(57)【要約】哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または哺乳動物の血管柄つき組織もしくはその血管柄つき部分の、膨張した脱細胞化細胞外マトリックスを提供するための方法、哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または哺乳動物の血管柄つき組織もしくはその血管柄つき部分の、膨張した脱細胞化細胞外マトリックス、およびその使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または血管柄つき哺乳動物組織もしくはその血管柄つき部分の、膨張した脱細胞化細胞外マトリックスであって、該脱細胞化細胞外マトリックスが血管樹、管、または腔を含み、ガス充填されこれを保持し、該臓器の該脱細胞化細胞外マトリックスが外表面を含み、かつ血管樹を含む該細胞外マトリックスが、脱細胞化の前の該細胞外マトリックスの形態を保持する、膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項２】
哺乳動物臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、骨格筋、小腸、大腸、胃、骨、脳、または肺である、請求項1記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項３】
血管柄つき部分が、哺乳動物の心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、骨格筋、小腸、大腸、胃、骨、脳、または肺の部分である、請求項1記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項４】
ガスが空気、酸素、または窒素を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項５】
ガスが蒸気である、請求項1記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項６】
ガスが薬物またはエアロゾル化薬物を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項７】
ガスが1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項８】
1つまたは複数のタンパク質がサイトカインまたは成長因子を含む、請求項7記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項９】
脱細胞化臓器または血管柄つき組織が、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、またはヒトの臓器または組織である、請求項1記載の膨張した脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項１０】
哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または哺乳動物の血管柄つき組織もしくはその血管柄つき部分の、脱細胞化細胞外マトリックスを膨張させる、エクスビボ方法であって、以下の段階を含む、方法：
哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または血管柄つき哺乳動物組織もしくはその血管柄つき部分の、脱細胞化細胞外マトリックスを提供する段階であって、該臓器の該細胞外マトリックスが無傷の外表面を含み、該臓器もしくはその一部分または組織もしくはその一部分の該細胞外マトリックスが血管樹を含み、該臓器の該脱細胞化細胞外マトリックスが、脱細胞化細胞外マトリックス血管樹に導入された液体またはガスの大部分を保持し、かつ該臓器または組織が実質的に閉鎖した脈管構造床を有する、段階；
1つまたは複数の血管、腔、および／または管において該臓器もしくはその一部分または該組織もしくはその一部分にカニューレを挿入し、それによってカニューレ装着された臓器もしくはその一部分またはカニューレ装着された組織もしくはその一部分を生成する段階；ならびに
膨張した細胞外マトリックスを提供するために、該カニューレ装着された臓器もしくはその一部分またはカニューレ装着された組織もしくはその一部分の該1つまたは複数の血管、腔、または管にガスを導入する段階。
【請求項１１】
ガスが空気、窒素、または酸素を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ガスが、VEGF、FGF-2、EGF、PDGF、IGF、もしくはHGFのうちの1つもしくは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物が、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、または齧歯類である、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
膨張した脱細胞化細胞外マトリックスを滅菌する段階をさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
細胞を、血管、管、または腔のうちの少なくとも1つに導入する段階をさらに含む、請求項10〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、骨格筋、小腸、大腸、胃、骨、脳、または肺である、請求項10〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜9のいずれか一項記載の細胞外マトリックスまたはその一部分を空隙または創傷に施す段階を含む、哺乳動物の体腔において空隙を増補するかまたは創傷を処置する方法。
【請求項１８】
施される前記一部分が粒状化または小分割化される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
施される細胞外マトリックスが凍結乾燥される、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
施すことが瘻孔に対するものである、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年3月26日に出願された米国特許出願第62/138,850号の出願日の恩典を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞外マトリックス (ECM) は、組織特異的構造を形成する構造タンパク質および機能タンパク質の複雑なネットワークである。ECMは、各組織および臓器中の常在細胞の分泌産物を含む。マトリックス分子には、構造タンパク質および機能タンパク質、糖タンパク質、ならびにグリコサミノグリカンが含まれる。ECMの常在細胞は、ECMを生成する以外に、そこからシグナルを受け取り、組織の発達および／または恒常性を可能にする。それらの特性は、組織工学および再生医療においてECMベースの材料を使用するための基礎である。ECMは、免疫原性の低い、細胞の生存および成長のための天然でかつ高度に保存された基質を提供するため、個々のECM成分を有するか、または脱細胞化組織全体のECMベースの基質は、前臨床設定および臨床設定の両方において広範囲の応用に用いられている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、哺乳動物の臓器もしくはその血管柄つき部分または血管柄つき哺乳動物組織もしくはその一部分の、ガス充填された（膨張した）脱細胞化細胞外マトリックスを提供する。1つの態様において、三次元の脱細胞化細胞外マトリックスは、元の臓器もしくはその一部分または組織もしくはその一部分の形状を保持する。1つの態様において、膨張後の細胞外マトリックスは、対応する膨張していない細胞外マトリックスのものと比較して、約0.2 cmから最大約0.6 cmまで、例えば約0.4 cmを含め約0.3 cm〜約0.5 cm高い、高さを有する。例えば、膨張後の大型哺乳動物の肝葉の細胞外マトリックスは、対応する膨張していない肝葉の細胞外マトリックスのものと比較して、約0.4 cmを含め約0.3 cm〜約0.5 cm高い、高さを有する。1つの態様において、膨張後の細胞外マトリックスは、対応する膨張していない細胞外マトリックスと比較して、少なくとも25%から最大1000%まで、例えば、少なくとも50%から最大約500%まで、または約75%から約250%まで上昇した、高さを有する。1つの態様において、臓器または組織の、ガス充填された脱細胞化細胞外マトリックスは、対応する天然の臓器または組織のものの、約25%〜125%、例えば約50%〜約150%または約75%〜約110%である、形状、サイズ、または体積を有する。臓器または組織の脱細胞化細胞外マトリックスへの、その天然の脈管構造または任意の他の導管、例えば管もしくは腔を介した、ガス、例えば蒸気（粒子または液滴を有するガス）の能動的導入は、その膨張していない形状と比較して拡大している、かついくつかの態様においては脱細胞化の前の天然の（細胞化）臓器または組織の元の形状を有する、臓器または組織の、ガス充填された脱細胞化細胞外マトリックスを提供する。ガスが組織または臓器内に捕捉され、もともと細胞によって占有されていた空間を満たす結果として、ガス充填された脱細胞化細胞外マトリックス、例えば空気が充填されたものの形状は保持される。1つの態様において、ガスは、密封せずに細胞外マトリックス内に保持される。産物は、これに限定されないが、手術用メッシュ、手術用充填剤、空隙充填剤、組織工学物等として移植に使用され得る三次元の脱細胞化細胞外マトリックスである。膨張は、細胞が占有していた区画を満たすことによってマトリックスを広げ、したがってマトリックスはより強固になるため、容易に切断されるようになる。同様に、ガスの導入によりマトリックスが広がることで、マトリックスは凍結された場合に、より容易に小分割化されるようになる。
【０００４】
1つの態様において、ガスは、通常の空気、CO2、アルゴン、窒素、もしくは酸素、またはそれらの任意の組み合わせを含む。1つの態様において、ガスは、エアロゾル化薬物、例えば、1つまたは複数のステロイド、抗生物質、または抗真菌剤を含む。1つの態様において、蒸気成分は、過酢酸もしくは過酸化水素などの殺菌剤、またはリン酸緩衝生理食塩水、ラクトース、グルコース、もしくはリポソーム担体などの担体、または1つもしくは複数の抗生物質、ステロイド、もしくは抗真菌剤を含むがこれらに限定されない様々な薬物もしくはタンパク質を有する噴霧器型蒸気、またはVEGF、FGF-2、EGF、PDGF、IGF、もしくはHGFなどのタンパク質、またはタンパク質、小分子、もしくは薬物を含む微粒子もしくはナノ粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
本特許または本出願書類は、カラーで作製された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公報のコピーは、請求および必要な費用の支払いに応じて、当局によって提供されるであろう。
【図１】膨張前の肝葉の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図２】膨張前の、カニューレ装着された肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図３】膨張時の、カニューレ装着された肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図４】図3の画像の後に撮影された、膨張時の、カニューレ装着された肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図５】図4の画像の後に撮影された、膨張時の、カニューレ装着された肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図６】図5の画像の後に撮影された、膨張時の、カニューレ装着された肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの画像。
【図７】膨張時の肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの側面画像。
【図８】膨張時の肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの側面画像。
【図９】膨張時の肝臓の脱細胞化細胞外マトリックスの側面画像。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
脱細胞化は、細胞外マトリックスを有する無細胞組織または臓器をもたらす。結果として生じた、もともと細胞によって占有されていた空間は、脱細胞化溶液または組織がその中に存在する何かそのような溶液によって占有される。細胞外マトリックスと比較して高い比率、例えば組織の型に応じて1:3〜1:20の比率の細胞を含む、肝臓、肺、筋肉、脾臓、および心臓などの組織および臓器では、かつて細胞を含んでいた区画が崩壊するために、臓器または組織の元の形状は縮小する。臓器または組織の元の形状は、加圧下でこれを灌流すれば維持され得るが、ひとたびそこから取り除くと、液体がゆっくりと排出されるにつれて臓器または組織は収縮する。臓器または組織の元の形状、サイズ、または体積を維持する三次元マトリックスを作るためには、ガス、または粒子もしくは液滴を含むガス（蒸気）を、脱細胞化臓器または組織の血管、管、または腔のうちの少なくとも1つに導入して空隙空間を満たすが、それによって、細胞が存在していた区画を崩壊させることなく、様々な用途のために切断、成形、および／またはモデル化され得る三次元マトリックスが生じる。
【０００７】
したがって、本発明は、1つの態様において、脱細胞化臓器または組織の血管網に能動的に到達する手段を提供する。これは、カニューレを挿入すること、ECMに直接注射すること、または容積式装置の使用、および任意で脱細胞化臓器もしくは組織に属する任意の大静脈もしくは大動脈を密封することによって達成され得る。いくつかの態様においては、他の脈管を遮断して、より閉鎖した脈管系を作ることもできる。1つの態様においては、ポンプ、シリンジ、加圧ガス、缶入りガス、および／または1つもしくは複数のタンパク質、小分子、薬物、もしくは他の薬剤を含むガスもしくは蒸気を含有するキャニスターを用いて、カニューレ装着した動脈または静脈血管に連結された管類、カニューレ、連結器、針、および／またはシリンジを介して脱細胞化臓器または組織に、例として例えば約10〜約10,000 mL／分のポンプ速度および約1〜約200 mm Hgの圧力で、例えば導入されたガスおよび／または蒸気の分布を引き起こすために組織の外側を真空に引くことを含め、ガスまたは蒸気を能動的に導入する。ガスまたは蒸気は、例えば、視覚的に判断して、または例として既定の体積もしくは容量形状まで、表面張力が増加するまで、および／もしくは背圧が増加するまで充填するなど物理学的測定により、所望の結果が達成されるまで、例えば2,000 mL／分といった所定の速度でポンプ注入する。膨張した臓器または組織中のガスまたは蒸気は、細胞区画中に捕捉され、そこに残存する。
【０００８】
ガスまたは蒸気が充填された脱細胞化臓器または組織マトリックスは、例えば、手術用充填剤、手術用メッシュ、瘻孔または他の空隙用の充填剤として有用な、および臓器または組織の脱細胞化ECMの粒状片または小分割片を調製するための、脱細胞化臓器もしくは組織全体または臓器もしくは組織の一部の使用を含む、様々な治療応用において用いることができる。小片は直径約0.5 mm〜約10 mmであり；顆粒は直径＜約0.5 mmである。小片の生成は、拡大したECMをすりつぶす段階、および次いで小片を一連の濾過器に通して、小片の所望のサイズ範囲を達成する段階を含み得る。顆粒の生成は、すりつぶした小片をより小さな小片に粉砕する段階、および次いでそれらを一連のさらにより細かい濾過器に通して、所望の粒子サイズ範囲を達成する段階を含み得る。あるいは、臓器または組織の脱細胞化ECMに、任意の種類の細胞または細胞の任意の組み合わせを播種することもできる。
【０００９】
1つの態様において、ガス充填された（拡大した）脱細胞化マトリックスは、形状保持手術用充填剤として使用される。1つの態様において、ガス充填された脱細胞化マトリックスは、瘻孔の処置における用途のために使用される。1つの態様においては、例えばマトリックスのタンパク質高次構造を定め、それによってその形状の保持を高めるために、ガス充填された脱細胞化マトリックスをeビーム滅菌に供する。1つの態様において、脱細胞化マトリックスを膨張させるために使用されるガスは、脱細胞化マトリックスを滅菌する。脱細胞化マトリックスの膨張により、マトリックスの所望の三次元部分を切断することが容易になり、創傷適用のために脱細胞化マトリックスを凍結乾燥および／または小分割化することが容易になる。1つの態様において、脱細胞化マトリックスは、蒸気を用いて膨張させるか、または粒子非含有、液滴非含有ガスによる最初の膨張後に、1つもしくは複数の薬物、例えば細胞と共に播種した場合にインビボでリモデリングを誘導するための、および／もしくは細胞の生着を高めるための、1つもしくは複数のサイトカインもしくは成長因子を有する蒸気に曝露する。1つの態様において、脱細胞化マトリックスは、1つもしくは複数の小分子またはタンパク質を含む蒸気を用いて膨張させるか、または粒子非含有、液滴非含有ガスによる最初の膨張後に、制御送達媒体、担体、もしくは装置としてゆっくりと放出されてインビボで作用するための1つもしくは複数の薬物を有する蒸気に曝露する。
【００１０】
図2〜6は、空気による脱細胞化肝臓の段階的な膨張を示す。図7〜9は、膨張した肝臓が、能動的圧力に依存せずにその形状を保持することを示す。膨張したマトリックスを分割する能力もまた、膨張した肝葉の横断切片によって実証される。
【００１１】
脱細胞化ECMのための臓器および組織の例示的な供給源
組織とは、共通の構造および機能を有する細胞の一群であり、例えば、上皮組織、結合組織、筋組織（骨格筋、心筋、または平滑筋）、および神経組織などがあり、組織には、臓器を被覆する、または裏打ちする、または結合する柔軟なシートが含まれる。臓器とは、連結して構造単位をなし、共通の機能を果たす、（2つ以上の）組織の集合体である。臓器には、脳、肝臓、膵臓、骨、脾臓、心臓、胃、腎臓、肺、全筋、胸腺、肛門、および腸が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる場合、臓器には、灌流可能な臓器全体、もしくは臓器の一部、またはそれらの血管柄付き構造が含まれ、組織には、血管柄付き組織を含む任意の構造体、例えば気管が含まれる。
【００１２】
1つの態様において、臓器もしくは組織またはそれらのECMの一部、例えば、心臓の心房もしくは心室、または島を含む膵臓の内部構造が、本発明の方法において用いられる。1つの態様において、その部分の厚さは約5〜約10 mmである。1つの態様において、その部分の厚さは約70〜約100 mmである。
【００１３】
臓器もしくは組織またはそれらの血管柄つき部分のECMは、非限定的に、心臓、肝臓、肺、骨格筋、脳、膵臓、脾臓、腎臓、子宮、眼、脊髄、腸、網、全筋、もしくは膀胱、またはそれらの任意の部分（例えば、大動脈弁、僧帽弁、肺動脈弁、三尖弁、肺静脈、肺動脈、冠血管系、中隔、右心房、左心房、右心室、もしくは左心室）を含む任意の供給源から得られ得る。固形臓器とは、「実質的に閉鎖した」脈管系を有する臓器を指す。臓器に関して「実質的に閉鎖した」脈管系とは、主要血管がカニューレ装着される、結紮される、または他の方法で拘束されると仮定した場合に、液体による灌流の際に、液体の大部分が固形臓器内に含まれているか、または天然の脈管構造を通過し、固形臓器から漏出しないことを意味する。「実質的に閉鎖した」脈管系を有するにもかかわらず、上記の臓器の多くは、灌流時に臓器全体に液体を導入し移動させるのに有用な、明確な「入口」および「出口」の血管を有する。加えて、例えば、関節（例えば、膝、肩、もしくは股関節）、肛門、気管、または脊髄のすべてまたは一部などの、その他の型の血管柄付き臓器または組織を、灌流により脱細胞化することもできる。さらに、脚全体などのより大きな血管柄付き構造の一部の場合には、例えば軟骨または角膜などの無血管組織を脱細胞化することもできる。
【００１４】
実質的に閉鎖した脈管系を有する臓器の灌流脱細胞化マトリックスは有用であり、その理由は、灌流脱細胞化により、無傷の脈管系および微小脈管系を含む無傷のマトリックスおよび微小環境が保たれ、このような脈管系、または管もしくは他の導管を利用して、細胞、ならびに栄養素および／または分化因子もしくは維持因子をインビトロで細胞に送達できるからである。細胞ならびに栄養素および／または他の因子は、他の手段、例えば注射もしくは受動的手段またはそれらの組み合わせにより送達することもできる。1つの態様においては、関心対象の細胞集団を、膨張後の、灌流により脱細胞化された臓器ECMに灌流させ、それによって脈管導管の外側の間質腔またはマトリックスへの播種を可能にする。このことは、細胞の自身の生来の微小構造への能動的遊走および／またはホーミング、例えば内皮細胞の脈管構造へのホーミングを含む。1つの態様においては、関心対象の細胞集団を灌流脱細胞化ECMに灌流させ、続いて第2の細胞集団、例えばβ細胞集団を導入し、続いて内皮細胞を導入するが、この場合、内皮細胞は自身の生来の微小環境と同様に脈管導管に残存する。1つの態様においては、関心対象の細胞集団を膨張後の灌流脱細胞化ECMに灌流させ、続いて第2の細胞集団、例えば内皮細胞集団を導入し、続いてβ細胞を含む細胞集団を導入するが、この場合、内皮細胞は自身の生来の微小環境と同様に脈管導管に残存する。別の態様では、2つ以上の細胞集団を組み合わせて、一緒に灌流させる。別の態様では、2つ以上の異なる細胞集団を、灌流、直接注射、または両方の組み合わせのいずれかにより連続的に導入する。
【００１５】
細胞は、細胞の増殖、代謝、および／または分化を支持する培地に導入することができる。あるいは、細胞がECMに定着した後に、培地を、細胞の増殖、代謝、および分化を支持する培地に交換する。培養細胞は、生理的な細胞密度でECMに存在することができ、細胞の増殖、代謝、および／もしくは分化を支持する培地、ならびに／または適切な微小環境がECMに存在することで、細胞の維持および／または機能分化が可能になる。
【００１６】
細胞とECMは、異種であっても同種であってもよい。1つの態様においては、部分的または完全に分化したヒト細胞と、小動物、例えば非ヒト哺乳動物に由来する灌流脱細胞化臓器または組織とを組み合わせることができる。一例では、ヒト由来の灌流脱細胞化肝臓マトリックスに、内皮細胞、および部分的に分化したヒトES由来の肝細胞を播種し、それによってそれぞれ同種または異種の細胞播種マトリックスが提供される。
【００１７】
臓器または組織の脱細胞化
脱細胞化は一般に、以下の段階を含む：固形臓器、例えばその血管柄つき構造、または固形組織の安定化、固形臓器または固形組織の脱細胞化、固形臓器または固形組織の再生および／または中和、固形臓器の洗浄、臓器に残存する任意のDNAの分解、臓器または組織の殺菌、ならびに臓器の恒常性維持。
【００１８】
臓器血管柄つき構造または組織を脱細胞化する際の最初の段階は、臓器または組織にカニューレを挿入することである。臓器または組織の血管、管、および／または腔に、当技術分野で公知の方法および材料を用いてカニューレを挿入することができる。次に、カニューレ装着された臓器血管柄つき構造または組織に、細胞破壊培地を灌流させる。臓器にわたる灌流は、多方向性（例えば、順行性および逆行性）であってよい。
【００１９】
心臓のランゲンドルフ灌流は、生理的灌流として当技術分野において常套的な手法である（4チャンバーワーキングモード灌流 (four chamber working mode perfusion) としても知られる）。例えば、Dehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988を参照されたい。
【００２０】
簡潔に説明すると、ランゲンドルフ灌流では、大動脈にカニューレを挿入し、生理溶液を含むリザーバーに接続して、指定された時間中、心臓が体外で機能できるようにする。灌流脱細胞化を達成するために、プロトコールを修正して、例えば注入もしくはローラーポンプによって一定の送達流速で、または一定の静水圧ポンプより、大動脈を下降して逆方向に送達される細胞破壊培地を灌流させるようにした。いずれの場合も、大動脈弁は強制的に閉鎖され、灌流液が冠動脈口に指向され（これにより心臓の心室質量全体が順行性により灌流される）、これは次いで冠静脈洞を介して右心房中に排出される。ワーキングモード灌流の場合、第2のカニューレを左心房に接続し、灌流を逆行性に変更することができる。
【００２１】
1つの態様において、生理溶液にはリン酸緩衝食塩水 (PBS) が含まれる。1つの態様において、生理溶液は、例えば栄養補助剤（例えば、グルコース）が補充された生理学的に適合性のある緩衝液である。肝臓の場合、生理溶液は、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgS04、1.2 mM KH2PO4、26 mM NaHC03、8 mMグルコース、および1.25 mM CaCl2を有し、2% BSAが補充されたクレブス・ヘンゼライト緩衝液であってよい。島細胞、β細胞、またはインスリン様細胞を有する再内皮化したグラフト肝の場合、生理溶液は、プロラクチンが補充されているかもしくは補充されていないMiami改変培地-1であってよく、または10%ウシ胎仔血清、25 mM HEPES、100単位／mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシン、pH 7.4を含み、VEGFを有するかもしくは有さない改変CMRL 1066組織培養培地であってよい。
【００２２】
他の臓器または組織を灌流する方法は、当技術分野において公知である。例として、以下の参考文献に、肺、肝臓、腎臓、脳、および肢の灌流が記載されている。Van Putte et al., Ann. Thorac. Surg., 74(3):893 (2002)；den Butter et al., Transpl. Int., 8:466 (1995)；Firth et al., Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657 (1989)；Mazzetti et al., Brain Res., 999(1):81 (2004)；Wagner et al., J. Artif. Organs, 6(3):183 (2003)。
【００２３】
1種類もしくは複数種類の細胞破壊培地用いて、臓器または組織を脱細胞化することができる。細胞破壊培地は一般に、これらに限定されないがSDS、PEG、CHAPS、またはTriton Xなどの、少なくとも1種類の界面活性剤を含む。細胞破壊培地は、培地が細胞と浸透圧的に適合しないように水を含み得る。あるいは、細胞破壊培地は、細胞と浸透圧的に適合するように、緩衝液（例えば、PBS）を含み得る。細胞破壊培地はまた、非限定的に、1種類もしくは複数種類のコラゲナーゼ、1種類もしくは複数種類のディスパーゼ、1種類もしくは複数種類のDNase、またはトリプシンなどのプロテアーゼなどの酵素を含み得る。場合によっては、細胞破壊培地は、1種類または複数種類の酵素の阻害剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、および／またはコラゲナーゼ阻害剤）を追加的にまたは代替的に含み得る。
【００２４】
ある特定の態様においては、カニューレ装着された臓器または組織を、2種類の異なる細胞破壊培地で連続的に灌流することができる。例えば、第1の細胞破壊培地は、SDSなどの陰イオン性界面活性剤を含んでよく、第2の細胞破壊培地は、Triton Xなどのイオン性界面活性剤を含み得る。少なくとも1種類の細胞破壊培地による灌流の後に、カニューレ装着された臓器または組織を、例えば、本明細書に開示されるような洗浄液および／または1種類もしくは複数種類の酵素を含む溶液で灌流することができる。
【００２５】
灌流の方向（例えば、順行性および逆行性）を交互させることにより、臓器または組織全体の脱細胞化を支援することができる。脱細胞化は一般に、臓器を完全に脱細胞化し、ECMに対してほとんど損傷を生じない。臓器または組織は、4〜40℃の適切な温度で脱細胞化することができる。臓器または組織のサイズおよび重量、ならびに細胞破壊培地中の特定の界面活性剤および界面活性剤の濃度に応じて、臓器または組織は一般に、固形臓器もしくは組織（一般に＞50グラム）1グラム当たり約0.05時間〜約5時間、または固形臓器もしくは臓器の組織（一般に＜50グラム）1グラム当たり約2時間〜約12時間かけて、細胞破壊培地で灌流する。臓器は、洗浄を含めて、固形臓器もしくは組織（一般に＞50グラム）1グラム当たり最長で約0.75時間〜約10時間、または組織（一般に＜50グラム）1グラム当たり約12時間〜約72時間かけて灌流することができる。脱細胞化時間は、全体的な質量の拡大縮小を制限した状態で、臓器または組織の血管密度および細胞密度に依存する。したがって、一般的な指針として、上記の時間範囲および質量が提供される。灌流は一般に、拍動流、拍動率、および拍動圧を含む生理的条件に調整される。
【００２６】
脱細胞化臓器または組織は、血管樹のECM成分を含む、臓器または組織のすべてまたは大部分の領域の細胞外マトリックス (ECM) 成分を有する。ECM成分は、以下のうちのいずれかまたはすべてを含み得る：フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー（例えば、コラーゲンI、III、およびIV）、成長因子およびサイトカインを含むECM関連成長タンパク質、グリコサミノグリカン、基底質、細網線維、ならびにトロンボスポンジン、これらは基底層などの明確な構造として組織化された状態のままであり得る。脱細胞化の成功は、標準的な組織学的染色手順を用いて、組織切片中に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、および核が存在しないこと、または蛍光測定法により測定して、検出可能なDNAの97%超が除去されていることと定義される。残存する細胞残屑は、脱細胞化臓器または組織から除去され得る。
【００２７】
脱細胞化の過程中および過程後は、ECMの形態および構造が維持される。本明細書で用いられる「形態」とは、臓器、組織、またはECMの全体的な形状を指し、本明細書で用いられる「構造」とは、外表面、内表面、およびこれらの間にあるECMを指す。
【００２８】
ECMの形態および構造は、視覚的および/または組織学的に調べることができる。例えば、固形臓器の外表面上、または臓器もしくは組織の脈管構造内の基底層は、灌流脱細胞化によって除去されるべきではなく、または顕著に損傷されるべきではない。加えて、ECMの原線維は、脱細胞化されていない臓器または組織のもの同様であるか、または顕著に変化していないべきである。
【００２９】
1種類または複数種類の化合物を脱細胞化臓器または組織の内部または表面に適用して、例えば、脱細胞化臓器を保護するか、または脱細胞化臓器もしくは組織を再細胞化のために調製するか、および/または再細胞化過程の間に細胞を支援もしくは刺激することができる。このような化合物には、1種類または複数種類の成長因子（例えば、VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-4、SDF-1、IGF、HGF、アクチビンA、レチノイン酸、およびbFGF）、免疫調節剤（例えば、サイトカイン、グルココルチコイド、IL2Rアンタゴニスト、ロイコトリエンアンタゴニスト）、化学物質（クロザピン-N-オキシド、ホスホイノシチド-3-キナーゼ阻害剤、およびニコチンアミド）、ならびに／または凝固カスケードを修飾する因子（例えば、アスピリン、ヘパリン結合タンパク質、およびヘパリン）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、脱細胞化臓器または組織を、例えば照射（例えば、UV、ガンマ）によりさらに処理して、脱細胞化臓器または組織の表面または内部に残存する任意の種類の微生物の存在を減少させるか、または排除することもできる。
【００３０】
心臓の例示的な灌流脱細胞化
PEG脱細胞化プロトコール
心臓を、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、0.25 μg/mLアンホテリシンB、1000 Uのヘパチン、および2 mgのアデノカルドを含有する200 ml PBSで、再循環させずに洗浄する。次いで心臓を、35 mlポリエチレングリコール（PEG；1 g/mL）で最長30分間、手動で再循環させながら脱細胞化する。次にこの臓器を500 mL PBSで最長24時間、再循環用ポンプを使用して洗浄する。洗浄段階は、各回少なくとも24時間かけて少なくとも2回繰り返す。心臓を35 ml DNase I (70 U/mL) に少なくとも1時間、手動で再循環させながら曝露する。この臓器を再度、500 ml PBSで少なくとも24時間洗浄する。
【００３１】
Triton Xおよびトリプシン脱細胞化プロトコール
心臓を、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、0.25 μg/mLアンホテリシンB、1000 Uのヘパチン、および2 mgのアデノカルドを含有する200 ml PBSで、少なくとも約20分間、再循環させずに洗浄する。次いで、心臓を0.05%トリプシンで30分間かけて脱細胞化した後、5% Triton-Xおよび0.1%水酸化アンモニウムを含有する500mL PBSで約6時間灌流する。心臓を脱イオン水で約1時間灌流し、次にPBSで12時間灌流する。次いで、再循環用ポンプを使用して、心臓を500mL PBSで3回、それぞれ24時間洗浄する。心臓を、手動で再循環させながら35ml DNase I (70 U/mL) で1時間灌流し、再循環用ポンプを使用して500mL PBSで2回、それぞれ少なくとも約24時間洗浄する。
【００３２】
1% SDS脱細胞化プロトコール
心臓を、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、0.25 μg/mLアンホテリシンB、1000 Uのヘパチン、および2 mgのアデノカルドを含有する200 mL PBSで、少なくとも約20分間、再循環させずに洗浄する。再循環用ポンプを使用して、心臓を、1% SDSを含有する水500 mLで少なくとも約6時間かけて脱細胞化する。次いで心臓を脱イオン水で約1時間洗浄し、PBSで約12時間洗浄する。再循環用ポンプを使用して、心臓を500mL PBSで3回、それぞれ少なくとも約24時間洗浄する。次いで心臓を、手動で再循環させながら35ml DNase I (70 U/mL) で約1時間灌流し、再循環用ポンプを使用して500mL PBSで3回、それぞれ少なくとも約24時間洗浄する。
【００３３】
Triton X脱細胞化プロトコール
心臓を、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、0.25 μg/mLアンホテリシンB、1000 Uのヘパチン、および2 mgのアデノカルド（アデノシン）を含有する200 mL PBSで、少なくとも約20分間、再循環させずに洗浄する。次いで、再循環用ポンプを使用して、心臓を、5% Triton Xおよび0.1%水酸化アンモニウムを含有する水500 mLで少なくとも6時間かけて脱細胞化する。次いで、心臓を脱イオン水で約1時間灌流し、次にPBSで約12時間灌流する。再循環用ポンプを使用して、500mL PBSで3回、それぞれ少なくとも24時間灌流することにより、心臓を洗浄する。次いで心臓を、手動で再循環させながら35ml DNase I (70 U/mL) で約1時間灌流し、500ml PBSで3回、それぞれ約24時間洗浄する。
【００３４】
心臓は、60cm H2Oの冠灌流圧で灌流することができる。必須ではないものの、心臓は、脱細胞化チャンバー内に載置し、抗生物質を含むPBSで完全に浸漬させ、5 mL／分の連続流の再循環モードで72時間灌流して、できるだけ多くの細胞成分および界面活性剤を洗い流すことができる。
【００３５】
脱細胞化の検出
脱細胞化の成功は、組織切片中に核酸が欠如していることによって測定することができる。脈管構造の保護の成功は、組織切片を包埋する前に2%エバンスブルーで灌流することによって評価することができる。臓器を、最初に、脱イオンH2O中に溶解したイオン性界面活性剤（1%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、およそ0.03 M）で、一定の冠灌流圧で順行性に灌流し、次に非イオン性界面活性剤（1% Triton X-100）で順行性に灌流して、SDSを除去し、およびおそらく細胞外マトリックス (ECM) タンパク質を再生させた場合に、高効率の脱細胞化が観察され得る。閉塞した毛細血管および小血管を通過させるため、断続的に臓器をリン酸緩衝液で逆行性に灌流することもできる。
【００３６】
脱細胞化後の無傷の脈管構造を実証するため、脱細胞化臓器をランゲンドルフ灌流によりエバンスブルーで染色して、脈管基底膜を染色し、大血管および微小血管の密度を定量化することができる。
【００３７】
膨張した臓器または組織の再細胞化
膨張した脱細胞化臓器または組織を、分化（成熟もしくは初代）細胞、幹細胞、または部分分化細胞のいずれかの細胞集団と接触させる。したがって、細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または多分化能細胞であってよく、非拘束細胞または拘束細胞であってよく、および単一系列細胞であってもよい。細胞は、未分化細胞、部分分化細胞、または胎児由来細胞を含む完全分化細胞であってよい。細胞には、前駆細胞、前駆体細胞、または臍帯細胞および胎児性幹細胞を含む「成体」由来幹細胞が含まれ得る。本発明のマトリックスに有用な細胞には、胚性幹細胞（米国国立衛生研究所 (NIH) により定義されるもの；例えば、ワールドワイドウェブ上のstemcells.nih.govにおける用語集を参照されたい）およびiPS細胞が含まれる。
【００３８】
膨張した脱細胞化臓器または組織を再細胞化するのに使用され得る細胞の例には、非限定的に、胚性幹細胞、臍帯血細胞、組織由来の幹細胞もしくは前駆細胞、骨髄由来の幹細胞もしくは前駆細胞、血液由来の幹細胞もしくは前駆細胞、間葉系幹細胞 (MSC)、骨格筋由来細胞、多能性成体前駆細胞 (MAPC)、またはiPS細胞が含まれる。使用され得るさらなる細胞には、心臓幹細胞 (CSC)、多能性成体心臓由来幹細胞、心臓線維芽細胞、心臓微小血管系内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、β細胞、角化細胞、プルキンエ線維、ニューロン、胆管上皮細胞、島細胞、肺胞上皮細胞、クララ細胞、刷子縁細胞、または有足細胞が含まれる。骨髄単核細胞 (BM-MNC) などの骨髄由来幹細胞、内皮または血管の幹細胞または前駆細胞、および内皮前駆細胞 (EPC) などの末梢血由来幹細胞もまた、細胞として使用することができる。
【００３９】
灌流により脱細胞化し膨張させた足場の内部および表面に導入される細胞の数は、臓器（例えば、どの臓器であるか、臓器のサイズおよび重量）または組織、ならびに再生細胞の種類および発達段階の両方に依存し得る。異なる種類の細胞は、それらの細胞が到達する集団密度に関して異なる傾向を有する場合がある。同様に、異なる臓器または組織は、異なる密度で細胞化され得る。例として、膨張した脱細胞化臓器または組織に、少なくとも約1,000個（例えば、少なくとも10,000個、100,000個、1,000,000個、10,000,000個、もしくは100,000,000個）の細胞を「播種」することができ；または約1,000個の細胞／mg組織（湿重量、例えば脱細胞化前）〜約10,000,000個の細胞／mg組織（湿重量）を付着させることができる。
【００４０】
細胞は、1つまたは複数部位への注射によって、膨張した脱細胞化臓器または組織に導入する(「播種する」)ことができる。加えて、2種類以上の細胞を、膨張した脱細胞化臓器または組織に導入することもできる。例えば、分化した細胞型の集団を、膨張した脱細胞化臓器もしくは組織の複数の位置に注射することができ、または異なる細胞型を、脱細胞化臓器もしくは組織の異なる部分に注射することもできる。注射の代わりにまたは注射に加えて、細胞または細胞のカクテルを灌流によって、カニューレ装着し膨張させた脱細胞化臓器または組織に導入することができる。例えば、灌流培地を用いて、膨張した脱細胞化臓器内に細胞を灌流させることができ、その後この培地を拡大および／または分化培地に交換して、細胞の成長および／または分化を誘導することができる。臓器内の様々な部位に、例えば心臓の心房、心室、または結節などの領域に細胞を配置することにより、部位特異的な分化を達成することができる。
【００４１】
再細胞化中は、臓器または組織を、細胞の少なくとも一部が脱細胞化臓器または組織の内部および表面で増殖および／または分化し得る条件下で維持する。このような条件には、非限定的に、適切な温度および／または圧力、電気的および／または機械的活性、力、適切な量のO2および／またはCO2、適度の湿度、ならびに無菌または無菌に近い状態が含まれる。再細胞化中は、脱細胞化臓器または組織、およびそれに付着している再生細胞を、適切な環境において維持する。例えば、細胞は、栄養補助剤（例えば、栄養素および／もしくはグルコースなどの炭素源）、外因性ホルモンもしくは成長因子、ならびに／または特定のpHを必要とし得る。
【００４２】
本明細書に記載される組織または臓器マトリックスを再細胞化する方法は、加圧下で組織または臓器マトリックスを生理的緩衝液で灌流する段階を含む。加圧下での組織または臓器マトリックスのこのような灌流は、任意の細胞をマトリックスに導入する前に行われ、WO 2007/025233に記載される脱細胞化過程において使用される灌流と同様に、臓器または組織マトリックスの脈管構造またはその他の管腔もしくは導管構造（例えば、肺の気管、肝臓の胆管、腎臓の尿道等）を介してなされ、一般に、臓器または組織マトリックスの脈管構造（例えば、動脈、静脈、細動脈、細静脈、および毛細血管）ならびに／またはその他の管腔および／もしくは導管（以後、「脈管構造型」構造と称する）のカニューレ装着から開始する（約1〜約300 Hg）。このようにカニューレ装着は、液体、物質、または老廃物を導入または除去するための、気管、膀胱、または血管のような身体の管、腔、または血管へのカニューレの挿入を含む。本明細書で用いられる場合、加圧下での組織または臓器マトリックスの灌流とは、組織または臓器マトリックス中の脈管構造および脈管構造型構造が開いて拡大したままであるために十分であるが、組織または臓器マトリックスの脈管構造または脈管構造型構造に損傷または拡張を引き起こすほどには高くない圧力下で、液体組成物（例えば、生理的緩衝液）を送達することを指す。加圧下での組織または臓器マトリックスの細胞前灌流に適した生理的緩衝液は、組織または臓器マトリックスと適合する任意の緩衝液であってよい。例えば、生理的緩衝液は、糖および炭水化物などの栄養素を含んでよく、例えば血管形成を誘導する化合物（例えば、VEGF、FGF-1、および／またはbFGF）などの内皮促進因子（例えば、内皮細胞または内皮に正の効果を及ぼす化合物）もまた含み得る。生理的緩衝液は、一般に生理的pHである。
【００４３】
1つの態様において、細胞前灌流または細胞灌流に適した生理的緩衝液には、移植を含む臓器の灌流および／または保護のために利用され得る、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、またはEGM-2、EGM-2MV、DMEM、PromoCell 内皮細胞用培地、Medium 200、DMEMF/12を含むがこれらに限定されない、内皮細胞培養に適した培養培地溶液、栄養補助剤、例えばグルコースを伴う緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。例えば心臓組織に関して、それらには例えば、以下の組成：118mM NaCl、4.7mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、11 mMグルコース、1.75 mM CaCl2、および2.0 mMピルビン酸、ならびに5 U/Lインスリンで調製された改変クレブス・ヘンゼライト緩衝液、または95% O2、5% CO2ガスで処理された、118 mM NaCl、4.7mM KCl、25 mM NaHCO3、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、2 mM CaCl2を含有するクレブス緩衝液；またはグルコース（例えば、11 mM）、または1 mMもしくは1.2 mMパルミチン酸と組み合わせたグルコースが含まれる。腎組織に関して、例示的な培地はKPS-1腎臓灌流溶液である。肝組織に関して、例示的な培地は、2% BSAが補充された、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、26 mM NaHCO3、8 mMグルコース、および1.25 mM CaCl2を含有するクレブス・ヘンゼライト緩衝液である。
【００４４】
任意の特定の機構によって縛られることはないが、加圧下でのこの細胞前灌流は、マトリックス、および特に組織または臓器マトリックスの血管床を開いて洗い流し、それにより再内皮化の際により多くのマトリックスを細胞に曝露させ、組織または臓器マトリックスの脈管構造の全体にわたって生存可能な内皮の確立を可能にすると考えられる。（例えば、異なる供給源、例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓等に由来する）異なる組織および臓器マトリックスは、異なる量の圧力に耐え得ることが、当業者により理解されるであろう。特定の組織または臓器マトリックスが耐え得る圧力の量は、その特定の組織または臓器マトリックスの血管床と、少なくとも部分的に関係している。
【００４５】
細胞は脱細胞化臓器もしくは組織と同種であってもよく（例えば、ヒトの脱細胞化臓器もしくは組織にヒト細胞を播種する）、または細胞は脱細胞化臓器もしくは組織と異種であってもよい（例えば、ブタの脱細胞化臓器もしくは組織にヒト細胞を播種する）。本明細書で用いられる「同種」とは、臓器または組織が由来する種と同じ種（例えば、血縁関係にある個体もしくは血縁関係にない個体）から得られる細胞を指し、本明細書で用いられる「異種」とは、臓器または組織が由来する種とは異なる種から得られる細胞を指す。
【００４６】
幹細胞または前駆細胞用培地は、例えば、KODMEM培地（ノックアウト・ダルベッコ変法イーグル培地）、DMEM、ハムF12培地、FBS（ウシ胎仔血清）、FGF2（線維芽細胞成長因子2）、KSR、またはhLIF（ヒト白血病抑制因子）を含む、種々の成分を含有し得る。細胞分化用培地はまた、L-グルタミン、NEAA（非必須アミノ酸）、P/S（ペニシリン／ストレプトマイシン）、N2、B27、およびβ-メルカプトエタノールなどの補助剤を含有し得る。細胞分化用培地に付加的な因子を添加してもよいことが企図され、これには、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸、上皮細胞成長因子ファミリー (EGF) のメンバー、FGF2、FGF7、FGF8、および／もしくはFGF10を含む線維芽細胞成長因子ファミリー (FGF) のメンバー、血小板由来成長因子 (PDGF) のメンバー、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／DANファミリータンパク質、ベントロピン (ventropin)、高用量アクチビン、およびアムニオンレス、またはそれらの変種もしくは機能的断片を含むがこれらに限定されない、トランスフォーミング成長因子 (TGF)／骨形成タンパク質 (BMP)／成長分化因子 (GDF) 因子ファミリーアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。TGF/BMP/GDFアンタゴニストは、TGF/BMP/GDF受容体-Fcキメラの形態で添加することもできる。添加され得る他の因子には、Delta様ファミリーおよびJaggedファミリーのタンパク質、ならびにNotchのプロセシングもしくは切断の阻害剤、またはそれらの変種もしくは機能的断片を含むがこれらに限定されない、Notch受容体ファミリーを通じてシグナル伝達を活性化または不活性化し得る分子が含まれる。他の成長因子には、インスリン様成長因子ファミリー (IGF)、インスリン、wingless関連 (WNT) 因子ファミリー、およびヘッジホッグ因子ファミリーのメンバー、またはそれらの変種もしくは機能的断片が含まれ得る。付加的な因子を添加して、中内胚葉の幹／前駆細胞、内胚葉の幹／前駆細胞、中胚葉の幹／前駆細胞、または胚体内胚葉の幹／前駆細胞の増殖および生存を促進することができ、ならびにこれらの前駆細胞の誘導体の生存および分化を促進することができる。
【００４７】
1つの態様においては、膨張した脱細胞化マトリックスを、胚様体 (EB) 法を用いて分化させたiPS細胞またはES細胞と組み合わせる。例えば、転写因子（OCT4、SOX2、NANOG、およびLIN28；Oct3/4、Sox2、Klf4、およびc-Myc；またはOct3/4、Sox2、およびKlf4）の形質導入、例えばレンチウイルス媒介性形質導入により再プログラムされたヒトiPS細胞株が用いられる。胎児起源または新生児起源のiPSクローンを使用することができる。ヒトES細胞株を使用することもできる。iPS細胞およびES細胞は、20% KnockOut血清代替物 (Invitrogen)、0.1 mmol/L非必須アミノ酸、1 mmol/L L-グルタミン、0.1 mmol/L βメルカプトエタノール (Sigma) が補充されたDMEM/F12培養培地中、6ウェル培養プレート (Nunc) において19,500個細胞／cm2の密度で、照射したマウス胚性線維芽細胞 (MEF) 上で維持することができる。加えて、iPS細胞の場合には100 ng/mLゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子、およびhES細胞の場合には4 ng/mLヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子 (Invitrogen) を、培地に補充することができる。iPS細胞株およびES細胞株はまた、15%ウシ胎仔血清（FCS；Sigma-Aldrich）、0.1 μmol/L 2-メルカプトエタノール (2ME)、および1,000単位／ml LIF (Chemicon Internationl) を含有するDMEM (Sigma-Aldrich) 中、ゼラチン化100-mmディッシュ上で維持することもできる。分化させるため、これらの細胞を0.25%トリプシン／エチレンジアミン四酢酸 (GIBCO) で処理し、3 x 104個細胞／ウェルの濃度で、10% FCSおよび0.05 μmol/L 2MEが補充されたα最小必須培地 (GIBCO) 中、ゼラチン化6ウェルプレートに移すことができる。
【００４８】
1 mg/mLディスパーゼ (Gibco) 溶液と共に37℃で8〜15分間インキュベートすることにより、培養プレートからコロニーを剥離し、懸濁培養液中、超低接着プレートに配置し、例えば4日間置くことができる。懸濁培養中、1日目に培地を交換し、その後の3日間は培地交換せずに培養することができる。次いでEBを、0.1%ゼラチンでコーティングされた培養プレート上に例えば1ウェル当たり50〜100個のEBという密度で、または灌流脱細胞化ECM内にプレーティングし、分化培地（例えば、毎日交換）中で培養する。
【００４９】
場合によっては、本明細書に記載される方法によって生成された臓器または組織は、患者に移植されることになる。そのような場合、脱細胞化臓器または組織を再細胞化するために用いられる細胞は、細胞が患者にとって「自己となるように、患者から採取することができる。患者由来の細胞は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、生涯の様々な段階（例えば、出生前、新生児期もしくは周産期、青年期、または成人期）における血液、骨髄、組織、または臓器から採取することができる。あるいは、脱細胞化臓器または組織を再細胞化するために用いられる細胞は、患者と同系（すなわち、一卵性双生児に由来）であってもよく、細胞は、例えば患者の血縁者もしくは患者と血縁関係のないヒトリンパ球抗原 (HLA) 適合個体に由来するHLA適合細胞であってもよく、または細胞は、例えばHLA不適合ドナーに由来するなど、患者と同種であってもよい。
【００５０】
細胞の供給源（例えば、自己か否か）にかかわらず、脱細胞化固形臓器は、患者にとって自己、同種、または異種であってよい。
【００５１】
再細胞化中、細胞の進行状況をモニターすることができる。例えば、再細胞化中の1つまたは複数の時点で生検を行うことにより、臓器または組織の表面または内部にある細胞の数を評価することができる。加えて、様々なマーカーが細胞または細胞集団内に存在するか否かを判断することにより、細胞に生じた分化の量をモニターすることができる。異なる細胞型およびそのような細胞型の異なる分化段階に関連するマーカーは、当技術分野において公知であり、抗体および標準的な免疫測定法を用いて容易に検出することができる。例えば、Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sonsの第3章および第11章を参照されたい。核酸アッセイならびに形態学的および／または組織学的評価を用いて、再細胞化をモニターすることができる。
【００５２】
内皮前駆細胞 (EPC) は、増殖し、遊走し、および内皮細胞へ分化する能力を有するが、成熟内皮細胞の特徴を未だ獲得していない未熟内皮細胞である。EPCは、例えば組織傷害などのある特定の生理的刺激に応答して、骨髄から末梢血へ動員され得る（循環EPC）。循環EPCは成人ヒト血液において同定され (Asahara et al. (1997) Science 275:964-967)、その後の研究により、内皮の完全性および機能の維持ならびに出生後の新血管新生におけるEPCの役割が示唆された。EPCは、血液、骨髄、または臍帯血から単離され得、成人ヒト末梢単核細胞のCD34+細胞画分中に同定される。これらは、直接的FACS選別、または磁性ビーズ、マイクロフルイディクス、ラブオンチップ、アフィニティカラム、もしくは関連装置などのその他の利用可能なエクスビボ選択法を介して、単独で、または末梢血中のEPCリッチ細胞画分としてのKDR+と組み合わせて、CD34+細胞またはCD133+細胞を用いて単離され得る。次いで、EPCをマトリックスに直接灌流させ、増殖および分化を支援するための適切な条件下で培養することもできるし、または初期拡大期に、1%ペニシリン-ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA) および組換えヒト (rh) Flt-3リガンド (100 ng/mL)、rh幹細胞因子 (100 ng/mL)、rh IL-3 (20 ng/mL)、rh IL-6 (20 ng/mL) が補充された無血清StemSpan（登録商標）培地 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) 中で7日間培養するなど、全細胞数を増加させるために、EPCをEPC維持培養培地中でインビトロ培養することもできる。次いでこれらの細胞を、EPCとしてマトリックスに灌流させるか、またはECに予め分化させ、マトリックスに灌流させる。EPCの分化は、FBS (2%) 、ヒドロコルチゾン、hFGF、VEGF、R3-IGF-1、アスコルビン酸、hEGF、ゲンタマイシン、アンホテリシンB、およびヘパリン (Lonza, Basel, Switzerland) を含有する内皮細胞成長培地-2 (EGM-2) 中、約3x105個〜約1x106個／1.5 mL／9.6 cm2を培養するなどの方法を通して、達成され得る。3日間の培養の後、細胞を収集し、約1x106個細胞／1.5 mL／9.6 cm2の密度で、フィブロネクチン (10 μg/ml) (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA) でコーティングされたプレートに移し、新鮮なEGM-2培地中でさらに3日間培養することができる。
【００５３】
同種の内皮前駆体または内皮細胞前駆体の集団を使用することができ、これはレシピエントのものと同種である組織から調製され得、レシピエントの組織適合性型と厳密に適合させるために、組織適合試験の周知の方法により使用について試験される。これらには、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)、免疫原性を低減させるため遺伝的に改変された内皮細胞、HLA適合内皮細胞、臍帯血由来内皮細胞、EPC由来EC、前駆細胞、iPS、または胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。大部分の同種アプローチは、移植後に免疫抑制剤の使用を必要とするであろう。最近の研究により、移植後に免疫抑制が必要とされない、EPC由来ECの免疫特権性が実証された (Cardiovasc Res. 2010 Oct 1;88(1):121-9. Epub 2010 Apr 13）。EPC分化法の例には、Pancoll rat (PAN-Biotech) を用いた密度勾配遠心分離による血液からのEPCの単離、およびCD45モノクローナル抗体を使用したCD45枯渇の実施が含まれる。20 mg/mLフィブロネクチンでコーティングされたディッシュにおいて、内皮分化培地［5% FCS、50 mg/mLゲンタマイシン、10 ng/mLラットVEGF、1 ng/mLウシbFGF、10 ng/mLマウスIGF-1（いずれもR&D Systems）、10 ng/mLマウスEGF、および1 mg/mLヒドロコルチゾンが補充されたEBM］中で、CD45 (-)画分を培養する。4日毎に培地交換により非接着細胞を除去した。約15〜約22日間の培養の後に、増幅中の細胞クラスターが出現し、クローニングリング内をトリプシン処理することによってそれを採取する。PECAM-1抗体およびIgG1 MicroBeadを使用するMACS分離により、PECAM-1(+) 細胞を選択する。PECAM-1(+) 画分は、最長25継代までさらに培養することができ、複数のマトリックスに灌流させることができる。
【００５４】
さらに、免疫抑制技法を用いる代わりに、Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985) により教示され、細胞株における遺伝子置換またはノックアウトにまで拡張された (Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991))、幹細胞における相同組換えを使用した遺伝子置換またはノックアウトの方法を、主要組織適合性複合体 (MHC) 遺伝子の消失のために、内皮細胞および内皮由来細胞に適用することができる。MHC発現を欠く細胞は、レシピエントを免疫抑制する必要なしに、同種間の、およびおそらくは異種間でさえ、組織適合性の障壁を越えて、濃縮された内皮細胞集団の移植を可能にする。ドナー細胞の抗原性を低減させるための組換え法の使用に関する一般的な総説および引用はまた、Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992) によって開示されている。表面修飾によって移植片の免疫原性を低減させるための例示的なアプローチは、PCT国際特許出願WO 92/04033およびPCT/US99/24630により開示されている。あるいは、MHC抗原が改変されているかまたは欠失しているトランスジェニック動物から細胞を調製することにより、グラフトの免疫原性を低減させることもできる。
【００５５】
内皮細胞前駆体には、内皮細胞コロニー形成単位 (CFU-EC)、循環血管形成細胞 (CAC）、循環内皮前駆体 (CEP)、内皮コロニー形成細胞 (ECFC)、低増殖能ECFC (LPP-ECFC)、および高増殖ECFC (HPP-ECFC)が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
1つの態様において、内皮細胞および内皮前駆細胞は、胚性幹細胞 (ESC) または人工多能性幹細胞 (iPSC) を適切な条件下で培養して、幹細胞を内皮系列に指向させることによって得られる。内皮前駆細胞とは、内皮細胞へ分化し始めたが（例えば、例えば、系列拘束された；例えば、内皮細胞となる運命にある細胞）、完全に分化した内皮細胞とは見なされない細胞である。例えば、内皮前駆細胞は、CD133などの前駆細胞マーカーを発現し得、非限定的に、血小板内皮細胞接着分子-1（PECAM1；別名CD31）、VEGFR-1（別名Flt-1）、VEGFR-2（別名Flk-1）、グアニル酸結合タンパク質-1（GBP-1）、トロンボモジュリン（別名CD141）、VE-カドヘリン（別名CD144）、フォン・ヴィレブランド因子 (vWF)、および細胞間接着分子2 (ICAM-2) などの内皮細胞マーカーもまた発現し得る。一般に、内皮前駆細胞は、アセチル化LDLを取り込むこともでき、さらにVEGFに向かって遊走し、かつ／またはMatrigel上で管を形成し得る。
【００５７】
ヒトESCおよびヒトiPSCなどのESCまたはiPSCは、完全に分化した内皮細胞をもたらす条件、例えばVEGFおよびbFGFの下でさらに培養することができる。付加的にまたは代替的に、内皮細胞は、骨髄、血液、皮膚、肝臓、心臓、肺、網膜、および内皮細胞を保持する任意の他の組織または臓器などの多数の供給源から得られ得る。例えば、代表的な内皮細胞には、非限定的に、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、細小血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、およびそれらの組み合わせが含まれる。当業者が理解するように、これは内皮細胞の網羅的なリストであることを意図していない。
【００５８】
EPCは、密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞 (PBMC) を単離することにより、末梢血から得られ得る。細胞懸濁液を、細胞を維持することができる任意の容器、具体的には、培養フラスコ、培養プレート、またはローラーボトル、より具体的には25 cm2培養フラスコなどの小さな培養フラスコに播種する。懸濁状態で培養する細胞は、およそ5x104個〜約2x105個細胞／mL（例えば、約1x105個細胞／mL）で再懸濁することができる。固定基材上にプレーティングする細胞は、およそ2〜約3x103個細胞／cm2でプレーティングすることができる。任意で、培養プレートは、コラーゲンなどのマトリックスタンパク質でコーティングする。細胞は、グルタミンおよびその他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル、およびトランスフェリンなどのタンパク質等などの、細胞代謝に必要とされる補助剤を含有する、HEM、DMEM、RPMI、F-12等を含む、細胞成長を支持し得る任意の公知の培養培地中に配置することができる。培養培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等などの、酵母、細菌、および真菌による夾雑を防止するための抗生物質もまた含有し得る。培養培地は、ウシ、ウマ、ニワトリ等に由来する血清を含有し得る。培養条件は、一般に、生理的条件に近似しているべきである。培養培地のpHは、生理的pHに近似しているべきである（例えば、pH 6〜8、約pH 7〜7.8、またはpH 7.4）。生理的温度は約30℃〜40℃の範囲である。EPCは、約32℃〜約38℃（例えば、約35℃〜約37℃）の温度で培養することができる。
【００５９】
任意で、培養培地には少なくとも1種の増殖誘導性（「分裂促進性」）成長因子が補充される。「成長因子」とは、EPCに対する成長増殖誘導効果、分化誘導効果、または栄養効果を有する、タンパク質、ペプチド、またはその他の分子である。「増殖誘導性成長因子」とは、EPCが増殖することを可能にする栄養因子であり、これには、細胞の表面上の受容体に結合して、細胞に対して栄養効果または成長誘導効果を発揮する任意の分子が含まれる。増殖誘導性成長因子には、EGF、アンフィレギュリン、酸性線維芽細胞成長因子（aFGFまたはFGF-1）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGFまたはFGF-2）、トランスフォーミング成長因子α（TGFα）、VEGF、およびそれらの組み合わせが含まれる。成長因子は通常、約1 fg/mL〜1 mg/mLの範囲の濃度で培養培地に添加する。約1〜100 ng/mLの濃度で通常は十分である。特定の成長因子の最適濃度を決定するために、単純な滴定アッセイを容易に実施することができる。成長因子および栄養因子の生物学的効果は一般に、細胞表面受容体への結合を通して媒介される。多数のこれら因子の受容体が同定されており、特定の受容体に対する抗体および分子プローブが利用可能である。分化の全段階で、EPCを成長因子受容体の存在について解析することができる。多くの場合、特定の受容体の同定により、外因性の成長因子または栄養因子の添加による、特定の発生経路に沿った細胞のさらなる分化において使用するための戦略に関する指針が提供される。
【００６０】
一般に、インビトロで約3〜10日後に、培地を吸引し、新鮮な培地を培養フラスコに添加することにより、EPCの培養培地を補充する。任意で、吸引された培地を収集し、濾過し、後にEPCを継代するための馴化培地として使用する。例えば、10%、20%、30%、40%、またはそれ以上の馴化培地が使用される。EPC細胞培養物は、増殖を再開させるために容易に継代することができる。例えば、インビトロで約3〜約7日後に、培養フラスコを十分に振盪し、次いでEPCを50 mL遠心管に移し、低速で遠心分離する。培地を吸引し、EPCを少量の培養培地に再懸濁し、次いで細胞を計数し、所望の密度で再度プレーティングして増殖を再開させる。この手順を毎週繰り返して、各継代において生存細胞の数の対数的増加をもたらすことができる。所望の数のEPCが得られるまで、この手順を継続する。
【００６１】
EPCおよびEPC子孫は、必要とされるまで、当技術分野において公知の任意の方法によって凍結保存することができる（例えば、米国特許第5,071,741号、PCT国際特許出願WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862、およびWO98/14058、Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993) を参照されたい）。EPCは、特定の凍結保存剤を含有する等張溶液、好ましくは細胞培養培地に懸濁することができる。そのような凍結保存剤には、ジメチルスルホキシド (DMSO)、グリセロール等が含まれる。これらの凍結保存剤は、5〜15%（例えば、8〜10%）の濃度で使用され得る。細胞は、-10℃〜-150℃（例えば、-20℃〜-100℃または-70℃〜-80℃）の温度まで徐々に凍結させる。
【００６２】
培養条件に応じて、EPCを内皮細胞または平滑筋細胞へと分化させることができる。EPCは、分化誘導性成長因子を含む培養培地中、固定基材上で内皮細胞または平滑筋細胞EPCへと分化させることができる。EPCの分化は、イノシトール三リン酸および細胞内Ca2+の遊離、ジアシルグリセロールの遊離、ならびにプロテインキナーゼCおよびその他の細胞キナーゼの活性化等を含む、成長をもたらす生物学的事象のカスケードを活性化する、当技術分野において公知の任意の方法によって誘導することもできる。ホルボールエステル、分化誘導性成長因子、およびその他の化学的シグナルによる処理によって、分化を誘導することができる。EPCの分化に影響を与えるために、EPCの増殖のための増殖誘導性成長因子（上記参照）の代わりに、分化誘導性成長因子を培養培地に添加することができる。その他の分化誘導性成長因子には、血小板由来成長因子 (PDGF)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン (TRH)、トランスフォーミング成長因子β (TGFβ)、インスリン様成長因子 (IGF-1) 等が含まれる。
【００６３】
分化した内皮細胞または平滑筋細胞は、当技術分野において公知の免疫細胞化学的技法を使用して検出され得る。免疫細胞化学（例えば、二重標識免疫蛍光および免疫ペルオキシダーゼ法）は、内皮細胞または平滑筋細胞の細胞的特徴または表現型特性を区別するために、細胞タンパク質を検出する抗体を使用する。内皮細胞の細胞マーカーには、例えば、VE-カドヘリン、CD144、CD141、CD 106、またはCD142が含まれ、平滑筋細胞の細胞マーカーにはFlkが含まれる。免疫細胞化学を用いて、CD31およびe-NOSなどの内皮細胞遺伝子の発現を検出することにより、内皮細胞を同定することもできる。
【００６４】
内皮遺伝子mRNAに特異的なcDNAまたはRNAプローブを使用して、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学を行うこともできる。特定の表現型の同定を強化するために、これらの技法を免疫細胞化学法と併用することができる。必要に応じて、上述の抗体および分子プローブをそれぞれウェスタンブロット手順およびノーザンブロット手順に適用して、細胞同定を補助することもできる。
【００６５】
内皮細胞は、例えば、世界中の多くの生物材料寄託機関のうちの1つから入手され得る。例えば、American Type Culture Collection（ワールドワイドウェブ上のATCC.org）またはInternational Depositary Authority of Canada（IDAC；ワールドワイドウェブ上のnml-lnm.gc.ca）を参照されたい。内皮細胞または内皮前駆細胞はまた、移植される組織または臓器マトリックスのレシピエントとなる個体から得られ得る。これらの細胞は、そのレシピエントにとって自己であると見なされる。さらに、ある特定の状況下では、組織または臓器マトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞との間の関係は、同種（すなわち、同一種からの異なる個体）であってよく；他の例では、組織または臓器マトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞との間の関係は、異種（すなわち、異なる種からの個体）であってよい。ある特定の例において、組織または臓器マトリックスはレシピエントと異種であり、かつ内皮細胞または内皮前駆細胞はレシピエントと同種である。
【００６６】
内皮細胞または内皮前駆細胞を含む組成物は、典型的には、これらの細胞と適合する溶液（例えば、生理的組成物）中、生理的条件（例えば、37℃）下で組織または臓器マトリックスに送達される。本明細書で言及される生理的組成物には、非限定的に、緩衝液、栄養素（例えば、糖、炭水化物）、酵素、拡大および／もしくは分化培地、サイトカイン、抗体、リプレッサー、成長因子、塩溶液、または血清由来タンパク質が含まれ得る。本明細書で用いられる場合、内皮細胞または内皮前駆細胞「から本質的になる」組成物とは、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を実質的に含まないが、生理的組成物中に見出され得る成分のいずれか（例えば、緩衝液、栄養素等）をさらに含み得る組成物である。
【００６７】
再内皮化を最適化するために、内皮細胞または内皮前駆細胞は一般に、灌流により臓器または組織マトリックスに導入される。細胞前灌流と同様に、およびWO 2007/025233に記載されるように、灌流は、臓器または組織マトリックスの脈管構造または脈管構造型構造（例えば、その他の管腔または導管）を介して行われる。臓器または組織マトリックスを再内皮化するための灌流は、脈管構造および脈管構造型構造に細胞の生理的組成物を循環させるのに十分な流速でなされるべきである；しかしながら、組織または臓器マトリックスを再内皮化するための灌流は、典型的には、圧力をほとんどまたは全くかけずに（例えば、血管床を拡大させ洗い流すための細胞前灌流段階において使用されるよりも低い圧力の下で）行われる。内皮細胞または内皮前駆細胞による灌流は、再内皮化をさらに最適化するため、多方向性（例えば、順行性および逆行性）であってよい。
【００６８】
再内皮化のために組織または臓器マトリックスに導入される内皮細胞または内皮前駆細胞の数は、臓器または組織（例えば、どの臓器もしくは組織であるか、臓器もしくは組織のサイズおよび重量、臓器もしくは組織の発達段階、ならびに／または臓器もしくは組織の血管新生の程度）、ならびに内皮細胞、内皮由来の未熟内皮細胞、または内皮前駆細胞の種類および発達段階の両方に依存する。加えて、2種類以上の内皮細胞または内皮前駆細胞（例えば、内皮細胞または内皮前駆細胞のカクテル）を、臓器または組織マトリックスに灌流させることができる。異なる種類の内皮細胞または内皮前駆細胞は、それらの細胞が到達する集団密度に関して異なる傾向を有する場合があり、同様に、異なる臓器または組織マトリックスは、異なる密度で再内皮化され得る。単なる例として、少なくとも約100個（例えば、少なくとも約103、104、105、106、107、109、または1010個）の内皮細胞または内皮前駆細胞を、臓器または組織マトリックスに導入することができる。
【００６９】
移植前に、マトリックスまたはグラフトは、例えば、VE-カドヘリン、CD144、CD141、CD 106、またはCD142を含む、内皮細胞の細胞マーカーの発現によって定義される成熟内皮細胞を過半数で含有するべきである。免疫細胞化学を用いて、CD31およびe-NOSなどの内皮細胞遺伝子の発現を検出することにより、内皮細胞を同定することもできる。内皮単離の非破壊的方法は、内皮細胞のごく一部＜0.01%を除去できるようにするためのトリプシン（0.25%以下）の短時間灌流またはその他の細胞剥離法であり、次いでそれらの内皮細胞を、CD105、CD31を含むがこれらに限定されない内皮細胞マーカーの発現およびe-NOSの機能的発現についてアッセイすることができる。加えて、内皮細胞の機能は、Matrigelアッセイにおける内皮管形成により評価することもできる。簡潔に説明すると、96ウェルプレートのウェルを、50μLの氷冷Matrigel（商標）でコーティングした後、37℃で1時間インキュベートした。その後、約25,000〜約50,000個の内皮細胞を含有するEGM-2培地100μLをMatrigel（商標）に添加する。5% CO2を含む37℃の加湿雰囲気において、インキュベーションを16時間行う。管形成を倒立顕微鏡により評価し、各単一ウェルのデジタル顕微鏡写真を4倍の倍率で撮影し、管の総数、分岐点、管の長さ、および管の長さの合計を、各ウェルについて計算することができる。内皮管の存在により、機能的な内皮細胞が規定された。
【００７０】
加えて、再内皮化の測定は、血小板活性化、酸化バースト、溶血、線維素溶解、フィブリン形成、トロンビンの生成、接触活性化、および補体活性化を含むがこれらに限定されない、標準的な血液適合性の試験およびアッセイを使用して完了され得る。非破壊的方法には、天然組織の公知の値に外挿され得る、マトリックス内に存在する内皮細胞の密度を決定するための、CellTiter Blueまたはその他の代謝アッセイなどの増殖アッセイの使用が含まれ、ここでの目標は、天然組織の＞50%の内皮細胞密度を有することである。
【００７１】
再内皮化の測定は、血小板活性化、酸化バースト、溶血、線維素溶解、フィブリン形成、トロンビンの生成、接触活性化、および補体活性化を含むがこれらに限定されない、標準的な血液適合性の試験およびアッセイを使用して行われ得る。非破壊的方法には、天然組織の公知の値に外挿され得る、マトリックス内に存在する内皮細胞の密度を決定するための、CellTiter Blueまたはその他の代謝アッセイなどの増殖アッセイの使用が含まれ、ここでの目標は、天然組織の＞50%の内皮細胞密度を有することである。
【００７２】
脈管構造は＞300 mm Hgの圧力を支え得るため、内皮細胞の導入のための灌流圧は一般に、マトリックスまたは足場が由来した組織または臓器の天然灌流圧に+/- 300%の範囲内で相当する。
【００７３】
本明細書に記載される再内皮化された組織または臓器マトリックスは、レシピエントに移植することができる。そのような再内皮化された組織または臓器マトリックスは、血栓形成をほとんど示さず、かつ免疫原性をほとんど示さない。そのような再内皮化された組織また臓器マトリックスは、ひとたび移植されると、インビボでさらに再細胞化され得る。移植後、そのような再内皮化された組織または臓器マトリックスは、インビボで（すなわち、レシピエント由来の天然細胞により）再細胞化され得る。インビボの再細胞化は、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞（例えば、肝細胞、胆管上皮細胞、幹細胞、前駆細胞、iPS細胞、骨髄単核細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、心臓線維芽細胞、線維芽細胞、クフナー (kuffner) 細胞、骨格筋細胞、衛星細胞、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄細部細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞（肺細胞の気腔を裏打ちする）、膵管細胞（房心細胞）、β細胞、島細胞、細胞、間在細胞、腸刷子縁細胞（微絨毛を有する）、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣上体主細胞、間質腎細胞、および／または精巣上体基底細胞などの、組織または臓器特異的細胞）によるさらなる再内皮化および／または再細胞化を含み得る。
【００７４】
任意で、組織もしくは臓器マトリックスが再内皮化される前に、または組織もしくは臓器マトリックスが再内皮化された後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞により、組織または臓器マトリックスをインビトロで再細胞化することができる。本明細書で用いられる場合、「内皮細胞、内皮由来細胞、または内皮前駆細胞以外の」細胞とは、特定の組織または臓器に定着する他のすべての種類の細胞を指す。本明細書に記載される方法では、幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、胚性幹細胞 (ESC）、成体幹細胞、もしくは人工多能性幹 (iPS)）を用いて、組織もしくは臓器の実質を再細胞化することができ、または組織もしくは臓器特異的細胞（すなわち、分化細胞もしくは部分分化細胞）を用いて、組織もしくは臓器の実質を再細胞化することができる。組織または臓器特異的細胞を用いる場合、送達される細胞の特定の型は、典型的には、最終的に生成される組織または臓器の型に依存する。例えば、心臓を再細胞化する場合には、心筋細胞、平滑筋細胞、心臓線維芽細胞、および／または心臓幹細胞を、組織または臓器マトリックスの内部または表面に導入することができ；肝臓を再細胞化する場合には、肝細胞、胆管細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および／または肝細胞前駆細胞を、組織または臓器マトリックスの内部または表面に導入することができ；腎臓を再細胞化する場合には、有足細胞、糸球体細胞、および／または上皮細胞を、組織または臓器マトリックスの内部または表面に導入することができ；肺を再細胞化する場合には、上皮細胞、クララ細胞、杯細胞、I型肺胞細胞、および／またはII型肺胞細胞を、組織または臓器マトリックスの内部または表面に導入することができ；膵臓を再細胞化する場合には、β細胞および／または島細胞を、組織または臓器マトリックスの内部または表面に導入することができる。
【００７５】
内皮細胞または内皮前駆細胞と同様に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞も、（例えば、緩衝液、栄養素、酵素、成長または分化用培地を含む）生理的組成物中、組織または臓器マトリックスに送達することができ、多数の経路（例えば、注射（例えば、複数の部位における）、灌流、注入、および／または局所適用）を用いて送達または導入することができる。
【００７６】
組織または臓器マトリックスの再内皮化の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞が導入される態様においては、任意の他の細胞が送達される前に、組織または臓器マトリックスの脈管構造内に内皮細胞または内皮前駆細胞を、いくらかの時間、付着させ定着させることが有益であり得る。内皮細胞または内皮前駆細胞が組織または臓器マトリックスに付着するのに十分な時間は、例えば30〜180分である。しかしながら、内皮細胞または内皮前駆細胞を、最長で例えば28〜30日間（例えば、約1ヶ月間）、組織または臓器マトリックスに付着させ定着させることもできる。
【００７７】
臓器または組織を脱細胞化および／または再細胞化するための制御システム
臓器または組織を脱細胞化および／または再細胞化するためのシステム（例えばバイオリアクター）は一般に、臓器または組織にカニューレを挿入するための少なくとも1つのカニューレ処置装置、カニューレを通じて臓器または組織を灌流するための灌流装置、および臓器または組織の無菌環境を維持するための手段（例えば、封じ込めシステム）を含む。カニューレ装着および灌流は、当技術分野において周知の手法である。カニューレ処置装置は一般に、臓器または組織の血管、管、および／または腔に導入するのに適したサイズの中空管を含む。典型的には、臓器内の1つまたは複数の血管、管、および／または腔にカニューレが挿入される。灌流装置は、液体（例えば、細胞破壊培地）の保持容器、および1つまたは複数のカニューレを介して液体を臓器内で移動させるための機構（例えば、ポンプ、空気圧、重力）を含み得る。脱細胞化および／または再細胞化中の臓器または組織の無菌性は、気流の制御および濾過、ならびに／または、例えば、望ましくない微生物の増殖を防ぐための抗生物質、抗真菌剤、もしくはその他の抗菌剤による灌流などの、当技術分野において公知の種々の技法を用いて維持することができる。
【００７８】
本明細書に記載される臓器または組織を脱細胞化および再細胞化するためのシステムは、ある特定の灌流特性（例えば、圧力、体積、流動パターン、温度、ガス、pH）、機械力（例えば、心室壁の運動および応力）、ならびに電気刺激（例えば、ペーシング）をモニターする能力を有し得る。脱細胞化および再細胞化の過程において冠血管床が変化するため（例えば、血管抵抗、体積）、大幅な変動を回避するには圧力調節型灌流装置が有利である。灌流の有効性は、流出液および組織切片において評価することができる。灌流体積、流動パターン、温度、O2分圧およびCO2分圧、ならびにpHは、標準的な方法を用いてモニターすることができる。
【００７９】
センサーを使用して、システム（例えば、バイオリアクター）および／または臓器もしくは組織をモニターすることができる。ソノマイクロメトリー、マイクロマノメトリー、および／またはコンダクタンス測定を使用して、心筋壁の運動および性能に対する、圧力-体積または前負荷動員一回仕事量に関する情報を取得することができる。例えば、センサーを使用して、カニューレ装着された臓器もしくは組織中を移動する液体の圧力；システム内の周囲温度、および／または臓器もしくは組織の温度；カニューレ装着された臓器もしくは組織中を移動する液体のpHおよび／もしくは流速；ならびに／または再細胞化中の臓器もしくは組織の生物活性をモニターすることができる。このような特性をモニターするためのセンサーを有することに加えて、臓器または組織を脱細胞化および／または再細胞化するためのシステムはまた、このような特性を維持または調整するための手段を含み得る。このような特性を維持または調整するための手段は、温度計、サーモスタット、電極、圧力センサー、オーバーフローバルブ、液体の流速を変化させるためのバルブ、溶液のpHを変化させるために使用される溶液との流体接続を開閉するためのバルブ、バルーン、体外式ペースメーカー、および／またはコンプライアンスチャンバーなどの成分を含み得る。安定した状態（例えば、温度等）を確実にする支援をするために、チャンバー、リザーバー、および管類にウォータージャケットを取り付けることができる。
【００８０】
臓器または組織を生成するためのシステムは、プログラム可能なプロセッサーと組み合わされたコンピュータ可読記憶媒体によって制御することができる（例えば、本明細書で使用されるコンピュータ可読記憶媒体には、プログラム可能なプロセッサーに特定の段階を実行させるための命令が格納されている）。例えば、プログラム可能なプロセッサーと組み合わされたこのような記憶媒体は、センサーの1つまたは複数からの情報を受信し処理することができる。プログラム可能なプロセッサーと併用されるこのような記憶媒体はまた、情報および命令をバイオリアクターおよび／または臓器もしくは組織に返送することもできる。
【００８１】
再細胞化を起こしている臓器または組織を、生物活性についてモニターすることができる。生物活性は、臓器または組織自体のものであってよく、心臓組織の場合には、臓器または組織の電気的活性、機械的活性、機械的圧力、収縮性、および／または壁応力などである。加えて、臓器または組織に付着している細胞の生物活性を、例えば、イオン輸送／交換活性、細胞分裂、および／または細胞生存度についてモニターすることもできる。例えば、Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall)、およびCurrent Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons) を参照されたい。上述の通り、再細胞化中に臓器に対する能動負荷をシミュレートすることが有用であり得る。本発明のコンピュータ可読記憶媒体をプログラム可能なプロセッサーと併用することで、臓器または組織に対する能動負荷をモニターするおよび維持するのに必要な成分を連係させることができる。
【００８２】
1つの態様では、本明細書に記載されるコンピュータ可読記憶媒体に臓器または組織の重量を入力することができ、この記憶媒体はプログラム可能なプロセッサーと組み合わせることで、その特定の臓器または組織についての曝露時間および灌流圧を計算することができる。このような記憶媒体は、前負荷および後負荷（それぞれ灌流の前または後の圧力）ならびに流速を記録することができる。この態様において、例えば、プログラム可能なプロセッサーと組み合わされたコンピュータ可読記憶媒体は、1つまたは複数のポンプおよび／またはバルブ制御を介して、灌流圧、灌流方向、および／または灌流溶液の種類を調整することができる。
【００８３】
すべての出版物、特許、および特許出願が、参照により本明細書に組み入れられる。前述の明細書において、本発明がそのある好ましい態様に関して説明され、多くの詳細が説明目的で記載されてきたが、本発明に付加的な態様を受け入れる余地があること、および本明細書における詳細のいくらかが、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることは、当業者に明らかであろう。
【図１】
2018512172.tif 000002
【図２】
2018512172.tif 000003
【図３】
2018512172.tif 000004
【図４】
2018512172.tif 000005
【図５】
2018512172.tif 000006
【図６】
2018512172.tif 000007
【図７】
2018512172.tif 000008
【図８】
2018512172.tif 000009
【図９】
2018512172.tif 000010
【国際調査報告】
2018512172.tif 000011
2018512172.tif 000012
2018512172.tif 000013