(57)【要約】本発明は概して代謝解毒に関し、より詳細には、細胞において抗炎症反応を誘発するための組成物及び方法、ならびに対象における疾患の治療に関する。2018522853.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の炎症誘発性分子を含む、細胞において抗炎症反応を誘発するための組成物であって、前記抗炎症反応が、抗炎症因子の増加した発現を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞が、組換えにより操作された細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞が、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞が、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記炎症誘発性分子が、１つもしくは複数のサイトカイン、損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、または病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記炎症誘発性分子が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質１−アルファ（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１−ベータ（ＭＩＰ−１β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、リンホタクチン、フラクタルカイン、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
疾患を有する対象の血液に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記疾患が、炎症性疾患である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記炎症性疾患が、肝硬変、肝炎及び脂肪肝疾患からなる群から選択される肝臓疾患である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記疾患が、自己免疫疾患または自己炎症性疾患である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗炎症因子が、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ゲルゾリン、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗炎症因子の発現が、少なくとも２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００倍またはそれ以上増加する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞が、インビトロで接触される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が、固体基質に接着されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞が、半固体基質に埋め込まれている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が、インビボで接触される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
真核細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記真核細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記真核細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記真核細胞が、組換えにより操作された細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記真核細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記真核細胞が、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞である、請求項７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記真核細胞が、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項３０】
細胞を、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の炎症誘発性組成物と接触させることを含む、細胞において抗炎症反応を誘発するか、または炎症反応を阻害する方法であって、前記抗炎症反応が、抗炎症因子の増加した発現を含む、前記方法。
【請求項３１】
前記細胞が、真核細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、肝細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、組換えにより操作された細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、Ｃ３Ａ細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が、肝硬変、肝炎または脂肪肝疾患である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗炎症因子が、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ゲルゾリン、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗炎症因子の発現が、少なくとも２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００倍またはそれ以上増加する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、インビトロで接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、固体基質に接着されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、半固体基質に埋め込まれている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、インビボで接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗炎症因子が、前記細胞を含有する対象に連結された体外血液解毒システムの活性カートリッジ内において生成される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、前記対象からの細胞によって生成される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、疾患状態の肝臓の細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患が、肝硬変、肝炎または脂肪肝疾患である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗炎症因子の発現を検出することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、１、６、２４、４８、６０、７２または８４時間を超えて継続的に接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
対象の疾患または障害を治療する方法であって、抗炎症因子を含む組成物を前記対象に投与し、それによって前記疾患または障害を治療することを含む、前記方法。
【請求項５４】
前記疾患または障害が、炎症性疾患である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が、自己免疫疾患または自己炎症性疾患である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、肝硬変、肝炎及び脂肪肝疾患からなる群から選択される肝臓疾患である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗炎症因子が、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン −１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ゲルゾリン、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の前記炎症誘発性組成物と接触した細胞によって生成される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、前記対象の循環系に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、前記対象に連結された体外血液解毒システムを介して投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物に反応して前記血液解毒システムの活性カートリッジ内において細胞により生成される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記血液解毒システムが、
ａ）前記対象の循環系に連結され、かつ血液を前記対象から限外ろ過液発生器を通してまた前記対象へと通わせるよう作動する血液回路、
ｂ）前記限外ろ過液発生器に連結され、かつ前記限外ろ過液発生器から限外ろ過液を取り出すよう、及び前記血液の細胞成分とは独立に限外ろ過液を処理するよう作動する再循環回路であって、ここで処理は、前記抗炎症因子を含む前記組成物を生成する細胞を含む活性カートリッジに前記限外ろ過液を通すことと、前記限外ろ過液に前記因子を導入することとを含む、前記再循環回路、ならびに
ｃ）前記対象に再導入する前に、前記再循環回路内の限外ろ過液と、前記血液回路内の細胞成分とを再び組み合わせるよう作動する導管接合部
を備える、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗炎症因子を検出することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記組成物が、１、６、２４、４８、６０、７２または８４時間を超えて継続的に投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
親Ｃ３Ａ細胞株から誘導された適任のＣ３Ａ細胞株であって、前記細胞株の細胞が、リポ多糖（ＬＰＳ）または炎症誘発性サイトカインのインターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）に反応して、抗炎症性メディエータータンパク質であるα―１−抗トリプシン（ＡＡＴ）及びインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の増加した発現を示す、前記細胞株。
【請求項６６】
前記ＡＡＴまたはＩＬ−１Ｒａの発現の増加が、ＬＰＳまたはＩＬ−６及びＩＬ−１βと接触していない細胞と比べて、少なくとも２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００倍またはそれ以上である、請求項６５に記載の細胞株。
【請求項６７】
前記細胞が、ゲルゾリンの増加した発現をさらに示す、請求項６５に記載の細胞株。
【請求項６８】
前記ゲルゾリンの発現が、ＬＰＳまたはＩＬ−６及びＩＬ−１βと接触していない細胞と比べて、少なくとも２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００倍またはそれ以上である、請求項６７に記載の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下で、２０１５年６月１５日に出願された、米国仮特許出願第６２／１７５，８２７号、及び２０１５年７月８日に出願された、米国仮特許出願第６２／１９０，０６７号の優先権を主張し、それらの全体を、参照として本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して細胞生物学に関し、より詳細には、細胞において抗炎症反応を誘発するための組成物及び方法、ならびに対象における疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
非限定的に、細菌、ウイルス、身体的傷害、化学傷害（例えば、アルコール、薬物など）、がん、化学療法、及び放射線治療を含む、種々の作用物質は、特定の作用物質及びそれに曝される動物の遺伝子構造に応じて、細胞及び組織への直接的な損傷を引き起こし、または長期で過度の炎症の環境を作り出す。通常の状態では、炎症は、動物が傷害から回復するのに役立つプロセスである。急性炎症は、有害な刺激への組織の初期反応である。それには、マクロファージ、樹状細胞、組織球、クッパー細胞、及びマスト細胞を含む、損傷した組織に存在する細胞が、その傷害に関連している分子を感知し、及び活性化された場合に開始される、複雑で、高度に制御されたプロセスが関与する。活性化に際して、これら細胞は、血管拡張物質などの炎症性メディエーターを放出する。この血管拡張物質は、傷害の近傍において、血流及び血管透過性の増加を誘発する。これは、次に、その損傷した組織へ、血液からの血漿及び白血球（好中球及びマクロファージを含む）の移動の増加をもたらす。炎症性メディエーターは、一般に、急速に分解されるため、急性炎症は、それが維持されるためには、持続的な刺激を必要とする。その結果、有害な刺激が一旦取り除かれると、急性炎症は終焉する。
【０００４】
慢性炎症は、肝炎、肝硬変、及び脂肪肝疾患などの肝疾患、心疾患、がん、呼吸器疾患、脳卒中、アルツハイマー病などの神経疾患、糖尿病、及び腎疾患を含む、多数の、広範囲な衰弱性疾患への寄与要因であると考えられている。慢性炎症の結果は、正常組織の破壊及びそれのコラーゲン豊富な結合組織との交換である。コラーゲン豊富な結合組織は、瘢痕組織としても知られており、正常組織と比較して低下した組織機能を示す。瘢痕組織の持続的かつ長期的な形成は、次に、線維症を引き起こす。線維症は、肺、皮膚、肝臓、心臓、及び骨髄に影響を与える疾患の、一般的な症状の一つであり、及び特発性肺線維症、強皮、ケロイド、肝硬変、心筋線維症、糖尿病性腎疾患、骨髄異形成症候群、及びその他の障害などの疾患における、重要な要因である。
【０００５】
慢性炎症及び線維症の研究は、活性化物質及び影響を受ける組織とは無関係に、シグナル伝達タンパク質の一般的なネットワークが、炎症促進状態を確立するために、同時に機能する傾向があることを示している。このシグナル伝達タンパク質のネットワークは、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む、多数の異なるサイトカイン、サイトカイン受容体、転写因子などを含んでいる。
【０００６】
血液処理は、肝炎などの炎症性肝疾患を含む治療目的に対応して、様々な血液成分を除去するために実施されてきた。血液処理方法の例示には、不十分な腎機能に苦しむ患者の血液から、代謝老廃物を除去することを可能にする透析を含む。患者から流れる血液は、これらの老廃物を除去するためにろ過され、及びその患者に戻される。血漿交換法ではまた、様々な疾患状態の治療に対応して、接線流膜分離を利用して血液を処理する。膜孔のサイズは、不要な血漿成分の除去に対応して選択できる。血液中に存在する生物学的成分を改変するために、生化学反応を利用した種々の装置を用いて、血液を処理することも可能である。例えば、ビリルビンまたはフェノールなどの血液成分を、膜表面に結合している酵素を介して、血液血漿の体外循環によって、糖化または硫酸化することができる。
【０００７】
現在利用されている技術は一般に、例えば、易感染性の肝機能を持つ患者を支援することに関しては、不十分である。従来のシステム及び方法では、移植のために適切なドナーの臓器が見つかり得るまで、またはその患者の元来の肝臓が健康な状態に再生できるまで、そのような患者を維持することに関連した、様々な問題に悩まされる。
【０００８】
アルコール、薬物または毒素によって引き起こされる肝炎などの炎症性疾患は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαのレベル上昇によって、ならびに肝細胞が急性期タンパク質（ＡＰＰ）を上方調節する、炎症カスケードによって特徴付けられる。したがって、血液解毒治療を必要とする患者は通常、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαのレベル上昇を示す。抗ＴＮＦαまたはステロイド療法は、臨床的な利点を実証してはいない。
【０００９】
過度の炎症を伴う症状についての知識が増加しているにもかかわらず、そのような症状の治療法が、定まらないままになっている。多くの薬物及びその他の物質が、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、抗炎症活性を有することが示されているが、しかし炎症によって引き起こされまたは促進される多くの症状に対しては、いまだ治療法が無い。さらに、多くの抗炎症療法は、有害な副作用と関連する。したがって、炎症性疾患を治療する、より先進的な組成物及び方法に対する要求がある。
【発明の概要】
【００１０】
１つの態様において、本開示は、細胞において、抗炎症性反応を誘発する組成物を提供する。当該組成物には、リポ多糖（ＬＰＳ）または炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）などの、１つ以上の炎症誘発性分子を含み、ここでその抗炎症反応には、抗炎症性メディエータータンパク質であるα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）及びインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）などの、抗炎症因子の増加した発現を含む。
【００１１】
他の態様において、本開示は、細胞において、抗炎症性反応を誘発するか、または炎症性反応を阻害する方法を提供する。この方法には、細胞を本開示の組成物と接触させ、それにより、その細胞において、抗炎症反応を誘発する、または炎症反応を阻害することを含む。
【００１２】
さらに他の態様において、本開示は、対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。当該方法には、本開示の組成物をその対象に投与し、それにより、その疾患または障害を治療することを含む。
【００１３】
またさらに他の態様において、本開示は、親Ｃ３Ａ細胞株から誘導された適任のＣ３Ａ細胞株を提供し、ここでその細胞株の細胞は、ＬＰＳまたは炎症誘発性サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１βなどの、１つ以上の炎症誘発性分子に反応して、抗炎症性メディエータータンパク質のＡＡＴ及びＩＬ−１Ｒａなどの、抗炎症因子の増加した発現を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図２】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図３】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図４】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図５】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図６】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図７】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図８】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図９】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１０】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１１】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１２】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１３】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１４】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１５】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１６】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１７】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１８】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図１９】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図２０】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図２１】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、一連のプロット図である。
【図２２】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、一連のプロット図である。
【図２３】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図２４】従来技術の体外ろ過及び解毒システムを示す、簡略化したブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本開示は、特定の細胞が、特異的な抗炎症因子の分泌によって、炎症誘発性因子に反応することができる、という予期しない発見に基づいている。そのような炎症誘発性因子を、細胞において抗炎症反応を誘発し、及び／または炎症反応を阻害し、それによって疾患を治療するために利用することができる。
【００１６】
本発明の組成物及び方法のさらなる記載に先立ち、本発明は、記載された特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されず、したがって、組成物、方法、及び条件は、変動する可能性があることが理解されよう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるものであって、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、及び限定を意図してはいないこともまた、理解されよう。
【００１７】
本開示における方法の原則及び運用は、図面及び付随する説明を参照して、より良好に理解することができる。
【００１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その文脈で明確に指示されない限り、複数参照を含む。したがって、例えば、「その方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する参照には、本開示を読む当業者などにとって明確になるように本明細書に記載される、１つ以上の方法、及び／または形式のステップを含む。
【００１９】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野において、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の、任意の方法及び材料が、本開示の実践または試験に使用され得るが、いくつかの好ましい方法及び材料が記載される。
【００２０】
本明細書に記載される本発明は、炎症誘発性サイトカインなどの、１つ以上の炎症誘発性分子を含む、炎症誘発性組成物に関する。当該組成物は、炎症性疾患または障害などの、疾患、障害、またはそれ以外の異常な症状の治療における使用に対応した、医薬組成物を生み出すために使用されて良い。
【００２１】
本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳類の対象を指す。このように、類目が哺乳類の任意の動物の治療が想定される。そのような動物には、非限定的に、馬、猫、犬、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、非ヒトの霊長類及びヒトを含む。したがって、本開示の方法は、ヒトへの使用だけでなく、獣医学の用途に使用することが意図されている。
【００２２】
本明細書に記載の対象の「治療」とは、治療的処置及び予防または予防対策の両方を指す。治療を必要とする者には、すでに疾患や障害を持つものだけではなく、それが防止されているものも含まれる。したがって、当該対象は、疾患または障害を有すると診断されている可能性があり、または疾患もしくは障害の傾向があるかまたは影響を受けやすい可能性がある。
【００２３】
発現の「有効量」とは、疾患または障害を、予防する、改善するもしくは治療するために有効である、炎症誘発性サイトカインなどの、炎症誘発性分子の量を指す。そのような有効量は一般に、疾患または障害の兆候、症状、またはその他の指標において、改善をもたらす。例えば、肝疾患においては、有効量は、弱った肝機能を示す、生化学的マーカーの減少をもたらす。
【００２４】
疾患または障害の「症状」は、任意の病的な現象、またはその対象及び疾患または障害を示す者が経験した、構造、機能、もしくは感覚における正常からの逸脱である。
【００２５】
本明細書に使用される「炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状」には、非限定的に、敗血症、感染症（ウイルス、細菌または真菌感染症など）、尋常性座瘡、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、自己免疫疾患、セリアック病、慢性（プラーク）前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、クローン病、潰瘍性大腸炎）、骨盤内炎症疾患、再かん流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶、血管炎、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー（タイプ１、２、及び３の過敏症、花粉症）、全身性硬化症としての炎症性筋疾患などの、炎症に関連する疾患を含み、または炎症成分を有していて良く、及び皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、ビタミンＡ欠乏症、がん（固形腫瘍、胆嚢がん）、歯周炎、肉芽腫性炎症（結核、ハンセン病、サルコイドーシス、及び梅毒）、線維素性炎症、化膿炎症、漿液性炎症、潰瘍性炎症、ならびに虚血性心臓病、Ｉ型糖尿病、及び糖尿病性腎症を含む。
【００２６】
特定の実施形態において、当該炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状には、炎症と関連するか、または炎症成分を有する、例えば過敏症の１つ以上のタイプに対応する、多数の自己免疫性の疾患または障害を含む。過敏症の１つ以上のタイプに対応する、例示的な自己免疫疾患または障害には、アトピーアレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性じんましん、セリアック病、寒冷凝集素症、接触皮膚炎、クローン病、１型糖尿病、円板状エリテマトーデス、胎児赤芽球症、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、エリテマトーデス、メニエール病、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、デビック病、神経性筋強直症、眼瘢痕類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連付けられている小児自己免疫神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、側頭動脈炎（または「巨細胞性動脈炎」とも呼ばれる）、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、じんましん様血管炎、及び血管炎を含む。
【００２７】
肝臓における、炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状には、脂肪肝疾患、肝硬変、肝臓がん、及びウイルス感染によって引き起こされる、急性または慢性肝炎（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎）、アルコール性肝炎、薬物または化学的中毒（例えば、四塩化炭素、アメトプテリン、テトラサイクリン、アセトアミノフェン、フェノプロフェンなど）、単核球症、アメーバ赤痢、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による、その他の系統の感染症、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または細菌を含んで良い。
【００２８】
腎臓における、炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状は、急性または慢性腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症（ベルガー病）、糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）及び炎症に関連する自己免疫疾患、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、腎盂腎炎、運動腎炎、腎臓結石、及び痛風と関連していて良い。
【００２９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸と小腸の炎症症状の一群である。ＩＢＤの主要なタイプは、クローン病及び潰瘍性大腸炎である。ＩＢＤのその他の形態には、通常、常にＩＢＤとして分類されるわけではないが、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸に発生した腸炎、ベーチェット病、及び不確定大腸炎を含む。
【００３０】
炎症性疾患、障害、またはそれ以外の膵臓の異常症状には、さまざまな原因及び症状を持つ膵炎の種々の形態を含み、アルコール、胆石、薬(例えば、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ジダノシン及びペンタミジンなどのＨＩＶ薬、利尿剤、抗痙攣性バルプロ酸、化学療法薬のＬ−アスパラギナーゼ及びアザチオプリン、血液トリグリセリドを増加する方法によるエストロゲン、コレステロール低下スタチン、及びメトホルミン、ビルダグリプチン、シタグリプチン、ならびに糖尿病薬のグリプチン）、外傷、おたふく風邪、自己免疫疾患、サソリ刺傷、高血中カルシウム、高血中トリグリセリド、低体温症、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、膵臓癒合、妊娠、２型糖尿病、膵臓がん、膵管結石、血管炎（膵臓の小さな血管の炎症）、コクサッキーウイルス感染症、及びポルフィリン症−特に急性間欠性ポルフィリン症ならびに赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ウイルス感染症(コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、おたふく風邪、水痘帯状疱疹ウイルスによる)、細菌感染症（レジオネラ、レプトスピラ、マイコプラズマ、サルモネラ)、真菌感染症(アスペルギルス)、または寄生感染症(回虫、クリプトスポリジウム、トキソプラズマ)によって引き起こされる膵炎を含む。
【００３１】
本明細書において使用される「炎症性疾患に関連する」とは、炎症性サイトカインが、炎症性疾患、障害、またはその他の異常症状を引き起こすことが知られている、その炎症性疾患、障害、またはその他の異常症状の少なくとも１つの兆候を悪化させる、またはその炎症性疾患、障害、もしくはその他の異常症状において、過剰発現されることが知られている、状態を指す。
【００３２】
本発明は、１つ以上の炎症誘発性分子を含む、炎症誘発性組成物を提供する。実施形態において、当該炎症誘発性分子は、その分子と接触した細胞による、１つ以上のポリペプチドの発現を誘発する。１つの実施形態において、当該炎症誘発性分子は、その分子と接触した細胞による、分泌または排泄される１つ以上の因子の発現を誘発する。１つの実施形態において、当該炎症誘発性分子は、１つ以上の抗炎症因子の発現を誘発する。実施形態において、当該炎症誘発性分子は、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ゲルゾリン、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、１つ以上の抗炎症因子の発現を誘発する。
【００３３】
実施形態において、当該炎症誘発性分子は、アルブミン、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍａｃｒｏ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ  Ａ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ｈ（Ａｐｏ  Ｈ）、ベータ−２−マクログロブリン（β２Ｍ）、ＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）、補体Ｃ３（Ｃ３）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、エオタキシン−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、可溶性Ｆａｓ受容体、第ＶＩＩ因子、フェリチン（ＦＲＴＮ）、フィブリノゲン、ゲルゾリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパリン結合性表皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータ（ｈＣＧ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ−１）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、セロトランスフェリン（トランスフェリン）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｔ細胞特異的タンパク質ＲＡＮＴＥＳ（ＲＡＮＴＥＳ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、組織メタロプロテイナーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ−１）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、可溶性Ｆａｓ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、１つ以上の因子の発現を誘発する。
【００３４】
多様な実施形態において、当該抗炎症因子の発現は、炎症誘発性分子との接触前の発現と比べて、少なくとも、２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００倍、またはそれ以上増加する。
【００３５】
本発明に有用な炎症誘発性分子は、任意の分子タイプ、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチドビニローグなどのペプチド、有機分子または有機小分子などの化合物などであり得る。
【００３６】
実施形態において、本開示の炎症誘発性組成物は、炎症誘発性サイトカインなどの、１つ以上の炎症誘発性ポリペプチドを含む。実施形態において、当該組成物は、ポリペプチドなどの１つ以上の炎症誘発性分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって、その他方の１つに連結したアミノ酸残基の直鎖系列を指定することと、本明細書では同義に使用される。
【００３７】
実施形態において、当該組成物は、炎症誘発性ポリペプチドの単一タイプを含む。その他の実施形態において、当該医薬組成物は、ＩＬ−６及びＩＬ−１βなどの、２つ以上の炎症誘発性ポリペプチドの組み合わせを含む。実施形態において、当該組成物は、血液中に見出される血液タンパク質及び／または代謝産物を、実質的に含まない。その他の実施形態において、当該組成物は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む。実施形態において、組成物に存在する任意のポリペプチドは、組換えにより生産される。実施形態において、組成物に存在する任意のポリペプチドは、対象の細胞によって、インビボで産生される。
【００３８】
実施形態において、当該組成物は、ＴＮＦ−α、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質１−アルファ（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１−ベータ（ＭＩＰ−１β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、リンホタクチン、フラクタルカイン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、１つ以上の炎症誘発性ポリペプチドを含む。
【００３９】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、病原体の存在を検出する。ＴＬＲは、両免疫細胞、クッパー細胞、内皮細胞、樹状細胞、胆道上皮細胞、肝星細胞、及び肝細胞に発現する。ＴＬＲシグナル伝達は、これら及びその他の細胞タイプにおいて、強力な先天性免疫反応を誘発する。そのようなことから、当該組成物は、１つ以上のＰＡＭＰを含んで良い。
【００４０】
ＴＬＲはまた、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる、内因性ＴＬＲリガンドを認識する能力に基づいて、炎症の調節における役割を果たす。そのようなことから、当該組成物は、１つ以上のＤＡＭＰを含んで良い。
【００４１】
実施形態において、当該組成物は、免疫刺激として機能する、トール様受容体またはＮＯＤ様受容体を含んで良い。トール様受容体には、非限定的に、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及びＴＬＲ−９から選択された一員を含んで良い。ＮＯＤ様受容体には、例えば、非限定的に、ＮＬＲＡ、ＮＬＲＢ、ＮＬＲＣまたはＮＬＲＰを含んで良い。
【００４２】
１つの実施形態において、１つ以上の炎症誘発性分子には、ＬＰＳ、ポリ（Ｉ：ＣＵ）、ＣｐＧ、イミキモド、レシキモド、ｄＳＬＩＭ、ＭＰＬＡ、フラゲリン、プラスミドＤＮＡ二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、サポニン、またはそれらの任意の組み合わせを含んで良い。
【００４３】
実施形態において、当該炎症誘発性分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、または抗炎症因子の発現及び/または活性（直接的または間接的に）を増加させる、ＲＮＡ分子である。多様な態様において、当該炎症誘発性分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどの、ＲＮＡ分子であって良い。
【００４４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一本鎖のＲＮＡ分子であり、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、転写されたＤＮＡからの遺伝子にコードされるが、しかしｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されず、代わりに、各一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる、短いステムループ構造になり、及び最終的に機能的なｍｉＲＮＡになる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と完全にまたは部分的に相補的であり、及びその主たる機能は、遺伝子発現を下方調節することである。マイクロＲＮＡは、独立した遺伝子によってコードされ得るが、しかしまたイントロン、ｍＲＮＡの３′ＵＴＲｓ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びトランスポゾンを含む、多様に異なるＲＮＡ種から（酵素ダイサーを介して）処理され得る。本明細書で使用される、マイクロＲＮＡにはまた、それらの内因性の相手と、同じかまたは実質的に同じ機能を持つ細胞に、外的に導入されたマイクロＲＮＡを意味する、「模倣構造」のマイクロＲＮＡを含む。したがって、当業者は、ある作用物質が、外的に導入されたＲＮＡであって良いと理解するであろうが、一方で、作用物質はまた、細胞においてマイクロＲＮＡの発現を増加または低下させる化合物、またはそのような物を含む。
【００４５】
用語「低分子干渉ＲＮＡ」及び「ｓｉＲＮＡ」がまた、本明細書において使用され、種々の生物学的役割を担う、短い二本鎖ＲＮＡ分子の分類である、短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡを指す。中でも注目すべき点は、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡが特定遺伝子の発現に干渉する場合に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与していることである。そのＲＮＡｉ経路におけるそれらの役割に加えて、ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡｉ関連経路（例えば、抗ウイルスメカニズムとして、またはゲノムのクロマチン構造の形成において）においても作用する。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」もしくは「核酸分子」がまた、本明細書において幅広く使用され、ホスホジエステル結合によって結ばれる、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味する。したがって、当該用語には、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、ｃＤＮＡ、合成したデオキシリボヌクレオチド酸配列などの、遺伝子またはその一部であり得て、及び一本鎖または二本鎖、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドであり得る。さらに、本明細書において使用される当該用語には、細胞から単離することができる、天然に存在する核酸分子、同様に例えば、化学合成法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素法よって調合できる、合成ポリヌクレオチドを含む。多様な用語は、例えば、組成物の異なる成分を区別するためなどの、考察の便宜上の目的だけで使用されていることを、認識する必要がある。
【００４７】
本明細書において考察するように、本開示の組成物は、単独の炎症誘発性ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。この組成物は、抗炎症性の、タンパク質及びその他ポリペプチドを、実質的に含まないことが可能である。当該組成物は、任意の抗炎症分子を、実質的に含まないことが可能である。本明細書で使用される用語「タンパク質及びその他のポリペプチドを、実質的に含まない」とは、その組成物の５％未満のタンパク質含有量が、炎症誘発性ポリペプチドではない、タンパク質及びその他のポリペプチドから構成されることを意味する。本明細書で使用される用語「抗炎症分子を、実質的に含まない」とは、その組成物の５％未満のタンパク質含有量が、抗炎症分子から構成されることを意味する。非炎症誘発性ポリペプチドを、実質的に含まない組成物は、抗炎症性であるタンパク質またはその他のポリペプチドを、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満であるか、もしくはそれ以下で有することができる。抗炎症分子を、実質的に含まない組成物は、そのような分子を、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満であるか、もしくはそれ以下で有することができる。したがって、当該組成物は、血清アルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、及び凝固因子などの血液タンパク質を、実質的に含まないことが可能である。あるいは、当該組成物は、血清アルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、及び凝固因子の１つ以上を含むことができる。
【００４８】
実施形態において、当該炎症誘発性ポリペプチドは、ヒトまたはその他の哺乳類もしくは動物に、天然には見出されない。例えば、当該ポリペプチドは、合成、組換えなどであって良い。しかしながら、本発明の組成物は、ヒトまたはその他の哺乳類もしくは動物に、天然に見出される、炎症誘発性ポリペプチドを含むことができる。
【００４９】
実施形態において、当該炎症誘発性ポリペプチドは、非天然に存在するアミノ酸を含んで良い。「アミノ酸」は、天然由来及び合成のアミノ酸、ならびに天然由来のアミノ酸と同じ方法で機能する、アミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然由来アミノ酸は、その遺伝子コードによってコードされるものであり、同様に、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなどの、その後に改変される、それらのアミノ酸である。「アミノ酸類似体」とは、天然由来のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有しているが、しかし天然由来のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有する化合物を指すが、しかし天然由来のアミノ酸と類似した方法で機能する。アミノ酸は、本明細書においては、通常知られている３文字表記によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字表記によるものを指して良い。
【００５０】
実施形態において、当該組成物は、本発明の炎症誘発性ポリペプチドの、１つ以上の保存的に改変された変異体を含む。実施形態において、その保存的に改変された変異体は、天然由来のポリペプチドと比べたアミノ酸のレベルにおいて、少なくとも８０％の配列類似性、しばしば少なくとも８５％の配列類似性、９０％の配列類似性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列類似性を有している。
【００５１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において、単一アミノ酸またはアミノ酸の少ない割合を変更、追加または欠失するような、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列への個別の置換、欠失または追加は、その変更が、化学的に類似したアミノ酸を伴うアミノ酸置換となる、「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換の表は、当技術分野では良く知られている。そのような保存的に改変された変異体は、さらに本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子を排除しない。
【００５２】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、またはＶ)が、そのグループの他の一員で置換される、またはアルギニンでリジンを、グルタミンでアスパラギン酸を、またはグルタミンでアスパラギンをなどのように、１つの極性残基で他を置き換えるなどの方法で、置換が行われて良い。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）の、８グループの各々は、他の１つに対して保存的置換となる、その他の例示的なアミノ酸を含む。
【００５３】
２つ以上のポリペプチド配列の状況下において、用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、デフォルトのパラメータを伴った、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用した測定で、または手動整列及び目視検査によって、同じであるかまたは同じアミノ酸残基の特定の割合を有する、２つ以上の配列または部分配列（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域を超えた、最大対応を比較し及び整列した場合、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または指定領域を超えたより高い同一性）を指す。その様な配列を指して、「実質的に同一の」状態であるという。
【００５４】
実施形態において、当該組成物は、インビボの炎症誘発性ポリペプチドに関連しているか、またはその炎症誘発性ポリペプチドと同時精製される、生体分子（非炎症誘発性ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、及び代謝産物など）を、実質的に含まない。本明細書で使用される用語「生体分子を実質的に含まない」は、その組成物の乾燥重量で５％未満が、炎症誘発性ポリペプチドではない生体分子で構成されていることを意味する。そのような生体分子を実質的に含まない組成物は、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満、またはそれ以下の、炎症誘発性ポリペプチドではない生体分子を有し得る。したがって、例えば、当該組成物は、例えば、脂肪酸、コレステロール、非タンパク質凝固因子、代謝産物等などである、血液中に豊富な生体分子を、実質的に含まないことが可能である。さらに、当該組成物は、赤血球、白血球、血小板、及び細胞断片を含む細胞を、実質的に含まないことが可能である。
【００５５】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｍｇ（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ、またはそれ以上）の炎症誘発性分子を含む。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｍｇから約１０００ｍｇ（例えば、約５ｍｇから約９００ｍｇ、約５ｍｇから約８００ｍｇ、約５ｍｇから約７００ｍｇ、約５ｍｇから約６００ｍｇ、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、約１０ｍｇから約４００ｍｇ、約１０ｍｇから約３００ｍｇ、約１０ｍｇから約２５０ｍｇ、約１０ｍｇから約２００ｍｇ、約１０ｍｇから約１５０ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇ、約５０ｍｇから約５００ｍｇ、約５０ｍｇから約４００ｍｇ、約５０ｍｇから約３００ｍｇ、約５０ｍｇから約２５０ｍｇ、約５０ｍｇから約２００ｍｇ、約５０ｍｇから約１５０ｍｇ、約５０ｍｇから約１００ｍｇ、約７５ｍｇから約５００ｍｇ、約７５ｍｇから約４００ｍｇ、約７５ｍｇから約３００ｍｇ、約７５ｍｇから約２５０ｍｇ、約７５ｍｇから約２００ｍｇ、約７５ｍｇから約１５０ｍｇ、約７５ｍｇから約１００ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約４００ｍｇ、約１００ｍｇから約３００ｍｇ、約１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２００ｍｇ、または前記２つの終点を含む、任意のその他の範囲）に等しい量の、炎症誘発性分子を含むことができる。
【００５６】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上）の炎症誘発性分子を含む、溶液を含むことができる。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｍｇ／ｍｌから約１０００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５ｍｇ／ｍｌから約９００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約７００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約６００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の濃度の、炎症誘発性分子を有する溶液を含むことができる。
【００５７】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｐｇ（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｐｇ、またはそれ以上）の、炎症誘発性分子を含む。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｐｇから約１０００ｐｇ（例えば、約５ｐｇから約９００ｐｇ、約５ｐｇから約８００ｐｇ、約５ｐｇから約７００ｐｇ、約５ｐｇから約６００ｐｇ、約１０ｐｇから約５００ｐｇ、約１０ｐｇから約４００ｐｇ、約１０ｐｇから約３００ｐｇ、約１０ｐｇから約２５０ｐｇ、約１０ｐｇから約２００ｐｇ、約１０ｐｇから約１５０ｐｇ、約１０ｐｇから約１００ｐｇ、約５０ｐｇから約５００ｐｇ、約５０ｐｇから約４００ｐｇ、約５０ｐｇから約３００ｐｇ、約５０ｐｇから約２５０ｐｇ、約５０ｐｇから約２００ｐｇ、約５０ｐｇから約１５０ｐｇ、約５０ｐｇから約１００ｐｇ、約７５ｐｇから約５００ｐｇ、約７５ｐｇから約４００ｐｇ、約７５ｐｇから約３００ｐｇ、約７５ｐｇから約２５０ｐｇ、約７５ｐｇから約２００ｐｇ、約７５ｐｇから約１５０ｐｇ、約７５ｐｇから約１００ｐｇ、約１００ｐｇから約５００ｐｇ、約１００ｐｇから約４００ｐｇ、約１００ｐｇから約３００ｐｇ、約１００ｐｇから約２５０ｐｇ、約１００ｐｇから約２００ｐｇ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の量の、炎症誘発性分子を含むことができる。
【００５８】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｐｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上）の、炎症誘発性分子を含む溶液を含むことができる。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｐｇ／ｍｌから約１０００ｐｇ／ｍｌ（例えば、約５ｐｇ／ｍｌから約９００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約８００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約７００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約６００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の濃度の、炎症誘発性分子を有する溶液を含むことができる。
【００５９】
本発明の当該組成物は通常、医薬組成物である。そのような医薬組成物は、１つ以上の炎症誘発性分子と、薬学的に許容される担体とを含むことができる。医薬組成物はさらに、本発明の炎症誘発性分子以外のタンパク質を含むことができる。その他のタンパク質は、ポリペプチド製剤などの、治療薬であり得る。あるいは、その他のタンパク質は、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。その医薬組成物中の当該炎症誘発性分子を、血清アルブミンと混合することによって、その炎症誘発性分子を、その血清アルブミンに、効果的に「負荷させ」得る。
【００６０】
実施形態において、本発明の当該組成物は、ヘパリンまたはクエン酸塩などの、抗凝固剤を含む。本明細書で使用される「クエン酸塩」は、クエン酸（３つのプロトンと複合化されたクエン酸陰イオン）、クエン酸陰イオンを含む塩類、及びクエン酸陰イオンの部分キャスターを含む、いずれかの形態におけるクエン酸陰イオンを指す。クエン酸陰イオンは、有機トリカルボン酸塩である。ＣＡＳ登録番号７７−９２−２を割り当てられているクエン酸は、分子式ＨＯＣ（ＣＯ２Ｈ）（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）２、及び式重量１９２．１２ｇ／ｍｏｌを有している。クエン酸塩（すなわち、クエン酸陰イオンを含む塩）は、１つ以上の生理的に許容される陽イオンと共存する、１つ以上のクエン酸陰イオンからなる。例示的な生理学的に許容される陽イオンには、非限定的に、プロトン、アンモニウム陽イオン及び金属陽イオンを含む。適切な金属陽イオンには、非限定的に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムを含み、ここでナトリウム及びカリウムが好ましく、ならびにナトリウムがさらに好ましい。クエン酸陰イオンを含む組成物は、生理的に許容される陽イオンの混合物を含んでいて良い。
【００６１】
１つの実施形態において、当該組成物は、クエン酸ナトリウムを含む。クエン酸ナトリウムは、乾燥した化学品粉末、結晶、丸薬または錠剤の形態であって良い。クエン酸またはクエン酸ナトリウムの生理学的に許容される形態が、利用されて良い。例えば、当該クエン酸またはクエン酸ナトリウムは、一水和物を含む、水和物の形態であって良い。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、所望の純度を有する１つ以上の炎症誘発性分子を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、調合されて良い（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、採用された投与量及び濃度で、受容者に無毒であり、及びリン酸塩、クエン酸塩などの緩衝剤、ならびにその他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル・アンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含むその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成の対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、及び/またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、非イオン性界面活性剤を含んで良い。
【００６３】
実施形態において、本発明の当該組成物は、生細胞を含んで良い。１つの実施形態において、当該組成物は、肝細胞を含む。１つの実施形態において、当該組成物は、任意で組換えにより操作された、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞を含む。
【００６４】
本発明の当該炎症誘発性分子は、細胞における抗炎症反応を誘発し、及び／または炎症性疾患などの、疾患または障害を治療するための強力な手段を提供する。
【００６５】
結果として、本発明は、当該細胞において、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の抗炎症性ペプチドの発現レベルを増加させることにより、細胞における抗炎症反応を誘発し、または炎症反応を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を、本発明の炎症誘発性分子と接触させることを含む。実施形態において、当該炎症誘発性分子は、ＡＡＴ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−α、ゲルゾリン、ＴＧＦ−β、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、１つ以上の抗炎症因子の発現を誘発する。実施形態において、当該炎症誘発性分子は、アルブミン、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍａｃｒｏ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ  Ａ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ｈ（Ａｐｏ  Ｈ）、ベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）、ＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）、補体Ｃ３（Ｃ３）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、エオタキシン−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、可溶性Ｆａｓ受容体、第ＶＩＩ因子、フェリチン（ＦＲＴＮ）、フィブリノゲン、ゲルゾリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパリン結合性表皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータ（ｈＣＧ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ−１）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、セロトランスフェリン（トランスフェリン）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｔ細胞特異的タンパク質ＲＡＮＴＥＳ（ＲＡＮＴＥＳ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、組織メタロプロテイナーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ−１）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、可溶性Ｆａｓ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、１つ以上の因子の発現を誘発する。
【００６６】
多様な実施形態において、当該抗炎症因子の発現は、当該炎症誘発性分子との接触前の発現と比較して、少なくとも２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００倍、またはそれ以上増加する。
【００６７】
本発明はまた、対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。この方法には、本発明の炎症誘発性分子（または、例えば、炎症誘発性ポリペプチドを含む、医薬組成物）を、対象、または細胞もしくは組織に投与することを含む。
【００６８】
本発明の方法において、当該炎症誘発性分子は、接触した細胞による、１つ以上の抗炎症因子の発現を誘発する。実施形態において、その接触させる細胞は、哺乳類細胞などの、真核細胞である。１つの実施形態において、その接触させる細胞は、肝細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、肝芽腫由来の細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞株のＣ３Ａ細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である。１つの実施形態において、当該細胞は、組換えにより操作された細胞である。
【００６９】
用語「Ｃ３Ａ細胞株」とは、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンを指す。このＣ３Ａ細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関で、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７４１として寄託されている、適任の細胞株である。
【００７０】
当該組成物の投与は、例えば、静脈内に、腹腔内に、非経口で、同所的に、皮下に、局所に、鼻孔内に、経口で、舌下で、眼球内に、埋込デポによって、ナノ粒子ベースの送達システムを使用して、マイクロニードルパッチで、微小体で、ビーズ状で、浸透または機械式ポンプで、及び／またはその他の機械的手段によってなどを含む、任意の適切な方法で実施されて良い。
【００７１】
多様な実施形態において、細胞は、インビボまたはインビトロで、当該組成物と接触されうる。１つの実施形態において、当該細胞は、エクスビボで接触され、米国特許第８，１０５，４９１号に記載される、体外解毒システムの活性カートリッジなどの、生細胞を含む活性カートリッジ（バイオリアクター）内に含まれる細胞であって、その記載内容の全体が、参照として本明細書に組み入れられる。このシステムは、対象、または細胞もしくはそれらの臓器、例えば、肝臓に、流体的に連結されて良い。
【００７２】
図２４に示すように、概して体外解毒システム１０は、患者に連結されるように構成され、かつ血液を患者から限外ろ過液発生器（ＵＦＧ）４０を通してまたその患者へと通わせるよう作動する血液回路１００；ＵＦＧ４０に連結され、そのＵＦＧ４０から限外ろ過液を取り出すよう、及び血液の細胞成分とは独立に限外ろ過液を処理するよう作動する再循環回路５０；患者に再導入する前に、再循環回路５０内の限外ろ過液と、血液回路１００内の細胞成分とを再び組み合わせるよう作動する導管接合部１５を備える。さらに図２４で示すのは、再循環回路５０内の、活性カートリッジ７０及び酸素供給器６０である。この活性カートリッジ７０は、限外ろ過液の処理に活用される。
【００７３】
用語「活性カートリッジ」とは、治療用途及び解毒処理に有用性を持つ、細胞（例えば、Ｃ３Ａ細胞株の細胞など）を含む中空糸系カートリッジを指す。
【００７４】
用語「血液回路」とは、二重内腔カテーテルに接続され、かつ血液を患者から血液制御ユニットへと至らせてまた患者に戻して循環させるよう作動する、チューブの回路を指す。
【００７５】
用語「Ｃ３Ａ細胞株」とは、ヒト肝芽腫の細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンを指す。実施形態において、Ｃ３Ａ細胞は、1つ以上の活性カートリッジの毛細管外の空間に含まれている。このＣ３Ａ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関で、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７４１として寄託されている。
【００７６】
用語「解毒装置」とは、流体の流れから、特定または非特定分子の除去の手段を提供する、カートリッジ、キャニスター、またはその他の装置を指す。例示として、透析カートリッジ、吸着カートリッジ、またはフィルタがある。
【００７７】
用語「毛細管外空間」（ＥＣＳ）とは、活性カートリッジまたは限外ろ過液発生器の中空糸の外側の空間を指す。活性カートリッジのＥＣＳは概して、当該Ｃ３Ａ細胞を収納する。
【００７８】
用語「毛細管内空間」（ＩＣＳ）とは、活性カートリッジまたは限外ろ過液発生器の中空糸の内側の空間を指す。このＩＣＳは、全血または限外ろ過液の流動経路である。
【００７９】
用語「再循環回路」とは、一般に限外ろ過液の流体のろ過、解毒、及び処理を可能にする回路を指し、いくつかの実装では、再循環回路は一般に、貯留部、酸素供給器、及び１つ以上の活性カートリッジを含む。
【００８０】
用語「限外ろ過液」（ＵＦ）とは、限外ろ過液発生器の半透過膜を通ってろ過された、血漿流体及び溶解した高分子物質を指す。
【００８１】
用語「限外ろ過液発生器」（ＵＦＧ）とは、「空の」活性カートリッジ（すなわち、治療活性細胞を含まない中空糸カートリッジ）を含みまたはそれと統合され、及び細胞の血液成分から血漿流体 （限外ろ過液）を分離するように構成されている装置を指す。この中空糸は、例えば、いくつかの実装において、約１００，０００ダルトンの公称分子量カットオフ値を有する半透過膜で構成されていて良い。このＵＦＧを使用中に、血液は中空糸のＩＣＳを通って循環され、血漿及び様々な高分子物質を含む限外ろ過液は、１つ以上の活性カートリッジを通って循環しながら、膜繊維の壁を通ってその再循環回路を通過する。
【００８２】
用語「限外ろ過」とは一般に、限外ろ過液が、ＵＦＧの半透過膜を通過した全血から抜き出される間のプロセスを指す。いくつかの実施形態において、限外ポンプは、限外ろ過液の産出速度を制御することができ、一方でＵＦＧの中空糸膜の細孔径は、膜を浸透する限外液の量を調節することができる。
【００８３】
臨床または治療的処置中に、ＵＦは、活性カートリッジ７０内の中空糸カートリッジの内腔（ＩＣＳ）を介して、ＵＦの毒素、栄養素、グルコース、及び溶存酸素が、膜を通してＥＣＳに拡散することができるようにポンプで送り出され、生細胞が、それらを代謝することができる。代謝産物は、その細胞により産生されたアルブミン及びその他のタンパク質と共に、その患者に戻されるように、膜を通してＵＦへ再び拡散される。
【００８４】
前述の説明及び本明細書で熟考されるように、当該Ｃ３Ａ細胞株は、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンである。Ｃ３Ａなどの、この親細胞株のいくつかのサブクローンは、例えば、高アルブミン産生及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）産生、ならびに例えば、サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１βを含む、本発明の炎症誘発性分子に反応した抗炎症性メディエータータンパク質のα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）及びＩＬ−１Ｒａの発現といった、肝臓に特異的な機能を示す。
【００８５】
多様な実施形態において、当該システムは、対象、または細胞もしくはそれらの臓器、例えば肝臓と、流体的に連結できる。本発明の組成物は、システム１０の血液回路に導入される。当該組成物は、対象の循環系に導入されて良く、または当該システムの血液流動経路に直接導かれても良い。１つの実施形態において、当該組成物は、治療されている対象の細胞によって生み出され、及び治療中に、システム１０の血液回路に流れ込む。
【００８６】
一旦、システム１０の血液回路１００において、本発明の組成物の炎症誘発性分子が、活性カートリッジ内で、細胞と接触すると、それによって抗炎症因子の発現及び分泌が誘発され、ＵＦへと誘導される。このＵＦは、血液流動経路に再導入され、及び対象へ再導入され、ここでＣ３Ａ細胞によって産生された抗炎症因子が、肝臓細胞などの対象の細胞と接触し、それによって疾患や障害の治療を促進する。
【００８７】
本実施形態において、活性カートリッジの細胞が、Ｃ３Ａ細胞として例示されているが、当業者は、当該活性カートリッジが、本明細書に開示される炎症性疾患などの、任意の多様な疾患の治療に有益である、任意の多数の適切な細胞種を含み得ることを理解されよう。実施形態において、当該活性カートリッジは、その対象の血液中の分子に反応して、特定の因子を産生する、組換えにより操作された細胞を含んで良い。
【００８８】
前述のいずれかの方法と併せて、当該組成物は、毎日（または１日おきに、もしくは毎週）投与され得て、ここで炎症誘発性分子の量が、約１ｍｇから約１０００ｍｇ（例えば、約５ｍｇから約９００ｍｇ、約５ｍｇから約８００ｍｇ、約５ｍｇから約７００ｍｇ、約５ｍｇから約６００ｍｇ、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、約１０ｍｇから約４００ｍｇ、約１０ｍｇから約３００ｍｇ、約１０ｍｇから約２５０ｍｇ、約１０ｍｇから約２００ｍｇ、約１０ｍｇから約１５０ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇ、約５０ｍｇから約５００ｍｇ、約５０ｍｇから約４００ｍｇ、約５０ｍｇから約３００ｍｇ、約５０ｍｇから約２５０ｍｇ、約５０ｍｇから約２００ｍｇ、約５０ｍｇから約１５０ｍｇ、約５０ｍｇから約１００ｍｇ、約７５ｍｇから約５００ｍｇ、約７５ｍｇから約４００ｍｇ、約７５ｍｇから約３００ｍｇ、約７５ｍｇから約２５０ｍｇ、約７５ｍｇから約２００ｍｇ、約７５ｍｇから約１５０ｍｇ、約７５ｍｇから約１００ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約４００ｍｇ、約１００ｍｇから約３００ｍｇ、約１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２００ｍｇ、または前記２つの終点を含む、任意のその他の範囲）の間である。
【００８９】
前述のいずれかの方法と併せて、当該組成物は、毎日（または１日おきに、もしくは毎週）投与され得て、ここで炎症誘発性分子の量が、約１ｐｇから約１０００ｐｇ（例えば、約５ｐｇから約９００ｐｇ、約５ｐｇから約８００ｐｇ、約５ｐｇから約７００ｐｇ、約５ｐｇから約６００ｐｇ、約１０ｐｇから約５００ｐｇ、約１０ｐｇから約４００ｐｇ、約１０ｐｇから約３００ｐｇ、約１０ｐｇから約２５０ｐｇ、約１０ｐｇから約２００ｐｇ、約１０ｐｇから約１５０ｐｇ、約１０ｐｇから約１００ｐｇ、約５０ｐｇから約５００ｐｇ、約５０ｐｇから約４００ｐｇ、約５０ｐｇから約３００ｐｇ、約５０ｐｇから約２５０ｐｇ、約５０ｐｇから約２００ｐｇ、約５０ｐｇから約１５０ｐｇ、約５０ｐｇから約１００ｐｇ、約７５ｐｇから約５００ｐｇ、約７５ｐｇから約４００ｐｇ、約７５ｐｇから約３００ｐｇ、約７５ｐｇから約２５０ｐｇ、約７５ｐｇから約２００ｐｇ、約７５ｐｇから約１５０ｐｇ、約７５ｐｇから約１００ｐｇ、約１００ｐｇから約５００ｐｇ、約１００ｐｇから約４００ｐｇ、約１００ｐｇから約３００ｐｇ、約１００ｐｇから約２５０ｐｇ、約１００ｐｇから約２００ｐｇ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の間である。
【００９０】
前述のいずれかの方法と併せて、当該炎症誘発性分子（またはそのような分子を含む医薬組成物）は、その疾患または障害の治療に有益な作用物質との併用で、投与され得る。１つの実施形態において、当該組成物は、抗生物質と共に投与される。本発明の組成物と相乗効果のある療法に対して、有用な抗生物質の特定分類の例示には、アミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）、ペニシリン（例えば、ピペラシリン）、セファロスポリン（例えば、セフタジジム）、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、カルバペネム（例えば、イミペネム）、テトラサイクリン、及びマクロライド（例えば、エリスロマイシン及びクラリスロマイシン）を含む。上記に列挙される抗生物質に加えて、典型的な抗生物質には、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシン・エストレート／エチルコハク酸塩／グルセプト酸塩／ラクトビオン酸塩／ステアリン酸塩）、ペニシリンなどのベータ−ラクタム（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、及びピペラシリン）、またはセファロスポリン（例えば、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セホテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、及びセフスロジン）を含む。抗生物質のその他の分類には、カルバペネム（例えば、イミペネム）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、キノロン（例えば、フレロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、及びシノキサシ）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、及び糖ペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン）を含む。その他の抗生物質には、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、ムピロシン、及び陽イオン性ペプチドを含む。
【００９１】
前述の本発明のいずれの方法もさらに、治療的処置の有効性を評価するステップを含む。本発明の当該炎症誘発性分子は、抗炎症因子の発現を誘発する能力を有するため、そのような因子（例えば、血清中で）のレベルを測定することにより、治療的処置の有効性を評価することができる。
【００９２】
以下の実施例は、本発明の実施形態の例示をさらに提供するが、しかし本発明の範囲を限定する意図はない。それらは、使用される実施形態に特有であるが、その他の手順、方法論、または当業者に公知の技術が、代わりに使用されて良い。
【実施例】
【００９３】
実施例１：Ｃ３Ａ細胞による、急性期タンパク質の発現
背景
アルコール、薬物または毒素によって引き起こされる肝炎は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαのレベル上昇によって、ならびに肝細胞が急性期タンパク質（ＡＰＰ）を上方調節する、炎症カスケードによって特徴付けられる。抗ＴＮＦαまたはステロイド療法は、臨床効果を実証しておらず、したがって、細胞に基づく代替戦略が必要とされる。
【００９４】
目的
本研究の目的は、炎症の解消に関連する因子を産生することにより、ＡＬＤ患者において見出された、選択された炎症性メディエーターに反応する、本発明の適任のＣ３Ａ細胞の能力を評価することであった。
【００９５】
材料及び方法
本開示の治療システムの活性カートリッジのＣ３Ａ細胞からの馴化培養液を、シングルＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ａｂｃａｍ）、化学発光マルチプレックス・アレイキット（Ａｕｓｈｏｎ）、及び／または受託サービス（Ｍｙｒｉａｄ  Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用し、炎症に影響を与えるＡＰＰ、サイトカイン、及びその他のメディエーターに対して評価した。肝炎患者の血清中に存在すると報告された炎症性サイトカイン（ＩＬ−６［０、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ］±ＩＬ−１β［０、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ］）を、単層の、またはその処理システムから回収したＣ３Ａ細胞と共に、２４時間または５４時間培養し、及び馴化培養液を、ＡＰＰのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、及びアルブミンに対して評価した。リポ多糖（ＬＰＳ）（０、０．０１、０．１、１、１０ＥＵ／ｍＬ)を、単層のＣ３Ａ細胞と共に２４時間培養し、及びＡＰＰに対して評価した。
【００９６】
結果
単層のＣ３Ａ細胞を、ＩＬ−６のみまたはＩＬ−１βのみで培養した場合、ＩＬ−１Ｒａのレベルは、増加しなかった。しかしながら、両サイトカインでの共培養では、２４時間でＩＬ−１Ｒａの分泌が、増加へと相乗効果的な反応を示し、５４時間ではでさらに増加した（図１）。
【００９７】
ＡＡＴは一般に、Ｃ３Ａ細胞中のＩＬ−１Ｒａ濃度が、ほぼ２００倍の濃度で、分泌された。ＡＡＴは、２４時間で、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの両方に対して、より投与量に依存した上方調節を示し、及び５４時間では、ＡＡＴの容積がさらに増加したが、その投与量依存性は、維持されなかった（図２）。
【００９８】
Ｃ３Ａ細胞を含む組織を、ＩＬ−６及びＩＬ−１β（各々１０ｎｇ／ｍＬ）と共に、２４時間培養した場合に、ＡＡＴではなく（図４）、ＩＬ−１Ｒａの増加（図３）が観察された。しかしながら、ＡＡＴに対抗する中和抗体が存在する場合には、そのＩＬ−１Ｒａ反応は、減衰しなかった（図６）。アルブミンは、ＩＬ−６及びＩＬ−１βに反応して減少した（図５）。
【００９９】
単層Ｃ３Ａ細胞の、ＬＰＳへの直接暴露は、評価した全ての濃度でＩＬ−１Ｒａ（図７）を、及びより高濃度でのみＡＡＴレベル（図８）を増加させたが、しかし、いずれも、ＩＬ−６及びＩＬ−１βでの刺激で観察されたものより低かった。
【０１００】
ＩＬ−６で処理した単層Ｃ３Ａ培養液において主に増加することが観察されたその他の因子は、フィブリノゲン（６倍）、ＩＬ−１０（１０倍）、ＩＬ−１８（９倍）、ＭＣＰ−１（１５倍）、及びＴＮＦ−β（１２倍）を含んだ。ＩＬ−１βで処理した単層Ｃ３Ａ培養液において主に増加することが観察された因子は、Ｇ−ＣＳＦ（５０倍）、ＳＣＦ（１００倍）、ＩＬ−８（２，０００倍）、及びＴＮＦα（２５倍）を含んだ。ＩＬ−６及びＩＬ−１βの両方が存在した場合に主に増加することが観察された因子は、ＩＣＡＭ−１（９倍）を含んだ。しかしながら、ＩＬ−６とＩＬ−１βの間の相乗効果は、Ｇ−ＣＳＦ（３００倍）に対して観察された。
【０１０１】
図の説明
図１：単層Ｃ３Ａ細胞のＩＬ−１Ｒａの分泌は、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの組み合わせで、上方調節され、及び暴露時間と共に増加する。サンプルは、プールした３つ組ウェルの1回の実験である。
【０１０２】
図２：単層Ｃ３Ａ細胞のＡＡＴの分泌は、ＩＬ−６のみ、ＩＬ−１βのみのいずれか、またはＩＬ−６及びＩＬ−１βの組み合わせで、上方調節され、ならびに暴露時間と共に増加する。サンプルは、プールした３つ組ウェルの1回の実験である。
【０１０３】
図３：Ｃ３Ａ組織のＩＬ−１Ｒａの分泌もまた、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせで、２４時間で上方調節される（＊ｐ＝０．００６７）。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６の実験である。
【０１０４】
図４：Ｃ３Ａ組織のＡＡＴの分泌は、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせで、２４時間で上方調節されない（ｐ＝０．５１４０）。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６の実験である。
【０１０５】
図５：単層Ｃ３Ａ細胞のアルブミンの分泌は、このＡＰＰで予想されたように、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせで、２４時間で下方調節される（＊ｐ＝０．０４７２４）。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝３の実験である。
【０１０６】
図６：ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせにおいて、２４時間で反応する、単層Ｃ３Ａ細胞のＩＬ−１Ｒａの分泌は、中和しているとみなされる抗ＡＡＴ抗体による処理には、影響されなかった。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝３の実験である。
【０１０７】
図７：単層Ｃ３Ａ細胞のＩＬ−１Ｒａの分泌は、ＬＰＳの存在で、２４時間で上方調節される。サンプルは、プールした３つ組ウェルの1回の実験であり、ピンク色の線は、未処理の対照反応を示す。
【０１０８】
図８：単層Ｃ３Ａ細胞のＡＡＴの分泌は、より高濃度のＬＰＳの存在で、２４時間で上方調節される。サンプルは、プールした３つ組ウェルの1回の実験であり、ピンク色の線は、未処理の対照を示す。
【０１０９】
考察
刺激のない状態では、この治療システムの活性カートリッジ中のＣ３Ａ細胞は、複数の抗炎症性ＡＰＰを放出するが、しかし炎症誘発性サイトカインまたはケモカインを、ほとんど放出しない。ここで、ＡＬＤのＩＬ−１β及びＩＬ−６に関連していることが判っている炎症誘発性サイトカインに反応して、ＡＡＴ及びＩＬ−１Ｒａを産生するＣ３Ａ細胞の能力が示される。外因性のＡＡＴ及びＩＬ−１Ｒａは、ＴＮＦα及びＩＬ−１β経路への干渉、ならびにＩＬ−１０産生の増進によって、炎症誘発性サイトカインの合成を抑制することが示されており、後者は広範な抗炎症特性を有している。この効果は、３つの異なるアッセイシステムで、再現されている。ＩＬ−１Ｒａの産生を変化させない、抗ＡＡＴ抗体の不能は、促進または抑制のいずれの方向においても、ＩＬ−１Ｒａに対するＡＡＴの自己分泌作用がないことを示唆している。ＡＬＤ患者において、上昇したサイトカインに反応した、炎症誘発性サイトカインの減少及び抗炎症性ＡＰＰの増加は、ＥＬＡＤシステムによって、炎症の解消に寄与する可能性がある。
【０１１０】
結論
Ｃ３Ａ細胞は、抗炎症性メディエーター、ＩＬ−１Ｒａ及びＡＡＴの分泌によって炎症性の損傷に対応する能力を有する。この事は、本開示の治療システムで治療された肝炎患者において、治療効果を高めるための、複数のメカニズムの１つを表している。
【０１１１】
実施例２：Ｃ３Ａ細胞による、急性期タンパク質の発現
方法
適任のＣ３Ａ細胞を含む活性カートリッジからの馴化培養液を、ＡＰＰ、サイトカイン、及び炎症に影響を与えるその他のメディエーターに対して評価した。患者の血清に存在する炎症性サイトカイン（ＩＬ−６±ＩＬ−１β）を、単層の、またはそのシステムから回収したＣ３Ａ細胞と共に、２４時間または５４時間培養し、及び培養液を、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）ならびにアルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）に対して評価した。
【０１１２】
結果
単層Ｃ３Ａ細胞を、ＩＬ−６またはＩＬ−１βと培養した場合、ＩＬ−１Ｒａのレベルは増加しなかった。しかしながら、両サイトカインとの共培養では、２４時間で、相乗効果的な反応が、ＩＬ−１Ｒａの分泌を増加させること示し、５４時間ではさらに増加した。ＡＡＴは、２４時間で、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの両方に対して、より投与量依存の上方調節を示し、及び５４時間で、ＡＡＴの容量はさらに増加したが、その投与量依存性は、維持されなかった。ＥＬＡＤのＣ３Ａ細胞を、ＩＬ−６及びＩＬ−１β（各々１０ｎｇ／ｍＬ）と２４時間培養した場合、ＩＬ−１Ｒａの増加が観察され、ＡＡＴには観察されなかった。しかしながら、そのＩＬ−１Ｒａの反応は、ＡＡＴに対抗する中和抗体が存在した場合には、減衰されなかった。
【０１１３】
結論
当該治療システムの活性カートリッジ中のＣ３Ａ細胞は、複数の抗炎症性ＡＰＰを放出するが、しかし炎症誘発性サイトカイン、及び炎症誘発性と考えられるケモカインを、ほとんど放出しない。外因性のＡＡＴ及びＩＬ−１Ｒａは、ＴＮＦα及びＩＬ−１β経路による干渉、ならびにＩＬ−１０産生の増進によって、炎症誘発性サイトカインの合成を抑制することが示されており、後者は広範な抗炎症特性を有している。上昇したサイトカインに反応した、炎症誘発性サイトカインの減少及び抗炎症性ＡＰＰの増加は、当該ＥＬＡＤシステムによる炎症の解消に寄与する可能性があり、及び治療上の利点に対応した、複数のメカニズムの一部となる可能性がある。
【０１１４】
実施例３：Ｃ３Ａ細胞による、急性期タンパク質の発現
背景
アルコール誘発肝不全（ＡＩＬＤ）の主要な原因には、無秩序の全身性炎症が含まれる。ＡＩＬＤ患者は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＴＮＦ−αなどの、血漿の炎症因子レベルが上昇している。疾患状態の肝臓は、これらの炎症性メディエーターに適切に対応することができない。この正常に機能しなくなった免疫反応は、患者を、患者の死亡率増加と関連する、全身性炎症症候群の影響を受けやすい状態にする。
【０１１５】
健康な肝臓においては、肝細胞は、全身炎症の制御に寄与する、急性期タンパク質（ＡＰＰ）の主要供給源である。健康な肝細胞は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及びα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）などの、炎症を解消するメディエーターを産生することにより、ＩＬ−１及びＩＬ−６（そのＡＰＰ反応の調節へと導く）に反応する。ＩＬ−１Ｒａ及びＡＡＴは、競争阻害、プロテアーゼ阻害、及び炎症性シグナル伝達カスケード生成のブロックを介して、全身の炎症を軽減する能力を持つ。
【０１１６】
ＡＩＬＤ患者に、抗炎症性ＡＡＰ及びその他の免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−１０）を提供することで、治療上の利点を提供できる。
【０１１７】
抗ＴＮＦ−αまたはステロイド投与などの治療法は、長期的な臨床効果が実証されていない。本明細書に開示された治療システムを伴った、本発明の適任のＣ３Ａ細胞株を利用する、多因子の、細胞に基づく戦略が、有益な可能性がある。
【０１１８】
目的
本研究の目的は、炎症の解消と関連した抗炎症因子を分泌することにより、ＡＩＬＤ患者の血漿中に普通に見出される、選択された炎症性メディエーター（単独または組み合わせで）に反応する、本発明のＣ３Ａ細胞の能力を評価することであった。
【０１１９】
材料及び方法
本発明のＣ３Ａ細胞を、単層に配置し、及びＬＰＳまたは炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及び／またはＴＮＦ−α）と、２４、４８、または５４時間培養した。サイトカインを、単独でまたは組み合わせで、各図に示すように０、１、１０、または１００ｎｇ／ｍｌを投与した。分離したＣ３Ａ細胞を、０、０．０１、０．１、１、または１０ＥＵ／ｍＬのＬＰＳと、２４時間培養した。
【０１２０】
さらに、無傷のＣ３Ａ組織（ポリスルホン中空糸の間で、３次元培養されたＣ３Ａ細胞）を、Ｃ３Ａ細胞カートリッジから摘出し、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βならびに１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に、２４時間投与した。これらの単層Ｃ３Ａ細胞及びＥＬＡＤのＣ３Ａ組織実験からの上清を、社内及び市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｂｃａｍ）、マルチプレックスＥＬＩＳＡｓ（Ｍｙｒｉａｄ）または化学発光マルチプレックス・アッセイキット（Ａｕｓｈｏｎ）の受託サービスを介して、ＩＬ−１Ｒａ、ＡＡＴ、ＩＬ−１０、またはアルブミンに対して評価した。
【０１２１】
単層Ｃ３Ａ細胞を、ＩＬ−１β及びＩＬ−６と共培養した場合、ＩＬ−１Ｒａの分泌が増加する、相乗効果的な反応が認められ、５４時間でさらに増加した（図９）。アルブミンのレベルは、５４時間で、同一の単層試料中のＩＬ−１β及びＩＬ−６に反応して、減少した（図１１）。しかしながら、単層のＣ３Ａ細胞を、ＩＬ−１βまたはＩＬ−６のみと培養した場合、ＩＬ−１Ｒａの分泌は、未処理の対照サンプルのレベル以上には増加しなかった。
【０１２２】
ＡＡＴは一般に、単層Ｃ３Ａ細胞におけるＩＬ−１Ｒａよりも、１，０００倍近く高濃度で分泌された。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、またはそれらの組合せに曝露した場合、 ＡＡＴ分泌に、明らかな効果はなかった（図１０）。全ての処理条件下において、ＡＡＴ濃度に時間依存の増加があった。
【０１２３】
フィブリノゲンは、主としてＩＬ−６処理の単層Ｃ３Ａ培養液において増加することが観察された。ＩＬ−１βの添加で、分泌を止めた（図１２）。α−２マクログロブリンもまた、ＩＬ−６に反応して増加したが、しかしＩＬ−１βには反応しなかった（図１３）。
【０１２４】
単層Ｃ３Ａ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βのみ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６のみ、またはその組み合わせで培養した場合、ＩＬ−１０の分泌は、対照サンプル以上に増加し、及びさらに４８時間で増加した。ＩＬ−６の投与は、ＩＬ−１０の分泌に、より大きな効果があった（図１４）。
【０１２５】
Ｃ３Ａ組織を、ＩＬ−１β及びＩＬ−６（各々１０ｎｇ／ｍＬ）と２４時間培養した場合、ＩＬ−１Ｒａにおける増加（図１５）が観察され、ＡＡＴにおいては観察されなかった（図８）。サンプルサイズは、投与後の細胞数に対して結果を正規化することができないため、変動性の対照を支援するために６回の実験に増やした。
【０１２６】
単層Ｃ３Ａ細胞によるＴＮＦ−αの分泌は、ＩＬ−１βとＩＬ−６との組み合わせに反応して増加した（図１７）。Ｃ３Ａ組織においても、同様の増加が見られた（データ示さず）。
【０１２７】
より高い投与量（１００ｎｇ／ｍＬ）において、ＩＬ−１Ｒａの分泌に増加が認められず、ＴＮＦ−α（１、１０、または１００ｎｇ／ｍＬ）単独では、単層Ｃ３Ａ細胞による、ＩＬ−１Ｒａの分泌が増加しなかった（図１８）。ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）単独、及びＴＮＦ−αとの組み合わせ（各々１０ｎｇ／ｍＬ）で、ＩＬ−１Ｒａの分泌が増加した（図１８）。繰り返すが、全ての投与群において、ＡＡＴ分泌に効果は無かった（データ示さず）。
【０１２８】
単層Ｃ３Ａ細胞の、ＬＰＳへの直接暴露では、評価した全ての濃度（０．０１、０．１、１、及び１０ＥＵ／ｍＬ）で、ＩＬ−１Ｒａの分泌が、おおよそ２倍に増加した（図１９）。ＡＡＴレベルは、より高濃度（１及び１０ＥＵ／ｍＬ）でのみ増加した（図２０）。
【０１２９】
Ｃ反応性タンパク質は、アッセイのより低レベルの量（０．０１２ｎｇ／ｍＬ）を下回った。ハプトグロビンのレベルは、全ての治療と有意性のある変化をしなかった（データ示さず）。
【０１３０】
単層において、ＩＬ−６処理のＣ３Ａ細胞における主要な増加が観察された、その他の因子には、フィブリノゲン（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約６倍）、ＩＬ−１０（対照サンプル（２４時間）に対して約１０倍）、ＩＬ−１８（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約９倍）、単遊走タンパク質１（ＭＣＰ−１）（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約１５倍）、対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して、ＩＬ−１βとの組み合わせで約２０倍、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−α）（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約１２倍）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約５０から７５倍）、対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して、ＩＬ−６との組み合わせで約３００倍及び５００倍、幹細胞因子（ＳＣＦ）（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約１００倍）、ＩＬ−７（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して、約１０倍及び１４倍）、ＩＬ−８（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約２，０００倍）、及びＴＮＦ−α（対照サンプル（２４時間、４８時間）に対して約２５倍）を含む。
【０１３１】
単層において、ＩＬ−１β及びＩＬ−６処理のＣ３Ａ細胞における主要な増加が観察された、その他の因子には、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（対照サンプル（２４時間）に対して約９倍）、及びトランスサイレチン（対照サンプル（４８時間）に対して約３倍減少）を含む。
【０１３２】
図の説明
図９：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のＩＬ−１Ｒａの分泌は、ＩＬ−６とＩＬ−１βとの組み合わせで、上方調節され、及び暴露時間に伴って増加する。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝３の生物学的実験である（各一対バーの左は２４時間、右は５４時間）。
【０１３３】
図１０：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のＡＡＴの分泌は、時間と共に増加するが、しかしＩＬ−６またはＩＬ−１β単独または組み合わせへの暴露には影響されない。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝３の生物学的実験である（各一対バーの左は２４時間、右は５４時間）。
【０１３４】
図１１：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のアルブミンの分泌は、この例のＡＰＰで予想されたように、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（＊ｐ＝０．０４７）との組み合わせで、５４時間で下方調節される。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝３の実験である。
【０１３５】
図１２：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のフィブリノゲンの分泌は、ＩＬ−６によって増加し、及びＩＬ−１βによって停止した。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である。
【０１３６】
図１３：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のα−２マクログロブリン（α−２Ｍ）の分泌は、ＩＬ−６単独によって、多少は上方調節されたように見えた。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である。
【０１３７】
図１４：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のＩＬ−１０の分泌は、ＩＬ−１βまたはＩＬ−６の存在で上方調節され、及びＩＬ−６によってより加速される。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である（各一対バーの左は２４時間、右は４８時間）。
【０１３８】
図１５：Ｃ３Ａ組織（細胞数に対して正規化されていない）のＩＬ−１Ｒａの分泌もまた、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）との組み合わせで、２４時間で上方調節される（＊Ｐ＝０．００７）。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６の生物学的実験である。
【０１３９】
図１６：Ｃ３Ａ組織（細胞数に対して正規化されていない）のＡＡＴの分泌は、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（ｐ＝０．５１）との組み合わせで、２４時間で上方調節されない。結果は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６の生物学的実験である。
【０１４０】
図１７：単層Ｃ３Ａ細胞（２．６×１０５細胞／ｃｍ２）のＴＮＦαの分泌は、ＩＬ−１βまたはＩＬ−６の存在で、上方調節される。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である（各一対バーの左は２４時間、右は４８時間）。
【０１４１】
図１８：単層Ｃ３Ａ細胞（２．６×１０５細胞／ｃｍ２）のＩＬ−１Ｒａの分泌は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在、及びＩＬ−１βとＴＮＦ−α（各１０ｎｇ／ｍＬ）との組み合わせで、上方調節されるが、ＴＮＦ−α単独ではそうならない。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である。
【０１４２】
図１９：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のＩＬ−１Ｒａの分泌は、ＬＰＳの存在で、２４時間で上方調節される。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である（緑色の線は、未処理の対照反応を示す）。
【０１４３】
図２０：単層Ｃ３Ａ細胞（１．３×１０５細胞／ｃｍ２）のＡＡＴの分泌は、高濃度のＬＰＳの存在で、２４時間で上方調節される。結果は、プールした３つ組ウェルの1回の実験である（緑色の線は、未処理の対照反応を示す）。
【０１４４】
考察
これらの研究において、Ｃ３Ａの単層細胞及び組織の両方において、炎症性サイトカイン及び急性期反応の主要メディエーターである、ＩＬ−１β、ＩＬ−６ならびにＴＮＦ−αへ、及びＬＰＳへ反応する、Ｃ３Ａ細胞の能力が証明された。
【０１４５】
Ｃ３Ａの単層細胞及び組織の両方において、当該Ｃ３Ａ細胞は、抗炎症性ＡＰＰの上方調節された及び／または常時の発現によって、ＡＩＬＤ患者に上昇した状態で見出される、これら炎症性メディエーターに反応する。
【０１４６】
急性期反応の特徴はそのままで、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの効果は、もたらされる因子によって変動し、及び互いに阻害しあったり（例えば、フィブリノゲン）または高めあったり（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）することができる。増加したＩＬ−１Ｒａの分泌と同時に、減少したアルブミンの産生もまた、急性期反応と一致する。
【０１４７】
外因性のＡＡＴ及びＩＬ−１Ｒａは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β経路への干渉、及びＩＬ−１０産生を増進によって、炎症誘発性サイトカインの合成を抑制することが示されており、後者は、幅広い抗炎症性の特性を有する。Ｃ３Ａ細胞によって増加したＩＬ−１０産生が、ＩＬ−６への暴露またはＩＬ−１Ｒａの自己分泌作用から直接もたらされたものかどうかは、これらの研究からは明確ではない。
【０１４８】
Ｃ３Ａ細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−１β及びそれらの組み合わせに反応して、ＴＮＦ−αの低いが、しかし上昇したレベルを産生した。しかしながら、ＴＮＦ−αは、培養液中で１０，０００倍以上高いと測定された投与量の場合を除き、ＡＰＰ発現に、著しい影響を与えなかった。
【０１４９】
ＡＩＬＤ患者での、上昇したサイトカイン及びＬＰＳへの反応において、炎症誘発性サイトカインの減少及び抗炎症性ＡＰＰの増加は、当該治療システムによって、炎症の解消に寄与する可能性がある。
【０１５０】
結論
Ｃ３Ａ細胞は、構造的に及びＩＬ−１βとＩＬ−６との共培養への反応の両方において、抗炎症因子を分泌する。それらの反応は、動的であり、抗炎症性メディエーターであるＩＬ−１Ｒａ及びＡＡＴの、時間及び用量依存性の分泌を示す。さらに、Ｃ３Ａ細胞は、ＬＰＳに反応して、ＩＬ−１Ｒａ及びＡＡＴを上方調節する。
【０１５１】
炎症を解消する反応は、当該治療システムで治療されるＡＩＬＤ患者において、治療効果の向上に対応した、複数メカニズムの１つを表すであろう。
【０１５２】
実施例４：Ｃ３Ａ細胞からの分泌因子が、アルコール性肝疾患に関連する、炎症及び好中球／マクロファージの機能不全の軽減に役立ち、免疫恒常性を回復するようにサポートする、エクスビボ及びインビトロモデル
アルコール性肝炎（ＡＨ）患者は、慢性的なアルコール消費からくる、増加した腸透過性及びその循環への細菌／内毒素の移行に部分的に起因する、炎症誘発性サイトカインの高いレベル及び易感染性の免疫細胞機能を持つ。全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）及び多臓器不全に進行するメカニズムは、完全に理解されてはいないが、それらに関連した死亡率の増加が、たびたび報告されている。
【０１５３】
これら研究の目的は、先天的免疫細胞機能のエクスビボ及びインビトロモデルを利用して、免疫恒常性を回復するために、本発明のＣ３Ａ細胞を有する、本明細書に開示された当該治療システムの可能性を評価することであった。
【０１５４】
システム治療を受けた（急性慢性肝不全の治療に対して）７人、及び疾患重症度に合わせた対照サンプルとしての２人の対象から採取した血漿サンプルで、治療開始の前及び２４時間後に、サイトカインを測定した。治療前、中、及び後に採取した、対象の血漿で処理した健康な対照の好中球において、酸化バースト及び貪食能を測定した。
【０１５５】
ＴＨＰ−１単球細胞を、炎症誘発性（Ｍ１）マクロファージの表現型に偏らせて接着するように誘発し、及びＣ３Ａ細胞の馴化培養液（ＣＭ）の有無による、サイトカイン産生及び貪食能を測定した。
【０１５６】
対象の血漿中のＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαは、治療の２４時間後に、すべて下方傾向を示し、炎症誘発性ＴＨ１様プロファイルから、抗炎症性ＴＨ２プロファイルへの移行を示唆した。酸化バーストは、システム治療前の対象の血漿で処理した好中球において、対照サンプルの血漿に比べて著しく高く、及びＥＬＡＤ治療とその後の間に、下方傾向を示した。ＦＩＴＣ標識化されたＥ．ｃｏｌｉの貪食は、ＥＬＡＤ治療前の血漿及びＥＬＡＤ治療の２４時間後に処理した好中球で最も低く、ならびに治療の最後及び３０日間の経過観察後に、ＥＬＡＤ治療の対象からの血漿で処理した好中球で上昇した。
【０１５７】
炎症誘発性（Ｍ１）ＴＨＰ−１細胞をＣＭで処理して、炎症性サイトカインの分泌を誘発したが（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦα）、貪食は、４８時間以内に回復しなかった。
【０１５８】
Ｃ３Ａ細胞が、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６への暴露に反応して、抗炎症性タンパク質ＩＬ−１Ｒａを産生すること、及びケーススタディ（ｎ＝３）において、治療中にシステム治療を受けた対象の血漿中で、ＩＬ−１Ｒａの濃度が増加することが、従来報告されていた。これらの現在の研究では、先天的免疫細胞機能のエクスビボ及びインビトロモデルにおいて、Ｃ３Ａ細胞が、免疫恒常性を回復し、及びその治療が効果を提供することによって、潜在的なメカニズムを示唆することを証明している。
【０１５９】
対象の血漿中のゲルゾリンレベルは、図２３に示すように、治療後２４時間で、著しく上昇する傾向があった。
【０１６０】
図の説明
図２１：当該治療システムで治療の間の、対象の血漿中の選択されたタンパク質レベル。
【０１６１】
図２２：当該治療システムで治療の間の、対象の血漿中の選択されたタンパク質のレベル。
【０１６２】
図２３：当該治療システムで治療の間の、対象の血漿中のゲルゾリンのレベル。
【０１６３】
本発明を、例示だけを使い、及び限定の意味としてではなく、特定の実施形態を関連させて、詳細に示し及び記載した。当業者は、例示的に記載された実施形態に対する多様な変更は、本開示の範囲及び熟考内にあることを理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、と解釈されるべきであるとみなされよう。
【図１】
2018522853.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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