(57)【要約】  本発明は、微生物ａ−アミラーゼを含む動物飼料組成物を提供する。本発明は、成長（体重増加）、平均１日体重増加または動物による飼料利用の効率を増大させるか、または動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を動物に供給する工程を含む方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物。
【請求項２】
前記微生物α−アミラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドまたは配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む、請求項１に記載の動物飼料組成物。
【請求項３】
植物材料を含む動物飼料組成物であって、前記植物材料が、組み換えα−アミラーゼを含む、動物飼料組成物。
【請求項４】
前記組み換えα−アミラーゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有するポリペプチドを含む、請求項３に記載の動物飼料組成物。
【請求項５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位に由来する植物材料を含む動物飼料組成物。
【請求項６】
前記トランスジェニック植物または植物部位が、前記植物材料の約１質量％〜約１００質量％を占める、請求項５に記載の動物飼料組成物。
【請求項７】
前記植物材料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、請求項５または６に記載の動物飼料組成物。
【請求項８】
前記植物材料が、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、および／またはキビに由来する、請求項３〜７のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項９】
前記植物材料が、トウモロコシである、請求項８に記載の動物飼料組成物。
【請求項１０】
前記トウモロコシが、トウモロコシ事象３２７３を含む、請求項９に記載の動物飼料組成物。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物に由来する前記植物材料が、種子である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項１２】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含むトウモロコシ飼料。
【請求項１３】
前記トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する前記植物材料が、前記トウモロコシ飼料の約１質量％〜約１００質量％を占める、請求項１２に記載のトウモロコシ飼料。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のトウモロコシ飼料を含む動物飼料組成物。
【請求項１５】
前記トウモロコシ飼料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、請求項１４に記載の動物飼料組成物。
【請求項１６】
動物が、家畜、動物園の動物および／またはコンパニオンアニマルである、請求項１〜１１または１４もしくは１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項１７】
動物の平均１日体重増加を増大させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記平均１日体重増加が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
【請求項１８】
動物の成長速度（体重増加）を増大させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記成長速度が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
【請求項１９】
動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給し、それにより、所望の体重を達成するのに必要な前記日数を減少させる工程を含む方法。
【請求項２０】
前記動物の所望の体重を達成するのに必要な前記日数が、約１日〜約２０日だけ減少される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物による飼料利用の効率を増大させる方法であって、前記動物による飼料利用の前記効率を増大させるのに有効な量で請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含む方法。
【請求項２２】
前記動物による飼料利用の前記効率が、約１％〜約２５％だけ増大される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物が、１日当たり約１ポンド〜約３０ポンドの前記動物飼料組成物を供給される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物が、１日当たり約１回〜約３回、前記動物飼料組成物を供給される、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記動物が、哺乳動物、鳥類、または魚類である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはブタである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、またはカモである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
動物によるトウモロコシの飼料価値を増大させる方法であって、請求項８または１５に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物によるトウモロコシの前記飼料価値が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１％〜約２５％だけ増大される、方法。
【請求項２９】
動物の飼料利用の効率を増大させる方法であって、請求項８または１５に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の飼料利用の前記効率が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約０．００５〜約０．０３だけ増大される、方法。
【請求項３０】
前記組み換えα−アミラーゼがその基質以外に標的化される、請求項５または１２に記載の動物飼料組成物。
【請求項３１】
前記組み換えα−アミラーゼが、葉緑体、液胞、細胞質、アポプラストおよび小胞体からなる群から選択される細胞小器官に標的化される、請求項３０に記載の動物飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の電子提出に関する陳述
２０１６年４月４日に作成され、ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された、１５，１７９バイトのサイズで“８０７８３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名称である、米国特許法施行規則（３７  ＣＦＲ）第１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表が紙のコピーの代わりに提供される。この配列表は、その開示のために参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、動物飼料組成物および動物の体重増加を増大させるためにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物飼料(animal feed)は、（１）濃縮物または化合物飼料および（２）粗飼料の２つの群に分類することができる。脂肪、穀物およびそれらの副産物（オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、コムギ）、高タンパク質油かす（ｏｉｌ  ｍｅａｌ）または油かす（ｏｉｌ  ｃａｋｅ）（ダイズ、キャノーラ、綿実、ピーナッツなど）、ならびにペレットまたは屑の形態で生成され得る、サトウダイコン、サトウキビ、動物、および魚類の加工からの副産物を含む濃縮物または化合物飼料はエネルギー値が高い。濃縮物または化合物飼料は、その他のあらゆるフード飼料(food ration)として提供され得るものを補給して１日に必要な食品の必要量の全てを提供することができ、または飼料(ration)の一部を提供することができる点で完全であり得る。粗飼料(roughage)としては、牧草、干し草、サイレージ、根菜作物、わら、および茎葉（トウモロコシ茎葉）が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
飼料は、食糧生産用の動物の飼育の最も大きいコストを占める。したがって、本発明は、動物飼料利用の効率を向上させ、それによって生産のコストを削減するための組成物および方法に関する。
【０００５】
本発明の一態様は、微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物を提供する。ある態様において、微生物α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドまたは配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。
【０００６】
本発明の別の態様は、植物材料を含む動物飼料組成物であって、植物材料が発現異種α−アミラーゼを含む、動物飼料組成物を提供する。ある特定の実施形態において、発現異種α−アミラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００７】
本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位に由来する植物材料を含む動物飼料組成物をさらに提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含むトウモロコシ飼料(ration)を提供する。本発明のさらに別の態様は、本発明のトウモロコシ飼料(ration)を含む動物飼料組成物を提供する。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、動物の平均１日体重増加を増大させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の平均１日体重増加が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、動物の成長速度（体重増加）を増大させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の成長速度が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに他の態様は、動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給し、それにより、所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる工程を含む方法を提供する。
【００１２】
他の態様において、動物による飼料利用の効率を増大させる方法であって、前記動物による飼料利用の効率を増大させるのに有効な量で本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
ここで、本発明の上記のおよび他の態様が、本明細書に記載される他の実施形態に関してより詳細に記載される。本発明が様々な形態で実施され得、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈されるものではないことが理解されるべきである。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
文脈上特に示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴が任意の組合せで使用され得ることが特に意図される。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明のある実施形態において、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組合せが除外または省略され得ることも想定している。例示するために、組成物が成分Ａ、ＢおよびＣを含むことを本明細書が記載している場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれかまたはそれらの組合せが単独でまたは任意の組合せで除外され、特許請求されないことがあることが特に意図される。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明に使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定することは意図されない。
【００１７】
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明記されない限り、複数形も含むことが意図される。
【００１８】
本明細書において使用される際、「および／または」は、関連する列挙される項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈されるときには組合せの欠如を指し、それらを包含する。
【００１９】
本明細書において使用される際の「約」という用語は、投与量、量または期間などの測定可能な値に言及するとき、規定の量（例えば、増加した体重または提供される飼料の量）の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、あるいは±０．１％の変動を包含することが意図される。
【００２０】
本明細書において使用される際、「Ｘ〜Ｙ」および「約Ｘ〜Ｙ」などの語句は、ＸおよびＹを含むものと解釈されるべきである。本明細書において使用される際、「約Ｘ〜Ｙ」などの語句は、「約Ｘ〜約Ｙ」を意味する。本明細書において使用される際、「約ＸからＹまで」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」という用語は、記載される特徴、整数、工程、動作、要素、および／または成分の存在を規定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、動作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在または追加を除外しない。
【００２２】
本明細書において使用される際、「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に記載される規定の材料または工程、および特許請求される本発明の基本的および新規な特徴に実質的に影響を与えないものを包含するものと解釈されることを意味する。したがって、本発明の特許請求の範囲において使用されるときの「から本質的になる」という用語は、「含む」と均等であると解釈されることが意図されない。
【００２３】
本発明は、動物飼料利用の効率を向上させ、それによって生産のコストを削減するための組成物および方法に関する。本発明者らは、微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物を供給された動物が、前記飼料組成物を供給されない動物と比較して平均１日体重増加または成長速度の増大、飼料利用の効率の増大を有することができ、または所望の体重を達成するための減少された日数を必要とすることを意外にも発見した。
【００２４】
したがって、本発明の一態様において、微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物が提供される。本発明のさらなる態様において、微生物α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドまたは配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。ある実施形態において、α−アミラーゼは液体である。したがって、本発明のある実施形態において、本発明の動物飼料組成物は、動物に提供される飼料に添加され得る液体微生物α−アミラーゼを含む栄養補助食品であり得る。
【００２５】
別の態様において、本発明は、植物材料を含む動物飼料組成物であって、植物材料が、発現された組み換えα−アミラーゼを含む、動物飼料組成物を提供する。ある特定の実施形態において、発現された組み換えα−アミラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位に由来する植物材料を含む動物飼料組成物を提供する。
【００２６】
特定の実施形態において、トランスジェニック植物または植物部位は、植物材料の約１質量％〜約１００質量％を占め得る。したがって、例えば、トランスジェニック植物または植物部位は、植物材料の質量基準で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、またはその中の任意の範囲を占め得る。したがって、ある実施形態において、植物材料は、１つまたは複数の異なるタイプの植物を含み得る。したがって、例えば、植物材料は、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現された植物に由来し得る。他の実施形態において、植物材料は、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現された植物に由来する材料および前記組み換えまたは異種α−アミラーゼを発現しない植物（例えば、商品植物）に由来する材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。したがって、ある実施形態において、植物材料が、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現された植物に由来する材料および前記組み換えまたは異種α−アミラーゼを発現しない植物（例えば、商品植物）に由来する材料を含むとき、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現された植物に由来する材料は、植物材料の約１質量％〜約９９質量％を占めることができ、前記組み換えまたは異種α−アミラーゼを発現しない植物に由来する材料は、植物材料の約９９質量％〜約１質量％を占め得る。
【００２７】
さらなる実施形態において、植物材料は、動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占め得る。したがって、例えば、植物材料は、動物飼料組成物の質量基準で約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、および／またはその中の任意の範囲を占め得る。
【００２８】
本発明の動物飼料は、本発明で有用である任意の形態であり得る。したがって、ある実施形態において、動物飼料の形態は、限定はされないが、ペレット、混合された１つまたは複数のタイプの穀粒（すなわち、混粒（mixed grain））を含む穀粒(grain)、穀粒とペレットとの混合物、サイレージ、乾燥圧延されたもの、蒸気フレーク(steam flaked)されたもの、全粒(whole kernel)、粗挽きした穀粒（例えば、粗挽きしたトウモロコシ）、高水分トウモロコシおよび／またはそれらの任意の組合せであり得る。ある実施形態において、動物飼料は、粗挽きした穀粒、湿潤蒸留穀物残渣（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎ）、乾燥蒸留穀物残渣、トウモロコシサイレージ、栄養補助食品／液体栄養補助食品、トウモロコシグルテン飼料、および／または粉砕干し草を含むがこれらに限定されない他の成分を含み得る。
【００２９】
本明細書において使用される際、「植物材料」という用語は、胚乳、胚（胚芽）、果皮（ふすま）、茎（茎頂）、花粉、胚珠、種子（穀粒）、葉、花、枝、茎、果実、穀粒、穂、穂軸、外皮、柄、根、根端、葯、植物および／または植物の部位において無傷である植物細胞を含む植物細胞、植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊などを含むがこれらに限定されない任意の植物部位を含む。さらに、本明細書において使用される際、「植物細胞」は、細胞壁を含む、植物の構造的および生理的単位を指し、プロトプラストを指すこともある。本発明の植物細胞は、単離された単一細胞の形態であり得、もしくは培養細胞であり得、または例えば、植物組織もしくは植物器官などの高度に組織化された単位の一部であり得る。「プロトプラスト」は、細胞壁を有さないまたは細胞壁の一部のみを有する単離された植物細胞である。したがって、本発明のある実施形態において、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換えα−アミラーゼを含む細胞を含み、細胞は、根細胞、葉細胞、組織培養物細胞、種子細胞、花細胞、果実細胞、花粉細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の植物または植物部位の細胞である。代表的な実施形態において、植物材料は、種子または穀粒であり得る。
【００３０】
植物材料は、任意の植物に由来し得る。ある実施形態において、植物材料は、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現され得る植物に由来する。さらに、本明細書に記載されるように、他の実施形態において、植物材料は、組み換えまたは異種（例えば、微生物）α−アミラーゼが発現された植物および前記組み換えまたは異種α−アミラーゼを発現しない植物（例えば、商品植物）に由来する植物材料の混合物であり得る。したがって、代表的な実施形態において、植物材料は、通常の「商品」植物材料（例えば、商品トウモロコシ）と、組み換えまたは異種α−アミラーゼを発現する本発明のトランスジェニック植物に由来する植物材料との混合物であり得る。
【００３１】
したがって、ある実施形態において、植物材料は、トウモロコシ植物、ソルガム(sorghum)植物、コムギ植物、オオムギ植物、ライムギ植物、オートムギ植物、コメ植物、および／またはキビ植物に由来し得る。代表的な実施形態において、植物材料は、トウモロコシ植物に由来し得る。他の実施形態において、植物材料は、トウモロコシ植物に由来する種子または穀粒であり得る。特定の実施形態において、植物材料は、トウモロコシ事象(event)３２７３を含むトウモロコシ植物であり得る（米国特許第８，０９３，４５３号明細書を参照）。
【００３２】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含む「完全混合飼料」を提供する。本明細書において使用される際、「完全混合飼料」は、例えば、トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料（例えば、トウモロコシ穀粒、粗挽きしたトウモロコシなど）、栄養補助食品および添加剤、（例えば、ビタミンおよびミネラル）、および／または「粗飼料」（例えば、牧草、干し草、サイレージ、根菜作物、わら、および茎葉（トウモロコシ茎葉））を含む、個別の動物への２４時間の飼料供給を意味し得る。
【００３３】
ある実施形態において、トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料は、完全混合飼料の約１質量％〜約１００質量％を占める。したがって、例えば、トランスジェニック植物または植物部位は、植物材料の質量基準で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、および／またはその中の任意の範囲を占め得る。
【００３４】
他の実施形態において、本発明の完全混合飼料を含む動物飼料組成物が提供される。ある実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占め得る。したがって、例えば、完全混合飼料は、動物飼料組成物の質量基準で約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、および／またはその中の任意の範囲を占め得る。代表的な実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の約５０％を占める。
【００３５】
さらに他の実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含むトウモロコシ飼料を提供する。本明細書において使用される際、「トウモロコシ飼料」は、個別の動物への２４時間のトウモロコシ供給を意味する。
【００３６】
ある実施形態において、トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料は、トウモロコシ飼料の約１質量％〜約１００質量％を占める。したがって、例えば、トランスジェニック植物または植物部位は、植物材料の質量基準で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、および／またはその中の任意の範囲を占め得る。
【００３７】
他の実施形態において、本発明のトウモロコシ飼料を含む動物飼料組成物が提供される。ある実施形態において、トウモロコシ飼料は、動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占め得る。したがって、例えば、トウモロコシ飼料は、動物飼料組成物の質量基準で約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、および／またはその中の任意の範囲を占め得る。代表的な実施形態において、トウモロコシ飼料は、動物飼料組成物の約５０％を占める。
【００３８】
ある実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の約１０質量％〜約４０質量％であり得る湿潤トウモロコシグルテン飼料を含み得る。さらなる実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の質量基準で約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％であり得る湿潤トウモロコシグルテン飼料を含み得る。
【００３９】
他の実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の約５質量％〜約２５質量％であり得る可溶性物質添加改変蒸留穀物残渣を含み得る。さらなる実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の質量基準で約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％であり得る可溶性物質添加改変蒸留穀物残渣を含み得る。
【００４０】
さらなる実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の約５質量％〜約２５質量％であり得る可溶性物質添加湿潤蒸留穀物残渣を含み得る。さらなる実施形態において、完全混合飼料は、動物飼料組成物の質量基準で約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％であり得る可溶性物質添加湿潤蒸留穀物残渣を含み得る。
【００４１】
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「相同体」と呼ばれる。相同体という用語は、同じおよび他の種に由来する相同配列、ならびに同じおよび他の種に由来するオーソロガス配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち、配列類似性または同一性）のパーセントに関して、２つ以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルを指す。相同性は、異なる核酸またはタンパク質の間の類似の機能特性の概念も指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）に対する相同体をさらに含む。本明細書において使用される際の「オーソロガス」は、種形成の際に共通の先祖遺伝子に由来する異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明の相同体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５に対する実質的配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）を有する。
【００４２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５の相同体は、単独でまたは互いにおよび／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５と組み合わせて、本発明の任意の飼料組成物または方法とともに用いられ得る。
【００４３】
本明細書において使用される際、「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の一連のアラインメントにわたって不変である程度を指す。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に計算され得る。
【００４４】
本明細書において使用される際、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適にアラインメントされているとき、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した参照（「問い合わせ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の線形ポリヌクレオチド配列における同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。ある実施形態において、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列における同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
【００４５】
２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列に関連して、「実質的に同一」という語句は、本明細書に記載され、当該技術分野において公知であるような以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または目視検査によって測定される際に最大一致性について比較およびアラインメントされるとき、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。本発明のある実施形態において、実質的同一性は、長さが少なくとも約５０の残基〜約２００の残基、約５０の残基〜約１５０の残基などである配列の領域にわたって存在する。したがって、本発明のある実施形態において、実質的同一性は、長さが少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、またはそれを超える残基である配列の領域にわたって存在する。さらなる実施形態において、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。さらに、代表的な実施形態において、実質的に同一のヌクレオチドまたはタンパク質配列は、実質的に同じ機能（例えば、α−アミラーゼ活性）を果たす。したがって、ある特定の実施形態において、配列は、少なくとも約１５０の残基にわたって実質的に同一であり、α−アミラーゼ活性を有する。
【００４６】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が試験配列を比較するための参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００４７】
比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法の探索などの手段により、ならびに任意選択的にＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施により行われ得る。試験配列および参照配列のアラインメントされたセグメントの「同一性割合」は、２つのアラインメントされた配列が共有する同一の構成要素の数を参照配列セグメント、すなわち、全参照配列または参照配列のより小さい規定の部分における構成要素の総数で除算した値である。配列同一性パーセントは、同一性割合に１００を乗算した値として表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長のポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に及び得る。本発明の趣旨では、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０、およびポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０を用いて決定され得る。
【００４８】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされるときに一致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たす、問い合わせ配列の長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次に、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対のための報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下降したとき、累積スコアが１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のためにゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列の末端に達したとき、各方向におけるワードヒットの拡張は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ値、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【００４９】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、参照ヌクレオチド配列との試験ヌクレオチド配列の比較における最小合計確率が約０．１未満〜約０．００１未満である場合、試験核酸配列は、参照配列と類似していると考えられる。したがって、本発明のある実施形態において、参照ヌクレオチド配列との試験ヌクレオチド配列の比較における最小合計確率は約０．００１未満である。
【００５０】
２つのヌクレオチド配列はまた、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするとき、実質的に同一であると考えられ得る。ある代表的な実施形態において、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。
【００５１】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔm）より約５℃低くなるように選択される。
【００５２】
Ｔmは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴmに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルタ上に１００を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、約１５分間にわたって７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、１５分間にわたって６５℃で０．２×ＳＳＣの洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については以下のＳａｍｂｒｏｏｋを参照）。多くの場合、バックグラウンドプローブ信号を除去するために、高度のストリンジェンシー洗浄前に低度のストリンジェンシー洗浄を行う。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための中程度のストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間にわたって４５℃で１×ＳＳＣである。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための低度のストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間にわたって４０℃で４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件は、典型的に、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含み、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける非関連プローブについて観察されるものの２倍またはより高い信号対雑音比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、ヌクレオチド配列のコピーが遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて作成されるときに起こり得る。
【００５３】
以下は、参照ヌクレオチド配列（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）に対して実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするのに使用され得る一連のハイブリダイゼーション／洗浄条件の例である。一実施形態において、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で洗浄しながら、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ中で「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。別の実施形態において、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で洗浄しながら、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ中または５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で洗浄しながら、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ中で「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。さらに他の実施形態において、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で洗浄しながら、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ中または６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で洗浄しながら、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ中で「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【００５４】
特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列が実質的に同一であるというさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるタンパク質が、第２の核酸によってコードされるタンパク質と免疫学的に交差反応性であるか、またはそれと特異的に結合することであり得る。したがって、ある実施形態において、例えば、２つのポリペプチドが、保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは第２のポリペプチドに対して実質的に同一であり得る。
【００５５】
したがって、本発明のある実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する実質的配列同一性を有するヌクレオチド配列が提供される。「実質的配列同一性」または「実質的配列類似性」は、別のヌクレオチド配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％の同一性または類似性を意味する。したがって、さらに別の実施形態において、「実質的配列同一性」または「実質的配列類似性」は、別のヌクレオチド配列との約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８１％〜約１００％、約８２％〜約１００％、約８３％〜約１００％、約８４％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約８６％〜約１００％、約８７％〜約１００％、約８８％〜約１００％、約８９％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９１％〜約１００％、約９２％〜約１００％、約９３％〜約１００％、約９４％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９６％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、および／または約９９％〜約１００％の同一性または類似性の範囲を意味する。したがって、ある実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列に対する実質的配列同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。ある実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列に対する８０％〜１００％の同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。代表的な実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列に対する９５％の同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００５６】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、αアミラーゼ活性を有する。
【００５７】
ある実施形態において、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列は、保存的に修飾された変異体であり得る。本明細書において使用される際、「保存的に修飾された変異体」は、配列中の単一のアミノ酸またはヌクレオチドまたは少ないパーセンテージのアミノ酸またはヌクレオチドを改変、付加または欠失させる個別の置換、欠失または付加を含むポリペプチドおよびヌクレオチド配列を指し、ここで、改変は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。
【００５８】
本明細書において使用される際、ポリペプチドの保存的に修飾された変異体は、生物学的に活性であり、したがって、本明細書に記載されるように、参照ポリペプチド（例えば、α−アミラーゼ活性）の所望の活性を有する。変異体は、例えば、遺伝的多型または人間の操作から生じ得る。参照ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される際、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性または類似性（例えば、約４０％〜約９９％またはそれを超える配列同一性または類似性およびその中の任意の範囲）を有し得る。活性な変異体は、１〜１５程度のアミノ酸残基、１〜１０程度、例えば６〜１０、５程度、４、３、２、またはさらには１つ程度のアミノ酸残基だけ参照ポリペプチド配列と異なり得る。
【００５９】
天然の変異体が集団内に存在し得る。このような変異体は、後述されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびハイブリダイゼーションなどの周知の分子生物学技術を用いて同定され得る。合成的に誘導されたヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリペプチドをコードする、部位特異的突然変異またはＰＣＲ媒介突然変異によって生成される配列も変異体として含まれる。置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質中に導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸置換、付加、または欠失は、本明細書に開示されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に導入され得る。付加（挿入）または欠失（切断）は、天然タンパク質のＮ末端またはＣ末端において、または天然タンパク質の１つもしくは複数の部位において行われ得る。同様に、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換は、天然タンパク質の１つまたは複数の部位において行われ得る。
【００６０】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１つまたは複数の予測される好ましくは非必須アミノ酸残基において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変せずにタンパク質の野生型配列から改変され得る残基であるが、「必須」アミノ酸は生物学的活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において公知である。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このような置換は、保存アミノ酸残基または保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基（ここで、このような残基はタンパク質活性に必須である）には行われない。
【００６１】
例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、酵素をコードするヌクレオチド配列を突然変異させることによって作製され得る。得られた変異体は、植物中で組み換え的に発現され、当該技術分野において周知の方法を用いてα−アミラーゼ活性を分析することにより、生物学的活性を保持するものについてスクリーニングされ得る。突然変異およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；およびＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ＆Ｇａａｓｔｒａ  ｅｄｓ．，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８３）およびその中で引用される参考文献；ならびに米国特許第４，８７３，１９２号明細書を参照されたい。明らかに、変異体をコードするＤＮＡにおいて行われる突然変異は、リーディングフレームを破壊してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を生成しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号明細書を参照されたい。該当するタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換についての指針は、参照により本明細書に援用されるＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（米国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出される。
【００６２】
本明細書に記載されるポリペプチドにおける欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特性（例えば、ポリペプチドの活性）の根本的な変化を生じることは予想されない。しかしながら、それを行う前に置換、欠失または挿入の厳密な影響を予測することが難しい場合、当業者は、該当する特定のポリペプチド活性（例えば、α−アミラーゼ活性）についてスクリーニングすることが可能な通例のスクリーニングアッセイによって影響を評価することができることを理解するであろう。
【００６３】
ある実施形態において、本発明の組成物は、ポリペプチドの活性な断片を含み得る。本明細書において使用される際、「断片」は、α−アミラーゼのポリペプチド活性を保持する参照ポリペプチドの部分を意味する。断片はまた、参照ポリペプチドをコードする核酸分子の部分を意味する。ポリペプチドの活性な断片は、例えば、（例えばインビトロ組み換え発現によって）ポリペプチドのコードされた断片を発現するポリペプチドをコードする核酸分子の部分を単離し、断片の活性を評価することによって調製され得る。このような断片をコードする核酸分子は、少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、または２２００の連続ヌクレオチドもしくはその中の任意の範囲、または完全長ポリペプチドをコードする核酸分子中に存在するヌクレオチドの数までであり得る。したがって、ポリペプチド断片は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５２５、５５０、６００、６２５、６５０、６７５、もしくは７００の連続アミノ酸残基、またはその中の任意の範囲、あるいは完全長ポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の総数までであり得る。したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１）の少なくとも約１５０の連続アミノ酸残基を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００６４】
本明細書において使用される際、核酸分子および／またはヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に関して、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」、「発現された」または「発現」などの用語は、核酸分子および／またはヌクレオチド配列が転写され、任意選択的に翻訳されることを示す。したがって、核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、該当するポリペプチドまたは機能性非翻訳ＲＮＡを発現または産生し得る。
【００６５】
「異種」または「組み換え」ヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド配列の非天然の複数のコピーを含む、それが導入される宿主細胞に天然に関連していないヌクレオチド配列である。
【００６６】
「天然」または「野生型」核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物中で自然に発生するまたは生物に内在するｍＲＮＡである。「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しているヌクレオチド配列である。
【００６７】
また、本明細書において使用される際、「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡまたはＲＮＡならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含し得る。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、または核酸という用語は、鎖の長さにかかわらずヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、改変された塩基対形成能力またはヌクレアーゼに対する向上した耐性を有する核酸を調製するのに使用され得る。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの相補体（完全相補体または部分相補体のいずれかであり得る）である核酸をさらに提供する。本明細書において提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’の方向で示され、米国の配列規則（Ｕ．Ｓ．ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｕｌｅ）、米国特許法施行規則（３７  ＣＦＲ）第１．８２１〜１．８２５条および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に記載されているようにヌクレオチドの性質を表す標準的なコードを用いて表される。
【００６８】
ある実施形態において、本発明の組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリペプチドは「単離」される。「単離」された核酸分子、「単離」されたヌクレオチド配列または「単離」されたポリペプチドは、人の手によってその天然環境とは別に存在し、したがって自然の産物ではない核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然の生物もしくはウイルスの他の構成要素、例えば、細胞もしくはウイルス構成成分またはポリヌクレオチドに関連して一般的に見られる他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離される精製された形態で存在し得る。代表的な実施形態において、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えて純粋である。
【００６９】
他の実施形態において、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、例えば、組み換え宿主細胞などの非天然環境中に存在し得る。したがって、例えば、ヌクレオチド配列に関して、「単離」という用語は、それが自然に存在する染色体および／または細胞からそれが分離されることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが自然に存在する染色体および／または細胞からそれが分離され、次に、遺伝学的状況、それが自然に存在しない染色体および／または細胞（例えば、自然界に見出されるものと異なる宿主細胞、異なる調節配列、および／またはゲノム中の異なる位置）に挿入される場合に単離される。したがって、組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびそれらのコードされたポリペプチドは、人の手によってそれらがそれらの天然環境とは別に存在し、したがって自然の産物ではないが、ある実施形態において、それらが組み換え宿主細胞中に導入され、組み換え宿主細胞中に存在し得る点で「単離」される。
【００７０】
ある実施形態において、本発明のヌクレオチド配列および／または核酸分子は、宿主細胞（例えば、植物細胞）中の発現のための様々なプロモータと動作可能に関連され得る。本明細書において使用される際、第２の核酸配列に動作可能に連結される第１の核酸配列に言及するときの「動作可能に関連される」は、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係に置かれた状況を意味する。例えば、プロモータがコード配列の転写または発現をもたらす場合、プロモータは、コード配列と動作可能に関連される。
【００７１】
ＤＮＡ「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位を含有し、ＤＮＡの転写を開始させる、コード領域の上流の非翻訳ＤＮＡ配列である。「プロモータ領域」は、遺伝子発現の調節因子として機能する他の要素も含み得る。プロモータは、例えば、組み換え核酸分子、すなわち、キメラ遺伝子の調製に使用するための、構成的、誘導性、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、組織優先および組織特異的プロモータを含み得る。特定の態様において、本発明で有用な「プロモータ」は、植物の細胞中のヌクレオチド配列の転写を開始させることが可能なプロモータである。
【００７２】
「キメラ遺伝子」は、調節ヌクレオチド配列が、関連されたヌクレオチド配列の転写または発現を調節することができるように、プロモータまたは他の調節ヌクレオチド配列がｍＲＮＡについてコードし、またはタンパク質として発現されるヌクレオチド配列と動作可能に関連された組み換え核酸分子である。キメラ遺伝子の調節ヌクレオチド配列は、通常、自然界に見られる関連されたヌクレオチド配列に動作可能に連結されていない。
【００７３】
プロモータの選択は、発現のための時間的および空間的要件と、およびさらに形質転換される宿主細胞とに応じて変化する。したがって、例えば、ヌクレオチド配列の発現は、任意の植物および／または植物部位内、（例えば、葉内、柄または茎内、穂内、花序内（例えば、穂、茎、穂軸など）、根、種子および／または苗内など）であり得る。双子葉植物に由来する多くのプロモータが単子葉植物において機能することが示されており、逆も同様であるが、理想的には、双子葉植物プロモータが双子葉植物における発現のために、および単子葉植物プロモータが単子葉植物における発現のために選択される。しかしながら、選択されたプロモータの起源に制限はなく、それらが所望の細胞中のヌクレオチド配列の発現の促進において機能すれば十分である。
【００７４】
本発明で有用なプロモータとしては、限定はされないが、構造的にヌクレオチド配列の発現を促すもの、誘導されると発現を促すもの、および組織特異的または発生学的に特異的な方法で発現を促すものが挙げられる。これらの様々なタイプのプロモータが当該技術分野において公知である。
【００７５】
構成的プロモータの例としては、限定はされないが、ケストルム（ｃｅｓｔｒｕｍ）ウイルスプロモータ（ｃｍｐ）（米国特許第７，１６６，７７０号明細書）、コメアクチン１プロモータ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３３９９−３４０６；ならびに米国特許第５，６４１，８７６号明細書）、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ＣａＭＶ  １９Ｓプロモータ（Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３１５−３２４）、ｎｏｓプロモータ（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：５７４５−５７４９）、Ａｄｈプロモータ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６６２４−６６２９）、スクロースシンターゼプロモータ（Ｙａｎｇ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４１４４−４１４８）、およびユビキチンプロモータが挙げられる。ユビキチンに由来する構成的プロモータは、多くの細胞型中に蓄積する。ユビキチンプロモータは、トランスジェニック植物、例えば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７９：８７−９４）、トウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２）、およびシロイヌナズナ（Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：８９５−９０６）において使用するためにいくつかの植物種からクローニングされている。トウモロコシユビキチンプロモータ（ＵｂｉＰ）は、トランスジェニック単子葉植物系において開発され、単子葉植物形質転換のために構築されたその配列およびベクターが特許公開欧州特許第０  ３４２  ９２６号明細書に開示されている。さらに、ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：１５０−１６０（１９９１））によって記載されるプロモータ発現カセットは、ヌクレオチド配列の発現のために容易に改変され得、単子葉植物宿主に使用するのに特に好適である。
【００７６】
ある実施形態において、組織特異的／組織優先プロモータが使用され得る。組織特異的または優先発現パターンとしては、限定はされないが、緑色組織特異的または優先、根特異的または優先、茎特異的または優先、および花特異的または優先発現パターンが挙げられる。緑色組織における発現に好適なプロモータは、光合成に関与する遺伝子を調節する多くのものを含み、これらの多くは、単子葉植物および双子葉植物の両方からクローニングされた。一実施形態において、本発明で有用なプロモータは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子に由来するトウモロコシＰＥＰＣプロモータである（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ＆Ｇｒｕｌａ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９−５８９（１９８９））。組織特異的プロモータの非限定的な例としては、種子貯蔵タンパク質（β−コングリシニン、クルシフェリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）およびファセオリンなど）、ゼイン（例えば、ガンマゼイン）または油体タンパク質（オレオシンなど）、または脂肪酸生合成に関与するタンパク質（アシル担体タンパク質、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ（ｆａｄ  ２−１）を含む）、および胚発生の際に発現される他の核酸（Ｂｃｅ４など、例えば、Ｋｒｉｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２０９−２１９；ならびに欧州特許第２５５３７８号明細書を参照）をコードする遺伝子と関連したものが挙げられる。植物、特に、トウモロコシにおけるヌクレオチド配列の発現に有用な組織特異的または組織優先プロモータとしては、限定はされないが、根、髄、葉または花粉内の発現を促すものが挙げられる。このようなプロモータは、例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開国際公開第９３／０７２７８号に開示されている。組織特異的または組織優先プロモータの他の非限定的な例としては、米国特許第６，０４０，５０４号明細書に開示されているワタルビスコプロモータ；米国特許第５，６０４，１２１号明細書に開示されているコメスクロースシンターゼプロモータ；ｄｅ  Ｆｒａｍｏｎｄ（ＦＥＢＳ  ２９０：１０３−１０６（１９９１）；Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに付与された欧州特許第０  ４５２  ２６９号明細書）によって記載されている根特異的プロモータ；米国特許第５，６２５，１３６号明細書（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに付与された）に記載され、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を促す茎特異的プロモータ；およびＰＣＴ公開国際公開第０１／７３０８７号に開示されているケストルムイエローリーフカーリングウイルス（ｃｅｓｔｒｕｍ  ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）プロモータが挙げられ、これらの文献は全て参照により本明細書に援用される。
【００７７】
組織特異的／組織優先プロモータのさらなる例としては、限定はされないが、根特異的プロモータＲＣｃ３（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：１８５−１９７（２０１０））およびＲＢ７（米国特許第５４５９２５２号明細書）、レクチンプロモータ（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｄｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１６０−１６７；およびＶｏｄｋｉｎ（１９８３）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１３８：８７−９８）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１プロモータ（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）（Ｖａｎｄｅｒ  Ｍｉｊｎｓｂｒｕｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３７（８）：１１０８−１１１５）、トウモロコシ光収穫複合体プロモータ（Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３６５４−３６５８）、トウモロコシ熱ショックタンパク質プロモータ（Ｏ’Ｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４５１−４５８；およびＲｏｃｈｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４５１−４５８）、エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータ（Ｃａｓｈｍｏｒｅ，“Ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｒｉｂｕｌｏｓｅ−ｌ，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ”ｐｐ．２９−３９  Ｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８３；およびＰｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：１９３−２００）、Ｔｉプラスミドマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモータ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３２１９−３２２３）、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼプロモータ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、上記を参照）、ペチュニアカルコンイソメラーゼプロモータ（ｖａｎ  Ｔｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２５７−１２６３）、インゲンマメグリシンリッチタンパク質１プロモータ（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１６３９−１６４６）、切断ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ（Ｏ’Ｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ジャガイモパタチンプロモータ（Ｗｅｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：３４７−３５４）、根細胞プロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７４４９）、トウモロコシゼインプロモータ（Ｋｒｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：９０−９８；Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３４：１０１５−１０２２；Ｒｅｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６４２５；Ｒｅｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７４４９；およびＷａｎｄｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２３５４）、グロブリン−１プロモータ（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８６３−８７２）、α−チューブリンｃａｂプロモータ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：４３１−４４０）、ＰＥＰＣａｓｅプロモータ（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ＆Ｇｒｕｌａ（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９−５８９）、Ｒ遺伝子複合体に関連するプロモータ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１７５−１１８３）、およびカルコンシンターゼプロモータ（Ｆｒａｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２６０５−２６１２）が挙げられる。
【００７８】
種子特異的発現に特に有用なのは、エンドウマメビシリンプロモータ（Ｃｚａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３５：３３−４０；ならびに米国特許第５，６２５，１３６号明細書に開示されている種子特異的プロモータである。ある実施形態において、プロモータは、トウモロコシガンマ−ゼインプロモータまたはトウモロコシＡＤＰ−ｇｐｐプロモータを含むがこれらに限定されない胚乳特異的プロモータであり得る。
【００７９】
成熟した葉における発現に有用なプロモータは、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に由来するＳＡＧプロモータなど、老化の開始時に作動されるものである（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１９８６−１９８８）。
【００８０】
さらに、プラスチドにおいて機能するプロモータが使用され得る。このようなプロモータの非限定的な例としては、バクテリオファージＴ３遺伝子９  ５’  ＵＴＲおよび米国特許第７，５７９，５１６号明細書に開示されている他のプロモータが挙げられる。本発明で有用な他のプロモータとしては、限定はされないが、Ｓ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータおよびＫｕｎｉｔｚトリプシン阻害遺伝子プロモータ（Ｋｔｉ３）が挙げられる。
【００８１】
本発明のある実施形態において、誘導性プロモータが使用され得る。したがって、例えば、化学的に調節されたプロモータを用いて、外因性化学調節剤の適用によって植物における遺伝子の発現を調節することができる。化学的に調節されるプロモータによるヌクレオチド配列の発現の調節は、作物植物が誘導性化学物質で処理されるときのみ、本発明のポリペプチドが合成されるのを可能にする。目的に応じて、プロモータは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する場合、化学物質誘導性プロモータであり、または化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合、化学物質抑制性プロモータであり得る。
【００８２】
化学物質誘導性プロモータが当該技術分野において公知であり、これらとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモータ、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモータ、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１  ａプロモータ（例えば、ＰＲ１ａシステム）、ステロイドステロイド応答性プロモータ（例えば、Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４、２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモータを参照）ならびにテトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモータ（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，２２９−２３７、ならびに米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同第５，７８９，１５６号明細書を参照、Ｌａｃリプレッサシステムプロモータ、銅誘導性システムプロモータ、サリチレート誘導性システムプロモータ（例えば、ＰＲ１ａシステム）、グルココルチコイド誘導性プロモータ（Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：６０５−６１２）、およびエクジソン誘導性システムプロモータが挙げられる。
【００８３】
誘導性プロモータの他の非限定的な例としては、ＡＢＡ誘導性および膨圧（ｔｕｒｇｏｒ）誘導性プロモータ、オーキシン結合タンパク質遺伝子プロモータ（Ｓｃｈｗｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４：４２３−４３２）、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼプロモータ（Ｒａｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１９：１８５−１９７）、ＭＰＩプロティナーゼ阻害剤プロモータ（Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：１４１−１５０）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１２９３−１２９８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：５５１−５６５；およびＱｕｉｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２９：４１２−４２１）が挙げられる。ベンゼンスルホンアミド誘導性（米国特許第５，３６４，７８０号明細書）およびアルコール誘導性（国際特許出願公開国際公開第９７／０６２６９号および国際公開第９７／０６２６８号）システムおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼプロモータも含まれる。同様に、Ｇａｔｚ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：１６８−１７２およびＧａｔｚ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：８９−１０８に記載されている誘導性プロモータのいずれかを使用することができる。植物における本発明のヌクレオチド配列の発現を促すのに有用な他の化学的誘導性プロモータは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６１４，３９５号明細書に開示されている。遺伝子発現による化学的誘導はまた、公開出願欧州特許出願公開第０  ３３２  １０４号明細書（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに付与された）および米国特許第５，６１４，３９５号明細書において詳述されている。ある実施形態において、化学的誘導のプロモータは、タバコＰＲ−１ａプロモータであり得る。
【００８４】
本発明のポリペプチドは、シグナル配列の使用によって植物内のコンパートメントに標的化されてもまたはされなくてもよい。多くのシグナル配列が、特定のコンパートメント／組織に対するまたは特定のコンパートメント／組織以外でのポリヌクレオチドの発現または標的化に影響を与えることが知られている。好適なシグナル配列および標的化プロモータが当該技術分野において公知であり、これらとしては、限定はされないが、本明細書において提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第７，９１９，６８１号明細書を参照）。標的の例としては、限定はされないが、液胞、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アミロプラスト、デンプン粒、細胞壁、種子、または特定の組織、例えば、胚乳が挙げられる。したがって、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）は、植物内のコンパートメントに対してポリペプチドを標的化および／または保持するためにシグナル配列に動作可能に連結され得る。ある実施形態において、シグナル配列は、ワキシー（ｗａｘｙ）に由来するＮ末端シグナル配列、ガンマ−ゼインに由来するＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、またはＣ末端デンプン結合ドメインであり得る。さらなる実施形態において、シグナル配列は、ＥＲシグナル配列、ＥＲ保持配列、ＥＲシグナル配列およびさらなるＥＲ保持配列であり得る。したがって、本発明のある実施形態において、α−アミラーゼポリペプチドは、１つまたは複数のシグナル配列と融合され得る（および／または前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結され得る）。
【００８５】
本明細書において使用される際、「発現カセット」は、該当するヌクレオチド配列（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列）を含む核酸分子を意味し、ここで、前記ヌクレオチド配列は、少なくとも制御配列（例えば、プロモータ）と動作可能に関連される。したがって、本発明のある実施形態は、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列を発現するように設計された発現カセットを提供する。このように、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列に対する実質的同一性を有するヌクレオチド配列と動作可能に関連された１つまたは複数の植物プロモータは、生物またはその細胞（例えば、植物、植物部位および／または植物細胞）内の発現のための発現カセットにおいて提供され得る。
【００８６】
該当するヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、これは、その構成要素の少なくとも１つがその他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組み換え形態で得られたものであり得る。しかしながら、典型的に、発現カセットは、宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然に存在せず、形質転換事象(event)によって宿主細胞または宿主細胞の祖先中に導入されたはずである。
【００８７】
発現されるべきヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモータに加えて、発現カセットは、他の調節配列も含み得る。本明細書において使用される際、「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内および／またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、および／または転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連したコード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。調節配列としては、限定はされないが、プロモータ、エンハンサ、イントロン、翻訳リーダー配列、終止シグナル、およびポリアデニル化シグナル配列が挙げられる。ある実施形態において、発現カセットは、本発明のポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたシグナル配列をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【００８８】
本発明の趣旨では、調節配列または領域は、植物、植物部位および／または植物細胞に由来／類似し得、および／または調節配列は、他の調節配列に由来／類似し得る。あるいは、調節配列は、植物（および／または植物部位および／または植物細胞）におよび／または互い（すなわち、調節配列）に対して異種であり得る。したがって、例えば、プロモータは、ポリヌクレオチドが由来する種と異なる種に由来するポリヌクレオチドに動作可能に連結されるとき、異種であり得る。あるいは、プロモータはまた、プロモータが、ポリヌクレオチドが由来するのと同じ／類似の種に由来するが、一方または両方（すなわち、プロモータおよび／またはポリヌクレオチド）がそれらの原型および／またはゲノム遺伝子座から実質的に改変され、および／またはプロモータが、動作可能に連結されたポリヌクレオチドのための天然のプロモータでない場合、選択されたヌクレオチド配列に対して異種であり得る。
【００８９】
ウイルスに由来するいくつかの非翻訳リーダー配列が遺伝子発現を促進することが知られている。具体的には、タバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＭＶ、「ω−配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス（Ｍａｉｚｅ  Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＣＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（Ａｌｆａｌｆａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）に由来するリーダー配列が発現を促進するのに有効であることが示されている（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１；およびＳｋｕｚｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９）。当該技術分野において公知の他のリーダー配列としては、限定はされないが、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）５’非コード領域リーダーなどのピコルナウイルスリーダー（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；タバコエッチ病ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）リーダーなどのポチウイルスリーダー（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）；トウモロコシモザイク病ウイルス（Ｍａｉｚｅ  Ｄｗａｒｆ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＤＭＶ）リーダー（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）、上記を参照）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）リーダー（Ｍａｃｅｊａｋ＆Ｓａｍｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；ＡＭＶの外被タンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４；Ｊｏｂｌｉｎｇ＆Ｇｅｈｒｋｅ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクＴＭＶリーダー（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ２３７−２５６）；およびＭＣＭＶリーダー（Ｌｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。
【００９０】
発現カセットは、任意選択的に、植物中で機能する転写および／または翻訳終止領域（すなわち、終止領域）も含み得る。様々な転写ターミネータが発現カセットに使用するために利用可能であり、該当する異種ヌクレオチド配列を超えた転写の終止および正確なｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。終止領域は、転写開始領域に由来してもよく、動作可能に連結された該当するヌクレオチド配列に由来してもよく、植物宿主に由来してもよく、または別の源に由来してもよい（すなわち、プロモータ、該当するヌクレオチド配列、植物宿主、またはそれらの任意の組合せに対して異質または異種である）。適切な転写ターミネータとしては、限定はされないが、ＣＡＭＶ  ３５Ｓターミネータ、ｔｍｌターミネータ、ノパリンシンターゼターミネータおよび／またはエンドウマメｒｂｃｓ  Ｅ９ターミネータが挙げられる。これらは、単子葉植物および双子葉植物の両方に使用され得る。さらに、コード配列の天然転写ターミネータが使用され得る。
【００９１】
本発明の発現カセットは、形質転換された植物、植物部位および／または植物細胞を選択するのに使用され得る、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択可能なマーカー」は、発現されるとき、マーカーを発現する植物、植物部位および／または植物細胞に明確な表現型を与え、それにより、このような形質転換された植物、植物部位および／または植物細胞が、マーカーを有さないものと区別されるのを可能にするヌクレオチド配列を意味する。このようなヌクレオチド配列は、マーカーが、選択的薬剤（例えば、抗生物質、除草剤など）を使用することなどによる化学的手段によって選択され得る特質を与えるかどうか、またはマーカーが単にスクリーニングなどにより観察または試験によって同定することができる特質（例えば、Ｒ遺伝子座の特質）であるかどうかに応じて、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。当然ながら、好適な選択可能なマーカーの多くの例が当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される発現カセットに使用され得る。
【００９２】
選択可能なマーカーの例としては、限定はされないが、カナマイシン、Ｇ４１８などに対する耐性を与える、ｎｅｏまたはｎｐｔＩＩをコードするヌクレオチド配列（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−１８８）；ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ｂａｒをコードするヌクレオチド配列；グリホサートに対する耐性を与える、改変５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼをコードするヌクレオチド配列（Ｈｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：９１５−９２２）；ブロモキシニルに対する耐性を与える、臭鼻菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ）に由来するｂｘｎなどのニトリラーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９−４２３）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を与える、改変アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードするヌクレオチド配列（欧州特許出願第１５４２０４号明細書）；メトトレキサート耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするヌクレオチド配列（Ｔｈｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２５００−１２５０８）；ダラポンに対する耐性を与える、ダラポンデハロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列；マンノースを代謝させる能力を与えるマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）とも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（米国特許第５，７６７，３７８号明細書および同第５，９９４，６２９号明細書）；５−メチルトリプトファンに対する耐性を与える、改変アントラニル酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列；および／またはハイグロマイシンに対する耐性を与える、ｈｐｈをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。当業者は、本発明の発現カセットに使用するのに好適な選択可能なマーカーを選択することができる。
【００９３】
さらなる選択可能なマーカーとしては、限定はされないが、それに対する様々な発色性基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ（ＧＵＳ）をコードするヌクレオチド配列；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する産物をコードするＲ遺伝子座ヌクレオチド配列（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｉｚｅ  Ｒ−ｎｊ  ａｌｌｅｌｅ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｔａｇｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ａｃ”，ｐｐ．２６３−２８２  Ｉｎ：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，１８ｔｈ  Ｓｔａｄｌｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ＆Ａｐｐｅｌｓ  ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８））；それに対する様々な発色性基質が知られている酵素であるβ−ラクタマーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７３７−３７４１）；カテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥをコードするヌクレオチド配列（Ｚｕｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１１０１−１１０５）；凝集してメラニンを形成するＤＯＰＡおよびドーパキノンへとチロシンを酸化することが可能な酵素であるチロシナーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３−２７１４）；それに対する発色性基質が存在する酵素であるβ−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｘ）をコードするヌクレオチド配列（Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９）；カルシウム感受性生物発光検出に用いられ得るイクオリンをコードするヌクレオチド配列（Ｐｒａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２６：１２５９−１２６８）；または緑色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列（Ｎｉｅｄｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １４：４０３−４０６）が挙げられる。当業者は、本発明の発現カセットに使用するのに好適な選択可能なマーカーを選択することができる。
【００９４】
本発明の他の態様において、動物の成長速度（体重増加）または平均１日体重増加を増大させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の成長速度または動物の平均１日体重増加が、本発明の動物飼料組成物を提供されない対照動物の成長速度と比較して約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法が提供される。したがって、ある実施形態において、成長速度または平均１日体重増加の増大は、約０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．１、４．２、４．２１、４．２２、４．２３、４．２４、４．２５、４．２６、４．２７、４．２８、４．２９、４．３、４．３１、４．３２、４．３３、４．３４、４．３５、４．３６、４．３７、４．３８、４．３９、４．４、４．４１、４．４２、４．４３、４．４４、４．４５、４．４６、４．４７、４．４８、４．４９、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、９、９．２５、９．５、９．７５、１０ポンド／日などおよび／またはその中の任意の範囲であり得る。ある特定の実施形態において、成長速度または平均１日体重増加の増大は、約０．０５ポンド／日〜約０．５ポンド／日であり得る。さらなる実施形態において、成長速度または平均１日体重増加の増大は、前記動物飼料組成物を提供されない対照動物の成長と比較して約０．１ポンド／日であり得る。
【００９５】
本発明のさらに他の態様において、動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給し、それにより、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物の同じ所望の体重を達成するのに必要な日数と比較して、所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる工程を含む方法が提供される。
【００９６】
本明細書において使用される際、「所望の体重」、「または所望の最終体重」は、生体重または温と体枝肉質量（ｈｏｔ  ｃａｒｃａｓｓ  ｗｅｉｇｈｔ）を意味し得る。したがって、例えば、畜牛の場合、所望の生体重は、約９５０〜約１，６００ポンドであり得、所望の温と体枝肉質量は、約７００〜約１，０００ポンドであり得る。
【００９７】
フィードロットに入る前、畜牛は、放牧地または牧草地で放牧されて生涯の大半を過ごし、次に仕上げのためにフィードロットに移送され、ここで、穀物および他の飼料濃縮物を供給される。一般に、畜牛は、約６００〜約７５０ポンドの体重でフィードロットに入る。配置時の体重、摂食状態、および所望の最終体重に応じて、フィードロット内の期間は、約９０日間〜約３００日間の範囲であり得る。平均増加は、約２．５〜約５ポンド／日であり得る。
【００９８】
したがって、本発明の別の態様において、本発明の動物飼料組成物を供給される動物の所望の体重を達成するのに必要な日数は、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１日〜約３０日だけ減少され得る。ある実施形態において、本発明の動物飼料組成物を供給される動物の所望の体重を達成するのに必要な日数は、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１日〜約２５日、約１日〜約２０日、約５日〜約２０日、約５日〜約１５日などだけ減少され得る。したがって、ある実施形態において、本発明の動物飼料組成物を供給される動物の所望の体重を達成するのに必要な日数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日などおよび／またはその中の任意の範囲だけ減少され得る。
【００９９】
本発明の他の態様において、動物による飼料利用の効率を増大させる方法であって、動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して、前記動物による飼料利用の効率を増大させるのに有効な量で本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含む方法が提供される。
【０１００】
飼料利用の効率は、提供される飼料の量当たりの動物の体重の増加として計算され得る。ある実施形態において、体重は、屠殺前の最終体重である。さらなる実施形態において、提供される飼料は、約９０日間〜約３００日間の期間にわたって提供される飼料の量である。したがって、ある実施形態において、提供される飼料は、約１００日間〜約２７５日間、約１２５日間〜約２５０日間、約１５０日間〜約２２５日間、約１８０日間〜約２００日間などの期間にわたって提供される飼料の量である。
【０１０１】
したがって、ある実施形態において、体重増加を測定する期間（日数）は、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００日間など、および／またはその中の任意の範囲である。
【０１０２】
本発明のさらなる態様において、動物によるトウモロコシの飼料価値は、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１％〜約２５％だけ増大される。トウモロコシの飼料価値は、本発明の飼料組成物の飼料効率と、前記飼料組成物を供給されない対照動物の飼料効率との差を、前記飼料組成物を供給されない前記対照動物の飼料効率で除算した値に等しく、それらの全ては、前記飼料組成物のトウモロコシ含有パーセントで除算される。したがって、ある実施形態において、トウモロコシの飼料価値の増大は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％など、および／またはその中の任意の範囲であり得る。特定の実施形態において、トウモロコシの飼料価値の増大は、対照と比較して約１％〜約１０％である。代表的な実施形態において、飼料価値の増大は、対照と比較して約５％である。
【０１０３】
本発明のさらなる態様において、動物による飼料利用の効率は、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約０．００５〜約０．１だけ増大される。したがって、ある実施形態において、飼料利用の効率の増大は、約０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９，０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３など、および／またはその中の任意の範囲であり得る。特定の実施形態において、飼料利用の効率の増大は、対照と比較して約０．００５〜約０．０１である。代表的な実施形態において、飼料利用の効率の増大は、対照と比較して約０．０６である。「Ｇ：Ｆ」としても知られている飼料利用の効率は、平均１日増加を動物の１日当たりの乾物摂取量で除算した値である。
【０１０４】
ある実施形態において、動物は、１日当たり動物当たり本発明の動物飼料組成物を約１ポンド〜約３０ポンド供給される。したがって、ある実施形態において、動物は、１日当たり動物当たり本発明の動物飼料組成物を約１ポンド、２ポンド、３ポンド、４ポンド、５ポンド、６ポンド、７ポンド、８ポンド、９ポンド、１０ポンド、１１ポンド、１２ポンド、１３ポンド、１４ポンド、１５ポンド、１６ポンド、１７ポンド、１８ポンド、１９ポンド、２０ポンド、２１ポンド、２２ポンド、２３ポンド、２４ポンド、２５ポンド、２６ポンド、２７ポンド、２８ポンド、２９ポンド、３０ポンドなど、および／またはその中の任意の範囲で供給される。ある実施形態において、動物は、１日当たり動物当たり本発明の動物飼料組成物を約９ポンド〜約２１ポンド供給される。ある実施形態において、動物は、本発明の動物飼料組成物を自由に供給され、または１日に約１回〜約３回（例えば、１、２、３回）またはそれらの任意の組合せで供給され得る。
【０１０５】
本発明の動物飼料組成物は、任意の動物、例えば、家畜、動物園の動物、実験動物および／またはコンパニオンアニマルに供給され得る。ある実施形態において、動物は、限定はされないが、ウシ亜科の動物（例えば、家畜牛（ウシ（例えば、乳牛および／または肉牛））、バイソン、バッファロー）、ウマ科の動物（例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、カモなど；例えば、家禽）、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、ブタ（ｐｉｇ）（例えば、ブタ類（ｓｗｉｎｅ））、イヌ科の動物、ネコ科の動物、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）；ウサギ、魚類などであり得る。ある実施形態において、動物は、ウシであり得る。ある実施形態において、動物は、家禽であり得る。他の実施形態において、動物は、ニワトリであり得る。さらなる実施形態において、動物は、ブタ類であり得る。さらに他の実施形態において、動物は、ブタであり得る。
【０１０６】
さらなる実施形態において、本発明は、乳畜（例えば、ウシ、ヤギなど）によって生産される乳の量を増大させる方法であって、本発明の動物飼料組成物を前記乳畜に供給する工程を含み、前記動物によって生産される乳の量が、本発明の前記動物飼料組成物を提供されない対照動物によって生産される乳の量と比較して約５％〜約２００％だけ増大される、方法を提供する。ある実施形態において、乳の量の増大は、約１〜約７２時間の期間にわたる。他の実施形態において、前記動物によって生産される乳の量が約２５％〜約１７５％、約５０％〜約１５０％などだけ増大される。さらなる実施形態において、前記動物によって生産される乳の量が、本発明の動物飼料組成物を供給されなかった対照動物と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％および／または２００％だけ増大される。
【０１０７】
「増大させる」、「増大させること」、「増大される」、「促進する」、「促進される」、「促進すること」、および「促進」（およびそれらの文法的変化形）という用語は、本明細書において使用される際、本発明の動物飼料組成物を動物に供給することによる動物の平均１日体重増加または動物の成長速度（体重増加）の増大（ここで、動物の平均１日体重増加または成長速度は、約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される）、または動物による飼料利用の効率を増大させるのに有効な量で本発明の動物飼料組成物を前記動物に供給することによる動物による飼料利用の効率の増大を表す。平均１日体重増加、成長速度（体重増加）、または動物による飼料利用の効率のこの増大は、平均１日体重増加、成長速度（体重増加）または動物による飼料利用の効率の増大を、本発明の動物飼料組成物を供給されない動物（すなわち、対照）と比較することによって観察され得る。
【０１０８】
本明細書において使用される際、「減少させる」、「減少された」、「減少させること」、「減少」、「低下させる」、「抑制する」、および「低減させる」という用語（およびそれらの文法的変化形）は、例えば、対照（例えば、動物飼料組成物を供給されない対照動物）と比較して動物の所望の体重を達成するのに必要な日数の減少または低減を表す。
【０１０９】
本発明は、その多くの変更形態および変形形態が当業者に明らかであるため、あくまでも例示として意図される以下の実施例においてより具体的に説明される。
【実施例】
【０１１０】
実験１
３００頭の交雑種去勢牛（初期ＢＷ＝６５８±３６ポンド）をＭｅａｄ，ＮＥの近くのｔｈｅ  ＵＮＬ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＲＤＣ）フィードロットにおいてフィードロット仕上げ試験に用いた。実験の開始前５日間にわたって、３２％の可溶性物質添加トウモロコシ湿潤蒸留穀物残渣、３２％のアルファルファ干し草、３２％の乾燥圧延されたトウモロコシ、および４％の栄養補助食品（ＤＭベース）からなる２％のＢＷの食餌を畜牛に制限給餌した。２日の初期体重を０日目および１日目に記録し、それを平均して初期ＢＷとして使用した。去勢牛を軽、中間、および重ＢＷブロックへとＢＷによって区分けし（それぞれｎ＝３、２、および１のペンレプリケート（ｐｅｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ））、ＢＷによって階層化し、５つの食餌処理のうちの１つに無作為に割り当てられたペンを含む３０のペンのうちの１つに無作為に割り当てた。１ペン当たり１０頭および１処理当たり６つの反復が存在していた。食餌処理は、乱塊法（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）において、１）市販のトウモロコシ源（ＣＯＮ）、２）Ｅｎｏｇｅｎ試験トウモロコシ（ＳＹＮ）、３）ＣＯＮおよびＳＹＮの５０：５０ブレンド、４）湿潤トウモロコシグルテン飼料を含むＣＯＮ（ＣＯＮ−ＳＢ）、および５）湿潤トウモロコシグルテン飼料を含むＳＹＮ（ＳＹＮ−ＳＢ）を含んでいた（表１）。去勢牛を、アルファルファ干し草の代わりにトウモロコシを用いて２１日間にわたって仕上げ飼料に適応させたが、トウモロコシサイレージ、可溶性物質添加トウモロコシ湿潤蒸留穀物残渣（ＷＤＧＳ）、および栄養補助食品の含有量は全ての食餌において同じままであった。湿潤トウモロコシグルテン飼料（Ｓｗｅｅｔ  Ｂｒａｎ（登録商標）（Ｃａｒｇｉｌｌ）；ＳＢ）を含有する食餌において、濃度は、全ての穀物適応食餌において同じままであった。タンパク質およびミネラルのＮＲＣ要件を満たすかまたはそれを超えるように食餌を配合した。最終仕上げ飼料は、去勢牛１頭当たり１日３６０ｍｇのＲｕｍｅｎｓｉｎ（３０ｇ／トンのＤＭ）、および去勢牛１頭当たり１日９０ｍｇのＴｙｌａｎ（９ｇ／トンのＤＭ）を提供した。１日目に去勢牛にＲｅｖａｌｏｒ−ＸＳを埋め込んだ。
【０１１１】
１７３日目に全ての去勢牛を商業的な食肉処理場（Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｏｍａｈａ  Ｐａｃｋ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）において収穫した。最終生ＢＷを屠殺当日に収集し、４％のペンシルシュリンク（ｐｅｎｃｉｌ  ｓｈｒｉｎｋ）を枝肉歩留り（ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）の計算に適用した。１７３日目に与えられた飼料は前日のＤＭＩの５０％であり、４：００ｐｍに質量を量った。次に去勢牛を輸送し、翌日屠殺するまで保持した。温と体枝肉質量および肝臓スコアを屠殺当日に記録した。４８時間の冷蔵後、脂肪厚、ＬＭ面積、およびＵＳＤＡマーブリングスコアを記録した。最終ＢＷ、ＡＤＧ、およびＦ：Ｇを、一般的な６３％の枝肉歩留りに調整されたＨＣＷを用いて計算した。
【０１１２】
実験２
２４０頭の交雑種去勢牛（初期ＢＷ＝６３４±３４ポンド）をＳｃｏｔｔｓｂｌｕｆｆ，ＮＥの近くのｔｈｅ  ＵＮＬ  Ｐａｎｈａｎｄｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＰＨＲＥＣ）フィードロットにおいてフィードロット仕上げ試験に用いた。畜牛の制限給餌および初期ＢＷプロトコルは実験１と同じであった。去勢牛を軽、中間、および重ＢＷブロックへとＢＷによって区分けし、ＢＷによって階層化し、４つの食餌処理のうちの１つに無作為に割り当てられたペンを含む２４のペンのうちの１つに無作為に割り当てた。１ペン当たり１０頭および１処理当たり６つの反復が存在していた。食餌処理は、１）ＣＯＮ、２）ＳＹＮ、３）ＢＬＥＮＤ、および４）去勢牛１頭当たり１日５ｇの割合で食餌に添加された酵素（Ａｍａｉｚｅ；Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を含むＣＯＮを含んでいた（ＮＺ；表２）。制限給餌、計量、区分け、埋め込み、および穀物適応手順は実験１と同じであった。重、中間、および軽ＢＷブロック中の去勢牛を（それぞれ）１４８日目、１６９日目および１８１日目に商業的な食肉処理場（Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｍｅａｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ，ＣＯ）において収穫した。最終日に去勢牛は飼料を控えられ、８：００ａｍに質量を量られてから同じ日に輸送され、屠殺された。データを、固定効果として初期ＢＷブロックおよび実験単位としてペンを用いた乱塊法として分析した。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
【表５】
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【０１１８】
実験３
乱塊法において何頭かの交雑種去勢牛（初期ＢＷ（体重）＝６８５±４６ポンド）を用いて、１７３日仕上げ試験を行った。実験の開始前５日間にわたって、４７．５％のアルファルファ干し草、４７．５％の湿潤トウモロコシグルテン飼料、および５％の栄養補助食品（ＤＭ（乾物）ベース）からなる２％のＢＷの食餌を去勢牛に制限給餌した。２日の初期体重を０日目および１日目に記録し、平均して初期ＢＷを求めた。１日目の初期ＢＷの測定とともに、去勢牛にＲｅｖａｌｏｒ−ＸＳを埋め込んだ。去勢牛を軽および重ＢＷブロックへとＢＷによって区分けし、ＢＷによって階層化し、ペンに無作為に割り当てた。次に、ペンを１ペン当たり８頭および１処理当たり６つの反復で食餌処理に無作為に割り当てた。
【０１１９】
食餌処理（表６）を、試験トウモロコシまたは対照（Ｅｎｏｇｅｎまたは非Ｅｎｏｇｅｎ）、および副産物のタイプ（ＭＤＧＳ（可溶性物質添加改変蒸留穀物残渣）またはＳｗｅｅｔ  Ｂｒａｎ）を含む要因により調整した。この試験に用いられる副産物は、タンパク源（１８％のＭＤＧＳ）またはアシドーシス制御の手段（３５％のＳＢ（Ｓｗｅｅｔ  Ｂｒａｎ（登録商標）（Ｃａｒｇｉｌｌ）））のいずれかとして提供された。去勢牛を、アルファルファ干し草の代わりにトウモロコシを用いて２１日間にわたって仕上げ飼料に適応させたが、ソルガムサイレージ、Ｓｗｅｅｔ  ＢｒａｎまたはＭＤＧＳ、および栄養補助食品の含有量は全ての食餌において同じままであった。タンパク質およびミネラルのＮＲＣ要件を満たすかまたはそれを超えるように食餌を配合した。最終仕上げ飼料は、去勢牛１頭当たり１日３３０ｍｇのＲｕｍｅｎｓｉｎ（３０ｇ／トンのＤＭ）、および去勢牛１頭当たり１日９０ｍｇのＴｙｌａｎ（８．１８ｇ／トンのＤＭ）を提供した。
【０１２０】
１７４日目に全ての去勢牛を商業的な食肉処理場（Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｏｍａｈａ  Ｐａｃｋ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）において収穫した。１７３日目に与えられた飼料は前日のＤＭＩの５０％であり、４：００ｐｍに質量を量った。次に去勢牛を商業的な食肉処理場に輸送し、翌日屠殺するまで保持した。温と体枝肉質量および肝臓スコアを屠殺当日に記録し、第十二肋骨脂肪厚、ＬＭ面積、およびＵＳＤＡマーブリングスコアなどの枝肉特性を４８時間の冷蔵後に記録した。歩留り等級を、ＵＳＤＡ  ＹＧ式［ＹＧ＝２．５＋２．５（脂肪厚、インチ）−０．３２（ＬＭ面積、平方インチ）＋０．２（ＫＰＨ脂肪、％）＋０．００３８（ＨＣＷ、ポンド）］を用いて計算した。最終ＢＷ、ＡＤＧ（平均１日増加）、およびＧ：Ｆ（増加対飼料比）を、一般的な６３％の枝肉歩留りに調整されたＨＣＷ（温と体枝肉質量）を用いて計算した。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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2018512149.tif 000014
【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
上記は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって規定され、特許請求の範囲の均等物がその中に包含される。
【０１２５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その中に参考文献が示される文章および／または段落に関して、教示のために全体が参照により援用される。
【配列表】
2018512149000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月7日(2017.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物。
【請求項２】
前記微生物α−アミラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドまたは配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む、請求項１に記載の動物飼料組成物。
【請求項３】
植物材料を含む動物飼料組成物であって、前記植物材料が組み換えα−アミラーゼを含む、動物飼料組成物。
【請求項４】
前記組み換えα−アミラーゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有するポリペプチドを含む、請求項３に記載の動物飼料組成物。
【請求項５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位に由来する植物材料を含む動物飼料組成物。
【請求項６】
前記トランスジェニック植物または植物部位が、前記植物材料の約１質量％〜約１００質量％を占める、請求項５に記載の動物飼料組成物。
【請求項７】
前記植物材料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、請求項５または６に記載の動物飼料組成物。
【請求項８】
前記植物材料が、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、および／またはキビに由来する、請求項３〜７のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項９】
前記植物材料が、トウモロコシである、請求項８に記載の動物飼料組成物。
【請求項１０】
前記トウモロコシが、トウモロコシ事象３２７３を含む、請求項９に記載の動物飼料組成物。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物に由来する前記植物材料が、種子である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項１２】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含むトウモロコシ飼料。
【請求項１３】
前記トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する前記植物材料が、前記トウモロコシ飼料の約１質量％〜約１００質量％を占める、請求項１２に記載のトウモロコシ飼料。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のトウモロコシ飼料を含む動物飼料組成物。
【請求項１５】
前記トウモロコシ飼料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、請求項１４に記載の動物飼料組成物。
【請求項１６】
動物が、家畜、動物園の動物および／またはコンパニオンアニマルである、請求項１〜１１または１４もしくは１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
【請求項１７】
動物の平均１日体重増加を増大させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記平均１日体重増加が、約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
【請求項１８】
動物の成長速度（体重増加）を増大させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記成長速度が、約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
【請求項１９】
動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給し、それにより、所望の体重を達成するのに必要な前記日数を減少させる工程を含む方法。
【請求項２０】
前記動物の所望の体重を達成するのに必要な前記日数が、約１日〜約２０日だけ減少される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物による飼料利用の効率を増大させる方法であって、前記動物による飼料利用の前記効率を増大させるのに有効な量で請求項１〜１５のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含む方法。
【請求項２２】
前記動物による飼料利用の前記効率が約１％〜約２５％だけ増大される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物が、１日当たり約１ポンド〜約３０ポンドの前記動物飼料組成物を供給される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物が１日当たり約１回〜約３回、前記動物飼料組成物を供給される、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記動物が、哺乳動物、鳥類、または魚類である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはブタである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、またはカモである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
動物によるトウモロコシの飼料価値を増大させる方法であって、請求項８または１５に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物によるトウモロコシの前記飼料価値が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１％〜約２５％だけ増大される、方法。
【請求項２９】
動物の飼料利用の効率を増大させる方法であって、請求項８または１５に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の飼料利用の前記効率が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約０．００５〜約０．０３だけ増大される、方法。
【請求項３０】
前記組み換えα−アミラーゼが、その基質以外に標的化される、請求項５または１２に記載の動物飼料組成物。
【請求項３１】
前記組み換えα−アミラーゼが、葉緑体、液胞、細胞質、アポプラストおよび小胞体からなる群から選択される細胞小器官に標的化される、請求項３０に記載の動物飼料組成物。
【請求項３２】
ペレット、穀粒、サイレージ、乾燥圧延された穀粒、蒸気フレークされた穀粒、全粒、粗挽きした穀粒、もしくは高水分トウモロコシ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１〜１１、１４〜１６、３０もしくは３１のいずれか一項に記載の動物飼料組成物または請求項１２、１３、３０もしくは３１のいずれか一項に記載のトウモロコシ飼料。
【請求項３３】
乳畜によって生産される乳の量を増大させる方法であって、請求項１〜１６または３０〜３２のいずれか一項に記載の動物飼料組成物またはトウモロコシ飼料を前記乳畜に供給する工程を含み、前記乳畜によって生産される乳の前記量が、前記動物飼料組成物を提供されない対照動物によって生産される乳の量と比較して約５％〜約２００％だけ増大される、方法。
【請求項３４】
前記乳畜が、ウシまたはヤギである、請求項３３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その中に参考文献が示される文章および／または段落に関して、教示のために全体が参照により援用される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕微生物α−アミラーゼを含む動物飼料組成物。
〔２〕前記微生物α−アミラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドまたは配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む、前記〔１〕に記載の動物飼料組成物。
〔３〕植物材料を含む動物飼料組成物であって、前記植物材料が、組み換えα−アミラーゼを含む、動物飼料組成物。
〔４〕前記組み換えα−アミラーゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有するポリペプチドを含む、前記〔３〕に記載の動物飼料組成物。
〔５〕配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼを含むトランスジェニック植物または植物部位に由来する植物材料を含む動物飼料組成物。
〔６〕前記トランスジェニック植物または植物部位が、前記植物材料の約１質量％〜約１００質量％を占める、前記〔５〕に記載の動物飼料組成物。
〔７〕前記植物材料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、前記〔５〕または〔６〕に記載の動物飼料組成物。
〔８〕前記植物材料が、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、および／またはキビに由来する、前記〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
〔９〕前記植物材料が、トウモロコシである、前記〔８〕に記載の動物飼料組成物。
〔１０〕前記トウモロコシが、トウモロコシ事象３２７３を含む、前記〔９〕に記載の動物飼料組成物。
〔１１〕前記トランスジェニック植物に由来する前記植物材料が、種子である、前記〔３〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
〔１２〕配列番号２、配列番号３、配列番号４および／または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む組み換えα−アミラーゼで安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する植物材料を含むトウモロコシ飼料。
〔１３〕前記トランスジェニックトウモロコシ植物または植物部位に由来する前記植物材料が、前記トウモロコシ飼料の約１質量％〜約１００質量％を占める、前記〔１２〕に記載のトウモロコシ飼料。
〔１４〕前記〔１２〕または〔１３〕に記載のトウモロコシ飼料を含む動物飼料組成物。
〔１５〕前記トウモロコシ飼料が、前記動物飼料組成物の約５質量％〜約１００質量％を占める、前記〔１４〕に記載の動物飼料組成物。
〔１６〕動物が、家畜、動物園の動物および／またはコンパニオンアニマルである、前記〔１〕〜〔１１〕または〔１４〕もしくは〔１５〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物。
〔１７〕動物の平均１日体重増加を増大させる方法であって、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記平均１日体重増加が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
〔１８〕動物の成長速度（体重増加）を増大させる方法であって、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物の前記成長速度が約０．０５ポンド／日〜約１０ポンド／日だけ増大される、方法。
〔１９〕動物の所望の体重を達成するのに必要な日数を減少させる方法であって、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給し、それにより、所望の体重を達成するのに必要な前記日数を減少させる工程を含む方法。
〔２０〕前記動物の所望の体重を達成するのに必要な前記日数が、約１日〜約２０日だけ減少される、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕動物による飼料利用の効率を増大させる方法であって、前記動物による飼料利用の前記効率を増大させるのに有効な量で前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含む方法。
〔２２〕前記動物による飼料利用の前記効率が、約１％〜約２５％だけ増大される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕前記動物が、１日当たり約１ポンド〜約３０ポンドの前記動物飼料組成物を供給される、前記〔１７〕〜〔２２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２４〕前記動物が、１日当たり約１回〜約３回、前記動物飼料組成物を供給される、前記〔１７〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２５〕前記動物が、哺乳動物、鳥類、または魚類である、前記〔１７〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕前記哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはブタである、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、またはカモである、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２８〕動物によるトウモロコシの飼料価値を増大させる方法であって、前記〔８〕または〔１５〕に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、前記動物によるトウモロコシの前記飼料価値が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約１％〜約２５％だけ増大される、方法。
〔２９〕動物の飼料利用の効率を増大させる方法であって、前記〔８〕または〔１５〕に記載の動物飼料組成物を前記動物に供給する工程を含み、動物の飼料利用の前記効率が、前記動物飼料組成物を供給されない対照動物と比較して約０．００５〜約０．０３だけ増大される、方法。
〔３０〕前記組み換えα−アミラーゼがその基質以外に標的化される、前記〔５〕または〔１２〕に記載の動物飼料組成物。
〔３１〕前記組み換えα−アミラーゼが、葉緑体、液胞、細胞質、アポプラストおよび小胞体からなる群から選択される細胞小器官に標的化される、前記〔３０〕に記載の動物飼料組成物。
【国際調査報告】
2018512149.tif 000016
2018512149.tif 000017
2018512149.tif 000018