(57)【要約】  １回又は複数回の凍結／融解サイクル中及び／又は凍結温度のすぐ上〜周辺温度の範囲の温度で液状での長期貯蔵中に、感染力を維持し、かつウイルス安定性の改善をもたらす、生ウイルス組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス、タンパク質、少なくとも１種類の糖、塩化ナトリウム、及びｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含み、凍結されている、生ウイルス組成物。
【請求項２】
前記組成物は、２℃〜少なくとも２５℃で解凍及び貯蔵される場合がある、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項３】
解凍に続いて、前記生ウイルス組成物は、少なくとも−３０℃の温度で再度凍結及び貯蔵される、請求項２に記載の生ウイルス。
【請求項４】
前記組成物は、２℃〜８℃で解凍及び貯蔵される場合がある、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項５】
解凍に続いて、前記生ウイルス組成物は、少なくとも−３０℃の温度で再度凍結及び貯蔵される、請求項４に記載の生ウイルス。
【請求項６】
前記タンパク質は、部分加水分解ゼラチン又はヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項７】
前記部分加水分解ゼラチンの濃度は、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項８】
前記ヒト血清アルブミンの濃度は、０．２５％〜１％である、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項９】
少なくとも１種類の糖は、ソルビトール、ミオイノシトール、又はスクロースである、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１０】
前記ソルビトールの濃度は、２％（ｗ／ｖ）である、請求項９に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１１】
前記ミオイノシトールの濃度は、４％（ｗ／ｖ）である、請求項９に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１２】
前記スクロースの濃度は、９％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項９に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１３】
前記塩化ナトリウムの濃度は、１４５ｍＭである、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１４】
前記リン酸ナトリウムの濃度は、１０２ｍＭである、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１５】
前記部分加水分解ゼラチンは、ブタのものである、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１６】
前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型である、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１７】
前記単純ヘルペスウイルスは、臨床分離株である、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１８】
前記単純ヘルペスウイルスは、再発性口唇ヘルペスに由来する臨床分離株である、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項１９】
前記単純ヘルペスウイルス１型株は、ＪＳ１株、１７＋株、Ｆ株、及びＫＯＳ株からなる群より選択される、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２０】
前記単純ヘルペスは、１つ又は複数の機能遺伝子を欠いている、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２１】
前記単純ヘルペスウイルスは、機能的なＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子を欠いている、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２２】
前記単純ヘルペスウイルスは、機能的なＩＣＰ４７をコードする遺伝子を欠いている、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２３】
前記単純ヘルペスウイルスは、さらに、機能的なＩＣＰ６をコードする遺伝子、機能的な糖タンパク質Ｈをコードする遺伝子、又は機能的なチミジンキナーゼをコードする遺伝子を欠いている、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２４】
前記単純ヘルペスウイルスは、機能的なｖｈｓをコードする遺伝子を欠いている、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２５】
前記単純ヘルペスウイルスは、機能的なＵＬ４３をコードする遺伝子を欠いている、請求項２４に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２６】
前記単純ヘルペスウイルスは、機能的なＶＭＷをコードする遺伝子、機能的なＩＣＰＯをコードする遺伝子、機能的なＩＣＰ４をコードする遺伝子、機能的なＩＣＰ２２をコードする遺伝子、又は機能的なＩＣＰ２７をコードする遺伝子を欠いている、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２７】
前記単純ヘルペスウイルスへの修飾は、Ｕｓ１１遺伝子が初期遺伝子として発現するようになされたものである、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２８】
前記単純ヘルペスウイルスは、１つ又は複数の異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子を含む、請求項２０に記載の生ウイルス組成物。
【請求項２９】
前記異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子は、サイトトキシン、免疫調節タンパク質、腫瘍抗原、プロドラッグ活性化因子、腫瘍抑制因子、プロドラッグ変換酵素、細胞同士の融合を引き起こすことができるタンパク質、ＴＡＰ阻害因子、ウイルスタンパク質Ｕｓ１１、アンチセンスＲＮＡ分子、又はリボザイムをコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項２８に記載の生ウイルス組成物。
【請求項３０】
前記異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子は、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ、テナガザル白血病膜融合糖タンパク質、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）ＵＬ４９．５ポリペプチド、又はウイルスタンパク質Ｕｓ１１をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項２８に記載の生ウイルス組成物。
【請求項３１】
前記単純ヘルペスウイルスは、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ（商標）、Ｇ２０７、ＯｒｉｅｎＸ０１０、ＮＶ１０２０、Ｍ０３２、ＩｍｍｕｎｏＶＥＸ、及びＯｎｃｏＶＥＸＧＡＬＶ／ＣＤからなる群より選択される、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【請求項３２】
患者の腫瘍細胞を殺傷する方法であって、腫瘍細胞を殺傷する必要がある対象に、該患者の腫瘍細胞を殺傷するのに有効な条件下、請求項１に記載の生ウイルス組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記生ウイルス組成物は、チェックポイント阻害剤と併用で投与される、請求項３２に記載の患者の腫瘍細胞を殺傷する方法。
【請求項３４】
前記生ウイルス組成物は、チェックポイント阻害剤の前、同時、又は後に投与される、請求項３３に記載の腫瘍細胞を殺傷する方法。
【請求項３５】
前記腫瘍細胞は、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、中皮腫、膀胱癌細胞、及び類表皮癌細胞からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者は、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与は、注射により行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
感染力は、同じ生ウイルス組成物からタンパク質を除いたものと比較して、上昇している、請求項１に記載の生ウイルス組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（Ｅ）の下、２０１４年１２月１８日出願の米国特許出願第６２／０９３，６６３号の優先権を主張し、その出願は、本明細書中参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルスなどの生きたウイルスは、概して、−８０℃より高い貯蔵温度での長期間の安定性がない。熱安定性の欠如は、そうしたウイルス、特に液状配合物に含まれる治療用ウイルスに難題をもたらしている。そうした治療用ウイルス組成物は、それらの治療上有効な感染力を維持するために、凍結されて貯蔵及び輸送されなければならず、解凍後すぐに使用されなければならない。
【０００３】
熱安定性の欠如は、製造、貯蔵、及び輸送の費用を上昇させる操作上の難題をもたらす。製造操作中、例えば、凍結／融解サイクルは、最善ではない製造工程歩留まり及び供給チェーンに必要な柔軟性の欠如を招く可能性がある。貯蔵及び輸送もまた難題をもたらすものであり、煩雑な取り扱い及び複雑な供給チェーンをもたらす。
【０００４】
熱安定性の欠如はまた、商業上の難題ももたらす。安定な貯蔵寿命を保証するために−８０℃貯蔵を必要とする生ウイルス組成物は、医療提供者にとって複雑な貯蔵及び取り扱いプロトコルを招く。そうした制約は、不適切に貯蔵された場合又は全製品が使用されない場合などの返品のリスクを増大させる。このことは、消費者が負担する費用を上昇させる可能性がある。
【０００５】
本発明は、複数回の凍結／融解サイクル中ならびに低温及び周辺温度での長期貯蔵中の感染力を安定化及び保存するのに使用することができる生ウイルス配合物を提供する。本配合物は、安定性及び／又は感染力を低下させることなく柔軟性を提供することにより、ウイルスの製造、輸送、貯蔵、及び使用中の制約を減らす。
【０００６】
腫瘍溶解性免疫療法の分野が成長するにつれて、腫瘍溶解性ウイルス組成物の治療使用が増加してきている。１回又は複数回の凍結／融解サイクル中及び／又は凍結温度のすぐ上〜周辺温度の範囲の温度での液状での長期貯蔵中、感染力を維持しかつ改善されたウイルス安定性を提供する改善を生ウイルス組成物に行うことは、どのようなものであっても、操作上の利点となると思われ、医療提供者及び患者の利便性及び柔軟性を大きく上昇させると思われる。本発明は、そのような組成物を提供することにより、この要求を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルス、タンパク質、少なくとも１種類の糖、塩化ナトリウム、及びｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含み、凍結されている、生ウイルス組成物を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、組成物は、２℃〜少なくとも２５℃で、解凍及び貯蔵することができる。関連する実施形態において、生ウイルス組成物は、２℃〜少なくとも２５℃で解凍された後、再び凍結されて、少なくとも−３０℃の温度で貯蔵される。
【０００９】
別の実施形態において、組成物は、２℃〜８℃で、解凍及び貯蔵することができる。関連する実施形態において、生ウイルス組成物は、２℃〜８℃で解凍された後、再び凍結されて、少なくとも−３０℃の温度で貯蔵される。
【００１０】
別の実施形態において、タンパク質は、部分加水分解ゼラチン又はヒト血清アルブミンである。
【００１１】
別の実施形態において、部分加水分解ゼラチンの濃度は、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）である。
【００１２】
別の実施形態において、ヒト血清アルブミンの濃度は、０．２５％〜１％である。
【００１３】
別の実施形態において、少なくとも１種類の糖は、ソルビトール、ミオイノシトール、又はスクロースである。関連する実施形態において、ソルビトールの濃度は、２％（ｗ／ｖ）である。関連する実施形態において、ミオイノシトールの濃度は、４％（ｗ／ｖ）である。関連する実施形態において、スクロースの濃度は、９％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）である。
【００１４】
別の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、１４５ｍＭである。
【００１５】
別の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１４５ｍＭである。
【００１６】
別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、１００ｍＭである。
【００１７】
別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭである。
【００１８】
別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、１０２ｍＭである。
【００１９】
別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、約１０２ｍＭである。
【００２０】
別の実施形態において、部分加水分解ゼラチンは、ブタのものである。
【００２１】
別の実施形態において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型である。
【００２２】
別の実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、臨床分離株である。
【００２３】
別の実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、再発性口唇ヘルペス由来の臨床分離株である。
【００２４】
別の実施形態において、単純ヘルペスウイルス１型株は、ＪＳ１株、１７＋株、Ｆ株、及びＫＯＳ株からなる群より選択される。
【００２５】
別の実施形態において、単純ヘルペスは、１つ又は複数の機能遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、機能的なＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、機能的なＩＣＰ４７をコードする遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、さらに、機能的なＩＣＰ６をコードする遺伝子、機能的な糖タンパク質Ｈをコードする遺伝子、又は機能的なチミジンキナーゼをコードする遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、機能的なｖｈｓをコードする遺伝子を欠いている。別の関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、機能的なＵＬ４３をコードする遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、機能的なＶＭＷをコードする遺伝子、機能的なＩＣＰＯをコードする遺伝子、機能的なＩＣＰ４をコードする遺伝子、機能的なＩＣＰ２２をコードする遺伝子、又は機能的なＩＣＰ２７をコードする遺伝子を欠いている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスの修飾は、Ｕｓ１１遺伝子が初期遺伝子として発現するようになされている。関連する実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、１つ又は複数の異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子を含む。関連する実施形態において、異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子は、サイトトキシン、免疫調節タンパク質、腫瘍抗原、プロドラッグ活性化因子、腫瘍抑制因子、プロドラッグ変換酵素、細胞同士の融合を引き起こすことができるタンパク質、ＴＡＰ阻害因子、ウイルスタンパク質Ｕｓ１１、アンチセンスＲＮＡ分子、又はリボザイムをコードする遺伝子からなる群より選択される。別の関連する実施形態において、異種遺伝子及び／又はウイルス遺伝子は、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ、テナガザル白血病膜融合糖タンパク質、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）ＵＬ４９．５ポリペプチド、又はウイルスタンパク質Ｕｓ１１をコードする遺伝子からなる群より選択される。
【００２６】
別の実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（タリモジーン・ラハーパレプベック）、Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ（商標）（ＨＳＶ−１７１６）、Ｇ２０７、ＯｒｉｅｎＸ０１０、ＮＶ１０２０、Ｍ０３２、ＩｍｍｕｎｏＶＥＸ、ＮＳＣ−７３３９７２、ＨＦ−１０、ＢＶ−２７１１、ＪＸ−５９４、Ｍｙｂ３４．５、ＡＥ−６１８、Ｂｒａｉｎｗｅｌ（商標）、Ｈｅａｐｗｅｌ（商標）、及びＯｎｃｏＶＥＸＧＡＬＶ／ＣＤからなる群より選択される。
【００２７】
別の実施形態において、患者の腫瘍細胞を殺傷する方法であって、本方法は、その必要がある対象に、上記の生ウイルス組成物を、患者の腫瘍細胞を殺傷するのに有効な条件下で、投与することを含む。関連する実施形態において、生ウイルス組成物は、チェックポイント阻害剤と併用で投与される。関連する実施形態において、生ウイルス組成物は、チェックポイント阻害剤の前、同時、又は後に投与される。関連する実施形態において、腫瘍細胞は、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、中皮腫、膀胱癌細胞、及び類表皮癌細胞からなる群より選択される。関連する実施形態において、患者は、ヒトである。関連する実施形態において、投与は、注射により行われる。
【００２８】
別の実施形態において、感染力は、同じ生ウイルス組成物からタンパク質を除いたものと比較して、上昇している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】凍結／融解安定性に対する緩衝液及び塩含有量の効果。黒塗りひし形、実線：１０ｍＭのＮａｐｈｏｓ、白抜き丸形、点線、１０ｍＭのＫｐｈｏｓ、黒塗り丸形、実線：１００ｍＭのＫｐｈｏｓ；黒塗り四角、実線：７３ｍＭのＮａＣｌ；白抜き四角、点線：０ｍＭのＮａＣｌ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図２Ａ】凍結／融解安定性に対する糖濃度の効果。黒塗り四角、実線：９％ソルビトール、白抜き四角、点線：１５％ソルビトール、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図２Ｂ】凍結／融解安定性に対する糖濃度の効果。黒塗り四角、実線、９％ソルビトール、黒塗り三角、実線：１５％スクロース、白抜き四角、点線：９％トレハロース、及び白抜き三角、点線：１５％トレハロース。
【図３】凍結／融解中の安定性に対するタンパク質／糖の組み合わせの効果。黒塗り四角、実線：９％スクロース、２％抗ストレプトアビジンｍＡｂ、白抜き四角、点線：９％スクロース、２％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：４％ｒＨＳＡ、白抜き丸形、点線：４％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図４Ａ】２〜８℃での液体安定性に対する糖及びタンパク質賦形剤の効果。黒塗り四角、実線：２％ｒＨＳＡ、白抜き四角、点線：２％ｐｈゼラチン；黒塗り丸形、実線：１５％トレハロース、白抜き丸形、点線：１５％スクロース、黒塗り三角、実線：９％スクロース、２％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図４Ｂ】２５℃での液体安定性に対する糖及びタンパク質賦形剤の効果。黒塗り四角、実線：２％ｒＨＳＡ、白抜き四角、点線：２％ｐｈゼラチン、白抜き丸形、点線：１５％スクロース、黒塗り三角、実線：９％スクロース及び２％ｒＨＳＡ、ならびに黒塗りひし形、点線：対照。
【図５】凍結／融解サイクル中の安定性に対するｒＨＳＡ及びｐｈゼラチン濃度の効果。黒塗り四角、実線：１％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：２％ｒＨＳＡ、黒塗り丸形、実線：４％ｒＨＳＡ、白抜き四角、点線：１％ｐｈゼラチン、白抜き三角、点線：２％ｐｈゼラチン、白抜き丸形、点線：４％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図６Ａ】２５℃での液体貯蔵中の安定性に対するｒＨＳＡ及びｐｈゼラチン濃度の効果。黒塗り四角、実線：１％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：２％ｒＨＳＡ、黒塗り丸形、実線：４％ｒＨＳＡ、白抜き四角、点線：１％ｐｈゼラチン、白抜き三角、点線：２％ｐｈゼラチン、白抜き丸形、点線：４％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図６Ｂ】２〜８℃での液体貯蔵中の安定性に対するｒＨＳＡ及びｐｈゼラチン濃度の効果。黒塗り四角、実線：１％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：２％ｒＨＳＡ、黒塗り丸形、実線：４％ｒＨＳＡ、白抜き四角、点線：１％ｐｈゼラチン、白抜き三角、点線：２％ｐｈゼラチン、及び白抜き丸形、点線：４％ｐｈゼラチン、黒塗りひし形、点線：対照。
【図７Ａ】２５℃での液体安定性に対するｒＨＳＡのグレード及び供給元の違いの効果。黒塗り四角、実線：２％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：２％Ｓｉｇｍａ、白抜き三角、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ、白抜き丸形、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｂｉｘ、及び白抜きひし形、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ。
【図７Ｂ】２５℃での液体安定性に対するｒＨＳＡのグレード及び供給元の違いの効果。黒塗り四角、実線：２％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：２％Ｓｉｇｍａ、白抜き三角、点線：１％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ、白抜き丸形、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ、及び白抜きひし形、点線：４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ。
【図７Ｃ】２５℃での液体安定性に対するｒＨＳＡのグレード及び供給元の違いの効果。黒塗り四角、実線：２％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：２％Ｓｉｇｍａ、白抜き三角、点線：１％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｂｉｘ、白抜き丸形、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｂｉｘ、及び白抜きひし形、点線：４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｂｉｘ。
【図７Ｄ】２５℃での液体安定性に対するｒＨＳＡのグレード及び供給元の違いの効果。黒塗り四角、実線：２％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：２％Ｓｉｇｍａ、白抜き三角、点線：１％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ、白抜き丸形、点線：２％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ、及び白抜きひし形、点線：４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ。
【図８Ａ】１０６ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｂ】１０８ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｃ】１０６ＰＦＵ／／ｍＬで２〜８℃での液体安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｄ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での液体安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｅ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での液体安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｆ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での液体安定性に対する０．２５〜１．０％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：１．０％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｇ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での液体安定性に対する０．０１％〜０．５％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．０１％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：０．０５％ｐｈゼラチン、白抜き丸形、実線：０．１％ｐｈゼラチン、星形、点線：０．２５％ｐｈゼラチン。黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図８Ｈ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での液体安定性に対する０．０１％〜０．５％ｐｈゼラチンの効果。黒塗り四角、実線：０．０１％ｐｈゼラチン、黒塗り三角、実線：０．０５％ｐｈゼラチン、白抜き丸形、実線：０．１％ｐｈゼラチン、星形、点線：０．２５％ｐｈゼラチン。黒塗り丸形、実線：０．５％ｐｈゼラチン、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ａ】１０６ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性に対する０．２５〜２．０％の効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ｂ】１０８ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性に対する０．２５〜２．０％の効果。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ｃ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での液体安定性に対する０．２５〜２．０％ｒＨＳＡの効果、経時的、週単位。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ｄ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での液体安定性に対する０．２５〜２．０％ｒＨＳＡの効果、経時的、週単位。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ｅ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での安定性液体安定性に対する０．２５〜２．０％ｒＨＳＡの効果、経時的、日数単位。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図９Ｆ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での安定性液体安定性に対する０．２５〜２．０％ｒＨＳＡの効果、経時的、週単位。黒塗り四角、実線：０．２５％ｒＨＳＡ、黒塗り三角、実線：０．５％ｒＨＳＡ、白抜き三角、実線：１．０％ｒＨＳＡ、星形、実線：２．０％ｒＨＳＡａｎｄ黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ａ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで−３０℃での長期凍結安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｂ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで−３０℃での長期凍結安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｃ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで−７０℃での長期凍結安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｄ】Ｂ）１０８ＰＦＵ／ｍＬで−７０℃での長期凍結安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｅ】１０６ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｆ】１０８ＰＦＵ／ｍＬでの凍結／融解サイクル中の安定性。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｇ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での長期液体安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｈ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２〜８℃での長期液体安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｉ】１０６ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での長期液体安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１０Ｊ】１０８ＰＦＵ／ｍＬで２５℃での長期液体安定性、時間は週単位。黒塗り四角：０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形：０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、点線：対照。
【図１１Ａ】１０６ＰＦＵ／ｍＬを２〜８℃での静置貯蔵、時間は週単位。黒塗り四角、点線：緩衝液＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、点線：緩衝液＋０．５％ｒＨＳＡ、黒塗りひし形、点線：緩衝液対照。黒塗り四角、実線：配合物＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：配合物＋０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、実線：配合物対照。
【図１１Ｂ】１０６ＰＦＵ／ｍＬを−７０℃で凍結させ、次いで２〜８℃で貯蔵（１回の凍結融解サイクル）、時間は週単位。黒塗り四角、点線：緩衝液＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、点線：緩衝液＋０．５％ｒＨＳＡ、黒塗りひし形、点線：緩衝液対照。黒塗り四角、実線：配合物＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：配合物＋０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、実線：配合物対照。
【図１２Ａ】１０８ＰＦＵ／ｍＬを２〜８℃での静置貯蔵、時間は週単位。黒塗り四角、点線：緩衝液＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、点線：緩衝液＋０．５％ｒＨＳＡ、黒塗りひし形、点線：緩衝液対照。黒塗り四角、実線：配合物＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：配合物＋０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、実線：配合物対照。
【図１２Ｂ】１０８ＰＦＵ／ｍＬを−７０℃で凍結させ、次いで２〜８℃で貯蔵（１回の凍結融解サイクル）、時間は週単位。黒塗り四角、点線：緩衝液＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、点線：緩衝液＋０．５％ｒＨＳＡ、黒塗りひし形、点線：緩衝液対照。黒塗り四角、実線：配合物＋０．５％ｐｈゼラチン、黒塗り丸形、実線：配合物＋０．５％ｒＨＳＡ、及び黒塗りひし形、実線：配合物対照。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書中記載される本発明は、複数回の凍結／融解サイクル中ならびに凍結温度近く及び周辺温度での長期貯蔵中の感染力の安定化及び保存に使用することができる生ウイルス組成物を提供する。本組成物は、凍結融解に柔軟性を提供することにより、製造、輸送、貯蔵、及び使用中の難題を減少させる。本発明の生ウイルス組成物は、凍結／融解サイクル中に及び、液体状態で生じる損傷から生ウイルスを保護し、本発明の生ウイルス組成物は、−３０℃以下の温度での凍結貯蔵中の良好な安定性を維持しながら、２〜８℃又は周辺温度での安定性を提供する。
【００３１】
ヘルペスウイルス粒子は、細胞由来の二重膜に包まれた正二十面体タンパク質カプシドに内包された二本鎖ＤＮＡゲノムからなる複雑構造体である。カプシドと脂質エンベロープの間には、テグメントとして知られるウイルスタンパク質の層が挟まれている［１、２］。膜エンベロープの存在は、多くの様々な種類の動物ウイルスを差別化する特徴である。生ウイルスを安定化する組成物の配合において、脂質エンベロープは、ウイルス粒子に顕著な物理的不安定性を与えているらしく、このため、このクラスのウイルスの安定化は、特にアデノウイルス、レオウイルス、及びポリオウイルスなどの非エンベロープ哺乳類ウイルスと比較して、困難になっている。例えば、２〜８℃での貯蔵では、アデノウイルス５型は、２年間安定であることが示されているが、ポリオウイルス及びレオウイルスでは、少なくとも１年間である［３〜５］。ポックスウイルスは、同様な温度で同様な程度の貯蔵安定性を示す、唯一のエンベロープ動物ウイルスと思われる。しかしながら、ポックスウイルスは、二重のエンベロープ及び他にも構造的差異を有していることから、他のエンベロープ動物ウイルスとは構造的に異なる［６、７］。実際、ポックスウイルスは、保管された組織、環境試料、及び２〜８℃で研究室貯蔵された乾燥試料で、６０年超という長期貯蔵が観察されることにより実証されるほどに非常に安定である［８〜１２］。
【００３２】
米国で認可された生エンベロープウイルス製品のうち［１３］、１種類（ポックスウイルスワクチン；ＡＣＡＭ２０００）以外は全て、ＰＨＧを含有する（表１）（もっとも、上記のとおり、ポックスウイルスは、様々な環境で特に安定であることが既知である）。表１に示すとおり、ＰＨＧを用いる生ウイルス配合物であっても、凍結乾燥を必要とし、このことは、ＰＨＧの使用が、液体組成物の、例えば２〜８℃での適切な貯蔵安定性を付与するのに不十分であることを示す。ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、凍結乾燥しなくても、液体組成物として２〜８℃で貯蔵可能であるが、もっともそれは約１８週間という比較的短期間である。対照的に、本発明の組成物は、生ウイルス液体配合物が、これまでの生ウイルス液体配合物を超えて大幅に向上した２〜８℃で少なくとも９ヶ月（３９週間）という貯蔵安定性を示すことを可能にする。
【表１】
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【００３３】
本発明の組成物は、凍結融解の損傷によるウイルスの不活性化も防ぐ。効力（又は活性）を低下させることなく製剤又は中間生成物を凍結及び融解できる能力は、極めて大きな価値がある。なぜなら、それにより、製造プロセス設計、ラベリング、梱包操作、最終製品の供給チェーン流通、及び医療提供者の取り扱いに柔軟性をもたらすからである。例えば、凍結融解の損傷から保護されている生ウイルス配合物は、偶然溶解された又は未使用の場合に再凍結させることができ、したがって、薬物損失量を減少させる。しかしながら、生物製剤は、大抵、凍結融解操作による損傷をなにか受けるものであり、したがって、通常は、効力の損失を最小限にするために、１回の凍結融解サイクルに限定される［１４、１５］。表１に列挙した生ウイルス製品のなかで、凍結乾燥製品のどれも、再構築後に再凍結することはできない。また、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、後で解凍して使用するために凍結するということはできない。図１０Ｅ及び図１０Ｆに示すとおり、本発明の組成物は、１０回の凍結融解サイクルを経ても効力を維持しており、一方、対照は、それぞれ、力価を＞２ｌｏｇ及び＞１ｌｏｇで失う。図９Ａ及び図９Ｂに示すとおり、このメリットは、比較的広範囲のＰＧＨ濃度にわたって実現される。
【００３４】
そのうえ、本明細書中記載される組成物にＰＨＧを加えることで、肉眼視できる粒子及び肉眼視できない粒子の形成を防ぐことができた。製品の外観は、重要な製品特質である；指定の外観基準を満たさない製品は、関連するウイルスロットの廃棄又は回収となる場合もあり得る。粒子の形成は、製造中であろうとその後（例えば、貯蔵中）であろうと、全ての生物製剤に対する重大な懸念である。組成物にＰＨＧを加えることで、製造後（図１１Ａ及び図１２Ａ）でも凍結融解後（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）でも、最終製品中に存在する粒子の量が大幅に減少した。なお、ＰＨＧが存在しない場合、組成物には、高レベルの粒子が出現した。これは、ＰＨＧが粒子形成をそのように高い度合いで防ぐことの最初の報告であると思われる。
【００３５】
したがって、本発明は、単純ヘルペスウイルス、タンパク質、少なくとも１種類の糖、塩化ナトリウム、及びリン酸ナトリウムをｐＨ７〜８で含み、凍結されている生ウイルス組成物を提供する。本発明はまた、単純ヘルペスウイルス、タンパク質、少なくとも１種類の糖、塩化ナトリウム、及びｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含み、凍結されている生ウイルス組成物を提供する。１つの実施形態において、生ウイルス組成物は、２℃〜少なくとも２５℃で解凍及び貯蔵される。別の実施形態において、生ウイルス組成物は、２℃〜２５℃で解凍及び貯蔵される。別の実施形態において、ウイルス組成物は、２℃〜８℃で解凍及び貯蔵される。別の実施形態において、解凍後、生ウイルス組成物は再凍結される。さらに別の実施形態において、解凍後、生ウイルス組成物は、−３０℃以下の温度で、再凍結及び貯蔵される。
【００３６】
実施形態によっては、ウイルス組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０回、解凍、貯蔵、及び再凍結される（すなわち、凍結／融解サイクルに供される）。実施形態によっては、ウイルス組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０回、解凍、貯蔵、及び再凍結される（すなわち、凍結／融解サイクルに供される）。
【００３７】
別の実施形態において、タンパク質は、部分加水分解ゼラチン（ＰＨＧ）又はヒト血清アルブミンである。実施形態によっては、ＰＨＧの濃度は、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）である。１つの実施形態において、部分加水分解ゼラチンは、ブタのものである。実施形態によっては、ＰＨＧの濃度は、０．０１％〜４％、０．１％〜４％、０．１％〜３．５％、０．１％〜３％、０．１％〜２．５％、０．１％〜２％、０．１％〜１．５％、０．０１％〜１％、０．１％〜１％、０．２％〜１％、０．３％〜１％、０．４％〜１％、０．３％〜０．９％、０．３％〜０．８％、０．３％〜０．７％、０．３％〜０．６％、又は０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）である。実施形態によっては、ＰＨＧの濃度は、約０．０１％〜約４％、約０．１％〜約４％、約０．１％〜約３．５％、約０．１％〜約３％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２％、約０．１％〜約１．５％、約０．０１％〜約１％、約０．１％〜約１％、約０．２％〜約１％、約０．３％〜約１％、約０．４％〜約１％、約０．３％〜約０．９％、約０．３％〜約０．８％、約０．３％〜約０．７％、約０．３％〜約０．６％、又は約０．４％〜約０．６％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ＰＨＧの濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、又は約４％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ＰＨＧの濃度は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、又は４％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、ＰＨＧの濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）である。さらに別の実施形態において、ＰＨＧの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）である。別の特定の実施形態において、ブタＰＨＧの濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）である。さらに別の実施形態において、ブタＰＨＧの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）である。タンパク質がヒト血清アルブミンである実施形態において、ヒト血清アルブミンの濃度は、約０．２５％〜約４％、約０．２５％〜約３．５％、約０．２５％〜約３％、約０．２５％〜約２．５％、約０．２５％〜約２％、約０．２５％〜約１．５％、又は約０．２５％〜約１％（ｗ／ｖ）である。タンパク質がヒト血清アルブミンである他の実施形態において、ヒト血清アルブミンの濃度は、０．２５％〜４％、０．２５％〜３．５％、０．２５％〜３％、０．２５％〜２．５％、０．２５％〜２％、０．２５％〜１．５％、又は０．２５％〜１％（ｗ／ｖ）。
【００３８】
別の実施形態において、少なくとも１種類の糖は、ソルビトール、ミオイノシトール、又はスクロースである。実施形態によっては、ソルビトールの濃度は、２％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約２％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約０．５％、約１％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、又は約５％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ソルビトールの濃度は、０．５％、１％、１．５％、１．６５、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、又は５％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約０．０１％〜約５％、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約４％、約０．５％〜約３％、約１％〜約３％、約１．５％〜約２．５％、約１．６％〜約２．４％、約１．７％〜約２．３％、約１．８％〜約２．２％、又は約１．９％〜約２．１％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、ソルビトールの濃度は、０．０１％〜５％、０．１％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜４％、０．５％〜３％、１％〜３％、１．５％〜２．５％、１．６％〜２．４％、１．７％〜２．３％、１．８％〜２．２％、又は１．９％〜２．１％（ｗ／ｖ）である。少なくとも１種類の糖がミオイノシトールである実施形態において、ミオイノシトールの濃度は、４％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、ミオイノシトールの濃度は、約４％（ｗ／ｖ）である。少なくとも１種類の糖がスクロースである実施形態において、スクロースの濃度は、９％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、スクロースの濃度は、約９％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）。
【００３９】
１つの実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、１４５ｍＭである。別の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１４５ｍＭである。実施形態によっては、塩化ナトリウムの濃度は、１０〜５００ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、５０〜２５０ｍＭ、１００〜２５０ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、１００〜１９０ｍＭ、１００〜１８０ｍＭ、１１０〜１８０ｍＭ、１２０〜１８０ｍＭ、１２０〜１７０ｍＭ、１３０〜１７０ｍＭ、１３０〜１６０ｍＭ、１４０〜１６０ｍＭ、又は１４０〜１５０ｍＭである。実施形態によっては、塩化ナトリウムの濃度は、約１０〜約５００ｍＭ、約１０〜約３００ｍＭ、約５０〜約３００ｍＭ、約５０〜約２５０ｍＭ、約１００〜約２５０ｍＭ、約１００〜約２００ｍＭ、約１００〜約１９０ｍＭ、約１００〜約１８０ｍＭ、約１１０〜約１８０ｍＭ、約１２０〜約１８０ｍＭ、約１２０〜約１７０ｍＭ、約１３０〜約１７０ｍＭ、約１３０〜約１６０ｍＭ、約１４０〜約１６０ｍＭ、又は約１４０〜約１５０ｍＭである。実施形態によっては、塩化ナトリウムの濃度は、１３５ｍＭ、１３６ｍＭ、１３７ｍＭ、１３８ｍＭ、１３９ｍＭ、１４０ｍＭ、１４１ｍＭ、１４２ｍＭ、１４３ｍＭ、１４４ｍＭ、１４５ｍＭ、１４６ｍＭ、１４７ｍＭ、１４８ｍＭ、１４９ｍＭ、１５０ｍＭ、１５１ｍＭ、１５２ｍＭ、１５３ｍＭ、１５４ｍＭ、又は１５５ｍＭである。実施形態によっては、塩化ナトリウムの濃度は、約１３５ｍＭ、約１３６ｍＭ、約１３７ｍＭ、約１３８ｍＭ、約１３９ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４１ｍＭ、約１４２ｍＭ、約１４３ｍＭ、約１４４ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１４６ｍＭ、約１４７ｍＭ、約１４８ｍＭ、約１４９ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５１ｍＭ、約１５２ｍＭ、約１５３ｍＭ、約１５４ｍＭ、又は約１５５ｍＭである。
【００４０】
１つの実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、１００ｍＭである。別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭである。別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、１０２ｍＭである。さらに別の実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、約１０２ｍＭである。実施形態によっては、リン酸ナトリウムの濃度は、１０〜５００ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、５０〜２５０ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、６０〜１４０ｍＭ、７０〜１３０ｍＭ、８０〜１２０ｍＭ、９０〜１１０ｍＭ、９１〜１０９ｍＭ、９２〜１０８ｍＭ、９３〜１０７ｍＭ、９４〜１０６ｍＭ、９５〜１０５ｍＭ、９６〜１０４ｍＭ、９７〜１０３ｍＭ、９８〜１０２ｍＭ、又は９９〜１０１ｍＭである。実施形態によっては、リン酸ナトリウムの濃度は、約１０〜約５００ｍＭ、約１０〜約３００ｍＭ、約５０〜約３００ｍＭ、約５０〜約２５０ｍＭ、約５０〜約１５０ｍＭ、約６０〜約１４０ｍＭ、約７０〜約１３０ｍＭ、約８０〜約１２０ｍＭ、約９０〜約１１０ｍＭ、約９１〜約１０９ｍＭ、約９２〜約１０８ｍＭ、約９３〜約１０７ｍＭ、約９４〜約１０６ｍＭ、約９５〜約１０５ｍＭ、約９６〜約１０４ｍＭ、約９７〜約１０３ｍＭ、約９８〜約１０２ｍＭ、又は約９９〜約１０１ｍＭである。実施形態によっては、リン酸ナトリウムの濃度は、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、又は１１０ｍＭである。実施形態によっては、リン酸ナトリウムの濃度は、約９０ｍＭ、約９１ｍＭ、約９２ｍＭ、約９３ｍＭ、約９４ｍＭ、約９５ｍＭ、約９６ｍＭ、約９７ｍＭ、約９８ｍＭ、約９９ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０１ｍＭ、約１０２ｍＭ、約１０３ｍＭ、約１０４ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１０６ｍＭ、約１０７ｍＭ、約１０８ｍＭ、約１０９ｍＭ、又は約１１０ｍＭである。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルス、部分加水分解ゼラチン、ソルビトール、塩化ナトリウム、及びｐＨ７〜８又はｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む組成物を提供する。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、部分加水分解ブタゼラチン、ソルビトール、塩化ナトリウム、及びｐＨ７〜８又はｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度約０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度約２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度約１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを、ｐＨ７〜８で、含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度約０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度約２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度約１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度約１０２ｍＭのリン酸ナトリウムを、ｐＨ７〜８で、含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度約０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度約２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度約１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度約１００ｍＭの約ｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度約０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度約２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度約１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度約１０２ｍＭの約ｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度約０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度１００ｍＭのｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、組成物は、単純ヘルペスウイルス１型、濃度０．５％（ｗ／ｖ）の部分加水分解ブタゼラチン、濃度２％（ｗ／ｖ）のソルビトール、濃度１４５ｍＭの塩化ナトリウム、及び濃度１０２ｍＭのｐＨ７．４のリン酸ナトリウムを含む。上記の実施形態において、単純ヘルペスウイルス１型は、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃの場合がある。
【００４２】
本明細書中使用される場合、「約」という用語は、示される値から５％の変分があることを示すか、又はある範囲の値の場合は、その範囲の下限及び上限の両方から５％の変分があることを意味する。
【００４３】
１つの実施形態において、生ウイルス組成物の感染力は、同じ生ウイルス組成物からタンパク質を除いたものと比較して、上昇している。ウイルス感染力（力価）は、本明細書中記載されるものなどのプラークアッセイをはじめとする、当業者に既知の方法により測定することができる。
【００４４】
本発明のウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）又は単純ヘルペス２型（ＨＳＶ２）株に由来する場合も、それらの誘導株に由来する場合もあるが、好ましくはＨＳＶ１に由来する。誘導株として、ＨＳＶ１株及びＨＳＶ２株由来のＤＮＡを含有するタイプ間組換え株が挙げられる。そのようなタイプ間組換え株は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １（３）；  ２７５  ２８６、及びＭｅｉｇｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５９；  ６０２  ６１４に記載されている。
【００４５】
単純ヘルペスウイルス株は、臨床分離株に由来する場合がある。そのような株は、感染した個体、例えば再発性口唇ヘルペスの個体などから単離される。臨床分離株は、米国特許第７，０６３，８３５号及び米国特許第７，２２３，５９３号に記載されるとおり、所望の能力又は特性について、例えば、標準の実験室株と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍及び／又は他の細胞中での複製が向上しているかどうかでスクリーニングされる場合がある。これらの特許はそれぞれ、そのまま全体が参照として援用される。１つの実施形態において、単純ヘルペスウイルスは、再発性口唇ヘルペスに由来する臨床分離株である。
【００４６】
単純ヘルペスウイルス１型ウイルス株として、ＪＳ１株、１７＋株、Ｆ株、及びＫＯＳ株、Ｐａｔｔｏｎ株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
単純ヘルペスウイルスは、例えば、それらの前駆体株と比較して、修飾されたウイルスが１つ又は複数の機能的ウイルス遺伝子を欠くように修飾される場合がある。本明細書中使用される場合、「機能的ウイルス遺伝子を欠いた」は、単純ヘルペスウイルスにより機能的ウイルスタンパク質がその遺伝子から発現されることが二度とないように、遺伝子（複数可）が、単純ヘルペスゲノムにおいて部分的又は完全に、消去、置換、再編、又はいずれにしろ改変されることを意味する。
【００４８】
修飾可能な遺伝子の例として、ＩＣＰ３４．５（γ３４．５）などのタンパク質をコードする病原性遺伝子が挙げられる。ＩＣＰ３４．５は、ＨＳＶ感染中に病原性因子として作用し、非分裂細胞での複製を制限し、ウイルスを非病原性にする。修飾可能な別のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４７をコードする遺伝子であり、ＩＣＰ４７は、感染した宿主細胞の表面での主要組織適合遺伝子複合体クラスＩの発現を下方制御し、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）と結合して、小胞体での抗原ペプチド輸送及びＭＨＣクラスＩ分子の担持をブロックする。その他にＩＣＰ６があるが、これは、リボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットであり、非分裂細胞でのヌクレオチド代謝及びウイルスＤＮＡ合成に関与するが、分裂細胞では関与しない。アシクロビルからモノリン酸アシクロビルへのホスホリル化に関与するチミジンキナーゼ、ビリオントランス活性化因子タンパク質ｖｍｗ６５、糖タンパク質Ｈ、ｖｈｓ、ＩＣＰ４３、ならびにＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２、及び／又はＩＣＰ０をコードする中間初期遺伝子も、修飾される場合がある。
【００４９】
修飾は、単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現のタイミングを改変するようになされる場合もある。例えば、Ｕｓ１１は、Ｕｓ１１遺伝子をＵｓ１２プロモーター下に配置することにより、初期遺伝子として発現させることができる。Ｍｕｌｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７３：４，  ３３７５−３３８５、米国特許番号ＵＳ５８２４３１８、Ｍｏｈｒ  ＆  Ｇｌｕｚｍａｎ（１９９６）  ＥＭＢＯ  １５：  ４７５９−４７６６。
【００５０】
修飾単純ヘルペスウイルスの例として、ＨＳＶゲノムの長反復領域のＢａｍＨＩ  ｓ断片の各コピー（０〜０−０２及び０−８１〜０．８３マップ単位）内に位置する７５９ｂｐの欠失、「ａ」配列の１８ｂｐのＤＲ〜エレメントの１つの完全コピーの除去、及び最初期（１Ｅ）遺伝子１の５’末端からｌｌ０５ｂｐ上流での終了を有する単純ヘルペスウイルス１型のＳｅｐｒｅｈｖｉｒ（商標）（ＨＳＶ１７１６）１７＋株が挙げられるが、これらに限定されない。ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：６３１−６３９）を参照。
【００５１】
Ｇ２０７は、野生型ＨＳＶ−１のＦ株に由来する腫瘍溶解性ＨＳＶ−１であり、ＨＳＶ神経毒性の主要決定因子、ＩＣＰ３４．５遺伝子の両コピー中の欠失、ならびに感染細胞タンパク質６（ＩＣＰ６）をコードするＵＬ３９へのＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子の不活性化挿入、を有する。Ｍｉｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １：９３８−９４３を参照。
【００５２】
ＯｒｉｅｎＸ０１０は、γ３４．５の両コピー及びＩＣＰ４７遺伝子の欠失ならびにＩＣＰ６遺伝子の中断及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の挿入を持つ単純ヘルペスウイルスである。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９（３１）：５１３８−５１４３を参照。
【００５３】
ＮＶ１０２０は、ＩＣＰ３４．５の１つのコピー、ＵＬ２４、及びＵＬ５６．３４、３５を含む、長（Ｌ）領域及び短（Ｓ）領域の接続領域が除去された、単純ヘルペスウイルスである。除去された領域は、ＨＳＶ−２のＵＳのＤＮＡ（ＵＳ２、ＵＳ３（ＰＫ）、ｇＪ、及びｇＧ）の断片で置き換えられた。Ｔｏｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９８：６３９６−６４０１を参照。
【００５４】
Ｍ０３２は、ＩＣＰ３４．５遺伝子の両方のコピーの除去及びインターロイキン１２の挿入がある単純ヘルペスウイルスである。Ｃａｓｓａｄｙ  ａｎｄ  Ｎｅｓｓ  Ｐａｒｋｅｒ，  （２０１０）  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：１０３−１０８を参照。
【００５５】
ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃは、臨床株、ＨＳＶ−１のＪＳ１株に由来し、欧州培養細胞保存機関（ＥＣＡＡＣ）に受入番号０１０１０２０９で寄託されている。ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃでは、ＩＣＰ３４．５及びＩＣＰ４７をコードするＨＳＶ−１ウイルス遺伝子が、機能的に除去されている。ＩＣＰ４７の機能的除去は、腫瘍選択性を低下させることなく、腫瘍細胞でのウイルス成長を促進する遺伝子であるＵＳ１１のより早い発現を招く。ヒトＧＭ−ＣＳＦのコード配列がウイルスゲノムに挿入されている。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：２９２−３０３，  ２００３を参照。
【００５６】
ＩｍｍｕｎｏＶＥＸ  ＨＳＶ２は、ｖｈｓ、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ４３、及びＵＳ５をコードする遺伝子が機能的に除去された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）である。
【００５７】
ＯｎｃｏＶＥＸＧＡＬＶ／ＣＤ、もまたＨＳＶ−１のＪＳ１株に由来し、これは、ＩＣＰ３４．５及びＩＣＰ４７をコードする遺伝子が機能的に除去されており、シトシンデアミナーゼ及びテナガザル白血病膜融合糖タンパク質をコードする遺伝子がＩＣＰ３４．５遺伝子の代わりにウイルスゲノムに挿入されている。
【００５８】
修飾単純ヘルペスウイルスのさらなる例として、ＮＳＣ−７３３９７２、ＨＦ−１０、ＢＶ−２７１１、ＪＸ−５９４、Ｍｙｂ３４．５、ＡＥ−６１８、Ｂｒａｉｎｗｅｌ（商標）、及びＨｅａｐｗｅｌ（商標）が挙げられる。
【００５９】
ヘルペスウイルス株及びそのような株の作り方は、米国特許番号ＵＳ５８２４３１８；ＵＳ６７６４６７５；ＵＳ６，７７０，２７４；ＵＳ７，０６３，８３５；ＵＳ７，２２３，５９３；ＵＳ７７４９７４５；ＵＳ７７４４８９９；ＵＳ８２７３５６８；ＵＳ８４２００７１；ＵＳ８４７０５７７；ＷＩＰＯ公開番号：ＷＯ１９９６００００７；ＷＯ１９９６３９８４１；ＷＯ１９９９０７３９４；ＷＯ２０００５４７９５；ＷＯ２００６００２３９４；ＷＯ２０１３０６７９５；中国特許番号：ＣＮ１２８３０３，ＣＮ１０２３０３３４，及びＣＮ１０２３０３３５；Ｖａｒｇｈｅｓｅ  ａｎｄ  Ｒａｂｋｉｎ，  （２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：９６７−９７ならびにＣａｓｓａｄｙ  ａｎｄ  Ｎｅｓｓ  Ｐａｒｋｅｒ，  （２０１０）  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：１０３−１０８にも記載されている。
【００６０】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、１つ又は複数の異種遺伝子も含む場合がある。異種遺伝子とは、ウイルスのゲノムに導入される遺伝子であって、通常はそのウイルスのゲノムで見つからない遺伝子又は異なる種由来のウイルスで発現する遺伝子の相同体であり、異なる核酸配列を有しており、異なる生化学機構を介して作用するものを示す。異種遺伝子は、１つ又は複数のタンパク質、例えば、サイトトキシン、免疫調節タンパク質（すなわち、抗原に対する宿主の免疫応答を増強又は抑制するタンパク質）、腫瘍抗原、プロドラッグ活性化因子、腫瘍抑制因子、プロドラッグ変換酵素、細胞同士の融合を引き起こすことができるタンパク質、ＴＡＰ阻害因子、アンチセンスＲＮＡ分子、又はリボザイムをコードする場合がある。免疫調節タンパク質の例として、例えば、サイトカインが挙げられる。サイトカインとして、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０；α、β、もしくはγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカイン（好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ走化性因子及び活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、ならびにマクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａ及びＭＩＰ−１ｂなど）、補体成分及びそれらの受容体、免疫系アクセサリー分子（例えば、Ｂ７．１及びＢ７．２）、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、２、及び３）、ならびに接着受容体分子が挙げられる。腫瘍抗原として、ヒトパピローマウイルスのＥ６抗原及びＥ７抗原、ＥＢＶ由来タンパク質、ＭＵＣ１などのムチン、黒色腫チロシナーゼ、及びＭＺ２−Ｅが挙げられる。プロドラッグ活性化因子として、ニトロレダクターゼ及びシトクロムｐ４５０が挙げられ、腫瘍抑制因子として、ｐ５３が挙げられる。プロドラッグ変換酵素として、シトシンデアミナーゼが挙げられる。細胞同士の融合を引き起こすことができるタンパク質として、テナガザル白血病膜融合糖タンパク質が挙げられる。ＴＡＰ阻害因子として、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）ＵＬ４９．５ポリペプチドが挙げられる。細胞又は病原体ｍＲＮＡの発現をブロックするのに使用可能なアンチセンスＲＮＡ分子。欠損細胞ＲＮＡを修復する、又は望ましくない細胞もしくは病原体にコードされたＲＮＡを破壊するように設計されたリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型又はヘアピン系リボザイム）であることが可能なＲＮＡ分子。
【００６１】
同じく含まれるものとして、複数のウイルス遺伝子の単純ヘルペスゲノムへの挿入、例えばウイルスタンパク質Ｕｓ１１をコードする遺伝子のコピーを１つ又は複数挿入することがある。
【００６２】
本発明の生ウイルス組成物は、ヒト又は動物の治療方法に使用される場合がある。詳細には、本発明の生ウイルス組成物は、癌治療方法に使用される場合がある。
【００６３】
本発明の生ウイルス組成物は、様々な腫瘍及び癌の治療に使用することができる。本発明はまた、腫瘍の治療を必要としている患者で、その個体に有効量の生ウイルス組成物を投与することにより腫瘍を治療する方法も提供する。本明細書中使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、同義で使用されて哺乳類を意味し、哺乳類として、ヒト又は非ヒト哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、患者は、ヒトである。
【００６４】
本発明の生ウイルス組成物は、患者の任意の固形腫瘍の治療に使用することができる。例えば、本発明の生ウイルス組成物は、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌、結腸癌、もしくは子宮頸癌；腺癌；黒色腫；リンパ腫；神経膠腫；軟部組織及び骨肉腫などの肉腫；又は頭頚部癌、及び好ましくは膀胱癌の患者に投与することができる。
【００６５】
本発明の生ウイルス組成物は、全ての種類の癌、新生物、又は悪性腫瘍を含む患者の癌の治療に使用することができ、そのような癌として、白血病、細胞腫、及び肉腫が挙げられる。癌の例として、乳癌、脳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頚部癌、肝臓、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、肉腫、胃癌、子宮癌、及び髄芽細胞腫が挙げられる。同じく、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵内分泌及び外分泌新生物、ならびに前立腺癌。
【００６６】
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される本発明の生ウイルス組成物は、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、中皮腫、及び類表皮癌細胞からなる群より選択される腫瘍細胞を殺傷するのに有用である。
【００６７】
本発明の生ウイルス組成物は、他の治療手法と組み合わせて使用することも可能であり、そのような手法として、制限なく、放射線、化学療法、温熱療法、治療タンパク質、及び手術が挙げられる。生ウイルス組成物は、その他の治療手法の前、同時、又は後に投与することができる。
【００６８】
治療タンパク質として、免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。本明細書中使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１種又は複数のチェックポイントタンパク質を、完全又は部分的に、減少、阻害、干渉、又は調節する分子を示す。
【００６９】
チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化又は機能を調節する。多数のチェックポイントタンパク質が知られており、例えば、ＣＴＬＡ−４及びそのリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６；ならびにＰＤ１とそのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２がある。これらのタンパク質は、Ｔ細胞反応の同時刺激又は阻害相互作用を担当する。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容ならびに生理学的免疫応答の期間及び幅を調節及び維持する。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含むか、抗体に由来する。
【００７０】
チェックポイント阻害剤として、細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）阻害因子が挙げられる。ＣＴＬＡ−４の阻害因子として、トレメリムマブ、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−Ｄ０１０としても知られ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）の名前で市販されている）、ならびに米国特許番号第：５，８１１，０９７；５，８１１，０９７；５，８５５，８８７；６，０５１，２２７；６，２０７，１５７；６，６８２，７３６；６，９８４，７２０；及び７，６０５，２３８号に記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。
【００７１】
他の免疫チェックポイントタンパク質として、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）ならびにプログラム細胞死リガンド１及び２（ＰＤＬ１）（ＰＤＬ２）が挙げられる。ＰＤ１ならびにＰＤＬ１及びＰＤＬ２を阻害する分子の例として、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ９３６５５８、ＯＮＯ４５３８）、ＰＤ−１と結合しそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるＰＤ−１の活性化をブロックする全ヒトＩｇＧ４抗体；キイトルーダ（商標）として市販されているペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、又はＳＣＨ９００４７５）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ、遺伝子改変抗ＰＤＬ１抗体（アテゾリズマブ）；ＣＴ−０１１；ＡＭＰ−２２４；ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）、ならびに米国特許番号第７，４８８，８０２号；同７，９４３，７４３号；同８，００８，４４９号；同８，１６８，７５７号；同８，２１７，１４９号，及びＰＣＴ公開特許出願番号第：Ｗ００３０４２４０２、ＷＯ２００８１５６７１２、Ｗ０２０１００８９４１１、Ｗ０２０１００３６９５９、ＷＯ２０１１０６６３４２、ＷＯ２０１１１５９８７７、ＷＯ２０１１０８２４００、及びＷＯ２０１１１６１６９９に記載されるものが挙げられる。
【００７２】
他の免疫チェックポイント阻害剤として、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）阻害因子、例えばＩＭＰ３２１など、可溶性Ｉｇ融合タンパク質；Ｂ７阻害因子、例えば抗Ｂ７−Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１などが挙げられる。同じく挙げられるのは、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害因子である。
【００７３】
医師は、投薬量が所望の効果を達成するものに到達するまで、生ウイルス組成物を投与することができる。したがって、組成物は、直接注射又は他の適切な投与様式により、単回用量として投与される場合も、経時的に２回以上の用量（各用量は、所望の分子を同量で含んでも含まなくてもよい）として投与される場合もある。本発明の生ウイルス組成物は、例えば、１回又は複数回、例えば、ある期間にわたり定期的に投与される場合がある。一般に、本発明の生ウイルス組成物は、患者が、選択した１つ又は複数の指標についてベースラインを超える医療上関連する度合いの改善を表すまで投与することができる。
【００７４】
１つの実施形態において、生ワクチン組成物は、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃを含む。組成物は、第１週の１日目に上限４．０ｍｌの１０６プラーク形成単位／ｍＬ（ＰＦＵ／ｍＬ）の用量で、続いて第４週の１日目及びその後２週間（±３日）ごとに上限４．０ｍｌの１０８ＰＦＵ／ｍＬの用量で、腫瘍内注射により、注射可能な皮膚、皮下、及び結節腫瘍へと投与される。腫瘍（複数可）に注射されるｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃの推奨量は、腫瘍（複数可）の大きさに依存する。全ての合理的に注射可能な病変（超音波誘導の有無に関わらず注射可能な皮膚、皮下、及び結節疾患）に、個々の投薬場面で利用可能な最大投薬量が注射されるべきである。各治療日において、注射の優先順位付けは、以下のとおりに推奨される：最後の注射以降に出現したあらゆる新規の注射可能な腫瘍；腫瘍の大きさによる、最大の腫瘍から開始する；以前は注射不可能であったが現在注射可能なあらゆる腫瘍（複数可）。
【００７５】
本明細書中特に記載がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から要求されない限り、単数形の用語は、複数形も含むものとし、複数形の用語は、単数形も含むものとする。一般に、本明細書中記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関して使用される命名法及びそれらの技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技法は、特に記載がない限り、一般に、当該分野で周知の従来方法に従って、ならびに本明細書全体を通じて引用及び記載される様々な一般参照及びより具体的な参照に記載されるとおりに行われる。特定される全ての特許及び他の公報は、そのまま全体が参照として本明細書中明白に援用される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
腫瘍溶解性ウイルスとともに使用するための、ブタ部分加水分解ゼラチン（ｐｈゼラチン）を含有する配合物を開発した。この配合物は、凍結条件下での長期貯蔵、複数回の凍結／融解サイクル、ならびに２〜８℃及び２５℃での液体貯蔵中の、感染力の低下から腫瘍溶解性ウイルスを保護する。また、配合物は、ｐｈゼラチンを含まない配合物と比較して、肉眼視できる粒子及び肉眼視できない粒子両方の形成を減少させた。この配合物は、製造、梱包、及びラベリング中、ｐｈゼラチンを含まない配合物に勝る利点を提供し、医療提供者の利便性及び柔軟性を大きく上昇させる。
【００７７】
試料調製
この実施例では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １０：２９２−３０３）を、１０６ＰＦＵ／ｍＬ及び１０８ＰＦＵ／ｍＬの濃度で使用した。ウイルス濃度が１０８ＰＦＵ／ｍＬの場合、濃厚賦形剤原液（すなわち１０〜２０％ｗ／ｖのｐｈゼラチン又は組換えＨＳＡ）を、所望の最終賦形剤濃度を達成する体積で加えることにより、試料を調製した。腫瘍溶解性ＨＳＶ−１濃度が１０６ＰＦＵ／ｍＬの場合、１０８ＰＦＵ／ｍＬ材料を所望の緩衝液に単純希釈することにより、試料を調製した。腫瘍溶解性ＨＳＶ−１濃度が１０８ＰＦＵ／ｍＬの場合、濃厚賦形剤原液及び緩衝液を濃厚腫瘍溶解性ＨＳＶ−１溶液に加えることにより、試料を調製した。試料は、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃ（登録商標）コーティングしたクロロブチルエラストマー栓（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．Ｅｘｔｏｎ．ＰＡ）の付いたすぐに使用できる２ｃｃ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｚｅｎｉｔｈ樹脂バイアル（Ｗｅｓｔ）に入れて、Ｆｌｉｐ−ｏｆｆ（登録商標）ＴｒｕＥｄｇｅ（登録商標）シール（Ｗｅｓｔ）で密閉した。
【００７８】
プラークアッセイ
試験試料を感受性指標細胞に漸増添加し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、その後のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を計数する（検出限度≧２．０８Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）ことにより、感染性腫瘍溶解性ＨＳＶ−１の量を定量した。
【００７９】
簡単に述べると、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ならびに抗生物質ストレプトマイシン及びペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）細胞を増殖させた。試験の１日前に、ＢＨＫ細胞を１２ウェルプレートに播種した。試験試料は、系列希釈して、単層の感染に使用した。ウイルスを吸着させるための最初のインキュベーション期間後、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含有するオーバーレイ培地及び増殖培地で細胞を覆い、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。続いて、接種菌液を吸引し、ＰＢＳ洗浄してから、細胞を０．０１％グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で固定した。次いで、細胞を２％クリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色して、プラークを可視化した。ウイルス力価を求めるため、試験試料の各希釈液について形成されたプラークを計数し、試験した２つ組の平均から最終力価を求めた（Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）。
【００８０】
肉眼視できない粒子の分析
肉眼視できない粒子は、２つの技法により観測した：光遮断法（ＨＩＡＣ）及びマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）。
【００８１】
ＨＩＡＣ
肉眼視できない粒子を、Ｒｙｃｏ  ＨＩＡＣパーティクルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて光遮断法により観測した。１５ミクロン粒子計数標準試料（Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を分析してから、試料を試験した。肉眼視できない粒子の計数は、０．２ｍＬの注入量で４回行った。最後の３回の読みを平均し、ｍＬあたりの累積数として記録した。
【００８２】
ＭＦＩ
肉眼視できない粒子の分析を、１００μｍシランコートフローセルを備えたマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）装置（４２００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で行った。各測定前に、システムに水を流して照明を最適化し、欠点のないベースラインにした。各試料について、合計１ｍＬを流速０．２ｍＬ／分でセルにポンプで送りこんだ。最初の０．３５ｍＬは、フローセルをパージするのに使用し、残りの０．６５ｍＬを分析した。≧２μｍの粒子の合計数を記録した。
【００８３】
凍結融解安定性
１回及び５回の凍結／融解サイクル後にウイルス感染力を試験することにより、複数の要因をスクリーニングした。
【００８４】
緩衝液及び塩
リン酸ナトリウムは、凍結状態では結晶化し、凍結状態のｐＨの大幅な低下を招くことが知られている。対して、リン酸カリウムは結晶化しない。
【００８５】
配合：２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、４％（ｗ／ｖ）ミオイノシトール、１４５ｍＭのＮａＣｌ、及び１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、対照として使用。対照配合を修飾して、リン酸ナトリウム濃度を１００ｍＭから１０ｍＭへと下げるか、１０又は１００ｍＭのリン酸カリウムに置き換えた。ＮａＣｌ濃度を７３ｍＭに下げるか又は完全に除去した配合も試験した。表１を参照。
【表２】
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【００８６】
試料を１０６ＰＦＵ／ｍｌで調製した。感染力（力価）を、上記のとおりプラークアッセイにより求めた。試料を少なくとも１日間−７０℃で凍結に供し、次いで室温で２時間以内で解凍した。解凍した試料を再び少なくとも１日間−７０℃で凍結に供し、次いで室温で２時間以内で解凍し、毎回この凍結／融解サイクルを行った（１回又は合計で５回のサイクル）。
【００８７】
リン酸ナトリウムを減らす又はリン酸カリウムに置き換えると、感染力の低下が、凍結／融解サイクル後に依然として見られ、これらのどちらも、対照に勝るどのような利点も提供しないと見なされた。同様に、ＮａＣｌ濃度の低下は、対照と比較して、凍結／融解サイクル中のウイルスの安定性に何の効果も有さなかった。（図１）。
【００８８】
糖類
糖類は、凍結防止賦形剤として一般的に使用されるので、凍結／融解サイクル中の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１安定性に対する糖類の効果について、様々な糖をある範囲の濃度で試験した。
【００８９】
対照配合を修飾して、ミオイノシトールを除外し、ソルビトールを９％又は１５％（ｗ／ｖ）いずれかに増加させた。試料の第二群では、対照配合を修飾して、ミオイノシトール及びソルビトールの両方を除外し、９％又は１５％トレハロース（ｗ／ｖ）あるいは９又は１５％スクロース（ｗ／ｖ）に置き換えた。表２を参照。
【表３】
2018502078.tif 000004
【００９０】
試料を１０６ＰＦＵ／ｍｌで調製した。試料を、上記のとおり１回又は５回の凍結融解サイクルに供した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。
【００９１】
９％及び１５％ソルビトールを含む配合物は、腫瘍溶解性ＨＳＶ−１安定性に大幅な上昇をもたらしつつ、５回の凍結／融解サイクル後の感染力に変化はなかった。同様に、スクロースを１５％ならびにトレハロースを９％及び１５％含む配合物は、凍結／融解ストレスに対する保護を提供した。スクロースを９％含む配合物は、凍結／融解ストレスに対する保護を提供しなかった。（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００９２】
糖類及びタンパク質
次いで、高糖含量と安定化タンパク質の組み合わせを、凍結／融解中の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１安定性に対する効果について試験した。対照配合を、ミオイノシトール及びソルビトールを除外し、９％スクロース（ｗ／ｖ）及び２％（ｗ／ｖ）抗ストレプトアビジンｍＡｂ（施設内製造）又は２％ブタ部分加水分解ゼラチン（ｐｈゼラチン）（ｗ／ｖ）（Ｇｅｌｉｔａ、Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ｂｌｕｆｆ、ＩＡ）に置き換えた。実験の第二セットでは、対照配合を維持したまま、４％ｐｈゼラチン（ｗ／ｖ）又は４％組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ、ＮＣ）（ｗ／ｖ）を加えた。表３を参照。
【００９３】
試料を１０６ＰＦＵ／ｍｌで調製した。試料を、１回又は５回の凍結融解サイクルに供した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。
【表４】
2018502078.tif 000005
【００９４】
安定化タンパク質ｒＨＳＡ、ｐｈゼラチン、又は抗ストレプトアビジンｍＡｂの添加は、凍結／融解ストレスに対する保護を提供しつつ、５回の凍結／融解サイクル後の感染力に低下はなかった。９％（ｗ／ｖ）スクロース、又は２％（ｗ／ｖ）ソルビトール及び４％（ｗ／ｖ）ミオイノシトールの対照組み合わせの存在下、ｐｈゼラチンも凍結／融解ストレスに対する保護に同等に有効であった。図３を参照。
【００９５】
凍結／融解安定性は、糖濃度を上昇させることにより、又は安定化タンパク質を加えることにより、改善された。腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、試験した全ての配合物で感染力を低下させることなく５回の凍結／融解サイクルに耐えた。このことは、３種のまったく異なるタンパク質が凍結／融解ストレスに対する保護を提供できることを実証する。３種のタンパク質のうち、ｒＨＳＡ及びｐｈゼラチンが最善の安定性を提供し、しかもこれらは治療用配合物での使用が承認されていることから、これらをその後の試験に選択した。
【００９６】
液体貯蔵
凍結／融解ストレスに対する保護となったこれら糖類及びタンパク質を、２〜８℃及び２５℃での腫瘍溶解性ＨＳＶ−１液体安定性に対する効果について試験した。実験の１つの組では、対照配合を修飾して、ソルビトール及びミオイノシトールを、１５％トレハロース、１５％スクロース、又は９％ソルビトール、及び２％ｒＨＳＡに置き換えた。実験の別の組では、対照配合は維持して、２％ｒＨＳＡ又は２％ｐｈゼラチンを加えた。表４を参照。
【表５】
2018502078.tif 000006
【００９７】
試料を、試験配合物に１０６ＰＦＵ／ｍＬで希釈し、−７０℃で少なくとも１日間凍結させ、次いで２〜８℃又は２５℃で貯蔵することにより調製した。それより高温では、腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は安定性の低下を示すので、試料を、２〜８℃に１４日間及び２５℃に３日間維持して、配合物間の違いを検出した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。
【００９８】
ソルビトール及びミオイノシトールを１５％トレハロースに置き換えると、２〜８℃でも２５℃でも液体貯蔵中の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を安定化しなかった。１５％スクロースに置き換えると、一貫性のない結果が得られ、いくらかの安定性が２５℃で観測されたが、２〜８℃では観測されなかった。対照的に、２％ｒＨＳＡ又は２％ｐｈゼラチンを加えると、２％ソルビトール＋４％ミオイノシトール又は９％スクロースいずれかの存在下、両方の温度で液体貯蔵中の良好な安定性が提供された。図４Ａ及び図４Ｂを参照。
【００９９】
まとめると、安定化タンパク質（ｐｈゼラチン又はｒＨＳＡいずれか）の添加は、凍結／融解及び液体貯蔵中の安定性の改善をもたらした。糖含量を修飾することで、凍結／融解中のさらなる安定性がもたらされたが、液体貯蔵中については比較的効果が小さかった。したがって、安定化タンパク質の様々なレベル及び種類の効果にさらに集中した。
【０１００】
実施例２
タンパク質濃度
凍結／融解及び液体安定性を合わせて改善することは、製造、梱包、及びラベリングに実質的な利点をもたらすだろう。２〜８℃で貯蔵できる能力は、医療提供者に、大きく改善された柔軟性及び利便性を提供するだろう。
【０１０１】
対照配合は維持したまま、１％、２％、もしくは４％ｐｈゼラチン、又は１％、２％、もしくは４％ｒＨＳＡを加えた。試料を１０６ＰＦＵ／ｍｌで調製した。感染力（力価）を、上記のとおりプラークアッセイにより求めた。試料を、上記のとおり５回の凍結／融解サイクルに供した。
【０１０２】
ｒＨＳＡ及びｐｈゼラチンの濃度を変化させて、腫瘍溶解性ＨＳＶ−１安定性に対するタンパク質濃度の効果を求めた。ｐｈゼラチン及びｒＨＳＡの両方とも、試験した全範囲にわたって、凍結／融解サイクル中の保護を提供した。図５を参照。
【０１０３】
次いで、２〜８℃及び２５℃での腫瘍溶解性ＨＳＶ−１液体安定性に対する様々なタンパク質濃度の効果を、試験した。対照配合は維持したまま、１％、２％、もしくは４％ｐｈゼラチン、又は１％、２％、もしくは４％ｒｈＨＳＡを加えた。試料を１０６ＰＦＵ／ｍｌで調製し、−７０℃で少なくとも１日間凍結させ（前凍結）、次いで２〜８℃及び２５℃で貯蔵した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。
【０１０４】
ｐｈゼラチン配合物は、液体貯蔵中に非常に良好な結果を出し、２５℃で３日後に活性が低下していなかった。対照的に、ｒＨＳＡ含有配合物は全て、同期間にわたって感染力の低下を示した。また、ｒＨＳＡを含有する配合物は、実際のところ、ｒＨＳＡ濃度が上昇するにつれて２５℃での結果が悪くなった。感染力のわずかな変化が、２〜８℃でこの期間中に観察された；図６Ａ及び図６Ｂを参照。
【０１０５】
ｒＨＳＡのグレード
ｒＨＳＡの量が増加した配合物ほど同量のｐｈゼラチンの場合よりも安定性が悪かったのは何故なのかを明らかにするため、ｒＨＳＡそのものを試験した。この結果は、ｒＨＳＡの成分、例えば混入物又はｒＨＳＡを安定化するために添加された化合物などによるのではないかと仮定した。そうでなければ、この結果は、ｒＨＳＡそのものの効果による可能性がある。
【０１０６】
４種の異なるグレードのｒＨＳＡを、２５℃で液体貯蔵中の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を安定化する能力について試験した。対照配合は維持したまま、２％Ｓｉｇｍａ、１％、２％、又は４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ、１％、２％、又は４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａｌｂｉｘ、あるいは１％、２％、又は４％Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ  ｒＨＳＡを加えた。また、対照配合に２％ｐｈゼラチンを加えたものも調製した。表５を参照。配合物を、上記のとおり２週間２５℃で液体安定性について試験した。
【表６】
2018502078.tif 000007
【０１０７】
各ｒＨＳＡグレードは、異なるレベルの純度及びｒＨＳＡを安定化させるための他の成分を有していた。Ｓｉｇｍａ材料は、研究用グレードであり、安定化効果が最も低かった。Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製の３種のグレード品（Ａｌｐｈａ、Ａｂｉｘ、及びＰｒｉｍｅ）は、極めて高純度のものであったが、それぞれ異なるレベルの他成分を有していた。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ｒＨＳＡグレード品は、Ｓｉｇｍａグレード品よりも高い安定性をもたらしたが、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ｒＨＳＡ間に差はなかった。また、３種のＮｏｖｏｚｙｍｅ  ｒＨＳＡは全て、濃度を上げて加えた場合に安定性の悪化を示した。最後に、ｐｈゼラチンと同様な結果を出したｒＨＳＡグレード品はなかった。図７Ａ〜図７Ｄを参照。
【０１０８】
タンパク質の下限
１０６及び１０８ＰＦＵ／ｍＬ濃度の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を安定化するために必要なｒＨＳＡ及びｐｈゼラチンの最小量を求めるために、さらにスクリーニングを行った。
【０１０９】
対照配合は維持したまま、０．２５％、０．５％、及び１％ｗ／ｖのｐｈゼラチンならびに０．２５％、０．５％、及び１％ｗ／ｖのｒＨＳＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｒｉｍｅ）を加えた。１０６及び１０８ＰＦＵ／ｍｌ濃度の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１の試料を調製した。１組の試料は、上記のとおり５回の凍結／融解サイクルに供した。２組の試料は、上記のとおり、一方は、２〜８℃で４週間、もう一方は２５℃で２週間、液体安定性について試験した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。
【０１１０】
ｐｈゼラチンは、１０６及び１０８ＰＦＵ／ｍＬのウイルス濃度の両方で、試験した全範囲、０．２５％〜１％ｗ／ｖにわたり、凍結／融解サイクル中、ならびに２〜８℃及び２５℃での液体貯蔵中の保護をもたらした（図８Ａ〜図８Ｆ）。ｒＨＳＡ含有配合物は全て、１０６及び１０８ＰＦＵ／ｍＬのウイルス濃度の両方で、試験したタンパク質濃度の全範囲にわたり、２〜８℃及び２５℃での液体貯蔵中の感染力の低下を示したが、凍結融解サイクル中の感染力の低下は見られなかった（図９Ａ〜図９Ｆ）。
【０１１１】
ｐｈゼラチンのレベルを下げて試験する追加スクリーニングを行った。対照配合は維持したまま、０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）のｐｈゼラチンを加えた。腫瘍溶解性ＨＳＶ−１濃度が１０６及び１０８ＰＦＵ／ｍｌの試料を調製し、上記のとおり、２〜８℃及び２５℃での液体安定性について試験した。感染力（力価）を、プラークアッセイにより求めた。ｐｈゼラチンは、試験したタンパク質濃度（０．０１％〜０．５％）の全範囲にわたり、液体貯蔵中の保護をもたらした。図８Ｇ及び図８Ｈを参照。
【０１１２】
長期安定性
対照配合物と比較したタンパク質含有配合物の安定性を求めるために長期試験を行った。腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を、１０６ＰＦＵ／ｍＬ及び１０８ＰＦＵ／ｍＬで、対照配合物に、又は０．５％（ｗ／ｖ）ｒＨＳＡもしくはｐｈゼラチンを含有する対照配合物に配合した。試料を、上記のとおり２〜８℃及び２５℃で液体貯蔵中；−３０℃及び−７０℃で凍結貯蔵、ならびに１０回の凍結融解サイクル中に、上記のとおり評価した。感染力（力価）を、上記のとおりプラークアッセイにより求めた。
【０１１３】
ｐｈゼラチンを含有する配合物は、再び、評価した全ての貯蔵条件で優れた安定性をもたらした。ｒＨＳＡを含有する配合物は、−３０℃（図１０Ａ及び図１０Ｂ）及び−７０℃（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）で凍結状態で貯蔵された配合物、及び１０回の凍結融解サイクルに供された場合（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）に限って同様な安定性をもたらした（アッセイの誤差内）。しかしながら、液状での貯蔵に関して、ｐｈゼラチン配合物は、より高い安定化効果を示し、その効果は、１０６ＰＦＵ／ｍＬ濃度の腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を２〜８℃（図１０Ｇ及び図１０Ｈ）及び２５℃（図１０Ｉ及び図１０Ｊ）で貯蔵した場合に最も顕著であった。２〜８℃で３９週間貯蔵後、ｐｈゼラチン含有配合物は、１．７ｌｏｇの低下を示したのに対し、ｒＨＳＡ含有配合物は、２．９ｌｏｇの低下を示した。対照配合物は、２〜８℃で１２週間貯蔵後、全ての活性を失った。２５℃で４週間貯蔵中、ｐｈゼラチン含有配合物は、２．３ｌｏｇの低下を示したのに対し、ｒＨＳＡ含有配合物は、３．６ｌｏｇの低下を示した。対照配合物は、２５℃で２週間貯蔵後、全ての活性を失った。
【０１１４】
配合物の粒子検査
２０％（ｗ／ｖ）ｒＨＳＡ又はｐｈゼラチン（又は等体積の対照配合緩衝液）を加えて、最終濃度を１０８ＰＦＵ／ｍＬのウイルス及び０．５％安定化タンパク質にすることにより、腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を配合した。次いで、シリコーンオイルフリー使い捨てシリンジ（ＮＯＲＭ−ＪＥＣＴ（登録商標）Ｌｕｅｒ  Ｓｌｉｐ  Ｃｅｎｔｒｉｃ  Ｔｉ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を用いて溶液を０．２２μｍフィルター（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に通して、無粒子出発物質を生成した。
【０１１５】
１組の試料は、上記のとおり、２〜８℃で貯蔵し（静的）、２組目の試料は、−７０℃で凍結させ、次いで２〜８℃で貯蔵した（１回の凍結融解サイクル）。
【０１１６】
サブビジブル分析又は目視観察により粒子を測定した。
【０１１７】
０．５％（ｗ／ｖ）のｒＨＳＡ又はｐｈゼラチンいずれかを含有する配合物は、サブビジブル分析技法により測定した場合、対照配合物に比べて粒子形成の減少を示した（図１１Ａ〜図１１Ｂ及び図１２Ａ〜図１２Ｂ）。また、濃度１０８ＰＦＵ／ｍＬの腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、対照配合物中で肉眼視できる粒子を形成したが、０．５％ｐｈゼラチン又はｒＨＳＡを含有する配合物では形成しなかった。
【０１１８】
参照文献
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【図１】
2018502078.tif 000008
【図２Ａ】
2018502078.tif 000009
【図２Ｂ】
2018502078.tif 000010
【図３】
2018502078.tif 000011
【図４Ａ】
2018502078.tif 000012
【図４Ｂ】
2018502078.tif 000013
【図５】
2018502078.tif 000014
【図６Ａ】
2018502078.tif 000015
【図６Ｂ】
2018502078.tif 000016
【図７Ａ】
2018502078.tif 000017
【図７Ｂ】
2018502078.tif 000018
【図７Ｃ】
2018502078.tif 000019
【図７Ｄ】
2018502078.tif 000020
【図８Ａ】
2018502078.tif 000021
【図８Ｂ】
2018502078.tif 000022
【図８Ｃ】
2018502078.tif 000023
【図８Ｄ】
2018502078.tif 000024
【図８Ｅ】
2018502078.tif 000025
【図８Ｆ】
2018502078.tif 000026
【図８Ｇ】
2018502078.tif 000027
【図８Ｈ】
2018502078.tif 000028
【図９Ａ】
2018502078.tif 000029
【図９Ｂ】
2018502078.tif 000030
【図９Ｃ】
2018502078.tif 000031
【図９Ｄ】
2018502078.tif 000032
【図９Ｅ】
2018502078.tif 000033
【図９Ｆ】
2018502078.tif 000034
【図１０Ａ】
2018502078.tif 000035
【図１０Ｂ】
2018502078.tif 000036
【図１０Ｃ】
2018502078.tif 000037
【図１０Ｄ】
2018502078.tif 000038
【図１０Ｅ】
2018502078.tif 000039
【図１０Ｆ】
2018502078.tif 000040
【図１０Ｇ】
2018502078.tif 000041
【図１０Ｈ】
2018502078.tif 000042
【図１０Ｉ】
2018502078.tif 000043
【図１０Ｊ】
2018502078.tif 000044
【図１１Ａ】
2018502078.tif 000045
【図１１Ｂ】
2018502078.tif 000046
【図１２Ａ】
2018502078.tif 000047
【図１２Ｂ】
2018502078.tif 000048
【国際調査報告】
2018502078.tif 000049
2018502078.tif 000050
2018502078.tif 000051