(57)【要約】  本発明は新規PEGx-GCSFコンジュゲートに関し、ここでxはGCSFあたりのPEG量であって4〜8である。本発明は個々のPEGx-GCSFコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団にも関し、ここで[x] は集団のGCSFあたりの平均PEG量であって4以上である。本発明の組成物は、有害副作用の可能性を回避または減少させながら、予測外の治療的効力を有する。
2018519359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
xが4〜8の整数である、PEGx-GCSF。
【請求項２】
xが5である、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項３】
xが6である、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項４】
xが7である、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項５】
PEGが、GCSF由来のアミンを介してGCSFに結合している、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項６】
非加水分解性の連結部を含む、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項７】
前記非加水分解性の連結部はウレタン連結部である、請求項6に記載のPEGx-GCSF。
【請求項８】
GCSFは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、ならびにそれらの機能的な誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項９】
前記アミノ酸配列は、配列番号1、配列番号1の機能的誘導体、または配列番号1のホモログであり、前記GCSFは、第17位のリジン残基、第35位のリジン残基、第41位のリジン残基、第44位のヒスチジン残基、第53位のヒスチジン残基、第80位のヒスチジン残基、第157位のヒスチジン残基、および第171位のヒスチジン残基を有する、請求項8に記載のPEGx-GCSF。
【請求項１０】
各PEGが、N末端、第17位のリジン残基、第35位のリジン残基、第41位のリジン残基、第44位のヒスチジン残基、第53位のヒスチジン残基、第80位のヒスチジン残基、第157位のヒスチジン残基、および第171位のヒスチジン残基からなる群から選択される位置においてGCSFに結合している、請求項9に記載のPEGx-GCSF。
【請求項１１】
前記PEGは、約3〜約15 kDaの平均分子量を有する、請求項1に記載のPEGx-GCSF。
【請求項１２】
前記PEGは、約5〜約6 kDaの平均分子量を有する、請求項11に記載のPEGx-GCSF。
【請求項１３】
[x]がxの平均値であり、[x]は約4以上である、PEGx-GCSFの集団を含むPEG[x]-GCSF。
【請求項１４】
[x]は約4〜約8である、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項１５】
[x] は約4〜約6である、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項１６】
[x] は約5〜約6である、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項１７】
xが1〜3であるPEGx-GCSF を10%未満含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項１８】
xが4であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項１９】
xが5であるPEGx-GCSFを少なくとも約30%含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２０】
xが6であるPEGx-GCSFを少なくとも約10%含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２１】
xが7であるPEGx-GCSFを15%未満含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２２】
xが6〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２３】
xが5〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約35%含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２４】
GCSFに由来するアミンを介してPEGがGCSFに結合している、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２５】
前記PEGx-GCSFは非加水分解性の連結部を含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２６】
前記非加水分解性の連結部はウレタン連結部である、請求項25に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２７】
GCSFは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、ならびにそれらの機能的な誘導体およびホモログからなる群から選択される配列を有するアミノ酸である、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２８】
前記アミノ酸配列は、配列番号1、配列番号1の機能的誘導体、または配列番号1のホモログであり、前記GCSFは、第17位のリジン残基、第35位のリジン残基、第41位のリジン残基、第44位のヒスチジン残基、第53位のヒスチジン残基、第80位のヒスチジン残基、第157位のヒスチジン残基、および第171位のヒスチジン残基を有する、請求項27に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項２９】
各PEGが、N末端、第17位のリジン残基、第35位のリジン残基、第41位のリジン残基、第44位のヒスチジン残基、第53位のヒスチジン残基、第80位のヒスチジン残基、第157位のヒスチジン残基、および第171位のヒスチジン残基からなる群から選択される位置においてGCSFに結合している、請求項28に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３０】
前記PEGは、約3〜約15 kDaの平均分子量を有する、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３１】
前記PEGは、約5〜約6 kDaの平均分子量を有する、請求項30に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３２】
前記集団は、
約0%〜約5%の、xが3であるPEGx-GCSF；
約22%〜約32%の、xが4であるPEGx-GCSF；
約38%〜約42%の、xが5であるPEGx-GCSF；
約18%〜約28%の、xが6であるPEGx-GCSF；および
約0%〜約9%の、xが7であるPEGx-GCSF
を含む、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３３】
前記PEGがウレタン連結部を介して前記GCSFに結合しており、前記PEGは約3〜約15 kDaの平均分子量を有する、請求項13に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３４】
前記PEGは約5〜約6 kDaの平均分子量を有する、請求項33に記載のPEG[x]-GCSF。
【請求項３５】
請求項13に記載のPEG[x]-GCSFの薬学的活性量とタンパク質非含有担体とを含む医薬製剤。
【請求項３６】
必要とする患者において白血球細胞数を増加させる方法であって、前記患者に、請求項35に記載の医薬製剤の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記患者は、好中球減少症の危険にあるか、または好中球減少症に罹患している、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記患者は、前記患者の白血球細胞数を減少させる薬剤で処置されたか、または処置されている、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者は、内因性GCSFレベルが低下している、請求項36に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者は、放射線治療を受けている、請求項36に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者は、癌の治療を受けている、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌は、骨髄癌である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者は、重症慢性好中球減少症または重症先天性好中球減少症または重症複合好中球減少症に罹患している、請求項37に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者は、自家幹細胞移植に先立って処置される、請求項36に記載の方法。
【請求項４５】
必要とする患者において重症敗血症または敗血症性ショックを治療する方法であって、前記患者に、請求項35に記載の医薬製剤の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
請求項1に記載のPEGx-GCSFを調製するための方法であって、
(a)約5.0 mg/mlの濃度を有するGCSF溶液を得る工程と；
(b)前記GCSF溶液をPEGと組み合わせる工程であって、PEGは前記GCSFのモル量の約65〜約75倍であるモル量において存在する工程と；
(c)前記GCSFとPEGとが反応してPEGx-GCSFを産生するために十分な時間を経過させる工程と；
(d)残余PEGと反応するために十分な量のヒドロキシルアミンを添加する工程と；
(e)未反応PEG、N-ヒドロキシスクシンイミド、およびヒドロキシルアミンからPEG[x]-GCSFを単離する工程と；
(f) PEGx-GCSFを単離する工程と
を含む、方法。
【請求項４７】
約5.0 mg/mlの前記GCSF溶液は、GCSFの溶液を濃縮する工程により得られる、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離されたPEGx-GCSFを溶液中で約5.5〜6 mg/mlに濃縮する工程(g)をさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
前記濃縮する工程は膜透析濾過により達成される、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
前記濃縮する工程は膜透析濾過により達成される、請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
工程(a)から(e)までpHが約7.75に維持される、請求項46に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法全体を通して温度は室温に維持される、請求項46に記載の方法。
【請求項５３】
工程(b)および(c)は約1時間行われる、請求項46に記載の方法。
【請求項５４】
工程(d)は約2時間行われる、請求項46に記載の方法。
【請求項５５】
請求項13に記載のPEG[x]-GCSFを調製するための方法であって、
(a)約5.0 mg/mlの濃度を有するGCSF溶液を得る工程と；
(b)前記GCSF溶液をPEGと組み合わせる工程であって、PEGは前記GCSFのモル量の約65〜約75倍であるモル量において存在する工程と；
(c)前記GCSFとPEGとが反応してPEGx-GCSFを産生するために十分な時間を経過させる工程と；
(d)残余PEGと反応するために十分な量のヒドロキシルアミンを添加する工程と；
(e)未反応PEG、N-ヒドロキシスクシンイミド、およびヒドロキシルアミンからPEGx-GCSFを単離する工程と；
を含む、方法。
【請求項５６】
約5.0 mg/mlの前記GCSF溶液は、GCSFの溶液を濃縮する工程により得られる、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記単離されたPEGx-GCSFを溶液中で約5.5〜6 mg/mlに濃縮する工程(f)をさらに含む、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記濃縮する工程は膜透析濾過により達成される、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
前記濃縮する工程は膜透析濾過により達成される、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
工程(a)から(e)までpHが約7.75に維持される、請求項55に記載の方法。
【請求項６１】
前記方法全体を通して温度は室温に維持される、請求項55に記載の方法。
【請求項６２】
工程(b)および(c)は約1時間行われる、請求項55に記載の方法。
【請求項６３】
工程(d)は約2時間行われる、請求項55に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、2015年6月11日に出願された米国特許仮出願第62/174,373号、および2015年6月24日に出願された米国特許出願第62/184,042号に基づく優先権を主張し、これらの全内容はどちらも参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、有害副作用の可能性を回避または実質的に低減しながら予測外の治療効力を有する、新規PEG-GCSFコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、例えばポリエチレングリコール（「PEG」）のような、非抗原性の水溶性ポリマーが、治療的および診断的重要性を有するポリペプチドの共有結合修飾のために使用されている。PEGは、非毒性であり、非免疫原性であり、高度に水溶性であり、身体から容易に除去されるポリマーである。PEGは多くの応用を有し、食品、化粧品、飲料、および処方箋医薬品において一般的に使用されている。医薬グレードPEGは、アメリカ食品医薬品局によって米国における使用が認可されており、その高度な生体適合性のために、バイオ医薬品担体として広く使用されている。PEG化は、バイオ医薬品の機能を改変することなくそれらの特性を修正し、それによって治療効果を増強することができる。
【０００４】
好中球顆粒球は、哺乳類における白血球のうち最も豊富な種類であり、自然免疫系の重要な部分を構成する。それらの産生は、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）がCD34+骨髄前駆細胞の表面上に位置するその同系受容体に係合することを介して制御される。受容体係合は、受容体鎖のオリゴマー化、再編成、および、細胞内キナーゼにより媒介されるシグナル伝達をもたらし、分化と細胞分裂を促進する遺伝子発現パターンを引き起こし、それによって好中球数を増加させる。GCSF受容体シグナリングの重要性は、サイトカイン：受容体シグナリング経路における先天的遺伝子エラーを有する個体において例証される。全体として、シグナリングの限定は、好中球の適切なレベルを維持する能力の低下をもたらす。GCSF受容体を介したシグナリングは、好中球の産生および維持のために重要であり、GCSFシグナリングにおける先天的遺伝子エラーを有する個体は、好中球数が減少しているため、重篤かつ反復性の微生物感染を受けやすくなっている。
【０００５】
同様に、多くの癌療法は、その抗増殖活性のために、好中球レベルの強い抑制を示す。多くの種類の化学療法剤で起こり得る最も深刻な副作用の１つは、好中球レベル低下（neutropenia：好中球減少症）を含む白血球数低減である。好中球減少症は、患者を重篤な感染症の危険性に晒すことがあり、従って化学療法処置サイクルの休止を強要し得る。事実、低白血球数に関連する合併症は、化学療法の用量減少または遅延の最も一般的な原因である（Link, et al. (2001) Cancer 92:1354-1367；Lyman, et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21:4524-4531；およびLyman, et al. (2002) Am. J. Med. 112:406-411参照。これら各々の文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる。）。この用量依存的現象が、多くの腫瘍薬の治療的投与量を劇的に制限してきた。
【０００６】
臨床的使用のための組換えGCSF（フィルグラスチム）の開発は、重症慢性好中球減少症（SCN：severe chronic neutropenia）を持って生まれた人々、および強い抗好中球活性を伴う癌療法を受けている人々の両方において劇的な改善をもたらした。GCSFは腎臓系を通して容易に除去される小さなタンパク質である。マウス版のGCSFは1983年に外植組織から精製され、ヒトの等価物は、1985年に、思いがけず高濃度でGCSFを発現しながら培養物中で増殖していた癌細胞株から精製された（例えばWelte, et al. (1985) PNAS USA 82:1526-30参照。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。）。ヒトGCSFは約19kDの糖タンパク質であることが見出され、炭水化物成分に依存して変動する酸性を有していた。炭水化物成分は生物学的活性のためには必須ではないことが後に見出された。ヒト組換えGCSFのクローニングおよび特徴分析は1984年から1986年までの間に行われ、大腸菌（E. coli）細胞でそれを発現すること、そして最終的には、化学療法誘発性好中球減少症に罹患した患者においてその化合物を試験するヒト臨床治験へとつながった。1991年に、大腸菌中で製造された組換えヒトGCSFがこの使用についてアメリカ食品医薬品局により認可され（フィルグラスチムと名付けられ、商品名はニューポジェン（登録商標）とされた）、1993年には、関連するチャイニーズハムスター卵巣細胞発現形態が（レノグラスチムの名で）欧州で認可された。コアタンパク質は174アミノ酸を含むことが見出されたが、ただし複数のバリアントが存在することが知られている（例えばNgata, et al. (1986) Nature 319:415-18；Souza, et al. (1986) Science 232:61-5；米国特許第4,999,291号参照。これらの文献の各々は参照により本明細書に組み入れられる。）。
【０００７】
アムジェン社が所有し1985年8月23日出願の米国特許出願第07/768,959号に基づく優先権を主張する米国特許第4,810,643号、第4,999,291号、第5,582,823号、および第5,580,755号は、特定のヒト多能性GCSF分子およびその製造方法を提供しており、これらの文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。これらの分子が、認可されたニューポジェン製品の基となっている。これらの案件において分子のPEG化の可能性は論じられていない。
【０００８】
フィルグラスチムはインビボで容易に分解されるので、ニューポジェンは、癌治療により引き起こされた発熱性好中球減少症の発生中に毎日投与することが求められる。しかしながら、PEG化は、GCSFタンパク質の流体力学的半径（hydrodynamic radius）を増加させて、血清クリアランスを減少させインビボの薬剤半減期を助長させるための現実味を帯びたアプローチを提示する。アルデヒド活性化された20 kDaの直鎖状PEGによる、GCSFのN末端における部位特異的PEG化を用いて（PCT公報第WO 96/11953号ならびに米国特許第5,824,784号および第7,090,835号参照）、PEG-フィルグラスチムが開発され、2002年に商品名ニューラスタ（NEULASTA）（登録商標）の下でアメリカ食品医薬品局により認可された（ニューラスタ（登録商標）［包装内添付文書］。カリフォルニア州サウザンドオークス、アムジェン社、2010年2月改訂；ニューラスタ（登録商標）［包装内添付文書］。カリフォルニア州サウザンドオークス、アムジェン社、2016年4月改訂v1。どちらの改訂版も参照により本明細書に組み入れられる。）。PEG部分がタンパク質のアミノ末端に共有結合されたこのモノPEG化型のGCSFは、GCSFタンパク質の分子量を増加させて、腎クリアランスを大いに低減させる。アミノ末端におけるPEG基の位置は、GCSFタンパク質−GCSF受容体相互作用を特に分断さるものではない。なぜならば、受容体との相互作用に関わる結合領域のタンパク質残基は、アミノ末端20 kDa PEGが直接的にPEG化したり立体障害となったりしていないからである。
【０００９】
安定化されたGCSF分子を提供するためのいくつかの代替的戦略も提案されてきた。PEGをシステイン残基に連結することは、標的指向化においていくらかの改善を提供した。チオール反応性PEG（PEG-マレイミドを含む）が、GCSFのフリーなシステイン残基に連結された。Veronese, et al. (2007) Bioconjugate Chem. 18:1824-1830は、GCSFをCys18にてPEG化することを記述しており、これは凝集を増加させることが示されたが、ただしその凝集物は共有結合による凝集はしていなかった。同様に、Hao, et al. (2006) Biodrugs 20:357-363は、Cys18へのPEG-マレイミドのコンジュゲーションを記述しており、これは、分子の半減期を増加させることが示された。
【００１０】
部位特異的変異誘発は、部位特異的ポリマー取付けのためにポリペプチドを調製することのために使用されてきたさらなるアプローチである。例えば、米国特許第6,646,110号は、GCSF活性を示し、かつ、PEGまたはオリゴ糖部分のための取付け基を含むアミノ酸残基が挿入された、ポリペプチドコンジュゲートを記述している。これらはリジン、グルタミン酸、システイン、またはアスパラギン酸を含み得る。
【００１１】
WO 2011/041376は、本願の発明者の一人による、部位特異的PEG化のためのさらに別のアプローチを反映したものである。WO 2011/041376の内容はその全体が参照により組み入れられる。この初期の研究では、DMSO含有反応緩衝液中でメトキシ-PEGアセトアルデヒドをGCSFと反応させて、一群のモノPEG化GCSFコンジュゲートを生じさせたが、そのコンジュゲーションはN末端近くのリジン基におけるものであり、その組成物の少なくとも30%はN末端PEG化されていない。代替的な実施形態では、その組成物は、少なくとも80%のモノPEG化GCSFコンジュゲートを含んでおり、その組成物の少なくとも30%はN末端PEG化されていない。
【００１２】
部位特異的PEG化に代わるものとして、N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルを用いたランダムPEG化はアミド結合を介して安定なタンパク質-PEGコンジュゲートを形成する。これらのエステル試薬は、リジン残基およびN末端のアミノ基との反応について比較的に特異性を有するが、ヒスチジン、セリン、およびチロシン残基のような他のタンパク質求核剤とも少ない程度において反応する。温度、pH、PEG試薬量、および時間のような反応条件が産物の不均一性（すなわち、モノ-PEG化、ジ-PEG化、トリ-PEG化、およびより高度なPEG化のコンジュゲートが形成され得る）を規定する。タンパク質上の異なる求核性基との反応により、多PEG化コンジュゲート（さらにはモノ-PEG化コンジュゲートであっても）は、生物学的および生物医学的特性において実質的に異なり得る複数の位置異性体を生じる。高度なPEG化可変性、および再現性のある様式で製造する能力が、臨床薬開発におけるSC-PEGの使用を制限してきた。しかしながら、ある条件ではそのようなコンジュゲートが臨床的に有意義になり得ることを実証する例が存在する（例えばOncaspar、Adagen）。
【００１３】
アミン反応性PEGを利用して、リジン残基またはN末端アミノ酸上の曝露されたアミン基に取り付けることによりPEG-GCSFを形成しようとする過去の試みが報告されているが成功は限られていた。当該タンパク質は4つのリジン残基およびN末端アミノ酸を含んでおり、それらリジン残基は受容体結合領域に位置しているため、このようなアプローチはGCSFにとって最適ではないことが観察された。従ってアミン反応性PEG試薬によるGCSFの修飾は、取り付けられるPEG分子の数および大きさに依存して、タンパク質のインビトロでの生物学的活性を3〜50倍低下させる。例えば20 kDaのPEGのような大きなPEG（タンパク質の半減期を延長させるうえで最も有用なものである）でGCSFが修飾された場合には、インビトロ生物活性の損失が最も大きくなる。アミン-PEG化GCSFは不均一であり、少なくとも4つのアイソフォームおよび複数の分子量種の複雑な混合物として生じており、それらの全てが異なる特異的活性を有し得る。
【００１４】
このアプローチの具体的な例が、麒麟麦酒株式会社の医薬研究者のグループにより、1990年代初期の2つの学術雑誌論文に記述されている：Tanaka et al. (1991) Cancer Research 51:3710-3714およびSatake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17:157-160。これらの研究者は、GCSFタンパク質の各分子が1個、2個、または3個（平均2個）のPEGによって修飾されていると見られるコンジュゲートの混合物を調製した。これらの研究者によって利用された活性化PEG試薬はSS-PEG（4.5 kDaまたは10 kDa）であった。タンパク質とPEGとの間の得られたアミド結合は安定であるが、リンカーがエステル基を含みこれが加水分解的に不安定である。化合物が水性媒体中にある限りそのような加水分解は起こり、従って、それが溶液中にある限りPEGの数は連続的に減少する。エステル結合の加水分解はスクシネート基を後に残し、これがスクシンイミジル基へと環状化し得る。そのような非天然の残基は、免疫原性を含め、抗体応答をもたらす潜在的可能性を有する。
【００１５】
PEG化バージョンを含め、既知のバージョンのGCSFに関連する副作用としては、用量関連糸球体腎炎、ならびに骨痛の有害事象および重篤有害事象が挙げられる。これにより、多くの癌患者が苦痛な治療期間を経験する結果となり、あるいは場合によっては、腎臓損傷および／または骨痛重篤有害事象のために全ての治療を低減または停止する結果となってきた。フィルグラスチムまたはPEG-フィルグラスチムの副作用は投与量レベルと関連している。従って、より新しいバージョンのGCSF（好ましくは改善されたPKプロファイルを有するPEGx-GCSF）は、副作用が減少し臨床的に有益な好中球の増加を提供することが正当である。従って、現行治療と同様の好中球増加をより低い投与量で生じ得る製剤が、好中球減少症に関連する状態を改善させるための望ましいアプローチとなるであろう。
【００１６】
長期的なGCSF療法の潜在的、追加的な帰結は、悪性病変を発生する可能性の増加である。生涯に渡るGCSF療法を要する重症慢性好中球減少症（SCN：severe chronic neutropenia）の患者は、骨髄異形成症候群のリスクが上昇し、これはGCSFで処置されてきた期間と直接比例する。GCSFは骨髄性癌を増悪させ得ることも知られている。従って、例えば骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、および二次性の急性骨髄性白血病（AML：Acute Myeloid Leukemia）の患者においてはニューポジェンは推奨されない。従って、正常細胞に対してより選択的であり従って現行の治療と比べて癌細胞の増殖を回避または低減するような増殖活性を有するGCSF療法を提供することも有利となるであろう。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の複数の実施形態はPEGx-GCSFに関するものであり、ここでxはGCSF当たりのPEGの数を表し4〜8の整数である。
【００１８】
PEGx-GCSFの複数の実施形態において、PEG部分は、約3〜約15 kDaの平均分子量を有し、あるいは好ましくは約5〜約6 kDaの平均分子量を有する。
【００１９】
本発明のPEGx-GCSFのある実施形態では、PEGは、GCSFに由来するアミンを介してGCSFに取り付けられて（結合されて）いる。代替的な実施形態では、PEGx-GCSFは、非加水分解性（加水分解不可能）の連結部、例えばウレタン連結部を含む。
【００２０】
本発明のPEGx-GCSFのさらなる実施形態では、GCSFは、配列番号（SEQ ID NO）1、配列番号3、配列番号4、ならびにそれらの機能的な誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。さらなる実施形態では、GCSFアミノ酸配列は配列番号1であり、各PEGが、N末端、第17位のリジン残基、第35位のリジン残基、第41位のリジン残基、第44位のヒスチジン残基、第53位のヒスチジン残基、第80位のヒスチジン残基、第157位のヒスチジン残基、および第171位のヒスチジン残基からなる群から選択されるGCSF位置に取り付けられている。
【００２１】
本発明の複数の実施形態はまた、PEG[x]-GCSF、すなわち一群のPEGx-GCSFを含む組成物に関し、ここで[x]はその一群についてのxの平均値であり、[x]は約4以上であるか、[x]は約4〜約8であるか、[x] は約4〜約6であるか、または[x] は約5〜約6である。
【００２２】
ある実施形態では、PEG[x]-GCSFは、以下のうちの1つまたは複数によって特徴づけられる：PEG[x]-GCSFは、xが1〜3であるPEGx-GCSF を10%未満含む；PEG[x]-GCSFは、xが4であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%含む；PEG[x]-GCSFは、xが5であるPEGx-GCSFを少なくとも約30%含む；PEG[x]-GCSFは、xが6であるPEGx-GCSFを少なくとも約10%含む；PEG[x]-GCSFは、xが7であるPEGx-GCSFを15%未満含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、PEG[x]-GCSFは、xが6〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%含むか、または、xが5〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約35%含む。
【００２４】
さらなる複数の実施形態は、薬学的活性量のPEGx-GCSFまたはPEG[x]-GCSFとタンパク質非含有担体とを含む医薬製剤に関する。
【００２５】
本発明のさらなる複数の実施形態は、xが4〜8である本発明のPEGx-GCSF、または[x]が4以上であるPEG[x]-GCSFを調製するための方法に関し、この方法は、(a)少なくとも約5.0 mg/mlの濃度を有するGCSF溶液を得る工程と；(b)そのGCSF溶液をPEGと組み合わせる工程であって、PEGのモル量がGCSFのモル量の約65〜約75倍である工程と；(c) GCSFとPEGとが反応してPEGx-GCSFを産生するために十分な時間を経過させる工程と；(d)残余PEGと反応するために十分な量のヒドロキシルアミンを添加する工程と；(e)未反応PEG、N-ヒドロキシスクシンイミド、およびヒドロキシルアミンからPEG[x]-GCSFを単離する工程とを含む。個々のPEGx-GCSFは、分子量によって分離する方法をはじめ、本技術分野で知られている、精製タンパク質コンジュゲートを単離するための方法によって集団からさらに単離される。
【００２６】
本発明の組成物は、既存の市販されているGCSFおよび／またはPEG-GCSF治療が骨痛の発生または癌細胞増殖のリスクのために禁忌となり得る多様な医学的状態の治療において、予測外の有用性を提供する。そのような医学的状態としては、重症先天性／慢性好中球減少症、自己免疫性／特発性好中球減少症、ならびに癌の治療に関連する好中球減少症が挙げられる。
【００２７】
本発明のさらなる利点は、本発明のある特定の実施形態のみを示して説明している以下の詳細な説明から当業者にとって容易に明らかになるであろう。理解されるように、本発明は他の異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの詳細点は、全く本発明から逸脱することなく様々な点においてルーチン的な改変が可能である。本発明は、これら特定の詳細点のいくつかまたは全てを用いずとも実施され得る。従って、この説明は、限定的ではなく例証的な性質のものとして考えられるべきである。
【００２８】
本開示の例示的実施形態は、部分的に本開示と添付の図面とを参照することにより理解され得、これら図面を下記に手短に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、主要な、完全にプロセスされたヒト顆粒球コロニー刺激因子（「GCSF」）（配列番号1）のアミノ酸配列を表す。対応するDNA配列は配列番号2として提供される。
【００３０】
【図２】図2は、本明細書に記述される発明のいくつかの実施形態において使用されるGCSFタンパク質についての配列決定データを記述する。図2は配列番号3および配列番号4をそれぞれ記述している。
【００３１】
【図３】図3は、本発明のPEGx-GCSFおよびPEG[x]-GCSFを調製するためのプロセスのフローチャートを提供する。
【００３２】
【図４】図4は、本発明のPEG[x]-GCSF試料の分析から得られた、代表的なバイオアナライザー電気泳動図である。
【００３３】
【図５】図5は、本発明のPEG[x]-GCSF試料についてのSDS-PAGE分析結果の代表例である。
【００３４】
【図６】図6は、市販のPEG-GCSF（NEULASTA（登録商標）、NLSTA）と比較した本発明のPEG[x]-GCSF（ANF-Rho）のバイオアッセイからの結果を示す効力グラフである。示されたGCSF化合物でM-NFS-60細胞を48時間処理した後に生存性染色を行った。データは未処理対照に対して基準化し、3パラメータロジスティック曲線あてはめモデルに当てはめた。データは重複実験の複数のウェルの平均および標準誤差を表している。
【００３５】
【図７】図7は、CD66およびCD14細胞の蛍光強度の二変量プロットの四分ゲーティングであり、インビトロでのヒトCD34(+)細胞に対する本発明のPEG[x]-GCSF（ANF-Rho）対NEULASTA（登録商標）の効果を示している。細胞を、ml当たり50 ngの本発明PEG[x]-GCSF（ANF-Rho）またはNEULASTA（登録商標）のどちらかで14日間処理した後に、CD66およびCD14について表面染色を行った。抗原発現をフローサイトメトリーによって定量化した。E4ゲートに表われている細胞事象は顆粒球集団を示すものである。
【００３６】
【図８Ａ】図8は、好中球減少性ラットにおける、様々な市販PEG-GCSF（NEULASTA（登録商標））および本発明PEG[x]-GCSFの試料の単一用量薬物動態のグラフである。ラットは、第-1日目におけるシクロホスファミド（CPA）の注射によって好中球減少性にした。第1日目に、4つの異なる濃度の本発明PEG[x]-GCSF（ANF-Rho）およびNEULASTA（登録商標）を表示された投与量において皮下投与した。表示された日にラットから血液試料を取得し、ELISAによってGCSF血漿濃度を測定した。データは、群あたり8匹のラットについての平均および標準誤差である。図8AはGCSF濃度の線形プロットである。
【図８Ｂ】図8BはGCSF濃度の対数プロットである。
【００３７】
【図９Ａ】図9は、好中球減少性ラットにおける、市販PEG-GCSF（NEULASTA（登録商標））および本発明PEG[x]-GCSF試料（ロット1〜3）の血漿曝露効果を示すグラフである。図9Aは、3つの異なる濃度（キログラム当たり100、50および25マイクログラム、すなわちμg/kg）における本発明PEG[x]-GCSFの3つの個別ロットと、単一濃度のNEULASTA（登録商標）（100μg/kg）とについての曲線下面積（AUC：area under the curve）を示す。星印は、キログラム当たり100マイクログラム（μg/kg）で投与されたNEULASTA（登録商標）と比較した、表示投与量における本発明PEG[x]-GCSF AUCの有意差を示す。星印は、NEULASTA（登録商標）処置群と比較したANOVAおよびダネットの多重比較検定事後分析による有意差（p<0.05）を示す。
【図９Ｂ】図9Bは、PEG-GCSF血漿曝露と投与量との線形性を示す。本発明PEG[x]-GCSFのロット1、ロット2、およびロット3についてのAUC値をまとめて線形回帰分析に付した。まとめた平均および95%信頼区間を各データセットの上に示している。点線および影を付けた領域は、100μg/kg NEULASTA（登録商標）処置群の平均AUCおよび上側と下側の95%信頼区間を示す。
【００３８】
【図１０】図10は、本発明PEG[x]-GCSFロット1、NEULASTA（登録商標）、または製剤用緩衝液（FB）で日毎に処置された好中球減少性ラットにおける好中球細胞数の典型的変化を示すグラフである。ラットは、第-1日目におけるシクロホスファミド（CPA）の注射によって好中球減少性にした。第1日目以後、ラットはPEG[x]-GCSF（100μg/kg）、NEULASTA（登録商標）（100μg/kg）または媒体溶液（FB）の日毎の注射を受けた。表示された日にラットから血液試料を取得して、好中球絶対数（ANC：absolute neutrophil counts）を決定した。データは群あたり8匹のラットについての平均および標準誤差である。影を付けた領域は、最初の好中球放出に関連するANC値を示し、これは曲線下面積の計算には含めなかった。
【００３９】
【図１１Ａ】図11は、PEG[x]-GCSFおよびNEULASTA（登録商標）を投与した好中球減少性ラットからの好中球絶対数（ANC）を示す。図11Aは、投与後経過時間の関数としてANC値をプロットした図10に示す2回目上昇ANCピークを用いてAUCを決定したものを示す。各用量における各PEG[x]-GCSFロットについての値をまとめ、96時間より前のデータ（事前に形成されていた好中球の放出を表す）は分析から除外した。データセットの上および下にある星印は、それぞれ製剤用緩衝液およびNEULASTA（登録商標）の処置群と比較した、PEGx-GCSFのまとめた投与量のANOVAによる有意差（p<0.05）を表す。
【図１１Ｂ】図11Bは、25μg/kg（四角）、50μg/kg（逆三角）、および100μg/kg（丸）における、PEG[x]-GCSFの3つの別ロットからの3つの濃度についてグループ化したデータを示す。影を付けた領域は、100μg/kg NEULASTA（登録商標）についての値および95% CI（信頼区間）を表す。0.64のr2値を有する全てのロットのANC-AUCと血漿AUCとの間の相関解析は、薬剤レベルとANC薬動力学との間の有意な相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
［定義］
アミノ酸配列に関して「実質的に相同的」とは、本明細書においては、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)に従ったFASTA検索法により決定されるところによって、別のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、典型的には少なくとも約80%、より典型的には少なくとも約90%の同一性を有する配列として定義される。
【００４１】
本明細書において、別の分子へのタンパク質の共有結合性連結の文脈で用いられる場合の「N末端」、「アミノ末端」という用語または類似の用語は、タンパク質のアミノ末端α-アミノ基を介した共有結合性連結を表す。
【００４２】
本明細書で用いられる「野生型」または「天然」という用語は、作用性または機能性の形態のタンパク質またはポリペプチドであって、典型的には身体中で自然に機能していることが見出されるものを表す。これらの用語はまた、人工的に修飾または改変されていない形態のタンパク質も表す。従ってこれらの用語は組換えタンパク質に関するものでもあり得る。従って、これらの用語は、そのタンパク質の核酸および／またはアミノ酸配列が元々由来した動物において産生されたものに対して改変されたグリコシル化パターン（グリコシル化の欠如を含む）を有するタンパク質も表し得る。
【００４３】
本明細書で用いられる「ANF-Rho」という用語は、実施例において使用されている、本発明のPEG[x]-GCSFの典型的試料を表す。例えば実施例3および表2参照。
【００４４】
NEULASTA（登録商標）は、PEGフィルグラスチム、すなわちPEG化形態の組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）類縁体フィルグラスチムの商品名である。この薬剤はフィルグラスチムタンパク質のN末端に20 kDaポリエチレングリコール（PEG）分子をカップリングさせることにより調製される。
【００４５】
［GCSF］
一般的に、本発明の実施において有用なGCSFタンパク質は、哺乳類生物体から単離される任意の形態のもの、ゲノムもしくはcDNAのクローニングもしくはDNA合成により得られる外因性DNA配列の原核生物もしくは真核生物宿主発現の産物、あるいは、化学的合成手順の産物もしくは内因性遺伝子の活性化による産物であり得る。すなわち、そのタンパク質は、組織、哺乳類／微生物細胞培養物、植物細胞培養物、トランスジェニック動物、酵母、真菌および／またはトランスジェニック植物から取得される、天然または組換え供給源のものであり得る。適切な原核生物宿主には大腸菌（E. coli）のような様々な細菌がふくまれ、適切な真核生物宿主には、出芽酵母（S. cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）のような酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはサル細胞のような哺乳類細胞、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジのようなトランスジェニック動物、昆虫または植物の細胞培養物、およびヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）（コケ）のようなトランスジェニック植物が含まれる。利用される宿主に依存して、タンパク質発現産物は、哺乳類、植物またはその他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されることがあり、あるいは非グリコシル化でもあり得る。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「GCSF」あるいは顆粒球コロニー刺激因子には、配列番号1（図1）に提示されるアミノ酸配列またはそれと実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質が包含され、その生物学的特性は白血球細胞産生の刺激に関係する。本明細書で用いられる用語GCSFには、例えば部位指向的突然変異誘発によって意図的に改変され、または突然変異を通じて偶発的に改変されて、天然GCSFに対してアミノ酸残基の付加、欠損、または置換を有するようになったタンパク質が包含される。これらの用語には、天然のヒトGCSFおよび組換え生成されたヒトGCSFの両方が包含される。GCSFは、組織、タンパク質合成、天然細胞もしくは組換え細胞を用いた細胞培養物のような任意の従来型供給源から得られるような、天然に起こるタンパク質または組換えタンパク質（典型的にはヒト）の両方を表す。
【００４７】
本発明の実施において有用なGCSF発現産物は、第1位において開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明は、そのような形態のGCSFのあらゆる全ての使用を企図するが、組換えGCSF、特に大腸菌由来のものが典型的である。いくつかのGCSF類縁体が生物学的に機能性であることが報告されており、これらもまた本発明に従ってコンジュゲート化され得る。これらのGCSF類縁体は、配列番号1によるGCSFアミノ酸配列と比較してアミノ酸の付加、欠損、および／または置換を有するものを含み得る。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号1と比較して、例えば、配列番号1の第36位、第37位、および第38位におけるVSEの挿入のような、アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号3または配列番号4のとおりである。
【００４８】
本明細書で用いられる「GCSF」という用語は、上述したGCSFの活性を有するタンパク質を包含し、これは天然のヒト糖タンパク質GCSF、GCSFの突然変異体、グリコシル化GCSF、非グリコシル化GCSF、および／またはその他の修飾を有するGCSFの構造的および／または機能的バリアントを含む。さらなる一実施形態では、GCSFは、配列番号1で特定されるアミノ酸配列を有し、これは細菌で産生される組換えGCSFに対応するものであって、174アミノ酸および追加のN末端のメチオニン残基を有する。第1位にメチオニン残基を含まないことにおいて配列番号1と異なる生物学的に活性なGCSFのアミノ酸配列も包含される。
【００４９】
［PEG］
「PEG」という用語は、リンカーまたは活性基を含むかあるいは含まない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を一般的に表す。本明細書で用いられるPEGという用語は、ポリエチレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ならびにそれらの誘導体および等価物を含むがこれらに限定されず、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、非置換であるかまたは（例えば一端においてアルキル基で）置換されている。本発明と共に使用するためのPEGポリマーは、広範囲の分子量の直鎖状、分岐状、櫛形、または星形であり得る。本発明の実施形態と共に使用するためのPEGの平均分子量は5から約100 kDaまでの範囲であり得る。
【００５０】
非常に多数のPEG誘導体ならびにそれらを作るための方法およびタンパク質にそれらをコンジュゲート化するための方法が本技術分野において知られており、本発明における使用のために適している。本発明における使用のために特に好ましい1つのPEGは、ポリマーの一端が、例えば低級C1〜6アルコキシ基のような比較的不活性な基で終結しているPEGである。好ましくは、PEGはモノメトキシ-PEG（一般にmPEGと呼ばれる）であり、これは、ポリマーの一端がメトキシ（--OCH3）基である直鎖状のPEGである。
【００５１】
さらにより好ましくは、本発明において使用されるPEGは、所望の活性化mPEGによるPEG化を促進するように、直鎖状PEGの一端がメトキシ基で終結し、他方の末端がGCSF上の好ましい部位へのカップリングに適したリンカーで終結する、「活性化mPEG」である。
【００５２】
好ましいリンカーは、アミン反応性リンカー、すなわち一級アミンと化学結合を形成する合成化学基を含む。これらには、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、NHSエステル、スルホニルクロライド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、およびフルオロフェニルエステルが含まれる。これらのアミン反応性リンカーのほとんどは、アシル化あるいはアルキル化のいずれかによってアミンにコンジュゲートする。
【００５３】
典型的な連結部（リンケージ）は、加水分解的に安定でありかつ水溶性である。代表的な好適リンカーは、アミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエーテル（スルフィドとしても知られる）、またはウレア（カルバミドとしても知られる）基のあらゆる組合せを含み得る。
【００５４】
特定の実施形態では、メトキシル化PEG（「mPEG」）は、本技術分野でよく知られる方法によって後でアミノ基に共有結合させるために活性化させられ得る。すなわち、mPEGは、利用可能なアミノ残基（例えばリジン残基）を含むアミノ酸残基を介して後でタンパク質に取り付けることに適した、様々な反応性部分を含むように改変され得る。そのような活性化PEGには、mPEG-スクシニミジルスクシネート（「SS-PEG」）、mPEG-スクシニミジルカーボネート（「SC-PEG」）、mPEG-イミデート、およびmPEG-シアヌル酸クロリドが含まれる。好ましい一実施形態では、加水分解に対して安定であるPEG-GCSF連結部を提供するようにリンカーが選択される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明と共に使用するためのPEGの平均分子量は、約2〜約50 kDaの範囲内、約3〜約25 kDa、約4〜約10 kDa、または本明細書に提供される上下限値の2つによって規定されるあらゆるサブ範囲内であり、これは、例えば4.5、5、5.6、および6 kDaのように、これらの範囲内に見出されるあらゆる単一数値の整数（自然数）または非整数（分数）を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の様々な実施形態における使用のためのPEGは、約5〜6 kDa SC-PEGの平均分子量、より具体的には約5.6 kDa SC-PEGの平均分子量を有する。GCSF の一級アミノ基とSC-PEGとの反応からもたらされるPEGx-GCSFは、上述したTanaka et al.およびSatake-Ishikawa et al.のマルチPEG化コンジュゲートにおける加水分解的に不安定な連結部とは異なり、加水分解に対して安定なウレタン連結部を含む。
【００５７】
［PEGx-GCSF］
本発明の一実施形態は「PEGx-GCSF」に関するものであり、これは、本明細書で定義されるように、共有結合により取り付けられたx個のPEG部分を含むGCSFコンジュゲートであり、xは4〜7の整数である。PEGx-GCSFの特定の実施形態には、xが4、5、6、7、および8であるものが含まれる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、各々のPEGは、GCSFに由来するアミン部分（例えばN末端、またはいずれかのリジンもしくはヒスチジン残基）を介してGCSFに取り付けられる。これらの特定の実施形態では、共有結合は、アミノ反応性リンカーで活性化されたPEGとGCSFアミン部分との間の反応によって形成される。特定の実施形態では、アミンとの反応の際に、アミノ反応性リンカーがGCSFに対して非加水分解性連結部を形成する。さらなる実施形態では、PEGx-GCSFは、例えばウレタン連結部のような、非加水分解性連結部を含む。
【００５９】
PEGx-GCSFの実施形態は、GCSFが、配列番号1、配列番号3、配列番号4、ならびにこれらの配列のいずれかの機能的な誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるものを含む。特定の実施形態では、そのアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号1の機能的誘導体、または配列番号1のホモログであり、GCSFは、第17位におけるリジン残基、第35位におけるリジン残基、第41位におけるリジン残基、ならびに、任意で、第44位におけるヒスチジン残基、第53位におけるヒスチジン残基、第80位におけるヒスチジン残基、第157位におけるヒスチジン残基、および第171位におけるヒスチジン残基を有する。PEGx-GCSFの関連する実施形態において、各々のPEGは、N末端、第17位におけるリジン残基、第35位におけるリジン残基、第41位におけるリジン残基、ならびに、任意で、第44位におけるヒスチジン残基、第53位におけるヒスチジン残基、第80位におけるヒスチジン残基、第157位におけるヒスチジン残基、および第171位におけるヒスチジン残基からなる群から選択される位置においてGCSFに取り付けられる。
【００６０】
特定の実施形態は、GCSFが配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、各々のPEGが、N末端、リジン、またはヒスチジン残基のようなGCSF由来アミンに取り付けられた、PEGx-GCSFに関する。例えば、N末端、第17位におけるリジン残基、第35位におけるリジン残基、および第41位におけるリジン残基からなる群から選択されるGCSF位置にPEGが取り付けられた実施形態である。さらなる一実施形態では、第44位におけるヒスチジン残基、第53位におけるヒスチジン残基、第80位におけるヒスチジン残基、第157位におけるヒスチジン残基、および第171位におけるヒスチジン残基からなる群から選択されるGCSF位置にPEGが取り付けられる。
【００６１】
PEGx-GCSFのいくつかの実施形態では、PEGの平均分子量は約2〜約50 kDaの範囲内、約3〜約25 kDa、約4〜約10 kDa、または本明細書に提供される上下限値の2つによって規定されるあらゆるサブ範囲内であり、これは、例えば4.5、5、5.6、および6 kDaのように、これらの範囲内に見出されるあらゆる単一数値の整数（自然数）または非整数（分数）を含む。PEGx-GCSFの特定の実施形態には、PEGが約5〜約6 kDa、好ましくは5.6 kDaの平均分子量を有するものが含まれる。
【００６２】
［PEG[x]-GCSF］
本発明の一実施形態は「PEG[x]-GCSF」に関するものであり、これは、本明細書で定義されるように、上述した個々のPEGx-GCSFを様々な割合で含む集団を含む組成物であり、ここで[x]はその集団についてのxの平均値であり、[x]は約4以上の正の数（小数値を含む）であり、例えば約4〜約8；約4〜約6；または約5〜約6である。PEG[x]-GCSFは、PEGx-GCSFコンジュゲートが異なる値のxを有し、PEGがGCSF分子上の異なる部位に取り付けられており、および／またはPEGが異なる分子量を有する、「不均一集団」を含む実施形態を包含する。
【００６３】
PEG[x]-GCSFの実施形態は、PEGの平均分子量が約2〜約50 kDaの範囲内、約3〜約25 kDa、約4〜約10 kDaであるPEGx-GCSFを含め、本明細書に記述される様々な個々のPEGx-GCSFのいずれかの集団を含む。PEGx-GCSFの特定の実施形態には、PEGが約5〜約6 kDa、好ましくは5.6 kDaの平均分子量を有するものが含まれる。
【００６４】
PEG[x]-GCSFのいくつかの実施形態は、以下の事項のうちの1つまたは複数によって特徴付けられる：xが1〜3であるPEGx-GCSFを10%未満、8%未満、または5%未満含む；xが4であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、または少なくとも約30%含む；xが5であるPEGx-GCSFを少なくとも約30%、少なくとも約35%、または少なくとも約40%含む；xが6であるPEGx-GCSFを少なくとも約10%、少なくとも約12%、または少なくとも約15%含む；xが7であるPEGx-GCSFを少なくとも約3%、少なくとも約5%、および／または約15%未満含む；xが6〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、または少なくとも約35%含む；xが5〜7であるPEGx-GCSFを少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%含む。PEG[x]-GCSFのさらなる実施形態には、xが7であるPEGx-GCSFを約15%未満、約12%未満、または約10%未満含むものが含まれ得る。
【００６５】
PEG[x]-GCSFの複数の実施形態は、本明細書に記述される様々な個々のPEGx-GCSFのいずれかの集団を含み、ここで、その集団についてのxの平均値である[x]は4より大きい。例えば、PEG[x]-GCSFの複数の実施形態は、N末端、リジン、またはヒスチジンのようなGCSF由来のアミンを介してPEG がGCSFに取り付けられているPEGx-GCSFの組成物を含み、ここで、PEGx-GCSFは、例えばウレタン連結部のような非加水分解性連結部を含み；GCSFは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、ならびにこれらの配列のいずれか1つの機能的な誘導体およびホモログのアミノ酸配列を有するタンパク質であり；各々のPEGは、配列番号1によるGCSFまたはその誘導体もしくはホモログに、N末端、第17位におけるリジン残基、第35位におけるリジン残基、第41位におけるリジン残基、第44位におけるヒスチジン残基、第53位におけるヒスチジン残基、第80位におけるヒスチジン残基、第157位におけるヒスチジン残基、および第171位におけるヒスチジン残基からなる群から選択される位置において取り付けられている。
【００６６】
いくつかの実施形態では、PEG[x]-GCSFは、以下のうちの1つまたは複数により特徴付けられるPEGx-GCSFの集団を含む：
約0%〜約5%の、xが3であるPEGx-GCSF；
約22%〜約32%の、xが4であるPEGx-GCSF；
約38%〜約42%の、xが5であるPEGx-GCSF；
約18%〜約28%の、xが6であるPEGx-GCSF；および
約0%〜約9%の、xが7であるPEGx-GCSF。
【００６７】
PEG[x]-GCSFの別の実施形態は、PEGがウレタン連結部を介してGCSFに取り付けられているPEGx-GCSFの集団を含み、任意で、PEGは約3〜約15 kDa、より好ましくは約5〜約6 kDaの平均分子量を有する。特定の実施形態において、PEG[x]-GCSFは、PEGがウレタン連結部を介してGCSFに取り付けられているPEGx-GCSFの集団からなり、任意で、PEGは約3〜約15 kDa、より好ましくは約5〜約6 kDaの平均分子量を有する。
【００６８】
［コンジュゲーションの方法］
以下の方法は、本発明に従って、xすなわちGCSFあたりのPEG数が4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、および、[x] すなわちPEGx-GCSFの集団中に存在するGCSFあたりの平均PEG数が4以上であるPEG[x]-GCSFコンジュゲート集団を生産するために用いられる。
【００６９】
図3に示すように、GCSFタンパク質は約5.0 mg/mlに濃縮され、10 kDa透析濾過膜を用いたバッファー交換に付される。撹拌機構が備えられた反応容器がタンパク質溶液で満たされる。所望の刃深に設定された二刃羽根車システムを容器中に浸してオンにする。タンパク質の量の約65〜約75倍の過剰モルのSC-PEG粉末（5 kDa）を、約15分間に渡り反応容器にゆっくり加える。反応がさらなる45分間ほど続けられるあいだpHを監視し約7.75に維持する。この後、反応容器にヒドロキシルアミン（HA）を加えさらに2時間ほど混合して、残余の反応性PEGをクエンチし、弱く結合したPEGを産物から取り除く。反応プロセス全体を通じて、反応容器の内容物は環境温度（すなわち、「室温」）に維持される。反応混合物は50 kDa膜を用いて二回透析濾過して、残余（すなわち未反応）のPEG、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびヒドロキシルアミンを取り除く。得られた「薬剤物質」を5.0〜6.0 mg/mlに濃縮する。それからTWEEN 20（登録商標）（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）およびソルビトールの添加を通じて、約2〜約10 mg/ml、好ましくは約5.0 mg/mlの最終薬剤産物濃度へと体積を調節しながら「薬剤産物」が製剤される。薬剤産物は、バイアルまたは注射器のような無菌容器閉鎖環境へと分注される。
【００７０】
［医薬製剤］
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で記述されるxが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、または、[x]が4以上である個別コンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団を（任意で薬学的に許容される担体中に）含む、薬学製剤に関する。いくつかの実施形態では、担体は実質的にタンパク質非含有である。
【００７１】
本発明の製剤は、本技術分野で知られる方法による、追加的な薬学的に許容される担体または媒体との混合または組合せにより、さらに注射に適するようにし得る。本発明の産物を製剤するための薬学的に許容される担体としては、食塩水、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質、等が挙げられる。本発明はまた、上述したコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤および／または担体とを含む医薬組成物に関する。そのような薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、および、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられ、食塩水および緩衝培地が含まれる。非経口的な媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液と栄養分の補給液、リンゲルのデキストロースに基づくもののような電解質補給液、等が挙げられる。保存剤その他の添加剤も存在していてよく、それは例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等である。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、本発明のxが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、または[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団の有効量を、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体と共に含む。そのような組成物は、様々なバッファー内容（例えばトリス-HC1、酢酸、リン酸）、pH、およびイオン強度の希釈剤；TWEEN 80（登録商標）（非イオン性オレイン酸、≧58.0%（残りは主にリノール酸、パルミチン酸、およびステアリン酸）、平均分子量1310、シグマアルドリッチ社から入手可能―ポリソルベート80とも呼ばれる）のような界面活性剤および可溶化剤、アスコルビン酸および二亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ベンジルアルコールのような保存剤、ならびにラクトースまたはマンニトールのような充填物質のような添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、等のようなポリマー性化合物の粒子状調製物中へまたはリポソーム中への材料の組み入れを含む。そのような組成物は、本発明によるPEGx-GCSFコンジュゲートの物理的状態、安定性、インビボ放出率、およびインビボ排出率に影響し得る。
【００７３】
本発明に従って調製される、xが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、または[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団は、本技術分野で知られる方法により、薬学的に許容される担体または媒体と共に、注射に適した医薬組成物に製剤され得る。例えば、参照により全内容が本明細書に組み入れられるW097/09996、W097/40850、W098/58660、およびW099/07401を参照。本発明の化合物は、例えば、浸透圧剤（例えば132 mM塩化ナトリウム）を含有するpH 7の10 mMリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中に製剤され得る。任意で、医薬組成物は保存剤を含み得る。
【００７４】
これらの医薬組成物は、一般的に、本発明に従って調製される、xが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、または[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団、約4.0〜約7.0の範囲内の溶液pH（ただし最も好ましくはこの範囲の低い方の端、すなわち約4.0）を維持するのに適した薬学的に許容されるバッファー中の複数の電荷を有する無機アニオン、ならびに、任意で、1つ以上の薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む。
【００７５】
［使用方法］
本発明の別の側面では、必要とする患者において白血球細胞数を増加させるための方法が提供され、この方法は、前記患者に本発明の医薬製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、患者は、好中球減少症の危険にあるか、または好中球減少症に罹患している。いくつかの実施形態では、患者は、その白血球細胞数を減少させる薬剤で処置されている。いくつかの実施形態では、患者は、内因性GCSFレベルが低下している。いくつかの実施形態では、患者は、放射線治療を受けている。患者は、肺癌、リンパ腫、乳癌、骨髄移植、精巣癌、AIDS関連悪性病変、骨髄異形成障害、急性白血病、先天性の周期性好中球減少症、または再生不良性貧血を有し得る（Mortsyn, et al.(1998) Filgrastim (r-metHuGCSF). In Clinical Practice, 2ndEd., Marcel Dekker, Inc., New York, NY参照）。いくつかの実施形態では、製剤は、感染の危険にある患者に投与される。
【００７６】
以下は、本発明の治療方法が有用となることが予期される、骨髄系細胞またはその前駆細胞の内因的欠損による一次性好中球減少症の例である：再生不良性貧血；良性好中球減少症を含む、慢性型の特発性好中球減少症；周期性好中球減少症；脊髄形成異常症；異常ガンマグロブリン血症に関連する好中球減少症；発作性夜間ヘモグロビン尿症；重症先天性好中球減少症（コストマン症候群）；および症候群関連好中球減少症（例えば軟骨毛髪形成不全症候群、チェディアック・東症候群、先天性角化異常症、糖原病IB型、シュワックマン・ダイアモンド症候群、骨髄性細胞貯留症候群、先天性免疫不全症候群）。
【００７７】
以下は、本発明の治療方法が有用となることが予期される、二次性または後天性好中球減少症の典型的原因である：アルコール依存症；AIDSにおける慢性的二次性好中球減少症を含む、自己免疫性好中球減少症；自己免疫疾患（例えばフェルティ症候群／関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス）；骨髄置換術または幹細胞移植；癌（例えば白血病による骨髄浸潤、骨髄腫、リンパ腫、または転移性固形腫瘍―例えば乳癌、前立腺癌）；Tγリンパ増殖性疾患；細胞毒性化学療法または放射線療法により引き起こされた発熱性好中球減少症；薬物誘発性好中球減少症；葉酸またはビタミンB12の欠乏症（巨赤芽球性貧血）；血液透析；脾機能亢進症；感染症（例えばパルボウイルス、肝炎ウイルス、マラリア、ライム病、サルモネラ、敗血症）；骨髄線維症（例えば肉芽腫性感染）；ゴーシェ病；中毒症（例えばヒ素）；および原発性免疫不全症―例えばX連鎖型の分類不能型免疫不全症（CVID）、X連鎖型の無ガンマグロブリン血症（XLA）、WHIM症候群、ウィスコット・オルドリッチ症候群、およびGATA2欠損症。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、現在市販されているGCSF製品の投与が禁忌とされるある種の骨髄癌（例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病）の治療において特に有用となり得る。これは、下記の実施例3で実証されているように、正常白血球細胞の増殖を引き起こしながら癌細胞の増殖は回避または低減するという、本発明のPEGx-GCSFおよび本発明のPEG[x]-GCSF集団の予測外の選択性のためである。
【００７９】
さらに、本発明により提供される、癌患者の特に有利な治療に加えて、生涯に渡るGCSF療法を要する重症先天性好中球減少症（SCN）をもたらし得る状態の患者が存在する。これらの患者は、GCSFタンパク質への累積的曝露に直接比例して骨髄異形成症候群の危険性が増加している。従って、癌細胞の増殖を回避または低減する本発明の組成物は、これらの患者にもユニークな利益を提供し得る。
【００８０】
さらに、好中球減少症を治療することに加えて、GCSFは、自家移植患者および同種（allogeneic）ドナーにおける末梢血幹細胞動員においても使用されてきた。移植に先立って、ドナーまたは患者は、幹細胞の回収が改善し従って移植手順の成功の確率が改善するように、前駆体幹細胞数を増加させるためにGCSFで処置される。本発明の医薬組成物は、下記の実施例4で実証されているような、その増強された生物活性を考慮すると、この目的のために特に有用であることが予期される。
【００８１】
本発明に従って調製される、xが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲート、または[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団は、例えば内毒素によるGCSF受容体の下方制御による、重症敗血症および敗血症性ショックの治療においても有用性を有する。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、化学療法の途中で単一用量において提供される。いくつかの実施形態では、製剤は、化学療法の途中で複数用量として提供される。特定の実施形態では、製剤は、1日毎に1度、1週間毎に1度、2週間毎に1度、または1月毎に1度投与される。製剤は、化学療法の投与の24時間以内に投与され得る。特定の実施形態では、製剤は、化学療法の投与の少なくとも14日前に投与される。しかしながら、下記においてより詳細に説明するように、本発明の製剤は、市販のNEULASTA（登録商標）製品の場合よりもはるかに高い投与柔軟性を提供する。本発明の製剤は、有利なことに、化学療法のあいだのあらゆる時点で患者に投与することができる。
【００８３】
特定の実施形態では、製剤は、注射として投与される。いくつかの実施形態では、製剤は、皮下、筋肉内、および腹腔内を含む複数の投与ルートに適している。別の実施形態では、製剤は、静脈内投与に適している。この製剤はまた、経口摂取可能な形態として提供され得る。患者は、少なくとも約1週間に1度投与を受け得る。別の実施形態では、患者は、少なくとも約2週間毎に1度、少なくとも約3週間毎に1度、または少なくとも約1カ月毎に1度、投与を受け得る。
【００８４】
治療的有効量は、骨髄細胞に白血球の産生を増加させるインビボ生物学的活性のために必要な、本発明に従って調製されるxが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲートまたは[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団の量である。PEGx-GCSFまたはPEG[x]-GCSFの正確な量は、処置される状態の正確な種類、処置される患者の状態、および組成物中の他の成分のような因子に左右される、好みの問題である。PEGx-GCSFまたはPEG[x]-GCSFを含有する医薬製剤は、白血球産生の低下または欠陥により特徴付けられる障害を経験しているヒト患者への様々な手段による投与のために有効な強度において製剤され得る。PEGx-GCSFまたはPEG[x]-GCSFの平均的な治療的有効量は変動し得、特に、適格な医師の推奨および処方に基づくべきである。例えば、体重kgあたり0.01〜10μg、典型的には体重kgあたり0.1〜3μgが投与され得る（例えば化学療法の1サイクルに1度）。あるいは、本発明の医薬組成物は、45 kg超の宿主のために有用な固定用量製剤において、PEGx-GCSFまたはPEG[x]-GCSFの固定された用量、例えば1〜10 mg、または2〜9もしくは約6 mgを含み得る。しかしながら、下記実施例4に実証されるように、例えばNEULASTA（登録商標）と比較して劇的に上昇した本発明の組成物のインビボ活性のレベルを考慮すると、これらの量は減少させてもよい。
【実施例】
【００８５】
［実施例1：本発明のPEG[x]-GCSFの合成］
例示的な、xが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲートまたは[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団を、上記「コンジュゲーションの方法」の節で提示された一般的手順に従って、下記においてより詳細に示すように、以下の4つの主要な工程を利用して製造した：(1)透析濾過pH 7.75 - 10kDa、(2) PEG化反応、(3) 透析濾過pH 4.0 - 30kDa/50kDaおよびフィルター濾過、ならびに、(4) ストッパー付き無菌ホウケイ酸ガラスバイアルまたはBD Hypak注射器（ベクトンディッキンソン社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）への充填完結。
【００８６】
［透析濾過pH 7.75-10kDa］
GCSFタンパク質は、20体積のPEG化バッファーと共に10kDaメンブレンを使用して、PEG化バッファー（pH 7.75における100 mMリン酸塩バッファー）へとバッファー交換した。バッファー交換後、その溶液を、UV分光光度測定によって5 mg/mlの溶液に濃縮した。
【００８７】
［PEG化反応およびヒドロキシルアミンの添加］
600 mLガラスビーカーに入った、リン酸塩バッファー中の濃縮GCSF（5 mg/ml）を、以下の条件下でPEGを加えながらゆっくり撹拌した：7.75のpH；環境温度；および反応時間1時間。SC-PEG粉末（5 kDa）を、65x〜75xのモル比（PEG:GCSF）にてゆっくり加え、添加のあいだ150 rpmで定常的に撹拌し、これを約15分で完了させた。反応pHを監視して、PEG添加のあいだ必要に応じて10N NaOHを加えることによって7.75に維持した。その後pHは一定になった。1時間撹拌した後、1.2 Mの塩酸ヒドロキシルアミン（HA）を加えることにより反応を終結させた。ヒドロキシルアミンの添加は、ヒスチジンにおける不安定なPEG付加を一掃し、産物の均質性および安定性を向上させる。これらの反応から、PEG化GCSFタンパク質の混合物、すなわち、GCSF分子の様々な部位にPEGが取り付けられたPEG[x]-GCSFが形成された。
【００８８】
［pH 4.0-30kDaにおける透析濾過およびフィルター濾過］
それから反応混合物を、20体積の酢酸塩バッファー（10 mM酢酸ナトリウム、pH 4.0）と共に30/50KDa透析濾過システムを使用して、酢酸ナトリウムpH 4バッファーにバッファー交換した。残余分中にPEG[x]-GCSFを回収した。N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ヒドロキシルアミン、および5kDa遊離PEGは透過分中に除去された。それから2回目の同一の透析濾過を行って、プロセスに関連する不純物のさらなる除去を促進させた。バッファー交換後、溶液を約5.5 mg/mlの溶液に濃縮した。得られたPEG[x]-GCSF溶液を無菌的に0.2μmフィルターを通してフィルター濾過し、最終的な精製PEG[x]-GCSF（「薬剤物質」ともいう）として、酢酸ナトリウムバッファー中に2〜8℃で保存した。示されたバッチから得られた産物の収量は、分光光度計を用いてOD280を測定することにより推定した。
【００８９】
［BD/Hypakガラス注射器への充填／完結］
得られたPEG[x]-GCSFの濃度は、5 mg/mlの推定体積における製剤用賦形剤を加えた後に、pH 4の酢酸ナトリウムバッファーを用いて5 mg/mlに調節した。それから、TWEEN 20（登録商標）（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）およびソルビトールの添加によって、最終薬剤産物濃度が約2〜約10 mg/ml、好ましくは約5.0 mg/mlとなるように体積を調節しながら最終的な「薬剤産物」を製剤し、手動充填具およびリピーターピペットを使用して、注射器あたり0.6 mlにてBD Hypakガラス注射器に充填した。最終的な薬剤産物はまた、2.0〜5.0 mg/mlに製剤されて、ストッパーを有する無菌ガラスバイアルにも無菌的に分注された。
【００９０】
［実施例2：PEG[x]-GCSFの特徴分析］
この実施例は、本明細書で例示される個々のPEGx-GCSFおよびPEG[x]-GCSF集団の発明実施形態の特徴分析（特にxの数値およびGCSFタンパク質に取り付けられたPEG分子の位置に関するもの）をするために行った分析的実験を記述する。さらに、本発明のPEG[x]-GCSFの属性を、Tanaka et al. (1991) Cancer Research 51:3710-3714およびSatake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17:157-160に記述されたマルチPEG化コンジュゲートのものと比較した。
【００９１】
［バイオアナライザー手順］
アジレント2100バイオアナライザーは、タンパク質を大きさに基づいて迅速に分離できるマイクロチップ系キャピラリー電気泳動システムであり、色素に基づいて、自動化された可視化および定量化の能力を提供する。4μlのPEG-GCSF試料―薬剤物質（すなわち、pH 4の10 mM酢酸ナトリウム中に製剤された本発明のPEG[x]-GCSF）または薬剤産物（すなわち、ソルビトールとTWEEN（登録商標）-20が加えられた薬剤物質）のいずれか―を、1 mg/mlに希釈し、ジチオスレイトール（DTT）（7μlの1M溶液を、アジレント変性溶液の新しいバイアルに加えた）を伴う2μlのアジレント変性溶液と組み合わせ、95〜100℃に5分間加熱した。変性された試料は、チップにロードする前に、84μlの水を加えることによりさらに希釈した。アジレントプロテイン230キットラダーおよび自家製5K PEGラダーを、PEG-GCSF試料と同じように調製した。5K PEGラダーは、PEG化の度合いが1〜4の範囲であるPEG-GCSFコンジュゲートの混合物であり、システム遂行のチェックとして、および、分析されるPEG-GCSF試料の組成の評価のための参照点として使用される。分析された各試料に関して、分離された各々のタンパク質種についてのピーク面積を表す電気泳動図が記録される。PEG-GCSFに関しては、典型的には4〜5のピークが見出され、これらは3〜7のPEGを含有するGCSFに分かれて相当する。各々のPEG化種のピーク面積の加重平均が、試験された試料についての平均PEG数を生じる。
【００９２】
図4に示すバイオアナライザーのゲル画像において、最も左のレーンは、「ラダー」と表示された隣のレーンにおいて分析されているタンパク質についての分子量を含んでいる。次の列の「5Kラダー」は、様々な量のPEG1-GCSF、PEG2-GCSF、およびPEG3-GCSF、ならびに少量のPEG4-GCSFから構成されるPEG-GCSF試料を含んでいる。PEG-GCSFのロットPG-051412-2が次の2つのレーンに適用されており、そのすぐ次に、PEG-GCSFロットPG-042413が、まず「スペーサー」として、それから分析目的で重複して適用されている。レーン2と3の境界にある数字は、表示されている各PEGx-GCSF種に関してGCSFに結合しているPEGの数xを表している。全てのバッチに関して、使用されたPEGの分子量は5.6 kDaであった。
【００９３】
GCSF分子あたり4つのPEGを有するものとして表示されているPEGx-GCSF種（すなわち、x = 4のもの）は、本当の平均分子量がおよそ41 kDaであるという事実にも関わらず、63 kDaタンパク質マーカーの移動に基づけば、63 kDaより大きい見かけの分子量において泳動していることに注意すべきである。Tanaka論文において報告されているデータについて下記で論ずるように、PEG化化合物の分子量は、球状タンパク質を分子量マーカーとして使用する場合には過大評価される。分析がここに記述されるようにバイオアナライザーによるものであろうと、あるいはTanaka論文に記述されるようにSDS-PAGEによるものであろうと、このことは当てはまる。
【００９４】
図4におけるバンドは定量化可能であり、各PEGx-GCSF種の面積%決定のために使用される。すぐ下の表1は、本発明のPEG[x]-GCSFのいくつかの異なるバッチについて得られた結果の範囲の要約を含む。
【表１】
2018519359.tif 000003
【００９５】
［SDS-PAGE］
Tanaka論文で記述されている分析方法はSDS-PAGEであるため、比較目的で、本発明のxが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲートまたは[x]が4以上である個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団についての結果の短い考察をここに提示する。PEG[x]-GCSF試料は、およそ3μgのタンパク質を含有する試料体積をエッペンドルフチューブ中に取り、DTTを有するサンプルバッファーで6倍希釈することにより調製した。試料をNupage 4〜12%ビス-トリスゲルのウェルにロードした。インビトロゲン社のXcell Surelock電気泳動システムを用いて、ゲルを、SDS-MOPS泳動バッファー中、200Vで10分間および150Vで40分間流した。酢酸／メタノールで固定を遂行し、続いて、10%酢酸、10% MeOH中の0.01%クーマシーで染色を行った。
【００９６】
SDS-PAGE分析の結果を図5に示す。本発明PEG[x]-GCSF試料についての結果はレーン1〜5に見られる。レーン6は、1〜4の範囲の既知PEG/GCSF比を有するPEG-GCSFから構成される「5Kラダー」についての結果を含んでいる。レーン7は、タンパク質標準マーカーを含んでいる。レーン5と6の間の数値は、存在する様々なバンドについての予測PEG/GCSF比に対応する。
【００９７】
GCSF分子あたり4つのPEGを有するものとして表示されているPEG4-GCSF種は、本当の平均分子量がおよそ41 kDaであるという事実にも関わらず、およそ55.4 kDaの見かけの分子量において泳動していることに注意すべきである。Tanaka論文において報告されているデータについて論じられているように、PEG化化合物の分子量は、球状タンパク質を分子量マーカーとして使用する場合には過大評価される。バンドの定量化は、Tanakaにより使用されている手順と同様の、デンシトメトリーにより行うことができる。しかしながら、バイオアナライザーにより提供される迅速な自動定量化機能が、SDS-PAGEのために求められるもっと面倒で退屈な定量化手順よりも好んで用いられ、そして2つの技術により得られる結果は同様である。
【００９８】
これらの結果と、Tanaka論文およびSatake-Ishikawa論文における情報との比較に基づくと、本発明のPEGx-GCSFコンジュゲートおよびPEG[x]-GCSFコンジュゲート混合物におけるPEG化の程度と比べて、以前記述された組成物におけるPEG化の程度は相当低い。Satake-Ishikawa論文の図1におけるデンシトメトリースキャンとの比較は、Satake-IshikawaのPEG/タンパク質比1、5、10、および50におけるSS-PEGとGCSFの反応が、モノ-PEG、モノ-PEG＋ジ-PEG、モノ-PEG＋ジ-PEG＋トリ-PEGからジ/トリ/テトラ-PEG混合物まで、ただし大部分はモノ-およびジ- PEG化GCSFの混合物からなるプロファイルをもたらすことを示している。
【００９９】
Tanaka論文における実験は、「PEG2」により修飾されたGCSFを利用しており、これは、Satake-Ishikawa論文に記述されているように2,4-ビス(O-メトキシポリエチレングリコール)-6-クロロ-s-トリアジン（活性化PEG 10,000；PEG2とも呼ばれる）であると当業者に理解される。これは本発明のプロセスで好ましく使用されるSC-PEGとは実質的に異なる化学である。Tanaka論文は、PEG2（平均分子量10,000）をGCSFのPEG化に使用し、得られた分子量は、30 kDa、40 kDa、および66 kDaのあいだで分配された約45 kDaであったと述べている。これはそれぞれ1つ、2つ、および3つのPEG、平均2つのPEGによる修飾と一致している。
【０１００】
従って、Tanaka論文およびSatake-Ishikawa論文のいずれかにより開示された方法により調製されるコンジュゲートは、本発明のxが4〜8であるPEGx-GCSFコンジュゲートまたは[x]が4、5、6、7もしくは8もしくはそれより大きい個々のコンジュゲートのPEG[x]-GCSF集団に存在するものよりもはるかに低いPEG化比率を有するものとして特徴付けられるコンジュゲートの混合物をもたらす。
【０１０１】
［PEGx-GCSFコンジュゲートにおけるPEG化の位置］
以下の考察においてGCSF分子上の位置への数字的参照の全ては、図1に示されるアミノ酸配列、すなわち配列番号1に対応する。
【０１０２】
本発明の実施形態による、4以上の[x]を有するPEG[x]-GCSFのコンジュゲート混合物の試料を、酸性残基であるグルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシ側鎖に特異的であるエンドプロテアーゼGlu-Cで消化した。N末端およびリジン-17を含むGlu-C断片1〜20、ならびに、リジン-35およびリジン-41を含むGlu-C断片35〜47は、Glu-Cペプチドマップの非PEG化領域には見出されず、このことはそれらがPEG化されたことと合致していた。対照的に、リジン-24を含むGlu-C断片21〜34は、その残基におけるPEG化を示さず、完全に不在であるかまたは検出レベル未満の微量であることが示唆された。このデータは、GCSFの各分子上に平均4〜6のPEGが存在していることを示すPEG化度合いのデータと合わせると、本発明のコンジュゲートがGCSFのN末端ならびに第17位、第35位、および第41位のリジンにおいて著しくPEG化されていることと合致する。このデータは、N末端ならびに第17位、第35位、および第41位のリジンは高度に露出しており、結果としてSC-PEGのような求電子試薬に対して反応性であるが、第24位のリジンはタンパク質の三次元構造の中に比較的埋もれており、結果として非常に制限されたSC-PEGとの反応性を示すという予測と合致する。上述したバイオアナライザーおよびSDS-PAGEの実験からの証拠は、本発明によって7個に及ぶPEGがGCSFに取り付けられ得、GCSFに取り付けられたPEGの平均数は4よりも5に近いというものであるから、残りの3つのPEGの取付け位置は、第44位、第53位、第80位、第157位、および第171位に存在するヒスチジン残基のイミダゾール基上であり、優先的な修飾は、個々のヒスチジン残基の露出の相対的程度および局所的電子環境により決定されると考えられる。
【０１０３】
［実施例3：インビトロ実験結果］
この実施例は、(i)ある種の癌細胞および(ii)正常な骨髄前駆細胞に関して、本発明のPEG[x]-GCSFの細胞増殖活性をNEULASTA（登録商標）のものと比較する。
【０１０４】
成長因子を評価するための標準的な生物学的スクリーニング試験は、GCSF製品の分析および医薬ロット出荷のために特に開発された細胞株の使用を含む。マウスM-NSF-60細胞株が開発され、現在、GCSFタンパク質の医薬出荷試験のために広く使用されている（Mire-Sluiset. Al., Pharm. Pharmacol. Commun. 5, 45-49; Shirafuji N1, Exp Hematol. 1989 Feb;17(2):116-9）。
【０１０５】
上記実施例1に従って調製したPEG[x]-GCSFの試料を、世界保健機関からのPEG-GCSFの国際標準（WHO STD）およびアムジェン社の市販製剤（NEULASTA（登録商標））と平行して、M-NFS-60細胞を用いてバイオアッセイで分析した。M-NFS-60細胞はATCCから購入し、62 ng/mLの組換えGCSF（r-GCSF）の存在下で、週ごとに2回、最低で20継代に渡って連続的に継代培養した。トリパンブルー色素排除を通じて細胞生存性を監視し、培養物生存率が>95%に維持されるようにした。第1日目に、細胞をカウントして、増殖培地（10% FBS、0.05 mM BME、1xペニシリン／ストレプトマイシン、および62 ng/mLのヒトr-GCSFで補完されたRPMI 1640）mLあたり5x105細胞に細胞密度を調節した。24時間後、トリパンブルー排除によって細胞数を決定し、細胞を遠心分離で回収して、アッセイ培地（10%ウシ胎児血清（FBS）、0.05mM BME、1xペニシリン／ストレプトマイシンで補完されたRPMI 1640）中に5x105細胞/mLにて懸濁し、37℃に戻して24時間置いた。第3日目に、細胞をカウントして、アッセイ中2x105細胞/mLに密度を調節し、ウェルあたり0.1 mLの細胞懸濁液を96ウェルプレートに分配した。アッセイ培地中2xアッセイ濃度の試験材料の段階的5倍希釈を調製し、0.1 mlを加えた。試料を加えた後、プレートを37℃インキュベーターに戻して48時間置いた。第5日目に、0.04 mLのプロメガCell Titer Aqueous One（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を各ウェルに加え、37℃でインキュベートした。4時間のインキュベーションの後、490 nMにおける吸光度（OD）を測定し、データをマイクロソフトエクセル（MSXL）ワークブックファイルに書き出した。処理済み細胞のODは未処理対照ウェルのODに対して基準化され、対照に対するパーセンテージとして表された。効力推定は、3パラメータロジスティック曲線当てはめモデルにデータを当てはめることによって行った（図6）。図6からのEC50、95%信頼区間、および適合度の代表的値をすぐ下の表2に示す。表2中の「相対的効力」の列は、本発明のPEG[x]-GCSF（表中は「ANF-Rho」と表示されている）と、WHO PEG-GCSFまたはNEULASTA（登録商標）との間の差の倍数を表す。
【表２】
2018519359.tif 000004
【０１０６】
図6および表2に示すように、WHO STD PEG-GCSFおよびNEULASTA（登録商標）はそれぞれ、0.15および0.02 ngのナノグラム未満効力値を示した。それに対し、本発明のPEG[x]-GCSF（図6および表2では「ANF-Rho」と表示されている）のEC50値は、約38 ng/mLのEC50値であり、255〜1955倍効力が低いと推定された。PEG-GCSFの3つ全ての調製物は、それぞれの最大処理濃度において同等に細胞増殖を引き起こすことができた。
【０１０７】
マウス癌細胞株を使用して実施した上記実験との比較の目的で、正常ヒト細胞に対する本発明のPEG[x]-GCSFの効果も測定した。具体的には、下記の手順に従って、造血幹細胞を、NEULASTA（登録商標）あるいは本発明のPEG[x]-GCSFのどちらかで処理し、CD34(+)幹細胞の成熟好中球への分化および増殖をフローサイトメトリーで定量化した。
【０１０８】
凍結保存された骨髄CD34+細胞およびCFCキットは、ステムセルテクノロジーズ社（カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）から購入し、細胞は、アッセイ時まで-135℃で保存した。10% FBSで補完された Iscove修正型ダルベッコ培地（IMDM）（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を37℃に加温した。バイアルを37℃槽に置くことにより細胞を解凍し、0.01 mL試料について生存率を直ちに決定した。細胞を、300μgのDnase I（ライフテクノロジーズ社）を含む無菌50mlチューブに移した。チューブを穏やかに回旋させ、最終体積が20mlになるまで加温培地を加えることにより、細胞をゆっくりと加温し続けた。懸濁液を穏やかに反転させることによって混合した。それからチューブを、室温で15分間、スウィングローター（swinging bucket rotor）で200g（840rpm、R&D lab、ベックマンJS4.2）にて遠心分離処理した。ピペットで上清を注意深く取り除き、少量の培地を残した。それから、残った培地に細胞ペレットを懸濁させ、次に20 mLの培地を加えて、穏やかな反転により細胞を混合した。この工程をもう一度繰り返した後に、細胞ペレットを1mLの培地に懸濁させ、細胞密度を1.5x105細胞/mlとした。
【０１０９】
MethoCult培地（ステムセルテクノロジーズ社、カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を4℃で一晩解凍し、その後、アッセイ開始の直前に25℃にした。それからNEULASTA（登録商標）および本発明のPEG[x]-GCSFを加えて50 ng/mLの最終アッセイ濃度とし、ボルテックスにより穏やかに混合した。中でふたを伴う2つの35 mm培養ディッシュを、ふたを有する100 mmペトリディッシュ中に置いた。適切な湿度レベルを維持するために、ふたを伴わず水を含む3つ目の35 mm培養ディッシュを追加した。細胞を、2% FBSで補完されたIMDM中に希釈して5x105細胞/mLの最終濃度とした。0.3 mlの希釈細胞を3 ml MethoCultのチューブに加え、ボルテックスにより穏やかに混合した。混合物を少なくとも5分間静置して、泡を最上部まで上昇させた。無菌16-ゲージ平滑末端針を無菌3 ml注射器に取り付けた。注射器から空気を排出し、それから針を溶液の表面下に配置し、およそ1 mlを注射器中に引き込んだ。プランジャーを穏やかに押し下げて排出培地を完全に排出させ、空気のスペースが見えなくなるまで繰り返した。細胞を含むMethoCult混合物を注射器中に引き込み、ディッシュに注射器を接触させることなく、各35ディッシュに1.1 mlの体積を分注した。ディッシュを穏やかに傾けて回転させることにより各35ディッシュの表面に渡って培地を均一に分配させ、ふたには培地が接触しないように注意しながら、ディッシュの全ての側の壁に培地を付着させた。培養ディッシュの内容物を100 mmディッシュ中に配置し、カバーを取った35 mmディッシュに約3 mlの無菌水を加え、湿度95%超の5% CO2中で37℃で14日間インキュベートした。2% FBS培地で補完された1 mlのIMDMを各ウェルに加えピペットを上下して完全に混ぜることにより、細胞をメチルセルロースマトリックスから回収した。混合物全体を15 mLチューブに移し、11 mlの培地を加えた。細胞を10分間600xgにてペレットとし、培地上清を吸引した。残った培地に細胞ペレットを懸濁し、トリパンブルー排除により細胞数を決定した。
【０１１０】
細胞ペレットを、320μlの冷染色バッファー（BD Pharmingen社、カリフォルニア州サンノゼ）中で5分間300xgで遠心分離することにより2回洗浄した。各ペレットに50μlのCytofix（BD Pharmingen社）を加えることにより細胞を固定し、穏やかにボルテックスすることにより再懸濁した。細胞を4℃で20分間インキュベートし、それから300 x gで5分間遠心分離した。それから細胞を1 mlの染色バッファーで合計3回洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）またはフィコエリトリン（PE）で直接コンジュゲート化された抗CD66bまたはCD-14抗体により細胞を染色した。直接コンジュゲート化されたアイソタイプ対照抗体を使用することにより染色特異性を確かめた。それからフローサイトメトリーおよびデータ獲得を行った。
【０１１１】
図7は、CD66およびCD14の蛍光強度の二変量プロットの四分ゲーティングを示す。CD66(+)、CD14(-)細胞は顆粒球を示す一方（ゲートE4）CD66(-)細胞、CD14(+)細胞（ゲートE1）はマクロファージに特徴的である。これらの抗原の両方について陽性に染色する細胞はゲートE2に現れる。NEULASTA（登録商標）処理（図7の左パネル）では、11%の細胞がCD66について陽性に染色した一方、本発明のPEG-GCSFコンジュゲートによる処理（図7の右パネル）では、51%の細胞がCD66について陽性に染色した。従って、本発明のコンジュゲートで処理された試料は、同濃度のNEULASTA（登録商標）で処理された試料と比べて、顆粒球の割合が4.6倍高かった。
【０１１２】
これらの結果は、上述したM-NFS-60バイオアッセイ（骨髄性白血病に由来する細胞株を使用し、本発明のPEG[x]-GCSFは現在利用可能な製品よりもはるかに効力が弱かった）におけるデータとは対照的に、本発明のPEG[x]-GCSFは、正常骨髄細胞を顆粒球へと分化および増殖させることにおいてNEULASTA（登録商標）よりもおよそ3桁高い効力を有することを示している。癌細胞株および正常細胞についての対応する効力データを合わせて考慮すると、本発明のPEG[x]-GCSFコンジュゲートは、ある種の癌の腫瘍成長を増悪させることなく正常骨髄細胞の増殖を引き起こすことにおいて、フィルグラスチムおよびPEG-フィルグラスチムと比べてより大きな臨床的治療濃度域（therapeutic window）を有することが予期される。
【０１１３】
従って、NEULASTA（登録商標）と比較した場合、本発明のPEG[x]-GCSFは、驚くべきことに、癌細胞の増殖を引き起こす望ましからぬ活性がはるかに小さい一方、骨髄細胞の増殖を刺激する望ましい活性をはるかに強く有する。
【０１１４】
［実施例4：動物実験結果］
この実施例は、ラットにおけるインビボの薬物動態学的および薬物動力学的な実験の結果を提示するものであり、本発明のPEG[x]-GCSFが好中球産生を刺激する能力がNEULASTA（登録商標）と比較して優れていることを実証している。
【０１１５】
上記実施例1に従って調製された本発明のPEG[x]-GCSFの3つのロットの薬物動態学および薬物動力学を、ラットへの単一皮下（SC）投与後に、NEULASTA（登録商標）と比較した。NEULASTA（登録商標）は購入した。さらに、適切な投与量を調製するために使用した製剤バッファーを、陰性対照として実験に含めた。
【０１１６】
96匹の、10週齢半のオスSprague Dawley（SD）ラットに、好中球減少症を誘導するために、第-1日目に、腹腔内（IP）注射により癌化学療法剤シクロホスファミドをキログラムあたり90ミリグラム投与した。それぞれの試験品を第1日目に皮下（SC）注射により投与した。個々の投与量は、第-1日目および第1日目にそれぞれシクロホスファミドおよび試験品の投与前に測った体重に基づいて計算した。全ての試験品溶液は環境温度に馴染ませ、投与前に穏やかに反転および回旋させた。全ての製剤は透明な溶液であった。シクロホスファミドは注射用無菌水中に再構成し、超音波処理して透明溶液を提供した。本発明のPEG[x]-GCSFの3つ別々のロットを、25、50、および100μg/kgにて投与した。NEULASTA（登録商標）は100μg/kgにて投与した。IPおよびSCの投与量は、それぞれ腹腔領域および剃毛した中肩甲部領域に、注射器と針で投与した。
【０１１７】
投与前、ならびに投与後12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、および288時間後に、注射器と針を通じて頸静脈から血液（およそ0.8 mL）を採取し、K2EDTA抗凝固剤を含むチューブに移した。血液は、投与前は群あたり2匹から、そしてすべての投与後採取については4匹／群／時間点から、採取した。各々の動物についての合計血液試料体積は、施設動物管理使用委員会（IACUC：Institutional Animal Care and Use Committee）の認可限度内であった。
【０１１８】
各血液試料を分割して、およそ400μLの血液を新しいチューブに移して、血漿を得るために遠心分離した。遠心分離に先立って血液試料を氷上に維持した。遠心分離は、採取の1時間以内に始めた。血漿を、ネジぶた付き冷結保存バイアルに移し、ドライアイス上に置いた後に、およそ-70℃において保存した。好中球絶対数（ANC：Absolute Neutrophil Count）を決定した。
【０１１９】
購入したELISAキットを、製造会社の説明書に従って使用して、ヒトGCSF血漿レベルを決定した。（カタログ番号DCS50、RnDシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）。投与後の経過時間の関数としての、本発明のPEG[x]-GCSFバッチおよびNEULASTA（登録商標）の血漿濃度を図8に示す。（本発明のPEG[x]-GCSFに対応するデータセットは、それぞれ「ロット1」「ロット2」および「ロット3」と表示されている。）
【０１２０】
統計学的分析：ANC（103細胞/mLとして表わされる）およびGCSF血漿レベル（ng/mLとして表わされる）はエクセル（マイクロソフト社、ワシントン州レッドモンド）を使用して照合した。データは、プリズムグラフパッド（グラフパッドソフトウェア社、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、投与後経過時間の関数としてのANCまたはGCSF濃度として可視化した。GCSFおよびANCの両方についての曲線下面積、1フェーズ減衰、および線形回帰分析を、ソフトウェア説明書に従って実行した。ダネットの事後検定を用いた分散分析（ANOVA）を行って処置群間の有意差（p<0.05）を立証した。
【０１２１】
図8Aは、どちらのPEG化GCSF分子のレベルも投与後24時間以内にピークに達し、その後比較的速く降下することを示している。しかしながら、図8Bで濃度を対数スケールで可視化する場合には、本発明のコンジュゲートとNEULASTA（登録商標）との間の差が明らかになる。100μg/kgのNEULASTA（登録商標）の濃度は、72時間後にはおよそ3桁落ちる。これは本発明のコンジュゲートとは対照的であり、本発明のコンジュゲートは、実験期間のあいだ、遅い、いくらか定常的な、血漿濃度減少を示し、投与後5日の後にはNEULASTA（登録商標）のレベルの20〜100倍に至るほど残存している。
【０１２２】
処置群の血漿レベルの差をさらに評価する試みで、「曲線下面積」分析（AUC：area under the curve）を使用した薬物動態を用いて、本発明のコンジュゲートおよびNEULASTA（登録商標）の血漿暴露を定量化した。図9Aは、各々の本発明コンジュゲートのロットおよび投与量ならびにNEULASTA（登録商標）についてのAUC値を要約している。100μg/kgで投与された本発明コンジュゲートの各ロットは、同用量のNEULASTA（登録商標）と比較して有意に高い血漿濃度をもたらした。25または50μg/kgで投与された動物からの本発明PEG[x]-GCSFの血漿レベルは、NEULASTA（登録商標）が投与されたラットからの血漿におけるGCSFレベルより有意に低かった（なぜならばNEULASTA（登録商標）の用量は100μg/kgだったから）。用量と血漿曝露との間の関係をさらに特徴分析するために、各々の本発明コンジュゲートのロットのAUC値を用量に基づいてとりまとめ、線形回帰分析に付した（図9B）。100μg/kg投与量の本発明PEG[x]-GCSFについてのまとめられた7322 ng/ml＊時間のAUCは、NEULASTA（登録商標）について算出された5543 ng/ml＊時間よりも有意に高かった。50および25μg/kgの本発明コンジュゲートの投与量は、それぞれ3127および1280という、NEULASTA（登録商標）よりも有意に低いAUC値を生じた（これもやはり、NEULASTA（登録商標）用量は100μg/kgだったのだから、予測外ではない）。この実験では、投与量と血漿AUCとの間に直線的関係が存在している（r2=0.91）。さらに、本発明の個別の100μg/kgコンジュゲートのAUC値を、NEULASTA（登録商標）が投与されたラットからの平均および95%信頼区間と比較した場合、この同じ用量において24匹中22匹のラットが、より高い血漿曝露を達成していた。
【０１２３】
図10は、本発明PEG[x]-GCSF、NEULASTA（登録商標）（NLST）、または製剤バッファー（FB）が投与されたラットからの、時間の関数としての好中球絶対数（ANC）の代表的グラフを示す。二つの点を考慮しなければならない：第一に、FBが投与されたラットでの、好中球のゆっくりとした増加（シクロホスファミド処置後に生得的な増殖応答が回復するため）；そして第二に、いずれかのPEG化試験品の投与の直後のANCレベルの急な上昇である。この第二の点は、骨髄およびその他の区画からの、事前形成されていた未成熟好中球のGCSF媒介性放出、すなわち「幹細胞貯蔵の動員」に起因する（影を付けた領域）。従って、本発明のコンジュゲートまたはNEULASTA（登録商標）により媒介される新規（de novo）増殖を正確に比較するために、AUC分析は96時間より後のANCレベルだけを考慮し、図10の影を付けた領域内のデータはANCの分析に含めなかった。約125時間と250時間の間でのANCカウントの比較は、同等投与量レベルのNEULASTA（登録商標）と比べて本発明のPEG[x]-GCSFでより高いANCカウントを示した。
【０１２４】
効力の差をより精確に分析するために、3つの異なる濃度（25、50、および100μg/kg）における本発明のPEG[x]-GCSFの 3つの独立したロットを用いて、新規増殖期間のあいだの好中球絶対数のAUC（AUC-ANC）を評価した。このようにして、好中球産生のレベルと持続時間とを定量化することができる。図11Aは、本発明のコンジュゲートおよびNEULASTA（登録商標）で処置された好中球減少性ラットからの好中球絶対数のAUCを要約している。製剤バッファーと比較した場合、NEULASTA（登録商標）と本発明のPEG[x]-GCSFはどちらも、各投与量において好中球増殖を有意に増加させることができた。さらに、100μg/kgで投与されたNEULASTA（登録商標）と比較して、50および25μg/kgレベルでの本発明のPEG[x]-GCSFは同様の好中球増殖を達成し、50μg/kg用量の場合には、わずかに上回る好中球増殖を達成した。さらに、NEULASTA（登録商標）と同じ100μg/kg用量における本発明のPEG[x]-GCSFは、著しく高い好中球レベルを達成した。同じデータセットを使用して線形回帰プロットも作成され、NLST（図11Bの影を付けた領域）と比較した本発明のPEG[x]-GCSFの薬物動力学的特性をさらに例証した。
【０１２５】
薬物動態学（図9）および薬物動力学（図10）のデータをまとめると、本発明のPEG[x]-GCSFは、NEULASTA（登録商標）とは異なるプロファイルを表している。本発明のPEG[x]-GCSFの25および50μg/kgの投与量は、100μg/kg NEULASTA（登録商標）と比較して有意に低い血漿レベルを示した。25および50μg/kgの血漿GCSF AUCは、100μg/kg NEULASTA（登録商標）と比較して4.3倍および1.8倍低く、ピークレベルはそれぞれ7.2倍および2.9倍低かった。しかしながら、本発明のコンジュゲートの、このより低い用量（25および50μg/kg）は、インビボでは、100μg/kgのNEULASTA（登録商標）と比べて同等の好中球産生をもたらした。実施例3に提示されるインビトロCD34 (+)前駆細胞の結果（同等の用量の本発明のコンジュゲートがNEULASTA（登録商標）の4倍超の顆粒球を産生することができたことを示している）と合わせると、これらのデータは、好中球産生においてPEG[x]-GCSFはNEULASTA（登録商標）よりも効力が高く、有意に長い循環半減期を有することが示唆される。このことは、本発明の製剤の以下の利点を示唆する：
・NEULASTA（登録商標）のような現在市販されている製剤とは異なり、本発明のPEG[x]-GCSFは、化学療法中の任意の時点で投与することができ、そして必要であれば、現行のまたは増加させた投与量における再投与を検討することができる。本発明のPEG[x]-GCSFの投与後のANCの上昇は、化学療法後の7日間（重篤な好中球減少症のリスクが最も高くなる重要な時期である）のあいだ、NEULASTA（登録商標）に起因し得るものより遅い。これは、NEULASTA（登録商標）は幹細胞貯蔵の大部分を動員する（好中球を急速に産生する結果を伴う）と見られるからであり、従って、NEULASTA（登録商標）の投与説明書は、NEULASTA（登録商標）を再び投与する前に14日間の遅れを求めている（幹細胞を再生させるため）。これに対し、本発明のPEG[x]-GCSFは、幹細胞貯蔵のより小さな部分のみを動員すると見られる（より漸進的でより長続きする好中球産生をもたらす）。この理由で、上記で実証されたようなより遅くより持続的なANCの増加に基づいて、本発明の製剤の場合には14日間の用心は必要ない。さらに、そのような「反復的投与」がないとしても、本発明の製剤の作用は、ANCが好中球減少性レベル（<2.0 x 10e5/L）に落ちることを防ぐ。臨床医は、典型的には、化学療法に対する応答を21日サイクル期間のあいだ監視する。従って、本発明のPEG[x]-GCSFは、腫瘍成長の望まれた減少が観察されない場合に、そのような21日サイクルを通じた任意の時点で化学療法用量強化をサポートするために使用することができる。
・本発明のPEG[x]-GCSFは、NEULASTA（登録商標）と比較して、より低い、それでいて同等以上に有効な投与量で、および／または、より低い頻度の投与で、患者を処置でき、例えば骨痛の低減をもたらすという点で、改善されたクオリティ・オブ・ライフを患者に提供する。
【０１２６】
［実施例5：臨床試験（骨痛）］
非PEG化およびPEG化GCSFの多数の治験において、骨痛は最も顕著で害になる有害事象である（Renwick et. al., 2009）。GCSF処置媒介性の骨痛を防止および治療することを試みたいくつかの種類の治療的介入が存在してきた。アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、およびオピオイドが、痛みを軽減するための試みで使われてきたが、成功の程度はまちまちである（Kirsher, 2007、Oagata 2005）。一つの観察的遡及研究は、PEG-フィルグラスチムの用量を6 mgから4 mgに減少させた場合に、25人の患者において骨痛が観察されなかったことを示した（Paba et al 2008）。上述した前臨床的な薬物動態学および薬物動力学に基づけば、本発明のPEG[x]-GCSFは、より低い用量でNEULASTA（登録商標）と同じくらい効力を有する可能性がある。そうすると、そのような低い用量で、本発明のコンジュゲートはNEULASTA（登録商標）投与に伴う骨痛を引き起こさないであろう。
【０１２７】
体重kgあたり5から10、20、40、80μgまでの漸増的単一皮下用量の本発明のコンジュゲートに基づく投与レジメンを含む、臨床試験を行った。二重盲検、ランダム化、プラセボ対照試験も行って、NEULASTA（登録商標）との比較における、ヒトでのPEG[x]-GCSFの安全性、耐容性、薬物動態学および薬物動力学を研究した。ボランティアに、一次安全性エンドポイントを有する本発明のコンジュゲートの漸増的投与量を皮下投与する。さらに、その他のパラメータの中では、骨痛スコアを、本発明のコンジュゲートとNEULASTA（登録商標）の両方についてベースライン値と比較する。特定の骨痛質問表と共に、視覚的アナログ尺度（VAS）を使用して全般的な痛みを決定する。VASと骨痛はどちらも、痛み記述語が付けられ線の左（無痛）側からの距離を測定することによって痛みが示される100 mm水平線を用いて定量化される。本発明のコンジュゲートが投与される患者は、NEULASTA（登録商標）が投与される患者よりも少ない骨痛を報告する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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