(57)【要約】  本発明は、ＴＳＬＰ若しくはＩＬ−２５又はその組み合わせを発現及び分泌する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌、並びに、特に炎症性疾患及び障害の処置に使用するための、プロバイオティクス又は治療薬としてのそれらの使用に関する。
2018512159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びインターロイキン−２５（ＩＬ−２５）から成る群から選択されるサイトカインをコードする異種ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項２】
前記サイトカインをコードする異種ヌクレオチド配列が、ラクトコッカス・ラクティスのＧｒｏＥＳＬオペロンのプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項３】
前記発現カセットが、細胞外アドレッシングペプチド、特にラクトコッカス・ラクティスのＥｘｐ４タンパク質のペプチドシグナル、をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１又は２に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項４】
前記ＴＳＬＰがヒトのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項５】
前記ＩＬ−２５がヒトのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項６】
プロバイオティクスとして又は抗炎症剤として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌を含む医薬組成物又はプロバイオティクス組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ＴＬＳＰを分泌することができる遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌、及び／又はＩＬ−２５を分泌することができる遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌を含む、請求項７に記載の医薬組成物又はプロバイオティクス組成物。
【請求項９】
前記組成物が、追加の有効成分、例えば抗炎症剤又は免疫調節性薬剤などの薬剤、を更に含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物又はプロバイオティクス組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌、又はその組み合わせ、好ましくは乳製品、を含む食品組成物。
【請求項１１】
炎症状態の予防又は処置に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌又はその組み合わせ。
【請求項１２】
前記炎症状態が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性大腸炎、空置性大腸炎、回腸嚢炎、壊死性腸炎、及び過敏性腸管症候群から成る群から選択されるものなどの腸の炎症状態である、請求項１１に記載の使用のための遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項１３】
経口投与を意図した、請求項１１又は１２に記載の使用のための遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項１４】
炎症の早期に投与することを意図した、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【請求項１５】
１週間未満の期間中、１日に１回又は２回投与されることを意図した、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、微生物学及び医療分野に関連する。より具体的には、治療薬として、特に抗炎症剤として使用するためのサイトカインを産生する遺伝子組み換え細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローン病（ＣＤ）や潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含めた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、１４０万人のアメリカ人を襲い、世界的には、有病率は１０００００人に３９６人である。発生率と有病率は、それほど影響を受けなかった人を含めて、世界の様々な地域で増大している。
その症状（下痢症状、腹痛、体重減少）のため、ＩＢＤは、身体機能を奪う疾患であるとみなされる。患者は、乾癬、癌又は関節炎のような他の炎症性又は非炎症性疾患を発症するより高いリスク因子を有する。今までのところ、その疾患に対する治療的処置は存在しない。
【０００３】
最も効果的な処置は、ＴＮＦ−αを標的とした組み換え抗体（インフリキシマブ）の注射であるが、６０％が早期応答者（primary responders）であっても、これが、１年間の処置後に寛解状態になるのが２５〜４０％まで低下する。ＩＢＤの最後の解決策は、腸の炎症を起こしている部分を取り除く外科手術である。しかし、外科手術は、短腸症候群として重症合併症に至る可能性があり、再発も頻繁に起こる。まとめると、これがＩＢＤを先進国の重大な健常問題の１つにしているので、革新的な治療薬又は治癒ストラテジーの開発は重要である。
【０００４】
疾患の症状を緩和するのに役立つものを探索する方法の１つは、遺伝子組み換え乳酸菌（ＬＡＢ）による抗炎症性分子の送達である。最近、プロテアーゼ・インヒビターＥｌａｆｉｎを発現しているＬＡＢを摂取させたマウスが、腸の炎症に対して保護されたことが示された。ＬＡＢは、食料保存のために数千年間にわたり使用され、活性分子を送達する有望なビヒクルであると考えられる。それらは、世界保健機構によって安全であると認識され、いくつかの株は抗炎症特性を有する可能性がある。
【０００５】
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）は、発酵乳製品の製造において最も幅広く使用されており、乳酸菌（ＬＡＢ）であり、更に、多くの遺伝的手段が開発され、且つ、その完全ゲノムが完全に配列決定されたので、モデルＬＡＢとみなされている（Bolotin, Wincker et al. 2001, Genome Res, 11, 731-753）。よって、この食品グレードのグラム陽性菌は、粘膜免疫系に対する治療用タンパク質を産生し、そして、送達するための優れた候補の典型である。ここ１０年間で、斯かるタンパク質を粘膜免疫系に送達する生きた遺伝子組み換えラクトコッカスの可能性が、幅広く調査されてきた（Steidler, Robinson et al. 1998, Infect Immun, 66, 3183-3189; Bermudez-Humaran, Cortes-Perez et al. 2004, J Med Microbiol, 53, 427-433; Hanniffy, Wiedermann et al. 2004, Adv Appl Microbiol, 56, 1-64; Wells and Mercenier 2008, Nat Rev Microbiol, 6, 349-362; Bermudez-Humaran, Kharrat et al. 2011, Microb Cell Fact, 10 suppl 1, S4）。このアプローチは、簡単な投与や、全身及び粘膜免疫応答の両方を誘発する能力など、従来の全身投与を越えるいくつかの利点を提供する（Mielcarek, Alonso et al. 2001, Adv Drug Deliv Rev, 51, 55-69; Eriksson and Holmgren 2002, Curr Opin Immunol, 14, 666-672）。
【０００６】
生物学的活性分子を分泌するＬ．ラクティスの使用の早期研究は、マウスインターロイキン−２（ＩＬ−２、炎症誘発性サイトカイン）（Steidler, Robinson et al. 1998、前掲）を用いて実施された。この先駆的な仕事で得られた有望なデータは、粘膜及び全身性反応が、モデル抗原Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ（ＴＴＦＣ）を伴ったｍｕＩＬ−２又はｍｕＩＬ−６（別の炎症誘発性サイトカイン）のいずれかの同時発現（及び分泌）によって促進され得るか否か、更に調査するように研究者を刺激した（Steidler, Robinson et al. 1998、前掲）。Ｌ．ラクティスのＴＴＦＣ発現菌株を用いて免疫されたマウスと比較して、抗ＴＴＦＣ血清反応ピークは、ＴＴＦＣを発現するＬ．ラクティス菌株及びｍｕＩＬ−２又はｍｕＩＬ−６のいずれかを発現するＬ．ラクティスを用いて同時免疫したマウスにおいて１０〜１５倍高かった。これは、ＬＡＢを使用して生物学的活性サイトカインを粘液に送達できる最初の実例になった。よって、研究室では、Ｌ．ラクティス菌株が粘膜表面（例えば、気道又は消化粘液）にてその場で生物学的活性ｍｕＩＬ−１２（ＬＬ−ｍｕＩＬ１２）を送達できることを報告した。ＩＬ−１２は、Ｔヘルパー１（ＴH１）細胞及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生を引き起こし、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の成熟を進め、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を促進して、そして、接種抗原と共に同時送達されるとアジュバント特性を備える強力な多機能サイトカインである。特に、我々は、ＬＬ−ｍｕＩＬ−１２が首尾よく使用された３種類のモデル：（１）アジュバントとして、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）に対する粘膜ワクチン接種に関連したアジュバントとして（Bermudez-Humaran, Langella et al. 2003, Infect Immun, 71, 1887-1896; Bermudez-Humaran, Cortes-Perez et al. 2004、前掲; Adel-Patient, Ah-Leung et al. 2005, Cin Exp Allergy, 35, 539-546）、（２）オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発喘息モデルにおいてＴH１／ＴH２バランスを調節するために（Wu, Yang et al. 2006, Int Immunopharmacol 6, 610-615）、及び（３）牛乳アレルゲンβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）に対するアレルギー反応を予防するために（Adel-Patient, Ah-Leung et al. 2005、前掲; Cortes-Perez, Ah-Leung et al. 2007, Clin Vaccine Immunol 14, 226-233）、を使用した。
【０００７】
しかしながら、依然として、抗炎症剤として使用できる新しいＬＡＢが大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、例えばストレス誘導制御型システム（ＳＩＣＥ）発現系を使用してインターロイキン２５（ＩＬ−２５）又は胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）のいずれかを発現する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌に関する。本明細書中に開示する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、生物学的活性型で両方のサイトカインを効率的に発現及び分泌できる。本発明者らは、ＩＬ−２５（ＬＬ−ＩＬ−２５）又はＴＳＬＰ（ＬＬ−ＴＳＬＰ）のいずれかを発現する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌が炎症を軽減するできることを示した。そのため、本発明は、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌に関し、ここで、該細菌は、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びインターロイキン−２５（ＩＬ−２５）から成る群から選択されるサイトカインをコードする異種ヌクレオチド配列を含む発現カセットを備えている。その異種ヌクレオチド配列は、ラクトコッカス・ラクティスのＧｒｏＥＳＬオペロンのプロモーターの制御下で発現され得る。好ましくは、その発現カセットは、細胞外アドレッシングペプチドをコードするヌクレオチド配列、特にラクトコッカス・ラクティスのＥｘｐ４タンパク質のペプチドシグナルを更に含む。ＴＳＬＰ又はＩＬ−２５がヒトのものであることがより好ましい。
【０００９】
本発明は更に、プロバイオティクスとして又は抗炎症剤として使用するために本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌に関する。
加えて、本発明は、本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌を含む医薬、動物用、又はプロバイオティクス組成物に関する。ある実施形態において、組成物は、ＴＬＳＰを分泌できる遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌、及び／又はＩＬ−２５を分泌できる遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌を含む。任意選択で、組成物は更に、追加の有効成分、例えば抗炎症剤又は免疫調節性薬剤などの薬剤を含んでもよい。
本発明は、本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌又はそれらの組み合わせを含む食品組成物、好ましくは乳製品に関する。
【００１０】
最後に、本発明は、炎症状態の予防又は処置に使用するための本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌又はそれらの組み合わせに関する。炎症状態の治療薬の製造に使用するための本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌又はそれらの組み合わせにも関する。それは、それを必要としている対象の炎症状態を処置するために方法であって、本明細書中に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌又はそれらの組み合わせの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。好ましくは、その炎症状態は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性大腸炎、空置性大腸炎、回腸嚢炎、壊死性腸炎、及び過敏性腸管症候群から成る群から選択される炎症状態などの腸炎症状態である。好ましくは、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、経口投与が意図される。好ましい実施形態において、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、炎症の早期において投与されることが意図される。好ましくは、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、１週間未満の期間中、１日に一度又は二度投与されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プラスミドを含有する菌株のために０．５％のグルコース及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティス野性型（ＮＺ９０００）、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ２５−Ｈｉｓ、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓの細菌増殖曲線。
【図２】１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭＲＳ培地におけるＬ．カゼイｐＮｉｓ−空（empty）、Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、及びＬ．カゼイｐＮｉｓ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図３】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、０．１、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＮｉｓ−空の細菌増殖曲線。
【図４】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、０．１、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５の細菌増殖曲線。
【図５】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、０．１、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓの細菌増殖曲線。
【図６】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、０．１、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図７】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、０．１、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓの細菌増殖曲線。
【図８】１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、１、１０、１５、２０又は２５ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭＲＳ培地におけるＬ．カゼイｐＮｉｓ−空の細菌増殖曲線。
【図９】１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、１、１０、１５、２０又は２５ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭＲＳ培地におけるＬ．カゼイｐＮｉｓ−ＩＬ−２５の細菌増殖曲線。
【図１０】１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、１、１０、１５、２０又は２５ｎｇ／ｍＬのナイシンを補充したＭＲＳ培地におけるＬ．カゼイｐＮｉｓ−ＩＬ−２５の細菌増殖曲線。
【図１１】０．５％のグルコース及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティス野性型（ＭＧ１３６３）、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、ｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ２５−Ｈｉｓ、ｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ、及びｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓの細菌増殖曲線。
【図１２】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充し、及び２．５％のＮａＣｌを補充した又は補充していないＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５の細菌増殖曲線。
【図１３】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、１、１．５、２、２．５、３又は３．５％のＮａＣｌを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５の細菌増殖曲線。
【図１４】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充し、及び２，５％ＮａＣｌを補充した又は補充していないＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図１５】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０、１、１．５、２、２．５、３又は３．５％のＮａＣｌを補充したＭ１７培地におけるＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図１６】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地における、３０℃、３７℃又は４０℃でのＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、及びＬ．ラクティスのｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓの細菌増殖曲線。
【図１７】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地における、３０℃、３７℃、４０℃又は４３℃でのＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図１８】０．５％のグルコース、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地における、ｐＨ７又はｐＨ５．２でのＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰの細菌増殖曲線。
【図１９】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のナイシン誘導（０、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図２０】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のナイシン誘導（０、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）培養物からの細菌細胞溶解物（Ｃ）又は上清画分（Ｓ）サンプル中のＩＬ−２５−Ｈｉｓのウエスタンブロットによる検出。
【図２１】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のナイシン誘導（０、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図２２】Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−ＩＬ−２５及びＬ．カゼイｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のナイシン誘導（０、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図２３】Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ及びＬ．カゼイｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のナイシン誘導（０、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図２４】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図２５】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図２６】Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５のＮａＣｌストレス（２．５％）誘導培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡ（eBioscience）による検出。
【図２７】Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５菌株のＮａＣｌ誘導（０、１、１．５、２、２．５、３又は３．５％）培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図２８】Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５及びＮａＣｌ誘導（０、１、１．５、２、２．５、３又は３．５％）後の上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図２９】Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ菌株のＮａＣｌ誘導（０、１、１．５、２、２．５、３又は３．５％）培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図３０】ヒートショック誘導（３０℃、３７℃、４０℃又は４３℃）Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ培養物からの上清画分中のＩＬ−２５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図３１】ヒートショック（３０℃、３７℃又は４０℃）Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図３２】Ｌ．カゼイｐＤｎａＫ−ＩＬ−２５及びＬ．カゼイｐＤｎａＫ−Ｎｕｃ培養物からの上清画分中のＴＳＬＰのＥＬＩＳＡによる検出。
【図３３】市販のＩＬ−２５（０、１、２．５、５、１０又は２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃縮上清からのＩＬ−２５又はＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ（陰性対照）の濃縮上清からの等量のタンパク質で刺激した脾細胞上清中のＩＬ−５のＥＬＩＳＡによる検出。
【図３４】市販のＩＬ−２５（０、１、２．５、５、１０又は２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃縮上清からのＩＬ−２５又はＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ（陰性対照）の濃縮上清からの等量のタンパク質で刺激した脾細胞上清中のＩＬ−１３のＥＬＩＳＡによる検出。
【図３５】市販のＴＳＬＰ（０、５、１０、５０又は１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５（５又は１０ｎｇ／ｍＬ）の濃縮上清からのＩＬ−２５又はＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ（陰性対照）の濃縮上清からの等量のタンパク質で刺激した、ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣｓ上清中のＩＬ−１２のＥＬＩＳＡによる検出。
【図３６】ＬＬ−ＴＳＬＰ誘導ＴＧＦ−β分泌物の経口投与。マウスに、５日間連続してＬＬ−ＴＳＬＰ又はＬＬ−ｗｔを経口的に投与し、その後、屠殺した。ＴＧＦ−β（Ａ）、ＩＬ−２５（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、及びＩＬ−１７（Ｄ）の濃度は、ＭＬＮからの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ−２８活性化細胞の上清中で計測された。
【図３７】マウスの急性ＤＳＳ誘導炎症に対するＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与の効果。マウスに、ＤＳＳ処置の５日前に試験終了まで、ＬＬ−ＷＴ又はＬＬ−ＴＳＬＰを経口的に投与した。体重変化（Ａ）及び疾患活動性指数（Ｂ）は、全ＤＳＳ処置期間の間、観察された。（Ｃ）結腸部分の組織学的スコア、（Ｅ）結腸洗浄液中のＩＦＮ−γ及び（Ｆ）ＭＬＮからの活性化細胞の上清中のＴＧＦ−β濃度。
【図３８】マウスのＤＳＳ回復大腸炎モデルに対するＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与の効果。マウスに、ＤＳＳ処置の５日前に試験終了までＬＬ−ＷＴ又はＬＬ−ＴＳＬＰを経口的に投与した。ＤＳＳ処置後に、マウスを５日間、回復させた。体重変化（Ａ）及びＤＡＩ（Ｂ）が、ＤＳＳ誘導大腸炎相、並びに続く５日間の回復中に観察された。
【図３９】短期、且つ、早期ＬＬ−ＴＳＬＰ投与が、ＤＳＳ誘導大腸炎中の炎症を軽減した。（Ａ）細菌投与プロトコールの略図。（Ｂ）体重変化。（Ｃ）ＬＬ−ＷＴ、ＬＬ−ＴＳＬＰ又はＬＬ ＴＳＬＰフェーズ１で処置されたマウスのＤＡＩ。（Ｄ）組織学的スコア。ＭＬＮからの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ−２８活性化細胞の上清中の（Ｅ）ＴＧＦ−β及び（Ｆ）ＩＬ−１７の濃度。
【図４０】４日間の大腸炎後のＬＬ−ＴＳＬＰの作用。（Ａ）大腸炎プロトコールの略図。ＬＬＷＴ又はＬＬ ＴＳＬＰを給餌したマウスの（Ｂ）ＭＬＮのＣＤ４＋集団中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋のパーセンテージ、（Ｃ）体重変化及び（Ｄ）ＤＡＩ。
【００１２】
発明の詳細な説明
第一の目的において、本発明は、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びインターロイキン−２５（ＩＬ−２５）から成る群から選択されるサイトカインをコードする異種ヌクレオチド配列を含む遺伝子組み換え又は遺伝子操作されたラクトコッカス・ラクティス細菌に関する。
【００１３】
ラクトコッカス・ラクティス細菌は優れたグレードの細菌であり、その結果、ＵＳＡ及び欧州共同体において、それぞれＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）及びＱＰＳ（Qualified Presumption of Safety）の立場によって承認された完全な安全プロファイルを有する。斯かる細菌は、良好な健常状態及び満足すべき生活状態、又は疾患の予防に関わる主張を有する機能性食品又は食品添加物の状態で安全に存在し得る。
【００１４】
好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス細菌は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（ctemoris）（Ａ７６、ＧＥ２１４、ＨＰ、ＩＢＢ４７７、ＫＷ２、ＭＧ１３６３、ＨＢ６０、ＨＢ６１、ＨＢ６３、ＮＢＲＣ１００６７６、ＮＺ９０００、ＳＫ１１、ＴＩＦＮ１、ＴＩＦＮ３、ＴＩＦＮ５、ＴＩＦＮ６、ＴＩＦＮ７、ＤＳＭ１４７９７、ＣＮＣＭ Ｉ−２８０７、ＤＮ０３００６６（ＣＮＣＭ Ｉ−１６３１）、ＤＮ０３００８７（ＣＮＣＭ Ｉ−２８０７）、ＣＮＣＭ Ｉ−１６３１、ＮＣＣ２２８７（ＣＮＣＭ Ｉ−４１５７）又はＵＣ５０９．９を含む）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（１ＡＡ５９、Ａ１２、ＣＮＣＭ Ｉ−１６３１、ＣＶ５６、Ｄｅｌｐｈｙ１、Ｉｌ１４０３、ＩＯ−１、ＤＰＣ３９０１、ＬＤ６１、ＴＩＦＮ２、ＴＩＦＮ４、ＮＢＲＣ１００９３３とも呼ばれるＪＣＭ５８０５、ＪＣＭ７６３８、Ｋ２１４、ＫＦ１４７、ＫＬＤＳ４．０３２５、ＮＣＤＯ２１１８又はＹＦ１１を含む）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（hordniae）（ＮＢＲＣ１００９３１などの）又はラクトコッカス・ラクティス亜種トゥクテ（tructae）の中で選択される細菌から調製される。好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス細菌は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、特にラクトコッカス亜種ラクティスｂｖジアセチラクティスから選択される。
【００１５】
特定の実施形態において、ラクトコッカス・ラクティス細菌は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、好ましくはＭＧ１３６３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００９００４）から調製される。
【００１６】
本発明の遺伝子組み換え又は遺伝子操作されたラクトコッカス・ラクティス細菌は、ＴＳＬＰ及びＩＬ−２５から成る群で選択されるサイトカインを発現及び分泌することができる。そのため、その細菌は、サイトカインをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを備えている。そのサイトカインを発現するヌクレオチド配列は、ラクトコッカス・ラクティスのＧｒｏＥＳＬオペロンのプロモーター制御下にあり得る。斯かる発現系は、ＷＯ２０１３／１７５３５８に詳細に開示され、そして、その開示を参照によって本明細書中に援用する。特に、プロモーター配列は、配列番号１〜４のうちのいずれか１つ、好ましくは配列番号１、又はこれらの配列の１つと少なくとも９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列の中から選択され得る。
【００１７】
「サイトカインをコードする異種ヌクレオチド配列」とは、ラクトコッカス・ラクティスで天然に生じる配列でないヌクレオチド配列、及び／又はラクトコッカス・ラクティスのＧｒｏＥＳＬオペロンのプロモーターに機能を果たすように連結された天然で見られない配列を意味する。第一の態様において、サイトカインはＴＳＬＰ（Homologene: 81957）である。好ましくは、サイトカインは、参照データベース：ＨＧＮＣ：３０７４３；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８５４８０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６９Ｄ９；ＮＰ＿１４９０２４；ＮＭ＿０３３０３５で開示されたヒトＴＳＬＰである。ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列は、配列番号５に示されている。任意選択で、コードされているＴＳＬＰは、そのシグナルペプチドを欠くＴＳＬＰである。例えば、ヒトＴＳＬＰでは、シグナルペプチドは、配列番号５の１〜２９位に位置している。そのため、コードされているＴＳＬＰは、配列番号５の３０位で始まり末端に至るまでのアミノ酸配列であり得る。細菌での発現のため、シグナルペプチドは、メチオニンによって置換されてもよい。或いは、動物向けの使用が企図される場合、処置されるべき動物のＴＳＬＰ配列が使用される。任意選択で、ＴＳＬＰは、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失又は付加など又は切断などのいくつかの修飾を有するＴＳＬＰ変異型を含んでもよい。変異型の例は、ＷＯ２００２／００７２４で開示されている。
【００１８】
第二の態様において、サイトカインはＩＬ−２５（Homologene:15429）である。好ましくは、サイトカインは、参照データベース：ＨＧＮＣ：１３７６５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：６４８０６；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ２９３；ＮＰ＿０７３６２６；ＮＭ＿０２２７８９で開示されたヒトＩＬ−２５である。ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列は、配列番号６に示されている。任意選択で、コードされているＩＬ−２５は、そのシグナルペプチドを欠くＩＬ−２５であり得る。例えば、ヒトＩＬ−２５では、シグナルペプチドは、１〜３２位に位置している。そのため、コードされているＩＬ−２５は、配列番号６の３３位で始まり末端に至るまでのアミノ酸配列であり得る。加えて、コードされているＩＬ−２５は、１〜１８残基がＭＹによって置換された（配列番号７に示された）アイソフォーム２であってもよい。細菌での発現のため、シグナルペプチドがメチオニンによって置換されてもよい。或いは、動物向けの使用が企図される場合、処置されるべき動物のＩＬ−２５配列が使用される。任意選択で、ＩＬ−２５は、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失又は付加など又は切断などのいくつかの修飾を有するＩＬ−２５変異型を含んでもよい。
【００１９】
サイトカインをコードするヌクレオチド配列は、任意の好適な遺伝コードも使用してもよく、天然に存在するコード配列であってもよい。或いは、コード配列は、ラクトコッカス・ラクティス細菌向けに最適化されてもよい。
加えて、発現カセットは、好ましくは、細胞外アドレッシングペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む。例えば、細胞外アドレッシングペプチドは、特に配列番号８で開示した、ラクトコッカス・ラクティスのＥｘｐ４タンパク質のシグナルペプチドである。細胞外アドレッシングペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細胞外アドレッシングペプチド及びサイトカインを含むタンパク質融合体の産生を引き起こすようにサイトカインをコードする配列に機能を果たすように連結される。任意選択で、細胞外アドレッシングペプチドは、サイトカインのシグナルペプチドを置換しても、又はサイトカインにただ付加されてもよい。
【００２０】
サイトカインをコードする発現カセットは、ラクトコッカス・ラクティス染色体内に組み込まれても、又は（すなわち、プラスミドの）エピソーム形態で維持されてもよい。
任意選択で、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、一方がＴＳＬＰ及びもう片方がＩＬ−２５の、２個の発現カセットを備えていても、又は両方のサイトカインを発現する発現カセットを備えていてもよい。
遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、ラクトコッカス・ラクティス細菌、特に先に開示したもの、に先に開示した発現カセットを導入することによって得られる。
【００２１】
特定の実施形態において、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４９７１（ＩＬ−２５用）及びＩ−４９７２（ＴＳＬＰ用）で、２０１５年４月１４日に25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex 15, FranceのＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Miroorganismes）に寄託された２種類の菌株のうちの１つである。加えて、遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、そのサイトカインのヒト配列で、これらの菌株の１つマウス配列を置換することによって調製されてもよい。
【００２２】
本発明はまた、プロバイオティクスとして、先に開示した遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティスを使用することにも関する。従って、それは、健常対照の炎症、特に腸炎症を要望するのに使用され得る。本発明は、ＴＳＬＰを産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、ＩＬ−２５を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、ＴＳＬＰ及びＩＬ−２５の両方を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、又はＴＳＬＰを産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス及びＩＬ−２５を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティスの組み合わせを含む食品組成物に関する。
或いは、本発明の遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌は、薬剤として、特に抗炎症剤として、使用するためのものであり得る。
【００２３】
本発明は、医薬組成物又は動物用組成物に関する。本発明による組成物は、ＴＳＬＰを産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、ＩＬ−２５を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、ＴＳＬＰ及びＩＬ−２５の両方を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス、又はＴＳＬＰを産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス及びＩＬ−２５を産生する遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティスの組み合わせを含み得る。好ましくは、その組成物は、効果的な量の細菌、特に治療上有効な量の細菌を含む。特に、治療上有効な量は、炎症性の状況が予防されるか又は回復する、炎症の進行が遅くなるか又は遮断される、及び炎症症状が緩和されるような量である。例えば、その組成物は、少なくとも１×１０6コロニー形成単位（ＣＦＵ）、好ましくは少なくとも１×１０7ＣＦＵ、より好ましくは少なくとも１×１０８ＣＦＵ、例えば１×１０7ＣＦＵ〜１×１０11ＣＦＵの細菌を含んでいる。
【００２４】
任意選択で、その組成物は、追加の有効成分を更に含んでもよい。その追加の有効成分は、別の細菌であり得る。その追加の有効成分はまた、抗炎症剤、免疫調節性薬剤などの薬剤であり得る。より詳細に、且つ、包括的ではなく、その追加の薬剤は、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、抗生物質、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬、例えば腫瘍壊死因子−α拮抗薬、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５などの中から選択され得る。
【００２５】
本発明は、本発明による遺伝子組み換えラクトコッカス・ラクティス細菌、又は炎症状態の予防又は処置に使用するための、先に開示した医薬組成物に関する。その炎症性疾患は、敗血症などの急性炎症；熱傷；及び慢性炎から成る群から選択され得る。その炎症性疾患は、腸（例えば、小児脂肪便症、憩室炎、及び盲腸を含む）、胃、肝臓、膵臓若しくは腹膜、又は胃腸管若しくは消化器系の他の組織の炎症状態に関する可能性もある。斯かる他の状態は、口腔、食道、膵臓、膵管、肝臓、胆嚢、十二指腸、胆管、小腸（回腸）、大腸（結腸）、盲腸、虫垂、又は直腸の炎症状態を含み得る。本発明の方法、組成物、及びキットによって処置可能であり得る胃腸系を冒す具体的状態は、例えば憩室炎（憩室症から進行した、特に大腸に見られる一般的な消化器系の疾患であり、結腸の外側に炎症を起こした袋（憩室）の形成を伴う）、小児脂肪便症（グルテンタンパク質に対して発症する自己免疫反応によって引き起こされる幼年中期から全年齢の遺伝的に発症しやすい人々に起こる小腸の自己免疫疾患）、盲腸（虫垂炎を特徴とする状態）、胃腸炎（胃腸管の炎症であって、胃と小腸の両方に関係し、且つ、急性下痢症を生じ、そしてそれが、多くの場合、特定のウイルスの感染によって引き起こされ、頻度は低いが、細菌、それらの毒素、寄生生物、又は食事若しくは薬物療法の何かに対する有害反応によって引き起こされる）、膵炎（様々な原因による慢性又は急性膵臓炎）、又は消化性潰瘍疾患を含み得る。
【００２６】
好ましい実施形態において、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性大腸炎、空置性大腸炎、回腸嚢炎；壊死性腸炎；過敏性腸管症候群；ＵＶ又は化学誘導皮膚炎症などの皮膚炎、湿疹、皮膚過敏症；眼の炎症；アレルギー、喘息；肥満に関連した炎症；加齢性軽度炎症、及びその組み合わせの中から選択される炎症性疾患である。その炎症性疾患はまた、炎症性呼吸器系疾患、炎症性関節病、及び炎症性泌尿生殖器疾患に関する炎症状態でもあり得る。炎症性呼吸器系疾患としては、嚢胞性繊維症、喘息、及びＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）が挙げられる。
【００２７】
本明細書中に使用される場合、「処置」又は「処置すること」という用語は、任意のプロセス、動作、適用、治療法、又は同様のものを含み、ここで、ヒトを含めた対象（又は患者）に、直接的又は間接的に対象の状態を改善するか、或いは対象の状態又は疾患の進行を遅くするか、或いは処置下の疾患又は障害の少なくとも１つの症状を改善する目的で作用物質又は組成物（又は本発明の作用物質を発現する遺伝子組み換え生物体）を提供するか又は投与する。
本発明の組成物は、任意の種類の組成物であってもよい。その組成物は、例えば、経口的、腸内、腟内、直腸内、局所又は眼に投与されてもよい。例えば、それは、医薬組成物、栄養補給食品、食品添加物、化粧用組成物、ペットフード、食品、又は飲料であってもよい。
【００２８】
本発明による組成物は、経口投与が意図されるのが好ましい。例えば、組成物は、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤又は散剤の形態で存在し得る。任意選択で、それは、飲料、例えば、乳飲料又は非乳飲料、の形態で存在し得る。或いは、本発明による組成物は、直腸投与が意図される。直腸投与は、坐剤、浣腸剤又はフォームの形態でおこなわれ得る。
処置されるべき対象は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。それは、幼児、小児、成人又は高齢者であり得る。
【００２９】
本発明の組成物は、１日に１回、２回、３回又は４回投与され得る。好ましくは、それは、１日１回又は２回、より好ましくは１回投与される。加えて、それは、毎日、２日毎、３日毎、１週間に１回又は２回投与され得る。処置の期間は、短いことも又は長いこともあり得る。短期間では、１週間未満、例えば、３、４、５又は６日間が意図される。長期間では、１週間超の期間、例えば、２、３又は４週間が意図される。好ましい実施形態において、組成物は、１週間未満の期間、１日に１回又は２回投与される。組成物は、複数の期間、好ましくは、２つの処置期間の間に休息期間をおいて、投与され得る。
【００３０】
組成物は、予防的治療として、すなわち、炎症性事象の出現前に、投与され得る。或いは、それは、炎症の早期、例えば、（単数若しくは複数の）最初の症状が現れてすぐに、投与され得る。加えて、それはまた、炎症の急性期中にも投与され得る。最後に、それは、炎症後に回復期中に投与され得る。それはまた、それらの相の組み合わせ中にも投与され得る。好ましい実施形態において、それは、炎症の早期に、１週間未満の期間中に１日に１回又は２回投与され得る。
【００３１】
上記の開示は、本発明を大まかに説明する。例示だけを目的として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない以下の具体例の参照によって、より完全な理解を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
概要
ＩＬ−２５及びＴＳＬＰは、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）応答にかかわる、上皮細胞によって主に分泌される２種類のサイトカインである。化学的に誘導したマウス大腸炎モデルにおいてこれらの２種類のサイトカインの影響を試験するために、数種類の遺伝子組み換え乳酸菌（ＬＡＢ）を構築した。
発明者らは、２つの異なった発現系：ナイシン誘導性制御系（ＮＩＣＥ）及びストレス誘導性制御系（ＳＩＣＥ）を使用して、インターロイキン２５（ＩＬ−２５）及び胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）サイトカインのいずれかを発現するラクトコッカス・ラクティス及びラクトバチルス・カゼイ（周知の２種類のＬＡＢ菌株）の様々な組み換え菌株を構築した。加えて、彼らはまた、これらの２種類のサイトカインのＨｉｓ−タグ付与形態を発現する遺伝子組み換えＬＡＢ菌株を構築した。
【００３３】
遺伝子組み換えＬＡＢの正常な成長を一旦確認すると、発明者らは、それらの対応するストレスを用いて、２つの異なった発現系を使用して、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２５及びＴＳＬＰの産生及び分泌を試験した。それらの結果は、遺伝子組み換えＬＡＢが２種類の発現系（すなわち、ＮＩＣＥ及びＳＩＣＥ）を使用して両方のサイトカインを発現するが、試験した条件では、ＮＩＣＥ系で分泌が観察されなかったことを示した。ＳＩＣＥ系に関して、良好な分泌は、遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株で観察されただけであった。更に、彼らは、生理的食塩水又はヒートショックストレスのいずれかの後にこれらの菌株でサイトカイン分泌が増強されることを実証した。そのうえ、彼らは、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによって分泌されたこれらのサイトカインの生物学的活性を示した。
【００３４】
次に、発明者らは、インビボにおいて、ＩＬ−２５及び／又はＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬＡＢの免疫調節性及び予防効果を評価した。彼らは、より高いサイトカイン分泌を示したＳＩＣＥ発現系下でＩＬ−２５又はＴＳＬＰのいずれかを発現する２種類の遺伝子組み換えＬ．ラクティスを選んだ。その菌株の予防及び免疫調節性効果を判定するために、様々な化学的に誘導したマウス大腸炎モデルを、発明者らの研究室で試験した。まず、彼らは、ＬＬ−ＴＳＬＰが腸の炎症を軽減することができ、よって、ＤＳＳ誘導急性大腸炎からマウスを保護することを示した。毎日のＬＬ−ＴＳＬＰ強制食餌は、大腸炎の始まりに臨床徴候（糞便の軟化及び出血）を遅らせた。より重要なことには、ＬＬ−ＴＳＬＰは、組織学的スコアの減少による化学的処置によって引き起こされた損傷から腸管上皮を保護する。更に、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによって分泌されたＴＳＬＰは、炎症誘導性サイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生を低減し、且つ、炎症誘導性Ｔｈ１７応答を軽減することができ、分泌したＴＳＬＰが炎症を調節することを示した。
【００３５】
発明者らはまた、５日間の回復後に、ＤＳＳ誘導大腸炎を起こした。このモデルで、彼らは、ＬＬ−ＴＳＬＰ処置後にいくつかの炎症マーカー、例えば（より少ない顆粒球の動員を反映する）ＭＰＯ活性の下降、結腸壁のよりわずかな肥大、及び結腸組織における炎症誘導性サイトカインＩＬ−１２の下降などを観察した。そのうえ、彼らは、ＬＬ−ＴＳＬＰが、ＤＳＳによって誘導された炎症誘導性Ｔｈ１７応答を減少でき、且つ、炎症の重要な調整経路：Ｔreg応答、を高めることができることを示した。これらの結果は、ＬＬ−ＴＳＬＰの抗炎症性の役割を説明していると考えられる。
【００３６】
その一方、発明者らは、ＩＬ−２５を分泌するＬ．ラクティスが、ＤＳＳ誘導急性大腸炎において、Ｔｈ２反応を駆動できたことを実証したが、この応答は、炎症からマウスを保護するのは十分でなかった。同時に、彼らは、Ｔｈ１炎症を駆動することが知られているＤＮＢＳ誘導急性大腸炎を使用した。彼らは、腸炎症の軽減におけるＩＬ−２５分泌Ｌ．ラクティスの重要な役割を示唆する、マウスの死亡率の低下、少ない体重減少及び結腸組織のよりわずかな肥大によってＩＬ−２５の保護的役割について観察した。
【００３７】
実施例１
ｍｕＩＬ−２５及びｍｕＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬＡＢの構築
胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びＩＬ−２５は、上皮細胞によって産生される２種類のサイトカインである。両方のサイトカインは、
好塩基球及びＴH２細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−１３（２つの抗炎症性サイトカイン）の分泌を含めた、ＴH２タイプの免疫応答を開始させる。
【００３８】
抗炎症性ＩＬ−４及びＩＬ−１３サイトカインの産生を活性化し、且つ、炎症誘導性ＩＬ−１２の産生を阻害することによって、発明者らは、遺伝子組み換えＬＡＢによる粘膜レベルのＴＳＬＰ及び／又はＩＬ−２５の送達が、抗炎症性免疫プロファイルに向かって免疫応答を調節するであろうと予想した。ＩＬ−２５又はＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬＡＢの構築及び特徴づけ後に、この仮説が正当であると確認した。
【００３９】
発明者らは、ＩＬ−２５又はＴＳＬＰサイトカインのいずれかを発現する１６この遺伝子組み換えＬ．ラクティス及びＬ．カゼイ菌株を首尾よく構築した。２種類の誘導性発現系、ナイシン誘導性制御系：ＮＩＣＥ及びストレス誘導性制御系：ＳＩＣＥ（Benbouziane, Ribelles et al. J Biotechnol, 168, 120-129）を使用して、ＩＬ−２５及びＴＳＬＰ発現、及びそれぞれのタンパク質の２つの異なった形態：天然形態及びＨｉｓ−タグ付与形態の産生、を達成した。遺伝子組み換えＬＡＢ（すなわち、Ｌ．ラクティス及びＬ．カゼイＢＬ２３）の正常な成長を一旦確認し、発明者らは、それらの対応する誘導原、ＮＩＣＥ系のナイシン及びＳＩＣＥ系のストレス、を用いて、２種類の異なった発現系を使用した、ＩＬ−２５及びＴＳＬＰの産生及び分泌を、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡの両方で試験した。それらの結果は、遺伝子組み換えＬＡＢが２種類の発現系を使用して両方のサイトカインを発現することができることを示したが、ＮＩＣＥ系では、試験した条件において、サイトカイン分泌が観察されなかった。ＳＩＣＥ系に関して、良好な分泌は、遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株で観察しただけであった。
【００４０】
材料と方法
菌株と培養条件
当該作業で使用した菌株及びプラスミドを、表１で列挙した。Ｌ．ラクティス菌株を、撹拌せずに、３０℃にて１％のグルコースを補充したＭ１７培地（Difco）中で培養した。Ｌ．カゼイ菌株を、撹拌せずに、３７℃にてＭＲＳ培地（Difco）中で培養した。大腸菌株を、３７℃及び１８０ｒｐｍにてルリア−ベルターニ（Difco）中で培養した。プラスミドを、次の抗生物質（１ｍｌあたりのミリグラム単位の濃度）：Ｌ．ラクティスにはクロラムフェニコール（１０）；Ｅ．コリにはアンピシリン（１００）及びクロラムフェニコール（１０）、の添加によって選別した。
【００４１】
２つの異なった細菌増殖曲線を実現した。
・サイトカインを分泌するＬＡＢ菌株の一晩の培養物を、６００ｎｍ（ＯＤ600nm）＝０．１の光学濃度で希釈した。次に、ストレスを誘導し、そして、１００μＬのそれぞれの細菌培養物を、無菌の９６ウェルプレートに播種した。これらのプレートを、マイクロプレートフォトスペクトロメーター（ＴＥＣＡＮ）内、３０℃（Ｌ．ラクティス）又は３７℃（Ｌ．カゼイ）にて２０時間インキュベートした。１５秒間の軌道振盪後に、ＯＤ600nmを１５分毎に計測した。
・ストレス誘導分泌アッセイ中、様々な細菌株のＯＤ600nmを、様々な時点で計測した（材料と方法、ＬＡＢによるストレス誘導サイトカイン分泌を参照）。
【００４２】
遺伝子組み換えＬＡＢ菌株の構築
プラスミドＤＮＡ分離及びＤＮＡ操作のための一般手法は、使用したキット（Qiagen、Promega）の市販のプロトコールに従う。
ＮＩＣＥ系
・Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−サイトカイン
マウスＩＬ−２５、Ｈｉｓ−タグ付与マウスＩＬ−２５（Ｃ−末端に６つのＨｉｓ残基）、マウスＴＳＬＰ又はＨｉｓ−タグ付与マウスＴＳＬＰ（Ｃ−末端に６つのＨｉｓ残基）を含むプラスミドを、Ｇｅｎｅａｒｔ（Invitrogen）によって合成した。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を有している。ＳｐｅＩ及びＮｓｉＩによる消化後に、着目の遺伝子（マウスＩＬ−２５、ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ−Ｈｉｓ）を含む断片を、ＳｐｅＩ／ＮｓｉＩによって消化したｐＮｉｓプラスミド内に統合した。構築物を、２、４ＫＶ、２００□、２５μＦにてＬ．ラクティスＮＺ９０００菌株内にエレクトロポレーションによって定着させた。次に、形質転換体を、１％のグルコース及びクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＭ１７寒天培地上で３０℃にて選別した。プラスミドを、遺伝子組み換え形質転換体から抽出し、消化及び配列決定によって確認し、そして、ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、及びｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓと命名した。
【００４３】
・Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−サイトカイン
ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、及びｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓプラスミドを、Ｌ．ラクティスから抽出し、そして、１．５ＫＶ、４００□、２５μＦにてＬ．カゼイｎｉｓＲＫ内にエレクトポレーション処置した。形質転換体を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）含有ＭＲＳ寒天培地上で３７℃にて選別した。プラスミドを、遺伝子組み換え形質転換体から抽出し、消化及び配列決定によって確認した。
【００４４】
ＳＩＣＥ系
・Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−サイトカイン
ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、及びｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩによって消化した。消化後に、着目の遺伝子（マウスＩＬ−２５、ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ−Ｈｉｓ）を含む断片を、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＧｒｏＥＬプラスミド内に組み込んだ。構築物を、１．５ＫＶ、４００□、２５μＦにてエレクトロポレーションによってＬ．カゼイＢＬ２３内に定着させた。形質転換体を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）含有ＭＲＳ寒天培地上で３７℃にて選択した。プラスミドを、形質転換体から抽出し、消化及び配列決定によって確認し、そして、ｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、ｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ、及びｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓと命名した。
【００４５】
・Ｌ．カゼイｐＤｎａＫ−サイトカイン
（Ｇｅｎｅａｒｔ（Invitrogen）によって合成した）ｐＭＡ−ｐｄｎａＫ−ＳＰｐ４０プラスミドを、ＢｇｌＩＩ及びＮｓｉＩによって消化した。消化後に、ｄｎａＫ遺伝子からのプロモーター及びＰ４０タンパク質（Ｌ．カゼイＢＬ２３でよく分泌されるタンパク質）のペプチドシグナルを含む断片を、ＢｇｌＩＩ／ＮｓｉＩで消化したｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、ｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、ｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ又はｐＮｉｓ−Ｎｕｃプラスミド内に組み込んだ。構築物を、Ｌ．ラクティスＭＧ１３６３内に、２，４００Ｖ、２００□、２５μＦでのエレクトロポレーションによって定着させた。形質転換体を、１％のグルコース及びクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＭ１７寒天培地上で３０℃にて選別した。プラスミドを、形質転換体から抽出し、消化及び配列決定によって確認し、そして、ｐＤｎａＫ−ＩＬ−２５、ｐＤｎａＫ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ｐＤｎａＫ−ＴＳＬＰ、ｐＤｎａＫ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ、及びｐＤｎａＫ−Ｎｕｃと命名した。
【００４６】
ＬＡＢによるナイシン誘導サイトカイン分泌
・Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−サイトカイン
サイトカインを分泌するＬ．ラクティス菌株の一晩培養物を、１％のグルコース及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地で、０．１のＯＤ600nmに希釈し、そして、０．４〜０．６のＯＤ600nmまで撹拌せずに３０℃にてインキュベートした。次に、ナイシン（Sigma）を、様々な濃度：０、１及び１０ｎｇ／ｍＬ、まで加え、そして、撹拌せずに３０℃にてインキュベートした。様々な時間（Ｔ３０分、Ｔ５時間、及びＴ２４時間）にて、１ｍＬの細菌培養物を回収し、そして、１０分間、４℃及び１００００ｒｐｍにて遠心分離した。ＥＬＩＳＡによるサイトカインの定量化のために、２μｍ濾過した上清を−２０℃にて保存した。
【００４７】
・Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−サイトカイン
使用したプロトコールは、Ｌ．ラクティスに使用したものと同一であったが、Ｌ．カゼイの特定の増殖条件を用いた。
【００４８】
ＬＡＢによるストレス誘導サイトカイン分泌
サイトカインを分泌するＬ．ラクティス菌株の一晩培養物を、１％のグルコース及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７培地で、０．１のＯＤ600nmに希釈し、そして、０．４〜０．６のＯＤ600nmまで撹拌せずに３０℃にてインキュベートする。次に、様々なストレスを、次のように加えた。
【００４９】
・塩ストレス
様々な体積のＮａＣｌの５Ｍ溶液を培養物に加えて、０、１、１．５、２、２．５、３、及び３．５％のＮａＣｌ終濃度（Ｔ０に対応）を得、そして、撹拌せずに３０℃にてインキュベートした。様々な時間（Ｔ３０分、Ｔ４時間、Ｔ５時間、又はＴ２４時間）にて、１ｍＬの細菌培養物を回収し、そして、１０分間、４℃及び１００００ｒｐｍにて遠心分離した。ＥＬＩＳＡによるサイトカインの定量化のために、２μｍ濾過した上清を−２０℃にて保存した。
【００５０】
・ヒートショック
細菌培養物を、１５分間、室温及び４７００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレットを、３０℃、３７℃、４０℃又は４３℃（Ｔ０に対応）にて予熱した培地で再懸濁し、そして、撹拌せずに様々な温度にてインキュベートした。様々な時間（Ｔ３０分、Ｔ４時間、及びＴ２４時間）にて、１ｍＬの細菌培養物を回収し、そして、４℃及び１００００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離した。ＥＬＩＳＡによるサイトカインの定量化のために、２μｍ濾過した上清を−２０℃にて保存した。
【００５１】
・酸性ｐＨストレス
細菌培養を、１５分間、室温及び４７００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレットを、様々なｐＨ、ｐＨ７又はｐＨ５、４（Ｔ０に対応）の培地で再懸濁し、そして、撹拌せずに３０℃にてインキュベートした。様々な時間（Ｔ３０分、Ｔ４時間、及びＴ２４時間）にて、１ｍＬの細菌培養物を回収し、そして、４℃及び１００００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離した。ＥＬＩＳＡによるサイトカインの定量化のために、２μｍ濾過した上清を−２０℃にて保存した。
【００５２】
ウエスタンブロット分析
ＩＬ−２５−Ｈｉｓを定量化するために、タンパク質サンプルを、２ｍＬの誘導又は非誘導培養物から調製した。遠心分離（１０分、１００００ｒｐｍ及び４℃）の後に、細胞ペレットと上清を別々に処理した。上清を、４℃にて２時間、２００μＬの１００％トリクロロ酢酸（sigma）で処理して、タンパク質を沈殿させた。これらのものを、４℃及び１３０００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離後にペレットから回収した。５サイクルの１０秒の超音波処置による細胞破壊によって、細胞分画を得た。ウエスタンブロット法を、同数の細菌に相当するサンプル、陽性対照としてのＨｉｓ−タグ付与タンパク質を用い、そして、ウサギ抗Ｈｉｓタグ（Sigma）及びヤギ抗ウサギ（P.A.R.I.S.Anticorps）を使用して実施した。
【００５３】
サイトカインの濃縮
サイトカインの濃縮を、共に２．５％のＮａＣｌを用いて誘導した、８８ｍＬのＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰの一晩培養物及び８０ｍＬのＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５の一晩培養物から、そして、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０遠心分離フィルタユニット（１０、０００ＮＭＷＬ）を使用して実施した。濃縮溶液を、ＥＬＩＳＡによって定量化した：ＩＬ−２５に関して１．５８μｇ／ｍＬ（KIT eBiosciences）又は２２μｇ／ｍＬ（KIT R&D systems）、及びＴＳＬＰに関して０．４８５μｇ／ｍＬ。各濃度に関して、細菌培養培地の陰性対照を、プラスミドが非関連タンパク質、ヌクレアーゼＮｕｃをコードするプラスミドを有するＬ．ラクティス菌株（Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ）を使用して調製した。
【００５４】
骨髄由来の樹状細胞の分離と培養
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄細胞を、無菌的に摘出し、１０％の脱補体処理したＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール５ｍＭ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（peprotech）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies）中、ペトリディッシュ内で平板培養した。１５ｍＬの培地を、３日目に加え、そして、５日目に完全に交換し、細胞を７日目に採取した。次に、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）を、５×１０5細胞／ウェル（９６穴／プレート）にて平板培養し、そして、１０％ ＣＯ2の加湿インキュベータ内で、１０％の脱補体処理したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃にて培養した。
【００５５】
ＴＳＬＰ活性試験：ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣアッセイ
ＢＭＤＣｓを、様々な濃度のＬＰＳ（非刺激又は５ｎｇ／ｍＬ）及び濃縮ｒＴＳＬＰで刺激した。市販のＴＳＬＰを０、５、１０、５０、及び１００ｎｇ／ｍＬ（Biolegend）にて加え、そして、濃縮ｒＴＳＬＰを５及び１０ｎｇ／ｍＬにて加えた。培地の陰性対照（Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃの濾過上清）を使用し、そして、濃縮ｒＴＳＬＰと共に使用した濃縮物に相当する同等なタンパク質量を加えた。刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２の定量化のために、細胞上清を採取した。
【００５６】
脾細胞の分離と培養
脾臓を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから無菌的に取り出し、そして、ＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies）中ですりつぶし、そして、単独細胞懸濁液を製造した。赤血球を、Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma）を用いて溶解した。脾細胞を、５×１０6細胞／ウェル（２４穴／プレート）にて１０％ ＣＯ2の加湿インキュベータ内で脱補体処理したＦＢＳ１０％及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃にて培養した。
【００５７】
ＩＬ−２５活性試験：脾細胞アッセイ
脾細胞を、市販のＩＬ−２５（非刺激、１、２．５、５、１０、及び２０ｎｇ／ｍＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬの濃縮ｒＩＬ−２５で刺激した。陰性対照の培地（Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃの濾過上清）を使用し、そして、濃縮ｒＩＬ−２５と共に使用した濃度に相当する同等なタンパク質量を加えた。刺激の７２時間後に、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−５又はＩＬ−１３の定量化のために、細胞上清を採取した。
【００５８】
サイトカイン（ＩＬ−２５、ＴＳＬＰ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１２）の検出
様々なＥＬＩＳＡキットを使用して、サイトカイン：ＩＬ−１２（mabTech）、ＩＬ−１３（eBioscience）、ＩＬ−５（mabTech）、ＴＳＬＰ（eBioscience）、及びＩＬ−２５（eBioscience及びR&D systems）、を定量化した。
【００５９】
統計解析
結果を、３〜６個のサンプルの平均＋／−ＳＤとして表した。スチューデントｔ検定を実施して、着目の条件と、図に示した条件ａ、ｂ又はｃとの間の統計的有意性を判定した（*、**、及び***は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を示す）。
【００６０】
結果
増殖曲線
１）ＮＩＣＥ系−通常条件
Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−サイトカイン
プラスミドｐＮｉｓ、別名ｐＳＥＣ（Bermudez-Humaran et. al. 2003 FEMS Microbiol, 224, 307-3013）は、ナイシン誘導プロモータ及び主要なＬ．ラクティス分泌タンパク質であるＵｓｐ４５タンパク質のシグナルペプチド（de Ruyter, Kuipers et al. 1996, Appl Environ Microbiol, 62, 3662-3667）を含む広範な宿主範囲を有するプラスミドｐＷＶ０１（Kok, van der Vossen et al. 1984, Appl Environ Microbiol, 48, 726-731）の誘導体である。このプラスミドは、グラム＋又はグラム−のいずれにおいても複製を可能にするＲｅｐ Ａ及びＲｅｐ Ｃ複製開始点を含む。
【００６１】
ｐＮｉｓ−サイトカインプラスミドを構築し、Ｌ．ラクティスにおいて形質転換した。配列決定による検証後、菌株の特徴づけの第１ステップは、古典的な研究室の富栄養培地：Ｍ１７における細菌増殖を測定することであった。
細菌増殖曲線を、１％のグルコース及びプラスミド含有菌株のための１０ｎｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７中、９６穴プレート内で実施した（図１）。プラスミドを含んでいない野生型Ｌ．ラクティスＮＺ９０００菌株を、陰性対照として使用した。組み換え株の細菌増殖のわずかな遅延は、培地中のクロラムフェニコール抗生物質の存在に起因する可能性があった。ＩＬ−２５、ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ−ＨｉｓをコードするｐＮｉｓプラスミドを有するＬ．ラクティス菌株の増殖における障害は、全く観察されなかった。
【００６２】
Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−サイトカイン
ｐＮｉｓ−サイトカインプラスミドを構築し、Ｌ．カゼイにおいて形質転換した。これらの菌株の細菌増殖を、９６穴プレートを使用して、１０ｎｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭＲＳ中で測定した（図２）。ｐＮｉｓプラスミドの存在により、Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−空を基準菌株となるように選択し、クロラムフェニコールを補充した複合培地中で、他の菌株のように増殖した。ＩＬ−２５又はＴＳＬＰをコードするｐＮｉｓプラスミドを有するＬ．カゼイの細菌増殖における障害は、全く観察されなかった。
【００６３】
２）ＮＩＣＥ系−ストレス条件
Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−サイトカイン
ｐＮｉｓプラスミドにおける遺伝子発現は、誘導因子としてナイシンによって制御されるので、次に、発明者らは、このバクテリオシンの存在下での細菌増殖を分析した。ｐＮｉｓ−空菌株の細菌増殖における障害は、ナイシンの存在下において（少なくとも試験した濃度において）全く観察されなかった（図３）。そのため、彼らは、我々の組み換え株にとってナイシンが毒性でないとの結論に至った。しかしながら、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ２５及びｐＮｉｓ−ＩＬ２５−Ｈｉｓ菌株の細菌増殖におけるわずかな遅延を、１ｎｇ／ｍＬ又はより高濃度のナイシンのいずれかで観察した（図４及び図５）。これらの増殖障害は、ナイシンをＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ及びｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓの培養物に追加したとき、非常に高かった（図６及び図７）。観察したように、０．１ｎｇ／ｍＬのナイシンの存在は、細菌増殖に影響がなく、ナイシンなしの細菌増殖を反映していた。より大きな増殖遅滞は、５ｎｇ／ｍＬのナイシンで観察された。１０ｎｇ／ｍＬの存在下における細菌増殖プロファイルは、５ｎｇ／ｍＬを用いて観察されたものと非常に類似していた。１ｎｇ／ｍＬのナイシンの添加は、中程度の増殖表現型を可能にする。培地中へのナイシンの添加は、細菌増殖を減速させた。この現象は他の組み換え株において頻繁に報告されたので、この減少は、産生された組み換えサイトカインの毒性による可能性がある。
【００６４】
Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−サイトカイン
発明者らは、ナイシンの存在下でＬ．カゼイｐＮｉｓ−サイトカイン菌株を用いて同じ実験をおこなった。試験した濃度におけるナイシンの存在下でのそれらの細菌増殖の欠陥が、ｐＮｉｓ−空菌株において観察され（図８）、そして、ナイシンがＬ．カゼイの増殖にとって有害性であることが示唆された。更に、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ２５及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ菌株の遅延は、１ｎｇ／ｍＬのナイシンから劇的に増大した（図９及び図１０）。
【００６５】
３）ＳＩＣＥ系−通常条件
ｐＧｒｏＥＬプラスミド（ＷＯ２０１３／１７５３５８）は、ＧｒｏＥＬタンパク質からのプロモーター、酸性ｐＨ、高熱、及び胆汁酸塩のようなストレス条件で、そして、最も重要なことには、マウスの胃腸管内で誘導されるＬ．ラクティスＭＧ１３６３タンパク質を含む広範な宿主範囲を有するプラスミドｐＷＶ０１（Kok, van der Vossen et al. 1984、前掲）の誘導体である（Kilstrup, Jacobsen et al. 1997, Appl Environ Microbiol, 63, 1826-1837; Roy, Meyrand et al. 2008, Proteomics 8, 1661-1676）。それはまた、Ｌ．ラクティスで良好に分泌されるタンパク質であるＥｘｐ４タンパク質のペプチドシグナル（Poquet, Ehrlich et al. 1998, J Bacteriol, 180, 1904-1912）、並びにグラム＋又はグラム−のいずれにおいても複製を可能にするＲｅｐ Ａ及びＲｅｐ Ｃ複製開始点も含む。このプラスミドは、ＧｒｏＥＬプロモーターの特異性のため、Ｌ．ラクティスだけで機能的である。
【００６６】
ｐＧｒｏＥＬ−サイトカインプラスミドを構築し、Ｌ．ラクティスに定着させた。配列決定によるバリデーション後に、発明者らは、ｐＮｉｓ−サイトカインプラスミドに関するように進めて、細菌増殖を測定した。細菌増殖曲線を、１％のグルコース及びプラスミド含有菌株のための１０ｎｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＭ１７中、９６穴プレート内で実施した（図１）。プラスミドを含んでいない野生型Ｌ．ラクティスＭＧ１３６３菌株を、対照として使用した。組み換え株の細菌増殖のわずかな遅延は、培地中のクロラムフェニコール抗生物質の存在に起因する可能性があった。ＩＬ−２５、ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ−ＨｉｓをコードするｐＧｒｏＥＬプラスミドを有するＬ．ラクティス菌株の増殖における障害は、全く観察されなかった。
【００６７】
４）ＳＩＣＥ系−ストレス条件
ｐＧｒｏＥＬ−サイトカインプラスミドにおける遺伝子発現はストレス条件によって制御されるので、発明者らは、次に、ストレス存在下での細菌増殖を分析した。これらのストレスアッセイを実施して、サイトカイン産生及び分泌、並びに細菌増殖の両方を分析する。
【００６８】
塩ストレス
Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰは、２．５％のＮａＣｌの存在下で類似した増殖曲線を有するので、それらの細菌増殖における同一の障害を示す（図１２及び図１４）。この増殖遅滞は、１％のＮａＣｌから観察され、塩化ナトリウム濃度が高いほど増強され、更に高いと細菌増殖が損なわれた（図１３及び図１５）。
【００６９】
ヒートショック
Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ、及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ菌株は、様々な温度条件に関して類似の増殖曲線を有する（図１６及び図１７）。３０℃、３７℃及び４０℃にて、これらの菌株の対数期は同一であるが、３７℃にて、菌株は、定常期に関してより高いＯＤ600nm値に達する。４３℃にて、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃは、同じ増殖障害を示す（図１６）。
【００７０】
酸性ｐＨストレス
Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ及びＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰは、酸性ｐＨにおいて類似の増殖曲線を有し、そして、それらの細菌増殖に同一の障害を示す（図１８）。
【００７１】
ＮＩＣＥ系を使用したサイトカイン分泌
発明者らは、様々なナイシン濃度を使用していくつかの試験を実施して、遺伝子組み換えＬＡＢによるサイトカインの産生及び分泌を測定する。サンプル（上清画分：Ｓ、及び細菌細胞溶解物：Ｃ）を、ナイシン誘導前３０分、５時間及び２４時間に採集し、そして、サイトカイン濃度を、Ｓ及びＣサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって計測した。
【００７２】
ＩＬ−２５又はＴＳＬＰのいずれかの有意なサイトカイン産生は、Ｃサンプルにおいて検出されなかった。ＥＬＩＳＡによる検出におけるこの失敗は、細菌細胞（すなわち、Ｃのサンプル）内の非分泌タンパク質形態でのシグナルペプチドの存在によって引き起こされる異なる立体構造のサイトカイン形態に起因する可能性がある。よって、発明者らは、Ｓサンプルにおけるそれらの実験に焦点を合わせる。しかしながら、また、いくつかのウエスタンブロット実験を、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによるＩＬ−２５−Ｈｉｓ産生に関して実施した。
【００７３】
・Ｌ．ラクティスによるＩＬ−２５の分泌：図１９に示すように、ＩＬ−２５のレベルは、試験した様々な時点、及び様々なナイシン濃度を用いたＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株の誘導培養物からのＳサンプルにおいて、有意な違いがなかった。よって、発明者らは、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５がこれらの条件下でＩＬ−２５を分泌しないとの結論に至った。
【００７４】
・Ｌ．ラクティスによるＩＬ−２５−Ｈｉｓの産生：次に、発明者らは、ウエスタンブロットによって、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−ＨｉｓによるＩＬ−２５−Ｈｉｓの産生及び分泌を分析した。図２０に示すように、ＩＬ−２５−Ｈｉｓは、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５−Ｈｉｓ菌株の誘導培養物からのＣサンプル中で検出されたが、Ｓ画分中では検出されなかった。同様の量のＩＬ−２５−Ｈｉｓが、３種類の異なった用量のナイシン（すなわち、１、５、及び１０ｎｇ／ｍＬ）を用いた誘導後にＣ画分中に検出された。ナイシンの不存在下、ＩＬ−２５−Ｈｉｓシグナルは検出されず、この系が厳密に調整されていることが確認された。要するに、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット実験は、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによってＩＬ−２５の分泌がないことを確認する。この現象は、Ｌ．ラクティスで産生された他の異種タンパク質に関して以前に観察されていたので、ＩＬ−２５−Ｈｉｓ組み換えサイトカインの前駆体形態の弱いプロセッシング及び分泌に起因する可能性があった。
【００７５】
・Ｌ．ラクティスによるＴＳＬＰの分泌：観察されたシグナルが、我々の陰性対照菌株：Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃの非誘導又はナイシン誘導（１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれからのＳサンプルにおいても同じレベルだったので、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ培養物からのＳサンプル中、ナイシン不存在下で、有意なＴＳＬＰ産生は検出されなかった（図２１）。際立ったことに、誘導Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ培養物からのＳサンプルは、ＴＳＬＰの明らかな産生及び分泌を示す（図２１）。ナイシンを伴った１時間のインキュベーションは、試験した２種類の用量（１及び１０ｎｇ／ｍＬ）のナイシン間にＴＳＬＰ分泌の有意差が全くないことを示す。しかしながら、タイムコース実験は、１ｎｇ／ｍｌのナイシン濃度にて、ＴＳＬＰが約５時間、培地中に蓄積し、そして、約１０００ｐｇ／ｍｌの最大濃度に達することを示した。
【００７６】
・Ｌ．カゼイによるサイトカインの分泌：検出されたＩＬ−２５（図２２）又はＴＳＬＰ（図２３）のレベルは、試験した様々な時点及び様々なナイシン濃度の存在下にて、ナイシン誘導Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−ＩＬ−２５、Ｌ．カゼイｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ、及びＬ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ培養物からのＳサンプルにおいて有意に異なっていなかった。遺伝子組み換えＬ．カゼイは、これらの条件下でＩＬ−２５及びＴＳＬＰサイトカインを分泌しない。
【００７７】
ＳＩＣＥ系を使用したサイトカイン分泌
発明者らは、様々なストレス（例えば、塩ストレス、ヒートショック、及び酸性ｐＨ）を使用していくつかの試験を実施して、ＳＩＣＥ系を使用した遺伝子組み換えＬＡＢによるサイトカインの産生及び分泌を測定する。Ｓ及びＣサンプルを、ストレス誘導前３０分、４時間、５時間及び２４時間に採取し、そして、サイトカイン濃度を、Ｓ及びＣサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって計測した。
ＮＩＣＥ系のように、ＩＬ−２５又はＴＳＬＰのいずれかの有意なサイトカイン産生は、Ｃサンプルにおいて検出されなかったので、発明者らは、ＥＬＩＳＡによって分析したＳサンプルにおいて実施した実験だけを提示した。
【００７８】
・陰性対照：Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ：Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−ＩＬ−２５（図２４）又はＬ．ラクティスｐＮｉｓ−ＴＳＬＰ（図２４）菌株のいずれかからのＳサンプルと比較したとき、Ｌ．ラクティスｐＮｉｓ−Ｎｕｃ菌株のＳ画分で弱いシグナルを観察し、ラクトコッカスタンパク質によるバックグラウンドが存在しないことを実証する。
【００７９】
・塩ストレス−Ｌ．ラクティスによるＩＬ−２５の分泌：Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５はサイトカインを分泌し、プロモーターが機能的であることを示した（図２６）。更に、検出されたＩＬ−２５のレベルは、２．５％のＮａＣｌの存在下、３０分にて３倍、４時間にて７倍ｐ２４時間にて１２倍に有意に高められた。このストレスは、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５によるＩＬ−２５の強い増大につながった。しかしながら、発明者らは、eBioscience製のこれに関するいくつかの問題の後に、R&D Systems製の別のＥＬＩＳＡキットを試験した。彼らは、R&D System製又はeBioscience製のＥＬＩＳＡによって同じサンプルにおいて計測した濃度で２０倍（以上）の違いを得た。彼らは、以降の結果にＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔを使用した。検出されたＩＬ−２５のレベルは、先の結果と同じプロファイル：経時的な分泌／細菌の減少、しかし、２０〜３０倍高い濃度値、を有する（図２７及び図２６）。３０分にて、発明者らは、２．５％を除くＮａＣｌの存在下で、ＩＬ−２５分泌の有意な強化を観察した。４時間、２４時間、及び３％の３０分にて、サンプル希釈は十分でなかった。得られた値は、標準を超えていたので、過小評価した。しかしながら、そして論理的に、これらの値はグラフに示したより高く、塩ストレス後のＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５によるＩＬ−２５分泌の増大を実証している。もう１回、発明者らは、サンプルを十分希釈しなかった（図２８）。しかしながら、塩ストレスは、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＩＬ−２５−ＨｉｓによるＩＬ−２５−Ｈｉｓ分泌の強い増大（２／４倍）をもたらした。
【００８０】
・塩ストレス−Ｌ．ラクティスによるＴＳＬＰの分泌：Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰはＴＳＬＰを分泌でき、そのプロモーターの開始を実証した（図２９）。ＥＬＩＳＡによって検出されたＴＳＬＰのレベルは、非刺激Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰによる分泌と比較して、ＮａＣｌの存在下でわずかに増大した（１．５倍）。
【００８１】
・ヒートショック−Ｌ．ラクティスによるＩＬ−２５及びＩＬ−２５−Ｈｉｓの分泌：次に、発明者らはヒートショックによる分泌誘導を試験した。まず、彼らは、３０℃、並びに３０分及び４時間にて等量のＩＬ−２５及びＩＬ−２５−Ｈｉｓを検出し、Ｌ．ラクティスによるＩＬ−２５とＩＬ−２５−Ｈｉｓとの間の類似した分泌を示した（図３０）。彼らはまた、ヒートショックの３０分後に、３７℃及び４３℃にて分泌の増大について観察した。しかしながら、この増大は、ヒートショックの４時間後には観察されなかった。
【００８２】
・ヒートショック−Ｌ．ラクティスによるＴＳＬＰの分泌：よって、発明者らは、ヒートショック後のＴＳＬＰ分泌を試験した。彼らは、Ｌ．ラクティスによる、ヒートショックの３０分及び４時間後の、３７℃及び４０℃でのこの分泌のわずかに増大を示した（図３１）。
【００８３】
・ヒートショック−Ｌ．カゼイによるＩＬ−２５の分泌：プラスミドｐＤｎａＫは、ＤｎａＫからのプロモーター、酸性ｐＨ及び胆汁酸塩のようなストレス条件で誘導されるＬ．カゼイＢＬ２３タンパク質を含む広範な宿主範囲を有するプラスミドｐＷＶ０１（Kok, van der Vossen et al. 1984、前掲）の誘導体である。それはまた、Ｌ．カゼイの分泌タンパク質であるＰ４０タンパク質のペプチドシグナル、並びにグラム＋又はグラム−のいずれにおいても複製を可能にするＲｅｐ Ａ及びＲｅｐ Ｃ複製開始点も含む。このプラスミドは、ＤｎａＫプロモーターの特異性により、Ｌ．カゼイでのみ機能的である。発明者らは、陰性対照であるＬ．カゼイｐＤｎａｋ−Ｎｕｃの上清においてＩＬ−２５の強い検出を観察した。それらは、実験の高いバックグラウンドのためＩＬ−２５分泌を示さず、Ｌ．カゼイのＳＩＣＥ系におけるこのサイトカインの産生又は分泌の問題を示唆した。次に、発明者らは、そのサイトカイン産生及び分泌が、これらの菌株において、塩（１％のＮａＣｌ）又はヒートショック（３７及び４２℃）ストレスのいずれかの後に増大することを実証した。際立ったことに、それらは、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによって産生及び分泌されたサイトカインの生物学的活性を示した。
【００８４】
サイトカイン活性試験
次の、そして、最も重要なステップは、Ｌ．ラクティスによって分泌されたサイトカインの生物学的活性の検証によって組み換え菌株を正当であると確認することであった。
【００８５】
・ＩＬ−２５活性試験：Rickelらは、脾細胞による、これらの細胞がＩＬ−２５によって刺激されたときの、ＩＬ−５及びＩＬ−１３分泌を示した（Rickel, Siegel et al. 2008, J Immunol, 181, 4299-4310）。この文献に基づいて、発明者らは、脾細胞を市販のＩＬ−２５又は遺伝子組み換え、且つ、濃縮したＩＬ−２５で刺激した。刺激の７２時間後に、彼らは細胞上清を回収し、そして、彼らは、これらのサンプル中のＩＬ−５及びＩＬ−１３濃度を計測した。図３３及び３４に示したように、且つ、予想したように、非刺激条件と比較して、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ（陰性対照）の濃縮上清を用いた刺激細胞において、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の両方の任意の有意な分泌は、観察されなかった。しかしながら、発明者らは、市販のＩＬ−２５を用いた刺激後に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３分泌の増大を検出し、そして、この増大は、用量依存的であった（図３３及び３４）。彼らはまた、現行の遺伝子組み換えＩＬ−２５を用いた刺激後にＩＬ−５及びＩＬ−１３分泌の増大を実証し、遺伝子組み換えＬ．ラクティスによって産生されたＩＬ−２５の生物学的活性を実証した。
【００８６】
・ＴＳＬＰ活性試験：Taylorらは、ＴＳＬＰ刺激後のＬＰＳ刺激ＢＭＤＣｓによるＩＬ−１２分泌の減少を示した（Taylor, Zaph et al. 2009, J Exp Med, 206, 655-667）。これらの結果に基づいて、発明者らは、市販のＴＳＬＰ、及び現行の遺伝子組み換え体、並びにＬ．ラクティスによって産生された濃縮ＴＳＬＰを用いて、ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣｓアッセイを実施した。刺激の２４時間後に、彼らは細胞上清を回収し、そして、我々は、サンプル中のＩＬ−１２濃度を計測した。発明者らは、彼らがＬ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−Ｎｕｃ（陰性対照）の濃縮上清で細胞を刺激したとき、非刺激条件と比較して、ＩＬ−１２の有意な分泌を観察した（図３５）。彼らは、市販のＴＳＬＰを用いた刺激後にＩＬ−１２分泌の減少を検出し、この減少は、用量依存的であった。彼らは、我々の遺伝子組み換えＴＳＬＰを用いたＩＬ−１２分泌の有意な減少を示し、ＴＳＬＰの生物学的活性を実証した。よって、彼らは、Ｌ．ラクティスｐＧｒｏＥＬ−ＴＳＬＰ菌株を正当であると確認した。
【００８７】
Ｌ．ラクティスによって分泌されたこれらのサイトカインは、生物学的に活性である。Ｌ．ラクティスによって分泌されたＩＬ−２５は、脾細胞を刺激できる。確かに、これらの細胞は、我々の遺伝子組み換えＩＬ−２５又は「市販」のＩＬ−２５のいずれかによる刺激の７２時間後に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を分泌する。そのうえ、Ｌ．ラクティスによって分泌されたＴＳＬＰは、ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣｓによるＩＬ−１２分泌の減少を誘導し、我々の遺伝子組み換えＴＳＬＰは、それがＢＭＤＣｓと相互作用し得る場合に、生物学的に活性であることを示した。これらの実験は、発明者らがこれらの遺伝子組み換え菌株が正当であると確認することを可能にした。
これらの有望な結果は、インビボにおいてＩＬ−２５及びＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬ．ラクティスの免疫調節性及び予防効果の評価に向かうステップを示す。
【００８８】
２種類の化学的に誘導した大腸炎のマウスモデルにおける、ｍｕＩＬ−２５及びｍｕＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株の免疫調節性及び予防特性の評価
候補細菌又は分子のいずれかの有益効果を判定するために、大腸炎の様々な化学的誘導マウスモデル（例えば、ＴＮＢＳ、ＤＮＢＳ、ＤＳＳ、ＩＬ−１０ＫＯなど）が、発明者らの研究室で現在使用される。彼らは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）又はジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）によって化学的に誘導された大腸炎の２種類のマウスモデルを使用すると決めた。
【００８９】
実際には、ＤＳＳは、出血性下痢、潰瘍形成、及び顆粒球浸潤を特徴とする大腸炎を誘導する。この分子は、消化管上皮細胞の基底腺窩に直接影響し、そのため粘膜関門の健全性に影響することが知られている。ＤＳＳ大腸炎モデルは、大腸炎の生得の免疫機構の貢献を試験及び特徴づけするのに特に有用である。対照的に、ＤＮＢＳ誘導大腸炎モデルは、Ｔヘルパー細胞依存性粘膜免疫応答を把握するために使用される。ＤＮＢＳは（粘膜関門を混乱させる）エタノール中で調製される一方で、ＤＮＢＳは結腸の自己又は複合微生物系タンパク質をハプテン化し、宿主免疫系に対してそれらを免疫原にし、炎症をもたらす。
両方のモデルは、異なる経路によって駆動されるので、よって、我々の組み換え株の作用機構を我々が把握する手助けとなる。
【００９０】
実施例２：インビボにおいてＴＳＬＰを発現する遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株の免疫調節性及び予防効果の評価
概要
炎症プロセスにおけるＴＳＬＰの役割を理解するために、発明者らは、ＴＳＬＰを産生するラクトコッカス・ラクティス菌株（ＬＬ−ＴＳＬＰ）を構築し、マウスの大腸炎モデルに対するその投与の効果を調査した。ＬＬ−ＴＳＬＰを用いた処置は、健常なマウスにおいてＴ細胞によって分泌されるＴＧＦ−βの量を増大した。急性大腸炎では、ＬＬ−ＴＳＬＰは、疾患活動性指数を遅らせ、且つ、組織学的スコア及びＩＮＦ−γ産生を低下させた。ＤＳＳ回復モデルでは、ＬＬ−ＴＳＬＰは、菌株を大腸炎開始時に投与した場合にだけ、防御効果を引き起こした。大腸炎４日目では、我々は、ＬＬ−ＴＳＬＰによるＴregの誘導を観察した。ＴＳＬＰは、大腸炎における抗炎症性の保護的役割を示した。発明者らは、短期及び早期のＬＬ−ＴＳＬＰ投与が持続的な処置より効果的であることを実証した。そのため、ＬＬ−ＴＳＬＰの経口の投与は、ＩＢＤの症状を緩和する有望なストラテジーになり得る。
【００９１】
材料と方法
マウス実験
少なくとも７日間の順化後に、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実験の全期間を通じて、ＰＢＳ又は１０9〜５×１０9コロニー形成単位のＬＬ−ＷＴ若しくは又はＬＬ−ＴＳＬＰを毎日給餌した。Ｄ０では、４日間（ＤＳＳ短期）又は７日間（ＤＳＳ急性及びＤＳＳ回復）、３６，０００〜５０，０００（ＭＰＢｉｏ）の分子量で２．５％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）を飲料水に加えることによって、大腸炎を誘導した。マウスを、ＤＳＳ誘導後、Ｄ４（ＤＳＳ短期）、Ｄ７（ＤＳＳ急性）又はＤ１２（ＤＳＳ回復）のいずれかにて屠殺した。ＤＳＳ回復に関して、ＤＳＳ大腸炎誘導には、通常の飲料水を用いた５日間の回復が続いた。対照ＤＳＳとして、マウスに１２日間、ＤＳＳ誘導を含まない給餌をした。マウスを、体重減少、大便の硬さ、及び便潜血について毎日観察した（Hemoccult, Beckman Coulter）。疾患活動性指数（ＤＡＩ）を、１９９３年にクーパーらによって公開されたプロトコール（Lab Investig, 69, 238-249）に従って計算した。マウスを、頸椎脱臼によって屠殺し、そして、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）並びに結腸を摘出した。
【００９２】
誘導リンパ球のインターロイキン産生
マウスから単離したＭＬＮを潰し、そして、濾過した（７０μｍ、BD biosciences）。濾液中のリンパ球を、フローサイトメトリー（Accuri C6）によってカウントし、２５×１０6細胞／ｍＬにて、１００単位のストレプトマイシン・ペニシリン、PAA Laboratories、及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Lonza）を伴った培地（ＲＰＭＩ、Lonza）中に再懸濁した。細胞溶液を、０．５％のＦＣＳを含むＰＢＳ中、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、４μｇ／ｍＬのそれぞれの抗体（eBioscience）と共に４時間プレインキュベートした２４穴プレート（Costar）に加えた。そのプレートを、３７℃、５％のＣＯ2にて４８時間インキュベートし、そして、サイトカインレベルをＥＬＩＳＡ（Mabtech）によって評価した。
【００９３】
組織学的評価
組織学的評価に関して、最も炎症が起きていた領域に位置する結腸サンプルを、４％のパラホルムアルデヒド酸（sigma）中で固定し、パラフィン内に包埋した。４マイクロメートルの切片を、ヘマトキシリン／エオシン染色し、Ａｍｅｈｏ基準に従ってブラインド試験した。
【００９４】
制御性Ｔ細胞（Ｔreg）の計数
潰したＭＬＮ濾液から１０6個の細胞を取り出した。Ｔreg細胞を、マウス制御性Ｔ細胞染色キット１（eBioscience）を使用してＣＤ４、ＣＤ３２、及びＦｏｘＰ３について染色した。細胞サンプルは、フローサイトメトリー（BD Accuri）を通して流し、ＣＤ４陽性細胞の中でＣＤ３２及びＦｏｘＰ３に関して二重陽性細胞をカウントした。
【００９５】
統計値
すべての統計値及びグラフを、Ｐｒｉｓｍ−ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）で実施した。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。統計的有意性は、チャートに関してＭａｎｎ−Ｗｉｔｈｎｅｙ検定によって、及び曲線に関してはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴った二元配置分散分析によって測定した*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．００１。
【００９６】
結果
ＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与は、健常なマウスの腸間膜リンパ節からの活性化細胞によるＴＧＦ−β分泌を誘導した
マウスに対するＴＳＬＰの腸粘膜投与の基本効果を評価するために、２群（ｎ＝８）の健常な動物に、経口経路によってＬＬ−ＷＴ又はＬＬ−ＴＳＬＰを与えた。体重及びＤＡＩを毎日観察し、そして、スコア化した。発明者らは、これらのスコアの違いを目にすることはなく、マウスの生理学変化は示さなかった（データ未掲載）。１４日間の処置後に、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を摘出し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ−２８抗体を用いて細胞を活性化した。発明者らは、ＬＬ−ＷＴ（図３６−Ａ）を経口的に投与したマウスと比較して、マウスがＬＬ−ＴＳＬＰを与えられたとき、有意に（Ｐ＜０．０５）高いＴＧＦ−βの分泌を検出した。彼らは、細胞上清中のＩＬ−５、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１７濃度において少しも有意な変化は観察されなかった（図３６−Ｂ、Ｃ、及びＤ）。ＩＬ−１０に違いは見られなかった（データ未掲載）。腸管腔内の遺伝子組み換えＬ．ラクティスによるＴＳＬＰ送達は、ＴＧＦ−β分泌を引き起こすことができる。
【００９７】
ＬＬ−ＴＳＬＰは急性炎症を低減する
腸炎症に対する局所的投与の影響を判定するために、発明者らは、最初に、我々が大腸炎誘導前７日間及び誘導中にＬＬ−ＴＳＬＰ又はＬＬ−ＷＴを経口的に投与した、マウスの急性ＤＳＳ誘導大腸炎モデルを完成させた。彼らは、２群のマウスに関して体重減少の違いは観察されなかった（図３７−Ａ）。ＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与は、Ｄ４にてＤＡＩを有意に減少させ、ＴＳＬＰ分泌Ｌ．ラクティスが大腸炎の臨床徴候、特に糞便の軟化及び出血、を遅らせたことを示した（図３７−Ｂ）。７日間の炎症後に、結腸組織を取り除いて、いくつかの炎症マーカーを分析した。組織学的スコアは、ＴＳＬＰの存在下で低下し（図３７−Ｃ及びＤ）、ＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与による腸上皮の保護を実証した。結腸洗浄液中の炎症誘導性サイトカインＩＦＮ−γの濃度もまた、ＬＬ−ＴＳＬＰを用いた経口処置後に減少した（図３７−Ｅ）。発明者らが、これらの結腸洗浄液中で、炎症誘導性ＩＬ−１２及び抗炎症性ＩＬ−１０の濃度において少しも違いが検出されなかった（データ未掲載）、彼らはまた、ＭＬＮｓからの活性化細胞の上清中の有意ではないが（ｐ＝０．０５３）、ＴＧＦ−βの増大を観察した。２つの条件間で、ＭＬＮｓからの活性化細胞の上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１７又はＩＬ−２２濃度における違いは検出されなかった（データ未掲載）。
【００９８】
ＴＳＬＰは、炎症の開始においてＤＡＩを減少させたが、回復期には減少させなかった
治癒プロセスにおけるＴＳＬＰの関与を試験するために、発明者らは、急性炎症実験に続いて、５日間の水から成る回復期を実施した。２群のマウスを、炎症並びに回復期間に並行して、大腸炎の７日前に、ＬＬ−ＷＴ又はＬＬ−ＴＳＬＰで処置した。経口ＴＳＬＰ投与は、体重減少を軽減することなく、そしてそれは、２群のマウス間で約２０％であったが（図３８−Ａ）、先に見たように、ＬＬ−ＴＳＬＰは、炎症の早期（Ｄ４）にＤＡＩを有意に（Ｐ＜０．０１）減少させ（図３８−Ｂ）、ＴＳＬＰが後期炎症及び回復期に効果がないことを示唆する。
【００９９】
炎症早期におけるＴＳＬＰ送達は、体重減少及びＤＡＩを減少させた
早期の大腸炎に対するＴＳＬＰの効果を正当であると確認するために、発明者らは、ＬＬ−ＷＴ、ＬＬ−ＴＳＬＰで処置したマウス群、並びにＤ−７からＤ４までのＬＬ−ＴＳＬＰ経口投与とそれに続く、Ｄ５からＤ１２までのＬＬ−ＷＴの経口投与に相当する、ＬＬ−ＴＳＬＰフェーズ１と呼ばれる第三の群に対して、急性炎症とそれに続く回復期を実施した（図３９−Ａ）。先に示したように、ＬＬ−ＴＳＬＰ条件とＬＬ−ＷＴ条件との間の体重減少の違いは有意でなかった。彼らは、マウスに早期ＴＳＬＰ送達を与えたときに体重減少の低下を観察し、そしてそれは、ＬＬ−ＷＴ条件と比較して、Ｄ１１及びＤ１２にて有意に（それぞれＰ＜０．０１及びＰ＜０．００１）異なっていた（図３９−Ｂ）。更に、発明者らは、ＬＬ−ＷＴ ＤＡＩと比較して、Ｄ５及びＤ７にて有意な（Ｐ＜０．０５）違いがある、ＬＬ−ＴＳＬＰフェーズ１群におけるＤＡＩの増大の低下を観察した（３９図−Ｃ）。組織学的スコアは、ＬＬ−ＷＴ群と比較し、ＬＬ−ＴＳＬＰフェーズ１群において有意に低下したが、ＬＬ−ＴＳＬＰ群ではそうではなかった（図３９−Ｄ）。Ｄ１２では、ＭＬＮからの細胞は活性化したが、我々には、３種類の細菌処置の間でこれらの細胞上清中のＴＧＦ−β分泌の少しの違いも検出されなかった（図３９−Ｅ）。しかしながら、発明者らは、ＬＬ−ＷＴ又はＬＬ−ＴＳＬＰフェーズ１と比較して、ＬＬ−ＴＳＬＰ投与を用いた、ＩＬ−１７分泌の有意な（Ｐ＜０．０１）減少に気付いた（図３９−Ｆ）。これらの結果は、ＴＳＬＰを炎症の早期で送達したときの、一部の大腸炎症状の減少／改善を実証する。
【０１００】
ＴＳＬＰは、大腸炎の早期におけるＴreg増殖を誘導する
大腸炎の早期に対するＴＳＬＰの効果を理解するために、発明者らは、大腸炎の４日目及び１２日目にＭＬＮのＴreg割合を分析した。４日目において、対照ＬＬ−ＷＴと比較して、マウスにＬＬ−ＴＳＬＰを給餌したとき、ＣＤ４＋集団中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３ Ｔregのパーセンテージは有意に高かった（図４０−Ａ）。この違いは、Ｄ４にＬＬ−ＴＳＬＰ処置マウスとＬＬ−ＷＴとの間で観察されたＤＡＩスコアの違いと合致した（データ未掲載）。ＣＤ４＋集団中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３ Ｔregのパーセンテージにおける違いは、１２日目に３つの群の間で観察されなかった（図４０−Ｂ）。
【０１０１】
考察
この試験では、大腸炎の処置におけるＴＳＬＰの腸粘膜投与の効果を、遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株ＬＬ−ＴＳＬＰを使用して調査した。炎症に対するＴＳＬＰの潜在的保護効果を更に理解するために、発明者らは、可溶性の機能的なＴＳＬＰを産生する乳酸菌（ＬＡＢ）の経口投与による腸粘膜レベルへのＴＳＬＰ送達のためのストラテジーを開発した。彼らは、ＴＳＬＰを産生するラクトコッカス・ラクティス菌株、ＬＬ−ＴＳＬＰを構築し、そして、特徴づけした。健常なマウスにおける２週間のＬＬ−ＴＳＬＰ経口投与後に、彼らは、腸間膜リンパ節からの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激細胞におけるＴＧＦ−β産生の増大を観察した。急性ＤＳＳ誘導炎症モデルにおいて、彼らは、７日間のＤＳＳの後、ＬＬ−ＴＳＬＰで処置したマウスのＤＡＩが、体重減少の変化がないもかかわらず、７日間の炎症中に低くなる傾向があることを示した。彼らは、Ｄ４にてこのスコアの有意な低下を観察し、大腸炎開始時の臨床徴候、特に糞便の軟化及び出血、を遅らせるＬＬ−ＴＳＬＰの能力を実証した。更に、彼らは、組織学的スコアによって計測される結腸組織健全性が、ＴＳＬＰ処置マウス内では障害されにくいことを示した。ＬＬ−ＴＳＬＰの経口投与は、炎症誘導性サイトカイン、ＩＦＮ−γの分泌を低減し、ＬＡＢによって分泌されるＴＳＬＰが化学的処置によって誘導された損傷から腸管上皮を保護し、そして、炎症を調節することを示した。
【０１０２】
回復期中のＬＬ−ＴＳＬＰの効果を評価するために、発明者らは、急性大腸炎モデルに続いて、５日間の寛解を実施した。すべて実験（炎症＋回復期）に並行して、ＴＳＬＰをＬＬ−ＴＳＬＰによって送達した。それらは、５日間の水の後に、体重減少及び組織学的スコアに少しの違いも示さなかったが、我々は、炎症のＤ４において早期のＤＡＩの減少を確認した。回復期は複雑なプロセスであるため、ＴＳＬＰの添加は、炎症マーカーの減少又は腸管上皮修復を加速するのに十分でないように思える。
【０１０３】
次に、発明者らは、ＬＬ−ＴＳＬＰを用いた早期処置が炎症マーカーを低減するのに十分であり得ると仮定した。Ａ群のマウスに、大腸炎の誘導前の７日間及び誘導後の４日間、ＬＬ−ＴＳＬＰを与え、続いて、実験終了までＬＬ−ＷＴを与えた。Ｄ４までの、早期の管腔におけるＴＳＬＰ送達は、ＬＬ−ＷＴと比較して、体重減少を低減させ、及びＤ１１及びＤ１２において体重増加を有意に増強した。そのうえ、それは、ＤＡＩを遅らせ、且つ、減少させ（Ｄ５及びＤ７にて有意）、及び組織学的スコアを低減した。そのため、発明者らは、疾患の遅延、並びに低い重症度によって実証されたとおり、短期、且つ、早期のＴＳＬＰ処置が、より長期の処置に比べて、大腸炎に対する優れた保護を可能にしたと結論づけた。
【０１０４】
ＴＳＬＰの添加が炎症の早期において結腸保護につながる機構を把握するために、発明者らは、Ｄ４においてマウスを屠殺した。このとき、彼らは、ＬＬ−ＴＳＬＰで処置したマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のより高い割合を観察し、疾患発生の遅延におけるＴreg細胞の役割を示唆した。ヒトでは、ＴＳＬＰで成熟させたＤＣは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の増殖及び分化を誘導することができる。
【０１０５】
発明者らは、管腔へのＴＳＬＰの添加が、疾患の遅延につながるＴreg細胞の数の上昇によって腸の恒常性の促進を可能にすると仮定した。ＴＳＬＰの放出は、Ｔreg分化に対して直接的又は間接的に作用する可能性がある。確かに、ＴＳＬＰは、数種類のクローディン及びオクルジンを増強することによって肺上皮細胞のタイトジャンクションを補強できる。このように、ＴＳＬＰは、腸上皮の健全性を保護し、且つ、上皮細胞によるレチノイン酸及びＴＧＦ−βの放出、並びにＴreg増殖を増強し得る。
【０１０６】
最後に、ＴＳＬＰ発現は、クローン病患者の結腸組織において低減し、そして、これらの患者が胃腸内の寛容原性ＤＣｓを促進しないことに関連し得る。小腸上皮細胞によるＴＳＬＰ分泌は、共生細菌及びプロバイオティクス細菌に依存し、且つ、それらによって調整される。クローン病に対する新規処置法は、糞便の移植である。将来、腸の恒常性及びより長い寛解期間を促進するために上皮細胞によるＴＳＬＰ分泌を増強できる、プロバイオティクスを用いてＴＳＬＰ発現を回復するか又は実際の処置を完成させる糞便の移植を標的とすることは、非常に興味深いことであり得る。
【０１０７】
実施例３：インビボにおける、ＩＬ−２５を発現する遺伝子組み換えＬ．ラクティス菌株の免疫調節性及び予防効果の評価
並行して、発明者らは、ＬＬ−ＴＳＬＰ菌株及び別のもの：ＤＮＢＳモデル、を用いて樹立した様々なマウス大腸炎モデルにおける、ＬＬ−ＩＬ−２５菌株の効果を試験するために、同一の実験（実施例２の材料と方法を参照）を実施した。急性ＤＳＳ誘導大腸炎中、ＬＬ−ＩＬ−２５はまた、大腸炎の開始時に処置された炎症を起こしているマウスにおいて臨床徴候を遅らせることもできた。発明者らは、ＬＬ−ＩＬ−２５がＴｈ２反応を強力に誘導することを観察した。このプロジェクト開始時に、彼らは、Ｔｈ２反応を誘導することが、マウスにおけるＴｈ１又はＴｈ１７誘導大腸炎を軽減し得ると仮定した。しかしながら、彼らは、Ｔｈ２誘導因子サイトカイン（ＩＬ−２５）を分泌するＬ．ラクティス菌株は、この応答を駆動できるが、炎症からマウスを保護するには十分でないことを観察した。
【０１０８】
ＤＳＳモデルは、先天性免疫応答を特徴づけるために頻繁に使用される。この理由で、発明者らは、別の炎症モデル：Ｔｈ１炎症を駆動することが知られているＤＮＢＳ誘導大腸炎、を試験することを決めた。彼らは、マウスにおける直腸内ＤＮＢＳ注射によって炎症を誘導した。またしても、炎症が重症過ぎたので、数匹のマウスが死滅した。彼らには、ＩＬ−２５分泌菌株を給餌した群の死滅は観察されず、ＬＬ−ＷＴを給餌した群と比較してＬＬＩＬ−２５の保護的役割を示唆している。そのうえ、ＬＬ−ＩＬ−２５の強制給餌は、Ｄ１におけるより少ない体重減少を可能にし、さらに、結腸組織のよりわずかな肥大も観察され、炎症の軽減におけるＬＬ−ＩＬ−２５の重要な役割を示唆している。結論として、これらの最初の予備的な結果は、非常に有望である。
【０１０９】
表１：この試験に使用した菌株及びプラスミド
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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