(57)【要約】本開示は、リポタンパク質代謝障害の治療のためのプロタンパク質転換酵素サブチリシン様／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の阻害剤に関する。【選択図】図１
2018511596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン受容体（ＨＳＰＧ）のＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる化合物。
【請求項２】
前記化合物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの少なくとも１個、すなわちＰＣＳＫ９（配列番号１）の、例えばアミノ酸残基７８〜９２のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９３〜９７のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９８〜１０３のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７のうちの少なくとも１個を含む、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５、及びＲ１６７からなる群から選択される１個以上のアミノ酸に結合する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、及びＨ１３９のうちの少なくとも１個、例えば少なくとも２個、例えば少なくとも３個、例えば少なくとも４個、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも６個全てに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が抗体またはその機能的等価物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記抗体またはその機能的等価物がマウスモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記抗体またはその機能的等価物がヒト化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記抗体の前記機能的等価物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位に結合することができる、前記抗体の抗原結合断片を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記抗体またはその機能的等価物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基９３、９６、９７、１０４、１０５、１３６、１３９、１６５、または１６７のうちの少なくとも１個を含むＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープ、例えばＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基９３、９６、９７、１０４、１０５、及び１３９のうちの少なくとも１個、例えば少なくとも２個、例えば少なくとも３個、例えば少なくとも４個、例えば少なくとも５個、例えば６個全てを含むエピトープを特異的に認識して結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び
（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７によって定義される重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び／または配列番号５によって定義される軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び
（ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９によって定義される重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び／または配列番号３によって定義される軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記抗体がドメインシャッフリングによって構成される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記抗体が抗体変異体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記抗体変異体が、半減期、安定性、溶解性、及び／またはバイオアベイラビリティを高めるために修飾されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記抗体変異体が遺伝子組換えドメイン内ジスルフィド結合を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
１つ以上のＦｖ断片が、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にペプチドリンカーを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記抗体のＰＣＳＫ９への結合が、前記抗体の不在下での結合と比較して、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を低下させる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記抗体が更に、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＬＤＬＲ結合部位内の領域を認識して結合することができ、前記領域がＰＣＳＫ９の残基１９４または３６７〜３８１の少なくとも１つを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
前記抗体のＰＣＳＫ９への結合が、前記抗体の不在下でのレベルと比較して、肝細胞などのＬＤＬＲ発現細胞のＬＤＬＲレベルを上昇させる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記抗体のＰＣＳＫ９への結合が、前記抗体の不在下での分解と比較して、ＬＤＬＲのリソソーム分解を減少させる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記抗体のＰＣＳＫ９への結合が、前記抗体の不在下でのレベルと比較して、ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルを低下させる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
ＬＤＬ−Ｃの前記血漿レベルがｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
ＬＤＬ−Ｃの前記血漿レベルが、ウェスタンブロット、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、超遠心分離、ＦＰＬＣ、または電気泳動法で決定される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
前記抗体が血清中で安定である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記抗体が投与後に無毒性である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ヘパリン類似体が、ＨＳＰＧの競合的アンタゴニスト、不競合的アンタゴニスト、非競合的アンタゴニスト、サイレントアンタゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ヘパリン類似体がヘパリンである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
前記ヘパリン類似体がペプチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
前記ヘパリン類似体がヘパリンのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３５】
前記化合物がヘパリン模倣体またはヘパリン類似体である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物が、式（Ｉ）の一般構造：
【化１】
2018511596.tif 000026
（式中、
−Ｒ１は、ＣＯＯＨ、及び−Ｏ３ＳＯからなる群から選択され、
−Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は、Ｏ及びＯＨからなる群から選択され、
−Ｒ４は、硫酸基からなる群から選択され、
−Ｒ６は、スルファメート基、ＯＨ、及びＯからなる群から選択され、
−Ｒ８は、硫酸基からなる群から選択され、
−ｎは１以上の整数であり、
ここで、Ｒ２及び／またはＲ７は、場合によりモノマー単位を連結するリンカーとして作用することができる）を有する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３７】
式（Ｉ）の前記化合物が、
ａ）フォンダパリヌクスであり、次式を有する化合物：
【化２】
2018511596.tif 000027
ｂ）ダルテパリンナトリウムまたはチンザパリンナトリウムなどの低分子量ヘパリン；及び
ｃ）式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2018511596.tif 000028
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、Ｈ、ＣＯＯＨ、−Ｏ３ＳＯ、Ｏ、ＯＨ、スルフェート、及びスルファメートからなる群から独立して選択され、ｎは１以上の整数）である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３８】
式（ＩＩ）の前記化合物がペントサンであり、次式：
【化４】
2018511596.tif 000029
（式中、ｎは１以上の整数である）を有する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記化合物が、式（ＩＩＩ）の一般構造：
【化５】
2018511596.tif 000030
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は、ＣＯＯＨ、−Ｏ３ＳＯ、Ｏ、ＯＨ、スルフェート、及びスルファメートからなる群から独立して選択され、ｎは１以上の整数であり、ここで、Ｒ１４は、場合によりモノマー単位を連結するリンカーとして作用することができる）を有する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
前記化合物が硫酸デキストランであり、次式：
【化６】
2018511596.tif 000031
（式中、ｎは１以上の整数である）を有する、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記化合物がスラミンであり、次式：
【化７】
2018511596.tif 000032
を有する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
前記化合物がホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＳ−ｄＮｎであり、ここで、ｎは前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート結合の数である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
ｎが１２〜６０である、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
ｎが１５〜５５、例えば２０〜５０、例えば２５〜４５、例えば３０〜４０、例えば３６である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
前記化合物が、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＬＤＬＲ結合ドメインに結合することができない、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
リポタンパク質代謝障害の治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４７】
医薬品として使用するための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４８】
治療を必要とする対象におけるリポタンパク質代謝障害の治療方法に使用するための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４９】
前記リポタンパク質代謝障害が、ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇のようなＬＤＬ−Ｃレベルの異常と関係する、請求項４８に記載の使用のための化合物。
【請求項５０】
前記リポタンパク質代謝障害が、ＰＣＳＫ９の血漿レベルの異常及び／または肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞のＬＤＬＲレベルの異常と関係している、請求項４８〜４９のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項５１】
前記リポタンパク質代謝障害が、脂質異常症、高コレステロール血症、及び冠動脈性心疾患からなる群から選択される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項５２】
前記治療が予防的である、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項５３】
前記対象が哺乳動物である、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項５４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項５５】
治療を必要とする対象におけるリポタンパク質代謝障害の治療方法であって、前記方法は請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記化合物が、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの１日投与量で投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
治療を必要とする個体におけるリポタンパク質代謝障害、例えば脂質異常症、高コレステロール血症、及び心臓冠動脈疾患の治療方法であって、前記方法は、
ｉ．前記個体から単離された組織サンプルまたは血漿サンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記組織のＬＤＬＲのレベル、ならびに／または前記血漿サンプル中のＰＣＳＫ９のレベル及び／もしくはＬＤＬ−Ｃのレベルを測定するステップと、
ｉｉｉ．ステップｉｉ）の発現レベルを対照組織サンプルまたは対照血漿サンプルのレベルと対比するステップと、
ｉｖ．治療計画を評価するステップと、
ｖ．請求項１〜４５のいずれか１項に記載の治療有効量の化合物を含む組成物を個体に投与するステップと、を含む、前記方法。
【請求項５８】
ＬＤＬＲの分解を阻害する方法であって、前記方法は、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物または請求項５９〜６９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５９】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物。
【請求項６０】
前記組成物が、スタチン、またはＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位に結合する抗体のような抗ＰＣＫ９抗体のうちの少なくとも１種を更に含む、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記組成物が、少なくとも１種の更なる化合物、例えばロデルシズマブ、ラルパンシズマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、及びボコシズマブからなる群から選択される化合物を更に含む、請求項５９〜６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記組成物が、以下の少なくとも１種を更に含む、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の医薬組成物：
−ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体；
−スタチン；
−コレスチラミン；
−エゼチミブ。
【請求項６３】
１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記組成物のｐＨがｐＨ４〜ｐＨ１０である、請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記組成物が経口投与に合わせて製剤化される、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記組成物が非経口投与に合わせて製剤化される、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記非経口投与が注射によるものである、請求項５９〜６４または６６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記非経口投与が静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス、または連続投与である、請求項５９〜６４または６６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記化合物が、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの１日投与量で投与される、請求項５９〜６８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体の選択方法であって、前記方法は、
ｉ．配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの少なくとも１個のアミノ酸残基、例えば配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも３０個、例えば少なくとも３５個、例えば少なくとも４０個、例えば少なくとも４５個、例えば少なくとも５０個、例えば少なくとも５５個、例えば少なくとも６０個、例えば少なくとも６５個、例えば少なくとも７０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも８０個、例えば少なくとも全てのアミノ酸を含むＰＣＳＫ９のポリペプチド断片、またはＰＣＳＫ９のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．前記ポリペプチドを認識する抗体を同定して選択するステップと、
ｉｉｉ．競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、前記選択された抗体が１種以上の対照抗体を置換できるかを決定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項７１】
前記方法が、前記対照抗体の少なくとも１つを置換できる抗体を選択するステップを更に含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項７０〜７１のいずれか１項に記載の方法であって、競合ＥＬＩＳＡにおいて、前記選択された抗体が１種以上の対照抗体と置換できるかを決定するステップが、
ｉ．前記対照抗体によって認識されるエピトープを含むＰＣＳＫ９またはその断片を提供するステップと；
ｉｉ．試験抗体及び前記対照抗体を前記ＰＣＳＫ９またはその断片に付加するステップであって、試験抗体または対照抗体のいずれかが、検出可能な標識で標識されているか、または両方の抗体が、異なった検出可能な標識で標識されているステップと；
ｉｉｉ．ＰＣＳＫ９での検出可能な標識の存在を検出するステップと、を含み、
それにより、試験抗体が対照抗体を置換できるかを検出する、前記方法。
【請求項７３】
請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、前記抗体を試験して前記抗体がＬＤＬＲの分解を阻害できるかを判定することと、ＬＤＬＲの分解を阻害できる抗体を選択することと、を更に含む、前記方法。
【請求項７４】
ヘパリンなどのＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができるペプチドまたはヘパリン類似体の選択方法であって、前記方法は、
ｉ．複数のペプチドまたはヘパリン類似体を提供するステップと；
ｉｉ．前記複数のペプチドまたはヘパリン類似体を、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞と培地中でインキュベートするステップと；
ｉｉｉ．前記培地中のＰＣＳＫ９のレベル及び／または前記細胞のＬＤＬＲのレベルを測定するステップと；
ｉｖ．ステップｉｉｉで測定したとき、ＰＣＳＫ９及び／またはＬＤＬＲを最も高レベルで生じさせるペプチドまたはヘパリン類似体を選択するステップと、を含む、前記方法。
【請求項７５】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物と選択的に結合することができる化合物。
【請求項７６】
前記化合物が抗体である、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７７】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体の作製方法であって、前記方法は、
ｉ．ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを含むタンパク質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはその機能的等価物を哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．ＰＣＳＫ９（配列番号１）に結合できる場合に前記抗体を選択するステップと；
ｉｉｉ．前記突然変異したＰＣＳＫ９がＨＳＰＧに結合できない場合、突然変異したＰＣＳＫ９に結合できない場合に前記抗体を選択するステップと、を含む、前記方法。
【請求項７８】
前記突然変異したＰＣＳＫ９が、９３位、９６位、９７位、１０４位、１０５位、１３６位、１３９位、１６５位、または１６７位で突然変異している、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記突然変異したＰＣＳＫ９が、９３位、９６位、９７位、１０４位、１０５位、及び１３９位で突然変異している、請求項７７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記突然変異したＰＣＳＫ９が、突然変異体Ｒ９３Ａ、Ｒ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｒ１０４Ａ、Ｒ１０５Ａ、Ｋ１３６Ａ、Ｈ１３９Ａ、Ｒ１６５Ａ、またはＲ１６７Ａからなる群から選択される、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記突然変異したＰＣＳＫ９が、Ｒ９３Ａ、Ｒ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｒ１０４Ａ、Ｒ１０５Ａ、Ｒ３９Ａ突然変異体である、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記哺乳動物が齧歯類である、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
請求項７７〜８２のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、前記哺乳動物から抗体産生細胞を単離することと、前記抗体産生細胞からハイブリドーマ細胞を調製することと、前記ハイブリドーマを培養することと、前記ハイブリドーマによって産生される抗体を単離することと、を更に含む、前記方法。
【請求項８４】
請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の方法であって、前記化合物は、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体であり、前記方法は、前記抗体をコードする核酸構築物で宿主細胞をトランスフェクトするステップを含む、前記方法。
【請求項８５】
前記抗体が組換え細胞により作製される、請求項７７〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記組換え細胞が、細菌及び真核微生物を含む群から選択される微生物である、請求項７７〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含む群から選択される細菌である、請求項７７〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記微生物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓを含む群から選択される真核微生物である、請求項７７〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記宿主細胞が、植物細胞及び動物細胞を含む群から選択される、請求項７７〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記植物細胞が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐ．，エンドウマメ、イネ、トウモロコシ、タバコ、オオムギ、またはその種子を含む群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣、マウス、及びヒトを含む群から選択される哺乳動物に由来する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記動物細胞が、昆虫または鳥類細胞株に由来する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体を同定及び選択するステップを更に含む、請求項７７〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
血漿ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を必要とする対象において血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法であって、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物、または請求項５９〜６９のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項９５】
前記対象がスタチン治療に反応しない、請求項９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、リポタンパク質代謝障害の治療のためのプロタンパク質転換酵素サブチリシン様／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる冠動脈疾患は、欧州及び米国において死因の上位を占める。アテローム性動脈硬化症を発症させる主要なリスク因子は、コレステロールを運搬する低密度リポタンパク質（ＬＤＬコレステロールすなわちＬＤＬ−Ｃ）粒子の血中濃度の上昇を伴う高コレステロール血症である。ＬＤＬコレステロール粒子の代謝は、体内のコレステロールの必要量を満たすため、コレステロールの合成と食事摂取とのバランスをとるように高度に調節されている。ＬＤＬコレステロールの代謝回転に関わる重要な調節因子が、ＬＤＬ粒子の細胞内取り込みを媒介し、ＬＤＬコレステロールの血中濃度を低下させるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）である。ＬＤＬＲの欠乏または機能障害によって引き起こされる家族性高コレステロール血症の患者にそれが表れている。
【０００３】
ＬＤＬコレステロールの血漿レベルを低下させる方法として奏功しているのが、細胞内のＬＤＬＲレベルを上昇させることであり、現在、ＬＤＬコレステロールを低下させるために最も広く使用されている薬物がスタチンである。スタチンは、コレステロールの合成を阻害し、ＬＤＬＲの発現を上方調節することにより、総合的に血中ＬＤＬコレステロール量を低下させる。しかしながら、相当数の患者が、スタチンに反応しないか、または様々な副作用によりスタチンに耐性がない。更にスタチンは、先頃、ＬＤＬＲの強力な陰性調節因子として同定された（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）プロタンパク質転換酵素サブチリシン様／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の発現を増加させ、その結果、ＬＤＬコレステロールに対する有益な効果を相殺する。
【０００４】
最近の血漿ＬＤＬ−Ｃを低下させるための手段が、ＰＣＳＫ９の標的化である（Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する能力により、細胞内のＬＤＬＲレベルが低下し、それによってこの受容体の再利用が損なわれ、リソソーム分解が増強される。ＰＣＳＫ９の機能獲得型変異は、ＬＤＬＲの分解の増加による血中ＬＤＬ−Ｃの有意な上昇をもたらす。対照的に、ＰＣＳＫ９の機能喪失型変異を有する個体は、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を示し、冠動脈性心疾患の発生事例は少ない。複数の大手製薬企業が、高コレステロール血症を緩和するＰＣＳＫ９を標的とした治療戦略の承認を取得している。ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位に対するＰＣＳＫ９特異的抗体の投与は、第ＩＩＩ相臨床試験においてＬＤＬ−Ｃ血漿レベルを低下させると報告されている（Ｍｕｌｌａｒｄ（２０１５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ；Ｓｈｅｒｉｄａｎ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。しかしながら、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲの結合定数は１２０〜６２０ｎＭの範囲内であるが（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、対するＰＣＳＫ９の血漿濃度は約６ｎＭである（Ｌａｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。このことは、生理的に適切な濃度でＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと直接結合する可能性が極めて低いことを表している。更にＰＣＳＫ９は肝臓内のＬＤＬＲのみを標的としており、高レベルのＬＤＬＲを同様に発現する、例えばステロイドホルモン産生組織内のＬＤＬＲは標的としない。このことは、肝臓特異的な共受容体の必要性を示唆している（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。このように、ＬＤＬＲはＰＣＳＫ９の一次受容体ではない可能性が高い。むしろ、未知の受容体（受容体Ｘ）が血中のＰＣＳＫ９を捕捉し、その後それをＬＤＬＲに送達している可能性がある。したがって、この受容体に対するＰＣＳＫ９の結合を阻害することは、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ相互作用の阻害よりも優れた戦略である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＬＤＬＲが肝細胞表面に対する唯一のＰＣＳＫ９受容体ではないという知見に関する。本発明者らは、ＰＣＳＫ９がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の結合モチーフを有することを見出した。このモチーフに導入された突然変異体、ならびにヘパリンによるＨＳＰＧへの結合の阻害は、驚くべきことにＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する。ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧとの間の相互作用の阻害は、ＰＣＳＫ９阻害抗体の臨床試験と比較して優れた治療可能性を有する（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。重要なことに、ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合モチーフは、ＬＤＬＲ結合表面のＨＳＰＧ結合モチーフとは異なる。ＨＳＰＧは、１つ以上のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン鎖で置換されたコアタンパク質からなる。ヘパリンは、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの一種である。ＨＳＰＧは、ＨＳＰＧ結合モチーフを有するタンパク質リガンドに結合する高度にグリコシル化された細胞表面タンパク質であり、例えば増殖因子の局所集積を生成する（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｅｓｋｏ，２０１４）。このデータは、ＰＣＳＫ９がＨＳＰＧに結合することと、ＰＣＳＫ９におけるＨＳＰＧ結合モチーフの部位特異的突然変異誘発により相互作用が消滅し、その結果ヘパリンに結合できないＰＣＳＫ９突然変異体が生じて、ＬＤＬＲの分解能の阻害を呈することを示している。更に、ヘパリン、ヘパリン模倣体、またはＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対するモノクローナル抗体と共に細胞をインキュベートすると、培地中のＰＣＳＫ９濃度の増加に伴って、ＬＤＬＲレベルの上昇をもたらす。総合すると、本実施例に概説する結果は、ＰＣＳＫ９の機能がＨＳＰＧの結合に依存し、ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧとの間の相互作用が抑止されると、細胞内のＬＤＬＲレベルが上昇することを示す。
【０００６】
したがって、ＨＳＰＧは、細胞表面ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９を介する分解において重要な共受容体として機能する。本知見は、ＨＳＰＧがＰＣＳＫ９誘導性のＬＤＬＲの下方調節において重要な機能を有することを示している。
【０００７】
ＰＣＳＫ９機能の遮断、特にＬＤＬＲレベルに対するＰＣＳＫ９の効果を阻害する際に、ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧとの間の相互作用部位を標的とすることができる。このように高コレステロール血症を治療及び冠動脈性心疾患を予防する新たな方法を開示する。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン受容体のＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる化合物に関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、リポタンパク質代謝障害の治療を目的とする医薬品の製剤化のための、本明細書で定義される化合物に関する。
【００１０】
更に別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための本明細書で定義される化合物に関する。
【００１１】
更に別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象におけるリポタンパク質代謝障害の治療方法に使用するための本明細書で定義される化合物に関する。
【００１２】
更に別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象におけるリポタンパク質代謝障害の治療方法であって、前記対象に本明細書で定義される化合物を投与することを含む前記方法に関する。
【００１３】
更に別の態様では、本発明は、治療を必要とする個体におけるリポタンパク質代謝障害、例えば脂質異常症、高コレステロール血症、及び心臓冠動脈疾患からなる群の治療方法であって、
ｉ．前記個体から単離された組織サンプルまたは血漿サンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記組織中のＬＤＬＲのレベル、ならびに／または前記血漿サンプル中のＰＣＳＫ９のレベル及び／もしくはＬＤＬ−Ｃのレベルを測定するステップと、
ｉｉｉ．ステップｉｉ）の発現レベルを対照組織サンプルまたは対照血漿サンプルのレベルと対比するステップと、
ｉｖ．治療計画を評価するステップと、
ｖ．本明細書で定義される治療有効量の組成物を含む組成物を個体に投与するステップと、を含む方法に関する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明はＬＤＬＲの分解を阻害する方法に関し、前記方法は本明細書で定義される化合物を投与することを含む。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は本明細書で定義される化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体の選択方法であって、
ｉ．配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの少なくとも１個のアミノ酸残基、例えば配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも３０個、例えば少なくとも３５個、例えば少なくとも４０個、例えば少なくとも４５個、例えば少なくとも５０個、例えば少なくとも５５個、例えば少なくとも６０個、例えば少なくとも６５個、例えば少なくとも７０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも８０個、例えば少なくとも全てのアミノ酸を含むＰＣＳＫ９のポリペプチド断片、またはＰＣＳＫ９のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド断片を哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．前記ポリペプチドを認識する抗体を同定して選択するステップと、
ｉｉｉ．競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、前記選択された抗体が１種以上の対照抗体を置換できるかを決定するステップと、を含む前記方法に関する。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、ヘパリンなどのＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができるペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体の選択方法であって、
ｉ．複数のペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を提供するステップと；
ｉｉ．前記複数のペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞と共に培地中でインキュベートするステップと；
ｉｉｉ．前記培地中のＰＣＳＫ９のレベル及び／または前記細胞のＬＤＬＲのレベルを測定するステップと；
ｉｖ．ステップｉｉｉで測定したとき、ＰＣＳＫ９及び／またはＬＤＬＲを最も高レベルで生じさせるペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を選択するステップと、を含む前記方法に関する。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は本明細書で定義される化合物と選択的に結合することができる化合物に関する。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は本明細書で定義される抗体の作製方法であって、
ｉ．ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを含むタンパク質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくはその機能的等価物を哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．ＰＣＳＫ９（配列番号１）に結合できる場合に前記抗体を選択するステップと；
ｉｉｉ．前記突然変異したＰＣＳＫ９がＨＳＰＧに結合できない場合、突然変異したＰＣＳＫ９に結合できない場合に前記抗体を選択するステップと、を含む前記方法に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を必要とする対象において血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法に関し、前記方法は、本明細書で定義される化合物または医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】文献に記載されている現行モデルの図。ＬＤＬＲが、コレステロールを運搬するＬＤＬ−Ｃ粒子を血中から取り込み、それをリソソームに送達して分解すると同時に、エンドソーム（Ａ）での運搬物の放出後、この受容体（ＬＤＬＲ）が細胞表面にリサイクルされることを示す。ＰＣＳＫ９に結合すると、ＬＤＬＲ自体がリソソーム（Ｂ）で分解される。したがって、ＰＣＳＫ９が高活性になると、細胞表面でのＬＤＬＲレベルの低下及び血漿コレステロールの増加をもたらし、対してＰＣＳＫ９活性が阻害されると、血漿コレステロールレベルが低下し、冠動脈疾患の進行が遅延化する。
【図２−１】（Ａ）それぞれ左右の矢印によって示されるＬＤＬＲ結合部位及びＨＳＰＧ結合部位を有するＰＣＳＫ９の空間充填モデルを示す。
【図２−２】（Ｂ）示された正荷電アミノ酸（Ｒ：アルギニン、Ｈ：ヒスチジン）を有する、ＰＣＳＫ９（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＰＭＷ）の予測されるＨＳＰＧ結合部位（Ｐｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）の静電表面（赤が負；青が正）にあるヘパリン五糖（ＳＡＮＯＲＧ、スティック）を示す。
【図２−３】（Ｃ）ＳＡＮＯＲＧをＰＣＳＫ９（リボン）のＨＳＰＧ結合部位に重ね合わせた状態。
【図２−４】（Ｄ）ヘパリナーゼＩの存在下または不在下で処理後の、ＰＣＳＫ９を発現する非透過性ＨｅｐＧ２細胞（白色）。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した（暗灰色）。（Ｅ）ヘパリンへのＰＣＳＫ９結合をヘパリンのアフィニティークロマトグラフィーにより分析した。ＰＣＳＫ９は、５００ｍＭのＮａＣｌ濃度でカラムから溶出した。
【図３−１】示されたアミノ酸残基がアラニンに変異したＰＣＳＫ９変異体をＣＨＯ細胞に一過性発現させた。（Ａ）細胞溶解物及び細胞培地の抗ＰＣＳＫ９ウェスタンブロッティングは、細胞溶解物中で、全てのＰＣＳＫ９変異体の発現と共に、プロタンパク質（ｐｒｏＰＣＳＫ９）から成熟ＰＣＳＫ９への正確なプロセッシングを示し、また細胞培地への成熟ＰＣＳＫ９の分泌を示した。モックトランスフェクト細胞ではＰＣＳＫ９の発現は検出されなかった。
【図３−２】（Ｂ）アフィニティークロマトグラフィー、続いて抗ＰＣＳＫ９を用いた画分のウェスタンブロッティングによって、一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培地に分泌されたＰＣＳＫ９突然変異体のヘパリンへの結合について分析した。突然変異体は全て、示された位置にアラニン置換を有する。野生型（ＷＴ）ＰＣＳＫ９及び突然変異体Ｒ１６５Ｒ１６７は、０．３〜０．４ＭのＮａＣｌに相当する画分に溶出したが、ＰＣＳＫ９突然変異体Ｒ９６Ｒ９７及びＲ１０４Ｒ１０５は、ヘパリンに対しては親和性の減少を示し、フロースルーまたは第１画分に検出された。ＰＣＳＫ９突然変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９及びＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９は、フロースルーにのみ検出され、ヘパリンには結合しなかった。
【図３−３】（Ｃ）ＨＳＰＧ結合ドメインは、ＬＤＬＲ断片（ＰＤＢ：３Ｐ５Ｂ）との複合体中のＰＣＳＫ９の表面を表すＰＣＳＫ９の空間充填モデルに示されるように、ＬＤＬＲ結合部位の反対側に位置する。ＬＤＬＲ断片はベータプロペラドメイン及びＥＧＦドメインＡとＢ及びＬ７を含み、一方、ＰＣＳＫ９のＣ末端、触媒ドメイン及びプロドメインは塩基性ヘリックスで示されている。モデル化したヘパリン断片はスティックとして示されている。（Ｄ）ＨｅｐＧ２細胞の培養培地からの内因性ＰＣＳＫ９及びＡｐｏＥを、アフィニティークロマトグラフィー及びウェスタンブロットにより分析したところ、ヘパリンに対して同様の結合を示した。
【図４】ＷＴＰＣＳＫ９（１０ｎＭ）と１８時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、突然変異体（Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９）ＰＣＳＫ９（ｍｕｔ）とインキュベートした細胞よりも有意に低いレベルのＬＤＬＲを示す。ＬＤＬ受容体レベルをウェスタンブロッティング（Ａ）により評価した。ＧＡＰＤＨのレベルを対照として示す。棒グラフ（Ｂ）は、デンシトメトリー（ｎ＝３）によって定量化されたＬＤＬＲの平均値と、標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。結果は、スチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５−１】ヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）と２４時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、ウェスタンブロッティングによる評価でＬＤＬＲレベルの上昇を示す（Ａ）。ＧＡＰＤＨのレベルを対照として示す。棒グラフ（Ｂ）は、デンシトメトリー（ｎ＝４）によって定量化されたＬＤＬＲの、平均値と標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ヘパリンとのインキュベーションはまた、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、培地中のＰＣＳＫ９のレベルも上昇させる（Ｃ）。棒グラフは平均ＰＣＳＫ９濃度とＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。結果は、スチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５−２】（Ｄ）＝非透過性ＨｅｐＧ２細胞のＰＬＡ分析は、ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９との共局在が、ヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）と細胞とのインキュベーションで顕著に減少することを示した。
【図６】（Ａ）無細胞ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合アッセイ（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＰＣＳＫ９（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７１２０７）のＬＤＬＲ結合領域を標的とする対照阻害剤、抗ＰＣＳＫ９抗体（５ｎＭ）とは対照的に、ヘパリン（５及び５０Ｕ／ｍｌ）がＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの直接的な相互作用を阻害しないことを見出した。結合アッセイにて、固定化されたＬＤＬＲに結合したビオチン化ＰＣＳＫ９からの化学発光シグナルを定量化し、阻害剤のないサンプルからのシグナルに対して正規化された結果をここに示す。棒グラフは、標準偏差エラーバー付きの平均値（ｎ＝３）を示す。結果は、スチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。Ｙ軸：阻害剤なしの場合との比（％）。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）で測定した、培地中のＰＣＳＫ９に対するヘパリンの用量依存的効果。Ｙ軸：培地中のＰＣＳＫ９（％）。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲによる細胞溶解物中のｍＲＮＡレベルの定量分析。
【図７】ＨｅｐＧ２細胞を、ヘパリン類似体Ａｒｉｘｔｒａ（フォンダパリヌクス、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａ）の濃度（０〜２５０μｇ／ｍｌ）を増加させながら２４時間インキュベートすると、ＬＤＬＲレベルが上昇した。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを負荷対照として示す。
【図８−１】（Ａ）フラミン（１００Ｕ／ｍｌ）及びＩｎｎｏｈｅｐ（１００Ｕ／ｍｌ）と１８時間インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲのウェスタンブロットであり、この２種の低分子量ヘパリン治療用製剤が、ヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）の効果に匹敵するほどＬＤＬＲの細胞内レベルを上昇させることができることを示す。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを負荷対照として示す。（Ｂ）１０μｇのＰＣＳＫ９単独または５０Ｕのヘパリンとの併用での静脈内投与から１時間経過した、マウスの肝臓におけるＬＤＬＲレベルを示すウェスタンブロット。５０μｇの膜製剤を充填した。対照として、ＰＣＳＫ９誘導性分解の標的ではないことが以前に示されたＰＣＳＫ９受容体であるソルチリンについてのウェスタンブロットを示す。
【図８−２】（Ｃ）バンドＢ）の定量化をデンシトメトリーにより定量化した。またドットプロットは、各サンプルの個々のレベルを、ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を注射した対照とのパーセント比の平均値及びＳＥＭで示す。ＰＣＳＫ９及びヘパリンを同時注射したマウスは、ＬＤＬＲレベルの有意な上昇を示している（２４．０±４．０４％に対して６０．３±１２．３％のＬＤＬＲ、ｎ＝７マウス／群、ｐ＝０．０１５７、両側スチューデントｔ検定）。
【図８−３】（Ｄ）ヒトＨＳＰＧ結合ドメインを有するラットＰＣＳＫ９をコードするＤＮＡで免疫した３匹のラットからの血清（１μｌ）による天然ヒト３５Ｓ標識ＰＣＳＫ９の免疫沈降を示すオートラジオグラフィー（１６時間露出）。陰性対照として、この動物からの免疫前血清を使用した。（Ｅ）免疫前ＩｇＧまたは免疫ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲを示すウェスタンブロット。免疫前対照と比較して、免疫ＩｇＧとのインキュベート後に、細胞内ＬＤＬＲレベルの顕著な上昇が見られた。
【図８−４】（Ｆ）Ａｌｄｅｖｒｏｎによって実施されたＥＬＩＳＡスクリーニングで選択した２４の個々のｍＡｂ（５００μｌの馴化ハイブリドーマ培地）によるヒト３５Ｓ−ＰＣＳＫ９の免疫沈降を示すオートラジオグラフィー（１６時間露出）。対照としてｍＡｂ＃２Ａ８を使用したが、これは、ＥＬＩＳＡスクリーニング（＊）（Ａｌｄｅｖｒｏｎによって実施されたＥＬＩＳＡ試験スクリーニングでは、ｍＡｂ＃２Ａ８を非特異的に試験した）、及び未馴化ハイブリドーマ培地（＊＊）でＰＣＳＫ９免疫反応性を何も示さなかった。
【図８−５】（Ｇ）ウェスタンブロットにより分析した、ｍＡｂ（１：１０希釈の馴化ハイブリドーマ培地）とインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲレベルを示す棒グラフ（２〜４回の実験の平均とＳＥＭ）。１２の個々のｍＡｂクローンは、ＬＤＬＲを約２倍上昇させる。（Ｈ）全てがＰＣＳＫ９阻害効果を示す１２の個々のｍＡｂ（５００μｌの馴化ハイブリドーマ培地）による、ヒト３５Ｓ突然変異体ＰＣＳＫ９（アラニン残基に変異したＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９を有する）の免疫沈降を示すオートラジオグラフィー（１６時間露出）。対照として、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＡＦ３８８８）を使用した。ｍＡｂのうち３つは、ＰＣＳＫ９突然変異体を沈降させなかったが、これはそれらがＨＳＰＧ結合ドメインを特異的に認識することを示す。
【図８−６】（Ｉ）ｍＡｂの１Ｇ８、５Ｅ１１及び１０Ｅ５による、３５Ｓ−ＰＣＳＫ９のＷＴならびに変異体Ｒ９６Ｒ９７、Ｒ１０４Ｒ１０４、Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｈ１３９、及びＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９の免疫沈降を示すオートラジオグラフィーであり、各ｍＡｂがＨＳＰＧ結合ドメイン内のエピトープを認識することを示す。対照として、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＡＦ３８８８（ｐＡｂ）を使用した。
【図９−１】（Ａ）ヘパリン模倣体硫酸デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）と２４時間インキュベート後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲのウェスタンブロットであり、この化合物が、ＬＤＬＲの細胞内レベルを強力に上昇させることができることを示す。比較としてヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）を示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照として示す。（Ｂ）硫酸デキストラン（０〜２００μｇ／ｍｌ）とインキュベート後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲの濃度依存的増加を示す、ＬＤＬＲレベルのデンシトメトリーによる定量化。棒グラフは、未処理細胞比のＬＤＬＲ平均（％）とＳＥＭエラーバーを示す。
【図９−２】（Ｃ）ＰＣＳＫ９及び硫酸デキストランのマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ：Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）結合曲線。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：硫酸デキストランまたはデキストランの濃度、ＫＤ＝１８０μＭ。円:硫酸デキストラン。正方形：デキストラン。
【図９−３】（Ｄ）硫酸ペントサン（０〜２００μｇ／ｍｌ）と２４時間インキュベート後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲのウェスタンブロット、及び（Ｅ）デンシトメトリーによる定量化であり、５０〜２００μｇ／ｍｌの硫酸ペントサンで処理した細胞からの細胞溶解物が、ＬＤＬＲを４倍増加させることを示す。棒グラフは、未処理細胞比のＬＤＬＲ平均（％）とＳＥＭエラーバーを示す。
【図９−４】（Ｆ）ＰＣＳＫ９及び硫酸ペントサンのＭＳＴ結合曲線。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：硫酸ペントサン濃度。円：硫酸ペントサン、ＫＤ＝３８１μＭ。正方形：対照。
【図９−５】（Ｇ）スラミン（０〜２００μｇ／ｍｌ）と２４時間インキュベート後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲの定量化。棒グラフは、未処理細胞比のＬＤＬＲ平均（％）とＳＥＭエラーバーを示す。スラミンとインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲの代表的なウェスタンブロットを（Ａ）に示す。（Ｈ）：ＰＣＳＫ９及びスラミンのＭＳＴ結合曲線。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：スラミン濃度。円：スラミン、ＫＤ＝１９０μＭ。正方形：対照。
【図９−６】（Ｉ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＳ−ｄＣ−３６（０〜５．０μＭ）と２４時間インキュベート後のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲのウェスタンブロット、及び（Ｊ）デンシトメトリーによる定量化であり、細胞受容体レベルの濃度依存的な上昇を示す。棒グラフは、未処理細胞比のＬＤＬＲ平均（％）とＳＥＭエラーバーを示す。結果は、スチューデントｔ検定を用いて評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図９−７】（Ｋ）ＰＣＳＫ９及びＳ−ｄＣ−３６のＭＳＴ結合曲線。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：Ｓ−ｄＣ−３６の濃度。円：Ｓ−ｄＣ−３６、ＫＤ＝４．８μＭ。正方形：対照。
【図１０−１】ＰＣＳＫ９（１０μｇ）注射前のヘパリナーゼＩの注入は、ＰＣＳＫ９誘導性のＬＤＬＲの分解を完全に阻害する。代表的なサンプルのウェスタンブロット（Ａ）及びＬＤＬＲを定量化した棒グラフ（Ｂ）を示す。ウェスタンブロットでは、ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用している（ｅ：空のレーン）。対照はｎ＝７、ＰＣＳＫ９はｎ＝６、ヘパリナーゼはｎ＝５、ヘパリナーゼ／ＰＣＳＫ９はｎ＝５。
【図１０−２】ＰＣＳＫ９のみを注射したマウスと比較して、ＰＣＳＫ９（１０μｇ）とヘパリン（５０Ｕ）またはスラミン（３００μｇ）を同時注射したマウスは、ＬＤＬＲレベルの有意な上昇を示している（Ｃ）。対照はｎ＝１５、ＰＣＳＫ９はｎ＝１０、ＰＣＳＫ９／ヘパリンはｎ＝７、ＰＣＳＫ９／スラミンはｎ＝３。（Ｄ）マウスＰＣＳＫ９特異的ＥＬＩＳＡによって評価した、ヘパリン（５０ｕ）の静脈注射後のＰＣＳＫ９の血漿レベル。
【図１１】１０μｇのＰＣＳＫ９単独または５０μｇのｍＡｂとの併用での静脈内投与から１時間経過した、マウスの肝臓におけるＬＤＬＲレベル。
【図１２】蛍光色素Ｂｏｄｉｐｙで標識した１０ｎｇ／ｍｌのＬＤＬ粒子と４時間インキュベートした後、スラミン（２００μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞における相対蛍光シグナルを示す棒グラフ。スラミンによるＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬの取り込みを２倍増加させる。
【図１３】（Ａ）及び（Ｂ）１００μＭのスラミンまたはＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤メバスタチン及びシンバスタチンと２４時間及び４８時間インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞において、ウェスタンブロットにより評価したＬＤＬＲレベルを示す棒グラフ。スラミンとインキュベートした細胞は、スタチンとインキュベートした細胞よりも高レベルのＬＤＬＲを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
ヘパリン類似体：本明細書で使用される場合、本用語は、ヘパリンと構造的に類似する化合物を指す。
【００２３】
ヘパリン模倣体：本明細書で本用語は、ヘパリンのように機能的に挙動する、すなわち模倣する化合物を指す。したがって、本用語は、構造的に類似している化合物双方を含むが、本開示の文脈においてヘパリンと構造は異なるが、機能が同じである化合物もまた含む。
【００２４】
ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベル：所与の個人に最適なＬＤＬ−Ｃレベルは、それぞれの潜在的な心臓疾患リスクに応じて異なる。健常人の場合、理想とされるＬＤＬ−Ｃレベルは、２．６〜３．３ｍｍｏｌ／Ｌ（すなわち１００〜１２９ｍｇ／ｄＬ）未満が望ましい。３．４〜４．１ｍｍｏｌ／Ｌ、すなわち１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬは高レベルの境界域であり、４．１〜４．９ｍｍｏｌ／Ｌ、すなわち１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬは高レベルであり、４．９ｍｍｏｌ／Ｌすなわち１８９ｍｇ／ｄＬ超は極めて高レベルである。心臓疾患リスクのある個人の場合、２．６ｍｍｏｌ／Ｌすなわち１００ｍｇ／ｄＬ未満のレベルが推奨され、心臓疾患のリスクが非常に高い個人の場合、１．８ｍｍｏｌ／Ｌすなわち７０ｍｇ／ｄＬ未満のレベルが望ましい。
【００２５】
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）レベル：細胞内でのＬＤＬＲの合成は、細胞内の遊離コレステロールのレベルによって調節され、コレステロールが細胞の必要量に対して過剰である場合、ＬＤＬＲの転写は阻害されることになる。ＬＤＬＲレベルは、限定するものではないが、ウェスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、及びフローサイトメトリーなどの当技術分野で既知の方法により推定することができる。
【００２６】
低分子量ヘパリン：天然ヘパリンは種々の長さ、すなわち種々の分子量の分子鎖から構成される。例えば、多分散系製薬等級のヘパリンは、５０００〜４０，０００超ダルトンの様々な分子量の鎖で構成されている。低分子量ヘパリンは、対照的に短鎖の多糖類のみで構成される。低分子量ヘパリンは、８０００Ｄａ未満の平均分子量を有し、全鎖の少なくとも６０％が８０００Ｄａ未満の分子量を有しているヘパリン塩であると定義される。低分子量ヘパリンは、高分子ヘパリンの分画または脱重合などの当業者に既知の様々な方法によって得られる。
【００２７】
リポタンパク質代謝障害：本用語は、例として高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群、黄色腫、高血圧症、狭心症、肥満、糖尿病、及び血管炎症を含む、脂質恒常性の障害及びそれに関連する障害を指す。
【００２８】
ＰＣＳＫ９のレベル：一般集団におけるＰＣＳＫ９の血漿レベルは３０〜３０００ｎｇ／ｍＬに分布し、中央値は一般的に男性よりも女性の方が高い。ＰＣＳＫ９のレベルはＬＤＬ−Ｃのレベルと相関する。
【００２９】
ホスホロチオエート（またはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドすなわちＳ−オリゴ）は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換されたＤＮＡ変異体である。ヌクレオチド間結合の硫化は様々なヌクレアーゼの作用を大幅に低減し、脂質二重層を横断する可能性を増加させると考えられている。
【００３０】
本発明は特許請求の範囲に記載の通りである。
【００３１】
本発明は、第１の態様においてＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる化合物に関する。本開示を通じて、ＨＳＰＧのＰＣＳＫ９変異体への結合を阻害することができる化合物も本発明の範囲内であると理解するものとする。ＰＣＳＫ９変異体とは、配列番号１と本質的に同じ配列を有するポリペプチド、例えば配列番号１のいくつかの残基の保存的置換を有する変異体であると理解される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、前記化合物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの少なくとも１個、すなわちＰＣＳＫ９（配列番号１）の、例えばアミノ酸残基７８〜９２のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９３〜９７のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９８〜１０３のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７のうちの少なくとも１個を含む、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。
【００３３】
本明細書では、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの少なくとも１個、すなわちＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの、例えば少なくとも２個、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも３０個、例えば少なくとも３５個、例えば少なくとも４０個、例えば少なくとも４５個、例えば少なくとも５０個、例えば少なくとも５５個、例えば少なくとも６０個、例えば少なくとも６５個、例えば少なくとも７０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも８０個、例えば少なくとも８５個、例えば少なくとも全てを含むＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する化合物を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜９２のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９３〜９７のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９８〜１０３のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７のうちの少なくとも１個を含む領域を特異的に認識して結合する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜９２、例えばアミノ酸残基９３〜９７、例えばアミノ酸残基９８〜１０３、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７のうちの少なくとも１つを含む領域を特異的に認識して結合する。
【００３６】
したがって、一実施形態では、化合物は、アミノ酸残基７８〜１６７を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基７８〜９５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基９６〜１００を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１０１〜１０５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１０６〜１１０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１１１〜１１５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１１６〜１２０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１２１〜１２５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１２６〜１３０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１３１〜１３５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１３６〜１４０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１４１〜１４５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１４６〜１５０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１５１〜１５５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１５６〜１６０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。別の実施形態では、化合物は、アミノ酸残基１６１〜１６７を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識して結合する。
【００３７】
したがって、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５、及びＲ１６７からなる群から選択される１個以上のアミノ酸、すなわちＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５、及びＲ１６７からなる群から選択される、例えば１個のアミノ酸、例えば２個のアミノ酸、例えば３個のアミノ酸、例えば４個のアミノ酸、例えば５個のアミノ酸、例えば６個のアミノ酸、例えば７個のアミノ酸、例えば８個のアミノ酸、例えば全てのアミノ酸に結合する化合物が提供される。
【００３８】
したがって、一実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９６に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９７に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０４に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＫ１３６に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６７に結合する。
【００３９】
一実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９６及びＲ９７に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０４及びＲ１０５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＫ１３６及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６５及びＲ１６７に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、及びＨ１３９に結合する。
【００４０】
抗体
本明細書で定義される化合物が、抗体またはその機能的等価物である化合物も開示する。
【００４１】
本発明の抗体は、本明細書に定義される抗原を認識して結合できるいずれのポリペプチドまたはタンパク質であってもよい。前記抗体は前記抗原と特異的に結合できることが好ましい。用語「特異的に結合する」とは、非特異的抗原（例えばＢＳＡ）に対するよりも、少なくとも１０倍高い親和性で抗原に結合することを意味する。
【００４２】
この抗体は、天然に存在する抗体またはその機能的等価物であってもよい。天然に存在する抗体は、抗原を認識して結合する能力を有するヘテロ四量体の糖タンパク質である。これには、ジスルフィド結合によって相互に結合した、同一な２本の重（Ｈ）鎖と同一な２本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記）と重鎖定常領域（本明細書でＣＨと略記）を含むか、好ましくはそれからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記）と軽鎖定常領域（本明細書でＣＬと略記）を含むか、好ましくはそれからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域と、その領域に割り込むフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域に細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含むか、好ましくはそれからなる。
【００４３】
天然に存在する抗体はまた、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ）が産生する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）であってもよい。ＨＣＡｂは、軽鎖及び第１の定常ドメインが欠損した、重鎖のみのホモ二量体である（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。他の天然に存在する抗体は、会合する軽鎖がない２本の重鎖の二量体として存在する新規テンジクザメ抗原受容体（Ｎｅｗ  ｏｒ  Ｎｕｒｓｅ  Ｓｈａｒｋ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＮＡＲ）タンパク質の場合と同様に軽鎖を欠損している場合もある。各鎖は１つの可変（Ｖ）ドメインと５つの定常ドメインから構成される。ＮＡＲタンパク質は、抗体分子よりもはるかに軽量である単一免疫グロブリン可変様ドメインを構成する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．）。
【００４４】
本発明による天然に存在する抗体は、１つのヘテロ四量体からなるものでも、いくつかの同一のヘテロ四量体を含むものであってもよい。したがって、本発明による天然に存在する抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択することができる。免疫グロブリンのサブユニット構造及びこれらの異なるクラスで構成される３次元構造は周知である。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４である。
【００４５】
この抗体は、天然に存在するモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態では、抗体は、天然に存在するポリクローナル抗体などのポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体については、本明細書中、以下で更に詳述する。
【００４６】
天然に存在する抗体は特定の種の抗体であってもよく、例えば抗体はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ラクダ、またはヒトの抗体であり得る。抗体は、マウスまたはラットのモノクローナル抗体であってもよい。ただし、抗体はまた、いくつかの種由来の抗体同士のハイブリッドであってもよく、例えば、抗体はヒト化抗体などのキメラ抗体であってもよい。ヒト抗体及びヒト化抗体については、本明細書中、以下で更に詳述する。
【００４７】
抗体の抗原結合断片
抗体の抗原結合断片は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片である。したがって、いくつかの実施形態では、抗体の機能的等価物には抗体の結合断片が含まれる。好ましくは、前記断片は、天然に存在する抗体の抗原結合断片である。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実現され得ることが示されている。天然に存在する抗体の抗原結合断片の例としては、例えば、（Ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）１本のアームの抗体のＶＬ及びＶＨからなるＦｖ断片；または（Ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）が挙げられる。Ｆａｂ断片は、パパイン消化によって調製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシン処理により調製することができる。
【００４８】
抗体の抗原結合断片は、好ましくは、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはより好ましくは場合により合成リンカーによって結合され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせを含む。抗体の抗原結合断片の更なる例は、（ｉ）免疫グロブリンのヒンジ領域のポリペプチドに融合された抗原結合部位、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、ドメイン結合免疫グロブリン融合タンパク質である。抗原結合部位は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。このようなドメイン結合免疫グロブリン融合タンパク質の詳細は、ＵＳ２００３／０１１８５９２及びＵＳ２００３／０１３３９３９に開示されている。これらの抗体断片は当業者に既知である従来の技術を用いて得られ、無傷抗体と同様の方法で断片の有用性についてスクリーニングされる。
【００４９】
抗体の抗原結合断片はまた、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であるダイアボディであってもよい。ダイアボディは、好ましくは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるリンカーを使用することにより、各ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３に詳細に記載されている。
【００５０】
異種特異的抗体
本明細書に開示される抗体はまた、二重特異性抗体のような「異種特異的抗体」であってもよい。二重特異性抗体は、特異性の異なる２つの異なった抗原結合部位を含むタンパク質またはポリペプチドである。例えば、二重特異性抗体は、（ａ）第１の抗原内の第１のエピトープと、（ｂ）第２の抗原内の第２のエピトープとを認識して結合することができるか、または同一抗原内の２つの異なったエピトープを認識して結合することができる。用語「異種特異的抗体」は、特異性の異なる３つ以上の異なった抗原結合部位を有する任意のタンパク質またはポリペプチドを含むことを意図する。例えば、異種特異的抗体は、（ａ）第１の抗原の第１のエピトープと、（ｂ）第２の抗原の第２のエピトープと、（ｃ）第３の抗原の第３のエピトープとを認識して結合することができるか、または（ａ）第１の抗原の第１のエピトープと、（ｂ）第２の抗原の第２及び第３のエピトープとを認識して結合することができるか、または同一抗原の異なったエピトープを認識して結合することができる。したがって、本発明は、限定するものではないが、同一または異なる抗原上の異なったエピトープを対象とする、二重特異性、三重特異性、四重特異性、及び他の多重特異性抗体を含む。
【００５１】
二重特異性抗体は、例えばモノクローナル抗体を出発して、例えば、化学的架橋によって、または組換え技術を用いて、２種のハイブリドーマを融合し、その特異性を組み合わせることにより調製することができる。例えば、２つの異なった抗体（１及び２）のＶＨ及びＶＬを組換え手段によって結合し、「クロスオーバー」鎖ＶＨ１−ＶＬ２及びＶＨ２−ＶＬ１を形成した後、二量化し、両方の抗原結合部位を再構築する（ＷＯ９４／０９１３１を参照）。二重特異性抗体はまた、例えばＷＯ９４／１３８０６に記載される特異性の異なる２つの一本鎖抗体を遺伝子結合することにより調製してもよい。また、１つの抗体の２つの抗原結合断片を結合してもよい。
【００５２】
ヒト抗体及びヒト化抗体
ヒト治療を目的としたヒト以外の抗体の使用は必ずしも望ましくない。したがって、本発明による抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。
【００５３】
本明細書から理解されるように、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列を使用する系から得られる抗体である。ヒト抗体は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマのトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）から単離された抗体であってもよい。ヒト抗体はまた、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離してもよい。ヒト抗体はまた、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離してもよい。
【００５４】
ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発を施すことができるため、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、またそれと関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然で存在しなくてもよい配列である。
【００５５】
ヒト抗体は、野生型ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列中、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。前記トランスジェニック動物またはトランス染色体動物は、再構成されていないヒト重鎖（μ及び／またはγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含んでいてもよい。更に、動物は、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座を不活性化する１つ以上の突然変異を含んでいてもよい。このような動物の例は、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）及びＷＯ０２／４３４７８に記載されている。
【００５６】
本明細書に開示される抗体は、キメラ抗体、すなわち異なった種に由来する領域を含む抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば、ある動物種からの可変領域と、別の動物種からの定常領域とを含み得る。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域と、ヒトである定常領域を有する抗体であり得る。このような抗体をヒト化抗体と称する場合もある。したがって、抗体はまた、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列から得た配列によって部分的にコードされ、かつ他の配列から得た配列によって部分的にコードされるヒト化抗体であってもよい。前記他の配列は、好ましくは、他の種、より好ましくは他の哺乳動物種からの生殖細胞系列の免疫グロブリンである。特に、ヒト化抗体は、抗原結合部位がヒト以外の種、好ましくはマウスまたはラットなどのヒト以外の哺乳動物からの免疫グロブリンに由来するが、分子の免疫グロブリン由来部分の残りの一部または全部がヒト免疫グロブリンに由来する抗体であり得る。前記ヒト以外の種からの抗原結合部位は、例えば、完全なＶＬもしくはＶＨまたは両方からなるか、あるいはＶＬもしくはＶＨまたは両方の対応するヒトフレームワーク領域に１つ以上のＣＤＲがグラフトされたものであってもよい。したがって、ヒト化抗体において、ＣＤＲはマウスまたはラットモノクローナル抗体由来であってよく、抗体の他の領域はヒト起源のものである。
【００５７】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、抗体分子が類似していることから、同一エピトープを認識して結合する抗体の集団を指す。モノクローナル抗体は一般に宿主細胞株によって、多くはハイブリドーマ細胞株によって産生される。モノクローナル抗体及び抗体合成ハイブリドーマ細胞の作製方法は当業者に周知である。抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗体産生Ｂリンパ球と不死化されたＢリンパ球細胞株との融合により調製してもよい。本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術によって、またはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載のように調製することができる。前記モノクローナル抗体は、好適な哺乳動物種であればどれに由来してもよいが、多くの場合、モノクローナル抗体は、マウスまたはラットモノクローナル抗体などの齧歯類抗体である。
【００５８】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、特異的な所定の抗原を認識して結合する異なった抗体分子の混合物を含む抗体の集団を指す。したがって、ポリクローナル抗体は、前記抗原内の異なったエピトープを認識することができる。一般に、ポリクローナル抗体は、以前に抗原で免疫された動物、好ましくは哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載された方法であれば、いずれによっても調製することができる。
【００５９】
組換え抗体
抗体はまた、組換え抗体、すなわち組換え手段により調製、発現、生成、または単離された抗体であってもよい。本発明による組換え抗体は、例えば、合成ライブラリを使用して、またはファージディスプレイによって産出してもよい。いくつかの実施形態では、抗体は組換え細胞内で産生される。組換え細胞は、細菌及び真核微生物を含む群から選択される微生物であってもよい。組換え抗体は、細菌、酵母または多細胞生物由来の細胞培養液などの微生物宿主生物中で産生し得る。多くの場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが宿主生物として有用である。多くの場合、組換え抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片のような少なくとも１つの抗原結合部位を含む天然に存在する抗体の断片であるか、または組換え抗体がｓｃＦＶである。したがって、いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片のような少なくとも１つの抗原結合部位を含む天然に存在する抗体の断片である。他の実施形態では、組換え抗体はｓｃＦＶである。
【００６０】
組換え抗体は、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイなど、様々なシステムを用いて同定することができる。ファージディスプレイの起点は通常、一本鎖抗体またはファージによって発現される天然に存在する抗体の断片などの抗体のライブラリである。ファージディスプレイでの使用に適したファージは、例えばＭ１３、ｆｄ繊維状ファージ、Ｔ４、Ｔ７、またはλファージなど、多種多様である。ファージミドを使用することもできるが、それには通常、ヘルパーファージの使用を必要とする。典型的には、ライブラリは１０７〜１０１５の範囲、例えば１０９〜１０１１の異なるファージを含む。抗体は、ナイーブまたは免疫源のいずれであってもよい。ライブラリの抗体は、確実に表面に提示されるようにファージコートタンパク質（例えば、ｇ３ｐまたはｇ８ｐ）と融合させてもよい。したがって、抗体（断片）は、ファージコートタンパク質をコードする核酸の上流または下流にクローニングされ、好適なプロモーターに操作可能に連結された核酸配列によってコードされてもよい。
【００６１】
例えば抗体可変ドメインに関する、抗体をコードするゲノム情報を、組換えＤＮＡ技術を用いて非免疫または免疫したドナーのＢ細胞から得て、ＶＨ及びＶＬ遺伝子セグメントを増幅し、適切なファージにクローニングすることができる。合成ライブラリは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子セグメントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成によって、及び／またはＶＨ及びＶＬ遺伝子セグメントへの人工配列の導入によって調製することができる。例えば合成ライブラリは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のフレームワークを使用するが、ランダムなオリゴヌクレオチドによってコードされ得る、その人工的な相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入して調製することができる。ライブラリはまた、後に宿主細胞中で組み合わされる、異なったライブラリであってもよい。したがって、１つのライブラリが、重鎖のＦｖ断片もしくはＦａｂ断片またはＶＨなどの重鎖配列と、軽鎖のＦｖ断片またはＦａｂ断片ＶＬなどの他の軽鎖配列を含んでもよい。通常、選別は例えば２〜５回、２〜３回などの複数ラウンドを実施する。この操作は、抗原を固定化して、ファージと抗原を接触させ、結合したファージを単離することにより行うことができる。抗原は、プラスチック表面、ビーズ（磁気ビーズなど）、カラム中の樹脂などの任意の好適な固体表面上に固定化するか、または細胞表面に発現させることができる。
【００６２】
一本鎖抗体
天然に存在する抗体はヘテロ四量体である。しかし、本明細書で定義される抗体はまた、１つ以上の抗原結合部位を含む単一のポリペプチドであってもよい。このような抗体は「一本鎖抗体」とも称される。したがって、抗体はまた一本鎖抗体であってもよい。一本鎖抗体は、Ｆｖ断片、ＶＬ、及びＶＨのうちの２つのドメインを含み得る。このような一本鎖抗体を得るために、ＶＬ及びＶＨをコードする遺伝子を組換え法を用いて結合することができる。通常、一本鎖抗体は、合成リンカー、例えば５〜１００個、例えば５〜５０個、例えば２５個のアミノ酸からなるリンカーによって分離されている。前記リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と結合することもできる。リンカーによって、ＶＬとＶＨ領域とが対合して一価抗体様の分子を形成している単一のタンパク質鎖（別称、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を産生することができる。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと。
【００６３】
一本鎖抗体はまた、二価抗体、例えば、リンカーによって２つずつ結合し得る、２つのＶＨと２つのＶＬ領域を含む単一のペプチド鎖であってもよい。一本鎖抗体はまた、多価抗体、例えば、リンカーによって２つずつ結合し得る、複数のＶＨと複数のＶＬ領域を含む単一のペプチド鎖であってもよい。ＶＨ及びＶＬ領域は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ単一特異的抗体または異種特異的抗体を形成し得る。前記ＶＨ及び前記ＶＬは、天然に存在するＶＨまたはＶＬであっても、少なくとも１つの抗原結合部位を含む合成のＶＨ及びＶＬであってもよい。好ましくは、前記ＶＨ及び前記ＶＬは、天然に存在するＶＨ及びＶＬである。
【００６４】
本明細書に開示される化合物は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、抗体の産生に適している当技術分野で既知の任意の生物、例えば、マウス、ヒツジ、ウサギなどの生物、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞株などの細胞培養液を起源とすることができる。抗体をヒト化してもよい。好ましくは、抗体はマウスモノクローナル抗体である。
【００６５】
抗体の結合断片を含む機能的等価物も本発明の範囲内である。断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＳｃＦｖ断片などのＦｖ断片からなる群から選択することができる。機能的等価物はまた一本鎖抗体であってもよい。他の実施形態は、例えば、上記で詳述したＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインに結合する抗体の結合断片を含むか、またはそれからなる機能的等価物に関する。いくつかの実施形態では、機能的等価物は更に、例えば抗体断片の半減期、安定性、バイオアベイラビリティ、溶解性また他の関連する特性を高めることができる遺伝子組換えドメインを含み得る。例えば、遺伝子組換えドメイン内スルフィド結合は抗体を安定化できることが当技術分野で知られている（Ｗｏｚｎｉａｋ−Ｋｎｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。安定化の他の方法としては、例えば、Ｆｖ断片の安定化をもたらすＶＨドメインとＶＬドメインとの間のペプドリンカーの使用が挙げられる（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００６６】
機能的等価物はまた、抗体模倣体、すなわち抗体を模倣する小分子であってもよい。限定するものではないが、抗体模倣体は、抗体と構造的に関連しないが抗原に特異的に結合できる核酸を含めた有機化合物である。抗体模倣体は通常、人工ペプチドまたはタンパク質であり、一般に約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する。一部のタイプは、抗体様βシート構造を有する。抗体模倣体は、抗体と比べて良好な溶解性、組織透過性、熱、及び酵素に対する安定性を示す場合があるほか、比較的製造コストが低い。
【００６７】
このように、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの少なくとも１個、すなわちＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜１６７のうちの、例えば少なくとも２個、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも３０個、例えば少なくとも３５個、例えば少なくとも４０個、例えば少なくとも４５個、例えば少なくとも５０個、例えば少なくとも５５個、例えば少なくとも６０個、例えば少なくとも６５個、例えば少なくとも７０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも８０個、例えば少なくとも８５個、例えば全てを含むＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体またはその機能的等価物を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜９２のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９３〜９７のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９８〜１０３のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７のうちの少なくとも１個を含むエピトープを特異的に認識して結合する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のアミノ酸残基７８〜９２のうちの少なくとも１個、例えばアミノ酸残基９３〜９７、例えばアミノ酸残基９８〜１０３、例えばアミノ酸残基１０４〜１０５、例えばアミノ酸残基１０６〜１３５、例えばアミノ酸残基１３６〜１３９、例えばアミノ酸残基１４０〜１６４、例えばアミノ酸残基１６５〜１６７を含むエピトープを特異的に認識して結合する。
【００７０】
したがって、一実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基７８〜１６７を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基７８〜９５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基９６〜１００を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１０１〜１０５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１０６〜１１０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１１１〜１１５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１１６〜１２０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１２１〜１２５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１２６〜１３０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１３１〜１３５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１３６〜１４０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１４１〜１４５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１４６〜１５０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１５１〜１５５を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１５６〜１６０を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物は、アミノ酸残基１６１〜１６７を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する。
【００７１】
したがって、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５、及びＲ１６７からなる群から選択される１個以上のアミノ酸、すなわちＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５、及びＲ１６７からなる群から選択される、例えば１個のアミノ酸、例えば２個のアミノ酸、例えば３個のアミノ酸、例えば４個のアミノ酸、例えば５個のアミノ酸、例えば６個のアミノ酸、例えば７個のアミノ酸、例えば８個のアミノ酸、例えば全てのアミノ酸に結合する抗体またはその機能的等価物が提供される。
【００７２】
したがって、一実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９３に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９６に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９７に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１０４に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１０５に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＫ１３６に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＨ１３９に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１６５に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１６７に結合する。
【００７３】
一実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９６及びＲ９７に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１０４及びＲ１０５に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＫ１３６及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９３及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、及びＨ１３９に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ１６５及びＲ１６７に結合する。別の実施形態では、抗体またはその機能的等価物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、及びＨ１３９に結合する。
【００７４】
特定の実施形態では、この抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はマウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的等価物はヒト化されている。抗体は一本鎖抗体であってもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。一実施形態では、二重特異性抗体は、上記に詳述したようなＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位を認識して結合することができるが、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位を認識して結合することもでき、その結果、そのような抗体のＰＣＳＫ９への結合は、ＰＣＳＫ９へのＨＳＰＧ及びＬＤＬＲの結合を阻害する。理論に束縛されるものではないが、ＬＤＬＲ結合部位は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）の残基１９４（Ａ１９４）及び残基３６７〜３８１、特にＰ３７９を含むドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、化合物は、上記のようにＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に結合することができ、ＬＤＬＲ結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することができる二重特異性抗体であり、ＬＤＬＲ結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号１の残基１９４であるか、または配列番号１の残基３６７〜３８１を含むドメイン内に含まれる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合ドメインに結合することができない。
【００７７】
したがって、以下を含む抗体またはその抗原結合断片も開示する：
（ｉ）配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び
（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型。
【００７８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの１つと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）、またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）、またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）、及びＣＤＲ３（配列番号１５）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの２つと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）、及びＣＤＲ３（配列番号１５）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）の全てと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）またはＣＤＲ３（配列番号１５）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）、及びＣＤＲ３（配列番号１５）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７によって定義される重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び／または配列番号５によって定義される軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む。
【００９１】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域またはそのヒト化型と、
（ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１によって定義される３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型と、を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの１つと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの１つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）のうちの２つと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）のうちの２つと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）、及びＣＤＲ３（配列番号２１）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）の全てと、軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）またはＣＤＲ３（配列番号２１）のうちの少なくとも２つを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域またはそのヒト化型は、ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、及びＣＤＲ３（配列番号１８）の全てと、ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）、及びＣＤＲ３（配列番号２１）の全てを含む軽鎖可変領域またはそのヒト化型とを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９によって定義される重鎖可変領域またはそのヒト化型、及び／または配列番号３によって定義される軽鎖可変領域またはそのヒト化型を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的等価物は抗体変異体である。このような変異体には、限定するものではないが、半減期、溶解性、及び／またはバイオアベイラビリティを高めるために修飾された抗体が含まれる。機能的等価物は、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位に結合することができる抗体の断片を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片からなる群から選択される。このような変異体は、遺伝子組換えドメイン内ジスルフィド結合を含み得る。
【０１０６】
抗体またはその機能的等価物は、ドメインシャッフリングによって得てもよい。ドメインシャッフリングは、従来的なクローニングまたはリガーゼ非依存的方法、例えばウラシル特異的切断試薬（ＵＳＥＲ）によるクローニング及び融合（Ｎｏｕｒ−Ｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）などの当技術分野において既知の方法により行うことができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的等価物の１つ以上のＦｖ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にペプチドリンカーを含む。
【０１０８】
ＬＤＬＲ及びＬＤＬ−Ｃのレベル
本明細書に開示される化合物のＰＣＳＫ９への結合は、前記化合物の不在下での結合と比較して、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を低下させる。これは更に、前記化合物の不在下でのレベルと比較して、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞の、例えば表面でのＬＤＬＲレベルを上昇させる。いくつかの実施形態では、化合物は抗体であり、それがＰＣＳＫ９に結合することで、前記抗体の不在下での結合と比較して、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を低下させる。これは更に、前記抗体の不在下でのレベルと比較して、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞のＬＤＬＲレベルを上昇させる。
【０１０９】
したがって、いくつかの実施形態では、化合物のＰＣＳＫ９への結合は、前記化合物の不在下でのレベルと比較して、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞のＬＤＬＲレベルを上昇させる。特定の実施形態では、化合物は上記で定義された抗体であり、この抗体のＰＣＳＫ９への結合は、前記抗体の不在下でのレベルと比較して、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞のＬＤＬＲレベルを上昇させる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、化合物のＰＣＳＫ９への結合は、前記化合物の不在下での分解と比較して、ＬＤＬＲのリソソーム分解を減少させる。特定の実施形態では、化合物は上記で定義された抗体であり、この抗体のＰＣＳＫ９への結合は、前記抗体の不在下での分解と比較して、ＬＤＬＲのリソソーム分解を減少させる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、化合物のＰＣＳＫ９への結合は、前記化合物の不在下でのレベルと比較して、ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルを低下させる。用語「血漿ＬＤＬ−Ｃレベル」は、血漿中のＬＤＬ−Ｃのレベル、すなわちＬＤＬ−Ｃタンパク質の量を指すと理解するものとする。特定の実施形態では、化合物は上記で定義された抗体であり、この抗体のＰＣＳＫ９への結合は、前記抗体の不在下でのレベルと比較して、ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルを低下させる。
【０１１２】
ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルを決定する方法は、当技術分野で既知であり、ウェスタンブロット、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、超遠心分離、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、及び電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書に開示される化合物は、血清中で安定な抗体であり得る。
【０１１４】
本明細書ではまた、特に投与後に無毒性である上記に定義された化合物を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は投与後に無毒性である抗体である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位に結合する抗体などの抗ＰＣＳＫ９抗体またはスタチンなどの別の化合物と併用投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、ロデルシズマブ（ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、アリロクマブ、エボロクマブ、及びボコシズマブからなる群から選択される抗体と一緒に投与される。
【０１１６】
したがって本明細書では、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を必要とする対象において血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法であって、本明細書で定義される化合物または医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。血漿ＬＤＬ−Ｃレベルは、上記のような、当技術分野で既知である任意の方法によってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。
【０１１７】
ヘパリン類似体及びヘパリン模倣体
いくつかの実施形態では、ＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる化合物は、ヘパリン類似体またはヘパリン模倣体である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒ．Ｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｈｅｐａｒｉｎ−Ａ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２０１２を参照のこと。
【０１１８】
ヘパリン類似体またはヘパリン模倣体は、ＨＳＰＧの競合的アンタゴニスト、不競合的アンタゴニスト、非競合的アンタゴニスト、サイレントアンタゴニスト、部分アゴニストまたは逆アゴニストであり得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、化合物はヘパリンである。他の実施形態では、ヘパリン類似体またはヘパリン模倣体はペプチドである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ヘパリン類似体またはヘパリン模倣体は、ヘパリンのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができる。ヘパリン類似体またはヘパリン模倣体は、本明細書の上記に記載されたＰＣＳＫ９のアミノ酸残基のうちのいずれにも結合し得る。
【０１２１】
化合物、ヘパリン類似体、またはヘパリン模倣体は、式（Ｉ）の一般構造を有し得る：
【化１】
2018511596.tif 000003
（式中、
−  Ｒ１は、ＣＯＯＨ、及び−Ｏ３ＳＯからなる群から選択され、
−  Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は、Ｏ及びＯＨからなる群から選択され、
−  Ｒ４は、硫酸基からなる群から選択され、
−  Ｒ６は、スルファメート基、ＯＨ、及びＯからなる群から選択され、
−  Ｒ８は、硫酸基からなる群から選択され、
−  ｎは１以上の整数であり、
ここで、Ｒ２及び／またはＲ７は、場合によりモノマー単位を連結するリンカーとして作用することができる。）
【０１２２】
一実施形態では、ヘパリン類似体または模倣体は、
ａ）フォンダパリヌクス（Ａｒｉｘｔｒａ（商標））であり、次式を有する化合物：
【化２】
2018511596.tif 000004
ｂ）ダルテパリンナトリウムまたはチンザパリンナトリウムなどの低分子量ヘパリン；及び
ｃ）式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2018511596.tif 000005
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、Ｈ、ＣＯＯＨ、−Ｏ３ＳＯ、Ｏ、ＯＨ、スルフェート、及びスルファメートからなる群から独立して選択され、ｎは１以上の整数）である。
【０１２３】
一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物はペントサンであり、次式を有する：
【化４】
2018511596.tif 000006
（式中、ｎは１以上の整数。）
【０１２４】
一実施形態では、化合物は低分子量ヘパリンである。特定の実施形態では、低分子量ヘパリンは、ダルテパリンナトリウム（商標名フラミン）である。別の実施形態では、低分子量ヘパリンは、チンザパリンナトリウム（商標名Ｉｎｎｏｈｅｐ（商標））である。
【０１２５】
更に別の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物である：
【化５】
2018511596.tif 000007
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、Ｈ、ＣＯＯＨ、−Ｏ３ＳＯ、Ｏ、ＯＨ、スルフェート、及びスルファメートからなる群から独立して選択され、ｎは１以上の整数）。
【０１２６】
一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物はペントサンであり、次式を有する：
【化６】
2018511596.tif 000008
（式中、ｎは１以上の整数。）
【０１２７】
いくつかの実施形態では、化合物はスラミンである。スラミンは次式を有する：
【化７】
2018511596.tif 000009
【０１２８】
特定の実施形態では、化合物は式（ＩＩＩ）の化合物である：
【化８】
2018511596.tif 000010
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は、ＣＯＯＨ、−Ｏ３ＳＯ、Ｏ、ＯＨ、スルフェート、及びスルファメートからなる群から独立して選択され、ｎは１以上の整数であり、ここで、Ｒ１４は、場合によりモノマー単位を連結するリンカーとして作用することができる。）
【０１２９】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は硫酸デキストランであり、次式を有する：
【化９】
2018511596.tif 000011
（式中、ｎは１以上の整数。）
【０１３０】
別の実施形態では、化合物はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＳ−ｄＮｎであり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート結合の数である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヘパリン模倣体として作用し、ヘパリン結合タンパク質、例えばｂＦＧＦに結合することが知られている（Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。そのポリアニオン骨格によって、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びペントサンと類似性をもつ。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳ−ｄＣｎである。他の実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳ−ｄＡｎである。他の実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳ−ｄＧｎである。他の実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳ−ＤＴｎである。他の実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれのヌクレオチドも、他のヌクレオチドとは独立してＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣからなる群から選択される。
【０１３１】
ｎが整数のヌクレオチドであるＳ−ｄＣｎの一般構造は、以下の式で表される：
【化１０】
2018511596.tif 000012
【０１３２】
好ましくは、ｎは１２〜６０である。したがって、いくつかの実施形態では、ｎは１５〜５５、例えば２０〜５０、例えば２５〜４５、例えば３０〜４０、例えば３６である。
【０１３３】
通常、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、その配列が標的ｍＲＮＡに相補的であるように設計され、それにより前記標的ｍＲＮＡの分解を特異的に誘導する。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本開示の文脈におけるホスホチオエートオリゴヌクレオチドにとって重要なメカニズムは、様々なタンパク質に非特異的に結合する能力であると考えている（例えば、Ｙａｂｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５を参照）。したがって、いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、アンチセンス活性を有しないか、またはほとんど有しない。むしろ、本明細書に記載されるＰＣＳＫ９のアミノ酸残基のいずれとも独立したヌクレオチド配列に結合する。Ｓ−オリゴヌクレオチドの設計を最適化して、このようなアンチセンス活性を示さないヌクレオチド配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを得る方法は、当業者に知られている。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドの長さ、特にホスホロチオエートの結合数は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヘパリン模倣活性に影響を及ぼすが、Ｓ−オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド配列はヘパリン模倣活性に本質的に影響を及ぼさないと思われる。したがって、当技術分野で慣例となっているように、Ｓ−オリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート結合の長さ及び数が最適化されていれば、どの配列でも使用することができる。
【０１３５】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成方法は、当技術分野で既知である。非限定的な例として、硫黄元素の二硫化炭素溶液をリン酸水素塩と反応させる方法もあれば、亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）または３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（ＢＤＴＤ）のいずれかで硫化する方法もある。
【０１３６】
ホスホロチオエート結合は本質的にキラルである。硫化法では、各導入部位に異性体の混合物が供給され、長さｎのオリゴの場合、２ｎ−１の異性体が生じる。理論に束縛されるものではないが、任意の標準Ｓ−オリゴヌクレオチド調製物中の異性体混合物は、オリゴヌクレオチドの生物活性に影響を与えないと思われる。一実施形態では、Ｓ−オリゴヌクレオチドは異性体混合物である別の実施形態では、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、１形態の異性体として提供される。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドを分解抵抗性にする場合、ホスホロチオエート結合がオリゴヌクレオチド全体に存在する必要はない。どのような方法でホスホロチオエート結合の数を調節できるかを当業者は理解している。
【０１３８】
リポタンパク質代謝障害
本明細書では、医薬品として使用するための上記に定義される化合物も提供する。
【０１３９】
本明細書に開示される化合物は、リポタンパク質代謝障害を治療するために有用である。したがって、本明細書では、リポタンパク質代謝障害の治療を目的とする医薬品の製剤化のための、本明細書で定義される化合物の使用も提供する。また、治療を必要とする対象におけるリポタンパク質代謝障害の治療方法に使用するための本明細書で定義される化合物についても開示する。ＰＣＳＫ９の配列は、対象ごとに異なる場合があり、例えば、保存的置換を生じ得る個体特異的なＳＮＰが一部の個体に見出される場合がある。このようなＰＣＳＫ９変異体へのＨＳＰＧの結合を阻害する化合物もまた本発明の範囲内であることは理解されるであろう。
【０１４０】
リポタンパク質代謝障害は、脂質恒常性の障害及びそれに関連する障害であり、例として高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群、黄色腫、高血圧症、狭心症、肥満、糖尿病、及び血管炎症を含む。このような障害は、例えば、リポタンパク質粒子の構造タンパク質、様々な種類のリポタンパク質を認識する細胞受容体、または脂肪を分解する酵素の欠損によって引き起こされ得る。このような欠損の結果として、脂質が血管壁に沈着することがある。
【０１４１】
高コレステロール血症（または脂質異常症）は、血液中に高レベルのコレステロールが存在する状態である。これは、高脂血症（脂質の血中濃度の上昇）及び高リポタンパク血症（リポタンパク質の血中濃度の上昇）の一形態である。
【０１４２】
高トリグリセリド血症は、トリグリセリドの血中濃度が高いことを示す。トリグリセリドのレベル上昇は、高コレステロール血症がない場合でもアテローム性動脈硬化症に関与し、心血管疾患の素因となる。トリグリセリドのレベルが非常に高い場合には、急性膵炎のリスクも高まる。
【０１４３】
シトステロール血症またはフィトステロール血症は、例えば高コレステロール血症、腱及び結節性黄色腫、アテローム性動脈硬化症の早期発生に至る、食物ステロールの過剰吸収及び胆汁排泄の減少を特徴とする希な常染色体劣性遺伝の脂質代謝障害である。
【０１４４】
アテローム性動脈硬化症（動脈硬化性血管疾患すなわちＡＳＶＤとしても知られる）は、動脈壁が、生存している活性白血球（炎症を引き起こす）及び死細胞の残存物（コレステロール及びトリグリセリドを含む）の両方を含む白血球の浸潤及び蓄積の結果として肥厚する動脈硬化の特異的形態である。したがってアテローム性動脈硬化症は、動脈壁における白血球の慢性炎症性反応に起因して、動脈血管に影響を及ぼす症候群である。
【０１４５】
動脈硬化症は、動脈壁の肥厚、硬化、弾性損失を伴う病態である。
【０１４６】
アテローム硬化性動脈疾患、アテローム硬化性心血管疾患、冠状動脈性心疾患、または虚血性心疾患としても知られる冠動脈性心疾患は、最も一般的な種類の心臓疾患であり、心臓発作の原因である。この疾患は、心臓動脈の内壁に沿って蓄積されるプラークが、動脈の内腔を狭くし、心臓への血流を減少させることによって引き起こされる。
【０１４７】
メタボリックシンドロームはエネルギー消費と蓄積の障害であり、以下の５つの医学的病態：腹部（中心性）肥満、高血圧、空腹時血漿グルコースの上昇、高血清トリグリセリド、及び高密度コレステロールのレベル低下のうち３つが併存する場合に診断される。メタボリックシンドロームは、心血管疾患、特に心不全及び糖尿病の発症リスクを高める。メタボリックシンドロームはまた、メタボリックシンドロームＸ、心血管代謝症候群、症候群Ｘ、インスリン抵抗性症候群、リーベン症候群、及びＣＨＡＯＳ（オーストラリア）としても知られている。メタボリックシンドロームと糖尿病前症は、単に一連の異なったバイオマーカーによって診断されるだけで同じ障害であると見なされる。
【０１４８】
急性冠症候群は、冠状動脈中の血流低下により、心筋の一部が適切に機能できないか、または機能停止する病態群を指す。
【０１４９】
黄色腫は、脂質が皮膚内の大きな泡沫細胞に蓄積する脂質代謝異常の皮膚症状である。黄色腫は、高脂血症と関連性がある。
【０１５０】
動脈性高血圧と呼ばれることもある高血圧症または高血圧は、動脈内の血圧が上昇する慢性の医学的病態である。
【０１５１】
狭心症（またはアンギナ）は、多くが冠状動脈の閉塞または攣縮による心筋の虚血を原因とする、胸部の痛み、圧迫、または絞扼の感覚を指す。狭心症は、貧血、心不整脈、及び心不全に由来し得るが、その主因は冠動脈疾患である。
【０１５２】
肥満は、過剰な体脂肪が健康に悪影響を及ぼし得る程度まで蓄積し、寿命の短縮及び／または健康問題の増加、例えば、心臓疾患、２型糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸症、ある種の癌、及び変形性関節症などのリスク増加に至る医学的病態である。
【０１５３】
一般に糖尿病と呼ばれる真性糖尿病は、高血糖値が長期にわたって存在する代謝性疾患群である。糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、及び妊娠糖尿病を含め、数種類が存在する。１型糖尿病は、膵臓にあるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の欠損を特徴とし、インスリン欠乏をもたらす。２型糖尿病は、インスリン抵抗性を特徴とし、インスリン分泌の相対的な低下を併発する場合がある。体内組織のインスリンに対する応答性の欠損には、インスリン受容体が関与すると考えられている。２型糖尿病と類似する妊娠糖尿病は、全妊娠の約２〜１０％に起こる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、リポタンパク質代謝障害は、ＰＣＳＫ９の血漿レベルの異常と関係している。他の実施形態では、リポタンパク質代謝障害は、肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞表面でのＬＤＬＲレベルの異常と関係している。リポタンパク質代謝障害はまた、ＰＣＳＫ９の血漿レベルの異常、及び肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞表面でのＬＤＬＲレベルの異常と関係し得る。ＰＣＳＫ９の血漿レベルは、ヒトで３０〜３０００ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＰＣＳＫ９の異常な血漿レベルとは、健常人の平均値と有意に異なるＰＣＳＫ９の血漿レベルを指す。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９の異常な血漿レベルは、健常人の平均値よりも有意に高い。同様に、例えば肝細胞表面での異常なＬＤＬＲレベルとは、健常人の平均値と有意に異なるＬＤＬＲレベルを指す。いくつかの実施形態では、肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞表面での異常なＬＤＬＲレベルは、健常人の平均値よりも有意に低い。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、この障害は、ＬＤＬ−Ｃレベルの異常、特にＬＤＬ−Ｃレベルの上昇を特徴とする。
【０１５６】
リポタンパク質代謝障害の治療
リポタンパク質代謝障害の治療を必要とする個体または対象は、リポタンパク質代謝障害に罹患している個体、罹患が疑われる個体、または罹患するリスクのある個体である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１５７】
好ましい実施形態では、リポタンパク質代謝障害は、脂質異常症、高コレステロール血症、及び冠動脈性心疾患からなる群から選択される。好ましい実施形態では、リポタンパク質代謝障害は、冠動脈性心疾患である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、治療は予防的である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、治療は、本明細書に開示される化合物を前記対象に投与するステップを含む。化合物は、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの１日投与量で投与することができる。したがって、いくつかの実施形態では、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．２〜９００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．３〜８００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５〜７００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１．０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば２５〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば７５〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１００〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量で化合物を投与する。いくつかの実施形態では、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１０〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば２５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量で化合物を投与する。
【０１６０】
本明細書では、治療を必要とする個体における脂質異常症、高コレステロール血症、及び心臓冠動脈疾患からなる群から選択されるリポタンパク質代謝障害の治療方法であって、
ｉ．前記個体から単離された組織サンプルまたは血漿サンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記組織中のＬＤＬＲのレベル、ならびに／または前記血漿サンプル中のＰＣＳＫ９のレベル及び／もしくはＬＤＬ−Ｃのレベルを測定するステップと、
ｉｉｉ．ステップｉｉ）の発現レベルを対照組織サンプルまたは対照血漿サンプルのレベルと対比するステップと、
ｉｖ．治療計画を評価するステップと、
ｖ．本明細書で開示される治療有効量の化合物を含む組成物を個体に投与するステップと、を含む方法も開示する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、この方法は、
ｉ．前記個体から単離された組織サンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記組織のＬＤＬＲのレベルを測定するステップと；
ｉｉｉ．ステップｉｉ）の発現レベルを対照組織サンプルのレベルと対比するステップと、
ｉｖ．治療計画を評価するステップと、
ｖ．本明細書で開示される治療有効量の化合物を含む組成物を個体に投与するステップと、を含む。
【０１６２】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療有効量の化合物を含む組成物は、前記組織の細胞表面でのＬＤＬＲのレベルが異常である場合に個体に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＤＬＲのレベルの異常は、ＬＤＬＲのレベルの低下である。いくつかの実施形態では、組織サンプルは肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞を含んでおり、前記細胞表面でのＬＤＬＲのレベルが測定される。
【０１６３】
他の実施形態では、この方法は、
ｉ．前記個体から単離された血漿サンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記血漿サンプル中のＰＣＳＫ９のレベル及び／またはＬＤＬ−Ｃのレベルを測定するステップと、
ｉｉｉ．ステップｉｉ）の発現レベルを対照血漿サンプルのレベルと対比するステップと、
ｉｖ．治療計画を評価するステップと、
ｖ．本明細書で開示される治療有効量の化合物を含む組成物を個体に投与することと、を含む。
【０１６４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物を含む治療有効量の組成物は、血漿サンプル中のＬＤＬ−Ｃのレベル及び／またはＰＣＳＫ９のレベルが異常である場合に個体に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＤＬ−Ｃのレベルの異常は、ＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇である。いくつかの実施形態では、組織サンプルは肝細胞のようなＬＤＬＲ発現細胞を含んでおり、前記細胞表面でのＬＤＬＲのレベルが測定される。
【０１６５】
本明細書では、ＬＤＬＲの分解を阻害する方法も開示し、前記方法は本明細書で定義される化合物を投与することを含む。特に化合物は、本明細書の上記に定義される一般式（Ｉ）の化合物であり得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、化合物はフォンダパリヌクスなどのヘパリン類似体または模倣体である。別の実施形態では、化合物はペントサンである。更に別の実施形態では、化合物はスラミンである。更に別の実施形態では、化合物は硫酸デキストランである。更に別の実施形態では、化合物は、ダルテパリンナトリウムまたはチンザパリンナトリウムなどの低分子量ヘパリンである。更に別の実施形態では、化合物は、本明細書の上記に定義されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０１６７】
医薬組成物
本明細書では、本明細書で定義される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物についても開示する。いくつかの実施形態では、組成物は本明細書で開示される１種の化合物を含む。他の実施形態では、組成物は、２種の化合物またはそれ以上、例えば３種の化合物またはそれ以上、例えば４種の化合物またはそれ以上、例えば５種の化合物またはそれ以上を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、組成物は以下のうち少なくとも１つを更に含む：
−ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体；
−スタチン；
−コレスチラミン
−コレステロール吸収阻害剤、例えばエゼチミブ。
【０１６９】
したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される少なくとも１種の化合物と、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体、スタチンまたはコレスチラミンからなる群から選択される少なくとも１つの追加化合物とを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体とを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、スタチンとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、コレスチラミンとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体と、スタチンとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体と、コレスチラミンとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、コレスチラミンと、スタチンとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に定義される１種の化合物と、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体と、スタチンと、コレスチラミンとを含む。
【０１７０】
医薬組成物は場合により、１種以上の薬学的に許容される担体賦形剤を含んでもよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９５，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されている従来技術によって調剤することができる。組成物は、例えばカプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁液、または局所適用などの従来形態であってもよい。通常、本発明の医薬組成物は、例えば静脈内注射または皮下注射による非経口投与用に処方することができ、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入の単位用量形態で、または防腐剤を添加した多回用量容器で提供することができる。組成物は、例えば水性ポリエチレングリコール溶液など、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態をとってもよい。組成物は、経口摂取に適したものであってもよい。これは、小分子組成物に特に適している。油性または非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、及び注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、これには保存剤、湿潤剤、乳化剤もしくは懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの処方剤が含有されていてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で構成するために、滅菌固体の無菌単離によって、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。非経口製剤に有用な油としては、石油、動物性油、植物性油、または合成油が挙げられる。このような製剤に有用な油の具体例としては、ラッカセイ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、及び鉱油が挙げられる。非経口製剤での使用に適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは好適な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤は通常、溶液中に約０．０００１〜約２５重量％、例えば約０．５〜約２５重量％の活性成分を含有する。防腐剤及び緩衝剤を使用してもよい。このような組成物には、注射部位の刺激を最小限にする、または除去するために、約１２〜約１７の親水性親油性比（ＨＬＢ）を有する１種以上の非イオン性界面活性剤が含有されている場合がある。このような製剤中の界面活性剤量は通常、約０．０００００１〜約１５重量％、例えば約０．０００００１〜約５重量％、または約５〜約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、例えばソルビタンモノオレエート、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、疎水性塩基とエチレンオキシドの高分子量付加物などが挙げられる。非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量または多回用量密封容器で提供することができるほか、注射用として使用直前に例えば水などの滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。
【０１７１】
しかしながら、最終的に関連組織を標的とするように薬剤を血流に導入するため、本発明による薬物送達の主な経路は非経口である。
【０１７２】
薬剤はまた、生体活性物質が供給されるように、動物の任意の粘膜、例えば鼻、膣、眼、口、生殖器官、肺、消化管、または直腸、好ましくは鼻または口の粘膜を通過するように投与してもよい。
【０１７３】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、非経口的に、すなわち静脈内、筋肉内、脊髄内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、または腹腔内投与により投与される。皮下及び筋肉内形態の非経口投与が一般に好ましい。このような投与に適した剤形は、従来技術によって調製することができる。化合物はまた、鼻腔内投与及び経口吸入投与による吸入によって投与してもよい。このような投与に適した、エアロゾル製剤または定量吸入器などの剤形は、従来技術によって調製することができる。
【０１７４】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、注射などによる非経口投与に合わせて製剤化される。
【０１７５】
更なる実施形態では、本発明による医薬組成物は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラスまたは連続投与に合わせて製剤化される。
【０１７６】
投与の速度及び頻度は、個々の症例に応じて医師が決定してよい。一実施形態では、投与は３０分〜２４時間間隔で、例えば１〜６時間の間隔で、例えば１日１回行われる。
【０１７７】
治療の継続期間は、疾患の重症度に応じて変化し得る。一実施形態では、治療の継続期間は、１日〜２８日、例えば２日〜２５日、例えば５日〜２０日、例えば７日〜１５日である。慢性症例の場合、治療の継続期間は、生涯にわたる場合がある。
【０１７８】
投与量は患者の特性ならびに投与の手段及び様式に応じて、担当医師が決定することができる。本発明の一実施形態では、本明細書の上記に定義される医薬組成物の活性化合物の投与量は、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１７９】
投与量は、ボーラス投与として、または連続投与として投与されてもよい。ボーラス投与に関して、医薬組成物は、３０分〜２４時間間隔で、例えば１日１回投与してもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、組成物のｐＨはｐＨ４〜ｐＨ１０である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、組成物は経口投与に合わせて製剤化される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、組成物は非経口投与に合わせて製剤化される。特定の実施形態では、非経口投与は注射によるものである。このような非経口投与は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス、または連続投与であり得る。
【０１８３】
抗体の選択方法
本明細書では、ＰＣＳＫ９（配列番号１）のＨＳＰＧ結合部位内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体の選択方法であって、
ｉ．配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの少なくとも１個のアミノ酸残基、例えば配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７からなるドメインのうちの、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも３０個、例えば少なくとも３５個、例えば少なくとも４０個、例えば少なくとも４５個、例えば少なくとも５０個、例えば少なくとも５５個、例えば少なくとも６０個、例えば少なくとも６５個、例えば少なくとも７０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも８０個、例えば少なくとも全てのアミノ酸を含むＰＣＳＫ９のポリペプチド断片、またはＰＣＳＫ９のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．前記ポリペプチドを認識する抗体を同定して選択するステップと、
ｉｉｉ．競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、前記選択された抗体が１種以上の対照抗体を置換できるかを決定するステップと、を含む前記方法も開示する。
【０１８４】
ＰＣＳＫ９のポリペプチド断片またはＰＣＳＫ９のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの投与方法は、当技術分野において既知であり、これには哺乳動物の免疫化またはファージディスプレイが含まれる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、この方法は更に、前記対照抗体の少なくとも１つを置換できる抗体を選択するステップを含む。対照抗体とは、ＰＣＳＫ９またはその断片に結合することができる抗体である。
【０１８６】
競合ＥＬＩＳＡにおいて、前記選択された抗体が１つ以上の対照抗体と置換できるかを決定するステップには、
ｉ．前記対照抗体によって認識されるエピトープを含むＰＣＳＫ９またはその断片を提供するステップと；
ｉｉ．試験抗体及び前記対照抗体を前記ＰＣＳＫ９またはその断片に付加するステップであって、試験抗体または対照抗体のいずれかが、検出可能な標識で標識されているか、または両方の抗体が、異なった検出可能な標識で標識されているステップと；
ｉｉｉ．ＰＣＳＫ９での検出可能な標識の存在を検出するステップと、を含み、
それにより、試験抗体が対照抗体を置換できるかを検出する。
【０１８７】
この方法は更に、抗体を試験して抗体がＬＤＬＲの分解を阻害できるかを判定することと、ＬＤＬＲの分解を阻害できる抗体を選択することとを含み得る。
【０１８８】
本明細書では、ヘパリンなどのＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害することができるペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体の選択方法であって、
ｉ．複数のペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を提供するステップと；
ｉｉ．前記複数のペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株に由来する細胞と共に培地中でインキュベートするステップと；
ｉｉｉ．前記培地中のＰＣＳＫ９のレベル及び／または前記細胞のＬＤＬＲのレベルを測定するステップと；
ｉｖ．ステップｉｉｉで測定したとき、ＰＣＳＫ９及び／またはＬＤＬＲを最も高レベルで生じさせるペプチドまたはヘパリン類似体もしくは模倣体を選択するステップと、を含む前記方法も開示する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９のレベルは、細胞表面から脱離するＰＣＳＫ９のレベルである。
【０１９０】
本明細書に開示される化合物を結合できる化合物
本明細書では、上記で定義される化合物と選択的に結合することができる化合物についても開示する。いくつかの実施形態では、上記で定義される化合物と選択的に結合することができる化合物は抗体である。
【０１９１】
本明細書に開示される抗体の作製方法本明細書で定義される抗体の作製方法であって、前記方法は
ｉ．ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを含むタンパク質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくはその機能的等価物を哺乳動物に投与するステップと；
ｉｉ．ＰＣＳＫ９（配列番号１）に結合できる場合に前記抗体を選択するステップと；
ｉｉｉ．前記突然変異したＰＣＳＫ９がＨＳＰＧに結合できない場合、突然変異したＰＣＳＫ９に結合できない場合に前記抗体を選択するステップと、を含む。
【０１９２】
ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを含むタンパク質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはその機能的等価物を投与する方法は、当技術分野において既知であり、これには哺乳動物の免疫化またはファージディスプレイが含まれる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、前記突然変異したＰＣＳＫ９は、９３位、９６位、９７位、１０４位、１０５位、１３６位、１３９位、１６５位、または１６７位の少なくとも１つで突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異はアラニン置換である。いくつかの実施形態では、９３位、９６位、９７位、１０４位、１０５位、１３６位、１３９位、１６５位、または１６７位のアミノ酸残基の２つ以上が突然変異している。
【０１９４】
特定の実施形態では、突然変異したＰＣＳＫ９は、突然変異体Ｒ９３Ａ、Ｒ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｒ１０４Ａ、Ｒ１０５Ａ、Ｋ１３６Ａ、Ｈ１３９Ａ、Ｒ１６５Ａ、またはＲ１６７Ａからなる群から選択され、この位置は配列番号１に定められているＰＣＳＫ９の位置である。特定の一実施形態では、変異したＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９のＲ９３位、Ｒ９６位、Ｒ９７位、Ｒ１０４位、Ｒ１０５位、及びＨ１３９位で突然変異している。好ましくは、突然変異はアラニンへの突然変異である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを含むタンパク質、またはその断片もしくはその機能的等価物が投与される哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットのような齧歯動物である。
【０１９６】
この方法は更に、前記哺乳動物から抗体産生細胞を単離することと、前記抗体産生細胞からハイブリドーマ細胞を調製することと、前記ハイブリドーマを培養することと、前記ハイブリドーマによって産生される抗体を単離することとを含み得る。ハイブリドーマ細胞から抗体を単離する方法は、当技術分野で既知である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示される抗体を作製するためのものであり、前記抗体をコードする核酸構築物で宿主細胞をトランスフェクトするステップを含む。抗体は、組換え細胞によって作製してもよい。好適な組換え細胞は、細菌及び真核微生物を含む群から選択された微生物であり得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含む群から選択される細菌である。
【０１９９】
他の実施形態では、微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓを含む群から選択される真核微生物である。
【０２００】
また宿主細胞は、植物細胞及び動物細胞を含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、エンドウマメ、イネ、トウモロコシ、タバコ、オオムギ、またはその種子を含む群から選択される植物細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣、マウス、及びヒトを含む群から選択される哺乳動物に由来する動物細胞である。他の実施形態では、動物細胞は、昆虫または鳥類細胞株に由来する。
【０２０１】
この方法は、抗体を同定及び選択するステップを更に含み得る。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：ＰＣＳＫ９内のＨＳＰＧ結合部位のマッピング。
我々は、ＰＣＳＫ９（ＰＤＢ：２ＰＭＷ）の静電表面を調べ（図２−２（Ｂ））、ＰＣＳＫ９プロドメインに位置する６つの表面露出した塩基性残基からなる推定ヘパリン結合部位を同定した。結合部位は、ヘパリン五糖（ＳＡＮＯＲＧ）の硫酸基と完全な対合を示す、９３位、９６位、９７位、１０４位、及び１０５位のアルギニン（Ｒ）残基、ならびに１３９位のヒスチジン（Ｈ）によって形成されている（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）（図２−２（Ｂ）及び２−３（Ｃ））。この結合部位は、ＰＣＳＫ９の不活性な触媒ドメインに位置するＬＤＬＲ結合表面の反対側に存在する（図２−１（Ａ））。ＰＣＳＫ９の共結晶構造にヘパリン断片がドッキングしてＬＤＬＲ（ＰＤＢ：３Ｐ５Ｂ）と複合体化することは、ＨＳＰＧ結合によって、以降のＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体形成が可能になることを示唆している（図３−３（Ｃ））。
【０２０３】
実施例２：ヘパリナーゼ処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９細胞表面の会合を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬ受容体を保護する。我々はＨＳＰＧがＰＣＳＫ９の取り込みに関与している可能性があると推測した。そこで、ＰＣＳＫ９を安定発現するヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞をヘパリナーゼＩで処理した。酵素ヘパリナーゼＩは、ウロン酸とＤ−グルコサミン間の１，４位のＯ結合でヘパラン硫酸ＧＡＧ鎖を切断し、それによって細胞表面のヘパラン硫酸鎖を除去する。
【０２０４】
ＰＣＳＫ９で安定的にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をカバースリップ当たり５０.０００細胞ずつ播種して一晩インキュベートした後、ＰＢＳ（０．０００２ＵＮ／ｍｌ）中のヘパリナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｈ２５１９）またはＰＢＳ単独を添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、一次抗体及び二次抗体を用いて非透過性細胞を免疫染色した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ色素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で可視化した。画像はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０で取得した。
【０２０５】
実際に、処理は表面ＰＣＳＫ９染色の強度に顕著な減少をもたらしたが、これは、ＨＳＰＧがＰＣＳＫ９細胞の結合に重要であることを示唆している（図２−４（Ｄ））。
【０２０６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９活性に対する、ヘパラン硫酸ＧＡＧの酵素的除去の効果を試験するため、１０〜１２週齢の雄ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊマウスに尾静脈カテーテル経由でヘパリナーゼＩ（３０Ｕ）を注入して投与する５分前にＰＣＳＫ９（１０μｇ）を注射した。対照マウスでは、ヘパリナーゼ注射及び／またはＰＣＳＫ９注射の代わりに０．９％生理食塩水を注射した。ヘパリナーゼ注射中に、マスク経由でイソフルランを連続投与してマウスに軽麻酔した。注射後１時間でマウスを犠牲死させ、肝組織サンプルを採取して瞬間凍結した後、ウェスタンブロットによるタンパク質の抽出及びＬＤＬＲレベルの評価を行った（図１０−１（Ａ））。ヘパリナーゼＩの注射は、ＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを完全に保護したが、これは、ＨＳＰＧがｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘導性分解に役立つことを示している（図１０−１（Ａ）及び（Ｂ））。
【０２０７】
ＰＣＳＫ９とヘパラン硫酸ＧＡＧ鎖との間の直接的な相互作用を検証するために、我々はヘパリンと共有結合されたセファロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いた。
【０２０８】
ＰＢＳ中の５ｍｌのＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、精製したＰＣＳＫ９を充填した。カラムをＡｋｔａ  Ｐｒｉｍｅに接続し、５カラム容積分の１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）で洗浄した。ＰＣＳＫ９を１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）及び２ＭのＮａＣｌの直線勾配法を用いて溶出し、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。測定した導電率に基づいて、溶出プロファイルを、変換係数０．０６５ｍＳ／ｍＭのＮａＣｌを用いてＮａＣｌ濃度の関数に変換した。ＰＣＳＫ９はヘパリンカラムに保持され、ＮａＣｌ濃度約５００ｍＭで溶出された（図２−４（Ｅ））が、これはヘパリンとの強力かつ高度に特異的な相互作用を示している。
【０２０９】
別の実験では、ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地を、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（結合緩衝液）中のヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。ローターにて４℃で一晩インキュベートした後、ビーズを結合緩衝液で洗浄し、ＮａＣｌ濃度を増加させながらヘパリン結合タンパク質をバッチ溶出した。インプット画分、フロースルー画分、及び溶出画分中のＰＣＳＫ９をウェスタンブロッティングにより評価した。
【０２１０】
我々は、ＨｅｐＧ２細胞の馴化培地からの内因性ＰＣＳＫ９もまた、ヘパリンセファロースに結合し、十分に確立されたＨＳＰＧ結合タンパク質であるＡｐｏＥのものと同様の溶出プロファイルを示すことを見出した（図３−３（Ｄ））。
【０２１１】
実施例３：ＰＣＳＫ９／ＨＳＰＧ相互作用にとって重要な残基の同定
ＰＣＳＫ９／ＨＳＰＧ相互作用に関与する重要な残基を更に絞り込むために、ＨＳＰＧ結合モチーフ内に点突然変異を有するＰＣＳＫ９変異体をクローニングして発現させた。ＰＣＲにより突然変異体を導入して、３Ｄ構造モデルのドッキングによって同定された荷電アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ／Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）をアラニン（Ａｌａ／Ａ）のような中性残基によって置換した。
【０２１２】
ヒト野生型及び以下のアラニン置換変異体を分析した：
野生型ＰＣＳＫ９（配列番号１）
突然変異体Ｒ９３
突然変異体Ｒ９６Ｒ９７
突然変異体Ｒ１０４Ｒ１０５
突然変異体Ｒ１６５Ｒ１６７
突然変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９Ａ
突然変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９
【０２１３】
不適切に折り畳まれたＰＣＳＫ９は一般にプロペプチドが切断されず、それにより小胞体に保持されるため、ＰＣＳＫ９突然変異体のプロセッシング及び分泌をモニターすることによって、フォールディングに誤りがないか評価することができる。ｐｒｏＰＣＳＫ９の成熟タンパク質へのプロセッシング及び成熟ＰＣＳＫ９変異体の分泌を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一過性トランスフェクションと、それに続く細胞溶解物及び周辺培地中のＰＣＳＫ９のウェスタンブロット分析により評価した（図３−１（Ａ））。
【０２１４】
ＰＣＳＫ９突然変異体タンパク質がヘパリンに結合する能力を、アフィニティークロマトグラフィーと、それに続く抗ＰＣＳＫ９抗体を用いたウェスタンブロッティングにより評価した。目的のＰＣＳＫ９変異体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの馴化培地を、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（結合緩衝液）中のヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とインキュベートした。ローターにて４℃で一晩インキュベートした後、ビーズを結合緩衝液で洗浄し、ＮａＣｌ濃度を増加させながらヘパリン結合タンパク質をバッチ溶出した。インプット画分、フロースルー画分、及び溶出画分中のＰＣＳＫ９をウェスタンブロッティングにより評価した。
【０２１５】
突然変異体Ｒ９３、Ｒ９６Ｒ９７、及びＲ１０４Ｒ１０５は、野生型ＰＣＳＫ９または突然変異体Ｒ１６５Ｒ１６７と比較してヘパリンに対して低親和性を示し、突然変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９及びＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９はヘパリンに結合せず、フロースルーのみで検出された（図３−２（Ｂ））。
【０２１６】
実施例４：突然変異したＨＳＰＧ結合ドメインを有するＰＣＳＫ９変異体は、ＬＤＬ受容体分解を誘導できない
精製したＰＣＳＫ９変異体を細胞アッセイで試験し、野生型ＰＣＳＫ９と比較したＬＤＬＲの分解を誘導する能力を試験した。ＬＤＬＲ分解の誘導を、ＨｅｐＧ２細胞と、野生型ＰＣＳＫ９（ＷＴ）または上記のＰＣＳＫ９突然変異体とのインキュベーションによって分析し、ＬＤＬＲレベルをウェスタンブロッティングにより評価した。ＨｅｐＧ２細胞を、１２ウェルプレートに１ウェル当たり２５０.０００細胞の密度で播種した。一晩のインキュベーション後、培地を、ＰＣＳＫ９ＷＴまたは突然変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９を含有する新鮮な培地と交換した。１８時間のインキュベーション後に細胞を採取して溶解し、ＬＤＬＲレベルをウェスタンブロッティング及びデンシトメトリーによる定量化によって評価した。
【０２１７】
突然変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９とインキュベートした細胞のＬＤＬＲレベルは、ＷＴＰＣＳＫ９とインキュベートした細胞で測定されたレベルと比較して顕著に（約２倍）高かった（図４（Ａ）及び（Ｂ））が、これは、ＨＳＰＧ結合ドメイン内の突然変異がＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解を減少させたことを示している。
【０２１８】
実施例５：ヘパリン及びヘパリン類似体は、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体の形成を妨げる。
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を用いて、外因的に添加されたヘパリンが内在性ＰＣＳＫ９の結合を細胞表面のＨＳＰＧと競合することで、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体の形成を妨げるかどうかを試験した（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２１９】
ＰＬＡ（ＤｕｏｌｉｎｋＩＩ、Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、抗ＰＣＳＫ９（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ／ＡＦ３８８８）及び抗ＬＤＬＲ（Ａｂｃａｍ／ａｂ５２８１８）を一次抗体として用いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。互いの距離が３０ｎｍ以内に位置するＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲは、オリゴヌクレオチド複合体化二次抗体によって可視化する。この二次抗体は、環形成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ、それによってローリングサークル増幅をプライミングする。増幅されたＤＮＡは、相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドの添加によって可視化される（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２２０】
このアッセイを非透過性ＨｅｐＧ２細胞の内因性細胞表面ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲに対して用い、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体のクラスター存在量を観察した（図５−２（Ｄ））。これは、ヘパリンとのインキュベーション時に数及び強度の両面で顕著に減少した。このことは、ＨＳＰＧへのＰＣＳＫ９結合が、以降の細胞表面ＬＤＬＲとの複合体形成に役立つことを示唆している。
【０２２１】
我々は、ＨｅｐＧ２細胞をヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）とインキュベート（１８時間）すると、ＬＤＬＲタンパク質のレベルが２〜３倍上昇し（図５−１（Ａ）〜（Ｂ））、また低分子量ヘパリンの２種の治療用製剤で同様の効果が観察されることを見出した（図８−１（Ａ））。
【０２２２】
ヘパリン処理したＨｅｐＧ２細胞における細胞内ＬＤＬＲの増加は用量依存的であり、培地中のＰＣＳＫ９の顕著な増加も伴った（図６（Ｂ））。ＰＣＳＫ９濃度は、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＨｕｍａｎ（ＤＰＣ９００）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者のプロトコルに従って測定した。
【０２２３】
最も高濃度のヘパリンでのＰＣＳＫ９を除いて、ｍＲＮＡに変化が観察されなかったため、ヘパリンによって誘導される細胞内ＬＤＬＲ及び細胞外ＰＣＳＫ９の増加は、翻訳後レベルで発生した（図６（Ｃ））。
【０２２４】
ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯＲＡＤ）による０．５μｇのＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ合成に続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ調製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してＨｅｐＧ２細胞からのＲＮＡ抽出を行った。リアルタイムＰＣＲをｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎスーパーミックス及びｉＴａｑポリメラーゼを用いて、以下のプライマーを使用して行い、ＬＤＬＲ（フォワードプライマー５’ＡＣＧＧＣＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＡ３’（配列番号２２）、リバースプライマー５’ＣＣＴＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＡ３’ （配列番号２３））、ＰＣＳＫ９（フォワードプライマー５’ＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＣ−ＣＣＣＴ３’ （配列番号２４）、リバースプライマー５’ＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＧＧＡＧＡ３’ （配列番号２５））、及びＧＡＰＤＨ（フォワードプライマー５’ＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧ３’ （配列番号２６）、リバースプライマー５’ＧＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡ−ＧＴＴＴＣ３’ （配列番号２７））の転写物を検出した。
【０２２５】
我々は、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルが２倍の上昇であるにもかかわらず、ＬＤＬＲのレベルが約２．５倍上昇したことから明らかなように、２５Ｕ／ｍｌのヘパリンが、ＰＣＳＫ９活性に効果的に拮抗することを見出した（図８−１（Ｂ））。
【０２２６】
ヘパリン（５０Ｕ／ｍｌ）と２４時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞を、ウェスタンブロッティングによって評価したところ、ＬＤＬＲレベルの上昇を示した（図５−１（Ａ））。また、ＬＤＬＲレベルをデンシトメトリー（ｎ＝４）によって定量化した（図５−１（Ｂ））。ヘパリンとのインキュベーションはまた、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、培地中のＰＣＳＫ９レベルを上昇させた（図５−１（Ｃ））。
【０２２７】
製造業者のプロトコルに従って、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合アッセイ（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析したところ、ヘパリンはＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の直接的な相互作用を妨害しない（図６（Ａ））。簡潔には、ＬＤＬＲ細胞外ドメインでコーティングしたマイクロタイタープレートウェルを、ヘパリン（５または５０Ｕ／ｍｌ）、またはＰＣＳＫ９（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃７１２０７）のＬＤＬＲ結合ドメインに対して惹起する抗ＰＣＳＫ９抗体の存在下で、ビオチン化ＰＣＳＫ９とインキュベートした。洗浄後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンとインキュベートし、ＨＲＰ基質の添加及び化学発光マイクロプレートリーダーを使用したシグナルの評価により、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ細胞外ドメインへの結合を評価した。
【０２２８】
ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用が、ヘパリンの添加による影響を受けなかったことは、ヘパリンのＰＣＳＫ９への結合が、ＰＣＳＫ９と細胞表面ＨＳＰＧとの相互作用を防止することによってＬＤＬＲの分解を減少させることを示している。
【０２２９】
フォンダパリヌクス（Ａｒｉｘｔｒａ）（２５、１００、または２５０μｇ／ｍｌ）と２４時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、ウェスタンブロッティングによって評価したところ、ＬＤＬＲレベルの上昇を示した（図７）。この結果は、フォンダパリヌクスのようなヘパリン類似体のＰＣＳＫ９への結合が、ＰＣＳＫ９と細胞表面ＨＳＰＧとの相互作用を防止することによってＬＤＬＲ分解を減少させることを示している。
【０２３０】
実施例６：ヘパリン模倣体は、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲの相互作用を妨げる。
過去１００年間にヘパリンの構造を模倣する複数の分子が、多数の治療用途のために開発されており、そのうちの７つが現在臨床使用されている。これらはヘパリン模倣体と呼ばれ、様々なオリゴ糖、オリゴヌクレオチド、及びナフタレン誘導体を含む多様な化学クラスに属している。出願人は、ヘパリン模倣体のサブセットが、ＨｅｐＧ２細胞中のＰＣＳＫ９に結合してＬＤＬＲを増加させる能力について試験した（図９−１〜９−７）。
【０２３１】
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）（Ｊｅｒａｂｅｋ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて、ＰＣＳＫ９とリガンド（スラミン、硫酸デキストラン５０００、デキストラン５０００、硫酸ペントサン、及びＳ−ｄＣ−３６）との平衡結合親和性を評価した。ＭＯ−Ｌ００３  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  Ｂｌｕｅ−ＮＨＳ標識キット（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＣＳＫ９を標識し、１：１モル比のタンパク質対色素の標識効率を達成した。ＰＣＳＫ９は最終濃度１００ｎＭで使用した。非標識結合パートナーを、（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で）１：１希釈で滴定した。最高濃度は、スラミンの場合は１５．４ｍＭ、デキストラン硫酸５０００の場合は２．３ｍＭ、デキストラン５０００の場合は２．３ｍＭ、硫酸ペントサンの場合は１６．３ｍＭ、及びＳ−ｄＣ−３６の場合は２５０μＭであった。ＭＳＴ測定は、２０％ＬＥＤ及び８０％ＭＳＴ駆動力を用いたＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の標準処理キャピラリー管（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。レーザーのオン／オフ時間はそれぞれ５秒と３５秒であった。陰性対照は、前述と同じ条件下で、１６本全てのキャピラリー管において、ＭＳＴ緩衝液中の１００ｎＭの標識ＰＣＳＫ９を用いて実施した。スラミン、硫酸デキストラン５０００、及びＳ−ｄＣ−３６では、８０％ＭＳＴ駆動力での温度ジャンプ相から、硫酸ペントサンでは、８０％ＭＳＴ駆動力での熱泳動＋温度ジャンプ相から結合曲線を得た。各結合相手に対して、シグモイド用量反応曲線をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いてフィッティングして平均ＫＤ値を得た。高濃度のスラミンの存在下でＰＣＳＫ９の蛍光消光が観察されたため、ＭＳＴ装置で分析する前に、ＰＣＳＫ９を１０％ＳＤＳで前処理し、次にサンプルを９０℃で１５分間加熱することにより変性試験を実施した。これにより消光効果が排除され、非変性条件下でのＰＣＳＫ９の蛍光消光が実際のリガンド結合事象に起因することが示された。
【０２３２】
ＭＳＴを用いて測定したところ、硫酸化オリゴ糖硫酸デキストラン（図９−２（Ｃ））及び硫酸ペントサン（図９−４（Ｆ））はいずれも、それぞれ１７９．５μＭ及び３８１．３μＭの親和性でＰＣＳＫ９と直接結合して、細胞内ＬＤＬＲの用量依存的増加をもたらし（図９−１（Ａ）〜（Ｂ）及び図９−３（Ｄ）〜（Ｅ））、ビヒクル対照と比較して約４００％のプラトーに達し、このアッセイにおけるスタチンの最大効果よりも顕著に優位であった。非硫酸化デキストランがＰＣＳＫ９に対する親和性を示さなかったことから、この相互作用は硫酸基の存在に依存していた。アフリカ睡眠病における抗寄生虫薬である、硫酸化ナフタレン誘導体スラミンは、１９０μＭの親和性でＰＣＳＫ９に結合し（図９−５（Ｈ））、最大１５倍のＬＤＬＲの増加をもたらし（図９−１（Ａ）、９−５（Ｇ））、蛍光標識されたＬＤＬ粒子の細胞内取り込みの増加も伴った（図１２）。更に出願人は、３６量体の一本鎖ＤＮＡ分子を試験し、これが４．８μＭのＫＤでＰＣＳＫ９に結合し（図９−７（Ｋ））、この濃度範囲で強力な阻害効果を示すことを見出した（図９−６（Ｉ）〜（Ｊ））。
【０２３３】
実施例７：低分子量ヘパリンの治療用製剤は、ＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する。
低分子量ヘパリン製剤フラミン（１〜１００Ｕ／ｍｌ）またはＩｎｎｏｈｅｐ（１〜１００Ｕ／ｍｌ）と一晩インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、ウェスタンブロッティングによって評価したところ、ＬＤＬＲレベルの上昇を示した（図８−１（Ａ））。フラミン及びＩｎｎｏｈｅｐの効果は、ヘパリン（図５−１（Ａ））及び五糖類Ａｒｉｘｔｒａ（図７）の効果に匹敵した。
【０２３４】
これらの結果は、ヘパリン：ＰＣＫＳ９複合体を鋳型として用いた構造ベースの薬物設計が、小分子ＰＣＳＫ９阻害剤の開発において実現可能なアプローチであることを示している。
【０２３５】
実施例８：ヘパリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する。
マウス（ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊ）に、１０μｇのヒト組換えＰＣＳＫ９を単独で、またはヘパリン（５０Ｕ）との併用で単回静脈内投与（尾静脈）を施した。注射後１時間でマウスを犠牲死させ、肝組織サンプルを採取した。膜タンパク質製剤中のＬＤＬＲのウェスタンブロット分析では、ＰＣＳＫ９のみを注射したマウスと比較して、ヘパリンと同時注入したマウスの肝ＬＤＬＲは有意に高いレベルを示した（図８−１（Ｂ）、図８−２（Ｃ）に定量化）。
【０２３６】
これらの結果は、ＰＣＳＫ９：ヘパリンの相互作用が、小分子ＰＣＳＫ９阻害剤開発の枠組みを提供し得ることを示している。
【０２３７】
実施例９：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合に対するポリクローナル抗体は、ＰＣＳＫ９活性を阻害する
ポリクローナル抗体は、ヒトＨＳＰＧ結合ドメインを含むキメララットＰＣＳＫ９をコードするＤＮＡで３匹のラットを免疫化することによって作製した。免疫沈降によって、免疫動物から得た血清サンプルをＰＣＳＫ９結合抗体について試験した。
【０２３８】
１μｌの免疫または免疫前のラット血清からの抗体を、ＧａｍｍａＢｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化し、以前に記載されているように（Ｇｕｓｔａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＰＣＳＫ９で一過性トランスフェクトされた代謝標識ＨＥＫ２９３の馴化培地からの３５ＳヒトＰＣＳＫ９の沈降（４℃で３時間）に使用した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含有するＴＢＳ中で３回洗浄した後、沈降したタンパク質を、２０ｍＭのジチオエリトリトール（ＤＴＥ）を補充したＮＵＰＡＧＥサンプル緩衝液中でサンプルを煮沸することにより溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、蛍光イメージングにより可視化した。
【０２３９】
全動物からの免疫血清が、３５−Ｓ標識ＰＣＳＫ９を特異的に沈降した。免疫前動物由来の血清を用いて実施した対照免疫沈降では、ＰＣＳＫ９の沈降は検出されなかった（図８−３（Ｄ））。
【０２４０】
免疫及び免疫前の血清サンプルから精製したＩｇＧを、ＰＣＳＫ９誘導性のＬＤＬＲ分解のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて試験したところ、免疫ＩｇＧとインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞がＬＤＬＲレベルの顕著な上昇を示した（図８−３（Ｅ））。この結果は、ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインを標的とする抗体がＰＣＳＫ９活性を効率的に阻害することを示している。
【０２４１】
実施例１０：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインに対するＰＣＳＫ９阻害ｍＡｂの作製
ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって、ヒトＨＳＰＧ結合ドメインを含むキメララットＰＣＳＫ９をコードするＤＮＡで３匹のラットを免疫化することにより作製した。ハイブリドーマクローンを産生するモノクローナル抗体は、ラット脾臓リンパ球とミエローマ細胞との融合及びそれに続く抗体産生細胞の単細胞サブクローニングの後、ハイブリドーマ上清を含むｍＡｂを回収することにより得た。ＧａｍｍａＢｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化されたｍＡｂ産生ハイブリドーマクローンからの５００μｌの馴化培地を用いた、３５ＳヒトＰＣＳＫ９の免疫沈降によって個々のｍＡｂを試験した。我々は、試験した２６のｍＡｂのうち１６が、天然の３５ＳヒトＰＣＳＫ９を特異的に沈降することを見出した（図８−４（Ｆ））。
【０２４２】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９結合ｍＡｂの更なる機能試験は、１２のクローンがＰＳＣＫ９活性を阻害し、ＬＤＬＲの細胞内レベルを約２倍上昇させることを示した（図８−５（Ｇ））。
【０２４３】
この１２のクローンを試験して、それらがＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９のＰＣＳＫ９突然変異体に結合できるかどうかを調べた（図８−５（Ｈ））。ＬＤＬＲの細胞内レベルを約２倍上昇させることができたクローンのうち４つは、この突然変異体に結合できなかった（図８−４（Ｆ）、８−５（Ｇ）、及び８−５（Ｈ）のｍＡｂ  １Ｇ８、５Ｅ１１、８ＨＡ、及び１０Ｅ５を比較）。更に試験したところ、ｍＡｂ  １Ｇ８及び５Ｅ１１がＷＴ  ＰＣＳＫ９のみを認識するのに対し（図８−６（Ｉ））、ｍＡｂ  １０Ｅ５はＷＴ  ＰＣＳＫ９ならびに突然変異体Ｒ９６Ｒ９７及びＲ１０４Ｒ１０５を沈降することを示した（図８−６（Ｉ））。この結果は、これらの３つのクローンがＨＳＰＧ結合ドメインに特異的に結合することを示している。
【０２４４】
クローン５Ｅ１１及び８ＨＡを配列決定した（配列番号２、４、６、及び８）。
【０２４５】
実施例１１：臨床試験のためのヒト化モノクローナル抗体の作製。
ラットＰＣＳＫ９とヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合モチーフで構成されるキメラタンパク質をコードするＤＮＡでラットを免疫化することにより、モノクローナル抗体を作製する。候補抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＰＣＳＫ９への結合をスクリーニングすることにより検出する。候補抗体を、エピトープ、ヒトＰＣＳＫ９に対する親和性、及び天然のＰＣＳＫ９の認識に関して特性決定する。選択した候補抗体がＰＣＳＫ９機能を阻害する能力をＨｅｐＧ２細胞培養アッセイで試験し、最も有望な抗体を、内因性のマウスＰＣＳＫ９プロモーターの制御下でヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジェニックマウスにおいて試験する。投与時に、肝臓中のＬＤＬ受容体レベル及び血漿中のコレステロールを分析することにより、抗体のＰＣＳＫ９中和作用を評価する。リード候補はヒト化して、臨床試験用に調製する。
【０２４６】
実施例１２：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合に対する抗体を用いた、ＬＤＬコレステロールの低下。
ＬＤＬコレステロールレベルの上昇した患者に、ヒトＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合部位に対するヒト化抗体からなる活性化合物を処方する。患者は１〜２８日の間隔で２５〜５００ｍｇの組成物の皮下注射を受ける。ＬＤＬ−Ｃレベルの顕著な低下が観察される。このデータは、ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対する抗体の非経口投与が、対象におけるＬＤＬ−Ｃレベルの低下をもたらし得ることを示す。
【０２４７】
実施例１３：スタチン治療に反応しない患者のＬＤＬコレステロールの低下。
ＬＤＬコレステロールの上昇した患者に、スタチン治療を処方する。患者はスタチン治療に反応しない。次に、ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対するヒト化抗体を含む２５〜５００ｍｇの組成物の皮下注射による治療を患者に処方する。注射は１〜２８日の間隔で行う。ＬＤＬ−Ｃレベルの顕著な低下が観察される。これは、ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対する抗体の非経口投与が、スタチン治療に反応しない患者においてＬＤＬ−Ｃレベルの低下をもたらし得ることを示す。
【０２４８】
実施例１４：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対する低分子化合物を用いた、ＬＤＬコレステロールの低下。
ＬＤＬコレステロールレベルの上昇した患者に、ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位を阻害するように設計された小分子化合物の投与を処方する。この化合物は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与する。ＬＤＬ−Ｃレベルの顕著な低下が観察される。これは、ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位を阻害するように設計された小分子の経口投与が、患者においてＬＤＬ−Ｃレベルの低下をもたらし得ることを示す。
【０２４９】
実施例１５：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対する抗体の作製。
精製したマウスＰＣＳＫ９キメラは、マウスＨＳＰＧ結合の配列伸長をヒト配列伸長（配列番号１のアミノ酸残基７８〜１６７内に包含される）で置換して構築される。マウスをキメラで免疫化する。その後、直接ＥＬＩＳＡによって２段階でクローンを選別する。第１のステップで、野生型ヒトＰＣＳＫ９に結合することができる抗体を、精製した野生型ヒトＰＣＳＫ９でコーティングされたマイクロタイターウェルを使用して選別する。第２の選別ステップでは、マイクロタイターウェルをＨＳＰＧに結合不能な突然変異体ヒトＰＣＳＫ９でコーティングする。突然変異体ＰＣＳＫ９に結合することができる抗体が選別される。固定化されたヒトＰＣＳＫ９に対する選択抗体の親和性を、そのＫｄを測定することによって評価する。引き続き、ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解を阻害する能力について抗体を試験する。
【０２５０】
ヒトＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインに誘導され、ＰＣＳＫ９誘導性ＬＤＬＲ分解を阻害することができる抗体がそれによって選別される。
【０２５１】
実施例１６：Ｂｉａｃｏｒｅを用いたＨＳＰＧ結合部位に対する抗体の選択。
ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対する抗体の親和性及び特異性は、記載されているように（Ｍｕｎｃｋ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、活性化されたＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ  ３０００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで実施される表面プラズモン共鳴法を用いて評価する。ＨＳＰＧに結合できない野生型ヒトＰＣＳＫ９またはヒト突然変異体ＰＣＳＫ９を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で密度７４〜８３ｆｍｏｌ／ｍｍ２になるように固定化し、残りの結合部位は１Ｍエタノールアミンでブロックする。抗体サンプルを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＣａＨＢＳ）中、２５℃で５μｌ／分で注入する。結合性は、固定化されたタンパク質フローセルと対応する対照フローセルとの間の応答の差として算出される相対応答単位（ＲＵ）で表される。速度論的パラメータは、例えばＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１を用いて決定する。
【０２５２】
実施例１７
ＨＳＰＧ結合ドメインに対するＰＣＳＫ９  ｍＡｂを、内因性マウスＰＣＳＫ９プロモーターの制御下でヒトＰＣＳＫ９を発現する、ＬＤＬＲ（ＬＤＬＲ＋／−）の冠動脈疾患マウスモデルヘテロ接合体を用いて試験する。西洋型食餌を与えた動物を、６〜８か月間にわたり３週毎にＰＣＳＫ９  ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置する。実験の最後に、マウスを犠牲にし、大動脈のアテローム性動脈硬化病変を顕微鏡検査する。血漿ＬＤＬ−ｃは、実験期間中、２か月ごとにＥＬＩＳＡによって評価する。
【０２５３】
実施例１８：ＨＳＰＧ及びＬＤＬＲ結合部位に対する抗体を用いた併用療法。
ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ−結合ドメイン（配列番号１のアミノ酸７８〜１６７の間）に誘導されるヒト化抗体は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体と併用される。相乗効果が観察され、それによって投与に要する各抗体の量が低減され、副作用の減少に繋がる。
【０２５４】
実施例１９：スタチン治療に反応しない患者のＬＤＬコレステロールの低下。
患者は、ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇を抑えるスタチン治療を受ける。しかしながら、当初ＬＤＬ−Ｃレベルが低下した後、スタチン誘発性のＰＣＳＫ９の発現増加により、この治療はＬＤＬ−Ｃレベルの有意な低下には奏功しない。
【０２５５】
スタチンに加えて、ＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害する化合物を患者に投与する。投与は低用量（２５〜１５０ｍｇ）の化合物をスタチンと併用して毎週行う。ＬＤＬ−Ｃレベルの顕著な低下が観察され、ＬＤＬ−Ｃが望ましいレベルに達する。
【０２５６】
本実施例は、スタチンを用いた治療に、ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインに対する抗体の投与を補うと、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下に奏功し得ることを示す。
【０２５７】
実施例２０：突然変異したＨＳＰＧ結合部位を有するＰＣＳＫ９は、ＬＤＬコレステロールレベルを上昇させない。
野生型ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合突然変異体は、ＣＧジヌクレオチドを含まない発現プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のハイドロダイナミック法による尾静脈注射によってマウス肝臓で過剰発現させる。このプラスミドは、ＣＧ塩基対のメチル化による不活性化が起こりやすい従来のプラスミドと比較して、長期発現を示す。野生型ＰＣＳＫ９の過剰発現は、ＬＤＬＲの分解の増強を誘発し、血清ＬＤＬコレステロールの上昇をもたらすことで、「機能獲得型」変異体として作用する。ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ突然変異体は、ＬＤＬ受容体の分解を低減することにより、血清ＬＤＬコレステロールレベルの上昇を生じさせない「機能喪失型」変異体として作用する。
【０２５８】
この結果は、動物におけるＬＤＬ受容体の分解に対して、ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合ドメインが果たす中心的役割を示している。
【０２５９】
実施例２１：ＰＣＳＫ９とヘパリン及びヘパリン模倣体との相互作用に基づく小分子ＰＣＳＫ９阻害剤の構造ベースの薬物設計。
ＨｅｐＧ２細胞培養アッセイにおいて、低分子量ヘパリン及びヘパリン模倣体から選択された候補化合物が、ＰＣＳＫ９機能を阻害し、ＬＤＬＲレベルを増加させる能力について試験する。ヘパリン類似体フォンダパリヌクス（商標名Ａｒｉｘｔｒａ）を対照化合物として使用する。得られた構造情報を用いて３−５ファーマコフォアモデルを導出し、これを用いて３００万種の購入可能な化合物からなる既存データベースをスクリーニングする。ＨｅｐＧ２細胞での機能試験のため、多様性に基づいて５０種の化合物のコレクションを選択する。適切な阻害剤は、分子ドッキングモデルの補正及び購入可能な化合物の二次スクリーニングを容易にする。購入してｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に用いる５０種の化合物を選択する。その後、３種の最も有望な候補をマウスモデルで試験し、肝臓内のＬＤＬＲレベル及び血漿中のコレステロールに対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価する。
【０２６０】
実施例２２：ＰＣＳＫ９阻害剤候補の試験
ＰＣＳＫ９阻害剤候補の前臨床試験を、内因性マウスＰＣＳＫ９プロモーターの制御下でヒトＰＣＳＫ９を発現する、ＬＤＬＲ（ＬＤＬＲ＋／−）の冠動脈疾患マウスモデルヘテロ接合体を用いて実施する。西洋型食餌を与えた動物を、６〜８か月間にわたりＰＣＳＫ９阻害剤で処置し、その後、解剖された大動脈の脂肪沈着物をオイルレッドＯ染色した後、顕微鏡によりアテローム斑領域を評価した。コレステロールの血漿濃度は、実験期間中、２か月ごとにＥＬＩＳＡによって評価する。
【０２６１】
本試験により、ＰＣＳＫ９阻害剤候補が血清コレステロールを低下させる能力の評価が可能になる。
【０２６２】
実施例２３：スラミンは、ＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する
スラミンは、非炭水化物ベースの硫酸化ヘパリン模倣体のクラスに属し、そのトロンビンとの複合体の構造モデルにおいて、ヘパリンと重複する結合部位を示す（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。スラミン（０〜２００μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートしたときのＰＣＳＫ９阻害効果をＨｅｐＧ２細胞で試験した（図９−１（Ａ）〜（Ｂ））。試験濃度が最大のスラミン（２００μｇ／ｍｌ）を用いた細胞では、ＬＤＬＲレベルが１５倍、上方調節された。このことは、スラミンがＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを強力に保護することを示唆している。
【０２６３】
実施例２４：肝臓ＬＤＬＲレベルに対するスラミンの効果
スラミンのｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、西洋型食餌を与えたマウスと西洋型食餌を与えなかったマウスに、５〜２０μｇのヒト組換えＰＣＳＫ９を単独で、または５０〜２００μｇのスラミンとの併用で単回静脈内投与（尾静脈）して実施する。各群５〜７匹のマウスを犠牲にし、ウェスタンブロット分析により肝臓ＬＤＬＲレベル（注射後１時間）を、ＥＬＩＳＡにより血漿ＬＤＬ−ｃ（注射後７時間）を評価する。
【０２６４】
本試験は、スラミンの投与がｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＤＬＲレベルの上昇をもたらすことを裏付けるものとなる。
【０２６５】
実施例２５：硫酸デキストラン及びペントサンは、ＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する
修飾多糖化合物のヘパリン模倣体クラスにおいて、硫酸デキストラン（図９−１（Ａ）〜（Ｂ））及びペントサン（図９−３（Ｄ）〜（Ｅ））を、ＨｅｐＧ２を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで試験した。一晩インキュベートした後、ウェスタンブロッティングによりＬＤＬＲレベルを評価すると、硫酸デキストラン（０〜２００μｇ／ｍｌ）での処理時にＬＤＬＲは濃度依存的増加を示し、ＬＤＬＲの上方調節は最大３倍であった。ペントサン（０〜２００μｇ／ｍｌ）のインキュベートは、５０μｇ／ｍｌからの濃度で４倍のＬＤＬＲの上昇をもたらした。
【０２６６】
実施例２６：肝臓ＬＤＬＲレベルに対するペントサンの効果
ヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにペントサンポリサルフェートを注射し、この物質がＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する能力を評価する。
【０２６７】
本試験は、ペントサンの投与がｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＤＬＲレベルの上昇をもたらすことを裏付けるものとなる。
【０２６８】
実施例２７：血清コレステロールレベルに対するペントサンの効果
血清コレステロールが上昇した患者を、ペントサンポリサルフェートの経口投与または皮下注射により処置して、この物質が血清コレステロールを低下させる能力を評価する。ペントサンポリサルフェートは、製造業者による経口用量の摂取後、２時間を中央値として消化管から吸収される。その後、コレステロールレベルを測定する。
【０２６９】
本試験は、ペントサンが血清コレステロールレベルの低下をもたらすことを裏付けるものとなる。
【０２７０】
実施例２８：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＳ−ｄＣ−３６は、ＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する
オリゴヌクレオチドｓ−ｄＣ−３６（０．５〜５．０μＭ）（図９−６（Ｉ）〜（Ｊ））とインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、細胞内ＬＤＬＲタンパク質のレベル上昇を示した（５．０μＭのＳ−ｄＣ−３６で２倍上昇）。Ｓ−ｄＣ−３６は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヘパリン模倣体クラスに属し、このデータはＳ−ｄＣ−３６がＰＣＳＫ９誘導性の分解からＬＤＬＲを効率的に保護することを示唆している。
【０２７１】
実施例２９：ＬＤＬＲ保護のためのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの最適長の決定
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヘパリン結合タンパク質に結合し、その機能を阻害する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが様々なタンパク質に非特異的に結合する能力は、十分に実証されている（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｔｅｉｎ  １９９５）。アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは通常、標的ｍＲＮＡに特異的に結合するための相補的塩基配列を有し、それによりｍＲＮＡの分解を誘導するように設計される。
【０２７２】
ＰＣＳＫ９に結合し、それによりＬＤＬＲを分解から保護するためのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの最適長を、ＨｅｐＧ２細胞株を用いた細胞培養アッセイにおいて決定する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの塩基配列は、種々の細胞株及び組織における遺伝子発現に対して最小の効果を有するように選択される。
【０２７３】
実施例３０：ＬＤＬＲ保護に対する最適化ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果
最適化されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスに注射し、この物質がＰＣＳＫ９誘導性分解からＬＤＬＲを保護する能力を評価する。
【０２７４】
実施例３１：血清コレステロールレベルに対する最適化ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果
最適化されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、血清コレステロールが上昇した患者に注射し、この物質が血清コレステロールを低下させる能力を評価する。
【０２７５】
実施例３２：ＬＤＬＲレベルに対するミポメルセンの効果
ＨｅｐＧ２細胞をミポメルセンとインキュベートし、この物質がＬＤＬＲのレベルを上昇させる能力を評価する。ミポメルセンは、ａｐｏＢ１００アンチセンス修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、コレステロール低下薬である。これは、アポリポタンパク質Ｂ１００のメッセンジャーＲＮＡを標的とするアンチセンス治療薬である。家族性高コレステロール血症に対して、この治療薬を週１回の注射により投与する。
【０２７６】
本試験は、ミポメルセンがＬＤＬＲレベルの上昇をもたらすことを示すものとなる。
【０２７７】
実施例３３
スラミンまたはＰＰＤＡＳ（ピリドキサル−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’−４’−ジスルホン酸）で処置したＡｐｏＥ−／−マウスを、肝臓ＬＤＬＲレベルの上方調節について試験する。スラミン及びＰＰＤＡＳは、ａｐｏＥ−／−マウスのプラークサイズを減少させることが報告されている（Ｇｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２７８】
実施例３４
スラミンで処置したＡｐｏＥ−／−マウスを、肝臓ＬＤＬＲレベルの上方調節について試験する。
スラミンは、ａｐｏＥ−／−マウスのプラークサイズを減少させることが報告されている（Ｇｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２７９】
実施例３６
ＡＴＰとは対照的に、Ｐ２Ｙ６選択的アゴニストＵＤＰは、Ｊ７７４マクロファージでのｍＲＮＡ発現、ならびに誘導性一酸化窒素合成酵素及びインターロイキン−６の活性を増加させる。この効果は、スラミン（１００〜３００μＭ）またはピリドキサル−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’−４’−ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ、１０〜３０ｍＭ）によってブロックされる。最終的に、コレステロール摂取したａｐｏＥ−／−マウスをスラミンまたはＰＰＡＤＳ（それぞれ５０及び２５ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間処置すると、プラーク組成（相対ＳＭＣ及びマクロファージ含量）または細胞複製を変化させることなく、プラークサイズが減少する。
【０２８０】
実施例３７
ｍＡｂ  ５Ｅ１１のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を１０〜１２週齢の雄ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊマウスで試験する。０．９％生理食塩水（ビヒクル対照）、または５Ｅ１１（５０〜２５０μｇ）を含む、もしくは含まないＰＣＳＫ９（１０μｇ）をマウスに静脈内（尾静脈）注射する。１つの実験では、注射の１時間後にマウスから採取し、肝臓ＬＤＬＲレベルをウェスタンブロッティングにより評価する。並行実験では、５Ｅ１１及びＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体結合部位に対する抗体の１：１混合物に相当する量をマウスに注射して、ＬＤＬＲ及びＨＳＰＧ結合部位の両方を標的とするＰＣＳＫ９阻害の効果を評価する。血漿ＬＤＬ−ｃ濃度は、注射後の特定の時点でＥＬＩＳＡにより評価する。ｍＡｂ  ８Ｈ４を用いて同様の実験を行う。
【０２８１】
配列
配列番号１：ＰＣＳＫ９タンパク質−ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００９０６１．１
2018511596.tif 000013
配列番号２（３）、４（５）、６（７）、及び８（９）は、記載のようなラットハイブリドーマＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１、ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４によって発現される免疫グロブリン遺伝子の可変領域を配列決定することにより得た。
配列番号２：ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１＿ＶＫ  ＤＮＡ
2018511596.tif 000014
ＬＯＣＵＳ  ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１＿ＶＫ  ３１８ｂｐ  ＤＮＡ直鎖状
2018511596.tif 000015
配列番号３：ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１  ＶＫ  ＤＮＡ
2018511596.tif 000016
配列番号４：ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４＿ＶＫ  ＤＮＡ
2018511596.tif 000017
ＬＯＣＵＳ  ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４＿ＶＨ  ３３６ｂｐ  ＤＮＡ直鎖状
2018511596.tif 000018
配列番号５：ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４＿ＶＫ  タンパク質
2018511596.tif 000019
配列番号６：ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４＿ＶＨ  ＤＮＡ
2018511596.tif 000020
2018511596.tif 000021
配列番号７：ＢＮＴ−５Ｅ１１−Ｄ４／Ｇ１−Ｅ４＿ＶＨ  タンパク質
2018511596.tif 000022
配列番号８：ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１＿ＶＨ  ＤＮＡ
ＬＯＣＵＳ  ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１＿ＶＨ   ３５４ｂｐ  ＤＮＡ直鎖状  ２０１６年３月９日
2018511596.tif 000023
2018511596.tif 000024
配列番号９：ＢＮＴ−８Ｈ４−Ｂ８／Ｃ７−Ｅ１１＿ＶＨ  タンパク質
2018511596.tif 000025
配列番号１０−配列番号７のＣＤＲ１
ＳＧＹＤＷＳ
配列番号１１−配列番号７のＣＤＲ２
ＤＩＳＹＳＧＳＴＮＹ  ＮＰＳＬＫＳ
配列番号１２−配列番号７のＣＤＲ３
ＬＰＧ
配列番号１３−配列番号５のＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＥＹＳＤ  ＧＹＴＹＬＥ
配列番号１４−配列番号５のＣＤＲ２
ＥＶＳＮＲＦＳ
配列番号１５−配列番号５のＣＤＲ３
ＦＱＧＴＨＤＰＬＴ
配列番号１６−配列番号９のＣＤＲ１
ＳＳＧＩＣＶＳ
配列番号１７−配列番号９のＣＤＲ２
ＴＩＣＷＥＤＳＫＧＹ  ＮＰＳＬＫＮ
配列番号１８−配列番号９のＣＤＲ３
ＶＹＹＷＹＦＤＦ
配列番号１９−配列番号３のＣＤＲ１
ＫＧＳＱＮＩＮＮＹＬ  Ａ
配列番号２０−配列番号３のＣＤＲ２
ＮＴＮＳＬＱＴ
配列番号２１−配列番号３のＣＤＲ２
ＹＱＹＮＮＧＮＴ
【０２８２】
参考文献
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【図１】
2018511596.tif 000033
【図２−１】
2018511596.tif 000034
【図２−２】
2018511596.tif 000035
【図２−３】
2018511596.tif 000036
【図２−４】
2018511596.tif 000037
【図３−１】
2018511596.tif 000038
【図３−２】
2018511596.tif 000039
【図３−３】
2018511596.tif 000040
【図４】
2018511596.tif 000041
【図５−１】
2018511596.tif 000042
【図５−２】
2018511596.tif 000043
【図６】
2018511596.tif 000044
【図７】
2018511596.tif 000045
【図８−１】
2018511596.tif 000046
【図８−２】
2018511596.tif 000047
【図８−３】
2018511596.tif 000048
【図８−４】
2018511596.tif 000049
【図８−５】
2018511596.tif 000050
【図８−６】
2018511596.tif 000051
【図９−１】
2018511596.tif 000052
【図９−２】
2018511596.tif 000053
【図９−３】
2018511596.tif 000054
【図９−４】
2018511596.tif 000055
【図９−５】
2018511596.tif 000056
【図９−６】
2018511596.tif 000057
【図９−７】
2018511596.tif 000058
【図１０−１】
2018511596.tif 000059
【図１０−２】
2018511596.tif 000060
【図１１】
2018511596.tif 000061
【図１２】
2018511596.tif 000062
【図１３】
2018511596.tif 000063
【配列表】
2018511596000001.app
【国際調査報告】
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