(57)【要約】  本発明は、処置の方法において使用するための非晶質の金属有機構造体を提供する。非晶質の金属有機構造体は、送達する成分を保持しうる。非晶質の金属有機構造体は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を非晶質化することにより取得される又は取得可能である。非晶質の金属有機構造体は、ジルコニウム含有又はビスマス含有金属有機構造体、たとえば、ベンゼンジカルボキシレート配位子等のアリールカルボキシレート配位子を有する構造体である場合がある。
2018522860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により薬学的に許容される1種又は複数の含有物と共に提供される、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である成分を保持する非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物。
【請求項２】
医学的処置の方法において使用するための、非晶質の金属有機構造体、又は前記非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物であって、前記非晶質の金属有機構造体は成分を保持し、前記成分は医学的処置の方法において使用する活性薬剤である、非晶質の金属有機構造体、又は前記非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物。
【請求項３】
医学的処置の方法において使用するための、非晶質の金属有機構造体、又は前記非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物であって、前記非晶質の金属有機構造体は成分を保持し、前記成分は医学的処置の方法において使用する活性薬剤であり、前記処置の方法は前記非晶質の金属有機構造体からの前記成分の持続放出を含む、非晶質の金属有機構造体、又は前記非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物。
【請求項４】
成分を目標の場所に送達する方法であって、
(i)目標の場所において、成分を保持している非晶質の金属有機構造体を提供する工程と、
(ii)前記非晶質の金属有機構造体からの前記成分の放出を可能にし、それによって前記目標の場所において前記成分を提供する工程と
を含む方法。
【請求項５】
成分を保持する非晶質の金属有機構造体であって、前記成分が分子状ヨウ素(I2)でない成分、たとえば、分子量が少なくとも100である、成分を保持する非晶質の金属有機構造体。
【請求項６】
前記金属有機構造体がジルコニウム含有金属有機構造体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項７】
前記ジルコニウム含有金属有機構造体がベンゼンジカルボキシレート配位子を有する、請求項6に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項８】
前記ベンゼンジカルボキシレート配位子が1,4-ベンゼンジカルボキシレート配位子である、請求項7に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項９】
前記金属有機構造体がUiO-66、NU-1000、又はNU-901、たとえばUiO-66である、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１０】
前記金属有機構造体がビスマス含有金属有機構造体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１１】
前記金属有機構造体がCAU-7である、請求項10に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１２】
前記成分が3個以上の原子を有する、請求項1から11のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１３】
前記成分が1個又は複数の炭素原子を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１４】
前記成分が、少なくとも255の分子量を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１５】
前記非晶質の金属有機構造体が、前記成分を保持する結晶質の金属有機構造体を非晶質化することにより取得される又は取得可能である、請求項1から14のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１６】
前記非晶質化が、前記成分を保持する結晶質の金属有機構造体のボールミル粉砕である、請求項15に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項１７】
前記目標の場所が、細胞内、たとえばex vivoの細胞内にある、請求項4に記載の方法。
【請求項１８】
目標の場所において前記非晶質の金属有機構造体を提供する前記工程が、前記非晶質の金属有機構造体を細胞壁、たとえば、真核細胞壁を貫通させることを含む、請求項4又は請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記非晶質の金属有機構造体が、塩基、たとえば、生理的pHの塩基水溶液等の塩基水溶液で処理されると前記成分を放出する、請求項4に記載の方法。
【請求項２０】
前記成分が水性相に放出される、請求項4に記載の方法。
【請求項２１】
最初の放出から48時間後に、前記成分の50%以下が、前記非晶質の金属有機構造体から放出可能である又は放出される、請求項1から20のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項２２】
前記成分の少なくとも80%が前記非晶質の金属有機構造体から放出される又は放出可能である、たとえば、最初の放出から30日後に、前記成分の少なくとも80%が前記非晶質の金属有機構造体から放出される又は放出可能である、請求項1から21のいずれか一項に記載の医薬組成物、非晶質の金属有機構造体、又は方法。
【請求項２３】
非晶質の金属有機構造体内に保持される、処置の方法において使用するための活性薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る研究は、European Union's Seventh Framework Programme(FP7/2007-2013)/ERC助成契約番号227781のもと、European Research Councilより財政的支援を受けている。
【０００２】
関連出願
本件は、2015年6月24日出願のGB1511125.5の優先権及びその権益を主張し、同出願の内容は、ここにその全体が参照により援用される。
【０００３】
本発明は、非晶質の金属有機構造体(amorphous metal-organic framework)、及び処置の方法におけるその使用を提供する。また、非晶質の金属有機構造体の調製方法、及び非晶質の金属有機構造体から成分を送達する方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
医学的処置の方法では、通常、生物活性化合物が使用される。化合物は、生物学的活性を有する場合もあるが、それでもなお、療法における使用にとって理想的に適しているわけではない場合もある。たとえば、化合物は、不十分な溶解性や選択的でない体内分布に煩わされる場合もあり、その結果、健常組織の損傷及び心臓毒性作用が生じることも多い(Mengら、Erttmannら、及びShanらを参照されたい)。
【０００５】
薬物送達システム(DDS)は、生体活性化合物の溶解性を向上させ、活性薬剤を分解から保護し、生体活性物のin vivoでの放出を制御し、標的化送達を実現し、毒性の副作用を低減することにより、こうした課題を克服することができる。
【０００６】
治療薬のための有効な薬物送達システムを見つけることは、生物工学において現在も進行中の課題である。最近では、金属有機構造体(metal-organic framework: MOF)が、その有用な化学的及び物理的特性により、薬物送達システムで使用される候補として浮上している。たとえば、金属有機構造体は、高い細孔容積、大きい表面積、多様なトポロジー、並びに調整可能な孔径及び表面化学を有することが知られている(Keskinら及びHorcajadaらを参照されたい)。
【０００７】
金属有機構造体は、有機配位子と相互に連結する配位中心として働く金属イオン又は金属クラスターから、自己集合プロセスによって調製される。得られる生成物は、明確な結晶質構造を有する。
【０００８】
金属有機構造体は、活性薬剤をその細孔構造内へと効率よく吸着させることによって被包することができる。たとえば、Horcajadaらは、異なる抗がん薬と抗ウイルス薬を金属有機構造体内にローディングしており、Morrisらは、金属有機構造体で、血管拡張薬である一酸化窒素ガス(NO)を被包及び送達しており、Heらは、金属有機構造体を抗がん性のシスプラチンと低分子干渉RNAの同時送達に使用して治療効果を高めることを報告している。ここで、siRNAは明らかに外表面上で金属部位に配位している。この状況では、明らかに、金属有機構造体の内部の多孔性はローディングに使用されていない。
【０００９】
他の有機(たとえば、リポソームやミセル)及び無機(たとえば、ゼオライトやメソポーラスシリカ)薬物送達システムと比べて、金属有機構造体は、高いローディング容量を有しており、またこの構造体は、生体活性物に対する親和性を高めるように、また構造体に特定の細胞型を標的とさせるように、容易に機能付与することもできる。
【００１０】
本発明者らは、この程、コンピューターによるスクリーニング研究について記載しており、その結果から、金属有機構造体が、多孔性固体構造物1グラムあたり2グラムまでの生体活性物を被包しうることが示された。これは、メソポーラスシリカ及び有機担体について報告されているローディング容量よりも高いローディング容量である。これらは、最大容量が、材料1mgあたり0.25〜0.30mgの薬物であるとされている(Berniniら及びJin-gouらを参照されたい)。
【００１１】
金属有機構造体の工業的な使用は、構造体の安定性が相対的に不十分であるせいで、往々にして限定されてきた。更に、薬物送達システムという状況の枠内で、金属有機構造体が呈する被包された生体活性物の動的送達は、非常に迅速である。たとえば、MIL-53金属有機構造体からのカフェインの急速放出について記載しているCunhaらを参照されたい。生体活性化合物の急速な放出が臨床環境内で常に望ましいとは限らず、活性薬剤の制御、持続、及び緩徐放出がより適切である場合もある。
【００１２】
Cunhaらは、カフェイン及びイブプロフェンを閉じ込めるための、UiO-66を主体とする結晶質のジルコニウム系金属有機構造体の使用についても記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Bennettら(Chem.-Eur. J.、2013、19、7049)
【非特許文献２】Bennettら(Chem. Commun. 2011、47、7983)
【非特許文献３】Rieterら(J. Am. Chem. Soc. 2008、130、11584)
【非特許文献４】Chapmanら(J. Am. Chem. Soc. 2011、133、18583)
【非特許文献５】Zhuoら(Plasma Chem. Plasma Process 2011、31、499)
【非特許文献６】Gimenez-Marquesら(Coordination Chem. Rev. 2016、307、342)
【非特許文献７】「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、2000、Lippincott, Williams & Wilkins
【非特許文献８】Handbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、1994
【非特許文献９】Heら(J. Am. Chem. Soc.、2014、136、5181)
【非特許文献１０】Mondlochら(J. Am. Chem. Soc. 2013、135、10294)
【非特許文献１１】Kungら(Chem. Mater. 2013、25、5012)
【非特許文献１２】Whiteheadら  Drug Discov. 2009、8、129
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、非晶質形態の金属有機構造体を使用して、細胞内環境へ成分を送達できることを確立した。本発明者らは、成分の放出が制御され、持続性であり、相対的に緩徐であること、及び放出は、対応する結晶質形態からの成分の放出と同じか、又はそれより高度な制御がなされ得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一般態様では、本発明は、非晶質の金属有機構造体及び医学的処置の方法におけるその使用を提供する。非晶質の金属有機構造体は、生物活性のある薬剤等の成分を保持し、この成分は、非晶質の金属有機構造体から放出可能である。
【００１６】
本発明者らは、非晶質の金属有機構造体が、保持した成分を、持続的な期間にわたって放出しうることを確立した。その上、非晶質の金属有機構造体の相対的な不安定性は、薬物送達システムでは、構造体が活性薬剤の放出中及び放出後にin vivoで容易に生分解されるので有利である。非晶質の金属有機構造体は、細胞膜を越えて輸送することもでき、したがって、金属有機構造体を使用して、構造体内に保持された成分を細胞内の空間へと送達することもできる。金属有機構造体のこの特色は、溶解性が不十分及び/又は細胞膜に不透過性である成分の送達に特に有用である。
【００１７】
非晶質の金属有機構造体が成分を放出する能力は、少なくとも、その非晶質の金属有機構造体の結晶質形態の能力に匹敵し、多くの場合では、非晶質形態の金属有機構造体は、結晶質形態のものと比べて、変更された放出プロファイルを示しうる。実際に、多くの場合において、非晶質形態では、より長い放出期間、より長い一定放出期間を実現することができ、かつ/又は結晶質形態におけるバースト放出の問題が回避される場合もある。
【００１８】
したがって、本発明の第1の態様では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体であって、場合により、成分は、分子状ヨウ素(molecular iodine)(I2)でない、たとえば、成分は、分子量が少なくとも100である、成分を保持する非晶質の金属有機構造体が提供される。
【００１９】
一実施形態では、成分は、1個又は複数の炭素原子及び/又は3個以上の原子を有する。
【００２０】
非晶質の金属有機構造体は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体から取得される又は取得可能である。結晶質の金属有機構造体をボールミル粉砕すると、それによって非晶質の金属有機構造体を得ることができる。別法として、結晶質の金属有機構造体を熱処理して、それによって、非晶質の金属有機構造体を得ることもできる。
【００２１】
一実施形態では、金属有機構造体は、ジルコニウム含有金属有機構造体、たとえば、ジルコニウムオキソクラスターを有する金属有機構造体である。加えて、又は別法として、金属有機構造体は、ビスマス含有金属有機構造体である。
【００２２】
一実施形態では、成分は、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である。
【００２３】
一実施形態では、非晶質の金属有機構造体は、水性混合物内に提供される。
【００２４】
本発明の第2の態様では、場合により薬学的に許容される1種又は複数の含有物と共に提供される、成分を保持する非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物であって、成分は、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である、医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明の第3の態様では、医学的処置の方法において使用するための、非晶質の金属有機構造体、又は非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物であって、非晶質の金属有機構造体は成分を保持し、成分は医学的処置の方法において使用する活性薬剤である、非晶質の金属有機構造体、又は非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物が提供される。
【００２６】
本発明の第4の態様では、増殖性疾患、たとえば、子宮頚がん等のがんの処置の方法において使用するための、非晶質の金属有機構造体、又は非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の第5の態様では、医学的処置の方法において使用するための、非晶質の金属有機構造体、又は非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物であって、非晶質の金属有機構造体は成分を保持し、成分は医学的処置の方法において使用する活性薬剤であり、処置の方法は、非晶質の金属有機構造体からの成分の持続放出、たとえば、少なくとも1日、たとえば少なくとも2日、たとえば少なくとも4日、たとえば少なくとも7日の期間にわたる、成分の実質上全部の放出を含む、非晶質の金属有機構造体、又は非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明の第6の態様では、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を非晶質化させる工程を含む、本発明の第1の態様による非晶質の金属有機構造体の調製方法が提供される。
【００２９】
一実施形態では、結晶質の金属有機構造体は、ボールミル粉砕によって非晶質化される。別法として、結晶質の金属有機構造体を熱処理してもよい。
【００３０】
一実施形態では、方法は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を調製する予備工程を含み、結晶質の金属有機構造体を成分と混合して、それによって、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を得る工程を含む。
【００３１】
本発明の第7の態様では、成分を目標の場所に送達する方法であって、
(i)目標の場所において、成分を保持している非晶質の金属有機構造体を提供する工程と、
(ii)非晶質の金属有機構造体からの成分の放出を可能にし、それによって目標の場所において成分を提供する工程と
を含む方法が提供される。
【００３２】
一実施形態では、目標の場所は、細胞内の場所である。
【００３３】
一実施形態では、目標の場所方法は、ex vivoである。
【００３４】
一実施形態では、目標の場所は、細胞外の場所である。
【００３５】
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態について、以下で詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】合成された結晶質のUiO-66(下から2番目のパターン)、カルセインローディングした結晶質のUiO-66(cal@UiO-66、上から2番目)、及びカルセインローディングした非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66、最上部)のPXRDパターンを、結晶質のUiO-66について算出されたPXRDパターン(最下部)と共に示すグラフである。
【図２】非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66、空白の円)及び結晶質のUiO-66(cal@UiO-66、べた塗りの円)から時間と共に放出されたカルセインの質量を示すグラフである(左が時間、右が日数)。黒の実践及び赤の点線は、それぞれcal@UiO-66及びcal@aUiO-66について、非線形回帰を使用して当てはめた、送達の動態を表す。青の断続線は、式[3]を使用したcal@aUiO-66の当てはめを表す。放出されたカルセインの質量は、非晶質又は結晶質のUiO-66から送達可能な合計カルセインに対する百分率として示す。
【図３】(a)24時間及び(b)48時間インキュベートしたHeLa細胞の一連の共焦点顕微鏡像である。細胞は、DMEM中にて、4%PFA(固定対照、最上列)、遊離カルセイン(0.013mg/mL、上から2番目)、cal@UiO-66(0.25mg/mL、下から2番目)、又はcal@aUiO-66(0.25mg/mL、最下列)と共に、37℃、5%CO2でインキュベートした。細胞は、引き続いてHoechst 33342(5μg/mL)及びPI(5μg/mL)で染色した。
【図４】(a)結晶質のUiO-66(UiO-66)及び(b)非晶質のUiO-66(aUiO-66)のSEM像(スケールバーは、1μmである)、並びに(c)結晶質のUiO-66(UiO-66、実線)及びカルセインを保持する結晶質のUiO-66(cal@UiO-66、断続線)について温度(℃)変化に応じた質量(%)の変化を示すTGA曲線である。
【図５】結晶質のUiO-66についての77KでのN2吸着等温線である。
【図６】結晶質のUiO-66濃度(mg/mL)の変化に応じたHELA細胞生存度(%)の変化を示すグラフである。
【図７】MTS検定における、結晶質のZr含有金属有機構造体濃度(mg/mL)の変化に応じたHELA細胞生存度(%)の変化を示すグラフである。構造体には、薬物をローディングしていない。
【図８】(Lx、ZrCl4、及びBiについては)MTS検定及び(H4TBAPyについては)アネキシンV検定における、リンカー、ZrCl4、及びBi(NO3)3・5H2O濃度(mg/mL)の変化に応じたHELA細胞生存度(%)を示すグラフである。
【図９】結晶質(べた塗りの円)及び非晶質の金属有機構造体(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１０】結晶質及び非晶質の金属有機構造体からのDCAの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１１】結晶質及び非晶質の金属有機構造体からのα-CHCの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１２】結晶質及び非晶質の金属有機構造体からの5-FUの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１３】結晶質(べた塗りの円)及び非晶質のNU-1000(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、温度非晶質化によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１４】結晶質(べた塗りの円)及び非晶質のNU-901(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示すグラフである。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化によって調製されている。放出プロファイルは、時間(日数)と共に放出された材料の量(%)を示すものであり、放出量は、構造体から放出可能な材料の合計量を基準にして示している。
【図１５】結晶質(べた塗りの円)及び機械的非晶質のNU-1000(空白の円)からのsiRNAの放出についての放出プロファイル(時間hにかけての放出%)を示すグラフであり、放出量は、構造体から放出可能なsiRNA材料の合計量を基準にして示している。
【図１６】カルセインローディングした結晶質のZr系金属有機構造体Zr-L1〜Zr-L6及びカルセインローディングしたBi系金属有機構造体CAU-7と共に24時間インキュベートしたHeLa細胞の一連の共焦点顕微鏡像である。細胞は、引き続いて、Hoechst 33342(5μg/ml)及びCellMask(商標)Orange(1×)で染色した。スケールバーは、像の上2列については10μm、像の残りの列については7.5μmである。
【図１７】陰性対照(siRNAなし)、裸のsiRNA、陽性対照(リポフェクタミンにローディングされたsiRNA)、及びローディングNU-1000(結晶質のNU-1000にローディングされたsiRNA)について、647nmでの検出を用いたフローサイトメトリーによって求められるsiRNAの発現レベル(%、陽性対照を基準とする)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、成分を保持する非晶質の金属有機構造体、及び処置の方法におけるこの金属有機構造体の使用を提供する。成分は、処置において使用する治療薬でよい。
【００３８】
Bennettら(Chem.-Eur. J.、2013、19、7049)は、分子状ヨウ素を保持する非晶質の金属有機構造体の調製について以前に記載している。構造体へのヨウ素の組み込みが研究され、その後の放出についても研究されている。ヨウ素を結晶質の構造体に吸着させ、引き続いて、これをボールミル粉砕によって崩壊させた。著者らは、分子状ヨウ素が構造体の多孔に閉じ込められたことを見出している。
【００３９】
Bennettらが記載している非晶質の金属有機構造体は、気体-固体界面相において使用されており、非晶質の金属有機構造体が、細胞間環境や細胞内環境等の生物学的環境において使用できるという提案はなされていない。
【００４０】
Bennettらは、金属有機構造体の多孔内部への分子状ヨウ素の吸着を記載している。分子状ヨウ素は、固体の金属有機構造体を加熱、たとえば、ZIF-8構造体を200℃で少なくとも3時間加熱した条件下で、金属有機構造体から放出可能であった。
【００４１】
更に、Bennettらは、非晶質の金属有機構造体を使用して、構造体内に保持された成分を細胞内の場所へ送達できることを提示又は提案していない。Bennettらは、非晶質の金属有機構造体からの、制御され、持続性であり、相対的に緩徐である成分の放出についても記載していない。
【００４２】
本発明の非晶質の金属有機構造体は、分子状ヨウ素より複雑な成分を保持し、その後放出するのに適する。本件の作業例に示すとおり、非晶質の金属有機構造体を使用して、比較的大きい有機分子であるカルセインを細胞内の空間へと送達することができる。
【００４３】
Bennettらは、非晶質の金属有機構造体にローディングする成分としてヨウ素を使用することしか開示していない。非晶質の金属有機構造体を使用して治療活性のある薬剤を被包できるという提案もなされていなければ、そうした薬剤を制御された形で放出できるという提案もなされていない。むしろ、Bennettらは、非晶質の金属有機構造体を使用して、有害なゲスト種(放射性ヨウ素を含める)を封鎖し、永久に貯蔵できるということを実は提案している。このことは、標的化送達戦略の一環として成分を被包し、その後放出するために非晶質の金属有機構造体を使用することから遠ざかることを教示している。
【００４４】
Bennettら(Chem. Commun. 2011、47、7983)は、ZIF-4の非晶質化についても記載している。非晶質材料の特性は、研究又は考察されておらず、構造体が、送達する成分を保持しうる又は保持すべきという提案はなされておらず、構造体が治療薬を保持すべきという提案は、間違いなくなされていない。
【００４５】
Bennettらは、構造体の孔内の小分子の存在に言及している。しかし、それらは、圧力伝達流体(PTF)の分子であり、例としては、メタノール/エタノールが挙げられる。そうした分子は、結晶質の出発材料に加えられ、非晶質化手順の間じゅう存在している。著者らは、PTF分子の大きさの変化に応じた非晶質構造の変化に目を向けている。
【００４６】
Rieterら(J. Am. Chem. Soc. 2008、130、11584)は、シスプラチン型の抗がん薬を保持及び送達するための無孔ナノスケール配位ポリマーの使用を記載している。Reiterらが記載しているシステムは、機能付与されたシスプラチン配位子であるDSCPによって連結されたTbイオンからなる。生成した粒子を安定化するために、これを後からシリカで被包する。このシステムでは、送達する薬物が、ネットワークをつなぎ止める配位子の一端をなしている。対照的に、本発明で使用する非晶質の金属有機構造体は、薬物等の成分を、構造体の孔内に保持する。
【００４７】
更に、ナノスケール配位ポリマーは、結晶質の金属有機構造体の非晶質化によって得られない。むしろ、ナノスケール配位ポリマーは、配位子及び金属前駆体を沈殿させることにより生成される。
【００４８】
Chapmanら(J. Am. Chem. Soc. 2011、133、18583)は、ZIF-8の非晶質化、及び分子状ヨウ素(I2)を保持するための、非晶質化されたZIF-8の使用を記載している。この論文における研究は、ヨウ素の捕捉及び放出に限定されており、ZIF-8がより複雑な化合物で機能しうること及び機能するであろうことを示す証拠はない。
【００４９】
Zhuoら(Plasma Chem. Plasma Process 2011、31、499)は、ベンゼンジカルボキシレートを有する亜鉛系構造体であるMOF-5を非晶質化する方法を論じている。この文書では、MOF-5を活性薬剤の保持及び送達に使用できる又は使用すべきという提案はどこにもなされていない。著者らは、単に、放電を使用してMOF-5を非晶質化する新たな方法を記載している。Zhuoらは、放電によって、非晶質化の過程の間に配位子の一部が破壊されるようであると説明している。対照的に、本件において記載する、ボールミル粉砕や温度非晶質化等の非晶質化手順は、金属有機構造体の化学官能性を変化させない。非晶質化の効果は、構造中の孔を崩壊させることであり、配位子の化学構造を変化させることではない。
【００５０】
本発明者らは、Gimenez-Marquesら(Coordination Chem. Rev. 2016、307、342)において、金属有機構造体からの薬物の放出について通則を決めるのは困難であり、所与の金属有機構造体の各送達条件について各薬物の放出を研究しなければならないと以前に提案している。しかし、この研究において、本発明者らは、思いがけなく、異なる非晶質の金属有機構造体が遅延した形で成分を放出しうること、加えて、一部のシステムは、高度に制御された形でも成分を放出しうることを示したところである。多くの場合、非晶質形態は、対応する結晶質形態より大幅に放出を遅延しうる。
【００５１】
金属有機構造体
本発明は、成分を保持する非晶質の金属有機構造体を提供する。非晶質の金属有機構造体は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体から取得される又は取得可能である。したがって、結晶質の金属有機構造体の物理的及び化学的特色並びに非晶質化方法によって、非晶質の金属有機構造体の物理的及び化学的特色が決まる。
【００５２】
結晶質の金属有機構造体は、無機の中心(又は接続点)が、有機配位子によって接続されているネットワーク固体である。無機の中心は、金属イオン又は金属クラスターの場合がある。結晶質の金属有機構造体内では、無機の中心は、規則性が高く、広がった配置で設けられる。結晶質の構造体は、長距離秩序を有するといわれている。
【００５３】
結晶質の金属有機構造体が成分を保持する場合では、その成分は、構造体の孔内に設けられる場合がある。加えて、成分が構造体の表面上にも設けられ、結晶質の金属有機構造体の外部表面ということになる場合もある。成分の大半、たとえば、実質上全部が、構造体の孔内に設けられることが好ましい。
【００５４】
非晶質の金属有機構造体は、結晶質の金属有機構造体から、長距離秩序を乱すことによって取得可能である。非晶質化の方法(以下で更に詳述するもの等)は、構造体に非周期性を導入し、それによって長距離秩序を乱すものである。
【００５５】
長距離秩序から無秩序への変化は、非晶質の構造体における拡散散乱のために、結晶質の構造体で観察可能であるブラッグ反射が失われる結果となる、X線回折パターンにおいて観察可能である。すなわち、非晶質の金属有機構造体のX線回折パターンは、識別可能なブラッグピークを含んでいない。
【００５６】
非晶質化の過程は、孔内に保持されている成分を取り巻く、結晶質の構造体の多孔性ネットワークを不可逆性に崩壊させる。すなわち、成分は、非晶質形態の構造体内に部分的に閉じ込められる。本発明者らは、この部分的な閉じ込めによって、非晶質の構造体からの成分の制御放出が長引く結果になるという確証を得た。非晶質の構造体からの成分の放出は、部分的な材料の分解(すなわち、構造体の溶解)、並びに残存する多孔性ネットワークを介した成分の拡散によって制御されると考えられる。
【００５７】
非晶質の構造体を調製するもととなる結晶質の金属有機構造体は、成分を保持する適性を考えて選択される。すなわち、結晶質の金属有機構造体の孔は、成分を中に保持する能力をもつべきである。更に、結晶質の構造体の孔は、成分に接触可能でなければならず、孔の入り口は、成分が孔内に入るのを可能にする大きさであるべきである。
【００５８】
入り口及び孔径が十分に大きくないと、成分は、結晶質の金属有機構造体の多孔に吸収されない。本発明者らは、成分が、それよりむしろ、構造体の外部表面に吸着されることを見出した。この状況では、結晶質の金属有機構造体が非晶質化されても、成分は中に閉じ込められない。成分は、非晶質の金属有機構造体の表面上に存在すると、構造体から急速に放出される。
【００５９】
成分が構造体内に閉じ込められているのか、又は単に外部表面に吸着されているだけであるのかは、分析的手段によって、又は非晶質の金属有機構造体からの成分の放出動態を研究することによって確かめることができる。
【００６０】
結晶質の金属有機構造体のXRDによる分析によって、成分が構造体の孔内に存在するかどうかを示すことができる。たとえば、外部表面上の成分の存在によって、結晶質の金属有機構造体それ自体のXRDシグナルが抑制される場合がある。
【００６１】
上で指摘したとおり、成分が閉じ込められている場合では、非晶質の構造体からのその放出は、結晶質の構造体と比べて相対的に緩徐になる。成分が外部表面に吸着されている場合では、非晶質の構造体からのその放出は、急速になり、結晶質の構造体からの成分の放出に匹敵する。一部の例では、非晶質の構造体からの放出が、結晶質の構造体より急速になることさえある。
【００６２】
本発明において使用する金属有機構造体は、通常、遷移金属、アルカリ金属、アルカリ土類金属、及び/又はポスト遷移金属を含有する。
【００６３】
一実施形態では、金属有機構造体は、1種又は複数の遷移金属を含有する。
【００６４】
本発明において使用する金属有機構造体は、ジルコニウム、亜鉛、コバルト、ニッケル、パラジウム、白金、銅、インジウム、鉄、ビスマス、マグネシウム、及びカリウム、並びにこれらの混合物からなる群から選択される金属を含有する場合がある。
【００６５】
本発明において使用する金属有機構造体は、ジルコニウム、亜鉛、コバルト、ニッケル、パラジウム、白金、銅、インジウム、及び鉄、並びにこれらの混合物からなる群から選択される金属を含有する場合がある。加えて、又は別法として、金属有機構造体は、ビスマスを金属として含有してもよい。
【００６６】
通常、金属有機構造体は、単一の種類の金属のみを含有する。
【００６７】
金属は、構造体中に、金属オキソクラスター等の金属クラスターとして存在してもよい。
【００６８】
ジルコニウム含有金属有機構造体の例は、UiO-66 (本件ではこれを典型例としている)、NU-1000、及びNU-901である。UiO-66は、Zr6O4(OH)4(BDC)6であり、BDCは、1,4-ベンゼンジカルボキシレートである。NU-1000及びNU-901は、Zr6(μ3-OH)8(OH)8(TBAPy)2の構造を有し、TBAPyは、1,3,6,8-テトラキス(p-安息香酸)ピレンであり、NU-1000構造体とNU-901構造体とでは、チャネル形状に違いがあり、前者は、六辺形状のチャネルを有し、後者は、ダイヤ形状のチャネルを有する。NU-1000は、八面体のZr6クラスターからなり、12のうち8つの縁端がTBAPyに接続しており、残存する配位部位は、8つの末端-OH配位子によってキャッピングされている。
【００６９】
亜鉛含有金属有機構造体の例としては、ZIF-1、ZIF-3、ZIF-4、MOF-5、及びMOF-177が挙げられる。
【００７０】
コバルト含有金属有機構造体の例は、Co-ZIF-4である。
【００７１】
ニッケル、パラジウム、白金、及び銅含有金属有機構造体の例としては、それぞれ、ニッケル(II)ビスイミダゾレート、パラジウム(II)ビスイミダゾレート、白金(II)ビスイミダゾレート、及び銅(II)ビスイミダゾレートが挙げられる。
【００７２】
マグネシウム含有金属有機構造体の例は、CPO-27である。
【００７３】
カリウム含有金属有機構造体の例は、CDMOF-1である。
【００７４】
ビスマス含有金属有機構造体の例は、CAU-7である。CAU-7の結晶構造では、Bi3+イオンは、BTB3-イオン(1,3,5-ベンゼントリス安息香酸イオン)が提供する酸素原子によって9倍配位され、それによって、3倍の面冠三角プリズムを形成する。BiO9多面体が面を共有する結果、c軸に沿った鎖が生じる。
【００７５】
一実施形態では、金属有機構造体中の金属は、ラットモデルにおいて、たとえば塩形態で測定したとき、経口致死用量が、少なくとも0.5g/kg、少なくとも1.0g/kg、少なくとも2.0g/kg、又は少なくとも10g/kgである。
【００７６】
一実施形態では、金属有機構造体は、ジルコニウム系有機構造体である。ジルコニウム系のシステムは、ジルコニウムが低毒性であるので、特に魅力的である。たとえば、ラットモデルにおいて、LD50として求められる、酢酸ジルコニルの経口致死用量は、およそ4.1g/kgである。更に、人体は、およそ300mgのジルコニウムを含んでおり、日常的に摂取されるジルコニウムの量は、通常、およそ3.5mg/日である。実際に、Zrについては、1日あたり0.05mgの一日所要量が示されている。
【００７７】
本発明者らは、結晶質のジルコニウム系有機構造体UiO-66は、HeLa細胞でのIC50測定値が、24時間及び48時間で、それぞれ、約1.50及び1.36mg/mLであることを見出した。
【００７８】
一実施形態では、結晶質又は非晶質の金属有機構造体は、HeLa細胞等の試験細胞系に対して測定されるIC50が、少なくとも0.1、少なくとも0.5、少なくとも1.0、又は少なくとも1.5mg/mLである。
【００７９】
IC50値の測定方法は、本件において記載しており、当技術分野でよく知られている。
【００８０】
構造体は、金属中心に接続された有機配位子を有する。金属有機構造体において使用される有機配位子は、通常、含アリール配位子であり、含カルボアリール及び含ヘテロアリール配位子の場合がある。
【００８１】
配位子は、イミダゾリルやピリジル等のヘテロアリール基を含んでよい。
【００８２】
配位子は、フェニル基を含んでもよい。
【００８３】
配位子は、多数のアリール基を含んでいる場合もあり、それらは、同じでも異なってもよい。たとえば、配位子は、2つのフェニル基を含んでいる場合がある。アリール基は、ビフェニル基のように、互いに結合していてもよい。
【００８４】
一実施形態では、配位子は、ピレン基やナフチル基等の縮合芳香族環系を含んでもよい。
【００８５】
アリール環は、存在する場合では、置換されていてもよく、たとえば、カルボキシ(COOH又はCOO-)、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシル、ハロ、及び/又はニトロ置換基が存在してもよい。アリール環は、1つ又は複数のカルボキシ基で置換されていることが好ましい。
【００８６】
これに代わる適切な有機配位子は、当技術分野でよく知られている。
【００８７】
一実施形態では、配位子は、1つ又は2つのアリール基を有する。ここで、アリール基は、フェニル基、又はナフチル基等の縮合芳香族基である場合がある。2つのアリール基が存在する場合では、それらは、配位子内に、ビフェニル基等のビアリール基として存在してもよい。
【００８８】
一実施形態では、配位子は、1つのアリール基を有する。ここで、アリール基は、フェニル基、又はナフチル基等の縮合芳香族基である場合がある。
【００８９】
一実施形態では、有機配位子は、含フェニル配位子である。フェニル基は、カルボキシ基で置換、たとえば二置換されていてもよく、場合により、更に置換されていてもよい。
【００９０】
一実施形態では、有機配位子は、1,4-ベンゼンジカルボキシレート等のベンゼンジカルボキシレートであり、ベンゼン環は、-NH2、-NO2、-Cl、-Br、-COOH(若しくは-COO-)、若しくは-CH3で場合により更に一置換されており、又は-CF3、-CH3、若しくは-OHで場合により更に二置換されている。このタイプの配位子の使用は、Cunhaらが記載している。
【００９１】
一実施形態では、各有機配位子は、BDC、BDC-Cl、BDC-Br、BDC-NH2、BDC-CH3、BDC-(OH)2、BDC-(CO2H)2、及びBDC-(CF3)2からなる群から独立に選択されるベンゼンジカルボキシレート配位子であり、BDCは、1,4-ベンゼンジカルボキシレートである。環が二置換、たとえば-CF3で二置換されている場合では、置換基は、パラ配置(1,4配置)で設けられる。
【００９２】
別法として、各有機配位子は、以下に示す配位子:
【００９３】
【化１】
2018522860.tif 000003
【００９４】
[アリール基は、NH2、-NO2、-Cl、-Br、-COOH(若しくは-COO-)、若しくは-CH3で場合により更に置換されていてもよく、又は-CF3、-CH3、若しくは-OHで場合により更に二置換されている]及びこれらの塩形態から選択される。
【００９５】
別法として、各有機配位子は、以下に示す配位子:
【００９６】
【化２】
2018522860.tif 000004
【００９７】
[アリール基は、NH2、-NO2、-Cl、-Br、-COOH(若しくは-COO-)、若しくは-CH3で場合により更に置換されていてもよく、又は-CF3、-CH3、若しくは-OHで場合により更に二置換されている]及びこれらの塩形態から選択される。
【００９８】
好ましくは、各有機配位子は、以下に示す配位子:
【００９９】
【化３】
2018522860.tif 000005
【０１００】
[Rは、-H、-Br、-NO2、及び-NH2から選択される]及びこれらの塩形態から選択される。
【０１０１】
金属有機構造体がジルコニウム含有構造体であるように、より好ましくは、各有機配位子は、以下に示す配位子:
【０１０２】
【化４】
2018522860.tif 000006
【０１０３】
[Rは、-H及び-NH2から選択される]及びこれらの塩形態から選択される。
【０１０４】
カルボキシレート基を有する有機配位子の使用は、非晶質の金属有機構造体が生理的条件下で分解される適用において特に好都合である。有機リンカー1,4-ベンゼンジカルボキシレート等のカルボキシレート含有有機配位子のpKa値は、通常は5.5未満である。約7.4という生理的pHでは、カルボキシレート含有有機配位子の脱プロトン化が(中性条件と比べて)容易であり、配位子の金属中心に対する錯化力は、それに応じて低減されるといわれている(たとえば、Horcajadaらを参照されたい)。
【０１０５】
通常、本発明の非晶質の金属有機構造体は、室温(たとえば、中性pHで25℃の温度)の脱イオン水中で安定である。
【０１０６】
有機配位子も、通常は毒性が低い。一実施形態では、金属有機構造体中の有機配位子は、ラットモデルにおいて、経口致死用量が、少なくとも0.5g/kg、少なくとも1.0g/kg、少なくとも2.0g/kg、又は少なくとも10g/kgである。
【０１０７】
一実施形態では、金属有機構造体は、Zr6クラスターコア、たとえば、Zr6八面体を有するジルコニウム系有機構造体である。クラスターコアは、Zr6O4(OH)4クラスターでよい。
【０１０８】
Zr6クラスターコアは、O及びOH基、たとえば、μ3-O及びμ3-OHキャッピング基を含んでよい。Zr6クラスターコアは、有機配位子によって架橋された多面体縁端を有してもよい。
【０１０９】
一実施形態では、金属有機構造体は、UiO-66、NU-1000、及びNU-901から選択される。
【０１１０】
一実施形態では、金属有機構造体は、UiO-66である。
【０１１１】
一実施形態では、金属有機構造体は、Zr6O4(OH)4(BDC)6であり、BDCは、1,4-ベンゼンジカルボキシレートである。
【０１１２】
結晶質の金属有機構造体の空間群は、特に限定されない。
【０１１３】
結晶質の金属有機構造体は、ナノ粒子等の粒子の形態で提供することができる。
【０１１４】
粒子の大きさは、粒子が真核細胞壁等の細胞壁を介して細胞に侵入しうるか否かを決定するのに重要である。大きめの粒子は、細胞壁の通過が妨げられる、又はその進行が、細胞送達剤としてのその使用を実行不可能にするのに十分なだけ妨げられる。小さめの粒子は、対象内の最も狭い毛管も自由に循環することができる。
【０１１５】
一実施形態では、粒子の平均最大寸法は、最高でも200nm、最高でも250nm、最高でも300nm、最高でも400nm、又は最高でも500nmである。
【０１１６】
別法として、粒子の平均最大寸法は、最高でも1μm、最高でも5μm、又は最高でも10μmである。
【０１１７】
一実施形態では、粒子の平均最大寸法は、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、又は少なくとも150nm、又は少なくとも200nmである。
【０１１８】
一実施形態では、粒子の平均最大寸法は、上で示した値から選択される上限及び下限を有する範囲内である。たとえば、粒子の平均最大寸法は、50〜300nm、たとえば、100〜200nmの範囲から選択される。更なる例では、粒子の平均最大寸法は、50nm〜5μm、たとえば、100〜5μmの範囲から選択される。
【０１１９】
粒径は、金属有機構造体の試料のSEM像から求めることができる。典型的なSEM法を本明細書に記載する。
【０１２０】
通常、結晶質の金属有機構造体の粒子は、狭い粒度分布を有する。対照的に、非晶質の金属有機構造体の粒子は、広い粒度分布を有する。
【０１２１】
たとえば、結晶質の金属有機構造体の粒子の相対標準偏差は、最高でも10%、たとえば、最高でも5%、たとえば、最高でも2%である。本件における作業例では、相対標準偏差が4.58%(262±12nm)である結晶質のUiO-66の調製について記載する。
【０１２２】
非晶質の金属有機構造体の粒子の相対標準偏差は、少なくとも15%、たとえば、少なくとも25%、たとえば、少なくとも50%でよい。本件における作業例では、相対標準偏差が57.7%(272±157nm)である非晶質のUiO-66の調製について記載する。
【０１２３】
結晶質の金属有機構造体は、大きい多孔度、たとえば、大きい表面積や大きい細孔容積を有する。一実施形態では、結晶質の金属有機構造体は、比表面積(SBET)が、少なくとも500、少なくとも700、少なくとも1,000、少なくとも1,100、又は少なくとも1,200m2g-1である。
【０１２４】
比表面積は、77Kでの窒素吸着を使用して、通常の手段で求めることができる。典型的なSBET法は、本明細書に記載しており、Cunhaらによっても記載されている。
【０１２５】
一実施形態では、結晶質の金属有機構造体は、比細孔容積が、少なくとも0.10、少なくとも0.20、少なくとも0.40、又は少なくとも0.50cm3g-1である。比細孔容積は、77Kでの窒素吸着によって、通常の手段で求めることができる。そのような方法は、Cunhaらが記載している。
【０１２６】
一実施形態では、結晶質の金属有機構造体は、単位体積あたりの四面体の頂点の数として示される金属原子密度が、最高でも2.5、最高でも2.6、最高でも3.0、最高でも3.5、又は最高でも5.0n/m3である。
【０１２７】
一実施形態では、結晶質の金属有機構造体は、単位体積あたりの四面体の頂点の数として示される金属原子密度が、少なくとも1.5、少なくとも2.0、少なくとも2.1、又は少なくとも2.2n/m3である。
【０１２８】
結晶密度は、X線結晶データから求めることができる。
【０１２９】
比細孔容積及び比表面積への言及は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体、又は成分が存在しない結晶質の金属有機構造体に該当しうる。非晶質の金属有機構造体の比細孔容積及び比表面積値は、結晶質の金属有機構造体について求められたこれらの値とは、おそらくは有意に異なることが予想される。
【０１３０】
非晶質の形態の金属有機構造体では、細孔容積及び表面積は最小限になる。
【０１３１】
結晶質の金属有機構造体は、空洞を含んでおり、それには、構造体にある入り口(又は、窓)から出入りがなされうる。本発明において使用する結晶質の金属有機構造体では、構造体内の空洞は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10Åの最大断面積(直径)を有する場合がある。構造体にある入り口は、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、又は少なくとも8Åの最大断面積(直径)を有する場合があり、入り口の最大断面積は、通常、空洞の最大断面積より小さい。
【０１３２】
金属有機構造体は、成分を保持する。成分は、少なくとも0.5wt%、少なくとも1wt%、少なくとも2wt%、又は少なくとも4wt%の量で存在する場合がある。
【０１３３】
一実施形態では、成分は、多くとも10wt%、多くとも15wt%、多くとも20wt%、多くとも25wt%、多くとも35wt%、多くとも50wt%、又は多くとも65wt%の量で存在する。一実施形態では、成分は、多くとも30wt%の量で存在する。
【０１３４】
たとえば、Cunhaらは、10〜25wt%の範囲の量のカフェイン又はイブプロフェンを保持する結晶質の金属有機構造体UiO-66を記載している。
【０１３５】
上記選択は、成分が、2,000以下、たとえば1,000以下、たとえば500以下等の比較的小さい分子量を有するときに該当しうる。
【０１３６】
別法として、成分は、多くとも0.5wt%、多くとも1wt%、多くとも2wt%、又は多くとも4wt%の量で存在する。
【０１３７】
成分は、少なくとも0.001wt%、少なくとも0.005wt%、少なくとも0.01wt%、少なくとも0.05wt%、又は少なくとも0.1wt%の量で存在する場合がある。
【０１３８】
上記選択は、成分が、2,000を超える、たとえば5,000以上、たとえば10,000以上等の比較的大きい分子量を有するときに該当しうる。
【０１３９】
結晶質の金属有機構造体等の金属有機構造体内の成分の量は、熱重量分析(TGA)によって求めることができる。このような方法は、本明細書に記載する。
【０１４０】
一実施形態では、金属有機構造体は、たとえば、処置の方法において使用するために、溶媒中に提供される、たとえば、水に溶解又は懸濁される。
【０１４１】
1種又は複数の溶媒が存在してよい。たとえば、水は、溶媒と共に提供される場合がある。溶媒は、薬学的に許容される溶媒でよい。
【０１４２】
成分を保持する金属有機構造体は、多くとも1wt%、多くとも5wt%、多くとも10wt%、又は多くとも20wt%の量で溶媒中に提供される場合がある。
【０１４３】
成分を保持する金属有機構造体は、少なくとも0.01wt%、少なくとも0.05wt%、少なくとも0.1wt%、又は少なくとも0.5wt%の量で溶媒中に提供される場合がある。
【０１４４】
Bennettらが記載している非晶質の金属有機構造体は、固体状態で提供されているようであることが指摘される。
【０１４５】
金属有機構造体は、生理的条件下で分解し(「生物侵食」)、その結果、構造体内に保持された成分の放出が可能になることがわかっている。そのため、金属有機構造体は、たとえば、処置の方法の範囲内で、成分をin vivoで放出するのに特に有用である。上で指摘したとおり、構造体の主要な構成要素である金属及び有機配位子は、毒性が非常に低いといえる。
【０１４６】
成分
非晶質の金属有機構造体は、成分を保持する。成分は、構造体から放出可能である。成分は、一般に、被包し、その後放出することが望ましい又は有益である、有用な成分である。非晶質の金属有機構造体は、成分を保持し、目標の場所に送達して必要に応じて放出するのを可能にする送達システムとして有用となりうる。
【０１４７】
本発明者らは、非晶質の金属有機構造体によって、延長された期間にわたる成分の持続放出が可能になることを見出した。非晶質の金属有機構造体の使用では、成分を急速かつ制御されない形で放出することが示されている結晶質形態の構造体に付きものの問題が回避される。
【０１４８】
一実施形態では、成分は、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である。たとえば、成分は、増殖性疾患、たとえば、子宮頚がん等のがんの処置の方法において使用するための活性薬剤である。
【０１４９】
一実施形態では、成分は、植物、又は花、種子、果実、塊茎等の植物材料を処置する方法において使用するための活性薬剤である。そのような方法は、通常、植物又は植物材料の保護及び/又は植物の発育促進のためのものである。
【０１５０】
一実施形態では、成分は、蛍光色素等の色素である。
【０１５１】
一実施形態では、成分は、農業化学品、たとえば、除草剤、殺虫剤、殺カビ剤等の農薬である。
【０１５２】
一実施形態では、成分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド(DNA又はRNAを主体とする配列を含める)、又は多糖である、又はこれを含む。たとえば、成分は、ポリヌクレオチド、たとえば、siRNA等の、DNA又はRNAを主体とする配列である場合がある。
【０１５３】
一実施形態では、成分は、分子量が少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも255、少なくとも300、又は少なくとも500g/molである化合物又はその塩である。
【０１５４】
一実施形態では、成分は、分子量が多くとも1,000、多くとも2,000、多くとも5,000、又は多くとも10,000g/molである化合物又はその塩である。
【０１５５】
一実施形態では、成分は、分子量が、上で示した値から選択される上限及び下限を有する範囲にある化合物又は化合物の塩である。たとえば、成分は、分子量が125〜2,000、たとえば255〜2,000g/molの範囲にある化合物又は化合物の塩である。
【０１５６】
分子量は、重量平均又は数平均分子量を指す場合がある。
【０１５７】
一実施形態では、成分は、少なくとも3個の原子、少なくとも10個の原子、又は少なくとも20個の原子を有する。
【０１５８】
一実施形態では、成分は、多くとも50個の原子、多くとも60個の原子、多くとも70個の原子、多くとも100個の原子、多くとも200個の原子、多くとも500個の原子、多くとも1,000個の原子、多くとも2,000個の原子、又は多くとも10,000個の原子を有する。
【０１５９】
一実施形態では、成分は、上で示した値から選択される上限及び下限を有する範囲にある原子数を有する。たとえば、成分は、20〜100個の原子、たとえば、20〜70個の原子の範囲にある原子数を有する。
【０１６０】
一実施形態では、成分への言及は、溶媒分子への言及でない。たとえば、成分は、メタノールでなく、エタノールでもない。
【０１６１】
一実施形態では、成分は、80℃以上、たとえば90℃以上、たとえば100℃以上である沸点を有する。
【０１６２】
一実施形態では、成分は、50℃以上、たとえば100℃以上、たとえば150℃以上、たとえば200℃以上である融点を有する。
【０１６３】
一実施形態では、成分は、50℃以上、たとえば100℃以上、たとえば150℃以上、たとえば200℃以上の温度で分解する。
【０１６４】
成分は、通常、結晶質の金属有機構造体の孔に、構造体の入り口を介して入ることのできる大きさである。したがって、成分の平均最大断面積は、入り口の平均最大断面積より小さいことになる。たとえば、成分の平均最大断面積は、3Å未満、4Å未満、5Å未満、6Å未満、7Å未満、又は8Å未満である。成分の大きさは、既知である場合もあり、又は動的光散乱等の標準の分粒技術によって求めることができる。成分の大きさは、金属有機構造体の計算モデリングから算出することもできる。
【０１６５】
一実施形態では、成分は、有機化合物又はその塩である。すなわち、成分は、場合により1個又は複数の窒素、酸素、及び/又は硫黄原子と共に、1個又は複数、たとえば2個以上の炭素原子を有する。
【０１６６】
一実施形態では、成分は、3個以上の炭素原子を有する。
【０１６７】
一実施形態では、成分は、1つ又は複数の芳香族基、たとえば、炭素芳香族(carboaromatic)又はヘテロ芳香族基を有する。生物活性を有する多くの薬剤は、芳香族官能性を有しており、本件における研究では、含芳香族化合物が、非晶質の金属有機構造体から持続した形で放出されうることが示されている。
【０１６８】
一実施形態では、成分は、ヨウ素原子を含んでいない。
【０１６９】
一実施形態では、成分は、分子状ヨウ素(I2)でない。
【０１７０】
一実施形態では、成分は、周囲条件下で固体又は液体、たとえば、固体である。周囲条件とは、101.3kPaの圧力で25℃の温度を指しうる。非晶質の金属有機構造体は、不揮発性成分の保持及び放出に特に適する。
【０１７１】
一実施形態では、成分は、親水性である。本発明者らは、非晶質の金属有機構造体を使用して、親水性成分を細胞膜を越えて輸送して、それによって、成分を細胞内の空間内に提供できることを見出した。親水性成分は、構造体から、必要に応じて、細胞内の空間へと放出されうる。
【０１７２】
一実施形態では、成分は、分配計数log Pが、5を超えない、たとえば4を超えない、たとえば3を超えない。
【０１７３】
これに代わる実施形態では、成分は、親水性である。このような成分も、細胞内空間へと送達可能である。
【０１７４】
一実施形態では、成分は、分配計数log Pが、5より大きい、たとえば6以上、たとえば7以上である。
【０１７５】
成分の分配計数は、20℃や25℃等の室温で測定される、水と1-オクタノールへの成分の分配から、実験的に求めることができる。別法として、成分の分配計数は、標準の定量的構造物性相関(QSPR)アルゴリズムを使用して予測してもよい。
【０１７６】
本件における作業例では、カルセインが、非晶質の金属有機構造体から、遅延及び制御された形で放出されうることを示す。抗がん化合物のジクロロ酢酸(DCA)、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(α-CHC)、及び5-フルオロウラシル(5-FU)も、非晶質の金属有機構造体から、遅延及び制御された形で放出されうる。
【０１７７】
非晶質の金属有機構造体の調製方法
非晶質の金属有機構造体は、結晶質の金属有機構造体から調製することができる。結晶質の金属有機構造体を非晶質化する方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１７８】
非晶質化の過程は、結晶質の金属有機構造体内に存在する長距離秩序を破壊するものである。非晶質の金属有機構造体は、高度に無秩序な構造体構造を有し、長距離秩序を欠いている。しかし、非晶質の構造体は、結晶質の金属有機構造体にも存在する基本的な金属-配位子接続性を保持する。非晶質化の過程は、結晶質の金属有機構造体の構造上の崩壊をもたらすということができる。
【０１７９】
金属有機構造体の結晶質から非晶質の構造への変化は、X線回折法、特に粉末X線回折法によって確かめることができる。通常、結晶質の金属有機構造体は、PXRDパターンにおいて明瞭なブラッグ反射を有する。金属有機構造体のPXRDパターンでは、こうしたブラッグ反射は失われる。これは、本件において、カルセインを保持する非晶質及び結晶質形態のUiO-66について実証される(図1を参照されたい)。
【０１８０】
本発明の方法では、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を非晶質化にかけて、それによって、成分を保持する非晶質の金属有機構造体を得る。
【０１８１】
非晶質化の過程によって、成分は、構造体の多孔に閉じ込められるようになると考えられている。非晶質化の過程は、構造体における金属-配位子群の破壊と関連すると考えられている、構造体の崩壊をもたらす。
【０１８２】
一実施形態では、非晶質化は、結晶質の金属有機構造体のボールミル粉砕によって実現される。
【０１８３】
別の実施形態では、非晶質化は、結晶質の金属有機構造体を、たとえば、100℃以上、たとえば200℃以上、たとえば300℃以上の温度に加熱することにより実現される。加熱温度は、最高で400℃でもよい。
【０１８４】
加熱温度は、100〜300℃、たとえば100〜200℃の範囲としてよい。
【０１８５】
構造体は、1時間以上、たとえば2時間以上、たとえば4時間以上、たとえば12時間以上、たとえば24時間以上加熱してよい。
【０１８６】
構造体は、減圧下、すなわち大気圧未満で加熱してもよい。
【０１８７】
結晶質の金属有機構造体の熱処理の結果、以下に記載するとおり、構造体から溶媒も除去される場合がある。
【０１８８】
別の実施形態では、非晶質化は、結晶質の金属有機構造体への放電の適用によって実現される。この方法は、電気による処理方法が、構造体内の有機配位子の分解をもたらしかねない(Zhuoらが示しているとおり)ので、それほど好ましくない。したがって、一実施形態では、非晶質化方法は、放電法でない、たとえば、電体バリア放電(DBD)法でない。
【０１８９】
更なる実施形態では、非晶質化は、結晶質の金属有機構造体への加圧力の適用、たとえば、少なくとも0.1、少なくとも1、少なくとも5、又は少なくとも10MPaの加圧によって実現される。ここでは、試料を水圧プレスで圧縮することができる。
【０１９０】
別の実施形態では、非晶質化は、結晶質の金属有機構造体からの溶媒の除去によって実現される。溶媒は、上述の温度等での加熱、及び/又は減圧で除去することができる。一実施形態では、溶媒は、高い表面張力、たとえば、水を有する。温度上昇下等で構造体の多孔から溶媒を除去すると、液体-気体メニスカスにおける内力の作用によって構造体多孔の崩壊が誘発されると考えられている。結果として、成分は、非晶質の金属有機構造体内に閉じ込められる。
【０１９１】
一実施形態では、溶媒は、25℃での表面張力yが、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、又は少なくとも70dyn/cm(mN/m)である。たとえば、水は、25℃で71.97dyn/cmの表面張力を有する。
【０１９２】
一部の実施形態では、非晶質化は上述の工程の1つ又は複数を含んでもよい。
【０１９３】
他の実施形態では、非晶質の金属有機構造体は、構成成分から、結晶質の金属有機構造体中間体を介して進む必要なく、直接調製することができる。
【０１９４】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体から、ボールミル粉砕によって取得される又は取得可能である。
【０１９５】
ボールミルを使用して、結晶質の金属有機構造体を粉砕することができる。
【０１９６】
適切なボールサイズを用い、適切な振動速度で、適切な時間ボールミル粉砕を実施して、結晶質の金属有機構造体の非晶質化を実現することができる。
【０１９７】
使用に向けて選択される(1又は複数の)ボールの直径は、少なくとも1mm、少なくとも2mm、少なくとも4mm、又は少なくとも5mmでよい。
【０１９８】
使用に向けて選択される(1又は複数の)ボールの直径は、最高でも10mm、最高でも15mm、又は最高でも20mmでよい。
【０１９９】
ボールミル粉砕の過程では、8mmのボールを使用することができる。ボールミル粉砕の過程では、7mmのボールを使用することもできる。
【０２００】
ボールの大きさは、たとえば、非晶質の金属有機構造体の粒子の大きさを様々にするために、様々に変えることができる。
【０２０１】
ボールは通常、結晶質の金属有機構造体の密度より高い密度及び/又は硬度のものである。一実施形態では、ボールは、ステンレス鋼ボール等の鋼ボールである。
【０２０２】
ボールミル粉砕の振動数は、少なくとも1Hz、少なくとも5Hz、少なくとも10Hz、又は少なくとも15Hzでよい。
【０２０３】
ボールミル粉砕の振動数は、最高でも25Hz、最高でも50Hz、又は最高でも100Hzでよい。
【０２０４】
通常、ボールミル粉砕は、20Hz前後の振動速度で実施される。
【０２０５】
ボールミル粉砕は、少なくとも10分間、少なくとも20分間、又は少なくとも30分間実施してよい。別法として、ボールミル粉砕は、少なくとも1分間、少なくとも2分間、又は少なくとも5分間実施する場合もある。
【０２０６】
ボールミル粉砕は、最高でも40分間、最高でも60分間、最高でも90分間、又は最高でも120分間実施することができる。
【０２０７】
非晶質の金属有機構造体の内部の空洞体積を過度に崩壊させるのを回避するために、長いボールミル粉砕時間を避けることが有益となりうる。結晶質の金属有機構造体は、成分が確実に閉じ込められるようにし、それによって、持続的な期間にわたって成分を放出できることを確実にするのに十分な時間粉砕することも必要である。
【０２０８】
通常、ボールミル粉砕は、30分間前後実施される。
【０２０９】
ボールミル粉砕非晶質化の過程は、構造体内に保持された成分を劣化させないようである。
【０２１０】
成分を保持する結晶質の金属有機構造体は、結晶質の金属有機構造体から、それに成分を付加することにより取得することができる、又は取得可能である。
【０２１１】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体の調製方法は、成分を保持する結晶質の金属有機構造体を調製する予備的な工程を含む。
【０２１２】
結晶質の金属有機構造体は、場合により溶媒内で、また場合により温度上昇下、たとえば、室温より高い温度、たとえば20℃以上、たとえば25℃以上、たとえば30℃以上で、成分と混ぜ合わせることができる。
【０２１３】
医薬組成物
本発明は、成分を保持する非晶質の金属有機構造体を含む医薬組成物を提供する。ここで、成分は、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である。非晶質の金属有機構造体は、場合により、薬学的に許容される1種又は複数の含有物と共に提供される。
【０２１４】
医薬組成物は、以下で更に詳しく論じるとおりの医学的処置の方法において使用される。
【０２１５】
非晶質の金属有機構造体は、限定はしないが、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、滑沢剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤(たとえば、湿潤剤)、マスキング剤、着色剤、着香剤、及び甘味剤を始めとする、当業者によく知られている薬学的に許容される他の1種又は複数の含有物と共に製剤することができる。製剤は、他の活性薬剤、たとえば、他の治療薬又は予防薬を更に含んでもよい。したがって、本発明は、上で定義したとおりの医薬組成物、及び医薬組成物の製造方法であって、上で定義したとおりの非晶質の金属有機構造体に、当業者に知られている薬学的に許容される他の1種又は複数の含有物、たとえば、担体、アジュバント、賦形剤等を混合することを含む製造方法を更に提供する。別個の単位(たとえば、錠剤等)として製剤する場合、各単位は、所定の量(投与量)の活性化合物を含有する。
【０２１６】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的見解の範囲内で、妥当な利益/リスク比に適って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、問題の対象(たとえば、ヒト)の組織と接触させて使用するのに適する含有物、材料、組成物、剤形等に関係する。各担体、アジュバント、賦形剤等は、製剤の他の含有物と適合するという意味で、「許容される」ものでもなければならない。  
【０２１７】
組成物は、適切な投与経路及び手段用に製剤することもできる。薬学的に許容される担体又は希釈剤には、経口、直腸、経鼻、局所(頬側及び舌下を含める)、経膣、又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、及び硬膜外を含める)投与に適する製剤において使用されるものが含まれる。たとえば、組成物は、喘息治療用の活性薬剤の投与等のために、当技術分野でよく知られているようなエアロゾルとして経口経路で投与されるように製剤することができる。
【０２１８】
適切な担体、アジュバント、賦形剤等に関する更なる教示は、標準の薬学教本、たとえば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、2000、Lippincott, Williams & Wilkins、及びHandbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、1994において見ることができる。
【０２１９】
成分の放出
本発明は、非晶質の金属有機構造体から成分を放出する方法を提供する。本発明者らは、成分の放出が、たとえば、結晶質の金属有機構造体からの成分の放出と比べて、制御され、持続し、比較的緩徐であることを見出した。
【０２２０】
このような放出は、かなりの期間にかけて、たとえば、5、10、又は15日にわたって活性薬剤の持続放出をとることが望ましい処置の方法において使用される。これについては、以下で更に詳しく述べる。
【０２２１】
一実施形態では、成分は、複合体から水性相へと放出される。
【０２２２】
したがって、非晶質の金属有機構造体は、成分を水性相へと放出するために、それ自体を水性混合物にして提供することができる。ここで、水性相には、細胞内の水性環境、及び/又はin vivoの水性環境を含めることができる。本発明者らは、この研究において、有機色素が、ジルコニウム系構造体からHeLa細胞へと放出可能であることを示している。
【０２２３】
一実施形態では、成分は、非晶質の構造体が塩基又は酸、たとえば水性の塩基又は水性の酸で処理されると、非晶質の構造体から放出可能である。
【０２２４】
一実施形態では、成分は、非晶質の構造体が、生理的pH、たとえばpH約7.4である水性混合物で処理されると、非晶質の構造体から放出可能である。
【０２２５】
他の実施形態では、成分は、たとえば、少なくとも50℃、少なくとも100℃、又は少なくとも200℃の温度で加熱されると、非晶質の構造体から放出可能である。
【０２２６】
更に別の実施形態では、成分は、加熱後及び減圧(たとえば、真空オーブン内)での成分の放出を含めて、減圧下で非晶質の構造体から放出可能である。減圧とは、たとえば、101.3kPa未満の圧力、たとえば90kPa未満の圧力である、周囲圧力未満である圧力である。
【０２２７】
非晶質の金属有機構造体からの成分の放出は、対応する結晶質の金属有機構造体、たとえば、非晶質の形態の取得元である結晶質の金属有機構造体からの成分の放出と比べて、遅延する。
【０２２８】
処置の方法を含めて、本発明の方法では、成分は、構造体から持続的な期間にわたって放出される。本発明者らは、結晶質の構造体の使用には、構造体からの成分の比較的急速な放出が伴いうることを見出した。結晶質の金属有機構造体の非晶質化によって、成分を構造体内に閉じ込めることが可能である。したがって、構造体からの成分の比較的急速な放出は、妨げられる、又は最小限に抑えられる。たとえば、作業例では、結晶質の金属有機構造体からの成分のバースト放出が、非晶質の金属有機構造体では妨げられることが示されている。更に、金属有機構造体の使用は、遊離形態の成分の使用と比べると、いずれにせよ遅延した放出をもたらす。
【０２２９】
一実施形態では、非晶質の金属有機構造体は、たとえば、最初の放出から12時間、24時間、48時間、又はこれを越える時点で、たとえば、3日、7日、14日、又は28日後に確認したとき、その構造体の対応する結晶質形態と比べて、保持された成分をより少なくしか放出しない。
【０２３０】
一部の実施形態では、非晶質の金属有機構造体と非晶質の金属有機構造体の結晶質形態からの成分の放出は、実質上同じ速度であり、その速度は、遅延した放出となりうる。したがって、非晶質形態は、成分送達システムにおいて、結晶質形態の適切な代用品となりうる。したがって、非晶質の金属有機構造体の送達への使用は、たとえば、Heら(J. Am. Chem. Soc.、2014、136、5181)が記載している結晶質の送達システムに代わるものである。
【０２３１】
本件では、UiO-66の結晶質版は、保持された成分の実質上全部を12時間かけて放出することが示されている。対照的に、UiO-66の非晶質版において成分が保持されるとき、30日より長期間にわたって成分の実質上全部が放出される。
【０２３２】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、12時間、24時間、48時間、又はこれより長時間後、たとえば、3日、7日、14日、又は28日後に、成分の50%以下しか放出しない。
【０２３３】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、48時間又はこれより長時間後、たとえば、3日、7日、14日、又は28日後に、成分の70%以下しか放出しない。
【０２３４】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、対応する結晶質の金属有機構造体から成分の50%が放出されるのより少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、又は少なくとも48時間長い時間をかけて、成分の50%を放出する。
【０２３５】
一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、対応する結晶質の金属有機構造体から成分の50%が放出されるのより少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも3日、少なくとも7日、又は少なくとも28日長い期間で成分の70%を放出する。
【０２３６】
成分を保持する非晶質の金属有機構造体の放出動態は、取得元である、成分を保持する結晶質の金属有機構造体と比較することができる。
【０２３７】
放出期間は、構造体からの成分の最初の放出を基準にして求められる。
【０２３８】
成分の放出量は、放出前に構造体において保持されている成分の合計量(調製方法から知ることができる)を基準にして見積もられる。成分の放出量は、標準の分光技術によって求めることができる。作業例では、放出された成分の吸光度の特徴を使用して、放出された材料の量を測定している。放出された成分のパーセンテージ量は、構造体において保持されている成分の合計量に対するモル%又はwt%を指す場合がある。
【０２３９】
一実施形態では、非晶質の金属有機構造体によって、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも7日、少なくとも10日、少なくとも14日、又は少なくとも28日間にわたる継続的な成分の放出が可能になる。継続的な放出は、必ずしも一定の放出速度でない。実際に、以下で論じるとおり、放出速度は、時間と共に変化しうる。
【０２４０】
非晶質の金属有機構造体では、保持された成分の実質上全部を構造体から放出させることが可能となりうる。したがって、一実施形態では、成分の少なくとも80%、たとえば少なくとも90%、たとえば少なくとも95%が、非晶質の金属有機構造体から放出される、又は放出可能である。
【０２４１】
これに代わる実施形態では、非晶質の金属有機構造体から放出される成分の量は、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも50%、又は少なくとも60%である。
【０２４２】
金属有機構造体から放出される成分の量は、5日、10日、14日、28日、又は50日の時点で求めることができる。これに代わる実施形態では、金属有機構造体から放出される成分の量は、2日又は3日日の時点で求めることができる。
【０２４３】
一実施形態では、28日後には、成分の少なくとも80%が放出される。
【０２４４】
非晶質の金属有機構造体は、成分を2段階で放出しうることがわかった。成分の一部の比較的急速な初期の放出段階が存在することがある。この放出は、構造体の非晶質の孔表面組織に沿った脱着及び拡散と関連する。第2の放出段階は、比較的緩徐な放出である。この放出は、多孔性構造の欠陥が部分的に溶解して、その結果、残存する被包された成分が遊離することと関連する。実質上すべての残存成分が、この第2段階で放出される。第2段階は、実質上線形の放出プロファイルを有する。
【０２４５】
通常、成分の10%以下、20%以下、30%以下、40%以下、50%以下、又は50%以下が、初期の放出において放出される。
【０２４６】
初期放出は、最高でも4時間、最高でも12時間、最高でも24時間、又は最高でも48時間の初期放出期間となりうる。
【０２４７】
処置の方法
本発明の一態様では、処置の方法において使用するための非晶質の金属有機構造体が提供され、非晶質の金属有機構造体は、成分を保持し、成分は、医学的処置の方法において使用する活性薬剤である。同様に、本発明の医薬組成物も、処置の方法において使用するために提供される。
【０２４８】
処置の方法において、非晶質の金属有機構造体それ自体を医学的処置の活性薬剤として使用すべきであるという意図はない。むしろ、該当する生物活性を有するのは、構造体内に保持される成分である。したがって、非晶質の金属有機構造体は、生物学的に活性のある成分の担体であり、成分を保護し、目標の場所に送達するためのものである。
【０２４９】
非晶質の金属有機構造体は、真核細胞の細胞膜を越えることができる。したがって、非晶質の金属有機構造体は、成分を細胞へと送達し、その細胞内で成分を放出するのに適する。
【０２５０】
上で指摘したとおり、非晶質の金属有機構造体は、保持された成分の、制御され持続した形での放出を可能にする。したがって、非晶質の金属有機構造体は、活性薬剤を持続的な期間にわたって放出することが臨床的に有益である処置の方法における使用に適する。
【０２５１】
ここで、成分は、処置の方法における使用に適する活性薬剤である。成分は、非晶質の金属有機構造体内に製剤され、非晶質の金属有機構造体を使用して、処置を受ける対象内の適切な場所に活性薬剤が送達される。成分は、非晶質の金属有機構造体から放出可能である。
【０２５２】
これに代わる態様では、医学的処置の方法において使用するための活性薬剤が提供され、活性薬剤は、非晶質の金属有機構造体内に保持される。一実施形態では、非晶質の金属有機構造体は、医薬組成物内に提供される。
【０２５３】
処置の方法において、成分は、非晶質の金属有機構造体から放出されて、それによって利用可能となる。上で論じたとおり、非晶質の金属有機構造体は、延長された期間にわたって成分を放出するのに適する。
【０２５４】
本発明の一実施形態では、成分を保持する非晶質の金属有機構造体は、がん等の増殖性疾患を処置するためのものである。したがって、成分は、がん等の増殖性疾患を処置するための活性薬剤である。がんは、子宮頚がんである場合がある。本明細書で提供する作業例では、金属有機構造体がHeLa細胞又はHEK-293細胞系へと送達可能であることを示す。
【０２５５】
送達方法
本発明の更なる態様では、目標の場所に成分を送達するための非晶質の金属有機構造体の使用が提供される。成分は、金属有機構造体によって保持され、金属有機構造体が目標の場所に提供されたなら、成分は、構造体から放出されうる。
【０２５６】
したがって、本発明の一態様では、成分を目標の場所に送達する方法であって、
(i)目標の場所において、成分を保持している非晶質の金属有機構造体を提供する工程と、
(ii)非晶質の金属有機構造体からの成分の放出を可能にして、それによって目標の場所において成分を提供する工程と
を含む方法が提供される。
【０２５７】
一実施形態では、目標の場所は、増殖性細胞、たとえばがん細胞等の細胞の内部(細胞内)にある。
【０２５８】
一実施形態では、細胞等の目標の場所は、in vivoである。
【０２５９】
一実施形態では、細胞等の目標の場所は、ex vivoである。
【０２６０】
一実施形態では、目標の場所は、細胞外の場所である。
【０２６１】
一実施形態では、目標の場所において非晶質の金属有機構造体を提供する工程は、非晶質の金属有機構造体を細胞膜に突き通すことを含む。細胞膜は、がん細胞等の増殖性細胞の膜である場合がある。細胞膜は、真核又は原核細胞膜である場合がある。
【０２６２】
一実施形態では、目標の場所において非晶質の金属有機構造体を提供する工程は、非晶質の金属有機構造体を、ミクロキャピラリー等の毛管に巡らせる工程を含む。
【０２６３】
送達方法において、非晶質の金属有機構造体は、目標の場所への送達に適する医薬組成物として製剤される場合もある。
【０２６４】
成分の放出は、非晶質の金属有機構造体が、水性塩基等の塩基に曝されることにより実現しうる。成分は、pH7.4等の生理的条件下で放出されうる。
【０２６５】
他の選択
上述の実施形態の両立できるありとあらゆる組合せを、ありとあらゆる組合せが個別かつ明示的に列挙されたかのように、本明細書において明示的に開示する。
【０２６６】
本発明の更なる種々の態様及び実施形態は、当業者には、本開示を考慮して明白となろう。
【０２６７】
本明細書で使用する「及び/又は」は、指定された2つの特色又は成分それぞれの、他方を含む又は含まない、詳細な開示であると解釈される。たとえば、「A及び/又はB」は、(i)A、(ii)B、及び(iii)A及びBのそれぞれの詳細な開示として、まさに、それぞれが本明細書において個々に提示されたかのように解釈される。
【０２６８】
文脈からそうでないことが規定されない限り、上で述べた特色の記述及び定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施形態に限定されず、記載されているすべての態様及び実施形態に等しく当てはまる。
【０２６９】
これより、本発明のある特定の態様及び実施形態を、例として、また上述の図面に即して説明する。
【０２７０】
実験
計測装置
PXRDデータは、Bragg-Brentanoの幾何学的配置において、Cu Kα1用の主Geモノクロメーター及びSol-X固体状態検出器を備えたD8 Bruker回折計で収集した。収集条件は、2〜70°の2θ、ステップサイズ0.02°、15秒/ステップ、発散スリット0.2mm、受光スリット0.2mmとした。
【０２７１】
SEM用の試料は、アルミニウムスタブに載せられた分光学的に純粋な炭素タブ(TAAB Ltd UK)に散乱させた。試料は、Quorum Emitech K575Xスパッタコーターにおいて15nmの金でコーティングして導電性にした。試料は、5keVで動作させたFEI XL30 FEGSEMにおいて、Everhart Thornley二次電子検出器を使用して画像処理した。
【０２７２】
熱重量分析(TGA)は、継続的な乾燥N2ガス流中で、白金皿上に保持された試料(0.7〜5mg)を用い、TA Instruments社Q-500シリーズの熱重量分析装置を使用して行った。600℃まで5℃/分の加熱速度を使用してTGA曲線を取得した。
【０２７３】
Micromeritics社のTriStar計器を使用して、77Kで、N2吸着等温線に着手した。
【０２７４】
合成及び特性決定
ジルコニウム系MOFであるUiO-66(UiO=University of Oslo)[Zr6O4(OH)4(BDC)6](BDC=1,4-ベンゼンジカルボキシレート)を、成分を目標の場所に送達するための典型的な金属有機構造体として使用した。
【０２７５】
UiO-66は、Zrオキソクラスター及びBDC配位子を主体とする立方構造を有し(Cavkaらを参照されたい)、2種の主要な空洞(空洞直径  約11及び8Å、入り口直径  約5及び7Å)によって形成される大きな多孔(SBET 1200m2g-1、Vp  約0.5cm3g-1)と相まって、高い熱及び化学安定性を有する(Cunhaらを参照されたい)。加えて、Zrは、毒性が低い(ラットにおける酢酸ジルコニル致死用量LD50  約4.1mg/mL、更に、人体は、約300mgのZrを含んでおり、1日摂取量は、約3.5mg/日である)。
【０２７６】
結晶質のUiO-66は、Katzらが記載している手順に従って取得した。すなわち、ZrCl4(0.125g)をDMF(5mL)とHCl(1mL、37%)の混合物に溶解させた。別途、テレフタル酸(BDC、0.123g)をDMF(10mL)に溶解させた。テフロン(登録商標)で内側が覆われた25mLのオートクレーブにおいて2種の溶液を混合し、80℃で16時間加熱した。得られる固体を、5,500rpmで10分間の遠心分離によって集め、次いで、DMF及びエタノールで3回洗浄した。次いで、白色の生成物を真空オーブンにおいて90℃で乾燥させて、残存する溶媒を除去した。
【０２７７】
結晶質のUiO-66の多孔度は、77KでのN2吸着を使用して分析した(図5を参照されたい)。分析の前に、100mgの試料を、真空中にて150℃で24時間排気した。合成されたUiO-66のBET面積は、文献において以前に報告されている値と同様に、1,166m2/gであった(Cavkaら及びCunhaらを参照されたい)。
【０２７８】
ローディング実験
化合物を細胞膜に不透過性にするその親水性の性質を考慮して、カルセインをモデル活性薬剤として選択した。加えて、カルセインは、蛍光分子であるので、共焦点顕微鏡法によって容易に追跡することができる。その自己消光特性のために、高い局所濃度のカルセイン(たとえば、金属有機構造体に吸着されているとき)は、検出することができない。したがって、カルセインは、検出されるとき、一般に、構造体からの薬剤の放出と関連付けられる。
【０２７９】
カルセイン吸着は、結晶質のUiO-66(20mg)を、5mLのカルセインメタノール溶液(5mg/mL)に、オービタル撹拌しながら37℃で6日間浸漬することにより実施した。5,500rpmで20分間遠心分離した後、ローディングされた材料を得、メタノールで2回洗浄し、10分間再び遠心分離し、37℃で終夜乾燥させて溶媒を除去した。
【０２８０】
紫外可視分光光度計を498nmで使用し、最初の遠心分離工程後の上清中に存在する薬物の量を測定して、吸着されたカルセインの量を定量化した。ローディング量は、式[1]によって示される。
【０２８１】
【数１】
2018522860.tif 000007
【０２８２】
付加されたカルセインは、t=0時点でのカルセインの量であり、材料は、加えた結晶質UiO-66の量である。
【０２８３】
MOF非晶質化
カルセインローディングした結晶質のUiO-66(cal@UiO-66、0.2g)を、8mmのステンレス鋼ボールと共に、テンレス鋼広口瓶に入れた。次いで、Retsch MM200ミルを使用して広口瓶を20Hzで30分間振動させ、カルセインローディングした非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66)を得た。
【０２８４】
PXRD、SEM、及びTGA分析
結晶質のUiO-66、カルセインローディングした結晶質のUiO-66(cal@UiO-66)、及びカルセインローディングした非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66)を、粉末X線回折(PXRD)によって分析した。
【０２８５】
結晶質のUiO-66についての算出回折パターンをcal@UiO-66と比較することにより、構造の保持が確認された(図1を参照されたい)。cal@UiO-66をボールミル粉砕によって非晶質化してcal@aUiO-66が生成された結果、非晶質材料のPXRDパターンから長距離秩序及び関連するブラッグ反射が消失した。
【０２８６】
結晶質のUiO-66の走査型電子顕微鏡(SEM)像から、261±12nmの粒径が明らかになった(図4を参照されたい)。非晶質化後の粒子の形態は、それほど均質でなく、粒径は、272±157nmである。
【０２８７】
結晶質のUiO-66の熱重量分析(TGA)から、溶媒分子の脱着に対応する、100℃未満での最初の質量減少に続いて、約475℃での固体分解が明らかになった(図4cを参照されたい)。cal@UiO-66の熱重量分析では、材料からのカルセイン脱着に対応する、約400℃での追加のステップが示される。TGAによって測定されたカルセインローディング量は、4.9±0.2wt%であった。
【０２８８】
カルセイン分子の大きさ及び材料の孔入り口直径によって、より大きいローディング量の可能性は制限される。それにもかかわらず、この量は、非晶質材料からの制御された送達の方法において使用するのに十分である。
【０２８９】
送達アッセイ
生理的条件に似せるために、37℃のインキュベーターにおいて、オービタル撹拌しながら、pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS、10mM)を使用して、カルセイン放出実験を行った。カルセインローディングした非晶質及び結晶質のUiO-66(3mg)を、合計体積10mLのPBSと共に、透析バッグ(MWCO 3,500、分子量カットオフDa、Medicell International社)に入れた。異なる時点で、1mLのPBSを採取し、1mLの新たなPBSと入れ替えた。紫外可視分光光度計を498nmで使用して、薬物の放出量を測定した。カルセイン放出の補正濃度は、式[2]によって示される。
【０２９０】
【数２】
2018522860.tif 000008
【０２９１】
ctは、時間tにおける補正されたカルセイン濃度であり、c'tは、見かけのカルセイン濃度であり、vは、採取された試料であり、Vは、溶液の合計体積である。どの実験もすべて、三通りに行った。
【０２９２】
放出の挙動を理解するために、結晶質及び非晶質のUiO-66からのカルセイン送達の動態を、非線形回帰を使用して調整した。結晶質材料については、単純双曲線モデル[3]に適合させた。
【０２９３】
【数３】
2018522860.tif 000009
【０２９４】
Nは、合計薬物ローディング量から放出された、質量パーセント量であり、Nmaxは、最大放出量であり、tは、日数での時間であり、t1/2は、最大送達量の半分に達するのに必要な時間である。
【０２９５】
カルセインローディングした非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66)については、送達を単純曲線に適合させることが可能でなかった。この場合では、異なる2つの放出段階を考慮に入れている双曲線モデルを使用した[4]。
【０２９６】
【数４】
2018522860.tif 000010
【０２９７】
Nmax及びt1/2は、2つの段階(1)及び(2)が考慮に入れられている。
【０２９８】
図2及びTable 1(表1)に、カルセインローディングした結晶質及び非晶質のUiO-66について、それぞれ、実験放出の当てはめ及び当てはめパラメーターを示す。
【０２９９】
cal@UiO-66によって送達されたカルセインの最大量は、97.07wt%であり、その量の半分は、1.86時間以内に放出された。観察されたcal@aUiO-66の2段階の放出パターンは、異なる2つの放出現象の存在と関係していると考えられる。第1段階の間、カルセインの放出は、材料の非晶質の孔表面組織に沿った脱着及び拡散を経て進行すると考えられる。約58wt%のカルセインがこの方法で放出可能であり、この量の半分は、14時間以内に放出され、cal@UiO-66と比べてはるかに緩徐な拡散であることを示している。
【０３００】
第2の放出段階は、aUiO-66の欠陥が部分的に溶解して、その結果、被包されたカルセインを遊離させることと関連していると考えられる、はるかに緩徐な過程である。
【０３０１】
【表１】
2018522860.tif 000011
【０３０２】
非晶質材料から送達されたカルセインを検出することが可能であったので、ボールミル粉砕過程によって、ゲストの分解は引き起こされなかったと結論付けるのが妥当となった。
【０３０３】
細胞培養
10%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、100単位/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンを補充したグルコース高含有(4,500mg/L)ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において、37℃、5%CO2で、HeLa細胞を維持した。細胞は、1週間に3回、2.8×104細胞/cm2の密度で(75〜80%の集密度で)継代した。
【０３０４】
細胞毒性検定
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)(Promega社、英国)還元検定を使用して、空の結晶質UiO-66の細胞毒性活性を調査した。実験前日、HeLa細胞を、96ウェルプレートに、ウェルあたり5×103細胞の密度で接種した。処理前に、細胞をPBSで2回洗浄した。
【０３０５】
UiO-66試料は、0.5%のDMSOを含有する細胞培養培地に、一定範囲の濃度で分散させた。UiO-66を含有する培地を、次いで細胞に加え、37℃、5%CO2で24時間及び48時間インキュベートした。
【０３０６】
毒性を測定するために、細胞を十分に洗浄して固体を除去し、培地を、MTS/フェナジンメトサルフェート溶液(20μL、20:1の割合)を含有する新たな培地(100μL)と入れ替え、プレートを37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。プレートを490nmで可視化した。
【０３０７】
実験において使用したDMSO濃度は、HeLa細胞に対して毒性でなかったことが確認された。
【０３０８】
24時間及び48時間の時点でIC50値を測定した。判明した値は、24時間及び48時間について、それぞれ、1.503±0.154mg/mL及び1.357±0.088mg/mLであった。これらの値は、MIL Fe系MOFについて報告されているものと同様である(Tamames-Tabarらを参照されたい)。
【０３０９】
非晶質のUiO-66は、結晶質のUiO-66と同じ毒性プロファイルを有することが予想され、毒性の結果は、非晶質形態と結晶質形態の金属有機構造体に共通する構成成分に関係する。
【０３１０】
共焦点顕微鏡法
細胞浸透検定については、HeLa細胞を、NUNC(商標)画像処理用4ウェルプレートに、1.11×105細胞/mLの密度で接種し、DMEM中にて37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、0.25mg/mLのカルセインローディングした結晶質のUiO-66(cal@UiO-66)又はカルセインローディングした非晶質のUiO-66(cal@aUiO-66)のいずれかと共に、24時間及び48時間インキュベートした。ローディング材料は、培地に十分に分散させてから、細胞を含有するウェルプレートに加えた。未処理細胞及び遊離カルセインを対照として含めた(0.013mg/mL)。Hoechst 33342(H33342)及びヨウ化プロピジウム(PI)(各5μg/mL)を、それぞれ、核の染色用及び生存度対照として使用した。
【０３１１】
インキュベート時間経過後、細胞を数回洗浄して、内部移行していないすべての材料を除去した。未処理細胞を4%p-ホルムアルデヒド(PFA)で5分間固定化し、後に、すべての試料を、H333421色素及びPIを含有する培地と共に15分間インキュベートした。次いで、細胞を十分に洗浄して色素を除去し、次いで、各試料に新たな培地(フェノールレッドなし)を加えた。最後に、画像処理を行うため、4ウェルプレートをLeica TCS SP5共焦点顕微鏡に設置した。顕微鏡は、405ダイオード、アルゴン、及びHeNeレーザーを備えていた。Leica LAS AFソフトウェアを使用して、画像を解析した。
【０３１２】
追加の実験作業
一連の別の非晶質構造体を調製した。そうした構造体には、それぞれが異なるジカルボキシレート有機配位子を有する、等細網状Zr系ファミリーのMOFが含まれた。異なる6種の配位子L1〜L6を使用しており、これらを以下に示す。
【０３１３】
【化５】
2018522860.tif 000012
【０３１４】
これらの金属有機構造体を、それぞれ、Zr-L1〜Zr-L6と呼ぶ。
【０３１５】
Zr含有NU-1000及びNU-901、並びにBi含有CAU-7も調製した。NU-901は、示されるH4TBAPy配位子を含み、CAU-7は、同じく以下に示すH3BTB配位子を含む。
【０３１６】
【化６】
2018522860.tif 000013
【０３１７】
合成について以下に記載する。Zr-L1は、その調製が上述されているUiO-66に相当する。
【０３１８】
合成
Zr-L2〜Zr-L4は、必要なリンカーL2、L3、又はL4(2.70mmol、1当量)、及びZrCl4(0.629g、2.70mmol、1当量)を、250mLの試薬びんに加えることにより合成した。DMF(60mL)及び塩酸(0.24mL)を加え、混合物を10分間音波処理した後、混合物を24時間120℃のオーブンに入れた。24時間後、びんを取り出し、室温に冷ました。生成物を遠心分離によって集め、DMF(30mL)及びアセトン(2×30mL)で洗浄した。試料を真空デシケーターに入れて乾燥させた。
【０３１９】
Zr-L5及びZr-L6は、L-プロリン(1.554g、13.50mmol、5当量)、必要なリンカーL5又はL6(2.70mmol、1当量)、及びZrCl4(0.629g、2.70mmol、1当量)を、250mLの試薬びんに加えることにより合成した。DMF(60mL)及び塩酸(0.24mL)を加え、混合物を10分間音波処理した後、混合物を24時間120℃のオーブンに入れた。24時間後、びんを取り出し、室温に冷ました。生成物を遠心分離によって集め、DMF(30mL)及びアセトン(2×30mL)で洗浄した。試料を真空デシケーターに入れて乾燥させた。
【０３２０】
CAU-7合成:30mLのマイクロ波対応ガラス反応容器(Biotage社)において、1,3,5-ベンゼントリス安息香酸(H3BTB)(200mg、0.46mmol)とBi(NO3)3・5H2O(148mg、0.31mmol)を混合し、これにメタノール(99.8%、20mL)を加えた。反応容器をセプタムで密閉し、反応混合物を均質化し、Biotage Initiatorマイクロ波合成装置において20分間120℃に加熱した。混合物は、反応の間、磁気撹拌子で撹拌した。得られる黄色の沈殿を濾過し、メタノール、DMF、及び再びメタノールで洗浄した。生成物は、X線粉末回折によって、純粋なCAU-7であると確認された。
【０３２１】
NU-1000は、H4TBAPy配位子の調製とNU-1000の調製の両方が記載されている、Mondlochら(J. Am. Chem. Soc. 2013、135、10294)のプロトコールに従って調製した。DMF(8mL)中でZrCl4(70mg、0.30mmol)と安息香酸(2,700mg、22mmol)を混合し、超音波を用いて溶解させた。透明な溶液を800℃のオーブンにおいて1時間インキュベートし、次いで室温に冷ました。次いで、この溶液にH4TBAPy(40mg、0.06mmol)を加え、混合物を20分間音波処理した。黄色の懸濁液を1,200℃のオーブンで48時間加熱し、次いで室温に冷ました。得られる材料を濾過によって単離し(35mgの活性化材料、収率54%)、DMFで洗浄し、引き続いてHClで活性化させた。次いで、多孔に残された残留溶媒を除去するために、材料を真空オーブンにおいて70℃で終夜熱処理する。
【０３２２】
NU-901は、H4TBAPy配位子の調製とNU-901の調製の両方が記載されている、Kungら(Chem. Mater. 2013、25、5012)のプロトコールに従って調製した。DMF(8mL)中でZrCl4(35mg)と安息香酸(1.35g)を混合し、超音波を用いて溶解させた。溶液を80℃のオーブンにおいて2時間インキュベートし、次いで室温に冷ました。この溶液にH4TBAPy(20mg)を加え、混合物を20分間音波処理した。得られる黄色の懸濁液を120℃のオーブンで4.5時間加熱し、次いで室温に冷ました。沈殿した材料を取り出し、試料をDMFで洗浄した。次いで、多孔に残された残留溶媒を除去するために、材料を真空中にて70℃で終夜熱処理する。
【０３２３】
NU-1000及びNU-901は、コア八面体Zr6クラスターを主体とする。NU-901は、斜方形(diagonal)又は菱形の形状の孔を有するのに対し、NU-1000は、主として六辺形の孔を有し、一部は、小さい三角形の孔である。幾何学的配列の違いは、合成方法の違いによって実現される。
【０３２４】
ローディング実験
上記実験において調製した金属有機構造体を、次いで、カルセイン、抗がん薬、又はsiRNAにローディングした。構造体にローディングするモデル成分は、カルセイン、並びにジクロロ酢酸(DCA)、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(α-CHC)、及び5-フルオロウラシル(5-FU)から選択される3種の抗がん薬の1種とした。
【０３２５】
カルセイン吸着は、金属有機構造体(Zr-L1〜Zr-L6、100mg)を、カルセインメタノール溶液(25mL、5mg/mL)に、オービタル撹拌しながら37℃で6日間浸漬することにより実施した。NU-1000に対するカルセイン吸着は、10mgの金属有機構造体を、5mLのカルセイン水溶液(脱イオン水中10mg/mL、約7.5にpH調整)に、オービタル撹拌しながら37℃で3日間浸漬することにより実施した。
【０３２６】
NU-901に対するカルセイン吸着は、金属有機構造体(100mg)を、カルセイン脱イオン水溶液(50mL、10mg/mL、約7.5にpH調整)に、オービタル撹拌しながら37℃で3日間浸漬することにより実施した。5,500rpmで50分間遠心分離することにより試料を集め、37℃で終夜乾燥させて溶媒を除去した。
【０３２７】
α-CHCローディングは、250mgの固体金属有機構造体を、25mLのα-CHCメタノール溶液(10mg/mL)に、撹拌しながら室温で1日浸漬することにより実現された。
【０３２８】
DCAローディングは、250mgの固体金属有機構造体を、5mLのDCAメタノール溶液(2M)に、室温で撹拌しながら浸漬することにより実現された。
【０３２９】
5-FUローディングは、150mgの固体金属有機構造体を、5mLの5-FUメタノール溶液(7mg/mL)に、撹拌しながら室温で3日間浸漬することにより実現された。
【０３３０】
(ローディングしたNU-1000及びローディングしたNU-901を除く)すべての場合において、薬物ローディングした金属有機構造体は、5,500rpmで20分間遠心分離することにより集め、メタノールで2回洗浄し、10分間再び遠心分離し、80℃で終夜乾燥させて溶媒を除去した。ローディングしたNU-1000構造体は、5,500rpmで20分間遠心分離することにより集め、37℃で終夜乾燥させて溶媒を除去した。ローディングしたNU-901は、5,500rpmで50分間遠心分離することにより集め、37℃で終夜乾燥させて溶媒を除去した。
【０３３１】
siRNAローディング試料は、NU-1000(110mg前後)を脱イオン水(5.5mL、DECP処理済み、無菌)に浸漬して、これを、siRNAの脱イオン水溶液(10μMの脱イオン水溶液、DECP処理済み、無菌)で100μLとすることにより実施した。溶液をオービタル撹拌機に載せて37℃で2時間混合し、その後試料を移し、3,500rpmで2〜4分間遠心分離した。上清を集め、ローディングを定量化するために保管した。ローディングされた構造体は、37℃で終夜乾燥させた。以下に記載するとおりのQubit法を使用して、ローディングを定量した。
【０３３２】
構造体に吸着されたカルセインの量は、TGAを使用して定量化した。構造体に吸着されたDCAの量は、ICP及びTGA分析によって定量化した。α-CHC及び5-FUの場合では、紫外可視分光光度計によって、それぞれ337及び266nmで、最初の遠心分離工程後の上清中に存在する薬物の量を測定して、構造体に吸着された薬物の量を測定した。ローディング量は、式[1]によって示される。
【０３３３】
【数５】
2018522860.tif 000014
【０３３４】
こうした分析から、種々の金属有機構造体のローディング量を求めており、ローディング量は、以下でTable 1(表2)に示す。
【０３３５】
【表２】
2018522860.tif 000015
【０３３６】
MOF非晶質化
機械的及び温度非晶質化手順を使用して、成分を保持する非晶質の金属有機構造体を生成した。
【０３３７】
機械的非晶質化
典型的な実験では、ローディングした金属有機構造体(0.1g)を、8mmのステンレス鋼ボールと共に、ステンレス鋼広口瓶に入れた。次いで、Retsch MM200ミルを使用して広口瓶を20Hzで30分間振動させて、ローディングした非晶質の金属有機構造体を得た。
【０３３８】
siRNAローディングしたNU-1000金属有機構造体及びカルセインローディングしたNU-901金属有機構造体については、構造体を、7mmのステンレス鋼ボールと共にステンレス鋼広口瓶に入れた。次いで、Retsch MM200ミルを使用して広口瓶を20Hzで2分間振動させて、ローディングした非晶質の金属有機構造体を得た。
【０３３９】
熱非晶質化
典型的な実験では、(ローディングしたNU-1000を除き、)40mgのローディングした金属有機構造体を、固体を湿らすのに十分な少量の水と共に、ガラスバイアルに入れた。次いで、試料を180℃で5時間加熱した。
【０３４０】
ローディングしたNU-1000については、金属有機構造体化合物を、上述のとおりに遠心分離によって集め、次いで、直ちに真空中にて180℃で24時間乾燥させた。
【０３４１】
薬物送達検定
薬物送達実験は、生理的条件に似せるために、37℃のインキュベーターにおいて、pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS、10mM)を媒質として使用して、オービタル撹拌しながら実施した。
【０３４２】
ローディングした金属有機構造体(カルセイン、α-CHC、及び5-FUローディング構造体については5mgのローディングした金属有機構造体、DCAローディング構造体については20mg)を、PBS(10mL)と共に透析バッグ(MWCO 3500、Medicell International社)に入れた。実験の間、一定分量のPBS (1mL)を試験用に取り出し、新たなPBS(1mL)と入れ替えた。
【０３４３】
別法として、ローディングした金属有機構造体(3〜5mg前後)を、1mLのPBSと共にエッペンドルフ管に入れた。試料を取り出す前に、管を16,000gで50秒間遠心分離した。試験用にPBS溶液を管から全部取り出し、これを新たなPBS(1mL)と入れ替えた。
【０３４４】
構造体から放出された薬物の量は、インキュベートする間の種々の時点で採取したPBS試料中に存在する材料の量から求めた。試料は、カルセイン及びα-CHCについて、それぞれ498及び337nmで検出を行う紫外可視分光法によって分析した。DCA及び5-FUの場合では、構造体から放出された薬物の量をHPLCによって測定した。
【０３４５】
カルセイン等の薬物放出の補正濃度は、式[2]によって示される。どの実験もすべて、三通りに行った。
【０３４６】
【数６】
2018522860.tif 000016
【０３４７】
図9に、結晶質(べた塗りの円)及び非晶質の金属有機構造体(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化によって調製されている。
【０３４８】
図13には、結晶質(べた塗りの円)及び非晶質のNU-1000(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、温度非晶質化によって調製されている。
【０３４９】
図14には、結晶質(べた塗りの円)及び非晶質のNU-901(空白の円)からのカルセインの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化によって調製されている。
【０３５０】
カルセインは、すべての結晶質の構造体から、およそ2〜3日日で放出され、非晶質の構造体の放出プロファイルと異なっていた。
【０３５１】
非晶質のZr-L2及び非晶質のZr-L3については、それぞれ2日及び7日で63%及び68%のカルセインが放出され、カルセインが構造体内に申し分なく閉じ込められたことが示唆された。非晶質のZr-L4の場合では、カルセインのより緩徐で漸進的な放出が15日にわたって観察された。
【０３５２】
ローディングしたZr-L5及びZr-L6構造体については、結晶質形態と非晶質形態からの放出に有意な差異がなかった。より長いリンカーを有する構造体については、ボールミル粉砕過程の間に多孔が完全に塞がれず、ゲスト分子の材料からの拡散が可能になった可能性がある。
【０３５３】
NU-1000放出プロファイルは、結晶質及び熱による非晶質両方の形態について、50日前後(約7週)で完全に全部の放出を示した。放出初期の最初の6日にかけて、非晶質は、結晶質形態と比べて放出が遅延している。
【０３５４】
NU-901からのカルセインの放出については、二元配置分散分析(two-way ANOVA)検定のとおり、結晶質構造と機械的非晶質構造からの放出に、顕著で統計学的に有意な差がある。反復実験において、非晶質のNU-901からのカルセインの放出は、より早期の結晶質の実験のものに対して正規化したとき、結晶質形態からの放出と比べて有意には遅延していなかった。このシステムについては、更なる研究が進行中である。それでも、非晶質の構造体からの、6日を越える期間にかけてのカルセインの持続放出が可能であることは明白である。
【０３５５】
図10には、結晶質及び非晶質の金属有機構造体からのDCAの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。
【０３５６】
DCAは、結晶質のZr系MOF Zr-L1〜Zr-L6から1〜2日で、非晶質のZr系MOF Zr-L1、Zr-L2、及びZr-L3から2日前後で送達された。3又は4日日後、非晶質のZr-L4から、利用可能な薬物の60%前後、非晶質のZr-L5及びZr-L6から80%が放出された。熱による非晶質MOFについては、Zr-L4〜Zr-L6構造体の結晶質形態と非晶質形態とに、放出プロファイルの差異が認められた。
【０３５７】
最後に、CAU-7について、DCAは、結晶質材料からは15日前後で完全に、機械的非晶質からは80%のDCAだけが送達された。珍しいことに、熱によって非晶質化されたCAU-7構造体からの完全な放出が結晶質形態より急速であったことが注目された。これは、熱非晶質化において、処理の間に構造体から薬物を引き寄せかねない水が使用された結果であると考えられる。またローディングレベルが非常に高い(たとえば、この特定の例では33wt%)ときも、これが起こりうると考えられる。
【０３５８】
図11には、結晶質及び非晶質の金属有機構造体からのα-CHCの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。
【０３５９】
α-CHCは、結晶質のZr系MOF Zr-L1〜Zr-L6からは、α-CHCの完全な放出が3日後にも実現されなかったZr-L3を除き、1〜3日前後で完全に送達された。結晶質と機械的非晶質の構造体の放出プロファイルには、いくらかの差異が認められたが、そうした差異は、重要な差異ではなかった。
【０３６０】
温度に基づく非晶質システムからは、非晶質のZr-L6及びCAU-7を試験した。熱によって非晶質化された構造体は、結晶質形態に比べて遅延した放出を示した。
【０３６１】
図12には、結晶質及び非晶質の金属有機構造体からの5-FUの放出プロファイルを示す。ここで、非晶質の金属有機構造体は、機械的非晶質化(赤い空白の円)又は温度非晶質化(青い空白の円)によって調製されている。
【０３６２】
5-FUは、試験した結晶質及び非晶質両方の金属有機構造体から、最大5時間で送達された。例外は、Zr-L1であり、非晶質形態と結晶質形態からの完全な放出に顕著な差があった(前者については6日、後者については0.04日)。
【０３６３】
種々の金属有機構造体から薬物が完全に放出される時間を、Table 2 (表3)にまとめて示す。
【０３６４】
【表３】
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【０３６５】
実験の時間枠で完全放出が認められない場合では、放出量を、量を記録したときの日数の下付き文字として示す。たとえば、263%は、2日目で63%の放出を指す。NTは、まだ試験していないシステムを指す。
【０３６６】
siRNA送達検定
siRNA送達実験は、37℃のインキュベーターにおいて、オービタル撹拌しながら実施した。
【０３６７】
siRNAローディングNU-1000実験は、脱イオン水(DECP処理済み、無菌)溶液中で実施した。分解の可能性を排除するために、使用前にすべての器具をRNAse Zapで清掃した。実験は、三通りに実施した。
【０３６８】
ローディングした非晶質の構造体(3〜5mg前後)を、脱イオン水(0.5mL)の入ったエッペンドルフ管に装入した。試料を取り出す前に、管を10,500×gで1分間遠心分離した。実験の間の種々の時点で、一定分量の溶液(0.5mL)を試験用に取り出し、新たな脱イオン水(0.5mL)と入れ替えた。溶液は、siRNA分解を始めとする試料の変化を最小限に抑えるために、必要になるまで冷凍庫において-20℃で保管した。Zymo Oligo Clean & Concentrator Kitを使用して試料溶液を精製して、NU-1000リンカー、金属クラスター、及び他の構造体成分の量が最小限に抑えられた脱イオン水中のsiRNA試料を得た。
【０３６９】
精製されたsiRNA試料は、オリゴヌクレオチドを検出するQubit検定を使用して分析した。Qubit microRNA色素保存液とmicroRNA緩衝液の1:200混合物を調製した。次いで、この混合物を、一定分量のsiRNA試料と共に試料管に加えた(7μLの試料を混合物で200μLとしたもの)。
【０３７０】
siRNA試料を直接加えた後、各試料管をボルテックス撹拌し、次いで2分間静置して、Qubit色素がsiRNAに結合するようにした。次いで、試料を、(0ng/mL及び500ng/mLの)2種のsiRNA標準と共に、Qubit Assay機器での測定にかけた。
【０３７１】
結晶質及び機械的非晶質のNU-1000からのsiRNAの放出プロファイルを、図15に、放出初期の9時間の差し込み拡大表示を含めて示す。
【０３７２】
siRNAは、結晶質及び非晶質化NU-1000から、約90時間にわたって放出可能であった。この時間の間、ローディングした結晶質のNU-1000は、その全積荷の約22%の放出を放出したのに対し、ローディングした非晶質化NU-1000は、その積荷の約17%を放出した。こうした最初の結果から、非晶質化過程によって、金属有機構造体からのsiRNA放出がより長期間遅延しうることが証明される。放出研究では、非晶質形態で、放出プロファイルの最初の9時間において、初期バースト放出が少なくなったことも示された。
【０３７３】
Heら(J. Am. Chem. Soc. 2014、136、5181)が、同じ溶媒(脱イオン水)及び同様の条件で実施した同様のsiRNA放出実験では、ローディングされたsiRNAのほんの20%足らずが放出された8時間までしか定量化されていない。Heらの研究は、結晶質形態の金属有機構造体の使用に注目しており、非晶質形態が成分の送達に有用となりうる又は有用となることは提案していない。
【０３７４】
各試料時点についての平均の差の二元配置分散分析を行い、結晶質のシステムの最終の2つの時点が、機械的非晶質のシステムと比べて、p値<0.05であり、統計学的に有意であったことが明らかになった。
【０３７５】
細胞培養
HeLa細胞を前に記載したとおりに調製した。
【０３７６】
細胞毒性検定
金属有機構造体が細胞活力に及ぼす影響を、MTS還元検定又はアネキシンV検定のいずれかを使用して代謝活性を測定することにより明らかにした。
【０３７７】
細胞毒性検定は、MTS還元検定(Promega社、英国)を使用して、実質的に上述のとおりに実施した。結晶質のZr含有金属有機構造体及び結晶質のBi含有構造体の細胞毒性活性を調査した。これらの構造体には、薬物をローディングしていなかった。
【０３７８】
実験前日、HeLa細胞を、96ウェルプレートに、ウェルあたり5×103細胞の密度で接種した。処理前に、細胞をPBSで2回洗浄した。どちらも様々な濃度の金属有機構造体及びα-CHCを、細胞培養培地に分散させた。次いで、これらを細胞に加え、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
【０３７９】
毒性を測定するために、細胞を十分に洗浄して固体を除去し、培地を新たな培地(100μL、20:1の割当てのMTS/フェナジンメトサルフェート20μlを含有する)と入れ替え、プレートを37℃、5%CO2で75分間インキュベートした。プレートを490nmで可視化した。
【０３８０】
リンカーH4TBAPyについてアネキシンV染色実験も行った。実験前日、HeLa細胞を、24ウェルプレートに、ウェルあたり0.05×106細胞の密度で接種した。処理前に、細胞をPBSで2回洗浄した。様々な濃度のリンカー化合物(L1〜L6及びH3BTB)を細胞培養培地に分散させた。得られる混合物を、次いで細胞に加え、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
【０３８１】
毒性を測定するために、細胞を十分に洗浄して固体を除去し、培地を(フェノールレッドなしの)新たな培地と入れ替えた。アネキシンV PE-Cy5染剤を各試料に加え、5分後、試料を、647nmで検出がなされる血球計算器に配置した。
【０３８２】
図7に、一定範囲の濃度の種々の金属有機構造体がHeLa細胞生存度に及ぼす影響を示す。図8には、一定範囲の濃度の種々の配位子並びにZr及びBi塩がHeLa細胞生存度に及ぼす影響を示す。Zr塩は、ZrCl4であり、Bi塩は、Bi(NO3)3.5H2Oであった。配位子は、上記合成の部において言及した配位子である。
【０３８３】
すべての金属有機構造体が、試験した濃度の範囲(1mg/mLまで)において生体適合性であった。金属有機構造体の調製に使用したすべての成分も、細胞に無害であった。
【０３８４】
NU-901についての細胞毒性分析は行わなかった。NU-1000とNU-901は、共通のリンカー、金属クラスターを有し、粒径もほぼ同じであるので、これら構造体の挙動、たとえば、その相互作用及び細胞への取込みに、有意差はないと考えられる。
【０３８５】
薬物の細胞取込み
HeLa細胞を、NUNC(商標)画像処理用4ウェルプレートに、1.11×105細胞/mLの密度で接種し、10%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、100単位/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンで補充したDMEMにおいて、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
【０３８６】
細胞をPBSで2回洗浄し、カルセインをローディングした結晶質のZr含有金属有機構造体(0.5mg/mL)と共に24時間インキュベートした。非晶質の構造体は、カルセインをローディングした結晶質のZr含有金属有機構造体の機械的非晶質化によって取得した。この金属有機構造体は、培地に十分に分散させてから、細胞に加えた。
【０３８７】
未処理細胞及び(0.075mg/mLの濃度の)遊離カルセインを対照として含めた。
【０３８８】
24時間インキュベートした後、細胞を数回洗浄して、内部移行していない粒子を除去した。次いで、細胞をHoechst 33342(H33342)及び1倍のCellMask(商標)Orangeと共に15分間インキュベートして、核及び細胞膜をそれぞれ染色した(各色素は、5μg/mLの濃度で用意した)。次いで、細胞を十分に洗浄して色素を除去し、各試料に新たな培地(フェノールレッドなし)を加えた。最後に、画像処理を行うため、プレートをLeica TCS SP5共焦点顕微鏡に設置した。顕微鏡は、405ダイオード、アルゴン、及びHeNeレーザーを備えていた。Leica LAS AFソフトウェアを使用して、画像を解析した。
【０３８９】
図16に、取込み実験から得られた共焦点顕微鏡像を示す。
【０３９０】
遊離カルセインと共にインキュベートした細胞は、24時間インキュベートの時点で、明るい小胞の形で薄く染色され(図16の最上列の像を参照されたい)、カルセインがエンドソームに被包されていることが示唆された。カルセインは、細胞膜に不透過性であると考えられているとはいえ、不透過性色素のエンドサイトーシスによる細胞取込みは、ヒト間葉系幹細胞(MSC)及びルシファーイエロー色素(LYCH)を使用して、以前に報告されている(Oliverら及びOrellana-Tavraらを参照されたい)。
【０３９１】
細胞をカルセインローディングした非晶質の構造体と共にインキュベートしたとき、24時間後に強いシグナルが検出され、MOF粒子が細胞によってうまく組み込まれたことが確認された。共焦点像における斑点状の染色は、MOFが細胞内小胞内に閉じ込められていることを示唆している。MOFは、明らかに細胞内部にあり、細胞膜の外部の部分上にはない。細胞核(青)、MOF粒子(緑)、及び細胞周辺(赤)を可視化することが可能であり、像が細胞の内部の平面であることが確認される。
【０３９２】
siRNA細胞取込み
HEK-293細胞を、24ウェルCorning細胞培養皿に、1.6×105細胞/mLの密度で接種し、10%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、0.1mg/mLのハイグロマイシンB、及び0.015mg/mLのブラスチシジンで補充したDMEMにおいて、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、種々の条件のsiRNAと共にインキュベートした。陰性対照は、DMEM培地と共にインキュベートした。
【０３９３】
陽性対照の各ウェルは、Thermo Fisher社のLipofectamine RNAmaxプロトコールに従い、タグ付けされたsiRNA(30pmol)と共にインキュベートした。裸のsiRNAタグの各ウェルは、タグ付けされたsiRNA(30pmol)と共にインキュベートした。
【０３９４】
タグ付けされたsiRNAがローディングされた結晶質のNU-1000は、上述のローディング方法に従って小規模調製で調製した。通常、NU-1000 (0.75mg)は、タグ付けされたsiRNAの10μM保存液(11.25μL)及び脱イオン水(26.25μL、DECP処理済み、無菌)で処理した。ウェルにおける試料の使用量は、ウェルあたりおよそ30pmolのタグ付けされたsiRNAが得られる量とした。
【０３９５】
24時間のインキュベート時間経過後、細胞を2回洗浄して、内部移行していないすべての材料を除去した。細胞をトリプシン(150μL)でおよそ5分間処理した後、完全培地(上述したもの、350μL)を加えた。混合物を1,200rpmで5分間遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を、フェノールレッドなしの完全培地(250μL)と入れ替えた。
【０３９６】
647nmに設定したλexを使用するフローサイトメトリーを実施した。タグ付けされたsiRNAと共にインキュベートされていない陰性HeLa細胞の集団の周囲に、その後の試料のゲートカウントが10,000事象となって、データ収集の精度が保証されるようにゲートを張った。
【０３９７】
タグ付けされたsiRNAの細胞取込みを示す、フローサイトメトリーにおける発現レベルを図17に示す。陰性対照では、siRNAインキュベートなし、したがって、インキュベートなしであった。陽性対照は、既知の細胞侵入物であるリポフェクタミン内部にローディングされたsiRNAを含んでいた。この値を100%発現に正規化して、他のすべての条件がこれと比較されるようにした。裸のsiRNAタグ条件は、純粋なタグ付けされたsiRNAを細胞と共にインキュベートしたものである。このsiRNAは、細胞外環境においてRNAses又は他のヌクレアーゼによって分解されるために、通常は分解され、細胞障壁を越えないことが知られている(Whiteheadら  Drug Discov. 2009、8、129を参照されたい)。siRNAを加えていない陰性対照と裸のsiRNAを加えた陰性対照の発現レベルには、統計学的有意性がなかった。
【０３９８】
NU-1000構造体にローディングされた、タグ付けされたsiRNAは、p値<0.0002となった一元配置分散分析のとおりに統計学的に有意な発現レベルで、細胞内部で検出された。
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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