(57)【要約】  生体分子を細胞へと送達するためのシリカ系生体分子担体、それを含む組成物、並びにその製造方法及びその使用が提供される。シリカ系生体分子担体は、多孔質コアと、第１の生理活性部分と、第１の生理活性部分と機能的に関連する第２の生理活性部分と、第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分を多孔質コアにそれぞれ複合化するリンカーとを含む。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ系生体分子担体であって、
多孔質コアと、
第１の生理活性部分と、
前記第１の生理活性部分と機能的に関連する第２の生理活性部分と、
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分を、前記多孔質コアにそれぞれ複合化させるためのリンカーと、
を含む、シリカ系生体分子担体。
【請求項２】
前記第１の生理活性部分が、酵素、抗体、触媒模倣物、リガンド、ホルモン、生体分子結合タンパク質、及びそれらの機能性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項３】
前記第１の生理活性部分が転写因子抗体であり、前記第２の生理活性部分がオルガネラターゲッティング生体分子又は細胞透過性生体分子である、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項４】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が、カスケード反応に関与する異なる酵素又は酵素フラグメントである、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項５】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が、活性酸素種代謝に関与する異なる酵素又は酵素フラグメントである、請求項４に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項６】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が変性形態である、又は部分的に活性形態である、請求項４に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項７】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分の少なくとも一方が細胞透過性ドメインを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項８】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分の少なくとも一方がポリヒスチジンタグを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項９】
前記リンカーの少なくとも１つがポリエチレングリコールセグメントを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１０】
前記リンカーの少なくとも１つが二価のニッケルイオン又はコバルトイオンを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１１】
前記リンカーの少なくとも１つが、共有結合を介して、前記第１の生理活性部分、前記前記第２の生理活性部分、又はそれらの両方に結合される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１２】
前記リンカーの少なくとも１つが、前記多孔質コアに連結した第１の末端と、前記第１又は第２の生理活性部分に連結した第２の末端と、細胞取込みを促進するための前記第１の末端と前記第２の末端との間の機能的セグメントとを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１３】
前記多孔質コアが、ポリエチレンイミン、アミノ基、ニトリロ三酢酸、ポリエチレングリコール、蛍光タグ、又はそれらの組み合わせによって官能基化される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１４】
前記多孔質コアが２ｎｍ〜５０ｎｍの平均孔径を有する、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１５】
前記多孔質コアが３００ｎｍ未満の粒径を有する、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１６】
生物学的媒質中に分散された、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシリカ系生体分子担体を複数含む医薬組成物。
【請求項１７】
組成物を作製する方法であって、
多孔質コアを有するシリカ系担体を準備することと、
前記多孔質コア上にリンカーを形成することと、
前記リンカーの少なくとも一部を介して第１の生体分子を前記多孔質コアに複合化させることと、
前記リンカーの少なくとも一部を介して前記第１の生体分子と機能的に関連する第２の生体分子を前記多孔質コアに複合化させることと、
を含む、方法。
【請求項１８】
細胞障害に関連する疾患又は状態の治療に対する医薬の製造において、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシリカ系生体分子担体を含む組成物を使用する方法。
【請求項１９】
前記疾患又は状態が、酵素欠損症、酵素欠乏、癌、及び代謝障害からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して生体分子担体、特にシリカ系生体分子担体、それを含む組成物、並びにその作製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
不十分な溶解度、並びにその他の薬物及び生体分子の送達の問題に対処するため、体内の標的部位に治療剤を送達することを期待して過去十年の間、様々な担体が開発されてきた。例えば、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）及びメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）等のシリカ系担体は、それらの好都合な化学特性、熱安定性及び生体適合性により、好適な送達試薬である。
【０００３】
ＨＳＮ又はＭＳＮに由来する薬物又は生体分子と複合化されたシリカ系材料は、癌治療法及び様々な難治性の疾患の治療に最も有望な方法の１つである。またさらに、シリカ系担体は、特定の酵素を有しない又は該酵素が十分ではない（only insufficient）患者においてその酵素を補充する医学的処置である、酵素補充療法（ＥＲＴ）に有用であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、いくつかの既存のアプローチの制限により、特に細胞取り込み、ターゲッティング、及び送達の問題に関して、より満足な解決策を探索する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施の形態によれば、細胞へ生体分子を送達するための担体が提供される。生体分子担体はメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）等のシリカ系多孔質コアを含み、生体分子はリンカーを介してシリカ系多孔質コアに複合化されることにより、第１の生理活性部分と第２の生理活性部分とを有するシリカ系生体分子担体を形成する。第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分は、互いに異なるが、機能的には関連しており、酵素、抗体、触媒模倣物、リガンド、ホルモン、生体分子結合タンパク質、及びペプチド又はポリペプチド等のそれらの機能性フラグメントから独立して選択されてもよい。
【０００６】
本発明の実施の形態によれば、前述のシリカ系生体分子担体を複数含む医薬組成物が開示される。
【０００７】
本発明の実施の形態によれば、前述の組成物を作製する方法であって、多孔質コアを有するシリカ系担体を準備することと、多孔質コア上にリンカーを形成することと、リンカーの少なくとも一部を介して第１の生体分子を多孔質コアに複合化させることと、リンカーの少なくとも一部を介して第１の生体分子と機能的に関連する第２の生体分子を多孔質コアに複合化させることとを含む、方法が開示される。
【０００８】
さらに、本発明の実施の形態によれば、限定されないが、酵素欠損症、酵素欠乏、癌及び代謝障害を含む細胞障害に関連する疾患又は状態の治療に対する医薬の製造において前述のシリカ系生体分子担体を含む組成物を使用する方法が開示される。例えば、最初にシリカ系生体分子担体を作製し、準備する。シリカ系生体分子担体は、多孔質コアと、リンカーによって該多孔質コアと複合化された生体分子から形成される、少なくとも２つの異なった、機能的に関連する生理活性部分とを含む。その後、シリカ系生体分子担体を、細胞と該担体とをインキュベートすることによって該細胞に接触させる。そのようにして、２つの異なった、機能的に関連する生体分子を同時に上記細胞へと同時送達する。
【０００９】
本発明の前述及び他の特徴及び利点をより理解できるようにするため、図を伴ういくつかの実施形態を以下に詳述する。
【００１０】
添付の図面は本発明の更なる理解を提供するために含まれており、引用することにより本明細書の一部をなす。図面は本発明の実施形態を示しており、本明細書と共に、本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】表面が官能基化された多孔質コアへのＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体及びＣｙｓ−ＴＡＴペプチドの複合化に対する反応スキームを説明する図である。
【図２Ａ】様々な官能基化されたＭＳＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図２Ｂ】様々な官能基化されたＭＳＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図２Ｃ】様々な官能基化されたＭＳＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図２Ｄ】様々な官能基化されたＭＳＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図３Ａ】様々な官能基化されたＭＳＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図３Ｂ】様々な官能基化されたＭＳＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図３Ｃ】様々な官能基化されたＭＳＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図４Ａ】ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子の複合化構造を説明する図である。
【図４Ｂ】ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子のＴＥＭ画像を示す図である。
【図５Ａ】Ｈｅｌａ細胞へのＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘの同時送達の保護効果を説明する図である。
【図５Ｂ】ＨｅＬａ細胞へのＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘの同時送達の保護効果を説明する図である。
【図５Ｃ】ＨｅＬａ細胞へのＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘの同時送達の保護効果を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
これより、本発明の好ましい実施形態の詳細に言及し、その実施例は添付の図面に示される。以下の実施形態では、１以上のシリカ系生体分子担体が記載される。実施例において示される引用例、原料、反応条件又はパラメーターは、例示の目的に過ぎず、本明細書に記載される例示的な実施形態による材料又は作製方法を限定することを意図するものではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１の生体分子及び第２の生体分子等の少なくとも２つの異なる生体分子は、シリカ系多孔質コアと複合化され、そのようにして形成されたシリカ系生体分子担体の、第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分等の少なくとも２つの異なる生理活性部分として作用する。２つの生体分子又は生理活性部分は互いに異なるが、機能的には関連しており、１以上のリンカーによって多孔質コアと複合化される。
【００１４】
本明細書に使用される「生体分子担体」の用語は、機能的な生体分子を保持する、多孔質コア等のマイクロスケール又はナノスケールの粒子、球体又は生物学的ビヒクルを意味することが意図される。本明細書で使用される「生体分子」の用語は、（１）一次代謝産物、二次代謝産物及び天然物等の低分子と並んで、タンパク質、炭水化物、脂質及び核酸等の大きな高分子を含む、生体に存在する任意の分子、又は（２）改変された天然分子、薬物又は生理活性物質等の人工又は合成の生成物を含む生体に存在しない任意の分子を包含する。
【００１５】
本明細書で使用される「生理活性部分」の用語は、生体分子担体の生理活性的な単位、部分、ブロック、領域又はドメインを指し、それらは多孔質コアへの生体分子の複合化によって形成される。生理活性部分は、例えば、生体、組織又は細胞に対する効果を有する、生物学的に活性で、診断的、治療的、及び予防的な分子であってもよい。生理活性部分は、多孔質コアと、酵素、抗体、触媒模倣物、リガンド、ホルモン、生体分子結合タンパク質、及びそれらの機能性フラグメント等の生体分子との間の複合化によって形成され得る。例えば、生理活性部分は、抗体、抗原、合成低分子ペプチド模倣物、受容体リガンド、酵素、接着ペプチド等の合成、組み換え又は単離されたペプチド及びタンパク質、ヌクレオチド、ＤＮＡ及びアンチセンス核酸分子等のポリ核酸、活性化された糖及び多糖、並びに有機性薬物分子から形成されてもよい。
【００１６】
一実施形態では、生理活性部分は、疾患及び臨床状態の治療又は予防に直接的に又は間接的に有効な多様な生体分子との多孔質コアの複合化によって形成される治療的部分である。シリカ系生体分子担体の用途に基づいて、好適な治療的部分を選択してもよい。例えば、好適な治療的部分は抗癌物質に見出される場合がある。治療的部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの条件下も含めて、多孔質コアに複合化された場合に、それらの治療的／生物学的な活性を保持する安定した実体であることが好ましい。好適な治療的部分の例は、低分子、タンパク質、ペプチド、糖、ステロイド、抗体（そのフラグメント及び変形を含む）、融合タンパク質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ等である。
【００１７】
２以上の生体分子を多孔質コアに複合化する場合、シリカ系生体分子担体の生理活性部分は互いと機能的に関連していることが好ましい。本明細書の文脈において、「機能的に関連する」の用語は広く解釈されるべきであり、１つの部分がその生体機能を行う点で他方に対して有利であるか、有用であることを意味する。例えば、２つの生体分子が保持される場合、第２の部分がその機能をより効果的に又は効率的に行うように促す機能（細胞透過又はターゲッティング等）を第１の部分が提供する場合、第１の部分は第２の部分と機能的に関連している。代替的には、第１の部分及び第２の部分が生物学的カスケード反応の異なる段階に関与する場合、第１の部分は第２の部分と機能的に関連している。
【００１８】
第１の部分は、細胞透過性ペプチド、正に帯電したポリペプチド、又はポリエチレンイミン等の細胞取り込み促進分子；核局在化配列ペプチド；エンドソームターゲッティングペプチド；オルガネラターゲッティング分子；リガンド、ペプチド、抗体及びアプタマーを含む分子を標的とする癌細胞；並びにカスケード反応に関与する酵素に由来し得ることが好ましい。
【００１９】
第２の部分は、カスケード反応に関与する酵素等の細胞制御活性を有する生体分子に由来し得ることが好ましい。第２の部分は、限定されないが、ファブリ病を含むリソソーム貯蔵障害、シントラー病、ゴーシェ病（１型、２型及び３型）、ポンペ病、ダノン病、ＭＰＳ  Ｉ（ハーラー症候群、ハーラー−シャイエ症候群、又はシャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター病）、ＭＰＳ  ＩＩＩ（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型及びＤ型）、ＭＰＳ  ＩＶ（Ａ型及びＢ型）、ＭＰＳ  ＶＩ（マロトー−ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＶＩＩ（スライ症候群）、ＭＰＳ  ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症）、クラッベ病、ファーバー病、ガラクトシアリドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス変異型ＡＢ、サンドホフ病、テイ−サックス病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ニーマン−ピック病（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）、異染性ロイコジストロフィー（ＭＬＤ）、多発性スルファターゼ欠損症、ムコリピドーシス（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型）、神経セロイドリポフスチン症（１型〜１０型）、ウォルマン病、アルファ−マンノシドーシス、ベータ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、シスチノーシス、ピクノディソストーシス、シアル酸蓄積症、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、コレステロールエステル蓄積症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、糖原病、ミトコンドリア障害、フリードライヒ運動失調症、ペルオキシソーム障害（ツェルヴェーガー症候群及び副腎白質ジストロフィーを含む）、金属代謝障害（ウィルソン病及びヘモクロマトーシスを含む）、有機酸血症、及び尿素サイクル異常症を含む代謝障害に関与する生体分子に由来し得ることが好ましい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第２の部分は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、ＰＣＴ特許出願公開の国際公開第２０１５／０４２２７９号に列挙されるものに限定される、新生物に関与する生体分子に由来してもよい。
【００２１】
一実施形態では、第１の生理活性部分は転写因子抗体であり、第２の生理活性部分は核ターゲッティング生体分子又は細胞透過性生体分子である。一実施形態では、第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分は、活性酸素種（ＲＯＳ）代謝に関与する異なる酵素又は酵素フラグメントである。別の実施形態では、第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分は、ヒト等のレシピエントへの投与前は変性形態又は部分的に活性形態であってもよく、投与後にリフォールディングされてもよい。
【００２２】
一実施形態では、第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分の少なくとも一方が細胞透過性ドメインを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、シリカ系生体分子担体によって保持されるのに適した生体分子として、システイン（チオール基）、リジン（アミノ基）、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸（カルボキシル基）を含む酵素、システイン（チオール基）、リジン（アミノ基）、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸（カルボキシル基）を含むペプチド、又はシステイン（チオール基）、リジン（アミノ基）、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸（カルボキシル基）を含む抗体が挙げられ得る。代替的には、シリカ系生体分子担体によって保持されるのに適した生体分子として、ポリヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−タグ）を含む酵素、ポリヒスチジン−タグを含むペプチド、又はポリヒスチジン−タグを含む抗体が挙げられ得る。本明細書では、ポリヒスチジン−タグは少なくとも６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からなる。
【００２４】
酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ及びそれらの酵素模倣物又はフラグメントを含む抗酸化酵素であってもよい。代替的には、酵素は、血液凝固、代謝経路及びシグナル伝達経路等の酵素を含む一連の生化学反応を指す生化学的酵素カスケードに関与する酵素であってもよい。
【００２５】
本開示によれば、シリカ系生体分子担体によって保持される生体分子は多孔質コアに複合化される。本明細書で使用される「に複合化された（conjugated to）」、「と複合化された（conjugated with）」、「複合化する」の用語又は類似の表現は、直接若しくは間接の共有結合又は非共有結合の相互作用によって連結された２以上の化学的又は生物学的な実体を指す。いくつかの実施形態では、関連は共有結合的なものである。いくつかの実施形態では、共有結合的な関連はリンカー部分によって媒介される。いくつかの実施形態では、関連は親和性相互作用、電荷相互作用、疎水的相互作用、金属配位、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気的相互作用、静電相互作用又は双極子相互作用等の非共有結合なものであり、それらはいずれもリンカーによってもたらされるか、又は媒介される。リンカーを介して生体分子をシリカ系多孔質コアに複合化する例示的な方法は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Academic Pressにより発行されたGreg T. Hermanson著、第３版（２０１３年９月２日付）の「Bioconjugate Techniques」から見出すことができる。
【００２６】
本発明によれば、リンカーは生体分子と多孔質コアとの間の複合化を行うために使用される。一実施形態では、複合化を行うために複数の同じ種類のリンカーを使用し、第１の生理活性部分と第２の生理活性部分とを同じリンカーによって、又は同じ種類の異なるリンカーによって連結してもよい。一実施形態では、複合化を行うため２以上の異なる種類のリンカーを使用し、異なる生理活性部分を異なるリンカーによって無作為に又は制御して連結してもよい。
【００２７】
本明細書で使用される「スペーサー」又は「架橋剤」としても知られる「リンカー」の用語は、コアとそれによって保持される生体分子との間の化学的又は物理的な連結のあらゆる形態を含むように広く解釈されるべきである。例えば、シリカ系多孔質コアを、その上にリンカーを形成するように官能基化又は修飾してもよい。作製の間に多孔質コアの表面特性を変更してもよく、又は作製後に合成後戦略を用いてリンカーを形成してもよい。活性な表面は、生体分子にシリカ系多孔質コアが連結することを可能とする。細胞認識又はその他の部位配向性（site-directing）の生体分子を有する多孔質コアの官能基化表面は、細胞の追跡又はターゲティングに理想的な薬剤となる。例えば、葉酸等のターゲッティングリガンドによる表面の改質又は官能基化を用いて、非癌細胞と比較して、癌細胞による特異的な取り込みを増強してもよい。シリカ系多孔質コアの改質又は官能基化に有用なアプローチは、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、ヘルシンキ大学（２０１２年）のLuis Maria Bimboによる博士論文「Biocompatibility and Biofunctionalization of Mesoporous Silicon Particles」に見出すことができる。
【００２８】
連結機能に加えて、本発明に開示されるリンカーは、シリカ系生体分子担体に、精製適応性、バイオアベイラビリティー、生体分布、標的特異性、細胞取り込み等の所望の特性を提供するため、１以上の機能的セグメントを有し得ることが好ましい。
【００２９】
一実施形態では、生体分子は、リンカーによってシリカ系多孔質コアに複合化される。最初に、多孔質コアの表面上に反応性のアミノ基を提供するため、多孔質コアを３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）等の試薬によって官能基化する。その後、アミノ基を、例えばスクシンイミジル基及びマレイミジル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体と共有結合することで、スクシンイミジル基とアミノ基との間の反応により多孔質コア上にこのＰＥＧリンカーがグラフトされ、マレイミジル基は、リンカーのマレイミジル基と生体分子のチオ基との間の反応により生体分子との連結を形成するのに有用な場合がある。この実施形態では、水溶性、生体適合性及び長さ柔軟性等の利点をリンカーにもたらすため、ヘテロ二官能性ＰＥＧ誘導体をリンカーとして使用する。一般に、ヘテロ二官能性ＰＥＧ誘導体は、Ｘ−ＰＥＧ−Ｙの一般的な構造を有する場合があり、ここで、Ｘ及びＹは２つの異なる官能基又は反応性基である。いくつかの有用なＰＥＧリンカーとして、限定されないが、ＨＯ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＧＡ、ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビオチン−ＰＥＧ−ＭＡＬ、及びアルキン−ＰＥＧ−ＭＡＬが挙げられる。多孔質コア及び保持される生体分子の特性に応じて異なるＸ及びＹを選択することができる。さらに、ＰＥＧリンカーの長さ又は分子量は、そのように形成されたシリカ系生体分子担体の最終用途又は適用と並んで、多孔質コア及び生体分子の種類に応じて選択されてもよい。
【００３０】
別の実施形態では、ニッケルイオン又はコバルトイオン等の二価金属イオンを含む分子は、リンカーとして使用される。例えば、多孔質コアをニトリロ三酢酸含有シラン（ＮＴＡシラン）で処理した後、ＮｉＣｌ２で処理することで、ポリヒスチジン−タグを有する生体分子を結合するため、多孔質コアの表面上にニッケルイオンを供給することができる。多孔質コア上に固定化される生体分子が遺伝子改変されたタンパク質又はポリペプチドである場合、二価金属イオンのアプローチはより有利である。また、代替的には、多孔質コアをＮｉ２＋：ＮＴＡ−ＰＥＧ誘導体によって処理してＰＥＧセグメント及び二価金属イオンとのリンカーを形成してもよい。
【００３１】
別の実施形態では、リンカーは、多孔質コアに連結した第１の末端と、第１又は第２の生理活性部分に連結した第２の末端と、細胞取込みを促進するための第１の末端と第２の末端との間の機能的セグメントとを含むことができる。所望の送達機能を達成するための上記シリカ系生体分子担体に存在するリンカーの種類、分子量、及び生物学的特性の選択は、過度な実験をすることなく決定することができる。
【００３２】
本明細書に使用される「多孔質コア」又は「コア」の用語は、概して、機能性生体分子を保持することができるナノスケールの粒子、球体又は生物学的ビヒクルを指す。別段の明示がない限り、「多孔質コア」又は「コア」の用語は、シリカ粒子のメソポーラス形態を指す「メソポーラスシリカナノ粒子」（ＭＳＮ）と同じ意味で使用され得る。多孔質コアの大きな表面積は、生体分子の送達に対して該粒子を有用なものとする。
【００３３】
様々なシリカ系多孔質コアの合成の豊富な成功例がこれまで報告されている。例えば、ＭＳＮは、ミセルロッドで作製されたテンプレートとテトラエチルオルトシリケートとを反応させることにより合成され得る。結果は、孔の規則的配列によって満たされるナノサイズの球体又はロッドの集合である。その後、テンプレートを適切なｐＨに調整した溶媒で洗浄することにより除去することができる。別のプロセスでは、単純なゾル−ゲル法又は噴霧乾燥法を使用して、ＭＳＮを合成することができた。また、テトラエチルオルトシリケートを追加のポリマー単量体（テンプレートとして）と共に使用する。他の方法として、速い自己組織化、ソフト及びハードテンプレート法、改変ストーバー法、溶解−再構成及び改変エアロゲルアプローチが挙げられる。多孔質コアを作製するいくつかの異なる合成の方法論は、例えば、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、"Synthesis of Mesoporous Silica Nanoparticles," Si-Han Wu et. al., Chem. Soc. Rev., 2013,42, 3862-3875、及び"Mesoporous Silica Nanoparticles in Target Drug Delivery System: A review," Charu Bharti et. al., Int J Pharm Investig. 2015 Jul-Sep; 5(3): 124-133に見出すことができる。形態、粒径、均一性及び／又は分散度の良好な制御が達成されるように、好適な合成方法論を選択することが好ましい。
【００３４】
一実施形態では、多孔質コアは２ｎｍ〜５０ｎｍ、例えば５ｎｍ〜５０ｎｍ、１０ｎｍ〜５０ｎｍ、２０ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜５ｎｍ又は２ｎｍ〜１０ｎｍの平均孔径を有する。一実施形態では、多孔質コアは３００ｎｍ未満、例えば２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満又は１００ｎｍ未満、例えば２ｎｍ〜３００ｎｍ、２ｎｍ〜２００ｎｍ、１０ｎｍ〜２００ｎｍ又は５０ｎｍ〜１００ｎｍの粒径（particle size or diameter）を有する。
【００３５】
種々の要求又は用途に応じて、多孔質コアのサイズを制御してもよい。この孔径の可同調性（tunability）は、低分子の薬物からタンパク質及び酵素等の高分子に及ぶ生体分子を保持する可能性を提供する。
【００３６】
一実施形態では、組織分布と並んで、細胞株中のサイズ依存性取り込みが、シリカナノ粒子について観察された。粒子のｉｎ  ｖｉｖｏでの生体内分布及びクリアランスは、それらの物理学的及び化学的な性質に大きく依存する。窒素等の気体吸着技術を使用して、材料の孔径分布を測定してもよい。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、それぞれ乾燥状態で及び水性媒質中においてナノ粒子のサイズを測定してもよい。
【００３７】
作製中又は作製後に、要求に応じて所望の特性を提供するように多孔質コアを官能基化することができることが好ましい。例えば、多孔質コアは、アミノ基、ニトリロ三酢酸、ポリエチレングリコール、蛍光タグ又はそれらの組み合わせによって官能基化されてもよい。
【００３８】
したがって、本発明によって作製されたシリカ系生体分子担体は、それを必要とするレシピエントへの投与のため、有効量のシリカ系生体分子担体を薬学的又は生理学的に許容可能な希釈剤等の生物学的媒質、例えば水又は生理食塩水に分散する、医薬組成物の作製に有用な可能性がある。
【００３９】
代替的には、別の実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）材料は、ペプチド及び／又は抗体を保持するように合成され官能基化される。ペプチドは、核局在化配列（ＮＬＳ）−ペプチド、癌ターゲッティングペプチド、及びリソソームターゲッティングペプチドを含む、システインタグ又はポリヒスチジンタグを含む任意のペプチドであってもよい。抗体は、シグナル伝達抗体及び癌ターゲッティング抗体を含む、システインタグ又はポリヒスチジンタグを含む任意の抗体であってもよい。
【００４０】
本発明は、ＮＦ−κＢ（核因子−カッパＢ）ｐ６５抗体の表面官能基化を伴うメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）及びＴＡＴ形質導入ペプチド（すなわち、転写（ＴＡＴ）タンパク質形質導入ドメインのＨＩＶトランス−活性化因子）からなるナノ粒子を提供する。ＴＡＴ形質導入ペプチドの配列は、ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲである。これらのナノ粒子は、核膜の近くで移動することができ、また、活性化されたｐ６５の核移行を阻止し得る。
【００４１】
図１は、表面が官能基化されたＭＳＮへのＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体及びＣｙｓ−ＴＡＴペプチドの複合化に関する反応スキームを説明する。官能基化されたＭＳＮを合成するため、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）と反応させることによってＭＳＮの表面にアミン基を形成し、元素分析により２．６重量％のＡＰＴＭＳの窒素含有量の平均負荷（average loading）を有するＭＳＮ−ＡＰＴＭＳを形成した。ＭＳＮ上にｐ６５抗体を固定化するため、異なる長さの２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーＭＡＬ−ＰＥＧ２ｋ−ＳＣＭ及びＭＡＬ−ＰＥＧ３．４ｋ−ＳＣＭを選択し、ＭＳＮ−ＡＰＴＭＳと反応させた。ここに略語を説明する。ＭＡＬ：マレイミド、ＰＥＧ２ｋ又はＰＥＧ３．４ｋ：２０００又は３４００の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＳＣＭ：スクシンイミジルカルボキシメチル。ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＳＣＭリンカーは、ＭＳＮ−ＰＥＧ（ＭＳＮ−ＰＥＧ：ＭＳＮ−ＰＥＧ２ｋ、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ）を得るため、活性なスクシンイミジル結合によってＭＳＮ−ＡＰＴＭＳのアミン基と反応性のスクシンイミジル部分を含む。ＭＳＮ−ＰＥＧのＭＡＬ端部は、抗体及びＣｙｓ−ＴＡＴペプチドのチオール基と反応した。
【００４２】
緑色蛍光メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）の合成
Ｃ１６ＴＡＢｒ（０．５８ｇ、１．６４×１０−３モル）とテトラエトキシシランの０．２２６Ｍエタノール溶液（ＴＥＯＳ、２０ｍＬの９９．５％エタノール中１ｍＬのＴＥＯＳ）５ｍＬを、３００ｇの０．１７Ｍアンモニア水溶液に溶解した。ストック溶液を４０℃で５時間撹拌した。ＴＥＯＳの１．１３Ｍエタノール溶液（２０ｍＬの９９．５％エタノール中、５ｍＬのＴＥＯＳ）５ｍＬ及びＦＩＴＣ−ＡＰＴＭＳを１時間に亘って勢いよく撹拌しながら添加した後、４０℃で２４時間に亘り静的にエイジングさせた。室温で２４時間に亘って５ｍＬエタノール（９９％）中、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、１ｍｇ）及び３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ、１００μＬ）を撹拌することによってＦＩＴＣ−ＡＰＴＭＳ、Ｎ−１−（３−トリメトキシシリルプロピル）−Ｎ’−フルオレシルチオウレア（fluoreceylthiourea）を予め用意した。その後、合成されたままの試料を１２０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離によって収集し、９９％エタノールで５回洗浄した。２００ｍｇの合成されたままの試料を３７重量％のＨＣｌ  ０．５ｇを含む２５ｍＬの９５％エタノールに再度分散した。６０℃で２４時間に亘ってエタノール懸濁液を加熱することにより界面活性剤を抽出した。ＦＩＴＣ−ＭＳＮと呼ばれる生成物を遠心分離によって収集し、エタノールで数回洗浄してエタノール中に保存した。
【００４３】
アミン官能基化ＭＳＮ（ＭＳＮ−ＡＰＴＭＳ）の作製
ＡＰＴＭＳによる処理でアミン基によってＭＳＮの表面を官能基化した。ＭＳＮ（２００ｍｇ）を最初に５０ｍＬのエタノールに分散し、その後、５００μＬのＡＰＴＭＳを添加した後、該溶液を１８時間還流した。遠心分離及びエタノールによる洗浄の後、アミン官能基化ＭＳＮをエタノールに再度分散させた。界面活性剤を除去するため、アミン官能基化ＭＳＮを酸性エタノール（５０ｍＬのＥｔＯＨ中の１ｇのＨＣｌ）に懸濁し、２４時間還流した。遠心分離及びエタノールによる洗浄の後、アミン官能基化ＭＳＮ（ＭＳＮ−ＡＰＴＭＳ）をエタノールに再度分散させた。
【００４４】
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）
７５ｋＶの動作電圧でＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７１００測定器を使用してＴＥＭ画像を得た。試料を超音波処理してエタノール中に分散し、１０μＬの懸濁液を滴下してマイクログリッド上に固定した。
【００４５】
免疫学的効率の評価のため、ｐ６５抗体を、Ｃ−Ｓ結合を介して種々の比率（１：６、１：１２、１：２４）でＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋのＭＡＬ末端と共有結合的に固定化した。ｐ６５抗体複合化の後、Ｃｙｓ−ＴＡＴペプチドを複合化してＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋのＭＡＬ自由端（free MAL-end）を埋めた。また、抗体カップリングのないＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋを、対照としてＣｙｓ−ＴＡＴと直接複合化した。ナノ粒子の物理学的特性を、窒素吸脱着等温線、粉体Ｘ線回折（ＸＲＤ）、ＦＴ−ＩＲ、ＴＥＭ、動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位によって特性評価した。図２Ａ〜図２Ｄは、様々な官能基化ＭＳＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。ＴＥＭ画像により、ＭＳＮ粒子が良く整ったメソポーラス構造を持ち、ＴＥＭ画像から得られた平均粒径は約４０ｎｍであることを観察することができる。
【００４６】
細胞の生存率及び増殖阻害アッセイ
ＷＳＴ−１アッセイを適用して、細胞の生存率及び増殖阻害アッセイを測定した：ＨｅＬａ細胞生存率アッセイのため、１ウェル当たり２×１０４個のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに１６時間に亘って蒔いた。ＨｅＬａ細胞を種々の量のＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴ（１００μｇ／ｍＬ）を含む血清不含培地中で４時間インキュベートした。頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）増殖阻害アッセイのため、ＨＮＳＣＣ細胞を４×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに１６時間に亘って蒔き、２００μｇ／ｍＬのＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ（１：２４）−ＴＡＴ、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−ＴＡＴ又は抗ＴＮＦ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に血清不含培地中で４時間インキュベートした。培養培地で培地交換をした後、ＨＮＳＣＣ細胞を更に７２時間インキュベートした。ＷＳＴ−１アッセイのため、ＨｅＬａ細胞又はＨＮＳＣＣ細胞をＷＳＴ−１（Clontech）を含む培養培地中、３７℃で４時間生育させた。生きている細胞によって生成される暗赤色のホルマザン色素は生きている細胞数に比例し、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad、モデル６８０）を使用して測定した。
【００４７】
ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴの細胞生存率をＷＳＴ−１アッセイの使用により調査したところ、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴは顕著な細胞毒性を示さない。
【００４８】
ウェスタンブロッティング分析
細胞溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した後、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに電気泳動的に転写させ、ブロッキングバッファー［１×Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５重量／容積％の脱脂粉乳］中、室温で１時間ブロッキングした。メンブレンを、Cayman（米国ミズーリ州アナーバーのCayman）製のＣＯＸ−２と共に、一次抗体：Santa Cruz Biotechnology（カリフォルニア州サンタクルーズ）製のＮＦ−κＢ  ｐ６５、ＴＮＦ−α、ラミンＢ、及びＧＡＰＤＨと４℃で一晩インキュベートした。全ての一次抗体をブロッキングバッファーに希釈した（ＮＦ−κＢ  ｐ６５：１：５００、ＴＮＦ−α：１：５００、ラミンＢ：１：３５００、ＧＡＰＤＨ：１：５０００、及びＣＯＸ−２：１：５００の希釈）。ＰＶＤＦメンブレンを広範囲に洗浄し、室温で１時間に亘ってホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化二次免疫グロブリンＧ抗体（１：２０００希釈、Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートした。製造業者のプロトコルに従って、増強化学発光基質キット（英国バッキンガムシャーのGE Healthcare UK LtdのAmersham Pharmacia Biotech）により免疫反応性のバンドを可視化した。
【００４９】
ＭＳＮ−ＰＥＧに対するＮＦ−κＢの細胞応答及びＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイ
１００μｇ／ｍＬのＭＳＮ−ＡＰＴＭＳ、ＭＳＮ−ＰＥＧ２ｋ及びＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋを４時間に亘ってＨｅＬａ細胞において処理した後、ＮＦ−κＢ活性化因子であるＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）を含まずに、又はそれらと共に更に０．５時間インキュベートした。細胞を採取した後、細胞質タンパク質及び核タンパク質を単離し、細胞質ゾル又は核のいずれかのｐ６５発現レベルをウエスタンブロット実験によって特定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイのため、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴ（１００μｇ／ｍＬ）をＨｅＬａ細胞の全溶解物と混合し、４℃で１８時間に亘ってｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。その後、該混合物を２０分間に亘って１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ウェスタンブロッティングにより遊離ｐ６５発現レベルについて上清（１０μＬ）をアッセイした。
【００５０】
図３Ａ〜図３Ｃは、様々な官能基化ＭＳＮナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイの結果を示す。ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴは、ＮＦ−κＢ  ｐ６５の核移行を阻止して、ＮＦ−κＢ  ｐ６５の下流のタンパク質発現を阻害する。ＨｅＬａ細胞を、種々の用量（図３Ｂについては１００μｇ／ｍＬ、図３Ｃについては５０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ）で４時間に亘ってＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−ＴＡＴ又はＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴで処理した。送達の後、更に０．５時間に亘って５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで細胞を刺激した、又は刺激しなかった。図３Ｃに示される遮断に関する用量依存性の研究は、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ（１：２４）−ＴＡＴの濃度が増加するにつれて核ｐ６５レベルが減少することを示す。
【００５１】
図３Ｂに示されるように、ウエスタンブロットを行ってＨｅＬａ細胞のｐ６５のレベルを定量した。処理の後、核及び細胞質中のｐ６５のレベルに関し、細胞溶解物を採取した。ウェスタンブロッティングの結果は、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴがＴＮＦ−αなしでｐ６５の核移動を全く誘導しなかったことを示した。しかしながら、ＴＮＦ−α処理のもと、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴが存在しない核においてｐ６５レベルの著しい増加が現れた。一旦異なる量の複合抗体と共にＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴが添加されると、抗体量の増加に伴って核ｐ６５のレベルが徐々に減少した。ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ（１：１２）−ＴＡＴ及びＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ（１：２４）−ＴＡＴはいずれもｐ６５の核移行の明らかな抑制を示すのに対し、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−ＴＡＴはＴＮＦ−α誘導性のｐ６５の核移行を妨げなかった。したがって、ＭＳＮ−ＰＥＧ３．４ｋ−Ａｂ−ＴＡＴは、免疫学的結合によるＮＦ−κＢ  ｐ６５核移行を阻止する特異性及び有効性を示す。
【００５２】
本明細書では、ＮＦ−κＢを標的とするナノ粒子／抗体複合体を採用し、核周囲領域でＲｅｌタンパク質ｐ６５を捕捉することにより、核膜孔ゲート近くで移行を阻止する。メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）上に複合化されたＴＡＴペプチドは、エンドサイトーシスによらない細胞膜導入を支援し、核周囲領域へと集まることで、ｐ６５特異抗体により、活性ＮＦ−κＢ  ｐ６５に対するターゲッティング及び捕捉が効果的に行われた。
【００５３】
別の実施形態では、ＭＳＮナノ粒子担体と１以上の変性融合タンパク質とを組み合わせるタンパク質送達システムが開発されている。ナノ材料と１以上の融合タンパク質とのかかる組み合わせは、化学溶媒、安定性、及び透過性を含むタンパク質送達の問題を解決するのみならず、タンパク質療法に対する新たなアプローチを提供する。
【００５４】
本明細書では、フリーラジカルスカベンジング、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）に対して同様の機能を有する２つの抗酸化酵素タンパク質が、ナノ粒子によって保持される同時送達された酵素として実証される。
【００５５】
ＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘのタンパク質の複合化のため、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）導入ドメイン（ＴＡＴ、４９残基〜５７残基）を含むＨｉｓ−タグヒトＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）を構築し過剰発現させた。ＴＡＴ導入ペプチドの配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲである。ＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘの遺伝子をクローニングし、ｐＱＥ−３０の原核生物タンパク質発現ベクターに挿入してｐＱＥ−ＴＡＴ−ＳＯＤ及びｐＱＥ−ＴＡＴ−ＧＰｘを形成した。ベクターをＪＭ１０９  Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換し、１時間及び３時間に亘ってＩＰＴＧタンパク質誘導によりＬＢブロス中で培養した。高タンパク質過剰発現を伴うＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において、誘導時間を増加させることにより表示した。最後に、Ｅ．コリの粗溶解物ペレットの上清はＴＡＴ−ＳＯＤを発現し、又はＴＡＴ−ＧＰｘには８Ｍ尿素において更なる直接複合化を試みた。
【００５６】
蛍光メソポーラスシリカナノ粒子（ＦＭＳＮ）の合成
色素−官能基化ＭＳＮを同時縮合プロセスによって合成した。５ｍｌの無水エタノール中に１ｍｇのＦＩＴＣを溶解することによってＦＩＴＣ溶液を用意した。室温で暗闇の中２４時間に亘って急速撹拌しながら１００μＬのＡＰＴＭＳを添加した。０．５８ｇのＣ１６ＴＡＢを０．１７ＭのＮＨ３溶液３００ｇに溶解し、５ｍＬの希釈ＴＥＯＳ溶液（５容積／容積％  ＴＥＯＳ／エタノール）を５時間に亘って撹拌しながら添加した。ＦＩＴＣ−ＡＰＴＭＳ溶液を添加した後、５ｍｌの濃縮ＴＥＯＳ溶液（２５容積／容積％  ＴＥＯＳ／エタノール）を１時間に亘って勢いよく撹拌しながら滴加した。その後、該溶液を４０℃で２４時間に亘ってエイジングし、シリカ縮合を完了した。合成されたままの生成物を遠心分離によって収集し、９５％エタノールで３回洗浄した。ＦＩＴＣ−ＭＳＮ（ＦＭＳＮ）と呼ばれる生成物を無水エタノール中に保存した。
【００５７】
ＮＴＡ−シラン及びＮｉ（ＩＩ）のＦＭＳＮとの複合化
１００ｍｇのＦＭＳＮを５０ｍｇのＮＴＡ−シランを含有する５０ｍＬのトルエン中に懸濁し、１８時間還流した。生成物をエタノールによって浄化して、過剰なシランを排除した。Ｃ１６ＴＡＢｒテンプレートを除去するため、粒子を酸性溶液（５０ｍＬのエタノール中１ｇのＨＣｌ）に分散して、６０℃で２４時間撹拌した。その後、６５℃で６時間に亘って撹拌しながら、水性ρ−ＴｓＯＨ（０．２６６ｇ、ｐＨ＝２．０）の存在下でＮＴＡリンカー上のメトキシカルボニルの加水分解を達成した。エタノールによって浄化した後、粒子を５０ｍＭのＮｉＣｌ２水溶液と室温で６時間反応させた。上に記載されるものと同じ浄化手順に従って、ＦＭＳＮ−ＮＴＡ−Ｎｉを得て、無水エタノール中に保存した。Ｎｉ含有量の平均負荷を伴うＦＭＳＮ−ＮＴＡ−Ｎｉは、ＩＣＰ−ＭＳ分析により０．６重量％であった。
【００５８】
ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子の合成
色素−官能基化ＭＳＮを同時縮合プロセスによって合成した。５ｍＬの無水エタノール中に１ｍｇのＦＩＴＣを溶解することによってＦＩＴＣ溶液を用意した。室温で暗闇の中２４時間に亘って急速撹拌しながら１００μＬのＡＰＴＭＳを添加した。０．５８ｇのＣ１６ＴＡＢを０．１７ＭのＮＨ３溶液３００ｇに溶解し、５ｍＬの希釈ＴＥＯＳ溶液（５容積／容積％  ＴＥＯＳ／エタノール）を５時間に亘って撹拌しながら添加した。ＦＩＴＣ−ＡＰＴＭＳ溶液を添加した後、５ｍＬの濃縮ＴＥＯＳ溶液（２５容積／容積％  ＴＥＯＳ／エタノール）を１時間に亘って勢いよく撹拌しながら滴加した。９００μＬのＰＥＧ−シラン及び４０μＬのＰＥＩ−シランを添加し、３０分間撹拌した。その後、該溶液を４０℃で２４時間エイジングしてシリカ縮合を完了した。該溶液を９０℃で２４時間及び７０℃で２４時間に亘って熱水条件下でエイジングした。合成されたままの生成物を遠心分離によって収集し、９５％エタノールで洗浄した。粒子を１ｇの３７重量％ＨＣｌを含む９５％エタノール５０ｍＬ中に１時間に亘って再度分散させた後、酸性溶液を５０μＬの３７重量％ＨＣｌを含む９５％エタノール５０ｍＬに変更してＣＴＡＢを除去した。ＦＩＴＣ複合化ＭＳＮ（ＦＭＳＮ）−ＰＥＧ／ＰＥＩ粒子を遠心分離によって収集し、９５％エタノールで３回洗浄した。
【００５９】
特性評価
１２０ｋＶで作動するＪＥＯＬ  ＪＳＭ−１２００  ＥＸ  ＩＩ上で透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を得た。試料のニッケル量を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ７７００ｅ測定器を使用して誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって特定した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（英国、Malvern）上で動的光散乱（ＤＬＳ）を使用してサイズ測定を行った。電気泳動度の後、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（英国、Malvern）に対してヘンリーの式（Henry equation）を適用することにより、ゼータ電位を特定した。表１は、種々の溶液中のＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子の平均粒径に対する動的光散乱（ＤＬＳ）データを示す。
【００６０】
【表１】
2018533543.tif 000003
【００６１】
図４ＡはＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子の複合化を示し、図４Ｂは、ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩナノ粒子のＴＥＭ画像を示している。ＴＥＭ画像は、これらのＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩ粒子が約６０ｎｍ〜７０ｎｍの平均粒径で良く整頓されたメソポーラス構造を持つことを示す。ＤＬＳで特定された粒径は、生体溶液中で凝集をほとんど示さない（表１）。
【００６２】
ＮＴＡ及びＮｉ（ＩＩ）のＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩとの複合化
２０ｍｇのＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩを２．５ｍＬのＰＢＳバッファーに分散した後、６．８ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（３．４ｋ）を２．５ｍＬのＰＢＳに溶解し、その後、ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩ溶液に添加した。該溶液を室温で２時間撹拌した。５ｍＬのＰＢＳバッファーに４００μＬのトラウト試薬（Traut's reagent）（１００μＭ）及び５．２４ｍｇのＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン水和物を添加し、３０分間撹拌することにより、チオール化Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン水和物（ＢＣＬＨ）溶液を用意した。チオール化ＢＣＬＨ溶液をＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩ溶液に添加し、４℃で一晩撹拌した。その後、６５℃で６時間に亘って撹拌しながら、水性ρ−ＴｓＯＨ（０．１３３ｇ、ｐＨ＝２）の存在下でＮＴＡリンカー上のメトキシカルボニルの加水分解を達成した。エタノールによって洗浄した後、粒子を５０ｍＭのＮｉＣｌ２水溶液と室温で６時間反応させた。上に記載されるものと同じ洗浄手順に従って、ＦＭＳＮ−ＰＥＧ／ＰＥＩ−ＮＴＡ−Ｎｉを得て、無水エタノール中に保存した。
【００６３】
ＦＭＳＮ−ＮＴＡ−ＮｉによるＨｉｓ−ＴＡＴ−タンパク質の固定化
Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＳＯＤ又はＨｉｓ−ＴＡＴ−ＧＰｘを含むＥ．コリ溶解物を４℃で一晩、ＦＭＳＮ−ＮＴＡ−Ｎｉと混合した。Ｎｉ（ＩＩ）と非常に低い解離定数を有する緊密な結合を提供するＨｉｓ−タグタンパク質との間の金属親和性に基づき、精製せずに８Ｍ尿素の下、Ｅ．コリの粗溶解物のペレット上清に由来するＴＡＴ−ＳＯＤ又はＴＡＴ−ＧＰｘタンパク質とＦＭＳＮ−ＮＴＡ−Ｎｉを直接混合した。タンパク質複合化粒子を遠心分離によって単離し、エタノールで洗浄した。タンパク質−官能化粒子をＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＳＯＤ又はＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＧＰｘとして表示する。
【００６４】
ＳＯＤ及びＧＰｘ活性の判定
ＳＯＤの場合、試料を３００μＬで用意し、マイクロプレートリーダー（Bio Tek、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１）を使用してモニターした。最初に、１ｍＬの５０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４にＥＤＴＡ（１０−４Ｍ）、シトクロムｃ（１０−５Ｍ）及びキサンチン（５×１０−５Ｍ）を含むカクテル試薬のストックを用意した。その後、２８０μＬのカクテル試薬に様々な試料、キサンチンオキシダーゼ（５８ｍＵ／ｍＬを１０μＬ）を添加し、最大３００μＬの全容積の脱イオン水で完了した。最後に、２００μＬの各試料をマイクロプレートリーダーに移し、５５０ｎｍでの吸光度を検出した。ＳＯＤ活性を測定するため、天然のＳＯＤとＳＯＤ試料との間のシトクロムｃ還元の阻害率をｔ＝０秒とｔ＝１８０秒との間の吸光度の勾配を使用して比較した。ＳＯＤ比活性は、全溶解物タンパク質１ミリグラム当たりの単位（Ｕ／ｍｇ）として表される（The Journal of Biological Chemistry, 1969, 244, 6049-6055.）。
【００６５】
ＨｅＬａ細胞中のＧＰｘ活性を、基質として過酸化水素を用い、Paglia及びValentineの方法に基づくグルタチオンペルオキシダーゼアッセイキット（Cayman Chemical）を使用して測定した。上記方法は、ＧＰｘが過酸化水素を還元しながら、ＧＳＨをＧＳＳＧへと酸化する、ＮＡＤＰＨ−カップリング反応に基づいた。生成されたＧＳＳＧをＧＲによるＮＡＤＰＨの消費によってＧＳＨへと還元した。酵素活性を３４０ｎｍで測定し、試料１ｍＬ当たり１分間当たりの１μモルのＮＡＤＰＨの酸化を示す単位で表した。ＧＰｘ比活性を、タンパク質の１ミリグラム当たりの単位（Ｕ／ｍｇ）として表した。
【００６６】
細胞生存率アッセイ：
増殖アッセイのため、１ウェル当たり３×１０４細胞を２４ウェルプレートに蒔いた。血清不含培地に懸濁された種々の量のナノ粒子と共にそれぞれ４時間インキュベートした後、その後、５００μＭのＮ，Ｎ’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウムジクロリド（パラコート）を２４時間に亘って培養培地に添加した。その後、粒子処理細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ中のＷＳＴ−１（１０％）２００μＬと共にインキュベートした。生きている細胞によって生成されるホルマザン色素によって細胞生存率を推定し、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad、モデル６８０）を使用して測定した。
【００６７】
図５Ａ〜図５Ｃは、Ｈｅｌａ細胞へのＴＡＴ−ＳＯＤ及びＴＡＴ−ＧＰｘの同時送達の保護効果を示す。図５Ａは、ＷＳＴ−１アッセイを使用することによる様々なナノ粒子に対する増強された細胞生存率の結果を示す。図５Ｂは、様々なナノ粒子に対するＲＯＳ検出の結果を示す。ＲＯＳのレベルをＤＨＥアッセイによって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。図５Ｃは、ウェスタンブロッティングアッセイの結果がＣＯＸ  ＩＩ及びｐ−ｐ３８のレベルを示すことを示す。ＰＱ、及びＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＳＯＤとＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＧＰｘとの同時送達（１：１の比率）の濃度は、それぞれ５００μＭ及び２５μｇ／ｍＬである。
【００６８】
本明細書では、変性されたＴＡＴ−ＳＯＤ又はＴＡＴ−ＧＰｘ融合タンパク質をＨｅｌａ細胞中に同時送達可能であること、また変性された融合タンパク質をリフォールディングし、細胞に送達された後に特異的な酵素活性を示すことができることを示す。本明細書に示される結果に基づけば、ＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＳＯＤ又はＦＭＳＮ−ＴＡＴ−ＧＰｘと命名されたＴＡＴ−ＳＯＤ又はＴＡＴ−ＧＰｘ融合タンパク質で官能基化されたＦＭＳＮは、細胞のリフォールディング機構によってなおも酵素活性を有する。
【００６９】
結論として、ＭＳＮの使用より、いくつかの実施形態のシリカ系生体分子担体は、求められる細胞の中にペプチド、タンパク質、酵素又は酵素模倣物を送達することができ、細胞の中に送達されるペプチド、タンパク質、酵素又は酵素模倣物の本来の活性が維持される。シリカ系生体分子担体は細胞内に位置するナノリアクターとして機能することができ、また、送達されたペプチド、タンパク質、酵素又は酵素模倣物は協働して複数の機能を提供する。
【００７０】
本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、本発明の構造にさまざまな変更及び変形を行うことができることは、当業者には明らかであろう。上記に鑑みて、本発明が、本発明の変更形態及び変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内に入ることを条件として、包含することが意図される。
【図１】
2018533543.tif 000004
【図２Ａ】
2018533543.tif 000005
【図２Ｂ】
2018533543.tif 000006
【図２Ｃ】
2018533543.tif 000007
【図２Ｄ】
2018533543.tif 000008
【図３Ａ】
2018533543.tif 000009
【図３Ｂ】
2018533543.tif 000010
【図３Ｃ】
2018533543.tif 000011
【図４Ａ】
2018533543.tif 000012
【図４Ｂ】
2018533543.tif 000013
【図５Ａ】
2018533543.tif 000014
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2018533543.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月5日(2016.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ系生体分子担体であって、
多孔質コアと、
第１の生理活性部分と、
前記第１の生理活性部分と機能的に関連する第２の生理活性部分と、
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分を、前記多孔質コアにそれぞれ複合化させるためのリンカーと、
を含み、
前記第１の生理活性部分及び第２の生理活性部分の１以上が変性形態若しくは部分的に活性形態である、又は、
前記シリカ系生体分子担体がオルガネラ転位を阻害するように、前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分の一方がオルガネラターゲッティング生体分子である、
シリカ系生体分子担体。
【請求項２】
前記第１の生理活性部分が、酵素、抗体、触媒模倣物、リガンド、ホルモン、生体分子結合タンパク質、及びそれらの機能性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項３】
前記第１の生理活性部分が転写因子抗体であり、前記第２の生理活性部分がオルガネラターゲッティング生体分子である、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項４】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が、カスケード反応に関与する異なる酵素又は酵素フラグメントである、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項５】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が、活性酸素種代謝に関与する異なる酵素又は酵素フラグメントである、請求項４に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項６】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分が変性形態である、又は部分的に活性形態である、請求項４に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項７】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分の少なくとも一方が細胞透過性ドメインを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項８】
前記第１の生理活性部分及び前記第２の生理活性部分の少なくとも一方がポリヒスチジンタグを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項９】
前記リンカーの少なくとも１つがポリエチレングリコールセグメントを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１０】
前記リンカーの少なくとも１つが二価のニッケルイオン又はコバルトイオンを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１１】
前記リンカーの少なくとも１つが、共有結合を介して、前記第１の生理活性部分、前記第２の生理活性部分、又はそれらの両方に結合される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１２】
前記リンカーの少なくとも１つが、前記多孔質コアに連結した第１の末端と、前記第１又は第２の生理活性部分に連結した第２の末端と、細胞取込みを促進するための前記第１の末端と前記第２の末端との間の機能的セグメントとを含む、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１３】
前記多孔質コアが、ポリエチレンイミン、アミノ基、ニトリロ三酢酸、ポリエチレングリコール、蛍光タグ、又はそれらの組み合わせによって官能基化される、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１４】
前記多孔質コアが２ｎｍ〜５０ｎｍの平均孔径を有する、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１５】
前記多孔質コアが３００ｎｍ未満の粒径を有する、請求項１に記載のシリカ系生体分子担体。
【請求項１６】
生物学的媒質中に分散された、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシリカ系生体分子担体を複数含む医薬組成物。
【請求項１７】
組成物を作製する方法であって、
多孔質コアを有するシリカ系担体を準備することと、
前記多孔質コア上にリンカーを形成することと、
前記リンカーの少なくとも一部を介して第１の生体分子を前記多孔質コアに複合化させることと、
前記リンカーの少なくとも一部を介して前記第１の生体分子と機能的に関連する第２の生体分子を前記多孔質コアに複合化させることと、
を含み、
前記第１の生体分子及び前記第２の生体分子の１以上が変性形態若しくは部分的に活性形態である、又は、
前記シリカ系担体がオルガネラ転位を阻害するように、前記第１の生体分子及び前記第２の生体分子の一方がオルガネラターゲッティング生体分子である、
方法。
【請求項１８】
細胞障害に関連する疾患又は状態の治療に対する医薬の製造において、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシリカ系生体分子担体を含む組成物を使用する方法。
【請求項１９】
前記疾患又は状態が、酵素欠損症、酵素欠乏、癌、及び代謝障害からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
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