(57)【要約】  シメックス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）に特異的な抗原の存在を検出するための抗体を作製する際に使用される、配列番号１もしくは５のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたタンパク質、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号６、および配列番号７のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたポリペプチドであって、抗体は、２μｇ／ｍｌ未満の抗原濃度の、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にあるシメックス・レクツラリウス抗原を検出することができる。
2018533619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シメックス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）に特異的な抗原の存在を検出するための抗体を作製する際に使用される、配列番号１もしくは５のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたタンパク質、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号６、および配列番号７のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたポリペプチドであって、前記抗体は、２０μｇ／ｍｌ未満の抗原濃度の、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にあるシメックス・レクツラリウス抗原を検出することができる、単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
シメックス・レクツラリウスに特異的な抗原の存在を検出するための抗体を作製する際に使用される、配列番号４もしくは８のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含み、前記抗体は、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にある２０μｇ／ｍｌ未満の抗原濃度のシメックス・レクツラリウス抗原に特異的である、請求項１に記載のシメックス・レクツラリウスタンパク質由来の組換え短縮ポリペプチド。
【請求項３】
前記作製される抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載のシメックス・レクツラリウス由来の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
前記抗体は、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度のシメックス・レクツラリウス抗原を検出することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
前記作製される抗体は、シメックス・レクツラリウスおよびシメックス・ヘミプテルス（Ｃｉｍｅｘ  ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）の両方に特異的な抗原を検出することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシメックス・レクツラリウス由来の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項６】
前記タンパク質は、不溶性タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシメックス・レクツラリウス由来の単離されるタンパク質。
【請求項７】
アレルゲン試験において使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシメックス・レクツラリウス由来の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項８】
試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの検出のための方法であって、
前記試料を請求項３に記載される特異的なモノクローナル抗体と接触させてモノクローナル抗体−ポリペプチド複合体を形成するステップと、
前記モノクローナル抗体−ポリペプチド複合体を、前記複合体に結合するレポーター物質で標識されたさらなるモノクローナル抗体と接触させ、それによって前記試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在を検出するステップと、を含む、方法。
【請求項９】
前記試料は、卵から、若虫、脱皮、または成虫までの、雄または雌トコジラミの任意の発達段階にあるシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体は、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にあるシメックス・レクツラリウス抗原に特異的である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの検出のための方法であって、
側方流動膜と、
試験試料を受容するために前記側方流動膜の第１の下方端部に位置する第１の領域であって、前記第１の領域は、請求項３に記載されるシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスに特異的なモノクローナル抗体を含み、前記抗体は、レポーター物質で標識されている、第１の領域と、
固定化された対照ポリペプチドを含む、前記側方流動膜の第２の上端部に位置する第２の領域と、
前記第１および第２の領域の間に位置する第３の領域であって、シメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスに特異的な固定化されたモノクローナル抗体を含む、第３の領域と、を含む、方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体は、１０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体は、５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な標識物質は、ラテックス抗体複合体または金抗体複合体のいずれか１つ以上から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体は、ＨＲＰまたはビオチンのいずれか１つ以上で標識される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在を検出するための診断キットであって、
配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片に特異的なモノクローナル抗体が固定化される、少なくとも１つの固体表面、
前記試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルス抗原への前記抗体の結合を可能にする条件下で前記試料を前記モノクローナル抗体と接触させること、および
前記試料に結合する抗体の量を対照値と比較して、そこから前記試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在または非存在を決定すること、を含む、診断キット。
【請求項１７】
請求項１５に記載の診断キットを含む、シメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在または非存在を決定するための、迅速検出法。
【請求項１８】
配列番号１もしくは５のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたタンパク質、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号６、および配列番号７のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号４もしくは８のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含む、シメックス・レクツラリウスタンパク質由来の組換え短縮ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規シメックス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）タンパク質と、家庭および商業施設等の環境においてトコジラミの存在を検出するための方法とに関する。
【０００２】
トコジラミは、赤褐色、無翅、偏性吸血性であり、羽化のために吸血を必要とする。それらは扁平、楕円、かつ細長い形状であり、約５〜７ｍｍの長さであり、３対の脚を有する。トコジラミは、ヒトおよび他の温血宿主の血液を餌にして生き延びる昆虫である。トコジラミは、熱、匂いのするトコジラミの糞、ならびに温血動物、鳥類、およびトコジラミ自身によって放出される二酸化炭素に引き寄せられる。就寝場所、マットレス、ボックススプリング、ベッドサイドテーブル、ヘッドボードは、トコジラミが隠れるのに理想的な環境である。トコジラミは、日中は狭くて暗い場所に潜んでいる可能性が最も高く、布、木材、およびざらついた紙やすり状表面の亀裂および隙間を好む。トコジラミは、ベッドおよび家具の隙間および亀裂に潜んでいるところを見つけられることが多い。
【０００３】
トコジラミは、血液を摂取し、夜間に活発であり、露出した皮膚のあらゆる領域を刺咬する。トコジラミの咬傷によって、皮膚発疹、アレルギー反応、および／または精神的苦痛を含む健康への多くの悪影響が生じ得る。
【０００４】
近年、欧州、オーストラリア、および北米において、トコジラミ蔓延の発生率に劇的な増加が見られている。これは、世界規模の旅行および移住の増加に一部起因している。他の説明としては、害虫駆除管理に対する駆除剤耐性／変化の増加、および中古家具の使用が挙げられる。トコジラミ集団の増大は、トコジラミの咬傷および関連する状態の増加に寄与してきた。
【０００５】
蔓延を引き起こすトコジラミの繁殖は、２つの形態の分散によって起こる：１つ目は、能動的分散であり、トコジラミが、歩行等の独自の手段によって、換気ダクト、壁の穴、およびパイプを通って部屋から部屋へと移動することを必要とする。能動的分散は、駆除剤の散布、異性間の対立、または宿主刺激の結果であり得る。２つ目は、受動的分散またはヒトによる運搬であり、トコジラミが、衣類の上でまたは荷物および家具の中で新しい場所に運ばれる。鳥類およびコウモリもまた、トコジラミの受動的分散に都合がよい。
【０００６】
トコジラミは、成虫期に達するまでに５齢期を経て成長する。この過程の間の各段階において、次の段階へと進むための脱皮を誘導するために吸血が必要となる。雌のトコジラミは、一生を通して２００〜５００個の卵を産むことができる。
【０００７】
ヒトと排他的に相互作用する２つの主なトコジラミの種が存在する。
１．シメックス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）（一般的なトコジラミ）
２．シメックス・ヘミプテルス（Ｃｉｍｅｘ  ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）（熱帯地域で見られる）
【０００８】
Ｃ．レクツラリウスおよびＣ．ヘミプテルスの２つの種は、混合集団で繁栄すると考えられ、オーストラリアおよび英国ではＣ．ヘミプテルス流行の増加まで見られていることから、それぞれの種が依然として生態的地位を持ちながらも、その境界が曖昧になってきていることが示唆される。
【０００９】
ごく最近までトランスクリプトミクスが行われたのみであったように、現在のところ、分子レベルでのトコジラミに関する情報は限られている。トランスクリプトミクスは、特定の時期に種々の細胞型または組織型に存在する転写されたＲＮＡの研究である。これらの発現したＲＮＡから、次いで、分子解析のためのｃＤＮＡライブラリーが作製される。これらの研究の結果、３つの異なるトコジラミ系統（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ：駆除剤耐性、Ｈａｒｌａｎ：駆除剤感受性、およびＯｈｉｏのアパートからの駆除剤暴露系統）から、多くの完全なおよび部分的に完全なｍＲＮＡ配列リードが得られた。
【００１０】
トコジラミの存在を迅速かつ容易に検出するための手段を提供する真の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、シメックス・レクツラリウスに特異的な抗原の存在を検出するための抗体を作製する際に使用される、配列番号１もしくは５のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたタンパク質、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号６、および配列番号７のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたポリペプチドであって、抗体は、２０μｇ／ｍｌ未満の抗原濃度の、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にあるシメックス・レクツラリウス抗原を検出することができる、単離されたタンパク質またはポリペプチドが提供される。
【００１２】
本発明の一実施形態は、シメックス・レクツラリウスに特異的な抗原の存在を検出するための抗体を作製する際に使用される、配列番号４もしくは８のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含み、抗体は、卵から成熟した成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にある２０μｇ／ｍｌ未満の抗原濃度のシメックス・レクツラリウス抗原に特異的である、シメックス・レクツラリウスタンパク質由来の組換え短縮ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、作製される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１４】
本発明の一実施形態において、抗体は、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度のシメックス・レクツラリウス抗原を検出することができる。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、作製される抗体は、シメックス・レクツラリウスおよびシメックス・ヘミプテルスの両方に特異的な抗原を検出することができる。
【００１６】
本発明の一実施形態において、シメックス・レクツラリウスから単離されるタンパク質は、不溶性タンパク質である。
【００１７】
本発明の一実施形態において、シメックス・レクツラリウス由来の単離されたタンパク質またはポリペプチドは、アレルゲン試験において使用される。
【００１８】
本発明によれば、試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの検出のための方法であって、
試料をモノクローナル抗体と接触させてモノクローナル抗体−ポリペプチド複合体を形成するステップと、
モノクローナル抗体−ポリペプチド複合体を、複合体に結合するレポーター物質で標識されたさらなるモノクローナル抗体と接触させ、それによって試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在を検出するステップと、を含む、方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、試料は、卵から、若虫、脱皮、または成虫までの、雄または雌のトコジラミの任意の発達段階にあるシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスを含む。最も好ましくは、モノクローナル抗体は、卵から、若虫、脱皮、成熟した雄および雌成虫までのシメックス・レクツラリウスの全ての発達段階にあるシメックス・レクツラリウス抗原に特異的である。
【００２０】
本発明によれば、試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの検出のための方法であって、
側方流動膜と、
試験試料を受容するために側方流動膜の第１の下端部に位置する第１の領域であって、第１の領域は、シメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスに特異的なモノクローナル抗体を含み、抗体は、レポーター物質で標識されている、第１の領域と、
固定化された対照ポリペプチドを含む、側方流動膜の第２の上端部に位置する第２の領域と、
第１および第２の領域の間に位置する第３の領域であって、シメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスに特異的な固定化されたモノクローナル抗体を含む、第３の領域と、を含む方法もまた提供される。
【００２１】
好ましくは、モノクローナル抗体は、１０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。最も好ましくは、モノクローナル抗体は、５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。
【００２２】
本発明の一実施形態において、検出可能な標識物質は、ラテックス抗体複合体または金抗体複合体のいずれか１つ以上から選択される。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、モノクローナル抗体は、ＨＲＰまたはビオチンのいずれか１つ以上で標識される。
【００２４】
本発明によれば、試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在を検出するための診断キットであって、
配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片に特異的なモノクローナル抗体が固定化される、少なくとも１つの固体表面、
試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルス抗原への前記抗体の結合を可能にする条件下で試料をモノクローナル抗体と接触させること、および
試料に結合する抗体の量を対照値と比較して、そこから試料中のシメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在または非存在を決定すること、を含む、診断キットが提供される。
【００２５】
本発明によれば、本発明の診断キットを含む、シメックス・レクツラリウスまたはシメックス・ヘミプテルスの存在または非存在を決定するための迅速検出法が提供される。
【００２６】
本発明の一実施形態は、配列番号１もしくは５のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたタンパク質、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号６、および配列番号７のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含むシメックス・レクツラリウスから単離されたポリペプチドを提供する。
【００２７】
本発明の一実施形態は、配列番号４もしくは８のいずれか一方から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含む、シメックス・レクツラリウスタンパク質由来の組換え短縮ポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明は、添付の図面を参照して以下の説明を読むことで、より明確に理解されるであろう。
【００２９】
【図１】図１は、マウスハイブリドーマ細胞株からトコジラミ卵殻タンパク質エピトープ１（ＥＳＰ）（配列番号２）およびエピトープ３（配列番号３）に対して産生された６つのマウスＩｇＧモノクローナル抗体を示す表である（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ社によって作製された）。
【図２】図２は、マウスハイブリドーマ細胞株からトコジラミタンパク質１エピトープ１（ＢＢＰ１）（配列番号６）およびエピトープ２（配列番号７）に対して産生された４つのマウスＩｇＧモノクローナル抗体を示す表である（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ社によって作製された）。
【図３】図３は、Ｈｉ−ＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって精製されたＥＳＰモノクローナル抗体の親和性精製プロファイルであり、（ａ）はモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］を示し、（ｂ）はｍＡｂ  ＥＳＰ−３［４Ｄ１Ｂ８および１０Ｂ９Ｆ９］を示す。モノクローナル抗体は、１ｍｌ／分の流速を使用して、０．１Ｍグリシン（ｐＨ６．５）で溶出した。矢印は、溶出の開始を示す。ピーク画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎデバイスを使用して濃縮した。
【図４】図４は、Ｈｉ−ＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって精製されたＢＢＰ１モノクローナル抗体の親和性精製プロファイルであり、（ａ）はモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１［５Ｄ３Ｅ８］を示し、（ｂ）はｍＡｂ  ＢＢＰ１−２［１０Ｂ１Ｃ５］を示す。モノクローナル抗体は、１ｍｌ／分の流速を使用して、０．１Ｍグリシン（ｐＨ６．５）で溶出した。矢印は、溶出の開始を示す。ピーク画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎデバイスを使用して濃縮した。
【図５】図５は、図３のプロテインＧカラムで親和性精製したｍＡｂ  ＥＳＰ−１およびｍＡｂ  ＥＳＰ−３モノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。  レーン１：フロースルーｍＡｂ  ＥＳＰ−１、レーン２：還元ｍＡｂ  ＥＳＰ−１、レーン３：非還元ｍＡｂ  ＥＳＰ−１、レーン４：ブランク、レーン５：フロースルーｍＡｂ  ＥＳＰ−３、レーン６：還元ｍＡｂ  ＥＳＰ−３、レーン７：非還元ｍＡｂ  ＥＳＰ−３、レーン８：ブランク、レーン９：ＢＳＡ対照（６６．５ｋＤａ）
【図６】図６は、図４のプロテインＧカラムで親和性精製したｍＡｂ  ＢＢＰ１−１およびｍＡｂ  ＢＢＰ１−２モノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。  レーン１：染色済みタンパク質マーカー、レーン２：ハイブリドーマ培地ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１、レーン３：還元ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１、レーン４：非還元ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１、レーン５：ブランク、レーン６：ハイブリドーマ培地ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２、レーン７：還元ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２、レーン８：非還元ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２、レーン９：ＢＳＡ対照（６６．５ｋＤａ）
【図７（ａ）】図７（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上で泳動させた、精製された天然ＥＳＰタンパク質を示す。
【図７（ｂ）】図７（ｂ）は、ＥＳＰタンパク質を同定するために、ウサギポリクローナル抗体抗ＥＳＰ−３を使用してプローブしたウェスタンブロットである。
【図８】図８は、（ｂ）未標識ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］に対する（ａ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］のビオチン標識を示すドットブロットである。スポット１：未希釈のトコジラミ卵ライセート、スポット２：１／５に希釈したトコジラミ卵ライセート、スポット３：ＢＳＡ対照、およびスポット４：膜上にドット形成された未希釈の抗体（対照）
【図９】図９は、モノクローナルｍＡｂ  ＥＳＰ−１およびｍＡｂ−ＥＳＰ−３に最適なコーティング濃度を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフである。二次複合体であるヤギ抗マウスＨＲＰを１／５０００に希釈した。ｍＡｂ  ＥＳＰ−３の最適なコーティング濃度は、約５〜１０μｇ／ｍｌであることが分かった。
【図１０】図１０は、ＢＢＰ１ペプチドを検出するＢＢＰ１ポリクローナル競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図１１】図１１は、糞試料、脱皮殻試料、およびトコジラミ死骸試料中のＢＢＰ１タンパク質を検出するＢＢＰ１ポリクローナル競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図１２】図１２は、濃縮した天然および組換え短縮ＥＳＰ（ｒｔＥＳＰ）の検出を示すウェスタンブロットである。  レーン１：分子量標準ラダー、レーン２：トコジラミ卵ライセート、レーン３：免疫沈降したＥＳＰタンパク質、レーン４：ｒｔＥＳＰ。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質および４０ｋＤａのｒｔＥＳＰを示す。
【図１３】図１３は、濃縮した天然および組換え短縮ＢＢＰ１（ｒｔＢＢＰ１）の検出を示すウェスタンブロットである。  レーン１：分子量標準ラダー、レーン２：トコジラミライセート、レーン３：免疫沈降したＢＢＰ１タンパク質、レーン４：ｒｔＢＢＰ１。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質および３９ｋＤａのｒｔＢＢＰ１を示す。
【図１４】図１４は、昆虫ライセートのＥＳＰタンパク質に対する交差反応性および抗体特異性を示すための、（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、（ｂ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−１でプローブしたウェスタンブロット、および（ｃ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−３でプローブしたウェスタンブロットである。  レーン１：染色済みタンパク質マーカー、レーン２：Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミ全昆虫ライセート、レーン３：ロンドン研究室系統トコジラミ全昆虫ライセート、レーン４：Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミ全卵ライセート、レーン５：ロンドン研究室系統トコジラミ全卵ライセート、レーン６：イエグモ全昆虫ライセート、レーン７：イエガ全昆虫ライセート、レーン８：ゴキブリ全昆虫ライセート、レーン９：ゴキブリ卵全ライセート、レーン１０：ワラジムシ全昆虫ライセート、レーン１１：ムカデ全昆虫ライセート、レーン１２：イエダニ全ライセート、レーン１３：イエバエ全昆虫ライセート、レーン１４：ハチ全昆虫ライセート、およびレーン１５：ＢＳＡ対照（６６．５ｋＤａ）。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質を示す。
【図１５】図１５は、昆虫ライセートのＢＢＰ１タンパク質に対する交差反応性および抗体特異性を示すための、（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、（ｂ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１でプローブしたウェスタンブロット、および（ｃ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２でプローブしたウェスタンブロットである。  レーン１：染色済みタンパク質マーカー、レーン２：Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミ全昆虫ライセート、レーン３：ロンドン研究室系統トコジラミ全昆虫ライセート、レーン４：Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミ脱皮殻ライセート、レーン５：ロンドン研究室系統トコジラミ脱皮殻ライセート、レーン６：イエグモ全昆虫ライセート、レーン７：イエガ全昆虫ライセート、レーン８：ゴキブリ全昆虫ライセート、レーン９：ゴキブリ卵全ライセート、レーン１０：ワラジムシ全昆虫ライセート、レーン１１：ムカデ全昆虫ライセート；レーン１２：イエダニ全ライセート、レーン１３：イエバエ全昆虫ライセート、レーン１４：ハチ全昆虫ライセート、およびレーン１５：ＢＳＡ対照（６６．５ｋＤａ）。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質を示す。
【図１６】図１６は、異なる地理的領域からのシメックス・レクツラリウス、およびシメックス・ヘミプテルスの検出を示すための、（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、（ｂ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−１でプローブしたウェスタンブロット、および（ｃ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−３でプローブしたウェスタンブロットである。  レーン１：染色済みタンパク質マーカー、レーン２：Ｈａｒｌａｎ系統（米国産シメックス・レクツラリウス）、レーン３：ロンドン研究室系統（殺虫剤感受性−シメックス・レクツラリウス）、レーン４：ロンドン野外系統（ピレスロイド耐性シメックス・レクツラリウス）、レーン５：ケニア野外系統（シメックス・レクツラリウス）、レーン６：ケニア熱帯性野外系統（シメックス・ヘミプテルス）、レーン７：ドイツ研究室系統（殺虫剤感受性シメックス・レクツラリウス）、レーン８：スウェーデン野外系統（シメックス・レクツラリウス）、レーン９：精製された天然ＥＳＰ、レーン１０：ＢＳＡ（６６．５ｋＤａ）。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質を示す。
【図１７】図１７は、異なる地理的領域からのシメックス・レクツラリウス、およびシメックス・ヘミプテルスの検出を示すための、（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、（ｂ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１でプローブしたウェスタンブロット、および（ｃ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２でプローブしたウェスタンブロットである。  レーン１：染色済みタンパク質マーカー、レーン２：Ｈａｒｌａｎ系統（米国産シメックス・レクツラリウス）、レーン３：ロンドン研究室系統（殺虫剤感受性シメックス・レクツラリウス）、レーン４：ロンドン野外系統（ピレスロイド耐性シメックス・レクツラリウス）、レーン５：スウェーデン野外系統（シメックス・レクツラリウス）、レーン６：ケニア野外系統（シメックス・レクツラリウス）、レーン７：ドイツ研究室系統（殺虫剤感受性シメックス・レクツラリウス）、レーン８：ケニア熱帯性野外系統（シメックス・ヘミプテルス）、レーン９：ＢＳＡ（６６．５ｋＤａ）。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質を示す。
【図１８】図１８は、ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］およびｍＡｂ  ＥＳＰ−１−ＨＲＰ抗体の結合プロファイルを示す、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイの結果のｒｔＥＳＰの標準曲線であり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図１９】図１９は、ｎＥＳＰのＥＬＩＳＡによる滴定の結合プロファイルおよびそのｒｔＥＳＰとの相関を示す捕捉ＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフであり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２０】図２０は、ｎＥＳＰに対する捕捉ＥＬＩＳＡの検出限界のグラフであり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２１】図２１は、ｎ  ＥＳＰに対する捕捉ＥＬＩＳＡの検出限界を示す表である。
【図２２】図２２は、環境試験室から異なる期間（２４時間目、７２時間目、１週目、２週目、３週目、および４週目）に採取された試料中のｎＥＳＰの検出を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１およびｍＡｂ  ＢＢＰ１−１−ＨＲＰ抗体の結合プロファイルを示す捕捉ＥＬＩＳＡアッセイの結果のｒｔＢＢＰ１の標準曲線であり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２４】図２４は、ｎＢＢＰ１のＥＬＩＳＡによる滴定の結合プロファイルおよびそのｒｔＢＢＰ１との相関を示す捕捉ＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフであり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２５】図２５は、脱皮殻の数という観点からのｎＢＢＰ１に対する捕捉ＥＬＩＳＡの検出限界のグラフであり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２６】図２６は、ｎＢＢＰ１に対する捕捉ＥＬＩＳＡの検出限界を示す表である。
【図２７】図２７は、環境試験室から異なる期間（２４時間目、７２時間目、１週目、２週目、３週目、および４週目）に採取された試料中のｎＢＢＰ１の検出を示すグラフであり、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【図２８】図２８は、トコジラミ卵ライセート（ａ）およびＢＢＰ１（ｂ）に対する側方流動試験を示す。  レーン１：陰性対照（８Ｍ尿素溶解緩衝液）、レーン２：抽出したトコジラミ卵ライセート（ａ）、および陽性トコジラミ部屋試料（ｂ）
【図２９】図２９は、（ａ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１、（ｂ）ｒｔＢＢＰ１の抗ヒトＩｇＥ検出、列Ａ：レーン１：０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、列Ｂ：レーン１：４μｇ  ｒｔＢＢＰ１、レーン２：２μｇ  ｒｔＢＢＰ１、レーン３：１μｇ  ｒｔＢＢＰ１、レーン４：０．５μｇ  ｒｔＢＢＰ１を示すドットブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
世界中におけるトコジラミの急速な蔓延により、ヒトの健康に及ぼす影響に対する懸念が増大した。
【００３１】
トコジラミは、ヒトの血液を摂取する。トコジラミから受ける咬傷は、皮膚反応を引き起こす可能性があり、咬傷が生じた後のかなり長い期間かゆみの原因となり得る。咬傷の第１の徴候は、通常、正確にいつまたはどこで昆虫に咬まれたのか分からずに起こる。これは、その人がどこで咬まれたのか知り得ないという状況を作り出す。それは、ホテル、友人の家、カウチ、または彼らのベッドであったかもしれない。多くの場合、何ヶ月もの間、またはトコジラミが見られた、もしくはトコジラミが頻繁に摂食している表面に糞および血液の染みが発見されたという目撃があるまでは、何も反応が見られない。トコジラミに対する恐怖は、不安およびストレスを引き起こし得る。
【００３２】
トコジラミの世界的流行の増加により、トコジラミの存在を検出する改善された手段の必要性が浮き彫りになる。トコジラミの存在が確認された場合、次いで、昆虫を排除するための措置を取ることができる。代替として、トコジラミの不在が確認された場合、安心して眠ることができる。
【００３３】
限定されたトコジラミ検出システムについて他の人が記載している。Ｔｏｌｌｅｙ  ＭＰら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｄ  ｂｕｇ（Ｃｉｍｅｘ  Ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｄ  ｂｕｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅｓ」ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｅｓａ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ｅｓａ／２０１１／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／ｐａｐｅｒ５４７７９．ｈｔｍｌ）は、トコジラミ特異的な唾液抗原であるニトロフォリンを使用するシステムについて記載している。このシステムは、トコジラミの糞中に排出されるヒト血液に特異的な抗原に依存する。結果の感度は、トコジラミの蔓延の関数であると考えられる。すなわち、少数集団は、検出可能な結果をもたらさない。
【００３４】
ＷＯ２０１３／１３０６１３（ＳＲＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、外寄生生物のためのポリクローナル抗体検出システムについて記載している。このシステムは、動物全体の抽出物を含む免疫原から作製されたポリクローナル抗体に依存する。調製された試料は、いずれの界面活性剤も加えなくても著しく可溶性であることが分かった。外寄生生物全体の免疫原に対して作製されたポリクローナル抗体の特異性はあまり高くなく、可溶性タンパク質のみを検出するものであった。
【００３５】
対照的に、本発明は、同定および単離された新規シメックス・レクツラリウスタンパク質を提供する。単離されたタンパク質は不溶性タンパク質である。タンパク質は、トコジラミの卵、脱皮殻、および外骨格、ならびに昆虫全体から容易に抽出されるが、単離されたタンパク質を可溶化するためには界面活性剤が必要である。外骨格は、任意の生活環の生きたまたは死んだ昆虫に由来し得る。単離されたタンパク質およびポリペプチドに対して産生された抗体は、卵から１齢〜５齢形態、成熟した成虫までの雄または雌トコジラミの生活環における全ての段階からの抗原の存在を検出することができることが分かった。さらに、脱皮殻（トコジラミは、寿命を通して５回まで脱皮できる）から抗原の存在が検出された。抗体は、非常に特異的であり、他の密接に関連する外寄生生物には交差反応性を示さないことが分かった。タンパク質上の抗体エピトープ領域が同定され、タンパク質に対して非常に特異的であることが分かった。エピトープ領域に対して産生された抗体は、非常に低い抗原濃度の試料中で抗原を検出することが分かった。
【００３６】
驚くべきことに、産生された抗体は、一般的なトコジラミ種シメックス・レクツラリウスおよび熱帯地域に見られるシメックス・ヘミプテルスの両方においてタンパク質を検出することが可能であった。本発明の特異的抗体を使用した本発明のアッセイシステムは、異なる地理的地域からのトコジラミを同定することが可能であるため世界的に適用できる。気候変動に起因して、シメックス・ヘミプテルスの発生は、より多くの温暖な気候において多くなっている。本発明は、トコジラミの存在を検出するために世界中で使用され得る高感度アッセイシステムを提供する。
【００３７】
１つの新規タンパク質は、シメックス・レクツラリウスの卵の卵殻内に存在することが明らかになった（卵殻タンパク質（ＥＳＰ））。
【００３８】
第２の新規タンパク質は、シメックス・レクツラリウス昆虫の全ての生活環内に存在することが明らかになった（トコジラミタンパク質１（ＢＢＰ１））。ＢＢＰ１は、シメックス・レクツラリウスの糞堆積物、脱皮殻、トコジラミの卵、成虫トコジラミ、１齢〜５齢形態［ｕ１］において検出された。
【００３９】
単離された新規卵殻タンパク質（ＥＳＰ）は、配列番号１を含む３６３アミノ酸タンパク質であることが分かった。同定された抗体エピトープ領域は、配列番号２および３を含む。天然ＥＳＰタンパク質に見られる分解からＥＳＰタンパク質を安定化する手段として、卵殻タンパク質（ＥＳＰ）が短縮タンパク質として産生された。予測構造ソフトウェア（Ｐｈｙｒｅ２、ＳＣＲＡＴＣＨ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）により、ＥＳＰタンパク質の２つのドメイン構造が示された。ＥＳＰの短縮型が、Ｖ１１４−Ｃ３６３から始まる予測されたタンパク質のＣ末端ドメインを組み込むために開発された。配列番号４を含む２５１個のアミノで構成されたｒｔＥＳＰタンパク質が、ＥＳＰアッセイにおける標準として使用するために調製された。
【００４０】
シメックス・レクツラリウスの全ての生活環に見られる単離された新規タンパク質（トコジラミタンパク質１−ＢＢＰ１）は、配列番号５を含む６５１アミノ酸タンパク質であることが分かった。同定された抗体エピトープ領域は、配列番号６および７を含む。ＢＢＰ１は、高度に反復性のアミノ酸配列を有する大型のタンパク質であり、この理由から、組換えタンパク質を構築したときにＢＢＰ１の短縮型が産生された。タンパク質Ｎ末端領域の２８０アミノ酸を用いて配列番号８を含む短縮組換えタンパク質を産生した。
【００４１】
単離された新規シメックス・レクツラリウスタンパク質は、他の昆虫のタンパク質に類似するＰＦＡＭドメインを有しないことが分かった。配列番号１を含む卵殻タンパク質は、シメックス・レクツラリウスの卵殻にのみ存在することが分かった。配列番号５を含むトコジラミタンパク質１−ＢＢＰ１は、シメックス・レクツラリウスの糞堆積物、ならびに脱皮殻、卵、成虫および１齢〜５齢形態に存在することが分かった。
【００４２】
本発明によれば、タンパク質またはポリペプチド配列の変異体または断片は、それらがタンパク質の免疫原性特性を保持するように保存置換または修飾を含む。変異体は、同様にまたは代替として、ポリペプチドの抗原特性に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失または付加を含む他の修飾を含有してもよい。
【００４３】
天然卵殻タンパク質（ＥＳＰタンパク質）およびトコジラミタンパク質１（ＢＢＰ１タンパク質）のタンパク質を差次的タンパク質抽出により精製し、抗体特異性についてウェスタンブロット法により確認した。
【００４４】
抗体エピトープ領域は、タンパク質上で同定され、新規シメックス・レクツラリウスタンパク質に特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を使用する感受性検出アッセイが開発された。新規タンパク質の単離および同定、ならびに新規タンパク質に対する抗体の産生は、試料中のトコジラミの検出のための潜在的な用途を提供する。アッセイは、全ての生活環におけるシメックス・レクツラリウスの存在を検出するために使用され得る。
【００４５】
タンパク質に対して産生された抗体の感度は、非常に高いことが分かった。抗体は、２０μｇ／ｍｌ未満の試料中の抗原濃度レベルを検出することができた。抗体は、１〜３μｇ／ｍｌもの低い抗原濃度レベルを検出することができた。
【００４６】
新規タンパク質上の抗体エピトープ領域に対して産生された抗体を使用してアッセイシステムが開発された。
【００４７】
本発明の抗体を使用した検出アッセイは、多くの分野において価値のある用途を有する。抗体を使用した検出アッセイは、試料中のトコジラミの存在または非存在を迅速かつ容易に決定することを可能にする。家庭使用者またはホテルは、その環境にトコジラミがいないことを確実に確認することができる。同様に、個々の旅行者は、ホテルの部屋またはベッドにトコジラミがいないかどうかを確認するための使用し易いアッセイキットを携帯することができるであろう。迅速で読み易い結果を示す検出アッセイキットを有することは、環境におけるトコジラミの存在または非存在を迅速に決定する際に非常に有益である。異なる種類の検出アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、または側方流動試験、または任意の他の迅速なアッセイプラットフォームが開発され得る。本発明の抗体は、アッセイフォーマット内で利用され得、アレイ、ナノ粒子、もしくは膜の表面に存在するか、および／または懸濁形態で存在する。
【００４８】
ディップスティックの形態の側方流動イムノクロマトグラフィー検出法を用いてトコジラミの存在を検出したところ、迅速かつ高感度な検出法を提供することが分かった（図２８）。使用において、試料は試験される領域から採取され、希釈剤中に配置され得る。モノクローナルを付着させた試料パッドを試料希釈剤に浸漬し、線の可視化によってトコジラミの存在が示唆される。
【００４９】
試料中のトコジラミの存在を検出するために本明細書に開示される抗体を使用するための別の形態は、当業者には明らかであろう。
【００５０】
トコジラミに対するアレルギーの発症が増加しており、著しい不快感および健康障害を引き起こし得る。トコジラミ咬傷に対する感受性は、暴露の繰り返しに伴って増加すると考えられるが、咬傷およびそれらに続く反応は誤診されることが多い。トコジラミに対する特定のアレルギーを有するかどうかを判断することができる能力は、非常に貴重であろう。
【００５１】
本発明の新規タンパク質は、アレルゲン試験に使用され得ることが分かった。トコジラミタンパク質は、咬傷または暴露後にＩｇＥ免疫応答を誘発する。この応答は、みみず腫れおよび喘息を含む多くの異なる症状をもたらし得る。皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）は、特定のアレルゲンに対するアレルギー応答を証明する。本発明の新規タンパク質を使用したＳＰＴは、トコジラミに対するアレルギーの存在を確認するために使用され得る。特定の診断は、治療選択の際に役立ち、また回避を通して症状の再発を防止するのに役立つ。
【００５２】
本発明を、以下の例に従ってさらに説明する。
【００５３】
例１．シメックス・レクツラリウスの卵からの天然ＥＳＰの抽出
摂食から３日後にトコジラミの卵を採取し、孵化させた。孵化した卵を尿素溶解緩衝液（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再懸濁し、１分間のバーストで３回超音波処理した。試料を２７  ０００×ｇで１０分間遠心分離し、試料の可溶性画分と不溶性画分とを分離した。
【００５４】
２５０個の卵から得られた天然タンパク質の収量は、精製された天然タンパク質全体のうち約６．２ｍｇであった。
【００５５】
例２．シメックス・レクツラリウスの全身および脱皮殻からの天然ＢＢＰ１の抽出
トコジラミ昆虫の死骸および脱皮殻を尿素溶解緩衝液（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再懸濁し、１分間のバーストで５分間ボルテックスした。試料を２７  ０００×ｇで１０分間遠心分離し、試料の可溶性画分と不溶性画分とを分離した。
【００５６】
１０個の脱皮殻から得られた天然タンパク質の収量は、精製された天然タンパク質全体のうち約３０μｇであった。
【００５７】
抽出および単離された新規タンパク質は、ＰＢＳを単独で使用して成功裏に抽出できないため、不溶性タンパク質であることが分かった。両方のタンパク質が完全に可溶化するためには、界面活性剤の使用が必要とされる。
【００５８】
例３．マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製およびクローンの選択
トコジラミ卵殻タンパク質エピトープ（ＥＳＰ）１（配列番号２）およびエピトープ３（配列番号３）に対する６つのマウスＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ならびにトコジラミタンパク質１エピトープ１（ＢＢＰ１）（配列番号６）およびエピトープ２（配列番号７）に対する４つのマウスＩｇＧ  ｍＡｂを、マウスハイブリドーマ細胞株から産生した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ社によって商業ベースで作製された）。ｍＡｂＥＳＰ−３に対する２つのクローンを組み合わせることで、免疫反応の感受性を著しく増加させた。選択されたモノクローナル抗体の表を図１および図２に示す。
【００５９】
ハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ＋Ｌグルタミン＋抗生物質中で増殖させ、Ｔ１７５組織培養フラスコ内でハイブリドーマ細胞が安定してから、ＦＢＳを２％に減少させた。培地が黄色に変化し、細胞が死滅するまで（約２週間）、ハイブリドーマ細胞を抗体産生のために成長させた。４℃で３０分間の最大速度（４  ３００×ｇ）での遠心分離により上清を採取した。
【００６０】
４℃で一晩、硫酸アンモニウム沈殿（５０％）により、ｍＡｂをハイブリドーマ細胞上清から精製した。沈殿した抗体をＰＢＳに再懸濁し、透析／緩衝液を交換して塩を除去した。ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］、ｍＡｂ  ＥＳＰ−３［４Ｄ１Ｂ８＆１０Ｂ９Ｆ９］、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１［５Ｄ３Ｅ８］、およびＢＢＰ１−２［１０Ｂ１Ｃ５］を、製造業者の指示に従ってＨｉ−ＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用してさらに精製した。端的に述べると、透析した硫酸アンモニウムで沈殿させたｍＡｂを０．４５μｍフィルターを通して濾過した。次いで、これらを１ｍｌプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通過させた。ＰＢＳ（５カラム体積×３回）を用いてカラムから未結合タンパク質を洗い流した。ｍＡｂは、グリシン−ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５）によって溶出し、濃縮し、次いで４℃で一晩ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）に対して透析した。精製プロセス中の吸光度は、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔ  ＦＬＰＣシステムを使用して、２８０ｎｍの波長で監視した。精製されたｍＡｂの濃度はＯＤ２８０ｎｍで算出した。
【００６１】
図３は、プロテインＧカラム上のＥＳＰに対する精製されたモノクローナル抗体（ａ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−１および（ｂ）ｍＡｂ  ＥＳＰ−３の溶出を示す。図４は、プロテインＧカラム上のＢＢＰ１に対する精製されたモノクローナル抗体（ａ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１および（ｂ）ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２の溶出を示す。
【００６２】
ｍＡｂの純度を還元条件および非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。図５は、ｍＡｂ  ＥＳＰ−１およびｍＡｂ  ＥＳＰ−３の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図６は、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１およびｍＡｂ  ＢＢＰ１−２の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００６３】
例４．ポリクローナル抗体の作製
ＥＳＰタンパク質に対するポリクローナル抗体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ社によって商業ベースで作製された。端的に述べると、２つのペプチドを、ＥＳＰ、配列番号２を含むＥＳＰ−１、および配列番号３を含むＥＳＰ−３のために作製し、１つのペプチドを、ＢＢＰ１、配列番号７を含むＢＢＰ１−２のために作製した。ペプチドを担体タンパク質と複合化し、ペプチド当たり２匹のウサギを免疫するために使用した。ポリクローナル抗体を親和性精製し、ＥＬＩＳＡにより確認した。
【００６４】
図７（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上で泳動させた、精製された天然ＥＳＰタンパク質を示す。図７（ｂ）は、ＥＳＰタンパク質を同定するために、ウサギポリクローナル抗体抗ＥＳＰ−３を使用してプローブしたウェスタンブロットである。
【００６５】
例５．ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］ｍＡｂのビオチン化
ＥＳＰに対するモノクローナル抗体をビオチン化し、抗体対ＥＳＰタンパク質の信号を増幅した。
【００６６】
精製されたｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］を、２〜８℃の炭酸緩衝液［０．１％ＮａＮ３を含有する０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）、ｐＨ９．５］を数回交換しながら該緩衝液に対して透析した。透析後、タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＮＨＳ−Ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を使用直前に（溶液を光から保護するため）２ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解した。免疫グロブリン溶液の全体積の１０％に等しい体積を使用して、ＮＨＳ−Ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ溶液を穏やかに撹拌しながらモノクローナル抗体溶液に少量ずつ加え、それを室温で４時間回転ホイール上でインキュベートした。反応溶液を、４℃のＰＢＳ緩衝液（０．１％  ＮａＮ３を含有す０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）を数回交換しながら該緩衝液に対して透析し、あらゆる未結合のビオチンを除去した。透析後、ビオチン化ｍＡｂ  ＥＳＰ−１［４Ｂ９Ｅ７］を暗所に−２０℃で保管した（ビオチンは感光性であるため）。
【００６７】
ビオチン化の効率は、ドットブロット分析により確認した（図８）。ビオチン化がモノクローナル抗体の効率を向上させたことが分かった。
【００６８】
例６．最適なコーティング濃度を決定するための捕捉ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に１００μｌ／ウェルで段階希釈（２０〜０．３１２μｇ／ｍｌ）したｍＡｂ  ＥＳＰ−１またはｍＡｂ  ＥＳＰ−３によりコーティングし、室温で一晩インキュベートした。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、室温で２時間ブロックした（炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中１０％スクロース、１％ＢＳＡ）。洗浄後、希釈率１／４０００のヤギ抗マウス抗体を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＵｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ検出試薬を用いて可視化した。Ｈ２ＳＯ４を用いて５分後に反応を停止した。４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定し、ΔＯＤ値を算出するために用いた（図９）。
【００６９】
例７．ＢＢＰ１ポリクローナル競合ＥＬＩＳＡを用いて試料中のシメックス・レクツラリウスの昆虫全体および脱皮殻を検出するためのアッセイ
ＢＢＰ１のビオチン化
製造業者の指示に従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−  ＮＨＳ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてＢＢＰ１ペプチド（配列番号７）をビオチン化した。端的に述べると、ＢＢＰ１ペプチドを２０倍過剰なＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ  Ｂｉｏｔｉｎと混合し、回転させながら室温で３０分間インキュベートした。次いで、試料をＣ１８カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社製）に通過させて、反応したＢＢＰ１−ビオチンから遊離ビオチンを除去した。
【００７０】
ＢＢＰ１のＥＬＩＳＡのための試料抽出
５つの脱皮殻、５つのトコジラミの死骸、および１ｃｍの糞採取紙を、５００μｌのＴＢＳ  Ｓａｌｉｎｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で、回転させながら２．５時間インキュベートした。試料は希釈せずに使用した。
【００７１】
競合ＥＬＩＳＡ
Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎプレート（Ｐｉｅｒｃｅ社）を製造業者の指示に従って使用した。ＥＬＩＳＡプレートをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の１００μｌのＢＢＰ１−ビオチンペプチド（２．５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、室温で２時間インキュベートした。５０μｌのペプチド（種々の濃度）または試料（未希釈）および５０μｌの抗ＢＢＰ１ポリクローナル抗体（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）の添加前に、ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳで３回洗浄した。プレートを室温で１時間インキュベートし、希釈率１／２５００の１００μｌの抗ウサギＨＲＰの添加前に３回洗浄した。ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ検出試薬を用いて信号を可視化し、Ｈ２ＳＯ４を用いて５分後に反応を停止した。４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定することによりΔＯＤを得た。
【００７２】
このアッセイにより、低レベルのＢＢＰ１タンパク質を検出することができた。ＢＢＰ１抗体は、２．５μｇ／ｍｌもの低いレベルで合成ＢＢＰ１ペプチドを検出することができた（図１０）。ＢＢＰ１抗体は、糞採取紙、脱皮殻、およびトコジラミの死骸から抽出した未希釈試料中の天然ＢＢＰ１タンパク質を検出することができた（図１１）。
【００７３】
例８．組換えタンパク質の精製
ＥＳＰおよびＢＢＰ１（ｒｔＥＳＰおよびｒｔＢＢＰ１）短縮タンパク質のための遺伝子を、ｇＢｌｏｃｋｓとして作製し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｐＥＴ３２ａベクターにクローン化した。タンパク質を、ｒｔＥＳＰ−ｐＥＴ３２ａの場合はＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、またはｒｔＢＢＰ１−ｐＥＴ３２ａ細胞の場合はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のいずれかに、製造業者の指示に従って発現させた。組換えタンパク質を封入体に発現させた。細菌ペレットを溶解緩衝液（５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、リン酸緩衝液（２５  ０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ））に再懸濁し、ライセートが透明になるまで最大出力５０％で超音波処理した（Ｓｙｃｌｏｎ社製超音波ホモジナイザー）。封入体を２７  ０００×ｇで１５分間ペレット化し、次いで洗浄緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、リン酸緩衝液）で１回洗浄し、次いで洗浄緩衝液ＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、リン酸緩衝液）で洗浄した。タンパク質ペレットを、次いでタンパク質再懸濁緩衝液（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、リン酸緩衝液）に再懸濁した。
【００７４】
ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１  ＣＮＢｒセファロースカラムを使用してｒｔＢＢＰ１をさらに精製した。ｒｔＢＢＰ１懸濁液をカラムに通過させ、１０カラム体積のＰＢＳで洗浄した。タンパク質を１００ｍＭグリシン（ｐＨ３）中でカラムから溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で緩衝した。
【００７５】
例９．天然ＥＳＰおよびＢＢＰ１の濃縮および検出
ｍＡｂ  ＥＳＰ−３／ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１  ＣＮＢｒセファロースカラムを使用して、天然ＥＳＰおよびＢＢＰ１タンパク質をトコジラミ卵ライセートおよびトコジラミの全ライセートからＴＳＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に免疫沈降させた。洗浄緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）およびＴＳＡでビーズを６回洗浄することにより未結合タンパク質を除去した。濃縮された試料を、還元条件下で１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。タンパク質試料をニトロセルロース膜に転写した。
【００７６】
ニトロセルロース膜をＰＢＳＴ中の５％粉乳でブロックした。希釈率１／１０００のｍＡｂ  ＥＳＰ−１またはｍＡｂ  ＢＢＰ１−１で１時間膜をプローブした。ニトロセルロース膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後、希釈率１／２０００の抗マウスＨＲＰで１時間プローブした。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質で信号を可視化した。
【００７７】
天然および組換え短縮ＥＳＰの検出結果を図１２に示す。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質および４０ｋＤａのｒｔＥＳＰを示す。
【００７８】
天然および組換え短縮ＢＢＰ１の検出結果を図１３に示す。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質および３９ｋＤａのｒｔＢＢＰ１を示す。
【００７９】
例１０．モノクローナル抗体のＥＳＰおよびＢＢＰ１タンパク質に対する交差反応性および抗体特異性を決定するための免疫ブロット
ＥＳＰおよびＢＢＰ１に対するモノクローナル抗体の交差反応性は、家庭環境に関連する様々な昆虫およびそれらの卵に対して確認した。昆虫を採集し、液体窒素中で凍結させ、乳棒および乳鉢を用いて粉砕した。
【００８０】
粉砕したライセートを尿素溶解緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤（ｐＨ８）に再懸濁した。２時間穏やかに混合することによりタンパク質を抽出した。これに続いて、可溶性の上清を除去するために２７  ０００×ｇでライセートを遠心分離した。可溶性の上清を除去し、スピンフィルターカラムを通して濾過した。ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を決定し、低分子量カットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎデバイスを使用して希釈タンパク質ライセートを濃縮した。次いで、試料を還元条件下で１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷して泳動させた。その結果を図１４（ａ）に示す。
【００８１】
電気泳動に続いて、それぞれの精製されたｍＡｂでプローブするためにタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。
【００８２】
ニトロセルロース膜をＰＢＳＴ中の５％粉乳でブロックした。希釈率１／１０００のｍＡｂ  ＥＳＰ−１、ｍＡｂ  ＥＳＰ−３、ならびに希釈率１／２０００のｍＡｂ  ＢＢＰ１−１およびｍＡｂ  ＢＢＰ１−２で１時間膜をプローブした。ニトロセルロース膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後、希釈率１／２０００の抗マウスＨＲＰで１時間洗浄した。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質で信号を可視化した。
【００８３】
図１４（ｂ）は、ｍＡｂ  ＥＳＰ−１を用いたプローブの結果を示す。図１４（ｃ）は、ｍＡｂ  ＥＳＰ−３を用いたプローブの結果を示す。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質を示す。
【００８４】
モノクローナル抗体は、Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミの全卵ライセートおよびロンドン研究室系統トコジラミの全卵ライセートの両方に対して特異性が高いことが分かった（図１４（ｂ）および（ｃ）のレーン４およびレーン５）。試験した他の卵には交差反応性は認められなかった。
【００８５】
例１１．モノクローナル抗体のＢＢＰ１タンパク質に対する交差反応性および抗体特異性を決定するための免疫ブロット
前の例と同様に、モノクローナル抗体のＢＢＰ１に対する交差反応性を、家庭環境に関連する様々な昆虫に対して確認した。
【００８６】
図１５（ａ）は、還元条件下で１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた試料を示す。図１５（ｂ）は、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１でプローブした結果を示す。図１５（ｃ）は、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２でプローブした結果を示す。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質を示す。
【００８７】
モノクローナル抗体は、Ｈａｒｌａｎ系統トコジラミの全昆虫ライセートおよび脱皮殻ライセート、ならびにロンドン研究室系統トコジラミの全ライセートおよび脱皮殻ライセートの両方に対して特異的であることが分かった（図１５（ｂ）（ｃ）、レーン２〜５）。試験した他の昆虫からのライセートには交差反応性は認められなかった。
【００８８】
例１２．異なる領域からのシメックス・レクツラリウス、およびシメックス・ヘミプテルスの検出を調査するための免疫ブロット
異なる領域から採取した様々なシメックス・レクツラリウストコジラミおよびトコジラミの卵、ならびにケニアの熱帯性トコジラミ種（シメックス・ヘミプテルス）を、以前に記載されたように尿素溶解緩衝液中に抽出した。試料を２７  ０００×ｇで１０分間遠心分離して、可溶性試料画分と不溶性試料画分とを分離した。ブラッドフォードアッセイにより可溶性画分の濃度を決定し、試料を同じ濃度に希釈して、還元条件下で１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、以前に記載されたようにウェスタンブロットを行った。
【００８９】
ＥＳＰについての還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１６（ａ）に示す。ｍＡｂ  ＥＳＰ−１を用いた検出を示すウェスタンブロットを図１６（ｂ）に、ｍＡｂ  ＥＳＰ−３を用いた検出を示すウェスタンブロットを１６（ｃ）に示す。矢印は、３６．３ｋＤａの天然ＥＳＰタンパク質を示す。
【００９０】
ＢＢＰ１についての還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１７（ａ）に示す。ｍＡｂ  ＢＢＰ１−１を用いた検出を示すウェスタンブロットを図１７（ｂ）に、ｍＡｂ  ＢＢＰ１−２を用いた検出を示すウェスタンブロットを図１７（ｃ）に示す。矢印は、６３ｋＤａの天然ＢＢＰ１タンパク質を示す。
【００９１】
驚くべきことに、モノクローナル抗体は、シメックス・レクツラリウスだけではなく、シメックス・ヘミプテルスにおいてもＥＳＰおよびＢＢＰ１に特異的であることが明らかになった（図１６、レーン６および図１７、レーン８）。
【００９２】
例１３．実地試験
環境試験室を、ベッド、ベッドサイドテーブル、および椅子を含むホテルの部屋を再現して設定した。部屋の温度（２３℃）および相対湿度（４５％±５％）は、試験を通して管理した。摂食させたトコジラミ（混合生活環）を１週間間隔で部屋に導入した。導入するトコジラミの数を毎週連続して倍増し、能動的な蔓延の指数関数的な影響を監視した。１週間後、人工フィーダーを部屋に導入し、一旦部屋に入るとトコジラミが摂食できるようにした。試験の２４時間目および４８時間目、ならびに１週目、２週目、３週目、および４週目に、既知のトコジラミの活動領域から掃除機を用いて試料を採取した。
【００９３】
例１４．捕捉ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１００μｌ／ウェルのｍＡｂ  ＥＳＰ−３またはｍＡｂ  ＢＢＰ１−１（５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、室温で２時間ブロックした（炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中１０％スクロース、１％ＢＳＡ）。抽出したトコジラミ試料をＰＢＳＴ、１％ＢＳＡ中１／４に希釈し、次いでＥＬＩＳＡプレートに段階希釈し（１：２）、プレート振盪プラットフォーム上で１時間室温でインキュベートした。洗浄後、希釈率１／５００のｍＡｂ  ＥＳＰ−１−ＨＲＰまたはｍＡｂ  ＢＢＰ１−２−ＨＲＰ抗体を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＵｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ検出試薬を用いて可視化した。Ｈ２ＳＯ４を用いて１０分後に反応を停止した。４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を測定し、ΔＯＤ値を算出するために用いた。
【００９４】
ｒｔＥＳＰタンパク質の標準曲線を図１８に示す。ｎＥＳＰのＥＬＩＳＡによる滴定およびｒｔＥＳＰとの相関を図１９に示す。検出限界（ＬＯＤ）を示すＥＬＩＳＡの結果を図２０に示す。抗体は、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で存在するＥＳＰタンパク質を検出することができた。このアッセイにより、１〜２個という少ないトコジラミの卵を含有する試料中のＥＳＰタンパク質を検出することができた（図２１）。
【００９５】
管理された部屋の中における、ＥＬＩＳＡを用いた異なる期間でのトコジラミの卵の検出結果を図２２に示す。
【００９６】
ｒｔＢＢＰ１タンパク質の標準曲線を図２３に示す。ｎＢＰＰ１のＥＬＩＳＡによる滴定およびｒｔＢＢＰ１との相関を図２４に示す。昆虫の脱皮殻によって検出限界（ＬＯＤ）を示すＥＬＩＳＡの結果を図２５に示す。抗体は、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で存在するＢＢＰ１タンパク質を検出することができた。このアッセイにより、１個という少ないトコジラミの脱皮殻を含有する試料中のＢＢＰ１タンパク質を検出することができた（図２６）。
【００９７】
管理された部屋の中における、ＥＬＩＳＡを用いた異なる期間でのトコジラミの検出結果を図２７に示す。
【００９８】
例１５．ラテックス−ｍＡｂ複合体の作製
１０％ｗ／ｖ溶液中のカルボキシル化した４００ｎｍ微粒子１００μｌを活性化緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）で３回洗浄した。微粒子のカルボキシル基を、室温で３０分間、４．８ｍＭ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）および４８ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を用いて活性化した。次いで、微粒子を活性化緩衝液で２回洗浄した後、活性化緩衝液に５０ｍｇ／ｇの抗体（ｍＡｂ  ＥＳＰ−１またはｍＡｂ  ＢＢＰ１−２）を加えた。微粒子：抗体溶液を４℃で一晩混合した。１％微粒子溶液を、室温で３０分間３０μｌのエタノールアミンでクエンチし、次いで、回転させながら室温で３時間、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１％カゼイン）でブロックした。ブロッキング緩衝液を使用した２回の洗浄後、微粒子を１％の最終濃度でブロッキング緩衝液に再懸濁した。微粒子は、プロセスを通して間隔を空けて超音波処理し、粒子の単分散を確実にした。
【００９９】
異なる濃度の抗体が微粒子に塗布されてもよく、またＥＳＰおよびＢＢＰ１タンパク質に対する異なる抗体が使用されてもよい。本方法は、抗体濃度レベルを増加させるためのＢＳＡ結合ステップに限定されない。
【０１００】
例１６．側方流動試験の準備
側方流動試験は、カセットまたは他の迅速検出形態にも使用され得るディップスティックモデルからなる。ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を膜バッキングシートに貼付し、ｍＡｂ  ＥＳＰ−３（５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ））またはｍＡｂ  ＢＢＰ１−１（６ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの試験ライン、および抗マウス（２５０ｕｇ／ｍｌ）対照ラインに噴霧した。
【０１０１】
前述のように調製したラテックス複合体（ｍＡｂ  ＥＳＰ−１およびｍＡｂ  ＢＢＰ１−２）を複合緩衝液（２％魚皮ゼラチン、１％スクロース、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ  ４０００）中で０．０５％〜０．１％の濃度に希釈し、次いでガラス繊維膜に塗布し、３７℃で７２時間乾燥させた。ガラス繊維膜は試料パッドとしても使用され、複合緩衝液で前処理し、コンジュゲートパッドと同じ条件下で乾燥させた。
【０１０２】
側方流動試験は、噴霧した膜の上部に吸光度パッドをやや重複させ、コンジュゲートパッドを噴霧した膜の下部にやや重複させることにより構成される。試料パッドは、試験の下部でコンジュゲートパッドとやや重複する。膜を３７℃で２４時間乾燥させた後、７５ｍｍ×４ｍｍの試験ストリップに切断する。側方流動ストリップをトコジラミ部屋試料および卵ライセートについて試験した。尿素溶解緩衝液を対照として使用した。陽性の結果を図２８（ａ）−ＥＳＰおよび図２８（ｂ）−ＢＢＰ１に示す。
【０１０３】
他の試料採取方法が用いられてもよく、例えば、領域のスワブまたはワイプを採取し、そのスワブまたはワイプを希釈剤に加え、続いてその中に側方流動ストリップを浸漬してもよい。
【０１０４】
例１７．金−ｍＡｂ複合体の作製
側方流動試験に使用するために金−ｍＡｂ複合体を調製した。
【０１０５】
非緩衝コロイド状金をｐＨ７．５に緩衝した後、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ（ｍＡｂ  ＥＳＰ−３）を溶液に加え、２時間回転させた。ＢＳＡブロッキング溶液で金ｍＡｂ複合体を室温で２時間ブロックした。金ｍＡｂ複合体を徹底的に洗浄した。
【０１０６】
金ｍＡｂ複合体（ｍＡｂ  ＥＳＰ−３）を複合緩衝液（２％魚皮ゼラチン、１％スクロース、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ  ４０００、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＶＰＫ−３０）中で１．５〜２．５のＯＤ範囲で使用し、次いでガラス繊維膜に塗布し、３７℃で７２時間乾燥させた。ガラス繊維膜は試料パッドとしても使用され、複合緩衝液で前処理し、コンジュゲートパッドと同じ条件下で乾燥させた。
【０１０７】
例１８−アレルゲン試験
ｒｔＢＢＰ１をニトロセルロース膜に滴定濃度（４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ）でスポットし、ＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を対照として使用した。ニトロセルロース膜をＰＢＳＴ中の５％粉乳でブロックした。希釈率１／１０００のｍＡｂ  ＢＢＰ１−１またはヒト血清で２時間膜をプローブした。ニトロセルロース膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後、希釈率１／２０００の抗マウスＨＲＰまたは希釈率１／５００の抗ヒトＩｇＥ−ペルオキシダーゼで１時間洗浄した。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質で信号を可視化した。ドットブロットの結果を図２９に示す。
【０１０８】
本発明は、非常に低い濃度レベルでシメックス・レクツラリウスおよびシメックス・ヘミプテルスの両方を検出することが可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、トコジラミに特異的な抗原を検出するための使用時点でのアッセイにおいて価値のある用途を有する。アッセイ方法は、ＥＬＩＳＡアッセイまたは側方流動イムノクロマトグラフィー試験を含み得る。使用者は、領域に掃除機を用いるか、スワブまたはワイプで領域を拭き取り、試料を読み取り装置に挿入することができる。非常に少数のトコジラミ集団を検出することができる。任意選択的な試薬は、採取装置からトコジラミ試料を可溶化するための溶液を含み得る。
【０１０９】
当然のことながら、本発明は、例としてのみ与えられる本明細書に記載されるような具体的な詳細に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、種々の代替および変更が可能であることを理解されたい。
【図１】
2018533619.tif 000003
【図２】
2018533619.tif 000004
【図３（ａ）】
2018533619.tif 000005
【図３（ｂ）】
2018533619.tif 000006
【図４（ａ）】
2018533619.tif 000007
【図４（ｂ）】
2018533619.tif 000008
【図５】
2018533619.tif 000009
【図６】
2018533619.tif 000010
【図７（ａ）】
2018533619.tif 000011
【図７（ｂ）】
2018533619.tif 000012
【図８（ａ）】
2018533619.tif 000013
【図８（ｂ）】
2018533619.tif 000014
【図９】
2018533619.tif 000015
【図１０】
2018533619.tif 000016
【図１１】
2018533619.tif 000017
【図１２】
2018533619.tif 000018
【図１３】
2018533619.tif 000019
【図１４（ａ）】
2018533619.tif 000020
【図１４（ｂ）】
2018533619.tif 000021
【図１４（ｃ）】
2018533619.tif 000022
【図１５（ａ）】
2018533619.tif 000023
【図１５（ｂ）】
2018533619.tif 000024
【図１５（ｃ）】
2018533619.tif 000025
【図１６（ａ）】
2018533619.tif 000026
【図１６（ｂ）】
2018533619.tif 000027
【図１６（ｃ）】
2018533619.tif 000028
【図１７（ａ）】
2018533619.tif 000029
【図１７（ｂ）】
2018533619.tif 000030
【図１７（ｃ）】
2018533619.tif 000031
【図１８】
2018533619.tif 000032
【図１９】
2018533619.tif 000033
【図２０】
2018533619.tif 000034
【図２１】
2018533619.tif 000035
【図２２】
2018533619.tif 000036
【図２３】
2018533619.tif 000037
【図２４】
2018533619.tif 000038
【図２５】
2018533619.tif 000039
【図２６】
2018533619.tif 000040
【図２７】
2018533619.tif 000041
【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
2018533619000001.app
【国際調査報告】
2018533619.tif 000044
2018533619.tif 000045
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