(57)【要約】本発明は、Ｔｈ１７媒介性疾患の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、それを必要とする被験体におけるＴｈ１７媒介性疾患を処置する方法であって、被験体に治療有効量のＣＤ９５拮抗薬を投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体におけるＴｈ１７媒介性疾患を処置する方法であって、被験体に治療有効量のＣＤ９５拮抗薬を投与することを含む方法。
【請求項２】
Ｔｈ１７媒介性疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨破壊、並びに細胞、組織及び臓器の移植拒絶反応からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｈ１７媒介性疾患が、ベーチェット病、多発性筋炎／皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、原発性肝硬変、グッドパスチャー症候群、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、アジソン病、円形脱毛症（alopecia greata）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、インスリン依存性糖尿病、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、硬腫、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ９５拮抗薬が可溶性ＣＤ９５Ｌ又はＣＤ９５に特異性を有する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、可溶性ＣＤ９５ＬへのＣＤ９５の結合を阻害することが可能であり、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、レセプターのオリゴマー化に関与するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合することが可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
抗体がＣＤ９５のシステインリッチドメイン１に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、ＣＤ９５中の４３位のアミノ酸と６６位のアミノ酸との間の区切られた領域に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗体が、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が単一ドメイン抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ９５拮抗薬が、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の細胞外ドメインの少なくとも一部の配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがＣＤ９５の細胞外ドメインに対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが異種ポリペプチドに融合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）に融合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドがアプタマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＤ９５拮抗薬がＣＤ９５発現又はＣＤ９５Ｌ発現の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ９５発現の阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、Ｔｈ１７媒介性疾患の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）は、腫瘍壊死因子（Tumour Necrosis Factor）（ＴＮＦ）ファミリーに属し、デスレセプターＣＤ９５（Ｆａｓとしても公知）のリガンドである。ＣＤ９５は、健常細胞上で遍在的に発現されるが、ＣＤ９５Ｌは、制限された発現パターンを示し、リンパ球の表面で主に検出され、そこで、ＣＤ９５Ｌは、感染細胞及び形質転換細胞の除去において重要な役割を担っている。ＣＤ９５Ｌはまた、炎症状態下の上皮細胞、マクロファージ及び樹状細胞上でも（Fouque et al., 2014）、並びに、ヒト及びマウスの腫瘍内皮上でも（Malleter et al., 2013; Motz et al., 2014）発現され得る。ＣＤ９５Ｌは、細胞間接触を通して局所的に作用する、３７kDaのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である（Suda et al., 1993）。ヒトＣＤ９５Ｌの細胞外ドメインは、膜近傍のストーク領域（103-136 aa）及びＴＮＦ相同ドメイン（137-281 aa）から構成される（Orlinick et al., 1997）。このストーク領域は、ＭＭＰ３（Matsuno et al., 2001）、ＭＭＰ７（Vargo-Gogola et al., 2002）、ＭＭＰ９（Kiaei et al., 2007）又はA Disintegrin And Metalloproteinase 10（ＡＤＡＭ−１０）などのメタロプロテアーゼによって切断され得（Kirkin et al., 2007; Schulte et al., 2007）、それによって、ＣＤ９５Ｌが血流中に放出される。この可溶性リガンドは、ＮＦ−κＢ（O’Reilly et al., 2006）及びＰＩ３Ｋ（Tauzin et al., 2011）などの非アポトーシス性シグナル伝達経路を誘導することによって、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの慢性炎症障害における炎症の増悪に寄与する（O’ Reilly et al., 2009; Tauzin et al., 2011）。膜に結合したＣＤ９５Ｌが存在するときは、アダプター分子ＦＡＤＤを動員し、これがアポトーシスを誘導するカスパーゼ−８の凝集を引き起こすことによって、デスドメイン（ＤＤ）と称されるＣＤ９５の細胞内領域は、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成を統制するが（Kischkel et al., 1995）、切断されたＣＤ９５Ｌ（ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ）によってトリガーされる非アポトーシス性シグナル伝達経路は、チロシンキナーゼリン酸化及びＣａ２＋流入応答を通して、運動誘導シグナル伝達複合体（ＭＩＳＣ）と呼ばれる異なる複合体の形成を遂行する（Kleber et al., 2008; Malleter et al., 2013; Tauzin et al., 2011）。ＭＩＳＣの全組成、さらに重要なことには、ＣＤ９５が非アポトーシス性からアポトーシス性のシグナル伝達経路の誘導へ切り替える分子機序は、未だ解明されていない（Fouque et al., 2014）。
【０００３】
ＳＬＥは、ほぼ全ての臓器及び組織を侵す慢性自己免疫障害であり、その病因及び発生機序は、大部分が未知のままである。ヒト及びマウス研究における多数の証拠は、ＳＬＥ疾患の発生機序において、サイトカインインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）及びＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞がある役割を果たしていることを支持している（概説については（Shin et al., 2011）を参照のこと）。ＳＬＥ患者における高い割合のＣＤ４＋Ｔ細胞及び数が増加した血中ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞は、ＩＬ−１７を産生し、そして、これらの細胞種は、ループス腎炎を伴う患者の腎臓に存在する（Crispin et al., 2008; Wang et al., 2010）。ＳＬＥ患者はまた、サイトカインを分泌するＴｈ１７Ｔ細胞の皮膚中への顕著な浸潤を示す（Yang et al., 2009）。機構的に、急性糸球体腎炎のネズミモデルの研究は、ｃｘｃｒ３−／−動物が、腎臓のＴｈ１７細胞蓄積の低下によって免疫病理から部分的に保護されることを実証した（Steinmetz et al., 2009）。したがって、臓器へのＴｈ１７リンパ球の輸送の機能障害は、ＳＬＥの発生機序に関与し得、そして、それらのモジュレーションは、炎症プロセスを低下させる魅力的な治療アプローチとして期待できる。機序的観点から、これらのＴ細胞の分化及び安定化の原因となる機序は、明確に理解されているが；反対に、ＳＬＥ患者の損傷を受けた臓器中にどのようにＴｈ１７リンパ球が蓄積するかを説明する見識はほとんどない。
【０００４】
発明の概要：
本発明は、Ｔｈ１７媒介性疾患の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明：
可溶性ＣＤ９５Ｌの高い血清中濃度は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者における病理の重症度に相関している。この可溶性ＣＤ９５Ｌは、活性化Ｔ細胞の溢出（炎症を起こした組織中のリンパ球の蓄積に寄与する細胞現象である）を増強することができる。今般、本発明者等は、ループス患者の炎症を起こした皮膚中の内皮細胞中でＣＤ９５Ｌが過剰発現されることを実証する。加えて、メタロプロテアーゼによる切断後、切断されたＣＤ９５Ｌ（ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ）は、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）リンパ球を犠牲にしてヒト及びネズミのＴヘルパー（Ｔｈ）１７リンパ球の内皮遊出を促進する。活性化Ｔ細胞の遊出は、ＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋シグナルを通して達成される。中和抗体、又はデコイレセプターポリペプチドを使用することによって、本発明は、Ｔｈ１７リンパ球のインビトロ内皮遊出を抑制する。それ故、この研究は、ｃｌ−ＣＤ９５ＬがＳＬＥ発生機序に寄与する細胞及び分子機序への新規見識を提供する。さらに、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌシグナル伝達経路を中和することは、臓器中の活性化Ｔｈ１７細胞の蓄積によって引き起こされる損傷を抑制することによって、ＳＬＥ患者を、しかし一般にはＴｈ１７媒介性疾患を処置する非常に魅力的な治療アプローチであると分かる。
【０００６】
したがって、本発明の一態様は、それを必要とする被験体におけるＴｈ１７媒介性疾患を処置する方法であって、被験体に治療有効量のＣＤ９５拮抗薬を投与することを含む方法に関する。
【０００７】
本明細書において使用される場合、表現「Ｔｈ１７媒介性疾患」は、本明細書において最も広い意味で使用され、その発生機序がＴｈ１７細胞の異常、特に臓器中のＴｈ１７細胞の蓄積を伴う全ての疾患及び病的状態を含む。本明細書において使用される場合、用語「Ｔｈ１７細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）を産生するＴヘルパー細胞のサブセットを指す。「A brief history of T(H)17、the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage」. Nat. Med. 13 (2): 139-145.）。用語「ＩＬ−１７」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、インターロイキン−１７Ａタンパク質を指す。典型的には、Ｔｈ１７細胞は、細胞表面におけるＣＤ４などのＴｈ細胞マーカーの古典的な発現によって、及びＩＬ１７の発現によって特徴付けられる。典型的には、本明細書において言及する場合、Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７＋細胞である。
【０００８】
Ｔｈ１７媒介性疾患の例は、限定されないが、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨破壊、並びに細胞、組織及び臓器の移植拒絶反応を含む。特に、上に述べたＴｈ１７媒介性疾患は、ベーチェット病、多発性筋炎／皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、原発性肝硬変、グッドパスチャー症候群、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、アジソン病、円形脱毛症（alopecia greata）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、インスリン依存性糖尿病、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、硬腫、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される１以上であり得る。
【０００９】
幾つかの実施態様において、本発明のＣＤ９５拮抗薬は、活性化Ｔｈ１７細胞の内皮遊出を抑制する、臓器中の活性化Ｔｈ１７細胞の蓄積を抑制する及び臓器中の活性化Ｔｈ１７細胞の蓄積によって引き起こされる損傷を抑制するために特に好適である。
【００１０】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ９５」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、その同族リガンドＣＤ９５Ｌの三量体形態に結合するとアポトーシスを誘導する能力を有すると最初に示されたＣＤ９５（哺乳動物細胞の表面に存在するレセプター）を指す（Krammer,P.H. (2000). CD95’s deadly mission in the immune system. Nature 407, 789-795）。ＣＤ９５は、ＦａｓＲ又はＡｐｏ−１としても公知である。ＣＤ９５の代表的なアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-Prot 登録番号：Ｐ２５４４５によって示される。
【００１１】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ９５Ｌ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通タンパク質であるＣＤ９５の同族リガンドを指す。本明細書において使用される場合、用語「可溶性ＣＤ９５Ｌ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとしても公知）の切断によって産生される可溶性リガンドを指す（Matsuno et al., 2001; Vargo-Gogola et al., 2002; Kiaei et al., 2007; Kirkin et al., 2007; 又は Schulte et al., 2007）。用語「血清中ＣＤ９５Ｌ」、「可溶性ＣＤ９５Ｌ」、「メタロプロテアーゼで切断されたＣＤ９５Ｌ」及び「ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ」は、本明細書を通して同じ意味を有する。ＣＤ９５Ｌの代表的なアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-Prot 登録番号：Ｐ４８０２３によって示される。
【００１２】
用語「ＣＤ９５拮抗薬」は、可溶性ＣＤ９５ＬへのＣＤ９５の結合によって媒介されるシグナル伝達を減衰する任意の分子を意味する。特に、ＣＤ９５拮抗薬は、Ｔｈ１７細胞の遊出を阻害、低下又は無効にする分子である。特に、ＣＤ９５拮抗薬は、ＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋シグナルを阻害、低下又は無効にする分子である。このような阻害は、以下の場合に生じ得る：（ｉ）本発明のＣＤ９５拮抗薬がシグナル伝達をトリガーすることなくＣＤ９５に結合して、可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるシグナル伝達を低下若しくは遮断する場合；（ｉｉ）ＣＤ９５拮抗薬が可溶性ＣＤ９５Ｌに結合して、ＣＤ９５への結合を抑制する場合；（ｉｉｉ）ＣＤ９５拮抗薬が、阻害されなければ、可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるＣＤ９５シグナル伝達を刺激する若しくはそうでなければ容易にする結果を有する調節鎖の一部である分子に結合するか、若しくはそうでなければその活性を阻害する場合；又は（ｉｖ）ＣＤ９５拮抗薬が、とりわけＣＤ９５若しくはＣＤ９５Ｌをコードする１以上の遺伝子の発現を低下若しくは無効にすることによって、ＣＤ９５発現若しくはＣＤ９５Ｌ発現を阻害する場合。典型的には、ＣＤ９５拮抗薬は、限定されないが、抗体、有機低分子、ポリペプチド及びアプタマーを含む。
【００１３】
幾つかの実施態様において、該作用物質は、抗体である。本発明は、抗体又は抗体の断片を包含する。典型的には、本発明の抗体は、可溶性ＣＤ９５ＬとＣＤ９５との間の相互作用を遮断する能力を有するか、又は、可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるシグナル伝達経路の誘導を遮断する能力を有する。該抗体は、可溶性ＣＤ９５Ｌ又はＣＤ９５に対して特異性を有し得る。
【００１４】
幾つかの実施態様において、該抗体又は抗体の断片は、ＣＤ９５の細胞外ドメインの全て又は一部に対する。幾つかの実施態様において、該抗体又は抗体の断片は、ＣＤ９５の細胞外ドメインに対する。より特定すると、本発明は、可溶性ＣＤ９５ＬへのＣＤ９５の結合を阻害することが可能な抗体又はその一部であって、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合する抗体又はその一部を提供する。さらにより特定すると、本発明は、レセプターのオリゴマー化に関与するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合することが可能な抗体又はその一部を提供する。典型的には、該抗体は、プレリガンドアセンブリドメイン（ＰＬＡＤ）と呼ばれるＣＤ９５のシステインリッチドメイン１に結合する（Edmond V, Ghali B, Penna A, Taupin JL, Daburon S, Moreau JF, Legembre P. Precise mapping of the CD95 pre-ligand assembly domain. PLoS One. 2012;7(9):e46236. doi: 10.1371/journal.pone.0046236. Epub 2012 Sep 25.）。特に、本発明の抗体は、４３位のアミノ酸と６６位のアミノ酸との間で区切られた領域に結合する。
【００１５】
本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体は、キメラ抗体である。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載される抗体又はその一部についての幾つかの実施態様において、抗体の一部は、抗体の１以上のＣＤＲドメインを含む。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「抗体」は、天然の抗体と非天然の抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びその一価及び二価断片を含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、単鎖抗体、及びその断片を含む。該抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるために組換え法によってヒト化され得る。
【００１７】
抗体は、慣用の方法論に従って調製される。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの方法を使用して生成され得る（Nature, 256:495, 1975）。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切な宿主動物が、抗原性形態の可溶性ＣＤ９５Ｌ、又はＣＤ９５で、好適な間隔（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）で免疫化される。屠殺の１週間以内に、最終「追加免疫」の抗原が動物に投与され得る。免疫中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましいことが多い。好適な免疫学的アジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ribiアジュバント、Hunter’s Titermax、サポニンアジュバント、例えばQS21若しくはQuilA、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。他の好適なアジュバントは、当分野において周知である。動物は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって免疫され得る。複数の経路によって、複数の形態の抗原で所与の動物が免疫され得る。簡潔に述べると、組換え可溶性ＣＤ９５Ｌは、組換え細胞株による発現によって提供され得る。ＣＤ９５は、その表面にＣＤ９５を発現するヒト細胞の形態で提供され得る。組換え形態のＣＤ９５又は可溶性ＣＤ９５Ｌは、任意の前記方法を使用して提供され得る。免疫レジメンの後、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して好適な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、以下に記載の通り、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマが成長可能な培地中に細胞を置く（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について、細胞上清を分析する。好適な分析技術は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングを含む。他のスクリーニング技術は、当分野において周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトなネイティブにフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認するもの、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００１８】
重要なことに、当技術分野において周知であるように、抗体分子のごく一部（パラトープ）のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford を参照のこと）。Ｆｃ’及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている抗体、又はｐＦｃ’領域なしで生産されている抗体（Ｆ（ａｂ’）２断片と称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されている抗体、又はＦｃ領域なしで生産されている抗体（Ｆａｂ断片と称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに進めて、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖と抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）とからなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主な決定基であり（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を変化させずに、最大１０個の異なる軽鎖と会合し得る）、そして、Ｆｄ断片は、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００１９】
抗体の抗原結合部分内には、当技術分野において周知であるように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とがある（一般に、Clark, 1986; Roitt, 1991 を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性に大きく関わる。
【００２０】
当技術分野において現在十分に確立されていることであるが、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を同種抗体又は異種特異的抗体の類似領域で置換することができる。これは、機能性抗体を生産するための、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合された「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に具現されている。
【００２１】
本発明は、特定の実施態様において、ヒト化形態の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書において使用される場合、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化の方法は、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第５，８５９，２０５号（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されているものを含む。また、上記の米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６１号、並びにＷＯ９０／０７８６１号は、ヒト化抗体を設計する際に使用され得る４つの可能な基準を提案している。第１案は、アクセプターについて、ヒト化しようとするドナー免疫グロブリンに通常は相同な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が通常のものではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なのものである場合、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択することができることであった。第３案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択することができることであった。第４案は、アミノ酸が抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測されかつＣＤＲと相互作用することが可能であると予測されるフレームワーク位置に、ドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために用いることができる幾つかの方法を単に例示したものである。当業者であれば、他の抗体ヒト化の方法に精通しているであろう。
【００２２】
ヒト化形態の抗体の幾つかの実施態様において、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部は不変である。所与の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限りは、アミノ酸のわずかな付加、欠失、挿入、置換又は改変が許容可能である。好適なヒト免疫グロブリン分子は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子を含むだろう。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかしながら、特定のヒト化の方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は、参照によって本明細書に組み入れられる）によって記載されているような「指向性進化」の方法を使用して増大させることができる。
【００２３】
また、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって、完全ヒトモノクローナル抗体を調製することもできる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号及びそこに引用されている参考文献（その内容は、参照によって本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えば、ネズミ）抗体の生産に機能的欠失があるように遺伝子的に改変されている。該動物は、これらの動物の免疫が目的の抗原に対する完全ヒト抗体の生産をもたらすように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するようさらに改変される。これらのマウス（例えば、XenoMouse（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫後、標準的なハイブリドーマ技術に従ってモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、そのため、ヒトに投与したときにヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しないだろう。
【００２４】
また、ヒト抗体を生産するためのインビトロ法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のインビトロ刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び第５，５６７，６１０号）を含む。これらの特許の内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２５】
それ故、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄ断片；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂ断片抗体；並びにＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄ断片抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体を含む。種々の抗体分子及び断片は、限定されないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００２６】
幾つかの実施態様において、本発明に係る抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、元来軽鎖を欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨはまた、「nanobody（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００２７】
幾つかの実施態様において、本発明のＣＤ９５拮抗薬は、ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、ＣＤ９５の機能的等価体である。本明細書において使用される場合、「ＣＤ９５の機能的等価体」は、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合することによってＣＤ９５との相互作用を抑制することが可能な化合物である。用語「機能的等価体」は、ＣＤ９５の断片、突然変異体、及び変異タンパク質を含む。それ故、用語「機能的に等価な」は、タンパク質類似体が可溶性ＣＤ９５Ｌに結合する能力を保持するようにアミノ酸配列を変えることによって、例えば１以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって得られるＣＤ９５の任意の等価体を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点変異によって行われ得る。機能的等価体は、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合する分子であって、ＣＤ９５の細胞外ドメインの全部又は一部を含む分子を含む。機能的等価体は、可溶性形態のＣＤ９５を含む。これらのタンパク質、又はその機能的等価体の好適な可溶性形態は、例えば、化学的方法、タンパク質分解法又は組換え法によって膜貫通ドメインが除去されている短縮形態のタンパク質を含み得る。好ましくは、機能的等価体は、対応するタンパク質に少なくとも８０％相同である。好ましい実施態様において、機能的等価体は、例えば、Pileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）などの任意の慣用の分析アルゴリズムによって評価した場合に、少なくとも９０％相同である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「機能的に等価な断片」は、本明細書において使用される場合、また、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合する任意のＣＤ９５の断片又はＣＤ９５の断片のアセンブリを意味し得る。したがって、本発明は、可溶性ＣＤ９５ＬへのＣＤ９５の結合を阻害することが可能なポリペプチドであって、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の細胞外ドメインの少なくとも一部の配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドはＣＤ９５の細胞外ドメインに対応する。
【００２９】
機能的に等価な断片は、本明細書において同定されるヒトＣＤ９５と同じタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」とは、共通の機能を共有しかつ共通の配列相同性を示す、タンパク質の一群を意味する。相同タンパク質は、非ヒト種に由来し得る。好ましくは、機能的に等価なタンパク質の配列間の相同性は、完全タンパク質のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも２５％である。より好ましくは、相同性は、タンパク質又はタンパク質断片のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも５０％、さらにより好ましくは７５％である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって８０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９５％超である。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、当業者には明らかであるように、任意の好適な手段によって生産され得る。本発明に係る使用のための十分な量のＣＤ９５又はその機能的等価体を生産するために、本発明のポリペプチドを含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現が簡便に達成され得る。好ましくは、該ポリペプチドは、組換え手段によって、コード核酸分子からの発現によって生産される。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。組換え形態で発現させる場合、該ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてコード核酸からの発現によって生成される。特定の系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞が使用され得る。好適な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞などを含む。細菌もまた、操作及び成長させることができる容易さから、組換えタンパク質の生産に好ましい宿主である。一般的な好ましい細菌宿主は、E coliである。
【００３１】
特定の実施態様において、その治療効果を改善するために、本発明の治療法において使用されるポリペプチドを改変できることが企図される。治療化合物のこのような改変を使用して、毒性を減少させる、循環時間を増加させる、又は体内分布を改変させることができる。例えば、体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルとの組み合わせによって、潜在的に重要な治療化合物の毒性を有意に減少させることができる。例えば、ジペプチドの追加は、内因性トランスポーターを使用することによる血液網膜関門を介した眼内への循環剤の浸透を改善することができる。薬物のバイアビリティを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーが、体内分布を改変し、細胞内取り込みの様式を改善し、生理学的障壁を通る浸透性を変化させ；そして、体内からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。高度の生体適合性及び改変の容易さを考慮して、薬物担体としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が広く使用されている。種々の薬物、タンパク質、及びリポソームへの付着は、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。鎖の末端のヒドロキシル基を通して及び他の化学的方法を介して、ＰＥＧを活性薬剤にカップリングさせることができる；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性薬剤に制限される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子当たりの付着点が多いという追加の利点を有し（より高い薬物ローディングをもたらす）、かつ様々な用途に適するように合成設計することができる新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーが検討された。当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を把握している。循環半減期及び体内分布の維持に重要なポリマー骨格に加えて、ターゲット組織内の特定のトリガー、典型的には、酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで治療剤をプロドラッグ形態に維持するために、リンカーが使用され得る。例えば、体内分布の特定部位への送達が必要であり、治療薬剤が病変部位又はその付近に放出される場合、この種の組織活性化薬物送達が特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは、当業者には公知であり、酵素動態、活性酵素の普及、及び選択される疾患特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、治療送達のために本明細書に記載されるタンパク質又はタンパク質の断片を改変する際に使用され得る。
【００３２】
幾つかの実施態様において、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、無関係のタンパク質に、例えば、免疫グロブリンタンパク質に由来するポリペプチド）に融合され得る。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「融合された」及び「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーション又は組換え手段を含むあらゆる手段によって、２以上の要素又は成分を一緒に連結することを指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するように、２以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連結して、連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。それ故、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（このセグメントは、通常、天然ではそのように連結されない）。それ故、リーディングフレームは、融合セグメント全体にわたって連続的であるが、該セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に離れていてもよい。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「融合タンパク質」は、ペプチド結合を介して第２のポリペプチドに直鎖状に接続された第１のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ９５融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合されたＣＤ９５の機能的等価体であるポリペプチドを指す。ＣＤ９５融合タンパク質は、一般に、ＣＤ９５ポリペプチド（上記の通り）と共通の少なくとも１つの生物学的特性を共有するであろう。ＣＤ９５融合タンパク質の一例は、ＣＤ９５イムノアドヘシンである。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を表す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体（すなわち、「異種」である）の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には、少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む連続アミノ酸配列である。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）であるが、必ずしもそうではない。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有益な化学的特性及び生物学的特性の多くを保有することができる。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、完全ヒト成分を使用して達成され得る。このようなイムノアドヘシンは、患者に対して最小限の免疫原性であり、慢性使用又は反復使用に安全である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ領域は、ネイティブな配列のＦｃ領域である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ領域は、変異Ｆｃ領域である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ領域である。ＣＤ９５イムノアドヘシンのＣＤ９５部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーによって連結され得る。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうではない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ、しかし好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得られ得る。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位、又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端に及ぶと定義される。
【００３７】
ＣＤ９５融合タンパク質の別の例は、ＣＤ９５ポリペプチドとKonterman et al. 2012 AlbudAb（商標） Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Lives に記載されているような AlbudAb（商標） Technology Platform に係るヒト血清アルブミン結合ドメイン抗体（AlbudAb）との融合体である。
【００３８】
典型的には、本発明に係るＣＤ９５融合体は、Apogenix（商標）によって開発されたＡＰＧ１０１であり得る。ＡＰＧ１０１は、ＣＤ９５レセプターの細胞外ドメインとＩｇＧ抗体のＦｃドメインとからなる完全ヒト融合タンパク質である。
【００３９】
幾つかの実施態様において、該作用物質は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識の点において抗体の代替物を表す分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質的には任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることが可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニーク配列の最終的には化学的に改変される直鎖状オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、E coliチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって提示される立体配座的に制限された抗体可変領域からなり、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される。
【００４０】
幾つかの実施態様において、本発明のＣＤ９５拮抗薬は、ＣＤ９５発現（又はＣＤ９５Ｌ発現）の阻害剤である。
【００４１】
「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。そのため、「ＣＤ９５発現の阻害剤」は、ＣＤ９５遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を表す。
【００４２】
本発明において使用するための遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ９５ｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を抑制するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることによって、ＣＤ９５ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断ように作用し、それにより、細胞内のＣＤ９５のレベルひいては活性を低下させる。例えば、少なくとも約１５塩基の、ＣＤ９５をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用のホスホジエステル技術によって合成して、例えば静脈内注射又は注入によって投与することができる。その配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００４３】
低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。腫瘍、被験体又は細胞を、遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させることによって、遺伝子発現を低下させることができる（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001)；Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；並びに国際公開第ＷＯ０１／３６６４６号、ＷＯ９９／３２６１９号、及びＷＯ０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００４４】
リボザイムもまた、本発明において使用するための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。ＣＤ９５ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それによって、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的なＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、リボザイム切断部位（これらは、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含む）についてターゲット分子をスキャンすることによって最初に同定される。同定されたら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価することができる。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適切性を評価することができる。
【００４５】
遺伝子発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは共に、公知の方法によって調製され得る。これらは、例えば、固相ホスホラミダイト（phosphoramadite）化学合成によるなどの化学合成技術を含む。代替的に、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写によって、アンチセンスＲＮＡ分子を生成することができる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々の改変を導入することができる。可能な改変は、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することを含む。
【００４６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターと組み合わせてインビボ送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の輸送を容易にすることが可能な任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるだろう分解度と比べ低下した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターは、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌起源に由来する他のビヒクルを含む。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス由来の核酸配列を含む：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びにＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターも容易に用いることができる。好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含み、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することができない）のレトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて全般的な有用性を有する。複製欠損のレトロウイルスを生産するための標準的なプロトコル（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によって組換えレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual,“W.H. Freeman C.O., New York, 1990) and in MURRY (“Methods in Molecular Biology,” vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991) に提供されている。特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように操作することができ、広範囲の細胞型及び種に感染することが可能である。それはさらに、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデ���随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限に抑えることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下、組織培養で１００継代を超えて受け継がれており、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能することができる。他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 を参照されたい。ここ数年間、プラスミドベクターが、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現させることができる。幾つかの一般的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、ＤＮＡの特定の断片を除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計することができる。プラスミドは、様々な非経口、粘膜及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドは、水溶液で提供されても、金粒子上で乾燥させても、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【００４７】
「治療有効量」の上述した通りのＣＤ９５拮抗薬とは、Ｔｈ１７媒介性疾患の処置のための十分な量のＣＤ９５拮抗薬を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の被験体のための具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低レベルで化合物の投与を開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当分野における技能の十分に範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。好ましくは、処置しようとする被験体への投与量の対症的調整のために、組成物は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、とりわけ約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００４８】
本発明のＣＤ９５拮抗薬を薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、とりわけヒトに投与された場合に有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入剤又は製剤化助剤の任意の種類を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は、単独で又は別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、慣用の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。好適な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、粉剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤などの経口経路形態、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態、並びに直腸投与形態を含む。好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）であるか、又は、場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水の添加によって注射液の構成が可能となる乾燥組成物、とりわけ凍結乾燥組成物であり得る。注射用途に好適な医薬形態は、滅菌水性液剤又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散剤の即時調製用の滅菌粉剤を含む。全ての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての本発明の化合物を含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で並びに油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有する。本発明のＣＤ９５拮抗薬は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩は、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と共に形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、好適なその混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。滅菌注射液は、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分と共に、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散剤は、基礎分散媒体と上に列挙されている成分の中からの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに種々の滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。製剤化したら、投与製剤と適合性の方法でかつ治療的に有効な量で液剤が投与される。製剤は、上述の注射液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。水性液剤での非経口投与の場合、例えば、必要な場合には前記液剤を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与にとりわけ好適である。これに関して、用いることのできる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には公知であろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下注入液１０００mlに添加するか、又は推奨注入部位に注射することができる。処置される被験体の病態に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。投与責任者は、いずれにしても、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【００４９】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
図面：
【図１】ＳＬＥ患者におけるＣＤ９５Ｌの高い血清中量は、活性化Ｔリンパ球の内皮遊出を誘導するホモ三量体リガンドに対応する。Ａ．新たに診断されたＳＬＥ患者及び健常者ドナーの血清中で可溶性ＣＤ９５ＬをＥＬＩＳＡによって測定した。＊＊＊は、両側スチューデントｔ検定を使用した、Ｐ≦０．０００１を示す。Ｂ．ＳＬＥ患者由来の血清を、サイズ排除S-300-HR Sephacrylカラムを使用して分画し、そして、ＣＤ９５ＬをＥＬＩＳＡによって捕捉した。挿入図（Inset）：ＣＤ９５Ｌを分画４０〜４６及び７６〜７８で免疫沈降させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中にロードした。抗ＣＤ９５Ｌイムノブロットを表す。Ｃ．健常者ドナー由来の活性化ＰＢＬを、Ｂで得られたゲル濾過分画の存在下でインキュベートし、そして、材料及び方法に記載の通り内皮遊出を評価した。示された場合では、分画７６〜７８を、拮抗薬の抗ＣＤ９５ＬｍＡｂＮＯＫ−１（１０μg/ml）と３０分間プレインキュベートした。Ｄ．ループス患者の炎症を起こした皮膚又は健常者の被験体（乳房切除術）で、ＣＤ９５Ｌ、ＩＬ１７及びＣＤ４の発現レベルを免疫組織化学によって分析した。番号は、異なる患者に対応する。Ｅ．Ｄに描写したＣＤ９５Ｌ及びＩＬ１７染色のデンシトメトリー分析は、これらの２つのマーカーの発現レベルが相関して変化することを明らかにした。Ｆ．表示のヒトＴ細胞サブセットを、ＳＬＥ患者又は対照として健常者ドナーから採取した血清の存在下、遊出アッセイに供した。マン・ホイットニーのＵ検定を使用してデータを分析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｇ．ヒトＴ細胞サブセットを、下部チャンバーにｃｌ−ＣＤ９５Ｌと並行して漸増濃度のＦａｓ−Ｆｃを加えた以外は上記と同様の遊出アッセイに供した。データは、４〜５の個々のドナーの平均±ＳＤを表し、２元分散分析（2-way Anova）を使用して分析した。Ｈ．ＣＤ４Ｔ細胞サブセットの遊出を、ボイデンチャンバー中ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（２００ng/ml）の存在下又は非存在下で分析した。Ｉ．ヒト制御性Ｔ細胞及びＴｈ１７細胞の遊出を、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下又は非存在下でボイデンチャンバーアッセイによって評価した。２元分散分析を使用してデータを分析した。Ｐ値＜０．０５を有意と見なした；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２】ｃｌ−ＣＤ９５Ｌのインビボ投与は、Ｔｈ１７細胞を優先的に誘引する。マウスにｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（２００ng）又はビヒクルを１回注射し、２４時間後に試験に供した。（Ａ−Ｂ）．腹腔（Ａ）及び脾臓（Ｂ）についての総細胞カウントを実施した。（Ｃ−Ｄ）．注射の２４時間後に白血球百分率カウントを実施した。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）（Ｃ）及び脾臓（Ｄ）細胞をフローサイトメトリー分析に供し、浸潤したＣＤ４＋細胞の百分率を同定した。（Ｅ−Ｉ）．ＡｕｔｏＭＡＣＳ分離によってＰＥＣ  ＣＤ４＋細胞を精製し、ＲＮＡを調製した。細胞を、（Ｅ）ＩＬ−１７Ａ、（Ｆ）ＩＬ−２３Ｒ、（Ｇ）ＣＣＲ６、（Ｈ）ＩＦＮ−γ、及び（Ｉ）ＦｏｘＰ３についてリアルタイムＰＣＲに供した。提示されたデータは、６匹のマウスの群の平均±ＳＤであり、実験を２回繰り返した。スチューデントｔ検定を使用してデータを分析し、Ｐ値＜０．０５を有意と見なした；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３】ＣＤ９５は、デスドメイン非依存性のＣａ２＋応答を遂行する。Ａ．ＣＥＭ細胞をＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL）で刺激し、そして、ＣＤ９５を免疫沈降させた。免疫複合体をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分割し、そして、表示のイムノブロッティングを実施した。全ライセートを対照としてロードした。Ｂ．親のＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＰＬＣ−γ１欠損対応物及びそのＰＬＣ−γ１再構成対応物に、Ｃａ２＋プローブＦｕｒａＰＥ３−ＡＭ（１μM）をロードし、次いで、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL、黒色の矢印）で刺激した。比像（Ratio image）（Ｆ３４０／Ｆ３８０、Ｒ）を１０秒毎に取得し、刺激前の値（Ｒ０）に対して正規化した。データは、ｎ個の細胞で測定されたＲ／Ｒ０の平均±ＳＤを表す。挿入図：ＰＬＣγ１欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞又はその再構成対応物を溶解し、そして、ＰＬＣγ１及びＣＤ９５の発現レベルをイムノブロッティングによって評価した。チューブリンをローディング対照として使用した。Ｃ．細胞にＣａ２＋プローブＦｕｒａＰＥ３−ＡＭ（１μM）をロードし、次いで、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/ml）で刺激した。Ｂに記載の通りデータを分析した。挿入図：親のＪｕｒｋａｔ細胞（Ａ３）又はＦＡＤＤ若しくはカスパーゼ−８のいずれかを欠くその対応物を溶解し、そして、ＣＤ９５、ＦＡＤＤ及びカスパーゼ−８の発現レベルをイムノブロッティングによって評価した。
【実施例】
【００５１】
実施例：全身性エリテマトーデスにおけるＴｈ１７細胞遊出及び病理進行を促進する、ＣＤ９５配列中のＣａ２＋誘導ドメインへの新たな見識。
【００５２】
方法：
患者及び倫理規定
ＳＬＥ患者は、１９８２年に改訂された疾患に関するＡＣＲ基準の４以上を満たした。全ての臨床試験は、ヘルシンキ宣言（（Declaration of Helsinki）に概説された指針に従って実行された。同意書を各個人から得た後、ＳＬＥと診断された患者から採血した。この研究は、ボルドー大学病院（Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux）の治験審査委員会によって承認された。
【００５３】
抗体、他の試薬
ＰＨＡ、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤は、Sigma-Aldrich（L’Isle-d’Abeau-Chesnes, France）から購入した。抗ＣＤ９５ＬｍＡｂは、Cell Signaling Technology（Boston, MA, USA）からであった。組換えＩＬ−２は、PeproTech Inc.（Rocky Hill, NJ, USA）から得た。抗ＰＬＣγ１は、Millipore（St Quentin en Yvelines, France）から購入した。抗ＣＤ９５ｍＡｂ（ＡＰＯ１−３）は、Enzo Life Sciences（Villeurbanne）からであった。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ９５（ＤＸ２）ｍＡｂ、抗ヒトＦＡＤＤｍＡｂ（clone1）、中和抗ＣＤ９５ＬｍＡｂ（Nok1）は、BD Biosciences（Le Pont de Claix, France）によって提供された。抗カスパーゼ−８（Ｃ１５）及び抗Ｆａｓ（Ｃ−２０）ｍＡｂは、Santa Cruz Biotechnology（Heidelberg, Germany）からであった。ＣＤ９５−Ｆｃ、中和抗ＩＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンｍＡｂ。
【００５４】
プラスミド及び構築物
ＧＦＰタグ化ヒトＣＤ９５（ｈＣＤ９５）構築物をＰＣＲによって得て、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）のＮｈｅ１部位とＥｃｏＲ１部位の間にインフレームで挿入した。全てのＣＤ９５構築物について、番号付けは、シグナルペプチドの１６個のアミノ酸の減算を考慮に入れたことに注目されたい。Quickchange Lightning 部位特異的突然変異誘発キット（Agilent Technologies, Les Ulis, France）を使用し、製造業者の指示に従って、ｈＣＤ９５（１−２１０）中の１８３位でシステインをバリンで置換を実施した。マウス完全長ＣＤ９５（ｍＣＤ９５）は、Pascal Schneider医師（Universite de Lausanne, Lausanne, Switzerland）の好意によって提供された。シグナルペプチド（ＳＰ−残基１〜２１）を欠くｍＣＤ９５配列をＰＣＲによって増幅させた。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩによる消化後、アンプリコンを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質と続くフラッグタグ配列及び６アミノ酸リンカーのＳＰ配列とインフレームで挿入した。Ｍｙｃタグ化完全長ヒトＰＬＣγ１をコードするｐＴｒｉＥｘ−４ベクターは、Matilda Katan医師（Chester Beatty Laboratories, The Institute of Cancer Research, London, United Kingdom）から贈られた。完全長ＣＤ９５Ｌ及び分泌ＩｇＣＤ９５Ｌをコードするプラスミドは、他の場所に記載されている（Tauzin et al., 2011）。両方の鎖を配列決定することによって、全ての構築物を検証した（GATC Biotech, Constance, Germany）。
【００５５】
細胞株及び末梢血リンパ球
全ての細胞は、ＡＴＣＣ（Molsheim Cedex, France）から購入した。Ｔ白血病細胞株ＣＥＭ、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔを、８％加熱不活性化ＦＣＳ（v/v）及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ中、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で培養した。少量の原形質膜ＣＤ９５を発現するＣＥＭ−ＩＲＣ細胞は（Beneteau et al., 2007; Beneteau et al., 2008）に記載された。ＨＥＫ２９３細胞を、８％加熱不活性化ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で培養した。健常者ドナー由来のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、Ficoll遠心分離によって単離し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。２時間の付着工程によって単球を除去し、そして、ナイーブなＰＢＬ（末梢血リンパ球）を、１μg/mlのＰＨＡを補充したＲＰＭＩ中で一晩インキュベートした。細胞を十分に洗浄し、１００ユニット／mlの組換えＩＬ−２を補充した培養培地中で５日間インキュベートした。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（Jaffe et al., 1973）を、ＬＳＧＳ（低血清成長サプリメント）を補充したヒト内皮細胞無血清培地２００（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）中で成長させた。ＣＥＭ−ＩＲＣ細胞に、ＢＴＭ−８３０エレクトロポレーションジェネレーター（BTX Instrument Division, Harvard Apparatus）を使用して１０μgのＤＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞を１mg/mLのネオマイシンで１週間処理し、次いで、限界希釈を使用してクローンを単離した。
【００５６】
免疫組織細胞学
ループス患者由来の皮膚をパラフィン包埋し、４μmの切片にカットした。ＣＤ４、ＣＤ８及びＩＬ１７の検出のために、Ventana OmniMap検出キット（Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA）を使用して、Discovery Automated IHC染色装置で免疫組織化学染色を実施した。Ventana Tris系反応緩衝液（Roche）でスライドをすすいだ。Ventana EZ Prep溶液（Roche）を用いた７５℃で８分間の脱パラフィン後、Ventana所有のTris系緩衝液ＣＣ１（ｐＨ８）抗体を使用して、９５℃〜１００℃で４８分間抗原賦活化を実施した。内因性ペルオキシダーゼを、Inhibitor-D ３％Ｈ２Ｏ２（Ventana）を用いて３７℃で１０分間ブロッキングした。すすいだ後、スライドを、ＩＬ１７（Bioss）、ＣＤ４及びＣＤ８（Dako）と６０分間、二次抗体：OmniMap HRP（Roche）と３２分間、３７℃でインキュベートした。Ventana ChromoMap Kit Slides（ビオチンフリー検出系）を使用してシグナル増強を実施した。ＣＤ９５Ｌ（BD Pharmigen）の検出のために、抗原脱マスキング溶液ｐＨ９（Vector）を使用して９５℃で４０分間抗原賦活化を実施し、そして、メタノール中の３％（w/v）過酸化水素を使用して内因性ペルオキシダーゼを１５分間ブロッキングした。スライドを、５％ＢＳＡ中、ＲＴで３０分間インキュベートし、次いで、４℃で一晩染色した。組織切片を、Envision＋システムＨＲＰコンジュゲート二次抗体とＲＴで３０分間インキュベートし、そして、液体ＤＡＢ＋を加えることによって標識を可視化した。切片を対比染色（ヘマトキシリン）し、ＤＰＸ封入剤で封入した。ImageJソフトウェア（IHC toolbox）を使用し、スキャンしたスライド上でデンシトメトリー分析を行って、異なるマーカーの量を評価した。各マーカーの平均面積を評価し、そして、本発明者等は、ＩＬ１７発現細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の量とＣＤ９５Ｌの発現レベルとの間に存在する相関関係を解明した。
【００５７】
マウス及びヒトＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの生成
動物実験は、ノッティンガム大学（University of Nottingham）による倫理審査を受け、適切であり、そして、UK Home Officeガイダンスに準じたPPL 40/3412を使用してＡＳＰＡ（１９８６）下で実施された。ネズミＴ細胞サブセットの生成のために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。Miltenyi Biotec マイクロビーズを使用して、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞を単離した。Miltenyi Biotec ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩを使用して、ナイーブなヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し、これを選別してＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の９９％純粋な集団を生産した。精製した細胞を、完全ＩＭＤＭ培地中、全てα−ＣＤ３（１μg/ml）、α−ＣＤ２８（２μg/ml）と共に、そして、以下の通り培養した；Ｔｈ１細胞  ＩＬ−１２（１０ng/ml）とα−ＩＬ−４（１０μg/ml）と共に、Ｔｈ２細胞  ＩＬ−４（１０ng/ml）及びα−ＩＦＮ−γ（１０μg/ml）、Ｔｈ１７細胞  Ｉｌ−６（１０ng/ml）、ＴＧＦ−β１（２ng/ml）、α−ＩＦＮ−γ（１０μg/ml）とα−ＩＬ−４（１０μg/ml）と共に、そして、Ｔｒｅｇ  ＩＬ−２（１０ng/ml）、ＴＧＦ−β１（５ng/ml）、α−ＩＦＮ−γ（１０μg/ml）及びα−ＩＬ−４（１０μg/ml）。細胞を、上記の通り５日間かけてＴ細胞サブセットへと変換した。全てのサイトカインは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（London, UK）から供給された。マウスＣＤ３（ｃｌｏｎｅ  ２Ｃ１１）；ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）；マウスＣＤ２８（３７．５１）；ヒトＣＤ２８（ＣＤ２８．２）；マウスＩＬ−４（１１Ｂ１１）；ヒトＩＬ−４（ＭＰ４−２５Ｄ２）；マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）；ヒトＩＦＮ−γＢ２７は、BD Pharmigenからであった。
【００５８】
、
ｃｌ−ＣＤ９５Ｌのインビボ投与
８〜１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Harlan UK）を６つの群に分け、腹腔内（ＩＰ）投与した。注射の２４時間後、マウスを屠殺して、５mlのＰＢＳ／２％ＦＣＳで腹腔を洗浄し、血液塗抹を調製し、そして、脾臓を回収した。腹膜細胞（ＰＥＣ）の血液塗抹及びサイトスピンをギムザ染色し、そして、白血球百分率カウントを実施した。脾臓及びＰＥＣの単一細胞懸濁液を調製し、細胞カウントを実施し、MiltenyiマイクロビーズでＣＤ４＋ＣＤ６２−Ｔ細胞を単離し、そして、トリパンブルー色素排除によって細胞数を決定した。全てのマウス実験は、ノッティンガム大学の局内動物実験委員会の倫理審査による承認下、並びに、UK Home Officeガイダンスに準じたProject License 40/3412下で実施された。
【００５９】
メタロプロテアーゼで切断されかつＩｇに融合したＣＤ９５Ｌの生産
Ｉｇ−ＣＤ９５Ｌを（Tauzin et al., 2011）に記載の通り研究室で生成した。８％ＦＣＳ含有培地中で維持したＨＥＫ２９３細胞に、３μgの空のプラスミド又は野生型ＣＤ９５Ｌ含有ベクターをカルシウム／リン酸塩沈殿法を使用してトランスフェクトした。トランスフェクトの１６時間後、培地を２mM Ｌ−グルタミンを補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Invitrogen）に交換し、５日後、切断されたＣＤ９５Ｌ及びエキソソームが結合した完全長ＣＤ９５Ｌを収集した。死細胞及び破片を、２工程の遠心分離（４５００rpm／１５分間）を通して取り除き、次いで、エキソソームを超遠心分離工程（１０００００ｇ／２時間）によって取り除いた。
【００６０】
サイズ排除クロマトグラフィー
４人の異なるＳＬＥ患者由来の血清（５．１０７細胞）を、０．２μmフィルターを使用して濾過し、次いで、５mlを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した中域分画S300-HR Sephacrylカラム（GE Healthcare）を使用して分割した。AKTAprime精製装置（GE Healthcare）を使用して、０．５mL／分の流速で分画を収集した。５０の分画を収集し、ＥＬＩＳＡによって分析してＣＤ９５Ｌを定量した。
【００６１】
ＣＤ９５Ｌ  ＥＬＩＳＡ
抗ＣＤ９５Ｌ  ＥＬＩＳＡ（Diaclone, Besancon, France）を、製造業者の推奨に従って実施して、血清中に存在する切断されたＣＤ９５Ｌを正確に定量した。
【００６２】
免疫沈降
Ｔ細胞（１条件当たり５×１０７細胞）を、Ｉｇ−ＣＤ９５Ｌ又はＣｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL）を用いて３７℃で表示時間刺激した。細胞を溶解し、ＡＰＯ１．３（１ug/mL）と４℃で１５分間インキュベートし、そして、Ａ／Ｇタンパク質結合磁気ビーズ（Ademtech, Pessac, France）を使用してＣＤ９５を１時間免疫沈降させた。十分な洗浄後、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、そして、表示の抗体でイムノブロッティングを実施した。
【００６３】
イムノブロット分析
細胞を、溶解緩衝液（２５mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１％（v/v）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０mM ＮａＣｌ、２mM ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤のミックス（Sigma-Aldrich）を補充）中、４℃で３０分間溶解した。ビシンコニン酸法（PIERCE, Rockford, IL, USA）によって製造業者のプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定した。タンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、ニトロセルロース膜（GE Healthcare, Buckinghamshire, England）に転写した。膜を、５％（w/v）脱脂粉乳（ＴＢＳＴＭ）を含有するＴＢＳＴ（５０mM Ｔｒｉｓ、１６０mM ＮａＣｌ、０．０５％（v/v）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．８）で１５分間ブロッキングした。一次抗体をＴＢＳＴＭ中４℃で一晩インキュベートした。膜を徹底的に洗浄し（ＴＢＳＴ）、次いで、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ又は抗マウス（SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, US）を４５分間加えた。タンパク質を高感度化学発光基質キット（ECL, GE Healthcare）で可視化した。
【００６４】
活性化Ｔリンパ球の経内皮遊走
３□ｍ孔径の膜（Millipore, Molsheim, France）を含有するボイデンチャンバー膜の水和後、活性化Ｔリンパ球（１０６）を、低血清（１％）含有培地中のＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層上のトップチャンバーに加えた。ボトムチャンバーを、１００ng/mlのｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下又は非存在下の低血清（１％）含有培地で満たした。ヒト血清を使用した実験では、健常者ドナー又はＳＬＥ患者のいずれか由来の血清５００μlを下部リザーバーに加えた。細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。標準の２．５×１０４個の蛍光ビーズ（Flow-count, Beckman Coulter）を使用したフローサイトメトリーによって、下部リザーバー中で遊出した細胞をカウントした。
【００６５】
内皮細胞接着アッセイ
CHEMICON（登録商標）内皮細胞接着アッセイ（Millipore）において、Ｅ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１に対するブロッキング抗体を使用した。簡潔に述べると、ＴＮＦ−αでの内皮細胞層の活性化後、抗マウスＩｇ対照、抗Ｅ−セレクチン又は抗ＩＣＡＭ−１を終濃度１０μg/mlで加えた。その後、カルセイン−ＡＭで染色したＴ細胞サブセットを２４時間インキュベートし、未結合の細胞を洗浄した。内皮に付着した細胞を、蛍光プレートリーダーを使用して評価した。
【００６６】
リアルタイムｑＰＣＲ
脾臓及びＰＥＣの単一細胞懸濁液を上述の通り調製した。フェノール／クロロホルムを使用してＣＤ４  Ｔ細胞からＲＮＡを抽出した。Promega GO-Script Reverse Transcription Kitを使用してｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲで使用した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ試料を、Roche Lightcyclerで実施されるTaqmanアッセイに供した。結果を、Δｃｔ法を使用して計算したＨＰＲＴに対する発現レベルとして報告する。
【００６７】
生細胞中のカルシウム応答のビデオ撮像
親細胞株での実験
ハンクス平衡塩溶液（Hank’s Balanced Salt Solution)（ＨＢＳＳ）中、室温で３０分間、Ｔ細胞にＦｕｒａ−ＰＥ３−ＡＭ（１μM）をロードした。洗浄後、細胞をＦｕｒａ−ＰＥ３−ＡＭの非存在下で１５分間インキュベートして、色素のエステル分解を完了した。細胞を、×４０ UApo/340-1.15 W水浸体物レンズ（Olympus）を備えた倒立落射蛍光顕微鏡（Olympus IX70）の温度制御チャンバー（３７℃）内に置き、そして、高速走査カメラ（CoolSNAP fx Monochrome, Photometrics）によって５１０nm及び１２ビットの解像度で蛍光顕微鏡画像を撮影した。ＵＶ露光を最小限に抑えるために、４×４のビニング機能を使用した。Ｆｕｒａ−ＰＥ３を３４０及び３８０nmで交互に励起させ、そして、得られた画像の比（５２０nmでの発光フィルター）を一定間隔（１０秒）で生成した。Ｆｕｒａ−ＰＥ３比（Ｆ比３４０／３８０）像を、Metafluor及びMetamorphを含むUniversal Imagingソフトウェアでオフライン分析した。Ｆ比は、細胞内Ｃａ２＋濃度変化を反映する。各実験を３回繰り返し、そして、２０超の単一細胞トレースの平均を分析した。
【００６８】
ＧＦＰ発現細胞株での実験
ＧＦＰ蛍光は、Ｆｕｒａ−ＰＥ３によるＣａ２＋測定を妨害するため、ＧＦＰ発現細胞での実験ではＦｕｒａ−ＰＥ３−ＡＭの代わりにＦｌｕｏ２−ＡＭを使用した。Ｆｕｒａ−ＰＥ３−ＡＭの場合と同様に、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で３０分間Ｔ細胞にＦｌｕｏ２−ＡＭ（１μM）をロードし、次いで、Ｆｌｕｏ２−ＡＭ不含ＨＢＳＳ中で１５分間インキュベートして、色素のエステル分解を完了した。Ｆｌｕｏ２−ＡＭをロードした細胞を５３５±３５nmで励起することによってＣａ２＋変化を評価した。各細胞についての放射された蛍光（６０５±５０nm）の値（Ｆ）を初期蛍光（Ｆ０）に対して正規化し、Ｆ／Ｆ０（相対Ｃａ２＋［ＣＹＴ］）として報告した。ＧＦＰ陽性細胞のみを考慮した。
【００６９】
結果：
ループス患者における血清中ＣＤ９５Ｌは、活性化Ｔｈ１７細胞の内皮遊出を促進する
最近の報告は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に罹患している患者の気管支肺胞洗浄液中で可溶性形態のＣＤ９５Ｌが増加することを示唆している。驚いたことに、この可溶性ＣＤ９５Ｌは、そのアミノ末端細胞外ストーク領域（アミノ酸残基１０３〜１３６）（膜に結合したＣＤ９５Ｌのメタロプロテアーゼによるシェディング後に通常取り除かれる領域）を保存する（Herrero et al., 2011）。追加的に、天然条件下では、このＡＲＤＳ  ＣＤ９５Ｌは、六量体の化学量論を示し、肺中の肺胞上皮細胞に対して細胞毒性活性を発揮した（Herrero et al., 2011）。これらの結果は、ＳＬＥ患者における血清中ＣＤ９５Ｌの化学量論を評価するように本発明者等を促した。第一に、本発明者等は、８人の年齢の一致した健常者ドナーと比較して、３４人のＳＬＥ患者の血清中で可溶性ＣＤ９５Ｌが有意に増加したことを確認した（健常者の被験体では３０．０４±２８．５２pg/mlに対して、ＳＬＥ患者では３６０±２２４．８pg/ml、Ｐ＜０．０００１）（図１Ａ）。第二に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してこれらの血清を分画し、そして、各溶出分画でＣＤ９５Ｌ濃度を定量した（図１Ｂ）。天然分子量が７５〜８０kDaの範囲であったタンパク質を含有する分画７６〜７８でＣＤ９５Ｌが検出された。このＣＤ９５Ｌを次に免疫沈降させ、変性／還元条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）下２６kDaで分割したが（図１Ｂ）、このことは、ループス患者において蓄積した血清中ＣＤ９５Ｌがホモ三量体リガンドに対応したことを示している。試験の上で、本発明者等は、機能的に、この血清中ＣＤ９５Ｌが、内皮単層を通過するＴリンパ球の遊出を促進したため、以前に報告された切断されたＣＤ９５Ｌ（ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ）の活性を保持していたことに注目した（図１Ｃ）。具体的には、画分７６〜７８に曝露された健常者ドナーから単離された有意により活性化されたＴリンパ球が、画分４２〜４４に曝露されたリンパ球と比較して、内皮単層を通過した。エキソソームが結合したＣＤ９５Ｌを含有するこれらの後者の画分（データ示さず）は、遊走促進（pro-migratory）効果を全く発揮しなかった（図１Ｃ）。さらに、画分７６〜７８によって誘導されたＴ細胞遊出は、中和抗ＣＤ９５ＬｍＡｂを使用して最大５０％阻害されたが（図１Ｃ）、このことは、ＳＬＥ患者中の可溶性ＣＤ９５ＬがＴリンパ球の内皮遊出においてある役割を果たしていることを裏付けている。Ｔ細胞浸潤が組織損傷に関与し、かつＴｈ１７細胞がＣＤ９５駆動性の動員を通してこの臨床転帰に寄与するならば、ＣＤ９５Ｌ発現細胞が炎症を起こした臓器中で検出されるはずであると本発明者等は仮定した。免疫組織化学を使用して、本発明者等は、皮膚病変を有するループス患者におけるＣＤ９５Ｌ及びＩＬ１７発現細胞の分布を評価した。注目すべきことに、ＣＤ９５Ｌ及びＩＬ１７染色は、ループス患者の皮膚生検中に観察されたが、一方で、これらは、対照の皮膚（すなわち、乳房再建術由来の皮膚）では検出できなかった（図１Ｄ）。さらに、ＣＤ９５Ｌは、免疫細胞浸潤によって囲まれた血管の内皮で主に検出された（図１Ｄ）。さらに、ループス患者（ｎ＝１０）のデンシトメトリー分析は、ＣＤ９５Ｌの量が組織に浸潤しているＩＬ１７発現免疫細胞の量に相関したことを強調したが、このことは、このリガンドがＣＤ４＋Ｔｈ１７細胞の化学走化性因子となり得ることを示唆している（図１Ｅ）。メタロプロテアーゼによる切断後、ＣＤ９５Ｌが、全てのＴリンパ球に対して化学走化性活性を発揮したか又は亜集団の遊走を選択的に促進したかをさらに調査するために、健常者ドナーから単離されてインビトロ分化を受けたナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞の内皮遊出を、健常者又はＳＬＥの血清の存在下又は非存在下で評価した。健常者の血清と比較して、ＳＬＥ患者由来の血清は、Ｔｈ１遊出の中度の増加をトリガーしたが、一方で、これらは、Ｔｈ１７細胞の内皮遊出を劇的に増強した（図１Ｆ）。さらに重要なことには、ＳＬＥの血清とデコイレセプター（ＣＤ９５−Ｆｃ）とのプレインキュベートがＴｈ１７細胞遊走を用量依存的に抑制したので、この遊出プロセスは、ＣＤ９５シグナル伝達に依拠していた（図１Ｇ）。
【００７０】
Ｔｈ１とＴｈ１７の両方のＴ細胞は、ループス患者及び疾患発生機序に寄与するループス自然発症マウスの炎症を起こした臓器中に蓄積すると報告されている。観察された現象における他の血清成分が果たす想定される役割を排除するために、本発明者等は、以降、組換え型及びホモ三量体型のＣＤ９５Ｌを使用した。この目的のために、ＨＥＫ２９３細胞に、完全長のＣＤ９５Ｌをコードするベクターをトランスフェクトし、そして、本発明者等は、この上清中に含有されたメタロプロテアーゼで切断されたＣＤ９５Ｌ（ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ）を使用した（Tauzin et al., 2011）。ループス患者中の血清中ＣＤ９５Ｌと同様に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、未分化のＴｈ０及び分化Ｔｈ２細胞と比較して、Ｔｈ１及びＴｈ１７リンパ球の遊出を促進するのにより効果的であった（図１Ｈ）。炎症を起こした臓器中のＴｈ１７／Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の比の不均衡が、自己免疫障害、具体的にはループス発生機序に関与することを示唆しているため（Yang et al., 2009）、本発明者等は、次にＴｒｅｇ細胞の遊出に及ぼすｃｌ−ＣＤ９５Ｌの効果を評価した。図１Ｉに示されるように、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、Ｔｈ１７Ｔ細胞の内皮遊出を増強したが、有意なＴｒｅｇ遊出を誘導できず、このことは、ループス患者の炎症を起こした組織中のＴｒｅｇ細胞を犠牲にしたＴｈ１７細胞の蓄積を示している。これらの知見は、健常者ドナーと比較してＳＬＥ患者における血清中ＣＤ９５Ｌのより高いレベルが炎症を起こした臓器中のＴｈ１７細胞の蓄積に寄与し得ることを明らかにした。
【００７１】
細胞の動員及び輸送は、リンパ球上の接着分子及び内皮細胞表面上のそれらの分子パートナーの発現レベルによって制御され得る。炎症応答中のこれらの分子の発現は、組織への免疫細胞の溢出を増加又は減少させる動的プロセスである。最近、活性化内皮上でのローリング及びＩＣＡＭ−１依存性の停止の間のＥ−セレクチンとの相互作用の結果として、Ｔｈ１７細胞が臓器中に蓄積することが示された（Alcaide et al., 2012）。これらの分子がＴｈ１７細胞のＣＤ９５媒介性の内皮Ｔ細胞遊走に寄与したかに対処するために、本発明者等は、内皮細胞及び分化Ｔｈ細胞上の重要な接着分子の発現レベルをｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下又は非存在下で評価した。注目すべきことに、ＨＵＶＥＣの表面で重要な量のＥ−セレクチンが観察された一方で、これらの細胞でＰ−セレクチンは検出されなかった。さらに、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、ＨＵＶＥＣ上の異なる接着分子の発現レベルを変化させなかった。対照的に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下で、Ｔｈ１７細胞は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質（ＰＳＧＬ−１）（Ｅ−及びＰ−セレクチンのリガンド）及びＩＣＡＭ−１結合パートナーＬＦＡ−１のアップレギュレーションを受けた。これらのリガンドの発現レベルは、Ｔｈ１細胞では影響を受けないままで、Ｔｒｅｇ細胞ではダウンレギュレーションされた状態に向かう傾向にあった。機能的に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激されたＴｈ１７細胞中のＰＳＧＬ−１アップレギュレーションの影響は、Ｅ−セレクチン中和ｍＡｂの使用によって評価された。抗Ｅ−セレクチンは、同様に処理されたＴｈ１細胞と比較して、Ｔｈ１７細胞遊出をより効果的に阻害した。反対に、抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂによるＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用の遮断は、内皮細胞を通過するＴｈ１とＴｈ１７の両細胞の遊走をより小さい程度に弱めた。これらの知見は、ｃｌ−ＣＤ９５ＬがＰＳＧＬ−１／Ｅ−セレクチン相互作用を増強することによってＣＤ９５媒介性のＴｈ１７細胞遊出を促進したことを示唆した。
【００７２】
Ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、インビボで急速なＴｈ１７細胞の蓄積を引き起こす
Ｔｈ１７細胞に対するｃｌ−ＣＤ９５Ｌの化学走化能をインビボで確認するために、マウスに単回用量のｃｌ−ＣＤ９５Ｌ又はビヒクルを腹腔内注射し、２４時間後、腹腔に浸潤しているＴ細胞（腹腔滲出細胞−ＰＥＣ）及び脾臓に浸潤しているＴ細胞の組成を調べた。ＰＥＣ及び脾臓由来の総細胞カウントは、ビヒクルを注射したマウスと比較して、これらの区画中のリンパ球の数の有意な増加を明らかにした（図２Ａ〜Ｂ）。ＣＤ６２Ｌ発現の喪失は、Ｔ細胞レセプター連結と関連する。このマーカーを使用して、本発明者等は、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌを注射した又は未注射のマウスの脾臓及び腹腔へ動員された活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−）の量を評価した。本発明者等は、対照媒体と比較してｃｌ−ＣＤ９５Ｌを注射したときに腹腔及び脾臓中に動員されたＴ細胞の数の増加を観察した（図２Ｃ〜Ｄ）。さらに、これらの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞で実施されたＩＬ−１７（図２Ｅ）、ＩＬ−２３Ｒ（図２Ｆ）及びＣＣＲ６（図２Ｇ）を含むＴｈ１７系列の重要なマーカーのＱ−ＰＣＲ分析は、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌがこれらの組織でＴｈ１７細胞の動員を誘導したことを示した。さらに、試験の上で、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１細胞）のレベル及びＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇ）レベルの増加はなく（図２Ｈ〜Ｉ）、このことは、ｃｌ−ＣＤ９５ＬがＴｈ１７Ｔ細胞に対して強力な走化性リガンドとして主に作用したことを強く支持している。
【００７３】
ＣＤ９５は、デスドメイン非依存性のＣａ２＋応答をトリガーする
本発明者等は、最近、ＣＤ９５連結が、アポトーシスシグナルを一過性に阻害した活性化Ｔリンパ球においてＣａ２＋応答を惹起したこと（Khadra et al., 2011）及び細胞運動性を促進したこと（Tauzin et al., 2011）を示した。これらの観察は、このＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋応答の阻害が、細胞遊走を同時に阻害し、かつ、アポトーシスシグナルを増強又は少なくとも未変化のままにし得るかという疑問を提起した。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露されたＴ細胞は、ホスホリパーゼＣγ１（ＰＬＣγ１）を含有する分子複合体を急速に形成した（図３Ａ）。注目すべきことに、Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔにおけるこのリパーゼの欠如は、ＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋シグナルの喪失を引き起こしたが、野生型ＰＬＣγ１でのこれらの細胞の再構築は、親Ｔ細胞株のカルシウム応答と類似のカルシウム応答を回復した（図３Ｂ）。次に、本発明者等は、ＤＩＳＣの主要成分がＣＤ９５媒介性カルシウムシグナルに関与したかを調査した。この目的のために、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激したＦＡＤＤ−及びカスパーゼ−８−欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞でカルシウムシグナルを評価した（図３Ｃ）。興味深いことに、これらの分子の排除は、アポトーシスシグナル伝達経路の伝達を遮断したが、ＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋シグナルに影響を及ぼすことはなく（図３Ｃ）、このことは、ＰＬＣγ１活性化がＤＩＳＣ形成及び細胞死シグナルの遂行とは無関係に生じたことを示している。
【００７４】
考察：
本発明者等の研究は、メタロプロテアーゼで切断されたＣＤ９５ＬがＳＬＥ患者において炎症を増強する細胞及び分子機序への新たな見識を提供する。本発明者等は、膜貫通ＣＤ９５Ｌがループス患者の炎症を起こした皮膚中の血管を覆う内皮細胞によって異所的に発現されることを示す。さらに重要なことには、これらのＣＤ９５Ｌ＋の血管は、巨大な免疫浸潤物によって囲まれており、このことは、これらの構造がそのＴｈ１７細胞の中でも炎症誘発細胞の「オープンドア」となり得ることを強く示唆している。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露されると、これらのＩＬ１７発現細胞は、ＰＳＧＬ−１及びＬＦＡ−１（内皮細胞への白血球のローリング及び係留に関与する２つの接着分子）をアップレギュレートする。注目すべきことに、最高レベルの機能性ＰＳＧＬ−１を有するＴ細胞はまた、最も高いエフェクターサイトカイン分泌能及び細胞毒性活性能を示す（Baaten et al., 2013）。そのため、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、炎症を起こした組織で活性化Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞の動員を促進するだけでなく、これらの臓器におけるサイトカイン放出のパターンを変化させることによっても、炎症プロセスを刺激し得る。最近のＩ／ＩＩ相臨床試験は、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ相互作用を遮断することが可能なデコイレセプター（ＡＰＧ１０１として公知）が、膠芽腫に罹患しているヒトで毒性を全く示さなかったことを見いだした（Tuettenberg et al., 2012）。本発明者等は、この治療薬が短期間でループス患者に利益をもたらし得ると想定し得る。それ故、本発明者等は、ＣＤ９５媒介性Ｃａ２＋応答の選択的阻害が、特定の慢性炎症障害においてｃｌ−ＣＤ９５Ｌの炎症誘発活性を遮断する優れた機会を提供するだろうと提唱する。
【００７５】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【００７６】
【表１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【国際調査報告】
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