(57)【要約】ストレプトマイセス・モバラエンシス由来の野生型トランスグルタミナーゼによって結合しない抗体を結合できる、トランスグルタミナーゼバリアント。
2018531935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体結合体を作製する方法であって：
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むバリアントのトランスグルタミナーゼの存在下において、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬および薬物からなる群から選択される成分ならびに一級アミンを含むアミンドナー化合物と抗体を混合すること、ただし、バリアントのトランスグルタミナーゼは、（Ａ）Ｅ３００Ａ、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する；および
（ｂ）バリアントのトランスグルタミナーゼが、抗体におけるグルタミンの側鎖カルボキサミドと、アミンドナー化合物の一級アミンとの間のアミド結合の形成を触媒することを可能にし、それによって抗体結合体を作製すること、を含む方法。
【請求項２】
抗体が、２９５番目にグルタミン、および２９７番目にグリコシル化されたアスパラギン（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を有する、ＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バリアントのトランスグルタミナーゼが、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アミンドナー化合物における成分が、薬物（好ましくはＤＮＡアルキル化剤、チューブリシン、オーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、またはメイタンシノイド化合物）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アミンドナー化合物が、式（Ｉ）
【化１】
2018531935.tif 000033
によって表される構造を有し、式中、Ｄは、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬または薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アミンドナー化合物が、式（Ｉａ）
【化２】
2018531935.tif 000034
によって表される構造を有し、
式中、Ｄは薬物（好ましくはＤＮＡアルキル化剤、チューブリシン、オーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、またはメイタンシノイド化合物）であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から独立して選択され；
ｐは１、２、３または４であり；
ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは１、２、３、４または５であり；かつ
ｓは０または１である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体結合体を作製する方法であって：
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むバリアントのトランスグルタミナーゼの存在下において、抗体を第１の化合物と混合すること、ここで第１の化合物は、一級アミンおよび第１の反応性官能基を有するアミンドナー化合物であり、バリアントのトランスグルタミナーゼは、（Ａ）Ｅ３００Ａ、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する；
（ｂ）バリアントのトランスグルタミナーゼが、抗体のグルタミンの側鎖カルボキサミドと、第１の化合物の一級アミンとの間のアミド結合の形成を触媒することを可能にし、抗体および第１の化合物の付加体を作製すること；
（ｃ）付加体を、第２の反応性官能基ならびに、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬および薬物からなる群から選択される成分を有する第２の化合物と接触させること；ここで、第２の反応性官能基は、第１の反応性官能基と反応し、それらの間に共有結合を形成できる；および
（ｄ）第１および第２の反応性官能基が反応してそれらの間に共有結合を形成するのを可能にし、それによって抗体結合体を作製すること、を含む方法。
【請求項８】
抗体が、２９５番目にグルタミン、および２９７番目にグリコシル化されたアスパラギン（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を有する、ＩｇＧ抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
バリアントのトランスグルタミナーゼが、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
第１の化合物が、式（ＩＩ）
【化３】
2018531935.tif 000035
によって表される構造を有し、式中、Ｒ’は、
【化４】
2018531935.tif 000036
【化５】
2018531935.tif 000037
から選択され；第２の化合物が、式（ＩＩＩ）
【化６】
2018531935.tif 000038
によって表される構造を有し、式中、Ｒ”は、
【化７】
2018531935.tif 000039
【化８】
2018531935.tif 000040
から選択され；
Ｄは薬物（好ましくはＤＮＡアルキル化剤、チューブリシン、オーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、またはメイタンシノイド化合物である）であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から独立して選択され；
ｐは１、２、３または４であり；
ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは１、２、３、４または５であり；かつ
ｓは０または１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むバリアントのトランスグルタミナーゼ、ただし、バリアントのトランスグルタミナーゼは、（ａ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（ｂ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（ｃ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する。
【請求項１２】
Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａアミノ酸置換の特徴を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のバリアントのトランスグルタミナーゼ。
【請求項１３】
Ｅ２４９Ｑアミノ酸置換の特徴を有し、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のバリアントのトランスグルタミナーゼ。
【請求項１４】
Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａアミノ酸置換の特徴を有し、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のバリアントのトランスグルタミナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２３６２７４号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、この開示は参照によって本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表
配列番号１から配列番号１２（これらは、本明細書で開示される核酸配列および／またはアミノ酸配列を含む）を含む、「12610WOPCT_ST25」という名前の配列表は、参照によって、その全体が本明細書に取り込まれる。配列表は、ＡＳＣＩＩテキスト形式で、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、本明細書と共に提出され、したがって紙の形式およびコンピュータで読み取り可能な形式の両方を構成する。配列表は、２０１５年９月２４日に、ＰａｔｅｎｔＩｎ３．５を用いて最初に作成され、約２５ＫＢのサイズであった。
【０００３】
本発明の背景
抗体は、医学およびバイオテクノロジーにおいて多くの応用がなされる。いくつかの応用において、抗体を別の化学成分と結合させる（すなわち、抗体をそのような成分と共有結合させる）ことが望ましい。例えばこの成分は、別のタンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬（例えば、ビオチンまたは蛍光ラベル）または薬物であり得る。
【０００４】
結合をもたらす多くの方法が開示されている。酵素であるトランスグルタミナーゼ、特にストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)由来の細菌性トランスグルタミナーゼ（配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、以下でＢＴＧと呼ばれる）は、抗体および他のタンパク質を結合するのに使用されている。
【０００５】
ＢＴＧは、アミド基転移反応において、第１のタンパク質におけるグルタミン（アミンアクセプター）のカルボキサミド側鎖と、第２のタンパク質におけるリジン（アミンドナー）のε−アミノ基との間に、アミド結合を形成できる。特異性について、これはグルタミン残基に関して選択的であり、タンパク質ループの柔軟な部分に位置し、特定のアミノ酸に隣接することを必要とする。逆に、ＢＴＧはリジン残基に関して許容的である：ＢＴＧは、リジンε−アミノ代替物として、非タンパク質源（アルキレンアミノ化合物など）由来のアミノ基でさえ受容する。Fontana et al. 2008参照。
【０００６】
ＩｇＧアイソタイプの抗体は多くのグルタミンを有する（正確な数はアイソタイプに依存するが、重鎖定常領域単独で９個以上）。しかしながら、天然の抗体において、それらのグルタミンは全て、ＢＴＧ反応性ではなく（すなわち、トランスグルタミナーゼによってアミド基転移されない）、抗体のいくつかの修飾が、反応性を誘導するのに必要である。通常、抗体は、重鎖のアスパラギン２９７（Ｎ２９７）においてグルコシル化される（Ｎ結合型グリコシル化）。Jeger 2009およびJeger et al. 2010は、Ｎ２９７Ａ置換によるグリコシル化部位の除去、またはＰＮＧａｓｅ Ｆ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ）などの酵素を用いた、翻訳後の酵素的脱グリコシル化のいずれかによる、抗体の脱グリコシル化が、近くのグルタミン２９５（Ｑ２９５）にＢＴＧ反応性を与えることを開示した（抗体定常領域におけるアミノ酸位置の参照は、Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest," 5th ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991（以後、「Kabat」）に記載の、ＥＵインデックスによるナンバリングを用いている）。彼らはさらに、Ｎ２９７Ｑ置換が、グリコシル化を除外するだけでなく、２９７番目の位置に第２のグルタミン残基（すなわちアミンアクセプター）を導入することを示した。したがって、単純な脱グリコシル化は、抗体ごとに２つのＢＴＧ反応性グルタミン残基（Ｑ２９５において、重鎖ごとに１つ）を生成し、Ｎ２９７Ｑ置換は、４つのＢＴＧ反応性グルタミン残基（Ｑ２９５およびＱ２９７において、重鎖ごとに２つ）を生成する。
【０００７】
ＢＴＧのグルタミン選択性を、そのアミノ酸配列を変化させることによって、調節できる。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と機能する場合、Norskov-Lauritsen et al. 2009は、ｈＧＨについて、Ｇｌｎ１４１と比較したＧｌｎ４０に対するＢＴＧの選択性が、最大で３つの塩基性または酸性アミノ酸残基を他の塩基性または酸性アミノ酸に置換することによって、改善され得ることを見出した。異なる生物であるストレプトベルチシリウム・ラダカヌム(Streptoverticillium ladakanum)と機能する場合、Hu et al. 2009, 2010aおよび2010bは、Ｇｌｎ１４１におけるそのトランスグルタミナーゼの選択性が、特定の位置のアミノ酸配列を改変することによって、またはそのＮ末端に残基を付加することによって、増加し得ることを報告した。
【０００８】
Tagami et al. 2009およびYokoyama et al. 2010は、アミンアクセプターとしてのジペプチドＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミニルグリシン（および、Tagami et al. 2009の場合において、オボアルブミン）に対するＢＴＧの比活性における変異の効果を調べた。作製された置換および比活性に対するそれらの効果をそれぞれ、その表１および表２〜４に要約している。グルタミン含有タグにおける別の開示について、2015年10月2日に出願された、Rao-Naikの米国仮特許出願第62/236,282号も参照。
【０００９】
ＢＴＧの基質特異性または活性を変化させるＢＴＧのアミノ酸配列の修飾と相補的な手法として、抗体の構造を、抗体をＢＴＧ反応性にするように、修飾できる。上述のJeger 2009およびJeger et al. 2010によって開示される修飾に加えて、グルタミン含有ペプチドまたは「タグ」を抗体に付加し、ＢＴＧ反応性の外来性グルタミンを導入できる。Dorywalska et al. 2015; Pons et al. 2013およびRao-Naik 2015参照。タグは、抗体に挿入または置換されたグルタミンであり得（すなわち、単一アミノ酸挿入または置換）、またはタグは、抗体鎖（必ずではないが、一般に重鎖）のＮ末端、中間もしくはＣ末端に挿入された、グルタミン含有ポリペプチドであり得る。
【００１０】
抗体結合体のうち、医学分野で強い関心を集めている種類は、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ、イムノコンジュゲートとも呼ばれる）である。ＡＤＣにおいて、治療薬（薬物、ペイロードまたは弾頭(warhead)とも呼ばれる）は、その抗原ががん細胞によって発現される（腫瘍関連抗原）抗体と共有結合している。抗体は、抗原と結合することによって、ＡＤＣをがん部位に送達する。そこで、共有結合の切断または抗体の分解が、治療薬の放出を導く。逆にＡＤＣが血中を循環している場合、治療薬は、抗体との共有結合のため、不活性に保たれる。その局在化した放出のため、ＡＤＣにおける治療薬は、通常の化学療法剤よりもはるかに強力（細胞傷害性）であり得る。要約すると、ＡＤＣは３つの構成要素を含む：（１）抗体、（２）薬物、および（３）抗体と薬物を共有結合的に連結している、リンカー。一般的なＡＤＣに関する総説について、Schrama et al. 2006参照。ＡＤＣのＢＴＧを介する調製に関する開示は：Dennler et al. 2014、Hu et al. 2015、Innate Pharma 2013、Jeger 2009、Jeger et al. 2010、Lhospice et al. 2015、Pons et al. 2013、およびStrop et al., 2013を含む。
【００１１】
他のトランスグルタミナーゼの開示（一般的に、タンパク質（抗体を含む）の標識化または修飾に関する）は：Bregeon 2014、Bregeon et al. 2013および2014、Chen et al. 2005、Fischer et al. 2014、Kamiya et al. 2011、Lin et al. 2006、Mero et al. 2009、Mindt et al. 2008、Sato 2002、Sato et al. 2001、Schlibi et al. 2007、ならびにSugimura et al. 2007を含む。
【００１２】
第一著者または発明者および年によって本明細書に引用された文書の完全な引用を、本明細書の最後に記載する。
【発明の概要】
【００１３】
原理的に、ＢＴＧは抗体結合体を作製する魅力的な物質であるが、実用上の制限は、いくつかの様式（脱グリコシル化またはＢＴＧ受容性グルタミンを含有するタグの付加）において、グルタミンをアミンアクセプターとして利用できるように抗体を修飾する必要があることである。
【００１４】
本発明は、バリアントのトランスグルタミナーゼ、およびこれを用いて抗体結合体を作製する方法を提供する。本発明の方法は、いかなる特定の抗体にも限定されないが、天然状態の抗体（すなわち、外来性のＢＴＧ反応性グルタミンを導入するために、または内在性グルタミンにＢＴＧ反応性を与えるために、修飾されておらず、ＢＴＧと結合できない抗体）を結合するのに、特に有利に使用される。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、抗体結合体を作製する方法を提供し、該方法は：
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一（好ましくは少なくとも９５％同一、およびより好ましくは１００％同一）のアミノ酸配列を含むバリアントのトランスグルタミナーゼの存在下において、一級アミンならびに、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬および薬物からなる群から選択される成分を含むアミンドナー化合物と、抗体を混合すること、ただし、バリアントのトランスグルタミナーゼは、（Ａ）Ｅ３００Ａ、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する；および
（ｂ）バリアントのトランスグルタミナーゼが、抗体におけるグルタミンの側鎖カルボキサミドと、アミンドナー化合物の一級アミンとの間のアミド結合の形成を触媒することを可能にし、それによって抗体結合体を作製すること、を含む。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、抗体結合体を作製する別の方法を提供し、該方法は：
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一（好ましくは少なくとも９５％同一、およびより好ましくは１００％同一）のアミノ酸配列を含むバリアントのトランスグルタミナーゼの存在下において、抗体を第１の化合物と混合すること、ここで第１の化合物は、一級アミンおよび第１の反応性官能基を有するアミンドナー化合物であり、バリアントのトランスグルタミナーゼは、（Ａ）Ｅ３００Ａ、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換の特徴を有する；
（ｂ）バリアントのトランスグルタミナーゼが、抗体のグルタミンの側鎖カルボキサミドと、第１の化合物の一級アミンとの間のアミド結合の形成を触媒することを可能にし、抗体および第１の化合物の付加体を作製すること；
（ｃ）付加体を、第２の反応性官能基ならびに、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬および薬物からなる群から選択される成分を有する第２の化合物と接触させること；ここで、第２の反応性官能基は、第１の反応性官能基と反応し、それらの間に共有結合を形成できる；および
（ｄ）第１および第２の反応性官能基が反応し、それらの間に共有結合を形成するのを可能にし、それによって抗体結合体を作製すること、を含む。
【００１７】
前記２つの方法のいずれかにおいて、抗体は、好ましくは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによってナンバリングされた、２９５番目にグルタミン（Ｑ２９５）および２９７番目にグリコシル化されたアスパラギン（Ｎ２９７）を有する、ＩｇＧ抗体である。そのような抗体は、ＢＴＧによってアミド基転移されないが、本発明のバリアントのトランスグルタミナーゼによって、Ｑ２９５においてアミド基転移される。
【００１８】
前記２つの方法のいずれかにおいて、バリアントのトランスグルタミナーゼは、好ましくは、（Ｂ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（Ｃ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（Ｄ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択される、アミノ酸置換の特徴を有する。
【００１９】
成分（場合により、第１の化合物または第２の化合物における成分）がタンパク質である場合、得られる結合体は融合タンパク質である。成分が放射性同位体である場合、得られる結合体は放射線療法に使用され得る。成分はアッセイ試薬（蛍光標識またはビオチンなどのリガンドなど）であり得、この場合、結合体は診断応用または分析応用に使用され得る。好ましくは、成分は薬物であり、この場合、生成物は抗体−薬物結合体であり、医学的処置（特にがんの処置）に使用され得る。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１と少なくとも９０％同一（好ましくは少なくとも９５％同一、およびより好ましくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む、バリアントのトランスグルタミナーゼを提供し、前記バリアントのトランスグルタミナーゼは、（ａ）Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ、（ｂ）Ｅ２４９Ｑ、ならびに（ｃ）Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａからなる群から選択される、アミノ酸置換の特徴を有するという条件を伴う。ある好ましい実施態様において、置換の特徴は、Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａである。別の好ましい実施態様において、置換の特徴は、Ｅ２４９Ｑである。さらなる別の好ましい実施態様において、置換の特徴はＥ３００ＡおよびＹ３０２Ａである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、一段階過程および二段階過程とそれぞれ呼ばれる２つの過程を経由する、結合体のＢＴＧを介する調製を、模式的に示す。
【００２２】
【図２】図２は、様々な抗体と、Ｍ８と名付けられたトランスグルタミナーゼバリアントとの結合の結果を示す、ウエスタンブロットである。
【００２３】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、抗グリピカン３抗体単独、およびバリアントＭ８を用いて結合した抗グリピカン３抗体の、トリプシン消化フラグメントを比較する。
【００２４】
【図４】図４は、２つの比較抗体／対照抗体における結果を伴う、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４と名付けられたトランスグルタミナーゼバリアントと結合した抗体の、ウエスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のバリアントのトランスグルタミナーゼは、ストレプトマイセス・モバラエンシス(S. mobaraensis)のトランスグルタミナーゼに対して反応しない抗体と結合できる。これは、いくつかの様式で抗体を遺伝子操作または修飾する必要性を回避するため、重要な利点である。
【００２６】
本発明のあるトランスグルタミナーゼバリアント（Ｍ８と命名）は、ストレプトマイセス・モバラエンシスの野生型トランスグルタミナーゼの配列（配列番号１）に対して、単一の変異（Ｅ３００Ａ）を有する。バリアントＭ８のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。Tagami et al. 2009は、３０を超える微生物トランスグルタミナーゼバリアントの中で、Ｅ３００Ａバリアントを開示したが、ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙまたはオボアルブミンに対する比活性について評価したのみであった。
【００２７】
本発明の別のトランスグルタミナーゼバリアント（Ｍ１０と命名）は、ストレプトマイセス・モバラエンシスの野生型トランスグルタミナーゼの配列（配列番号１）に対して、二重変異（Ｉ２４０ＡおよびＰ２４１Ａ）を有する。バリアントＭ１０のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００２８】
本発明のさらなる別のトランスグルタミナーゼバリアント（Ｍ１２と命名）は、ストレプトマイセス・モバラエンシスの野生型トランスグルタミナーゼの配列（配列番号１）に対して、単一の変異（Ｅ２４９Ｑ）を有する。バリアントＭ１２のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２９】
本発明のさらなる別のトランスグルタミナーゼバリアント（Ｍ１４と命名）は、ストレプトマイセス・モバラエンシスの野生型トランスグルタミナーゼの配列（配列番号１）に対して、二重変異（Ｅ３００ＡおよびＹ３０２Ａ）を有する。バリアントＭ１４のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００３０】
バリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４は、それぞれの特徴的な置換（ａ）Ｅ３００Ａ、（ｂ）Ｉ２４０Ａ／Ｐ２４１Ａ、（ｃ）Ｅ２４０Ｑまたは（ｄ）Ｅ３００Ａ／Ｙ３０２Ａが保存されるという条件で、保存的な置換を有し得る。バリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４の、そのような保存的な修飾型は、本発明の範囲に含まれる。「保存された修飾」または「保存された置換」は、ポリペプチドについて、そのアミノ酸が類似の側鎖を有する別のアミノ酸に置換されることを意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは当分野で公知である。そのようなファミリーは、塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（トレオニン、バリン、イソロイシン）、低分子側鎖（グリシン、アラニン、セリン）、鎖配向が変化している側鎖（グリシン、プロリン）および芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸を含む。複数の保存的な置換／修飾が存在し得る。好ましくは、バリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４の保存的な修飾型は、それぞれの修飾されていない配列と、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、あるいは１〜３個の保存的なアミノ酸置換を有する。
【００３１】
ＢＴＧバリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４はさらに、配列番号８（ＦＲＡＰ）におけるテトラペプチドのＮ末端伸長を含み得る。Yokoyama et al. 2010は、Ｓ１９９Ａ置換に関連して、ＦＲＡＰ伸長が比活性に正の影響を与え得ることを開示する。
【００３２】
ＢＴＧバリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４はさらに、配列番号３のアミノ酸残基３３６〜４４１に例示されるように、そのＣ末端において、ポリヒスチジンペプチド伸長を含み得る。ポリヒスチジンペプチドは、精製の目的において有用なタグであり、酵素活性に影響を与えない。典型的に、ポリヒスチジンペプチドは６〜８残基長であり、好ましくは６残基長である。
【００３３】
本発明の方法によって結合され得る抗体は、以下の抗原を認識する抗体を含む：メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４（Ｏ８Ｅとしても知られる）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、グリピカン−３、ＲＧ１、フコシル−ＧＭ１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４４。抗体は、動物（例えば、マウス）、キメラ、ヒト化、または好ましくはヒト抗体であり得る。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体（特にヒトモノクローナル抗体）である。いくつかの上記抗原に対するヒトモノクローナル抗体の調製が、Korman et al., US 8,609,816 B2（2013；Ｂ７Ｈ４、０８Ｅとしても知られる；特に抗体２Ａ７、１Ｇ１１および２Ｆ９）；Rao-Naik et al., 8,097,703 B2（2012；ＣＤ１９；特に抗体５Ｇ７、１３Ｆ１、４６Ｅ８、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３および３Ｃ１０）；King et al., US 8,481,683 B2（2013；ＣＤ２２；特に抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６）；Keler et al., US 7,387,776 B2 （2008；ＣＤ３０；特に抗体５Ｆ１１、２Ｈ９および１７Ｇ１）；Terrett et al., US 8,124,738 B2（2012；ＣＤ７０；特に抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７および６９Ａ７）；Korman et al., US 6,984,720 B1（2006；ＣＴＬＡ−４；特に抗体１０Ｄ１、４Ｂ６および１Ｅ２）；Vistica et al., US 8,383,118 B2（2013、フコシル−ＧＭ１、特に抗体５Ｂ１、５Ｂ１ａ、７Ｄ４、７Ｅ４、１３Ｂ８および１８Ｄ５）；Korman et al., US 8,008,449 B2（2011；ＰＤ−１；特に抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４）；Huang et al., US 2009/0297438 A1 (2009；ＰＳＭＡ、特に抗体１Ｃ３、２Ａ１０、２Ｆ５、２Ｃ６）；Cardarelli et al., US 7,875,278 B2（2011；ＰＳＭＡ；特に抗体４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３）；Terrett et al., US 8,222,375 B2（2012；ＰＴＫ７；特に抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８）；Terrett et al., US 8,680,247 B2（2014；グリピカン−３；特に抗体４Ａ６、１１Ｅ７および１６Ｄ１０）；Harkins et al., US 7,335,748 B2（2008；ＲＧ１；特に抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）；Terrett et al., US 8,268,970 B2（2012；メソテリン；特に抗体３Ｃ１０、６Ａ４および７Ｂ１）；Xu et al., US 2010/0092484 A1（2010；ＣＤ４４；特に抗体１４Ｇ９.Ｂ８.Ｂ４、２Ｄ１.Ａ３.Ｄ１２および１Ａ９.Ａ６.Ｂ９）；Deshpande et al., US 8,258,266 B2（2012；ＩＰ１０；特に抗体１Ｄ４、１Ｅ１、２Ｇ１、３Ｃ４、６Ａ５、６Ａ８、７Ｃ１０、８Ｆ６、１０Ａ１２、１０Ａ１２Ｓおよび１３Ｃ４）；Kuhne et al., US 8,450,464 B2（2013；ＣＸＣＲ４；特に抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２）；およびKorman et al., US 7,943,743 B2（2011；ＰＤ−Ｌ１；特に抗体３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７、および１３Ｇ４）に開示されており；これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３４】
抗体結合体のＢＴＧを介する調製は、図１に模式的に示されるように、一段階過程または二段階過程によるものであり得る。一段階過程において、ＢＴＧは、アミン受容体として作用する抗体上のグルタミンカルボキサミド、およびアミンドナー化合物Ｈ２Ｎ−Ｌ−Ｄ（ここでＬはリンカー成分であり、Ｄはタンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬または薬物である）と結合し、結合体を直接形成する。二段階過程において、ＢＴＧは、アミン受容体として作用する抗体のグルタミンカルボキサミドと、アミンドナー化合物である第１の化合物Ｈ２Ｎ−Ｌ’−Ｒ’（ここでＬ’はリンカー成分であり、Ｒ’は第１の反応性官能基である）との間の、最初のアミド基転移付加体の形成を触媒する。次に、付加体を、第２の化合物Ｒ”−Ｌ”−Ｄ（ここでＲ”は、Ｒ’と反応できる第２の反応性官能基であり、Ｌ”はリンカー成分であり、Ｄは上記で定義されている）と反応させる。一段階過程は酵素過程、二段階過程は化学−酵素過程と呼ばれることもある。
【００３５】
アミンドナー（Ｈ２Ｎ−Ｌ−ＤまたはＨ２Ｎ−Ｌ’−Ｒ’）は、グルタミンカルボキサミドと抗体におけるリジンのε−アミノ基との間の、望ましくないアミド基転移を抑えるため、過剰に用いられることが多い。成分Ｄが高価または入手困難である場合、過剰の使用は非実用的であり得る。このような場合に、二段階過程が好ましいことがある。
【００３６】
好ましい実施態様において、一段階過程のアミンドナー化合物は式（Ｉ）で表される：
【化１】
2018531935.tif 000003
式中、Ｄは、タンパク質、放射性同位体、アッセイ試薬または薬物である。
【００３７】
さらに好ましくは、一段階の方法を用いて、アミンドナー化合物が式（Ｉａ）によって表される構造を有し得るように、ＡＤＣを作製する：
【化２】
2018531935.tif 000004
式中、
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基(self-immolating group)であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から独立して選択され；
ｐは１、２、３または４であり；
ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは１、２、３、４または５であり；かつ
ｓは０または１である。
【００３８】
式（Ｉａ）において、−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、その長さがｐの値によって決定される、ポリペプチドを表す（ｐが１の場合ジペプチド、ｐが３の場合テトラペプチドなど）。ＡＡａは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在し、そのカルボキシ基は、薬物Ｄ（または、もしあれば自己犠牲基Ｔ）のアミン窒素とペプチド（アミド）結合を形成する。逆に、最後のＡＡｂは、ポリペプチドのアミノ末端に存在し、そのα−アミノ基は、
【化３】
2018531935.tif 000005
と、ｓがそれぞれ１であるか０であるかに依存して、ペプチド結合を形成する。好ましいポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、およびＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、Ｈ２Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ２Ｈのように、通常ＮからＣの方向に記載される。より好ましくは、ポリペプチドは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、またはＶａｌ−Ａｌａである。好ましくは、ポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、標的（がん）細胞の内部に見出される酵素（例えば、カテプシンおよび特にカテプシンＢ）によって切断可能である。
【００３９】
下付き文字ｓが１である場合、薬物−リンカー（Ｉａ）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基を含み、これは薬物−リンカー（Ｉａ）の溶解度を有利に改善し得、抗体との結合（水性媒体において実行される工程）を促進する。またＰＥＧ基は、抗体のバルクが、ペプチド切断酵素の作用と立体的に干渉しないように、抗体とペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−との間のスペーサーとして役立ち得る。
【００４０】
下付き文字ｔが０または１であることによって示されるように、自己犠牲基Ｔは、場合により存在する。自己犠牲基は、ＡＡａまたはＡＡｂからの切断が、場合により、自己犠牲基が自身を薬物Ｄから解離させ、薬物Ｄを遊離させ、その治療機能を発揮させることをもたらす、一連の反応を開始するような基である。存在する場合、自己犠牲基Ｔは、好ましくはｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基であり、この構造を以下に示し、ここでアスタリスク（＊）は、薬物Ｄのアミン窒素と結合しているＰＡＢＣの末端を表し、波線
【化４】
2018531935.tif 000006
は、ポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−と結合している末端を表す。
【化５】
2018531935.tif 000007
【００４１】
使用可能な別の自己犠牲基は、Feng, US 7,375,078 B2 (2008)に開示される、置換されたチアゾ−ルである。
【００４２】
二段階結合において、Ｒ’基およびＲ”基の多くの組合せが使用され得る。Ｒ’およびＲ”（または逆に、Ｒ”およびＲ’）の適切な組合せは：
（ａ）
【化６】
2018531935.tif 000008
などの、マイケル付加物を形成する、マレイミド基およびスルフヒドリル基；
（ｂ）
【化７】
2018531935.tif 000009
などの、「クリック」ケミストリーを介して環化付加生成物を形成する、ジベンゾシクロオクチン基およびアジド基；
（ｃ）
【化８】
2018531935.tif 000010
などの、アミドを形成する、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびアミン；および
（ｄ）
【化９】
2018531935.tif 000011
などの、オキシムを形成する、アルデヒドまたはケトン（ここで「アルキル」は、好ましくはＣ１−３アルキルである）およびヒドロキシルアミン、を含む。
【００４３】
したがって、Ｒ’は、
【化１０】
2018531935.tif 000012
【化１１】
2018531935.tif 000013
から選択され得；交換的に、Ｒ”は、
【化１２】
2018531935.tif 000014
【化１３】
2018531935.tif 000015
から選択され得る。
【００４４】
二段階過程における、適切なアミンドナー化合物Ｈ２Ｎ−Ｌ’−Ｒ’は、式（ＩＩ）
【化１４】
2018531935.tif 000016
において表され、式中、Ｒ’は上述で定義され、好ましくは、
【化１５】
2018531935.tif 000017
である。
【００４５】
対応する適切な化合物Ｒ”−Ｌ”−Ｄは、式（ＩＩＩ）
【化１６】
2018531935.tif 000018
において示され、式中、Ｒ”は上述で定義され、好ましくは、
【化１７】
2018531935.tif 000019
であり、ｒ、ｑ、ｓ、ＡＡｂ、ｐ、ＡＡａ、Ｔ、ｔ、およびＤは、式（Ｉａ）に関して上述で定義されたものと同じである。
【００４６】
結合体が、がん処置における使用を意図するＡＤＣである場合、薬物部分は、好ましくは、標的がん細胞の死を引き起こす細胞傷害性薬物である。ＡＤＣにおいて使用され得る細胞傷害性薬物は、以下の種類の化合物ならびにそれらの類似体および誘導体を含む：
（ａ）カリケアマイシン（例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464および3466参照）およびウンシアラマイシン（例えば、Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007); Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012);およびNicolaou et al., WO 2015/023879 A1 (2015)参照）などの、エンジイン；
（ｂ）チューブリシン(tubulysin)（例えば、Domling et al., US 7,778,814 B2 (2010); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013);およびCong et al., US 8,980,824 B2 (2015)参照）；
（ｃ）ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン（例えば、Boger, US 6,5458,530 B1 (2003); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013);およびZhang et al., US 8,852,599 B2 (2014)参照）の類似体などの、ＤＮＡアルキル化剤；
（ｄ）エポチロン（例えば、Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007)およびUS RE42930 E (2011)参照）；
（ｅ）オーリスタチン（例えば、Senter et al., US 6,844,869 B2 (2005)およびDoronina et al., US 7,498,298 B2 (2009)参照）；
（ｆ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（例えば、Howard et al., US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013);およびWO 2013/041606 A1 (2013)参照）；ならびに
（ｇ）ＤＭ１およびＤＭ４（例えば、Chari et al., US 5,208,020 (1993)およびAmphlett et al., US 7,374,762 B2 (2008)）などの、メイタンシノイド。
【００４７】
好ましくは、薬物は、ＤＮＡアルキル化剤、チューブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンジインまたはメイタンシノイド化合物である。具体例は：
【化１８】
2018531935.tif 000020
【化１９】
2018531935.tif 000021
【化２０】
2018531935.tif 000022
【化２１】
2018531935.tif 000023
【化２２】
2018531935.tif 000024
【化２３】
2018531935.tif 000025
【化２４】
2018531935.tif 000026
【００４８】
場合により、リンカーＬまたはＬ”との結合をもたらす官能基は、上記の最初の５つの薬物において、アミン（−ＮＨ２）基であり、後の２つの薬物において、メチルアミン（−ＮＨＭｅ）基である。
【００４９】
上記薬物部分は、一段階過程または二段階過程のいずれかで作製されたＡＤＣにおいて、使用され得る。
【００５０】
前記参考文献は、薬物部分の適切な開示に加えて、式（Ｉａ）または（ＩＩＩ）における薬物−リンカーコンストラクト、または必要な変更を加えて、そのような薬物−リンカー化合物を作製するのに容易に順応できる薬物−リンカーコンストラクトをも開示する。特に、薬物−リンカー化合物の調製に関する、適切な開示は、Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013); Cong et al., US 8,980,824 B2 (2015); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013);およびZhang et al., US 8,852,599 B2 (2014)に見出される。これらの参考文献は、特定の薬物部分に関連し得るが、当業者は、薬物−リンカー化合物を作製する原理が、必要な変更を加えて、他の種類の薬物に適用できることを認識する。
【００５１】
当業者は、本発明のバリアントのトランスグルタミナーゼを用いて、抗体結合体を作製する特別な利点が、抗体を修飾し、外来性ＢＴＧ反応性グルタミンを導入する必要性、または内在性グルタミンにＢＴＧ反応性を与える必要性の排除であることを認識する。しかしながら、そのように修飾された抗体結合体を作製するための、バリアントのトランスグルタミナーゼの使用は、排除されない。抗体を修飾し、内在性アミノ酸をグルタミンに置換することによって、ＢＴＧ反応性外来性抗体を導入してもよい。Jeger 2009およびJeget et al. 2010によって開示される、Ｎ２９７Ｑ置換は例示である。または、外来性グルタミンを、Dorywaslka et al. 2015、Pons et al. 2013およびRao-Naik 2015に開示されるように、グルタミンを含むペプチドもしくは「タグ」を抗体（特に重鎖）のＮ末端、内部もしくはＣ末端に挿入することによって、導入してもよい。内在性グルタミンにＢＴＧ反応性を与える抗体修飾の例は、Jeger 2009およびJeger et al. 2010に開示されるように、２９７番目におけるグリコシル化の除去、酵素的脱グリコシル化、Ｎ２９７Ａ置換またはＮ２９７Ｑ置換による、Ｑ２９５の活性化である。
【００５２】
抗体におけるグルタミンは、そのカルボキサミド側鎖が、ヒドロキシルアミンをアミンドナーとして用いて、ストレプトマイセス・モバラエンシスのトランスグルタミナーゼ（配列番号１）のためのアミンアクセプターとして働く場合、ＢＴＧ反応性（同意語として、トランスグルタミナーゼ反応性）グルタミンである。
【００５３】
本発明の実践は、以下の実施例を参照することによりさらに理解され得、実施例は、限定の目的ではなく、説明の目的で提供される。
【実施例】
【００５４】
実施例１−トランスグルタミナーゼ
ストレプトマイセス・モバラエンシスのトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。本発明の変異体の作製において、ＢＴＧを、大腸菌(E.coli)における発現によって組換えで生成し、最初に配列番号２における酵素前駆体を生成した。ディスパーゼでのＮ末端ペプチドの切断による活性化は、配列番号３における組換えＢＴＧをもたらし、これはＮ末端にＦＲＡＰテトラペプチドおよびＣ末端にポリヒスチジン鎖（それぞれ、配列番号３のアミノ酸１〜４および３３６〜４４１）を含んでいた。配列番号３の中心部分（アミノ酸５〜３３５）は、配列番号１と同一であった。この組換えＢＴＧは、野生型ＢＴＧと同様の活性を有していた。本明細書で使用される組換えＢＴＧの調製を以下に詳述する。
【００５５】
ストレプトマイセス・モバラエンシス由来の細菌性トランスグルタミナーゼを、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する酵素前駆体として、大腸菌に発現させた。酵素前駆体を発現する菌体ペレットを回収し、以下のように処理した。ペレットを、凍結中に秤量した。各１ｇのペレットにおいて、２ｍＬのＢＰＥＲ ＩＩ試薬、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）エンドヌクレアーゼ(EMD Millipore)および１錠のプロテアーゼ阻害剤の錠剤を添加し、ペレットを再懸濁した。再懸濁液が均質となった後、これを遠心管に移行し、２７０００ｘｇで１５分間遠心した。上清を別々の容器にデカントし、追加の再懸濁緩衝液を、さらなる再懸濁のためにペレットに添加し、２７０００ｘｇで１５分間遠心した。この過程を２回繰り返し、回収した上清分画をプールした。プールした上清分画を、精製用カラムに充填する前に、０．２μｍのフィルターに通して濾過した。
【００５６】
５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）Ｅｘｃｅｌカラムを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭグルタチオン、ｐＨ８．０で、１０ＣＶで平衡化した。抽出されたタンパク質（約４０ｍＬ）をカラムに充填した。次いで、カラムを、平衡化緩衝液（約２０カラム体積）で洗浄した。次に、１．３ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ酵素を含む平衡化緩衝液を用いて、ディスパーゼがカラム内で平衡化した指標としてベースラインが増加するまで、カラムを洗浄した。カラムを、装置から取り外し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、カラムを平衡化緩衝液（ディスパーゼなし）で、ベースラインに到達するまで洗浄した。活性化したタンパク質を、３５％緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ８．０）で溶出した。
【００５７】
溶出液から回収したピークの分画をプールし、５０ｍＭ酢酸Ｎａ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ５．５で一晩透析した。透析後、最終物質を、０．２μｍのフィルターに通して濾過し、分取し、−８０℃で保存した。
【００５８】
Zediraからの微生物トランスグルタミナーゼキットを用いて、ＢＴＧおよび本発明のバリアントの比活性を測定した。キットは、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミニルグリシン（Ｚ−Ｇｌｎ−ＧｌｙまたはＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）をアミンアクセプター基質として用い、ヒドロキシルアミンをアミンドナーとして用いる。トランスグルタミナーゼの存在下において、ヒドロキシルアミンは取り込まれ、Ｚ−グルタミルヒドロキサメートグリシンを形成し、これは、５２５ｎｍにおいて検出できる、鉄（ＩＩＩ）を含む有色の結合体に発展する。
【００５９】
実施例２−バリアントのトランスグルタミナーゼの調製
トランスグルタミナーゼの挿入物を、組換え特異的プライマーｚｇ６７，９０１（配列番号１０）およびｚｇ６７，９００（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマーを用いて、各バリアントにおける１２３８塩基対のトランスグルタミナーゼフラグメントを増幅した。説明として、バリアントＭ８における増幅産物のヌクレオチド配列を、配列番号１２に示す。当業者は、バリアントＭ１０、Ｍ１２およびＭ１４における、対応するヌクレオチド配列を導くことができる。挿入物を社内でコドン最適化し、挿入物はＣ末端（Ｈｉｓ）６タグを含み、封入体発現ベクター（ｐＴＡＰ２３８アクセプターベクター、社内で生成）にサブクローニングするのに使用した。得られたプラスミドを、ｐＳＤＨ８３９（Ｍ８、Ｅ３００Ａ）、ｐＳＤＨ８３５（Ｍ１０、Ｉ２４０Ａ／Ｐ２４１Ａ）、ｐＳＤＨ８３６（Ｍ１２、Ｅ２４９Ｑ）およびｐＳＤＨ８４０（Ｍ１４、Ｅ３００Ａ／Ｙ３０２Ａ）と命名した。次いで、プラスミドを、発現解析およびタンパク質産生のスケールアップのために、大腸菌宿主ＺＧＯＬＤ５に形質転換した。
【００６０】
実施例３−バリアントＭ８による抗体の結合
Ｎ−（ビオチニル）カダベリン（ＮＢＣ、その塩酸塩として、Zedira GmbH, Germany, カタログ番号B002から得た）をアミンドナー化合物として用い、本発明のＢＴＧバリアントが、Ｎ２９７におけるグリコシル化の存在にもかかわらず、抗体をＱ２９５において結合させる能力を示した。
【００６１】
トランスグルタミナーゼバリアントＭ８を用いて、ＮＢＣを４つの異なる抗体（抗メソテリン、抗グリピカン３、抗フコシルＧＭ１および抗ＣＤ７０、それぞれはＮ２９７がグリコシル化していた）と結合させた。
【００６２】
抗メソテリンおよび抗グリピカン３の実行を、より大きなスケールで、以下のように行った：抗体を、結合反応のために１．１４ｍｇ／ｍＬに事前に希釈した。１１．４ｍｇの抗体反応（１．１４ｍｇ／ｍＬで１０ｍＬ）において、０．２５５ｍＬのバリアントＭ８（正味）および１．１２６ｍＬのＮＢＣ（２０倍モル過剰の抗体当たり４つの反応性グルタミンを想定して、８０倍モル過剰）を反応混合物に添加し、１．０ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度および０．１ｍｇ／ｍＬのバリアントＭ８の最終濃度を得た。反応混合物を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００６３】
抗フコシルＧＭ１抗体の結合反応を、より小さなスケールで行った。抗体を１．１４ｍｇ／ｍＬに事前に希釈した。０．５７ｍｇの抗体反応（１．１４ｍｇ／ｍＬで０．５ｍＬ）において、０．０１２７ｍＬのバリアントＭ８（正味）および０．０５６ｍＬのＮＢＣ（部位当たり２０倍モル過剰で、８０倍モル過剰のペイロード）を反応混合物に添加し、１．０ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度および０．１ｍｇ／ｍＬのバリアントＭ８の最終濃度を得た。反応混合物を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００６４】
２４時間のインキュベーション後、非結合のビオチン−カダベリンを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを用いて、反応混合物から除去した。カラムを、充填前に、まず１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した。反応混合物をカラムに充填した後、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭコハク酸、ｐＨ３．２で溶出する前に、平衡化緩衝液で洗浄した。溶出プールを、製剤緩衝液(formulation buffer)（２０ｍｇ／ｍＬソルビトール、１０ｍｇ／ｍＬグリシン、ｐＨ５．０）中で、一晩透析した。
【００６５】
図２は、結合の結果を示すウエスタンブロットである。ニュートラアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(Thermo Scientific, カタログ番号31001)を用いて、ニュートラアビジンＨＲＰによって、タンパク質に結合したビオチンを検出および可視化した。表１は、レーンの帰属を示す。
【表１】
2018531935.tif 000027
【００６６】
５１ｋＤａのバンド（矢印）は、抗体の重鎖に対応する。非結合の抗体のため、レーン１、３、５および７は暗い。逆に、５１ｋＤａのバンドは、レーン２、４、６および８において発光しており、これはＮＢＣが抗体重鎖にうまく結合したことを証明する。抗フコシルＧＭ１抗体は、その軽鎖のＣＤＲ２にグルタミンを有し、これもＢＴＧによってアミド基転移されたようであり、レーン６の２８ｋＤａにおける発光スポットを説明する。
【００６７】
上記の実験で用いた、非結合の抗グリピカン３抗体および結合した抗グリピカン３抗体の両方を、トリプシン消化した。図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ非結合の抗体および結合した抗体における、得られたフラグメントのクロマトグラフィーの出力である。図３Ｂにおいて、ビオチン化ペプチドＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号９）に対応する追加のピークが存在し、これは、バリアントＭ８によってアミド基転移されたグルタミンとして、Ｑ２９５を特定する。
【００６８】
抗体当たりの結合するビオチン基の数を表２に示す。ビオチン含量を、Thermo ScientificからのＰｉｅｒｃｅビオチン定量キットを用いて測定し、このキットは可視化試薬としてＨＡＢＡ（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）を使用している。
【表２】
2018531935.tif 000028
【００６９】
実施例４−バリアントＭ１０、Ｍ１２およびＭ１４による抗体の結合
上記の実施例と同様の技術を使用して、トランスグルタミナーゼバリアントＭ１０、Ｍ１２およびＭ１４を用いて抗体を結合させた。さらに、Ｍ９（Ｑ７４Ａ／Ｙ７５Ｆ／Ｐ７６Ｇ）およびＭ１１（Ｙ７５Ｆ／Ｎ２３９Ａ）と命名した、２つの他のバリアントを比較例として用いた。
【００７０】
図４は、結果を示すウエスタンブロットである。レーンの帰属を表３に与える。
【表３】
2018531935.tif 000029
【００７１】
５１ｋＤａのバンドを参照すると、比較バリアントＭ９およびＭ１１に属するレーン１、３、６および８は暗く、これはＮＢＣが存在しないことを示し、一方本発明のバリアントＭ１０、Ｍ１２およびＭ１４に属するレーン２、４、５、７、９および１０は明るく、これはビオチンが結合しており、ニュートラアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体によって検出および可視化されたことを示す。
【００７２】
ビオチン／抗体比を、表４に示す。
【表４】
2018531935.tif 000030
【００７３】
実施例５−バリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４の比活性
ＢＴＧ対照（未変異）と比較した、バリアントＭ８、Ｍ１０、Ｍ１２およびＭ１４の比活性を表５に与える。活性を、上記で参照したZediraのキットならびに基質対のＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙおよびヒドロキシルアミンを用いて取得した。
【表５】
2018531935.tif 000031
【００７４】
本発明の上記の詳細な説明は、本発明の特定の部分または態様と主に、または独占的に関係する一節を包含する。これは明確性および利便性のためであり、特定の特徴は、開示された分節だけでなくそれ以上のものと関連し得、本明細書の開示は、種々の分節において見出される情報の、あらゆる適切な組み合わせを包含することが理解されるべきである。同様に、本明細書における様々な図および記載は、本発明の特定の実施態様と関連するが、特定の特徴が特定の図または実施態様に関連して開示されている場合、そのような特徴は、別の特徴と組み合わせて、または本発明において一般的に、別の図または実施態様に関連して、適切な程度で使用され得ることが理解されるべきである。
【００７５】
さらに本発明は、特定の好ましい実施態様に関して詳細に記載されているが、本発明はそのような好ましい実施態様に限定されない。むしろ本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によって規定される。
【００７６】
参考文献
本明細書中に第一著者（または発明者）および先の日付によって省略形で引用された以下の参考文献における完全な引用を、以下に提供する。これらの各参考文献は、あらゆる目的において、引用によって本明細書に組み込まれる。
【００７７】
Bregeon et al., US 2013/0189287 A1 (2013).
Bregeon, WO 2014/202773 A1 (2014).
Bregeon et al., WO 2014/202775 A1 (2014).
Chen et al., US 2005/0136491 A1 (2005).
Dennler et al., Bioconjug. Chem. 2014, 25, 569.
Dorywalska et al., Bioconjug. Chem. 2015, 26, 650.
Fischer et al., WO 2014/072482 A1 (2014).
Fontana et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 60, 13.
Hu et al., US 2009/0318349 A1 (2009).
Hu et al., US 2010/0087371 A1 (2010) [2010a].
Hu et al., US 2010/0099610 A1 (2010) [2010b].
Hu et al., WO 2015/191883 A1 (2015).
Innate Pharma, "A New Site Specific Antibody Conjugation Using Bacterial Transglutaminase," presentation at ADC Summit, San Fransisco, California, Oct. 15, 2013.
Jeger, Doctoral Thesis, ETH Zurich, "Site-Specific Conjugation of Tumour-Targeting Antibodies Using Transglutaminase" (2009).
Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995.
Kamiya et al., US 2011/0184147 A1 (2011).
Lhospice et al., Mol. Pharmaceutics 2015, 12, 1863.
Lin et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4542-4543.
Mero et al., Bioconjug. Chem. 2009, 384-389.
Mindt et al., Bioconjug. Chem. 2008, 19, 271.
Norskov-Lauritsen et al., US 2009/0117640 A1 (2009).
Pons et al., US 2013/0230543 A1 (2013).
Rao-Naik, US Provisional Appl'n Ser. No. 62/130673, filed Mar. 7, 2015.
Sato et al., US 6,322,996 B1 (2001).
Sato, Adv. Drug Deliv. Rev. 2002, 54, 487.
Schibli et al., US 2007/0184537 A1 (2007).
Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.
Strop et al., Chemistry & Biology 2013, 20, 161.
Sugimura et al., J. Biotechnol. 2007, 131, 121.
Tagami et al., Protein Engineering Design Selecttion 2009, 22 (12), 747.
Yokoyama et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87, 2087.
【００７８】
配列の表
【表６】
2018531935.tif 000032
【図１】
2018531935.tif 000041
【図２】
2018531935.tif 000042
【図３Ａ】
2018531935.tif 000043
【図３Ｂ】
2018531935.tif 000044
【図４】
2018531935.tif 000045
【配列表】
2018531935000001.app
【国際調査報告】
2018531935.tif 000046
2018531935.tif 000047
2018531935.tif 000048
2018531935.tif 000049