(57)【要約】  本発明の特定の実施形態は、カラムの中のクロマトグラフィー媒体の飽和のレベルをモニターするための方法を提供し、その方法は、非負荷カラムの入口の第１の圧力を測定すること；負荷カラムからの入口の第２の圧力を測定すること；ならびに第１および第２の圧力測定値を比較して、クロマトグラフィー媒体の飽和レベルを決定することを含む。本発明の実施形態は、クロマトグラフィーシステムを制御するための関連する方法および周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法、ならびに前記新規な方法で使用するために適したクロマトグラフィーシステムも提供する。【選択図】図３
2018502293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラムの中のクロマトグラフィー媒体の飽和のレベルをモニターするための方法であって、前記方法が、
非負荷カラムの入口の第１の圧力を測定する工程と；
負荷カラムからの入口の第２の圧力を測定する工程と；
前記第１および第２の圧力測定値を比較して、前記クロマトグラフィー媒体の前記飽和のレベルを決定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記第２の圧力を連続的に測定することによって、クロマトグラフィープロセスの間に前記飽和のレベルが連続的にモニターされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非負荷カラムおよび前記負荷カラムの溶出液ラインからの圧力をそれぞれ測定する工程と；
前記第１の圧力および前記第２の圧力を前記溶出液ラインからの前記対応する圧力で調節することにより、前記非負荷カラムおよび前記負荷カラムの補正圧力を生成する工程とをさらに含み；
前記比較工程が前記補正した第１の圧力と第２の圧力を比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クロマトグラフィープロセス中の２つの異なる時点の前記第１の圧力と前記第２の圧力の差としてデルタ圧力を計算する工程；および、前記デルタ圧力を用いて前記カラムの飽和点（ｆ）を決定する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
周期的向流（ＰＣＣ）システムの各々のクロマトグラフィーカラムからの第１および第２の圧力を測定する工程、およびこれらの第２の圧力を前記第１の圧力と一緒に用いて、前記クロマトグラフィープロセスの間に前記ＰＣＣシステムの前記異なるクロマトグラフィーカラムの前記飽和のレベルを連続的に決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２の圧力が、同じ種類の検出器を用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２の圧力が、圧力センサを用いて測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを備えるクロマトグラフィーシステムであって：
供給ポンプと前記少なくとも１つのカラムの入口との間の供給ラインの第１および第２の圧力を測定するように構成されている第１の検出器（この際、第１の圧力は非負荷カラムについて測定され、第２の圧力は負荷カラムについて測定される）；
前記システムの第１のカラムからの溶出液ラインの圧力を測定するように構成されている随意の第２の検出器；および
前記検出器に接続され、前記第１および第２の圧力比較に基づいて前記第１のカラムの飽和レベルを決定するように構成されている、判定ユニット
をさらに備える、クロマトグラフィーシステム。
【請求項９】
前記判定ユニットが、前記第１および／または第２の検出器によって測定される圧力に基づいて、前記少なくとも１つのカラムの飽和レベルを前記クロマトグラフィープロセスの間に連続的に決定するように構成されている、請求項８に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１０】
少なくとも２つのカラムを周期的向流システムで備え、さらなる検出器を各々のさらなるカラムの後に１つさらに備え、各々のさらなる検出器が、各々のさらなるカラムからの前記溶出液ラインのさらなる圧力を測定するように構成され、各々の検出器が前記判定ユニットに接続され、前記判定ユニットが、前記第１、第２およびさらなる検出器によって測定した前記圧力に基づいて各々のクロマトグラフィーカラムの飽和レベルを前記クロマトグラフィープロセスの間に連続的に決定するように構成されている、請求項８に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１１】
前記全ての検出器が同じ種類である、請求項８に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１２】
前記検出器が圧力センサである、請求項１１に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１３】
前記判定ユニットが、前記測定した圧力を使用して各々のカラムについて、それぞれ前記供給ラインからの前記第１および第２の圧力から前記溶出液ラインの前記圧力を引いたものである、補正した第１および第２の圧力を求め；前記補正した第１および第２の圧力を比較するように構成されている、請求項９に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１４】
前記判定ユニットが、前記クロマトグラフィープロセス中の２つの異なる時点の前記補正した第１の圧力と前記補正した第２の圧力の差としてデルタ圧力を計算し；前記デルタ圧力を用いて前記カラムの飽和点（ｆ）を決定するようにさらに構成されている、請求項１３に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１５】
前記判定ユニットに接続され、前記クロマトグラフィープロセスの間に前記決定した飽和レベルを連続的にモニターし、前記決定した飽和レベルに依存して異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止をリアルタイムで制御するように構成されている制御ユニットをさらに備える、請求項８に記載のクロマトグラフィーシステム。
【請求項１６】
少なくとも１つのカラムを備えるクロマトグラフィーシステムを制御するための方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムの飽和レベルを決定する工程と；
前記決定した飽和レベルに従って前記異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止を制御する工程とを含む、方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィープロセスの間に前記飽和レベルを連続的に決定すること、および前記決定した飽和レベルに従って前記異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止をリアルタイムで制御することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つのカラムを備える周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法であって、
前記システムの各々のカラムから前記非負荷カラムを代表する第１の圧力を測定する工程と；
前記システムの各々のカラムから前記負荷カラムを代表する第２の圧力を測定する工程と；
請求項６に記載の各々のクロマトグラフィーカラムの前記飽和レベルを決定する工程と；
前記決定した飽和レベルに依存して前記カラムへの、および前記カラム間の供給を制御する工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
前記クロマトグラフィープロセスの間に前記飽和レベルを連続的に決定すること、ならびに前記決定した飽和レベルに依存して前記カラムへの、および前記カラム間の前記供給をリアルタイムで制御することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記決定した飽和レベルに依存して前記供給ポンプと緩衝液ポンプの流量を制御することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記決定した飽和レベルに従って、異なるカラムが負荷ゾーンにどのくらいの時間、どの位置にいなければならないかを調節することによって、前記異なるカラムの特性および／または流量の相違を補うことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記判定ユニットが、デルタ圧力を前記クロマトグラフィープロセスの間に２つの異なる時点の前記第１の圧力と前記第２の圧力の差として計算し；前記デルタ圧力を用いて前記カラムの飽和点（ｆ）を決定するようにさらに構成されている、請求項９に記載のクロマトグラフィーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィーカラムの結合容量を求めるための方法、クロマトグラフィーシステムおよびクロマトグラフィーシステムを制御するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーカラムの溶質に対する結合容量は、プロセスクロマトグラフィーにおいて非常に重要な要因である。結合容量は、クロマトグラフィーステップの生産性およびコストに直接影響を及ぼす。結合容量は、動的／破過容量の点で、または最大結合容量として定義される。動的容量は、溶液がクロマトグラフィー媒体に充填されたカラムを通って流れる条件、例えばカラム体積と供給流量の比として定義される滞留時間によって決まる。最大結合容量は、滞留時間が無限に長い場合には、カラムの破過容量を表す。初期破過容量は、溶質が溶出液中で最初に検出される時点にカラムによって取り上げられる結合溶質の量として定義される。破過容量はまた、破過の所与百分率の容量としても定義されることができ、ここでその百分率は、供給材料中に存在する溶質の百分率で表される、カラムからの溶出液中に存在する結合溶質の量を表す。この定義によれば、最大結合容量は、１００％の破過容量、すなわち溶質がこれ以上カラムに結合することができない時点と等しくなる。そのため、最大容量を求めるために、破過容量は異なる破過レベルで測定され、ここでそのレベルは、サンプル負荷の間にカラムからの溶出液において測定される溶質の濃度のレベルによって定義される。多くの場合、これらの濃度は、溶出液ラインに設置された検出器で通過画分中のシグナルを連続的にモニターすることによって求められる。これらの濃度（シグナル）の時間（または体積または負荷質量）に対するプロットは、破過曲線と呼ばれる。クロマトグラムでの破過の位置およびその形状は、どのくらい多くの溶質がカラムに結合することができるか、およびどれほど素早く全ての吸着部位が溶質によって飽和するかに関連する。それはまた、任意の時点にどれほど多くの溶質がカラムに結合することができるかも示す。
【０００３】
不純物が存在する場合の溶質の破過結合容量は、精製プロトコールを開発する際に最適化する最も重要なパラメータの１つである。不純物は溶質と同様の光吸収性を有することがかなり多いので、結合破過容量の決定は、退屈で面倒な作業である。典型的な実験では、カラムからの溶出液は一連の画分に回収され、それはその後に溶質について高解像度技術、例えばＨＰＬＣなどを用いて分析される。従って、クロマトグラフィーカラムの結合容量の決定は、むしろ難しくなる。クロマトグラフィーカラムへの供給材料適用の間に供給液の濃度が無作為に変動する例では、真の破過容量は測定することが不可能である。最適なプロセス条件でカラムを操作したい場合、後者は非常に重要である。例えば、目的の溶質がカラム溶出液中のその濃度の特定の値、例としてその初期濃度の１０％に達する時に、特定の条件下で捕獲クロマトグラフィーステップの最大の生産性が得られることを示すことができる。破過容量が上記の方法に従って求められる場合、供給材料濃度かまたはプロセス条件（流量および／またはクロマトグラフィー媒体の性質を含む）のいずれかが、予測不能な形で時間とともに変動するならば、カラムの負荷を正確な１０％の破過で終了することは不可能である。
【０００４】
さらに、変動するプロセス条件下で異なる破過レベルで破過容量を決定することは、連続クロマトグラフィーの場合に非常に重要である。
【０００５】
連続クロマトグラフィーでは、数個の同一のカラムは、方法要件に応じて、カラムが直列に、かつ／または並列に動作するような配置に接続される。従って、全てのカラムは原則としては同時に、しかし方法ステップでは僅かにずれた状態で実行することができる。この手順は繰り返すことができるので、各々のカラムは、プロセスにおいて数回負荷され、溶出され、そして再生される。１回のクロマトグラフィーサイクルがいくつかの連続するステップ、例えば負荷、洗浄、溶出および再生に基づいている「従来の」クロマトグラフィーと比較して、複数の同一カラムに基づく連続クロマトグラフィーでは、これらの全てのステップは同時に、各々異なるカラムで行われる。連続的なクロマトグラフィーの運用は、結果としてクロマトグラフィー樹脂の利用が改善され、処理時間が短くなり、バッファー要件が少なくなり、その全てがプロセスの経済に役立つ。連続クロマトグラフィーは、時々、擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーと表示される。擬似移動床クロマトグラフィーは、周期的にシステムを構成する全てのクロマトグラフィーカラムがサンプルの流れと反対の方向に同時に動くので、周期的向流プロセスの一例である。カラムの見かけ上の動きは、カラムに出入りする入口および出口の流れの向きを適切に変えることによって実現される。
【０００６】
Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ  （“Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｂｅｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”，  Ｂｉｓｃｈｏｐｓ，  Ｍ．ａｎｄ  Ｐｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｍ．，  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＸＩ，  （２００３）  Ｂａｎｆｆ，  Ａｌｂｅｒｔａ，  Ｃａｎａｄａ）は、擬似移動床（ＳＭＢ）技術に基づく連続クロマトグラフィー法を開示し、それはプロテインＡ親和性樹脂によるＩｇＧの実験室規模の精製に首尾よく用いられた。ＳＭＢによって得られるマルチカラムおよびマルチゾーン連続アプローチはプロセス効率を大幅に増加させるという事実にも関わらず、ＳＭＢシステムは大規模なｃＧＭＰバイオ医薬品の製造にこれまで利用されてこなかった。それは主にハードウェアの全体像と操作上の全体像の両方からシステムが複雑であるためである。連続した方法はより複雑であり、非常に正確に予め定義された時点で同時に行う多くの操作（ステップ）を必要とするので、操作上の全体像は特に注目される。バッチクロマトグラフィーと対照的に、システムへの入力に変動性がない場合にのみ確立することのできる定常状態の仮定に基づいて安全率が機能するという定義によって、プロセス変数を説明するために安全率を導入することは連続プロセスに推奨されない。
【０００７】
Ｈｅｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （Ｈｅｅｔｅｒ，  Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｉａｐｉｓ，  Ａ．Ｉ．，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍ  Ａ，  ７１１  （１９９５）は、典型的な４ゾーンのＳＭＢシステムに変わるものとして、３カラムの周期的向流クロマトグラフィー（３Ｃ−ＰＣＣ）原理に基づく方法を示唆した。最近、Ｌａｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，  Ｌａｃｋｉ，  Ｋ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｒｙｎｔｅｓｓｏｎ，  Ｌ．Ｍ．，  ＡＣＳ  （２００４）  Ａｎａｈｅｉｍ，  ＣＡ  ＵＳＡ）は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂へのＩｇＧ吸着のためのそのような３Ｃ−ＰＣＣシステムの使用を記載した。この３Ｃ−ＰＣＣ法は、典型的な４ゾーンのＳＭＢシステムよりも単純なハードウェアおよび容易な操作を必要とし、システムの資本設備および維持に関連するコストを直接的に低減する。
【０００８】
実際に、擬似移動床技術は、様々なその他の分野において数十年間利用されてきた。例えば、米国特許第３，２９１，７２６号（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｉｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、石油化学工業向けの連続擬似向流吸着プロセスを早くも１９６６年に記載した。
【０００９】
歴史的に、信頼性のある連続プロセスに必須の要因は：１）使用するカラムの品質、より具体的にはカラム間の類似性またはさらには同一性、２）一定の供給材料組成、および３）ハードウェア信頼性、より具体的にはポンプによって送達される一定の流量である。カラムが同一でない場合、一般に連続クロマトグラフィープロセスを設計するために使用される理論計算は正しくないことになり、効率的で頑丈な連続クロマトグラフィープロセスを設計することは困難になる。同じ議論は、供給材料濃度および流量が予期しない方法で時間とともに変動する場合にあてはまる。そのため、同一のカラムでスケールアップを検討するには、信頼性のあるポンプがシステムに必要不可欠である。しかし、反復可能な結果を得るために、カラムをクロマトグラフィー媒体で充填することは非常に複雑である。プレート数またはその他の充填特性の小さな相違でさえ、最終結果に大きな影響を及ぼし得る。さらに、クロマトグラフィー樹脂の容量は一般に樹脂耐用年数／使用の間に変化するので、新鮮な樹脂に選択されるプロセス条件は、数回使用した樹脂に適用できない。また、供給液濃度も変動するならば、常にその最適条件で動く効果的な連続クロマトグラフィープロセスを設計することはさらにより複雑になるであろう。
【００１０】
近年、Ｂａｎｇｔｓｓｏｎ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．は、クロマトグラフィーカラムが飽和して、プロセスの目的、例として収率または生産性を満たすレベルとなる時点を検出する方法を提案した（米国特許出願公開第２０１２００９１０６３号）。この方法では、飽和レベルの検出は、供給材料および溶出液からの負荷カラムの前後のＵＶシグナルの比較に基づく。この溶液は多くの分離タスクに対して頑丈であることが示されているが、生成物濃度が低い場合および／または不純物の濃度が高い場合には、この方法の適用性は制限されることが証明され得る。単一カラム構成であろうと、多層カラムシステムであろうと、クロマトグラフィー媒体の飽和のレベルを効果的にモニターすることのできる方法を開発することが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７４４８１号
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、カラムの中のクロマトグラフィー媒体の飽和レベル／結合容量を判定およびモニターするための信頼性のある動的な方法を提供することである。
【００１３】
従って、一態様では、本発明は、カラムの中のクロマトグラフィー媒体の飽和のレベルをモニターするための方法を提供し、その方法は、非負荷カラムの入口の第１の圧力を測定すること；負荷カラムの入口の第２の圧力を測定すること；ならびに第１および第２の圧力測定値を比較して、クロマトグラフィー媒体の飽和のレベルを決定することを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、飽和のレベルは、第２の圧力を連続的に測定することによって、クロマトグラフィープロセスの間に連続的にモニターされる。特定の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィープロセスの間の２つの異なる時点の第１の圧力と第２の圧力の差としてデルタ圧力を計算すること；および、デルタ圧力を用いてカラムの飽和点（ｆ）を決定することをさらに含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本方法は、非負荷カラムおよび負荷カラムの溶出液ラインからの圧力をそれぞれ測定する工程；ならびに、第１の圧力および第２の圧力を対応する溶出液ラインからの圧力で調節することにより、非負荷カラムおよび負荷カラムの補正圧力を生成する工程をさらに含み；この際、比較工程は、補正した第１の圧力と第２の圧力を比較する。
【００１６】
特定の実施形態では、本方法は、周期的向流（ＰＣＣ）システムの各々のクロマトグラフィーカラムからの第１および第２の圧力を測定すること、ならびにこれらの第２の圧力を第１の圧力と一緒に用いて、クロマトグラフィープロセスの間にＰＣＣシステムの異なるクロマトグラフィーカラムの飽和のレベルを連続的に決定することをさらに含む。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、カラムの中のクロマトグラフィー媒体の飽和レベル／結合容量を判定およびモニターするための方法を実現するためのクロマトグラフィーシステムを提供することである。従って、本発明のもう一つの態様は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを備えるクロマトグラフィーシステムを提供し、そのシステムは、供給ポンプと少なくとも１つのカラムの入口との間の供給ラインの第１および第２の圧力を測定するように構成されている第１の検出器（この際、第１の圧力は非負荷カラムについて測定され、第２の圧力は負荷カラムについて測定される）；システムの第１のカラムからの溶出液ラインの圧力を測定するように構成されている随意の第２の検出器；および、検出器に接続され、第１および第２の圧力比較に基づいて第１のカラムの飽和レベルを決定するように構成されている判定ユニットをさらに備える。
【００１８】
特定の実施形態では、クロマトグラフィーシステムの判定ユニットは、第１および／または第２の検出器によって測定される圧力に基づいて、少なくとも１つのカラムの飽和レベルをクロマトグラフィープロセスの間に連続的に決定するように構成されている。特定の実施形態では、判定ユニットは、クロマトグラフィープロセスの間の２つの異なる時点の第１の圧力と第２の圧力の差としてデルタ圧力を計算し；デルタ圧力を用いてカラムの飽和点を決定するようにさらに構成されている。特定の実施形態では、判定ユニットは、測定した圧力を使用して、各々のカラムについて、それぞれ供給ラインからの第１および第２の圧力から溶出液ラインの圧力を引いたものである、補正した第１および第２の圧力を求め；補正した第１および第２の圧力を比較するように構成されている。特定の実施形態では、判定ユニットは、デルタ圧力をクロマトグラフィープロセスの間の２つの異なる時点の補正した第１の圧力と補正した第２の圧力の差として計算し；デルタ圧力を用いてカラムの飽和点を決定するようにさらに構成されている。
【００１９】
特定の実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも２つのカラムを周期的向流システムで備え、さらなる検出器を各々のさらなるカラムの後に１つさらに備え、各々のさらなる検出器は、各々のさらなるカラムからの溶出液ラインのさらなる圧力を測定するように構成され、各々の検出器は判定ユニットに接続され、判定ユニットは第１、第２およびさらなる検出器によって測定した圧力に基づいて各々のクロマトグラフィーカラムの飽和レベルをクロマトグラフィープロセスの間に連続的に決定するように構成されている。
【００２０】
特定の実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、判定ユニットに接続され、クロマトグラフィープロセスの間に決定した飽和レベルを連続的にモニターし、決定した飽和レベルに依存して異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止をリアルタイムで制御するように構成されている、制御ユニットをさらに備える。
【００２１】
本発明の一実施形態では、クロマトグラフィーシステムは周期的向流システムである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、クロマトグラフィーシステムを制御するための信頼性のある動的な方法を提供することである。従って、一態様では、本発明は、本発明の特定の態様に従う少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムの飽和レベルを決定する工程；および、決定した飽和レベルに従って異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止を制御する工程を含む、少なくとも１つのカラムを備えるクロマトグラフィーシステムを制御するための方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィープロセスの間に飽和レベルを連続的に決定すること、および決定した飽和レベルに従って異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止をリアルタイムで制御することを特徴とする。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための信頼性のある動的な方法を提供することである。従って、一態様では、本発明は、システムの各々のカラムから非負荷カラムを代表する第１の圧力を測定する工程；システムの各々のカラムから負荷カラムを代表する第２の圧力を測定する工程；発明の特定の態様に従って各々のクロマトグラフィーカラムの飽和レベルを決定する工程；および、決定した飽和レベルに依存してカラムへの、およびカラム間の供給を制御する工程を含む、少なくとも２つのカラムを備える周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法は、クロマトグラフィープロセスの間に飽和レベルを連続的に決定すること、ならびに決定した飽和レベルに依存してカラムへの、およびカラム間の供給をリアルタイムで制御することを特徴とする。
【００２５】
特定の実施形態では、周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法は、決定した飽和レベルに依存して供給ポンプと緩衝液ポンプの流量を制御することをさらに含む。
【００２６】
特定の実施形態では、周期的向流クロマトグラフィーシステムを制御するための方法は、決定した飽和レベルに従って、異なるカラムが負荷ゾーンにどのくらいの時間、どの位置にいなければならないかを調節することによって、異なるカラムの特性および／または流量の相違を補うことをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による１つのクロマトグラフィーカラムと２つの検出器を備えるクロマトグラフィーシステムを概略的に示す図である。
【図２】図１のクロマトグラフィーシステム設計による検出器から得られるＵＶシグナルと圧力シグナルを比較する図表を示す図である。
【図３】本発明による４つの検出器を備える３カラムの周期的向流（３Ｃ−ＰＣＣ）システムを概略的に示す図である。
【図４ａ】図３の３つのバルブを概略的に示す図である。
【図４ｂ】図３の３つのバルブを概略的に示す図である。
【図４ｃ】図３の３つのバルブを概略的に示す図である。
【図５】３Ｃ−ＰＣＣシステムの３つの検出器から得られるＵＶシグナルと圧力シグナルを比較する図表を示す図である。実線：ＵＶシグナル；点線：圧力シグナル。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
先行技術に関連して考察される困難を回避するために、フィードバックのような制御原理に基づくリアルタイム制御アルゴリズムが本発明によって提供される。従って、プロセスのどんな時点でも異なるカラムの状態を評価するための方法は、特に関心が持たれる。例えば、特定の破過レベルのクロマトグラフィーカラムの結合容量を知ることにより、カラムがまだ溶質に結合することができるか、およびカラムが完全な飽和に達するまでにどのくらいの溶質が結合できるかを評価することができる。同様に、初期破過容量に達したかどうかを知ることはプロセス収率を展望する上で重要な関心事である。それは、この時点で溶質はカラムからの溶出液流に見出され、適切な行動が取られなければ、廃棄流に向けられるかまたはその他の非結合成分と一緒に回収されることになるためである。
【００２９】
従って、本発明の一実施形態は、飽和しているカラムの圧力低下をモニターし、この情報を用いて望ましい破過点を検出することに基づく、カラムの飽和レベルまたは破過を検出するための方法論を提供した。これは、（１）圧力低下の明確な値を検出すること、または（２）時間およびまたは適用した体積または質量の関数として圧力低下の変化率を検出することによって達成することができる。本発明の別の実施形態は、カラムの飽和レベルまたは破過を検出するためのより単純な方法を提供する。従って、検出は、非負荷カラムからの圧力と負荷カラムからの圧力の比較に基づくものでありうる。「非負荷カラム」とは、分離するサンプルをまだ負荷していないか、あるいは標的化合物かまたは不純物の破過の直前の、同じカラムを意味する。あるいは、「非負荷カラム」は、分離カラムとして同じ種類の樹脂で充填され、同じカラム平衡化緩衝液で平衡化される同一のカラムであってよい。
【００３０】
図１は、本発明の一実施形態による簡単なクロマトグラフィーシステムの部分を概略的に示す。このクロマトグラフィーシステムは、１つのクロマトグラフィーカラム１を含む。それは、クロマトグラフィーカラム１の入口端５に接続された供給ライン３をさらに含む。カラム１に通すサンプルは、供給ライン３を通して加えることができる。システムは、反対側、すなわちクロマトグラフィーカラム１の出口端７に接続された溶出液ライン９をさらに含む。クロマトグラフィーカラム１を通過したサンプルは、溶出液ライン９を通過することができる。クロマトグラフィーシステムは、好ましくはカラム１の入口端５に近い、供給ライン３に沿ったどこかに位置する第１の検出器１１を含む。第１の検出器１１は、供給ラインのシグナルを検出するように構成されている。さらに、クロマトグラフィーシステムは、好ましくはカラム１の出口端７に近く、溶出液シグナルを検出するように構成されている、溶出液ライン９に沿ったどこかに位置する第２の検出器１３を含む。第１および第２の検出器１１、１３は、好適には同じ種類の検出器である。特定の実施形態では、第１および第２の検出器は、圧力センサである、すなわちサンプルの圧力を測定する。圧力センサは周知であり、あるいは、他の名前の中でも、圧力変換器、圧力伝送器、圧力送信器、圧力指示器、ピエゾメーターおよびマノメーターと呼ばれることがある。その他の可能性のある種類の検出器は、ＵＶ、ｐＨ、導電率、光散乱、蛍光、ＩＲまたは可視光を測定するものである。システムの中の異なる検出器が同じ種類の検出器でない場合、検出されたシグナルは、本発明によるさらなる計算に使用される時に相関している必要がある。
【００３１】
さらに、本発明によれば、第１および／または第２の検出器１１、１３は、判定ユニット１５に接続されている。このユニットは、クロマトグラフィーカラムの結合容量を求めるために、第１および第２の検出器１１、１３で検出されたシグナルを分析する。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態では、図１に示されるクロマトグラフィーシステムと対照的に、クロマトグラフィーシステムは、好ましくはカラムの入口端に近い、供給ラインに沿ったどこかに位置する１つの検出器を含む。この検出器は、カラムが負荷されていない時であろうと、カラムが負荷されている時であろうと、クロマトグラフィープロセスの間に供給ラインの圧力シグナルを検出するように構成されている。特定の実施形態では、検出器は圧力センサである。さらに、クロマトグラフィーカラムの結合容量および／または飽和レベルを求めるために、検出器は、検出器で検出されたシグナルを分析する判定ユニットに接続される。
【００３３】
本発明のもう一つの実施形態では、図１および上に示される代わりのクロマトグラフィーシステムとは対照的に、クロマトグラフィーシステムは、カラムの供給ラインに沿ったどこかに位置する別の検出器をさらに含んでよい。この検出器は、供給ラインの圧力とは異なるシグナルを検出するように構成されている。さらに、クロマトグラフィーシステムは、溶出液ラインに沿ったどこかに位置し、圧力以外の溶出液シグナルを検出するように構成されている別の検出器を含む。これらの検出器は、好適には同じ種類の検出器であってよい。特定の実施形態では、検出器は、ＵＶ、ｐＨ、導電率、光散乱、蛍光、ＩＲまたは可視光を測定する。さらに、これらの検出器も、判定ユニットに接続される。このユニットは検出したシグナルを分析し、クロマトグラフィーカラムの結合容量およびまたは飽和レベルを評価する際にこれらのシグナルと圧力シグナルを使用する。
【００３４】
本発明の特定の実施形態を実証するために、検出した圧力シグナルを図２（シグナル強度を経時的に示す）に示し、ＵＶシグナルと比較する。図２は、カラム前のＵＶシグナル（２１、供給材料シグナル）、カラム後のＵＶシグナル（２５、溶出液シグナル）、および供給ライン（２８）で測定される圧力シグナルを表す曲線を示す。
【００３５】
曲線２１および２５は、供給材料中の生成物の総濃度を表すＵＶ値（２７）を決定するために使用される。２１と２５の差の変化を追うことにより、カラムからの溶出液流中の生成物の濃度をモニターすることができ、それを使用して生成物によるカラム飽和のレベルを計算することができる（米国特許出願公開第２０１２００９１０６３号）。供給材料サンプルは、この例で、この時間ウィンドウの間は組成が一定であるので、供給材料シグナル２１は、基本的に直線である。溶出液シグナル２３は、一部のサンプルがカラム１を通過し、第２の検出器１３が位置する溶出液ライン９の通路に入るとすぐに点ａでゼロから上昇し始める。シグナルはその後、点ｂまで上昇し、そこでそれは平坦域２５で横ばいになる。この平坦域２５は、供給材料中の全ての非結合成分がカラムを通過した時に上昇する。シグナル２３が再び上昇し始める時に平坦域２５の後に、破過点ｃがさらに定められる。これは、カラム１中のクロマトグラフィー媒体が飽和し始め、カラムに結合しているはずのサンプルの一部の部分がカラムを破過するという事実による。シグナル２３がシグナル２１に接近する時に、破過点ｄがさらに定められる。この点は飽和点として定義され、クロマトグラフィー媒体がサンプルの成分によってほぼ完全に飽和する瞬間を表す。
【００３６】
曲線２８は、カラムへの供給材料適用中に供給ラインで測定された圧力の変化を表す。負荷フェーズ中の圧力の安定した増加により、カラムでかつ／または供給ラインで測定された圧力を、生成物で飽和したカラムと互いに関係づけることが可能になる。圧力曲線（２８）はまた、そうでなければ米国特許出願公開第２０１２００９１０６３号のデルタＵＶ法（点ｃおよびｄ）を用いて測定される、カラムからの生成物の様々な破過レベル（例えば、点ｅおよびｆで表されるレベル）を検出するために使用することもできる。一実施形態では、圧力曲線とＵＶ曲線（２５）の破過部分との間の相間は、ＵＶ曲線が分かっているならば確立することができる。もう一つの実施形態では、圧力の変化（曲線２８）は、カラムに異なる量の生成物を負荷し、圧力を測定し、カラムからの溶出液から回収した画分中の生成物の濃度を決定する実験を実施することによって、カラム飽和レベルと互いに関係づけられる。クロマトグラフィーシステムの測定された圧力は、例えば、樹脂の多孔性、樹脂の粒度、供給材料の粘度、カラムの長さおよび幅によって変化することがある。
【００３７】
本発明によれば、任意の時点で、例として所定の時点で測定される点（ｅ）または（ｆ）のシグナルから、前の時点で測定されたシグナル（ｇ）を引いたシグナル差として定義される、Ｄｅｌｔａｓｉｇｎａｌを計算することができる。完全なカラム飽和で測定されたシグナルからサンプル適用の初めに測定されたシグナル（点ｇ）を引いたものとして定義される、Ｄｅｌｔａｓｉｇｎａｌｍａｘを計算することもできる。次に、このＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌを例えば破過点および飽和点に適したレベルを定めるために使用することができる。破過点は、Ｄｅｌｔａｓｉｇｎａｌｍａｘの特定の予め定義した百分率、例えばおよそ１〜１０％の範囲内またはより適切には１〜３％の範囲であると適切に定めることができ、飽和点はＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌｍａｘの特定の予め定義した百分率、例えばおよそ６０〜９０％の範囲またはより適切には７０〜８０％の範囲であると適切に定めることができる。その他の実施形態では、破過点は、特定の予め定義したレベルのＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌと適切に定めることができる。
【００３８】
破過点および飽和点を決定するこのアプローチの１つの利点は、これをリアルタイムで自動的に行うことができ、供給材料濃度に依存しないことである。
【００３９】
本発明のさらなる態様では、結合容量、例えば破過点および飽和点のこれらの決定は、異なるクロマトグラフィープロセスステップの開始および停止を自動制御するために使用される、すなわち特定の破過または飽和点レベルに達すると、制御システムはクロマトグラフィーシステムを制御してカラム溶出液を異なる回収点に向け直すなどの次のプロセスステップに進めるか、または負荷ステップを停止してカラム洗浄ステップを開始することができる。
【００４０】
本発明のもう一つの態様では、クロマトグラフィーシステムは、いわゆる周期的向流（ＰＣＣ）システムにおいて、１以上のクロマトグラフィーカラムを備える。周期的向流システムでは、ほとんどの時間、供給材料は直列に接続された少なくとも２つのカラムを通過する。この連続は多くの場合、負荷ゾーンと呼ばれ、負荷ゾーンへのカラムの付加および負荷ゾーンからのカラムの除去は、それぞれ直列の最後と最初のカラムの予め定めた破過点および飽和点に基づく。図３では、そのような３つのカラムを備える本発明によるシステムが概略的に示される。本発明の利益は、この例ではさらにより明白である。なぜならＰＣＣシステムにおける１つの共通する問題が、効率的なシステム運用を得ることができるように、システムで使用されるカラムはできる限り同一である必要があり、供給材料の組成および流量は一定であるべきであるか、または少なくともプロセス時間によるそれらの変化を演繹的に分かっていなければならないということであるためである。本発明によって、決定した破過点および飽和点に従って、異なるカラムが負荷ゾーンにどのくらいの時間、どの位置にいなければならないかを調節することによって、カラム結合容量および／または流量の相違を補うことができる。
【００４１】
図３では、供給ポンプ３１は、第１の検出器３３を介して第１のバルブブロック３５に接続されていることが示される。緩衝液ポンプ３７もこの第１のバルブブロック３５に接続されている。第１のバルブブロック３５は、さらに、第１のＴバルブ４１を介して第１のカラム３９の入口に接続されている。第１のカラム３９の出口端は、第２の検出器４５を通って第２のＴバルブ４３に接続されている。第１のバルブブロック３５は、さらに、第２のバルブブロック４９を介して第２のカラム４７の入口に接続されている。第２のカラム４７の出口端は、第３の検出器５３を介して第３のバルブブロック５１に接続されている。さらに、第３のＴバルブ５５は、第２のＴバルブ４３と第３のバルブブロック５１の間に接続されている。第３のＴバルブ５５は、第４のＴバルブ５７にも接続され、第４のＴバルブ５７は第１のＴバルブ４１と第２のバルブブロック４９にも接続されている。この結果、第１のカラム３９からの溶出液を、Ｔバルブ４３、５５、５７および第２のバルブブロック４９を通って第２のカラム４７の入口に向けることができる。
【００４２】
さらに、第１のバルブブロック３５は、第５のＴバルブ６１を介して第３のカラム５９の入口に接続されている。第３のカラム５９の出口端は、第４の検出器６５を介して第６のＴバルブ６３に接続されている。さらに、第７のＴバルブ６７は、第３のバルブブロック５１と第６のＴバルブ６３の間に接続されている。第７のＴバルブ６７は、第８のＴバルブ６９にも接続され、第８のＴバルブ６９は第２のバルブブロック４９と第５のＴバルブ６１にも接続されている。この結果、第２のカラム４７からの溶出液を、第３のカラム５９の入口に向けることができる。第３のカラム５９からの溶出液は、バルブ６３、６７、５１、５５、５７および４１を通って第１のカラム３９の入口に向けることができる。第１のバルブブロック３５の構造は図４ａに概略的に示され、第２のバルブブロック４９の構造は図４ｂに概略的に示され、第３のバルブブロック５１の構造は図４ｃに概略的に示される。これらの図面では、４つのボックスからなる各群がＴバルブ（スリーウェイバルブ）を表す。さらに、本発明によれば、第１、第２、第３および第４の検出器３３、４５、５３、６５は全て判定ユニット７１に接続されている。判定ユニットは、検出した検出器からのシグナルを使用して、３つの異なるカラムの破過点および飽和点を決定するように構成されている。判定ユニット７１および全てのバルブブロックおよびＴバルブおよびポンプは、さらに、制御ユニット７３に接続され（全ての接続は図示しない）、これは負荷ゾーンからカラムを除去するかまたは負荷ゾーンにカラムを負荷する時、流量を変える時、新しい洗浄ステップを開始する時に関してクロマトグラフィーシステムを制御するように構成されている。検出器３３、４５、５３、６５は、一実施形態では圧力センサである。本発明に使用することのできる検出器のその他の例は、既に考察されている。
【００４３】
本発明の一実施形態では、図３のシステムで実行されるクロマトグラフィープロセスは、以下を含む：
（ａ）供給ラインのシグナルを第１の検出器３３で、そしてカラム３９、４７、５９の各々からの溶出液のシグナルを（第２、第３および第４の検出器４５、５３、６５で）連続的にモニターし、各々のカラム３９、４７、５９について、補正したシグナルを計算すること；
（ｂ）少なくとも１つの標的化合物を含む供給材料を第１の吸着剤（第１のカラム３９中のクロマトグラフィー媒体）に通し、第１の吸着剤について測定した補正シグナル（図２に関して上記のような定義）が予め定めた値ｘ１に達する時に第１の吸着剤からの流出物を第２の吸着剤（第２のカラム４７中のクロマトグラフィー媒体）に向け直すこと；
（ｃ）供給材料を第２の吸着剤に向け直し、第１の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ２に達する時に標的化合物が結合した第１の吸着剤に洗浄液を通すこと；
（ｄ）洗浄液流出物を第３の吸着剤（第３のカラム５９中のクロマトグラフィー媒体）に向け、その後、第２の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ１に達する時に第２の吸着剤からの流出物を第３の吸着剤に向けること；
（ｅ）第１の吸着剤を再生すること；
（ｆ）供給材料を第３の吸着剤に向け直し、第２の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ２に達する時に標的化合物が結合した第２の吸着剤に洗浄液を通すこと；
（ｇ）洗浄液流出物を第１の吸着剤に向け、その後、第３の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ１に達する時に第３の吸着剤からの流出物を第１の吸着剤に向けること；
（ｈ）第２の吸着剤を再生すること；
（ｉ）供給材料を第１の吸着剤に向け直し、第３の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ２に達する時に標的化合物が結合した第３の吸着剤に洗浄液を通すこと；
（ｊ）洗浄液流出物を第２の吸着剤に向け、その後、第１の吸着剤について得た補正シグナルが予め定めた値ｘ１に達する時に第１の吸着剤からの流出物を第２の吸着剤に向けること；
（ｋ）第３の吸着剤を再生すること；
（ｌ）ステップ（ｂ）〜（ｋ）を繰り返すこと；
この際、少なくとも１つの標的化合物は、ステップ（ｄ）、（ｇ）および／または（ｊ）で回収される。予め定めた値ｘ１およびｘ２は、それぞれ破過点および飽和点を表す。
【００４４】
本発明は、カラムの各々について測定したＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌおよびＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌｍａｘに基づいて破過および飽和の切り替え点を自動的に調節することによってカラムの特性のどんな相違も補うことができるので、向流システムを運用する際に同一でないカラムの使用を可能にする。また、それは、供給材料濃度の予想外の変化が供給材料濃度のどんな変化としても起こる場合に向流システムを運用することも可能にする、従って、カラムに負荷した標的の量の変動を自動的に補うＤｅｌｔａｓｉｇｎａｌに基づく破過および飽和の切り替え点を自動的に調節することによって、各々のカラムに負荷される質量の変化を補うことができる。
【００４５】
本発明のもう一つの実施形態では、３以上のクロマトグラフィーカラムを備えるクロマトグラフィーシステムを、灌流細胞培養に由来する供給材料の流れからの生成物の直接捕獲に使用することができる。そのような流れの中の成分の濃度は時間とともに変動すること、そして、自動制御アルゴリズムなしにクロマトグラフィーシステムを運用することは、誤って演繹的に割り当てられたリダイレクト点のために生成物をかなり失うというリスクなしには不可能であることが当業者には周知である。
【実施例】
【００４６】
本実施例は、説明目的のためだけに提供されるものであり、添付される特許請求の範囲によって定義される本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【００４７】
この実施例は、本発明による３カラム周期的向流（３Ｃ−ＰＣＣ）システムを使用し、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂での、ＭＡｂと宿主細胞タンパク質を含有する混合物からモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を精製するための連続一次捕獲ステップを例示する（すなわち、この例では検出器はＵＶ検出器または圧力センサである）。より具体的には、３つの同様のカラムに、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン）を充填した。３つのカラムの各々の前後に測定したＵＶまたは圧力シグナルの連続比較に基づく自動制御機能を持つ３カラム周期的向流システム、３Ｃ−ＰＣＣに構成されたＡＫＴＡ（商標）ＰＣＣ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン）クロマトグラフィーシステムにカラムを接続した。各々の検出器からの吸光度を、ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）ソフトウェア（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン）を用いて記録した。ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）は、全てのポンプおよびバルブの制御にも使用される。プロテインＡカラムＭＡｂからの溶出液を１つのプールに回収した。
【００４８】
次の単一のカラムクロマトグラフィーサイクルを、３カラムＡＫＴＡＰＣＣシステムを連続的に操作するためのベースとして使用した：１）５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａによるカラム平衡化；２）供給材料によるカラム負荷；３）５ＣＶの緩衝液Ａによるカラム洗浄；４）１ＣＶの緩衝液Ｂによるカラム洗浄；５）４ＣＶの緩衝液Ｃによるカラム溶出；６）２ＣＶの緩衝液Ｄによるカラムストリップ；７）３ＣＶの緩衝液ＥによるカラムＣＩＰ。全てのステップは流量０．９４ｍＬ／分で実施した。
【００４９】
使用した溶液の組成を下に記載する：
緩衝液Ａ：ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４
緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  酢酸塩緩衝液  ｐＨ６
緩衝液Ｃ：５０ｍＭ  酢酸塩緩衝液  ｐＨ３．５
緩衝液Ｄ：１００ｍＭ  酢酸塩  ｐＨ２．９
緩衝液Ｅ：１００ｍＭ  ＮａＯＨ
供給材料：宿主細胞タンパク質を含有する清澄化細胞培養流体中約２．００ｇ／Ｌ  ＭＡｂ
数百ミリリットルの供給材料含有溶液を、上記の実験的な３Ｃ−ＰＣＣ構成に連続的に供給した。供給液の吸光度および圧力は、供給ライン上に位置する第１の検出器によって連続的に測定された。緩衝液Ｂを飽和したカラムに適用することによって、精製されたＭＡｂを別々の方法でシステムから溶出した。飽和したカラムは、溶出ステップの前に洗浄した。
【００５０】
図５は、３カラム周期的向流システムを使用して、プロテインＡカラムでのモノクローナル抗体の連続捕獲の間に得た部分データを示す。３つの異なる負荷サイクルについて測定した対応する圧力変化とＵＶシグナルの変化は、十分に文書化されている。初期圧力増加および各々のサイクルの終わりの圧力低下は、ＰＣＣ運用の間のそれぞれの流路の開閉に関連するシステム構成の効果によるものである。
【００５１】
本発明の特定の実施形態が示され記載されたが、本発明の教示から逸脱することなく変更および修正がなされてよいことは当業者には明らかである。前述の説明および添付の図面に示される事項は、説明のために提供されるものであり、制限として提供されるものではない。本発明の実際の範囲は、先行技術に基づいて正しい見方で考察される場合、以下の特許請求の範囲において定義されるものとする。
【符号の説明】
【００５２】
１  クロマトグラフィーカラム
３  供給ライン
５  入口端
７  出口端
９  溶出液ライン
１１  第１の検出器
１３  第２の検出器
１５  判定ユニット
２１  供給材料シグナル
２３  溶出液シグナル
２５  平坦域
２７  ＵＶ値
２８  供給ライン  曲線
３１  供給ポンプ
３３  第１の検出器
３５  第１のバルブブロック
３７  緩衝液ポンプ
３９  第１のカラム
４１  第１のＴバルブ
４３  第２のＴバルブ
４５  第２の検出器
４７  第２のカラム
４９  第２のバルブブロック
５１  第３のバルブブロック
５３  第３の検出器
５５  第３のＴバルブ
５７  第４のＴバルブ
５９  第３のカラム
６１  第５のＴバルブ
６３  第６のＴバルブ
６５  第４の検出器
６７  第７のＴバルブ
６９  第８のＴバルブ
７１  判定ユニット
７３  制御ユニット
【図１】
2018502293.tif 000003
【図２】
2018502293.tif 000004
【図３】
2018502293.tif 000005
【図４ａ】
2018502293.tif 000006
【図４ｂ】
2018502293.tif 000007
【図４ｃ】
2018502293.tif 000008
【図５】
2018502293.tif 000009
【国際調査報告】
2018502293.tif 000010
2018502293.tif 000011