(57)【要約】２つの対立する大きな壁；大きな壁に取り付けられ、それにより、底を有する反応チャンバの輪郭を示す小さな壁システム、ここで、大きな壁と小さな壁は熱伝導性材料で形成されており；反応容器中に液体を導入可能にする注入ポート；注入ポートを密封するキャップ；および、容器の反応チャンバの底の光透過性ウィンドウを含み、１００マイクロリットルより大きな容量を有する核酸増幅（ＮＡＡ）反応容器。容器を用いるプロセスと装置も記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの対立する大きな壁、
前記大きな壁に取り付けられ、それにより、底を有する反応チャンバの輪郭を示す小さな壁システム、ここで、前記大きな壁と前記小さな壁は熱伝導性材料で形成されており、
反応容器中に液体を導入可能にする注入ポート、
前記注入ポートを密封するように設定されたキャップ、および、
前記容器の反応チャンバの底の光透過性ウィンドウ
を含み、
１００〜１０００マイクロリットルの容量を有する。
核酸増幅（ＮＡＡ）反応容器。
【請求項２】
２００〜６００マイクロリットルの容量を有する
請求項１に記載の容器。
【請求項３】
前記反応チャンバの底が前記容器の本体の残りの部分よりも狭い
請求項１もしくは２に記載の容器。
【請求項４】
前記容器の形状は側面図では、ひし形もしくは正方形、または、前記底に先端を有する開封された封筒のような形状、あるいは、盾のような形状である
請求項３に記載の容器。
【請求項５】
前記ウィンドウを含む平らな底を有する盾形の形状である
請求項４に記載の容器。
【請求項６】
第２の注入ポートおよび前記第２の注入ポート用のキャップを有する
請求項１〜５のいずれか１項に記載の容器。
【請求項７】
前記複数のキャップが互いに識別可能である
請求項６に記載の容器。
【請求項８】
前記注入ポートもしくは個々の注入ポートが前記容器の前記底に向かう導水管を含む
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項９】
前記キャップもしくは個々のキャップが前記反応チャンバを貫通し、底で終了する
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１０】
前記キャップもしくは個々のキャップがハンドルを有する
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１１】
前記大きな壁と前記小さな壁を１つのステージでまとめて成形することにより、形作られる
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１２】
前記小さな壁が下向きに先細りになっている
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１３】
前記先細りは全体で４度である
請求項１２に記載の容器。
【請求項１４】
前記小さな壁に、穴を開けたステーションを有する
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１５】
複数の前記大きな壁の間の前記容器の内部の幅が、２．５〜４ｍｍである
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１６】
前記大きな壁は０．２〜０．６ｍｍの厚さである
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１７】
前記大きな壁は０．４〜０．６ｍｍの厚さである
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１８】
前記容器の全体の大きさは、深さが２０ｍｍ〜２５ｍｍで、幅が２０ｍｍ〜２５ｍｍである
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１９】
前記大きな壁が、炭素を重量の５０〜６５％含むポリプロピレンを含む
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項２０】
内容積が６００マイクロリットルである
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器。
【請求項２１】
前述の請求項のいずれか１項に記載の容器を生成する方法であって、
透明プラスチック光学ウィンドウを射出成形し、その後で前記ウィンドウの上の前記反応容器の本体の成形が行われる２パートプロセスを含み、
前記キャップ、および、漏斗状部材を別々に成形し、
前記容器本体は炭素を担持したポリプロピレンで形成される
方法。
【請求項２２】
前述の請求項のいずれか１項に記載の反応容器を取り外し可能に受け入れるように構成された、核酸増幅反応および検出装置であって、前記装置は、
少なくとも１つの反応容器受け入れステーション、
ステーションごとの２つのヒーター保護板であって、容器の両方の側面に存在し、容器の大きな壁に接触しているヒーター保護板、
前記ヒーター保護板の前記反応容器から遠いほうの面で個々のヒーター保護板に設置された、稼動面を有するペルチェセルであって、前記ペルチェセルは底面も有し、
個々のペルチェセルの前記底面に接している温度基準モジュール
を備える。
【請求項２３】
前記反応容器を前記装置中の反応容器ステーション中に留めるために配置された保持器を含み、このため、容器の外壁とヒーター保護板が近接した状態に保たれる
請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
個々のステーションに関連付けられた温度センサを有する
請求項２２もしくは２３に記載の装置。
【請求項２５】
温度センサは個々の保護板に取り付けられている
請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記保護板は、前記ペルチェセルを置くために設定された縁を伴って形成される
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
熱界面ペーストが前記ペルチェセルを前記保護板に取り付ける
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
前記保護板は、前記反応チャンバの天井および前記ウィンドウを除いて、前記反応チャンバが前記保護板に完全に囲まれるように、前記反応容器を置くために設定された縁を伴って形成される
請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
縦方向のクランプ手段によって結びついており、
前記クランプ手段は、ペルチェセルの膨張および収縮に適応するための弾性部材を含む
請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３０】
前記キャップおよび前記容器を所定の場所にとどめるために、取り外し可能なように前記容器のキャップを保持するように配置された保持器を有する
請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３１】
反応容器の内容物を前記容器のウィンドウを通して励起し、前記容器の内容物からの発光を受光するように配置された光学アレイを有する
請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３２】
前記光学アレイが、２コアガラスファイバ、励起光源、および、分光光度計を含む
請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
個々のうちの少なくとも１つのステーションに、反応容器への光および反応容器からの光を選択的に遮るために配置されたシャッターを有する
請求項３１もしくは３２記載の装置。
【請求項３４】
前記ペルチェセルが
正方形であり、
反応容器に隣接するか重なるように配置される
請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３５】
前記温度基準ユニットは、一定温度を保つのに適している
請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３６】
前記温度基準ユニットは、液体がポンプでくみ上げられて通り得る液体流ダクトを伴うように構成される
請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３７】
前記ダクトは、曲がりくねったシステム、入り組んだシステム、もしくは、シケインシステムの少なくとも１つを含む
請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
ポンプ、および、前記液体が一定温度を保つことを確実にするように設置された熱交換器を含む
請求項３６もしくは３７に記載の装置。
【請求項３９】
複数の反応容器ステーションを有する
請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４０】
個々のステーションは、個別のランダムな制御のために設計されている
請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の装置を用いた、核酸の増幅および検出のためのプロセスであって、
指の刺し傷からの血液、もしくは、唾液、または、口腔スワブなどのぬぐい液などの試料を取得するステップ、
前記試料を前記反応容器に入れ、大量の凍結可能な液体を加えるステップ、
細胞を溶解するために、循環的に、前記容器の内容物を凍結（最初）し、その後、解凍するステップ、
その後、ＮＡＡ試薬、および、蛍光ラベルプローブを前記容器に添加するステップ、
前記反応容器の内容物にＮＡＡを行うステップ、
ＰＣＲの間、前記反応容器の内容物を光学的に調べるステップ
を含むプロセス。
【請求項４２】
冷凍温度／解凍温度は、それぞれ、−５℃未満、および、少なくとも２０℃である
請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
解凍ステップの後に、少なくとも７０℃まで加熱するステップを含む
請求項４１もしくは４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
ＮＡＡ試薬の添加の前に逆転写が行われ、従って、ＲＮＡがＤＮＡに変換される
請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記ＮＡＡ試薬は、逆転写酵素を含む
請求項４１〜４４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記ＮＡＡ試薬は、前記容器中の液体に接触すると活性化される凍結乾燥された試薬を含む
請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記容器の内容物に電気泳動を行うステップをさらに含む
請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４８】
請求項４０に記載のプロセスであって、
１．第１のキャップを開けて、ウイルス性の病原体を含むだろうと疑われている１５μｌの全血を、反応容器に挿入する
２．１５μｌの抽出バッファを加えて第１のキャップを閉める
３．−１０℃〜＋２０℃で冷凍／解凍を８回繰り返す
４．１秒間、８０℃まで加熱
５．第２のキャップを開ける
６．４７０μｌの１ステップＲＴ−ＱＰＣＲ試薬を加え、第２のキャップを閉める
７．４５サイクルのＱＰＣＲを行い、増幅サイクルごとに１つのスペクトルを取る
８．交差閾値を決定し、その結果、対象が存在するかを決定するために、蛍光値に対するサイクル数のＱＰＣＲカーブをプロットする
処理を含むプロセス。
【請求項４９】
請求項４１に記載のプロセスであって、
【請求項５０】
使い捨て可能な反応容器をパッケージしたキットであって、前記キットは、
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の反応容器、
抽出バッファの管、
試薬を再懸濁するための水の管、
凍結乾燥された試薬の管
を含む。
【請求項５１】
採血用のＭｉｃｒｏｓａｆｅ（登録商標）製品も含む
請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
請求項１に記載され、添付の図面を参照しながら実質的に以上に記載された、ＮＡＡ反応容器。
【請求項５３】
請求項２２に記載され、添付の図面を参照しながら実質的に以上に記載された、核酸増幅反応および検出装置
【請求項５４】
請求項４１に記載され、添付の図面を参照しながら実質的に以上に記載された、核酸の増幅および検出のためのプロセス
【請求項５５】
請求項５０に記載され、添付の図面を参照しながら実質的に以上に記載された、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の核酸を増幅する装置およびプロセスに関する。特に、ヨーロッパ特許出願ＥＰ２５８５５８１に示したように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＱＰＣＲ、および、ＱＰＣＲを含む核酸増幅（Nucleic Acid Amplification、ＮＡＡ）に関連し、とりわけ、血液や唾液のような生物学的粗試料（crude biological samples）からの直接の増幅に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ２５８５５８１は、氷の結晶が細胞膜もしくはウイルスのカプシドを物理的に破壊し、その後、解凍が重度の浸透圧衝撃を誘導して細胞の内容物を放出するように、試料の凍結と解凍を複数サイクルにわたって行うことによる細胞破壊方法を記載している。好適な実施形態では、放出された核酸の直接検出が、１つの閉管中の凍結プロセス、解凍プロセス、リアルタイムＰＣＲプロセスなどの増幅と組み合わせて記載されている。その明細書の欠点は、増幅に基づく検出ステップに直接加えることが可能な試料の量である。疑わしい病原体の量が非常に少ない場合、ＰＣＲは検出手段として不正確になりうるし、また、少なくともある望ましい状態よりも時間がかかりうる。例は、細菌数が１ｍｌの血液あたり１０程度に少なくなりうる場合の細菌性敗血症の検出や、ＨＩＶ等のウイルスレベルが同様に低いウイルス性疾患の検出であり得る。さらに試料を追加するとプロセスの阻害物質の割合もさらに増加する（例えば、血中の鉄は、ＰＣＲの阻害物質である）ため、試料マトリクスはそれ自体で複雑である。このため、感度を向上するために最終的な血液の割合を増やすことができない。
【０００３】
既知のＮＡＡは通常は、マイクロタイター容積の反応容器（すなわち、およそ２０μｌ〜５０μｌであり、容器は外部の直径が４ｍｍ程度の反応チャンバを含む２ｃｍ未満の管である）を用いて行われる。
【０００４】
従って、上記の記載から理解されるように、感度が高く、さらに、ごく短時間で終了できる診断テストに対する要求がある。例えば、病気のアウトブレイクに際したフィールドでのスクリーニング（in-field screening）で多くの命を救うことができうる。唾液や尿などのさらにいくつかのマトリクスでは、粗試料が直接的に反応容器に加えられる場合、対象物の実際の量はこれまでに知られているアッセイの直接検出の検出下限未満であり得る。また一方、出血性疾患のようないくつかの血中の疾患は検出できるが、原因論的には非常に少量の力価（titre）でキャラクタリゼーションされる初期段階があることを意味し、さらに、迅速な検出が不可欠である。その上、病気の兆候および症状がないときのスクリーニング操作での病原体の検出は、病原体がまだ大量に複製されていないので、非常に望ましい。
【０００５】
このような状況でのＰＣＲの望ましい性能は、単純に反応容器の大きさを大きくすることであり得る。しかしながら、大きな容器を用いた場合、迅速で正確な一貫性のある入力や、試料の加熱や冷却（extraction of heat to and from a sample）を行うことは非常に困難である。さらに、病原体の核酸（ＲＮＡとＤＮＡのいずれも）の有力で迅速な検出は、迅速に熱循環すること、遷移時間を最小化すること、および、分析される試料の内容物での熱均一性を保証することを示唆する。
【０００６】
ヨーロッパ特許明細書２３０８９９５（Ｃｅｐｈｅｉｄ）は、１００マイクロリットル未満のチャンバを有する反応容器であって、２つの対立する大きな壁、反応チャンバを形成するように前記大きな壁に接合する複数の小さな壁、液体を前記チャンバに導入するためのポートを含み、前記小さな壁の２つは光学ウィンドウを提供するために光透過性であって、前記大きな壁の熱伝導と前記小さな壁の熱伝導の比が少なくとも２：１であるチャンバを説明している。いろいろな方法で、この容器は、十分に熱伝導性でもなく、商業的に入手可能な実施例では２５マイクロリットル未満に制限され、十分に大きな体積でもないので、本明細書に記載する手段を用いた迅速な核酸増幅と検出のための時には競合する要求の全てを満たすには理想的ではない。
【０００７】
ヨーロッパ特許明細書２３３３５２０（Ｃｅｐｈｅｉｄ）は、光学的に調査される化学反応アセンブリの熱交換であって、反応チャンバを有する容器（前記反応容器は２つの対立する大きな壁、および、複数の硬い小さな壁で定義される）、液体を前記チャンバ、および、前記ポートと前記チャンバを結ぶ導水管に導入するポート、ならびに、前記チャンバ内の圧力を増大させるために前記導水管に挿入可能なプラグを含み、前記アセンブリは少なくとも１つの伝熱面も含む熱交換を説明する。
【０００８】
文献Ｃｅｐｈｅｉｄに記載されている装置や容器は、起こりうる状況の全てにおいて、迅速な増幅と検出を実行するには不十分である。特に、血液、唾液、および、ぬぐい液などの粗試料から、直接、病原体を検出する重要なプロセスがある。このプロセスは、文献Ｃｅｐｈｅｉｄに記載されておらず、文献Ｃｅｐｈｅｉｄの記載や他の既知の装置では実行できない。
【発明の概要】
【０００９】
十分な試料容量に対する要求は、一方では、希釈の影響を受ける（例えば、濃度をモーラー単位からミリモーラーの範囲に減少させるために、最低でも１０倍希釈する必要がある）十分な試料容量であり、他方では、反応容器と循環装置に対するある極めて厳格な基準を課した迅速な冷凍と煮沸を行うための十分な速度である。発明者らは、実験的に、１０，０００のウイルスを検出するためには２０マイクロリットルの全血が必要であるが、１ｍｌの全血ごとに１００，０００ウイルス粒子のウイルス量を検出するために、少なくとも５マイクロリットルの全血試料が必要であることを発見した。ジカウイルス感染症の患者でのウイルス量は、１ｍｌ中に１００，０００超まで上昇するが、８日後には１０，０００未満にまで下がる。従って、この事例ウイルスの検出のために設計されるいずれのアッセイでも、このような低レベルでの検出が可能でなくてはならない。血液はＰＣＲの阻害物質である。修正されたＰＣＲ酵素（例えば、ＵＳ２０１３２５２３０）では最大割合は１２％程度まで高くしうるが、修正されていないＰＣＲ酵素では、認められうる血液の最大割合は２％程度である。５〜２０μｌの血液を２％〜１２％まで低濃度に希釈するためには、最終的な反応体積（reaction volume）が２５０μｌ〜７５０μｌの範囲に入らなければならないことは明らかである。結果として、熱循環される体積は、通常の５０μｌの反応の１５倍程度になる。
【００１０】
本発明は、複数の核酸種（ＲＮＡとＤＮＡのいずれも）を迅速に２００μｌの体積を超える試料（すなわち、慣例的に指から直接とった血液試料を含む）から検出可能なシステムを提供する。プロセスと装置は、迅速ＰＣＲの分野について過去に行った背景的な研究（ＥＰ２５８５５８１）の上に確立された。すなわち、１つの管内での直接冷凍／解凍抽出、および、結び付けられた増幅、ならびに、後のポイントオブケア（point of care）でのアッセイの実施のためのランダムアクセス機器である。
【００１１】
高い熱伝導率を有し、熱質量が削減され、表面領域への容積領域が最大化され、薄い外壁を有する、大きくて消費可能な反応容器が提供される。さらに、検出時間を最短化するように、熱除去モジュール（ＵＳ８５９７３９７）、および、一組のペルチェ素子に基づいた加熱／冷却配置が説明される。システムは、何回も繰り返される冷凍／解凍のサイクルに耐えられるように組み立てられる。容器は、最小限４０％の炭素をグラファイトおよび粉末、または、窒化ホウ素のような好適な充填剤の形状で担持したポリプロピレンを射出成形して形成され得る。好適な実施形態では、担持は６５％である。
【００１２】
増幅試薬を含む反応容器に直接、試料が添加されるプロセスか、または、後続する増幅試薬の添加の前に冷凍／解凍ステップが行われる２ステップのプロセスを試料が受けるプロセスが提供される。２ステップアプローチの利点は、例えば長い煮沸ステップなど、増幅試薬中の酵素を変性させ得る熱変化を適用できること、あるいは、細胞溶解を促進する化学物質（１ステッププロセスでは濃度が濃すぎるが２ステッププロセスでは試薬の添加によって希釈されるものなど）を使用できることである。例えば、血液のような粗試料を化学物質中に入れた場合、血液だけでは５０／５０の割合であり、増幅プロセスに不適合である。しかしながら、その後の増幅試薬の添加は、反応物中の濃度を適合するまで希釈するのに十分である。
【００１３】
本発明の第１の態様によると、核酸増幅（ＮＡＡ）反応容器は、
２つの対立する大きな壁、
前記大きな壁に取り付けられ、それにより、底を有する反応チャンバの輪郭を示す小さな壁システム、ここで、前記大きな壁と前記小さな壁は熱伝導性材料で形成されており、
前記反応容器中に液体を導入可能にする注入ポート、
前記注入ポートを密封するキャップ、および、
前記容器の反応チャンバの底の光透過性ウィンドウ
を含み、
前記容器は１００〜１０００マイクロリットル、好ましくは２００〜６００マイクロリットルの容量を有する。
【００１４】
本発明の第１の態様の特徴によると、前記容器は、以下の要素のどれでも有し得るし、以下の要素のいくつか又は全てを有しうる。
・その側面図中の形状は、前記反応チャンバが他の部分よりも若干狭く、実質的に尖っていても良い底を有する。従って、その形状は丸い形であっても良いし、また、縦の主軸を有する長円形により近くても良く、あるいは、ひし形もしくは四角であっても良い。また、前記反応チャンバの底もしくは保護物に先端を有する開封された封筒のような形状であっても良い。
・光透過性ウィンドウは、前記容器の底の前記小さな壁にある。
・第２の注入ポートがある。
・そのポートか各々のポートは、前記容器の底に集中する導水管（channel）を含む。
・小さな壁は上端から底まで下向きに先細りになっている。これは、全体で１〜４度のオーダーであってよく、前記大きな壁とヒーター素子の接触を保つことを支援するように配置される。
・好ましくは小さな壁の上部に、容器の内容物を簡単に電気泳動デバイスへと移し変えることができるようにするために設計された穴あけ可能なステーション（pierceable station）
・前記容器幅は、前記大きな壁の間が２〜３ｍｍで、好ましくは２．４ｍｍ。
・前記大きな壁は０．２〜０．６ｍｍの厚さで、好ましくは０．４ｍｍの厚さであり、このため、全体の幅が３．２ｍｍのオーダーである。
・前記容器の全体の大きさは、高さ４０ｍｍまでで、幅は３３ｍｍまでである。
・前記容器は消耗品である。
・キャップは反応チャンバを貫通し、従って、反応物を前記チャンバ内に確実に留めることと、結露の最小化を含めることを支援するために、前記チャンバに連続的で実質的に平面の天井を形成する。
・前記容器は２ショット成形プロセスで製造され得る。それにより、透明プラスチックウィンドウは成形された容器の残りを有し、透明ウィンドウはポリプロピレンであり、残余は高度に担持された熱伝導性化合物（例えば、２５〜７０％、好ましくは４０〜６５％の炭素が担持されたポリプロピレンなど）である。他の透明材料も使用され得るが、ポリプロピレンが特に他の容器材料と統合するのに適している。
【００１５】
三角形になっている（好ましくは）ことによってか、または、長円形もしくは円形であることによって効果的に先細りになっている反応チャンバを有する容器の有用性は、この容器が容量の多い試料だけでなく、非常に少量の試料（例えば、血液、唾液、もしくは、ぬぐい液）に使用できることである。従って、さらに重要なことには、２ステージプロセスに使用可能である。このことは、好ましい容器が各々ラベルづけされ得る２つの注入ポートを有する理由である。これは、２ステージプロセスにおいて、危険であり得る試料の漏出の防止を助ける。
【００１６】
幾分より正確な容器の大きさとしては
・長方形ひし形の場合、辺は２４ｍｍのオーダーである。
・長方形の場合、高さは２９ｍｍ〜４０ｍｍであり、幅は２４ｍｍ〜３３ｍｍである。
・例えば盾形のように三角形の底か半円の底を有する長方形の場合、高さは３５ｍｍのオーダーで、幅は３３ｍｍのオーダーで、底の突起は６ｍｍのオーダーである。
【００１７】
本発明の第２の態様の特徴によると、前記反応容器は
透明プラスチック光学ウィンドウの射出成形し、その後で反応容器本体のオーバーモールドが行われる２パートプロセスで構成され、
１つのスプルー上のキャップ、および、漏斗状部材（funnel member）を成形（molding）し、
前記容器本体は炭素を担持したポリプロピレンで形成される。
好ましくは、６５％の炭素が担持される。好適なグラファイト担持ポリプロピレンは、イタリアのＬＡＴＩ社から参照番号「ＬＡＴＩＣＯＮＴＨＥＲ  ５２／１１  ＧＲ／７０  ＮＡＴ  ８８２６Ｆ１」で供給されている。
【００１８】
本発明の第３の態様の特徴によると、本発明の第１の態様に従った反応容器を受け入れるように構成された核酸増幅反応装置が提供される。装置は、
少なくとも１つの反応容器受け入れステーション、
容器の両方の側面に存在し、容器の大きな壁に接触している２つのヒーター保護板、
前記ヒーター保護板の前記反応容器から遠いほうの面で個々のヒーター保護板に接している稼動面（working face）を有するペルチェセルであって、前記ペルチェセルは底面（base face）も有し、
個々のペルチェセルの前記底面に接している基準ユニット
を備える。
【００１９】
前記保護板の機能は、ペルチェセルを容器の出し入れから保護することだけでなく、ペルチェセルの位置を決めて搭載し、ペルチェセルを適切な位置にとどめることでもある。さらに、前記保護板は稼動面に収納部（recess）を保持しうるので、光学的アクセスを除いて、反応容器はほぼ完全に封入される。これは、前記容器（すなわち、大きな壁および小さな壁、実質的には光学アクセスが要求される（透明）部分を除いていたるところ）を同じ熱伝導性材料で製造することに伴っている。従って、前記保護板は両方の側面で奥まった位置に置かれている、すなわち、好ましくは、保護板は、ペルチェセルが置かれている縁壁（edge wall）を有する。
【００２０】
本発明の第３の態様の特徴によると、装置は、縦方向のクランプを有し得るし、ペルチェセルの膨張および収縮に適応するための弾性素材製のパッド（ゴム製のＯ−リングなど）も含み得る。装置はさらに、以下を含みうる。
・反応容器を装置中の反応容器ステーション中に留めるために配置された保持器。このため、容器の外壁とヒーター保護板が近接した状態に保たれる。保持器は、容器の複数のキャップを保持するために配置された高架型デバイスであっても良い。このため、これらも所定の場所に留まる。
・個々のステーションに関連付けられた温度センサもしくはサーミスタ。好ましくは、個々のヒーター保護板に取り付けられている。
・反応容器の内容物を容器の光透過領域を通して励起し、容器の内容物からの発光を受光するように配置された光学アレイ
【００２１】
装置が一揃いの反応ステーション（例えば４つ）を含む場合、分光光度計に他の空のステーションもしくは外部環境から外部光が入るのを防ぐために、ソレノイド稼動シャッターなどのデバイスが含まれ得る。先細りになっている容器を装置内の下方にとどめておくための高架型保持器も含まれていても良い。
【００２２】
基準温度ユニットは、熱伝導性で（好ましくは金属製、より適切には焼結金属製）ケースを含み得る。ケースは、ケースから液体を流すダクトを有する。ここで、ダクトは、流体ポンプも含む回路で、流体（通常は水）を一定温度で保つように整えられた熱交換器に接続され得る。試料の冷凍および解凍を含むプロセスに関連する装置中では、ＮＡＡを行う直前に、基準温度はペルチェのΔＴ（デルタＴ）が冷凍と煮沸の両方を含むことができるようになっている。典型的には、１８〜２６℃であり得る。ダクトは、熱伝道を最大化して温度制御手段の撹拌を保証するために、ユニット中の入口から出口まで実質的に同じ温度であるシケインシステム（chicane system）を含み得る。基準温度ユニットは、ペルチェセルの底面を安置するための隙間（crenellation）を含み得る。
【００２３】
本明細書の文脈では、ペルチェセルは通常はリバーシブルな直流で操作されるように設定されることが理解されるだろう。このため、稼動面はある例ではヒーターになり、ある例では冷却装置になる。ペルチェセルおよび反応容器の大きな壁は、実質的に隣接しうるが、熱の出入を確実にするために、好ましくは、ペルチェセルが容器の側面に重なり得る。ペルチェセルは、通常は正方形である。
【００２４】
好適な光学的配列は、２コア光学ファイバを用いた反射プローブ配列（reflectance probe arrangement）であり、一方のコアが、レーザーダイオードもしくはＬＥＤ、または、その他の高出力光源からの励起光を反応チャンバに送るために配置され、他方のコアが装置内に含まれ得る分光光度計に光を出力する。１つのステーションが使用されない場合に、１つのステーションと他のステーションの間の光学的干渉を最小化するために、容器とファイバの間にシャッターが含まれ得る。
【００２５】
複数のステーションを含む装置の好適な配置は、個々のステーションがランダムにアクセス可能なように配置される装置であるということが理解されるだろう。この場合、１つ以上の反応容器が空であっても他の容器もしくは環境光からの干渉がない状態で、任意の１つの反応容器が共通の分光光度計で撮像され得るように、ソレノイドスイッチが光学ファイバアレイ中に配置され得る。
【００２６】
本発明の第４の態様によると、核酸を増幅および検出するためにプロセスは以下を含む。
・例えば、指の刺し傷からの血液、もしくは、唾液、または、口腔スワブなどのぬぐい液などの試料を取得するステップ。
・前記試料を前記反応容器に入れ、大量の凍結可能な液体（水、あるいは、第４級アンモニウム塩を含む溶液、カオトロピック塩を含む溶液、界面活性剤を含む溶液、もしくは、酸／塩基を含む溶液など、細胞溶解の効率を増大させるために選択された液体）を加えるステップ。
・細胞を溶解するために、循環的に、容器の内容物を凍結（最初）し、その後、解凍するステップ。
・ＮＡＡ試薬、および、蛍光ラベルプローブを添加するステップ。
・反応容器の内容物にＮＡＡを行うステップ。
・ＰＣＲの間、反応容器の内容物を光学的に調べるステップ。
【００２７】
本発明の第４の態様の重要な特徴によると、以下の通りである。
・ＰＣＲステップの前に逆転写が随意に行われ、従って、ＲＮＡがＤＮＡに変換される。
・冷凍温度／解凍温度は、それぞれ、−５℃、および、２０℃のオーダーである。
・冷凍／解凍段階の後に、８８〜９８℃のオーダーの煮沸段階があり得る。随意に、この温度変化は、プライマー／プローブの融点の少し上であり得る。
・前記プローブは、フルオレセイン、ＨＥＸ、および、ＴＥＴなど、当業界で既知の染料で標識され得る
・ＮＡＡはＰＣＲもしくは等温の増幅方法であり、試薬は容器の液体に接触すると活性化される凍結乾燥試薬（lyophilized reagents）を含み得る。
【００２８】
本発明の好適な実施形態には、本プロセスを実行するために特に価値のある２つの特徴がある。１つは、容器の２つのポートのうちの１つから、他方のポートを閉じたままで、試料を容器に入れることである。この特徴は、２つ目のポートから試薬が加えられるときにコンタミネーションが起こる可能性を最小限にする。そこで、本プロセスは１つの容器内で、プロセス中の凍結／解凍パートの間に試薬が変性するリスクをとらずに、実行され得る。２つ目は、容器の内容物の電気泳動を行うことにより、多様な病原体を検出しうることである。この目的のために、容器中の内容物を電気泳動デバイスに移しやすくするために、穴を開けたステーション（pierce station）が容器情報の小さな壁に含められうる。
【００２９】
本発明の有用性の１つの典型的な例は、ヒトの全血からエボラウイルスを検出する場合にある。本発明にかかる装置を用いると、直接ＲＴＱＰＣＲを行うことができ、全血試料中の６フィロウイルス（ＺＥＢＯＶ）粒子まで少なくても検出できる。このことは、試料を提示した感染患者を、本アッセイによって、効果的にスクリーニングおよびトリアージすることができることを意味する。本発明のプロセスによって特定しうる他の病原体は、ラッサ熱ウイルス、マールブルクウイルス、ジカウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、リケッチア、ＨＩＶ、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ブルータングウイルス、および、ＰＰＲＶを含み、これらの全ては血液感染性である。
【００３０】
本発明の第５の態様によると、使い捨て可能な反応容器はキット中に梱包され得る。パッケージは、反応容器、抽出バッファの容器、試薬を再懸濁するための水、および、凍結乾燥された試薬の容器を含む。随意に、指を刺すためのデバイス（finger pricking device）、および、採血用のｍｉｃｒｏｓａｆｅデバイス（microsafe device）などの毛細管もあり得る。本発明にかかる装置は容易に、熱帯地方などの現場作業のために構成されうる。
【００３１】
本発明は全体として、かなり多量の利点を提供する。本明細書に記載した大きな反応容器は、血液がＰＣＲの阻害物でもあることを前提として、反応物中の血液濃度を最小化しつつ、合理的な量の血液試料の試験ができるようにする。さらに、本発明が提供する２ステッププロセス（凍結／解凍、その後のＰＣＲ）に使用されると、より大きな容器は、１番目のステップで追加の抽出バッファを高濃度で追加し、その後の追加的な２番目のステップでのＰＣＲ試薬で抽出バッファを希釈することができるようにする。
【００３２】
既知の装置では、６２．５μｌアッセイは、５μｌの全血部分を有するので、容量の８％である。原理上は、このアッセイは１ｍｌあたり１０４の対象物を検出可能であり、２倍の血液サンプルを使用すると感度も２倍になるはずである。しかしながら、これは、増幅と蛍光信号の両方に対する血液の阻害的影響を無視している。本発明にかかる装置とプロセスを用いると、同じ量の対象が添加されたより大量の反応物により、最終的な血液濃度が減少され、対象物の量が同じであっても実際には１０倍以上感度が良くなることを示すことができる。
【００３３】
従って、本発明の利点により、熱伝導率が高く、迅速な凍結／解凍を実行可能にする高いアスペクト比を有する容量の大きい反応容器が提供される。このため、従来のマイクロタイター管に比べて、より大きな容量の反応物が調製できるようになり、特に、同じ量の粗試料を反応物中の最終割合がより低くなるように希釈することができる。この希釈効果は、従来よりも広い範囲の種類の粗試料を使用可能にする。さらに、従来の１ステッププロセスは、下流プロセスに適合する試料を使用するという制約があった。例えば、測定可能な程度に細胞溶解を促進するのに十分な濃度で添加物が存在すると、添加物が反応を阻害しうるため、細胞溶解を促進するいずれの添加物（細胞溶解プロセスを促進するためのカオトロピック物質（chaotropes）など）も加えることができなかった。同様の例は、極度のｐＨ、または、極度の溶媒もしくは洗浄剤の添加であり得る。これらもまた、細胞溶解を促進するが、ＮＡＡ反応の効率を低下させるため、全体としては感度を下げる影響を有する。本発明にかかるより大きな容量の反応容器は、１つの容器中に収容されていながら２ステッププロセスを可能にする。従って、プロセスは、１番目のステップの反応物の上方に大きなスペースに起因して１番目のステップの反応物が２番目のステップに対応できる程度に希釈できるため、例えば、１番目のステップで非常に低いｐＨもしくは非常に高いｐＨにできるようにする。同様に、１番目のステップは、第２ステップに備えて最初から酵素が含められていた場合に、酵素を変性させ得る程度の大きな熱変化（thermal excursions）を含み得る。従って、２ステップ法は全体として、本発明のより大きな容量の容器中で実行され、実際に、従来の小容量法よりも感度を改善し、特に、直接検出法の利点を提供する。それにも関わらず、２ステップの間でＲＴ−ＱＰＣＲプロセスを分離できる可能性もある。例えば、凍結／解凍の後で、血液試料と共に存在する試薬で逆転写を実行し、その後、第２のより大容量のＰＣＲ試薬を添加する。これは、各プロセスのバッファを正しい酵素反応に最適化することができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
これから、本発明の実施形態を、以下の添付の図面を参照しながら実施例として説明する。
【図１】反応容器の正面からの立面図である。
【図２】図１の反応容器の側面からの立面図である。
【図３】図１の反応容器の等角図である。
【図４】図１の容器の部品の立体分解図である。
【図５】図１の容器の反応チャンバ部分の等角図である。
【図６】図１の容器の反応チャンバ部分の逆等角図（inverted isometric view）である。
【図７】図１の容器の漏斗状部分の等角図である。
【図８】図１の容器の漏斗状部分の逆等角図である。
【図９】図１の容器のキャップの等角図である。
【図１０】図１の容器用の反応装置の等角図である。
【図１１】図１０の反応装置の立体分解図である。
【図１２】保護プレートおよびペルチェセルを伴った図１の反応容器の組立分解等角図である。
【図１３】組み立てられている状態の図１２の要素の等角図である。
【図１４】反応装置の並びの外略図である。
【図１５】付帯設備を伴う完全な反応装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１〜図７は、本発明にかかる反応容器を図示する。反応容器は実質的に盾形をしているが平らな底を有する。容器は、反応チャンバ部分１００、フィラー漏斗レセプタクル（filler funnel receptacle）部分１０３、および、フィラー漏斗１０５を含む。反応チャンバ部分は、小さな壁１０８によって側面を囲まれ、透明ウィンドウ１０９で底を囲まれている２つの大きな壁１０７から構成される。フィラー漏斗１０５は２つの入口ポート１０５ａと１０５ｂを含み、両者は反応チャンバ１０９の底に集中される。レセプタクル部分１０３は、反応チャンバ部分１００にそろえて形成され、反応チャンバ部分１００の補強材として作られ、フィラー漏斗１０５を、へり１０３ａを介して密封可能に受ける。
【００３６】
小さな壁１０８の上の方に穴あけ可能なアクセスステーション（pierceable access station）１０８ａがある。穴あけ可能なアクセスステーション１０８ａは、皮下注射用デバイスで貫通することができ、反応チャンバの内容物を、回収して、電気泳動装置に移すことを可能にする。
【００３７】
２つのキャップ１１０ａと１１０ｂは密封部材１１１とハンドルタグ１１２を有する。密封部材１１０は漏斗１０５ａと１０５ｂ中にぴったりと押し込まれる形状である。漏斗１０５ａと１０５ｂは、取り付けられたときに反応チャンバ１０７に実質的につながった天井に形成するように、それらの底面で閉められる（図９に示す）。
【００３８】
キャップ（１１０ａ、１１０ｂ）のハンドルタグ１１２は、保護手袋をした人が操作するのに十分に大きく、反応チャンバ１０７の天井を形成する１つの平らな表面を提供するように、末端部分１１１はキャップの底で閉められる。この平らな部分は、結露の発生を防ぐように、加熱および冷却が行われる部分に位置する。オペレータが２ステップのプロセスの各々でどのキャップを空けないといけないかが分かるように、キャップが色分け、及び／または、ナンバリングされても良い。
【００３９】
容器の小さい壁（１０８）は、下向きの圧力がかかったときの熱循環装置への良好な熱的接触を確実にするために、４度の先細りになっている。大きな壁（１０７）の厚さは０．４ｍｍである。このことは、実現可能な最短時間で冷凍／煮沸できるように、迅速な熱伝達を確実にする。反応チャンバの大きさは、高さ２３ｍｍで幅２０ｍｍであり、内部の壁の間の距離は３．６ｍｍである。２枚の壁の厚みを考慮すると、容器の外側の厚みは４．４ｍｍとなる。反応チャンバ（１００）の内容積は６００μｌである。完成した容器は、反応容器チャンバ（１００）を取り込んで、レセプタクル部分１０３の内側に位置する保持構造（１０３ａ）によって、キャップホルダー挿入物（１０５）をカチッと音がするまではめこむことで、作られる。
【００４０】
反応容器１００は、２パートプロセス中の射出成形で作られる。キャップ（１１０）と挿入物（１０５）は１つのスプルー上にあり、容器自体（１００）は透明プラスチック光学ウィンドウ（１０９）を成形し、その後、反応容器の残りの部分をオーバーモールドすることで製造される。熱伝導を良くするために、カーボンブラックとグラファイトの混合物としての炭素を６５％担持したポリプロピレンで、容器が作られる。
【００４１】
反応容器は使い捨てできることが分かるだろう。換言すると、１回使用した後に反応容器を廃棄できることが意図されている。
【００４２】
図１０〜図１３は、反応容器の熱循環に使用される装置２００が説明されている。
【００４３】
装置は、土台２０１を有する台、２つの支持物２０２、および、光学ユニットアクセス孔２０３を含む。個々の支持物２０２には、クランプホルダー孔２０４がある。支持物２０２の間の間隔は２つの保護板２０５を受けるのに適している。保護板２０５は、反応容器の反応チャンバ１００をぴったりと取り囲むために適している複数のフランジ壁２０５ａとフランジ壁２０５ａの反対側に突き出たフランジ壁２０５ｂも伴うように形成される。フランジ壁２０５ｂは、反応容器の両側に、恒久的又は取り外し可能なように、ペルチェセル２０７が取り付けられるステーションを形成する。個々のペルチェセル２０７は反応容器に結合されることになる稼動面２０７ａと、稼動面２０７ａから離れた底面２０７ｂを有する。個々の底面２０７ｂには熱基準ユニット２１０が結合される。熱基準ユニット２１０は、入口ポート２１０ａと出口ポート２１０ｂを有し、これらの間は、曲がりくねっているかシケイン状になっている液体ダクトである。熱基準ユニット２１０は、ペルチェセル２０７の底面２０７ｂを安置するための隙間２１０ｃも有する。熱伝導を確実に良くするために、熱ペースト（thermal paste）がペルチェセル２０７の両面に塗布される。保護板２０５中には温度センサ２０８がある。
【００４４】
装置は、ペルチェセルの稼動面２０７ａを反応容器に保護板２０５を介して接するようにするとともに、熱基準ユニット２１０をペルチェセルの底面２０７ｂに接するようにする固定具を有する。固定具は、熱基準ユニット２１０と支持物２０２のホルダー孔２０４を貫通する４つのボルト２１２を有する。熱基準ユニット２１０中の２つの孔にはネジ山が施されている。ボルト２１２に搭載可能な、ばね２１４は、熱基準ユニット２１０のペルチェセル２０７、保護板２０５、および、反応容器１００の各々にかける圧力を保つ。固定具は、ペルチェセル２０７が加熱や冷却の間に膨張および収縮できるような程度の自由度を許容する。このため、ペルチェセルが壊れない。
【００４５】
光学ユニットアクセス孔２０３は、ウィンドウ１０９を介して反応チャンバ１００中の反応の進行を読取るためのデュアルコア光学ガラスファイバ２２０を備え付けられる。一方のコアは、赤色６３５ｎｍレーザーダイオード２２１による励起を提供する。他方のコアは、容器から発光した蛍光を集め、それを６５０ｎｍ〜８００ｎｍのスペクトル範囲の全ての信号を集める分光光度計２２２に供給する。選択された反応容器だけからの光が分光光度計２２２に届くことを確実にするために、ソレノイド駆動シャッター２２３が提供される。
【００４６】
図１２および図１３は、ペルチェセル２０７が反応容器よりも少し大きく、容器の全体が過熱及び冷却される領域になるように、ヒーター保護板２０５が容器の側面にかかっていることを示す。
【００４７】
図１４に図示された４ステーション反応装置には、反応容器を装置中に留めて、反応容器の保持と操作中の装置内での熱接触を確実にするために設計された高架型保持器２３０がある。
【００４８】
図１５は、組み立てられた熱循環装置を図示する。
【００４９】
ポンプ２４１を介して一定の温度の液体（水）を供給するために、温度基準ユニットは熱交換ユニット２４０に接続されている。従って、ある方向の電流がペルチェセル２０７に供給されると、ペルチェセル２０７の稼動面２０７ａが冷えて、その結果、保護板２０５及び反応チャンバは冷却される。逆向きの電流がペルチェセル２０７に供給されると、稼動面２０７ａが加熱され、その結果、保護板２０５及び反応チャンバは加熱される。
【００５０】
反応容器１００および装置２００を用いるプロセスでは、粗血液試料が注入ポート１０５ａ、１０５ｂのうちの１つを介して反応チャンバに加えられ、抽出バッファ、または、別の方法では逆転写試薬も加えられる。反応容器は、その後、装置２００に設置される。試料は、試料中に含まれる全てのウイルス粒子を溶解するために、冷凍と解凍を複数サイクル受けなければならない。冷凍ステップの好ましい温度は、−５〜−２０℃であり、解凍は２０℃で行われる。環境の状態に関わらず、ペルチェセル２０７のデルタＴによって、反応容器の内容物を−２０℃にすることができるように、温度基準ユニット２１０の使用により、一定温度（好ましくは２０℃）が保たれる。温度基準ユニット２１０は、温度が制御された流体が通る流体管路を含む。この流体導水管は、流体が接している時間が最大化されるように曲がりくねった形であっても良い。
【００５１】
記載された容器は、核酸種を粗試料から直接検出するプロセスに使用される。関係のある例は、エピデミックが発生した状況での、指の刺し傷から採ったヒトの全血からのウイルスのＲＮＡの直接検出である。プロセスは、反応容器に直接的に粗試料を直接添加すること（例えば、ＭｉｃｒｏＳａｆｅ（登録商標）デバイス（MicroTec Ltd）、もしくは、綿棒、又は、他の容器を介して）と、その後、ウイルス粒子もしくは病原体を溶解するために粗試料に冷凍／解凍の循環プロセスを行うことを含む（ＥＰ２５８５５８１）。粗試料は予め分注された容量の抽出プロセスの効率を改善する媒体（強酸／強塩基、もしくは、文献で知られているようにカオトロピック塩）に加えられうる。この１番目のステップは、増幅試薬（ＥＰ２５８５５８１のケースではＰＣＲプロセス試薬）の存在下で直接冷凍／解凍が行われるＥＰ２５８５５８１の教示に対するオプションとできる。代替として、試薬が溶解ステップに存在していない場合、ＰＣＲを阻害しうる濃度の抽出試薬の使用、もしくは、増幅プロセスに重要な酵素が変性しうる温度変化（例えば沸点を保持する）を行うことが可能になる。
【００５２】
１ステッププロセスでは、凍結乾燥ＰＲＣ試薬が先に再懸濁されている反応容器に、直接、血液試料（例えば２０μｌ）が加えられる。エボラ熱のようなウイルス感染症では、力価で１マイクロリットルあたり１００のウイルス超であるが、ＨＩＶのような他の血液感染する病気では、力価は１マイクロリットルあたり１ウイルスまで低くなる。このため、本発明の利点は、３３マイクロリットルまで加えても血液の濃度を、８％未満（ｏｍｎｉｔａｑ  ＵＳ４６２４７５のように、あつらえて設計されたポリメラーゼを用いてＰＣＲがまだ起こる上限値である）に抑えることができることである。エボラ熱を例とすると、−１０℃から２０℃の８サイクルは、１００％の溶解が得られるのに十分であった。これは最も重要であるが、このことは、３０分未満で完全プロセスによる同定が行われることを意味する。
【００５３】
２ステッププロセスでは、第１のキャップが開けられて規定の容量の抽出バッファが加えられる。バッファは、水での凍結による溶解もしくは血液単体での凍結による溶解よりも、溶解の効率を改善するために選択されたものであっても良い。バッファの量は粗試料の２倍のオーダーであり得る。抽出バッファの例は最終濃度が２モーラーの塩化グアニジウムであり得る。他の例は、トリトンＸ−１００（登録商標）などの、高分子量の洗剤（high molarity detergents）であり得る。５〜３０μｌの全血の粗試料が、ｍｉｃｒｏｓａｆｅデバイスを用いて、患者の刺し傷から採取される。反応容器のキャップは置き換えられ、容器は装置に設置される。装置は３〜８サイクルの凍結と解凍を行い、その後、細胞壁マトリックスの処理のように難しい対象物の場合には、随意に、短い煮沸ステップを行う。これは、ウイルス、細菌、および、菌類を含む広範囲の有機体や種から、核酸を放出し、増幅可能にするのに十分である。試料が反応チャンバ中にあっても、第２のキャップが除去されて凍結乾燥されたＰＣＲ試薬の再懸濁された混合物が反応容器に添加される。典型的な試薬は、１ステップＲＴ−ＱＰＣＲに最適化されたバッファシステム中のＴａｑポリメラーゼおよびＭＭＵＬＶである。キャップが元に戻され、装置の蓋が再度下げられ、５〜１０分おくことで、対象ＲＮＡの逆転写が引き起こされる。しかし、対象がＤＮＡの場合、システムは、４０〜４５サイクルのリアルタイムＰＣＲプロセスに直接遷移する。反応容器の内容物は、底部分のウィンドウに向けられた２コア光ファイバを介し、レーザダイオードベースの励起を用いて光学的に調査される。信号の集光の後、分光光度計によって検出が達成される。分光光度計は、１回の読み取りでの複数の波長／対象物からの信号を照合し、最初の血液試料中に潜在的な病原体が存在したか、および、いずれの潜在的な病原体が存在したかを決定するために、得られたスペクトルの色の解析（dye deconvolution）が用いられる。
【００５４】
プロセスの例の簡単な説明は以下である。
１．第１のキャップを開けて、ウイルス性の病原体を含むだろうと疑われている１５μｌの全血を、反応容器に挿入する
２．１５μｌの抽出バッファを加えて第１のキャップを閉める
３．冷凍／解凍を８回繰り返す。−１０℃〜＋２０℃
４．１秒間、８０℃まで加熱
５．第２のキャップを開ける
６．４７０μｌの１ステップＲＴ−ＱＰＣＲ試薬を加え、第２のキャップを閉める
７．４５サイクルのＱＰＣＲを行う。増幅サイクルごとに１つのスペクトルを取る
８．交差閾値（crossing threshold）を決定し、その結果、対象が存在するかを決定するために、蛍光値に対するサイクル数のＱＰＣＲカーブをプロットする
９．ユーザに、ウイルス性の対象が存在したかを報告する。
【００５５】
代替のプロセスは、１ステップアプローチとは対照的に、２ステップＲＴ−ＱＰＣＲの性能を含む。２ステップ反応を実行するバッファシステムを最適化するために、第２のステップでマンガン触媒酵素を用いることができる。この実施形態では、ＭＭＵＬＶ酵素もしくはＡＭＶ酵素を含み得る逆転写試薬が冷凍／解凍段階に実在する。このアプローチの利点は、１ステップアプローチで必然的に妥協が生じるのとは対照的に、個々の酵素について、最高の反応効率を確実にするために、２つのバッファリングシステムを最適化できることである。ある実施形態の実施例は、マンガンイオンをキレートするために、第１のバッファもしくは第２のバッファにＥＧＴＡを添加すること、または、マンガンイオンをキレートするためにＥＤＴＡ添加することである。大容量の第２のＰＣＲＴ反応物の希釈効果と組み合わせると、効果的な逆転写バッファを第２のステップのＱＰＣＲに適したものに変換することができる。
【００５６】
このプロセスの例の簡単な説明は以下である。
１．第１のキャップを開けて、ウイルス性の病原体を含むだろうと疑われている１５μｌの全血を、反応容器に挿入する
２．８５μｌの逆転写試薬を加えて第１のキャップを閉める
３．冷凍／解凍を８回繰り返す。−１０℃〜＋２０℃
４．随意に、１秒間、７０℃まで加熱
５．第２のキャップを開ける
６．４００μｌのＱＰＣＲ試薬を加え、第２のキャップを閉める
７．４５サイクルのＱＰＣＲを行う。増幅サイクルごとに１つのスペクトルを取る
８．交差閾値（crossing threshold）を決定し、その結果、対象が存在するかを決定するために、蛍光値に対するサイクル数のＱＰＣＲカーブをプロットする
９．ユーザに、ウイルス性の対象が存在したかを報告する。
【００５７】
更なる病原体の同定を行うために、電気泳動を行うことが決定された場合、反応容器はＮＡＡ装置から除去され、反応容器から流れる液体が穴あけ可能な構造１０８ａを介して電気泳動装置に入るように、電気泳動装置に提供される。代替として、液体移行は皮下注射的に（hyperdermically）達成されても良い。
【００５８】
電気泳動が行われるか否かに関わらず、反応容器は使い捨て可能であり、プロセスが終了すると、すぐにキャップを介して回収され、衛生的に廃棄される。
【００５９】
記載された盾形のＮＡＡ反応容器は、小さな体積に濃縮されているプロセスの第１の段階、および、大きな体積のその後の段階を可能にし、その上、２つの手動で操作できる注入ポートのためのスペースも提供するので、非常に好都合である。さらに、先細りの形状を含めたことは、単純で量の欠落（quantity of discontinuities）を最小化する。しかしながら、反応容器の他の形状も可能である。１つは上部の長方形部分と表方形部分から決まる二等辺三角形（三角形の２つの辺の間の角度が実質的に９０度）を含む。三角形の部分は、ペルチェセルの対角線が三角形の斜辺と実質的に隣接する場合に、三角形部分が四角形のペルチェセルの２つの面で実質的に隣接するように形成される。ひし形もしくはダイヤモンド型も可能である。容器の挟みつけ手段と保持手段は、例えば、処理時間を短くし、反応容器ごとに１つが個別の位置にランダムにアクセスできるように、レバーを介してなど、すばやく開けられるように設計されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月29日(2018.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの対立する大きな壁、
前記大きな壁に取り付けられ、それにより、底を有する反応チャンバの輪郭を示す小さな壁システム、ここで、前記大きな壁と前記小さな壁は熱伝導性材料で形成されており、
反応容器中に液体を導入可能にする注入ポート、
前記注入ポートを密封するように設定されたキャップ、および、
前記容器の反応チャンバの底の光透過性ウィンドウ
を含み、
１００〜１０００マイクロリットルの容量を有する
核酸増幅（ＮＡＡ）反応容器。
【請求項２】
２００〜６００マイクロリットルの容量を有する
請求項１に記載の容器。
【請求項３】
前記反応チャンバの底が前記容器の本体の残りの部分よりも狭い
請求項１もしくは２に記載の容器。
【請求項４】
前記容器の形状は側面図では、ひし形もしくは正方形、または、前記底に先端を有する開封された封筒のような形状、あるいは、盾のような形状である
請求項３に記載の容器。
【請求項５】
前記ウィンドウを含む平らな底を有する盾形の形状である
請求項４に記載の容器。
【請求項６】
第２の注入ポートおよび前記第２の注入ポート用のキャップを有する
請求項１、２、３、４、および、５のいずれか１項に記載の容器。
【請求項７】
前記複数のキャップが互いに識別可能である
請求項６に記載の容器。
【請求項８】
前記注入ポートもしくは個々の注入ポートが前記容器の前記底に向かう導水管を含む
請求項１、２、３、４、５、６、および、７のいずれか１項に記載の容器。
【請求項９】
前記キャップもしくは個々のキャップが前記反応チャンバを貫通し、底で終了する
請求項１、２、３、４、５、６、７、および、８のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１０】
前記キャップもしくは個々のキャップがハンドルを有する
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、および、９のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１１】
前記大きな壁と前記小さな壁を１つのステージでまとめて成形することにより、形作られる
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、および、１０のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１２】
前記小さな壁が下向きに先細りになっている
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および、１１のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１３】
前記先細りは全体で４度である
請求項１２に記載の容器。
【請求項１４】
前記小さな壁に、穴を開けたステーションを有する
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および、１３のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１５】
複数の前記大きな壁の間の前記容器の内部の幅が、２．５〜４ｍｍである
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および、１３のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１６】
前記大きな壁は０．２〜０．６ｍｍの厚さである
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および、１５のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１７】
前記大きな壁は０．４〜０．６ｍｍの厚さである
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および、１６のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１８】
前記容器の全体の大きさは、深さが２０ｍｍ〜２５ｍｍで、幅が２０ｍｍ〜２５ｍｍである
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および、１７のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１９】
前記大きな壁が、炭素を重量の５０〜６５％含むポリプロピレンを含む
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および、１８のいずれか１項に記載の容器。
【請求項２０】
内容積が６００マイクロリットルである
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、および、１９のいずれか１項に記載の容器。
【請求項２１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および、２０のいずれか１項に記載の容器を生成する方法であって、
透明プラスチック光学ウィンドウを射出成形し、その後で前記ウィンドウの上の前記反応容器の本体の成形が行われる２パートプロセスを含み、
前記キャップ、および、漏斗状部材を別々に成形し、
前記容器本体は炭素を担持したポリプロピレンで形成される
方法。
【請求項２２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および、２０のいずれか１項に記載の反応容器を取り外し可能に受け入れるように構成された、核酸増幅反応および検出装置であって、前記装置は、
少なくとも１つの反応容器受け入れステーション、
ステーションごとの２つのヒーター保護板であって、容器の両方の側面に存在し、容器の大きな壁に接触しているヒーター保護板、
前記ヒーター保護板の前記反応容器から遠いほうの面で個々のヒーター保護板に設置された、稼動面を有するペルチェセルであって、前記ペルチェセルは底面も有し、
個々のペルチェセルの前記底面に接している温度基準モジュール
を備える。
【請求項２３】
前記反応容器を前記装置中の反応容器ステーション中に留めるために配置された保持器を含み、このため、容器の外壁とヒーター保護板が近接した状態に保たれる
請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
個々のステーションに関連付けられた温度センサを有する
請求項２２もしくは２３に記載の装置。
【請求項２５】
温度センサは個々の保護板に取り付けられている
請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記保護板は、前記ペルチェセルを置くために設定された縁を伴って形成される
請求項２２、２３、２４、および、２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
熱界面ペーストが前記ペルチェセルを前記保護板に取り付ける
請求項２２、２３、２４、２５、および、２６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
前記保護板は、前記反応チャンバの天井および前記ウィンドウを除いて、前記反応チャンバが前記保護板に完全に囲まれるように、前記反応容器を置くために設定された縁を伴って形成される
請求項２２、２３、２４、２５、２６、および、２７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
縦方向のクランプ手段によって結びついており、
前記クランプ手段は、ペルチェセルの膨張および収縮に適応するための弾性部材を含む
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、および、２８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３０】
前記キャップおよび前記容器を所定の場所にとどめるために、取り外し可能なように前記容器のキャップを保持するように配置された保持器を有する
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および、２９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３１】
反応容器の内容物を前記容器のウィンドウを通して励起し、前記容器の内容物からの発光を受光するように配置された光学アレイを有する
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および、３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３２】
前記光学アレイが、２コアガラスファイバ、励起光源、および、分光光度計を含む
請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
個々のうちの少なくとも１つのステーションに、反応容器への光および反応容器からの光を選択的に遮るために配置されたシャッターを有する
請求項３０もしくは３１記載の装置。
【請求項３４】
前記ペルチェセルが
正方形であり、
反応容器に隣接するか重なるように配置される
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、および、３３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３５】
前記温度基準ユニットは、一定温度を保つのに適している
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および、３４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３６】
前記温度基準ユニットは、液体がポンプでくみ上げられて通り得る液体流ダクトを伴うように構成される
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および、３５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３７】
前記ダクトは、曲がりくねったシステム、入り組んだシステム、もしくは、シケインシステムの少なくとも１つを含む
請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
ポンプ、および、前記液体が一定温度を保つことを確実にするように設置された熱交換器を含む
請求項３６もしくは３７に記載の装置。
【請求項３９】
複数の反応容器ステーションを有する
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、および、３８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４０】
個々のステーションは、個別のランダムな制御のために設計されている
請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および、４０のいずれか１項に記載の装置を用いた、核酸の増幅および検出のためのプロセスであって、
指の刺し傷からの血液、もしくは、唾液、または、口腔スワブなどのぬぐい液などの試料を取得するステップ、
前記試料を前記反応容器に入れ、大量の凍結可能な液体を加えるステップ、
細胞を溶解するために、循環的に、前記容器の内容物を凍結（最初）し、その後、解凍するステップ、
その後、ＮＡＡ試薬、および、蛍光ラベルプローブを前記容器に添加するステップ、
前記反応容器の内容物にＮＡＡを行うステップ、
ＰＣＲの間、前記反応容器の内容物を光学的に調べるステップ
を含むプロセス。
【請求項４２】
冷凍温度／解凍温度は、それぞれ、−５℃未満、および、少なくとも２０℃である
請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
解凍ステップの後に、少なくとも７０℃まで加熱するステップを含む
請求項４１もしくは４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
ＮＡＡ試薬の添加の前に逆転写が行われ、従って、ＲＮＡがＤＮＡに変換される
請求項４１、４２、および、４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記ＮＡＡ試薬は、逆転写酵素を含む
請求項４１、もしくは、４２に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記ＮＡＡ試薬は、前記容器中の液体に接触すると活性化される凍結乾燥された試薬を含む
請求項４１、４２、４３、４４、および、４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記容器の内容物に電気泳動を行うステップをさらに含む
請求項４１、４２、４３、４４、４５、および、４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４８】
請求項４１に記載のプロセスであって、
１．第１のキャップを開けて、ウイルス性の病原体を含むだろうと疑われている１５μｌの全血を、反応容器に挿入する
２．１５μｌの抽出バッファを加えて第１のキャップを閉める
３．−１０℃〜＋２０℃で冷凍／解凍を８回繰り返す
４．１秒間、８０℃まで加熱
５．第２のキャップを開ける
６．４７０μｌの１ステップＲＴ−ＱＰＣＲ試薬を加え、第２のキャップを閉める
７．４５サイクルのＱＰＣＲを行い、増幅サイクルごとに１つのスペクトルを取る
８．交差閾値を決定し、その結果、対象が存在するかを決定するために、蛍光値に対するサイクル数のＱＰＣＲカーブをプロットする
処理を含むプロセス。
【請求項４９】
請求項４１に記載のプロセスであって、
１．第１のキャップを開けて、ウイルス性の病原体を含むだろうと疑われている１５μｌの全血を、反応容器に挿入する
２．８５μｌの逆転写試薬を加えて第１のキャップを閉める
３．−１０℃〜＋２０℃で冷凍／解凍を８回繰り返す
４．随意に、１秒間、７０℃まで加熱
５．第２のキャップを開ける
６．４００μｌのＱＰＣＲ試薬を加え、第２のキャップを閉める
７．４５サイクルのＱＰＣＲを行い、増幅サイクルごとに１つのスペクトルを取る
８．交差閾値を決定し、その結果、対象が存在するかを決定するために、蛍光値に対するサイクル数のＱＰＣＲカーブをプロットする
処理を含むプロセス。
【請求項５０】
使い捨て可能な反応容器をパッケージしたキットであって、前記キットは、
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および、２０のいずれか１項に記載の反応容器、
抽出バッファの管、
試薬を再懸濁するための水の管、
凍結乾燥された試薬の管
を含む。
【請求項５１】
採血用のＭｉｃｒｏｓａｆｅ（登録商標）製品も含む
請求項５０に記載のキット。
【国際調査報告】
2018533359.tif 000018
2018533359.tif 000019
2018533359.tif 000020
2018533359.tif 000021
2018533359.tif 000022
2018533359.tif 000023