(57)【要約】  本発明は、フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードのメンバーの外因性活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物に関する。
2018533424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物であって、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、シーラント配合物。
【請求項２】
前記ブレンドが、乾燥形態にあるか、又は液体ブレンドの形態にある、請求項１に記載のシーラント配合物。
【請求項３】
前記ブレンドが、フィブリノーゲン及び前記活性剤を、７０，０００：１〜２５：１のモル比で含む、請求項１又は２に記載のシーラント配合物。
【請求項４】
前記血液凝固カスケードの前記メンバーがチモーゲンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項５】
前記活性剤が非ヒト源である、請求項１から４のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項６】
前記活性剤が、毒、毒構成成分又は毒構成成分のアナログを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項７】
前記毒構成成分が、エカリン、ラッセルクサリヘビ毒第Ｘ因子（ＲＶＶ−Ｘ）、ラッセルクサリヘビ毒第Ｖ因子（ＲＶＶ−Ｖ）、ノスカリン、オスクタリン、トロカリン、コンブルキシン、ボトロセチン、及び前記毒構成成分のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載のシーラント配合物。
【請求項８】
前記活性剤が、前記凝固カスケードの前記メンバーの上流で活性なタンパク質分解性酵素であるか、又は前記タンパク質分解性酵素の組換え形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項９】
前記活性剤がエカリンである、請求項７又は８に記載のシーラント配合物。
【請求項１０】
前記活性剤がＲＶＶ−Ｘである、請求項７又は８に記載のシーラント配合物。
【請求項１１】
前記活性剤がＲＶＶ−Ｖである、請求項７又は８に記載のシーラント配合物。
【請求項１２】
前記活性剤が、ＲＶＶ−ＸとＲＶＶ−Ｖとの組合せである、請求項１０又は１１に記載のシーラント配合物。
【請求項１３】
前記活性剤が、プロトロンビンに対して活性である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１４】
前記活性剤が、第Ｘ因子に対して活性である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１５】
前記活性剤が、第Ｖ因子に対して活性である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１６】
トロンビン、又はトロンビンの機能的アナログを含まない、請求項１から１５のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１７】
カルシウムを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１８】
前記フィブリノーゲンが、寒冷沈降反応によって得られる、請求項１から１７のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項１９】
前記フィブリノーゲンが、生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項２０】
前記フィブリノーゲンが、クリオプレシピテートに由来する抗血友病因子調製物の生物的に活性な構成成分である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項２１】
室温で少なくとも５日間、安定している、請求項１から２０のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項２２】
２℃〜８℃で少なくとも５日間、安定している、請求項１から２０のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フィブリノーゲンをベースとするシーラント配合物及びその使用に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本開示の主題の背景として関連があると思われる参照文献を以下に列記する。
米国特許第８，９６２，０３３号
【０００３】
本明細書において上記参照文献を承認することは、これらが本開示の主題の特許性と何らかの形で関連すると解釈することを示唆するものではない。
【背景技術】
【０００４】
止血のためのフィブリンシーラント配合物は、通常、２つの液体構成成分、すなわちフィブリノーゲン及びトロンビンを含有しており、これらは、凍結して、又は凍結乾燥状態で保管される。
【０００５】
米国特許第８，９６２，０３３号は、フィブリンマトリックス、具体的には、滲出性組織上にフィブリンマトリックスを施用する方法を記載しており、この方法は、フィブリノーゲンと反応するとフィブリンを形成することが可能なタンパク質分解性酵素を含む固体のフィブリンシーラントブレンドをある量で組織の上に施用すること、次に、固体フィブリンシーラントの上に、ある量の液状フィブリンシーラント配合物を施用することを含む。
この固体フィブリン及び液状フィブリンを組み合わせると、組織上にフィブリンマトリックスが形成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、液状形態で保管した時、安定しているシーラント配合物を開発することに基づいている。
具体的には、及びその第１の態様によれば、本開示は、フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物であって、当該活性剤が、当該哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、当該メンバーが、哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、シーラント配合物を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本シーラント配合物は、液体ブレンドである。
本液体ブレンドは、２℃〜８℃、及び室温において、少なくとも５日間、安定していることが分かった。
【０００８】
一部の実施形態では、活性剤は、毒、毒構成成分又は毒構成成分のアナログを含む。
毒又は毒構成成分に関する例としては、それらに限定されず、エカリン、ラッセルクサリヘビ毒第Ｘ因子（ＲＶＶ−Ｘ）、ラッセルクサリヘビ毒第Ｖ因子（ＲＶＶ−Ｖ）、ノスカリン、オスクタリン、トロカリン、コンブルキシン、ボトロセチン、及び当該毒構成成分のいずれかの組合せが挙げられる。
【０００９】
一部の実施形態では、活性剤はエカリンである。
【００１０】
一部の実施形態では、活性剤はＲＶＶ−Ｘである。
【００１１】
一部の実施形態では、活性剤はＲＶＶ−Ｖである。
【００１２】
一部の実施形態では、活性剤は、ＲＶＶ−ＸとＲＶＶ−Ｖとの組合せである。
【００１３】
本開示はまた、本明細書に開示されているシーラント配合物を保持するバレル（barrel）、及び必要な際に、内部を通して本シーラント配合物を送達するための再封止可能な開口部を備えたアプリケータを提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本アプリケータは、液状形態のシーラント配合物を保持するシリンジの形態にある。
【００１５】
更に別の態様によれば、本開示は、本明細書に開示されているシーラント配合物を保持する支持マトリックスを備えた、創傷ドレッシングを提供する。
【００１６】
さらなる態様によれば、本開示は、フィブリン塊の形成を促進する方法であって、血液を開示されているシーラント配合物に接触させることを含む、方法を開示する。
【００１７】
更に別の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象において、出血創傷を処置する方法であって、当該創傷の少なくとも一部の上に、対象の創傷において凝固を促進するのに有効な、ある量の本明細書に開示されているシーラント配合物を施用することを含む、方法を提供する。
【００１８】
最後に、別の態様によれば、本明細書において開示されているシーラント配合物、及び当該創傷において凝固を促進するためのシーラント配合物の使用に関する指示書を含むキットであって、当該指示書が当該創傷の少なくとも一部の上にシーラント配合物を施用することを含む、キットが本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本明細書に開示される主題をよりよく理解し、実際にその主題をどのように実施することができるのかを例示するために、ここで添付の図面を参照しながら単なる非限定的な例によって実施形態について説明する。
【図１】エカリン濃度の関数として、凝固時間を示すグラフである。
【図２】室温又は２℃〜８℃でシーラント配合物を保管した後の、凝固時間の安定性を示すグラフであり、安定性は、エカリンを加えた後の時間（分間）の関数である。
【図３】室温又は２℃〜８℃でシーラント配合物を保管した後の、凝固時間の安定性を示すグラフであり、安定性は、エカリンを加えた後の時間（日数）の関数である。
【図４】ＲＶＶ−Ｖを含む又は含まない、ＲＶＶ−Ｘ濃度の関数として、平均凝固時間を示すグラフである。
【図５】ＲＶＶ−Ｖを含む又は含まない、ＲＶＶ−Ｘ濃度の関数として、平均凝固時間の対数を示すグラフである。
【図６】ＲＶＶ−Ｘを加えた後の時間（分間）の関数として、室温での、又は２℃〜８℃での保管時の、凝固時間の平均値を示すグラフである。
【図７】ＲＶＶ−Ｘを加えた後の時間（日数）の関数として、室温での又は２℃〜８℃で保管時の、凝固時間の安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、即時使用可能なオールインワン（ＡＩＯ）型シーラント配合物の開発に基づくものである。
本発明者らは、現在利用可能なシーラントの場合には主流の現象である、（たとえば、望ましくない凝固に起因する）詰まりのない、シリンジ（単一バレル）中での送達が可能な配合物を開発した。
【００２１】
具体的には、フィブリノーゲンと凝固カスケードにおける重要なメンバーの１つの活性剤、すなわちフィブリノーゲンに直接作用しない活性剤とを混合物ことにより、混合ブレンドが液状形態でさえも安定であることが見いだされた。
この配合物は、凝固に必要な酵素前駆体、たとえば、プロトロンビン、第Ｘ因子などのいずれも含有しないので、液体安定性があると思われる。
上記のメンバー、たとえばチモーゲンを含有する血液の存在下では、凝固は、活性剤によって迅速に活性化されると思われる。
【００２２】
非限定的に示されているとおり、フィブリノーゲンに対して上流の凝固カスケードのメンバーに作用する活性剤を使用すると、活性剤がない場合、４９０秒超となるのに比較して、血漿による凝固時間が３０秒未満へと劇的に低減した。
活性剤とフィブリノーゲンとの混合物は、室温（本明細書では、２０〜２５℃に等しい又はそれらの間の温度として定義される）でさえも、少なくとも５日間、安定であること、並びに凍結及び解凍により影響を受けないことが分かった。
【００２３】
したがって、第１の態様によれば、フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物であって、当該活性剤が、当該哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、当該メンバーが、血液凝固カスケードにおいて、当該フィブリノーゲンの上流にある、シーラント配合物が本明細書において提供される。
【００２４】
本発明の文脈では、用語「シーラント配合物」は、組織接着剤として理解されるべきであり、配合物は、組織又は血液と接触すると、反応して、その後に組織接着剤を形成し、これにより、出血を停止させる、及び／又はたとえば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ、胆汁、消化管（ＧＩ）内容物の生理学的滲出、肺からの空気漏出などを封止する成分を有する。
本開示の文脈では、上記の配合物成分は、互いに相互作用することがなく、かつそれらが、活性剤が作用するメンバーと接触するようになるまで、実質的に不活性であることを理解すべきである。
メンバーが一旦、活性剤により活性化されると、凝固が始まり、フィブリン塊をベースとする組織接着が形成される。
【００２５】
シーラント配合物は、少なくともフィブリノーゲン及び活性剤からなるブレンドを含む。
「ブレンド」と言う場合、混合物、すなわち少なくともフィブリノーゲンと活性剤との均質な及び非均質な混合物のいずれかの形態として理解すべきである。
このブレンドは、以下に更に詳述されている他の成分を含んでもよい。
しかし、本配合物は、活性剤により活性化される凝固カスケードのメンバー、又は当該活性剤の下流にある凝固カスケードの任意の活性なメンバーを含まない（すなわち、存在しない）。
言い換えると、本配合物は、互いに相互作用することがない、血液凝固カスケードの構成成分しか含まないよう設計されている。
したがって、トロンビンは、フィブリノーゲンと相互作用すると思われるので、本配合物は、トロンビンを含まない。
【００２６】
本開示の文脈では、ブレンドとは、液体ブレンドである。
液体ブレンドと言う場合、室温で液体であるものとして理解すべきである。
この範囲には、本開示はまた、使用時に、製品が室温では液体状態となるよう解凍されるような凍結形態のシーラント配合物も包含する。
【００２７】
本配合物は、血液凝固の形成を促進する少なくとも２種の構成成分を含み、一方はフィブリノーゲンであり、他方は活性剤である。
【００２８】
本発明の文脈では、活性剤は、生物学的又は化学的実体（entity）であり、血液と接触すると、メンバーは、その活性形態に生化学的変化を受ける。
【００２９】
一部の実施形態では、活性剤は、哺乳動物に対して、特に、哺乳動物の血液凝固カスケードに対して外因性のものである。
この本文脈では、外因性活性剤とは、哺乳動物種の凝固カスケードを活性化することが可能であるが、そうした特定の哺乳動物種には、通常、存在していない、物質（タンパク質など）を指すことを理解すべきである。
たとえば、及びそれらに限定されないが、ヘビ毒酵素であるエカリンは、哺乳動物の血液中には通常、存在しておらず、ヒト血液凝固カスケードのメンバーの活性剤である。
したがって、用語「外因性」を使用する場合、活性剤は、哺乳動物の凝固カスケード内に、通常、含有されている構成成分と単に区別する目的に過ぎない。
【００３０】
一部の実施形態では、活性剤は、哺乳動物の凝固カスケードの当該メンバーに対して上流で、活性を有するタンパク質分解性酵素である（しかし、特定の哺乳動物カスケードに対して外因性である。すなわち、特定の哺乳動物の凝固カスケードに、当然ながら関与しない）。
【００３１】
一部の実施形態では、活性剤は、プロテアーゼである。
【００３２】
一部の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。
【００３３】
一部の他の実施形態は、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである。
【００３４】
一部の実施形態では、活性剤はヘビ毒であるか、又はヘビ毒に由来するプロテアーゼなどの構成成分を含むか、又は毒構成成分のアナログであり、このようなヘビ毒又はアナログは、本来、哺乳動物種に対して外因性である。
アナログは、以下で更に議論されているとおり、たとえば、毒構成成分の組換え形態、又はその修飾形態とすることができる。
アナログは、組換えされているか又は修飾されているかに関わらず、凝固カスケードに関与する官能基／活性を維持し、そうして、シーラント配合物が血液に接触するようになると、これらのアナログは、フィブリン塊を含むシーラントが形成される程度に、血液凝固カスケードのメンバーを活性化する。
【００３５】
一部の実施形態では、活性剤はプロトロンビンを活性化する。
活性剤は、たとえば以下の１つ又は組合せとすることができる：カーペットバイパー（Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）の毒から単離されるエカリン；オーストラリアタイガースネーク（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ）の毒から抽出されるノスカリン；ラフスケールドスネーク（rough scaled snake）（Tropidechis carinatus）から抽出されるトロカリン；タイパン（Oxyuranus scutellatus）の毒から抽出されるオスクタリン。
当該活性剤はそれぞれ、本開示の独立した実施形態と見なすべきである。
【００３６】
一部の実施形態では、活性剤は、第Ｘ因子を活性化するラッセルクサリヘビ毒に由来する、ＲＶＶ第Ｘ因子活性剤（ＲＶＶ−Ｘ）である。
【００３７】
一部の実施形態では、活性剤は、第Ｖ因子を活性化するラッセルクサリヘビ毒（Ｄ．ｒｕｓｓｅｌｉｉ）にやはり由来する、ＲＶＶ−第Ｖ因子活性剤（ＲＶＶ−Ｖ）である。
【００３８】
一部の実施形態では、活性剤は血小板に作用し、血小板を活性化するコンブルキシン；血小板凝集を引き起こすハララカ（Bothrops jararaca）から単離されるボトロセチン；血小板凝集を引き起こすアミコラトプシス・ルリダ（Amycolatopsis lurida）から単離されるリストセチンのうちのいずれか１つ又は組合せである。
【００３９】
更に一部の実施形態では、活性剤は、たとえば、血小板凝集の誘発によって、凝固酵素産生又は活性化の速度を直接、又は間接的に向上することのないものである。
【００４０】
一部の実施形態では、活性剤は、凝固酵素の組換え形態である。
組換え毒プロトロンビン活性剤の例には、とりわけ、Ａｎｎ  Ｌｏｖｇｒｅｎ（その内容の全体が本明細書に組み込まれている、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ」、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ４巻：３号、１５３〜１５７頁、２０１３年）によって記載されている。
これらには、とりわけ、エカリン、トロカリン、オスクタリンが挙げられる。
【００４１】
一部の実施形態では、活性剤は、エカリンを含むか、又はエカリンである。
【００４２】
一部の実施形態では、活性剤は、ＲＶＶ−Ｘを含むか、又はＲＶＶ−Ｘである。
【００４３】
一部の実施形態では、活性剤は、ＲＶＶ−Ｖを含むか、又はＲＶＶ−Ｖである。
【００４４】
一部の実施形態では、活性剤は、哺乳動物種に対して外因性であり、たとえば、非ヒト源であり、時には、哺乳動物のホストの免疫応答から活性剤をマスクする物質により修飾されている。
したがって、本開示の文脈では、活性剤を言う場合、活性剤の性能を改善するために修飾されている、活性剤それ自体（すなわち、それ自体活性実体である）も含むことが理解されたい。
性能の向上は、血液中の活性剤の循環時間を増加させることによって、活性剤に対する免疫応答などを低減することができる。
それらに限定されないが、このような修飾活性剤は、活性剤それ自体、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、又は多糖類（デキストランなど）からなる群から選択される物質を含むことができる。
【００４５】
一部の実施形態では、活性剤はＰＥＧで修飾されている。すなわち、活性剤はＰＥＧ化されている。
これに関連して、活性剤を指す場合、やはり修飾されている活性剤を指すと理解すべきである。
【００４６】
本開示の文脈では、上記で列挙されている活性剤、その組換え形態又は機能的アナログはそれぞれ、活性剤の群として列挙されている場合でさえも、本開示の個々の実施形態又は個別の実施形態と見なすべきである。
【００４７】
本明細書で定義されているとおり、活性剤は、哺乳動物の凝固カスケードのメンバーを活性化する。
【００４８】
本開示の文脈では、「凝固カスケードのメンバー」は、血液凝固カスケードに関与する任意の生物学的物質を指すものと理解すべきである。
このメンバーは、好ましくは、カスケードにおける重要な関与物であるべきである。すなわち、それが存在しない場合、凝固が起こらない、又は不十分な凝固が起こり、フィブリンマトリックスが形成されないか、又はその形成が不十分となる。
【００４９】
一部の実施形態では、メンバーは、チモーゲンである。
理解されているとおり、チモーゲンは、不活発な酵素前駆体であり、活性な酵素となるためには、生化学的変化（活性部位を露出させる加水分解反応、又は活性部位を露出させるための確認（confirmation）の変化など）を必要とする。
【００５０】
一部の実施形態では、チモーゲンは、セリンプロテイナーゼの前駆体である。
一部のさらなる実施形態では、チモーゲンは、プロトロンビン、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＶＩＩ因子のいずれか１つである。
【００５１】
一実施形態では、チモーゲンは、プロトロンビンである。
【００５２】
一部の実施形態では、メンバーは、凝固カスケードの経路に関与する、因子又は補因子である。
一部の実施形態では、凝固カスケードの因子又は補因子メンバーは、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子からなる群から選択されるが、それらに限定されない。
第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子は、凝固反応を加速する凝固カスケードにおける補因子である。
【００５３】
一部の実施形態では、メンバーは、血小板である。
一部の実施形態では、メンバーが血小板を含む場合、活性剤は、コンブルキシン；ボトロセチン；リストセチンからなる群から選択されるものである。
【００５４】
フィブリノーゲン及び活性剤の量は、さまざまとなり得る。
一部の実施形態では、その量は、２つの構成成分の間、すなわちフィブリノーゲンと活性剤との間のモル比は、７０，０００：１から２５：１の範囲となるような量である。
この範囲は、凝固を引き起こすのに有効であることが分かっている活性剤（例では、エカリン）の最低の試験量（当該最低量は、６６，０９４：１のフィブリノーゲンと活性剤とのモル比をもたらす）、及び有効であることが示されている活性剤の最高の試験量（最大で約２６：１の比をもたらす）にとりわけ基づいている。
【００５５】
本配合物は、凝塊の促進に必要な他の成分を含むことができる。
一部の実施形態では、本シーラント配合物は、カルシウムを含む。
たとえば、以下の非限定例において示されているとおり、ＲＶＶ−Ｘは、第Ｘ因子を活性化するために、カルシウムイオンの存在を必要とする。
【００５６】
一部の実施形態では、活性剤の濃度は、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、時として、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び最大でも１００ｍｇ／ｍｌ、時として最大でも９５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌである。
【００５７】
カルシウムが配合物の一部である時、その濃度は、さまざまとなり得る。一部の実施形態では、配合物中のカルシウム濃度は、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ又は８ｍｇ／ｍｌ、及び最大でも、２０ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ又は９ｍｇ／ｍｌである。
【００５８】
一部の実施形態では、本シーラント配合物は、シーラント配合物の性能を支援することができる他の構成成分を含む。
たとえば、それらに限定されないが、本シーラント配合物は、第ＸＩＩＩ因子、抗線維素溶解剤（アミノカプロン酸（ε−アミノカプロン酸）、アプロチニン及びトラネキサム酸など）、抗生物質、安定剤（アルギニン、リシンなど）、フィブロネクチン、ヴォンヴィレブランド因子；
ＲＧＤペプチド；
成長因子、軟骨誘発因子、類骨誘発因子、骨成長因子、コラーゲン成長因子；
サイトカイン；
インターフェロン；
ホルモン；
治療剤（抗微生物剤、抗炎症剤など）；
抗がん薬；
化学療法剤；
鎮痛剤；
インターロイキン；
ミネラル；
細胞移動、接着及び／又は増殖を刺激する分子；
酵素；
神経栄養因子（神経成長因子（ＮＧＦ）など）；
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、それらの薬学的に許容される塩又はそれらの混合物などのうちの１つ以上を含み、こうした添加物は、シーラント配合物の当業者に公知なものとして選択される。
可能なシーラント添加物の一覧表示は、とりわけ、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｚ−Ｍｅｄｉｃａへの米国特許第８，８５８，９６９号の「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、及びＯｒｔｈｏｖｉｔａへの米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１０号の「Ｇｅｌａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｇｉｎａｔｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ」に見いだすことができる。
【００５９】
シーラント添加物は、ヒト若しくは哺乳動物の血漿から単離することができるか、又は組変え体とすることができる。
【００６０】
フィブリノーゲンは、本来、血漿から精製することができる血液に由来する可溶性タンパク質であり、たとえば、酵素であるトロンビンによって、フィブリンモノマーに変換される。
フィブリンモノマーは、血塊を構築するフィブリンポリマーに自発的に集積する。
【００６１】
フィブリノーゲン構成成分は、最初の血液組成物から調製することができる。
血液組成物は、全血液、又は血液画分、すなわち血漿などの全血液の産生物とすることができる。
フィブリノーゲンは、プールされている血漿を含む自己ヒト血漿、又は非ヒト源の血漿をとすることができる。
フィブリノーゲンは、組換え方法によって調製されるか、又は化学的に修飾され得ることも可能である。
【００６２】
本開示の文脈では、フィブリノーゲンを指す場合、精製された及び単離されたフィブリノーゲン自体を指すが、血漿由来のタンパク質の溶液を含むヒト血漿の、フィブリノーゲンを濃縮したウイルス非活性化クリオプレシピテートを含む、血漿の生物的に活性な構成成分（ＢＡＣ）もやはり指すものとして理解すべきである。
【００６３】
一部の実施形態では、フィブリノーゲンは、生物的に活性な構成成分（ＢＡＣ）の一部として提供される。
いくつかのタイプのＢＡＣが存在する。
一部の実施形態では、ＢＡＣは、抗線維素溶解剤として、トラネキサム酸を含有する生物的に活性な構成成分である。
トラネキサム酸を含有しているＢＡＣは、製品名Ｑｕｉｘｉｌ（Ｏｍｒｉｘ、イスラエル）によって、時として知られている。
【００６４】
一部の他の実施形態では、ＢＡＣは、トラネキサム酸を含有していない生物的に活性な構成成分である。
これは、第２世代ＢＡＣと考えられ、ＢＡＣ２と当分野では呼ばれている。
ＢＡＣ２は、ＢＡＣの安定形態と考えられ、この場合、その調製の間に、プラスミノーゲン（フィブリノーゲン及びフィブリンを分解する、プラスミンの酵素前駆体）が除去されている。
【００６５】
好ましい実施形態では、ＢＡＣはＢＡＣ２、すなわち、トラネキサム酸を欠如している生物的に活性な構成成分である。
ＢＡＣ２は、ＥＰ  ５３４  １７８の開示中の構成成分Ａとして、通常、調製される。
たとえば、その中の構成成分Ａは、濃縮されたクリオプレシピテートから調製され、溶媒界面活性剤処理及び低温殺菌によって、ウイルスの不活性化を受ける。
一部の実施形態では、ＢＡＣ２は、主にフィブリノーゲンを含む、濃縮されたウイルス不活性化クリオプレシピテートであり、プラスミノーゲン不含（ＥＰ  １  ３９０  ４８５に記載されているとおり、プラスミノーゲンの除去を行うことができる）である。
ＢＡＣ２は、抗線維素溶解剤を含まない。
【００６６】
一部の実施形態では、フィブリノーゲンは、クリオプレシピテートに由来する抗血友病因子調製物の生物的に活性な構成成分である。
当分野において公知のとおり、抗血友病因子は、フィブリノーゲンにやはり富む第ＶＩＩＩ因子濃縮物としても知られている。
【００６７】
フィブリノーゲン源が、外因性活性剤が作用するメンバーに対するチモーゲン（不活発な前駆体）を含有していないかぎり、他のフィブリノーゲン源のいずれも使用することができる。
【００６８】
フィブリノーゲン源の例には、以下に限定されないが、ＥＶＩＣＥＬのフィブリノーゲン構成成分（すなわち、ＢＡＣ２）、Ｔｉｓｓｅｅｌ（アプロチニンを含有する）のフィブリノーゲン構成成分、抗線維素溶解剤を含めた、組換えフィブリノーゲン、精製フィブリノーゲンを含む。
【００６９】
ＢＡＣ溶液は、当分野において公知の、アルギニン、リシンなどの安定剤、及び他のシーラント用添加物を更に含むことができる。
【００７０】
一部の実施形態では、ＢＡＣ及び好ましくはＢＡＣ２は、クリオプレシピテート（以下で説明されている、血漿から調製される凍結血液生成物である、クリオプレシピテート由来抗血友病因子）、特に、濃縮されているクリオプレシピテートに由来することができる。
【００７１】
本明細書において、特に明記されないかぎり、ＢＡＣを言う場合、好ましくは、専らではないが、ＢＡＣ２を指すものと理解すべきである。
【００７２】
具体的には、本開示の文脈では、用語「クリオプレシピテート」とは、全血液から調製された凍結血漿から得られる、血液構成成分を指す。
クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、通常は０〜４℃の温度で解凍すると得ることができ、フィブリノーゲンを主に含む沈殿物が形成される。
この沈殿物は、たとえば、遠心分離によって採集されて、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭグリシン、９５ｍＭアルギニン塩酸塩を含有するバッファーなどの好適なバッファーに溶解することができる。
ＢＡＣは、たとえば、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチンなどの追加の因子を含むことができる。
ＢＡＣは、それらの内容が参照より組み込まれている、ＵＳ６，１２１，２３２及び／又はＷＯ９８／０３３５３３に記載されているとおり調製することができる。
ＢＡＣの組成物は、抗線維素溶解剤（たとえばトラネキサム酸）及びアルギニン塩酸塩などの安定剤を含むことができる。
ＢＡＣ中のトラネキサム酸などの抗線維素溶解剤の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００７３】
一部の実施形態では、ＢＡＣを得るため、血液に由来する溶液中のプラスミノーゲン及び／又はプラスミンの濃度は、１５μｇ／ｍｌ以下に、時として、１２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ以下に、又は５μｇ／ｍｌ未満にもなるプラスミノーゲンに能動的に低下される。
プラスミノーゲン及び／又はプラスミンの減量は、ＵＳ７，１２５，５６９、ＥＰ１，３９０，４８５及びＷＯ０２／０９５０１９のいずれか１つに記載されている方法にしたがって実現することができ、それらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７４】
一部の実施形態では、ＢＡＣは、プラスミノーゲン及び／又はプラスミンを含有する。
これらが存在する場合、抗線維素溶解剤、たとえばトラネキサム酸又はアプロチニンが必要である。
しかし、プラスミノーゲン及びプラスミンの濃度が、１５μｇ／ｍｌ以下である時、ＢＡＣ（たとえば、ＢＡＣ２）は、抗線維素溶解剤（プラスミンの濃度は、フィブリノーゲン分解の誘発に有効ではないと思われるので）を不含とすることができる。
【００７５】
フィブリノーゲンはまた、上記のとおり、ＢＡＣ２構成成分（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）からのフィブリノーゲン構成成分）などの市販のもの、又はヒト血清から生成された精製フィブリノーゲン、組換えフィブリノーゲン又はクリオプレシピテートなどの任意の他のフィブリノーゲン含有溶液とすることもできる。
本文脈では、ＢＡＣ２は、ヒトフィブリノーゲンの濃縮物（５５〜８５ｍｇ／ｍｌ）から主になる、凍結滅菌溶液（ｐＨ６．７〜７．２）として知られており、他の成分は、アルギニン塩酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、注射用水（ＷＦＩ）である。
【００７６】
シーラント配合物の必須の特徴は、トロンビン又はトロンビン樣分子（すなわち、血液凝固カスケードにおいて、トロンビンと同じ生物学的官能基を有する分子）が不含であるということである。
【００７７】
シーラント配合物は、任意の物理形態にあることができる。
一部の実施形態では、本配合物は、凍結乾燥配合物などの乾燥形態にある。
【００７８】
一部の他の実施形態では、シーラント配合物は、液状形態にある。
すなわち、少なくとも活性剤とフィブリノーゲンとの液体ブレンドである。
液状形態の時では、液体担体は、通常、シーラント配合物のｐＨをほぼ中性、たとえば、ｐＨ７．０±０．５に維持するバッファーである。
【００７９】
本配合物の物理相（たとえば液体、凍結乾燥されているなど）に関わらず、本配合物は、保管条件下で安定している。
安定性は、２５℃で少なくとも５日間、保管した後に、配合物中にフィブリン塊が存在しないものとして判定される。
安定性はまた、特に配合物が液状形態にある時に、保管の間に目視可能な凝集物がないことから明白である。
更に、及び本開示によれば、安定しているシーラント配合物と言う場合、使用時に、その保管温度によって影響を受けない、凝固時間を有するものとしてやはり理解されるべきである。
言い変えると、シーラント配合物は、使用時に、室温で、又はより低い温度、たとえば、１℃〜室温の間、又は２℃〜８℃で保管したかどうかに関わらず、実質的に同じ期間で、凝固するであろう。
【００８０】
本開示はまた、シーラント配合物を送達するためのアプリケータも提供する。
本開示の文脈では、アプリケータは、装置である。
【００８１】
一部の実施形態では、アプリケータは、本明細書に開示されているシーラント配合物を保持するバレル、及び内部を通して配合物を送達するための再封止可能な開口部を備えている。
【００８２】
一部の実施形態では、アプリケータは、シリンジであって、シリンジのバレル中に、配合物を保持するシリンジある。
本配合物は、液状形態又は乾燥形態にあってもよく、後者の乾燥形態は、施用前に湿潤させる（たとえば、生理食塩水により）ことになる。
【００８３】
一部の他の実施形態では、アプリケータは、噴霧により配合物を施用するよう構成されている噴霧器の形態にある。
【００８４】
アプリケータは、単回使用向け、すなわち、シーラント配合物の全部又は一部を使用した後に廃棄することができる。
又は、アプリケータは、その開口部が使用と使用との間に、再封止されるよう、多回使用向けに設計されていてもよい。
【００８５】
一部の他の実施形態では、アプリケータは、シーラント配合物を保持する支持マトリックスである、創傷ドレッシングの形態にある。
この実施形態の文脈では、支持マトリックスは、配合物が、その上で吸収される、浸漬される、又は膨潤されるなどのウエットワイプに使用されるものなどの、不織布とすることができる。
シーラント配合物を含む支持マトリックスは、サシェ中などの容器内に入れることができ、それぞれが、使用前に開封される。
【００８６】
本開示はまた、フィブリンマトリックスの形成を促進する方法も提供する。
本方法によれば、有効量のシーラント配合物が、血液又は血漿と接触される。
【００８７】
本開示はまた、創傷を処置する方法であって、当該創傷の少なくとも一部の上に有効量のシーラント配合物を施用することを含む方法も提供する。
【００８８】
この施用及び接触は、それらに限定されないが、血液との混合、出血創傷への噴霧、出血創傷への散布、出血創傷への本配合物のドリップを含めた、任意の適用可能な手段によることができる。
【００８９】
本開示の文脈では、「有効量」は、創傷上にフィブリンマトリックスの形成を促進するのに十分な量である。
一部の実施形態では、その量は、創傷の出血を少なくとも阻止するために、時として、創傷の出血を停止させるために、及び止血を実現するのに必要な時間を低減するために有効である。
この量は、出血のレベル、創傷の寸法（切開及び深さサイズ）、並びに出血創傷を有する対象の年齢及び状態、並びに当業者により認識され得る他の要因などのさまざまなパラメータに依存し得る。
たとえば、本配合物は、０．０１〜１０ｍＬ／ｃｍ２の体積範囲で施用することができる。
【００９０】
一部の実施形態では、有効量は、迅速なフィブリン塊、すなわち、６１秒未満でフィブリン塊の形成を生じる量とすることができる。
【００９１】
一部の実施形態では、活性剤がＲＶＶ−Ｘである時、有効量は、約０．００１〜０．００３Ｕ／ｍＬ、時として、約０．００２Ｕ／ｍＬ（Ｕは単位を表す）である。
活性剤がエカリンである時、有効量は、約０．０５〜０．２Ｕ／ｍｌ、時として約０．１Ｕ／ｍｌである。
【００９２】
さまざまな可能な活性剤、たとえば毒酵素の単位（Ｕ）は、さまざまに決定される（それらは、異なる基質に作用するため）ことに留意されたい。
エカリン、ＲＶＶ−Ｘ、ＲＶＶ−Ｖの場合、単位は、以下に列挙されているとおり定義される。
【００９３】
エカリン単位：１単位は、ｐＨ８．４、３７℃、において、プロトロンビンを活性化して、アミド分解活性１単位を生じる。
１アミド分解単位は、ｐＨ８．４、３７℃において、１分あたり、１．０μモルのＮ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを加水分解する。
【００９４】
ＲＶＶ−Ｘ：１単位は、第Ｘ因子から、１国際単位の第Ｘａ因子を生じる、ＲＶＶ−Ｘの量である。
【００９５】
ＲＶＶ−Ｖ：１は、正常な血漿１ｍＬ中に含有している第Ｖ因子の完全な活性化に必要なＲＶＶ−Ｖの活性である。
【００９６】
更に、本開示は、以下：
ａ．本明細書に開示されているシーラント配合物
ｂ．出血創傷上にフィブリン塊の形成を促進するシーラント配合物を使用するための指示書であって、当該創傷にシーラント配合物を施用することを含む、指示書を含む、パッケージ（キット）を提供する。
【００９７】
一部の実施形態では、シーラント配合物は乾燥形態にあり、指示書は、乾燥形態で創傷に配合物を施用すること（血液によって湿らされることになる）、又は創傷に施用する前に、乾燥体を湿潤することを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、本パッケージはまた、シーラント配合物の創傷への接触を促進するように構成されているシーラントアプリケータも備える。
【００９９】
一部の実施形態では、アプリケータ内に既にあるシーラント配合物を含むパッケージが提供される。
一部の他の実施形態では、本シーラント配合物は、容器中で供給され、使用前に、アプリケータに導入される。
【０１００】
一部の実施形態では、アプリケータは、本明細書に記載されているシリンジである。
更に一部の他の実施形態では、アプリケータは、本明細書の上にやはり記載されているとおり、支持マトリックス上に保持されている配合物を含む創傷ドレッシングの形態にある。
【０１０１】
本シーラント配合物は、包帯、発泡体、創傷ドレッシング、パッド及び／又はマトリックスの上に塗布され得る／それらに組み込まれ得る。
本配合物は、包帯、創傷ドレッシング、パッド、発泡体、スポンジ及び／又はマトリックスなどのさまざまな送達剤から、所望の位置に／その上に放出され得る。
この作用剤は、天然物質及び／又は合成物質から作製することができる。
このような物質の例としては、以下に限定されないが、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［ＰＨＥＭＡ］、寒天、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）、自己集積ペプチド［ＳＡＰ］、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン及びそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書において開示されているシーラント（seleant）配合物は、封止が必要な組織上に噴霧又はドリップすることにより、施用される。
一部の実施形態では、たとえば、大きな表面積を出血から密封する必要がある場合、噴霧が一般に使用されると思われる。
たとえば、生検後に、出血が、封止領域から起こっている場合、ドリップが一般に使用されると思われる。
代替として、噴霧及びドリップは、同一手順で使用することができる。
【０１０２】
シーラントの送達形式は、必要な封止のタイプ／程度、（封止を必要とする）開口部のタイプ／寸法、及び医師によって認識される他の考慮点などの、さまざまな考慮点に基づいて決定され得る。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に指示しないかぎり、単数及び複数の指示物を含む。
たとえば、用語「活性剤」は、凝固カスケードの１つ以上のメンバーを活性化することが可能な、１つ以上の活性剤を含む。
【０１０４】
更に、本明細書で使用する場合、用語「含む（comprising）」は、配合物が、列挙されている構成成分、すなわち、フィブリノーゲン及び（１つ以上の）活性剤を含むが、生理学的に許容される担体及び添加剤、並びに他の活性剤などの他の要素を除外するものでないことを意味することが意図されている。
用語「実質的になる（consisting essentially of）」は、列挙されている構成成分を含むが、凝固カスケードに対して実質的に有意性を有することがある他の要素を除外する配合物を定義するために使用される。
したがって、「からなる（consisting of）」は、他の要素のうちの微量要素を超えるものを除外することを意味するものとする。
これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【０１０５】
更に、たとえば、配合物を構成している構成成分の量又は範囲を参照する場合、すべての数値は、明記されている値の最大２０％、時には最大１０％の（＋）又は（−）変動である概算値となる。
常に明確に記載されていない場合でさえも、すべての数値の表示は、用語「約」が前についていると理解すべきである。
【０１０６】
本発明は、ここから、本発明によって実施される実験の以下の説明で例示される。
これらの実施例は、限定というよりも例示という性質を帯びたものであることが意図されていると理解すべきである。
明らかなことに、上の教示に照らし合わせて、これらの実施例の多数の修正及び改変が可能である。
したがって、添付の特許請求の範囲内において、本発明は、本明細書の以下に具体的に記載されているよりも、他の多数の可能な方法で、実施され得ることを理解すべきである。
【０１０７】
非限定的実施例
物質及び方法
物質：
ＦＡＣＴ血漿は、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製の因子が分析済みの血漿であり、製品番号０２０−１の１ｍＬバイアルである。
エカリンは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のカーペットバイパー（Echis carinatus）に由来するプロトロンビン活性剤であり、カタログ番号Ｐ１１６−０１−５０ＥＵで、５０ＥＵのバイアルである。
ＲＶＶ−Ｘは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のラッセルクサリヘビに由来する第Ｘ因子の活性剤であり、カタログ番号Ｐ１２１−０７−５０Ｕ、５０Ｕのバイアルである。
ＲＶＶ−Ｖは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のラッセルクサリヘビに由来する第Ｖ因子の活性剤であり、カタログ番号Ｐ１２１−０３−１０００Ｕ、１０００Ｕのバイアルである。
ＢＡＣ２フィブリノーゲンは、Ｏｍｒｉｘ製のものであり、Ｅｖｉｃｅｌ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ（ヒト）の構成成分である。
精製フィブリノーゲンは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のカタログ番号Ｆｉｂ３フィブリノーゲンである。
２００ｍＭのカルシウム保存溶液は、塩化カルシウム二水和物、ＡＣＳグレード（９９＋％、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）から調製した。
２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４のｔｒｉｓ保存バッファーは、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（９９％、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）から調製した。
【０１０８】
方法：
複数のインビトロ検討は、さまざまな用量の酵素を用いた凝固速度、カルシウムの必要量、並びに凍結−解凍の安定性及び影響を評価するため、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ４凝固分析器を使用して行った。
この分析器は、使い捨てキュベット内で振動するステンレス鋼ボールのインピーダンスに基づく、フィブリン塊配合物の速度を測定するものである。
【０１０９】
具体的には、以下の実施例に記載されている凝固検討の場合、１００μＬの試料（通常、フィブリノーゲン、カルシウム及び活性剤からなる）を分析器のキュベットに加えた。
反応を開始するため、１００μＬのプールした正常血漿（ＰＮＰ、さまざまなドナーに関する凝固因子レベルの変動を最小化するため、複数ドナー、通常、少なくとも２０名のドナーからの血漿の混合物）を上記のキュベットに加え、凝固形成速度を、上に記載されているとおり測定した。
凝固アッセイはすべて、３７℃で行った。
【０１１０】
結果
実施例１：外因性活性剤を使用しない凝固。
この実験の目的は、ベースラインを確立するよう、活性剤を使用しない、フィブリノーゲン、カルシウム及び血漿の凝固時間に関するベースラインを確立することであった。最適カルシウム濃度も決定した。
【０１１１】
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓから市販されている精製フィブリノーゲンを、フィブリノーゲン源として、さまざまな検討に使用した。
【０１１２】
表１に示されているとおり、凝固時間は、１０ｍＭカルシウムの場合、４９４．０秒と短いものであった。
１５ｍＭ及び２０ｍＭのカルシウムでは、凝固時間は、それぞれ、５６３．４秒及び６８３．０秒であった。
２０ｍＭより高い他のカルシウム濃度では、凝固時間は、９９９秒以内に、分析器によって記録されなかった。
【０１１３】
【表１】
2018533424.tif 000003
＊９９９秒が分析器の最大測定時間である
【０１１４】
実施例２：凝固に及ぼすエカリンの作用
２Ａ−エカリン用量応答
この検討の目的は、凝固時間に及ぼすさまざまなエカリン濃度の影響を評価すること、及び将来の検討のための好適な濃度を決定することであった。
【０１１５】
フィブリノーゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）、カルシウム（最終濃度１０ｍＭ）及び血漿を用いて、１ｍｌあたり０〜５単位のエカリンとなる範囲のエカリンのさまざまな濃度（表２を参照されたい）を試験した。
フィブリノーゲン／カルシウム／エカリン試料を、凝固分析器のインキュベート用ウェル中で温めた（３７℃）一方、プールした正常血漿（ＰＮＰ）は、試薬のウェル中で温めた（３７℃）。
これらの検討に関すると、試料（通常、フィブリノーゲン、カルシウム及び活性剤からなる）１００μＬを、１００μＬのプールした正常血漿とキュベット内で混合し、凝固形成速度を測定した。
【０１１６】
図１において示されているとおり、エカリンは、最低濃度でさえも、フィブリノーゲン／カルシウムの凝固時間を大幅に低下させた。
明確な用量応答があった。エカリン濃度が向上すると、凝固時間が低下した。
対数スケールでは、用量応答は、完全な線形となり、０．９９５２のＲ２乗値を有した。
【０１１７】
【表２】
2018533424.tif 000004
【０１１８】
２Ｂ：安定性検討
この検討の目的は、フィブリノーゲン及びカルシウムを含むエカリンの安定性を決定することであった。
フィブリノーゲン、カルシウム及びエカリンを一緒にして、それぞれ、１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ及び１Ｕ／ｍＬの最終濃度を達成し、さまざまな時間及び温度でインキュベートした。
血漿を用いる凝固時間は、Ｔ０（エカリンがフィブリノーゲン／カルシウムに加えられた時間）後のさまざまな時間において、分析器を使用して測定した。
【０１１９】
経時的な凝固の変化を使用して、エカリン／フィブリノーゲン／カルシウム混合物の安定性を評価した。
溶液を室温、又は２℃〜８℃の温度（冷蔵庫中）のどちかで保管した時の安定性を測定した。
【０１２０】
以下の表３及び図２で分かるとおり、凝固時間は、検討過程全体にわたり、わずかに変動したが、一般に、２５〜４２秒の範囲内のままであった。
【０１２１】
【表３】
2018533424.tif 000005
【０１２２】
更に、図３は、凝固時間データに基づいて、最大５日間の間の時間点における、フィブリノーゲン及びカルシウムを含む溶液中でのエカリンの長期安定性を示す。
【０１２３】
２Ｃ：エカリンのカルシウム依存性検討。
この検討の目的は、フィブリノーゲン及び血漿の凝固時間の短縮における、エカリンのカルシウム依存性を決定することであった。
カルシウムを含む及び含まないフィブリノーゲンにエカリンを添加し、次に、血漿による凝固時間を測定した。
【０１２４】
表４に示されているとおり、フィブリノーゲン／カルシウム／エカリン混合物は、対照試料（すなわちカルシウムを含まないフィブリノーゲン及びエカリン）とほぼ同じ速度で凝固し、したがって、凝固時間に及ぼすエカリンの作用は、カルシウムに依存しないことが決定された。
【０１２５】
【表４】
2018533424.tif 000006
【０１２６】
実施例３：凝固に及ぼすＲＶＶ−Ｘ及びＲＶＶ−Ｖの影響
３Ａ：ＲＶＶ−Ｘ及びＲＶＶ−Ｖの凝固時間
この検討の目的は、血漿と混合した場合の、ＲＶＶ−Ｘ及び／又はＲＶＶ−Ｖ、並びにカルシウムが補給されているフィブリノーゲンの凝固時間を決定することであった。
ＲＶＶ−Ｖを含む及び含まないＲＶＶ−Ｘのいくつかの濃度を試験して、用量応答を決定した。
具体的には、ＲＶＶ−Ｘの濃度は、１ｍＬ当たり０〜５単位の範囲とし、ＲＶＶ−Ｖの濃度は、それを添加した時は、１ｍＬあたり１０単位とした。
【０１２７】
表５、図４及び図５に示されているとおり、ＲＶＶ−Ｘは、血漿を含むフィブリノーゲン及びカルシウムの凝固時間がかなり短縮されたが、凝固時間は、ＲＶＶ−Ｘがより低い濃度になるまで、ほぼ同じままであったので、０．１Ｕ／ｍＬより高い濃度では明確な用量応答性はなかった。
理論によって拘泥されないが、このことは、律速となり得る反応において、他の要因、恐らくは、リン脂質レベルの関与の結果であり得る。
【０１２８】
ＲＶＶ−Ｘの存在下で、ＲＶＶ−Ｖが添加されると、凝固時間がわずかに短縮した。
ＲＶＶ−Ｖでは、ＲＶＶ−Ｘが存在しない時、５２０．１秒から１４１．３秒へと、凝固時間がかなり短縮した。
これにより、ＲＶＶ−Ｖが、活性化に重要な役割を果たしていること、及び配合物中に存在する場合、凝固時間を短縮することができることが示された。
【０１２９】
【表５】
2018533424.tif 000007
＊ＲＶＶ−Ｖの最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌであった。
【０１３０】
３Ｂ：ＲＶＶ−Ｘ安定性検討
この検討の目的は、フィブリノーゲン及びカルシウムを含むＲＶＶ−Ｘの安定性を決定することであった。
フィブリノーゲン、カルシウム及びＲＶＶ−Ｘを混合して（それぞれ、１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ及び１単位／ｍＬの最終濃度に到達）、次に、血漿による凝固時間を、Ｔ０（フィブリノーゲン／カルシウムにＲＶＶ−Ｘを添加した時間）からさまざまな時間で測定した。
６日間にわたる凝固時間の変化を使用して、ＲＶＶ−Ｘ／フィブリノーゲン／カルシウム混合物の安定性を評価した。
溶液を室温、及び２℃〜８℃の温度（冷蔵庫中）のどちらかで保管した時の安定性を測定した。
【０１３１】
表６、図６及び図７に示されているとおり、凝固時間は、検討の過程にわたり、２１〜２７秒という狭い範囲内のままであった。
室温で保管した試料と２〜８℃の冷蔵庫で保管した試料との間に、実質的な差異はなかった。
【０１３２】
フィブリノーゲン及びカルシウムを含む溶液中のＲＶＶ−Ｘの安定性は、ここで示されている凝固時間データに基づいて、６日間の間の時間点で実証された。
【０１３３】
【表６】
2018533424.tif 000008
【０１３４】
３Ｃ：ＲＶＶ−Ｘのカルシウム依存性
この検討の目的は、フィブリノーゲン及び血漿の凝固時間の短縮における、ＲＶＶ−Ｘのカルシウム依存性を決定することであった。
ＲＶＶ−Ｘを１Ｕ／ｍＬの量で、１０ｍＭのカルシウム含む及び含まないフィブリノーゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加し、次に、血漿による凝固時間を測定した。
【０１３５】
表７に示されるとおり、フィブリノーゲン／カルシウム／ＲＶＶ−Ｘ混合物は、用量応答検討に基づいて予期されるものとほぼ同じ時間、すなわち約２０秒で凝固した。
しかし、カルシウムを有しなかった対照試料は、凝固分析器中で凝固せず、ＲＶＶ−Ｘの活性はカルシウム依存性であることを示している。
【０１３６】
【表７】
2018533424.tif 000009
【０１３７】
実施例４：凍結及び解凍の影響
この検討の目的は、凍結が、外因性活性剤としてＲＶＶ−Ｘ及び／又はエカリンを含む配合物にとって、保管の実現可能な方法かどうか判断することであった。
この目的のため、カルシウム（１０ｍＭ）及び活性剤（１Ｕ／ｍＬのＲＶＶ−Ｘ又は１Ｕ／ｍＬのエカリンのどちらか一方）を含むフィブリノーゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）溶液を調製し、プールした血漿を用いて試験し、凝固時間を決定した。
それらの試料の一部を−７０℃で一晩、凍結し、その翌日、解凍して、血漿による凝固時間を再度、決定した。
【０１３８】
表８に示されているとおり、凍結前及び凍結後の凝固時間に有意な変化は存在せず、したがって、凍結は、溶液を保管する実現可能な方法である。
【０１３９】
【表８】
2018533424.tif 000010
【０１４０】
〔実施の態様〕
（１）  フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物であって、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、シーラント配合物。
（２）  前記ブレンドが、乾燥形態にあるか、又は液体ブレンドの形態にある、実施態様１に記載のシーラント配合物。
（３）  前記ブレンドが、フィブリノーゲン及び前記活性剤を、７０，０００：１〜２５：１のモル比で含む、実施態様１又は２に記載のシーラント配合物。
（４）  前記血液凝固カスケードの前記メンバーがチモーゲンである、実施態様１から３のいずれかに記載のシーラント配合物。
（５）  前記活性剤が非ヒト源である、実施態様１から４のいずれかに記載のシーラント配合物。
【０１４１】
（６）  前記活性剤が、毒、毒構成成分又は毒構成成分のアナログを含む、実施態様１から５のいずれかに記載のシーラント配合物。
（７）  前記毒構成成分が、エカリン、ラッセルクサリヘビ毒第Ｘ因子（ＲＶＶ−Ｘ）、ラッセルクサリヘビ毒第Ｖ因子（ＲＶＶ−Ｖ）、ノスカリン（Noscarin）、オスクタリン（Oscutarin）、トロカリン（Trocarin）、コンブルキシン、ボトロセチン、及び前記毒構成成分のいずれかの組合せからなる群から選択される、実施態様６に記載のシーラント配合物。
（８）  前記活性剤が、前記凝固カスケードの前記メンバーの上流で活性なタンパク質分解性酵素であるか、又は前記タンパク質分解性酵素の組換え形態である、実施態様１から７のいずれかに記載のシーラント配合物。
（９）  前記活性剤がエカリンである、実施態様７又は８に記載のシーラント配合物。
（１０）  前記活性剤がＲＶＶ−Ｘである、実施態様７又は８に記載のシーラント配合物。
【０１４２】
（１１）  前記活性剤がＲＶＶ−Ｖである、実施態様７又は８に記載のシーラント配合物。
（１２）  前記活性剤が、ＲＶＶ−ＸとＲＶＶ−Ｖとの組合せである、実施態様１０又は１１に記載のシーラント配合物。
（１３）  前記活性剤が、プロトロンビンに対して活性である、実施態様１から１２のいずれかに記載のシーラント配合物。
（１４）  前記活性剤が、第Ｘ因子に対して活性である、実施態様１から１２のいずれかに記載のシーラント配合物。
（１５）  前記活性剤が、第Ｖ因子に対して活性である、実施態様１から１２のいずれかに記載のシーラント配合物。
【０１４３】
（１６）  トロンビン、又はトロンビンの機能的アナログを含まない、実施態様１から１５のいずれかに記載のシーラント配合物。
（１７）  カルシウムを含む、実施態様１から１６のいずれかに記載のシーラント配合物。
（１８）  前記フィブリノーゲンが、寒冷沈降反応によって得られる、実施態様１から１７のいずれかに記載のシーラント配合物。
（１９）  前記フィブリノーゲンが、生物的に活性な構成成分２（ＢＡＣ２）である、実施態様１から１７のいずれかに記載のシーラント配合物。
（２０）  前記フィブリノーゲンが、クリオプレシピテートに由来する抗血友病因子調製物の生物的に活性な構成成分である、実施態様１から１７のいずれかに記載のシーラント配合物。
【０１４４】
（２１）  室温で少なくとも５日間、安定している、実施態様１から２０のいずれかに記載のシーラント配合物。
（２２）  ２℃〜８℃で少なくとも５日間、安定している、実施態様１から２０のいずれかに記載のシーラント配合物。
（２３）  アプリケータであって、（ｉ）フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物を保持するバレルであって、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、バレル、及び（ｉｉ）内部を通して前記シーラント配合物を送達するための再封止可能な開口部、を備えた、アプリケータ。
（２４）  前記シーラント配合物が、実施態様２から２２のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２３に記載のアプリケータ。
（２５）  液状形態の前記シーラント配合物を保持するシリンジの形態である、実施態様２３又は２４に記載のアプリケータ。
【０１４５】
（２６）  シーラント配合物を保持する支持マトリックスを備えた創傷ドレッシングであって、前記シーラント配合物が、フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含み、前記活性剤が、前記哺乳動物に対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、創傷ドレッシング。
（２７）  前記シーラント配合物が、実施態様２から２２のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２６に記載の創傷ドレッシング。
（２８）  前記シーラント配合物が、前記支持マトリックスの上に吸収されているか、又はその中に埋め込まれている、実施態様２６又は２７に記載の創傷ドレッシング。
（２９）  前記支持マトリックスが不織繊維である、実施態様２８に記載の創傷ドレッシング。
（３０）  フィブリン塊の形成を促進する方法であって、前記方法は血液をフィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物に接触させることを含み、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、方法。
【０１４６】
（３１）  前記シーラント配合物が、実施態様２から２２のいずれかに定義されたとおりである、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  前記シーラント配合物が、液状形態にある、実施態様３０又は３１に記載の方法。
（３３）  出血創傷を処置することを必要とする対象における出血創傷を処置する方法であって、前記方法は、前記創傷の少なくとも一部に、フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドの形態にある、ある量のシーラント配合物を施用することを含み、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にあり、前記シーラント配合物の量が、前記創傷に接触されると、前記創傷において凝固を促進するほど有効である、方法。
（３４）  前記シーラント配合物が、実施態様２から２２のいずれかに定義されたとおりである、実施態様３３に記載の方法。
（３５）  キットであって、
ａ．フィブリノーゲン、及び哺乳動物の血液凝固カスケードの１つのメンバーの活性剤を含有するブレンドを含むシーラント配合物であって、前記活性剤が、前記哺乳動物のカスケードに対して外因性であり、前記メンバーが、前記哺乳動物の血液凝固カスケードにおいて、フィブリノーゲンの上流にある、シーラント配合物、
ｂ．創傷に凝固を促進する前記シーラント配合物を使用するための指示書であって、前記創傷の少なくとも一部に前記シーラント配合物を施用することを含む、指示書、を含む、キット。
【０１４７】
（３６）  前記指示書が、液状形態の前記シーラント配合物を供給することを含む、実施態様３５に記載のキット。
（３７）  前記シーラント配合物を前記創傷の上及び／又は前記創傷内に前記施用することを促進するように構成されている、シーラントアプリケータを含む、実施態様３５又は３６に記載のキット。
（３８）  シーラントアプリケータ内に前記シーラント配合物を含む、実施態様３７に記載のキット。
（３９）  前記シーラントアプリケータがシリンジである、実施態様３７又は３８に記載のキット。
（４０）  出血創傷において、凝固を促進するための、実施態様１から２２のいずれかに記載のシーラント配合物の使用。
【図１】
2018533424.tif 000011
【図２】
2018533424.tif 000012
【図３】
2018533424.tif 000013
【図４】
2018533424.tif 000014
【図５】
2018533424.tif 000015
【図６】
2018533424.tif 000016
【図７】
2018533424.tif 000017
【国際調査報告】
2018533424.tif 000018
2018533424.tif 000019
2018533424.tif 000020