(57)【要約】  本開示は、ヒトプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメント（限定的なものではないがモノクローナル抗体を含む）を提供する。本発明は更に、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントをコードする核酸、ならびにそれらで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の抗体および抗原結合性タンパク質は組織サンプルにおけるヒトＰＤ−Ｌ２発現の免疫組織化学的検出のための方法において有用である。
2018533914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の、３個の軽鎖ＣＤＲ、ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の、３個の重鎖ＣＤＲを含む、ヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号２または配列番号２の変異体であり、
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号４または配列番号４の変異体であり、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号６または配列番号６の変異体であり、
（ｄ）ＣＤＲＨ１は配列番号１０または配列番号１０の変異体であり、
（ｅ）ＣＤＲＨ２は配列番号１２または配列番号１２の変異体であり、
（ｆ）ＣＤＲＨ３は配列番号１４または配列番号１４の変異体である、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
前記の３個の軽鎖ＣＤＲが配列番号２、配列番号４および配列番号６であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲが配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４である、請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号８または配列番号８の変異体からなる群から選択され、
（ｂ）重鎖可変領域が、配列番号１６または配列番号１６の変異体からなる群から選択される、
軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項２記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
軽鎖可変領域が配列番号８であり、重鎖可変領域が配列番号１６である、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項３記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
マウスＩｇＧ１定常領域を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の単離された抗体。
【請求項６】
各重鎖がマウスＩｇＧ１定常領域を含み、各軽鎖がマウスカッパ定常領域を含む、２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の単離された抗体。
【請求項７】
抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸であって、抗体軽鎖可変領域が配列番号８を含み、抗体重鎖可変領域が配列番号１６を含む、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１７および配列番号１８の一方または両方を含む、請求項７記載の単離された核酸。
【請求項９】
請求項７または８記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
ヒトから摘出された組織サンプルをＰＤ−Ｌ２発現に関してアッセイする方法であって、
（ａ）ヒトＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−Ｌ２結合性試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをＰＤ−Ｌ２結合性試薬と接触させ、ここで、該結合試薬は、請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含み、
（ｂ）未結合のＰＤ−Ｌ２結合性試薬を除去し、
（ｃ）結合したＰＤ−Ｌ２結合性物質の存在または非存在を検出することを含む、方法。
【請求項１２】
結合した結合性試薬の量を定量することを更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
結合性試薬が２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖を含み、各重鎖が配列番号１６およびマウスＩｇＧ１定常領域を含み、各軽鎖が配列番号８およびマウスカッパ定常領域を含む、請求項１１または請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
組織サンプルが腫瘍由来である、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
組織サンプルが腫瘍由来であり、患者が膀胱癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌または三種陰性乳癌と診断されている、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ヒトＰＤ−Ｌ２に結合した該抗体または抗原結合性フラグメントの複合体を検出するための試薬のセットとを含むキット。
【請求項１７】
該抗体が２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖を含み、各重鎖が配列番号１６およびマウスＩｇＧ１定常領域を含み、各軽鎖が配列番号８およびマウスカッパ定常領域を含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
（１）腫瘍由来のサンプルがＰＤ−Ｌ２発現に関して陽性であるか陰性であるかを判定し、
（２）腫瘍がＰＤ−Ｌ２に関して陽性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストの治療的有効量を対象に投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法。
【請求項１９】
腫瘍組織サンプルがＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性であるかどうかを判定する工程を更に含み、サンプルがＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方に関して陽性であると判定された場合には、患者にＰＤ−１アンタゴニストを投与する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
サンプルがＰＤ−Ｌ２発現に関して陽性であるか陰性であるかを判定する工程を、請求項１１〜１３または１５のいずれか１項記載の方法を用いて行う、請求項１８または１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に結合し、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析によるヒト組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ２発現の検出に有用である抗体およびその抗原結合性フラグメントに関する。本発明はまた、この抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体を使用する免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイに関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１５年９月２１日付け出願の米国仮特許出願第６２／２２１，４７２号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００３】
電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、ファイル名「２４１８８ＷＯＰＣＴ−ＳＥＱＬＩＳＴ−１４ＳＥＰＴ２０１６．ＴＸＴ」、２０１６年９月１４日の作成日および１３．７ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【背景技術】
【０００４】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）系を標的とする免疫チェックポイント療法は複数のヒト癌における臨床応答の画期的な改善をもたらしている（Ｂｒａｈｍｅｒら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２，３６６：２４５５−６５；Ｇａｒｏｎら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５，３７２：２０１８−２８；Ｈａｍｉｄら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３，３６９：１３４−４４；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４，３８４：１１０９−１７；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５，３７２：２５２１−３２；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５，３７２：３２０−３０；Ｔｏｐａｌｉａｎら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２，３６６：２４４３−５４；Ｔｏｐａｌｉａｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４，３２：１０２０−３０；Ｗｏｌｃｈｏｋら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３，３６９：１２２−３３）。Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体と腫瘍および免疫浸潤細胞上のそのリガンド（すなわち、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）との相互作用はＴ細胞媒介性免疫応答を調節し、ヒト腫瘍による免疫逃避において何らかの役割を果たしている可能性がある（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２：２５２−６４）。ＰＤ−１の、そのリガンドのいずれかへの結合は、Ｔ細胞への抑制性刺激の運搬をもたらす。ＰＤ−１系を標的とする免疫療法には、ＰＤ−１受容体に対するモノクローナル抗体［ＯＰＤＩＶＯ（ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪおよびＫＥＹＴＲＵＤＡ（ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）），Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ］、そしてまた、ＰＤ−Ｌ１リガンドに結合するもの［ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ］が含まれる。どちらの治療アプローチも幾つかの癌型において抗腫瘍効果を示している。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ２タンパク質発現は或る条件下の抗原提示細胞上および腫瘍微小環境中で検出されている。また、種々の組織のノーザンブロット分析は、ＰＤ−Ｌ２  ＲＮＡが心臓、胎盤、肝臓、膵臓、脾臓、リンパ節、肺、平滑筋および胸腺において発現されることを示している。したがって、ヒト組織において（例えば、ＩＨＣアッセイにより）インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でＰＤ−Ｌ２タンパク質を検出しうることが、ＰＤ−Ｌ２タンパク質の生物学的活性を調べるのに、およびＰＤ−１系を標的とする薬物の抗腫瘍効力を評価するのに重要である。
【０００６】
ＩＨＣアッセイは、ヒト組織サンプルにおける目的のタンパク質を検出するための最も一般的な技術の１つである。ヒト患者から摘出された腫瘍組織サンプルは、典型的には、個々の組織切片を凍結させることにより、またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を調製することにより、後続分析のために保存される。類似した特異性および感度を有する凍結組織切片およびＦＦＰＥ組織切片の両方について染色パターンを生成しうる、および再現可能な様態でそれを行いうる抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明は、非常に特異的で高感度で再現性のある様態で凍結組織切片およびＦＦＰＥヒト組織切片の両方におけるＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合しうる新規抗ヒトＰＤ−Ｌ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。本発明者らは、この新規抗ヒトＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂが、以下の基準、すなわち、特異性、感度および再現性の１以上に基づいて、ＩＨＣアッセイで使用される幾つかの商業的に入手可能な抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体より優れていると考えている。これらの３つの基準の３つ全てを満たしているわけではない市販抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体としては、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）からカタログ番号ＭＡＢ１２２４として入手可能なマウスＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂであるクローン＃１７６６１１、ポリクローナルヤギＩｇＧであるＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＡＦ１２２４として入手可能なもの、およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）（サンディエゴ，ＣＡ  ＵＳＡ）からカタログ番号３４５５０１として入手可能なマウスＩｇＧ１  ｍＡｂであるクローンＭＩＨ１８が挙げられる。したがって、本発明はまた、ＦＦＰＥ組織切片におけるＰＤ−Ｌ２を検出するためのＩＨＣアッセイを含む、ヒト細胞の表面上のＰＤ−Ｌ２発現の検出における本発明の抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂの使用に関する。
【０００８】
１つの態様においては、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該単離ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の、３個の軽鎖ＣＤＲ、ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の、３個の重鎖ＣＤＲを含む。
【０００９】
本発明の１つの実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号２または配列番号２の変異体であり、ＣＤＲＬ２は配列番号４または配列番号４の変異体であり、ＣＤＲＬ３は配列番号６または配列番号６の変異体である。
【００１０】
１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号１０または配列番号１０の変異体であり、ＣＤＲＨ２は配列番号１２または配列番号１２の変異体であり、ＣＤＲＨ３は配列番号１４または配列番号１４の変異体である。
【００１１】
１つの実施形態においては、前記の３個の軽鎖ＣＤＲは配列番号２、配列番号４、および配列番号６であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲは配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４である。
【００１２】
本発明の幾つかの抗体および抗原結合フラグメントは軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態においては、軽鎖可変領域は配列番号８または配列番号８の変異体を含み、重鎖可変領域は配列番号１６または配列番号１６の変異体を含む。そのような実施形態においては、変異体軽鎖または重鎖可変領域配列は、フレームワーク（すなわち、ＣＤＲの外部）に１、２、３、４または５個のアミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一である。幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換の１、２、３、４または５個は保存的置換である。
【００１３】
本発明の１つの抗体または抗原結合性フラグメントにおいては、軽鎖可変領域は配列番号８であり、重鎖可変領域は配列番号１６である。
【００１４】
前記抗体の実施形態の全てにおいては、単離された抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラスの完全長抗体でありうる。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。１つの実施形態においては、抗体は２個の同一重鎖および２個の同一軽鎖を含み、ここで、各重鎖はマウスＩｇＧ１定常領域を含み、各軽鎖はマウスカッパ定常領域を含む。
【００１５】
本発明はまた、製剤中に前記抗体または抗体フラグメントのいずれかを含む抗体組成物を提供する。１つの適切な製剤は２０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび９％  スクロースをｐＨ５．０で含む。
【００１６】
前記実施形態のいずれかにおいては、抗原結合性フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントでありうる。
【００１７】
前記実施形態のいずれかにおいては、抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能な標識を更に含みうる。
【００１８】
本発明はまた、前記で開示されている抗体可変領域のいずれかをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。１つの実施形態においては、核酸分子は、配列番号１７または配列番号１８に記載されているヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態においては、核酸分子は、配列番号１７および配列番号１８に記載されているヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、前記で開示されている抗体、抗原結合性フラグメントまたは抗体可変領域のいずれかをコードする発現ベクターを含む宿主細胞に関する。１つの実施形態においては、発現ベクターは重鎖および軽鎖の両方をコードする。１つの実施形態においては、発現ベクターは配列番号１７および配列番号１８の一方または両方を含む。
【００２０】
本発明はまた、ヒトから摘出されたヒト組織サンプルをＰＤ−Ｌ２発現に関してアッセイする方法を提供する。該方法は、ヒトＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−Ｌ２結合性試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをＰＤ−Ｌ２結合性試薬と接触させ、未結合のＰＤ−Ｌ２結合性試薬を除去し、結合したＰＤ−Ｌ２結合性物質の存在または非存在を検出することを含む。１つの好ましい実施形態においては、該方法は、結合した結合性試薬の量を定量することを更に含む。ＰＤ−Ｌ２結合性試薬は前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかである。１つの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２結合性試薬は、配列番号８および配列番号１６を含む抗体である。１つの実施形態においては、組織サンプルは腫瘍由来である。１つの実施形態においては、組織サンプルは、膀胱癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）または三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）と診断された患者から摘出された腫瘍組織を含む。１つの実施形態においては、該方法は、ＰＤ−Ｌ１発現に関して組織サンプルを試験することを更に含む。１つの実施形態においては、患者から摘出された別の組織サンプルはＰＤ−Ｌ２発現に関して陰性の試験結果を過去に示している。
【００２１】
もう１つの態様においては、該方法は、癌と診断された患者を治療することを含む。該方法は、前記の抗ＰＤ−Ｌ２モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを使用するＩＨＣアッセイによりＰＤ−Ｌ２発現に関して患者が陽性の試験結果を示すかどうかを判定し、患者が陽性試験結果を示した場合には、患者をＰＤ−１アンタゴニストで治療し、該ＩＨＣアッセイによりＰＤ−Ｌ２発現に関して患者が陰性の試験結果を示した場合には、患者をＰＤ−１アンタゴニストで治療しないことを含む。１つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である。
【００２２】
更にもう１つの態様においては、本発明は、ＰＤ−Ｌ２発現に関してヒト組織サンプルをアッセイするためのキットを提供する。該キットは、ＰＤ−Ｌ２結合性物質と、ヒトＰＤ−Ｌ２に結合した結合性物質を含む複合体を検出するための試薬のセットとを含む。ＰＤ−Ｌ２結合性物質は、ヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する前記の任意のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２結合性試薬は配列番号８および配列番号１６を含む。
【００２３】
発明の詳細な説明
腫瘍関連ＰＤ−Ｌ１発現は抗ＰＤ−１療法に対する臨床的応答に関連している。しかし、ＰＤ−Ｌ１陰性患者も抗ＰＤ−１療法に応答しうる。このことは、他のＰＤ−１相互作用が応答性に関連している可能性があることを示唆している。ＰＤ−１のもう一方の公知リガンドであるＰＤ−Ｌ２の保有率および分布は十分には研究されていない。商業的に入手可能な抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体は、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣアッセイにおいてヒトＰＤ−Ｌ２を検出するのに満足しうるものではない。この目的を達成するために、本発明は、単離された抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質、およびヒト組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ２発現の検出方法における該抗原結合性タンパク質の使用方法を提供する。本発明は更に、抗ＰＤ−１治療を要する患者における抗ＰＤ−１治療に対する臨床応答性を予測するための、本発明のＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。幾つかの実施形態においては、患者は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有する。
【００２４】
抗ＰＤ−１標的化療法に対する臨床応答は腫瘍型によって異なる可能性があり、これらの療法から最大の利益を受ける患者を特定するのに役立つ予測バイオマーカーを見出すことに多大な努力が払われている。ＰＤ−１系標的化治療に適した患者のスクリーニングは、主として、免疫組織化学法（ＩＨＣ）により検出される、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現の評価に焦点が合わされている。ＰＤ−Ｌ１発現に関する試験は幾つかの腫瘍型における応答者集団を絞り込むことを可能にしているが、ＰＤ−Ｌ１陽性患者の一部は抗ＰＤ−１系療法に対して低い応答性しか示しておらず、一部のＰＤ−Ｌ１陰性患者は良好な応答を示している（Ｇａｒｏｎら，２０１５，前掲；Ｒｏｂｅｒｔら，２０１５，前掲；Ｈｅｒｂｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５：５６３−７；Ｔｕｍｅｈら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５：５６８−７１）。このことは、ＰＤ−Ｌ２を含むＰＤ−Ｌ１以外のＰＤ−１との分子的相互作用がこれらの治療に対する臨床応答性の予測に関連している可能性があることを示唆している。
【００２５】
腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ２の発現およびＰＤ−１系標的化療法に対する応答とのその相関性は十分には研究されていない。ＰＤ−Ｌ１と同様に、ＰＤ−Ｌ２とのＰＤ−１相互作用はＴ細胞増殖、サイトカイン産生およびＴ細胞細胞溶解を抑制する（Ｌａｔｃｈｍａｎら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，２：２６１−８；Ｒｏｄｉｇら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３，３３：３１１７−２６）。これまでの研究は、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージならびに非免疫細胞において発現されることを見出しており、一方、ＰＤ−Ｌ２発現は抗原提示細胞に、より限局される（尤も、種々の微小環境刺激により他の免疫細胞および非免疫細胞において誘導可能である）ことが確認されている（Ｌａｔｃｈｍａｎら，２００１，前掲；Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１，４９：１−３；Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１１，１２１：３１００−８；Ｍｅｓｓａｌら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１，４８：２２１４−９）。これらの相違はＰＤ−１系におけるこれらの２つのリガンドに関する異なる機能を反映している可能性があり、この場合、ＰＤ−Ｌ１はより一般的な抗炎症作用を媒介し、ＰＤ−Ｌ２はＴ細胞プライミングにおいて何らかの役割を果たしている可能性がある（Ｃｈｅａｈら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５，２７：３８４−９１）。限られた研究において、調べられた幾つかの適応症からのヒト腫瘍においてＰＤ−Ｌ２発現が示されており、幾つかのサンプルにおいてはＰＤ−Ｌ１の非存在下で発現が検出され、臨床応答とのその関係に関して種々の結果が示された（Ｈｅｒｂｓｔら，２０１４，前掲；Ｔａｕｂｅら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４，２０：５０６４−７４；Ｓｃｈｉｍｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１６，３４  Ｓｕｐｐｌ  １５，１１５０６）。
【００２６】
ＰＤ−Ｌ２の発現が、単独で又はＰＤ−Ｌ１と組合されて、ＰＤ−１系を標的とする療法の有効性に影響を及ぼしうることを考慮して、本発明者らは、本発明のＰＤ−Ｌ２抗体を使用する新規ＰＤ−Ｌ２  ＩＨＣアッセイを用いて、７つの癌適応症にわたる４００個を超える保存ヒト腫瘍サンプルにおいて、ＰＤ−Ｌ２の保有率および分布を本発明で評価した。ＰＤ−Ｌ２発現は全ての腫瘍型において観察され、間質、腫瘍および内皮細胞において発現された。本発明者らは更に、ＰＤ−Ｌ２の保有率および分布がＰＤ−Ｌ１と有意に相関する（Ｐ＝０．００１２−＜０．０００１）ことを本明細書に示す。しかし、幾つかの腫瘍型においてはＰＤ−Ｌ２はＰＤ−Ｌ１の非存在下で検出された。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の陽性がペンブロリズマブに対する臨床応答を有意に予測したことも示されており、この場合、ＰＤ−Ｌ１の状態には無関係にＰＤ−Ｌ２の状態の影響が有意であった。全体的な応答は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に両方に関して陽性の患者においては（２７．５％）、ＰＤ−Ｌ１のみに関して陽性の患者の場合（１１．４％）より大きかった。ＰＤ−Ｌ２の状態は、ＰＤ−Ｌ１の状態には無関係に、ペンブロリズマブ療法での無増悪生存（ＰＦＳ）の有意な予測因子であった。ＰＤ−Ｌ２陽性患者においては、ＰＤ−Ｌ２陰性患者の場合より長いＰＦＳ生存期間中央値および全生存が認められた。
【００２７】
定義および略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
【００２８】
ＣＤＲ：特に示されていない限り、Ｋａｂａｔ番号付け系を用いて定められる、免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＥＣ５０：５０％の効力または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ：酵素結合イムノソルベントアッセイ
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋
ＦＲ：フレームワーク領域
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＮＳＣＣ：頭頸部扁平上皮細胞癌
ＩＣ５０：５０％の抑制をもたらす濃度
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＨＣ：免疫組織化学または免疫組織化学的
ｍＡｂまたはＭａｂ：モノクローナル抗体
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ−１：プログラム死１
ＰＤ−Ｌ１：プログラム細胞死１リガンド１
ＰＤ−Ｌ２：プログラム細胞死１リガンド２
ＴＮＢＣ：三種陰性乳癌
ＶＨ：免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ：免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
ＶＬ：免疫グロブリン重鎖可変領域
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用語を特に以下に定義する。本明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書で用いられている全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されている意味を有する。
【００２９】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の単語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、対応する複数対象物を含む。
【００３０】
分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「活性」は、先天性または適応免疫系の成分のモジュレーションを意味しうる。
【００３１】
典型的には、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは（親抗体と比較された場合、すなわち、抗体３Ｇ２の軽鎖および重鎖可変領域を含む四量体抗体と比較された場合）そのヒトＰＤ−Ｌ２結合活性の少なくとも１０％（その活性がモル基準で表された場合）を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、親抗体としてのヒトＰＤ−Ｌ２結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保有する。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸置換（該抗体の「保存的変異体」または「機能保存変異体」と称される）を含みうることも意図される。
【００３２】
「投与」および「治療（処理、処置）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。細胞の処理は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療、処置）」は、試薬、診断剤、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「対象」なる語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。
【００３３】
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体を意味する。したがって、それは最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびキメラ抗体（これらに限定されるものではない）を含む。「親抗体」は、意図される用途のための抗体の修飾（例えば、ヒト治療用抗体としての使用のための抗体のヒト化）の前の、抗原への免疫系の曝露により得られた抗体である。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、抗体は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全抗体（無傷抗体）は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同一である。
【００３５】
典型的には、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）により包囲された、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。一般に、Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖および重鎖可変領域はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。特に示されていない限り、本発明の抗体の種々の領域へのアミノ酸の帰属はＫａｂａｔの定義に従っている（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６を参照されたい）。ＣＤＲの帰属のための代替的アプローチはＣｈｏｔｈｉａの定義を用いる（例えば、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３を参照されたい）。
【００３６】
特定された標的タンパク質に「特異的に結合する」抗体は、他のタンパク質と比較して該標的タンパク質への優先的な結合を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要しない。したがって、抗ＰＤ−Ｌ２抗体が、与えられたアミノ酸配列（例えば、成熟ヒトＰＤ−Ｌ２分子のアミノ酸配列または成熟ヒトＰＤ−Ｌ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列）を含むヒトＰＤ−Ｌ２ポリペプチドに対して特異的であると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチドには結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。また、抗ｈＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原結合性フラグメントがヒトＰＤ−Ｌ２に「特異的」とみなされるのは、例えば、ＩＨＣ診断アッセイにおける偽陽性のような望ましくない結果をもたらすことなく、その結合がサンプル中のヒトＰＤ−Ｌ２の存在の決定因子である場合である。抗ｈＰＤ−Ｌ２抗体または抗原結合性フラグメントに必要な特異性の度合は該抗体またはフラグメントの意図される用途に左右されうるが、いずれにせよ、意図される目的の用途のためのその適合性により定められる。本発明において有用な抗体またはその結合性フラグメントは、非標的タンパク質に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティでヒトＰＤ−Ｌ２に結合する。
【００３７】
特に示されていない限り、本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、抗体の抗原結合性フラグメントを、すなわち、完全長抗体に結合する抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
「Ｆａｂフラグメント」は１個の軽鎖と１個の重鎖のＣＨ１および可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の生成物でありうる。
【００３９】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２個の重鎖フラグメントを含有する。それらの２個の重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により合体している。
【００４０】
「Ｆａｂ’フラグメント」は１個の軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１個の重鎖の一部分またはフラグメント、そしてまた、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の領域を含有していて、２個のＦａｂ’フラグメントの２個の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成しうる。
【００４１】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部分を含有する２個の重鎖と、２個の軽鎖とを含有していて、それらの２個の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２個の重鎖の間のジスルフィド結合により合体する２個のＦａｂ’フラグメントから構成される。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は抗体のペプシン切断の生成物でありうる。
【００４２】
「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００４３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを意味し、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００４４】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して２価ドメイン抗体を形成している。２価ドメイン抗体の、２個のＶＨ領域は、同じ又は異なる抗原を標的としうる。
【００４５】
「２価抗体」は２個の抗原結合部位を含む。幾つかの場合には、それらの２個の結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、２価抗体は二重特異性でありうる（後記を参照されたい）。
【００４６】
本明細書中で用いる「ジアボディ」なる語は、２個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同一鎖上の２個のドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペア形成を強要され、２つの抗原結合部位を形成する。ジアボディは、例えばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８に更に詳しく記載されている。操作された抗体変異体の概説としては、全般的には、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１１２６−１１３６を参照されたい。
【００４７】
本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」なる語は、ＣＤＲアミノ酸配列と重複しない抗体可変領域におけるアミノ酸配列を意味する。
【００４８】
抗体３Ｇ２は、以下の表１に示す構造的特徴を含む、ハイブリドーマクローンＭＥＢ１２３．３Ｇ２．０３８から産生されるマウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂである。
【表１】
2018533914.tif 000003
【００４９】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、全てのそのような語は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、導入の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代が厳密に同じＤＮＡ含量を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞において選別されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【００５０】
「含む」、または「含み」、「含んでいて」もしくは「含まれる」のような派生語は、明確な言語または必然的暗示によって文脈に矛盾している場合を除き、本明細書および特許請求の範囲の全体において包括的な意味で用いられ、すなわち、本発明の実施形態のいずれかの実施または有用性を実質的に促進しうる更なる特徴の存在または付加を排除することなく、示されている特徴の存在を特定するために用いられる。
【００５１】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、この場合、該変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を表２に記載する。
【表２】
2018533914.tif 000004
【００５２】
本明細書および特許請求の範囲の全体において用いられる「から実質的になる」およびその派生語、例えば「から実質的になり」または「から実質的になっており」は、任意の列挙されている要素または要素群の包含、および特定されている投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、列挙要素と類似した又は異なる性質の他の要素の随意的（すなわち、所望により含んでいてもよい）包含を示す。非限定的な一例としては、列挙されているアミノ酸配列から実質的になる抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、結合特異性または活性に実質的な影響を及ぼさない、１以上のアミノ酸残基の置換を含む１以上のアミノ酸をも含んでいてもよい。
【００５３】
「制御配列」なる語は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、所望により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公知である。
【００５４】
核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能的に連結（されている）」は、連結されているそれらのＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつ、リーディングフェーズにおけるものであることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は簡便な制限部位における連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００５５】
「診断用抗ＰＤ−Ｌモノクローナル抗体」は、ある哺乳類細胞の表面上で発現される示されているＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２）の成熟形態に特異的に結合するｍＡｂを意味する。
【００５６】
本明細書中で用いる診断用抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂまたは抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、成熟ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するｍＡｂを意味する。成熟ヒトＰＤ−Ｌ１分子は以下の配列のアミノ酸１９〜２９０からなる。
【００５７】
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号２１）。
【００５８】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現の免疫組織化学的（ＩＨＣ）検出のための診断用ｍＡｂとして有用な診断用抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの具体例としては、抗体２０Ｃ３および抗体２２Ｃ３が挙げられ、これらは、２０１３年１２月１８日に出願され２０１４年６月２６日にＷＯ２０１４／１０００７９として公開された同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／０７５９３２に記載されている。ＦＦＰＥ組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現のＩＨＣ検出に有用であると報告されているもう１つの抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：３４６２−３４７３（２０１３））は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  １００８４−Ｒ０１５）から公的に入手可能なウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂである。
【００５９】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の、それらが最適に整列（アライメント）された場合の配列類似性を意味する。それらの２つの比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占拠されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の百分率（％）は、それらの２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算したものである。例えば、２つの配列における１０個中８個の位置が、それらの配列が最適に整列された場合に一致（マッチ）している又は相同であれば、それらの２つの配列は８０％相同である。一般に、該比較は、最大の相同性（％）を与えるように２つの配列が整列された場合に行われる。例えば、該比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われることが可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される。
【００６０】
以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００６１】
「ヒトＰＤ−Ｌ２」、「ｈＰＤ−Ｌ２」および「ヒト成熟ＰＤ−Ｌ２」なる語は本明細書において互換的に用いられ、特に示されていない限り又はそうでないと文脈から容易に理解されない限り、同じ分子を意味すると理解されるべきである。成熟ＰＤ−Ｌ２分子は、リーダーペプチドとも称される分泌前リーダー配列を欠いている。ＰＤ−Ｌ２の別名または同義語にはＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が含まれる。成熟ヒトＰＤ−Ｌ２アミノ酸配列はＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ番号：ＮＰ ０７９５１５に記載されており、以下に示すアミノ酸配列からなる。
【００６２】
ＦＴＶＴＶＰＫＥＬＹＩＩＥＨＧＳＮＶＴＬＥＣＮＦＤＴＧＳＨＶＮＬＧＡＩＴＡＳＬＱＫＶＥＮＤＴＳＰＨＲＥＲＡＴＬＬＥＥＱＬＰＬＧＫＡＳＦＨＩＰＱＶＱＶＲＤＥＧＱＹＱＣＩＩＩＹＧＶＡＷＤＹＫＹＬＴＬＫＶＫＡＳＹＲＫＩＮＴＨＩＬＫＶＰＥＴＤＥＶＥＬＴＣＱＡＴＧＹＰＬＡＥＶＳＷＰＮＶＳＶＰＡＮＴＳＨＳＲＴＰＥＧＬＹＱＶＴＳＶＬＲＬＫＰＰＰＧＲＮＦＳＣＶＦＷＮＴＨＶＲＥＬＴＬＡＳＩＤＬＱＳＱＭＥＰＲＴＨＰＴＷＬＬＨＩＦＩＰＦＣＩＩＡＦＩＦＩＡＴＶＩＡＬＲＫＱＬＣＱＫＬＹＳＳＫＤＴＴＫＲＰＶＴＴＴＫＲＥＶＮＳＡＩ（配列番号２２）。成熟ヒトＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインは配列番号２２のアミノ酸１〜２２０からなる。
【００６３】
「単離された抗体」または「単離された抗体フラグメント」は精製状態を意味し、そのような文脈においては、該分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または細胞残渣および増殖培地のような他の物質を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味することを意図されないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。
【００６４】
「単離された核酸分子」は、該単離ポリヌクレオチドが天然で見出される場合のポリヌクレオチドの全部または一部を伴っておらず、あるいはそれが天然で連結していないポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示の目的においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無傷染色体を含まない、と理解されるべきである。特定されている核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定されている配列に加えて、１０個まで又は更には２０個まで又はそれ以上の他のタンパク質またはその一部もしくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、および／あるいは、ベクター配列を含むことが可能である。
【００６５】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味する。すなわち、該集団を構成する抗体分子は、少量で存在しうる可能な天然に生じる突然変異以外はアミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、可変ドメイン、特にＣＤＲ内に種々のアミノ酸配列を有する多数の種々の抗体を含み、これらは種々のエピトープに特異的であることが多い。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたという、抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による該抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されることが可能である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いるファージ抗体ライブラリーからも単離されうる。また、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
【００６６】
本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているとおり、特定の核酸配列、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅する方法または技術を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、関心領域の末端またはその向こうからの配列情報が用いられる。これらのプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列において同一または類似である。それらの２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と一致しうる。ＰＣＲは、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するために用いられうる。全般的には、Ｍｕｌｌｉｓら，（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ編，（１９８９）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本明細書中で用いるＰＣＲは、核酸の特異的断片を増幅し又は生成させるための核酸ポリメラーゼとプライマーとしての既知核酸との使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例（しかし唯一の例ではない）とみなされる。
【００６７】
本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再編成免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を意味する。いずれかの適当な未再編成免疫グロブリン配列源が用いられうる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上でＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１に記載されているとおりに得られうる。
【００６８】
本明細書中で用いる「ＰＤ−Ｌ１」または「ＰＤ−Ｌ２」発現は、細胞表面における示されているＰＤ−Ｌタンパク質の、または細胞もしくは組織内の示されているＰＤ−Ｌ  ｍＲＮＡの任意の検出可能なレベルの発現を意味する。ＰＤ−Ｌタンパク質発現は、腫瘍組織切片のＩＨＣアッセイにおいて診断用ＰＤ−Ｌ抗体で、またはフローサイトメトリーにより検出されうる。あるいは、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌタンパク質発現は、所望のＰＤ−Ｌ標的、例えばＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する結合性物質（例えば、抗体フラグメント、アフィボディなど）を使用して、ＰＥＴイメージングにより検出されうる。ＰＤ−Ｌ  ｍＲＮＡ発現を検出し測定するための技術にはＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲが含まれる。
【００６９】
「組織切片」は、組織サンプルの単一の部分または断片、例えば、正常組織または腫瘍のサンプルから切断された組織の薄片を意味する。
【００７０】
「腫瘍」は、癌を有すると診断された又は癌を有する疑いのある対象に適用される場合には、任意のサイズの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊を意味し、原発腫瘍および続発性新生物を含む。固形（充実性）腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない、組織の異常成長または塊を意味する。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞の型にちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病（血液の癌）は、一般に、固形腫瘍を形成しない（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｒｍｓ）。
【００７１】
抗ＰＤ−Ｌ２抗体
本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは３個の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）および３個の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）を含む。該単離抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはその結合性フラグメントは細胞表面上のヒトＰＤ−Ｌ２発現の検出に有用である。本発明の抗ＰＤ−Ｌ２抗体の例には、抗体３Ｇ２の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（表１を参照されたい；ＶＬは配列番号８を含み、またはそれからなり、またはそれから実質的になり、ＶＨは配列番号１６を含み、またはそれからなり、またはそれから実質的になる）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
本発明の幾つかの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２に結合する組換え抗原結合性タンパク質は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のＣＤＲの３、４、５または６個を含む（表１）。１つの実施形態においては、本発明は、抗体３Ｇ２のＣＤＲの６個全てを含む、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００７３】
本発明の１つの実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号２または配列番号２の変異体であり、ＣＤＲＬ２は配列番号４または配列番号４の変異体であり、ＣＤＲＬ３は配列番号６または配列番号６の変異体である。
【００７４】
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントにおいては、変異体ＣＤＲ配列（軽鎖または重鎖）は、参照配列と比較した場合の１個または２個のアミノ酸置換以外は、参照配列と同一である。幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本発明の１つの実施形態においては、変異体ＣＤＲは参照ＣＤＲ配列におけるただ１つのアミノ酸置換を有する。１つの実施形態においては、変異体ＣＤＲにおける前記の１つのアミノ酸置換は保存的置換である。好ましい実施形態においては、３個の軽鎖ＣＤＲの多くとも２個が変異体配列であり、３個の重鎖ＣＤＲの多くとも２個が変異体配列である。より好ましい実施形態においては、変異体配列は６個のＣＤＲのうちの３個、２個または１個のみにおいて存在する。
【００７５】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号２のＣＤＲＬ１、配列番号４のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインを含む。
【００７６】
もう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。１つの実施形態においては、ＶＨドメインは配列番号８からなる。
【００７７】
ＰＤ−Ｌ２に結合する単離された抗原結合性タンパク質は、本発明の抗原結合性タンパク質（例えば、抗体３Ｇ２）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の１以上を含む少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含みうる。特定の実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、本発明の抗原結合性タンパク質の、３個のＣＤＲを含むＶＨドメインを含む。
【００７８】
１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号１０または配列番号１０の変異体であり、ＣＤＲＨ２は配列番号１２または配列番号１２の変異体であり、ＣＤＲＨ３は配列番号１４または配列番号１４の変異体である。
【００７９】
１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号１０に記載されているＣＤＲＨ１、配列番号１２に記載されているＣＤＲＨ２および配列番号１４に記載されているＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインを含む。
【００８０】
もう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。１つの実施形態においては、ＶＨドメインは配列番号１６からなる。
【００８１】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。本発明のもう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列からなるＶＬドメイン、および配列番号１６に記載されているアミノ酸配列からなるＶＨドメインを含む。
【００８２】
他の実施形態においては、本発明は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の誘導体である抗原結合性タンパク質を提供する。本発明の抗原結合性タンパク質誘導体はＰＤ−Ｌ２に特異的に結合し、本明細書に開示されている抗体（例えば、表１におけるもの）のＶＬドメインおよびＶＨドメインに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する一方で、所望の結合および機能的特性（例えば、ＰＤ−Ｌ２結合）を尚も示す。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメインを含む一方で、所望の結合および機能的特性を尚も示す。
【００８３】
本発明の抗原結合性タンパク質誘導体はまた、ＰＤ−Ｌ２に特異的に結合し、本発明の抗原結合性タンパク質（例えば、表１におけるもの）のＶＬドメインおよびＶＨドメインに関して本明細書に開示されているＣＤＲに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）およびＶＨドメインのＣＤＲを有する一方で所望の結合および機能的特性（例えば、ＰＤ−Ｌ２結合）を尚も示す誘導体を含む。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、０、１、２、３個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する開示されているＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲを含む一方で、所望の結合および機能的特性を尚も示す。
【００８４】
配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸が、それらの２つの配列が最適に整列された場合に同等位置において同一である度合を意味する。配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定されることが可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される。以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００８５】
典型的には、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、（親抗原結合性タンパク質と比較された場合）そのヒトＰＤ−Ｌ２結合活性の少なくとも１０％（その活性がモル基準で表された場合）を保有する。好ましくは、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、親抗原結合性タンパク質としてのＰＤ−Ｌ２結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保有する。
【００８６】
該抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部を更に含みうる。１つの実施形態においては、該抗体は２個の免疫グロブリン重鎖および２個
の免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、ここで、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は例えばジスルフィド結合により互いに連結されている。重鎖定常領域は３個のドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合をもたらす。「抗体」なる語はタイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそれらのサブタイプ）の無傷免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダのタイプのものでありうる。
【００８７】
軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００８８】
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は軽鎖可変領域ＣＤＲおよび重鎖可変領域ＣＤＲからのアミノ酸残基を含む。
【００８９】
本発明の抗原結合性タンパク質の機能保存的誘導体も本発明により想定される。本明細書中で用いる「機能保存的誘導体」なる語は、抗原アフィニティおよび／または特異性および／または中和活性のような所望の特性を変化させることなく１以上のアミノ酸残基が変化している抗原結合性タンパク質を意味する。そのような変異体は、類似特性を有するアミノ酸によるアミノ酸の置換、例えば、表２の保存的アミノ酸置換を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
また、高いアフィニティおよび特異性でＰＤ−Ｌ２に結合する能力を尚も示す一方で、１、２、３、４または５個まで又はそれ以上のアミノ酸置換を有する本発明の抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質のＶＨドメインを含む組換えポリペプチド、および本発明の抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質のＶＬドメインを含む組換えポリペプチドを提供する。
【００９１】
もう１つの実施形態においては、本明細書に記載されているＶＬドメインまたはＶＨドメインに対して少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または５０％の配列相同性を有するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを有し、ＰＤ−Ｌ２への特異的結合を示す抗原結合性タンパク質を提供する。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、１、２、３、４または５個まで又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＶＬドメインおよびＶＨドメイン（シグナル配列を伴う又は伴わない）を含み、ＰＤ−Ｌ２への特異的結合を示す。
【００９２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合し、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを有し、表１の軽鎖および重鎖ＣＤＲに対して１００％の配列相同性ならびに表１の軽鎖および重鎖成熟可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％の配列相同性を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
【００９３】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、種々のクラスに帰属されうる。免疫グロブリンの、少なくとも５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗体および抗原結合性フラグメントを含む。
【００９４】
核酸
本発明はまた、本明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗原結合性フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする組換え核酸を提供する。例えば、本発明は、表１に記載されているアミノ酸配列をコードする核酸、およびそれにハイブリダイズする核酸を含む。
【００９５】
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３（配列番号２、４および６）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合性タンパク質をコードする。
【００９６】
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３（配列番号１０、１２および１４）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗原結合性タンパク質をコードする。
【００９７】
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、少なくとも１つの軽鎖（ＶＬ）ドメインと少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む抗原結合性タンパク質をコードし、ここで、ＶＬドメインは、配列番号２、４および６に記載されているアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号１０、１２および１４に記載されているアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。１つの実施形態においては、単離された核酸は、配列番号８に記載されている軽鎖可変領域、および配列番号１６に記載されている重鎖可変領域をコードする。幾つかの実施形態においては、単離された核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の実施形態においては、軽鎖および重鎖は別個の核酸分子上でコードされる。もう１つの実施形態においては、該核酸は更にシグナル配列をコードする。
【００９８】
本発明はまた、ハイブリドーマＭＥＢ１２３．３Ｇ２から単離された全ＲＮＡから調製された抗体可変軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ（それぞれ配列番号１７および配列番号１８）のヌクレオチド配列を提供する。
【００９９】
本発明は更に、本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸を含む。一般に、該核酸は、中等度または高度なストリンジェンシーの条件下、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質をコードする、そしてまた、ＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する能力を維持する抗原結合性タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする。第１核酸分子が第２核酸分子に「ハイブリダイズ可能」と言えるのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）、第１核酸分子の一本鎖形態が第２核酸分子にアニーリングしうる場合である。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド非含有；または３０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、４２℃である。典型的な中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は４０％  ホルムアミド、ならびに５×または６×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、４２℃である。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５０％  ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ、４２℃、または所望により、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）である。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、それらの２つの核酸が相補的配列を含有することを要する。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ、および相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きければ大きいほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチドを超える長さのハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、例えばオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，１１．７−１１．８を参照されたい）。
【０１００】
もう１つの実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されている単離された抗ＰＤ−Ｌ２抗体または抗原結合性フラグメントのポリペプチド鎖の少なくとも１つをコードする単離された核酸（単数または複数）、例えばＤＮＡを提供する。幾つかの実施形態においては、単離された核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の実施形態においては、軽鎖および重鎖は別個の核酸分子上でコードされる。もう１つの実施形態においては、該核酸は更にシグナル配列をコードする。
【０１０１】
また、本明細書に記載されている抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も本発明に含まれる。
【０１０２】
本発明は、本発明の単離された核酸分子を含む発現ベクターをも提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、また、該抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培地内で培養し、該宿主細胞または培地から抗原またはその抗原結合性フラグメントを単離することを含む、本明細書に開示されている抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法も提供する。
【０１０３】
エピトープ結合
本発明は更に、抗体３Ｇ２（「参照抗体」）の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む四量体抗体の、ヒトＰＤ−Ｌ２への結合を、参照抗体と同じエピトープへの結合により遮断する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。そのような抗体および結合性フラグメントは、当技術分野で公知の任意の交差遮断または競合分析を用いて特定されうる。第１抗体が第２抗体の結合を交差遮断するとみなされるのは、飽和状態までの第１抗体への標的の予備結合が、標的の最大半量結合を達成するのに必要な第２抗体の濃度を２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍以上増加させる場合である。交差遮断抗体の結合性エピトープは、当技術分野でよく知られた技術を用いて特定されうる。
【０１０４】
１つのそのようなエピトープマッピング技術は、タンパク質分解および質量分析と組合された水素／重水素交換（ＨＤＸ−ＭＳ）である。この方法は、重水（Ｄ２Ｏ）単体中、およびその抗体の存在下、種々の時間間隔でインキュベートされた際の抗原による重水素取り込みの度合の正確な測定および比較に基づいている。重水素は露出領域内のタンパク質のアミド主鎖上の水素と交換され、一方、抗体に結合した抗原の領域は保護され、タンパク質分解断片の液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析の後、交換をより少量しか又は全く示さない。
【０１０５】
抗体およびその抗原結合性フラグメントの製造方法
本発明の抗体は、所望の抗体を発現するハイブリドーマクローンを培養することにより製造されうる。例えば、約１グラムの３Ｇ２抗体は、以下の方法を用いて、マウスハイブリドーマ細胞株ＭＥＢ１２３．３Ｇ２．０３８から製造され、精製されうる。凍結ＭＥＢ１２３．３Ｇ２．０３８細胞を、０．１８％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の存在下または非存在下で２ｍＭの追加的Ｌ−グルタミンを含有するハイブリドーマ血清非含有培地を含む振とうフラスコ内に解凍する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の存在は振とうフラスコ培養の生存性を改善しうる。細胞が振盪フラスコ内に完全に馴化したら、１０％  ＣＨＯ  ＣＤ高効率フィードＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ１０２４０−０１）を加えながら、ＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）内の無血清培地において２０リットルの生産培養を行う。細胞増殖のために、１リットルの培養を小さなＷＡＶＥバッグ内で開始させ、ついでその１ＬのＷＡＶＥ培養物をＷＡＶＥバイオリアクターにおいて２０Ｌの培養へと拡大させる。その２０リットルの培養を０．５×１０６  生存細胞／ｍＬの細胞密度で開始させ、第１日に１０％  ＣＨＯ  ＣＤ高効率フィードＢを供給し、１Ｎ  Ｎａ２ＣＯ３でｐＨを毎日調節する。４日後に細胞を集める。ＮＯＶＡ分析のために、少量のサンプルを毎日採取することが可能である。
【０１０６】
本発明の抗ｈＰＤ−Ｌ２抗体は以下の方法によりハイブリドーマ培養から精製されうる。１．２マイクロメーターガラス繊維および０．２マイクロメーター酢酸セルロースフィルターを使用するデプス濾過により、該ハイブリドーマ培養を清澄化する。等体積の２×ＰｒｏＳｅｐＡバッファー（１００ｍＭ  ホウ酸，５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）を該清澄化回収物に加え、該希釈回収物を１７０ｍＬ床体積プロテインＡカラム上にローディングする。該カラムを５カラム体積（ＣＶ）の１×ＰｒｏＳｅｐＡバッファー（５０ｍＭ  ホウ酸，２．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）で洗浄し、ついで２ＣＶの１×ＰＢＳで洗浄し、該抗ｈＰＤ−Ｌ２抗体を５ＣＶの溶出バッファー（０．１Ｍ  グリシン，ｐＨ３．０）で溶出する。ＩｇＧを含有する溶出画分を一緒にし、１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨバッファーの１／１０の体積を加えることによりｐＨを中和する。ついで該中和抗体組成物を、１０ｋＤａ  使い捨てＴＦＦカセットを使用して滅菌濾過する。該抗体は、１０リットルの製剤化バッファー（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム，９％  スクロース，ｐＨ５．０）に対するダイアフィルトレーションおよび２０体積の交換により、保存のために製剤化されうる。
【０１０７】
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体は組換え法（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系において）によっても製造されうる。この実施形態においては、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸が、ｐＥＴに基づくプラスミド内に挿入され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７系において発現されうる。当技術分野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造のための方法の一例は米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するためのいずれかの公知方法によるものでありうる。哺乳類細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。また、核酸分子はウイルスベクターにより哺乳類細胞内に導入されうる。細胞の形質転換方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。
【０１０８】
抗体ＰＤ−Ｌ２抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている方法のいずれかによっても製造されうる。
【０１０９】
本明細書に開示されている抗体またはフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系が含まれる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを判断することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現、またはより好ましくは、該宿主細胞が増殖する培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり、該宿主細胞を培養することにより、該抗体を産生させる。
【０１１０】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗体（またはそれからの他の部分）の発現は、幾つかの公知技術を用いて増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある条件下の発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は全体的または部分的に欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５および第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に記載されている。
【０１１１】
本発明は更に、本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体の抗体フラグメントを含む。該抗体フラグメントには、Ｆ（ａｂ）２フラグメントが含まれ、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断により産生されうる。
【０１１２】
１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えばγ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。限定的ではない例示に過ぎないが、ヒト重鎖定常領域はγ１であることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう１つの実施形態においては、該抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を有するγ４である（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１−８，２００１）。
【０１１３】
抗体の改変
親抗原結合性タンパク質の可変ドメイン内のフレームワーク残基に対する修飾を含むように、例えば、抗原結合性タンパク質の特性を改善するために、抗ＰＤ−Ｌ２抗原結合性タンパク質が改変（操作）される実施形態が更に含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗原結合性タンパク質の免疫原性を低下させるために行われる。これは通常、親抗原結合性タンパク質における可変ドメイン内の非ＣＤＲ残基（すなわち、フレームワーク残基）を、該抗原結合性タンパク質が使用されることになる種の免疫レパトワからの類似残基（例えば、ヒト用治療剤の場合にはヒト残基）で置換することにより達成される。そのような抗体は「ヒト化」抗原結合性タンパク質と称される。幾つかの場合には、改変（例えば、ヒト化）抗原結合性タンパク質の特異性を変化させ、またはアフィニティを増強することが望ましい。１つのアプローチは１以上のフレームワーク残基を対応生殖系列配列へと「復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳しくは、体細胞突然変異を受けた抗原結合性タンパク質は、該抗原結合性タンパク質が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有しうる。そのような残基は、該抗原結合性タンパク質が由来する生殖系列配列と該フレームワーク配列を比較することにより特定されうる。もう１つのアプローチは、該改変（例えば、ヒト化）抗原結合性タンパク質の位置の１以上において元の親残基へと復帰突然変異させること、例えば、フレームワーク残基の置換の過程において喪失した可能がある結合アフィニティを回復させることである（例えば、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，５３０，１０１号を参照されたい）。
【０１１４】
特定の実施形態においては、以下のとおりに、最終的な抗原結合性タンパク質の、より高い化学的安定性を得るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基へと変化させることが望ましいであろう。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じ、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらすことが可能であり、該残基はポリペプチド鎖内にねじれ（キンク）を導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）。ある実施形態においては、本開示の抗原結合性タンパク質はアスパラギン異性部位を含有しない。
【０１１５】
例えば、特にＣＤＲ内の、いずれかのＡｓｎ−Ｇｌｙ配列におけるイソアスパルタートの形成の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）残基はＧｌｎまたはＡｌａへと改変されうる。同様の問題はＡｓｐ−Ｇｌｙ配列においても生じうる。ＲｅｉｓｓｎｅｒおよびＡｓｗａｄ（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１２８１。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を減弱し、または完全に阻止しうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４を参照されたい。１つの実施形態においては、該アスパラギンはグルタミン（Ｇｌｎ）へと改変される。小さなアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミンに隣接して存在する場合にはより高い率で生じる脱アミド化の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接したアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ＆  Ｋｏｌｂｅ（１９９４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６２：２６１を参照されたい。また、抗原結合アフィニティを低減しうる、そしてまた、最終抗体調製物における分子不均一性に寄与しうるメチオニン硫黄の酸化の可能性を低減するために、ＣＤＲ内のいずれかのメチオニン残基（典型的には溶媒露出Ｍｅｔ）がＬｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅへと改変されうる（同誌）。１つの実施形態においては、メチオニンはアラニン（Ａｌａ）へと改変される。また、Ａｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の潜在的な切断を妨げ又は最小にするために、ＣＤＲにおいて見出されるいずれかのＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せをＧｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｓｎ−Ａｌａへと改変することが望ましいかもしれない。ついで、そのような置換を有する抗体をスクリーニングして、該置換がヒトＰＤ−Ｌ２に対する抗体のアフィニティまたは特異性を、許容し得ないレベルに低減しないことを確認する。
【表３】
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【０１１６】
ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲの変異は、独立して、任意の組合せで選択されうる。また、所望の活性または結合能が維持される限り、本明細書に記載されている任意の変異は、独立して、任意の組合せで選択されうる。
【０１１７】
Ｆｃ領域の改変
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質はまた、Ｆｃ領域内の修飾を含むように、典型的には、抗原結合性タンパク質の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能（例えば、抗原依存性細胞傷害性）の１以上を変化させるために改変されうる。更に、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は化学的に修飾可能であり（例えば、１以上の化学的部分が該抗原結合性タンパク質に結合可能である）、あるいは、再び抗原結合性タンパク質の機能特性の１以上を改変するために、そのグリコシル化を改変するように修飾されうる。これらの実施形態のそれぞれは後記に更に詳細に記載されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１１８】
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、改変されたエフェクター機能をもたらすための、修飾（または遮断）されたＦｃ領域を有する抗原結合性タンパク質をも含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２を参照されたい。そのような修飾は、診断および療法における可能な有益な効果を伴って、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために用いられうる。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加が含まれる。Ｆｃに対する変化はまた、治療用抗原結合性タンパク質における抗体の半減期を改変することが可能であり、それほど頻繁でない投与ならびにそれによる便利さの向上および物質の使用の減少を可能にする。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４−３５を参照されたい。
【０１１９】
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、重鎖定常領域のヒンジ領域内の２２８位に対応する位置におけるセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵインデックス）を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体の抗体またはそのフラグメントである。この突然変異はヒンジ領域内の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を排除することが報告されている（Ａｎｇａｌら，前掲；２４１位はＫａｂａｔ番号付け系に基づく）。
【０１２０】
１つの実施形態においては、ＣＨ１のヒンジ領域は、該ヒンジ領域内のシステイン残基の数が増加または減少するように修飾される。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に更に詳細に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進させるために、または抗体の安定性を増強もしくは低減するために改変される。
【０１２１】
もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許６，２７７，３７５号に記載されているとおり、以下の突然変異の１以上が導入されうる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されているとおり、生物学的半減期を増加させるために、該抗原結合性タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合性エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
【０１２２】
更に他の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗原結合性タンパク質がエフェクターリガンドに対する改変されたアフィニティを有するが、親抗原結合性タンパク質の抗原結合能を保有するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置換されうる。アフィニティが改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に更に詳細に記載されている。
【０１２３】
もう１つの例においては、アミノ酸２３１位および２３９位における１以上のアミノ酸残基を改変して、それにより、補体を固定する該抗原結合性タンパク質の能力を改変する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１に更に詳細に記載されている。
【０１２４】
更にもう１つの例においては、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらす該抗原結合性タンパク質の能力を増強もしくは低減するために、および／またはＦｃγ受容体に対する該抗原結合性タンパク質のアフィニティを増強もしくは低減するために、以下の位置：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９位における１以上のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ  ００／４２０７２に更に詳細に記載されている。更に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位が位置決定されており、改善された結合を示す変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９位における特定の突然変異はＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。また、以下の組合せ突然変異体はＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１２５】
更にもう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、非グリコシル化抗原結合性タンパク質（すなわち、該抗原結合性タンパク質はグリコシル化を欠く）が製造されうる。抗原結合性タンパク質のグリコシル化パターンは、例えば、抗原に対する該抗原結合性タンパク質のアフィニティまたはアビディティを増強するように改変されうる。そのような修飾は、例えば、該抗原結合性タンパク質配列内のグリコシル化部位の１以上を改変することにより達成されうる。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位の１以上の除去をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換が施されうる。そのような非グリコシル化は抗原に対する該抗体のアフィニティまたはアビディティを増強しうる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【０１２６】
抗体コンジュゲート
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗体フラグメントはまた、放射性核種または他の検出可能な標識のような化学的部分にコンジュゲート化されうる。放射性核種には、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈおよび４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが含まれる。蛍光または化学発光標識には、発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルが含まれる。
【０１２７】
抗体分子を種々の部分にコンジュゲート化するための当技術分野で公知のいずれかの方法が使用可能であり、これらには、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されている方法が含まれる。抗体をコンジュゲート化する方法は通常のものであり、当技術分野で非常によく知られている。
【０１２８】
実験的および診断的用途
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗体フラグメントは、細胞の表面上で発現されたヒトＰＤ−Ｌ２を特異的に検出するために使用されうる。該細胞は、ヒト個体から得られた組織または血清サンプル中に存在することが可能であり、ＰＤ−Ｌ２発現の検出は、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ方法のいずれかを用いて行われる。
【０１２９】
例えば、特定の実施形態はＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）を含み、これは典型的には以下の工程を含む：
（ａ）基体（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレートの表面）を抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆（コート）し、
（ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ１の存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用し、
（ｃ）該サンプル中の未結合物質が除去されるように、該プレートを洗浄し、
（ｄ）同様にヒトＰＤ−Ｌ１に特異的である、検出可能な様態で標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用し、
（ｅ）未結合標識抗体が除去されるように、該基体を洗浄し、
（ｆ）該標識抗体が、結合した酵素である場合には、該酵素により蛍光シグナルへと変換される化学物質を適用し、
（ｇ）該標識抗体の存在を検出する。
【０１３０】
もう１つの実施形態においては、ＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な変色を引き起こすペルオキシダーゼで、標識抗体を標識する。あるいは、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の存在下でシンチレーションカウンターにより検出されうる検出可能な放射性同位体（例えば、３Ｈ）で標識抗体を標識する。
【０１３１】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ２抗体およびその抗原結合性フラグメントはウエスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット法において使用されうる。そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば以下を含む：
（１）ヒトＰＤ−Ｌ２の存在に関して試験されるべき膜または他の固体基体を本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させる。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいてＰＤ−Ｌ２の存在に関して試験されるべきタンパク質が（例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で）移されたニトロセルロースまたはビニル系（例えば、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ））膜の形態をとりうる。抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはフラグメントとの膜の接触の前に、膜を、所望により、例えば乾燥脱脂乳などでブロッキングして、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合するようにする。
【０１３２】
（２）膜を１回以上洗浄して、未結合抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはフラグメントおよび他の未結合物質を除去する。
【０１３３】
（３）結合抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはフラグメントを検出する。該結合抗体またはフラグメントは、検出可能な様態で標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と共に該結合抗体またはフラグメントをインキュベートし、ついで該二次抗体の存在を検出することにより検出されうる。
【０１３４】
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗原結合性フラグメントは免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおいても使用可能であり、これは当技術分野で公知の種々のＩＨＣ形態を用いて実施可能であり、それは本発明の実施形態を構成する。典型的なＩＨＣアッセイは、顕微鏡スライド上でマウントされ乾燥される約３〜４ミリメートル、好ましくは４マイクロメートルのＦＦＰＥ組織切片を使用し、例えば、（１）組織切片を脱パラフィンおよび水和に付し、該再水和組織切片を本発明の抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、（２）該組織内の１以上の細胞の表面上で抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原結合性フラグメントを検出することを含む。該抗体またはフラグメント自体が検出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、該抗体またはフラグメントは、検出可能な様態で標識された検出される二次抗体により結合されうる。
【０１３５】
好ましいＩＨＣアッセイは、商業的に入手可能なＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ検出系を使用し、これはＤａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ装置（Ｄａｋｏ，ａｎ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と併用されることが意図される。本発明の抗体（すなわち、３Ｇ２抗体、３Ｇ２の６個のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント、あるいは３Ｇ２の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメント）と共にこの系を使用する場合、ＩＨＣアッセイは以下のとおりに行われうる。
【表４】
2018533914.tif 000006
【０１３６】
アッセイプロトコル
１）ＦＦＰＥ組織を４μｍに薄片化し、一晩風乾させる。
【０１３７】
２）使用前にスライドを６０℃で４５分間焼く。
【０１３８】
３）使用当日に、以下のとおりに設定されたＬｅｉｃａ  Ｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬ（プログラム１）を使用してスライドを脱パラフィン化する：
１）キシレン    ５分×３
２）キシレン    ３分×１
３）１００％  アルコール    ３分×２
４）９５％  アルコール    ３分×１
５）９５％  アルコール    ２分×１
６）７０％  アルコール    ２分×１
７）脱イオン水    １分×１。
【０１３９】
４）脱パラフィン化後、大気圧で９７℃で２０分間、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ高ｐＨ標的回収溶液を使用して、ＦＦＰＥスライドを熱誘発性エピトープ回収（ＨＩＥＲ）に付す。
【０１４０】
５）ついでスライドを脱イオン水中に浸漬し、ついでＴＢＳＴ中に２回浸漬する（乾燥アーチファクトを避けるために、切片を常に湿潤状態で維持しなければならない）。
【０１４１】
６）ついで、以下のとおりに設定（プログラム）されたオートステイナー内にスライドをロードする。
【表５】
2018533914.tif 000007
【０１４２】
７）オートステイナープログラムが完了した後、スライドを装置から取り出し、脱イオン水に浸漬し、対比染色／脱水する。これは、以下のとおりに設定されたＬｅｉｃａ  Ｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬ（プログラム３）を使用して行う。
【０１４３】
１）マイヤー（Ｍａｙｅｒ’ｓ）ヘマトキシリン    ３０秒×１
２）脱イオン水    ２分×１
３）リチャード・アレン（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌｅｎ’ｓ）ブルーイング試薬          ２０秒×１
４）脱イオン水    ２分×１
５）９５％  アルコール    １分×１
６）１００％  アルコール    １分×２
７）キシレン    １分×３
８）キシレン    終了。
【０１４４】
８）スライドをマイクロマウント（Ｍｉｃｒｏｍｏｕｎｔ）媒体でカバーガラス化し、十分に乾燥させてから顕微鏡で観察する。
【０１４５】
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ２抗体およびその抗原結合性フラグメントはインビボ腫瘍イメージングにも使用されうる。そのような方法は、放射能標識抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原結合性フラグメントを、ＰＤ−Ｌ２発現を伴う腫瘍の存在に関して試験されるべきヒト患者の体内に注射し、ついで、例えば、該腫瘍に結合した高濃度の該抗体またはフラグメントを含む部位における、該標識抗体またはフラグメントの存在を検出するために、患者の身体の核イメージングを行うことを含みうる。１つの実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、表１に挙げられている６個のＣＤＲを含むヒト化抗体である。イメージング技術には、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放出型コンピュータ断層撮影）またはＰＥＴイメージング（陽電子放射断層撮影）が含まれる。標識には、例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと組合されるヨウ素−１２３（１２３Ｉ）およびテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、または例えばＰＥＴイメージングと組合される１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏもしくは１８Ｆ、またはインジウム−１１１が含まれる（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５−４４０を参照されたい）。
【０１４６】
治療方法
本発明はまた、ＰＤ−１アンタゴニストに対する臨床応答を予測するための方法を提供する。１つの実施形態においては、該方法は、ヒト患者から摘出された腫瘍組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ２の発現レベルを測定し、腫瘍組織サンプルがＰＤ−Ｌ２に関して陽性であるか陰性であるかを判定し、サンプルがＰＤ−Ｌ２陽性であると判定された場合にはＰＤ−１アンタゴニストを患者に投与することを含む。
【０１４７】
本発明はまた、腫瘍を有する患者の治療方法に関する。該方法は、（１）腫瘍がＰＤ−Ｌ２発現に関して陽性であるか陰性であるかを判定し、（２）腫瘍がＰＤ−Ｌ２に関して陽性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストの治療的有効量を対象に投与し、または腫瘍がＰＤ−Ｌ２に関して陰性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストを含まない癌治療を対象に投与することを含む。
【０１４８】
前記方法の実施形態においては、該方法は更に、腫瘍組織サンプルがＰＤ−Ｌ１陽性であるかどうかを判定することを含む。該方法の特定の実施形態においては、サンプルがＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方に関して陽性であると判定された場合に、ＰＤ−１アンタゴニストを患者に投与する。
【０１４９】
前記方法の１つの実施形態においては、ＩＨＣアッセイにおいて、抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはその抗原−タンパク質フラグメントを使用して、ＰＤ−Ｌ２の発現レベルを決定する。本発明の実施形態においては、ＩＨＣアッセイにおけるＰＤ−Ｌ２発現のレベルが、染色の強度に基づく０〜５の尺度において１以上である場合に、サンプルを「ＰＤ−Ｌ２陽性」と評価する。この場合、染色を分類するために以下の尺度を用いる：０＝陰性、１＝稀少、２＝低い、３＝中等度、４＝高い、５＝非常に高い。他の実施形態においては、ＩＨＣアッセイにおけるＰＤ−Ｌ２発現スコアが２以上、３以上、４以上または５である場合に、サンプルをＰＤ−Ｌ２陽性と評価する。
【０１５０】
前記方法の１つの実施形態においては、患者は、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、胃癌、三種陰性乳癌および膀胱癌からなる群から選択される癌を有する。特定の実施形態においては、患者は頭頸部扁平上皮癌を有する。
【０１５１】
前記方法のいずれかの１つの実施形態においては、判定（決定）工程は、患者の腫瘍からサンプルを得、ＰＤ−Ｌ２の存在または非存在に関してサンプルを試験するよう依頼すると共に腫瘍サンプルを検査所へ送り、腫瘍サンプルがＰＤ−Ｌ２に関して陽性であるか陰性であるかを示す、検査所からの報告を受け取ることを含む。
【０１５２】
前記方法の特定の実施形態において、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブまたはニボルマブである。１つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブである。
【０１５３】
前記方法のいずれかの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２発現は、ＰＤ−Ｌ２に結合する組換え抗原結合性タンパク質（ここで、抗体は３Ｇ２またはその変異体である）を使用するＩＨＣアッセイにおいて決定される。
【０１５４】
本発明の方法の１つの実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号２または配列番号２の変異体であり、ＣＤＲＬ２は配列番号４または配列番号４の変異体であり、ＣＤＲＬ３は配列番号６または配列番号６の変異体である。
【０１５５】
本発明の方法の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号２のＣＤＲＬ１、配列番号４のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１５６】
他の実施形態においては、ＩＨＣアッセイにおいて使用される抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。１つの実施形態においては、ＶＨドメインは配列番号８からなる。
【０１５７】
１つの実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号１０または配列番号１０の変異体であり、ＣＤＲＨ２は配列番号１２または配列番号１２の変異体であり、ＣＤＲＨ３は配列番号１４または配列番号１４の変異体である。
【０１５８】
１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号１０に記載されているＣＤＲＨ１、配列番号１２に記載されているＣＤＲＨ２および配列番号１４に記載されているＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインを含む。
【０１５９】
本発明の方法のもう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。１つの実施形態においては、ＶＨドメインは配列番号１６からなる。
【０１６０】
前記方法の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＶＨドメインとを含む。本発明のもう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列からなるＶＬドメインと、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列からなるＶＨドメインとを含む。
【０１６１】
本発明はまた、医薬組成物と処方情報とを含む医薬品を提供し、ここで、該医薬組成物はＰＤ−１アンタゴニストおよび少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を含み、該処方情報は、該医薬組成物が、ＰＤ−Ｌ２に関して陽性の試験結果を示す腫瘍を有する対象における使用に適応することを記載している。
【０１６２】
本発明のこの態様の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブである。
【０１６３】
検出キットおよび治療用キット
便宜上、本明細書に開示されている抗体または特異的結合性物質は、キット、すなわち、診断または検出アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージされた組合せとして提供されうる。該抗体が酵素で標識される場合、該キットは基質と、酵素により要求される補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体）とを含むであろう。また、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは細胞溶解バッファー）などのような他の添加剤が含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する該試薬の溶液中の濃度がもたらされるように広範に変動しうる。特に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解に際して与える賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。
【０１６４】
また、例えばＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型または競合形態）のようなイムノアッセイを含む種々の検出アッセイにおける使用のための、１以上のそのような試薬を含む診断または検出試薬およびキットを提供する。該キットの成分は固体支持体に予め付着していることが可能であり、あるいは、該キットが使用される際に固体支持体の表面に適用されることが可能である。幾つかの実施形態においては、シグナル生成手段は、本発明の抗体に予め結合したものであることが可能であり、あるいは、使用前に１以上の成分、例えばバッファー、抗体−酵素コンジュゲート、酵素基質などと組合されることを要しうる。キットはまた、追加的試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質などを含みうる。該固相表面はチューブ（管）、ビーズ、マイクロタイタープレート、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを固定化するのに適した他の材質の形態でありうる。特定の態様においては、化学発光もしくは色素原産物の形成または化学発光もしくは色素原基質の還元を触媒する酵素がシグナル生成手段の一成分である。そのような酵素は当技術分野でよく知られている。キットは、本明細書に記載されている捕捉剤および検出試薬のいずれかを含みうる。所望により、該キットは、本発明の方法を実施するための説明をも含みうる。
【０１６５】
本明細書に開示されている検出キットはまた、本明細書に開示されている抗体または抗原結合性フラグメントの少なくとも１つと、検出試薬として該組成物を使用するための説明とを含むものとして製造されうる。そのようなキットにおいて使用する容器は、典型的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または該検出組成物の１以上が配置され、好ましくは適切にアリコート化されうる他の適当な容器を含みうる。本明細書に開示されているキットは、典型的には、商業的販売のために密封された、バイアルを含有するための手段、例えば、所望のバイアルが収容される射出成型またはブロー成型プラスチック容器をも含むであろう。放射能標識、色素原、発蛍光または他のタイプの検出可能な標識または検出手段が該キット内に含まれる場合には、該標識剤は検出組成物自体と同じ容器内で提供されることが可能であり、あるいはこの第２の組成物が配置され適切にアリコート化されうる第２の別個の収容手段内に配置されることが可能である。あるいは、該検出試薬は単一容器手段において調製されることが可能であり、ほとんどの場合、該キットは、典型的には、商業的販売および／または簡便なパッケージングおよび運搬のために密封された、該バイアルを収容するための手段をも含むであろう。
【０１６６】
本明細書に記載されている検出またはモニタリング方法を行うための装置または器具も提供する。そのような装置は、サンプルが投入されうるチャンバ（室）またはチューブ、流体処理系（これは、所望により、サンプル流を装置へ導くための弁またはポンプを含みうる）、血液から血漿または血清を分離するための所望により含まれうるフィルター、捕捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバ、および捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための所望により含まれうる検出装置を含みうる。サンプル流は受動的なもの（例えば、毛管力、静水力、またはサンプルが一旦適用されると装置の更なる操作を要しない他の力によるもの）または能動的なもの（例えば、機械式ポンプ、電気浸透ポンプにより生じる力、遠心力、増加した空気圧の適用によるもの）または能動的な力および受動的な力の組合せによるものでありうる。
【０１６７】
更なる実施形態はまた、プロセッサ、コンピュータ読取可能メモリ、およびコンピュータ読取可能メモリ上に保存され、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うために該プロセッサ上で実行されるように適合化されたルーチンを提供する。適当なコンピューティング（計算）システム、環境および／または構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、携帯式またはラップトップ装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能な大衆消費電子商品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、前記システムまたは装置のいずれかを含む分散コンピューティング環境、あるいは当技術分野で公知のいずれかの他のシステムが含まれる。
【０１６８】
一般的方法
分子生物学における標準的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２  ＆  １９８９  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。標準的な方法はＡｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも見られ、これは細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載している。
【０１６９】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学的分析、化学的修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１）を参照されたい）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造、精製およびフラグメント化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１７０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体は製造可能である（例えば、ＳｈｅｐｅｒｄおよびＤｅａｎ（編）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号を参照されたい）。
【０１７１】
抗体は例えば小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、色素、放射性同位体、酵素または金属、例えばコロイド金にコンジュゲート化またはカップリング（結合）されうる。（例えば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；ＨｓｉｎｇおよびＢｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照されたい）。
【０１７２】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドおよび抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１７３】
免疫系の標準的な組織学的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【０１７４】
本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＮＣＢＩ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が、参照により組み入れるという特別な陳述に直に隣接して存在しない場合であっても、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関するものであることが出願人により意図される。参照により組み入れるという特別な陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
【０１７５】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１７６】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、ハイブリドーマＭＥＢ１２３．３Ｇ２から単離された全ＲＮＡから調製された抗体可変軽鎖および重鎖ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１７および配列番号１８）、ならびにそれによりコードされる推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号１９および配列番号２０）を示し、括弧はリーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、下線はＣＤＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、３つの抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、すなわち、本発明のモノクローナル抗体（クローン３Ｇ２、左パネル）、市販のポリクローナル抗体（ＡＦ１２２４、中央パネル）およびモノクローナル抗体（クローンＭＩＨ１８、右パネル）の１つで染色された正常ヒト扁桃組織のＦＦＰＥ組織切片を示す。
【図３】図３は、本明細書に記載されている３Ｇ２抗ＰＤ−Ｌ２抗体およびＩＨＣアッセイを用いて検出された７つの異なる癌型からの保存組織切片におけるＰＤ−Ｌ２発現を示す。
【図４】図４は、本明細書に記載されている３Ｇ２抗ＰＤ−Ｌ２抗体およびＩＨＣアッセイを用いて検出された７つの異なる腫瘍における細胞型によるＰＤ−Ｌ２発現を示す。
【図５】図５は腫瘍型におけるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の関係を示す。両方のアナライトについて同じ０〜５のスコア系を使用した場合の、全てのサンプルにわたるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２との間の全体的発現の相関プロット。スコアは全ての適応症において有意に相関していた（Ｐ＝０．００１２〜Ｐ＜０．０００１）。円形は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２とのスコアが大幅に異なるサンプルを強調表示している。
【図６】図６はＨＮＳＣＣコホートにおける患者のベースライン特性を示す（処置全患者集団；実施例５を参照されたい）。
【図７】図７はＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２の状態ならびに全体的な臨床応答を示す（実施例５を参照されたい）。
【図８】図８Ａおよび８ＢはＰＤ−Ｌ２状態ごとの無増悪生存および全生存（ＯＳ）を示す。ＫＥＹＮＯＴＥ−１２における１７２名の処置全患者集団からのＰＤ−Ｌ２陽性およびＰＤ−Ｌ２陰性腫瘍サンプル（腫瘍および免疫細胞）についてのＰＦＳ（図８Ａ）およびＯＳ（図８Ｂ）を示すカプラン−マイヤー曲線。
【０１７８】
実施例１
抗ＰＤ−Ｌ２ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
幾つかの市販抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体の試験が、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣアッセイにおいてヒトＰＤ−Ｌ２を検出するのにそれらが満足しうるものではないことを示した後、本発明者らは、高品質抗ヒトＰＤ−Ｌ２  ＩＨＣ試薬を作製することを試みるために一連のげっ歯類免疫化実験を本実施例で行った。最初の２つの実験で用いた免疫原はヒトＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：カタログ番号：１２２４−ＰＬ、ロット番号：ＦＣＩ０５１３０２Ａ）およびヒトＰＤ−Ｌ２−ＨｉｓＴａｇ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ：カタログ番号：１０２９２−Ｈ０８Ｈ、ロット番号：ＭＢ０５ＯＣ０９１０）であった。該ＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１フラグメントに融合したヒトＰＤ−Ｌ２（Ｌｅｕ２０−Ｐｒｏ２１９，ＮＣＢＩアクセッション番号Ｑ９ＢＱ５１．２）の細胞外ドメインを含有する。該ＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓタグ融合体は、ポリヒスチジンタグに融合したヒトＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含有する。第３の実験においては、同じ２つの融合タンパク質を、それらを５分間煮沸して変性させた後、免疫原として使用した。
【０１７９】
各実験において５匹のマウスを免疫化した。ここで、最初の２回の注射には該ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合体を使用し、残りの注射（実験に応じて１０〜１７回）には該ＰＤ−Ｌ２−ＨｉｓＴａｇを使用した。第３の実験においては、１３回および１５回の免疫化のそれぞれの後でハイブリドーマを作製した。
【０１８０】
得られたハイブリドーマの上清をスクリーニングして、ヒトＰＤ−Ｌ２に対する抗体を産生するハイブリドーマを特定した。用いたスクリーニングの１つは、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡであり、これは、該ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ、変性ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ、変性ＰＤ−Ｌ２−ＨｉｓＴａｇ融合体、または無関係なＩｇ陰性対照（４７ＡＤＹ）への結合を測定した。細胞に基づくＥＬＩＳＡである２次スクリーニングを行い、これは、陰性対照としての親ＣＨＯ細胞またはヒトＰＤ−Ｌ２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への結合を測定した。
【０１８１】
免疫スケジュールおよびスクリーニング結果を以下の表に要約する。
【表６】
2018533914.tif 000008
【０１８２】
ついで、１次スクリーニングおよび２次スクリーニングの両方においてヒトＰＤ−Ｌ２への結合に関して陽性の試験結果を示したハイブリドーマ上清をＩＨＣアッセイにおいてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ヒト正常扁桃組織の標識に関してスクリーニングした。染色、核染色、上皮細胞もしくは他の非特異的染色を示さない、または低いシグナル対ノイズ比を有するハイブリドーマを、更なる考慮から完全に除外した。最初の２回の免疫化実験からのＰＤ−Ｌ２結合上清はいずれも、満足しうるＩＨＣ染色結果を示さなかった。このことに促されて、本発明者らは、第３の実験における免疫原として変性ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質を使用した。ＰＤ−Ｌ２結合上清を与えた実験からの４２０個のハイブリドーマのうち、本発明者らは、ＩＨＣにおけるＰＤ−Ｌ２検出試薬として使用される候補とみなされるのに十分な標識強度、低いバックグラウンドレベルおよびシグナル鮮明度を有する５個だけを特定した。ついで、これらのハイブリドーマを更なる評価のためにサブクローニングし、精製し、抗体クローン３Ｇ２が評価基準において最良の特性を有していた。
【０１８３】
実施例２
材料および方法
染色
ＦＦＰＥ組織切片を常法により脱パラフィン化し、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣのために再水和させた。全てのスライドを熱誘発性エピトープ回収に付し、内因性ペルオキシダーゼブロッキングを行った後、一次抗体（抗ＰＤ−Ｌ２クローン３Ｇ２または抗ＰＤ−Ｌ１クローン２２Ｃ３，Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）の存在下でインキュベーションを行った。抗原−抗体結合を３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原（Ｋ４３６８，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ  ＣＡ）で可視化した。
【０１８４】
保存腫瘍検体のスコア化
保存ＦＦＰＥ腫瘍検体をＭｅｒｃｋ  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ組織バンクから入手した。スコア化は病理学者により行われた。スコアは腫瘍細胞および非腫瘍細胞の両方の標識の保有率を含む。半定量的な０〜５のスコア化系（０＝陰性、１＝稀少、２＝低い、３＝中等度、４＝高い、５＝非常に高い）を用いた。内皮細胞発現の存在または非存在を、特に、別個の値として評価した。
【０１８５】
インシトゥハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
ＲＮＡＳｃｏｐｅプラットフォーム（ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ２．０高精細度キット，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ［ＡＣＤ］，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）を製造業者の説明に従い使用するＩＳＨにより、ＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡの細胞分布を評価した。ヒトＰＤ−Ｌ２用のアンチセンスおよびセンスＤＮＡプローブ（それぞれ試験プローブおよび陰性対照）ならびにＰＰＩＢ用のアンチセンスプローブ（陽性対照）［全て、ＡＣＤにより設計されたもの（それぞれカタログ番号３１６２９１、５１９８９１および３１３９０１）］を使用して、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１８６】
遺伝子発現解析
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲ分析のために、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の説明に従い使用して、ＤＮアーゼ処理された全ＲＮＡを逆転写した。ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ２７３）に特異的なプライマーをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から商業的に入手した。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの存在下でＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと共に特異的プローブ／プライマー混合物を使用して、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ上でリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。ユビキチンレベルを別の反応において測定し、それを用いてΔＣｔ方法によりデータを正規化した。
【０１８７】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法
製造業者のプロトコール（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）に従って切片化ＦＦＰＥ組織から組織ライセートを得た。細胞ライセート（サンプル当たり５０ｎｇ）をバーコード化３’ビオチン化捕捉プローブおよび蛍光タグ化５’レポータープローブ（所望の遺伝子発現コードセットからのもの）と混合した。プローブおよび標的転写産物を、製造業者の推奨に従い、一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたサンプルをＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｔｅｒ（商標）装置において使用し、ついで、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、最大スキャン解像度でサンプルをスキャンした。
【０１８８】
分位（ｑｕａｎｔｉｌｅ）正規化を用いてデータ分析を行った。この場合、各サンプルにおける（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇコードセット上のすべての遺伝子にわたる）遺伝子の相対的ランクを、（該データセットにおける全てのサンプルおよび遺伝子からの）プールされた分布からの同じ相対ランクを有する値により置換した。ついで全ての分位正規化データをｌｏｇ１０変換に付した。
【０１８９】
実施例３
３Ｇ２抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂの品質評価
ヒトＰＤ−Ｌ２タンパク質の検出のためのＩＨＣ試薬としての３Ｇ２抗体の品質を試験した。該試験は、１０μｇ／ｍＬの濃度で適用された場合のＦＦＰＥヒト正常扁桃組織の標識に関する初期スクリーニング、高分解能、低いバックグラウンドノイズをもたらすアッセイの最適化（抗体の力価測定、複数の検出系の評価）を含む一連の工程、およびそれに続く一連の妥当性確認工程により行った。妥当性確認工程においては、以下の処理を行った：１）各組織に関する対応アイソタイプ対照を伴う３７個の正常ヒト組織のパネル上（この場合、ＰＤ−Ｌ２の豊富な発現が胎盤および複数のリンパ組織において検出された）および複数のヒト腫瘍のコホートにおいてアッセイを行った；２）ＩＨＣアッセイにおいて陽性シグナルを示していたサンプル上でＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡに関してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡｓｃｏｐｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）を行うことにより、ＩＨＣによる組織におけるシグナルの分布の妥当性をクロスチェックした；３）ブロッキング研究の実施により（この場合、ＩＨＣアッセイにおいて標識を示していた組織を共に常法で使用した）、および抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合に対する標識の依存性を判定するために、免疫原での該抗体の予備吸着の後でのみ、該組織への該抗体の適用により、ＩＨＣにより生成されたシグナルの特異性をクロスチェックした；４）通常のＲＮＡ分析方法により検出されたｍＲＮＡの量と、ＩＨＣにより生成されたシグナルの度合を比較するために、ＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡ発現のレベル差を示すことが知られている一連の細胞系（ＣＨＯ−Ｋ１、ＰＤ−Ｌ２トランスフェクト化ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＣＩＨ−２２６、ＮＣＩＨ−２３、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７、Ｍ１４、ＳＲ、ＲＰＭＩ  ８２２６）から得られたＦＦＰＥ細胞ペレット上でアッセイを行った；ならびに５）ＩＨＣシグナルの再現性を評価するために、出力の比較可能性の病理学者による評価により、３つの正常扁桃上で３日間にわたってアッセイを行った。ＰＤ−Ｌ２  ＩＨＣシグナルは、ヒト腫瘍サンプルにおいてＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法により定量されたＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡレベルとも有意に相関した（ｐ＜０．０００１〜ｐ＝０．００３７；データ非表示）。
【０１９０】
本発明者らはまた、正常ヒト扁桃腺組織の染色において、３Ｇ２抗体および２つの商業的に入手可能な抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体を比較した。使用した市販抗体は前記のＡＦ１２２４ポリクローナル抗体およびＭＩＨ１８モノクローナル抗体であった。隣接ＦＦＰＥ組織切片を、同じＩＨＣアッセイ条件を用いて染色し、各抗体に関する最良の染色結果を図４に示し、染色結果の、病理学者の評価を以下に示す。
【０１９１】
３Ｇ２：胚中心における樹状形態および円形細胞の両方を伴う、強力な鮮明なシグナル。胚中心の外側にそれほど多くはない数の散在性個別化陽性細胞。非常に綺麗なバックグラウンド。
【０１９２】
ＡＦ１２２４：胚中心における強力な円形細胞標識を示し、他の胚中心標識を伴い、それはおそらくは樹状であるが、バックグラウンドからの最終的な区別が困難である。胚中心の外側に、軽度のバックグラウンドが認められ、バックグラウンドより明らかな陽性細胞標識は存在しない。
【０１９３】
ＭＩＨ１８：胚中心における形態学的に円形の細胞の集団の非常に綺麗な標識。胚中心の外側には標識細胞は存在しない。非常に綺麗なバックグラウンド。
【０１９４】
実施例４
腫瘍および免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ２発現
腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ２発現を検出するための３Ｇ２  ｍＡｂの有用性を評価するために、７つの異なる腫瘍型の保存サンプルを、３Ｇ２抗体を使用する本明細書に記載されているＩＨＣアッセイに付した。腎細胞癌（ｎ＝７１）、膀胱癌（ｎ＝３４）、メラノーマ（ｎ＝８３）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ｎ＝９４）、ＨＮＳＣＣ（ｎ＝４０）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）（ｎ＝２２）および胃癌（ｎ＝７３）を含む幾つかの腫瘍型のコホートにおいて、３Ｇ２抗ＰＤ−Ｌ２抗体でのＩＨＣ染色により、ＰＤ−Ｌ２タンパク質の発現を評価した（図３を参照されたい）。ＰＤ−Ｌ２発現のレベルは、染色の強度に基づいて０（陰性）、１（稀少）、２（低い）、３（中等度）、４（高い）または５（非常に高い）として、病理学者によりスコア化された。本発明者らはまた、種々の腫瘍型にわたる或る範囲のＰＤ−Ｌ２発現を示す結果を分析した。また、本発明者らは、腫瘍組織切片における３つの異なる細胞型、すなわち、間質細胞、腫瘍細胞および内皮細胞において、ＰＤ−Ｌ２発現のレベルを評価し、その結果を図４に示す。簡潔に説明すると、該結果は、ＰＤ−Ｌ２タンパク質が間質細胞（免疫細胞浸潤物を含む）、腫瘍細胞および内皮細胞上で種々の度合で発現されたことを示している（後記）。
【０１９５】
各コホートをＰＤ−Ｌ２発現の全体的分布率に関して評価した。ここでは、間質細胞、腫瘍細胞および内皮細胞を一緒に評価した。評価した全ての腫瘍型においてＰＤ−Ｌ２発現が観察されたが、ＰＤ−Ｌ２発現の全体的分布率は適応症によって異なっていた（図３）。腎細胞癌に関しては、ＰＤ−Ｌ２発現は、特に低い全体レベルに偏向していることが注目されたが、胃およびＴＮＢＣは中程度ないし高発現に強く偏向していた。他の腫瘍型における発現は、評価サンプルにわたって低から高へ、より均一に分布していた。
【０１９６】
各腫瘍型に関して間質、腫瘍および内皮細胞の３つの範疇においてＩＨＣ染色によりＰＤ−Ｌ２タンパク質発現の存在または非存在（０〜５の尺度でそれぞれ１以上および１未満のスコア）を評価したところ、幾つかのパターンが現れた（図４）。免疫細胞浸潤物を含む間質細胞におけるＰＤ−Ｌ２発現の存在は概ね最も一般的であり、比較的最小の変動を伴って全ての腫瘍型にわたって観察された。これとは対照的に、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ２発現は腫瘍型にわたって非常に大きく変動し、腎細胞癌は腫瘍細胞発現を全く示さず、メラノーマはほとんど示さなかったが、ＨＮＳＣＣの半分以上がＰＤ−Ｌ２を発現した。最後に、内皮細胞発現は、評価された腫瘍型のほとんどに関して、少数のサンプルにおいて認められたが、内皮発現を示すサンプルの分布は腎細胞癌および胃癌において、顕著に、より高かった。
【０１９７】
これらのコホートにおける腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ２タンパク質の相対的な保有率および分布を、Ｍｅｒｃｋの２２Ｃ３抗ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ抗体（ＷＯ２０１４  ／１０００７９）を使用して、同じサンプルの追加的な区分におけるＰＤ−Ｌ１の場合と比較した。一般に、ＰＤ−Ｌ２の分布パターンおよび保有率はＰＤ−Ｌ１の場合と厳密に一致した（データ非表示）。しかし、他のサンプルはＰＤ−Ｌ２とＰＤ−Ｌ１との間の不一致を示し、幾つかはＰＤ−Ｌ２の非存在下でＰＤ−Ｌ１シグナルを示し、他のサンプルはＰＤ−Ｌ１の非存在下でＰＤ−Ｌ２発現を示した。
【０１９８】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の全体的な発現を全てのサンプルにわたって比較したところ（両方のバイオマーカーに関して０〜５のスコア化系）、調べた全ての適応症に関して、スコアは有意に相関することが判明した（Ｐ＝０．００１２〜Ｐ＜０．０００１）（図５）。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２との間の最も強い関連性（Ｒ２＝０．６２３８）は三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）において認められ、それらのサンプルのいずれに関してもＰＤ−Ｌ２発現とＰＤ−Ｌ１発現との間に有意な不一致は認められなかった。全ての他の適応症に関して、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１の発現スコアは有意に相関していたが、幾つかのサンプルでは発現の不一致が認められた。メラノーマおよび腎細胞癌では双方向性の不一致発現が認められ、ＰＤ−Ｌ２を大きく上回るＰＤ−Ｌ１発現を示したサンプルもあれば、ＰＤ−Ｌ１を大きく上回るＰＤ−Ｌ２発現を示したサンプルもあった。調べた他の適応症では、主に一方向性の不一致が認められ、ＮＳＣＬＣおよび膀胱腫瘍サンプルの一部においては、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−Ｌ２を上回る発現を示したが、ＨＮＳＣＣおよび胃腫瘍サンプルの一部においては、ＰＤ−Ｌ２がＰＤ−Ｌ１を上回る発現を示した。
【０１９９】
本発明者らの分析において評価した全ての腫瘍型において、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現は強く相関していたが、幾つかの腫瘍内ではＰＤ−Ｌ２はＰＤ−Ｌ１の非存在下で発現し、腫瘍細胞と免疫細胞との組合せにおいて評価された場合、ペンブロリズマブで治療されたＨＮＳＣＣ患者のコホートにおける臨床応答と、独立して関連していた。
【０２００】
実施例５
３Ｇ２抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂを使用するＩＨＣアッセイの臨床的有用性
ＫＥＹＮＯＴＥ−１２治験（Ｓｅｉｗｅｒｔら，２０１６年提出；Ｃｈｏｗら，２０１６年提出）からの１７２名のＨＮＳＣＣ患者からの腫瘍組織サンプルにおいて、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２発現ならびに抗ＰＤ−１療法に対する臨床応答の間の関係を調べた。ＲＥＣＩＳＴ１．１に従い測定可能な再発性または転移性疾患を有し、０または１のＥＣＯＧ性能状態を有し、２００ｍｇのペンブロリズマブで３週間ごとに又は１０ｍｇ／ｋｇで２週間ごとに治療された、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２  ＩＨＣスコア化データが入手可能なＨＮＳＣＣ患者からの前治療サンプルを含めた。腫瘍および免疫浸潤細胞の両方の評価を含む１％  陽性カットオフ（陽性＞１％；陰性＜１％）を用いて、両方のアナライトに関する発現をスコア化した。１用量以上の治験薬の投与を受け、ベースライン疾患測定値および１以上のベースライン後スキャンを有する者、または薬物関連有害事象もしくは臨床進行性疾患ゆえに服薬を中断した者として定義される完全分析セット集団におけるこれらの患者の１４６名において、全体的な応答率（ＯＲＲ）を評価した。１用量以上の治験薬の投与を受けた者として定義される１７２名の処置全患者集団において、無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）を評価した。片側検定、ＰＤ−Ｌ１発現に関する補正を伴う又は伴わないロジスティック（ＯＲＲ）またはＣｏｘ（ＰＦＳ，ＯＳ）回帰分析により、ＰＤ−Ｌ２発現との関係を調べた。ＰＤ−Ｌ２陽性および陰性患者におけるＰＦＳおよびＯＳに関する生存期間中央値を推定するために、カプラン−マイヤー統計を用いた。
【０２０１】
結果
入手可能なＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣスコア化データを有する、ＫＥＹＮＯＴＥ−１２治験における再発性または転移性疾患を有する１７２名のペンブロリズマブ処置ＨＮＳＣＣ患者に由来する腫瘍組織サンプルにおいて、ＰＤ−Ｌ２発現の臨床的関連性を評価した。サンプリングされた患者の年齢中央値は６０歳（範囲は３７〜８４歳）で、ほとんどが男性であり（８３．１％）、大部分はＨＰＶ陰性（６５．７％）であった（図６）。患者の大半はＥＣＯＧ状態１であり（７１．５％）、Ｍ１の転移病期を有し（８４．９％）、多数（６０．４％）は再発性または転移性疾患に対する２以上の過去の療法を受けていた。
【０２０２】
腫瘍細胞および免疫浸潤細胞の組合せにおけるＩＨＣ染色により、完全分析セット集団における１４６名の患者において、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２状態（陽性カットオフ＞１％）の関数として、全体的な応答率を評価した。これらのうち、１２６名（８６．３％）の患者は、ＰＤ−Ｌ１陽性と評価された腫瘍を有し、９４名（６４．３％）は、ＰＤ−Ｌ２陽性と評価された腫瘍を有し、２０名（１３．６％）は、ＰＤ−Ｌ１陰性と評価された腫瘍を有し、５２名（３５．６％）は、ＰＤ−Ｌ２陰性と評価された腫瘍を有していた（図７）。ＰＤ−Ｌ１（２３．０％；９５％  ＣＩ  １６．０，３１．４）およびＰＤ−Ｌ２（２６．６％；９５％  ＣＩ  １８．０，３６．７）陽性患者の応答率は、ｐ＜０．０５のレベルで、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２陰性患者における応答率より有意に高かった（図７）。ＰＤ−Ｌ１状態に関して補正されたロジスティック回帰モデルにおけるＰＤ−Ｌ２状態の更なる評価は、ＰＤ−Ｌ２陽性が、応答を決定するための追加的な予測値を与えることを示唆しており（ｐ＝０．０３８）、ＰＤ−Ｌ２陽性率は、ＰＤ−Ｌ１陽性（７２．２％［９５％ＣＩ  ６３．５，７９．８］）腫瘍においては、ＰＤ−Ｌ１陰性（１５．０％［９５％ＣＩ  ３．２，３７．９］腫瘍より、統計的に有意（ｐ＜０．００１）に高かった。ＯＲＲは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方に関して陽性である患者において最大であり、ＰＤ−Ｌ１のみに関して陽性である腫瘍を有する患者（１１．４％［９５％ＣＩ  ３．２，２６．７］）より２倍高かった（２７．５％［９５％  ＣＩ  １８．６，３７．８］）。
【０２０３】
全１７２名の患者（処置全患者集団）のコホート全体において、ＰＦＳとＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２状態との関係をそれぞれ個別に評価した。ＰＤ−Ｌ１陽性状態はＰＦＳと有意には関連していなかった（ｐ＝０．０８０）。しかし、ＰＤ−Ｌ２陽性状態はＰＦＳの有意な予測因子であり（ｐ＝０．００３）、ＰＤ−Ｌ１状態に関する補正の後でも尚もＰＦＳと有意に関連していた（ｐ＝０．０１３）。ＯＳとＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との関係も同様に評価した。ＰＤ−Ｌ２陰性患者およびＰＤ−Ｌ２陽性患者の無増悪生存期間中央値はそれぞれ５９日および６５日であり、全生存期間中央値はそれぞれ１９９日および３０３日であった（図８）。
【０２０４】
これらのデータは、ＰＤ−Ｌ２発現が、ＰＤ−Ｌ１発現に関する補正の後、より高い客観的応答率（ＯＲＲ）と関連していること、およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ−Ｌ１状態の影響に関する補正の後、より長い無増悪生存（ＰＦＳ）と正に関連していることを示唆している。これは、ＰＤ−Ｌ２発現が存在する幾つかの状況においては、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方を標的とする抗ＰＤ１療法が、抗ＰＤ−Ｌ１標的化剤と比較して大きな利益を有しうることを示唆している。
【図１】
2018533914.tif 000009
【図２】
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【図３】
2018533914.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018533914.tif 000015
【図８】
2018533914.tif 000016
【配列表】
2018533914000001.app
【国際調査報告】
2018533914.tif 000017
2018533914.tif 000018
2018533914.tif 000019