ＣＨ２基、および８Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来の４つの−ＣＨ２基）、２．１−２．２５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．２３（２Ｈ、ｔ、―ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．７−３．０（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋、および１Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来のＣＨ基）、２．９５、３．１０、３．２８、３．３０（６Ｈ、４セットの一重線、２つの―ＣＨ３−Ｎ＋；恐らく脂肪酸塩の異なる凝集状態に起因する帯電した界面における化学シフトの差）、３．６−３．８５（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋および１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、３．９５−４．１（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、５．４−５．５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−ＯＨ、メチンプロトン）、７．２−７．６（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）．
【０２０６】
グリコピロニウムパルミタートに関するＮＭＲデータを図２０に示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８８（３Ｈ、ｔ、ＣＨ３−）、１．２０−１．７０（２６Ｈ、ｍ、脂肪酸鎖由来の１３の―ＣＨ２基、および８Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来の４つの―ＣＨ２基）、２．０−２．２（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．２５（２Ｈ、ｔ、―ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．７−２．９５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋、および１Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来のＣＨ基）、２．９３、３．１１、３．３４、３．３７（６Ｈ、４セットの一重線、２つの―ＣＨ３−Ｎ＋；恐らく脂肪酸塩の異なる凝集状態に起因する帯電した界面における化学シフトの差）、３．６−３．８（２Ｈ、ｍ、―ＣＨ２−Ｎ＋）、３．８−４．０（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、４．１−４．２５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｎ＋）、５．４０−５．５５（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−ＯＨ、メチンプロトン）、７．２−７．６（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）．
【０２０７】
グリコピロニウムリノレートに関するＮＭＲデータを図２１に示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８８（３Ｈ、ｔ、ＣＨ３−）、１．２０−１．７０（１６Ｈ、ｍ、脂肪酸鎖由来の８つの―ＣＨ２基、および８Ｈ、ｍ、シクロペンチル環由来の４つの―ＣＨ２基）、２．０−２．１（４Ｈ、ｍ、アリルプロトン  ―ＣＨ２Ｃ＝Ｃ）、２．０−２．２（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋）、２．２（２Ｈ、ｔ、―ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．８５（２Ｈ、ｔ、ダブルアリルプロトン（ｄｏｕｂｌｙ  ａｌｌｙｌｉｃ  ｐｒｏｔｏｎｓ）  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ）、２．７−２．９（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−Ｃ−Ｎ＋、および１Ｈ、ｍ、シクロペンチル基由来のＣＨ基）、２．９１、３．０９、３．２９、３．３１（６Ｈ、一重線の４つのセット、２つの―ＣＨ３Ｎ＋；オレフィンプロトン）、５．３５−５．５０（１Ｈ、ｍ、―ＣＨ−ＯＨ、メチンプロトン）、５．６−５．７５（２Ｈ、ｍ、オレフィンプロトン）、７．２−７．６（５Ｈ、ｍ、芳香族プロトン／フェニル基）
【０２０８】
ＮＭＲ分析を、脂肪酸成分の合計量（すなわち化学量的に結合した脂肪酸アニオンと遊離脂肪酸）に対するグリコピロニウムのモル比を正確に評価するために、有効に使用することができた。グリコピロニウム脂肪酸塩サンプルのＨ１ＮＭＲ結果の比較を、表２４に示す。ステアリン酸のサンプルに関する芳香族領域における干渉するピークを注視したが、グリコピロニウムの多重線は鮮明であり、干渉はなかった。
【０２０９】
【表２６】
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【０２１０】
グリコピロニウムＨＰＬＣアッセイ（ＧＰ重量％含有量）は、様々な脂肪酸塩に対して適用可能である。グリコピロニウムステアラートを用いてＨＰＬＣ方法を進行させたが、干渉するピークまたは他の問題は、ラウリン酸、パルミチン酸およびリノール酸から調製されたグリコピロニウム脂肪酸塩の分析において観察されず、これらの混合物におけるグリコピロニウム含有量の定量化が可能である。
【０２１１】
同様に、ＮＭＲは、多数の異なる脂肪酸基質（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を使用して、様々な脂肪酸塩を効果的に特徴づける。グリコピロニウムステアラートの場合のように、脂肪酸鎖の末端のメチル基（３Ｈ）が、ラウリン酸、パルミチン酸、およびリノール酸から調製されたグリコピロニウム脂肪酸塩に対して分離された材料中に存在する、モル比（ＧＰ：ＦＡ）の計算のためのグリコピロニウム（ＧＰ）の多重線と比較するための、適切な統合（４Ｈの合計、３．５−４．２ｐｐｍ）を提供した。
【０２１２】
グリコピロニウム脂肪酸塩のサンプルは、比較的安定していた。分解物「酸Ａ」のレベルは、最初の単離ではすべてのサンプルにおいて低かったが、経時的な安定性（数カ月）のみ、グリコピロニウムステアラートに関して検討した。グリコピロニウムステアラートに関しては、周囲条件で、〜４カ月にわたって分解を観察した。
【０２１３】
質量回収率は、様々な脂肪酸にわたって調整可能であった。質量回収率は、グリコピロニウム脂肪酸のサンプルにわたって、より悪い値からはるかに良い値まで、様々であった（パルミチン酸＜ステアリン酸＜ラウリン酸＜リノール酸）。これは、単離したグリコピロニウム脂肪酸塩における、グリコピロニウム塩活性の保持、および回収率をさらに向上させることによる、さらなる手順の最適化の機会を強調する。塩の回収率を向上させるいくつかの方法は、限定されないが、逆抽出を実行すること、塩析させること、または代替的な抽出溶媒を選択することを含む。
【０２１４】
長時間の乾燥が、特にラウリン酸およびパルミチン酸を用いて、低レベルの剰余のｎ−ヘプタンを達成するために必要であった（ＮＭＲによってヘプタンが検出できなくなるまで乾燥）。乾燥条件のさらなる最適化が、プロセスを向上させる可能性がある。例えば、乾燥条件の真空および／または温度は、分解を回避しながら、プロセスを向上させるために調節可能であった。
【０２１５】
最終生産物における脂肪酸：グリコピロニウム（ＦＡ：ＧＰ）に関する類似のモル比を注視した。単離したグリコピロニウム脂肪酸塩混合物はすべて、投入比率と比較して、（グリコピロニウムに対する）脂肪酸のいくらかの濃縮を示した。単離した生成物はすべて、２．２：１  ＦＡ：ＧＰの投入比率を超えていた。
【０２１６】
脂肪酸はＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）のステータスを享受し、製剤において広く使用され、現在消費されている多くの食物においても見られる。したがって、グリコピロニウム脂肪酸における大過剰な遊離脂肪酸は、薬剤開発においてグリコピロニウム脂肪酸の使用に関する問題をもたらさないだろう。
【０２１７】
現在の調製法および分析法は、他の脂肪酸、好ましくは少なくとも８つの炭素分子を備えた脂肪酸に対して適用してもよい。いくつかの例は、グリコピロニウム脂肪酸塩を作るために、限定されないが、アラキン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、エルカ酸、アラキドン酸、ラウリン酸、カプリン酸、リノール酸、リノレン酸、またはミリスチン酸を含む。
【０２１８】
生成物および分解物の分析
その分析法は、さらなる進行を可能にするために規制条件を満たすような組成および純度を特徴づけるのに十分である必要があった。脂肪酸成分および３−ヒドロキシ−１、１−ジメチルピロリジニウム分解物に関する発色団の欠如は、ＨＰＬＣ／ＵＶに対する代替手段の進行を必要とした。ＨＰＬＣによる臭化物および３−ヒドロキシ−１、１−ジメチルピロリジニウムの保持／分離の欠如は、これらの成分を定量化するために別個の相補的な方法の進行および使用を必要とした。
【０２１９】
医薬品活性成分混合物の課題となる溶解度特性（サンプルの析出、カラムの目詰まり、カラム性能の加速的低下）は、方法の進行を妨げたが、これらの問題は、根本的に克服された。単一の方法は、分析のすべての成分に適切でないため、相補的な方法（直交法）が必要とされ、成功裡に進行してきた。
【０２２０】
粗製生成物の混合物のサンプルおよび重要な加水分解の副産物の各々は、方法の進行を可能にするために調製され、出発物質のサンプルとともに分析された。調製されたサンプルを表２５に示す。
【０２２１】
【表２７】
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【０２２２】
副産物（分解物）のサンプル調製
臭化グリコピロニウムの加水分解、および副産物の単離を実施した。３．９８ｇ（１０ｍｍｏｌ、１．０当量）の臭化グリコピロニウムと、０．８０ｇ（２０ｍｍｏｌ、２．０当量）の水酸化ナトリウムと、２０ｍＬの水との混合物を、室温で一晩撹拌した。結果として生じる溶液を、微量の粘質の固体を取り除くためにろ紙によってろ過し、その後、４．７８ｇ（２８．３５ｍｍｏｌ、２．８３５当量）の４８％水溶液の臭化水素酸を滴下することによって酸性化した。その後、形成された濃い白いスラリーをろ過し、〜５ｍＬの水で洗浄した。単離した白色固形物を風乾し、２．０２５ｇの「酸Ａ」（ＣＡＳ４２７−４９−６、α−シクロペンチル−α−ヒドロキシ−ベンゼン酢酸）を加えた。四級アミノアルコール副産物（ＣＡＳ５１０５２−７４−５、３−ヒドロキシ−１、１−ジメチル臭化ピロリジニウム）ならびに〜０．９５／１のｗ／ｗ比のＮａＢｒを含む、３．８７ｇの油状のペーストを提供するために、混ぜ合わせたろ液およびすすぎ液を４０℃／９Ｔｏｒｒで減圧濃縮した。
【０２２３】
【化２１】
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【０２２４】
ＨＰＬＣ法
独自のＨＰＬＣ法を、反応の生成物を分析するために進行させた。表２６は、ＨＰＬＣ法の条件に関するスクリーニングを示す。
【０２２５】
【表２８】
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【０２２６】
表記されたスクリーニングに加えて、グリコピロレートのためのＵＳＰ法を評価した。この方法では、Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、４．６×１００ｍｍ、２．６μ、移動相Ａ：ＤＩ  Ｈ２Ｏ中のＨ３ＰＯ４を含む０．０２５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ２．５、移動相Ｂ：１００％ＣＡＮ、を使用した。ＵＳＰ法に従って、希釈液は、０．５ｍｇ／ｍＬのサンプル濃度で、１：１の移動相ＡおよびＢとした。
【０２２７】
グリコピロニウムステアラートの第１のサンプル（ＥＥ−００８−００１−３ｂ、ＧＰＢｒ／ステアリン酸／ステアリン酸カリウム由来のワックス状の固体、表２５）は、ＵＳＰ希釈液に可溶でると思われるが、一貫性のためにスクリーニングされる条件、および全てのサンプルにわたってメタノールを使用し、ＭｅＯＨ中０．５ｍｇ／ｍＬで調製した。
【０２２８】
ＵＳＰ法では、ベースラインは好適ではなかった（非常に不規則なベースライン）。また、繰り返し注入する上で多数の小さなピークが観察された。カラムにおける析出が、その問題の原因として疑われるため、移動相の混合物を、析出があるか確認した。グラジエントの高域（１５％の移動相Ａおよび８５％の移動相Ｂ）において、ＫＨ２ＰＯ４バッファーが析出したことが分かった。ほとんどのＣ１８カラムは、適切にグリコピロレート（ＧＰ）を保持した。ピーク形状（ＧＰ）は、低いｐＨ（リン酸）において十分であると分かった。
【０２２９】
スクリーニングされた条件から、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、５μｍ、Ｐ／Ｎ：９９３９６７−９０２、およびＨ２Ｏ／アセトニトリル溶媒系中の０．１％Ｈ３ＰＯ４が、最も良い成績（ベースラインおよびピーク形状）を提供した。しかしながら、分解物「ＱＡＡ」（表２、項目８において示される、サンプルＥＥ−００８−００１−４ｂ）は、臭化物ピークと共溶出した。広範な努力にもかかわらず、臭化物およびＱＡＡのピークの保持および分離を向上することができなかった。
【０２３０】
グリコピロニウムおよび「酸Ａ」分解物を、ＨＰＬＣによって他の成分から即座に分割して定量化し、グリコピロニウムの含有量に関する重量パーセントの分析を進行させた。ＨＰＬＣによってＱＡＡの含有量を直接定量化することが望まれていたが、別個の方法（ＩＣ）によって臭化物を測定し、その後、臭化物の含有量を減じるように計算して、ＨＰＬＣによってＱＡＡの含有量を予想することが依然として必要であった。ＨＰＬＣ法を進行させる過程中に、最初の使用月の間に、サンプルＥＥ−００８−００１−３ｂにおいて「酸Ａ」が観察されなかったことがわかった。
【０２３１】
進行していた１つの分析法は、発色団の出発物質、生成物、および分解物の定量化のための方法であった。その方法は、フォトダイオードアレイ検出法（ＰＤＡ）でＨＰＬＣを使用した。
【０２３２】
グリコピロニウムステアラートのＨＰＬＣ方法が進行され、それによって、ＨＰＬＣによるグリコピロニウムまたは３［（シクロペンチルヒドロキシフェニルアセトキシ］−１、１−ジメチルピロリジニウム（ＧＰ）ステアラートの分析と不純物プロファイルの測定に関する手順を提供する。
【０２３３】
Ａｇｉｌｅｎｔ、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、５μｍ、Ｐ／Ｎ：９９３９６７−９０２のカラムのためのＨＰＬＣ運転条件を、表２７に示し、移動相のグラジエントを表２８に示す。０．１％の０．２５ｍｇ／ｍＬＧＰＢｒ、平均Ｓ／Ｎ比＝１１．２。０．２５ｍｇ／ｍＬＧＰＢｒの２５％から１２０％までの直線性は、直線である。相関係数＝１．０００．
【０２３４】
【表２９】
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【０２３５】
【表３０】
2018519289.tif 000053
【０２３６】
図２２はグリコピロニウム濃度対グリコピロニウムピーク面積を示す。図２３はブランクのクロマトグラムを示し、図２４は分解溶液のクロマトグラムを示す。方法の正確性を表２９に示す。
【０２３７】
【表３１】
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【０２３８】
臭化物の含有量に関するイオンクロマトグラフィー
別の方法では、イオンクロマトグラフィー（アニオンモード）を使用して、生成物中の剰余の臭化物イオンを定量化した。まず、グリコピロニウムステアラートのサンプルＥＥ−００８−００１−３ｂ（表１０  ｐ．１９）を大雑把に確認したところ、臭化物は＜１％ｗ／ｗであることが分かった（限度試験）。完全な較正シーケンスおよび分析を実行した。結果はすべて、臭化物の効果的な除去を示した。最後の臭化物アッセイ法は、剰余の臭化物イオンを確認し、＜０．１％に制御することができる。
【０２３９】
この方法は、イオンクロマトグラフィーを使用して、グリコピロニウムステアラート／ステアリン酸の混合物中の剰余の臭化物イオンの極微量を測定するための手順を提供するために、進行された。その分析法は、グリコピロニウムステアラート／ステアリン酸の混合物中の剰余の臭化物イオンの定量化に適用される。その方法は、０．５ｍｇ／ｍＬのサンプル濃度の臭化物イオンのための０．１％（１０００ｐｐｍ）の限界に対応する。
【０２４０】
イオンクロマトグラフィーのパラメーターおよび条件を表３０に示す。
【０２４１】
【表３２】
2018519289.tif 000055
【０２４２】
臭化物の標準に関するイオンクロマトグラフィーのデータを図２５に示す。グリコピロニウムステアラート中の臭化物に関するイオンクロマトグラフィーのデータを、図２６に示す。図２６中の標識されていないピークは、サンプルマトリックス中に存在する非臭化物の荷電種である（アーティファクト、臭化物標準トレースと比較する）。図２６に示されるように、臭化物はほとんどサンプル中に残っておらず、そのことは、反応が所望の結果、グリコピロニウムステアラートの生成に成功したことを示す。
【０２４３】
カリウムの含有量に関するイオンクロマトグラフィー
また、別の方法で、イオンクロマトグラフィー（カチオンモード）を使用して、生成物中の剰余のカリウム（またはナトリウム）イオンを定量化した。重要な課題は、溶解度が適切な希釈液中のサンプルに限定されたこと、およびカリウム保持時間付近の干渉するピークが最初に観察されたこと。これらは解決され、その方法では、０．５ｍｇ／ｍＬのＡＰＩサンプルに対する０．１％レベルの定量化の限界まで、カリウムイオンを検知することができる。
【０２４４】
グリコピロニウムステアラート中のカリウムに関するイオンクロマトグラフィーのデータを、図２７に示す。ピーク１は、サンプル中になお存在するカリウムを示す。ピーク２は未知であるが、ブランクサンプル中にも存在した。図２７に示されるように、カリウムはほとんどサンプル中に残っておらず、そのことは、反応が所望の結果、グリコピロニウムステアラートの生成に成功したことを示す。まとめると、図２６および２７に示される結果の組み合わせもまた、優れた反応を示す。
【０２４５】
脂肪酸の含有量に関するガスクロマトグラフィー
進行していた別の分析法は、弱いまたは非発色団の出発物質および分解物（脂肪酸および抽出された塩、ジメチルヒドロキシピロリジニウム分解物）の定量化のための方法であった。その方法は、ステアリン酸の含有量を測定するために、ＧＣ（ＦＩＤ）の方法を使用した。
【０２４６】
グリコピロニウムステアラート中のステアリン酸の含有量を測定するために、ガスクロマトグラフィーを使用した。直接注入式のガスクロマトグラフ法は、ステアリン酸のための重量％分析に関して進行された。ＴＨＦ中にグリコピロニウムステアラートを溶解し、氷酢酸で酸性化した。その方法は、他の脂肪酸に、場合によっては適用可能である（温度勾配に対する変更で）。グリコピロニウム脂肪酸塩の混合物の他の成分は検出されなかった（したがって、干渉されてもいない）。サンプルの分析によって、表３１に示される結果が与えられた。
【０２４７】
【表３３】
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【０２４８】
塩から過剰な遊離脂肪酸を分離するのは多少難しい。どれだけの過剰な遊離脂肪酸が混合物中になお存在するかを測定するために、当業者はその過剰分を求めるために、グリコピロニウム（化学量論の計算を用いて測定することができる）に結合する量を減じることができる。表３１中のろ過可能な固体は、析出するものを表し、それは、主に遊離脂肪酸（表中のステアリン酸）である。極めて純粋なこのろ過可能な固体（９８．３重量％のステアリン酸）を廃棄する。所望の生成物（グリコピロニウムステアラート）はワックス状の固体である。ろ過可能な固体内に過剰分のいくらかをろ過してきたが、ワックス状の固体内で測定されるステアリン酸は、グリコピロニウムステアラートの一部であるステアリン酸、および過剰な遊離ステアリン酸の両方である。
【０２４９】
図９および１０、ならびに表３１は、ステアリン酸の含有量に関するガスクロマトグラフィーの結果のみを示すが、ガスクロマトグラフィーは、ガスクロマトグラフィー方法に対して細かな変更によって、他の脂肪酸を定量化するためにも使用することができた。変更可能であったいくつかのパラメーターは、限定されないが、保持時間、注入温度、注入のための濃度、および温度を上昇させる時間を含む。代替的に、ＮＭＲの結果を脂肪酸の量を定量化するために使用してもよい。化学量論を使用して、結合した脂肪酸の量を測定することができる。特定の脂肪酸の長さは、グリコピロニウム脂肪酸塩のどれだけが脂肪酸であるのか、およびグリコピロニウムがどれだけあるのかを測定する。ガスクロマトグラフィーの動作を表３２に示す。
【０２５０】
【表３４】
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【０２５１】
図２８は標準クロマトグラムを示し、図２９はサンプルのクロマトグラムを示す。ステアリン酸のためのピークＩＤに関するおよその保持時間は、２０．１分であった。
【０２５２】
対象のグリコピロニウム脂肪酸塩を作るために化学反応に起因する複合混合物は、簡単な分析には適用可能ではなかった。例えば、それらは、遊離脂肪酸を含めた油性混合物を含んでいた。たいていのクロマトグラフィー法は、化合物の検出を使用するが、個別の方法では、全ての材料（出発物質、分解物および最終生成物を含む）に関する情報を取り込むには至らなかった。例えば、ＵＶでは出発物質および最終生成物を認識することができるが、分解物ＱＡＡは認識できない。最終生成物は発色団を含み、そのことがＵＶでそれを検出することができる理由であるが、発色団を持たない分解生成物は、ＵＶ検出法を用いて検出可能ではない。個別の成分の化学的性質により、複数の解析的な戦略が必要であった。出発物質、最終生成物および分解産物を定量化するために、複数の方法をともに使用した。反応に使用される脂肪酸の各々に対して分析を最適化してもよい。
【０２５３】
手順はグリコピロニウム脂肪酸塩に関して進行し、これらの手順は、様々な脂肪酸からのグリコピロニウム脂肪酸塩の調製を可能にした。脂肪酸塩の分析は、様々な手順を含んだ。これらの手順は、フォトダイオードアレイ検出法を用いるＨＰＬＣ、ならびにステアリン酸のためのＧＣ（ＦＩＤ）法、イオンクロマトグラフィー（アニオンモード）による臭化物含有物、およびイオンクロマトグラフィー（カチオンモード）によるカリウム含有物を含んだ。これらの方法に加えて、ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ中の）による分析が、単離した材料の特徴づけのために有用であることが分かった。
【０２５４】
本明細書に主に記載された例が臭化グリコピロニウムを説明している一方、別の四級アンモニウム抗コリン作用性のムスカリン受容体アンタゴニスト、例えば塩化トロスピウムは、生成物、四級アンモニウム脂肪酸塩（例えばトロスピウム脂肪酸塩）に対する反応において、臭化グリコピロニウムの代わりとして用いることができる。
【０２５５】
そのような塩を製造する１つの方法では、塩化トロスピウムを二相性の反応混合物中で脂肪酸塩と反応させて、少なくとも０．２モル当量の過剰な遊離脂肪酸を反応混合物に加える。その方法は、脂肪酸塩を形成するために全ての固体が溶解するまで、好ましくは、脂肪酸を、水、２−メチル−テトラヒドロフラン（または別の適切な溶媒）、ならびにアルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から成る群から選択される金属水酸化物と混合する。グリコピロニウム脂肪酸塩に関して記載された工程および変化のいずれも、トロスピウム脂肪酸塩を作るために、代替的に使用することができた。
【０２５６】
全ての引用文献は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２５７】
したがって、本明細書に記載された発明の実施形態が、発明の法則の出願の単に例示となることが理解されるべきである。例示された実施形態の詳細に対する本明細書における引用は、請求項の範囲を制限することを意図せず、請求項自身が、本発明に不可欠であると見なされる特徴を列挙する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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