(57)【要約】  本開示は、天然ジフテリア毒素よりも免疫応答の誘導が少ないジフテリア毒素(DT)分子を生じるように変異させたDT分子を含む二重特異性リガンド指向型毒素(BLT)を提供する。脱免疫化DT分子は標的化リガンドと融合されて、細胞を標的としてその標的細胞を殺す脱免疫化DTを選択的に送達できる融合タンパク質が生成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ジフテリア毒素（DT）ドメイン：
DT触媒部位；及び
抗毒素抗体の誘導が野生型ジフテリア毒素と比較して低くなる1つ以上のアミノ酸置換；を有する；及び
標的に選択的に結合する1つ以上の標的化ドメイン；
を含有する、ポリペプチド。
【請求項２】
測定可能なジフテリア毒素毒性を呈する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的化ドメインが腫瘍細胞の成分に選択的に結合する、請求項1又は2のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記標的化ドメインが、上皮増殖因子（EGFR）に選択的に結合する上皮増殖因子（EGF）ポリペプチドを含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記標的化ドメインが、IL-13受容体に選択的に結合するIL-13ポリペプチドを含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記標的化ドメインが、CD22に選択的に結合するポリペプチドを含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記標的化ドメインが、CD19に選択的に結合するポリペプチドを含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記DTドメインがDT390を含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
2つ以上の標的化ドメインを含有する、請求項1〜8のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第一の標的化ドメインがIL-13ポリペプチドを含有し、第二の標的化ドメインがEGFポリペプチドを含有する、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第一の標的化ドメインがCD19に選択的に結合するポリペプチドを含有し、第二の標的化ドメインがCD22に選択的に結合するポリペプチドを含有する、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記DTドメインが3つ以上のアミノ酸置換を含むDT390のバリアントを含有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記3つ以上のアミノ酸置換が、アミノ酸残基104、アミノ酸残基385、及びアミノ酸残基292の置換を含む、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記3つ以上のアミノ酸置換が、K104S、K385G、及びE292Sを含む、請求項13に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記DT390のバリアントが7つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記7つ以上の置換が、アミノ酸残基173、アミノ酸残基245、アミノ酸残基385、アミノ酸残基292、アミノ酸残基184、アミノ酸残基227の置換を含む、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記7つ以上のアミノ酸置換が、K125S、R173A、Q245S、K385G、E292S、Q184S及びK227Sを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
細胞を殺す方法であって、以下の工程：
殺す細胞を、細胞がポリペプチドを内部化することを可能とする条件下で、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリペプチドと接触させる工程；及び
ポリペプチドに細胞を殺させる工程；
を含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞がインビトロで存在する、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がインビボで存在する、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍を担持する対象を治療する方法であって、以下の工程：
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドを対象に投与する工程；
を含み、ここで1つ以上の標的化ドメインが腫瘍の細胞上に存在する標的上に選択的に結合する、方法。
【請求項２２】
前記標的がEGFRを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的が、Her2、CD19、CD133、ROR1、CD20、CD22、CD33、CD52、EpCAM、CEA、UPA、又はVEGFRを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、化学治療薬物の投与の前、同時、又は後に投与される、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
ジフテリア毒素ポリペプチドを脱免疫化する方法であって、以下の工程：
天然のジフテリア毒素ポリペプチドの表面に配置される親水性アミノ酸残基を同定する工程；
同定された親水性アミノ酸残基の1つの置換を含む改変ジフテリア毒素ポリペプチドを構築する工程；
天然ジフテリア毒素ポリペプチドの生物学的機能に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程；及び
抗体の誘導に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程；
を含む、方法。
【請求項２６】
前記改変ポリペプチドが、同定された親水性アミノ酸残基の2つ以上の置換を含むように構築される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記改変ポリペプチドが、天然ポリペプチドの生物学的活性の10%以上を呈する、請求項25又は26のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願との相互参照
本発明は、2015年10月2日に出願したU.S. Provisional Patent Application No. 62/236,568に対し優先権を主張し、本発明は当該出願を参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、National Institutes of HealthよりR01 CA36725として与えられた米国政府の援助により成された。本発明において米国政府は一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本発明は、2016年9月30日に作成されたサイズ58キロバイトの題名「2016-09-30-SequenceListing_ST25.txt」のASCIIテキストファイルとしてUnited States Patent and Trademark OfficeにEFS-Webを介して電子的に提出された配列表を含む。この配列表に含まれる情報は本発明において参照により援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、一つの側面において、ジフテリア毒素(DT)ドメイン及び標的化ドメインを含有する加工ポリペプチドを記載する。DTドメインは、DT触媒部位と、野生型ジフテリア毒素と比較して抗毒素抗体の誘導を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む。標的化ドメインは、標的に選択的に結合する標的化部分を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
幾つかの態様において、標的化ドメインは、腫瘍細胞の成分に選択的に結合する。幾つかの態様において、前記ポリペプチドは、2つ以上の標的化ドメイン及び/又は2つ以上の標的化部分を含み得る。
【０００６】
幾つかの態様において、DTドメインは、DT390のアミノ酸配列と比較して3つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０００７】
他の側面において、この開示者は、細胞を殺す方法を記載する。一般に、当該方法は、殺す細胞を、細胞がポリペプチドを内部化することを可能とする条件下で、上記いずれかの態様のポリペプチドと接触させる工程；及びポリペプチドに細胞を殺させる工程を含む。様々な態様において、細胞はインビトロ又はインビボであってもよい。
【０００８】
他の側面において、この開示者は、腫瘍を担持する対象を治療する方法を記載する。一般に、当該方法は、上記いずれかの態様のポリペプチドを対象に投与する工程を含み、ここで当該ポリペプチドは、腫瘍の細胞上に存在する標的上に選択的に結合する標的化ドメインを含有する。
【０００９】
他の側面において、この開示者は、ジフテリア毒素ポリペプチドを脱免疫化する方法を記載する。一般に、当該方法は、天然のジフテリア毒素ポリペプチドの表面に配置される親水性アミノ酸残基を同定する工程、同定された親水性アミノ酸残基の1つの置換を含む改変ジフテリア毒素ポリペプチドを構築する工程、天然ジフテリア毒素ポリペプチドの生物学的機能に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程、及び抗体の誘導に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程を含む。
【００１０】
本発明の上記概要は、本発明のそれぞれの開示される態様又はあらゆる実施を記載していると意図されない。以下の記載は、より具体的に説明的な態様を例示する。本願全体の幾つかの場所で、例示の一覧を通じて指導が提供され、これらの例示は、様々な組み合わせで用いられ得る。各例において、列挙される一覧は、代表的な群とのみ見做され、排他的な一覧と解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、dDTEGF13遺伝子を含有するプラスミドの構築を示す。(A)dDTEGF13コーディング配列(配列番号13)を含有するpET発現ベクターを示す。PyMol球形図は、ジフテリア毒素のProtein Data Bank (RCSB PDB; Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res 28:235-242)x線結晶学的構造(DT; PBD ID: 1MDT)をPyMOL 3D分子モデリングプログラム(Schrodinger, LLC, New York, NY)中にダウンロードすることによって生成された。当該タンパク質の正面像及び当該分子の180°反転像を示す。(B)ADP-リボシル化(触媒部位)と結合するアミノ酸を黒色で示す。(C)脱免疫化のために変異させたアミノ酸を黒色で示す。(D)SDS-PAGEゲル解析を実施してサイズ及び純度を確認し、クーマシーブルーで染色した。レーン1-分子量マーカー、レーン2-dDTEGF13非減少、レーン3-dDTEGF13減少。クーマシーブルーを用いてゲルを染色した。(E)精製した薬物のHPLC解析でも、TSK3000サイズ排除カラムから得られた殆ど単一のピークが示される。1つだけのピークが回収され、>95%の純度がもたらされた。
【００１２】
【図２】図２は、脱免疫化を達成する様々なDTEGF13変異体を生産及びスクリーニングする3相の戦略を示す。1相において、8個の3重変異体が合成及び精製された。これらの4つが、無変異親対照と比較して、インビトロスクリーニングアッセイにおいて、1ログを下回る活性の損失を示した。2相において、変異体を組み合わせて、親と比較して1ログを下回る活性の損失を尚も有する5重変異体を作製した。3相において、1つの7重変異体が、尚も1ログを下回る活性損失を有していた。グリシン、アラニン及びセリン置換が採用された。
【００１３】
【図３】図３は、dDTEGF13のインビトロ活性を示す。(A)二特異性DTEGF13及びその一特異性対応物を試験し、それらのMiaPaCa-2細胞に対する反応性を比較した。標的化毒素と共に72時間インキュベーションした後の3H-チミジン取込みを解析することによって、増殖アッセイを実施した。データは、対照の反応性のパーセントとしてレポートされる。各データポイントは、3重の測定値の平均±S.Dを表す。脱免疫化DTEGF13及び無変異親DTEGF13が試験され、チミジン取込みアッセイにおいて、(B)HT-29結腸細胞及び(C)PC-3前立腺癌細胞に対する活性が比較された。(D)ブロッキングアッセイが実施された。このアッセイにおいて、MiaPaca-2膵臓癌細胞系を阻害用量のDTEGF13と共にインキュベーションし、漸増濃度の毒素を欠くEGF13リガンドでブロックした。そしてチミジン取込みを測定した。
【００１４】
【図４】図４は、Raji細胞に対するdDTEGF13のインビトロ活性を示す。二特異性dTEGF13及びその一特異性対応物を、RajiB細胞に対するそれらの反応性について試験した。標的化毒素と共に72時間インキュベーションした後の3H-チミジン取込みを解析することによって、増殖アッセイを実施した。データは、対照の反応性のパーセントとしてレポートされる。
【００１５】
【図５】図５は、dDTEGF13の免疫原性を示す。0.25μgのDTEGF13(n=5)又はdDTEGF13(n=5)で免疫化したマウスから毎週採取した試料に対し抗DT390血清IgGを測定することによって、脱免疫化dDTEGF13及び無変異親薬物に対する免疫応答を判定した。間接ELISAを用いて測定を行い、高度に精製した高力価の抗DT抗体によって作成した標準曲線を用いて抗体の定量を行った。(A)BALB/cマウスにおける応答；(B)C57BL/6マウスにおける応答。
【００１６】
【図６】図６は、中和抗体を示す。56日目に(A)親DTEGF13又は(B)dDTEGF13の多重注射で免疫化したマウスから血清を回収した。個々のマウスから採取した血清を既知の阻害濃度のDTEGF13で処理した細胞と共にインキュベーションして、中和を試験した。72時間後のトリチウムチミジンの取込みを測定することによって、増殖アッセイを実施した。56日での各血清において測定されたIgG抗毒素の血清濃度を示す。血清レベルと中和抗体の存在との間に相関が存在する。
【００１７】
【図７】図７は、樹立されたPC-3腹側部腫瘍のdDTEGF13による処理の効果を示す。(A)PC-3腹側部腫瘍を担持するヌードマウスを、dDTEGF13、対照DT2219ARLで腫瘍内的に処理し、又は処理しなかった。腫瘍に対し、dDTEGF13を12回注射して処理を行った。各処理群において、平均腫瘍体積を示す。(B)個々の腫瘍体積は、無関係の対照BLT処理群(DT2219ARL)及び無処理マウスの両方において示される。個々の腫瘍の成長は時間に対しプロットされる。
【００１８】
【図８】図８は、dDT2219(配列番号3)のインビトロ活性を示す。dDT2219は、トリパンブルー生存率アッセイにおいて試験された。この試験において、異なる細胞系、CD22+CD19+ Daudi細胞をプレーティングし、10nMの薬物をプレートに添加した。生存率は毎日判定された。死んだ細胞はトリパンブルー色素を取り込み、一方生きている細胞は取り込まない。細胞は、血球計算板を用いて視覚的にカウントした。dDT2219で処理して3日後に生存している細胞は無かった。Bic3で処理した細胞において、影響は最小限であった。
【００１９】
【図９】図９は、非脱免疫化DTアミノ酸配列(配列_2;配列番号2)と比較した例示的脱免疫化DTアミノ酸配列(配列_1;配列番号1)を示す。ボックスは、アミノ酸置換の例示的部位を示す。
【００２０】
【図１０】図１０は、dDT2219の構築及び精製を示す。(A)dDT2219コード領域はNcoI制限部位、脱免疫化DT分子の最初の390アミノ酸(dDT390)、抗CD22scFv、抗CD19scFv、及びXhoI制限部位を有する。(B)dDT2219の吸光度トレースを示す。矢印は所望の産物をマークしている。(C)SDS-PAGEゲル及びクーマシーブルー染色によってサイズ比較を実施した。dDT2219、DT2219、分子量スタンダード[MWスタンダード]、DTを欠いて抗CD22scFvとスプライスされた抗CD19scFv[2219]及びジフテリア毒素単独[DT]のサイズが比較された。dDT2219のサイズは97.5kDである。(D)サイズ排除カラム精製後の純度は90%超であった(産物はC3〜C6フラクションでマークされる)。
【００２１】
【図１１】図１１は、dDT2219の活性及び動態を示す。(A)dDT2219、(B)DT2219及び(C)BIC3(DTとコンジュゲートした一特異性抗CD3scFv)の動態及び活性を、Daudi細胞を用いて評価した。ラベルされたように薬物の濃度を漸増して、12時間、24時間又は36時間のインキュベーション時間後に比較を実施した。dDT2219と比較して、より高濃度(1、10、100nM)のDT2219において僅かに活性の亢進が観察されたが、陰性対照のBIC3において効果は見られなかった(Daudi細胞はCD19及びCD22を発現するがCD3を発現しない)。(D)において、異なるBurkitt Lymphoma細胞系(Raji細胞)を用いて直接比較が実施された。dDT2219及びDT2219において効果が確認されたが、BIC3において効果は見られなかった(Daudi細胞はCD19及びCD22を発現するがCD3を発現しない)。
【００２２】
【図１２】図１２は、標的細胞の死滅の特異性を示す。dDT2219の特異性を評価するため(DT2219及びBIC3は対照)、増殖アッセイを実施した。(A)HPB-MLT細胞(CD3を発現するT細胞白血病細胞)に各薬物を添加した後、BIC3においてのみ増殖の阻害が見られた。HL-60細胞(CD3-、CD22-、CD19-急性前骨髄白血病細胞系)に各薬物を添加した場合、増殖の阻害は検出されなかった。
【００２３】
【図１３】図１３は、特異的結合の評価を示す。ラベルされた濃度におけるFITC標識dDT2219(A)又はDT2219(B)にDaudi細胞を暴露した。蛍光は、dDT2219-FITCにおいて<85%及びDT2219-FITCにおいて75%の結合を示した。更に、Daudi細胞を、漸増濃度のdDT2219-FITC及びDT2219-FITCと、同一の無標識の薬物100 nM, 200 nM, 又は500 nMに再び暴露した。FITC標識した薬物は両方とも、無標識構築物の特異的ブロッキングにより、結合の減少を示した。
【００２４】
【図１４】図１４は、CLLにおける結合を示す。患者由来のCLL試料を、FITC-標識dDT2219, DT2219 及び抗-EpCAM scFv (対照)に暴露した。(A), (B)及び(C)は、ラベルされた通りの漸増濃度の各薬物の暴露後の結果を示す。(D)患者由来CLL試料をFITC-標識dDT2219又はDT2219に暴露した。各構築物100nMとの結合特性の直接比較は、それぞれdDT2219及びDT2219群において93 ± 3.5%及び88 ± 4.4%の統計的に異ならない結合を示した(p=0.25)、(n=12)。
【００２５】
【図１５】図１５は、中和抗体を示す。14頭のBALB/c免疫適合マウスを各7頭ずつ2つの群に分割した。両群にdDT2219(実験群)又はDT2219(対照群)を腹腔内接種し、21, 35, 49, 63, 77, 99, 160日に血液を採取した。α-DT390抗体を検出するELISAを実施して血清を評価した。(A)評価した全ての日で、dDT2219群におけるα-DT390抗体の顕著な濃度低下が見られた。(B)検出された抗体の機能性を評価するため、Raji標的を用いて中和アッセイを実施した。dDT2219群において、機能的な中和抗体の量の顕著な低下が見られた。(C, D)DT2219で免疫化した群において、7頭中6頭のマウス(マウス2〜7)は高力価の中和抗体を生じたが、dDT2219で処理した群において、機能的抗体を生じたマウスは7頭中2頭(マウス3〜7)であった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
例示的態様の詳細な説明
本開示は、脱免疫化標的化毒素に関連する化合物、組成物及び方法を記載する。生物薬物の使用は、それらがヒト免疫系によって異物と認識され得るため、限定され得る。これは、例えばジフテリア毒素(DT)のような細菌タンパク質である場合に特に顕著であり得る。ジフテリア毒素は、標的化毒素として有望であるが、デニロイキンジフチトックス(ONTAK, Eisai Co., Ltd., Tokyo, Japan)のような連邦医薬品局(FDA)が認可したDTベースの薬物でさえ、複数回処理後の抗毒素応答を引き起こし得る。更に、ジフテリア、破傷風及び百日咳(DPT)免疫化を幼少期に受けた者は、DTベース薬物による複数回処理で抗毒素応答を引き起こす確率がより高くなる。DT標的化毒素(TT)は、多くの異なる動物モデル及び患者において、抗癌応答を引き起こす効果が実証されている。従って、この毒素の脱免疫化形態の追求は望ましいが、達成できない目標ではない。
【００２７】
ジフテリア毒素は、2つの機能ドメインを有する535アミノ酸タンパク質(mw58.3kDa)である。C末端Bドメインは、殆どの赤血球に結合する。Bドメインは除去されて、DT390を形成してもよく、及び／又はリガンドと置換されて、DT標的化毒素を形成し得る。N末端Aドメインは、伸長因子2(EF-2)をADP-リボシル化する触媒領域を含む。
【００２８】
DTEGF13は、短縮DT(DT390)及び2つのリガンドを有する、二機能性リガンド指向毒素(BLT)である。リガンドは、IL=13及び上皮成長因子(EGF)を含む。これらのリガンドは、関連しない受容体に結合する。EGFはerbBファミリーに属する膜貫通シグナリングタンパク質である上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する。EGFRは、前立腺癌、膵臓癌、乳癌及び／又は肺がんを含む様々な癌で過剰発現する。IL-13は多面的なリンホカインであり、その受容体は、腫瘍、B細胞及び単核球で過剰発現している。DTEGF13は、それらの標的と、EFF及びIL-13リガンドを介して結合し、一旦内部化すると、それは標的細胞に毒性となる。インビボで、DTEGF13は、限定されないが、局所又は全身異種移植モデルにおける前立腺癌、膠芽腫、及び膵臓癌を含む癌に対して、局所的及び全身的に有効である。従って、DTEFF13は、インビボで注入されたとき抗ジフテリア毒素応答を生じ、脱免疫化のモデルを提供する。
【００２９】
X-線結晶構造モデルに基づいて、表面に位置して、NAD-リボシル化触媒部位から遠い、親水性アミノ酸を、本発明の脱免疫化DT分子を創作するための点突然変異のために選択した。突然変異体を連続的にスクリーニングして、活性の損失が最小のものを選択した。少なくとも7つの突然変異を有する候補変異体を、動物モデルに複数回注入で投与した場合抗毒素IgG抗体を産生するそれらの能力を試験した。複数回の免疫化に拘らず、脱免疫化DTEGF13(dDTEFG13;配列番号8)は、無変異親形態と比較して、抗毒素誘導の減少を示した。
【００３０】
図1Aは、dDEGF13プラスミド構築物及びX-線結晶構造の前及び逆(180°)位置の両方のPyMol球形モデルを示す。活性部位のアミノ酸は、図1Bに示す。図1Cは、脱免疫化のための7つの変異アミノ酸を示し、分子上の表面位置を暗くして分かりやすくしている。クーマシーブルー染色によって決定された純度95%超のdTEGF13のSDS-PAGEゲル解析を、図1Dに示す。分子量スタンダードから、分子量サイズは、68.9kDaと推定される。
【００３１】
X-線結晶構造による分子モデルに基づき、表面位置に配置された20個のアミノ酸残基が同定された。一連の8つの変異体が作製され、それぞれ3つの点突然変異を有する。従って、全体で24個の点突然変異を探索した。アラニン及びセリン置換を採用した。チミジン取込みを測定する標準的な高度に再現性の増殖阻害アッセイを用いて、活性損失について変異体をスクリーニングした。
【００３２】
図2は、いずれの変異体が最小の活性損失を呈し、他の変異体とその後組み合わせられたかを示す(相1)。1ログを下回る損失を呈した変異体の点突然変異が、DTEGF13まで同一の分子上で、当該分子の別個の領域における7つの突然変異と組み合わせられ、そしてインビトロ増殖アッセイにおいて1ログを下回る活性の減少が得られた(相3)。図1Aに示す変異体は、その後、免疫適合マウスにおける抗毒性応答を生じる能力において試験された。
【００３３】
図3Aは、DTEFG13二機能性リガンド指向毒素がEGF+IL13+細胞系MDA-MB-23乳癌細胞系に対し強力かつIC50が0.019 nMであり、そしてインビトロ増殖スクリーニングアッセイにおけるその一機能性対応物よりも優れた活性を有することを示す。加えて、図3Bは、dDTEGF13が、HT-29ヒト大腸癌細胞系に対し無変異親対照と同等の活性を有することを示す。図3Cは、dDTEGF13及び無変異親対照がPC-3前立腺癌に対して試験された場合も同じであったことを示す。図3Dは、DTEGF13がMiaPaCA-2細胞に対する毒性を欠くEGF13リガンドでブロックできたため、dDTEGF13分子のEGF13リガンド部分が、標的細胞に対する選択的な結合によって仲介されたことを示す。図4は、dDTEGF13が、EGFR-IL13R-対照B細胞系Daudiを阻害せず、陽性対照抗B細胞BLTのDT2219ARL (Vallera et al., 2009, Leuk Res 33:1233-1242)を阻害したことを示す。これらのデータは、活性がリガンドの選択的結合を通じて仲介されることを示唆する。
【００３４】
DTEGF13が確かに脱免疫化したかどうかを判定するため、免疫適合BALB/cマウスの群(H-2d)を0.25 μgの変異dDTEGF13又は無変異親DTEGF13で毎週免疫化した。マウスは、82日間腹腔内投与で免疫化された。血清試料を毎週採取し、ELISAを用いて抗dDTEGF13IｇGを検出した。免疫化実験の結果を図5Aに纏める。これは、dDTEGF13 MC2及び親対照で免疫化したマウスの群の抗毒素応答の間に統計的差異が有ることを示している。12回の免疫化の後、dDTEGF13 MC2群の免疫応答は最小であったが、親群の平均の抗DT390応答は1500μg/ml超であった。抗原の提示が異なる第二の系において抗毒素血清レベルが減少し得るかどうかを判定するため、異なるH-2ハプロタイプ(H-2b)を有するC57BL/6マウスを用いて同じ実験を反復した。その結果は殆ど同一であった(図5B)。
【００３５】
免疫化マウスの血清中に中和抗体が存在していたかどうかを判定するため、図5Aのマウスの血清を、既知の阻害濃度1000ng/mlのdDTEGF13に添加した。処理された細胞を増殖アッセイにおけるトリチウムチミジン取込みによって試験した。図6Aは、処理したMiaPaCa-2細胞の対照応答パーセント及び親DTEGF13で複数回処理した3頭のマウスの56日目の血清で処理した細胞の応答を示す。これらのマウスによって高いIgG血清抗毒素レベルが見られ(2,429 μg/ml, 1,272 μg/ml, 及び579 μg/ml)、これは高い中和活性に関連する。対照的に、図6Bは、dDTEGF13で複数回免疫化した3頭のマウスの56日目の血清で処理した細胞の応答を示す。血清抗毒素レベルは低く、これは中和活性の欠如に関連する。これらのデータは、dDTEGF13で免疫化したマウスの56日目の血清中に、中和抗体が存在しなかったことを示す。
【００３６】
インビボでdDTEGF13が腫瘍増殖を阻害する能力を試験するため、ヌードマウスの脇腹にPC-3細胞を注入した。腫瘍が樹立し触診可能になってから、マウスに複数回腫瘍内注射で処理を行った。ヒトEGF及びIL-13(DTEGF13の)はそれぞれマウスEGFR及びIL13Rと反応するので、dDTEGF13は、マウスモデルにおいて試験された。図7Aは、マウス群に対し無処理又は0, 1, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77日にdDTEGF13の注入(0.25μg/注入)を与えた第一の実験の平均腫瘍体積データを示す。図7Bは、個別の対照マウスの腫瘍増殖を示す。対照マウスは、無処理又は無関係の免疫毒素対照DT2219ARLのいずれかであった。複数回のdDTEGF13の注射は、45日で実験が終了するまで、陰性対照と比較して腫瘍増殖の阻害の効果を示した。
【００３７】
この開示は、従って、一つの側面において、分子薬物の開発に用いられ得る脱免疫化DT標的化毒素ポリペプチドを記載する。一般に、前記ポリペプチドは、DT触媒部位と、標的細胞に選択的に結合するように選択された1つ以上の標的化ドメインを含有する、脱免疫化ジフテリア毒素ドメインを含有する。幾つかの場合、標的化ドメインは、腫瘍細胞標的に選択的に結合するドメインを含有し得る。ここで、「脱免疫化」とは、脱免疫化されていない分子と比較して、それが投与された対象においてポリペプチドが誘導する免疫応答の程度が減少するように改変されたポリペプチドを意味する。幾つかの場合、DT標的化毒素分子に対する抗体応答が測定される。一つの態様において、抗体誘導は、免疫適合マウス系統において誘導される抗体酸性に関して特徴づけられ得る。また、ここで、「選択的」とは、特定の所望の標的に対する、任意の程度での、例えば一般に非選択的親和性といわれるよりも高い、差異的な親和性を有することを意味する。例示的標的化ドメインは、標的細胞が発現するその受容体に選択的に結合する、例えばEGF, IL-13、抗-CD19、及び／又は抗-CD22等のリガンド又は結合部分の十分な部分を含み得る。得られるポリペプチドは、測定可能なジフテリア毒素毒性を呈し、野生型ジフテリア毒素と比較して免疫適合マウス中の抗毒素抗体の誘導が低い。このポリペプチドは、膵臓癌、乳癌及びグリオーマ等の新生物症状等に対して有効な薬物として有用であり得る。
【００３８】
幾つかの態様において、脱免疫化DT分子は、DT390(又は全長DT)と比較して1つ以上のアミノ酸置換を有し得る。従って、dDT分子は、DT390又は全長DTに対し、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上の変異を有し得る。
【００３９】
従って、幾つかの態様において、dDT分子は、15, 100, 104, 125, 173, 185, 227, 242, 245, 292, 318, 又は385アミノ酸残基の3つ以上の置換を含み得る。一つの態様において、dDT分子は、K125, R173, 及びQ245のアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K125S, R173A, 及びQ245Sのアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K104, K385, 及びE292のアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K104S, K385G, 及びE292Sのアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、E100, Q184, 及びK227のアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、E100S, Q184S, 及びK227Sのアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、E15S, D318, 及びK242Sのアミノ酸置換を含み得る。
【００４０】
他の態様において、dDT分子は、5つ以上のアミノ酸置換を含み得る。従って、一つの態様において、dDT分子は、K125, R173, Q245, K385, 及びE292のアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K125S, R173A, Q245S, K385G, 及びE292Sのアミノ酸置換を含み得る。
【００４１】
尚も他の態様において、dDT分子は、7つ以上のアミノ酸置換を含み得る。従って、一つの態様において、dDT分子は、K125, R173, Q245, K385G, E292, Q184及びK227のアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K125S, R173A, Q245S, K385G, E292S, Q184S, 及びK227Sのアミノ酸置換を含み得る。他の態様において、dDT分子は、K125S, R173A, Q245S, K385G, E292S, Q184S, 及びK227Sのアミノ酸置換を含み得る。
【００４２】
dDT分子はセリン、アラニン及び／又はグリシンの置換を用いて記載されるが、これらは例示的分子であり、当業者は、他のアミノ酸が本願dDT分子を提供し得るかどうかを容易に判定し得る。例えば、実施例に記載するように、アラニン、セリン及びグリシンは、活性及び免疫原性の減少についてスクリーニングされ得るdDT分子を生産するために相互置換可能で使用され得る。
【００４３】
標的化ドメインが、所望の標的に選択的に結合するのに十分なEGF, IL-13, 抗CD19, 抗CD22の部分を含有している例示的態様の文脈において、標的ドメインは、任意の適切な標的化部分を含有し得る。「標的化部分」は、標的化ドメインに採用され得る標的選択的親和性(例えばリガンドに対する受容体への)を有する化合物(例えばリガンド)の部分を意味する。標的化部分は、リガンド、抗体、サイトカイン又はインターロイキンであり得、又はそれらに由来し得る。幾つかの場合、標的化部分は、標的細胞が有る程度特異的に発現する受容体に結合するリガンド等の腫瘍特異的マーカーの少なくとも一部を認識する剤であり得、又はそれに由来し得る。他の場合、標的化部分は、抗体であり得、又は抗体に由来し得る（例えば、ある程度の免疫特異性を提供し得るのに十分な抗体の免疫特異的部分）。
【００４４】
様々な態様において、標的化ドメインは、1つ以上の標的化部分を含有し得る。例えば、dDTEGF13として本願で示す例示的態様は、第一及び第二の標的化部分を含有する。第一の標的化部分は、EGFRに選択的に結合するためのEGFの十分な部分を含み、一方、第二の標的化部分は、IL-13受容体に選択的に結合するためのIL-13の十分な部分を含む。同様に、dDT2219として本願で示す例示的態様も、第一及び第二の標的化部分を含有する。第一の標的化部分は、CD-19に選択的に結合するための抗-CD19 scFvの十分な部分を含み、一方、第二の標的化部分は、CD-22に選択的に結合するための抗-CD22 scFvの十分な部分を含む。
【００４５】
従って、様々な態様において、標的化ドメインは、例えばEGFR, HER2/neu, EpCAM, CD19, CD20, CD22, CD30, CD52, CD33, ROR-1, UPAR, VEGFR, CEA, UPA, LIV-1, SGN-CD70A, CD70, IL-3アルファ受容体, IL-4R, CD133, ROR1, メソテリン, TRAIL, CD38, CD45, CD74, 又はCD23に選択的に結合するポリペプチドを含有し得る。
【００４６】
dDT2219分子は、当該分子のジフテリア毒素ドメインが脱免疫化DTドメインに置換されたDT2219の操作バリアントである。DT2219は、ヒトCD19及びCD22細胞表面受容体を標的とする抗体の二機能性一本鎖可変断片(scFV)と融合させたジフテリア毒素(DT390)の触媒及び転移促進ドメインを含む組換え融合タンパク質である。当該タンパク質は、DTの天然の結合領域がより強力に結合するscFVによって置換されるように操作される。結合後、CD19及びCD22は急速に内部化されて、毒素のサイトゾル内への浸入、タンパク質合成の阻害、及び／又はその後のアポトーシス細胞死が促進される。
【００４７】
CD19は95kDaの膜糖タンパク質であり、Bリンパ球の全ての分化段階で細胞表面に常に存在し、また殆どのB細胞成熟リンパ腫及び白血病細胞上でも発現している。CD22は、135-kDaの糖たんぱく質で、前駆B急性リンパ芽球性白血病を含むB系列リンパ系前駆体上で発現し、しばしば成熟B細胞悪性腫瘍上でCD19と共発現している。DTは、強力な細胞周期非依存的細胞死を誘導するため、化学療法不応性の悪性腫瘍の代替療法として特に有効であり得る。
【００４８】
dDT2219分子の構築は、図10Aに示されている。脱免疫化DT(dDT390), 抗-CD22のVH及びVL領域、並びに抗-CD19 scFvのVH及びVL領域が、図のように組み立てられている。活性断片はEASGGPE(配列番号4)及びARLリンカー(配列番号6)を介して連結されて、dDT2219を形成する。三段階溶出プロトコルを用いた薬物精製における第一相としてFFQイオン交換カラムから溶出したdDT2219における吸光度追跡を、図10Bに示す。当該カラムから溶出した第一のピークが所望の産物を示す。SDS-PAGEゲル(図10C)及びクーマシーブルー染色は、イオン交換及びサイズ排除カラム精製の両方の後の純度を示す(図10D)。産物の純度は90%以上であり、サイズは約97.5kDaであった。
【００４９】
親DT2219と比較したdDT2219の活性及び動態を示すため、CD19+/CD22+ Burkittリンパ腫細胞系Daudi及びRajiを用いて増殖アッセイを実施した。従って、Daudi細胞によるチミジン取込みが、漸増濃度(0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 及び100 nM)の各薬物(図11A dDT2219, 図11B DT2219)に暴露された12時間、24時間及び36時間後に評価された。より高い濃度(1-100 nM)で、24及び36時間後、DT2219群における活性のパーセンテージの僅かな増大が見られ、一方BIC3に暴露した対照群においては、全ての時間で増殖の阻害は見られなかった(Daudi細胞はCD3を発現しない)(図11C)。加えて、Burkittリンパ腫細胞系Rajiを用いて、この結果の再現性を確認した。dDT2219, DT2219, 及びBIC3を用いて72時間インキュベーションする同様の増殖アッセイにおいて、IC50はdDT2219において1.03、DT2219において0.23と推定された。やはりBIC3は効果を示さなかった(図11D)。
【００５０】
dDT2219の特異性を評価するため(DT2219及びBICを対照とした)、HPB-MLT細胞(CD3を発現するがCD19又はCD22を発現しないT-細胞白血病細胞)並びに所定の漸増濃度のdDT2219, DT2219, 及びBIC3を用いて、増殖アッセイを行った。dDT2219及びDT2219暴露後、効果は見られなかった。BIC3のみアポトーシスが減少した(図12A)。CD22, CD19及びCD3が陰性である急性前骨髄白血病細胞HL-60は、処理後阻害を示さなかった(図12B)。
【００５１】
フローサイトメトリーを用いて、結合及びブロック特性を比較した。漸増濃度(1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 又は500 nM)のFITC標識dDT2219(図13A)及びDT2219(図13B)を添加して、Daudi細胞をインキュベーションした。dDT2219において85%超、DT2219において75%超の結合能力の増大が見られた。同一の細胞を、同一の用量のdDT2219又はDT2219で処理し、100 nM, 200 nM, 又は500 nMの無標識dDT2219又はDT2219にも暴露した。これら脱免疫化及び親無標識薬剤は十分な結合を示し、蛍光強度の減少に見られるように、FITC標識薬物の連続的及び用量依存的ブロックを示した。
【００５２】
臨床的文脈での結合能力を評価するため、CLL患者から得た試料を用いて、dDT2219及びDT2219の結合を比較した。試料を漸増濃度(薬物無し、1 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM, 又は100 nM)のFITC-標識dDT2219又はDT2219に暴露した。CLL集団上で開閉した後、両方の構築物において、用量依存的な結合の増大が見られた(図14A及び14B)。陰性対照としてFITC-標識抗-EpCAM scFvを用い(図14C)、これは結合を示さなかった。dDT2219及びDT2219の間の直接比較において、各患者試料を100 nMのdDT2219又はDT2219に暴露した。全ての12個のCLL試料において見られた平均の蛍光(結合を示す)は93%及び88%で、両群間で有意な差は無かった(p＝0.25)(図14D)。これは、結合特性が同じであることを示唆する。
【００５３】
dDT2219に反復して暴露した後の免疫化マウスの血清中に中和抗体が生じているか否かを評価するため、BALB/cマウスを7頭の群2つに分けた。両群をdDT2219又はDT2219(対照群)のいずれかで同時に免疫化した。両群を、同濃度のdDT2219又はDT2219で処理した。全ての評価した日において、dDT2219群の血清は、α-DT390を検出するELISAによって、顕著に低い(p<0.05)抗体誘導を示した(図15A)。実験終了時点で各薬剤1μgによって4回ブーストしたが、dDT２２１９群の抗体誘導は顕著に低いものであった。
【００５４】
検出された抗体が実際にdDT2219又はDT2219を中和するかどうかを特定するため、Raji標的と160日の両動物群を用いて、中和アッセイを実施した。DT2219を接種した対照群と比較して、dDT2219群において、中和抗体の量は顕著に低かった(p<0.05)(図15B)。DT2210接種後7頭中6頭のマウスが高力価の中和抗体を生じたが(図15C)、dDT2219群において中和抗体を生じたのは7頭中2頭だけであった(図15D)(表1)。
【表１】
2018533553.tif 000002
【００５５】
CD19及び/又はCD22を発現する成熟又は前駆B細胞リンパ性悪性疾患を有する患者25名がDT2219の安全性を評価する試験に参加した。全ての患者は単一コースのDT2219を受けた。体重増加、アルブミン減少、高トランスアミナーゼ血症及び発熱当の最も一般的な副作用(AE)は一時的グレード1〜2であり、高用量コホート(＞40 μg/kg/日)における患者で見られた。40 μg/kg及び60 μg/kgの用量レベルで、2名の患者がDLTを経験した。4つのコースの処理の後に30%の患者において、及び40 μg/kg以上で処置した全ての患者において、中和抗体が見られたBachanova et al., 2015. Clin Cancer Res 21:1267-1272)。
【００５６】
DT2219の免疫原性を限定するアプローチは検討されていたが、いずれもDT2219に対する免疫康太王を減少する実用的な方法となり得ることは示されていない。様々なアプローチとして、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーやRNaseを生物活性薬物とコンジュゲートしたり、又はB細胞減少剤(例えばリツキシマブ)と共投与する方法が挙げられる。
【００５７】
従って、本願は、治療活性を有する例示的標的化毒物として、脱免疫化DT2219のdDT2219を記載する。dDT2219は、2つの異なるBurkitt-リンパ腫細胞系を含むB-細胞悪性腫瘍に対し有効性を示している。CD22又はCD19を発現しない細胞系において、毒性は見られなかった。dDT2219構築物は、その親フォームと同等のCLLに対する結合能力を示し、免疫適合BALB/cマウスにおいて、中和抗体の誘導は顕著に低かった。DT標的化毒素ポリペプチド及び特にDT2219はインビボ及びインビトロでの抗癌応答の誘導において有望な結果を提供しているため、脱免疫化dDT2219は、複数回投与後の抗薬物抗体の限定、及び患者の記録におけるワクチンステータスの限定から独立して、抗腫瘍治療を提供し得る。
【００５８】
上記のように、脱免疫化標的化毒素は、CD19及び/又はCD22以外の標的に選択的に結合する標的化ドメインを含有し得る。表２に示すように、dDT2219と同様に、追加の例示的な脱免疫化二機能性標的化毒素が作製及び試験された。
【表２】
2018533553.tif 000003
【００５９】
dDTEpCAMe23は、EpCAM上皮細胞接着分子、上皮におけるCa2+-非依存的ホモ型細胞-細胞接着を媒介する膜貫通糖タンパク質、及びe23又はHER2、ヒト上皮増殖因子受容体(HER/EGFR/ERBB)ファミリーのメンバーを、同時に標的とする。dDTEpCAM133は、EpCAM及び確立した癌幹細胞マーカーCD133を同時に標的とする。プロミニン-1としても知られるCD133は、ヒトにおいてPROM1遺伝子によりコードされ、細胞突起に特異的に局在化するペンタスパン膜貫通糖タンパク質(5-トランスメンブレン、5-TM)のメンバーである、糖タンパク質である。dDTEGFATFは、EGFR及びウロキナーゼ(uPA)のアミノ末端断片(ATF)を同時に標的とする。dDTROR1ATFは、ATF及びROR1を同時に標的とする。ROR1は、神経突起成長を調整する受容体チロシンキナーゼである。それは、細胞表面受容体のRORサブファミリーに属するI型膜タンパク質であり、癌細胞の転移におけるその役割が研究されている。
【００６０】
他の側面において、この開示は、細胞を殺す方法を記載する。一般に、本方法は、細胞を、上記脱免疫化DT標的化毒素ポリペプチドと接触させる工程、当該脱免疫化DT標的化毒素ポリペプチドを細胞に内在化させる工程、及び当該脱免疫化DT標的化毒素ポリペプチドに細胞を殺させる工程を含む。本方法は、インビボ又はインビトロで実施され得る。
【００６１】
他の側面において、この開示は、腫瘍を有する対象を治療する方法を記載する。一般に、本方法は、１つ以上の腫瘍の兆候又は臨床的サインを改善するのに有効な量の脱免疫化ジフテリア毒素(dDT)標的化毒素化合物を対象に投与する工程を含む。「治療する」又はそれに類する語は、任意の程度で、ある症状に関連する兆候又はサインを、減少し、進行を限定し、改善し、又は解消することを意味する。ここで、「改善する」とは、特定の症状の兆候又は臨床的サインの特性の、程度、重症度、頻度及び/又は可能性を何らかの形で減少することを意味する。「兆候」は、疾患の、又は患者の症状の、主観的根拠を意味する。「サイン」又は「臨床的サイン」は、患者以外の者によって見出され得る特定の症状に関連する客観的物理的知見を意味する。
【００６２】
「治療（treatment）」とは、治療的又は予防的であり得る。「治療的（Therapeutic）」及びその変形は、状態に関連する１又は２以上の既存の症状又は臨床学的徴候を改善する治療を言及する。「予防的（Prophylactic）」及びその変形は、状態の症状又は臨床学的徴候の発症及び／又は出現を、ある程度、制限する治療を言及する。一般的に「治療的」処置は、対象における状態の出現の後、開始されるが、ところが「予防的」処置は、対象における出現の前、開始される。従って、特定の実施形態によれば、前記方法は、状態を発症する危険のある対象の予防的治療を含むことができる。「危険のある（at risk）」とは、記載された危険性を実際に有していても良く、又は有さなくても良い。従って、例えば、特定の状態を発症する「危険のある」対象は、対象が状態を有するか又は発症している任意の症状又は臨床学的徴候を発症しているかどうかに係わらず、１又は２以上の印を欠いている個人に比較して、特定の状態を有するか又は発症する、高められた危険性の１又は２以上の印を有する対象である。状態の典型的な印は例えば、以下を含むことができる：遺伝的素因、祖先、年齢、性別、地理的位置、生活習慣、又は病歴。治療は、再発を予防し、又は遅延するために、症状が改善した後も続けられ得る。
【００６３】
dDT標的化毒素化合物は、腫瘍の細胞上に存在する標的に選択的に結合する標的化ドメインを有する上記dDT標的化毒素化合物の任意の態様であり得る。
【００６４】
幾つかの場合、腫瘍は、外科的に切除したもの、又は化学(例えば化学療法剤)及び/又は放射線療法を用いて縮小されたものであり得る。そのような態様において、dDTは、腫瘍が切除又は縮小される前、同時又は後に、対象に投与され得る。従って、幾つかの態様において、dDTは、対象に化学療法剤が投与される前、同時又は後に、対象に投与され得る。
【００６５】
腫瘍は、固形腫瘍又は液体腫瘍であり得る。従って、dDTは、前立腺癌、肺癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、黒色腫、膵臓癌、腎臓癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、脳癌、卵巣癌、造血癌及び/又はリンパ癌等を含む、様々な形態の癌の治療に用いられ得る。
【００６６】
「対象」は、任意の動物対象であり、例えば哺乳類対象(例えば、犬、猫、馬、牛、羊、山羊、猿、霊長類、ヒト等)である。幾つかの態様において、対象はヒトであってもよく、男性又は女性対象の両方、及び新生児、幼児、少年、青年、成人、及び高齢者対象を含み得る。
【００６７】
従って、幾つかの態様において、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)に選択的に結合する上皮細胞増殖因子(EGF)の十分な部分を含有する標的化ドメインは、前立腺、膵臓、胸部及び/又は肺の癌等の、EGFRを発現する腫瘍細胞を標的とする、dDT標的化毒素化合物として使用され得る。
【００６８】
他の態様において、抗CD19及び/又は抗CD22 scFvを含む標的化ドメインは、例えば非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、又はBurkittリンパ腫等のB細胞悪性疾患のようなCD19及び/又はCD22を発現する腫瘍細胞を標的とするdDT標的化毒素化合物として使用され得る。
【００６９】
本明細書に記載されるdDT標的化毒素は、医薬的に許容できる担体と共に処方され得る。本明細書において使用される場合、「担体（carrier）」とは、任意の溶媒、分散媒、ビークル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、及び/又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド、及び同様のものを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体及び／又は剤の使用は、当業界において周知である。任意の従来の媒体成分もまた、組成物に組込まれ得る。本明細書において使用される場合、「医薬的に許容できる（pharmaceutically acceptable）」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものでない物質を言及し、すなわち、その物質は、何れか望ましくない生物学的効果を引起すことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の任意の他の成分と、有害な態様で相互作用することなく、dDT標的化毒素と共に個人に投与され得る。
【００７０】
従って、dDT標的化毒素は、医薬組成物中に処方され得る。医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した種々の形で製剤化され得る。従って、組成物は、例えば経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、又は局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む既知の経路を介して投与され得る。組成物はまた、持続又は遅延放出を介しても投与され得る。
【００７１】
従って、dDT標的化毒素は、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル又は任意の形の混合物（但し、それらだけには制限されない）を含む任意の適切な形で提供され得る。組成物は、任意の医薬的に許容できる賦形剤、担体又はビークルを含む製剤で送達され得る。例えば、製剤は、例えば、従来の局所剤形、例えばクリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローション等で送達され得る。製剤はさらに、１又は２以上の添加剤、例えばアジュバント、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、風味剤、モイスチャライザー、増粘剤、などを含むことができる。
【００７２】
製剤は、単位投薬形で便利に提供され得、そして薬学の分野で周知の方法により調製され得る。医薬的に許容される担体を有する組成物の調製方法は、dDT標的化毒素を、１又は２以上の付属成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又は両者と活性化合物とを、均等に及び／又は緊密に会合され、そして次に、必要な場合、所望する製剤に生成物を成形する工程を包含する。
【００７３】
投与されるdDT標的化毒素の量は、使用される特定のdDT標的化毒素、対象の体重、身体状態及び／又は年齢、及び／又は投与経路（但し、それらだけには制限されない）を含む種々の要因に依存して変化することができる。従って、所定の単位投薬形で含まれるdDT標的化毒素の絶対重量は、広く変化することができ、そして対象の種、年齢、体重及び体調、及び／又は投与方法などの要因に依存する。従って、全ての可能な用途のために有効なdDT標的化毒素の量を構成する量を、一般的に示すことは現実的ではない。しかしながら、当業者は、そのような要因を考慮して適切な量を容易に決定することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、対象に約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分なdDT標的化毒素を投与することを含むことができるが、いくつかの実施形態によれば、この方法法は、dDT標的化毒素を、この範囲外の用量で投与することより実施され得る。それらの実施形態のいくつかによれば、この方法は、対象に、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分なdDT標的化毒素を投与することを含む。
【００７５】
他方では、用量は、治療経過の開始直前に得られた実際の体重を用いて計算され得る。このようにして計算された投薬量に関して、体表面積（ｍ２）は、Ｄｕｂｏｉｓ法を用いて治療経過の開始前に計算される：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×高さｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、例えば約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の用量を提供するのに十分なdDT標的化毒素を投与することを含むことができる。
【００７７】
いくつかの実施形態によれば、dDT標的化毒素化合物は、例えば週１回の用量〜複数回の用量で投与され得るが、いくつかの実施形態によれば、その方法は、この範囲外の頻度でdDT標的化毒素を投与することにより実施され得る。特定の実施形態によれば、dDT標的化毒素は、月に約１回〜週に約５回、投与され得る。
【００７８】
尚も他の側面において、この開示は、毒素を脱免疫化する方法を記載する。一般に、本方法は、抗B細胞応答の発生に関与し得る毒素ポリペプチドの表面位置に配置される親水性アミノ酸残基を標的化する工程、同定された親水性アミノ酸残基の1つの置換を含む改変ジフテリア毒素ポリペプチドを構築する工程、天然ジフテリア毒素ポリペプチドの生物学的機能に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程、及び抗体の誘導に基づき改変ジフテリア毒素ポリペプチドをスクリーニングする工程を含む。ここで「生物学的機能」、「生物学的活性」、それらの類語は、ポリペプチドの天然の生物学的機能を意味する。幾つかの場合、しかしながら、生物学的機能(又は生物学的活性等)は、サイトカイン誘導、細胞シグナル等の治療的使用に関連する特定の機能を意味する。
【００７９】
この脱免疫化方法は、エピトープマッピング技術等よりも短時間かつ安価で実施出来る。公知のDT390のX線結晶構造を用いて、分子表面の有望な位置に配置された24個の潜在的なアミノ酸(R、K、D、E及びQ)を選択して、選択した部位に点突然変異を導入する。DTEGF13親構築物は、三重変異体を作製する三部位特異的PCRプライマーと同時に変異化された。活性の喪失を呈しなかったものを更に変異化し、最終的に、それぞれ7つの点突然変異を有するが活性喪失が最小の2つの構築物が得られた。DTEGF13の変異化及び産物の発現により、無変異親フォームと変異体のインビトロ抗癌活性を比較するアッセイで変異体を効率的にスクリーニングできる。
【００８０】
ジフテリア毒素の構造及びメカニズムは、良く知られている。点突然変異は、触媒活性部位から離れた位置に選択されるべきであった。更に、点突然変異がT細胞又はB細胞エピトープを除去したかどうかを検証するために、異なるMHCハプロタイプ(H-2b及びH-2d)を有するマウスの2つの異なる系統を免疫化した。MHC分子は、T細胞エピトープとして提示のためにペプチド断片の様々な領域を積載する筈であり、T及びBエピトープは必ずしも連結しない。変異化薬物(dDTEGF13;配列番号8)は両系統において抗毒素応答の減少に等しく効果的であり、これは、T細胞エピトープよりもB細胞エピトープがDTから除外されたことを示唆する。
【００８１】
幾つかの場合、従って、dDT標的化毒素化合物は、5%以上、例えば10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の、生物学的活性を呈し得る。
【００８２】
幾つかの場合、dDT標的化毒素化合物の抗毒素抗体の誘導は、無改変天然ジフテリア毒素と比較して、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、19%以下、18%以下、17%以下、16%以下、15%以下、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。
【００８３】
本願において、「及び/又は」とは、列挙した要素の１つ又は全て又はそれらの２以上の組み合わせを意味し；「含む」、「含有する」及びそれらの類語は、それらが非限定的であると解釈されるべきで、即ち、追加の要素又は工程が任意で及び存在してもしなくてもよい。他に特定の無い限り、「ある」、「一つの」、「当該」、「一つ以上の」は相互置換可能に用いられ、一つ又はそれ以上を意味し；エンドポイントによる数値範囲の限定は、その範囲内に有る全ての数値を含む(例えば1〜5は1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等を含む)。
【００８４】
前述の説明においては、特定の実施形態が、明確にするために独立して記載され得る。特定の実施形態の特徴が別実験形態の特徴と互換性がないことが特に記載されない限り、特定の実施形態は、１又は２以上の実施形態に関連して本明細書に記載される相互性のある特徴の組合せを含むことができる。
【００８５】
離散的工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、その工程は任意の実行可能な順序で実行され得る。そして、適切な場合、２つ以上の工程の任意の組合せが同時に行われ得る。
【００８６】
本発明は、以下の実施例により説明される。特定の実施例、材料、量及び手順は、本明細書に記載される本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることが理解される。
【実施例】
【００８７】
実施例１
dDTEGF13の構築
DTEGF13コード領域(配列番号13)は、初めはアッセンブリーPCRを用いて合成された。その最後の組み立てにおいて、コード領域(5´端から3´端)は、Nco1制限部位、ATG開始コドン、DT分子の最初の389アミノ酸(DT390)、7アミノ酸リンカーEASGGPE、ヒト筋肉アルドラーゼ(hma)の20アミノ酸断片により連結されたヒトEGF及びIL-13のコード領域、及びXhoI制限部位を含有する(図1A)。最後の1755bpのNcoI/XhoI標的化遺伝子を、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性T7プロモーターのコントロール下のpET21d発現ベクターにスプライシングした。この遺伝子が正しい配列を有することを評価するために、DNA解析を使用した(Biomedical Genomics Center, University of Minnesota)。DTCD3CD3は、2つの反復するscFvs認識ヒトCD3イプシロンをDT390と連結することにより対照として合成された(Vallera et al., 2005, Leuk Res 29:331-341)。
【００８８】
脱免疫化薬物を作製するため、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene. La Jolla, CA)を用いてDTEGF13を変異化し、DNAシークエンシングによって部位特異的突然変異を確認した。
【００８９】
封入体の単離、再フォールディング及び精製
これらの手順は、他の文献に記載されている(Stish et al., 2007, Clin Cancer Res 13:6486-6493)。プラスミドをE. coli株BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI)に形質転換した。一昼夜培養後、細菌をLuriaブロス中で増殖した。遺伝子発現をIPTG(FischerBiotech, Fair Lawn, NJ)の添加によって誘導した。誘導2時間後、遠心分離によって細菌を回収した。細胞ペレットを懸濁し、ホモジナイズした。ソニケーション及び遠心分離後、ペレットを抽出し洗浄した。封入体」を溶解し、タンパク質を再フォールディングした。再フォールディングしたタンパク質を、連続勾配を用いた急速タンパク質液体クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー(QセファロースFast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)によって精製した。
【００９０】
抗体及び細胞
抗-Ly5.2、クローンA20-1.7由来のラットIgG2aは、Dr. Uli Hammerling, Sloan Kettering Cancer Research Center, New York, NYから提供頂いた。抗-Ly5.2は、ヒト細胞上で発現していない造血細胞表面マーカーであるマウスCD45.2を認識するので、対照として使用された。
【００９１】
ヒト細胞株
ヒト前立腺癌細胞株PC-3(ATCC CRL-14435; Kaighn et al., 1979, Invest Urol 17:16-23)、ヒト直腸結腸細胞株HT-29(ATCC HTB-38; Fogh et al., 1977, J Natl Cancer Inst 59:221-226)、ヒト膵臓癌MiaPaCa-2(ATCC CRL-1420; Yunis et al. 1977, Int J Cancer 19:128-35)、及びBurkittリンパ腫細胞株Daudi(ATCC CCL-213; Klein et al., 1968, Cancer Res 28:1300-1310)を、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville MD)から取得した。細胞は、10%牛胎児血清、2 mmol/L L-グルタミン、100ユニット/mLペニシリン及び100 μg/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地(Cambrex, East Rutherford, NJ)中で維持された。全ての癌細胞は単層で増殖し、Daudi細胞は、培養フラスコ中で懸濁培養された。細胞培養物は、5% CO2を含有する加湿37℃空気中でインキュベーションされた。接着細胞が80-90%コンフルエントになったとき、それらをトリプシン-EDTAを用いて剥離して継代した。実験には、トリパンブルー排除による判定で生存率>95%の細胞のみを用いた。
【００９２】
増殖アッセイ
腫瘍細胞に対する薬物の効果を判定するため、細胞(2 × 104)を、10%牛胎児血清、2 mM L-グルタミン、100ユニット/mLペニシリン及び100 μg/mLストレプトマイシンを添加したRPMI中96ウェル平底プレート中に播種した。様々な濃度のBLTを、細胞を含有する三重のウェル中に添加した(Tsai et al., 2011, J Neurooncol 103:255-266)。プレートを、37℃5% CO2で72時間インキュベーションした。そして細胞をウェルあたり1μCiの[メチル-3H]-チミジン(GE Healthcare, UK)と共に8時間インキュベーションし、ガラス繊維フィルター上に回収し、洗浄し、乾燥させ、標準的なシンチレーションカウンター中で10分間カウントした。データはPrism 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を用いて解析され、無処理細胞の1分あたりのカウント(cpm)を免疫毒素処理細胞のcpmで割って算出した(×100)「対照応答パーセント」として表された。
【００９３】
ブロッキング試験が行われ、特異性が試験された。要するに、0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM又は100 nM DTEGF13を含有する培地に、毒素を欠く1 nM, 10 nM, 100 nM又は1000 nM EGF13を添加した(Vallera et al., 2010, Mol Cancer Ther 9:1872-1883)。得られた混合物を腫瘍細胞を含有するウェルに添加し、上記のようにチミジン取込みによって増殖を測定した。データは対照応答パーセントとして表された。
【００９４】
中和抗体を検出するため、免疫化マウスから採取した90%血清を、既知の阻害濃度DTEGF13 (1000 ng/ml)ので処理した細胞に添加した。そして増殖アッセイを上記のように実施した。
【００９５】
ELISAアッセイを用いた血清IgG抗毒素含量の検出
IgG抗毒素抗体を検出するアッセイは過去に報告されている(Vallera et al., 2009, Leuk Res 33:1233-1242)。要するに、正常な免疫適合BALB/c(NCI)マウスを、0.25 μg 無変異2219KDEL又は変異2219KDEL 7 mutを毎週注射して免疫化した。5回注入後、最後の注入の4日後に血清を回収した。プレートに組換えDT390が接着している標準的なELISAアッセイが用いられた。免疫化マウスから採取した試験血清を添加し、その後検出抗体、抗マウスIgGペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加した。プレートは、o-フェニレンジアミン二塩酸塩(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を用いて室温で15分間現像した。反応は、2.5MのH2SO4を添加して停止された。吸光度は490nmで読み取られ、最終濃度は、高度精製抗DT390を用いた標準曲線から決定された。全ての試料及び標準は、三重に試験された。
【００９６】
インビボ有効性試験
雄nu/nuマウスをNational Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Center, Animal Production Areaから購入し、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careが認可した特別な病原性フリーの施設でDepartment of Research Animal Resources, University of Minnesotaのケアの下飼育された。動物実験のプロトコールは、によって承認された。全ての動物は、汚染ウイルスの感染の可能性を最小にするため、マイクロアイソレーターケージ中で飼育された。
【００９７】
体側腫瘍モデルは過去に報告されている(Stish et al., 2007, Clin Canc Res 13:6486-6493)。この実験の主要な点が臨床プロトコールの模擬ではなく、脱免疫化DTEGF13が効果的であるか否かの判定であったので、この投与経路が選択された。直接腫瘍内投与は、全身投与の腫瘍な問題を回避する。これらは、移動距離及び望ましくない腫瘍血管系動態(高い間質圧)に関連する腫瘍部位への非効率な分配を含む(Jain RK 1989, J Natl. Cancer Inst. 81:570-576)。従って、腫瘍内療法は、全身暴露を限定しつつ、組換え毒素融合タンパク質が標的部位により構成的かつ妥当に送達されるのを保証して、効率を最大化する。
【００９８】
腫瘍の誘導のため、マウスの左脇腹に、1：1 RPMI/Matri-Gel混合物100μL中に懸濁した4 × 106 PC-3を注入した。触診可能な腫瘍が形成された後(15日)、マウスを複数の群に分け、15日から25日までDTEGF13を複数回注射して処理した。全ての薬物は、29ゲージ針を付けた3/10ccシリンジを用いて腫瘍内注射によって投与された。全ての処理は、滅菌PBS100μL体積中で与えられた。デジタルキャリパーを用いて腫瘍サイズが測定され、体積は、長さ、幅及び高さの積から計算された。
【００９９】
実施例２
dDT2219の構築
dDT2219コード領域は、アッセンブリーPCRを用いて合成された。完全に組み立てられたコード領域(5´末端から3´末端)は、NcoI制限部位、ATG開始コドン、変異及び脱免疫化DT分子の最初の390アミノ酸(DT390)、7アミノ酸リンカーEASGGPE(配列番号4)、抗-CD22 scFvのVL及びVH領域、GGGGS(配列番号5)リンカー、抗-CD19 scFvのVL及びVH領域、及びXhoI制限部位を含有する。各scFvのVL及びVH遺伝子は、凝集減少リンカー(ARL)として設計されたリンカー(GSTSGSGKPGSGEGSTKG;配列番号6)によって連結された。最後の1755bpのNcoI/XhoIコード領域は、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導T7プロモーターのコントロール下のpET21d発現ベクターにスプライシングされた。遺伝子が正しい配列であることを評価するため、DNA解析が用いられた(Biomedical Genomics Center, University of Minnesota, MN)。脱免疫化薬物を生産するため、QUICKCHANGE部位指向変異生成キット(Stratagene Corp., La Jolla CA)を用いてDT2219に突然変異を加え、部位特異的突然変異はDNAシークエンシングによって確認された。以下のアミノ酸は、DT390を脱免疫化するため変更された：アミノ酸(aa)173KをSに変更；aa173RをAに；aa184QをSに；aa227KをSに；aa245QをSに；aa292EをSに；及びaa385KをGに変更。
【０１００】
封入体単離、再フォールディング及び精製
タンパク質発現に、Escherichia coli株BL21(DE3)(プラスミド導入済み)(Novagen, Inc., Madison, WI, USA)を使用した。細菌は、50mg/mlカルベニシリンを含有するLuriaブロス800ml中で一昼夜培養された。発現は、培養物の光学密度(OD)600が0.65に達した後、IPTGを添加して誘導された。誘導2週間後、増殖した細菌を回収し遠心分離した。細胞ペレットを溶解緩衝剤(50 mM tris, 50 mM NaCl,及び5 mM EDTA pH 8.0)中でホモジナイズし、ソニケーションし、再び遠心分離した。ペレットを0.3% デオキシコール酸ナトリウム、5% Triton X-100, 10%グリセリン、50 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA (pH 8.0)を用いて抽出し、そして洗浄した。精製の手順は、過去に記載された通りである(Schmohl et al., 2015. Targeted Oncology 11(3):353-361; Schmohl et al., 2016. Mol Ther 24(7):1312-1322)。ホモジナイズされた封入体を溶解し、タンパク質を再フォールディングした。精製は、連続勾配を有するイオン交換クロマトグラフィー(QセファロースFast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて実施された。
【０１０１】
組織培養
Burkittリンパ腫細胞株Daudi(ATCC CCL-213; Klein et al., 1968, Cancer Res 28:1300-1310) and Raji (ATCC CCL-86; Pulvertaft JV, 1964. Lancet 1:238-240.)、並びにヒト前骨髄球性白血病細胞株HL-60(ATCC CCL-240; Gallagher et al., 1979. Blood 54:713-733)は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville MD)から入手した。T細胞白血病HPB-MLT (Morikawa et al., 1978. Int J Cancer 21(2):166-170は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Accession No. ACC 483)から取得した。全ての細胞株は、過去に記載されたように懸濁培養された(Klein et al., 1968, Cancer Res 28:1300-1310)。細胞は、RPMI1640(10%胎児血清添加)中で維持された。
【０１０２】
増殖アッセイ/ブロッキングアッセイ
薬物の有効性を評価するため、(2×104)標的細胞を丸底96ウェルプレートにプレーティングし、10%牛胎児血清、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI中に懸濁した。DT2219、dDT2219又はBIC3(ジフテリア毒素の触媒及び転移ドメイン及び2つの抗CD3 scFvからなる二価scFv構築物; Vallera et al., 2005. Leuk Res 29:331-341)を異なる濃度で添加した。アッセイは三重に実施された。経時的アッセイにおいて、細胞は12時間、24時間又は36時間インキュベーションされた。標準的な増殖アッセイにおいて、インキュベーションは、37℃、5% CO2で実施された。そして細胞をウェルあたり1μCiの[メチル-3H]-チミジン(GE Healthcare, UK)と共に8時間インキュベーションし、ガラス繊維フィルター上に回収し、洗浄した。乾燥工程の後、フィルターは、標準的なシンチレーションカウンター中で10分間カウントされた。データはPrism 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を用いて解析され、無処理細胞の1分あたりのカウント(cpm)を免疫毒素処理細胞のcpmで割って算出した(×100)「対照応答パーセント」として表された。
【０１０３】
ブロッキング試験が行われ、特異性が試験された。  各量のDT2219又はdDT2219のいずれかに、100 nM, 200 nM,又は500 nMの2219、二特異性抗-CD19及び抗-CD22 scFvの構築物を添加し、標的細胞と共に37℃5% CO2でインキュベーションした。インキュベーション後、3H-チミジン取込みを上記のように測定した。
【０１０４】
患者試料及び結合アッセイ
University of Minnesotaで、CLL患者から12個の患者試料を回収した。試料は凍結保存され、使用時まで標準的な手順に従い保存された。結合の評価のため、各試料の4×105末梢血核細胞(PBMC)を洗浄し、0 nM, 1 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM,又は100 nMイソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)標識構築物：dDT2219、抗-EpCAM scFv(陰性対照)、又はDT2219と共に、4℃でインキュベーションした。4℃で30分間インキュベーションした後、細胞を1×PBSで洗浄し、以前記載されている(Hayes, et al., 2010. Leuk Res 34:809-815)通り、APC Cy 7コンジュゲート抗-CD20モノクローナル抗体(mAb) (BioLegend, San Diego, CA), Pacific blueコンジュゲート抗-CD5 mAb (BioLegend, San Diego, CA)、又はPE-CF592コンジュゲート抗-CD3 mAb (BD Biosciences, San Jose, CA)で染色した。15分間インキュベーション後(4℃)、細胞を1×PBSで洗浄し、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いてFACS解析によって蛍光強度を評価した。
【０１０５】
マウス中の抗毒素抗体の検出
IgG抗毒素抗体は、過去に記載された(Schmohl et al., 2015. Toxins 7:4067-4082)ように検出された。要するに、正常な免疫適合BALB/cマウス(NCI)を、無変異DT2219 (n=7マウス)又は変異DT2219 (dDT2219) (n=7マウス)で腹腔内投与で免疫化した(実験登録番号DAV529)。マウスは毎週12週間0.25μgのタンパク質で免疫化され、続いて毎週2週間0.5μgのタンパク質で免疫化され、6週間の休息ののち、3週間1μgのタンパク質で免疫化された。実験は160日で終了した。血液は、21, 35, 49, 63, 77, 99, 及び160日に採取された。標準的なELISAアッセイが用いられ、DT390がプレートに接着された。免疫化マウスの試験血清が添加され、続いて検出抗体及び抗マウスIgGペルオキシダーゼが添加された(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。プレートは、o-フェニレンジアミン二塩酸塩(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を用いて室温で15分間現像した。反応は、2.5MのH2SO4を添加して停止された。吸光度は490nmで読み取られ、最終濃度は、ジフテリア毒素に対するマウスモノクローナル抗体([11D9], Abcam Inc., Cambridge, MA)を用いた標準曲線から決定された。全ての試料及び標準は、三重に試験された。
【０１０６】
マウス中の中和抗体の検出
中和抗体を検出するため、免疫化マウスの90%抗体を、既知の阻害濃度のDT2219及びdDT2219(1000 ng/ml)で処理した細胞に添加した。そして上記のように増殖アッセイを実施した。血清IgG抗毒素含量の検出のため、ELISAアッセイが使用された。
【０１０７】
統計解析
データは、平均+/-標準偏差として表される。群間の差を評価するため、Studentのt検定又はone-way-ANOVAが使用された。解析及びデータの表示は、Graphpad prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)を用いて行われた。
【０１０８】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物、並びに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｇにおけるヌクレオチド配列提出、及び例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｏ、ＰＩＲ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｇにおける注釈付きのコード領域からの翻訳）の完全な開示は、その全体の参照により本明細書に組込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組込まれる任意の文献の開示との間に矛盾が存在する場合、本願の開示が適用される。前述の詳細な記載及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。それから不必要な制限が理解されるべきでない。本発明は、図示され、そして説明された正確な詳細に限定されず、当業者に明白な変形が特許請求の範囲により定義される本発明内に含まれるであろう。
【０１０９】
特にことわらない限り、本明細書及び特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量などを表すすべての数字は、全ての場合、用語「約（about）」により修飾されるものとして理解されるべきである。従って、特にことわらない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明により得られることが求められる所望の性質に依存して変化しえる近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に等価物の教えを限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め（rounding）技法の適用により解釈されるべきである。
【０１１０】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、すべての数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差に必然的に起因する範囲を本質的に含む。
【０１１１】
特にことわらない限り、全ての見出しは、読者の便宜のためであり、そして見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。
【０１１２】
配列表フリーテキスト
配列番号3 (dDT2219)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPEDIQM TQTTSSLSAS LGDRVTISCR ASQDISNYLN WYQQKPDGTV KLLIYYTSIL HSGVPSRFSG SGSGTDYSLT ISNLEQEDFA TYFCQQGNTL PWTFGGGTKL EIKGSTSGSG KPGSGEGSTK GEVQLVESGG GLVKPGGSLK LSCAASGFAF SIYDMSWVRQ TPEKRLEWVA YISSGGGTTY YPDTVKGRFT ISRDNAKNTL YLQMSSLKSE DTAMYYCARH SGYGTHWGVL FAYWGQGTLV TVSAGGGGSD ILLTQTPASL AVSLGQRATI SCKASQSVDY DGDSYLNWYQ QIPGQPPKLL IYDASNLVSG IPPRFSGSGS GTDFTLNIHP VEKVDAATYH CQQSTEDPWT FGGGTKLEIK RGSTSGSGKP GSGEGSTKGQ VQLQQSGAEL VRPGSSVKIS CKASGYAFSS YWMNWVKQRP GQGLEWIGQI WPGDGDTNYN GKFKGKATLT ADESSSTAYM QLSSLASEDS AVYFCARRET TTVGRYYYAM DYWGQGTSVT
VSS
【０１１３】
配列番号4
EASGGPE
【０１１４】
配列番号5
GGGGS
【０１１５】
配列番号6
GSTSGSGKPG SGEGSTKG
【０１１６】
配列番号7 (dDT2219ARL)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPEDIQM TQTTSSLSAS LGDRVTISCR ASQDISNYLN WYQQKPDGTV KLLIYYTSIL HSGVPSRFSG SGSGTDYSLT ISNLEQEDFA TYFCQQGNTL PWTFGGGTKL EIKGSTSGSG KPGSGEGSTK GEVQLVESGG GLVKPGGSLK LSCAASGFAF SIYDMSWVRQ TPEKRLEWVA YISSGGGTTY YPDTVKGRFT ISRDNAKNTL YLQMSSLKSE DTAMYYCARH SGYGTHWGVL FAYWGQGTLV TVSAGGGGSD ILLTQTPASL AVSLGQRATI SCKASQSVDY DGDSYLNWYQ QIPGQPPKLL IYDASNLVSG IPPRFSGSGS GTDFTLNIHP VEKVDAATYH CQQSTEDPWT FGGGTKLEIK RGSTSGSGKP GSGEGSTKGQ VQLQQSGAEL VRPGSSVKIS CKASGYAFSS YWMNWVKQRP GQGLEWIGQI WPGDGDTNYN GKFKGKATLT ADESSSTAYM QLSSLASEDS AVYFCARRET TTVGRYYYAM DYWGQGTSVT
VSS
【０１１７】
配列番号 8 (dDTEGF13)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPENSDS ECPLSHDGYC LHDGVCMYIE ALDKYACNCV VGYIGERCQY RDLKWWELRP SGQAGAAASE SLFVSNHAYG PVPPSTALRE LIEELVNITQ NQKAPLCNGS MVWSINLTAG MYCAALESLI NVSGCSAIEK TQRMLSGFCP HKVSAGQFSS LHVRDTKIEV AQFVKDLLLH LKKLFREGRF N
【０１１８】
配列番号9 (dDTEpCAMe23)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPEDIQM TQSPSSLSAS VGDRVTITCR STKSLLHSNG ITYLYWYQQK PGKAPKLLIY QMSNLASGVP SRFSSSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCA QNLEIPRTFG QGTKVELKRA TPSHNSHQVP SAGGPTANSG TSGEVQLVQS GPGLVQPGGS VRISCAASGY TFTNYGMNWV KQAPGKGLEW MGWINTYTGE STYADSFKGR FTFSLDTSAS AAYLQINSLR AEDTAVYYCA RFAIKGDYWG QGTLLTVSSP SGQAGAAASE SLFVSNHAYD VQLTQSPAIL SASPGEKVTM TCRATPSVSY MHWYQQKPGS SPKPWIYTTS NLASGVPARF SGGGSGTSYS LTVSRVEAED AATYYCQQWS RSPPTFGGGS KLEIKGSTSG SGKSSEGKGV QLQESGPEVV KPGGSMKISC KTSGYSFTGH TMNWVKQSHG KNLEWIGLIN PYNGDTNYNQ KFKGKATFTV DKSSSTAYME LLSLTSEDSA VYYCARRVTD WYFDVWGAGT TVTVS
【０１１９】
配列番号10 (dDTEpCAM133)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPEDIQM TQSPSSLSAS VGDRVTITCR STKSLLHSNG ITYLYWYQQK PGKAPKLLIY QMSNLASGVP SRFSSSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCA QNLEIPRTFG QGTKVELKRA TPSHNSHQVP SAGGPTANSG TSGEVQLVQS GPGLVQPGGS VRISCAASGY TFTNYGMNWV KQAPGKGLEW MGWINTYTGE STYADSFKGR FTFSLDTSAS AAYLQINSLR AEDTAVYYCA RFAIKGDYWG QGTLLTVSSE PKSSDKTHTS PPSPDIVLSQ SPAIMSASPG EKVTISCSAS SSVSYMYWYQ QKPGSSPKPW IYRTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS MEAEDAATYY CQQYHSYPPT FGAGTKLELK SSGGGGSGGG GGGSSRSSLE VKLVESGPEL KKPGETVKIS CKASGYTFTD YSMHWVNQAP GKGLKWMGWI NTETGEPSYA DDFKGRFAFS LETSASTAYL QINNLKNEDT ATYFCATDYG DYFDYWGQGT TLTVSSAKTT PPSVTS
【０１２０】
配列番号11 (dDTEGFATF)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPENSDS ECPLSHDGYC LHDGVCMYIE ALDKYACNCV VGYIGERCQY RDLKWWELRP SGQAGAAASE SLFVSNHAYS NELHQVPSNC DCLNGGTCVS NKYFSNIHWC NCPKKFGGQH CEIDKSKTCY EGNGHFYRGK ASTDTMGRPC LPWNSATVLQ QTYHAHRSDA LQLGLGKHNY CRNPDNRRRP WCYVQVGLKP LVQECMVHDC
ADGK
【０１２１】
配列番号12 (dDTROR1ATF)
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTN VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFISRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKAGQDAMYE YMASACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPISNKM SESPNKTVSE EKAKSYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SSTADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHGTQPFE ASGGPEQVQL QQSGAELVRP GASVTLSCKA SGYTFSDYEM HWVIQTPVHG LEWIGAIDPE TGGTAYNQKF KGKAILTADK SSSTAYMELR SLTSEDSAVY YCTGYYDYDS FTYWGQGTLV TVSAGGGGSG GGGSGGGGSD IVMTQSQKIM STTVGDRVSI TCKASQNVDA AVAWYQQKPG QSPKLLIYSA SNRYTGVPDR FTGSGSGTDF TLTISNMQSE DLADYFCQQY DIYPYTFGGG TKLEIKPSGQ AGAAASESLF VSNHAYSNEL HQVPSNCDCL NGGTCVSNKY FSNIHWCNCP KKFGGQHCEI DKSKTCYEGN GHFYRGKAST DTMGRPCLPW SATVLQQTYH AHRSDALQLG LGKHNYCRNP DNRRRPWCYV QVGLKPLVQE CMVHDCADGK
【０１２２】
配列番号13 (dDTEGF13 Coding Sequence)
GGCGCTGATG ATGTTGTTGA TTCTTCTAAA TCTTTTGTGA TGGAAAACTT TTCTTCGTAC CACGGGACTA AACCTGGTTA TGTAGATTCC ATTCAAAAAG GTATACAAAA GCCAAAATCT GGTACACAAG GAAATTATGA CGATGATTGG AAAGGGTTTT ATAGTACCGA CAATAAATAC GACGCTGCGG GATACTCTGT AGATAATGAA AACCCGCTCT CTGGAAAAGC TGGAGGCGTG GTCAAAGTGA CGTATCCAGG ACTGACGAAC GTTCTCGCAC TAAAAGTGGA TAATGCCGAA ACTATTAAGA AAGAGTTAGG TTTAAGTCTC ACTGAACCGT TGATGGAGCA AGTCGGAACG GAAGAGTTTA TCTCAAGGTT CGGTGATGGT GCTTCGCGTG TAGTGCTCAG CCTTCCCTTC GCTGAGGGGA GTTCTAGCGT TGAATATATT AATAACTGGG AACAGGCGAA AGCGTTAAGC GTAGAACTTG AGATTAATTT TGAAACCCGT GGAAAAGCTG GCCAAGATGC GATGTATGAG TATATGGCTT CAGCCTGTGC AGGAAATCGT GTCAGGCGAT CAGTAGGTAG CTCATTGTCA TGCATAAATC TTGATTGGGA TGTCATAAGG GATAAAACTA AGACAAAGAT AGAGTCTTTG AAAGAGCATG GCCCTATCTC AAATAAAATG AGCGAAAGTC CCAATAAAAC AGTATCTGAG GAAAAAGCTA AATCATACCT AGAAGAATTT CATCAAACGG CATTAGAGCA TCCTGAATTG TCAGAACTTA AAACCGTTAC TGGGACCAAT CCTGTATTCG CTGGGGCTAA CTATGCGGCG TGGGCAGTAA ACGTTGCGCA AGTTATCGAT AGCTCAACAG CTGATAATTT GGAAAAGACA ACTGCTGCTC TTTCGATACT TCCTGGTATC GGTAGCGTAA TGGGCATTGC AGACGGTGCC GTTCACCACA ATACAGAAGA GATAGTGGCA CAATCAATAG CTTTATCGTC TTTAATGGTT GCTCAAGCTA TTCCATTGGT AGGAGAGCTA GTTGATATTG GTTTCGCTGC ATATAATTTT GTAGAGAGTA TTATCAATTT ATTTCAAGTA GTTCATAATT CGTATAATCG TCCCGCGTAT TCTCCGGGGC ATGGAACGCA ACCATTTGAA GCTTCCGGAG GTCCCGAGAA CAGCGACAGC GAATGTCCGC TGAGCCACGA CGGTTACTGT CTGCACGACG GTGTTTGTAT GTACATCGAA GCTCTAGACA AATACGCTTG TAACTGTGTT GTTGGTTACA TCGGTGAACG CTGTCAGTAC CGCGACCTGA AATGGTGGGA ACTGCGCCCG TCTGGTCAGG CTGGTGCTGC TGCTAGCGAA TCTCTGTTCG TTTCTAACCA CGCTTACGGC CCTGTGCCTC CCTCTACAGC CCTCAGGGAG CTCATTGAGG AGCTGGTCAA CATCACCCAG AACCAGAAGG CTCCGCTCTG CAATGGCAGC ATGGTATGGA GCATCAACCT GACAGCTGGC ATGTACTGTG CAGCCCTGGA ATCCCTGATC AACGTGTCAG GCTGCAGTGC CATCGAGAAG ACCCAGAGGA TGCTGAGCGG ATTCTGCCCG CACAAGGTCT CAGCTGGGCA GTTTTCCAGC TTGCATGTCC GAGACACCAA AATCGAGGTG GCCCAGTTTG TAAAGGACCT GCTCTTACAT TTAAAGAAAC TTTTTCGCGA GGGACGGTTC
AAC
【図１】
2018533553.tif 000004
【図２】
2018533553.tif 000005
【図３】
2018533553.tif 000006
【図４】
2018533553.tif 000007
【図５】
2018533553.tif 000008
【図６】
2018533553.tif 000009
【図７】
2018533553.tif 000010
【図８】
2018533553.tif 000011
【図９】
2018533553.tif 000012
【図１０】
2018533553.tif 000013
【図１１】
2018533553.tif 000014
【図１２】
2018533553.tif 000015
【図１３】
2018533553.tif 000016
【図１４】
2018533553.tif 000017
【図１５】
2018533553.tif 000018
【配列表】
2018533553000001.app
【国際調査報告】
2018533553.tif 000019
2018533553.tif 000020
2018533553.tif 000021
2018533553.tif 000022