(57)【要約】
2018519391.tif 000016  本発明は，硫酸化多糖の構造におけるα，β-不飽和アルデヒドの調製及び使用に関する。一般構造式（I）に従ったアルデヒドに対して６位に位置するガラクトピラノース部分の４位及び５位に共役二重結合を有する誘導体，又は一般構造式（II）に従ったその水和形態に関する。これらの誘導体の調製は，４位で硫酸化し，α（１→３）又はβ（１→３）Ｏ‐グリコシド結合を介してポリマー鎖に結合したガラクトピラノース環を含む硫酸化多糖に由来する。記載の解決策では，硫酸化多糖は位置及び化学選択的酸化を受けてＣ６飽和アルデヒドを形成し，これは硫酸基の直接的な脱離を介して，一般式（I）又は（II）に従ったα，β‐不飽和誘導体を提供する。記載の解決策は，脱離剤，高温，又は合成中の中間体の単離が必要なく，α，β‐不飽和アルデヒドを直接生成するため，技術的に有利である。α，β‐不飽和アルデヒドの構造中の共役により，生理学的条件下で，硫酸化多糖の構造中で広範な生体適合性アミンに結合することが可能になる。提案した方法により，ｐＨ応答性ドラッグデリバリーシステム，又は組織工学もしくは再生医療における足場の調製に適した材料を調製することが可能になる。上記（I），（II）の式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ａｃである。
2018519391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４位と，一般式Iに従って６位のアルデヒドと共役しているか又は一般式IIに従ってその水和形態に隣接しているガラクトサミン環の５位とにおいて二重結合で修飾された硫酸化多糖の誘導体であって，
2018519391.tif 000014
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ａｃであることを特徴とする硫酸化多糖の誘導体。
【請求項２】
前記多糖はコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナンならびにこれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩から成る群より選択されることを特徴とする請求項１記載の硫酸化多糖の誘導体。
【請求項３】
前記多糖の分子量は１×１０３〜５×１０４g.mol-1の範囲であり，置換度は１〜４０％，好ましくは１０〜２５％の範囲であることを特徴とする請求項１又は２記載の硫酸化多糖の誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項で定義した前記硫酸化多糖の誘導体の調製方法であって，前記硫酸化多糖は天然形態では水溶性であり，一般構造式（III）の，４位で硫酸化され，α（１→３）又はβ（１→３）Ｏ‐グリコシド結合を介してポリマー鎖状に結合する少なくとも１つのガラクトピラノース単位を含み，
2018519391.tif 000015
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３であり，Ｒ１はＨ又はＮａであり，６位でアルデヒドへと酸化し，酸化直後に酸化誘導体が同じ反応混合物中で脱離し，請求項１〜３いずれか１項で定義した前記硫酸化多糖の誘導体を形成することを特徴とする調製方法。
【請求項５】
分子量が１×１０４〜５×１０６g.mol-1の範囲内にある硫酸化多糖を使用することを特徴とする請求項４記載の調製方法。
【請求項６】
コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナン，及びそれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩からなる群より選択される硫酸化多糖を使用することを特徴とする請求項４又は５記載の調製方法。
【請求項７】
前記酸化は，水又は無機塩の水溶液中で，５〜２５°Cで，Ｒ３‐ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系により行い，式中，Ｒ３は水素又はＮ‐アセチルであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項記載の調製方法。
【請求項８】
前記硫酸化多糖の二量体に対して，Ｒ３‐ＴＥＭＰＯのモル量は０．０１〜０．２当量であり，ＮａＣｌＯのモル量は０．１〜２．０当量の範囲内にあることを特徴とする請求項７記載の調製方法。
【請求項９】
前記無機塩の水溶液はアルカリ金属塩及び／又は緩衝液，例えばリン酸緩衝液を含む水溶液であることを特徴とする請求項７又は８記載の調製方法。
【請求項１０】
前記脱離は５〜２５°Cで，４位で硫酸化された前記ガラクトピラノースのサブユニット中の飽和Ｃ６‐アルデヒドの単離をせずに進行することを特徴とする請求項４〜９のいずれか１項記載の調製方法。
【請求項１１】
前記誘導体は前記一般式Ｒ２‐ＮＨ２のアミンと反応し，式中，Ｒ２はアルキル，アリール，ヘテロアリール，直鎖もしくは分枝Ｃ１‐Ｃ３０鎖であり，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項で定義した誘導体の修飾方法。
【請求項１２】
前記アミンは生物学的に活性なアミン，主にアミノ酸又はペプチドであることを特徴とする請求項１１記載の修飾方法。
【請求項１３】
前記誘導体は，遊離アミノ基を有する生物学的に許容可能なポリマーであるアミンと反応することを特徴とする請求項１１記載の誘導体の修飾方法。
【請求項１４】
前記アミノ基はゼラチン，キトサン，脱アセチル化ヒアルロン酸及び脱アセチル化コンドロイチン硫酸から成る群より選択されるポリマーの直接的な一部であることを特徴とする請求項１３記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記アミノ基はアミノ，ヒドラジン，ヒドラジド，アミノアルコキシ，ヒドロキシル，カルボキシル，チオール基，又はそれらの任意の組み合わせを含むリンカーを介してポリマーに結合することを特徴とする請求項１３記載の修飾方法。
【請求項１６】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド，又はポリマーの遊離アミノ基の量は前記硫酸化多糖の二量体に対して０．０５〜３．０当量の範囲内であることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１７】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド，又は遊離アミノ基を含むポリマーとの前記反応は水，リン酸緩衝液，又は水‐有機溶媒系中で，２０〜６０°Cの範囲の温度で１０分〜１５０時間かけて進行することを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１８】
前記有機溶媒は水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性で極性且つ非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドから成る群より選択され，前記混合液中の水分は少なくとも５０体積％であることを特徴とする請求項１７記載の修飾方法。
【請求項１９】
前記誘導体は，アルキルアミン，アリールアミン，ヘテロアルキルアミン，ヘタリールアミン，アミノ酸，ペプチド，遊離アミノ基を有するポリマー，ヒドラジン，ヒドロキシルアミン，ヒドラジド，セミカルバジド又はチオセミカルバジドから成る群より選択される水溶性で生体適合性の二官能性及び多官能性Ｎ‐求核剤と反応し，前記誘導体が架橋することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の誘導体の修飾方法。
【請求項２０】
前記Ｎ‐求核剤はヒドラジド，脱アセチル化多糖，又はアルコキシアミンであり，前記反応はリン酸緩衝液中で進行することを特徴とする請求項１９記載の修飾方法。
【請求項２１】
化粧品及び製薬分野において，ｐＨ値を変えることにより放出が制御される生物学的に活性な物質の担体としての，請求項１〜３のいずれか１項で定義した誘導体の使用。
【請求項２２】
生物医学的用途，及び組織工学用又は再生医療用足場の形成のための生体適合性材料としての，請求項１１〜２０のいずれか１項で定義した方法により修飾した誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は,アルデヒドについては６位に位置するガラクトピラノース環の４位及び５位に共役二重結合を有する硫酸化多糖類の誘導体に関する。更に，本発明はその調製，修飾及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは，ケラチン硫酸を除くアミノヘキソース及びウロン酸から成る直鎖状多糖類である。グリコサミノグリカンは結合組織，特に軟骨，靭帯及び腱の細胞内マトリクスの大部分を形成する。硫酸化多糖類，例えばコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸は，ヒアルロン酸の他にグリコサミノグリカン(glycosaminglycanes)の重要な例でもある。
【０００３】
コンドロイチン硫酸は，β（１→３）及びβ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を介して互いに結合したＮ‐アセチル‐Ｄ‐ガラクトサミン及びＤ‐グルクロン酸の反復モノマー単位から成る直鎖の硫酸化負荷電グリコサミノグリカンである（コンドロイチン硫酸の構造式は下記参照）。
2018519391.tif 000003
式中，Ｒ１はＨ又はＮａであり，Ｒ２はＨ，‐ＳＯ２‐ＯＨ，又は‐ＳＯ２‐ＯＮａである。
【０００４】
コンドロイチン硫酸は動物結合組織に由来し，そこでタンパク質に結合し，それによりプロテオグリカンの一部を形成する。コンドロイチンは様々な位置及び様々な種類のスルホトランスフェラーゼにより硫酸化する。ポリマー鎖中にある特定位置の独自の硫酸化パターンは，コンドロイチン硫酸の特異的な生物学的活性をコードする。コンドロイチン硫酸は関節軟骨の重要な構成成分であり，関節に圧縮抵抗を付与し，関節潤滑組成物のバランスを修復する（Baeurle S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymer 50: 1805）。グルコサミンと共に，コンドロイチン硫酸はヒト（例えばFlextor（登録商標），Advance Nutraceutics社）又は動物（例えばGelorendog（登録商標），Contipro Pharma社）における骨関節炎の治療又は予防のための栄養補助食品として使用される。薬理学的観点から，コンドロイチン硫酸は関節の変性疾患における疼痛抑制の応答が遅い薬物であると考えられている（Aubry-Rozier B. 2012. Revue Medicale Suisse 14: 571）。
【０００５】
デルマタン硫酸はβ（１→３）及びβ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を介して互いに結合したＮ‐アセチル‐Ｄ‐ガラクトサミン及びＬ‐イズロン酸の反復モノマー単位から成る直鎖の硫酸化負荷電グリコサミノグリカンである（デルマタン硫酸の構造式は下記参照）。
2018519391.tif 000004
式中，Ｒ１はＨ又はＮａであり，Ｒ２はＨ，‐ＳＯ２‐ＯＨ，又は‐ＳＯ２‐ＯＮａである。
【０００６】
デルマタン硫酸は，Ｄ‐グルクロン酸のＣ５エピマーであるＬ‐イズロン酸の存在によりコンドロイチン硫酸とは異なる。イズロン酸の逆構造は，デルマタン硫酸鎖の柔軟性をより優れたものにし，周辺領域のグリコサミン‐糖タンパク質の特異的相互作用を確実にする。これらの相互作用は遊走，増殖，分化又は血管新生などのいくつかの細胞プロセスの調節に寄与する。コンドロイチン硫酸のデルマタン硫酸への形質転換は３種の酵素：デルマタン硫酸エピメラーゼ１（ＤＳ‐ｅｐｉ１），デルマタン硫酸エピメラーゼ２（ＤＳ‐ｅｐｉ２）及びデルマタン４‐Ｏ‐スルホトランスフェラーゼ（Ｄ４ＳＴ１）により行う。硫酸化の方法と共に，グルクロン酸のイズロン酸へのエピマー化反応はランダムではなく，特異的に酵素的に制御し，結果として，読み取ったグリコサミノグリカンの機能に関する情報をコードすることとなる（Thelin M., et al. 2013. FEBS Journal 280: 2431）。
【０００７】
カラギーナン類は，赤色海藻の抽出により得られる直鎖硫酸化多糖類の群である。α（１→３）又はβ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を介して互いに結合するガラクトース及びその３，６‐無水誘導体はカラギーナン類の基本的な構造単位である。カラギーナンには３つの主要なタイプがあり，それらは硫酸化及び水溶性の程度が異なる。カッパカラギーナンは二量体当たり１つの硫酸塩を有し，水中で剛性ゲルを形成する。イオタカラギーナンは２つの硫酸塩を含み，軟質ゲルを形成するが，３つの硫酸塩を有するラムダカラギーナンはゲル形成特性を示さない。カラギーナンは菜食主義者や完全菜食主義者のための動物ゼラチンの代替品である。それは食品の増粘及び安定化のために，また医薬品及び繊維産業における乳化剤として使用される。
【０００８】
グリコサミノグリカンの酸化
その機能的多様性により，多糖類は様々な位置で酸化し得る（Cumpstey I., 2013. ISRN Organic Chemistry, 1）。グリコサミノグリカン(glycosaminglycanes)の場合，酸化方法は３つある。第１の方法では，第１級ヒドロキシルを酸化し，カルボン酸を形成する。酸化のためにＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯの組み合わせを使用することが最も多い（Jiang B., et al. 2000. Carbohydrate Research 327: 455; Huang L. et al. 2006. Chemistry, 12: 5264）。ＴＥＭＰＯが立体的に嵩高であるため，この方法は第１級ヒドロキシルに対してのみ位置選択的である。
【０００９】
反対に，第２の方法は第２級ヒドロキシルを酸化し，ジケトン化合物を形成する。この場合，酸化剤として，Ｃｒ（VI）（Hassan R., et al. 2013, Carbohydrate Polymers, 92: 2321）又はＭｎ（VII）（Gobouri A. A., et al. 2013. International Journal of Sciences, 2: 1; Zaafarany I. A., et al. 2013. Journal of Materials Science Research, 2: 23）をベースとする遷移金属の酸化物を使用する。
【００１０】
第３タイプの酸化は，第２級ヒドロキシル基を攻撃するが，同時にピラノース環を破壊する過ヨウ素酸塩（ＩＯ４−）の酸化に基づいている（Dawlee S. et al. 2005. Biomacromolecules, 6: 2040; Liang Y., et al. 2011. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 82: 1; Xu Y., et al. 2012. Carbohydrate Polymers, 87: 1589）。酸化中，ジアルデヒドが最初に形成され，次いでジカルボン酸へと更に酸化する。
【００１１】
上述の酸化方法全てには欠点がいくつかある。ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯを用いた酸化の場合，所望のＣ６‐アルデヒドの代わりにポリウロン酸を形成することが好ましい。ヒアルロン酸の場合で説明したように，アルデヒドレベルの反応条件を最適化する必要がある（Buffa R., et al., WO2011069475, Sedova P., et al., 2013. Carbohydrate Research, 371: 8）。また，ポリマー中のカルボキシル基の含量が高いと，立体構造，相互作用，及び生物学的環境による多糖の認識にかなり影響が及ぶ（Zou X. H., et al. 2009. Acta Biomaterialia, 5: 1588）。
【００１２】
過ヨウ素酸塩の酸化により反応の化学選択的な過程が達成可能になるとしても，この方法は，ポリマー分子量が劇的に減少し，ピラノース環が不可逆的に切断され，結果として多糖本来の特性が失われるため好ましいとは言えない。
【００１３】
遷移金属酸化物に由来する酸化剤の使用に関しては，酸化した多糖は毒性が高いために生物医学的用途には使用できない（Normandin L., 2002. Metabolic Brain Disease, 17: 375; Katz S.A., et al. 2006. Journal of Applied Toxicology, 13: 217）。
【００１４】
多糖の酸化誘導体の脱水反応
多糖構造中にアルデヒドが存在すると，隣接するα位の水素原子が酸特性を示す。この水素は脱離反応の塩基性条件下で容易に利用可能になり，カルバニオンを形成し，これは隣接するアルデヒドとの共役により安定し，それによりβ位の脱離基を置換する（方法ａ，スキーム１）。脱離は酸性条件下でも進行可能であり，ここでは脱離基の活性化が最初に起こり，β位においてカルバニオンを形成する（方法ｂ，スキーム１）。反応混合物中で，カルバニオンはα位において遊離電子対で中和される。第３の考え得る方法は分子の同時脱離を利用し，塩基又は酸を添加することなく実施可能である（方法ｃ，スキーム１）。
2018519391.tif 000005
スキーム１．アルデヒド構造における脱離反応：（ａ）塩基処理によるカルバニオンの形成，Ｅ１ｃｂ機構；（ｂ）酸処理によるカルバニオンの形成，Ｅ１機構；（ｃ）同時脱離，Ｅ２機構。
【００１５】
グルコサミン環の６位におけるヒアルロナンのアルデヒドの標的脱水は特許（Buffa et al.: CZ304512）に記載されている。著者らはヒアルロナンのα，β‐不飽和アルデヒドの調製及び架橋反応におけるその使用を述べている。開示された合成には，５０〜６０°Cの高めの温度下で，ＤＭＳＯタイプの水溶性有機溶媒とスルホランとの３／１〜１／２の割合の混合液中，立体的に嵩高い有機塩基（例えばジイソプロピルアミン，トリメチルアミン）及び無機塩基，例えばＣａ（ＯＨ）２を使用する工程が含まれる。脱水はまた，ポリマーを５０〜１００°Cで４〜５日間加熱することにより固体状態で行う。著者らは，２段階でのヒアルロン酸の酸化及び脱水を述べており，酸化段階中の直接的脱水は述べていない。この解決策には，２段階合成，苛性（腐食性）除去剤の存在下での不適切な反応条件の使用，有機溶媒の存在，高温の必要性，及び長い反応時間という重要な欠点がある。技術的観点から，これらのパラメータは全て，合成をより高額にし，より複雑にする（例えば，製造装置の腐食，生成物の困難な精製，高額なＤＭＳＯやスルホランなどの双極性非プロトン性溶媒及びＥｔ３ＮやＤＩＰＥＡなどの脱離剤，エネルギー及び冷却水の高い消費，生成物中の残留物の高い危険性，製品の生体適合性の危険性，基本環境に起因する高いポリマー分解率，ならびに高温）。ＣＺ３０４５１２でのＨＡのα，β‐不飽和アルデヒド合成の前記欠点は，本発明によれば，室温で数時間単位の反応時間で，飽和Ｃ６‐アルデヒドの形態で中間生成物を単離する必要なく，脱離剤及び有機溶媒を添加することなくワンポットで合成が進行するので，首尾よく解決できる。
【００１６】
酸化多糖類の架橋反応
アルデヒドを多糖構造へ導入すると，求核的付加を利用してポリマー鎖を更に修飾することが可能となる。アルデヒドへのアミンの結合を記載するいくつかの特許文献が知られている。グリコサミノグリカンの典型的な反応例には，生体適合性ハイドロゲルを調整するための，過ヨウ素酸塩での酸化により形成されたジアルデヒドと，様々な低分子（アミン，ヒドラジド，アルコキシアミン，セミカルバジド）又はポリマーＮ‐求核剤（ゼラチン，キトサン）又はＳ‐求核剤（チオール，アミノチオール）との反応が挙げられる（Dawlee S., et al. 2005. Biomacromolecules, 6: 2040; Weng L., et al. 2008. Journal of Biomedical Materials Research part A, 85: 352, Bergman K., et al.: WO2009/108100, Hilborn J., et al.: WO2010/138074）。デス‐マーチンペリオジナン又はＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯの組み合せを用いて調整したヒアルロン酸のアルデヒドと，様々なアミンとの架橋が特許文献（Buffa R., et al.: WO2011069474; Buffa R., et al.: WO2011069475）に記載されている。ヒアルロン酸のα，β‐不飽和アルデヒドは，Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンサブユニット中でＣ６‐アルデヒドを脱水して調製した（Buffa R., et al: CZ304512）。ヒアルロン酸の酸化誘導体に加えて，著者らはまた，Ｎ，Ｓ又はＯ原子を任意の量で含む脂肪族，芳香族アミン類との反応におけるその使用を述べている。しかし，それらは高温下で腐食性脱離剤を使用して調製しており，このことは，生じ得る変性及び副産物の存在のために生物学的活性を維持するには非常に不都合である。更に，調製したハイドロゲルのレオロジー特性に影響を与える多糖由来アルデヒドの共役の利点を説明するために，ヒアルロン酸のα，β‐不飽和アルデヒドと，多官能性アミノリンカーとしての脱アセチル化多糖との架橋反応が述べられている。しかし，このようにして調製されたハイドロゲルは，特にハイドロゲルの剛性に関する限りでは十分な機械的特性を示さない。
【００１７】
発明の概要
本発明の目的は，温和な反応条件下，より短時間で，且つ脱離剤又は有機溶媒の不要な不純物を使用せずに硫酸化多糖類を調製することである。この方法は，組織工学，再生医療又は生物医学的用途に重要な硫酸化多糖類の生物学的特性の著しい劣化及び損失を防止する。本発明の目的は，一般式I又はIIに従って修飾された少なくとも１種のガラクトピラノース環をポリマー鎖の一部として有する硫酸化多糖類の誘導体で構成され，上記環は，４位と，共役アルデヒド又はその水和形態（一般式II）を有する各々の５位とにおいて二重結合を含む。
2018519391.tif 000006
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３である。
【００１８】
必要な条件は，鎖中に少なくとも１つのガラクトピラノース環を含む硫酸化多糖類の使用であり，一般構造式IIIによれば，この環は４位で硫酸化され，同時にα（１→３）又はβ（１→３）Ｏ‐グリコシド結合を介して鎖状に結合する。
2018519391.tif 000007
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３である。
Ｒ１はＨ又はＮａである。
【００１９】
多糖は好ましくは，コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナンならびにこれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩から成る群より選択し，その分子量は好ましくは１×１０３〜５×１０４g.mol-1の範囲であり，置換度は１〜４０％，好ましくは１０〜２５％の範囲である。式I又はIIでは，用語「置換度」はそれぞれ不飽和アルデヒド又はその水和形態への修飾の程度を指す。
【００２０】
この溶液は，アルデヒド由来多重結合により硫酸化多糖とアミンとの共役を安定化させることが可能であるため，生理的条件下でこのように修飾された（スキーム２）多糖類において，かなり広範なアミン類が更に安定的に結合可能となる。
2018519391.tif 000008
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３である。
Ｒ２はアルキル，アリール，又はヘタリールである。
スキーム２．硫酸化多糖のα，β‐不飽和アルデヒドへのアミンの結合
【００２１】
更に，本発明は一般構造式I又はIIの誘導体の調製方法に関するものであり，前記硫酸化多糖は，天然型では水溶性であり，そして，４位で硫酸化され，α（１→３）又はβ（１→３）Ｏ‐グリコシド結合を介してポリマー鎖状に結合する少なくとも１つのガラクトピラノース単位をその構造中に含もので，最初に６位においてアルデヒドへと酸化され，該酸化直後にその時点の反応混合物内で，直接脱離を介してα，β‐不飽和アルデヒドを生成する（スキーム３）。
2018519391.tif 000009
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３である。
Ｒ１はＨ又はＮａである。
スキーム３．硫酸化多糖の構造におけるα，β‐不飽和アルデヒドの調製方法。
【００２２】
ガラクトピラノースの６位の第一級ヒドロキシル基の選択的酸化は，例えば２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルＲ３‐ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯの酸化系により実行可能であり，式中，Ｒ３は水又は無機塩の水溶液中では水素又はＮ‐アセチルである。好ましくは，この工程は５〜２５°C，より好ましくは５〜１０°Cで水中で進行し，硫酸化多糖二量体に対して，ＮａＣｌＯのモル量は０．１〜２．０当量の範囲内にあり，Ｒ３‐ＴＥＭＰＯのモル量は０．０１〜０．２当量の範囲内にある。初期硫酸化多糖の分子量は１×１０４〜５×１０６g.mol-1の範囲内にあり，４位で硫酸化されたガラクトピラノース単位を含有している必要があり，ポリマー鎖中のα（１→３）又はβ（１→３）Ｏ−グリコシド結合を介して結合する。好ましくは，初期硫酸化多糖はコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナン，又はそれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩である。塩の水溶液は，例えばアルカリ金属塩及び／又は緩衝液を含む水溶液，例えばＰＢＳであってもよい。
【００２３】
脱離剤，特に酸もしくは塩基，有機溶媒を添加する必要なく，又は反応温度が上昇せずに，そして４位で硫酸化されたガラクトピラノースサブユニット内の飽和Ｃ６‐アルデヒドの単離をせずに，酸化及び硫酸化された多糖の脱離反応は，同じ反応混合物内で酸化段階の直後に進行する。脱離反応は５〜２５°Cで，水，又は無機塩（例えばアルカリ金属塩）の水溶液もしくは緩衝液（例えばＰＢＳ）中で進行し，反応時間を延長する必要はない。また，脱離段階は，反応混合物内で達成された酸化段階に比例する。α，β‐不飽和アルデヒドの調製方法では，酸化段階から中間物を単離することなく，２つの反応段階（酸化及び脱離）をワンポットに統合する。この酸化により，硫酸化多糖の構造中，飽和Ｃ６‐アルデヒドの代わりにα，β‐不飽和アルデヒドが生じる。ヒアルロン酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製方法（Buffa R et al.: CZ304512）と比較して，報告のアプローチは別様であり，表１に収載したパラメータでは明らかに有利である。
【００２４】
表１：先行技術と比較したα，β‐不飽和アルデヒド調製の違い
2018519391.tif 000010
【００２５】
上記の表１から，本発明の硫酸化多糖誘導体の調製方法によりその飽和類似体の代わりにα，β‐不飽和アルデヒドが直接形成されることが明らかに分かる。本発明の報告した方法の別の相違点は，硫酸塩の存在がプロセスに必要であることから，当該方法は先行技術において言及された多糖には利用できないことである。他の利点は，有機溶媒又は脱離剤の添加を必要とせずに，水中のみで進行する反応に対応していることである。更に，飽和Ｃ６‐アルデヒドを単離せずに，短い反応時間（１〜２時間）で室温（２０〜２５°C）で反応が進行する。上述の方法では，ＤＳが２０〜２５％の範囲内で，一般式I及び／又はIIを有する硫酸化多糖の誘導体が生じる。それらの調製方法は技術的に興味深く，また既知の方法と比較して時間的及びコスト的観点からかなり好ましい。
【００２６】
化学修飾を考慮すると，硫酸化多糖中のα，β‐不飽和アルデヒドは主に種々のＮ‐求核剤との縮合反応に使用可能である。反応性求電子中心の役割においてアルデヒドは水中でもその安定性及び反応性を維持し，これは生体適合性アミンと一般式I及びIIの誘導体との前述の結合（共役）に好ましく使用できる。用語「アミン」は当業者に周知であり，それはアルキルアミン，アリールアミン，ヘタリールアミン，アミノ酸，ペプチド，又は遊離アミノ基を有するポリマーとすることが可能であるが，これらに限定されるものではない。遊離アミノ基は，ポリマーに直接組み込むか，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含む直鎖又は分枝状となり得る好適なリンカーを介して結合させることが可能である。用語「アミノ基を有するポリマー」は脱アセチル化多糖，タンパク質，ペプチド，又は別のバイオポリマーもしくは生体適合性合成ポリマーであると理解されているものとする。
【００２７】
従って，本発明は更に，一般式I又はIIの誘導体の修飾方法に関するものであり，ここでは誘導体は一般式Ｒ２‐ＮＨ２のアミンと反応し，式中，Ｒ２はアルキル，アリール，ヘテロアリール，直鎖もしくは分枝Ｃ１‐Ｃ３０鎖であり，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含む。アミンは，好ましくは生物学的に活性なアミン，特にアミノ酸もしくはペプチド，又は遊離アミノ基を含む生物学的に許容可能なポリマーであり，このアミノ基は当該ポリマーに固有の部分（例えば，ゼラチン，キトサン，脱アセチル化ヒアルロン酸，脱アセチル化コンドロイチン硫酸等）であるか，あるいはアミノ，ヒドラジン，ヒドラジド，アミノアルコキシ，ヒドロキシル，カルボキシル，チオール基，又はそれらの任意の組み合わせを含むリンカーを介してポリマーに結合する。アミンのモル量は好ましくは，硫酸化多糖の二量体に対して０．０５〜３当量の範囲内にすることが可能である。アミンの結合は水，リン酸緩衝液，又は水‐有機溶媒系中で，２０〜６０°Cの範囲の温度で１０分〜１５０時間かけて進めることが可能である。好適な有機溶媒は水混和性アルコール，好ましくはイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性非プロトン性溶媒，好ましくはジメチルスルホキシドであると理解され，反応混合物のそれらの含有量は５０％（v/v）を超えない。アミンとの反応は，生理的条件（ｐＨ＝７．４，Ｔ＝３７°C）下で行えることが好ましい。アミンの他に，反応はヒドラジン，ヒドロキシルアミン，ヒドラジド，セミカルバジド又はチオセミカルバジドなど，その構造中にアミノ基を含む他のＮ‐求核剤を使用しても進行する。一官能性Ｎ‐求核剤との反応の場合，それらはポリマーに結合し，二官能性及び多官能性Ｎ‐求核剤を使用するとポリマー鎖が架橋され，すなわちハイドロゲルが形成される。使用するＮ‐求核剤の種類に応じて，その結合部位の比率に対する量，ポリマー構造，溶液濃度，置換度，ならびに広範な粘弾性及び機械特性を有するポリマー及び架橋ポリマーの分子量は，組織工学又は再生医療における意図した用途の必要性に従って正確に調製することが可能である。本発明の誘導体とアミンとの反応が，ｐＨの全範囲内で進行可能である特定の場合もあれば，ｐＨ値が反応にとって重要である場合もある。当業者であれば，ｐＨを事前に認識するか，又は通常の測定により決定することが可能である。
【００２８】
意図した用途は主として，細胞外マトリクスを模倣する生物活性及び生分解性の支持材料としての足場の調製であることを意味する。これらの材料は，細胞又は生物学的活性物質，細胞誘引物質のための担体として，組織欠損部位への細胞送達のための担体媒体として，組織補填材，適切な組織代替物又は保護バリアとして働くことが可能である。機能的足場に必要な他の要素は，細胞増殖及び分化や栄養素及び細胞代謝の廃棄物の輸送ための好適な化学的及び生理学的環境の確保である。足場の適用の方法に応じて，ゲル形成溶液の様態である架橋される硫酸化多糖から注入可能な足場を調製すること，ここでは足場及び新たな組織がインビボで形成する，又はインビトロでの細胞培養及び新たな組織の形成後に生体に移植する強固な足場を調製することが可能である。更に，架橋反応のパラメータ（濃度及び結合部位比率）を適切に選択すれば，ゲル化時間を数秒程短縮することが可能になり（実施例３０参照），これは，生物学的材料の存在下のインサイツでのゲル化，いわゆる細胞カプセル化に好ましく利用可能である。架橋反応をスキーム４に示す：
2018519391.tif 000011
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３である。
スキーム４．α，β‐不飽和アルデヒド及びジアミンによる硫酸化多糖の架橋。
【００２９】
アルデヒドと隣接する二重結合との共役により，従来の飽和アルデヒドと比較してアミンとα，β‐不飽和アルデヒドとの結合が確実に安定する。従って，ヒアルロン酸の非硫酸化多糖の例（Buffa R., et al: CZ304512）で示したように，硫酸化多糖をベースとする更に安定的かつ良好な架橋材料を調製することが可能となる。
【００３０】
前記誘導体と，アルキルアミン，アリールアミン，ヘテロアルキルアミン，ヘタリールアミン，アミノ酸，ペプチド，遊離アミノ基を有するポリマー，ヒドラジン，ヒドロキシルアミン，ヒドラジド，セミカルバジド又はチオセミカルバジドから成る群より選択される水溶性で生体適合性の二官能性及び多官能性Ｎ‐求核剤とを反応させることにより架橋を行う。好ましい求核剤はヒドラジド，ジヒドラジド，脱アセチル化多糖又はアルコキシアミンを含む。この反応は，好ましくはリン酸緩衝液中で進行することができる。
【００３１】
しかし，機械的性質（圧縮時弾性のヤング率，圧縮時弾性限度，及び架橋ゲルの変形率）の比較分析により，酸化ヒアルロナンをベースとするゲルと比較して酸化コンドロイチン硫酸から調製したゲルの密度の方が高いことが判明した（本発明の実施例３１参照）。ゲルの剛性が高いことは，多糖の構造における架橋密度が高いことを反映しており，従って，架橋した材料の量及び形状安定性がより良好に保証される。また，より良好な架橋材料は経時的な機械的性質の変化が少ないため，機能的な細胞足場に課される必要条件が満たされる。この場合，より効果的な架橋は，硫酸化多糖の構造においてα，β‐不飽和アルデヒドの置換度が高くなることにより達成可能となり（上記表１参照），これは従来技術と比較して本発明の重要な利点の１つである。
【００３２】
ゲルがより効率的に架橋されることの第２の利点は，生理学的媒体における膨張率がより低いことにある。これは，組織との接触時に生体内で材料性能の制御が望まれる組織工学において，その機械的特性，形状又は体積が劇的に変化することなく足場に使用できることが好ましい。
【００３３】
硫酸化多糖類の構造においてα，β‐不飽和アルデヒドの置換度がより高いという第３の利点は，例えば生物学的に活性なアミンをより多く結合できることである。このように，上述の発明も好ましく使用できる支持系の適用に効果的な部位で，生物学的に活性な物質をより高濃度にできる。更に，提案した方法により，天然の（活性な）形態で自然に放出され得る生物学的に活性なアミン（例えばアミノ酸，ペプチド）がより多様に結合できるようになる。複数の例（ブチルアミン，リジン，ＲＧＤペプチド）で，より低いｐＨでは結合アミン‐α，β‐不飽和アルデヒドがあまり安定でないことが反復的に見られるため（スキーム５），調製した複合体はｐＨ応答性生体材料をベースとするドラッグデリバリーシステムに使用できることが好ましい。
2018519391.tif 000012
スキーム５．水中におけるＲＧＤペプチド（アミノヘキサン酸‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｓｐ‐ＮＨ２）でのα，β‐不飽和アルデヒドコンドロイチン硫酸（ＤＳ＝２０％）のイミンの安定性。
【００３４】
より具体的には，水中のアルキル，アリール又はヘタリールアミンをベースとするイミンのこの安定性は以下のように利用できる：生物学的に活性なアミン（例えば薬物，防腐剤，ペプチド，アミノ酸等），及び中程度の塩基条件下で安定的な多糖（担体）により形成された複合体（イミン）が，ｐＨが異なる（中性又は中程度の酸）生物の標的部位に取り込まれると，この複合体は分解され，生物学的に活性な物質がこの部位で放出される。
【００３５】
コンドロイチン硫酸構造中のα，β‐不飽和アルデヒド自体は，細胞毒性はないことが証明されている（本発明に記載の実施例３２参照）ため，式I又はIIのα，β‐不飽和アルデヒドと生体適合性アミンとの複合体及び架橋生成物は生物医学及び組織工学における標的用途に適している。これらの物質は細胞生存率に悪影響を与えず，生体内で免疫反応を誘導せず，酵素的に分解可能であると考えられているが，その分解生成物も生体適合性である。従って，式I又はIIの誘導体は，化粧品もしくは製薬の分野における生物学的に活性な物質の支持体の調製用に，又はｐＨを変えることにより放出が制御された生物学的に活性な物質の支持体として，使用可能である。生理学的条件下，生体適合性の初期材料で反応を円滑に進行させるには，硫酸化多糖の架橋生成物が組織工学又は再生医療における細胞足場の有望な材料であるとも考えられ，当該架橋生成物は細胞の取り込み及びその後の培養に使用可能であることが好ましい。本発明に記載の方法は費用や時間もかからないため，産業的に容易に実現可能である。何故なら中間物を単離する必要がなく，２工程をワンポットにまとめられるからである。別の利点は，反応が水中でのみ進行するので，脱離剤の役割において有毒且つ腐食性又は高価な化学物質が必要ないこと，また有機溶媒が必要ないことである。反応時間は短く；更に，反応は室温で進行する。最終生成物は，環境に有害な影響を及ぼすことなく，アルコール又は無機塩溶液での沈殿により単離する。また，（Buffa R., et al: CZ304512，上記表１参照）より大幅に穏和な条件下で，提案の方法により比較的高い置換度（２０〜２５％）が達成される。
【００３６】
記載された本発明の方法により修飾した硫酸化多糖は，様々なＮ‐求核剤との共役又は架橋反応の前駆体として適切であり，生物医学的用途，組織工学及び再生医療に適した生体適合性材料を生成する。より詳細には，本発明の方法により調製した誘導体は，化粧品及び製薬分野において，ｐＨ値を変えることにより放出が制御される生物学的に活性な物質の支持体として使用できる。本発明の方法により修飾した誘導体は，生物医学的用途，及び組織工学用又は再生医療用足場の形成のための生体適合性材料として使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】アジピン酸ジヒドラジドと結合した酸化コンドロイチン硫酸をベースとするハイドロゲルの形成を示す（実施例２１）：（ａ）ＰＢＳ中コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの溶液，（ｂ）ＰＢＳ中アジピン酸ジヒドラジド溶液の添加後の溶液のゲル化，（ｃ）ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，ｃ＝０．９％w/v）に１時間入れた後のハイドロゲル，（ｄ）ハイドロゲルを調製するための例示的な形態の使用，（ｅ）ハイドロゲルを調製するための規定した形態の使用，（ｆ）ハイドロゲル断片の詳細図。
【図２】アジピン酸ジヒドラジドと結合した酸化コンドロイチン硫酸をベースとする凍結乾燥ハイドロゲルの走査型電子顕微鏡で撮影した写真である：（ａ）断面，倍率２００×，二次電子の検出，（ｂ）直径を測定したハイドロゲルの多孔質構造の拡大断面。
【図３】コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（Ｍｗ＝４×１０４g/mol，ＤＳ＝２０％）における３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率試験の結果を示す。時間Ｔ＝０時間（１００％）における，対照に対する％で表した活性化ｖｓ阻害曲線。６回繰り返したＭＴＴ法による評価。
【図４】ゲル点（Ｔｇ＝９７s，Ｔ＝４５°C）を判定した実施例３０のゲル化速度である。弾性率（Ｇ’）及び粘性率（Ｇ’’）の時間依存性のグラフ表示。
【００３８】
実施例
本明細書で使用される用語「当量」（eq）は，特段の記載がない限り，硫酸化多糖の二量体単位を指す。パーセンテージは，特段の記載がない限り，重量パーセンテージとして表している。初期コンドロイチン硫酸（製造元：Sigma Aldrich社，チェコ共和国，プラハ）の分子量は４×１０４〜５×１０４g.mol-1の範囲内の重量平均分子量である。
【００３９】
コンドロイチン‐４‐硫酸（Ａ型）とコンドロイチン‐６‐硫酸（Ｃ型）との比は３：２であった。材料は動物材料から単離した。
【００４０】
水中で５mg/mlの溶解度であるデルマタン硫酸のナトリウム塩（コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム塩）をSigma Aldrich社から購入した。材料は動物材料から単離した。
【００４１】
水中で１０mg/mlの溶解度であるラムダカラギーナンをSigma Aldrich社から購入し，天然形態ではゲル化特性のない海藻から単離した。
【００４２】
硫酸化多糖の構造におけるα，β‐不飽和アルデヒドの置換度を以下の計算に従って求めた：
ＤＳ＝α，β‐不飽和アルデヒドの置換度＝１００％＊（硫酸化多糖の修飾二量体のモル量）／（硫酸化多糖の全二量体のモル量）
【００４３】
硫酸化多糖の構造におけるアミノ化反応の置換度を以下の計算に従って求めた：
ＤＳ＝アミノ化の置換度＝１００％＊（硫酸化多糖の修飾二量体のモル量）／（硫酸化多糖の全二量体のモル量）
【００４４】
ＦＴ‐ＩＲスペクトルは，分光計Nicolet 6700 FTIRを用いて，ＫＢｒ中，４０００〜４００cm-1の範囲内で測定した。ＵＶ‐ＶＩＳスペクトルを装置Shimadzu UV-2401PCを用いて２００〜６００nmの範囲で測定し，UV Probeソフトウェア，バージョン２，００を用いて処理した。
【００４５】
ゲル化速度は装置AR-G2により求め，評価ソフトウェアとしてTA Analysisを使用した。ゲル化点（Ｔｇ）は，弾性率及び粘性率の時間依存性から求めた。
【００４６】
選択したゲルの機械的特性を装置Instron 3433を用いた圧縮試験により測定し，Bluehillソフトウェアを用いて評価した。各試料について求めたパラメータは以下であった：圧縮時ヤング率，圧縮強度，極限強度における変形，及び靭性。
【００４７】
凍結乾燥材料の表面形態を，電子顕微鏡Zeiss Ultra Plusを用いて分析した。
【００４８】
脱アセチル化ヒアルロン酸はBuffa R., et al CZ304512に従ってヒドラジンで脱アセチル化することにより調製した。
【００４９】
ヒアルロン酸のアミノプロポキシル及びヒドラジン誘導体はBuffa R., et al.: WO2011069474に従って還元的アミノ化により調製した。
【００５０】
略語のリスト
ＴＥＭＰＯ  ―  ２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカル
４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ  ―  ４位にアセトアミド基を有するＴＥＭＰＯ
ＰＢＳ  ―  リン酸緩衝生理食塩水
ＲＧＤペプチド  ―  アミノヘキサン酸‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｓｐ‐ＮＨ２の配列のペプチド
ＡＭＫ  ―  アミノ酸
ＩＰＡ  ―  イソプロピルアルコール
ＤＭＳＯ  ―  ジメチルスルホキシド
【００５１】
実施例１
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製
方法１：リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（０．８当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，５°Cに冷却されたコンドロイチン硫酸（２００mg，Ｍｗ＝４．５×１０４g.mol-1）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．８当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応液に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。
生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２３％（ＮＭＲにより測定），Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳにより測定）
方法２：臭化ナトリウム（０．８当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有し，５°Cに冷却したコンドロイチン硫酸（２００mg，Ｍｗ＝４．５×１０４g.mol-1）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．８当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応液に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲにより測定）
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドのスペクトル分析：ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：２．０２（３Ｈ，Ａｃ‐ＮＨ‐，ｂｓ），４．３１（１Ｈ，Ｈ２，ｂｓ），４．４９（１Ｈ，Ｈ３，ｂｓ），５．２０（１Ｈ，Ｈ１，ｂｓ），６．３４（１Ｈ，Ｈ４，ｂｓ），９．２１（１Ｈ，Ｈ６，ｂｓ）；
ＮＭＲ  １Ｈ‐１Ｈ  ＣＯＳＹ（Ｄ２Ｏ），クロスピーク，δppm：４．３１〜４．４９，４．３１〜５．２０，４．４９〜６．３４；ＮＭＲ１Ｈ‐１３Ｃ  ＨＳＱＣ
（Ｄ２Ｏ），クロスピーク，δppm：２．０２〜２５．１，４．３１〜５１．０，４．４９〜７３．１，５．２０〜９８．６，６．３４〜１２２．０，９．２１〜１８９．０；
ＮＭＲ  ＤＯＳＹ（Ｄ２Ｏ），ｌｏｇＤ（（２．０２，Ａｃ‐ＮＨ‐），（４．３１，Ｈ２），（４．４９，Ｈ３），（５．２０，Ｈ１），（６．３４，Ｈ４），（９．２１，Ｈ６））≒−１０．３m2S-1，ｌｏｇＤ（４．７２，Ｈ２Ｏ）≒−８．６m2S-1；
ＩＲ（ＫＢｒ，cm-1）：１７２５，１６５０（ｖ  Ｃ＝Ｏ  ｓｔ），１６１５，１６６３（ｖ  Ｃ＝Ｃ  ｓｔ）；
ＵＶ／Ｖｉｓ（０．１％，Ｈ２Ｏ）；λｍａｘ１，２（Ｃβ＝Ｃα‐Ｃ＝Ｏ）＝２５４nm（π→π＊），３００〜３５０（ｎ→π＊）
【００５２】
実施例２
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製
リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（０．４当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，５°Cに冷却されたコンドロイチン硫酸（２００mg，Ｍｗ＝４．５×１０４g.mol-1）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．４当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応物に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２％（ＮＭＲで測定），Ｍｗ＝２．８×１０４g.mol-1（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳで測定）。生成物の構造解析は実施例１に示している。
【００５３】
実施例３
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製
リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（１当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，５°Cに冷却されたコンドロイチン硫酸（２００mg，Ｍｗ＝４．５×１０４g.mol-1）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（１当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応液に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２１％（ＮＭＲで測定），Ｍｗ＝２．０×１０４g.mol-1（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳで測定）。生成物の構造解析は実施例１に示している。
【００５４】
実施例４
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製
リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（２当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，５°Cに冷却されたコンドロイチン硫酸（２００mg，Ｍｗ＝４．５×１０４g.mol-1）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（２当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応液に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２１％（ＮＭＲで測定），Ｍｗ＝１．８×１０４g.mol-1（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳで測定）。生成物の構造解析は実施例１に示している。
【００５５】
実施例５
デルマタン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドの調製
リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（０．８当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，５°Cに冷却されたデルマタン硫酸（２００mg，０．４２mol）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．８当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を５°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応液に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
デルマタン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドのスペクトル分析：ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：２．０１（３Ｈ，Ａｃ‐ＮＨ‐，ｂｓ），６．３０（１Ｈ，Ｈ４，ｂｓ），９．２０（１Ｈ，Ｈ６，ｂｓ）
【００５６】
実施例６
カラギーナンのα，β‐不飽和アルデヒドの調製
リン酸二ナトリウム１２水和物（２．２当量），臭化ナトリウム（０．８当量）及び４‐ＡｃＮＨ‐ＴＥＭＰＯ（０．０１％）を含有する，１０°Cに冷却されたカラギーナン（２００mg，０．３１mol）の１％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．８当量，１１％の活性塩素）を徐々に添加した。混合液を１０°Cで２時間撹拌した。次いでエタノール（１０当量）を反応物に添加し，これを室温で更に１時間撹拌した。生成物をＩＰＡで沈殿させて単離し，ＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝１０％（ＮＭＲで測定）
カラギーナンのα，β‐不飽和アルデヒドのスペクトル分析：ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：６．３０（１Ｈ，Ｈ４，ｂｓ），９．２０（１Ｈ，Ｈ６，ｂｓ）
【００５７】
実施例７
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのヒドラジンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ヒドラジン水和物（２当量）を添加した。反応液を室温で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．４０（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．３８（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００５８】
実施例８
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのブチルアミンの結合
方法１：Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ブチルアミン（０．２当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝１１．２０で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．６７（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．７４（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
方法２：方法１のＮＭＲ試料に重水素化酢酸（１４．５μL）を添加した。測定したｐＨは４．１０であり，次いで試料をＮＭＲで分析した。
ＤＳ＝０％（ＮＭＲで測定）
【００５９】
実施例９
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのブチルアミンの結合
重水素化ＰＢＳ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ブチルアミン（０．２当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝７．３０で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝０％（ＮＭＲで測定）
【００６０】
実施例１０
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのヘキサン‐１，６‐ジアミンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ヘキサン‐１，６‐ジアミン（０．５当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝１１．６０で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．６８（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．７４（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００６１】
実施例１１
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのプロポキシアミンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，プロポキシアミン塩酸塩（０．５当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝３．９０で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．５７及び６．８８（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．５２及び７．７０（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００６２】
実施例１２
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのリジンの結合
重水素化ＰＢＳ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，リジン塩酸塩（０．５当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝７．４６で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝４％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．６９〜５．７５（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．７０〜７．７５（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００６３】
実施例１３
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのリジンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，リジン塩酸塩（０．５当量）を添加した。重炭酸ナトリウム（２当量）を添加して反応液のｐＨを８．４０に調整した。反応液を室温で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝７％（ＮＭＲで測定）
構造解析は実施例１２に示している。
【００６４】
実施例１４
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのＲＧＤペプチドの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ＲＧＤペプチド（０．２当量，配列Ａｈｘ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｓｐ‐ＮＨ２）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝４．２２で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝０％（ＮＭＲで測定）
【００６５】
実施例１５
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのＲＧＤペプチドの結合
重水素化ＰＢＳ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ＲＧＤペプチド（０．２当量，配列Ａｈｘ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｓｐ‐ＮＨ２）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝７．２２で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝４％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．６８（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），７．７４（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００６６】
実施例１６
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのＲＧＤペプチドの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，ＲＧＤペプチド（０．２当量，配列Ａｈｘ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｓｐ‐ＮＨ２）を添加した。重炭酸ナトリウム（２当量）を添加して反応液のｐＨを１０．４９に調整した。反応液を室温で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
構造解析は実施例１５に示している。
【００６７】
実施例１７
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのアニリンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，アニリン（０．３当量）を添加した。重水素化酢酸（８．８μL）を添加して反応液のｐＨを４．２２に調整した。反応液を室温で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝０％（ＮＭＲで測定）
【００６８】
実施例１８
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのアニリンの結合
重水素化ＰＢＳ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，アニリン（０．３当量）を添加した。反応液を室温，ＰＨ＝７．４２で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：５．９３（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ），８．０３（１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）
【００６９】
実施例１９
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのアニリンの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，アニリン（０．３当量）を添加した。炭酸ナトリウムを添加して反応液のｐＨを１０．７３に調整した。反応液を室温で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２５％（ＮＭＲで測定）
構造解析は実施例１８に示している。
【００７０】
実施例２０
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドへのアジピン酸ジヒドラジドの結合
Ｄ２Ｏ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の２％溶液に，アジピン酸ジヒドラジド（３当量）を添加した。反応液を室温，ｐＨ＝７．５０で２４時間撹拌した。生成物を粗反応混合物の形態で分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲで測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：１．６４（４Ｈ，ＤＨＡ２，３，ｂｓ），２．０４（３Ｈ，Ａｃ‐ＮＨ‐，ｂｓ），２．３４（４Ｈ，ＤＨＡ１，４，ｂｓ），４．２８（１Ｈ，Ｈ２，ｂｓ），４．３６（１Ｈ，Ｈ３，ｂｓ），５．２０（１Ｈ，Ｈ１，ｂｓ），５．６２（１Ｈ，Ｈ４シス，ｂｓ），５．６８（１Ｈ，Ｈ４トランス，ｂｓ），７．５２〜７．４８（１Ｈ，Ｈ６シス，ｂｓ），７．６１（１Ｈ，Ｈ６トランス，ｂｓ）；
ＮＭＲ  １Ｈ‐１Ｈ  ＣＯＳＹ（Ｄ２Ｏ），クロスピーク，δppm：１．６４〜２．３４，４．２８〜５．２０，４．３６〜５．６８；ＮＭＲ  １Ｈ‐１３Ｃ  ＨＳＱＣ
（Ｄ２Ｏ），クロスピーク，δppm：１．６４〜２４．９，２．３４〜３４．１，４．２８〜５１．０，４．３６〜７３．６，５．２０〜９８．８，５．６８〜１１１．３，７，６１１４８，５；
ＮＭＲ  ＤＯＳＹ（Ｄ２Ｏ），ｌｏｇＤ（（２．０４，Ａｃ‐ＮＨ‐），（４．２８，Ｈ２），（４．３６，Ｈ３），（５．２０，Ｈ１），（５．６２及び５．６８，Ｈ４シス／トランス），（７．５２及び７．６８，Ｈ６シス／トランス））≒−１０．４m2s-1，ｌｏｇＤ（４．７２，Ｈ２Ｏ）≒−８．６m2s-1；
ＩＲ（ＫＢｒ，cm-1）：１６４０〜１６５０（ｖ  ‐Ｃ＝Ｎ‐  ｓｔ）；
ＵＶ／Ｖｉｓ（０．１％，Ｈ２Ｏ）；λｍａｘ１，２（‐Ｃ＝Ｎ‐）＝２８０ｎｍ（π→π＊）
【００７１】
実施例２１
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドとアジピン酸ジヒドラジドとの架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（４０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の８％溶液に，ＰＢＳ中，アジピン酸ジヒドラジド（０．１２当量，結合部位比１：１）を添加した。アジピン酸ジヒドラジド溶液の添加後，暫くするとゲル化した（Ｔｇ＝３４s）。弾性ゲルを撮影し（図１），凍結乾燥し，ＳＥＭで分析した（図２）。
圧縮時弾性のヤング率＝９×１０３Pa
圧縮時極限強度＝６４×１０３Pa
極限強度における変形率＝６４％
靭性＝３６６８J.m-3
【００７２】
実施例２２
デルマタン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドとアジピン酸ジヒドラジドとの架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，デルマタン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（４０mg，ＤＳ＝２０％，Ｍｗ≦４０kDa）の８％溶液に，ＰＢＳ中，アジピン酸ジヒドラジド（０．１当量，結合部位比１：１）を添加した。アジピン酸ジヒドラジド溶液の添加後，ゲル化が進行した。
【００７３】
実施例２３
カラギーナンのα，β‐不飽和アルデヒドとアジピン酸ジヒドラジドとの架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，カラギーナンのα，β‐不飽和アルデヒド（４０mg，ＤＳ＝１０％，Ｍｗ≦５０kDa）の８％溶液に，４０μLのＰＢＳ中，アジピン酸ジヒドラジド（０．０５当量）を添加した。アジピン酸ジヒドラジド溶液の添加後，粘度が増加した。
【００７４】
実施例２４
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドとヒアルロン酸のヒドラジド誘導体との架橋
ＰＢＳ中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（１０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の４％溶液に，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，ｃ＝０．９％w/v）中，ヒアルロン酸のヒドラジド誘導体（９．２mg，ＤＳ＝２５％，Ｍｗ＝１３８×１０３g.mol-1）の４％溶液を添加した。溶液の混合後，暫くするとゲル化した（Ｔｇ＝１０９s）。
圧縮時弾性のヤング率＝６×１０３Pa
圧縮時極限強度＝８４０×１０３Pa
極限強度における変形率＝９６％
靭性＝１１９７８J.m-3
【００７５】
実施例２５
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドと脱アセチル化ヒアルロン酸との架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（１０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の４％溶液に，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，ｃ＝０．９％w/v）中，脱アセチル化ヒアルロン酸（２当量，ＤＳ＝１１％，Ｍｗ＝１１６kDa，結合部位比１：１）の２％溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌し，０．５時間後に粘度増加が見られ，１時間後に弾性ゲルが形成された。
圧縮時弾性のヤング率＝３×１０３Pa
圧縮時極限強度＝３９５×１０３Pa
極限強度における変形率＝９５％
靭性＝１４６７０J.m-3
【００７６】
実施例２６
酸形態のコンドロイチン硫酸の調製
蒸留水中コンドロイチン硫酸（５００mg，１．１mmol）の１％溶液を調製した。溶液を５°C に冷却し，１．２mlのAmberlite IR 120 Na (H+) Catexを添加した。反応混合物を５°C で２４時間撹拌した。Catexを濾別し，生成物を凍結し，凍結乾燥した。ＤＳＭＯ中の溶解度を試験し，十分であることが判明した。
【００７７】
実施例２７
脱アセチル化コンドロイチン硫酸の調製
ＤＭＳＯ中で，酸形態のコンドロイチン硫酸の１％溶液を調製した（２００mg，０．４４mmol，Ｍｗ≦４０kDa）。溶液を窒素気流により脱気した。１０．６mLのヒドラジン水和物及び３当量のヒドラジン硫酸を添加した。反応混合物を窒素存在下，６０°Cで２４時間撹拌した。次いで，反応混合物にＮａＨＣＯ３を添加した。生成物をＩＰＡで沈殿させることにより単離した。
ＤＳ＝１０％（ＮＭＲにより測定），Ｍｗ＝１．８×１０４g.mol-1（ＳＥＣＭＡＬＬＳにより測定）
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，１％ＮａＯＤ  ｖ  Ｄ２Ｏ，δppm）：３．０１  （１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐，ｂｓ）ＨＳＱＣ（５００MHz，Ｄ２Ｏ，δppm）：クロスピーク：３．４２〜５２．２ppm
【００７８】
実施例２８
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドと脱アセチル化コンドロイチン硫酸との架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（２０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の８％溶液に，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，ｃ＝０．９％w/v）中，脱アセチル化コンドロイチン硫酸（２当量，ＤＳ＝１０％，Ｍｗ＝１．８×１０４g.mol-1，結合部位比＝１／０．８５）の８％溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌し，０．５時間後に粘度増加が見られ，３時間後に弾性ゲルが形成された。
圧縮時弾性のヤング率＝３×１０３Pa
圧縮時極限強度＝７７４×１０３Pa
極限強度における変形率＝９５％
靭性＝１６４８９J.m-3
【００７９】
実施例２９
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドとプロポキシアミンとの架橋
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（５０mg，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の１０％溶液に，プロポキシアミン塩酸塩（０．１２当量，結合部位比１／１）のＰＢＳ溶液を添加し，暫くすると，ゲルが形成された（Ｔｇ＝１１０s）。
圧縮時弾性のヤング率＝８×１０３Pa
圧縮時極限強度＝７４×１０３Pa
極限強度における変形率＝６５％
靭性＝３７６８J.m-3
【００８０】
実施例３０
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒドとヒアルロン酸のアミノプロポキシル誘導体との架橋反応におけるゲル化速度の測定
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（１０ｍｇ，ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1）の４％試料と，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，ｃ＝０．９％w/v）中，ヒアルロン酸のアミノプロポキシル誘導体（１当量，ＤＳ＝２５％，Ｍｗ＝６６kDa）の４％溶液を用いてゲル化速度を測定した。第１の巨視的ゲルネットワークが形成されるときのゲル化時間，すなわち段階は（Ｔｇ＝９７s，図４）であると判定した。
【００８１】
実施例３１
コンドロイチン硫酸の架橋α，β‐不飽和アルデヒドをベースとするハイドロゲル，及びヒアルロナンのα，β‐不飽和アルデヒドをベースとするハイドロゲルの機械的特性の比較
溶液１：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（ＤＳ＝２３％，Ｍｗ＝２．１×１０４g.mol-1，実施例１）の４％溶液。
溶液２：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，ヒアルロン酸のα，β‐不飽和アルデヒド（ＤＳ＝７％，Ｍｗ＝２．５×１０４g.mol-1）の４％溶液。
溶液３：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４０，ｃ＝０．９％w/v）中，ヒアルロン酸のアミノプロポキシル誘導体（ＤＳ＝２５％，Ｍｗ＝６６kDa）の４％溶液。
ハイドロゲルは，以下の組み合せ：溶液１＋溶液３（試料Ａ）及び溶液２＋溶液３（試料Ｂ）を等体積比で混合することにより，上記溶液から調製した。試料Ａ及びＢを室温で３時間熟成させた。次いで，材料の機械的特性，すなわち圧縮時弾性のヤング率，圧縮時極限強度，及び極限強度での変形率を測定した（表２）。
表２：コンドロイチン硫酸に由来する架橋α，β‐不飽和アルデヒドをベースとするハイドロゲル，及びヒアルロン酸に由来する架橋α，β‐不飽和アルデヒドをベースとするハイドロゲルの機械的特性の比較
2018519391.tif 000013
測定したデータから，コンドロイチン硫酸誘導体（試料Ａ）において，この誘導体から調製したハイドロゲルはヒアルロン酸誘導体（試料Ｂ）と比較して剛性が高く，変形率が低いことから，置換度がより高い材料の使用が有利であることが示されている。試料Ａ，Ｂが同じ分子量であり，同じ条件下で分析されたため，この事実は高い架橋密度の結果であると考えられ，それは修飾多糖構造中のα，β‐不飽和アルデヒドの分子量は同じであるが置換度は高いことと直接関連している。
【００８２】
実施例３２
コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド存在下での３Ｔ３線維芽細胞の生存率試験
試験物質，コンドロイチン硫酸のα，β‐不飽和アルデヒド（ＤＳ＝２０％，Ｍｗ＝４０kDa）を完全３Ｔ３培地に溶解した。この溶液を０．２２μmフィルターで濾過した。試験した溶液の最終試験濃度は１０，１００，５００及び１０００μg.mL-1であった。密度３０００細胞個／ウェルの３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに播種した。処理に先立って，細胞を完全培地中で２４時間培養した。３‐［４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル］‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミドを用いる分光光度法（ＭＴＴ法）により，０，２４，４８，７２時間の間隔で細胞生存率を評価した。実験全体で未処理対照及びブランク試料のセットを追加した。測定された光学密度データは，時間Ｔ０時間での対照に対するパーセンテージ形式に変換し（未処理対照Ｔ０の光学密度に対する処置試料の光学濃度の割合に１００を乗じる），平均の標準誤差（ＳＥＭ）を算出した。試験の結果を図３にグラフで示す。
【図１Ａ】
2018519391.tif 000017
【図１Ｂ】
2018519391.tif 000018
【図１Ｃ】
2018519391.tif 000019
【図１Ｄ】
2018519391.tif 000020
【図１Ｅ】
2018519391.tif 000021
【図１Ｆ】
2018519391.tif 000022
【図２】
2018519391.tif 000023
【図３】
2018519391.tif 000024
【図４】
2018519391.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月2日(2018.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式I又は一般式IIに従って修飾された少なくとも１つのガラクトピラノース環をポリマー鎖の一部として有し，且つ，前記ガラクトピラノース環が，４位と，前記一般式Iに従って６位のアルデヒドと共役しているか又は前記一般式IIに従ってその水和形態に隣接している５位とにおいて二重結合を含む硫酸化多糖の誘導体であって，
2018519391.tif 000026
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ａｃであることを特徴とする硫酸化多糖の誘導体。
【請求項２】
前記多糖はコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナンならびにこれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩から成る群より選択されることを特徴とする請求項１記載の硫酸化多糖の誘導体。
【請求項３】
前記多糖の分子量は１×１０３〜５×１０４g.mol-1の範囲であり，置換度は１〜４０％の範囲であることを特徴とする請求項１又は２記載の硫酸化多糖の誘導体。
【請求項４】
前記置換度は１０〜２５％の範囲であることを特徴とする請求項３記載の硫酸化多糖の誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項で定義した前記硫酸化多糖の誘導体の調製方法であって，前記硫酸化多糖は天然形態では水溶性であり，一般構造式（III）の，４位で硫酸化され，α（１→３）又はβ（１→３）Ｏ‐グリコシド結合を介してポリマー鎖状に結合する少なくとも１つのガラクトピラノース単位を含み，
2018519391.tif 000027
式中，ＲはＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＨ，Ｏ‐ＳＯ２‐ＯＮａ，又はＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ３であり，Ｒ１はＨ又はＮａであり，６位でアルデヒドへと酸化し，酸化直後に酸化誘導体が同じ反応混合物中で脱離し，請求項１〜４いずれか１項で定義した前記硫酸化多糖の誘導体を形成することを特徴とする調製方法。
【請求項６】
分子量が１×１０４〜５×１０６g.mol-1の範囲内にある硫酸化多糖を使用することを特徴とする請求項５記載の調製方法。
【請求項７】
コンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナン，及びそれらの薬学的に許容可能な誘導体及び／又は塩からなる群より選択される硫酸化多糖を使用することを特徴とする請求項５又は６記載の調製方法。
【請求項８】
前記酸化は，水又は無機塩の水溶液中で，５〜２５°Cで，Ｒ３‐ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系により行い，式中，Ｒ３は水素又はＮ‐アセチルであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
前記硫酸化多糖の二量体に対して，Ｒ３‐ＴＥＭＰＯのモル量は０．０１〜０．２当量であり，ＮａＣｌＯのモル量は０．１〜２．０当量の範囲内にあることを特徴とする請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
前記無機塩の水溶液はアルカリ金属塩及び／又は緩衝液を含む水溶液であることを特徴とする請求項８又は９記載の調製方法。
【請求項１１】
前記緩衝液がリン酸緩衝液であることを特徴とする請求項１０記載の調製方法。
【請求項１２】
前記脱離は，５〜２５°Cで，４位で硫酸化された前記ガラクトピラノースサブユニット中の飽和Ｃ６‐アルデヒドの単離をせずに，進行することを特徴とする請求項５〜１１のいずれか１項記載の調製方法。
【請求項１３】
前記誘導体は前記一般式Ｒ２‐ＮＨ２のアミンと反応し，式中，Ｒ２はアルキル，アリール，ヘテロアリール，直鎖もしくは分枝Ｃ１‐Ｃ３０鎖であり，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項で定義した誘導体の修飾方法。
【請求項１４】
前記アミンは生物学的に活性なアミン，主にアミノ酸又はペプチドであることを特徴とする請求項１３記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記誘導体は，遊離アミノ基を有する生物学的に許容可能なポリマーであるアミンと反応することを特徴とする請求項１３記載の誘導体の修飾方法。
【請求項１６】
前記アミノ基はゼラチン，キトサン，脱アセチル化ヒアルロン酸及び脱アセチル化コンドロイチン硫酸から成る群より選択されるポリマーの直接的な一部であることを特徴とする請求項１５記載の修飾方法。
【請求項１７】
前記アミノ基はアミノ，ヒドラジン，ヒドラジド，アミノアルコキシ，ヒドロキシル，カルボキシル，チオール基，又はそれらの任意の組み合わせを含むリンカーを介してポリマーに結合することを特徴とする請求項１５記載の修飾方法。
【請求項１８】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド，又はポリマーの遊離アミノ基の量は前記硫酸化多糖の二量体に対して０．０５〜３．０当量の範囲内であることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１９】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド，又は遊離アミノ基を含むポリマーとの前記反応は水，リン酸緩衝液，又は水‐有機溶媒系中で，２０〜６０°Cの範囲の温度で１０分〜１５０時間かけて進行することを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項記載の修飾方法。
【請求項２０】
前記有機溶媒は水混和性アルコール及び水混和性で極性且つ非プロトン性溶媒から成る群より選択され，前記混合液中の水分は少なくとも５０体積％であることを特徴とする請求項１９記載の修飾方法。
【請求項２１】
前記水混和性アルコールがイソプロパノール又はエタノールであり，前記非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドであることを特徴とする請求項２０記載の修飾方法。
【請求項２２】
前記誘導体は，アルキルアミン，アリールアミン，ヘテロアルキルアミン，ヘタリールアミン，アミノ酸，ペプチド，遊離アミノ基を有するポリマー，ヒドラジン，ヒドロキシルアミン，ヒドラジド，セミカルバジド又はチオセミカルバジドから成る群より選択される水溶性で生体適合性の二官能性及び多官能性Ｎ‐求核剤と反応し，前記誘導体が架橋することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の誘導体の修飾方法。
【請求項２３】
前記Ｎ‐求核剤はヒドラジド，脱アセチル化多糖，又はアルコキシアミンであり，前記反応はリン酸緩衝液中で進行することを特徴とする請求項２２記載の修飾方法。
【請求項２４】
化粧品及び製薬分野において，ｐＨ値を変えることにより放出が制御される生物学的に活性な物質の担体としての，請求項１〜４のいずれか１項で定義した誘導体の使用。
【請求項２５】
生物医学的用途，及び組織工学用又は再生医療用足場の形成のための生体適合性材料としての，請求項１１〜２３のいずれか１項で定義した方法により修飾した誘導体の使用。
【国際調査報告】
2018519391.tif 000028
2018519391.tif 000029