(57)【要約】  本開示は、２つ以上の異なる集団、たとえば、アルツハイマー病を分類するための方法を記載する。本開示は、アルツハイマー病患者の同年齢対照および非アルツハイマー病型認知症患者からの分離を増強するための新規の２段階分析、たとえば関連するバイオマーカーを利用する。分析は、変数、たとえば、ウシ胎児血清、患者の年齢，および／またはタンパク質濃度により変更される入力変数における出力変数の線形依存性を説明する。【選択図】  図１
2018512128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団を同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団から分類するための方法であって：
（ａ）前記ＡＤ集団、前記ＡＣ集団、および／または前記非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）前記生物学的試料に対して前記バイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、前記アッセイ出力変数は前記アッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ＊ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること
を含み、前記ＡＤ集団の前記ＡＣ集団および／または前記非ＡＤＤ集団からの分離をもたらす方法。
【請求項２】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料はヒト皮膚線維芽細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト皮膚線維芽細胞は、ウシ胎児血清において培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーは、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブバイオマーカー（ＡＤＮＩ）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが線維芽細胞凝集体である場合、前記出力変数は（面積／数）の自然対数であり、前記入力変数は細胞密度の自然対数およびウシ胎児血清である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーがフラクタル次元である場合、前記入力変数はフラクタル曲線に対する切片であり、前記出力変数は傾きの逆数である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
普遍的なカットオフ値を確立することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）を行うことは、シグナル対ノイズ比に基づくカットオフ値を有する識別限界を確立することを含み、前記ＡＤ集団、前記ＡＣ集団および／または前記非ＡＤＤ集団から生成される複数のデータポイントはカットオフ値を交差しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカーに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）前記対象から生物学的試料を得ること；
（ｂ）前記生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行うこと；
（ｃ）前記バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）前記対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）前記対象のバイオマーカー結果から前記２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること、を含み、前記対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である方法。
【請求項１３】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料はヒト皮膚線維芽細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒト皮膚線維芽細胞は、ウシ胎児血清において培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオマーカーは、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブバイオマーカー（ＡＤＮＩ）から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーが線維芽細胞凝集体である場合、入力変数は（面積／数）の自然対数であり、出力変数はウシ胎児血清である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーがフラクタル次元である場合、入力変数はフラクタル曲線に対する切片であり、出力変数は傾きの逆数である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
普遍的なカットオフ値を確立することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）を行うことはシグナル対ノイズ比に基づく識別限界を確立することを含み、２つ以上のＡＤ集団から生成される複数のデータポイントはカットオフ値を交差しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団を同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団から分類するための方法であって：
（ａ）前記ＡＤ集団、前記ＡＣ集団、および／または前記非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブバイオマーカー（ＡＤＮＩ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、前記アッセイ出力変数は前記アッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること
を含み、前記ＡＤ集団と前記ＡＣ集団および／または前記非ＡＤＤ集団の分離をもたらす方法。
【請求項２４】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
バイオマーカーに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）前記対象から皮膚線維芽細胞を提供すること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブバイオマーカー（ＡＤＮＩ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）前記バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）前記対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）前記対象のバイオマーカー結果から前記２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること
を含み、前記対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である方法。
【請求項２８】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、２つ以上のＦＢＳロットについてランク付けした順位を確立するための方法であって：
（ａ）２つ以上の異なる集団から生物学的試料を得ること；
（ｂ）前記試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、前記アッセイ出力変数は前記アッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、前記２つ以上の異なる集団が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；ならびに
（ｇ）前記２つ以上の異なる集団のダイナミックレンジをプロットすること
を含み、前記プロットは、２つ以上のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす方法。
【請求項３２】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料はヒト皮膚線維芽細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ダイナミックレンジは、前記２つ以上の異なる集団の間の距離に基づく、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ダイナミックレンジは、距離により正規化した平均変動係数に基づく、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないＦＢＳロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）前記試験されていないＦＢＳロットでアッセイを行うこと；
（ｃ）２つ以上の追加のＦＢＳロットを用いる生物学的アッセイで、２つ以上の集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、前記アッセイ出力変数は前記アッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、前記２つ以上の集団の対象が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）前記試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｉ）前記２つ以上の追加のＦＢＳロットおよび前記試験されていないＦＢＳロットのダイナミックレンジをプロットすること
を含み、前記プロットは、全体のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす方法。
【請求項３９】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはアルツハイマー病試料を含み、第３の複数のデータポイントは非アルツハイマー病型認知症試料を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記非アルツハイマー病型認知症試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料はヒト皮膚線維芽細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ダイナミックレンジは、前記２つ以上の異なる集団の間の距離に基づく、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ダイナミックレンジは、距離により正規化した平均変動係数に基づく、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないＦＢＳロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）前記試験されていないＦＢＳロットで生物学的アッセイを行うこと；
（ｃ）前記試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｄ）試験したＦＢＳロットのランク付けした順位に、試験されていないＦＢＳロット正規化結果をプロットすること
を含む方法。
【請求項４６】
前記アッセイは診断アッセイである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記診断アッセイは、アルツハイマー病に関するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
診断システムに基づいて、２つ以上の異なる集団を分類するための方法であって：
（ａ）前記２つ以上の異なる集団から分類のための試料を得ること；
（ｂ）前記試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、前記アッセイ出力変数は前記アッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂで（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程（ｄ）を逆転させること
を含み、前記２つ以上の異なる集団の分離をもたらす方法。
【請求項４９】
前記診断システムは、アルツハイマー診断アッセイ、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
診断システムに基づいて、それを必要とする対象をある集団に分類するための方法であって：
（ａ）分類するための試料を得ること；
（ｂ）前記試料においてアッセイを行うこと；
（ｃ）前記アッセイで、２つ以上の異なる集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、前記アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）前記試料からアッセイ結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）前記試料のアッセイ結果から前記２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定することを含み、前記試料のアッセイ結果から集団までの最短距離が分類である方法。
【請求項５１】
前記診断システムは、アルツハイマー診断アッセイ、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学から選択される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１５年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１２９，７１５号および２０１５年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１９８，８３８に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９下の優先権の利益を主張し、それぞれの出願の各々の内容は参照によりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]
[0003]アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶および認知機能の進行性の低下により特徴付けられる神経変性障害である。五百万人を超える米国人が、この進行性で致命的な疾患と共に生きていると推定される。アルツハイマー病は、脳細胞を破壊し、記憶の喪失、ならびにクオリティオブライフを低減する思考および行動に関する問題を引き起こす。ＡＤには公知の治療法はないが、症状の処置により、ＡＤに罹患している、何百万もの人々、および彼らの家族のクオリティオブライフを改善することができる。ＡＤの早期診断は、クオリティオブライフを最大にする選択を行う時間を患者に与え、未知の問題についての不安を低減し、将来について計画するためにより多くの時間を与え、処置から恩恵を受けるより良好な機会をもたらす。
【０００３】
[0004]しかしながら、ＡＤについての診断の不正確さは、早期段階において特に、重大な神経変性および認知障害を予防するためのその治療介入を困難にする。したがって、アルツハイマー病を診断するための感度および特異度の高い試験が必要である。
【０００４】
[0005]ＡＤについてのバイオマーカーアッセイは、アッセイに用いる前の細胞の状態に関連する入力変数により影響される。Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）；Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）；Ｗ．Ｑ．Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．１１，１６６−１８３（２００２）；Ｔ．Ｋ．Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（３５），１３２０３−１３２０７（２００６）；Ｔ．Ｋ．Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ３１（６），８８９−９００（２００８）；Ｔ．Ｋ．Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３４（２），３３２−３２９（２００９）。このような入力変数には、細胞密度（細胞間相互作用）、患者の年齢、継代数（細胞集団複製の数）、同様に他のアッセイ成分、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれる。細胞ベースアッセイが、実用上の価値に到達する前に長く多変量解析を受けなければならないことが頻繁にある。
【０００５】
[0006]たとえば、ＦＢＳロット間の変動は、しばしばアッセイの出力を変化させ、カットオフをシフトさせる。このようなシフトは図１（Ａ）、（Ｃ）、および図２（Ａ）〜（Ｂ）に示され、Ｌｎ（細胞密度）における、単位凝集体面積の自然対数（Ｌｎ（面積／数））により測定される、ヒト皮膚線維芽細胞凝集の依存性が示される。Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）；Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）。この研究では、３つの異なる会社（すなわち、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、およびＡｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に由来する５つのＦＢＳロットを使用した。
【０００６】
[0007]しかしながら、たとえば、アルツハイマー病についての診断アッセイの事例では、ＦＢＳロットを見出すために長く労力を要するプロセスとなることがあり、細胞ベースアッセイ（たとえば、細胞凝集アッセイについてＬｎ（Ａ／Ｎ）およびネットワーク複雑性アッセイについてフラクタル次元）の出力について、良好なダイナミックレンジ（たとえば、ＡＤおよびＡＣおよび／または非ＡＤＤ集団の間を良好に分離する）が提供される。たとえば、１０から１５のＦＢＳロットを試験し、次にダイナミックレンジ、患者の異なるクラスの間の可分性（separability）、変動係数、直線性などの観点でランク付けしなければならないことになる。このアプローチは、アッセイの実用上の価値に到達することにおいては遅延と解釈される。アッセイが既に商業的に利用可能である場合には、患者について結果を得ることは、ＦＢＳロットが、別のＦＢＳロットを選ぶために必要とされる機能的な品質管理（ＱＣ）に起因して変化するときにはいつでも遅延することになる。さらに、ロット間ＦＢＳ変動は、アッセイが異なるクラスの患者を識別するため用いられる場合の事例では、固定されたカットオフの使用が不可能となり、カットオフは新しいロットが用いられるたびに再調整しなければならないことになる。
【０００７】
[0008]ロット間変動をバイパスする１つの戦略は、ＦＢＳを無血清培地で置きかえることである。Ｄ．Ｗ．Ｊａｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４，５４７−５４８（１９８８）；Ｈ．Ｈａｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７（６），１６７９−８５（２０１３）；Ｅ．Ｆａｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２０，３９５−４００（２００６）；Ｄ．Ｂｒｕｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＬＴＥＸ  ２７（１），５３−６２（２０１０）；Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．２４（４），１０５３−１０６３（２０１０）；Ｄ．Ｗ．Ｊａｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３（１−３），２７−３６（２０００）。この戦略は、細胞がより均一に成長することを可能にする。結果として、いくつかの細胞の特性は、ＦＢＳの変化に対する傾向性が少なくなる。しかしながら、この戦略は、より労働集約的であり、より高価であり、成長因子の制御の性質に起因して全ての細胞ベースアッセイについて成功しないであろう。実用上の観点から、より高価であり、より労働集約的な方法は、より高いコストおよびより低い利幅であると解釈される。さらに、血清が、無血清培地に対して好ましい状況がある。Ｈ．Ｈａｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７（６），１６７９−８５（２０１３）。
【０００８】
[0009]ここで開示される方法による、別の戦略は、ＦＢＳロットにかかわらず同じカットオフを提供して、ＦＢＳロット間の比較をより容易にする。
【０００９】
[0010]ここで開示されるＡＤ診断アッセイの検証プロセスの間に、発明者らは、驚くべきことに、患者の分類が２つの予想外の変数に依存することを発見した。第１の変数ｘは、細胞密度の自然対数により測定される、実験前の細胞の状態である。第２の変数ｙは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と呼ばれるヒト皮膚線維芽細胞に供給される培地の成分の１つである。第１の変数であるＬｎ（細胞密度）における依存性は直線的であるが、第２の変数であるＦＢＳロットは別個の様式でデータクラスの線形パラメーターを変更する（図１（Ａ）、（Ｃ）および図２（Ａ）〜（Ｂ））。
【００１０】
[0011]最適な診断（すなわち、２つのクラスの患者の線形依存性が、第２の変数で別個に変化される場合に、それらの間の分離）を決定するため、発明者らは、第２の変数に関して最適な選択をもたらす２段階方法を開発した。
【００１１】
[0012]したがって、本発明者らは、１つ以上のバイオマーカーに基づいて、２つ以上のＡＤ集団、たとえば、ＡＤクラス１（Ｃ１）および同年齢対照クラス２（Ｃ２）を分類するための新規方法を開発した。たとえば、本発明者らは、驚くべきことに、診断アッセイ測定値、実験前の細胞密度およびＦＢＳにおける、Ｌｎ（面積／数）（Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）；Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）を参照されたい）の依存性を説明する新規の２段階方法を発見した。結果として、これらの新規方法は、他の分野の研究、たとえば、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学にも適用することができる。
【００１２】
[0013]いくつかの態様において、バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団を同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団から分類するための方法であって：
（ａ）ＡＤ集団、ＡＣ集団、および／または非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること
を含み、
ＡＤ集団のＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団からの分離をもたらす方法が、ここで開示される。
【００１３】
[0014]バイオマーカーに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）対象から生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行うこと；
（ｃ）バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）対象のバイオマーカー結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること
を含み、対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である、方法もここで開示される。
【００１４】
[0015]種々の態様において、バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団を同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団から分類するための方法であって：
（ａ）ＡＤ集団、ＡＣ集団、および／または非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、およびアルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること
を含み、
ＡＤ集団とＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団の分離をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００１５】
[0016]いくつかの態様において、バイオマーカーに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）対象から生物学的試料を得ること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、およびアルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）対象のバイオマーカー結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること、を含み、対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である、方法が、ここで開示される。
【００１６】
[0017]種々の態様において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、２つ以上のＦＢＳロットについてランク付けした順位を確立するための方法であって：
（ａ）２つ以上の異なる集団から生物学的試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成すること、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、２つ以上の異なる集団が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；ならびに
（ｇ）２つ以上の異なる集団のダイナミックレンジをプロットすること
を含み、プロットは、２つ以上のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００１７】
[0018]いくつかの態様において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないＦＢＳロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）試験されていないＦＢＳロットでアッセイを行うこと；
（ｃ）２つ以上の追加のＦＢＳロットを用いる生物学的アッセイで、２つ以上の集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、２つ以上の集団の対象が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｉ）２つ以上の追加のＦＢＳロットおよび試験されていないＦＢＳロットのダイナミックレンジをプロットすること
を含み、プロットは、全体のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００１８】
[0019]種々の態様において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないＦＢＳロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）試験されていないＦＢＳロットで生物学的アッセイを行うこと；
（ｃ）試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｄ）試験したＦＢＳロットのランク付けした順位に、試験されていないＦＢＳロット正規化結果をプロットすることを含む方法が、ここで開示される。
【００１９】
[0020]いくつかの態様において、診断システムに基づいて、２つ以上の異なる集団を分類するための方法であって：
（ａ）２つ以上の異なる集団から分類のための試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程（ｄ）を逆転させること
を含み、２つ以上の異なる集団の分離をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００２０】
[0021]種々の態様において、診断システムに基づいて、それを必要とする対象をある集団に分類するための方法であって：
（ａ）分類するための試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行うこと；
（ｃ）アッセイで、２つ以上の異なる集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）試料からアッセイ結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）試料のアッセイ結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること
を含み、試料のアッセイ結果から集団までの最短距離が分類である、方法が、ここで開示される。
【００２１】
[0022]本開示の他の側面および態様が、明記されるまたは以下の詳細な説明から容易に明らかとなろう。前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的なおよび説明的なもののみであり、特許請求の範囲の限定であることを意図するものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】[0023]図１（Ａ）は、Ｌｎ（細胞密度）における単位凝集体面積の自然対数（Ｌｎ（面積／数））により測定される、ＡＣ試料と比較してＡＤ皮膚試料についてのアッセイにおけるヒト皮膚線維芽細胞凝集の依存性を示す；図１（Ｂ）は、正規化したアッセイ（傾き＝０）を説明する；図１（Ｃ）は、図１（Ａ）からの近似線の傾きおよび切片に付されたノイズを示す；図１（Ｄ）は、図１（Ｃ）からのノイズデータクラスについての正規化したアッセイを示す。
【図２】[0024]図２（Ａ）−（Ｂ）は、Ｌｎ（細胞密度）における（Ｌｎ（面積／数））およびＡＣ試料と比較したＡＤ皮膚試料についてのＦＢＳロットの依存性を示す；図２（Ｃ）は、図２（Ｂ）からの生データについての確率分布を説明する；図２（Ｄ）は、方法の第１段階後の正規化データについての確率分布を説明する。
【図３】[0025]図３（Ａ）−（Ｆ）は、図１（Ｃ）からの患者の２つのノイズデータクラスに関する方法における分析の第１段階のステップバイステップ方式での説明を示す。
【図４】[0026]図４（Ａ）は、未知のもので検査された種々のＦＢＳロットについての距離によりランク付けした生データを示す；図４（Ｂ）は、未知のものを含む図４（Ａ）のデータについての距離により正規化された平均変動係数を示す。
【図５】[0027]図５（Ａ）および（Ｂ）は、Ｌｎ（細胞密度）の関数としてのＦＢＳロットに関するカットオフ（ｘ）関数をプロットする。
【図６】[0028]図６（Ａ）は、ＡＤ試料、ＡＣ試料、および非アルツハイマー病型認知症試料についてのフラクタル曲線に関する傾きの逆数対切片を示す；図６（Ｂ）は、図６（Ａ）からの正規化データを示す；図６（Ｃ）は、１２０個の無作為に生成された代理データを示す；図６（Ｄ）は、図６（Ｃ）からの正規化データを示す。
【図７】[0029]図７（Ａ）は、無作為に生成されたデータの３つの対間の距離をランク付けする；図７（Ｂ）は、ランク付けした距離が、線形依存性Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）を有することを示す。
【図８】[0030]図８（Ａ）および（Ｂ）は、識別限界（ｄ−ｌｉｍｉｔ）の確立におけるシグナル対ノイズ比を示す（ここで、ノイズのレベルは１０％である）。
【図９】[0031]図９（Ａ）は、ＡＤ試料（Ｃ1）、ＡＣ試料（Ｃ3）、およびＭと標識された第３の群についてのＬｎ（面積／数）対Ｌｎ（細胞密度）を示す；図９（Ｂ）は、図９（Ａ）からの３つのクラスを水平および平行なデータクラスへとマップしている；図９（Ｃ）は、傾きにおける全長（Ｌ）の依存性を示す（ここで、図９（Ａ）からの３つのクラスの位置は、四角（Ｃ1）、円（Ｍ）、および三角（Ｃ3）で示される）；図９（Ｄ）は、図９（Ａ）からのＸ射影／Ｘ範囲におけるおよび傾きにおける長さ（Ｌ）の依存性を示す；図９（Ｅ）は、図９（Ａ）および図９（Ｂ）からのセグメントの対間の距離を示す（ここで、黒色実線での曲線は、線形および指数関数的な近似である）；図９（Ｆ）は、図９（Ｅ）における距離の比を示す。
【図１０】[0032]図１０（ａ）は、酵母（Saccharomyces cerevisiae）の２種の細胞周期調節遺伝子に関する生データを示す。Ｐ．Ｔ．Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９，３２７３−３２９７（１９９８）を参照されたい；図１０（ｂ）は、低い表面輝度銀河の回転曲線を示す。Ｋ．ｄｅ  Ｎａｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＡｐＪＳ  １６５，４６１−４７９（２００６）；Ｋ．ｄｅ  Ｎａｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＡｐＪＳ  ６７６，９２０−９４３（２００８）を参照されたい；図１０（ｃ）は、図１０（Ａ）におけるクラスに関する最適化されたデータを示す；図１０（ｄ）は、図１０（ｂ）におけるクラスに関する最適化されたデータを示す。
【図１１】[0033]図１１（ａ）−（ｆ）は、ブリオスタチンもしくはプラセボの投与の３時間後のミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ：mini-mental state examination）またはＦｏｌｓｔｅｉｎ試験における変化対４８時間での神経心理状態反復性バッテリー（ＲＢＡＮＳ：Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status）における変化を示す（ここで、両群に関する依存性は、直線的である）。
【図１２】[0034]図１２（ａ）および（ｂ）は、アルツハイマー病診断アッセイについての年齢依存性を分類する方法に関する生データおよびアルゴリズムデータをプロットしている。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
[0035]以下は、本明細書において用いられる用語の定義である。本明細書の群または用語について提供される初期の定義は、別段の記載がない限り、個々にまたは別の群の部分として、本明細書を通して、その群または用語に適用される。
【００２４】
[0036]略語：ＡＤ：アルツハイマー病；ＡＣ：認知症になっていない同年齢対照；非ＡＤＤ：非アルツハイマー型認知症；Ｓ＝任意の診断システム；Ｃ1，Ｃ2，．．．，Ｃn：データの２つ以上のクラス；Ｄ＝データクラス間の距離。
【００２５】
[0037]ここで用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段指示しない限り、複数の参照物を含む。
【００２６】
[0038]ここで用いられる場合、アルツハイマー病集団は、アルツハイマー病患者集団、同年齢対照（ＡＣ）集団、および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団を意味することができる。
【００２７】
[0039]ここで用いられる場合、用語「対象」は、一般的に、生物を指す。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む哺乳動物または哺乳動物細胞でありうる。該用語はまた、細胞またはこのような細胞のドナーもしくはレシピエントを含む、生物を指す。種々の態様において、用語「対象」は、ここに記載される化合物または薬学的組成物のレシピエントである、ヒト、哺乳動物および非哺乳動物、たとえば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、ならびに爬虫類が含まれるがこれらに限定されない、任意の動物（たとえば、哺乳動物）を指す。いくつかの状況下で、用語「対象」および「患者」は、ここでヒト対象と交換可能に使用される。
【００２８】
[0040]バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団と同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団を分類するための新規方法であって：
（ａ）ＡＤ集団、ＡＣ集団、および／または非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること、
を含み、ＡＤ集団とＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団の分離をもたらす、方法を、本発明者らは発見した。
【００２９】
[0041]いくつかの態様において、方法の第１段階に関して、切片による２つ以上のクラスの患者の距離保存（すなわち、等長変換）に基づく正規化の新規アプローチが提供される。Ｈ．Ｓ．Ｍ．Ｃｏｘｅｔｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６１）；Ｉ．Ｍ．Ｙａｇｌｏｍ，Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｉ，  ＩＩ，  ＩＩＩ，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を参照されたい。この方法の第１段階は、２つ以上のデータクラスの正規化、すなわち傾き＝０、および固定されたカットオフの確立である。しかしながら、第１段階であるため、２つのクラスの患者の分離は指数関数的に増大する。この段階の最後には、データクラスは、固定されたカットオフに関して平行、水平、対称であり、切片により分類される。したがって、いくつかの態様において、方法の第１段階は、４つの等長変換を用い、傾きを横断的に正規化し、固定されたカットオフを設定し、患者のクラス間の距離を指数関数的に増大させる。
【００３０】
[0042]いくつかの態様において、第１段階は、広範囲の診断システムにおける線形近似の切片についてのソーティング手順として作用する（図３および１０を参照されたい）。種々の態様において、これらの診断システムは、以下から選択される：（１）ＡＤ診断アッセイ（Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）；Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４））；（２）機械学習（Ｄ．Ｅｌｉｚｏｎｄｏ，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＮＥＵＲＡＬ  ＮＥＴＷＯＲＫＳ  １７（２），３３０−３４４（２００６））；（３）神経ネットワーク（Ｆ．Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｏｌ．５（８４２），１−２４（２０１４）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｌａｕｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｍｏｄｅｌｓ（１９９４）ｉｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ａｓ  Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ２４７−２５９（２０１３）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｙｂｅｒｎ．６２，３６３−３７６（１９９０）；Ｍ．Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ２９（８）１１５３−１１６４（２００１））；（４）データマイニング（Ｒ．Ｈａｒａｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ３５８７，１３２−１４（２００５））；（５）遺伝子発現（Ｓ．Ｔａｖａｚｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．２２（３），２８１−２８５  （１９９９）；Ｐ．Ｔ．Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９，３２７３−３２９７（１９９８））；（６）パターンもしくは顔認識（Ａ．Ｌ．Ｙａｒｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｆｉｚｉｋａ．６（２），５２−５６（１９６１）；Ｋ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  ９（４），４９１−５０８（１９９７））；（７）認知心理学（（Ｆ．Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｏｌ．５（８４２），１−２４（２０１４）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｌａｕｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｍｏｄｅｌｓ（１９９４）ｉｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ａｓ  Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ２４７−２５９（２０１３）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｙｂｅｒｎ．６２，３６３−３７６（１９９０）；Ｍ．Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ２９（８），１１５３−１１６４（２００１）；Ｊ．Ｂ．Ｔａｌｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉａ  ５１（３），４７２−４８１（２０１３））；ならびに（８）天文学（Ｉ．Ｍ．Ｙａｇｌｏｍ，Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅ���ｉｃａ；Ｄ．Ｅｌｉｚｏｎｄｏ，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＮＥＵＲＡＬ  ＮＥＴＷＯＲＫＳ  １７（２）３３０−３４４（２００６）；Ｆ．Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｏｌ．５（８４２），１−２４（２０１４）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｌａｕｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｍｏｄｅｌｓ（１９９４）ｉｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ａｓ  Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（２０１３））。
【００３１】
[0043]バイオマーカーに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）対象から生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行うこと；
（ｃ）バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）対象のバイオマーカー結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること、を含み、対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である、方法を、本発明者らはさらに発見した。
【００３２】
[0044]方法の第２段階について、第１段階からもたらさせる固定されたカットオフを有する正規化データクラスは、第２の変数、たとえばウシ胎児血清と比較される。いくつかの態様において、この第２段階は、以下の分類のための２つの基準を採用する：（１）データクラス間の距離Ｄ＝［（ＸC1−ＸC2）2＋（ＹC1−ＹC2）2］1/2、ならびに（２）データクラス間の距離により正規化した平均変動係数＜ＣＶ＞／Ｄ＝［（ＣＶC1＋ＣＶC2）／２］／Ｄ（図１（Ｂ）および（Ｄ））。したがって、いくつかの態様において、第２段階は、患者のクラスの間の距離および距離により正規化した平均変動係数を使用し、それらを別個の変数ｙ（たとえば、ウシ胎児血清ロット）でランク付けしてもよい。この依存性（標準曲線と呼ばれる）Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）は、直線的である。
【００３３】
[0045]一般論として、ここに開示される方法は、変数の１つｘにおいて線形依存性を示し、線形依存性は第２の変数ｙで別個に変化する、２つのデータクラス（Ｃ１，Ｃ２）を分離するシステムＳの状態をランク付けすることを含む。いくつかの態様において、データクラスＤの間の距離により測定される、システムＳ＝Ｓ（Ｃ１，Ｃ２，ｘ，ｙ）に関して２つのクラスの患者の分離は、別個の変数ｙでランク付けされるＤ＝Ｄ（Ｒａｎｋｙ）。
【００３４】
[0046]いくつかの態様において、ここに開示されるＡＤ診断アッセイは、たとえば、細胞密度、ＦＢＳ、年齢などの予想外の変数も取り扱う場合に、患者を診断するための定量的なフレームワークを確立する。このＡＤ診断アッセイに関する戦略は、ＦＢＳロットを変化させる場合に、有意に低減された品質管理（ＱＣ）期間を含む。いくつかの態様において、開示される方法は、線形近似を確立するため、患者のそれぞれのクラスにおいて要求される、より少数の試料（＜５）を必要とする。低減されたＱＣ期間は、アッセイの実用上の価値を増大させる、その理由は、試験所が、細胞ベースアッセイを用い、ＦＢＳロットまたは無ＦＢＳ培地の異なる変種での出力シフトに直面する際に援助しうるからである。いくつかの態様において、ここで開示される方法は、タイプＳ＝Ｓ（Ｃ1，Ｃ2，．．．，Ｃn，ｘ，ｙ）のＡＤ診断アッセイに適用されてもよい。
【００３５】
[0047]ここで記載される方法は、線形依存性または線形入出力関数を示す任意のシステムに対して一般的な適用可能性を有する。たとえば、方法は、分離される必要があるデータクラスの数の観点で制限はない。いくつかの態様において、２段階手順は、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学などの分野で採用されてもよい。たとえば、種々の態様において、２段階分析は、等長変換による変動に対する補正のための標準化した方法を提供するため、ＦＢＳおよび無ＦＢＳ培地の販売会社により利用されてもよい。いくつかの態様において、２段階手順を採用することにより少なくとも１つのＦＢＳロットをスクリーニングするための方法が、ここで開示される。
【００３６】
[0048]いくつかの態様において、ＦＢＳでのアッセイを用いて、２つ以上のウシ胎児血清（ＦＢＳ）ロットについてランク付けした順位を確立するための方法であって：
（ａ）２つ以上の異なる集団から生物学的試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、２つ以上の異なる集団が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；ならびに
（ｇ）２つ以上の異なる集団のダイナミックレンジをプロットすること、を含み、プロットは、２つ以上のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００３７】
[0049]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【００３８】
[0050]いくつかの態様において、試料は、ヒト皮膚線維芽細胞を含む。
【００３９】
[0051]種々の態様において、ダイナミックレンジは、２つ以上の異なる集団の間の距離に基づく。種々の態様において、ダイナミックレンジは、距離により正規化した平均変動係数に基づく。
【００４０】
[0052]ＦＢＳでのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないウシ胎児血清（ＦＢＳ）ロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）試験されていないＦＢＳロットでアッセイを行うこと；
（ｃ）２つ以上の追加のＦＢＳロットを用いる生物学的アッセイで、２つ以上の集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させることであって、２つ以上の集団の対象が分離される、下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｉ）２つ以上の追加のＦＢＳロットおよび試験されていないＦＢＳロットのダイナミックレンジをプロットすること、を含み、プロットは、全体のＦＢＳロットのランク付けした順位をもたらす、方法も、ここで開示される。
【００４１】
[0053]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【００４２】
[0054]いくつかの態様において、試料は、ヒト皮膚線維芽細胞を含む。
【００４３】
[0055]種々の態様において、ダイナミックレンジは、２つ以上の異なる集団の間の距離に基づく。種々の態様において、ダイナミックレンジは、距離により正規化した平均変動係数に基づく。
【００４４】
[0056]いくつかの態様において、ＦＢＳでのアッセイを用いて、少なくとも１つの試験されていないウシ胎児血清（ＦＢＳ）ロットをランク付けする方法であって：
（ａ）試験されていないＦＢＳロットを得ること；
（ｂ）試験されていないＦＢＳロットで生物学的アッセイを行うこと；
（ｃ）試験されていないＦＢＳロットからバイオマーカー結果を正規化すること；
（ｄ）試験したＦＢＳロットのランク付けした順位に、試験されていないＦＢＳロット正規化結果をプロットすることを含む、方法が、ここで開示される。いくつかの態様において、アッセイは、診断アッセイ、たとえば、アルツハイマー病に関する診断アッセイである。
【００４５】
[0057]いくつかの態様において、方法において等長変換を、自動化のため用いてもよい。傾きを横断するデータクラスの正規化および固定されたカットオフの確立によって、第２の変数ｙ（たとえば、ＦＢＳロット）の比較および分類が可能になる。いくつかの態様において、ここで開示される方法は、参照標準、すなわち、ダイナミックレンジＤと別個の変数ｙのランクの間の線形依存性Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）をさらに確立する。別個の変数ｙ（たとえば、ＦＢＳロット）における任意の他の新規条件は、この参照標準と比較されてもよい。いくつかの態様において、試験されていないＦＢＳロットのランクは、新規ｙ−状態（たとえば、ＦＢＳロット）が、１次標準曲線における位置に基づいて、良好なダイナミックレンジＤおよび正規化した変動係数＜ＣＶ＞／Ｄによるノイズの小さいレベルを有する場合、直ちに決定することができる（図４を参照されたい）。
【００４６】
[0058]いくつかの態様において、試料は、ヒト対象から得られた少なくとも１つの細胞を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞は、末梢細胞（すなわち、非ＣＮＳ組織から得られた細胞）である。いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞は、線維芽細胞である。種々の態様において、線維芽細胞は、皮膚線維芽細胞である。線維芽細胞の細胞前駆体、たとえば誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）も用いられてもよい。たとえば、ヒト皮膚線維芽細胞からＩＰＳＣを得る最近の技術は、複数種の細胞、たとえば神経細胞へのＩＰＳＣの分化を可能にし、皮膚線維芽細胞とＩＰＳＣが分化した神経細胞との両方においてＡβの不均衡を示した。Ｗｈａｌｌｅｙ  Ｋ．，”Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｉｓｈｉｎｇ  ｕｐ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３，１４９（Ｍａｒｃｈ  ２０１２）｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ３２０１。
【００４７】
[0059]いくつかの態様において、試料は、皮膚細胞、血液細胞（リンパ球）、および口腔粘膜細胞から選択される少なくとも１つの細胞を含む。
【００４８】
[0060]非アルツハイマー病細胞は、たとえば同年齢対照から選択されてもよい。いくつかの態様において、同年齢対照は、非ＡＤの認知症になっていない集団から選択される。いくつかの態様において、同年齢対照は、非ＡＤの認知症になっている集団、たとえばハンチントン舞踏病またはパーキンソン病を有する患者から選択される。
【００４９】
[0061]少なくとも１つの細胞は、成長のため培地において培養されてもよい。いくつかの態様において、培地は、ＦＢＳを含む。いくつかの態様において、細胞は、タンパク質混合物、たとえば、ゼラチン状のタンパク質混合物である培地において培養される。非限定的な例示的なゼラチン状のタンパク質混合物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、エンゲルブレス−ホルム−スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞により分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物の商品名であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売される。この混合物は、多くの組織において見られる複雑な細胞外環境と似ており、細胞生物学者により細胞培養の基質として用いられる。
【００５０】
[0062]いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞は、細胞外基質タンパク質を含む調製物において培養される。いくつかの態様において、調製物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ナイドジェン、および／またはその組み合わせを含む。いくつかの態様において、調製物は、腫瘍、たとえばＥＨＳマウス肉腫から抽出される。調製物は、成長因子、たとえばＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／もしくは他の成長因子、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。特定の態様において、成長因子は、ＥＨＳマウス肉腫において自然に生じる。細胞外基質タンパク質はまた、多数の他のタンパク質を含有してもよい。
【００５１】
[0063]いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞は、基底膜調製物において培養される。いくつかの態様において、調製物は可溶化される。いくつかの態様において、基底膜調製物は、腫瘍、たとえば細胞外基質タンパク質に富む腫瘍であるＥＨＳマウス肉腫から抽出される。その主要な構成成分は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ナイドジェンである。いくつかの態様において、調製物は、ＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／またはＥＨＳ腫瘍において自然に生じてもよいか、または生じなくてもよい他の成長因子を含有する。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ）は、より高度に定義された基底膜調製物を必要とする適用に特に十分に適合することが分かっている。
【００５２】
[0064]培養後短時間のうちに、測定可能な細胞ネットワークが形成される。この期間は、たとえば細胞タイプおよび状態を考慮して変動してもよいが、一般的に、この期間は、約１時間以下の範囲、約１０分〜約６０分の範囲、たとえば約１０分〜約４５分またはそれらの間の任意の時間にある。ある時間、たとえばおよそ５時間後、これらのネットワークは変性し始め、エッジが後退して、測定可能な「集塊」または凝集体が残る。いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞を培養するための期間は、約１時間〜約７２時間、たとえば約１２時間〜約７２時間、または約２４時間〜約４８時間から選択される。特定の態様において、期間は、約４８時間、またはその任意の１時間の増分区分（increment subdivision）である。
【００５３】
[0065]方法は、培養された細胞を期間の最後にイメージングすることをさらに含んでもよい。画像は、当該技術分野において公知の技術に従い取得されてもよい。たとえば細胞ネットワークの画像は、倒立顕微鏡、たとえばＷｅｓｔｅｒｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２０００で取得されてもよく、所望の拡大率において画像取得ソフトウエアを介してコンピューターにより制御されてもよい。適当なイメージング技術は、共焦点顕微鏡、位相差、明視野、蛍光、微分干渉コントラスト、およびロボットシステムを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
[0066]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、バイオマーカーアッセイに基づいて、２つ以上のＡＤ集団を分類する。バイオマーカーアッセイは、任意のＡＤ診断アッセイであってもよい。たとえば、ＡＤ診断アッセイは、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）イプシロン、アルツハイマー病特異的バイオマーカー（ＡＤＳＭＢ）、空隙度（lacunarity）、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブ（ＡＤＮＩ：Alzheimer's disease Neuroimagining Initiative）バイオマーカーを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
[0067]細胞凝集
[0068]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、細胞凝集である。たとえば、凝集体の面積は、任意の適当な方法により、たとえば楕円を凝集体にわたり近似することにより、決定することができる。凝集体のカウント、ならびに凝集体面積の決定は、手動で行うことができるか、またはたとえば当該技術分野で公知の画像処理技術により、自動化することができる。
【００５６】
[0069]いくつかの態様において、細胞密度は、μｍ2または視野当たりの細胞の数に基づき測定される。特定の態様において、細胞密度は、１０×画像当たりの細胞の数を測定することにより測定される。特定の態様において、細胞密度の関数としての凝集体の数当たりの平均面積の変化率は、３２０〜５５０個の細胞／１０ｘ画像の境界、またはたとえば３３０〜５００個の細胞／１０ｘ画像の境界内で評価される。
【００５７】
[0070]細胞凝集率は、凝集体の数当たりの平均面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、決定される。いくつかの態様において、細胞密度の関数としての凝集体の数当たりの平均面積の変化率は、凝集体の数当たりの平均面積と細胞密度との間の線形近似の傾きを決定することにより、評価される。
【００５８】
[0071]ヒト対象から得られ培養された細胞の凝集率は、非アルツハイマー病対照細胞を用いて決定された凝集率と比較される。ヒト対象由来の培養された細胞の凝集率が、非アルツハイマー病対照細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、診断はアルツハイマー病について陽性である。
【００５９】
[0072]フラクタル次元
[0073]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、フラクタル次元である。たとえば、ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークの複雑性は、これらのフラクタル次元を計算することにより数量化することができる。フラクタル分析は、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞を区別するための基準としてネットワークの複雑性を利用する。ＡＤに罹患している患者から得られた線維芽細胞は、組織培養において成長させる場合に、ＡＣ細胞よりも統計的に有意により低いフラクタル次元を有する。フラクタル次元により測定されるネットワークの複雑性はまた、ＡＣおよび非ＡＤＤ線維芽細胞と比較して、ＡＤから取られた線維芽細胞に関して著明に異なる。したがって、ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークＡＤ事例の複雑性の低減により、ＡＣと非ＡＤＤ事例の区別が提供される。
【００６０】
[0074]ネットワーク変性（たとえば、約４８時間）の後、細胞は、遊走し、数日内にコンフルエンスに到達する。この回復は、フラクタル次元における直線的な増大により取得される。したがって、フラクタル曲線の傾きおよび切片により測定されるような回復は、ＡＤ、非ＡＤＤ、およびＡＣ細胞の間の数量化可能な差を示す。
【００６１】
[0075]フラクタル次元は、Ｎ（ｓ）＝（１／ｓ）Dに一般化することができ、式中のＤは次元であり、整数または非整数であってもよい。両側の対数を取るとｌｏｇ（Ｎ（ｓ））＝Ｄ  ｌｏｇ（１／ｓ）が与えられ、フラクタル次元はｌｏｇ（１／ｓ）に対してｌｏｇ（Ｎ（ｓ））をプロットすることにより決定することができる。傾きが非整数である場合、次元はフラクショナル（フラクタル）次元である。
【００６２】
[0076]未処理画像（たとえば、デジタル画像）を２つのガウスの差などを用いるエッジ検出手順を通してフィルター処理した後、フラクタル次元は標準のボックスカウンティング手順を用いて計算してもよい。エッジ検出は、たとえば、画像輝度が急に変化するまたは他の不連続性を有する、デジタル画像における識別点に向けたアルゴリズムを指すため、画像処理の分野、特に特徴検出および特徴抽出の領域において用いられる用語である。
【００６３】
[0077]結像モデルに対するむしろ一般的な仮定のもと、画像輝度における不連続性は、深さにおける不連続性、表面配向における不連続性、材料特性における変化およびシーンイルミネーションにおける変動の１つ以上に相当する可能性があることを示すことができる。
【００６４】
[0078]画像にエッジ検出器を適用することにより、オブジェクトの境界、表面マーキングの境界、同様に表面配向における不連続性に相当する曲線を示す１セットの連結曲線が導かれうる。したがって、画像にエッジ検出器を適用することにより、処理されるデータの量が有意に低下されうる、したがって、関連性がより少ないと考慮されうる情報がフィルターを通して出されるが、画像の重要な構造上の特性は保存される。したがって、エッジ検出工程が成功する場合、オリジナル画像中の情報内容を解釈する引き続くタスクは実質的に単純化されうる。
【００６５】
[0079]エッジ検出のための方法は、探索ベースおよびゼロ交差ベースの２つのカテゴリーに一般にグループ分けすることができる。探索ベース方法は、通常、グラジエント規模などの１次導関数式であるエッジ強度の測定値を最初に計算すること、通常、グラジエント方向であるエッジの局所の配向性の計算された推定値を用いてグラジエント規模の局所の方向極大値（local directional maxima）を次に探索することによりエッジを検出する。ゼロ交差ベースの方法は、通常、ラプラシアンのゼロ交差または非線形微分式のゼロ交差である、エッジを見出すために、画像から計算された２次導関数式におけるゼロ交差を探索する。エッジ検出に対する前処理工程として、スムージング段階、たとえば、ガウススムージングが適用されてもよい。他の態様において、ノイズフィルタリングアルゴリズムが採用されてもよい。
【００６６】
[0080]公開されているエッジ検出方法は、適用されるスムージングフィルターのタイプおよびエッジ強度の測定が計算される様式において主に異なる。多くのエッジ検出方法は画像グラジエントの計算に頼っているので、それらはｘ−およびｙ−方向におけるグラジエント推定を計算するために用いられるフィルターのタイプにおいても異なる。
【００６７】
[0081]フラクタル次元は、画像がボックスでカバーされるボックスカウンティング手順を用いて、たとえばコンピューターにより決定される。目標は、画像をカバーするために要求されるボックスの数が、どのようにしてボックスのサイズで変化するかを決定することである。オブジェクトが１次元、たとえば、線である場合、上記の通り関係性はＮ（ｓ）＝（１／ｓ）１であり、高次についても同様である。いくつかの態様において、ボックスカウンティング手順は、細胞試料のデジタル画像を用いてコンピューター上で実行される。
【００６８】
[0082]ＡＤに関する陽性診断は、Ａβ処理した試験細胞についてのフラクタル次元が、無処置の試験細胞についてのフラクタル次元未満である場合になされる。ＡＤに関する陽性診断は、Ａβ処理した試験細胞とＡＤ対照細胞との間のフラクタル次元の差が、統計的に有意である場合になされる。
【００６９】
[0083]空隙度
[0084]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、空隙度である。ここで用いられる場合、「空隙度」は、どのようにしてフラクタルによって空間を充填させるかの基準を指す。それを用いることにより、同じフラクタル次元を共有しうると同時に、非常に視覚的に異なって現れる、フラクタルおよびテクスチュアがさらに分類される。高密度なフラクタルは、低い空隙度を有する。フラクタルの粗さが増大するにつれて、空隙度は低減し；直観的に空隙は「ギャップ」を意味する（より多くのギャップ＝より高い空隙度）。たとえば、ここに参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４８６４８号を参照されたい。
【００７０】
[0085]空隙度は、細胞ネットワーク中のギャップを数量化する複雑性識別（complexity discrimination）のための補足的な基準である。ＡＤ細胞株は、ＡＣおよび非ＡＤＤ個体からの細胞株と比較した場合に平均空隙度の増大を示す。
【００７１】
[0086]ここで開示される空隙度分析方法は、識別の第２レベルとして用いられる複雑性の補足的な基準として、線維芽細胞パターンのギャップを数量化する。平均空隙度は、ＡＣおよび非ＡＤＤ線維芽細胞との比較ではＡＤ線維芽細胞に対してより高い。典型的には、ネットワーク変性が最大化される、すなわち、単離された凝集物のみが可視である場合に、空隙度が増大し、ピークに達する。空隙度は、ネットワーク再生が開始される際に低下する。
【００７２】
[0087]ＡＤに関する陽性診断は、Ａベータ処理した試験細胞についての空隙度が、無処置の試験細胞についての空隙度より大きい場合になされる。いくつかの態様において、ＡＤに関する陽性診断は、Ａβ処理した試験細胞とＡＤ対照細胞との間の空隙度の差が、統計的に有意である場合になされる。
【００７３】
[0088]細胞遊走
[0089]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、細胞凝集である。細胞遊走は、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞を区別することを可能にする。自由に遊走している細胞（freely migrating cell）は、凝集物に付着しない細胞と定義される。自由に遊走している細胞は、培養の間に、異なる時間で計数されてもよい。たとえば、時間ｔ1およびｔ2に関して、遊走率はＲ＝（Ｎ2−Ｎ1）／ΔＴ（式中、ΔＴ＝ｔ２−ｔ１は細胞遊走カウントの間の時間間隔であり、Ｎ１およびＮ２は時間ｔ1およびｔ2で遊走している細胞の数である）として計算される。たとえば、いくつかの態様において、自由に遊走している細胞の数は、プレーティング後約２４時間、たとえば、プレーティング後約３６時間、約４８時間、約５０時間、約５２時間、約５５時間、約５７時間、または約６０時間計数されてもよい。少なくとも１つの態様において、遊走率はＮ1＝プレーティング後４８時間およびＮ2＝プレーティング後５５時間の時間に計数される。いくつかの態様において、初期細胞密度は、制御される。少なくとも１つの態様において、初期細胞密度は、約５０個の細胞／ｍｍ3に制御される。
【００７４】
[0090]ＡＤに関する陽性診断は、遊走している細胞の数が、同年齢対照（ＡＣ）または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）患者についての遊走している細胞の数未満である場合になされる。いくつかの態様において、ＡＤに関する陽性診断は、ＡＤとＡＣまたはＡＤと非ＡＤＤ細胞の間の遊走している細胞の数における差が、平均から１標準偏差未満である場合になされる。少なくとも１つの態様において、約０．３ｈｒ-1より低い遊走率は、ＡＤを示す。
【００７５】
[0091]ＰＫＣイプシロン
[0092]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、ＰＫＣイプシロンである。たとえば、特にαおよびεのプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソザイムは、シナプスの欠損、Ａβおよびアミロイドプラークの生成、ならびに神経原繊維性タングル中のｔａｕのＧＳＫ−３β媒介性過剰リン酸化を含む、ＡＤ病状の主要な側面の調節に重要な役割を果たす。ＡＤ特異的なシグナル伝達欠陥の証拠は、末梢組織、たとえば、血液、皮膚線維芽細胞、および眼球組織において以前から見出されている。ＰＫＣ−εは、ＡＤ皮膚線維芽細胞における正確なＡＤバイオマーカーである。
【００７６】
[0093]ＰＫＣイプシロンレベルは、同年齢対照（ＡＣ）よりアルツハイマー病対象（ＡＤ）においてより低い。すなわち、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法は、以下の工程：
ａ）前記ヒト対象におけるＰＫＣイプシロンレベルを決定すること、および
ｂ）前記ヒト対象におけるＰＫＣイプシロンレベルを対照者におけるＰＫＣイプシロンレベルと比較すること
を含み、前記方法は、前記ヒト対象におけるＰＫＣイプシロンレベルが、前記対照者におけるＰＫＣイプシロンレベルより低い場合、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す。たとえば、内容がここに参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／００３８１８６号を参照されたい。
【００７７】
[0094]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカー（ＡＤＳＭＢ）
[0095]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、アルツハイマー病特異的分子バイオマーカー（ＡＤＳＭＢ）またはＡＤ指標である。たとえば、それぞれの内容がここに参照によって組み込まれる、米国特許第７，５９５，１６７号および米国特許出願公開第２０１４／００３１２４５号を参照されたい。たとえば、診断方法およびアルツハイマー病を処置するため有用な化合物のスクリーニングの方法は、アルツハイマー病に関する固有の分子バイオマーカーに基づく。アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカー（ＡＤＳＭＢ）の数値は、特定の変数、たとえば、アッセイに使用される細胞、アッセイに使用されるプロテインキナーゼＣ活性化因子およびリン酸化の比率の測定の標的とされる特定のＭＡＰキナーゼタンパク質に依存する。
【００７８】
[0096]たとえば、アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、炎症性メディエータである、ブラジキニンで刺激された細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を決定すること、これからブラジキニン（すなわち、炎症性メディエータ）を欠く対照溶液（ビヒクル）で刺激された細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を差し引くことによって測定されうる。特定の態様において、差がゼロよりも大きい場合（すなわち、正の値）、これがアルツハイマー病の診断である。差がゼロ未満またはゼロと等しい場合、これがアルツハイマー病の非存在を示す。
【００７９】
[0097]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、炎症性メディエータである、ブラジキニンでの細胞の刺激後に２つのリン酸化されたＭＡＰキナーゼタンパク質の比を決定することにより測定される。分子バイオマーカーは、ブラジキニン（すなわち、炎症性メディエータ）で刺激された細胞における第１のリン酸化されたＭＡＰキナーゼタンパク質とリン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質との比を決定すること、これからブラジキニンを欠く対照溶液（ビヒクル）で刺激された細胞におけるリン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質とリン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質との比を差し引くことによって測定されうる。特定の好ましい態様において、差がゼロよりも大きい場合（すなわち、正の値）、これがアルツハイマー病の診断である。差がゼロ未満またはゼロと等しい場合、これがアルツハイマー病の非存在を示す。
【００８０】
[0098]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、アルツハイマー病と診断された患者から得た細胞試料（ＡＤ細胞）における正の数値である。アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーがブラジキニンで刺激されたＡＤ細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を決定することによって測定される場合、ＡＤ細胞におけるアルツハイマー病特異的分子バイオマーカーに関する正の数値は約ゼロから約０．５の範囲であってもよい。
【００８１】
[0099]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、非アルツハイマー型認知症（非ＡＤＤ細胞）、たとえば、パーキンソン病またはハンチントン病または臨床の精神分裂病と診断された対象から得た細胞において測定される場合、負の数値である。アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーがブラジキニンで刺激された非ＡＤＤ細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を決定することによって測定される場合、負の数値は約ゼロから約−０．２または約−０．３の範囲であってもよい。
【００８２】
[00100]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、アルツハイマー病を有していない患者から得た同年齢対照細胞（ＡＣ細胞）からの細胞試料における負の数値、ゼロまたは非常に低い正の数値であってもよい。アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーがブラジキニンで刺激されたＡＣ細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を決定することによって測定される場合、ＡＣ細胞におけるアルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは約０．０５未満から約−０．２の範囲であってもよい。
【００８３】
[00101]アルツハイマー病特異的分子バイオマーカーは、ブラジキニンで刺激された細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比からブラジキニンを欠く溶液で刺激された細胞におけるリン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比を引いて計算することにより測定されてもよい。これは以下のように表現される：アルツハイマー病特異的分子バイオマーカー＝｛（ｐＥｒｋ１／ｐＥｒｋ２）ブラジキニン｝−｛（ｐＥｒｋ１／ｐＥｒｋ２）ビヒクル｝。
【００８４】
[00102]具体的に意図されるプロテインキナーゼＣ活性化因子は：ブラジキニン；アルファ−ＡＰＰモジュレーター；ブリオスタチン１；ブリオスタチン２；ＤＨＩ；１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール；ＦＴＴ；グニディマクリン、ステレラ  カマエヤスメ（Ｓｔｅｌｌｅｒａ  ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ  Ｌ．）；（−）−インドラクタムＶ；リポキシンＡ4；リングビアトキシンＡ、ミクロモノスポラ属種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）；オレイン酸；１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール；４アルファ−ホルボール；ホルボール−１２，１３−ジブチラート；ホルボール−１２，１３−ジデカノアート；４α−ホルボール−１２，１３−ジデカノアート；ホルボール−１２−ミリスチン酸エステル−１３−アセテート；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸エステル、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸エステル、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸エステル、ジパルミトイル−、ヘプタアンモニウム塩；１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロール；チメレアトキシン（Ｔｈｙｍｅｌｅａ  ｈｉｒｓｕｔａ  Ｌ．）；インシュリン、ホルボールエステル、リゾホスファチジルコリン、リポ多糖、アントラサイクリンダンノルビシン（anthracycline dannorubicin）および硫酸バナジルを含むが、これらに限定されない。同様に含まれるものは、「ブリオログ（bryologues）」として知られる化合物である。ブリオログは、たとえば、Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）Ｍａｙ  １２，２００５，７（１０）ｐ１９９５−８；Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）Ｍａｒ．１７，２００５，７（６）ｐ１１７７−８０；Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）Ｄｅｃ．１６，２００４，４７（２６）ｐ６６３８−４４において記載される。プロテインキナーゼＣ活性化因子は、ここで開示される診断方法、キットおよび化合物をスクリーニングする方法において単独でまたは任意の他のプロテインキナーゼＣ活性化因子と組み合わされてもよい。
【００８５】
[00103]ＰＫＣアイソザイム指標
[00104]いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイは、ＰＫＣアイソザイム指標である。たとえば、ＰＫＣアイソザイム指標は、候補対象からのおよび任意に非ＡＤ対照者（ＡＣ）からの末梢細胞における定常状態またはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのレベルを測定することを含む。たとえば、ここに参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０２１２４７４号を参照されたい。連続的にまたは同時に、第１のＰＫＣアイソザイムの定常レベルは、Ａβペプチドの非存在下および存在下においてＡＤとＡＣ対象両方からの末梢細胞において測定して、ＰＫＣアイソザイムレベルの第１の比（Ａβペプチドの非存在下のＰＫＣアイソザイムレベル／Ａβペプチドの存在下でのＰＫＣアイソザイムレベル）を生成する。第２のＰＫＣアイソザイム比はまた、再びＡβペプチドの非存在下および存在下で、対象からの末梢細胞において第２のＰＫＣアイソザイムの定常状態またはリン酸化されたレベルを測定することにより得られる。これらの測定の結果を次に用いて第３の比を構築し、ここで、第１の比（Ａβペプチドと接触されていない細胞において得られた第１のＰＫＣアイソザイムのレベル／Ａβペプチドと接触された細胞において得られた第１のＰＫＣアイソザイムのレベル）は、第２の比（Ａβペプチドと接触されていない細胞における第２のＰＫＣアイソザイムのレベル／Ａβペプチドと接触された細胞における第２のＰＫＣアイソザイムのレベル）で割ってＰＫＣアイソザイム指標を生成する。
【００８６】
[00105]いくつかの態様において、入力変数は、出力または従属変数（たとえば、エンジンについて、燃料−空気比は独立／入力変数であるが、排気またはパワーは従属／出力変数である）の変化を引き起こす独立変数である。（ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ）のような式において、たとえば、ｘは、従属／出力変数である線形関数ｆに関する独立／入力変数である。いくつかの態様において、アルツハイマー病を診断する場合に、入力変数は、細胞密度（細胞間相互作用）、患者の年齢、継代数（細胞集団複製の数）、同様に他のアッセイ成分、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）、供給時間（feeding time）、または細胞周期における任意の変数を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
[00106]いくつかの態様において、出力変数は、入力／独立変数の結果として変化する従属変数である。たとえば、アルツハイマー病を診断する場合に、出力変数は、（面積／数）の自然対数（たとえば、バイオマーカーが線維芽細胞凝集である場合、入力変数は細胞密度の自然対数およびウシ胎児血清である）、および傾きの逆数（たとえば、バイオマーカーがフラクタル次元である場合、入力変数はフラクタル曲線に対する切片である）を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
[00107]いくつかの態様において、バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団と同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団を分類するための方法であって：
（ａ）ＡＤ集団、ＡＣ集団、および／または非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること、
を含み、ＡＤ集団とＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団の分離をもたらす、方法が、ここで開示される。
【００８９】
[00108]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【００９０】
[00109]いくつかの態様において、試料はヒト皮膚線維芽細胞を含み、これはウシ胎児血清において培養されてもよい。
【００９１】
[00110]いくつかの態様において、バイオマーカーは、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、およびアルツハイマー病特異的分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）から選択される。いくつかの態様において、バイオマーカーが線維芽細胞凝集体である場合、出力変数は（面積／数）の自然対数であり、入力変数は細胞密度の自然対数およびウシ胎児血清である。種々の態様において、バイオマーカーがフラクタル次元である場合、入力変数はフラクタル曲線に対する切片であり、出力変数は傾きの逆数である。
【００９２】
[00111]いくつかの態様において、方法は、普遍的なカットオフ値を確立することをさらに含む。種々の態様において、工程（ｃ）を行うことはシグナル対ノイズ比に基づくカットオフ値を有する識別限界を確立することを含み、ＡＤ集団、ＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団から生成される複数のデータポイントはカットオフ値を交差しない。
【００９３】
[00112]種々の態様において、バイオマーカーアッセイに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）対象から生物学的試料を得ること；
（ｂ）生物学的試料においてバイオマーカーアッセイを行うこと；
（ｃ）バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）対象のバイオマーカー結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること、を含み、対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である、方法が、ここで開示される。
【００９４】
[00113]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【００９５】
[00114]いくつかの態様において、試料はヒト皮膚線維芽細胞を含み、これはウシ胎児血清において培養されてもよい。
【００９６】
[00115]いくつかの態様において、バイオマーカーは、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、およびアルツハイマー病特異的分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）から選択される。いくつかの態様において、バイオマーカーが線維芽細胞凝集体である場合、出力変数は（面積／数）の自然対数であり、入力変数は細胞密度の自然対数およびウシ胎児血清である。種々の態様において、バイオマーカーがフラクタル次元である場合、入力変数はフラクタル曲線に対する切片であり、出力変数は傾きの逆数である。
【００９７】
[00116]いくつかの態様において、方法は、普遍的なカットオフ値を確立することをさらに含む。種々の態様において、工程（ｃ）を行うことはシグナル対ノイズ比に基づくカットオフ値を有する識別限界を確立することを含み、ＡＤ集団、ＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団から生成される複数のデータポイントはカットオフ値を交差しない。
【００９８】
[00117]バイオマーカーアッセイに基づいて、アルツハイマー病（ＡＤ）集団と同年齢対照（ＡＣ）集団および／または非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）集団を分類するための方法であって：
（ａ）ＡＤ集団、ＡＣ集団、および／または非ＡＤＤ集団から分類のための生物学的試料を得ること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブ（ＡＤＮＩ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること、を含み、ＡＤ集団とＡＣ集団および／または非ＡＤＤ集団の分離をもたらす、方法も、ここで開示される。
【００９９】
[00118]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【０１００】
[00119]バイオマーカーアッセイに基づいて、それを必要とする対象をアルツハイマー病（ＡＤ）集団に分類するための方法であって：
（ａ）対象から皮膚線維芽細胞を提供すること；
（ｂ）ウシ胎児血清で培養された細胞において、細胞凝集、フラクタル次元、プロテインキナーゼＣイプシロン、アルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー（ＡＳＤＭＢ）、空隙度、細胞遊走、ＰＫＣアイソザイム指標、およびアルツハイマー病神経画像処理イニシアティブ（ＡＤＮＩ）から選択されるバイオマーカーアッセイを行い、複数のデータポイントを生成すること、ここで、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する；
（ｃ）バイオマーカーアッセイで、２つ以上のＡＤ集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成すること、ここで、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）対象からバイオマーカー結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）対象のバイオマーカー結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること、を含み、対象のバイオマーカー結果から集団までの最短距離が診断である、方法も、ここで開示される。
【０１０１】
[00120]いくつかの態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含む。種々の態様において、第１の複数のデータポイントは対照を含み、第２の複数のデータポイントはＡＤ試料を含み、第３の複数のデータポイントは非ＡＤＤ試料を含む。非ＡＤＤ試料は、ハンチントン舞踏病試料およびパーキンソン病試料から選択されてもよい。
【０１０２】
[00121]種々の態様において、診断システムに基づいて、２つ以上の異なる集団を分類するための方法であって：
（ａ）２つ以上の異なる集団から分類のための試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行い、複数のデータポイントを生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを生成すること；
（ｃ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂで（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｄ）それぞれの線形関数について、切片「ｂ」を差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；ならびに
（ｆ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程（ｄ）を逆転させること、を含み、２つ以上の異なる集団の分離をもたらす、方法が、ここで開示される。いくつかの態様において、診断システムは、アルツハイマー診断アッセイ、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学から選択される。
【０１０３】
[00122]診断システムに基づいて、それを必要とする対象をある集団に分類するための方法であって：
（ａ）分類するための試料を得ること；
（ｂ）試料においてアッセイを行うこと；
（ｃ）アッセイで、２つ以上の異なる集団から複数のデータポイントを提供することまたは生成することであって、アッセイは入力変数および出力変数を含み、アッセイ出力変数はアッセイ入力変数に直線的に依存する、複数のデータポイントを提供することまたは生成すること；
（ｄ）それぞれの複数のデータポイントを線形関数ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ（式中、「ａ」は傾きであり、「ｘ」はｘ−入力であり、「ｂ」はｙ−切片である）で近似すること；
（ｅ）それぞれの線形関数について、切片ｂを差し引くことにより、それぞれの複数のデータポイントを原点に平行移動させること；
（ｆ）それぞれの線形関数について、ａｔａｎ（ａ）によりそれぞれの複数のデータポイントを反時計回りに回転させること；
（ｇ）それぞれの線形関数について、切片ｂにより上方にそれぞれの複数のデータポイントを平行移動させることにより下方の平行移動工程を逆転させること；
（ｈ）試料からアッセイ結果を正規化すること；ならびに
（ｉ）試料のアッセイ結果から２つ以上の集団のそれぞれまでの距離を決定すること
を含み、試料のアッセイ結果から集団までの最短距離が分類である、方法も、ここで開示される。いくつかの態様において、診断システムは、アルツハイマー診断アッセイ、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学から選択される。
【０１０４】
［実施例］
[00123]材料および方法
[00124]本研究において用いた保存細胞株および新たな細胞株。４０人の患者由来の皮膚線維芽細胞試料−Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）により提供された２４個の保存試料（表１）、およびＭａｒｓｈａｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ、ＷＶ）により提供された診療所からの１６例（表２）−を用いて、実施例実験を行った。
【０１０５】
[00125]線維芽細胞を、１２ウェルのプレート上の３−Ｄ  ｍａｔｒｉｘ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の厚い層（約１．８ｍｍ）に蒔いた。Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３３，１６５−１７６（２０１３）を参照されたい。入手可能な患者情報をＣｏｒｉｅｌｌウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｒ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ／）に掲載する。分析した細胞株（４０）は、剖検および遺伝的な家族歴を含む、いくつかの判定基準に基づいていた。試料（７）の有意な数を、二重盲検条件下（表１）で研究し、さらなる試料により新たに得られた皮膚試料における診断上の相違が確認された。同年齢対照（ＡＣ）試料は、皮膚生検摘出の日に認知症になっていなかった。全ての試料は、死後に得たＡＧ０８２４５の１つの例外を除き生前に得た。保存皮膚線維芽細胞は、液体窒素下の凍結ストックであった。これらの凍結試料を解凍した後、初代培養を確立し、継続的継代を終始続けた。本研究において用いた全ての細胞株は初代細胞株であり、不死化させるために処理しなかった。
【０１０６】
[00126]新たに採取した線維芽細胞を次の通りに得た。患者および対照からの皮膚組織のパンチ生検（２〜３ｍｍ、上腕）を得た。５〜１５回継代の細胞を用いた（表２）。
【０１０７】
[00127]初期の細胞密度を、５０個の細胞／ｍｍ3に制御し、それぞれのウェルについて１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地１．５ｍｌと共にホモジナイズした。細胞を、ＣＯ2、水ジャケットインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において蒔いた後最大７日維持した。
【０１０８】
[00128]画像取得。１０ｘおよび４ｘ対物レンズを用いて、画像収集ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｎ  ２．０．０）を介してコンピューターにより制御した、倒立顕微鏡（Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２０００、Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡ）で、細胞ネットワークの画像を取得した。ウェル当たり取得した５つ〜９つの画像、および細胞株当たり３つのウェルを、典型的に用いた。１日目は毎時に、２日目は１時間おきに、および残りの３日は１日３回で画像を取得した。画像を、ＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）から無料で入手可能なソフトウエア、ＩｍａｇｅＪで処理した。
【０１０９】
[00129]画像数量化。中心画像に対して１画像フィールドを動かすことにより、同一の標準的パターン、中心（１）、上方（２）、下方（３）、左（４）、右（５）を用いて、ウェル当たり５つの画像を最初に得た。Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）を参照されたい。処理において後に、調べる面積を増大し、診断の判別性に影響することなく変動係数をさらに改善するために、四角形のコーナーを６から９の画像で埋めることにより、画像の数を５から９に増大させた。画像１は、ウェルの中心に常に位置した。ウェルの中心を決定するため、以下の方法のうちの１つを用いた：
ａ）４ｘ拡大率下でのライブ画像は対称であるべきであり、すなわち、４つのコーナーの陰影は、位置合わせした顕微鏡（aligned microscope）に対して等しい面積を有すべきである；
ｂ）針で中心をマークする；
ｃ）格子付プレート（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ、ＭＡ）を用いる（ここで、中心の四角は、中心の行または列において常に６番目である。画像の数量化については、２セットのツール：最初に、顕微鏡に付随するソフトウエア、Ｍｉｃｒｏｎにより提供される通り手動；後に、ＮＩＨからの無料で入手可能なソフトウエアであるＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて自動）。
【０１１０】
[00130]初期の細胞カウントについて、慣習的ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇ−ｉｎを用い、「スペックル除去（despeckle）」を３回実施し、画像を半径０．５の最小フィルターを用いて３回フィルター処理し、「バックグラウンド減算（Ｓｕｂｔｒａｃｔ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」を、回転半径２０を用いて実行した。最後に、画像を２値化し、「粒子解析（Ａｎａｌｙｚｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」をサイズ範囲１８０〜無限大において実行した。これらのＩｍａｇｅＪコマンドの全てをループの内側で実行し、自動的に１個の細胞株由来の全ての画像の分析が可能になった。同一画像における手動の細胞カウントを用いることにより、ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇ−ｉｎを調整し、相対誤差は７％未満であった。
【０１１１】
[00131]１０ｘ画像当たりの細胞の標的数は、初期細胞濃度、５０個の細胞／μｌに対応する４１７であった。４５〜６０個の細胞／μｌの細胞濃度の変動を可能にした。画像における細胞分布の不均一性を最小限にするために、１０ｘ画像当たり１９５〜６５０個の細胞の範囲から外れた画像を除外した。４８時間における細胞凝集体について、Ｍｉｃｒｏｎソフトウエアによる手動楕円近似を用いた。
【０１１２】
[00132]フラクタル次元および空隙度。フラクタルおよび空隙度解析に関して、「ボックスカウンティング」方法を用いるＦｒａｃＬａｃ＿２．５  ｐｌｕｇ−ｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｐｌｕｇｉｎｓ／ｆｒａｃｌａｃ／ｆｒａｃｌａｃ．ｈｔｍｌ）を用いた。回復傾きおよび切片を、２０−８０％範囲の最小−最大差において線形近似することによりモニターした。平均空隙度を、０〜１２０時間計算した。
【０１１３】
[00133]凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）。凝集体の数当たりの平均面積を次の方法で計算した。それぞれの画像について、平均凝集体面積＜Ａ＞iおよび凝集体の数Ｎiを計算した。次に、それぞれの画像について、比＜Ａ＞i／Ｎiを評価した。典型的には、ウェル当たり５つの画像を用い、それぞれのウェルについて、数当たりの平均面積を
【０１１４】
【数１】
2018512128.tif 000003
【０１１５】
として評価した。
さらなる平均値化を、３つのウェルに対して行った：
【０１１６】
【数２】
2018512128.tif 000004
【０１１７】
。
次に、この測定値の自然対数
【０１１８】
【数３】
2018512128.tif 000005
【０１１９】
を、それぞれの細胞株について計算した（図１）。凝集体を、Ｍｉｃｒｏｎ  ２．０ソフトウエアを用いて手動で楕円近似し、その面積および数を記録した。ＩｍａｇｅＪについての自動スクリプトを開発し、これは手動楕円近似と十分に一致した。これら２つのアプローチは、互いの１標準偏差内であった。
【０１２０】
[00134]細胞密度。検証プロセスの間に、発明者らは、驚くべきことに、細胞密度が、アッセイの出力に影響することができる陰の変数であることを発見した。この細胞密度は、アッセイにおいて細胞を用いる前のＴ２５フラスコにおけるものである。細胞密度を、血球計数器で測定される平均細胞数に基づいて計算した。細胞の総数をトリプシン処理後に用いられた培地の体積に基づいて最初に推定し、次に、この細胞の総数をフラスコの表面２５ｃｍ2で割った。細胞密度はまた、細胞コンフルエンスの間接的な測定値である。
【０１２１】
[00135]統計分析。データクラス間の可分性は、関心領域（ｘmin，ｘmax）における平均近似関数、すなわち、Ｓｅｐ＝｛［ｆ（ｘmin）＋ｆ（ｘmin）／２−［ｇ（ｘmin）＋ｇ（ｘmin）／２｝の間の差と定義される。オーバーラップ確率は、両側検定での単純ｔ検定関数および不等分散を有する２つの試料から計算される。図２からの確率表面（probability surface）の構築についての詳細は、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）およびＦ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）に記載される。
【０１２２】
[00136]データ分析。データ分析については、Ｇｎｕｐｌｏｔ４．４を用いた。Ｇｎｕｐｌｏｔ４．４は、無料で入手可能なソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｕｐｌｏｔ．ｉｎｆｏ）である。生データポイントの近似について、Ｇｎｕｐｌｏｔ由来のビルトインの近似関数を用いた、これは非線形最小２乗（ＮＬＬＳ）Ｍａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムの実行に用いられる。別段特定されない限り、エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。Ｇｎｕｐｌｏｔが選択された、その理由は、全ての工程が、可視化され、ソースコードとして「．ｇｎｕ」ファイル形式にセーブすることができ、回復および可視化を容易にするからである。しかしながら、この方法は、選り抜きの他のソフトウエア、たとえば、ＣまたはＣ＋＋において、容易に実行することができる。全ての工程は標準であり、その理由は、これらが、データクラスの傾きおよび切片に依存し、したがって、自動化される傾向があるからである。
【０１２３】
[00137]確率分布。全てのアルツハイマー病患者（ＡＤ）および全ての同年齢対照患者（ＡＣ）について、Ｌｎ（細胞密度）およびＬｎ（面積／数）についての値を、ポイントの密度に対して逆比例する間隔にビニングし、それぞれの変数についてガウス関数を用いて近似し、次に、正規化２次元分布に統合した。
【０１２４】
[00138]等長変換。アルゴリズムの第１段階に関する４つの等長変換を、Ｇｎｕｐｌｏｔにおいてステップバイステップ方式で実行し、容易な検証のためにｇｎｕファイルとしてセーブした。これらの４つの等長変換は、それぞれのデータクラスについて、初期近似パラメーターである傾きおよび切片に基づくものである。
目的および実験
[00139]目的
[00140]ここで開示される研究の目的には、皮膚線維芽細胞を用いる、ＡＤに関する末梢性バイオマーカーについての検証が含まれる。詳細な実験方法は、ここに簡単に記載され、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）；Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）において詳細に記載される。検証研究の目標は、ＡＤの診断に影響し、次に、これらの依存性を数量化しうる変数（たとえば、陰のまたは予想外の変数）を見出すことであった。別の目標は、これらの変数におけるアッセイの依存性を除去しうる、修正手順を適用することであった。
【０１２５】
[00141]異なるＦＢＳロットが関与するアッセイ検証の間に行われるいくつかの実験のデータ分析も、ここで開示される。さらに、無作為に生成されたデータセットをここで開示される方法の普遍性を強調するため例示し、同じ線形ランク付関係性Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）を発見した。
【０１２６】
[00142]例
例１
異なるＦＢＳロットについてのアルツハイマー病診断アッセイ
[00143]図１（Ａ）および図２（Ａ）〜（Ｂ）は、異なるＦＢＳロットについてのＡＤ診断アッセイに関する入出力関数を示す。図１において、ＦＢＳ  Ａ１４はＧｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから（三角）、ＦＢＳ  ９４１はＧｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから（四角）、ＦＢＳ  Ｄ１１はＡｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから（円）である。図２において、ＦＢＳロットＡ９２はＧｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから（図２（Ａ））、ＦＢＳロット６９２はＧｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから（図２（Ｂ））である。さらに、図２において、ｎは、患者の数を表す。アッセイ出力Ｌｎ（Ａ／Ｎ）は、クラス１−（ＡＤ；中空の記号）およびクラス２−（ＡＣ；塗りつぶした記号）の２つのクラスの患者に関して、および５つのＦＢＳロットに関してアッセイ入力Ｌｎ（細胞密度）に直線的に依存する。図１（Ａ）および図２（Ａ）〜（Ｂ）に示される通り、アッセイ入力におけるアッセイ出力の依存性は、使用されたＦＢＳロットにかかわらず直線的である。しかしながら、それぞれのＦＢＳロットでは、線形依存性において軽微な差、すなわち、それぞれのクラスの患者に関して傾きおよび切片において差が存在する。ＦＢＳロットにおけるこの依存性は、カットオフにおいて、したがって、診断アッセイにおいて変化するため、実用的な意味合いを有する。
【０１２７】
例２Ａ
方法の第１段階
[00144]ここで開示される方法における第１段階は、５つの工程を含む（たとえば、図３を参照されたい）。
【０１２８】
[00145]工程１は、従属／入出力関数が直線的である、表示を見出すこと、および患者のクラスを線形関数で近似することを含む。２つのクラスの患者について、この表示は、Ｌｎ（Ａ／Ｎ）対Ｌｎ（細胞密度）プロットにおけるものである（図１（Ａ）および図２（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）。方法の普遍性を強調するため、３対のデータクラスを、図１（Ａ）からの生データの近似線に基づいて、生成した。次に、ノイズを、傾きおよび切片に付した（図１（Ｃ）を参照されたい）。研究した３つの異なる条件のうち、１つの異なる条件を選んで（図１（Ｃ）におけるＦＢＳロット９４１に対応する２つの線を参照されたい）、方法の第１段階の例として示した。近似関数は、クラス１−ＡＤ皮膚試料（四角）についてｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂであり、クラス２−ＡＣ試料（円）についてｇ（ｘ）＝ｃ*ｘ＋ｄである（図３（Ａ））。
【０１２９】
[00146]工程２は、すなわち、切片、すなわち、「−ｂ」および「−ｄ．」を差し引くことにより、データクラスを原点に平行移動させることを含む（図３（Ｂ）を参照されたい）。
【０１３０】
[00147]工程３は、近似線の俯角、すなわち、「−ａｔａｎ（ａ）」および「−ａｔａｎ（ｃ）」によりデータクラスを回転させることを含む（図３（Ｃ）を参照されたい）。
【０１３１】
[00148]工程４は、切片「＋ｂ」および「＋ｄ」によりデータを平行移動させることにより工程２からの切片でのデータのシフトを逆転させることを含む（図３（Ｄ）を参照されたい）。
【０１３２】
[00149]工程５は、ギャップの中間「（ｂ＋ｄ）／２」に固定されたカットオフを設定すること、したがって、差［８−（ｂ＋ｄ）／２］によりデータを平行移動させることを含む（図３（Ｅ）を参照されたい）。最終工程は、図３（Ｆ）に描写され、図３（Ａ）からの生データクラスと比較することができる。
【０１３３】
[00150]したがって、第１段階は、線形化および近似工程ならびに平行移動、回転、平行移動、平行移動の４つの等長変換を含む。
【０１３４】
[00151]最初の４つの工程は、近似パラメーター、すなわち、傾きおよび切片に依存し、これが線形化および近似工程を作り上げる。図３（工程５）における最終工程は、固定されたカットオフに関する任意の値を有し、これに８の値を割り当てた。しかしながら、固定されたカットオフが第２の変数ｙ（ここで、異なるＦＢＳロット）における全ての異なる条件について固定されている限り、第２の変数に関するランク付けおよび分類は、固定されたカットオフの選択に依存しない。
【０１３５】
例２Ｂ
方法の第１段階の結果
[00152]いくつかの態様において、方法の第１段階は、以下を作り出す：
（ａ）データセットの切片、すなわち、「ｂ」および「ｄ」によるデータセットの分類；
（ｂ）傾きの正規化、傾き＝０、および２つのデータクラスを平行にする；
（ｃ）固定されたカットオフに関する等距離データクラス（すなわち、両方のデータクラス）は、切片の間で半分の差（（ｂ−ｄ）／２）である；ならびに
（ｄ）固定されたカットオフ（図１（Ｂ）、（Ｄ））。最初の３つの等長変換について用いられるパラメーターは、それぞれのデータクラスに関する線形近似の傾きおよび切片によりセットされる。第四の等長変換は、任意であるが、固定されたカットオフを有する。この第２の変数に関する分類は、任意のカットオフに依存しない。この方法の第１段階の標準的な性質に起因して、結果は、患者のクラス間の測定可能な距離Ｄである（図１（Ｂ）、（Ｄ））。いくつかの態様において、アッセイの出力は、たとえば、用いられるＦＢＳロットであってもよい、第２の変数ｙの関数としてソーティングされてもよい（図４）。
【０１３６】
例３Ａ
方法における第２段階の説明
[00153]固定されたカットオフならびに２つのデータクラス平行、水平（傾き＝０）、および等距離で、第２の変数ｙ（たとえば、ＦＢＳロット）に関する分類が行われてもよい（図１（Ｂ）、（Ｄ））。患者の２つのデータクラス間のダイナミックレンジについての測定値は、距離Ｄ＝［（ＸAD−ＸAC）2＋（ＹAD−ＹAC）2］1/2である（図１（Ｄ）、図４（Ａ）〜（Ｂ））。アッセイノイズレベルの測定値について、提案される測定値は、データクラス間の距離により正規化した２つのデータクラスについての平均変動係数＜ＣＶ＞／Ｄ＝［１００*（ＣＶAD＋ＣＶAC）／２］／Ｄである（図１（Ｄ）、図４（Ｃ）〜（Ｄ））。
【０１３７】
例３Ｂ
方法における第２段階の結果
[00154]図４（Ａ）および（Ｃ）は、距離Ｄによりランク付けした生データおよび距離により正規化した平均変動係数＜ＣＶ＞／Ｄを示す。図４（Ｂ）および（Ｄ）は、図１（Ｃ）からのノイズデータに関する、同じ測定値、距離Ｄおよび距離により正規化した平均変動係数＜ＣＶ＞／Ｄを示す。第２の変数ｙ／ＦＢＳロットに関して、両方の測定値の直線性、距離Ｄ、および平均の正規化した変動係数＜ＣＶ＞／Ｄは、著しい。驚くべきことに、図１（Ｃ）からのノイズデータは生データと同じランク付けを算出し、非常に近い線形依存性は第２の変数（たとえば、ＦＢＳロット）に関する明確な分類を可能にする。さらに、この線形依存性Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）は、患者のクラス間の最適な分離が、たとえば、低くランク付けされたＦＢＳロットに関して生じることを示す。
【０１３８】
例４
未知のｙ−状態（たとえば、ＦＢＳロット）の分類
[00155]方法の第１段階の後、正規化した形態におけるデータクラス間の距離Ｄは、第２の変数ｙ（たとえば、ＦＢＳロット）のランクに直線的に依存する。たとえば、図４（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい。
【０１３９】
[00156]任意の新しいおよび試験されていないＦＢＳロットｙuは、同じ１次標準曲線Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）に収まる。最適なＦＢＳロットは大きいダイナミックレンジＤ（すなわち、小さいランク）を有するが、最適以下のロットは小さいダイナミックレンジＤ（すなわち、大きいランク）を有する。これは、線形依存性Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）参照標準と呼ばれる。ＦＢＳロットのランクにかかわらず、この表示は、シグナルプラスノイズがカットオフラインに交差しない範囲に使用することができる。
【０１４０】
[00157]加えて、試験されていないＦＢＳロットは、図４から参照標準曲線を用いて測定することができる。任意の試験されていないＦＢＳロットについて、およそデータクラス当たり５個の試料／患者が、それぞれのクラスＣ1；ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ、Ｃ2；ｇ（ｘ）＝ｃ*ｘ＋ｄに関する線形依存性を決定するために必要とされる。いくつかの態様において、データクラス当たり３から５個の範囲の試料／患者が、線形依存性を決定するために必要とされうる。この依存性が確立されると、ここで記載される２段階方法を用いて、参照標準曲線Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）において新しいＦＢＳロットｙuがランク付けされうる（図４を参照されたい、線は最適な近似である）。最適なｙ−状態／ＦＢＳロットは、良好なダイナミックレンジ（大きいＤ）および低いノイズ、小さい＜ＣＶ＞／Ｄ、すなわち、低いランクを有する。これにより、ＦＢＳロットがランク付けされたら（たとえば、矢印をつけた未知のＦＢＳロット（Ｕ）の両方は、Ｄおよび変動係数に対してプロットされたことを示す、図４（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）、分離境界／カットオフ関数および識別限界を決定することができる。次に、任意の未知の試料を分類することができる。
【０１４１】
例５
データクラス分離境界−カットオフ関数の確立
[00158]実用上および検証上の観点から、２つの線形データクラス間の分離境界／カットオフを定義する明確な関数を確立することが望ましい（たとえば、図５における太線を参照されたい）。第１の変数ｘにおける、患者の２つのクラスの線形依存性が与えられると、カットオフも、線形関数であると推測され、また患者の２つのクラスへの距離、すなわち、近似線が等しい（ｄAD＝ｄAC）位置として解析的に判明しうる。カットオフについての式は、角の二等分線に対する式により与えられる。正の解だけが、ここで開示される方法におけるカットオフ位置に使用可能である：
カットオフ（ｘ）＝（｛ｃ＋ａ［（ｃ2＋１）／（ａ2＋１）］1/2｝ｘ＋ｄ＋ｂ［（ｃ2＋１）／（ａ2＋１）］1/2）／｛１＋［（ｃ2＋１）／（ａ2＋１）］1/2｝（図５における太線）。
【０１４２】
[00159]いくつかの態様において、このアプローチの変形が、切片の内側でクラスが未決定である切片の百分率で上方および下方にシフトした平行線を形成する、特定の百分率のバンドとしてカットオフ（ｘ）ライン付近の領域を定義することにより用いられてもよい（図５（Ｂ）破線を参照されたい）。しかしながら、この戦略は、シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）、＜ＣＶ＞／Ｄ、および２つのデータクラスが近似線の交点にどれほど近いかにおいて、比較されることが要求される２つのデータクラスのダイナミックレンジＤに依存する（例１０を参照されたい）。
【０１４３】
例６
未知の試料の分類
[00160]入力変数における患者の２つのクラスに関する線形依存性が確立されると、任意の未知の試料は、その位置（たとえば、（ｘu，ｙu））から２つの近似線ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ、ｇ（ｘ）＝ｃ*ｘ＋ｄへの最短距離に基づいて、クラス１−ＡＤまたはクラス２−ＡＣとして類別されうる（図５（Ａ）中の点線／破線を参照されたい）。（ｘu，ｙu）に位置する未知の試料とＡＣクラスに対する近似線の間の距離は、ＡＣ近似線に対する垂直セグメント線により与えられる（図５（Ａ）中の点線を参照されたい）。同様に、未知の試料（ｘu，ｙu）からの距離およびＡＤクラスに対する近似線は、ＡＤ近似線に対する垂直セグメント線により与えられる（図５（Ａ）中の破線を参照されたい）。最短距離がｄAC、すなわち、ｄAC＜ｄADである場合、その事例はクラス２−ＡＣである（図５（Ａ）における円）。最短距離がｄAD、すなわち、ｄAD＜ｄACである場合、その事例はクラス１−ＡＤである（図５（Ａ）における四角）。ここで記載される距離ｄACおよびｄADは、解析的な作図（analytical description）を有する。未知の試料の分類は、識別限界次第でありうる（例１０を参照されたい）。
【０１４４】
[00161]上記で考察した概念の例は、クラスの対間のカットオフ関数の基礎において、無作為に生成された１２０試料を、クラス１−ＡＤ、クラス２−ＡＣ、クラス３−非ＡＤＤ（Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）を参照されたい）として分類した、図６（Ｃ）および（Ｄ）において説明される。手順の第１段階は、他の陰の変数、たとえば、ｙ／ＦＢＳロットで、３つのデータクラスを解いて正規化してアッセイ性能をさらに分類した。
【０１４５】
例７
参照標準Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）の確立
[00162]この例において、３つの異なる会社からの５つのＦＢＳロットは、第２の変数
【０１４６】
【数４】
2018512128.tif 000006
【０１４７】
に対する別個の値とみなされる。図１（Ａ）および（Ｃ）は、３つのＦＢＳロットに対するＦＢＳロット変動性を説明する。この第２の変数に関する不偏性の分類が、この研究の結果である（図４を参照されたい）。いくつかの態様において、方法の第１段階は、異なるＦＢＳロットの偏りのない定量的な比較を可能にする、固定されたカットオフ（たとえば、８）を確立することによる標準化を可能にする。いくつかの態様において、方法の第２段階は、データクラスＤ間の距離に基づいておよび正規化した変動係数＜ＣＶ＞／Ｄに基づいて、５つのＦＢＳロットがランク付けされることを可能にする（図４を参照されたい）。興味深いことに、ランク付けは、第２の変数に関して、線形依存性を示し、これは参照標準Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）と呼ばれる。さらに、この線形依存性は、３対の無作為に生成されたデータセットについても追随される（図７を参照されたい）。
【０１４８】
[00163]実用上の観点から、ここで開示される方法は、ＱＣ時間を低減させるとの利点を提供する。実用上、ＦＢＳロット間変動問題が、取り除かれる。さらに、ここで記載される範囲内の任意のロットは、たとえば、典型的には、少数の試料、たとえば、一般的にデータクラス当たり５個未満の試料有するデータクラス内で線形依存性を確立した後に用いることができる。いくつかの態様において、シグナル対ノイズ比は、運用範囲を識別限界まで制限しうる（例１０を参照されたい）。
【０１４９】
例８
３つのデータクラスについての第１段階の一般化（フラクタル次元）
[00164]いくつかの態様において、方法の分析の第１段階を、異なる時点にフラクタル次元で皮膚線維芽細胞ネットワーク複雑性を数量化する異なるＡＤ診断アッセイで検証した（Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３））。フラクタル曲線を構築し、次に、曲線の直線部分を傾きおよび切片を抽出した線で近似した。このアッセイで３つのクラスの患者を研究した、クラス１−ＡＤ、クラス２−同年齢の認知症になっていない対照（ＡＣ）、およびクラス３−非アルツハイマー病型認知症（非ＡＤＤ）、これにはハンチントン舞踏病（ＨＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）患者が含まれる（図６（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）。このアッセイについて、線形表現は、フラクタル曲線の直線部分の１／傾き対切片として提示される。たとえば、図６（Ａ）（ＡＤ試料（四角）、ＡＣ試料（円）、および非ＡＤＤ試料（三角）についての生データを示す）を参照されたい。図６（Ｂ）に示される通り、３つのクラスＡＤ、ＡＣ、非ＡＤＤについて方法の第１段階を用いた場合に、固定されたカットオフの正規化および設定が達成される。さらに、１２０の無作為な代理データを、この１／傾き対切片平面において生成した（図６（Ｃ））。これらの代理データは、このアッセイで試験されうる未知の試料の役割を果たす。カットオフを角の二等分線の式を用いることにより確立し、次に、方法の分析の第１段階を用いて、データを正規化し、２つの重要なデータクラスＡＤおよび非ＡＤＤの間に固定されたカットオフを設定した。図６（Ｄ）を参照されたい。いくつかの態様において、この一般化は、図６（Ａ）において記載される線形依存性を変化させる予想外の変数が存在する、システムにおける方法の第２部分を適用するための段階を設定する。いくつかの態様において、ＦＢＳロットは、このアッセイにおける予想外の変数である。しかしながら、他の変数、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）中のタンパク質濃度はまた、図６（Ａ）からの線形依存性を変化させうる。
【０１５０】
例９
方法の普遍性
[00165]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、一般的であり、分離される２つ以上の患者のクラス（Ｃ1，Ｃ2，．．．，Ｃn）での、他の診断システムＳに対する適用可能性を有し、これは第２の変数
【０１５１】
【数５】
2018512128.tif 000007
【０１５２】
での別個の変化での、変数ｘの１つにおけるアッセイ出力の線形依存性を示す。さらに、いくつかの態様において、方法の第１段階は、正規化される必要があるデータクラスの数の観点で制限はない。方法の第２段階について、いくつかの態様において、２つを超えるデータクラスが分離される必要がある場合、決定は分離される必要がある２つの最も重要なクラスについてなされなければならない。図７は、無作為に生成されたデータクラスＣ１およびＣ２に対する、方法の第１および第２段階を説明する。２段階手順の普遍性を実証するため、円、四角、および三角として表される、２つの無作為に生成されたデータクラスを、タイプａ*ｅｘｐ（−ｘ／ｂ）（式中のａおよびｂは、パラメーターである）の指数関数から考慮した（図７（Ａ）を参照されたい；中空の記号は上方のデータセットを表し、塗りつぶした記号は下方のデータセットを表す）。クラス１を関数ｃ１（ｘ）＝｛ｅｘｐ［−ｘ／（２＋０．２*ｒａｎｄ（０）］｝＋２*ｒａｎｄ（０）*｛ｅｘｐ［−ｘ／（２＋．２*ｒａｎｄ（０））｝により生成し、クラス２を関数ｃ２（ｘ）＝｛０．２*ｅｘｐ［−ｘ／（３＋０．３*ｒａｎｄ（０））］｝＋２*ｒａｎｄ（０）*｛０．２*ｅｘｐ［−ｘ／（３＋０．３*ｒａｎｄ（０））］｝により生成し、ここで、ｒａｎｄ（０）は０〜１の乱数を生成する。これらの無作為に生成されたデータクラスは、線形依存性を示す（図７（Ａ））。第２の陰の変数ｙとの線形依存性の変化を模倣するため、赤色、緑色、および青色として３対のデータクラス標識を生成した（図７（Ａ））。２段階手順を適用後、ダイナミックレンジＤとランクの間の同様の線形依存性を決定した、図７（Ｂ）、Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）。いくつかの態様において、ＡＤ診断アッセイに関して見出された参照標準は、データ分類を必要とし、ｘにおいて直線的である陰の変数でカットオフにおける変化を有し、第２の変数ｙでの線形近似パラメーターを変化させる、他のシステムについて見出されうる。
【０１５３】
[00166]追加の例は、３つのクラスのデータについて図６に与えられ、そのうちの２群、ＡＤおよび非ＡＤＤ患者、の間の分離が、関心のある２つの集団として識別された。この決定に基づいて、固定されたカットオフが、これらの２つのクラスの間に確立され、さらに任意の他の陰の変数ｙでの数量化およびランク付けが可能になる。
【０１５４】
例１０
ノイズレベルによる識別限界／ｄ−ｌｉｍｉｔの確立
[00167]いくつかの態様において、データにおけるシグナルに関するノイズのレベルは、２つのクラスが分離境界／カットオフに対して交差する、患者の２つの線形クラスの交点の重要な近似となりうる（図８（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）。図８（Ａ）中の垂直の破線は、識別限界（ｄ−ｌｉｍｉｔ）を定義する。識別限界の右に向かって、シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は乏しい。たとえば、示される通り、クラス１からの５１データポイントのうち１１およびクラス２からの５１データポイントのうち１８は、カットオフラインに対して交差する。図８（Ａ）からの垂直の破線は、シグナルプラスノイズがカットオフラインと交わる場所に位置する。ＳＮＲ比は、距離により正規化した平均変動係数＜ＣＶ＞／Ｄと密接に関連する。ここで、ｄ−ｌｉｍｉｔは、高い細胞密度が、細胞凝集に基づく、この診断アッセイに望ましくないことを示唆する。
【０１５５】
例１１
理論的な考察
[00168]患者の２種のクラス、ＡＤ患者（Ｃ１；ｆ（ｘ）＝ａｘ＋ｂ）、およびＡＣ対照（Ｃ３；ｇ（ｘ）＝ｃｘ＋ｄ）に対応する図１（Ａ）および（Ｃ）からのＦＢＳ  ９４１に対する２つの近似線を、（Ｃ２；ｌ（ｘ）＝ｍｘ＋ｎ）と標識された中間的な傾きを有する線と同様に用いた。これらの３つのデータクラスを、ここで開示される理論的な研究についての生データとして用いた。図９（Ａ）を参照されたい。これらの近似線の緻密さ（thickness）も、Ｃ１からＣ３に低減し、３つのデータクラスを容易に区別することができる。方法の第１段階からの最初の３つの等長変換、平行移動、回転、平行移動を、３つのデータクラスに適用した（図９（Ｂ））。結果は、図９（Ａ）からの（ｘ，ｙ）セグメントの図９（Ｂ）における異なる平面（長さ、切片）へのマッピングである。プロセス中で、データクラスを、平行（および水平）、すなわち傾きゼロにした。方法の分析の第１段階を見る別の様式は、傾きの横断的な正規化（傾き＝０）と同時に、切片ｂ、ｎ、ｄによりデータクラスをソーティングすることである。
【０１５６】
[00169]関心領域中のラインセグメントの全長は、Ｌ＝｛Ｘ射影／ｃｏｓ［ａｔａｎ（傾き）］｝により与えられ、この特定の事例（図９（Ａ））ではＸ射影は１０であり、ｘ範囲を表すが、傾きは近似線の傾き、すなわち、ａ、ｍ、ｃである。全長（Ｌ）を説明するため、３つのデータクラスに対する３つの値を、図９（Ｂ）における右手側に四角、円、および三角でプロットした。長さ（Ｌ）は傾きに第一に依存（図９（Ｃ））するが、Ｘ射影／Ｘ範囲にも依存する（図９（Ｄ））。方法の別の説明について、ポイント（たとえば、四角、円、三角）を、図９（Ａ）および（Ｃ）に示される３つのデータクラスに関してプロットした。この曲線に沿ったデータクラスＣ１（四角）とＣ３（円）の間の距離は、方法の第２段階（図１（Ｄ）および図４（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）に定義され、また５つのＦＢＳロットをランク付けることに用いられた、ダイナミックレンジＤに比例する。
【０１５７】
[00170]方法の第１段階によるデータを解くプロセス（図９（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）において、データクラス間の分離は指数関数的に増大した（図９（Ｅ）〜（Ｆ）を参照されたい）。たとえば、最小の記号を有するセグメントは、図９（Ａ）中で互いに非常に近いが、図９（Ｂ）中では、より大きな分離を有する。方法の第１段階は、図９（Ｅ）〜（Ｆ）により示される通り、セグメント間の距離を増幅し、この増幅は、線の交点が接近するにつれて指数関数的に増大する。データクラス間の距離が増幅すると、ノイズも分析の第１段階により増幅される。いくつかの態様において、ここで開示される方法は、識別限界ｄ−ｌｉｍｉｔを超えて運用することはできない（図８（Ｂ）を参照されたい）。したがって、指数関数的な増幅は、このＦＢＳロットについて９．８に等しいｄ−ｌｉｍｉｔで停止する。
【０１５８】
[00171]方法セクションにおいてＳｅｐ関数として定義される通り、患者のクラス間の可分性は、方法の第１段階により作り出される、指数関数的な増幅の結果として、少なくとも２桁の規模で増大する。いくつかの態様において、５つのＦＢＳロットについて方法の第１段階を適用後、Ｓｅｐ関数の百分率増大は、２００から２５００％の範囲である。さらに、ｔ検定により測定される患者のクラス間のオーバーラップ確率は、方法の第１段階を適用後、数桁の規模で低減する。
【０１５９】
例１２
臨床試験データの分類
[00172]いくつかの態様において、ここで開示される方法はまた、臨床試験データの分離を強化するため用いられてもよい。たとえば、図１１は、ブリオスタチンまたはプラセボの投与の３時間後のミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）またはＦｏｌｓｔｅｉｎ試験における変化対４８時間での神経心理状態反復性バッテリー（ＲＢＡＮＳ）における変化を示す。図１１（Ａ）は、依存性が、ブリオスタチンとプラセボの両方について直線的であることを示す。いくつかの態様において、ここで開示される等長変換を臨床試験データに適用して、図１１（Ｂ）に示される通り、２つの群を変化させてもよい。ＭＭＳＥ（図１１（Ｃ））における変化の平均値プラス平均の標準誤差に基づくと、いくつかのオーバーラップが存在し、分離がＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定（アルファ０．１０、図１１（Ｅ））下ならびにウィルコクソン検定（アルファ０．１０、データは示さず）またはｔ−検定（アルファ＝０．０９７、データは示さず）下で統計的に有意である。ここで開示される等長変換を用いた後、分離は、明確であり（図１１（Ｄ））、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定（任意のアルファ、すなわち、理想的な事例、図１１（Ｆ））下で統計的に有意である。
【０１６０】
[00173]
例１３
遺伝学および天文学の分類
[00174]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、たとえば、酵母（Saccharomyces cerevisaie）の２種の細胞周期調節遺伝子および低い表面輝度銀河の回転曲線に関する生データの分離を強化するために用いられてもよい。Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９，３２７３−３２９７（１９９８）；Ｋｕｚｉｏ  ｄｅ  Ｎａｒａｙ，Ｔ．，ＭｃＧａｕｇｈ，Ｓ．Ｓ．ｄｅＢｌｏｋ，Ｗ．Ｊ．Ｇ．＆Ｂｏｓｍａ，Ａ．，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  １１  Ｌｏｗ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  Ｇａｌａｘｉｅｓ，ＡｐＪＳ  １６５，４６１−４７９（２００８）；Ｋｕｚｉｏ  ｄｅ  Ｎａｒａｙ，Ｔ．，ＭｃＧａｕｇｈ，Ｓ．Ｓ．ｄｅＢｌｏｋ，Ｗ．Ｊ．Ｇ．＆Ｂｏｓｍａ，Ａ．Ｍａｓｓ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  Ｇａｌａｘｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ｆｉｅｌｄｓ，ＡｐＪ  ６７６，９２０−９４３（２００８）。図１０（ａ）は、酵母（Saccharomyces cerevisaie）の２種の細胞周期調節遺伝子に関する生データをプロットする；図１０（ｃ）は、酵母（Saccharomyces cerevisaie）の２種の細胞周期調節遺伝子に関するアルゴリズム最適化データである。図１０（ｂ）は、低い表面輝度銀河の回転曲線をプロットし、８つの低い表面輝度銀河に関する速度対半径が、８つのデータクラス（Ｃ1-8）について原点に近接する線形依存性を示す；図１０（ｄ）は、銀河の半径が７０ａｒｓｅｃであるとした場合に銀河の観察速度がどれほどであるかを示す、アルゴリズム最適化データである。
【０１６１】
[00175]
例１４
アルツハイマー病診断の年齢依存性
[00176]図１２は、アルツハイマー病診断アッセイについての年齢依存性を解決するための方法の検証を説明する。図１２（ａ）において、生データが提示され、２つのデータクラスであるクラス１−ＡＤ−四角およびクラス２−ＡＣ円、患者の年齢に対するアッセイ出力Ｌｎ（Ａ／Ｎ）の線形依存性が示される。図１２（ｂ）は、同じ２つのクラスの患者についてのアルゴリズム正規化データを示す。
【０１６２】
[00177]考察
[00178]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、第２の別個の変数ｙに関して変化し、したがって、カットオフ値を変化させる、患者の２つ以上の線形クラス（Ｃ1，Ｃ2，．．．，Ｃn）についての診断上の分離を増大させることに適用される。いくつかの態様において、方法の第１段階は、傾きに関してデータクラスを正規化し（すなわち、傾き＝０）、切片によりデータクラスをソーティングし、固定されたカットオフを確立し、固定されたカットオフに関してデータクラスを等距離とする。いくつかの態様において、方法の第２段階は、第２の変数ｙ（たとえば、ＦＢＳロット）に関して出力をランク付けする。ランク付けは、ダイナミックレンジＤの測定値およびシグナル対ノイズ比＜ＣＶ＞／Ｄに基づき、参照標準Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）と呼ばれる。上記で考察した通り、この参照標準は、対のデータクラスが無作為に生成された場合でさえ直線的である。
【０１６３】
[00179]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、分離Ｄ（たとえば、ＡＤと同年齢対照の間）のランク付けを、第２の変数（たとえば、ＦＢＳロット）がこの分離を変化させる場合に、必要とする診断アッセイと伴に用いられてもよい。上記で考察した通り、ここで開示される方法は、３つの会社からの５つのロットのウシ胎児血清（ＦＢＳ）および参照標準Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）を構築するため無作為に生成されたデータクラスに用いられた。いくつかの態様において、参照標準は、任意の未知のＦＢＳロットの分類に用いられてもよい。方法の第１段階はまた、ネットワーク複雑性を測定する異なるアッセイで検証され、３つのデータクラスＡＤ患者、同年齢対照（ＡＣ）、および非ＡＤＤ患者に対して一般化された。しかしながら、いくつかの態様において、同じ第１段階は、より大きな数のデータクラスに対して一般化することができる。方法は、無作為に生成された試料および３つのクラスの患者（図６および図７（Ａ）〜（Ｂ））で試験された。
【０１６４】
[00180]いくつかの態様において、手順の第１段階は、変数（たとえば、陰のまたは予想外の）に直線的に依存する、分離する任意のクラスの患者（Ｃ1，Ｃ2，．．．，Ｃn）に適用される（図７を参照されたい）。これらのデータクラスは、機械学習、神経ネットワーク、データマイニング、遺伝子発現、パターンもしくは顔認識、認知心理学、または天文学から選択されてもよい。２段階手順の普遍性を実証するため、円、四角、および三角として表される、２つの無作為に生成されたデータクラスを、タイプａ*ｅｘｐ（−ｘ／ｂ）（式中、ａおよびｂは、パラメーターである）の指数関数から考慮した（図７（Ａ）を参照されたい；中空の記号は上方のデータセットを表し、塗りつぶした記号は下方のデータセットを表す）。
【０１６５】
[00181]いくつかの態様において、ここで開示される方法は、分離されるデータクラスの切片が統計的に有意である限り、特定の結果を作り出す。種々の態様において、方法はまた、シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）が、分離境界／カットオフラインに交差しない程度十分に大きい（すなわち、識別限界（ｄ−ｌｉｍｉｔ）の左手側にある）、限りにおいては、特定の結果を作り出す（図８（Ａ）を参照されたい）。小さいシグナル対ノイズ比（すなわち、識別限界（ｄ−ｌｉｍｉｔ）の右手側にある）について（図８（Ｂ）を参照されたい）、方法は、推定目的だけのために適用することができる。
【０１６６】
[00182]いくつかの態様において、第１の変数ｘにおける線形依存性が、確立される必要がある。実用上および検証上の観点から、線形依存性は、非線形の依存性と比較される場合に、等長変換を介して操作されてもよい。したがって、この方法は、その表示において、第１の変数ｘにおける依存性が直線的であることを決定する。初期依存性が非線形であり、指数関数的に推測することができる場合、変換（たとえば、自然対数プロット）により、依存性を線形化することができる。このプロセスは、しばしば「線形化」と呼ばれる。ここで開示されるＡＤ診断アッセイの１つについて、Ａ／ＮよりもＬｎ（Ａ／Ｎ）のプロットが、Ｌｎ（細胞密度）と対比して提示される場合に、この線形化に到る。ここで開示される第２のＡＤ診断アッセイはまた、線形依存性を有する（図６を参照されたい）。線形依存性／入出力関数はまた、一般的に任意のシステムの予測可能性のために望ましい、その理由は、システムの独立変数／入力における小さい摂動が、予想可能性を生じ、従属変数／出力における小さい摂動と直線的に関連しうるからである。
【０１６７】
[00183]結論
[00184]いくつかの態様において、ここで開示される方法の２段階手順は、出力が２つの変数（たとえば、実験の細胞密度およびＦＢＳ）に依存する、ＡＤ診断アッセイに適用されてもよい。変数の１つにおけるアッセイ出力の依存性は、直線的である。第２の変数は、患者／データのそれぞれのクラスに対する線形依存性のパラメーター（すなわち、傾きおよび切片）を変化させる。
【０１６８】
[00185]いくつかの態様において、ここで開示される方法の第１段階は、傾きを横断して線形依存性を正規化し（傾き＝０）、患者／データのクラスを平行にし、および固定されたカットオフに関して等距離にする。患者／データのクラスを解くプロセス内で、患者のクラス間の距離は、指数関数的に増大する。シグナル対ノイズ比により、２つのクラスの患者が、角の二等分線の式としてここに解析的に定義される、カットオフ境界に対して交差する、位置として識別限界（ｄ−ｌｉｍｉｔ）が確立される。
【０１６９】
[00186]いくつかの態様において、方法の第１段階はまた、アルツハイマー病、同年齢対照、および非アルツハイマー病型認知症患者の３つのクラスの患者の間を区別する、ＡＤ診断アッセイに適用される。
【０１７０】
[00187]いくつかの態様において、方法の第２段階は、距離および正規化した変動係数により患者の正規化したクラスをランク付けする。この標準曲線は、線形Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）である。
【０１７１】
[00188]いくつかの態様において、他のＡＤ診断アッセイに関する１次標準曲線Ｄ＝Ｄ（Ｒａｎｋy）の普遍性を強調するため、対の無作為なデータクラスを用いた。
【０１７２】
【表１−１】
2018512128.tif 000008
【表１−２】
2018512128.tif 000009
【表１−３】
2018512128.tif 000010
【０１７３】
【表２−１】
2018512128.tif 000011
【表２−２】
2018512128.tif 000012
【図１】
2018512128.tif 000013
【図２】
2018512128.tif 000014
【図３】
2018512128.tif 000015
【図４】
2018512128.tif 000016
【図５】
2018512128.tif 000017
【図６】
2018512128.tif 000018
【図７】
2018512128.tif 000019
【図８】
2018512128.tif 000020
【図９】
2018512128.tif 000021
【図１０】
2018512128.tif 000022
【図１１】
2018512128.tif 000023
【図１２】
2018512128.tif 000024
【国際調査報告】
2018512128.tif 000025
2018512128.tif 000026
2018512128.tif 000027
2018512128.tif 000028
2018512128.tif 000029