(57)【要約】  本明細書において開示されるのは、神経細胞外小胞（ＥＶ）、並びに脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷及び神経変性疾患の治療におけるこれらのＥＶ使用方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞（ＥＶ）産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中でヒト誘導多能性幹細胞由来の神経前駆（ＮＰ）細胞を培養し、前記ＥＶを前記細胞培地から単離することによって得られた前記ＥＶを含む組成物。
【請求項２】
前記ヒト誘導多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒト誘導多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記神経前駆細胞は、ＳＯＸ１＋、ＳＯＸ２＋及びＯＣＴ４−である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥＶは、表９の１つ以上のタンパク質バイオマーカーを含む、請求項１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
細胞外小胞（ＥＶ）産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中でヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞から直接的又は間接的に生じた神経細胞を培養し、前記ＥＶを前記細胞培地から単離することによって得られた前記ＥＶを含む組成物。
【請求項７】
前記神経細胞は、前記ｈＥＳ細胞由来の神経前駆（ＮＰ）から分化する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記神経細胞はグリア細胞である、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記グリア細胞は星状細胞を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＶは、表８の１つ以上のタンパク質バイオマーカーを含む、請求項６から９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１１】
細胞外小胞（ＥＶ）産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中でヒト誘導多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、前記ＥＶを前記細胞培地から単離することによって得られた前記ＥＶを含む組成物。
【請求項１２】
前記ヒト誘導多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６２／２５６，８２３号の利益を主張するものであり、その仮特許出願は、その全体が参照により本出願に援用される。
【背景技術】
【０００２】
先天性障害、癌、変性疾患及び脊髄損傷を含む、神経系への疾患及び傷害は、あらゆる年齢の多くのヒトに影響を及ぼす。先天性障害は、脳又は脊髄が発達中に正しく形成されない場合に発生する。神経系の癌は、異常細胞の制御されない拡散に起因する。変性疾患は、神経系が神経細胞の機能を喪失した場合に発生する。喪失した細胞を、成熟して神経細胞となることができる細胞から生じた新しい細胞、即ち神経幹細胞で置換することによって、損傷を回復させることができるということが証明されている。しかしながら、移植された幹細胞は、埋入部位から移動し、何らかの細胞形質転換を経て奇形腫の形成をもたらすことがあり、これはしばしば起こる。更に幹細胞は、そのサイズにより、ＣＮＳに直接注入され、これは合併症を誘発する可能性がある。侵襲的ＣＮＳ手術は、出血及び浮腫を含むがこれらに限定されない、送達中及び送達後に発生する合併症により、危険に患者をさらす。全身的に投与された幹細胞はしばしば毛細血管内に留まり、これは肺に望ましくない影響を誘発する可能性があり、疾患又は傷害に到達しないことさえある。幹細胞療法はまた、引き起こされる有害な免疫応答を誘発し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本明細書では、神経細胞外小胞（ＥＶ）、並びにこれらＥＶの脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷並びに神経変性疾患の治療における使用方法が開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、神経前駆（ＮＰ）細胞にとってのＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中で多能性幹細胞（例えばヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から生成されたＮＰ細胞を培養し、そのＥＶを細胞培地から単離することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、ＮＰ細胞はＳＯＸ１＋、ＳＯＸ２＋、ＯＣＴ４−及びＮＥＳＴＩＮ＋である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（例えばＥＳＣ又はｉＰＳＣ）から直接的又は間接的に生じた神経細胞を、ＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って細胞培地中で培養し、そのＥＶを培地から単離することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ由来の神経細胞は、星状細胞又は希突起膠細胞などのグリア細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ由来神経細胞はニューロンを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ由来神経細胞は、ｈＥＳ細胞由来のＮＰ細胞から分化する。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ由来神経細胞はＰＳＣから直接分化する
【０００６】
また、星状細胞にとってのＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中でいずれかの起源の星状細胞を培養し、そのＥＶを細胞培地から単離することによって得られるＥＶが開示される。
【０００７】
あるいはいくつかの実施形態では、開示のＥＶは、ＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中でＰＳＣから生成された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、そのＥＶを細胞培地から単離することによって得ることができる。
【０００８】
本明細書において開示されるように、ｈＮＰ細胞（本明細書ではＮＰＥＸとも呼ぶ）から産生されるＥＶは、幹細胞由来星状細胞（本明細書ではＡＰＥＸとも呼ぶ）又は間葉系幹細胞（本明細書ではＭＳＣＥＸとも呼ぶ）由来のＥＶでは確認されない１６５３個のタンパク質（表９参照）を有していた。従っていくつかの実施形態では、そのＥＶは、表９に列挙した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００個以上のタンパク質バイオマーカーを含む。
【０００９】
本明細書において開示されるように、ＡＰＥＸから産生されるＥＶは、ＮＰＥＸ又はＭＳＣＥＸでは確認されない５９６個のタンパク質（表８参照）を有していた。従っていくつかの実施形態では、そのＥＶは、表８に列挙した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個以上のタンパク質バイオマーカーを含む。
【００１０】
本明細書において開示されるように、ＭＳＣＥＸから産生されるＥＶは、ＡＰＥＸ又はＭＳＣＥＸでは確認されない５３６個のタンパク質（表７参照）を有していた。従っていくつかの実施形態では、そのＥＶは、表７に列挙した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００個以上のタンパク質バイオマーカーを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、実質的に均質な細胞集団から産生される。いくつかの実施形態では、開示のＥＶは非形質転換細胞から産生される。
【００１２】
また、開示のＥＶを含有する組成物が開示される。いくつかの実施形態では、その組成物は、ヒドロゲルなどの生体適合性の足場材料内に開示のＥＶを含む。適したヒドロゲルとしては、体温において固化又は硬化する温度依存性ヒドロゲル、例えばＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）；イオンによって架橋したヒドロゲル、例えばアルギン酸ナトリウム；可視光又は紫外光への曝露によって硬化するヒドロゲル、例えばアクリル酸末端基を有するポリエチレングリコール−ポリ乳酸共重合体；及びｐＨの変化によって硬化又は固化するヒドロゲル、例えばＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標）などである。例えばヒドロゲルは次のいずれかを含むことができる：多糖類、タンパク質、ポリホスファゼン、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロック共重合体、エチレンジアミンのポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロック共重合体、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、及びスルホン化ポリマー。
【００１３】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶを含む組成物は更に、１つ以上の神経栄養剤を含む。その組成物は更に、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−６、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＦＮ−γ、インスリン様成長因子結合タンパク質（ｌＧＦＢＰ−２）、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）、単核食細胞コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、神経栄養因子（ＮＴ３）、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）、ＴＩＭＰ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｄ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＬ１−ａ、ＩＬ−３、レプチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ−１）及びＴＧＦβ−３からなる群から選択される１つ以上の作用剤を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶを含む組成物は更に、プロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素阻害剤又はこれらの組み合わせを含む。
【００１５】
また、開示の神経ＥＶを含有する有効量の組成物を対象に投与することを含む、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷又は神経変性疾患を有する対象の治療方法が開示される。いくつかの実施形態では、その神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、ハンチントン病、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【００１６】
開示のＥＶの内容物中には、いくつかの加齢関連疾患について有益であり得るいくつかのタンパク質ファミリーが存在する。これらは、メタロプロテアーゼなどの触媒活性酵素、いくつかのカルシウム媒介シグナル伝達タンパク質、及び他のイオンチャネルを含む。いくつかのＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼサブユニット、並びにユビキチンリガーゼ、及びプロテアソームサブユニットが存在する。従って、本明細書において開示される神経ＥＶを含有する有効量の組成物を対象に投与することを含む、タンパク質ホメオスタシス障害又はタンパク質障害を有する対象の治療方法もまた開示される。
【００１７】
また、脊髄損傷を有する患者若しくは対象、脳卒中若しくは外傷性脳損傷に罹患した患者若しくは対象、又は神経変性疾患を有する患者若しくは対象を治療するための医薬品の製造における、神経ＥＶを含有する組成物の使用が開示される。
【００１８】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、その説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞外小胞（ＥＶ）（例えばエキソソーム）が得られる可能性のある、潜在的な細胞源を示す。
【図２】ＥＶを含有する多小胞体（ＭＶＢ）が神経前駆（ＮＰ）細胞中によく見られることを示す、超微細構造分析である。従来「小胞が、より小さい球体及び楕円体の小胞、並びに微繊維、顆粒、一様でない高密度の塊、及び膜成分として記載される他の含有物を含有する」と記述されているが、これはＮＰの境界膜付近において明らかである。また報告されているように、その小胞は、３つ以上の小胞の集まりにおいてよく見られた（図Ａ、Ｂ）。図Ｂからの拡大図が図Ｃに示されており、このＭＶＢは実際に、内側に出芽する小胞を有してより大きな多小胞体になり、これらの小胞が原形質膜からタンパク質を再利用する役割を支援する。これらの小胞は、原形質膜と結合し、ＥＶを細胞外空間に放出しているように見える（図Ｄ、Ｅ）。過去の報告は、小胞が合体することができることを示しており、これはＮＰにおいてよく見られるようであり、そしてＭＶＢの集まりを有するほとんどの細胞で確認することができる（図Ａ、Ｆ、Ｇ）。図Ｈは、ＮＰからの精製ＥＶの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図３Ａ−３Ｄ】ＥＶは、精製されてナノ粒子追跡分析によって検出されることができることを示している。図３Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたエキソソームからのタンパク質、及びクマーシー染色で染色されたゲルを示す。ＥＶからのタンパク質のプロファイルは重複していたが、細胞ペレットとは異なるものであり、これは積荷タンパク質がＥＶへと特異的に輸送されることを支持する。図３Ｂは、上記プロファイルでのタンパク質の量が、細胞を栄養欠乏などのストレス条件に曝露した場合に変化することが、ＢＣＡアッセイで比較した際のタンパク質含有量により明らかとなることを示している。図３Ｃ及び３Ｄは、神経前駆細胞（図３Ｃ）及び星状細胞（図３Ｄ）由来の精製ＥＶの、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析を示す。これらのＥＶは、重複するものの異なるサイズプロファイルを示し、両タイプの細胞が、５５ｎｍの小胞でのピークと、２５〜２５０ｎｍの範囲を生じる。
【図４】分化した神経細胞が、神経前駆細胞由来のＤｉＩ標識ＥＶを吸収することを示す。最終的なＥＶの脱水及びＰＢＳ洗浄の３０分前に細胞上清に１０μＭのＤｉＩを添加することによって、ＥＶを標識することができた。分化した細胞の培地に添加すると、ＥＶの取り込みは、５分以内には明らかとなった。
【図５Ａ−５Ｂ】神経前駆細胞由来のＥＶが、更に分化した神経細胞を飢餓ストレスから保護することを示す。図５Ａは、神経前駆細胞（ＮＰ）、星状細胞又はヒト臍帯ＭＳＣから限外ろ過によって採取されたＥＶを示す。タンパク質含有量をＢＣＡで測定し、ＥＶを連続希釈して、等容積のリン酸緩衝血清（ＰＢＳ）中で、ＮｅｕｒｏＮｅｔ細胞（６〜８週分化）を含有するウェルへ移した。細胞を１０日間の飢餓ストレスに供し、そこで細胞が固定され、β−ＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ）を染色した。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎを用いて、１ウェルにつき中央の２０の視野を撮像した（４つの技術的報告での代表的な画像が示される）。図５Ｂは、ＮＰ及び星状細胞ＥＶが細胞を飢餓ストレスから保護し、単層及び伸長の完全性を概ね維持したことを示す。ＭＳＣ処理済みのウェル内により多くの細胞及び破片が存在する場合、細胞はその神経形態をほとんど喪失した。ＰＢＳのみを受け入れたウェルでは、やはり検出可能な細胞はほとんど存在しなかった。ＮＰ及び星状細胞ＥＶ試料は、より高いタンパク質濃度を有し、そのため５０μｇタンパク質／ウェルで処置された。タンパク質はＭＳＣ試料では限界があり、従って可能な最高濃度は６．２５であったが、それでも細胞を濃度依存的に殺すようであるので、より高い用量（５０、２５又は１２．５μｇ／ウェル）が異なる結果をもたらす可能性は低い。
【図６Ａ−６Ｃ】インジウム１１１標識済みＥＶを、注入後１時間以内に脳卒中組織近傍で発見することができることを示している。図６Ａ〜６Ｃは、インジウム１１１標識済みＥＶ（図６Ｂ、６Ｃ）の生体分布を、遊離インジウム（図６Ａ）と比べて示しており、これは脳卒中後即座に注入した場合（図６Ｂ左図の円）、又は脳卒中発生の２４時間後に注入した場合（図６Ｃ左図の円）に、ＥＶが注入の１時間以内に脳内の脳卒中の近傍に存在することを示す。初期注入のタイミングにかかわらず、ＥＶは、注入後２４時間にその領域から、少量の放射能が依然として検出されるもののほとんど消失しており（図６Ｂ、６Ｃ右図の円）、これは周囲の組織によってＥＶが代謝されたことを示していると思われる。
【図７】子ブタの脳におけるＤｉＲ標識済みＥＶの生体内分布を示す。ＤｉＲ標識済みＥＶ（およそ２．７×１０10小胞／ｋｇ）が、定位注入による脳実質への直接送達（上図）及びクモ膜下腔内のＣＳＦへの直接送達（下図）によって、背側及び腹側の両方から検出可能であった。蛍光は両方の場合において、脳の背側及び腹側の側面で検出可能であったが、ＩＰ注入時の背側領域（上図）及びＣＳＦ注入後の脳の腹側領域（下図）において、より顕著であった。
【図８Ａ−８Ｅ】神経細胞由来のＥＶを用いた治療が、マウス塞栓性脳卒中モデルにおいて、梗塞サイズ及び機能転帰を改善することを示す。ＡＰＥＸ、ＭＳＣＥＸ、ＰＢＳ及びＮＰＥＸのアリコートを、盲検の調査者に、塞栓性脳卒中の誘発後のマウスへの注入（脳卒中の２、１４及び２８時間後に、３回の繰り返しのおよそ２．７×１０11小胞／ｋｇの投薬）のために提供した。脳卒中の９６時間後に得られた脳のＴＴＣ染色により、ＮＰＥＸ又はＡＰＥＸ処置後に梗塞のサイズの有意な減少が明らかになったが、ＭＳＣＥＸは効果を有しなかった（図８Ａ、８Ｃ）。ＮＰＥＸ及びＡＰＥＸはまた、研究の過程で死亡率を低下させ、対照及びＭＳＣＥＸ処置動物の４０％超は研究の過程で合併症に罹り、その一方でＡＰＥＸ及びＮＰＥＸ処置動物のおよそ２５〜３０％が死亡した（図８Ｂ）。粘着テープ試験によって検出された感覚能力の改善を含む表現型の恩恵、及び神経学的欠損スコアによって集約されるような神経学的欠損の低下もまた、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸ処置動物において認められた。
【図９Ａ−９Ｃ】神経細胞由来のＥＶが、脳卒中後の免疫応答を調節することを示す。脳卒中後９６時間における血液試料のフローサイトメトリーは、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸが、ＭＳＣＥＸ及び対照（ビヒクル）処置群に対して、制御性Ｔ細胞を増加させ（図９Ａ）、炎症性Ｔヘルパー細胞を減少させ（図９Ｂ）、循環中の抗炎症Ｍ２マクロファージを増加させる（図９Ｃ）ことを示す。
【図１０Ａ−１０Ｃ】ＮＰＥＸ処置が、ＭＲＩでの測定により、脳卒中後２８±４時間以内に梗塞体積の減少をもたらすことを示す。脳卒中となった動物は、ＮＰＥＸ（およそ２．７×１０10小胞／ｋｇ）又はＰＢＳ（ビヒクル）を、脳卒中の２、１４及び２４時間後に投与された。動物はまた麻酔下でＭＲＩで分析された。ＮＰＥＸ処置動物は、ＰＢＳを投与された動物に比べて梗塞の体積が有意に減少した（図Ａ〜Ｃ）。同側と反対側との間でのサイズ差を評価すると、ＮＰＥＸ群では半球間の差がより小さく、これは対照と比較して浮腫及び腫脹が少ないことを示す。
【図１１】ＮＰＥＸ処置が脳卒中の１２週間後に分子欠損を改善することを示す。Ｔ２及びＴ２フレア画像はいずれも、脳卒中の１２週間後のＮＰＥＸで処置されたブタにおいて検出可能な損傷がより少ないことを示している。処置動物では、組織の欠如（死）は１２週時点で有意に減少し、宿主組織に適合しない密度の領域がはるかに明らかでなかった。
【図１２】ＮＰＥＸ、ＡＰＥＸ及びＭＳＣＥＸのＥＶに特有のタンパク質、並びにこれらが共有するタンパク質の数を示すベン図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明に従って、当技術分野における従来の細胞培養方法、化学合成方法、並びに他の生物学的及び薬学的技法を用い得る。このような技法は公知であり、さもなければ文献で十分に説明されている。
【００２１】
ある範囲の値が与えられる場合は、文脈上そうでないことが明らかでない限り（例えば多数の炭素原子を含有する基の場合、この場合はその範囲内の各炭素原子数が与えられる）、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びその明記された範囲でのいずれかの他の明記された値又は中間値が本発明に含まれるものと理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してそのより小さい範囲内に含まれることができ、その明記された範囲でいずれかの特に除外される限界を条件として、そのより小さい範囲もまた本発明の範囲内に包含される。その明記された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００２２】
別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等であるいずれの方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験において用いられ得るが、好ましい方法及び材料がここに記載される。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は、その状況が明らかに他を示さない限り、複数についての言及を包含することに留意されたい。
【００２４】
更に、以下の用語は下記の定義を有するものとする。ある用語が本明細書において下記で定義されていない場合は、その用語は当業者による文脈内での典型的な使用の範囲内での意味を有するものとする。
【００２５】
用語「対象」は、投与又は処置の対象となるいずれかの個体を指す。対象は脊椎動物、例えば哺乳類とすることができる。よって対象は、ヒト患者又は獣医学的患者とすることができる。用語「患者」は、臨床医、例えば内科医の治療を受けている対象を指す。
【００２６】
用語「治療に有効な」は、使用される組成物の量が、疾患又は障害のうちの１つ以上の原因又は症状を改善するために十分な量であることを指す。このような改善は、低減又は変化でさえあればよく、必ずしも排除でなくてよい。
【００２７】
用語「薬学的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な効果／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接して使用するのに適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「治療する」（treat）、「治療する」（treating）及び「治療」（treatment）などの用語は、本発明による細胞組成物を使用して改善され得る病状、状態若しくは欠損の危険があるか又はこれらに罹患している患者に効果をもたらすいずれかの行為を指す。状態の治療は、少なくとも１つの症状の軽減又は抑制、病状若しくは状態の影響の発生の防止又は遅延を含む病状若しくは状態の影響の進行の遅延などによって、状態を改善することを含む。本願では、処置は、脊髄損傷又は脳卒中の影響の低減を伴うことができ、それはそのような傷害の影響を回復及び／又は阻害することを含み、神経変性疾患が改善する及び／又は進行若しくは悪化しないように、神経変性疾患を回復、改善、阻害及び／又は安定化することを伴うことができる。用語「予防的」は、多くの場合に病状及び／又は状態の進行及び／又は悪化である、ある特定の結果が生じる「可能性を低減する」方法を記述するために使用される。
【００２９】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関与する酵素反応のための、細胞の成長、細胞の分離、及び関連する場合はクローニング、ＤＮＡの単離、増幅及び精製のための標準的な技法、並びに様々な分離技法は、当業者に公知でありかつ一般的に用いられているものである。多数の標準的な技法が、以下に記載されている：Sambrookほか, 1989年 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatisほか, 1982年 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993年 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979年 Meth, Enzymol. 68; Wuほか, (Eds.) 1983年 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980年 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972年 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981年 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982年 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985年 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985年 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK;及びSellow and Hollaender 1979年 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1−4, Plenum Press, New York。略語及び命名法が用いられている場合、それらは本分野における及び本明細書で引用したものなどの専門誌において一般的に使用されている標準的なものとみなされる。
【００３０】
用語「ヒト多能性幹細胞」（「ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）はそのサブセットである）は、受精後のいずれかの時点における前胚、胚、胎児組織又は成人幹細胞（ヒト誘導多能性幹細胞の場合）に由来し、適切な条件下において、特に神経幹細胞及び前駆細胞、神経堤細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、並びに関連する増殖性及び非増殖性神経細胞を含む、いくつかの異なる細胞型の子孫を生成することができるという特徴を有する。この用語は、様々な種類の幹細胞の樹立された株、及び本明細書に記載の方法で多能性の一次組織から得られた細胞の両方を含む。
【００３１】
用語「胚性幹細胞」は、胎盤胞期の胚から単離された、好ましくは人を含む霊長類の、多能性細胞を指す。
【００３２】
用語「神経前駆細胞」は、神経及びグリア細胞型に分化する能力を有する、限られた回数だけ分裂することができる細胞を指す。
【００３３】
用語「細胞外小胞」及び「ＥＶ」は、本明細書では、脂質二重層又はミセルによって含有される細胞からの流体、マクロ分子、溶質及び代謝産物からなる、サイズが約１０ｎｍ〜１０μｍの小胞を示すために使用される。いくつかの場合では、ＥＶは細胞由来ＥＶである。用語「ＥＶ」はまた、神経ＥＶなどの細胞由来ＥＶに見られる生物活性分子を含有するよう操作された脂質小胞を含む。これらの用語は、エキソソーム及びエクトソームの両方を包含する。エキソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）のエキソサイトーシスの際に放出される。エクトソームは、原形質膜に集合して原形質膜から放出される小胞である。いくつかの場合では、ＥＶのサイズは約２０ｎｍ〜１０μｍ、２０ｎｍ〜１μｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、３０ｎｍ〜１００ｎｍ、３０ｎｍ〜１６０ｎｍ又は８０〜１６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、サイズが約２０〜１５０ｎｍのエキソソームである。
【００３４】
用語「自己ＥＶ」は、ＥＶが投与される対象又は患者の細胞から得られたＥＶの集団を記述するために使用される。
【００３５】
用語「神経ＥＶ」は、多能性幹細胞からインビトロで得られた神経前駆細胞、又はその神経前駆細胞から若しくは多能性幹細胞からインビトロで得られた神経細胞から産生された、細胞由来ＥＶを指す。この用語はまた、細胞由来神経ＥＶに見られる十分な数の生物活性分子を含有して実質的に同一の生物活性を有するように操作された小胞も指す。
【００３６】
組成
本明細書で開示されるのは、神経ＥＶ（例えばエキソソーム）、並びに脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷及び神経変性疾患の治療におけるこれらＥＶの使用方法である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、神経前駆（ＮＰ）細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にとってのＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って、細胞培地中で多能性幹細胞（例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））からインビトロで生成されたＮＰ細胞又はＭＳＣを培養することによって、得ることができる。
【００３８】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）からヒト神経前駆（ｈＮＰ）細胞を生成する方法は、例えば米国特許第７，５３１，３５４号に記載されており、この文献は、これらの細胞の教示に関して、その全体が参照により本出願に援用される。ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰ）は、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２及びＳｏｘ３を含む、最も初期の多能性神経細胞に関連するマーカーを発現することが知られている。ＥＶを産生するためにフィーダー細胞を含まない神経前駆細胞を用い得るが、本明細書に別に記載されるいずれかの神経前駆細胞もまた用い得ることに留意されたい。好ましい神経前駆細胞は、米国特許第７，５３１，３５４号に示されている方法に従って生成され、付随的なフィーダー細胞を用いず、また胚様体も用いない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、多能性幹細胞から直接的又は間接的に得られた星状細胞などの分化済み神経細胞を、ＥＶ産生のための十分な条件下でかつ十分な時間に亘って細胞培地中で培養し、そのＥＶを培地から単離することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、分化済み神経細胞は、ｈＮ２（商標）神経細胞（ＡｒｕｎＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、ＮｅｕｒｏＮｅｔ（商標）ニューロン、又はＡｓｔｒｏＰｒｏ（商標）星状細胞（ＡｒｕｎＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）である。
【００４０】
ＥＶ産生ＮＰ細胞、神経細胞又はＭＳＣの生成に使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などである。
【００４１】
多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現し得る（Thomsonほか, Science 282: 1145, 1998年）。多能性幹細胞のインビトロでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１の発現（存在する場合）の喪失及びＳＳＥＡ−１の発現の増加をもたらす。未分化多能性幹細胞は、通常はアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを製造元（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンガム）の説明どおりに基質として用いて成長させることによって検出されることができる。未分化多能性幹細胞は、通常はＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現し、ＲＴ−ＰＣＲで検出される。
【００４２】
使用できる多能性幹細胞の種類としては、妊娠後に形成された組織に由来する多能性細胞の樹立された株が挙げられ、これは前胚組織（例えば胎盤胞）、胚組織又は胎児組織を含み、これらは妊娠中のいずれかの時点で採取され、典型的にはおよそ妊娠の１０〜１２週より前であるが、必ずしもそうでなくてもよい。限定でない例としては、例えばヒト胚性幹細胞株ＷＡ０１、ＷＡ０７及びＷＡ０９９（ＷｉＣｅｌｌ）などの、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の樹立された倫理的な株である。更に考えられるのは、このような細胞の初期樹立又は安定化中での開示の組成物の使用であり、この場合では、供給源細胞は供給源組織から直接採取された一次多能性細胞となる。また適したものとしては、フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取された細胞である。また適したものとしては、例えばＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ、ジョージア州アセンス）などの突然変異ヒト胚性幹細胞株、並びにＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９（ＷｉＣｅｌｌ）及びＢＧ０１、ＢＧ０２（ＢｒｅｓａＧｅｎ、ジョージア州アセンス）などの正常なヒト胚性幹細胞である。
【００４３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、例えばThomsonほか（米国特許第５，８４３，７８０号； Science 282; 1145, 1998年; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff, 1998年; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 92:7844, 1995年）に記載されているような、当技術分野において説明されている方法によって調製され得る。あるいは、ヒト胚性幹細胞は市販品であってもよい。
【００４４】
エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳｃ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、初期の着床後の胚から単離される。これらはＯｃｔ４を発現し、多能性である。ｉＰＳＣは、４つの遺伝子（ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４）のレトロウイルス導入によって成体の体細胞を多能性状態へと脱分化させることによって作製される。
【００４５】
米国特許出願第２０１４０３５６３８２号に記載されているように、「細胞から産生されたエキソソームは、培地及び／又は細胞組織からいずれかの適した方法で回収されることができる。典型的には、ＥＶの調製は、細胞培養物又は組織上清から遠心分離、ろ過又はこれらの方法の組み合わせによってされることができる。例えばＥＶは、分画遠心分離、即ち比較的大きな粒子をペレット化するための低速（＜２，００００ｇ）の遠心分離に続くＥＶをペレット化するための高速（＞１００，０００ｇ）遠心分離、適切なフィルタ（例えば０．２２μｍフィルタ）を用いたサイズろ過、勾配超遠心分離（例えば、スクロース勾配を用いた）、又はこれらの方法の組み合わせによって、調製されることができる」。ＥＶの含有物、即ち脂質二重層が除去又は排除されて得られた含有物を用いて、人工ＥＶを作り出してもよいことに留意されたい。
【００４６】
更に、米国特許出願第２０１４０３５６３８２号に記載されているように、エレクトロポレーション（電気穿孔法）又はトランスフェクション試薬の使用を含む多数の異なる技法によって、外因性タンパク質及び／又はペプチド、並びに他の積荷タンパク質を、ＥＶに導入することができる。エレクトロポレーションの条件は、生物学的治療の積荷タンパク質の電荷及びサイズに応じて変わり得る。典型的な電圧は、２０Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍ、例えば２０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍであり、キャパシタンスは典型的には２５μＦ〜２５０μＦ、例えば２５μＦ〜１２５μＦである。１５０ｍＶ〜２５０ｍＶの電圧、特に２００ｍＶの電圧が、ＥＶに抗体を装填するために好ましい。あるいはトランスフェクション試薬を用いて、ＥＶに外因性タンパク質及び／又はペプチドを装填してもよい。ＥＶのサイズが小さいにもかかわらず、タンパク質及び／又はペプチドによるＥＶのトランスフェクションのために、従来のトランスフェクション試薬が使用されることができる。ＥＶの装填はまた、関心の対象である治療用タンパク質又はペプチドを発現する核酸構成で宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションして、ＥＶをその細胞から産生する際にその治療用タンパク質又はペプチドをＥＶに取り込むことによって行われてもよい。
【００４７】
説明されている実施形態では、本明細書において開示されるＥＶ産生ＮＰ細胞及び／又は神経細胞は、細胞及びそのＥＶを産生する能力に応じて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日に亘って、又は約１、２、３、４、５、６、７、８週間若しくは約１、２、３、４、５若しくは６ヶ月に亘って培養される。ＥＶ産生細胞は、適した培地中で培養されて、当業者によって容易に決定される条件下で成長されることができる。細胞培養条件は、細胞の種類によって変わることがあり、以下で示される例では、適した培地及び条件が示される。例えば、胎児ウシ血清（例えば１０％）を含み、任意でグルタミン又はグルタミン含有混合物及び抗生物質が追加された、ＣＭＲＬ１０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞を表面（フィーダー細胞）上で成長させることができ、例えば細胞をその表面上の単層として成長させることができ（フィーダー細胞を有しない）、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％コンフルエントまで成長させることができる。
【００４８】
細胞成長培地は当技術分野で公知であり、少なくとも１つの最低限必須である培地と、成長因子、アスコルビン酸、グルコース、非必須アミノ酸、塩（微量元素を含む）、グルタミン、インスリン（指示されかつ排除されていない場合）、アクチビンＡ、トランスフェリン、βメルカプトエタノール、及び当技術分野で公知である及び本明細書の他の箇所に記載されているような他の作用剤などの１つ以上の任意の要素とを含む。好ましい培地は、神経細胞を支援する、低タンパク質の血清非含有を基礎とした成長培地である。使用される成長因子は、単独の又は好ましくは白血病阻害因子（ＬＩＦ）と組み合わせた、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）とすることができる。成長培地中で成長させるＮＰ又は神経細胞よっては、ＬＩＦを含むことが好ましいが、必要でない場合もある。更なる培地としては、例えば約０．１％〜２０％（好ましくは約２〜１０％）のウシ胎仔血清である血清を含有してもよく、又は所定の培地に関しては、ウシ胎児血清及びＫＳＲを含まず、任意でウシ血清アルブミン（約１〜５％、好ましくは約２％）を含む、基本細胞培地などである。好ましい培地が規定され、それは血清を含まず、低タンパク質である。成長培地の成分は、成長させる神経細胞の種類に依存し、その全てが当技術分野で公知である。特に好ましい培地は、ＡｒｕｎＡ製の培地及び添加物である。ＡＢ２（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｋｉｔは、ＡＢ２（商標）Ｂａｓａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（培地）及びＡＮＳ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（添加物）を含有する。その培地及び添加物は、全ての神経細胞の培養における必要条件を満たす汎用性のために、特定の操作を受ける。ＡＢ２（商標）Ｂａｓａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＡＮＳ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、様々な神経表現型へのｈＮＰ１（商標）株の分化を方向づけるための専用の培地のための基礎として使用されることができる。培地及び添加物の各ロットは、細胞成長、無菌性、ｐＨ、モル浸透圧濃度及び内毒素に関して試験することによって、使用のために事前検査をされる。
【００４９】
ＡｒｕｎＡ社の調製は、神経細胞の培養は、フィーダー細胞を必要とすることなく、複数の継代に亘って安定した核型を維持できるようになり、このことはそれを早期の薬剤発見を含む多様な研究用途のための優れた選択肢とする。
【００５０】
培地に任意で追加されることができる他の作用剤としては、培地中で成長される細胞の種類に応じて、多数の他の成分の中でも特に、例えばニコチンアミド；ＴＧＦ−β１、２及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー；アクチビンＡ；ノーダル（ｎｏｄａｌ）；骨形態形成因子タンパク質（ＢＭＰ２〜７）血清アルブミン；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー；血小板由来成長因子−ＡＡ及び−ＢＢ；富血小板血漿；インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ、ＬＲ−ＩＧＦ）；成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）；グルカゴン様ペプチドＩ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）；ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ミメティボディ；エキセンジン４；副甲状腺ホルモン；インスリン；プロゲステロン；アプロチニン；ヒドロコルチゾン；エタノールアミン；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ガストリンＩ及びＩＩ；例えばトリエチレンペンタミンなどの銅キレート剤；フォルスコリン；Ｎａ−ブチレート；ベータセルリン；ＩＴＳ；ノギン；神経突起成長因子；ノーダル；バルプロ酸；トリコスタチンＡ；酪酸ナトリウム；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；スフィンゴシンＩ；ＶＥＧＦ；ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）；Ｎ２及びＢ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）；例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）などのステロイドアルカロイド；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）；Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー；ウシ下垂体抽出物；島新生物関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）；インディアンヘッジホッグ；ソニックヘッジホッグ；プロテアソーム阻害剤；ノッチ経路阻害剤；ソニックヘッジホッグ阻害剤；へレグリン；又はこれらの組み合わせのうちのいずれかの１つ以上などである。これらの各成分は、含まれる場合には有効量で含まれる。
【００５１】
更なる例として、適した培地を、例えばダルベッコ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；βメルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１３２５６−０２９などの成分から作製してもよい。
【００５２】
細胞培地は市販されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（ＧＩＢＣＯ）、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル、ベイトハエメク）及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能なものなどの、規定された異種非含有成分を含む、市販の成分を添加することができる。当業者であれば、本発明による標的細胞のうちのいずれか１つ以上を生成するために、細胞培地を容易に修飾することができる。
【００５３】
開示のＥＶ産生細胞は、細胞を様々な方法で支持するフィーダー細胞の層上で培養されてもよい。細胞をフィーダー細胞の層上で培養するための方法は、当技術分野で公知である。その細胞は、胚様体として又は懸濁液中でなく、接着性単層としての細胞支持体又はマトリクス上で成長されることができる。特定の実施形態では、ＥＶの産生に使用される細胞に応じて、細胞支持体の使用が好ましい場合がある。細胞支持体は、使用される場合には、好ましくは少なくとも１つの基質タンパク質を含む。基質タンパク質は、例えば細胞外マトリクスタンパク質を含み、これはラミニン、テナシン、トロンボスポンジン及びこれらの混合物などの、細胞外マトリクス中に見られるタンパク質であり、これは成長の促進を示し、上皮成長因子（ＥＧＦ）との相同性を有するドメインを含有して成長促進活性を示す。使用し得る他の基質タンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ビブロネクチン、ポリリシン、ポリオルニチン、及びこれらの混合物などである。更に、ゲル及び他の材料、例えばメチルセルロース、又はこれらの胚性幹細胞分化タンパク質のうちの１つ以上を有効濃度で含有する他のゲルもまた使用し得る。例示の分化タンパク質、又はこの分化タンパク質を含む材料としては、特に、例えばラミニン、ＢＤ  Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（商標）細胞及び組織接着剤、ＢＤ（商標）ＦＩＢＲＯＧＥＮヒト組み換えコラーゲンＩ、ＢＤ（商標）ＦＩＢＲＯＧＥＮヒト組み換えコラーゲンＩＩＩ、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリクス、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリクス高濃度（ＨＣ）、ＢＤ（商標）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）ペプチドヒドロゲル、コラーゲンＩ、コラーゲンＩ高濃度（ＨＣ）、コラーゲンＩＩ（ウシ）、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ及びコラーゲンＶＩなどである。
【００５４】
あるいは、これらの細胞は、基本的にフィーダー細胞を含まないが、ＥＶの産生のために細胞の増殖を支援する培養系で培養されてもよい。フィーダー非含有培養での細胞の成長は、事前に別の細胞種類を培養することによって調整された培地を用いて支援されることができる。あるいは、分化を用いないフィーダー非含有培養におけるＥＶ産生細胞の成長は、化学的に規定された培地を用いて支援されることができる。これらの方法は、当技術分野で公知である。本発明の特定の実施形態では、細胞をフィーダー細胞非含有培地中で成長させる。
【００５５】
ＥＶは、様々な時間間隔で（例えばＥＶ産生速度に応じて約２、４、６、８又は３、６、９、１２日又はそれより長い間隔で）採取されることができる。ＥＶの例示の収率は、本明細書の他の箇所に記載されるような増殖性及び非増殖性神経細胞の約２４時間〜７日間の培養期間中に、少なくとも約１ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約１０ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約５０ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約１００ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約５００ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約７５０ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約８００ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約９００ｎｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約１．０μｇＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約１．５μｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約の２．０μｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約２．５μｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも例えば約３．０μｇのＥＶ／細胞１００万個、少なくとも約５．０μｇのＥＶ／細胞１００万個、及び少なくとも約１０．０μｇのＥＶ／細胞１００万個からの範囲であり得る。
【００５６】
特定の実施形態では、ＥＶは超遠心分離若しくは分画遠心分離又はこれらのいずれかの組み合わせによって採取及び回収され、ペレット化されたＥＶが回収され、任意で回収されたペレット化されたＥＶは適した媒体で洗浄される。ＥＶの調製は、細胞培養物又は組織上清から遠心分離、ろ過又はこれらの方法の組み合わせによってされることができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、分画遠心分離、即ち比較的大きな粒子をペレット化するための低速（＜２，００００ｇ）の遠心分離に続くＥＶをペレット化するための高速（＞１００，０００ｇ）遠心分離、適切なフィルタ（例えば０．２２μｍフィルタ）を用いたサイズろ過、勾配超遠心分離（例えば、スクロース勾配を用いた）、又はこれらの方法の組み合わせによって、調製されることができる。ＥＶは、分画遠心分離、微小遠心分離及び超遠心分離、ポリマー沈殿法、マイクロ流体分離、免疫捕獲、並びにサイズ排除クロマトグラフィによって精製されてもよい。ＥＶを単離及び精製するためのこれらの及び／又は関連する方法は、・・・・・・・・ほか, Current Protocols in Cell Biology, (2006) 3.221−3.22.29、copyright 2006年 by John Wiley & Sons, Inc,; Sokolovaほか, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces、2011年, 87, 146−150; Wiklanderほか, Journal of Extracellular Vesicles, 2015年, 4, 26316, pp.1−13;及びB・ingほか, Journal of Extracellular Vesicles, 2014年, 3, 23430, pp. 1−11に記載されている。高周波電界及び音響などの他の単離方法も開発されることができる。
【００５７】
医薬組成物
治療に有効な量の開示のＥＶのうちの１つ以上及び薬学的に許容可能なキャリアを含有する、医薬組成物が開示される。開示のＥＶを含有する製剤は、液体、固体、半固体又は凍結乾燥粉体形態、例えば、好ましくは正確な用量の簡単な投与に適した単位剤形である、溶液、懸濁液、乳剤、徐放性製剤、錠剤、カプセル、粉剤、座薬、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾル、パッチなどの形態を取り得る。
【００５８】
医薬組成物は、典型的には従来の医薬キャリア及び／又は賦形剤を含み、更に他の医薬品、キャリア、アジュバント、添加剤などを追加で含んでもよい。ＥＶ：１つ以上の賦形剤の重量％比は、約２０：１〜約１：６０、又は約１５：１〜約１：４５、又は約１０：１〜約ｌ：４０、又は約９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１又は１：１〜約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０又は１：３５とすることができ、好ましくは約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１又は５：１である。いくつかの実施形態では、開示の組成物は、約１μｇ〜約１ｇ以上の合計ＥＶ、約５００μｇ〜約５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの合計ＥＶ、約５〜約５００ｍｇ、約１０〜約５００ｍｇ、約２５〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約７５ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約４５０ｍｇ、又は約７５ｍｇ〜約３２５ｍｇ、又は約１００ｍｇ〜約６５０ｍｇの合計ＥＶを含み、任意で１つ以上の適した医薬キャリア、添加剤及び／又は賦形剤を含有してもよい。
【００５９】
非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、髄腔内、脳脊髄内、又は鼻腔内）のための注入組成物は、典型的には無菌生理食塩水溶液などの適したｉ．ｖ．溶液中に、そのＥＶと、任意の追加成分とを含有する。その組成物は、水性乳液中の懸濁液として製剤されてもよい。
【００６０】
液体組成物は、そのＥＶ及び任意の医薬アジュバントを含む医薬組成物を、例えば食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール又はエタノールなどのキャリア中に溶解又は分散させて、溶液又は懸濁液を形成することによって調製されることができる。経口液体製剤として使用するために、組成物は溶液、懸濁液、乳液又はシロップとして製剤されることができ、これらは液体形態、又は水若しくは通常生理食塩水中での水和に適した乾燥形態で供給される。鼻腔内、気管内又は肺内投与の場合、組成物は、鼻腔、気管及び／又は肺内へと噴霧することができる液体組成物として提供されてもよい。
【００６１】
経口投与に関して、そのような賦形剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。必要に応じて、組成物は、湿潤剤、乳化剤又は緩衝剤などの微量の非毒性補助物質を含有することもできる。
【００６２】
組成物を経口投与用の固体製剤の形態で使用する場合、その製剤は、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセルなどにされることができる。錠剤形態では、組成物は典型的には、例えば糖類又はセルロース製剤などの賦形剤、デンプンペースト又はメチルセルロースなどの結合剤、充填剤、崩壊剤、及び医薬製剤の製造において一般的に使用される他の添加剤を用いて製剤される。
【００６３】
このような剤形の製剤方法は、当業者に公知であるか又は明らかである。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co. 1985年)を参照されたい。投与される組成物は、本発明による患者又は対象を含む生体系における治療での使用のための薬学的に有効な量で、選択された化合物の量を含有することになる。
【００６４】
静脈内投与製剤は、本明細書に記載のＥＶ、等張性媒体、及びＥＶの凝集を防止する１つ以上の物質を含むことができる。例示の静脈内／髄腔内／脳脊髄内投与流体製剤は、生理食塩水溶液（例えば、通常生理食塩水（ＮＳ）；約０．９１％ｗ／ｖのＮａＣｌ、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ）及び／又は０．１８％生理食塩水中の４％デキストロース、及び任意で１％、２％又は３％のヒト血清アルブミンを含有してもよい。更に、本発明による組成物中で使用される含有量を得るために、ＥＶを崩壊させてもよい。
【００６５】
例示の実施形態では、本発明の製剤は、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷及び／又は神経変性疾患の治療に使用するための静脈内／髄腔内／脳脊髄内投与流体媒体１ｍｌ当たり約５０ｎｇのＥＶ、約１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１．０μｇ、１．５μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、５．０μｇ、１０．０μｇ、１５．０μｇ、２０．０μｇ、１００μｇ又はそれ以上のＥＶを含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、静脈内投与製剤は、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．１μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．２μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．３μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．４μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．５μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．６μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．７μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．８μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約０．９μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約１．０μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約１．５μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約２．０μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約２．５μｇのＥＶ、例えば静脈内投与媒体１ｍｌ当たり少なくとも約３．０μｇのＥＶ、例えば静脈内投与媒体１ｍｌ当たり少なくとも約５．０μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約１０．０μｇのＥＶ、静脈内投与媒体１ｍｌ当たり１５．０μｇのＥＶ、又は静脈内投与媒体１ｍｌ当たり約２０．０μｇ以上のＥＶを含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、上記医薬組成物は、少なくとも２５ｍｇのＥＶ、少なくとも５０ｍｇのＥＶ、少なくとも６０ｍｇのＥＶ、少なくとも７５ｍｇのＥＶ、少なくとも１００ｍｇのＥＶ、少なくとも１５０ｍｇのＥＶ、少なくとも２００ｍｇのＥＶ、少なくとも２５０ｍｇのＥＶ、少なくとも３００ｍｇのＥＶ、約３５０ｍｇのＥＶ、約４００ｍｇのＥＶ、約５００ｍｇのＥＶ、約７５０ｍｇのＥＶ、約１ｇ（１，０００ｍｇ）以上のＥＶを、単独で又は治療に有効な量の少なくとも１つの追加の生物活性剤と組み合わせて含む剤形の形態であり、生物活性剤は、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷及び／又は神経変性疾患の治療において有用なものであってもよい。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、約１０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約６５０ｍｇ、又は約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、又は約３５ｍｇ〜約４５０ｍｇ、最も多くの場合には約５０〜約５００ｍｇのＥＶを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、静脈内投与製剤は、本明細書に記載のＥＶ、等張性媒体、及びＥＶの凝集を防止する１つ以上の物質を含む。従って静脈内投与製剤は、生理食塩水（例えば、通常生理食塩水（ＮＳ）；約０．９１％ｗ／ｖのＮａＣｌ、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ）及び／又は０．１８％生理食塩水中の４％のデキストロース、及び任意で１％、２％又は３％のヒト血清アルブミンを含有してもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶを含む組成物は更に、１つ以上の神経栄養剤を含む。その組成物は更に、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−６、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＭＧＦ）、ＩＦＮ−γ、インスリン様成長因子結合タンパク質（ｌＧＦＢＰ−２）、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、１Ｌ−８、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）、単核食細胞コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、神経栄養因子（ＮＴ３）、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）、ＴＩＭＰ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｄ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＬ１−ａ、ＩＬ−３、レプチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子−１１（ＳＤＦ−１）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ−１）及びＴＧＦβ−３からなる群から選択される１つ以上の作用剤を含むことができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、ヒドロゲルなどの生体適合性の足場材料内又は足場材料上に含有される。適したヒドロゲルとしては、体温において固化又は硬化する温度依存性ヒドロゲル、例えばＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）；イオンによって架橋したヒドロゲル、例えばアルギン酸ナトリウム；可視光又は紫外光への曝露によって硬化するヒドロゲル、例えばアクリル末端基を有するポリエチレングリコールポリ乳酸共重合体；及びｐＨの変化によって硬化又は固化するヒドロゲル、例えばＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標）などである。これらの様々なヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例としては、イオンで架橋した、アルギン酸、ポリホスファゼン及びポリアクリル酸類などの多糖類、又は温度変化によって固化するポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロック共重合体であるＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＳ（商標）としても知られる）、又はｐＨの変化によって固化するエチレンジアミンのポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックポリマーであるＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＰＯＬＯＸＡＭＩＮＥＳ（商標）としても知られる）などのブロック重合体などである。
【００７１】
適したヒドロゲルとしては、膀胱、腸、血液及び脳を含むがこれらに限定されない組織に由来する、不確定の細胞外マトリクス由来ヒドロゲルも挙げられる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、コラーゲン、フィブリン、シルク、アガロース、アルギン酸、ヒアルロナン、キトサン、生分解性ポリエステル（例えばポリ乳酸−コ−グリコール酸、ポリ乳酸又はポリグリコール酸）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリエーテルスルホン、ペプチド系生体材料、グリコースアミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン又はこれらのいずれかの組み合わせを含む、生体適合性の足場材料内又は足場材料上に含有される。
【００７３】
いくつかの場合では、ヒドロゲルは、アルギン酸のアニオン塩、海藻から単離した炭水化物ポリマーを、カルシウムカチオンなどのイオンで架橋させることによって生成される。ヒドロゲルの強度は、カルシウムイオン又はアルギン酸の濃度の増大と共に増大する。例えば米国特許第４，３５２，８８３号は、ヒドロゲルマトリクスを形成するための、室温の水中でのアルギン酸と２価カチオンのイオンでの架橋を記載している。
【００７４】
ＥＶは、アルギニン酸溶液と混合され、この溶液は既に埋入された支持構造体へ供給した後、生理学的濃度のカルシウムイオンが生体内に存在することによって短時間で固化する。あるいはその溶液を、埋入前の支持構造体に供給し、カルシウムイオンを含有する外部溶液で固化させる。
【００７５】
一般にこれらのポリマーは、例えば水である水性溶液、又は荷電側基若しくはその１価イオン性塩を有するアルコール水溶液に、少なくとも部分的に溶解する。カチオンと反応することができる酸性側基を有するポリマーの例は多数存在し、例えばポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）及びポリ（メタクリル酸）である。酸性基の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、及びハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基などである。アニオンと反応することができる塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）及びポリ（ビニルイミダゾール）である。
【００７６】
ポリホスファゼンは、交互の単結合及び二重結合で分かれた窒素原子及びリン原子から成る骨格を有するポリマーである。各リン原子は２つの側鎖と共有結合する。使用することができるポリホスファゼンは、大多数の酸性である側鎖を有し、２価又は３価カチオンと塩橋を形成することができる。酸性側鎖の例は、カルボン酸基及びスルホン酸基である。
【００７７】
生体内分解性のポリホスファゼンは、多価カチオンと塩橋を形成することができる酸性側基と、インビボ条件下で加水分解する側基、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール及びグルコシルの、少なくとも２つの異なる種類の側鎖を有する。生体内分解性又は生分解性ポリマー、即ち所望の用途において（通常は生体内療法において）許容可能な期間内に溶解又は分解するポリマーは、約２５℃〜３８℃のｐＨ６〜８の生理学的溶液に曝露されると、約５年未満、最も好ましくは約１年未満に分解する。側鎖の加水分解により、ポリマーの分解が起こる。加水分解性側鎖の例は、未置換及び置換イミダゾール、並びに側鎖がアミノ結合を介してリン原子に結合しているアミノ酸エステルである。
【００７８】
様々な方式のポリホスファゼンの合成方法及び分析が、米国特許第４，４４０，９２１号、４，４９５，１７４号及び４，８８０，６２２号に記載されている。上述の他のポリマーの合成方法は、当業者には公知である。例えばConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz, editor (John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1990年)を参照されたい。ポリ（アクリル酸）、アルギン酸及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの多くのポリマーが市販されている。
【００７９】
荷電側基を有する水溶性ポリマーは、そのポリマーが酸性側基を有する場合は多価カチオンであり、又はポリマーが塩基性側基を有する場合は多価アニオンである、反対の電荷の多価イオンを含有する水溶液と、そのポリマーを反応させることによって架橋される。ポリマーを酸性側基と架橋させてヒドロゲルを形成するためのカチオンとしては、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム及びストロンチウムなどの２価及び３価カチオンなどである。これらのカチオンの塩の水溶液をポリマーに添加して、軟質で高膨潤性のヒドロゲルを形成する。
【００８０】
ポリマーを架橋してヒドロゲルを形成するためのアニオンには、低分子量ジカルボン酸イオン、テレフタル酸イオン、硫酸イオン及び炭酸イオンなどの２価及び３価のアニオンが含まれる。これらのアニオンの塩の水溶液をポリマーに添加して、カチオンに関して上述したように、軟質で高膨潤性のヒドロゲルを形成する。
【００８１】
抗体がヒドロゲル内へ移動することを防止し、一方で栄養は入ることができるようにするために、ヒドロゲルにおいて有用なポリマーのサイズは、１０，０００Ｄ〜１８，５００Ｄである。
【００８２】
温度依存性又は熱感受性ヒドロゲルは、いわゆる「逆ゲル化」特性を有する。即ちこれらは、室温以下において液体であり、より高い温度、例えば体温まで温められるとゲルとなる。よってこれらのヒドロゲルは、室温以下では液体として容易に塗布でき、体温まで温められると自動的に半固体ゲルを形成する。その結果、これらのゲルは、まず支持構造体を患者に埋入した後でヒドロゲル−ＥＶ組成物を充填する場合に、特に有用である。このような温度依存性ヒドロゲルの例は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンＦ−１０８、Ｆ−６８及びＦ−１２７などのＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、並びにＮ−イソプロピルアクリルアミド共重合体である。
【００８３】
これらの共重合体を標準的な技法で操作して、その多孔率、分解速度、転移温度及び剛性の程度などの物理的特性に影響を与えることができる。例えば、塩の存在下及び非存在下における低分子量糖類の添加は、典型的な熱感受性ポリマーの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）に影響を及ぼす。更にこれらのゲルを、４℃での分散によって５〜２５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で調製した場合、粘度及びゲル−ゾル転移温度が影響を受け、ゲル−ゾル転移温度は濃度に対して逆の関係を有する。
【００８４】
米国特許第４，１８８，３７３号は、水性組成物中でＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）ポリオールを用いて、熱ゲル化水溶液系を提供することを記載している。米国特許第４，４７４，７５１号、７５２号、７５３号及び４，４７８，８２２号は、熱硬化性ポリオキシアルキレンゲルを利用する薬剤送達系について記載しており、この系を用いると、ゲルのゲル転移温度及び／又は剛性を、ｐＨ及び／又はイオン強度の調整によって、並びにポリマーの濃度によって修正することができる。
【００８５】
ｐＨ依存性ヒドロゲルは、特定のｐＨ値において、特定のｐＨ値未満において、又は特定のｐＨ値より上で液体であり、また特定のｐＨ、例えば人体内の細胞外流体の正常なｐＨ範囲である７．３５〜７．４５に曝露された場合にゲルとなる。従ってこれらのヒドロゲルは、埋入された支持構造体まで液体として容易に送達でき、そして身体のｐＨに曝露された場合に自動的に半固体ゲルを形成する。このようなｐＨ依存性ヒドロゲルの例は、ＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、エチレンジアミンのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー、ポリ（ジエチルアミノエチルメタクリレート−ｇ−エチレングリコール）、及びポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）である。これらの共重合体は、その物理的特性に影響を及ぼすために、標準的な技法で操作されることができる。
【００８６】
可視光又は紫外光によって固化するヒドロゲルは、米国特許第５，４１０，０１６号に記載されているように、水溶性領域、生分解性領域、及び少なくとも２つの重合性領域を含むマクロマーから作製することができる。例えばそのヒドロゲルは、コア、そのコアの各端部からの延長部分及び各延長部分の端部キャップを含む、生分解性かつ重合性のマクロマーから開始することができる。コアは親水性ポリマーであり、延長部分は生分解性ポリマーであり、端部キャップは、可視光又は紫外光、例えば長波長紫外光への曝露時に上記マクロマーを架橋することができるオリゴマーである。
【００８７】
このような光固化性ヒドロゲルの例としては、酸化ポリエチレンブロック共重合体、アクリル酸末端基を有するポリエチレングリコールポリ乳酸共重合体、及び両端をアクリル酸でキャップされた１０Ｋポリエチレングリコール−グリコリド共重合体などである。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）ヒドロゲルと同様、これらのヒドロゲルを含む共重合体を標準的な技法で操作して、その分解速度、結晶化度の差及び剛性の程度などの物理的特性を修正することができる。
【００８８】
処置の方法
更に開示されるのは、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷又は神経変性疾患を有する対象の治療方法であり、これは、開示の神経ＥＶの集団を含有する有効量の組成物をその対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、ハンチントン病、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【００８９】
用語「脊髄損傷」は、脊髄の正常な運動、自律又は感覚機能の一時的又は恒久的な変化をもたらす脊髄損傷を記述するために使用される。この損傷は多くの場合、スポーツによる損傷、滑落事故、又は自動車事故などの物理的な外傷から発生するが、脊椎破裂、フリードライヒ運動失調症及び／又は横断性脊髄炎などの疾患からも発生し得る。機能の喪失をもたらす脊髄に対する損傷は、必ずしも脊髄の完全な切断の結果ではない。脊髄及びその神経根が損傷した部位に応じて、症状及び損傷の程度は、疼痛から失禁、そして麻痺まで、大きく変わり得る。脊髄損傷は、不完全なものから、機能の完全な喪失をもたらす完全な損傷まで、様々なレベルで記述される。脊髄損傷は、対麻痺又は四肢麻痺をもたらし得る。
【００９０】
脊髄損傷の従来の治療は、脊椎を安定させ、脊髄の損傷に関わる炎症を制御して更なる損傷を防止することから開始される。他の介入は、損傷の部位及び程度に応じて大きく変わり得る。多くの場合、従来の療法を用いると、脊髄損傷は、特にその損傷が日常生活の活動を妨げる場合に、相当な長期間の物理療法及びリハビリを必要とする。
【００９１】
脊髄損傷は、その原因、即ち機械的な力、毒性、及び血流の欠乏による虚血に基づいて、３つの種類に分類されることができる。脊髄損傷はまた、一次損傷及び二次損傷に分けられることができる。一次損傷は、最初の損傷（物理的外傷、毒素への曝露、又は虚血）において直ちに発生する細胞死によって引き起こされ、二次損傷は、最初の損傷によって引き起こされたその結果の連鎖によって生じ、更なる組織損傷を引き起こす。これらの二次損傷の経路としては、炎症、膨潤、神経伝達物質の欠乏／不均衡、虚血及び細胞自殺の結果などである。本発明を用いて、特に完全及び不完全な損傷、虚血、Ｘ線写真異常のない脊髄損傷、中枢性脊髄症候群、前脊髄症候群、ブラウン・セカール症候群、後脊髄症候群、脊髄癆、並びに脊髄円錐を含む、あらゆる形態の脊髄損傷を治療することができる。
【００９２】
用語「脳卒中」は、脳血管発作（ＣＶＡ）、脳血管障害（ＣＶＩ）又は脳梗塞を記述するために使用され、脳への血流の悪化が細胞死を引き起こした際に発生する。脳卒中には主要な２つの種類、即ち血流の欠乏による虚血性のものと、出血による出血性のものがある。脳卒中のこれらの種類の両方が、脳の一部が適切に機能しなくなることをもたらす。脳卒中の徴候及び症状としては特に、身体の片側における動き又は感覚が不能となること、理解若しくは話すことでの問題、回転感覚、又は片側視野の喪失などである。徴候及び症状は、脳卒中が発生した直後に現れることが多い。症状が１時間又は２時間未満しか持続しない場合、これは一過性虚血性発作として知られている。出血性脳卒中はまた、重篤な頭痛に関連する場合がある。脳卒中の症状は恒久的となり得る。脳卒中の長期の合併症としては、肺炎、又は膀胱の制御の喪失などである。脳卒中の主な危険因子は高血圧である。他の危険因子としては特に、喫煙、肥満、高血中コレステロール、糖尿病、過去の一過性虚血発作（ＴＩＡ）及び心房細動などである。虚血性脳卒中は、一般的には血管の閉塞によって引き起こされる。出血性脳卒中は、直接脳内へ、又は脳周囲の空間へ出血することによって引き起こされる。出血は、脳動脈瘤によって発生する場合がある。虚血性及び出血性脳卒中はいずれも、本発明によって治療される。
【００９３】
用語「外傷性脳損傷」（ＴＢＩ）は、頭蓋内での脳の動きによって引き起こされる脳への損傷、又は異物によって引き起こされる脳への損傷を記述するために使用される。ＴＢＩの原因としては、落下、自動車事故、又は物体による又は物体との衝突などである。ＴＢＩはまた、侵入物、即ち頭蓋に入った異物によって生じた脳への損傷によって引き起こされる場合もある。原因としては、射創又は鋭利な物体で打つことなどである。ＴＢＩは、脳震盪、無意識（昏睡）又は記憶喪失を引き起こす場合がある。ＴＢＩは、認知機能（例えば、注意及び記憶）、運動機能（例えば、極端な衰弱、協調及びバランスの障害）、感覚（例えば聴覚、視覚、知覚及び触覚の障害）、並びに感情（例えば鬱、不安、攻撃性、衝動制御、人格変化）のうちの１つ以上を損なう場合がある。
【００９４】
用語「神経変性疾患」は、中枢神経系への損傷によって引き起こされる疾患を記述するために明細書を通して使用され、その損傷は、本発明による神経細胞を患者の脳及び／又は脊髄の損傷領域に移植することによって低減及び／又は緩和されることができる。本発明による神経細胞及び方法を用いて治療することができる例示の神経変性疾患は、例えばパーキンソン病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）；アルツハイマー病；リソソーム蓄積症（例えばFolkerth, J. Neuropath. Exp. Neuro., 58, 9, Sep., 1999年に記載されているような「白質病」又はグリア／脱髄疾患）；テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損）；他の遺伝子疾患；多発性硬化症；虚血、事故、外界からの損傷などによって引き起こされた脳損傷又は外傷；脊髄損傷；運動失調；及びアルコール中毒などである。更に本発明を用いて、患者での脳卒中又は心臓発作の中枢神経系に対する影響、別の状況では患者の脳のある部位に対する血流の欠乏若しくは虚血によって発生する又は脳及び／若しくは脊髄に対する物理的損傷によって発生する中枢神経系に対する影響を低減及び／又は排除することができる。用語「神経変性疾患」はまた、例えば自閉症などの神経発達障害や、特に統合失調症などの関連する神経学的疾患も含む。
【００９５】
本明細書において開示される、医薬組成物を含めた組成物は、局所治療又は全身治療のいずれが望ましいかに応じて、更に治療される領域に応じて、多くの方法で投与されることができる。
【００９６】
対象の治療方法は、有効量の本明細書に記載のＥＶと、任意で少なくとも１つの追加の生物活性剤（例えば神経変性疾患、脳卒中及び／又は脊髄損傷の治療に有用な作用剤）とを含む医薬組成物の投与を含む。例えば、約０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは１００ｍｇ／患者の体重（ｋｇ）／日、又はいくつかの実施形態では１００超、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ｍｇ／ｋｇの治療に有効な投薬量の開示のＥＶが、これらの組成物を服用する患者に投与されるようにして、組成物が製剤されることができる。
【００９７】
対象に投与されるＥＶの用量は、１０μｇ未満、２５μｇ未満、５０μｇ未満、７５μｇ未満、０．１０ｍｇ未満、０．２５ｍｇ未満、０．５ｍｇ未満、１ｍｇ未満、２．５ｍｇ未満、５ｍｇ未満、１０ｍｇ未満、１５ｍｇ未満、２０ｍｇ未満、５０ｍｇ未満、７５ｍｇ未満、１００ｍｇ未満、５００ｍｇ未満、７５０ｍｇ未満、１ｇ未満、又は１ｇ超とすることができる。投与は、多数の投与経路とされ得るが、静脈内、髄腔内、鼻腔内及び／又は脳脊髄内が、投与の経路として使用されることが多い。
【００９８】
いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、脳卒中又は外傷後２４時間以内に投与される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＥＶは、脳卒中又は外傷の少なくとも１、２、３又は４週間後に投与される。いくつかの実施形態では、開示のＥＶは、１、２、３又は４日以上離れた複数回で投与される。神経変性疾患の場合などのいくつかの場合では、ＥＶは疾患の間に亘って連続して（例えば１、２、３又は４週間毎に１回）投与される。
【００９９】
ＥＶに、神経変性プロセスに関与するペプチド又はペプチド翻訳生成物を標的とする、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は抗体を装填してもよい。
【０１００】
特定の実施形態では、開示のＥＶは、追加の生物活性剤が装填されるか、又は追加の生物活性剤、特に神経変性疾患の治療に有用な作用剤と同時投与される。
【０１０１】
用語「同時投与される」、「同時投与」又は「併用療法」は、有効量の少なくとも２つの活性化合物／組成物を用いて、神経傷害及び／又は神経変性疾患を治療する療法を記述するために使用される。同時投与の用語は、好ましくはＥＶと少なくとも１つの追加の活性化合物とを対象に同時に投与することを含むが、それらの化合物／組成物は、有効量の個々の化合物／組成物が患者内に同時に存在しさえすれば、患者に同時に投与する必要はない。よって、同時投与の用語は、ＥＶ及び１つ以上の生物活性剤をおおよそ同時に（同時期に）投与すること、又は本明細書中の他の箇所に記載されているような他の化合物／組成物と約１〜数分から約８時間、約３０分〜約６時間、約１時間〜約４時間、若しくはそれ以上（１日若しくは更に長い時間に至るまで）離れて投与することを含む。
【０１０２】
ＥＶに装填され得る又はＥＶと共に同時投与され得る薬剤としては、例えばアルツハイマー病のためのアリセプト、ナメンダ、ドネペジル、エクセロン、ラザダイン、グランタミン、リバスチグミン、メマンチン、エルゴロイド、ナムザリック及びこれらの混合物；パーキンソン病のためのビペリデン、アポモルヒネ、トリヘキシフェニジル、カルビドパ／レボドパ、ラサグリン、ベラドンナ、レボドパ、ベンズトロピン、エンタカポン、セレギリン、リバスチグミン、プラミペキソール、ロチゴチン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、カルビドパ／エンタカポン／レボドパ、アマンタジン、トルカポン、トリヘキシフェニジル及びこれらの混合物；ハンチントン病のためのテトラベナジン、ハロペリドール、クロルプロマジン、オランザピン、フルオキセチン、セルトラリン、ノルトリプチリン、ベンゾジアゼピン、パロキセチン、ベンラファキシン、βブロッカー、リチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン、ボツリヌス毒素及びこれらの混合物；運動神経疾患のための抗コリン薬、抗けいれん剤、抗うつ剤、ベンゾジアゼピン、うっ血除去剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、覚醒剤及びこれらの混合物；脊髄小脳失調症の治療のための選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、選択的ノルエピネフリン−セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、アセタゾラミド、バクロフェン、クロナゼパム、フルナリジン、ガバペンチン、メクリジン、メマンチン、オンダンセトロン、スコポラミン、モダフィニル、アルモダフィニル、アマンタジン、アトモキセチン、ブプロピオン、カルニチン、クレアチン、モダフィニル、アルモダフィニル、ピリドスチグミン、セレギリン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、ブスピロン、リルゾール、バレニクリン、メマンチン、バクロフェン、チザニジン、シンバルタ、リリカ、アセタゾラミド、カルバマゼピン、クロナゼパム、イソニアジド、ドロキシドパ、エフェドリン、フルドロコルチゾン、ミドドリン、レボドパ、プラミペキソール、フルオキセチン、ｎ−アセチルシステイン、バクロフェン、ダントロレンナトリウム、ジアゼパム、ロピニロール、チザニジン、トリヘキシフェニジル、クロザピン、フルナリジン、レベチラセタム、プリミドン、トピラマート、バルプロ酸、フェニトイン、４−アミノピリジン及びこれらの混合物；並びに脊髄性筋萎縮症の治療のためのリルゾールなどである。脳卒中の治療のための薬剤としては特に、アスピリンなどのサリチル酸、血栓溶解剤（アルテプラーゼ）、及び血小板凝集阻害剤（クロピドグレル）などである。
【０１０３】
より一般的には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）及び他の抗炎症剤を、本明細書に記載の神経変性疾患の治療に使用してもよい。
【０１０４】
本明細書に記載のＥＶの活性は、当技術分野で公知の方法で評価されることができる。治療での使用に必要なＥＶの量は、ＥＶの調製元である特定の細胞のみならず、投与経路、治療される状態の性質、並びに患者の年齢及び状態によって変わる可能性があり、最終的には、対応する内科医又は臨床医の裁量によるものとなる。しかしながら一般には、用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日とすることができる。
【０１０５】
疾患関連タンパク質及びその生物学的活性断片の活性及び発現を調節することによって行われる、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷及び／又は神経変性疾患を治療するための本発明の方法において有用なＥＶの確認は、多様なスクリーニング技法のうちのいずれかでＥＶ活性をスクリーニングすることによって行われることができる。このスクリーニングは、ＥＶ全体又はその内容物に関して行われることができる。そのようなスクリーニング試験で使用される断片は、溶液中で遊離していても、固体支持体に付着していても、細胞表面上にあっても、又は細胞内にあってもよい。生物活性の阻害又は低減、又は疾患関連タンパク質とＥＶ及び／若しくはＥＶの１つ以上の成分との間の結合複合体形成の阻害又は低減は、当技術分野で利用可能な方法で測定されることができる。
【０１０６】
本発明の多数の実施形態が説明されている。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得ることが理解されるであろう。従って他の実施形態は、後述の請求項の範囲内である。
【実施例】
【０１０７】
ＥＶが神経幹細胞に対してパラクリンによる効果を与え、最適なインビトロ神経培養条件及び神経幹細胞治療の治療結果の両方においてある役割を果たすかどうかを明らかにするために、研究を行った。研究の目的は、神経系譜のヒト幹細胞、具体的には神経前駆細胞及び／又は分化済みの有糸分裂後の神経細胞から、ＥＶを単離することができるかどうかを明らかにすることであった。ＥＶは、ヒト多能性幹細胞株又は分化済み神経細胞（β−ＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）＋、ＭＡＰ２＋、Ｏｃｔ４−；ｈＮ２（商標）ＡｒｕｎＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）由来の神経前駆細胞（ＳＯＸ１＋及び２＋、ＯＣＴ４−；ｈＮＰｌ（商標）ＡｒｕｎＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）から精製された。
【０１０８】
実施例１
ヒト多能性幹細胞［Chambersほか Methods Μοl Biol, 2016年 1307; p. 329−43を参照されたい］株を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどの販売元から市販されているＭＴｅＳＲ又はＥ８などの血清が不在の培地中でフィーダーなしの条件を用いて、又はＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）培地（ＤＭＥＭ＝Ｆ１２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２０％のＫＳＲ）（全てＧｉｂｃｏ、カナダ、カールスバッド）製）及び４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）から成る培地中で培養した。細胞は、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で又はフィーダーを用いずに培養し、手動で又は酵素を用いて分離し、２〜５日毎に新たなフィーダー層へと継代させた。調整済み培地でのｈＰＳＣのフィーダーなしでの培養については、ＭＥＦ上で成長させた細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）で１回洗浄した後、ＭＥＦ層が持ち上がって皿から離れるまで、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いてインキュベートした。浮き上がったＭＥＦ層を揺り動かして付着した幹細胞を取り外した後に廃棄し、その幹細胞を回収し、遠心分離して、ＭＥＦ調整済み培地（ＣＭ）に再懸濁した。ＣＭは、２０％ＫＳＲ培地をＭＥＦ上に２４時間置いた後、回収した培地に追加の４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加することによって調製した。細胞を、ラミニン基質（１ｍｇ／ｃｍ2；Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた組織培養皿上に播種し、およそ９０％コンフルエントまで成長させた。細胞を少なくとも３回継代させ、ＭＥＦ汚染を最小化した［Boydほか, Tissue Eng Part A, 2009年 15(8): p. 1897-907, Mumawほか, Microsc Microanal, 2010年 16(1): p. 80-90及びYoungほか, Neuroscience, 2011年 192: p. 793-805を参照されたい］。培養方法にかかわらず、全ての培地を回収し、培地からＥＶを回収して患者の治療に使用した。
【０１０９】
新たなフィーダー細胞上へ手動で継代させた後、ｈＥＳＣをＥＳ培地中で７日間増殖させた（ステージ１）。続いて、ＤＮ２、ＭＥＤＩＩ又はＥＳ培地を用いて更に７日間、細胞分化を誘発した（ステージ２）。ＤＮ２培地は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地である。この研究のためのＭＥＤＩＩ培地は、（そうでないことが注記されていない限りは）５０％が調整済み培地で補われたＤＮ２培地である。ここで適用される分化ステップを理解してこれに従うために、表現型マーカー発現を様々な時間間隔で検査した。ステージ１、２及び３において、集団を採取し、マーカーＭｕｓａｓｈｉ−１、ネスチン及びＯｃｔ−４を観察した。免疫細胞化学的解析も、付着した細胞集団に対して実施した。両方のステージの細胞をネスチン及びＯｃｔ−４で二重染色し、形態学に関連する免疫細胞化学的検査のために、蛍光顕微鏡下で観察した。次に、表現型の差異を示した群を、フローサイトメトリーを用いた、上記と同一のマーカーに関する定量分析に供した。全ての実験は、そうでないことが注記されていない限り、３回繰り返した。新たなフィーダー細胞上へ手動で継代させた後、ｈＥＳＣをＥＳ培地中で７日間増殖させた（ステージ１）。続いて、ＤＮ２、ＭＥＤＩＩ又はＥＳ培地を用いて更に７日間、細胞分化を誘発した（ステージ２）。ＤＮ２培地は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地である。この研究のためのＭＥＤＩＩ培地は、（そうでないことが注記されていない限りは）５０％が調整済み培地で補われたＤＮ２培地である（上述の通り）。ステージ１、２及び３において、集団を採取し、マーカーＭｕｓａｓｈｉ−１、ネスチン及びＯｃｔ−４を観察した。免疫細胞化学的解析も、付着した細胞集団に対して実施した。両方のステージの細胞をネスチン及びＯｃｔ−４で二重染色し、形態学に関連する免疫細胞化学的検査のために、蛍光顕微鏡下で観察した。次に、表現型の差異を示した群を、フローサイトメトリーを用いた、上記と同一のマーカーに関する定量分析に供した。全ての実験は、そうでないことが注記されていない限り、３回繰り返した。
【０１１０】
新たなフィーダー細胞上へ手動で継代させた後、ｈＥＳＣをＥＳ培地中で７日間増殖させた（ステージ１）。続いて、ＤＮ２、ＭＥＤＩＩ又はＥＳ培地を用いて更に７日間、細胞分化を誘発した（ステージ２）。ＤＮ２培地は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地である。この研究のためのＭＥＤＩＩ培地は、（そうでないことが注記されていない限りは）５０％が調整済み培地で補われたＤＮ２培地である（上述の通り）。ステージ１、２及び３において、集団を採取し、マーカーＭｕｓａｓｈｉ−１、ネスチン及びＯｃｔ−４を観察した。免疫細胞化学的解析も、付着した細胞集団に対して実施した。両方のステージの細胞をネスチン及びＯｃｔ−４で二重染色し、形態学に関連する免疫細胞化学的検査のために、蛍光顕微鏡下で観察した。次に、表現型の差異を示した群を、フローサイトメトリーを用いた、上記と同一のマーカーに関する定量分析に供した。全ての実験は、そうでないことが注記されていない限り、３回繰り返した。
【０１１１】
ｈＰＳＣをｈＰＳＣ培地（上述のもののうちのいずれか）中で、単層又は胚様体としておよそ５〜１０日間増殖させた（ステージ１）。続いて、一般的にＮ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び通常４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地である培地を用いて、細胞分化を誘発した。ネスチン及びＯＣｔ−４を観察したが、神経ロゼットが形成される。神経ロゼットを単離し（手動で又は酵素を用いて）、付着したロゼット集団に対して免疫細胞化学的解析を実施した。両方のステージの細胞をネスチン＋及びＯｃｔ−４−で二重染色し、形態学に関連する免疫細胞化学的検査のために、蛍光顕微鏡下で観察した［Shinほか, Stem Cells, 2006年 24(1): P. 125-38］。汚染された細胞の大半から単離した場合、ロゼットは、ヒト神経前駆細胞であるとみなされる。簡潔に述べると、ｈＮＰ細胞をポリオルニチン（２０ｍｇ／ｍＬ）／ラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．）（５ｍｇ／ｍＬ）コーティング済みプレート、又はマトリゲルなどの他のＥＣＭ上で成長させ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２０ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦを含む培地中に保持して膨張させた。ｈＮＰ細胞をおよそ４８時間毎に継代させ、手動での分離に続いて１：２に分けた［Mumawほか Id, Youngほか, Id, and Dharaほか Methods Mol Biol, 2011年 767; p. 343-54を参照されたい］。
【０１１２】
あるいは、神経の誘発を、アクチビン／ノーダル経路の阻害剤を用いたＳＭＡＤシグナル伝達、及び／又はＢＭＰシグナル伝達の阻害剤によって刺激してもよい（阻害剤の例は、ノギン、ＳＢ４３１５４２［Chambersほか Nat Biotechnol 2009年 27(3): p. 275-80］、化合物Ｃ[Zhouほか, Stem Cells, 2010年 28(10); p. 1741-508］又は他の方策の単独若しくは組み合わせであってもよい）。細胞をマトリゲル又は他の細胞外マトリクス上で、ＡＢ２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ又は上述の他の培地中で、ソニックヘッジホッグの存在下又は非存在下で培養してもよい［Chambersほか, Id., and Zhouほか, Id.］。
【０１１３】
ｈＮＰ細胞を、ｂＦＧＦ及びＬＩＦを含まない上述の維持培地下で、ポリオルニチン及びラミニンコーティング済みプレート、又はマトリゲルなどのＥＣＭ上で分化させた。あるいはｈＮＰ細胞にＬＩＦ又はＥＧＦを添加し、これらの２つの条件下で１〜７週間分化させた。［Mumawyほか, Id., and Dodiaほか, PLoS One, 2011年 6(8): p. e232669］。
【０１１４】
ポリオルニチン及びラミニンコーティング済みプレート上でｈＮＰ細胞をニューロンに分化させる（ｂＦＧＦ又はｂＦＧＦ及びＬＩＦ又はＥＧＦを含まない維持培地中での２つの条件下で）などの１〜４週間の神経分化の後、神経細胞をｈＮＳＣ維持培地から１％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した塩基性培地（ＤＭＥＭ  ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン）に切り替えることにより、星状細胞分化を誘発した。Mumawほか, Id.及びYoungほか, Id.を参照されたい。最後に、維持培地を１０％のＦＣＳを含有する塩基性培地に交換することにより、多重線形分化を達成した。４５〜５０日後、培養物は、グリアマーカーＳ１００β及びビメンチンに関してほぼ１００％陽性となった［Palmほか, Sci Rep, 2015年, 5: p. 1632110］。
【０１１５】
あるいはｈＮＰ細胞を、文献（Shinほか, Id.）に記載されているように、増殖培地（ＡＢ２（商標）、ＡＮＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）、１×Ｂ２７、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、Ｐ／Ｓ、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）など）中の付着性単層培養物として伝播させ、ＦＧＦを除去することによって分化させた。ｈＮＰ細胞の星状細胞分化のために、神経分化培地に、ＢＭＰ２などの組み換えタンパク質、及びアザシチジン、トリコスタチンＡ又は同様の分子などの化学物質の組み合わせを１〜５日間添加し、その間に培地を完全に変更し、その後分化培地に上記分子を別個に又は組み合わせて添加した。細胞を、処置の５、１５若しくは３０日目の分析前に、又は分化の６日目若しくは１０日目に低温保存のために、採取した。低温保存に関して、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で分離させ、１０％のＤＭＳＯを含有する分化培地中で冷凍した［Majumderほか, Stem Cell Res, 2013年 11(1): p. 574-86］。
【０１１６】
上述のようにフィーダーを用いずに培養したｈＰＳＣが９０％コンフルエントに達すると、１００ｍｍの皿をＰＢＳ＋＋（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む）で洗浄して、新たな内皮成長培地２毛細血管（ＥＧＭ２−ＭＶ）（Ｌｏｎｚａ；５％  ＦＢＳ、独自の内皮基本培地２（ＥＢＭ２）、並びにある濃度のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ及びＲ３−ＩＧＦ−１２５）で置換した。２０〜３０日の期間に亘って、培地を２〜３日毎に交換した。ｈＥＳＣから上皮シートへの遷移の完了後、細胞をＴ７５フラスコにトリプシン継代させ、コンフルエントまで成長させた。初期細胞培養物を膨張させるために、細胞を継代させて、フラスコ１ｃｍ2当たりおよそ４×１０4個の細胞という標的密度で播種した。実験のための後続の培養のために、細胞を１０6細胞＝Ｔ７５フラスコ（およそ１．３×１０5個の細胞／ｃｍ2）で継代培養し、５〜７日に亘ってコンフルエントまで成長させた［Boydほか, Id］。
【０１１７】
実施例２
方法
細胞培地を、培地変更の２４時間後に、コンフルエントした培養物から回収し、−２０℃で冷凍した。培地を４℃で一晩解凍し、０．２２μｍのＳｔｅｒｉｆｌｉｐユニットを通してろ過した後、ＥＶ精製した。
【０１１８】
超遠心分離による細胞外小胞の精製
細胞培地からの細胞外小胞の単離は、Thery, C.ほか, Isolation and Characterization of EVs from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids, in Current Protocols in Cell Biology, 2001年, John Wiley & Sons, Inc.によって公表されているプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、ろ過済みの培地を３００×ｇで１０分間連続遠心分離し、上清を、２０００×ｇで１０分間の遠心分離のために、新しいチューブに移した。続いて、回収した上清を１００００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清を新しいチューブに回収した。ＥＶを標識するために、最終濃度１０μＭの精製済み上清にＤｉＩを添加し、室温で３０分間インキュベートした。上清を１１．５ｍｌのＳｏｒｖａｌｌ  Ｕｌｔｒａｃｒｉｍｐチューブ内に分散させ、密封した後、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｔ８８０固定角度ローターに移し、４℃において１０００００×ｇで７０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレット化した材料をＰＢＳ中で再懸濁して、別のＵｌｔｒａｃｒｉｍｐチューブに移し、再び４℃において１０００００×ｇで７０分間遠心分離した。ＰＢＳを除去し、各チューブからのペレット化した材料を、１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した。同一の細胞タイプからの全ての精製済みＥＶをプールし、粉砕して、ＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素非含有チューブへとアリコートして（２０〜５０μｌのアリコート）、−２０℃で保管した。
【０１１９】
限外ろ過による細胞外小胞の精製
細胞外小胞の限外ろ過は、心筋細胞由来の細胞外小胞の精製のために開発された手順に従って実施した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００ｋＤａ分子量カットオフフィルタを１０ｍｌのＰＢＳで湿潤させ、スインギングバケットローター内で４０００×ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＳを廃棄し、細胞培地をフィルタに、およそ１５ｍｌ／チューブで添加し、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。幹細胞由来の細胞外小胞をろ過する場合は、更に１５ｍｌの培地をフィルタに添加した。それは、最初の実行によってフィルタ内に保持される培地は比較的少なく、従ってＨ９由来ＮＰ、星状細胞及びＭＳＣ株に関しては合計およそ３０ｍｌの培地がろ過される一方で、ＳＨ  ＳＹ５Ｙ細胞に関しては１５ｍｌの培地しかろ過されないためである。フィルタ内の培地を４０００×ｇで５分の増分で遠心分離して、およそ１ｍｌの残余分を得た。次にこれを、ＤｉＩ標識（１０μＭで３０分間）のために又は未標識精製のために１．５ｍｌチューブに移し、ＰＢＳを用いて１５ｍｌに希釈し、２回洗浄した後、１〜１．５ｍｌの最終体積が得られるまで５分の遠心分離の増分を繰り返した。精製済みの細胞外小胞調製物を同一の細胞タイプからプールし、およそ１００μｌのアリコート（ＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素非含有チューブ）へと分散させて、−２０℃で保管した。
【０１２０】
小胞のＤｉＩ標識
標識済み小胞を、限外ろ過によって生成した。限外ろ過の完了後、フィルタの残余分を遠心分離チューブに移し、３０分間、１０μＭのＤｉＩを上清に添加した。この時間中にＰＢＳをろ過ユニットに添加し、フィルタが乾燥するのを防止した。標識剤を用いたインキュベーション後、上清をろ過デバイスに戻し、ＰＢＳ（およそ４５ｍｌ）で３回洗浄して、遊離している標識を除去した。最後の洗浄の後、残余分をおよそ１ｍｌに濃縮し、これをアリコートして−２０℃で保管した。
【０１２１】
電子顕微鏡検査
小胞調製物を、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）と１：１で混合し（最終的にＰＦＡは２％となった）、１５分間インキュベートした。固定された小胞懸濁液の５μｌの液滴をＦｏｒｍｖａｒコーティング済みグリッドに２０分間移し、その後ＰＢＳの液滴中に移動させることによって洗浄した。グリッドを１％のグルタルアルデヒドの液滴上へと５分間移動させた後、数滴の水上を移動させて、残留したグルタルアルデヒドを除去した後、ウラニルオキサレートへと移動させた。８０ｋＶの電子顕微鏡でグリッドを撮像した。
【０１２２】
結果
最初の報告は、神経前駆細胞が分泌するＥＶが他の細胞タイプよりも少ないことを示しているが細胞の超微細構造分析により、エンドサイト由来の顕著な小胞が明らかになり（図２Ａ〜２Ｃ）、その多くは、細胞の外側境界膜に近接しているか、又は外側境界膜と結びついている（図２Ｄ、２Ｅ）。多小胞体（ＭＶＢ）内の積荷タンパク質は、サイズが様々であり（図２Ｂ、２Ｃ）、小胞内へと出芽していることが視認される場合もある（矢印）。比較的小さな小胞は、細胞の周縁へと移動するにつれて、より大きなＭＶＢへと合体するように見える（図２Ｆ、２Ｇ）。神経前駆細胞の培地から小胞を精製して可視化できた（図２Ｈ）。これらのデータは、神経前駆細胞が細胞外小胞から細胞培地内へと放出されこれらの小胞を、公開されているＥＶ精製プロトコルを用いて精製することができることを示唆している。全てのスケールバーは５００ｎｍである。
【０１２３】
神経前駆細胞が、精製及び電子顕微鏡での可視化が可能であるＥＶを産生する能力を有することを理解した後、複数の細胞タイプ由来の精製済み小胞を特性決定するプロセスを、クマーシー染色によるタンパク質プロファイリング（図３Ａ）、及びタンパク質総量のＢＣＡ分析（図３Ｂ）によって開始した。全て同一のＥＳ細胞株に由来する神経前駆細胞、分化済み神経細胞及び星状細胞、並びに陽性対照として使用されたヒト神経芽細胞腫細胞であるＳＨ  ＳＹ５Ｙ細胞からの、タンパク質プロファイルを比較した。初期実験は、タンパク質、プロファイルが重複しているものの、神経前駆細胞及び分化済み神経細胞中に、これらの細胞が同一の遺伝子的起源のものである場合であっても、異なるタンパク質が存在することを示している。同様に、同一の遺伝子的起源による神経前駆細胞及び星状細胞からの小胞のサイズプロファイルの比較は、これら２つの細胞タイプからの小胞のサイズが重複している（５５ｎｍの小胞を高いパーセンテージで含む）ものの、これら２つの細胞タイプ間で異なる、別個の亜集団が存在し、星状細胞は２５ｎｍ集団及びわずかに大きい１３５ｎｍ集団を含む特有の小胞サイズを示す（図３Ｃ、３Ｄ）ことを示している。これらのデータを合わせると、積荷タンパク質がＭＶＢを特異的に標的としていること、及びこれらの積荷タンパク質が分化プロセスにおいて変化して、ＥＶが発現プロセス全体を通して細胞間通信においてある役割を果たすのを支援することを示している。
【０１２４】
ＥＶの標識、及び別の細胞によるＥＶの取り込みの可視化が可能であったかどうかを明らかにするために、３０秒〜３０分の範囲の複数の時点において、分化済み神経細胞（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を含まない分化培地中で６〜８週間）を星状細胞由来小胞で処置し、その後細胞を固定して、β−ＩＩＩチューブリンに関して染色した。最も早い時点においては、細胞中には小胞がほとんど認められなかった（図４Ａ〜４Ｃ）。培養物中において５分までに顕著な赤色蛍光を有する神経細胞を確認でき、これはこれらの細胞中での小胞の取り込みを示している（図４Ｄ〜４Ｆ）。
【０１２５】
これらの小胞がレシピエント細胞中である効果を誘発し得るかどうかを明らかにするために、分化済み神経細胞を、全て同一のＥＳ細胞株、即ちＳＨ  ＳＹ５Ｙ細胞由来である神経前駆細胞、星状細胞又はＭＳＣに由来する、連続希釈した複数の濃度の小胞で処置した。続いてこれらの細胞を、１０日間の栄養欠乏状態に供し、神経突起伸長に関して分析した。予想されたように、ＰＢＳのみを受け入れたウェルでは、単層が破壊され、細胞はほとんど残らなかった（図５Ｄ）。しかしながら、神経前駆細胞又は星状細胞由来のＥＶを最高濃度で受け取った細胞は、この栄養欠乏状態を生き延びることができ、無傷の神経突起を有する細胞の単層のほとんどが無傷のままであった（図５Ａ、Ｂ）。ＭＳＣ由来ＥＶで処置されたウェルは、未処置のウェルよりも多くの細胞を内包していたが、単層は無傷ではなく、神経突起のほとんどが喪失した（図５Ｃ）。これらのデータは、小胞による処置がレシピエント細胞を栄養欠乏状態から保護することを示しており、また重要なことに、細胞が、異なる細胞タイプから発生した小胞に対して、これらの小胞が同質遺伝子の供給源又は自己供給源からのものである場合でさえ、異なる応答を示すことを示している。
【０１２６】
これらのデータを合わせると、これらのデータは、親となる供給源が得られる小胞に影響を及ぼすというアイデアを支持する。これは、再生医療のために利用することができる可能性がある治療用供給源として細胞外小胞を考えるにあたって意味があり、また、ＣＮＳ傷害及び／又は疾患の治療に関する神経供給源由来の小胞の必要性を強調する。重要なことに、これらのデータはまた、ニューロン由来の小胞だけでなくグリア小胞も、インビトロで効果をもたらすことを示している。
【０１２７】
実施例３
生体分布方法：単一光子放射によるげっ歯類での生体分布。ＰＢＳ中の１．５〜２ｍＣｉのインジウム１１１−オキシンを、ＥＶ（約２．７×１０11小胞／ｋｇ）を含有する２００μｌの用量に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。遊離したインジウムを、Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤＡ限外ろ過デバイスを通したＰＢＳでの洗浄を３回繰り返すことによって除去した。回収したＥＶを、１用量当たりの放射能が２００μＣｉとなるまで希釈し、脳卒中の１時間又は２４時間後のマウスの尾部の静脈に静脈内注入した。対照動物は、遊離インジウム１１１−オキシンの注入を受けた。全身及び頭部の単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像を、Ｍｅｄｉｓｏ製ｎａｎｏＳｃａｎ  ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴシステムで、注入の１時間及び２４時間後に取得し、最大強度に従って投影画像を再構成して、脳内及び全身の放射能を明らかにした。
【０１２８】
子ブタでの生体分布：ＥＶを、上述のようなＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニットを用いた限外ろ過によって濃縮した後、暗所で３０分間のＤｉＲ標識（５μＭ）のために、５０ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブに移動させた。標識済みＥＶを、１０００００×ｇで４時間の超遠心分離によって回収した。ペレット化されたＥＶをＰＢＳで洗浄し、再び超遠心分離によって回収した。ＥＶをＰＢＳ中で再懸濁し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００ナノ粒子追跡分析に基づいて、個々の子ブタに対して（２００μｌのＰＢＳ中で）２．７×１０10個の小胞／ｋｇ体重となるまで希釈した。静脈内注入（尾部静脈）、鼻腔内送達、クモ膜下槽への脳脊髄液ＥＶ注入、又は脳実質への直接注入のために、イソフルランを用いて子ブタに麻酔を施した。脳実質内注入のために、ＥＶを、５μｌ／分の流量で送達した。ＥＶ送達完了の３０分後、イソフルラン及びそれに続くＣＯ2窒息によって、動物を安楽死させた。脳、心臓、肝臓、腎臓、肺及び膵臓を取り出し、ＬｕｍｉｎａＩＶＩＳ（モデル）を用いて撮像してＤｉＲ蛍光を明らかにした。
【０１２９】
マウス：遊離インジウム１１１又はインジウム１１１標識済みＥＶを、脳卒中の直後（図６Ｂ）又は２４時間後（図６Ｃ）に、マウスの尾部静脈に注入した後、ＥＶの生体分布を評価した。ＳＰＥＣＴ走査を注入の１時間後（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、左図）に実施し、注入の２４時間後（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、右図）に再び実施した。最大強度によって再構成した画像は、インジウム１１１標識済みＥＶが、初期時点及び２４時間後のいずれにおいても、体内のろ過を行う臓器である肺、肝臓、膵臓及び腎臓全てに分布している（図６Ｂ、６Ｃ；全身走査）一方で、遊離インジウム１１１は初めほとんどが肺に局在し、その後、２４時間後には肝臓、膵臓及び腎臓へと分布する（図６Ａ；全身走査）（これは腎臓系を通して除去されていることを示していると思われる）ことを示している。特筆すべきことには、標識済みＥＶは、脳卒中の直後又は２４時間後のいずれに注入した場合でも、注入の１時間以内は脳内の脳卒中の近傍に存在し（図６Ｂ、６Ｃ；円）、これは、血流脳関門の破壊による循環からのアクセス、損傷した組織へと向かうアクセス、又はこれら２つの多少の組み合わせによるアクセスを示している。遊離インジウムは、評価したいずれの時点においても、脳卒中が発生した組織に局在していなかった（図６Ａ、円）。
【０１３０】
独自性：これは、ＥＶのＩＶ注入が、脳卒中後の梗塞状態の脳及びその周りに分布することを初めて示したものである。ほとんどのＥＶは、心臓、肝臓、肺及び腎臓などの他の臓器に分布していた。本発明者らは初めて、ＥＶが脳卒中後の免疫応答に対して全身的効果を有することを示唆するデータを得た（他の節のデータ）。よって、周縁部のＥＶの全身的効果は、脳卒中後の分子及び表現型に関する効果に対するプラスの作用を有する。よってＥＶは損傷部位に直接的な効果を有することができ、これは、局所的な免疫細胞を介したもの、又はニューロンに対する直接的な効果及び免疫系に対する全身的効果であってもよい。これは大型動物の脳における生体分布を示す初のデータである。
【０１３１】
子ブタ：脳卒中後の脳へのＥＶ送達を最適化するために、蛍光標識（ＤｉＲ、５μＭ）の生体分布を、傷害のない子ブタにおいて評価した。標識済みＥＶを、脳実質への（図７、上図）、又は頭蓋の底部のクモ膜下槽のＣＳＦへの（図７、下図）直接注入後に、脳内で検出した。これは、大型動物での研究におけるＥＶ生体分布の初の実証である。
【０１３２】
実施例４：
方法
マウスモデル
中年のＣ５７／Ｂ６  オスマウス（保育器を９〜１１ヶ月で出たもの）を、３日間の粘着テープ試験（ＡＴＴ）のために準備し、その後脳卒中手術（３回試行／日）を行った。マウスをその個体識別のためにマーキングし、番号付与し、塞栓性脳卒中の誘発後に、脳卒中後の療法のために異なる複数の治療群へと、ブロックサイズ４（同一のケージから４頭の動物）でランダム化した。脳卒中及び脳血流（ＣＢＦ）の手術を実施する外科医、並びに神経挙動及び神経学的欠損のスコアリングを実施する調査者は、群の個体識別に関して盲検とされた。受け取った４つ全ての治療剤を解凍し、脳卒中の２、１４及び３８時間後に、それぞれ用量１、２及び３を静脈内注入した。相対脳血流（ＣＢＦ）を、脳卒中の６及び４８時間後に測定した。神経学的欠損スコア（ＮＤＳ）を、脳卒中の４８時間後に評価し、体性感覚機能を反映するＡＴＴを、脳卒中の９６時間後、安楽死直前に実施した。死亡率を毎日モニタリングし、４日目の安楽死前まで記録した。
【０１３３】
塞栓性脳卒中
脳卒中手術の２０分前にマウスをブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇＳＣ）で鎮静させ、３．５％イソフルランで麻酔した。手術中、麻酔の手術面を１．５〜２．０％に維持した。体温は、温度調節手術パッドで３７℃に維持した。頸部腹皮の正中切開により、右総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）及び内頸動脈（ＩＣＡ）を評価した。カテーテル挿入中の血液損失を防止するために、一時的な非外傷性クリップをＣＣＡ上に配置した。単一富フィブリン凝固塊（長さ９±０．５ｍｍ）を内包する改造ＰＥ−１０カテーテルをＥＣＡに導入し、ＩＣＡへと前進させた。上記凝固塊に１００μＬのＰＢＳを静かに注入し、塞栓術直後にカテーテルを除去し、動脈の創傷を固定して血液の損失を防止した。脳卒中の誘発は、オンサイトポータブル一点皮質レーザドップラー流量計（ＰｅｒｉＭｅｄ  Ｉｎｃ．）を用いて確認した。最後に上記一時的なクリップを取り外し、ＣＣＡの血流を回復させた。手術部位を＃６滅菌モノフィラメントナイロン縫合糸を用いて閉鎖し、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇＳＣ）を再び注入した。マウスを清潔な回収ケージに移し、動物の温度を維持した。意識のあるマウスを、食物及び水に自由にアクセスすることができる清潔な通常のケージに移した。何らかの脱水の徴候が見られる場合には、必要に応じてＮＡＰＡゲルおよび乳酸リンガー溶液を供給した。その他の場合には、３７℃で予熱した通常の滅菌生理食塩水１ｍｌを１２時間毎にＳＣ注入した。
【０１３４】
レーザスペックルコントラスト撮像
簡潔に述べると、脳卒中の６時間後、体温を３７±０．５℃に維持しながらイソフルランを用いてマウスを麻酔した。頭蓋を削り、正中皮膚切開を行って、中大脳領域を露出させた。照明用の７０ｍＷの内蔵レーザダイオードと、頭蓋骨の上方１０ｃｍに設置された１３８８×１０３８ピクセルのＣＣＤカメラ（速度１９Ｈｚ、露光時間６ミリ秒、１．３×１．３ｃｍ）とを備える、ＰｅｒｉＣａｍ高解像度レーザスペックルコントラスト撮像機（ＬＳＣＩ；ＰＳＩシステム、Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて、灌流画像を取得した。取得した動画及び画像を、ＣＢＦの動的変化に関して分析した。虚血領域の全体的な灌流を、無傷の対側半球からの同一サイズの関心領域と比較して、相対ＣＢＦを推定した。皮膚創傷は、組織接着剤を用いて閉鎖した。脳卒中の４８時間後、皮膚を再び開き、洗浄し、中大脳動脈領域を露出させて、上述のＬＳＣＩ手順を繰り返した。
【０１３５】
神経学的欠損スコア（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  Ｓｃｏｒｅ：ＮＤＳ）
脳卒中の４８時間後の治療群に対して盲検の調査者が、マウスの神経学的欠損を５点スケールで評価し、最高の数が最も悪い転帰を示し、数が小さくなるほど、以下の基準に従って良好な神経学的転帰を示す：０＝欠損なし（正常なマウス）；１＝対側の前肢屈曲欠損；２＝尾部で保持した場合の側方への押圧に対する抵抗及び胴体の方向転換の減少を伴う屈曲欠損；３＝ケージ内での移動中の患部側への極めて有意な回遊、及び患部側で体重を支承する能力の低減を含む、スコア２の全ての欠損；４＝上述の全ての欠損、ただし自発的運動がほぼなくなり、安静状態に留まることを好む；５＝終末期とみなされ、動物のケアの要件に従って安楽死させる。
【０１３６】
体性感覚検査のためのＡＴＴ
粘着テープ試験（ＡＴＴ）を体性感覚運動機能の試験として使用し、安楽死の直前、脳卒中の９６時間後に実施した。簡潔に述べると、未感作マウスを透明アクリルボックス（１５ｃｍ×２５ｃｍ）に入れることにより、手術前３日間に亘って試験の手順に順応させた。２片の粘着テープ（０．３ｃｍ×０．４ｃｍ）を、無毛部分を覆うように各前肢の遠位放射状領域に取り付けた（３パッド、拇指球及び小指球）後、両側の触覚刺激として使用した。１８０秒以内に、テープ除去時間を感覚運動機能として記録した。マウスがテープを１８０秒以内に取り外せなかった場合、上記マウスには「１８０秒」のスコアが与えられた。従って、時間スコアが短いほど良好な転帰を示し、時間が長いほど欠損が大きい転帰を示す。
【０１３７】
安楽死及び２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色
ＴＴＣ染色は、脳卒中後に代謝的に活性（生存又は半影）の組織と不活性（死亡又は中核）の組織との間で異なる。ＴＴＣは無色の溶液であり、生存組織からの主にミトコンドリアデヒドロゲナーゼである様々なデヒドロゲナーゼの酵素的作用によって、赤色の１，３，５−トリフェニルホルマザン（ＴＰＦ）へと還元されるが、中核（死亡組織）は白色のままである。従って、白色領域が大きいほど、傷害及び梗塞の体積が大きいことが示される。脳卒中の９６時間後、かつＡＴＴの実施後、マウスを、イソフルラン（５％）を用いて深く麻酔した。直接心穿刺により血液を採取し、その後血清を単離して得た。低温の０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２５ｍｌを用いて脳を極めて迅速に灌流し、新鮮な状態で採取し、即座に金属製マウス脳マトリクスに移した。梗塞領域を注視しながら、５つのブレードを交互に間隙ができるように配置して、２ｍｍの冠状断（脳１つ当たり４切片）を得た。切片を、予熱（３７℃）されたＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中の５％のＴＴＣを３ｍｌ内包する３５ｍｍ皿に、３７℃で２０〜３０分間入れ、その後低温のＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリンを用いて固定した。撮像のために、固定された切片を皿から取り出し、高解像度Ｃａｎｎｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒ上に順番に配置した。画像をトリミングし、分析のために保存した。補正された梗塞の体積を、グレースケール画像及びＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて推定し、無傷害側の％体積として提示した。
【０１３８】
血液試料のフローサイトメトリー（Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ、Ｍ２）
安楽死の前に血液を回収し、精製した細胞を蛍光活性化細胞分類に供して、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋／ＦＯＸ３Ｐ＋）集団、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＩＬ１７＋）及びＭ２マクロファージ（ＩＬ１０＋／ＣＤ２０６＋）集団を含む全身に存在する免疫細胞の集団を確認した。
【０１３９】
結果
標準的な方法（「製造」の節を参照されたい）を用いて、同質遺伝子由来の星状細胞前駆細胞（ＡＰＥＸ）、ＭＳＣ（ＭＳＣＥＸ）及び神経前駆細胞（ＮＰＥＸ）からＥＶを精製し、ナノ粒子追跡分析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ−ＮＳ３００）で評価し、個別用量のアリコートとして、塞栓性脳卒中後の尾部静脈注入の直前に室温で解凍するまで、−２０℃で保管した。３つのＥＶタイプ及びＰＢＳを、塞栓性脳卒中後に盲検の調査者によって、およそ２．７×１０11個の小胞／ｋｇ（又はビヒクル）の３用量で、脳卒中の２、１４及び２８時間後に投与した。評価した全てのパラメータにおいて、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸの両方が、ビヒクル処置対照及びＭＳＣＥＸ処置群よりも優れていた。安楽死直後、２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）を用いて、代謝的に活性（生存、赤色）の組織と不活性（死亡、無色）の組織とを区別した。重要なことにはＴＴＣは、ＡＰＥＸ又はＮＰＥＸ（商標）処置後に傷害及び梗塞の体積の低減を示し（図８Ａ）、その一方でＭＳＣＥＸ処置は対照と同等であった。脳卒中後９６時間以内に、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸ処置は、それぞれ２０％及び１７％まで死亡率を低下させた（図８Ｂ）。脳卒中の４８時間後に（欠損なし［０］から終末期欠損［５］まで重篤度が増大する５点スケールで）評価した神経学的欠損は、ＡＰＥＸ又はＮＰＥＸを投与されたマウスに関して挙動に関する転帰が有意に良好であることを示した（図８Ｄ）。各前肢の遠位放射状領域に取り付けられる両側触覚刺激として使用した粘着テープを取り外す能力は、同様に感覚運動機能が改善されたことを示した（図８Ｅ）。これらのデータを合わせると、これらのデータは、生存、分子及び機能転帰が、現行のビヒクル対照に比べて、ＮＰＥＸ処置された血栓塞栓性脳卒中げっ歯類モデルにおいて改善されることを示している。
【０１４０】
安楽死直前の９６時間時点における血液細胞のフローサイトメトリー分析は、神経細胞タイプ由来の神経細胞ＥＶ、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸによる処置が、循環中の保護性制御性Ｔ細胞の存在を増加させた（図９Ａ）一方で、ＭＳＣＥＸは対照と区別できなかったことを示している。炎症促進性Ｔヘルパー細胞は、ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸ群では減少した（図９Ｂ）が、抗炎症性Ｍ２マクロファージはこれらの群では増加した（図９Ｃ）。これらのデータを合わせると、これらのデータは、脳卒中後の免疫応答を調節させることにより、神経細胞タイプ由来のＥＶがその効果の一部又は全てを発揮することを示している。
【０１４１】
同一のＥＳ細胞株から、同質遺伝子（遺伝子的に同一）由来の神経前駆細胞、星状細胞前駆細胞及びＭＳＣ細胞を生成するために使用される、生成及び品質制御方法により、これら３つの細胞タイプからのＥＶを、供与体材料の供給源による遺伝子変異の交絡変数を伴わずに比較する独自の機会が得られる。幹細胞由来ＥＶに関する文献の大半は、ＭＳＣ由来ＥＶの使用を中心としている。本明細書において初めて、神経細胞由来ＥＶの（ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸを評価し、ＭＳＣ由来ＥＶと直接比較した。ＭＳＣＥＸに比べて、神経由来ＥＶ（ＡＰＥＸ及びＮＰＥＸ）の分子的な効果（梗塞の体積）の有意な改善、生存率の上昇及び機能的転機の改善が見られる。これらの改善は、比較的死亡しやすい高齢動物において迅速に発生した。よって、いずれかのＥＶ（ＭＳＣ又は神経）療法が、ヒト脳卒中状態（塞栓性脳卒中）及び年齢（中年のマウス）などの合併症因子を複製したマウスモデルにおいて、このような強力かつ迅速な改善を有することは、他のどの群も示していない。これらの早期の完全な硬化は、本明細書で開示される神経ＥＶを用いてしか得ることができないと思われる。
【０１４２】
これらの研究は、作用の機序が部分的に、抑制性ＩＬ１７サイトカインを含むがこれに限定されない炎症性Ｍ１応答を抑制する免疫調節、及びこれと同時の、ＩＬ１０又は他のサイトカインによると思われるＭ２応答の増強によるものであることを示唆する。
【０１４３】
実施例５
ブタモデル、中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞によって誘発される虚血性傷害
ランドレース種の去勢したブタ（５〜６月齢、１５０〜１７０ポンド）に、完全に発達したブタ脳卒中モデルのみを用いて上述のような傷害を施した［１］。簡潔に述べると、頬骨弓の一部分を切除し、下にある筋肉を背側に持ち上げて頭頂骨を露出させた。硬膜を露出させる窓を骨表面に生成した。近位ＭＣＡを恒久的に閉塞することにより、前頭葉の最も尾側の面、並びに側頭葉、頭頂葉及び後頭葉の大部分に広がる梗塞を得た。
【０１４４】
磁気共鳴分光法
ＧＥ  １６チャネル固定部位Ｔｗｉｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓｉｇｎａ  ＨＤ×３．０  Ｔｅｓｌａ  ＭＲＩシステム上で、ＭＣＡＯ手術の２４時間及び９０日後に磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）を実施した。麻酔下において、マルチチャネルフェーズドアレイ脊柱コイルを用いて神経頭蓋のＭＲＩを実施し、ここで患者は背殿位であった。標準的な多面ＭＲ脳撮像シリーズを取得した。これらは、Ｔ２加重（Ｔ２ｗ）、Ｔ２加重流体減衰反転回復（ｆｌｕｉｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ：ＦＬＡＩＲ）、Ｔ１加重（Ｔ１ｗ）ＦＬＡＩＲ、及び核酸加重撮像（ＤＷＩ）シリーズを含んでいた。ＤＷＩは、ｂ＝０及びｂ＝１０００で取得した。ＤＷＩ、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）マップ及びＴ１ｗ  ＦＬＡＩＲ画像を、大脳梗塞の存在及び大脳半球の体積の変化に関して、Ｏｓｉｒｉｘ（登録商標）ソフトウェアを用いて評価した。具体的には、虚血領域の体積を、ＤＷＩシーケンスから生成されたＡＤＣマップから手動で導出した。虚血領域は、２つのレベルのＡＤＣ数値の減少によって規定され、対側大脳半球のＡＤＣ数値は正常なＡＤＣ値を提供する。正常なものの８０％及び４０％のＡＤＣ値によって規定される虚血領域を、時系列ＡＤＣ画像上に手動でトレースした。各領域をスライス厚さで乗算して、虚血組織の体積を得る。この方法が選択されたのは、この方法が、組織学的に規定された領域と強く相関することが実証されているためである。大脳半球の体積は同様のプロセスで明らかにされ、これにより大脳半球の体積は、（溝及び側脳室空間を除いて）Ｔ１ｗ  ＦＬＡＩＲ画像上で定量化された。Ｔ２ｗ  ＦＬＡＩＲ画像は、ＣＳＦで満たされた領域と高強度の柔組織領域とを区別するための基準として使用した（Platt, S.R.ほか, Experimental & Translational Stroke Medicine, 2014年 6:5）。
【０１４５】
ＥＶ投薬量及び投与
５０〜６０ｍｌのＰＢＳ中に約２．７×１０10個の小胞／ｋｇを含有するＮＰＥＸ  ＥＶを４℃で解凍し、生物学的に安全なキャビネット内に置いたまま、無菌技法を用いて６０ｃｃシリンジに移した。耳静脈カテーテルを介した静脈内注入の直前に、試料を最低２５回転倒させた。ブタは、ＭＣＡＯ後２、１４及び２４時間時点において、３用量（５０〜６０ｍｌ）のＮＰＥＸ又はＰＢＳ（ビヒクル）を投与された。
【０１４６】
動物の評価及び回復
手術後、動物を清浄な回復用檻に移し、抜管まで継続的に監視した。ブタが覚醒し、バイタルサインが正常は範囲内で安定するまで、直腸温、心拍数及び呼吸数（ＴＰＲ）を１５分毎に記録した。その後、バイタルサインが正常状態から逸脱する（例えば発熱）することがない限り、ＴＰＲ測定をまず１〜２時間間隔に低減し、その後、ブタが回復するにつれて、次の４８時間に亘ってより長い間隔に低減した。最初の３６時間の間、４時間を超えて、一般には２時間以上、ブタを観察されていない状態に放置することはなかった。ＴＰＲに加えて、記録された他の観察は、回復の到来から動物が最初に自力で立ち上がるまでの時間、補助付きで飲食するまでの時間、及び補助なしで飲食するまでの時間を含んでいた。発熱（直腸温１０３oＦ以上）、旋回挙動及び発作などの事態も監視して記録した。
【０１４７】
表１で確認できるように、慣例的な評価は、ＮＰＥＸ処置の場合の、脳卒中後の即時回復における生存率及び機能転帰の改善を示す。生存率はＮＰＥＸ処置群において大幅に良好であり、７／７の豚が脳卒中後７２時間以上生存したが、対照群では５／８のみ生存した。動物が補助なしで立ち上がることができるまでの時間は、ＮＰＥＸ処置によって約２時間短縮された。脳卒中後７２時間以内に極めて一般的である発熱は、６／８の動物が少なくとも１回の発熱を有する対照群と比較して、４／７の動物が１回以上の発熱事象を有するＮＰＥＸ処置群において減少した。補助なしで飲食するまでの時間、旋回挙動を示す動物の数、及び発作活動が記録された動物の数は、複数の群の間で同様であった。
【０１４８】
【表１】
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【０１４９】
表２で確認できるように、歩行分析は、対照に比べてＮＰＥＸ処置されたブタにおいて運動機能が改善されることを示す。脳卒中の７日後において、ＮＰＥＸ処置されたブタは、より迅速に、またストライドによって移動する際により良好なケイデンス（律動性）で移動する。右半球の脳卒中により、左側に特異的な欠損が顕著であった。左側の特定の測定値は、より大きなステップ長さ、より短いサイクル時間、より大きなストライド長さ、及びより大きなサイクル時間のスイング百分率を示す。処置された動物は、ストライドによって移動する際により高い圧力を各足にかけており、また、到達範囲によって示される、後肢が前肢を越える運動をより顕著に示し、これは対照に比べてより自然な運動であることを示す。
【０１５０】
【表２】
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【０１５１】
結果
２８±４時間における初期ＭＲＩ分析は、ＮＰＥＸ処置されたブタでは対照に比べて病変の体積が小さいことを示した（図１０Ａ〜１０Ｃ）。同側及び対側半球の体積測定は、ＮＰＥＸ処置の場合に脳卒中後の体積変化がより小さいことを示し（図１０Ｄ）、これは、脳卒中後最初の２４時間における同側半球の膨潤が小さいことを示しており、これは、免疫応答の初期調節を示すげっ歯類でのデータと一致しており、ブタモデルにおける同様の神経保護効果の指標となる。生理学的パラメータ、特に生存率も、脳卒中の誘発の７２時間後において増大した。処置された動物はまた、対照よりも２時間早く、補助なしで立ち上がることができた。脳卒中の７日後の歩行分析は、速度及びケイデンス（律動性）の増大、並びに運動全体を通して各足にかかる圧力がより大きいこと、ステップ及びストライド長さの増大、サイクル当たりのスイングスタンス（地面からの踏み出し）の増大、並びに四足動物において予想されるような、後肢が前肢を越えて延在する際のより深い到達範囲によって検出される、運動機能の改善を示した。
【０１５２】
ＮＰＥＸ処置はまた、ＭＲＩ  Ｔ２及びＴ２  ＦＬＡＩＲ画像（図１１）によって検出されたように、脳卒中１２週後の動物における分子的な効果に関して大きな効果を有していた。対照動物に比べて、心室の完全性を概ね保持したまま、死亡した／死亡しつつある組織が処置によって減少し、また主に皮質組織を含む損傷した組織（緑色のトレース）がはるかに減少した。ＮＰＥＸを投与された動物は、対照処置を受けた動物よりも、１２週間の研究に亘って、大きなサイズ（脳卒中の２４時間後において３．８ｃｍ3もの大きさ）の梗塞に耐えることができた。これは恐らく、脳卒中の重篤度の低減をもたらし、かつ脳組織並びに挙動及び運動機能の完全性を含むより良好な長期転帰を促進する、ＮＰＥＸの抗炎症特性によるものである。
【０１５３】
これまでいずれの種類のＥＶも、大型動物における脳卒中の転帰又はこれに関連するいずれの神経欠損も改善したことはなかった。小動物の場合と同様に、本発明者らは、ＮＰＥＸが脳に即時作用し、従ってＮＰＥＸがブタ及びマウスにおいて迅速に作用することを示している。本発明者らは、このこと、及び脳卒中を罹患した動物に対するＥＶの即時効果を示唆した他の研究を全く知らない。ＮＰＥＸは生存率及び運動機能（動物が回復する速度、立ち上がるまでの時間、バランスなど）を即座に改善した。大型動物種における分子的及び表現型的転帰は上述のげっ歯類データに拡張され、これは、ＥＶが比較的長期間持続する神経増殖のような効果を発揮することを示している。この効果は、分子及び表現型の差異が脳卒中の２４時間後という早期に検出可能であることによる、脳卒中後に発生する免疫応答の消滅と、その後の増強されたＭ２応答に対する効果（これは神経修復性である）とによる、二次傷害の連鎖の調節に一部起因すると考えられる。この比較的長期間持続する効果は全体を通して観察され、ＮＰＥＸ処置された動物の歩行の改善をもたらす。
【０１５４】
要約すると、これは、作用の機序が複数の動物間で一致することを示唆する最初の脳卒中研究であり、またヒトと同様の構造の比較的複雑な脳における研究を含む。本発明者などによるインビトロでのヒト細胞の研究は、損傷した神経細胞に対する直接的な神経保護作用を示唆し、またマウス及びブタの研究は、免疫系による保護を示唆している。両種の神経修復機構に対する比較的長期間作用する効果が観察され、またこれは、Ｔｒｅｇ細胞の上方制御に一部起因するものであり得る（今のところマウスのみ）。重要なことには、マウスと違ってブタの脳は、白質の比率、皺能皮質の存在、細胞構造、サイズなど、ヒトの脳との多くの相同性を共有している。これらの類似性から、ブタはげっ歯類に比べて優れたモデル系であると考えられ、治療用に産生された神経前駆細胞由来ＥＶを用いたヒトにおける虚血性脳卒中の治療において予想される効果をより良好に表すものと思われる。
【０１５５】
これは、神経前駆細胞培養から大量のＥＶを産生できる能力（ＭＳＣから得られる収率よりもおよそ５倍高い）によって可能である。培養物から一貫して商業規模でＥＶを生成することができる能力には、ＥＶ産生細胞が、細胞の取り扱い及び得られたＥＶの生成に関する厳格な品質制御プロセスに依存していることが必要となる。
【０１５６】
実施例６
一次ろ過（ステップ１、全ての精製方法に使用される）
培養細胞を内包するプレート又はフラスコから培地を採取する。採取した培地を一次ろ過の前又は後に−２０℃で冷凍し、４℃で解凍した。ろ過を無菌層流フード内で完了させることにより、汚染を最小限とする。採取した培地を、０．２２μｍフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を通したデッドエンドろ過によりろ過した。この一次ろ過は、採取された培地からいずれかの細胞破片及び／又は死亡細胞を除去する。これにより、ＥＶ及び微小胞をろ液へと通過させて、更なる精製を行うことができる。
【０１５７】
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ限外ろ過
一次ろ過を実施すると、培地は二次ろ過の準備ができた状態となる。このステップは、１回転当たり最大７０ｍｌの培地を処理することができるＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心分離ユニットを含むシステムを利用する。このろ過プロセスは、富化されたＥＶを回収するために１００ｋＤａフィルタを使用する。このプロセス中、培地を４０００×ｇでの遠心分離によってフィルタディスクに通す。残余分がユニット当たり２５０μＬ〜５ｍＬに達すると、ＰＢＳ＋／＋の開始培地体積のおよそ９０％を用いて、バッファの交換を実施する。残余分がフィルタユニット当たり２５０μＬ〜１ｍＬの体積に達するまで、ＰＢＳ＋／＋を、２０００×ｇでの遠心分離によってＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルタに通す。この時点で残余分をＥＶ分析のために回収する。即時のナノ粒子追跡分析のために試料を採取し、同一の細胞タイプからの精製済みＥＶをプールし、粉砕し、−２０℃での保管のためにＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素非含有チューブへとアリコートした。
【０１５８】
Ａｍｉｃｏｎ撹拌細胞限外ろ過
大容積の限外ろ過のために、Ａｍｉｃｏｎ撹拌細胞限外ろ過ユニットを使用し、ここで３つのユニットを並べて接続した。各ベースユニットは４００ｍｌの培地を保持し、これは、スループットを増加させるために、リザーバを用いて更に拡張された。このステップは、高圧容器と、順次作動する３つのＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｕｎｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）とを含むシステムを利用する。このステップも同様にデッドエンドろ過を利用し、培地を１００ｋＤａフィルタディスク（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に通す。このプロセス中、圧縮窒素ガスによって供給される２５ｐｓｉの正圧を用いて、培地をフィルタディスクに通す。残余分が５０ｍｌ／撹拌細胞ユニットに達すると、システムを減圧する。次に、ＰＢＳ＋／＋の開始培地体積の５０％を用いて、バッファの交換を実施する。残余分がフィルタユニット当たり５０ｍＬの体積に達するまで、ＰＢＳ＋／＋を撹拌細胞フィルタに通す。この時点で残余分をＥＶ分析のために回収する。即時のナノ粒子追跡分析のために試料を採取し、同一の細胞タイプからの精製済みＥＶをプールし、粉砕し、−２０℃での保管のためにＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素非含有チューブへとアリコートした。
【０１５９】
線維芽細胞成長因子ＥＬＩＳＡ
ｈＦＧＦ２の含有量を明らかにするために、ＮＰＥＸ（商標）、ＡＰＥＸ及びＭＳＣＥＸ  ＥＶの低温保存した試料を、同一体積のＥＶ溶解バッファを用いて解凍し、エキソソーム内容物を放出させた。市販のヒトＦＧＦ２  ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＫＨＧ００２１）を製造元のプロトコルに従って使用して、溶解物をヒトＦＧＦ２に関して分析した。このキットによって提供されるＦＧＦ２標準を用いて、試験試料の標準曲線及び定量化されたＦＧＦ２を生成した。ＦＧＦ２は、ＮＰＥＸ（商標）試料において４９０ｐＧ／ｍＬで検出された。ＡＰＥＸ（商標）又はＭＳＣＥＸ（商標）試料ではＦＧＦ２を検出できなかった。
【０１６０】
質量分析
神経ＥＶとＭＳＧ由来ＥＶとの特有のタンパク質を比較するために、精製済みＥＶタンパク質を、Ｂｉｏｐｒｏｘｉｍｉｔｙ，  ＬＬＣによる質量分析に供した。
【０１６１】
結果
上述のような超遠心分離及び限外ろ過方法を用いた。大容積精製には、Ａｍｉｃｏｎ撹拌細胞システムを利用し、１作業週中に２４リットルを越える細胞培地を精製した。
【０１６２】
線維芽細胞成長因子ＥＬＩＳＡの結果
タンパク質であるヒト線維芽細胞成長因子２（ｈＦＧＦ２）を、ｈＮＰ１（商標）培地に添加して、ｈＮＰ１（商標）細胞の増殖状態を維持する。ｈＦＧＦ２補充培地中で培養されたｈＮＰ１（商標）細胞（ＮＰＥＸ）細胞によって産生されたＥＶは、エキソソームタンパク質内容物の一部として、このｈＦＧＦ２タンパク質のいずれかを蓄積／含有し得る。生存ｈＮＰ１（商標）細胞培養物から回収されたｈＮＰ１（商標）培地から採取されたＮＰＥＸ  ＥＶを、ｈＦＧＦ２の存在に関して試験した。これらの精製及び冷凍保存済みＮＰＥＸ（商標）ＥＶは、解凍後、検出可能なレベルのｈＦＧＦ２を含有していた。一方ｈＡｓｔｒｏＰｒｏ（商標）ヒト星状細胞（ＡＰＥＸ）からのＥＶ及び間葉系幹細胞（ＭＳＣＥＸ）からのＥＶ（ここでは細胞培地にｈＦＧＦ２が添加されていない）は、いずれの検出可能なｈＦＧＦ２も含有していなかった。これらのデータを合わせると、これらのデータは、トランスフェクション又は細胞内のタンパク質を過剰発現させるための他の技法を用いない場合でさえ、培地に補充したタンパク質が細胞に取り込まれ、富化ＥＶ試料中に存在することを示している。
【０１６３】
質量分析
図１２は、ＮＰＥＸ、ＡＰＥＸ及びＭＳＣＥＸ小胞に特有のタンパク質並びにこれらが共有するタンパク質の数を示すベン図である。合計２７２７個のタンパク質が、これらの小胞全てによって共有されていた（表３）。ＡＰＥＸ及びＭＳＣＥＸは、ＮＰＥＸ小胞中に存在しない２７８６個のタンパク質を共有していた（表４）。ＮＰＥＸは４６７個のタンパク質をＭＳＣＥＸだけと共有し（表５）、４２６個のタンパク質をＡＰＥＸ小胞だけと共有していた（表６）。ＭＳＣＥＸは、ＡＰＥＸ又はＮＰＥＸ小胞中では確認されなかった５３６個の特有のタンパク質を有していた（表７）。ＡＰＥＸは、ＮＰＥＸ又はＭＳＣＥＸ小胞中では確認されなかった５９６個の特有のタンパク質を有していた（表８）。ＮＰＥＸは、ＡＰＥＸ又はＭＳＣＥＸ小胞中では確認されなかった１６５３個の特有のタンパク質を有していた（表９）。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
【表８】
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【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
従って開示のＥＶは、そのＥＶが由来する細胞の供給源に基づいて一意である。更にこれらのタンパク質を、ＥＶを確認するためのシグニチャとして使用することができる。
【０１７２】
議論
これは、Ａｍｉｃｏｎ撹拌細胞限外ろ過ユニットを必要とするスケールで１週間以内に２４リットルの培地（これは、超遠心分離では論理的に精製が不可能であり、かつ相当なマンパワー及びより小型のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ／Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタユニットを用いた複数回の遠心分離を必要とする培地量である）からのろ過及びＥＶ富化が可能であることに本発明者などが気づいたことの初の文書化である。
【０１７３】
ＮＰＥＸ（商標）に細胞培地からのｈＦＧＦ２を含めて、ＣＮＳ内の標的まで分布することができるＮＰＥＸ  ＥＶの能力（「生体分布」の節で実証）を組み合わせることは、これらのＥＶが潜在的に、血流脳関門を越えて標的ＣＮＳ組織へとｈＦＧＦ２を送達することができることを示唆している。これらの結果は、ＥＶ供給源細胞（上述の例ではｈＮＰ１（商標）培地に関心対象の分子を添加することによって、細胞外小胞（ＮＰＥＸ（商標）を用いて、タンパク質（上述の例ではｈＦＧＦ２）を含む大分子を、ＣＮＳを含むインビボの標的に送達するための、可能性のある方法を示唆している。
【０１７４】
そうでないことが定義されていない限り、本明細書中で使用されている全ての技術及び科学用語は、開示の発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書中で引用した刊行物、及び上記刊行物の引用の理由となる資料は、参照により具体的に援用される。
【０１７５】
当業者であれば、本明細書に記載された本発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図８Ｄ−Ｅ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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