(57)【要約】  本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、異種Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたはＴ細胞誘引性ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。
2018519805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたはＴ細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、異種核酸配列が組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに安定に組み込まれている、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
弱毒化されている、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスまたは腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスである、請求項１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスであり、異種核酸配列がＢ細胞誘引性ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスまたはレオウイルスである、請求項３または４に記載の組換え腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス。
【請求項６】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスであり、異種核酸配列がＴ細胞誘引性ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノウイルスである、請求項３または６に記載の組換え腫瘍溶解性ＤＮＡウイルス。
【請求項８】
Ｂ細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列がＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３である、請求項１または４に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
Ｔ細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列がＣＸＣＬ１０である、請求項１または６に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３、ＶＶ−ＣＸＣＬ１３、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０である、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
組換え腫瘍溶解性ウイルスが、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３を、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１３またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０と組み合わせて含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
全身投与のために製剤化されている、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
有効量の請求項１から１０に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または請求項１１から１３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項１５】
がんが乳がん、結腸直腸がん、肺がん、メラノーマ、または卵巣がんである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍を請求項１から１０のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む、免疫細胞を腫瘍に動員する方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞の増殖を阻害するかまたは腫瘍細胞の死滅を促進する方法であって、腫瘍細胞を請求項１から１０のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
組換え腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞の細胞死を引き起こすのに十分な投薬量で提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象におけるがんを処置するための、請求項１から１０に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または請求項１１から１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、異種Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたはＴ細胞誘引性ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、がん患者の臨床成績において重要な役割を果たすと考えられている。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、がんに対する身体防御に関連づけられている。例えば、ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞は、ＥＲ−乳がん、および卵巣がんにおける顕著に増加した生存と関連していた（１３、２３）。さらに、腫瘍浸潤Ｂ細胞は、卵巣がんにおける正の予後因子として関連づけられてきた（１６）。
腫瘍における非常に多くのＴＩＬに加えて、腫瘍内のリンパ球の組織化が抗腫瘍免疫応答における重要な役割を果たすと考えられている。二次リンパ器官に似た免疫細胞のインサイチュ凝集物である三次リンパ構造（ＴＬＳ）は、乳、結腸直腸、および他のヒトがんを含めた多くのがんにおける増加した患者生存と相関していた（６、２０で概説されている）。
【０００３】
ケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１３は、ＴＬＳと関連している（４、１０、１１、１５）。ＣＸＣＬ１０発現は、ウイルス感染またはＴ細胞の抗原特異的活性化などのプロセスから産生されるＩ型またはＩＩ型インターフェロンによって誘発され得る。次いで、ＣＸＣＬ１０は、活性化Ｔ細胞に関する化学誘引物質として働く。ＣＸＣＬ１３は、Ｂ細胞および濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴFH）に関する化学誘引物質である。さらに、結腸直腸がんのマウスモデルにおけるＣＸＣＬ１３の組換え体の内視鏡的注入は、処置されたマウスの８０％における腫瘍拒絶をもたらした（１）。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、がん細胞において選択的に複製するウイルスである。生きた複製ＯＶがいろいろなヒトがんにおける臨床治験において試験された（１７で概説されている）。ＯＶは、抗腫瘍免疫応答、および腫瘍細胞の直接溶解を誘発し得る。一般的なＯＶは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびワクシニアウイルス（ＶＶ）の弱毒化株を含む。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、異種Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたはＴ細胞誘引性ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【０００５】
一態様では、本発明は、Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたはＴ細胞誘引性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、異種核酸配列が組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに安定に組み込まれている、組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。組換え腫瘍溶解性ウイルスは、弱毒化されていてもよい。組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスまたは腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスであってもよい。
【０００６】
一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス（Ｍａｒａｂａ  Ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスまたはレオウイルスなどの腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスであってもよく、異種核酸配列は、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３ポリペプチドなどのＢ細胞誘引性ポリペプチドをコードし得る。
一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノウイルスなどの腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスであってもよく、異種核酸配列は、ＣＸＣＬ１０などのＴ細胞誘引性ポリペプチドをコードし得る。
一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３、ＶＶ−ＣＸＣＬ１３、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０であってもよい。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３を、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１３またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０と組み合わせて含んでいてもよい。医薬組成物は、全身投与のために製剤化されていてもよい。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによりがんを処置する方法を提供する。がんは、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、メラノーマ、または卵巣がんであってもよい。代替の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、または医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本発明は、腫瘍を本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることにより免疫細胞を腫瘍に動員する方法を提供する。
【０００９】
一部の態様では、本発明は、腫瘍細胞を本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることにより腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは腫瘍細胞の死滅を促進する方法を提供する。組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の細胞死を引き起こすのに十分な投薬量で提供され得る。
この概要は、本発明の必ずしも全ての特色を記載したものではない。
本発明のこれらおよび他の特色は、添付の図面が参照される以下の説明からより明らかになると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】組換え腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびワクシニアウイルス（ＶＶ）によるケモカインＣＸＣＬ１０産生の検証を示すグラフである。
【図１Ｂ】組換え腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびワクシニアウイルス（ＶＶ）によるケモカインＣＸＣＬ１３産生の検証を示すグラフである。
【図２Ａ】マウス乳房腫瘍細胞におけるＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３による免疫細胞動員およびクラスター形成を決定するための実験手法を示す模式図である。
【図２Ｂ】ＰＢＳ、ＶＳＶ−ＧＦＰおよびＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３の腫瘍内注入後のマウス乳房腫瘍細胞におけるＢ細胞含有リンパクラスターの数を示すグラフである。
【図３Ａ】乳房がんのマウスモデルにおけるＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３の治療有効性を決定するための実験手法を示す模式図である。
【図３Ｂ】腫瘍内ＰＢＳに応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図３Ｃ】腫瘍内ＶＳＶ−ＧＦＰに応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図３Ｄ】腫瘍内ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３に応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図３Ｅ】腫瘍内ＰＢＳ、ＶＳＶ−ＧＦＰまたはＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３で処置されたマウスの生存を比較するグラフである。
【図４Ａ】マウス乳房腫瘍細胞におけるＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０の治療有効性を決定するための実験手法を示す模式図である。
【図４Ｂ】腫瘍内ＰＢＳに応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図４Ｃ】腫瘍内ＶＳＶ−ＧＦＰに応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図４Ｄ】腫瘍内ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０に応答した腫瘍サイズを示すグラフである。
【図４Ｅ】腫瘍内ＰＢＳ、ＶＳＶ−ＧＦＰまたはＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０で処置されたマウスの生存を比較するグラフである。
【図５Ａ】３’ＵＴＲを欠くマウスＣＸＣＬ１０のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。この配列は、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０を産出するためにＶＳＶ−ｄ５１プラスミドにクローニングされた。
【図５Ｂ】マウスＣＸＣＬ１０のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図５Ｃ】ヒトＣＸＣＬ１０  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１５６５．１（配列番号３）を示す図である。
【図５Ｄ】ヒトＣＸＣＬ１０のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５６．２（配列番号４）を示す図である。
【図５Ｅ】３’ＵＴＲを欠くマウスＣＸＣＬ１３のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である。この配列は、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３を産出するためにＶＳＶ−ｄ５１プラスミドにクローニングされた。
【図５Ｆ】マウスＣＸＣＬ１３のアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図５Ｇ】ヒトＣＸＣＬ１３  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６４１９．２（配列番号７）を示す図である。
【図５Ｈ】ヒトＣＸＣＬ１３のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６４１０．１（配列番号８）を示す図である。
【図５Ｉ】マウスＣＸＣＬ１２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す図である。
【図５Ｊ】マウスＣＸＣＬ１２のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。
【図５Ｋ】ヒトＣＸＣＬ１２変異体２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００６０９．６（配列番号１１）を示す図である。
【図５Ｌ】ヒトＣＸＣＬ１２変異体１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００６０９．３（配列番号１２）を示す図である。
【図５Ｍ】ヒトＣＸＣＬ１２−ベータポリペプチドのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００６００．１（配列番号１３）を示す図である。
【図５Ｎ】ヒトＣＸＣＬ１２−アルファポリペプチドのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９５４６３７．１（配列番号１４）を示す図である。
【図５Ｏ】ヒトＣＸＣＬ１２−ガンマポリペプチドのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０２９０５８．１（配列番号１５）を示す図である。
【図５Ｐ】ヒトＣＸＣＬ１２−デルタポリペプチドのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１７１６０５．１（配列番号１６）を示す図である。
【図５Ｑ】ヒトＣＸＣＬ１２−アイソフォーム５ポリペプチドのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２６４９１９．１（配列番号１７）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。より詳細には、本開示は、部分的に、異種Ｂ細胞および／またはＴ細胞誘引性ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルス、およびその使用に関する。
【００１２】
Ｂ細胞誘引性ポリペプチド
「Ｂ細胞誘引性ポリペプチド」は、本明細書では、Ｂ細胞を特定の位置に動員する能力があるポリペプチドを表す。一部の実施形態では、位置は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を支持する能力がある位置であってもよい。一部の実施形態では、位置は、固形腫瘍であってもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるＢ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＢ細胞の総数を、Ｂ細胞誘引性ポリペプチドの非存在下でのその特定の位置におけるＢ細胞の数と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれより多く増加させ得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるＢ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＢ細胞の総数を、Ｂ細胞誘引性ポリペプチドの非存在下でのその特定の位置におけるＢ細胞の数と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれより多く増加させ得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＢ細胞のクラスター（「Ｂ細胞クラスター」）の形成を誘発し得る。「Ｂ細胞クラスター」は、本明細書では、固形腫瘍などの特定の位置におけるリンパ系細胞、主にＢ細胞の凝集物を表す。一部の実施形態では、Ｂ細胞クラスターは、少数のＴ細胞または他の細胞を含み得ることが理解されよう。一部の実施形態では、Ｂ細胞クラスターは、１０％未満のＴ細胞を含み得る。一部の実施形態では、Ｂ細胞クラスターは、三次リンパ構造（ＴＬＳ）の特徴、例えば構造的組織化を欠き得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、Ｂ細胞クラスターの形成を誘発し得るが、ＴＬＳは誘発し得ない。Ｂ細胞クラスターの存在は、例えば、免疫組織化学的技法を使用し、固形腫瘍などの位置におけるＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞の存在を決定することによって決定され得る。一部の実施形態では、Ｂ細胞クラスターの存在は、Ｂ細胞誘引性ポリペプチドに曝露されていてもまたはされていなくてもよい固形腫瘍試料などの試料を比較することによって決定され得る。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、生物学的に活性な断片であってもよい。「生物学的に活性な断片」は、本明細書では、１つまたは複数の残基だけ全長ポリペプチドよりも短く、Ｂ細胞を固形腫瘍などの特定の位置に動員する能力があるＢ細胞誘引性ポリペプチドの部分を意味する。
本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、恒常性ケモカインなどのケモカインであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３、またはその生物学的に活性な断片であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＢ細胞誘引性ポリペプチドは、限定することなく、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３配列と実質的に同一な配列を有するポリペプチドを含み得る。
【００１５】
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、配列番号１０、１３〜１７の１つもしくは複数、またはＭＧＩ  ＯＴＴＭＵＳＰ００００００２６１１４もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０００６００．１、ＮＰ＿９５４６３７．１、ＮＰ＿００１０２９０５８．１、ＮＰ＿００１１７１６０５．１もしくはＮＰ＿００１２６４９１９．１に記載された配列の１つもしくは複数に記載されたまたはこれらと実質的に同一な配列を有し得る。
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、配列番号９、１１もしくは１２の１つもしくは複数によってコードされるまたはＭＧＩ  ＯＴＴＭＵＳＴ００００００５４６６４もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００６０９．６もしくはＮＭ＿０００６０９．３に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
【００１６】
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１２核酸分子は、配列番号９、１１もしくは１２、またはＭＧＩ  ＯＴＴＭＵＳＴ００００００５４６６４もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００６０９．６もしくはＮＭ＿０００６０９．３に記載された核酸配列の１つもしくは複数に記載された配列またはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、３’ＵＴＲを欠くｃＤＮＡ断片を有し得る。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドは、配列番号６もしくは８に記載された、またはＭＧＩ  ＯＴＴＭＵＳＰ００００００７２６１４もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００６４１０．１に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドは、配列番号５もしくは７に記載された、またはＯＴＴＭＵＳＴ０００００１３８０２１もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００６４１９．２に記載された配列の１つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、３’ＵＴＲを欠くｃＤＮＡ断片を有し得る。
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１３核酸分子は、配列番号５もしくは７に記載された、またはＯＴＴＭＵＳＴ０００００１３８０２１もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００６４１９．２に記載された核酸配列の１つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、３’ＵＴＲを欠くｃＤＮＡ断片を有し得る。
【００１７】
Ｔ細胞誘引性ポリペプチド
「Ｔ細胞誘引性ポリペプチド」は、本明細書では、Ｔ細胞を特定の位置に動員する能力があるポリペプチドを表す。一部の実施形態では、位置は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を支持する能力がある位置であってもよい。一部の実施形態では、位置は、固形腫瘍であってもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるＴ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＴ細胞の総数を、Ｔ細胞誘引性ポリペプチドの非存在下でのその特定の位置におけるＴ細胞の数と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれより多く増加させ得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるＴ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＴ細胞の総数を、Ｔ細胞誘引性ポリペプチドの非存在下でのその特定の位置におけるＴ細胞の数と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれより多く増加させ得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＴ細胞誘引性ポリペプチドは、固形腫瘍などの特定の位置におけるＢ細胞のクラスター（「Ｔ細胞クラスター」）の形成を誘発し得る。「Ｔ細胞クラスター」は、本明細書では、固形腫瘍などの特定の位置におけるリンパ系細胞、主にＴ細胞の凝集物を表す。一部の実施形態では、Ｔ細胞クラスターは、少数のＢ細胞または他の細胞を含み得ることが理解されよう。一部の実施形態では、Ｔ細胞クラスターは、１０％未満のＢ細胞を含み得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞クラスターは、三次リンパ構造（ＴＬＳ）の特徴、例えば構造的組織化を欠き得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示されたＴ細胞誘引性ポリペプチドは、Ｔ細胞クラスターの形成を誘発し得るが、ＴＬＳは誘発し得ない。Ｔ細胞クラスターの存在または非存在は、例えば、免疫組織化学的技法を使用し、固形腫瘍などの位置におけるＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞の存在を決定することによって決定され得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞クラスターの存在は、Ｔ細胞誘引性ポリペプチドに曝露されていてもまたはされていなくてもよい固形腫瘍試料などの試料を比較することによって決定され得る。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されたＴ細胞誘引性ポリペプチドは、生物学的に活性な断片であってもよい。「生物学的に活性な断片」は、本明細書では、１つまたは複数の残基だけ全長ポリペプチドよりも短く、Ｔ細胞を固形腫瘍などの特定の位置に動員する能力があるＴ細胞誘引性ポリペプチドの部分を意味する。
本明細書で開示されたＴ細胞誘引性ポリペプチドは、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドなどのケモカインであってもよい。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号２もしくは４に記載された、またはＯＴＴＭＵＳＰ００００００３６４２４もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１５５６．２に記載された配列、またはそれらと実質的に同一な配列を有し得る。
【００２０】
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１もしくは３に記載された、またはＯＴＴＭＵＳＧ００００００２８７４０もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１５６５．１に記載された配列の１つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実質的に同一な配列、またはその断片、例えば、３’ＵＴＲを欠くｃＤＮＡ断片を有し得る。
【００２１】
代替の実施形態では、ＣＸＣＬ１０核酸分子は、配列番号１もしくは３に記載された、またはＯＴＴＭＵＳＧ００００００２８７４０もしくはＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１５６５．１に記載された核酸配列の１つもしくは複数によってコードされるまたはこれらと実施的に同一な配列、またはその断片、例えば、３’ＵＴＲを欠くｃＤＮＡ断片を有し得る。
【００２２】
実質的に同一な配列
「実質的に同一な」は、アミノ酸もしくは核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列の位置に位置する１つもしくは複数の保存的置換だけ、または１つもしくは複数の非保存的置換、欠失、もしくは挿入のみがＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３配列などの参照配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。かかる配列は、例えば、Ａｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Myers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17）またはＦＡＳＴＡを使用して、比較に使用される配列にアミノ酸またはヌクレオチドレベルで最適に整列した場合、約４５％から約９９％の間の任意の値で同一あってもよく、またはより一般的に、少なくとも４５％、４８％、５０％、５２％、５５％、５７％もしくは６０％同一であってもよく、または少なくとも６３％、６５％、６８％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％同一であってもよく、または９６％、９７％、９８％、もしくは９９％もの値で同一であってもよい。ポリペプチドに関して、比較配列の長さは、少なくとも１０、１５、２０、２５、または３０アミノ酸であってもよい。代替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも３５、４０、もしくは５０アミノ酸、または６０、８０、もしくは１００を超えるアミノ酸であってもよい。核酸分子に関して、比較配列の長さは、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０ヌクレオチドであってもよい。代替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも６０、７０、８０、もしくは９０ヌクレオチド、または１００、２００、もしくは５００を超えるヌクレオチドであってもよい。配列同一性は、公的に利用可能な配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手可能な、もしくは本明細書に記載のＢＬＡＳＴソフトウェア）を使用して容易に測定され得る。有用なソフトウェアの例は、Ｐｉｌｅ−ｕｐおよびＰｒｅｔｔｙＢｏｘプログラムを含む。かかるソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、置換、および他の修飾に割り当てることによって類似した配列を一致させる。
【００２３】
代わりに、または追加的に、２つの核酸配列は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、「実質的に同一」であってもよい。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を含有する緩衝液において６５℃の温度で、または４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液において４２℃の温度で、長さが少なくとも５００ヌクレオチドのＤＮＡプローブを使用して生じるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件である。（これらは、高ストリンジェンシーノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションに関する典型的な条件である。）ハイブリダイゼーションは、約２０〜３０分、または約２〜６時間、または約１０〜１５時間の期間にわたって、または２４時間以上にわたって実施され得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定法、一本鎖高次構造多型分析、およびインサイチュハイブリダイゼーションなどの分子生物学者によって常法に従って行われる多数の技法の成功に関しても頼られている。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションと対照的に、これらの技法は、相対的に短いプローブ（例えば、通常、ＰＣＲまたは配列決定に関して約１６ヌクレオチド以上およびインサイチュハイブリダイゼーションに関して約４０ヌクレオチド以上）で通常行われる。これらの技法において使用される高ストリンジェンシー条件は、分子生物学の当業者に周知であり、それらの例は、例えば、Ausubel et al.（２４）において見出され得る。
実質的に同一な配列は、例えば、本明細書で記載されたマウスもしくはヒトＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２もしくはＣＸＣＬ１３配列と、または任意の哺乳類種において見出される相同配列と実質的に同一である配列であってもよい。
【００２４】
腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、がん細胞において選択的に複製するウイルスである。それ自体、ＯＶは、非がん細胞に及ぼす著しい効果を有することなく、がん細胞の死を誘発する能力があり得る。
【００２５】
本明細書では、「腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス」は、その遺伝子材料としてリボ核酸（ＲＮＡ）を有し、例えば、インターフェロン産生を刺激することによって炎症を誘発する腫瘍溶解性ウイルスを表す。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、かなり長い時間、腫瘍またはがん細胞において存続しない、すなわち、一過性に存在する。例えば、一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、最後の接種後約２４時間〜約７２時間の接種物の量より３〜５桁少ないレベルで腫瘍またはがん細胞に存在し得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、最後の接種後約２４時間〜約７２時間の接種物の量より１、２、３、４、または５桁少ないレベルで腫瘍またはがん細胞に存在し得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、最後の接種後約２４時間〜約７２時間の接種物の量より５を超える桁少ないレベルで腫瘍またはがん細胞に存在し得る。微量（例えば、感染後１日に存在する量と比較して１０％未満）の腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスが最後の接種後７日に腫瘍またはがん細胞に存在し得ることが理解されよう。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、最後の接種後約１４日後に腫瘍またはがん細胞から完全に排除され得る、すなわち、標準的な検出技法を使用して検出不可能であり得る。
腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、限定することなく、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、またはニューカッスル病ウイルスを含む。
一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、弱毒化されている、すなわち、病原性ではなく、病気を引き起こす能力もないが、がん細胞に感染し、免疫応答を刺激する能力を保持する。
一部の実施形態では、ＶＳＶは、限定することなく、ＶＳＶインディアナ株を含み得る。
一部の実施形態では、ＶＳＶは、限定することなく、Ｍタンパク質における変異を含むＶＳＶを含み得る。
【００２６】
一部の実施形態では、ＶＳＶは、限定することなく、例えば、Stojdl, DF et al.（２１）において報告されたＭタンパク質におけるデルタ−５１変異を含むＶＳＶを含み得る。一部の実施形態では、ＶＳＶは、限定することなく、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１５６０．１に記載された配列を有しかつＭタンパク質におけるメチオニン５１の欠失をさらに含むＶＳＶを含み得る。
【００２７】
一部の実施形態では、マラバウイルスは、限定することなく、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０２５２５５．１に記載された配列を有するマラバウイルスを含み得る。一部の実施形態では、マラバウイルスは、限定することなく、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０２５２５５．１に記載された配列において、それぞれ、ＭおよびＧタンパク質におけるＬ１２３ＷおよびＱ２４２Ｒ変異を有するマラバウイルスを含み得る（２）。
【００２８】
一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスを含む。本明細書では、「腫瘍溶解性ＤＮＡウイルス」は、その遺伝子材料としてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する腫瘍溶解性ウイルスを表す。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスよりもゆっくりと複製し得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスよりも長い期間腫瘍において存続し得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、Ｉ型インターフェロンの強力な刺激因子ではない場合がある。
腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、限定することなく、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノウイルスを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、ＶＶは、限定することなく、ワクシニアウイルスウエスタンリザーブ株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４３３１２．１）、ワクシニアウイルスＡｃａｍｂｉｓ  ２０００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ３１３８４７．１）を含み得る。一部の実施形態では、ＶＶは、限定することなく、その遺伝子座における異種配列の挿入により、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座における弱毒変異を有するワクシニアウイルスを含み得る。
「組換え腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書では、異種Ｂ細胞誘引性ポリペプチドまたは異種Ｔ細胞誘引性ポリペプチドを発現する腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスまたは腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスを意味する。
【００３０】
「組換え」は、本明細書では、核酸またはアミノ酸配列の修飾を意味し、これは、天然に見出されない産物をもたらす。核酸構築物を参照する場合、その用語は、分子生物学的技法を用いて一緒に結合されたまたは作製された核酸配列で構成されている分子を表す。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを参照する場合、分子生物学的技法を用いて作り出された組換え核酸構築物を使用して発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を表す。組換え核酸構築物は、それが天然にライゲートしていない、またはそれが異なる位置で天然にライゲートしている核酸配列にライゲートしている、またはライゲートするようになるように操作されているヌクレオチド配列を含み得る。したがって、核酸構築物を「組換え」と称することにより、核酸分子が遺伝子工学を使用して、すなわち、ヒトの介入によって操作されていることが示される。組換え核酸構築物は、例えば、本明細書に記載されたまたは当技術分野で既知の任意の適した手段によって宿主細胞に導入され得る。かかる組換え核酸構築物は、同じ宿主細胞種にまたは異なる宿主細胞種に由来する配列を含み得、これらは、単離され、宿主種の細胞に再導入されている。組換え核酸構築物配列は、宿主細胞の本来の形質転換の結果として、または後の組換えおよび／または修復事象の結果として、宿主細胞ゲノム、例えば腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに取り込まれる（「安定に組み込まれる」）ようになり得る。
【００３１】
「異種」は、それが天然に見出される場所以外の場所に位置するようにヒトの介入によって操作された核酸またはポリペプチド分子を意味する。例えば、ある種由来の核酸配列は、別の種のゲノムに導入され得る、またはあるゲノム遺伝子座由来の核酸配列は、同じ種における別のゲノム遺伝子座に移動され得る。異種タンパク質は、例えば、異種コード配列から発現されたタンパク質またはタンパク質を天然に発現しない細胞における組換え遺伝子から発現されたタンパク質を含む。
「組換え」という用語は、腫瘍溶解性ウイルスに関連して使用される場合、結果として生じる組換え腫瘍溶解性ウイルスが、野生型であろうと弱毒化されていようとその腫瘍溶解性ウイルスによって通常発現されないタンパク質またはポリペプチドを発現するように、腫瘍溶解性ウイルスが異種核酸配列の導入によって修飾されていることを示す。一部の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、１つを超える異種核酸配列を発現するように操作され得る。
組換えＶＳＶは、例えば、ＶＳＶゲノムにおけるＧタンパク質とＬタンパク質の間、または任意の２つの隣接するＶＳＶ遺伝子の間に異種核酸配列を挿入することによって産出され得る。一部の実施形態では、ＶＳＶは、Ｍタンパク質における変異、または腫瘍選択性を与え得るＶＳＶタンパク質における他の変異を有し得る。一部の実施形態では、Ｍタンパク質での変異は、例えば、メチオニン５１位置での記載された欠失であってもよい。
弱毒化組換えＶＶは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子座、またはワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子座、または遺伝子の混乱が腫瘍選択性を与える任意の他の遺伝子座内に異種核酸配列を挿入することによって産出され得る。
【００３２】
一部の実施形態では、異種核酸配列は、ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ、完全なコード配列、および終止コドンを含み得る。一部の実施形態では、異種核酸配列は、例えば、かかる除外が異種核酸配列の発現を改善する場合、３’ＵＴＲを除外し得る。一部の実施形態では、さらなる異種３’ＵＴＲ配列が、ｍＲＮＡの翻訳を改善するために異種核酸配列ｃＤＮＡに導入され得る。一部の実施形態では、さらなる異種３’ＵＴＲ配列は、例えば、Levitt, N et al.（９）によって報告された合成配列であってもよい。
腫瘍溶解性ウイルスがＶＶである場合、異種核酸配列は、配列：ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号１８）を有するＶＶ合成初期／後期プロモーターの制御下に置かれ得る。
【００３３】
したがって、一部の実施形態では、本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、Ｂ細胞誘引性ポリペプチドを発現するように修飾された腫瘍溶解性ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを表し、限定することなく、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３、またはＶＶ−ＣＸＣＬ１３を含む。
一部の実施形態では、本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔ細胞誘引性ポリペプチドを発現するように修飾された腫瘍溶解性ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを表し、限定することなく、本明細書に記載のＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０ウイルスを含む。
異種ポリペプチドを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスは、特定の位置での接種後のある一定の期間後に検出不可能であり得るけれども、異種ポリペプチドは、例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルスによってその位置に動員された免疫細胞によって発現され続け得、したがって、検出され得ることが理解されよう。
【００３４】
がん
本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞を固形がん、腫瘍または新生物に動員するために使用され得る。「がん」、「腫瘍」または「新生物」は、生理学的機能を果たさない細胞の任意の望まれない増殖を意味する。一般に、新生物の細胞は、その正常な細胞分裂制御から解放されている、すなわち、その増殖が細胞環境における通常の生化学的および物理学的影響によって調節されない細胞である。大部分の場合、新生物細胞は、増殖して、良性または悪性である細胞のクローンを形成する。がんまたは新生物の例は、限定することなく、形質転換および不死化細胞、腫瘍、ならびに乳腺細胞癌および前立腺癌などの癌を含む。がんという用語は、技術的に良性であるが、悪性になるリスクを保有する細胞増殖を含む。
「悪性」は、任意の細胞型または組織の異常な増殖を意味する。悪性という用語は、技術的に良性であるが、悪性になるリスクを保有する細胞増殖を含む。この用語は、任意のがん、癌腫、新生物、異常増殖、または腫瘍も含む。大部分のがんは、３つの広い組織学的分類に入る：癌、これは、最も多数を占めるがんであり、上皮細胞または臓器、腺、もしくは他の身体構造（例えば、皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸）の外または内面を覆っている細胞のがんであり、転移する傾向がある；肉腫、これは、結合または支持組織（例えば、骨、軟骨、腱、靭帯、脂肪、筋肉）に由来する；および血液腫瘍、これは、骨髄およびリンパ組織に由来する。癌は、腺癌（乳房、肺、結腸、前立腺または膀胱などの分泌の能力がある臓器または腺において一般に生じる）であってもよいし、または扁平上皮癌（扁平上皮において起こり、身体の大多数の領域において一般に生じる）であってもよい。肉腫は、骨肉腫または骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫もしくは中皮腫（体腔の膜裏）、線維肉腫（線維性組織）、血管肉腫もしくは血管内皮腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、神経膠腫もしくは星状細胞腫（脳に見出される神経原性結合組織）、粘液肉腫（原始胚性結合組織）、または間葉性もしくは混合性中胚葉腫瘍（混合性結合組織型）であってもよい。さらに、腺扁平上皮癌、混合性中胚葉腫瘍、癌肉腫、または奇形癌などの混合型がんも存在する。
【００３５】
がんは、例えば、乳房、脳、肺、肝臓、皮膚、前立腺、精巣、膀胱、結腸および直腸、子宮頚部、子宮などのがんなどのように、それらが起こる臓器、すなわち、「原発部位」に基づいても命名され得る。この呼称は、そのがんが原発部位とは異なる身体の別の部分に転移した場合でさえも持続する。原発部位に基づいて命名されたがんは、組織学的分類と相関し得る。例えば、肺がんは、一般に、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんであり、これは、扁平上皮癌、腺癌、または大細胞癌であってもよい；皮膚がんは、一般に、基底細胞がん、扁平上皮がん、またはメラノーマである。リンパ腫は、頭部、頚部および胸部と関連しているリンパ節において、ならびに腹部リンパ節においてまたは腋窩もしくは鼠径リンパ節において生じ得る。がんの型および段階の同定および分類は、例えば、米国におけるがん発生率および生存に関する情報の権威筋であり、世界中で認識されている、Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program of the National Cancer Institute (http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html）によって提供された情報を使用することによって行われ得る。ＳＥＥＲプログラムは、現在、ＵＳ人口の約２６パーセントを網羅する１４の集団に基づくがん登録および３つの補足的登録からのがん発生率および生存データを集め、公表している。プログラムは、患者の人口統計、原発腫瘍部位、形態、診断時の段階、処置の第１の経過、および生命状態に関する追跡に関するデータを常に集めており、診断時のがんの段階および各段階内の生存率を含む米国における人口に基づく情報の唯一の包括的源である。３００万を超える上皮内および浸潤がん症例に関する情報がＳＥＥＲデータベースに含まれており、約１７０，０００の新しい症例がＳＥＥＲ適用範囲領域内で毎年加えられる。ＳＥＥＲプログラムの発生率および生存データは、特定のがん部位および段階に関する標準的な生存時間を入手するために使用され得る。例えば、最適な比較群を保証するために、診断の日付および正確な段階を含めた具体的な基準がデータベースから選択され得る。
【００３６】
以下のリストは、原発がんおよび二次的拡散（転移）に関するそれらの一般的な部位の一部の非限定的な例を提供する：
原発がん  転移に関する一般的な部位
乳房  骨、肺、皮膚、脳
肺  骨、脳
結腸  肝臓、肺、骨
腎臓  肺、骨
膵臓  肝臓、肺、骨
メラノーマ  肺
子宮  肺、骨、卵巣
卵巣  肝臓、肺
膀胱  骨、肺
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、メラノーマ、または卵巣がんなどのＢ細胞の動員によって利益を与えられるがんを含む。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の動員によって利益を与えられるがんを含む。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、腫瘍溶解性ウイルスから産生される外来性ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＬ１０発現が遺伝的または後成的手段によってサイレンシングされているがんにおいて特に有用であり得る。
【００３８】
医薬および獣医学的組成物、投薬量、および投与
本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、対象への投与に適した形で薬学的に許容される担体などの担体とともに製剤化されていてもよい。一部の実施形態では、エクスビボ技法が使用され得る。例えば、一部の実施形態では、担体は、Lemay CG et al.（８）によって報告されたエクスビボ感染自己腫瘍細胞であってもよい。
本明細書では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどであってもよい。対象は、臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物などであってもよい。対象は、がんまたは新生物を有するリスクを有していてもよく、がんまたは新生物と診断されてもよい、またはがんも新生物も有さないと確認された対照対象であってもよい。がんまたは新生物に関する診断法およびかかる診断の臨床描写は、当業者に既知である。
ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３などの異種ポリペプチドを発現する１つまたは複数の組換え腫瘍溶解性ウイルスが対象に投与され得る。例えば、対象は、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３の１つまたは複数をそれぞれ発現するＶＳＶまたはＶＶなどの１つまたは複数の組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与され得る。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＶＳＶ−ＣＸＣＬ１２またはＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３ウイルスなどの組換え腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、単独でまたは他の化合物（例えば、核酸分子、小分子、ペプチド、ペプチド類似体、または組換え腫瘍溶解性ＤＮＡウイルス）と組み合わせて提供され得る。例えば、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１２またはＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３ウイルスは、ＶＶ−ＣＸＣＬ１２、ＶＶ−ＣＸＣＬ１３ウイルス、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０ウイルスおよび／またはＶＶ−ＣＸＣＬ１０ウイルスと組み合わせて提供され得る。
必要に応じて、本開示による組換え腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスでの処置は、がんまたは新生物に関するより伝統的かつ既存の療法と組み合わされ得る。本開示による組換え腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、慢性的または断続的に提供され得る。「慢性的」投与は、急性的方式とは対照的に、最初の治療効果（活性）を長期間維持するための連続的方式での薬剤の投与を表す。「断続的」投与は、中断なく継続的に行われないが、本来ある程度周期的である処置である。
【００４０】
従来の薬務が、組換え腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスを、例えば注入または吸入によって、がんまたは新生物を患っているまたはこれらを有する疑いのある対象に投与するための適した製剤または組成物を提供するために用いられ得る。投与の任意の適切な経路が用いられ得、例えば、非経口、静脈内、皮下、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、関節内、脊髄内、くも膜下腔内、嚢内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、局所的、または投与である。治療製剤は、溶液または懸濁液の形；鼻腔内製剤に関して、点鼻薬、またはエアロゾルの形であってもよい。
【００４１】
製剤を作製するための当技術分野で周知の方法は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" (19th edition), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Paにおいて見出される。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）を含有し得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが化合物の放出を制御するために使用され得る。他の潜在的に有用な非経口送達系は、例えば、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系、およびリポソームを含む。吸入のための製剤は、賦形剤、例えば、ラクトースを含有し得る、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する水溶液であってもよい、または点鼻薬の形の投与のための油性溶液であってもよい。治療組成物に関して、化合物は、がんまたは新生物を停止させるまたは遅らせるのに十分な量で個体に投与される。
【００４２】
「治療有効量」は、がんまたは新生物を停止させるまたは遅らせるなどの望ましい治療結果を達成するために必要な投薬時の効果的な量および期間を表す。化合物の治療有効量は、個体の疾患状況、年齢、性別、および体重などの因子および化合物が個体における望ましい応答を引き出す能力によって変動し得る。投薬レジメンは、最適の治療応答を提供するために適合され得る。治療有効量は、治療的に有益な効果が化合物の任意の毒性または有害効果を上回るものでもある。一部の実施形態では、治療有効量は、対象１ｋｇあたり１ｅ４、１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１１、１ｅ１２、１ｅ１３、１ｅ１４、１ｅ１５以上のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。
【００４３】
投薬量の値は、緩和される状態の重症度、または使用される特定の組換え腫瘍溶解性ウイルスによって変動し得ることに留意されたい。任意の特定の対象に関して、具体的な投薬レジメンは、個々の必要性および投与するまたは組成物の投与を監督する人の専門的な判断によって経時的に適合され得る。本明細書で記載された投薬量の範囲は、単に典型的なものであり、医師によって選択され得る投薬量の範囲を限定しない。組成物中の活性な組換え腫瘍溶解性ウイルスの量は、個々の対象の疾患状況、年齢、性別、および体重などの因子によって変動し得る。投薬レジメンは、最適の治療応答を提供するために適合され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得る、いくつかの分割用量が経時的に投与され得る、または用量は、治療状況の緊急事態によって示されるように比例的に減少または増加され得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位の形態で非経口組成物を製剤化することは有利であり得る。
使用の方法
本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍細胞の死滅を促進する、または免疫細胞（Ｔ細胞またはＢ細胞など）を腫瘍に動員するために使用され得る。
【００４４】
「腫瘍の増殖を阻害する」は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非存在下での類似した腫瘍と比較した場合の、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの存在下での腫瘍のサイズの１０％から９０％の間の任意の値、または３０％から６０％の間の任意の値の、または１００％を超える低下、または１倍、２倍、５倍、１０倍以上の低下を意味する。阻害することは、完全な阻害を必要としないことが理解されよう。
【００４５】
「腫瘍細胞の死滅を促進する」は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非存在下での類似した腫瘍と比較した場合の、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの存在下での腫瘍細胞の死の１０％から９０％の間の任意の値、または３０％から６０％の間の任意の値の、または１００％を超える増加、または１倍、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、５０倍、１００倍以上の増加を意味する。死滅は、全ての腫瘍細胞が殺されることを必要としないことが理解されよう。
「免疫細胞を腫瘍に動員する」は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非存在下でのＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞の数と比較した場合の、本明細書に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの存在下でのＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞の数の１０％から９０％の間の任意の値、または３０％から６０％の間の任意の値の、または１００％を超える増加、または１倍、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、５０倍、１００倍以上の増加を意味する。
【００４６】
本明細書に記載のまたは当技術分野で既知の任意の適したアッセイが使用され得る。例えば、ウエスタンブロット法は、感染細胞による異種タンパク質の産生を検出するために使用され得；Ｂ細胞の移動は、トランスウェル移動アッセイによって決定され得、移動の特異性は、移動を遮断する特異的モノクローナル抗体を使用して評価される。ＮＯＰ乳房がん動物モデルは、マウスにウイルスを注入し、腫瘍増殖を監視することによって、組換えウイルスが抗腫瘍有効性を増強する能力を評価するために使用され得る。マウスは、フローサイトメトリーおよび／またはマルチカラー免疫組織化学的検査を使用して、腫瘍浸潤Ｂ細胞の数および活性化状況を比較し、リンパクラスターの形成を監視するために、連続的な時点で屠殺され得る。
本発明は、以下の例においてさらに例証されることになる。
【実施例】
【００４７】
組換えウイルスの産出
本発明者らは、ケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１３をＶＳＶおよびＶＶの弱毒化株中に操作した。ＶＳＶ組換えウイルスにおいて、ケモカインをＶＳＶゲノムにおけるＧとＬタンパク質間に挿入した。ＶＶ組換えウイルスに関して、ケモカインをチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入した。両方のウイルスに関して、導入遺伝子は、ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ、完全なコード配列、および終止コドンを含み；３’ＵＴＲを除外した。本発明者らは、ＰＣＲクローニングを使用して、マウスＣＸＣＬ１３（ｍＣＸＣＬ１３）遺伝子をＶＳＶに挿入した。本発明者らは、これをマウス脾細胞から抽出されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡから増幅した。この増幅のためのプライマーは、ＶＳＶウイルスゲノム中への挿入を可能にする制限酵素部位を含んだ。組換えＶＳＶクローンを得ると同時に、本発明者らは、ｍＣＸＣＬ１３の挿入が成功的であったことをサンガーシークエンシングによって確認した。組換えＶＳＶ−ｍＣＸＣＬ１３ウイルスをＤＮＡ構築物から産出した。ＶＶに関して、本発明者らはまた、マウス脾細胞ｃＤＮＡからｍＣＸＣＬ１３に関するＤＮＡをＰＣＲ増幅した。この場合、ＰＣＲプライマーを、それらがＶＶウイルスゲノム中へのｍＣＸＣＬ１３の挿入を可能にするように設計した。さらに、ＶＶに関するレフトプライマーは、組換えウイルスに感染した標的細胞中でのｍＣＸＣＬ１３の高発現を強制するための合成プロモーターを含有するように設計した。
【００４８】
組換え腫瘍溶解性ウイルスプラスミドへのケモカイン遺伝子のクローニング
より詳細には、活性化マウス脾細胞からｃＤＮＡを単離するために、新鮮に収集されたマウス脾臓をシリンジプランジャーの鈍い末端ですりつぶし、次いで、１００μｍスクリーンを通してろ過した。脾細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁した。室温での５分のインキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで、４０μｍろ過器を通したろ過の前に完全ＲＰＭＩに再懸濁した。脾細胞を１〜２×１０6細胞／ｍＬの濃度で完全ＲＰＭＩ培地中で増殖した。Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、細胞を１μｇ／ｍＬの濃度で刺激した。細胞を４８時間インキュベートし、次いで、遠心分離によってペレット化し、均質化の前に１％β−メルカプトエタノールを有する緩衝液ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）の溶液に再懸濁した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従ってホモジネートからＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを製造者のプロトコールに従ってｑＳｃｒｉｐｔ（商標）  ｃＤＮＡ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＲＮＡから調製した。
表１のプライマーを使用して、全マウスｃＤＮＡから３’ＵＴＲを欠くＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１３  ｃＤＮＡを増幅した。ＶＳＶクローニングに関して、プライマーをｘｈｏＩおよびＮｈｅＩ制限部位を含有するように設計した。ワクシニアウイルスクローニングに関して、プライマーをｓｐｅＩ制限部位を含有するように設計した。加えて、レフトワクシニアウイルスプライマーは、ケモカイン遺伝子の高発現を駆動するための合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーター：ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号１８；３）を含有した。全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＰＣＲを高忠実度Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して行った。
【００４９】
【表１】
2018519805.tif 000003
【００５０】
標準的なクローニング技法を使用してＶＳＶ構築物をＶＳＶ−ｄ５１プラスミド（２１）中にクローニングし、ワクシニアウイルス構築物をプラスミドｐＳＥＭ−１プラスミド（１９）中にクローニングした。ＶＳＶ−ｄ５１プラスミドは、導入遺伝子のＧとＬ遺伝子間の挿入を可能にし、ｐＳＥＭ−１プラスミドは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座中への挿入を可能にする。いったんケモカイン発現構築物をそれらのそれぞれの組換えウイルスプラスミド中にクローニングしたら、ケモカイン構築物を配列決定して（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、組換えウイルスの産出に進む前にエラーがないことを保証した。
【００５１】
ケモカイン構築物が少なくとも以下の配列を有することを確認した：
３’ＵＴＲを欠くｍＣＸＣＬ１０  ｃＤＮＡ：
ＧＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＴＡＡ（配列番号１）
【００５２】
３’ＵＴＲを欠くｍＣＸＣＬ１３  ｃＤＮＡ：
ＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＧＧＴＣＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＣＡＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡ（配列番号５）
組換えＶＳＶの産出
【００５３】
組換えＶＳＶを産出するために、本発明者らは、確立された組換えウイルスレスキュープロトコール（７）を使用した。５ｅ５  Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）細胞／ウェルを２ｍｌの完全培地（５００ｍｌ高グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ、５０ｍｌ熱失活ウシ胎仔血清、各５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における６ウェル組織培養プレートで平板培養した。２４時間後、細胞がコンフルエントな単層を形成した時、培地を除去し、細胞をウェルあたり１００ｕｌの体積の無血清高グルコースＤＭＥＭ中で５のＭＯＩ（５ｅ６  ｐｆｕ）でＴ７−発現ワクシニア（ＶＶ−Ｔ７）に感染させた。感染の２時間後、以下の構成要素を含有するトランスフェクション混合物を調製した：１ｕｇ／ウェルのＶＳＶ−Ｎプラスミド、１．２５ｕｇ／ウェルのＶＳＶ−Ｐプラスミド、０．２５ｕｇ／ウェルのＶＳＶ−Ｌプラスミド、および４ｕｇ／ウェルの組換えＶＳＶゲノムプラスミド。トランスフェクションあたりの最終体積をＯｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で２５０ｕｌにした。
別個の管において、５ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２５０ｕｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに加えた。プラスミドおよびリポフェクタミン溶液を一緒に混合し、室温で１０〜２０分間インキュベートした。
【００５４】
ＶＶ−Ｔ７に感染したウェルからの上清を接種物を吸引することによって除去し、５００ｕｌ／ウェルのトランスフェクション混合物を細胞上に直接滴下添加した。１つのＶＶ−Ｔ７感染ウェルを負の対照としてトランスフェクトしないままにした。プレートをトランスフェクション溶液中で４〜５時間、３７Ｃでインキュベートした。このインキュベーション後、トランスフェクション溶液を吸引し、２ｍｌ／ウェルの完全培地と交換した。プレートを２日間インキュベートした。
２日のインキュベーション後、培養物を収集し、１６００ＲＰＭで１０分間遠心分離して、細胞片をペレット化した。次いで、上清を０．２ｕｍフィルターを通過させて、全てのワクシニアウイルス汚染物質を除去した。
１ｍｌのこの清澄上清を６−ウェル組織培養プレートの６ｅ５  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルの新鮮な、コンフルエントな層上で平板培養し、３７Ｃで２４〜４８ｈインキュベートした。成功的な組換えウイルスレスキューが２４〜４８ｈ以内の細胞死によって示された。
成功的にレスキューされたウェルを一緒にプールし、−８０Ｃで凍結させた。これらのストックを使用して、実験において使用する後のウイルスストックを産出した。
【００５５】
組換えＶＳＶにおけるケモカイン発現の確認
ウェルあたり２ｍＬの完全培地における６ｅ５  Ｖｅｒｏ細胞を６−ウェル組織培養プレートで平板培養した。翌日、培地を除去し、細胞をレスキューされた組換えＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３を含有する上清に感染させた。感染を、無血清高グルコースＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で全体で５００μＬにした様々な量の上清を使用して行った。ウイルスをＶｅｒｏ細胞に加え、次いで、細胞を、プレートを１５分毎に穏やかに揺り動かしながら３７Ｃで１時間インキュベートした。次いで、ウェルを１．５ｍＬの２％ＦＢＳ高グルコースＤＭＥＭ培地で覆い、３７Ｃでインキュベートした。翌日、セルスクレーパー（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して細胞を収集し、次いで、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをβ−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する３５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に再懸濁した。次に、ＲＮＡをＲＮＥａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  キット（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。次に、ＰＣＲを使用して、ＶＳＶゲノムからのケモカイン遺伝子の発現をスクリーニングした。ＰＣＲを、組換えウイルスを産出するために使用したクローニングプライマーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＰＣＲサイクリング条件は、以下の通りであった：９５℃で３０秒間の最初の変性、その後の９５℃で３０秒、５４．５℃で３０秒および７２℃で３５秒からなる３５サイクルを７２℃で２分の長さの最終伸長ステップで行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で可視化した。ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１３組換えＶＳＶの両方に関して、本発明者らは、導入遺伝子が転写されたこと示す期待されたサイズのバンドを検出することができた。
【００５６】
組換えワクシニアウイルスの産出
組換えワクシニアウイルス株を産出するために、本発明者らは、Rintoul et al.（１９）によって以前報告された方法を適応した。簡潔に述べると、９ｅ５  Ｕ−２  ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）を６ウェル組織培養プレート中の２ｍｌの完全培地（５００ｍｌ高グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ、５０ｍｌ熱失活ウシ胎仔血清、各５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で平板培養し、３７Ｃでインキュベートした。
翌日、ヘルパーウイルス（野生型ワクシニアウイルスウエスタンリザーブ株）を無血清培地に希釈した。培地をウェルから吸引し、細胞をウェルあたり３００〜５００ｕｌの体積で３〜５のＭＯＩで感染させ、プレートを１５分毎に穏やかに揺り動かしながら３７Ｃで１時間インキュベートした。
【００５７】
細胞に感染している間、１０ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２５０ｕｌの還元−血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えた。４ｕｇの組換えプラスミドＤＮＡを等体積（２５０ｕｌ）のＯｐｔｉ−ＭＥＭに加え、次いで、リポフェクタミン混合物と組み合わせた。リポフェクタミン／プラスミド混合物を室温で１０〜２０分間インキュベートした。
１時間のウイルス感染後、培地をウェルから吸引し、トランスフェクション混合物をウェルに滴下添加した。負の対照として、１つのウェルをヘルパーウイルスに感染させたが、トランスフェクトしないままにした。プレートを３７Ｃで３〜４時間インキュベートした。このインキュベーション後、トランスフェクション混合物を吸引し、２ｍｌ／ウェルの高グルコースＤＭＥＭ培地と交換した。次いで、プレートを３７Ｃで２４〜４８ｈインキュベートした。
【００５８】
このインキュベーション後、ウェルの内容物をセルスクレーパー（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して収集し、３０００ＲＰＭで１０分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットを２００ｕｌ（６−ウェルプレートにおける元々のウェルあたり）の１ｍＭトリス、ｐＨ９に再懸濁した。このウイルス混合物をクライオバイアルに移し、３回の凍結融解サイクル（−８０Ｃおよび３７Ｃ）に供した。
次に、コンフルエントなＵ２−ＯＳ細胞を含有する６ウェルプレートにおいて、培地を除去し、５〜２０ｕｌの凍結融解ウイルスを無血清培地と混合して、総体積を５００ｕｌにし、１時間、平板培養した。１時間のインキュベーション後、ウイルス混合物を除去し、２ｍｌ／ウェルのＧＰＴ選択完全高グルコースＤＭＥＭ培地（２５０μｇ／ｍＬキサンチン、１５μｇ／ｍＬヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、および２５μｇ／ｍＬミコフェノール（ＭＰＡ，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する）を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で２４〜９６時間の間インキュベートした。
【００５９】
プレートをＹＦＰ選択マーカーの存在に関して蛍光顕微鏡下で毎日点検した。ＹＦＰ＋ｖｅコロニーがはっきりと認識できるサイズに達した時、それらを蛍光顕微鏡下で１００〜１５０ｕｌの１ｍＭトリス、ｐＨ９中に直接採取した。この方法で採取されたウイルスを３回凍結融解し（−８０Ｃ〜３７Ｃ）、次いで、上述のようにＧＰＴ選択の存在下で６ウェルプレート中の新鮮なＵ２−ＯＳ細胞上で平板培養した。
総計で、ウイルスは、４〜５ラウンドのＧＰＴ選択／プラーク採取を経た。ウイルスの最終粗ストックを−８０Ｃで保管し、後のウイルスストックを産出するために使用した。
【００６０】
組換えワクシニアウイルス純度の確認
本発明者らの組換えウイルス調製物中に野生型ウイルス汚染物質がないことを確認するために、本発明者らは、最初に、Meyer et al.（１２）によって報告されたようにＵ２−ＯＳ細胞を組換えウイルスに感染させ、次いで、結果として生じた細胞／ウイルス混合物からＤＮＡを抽出した。本発明者らは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座にアニールするプライマーと組み合わせて使用して、野生型汚染物質をスクリーニングした。野生型ウイルスでは、ＴＫプライマーセットは、約５００ｂｐのバンドを増幅する。組換えウイルスでは、ＴＫ遺伝子座中への挿入により、ＴＫプライマーセットは、約５ｋｂの領域を増幅する。したがって、約５００ｂｐバンドの非存在（約５ｋｂバンドの存在）は、組換えストックの純度を示す。ＰＣＲサイクリング条件は、以下の通りであった：９４Ｃで２分間の１サイクル；９４Ｃで３０秒間、５８Ｃで３０秒間、６８Ｃで５．５分間の４０サイクル；６８Ｃで１０分間の１サイクル；４Ｃで維持。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で可視化した。ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１３組換えワクシニアウイルスストックの両方は、純粋であることが分かった。
【００６１】
ウイルスの産生
ＶＳＶ
Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層を１５０ｍｍ培養皿上で増殖させた。各皿を無血清培地中で５ｍＬに希釈されたウイルスを用いておよそ０．０２のＭＯＩでＶＳＶに感染させた。１５分毎にプレートを揺り動かしながらの１時間のインキュベーション後、２０ｍＬの２％血清含有培地を各プレートに加え、２４時間インキュベートした。感染した培養物からの上清を収集し、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで、０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通してろ過した。次いで、ろ過された上清をＪＡ−２５．５ローターを有するＡｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して１６０００ｒｐｍで４Ｃで９０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、ウイルスペレットをプールし、１０プレートあたり１ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁した。次いで、ウイルスをアリコートし、−８０Ｃで保管した。ウイルスをＶｅｒｏ細胞上で標準的なプラークアッセイを使用してタイターした。
【００６２】
ワクシニアウイルス
Ｕ２−ＯＳ細胞のコンフルエントな単層を１５０ｍｍ培養皿上で増殖させた。各皿をプレートあたり２ｅ６  ｐｆｕで無血清培地中で５ｍＬに希釈されたワクシニアウイルスに感染させた。プレートを１５分毎に揺り動かしながらの１時間のインキュベーション後、２０ｍＬの２％血清含有培地を各プレートに加え、約７２時間インキュベートした。感染細胞を擦り取り、３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。ペレットを１ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９（プレートあたり４ｍＬ）に再懸濁し、３回凍結融解した。管を３０００ｒｐｍで１０分間回転させて、細胞片を除去した。清澄上清を１０ｍＬ  ３６％スクロース溶液上に覆わせた（管あたり２０ｍＬ清澄上清）。次いで、管をＪＳ−１３．１スインギングバケットローターを使用してＡｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）において１１，５００ｒｐｍで１．５時間回転させた。上清を捨て、過剰なスクロースをピペットで除去した。ペレットを１ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９（１０プレートあたり１ｍｌ）に再懸濁した。ウイルスをアリコートし、−８０Ｃで保管した。ウイルスをＵ２−ＯＳ細胞上で標準的なプラークアッセイを使用してタイターした。
【００６３】
組換えウイルスによるケモカインタンパク質産生の確認
腫瘍細胞に感染すると組換えウイルスがケモカインタンパク質を産生したことを検証するために、３ｅ４  ＮＯＰ２３マウス乳房腫瘍細胞（２２）を９６−ウェルプレートで平板培養し、２４時間インキュベートした。次いで、ＮＯＰ２３腫瘍細胞をＭＯＩ＝１で組換えまたは親（ＧＦＰ発現）ウイルスに感染させ、次いで、４８時間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離し、培養上清中のケモカインを、製造者のプロトコールに従ってＭｏｕｓｅ  ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２またはＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡによって定量化した。ウェルの色強度をＶｅｒｓａＭａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡは、親ＶＳＶが腫瘍細胞におけるＣＸＣＬ１０産生を刺激し、この発現がＣＸＣＬ１０導入遺伝子によってさらに増加され得るであろうことを明らかにした。対照的に、ＶＶ−ＧＦＰは、腫瘍細胞におけるＣＸＣＬ１０産生を刺激し得ず、しかしながら、組換えＶＶ−ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＬ１０の頑強な産生を刺激した（図１Ａ）。
ＶＳＶ−ＧＦＰ感染もＶＶ−ＧＦＰ感染も腫瘍細胞からのＣＸＣＬ１３発現を誘発しなかった。対照的に、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３およびＶＶ−ＣＸＣＬ１３の両方は、腫瘍細胞におけるＣＸＣＬ１３の頑強な発現を誘発した（図１Ｂ）。
ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
乳房がんのマウスモデル（２２）を使用して、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３の治療有効性およびそのＢ細胞を動員する能力を決定した。使用した実験手法を図２Ａにおける模式図に示す。
【００６５】
より詳細には、１ｅ６  ＮＯＰ２３乳房腫瘍細胞を１００ｕｌ  ＰＢＳの体積で乳房脂肪パッドに移植した。およそ３週間後、腫瘍が約３０〜５０ｍｍ2のサイズに達した時、動物は、ＰＢＳ、または５ｅ８  ｐｆｕのＶＳＶｄ５１−ＧＦＰもしくはＶＳＶ−ｄ５１−ＣＸＣＬ１３の６〜８腫瘍内（１日おきに１回）注入を受けた。腫瘍サイズをデジタルノギスを使用して監視した。マウスのいくつかのコホートを最初のウイルス／ＰＢＳ処置後１４日で安楽死させ、それらの腫瘍をホルマリン中に収集して、免疫組織化学的検査によりＴおよびＢ細胞浸潤物を評価した。腫瘍スライドをヘマトキシリン、茶色３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原を有する抗マウスＣＤ３、およびＦａｓｔ  Ｒｅｄ色素原を有する抗マウスＰａｘ５抗体で染色した。
【００６６】
免疫細胞およびリンパクラスター（ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＰａｘ５＋Ｂ細胞の大きい凝集物）を腫瘍切片全体において計数した（図２Ｂ）。ＰＢＳ処置マウスからの腫瘍は、免疫細胞を欠いた一方、ＶＳＶ−ＧＦＰ処置マウスは、高密度のＴ細胞を有したが、Ｂ細胞をほとんど含有しなかった。ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３で処置されたマウスは、Ｔ細胞浸潤物を含有し、マウスのサブセットは、Ｂ細胞浸潤物も含有した。本発明者らは、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）においてもＶＳＶ−ＧＦＰ処置動物においてもいかなるリンパクラスターも検出しなかった。対照的に、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３処置は、動物のサブセットにおいてリンパクラスターを誘発し、一部の場合では、個々の腫瘍は、複数のリンパクラスターを含有し、これは、腫瘍をＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３で処置することにより、Ｂ細胞を腫瘍に動員することができ、これらのＢ細胞がリンパクラスターをしばしば形成することを示している。データは、３つの独立的な実験の組合せを表している。ＰＢＳに関してＮ＝１２；ＶＳＶ−ＧＦＰおよびＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３に関してＮ＝１３。
【００６７】
ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３の治療有効性を決定するために、動物は、ＰＢＳ、５ｅ８  ｐｆｕのＶＳＶｄ５１−ＧＦＰまたはＶＳＶ−ｄ５１−ＣＸＣＬ１３の６回の腫瘍内（１日おきに１回）注入を受けた（図３Ａ）。腫瘍サイズをデジタルノギスを使用して監視した。動物を、それらがサイズが１５０ｍｍ2以上の腫瘍と定義したエンドポイントに達した時、安楽死させた。ＶＳＶ−ＧＦＰ処置は、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）処置動物と比較して、腫瘍増殖の速度を減少させた（図３Ｂ、Ｃ）。ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３処置は、ＶＳＶ−ＧＦＰ処置よりもさらに効果的であり、腫瘍増殖および生存における統計的有意（ｐ＜０．０００１）差をもたらした（図３Ｄ、Ｅ）。一部の場合では、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３処置動物は、完全な、耐久性のある腫瘍退縮を有した（図Ｄ、Ｅ）。データは、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３が親（ＶＳＶ−ＧＦＰ）処置よりも治療的に優れていることを示している。データは、３つの独立的な実験の組合せを表している。
【００６８】
ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０の治療有効性を決定するために、乳房がんのＮＯＰ２３マウスモデル（２２）を使用した。ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１３に関して、１ｅ６  ＮＯＰ２３乳房腫瘍細胞を１００ｕｌ  ＰＢＳの体積で乳房脂肪パッドに移植した。およそ３週間後、腫瘍が約３０〜５０ｍｍ2のサイズに達した時、動物は、ＰＢＳ、５ｅ８  ｐｆｕのＶＳＶｄ５１−ＧＦＰまたはＶＳＶ−ｄ５１−ＣＸＣＬ１０の６回の腫瘍内（１日おきに１回）注入を受けた（図４Ａ）。腫瘍サイズをデジタルノギスを使用して監視した。動物を、それらがサイズが１５０ｍｍ2以上の腫瘍と定義したエンドポイントに達した時、安楽死させた。ＶＳＶ−ＧＦＰ処置は、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）処置動物と比較して、腫瘍増殖の速度を減少させた（図４Ｂ、Ｃ）。ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０処置は、ＶＳＶ−ＧＦＰ処置よりもさらに効果的であり、腫瘍増殖および生存における統計的有意（ｐ＝０．００７３）差をもたらした（図４Ｄ、Ｅ）。一部の場合では、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０処置動物は、完全な、耐久性のある腫瘍退縮を有した（図４Ｄ、Ｅ）。データは、ＶＳＶ−ＣＸＣＬ１０が親（ＶＳＶ−ＧＦＰ）処置よりも治療的に優れていることを示している。データは、親（ＶＳＶ−ＧＦＰ）ウイルスがＣＸＣＬ１０発現を誘発するけれども、ＣＸＣＬ１０導入遺伝子でこの発現をさらに増加させることは、治療的利点を有し得ることも示唆している。データは、２つの独立的な実験の組合せを表している。
参考文献
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６９】
本発明を１つまたは複数の実施形態に関して記載した。しかしながら、多くの変形形態および変更形態が特許請求の範囲において定義された本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることが当業者には明らかになると予想される。
2018519805.tif 000004
2018519805.tif 000005
2018519805.tif 000006
【図１Ａ】
2018519805.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ−１】
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【図５Ｉ−２】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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