(57)【要約】人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって、細胞の細胞周期を停止させ、次いで、該細胞を形質転換してｉＰＳＣにすることによる方法が開示される。例えば、人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと；該細胞の細胞周期を停止させること；および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成すること、を包含する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、
細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと；
該細胞の細胞周期を停止させること；および
該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成すること、
を包含する方法。
【請求項２】
前記細胞周期を停止させることは、細胞増殖を制限する血清濃度またはアミノ酸濃度を含む培地中で前記細胞をインキュベートすることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞周期を停止させることは、ＣＥＫ相互作用タンパク質（ｃｉｐ）経路、キナーゼ阻害性タンパク質（ｋｉｐ）経路、キナーゼ４インヒビター（ＩＮＫ４ａ）経路、または選択的リーディングフレーム（ＡＲＦ）経路を調節することを包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞周期を停止させることは、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、またはｐ５７を活性化することを包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞周期を停止させることは、サイクリンＤ経路を調節することを包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞周期を停止させることは、サイクリン依存性キナーゼ４またはサイクリン依存性キナーゼ６を阻害することを包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞とサイクリン依存性キナーゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、サイクリン依存性キナーゼ４インヒビターまたはサイクリン依存性キナーゼ６インヒビターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、パルボシクリブ、リボシクリブ、ボルシクリブ、またはアベマシクリブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞周期を停止させることは、チミジンを含む培地中で前記細胞をインキュベートすることを包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞において微小管重合を阻害することを包含する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
微小管重合を阻害することは、前記細胞と微小管重合のインヒビターとを接触させることを包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することを包含する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することは、該細胞とヌクレオチド生合成のインヒビターとを接触させることを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼを阻害することを包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼを阻害することは、前記細胞とＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてＤＮＡポリメラーゼを阻害することを包含する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡポリメラーゼを阻害することは、前記細胞とＤＮＡポリメラーゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞と、ロバスタチン、コンパクチン、メビノリン、ミモシン、アフィジコリン、アミノプテリン、ヒドロキシウレア、コルヒチン、コルセミド、ラゾキサン、ロスコビチン、ビンクリスチン、カチノン、パントポン、アミノプテリン、メトトレキサート、フルオロデオキシウリジン、ブチレート、シトシンアラビノシド、ＭＧ１３２、ＲＯ−３３０６、ノスカピン、ブレビスタチン、リベロマイシンＡ、サイトカラシンＤ、またはノコダゾールとを接触させることを包含する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞周期を停止させることは、前記細胞を低温でインキュベートすることを包含する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、約２７℃〜約３３℃でインキュベートされた細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞周期を停止させることは、間期、Ｇ０期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ１期初期、Ｇ１期、Ｇ１期後期、Ｇ１／Ｓ期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、またはＭ期において該細胞周期を停止することを包含する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前期細胞周期は、Ｍ期で停止される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の人工多能性幹細胞が生成される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、
複数の細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと；
該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の１もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること；および
細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成すること
を包含する方法。
【請求項２６】
細胞の前記サブセットは、Ｇ０期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ１期初期、Ｇ１期、Ｇ１期後期、Ｇ１／Ｓ期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、またはＭ期において富化されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の細胞と核酸に結合する色素とを接触させることをさらに包含し、ここで細胞の前記サブセットを選択することは、類似の量の該色素を含む細胞を選択することを包含する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、蛍光活性化セルソーティングによって選択される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、遠心エルトリエーションまたは有糸分裂シェイクオフによって選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｇｌｉｓ１、Ｅｓｒｒｂ、およびＥｓｒｒｇからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、およびｃ−Ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を形質導入することは、該細胞を、少なくとも１種の遺伝子を含むベクターで形質導入することを包含する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターは、プラスミド、ウイルス、転移因子、またはナノ粒子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターは、ウイルスを含み、該ウイルスは、センダイウイルスもしくはアデノウイルスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を形質転換することは、該細胞とバルプロ酸、ＢＩＸ−０１２９４、ＳＢ４３１４１２、またはＰＤ０３２５９０１とを接触させることを包含する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を形質転換することは、該細胞と、グリコーゲンシンターゼキナーゼインヒビター、ＴＧＦＰレセプターインヒビター、サイクリックＡＭＰアゴニスト、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼインヒビター、およびヒストンアセチル化を促進する薬剤のうちの少なくとも１種と接触させることを包含する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞は、体細胞である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１５年１１月２日に出願した米国仮出願第６２／２４９，５２０号に対する優先権の利益を主張する。米国仮出願第６２／２４９，５２０号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
幹細胞は、稀であり、かつ相当数で成体組織から単離することは困難である。２００６年に、山中伸弥が率いる研究チームが、分化した成体細胞をどのようにして再プログラミングして、多能性を含めた、幹細胞の特性のうちの多くを示させ得るかを記載する論文を発表した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６  （２００６））。これらの「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、本質的に無限に複製し得、そしてそれらは、３種の胚性胚葉に由来する細胞タイプのうちのいずれかへと分化して、ヒト身体における潜在的に任意の細胞を形成し得る。従って、ｉＰＳＣ方法論の開発は、個別化医療および再生医療に新たな道を開いた。ｉＰＳＣを生成するための方法論は、十分に規定されている；しかし、それらの効率は低い。従って、ｉＰＳＣ生成の効率を向上させるための方法が望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６  （２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
いくつかの局面において、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法に関し、該方法は、細胞を提供すること；該細胞の細胞周期を停止させること；および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成することを包含する。本方法はまた、複数の人工多能性幹細胞を生成するために用いられ得る。
【０００５】
いくつかの局面において、本発明は、複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、該方法は、複数の細胞を提供すること；該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の１もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること；および細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成することを包含する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
注目すべきことには、本発明者らは、細胞群の細胞周期を同期化すると、その後の形質転換工程の後に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のより高い収量が生じることを発見した。同期化は、例えば、細胞の細胞周期を停止させることによって、または細胞周期の１もしくはこれより多くの期が富化された細胞を、複数の細胞から選択することによって、達成され得る。
【０００７】
いくつかの局面において、本発明は、人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、この方法は、細胞を提供すること；該細胞の細胞周期を停止させること；および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成することを包含する。該細胞は、好ましくは、幹細胞ではない（例えば、該細胞は、分化した細胞であり得る）。この方法はまた、複数の人工多能性幹細胞を生成するために使用され得る。
【０００８】
いくつかの局面において、本発明は、複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、この方法は、複数の細胞を提供すること；該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の１もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること；および細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成することを包含する。好ましい実施形態において、該細胞は、幹細胞ではない。該複数の細胞は、幹細胞を含み得、そしてこのような複数はまた、幹細胞ではない細胞を含む（例えば、該複数はまた、分化した細胞を含む）。
【０００９】
Ｉ．細胞
該細胞は、真核生物細胞（例えば、後生動物細胞）であり得る。該細胞は、哺乳動物細胞であり得る。該細胞は、齧歯類、ウサギ目動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、または霊長類に由来し得る。例えば、該細胞は、ヒト細胞であり得る。好ましい実施形態において、該細胞は、体細胞である。好ましい実施形態において、該細胞は、二倍体細胞である。
【００１０】
該細胞は、分化した細胞であり得る。該細胞は、外胚葉、内胚葉、または中胚葉に由来し得る。該細胞は、上皮、結合組織、筋組織、または神経組織から始まり得る（originate）。該細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または線維芽細胞であり得る。該細胞は、リンパ球であり得る。いくつかの実施形態において、該細胞は、脂肪細胞である。
【００１１】
ＩＩ．細胞周期を停止させること
いくつかの局面において、本発明は、該細胞の細胞周期を停止させることを包含する方法に関する。該細胞の細胞周期を停止させることは、有糸分裂を阻害する任意の公知の方法を包含し得る（例えば、Ｂａｎｆａｌｖｉ，  Ｇａｓｐａｒ，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１１）；およびＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１０／１１８７０９（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。細胞周期の有糸分裂期（Ｍ期）にある細胞は、形質導入および／またはトランスフェクションをより受け入れやすい。従って、いくつかの好ましい実施形態において、細胞周期を停止させることは、（例えば、該細胞と薬剤（例えば、コルヒチン、コルセミド、ラゾキサン、またはノスカピン）とを接触させることによって）細胞周期をＭ期で停止させることを包含する。それにもかかわらず、細胞周期を停止させることは、間期（例えば、Ｇ０期、Ｇ１期、Ｓ期、またはＧ２期）で細胞周期を停止させることを包含し得る。例えば、細胞は、（例えば、チミジン、例えば、４ｍＭ  チミジンを１６〜２４時間を使用して）Ｇ１／Ｓ期で停止され得、該方法は、該細胞を形質転換する前に、該細胞を停止から解放した後のある期間にわたって（例えば、該細胞が形質転換される場合に、該細胞がＭ期にあるように、チミジンブロックからの開放後１２時間）、該細胞をインキュベートすることを包含し得る。
【００１２】
方法は、複数の細胞の細胞周期を停止させることを包含し得、このような実施形態に関して、語句「細胞周期を停止させること」は、「細胞周期を同期化すること」と同義である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、特定の期で細胞周期を休止させない。そしてなお、細胞周期は、形質転換が、細胞周期を停止させることなしでよりも効率的であるように、阻害される。例えば、アフィジコリンおよびノコダゾールは、形質転換効率を増大させるために有用である、Ｇ２／Ｍ期で細胞を停止させるために使用され得る。細胞周期を停止させることは、間期、Ｇ０期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ１期初期、Ｇ１期、Ｇ１期後期、Ｇ１／Ｓ期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、またはＭ期で細胞周期を停止させることを包含し得る。
【００１４】
血清飢餓または栄養素飢餓によって細胞周期を停止させることは、当該分野で周知であり、細胞周期を、例えば、Ｇ１期またはＧ０期で停止させるために使用され得る（例えば、米国特許第８，９９３，３２８号を参照のこと；本明細書に参考として援用される）。いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、細胞増殖を制限する血清濃度および／またはアミノ酸濃度を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。該細胞は、細胞増殖を制限する血清濃度および／またはアミノ酸濃度を含む培地中で、約１時間〜約１０日間、例えば、約１日間〜約７日間、例えば、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間にわたってインキュベートされ得る。該期間は、例えば、異なる細胞および異なる細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。該培地は、例えば、約０％〜約１０％（例えば、約０．１％〜約５％、約０．１％〜約２％、または約０．１％〜約１．０％）の血清濃度を有し得る。該培地は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の血清濃度を有し得る。該培地は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％の血清濃度を有し得る。該培地は、無血清培地（すなわち、血清を含まない培地）であり得る。次いで、細胞周期は、例えば、該細胞と第２の血清濃度（すなわち、細胞増殖を制限する血清濃度よりも高い血清濃度）を含む培地とを接触させることによって、再開され得る。従って、該方法は、第２の血清濃度および／または第２のアミノ酸濃度を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含し得、ここで例えば、該第２の血清濃度および／または第２のアミノ酸濃度は、該細胞増殖を制限する血清濃度またはアミノ酸濃度よりも高い。該第２の血清濃度は、約２％〜約３５％（例えば、約５％〜約３０％、または約１０％〜約２５％）であり得る。該第２の血清濃度は、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、または約２５％であり得る。該血清は、例えば、ウシ胎仔血清であり得る。
【００１５】
細胞周期を停止させることは、該細胞と薬剤とを接触させることを包含し得る。該細胞と薬剤とを接触させることは、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含し得る。該薬剤は、低分子または生体分子であり得る。本明細書で使用される場合、用語「低分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、５，０００ａｍｕ未満（例えば、約３０〜約１０００ａｍｕ、約４０ａｍｕ〜約８００ａｍｕ、または約５０ａｍｕ〜約７５０ａｍｕ）の分子量を有する分子をいう。用語「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、および／または炭水化物を包含する分子をいう。生体分子は、例えば、サイトカイン（例えば、トランスフォーミング増殖因子β）であり得る。該薬剤は、転写因子、酵素（例えば、キナーゼまたはホスホリラーゼ）、または細胞経路のインヒビターであり得る。例えば、該薬剤は、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、サイクリン依存性キナーゼ４インヒビター、サイクリン依存性キナーゼ６インヒビター、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼインヒビター、ヌクレオチド生合成のインヒビター、または微小管重合のインヒビターであり得る。
【００１６】
好ましい実施形態において、該薬剤は、細胞周期の可逆的インヒビターであり、例えば、該細胞は、該薬剤が該薬剤を含む培地から除去された後に、その細胞周期を再開し得る。好ましい実施形態において、該薬剤は、非毒性であり、例えば、該細胞に対して非毒性である該薬剤濃度は、該細胞の細胞周期を停止させるために十分である。好ましい実施形態において、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることは、該細胞に対して非毒性である濃度の該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。該薬剤は、アベマシクリブ、アミノプテリン、アフィジコリン、ブレビスタチン、ブチレート、カチノン、コルセミド、コルヒチン、コンパクチン、サイトカラシンＤ、シトシンアラビノシド、フルオロデオキシウリジン、ヒドロキシウレア、ロバスタチン、メトトレキサート、メビノリン、ＭＧ１３２、ミモシン、ノコダゾール、ノスカピン、パルボシクリブ、パントポン、ラゾキサン、リベロマイシンＡ、ＲＯ−３３０６、ロスコビチン、リボシクリブ、ビンクリスチン、またはボルシクリブであり得る。
【００１７】
薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることは、該薬剤を含む培地中で、該細胞を、約１時間〜約１０日間（例えば、約２時間〜約７日間、例えば、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間）にわたってインキュベートすることを包含し得る。該期間は、例えば、異なる細胞および異なる細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該方法は、例えば、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることの後に、該薬剤を含まない培地中で該細胞をインキュベートして細胞周期を再開させることを包含する。例えば、該方法は、ダブルチミジンブロック後に、例えば、該細胞が形質転換の間にＭ期にあるように、該薬剤を含まない培地中で該細胞を約４時間〜約２４時間にわたってインキュベートすることを包含し得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、ＣＥＫ相互作用タンパク質（ｃｉｐ）経路、キナーゼ阻害性タンパク質（ｋｉｐ）経路、キナーゼ４インヒビター（ＩＮＫ４ａ）経路、または選択的リーディングフレーム（ＡＲＦ）経路を調節することを包含する。例えば、ｃｉｐ／ｋｉｐファミリーメンバーであるｐ２１、ｐ２７、およびｐ５７は、細胞周期をＧ１期で停止させる。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）は、ｐ２７を活性化するために使用され得る。同様に、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦファミリーは、ｐ１６ＩＮＫ４ａを含み、これは、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）に結合して、細胞周期をＧ１期で停止させる。いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１８、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、またはｐ５７を活性化することを包含する（例えば、米国特許第６，０３３，８４７号を参照のこと；本明細書に参考として援用される）。
【００２０】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、サイクリンＤ経路を調節することを包含する。細胞周期を停止させることは、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）またはサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）を阻害することを包含し得る。細胞周期を停止させることは、該細胞とサイクリン依存性キナーゼインヒビターとを接触させることを包含し得る。該サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、例えば、サイクリン依存性キナーゼ４インヒビターまたはサイクリン依存性キナーゼ６インヒビターであり得る。パルボシクリブは、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方の選択的インヒビターである。いくつかの実施形態において、該サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、パルボシクリブ、リボシクリブ、ボルシクリブ、またはアベマシクリブである（ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１４／１０９８５８もまた参照のこと；本明細書に参考として援用される）。
【００２１】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することを包含する。該細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することは、該細胞とヌクレオチド生合成のインヒビターとを接触させることを包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、ヒドロキシウレアまたはチミジンを含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。ヒドロキシウレアおよびチミジンは、ＤＮＡの主要な構造単位である遊離デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の減少を引き起こす。ＤＮＡ複製の阻害は、細胞をＧ１期とＳ期との間の移行に停止させる。この方法の利点としては、複製インヒビターへの反復曝露によって同質の同期化した細胞集団に達する可能性および複製インヒビターが安価であるという事実が挙げられる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞において微小管重合を阻害することを包含する。微小管重合を阻害することは、該細胞と微小管重合のインヒビター（例えば、ノコダゾール）とを接触させることを包含し得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼを阻害することを包含する。ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼを阻害することは、該細胞とＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼインヒビター（例えば、ロバスタチン）とを接触させることを包含し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてＤＮＡポリメラーゼを阻害することを包含する。ＤＮＡポリメラーゼを阻害することは、該細胞とＤＮＡポリメラーゼインヒビター（例えば、アフィジコリン）とを接触させることを包含し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞と、アベマシクリブ、アミノプテリン、アフィジコリン、ブレビスタチン、ブチレート、カチノン、コルセミド、コルヒチン、コンパクチン、サイトカラシンＤ、シトシンアラビノシド、フルオロデオキシウリジン、ヒドロキシウレア、ロバスタチン、メトトレキサート、メビノリン、ＭＧ１３２、ミモシン、ノコダゾール、ノスカピン、パルボシクリブ、パントポン、ラゾキサン、リベロマイシンＡ、ＲＯ−３３０６、ロスコビチン、リボシクリブ、ビンクリスチン、またはボルシクリブとを接触させることを包含する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞を低温でインキュベートすることを包含する。該低温は、例えば、約３５℃未満、３４℃未満、３３℃未満、３２℃未満、３１℃未満、または３０℃未満であり得る。該低温は、約２０℃〜約３５℃（例えば、約２７℃〜約３３℃）であり得る。該低温は、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、または約３３℃であり得る。該細胞は、約１時間〜約１０日間（例えば、約１日間〜約７日間、例えば、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間）にわたって低温でインキュベートされ得る。該期間は、例えば、種々の細胞および種々の細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。
【００２８】
ある特定の実施形態において、該方法は、血清飢餓または栄養素飢餓を含め、本明細書で記載される方法のうちの１つより多くを使用して細胞周期を停止させること、該細胞と薬剤とを接触させること、該細胞と１より多くの薬剤とを接触させること、細胞経路を調節すること、および該細胞を低温でインキュベートすることを包含する。
【００２９】
ＩＩＩ．細胞周期の１つの期で細胞を選択すること
いくつかの局面において、本発明は、該複数の細胞のサブセットを選択することを包含する方法に関し、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の１もしくはこれより多くの期の細胞が富化されている。該方法は、例えば、該サブセットを選択することの前に本明細書で記載される任意の方法を使用して、該複数の細胞に関して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。同様に、該方法は、細胞の該サブセットに関して、例えば、該サブセットを選択することの後に本明細書で記載される任意の方法を使用して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。
【００３０】
該方法は、Ｇ０期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ１期初期、Ｇ１期、Ｇ１期後期、Ｇ１／Ｓ期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、またはＭ期の細胞が富化されている該複数の細胞のサブセットを選択することを包含し得る。ある特定の好ましい実施形態において、該方法は、Ｍ期の細胞が富化されている細胞のサブセットを選択することを包含する。
【００３１】
該方法は、細胞の集団と色素とを接触させることを包含し得、ここで細胞の該サブセットを選択することは、該色素の類似の量を含む細胞を選択することを包含する。本明細書で使用される場合、用語「色素（ｄｙｅ）」とは、赤外線波長、可視光線波長、または紫外線波長で光を吸収し得るかまたは光を発し得る分子または粒子（例えば、発色団または発蛍光団）をいう。例えば、該色素は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、シアニン５（Ｃｙ５）、ビスベンゾイミダゾール（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、アクチノマイシン、ミトラマイシン、アントラキノン、ＴＯ−ＰＲＯ−３、またはヨウ化プロピジウムを含み得る。該色素は、細胞構成要素（例えば、核酸、２本鎖核酸、ＤＮＡ、クロマチン、または微小管）に結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）。該色素は、細胞の表面上にある分子に結合し得る。該色素は、インターカレート剤（例えば、ヨウ化プロピジウム）であり得る。ある特定の実施形態において、細胞周期の１つのステージにある細胞は、細胞周期の異なるステージにある細胞よりも多くの、該色素に特異的に結合する分子（例えば、ＤＮＡまたは微小管）を含み、その結果、該色素は、異なるステージにある細胞の識別を可能にする。例えば、ＤＮＡに結合する色素は、細胞周期の異なるステージにある細胞の識別を可能にする。なぜならＧ２期およびＭ期の細胞は、Ｇ０またはＧ１期の細胞の２倍という多くのＤＮＡを含み、Ｓ期の細胞は中間のＤＮＡ量を含むからである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、該方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１４／１０９７１３およびＷＯ  ２０１０／１１８７０９（その各々が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００３３】
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞の集団と色素とを接触させることを包含しない。例えば、ＦＡＣＳシステムの前方散乱および側方散乱チャネルは、細胞周期の異なるステージで細胞を識別するために使用され得る（例えば、「蛍光活性化セルソーティング」は、蛍光よりむしろ前方散乱および側方散乱に依拠し得る）。同様に、遠心エルトリエーションおよび有糸分裂シェイクオフ（mitotic  shake-off）のような方法は、色素に依拠しない。
【００３４】
該複数の細胞のサブセットを選択することは、遠心エルトリエーションを含み得る（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１３／０６７０３８およびＷＯ  ２００３／０９３４６９を参照のこと；その各々が本明細書に参考として援用される）。遠心エルトリエーションシステムは、遠心力および対向するバルク媒体フローが、より小さな細胞が頂部にあり、より大きな細胞が底部にある勾配を作り出す専用の遠心分離ローターからなる。そのローター速度または媒体フローは、サイズ分離した細胞の勾配が、頂部に向かって押し出され、勾配の頂部にあるより小さな細胞が最終的にはエルトリエーションチャンバから収集容器へと押し出されるように操作される。ローター速度および媒体フローをさらに操作すると、徐々により大きな細胞がエルトリエーションチャンバから押し出される。Ｇ１細胞は、有糸分裂細胞またはＧ２後期細胞のサイズのおよそ半分であるので、遠心エルトリエーションは、細胞周期におけるそれらの位置に従って細胞を選択するために使用され得る。
【００３５】
該複数の細胞のサブセットを選択することは、有糸分裂シェイクオフを含み得る（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１０／１１８７０９；米国特許第５，７１０，０２２号；および米国特許出願公開番号２００５／０２７３８７０を参照のこと；これらの各々は本明細書に参考として援用される）。有糸分裂シェイクオフは、球形の有糸分裂（Ｍ）期細胞の選択を可能にする。これは、Ｇ０期、Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２期の細胞ほどしっかりとは表面に接着しない。従って、接着性細胞の振盪培養は、他の期にある細胞からのＭ期細胞の分離を可能にする。
【００３６】
ＩＶ．細胞を形質転換すること
該方法は、該細胞を形質転換して、人工多能性幹細胞を生成することを優先的に包含する。該細胞を形質転換することは、該細胞を１もしくはこれより多くのタンパク質、１もしくはこれより多くの核酸、１もしくはこれより多くのベクター、および／または１もしくはこれより多くの低分子で形質転換することを包含し得る。
【００３７】
人工多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子で形質導入することを包含し得る（例えば、米国特許出願公開番号２００９／０２２７０３２を参照のこと；本明細書に参考として援用される）。例えば、人工多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子で形質導入することを包含し得る。該方法は、該細胞を、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（Ｋｌｆ４）、オクタマー結合転写因子３／４（Ｏｃｔ−３／４）、オクタマー結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２）、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子で形質導入することを包含し得る。多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｇｌｉｓ１、Ｅｓｒｒｂ、および／もしくはＥｓｒｒｇの遺伝子で形質導入することを包含し得る。ある特定の好ましい実施形態において、多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、およびｃ−Ｍｙｃの遺伝子で形質導入することを包含する。
【００３８】
該細胞を形質導入することは、該細胞を、少なくとも１種のベクターで形質導入することを包含し得、例えば、ここで上記少なくとも１種のベクターは、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子を含む。該ベクターは、プラスミド、ウイルス、転移因子（transposable  element）、またはナノ粒子を含み得る。該ベクターは、例えば、プラスミドベクターもしくはウイルスベクター（例えば、センダイウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）であり得る。上記細胞を形質導入する工程は、上記細胞を、少なくとも１種のセンダイウイルスベクターで形質導入する工程を包含し得、例えば、ここで上記少なくとも１種のセンダイウイルスベクターは、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子を含む。
【００３９】
多能性幹細胞を細胞から生成するための方法は、当該分野で周知であり、米国特許出願公開第２０１１／０２２３６６９号および同第２０１３／００６５３１１号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載されるものを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、グリコーゲンシンターゼキナーゼインヒビター、ＴＧＦＰレセプターインヒビター、サイクリックＡＭＰアゴニスト、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼインヒビター、およびヒストンアセチル化を促進する薬剤のうちの少なくとも１種で形質転換することを包含する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、低分子（例えば、バルプロ酸、ＢＩＸ−０１２９４、ＳＢ４３１４１２、またはＰＤ０３２５９０１）で形質転換することを包含する。該方法は、該細胞を、バルプロ酸、ＢＩＸ−０１２９４、ＳＢ４３１４１２、およびＰＤ０３２５９０１で形質転換することを包含し得る。多能性幹細胞を、核酸ではなく低分子を使用して体細胞から生成するための方法もまた、当該分野で公知である（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１５／００３６４３（参考として援用される）；およびＨｏｕ，  Ｐ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：６５１−５４  （２０１３）を参照のこと）。１もしくはこれより多くの低分子は、本明細書で記載される遺伝子もしくはそれらの遺伝子生成物のうちの１もしくはこれより多くの代わりに、またはこれらと組み合わせて、使用され得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、１もしくはこれより多くのマイクロＲＮＡで形質転換することを包含する（例えば、米国特許第８，８５２，９４１号を参照のこと；本明細書に参考として援用される）。
【００４３】
いくつかの実施形態において、該方法は、人工多能性幹細胞を分化させることを包含する。該方法は、該ｉＰＳＣを線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、単核細胞、樹状細胞、単球、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓の細胞、心筋細胞、食道の細胞、胃の細胞、膵臓の細胞、肝細胞、卵丘細胞、または生殖母細胞へと分化させることを包含し得る。幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を分化させるための方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許出願公開番号２００９／０２２７０３２を参照のこと；本明細書に参考として援用される）。
【実施例】
【００４４】
例示
実施例１．末梢血単核細胞の採取
【００４５】
１２ｍＬ  ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブに、３ｍＬ  ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭ分離培地（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）を満たす。そのチューブを、３０秒間、１０００ｒｃｆで、室温において遠心分離して、そのチューブの中の分離培地を多孔性バリアの下に配置する。
【００４６】
４ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；カルシウムおよびマグネシウムを含まない）を、１５ｍＬ  コニカルチューブに添加する。４ｍＬ  バキュテイナー中のヒト血液を、１０回転倒混和して、血液を混合する。次いで、その血液を、上記ＰＢＳを含むコニカルチューブに添加し、その血液およびＰＢＳを混合する。次いで、その血液およびＰＢＳ混合物を、ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブの中に注ぐ。
【００４７】
そのＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブを、Ｌａｂｎｅｔ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで室温において３０分間、１２５０ｒｃｆで（またはＢｅｃｋｍａｎスイングバケット遠心分離機で２１００ｒｐｍにおいて）遠心分離する。その富化された細胞画分（リンパ球および末梢血単核細胞を含む）を、多孔性バリアの上の血漿上清および富化された細胞画分の両方を新しい１５ｍＬ  遠心分離チューブに注ぐことによって集める。その細胞を、５００ｒｃｆで１０分間、Ｌａｂｎｅｔ遠心分離機で（または１１００ｒｐｍにおいて１０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で）ペレットにし、その上清を廃棄する。
【００４８】
上記ペレットを、１ｍＬの凍結用培地（熱不活性化牛胎仔血清中１０％  ＤＭＳＯ）の中で再懸濁する。その１ｍＬサンプルを、２つの０．５ｍＬアリコートに分け、−８０℃冷凍庫中で凍結する。各０．５ｍＬのアリコートは、およそ１，０００，０００個の末梢血単核細胞を含む。
【００４９】
実施例２．末梢血単核細胞の形質導入
末梢血単核細胞の０．５ｍＬのアリコートを、０．５ｍＬの拡大培地で洗浄し、そして１５ｍＬ  コニカルバイアル中に入れる。該細胞を、２５０ｒｃｆにおいて７分間ペレットにし、およそ１００μＬの培地をチューブの中に残して、その上清を廃棄する。
【００５０】
０．４ｍＬ  ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  Ｌａｎｃｅ  Ｍｅｄｉａ；５μＬ  ｈＫＯＳ；５μＬ  ｈｃ−Ｍｙｃ；３μＬ  ｈ−Ｋｌｆ４；２μＬ  水中ポリブレン（１ｍｇ／ｍＬ希釈物）；およびポリブレン試薬（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む形質導入培地を調製する。
【００５１】
凍結したＣｙｔｏＴｕｎｅウイルスバイアルを、３７℃のバスの中に８秒間入れ、試薬を融解させ、次いで、４℃の冷ブロックに置く。そのウイルスを、ＰＢＭＣ拡大培地へと混合する。
【００５２】
次いで、その形質導入培地を、１５ｍＬ  コニカルバイアルの中に入れて、その細胞ペレットを再懸濁する。上記形質導入培地および細胞を、２４ウェルプレートのうちの１ウェルに入れ、３７℃において、５％  ＣＯ２加湿雰囲気中で一晩インキュベートする。
【００５３】
参考による援用
本明細書で引用される特許、公開された特許出願、および非特許参考文献の各々は、それらの全体において参考として援用される。
【００５４】
均等物
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【国際調査報告】
2018531610.tif 000002
2018531610.tif 000003