(57)【要約】大規模レベルで細胞を培養及び製造する方法を開示する。特には、アルギネートポリマー製の中空ファイバーにおいて細胞を培養及び製造するための製造システム及びデバイス並びにこれらのシステム及びデバイスを使用する方法を提供する。【選択図】図１
2018534936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間に細胞を含む細胞溶液を浮遊させるステップと、
前記細胞を含む前記ファイバーを細胞培養培地に浮遊させるステップと、
前記細胞を培養するステップとを含む、様々な規模で細胞を製造する方法。
【請求項２】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーが、アルギネート酸ポリマー、アルギン酸ナトリウムポリマー、修飾アルギネートポリマー及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるアルギネートポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプを再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、Ｔ細胞、哺乳動物組織幹細胞、哺乳動物細胞株、インサート細胞、植物細胞、酵母及び細菌細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間から前記培養した細胞を解放するステップをさらに含み、前記解放するステップが前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）及びアルギネートリアーゼ溶液から成る群から選択される化学的溶剤を使用して前記ファイバーを化学的に溶解させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、機械的な力を用いて前記ファイバーを物理的に溶解させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶液及びアルギネート溶液を細胞適合性溶液内へと押し出し、前記細胞適合性溶液がアルギネートポリマーをアルギネートポリマー溶液内で架橋して中空アルギネートハイドロゲルファイバーを形成するステップと、
細胞を含む前記ファイバーを細胞培養培地又は細胞適合性バッファに浮遊させるステップと、
前記細胞を培養するステップとを含む、様々な規模で細胞を製造する方法。
【請求項８】
前記アルギネート溶液を、アルギネートポリマーを約０．０１〜約２０重量／体積％アルギネートポリマーの濃度で溶液に浮遊させることで調製する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞適合性溶液がカルシウムイオン及びバリウムイオンの１つ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーから前記培養した細胞を解放するステップをさらに含み、前記解放するステップが前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）及びアルギネートリアーゼ溶液から成る群から選択される化学的溶剤を使用して前記アルギネートハイドロゲルファイバーを化学的に溶解させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、機械的な力を用いて前記アルギネートハイドロゲルファイバーを物理的に溶解させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
第１インレット、第２インレット、コアチャネル、シェルチャネル及びアウトレットを備えたハウジングであって、前記第１インレットは細胞溶液を前記コアチャネルへと導入し、前記第２インレットはアルギネート溶液を前記シェルチャネルへと導入し、前記シェルチャネルは前記コアチャネルと流体的に接触しており、前記細胞溶液と前記アルギネート溶液との接触を可能にするハウジングと、
前記アウトレットで前記ハウジングと流体接触している細胞培養槽とを含み、前記細胞培養槽は細胞適合性バッファを含む、細胞を培養するためのシステム。
【請求項１４】
前記ハウジングが、前記アルギネート溶液を第２シェルチャネルに導入する第３インレットをさらに備える、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記細胞溶液が、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプを再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、Ｔ細胞、哺乳動物組織幹細胞、哺乳動物細胞株、インサート細胞、植物細胞、酵母及び細菌細胞から成る群から選択される細胞を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記アルギネート溶液が、アルギネート酸ポリマー、アルギン酸ナトリウムポリマー、修飾アルギネートポリマー及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるアルギネートポリマー材料を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１７】
前記アルギネート溶液が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
前記細胞適合性バッファがカルシウムイオン及びバリウムイオンの少なくとも一方を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１９】
前記細胞適合性バッファが、ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２の少なくとも一方を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第１インレット及び第２インレットの一方と流体連結している少なくとも１つのポンプをさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１１月２５日に出願の米国仮特許出願第６２／２６０１０９号の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の開示は参照により全て本願に明示的に援用される。
【０００２】
本開示は概して、アルギネートポリマー製の中空ハイドロゲルファイバーにおける細胞の培養及び製造に関する。より具体的には、本開示は、様々な規模、特には大規模なレベルでもって、多種多様な用途に使用可能な細胞を培養するための製造システム及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物の細胞には数多くの用途がある。幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びこれらの後代細胞（すなわち、幹細胞から分化した細胞）を含めたヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、変性疾患、外傷及びがんの治療に用いることができる。また、人工組織及び臓器の作製に使用できる。加えて、幹細胞及びその後代細胞は、疾患のモデリング、薬剤のスクリーニング並びに化学物質の有効性及び毒性の試験に用いることができる。哺乳動物の細胞はまた、研究室及び産業の両方において、組み換えタンパク質及びウイルスの発現に広く用いられている。これらのタンパク質及びウイルスの多くは診療所で用いられている。これらの用途では、高品質な細胞が大量に必要となる。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）又はＩ型糖尿病の患者の治療にはそれぞれ、約１０５個の生存ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、約１０９個の心筋細胞又は約１０９個のβ細胞が必要となる。加えて、初期にはそれよりずっと多くの細胞が必要となる。インビトロでの細胞培養収率及び続くインビボでの移植細胞の生存率は共に、通常、極めて低いからである。後者の例としては、齧歯類のモデルにおいては、移植から数ヶ月後に生き残っていたのは、移植したドーパミン作動性ニューロンの約６％又は注入した心筋細胞の約１％だけだったと報告されている。さらに、変性疾患又は臓器不全を抱えた患者人口は大きく、米国だけでも１００万人を超えるＰＤ患者、１００−２５０万人のＩ型糖尿病患者及び約８００万人のＭＩ患者が含まれる。また、組織工学等の用途では多数の細胞が必要であり、例えば人工のヒトの肝臓又は心臓にはそれぞれ約１０１０個の肝細胞又は心筋細胞が必要となる。加えて、１００万種の化合物ライブラリを１度スクリーニングするには約１０１０個の細胞が必要となる場合があり、またコンビナトリアルケミストリーにおける進歩、非翻訳ＲＮＡ並びに複雑なシグナル伝達及び転写ネットワークについての研究は、多数のターゲットに対してスクリーニングできる大型のライブラリを生みだしてきた。多数の哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）及びヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）も治療用バイオテクノロジー製品、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、酵素及びウイルス粒子の製造に必要である。
【０００４】
現在、費用効率高く幹細胞及びその後代細胞並びに初代細胞を特には大規模に製造できる方法は殆どない。最も広く用いられている、二次元表面上で細胞を培養する２Ｄ細胞培養システムは、その低い収率、不均質性、スケーラビリティ及び再現性により限界がある。例えば、表面積１ｃｍ２あたり約５００００個の心筋細胞しか培養できない。
【０００５】
上記の欠点から、製造をスケールアップするために、三次元（３Ｄ）浮遊細胞培養システム、例えばスピナーフラスコ及び撹拌槽バイオリアクタが広く研究さえている。しかしながら、浮遊培養物中の細胞スフェロイドは寄り集まって大きな細胞集塊物を形成することが多い。直径５００μｍを超える集塊物の中心（図１０Ａ）に位置する細胞への栄養分、酸素及び増殖因子、また細胞からの代謝廃棄物の輸送は不十分となり、緩慢な細胞増殖、アポトーシス及びコントロールできない分化につながることはよく知られている。培養物を撹拌又は振盪することで細胞の集塊は低減できるが、流体力学的応力も生じ、これは細胞生存率、増殖及び表現型に負に作用する。培養物における高い細胞密度もまた、細胞の集塊を促進する。これら全ての要因を考慮し、現行の浮遊培養研究においては、細胞を概して低密度（例えば、約３×１０５細胞／ｍＬ）で播種し、７０〜１２０回転／分（ｒｐｍ）で撹拌する。こういった最適化した条件下であっても、緩慢な細胞の成長、著しい細胞死、表現型の変化、ゲノム変異及び低容積収率は一般的である。例えば、ｈＰＳＣは典型的には４日で４倍伸展して約２．０×１０６細胞／ｍＬとなることが判明している。これらの細胞はバイオリアクタの容積の０．４％未満しか占めない。収率のこの低さは、細胞を大規模に製造するにあたっての経済的及び技術的双方の課題となる。
【０００６】
上記に基づき、当該分野においては、異なるタイプの細胞を様々な規模、特には大規模に費用効率高く製造できるロバストな細胞培養システムが必要とされている。このシステムは、研究施設及び産業の両方において有用となり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は概して、アルギネートポリマーの中空ハイドロゲルファイバーにおける哺乳動物細胞の培養及び製造を対象とする。より具体的には、本開示は、様々な規模、特には大規模なレベルでもって細胞を製造可能な培養システム及びデバイス、またアルギネートポリマー製の中空ハイドロゲルファイバーにおいて細胞を培養及び製造するためのシステム及びデバイスの使用方法を対象とする。
【０００８】
細胞培養システムとしての中空ハイドロゲルファイバーの使用は初期の細胞クラスタ形成を促進し、細胞への効率的な物質輸送を確実にし、細胞の流体力学的応力を取り除き、生存率が高い細胞の培養、高い細胞成長率及び高い容積収率（例えば、容積１ｍｌあたり最高５．０×１０８個の細胞を製造）を可能にする。これらの利点によりバイオリアクタの容積、製造時間及びコストは劇的に減少する。したがって、この新しい培養システムには、細胞製造を一変させる可能性がある。
【０００９】
１つの態様において、本開示は、様々な規模でもって細胞を製造する方法を対象とし、この方法は、アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間に細胞を含む細胞溶液を浮遊させ、細胞のはいった中空ファイバーを細胞培養培地に浮遊させ、細胞を培養することを含む。
【００１０】
別の態様において、本開示は、様々な規模でもって細胞を製造する方法を対象とし、この方法は、細胞溶液及びアルギネート溶液を細胞適合性溶液内へと押し出し、この細胞適合性溶液はアルギネートポリマーをアルギネートポリマー溶液内で架橋して中空アルギネートハイドロゲルファイバーを形成し；細胞がはいった中空ファイバーを細胞培養培地又は細胞適合性バッファに浮遊させ、細胞を培養することを含む。
【００１１】
別の態様において、本開示は、細胞を培養するためのシステムを対象とする。このシステムは、第１インレット、第２インレット、コアチャネル、シェルチャネル及びアウトレットを備えたハウジングであって、第１インレットは細胞溶液をコアチャネルへと導入し、第２インレットはアルギネート溶液をシェルチャネルへと導入し、シェルチャネルはコアチャネルと流体的に接触しており、細胞溶液とアルギネート溶液との接触を可能にするハウジングと、アウトレットでハウジングと流体接触している細胞培養槽とを含み、細胞培養槽は細胞適合性バッファを含む。
【００１２】
本開示において、本方法は、驚くべきことに、多種多様な細胞を大規模なレベルでもって培養できると判明している。本明細書において、「大きい」又は「大規模な」とは約１０７〜約１０１５個の細胞、約１０７〜約１０１２個の細胞を含めた約１０７〜約１０３０個の細胞生産量を指す。本開示の方法及び製造システムは再生医療に大きな影響を与えるが、これは高品質で手頃な価格の細胞を十分供給できるからである。さらに、本発明のシステム及び方法は、組み換えタンパク質及びウイルスを製造するためのより手頃な方法を提供することでバイオ医薬品産業に有利な影響をもたらす。
【００１３】
以下の詳細な説明を考慮すると本開示がより理解でき、上記のもの以外の特徴、態様及び利点が明らかとなる。そのような詳細な説明では以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】中空アルギネートハイドロゲルファイバーを加工するための本開示のデバイスの概略図である。
【図２】中空アルギネートハイドロゲルファイバーを加工するための本開示のデバイス例を描いたものである。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内で細胞を培養するための本開示の方法ステップの概略図である。図３Ａでは、中空アルギネートハイドロゲルファイバーの培地を充填した空間で培養されている細胞を描いている。細胞の入ったファイバーを細胞培養槽又はバイオリアクタ内の細胞培養培地に浮遊させる。細胞を中空ファイバー内で伸展させ（図３Ｂ）、回収し（図３Ｃ）又は分化させる（図３Ｄ）。中空ファイバー内の細胞は、組み換えタンパク質及びウイルスの製造にも使用できる（図３Ｅ）。
【図４】本開示で開示する、細胞培養培地に浮遊させた細胞が入った中空アルギネートハイドロゲルファイバーを描いたものである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、中空ハイドロゲルファイバーにおける幹細胞の培養を描いたものである。Ｈ９ヒト胚性幹細胞（図５Ａ）、人工ヒト多能性幹細胞、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ（ヒト間葉系幹細胞から作製されたｉＰＳＣ）（図５Ｂ）及びＦｉｂ−ｉＰＳＣ（ヒト線維芽細胞から作製されたｉＰＳＣ）（図５Ｃ）を示す。細胞を中空ファイバー内で８日間にわたって培養し、その間、細胞は単細胞から大きな凝集体へと成長した。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、皮質ニューロン（図６Ａ〜６Ｃ）及びドーパミン作動性ニューロン（図６Ｄ〜６Ｆ）に分化したヒトｉＰＳＣを描いたものである。図６及び６Ｂは、３０日目の中空アルギネートハイドロゲルファイバー内の皮質ニューロンのフェーズ画像である。図６Ｄ及び６Ｅは、３０日目の中空ファイバー内のドーパミン作動性ニューロンのフェーズ画像である。図６Ｃ及び６Ｆは、３０日目の対応するニューロンに分化したヒトｉＰＳＣの免疫染色を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内で培養したヒトグリオブラストーマ幹細胞を示す。図７Ａは、７日間にわたって中空ファイバー内で培養した細胞株Ｌ０を示す。図７Ｂは、７日間にわたって中空ファイバー内で培養した細胞株Ｌ１を示す。図７Ｃは、７日間にわたって中空ファイバー内で培養した細胞株Ｌ２を示す。細胞は単細胞から大きな凝集体へと成長した。
【図８】組み換えＷｎｔ３Ａタンパク質を製造するための、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内で培養したマウスＬ細胞を示す。Ｗｎｔ３Ａタンパク質を安定して発現しているＬ細胞を、６日間にわたって中空ファイバー内で培養した。細胞は６日目で高密度凝集体へと成長した。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｊは、実施例５で分析する中空アルギネートハイドロゲルファイバー細胞培養システム（「細胞培養システム」）を示す。図９Ａ及び９Ｂは、１本の中空ファイバーを加工するための自家製マイクロエクストルーダを示す。単細胞を含有するヒアルロン酸（ＨＡ）溶液及びアルギネート溶液をマイクロエクストルーダの中央及び側方チャネルにそれぞれポンプ輸送することで同軸コアシェル流れを作り出し、この流れは１００ｍＭ  ＣａＣｌ２バッファ中に押し出され、これによりアルギネートは架橋されてハイドロゲルシェルを形成し、１本の中空ファイバーとなる。続いて、ＣａＣｌ２バッファを細胞培養培地と交換し、細胞を浮遊させ、中空ファイバーのコアマイクロスペース内で成長させる。
【図９Ｂ】図９Ａ及び９Ｂは、１本の中空ファイバーを加工するための自家製マイクロエクストルーダを示す。単細胞を含有するヒアルロン酸（ＨＡ）溶液及びアルギネート溶液をマイクロエクストルーダの中央及び側方チャネルにそれぞれポンプ輸送することで同軸コアシェル流れを作り出し、この流れは１００ｍＭ  ＣａＣｌ２バッファ中に押し出され、これによりアルギネートは架橋されてハイドロゲルシェルを形成し、１本の中空ファイバーとなる。続いて、ＣａＣｌ２バッファを細胞培養培地と交換し、細胞を浮遊させ、中空ファイバーのコアマイクロスペース内で成長させる。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＣａＣｌ２バッファ中の新たに作製された中空ファイバーを示す。
【図９Ｄ】図９Ｄ〜９Ｆは、同時に９本の中空ファイバーを加工するための９個のノズルを備えたマイクロエクストルーダを示す。
【図９Ｅ】図９Ｄ〜９Ｆは、同時に９本の中空ファイバーを加工するための９個のノズルを備えたマイクロエクストルーダを示す。
【図９Ｆ】図９Ｄ〜９Ｆは、同時に９本の中空ファイバーを加工するための９個のノズルを備えたマイクロエクストルーダを示す。
【図９Ｇ】図９Ｇは、欠陥のない中空ファイバーを加工するためにはＨＡが必要であることを示す。ＨＡがないと（−ＨＡ）、非対称のシェル又はビーズがあるファイバーが形成される。スケールバー：（図９Ｇ、９Ｉ及び９Ｊ）２００μｍ。
【図９Ｈ】図９Ｈは、細胞培養システム内で細胞が成長している中空アルギネートハイドロゲルファイバーを描いたものである。何時間かで単細胞は会合して小さな細胞クラスタ（すなわち、初期のクラスタ形成）を形成する。続いて、細胞は増殖し、小さな細胞クラスタはスフェロイドとして伸展し、最終的には合体して円筒形の細胞塊を形成する。細胞塊の直径を５００μｍ未満に制御することで細胞塊における効率的な物質輸送を確保する。ＤＩＯ及びＤＩＤ色素で染色したそれぞれ緑色及び赤色の蛍光色に見えるＨ９  ｈＥＳＣの２つのバイアルを１：１で混合し、細胞培養システムで培養した。単細胞（０日目）、小さな細胞クラスタ（１日目）、円筒形の細胞塊（９日目）がはっきりと見てとれた。スケールバー：（図９Ｇ、９Ｉ及び９Ｊ）２００μｍ。
【図９Ｉ】細胞培養システム内で細胞が成長している中空アルギネートハイドロゲルファイバーを描いたものである。何時間かで単細胞は会合して小さな細胞クラスタ（すなわち、初期のクラスタ形成）を形成する。続いて、細胞は増殖し、小さな細胞クラスタはスフェロイドとして伸展し、最終的には合体して円筒形の細胞塊を形成する。細胞塊の直径を５００μｍ未満に制御することで細胞塊における効率的な物質輸送を確保する。ＤＩＯ及びＤＩＤ色素で染色したそれぞれ緑色及び赤色の蛍光色に見えるＨ９  ｈＥＳＣの２つのバイアルを１：１で混合し、細胞培養システムで培養した。単細胞（０日目）、小さな細胞クラスタ（１日目）、円筒形の細胞塊（９日目）がはっきりと見てとれた。スケールバー：（図９Ｇ、９Ｉ及び９Ｊ）２００μｍ。
【図９Ｊ】図９Ｊは、初期細胞の生存に必要なＲＯＣＫ阻害剤（ＲＩ）を示す。生細胞／死細胞染色から、ＲＩなしでは（−ＲＩ）、２４時間後には細胞の大半がアポトーシスを起こしたことがわかった。ＲＩがあると（＋ＲＩ）細胞は生存し、よく成長した。スケールバー：（図９Ｇ、９Ｉ及び９Ｊ）２００μｍ。
【図１０】図１０Ａは、現行の３Ｄ浮遊培養においては（例えば、スピナーフラスコ又は撹拌槽バイオリアクタ）、２４時間以内に単一のｈＰＳＣが会合して小さな細胞クラスタを形成し（すなわち、初期のクラスタ形成フェーズ）、続いてスフェロイドに伸展した（すなわち、細胞伸展フェーズ）ことを示す。細胞及びスフェロイドは互いに融合して大きな集塊物を形成することが多い。図１０Ｂでは細胞の集塊を実験で確認しており、ＤＩＯ及びＤＩＤ色素でそれぞれ染色したＨ９  ｈＥＳＣの２つのバイアルを１：１で混合し、浮遊培養した。脂溶性のＤＩＯ及びＤＩＤ色素は、細胞を、蛍光顕微鏡下でそれぞれ緑色及び赤色に見えるように染色した。単細胞（０日目）、緑色及び赤色両方の細胞の小さなクラスタ（１日目）、緑色及び赤色両方の細胞のスフェロイド及び集塊物（４日目）がはっきりと見てとれた。スケールバー：１００μｍ。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞培養システムにおける、アルギネートハイドロゲルの形成がｈＰＳＣ培養に与える影響を示す。Ｈ９  ｈＥＳＣを、様々な粘度又は分子量（５００〜６００ｃｐ、３００〜４００ｃｐ及び８０〜１２０ｃｐ）のＳｉｇｍａ（＃Ａ２０３３〜１００Ｇ）又はＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの２％アルギネートから加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバー（内径：約４００μｍ、シェル厚さ：約４０μｍ）内で９日間にわたって培養した。図１１Ａは、中空ファイバー内の０日目のＨ９単細胞及び４日目のＨ９スフェロイドを写したフェーズ画像である。スケールバー：（図１１Ａ及び１１Ｂ）４００μｍ；（図１１Ｃ）５０μｍ。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、生細胞／死細胞染色により中空ファイバー内に死細胞が殆どないことが判明したことを示している。スケールバー：（図１１Ａ及び１１Ｂ）４００μｍ；（図１１Ｃ）５０μｍ。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。矢印は分化したＯｃｔ４−細胞を指し示す。スケールバー：（図１１Ａ及び１１Ｂ）４００μｍ；（図１１Ｃ）５０μｍ。
【図１１Ｄ】図１１Ｄ及び１１Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。＊＊＊は、ｐ＜０．００１のレベルでの統計学的有意を示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｄ及び１１Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。＊＊＊は、ｐ＜０．００１のレベルでの統計学的有意を示す。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。＊＊＊は、ｐ＜０．００１のレベルでの統計学的有意を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｅは、アルギネートハイドロゲルの組成が細胞培養システムにおけるｈＰＳＣ培養に及ぼす影響を示す。Ｈ９を９日間にわたって、１％、１．５％又は２％のＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓのアルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバー（内径：約４００μｍ、シェル厚さ：約４０μｍ）内で培養した。図１２Ａは中空ファイバー内の０、１及び８日目の細胞のフェーズ画像である。スケールバー：（図１２Ａ）４００μｍ；（図１２Ｄ）５０μｍ。
【図１２Ｂ】図１２Ｂ及び１２Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１２Ｃ】図１２Ｂ及び１２Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。スケールバー：（図１２Ａ）４００μｍ；（図１２Ｄ）５０μｍ。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ−１３Ｇは、細胞培養システムにおいてハイドロゲルシェルの厚さがｈＰＳＣ培養に及ぼす影響を示す。Ｈ９を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した、シェル厚さ３０、４０、７０又は９０μｍの中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて９日間にわたって培養した。図１３Ａでは、細胞溶液及びアルギネート溶液の容積流量並びにファイバー外径に基づいてシェル厚さを予測するための等式を示す。図１３Ｂは、実験的シェル厚さが予測データによくフィットすることを示す。図１３Ｃは、０日目の、様々なシェル厚さを有する中空ファイバーにおける細胞のフェーズ画像を示す。図１３Ｄ及び１３Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。図１３Ｆは、１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。図１３Ｇは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。スケールバー：（図１３Ｃ）２００μｍ；（図１３Ｄ）５０μｍ。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実験的シェル厚さが予測データによくフィットすることを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、０日目の、様々なシェル厚さを有する中空ファイバーにおける細胞のフェーズ画像を示す。スケールバー：（図１３Ｃ）２００μｍ；（図１３Ｄ）５０μｍ。
【図１３Ｄ】図１３Ｄ及び１３Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。スケールバー：（図１３Ｃ）２００μｍ；（図１３Ｄ）５０μｍ。
【図１３Ｅ】図１３Ｄ及び１３Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｅは、細胞培養システムにおいて中空ファイバーの内径がｈＰＳＣ培養に及ぼす影響を示す。Ｈ９を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した、内径４００、２５０又は１２０μｍの中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて９日間にわたって培養した。図１４Ａは、中空ファイバーにおける０、１、５及び８日目の細胞のフェーズ画像である。スケールバー：（図１４Ａ）４００ｐｍ；（図１４Ｄ）５０ｐｍ。
【図１４Ｂ】図１４Ｂ及び１４Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ｂ及び１４Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。スケールバー：（図１４Ａ）４００ｐｍ；（図１４Ｄ）５０ｐｍ。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｆは、細胞培養システムにおいてリキッドコアニッシェがｈＰＳＣ培養に及ぼす影響を示す。Ｈ９を、３％メチルセルロース（ＭＣ）、１％ヒアルロン酸（ＨＡ）、２％ＨＡ、２％ＨＡ＋１μｇ／ｍＬフィブロネクチン＋０．５μｇ／ｍＬラミニン又は２％ＨＡ＋ＳｔｅｍＢｅａｄを含む様々なコアリキッド組成でＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて９日間にわたって培養した。図１５Ａは、０及び３日目の細胞のフェーズ画像である。スケールバー：（図１５Ａ＆１５Ｂ）４００μｍ；（図１５Ｃ）５０μｍ。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、生細胞／死細胞染色により中空ファイバー内に死細胞は殆どなかったことが判明したことを示す。スケールバー：（図１５Ａ＆１５Ｂ）４００μｍ；（図１５Ｃ）５０μｍ。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。スケールバー：（図１５Ａ＆１５Ｂ）４００μｍ；（図１５Ｃ）５０μｍ。
【図１５Ｄ】図１５Ｄ及び１５Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１５Ｅ】図１５Ｄ及び１５Ｅは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｅは、細胞培養システムにおいて細胞播種密度がｈＰＳＣ培養に及ぼす影響を示す。Ｈ９を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて９日間にわたって培養した。図１６Ａは、中空ファイバーにおける細胞のフェーズ画像である。２４時間後、細胞クラスタは播種密度が高いほど大きかったが、クラスタの数は同様であった。スケールバー：（図１６Ａ）４００μｍ；（図１６Ｄ）５０μｍ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、５、７及び９日目の伸展倍率はｈＰＳＣがより低い播種密度でより速く成長し、同時に９日目の最終容積収率が極めて近かったことを示している（図１６Ｃ）。＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの統計的有意を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１６Ｃ】図１６Ｂは、５、７及び９日目の伸展倍率はｈＰＳＣがより低い播種密度でより速く成長し、同時に９日目の最終容積収率が極めて近かったことを示している（図１６Ｃ）。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を９日目に中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。スケールバー：（図１６Ａ）４００μｍ；（図１６Ｄ）５０μｍ。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、培養から９日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｆは、超低播種密度での細胞培養システムにおけるｈＰＳＣの培養を示す。Ｈ９を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて、１．０×、３．０×又は５．０×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。図１７Ａは、幾つかのＨ９が中空ファイバー内で円筒形の細胞塊に成長したことを示すフェーズ画像である。スケールバー：（図１７Ａ及び１７Ｂ）４００μｍ；（図１７Ｅ）５０μｍ。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、生細胞／死細胞染色により死細胞は殆どなかったことが判明したことを示す。スケールバー：（図１７Ａ及び１７Ｂ）４００μｍ；（図１７Ｅ）５０μｍ。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、培養の様々な時期でのＨ９を伴う１本のファイバーを示す画像である。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、最終的な容積収率が全ての播種密度で近似していたことを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、１０日目の細胞でのＯｃｔ４染色を示す。Ｈ９を中空ファイバーから解放し、マトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。スケールバー：（図１７Ａ及び１７Ｂ）４００μｍ；（図１７Ｅ）５０μｍ。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、培養から１０日後のＯｃｔ４＋細胞のパーセンテージを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｄは、細胞培養システムにおけるｈＰＳＣの継代１培養を示す。Ｈ９、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣをＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて培養した。図１８Ａはフェーズ画像及び細胞培養システムにおけるｈＰＳＣの生細胞／死細胞染色を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂ及び１８Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１８Ｃ】図１８Ｂ及び１８Ｃは、５、７及び９日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、９日目の細胞塊を固定及び多能性マーカー：Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について染色したことを示す。円筒形細胞塊の様々な切片の画像を示す。同様の結果が、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣについて得られた。スケールバー：４００μｍ。
【図１９Ａ】図１９Ａ及び１９Ｆは、細胞培養システムにおけるｈＰＳＣの長期培養を示す。Ｈ９、Ｆｉｂ−ｉＰＳＣ及びＭＳＣ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。図１９Ａは、１０継代目での中空ファイバーにおける０、３及び５日目の細胞のフェーズ画像である。スケールバー（図１９Ａ及び１９Ｂ）：４００μｍ；（図１９Ｅ）２００μｍ。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、生細胞／死細胞染色により１０継代目で中空ファイバー内に死細胞は殆どなかったことが判明したことを示す。スケールバー（図１９Ａ及び１９Ｂ）：４００μｍ；（図１９Ｅ）２００μｍ。
【図１９Ｃ】図１９Ｃ及び１９Ｄは、１０継代目での５、７及び９日目のｈＰＳＣの伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１９Ｄ】図１９Ｃ及び１９Ｄは、１０継代目での５、７及び９日目のｈＰＳＣの伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、１０継代目での９日目の細胞塊における多能性マーカー：Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現を示す。スケールバー（図１９Ａ及び１９Ｂ）：４００μｍ；（図１９Ｅ）２００μｍ。
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、１０継代目の細胞の約９５％がＯｃｔ４及びＮａｎｏｇを発現したことを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１９Ｇ】図１９Ｇは、１．０×１０７細胞／ｍＬで播種した場合、ｈＰＳＣは、長期培養の間、継代ごと、５日毎に約１５倍一貫して伸展した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。Ｈ９を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。細胞は、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと胚様体アッセイ（ＥＢ）アッセイにおいて分化し（図２０Ａ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマ（図２０Ｂ）を形成し、正常な核型（図２０Ｃ）を有した。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。
【図２０Ｂ】細胞は、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと胚様体アッセイ（ＥＢ）アッセイにおいて分化し（図２０Ａ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマ（図２０Ｂ）を形成し、正常な核型（図２０Ｃ）を有した。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。
【図２０Ｃ】細胞は、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと胚様体アッセイ（ＥＢ）アッセイにおいて分化し（図２０Ａ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマ（図２０Ｂ）を形成し、正常な核型（図２０Ｃ）を有した。
【図２０Ｄ】中胚葉（図２０Ｄ）又は内胚葉（図２０Ｅ）又は心筋細胞（図２０Ｆ）分化培地におけるさらなる培養により、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内のｈＰＳＣは対応するブラキュリ＋中胚葉又はＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞又はｃＴＮＴ＋心筋細胞に高い効率で分化できた。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。
【図２０Ｅ】中胚葉（図２０Ｄ）又は内胚葉（図２０Ｅ）又は心筋細胞（図２０Ｆ）分化培地におけるさらなる培養により、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内のｈＰＳＣは対応するブラキュリ＋中胚葉又はＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞又はｃＴＮＴ＋心筋細胞に高い効率で分化できた。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。
【図２０Ｆ】中胚葉（図２０Ｄ）又は内胚葉（図２０Ｅ）又は心筋細胞（図２０Ｆ）分化培地におけるさらなる培養により、中空アルギネートハイドロゲルファイバー内のｈＰＳＣは対応するブラキュリ＋中胚葉又はＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞又はｃＴＮＴ＋心筋細胞に高い効率で分化できた。スケールバー：（図２０Ａ及び２０Ｂ）１００μｍ；（図２０Ｄ〜２０Ｆ）２００μｍ。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。両細胞は、ＥＢアッセイにおいて、ネスチン＋外胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びＦＯＸＡ２＋内胚葉細胞へと分化し（図２１Ａ及び２１Ｂ）、３つの胚葉組織を含むテラトーマを形成し（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、正常な核型（図２１Ｅ及び２１Ｆ）を有した。スケールバー：１００μｍ。
【図２２】ｈＰＳＣが細胞培養システムにおける長期培養後も多能性を維持したことを示す。Ｈ９、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ及びＦｉｂ−ｉＰＳＣを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの１．５％アルギネート（８０〜１２０ｃｐ）から加工した中空ファイバーにおいて１０継代にわたって培養した。これらの細胞を、マトリゲル被覆プレート上でさらに培養した。マトリゲル被覆プレート上で１継代後に多能性マーカーＯｃｔ４を発現するｈＰＳＣコロニーの画像を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｆは、中空アルギネートハイドロゲルファイバーを入れたプロトタイプバイオリアクタを示す。図２３Ａは、円筒形コンテナに浮遊させた細胞の入った中空ファイバーを示す。培地をプラスチック製のベローに入れ、それぞれベローを押して培地をコンテナ内に送り出す又は開放してコンテナから培地を抜き出すことができた。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ベローを押す及び開放するためのメカニカルステージ；押し出し及び開放速度、また押し出しと解放との間隔、またコンテナ及びベローについてプログラム可能なコントローラの画像である。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、１０日目のバイオリアクタにおける円筒形で白色の細胞塊の画像である。スケールバー（図２３Ｃ）１ｃｍ；（図２３Ｅ）２００μｍ。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、１．０×１０９個の細胞が２．０ｍＬの中空ファイバーで製造されたことを示す。
【図２３Ｅ】図２３Ｅ及び２３Ｆは、これらの細胞が多能性マーカー：Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４及びＡＬＰを発現したことを示す。スケールバー（図２３Ｃ）１ｃｍ；（図２３Ｅ）２００μｍ。
【図２３Ｆ】図２３Ｅ及び２３Ｆは、これらの細胞が多能性マーカー：Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４及びＡＬＰを発現したことを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｅは、細胞培養システムにおける、Ｗｎｔ３ａタンパク質を発現するように操作したＬ−Ｗｎｔ−３Ａ−細胞の培養を示す。細胞を、１．０×又は２．０×１０７細胞／ｍＬの播種密度でもって細胞培養システムにおいて培養した。図２４Ａは、中空ファイバー内の細胞のフェーズ画像を示す。スケールバー：（図２４Ａ及び２４Ｂ）：４００μｍ。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、生細胞／死細胞染色により死細胞は殆どなかったことが判明したことを示す。スケールバー：（図２４Ａ及び２４Ｂ）：４００μｍ。
【図２４Ｃ】図２４Ｃ及び２４Ｄは、２及び６日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２４Ｄ】図２４Ｃ及び２４Ｄは、２及び６日目の伸展倍率及び容積収率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２４Ｅ】図２４Ｅは、１６日間にわたる培養の間、Ｗｎｔ３ａタンパク質が一貫して発現したことを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｅは、細胞培養システムのためのプロトタイプバイオリアクタを示す。細胞の入った中空ファイバーを閉鎖した細胞培養チャンバに収容した。培地をフラスコに入れ、チャンバへと連続的に潅流させた。図２５Ｃは、１０ｃｍディッシュにおける円筒形で白色の細胞塊（１０日目にバイオリアクタから回収した）の画像である。図２５Ｄ及び２５Ｅは、１００本の中空ファイバーを同時に処理するための１００個のノズルを備えたエクストルーダを示す。
【発明する実施するための形態】
【００１５】
開示は多様な改変及び代替形態をとり得て、図ではその具体的な実施形態を例として示し、本明細書において以下、詳細に説明している。しかしながら、具体的な実施形態の説明が開示内容を限定することを目的としたものではなく、添付の請求項により定義される開示の趣旨及び範囲内に入る全ての改変、等価物及び代替物をその範囲に含むものと理解すべきである。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的な用語は、本開示が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価であるいかなる方法及び材料も本開示の実施又は試験に使用できるものの、好ましい方法及び材料は後述する通りである。
【００１７】
本開示では、本方法は、驚くべきことに細胞を大規模レベルで培養及び製造することができると判明している。特に、本開示は、アルギネートポリマーの中空ファイバーにおいて細胞を培養及び製造するための製造システム及びデバイス、またこれらのシステム及びデバイスを使用する方法を提供する。
【００１８】
細胞の製造／培養方法
本開示の方法は、様々な規模で細胞を培養及び製造するのに使用し得る。本方法は、慣用の細胞培養方法と比較して、少なくとも以下の利点を有する：（１）大規模細胞培養ができる、（２）高密度細胞培養により細胞培養に必要な空間、手間及び材料を削減できる、（３）様々なタイプの細胞を培養することができる、（４）より安価且つ効率的なやり方で細胞を製造できる。本明細書に記載の方法及びシステムを使用して培養及び製造できるそのような細胞の非限定的な例には哺乳動物の細胞、インサート細胞（例えば、ドロソフィラＳ２細胞）、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞が含まれる。哺乳動物、特にはヒト多能性幹細胞を使用してより詳しく説明するが、本明細書に記載の方法及びシステムは、本開示の範囲から逸脱することなく上記のタイプの細胞のいずれでも使用できることを認識すべきである。
【００１９】
本明細書において、「哺乳動物細胞」とはヒト及び動物由来の両方の細胞のことである。本開示の方法及びシステムで使用するのに特に適した哺乳動物の細胞には、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプ（例えば、ヒト線維芽細胞を再プログラムしたヒトニューロン）を再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、Ｔ細胞）、哺乳動物組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、胎性神経幹細胞）、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が含まれる。
【００２０】
概して、本開示の方法は、中空ハイドロゲルファイバー内の液状培地を充填した空間内に細胞を浮遊させ、細胞培養培地内で中空ファイバーを浮遊させることで細胞を伸展及び／又は分化させ、細胞を回収することを含む。
【００２１】
細胞を細胞培養培地又は細胞適合性バッファ内に浮遊させることで細胞溶液を調製する。細胞培養培地は細胞タイプに依存する。適切には、細胞は、１ｍｌ３あたり１〜数１０億個の細胞の濃度で培地に浮遊させる。
【００２２】
中空ファイバーはアルギネートポリマー材料から作製する。ファイバーの作製に使用するのに適したアルギネートポリマー材料には全ての市販の又は自家精製アルギネートポリマー、例えばＳｉｇｍａ（＋Ｗ２０１５０２）のアルギネート酸又はアルギン酸ナトリウム、修飾アルギネートポリマー、例えばメタクリレート修飾アルギネート及びこれらの組み合わせが含まれる。本明細書において、「これらの組み合わせ」とは、ポリマー混合物及びポリマーブレンドのことである。さらに、一部の実施形態においては、ヒアルロン酸等の他のポリマーをアルギネートポリマーにブレンド又は組み入れることでアルギネートハイドロゲルをドープできる。ファイバーを作製するためには、アルギネートポリマーをまず水又は細胞適合性バッファに溶解させることで約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含むアルギネート溶液を調製する。特に適切な態様においては、次にファイバーを作製し、エクストルーダを使用して細胞を充填する。押出条件は、特定の細胞生存率及び成長に適した、当該分野で公知のものになる。
【００２３】
例えば、図１及び２に示すように、細胞を含む細胞溶液を第１インレット１００から供給し、アルギネート溶液を少なくとも第２インレット（図１においてはインレット１０２、１０４として示す）から供給する。細胞溶液を含む第１流れとアルギネート溶液を含む第２流れの両方を、アルギネートポリマーをアルギネート溶液内で架橋できるカルシウムイオン又は他のイオン若しくは化学物質、例えばバリウムイオンを含有する細胞適合性溶液へと押し出す。細胞適合溶液はアルギネートポリマーを一瞬で架橋することができ、アルギネート溶液はゲル化して中空ファイバーが形成される。典型的には、ファイバーは約１〜３０分で十分に架橋される。
【００２４】
典型的には、形成時、中空ファイバーを特定の細胞及び所望の細胞伸展量に合わせてサイズ調節する。ファイバーは、典型的にはミリメートルからメートルの範囲の長さを有し得る。加えて、中空ハイドロゲルファイバーの外径及び内径はマイクロメートルからミリメートルになり得る。
【００２５】
一旦十分な架橋が行われて中空ファイバーが形成されたならば、細胞適合性溶液を除去し、細胞培養培地を培養物に添加して、現在は架橋された中空アルギネートハイドロゲルファイバー内にある細胞を培養する。幾つかの態様においては、細胞を含むファイバーを、細胞培養槽又はバイオリアクタ内の細胞培養培地に浮遊させる。細胞培養培地は、細胞の生存、成長及び分化の支援に適した、細胞培養分野で公知の任意の培地になり得る。典型的には、細胞培養培地は、以下に限定するものではないが、炭素源、窒素源及び成長因子を含む。架橋中空アルギネートハイドロゲルファイバー内での細胞の培養に使用するための具体的な細胞培養培地は、培養する細胞タイプに左右される。
【００２６】
細胞培養条件は、細胞タイプ、細胞伸展量及び所望する細胞数に左右される。一旦十分な細胞伸展及び所望の細胞数に達したら、細胞を継代し、続く成長及び伸展のために新しい架橋中空アルギネートハイドロゲルファイバー内に播種する。あるいは、伸展させた細胞を、中空空間内で最終的な所望の細胞タイプに分化させることができる。
【００２７】
最後に、ファイバーを化学的又は物理的に溶解させることで細胞をファイバーの中空空間から解放する。一態様において、ファイバーは、化学的溶剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）又はアルギネートリアーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を使用して溶解させる。別の態様において、ファイバーは機械的な力を用いて溶解させる。中空ファイバー内での細胞の持続時間は典型的には数日から数ヶ月である。
【００２８】
細胞は、研究所及び産業の両方で有用である。小規模及び大規模の細胞を、実験及び産業用途向けにそれぞれシステムで製造できる。細胞は、変性疾患及び外傷治療、薬剤スクリーニング、タンパク質の発現等で使用するために、サイズ及び数において効率的且つ効果的に用意できる。加えて、細胞はタンパク質及びワクチンの製造に使用できる。さらに別の態様において、細胞は組織工学に使用できる。
【００２９】
アルギネート中空ファイバーを加工するためのシステム／デバイス
別の態様において、本開示は、中空空間に細胞を浮遊させたアルギネートポリマーの中空ファイバーを加工するためのデバイスを対象とする。概して、図１を参照するが、デバイス１はハウジング２を含み、ハウジング２はその中心を下に通るコアチャネル１０６を含む。コアチャネルは、細胞をハウジング２に導入するための第１インレット１００につながる。デバイス１のハウジング２はさらに、第２インレット１０４、１０２を介して導入されたアルギネート溶液をハウジング２に流すためのシェルチャネル１０８、１１０をさらに含む。２本のシェルチャネルを図示しているが、ハウジングはより少ない又は多いシェルチャネル、例えば１本のシェルチャネル又は３、４、５若しくはそれ以上の本数のシェルチャネルを、本開示の範囲から逸脱することなく含み得ることを理解すべきである。幾つかの特に適切な実施形態において、インレット１００、１０２、１０４には、細胞及びアルギネート溶液の流れをデバイス１のハウジング２内に押し出すためのポンプ（図示せず）が含まれる。
【００３０】
デバイス１のチャネル１０６のアウトレットは細胞適合性バッファが入った細胞培養槽又はバイオリアクタ１１２と接触し、ハウジング２及び細胞培養槽又はバイオリアクタ１１２を含むシステムを構成している。槽１１２は、上述したようにアルギネートポリマーをアルギネート溶液内で架橋して溶液をゲル化させてファイバーを形成させることができるカルシウムイオン又は他のイオン又は他の化学物質を含むバッファ１１４を含む。
【００３１】
開示は、以下の非限定的な実施例を考察することでより完全に理解できる。
【実施例】
【００３２】
特段の定めがない限り、中空ファイバーは上述した通りに作製した。
【００３３】
実施例１
本実施例において、中空ファイバーにおけるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳＣ）を含めたヒト多能性幹細胞の伸展及び成長を８日間にわたって分析した。
【００３４】
単一ヒト胚性幹細胞（Ｈ９、ＷｉＣｅｌｌ）（図５Ａ）又はヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ｉＰＳＣ）（図５Ｂ）又はヒト皮膚線維芽細胞（Ｆｉｂ−ｉＰＳＣ）（図５Ｃ）から再プログラムした人工ヒト多能性幹細胞を、密度１×１０６細胞／ｍｌで、０．５％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、１．２％（ｗ／ｖ）アルギネートの濃度に達するまで０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ（例えば、図１及び２を参照のこと）でもって、１０ｍｌの細胞溶液及び１０ｍｌのアルギネート溶液を、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する室温の１００ｍｌの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをＣａＣｌ２溶液内で５分間にわたって室温で架橋させた。ＣａＣｌ２溶液を除去し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地と置き換えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、空気９５％、１気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて、培地に浮遊させた中空ファイバー内で８日間にわたって培養した。単細胞は細胞凝集体へと成長した。細胞を回収するために、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を除去し、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）又は４０ｍｇ／ｍｌアルギネートリアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含有する３７℃のＰＢＳと１０分間にわたって置き替えた。アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させ、細胞を回収した。これらの細胞凝集体を、３７℃のＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１０分間にわたって処理することで単細胞に分離した。細胞は、２回目の伸展のためにアルギネート中空ファイバー内へと加工することができる。図５Ａ〜５Ｃに示すように、細胞は、中空ファイバーを使用することで単細胞から大きな凝集体へと効果的に成長した。
【００３５】
実施例２
この実施例においては、実施例１で作製したようなヒトｉＰＳＣを含む中空アルギネートファイバーを、ファイバー内で皮質ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンへと分化させた。
【００３６】
ヒトＭＳＣ−ｉＰＳＣを、中空ファイバー内で５日間にわたって伸展させた。次に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を自家製及び科学的に定義されたニューロン分化培地と置き換え、次に皮質ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンへとアルギネート中空ファイバー内で３０日間にわたって分化させた。結果を図６Ａ〜６Ｆに示す。図６Ｃ及び６Ｆに示すように、３０日目の免疫染色は、ヒトｉＰＳＣの大半が対応するニューロンへと分化したことを示した。
【００３７】
実施例３
この実施例においては、ヒトグリオブラストーマ幹細胞を中空ファイバー内で培養した。
【００３８】
ヒトグリオブラストーマから単離した３つのがん幹細胞株Ｌ０、Ｌ１及びＬ２を中空ファイバー内で培養した。単細胞を、密度０．５×１０６細胞／ｍｌで、０．８％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含有するＮｅｕｒｏＣｕｌｔ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネートの濃度に達するまで０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ（例えば、図１及び２を参照のこと）でもって、１０ｍｌの細胞溶液及び１０ｍｌのアルギネート溶液を、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する室温の１００ｍｌの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをＣａＣｌ２溶液内で１０分間にわたって室温で架橋させた。ＣａＣｌ２溶液を除去し、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ培地と置き換えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、空気９５％、１気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて培地に浮遊させた中空ファイバー内で７日間にわたって培養した。単細胞は細胞凝集体へと成長した。細胞を回収するために、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ培地を除去し、４０ｍｇ／ｍｌアルギネートリアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する３７℃のＰＢＳと１０分間にわたって置き替えた。アルギネートファイバーを溶解させ、細胞凝集体を回収した。これらの凝集体は、３７℃の０．０５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１０分間にわたって処理することで単細胞に分離できる。細胞は、２回目の伸展のためにアルギネート中空ファイバー内へと加工することができる。細胞は、単細胞から大きな凝集体へと成長した（図７Ａ〜７Ｃを参照のこと）。
【００３９】
実施例４
この実施例においては、Ｗｎｔ３Ａタンパク質を発現するように操作したマウスＬ細胞を、中空ファイバー内で組み換えタンパク質を製造するために培養した。
【００４０】
Ｗｎｔ３Ａタンパク質（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６４７）を安定して発現しているマウスＬ細胞を中空ファイバー内で２０日間にわたって培養した。単細胞を、密度１×１０６細胞／ｍｌで、０．８％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、１．２％（ｗ／ｖ）アルギネートの濃度に達するまで０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ（例えば、図１及び２を参照のこと）でもって、２０ｍｌの細胞溶液及び２０ｍｌのアルギネート溶液を、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する室温の２００ｍｌの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをＣａＣｌ２溶液内で５分間にわたって室温で架橋させた。ＣａＣｌ２溶液を除去し、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を含有するＤＭＥＭ培地と置き換えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、空気９５％、１気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて培地に浮遊させた中空ファイバー内で２０日間にわたって培養した。細胞は、６日目までに高密度凝集体へと成長した（図８を参照のこと）。
【００４１】
実施例５
この実施例においては、様々な細胞を中空アルギネートハイドロゲルファイバーに浮遊させ、そこで成長させた（細胞培養システム又は培養システムとも称する）。
【００４２】
材料及び方法
材料：Ｆｉｂ−ｉＰＳＣ（ヒト皮膚線維芽細胞から再プログラムしたｉＰＳＣ）及びＭＳＣ−ｉＰＳＣ（ヒト間葉系幹細胞から再プログラムしたｉＰＳＣ）をＧｅｏｒｇｅ  Ｑ．Ｄａｌｅｙ研究室（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｓｔｏｎ，ボストン）から入手した。Ｈ９  ｈＥＳＣをＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。Ｌ  Ｗｎｔ−３Ａ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６４７（商標））をＡＴＣＣから得た。試薬及びその供給業者：Ｅ８培地（Ｅ８）、Ａｃｃｕｔａｓｅ及び生細胞／死細胞生存能染色キット：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｙ−２７６３２：Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ；マトリゲル：Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ  ７００Ｋ−１）：Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ。アルギン酸ナトリウム（５００〜６００ｃｐ；３００〜４００ｃｐ及び８０〜１２０ｃｐ）：Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。アルギン酸ナトリウム（Ａ２０３３−１００Ｇ）：Ｓｉｇｍａ。Ｖｙｂｒａｎｔ細胞標識溶液：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．。ＤＭＥＭ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＦＢＳ：Ａｔｌａｎｔａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｇ４１８：Ｓｉｇｍａ。抗体及びその供給業者：Ｏｃｔ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００）；ＦＯＸＡ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：２００）；α−ＳＭＡ（Ａｂｃａｍ；１：２００）；ネスチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：２００）。Ｎａｎｏｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｏｃｔ４（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＳＳＥＡ−４（１０ｍｇ／ｍＬ）及びアルカリ性ホスファターゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）及びブラキュリ（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）。シリンジポンプ（Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）；使い捨てシリンジ（Ｈｅｎｋｅ  ｓａｓｓ  ｗｏｌｆ）；透明アクリル矩形棒、鋼管及びプラスチック管（ＭｃＭａｓｔｅｒ）；塩化カルシウム（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｃａｎｉｃｓ）；塩化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。メカニカルステージ及びコントローラ（ＣＥＳＣＯ）；ベローズボトル（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．）；ルシフェラーゼアッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｋ８０１−２００）。
【００４３】
アルギネート中空ファイバーの加工：自家製マイクロエクストルーダを使用してアルギネート中空ファイバーを加工した。単細胞及びアルギネート溶液を含有するヒアルロン酸（ＨＡ）溶液を、自家製マイクロエクストルーダの中央及び側方チャネル内へとそれぞれポンプ輸送し、ＣａＣｌ２バッファ（１００ｍＭ）内へと押し出すことで中空ファイバーを形成した。続いて、ＣａＣｌ２バッファを細胞培養培地と置き換えた。
【００４４】
中空アルギネートハイドロゲルファイバー内でのｈＰＳＣの培養：典型的な細胞培地の場合、アルギネート中空ファイバー内の２０μＬの細胞溶液を、６ウェルプレート内の２ｍＬのＥ８培地に浮遊させ、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２、３７℃のインキュベータにおいて培養した。培地は毎日交換した。細胞を継代するために、培地を除去し、アルギネートハイドロゲルを０．５ｍＭ  ＥＤＴＡに５分間にわたって溶解させた。細胞塊を１００ｇで５分間にわたって遠心分離することで回収し、３７℃のＡｃｃｕｔａｓｅで１２分間にわたって処理し、続く培養のために単細胞に分離した。
【００４５】
中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおけるＬ−Ｗｎｔ３Ａ細胞の培養：典型的な細胞培養の場合、アルギネート中空ファイバー内の２０μＬの細胞溶液を、６ウェルプレート内の２ｍＬのＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ及び０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８に浮遊させ、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２、３７℃のインキュベータ内で培養した。培地は毎日交換し、Ｗｎｔ３Ａタンパク質の定量化のために回収した。Ｗｎｔ３Ａタンパク質を定量化するために、正準Ｗｎｔシグナル伝達のために、ＭＤＡ−４６８細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））に安定的にルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃２４３０８）。これらのＭＤＡ−４６８−ＴＦＰ細胞を９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル／２００ｍＬ培地）にプレーティングした。２４時間後、１５０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ及び５０ｍＬのＬ−Ｗｎｔ３Ａ−細胞条件培地を添加し、さらに１８時間にわたってインキュベートした。次に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄してから２００ｍＬの細胞溶解バッファを添加し、１０分間にわたって室温でインキュベートした。ルシフェラーゼアッセイキットの５０ｍＬの細胞ライセート、５０ｍＬの基質Ａ及び５０ｍＬの基質Ｂを混合し、速やかに光信号をルミノメータで読んだ。Ｗｎｔ３ａタンパク質の量を標準曲線で計算した。
【００４６】
中空アルギネートハイドロゲルファイバー内のｈＰＳＣのバイオリアクタでの培養：中空ファイバー内の２．０ｍＬの細胞溶液を自家製バイオリアクタに浮遊させた。細胞を、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２、３７℃のインキュベータにおいて１０日間にわたって培養した。バイオリアクタ１の場合、培地をフラスコ内に入れ、バイオリアクタ内へと連続的に潅流させた。バイオリアクタ２の場合、培地をベローに保存し、ベローを定期的に押すことで培地をコンテナ内へと流した又はベローを開放して培地をコンテナから抜いた。
【００４７】
染色及び画像化：二次元表面上で培養した細胞を、室温の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間にわたって固定し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間にわたって透過処理し、５％ロバ血清で１時間にわたってブロックした。次に、細胞を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。十分に洗浄後、二次抗体及び４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）を添加し、さらに１時間にわたって室温でインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄してからＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ蛍光顕微鏡で画像化した。細胞の多能性を評価するために、ｈＰＳＣをマトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。Ｏｃｔ４＋又はＮａｎｏｇ＋核の割合をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで定量化した。少なくとも１０００個の核を分析した。３Ｄ円筒形細胞塊を染色するために、細胞塊を回収し、室温の４％ＰＦＡで３０分間にわたって固定し、次にＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋５％ヤギ血清＋一次抗体と４℃で４８時間にわたってインキュベートした。十分に洗浄後、２％ＢＳＡ中の二次抗体を添加し、４℃で２４時間にわたってインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄してからＮｉｋｏｎ  Ａ１共焦点顕微鏡で画像化した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存能染色を用いて生細胞及び死細胞を製品マニュアルにしたがって評価した。
【００４８】
胚様体（ＥＢ）分化：中空アルギネートハイドロゲルファイバーから解放したｈＰＳＣを、低接着プレート内のＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１０μＭβ−メルカプトエタノールに６日間にわたって浮遊させた。次に、細胞塊を、０．１％ゼラチンをコーティングしたプレートに移し、同じ培地でさらに６日間にわたって培養し、続いて上述したように固定及び染色した。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのテラトーマ形成：全ての動物プロトコルは、ネブラスカ−リンカーン大学の動物実験委員会により認可されている。動物を含めた全ての実験手順は、ネブラスカ−リンカーン大学の動物実験委員会のガイドラインに沿って行った。２×１０６個のｈＰＳＣを２５μＬのＰＢＳ＋２５μＬのマトリゲルに浮遊させ、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の背中に皮下注射した。腫瘍を６〜１２週間後に摘出した。腫瘍を４％ＰＦＡで４８時間にわたって固定し、連続的に７０％、９５％及び１００％のエタノールで脱水し、キシレンで２時間にわたって脱脂してからパラフィンに包埋した。次に、厚さ１０μｍの切片を切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００５０】
核型：核型分析をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで行った。
【００５１】
中胚葉誘導：中空ファイバー内のＨ９細胞をＥ８培地で７日間、次に１％Ｂ２７（インスリン除外）及び１２ｍＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において２４時間にわたって培養してから固定及び染色した。
【００５２】
内胚葉誘導：中空ファイバー内のＨ９細胞をＥ８培地で７日間、次に１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％Ｂ２７（インスリン除外）、４ｍＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地で２４時間、また１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％Ｂ２７（インスリン除外）を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地でさらに２４時間にわたって培養してから固定及び染色した。
【００５３】
心筋細胞の分化：中空ファイバー内のＨ９細胞をＥ８培地で７日間、次に１％Ｂ２７（インスリン除外）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間、１％Ｂ２７を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２で９日間にわたって培養した。以下の小分子を分化中に添加した：１２ｍＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を０〜１日目；５ｍＭ  ＩＷＲ１を３〜４日目。細胞塊を１１日目にゼラチン被覆プレート上に解放した。拍動する心筋細胞を１５日目に撮影した。幾つかのサンプルを１１日目にｃＴＮＴ免疫染色のために固定した。
【００５４】
統計解析：統計解析を、統計パッケージＩｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して行った。
【００５５】
結果
アルギネートハイドロゲルから中空ファイバーを加工するためにマイクロエクストルーダを作製した（図９Ａ及び９Ｂ）。エクストルーダは、１本又は複数の中空ファイバーを同時に加工するための１つ又は複数のノズルを有し得る（図９Ａ〜９Ｆ）。細胞溶液及びアルギネート溶液の粘度は、無欠陥の中空ファイバーを加工するためには近いものであるべきことが判明した。この目的には、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びメチルセルロース（ＭＣ）の両方の溶液を使用して細胞を浮遊させることができる。ＨＡ又はＭＣなしでは、非対称のシェル又はビーズの中空ファイバーが形成されることが多い（図９Ｇ）。これらの欠陥は両方とも、細胞培養の失敗につながり得る。浮遊培養物中のｈＰＳＣと同様に（図１０Ａ及び１０Ｂ）、中空ファイバー細胞培養システム内のｈＰＳＣは初期クラスタ形成フェーズから続く細胞伸展フェーズを通して成長し（図９Ｈ及び９Ｉ）、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２が分離したｈＰＳＣの初期生存に必要であった（図９Ｊ）。
【００５６】
ファイバー内のｈＰＳＣの増殖及び多能性はアルギネートハイドロゲルの組成に著しく影響されることが判明した。例えば、Ｓｉｇｍａ（＃Ａ２０３３−１００Ｇ）及びＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（５００〜６００ｃｐ；３００〜４００ｃｐ及び８０〜１２０ｃｐ）からの２％アルギネートから加工した中空ファイバーで９日間にわたって培養した場合、ｈＰＳＣは２７、５１、５１及び４９倍に伸展して２．７×、５．１×、５．１×及び４．９×１０８細胞／ｍＬが得られ、それぞれ最終細胞の４７％、７６％、８０％及び８９％が多能性マーカーＯｃｔ４を発現した（図１１Ａ〜１１Ｆ）。生細胞／死細胞染色により、全ての培養物について細胞死が殆どなかったことが判明した（図１１Ｂ）。アルギネートのタイプと比較して、１．０〜２．０％の範囲のアルギネート濃度の影響はずっと少なかった。例えば、１．０％、１．５％及び２．０％のＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（８０〜１２０ｃｐ）のアルギネート（図１２Ａ〜１２Ｅ）を加工した中空ファイバーで９日間にわたって培養したｈＰＳＣについて、細胞の増殖及び多能性に有意な差異はなかった（図１２Ａ〜１２Ｅ）。１．５％のＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（８０〜１２０ｃｐ）アルギネートハイドロゲルは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー細胞培養システムにおいてｈＰＳＣを培養するのに適当であると結論づけられた。
【００５７】
ファイバー形状もまた、細胞培養システムにおけるｈＰＳＣ培養に影響した。所与のファイバー外径では、細胞溶液及びアルギネート溶液の流量の比を変化させることでハイドロゲルシェル厚さを制御でき、また図１３Ａ及び１３Ｂに記載の等式で予測できる。ファイバー外径はエクストルーダノズルの内径に大体等しい。３０、４０、７０及び９０μｍシェルの中空ファイバーで９日間にわたって培養した場合、最終細胞の９４％、９２％、８５％及び８０％が多能性マーカーＯｃｔ４を保持した。異なる条件間で細胞生存率及び伸展に有意な差はなかった（図１３Ｃ〜１３Ｅ）。内径４００μｍ、２５０μｍ及び１２０μｍの中空ファイバー内で９日間にわたって培養した場合、細胞の９５％がＯｃｔ４マーカーを保持した（図１４〜１４Ｅ）。シェル厚さ＜７０μｍ及び内径＜４００μｍの中空ファイバーは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー細胞培養システムにおいてｈＰＳＣを培養するのに適当であると結論づけられた。
【００５８】
研究は、細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン及びラミニンの添加が浮遊培養物におけるｈＰＳＣ培養効率を高めると示した。本実施例の結果は、試験した濃度のこれらのタンパク質は細胞生存率、成長速度及び多能性を改善せず、またこの細胞培養システムでは不要であることを示した（図１５Ａ〜１５Ｆ）。ＨＡ及びＭＣの両方を細胞に使用し得たため、これらが細胞培養に差別的に影響したか否かをさらに分析した。結果は、１％ＨＡ、２％ＨＡ及び３％ＭＣが同様の細胞生存率、伸展及び多能性をもたらすことを示した（図１５Ａ〜１５Ｆ）。アルギネート中空ファイバー内でｈＰＳＣを培養することの主な懸念は、培地中の大きなタンパク質因子（例えば、ｂＦＧＦ、インスリン及びトランスフェリン）はハイドロゲルシェル及び細胞塊内を効率的に移動して細胞に届かない可能性があることである。ｂＦＧＦを含有し徐々に放出するポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ミクロスフィア（ＳｔｅｍＢｅａｄｓ）を中空ファイバーのリキッドコアに添加した場合、細胞生存率、伸展及び多能性は改善されず、これは新規な培養システムにおけるタンパク質の輸送が効率的且つ十分であることを示している（図１５Ａ〜１５Ｆ）。
【００５９】
細胞培養システムにおいて細胞播種密度がｈＰＳＣ培養に及ぼす影響も調査した。１．０×１０６、２．０×１０６、５．０×１０６、１０．０×１０６細胞／ｍＬで播種した場合、ｈＰＳＣは９日目にそれぞれ４３３、１９６、１０４及び４６倍まで伸展し、約５．０×１０８細胞／ｍＬが得られた（図１６Ｂ）。全ての条件に関して、細胞は上述の２つのフェーズを通して成長した（図１６Ａ）。２４時間の時点で、細胞クラスタサイズは高播種密度でより大きく、ただし体積あたりの細胞クラスタ数は播種密度に有意に影響されなかった（図１６Ａ、１日目、インサート）。これらの結果は、ｈＰＳＣが低播種密度でより速く成長したことを示した。しかしながら、播種密度は多能性には影響しなかった（図１６Ｄ及び１６Ｅ）。超低密度で播種したｈＰＳＣもまた、細胞生存率及び多能性を犠牲にすることなく成長したことは実に興味深いことであった。１．０×、３．０×及び５．０×１０５細胞／ｍＬで播種した場合、ｈＰＳＣは４０００、１６６６及び１０００倍に伸展し、それぞれ約４．２×、５．１×、４．８×１０８細胞／ｍＬが１４、１２及び１０日目に得られた（図１７Ｄ）。
【００６０】
最適化後、複数のｈＰＳＣ株を長期にわたって培養することについて細胞培養システムを評価した。全てのｈＰＳＣは細胞培養システムでよく成長し、細胞の形態、生存率、成長速度及び多能性においてｈＰＳＣ株間で有意な差はなかった（図１８Ａ〜１８Ｄ）。細胞培養システムにおける１０継代培養中、１．０×１０７細胞／ｍＬで播種した場合、ｈＰＳＣは、１継代あたり５日毎に一貫して約１５倍伸展し、＞９５％の細胞がＯｃｔ４を発現した（図１９Ｇ）。細胞培養システムにおける長期培養は、継代１でのｈＰＳＣと同様の形態、生存率、成長速度及び多能性により示されるように、細胞の表現型を変化させなかった（図１８Ａ〜１８Ｄ及び図１９Ａ〜１９Ｇ）。インビトロでの胚様体（ＥＢ）分化及びｉｎ  ｖｉｖｏでのテラトーマ形成により、長期培養後のその多能性が確認された。全てのｈＰＳＣは成功裡にＦＯＸＡ２＋内胚葉、α−ＳＭＡ＋中胚葉及びネスチン＋外胚葉細胞へとＥＢアッセイにおいて分化した（図２０Ａ及び２１Ａ及び２１Ｂ）。全てのｈＰＳＣは、免疫不全マウスに移植した場合、内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織を含むテラトーマを形成した（図２０Ｂ及び２１Ｃ及び２１Ｄ）。加えて、長期培養後、全てのｈＰＳＣは正常な核型（図２０Ｃ及び２１Ｅ及び２１Ｆ）を保持し、凍結保存又はマトリゲル被覆２Ｄ面でさらに培養し得た（図２２）。中胚葉又は内胚葉又は心筋細胞分化培地での伸展及びさらなる培養後、中空ファイバーにおいてｈＰＳＣは対応する中胚葉細胞又は内胚葉細胞又は心筋細胞へと高効率で分化でき、これは細胞培養システムがｈＰＳＣ分化を支援したことを示す（図２３Ｄ〜２３Ｆ）。
【００６１】
培養システムは、ｈＰＳＣ以外の細胞の培養にも使用し得る。例えば、Ｗｎｔ３ａタンパク質を発現するように操作されたマウスＬ細胞は注目すべき細胞死なく効率的に培養でき、約６．０×１０８細胞／ｍＬが得られた。重要なことには、これらの細胞は、１６日間にわたる培養中、Ｗｎｔ３ａタンパク質を一貫して、２Ｄディッシュで培養したＬ細胞が発現したものと同様のレベルで発現した（図２４Ａ〜２４Ｅ）。この結果は、細胞の培養に一般的に適用可能なシステムとしての中空ハイドロゲルファイバーの可能性を実証した。
【００６２】
２つのプロトタイプバイオリアクタを、本発明の細胞培養システム用に設計及び作製した。細胞のはいった中空ファイバーを円筒形コンテナ内に入れた。バイオリアクタ１においては、フラスコに入れた培地を連続的にコンテナ内へと潅流させた（図２５Ａ〜２５Ｃ）。バイオリアクタ２においては、培地をプラスチック製ベローに入れた。ベローを押して培地をコンテナ内へと流し、あるいはベローを開放して培地をコンテナから引き抜くことがそれぞれできる（図２３Ａ〜２３Ｆ）。両方のバイオリアクタ内のｈＰＳＣは良く成長し、約５．０×１０８細胞／ｍＬが１０日目に得られた。＞９５％の細胞が多能性マーカーを発現した。これらのプロトタイプバイオリアクタは、将来的にはスケールアップし得る。中空アルギネートハイドロゲルファイバーの加工をスケールアップするために、エクストルーダもまた、３０分以内に１リットルの中空ファイバーを処理できるように１００ノズルのものにした（図２５Ｄ及び２５Ｅ）。
【００６３】
これらの結果は、本開示の方法及びデバイスを使用して中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて細胞を培養及び製造できることを実証した。本方法は、研究所及び産業の両方において、疾患及び外傷治療、薬剤のスクリーニングライブラリ、またタンパク質及びワクチンの製造にとって十分且つ高品質な細胞を作製するのに有用であると考えられる。
【図１】
2018534936.tif 000003
【図２】
2018534936.tif 000004
【図３】
2018534936.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月30日(2018.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2018534936.tif 000098
【図２】
2018534936.tif 000099
【図３】
2018534936.tif 000100
【図４】
2018534936.tif 000101
【図５】
2018534936.tif 000102
【図６】
2018534936.tif 000103
【図７】
2018534936.tif 000104
【図８】
2018534936.tif 000105
【図９Ａ】
2018534936.tif 000106
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
2018534936.tif 000181
【図２３Ｂ】
2018534936.tif 000182
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
2018534936.tif 000184
【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
2018534936.tif 000187
【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
2018534936.tif 000190
【図２４Ｅ】
2018534936.tif 000191
【図２５】
2018534936.tif 000192
【国際調査報告】
2018534936.tif 000193