(57)【要約】  選択された部位に安定且つ機能的なゲノム編集を有する、ゲノム改変ｉＰＳＣ、および派生細胞を得るための、方法および組成物が提供される。また、１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドの標的組込み、および／または、１もしくは複数の選択された内在性遺伝子における挿入／欠失を含む、ゲノム改変ｉＰＳＣ由来の細胞集団またはクローナル細胞株が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むコンストラクトであって、
前記コンストラクトに含まれる１もしくは複数の外来性プロモーターに機能的に連結された、または、組込み後に選択された部位に含まれる内在性プロモーターに機能的に連結された、１または複数の目的の外来性ポリヌクレオチド；および、前記選択された部位に特異的であり、且つ、前記目的の外来性ポリヌクレオチドと隣接している、一対のホモロジーアーム、
前記コンストラクトは、ｉＰＳＣの選択された部位における外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのためのコンストラクトであり；
前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、後に増殖されたｉＰＳＣ、前記ｉＰＳＣに由来する分化細胞、および／またはそれに由来する脱分化細胞において、組み込まれ、且つ機能的なままである、
コンストラクト。
【請求項２】
前記１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドがリンカー配列によって互いに連結されている；または、前記１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドが同一もしくは異なるプロモーターの下で発現する、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記リンカー配列が自己切断型ペプチドをコードする、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記リンカー配列が配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を与える、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項５】
マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記選択された部位における内在性プロモーターによって駆動される、マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記選択された部位が、セーフ・ハーバー遺伝子座、高発現遺伝子座、時間発現される遺伝子座、または妨害のための遺伝子座である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記セーフ・ハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、もしくはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす遺伝子座を含む；または、前記妨害のための遺伝子座がＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記外来性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または細胞型特異的プロモーターを含む外来性プロモーターに機能的に連結されている、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
前記１または複数のポリヌクレオチドが、１または複数のセーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質またはペプチド；薬物標的候補；並びに、前記コンストラクトを組み込まれたｉＰＳＣまたはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を促進するタンパク質をコードする、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記１または複数のポリヌクレオチドがカスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
セーフティ・スイッチタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドがＣＡＧに機能的に連結されている、請求項１１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
ゲノム内の１または複数の選択された部位に少なくとも１つの標的ゲノム編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣを作製する方法であって、以下の（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を含み：
（Ｉ）：ｉＰＳＣを遺伝子改変することであって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の片方または両方を任意の順序で含む：
（ｉ）ｉＰＳＣに請求項１に記載のコンストラクトを１または複数導入して、選択された部位に標的組込みさせること；
（ｉｉ）
（ａ）選択された部位の認識が可能な１または複数のエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、１または複数の二重鎖切断をｉＰＳＣに導入すること；および
（ｂ）段階（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養して、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；
（ＩＩ）：再プログラム化中の非万能性細胞を遺伝子改変して、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ることであって、以下を含む：
（ｉ）非万能性細胞を、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、前記非万能性細胞の再プログラム化を開始させること；並びに
（ｉｉ）段階（ＩＩ）（ｉ）の再プログラム化中の非万能性細胞に、（ａ）および（ｂ）の片方または両方を、任意の順序で導入すること：
（ａ）選択された部位における標的組込みを可能にする、請求項１に記載の１または複数のコンストラクト；
（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における１または複数の二重鎖切断、
ここで、段階（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を、培養することで、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせる；
並びに、
（ＩＩＩ）：再プログラム化のための非万能性細胞を遺伝子改変して、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ることであって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む：
（ｉ）非万能性細胞に、（ａ）および（ｂ）の片方または両方を、任意の順序で導入すること：
（ａ）選択された部位における標的組込みを可能にする、請求項１に記載の１または複数のコンストラクト；
（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における１または複数の二重鎖切断、
ここで、段階（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を、培養することで、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせる；並びに
（ｉｉ）段階（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞に、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を接触させて、選択された部位に標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣを得ること；
これらにより、少なくとも１つの機能的な標的ゲノム編集を含み、且つ、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、ゲノム改変ｉＰＳＣを得る方法。
【請求項１４】
１または複数の選択された部位における少なくとも１つの標的ゲノム編集が、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、ゲノム改変ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記外来性ポリヌクレオチドが、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１または複数の異なる外来性ポリヌクレオチドを含み、前記ゲノム改変ｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、前記自殺遺伝子はＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した１または複数の内在性遺伝子に挿入／欠失を含む、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記内在性遺伝子が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
（Ｉ）群、（ＩＩ）群および／または（ＩＩＩ）群が、前記ゲノム改変ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、機能的であり、分化能を有し、且つ、同一の機能的なゲノム編集を含む非万能性細胞に分化可能である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法１３〜２１のいずれか１つから作製されたゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２３】
ｉＰＳＣが請求項１に記載のコンストラクトに含まれた１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、前記外来性ポリヌクレオチドが１または複数の選択された部位に組み込まれている、請求項２２に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２４】
標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む、請求項２２または２３に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２５】
前記内在性遺伝子がＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項２４に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２６】
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰおよび染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現低下を含む、請求項２２に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２７】
ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む、請求項２２または２６に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２８】
前記導入または発現増加が、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである、請求項２７に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項２９】
ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している、請求項２２または２６に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３０】
ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１、および／またはヌルまたは低発現のＴＡＰ２を含む、請求項２２または２９に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３１】
ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む；または、ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項２２または３０に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３２】
高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可のＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または、切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２または３１に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３３】
セーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド；薬物標的候補；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３４】
前記１または複数のコンストラクトに含まれる外来性ポリヌクレオチドが、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１もしくは複数の内在性プロモーターに、組込みの後に機能的に連結される、請求項３３に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３５】
カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３６】
ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む同一のセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、少なくとも２つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３７】
ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３８】
同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加された免疫耐性、または増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項３９】
部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能であり、前記部分分化細胞または完全分化細胞は前記ｉＰＳＣに含まれた少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項４０】
造血系細胞に分化可能な、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項４１】
前記部分分化細胞が中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、またはＮＫ細胞前駆細胞を含み；前記完全分化細胞がＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項４２】
以下を含むゲノム改変ｉＰＳＣ：
（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；
（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；
（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；
（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；
（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；
（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；
（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；
（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；
（ｉｘ）Ｆｃ受容体；
（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；
（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；
（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ。
【請求項４３】
前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項４２に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項４４】
同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項４２または４３に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ。
【請求項４５】
ＨＬＡクラスＩおよび／またはＩＩを欠損しており、且つ、（１）外来性のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４ｌＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１のうちの一つもしくは複数；または、（２）ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４ｌＢＢＬタンパク質、ＣＤ４７タンパク質、ＣＤ１１３タンパク質、およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入；並びに所望により、（３）ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ。
【請求項４６】
前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項４５に記載の改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ。
【請求項４７】
同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、ＨＬＡ欠損であり且つ同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項４５または４６に記載の改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ。
【請求項４８】
ゲノム改変ｉＰＳＣ由来のゲノム改変非万能性細胞を作製する方法であって、
（ｉ）  少なくとも１つの機能的なゲノム編集を含む、請求項２２〜４４のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣまたは請求項４５〜４７に記載の改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを得ること；および
（ｉｉ）  前記ゲノム改変ｉＰＳＣまたは前記改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを分化させて、前記ゲノム改変ｉＰＳＣに含まれた同一の機能的な標的ゲノム編集を含む派生非万能性細胞を得ること、
を含む方法。
【請求項４９】
前記派生非万能性細胞が造血系細胞を含み；前記分化段階（ｉｉ）が胚様体の形成を含まない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記派生非万能性細胞が中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ｉＰＳＣからゲノム改変非万能性細胞を作製する方法であって、
（ｉ）  ｉＰＳＣを、系譜特異的分化を開始させるのに十分な条件下に曝すこと；並びに
（ｉｉ）  任意の順序の（ａ）および（ｂ）の片方または両方によって、段階（ｉ）の分化中の細胞を遺伝子改変してゲノム改変非万能性細胞を得ること：
（ａ）段階（ｉ）の分化中の細胞に請求項１に記載のコンストラクトを１または複数導入して、選択された部位に標的組込みさせること；
（ｂ）
（１）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、１または複数の二重鎖切断を段階（ｉ）の分化中の細胞に導入すること；および
（２）段階（ｉｉ）（ｂ）（１）から得られた細胞を培養して、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；
を含み、
これらにより、１または複数の選択された部位に１または複数の機能的な標的編集を含むゲノム改変非万能性細胞を得る方法。
【請求項５２】
前記ゲノム改変非万能性細胞が造血系細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ゲノム改変非万能性細胞が中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
１または複数の機能的な標的ゲノム編集を含む、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されたｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項５５】
中胚葉細胞、造血内皮細胞、ＣＤ３４細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項５４に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項５６】
セーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド；薬物標的候補；または、非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項５４および請求項５５に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項５７】
標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む、請求項５４および請求項５６に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項５８】
１または複数の挿入／欠失を含む前記内在性遺伝子がＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項５７に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項５９】
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つに欠失または発現減少を含む、請求項５７に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６０】
ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む、請求項５７に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６１】
（ｉ）同一のセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来性ポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）異なるセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来性ポリヌクレオチド、
を含む、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６２】
セーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、請求項６１に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６３】
前記セーフ・ハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む、請求項６１に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６４】
非万能性細胞に含まれた同一の機能的な外来性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣに再プログラム化することが可能な、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６５】
ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞から再プログラム化されたｉＰＳＣが部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、請求項６４に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６６】
細胞が異なる予定運命の非万能性細胞に分化転換可能な、請求項５４〜６３に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。
【請求項６７】
以下を含み：
（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；
（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；
（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；
（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；
（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；
（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；
（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；
（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；
（ｉｘ）Ｆｃ受容体；
（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；
（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；
（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ、
ｉＰＳＣはゲノム改変造血系細胞と同じゲノム編集を含む、
ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞。
【請求項６８】
前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項６７に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞。
【請求項６９】
中胚葉細胞、造血内皮細胞、ＣＤ３４細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、またはＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項６７または６８に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞。
【請求項７０】
向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞。
【請求項７１】
ｉＰＳＣ由来造血細胞を含む組成物であって、
請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の、
（ａ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＣＤ３４細胞；
（ｂ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血幹細胞・前駆細胞；
（ｃ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血幹細胞・前駆細胞；
（ｄ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血性多能性前駆細胞；
（ｅ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変Ｔ細胞前駆細胞；
（ｆ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＮＫ細胞前駆細胞；
（ｇ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変Ｔ細胞；または
（ｈ）  ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＮＫ細胞；
またはこれらのあらゆる組み合わせ、
を含む組成物。
【請求項７２】
以下を含むゲノム改変造血系細胞：
（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；
（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；
（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；
（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；
（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；
（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；
（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；
（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；
（ｉｘ）Ｆｃ受容体；
（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；
（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；
（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ。
【請求項７３】
ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項７２に記載のゲノム改変造血系細胞。
【請求項７４】
中胚葉細胞、造血内皮細胞、ＣＤ３４細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項７２または請求項７３に記載のゲノム改変造血系細胞。
【請求項７５】
向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載のゲノム改変造血系細胞。
【請求項７６】
ＨＬＡクラスＩおよび／またはＩＩを欠損しており、且つ、（１）外来性のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４ｌＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１のうちの一つもしくは複数；または、（２）ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４ｌＢＢＬタンパク質、ＣＤ４７タンパク質、ＣＤ１１３タンパク質、およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入；並びに所望により、（３）ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変ＨＬＡ欠損造血系細胞。
【請求項７７】
ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項７６に記載の改変ＨＬＡ欠損造血系細胞。
【請求項７８】
向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低い改変ＨＬＡ欠損造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項７６または請求項７７に記載の改変ＨＬＡ欠損造血系細胞。
【請求項７９】
ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための組成物であって、以下を含み：
（ｉ）  ゲノム内の１または複数の選択された部位に少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む、ゲノム改変非万能性細胞、または請求項５４〜７０もしくは請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の細胞；
（ｉｉ）  １または複数の再プログラム化因子；並びに所望により、
（ｉｉｉ）  ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物；
ゲノム改変非万能性細胞に含まれた同一の標的ゲノム編集を含むｉＰＳＣを得るために有用である、組成物。
【請求項８０】
１または複数の選択された部位における少なくとも１つの標的ゲノム編集が、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド、薬物標的候補、または、前記非万能性細胞およびそれから再プログラム化されたｉＰＳＣの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドが、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む選択された挿入部位に含まれた１または複数の内在性プロモーターに機能的に連結されている、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、カスパーゼをコードするポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、チミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、非万能性細胞およびそれに由来するｉＰＳＣの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む、請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８７】
前記内在性遺伝子がＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む、請求項７９〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記ゲノム改変非万能性細胞が、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記導入または発現増加が外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである、請求項７９〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記ゲノム改変非万能性細胞がＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している、請求項７９〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ゲノム改変非万能性細胞がヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１および／またはヌルまたは低発現のＴＡＰ２を含む、請求項７９〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ゲノム改変非万能性細胞がＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む；または、前記ゲノム改変非万能性細胞がＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項７９〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ゲノム改変された非万能性細胞が、高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可のＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または、切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項７９〜９３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記ゲノム改変非万能性細胞が中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項７９〜９４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ゲノム改変非万能性細胞が向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変非万能性細胞が増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する、請求項７９〜９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための組成物であって、
（ｉ）  非万能性細胞；
（ｉｉ）  １または複数の選択された遺伝子座における標的編集のための１または複数のコンストラクト；
（ｉｉｉ）  １または複数の再プログラム化因子；並びに所望により、
（ｉｖ）  ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物；
を含み、
標的ゲノム編集を含むｉＰＳＣを得るために有用であり、それによって、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する、組成物。
【請求項９８】
選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な１もしくは複数のエンドヌクレアーゼ；並びに／または、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクト、をさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドが、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０４】
１または複数の挿入／欠失を含む前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記非万能性細胞が中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣの万能性を維持するためのＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物をさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０７】
以下を含む組成物であって、
（ｉ）  以下から得られるゲノム改変ｉＰＳＣ、
（ａ）得られるｉＰＳＣがゲノム改変非万能性細胞の選択された部位における同一の標的組込みおよび／もしくは標的挿入／欠失を含む、ゲノム改変非万能性細胞の再プログラム化；または
（ｂ）１もしくは複数の選択された部位に１もしくは複数の標的組込みおよび／もしくは標的挿入／欠失を導入することによる、クローナルｉＰＳＣもしくはｉＰＳＣのプールの遺伝子改変；または
（ｃ）１もしくは複数の選択された部位に１もしくは複数の標的組込みおよび／もしくは標的挿入／欠失を、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望によりＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／もしくはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させられている再プログラム化中の非万能性細胞のプールに導入することによる、ゲノム改変；
並びに、
（ｉｉ）  ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物、
を含み、
前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチド；並びに／または、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した１もしくは複数の内在性遺伝子における挿入／欠失を含む、
組成物。
【請求項１０８】
選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な１または複数のエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドが、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択されるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、カスパーゼをコードする遺伝子をＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、チミジンキナーゼをコードする遺伝子をＨ１１遺伝子座に含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１３】
１または複数の挿入／欠失を含む前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介した導入または発現増加を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣがＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣがヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１および／またはヌルまたは低発現のＴＡＰ２を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣがＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣがＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが、高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可のＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または、切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣが増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが同一の機能的な標的ゲノム編集を有する造血系細胞を含む非万能性細胞への分化能を有する、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記ゲノム改変ｉＰＳＣが中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞への分化能を有する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
以下を含む医薬組成物：
（ａ）  請求項２２〜４４のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣ；
（ｂ）  請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ；
（ｃ）  請求項５４〜６６のいずれか一項に記載のゲノム改変非万能性細胞；
（ｄ）  請求項６７〜７０および請求項７２〜７５のいずれか一項に記載のゲノム改変造血系細胞；または
（ｅ）  請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の改変ＨＬＡ欠損造血系細胞；またはこれらのあらゆる組み合わせ；並びに薬剤的に許容できる培地。
【請求項１２５】
組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる１２４の医薬組成物の治療用途であって、前記対象は自己免疫障害；造血器腫瘍；固形腫瘍；がん、または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスと関連した感染症を有する、治療用途。
【請求項１２６】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のゲノム改変ｉＰＳＣを製造し、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載のそれに由来する非万能性細胞を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２５１，０３２号；２０１６年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３３７，２５８号；および２０１６年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３６６，５０３号に基づく優先権を主張するものであり、これらの開示はそれら全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、概して、幹細胞の遺伝子編集およびゲノム改変の分野に関する。より具体的には、本開示は、特定の遺伝子座を標的とし、且つ、編集された遺伝物質の持続的な保持および／または機能を保証する分子戦略を用いる、クローナルな万能性幹細胞の遺伝子調節の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト誘導万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の研究分野が進歩を続け、さらに、遺伝子改変ｈｉＰＳＣによる細胞治療学の臨床研究が行われ始めたことから、遺伝子改変細胞を投与することに関する安全性の懸念への取り組みとその軽減が必要となっている。これらの安全性問題への取り組みとして、異常細胞の選択的排除を促すための、組換えペプチド、モノクローナル抗体、小分子調節酵素活性および遺伝子特異的改変を含むいくつかの戦略が調査された。一般的に、以前の研究では、ヘルペス複合ウイルス（herpes complex virus）チミジンキナーゼまたは誘導性カスパーゼ−９（誘導性カスパーゼ９）を含む自殺遺伝子をヒト細胞に安定に導入するために、レンチウイルス等のウイルスベクターおよび短いプロモーターが使用されていた。しかし、ウイルスベクターの使用は、疾患関連遺伝子を破壊または活性化し、有害作用を引き起こし得る、ランダムインテグレーション事象をもたらす可能性がある。現在使用されている方法における他の問題としては、低い挿入率；ランダムな挿入；変異；挿入コピー数の多さ；および、ランダム挿入により挿入コピー数が様々である不均一細胞集団を選別するための骨の折れる細胞選別が挙げられ、これらに限定されない。さらに、ｉＰＳＣゲノム改変において、多くの人工的なプロモーターおよびゲノム領域は、万能性状態および分化状態の両方においてエピジェネティックな遺伝子発現サイレンシングを引き起こし易く、これは結果として、細胞増殖、継代、再プログラム化、分化、および／または脱分化等の事象に対するプロモーターまたは挿入された遺伝子の無応答性に繋がる。すなわち、特に治療用の遺伝子改変免疫細胞を開発する場合に、安全性を損なうことなく、挿入された機能的なモダリティの応答を維持するための、最適なゲノム改変戦略、組込み部位、プロモーター、および他の要素を特定することが、非常に重要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、分化後、脱分化後、再プログラム化後、増殖後、継代後および／または移植後の派生後の細胞においても保持され且つその機能性が維持される、ポリヌクレオチド挿入、欠失、および置換を包含する１またはいくつかの遺伝子改変を選択された部位に含む、単一細胞由来のクローナルｉＰＳＣ株、またはその派生細胞、を作製するための方法および組成物を提供することである。
【０００５】
本発明の目的は、標的組込みおよび／または標的挿入（ｉｎ）／欠失（ｄｅｌ）を包含する同一の遺伝子改変を含む非万能性細胞の再プログラム化を通じて、１またはいくつかの遺伝子改変を選択された部位に含む、単一細胞由来のクローナルｉＰＳＣ株を作製することである。特に、本発明の目的は、後のゲノム編集のためのｉＰＳＣまたはより分化程度の低い細胞が最初に得られるように、非万能性細胞を再プログラム化した後に、再プログラム化された細胞をゲノム改変することである。また本発明の目的は、後の細胞再プログラム化のためのゲノム改変された非万能性細胞が最初に得られるように、非万能性細胞をゲノム改変した後に、非万能性細胞を再プログラム化することである。本発明のさらなる目的は、再プログラム化もしくはゲノム改変のいずれかから、または再プログラム化もしくはゲノム改変のいずれかの故に、中間細胞が単離されないように、且つ、前記２つのプロセスが単一の細胞プールにおいて同時に起こるように、非万能性細胞のゲノム改変と同時に、前記非万能性細胞を再プログラム化することである。
【０００６】
本発明の目的は、同一の遺伝子改変を選択された部位に含むｉＰＳＣまたはより分化程度の低い細胞の分化を介して、１またはいくつかの遺伝子改変を選択された部位に含む、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞（hemogenic endothelium cell）、ＨＳＣ（造血幹細胞および造血前駆細胞）、造血性多能性前駆細胞（hematopoietic multipotent progenitor cell）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を含むがこれらに限定はされない、ｉＰＳＣ（またはより分化程度の低い細胞）に由来する非万能性細胞を作製することである。特に、本発明の目的は、後の細胞分化のためのゲノム改変されたより分化程度の低い細胞が最初に得られるように、前駆細胞および万能性細胞を包含するより分化程度の低い細胞を、前記より分化程度の低い細胞のゲノム改変の後に分化させることである。本発明のさらなる目的は、分化もしくはゲノム改変のいずれかから、または分化もしくはゲノム改変のいずれかの故に、中間細胞が単離されないように、且つ、前記２つのプロセスが単一の細胞プールにおいて同時に起こるように、より分化程度の低い細胞のゲノム改変と同時に前記より分化程度の低い細胞を分化させることである。
【０００７】
本発明の１つの態様は、（１）コンストラクトに含まれる１もしくは複数の外来性プロモーターに機能的に連結された、または、組込み後に選択された部位に含まれる内在性プロモーターに機能的に連結された、１または複数の目的の外来性ポリヌクレオチド；および、（２）ｉＰＳＣの前記選択された部位における前記外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのための、前記選択された部位に特異的であり、且つ、前記目的の外来性ポリヌクレオチドと隣接している、一対のホモロジーアームを含み；後に増殖されたｉＰＳＣ、前記ｉＰＳＣに由来する分化細胞、および／またはそれに由来する脱分化細胞において、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは組み込まれ且つ機能的なままである、コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドはリンカー配列によって互いに連結されている。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は自己切断型ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を与える。いくつかの他の実施形態では、上記のコンストラクトはマーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、前記コンストラクトは、前記選択された部位における前記内在性プロモーターによって駆動される、マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記選択された部位は、セーフ・ハーバー遺伝子座、高発現遺伝子座、時間発現される遺伝子座、または妨害のための遺伝子座である。いくつかの実施形態では、前記セーフ・ハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、または本明細書において定義されるゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす遺伝子座であり得る。いくつかの実施形態では、妨害のための遺伝子座は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２もしくはタパシン、またはその妨害が望ましい細胞機能または特性に関連している他の目的遺伝子、例えば、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む。
【０００８】
上記コンストラクトのいくつかの実施形態では、前記外来性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または細胞型特異的プロモーターを含む外来性プロモーターに機能的に連結されている。一実施形態では、前記コンストラクトに含まれる前記外来性プロモーターはＣＡＧである。いくつかの他の実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、セーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質またはペプチド；薬物標的候補；並びに、前記コンストラクトを組み込まれたｉＰＳＣまたはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を促進するタンパク質のうちの１または複数をコードする。いくつかの特定の実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記カスパーゼは、カスパーゼ９、カスパーゼ３、またはカスパーゼ７であり得る。いくつかの他の実施形態では、前記セーフティ・スイッチタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記コンストラクト内のＣＡＧに機能的に連結されている。
【０００９】
本発明の１つの態様は、以下の（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を含む、ゲノム内の１または複数の選択された部位に少なくとも１つの標的ゲノム編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣを作製する方法を提供する：
【００１０】
（Ｉ）：任意の順序の（ｉ）および（ｉｉ）の片方または両方によって、ｉＰＳＣを遺伝子改変すること：（ｉ）ｉＰＳＣに請求項１に記載のコンストラクトを１または複数導入して、選択された部位に標的組込みさせること；（ｉｉ）（ａ）選択された部位の認識が可能な１または複数のエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、１または複数の二重鎖切断をｉＰＳＣに導入すること；および、（ｂ）段階（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養して、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；これらにより、少なくとも１つの機能的な標的ゲノム編集を含み、且つ、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ること。
【００１１】
（ＩＩ）：以下により、再プログラム化中の非万能性細胞を遺伝子改変させてゲノム改変ｉＰＳＣを得ること：（ｉ）非万能性細胞を、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、前記非万能性細胞の再プログラム化を惹起すること；並びに、（ｉｉ）段階（ＩＩ）（ｉ）の再プログラム化中の非万能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位における標的組込みを可能にする請求項１に記載の１または複数のコンストラクト；（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における１または複数の二重鎖切断、の片方または両方を任意の順序で導入し、段階（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養することで、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；これらにより、少なくとも１つの機能的な標的ゲノム編集を含み、且つ、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ること。
【００１２】
（ＩＩＩ）：以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、再プログラム化のために非万能性細胞を遺伝子改変して、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ること：（ｉ）非万能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位における標的組込みを可能にするための、請求項１に記載の１または複数のコンストラクト；（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における１または複数の二重鎖切断、の片方または両方を任意の順序で導入し、段階（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養することで、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；並びに、（ｉｉ）段階（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞を、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させることで、選択された部位に標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣを得ること；これらにより、少なくとも１つの機能的な標的ゲノム編集を含み、且つ、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、ゲノム改変ｉＰＳＣを得ること。
【００１３】
上記方法の一実施形態では、１または複数の選択された部位における少なくとも１つの標的ゲノム編集は、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、ゲノム改変ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための前記外来性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１または複数の異なる外来性ポリヌクレオチドを含み、前記ゲノム改変ｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、前記自殺遺伝子はＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。
【００１４】
いくつかの他の実施形態では、本明細書において提供される方法を用いて作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した１または複数の内在性遺伝子に、挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、破壊のための前記内在性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
さらに他のいくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法を用いて作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む。
【００１６】
さらに他のいくつかの実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）は、前記ゲノム改変ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させることで、前記ゲノム改変ｉＰＳＣの万能性を維持することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣは、機能的であり、分化能を有し、且つ、同一の機能的なゲノム編集を含む非万能性細胞に分化可能である。
【００１７】
本発明の別の態様は、上記の方法のいずれか１つから作製されるゲノム改変ｉＰＳＣを提供する。一実施形態では、前記作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、上記で提供されたコンストラクトを用いて導入された１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、前記外来性ポリヌクレオチドは前記ｉＰＳＣの１または複数の選択された部位に組み込まれている。一実施形態では、前記作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む。一実施形態では、前記内在性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む。いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、前記導入または発現増加は、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣはＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣはヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１および／またはヌルまたは低発現のＴＡＰ２を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣはＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣがＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。いくつかの実施形態では、前記非組込み型外来性ポリヌクレオチドは、センダイウイルス、エピソーム、またはプラスミドを用いて導入される。
【００１８】
いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または、切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド；薬物標的候補；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
さらに他のいくつかの実施形態では、前記１または複数のコンストラクトに含まれる外来性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１もしくは複数の内在性プロモーターに、組込みの後に機能的に連結されている。いくつかの他の実施形態では、前記ｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、同一のセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、少なくとも２つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、前記ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、前記ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、提供された前記方法を用いて作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加された免疫耐性、または増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している。一実施形態では、前記作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能であり、前記部分分化細胞または完全分化細胞は前記ｉＰＳＣに含まれた少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む。一実施形態では、前記作製されたゲノム改変ｉＰＳＣは、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞；Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を包含する造血系細胞に分化可能である。
【００２１】
本発明の別の態様は、（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；（ｉｘ）Ｆｃ受容体；（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、またはこれらのあらゆる組み合わせ、を含むゲノム改変ｉＰＳＣを提供する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣはＢ２Ｍヌル、ＴＡＰ１ヌル、ＴＡＰ２ヌル、またはタパシンヌルである。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、およびｈｎＣＤ１６のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、およびＣＡＲのうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、および少なくとも１つのセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。いくつかの他の実施形態では、前記発現導入は外因性発現である。いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子は誘導性である。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している。
【００２２】
さらに、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＩＩを欠損しており、且つ、（１）外来性のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４ｌＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１のうちの一つもしくは複数；または、（２）ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４ｌＢＢＬタンパク質、ＣＤ４７タンパク質、ＣＤ１１３タンパク質、およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入；並びに所望により、（３）ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。一実施形態では、前記改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣに含まれる前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子は誘導性である。いくつかの実施形態では、前記改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣは、同じゲノム改変を持たないｉＰＳＣと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；且つ、万能性を維持し；且つ、ＨＬＡ欠損であり且つ同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、（ｉ）少なくとも１つの機能的なゲノム編集を含む、上記で提供されたゲノム改変ｉＰＳＣまたは改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを得ること；および、（ｉｉ）前記ゲノム改変ｉＰＳＣまたは前記改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを分化させて、前記ゲノム改変ｉＰＳＣに含まれた同一の機能的な標的ゲノム編集を含む派生非万能性細胞を得ること、を含む、ゲノム改変ｉＰＳＣ由来のゲノム改変非万能性細胞を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記分化段階は胚様体の形成を必要としない。いくつかの実施形態では、前記分化は無フィーダー分化、無間質分化、または無血清分化である。いくつかの実施形態では、前記派生非万能性細胞は造血系細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記派生非万能性細胞は中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、ｉＰＳＣからゲノム改変非万能性細胞を作製する方法を提供し、前記方法は以下を含む：（ｉ）ｉＰＳＣを、系譜特異的分化を開始させるのに十分な条件下に曝すこと；並びに、（ｉｉ）任意の順序の（ａ）および（ｂ）の片方または両方によって、段階（ｉ）の分化中の細胞を遺伝子改変してゲノム改変非万能性細胞を得ること：（ａ）段階（ｉ）の分化中の細胞に、請求項１に記載の１または複数のコンストラクトを導入して、選択された部位に標的組込みさせること；（ｂ）（１）選択された部位の認識が可能な１または複数のエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、１または複数の二重鎖切断を、段階（ｉ）の分化中の細胞に導入すること；および、（２）段階（ｉｉ）（ｂ）（１）から得られた細胞を培養して、内在性ＤＮＡ修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入／欠失を生じさせること；これらにより、１または複数の選択された部位に１または複数の機能的な標的編集を含むゲノム改変非万能性細胞を得ること。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は造血系細胞を含む。いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。
【００２５】
本発明はさらに、上記の通常法を用いて作製されるｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞を提供し、前記作製された非万能性細胞は１または複数の機能的な標的ゲノム編集を含む。一実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は、中胚葉細胞、造血内皮細胞、ＣＤ３４細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は、セーフティ・スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド；薬物標的候補；または、前記非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。さらに他のいくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、前記非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は１または複数の挿入／欠失を有する内在性遺伝子を含み、前記内在性遺伝子はＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、または染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記由来ゲノム改変非万能性細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む。いくつかの他の実施形態では、前記由来ゲノム改変非万能性細胞は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む。
【００２６】
さらに他のいくつかの実施形態では、（ｉ）同一のセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来性ポリヌクレオチド；または、（ｉｉ）異なるセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞。前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞のいくつかの実施形態では、セーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択される。前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞のいくつかの実施形態では、前記セーフ・ハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は、前記非万能性細胞に含まれた同一の機能的な外来性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣに再プログラム化することが可能である。前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞のいくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞から再プログラム化されたｉＰＳＣは、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である。別のいくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変非万能性細胞は、異なる予定運命の非万能性細胞に分化転換可能である。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；（ｉｘ）Ｆｃ受容体；（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、またはこれらのあらゆる組み合わせ、を含む、ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞はＢ２Ｍヌル、ＴＡＰ１ヌル、ＴＡＰ２ヌル、またはタパシンヌルである。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、およびｈｎＣＤ１６のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、およびＣＡＲのうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、および少なくとも１つのセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。いくつかの他の実施形態では、前記発現導入は外因性発現である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞に含まれる前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子は誘導性である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血系細胞は、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している。
【００２８】
本発明はさらに、上記の、（ａ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＣＤ３４細胞；（ｂ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血幹細胞・前駆細胞；（ｃ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変造血性多能性前駆細胞；（ｄ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変Ｔ細胞前駆細胞；（ｅ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＮＫ細胞前駆細胞；（ｆ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変Ｔ細胞；（ｇ）ｉＰＳＣ由来ゲノム改変ＮＫ細胞、およびこれらのあらゆる組み合わせを含む、ｉＰＳＣ由来造血細胞を含む組成物を提供する。
【００２９】
さらに、（ｉ）ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ；（ｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ１；（ｉｉｉ）ヌルまたは低発現のＴＡＰ２；（ｉｖ）ヌルまたは低発現のタパシン；（ｖ）ＨＬＡ−Ｅもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｅの発現導入；（ｖｉ）ＨＬＡ−Ｇもしくは切断不可ＨＬＡ−Ｇの発現導入；（ｖｉｉ）ＰＤＬ１の発現導入；（ｖｉｉｉ）高親和性切断不可ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）；（ｉｘ）Ｆｃ受容体；（ｘ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；（ｘｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｘｉｉ）セーフティ・スイッチタンパク質を発現する１もしくは複数の自殺遺伝子；（ｘｉｉｉ）二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、またはこれらのあらゆる組み合わせ、を含む、ゲノム改変造血系細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞はＢ２Ｍヌル、ＴＡＰ１ヌル、ＴＡＰ２ヌル、またはタパシンヌルである。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、およびｈｎＣＤ１６のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、およびＣＡＲのうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤＬ１、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、および少なくとも１つのセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つまたは複数の発現導入を有する。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。いくつかの他の実施形態では、前記発現導入は外因性発現である。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞に含まれる前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、または自殺遺伝子は誘導性である。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変造血系細胞は、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している。
【００３０】
さらに、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＩＩを欠損しており、且つ、（１）外来性のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４ｌＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１のうちの一つもしくは複数；または、（２）ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４ｌＢＢＬタンパク質、ＣＤ４７タンパク質、ＣＤ１１３タンパク質、およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入；並びに所望により、（３）ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変ＨＬＡ欠損造血系細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記発現導入は、前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。いくつかの実施形態では、前記改変ＨＬＡ欠損造血系細胞に含まれる前記ＴＣＲ、ＣＡＲ、エンゲージャー、Ｆｃ受容体、または自殺遺伝子は誘導性である。いくつかの実施形態では、本明細書にて提供される改変ＨＬＡ欠損造血系細胞は、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し；分化度が低い改変ＨＬＡ欠損造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している。
【００３１】
本発明の別の態様は、ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための組成物を提供し、前記組成物は、（ｉ）ゲノム内の１または複数の選択された部位に少なくとも１つの標的ゲノム編集を含む、本明細書にて提供されるゲノム改変非万能性細胞；（ｉｉ）１または複数の再プログラム化因子；並びに所望により、（ｉｉｉ）ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物、を含み、前記組成物は前記ゲノム改変非万能性細胞に含まれた同一の標的ゲノム編集を含むｉＰＳＣを得るために有用である。いくつかの実施形態では、１または複数の選択された部位における上記細胞の前記少なくとも１つの標的ゲノム編集は、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド、薬物標的候補、または、前記非万能性細胞およびそれから再プログラム化されたｉＰＳＣの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む。
【００３２】
前記組成物のいくつかの実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む選択された挿入部位に含まれた１または複数の内在性プロモーターに機能的に連結されている。前記組成物のさらに他のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞が、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。前記組成物の特定の一実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、カスパーゼをコードするポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、チミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む。前記組成物のいくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、非万能性細胞およびそれに由来するｉＰＳＣの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む。
【００３３】
前記組成物のいくつかの実施形態では、挿入／欠失による破壊のための前記１または複数の内在性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子から選択される。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む。前記組成物のいくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記導入または発現増加は、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである。いくつかの実施形態では、前記非組込み型外来性ポリヌクレオチドは、センダイウイルス、またはエピソーム、またはプラスミドを用いて導入される。前記組成物の一実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞はＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している。一実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１、ヌルまたは低発現のＴＡＰ２、および／またはヌルまたは低発現のタパシンを含む。前記組成物のいくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つまたは複数をコードする組込み型または非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記非組込み型外来性ポリヌクレオチドは、センダイウイルス、またはエピソーム、またはプラスミドを用いて導入される。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、ＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つまたは複数の発現導入を含み、前記発現導入は前記細胞に含まれる非発現遺伝子または低発現遺伝子からの発現増加である。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６  受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。前記組成物���さらに他のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変非万能性細胞は向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変非万能性細胞は増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための組成物を提供し、前記組成物は、（ｉ）非万能性細胞；（ｉｉ）１または複数の選択された遺伝子座における標的編集のための１または複数のコンストラクト；（ｉｉｉ）１または複数の再プログラム化因子；並びに所望により、（ｉｖ）ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物、を含み、前記組成物は標的ゲノム編集を含むｉＰＳＣを得るために有用であり、これにより、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記の組成物は、選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な１もしくは複数のエンドヌクレアーゼ；並びに／または、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクト、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている。前記組成物のいくつかの実施形態では、前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの他の実施形態では、前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
いくつかの他の実施形態では、前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをＨ１１遺伝子座に含む。さらに他のいくつかの実施形態では、前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣは、標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；並びに、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた１または複数の挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、１または複数の挿入／欠失を含む前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む。
【００３７】
一実施形態において、前記組成物の非万能性細胞は、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。別の実施形態では、前記組成物は、前記得られたゲノム改変ｉＰＳＣの万能性を維持するためのＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物をさらに含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、ゲノム改変ｉＰＳＣの万能性を維持するための組成物を含み、前記組成物は、（ｉ）ゲノム改変ｉＰＳＣ、並びに（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣはゲノム改変非万能性細胞の再プログラム化から得られ、前記得られたｉＰＳＣは、前記ゲノム改変非万能性細胞の選択された部位に同一の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、１または複数の選択された部位に１または複数の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を導入することによる、クローナルｉＰＳＣまたはｉＰＳＣのプールの遺伝子改変から得られる。いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、１または複数の選択された部位に１または複数の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を、１または複数の再プログラム化因子、並びに所望によりＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させられている再プログラム化中の非万能性細胞のプールに導入することによる、ゲノム改変から得られる。
【００３９】
前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチド；並びに／または、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した１もしくは複数の内在性遺伝子における挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１もしくは複数の外来性プロモーター；または、（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位に含まれる１または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、前記組成物は、選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な１または複数のエンドヌクレアーゼをさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、Ｂ細胞ＣＤ２０、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択されるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、２つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、カスパーゼをコードする遺伝子をＡＡＶＳ１遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする遺伝子をＨ１１遺伝子座に含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは１または複数の挿入／欠失を含み、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失または発現減少を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも１つの導入または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介した導入または発現増加を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣはＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを欠損している。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１および／またはヌルまたは低発現のＴＡＰ２を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣはＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣがＨＬＡ−Ｅタンパク質、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、ＣＤ１６タンパク質、４１ＢＢＬタンパク質およびＰＤＬ１タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、高親和性ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可ＣＤ１６受容体をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；高親和性且つ切断不可のＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；切断不可なＨＬＡ−Ｅをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド；または、切断不可なＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する；または、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは増加されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞に対する抵抗性を有する。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、同一の機能的な標的ゲノム編集を有する造血系細胞を含む非万能性細胞への分化能を有する。いくつかの実施形態では、前記組成物の前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞への分化能を有する。
【００４３】
さらに、本発明は、（ｉ）本発明において開示される方法および組成物によって提供される、ゲノム改変ｉＰＳＣ集団、改変ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ集団、ゲノム改変非万能性細胞集団、ゲノム改変造血系細胞集団、改変ＨＬＡ欠損造血系細胞集団、またはこれらのあらゆる組み合わせの１または複数；並びに、（ｉｉ）薬剤的に許容できる培地、を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記造血系細胞は、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含む。
【００４４】
さらに、自己免疫障害；造血器腫瘍；固形腫瘍；がん、またはＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスと関連した感染症を有する、養子細胞療法に適した対象に組成物を導入することによる、上記医薬組成物の治療用途が提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、本明細書において提供される方法および組成物を用いて、ゲノム改変ｉＰＳＣに由来する非万能性細胞を製造する方法を提供する。
【００４６】
この使用の様々な目的および利点が、本発明のある特定の実施形態の説明および例示として記載される、添付の図面と併せた以下の説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子のＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー標的挿入、および、自殺遺伝子がＡＰ１９０３によって活性化された場合の細胞応答を図に示したものである。Ａ．  ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計された、ドナーコンストラクトであるＡＡＶＳ１−Ｇ１．０の図示。Ｂ．  ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよび前記ドナーコンストラクトをトランスフェクトされた、ピューロマイシンセレクションを受けた２９３Ｔ細胞における、ＧＦＰ発現に対するフローサイトメトリー。Ｃ．  ピューロマイシンセレクションを受けた２９３Ｔ細胞を、ＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）処理に２４時間曝した。処理された細胞を回収し、（膜が損なわれた死につつある細胞を染色する）７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤ陰性細胞（おそらくは生細胞）の割合を、各処理（ｎ＝２）に対してプロットした。ＡＰ１９０３処理後、有意な細胞死が検出された。Ｄ．  ピューロマイシンによるセレクションを受けた２９３Ｔ細胞から得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲは、ＡＡＶＳ１遺伝子座へのドナーベクターの標的挿入を示した。Ｅ．  ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＣＭＶ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクト（ＡＡＶＳ１−Ｇ１．０）をトランスフェクトした。ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。ＧＦＰ強度に基づいて３つの集団を選別し、さらなる解析のために増殖させた。Ｆ．  選別および増殖されたＧＦＰ（陰性）集団、ＧＦＰ（低）集団およびＧＦＰ（高）集団を、ＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）処理に、２４時間曝した。処理された細胞を回収し、７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤ陰性細胞（生細胞）の割合を、各処理に対してプロットした。Ｇ．  ピューロマイシンによるセレクションおよび選別を受けたｈｉＰＳＣから得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲは、ＧＦＰ（低）集団において、ドナーベクターのＡＡＶＳ１遺伝子座への標的挿入を示したが、ＧＦＰ（陰性）集団およびＧＦＰ（高）集団では示さなかった。
【００４８】
【図２】図２は、ｈｉＰＳＣにおける、種々の内在性プロモーターおよび外来性プロモーター下の誘導性カスパーゼ９の、セーフ・ハーバー遺伝子座標的挿入を示す図である。Ａ．  ＡＡＶＳ１プロモーターが遺伝子発現を駆動し、ＡＡＶｓ１遺伝子座を標的とするように設計された、コンストラクトの図示。Ｂ．  ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＡＡＶＳ１内在性プロモーターの制御下の誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトし；ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。Ｃ．  増殖させたピューロマイシン耐性ｉＰＳＣをＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）処理に２４時間曝した。処理された細胞を回収し、７ＡＡＤで染色した。７ＡＡＤ陰性細胞の割合を、各処理に対してプロットした。Ｄ．  ピューロマイシン耐性プールから得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲは、この集団における、ＡＡＶＳ１遺伝子座へのドナーベクターの標的挿入を示した。Ｅ．  種々のプロモーターを有するＡＡＶｓ１遺伝子座を標的とするように設計されたコンストラクトの図示。Ｆ．  ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮ、並びに種々の内在性プロモーターおよび外来性プロモーターの制御下の誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。
【００４９】
【図３】図３は、ｉＰＳＣにおけるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバーへのＥＦ１αプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９の標的挿入を示す図である。Ａ．  ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＥＦ１ａ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクト（図２参照）をトランスフェクトし、ピューロマイシンによるセレクション後、ＡＰ１９０３で処理した。ゲートをかけられた領域は、ＡＰ１９０３細胞死誘導に応答性の、ＧＦＰ陽性細胞をハイライトしている。Ｂ．  ＴＲＡ１８１陽性且つＧＦＰ陽性のｈｉＰＳＣを、バルク選別するか、または９６ウェルプレート内で個別選別した。Ｃ．  ＧＦＰ陽性のバルク選別されたｈｉＰＳＣを、ピューロマイシン非含有培地中でさらなる時間維持して、長期にわたる集団特性を確かめた。Ｄ．  単一細胞に選別されたＴＲＡ１８１且つＧＦＰ細胞に由来するクローナルなｈｉＰＳＣの明視野（bright filed）画像。Ｅ．  クローナルなｈｉＰＳＣを増殖させたところ、増殖後にＧＦＰ発現は様々な程度で失われた。
【００５０】
【図４】図４は、ｈｉＰＳＣにおけるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバーへのＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９の標的挿入を示す図である。Ａ．  ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクト（図２参照）をトランスフェクトした。ピューロマイシン耐性細胞を、バルク選別するか、または９６ウェルプレート内で個別選別した。Ｂ．  ＧＦＰ＋バルク選別ｉＰＳＣを、ピューロマイシン非含有培地中で２１日間維持し、その後、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。Ｃ．  ＡＰ１９０３で処理された際、ＧＦＰ陽性細胞は７ＡＡＤ染色陽性になった。Ｄ．  個別選別後の典型的なコロニーの明視野（bright-filed）画像。Ｅ．  単一細胞から生じたコロニーを増殖させたところ、フローサイトメトリー評価はＧＦＰおよびＴＲＡ１８１の高発現を示した。Ｆ．  選択されたクローンの平均蛍光強度。Ｇ．  親ｈｉＰＳＣ集団プールおよびＣＡＧ  ｈｉＰＳＣ集団プールの両方における、ドナーコンストラクトおよびＡＡＶＳ１遺伝子座の相同組換えを検出するための、ゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲ。
【００５１】
【図５】図５は、ＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンの万能性評価を示す図である。Ａ．  無フィーダー培養で維持されたＣＡＧクローンＣ３８の代表的な画像。Ｂ．  万能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の蛍光免疫染色。Ｃ．  種々の内在性万能性マーカーの発現についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ。Ｄ．  選択されたＣＡＧクローンを、胚葉特異的分化へと方向付け、胚葉マーカーについて評価した。ネスチン、外胚葉；αＳＭＡ、中胚葉、ＳＯＸ１７、内胚葉。Ｅ．  ＣＡＧ−Ｃ３８を、種々の系譜からなる奇形腫を生じる能力について評価した。奇形腫は注射の６週間後に採取した。
【００５２】
【図６】図６は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化されたＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９を有する、万能性状態および分化状態の両方におけるｈｉＰＳＣクローンの、誘導性の自殺遺伝子を介した死滅を示す図である。Ａ．  ２０種のＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを、ＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）で２４時間処理し、その後、フローサイトメトリーでＧＦＰおよび７ＡＡＤ染色について解析した。クローンＣＡＧ−Ｃ５およびＣＡＧ−Ｃ３８から得られたフローサイトメトリープロットもこの図に示した。Ｂ．  １５種のうち１種のＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｉＰＳＣクローンが、ＡＰ１９０３（１０ｎＭ）処理後も生存した。Ｃ．  ＡＰ１９０３（１０ｎＭ）処理後の１０ｃｍディッシュ上のＣＡＧ−Ｃ５生細胞の被覆率の動態。Ｄ．  ＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを誘導して内胚葉細胞、中胚葉細胞または外胚葉細胞に分化させ、各々をＡＰ１９０３で処理し、その後、回復および分化させた。処理前および回復後のレプリケートウェルをクリスタルバイオレットで染色し、イメージングした。ＣＡＧ−Ｃ５クローンから得られた画像を代表として示した。Ｅ．  ＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを誘導してＣＤ３４＋細胞に分化させ、それをＡＰ１９０３で４８時間処理し、細胞死についてフローサイトメトリー解析した。
【００５３】
【図７】図７は、インビボにおける誘導性カスパーゼ９−ｉＰＳＣクローン由来奇形腫のＡＰ１９０３誘導性退縮を示す図である。Ａ．  ＮＳＧマウス試験における皮下注射位置の図示。Ｂ．  ７〜１１日目に親ｈｉＰＳＣ株およびＣＡＧ−Ｃ３８クローンをＡＰ１９０３（腹腔内、計２００μｇ）で処理してから３４日目に採取された奇形腫の画像。Ｃ．  採取された奇形腫を体積測定した。Ｄ．  ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された、親ｈｉＰＳＣまたはＣＡＧ−Ｃ３８株に由来する、採取された奇形腫。親ｈｉＰＳＣ株は多数の三胚葉分化細胞型を示したが、ＣＡＧ−Ｃ３８は、大部分が高度に組織化された脂肪様細胞からなっているように見える。Ｅ．  親ｈｉＰＳＣ株およびＣＡＧクローンを、４Ｅ６細胞で注射し、４０〜４６日目にＡＰ１９０３（腹腔内、計２００μｇ）で処理した。全ての腫瘍を定期的に体積測定した。
【００５４】
【図８】図８は、回避クローンの特徴付けを示す図である。Ａ．  ＡＰ１９０３処理を生存するクローンを選択する方法の図示。Ｂ．  誘導性カスパーゼ９導入遺伝子のＰＣＲ増幅と、その後の精製およびゲノム配列決定による、配列変異が存在するかどうかの確認。Ｃ．  回避クローンのフローサイトメトリー評価は、ＧＦＰおよびＴＲＡ１８１の高発現を示した。Ｄ．  配列決定された全クローンにおける単一点変異Ｋ１８９Ｅの特定。Ｅ．  Ｋ１８９Ｅが不応性クローンの直接的な理由であるかどうかを確認するため、誘導性カスパーゼ９変異型を作製し試験した。Ｆ．  誘導性カスパーゼ９変異型導入遺伝子がＡＰ１９０３処理生存の理由であると確認された。
【００５５】
【図９】図９は、誘導性カスパーゼ９の標的化挿入またはヌクレアーゼ非依存的挿入にＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９を用いる、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座のゲノム編集を示す図である。Ａ．  ＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９を有するＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とするように設計されたコンストラクトの図示。Ｂ．  ｈｉＰＳＣに、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に特異的なｇＲＮＡ／カスパーゼ９−ＲＦＰプラスミド、およびＡに示されたＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞集団をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析し、トランスフェクション効率を求めた（約８９％）。トランスフェクションの２０日後、ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。Ｃ．  コンストラクトを導入された２９３Ｔ細胞におけるＡＰ１９０３誘導性細胞死解析。Ｄ．  ２９３Ｔ細胞におけるコンストラクトの標的挿入。Ｅ．  コンストラクトを導入され、ピューロマイシンによるセレクションによって標的細胞について濃縮された、ｈｉＰＳＣ。
【００５６】
【図１０】図１０は、単一対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９標的組込みを有するｉＰＳＣクローンおよび両対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９標的組込みを有するｉＰＳＣクローンの作製を示す図である。Ａ．  表示のＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９クローンにおける、導入遺伝子（誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰ）コピー数の、定量ＰＣＲに基づく評価。Ｂ．  フローサイトメトリーによって求められた、選別されプールされた培養物（黒色）における、または、単一対立遺伝子性（薄い灰色）もしくは両対立遺伝子性（濃い灰色）誘導性カスパーゼ９標的挿入を有するクローンにおける、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）。Ｃ．  標的化されプールされた細胞およびクローンにおける、ＡＡＶＳ１−導入遺伝子接合部に重なるプライマーを用いた、導入遺伝子組込みのＰＣＲ分析。Ｄ．  ＰＣＲに基づく方法およびＡＡＶＳ１組込み部位に特異的なプライマーを用いた、ＡＡＶＳ１対立遺伝子への標的組込みの数の評価。Ｅ．  生細胞イメージングを用いた、１０ｎＭ  ＡＰ１９０３を添加された直後の、未選別標的化プール細胞、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰについて選別された標的化プール細胞、並びにクローナルなＣＡＧ−Ｃ３８細胞株およびＣＡＧ−Ｃ５細胞株による、プレート表面被覆率の評価。
【００５７】
【図１１】図１１は、外来性ＣＡＧプロモーターが樹立ｉＰＳＣ由来奇形腫の誘導性カスパーゼ９媒介性除去を可能にしたことを示す図である。Ａ．  試験設計の図式的な説明。Ｂ．  ＡＰ１９０３投与前（上段パネル）、およびＡＰ１９０３投与終了の３日後（１２５μｇ、腹腔内、１９〜２５日目から、下段パネル）の、表示された３群のＮＳＧマウス（ｎ＝２）の生物発光画像法。Ｃ．  平均値およびＳＤとして示された、表示された細胞型から生じた奇形腫の発光量（光子／秒）。Ｄ．表示される細胞型についての、処置前の発光量（平均値−／＋ＳＤ）に対する処置後の発光量の比。Ｅ．  クローナルなＣＡＧ−Ｃ３８細胞およびＣＡＧプール細胞の両方を注射されたマウスの結果。Ｆ．  表示される細胞型に由来する奇形腫の末期体積測定値（２８日目）。Ｇ．  ２８日目の奇形腫の画像。ＣＡＧ−Ｃ３８クローンまたはＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９プール細胞を注射された側からは、奇形腫は検出されなかった。＊０．０５未満のｐ値、対応のないｔ検定によって測定。ｎｓ；有意差なし。
【００５８】
【図１２】図１２は、単一対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンの誘導性死滅と比較した場合の、移植された両対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンのより有効な誘導性死滅を示す図である。Ａ．  試験設計の図式的な説明。Ｂ．  ｉＰＳＣ移植後７日目、１４日目および４２日目の、表示される細胞型（両対立遺伝子性ＣＡＧ−Ｃ５クローン、単一対立遺伝子性ＣＡＧ−Ｃ３８クローンおよび親ｉＰＳＣ）を移植されたＮＳＧマウスの生物発光画像法。７日目のイメージングはＡＰ１９０３投与（腹腔内１２５μｇ；７〜１３日目）の直前に行った。Ｃ．  下段パネルは、存在する場合に４２日目に採取された奇形腫の画像を示している。Ｄ．  平均値およびＳＤとして示された、表示された群から生じた奇形腫の発光量（光子／秒）。＊０．０５未満のｐ値；＊＊０．０１未満のｐ値；＊＊＊ ＊＊０．００１未満のｐ値、対応のないｔ検定によって測定。ｎｓ；有意差なし。
【００５９】
【図１３】図１３は、別々のセーフ・ハーバー遺伝子座に標的化された二重の自殺遺伝子による安全監視システムの作製を示す図である。Ａ．  ｓｒ３９ＴＫ、ｓｒ３９ＴＫ−ブラストサイジン（Ｂｓｄ）接合部または内在性Ｈ１１配列−導入遺伝子接合部に特異的なプライマーを用いた、Ｈ１１セーフ・ハーバー遺伝子座へのｓｒ３９ＴＫの特異的なゲノム組込みのＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。Ｂ．  以下の処理を行った、Ｈ１１遺伝子座へのｓｒ３９ＴＫの標的挿入を有する、ＣＡＧ−Ｃ３８  誘導性カスパーゼ９  ｉＰＳＣクローン：（ｉ）ＧＣＶ処理またはＡＰ１９０３処理のいずれも無しで増殖中；（ｉｉ）ＡＰ１９０３のみで２日間処理；（ｉｉｉ）ＧＣＶのみで９日間処理；並びに、（ｉｖ）ＡＰ１９０３およびＧＣＶの両方による２日間の併用処理、その後ＡＰ１９０３を洗浄により除去し、ＧＣＦによる処理をさらに７日間継続。
【００６０】
【図１４】図１４は、Ｂ２Ｍ−／−、ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの作製を示す図である。Ａ．  トランスフェクション前（左パネル）およびトランスフェクション後（中央パネル）のＧＦＰ発現、並びにＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｉ発現のフローサイトメトリー解析。Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｉの両方について陰性の細胞をバルク選別した（右パネル）。Ｂ．  ９６ウェルプレートにクローナルに選別されたＢ２Ｍ陰性且つＨＬＡ−Ｉ陰性細胞のフローサイトメトリー解析。
【００６１】
【図１５Ａ】図１５は、Ｂ２Ｍ−／−、ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの残留性の向上を示す図である。Ａ．  予備刺激されたＴ細胞によって死滅しなかったＢ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣ。Ｂ．  単一ウェル内でＮＫ細胞により共培養下で認識されなかったＢ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣ。Ｃ．  別々のウェル内でＮＫ細胞により共培養下で認識されなかったＢ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣ。Ｄ．  Ｂ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣは免疫応答性マウスにおける残留性が増加している。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１５Ｄ】同上。
【００６２】
【図１６Ａ】図１６は、ｉＰＳＣ上のＨＬＡクラスＩの調節が免疫応答性レシピエントにおけるｉＰＳＣの残留性を増加させることを示している。Ａ．  遺伝子改変されたＨＬＡ改変ｉＰＳＣは、細胞表面上にＨＬＡ−Ｅを発現し、万能性表現型を維持している。Ｂ．  インビボにおける、野生型ｉＰＳＣと比較して増加した残留性を示すＢ２Ｍ−／−ＨＬＡＥ  ｉＰＳＣの注射後７２時間の時点における奇形腫のルシフェリンイメージング。
【図１６Ｂ】同上。
【００６３】
【図１７】図１７は、高親和性切断不可ＣＤ１６受容体および４１ＢＢＬ共起刺激分子を発現するように遺伝子改変されたｉＰＳＣがｉＣＤ３４細胞への分化の間ずっと発現を保持することを示している。Ａ．  ０日目の未分化細胞。Ｂ．  １０日目の分化細胞。
【００６４】
【図１８】図１８は、ＦＴＶ１０６で遺伝子改変されたＴ細胞由来のｉＰＳＣにおけるＣＡＲ（ＦＴＶ１０６）組込みのＰＣＲ分析によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の、供給源Ｔ細胞の同じ遺伝的インプリントを保持するｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）への再プログラム化を示している。
【００６５】
【図１９Ａ】図１９は、ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲの共通識別子としての切断型ＬＮＧＦＲ細胞表面マーカーを発現するように遺伝子改変されたｉＰＳＣが、ｉＣＤ３４細胞への分化を通じて発現を保持することを示している。Ａ．  ０日目の未分化細胞。Ｂ．  １０日目の分化細胞。
【図１９Ｂ】同上。
【００６６】
【図２０】図２０は、内在性ＴＣＲプロモーターによって駆動されるＣＡＲの細胞型特異的な発現、並びに、ＣＡＲの遺伝子座特異的挿入によるＴＣＲの発現および機能のノックアウトを示している。
【００６７】
【図２１】図２１は、免疫抑制タンパク質を発現するように改変されたｈｉＰＳＣが、ＣＤ３４細胞を生じることが可能であることを示している。Ａ．  改変されたＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの細胞表面上のＨＬＡＥ、ＨＬＡＧおよびＰＤＬ１の発現；Ｂ．  全ての改変されたＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣは分化培養の１０日後にＣＤ３４＋ＨＥに分化する。
【００６８】
【図２２】図２２は、免疫抑制タンパク質を発現するように改変されたｈｉＰＳＣが造血系細胞を生じることが可能であることを示している。
【００６９】
【図２３】図２３は、改変された非古典的ＨＬＡ免疫抑制タンパク質の発現がｈｉＰＳＣの血球分化の間に下方制御されることを示している。Ａ．  ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質が存在しないが、一方、ＰＤＬ１発現は維持されている。Ｂ．  タンパク質の分断を示す、上清画分中のＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【００７０】
【図２４】図２４は、ｈｉＰＳＣにおける切断不可なＨＬＡＧ  融合タンパク質の設計および発現を示している。Ａ．  融合タンパク質であるＨＬＡ−Ｅ／Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ／Ｂ２Ｍの切断耐性型の設計。Ｂ．  ＨＬＡ−Ｇ／ＨＬＡ−Ａ３切断不可タンパク質は、ｉＰＳＣの質に影響を与えることなく、細胞表面上に発現される。
【００７１】
【図２５】図２５は、ＨＬＡクラスＩの発現減少を示すＴＡＰ２−／−ｉＰＳＣの発生を示している。Ａ．  親ＦＴｉ１２１との比較でＨＬＡクラスＩ発現において有意な減少を示す２つの選択されたクローンのフローサイトメトリー解析。Ｂ．  ＩＦＮγでの処理の後、これらのＴＡＰ２−／−クローンは野生型ＦＴｉ１２１との比較においてＨＬＡクラスＩの発現減少を示す。
【００７２】
【図２６】図２６は、宿主ＮＫ細胞が免疫応答性レシピエントにおけるｈｉＰＳＣ奇形腫拒絶の一因となっていることを示している。Ａ．  抗体注射の３日後のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の不在。Ｂ．  ｉＰＳＣ注射後１２０時間の時点のＮＫ枯渇マウスは、ＩｇＧコントロールで処置された動物との比較で、最も高い腫瘍拒絶抵抗性を示した。
【００７３】
【図２７Ａ】図２７は、インビトロにおいて、改変されたＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣが増加した残留性および抵抗性を有することを示している。ｈｉＰＳＣ由来細胞上の免疫抑制タンパク質の発現は以下の認識および増殖を妨げる：Ａ．  精製された同種他家由来ヒトＴ細胞；Ｂ．  ＰＢＭＣ同種他家由来ヒトＴ細胞；Ｃ．  ＰＢＭＣ同種他家由来ヒトＮＫ細胞。
【図２７Ｂ】同上。
【図２７Ｃ】同上。
【００７４】
【図２８Ａ】図２８は、ｈｎＣＤ１６タンパク質の発現が改変されたｉＰＳＣの血球分化能に影響を与えないことを示している。Ａ．  ｈｎＣＤ１６細胞表面発現を有する改変されたｉＮＫ細胞。Ｂ．  ｈｎＣＤ１６は、遺伝子改変ｉＰＳＣ由来のｉＮＫ上で、構成的に発現され、且つ持続的に維持される。
【図２８Ｂ】同上。
【００７５】
【図２９Ａ】図２９は、ｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞の機能性の増強を示している。Ａ．  ｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞におけるＣＤ１６刺激によって誘導されるサイトカイン産生の増強。Ｂ．  ｈｎＣＤ１６はｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する。
【図２９Ｂ】同上。
【００７６】
【図３０】図３０は、ｉＮＫ細胞増殖を手段として、ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞の質を示している。
【００７７】
【図３１】図３１は、ｉＮＫ細胞が成熟ＮＫ細胞と比較してより長いテロメアを有していることを示している。
【００７８】
【図３２Ａ】図３２は、ドキシサイクリン誘導性ＣＡＲを組み込まれたｉＰＳＣ株における、Ｔｅｔ誘導性ＣＡＲ−２Ａ−ＬＮＧＦＲ発現を示している。Ａ．  ＴｅｔＣＡＲ  ｉＰＳＣにおける誘導性ＣＤ１９ＣＡＲ発現。Ｂ．  ｉＮＫ媒介性細胞毒性を標的細胞上のカスパーゼ−３の発現についてのフローサイトメトリーで評価した。ｉＮＫ細胞毒性は誘導性ＣＤ１９ＣＡＲ発現によって増強される。
【図３２Ｂ】同上。
【００７９】
【図３３】図３３は、ｉＰＳＣにおけるＣｒｅまたはドキシサイクリン誘導性発現を図示している。Ａ．  １回限りのＣｒｅリコンビナーゼ誘導の後に、終止コドンが除去され、ＣＡＲ発現が活性化される。Ｂ．  １回限りのドキシサイクリン誘導の後に、終止コドンが除去され、ＣＡＲ発現が活性化される。
【００８０】
【図３４】図３４は、破壊のために選択された遺伝子座における目的遺伝子の挿入、および遺伝子編集後のｈｉＰＳＣのクローナルなセレクションを図示している。Ａ．  目的遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入するための標的ベクターおよびドナーベクターのコンストラクト設計。Ｂ．  挿入のための前記選択された遺伝子座に最適な遺伝子を含有するクローン集団に対する、遺伝子編集後のｈｉＰＳＣセレクション。
【００８１】
【図３５】図３５は、Ａ．  プロＴ細胞単離前の；Ｂ．  解凍の３日後の；Ｃ．  １０＋１３日目に凍結保存された；Ｄ．  凍結保存されなかった、プロＴ細胞におけるフローサイトメトリーによる、誘導性プロＴ変換（iProT conversion）、凍結保存、並びに、ＣＤ３４およびＣＤ７の発現を示している；Ｅ．  プロＴ細胞は解凍後に生存可能であり、Ｔ細胞分化培地中で培養された場合、増加された細胞増殖を示す。
【００８２】
【図３６】図３６は、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞およびＣＢ由来プロＴ細胞の機能的特徴付け（サイトカイン放出および化学走性）を示している。Ａ．  ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞はＣＣＬ２１およびＳＤＦに向かって首尾よく移動可能である；Ｂ．  ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞は、応答により、サイトカインであるＩＦＮγおよびＴＮＦαを、産生し分泌することが可能である。
【００８３】
【図３７】図３７は、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞が、ＴＣＲγ遺伝子座から残る生殖系列の割合を減少させており、ＴＣＲ遺伝子座のＶＤＪ組換えを開始していることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
ｈＥＳＣ（胚性幹細胞）またはｉＰＳＣ（誘導万能性幹細胞）等の幹細胞のゲノム改変は、ポリヌクレオチドの挿入、欠失および置換を包含する。ゲノム改変ｉＰＳＣにおける外来遺伝子発現は、元のゲノム改変ｉＰＳＣの長期のクローン増殖後の、細胞分化後の、およびゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞からの脱分化細胞型における、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子発現減少等の、問題にしばしば遭遇する。本発明は、自殺遺伝子および他の機能様式を包含する１または複数の外来遺伝子をｉＰＳＣに安定に組み込み、増殖したｉＰＳＣおよびゲノム改変ｉＰＳＣ由来の分化細胞における前記遺伝子の機能的応答を維持するための、効率的で、信頼ができ、且つ標的化されたアプローチを提供する。一実施形態では、前記ｉＰＳＣは単一細胞由来のクローナルｉＰＳＣである。一実施形態では、本発明は、ｉＰＳＣ、増殖したｉＰＳＣ、およびそれに由来する分化細胞における、特定の無毒性化学誘導物質に応答性の、１または複数の選択された部位における標的組込みに適した、遺伝的にコードされた誘導可能な「自殺」システムを提供する。本発明はすなわち、種々の細胞治療学に適した、周囲の細胞および組織を損傷することなく、投与された細胞を除去するための、効率的で、信頼ができ、且つ標的化されたアプローチである。さらに、本発明はまた、再プログラム化および脱分化、ｉＰＳＣ分化、ＨＳＣ（造血幹細胞・前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞を含むがこれらに限定はされない、ｉＰＳＣまたはその派生細胞の、移植、輸送、ホーミング、遊走、細胞毒性、生存度、維持、増殖、長寿命、自己複製、残留性、および／または生存を促進するタンパク質に関与する、複数の遺伝学的モダリティを組み込まれたクローナルｉＰＳＣを得るための方法およびシステムを提供する。加えて、本発明により、細胞を化学的誘導に対して不応性とし、且つ誘導細胞死からの回避を可能にする、誘導性カスパーゼ９遺伝子における変異の特定、並びに、そのような回避を克服または阻止するための二重自殺遺伝子安全監視システムまたは両対立遺伝子性自殺遺伝子挿入等のアプローチが記述される。
【００８５】
定義
別に規定していない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同様の意味を有する。本発明のために、以下の用語を以下で規定する。
【００８６】
冠詞“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、本明細書では、冠詞の文法上の対象のうちの１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために用いる。例としては、“要素（ある要素）”は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００８７】
択一（例えば、「又は（or）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方又は任意のそれらの組み合わせのうちのいずれかを意味するということを理解されたい。
【００８８】
用語「及び／又は」は、選択肢のうちの１つ又は両方のいずれかを意味するということを理解されたい。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「約」又は「概ね」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さと比べて１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％程度異なる、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さをいう。一実施形態では、用語「約」又は「概ね」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの前後±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％又は±１％である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの範囲をいう。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に」又は「本質的に」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さと比べて約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さをいう。一実施形態では、用語「本質的に同一」又は「実質的に同一」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さとほぼ同一である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの範囲をいう。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「〜を実質的に含まない」および用語「〜を本質的に含まない」は同義的に使用され、細胞集団または培地等の組成物の記述に使用される場合、特定の物質もしくはその供給源を含まない、例えば、特定の物質もしくはその供給源の９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まない、または、常法で測定された場合に検出不能である、組成物を指す。また、組成物中にある特定の成分または物質「を含まない」または「を本質的に含まない」という用語は、係る成分または物質が、（１）いかなる濃度においても前記組成物中に含まれないこと、または、（２）機能的に不活性な低濃度で前記組成物中に含まれること、を意味する。組成物の特定の物質またはその供給源が存在しないことを指す、用語「〜が存在しない（absence of）」にも、同様の意味が当てはまる。
【００９２】
本明細書を通して、別の解釈が必要な文脈でない限り、「備える（含む）」及び「備えた（含んだ）」という文言は、記載されているステップ又は要素又はステップもしくは要素の群を包含するが、その他のステップ又は要素又はステップもしくは要素の群を除外しないことを示唆していると理解されるであろう。特定の実施形態では、用語「含む」、「有する」、「含有する」及び「備える」は同義的に用いる。
【００９３】
「〜からなる」とは、「〜からなる」という句の前に記載したもの全てを含み、それに限定されることを意味する。そのため、「〜からなる」という句は、列記した要素が必要又は必須であり、他の要素は存在し得ないということを示唆する。
【００９４】
「本質的に〜からなる」とは、この句に前に列記した要素と、該列記した要素への開示において特定されている動作又は作用に対して介入又は寄与しないような他の要素に限定される要素とであるあらゆる要素を含むことを意味する。すなわち、「本質的に〜からなる」という句は、列記した要素を必要又は必須とするが、その他の要素は随意であって、列記した要素の動作又は作用にそれらが影響するか否かに応じて、存在してもよく又は存在しなくてもよい。
【００９５】
本明細書全体にわたって「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連の実施形態」、「或る実施形態」、「付加的な実施形態」もしくは「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせを参照することは、その実施形態に関連して記載した特定の特徴、構造又は特性を、本発明の少なくとも１つの実施形態に含むことを意味する。そのため、この明細書全体にわたって様々な箇所で上述の句が登場するが、必ずしも、全てが同一の実施形態を指すものではない。また、特定の特徴、構造又は特性は、１つ又は複数の実施形態で、任意の好適な方法において組み合わせることができる。
【００９６】
用語「生体外（ex vivo）」は、概して、好ましくは天然条件との違いを最小限にした有機体外の人工的な環境における生体組織内又は生体組織上で成される実験又は測定などである、有機体外で実行する活動をいう。特定の実施形態では、「生体外」手順は、有機体から取得し、通常無菌状態下で実験室の装置内において、典型的には数時間又は最大で約２４時間であるが、状況に応じて最大４８時間又は７２時間、培養した生体細胞又は組織を必要とする。或る実施形態では、かかる組織又は細胞は、回収して凍結させ、その後生体外処理のために解凍させることができる。生体細胞又は組織を用いる、数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「管内（in vitro）」とみなされるが、或る実施形態では、この用語を生体外と区別なく用いることがある。
【００９７】
用語「生体内（in vivo）」は、概して、有機体内で行われる活動をいう。
【００９８】
本明細書で用いる場合、用語「初期化（reprogramming）」又は「脱分化（dedifferentiation）」又は「細胞能力（cell potency）の増加」又は「発生能（developmental potency）の増加」は、細胞の能力を増加させる方法又は細胞を低分化状態に脱分化させる方法をいう。例えば、増加した細胞能力を有する細胞は、非初期化状態にある同一細胞と比較して、発生上の可塑性がより高い（すなわち、より多くの細胞型に分化可能）。すなわち、非初期化状態にある同一細胞よりも低分化状態である細胞が、初期化細胞である。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特殊化されていない（「運命決定されていない（uncommitted）」）、または特殊化の程度が低い細胞が、例えば血液細胞または筋細胞等の特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、または分化誘導された細胞は、細胞の系譜内で、より特殊化された（「運命決定された」）位置付けとなった細胞である。用語「運命決定された（committed）」とは、分化の過程に適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型または細胞型サブセットに分化し続け、且つ、通常の状況下で、異なる細胞型に分化できない、または、より分化程度の低い細胞型に戻ることができない、ポイントにまで分化経路を進んだ細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「万能性」とは、身体（body）または体細胞（soma）（すなわち、胚本体（embryo proper））の全ての系譜を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の三胚葉のそれぞれから細胞を形成することが可能な万能性幹細胞の一種である。万能性は、完全な生物を生じることができない不完全または部分的万能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じることができるより原始的でより万能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）まで及ぶ、一連の発生能である。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「誘導万能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）」、またはｉＰＳＣ、とは、３つ全ての胚葉または皮層（中胚葉、内胚葉、および外胚葉）の組織に分化可能な細胞へと、誘導または変化、すなわち再プログラム化された、分化型の成熟した新生児期細胞または胎生期細胞から作製された、幹細胞を意味する。作製されたｉＰＳＣは、それが天然に存在する場合の細胞を指さない。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞（embryonic blastocyst）の内部細胞塊の自然発生的な万能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は、万能性であり、且つ、発生中に３つの一次胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）の全ての誘導体を生じる。胚性幹細胞は、胚体外膜または胎盤に寄与せず、すなわち全能性ではない。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞（multipotent stem cell）」とは、３つ全てではないが、１または複数の胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。従って、多能性細胞は「部分分化細胞（partially differentiated cell）」とも称され得る。多能性細胞は当該技術分野において周知であり、多能性細胞の例としては、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞等の成体幹細胞が挙げられる。「多能性」とは、細胞が、所与の系譜における多くの細胞型を形成し得るが、他の系譜の細胞を形成しないこと、を表す。例えば、多能性造血細胞は、多種様々な血液細胞（赤血球、白血球、血小板等）を形成できるが、ニューロンを形成できない。従って、用語「多能性」とは、発生能の程度が全能性にも万能性にも満たない細胞の状態を指す。
【０１０３】
多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することによって判断することができる。多能性特性には、限定するものではないが、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無限自己複製の可能性、（ｉｉｉ）限定するものではないがＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４；ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１−６０／８１；ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含む、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３体細胞系（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の全てに分化する能力、（ｖ）３体細胞系からなるテラトーマ形成、及び（ｖｉ）３体細胞系からの細胞からなる胚様体の形成が含まれる。
【０１０４】
２種類の多能性である、後期の胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似である、「初回刺激を受けた」状態の多能性又は「準安定」状態の多能性、及び、初期／着床前の胚盤胞の内細胞塊に類似である、「ナイーブ」状態の多能性又は「基底」状態の多能性について先に述べた。該多能性の状態はいずれも、上記に記載した特性を呈するが、ナイーブ又は基底状態では、（ｉ）雌性細胞内のＸ染色体の事前の不活性化（preinactivation）又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存性の向上、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な低下、（ｉｖ）発生上の調節性遺伝子プロモーター上でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制型クロマチン標識の局在の低下、及び（ｖ）初回刺激を受けた状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現が低減すること、をさらに呈する。外因性多能性細胞を体細胞に誘導し、発現し、その後サイレンシングされるか又は得られた多能性細胞から除去されるという、細胞の初期化の標準的な方法論は、概して、初回刺激を受けた状態の多能性の特性を有するものと見られている。標準的な多能性細胞培養条件下では、かかる細胞は、基底状態の特性が観察されるものである外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、初回刺激を受けた状態のままである。
【０１０５】
本明細書で用いる場合、用語「多能性幹細胞形態」は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴をいう。正常な胚性幹細胞形態は、高いＮＣ比（nucleus-to-cytoplasm ratio）、核小体の顕著な存在、及び典型的な細胞間隙をもつ、球状の小さい形状によって特性決定される。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、あらゆる動物を指し、好ましくは、ヒト患者、家畜（livestock）、または他の家畜化された動物（domesticated animal）を指す。
【０１０７】
「万能性因子（pluripotency factor）」または「再プログラム化因子（reprogramming factor）」とは、単独で、または他の剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることが可能な剤を指す。万能性因子には、細胞の発生能を増加させることが可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が包含されるが、これらに限定はされない。例示的な万能性因子としては、例えば、転写因子および小分子再プログラム化剤（small molecule reprogramming agent）が挙げられる。
【０１０８】
「培養」又は「細胞培養」は、管内環境での、細胞の維持、成長及び／又は分化をいう。「細胞培地（培養培地）」、「培地（培養培地）」（いくつかの場合では単に「培地」）、「サプリメント」及び「培地サプリメント」は、細胞培養を育成する栄養成分をいう。
【０１０９】
「育成（培養）する（cultivate）」は、組織外又は体外にある細胞、例えば無菌のプラスチック（又は被覆プラスチック）細胞培養ディッシュ又はフラスコ中にある細胞を、維持すること、繁殖させること（増殖させること）及び／又は分化させることをいう。「育成（培養）」には、栄養、ホルモン及び／又は、細胞を繁殖ならびに／もしくは維持するのに役立つ他の因子の源として、培地が利用され得る。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「中胚葉」とは、初期胚形成期に現れ、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、並びに他の支持組織および結合組織を含む、種々の特殊化した細胞型を生じる、３つの胚葉（germinal layer）のうちの１つを指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「運命確定造血内皮（definitive hemogenic endothelium）」（ＨＥ）または「万能性幹細胞由来運命確定造血内皮（pluripotent stem cell-derived definitive hemogenic endothelium）」（ｉＨＥ）とは、内皮造血転換（endothelial-to-hematopoietic transition）と称されるプロセスにおいて造血幹細胞・前駆細胞を生じる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から、血管芽細胞を介して、運命確定造血内皮および造血前駆細胞まで、順次進行する。
【０１１２】
用語「造血幹細胞・前駆細胞（hematopoietic stem and progenitor cell）」、「造血幹細胞（hematopoietic stem cell）」、「造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cell）」、または「造血前駆細胞（hematopoietic precursor cell）」とは、造血系に運命決定されたが、さらなる血球分化が可能である細胞を指し、多能性造血幹細胞（血球母細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞を包含する。造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。用語「運命確定造血幹細胞（definitive hematopoietic stem cell）」とは、本明細書で使用される場合、成熟骨髄系細胞型、並びにＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞を含む成熟リンパ系細胞型の両方を生じることが可能なＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞は、未分化の赤血球、巨核球（megakarocyte）およびマクロファージを生じる、種々の未分化造血細胞サブセットも包含する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、同義的に使用され、胸腺内での成熟を完了した、且つ、身体内の特定の外来抗原の特定、並びに他の免疫細胞の活性化および非活性化を含む、免疫系における種々の役割を有する、主要な白血球型を指す。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、または哺乳動物から得られるＴ細胞、等のあらゆるＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、あらゆる種類のＴ細胞とすることができ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞（regulator T cell）、γδＴ細胞等を含むがこれらに限定はされない、あらゆる発生段階のＴ細胞とすることができる。ヘルパーＴ細胞のさらなるの種類としては、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、またはＴｆｈ細胞等の細胞が挙げられる。メモリーＴ細胞のさらなる種類としては、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）等の細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞等の、遺伝子改変Ｔ細胞も指し得る。Ｔ細胞は、幹細胞または前駆細胞からも分化され得る。
【０１１４】
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、その表面上にＣＤ４を発現し、且つ、細胞性免疫応答と関連した、Ｔ細胞サブセットを指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０等のサイトカインの分泌を含み得る、刺激後の分泌プロファイルによって特徴づけられる。「ＣＤ４」は、元々はＴリンパ球上の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞上でも見つかった。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ制限免疫応答における連合性の認識要素として意味付けられている。Ｔリンパ球上で、ＣＤ４抗原がヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。
【０１１５】
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、その表面上にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限性であり、且つ、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する、Ｔ細胞サブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞上、並びに細胞傷害性Ｔリンパ球上およびサプレッサーＴリンパ球上に存在する分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限相互作用における連合性（associative）の認識要素である。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」とは、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される、末梢血リンパ球サブセットを指す。本明細書で使用される場合、用語「獲得ＮＫ細胞（adaptive NK cell）」および「メモリーＮＫ細胞（memory NK cell）」は置き換え可能であり、表現型がＣＤ３−且つＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ５７、並びに所望によりＣＤ１６を発現するが、以下（ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、およびＥＡＴ−２）のうちの一つまたは複数の発現を欠く、ＮＫ細胞サブセットを指す。いくつかの実施形態では、単離されたＣＤ５６＋ＮＫ細胞亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化ＫＩＲおよび抑制ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ並びにＤＮＡＭ−１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、薄暗い発現であっても明るい発現であってもよい。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞」または「ナチュラルキラーＴ細胞」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞を指す。通常の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を検知する通常のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子である、ＣＤ１ｄにより提示される脂質抗原を認識する。２種類のＮＫＴ細胞が現在認知されている。インバリアントまたはＩ型のＮＫＴ細胞は、非常に限定されたＴＣＲレパートリー、限定された範囲のβ鎖（ヒトではＶβ１１）と結合した標準的なα鎖（ヒトではＶα２４−Ｊα１８）、を発現する。第二のＮＫＴ細胞集団は、非古典的または非インバリアントなＩＩ型のＮＫＴ細胞と呼ばれ、より不均一なＴＣＲαβの使用を示す。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、現在、免疫療法に好適と見なされている。獲得またはインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも一つまたは複数の発現により特定することができる：ＴＣＲ  Ｖａ２４−Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１およびＣＤ５６。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」等は、その元の環境から分離された細胞または細胞集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境が「未単離の」参照細胞が存在する環境に存在する少なくとも１つの成分を実質的に含まないこと、を指す。前記用語は、その天然の環境（例えば、組織、生検）に存在する場合の、いくつかまたは全ての成分から取り出された細胞を包含する。前記用語は、非自然発生的な環境（例えば、培地、細胞懸濁液）に存在する場合の、少なくとも１、いくつかまたは全ての成分から取り出された細胞も包含する。従って、単離された細胞は、天然に存在する場合の、または、非自然発生的な環境下で増殖、貯蔵もしくは生存した場合の、他の物質、細胞または細胞集団を含む少なくとも１つの成分から、部分的または完全に分離されている。単離された細胞の具体例としては、部分的に純粋な細胞、実質的に純粋な細胞、および非自然発生的な培地中で培養された細胞が挙げられる。単離された細胞は、所望の細胞またはその集団を、環境内の他の物質もしくは細胞から分離することによって得てもよいし、または、１もしくは複数の他の細胞集団もしくは細胞亜集団を環境から除去することによって得てもよい。本明細書で使用される場合、用語「精製する」等は、純度を増加させることを指す。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％に増加され得る。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「コードする」とは、定められたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定められたアミノ酸配列を有する、生物学的プロセスにおいて他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列の、固有の特性、並びにそれからもたらされる生物学的特性を指す。すなわち、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によって、細胞または他の生物系においてタンパク質が産生される場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、配列表に通常示されるヌクレオチド配列であるコード鎖、および、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖は共に、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物コードしていると言える。
【０１２０】
「コンストラクト」とは、インビトロまたはインビボにおいて、宿主細胞へと送達される、高分子またはポリヌクレオチドを含む分子の複合体を指す。「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、外来遺伝物質の、該外来遺伝物質の複製および／または発現が可能な標的細胞への、送達または移行を指示可能な、あらゆる核酸コンストラクトを指す。用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、送達されるコンストラクトを含む。ベクターは線状分子であっても環状分子であってもよい。ベクターは組込型ベクターであっても非組込型ベクターであってもよい。ベクターの主な種類には、限定はされないが、プラスミド、エピソーマルベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が包含される。ウイルスベクターとしては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。
【０１２１】
「組込み」とは、コンストラクトの１または複数のヌクレオチドが、細胞ゲノムに安定に挿入されること、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されること、を意味する。「標的組込み」とは、予め選択された部位すなわち「組込み部位」において、コンストラクトのヌクレオチドが細胞の染色体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。用語「組込み」はさらに、本明細書で使用される場合、組込み部位における内在性の配列またはヌクレオチドの欠失を伴うまたは伴わない、コンストラクトの１または複数の外来配列またはヌクレオチドの挿入を含むプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組込み」は、１または複数の挿入ヌクレオチドと共に欠失した内在性の配列またはヌクレオチドの置換もさらに含み得る。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「外来性」は、参照された分子または参照された活性が宿主細胞に導入されたものであることを意味することを意図している。前記分子は、例えば、宿主染色体への組込み等による、宿主の遺伝物質へのコード核酸の導入によって、または、プラスミド等の非染色体性遺伝物質として、導入することができる。従って、前記用語は、コード核酸の発現に関連して使用される場合、発現可能な形態におけるコード核酸の細胞への導入を指す。用語「内在性」とは、宿主細胞内に存在する参照される分子または活性を指す。同様に、前記用語は、コード核酸の発現に関連して使用される場合、細胞内に含有され、外来的に導入されない、コード核酸の発現を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「目的遺伝子（gene of interest）」または「目的ポリヌクレオチド配列（polynucleotide sequence of interest）」は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合に、インビボにおいて、ＲＮＡに転写され、場合によってポリペプチドに翻訳される、ＤＮＡ配列である。目的遺伝子または目的ポリヌクレオチドは、原核生物配列（prokaryotic sequence）、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含し得るが、これらに限定されない。例えば、目的遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に存在するポリペプチド）またはその断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）またはその断片；操作されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療用のペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択マーカー等をコードし得る。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、あらゆる長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体）の重合形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）の４種のヌクレオチド塩基から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（Ｕ）である。ポリヌクレオチドは、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーを包含し得る。また、ポリヌクレオチドは二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２個のアミノ酸を含まなければならないが、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に限度は無い。本明細書で使用される場合、前記用語は、当該技術分野において一般に、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短い鎖、並びに、当該技術分野において一般にポリペプチドまたはタンパク質と称されるより長い鎖、の両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に挙げられる。これらのポリペプチドには、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの組み合わせが包含される。
【０１２６】
「機能的に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片に対する核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることが可能である（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターによる転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列または機能的ＲＮＡと機能的に連結されている。コード配列は、センス配向においてもアンチセンス配向においても、制御配列に機能的に連結可能である。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的インプリント（genetic imprint）」とは、供給源である細胞またはｉＰＳＣにおける優先的な治療的特性に寄与し、且つ、前記供給源細胞に由来するｉＰＳＣおよび／または前記ｉＰＳＣに由来する造血系細胞において保持可能な、遺伝的または後成的な情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞（source cell）」は、再プログラム化を通じたｉＰＳＣの作製に使用され得る非万能性細胞であり、供給源細胞に由来するｉＰＳＣは、あらゆる造血系細胞を包含する特定の細胞型にさらに分化し得る。文脈によっては、供給源細胞に由来するｉＰＳＣ、およびそれからの分化細胞は、まとめて「派生細胞（derived cell）」と呼ばれる場合がある。本明細書で使用される場合、優先的な治療的特性を与える遺伝的インプリントは、ドナー特異的、疾患特異的、もしくは治療応答特異的な選択された供給源細胞の再プログラム化を通じて、または、ゲノム編集を用いたｉＰＳＣへの遺伝子改変様式の導入を通じて、ｉＰＳＣに組み込まれる。具体的に選択されたドナー状況、疾患状況または治療状況から得られる供給源細胞の局面において、優先的な治療的特性に寄与している遺伝的インプリントは、根底にある分子現象が特定されているかどうかにかかわらず、選択された供給源細胞の派生細胞に受け継がれた、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療的特性を顕在化させる、あらゆる状況特有の遺伝子改変またはエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的な供給源細胞は、ｉＰＳＣおよび派生造血系細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含み得るが、この遺伝的インプリントとしては、限定はされないが、所定の単一特異的ＴＣＲ、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞またはインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からのもの；追跡可能且つ望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異についてホモ接合性のもの；並びに、所定のＨＬＡ要求、すなわち、個体群が増加したハプロタイプを示す、選択されたＨＬＡに適合したドナー細胞が挙げられる。本明細書で使用される場合、優先的な治療的特性には、移植の改善、輸送の改善、ホーミングの改善、生存度の改善、自己複製の改善、残留性の改善、免疫応答の制御および調節の改善、生存の改善、並びに派生細胞の細胞毒性の改善が包含される。優先的な治療的特性は、抗原標的化受容体の発現；ＨＬＡ提示またはその欠如；腫瘍内微小環境に対する耐性；傍観者免疫細胞（bystander immune cell）および免疫調節の誘導；腫瘍外効果（off-tumor effect）の減少に伴う、対標的特異性（on-target specificity）の向上；化学療法等の治療に対する耐性にも関連し得る。
【０１２８】
用語「増強された治療的特性」とは、本明細書で使用される場合、同一の通常の細胞型の典型的な免疫細胞と比較した場合に、増強された細胞の治療的特性を指す。例えば、「増強された治療的特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な、無改変の、および／または自然発生的なＮＫ細胞と比較した場合に、増強、改善、且つ／または増大された治療的特性を有する。免疫細胞の治療的特性には、細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、免疫応答の制御および調節、生存、並びに細胞毒性が包含され得るが、これらに限定はされない。免疫細胞の治療的特性は、以下によっても顕在化される：抗原標的化受容体発現；ＨＬＡ提示またはその欠如；腫瘍内微小環境に対する耐性；傍観者免疫細胞および免疫調節の誘導；腫瘍外効果の減少に伴う、対標的特異性の向上；化学療法等の治療に対する耐性。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「エンゲージャー（engager）」は、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球と、腫瘍細胞との間の連結形成；および免疫細胞の活性化、が可能な分子、例えば融合ポリペプチド、を指す。エンゲージャーの例としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合する汎用エンゲージャー（universal engager）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「表面上誘発受容体（surface triggering receptor）」は、免疫応答、例えば細胞傷害反応、を誘発または惹起することができる受容体を指す。表面上誘発受容体は操作されている場合があり、エフェクター細胞上、例えばＴ細胞上、ＮＫ細胞上、ＮＫＴ細胞上、Ｂ細胞上、マクロファージ上、好中球上に発現され得る。いくつかの実施形態では、表面上誘発受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは無関係に、二重特異性抗体または多重特異性抗体による、エフェクター細胞と特異的な標的細胞（例えば腫瘍細胞）との間の結合を促進する。このアプローチを用いて、普遍的な表面上誘発受容体を含むｉＰＳＣを作製した後、係るｉＰＳＣを普遍的な表面上誘発受容体を発現する種々のエフェクター細胞型の集団に分化させてよい。「普遍的（universal）」とは、表面上誘発受容体が、細胞型とは無関係にあらゆるエフェクター細胞で発現され、それを活性化し得ること、並びに、普遍的な受容体を発現する全てのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性にかかわらず、表面上誘発受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに共役または連結され得ること、を意味している。いくつかの実施形態では、普遍的な表面上誘発受容体との共役のために、同じ腫瘍標的特異性を有するエンゲージャーが用いられる。いくつかの実施形態では、普遍的な表面上誘発受容体との共役のために、異なる腫瘍標的特異性を有するエンゲージャーが用いられる。従って、１または複数のエフェクター細胞型を結合させることで、一部の例では特定の１種の腫瘍細胞を死滅させることができ、他の一部の例では２種以上の腫瘍を死滅させることもできる。表面上誘発受容体は、通常、エフェクター細胞活性化およびエンゲージャーのエピトープに対して特異的な抗エピトープのための共刺激ドメインを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面上誘発受容体の抗エピトープに対し特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に対し特異的である。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「セーフティ・スイッチタンパク質（safety switch protein）」とは、細胞療法の潜在的な毒性またはさもなくば有害作用を防ぐように設計された、操作されたタンパク質を指す。場合によって、セーフティ・スイッチタンパク質の発現は、セーフティ・スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノム内に永続的に組み入れた、移植された被操作細胞に関する安全性の懸念に対処するために、条件的に制御される。この条件的制御は、変じ得るものであり、小分子介在性の翻訳後活性化および組織特異的且つ／または時間的な転写制御を介した制御を包含し得る。前記セーフティ・スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写性および転写後の遺伝的調節、並びに／または抗体を介した枯渇を媒介し得る。場合によって、セーフティ・スイッチタンパク質は、活性化された場合に治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を引き起こす、外来性分子（例えばプロドラッグ）によって活性化される。セーフティ・スイッチタンパク質の例としては、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくはカスパーゼ７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ等の自殺遺伝子、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。この戦略では、有害事象の場合に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入細胞を死滅させる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「薬剤的に活性なタンパク質またはペプチド」とは、生物に対し生物学的および／または薬剤的な効果を達成することが可能な、タンパク質またはペプチドを指す。薬剤的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的な、治療的な、または対症的な性質を有し、疾患の重症度を改善、軽減、緩和、逆転（reverse）または低減するために投与され得る。薬剤的に活性なタンパク質は、予防的な性質も有し、疾患の発生を予防するために、または、実際に発病した場合にそのような疾患もしくは病的状態の重症度を低減するために、使用される。薬剤的に活性なタンパク質として、タンパク質全体もしくはペプチド全体またはその薬剤的に活性な断片が包含される。タンパク質もしくはペプチドの薬剤的に活性な類似体、またはタンパク質もしくはペプチドの断片の類似体も包含される。薬剤的に活性なタンパク質という用語は、協同的または相乗的に作用して治療効果をもたらす、複数のタンパク質またはペプチドのことも指す。薬剤的に活性なタンパク質またはペプチドの例としては、受容体、結合タンパク質、転写因子および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体もしくはその断片、増殖因子、並びに／またはサイトカインが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「シグナル伝達分子」とは、細胞間情報伝達を調節する、それに関与する、それを阻害する、それを活性化する、それを低減させる、またはそれを増加させる、あらゆる分子を指す。シグナル伝達とは、最終的には細胞における生化学的事象を惹起する経路に沿った、タンパク質複合体のリクルートによる、化学修飾の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は、当該技術分野において周知であり、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達（toll gate signaling）、リガンド開口型イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル経路、Ｗｎｔシグナル経路、ｃＡＭＰ依存性経路、およびＩＰ３／ＤＡＧシグナル経路が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「標的化モダリティ（targeting modality）」とは、ｉ）ユニークなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する場合の、抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関する場合の、エンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、および、ｖ）特異的な抗原または表面分子が無い場合の他の標的化戦略、を含むがこれらに限定はされない、抗原特異性および／またはエピトープ特異性を促進するために、細胞に遺伝的に組み込まれた分子、例えばポリペプチド、を指す。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「特異的」または「特異性」は、非特異的または非選択的な結合と対比して、分子、例えば受容体またはエンゲージャーの、標的分子に選択的に結合する能力を指して用いられ得る。
【０１３６】
本明細書で使用される用語「養子細胞療法（adoptive cell therapy）」とは、本明細書で使用される場合に、輸血前に生体外で増殖された、遺伝子改変されたまたはされていない、Ｔ細胞またはＢ細胞とされる、自己または同種間のリンパ球の輸血に関する、細胞に基づく免疫療法を指す。
【０１３７】
「治療上十分な量（therapeutically sufficient amount）」は、本明細書で使用される場合、その意味の中に、所望の治療効果をもたらすとされる、無毒の、ただし十分量および／または有効量の、特定の治療用および／または医薬組成物を含む。正確な必要量は、患者の全体的な健康、患者の年齢、並びに状態の段階および重症度等の要因に応じて、対象毎に異なる。特定の実施形態では、治療上十分な量は、治療中の対象の疾患または状態に伴う少なくとも１つの症状を改善、低減、および／または改善するのに十分および／または有効である。
【０１３８】
万能性幹細胞の分化は、培地中の刺激剤または細胞の物理的状態を変化させる等、培養系の変化を必要とする。最もありふれた戦略では、系譜特異的分化を開始させるために、共通且つ決定的な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成が利用される。「胚様体」は、その三次元領域内に多数の系譜を生じることから胚発生を模倣することが示されている、三次元的なクラスターである。典型的には数時間から数日間の分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化するよう誘導された凝集した万能性幹細胞）は、成熟を続けて嚢胞性ＥＢへと発達し、その時点で、典型的には数日から数週間、分化を継続するようにさらに処理される。ＥＢ形成は、万能性幹細胞同士を三次元的多層細胞クラスター内で互いに接近させることで惹起され、典型的には、これは、万能性細胞を液滴中に沈降させ、細胞を「Ｕ」字底ウェルプレートに沈降させることを含むいくつかの方法のうちの１つによって、または機械撹拌によって、達成される。ＥＢ発生を促進するため、万能性幹細胞の凝集体は、万能性培養維持培地中で維持される凝集体は適切なＥＢを形成しないため、さらなる分化の合図を必要とする。従って、万能性幹細胞凝集体は、最適な系譜に向けた誘発合図を供給する分化用培地に移される必要がある。ＥＢベースの万能性幹細胞培地は、典型的には、ＥＢ細胞塊内の中程度の増殖と共に、分化細胞集団（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の生成をもたらす。細胞分化を促進することは分かっているが、ＥＢは、三次元構造内での、環境由来の分化合図への一貫しない細胞暴露により、分化状態が一様でない不均一な細胞を生じる。さらに、ＥＢは作製と維持に手間がかかる。さらに、ＥＢを介した細胞分化は中程度の細胞増殖を伴い、これは低い分化効率の一因にもなる。
【０１３９】
比較すると、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」と異なり、万能性幹細胞に由来する細胞集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく万能性幹細胞の増殖中、培地は増殖および万能性を維持するように選択される。細胞増殖は、一般に、より大きな凝集体の形成により凝集体のサイズを増加させるが、これらの凝集体を定期的に機械的または酵素的により小さな凝集体へと分離させることで、培養物内の細胞増殖を維持し、細胞数を増加させることができる。ＥＢ培養と異なり、維持培養液中の凝集体内で培養された細胞は、万能性のマーカーを維持する。万能性幹細胞凝集体は、分化を誘発するためにさらなる分化合図を必要とする。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「単層分化」は、三次元的多層細胞クラスターを介した分化、すなわち「ＥＢ形成」とは異なる分化法を指す用語である。単層分化は、他の利点も本明細書で開示されるが、分化惹起にＥＢ形成の必要がない。単層培養はＥＢ形成等の胚発生を模倣していないため、ＥＢにおける３つ全ての胚葉分化と比較して、特定の系譜に向けた分化は最低限と見なされる。
【０１４１】
本明細書で用いる場合、「解離させた」細胞は、他の細胞又はある面（例えば、培養皿表面）から、実質的に離した又は精製した細胞をいう。例えば、機械的方法又は酵素的方法によって、動物又は組織から細胞を解離させることができる。あるいは、例えばクラスターの、単一細胞の、又は単一細胞とクラスターとの混合物の懸濁液に、酵素的又は機械的に解離させるなどによって、管内で凝集している細胞を、互いに解離させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、培養皿又は他の面から接着細胞を解離させる。そのため、解離により、細胞外基質（ＥＣＭ（extracellular matrix））及び培養基質（例えば、培地表面）との細胞相互作用を破壊すること又は細胞間におけるＥＣＭを破壊することに関与する場合がある。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、フィーダー細胞が第二の細胞型の支持のために増殖因子および栄養分を供給することから、第二の種類の細胞が増殖可能な環境を与えるために、第二の種類の細胞と共培養される、１種の細胞を記述する用語である。フィーダー細胞は、フィーダー細胞が支持している細胞と異なる種由来であってもよい。例えば、幹細胞を含む、ある特定の種類のヒト細胞は、マウス胎仔線維芽細胞の初代培養物、または不死化したマウス胎仔線維芽細胞によって支持することができる。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養されている時、フィーダー細胞が支持している細胞よりも増殖することを防ぐための、照射またはマイトマイシン等の有糸分裂阻害剤による処理によって、不活性化され得る。フィーダー細胞には、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病細胞が包含され得る。上記を制限することなく、１つの特定のフィーダー細胞型はヒト皮膚線維芽細胞等のヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。一般に、様々なフィーダー細胞を部分的に使用することで、万能性の維持、ある特定の系譜への分化の配向、および、エフェクター細胞等の特殊化した細胞型への成熟の促進が可能である。
【０１４３】
本明細書で用いる場合、「フィーダーフリー（ＦＦ）」環境は、フィーダー細胞を本質的に含まない及び／又はフィーダー細胞の育成によって予め条件付けしていない、細胞培養又は培地などの環境をいう。「予め条件付けした」培地は、例えば少なくとも１日である期間の間、培地内でフィーダー細胞を育成した後、採取した培地をいう。予め条件付けした培地は、培地内で育成したフィーダー細胞によって分泌された増殖因子及びサイトカインを含む多数の介在物質を含有する。
【０１４４】
「機能的」とは、ｉＰＳＣおよびそれから分化した派生非万能性細胞のゲノム編集もしくはゲノム修飾、または、非万能性細胞およびそれから再プログラム化された派生ｉＰＳＣのゲノム編集もしくはゲノム修飾に関連して使用される場合、以下を指す：（１）遺伝子レベルでは、直接的なゲノム編集もしくはゲノム修飾を通じて、もしくは、最初にゲノム操作された開始細胞からの分化もしくはその再プログラム化を介した「伝播（passing-on）」を通じて達成される、望ましい細胞発生段階における誘導性発現もしくは時間的発現等の、ノックイン、ノックアウト、ノックダウンが成功した遺伝子発現、遺伝子導入による遺伝子発現、もしくは制御された遺伝子発現；または、（２）細胞レベルでは、以下を介した細胞機能／特徴の除去、付加、または変化の成功：（ｉ）直接的なゲノム編集を通じて前記細胞において獲得される遺伝子発現修飾、（ｉｉ）最初にゲノム操作された開始細胞からの分化もしくはその再プログラム化を介した「伝播」を通じて前記細胞において維持される遺伝子発現修飾；（ｉｉｉ）前記細胞の発生初期段階にのみ現れる、もしくは、分化もしくは再プログラム化を介して前記細胞を生じる開始細胞においてのみ現れる、遺伝子発現修飾の結果としての、前記細胞における下流遺伝子制御；もしくは、（ｉｖ）初めにｉＰＳＣ、前駆細胞もしくは脱分化した細胞起源で行われるゲノム編集もしくはゲノム修飾から生じた、成熟細胞性産物内で示される、細胞機能もしくは特性の増強もしくは新規獲得。
【０１４５】
ＨＬＡクラスＩ欠損、もしくはＨＬＡクラスＩＩ欠損、または両方を包含する、「ＨＬＡ欠損」とは、細胞が、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全ＭＨＣ複合体の細胞表面発現を、欠いている、またはそれをもはや維持できない、またはそのレベルを減少させており、その結果、減弱または減少後のレベルが、他の細胞により、または合成法により、天然に検出可能なレベルに満たないことを指す。ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）のいずれかの領域の機能的欠失、または、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子およびタパシンを含むがこれらに限定はされない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の発現レベルの欠失もしくは減少によって達成され得る。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定はされない、ＨＬＡ−ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または減少によって達成され得る。ＨＬＡ複合体が欠損または改変されたｉＰＳＣが、調節された活性を保持しながら、発生段階に入り、成熟し、機能的な分化細胞を生じる能力を有しているかどうかは、本発明より以前は不明であった。さらに、ＨＬＡ複合体欠損分化細胞を、ＨＬＡ複合体欠損を持たせつつ、ｉＰＳＣに再プログラム化し、万能性幹細胞として維持可能であるかどうかは、本発明より以前は不明であった。細胞の再プログラム化、万能性の維持および分化の間の予期しない失敗は、発生段階に特異的な遺伝子発現またはその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要求、導入された表面発現様式のタンパク質分断、適切且つ効率的なクローナルな再プログラム化の必要性、および分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定はされない、局面に関連している場合がある。
【０１４６】
「改変型ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」とは、本明細書で使用される場合、限定はされないが、分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、残留性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、同時刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、化学走性、および細胞傷害活性の向上に関連したタンパク質、例えば、非古典的なＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６  Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１、を発現する遺伝子の導入により、さらに改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変型ＨＬＡ欠損」細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も包含される。
【０１４７】
ＦｃＲと略される「Ｆｃ受容体」は、それが認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的な抗体クラスのＩｇＧと結合するものはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と称され、ＩｇＡと結合するものはＦｃα受容体（ＦｃαＲ）と称され、ＩｇＥと結合するものはＦｃε受容体（ＦｃεＲ）と称される。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞）および各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）はいくつかのメンバー、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、を包含するが、これらは分子構造の違いにより抗体親和性が異なる。
【０１４８】
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体の２つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）、として同定された。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通型タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧと結合することで、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する。「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可ＣＤ１６」または「高親和性切断不可ＣＤ１６」とは、本明細書で使用される場合、ＣＤ１６の変異型を指す。野生型のＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞活性化後に白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質切断プロセスである細胞外ドメイン切断を受ける。Ｆ１７６ＶおよびＦ１５８Ｖは高親和性を有する例示的なＣＤ１６バリアントであり；一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは切断不可ＣＤ１６の一例である。
【０１４９】
Ｉ．  ｉＰＳＣ細胞における選択された遺伝子座に標的化された編集法
本明細書において同義的に使用される、ゲノム編集（genome editing）、またはゲノム編集（genomic editing）、または遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにおいてＤＮＡが挿入、欠失、および／または置換される、遺伝子工学の一種である。標的ゲノム編集（targeted genome editing）（「標的ゲノム編集（targeted genomic editing）」または「標的遺伝子編集」と置き換え可能）は、ゲノム内の予め選択された部位においての挿入、欠失、および／または置換を可能にする。標的編集の間に挿入部位において内在配列が欠失された場合、影響を受けた配列を含む内在性遺伝子は、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされ得る。従って、標的編集は内在性遺伝子発現を妨害する目的にも使用され得る。挿入部位における内在配列の欠失を伴うまたは伴わない、１または複数の外来配列の挿入を含むプロセスを指す「標的組込み」という用語も、本明細書で同様に使用される。比較において、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受けることで、その発現を不確かで予測不可能なものにする。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、導入遺伝子サイレンシングを特に受け易い。相互的に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内在性遺伝子およびクロマチンに影響を与えることで、細胞の挙動を変化させる、または細胞形質転換を援助する場合がある。従って、セーフ・ハーバー遺伝子座、またはゲノム内セーフ・ハーバー（ＧＳＨ）等の予め選択された遺伝子座に外来性ＤＮＡを挿入することが、安全性、効率、コピー数制御、および信頼できる遺伝子応答制御にとって重要となる。
【０１５０】
標的編集は、ヌクレアーゼに非依存的なアプローチを通じて、またはヌクレアーゼに依存的なアプローチを通じて、達成され得る。ヌクレアーゼに非依存的な標的編集アプローチでは、宿主細胞の酵素機構を通じて、挿入される外来性ポリヌクレオチドに隣接した相同配列によって、相同組換えが導かれる。
【０１５１】
あるいは、標的編集は、特定のレアカットエンドヌクレアーゼ（rare-cutting endonuclease）による二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を通じて、より高い頻度で達成され得る。このようなヌクレアーゼに依存的な標的編集では、ＤＳＢに応答して起る非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構が利用される。外来性遺伝物質を含有するドナーベクター無しでは、このＮＨＥＪによって、少数の内在性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（挿入／欠失）がしばしば生じる。比較において、一対のホモロジーアームに挟まれた外来性遺伝物質を含有するドナーベクターが在る場合、この外来性遺伝物質は、相同組換えによる相同組換え修復（ＨＤＲ）の際にゲノムに導入することが可能であり、この結果「標的組込み」が起こる。
【０１５２】
特異的且つ標的化されたＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ−カスパーゼ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９；Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ９）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらに、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼおよびＢｘｂ１インテグラーゼを利用する、ＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換（dual integrase cassette exchange））システムも、標的組込みの有望なツールである。
【０１５３】
ＺＦＮは、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」とは、１または複数のＺｎフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡと結合するポリペプチドドメインを意味する。Ｚｎフィンガーは、亜鉛イオンの配位を通じて安定化される構造を有するＺｎフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。Ｚｎフィンガーの例としては、Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガー、Ｃ３ＨＺｎフィンガー、およびＣ４Ｚｎフィンガーが挙げられるが、これらに限定はされない。「設計された」Ｚｎフィンガードメインは、合理的基準、例えば、既存ＺＦＰの設計および結合データの情報を保存しているデータベース内の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用、から主に導かれる設計／組成を有する、天然には生じないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号；また、国際公開第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号および同第０３／０１６４９６号を参照されたい。「選択された」Ｚｎフィンガードメインは、ファージディスプレイ、相互作用トラップ（interaction trap）またはハイブリッド選択等の実験的プロセスから主にその生成がもたらされる、天然には存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号および同第７，９７２，８５４号により詳細に記述されており、これら米国特許の完全な開示は参照によって本明細書に援用される。当該技術分野において最も認知されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。
【０１５４】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与する、ＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染において、キサントモナス属の植物病原菌によって分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に進入し、そのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列と結合し、そのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列における遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、エフェクターによって変動する、反復可変二残基（repeat variable-diresidue）（ＲＶＤ）と称される選択された反復位置における多型を含む不完全３４アミノ酸反復の数に依存している。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記述されており、この米国特許出願は参照によって本明細書に援用される。当該技術分野において最も認知されているＴＡＬＥＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとの融合ポリペプチドである。
【０１５５】
本法で有用な標的化ヌクレアーゼの別の例として、目的のＤＮＡ配列に対する特異性を有する、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン等に融合された、ヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである、標的化Ｓｐｏ１１ヌクレアーゼがある。例えば、その開示が参照によって本明細書に援用される、米国出願第６１／５５５，８５７号を参照されたい。
【０１５６】
本発明に好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例として、個々に使用されるか組み合わせて使用されるかは問わず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、およびＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１−１が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５７】
標的化ヌクレアーゼの他の非限定例には、自然発生的なヌクレアーゼおよび組換えヌクレアーゼが包含され、例えばＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９、制限酵素、メガヌクレアーゼ  ホーミングエンドヌクレアーゼ等がある。
【０１５８】
ＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ−９は２つの主要成分を必要とする：（１）カスパーゼ−９エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓｐ９）および（２）ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体。共発現された際、これら２つの成分は複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭ近位のシーディング領域（seeding region）を含む標的ＤＮＡ配列にリクルートされる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、組み合わされることで、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、これがＣａｓｐ９をガイドして選択された配列を標的化し得る。これら２つの成分はその後、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳類細胞に送達され得る。
【０１５９】
ＤＩＣＥ介在性挿入では、各酵素の小さなａｔｔＢ認識部位およびａｔｔＰ認識部位に密接に制限された外来性ＤＮＡの一方向組込みを可能にするために、一対のリコンビナーゼ（例えばｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１）が使用される。これらの標的ａｔｔ部位は、哺乳類ゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組込み部位においてゲノム内に導入しなければならない。例えば、その開示が参照によって本明細書に援用される、米国出願公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたい。
【０１６０】
本発明の１つの態様は、標的化されたゲノム組込みのための１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供する。一実施形態では、前記コンストラクトは、所望の組込み部位に特異的な一対のホモロジーアームをさらに含み、この標的組込み法は、前記コンストラクトを細胞に導入することを含むことで、前記細胞の宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能とする。別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを前記細胞に導入すること、および、所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを前記細胞に導入することを含むことで、ＺＦＮ介在性挿入を可能とする。別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを前記細胞に導入すること、および、所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを前記細胞に導入することを含むことで、ＴＡＬＥＮ介在性挿入を可能とする。別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを前記細胞に導入すること、カスパーゼ９発現カセット、および所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを前記細胞に導入することを含むことで、カスパーゼ９介在性挿入を可能とする。さらなる別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１または複数のａｔｔ部位を含むコンストラクトを前記細胞の所望の組込み部位に導入すること、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを前記細胞に導入すること、およびＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入すること、を含むことで、ＤＩＣＥ介在性標的組込みを可能とする。
【０１６１】
標的組込みのための有望な部位としては、限定はされないが、セーフ・ハーバー遺伝子座、またはゲノム内セーフ・ハーバー（ＧＳＨ）が挙げられ、これは、宿主細胞または宿主生物に対する有害作用が無い、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に理論上は対応可能な、ヒトゲノムの遺伝子内領域または遺伝子外領域である。有用なセーフ・ハーバーは、望ましいレベルの、ベクターにコードされたタンパク質または非コードＲＮＡを得るのに十分な導入遺伝子発現を可能にしなければならない。また、セーフ・ハーバーは、細胞の悪性転換の素因となることも、細胞機能を改変することも、してはならない。組込み部位が有望なセーフ・ハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、限定はされないが以下の基準を満たす必要がある：調節エレメントまたは調節遺伝子の破損が無いこと（配列アノテーションによって判断される）；遺伝子が密な領域における遺伝子間領域、すなわち反対方向に転写される２遺伝子間の集合点であること；ベクターにコードされる転写活性化因子と、隣接遺伝子、特にがん関連遺伝子およびミクロＲＮＡ遺伝子、のプロモーターとの間の、長距離相互作用の可能性を最小限に抑えるための距離を維持していること；並びに、明らかに遍在的な転写活性を有していること（遍在的な転写活性を示す、空間的、時間的に広い発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンに反映される）。この後者の特徴は、分化中のクロマチンリモデリングが、典型的に、いくつかの遺伝子座のサイレンシングをもたらし、他を活性化する可能性がある、幹細胞において特に重要である。外来挿入に好適な領域内の、挿入のために選ばれる的確な遺伝子座は、反復成分も保存配列も有しているべきではなく、ホモロジーアームの増幅のためのプライマーが容易に設計可能なものである。
【０１６２】
ヒトゲノム編集、または具体的には、標的組込みに好適な部位としては、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座およびマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログが挙げられるが、これらに限定はされない。さらに、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログも、本明細書で開示される組成物および標的組込み法を用いた挿入に適した部位であり得る。さらに、コラーゲン遺伝子座およびＨＴＲＰ遺伝子座も、標的組込みのためのセーフ・ハーバーとして使用され得る。しかし、特に幹細胞においては、各々の選択された部位の有効性確認が特異的な組込み事象のために必要であることが示されており、プロモーター選出、外来遺伝子の配列および配置、並びにコンストラクト設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば求められる。
【０１６３】
標的挿入／欠失において、編集部位はしばしば、その発現および／または機能が欠損されることを目的とした内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、標的挿入／欠失を含む内在性遺伝子は、免疫応答の制御および調節と関連する。いくつかの他の実施形態では、標的挿入／欠失を含む内在性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、または、幹細胞および／もしくは前駆細胞およびその由来細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連している。
【０１６４】
従って、本発明の１つの態様は、本明細書にて提供される、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、ＴＡＰ２遺伝子座またはタパシン遺伝子座等の、持続的または時間的な遺伝子発現のために安全で且つよく制御されたものであることが既知であるまたは判明した、ゲノム内セーフ・ハーバーまたは予め選択された遺伝子座を包含する、選択された遺伝子座における標的組込みの方法を提供する。一実施形態では、標的組込み法のためのゲノム内セーフ・ハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む１または複数の所望の組込み部位を含む。一実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入すること、並びに、所望の組込み部位に特異的な一対のホモロジーアームおよび１または複数の外来配列を含むコンストラクトを導入することを含むことで、前記細胞の宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能とし、ここで前記所望の組込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。
【０１６５】
別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入すること、および、所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入することを含むことで、ＺＦＮ介在性挿入を可能とし、ここで前記所望の組込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入すること、および、所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入することを含むことで、ＴＡＬＥＮ介在性挿入を可能とし、ここで前記所望の組込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入すること、カスパーゼ９発現カセット、および所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入することを含むことで、カスパーゼ９介在性挿入を可能とし、ここで前記所望の組込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。さらなる別の実施形態では、細胞における標的組込み法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１または複数のａｔｔ部位を含むコンストラクトを前記細胞の所望の組込み部位に導入すること、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを前記細胞に導入すること、およびＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入することを含むことで、ＤＩＣＥ介在性標的組込みを可能とし、ここで前記所望の組込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。
【０１６６】
さらに、本明細書にて提供される場合、上記のセーフ・ハーバーにおける標的組込み法は、あらゆる目的ポリヌクレオチド、例えば、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、並びに、幹細胞および／または前駆細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、前記１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、１または複数のマーカー遺伝子をさらに含む。一実施形態では、本発明のコンストラクト内の外来性ポリヌクレオチドは、セーフティ・スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導性細胞死に好適な自殺遺伝子系としては、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくはカスパーゼ７）およびＡＰ１９０３；チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）および５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）が挙げられるが、これらに限定はされない。加えて、いくつかの自殺遺伝子系は細胞型特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０によるＴリンパ球の遺伝子改変は、ｍＡｂリツキシマブの投与後のＴリンパ球の除去を可能にする。さらに、セツキシマブによって認識されるエピトープを含有する改変ＥＧＦＲを用いることで、遺伝子改変細胞がセツキシマブに暴露された場合、前記遺伝子改変細胞を枯渇させることができる。従って、本発明の１つの態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、およびＢ細胞ＣＤ２０から選択されるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする１または複数の自殺遺伝子の標的組込み法を提供する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書における前記方法によって組み込まれる１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、標的組込みのためのコンストラクトに含まれる作動可能なように連結された外来性プロモーターによって駆動される。前記プロモーターは、誘導性プロモーターであっても、または構成的プロモーターであってもよく、さらに、時間的特異的であっても、組織特異的であっても、または細胞型特異的であってもよい。本発明の方法に好適な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターおよびユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。一実施形態では、前記外来性プロモーターはＣＡＧである。
【０１６８】
本明細書における前記方法によって組み込まれる外来性ポリヌクレオチドは、組込み部位において、宿主ゲノム内の内在性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノム内のＡＡＶＳ１遺伝子座における１または複数の外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドが、内在性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノム内のＲＯＳＡ２６遺伝子座における標的組込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドが、内在性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノム内のＨ１１遺伝子座における標的組込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドが、内在性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノム内のコラーゲン遺伝子座における標的組込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドが、内在性コラーゲンプロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノム内のＨＴＲＰ遺伝子座における標的組込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドが、内在性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、望ましい部位に正確に挿入できさえすれば、内在性プロモーターによって駆動される外来遺伝子の遺伝子発現は可能となるであろう。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、標的組込み法のためのコンストラクトに含まれる１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトは、同一のプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチドの間に１または複数のリンカー配列を含むことで、前記部分間により大きな物理的分離を与え、酵素機構への接触性を最大化する。前記リンカー配列のリンカーペプチドは、前記部分（外来性ポリヌクレオチド、および／またはそれにコードされるタンパク質もしくはペプチド）間の物理的分離を、関連する機能に応じて、より柔軟にまたはより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。前記リンカー配列は、分離した部分を得るために、プロテアーゼによって切断可能としてもよいし、または化学的に切断可能としてもよい。リンカー内の酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、活性化第Ｘ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、およびトロンビン等の、タンパク質分解酵素による切断のための部位が包含される。いくつかの実施形態では、前記プロテアーゼは、宿主により天然に産生されるプロテアーゼであるか、または、外来的に導入されたプロテアーゼである。あるいは、前記リンカー内の切断部位は、選択された化学薬品、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または低ｐＨへの暴露後に切断が可能な部位であり得る。所望による前記リンカー配列は、切断部位の提供以外の目的にも役立ち得る。前記リンカー配列は、前記部分が適切に機能するための、別の隣接部分に対する前記部分の有効なポジショニングを可能にするはずである。前記リンカーは、前記部分間のあらゆる立体障害を防止するのに十分な長さを有する、単純なアミノ酸配列であってもよい。さらに、前記リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ−カルボキシル化部位等を含むがこれらに限定はされない、翻訳後修飾を可能にし得る。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない高次構造で保持しないように、柔軟性を有する。前記リンカーを、グリシン、アラニン、およびセリン等の小さな側鎖を有するアミノ酸から主に構成させることで、柔軟性を与えてもよい。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列の約８０パーセントまたは約９０パーセントまたはそれ以上が、グリシン残基、アラニン残基、またはセリン残基、特にグリシン残基およびセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドが、融合タンパク質の末端処理ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを隔てている。他の実施形態では、２Ａリンカー配列が、２つの別々のタンパク質が一回の翻訳から産生されることを可能にしている。好適なリンカー配列は、実験により容易に特定できる。加えて、リンカー配列の好適なサイズおよび配列も、従来のコンピューターモデリング技術により決定できる。一実施形態では、前記リンカー配列は自己切断型ペプチドをコードする。一実施形態では、前記自己切断型ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を与える。いくつかの実施形態では、���つの連続したリンカー配列はいずれも異なるものである。
【０１７０】
標的組込みのための外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入する方法は、それ自体が公知の、細胞に対する遺伝子導入法を用いて達成できる。一実施形態では、前記コンストラクトは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクター（例えば、ｐＡｌ−１１、ｐＸＴｌ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）等が、標的細胞に対する、外来性ポリヌクレオチドの送達および／または発現に使用される。いくつかの他の実施形態では、標的細胞への外来性ポリヌクレオチドの送達に、エピソーマルベクターが使用される。いくつかの実施形態では、相同組換えを通じて挿入、欠失または置換を導入するための遺伝子工学に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が使用できる。レンチウイルスと異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来のターゲティングプラスミドのトランスフェクションと比較してかなりより高速の、相同性指向性遺伝子ターゲティングを媒介する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノム内の標的部位における挿入、欠失または置換の導入に、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ２ベクターが使用される。
【０１７１】
ＩＩ．  ゲノム改変ｉＰＳＣを入手および維持する方法
本発明は、１または複数の所望の部位に１または複数の標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣを入手し維持する方法を提供するものであり、ここで、前記標的編集は、各々の選択された編集部位において、増殖後のゲノム改変ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来非万能性細胞においてインタクト且つ機能的なままである。前記標的編集は、ゲノムｉＰＳＣ（genome iPSC）に、選択された部位における、挿入、欠失、および／または置換、すなわち、標的組込みおよび／または挿入／欠失を導入する。
【０１７２】
特定の実施形態において、１または複数の選択された部位に１または複数の標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣは、予定運命維持培地（Fate Maintenance Medium）（ＦＭＭ）として表１に示される細胞培養培地中で、長期間、単一細胞として、維持、継代および増殖され、前記ｉＰＳＣは選択された部位における標的編集および機能的改変を保持する。前記培地の成分は、表１に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭ中で培養されたｉＰＳＣは、培養液洗浄またはセレクションの必要無く、それらの未分化、且つ基底状態またはナイーブ型の特性、すなわちゲノム安定性を維持し続けることを示し、インビトロにおいては胚様体または単層（胚様体の形成無し）を介した分化により；およびインビボにおいては奇形腫形成による分化により、３つ全ての体細胞系を容易に生じる。例えば、その開示が参照によって本明細書に援用される、米国出願第６１／９４７，９７９号を参照されたい。
【表１】
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【０１７３】
いくつかの実施形態では、１または複数の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含むゲノム改変ｉＰＳＣは、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、且つ、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないまたは本質的に含まない培地中で、維持、継代および増殖され、前記ｉＰＳＣは選択された部位においてインタクト且つ機能的な標的編集を保持する。いくつかの実施形態では、標的組込みのための部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、標的挿入／欠失のための部位は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；または、ｉＰＳＣまたはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、維持、継代および増殖されたゲノム改変ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１または複数の所望の組込み部位に組み込まれた、１または複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、維持、継代および増殖されたゲノム改変ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、幹細胞および／もしくは前駆細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、同じまたは異なる所望の組込み部位に含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ゲノム改変ｉＰＳＣは、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、さらに、１または複数の内在性遺伝子に挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、遺伝子発現の破損をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、選択された部位に挿入／欠失を含む１または複数の標的編集をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、免疫応答の制御および仲介と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性ＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、主要組織適合遺伝子複合体と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＰＤ１遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定はされない、１または複数の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）をコードする遺伝子に標的編集をさらに含む。
【０１７５】
本発明の別の態様は、ｉＰＳＣ標的編集を通じて；または、まず標的編集によりゲノム改変非万能性細胞を作製し、次に選別／単離されたゲノム改変非万能性細胞を再プログラム化して、前記非万能性細胞と同じ標的編集を含むｉＰＳＣを得ることを通じて、ゲノム改変ｉＰＳＣを作製する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を細胞に導入することにより、再プログラム化を同時に起こしているゲノム改変中の非万能性細胞を提供し、ここで、接触される非万能性細胞は再プログラム化に十分な条件下に在り、再プログラム化のための条件は非万能性細胞を１または複数の再プログラム化因子および小分子と接触させることを含む。同時にゲノム改変および再プログラム化するための方法の種々の実施形態において、標的組込みおよび／または標的挿入／欠失は、再プログラム化の開始より前、またはそれと本質的に同時に、非万能性細胞を１または複数の再プログラム化因子および小分子と接触させることにより、非万能性細胞に導入され得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、非万能性細胞を同時にゲノム改変および再プログラム化するために、標的組込みおよび／または標的挿入／欠失は、複数日間の再プログラム化プロセスが、非万能性細胞を１または複数の再プログラム化因子および小分子と接触させることにより開始された後に、非万能性細胞に導入されてもよく、ここで、コンストラクトを保有するベクターは、再プログラム化中の細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１およびＣＤ３０を含むがこれらに限定はされない１または複数の内在性万能性遺伝子の安定発現を示す前に導入される。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、再プログラム化は、非万能性細胞を、少なくとも１つの再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表１）と接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上記のあらゆる方法を通じてゲノム改変されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表１）を用いて、さらに維持および増殖される。
【０１７８】
ゲノム改変ｉＰＳＣ作製法のいくつかの実施形態では、前記方法は、１または複数の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失をｉＰＳＣに導入してゲノム改変ｉＰＳＣを得ることにより、選択された部位においてｉＰＳＣをゲノム改変すること、を含む。あるいは、前記ゲノム改変ｉＰＳＣ作製法は、（ａ）１または複数の標的編集を非万能性細胞に導入して、選択された部位に標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含むゲノム改変非万能性細胞を得ること、並びに、（ｂ）前記ゲノム改変非万能性細胞を１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位に標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含むゲノム改変ｉＰＳＣを得ること、を含む。あるいは、前記ゲノム改変ｉＰＳＣ作製法は、（ａ）非万能性細胞を１または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非万能性細胞の再プログラム化を惹起すること；（ｂ）ゲノム改変のために、１または複数の標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を前記再プログラム化中の非万能性細胞に導入すること；並びに、（ｃ）選択された部位に標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含むクローナルなゲノム改変ｉＰＳＣを得ること、を含む。
【０１７９】
前記再プログラム化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、およびこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。前記１または複数の再プログラム化因子はポリペプチドの形態であってもよい。前記再プログラム化因子は、ポリヌクレオチドの形態であってもよいことから、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、およびミニサークル等のベクターによって非万能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする前記１または複数のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、エピソーマルベクターによって導入される。種々の他の実施形態において、前記１または複数のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、前記非万能性細胞は、同一または異なる選択された部位における標的組込みのために、複数のベクターによって、異なる外来性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含む複数のコンストラクトを導入される。これらの外来性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、または、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補をコードする遺伝子、または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする遺伝子、を含み得る。いくつかの実施形態では、前記外来性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定はされない、ＲＮＡをコードする。これらの外来性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織型または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１または複数のプロモーターによって駆動され得る。従って、前記ポリヌクレオチドは、前記プロモーターを活性化する条件下に在る場合に、例えば、誘発剤の存在下または特定の分化細胞型内で、発現可能である。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣ内および／または該ｉＰＳＣから分化した細胞内で、発現される。一実施形態では、１または複数の自殺遺伝子が構成的プロモーターによって駆動され、例えば、カスパーゼ９（Capase-9）はＣＡＧによって駆動される。異なる外来性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含むこれらのコンストラクトは、同時または順次に、非万能性細胞に導入できる。複数のコンストラクトの標的組込みを受けている非万能性細胞を、同時に前記１または複数の再プログラム化因子と接触させることで、ゲノム改変と同時に再プログラム化を惹起し、それにより、同一の細胞プール内で複数の標的組込みを含むゲノム改変ｉＰＳＣを得ることができる。従って、このロバストな方法は、同時の再プログラム化および編集戦略によって、複数のモダリティが１または複数の選択された標的部位に組み込まれたクローナルなゲノム改変ｈｉＰＳＣを得ることを可能にする。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、前記非万能性細胞は、１または複数の内在性遺伝子を含む選択された部位において、１または複数の挿入／欠失を導入される。いくつかの実施形態では、１または複数の挿入／欠失を含む前記非万能性細胞は、上記の１または複数の標的組込みをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、遺伝子発現の破損をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、選択された部位に挿入／欠失を含む１または複数の標的編集をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、免疫応答の制御および仲介と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性ＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、主要組織適合遺伝子複合体と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＰＤ１遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定はされない、１または複数の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）をコードする遺伝子に標的編集をさらに含む。
【０１８２】
ＩＩＩ．  ゲノム改変ｉＰＳＣの分化による遺伝子改変非万能性細胞の入手法
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム改変ｉＰＳＣのインビボ分化法を提供し、前記方法において、ゲノム改変ｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、所望の部位に標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を包含するインタクト且つ機能的な標的編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム改変ｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ  Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１または複数の所望の部位に組み込まれた、１または複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム改変ｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または、幹細胞および／もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１または複数の誘導性自殺遺伝子を含む、奇形腫を介してゲノム改変ｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、免疫応答の制御および仲介と関連した内在性遺伝子に１または複数の挿入／欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性ＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、主要組織適合遺伝子複合体と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＰＤ１遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定はされない、１または複数の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）をコードする遺伝子に標的編集をさらに含む。
【０１８３】
特定の実施形態では、本明細書において提供される、選択された部位に１または複数の標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣは、インビトロで造血細胞系またはあらゆる他の特定の細胞型を得るために使用され、派生した非万能性細胞は前記選択された部位に機能的な前記標的編集を保持する。一実施形態では、ゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞には、限定はされないが、運命確定造血内皮（ＨＥ）への分化能を有する中胚葉細胞、運命確定ＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が包含され、これらのゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は所望の部位に機能的な標的編集を保持している。
【０１８４】
ｉＰＳＣ由来造血細胞系を得るために適用できる分化法および組成物として、例えば国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４１２２に示されているものが挙げられ、前記国際出願の開示は参照によって本明細書に援用される。提供されている通り、造血細胞系を作製するための方法および組成物は、ＥＢ形成の必要無く、無血清、フィーダー非含有、且つ／または間質非含有の条件下で、且つ、拡張可能且つ単層の培養プラットフォーム内で、ｈｉＰＳＣを包含する万能性幹細胞に由来する運命確定造血内皮（ＨＥ）を通じたものである。提供された方法に従って分化され得る細胞は、万能性幹細胞から、特定の高分化型細胞に運命決定された前駆細胞、および万能性の中間体を経由することなく造血性運命に直接移行した種々の系譜の細胞である分化転換細胞（transdifferentiated cell）まで、多岐にわたる。同様に、幹細胞の分化によって生じる細胞も、多能性幹細胞または多能性前駆細胞から、高分化型幹細胞、および介在する全ての造血細胞系まで、多岐にわたる。
【０１８５】
単層培養において万能性幹細胞から造血系細胞を分化および増殖させるための方法は、前記万能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、および所望によりｂＦＧＦと、接触させることを含む。提供されている通り、万能性幹細胞に由来する中胚葉細胞が、万能性幹細胞から胚様体を形成することなく、獲得し増殖される。前記中胚葉細胞が次に、ＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＷＮＴ経路活性化因子との接触を受けることで、万能性幹細胞からの胚様体の形成なく、運命確定造血内皮（ＨＥ）分化能を有する増殖した中胚葉細胞が得られる。後のｂＦＧＦ、並びに所望により、ＲＯＣＫ阻害剤、および／またはＷＮＴ経路活性化因子、との接触により、運命確定ＨＥ分化能を有する中胚葉細胞が運命確定ＨＥ細胞に分化し、これは分化中に増殖もする。
【０１８６】
ＥＢ形成が、中程度〜最小限の細胞増殖をもたらすこと、集団内の細胞の均一な増殖および均一な分化を必要とする多くの適用にとって重要な単層培養が可能でないこと、並びに、手間がかかり効率が低いことから、造血系細胞を得るための本明細書で提供される方法はＥＢを介した万能性幹細胞分化よりも優れている。
【０１８７】
提供される単層分化プラットフォームは、運命確定造血内皮に向けた分化を促進して、造血幹細胞の誘導、並びにＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞等の分化した子孫をもたらす。増強された分化効率と大量増殖とを組み合わせた単層分化戦略は、種々の治療適用のための、治療上有意味な数の万能性幹細胞由来造血細胞の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を用いる単層培養は、インビトロでの分化、エキソビボでの調節、並びにインビボでの長期間の造血性自己複製、再構成および移植の全てを可能にする機能的な造血系細胞をもたらす。提供されている通り、ｉＰＳＣ由来造血系細胞は、運命確定造血内皮、造血性多能性前駆細胞、造血幹細胞・前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および好中球を包含するがこれらに限定はされない。
【０１８８】
万能性幹細胞の分化を運命確定造血系細胞に配向するための方法は、（ｉ）万能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子および所望によりｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、前記万能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化および増殖を惹起すること；（ｉｉ）前記中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含み、所望によりＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、前記中胚葉細胞からの運命確定ＨＥ分化能を有する中胚葉細胞の分化および増殖を惹起すること；（ｉｉｉ）前記運命確定ＨＥ分化能を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤；ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン；並びに所望によりＷｎｔ経路活性化因子、を含み、所望によりＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、運命確定造血内皮分化能を有する万能性幹細胞由来中胚葉細胞からの運命確定造血内皮の分化および増殖を惹起すること、を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、万能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、万能性幹細胞を播種および増殖させること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、またはナイーブ型ｉＰＳＣ、または１もしくは複数の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり；ｉＰＳＣに含まれる１または複数の遺伝的インプリントは、ｉＰＳＣから分化した造血細胞で保持される。万能性幹細胞の分化を造血系細胞に配向するための方法のいくつかの実施形態では、万能性幹細胞の造血系細胞への分化は、胚様体を生じず、且つ単層培養形態である。
【０１９０】
上記方法のいくつかの実施形態では、得られる万能性幹細胞由来の運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られる運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−である。いくつかの実施形態では、運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−ＣＸＣＲ４−ＣＤ７３−である。いくつかの実施形態では、運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４−ＣＤ７３−である。いくつかの実施形態では、運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−ＣＤ９３−である。いくつかの実施形態では、運命確定造血内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９３−である。
【０１９１】
上記方法のいくつかの実施形態では、前記方法は、（ｉ）万能性幹細胞由来運命確定造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン；並びに所望によりＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、運命確定造血内皮のプレＴ細胞前駆細胞（pre-T cell progenitor）への分化を惹起すること；並びに所望により、（ｉｉ）前記プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの一つまたは複数を含まない、組成物と接触させて、前記プレＴ細胞前駆細胞のＴ細胞前駆細胞またはＴ細胞への分化を惹起すること、をさらに含む。前記方法のいくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。前記方法のいくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆細胞はＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。
【０１９２】
万能性幹細胞の分化を造血系細胞へと配向するための上記方法のさらなるいくつかの実施形態では、前記方法は、（ｉ）万能性幹細胞由来運命確定造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン；並びに所望により、ＢＭＰ活性化因子、を含む組成物と接触させて、運命確定造血内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞（pre-NK cell progenitor）への分化を惹起すること；並びに所望により、（ｉｉ）万能性幹細胞由来プレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの一つまたは複数を含まない、組成物と接触させて、プレＮＫ細胞前駆細胞のＮＫ細胞前駆細胞またはＮＫ細胞への分化を惹起すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞由来ＮＫ前駆細胞はＣＤ３−ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞由来ＮＫ細胞はＣＤ３−ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、所望により、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋およびＣＤ１６＋をさらなる特徴とする。
【０１９３】
すなわち、上記の分化法を用いることで、１または複数のｉＰＳＣ由来造血細胞集団が得られ得る：（ｉ）ＣＤ３４＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）は、ｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ２、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される１もしくは複数の培地を使用；（ｉｉ）運命確定造血内皮（ｉＨＥ）は、ｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ２、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される１もしくは複数の培地を使用；（ｉｉｉ）運命確定ＨＳＣは、ｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ２、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される１もしくは複数の培地を使用；（ｉｖ）多能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）は、ｉＭＰＰ−Ａを使用；（ｖ）Ｔ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ−Ｔ）は、ｉＴＣ−Ａ２、およびｉＴＣ−Ｂ２から選択される１もしくは複数の培地を使用；（ｖｉ）Ｔ細胞（ｉＴＣ）は、ｉＴＣ−Ｂ２を使用；（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ−ＮＫ）は、ｉＮＫ−Ａ２、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される１もしくは複数の培地を使用；並びに／または、（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびｉＮＫ−Ｂ２。いくつかの実施形態では、前記培地：
ａ．  ｉＣＤ３４−Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、およびＥＰＯからなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン、並びに所望により、Ｗｎｔ経路活性化因子を含み；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
ｂ．  ｉＭＰＰ−Ａは、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３ＬおよびＩＬ１１からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；
ｃ．  ｉＴＣ−Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン；並びに所望により、ＢＭＰ活性化因子を含み；
ｄ．  ｉＴＣ−Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；前記組成物はＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの一つまたは複数を含まず；
ｅ．  ｉＮＫ−Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカイン；並びに所望により、ＢＭＰ活性化因子を含み、
ｆ．  ｉＮＫ−Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７およびＩＬ１５からなる群から選択される１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、上記方法から得られたゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１または複数の所望の組込み部位に組み込まれた、１または複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、幹細胞および／もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１または複数の自殺遺伝子を含むゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内在性Ｔ細胞受容体遺伝子、およびＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子を含むがこれらに限定はされない、免疫応答の制御および仲介と関連した１または複数の内在性遺伝子内に、１または複数の挿入／欠失をさらに含む。一実施形態では、１または複数の自殺遺伝子を含むゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に挿入／欠失をさらに含み、このＢ２Ｍはノックアウトされる。
【０１９５】
さらに、第一予定運命のゲノム改変造血細胞〜第二予定運命のゲノム改変造血細胞を得るために適用できる脱分化法および組成物として、例えば国際公開第ＷＯ２０１１／１５９７２６号に示されているものが挙げられ、前記国際公開の開示は参照によって本明細書に援用される。前記国際公開で提供される方法および組成物は、再プログラム化中に内在性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限し；非万能性中間細胞を、該中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に曝すことにより、開始非万能性細胞を非万能性中間細胞に部分的に再プログラム化することを可能にする。
【０１９６】
ＩＶ．  ｉＰＳＣ細胞において目的遺伝子を組み込むための選択された遺伝子座における標的組込みのための組成物
上記に鑑みて、本発明は、組込み部位における内在性配列の欠失を伴うまたは伴わない、選択された部位における誘導万能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノムへの１または複数の外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのためのコンストラクトを提供する。一実施形態では、前記コンストラクトは、１または複数の目的タンパク質を発現する１または複数の外来性ポリヌクレオチドに機能的に連結された少なくとも１つの外来性プロモーターを含む。一実施形態では、前記コンストラクトは、標的組込み用のベクターによってｉＰＳＣに導入される。別の実施形態では、前記コンストラクトが標的組込み用のベクターによって非万能性細胞に導入され、その後、前記非万能性細胞が再プログラム化を受けて、ゲノム改変ｉＰＳＣが得られる。いずれのアプローチによっても、前記コンストラクトは組み込まれたままであり、前記外来性ポリヌクレオチドは、再プログラム化またはベクター導入から得られたｉＰＳＣにおいて、後に増殖されたｉＰＳＣにおいて、前記ｉＰＳＣに由来する分化細胞において、およびそれに由来する脱分化細胞において、機能的である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、１または複数の外来性ポリヌクレオチドに機能的に連結された少なくとも１つの外来性プロモーターを含むコンストラクトは、選択された部位に特異的なホモロジーアームをさらに含み、前記ホモロジーアームは前記コンストラクト内で前記プロモーターおよび目的の外来性ポリヌクレオチドと隣接している。コンストラクトのこの実施形態は、ヌクレアーゼに非依存的な標的組込み戦略を可能にする。いくつかの実施形態では、前記外来性プロモーターはＣＡＧである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの外来性プロモーターを有するコンストラクトに含まれる１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、リンカー配列によって互いに連結されている。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は自己切断型ペプチドをコードする。他の実施形態では、前記リンカー配列は配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を与える。いくつかの実施形態では、前記コンストラクト内の１または複数の外来性ポリヌクレオチドは、多シストロン性である。
【０１９９】
１または複数の外来性プロモーターおよび作動可能なように連結された１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトのいくつかの実施形態は、マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、選択された部位における内在性プロモーターによって駆動される。一実施形態では、１つのポリヌクレオチドは蛍光タンパク質をコードする。別の実施形態では、１つのポリヌクレオチドはピューロマイシン耐性遺伝子である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、セーフ・ハーバー遺伝子座における標的組込みを可能にする成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セーフ・ハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲおよびＲＵＮＸ１からなる群から選択される。
【０２０１】
作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、ゲノム改変ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、同一のプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織型または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１または複数の異なるプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、同一の選択されたセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、異なる選択されたセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。１つの特定の実施形態において、外来性または内在性プロモーターに機能的に連結された外来性ポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数は、１または複数のセーフティ・スイッチタンパク質をコードする。前記セーフティ・スイッチタンパク質は、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくはカスパーゼ７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、およびＢ細胞ＣＤ２０からなる群から選択され得る。一実施形態では、前記コンストラクトに含まれる自殺遺伝子は、カスパーゼ９をコードする。一実施形態では、前記コンストラクトに含まれる自殺遺伝子は、チミジンキナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１、およびゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座の１つにおける標的組込みのためのコンストラクトである。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトはＡＡＶＳ１における標的組込みのためのコンストラクトである。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトはＲＯＳＡ２６における標的組込みのためのコンストラクトである。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトはＨ１１における標的組込みのためのコンストラクトである。
【０２０２】
本発明はまた、１もしくは複数の外来性ポリヌクレオチド、および／または挿入／欠失を選択された部位に含む、ゲノム改変ｉＰＳＣを提供する。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣへのベクターによるコンストラクト導入、および／またはＮＨＥＪを用いた編集を通じて、得られる。いくつかの他の実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、標的組込みおよび／または標的挿入／欠失を含む標的編集を有する再プログラム化中の非万能性細胞から得られる。さらに別のいくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、再プログラム化因子、再プログラム化小分子、および／または目的ポリヌクレオチドの標的組込みのためのコンストラクトを保有するベクターを用いて、非万能性細胞を同時に再プログラム化およびゲノム改変することから得られる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補；またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質から選択されるタンパク質をコードする１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連したタンパク質をコードする１または複数の内在性遺伝子に、挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、さらに、１または複数の内在性遺伝子に挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、遺伝子発現の破損をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれる挿入／欠失は、編集された遺伝子のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、選択された部位に挿入／欠失を含む１または複数の標的編集をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、免疫応答の制御および仲介と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、１または複数の内在性ＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、主要組織適合遺伝子複合体と関連した１または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入／欠失は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＰＤ１遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定はされない、１または複数の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）をコードする遺伝子に標的編集をさらに含む。一実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子に標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍヌルまたは低発現、且つＨＬＡ−Ｉ欠損である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、選択された部位に組み込まれた少なくとも１つの自殺遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、同じまたは異なる組込み部位にそれぞれ組み込まれた少なくとも２つの自殺遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記外来性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織型または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１または複数のプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、選択された組込み部位に１または複数の自殺遺伝子を含み、さらに、１または複数の選択された内在性遺伝子に挿入／欠失を含む。本明細書に記載されるように、所望の様式の複数の標的編集を有する非万能性細胞は、派生ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための、表１の培養プラットフォームを用いた再プログラム化に好適である。いくつかの実施形態では、標的組込みまたは標的挿入／欠失のための非万能性細胞のゲノム改変は、前記非万能性細胞の再プログラム化と同時に起き、これにより、ロバストで、効率的で、正確で且つ信頼性のある方法で、ゲノム改変ｉＰＳＣが得られる。
【０２０５】
本発明はさらに、前記ゲノム改変ｉＰＳＣに由来する非万能性細胞を提供し、ここで、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの標的編集を通じて、または、部位特異的な組込みもしくは挿入／欠失を有するゲノム改変非万能性細胞の、継続的（再プログラム化ｉＰＳＣを最初に得て、その後にゲノム改変を行う；もしくは、ゲノム改変非万能性細胞を最初に得て、その後に再プログラム化を行う）な、もしくは同時（同一プールの細胞を同時に再プログラム化およびゲノム改変）の再プログラム化を通じて、得られる。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣ由来非万能性細胞は、前駆細胞または完全分化細胞である。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣ由来細胞は、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血性幹もしくは前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞である。
【０２０６】
本発明はまた、ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物は、ゲノム改変非万能性細胞を同一の標的編集を含むゲノム改変ｉＰＳＣへと再プログラム化するための、ゲノム改変非万能性細胞；１または複数の再プログラム化因子；並びにＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を含む。上記組成物のいくつかの実施形態では、再プログラム化のためのゲノム改変非万能性細胞は、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数のポリヌクレオチドを含み、前記１または複数のポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織型または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１または複数のプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、前記１または複数のポリヌクレオチドは、同一または異なる選択された部位における標的組込みが可能な異なるコンストラクトに含まれる。いくつかの実施形態では、前記１または複数の選択された部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β−２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。
【０２０７】
いくつかの他の実施形態では、ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための前記組成物は、非万能性細胞、１または複数の部位特異的エンドヌクレアーゼ、１または複数の再プログラム化因子；並びに、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ、並びに所望により、標的組込みのためのホモロジーアームに挟まれた作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含む１または複数のコンストラクト、を含み、前記組成物は、標的組込み、および／または挿入／欠失を選択された部位に含むゲノム改変ｉＰＳＣへの、非万能性細胞の同時のゲノム改変および再プログラム化に有用である。いくつかの実施形態では、前記異なるコンストラクトおよび／または挿入／欠失は、再プログラム化因子と同時にまたは連続的に、非万能性細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記異なるコンストラクトおよび／または挿入／欠失は、ゲノム改変と再プログラム化とが同時（simultaneous）または並行（concurrent）して起るように、再プログラム化の間に非万能性細胞に導入される。
【０２０８】
いくつかの他の実施形態では、ゲノム改変ｉＰＳＣを得るための前記組成物は、非万能性細胞、１または複数の再プログラム化因子；並びに、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ、並びに、標的組込みのためのホモロジーアームに挟まれた作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含む１または複数のコンストラクト、を含み、前記組成物は、標的組込み、および／または選択された部位における挿入／欠失を含むゲノム改変ｉＰＳＣへの、非万能性細胞の同時のゲノム改変および再プログラム化に有用である。いくつかの実施形態では、前記異なるコンストラクトおよび／または挿入／欠失は、再プログラム化因子と同時にまたは連続的に、非万能性細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記異なるコンストラクトおよび／または挿入／欠失は、ゲノム改変と再プログラム化とが同時または並行して起るように、再プログラム化の間に非万能性細胞に導入される。
【０２０９】
さらに、ゲノム改変非万能性細胞の再プログラム化から得られたゲノム改変ｉＰＳＣを維持するための組成物も、本明細書において提供される。一実施形態では、前記組成物は、ゲノム改変非万能性細胞から再プログラム化されたゲノム改変ｉＰＳＣ；並びに、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む。一実施形態では、再プログラム化から得られた前記ｉＰＳＣは、長期の継代および増殖の間も、万能性および標的編集を保持する。
【０２１０】
また、ゲノム改変ｉＰＳＣ、並びにＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を含む組成物も提供され、ここで、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは以下から得られる：（ａ）ゲノム改変非万能性細胞の再プログラム化から得られ、得られたｉＰＳＣは前記ゲノム改変非万能性細胞に含まれた同一の標的編集を含む；または、（ｂ）選択された部位に１もしくは複数の標的編集を組み込むことによる、クローナルｉＰＳＣもしくはｉＰＳＣプールのゲノム改変；または、（ｃ）１もしくは複数の再プログラム化因子、並びに所望によりＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／もしくはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触している、再プログラム化中の非万能性細胞プールへの、選択された部位における１もしくは複数の標的編集の導入によるゲノム改変。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補；または非万能性細胞から再プログラム化されたｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１または複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補；免疫応答の制御および調節；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連したタンパク質をコードする１または複数の内在性遺伝子に、挿入／欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変ｉＰＳＣは、１または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、さらに、１または複数の内在性遺伝子に挿入／欠失を含む。
【０２１１】
Ｖ．  遺伝子改変ｉＰＳＣおよびそれに由来する機能的なモダリティを有する派生免疫細胞の治療用途
本発明は、遺伝子改変ｉＰＳＣおよび／または開示される方法および組成物を用いて前記ｉＰＳＣから派生した免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供し、前記免疫細胞は、遺伝子改変されており、細胞に基づいた養子療法に好適である。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ＨＳＣ細胞由来のｉＰＳＣを含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のプロＴ細胞またはＴ細胞を含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のｐｒｏＮＫ細胞またはＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来遺伝子改変免疫細胞は、治療能の向上のためにエキソビボでさらに調節される。一実施形態では、ｉＰＳＣから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞の数または割合が増加している。一実施形態では、ｉＰＳＣから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数または割合が増加している。別の実施形態では、ｉＰＳＣから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、獲得ＮＫ細胞の数または割合が増加している。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子改変されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞の単離された集団または亜集団は、同種他家由来である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子改変されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞の単離された集団または亜集団は、自己由来である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、分化用のｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療特性を伝達する遺伝的インプリントを含み、前記遺伝的インプリントは前記ｉＰＳＣから派生した分化後の造血細胞において保持されており且つ機能的である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、前記万能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非万能性細胞からｉＰＳＣへの再プログラム化の間もしくは後の、万能性細胞のゲノムにおける、ゲノム内の挿入、欠失もしくは置換を通じて得られる、１もしくは複数の遺伝子改変されたモダリティ；または、（ｉｉ）ドナー特異的、疾患特異的、もしくは治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の１もしくは複数の保持可能な治療特性を含み、前記万能性細胞は前記供給源特異的免疫細胞から再プログラム化されたものであり、前記ｉＰＳＣは前記供給源治療特性を保持しており、前記供給源治療特性は前記ｉＰＳＣから派生した造血系細胞にも含まれる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変されたモダリティは、以下のうちの一つまたは複数を含む：セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、免疫応答の制御および調節、並びに／もしくは生存を促進するタンパク質。いくつかの他の実施形態では、前記遺伝子改変されたモダリティは、以下のうちの一つまたは複数を含む：（ｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子の発現の欠失または減少；（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＡＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、または二重特異性もしくは多重特異性もしくは普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体の導入または発現増加。
【０２１５】
さらに別のいくつかの実施形態では、前記造血系細胞は、以下のうちの一つまたは複数に関連する供給源特異的免疫細胞の治療特性を含む：（ｉ）抗原標的受容体の発現；（ｉｉ）ＨＬＡの提示またはその欠如；（ｉｉｉ）腫瘍内微小環境に対する耐性；（ｉｖ）傍観者免疫細胞および免疫調節の誘導；（ｉｖ）腫瘍外効果の減少に伴う、対標的特異性の向上；（ｖ）化学療法等の治療に対する耐性；並びに（ｖｉ）ホーミング、残留性、および細胞毒性の向上。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣおよびその派生造血細胞は、ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ヌルまたは低発現のＨＬＡ−Ｅ／Ｇ、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＬＡＧ３、ヌルまたは低発現のＴＩＭ３、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１、ヌルまたは低発現のＴＡＰ２、ヌルまたは低発現のタパシン、ヌルまたは低発現のＮＬＲＣ５、ヌルまたは低発現のＰＤ１、ヌルまたは低発現のＲＦＫＡＮＫ、ヌルまたは低発現のＣＩＩＴＡ、ヌルまたは低発現のＲＦＸ５およびヌルまたは低発現のＲＦＸＡＰのうちの一つまたは複数を含む。改変ＨＬＡクラスＩおよび／または改変ＨＬＡクラスＩＩを有するこれらの細胞は、免疫検出に対する耐性が増加していることから、インビボ残留性の向上を示す。さらに、そのような細胞は、養子細胞療法におけるＨＬＡ適合要求を回避可能であることから、普遍的な、既製の治療用投与計画の源を与える。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよびその派生造血細胞は、ｈｎＣＤ１６（高親和性切断不可ＣＤ１６）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、またはＴＣＲのうちの一つまたは複数を含む。そのような細胞は向上した免疫エフェクター能を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよびその派生造血細胞は、抗原特異的である。
【０２１９】
本発明の免疫細胞を養子細胞療法に適した対象に導入することによって、様々な疾患が改善され得る。疾患の例としては、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、ある種の若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、ある種の心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身紅はん性、エリテマトーデス、ある種の甲状腺炎、ある種のブドウ膜炎、白斑、多発性血管炎を伴う（ウェゲナー）肉芽腫症を含むがこれらに限定はされない、種々の自己免疫障害；急性白血病および慢性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群を含むがこれらに限定はされない、造血器腫瘍；脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頸部、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、または食道の腫瘍を含むがこれらに限定はされない、固形腫瘍；並びに、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）関連障害、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）関連障害、ＥＢＶ（エプスタイン‐バーウイルス）関連障害、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）関連障害、アデノウイルス関連障害およびＢＫポリオーマウイルス関連障害を含むがこれらに限定はされない、感染症が挙げられる。
【０２２０】
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の細胞のいずれかを含む組成物を対象に投与することによる、治療を必要とする対象を治療する方法を対象とする。特定の実施形態では、用語「治療する」、「治療」等は、本明細書においては、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを一般に意味するように使用される。前記効果は、疾患の完全もしくは部分的な防止という観点では、予防的であり、並びに／または、疾患および／もしくは該疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という観点では、治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含しており、前記疾患に罹患し易いが、それに罹患しているとはまだ診断されていない対象において、前記疾患が生じることを予防すること；前記疾患を抑制すること、すなわち、その発達を抑止すること；または、前記疾患を軽減すること、すなわち、前記疾患の後退を引き起こすこと、を包含する。治療薬または組成物は、疾患または傷害の発生の前、間または後に投与され得る。患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する、進行中の疾患の治療は、特に重要である。
【０２２１】
特定の実施形態では、前記対象は、細胞療法により治療、寛解、および／または改善可能な疾患、状態、および／または傷害を有する。いくつかの実施形態では、細胞療法を必要としている対象が、ある傷害、疾患、または状態を有する対象であること、それによって、細胞療法（例えば、細胞性物質が前記対象に投与される療法）が、前記傷害、疾患、または状態と関連した少なくとも１つの症状を治療、寛解、改善する、および／またはその重症度を低減することが可能であることが企図される。ある特定の実施形態は、細胞療法を必要としている対象が、限定はされないが、骨髄移植または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性疾患もしくはがん（例えば造血系の過剰増殖性疾患もしくはがん）に罹患している、またはそれに罹患する危険性がある対象、腫瘍（例えば、固形腫瘍）を有する、またはそれを発生する危険性がある対象、ウイルス感染またはウイルス感染と関連した疾患に罹患している、またはそれに罹患する危険性がある対象を包含することが企図される。
【０２２２】
従って、本発明はさらに、本明細書で開示される方法および組成物によって作製された万能性細胞由来造血系細胞を含み、薬剤的に許容できる培地をさらに含む、医薬組成物を提供する。一実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書で開示される方法および組成物によって作製された万能性細胞由来Ｔ細胞を含む。一実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書で開示される方法および組成物によって作製された万能性細胞由来ＮＫ細胞を含む。一実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書で開示される方法および組成物によって作製された万能性細胞由来ＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書で開示される方法および組成物によって作製された万能性細胞由来ＨＳＣ細胞を含む。
【０２２３】
加えて、本発明は、自己免疫障害；造血器腫瘍；固形腫瘍；またはＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスと関連した感染症を有する、養子細胞療法に適した対象に組成物を導入することによる、上記医薬組成物の治療用途を提供する。
【０２２４】
前記単離された万能性幹細胞由来造血系細胞は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含み得る。いくつかの実施形態では、前記単離された万能性幹細胞由来造血系細胞は、約９５％〜約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要としている対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣの単離された集団を含む組成物等の、精製されたＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、またはＨＳＣを含む医薬組成物を提供する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、約０．１％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、または約３０％未満のｉＰＳＣ由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含む、万能性幹細胞由来造血系細胞の単離された集団を含む。前記派生造血系細胞の単離された集団は、いくつかの実施形態では、約０．１％超、約０．５％超、約１％超、約２％超、約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、または約３０％超のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含み得る。他の実施形態では、前記派生造血系細胞の単離された集団は、約０．１％〜約１％、約１％〜約３％、約３％〜約５％、約１０％〜約１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約６０％〜７０％、約７０％〜８０％、約８０％〜９０％、約９０％〜９５％、または約９５％〜約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含み得る。
【０２２６】
特定の実施形態では、前記派生造血系細胞は、約０．１％、約１％、約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞またはＨＳＣを含み得る。
【０２２７】
当業者には理解されることであるが、自己由来免疫細胞および同種他家由来免疫細胞の両方が、細胞療法に使用可能である。自己由来細胞療法は、感染が低減され、ＧｖＨＤの確率が低く、且つ、免疫再構築が速い可能性がある。同種他家由来細胞療法は、免疫介在性の移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）効果を有し、且つ、再発率が低い可能性がある。細胞療法を必要としている患者または対象の特定の条件に基づいて、当業者であれば、どちらの特定タイプの療法を施行するかを決定することができる。
【０２２８】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物の前記派生造血系細胞は、対象に対して同種他家由来である。特定の実施形態では、本発明の医薬製剤の前記派生造血系細胞は、対象に対して自己由来である。自家移植において、前記派生造血系細胞の単離された集団は、患者と、完全ＨＬＡ適合または部分ＨＬＡ適合である。別の実施形態では、前記派生造血系細胞は、対象とＨＬＡ適合ではない。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも０．５×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１０×１０５細胞、少なくとも０．５×１０６細胞、少なくとも０．７５×１０６細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも１．２５×１０６細胞、少なくとも１．５×１０６細胞、少なくとも１．７５×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも２．５×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１０×１０６細胞、少なくとも１５×１０６細胞、少なくとも２０×１０６細胞、少なくとも２５×１０６細胞、または少なくとも３０×１０６細胞である。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、約０．１×１０５細胞〜約１０×１０５細胞；約０．５×１０６細胞〜約５×１０６細胞；約１×１０６細胞〜約３×１０６細胞；約１．５×１０６細胞〜約２．５×１０６細胞；または約２×１０６細胞〜約２．５×１０６細胞である。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、約１×１０６細胞〜約３×１０６細胞；約１．０×１０６細胞〜約５×１０６細胞；約１．０×１０６細胞〜約１０×１０６細胞、約１０×１０６細胞〜約２０×１０６細胞、約１０×１０６細胞〜約３０×１０６細胞、または約２０×１０６細胞〜約３０×１０６細胞である。
【０２３２】
いくつかの他の実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、約１×１０６細胞〜約３０×１０６細胞；約１．０×１０６細胞〜約２０×１０６細胞；約１．０×１０６細胞〜約１０×１０６細胞、約２．０×１０６細胞〜約３０×１０６細胞、約２．０×１０６細胞〜約２０×１０６細胞、または約２．０×１０６細胞〜約１０×１０６細胞である。
【０２３３】
さらに他の実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、約１×１０６細胞、約２×１０６細胞、約５×１０６細胞、約７×１０６細胞、約１０×１０６細胞、約１５×１０６細胞、約１７×１０６細胞、約２０×１０６細胞  約２５×１０６細胞、または約３０×１０６細胞である。
【０２３４】
一実施形態では、前記医薬組成物中の派生造血系細胞の数は、部分的または一本の臍帯内血液中の免疫細胞の数であり、すなわち、少なくとも０．１×１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５×１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも１×１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも５×１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも１０×１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．７５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．２５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．７５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２．５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１０×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１５×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２０×１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２５×１０６細胞／体重ｋｇ、または少なくとも３０×１０６細胞／体重ｋｇである。
【０２３５】
本発明により与えられた前記派生遺伝子改変造血系細胞は、投与前にエキソビボまたはインビトロで増殖させることなく、対象に投与することができる。特定の実施形態では、派生遺伝子改変造血系細胞の単離集団は、治療能が改善した免疫細胞を得るための１または複数の剤を用いて、エキソビボで調節および処理される。前記調節された派生遺伝子改変造血系細胞集団を洗浄することで前記処理剤を除去することができ、前記改善された集団は、前記集団のインビトロでのさらなる増殖なしで、患者に投与される。
【０２３６】
他の実施形態では、本発明は、１または複数の剤による調節の前に増殖される、派生遺伝子改変造血系細胞の単離集団を提供する。派生造血系細胞の単離集団は、本明細書にて提供される方法および組成物を用いて、ＴＣＲ、ＣＡＲまたは他のタンパク質を発現するように、組換えにより作製できる。
【０２３７】
組換えＴＣＲまたはＣＡＲを発現する遺伝子改変された派生造血系細胞について、細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、前記細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を用いて、活性化および増殖可能である。
【０２３８】
ある特定の実施形態において、派生遺伝子改変造血系細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコルによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える剤は、溶液中にあってもよく、または表面に結合させてもよい。表面に結合させる場合、前記剤は、同一表面に結合させてもよいし（すなわち、「シス」構造）、または別々の表面に結合させてもよい（すなわち、「トランス」構造）。あるいは、一方の剤を表面に結合させ、他方の剤を溶液としてもよい。一実施形態では、共刺激シグナルを与える剤は細胞表面に結合させることができ、一次活性化シグナルを与える剤は、溶液とするか、または表面に結合させる。ある特定の実施形態では、両方の剤が溶液とされ得る。別の実施形態では、これらの剤は、可溶形態にした後、これらの剤に結合する、Ｆｃ受容体を発現する細胞または抗体または他の結合剤等の表面に架橋結合することができ、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および同第２００６００３４８１０号に開示されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、本発明のＴリンパ球の活性化および増殖において使用が企図される。
【０２３９】
本発明の派生造血系細胞の集団を含む組成物は、無菌にすることができ、且つ、ヒト患者への投与に適し、且つ投与可能な状態の（すなわち、さらなる処理無しで投与できる）ものにすることができる。いくつかの実施形態では、前記治療用組成物は、患者に点滴可能な状態である。投与可能な状態の細胞ベースの組成物とは、対象への移植または投与の前にいかなる追加の処理も操作も必要としない組成物を意味する。
【０２４０】
患者への投与に適した、無菌の治療上許容できる組成物は、１もしくは複数の薬剤的に許容できる担体（添加剤）および／もしくは希釈剤（例えば、薬剤的に許容できる培地、例えば、細胞培養培地）、または他の薬剤的に許容できる成分を含み得る。薬剤的に許容できる担体および／または希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物、および治療用組成物の投与に使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の治療用組成物には種々様々な好適な製剤が存在する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985を参照、この開示はその全体が参照によって本明細書に援用される）。
【０２４１】
特定の実施形態では、派生遺伝子改変造血系細胞の単離集団を含む治療用細胞組成物は、薬剤的に許容できる細胞培養培地も含む。本明細書に開示される派生遺伝子改変造血系細胞集団を含む治療用組成物は、所望の治療目的を果たすために、経腸投与法もしくは非経口投与法によって単独で、または他の好適な化合物と共に、投与することができる。
【０２４２】
前記薬剤的に許容できる担体および／または希釈剤は、治療されるヒト対象への投与に好適とするために、純度が十分に高く、且つ毒性が十分に低くなければならない。それによって、治療用組成物の安定性がさらに維持または増加されるはずである。
【０２４３】
そのような担体溶液は、緩衝液、希釈剤および他の好適な添加剤も含有できる。緩衝液とは、ＰＨを大きく変化させずに酸または塩基を中和する化学的構成を有する溶液または液体を指す。本発明により想定される緩衝液の例としては、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、５％ブドウ糖水溶液（Ｄ５Ｗ）、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２４４】
これらの薬剤的に許容できる担体および／または希釈剤は、治療用組成物の約３〜約１０のＰＨを維持するのに十分な量で存在してもよい。すなわち、前記緩衝剤は、重量対重量ベースで、組成物全体の約５％ほどもあってよい。限定はされないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム等の電解質も、治療用組成物に含ませることができる。一態様において、治療用組成物のＰＨは約４〜約１０の範囲内である。あるいは、治療用組成物のＰＨは、約５〜約９、約６〜約９、または約６．５〜約８の範囲内である。別の実施形態では、治療用組成物は、前記ＰＨ範囲の１つに含まれるＰＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は約７のＰＨを有する。あるいは、治療用組成物は約６．８〜約７．４の範囲内のＰＨを有する。さらなる別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のＰＨを有する。
【０２４５】
本発明の無菌組成物は、無毒の薬剤的に許容できる培地中の、無菌溶液または無菌懸濁液であり得る。懸濁液は、細胞が固相に接着していない非接着状態を指し得る。例えば、懸濁液で維持された細胞は、撹拌が可能であり、培養皿等の支持体に接着していない。
【０２４６】
懸濁液は、微細な化学種が別の化学種と組み合わされた分散液（混合物）であり、前者は非常に細かく分割され混合されているために急速には沈降しない。懸濁液は、溶液を包含する液体培地等のビヒクルを用いて調製できる。いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物は、幹細胞および／または前駆細胞が、許容できる液体培地または溶液（例えば、食塩水または無血清培地）中に分散し、固相に付着していない、懸濁液である。日常生活において、最も一般的な懸濁液は、液体の水の中の固形物の懸濁液である。使用が可能な許容できる希釈剤（例えば、ビヒクルおよび溶媒）としては、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム（食塩水）溶液、および無血清細胞培養培地がある。いくつかの実施形態では、高張液が懸濁剤の作製で使用される。加えて、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁媒として従来より使用されている。非経口適用において、特に好適なビヒクルは、溶液、好ましくは油性溶液または水性溶液、および懸濁液、乳濁液、またはインプラントからなる。水性懸濁剤は、前記懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することがあり、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが含まれる。いくつかの実施形態では、前記輸液は対象組織と等張である。いくつかの実施形態では、前記輸液は対象組織に対して高張である。
【０２４７】
本発明の投与可能な状態の医薬組成物を含む薬剤的に許容できる担体、希釈剤、および他の成分は、治療用組成物の臨床療法での使用を可能にする、米国医薬品グレードの試薬類から得られる。典型的には、あらゆる培地、溶液、または他の薬剤的に許容できる担体および／または希釈剤を含む、これらの最終試薬は、濾過滅菌等の、当該技術分野において慣行の方法で滅菌され、使用前に、マイコプラズマ汚染、エンドトキシン汚染、またはウイルス汚染等の、種々の望まれない汚染物質について検査される。薬剤的に許容できる担体は、一実施形態では、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、造血幹細胞・前駆細胞を包含する、医薬組成物の細胞集団の保存に適している。前記医薬組成物はヒト患者に投与されることが意図されているため、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎児血清等の細胞培養液成分を実質的に含まない。
【０２４８】
また本発明は、部分的には、本発明の薬剤的に許容できる細胞培養培地、特に組成物および／または培養液、の用途を提供する。そのような組成物はヒト対象への投与に適している。一般的に、本発明の前記派生造血系細胞の維持、増殖、および／または健康を支持するあらゆる培地が、医薬品用細胞培地としての使用に適している。特定の実施形態では、薬剤的に許容できる細胞培養培地は、無血清、且つ／またはフィーダー非含有の培地である。
【０２４９】
前記医薬組成物は、調節された派生造血系細胞の単離集団の保存に適した無血清培地を含むことができる。種々の実施形態において、前記無血清培地は動物質を含まず、所望により無タンパク質であってもよい。所望により、前記培地は生物製剤的に許容できる組換えタンパク質を含有してもよい。動物質を含まない培地とは、成分が非動物供給源に由来している培地を指す。組換えタンパク質が、動物質を含まない培地中の元々含まれていた動物性タンパク質を代替しており、これらの栄養分は合成供給源、植物供給源または微生物供給源から得られる。無タンパク質培地は、対照的に、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
【０２５０】
上記の培地の例が、例示であって、本発明における使用に適した培地の配合を限定するものではないこと、および、当業者に公知であり利用可能な多くの好適な培地が存在することは、当業者には理解される。
【０２５１】
前記医薬組成物は、マイコプラズマ汚染、エンドトキシン汚染、および微生物汚染を実質的に含まない。特定の実施形態では、前記治療用組成物は、約１０、約５、約４、約３、約２、約１、約０．１、または約０．０５μｇ／ｍｌ未満のウシ血清アルブミンを含有する。
【０２５２】
マイコプラズマ汚染および微生物汚染に関して、「を実質的に含まない」とは、本明細書で使用される場合、当業者に公知の一般に認められた検査での測定値が陰性であることを意味する。例えば、マイコプラズマ汚染は、適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールと共に、ブロス培地中で治療用組成物の試料を継代培養し、３７℃で１日目、３日目、７日目、および１４日目に寒天板上に播くことによって、判定される。試料の見た目が、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの見た目と、１００×の顕微鏡で比較される。さらに、指標細胞培養物の播種物が３日間および５日間インキュベートされ、マイコプラズマの有無について、ＤＮＡ結合性蛍光色素を用いる落射蛍光顕微鏡法によって６００×で検査される。前記寒天および／またはブロス培地の手順、並びに前記指標細胞培養の手順がマイコプラズマ汚染の証拠を何も示さない場合に、試料は満足のいくものと見なされる。
【０２５３】
有機溶剤または好適な有機溶剤は、全体として、固形、液状、またはガス状の溶質を溶解し、溶液をもたらす、炭素を含有する液体または気体に関する。好適な有機溶剤は、哺乳類細胞へのエキソビボ投与、または哺乳類細胞とのインキュベーションに適した有機溶剤であり、インキュベーションまたは投与の時間、選択された濃度において、エキソビボ条件（例えば、細胞培養）下またはインビボにおいて毒性または他の阻害効果が最小であること等により、対象へのインビボ投与にも適したものであり得る。好適な有機溶剤は、本明細書に記載の剤の保存安定性および取り扱いにも適したものであるべきである。
【０２５４】
好適な有機溶剤の例としては、限定はされないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、およびジメチルアセトアミドが挙げられ、これらの混合物または組み合わせも含まれる。ある特定の実施形態では、組成物または有機溶剤は酢酸メチルを実質的に含まず、これは、組成物または溶媒中に微量の酢酸メチルしか存在すべきでないこと、好ましくは検出不能な量であること、を意味している（例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等で測定）。
【０２５５】
エンドトキシンを含まない容器または組成物とは、容器または組成物が、高々微量（すなわち、対象に対して有害生理作用を示さない量）のエンドトキシン、または検出不能な量のエンドトキシンを含有すること、を意味する。「実質的にエンドトキシンを含まない」とは、生物製剤についてＦＤＡによって許可されている、５ＥＵ／ｋｇ体重／日の全エンドトキシン、平均７０ｋｇの人の場合で３５０ＥＵ／細胞総用量、よりも細胞の用量当たりのエンドトキシンが少ないことを意味する。
【０２５６】
一実施形態では、エンドトキシンを含まない容器および／または組成物は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％エンドトキシン非含有である。エンドトキシンはリステリア菌（Listeria monocytogenes）等のグラム陽性細菌に存在し得るが、エンドトキシンは、ある特定の細菌、典型的にはグラム陰性細菌、と関連した毒素である。最も多く見られるエンドトキシンは、種々のグラム陰性細菌の外膜に存在し、且つ、これらの細菌の疾患を引き起こす能力において中心的な病原特性を示す、リポ多糖類（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）である。少量のエンドトキシンは、ヒトにおいて、他の有害生理作用の中でも、発熱、血圧低下、並びに炎症および凝固の活性化、を引き起こし得る。従って、少量であってもヒトにおいて有害作用を引き起こし得ることから、微量のエンドトキシンの大部分または全てを製剤容器から除去することが、しばしば望ましい。エンドトキシンは、当該技術分野において公知の方法を用いて容器から除去可能であり、例えば、容器は、エンドトキシンを含まない水を用いるＨＥＰＡ除菌洗浄装置内で洗浄され、２５０℃で脱パイロジェン処理され、クラス１００／１０クリーンルーム（例えば、クラス１００クリーンルームは、１立方フィートの空気中に０．５ミクロンより大きい粒子を１００個しかない）内に設置されたＨＥＰＡ除菌ワークステーションでクリーンパッケージされ得る。
【実施例】
【０２５７】
以下の実施例は例示であり、限定を目的とするものではない。
【０２５８】
実施例１：材料および方法
様々なセーフ・ハーバー遺伝子座の組込み戦略と組み合わせて、種々のプロモーターの制御下の自殺系を効率的に選択および試験するために、出願人の登録商標のあるｈｉＰＳＣプラットフォームを用いた。前記ｈｉＰＳＣプラットフォームは、単一細胞の継代と、ハイスループットな９６ウェルプレートを基盤としたフローサイトメトリーソーティングとを可能にし、単一または複数の遺伝子調節によるクローナルなｈｉＰＳＣの誘導を可能にする。
【０２５９】
小分子培養液中でのｈｉＰＳＣの維持：
培養物の培養密度が７５％〜９０％に達したら、ｈｉＰＳＣを単一細胞として定期的に継代した。単一細胞解離のため、ｈｉＰＳＣを、ＰＢＳ（メディアテック社（Mediatech））で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社）で３７℃で３〜５分間処理し、その後、ピペッティングにより確実に単一細胞解離させた。この単一細胞懸濁液を次に、通常の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心し、ＦＭＭ中に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆された表面上に播種した。継代は通常１：６〜１：８とし、Ｍａｔｒｉｇｅｌで３７℃で２〜４時間事前に被覆された組織培養プレートに移し、２〜３日毎にＦＭＭを与えた。細胞培養物は３７℃、５％ＣＯ２に設定された加湿恒温器内で維持した。
【０２６０】
ゲノム内セーフ・ハーバーに誘導性カスパーゼ９を標的挿入するための、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲによる、ヒトｉＰＳＣゲノム編集：
ＺＦＮを介したゲノム編集において、２×１０６個のｉＰＳＣに、２．５ｕｇのＺＦＮ−Ｌ（ＦＴＶ８９３；配列番号：２および４）、２．５ｕｇのＺＦＮ−Ｒ（ＦＴＶ８９４；配列番号：３および５）並びに５ｕｇのＡＡＶＳ１  誘導性カスパーゼ９ドナーコンストラクト（ＦＴＶ８９５、ＦＴＶ９３０、ＦＴＶ９２１、ＦＴＶ９３１、ＦＴＶ９３２、ＦＴＶ９５２またはＦＴＶ９５３；誘導性カスパーゼ９配列番号：７および８）プラスミドＤＮＡの混合物をトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集においては、２×１０６個のｉＰＳＣに、５ｕｇのＲＯＳＡ２６−ｇＲＮＡ／カスパーゼ９（ＦＴＶ９２２；配列番号６）および５ｕｇのＲＯＳＡ２６  誘導性カスパーゼ９ドナーコンストラクト（ＦＴＶ９５５またはＦＴＶ９５６）の混合物をトランスフェクトした。トランスフェクションはＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）（パラメーターは１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用）を用いて行った。前記プラスミドが人工プロモーターにより駆動されるＧＦＰおよび／またはＲＦＰ発現カセットを含む場合、トランスフェクション後の２日目または３日目に、フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の４日目に、ピューロマイシンを、最初の７日間は０．１ｕｇ／ｍｌの濃度で、７日後に０．２ｕｇ／ｍｌの濃度で、培地に加えて、標的細胞を選択した。ピューロマイシンによるセレクション中、１０日目に、細胞を新鮮ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上に継代した。ピューロマイシンによるセレクションの１６日目から、生存細胞をＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。
【０２６１】
ゲノム編集ｉＰＳＣのバルク選別およびクローナル選別：
ＺＦＮを介してＡＡＶＳ１  ＥＦ１αまたはＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９−２Ａ−ＧＦＰによって標的とされたｉＰＳＣについて、ピューロマイシンによるセレクションの２０日後のＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣのバルク選別（bulk sort）およびクローナル選別（clonal sort）を行った。単一細胞に解離された標的ｉＰＳＣのプールを、最適性能のために新鮮なものとされた、ハンクス平衡塩類溶液（メディアテック社）、４％ウシ胎児血清（インビトロジェン社）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（メディアテック社）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（メディアテック社）を含有する冷却染色バッファー中に再懸濁した。ＳＳＥＡ４−ＰＥ、ＴＲＡ１８１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７（ＢＤバイオサイエンス社）を含む、結合型一次抗体を、この細胞液に加えて、氷上で１５分間インキュベートした。抗体は全て、１０６個の細胞当たり、１００μＬの染色バッファー中、７μＬで使用した。細胞液を染色バッファーで１回洗浄し、２２５ｇで４分間遠心沈殿させ、１０μＭチアゾビビン（Thiazovivn）を含有する染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリーソーティングはＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で行った。バルク選別では、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞をゲーティングし、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌ標準チューブ内に選別した。クローナル選別では、選別された細胞を、３イベント／ウェルの濃度で、１００μＭノズルを用いて９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬフィブロネクチンおよび１×ペニシリン／ストレプトマイシン（メディアテック社）を添加した２００μＬのＦＭＭを事前に充填し、５×Ｍａｔｒｉｇｅｌで一晩事前に被覆した。５×Ｍａｔｒｉｇｅｌの事前被覆は、一定分量のＭａｔｒｉｇｅｌを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に加え、次に４℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、そして５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、その後３７℃で一晩インキュベートすることを含む。この５×Ｍａｔｒｉｇｅｌは各ウェルへの培地添加の直前に吸引される。選別完了後、９６ウェルプレートを２２５ｇで１〜２分間遠心し、その後インキュベートする。プレートを７日間静置した。７日目、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと置き換えた。選別後の１０日目に、ウェルに追加の１００μＬのＦＭＭを再度加える。コロニー形成が早くも２日目に認められ、ほとんどのコロニーが選別後の７日目〜１０日目の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのＡｃｃｕｔａｓｅで、３７℃でおよそ１０分間剥離させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ処理延長の必要性は、長期間培養液中で未処理状態であったコロニーが詰まっていることを表す。細胞が剥離しているように見えたら、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーをばらばらにする。剥離されたコロニーを、５×Ｍａｔｒｉｇｅｌで事前被覆された９６ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、２２５ｇで２分間遠心し、その後インキュベーションする。この１：１継代は初期コロニーを増殖前に横に広げるために行われる。後の継代は、７５〜９０％コンフルエント後に、３〜５分間のＡｃｃｕｔａｓｅ処理、および１×Ｍａｔｒｉｇｅｌで事前被覆されたより大きなウェル内のＦＭＭ中での１：４〜１：８増殖により、定期的に行った。それぞれのクローナル細胞株を、ＧＦＰ蛍光レベルおよびＴＲＡ１−８１発現レベルについて分析した。１００％近くがＧＦＰ＋およびＴＲＡ１−８１＋であるクローナル株を、さらなるＰＣＲスクリーニングおよび解析のために選択した。フローサイトメトリー解析はＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ８  ＨＴ（ミリポア社）で行い、Ｆｌｏｗｊｏ（フロージョー社（FlowJo, LLC））を用いて解析した。
【０２６２】
誘導性カスパーゼ９を組み込まれたｉＰＳＣのインビトロにおける誘導性死滅：
二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ；ＡＰ１９０３）を、メドケムエクスプレス社（Medchemexpress）（ニュージャージー州マンモスジャンクション）から購入した。ＣＩＤ暴露の２４時間後、細胞を回収し、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で、製造業者の取扱説明書（ＢＤバイオサイエンス社）に従って染色した。７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビルリカ）によって死細胞として定量化し、ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで解析した。
【０２６３】
ＡＰ１９０３が誘導性カスパーゼ９標的化ｉＰＳＣクローンの完全な細胞死を誘導するかどうかを調べるために、各標的化ｉＰＳＣクローンの３ウェルを、ＡＰ１９０３で４８時間処理し、次いで、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、新鮮なｉＰＳＣ培地を加えた。ウェルを、２日毎に計５日間、培地交換により回復させた。その後、ウェルをアルカリホスファターゼ染色試薬（シグマ社）で染色した。
【０２６４】
インビトロにおける、誘導性カスパーゼ９標的化クローンの三胚葉指向性分化および誘導性死滅：
指向性単層三胚葉分化では、ｈｉＰＳＣを、分化開始の前日に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上のＦＭＭ中に播種した（例えば、内胚葉については２×１０５細胞／ウェル、外胚葉については５×１０４細胞／ウェル、中胚葉については１×１０４および５×１０４細胞／ウェル）。各胚葉分化について４つのレプリケートウェルを設けた。内胚葉分化では、ＦＭＭ培地を内胚葉誘導培地（ＲＰＭＩ−１６４０、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４５０μＭ）、１×グルタミン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（０．２０％）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（バイオビジョン社（Biovision））（３μＭ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン）と置換した。２日後、培地（ＲＰＭＩ−１６４０、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４５０μＭ）、１×グルタミン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（０．５０％）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン）と置換した。３日目に、１つのウェルを固定し、Ｓｏｘ１７について染色した（Ｒ＆Ｄシステムズ社）。３日目に、１つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。２つの他のウェルは、ＡＰ１９０３で４８時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、５日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。中胚葉分化では、培地を、ＩＴＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２０μＭフォルスコリンおよび３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（メディアテック社）で置換した。培地を一日おきに交換し、４日目に１つのウェルを固定し、αＳＭＡについて染色した（シグマ社）。4日目に、１つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。２つの他のウェルは、ＡＰ１９０３で４８時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、５日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。外胚葉分化では、ＦＭＭ培地を、神経誘導培地（１×Ｂ２７培地添加物（ライフテクノロジーズ社）、１×Ｎ２培地添加物（ライフテクノロジーズ社）、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２および１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（メディアテック社））と置換した。培地を一日おきに交換し、７日目に１つのウェルを固定し、ネスチンについて染色した（アブカム社）。７日目に、１つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。２つの他のウェルは、ＡＰ１９０３で４８時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、５日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。
【０２６５】
クリスタルバイオレット染色：
１００ｍＬの脱イオン水中に０．５ｇのクリスタルバイオレット染色液（シグマ社）を溶解させることにより、０．５％クリスタルバイオレット溶液を調製した。濾過し、室温で保存する。染色について、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで置換し、１５分間室温に置く。ＰＢＳで２回リンスする。０．１％クリスタルバイオレット（１０％エタノール中で調製）で室温で１５分間染色する。ＣＶを捨てる。細胞を洗浄ビンからの脱イオン水で、水が暗色にならなくなるまで、穏やかに洗浄する。脱イオン水を取り除き、染色された細胞を乾燥させ、その後撮影した。
【０２６６】
誘導性カスパーゼ９を組み込まれたｉＰＳＣに由来する奇形腫のインビボ誘導性死滅：
マウスは全て出願人の施設に収容された。マウスに関する実験プロトコルは全て、出願人の施設内動物管理使用委員会に承認されたものである。本研究で使用されたマウスは全て、７〜１０週齢の雌ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｎｕｌｌ、ジャクソン研究所）であった。奇形腫アッセイでは、５０％のＦＭＭ培地および５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ中の１〜２×１０６ｉＰＳＣからなる２００μｌを、背外側領域の皮下に導入した。各マウスには、両側に２種の細胞注射を与え、誘導性カスパーゼ９を組み込まれたｉＰＳＣを左側に注射し、未改変親ｉＰＳＣ系統を右側に注射した。指示された時点でインビボ死滅を惹起するため、マウスに、５日間または７日間の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、ＡＰ１９０３（１２５μｇ／マウス）を毎日投与した。マウスの奇形腫形成をモニターし、３週目または表示の通りに体積測定を開始した。奇形腫を表示された時点に採取し、組織学的検査または分子アッセイ用に処理した。ＡＰ１９０３ストックをＤＭＳＯ中で調製した（２５μｇ／ｍｌ）。１回の腹腔内注射用に、５μｌの原液を２００μｌのＰＢＳに加え、その後、水浴中で１０分間超音波処理した。組織学的検査では、奇形腫をＰＢＳ中に採取し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後、加工のために、７０％エタノール中で室温で維持した。試料を、切り出しおよびヘマトキシリン・エオシン染色用に、ＵＣＳＤ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出した。切片を調べ、解釈(interpret)し、ニコン社製ＤＳ−Ｆｉ１カメラを備えたニコン社製Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００顕微鏡を用いて撮影した。
【０２６７】
移植されたルシフェラーゼ発現ｉＰＳＣの誘導性死滅のインビボ可視化：
ＡＰ１９０３誘導性死滅をインビボで可視化するために、誘導性カスパーゼ９を組み込まれたｉＰＳＣおよび未改変親ｉＰＳＣに、ＩＲＥＳによって連結されたホタルルシフェラーゼ遺伝子およびＲＦＰから構成され、ＥＦ１αの制御下で発現される、多シストロン性カセットを含むレンチウイルス（バイオセティア社（Biosettia））を感染させた。感染細胞をＲＦＰ＋細胞について選別し、上記の通りに注射した。２×１０６個の誘導性カスパーゼ９導入ｉＰＳＣをＮＳＧマウスの左側の皮下に注射し、同数の親ｉＰＳＣを右側に注射した。ＡＰ１９０３腹腔内注射を、表示された日に投与した。ｉＰＳＣ移植の直後（０日目）から、キセノジェン社製（Xenogen）ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて、移植および奇形腫体積を毎週モニターした。イメージングでは、マウスにＤ−ルシフェリン（４ｍｇ／マウス、サーモ・フィッシャー社（Thermo Fisher））を腹腔内注射し、１０分後の生物発光を記録した。キセノジェン社製Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて解析を行った。
【０２６８】
実施例２：ＣＭＶプロモーターにより制御されるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー標的化誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子は、ＡＰ１９０３により活性化された場合に、一様でない応答を誘起する
ｉＰＳＣにおける適切な組込みおよび発現戦略のハイスループット解析を行うために、カスパーゼ−９を介した迅速な細胞死をＡＰ１９０３等の二量体化の小分子化学誘導物質によって誘導できる、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子プラットフォームを選択した。なお、小分子誘導が最終産物へ向けた各発生段階において有効性を示すために、誘導性カスパーゼ９遺伝子は万能性幹細胞の維持および分化の全ての段階で継続的に発現される必要がある。ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＨ１１遺伝子座を含むがこれらに限定はされない、セーフ・ハーバー遺伝子座に、種々の自殺遺伝子発現カセットを、効率的且つ正確に組込みそして維持するために、１ウェルにつき１個のｈｉＰＳＣとした。内在性ＡＡＶＳ１またはＲＯＳＡ２６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターおよびユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含む、種々の外来性プロモーターおよび内在性プロモーターの下流に自殺遺伝子発現カセットをそれぞれ含有するいくつかの組込みベクターを試験して、ｈｉＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ由来分化細胞の療法における様々な自殺系の活性を系統的に解析し比較した。
【０２６９】
ＣＭＶ駆動型誘導性カスパーゼ９（ＡＡＶＳ１−Ｇ１．０）を含むドナーコンストラクトは、ＡＡＶＳ１遺伝子座（図１Ａ）を標的とし、Ｃａｓｐ９自殺遺伝子を２９３Ｔ細胞に組み込むように設計された。このドナーコンストラクトはＧＦＰ遺伝子およびピューロマイシン遺伝子も含んでおり、標的挿入が起こった後はこれらの発現はＡＡＶＳ１内在性プロモーターによって駆動される（図１Ａ）。２９３Ｔ細胞に、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびドナーコンストラクトＡＡＶＳ１−Ｇ１．０をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ピューロマイシンによるセレクションを開始し、１２日間続けた。ピューロマイシンによるセレクションを受けた集団を、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析し、一連のＧＦＰ発現レベルを観測した。ピューロマイシンによるセレクションを受けた細胞集団の約８２％がＧＦＰを発現していたことが認められた（図１Ｂ）。次に、ピューロマイシンによるセレクションを受けた２９３Ｔ細胞を、１０ｎＭまたは１２０ｎＭのＡＰ１９０３（コントロールとしてはＤＭＳＯを使用）処理に２４時間曝した。処理された細胞をその後回収し、膜が損なわれた死につつある細胞を選択的に染色する７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤ陰性細胞（おそらくは生細胞）の割合を、各処理（コントロールにおけるＤＭＳＯ；ＡＰ１９０３  １０ｎＭ；およびＡＰ１９０３  １２０ｎＭ）（ｎ＝２）に対してプロットした。ＡＰ１９０３処理後、両方の濃度で、有意な細胞死が検出された（図１Ｃ）。ＡＰ１９０３の投与量は、死につつある細胞の割合に影響が無いようであった。ピューロマイシンによるセレクションを受けた２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座へのドナーベクターの標的挿入を、これらのピューロマイシンによるセレクションを受けた２９３Ｔ細胞から得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲ（Junction PCR）を用いてさらに検証した（図１Ｄ）。ＰＣＲ増幅産物の存在はドナーベクター挿入によって形成された接合部に特有である。
【０２７０】
２９３Ｔ細胞と同様に、ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＣＭＶ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクト（ＡＡＶＳ１−Ｇ１．０）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ピューロマイシンによるセレクションを開始し、１６日間続けた。ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。ＧＦＰ強度に基づいた３つの集団、ＧＦＰ（陰性）、ＧＦＰ（低）およびＧＦＰ（高）を、フローサイトメトリーで選別した（図１Ｅ）。選別されたＧＦＰ（陰性）集団、ＧＦＰ（低）集団およびＧＦＰ（高）集団を増殖させ、その後、ＡＰ１９０３処理（１０ｎＭもしくは１００ｎＭ）、またはコントロールとしてのＤＭＳＯに、２４時間曝した。処理された細胞を回収し、７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤ陰性細胞（おそらくは生細胞）の割合を、各処理に対してプロットした。しかし、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化Ｃａｓｐ９挿入を有する２９３Ｔ細胞とは対照的に、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化Ｃａｓｐ９挿入を有するｉＰＳＣでは、全ての処理においてＡＰ１９０３によって仲介される細胞死は検出されなかった（図１Ｆ）。ピューロマイシンによるセレクションおよび選別を受けたｈｉＰＳＣから得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲは、ＧＦＰ（低）集団においてのみ、ドナーベクターのＡＡＶＳ１遺伝子座への標的挿入を示し、ＧＦＰ（陰性）集団およびＧＦＰ（高）集団では示さなかった（図１Ｇ）。すなわち、ＧＦＰ（高）集団における細胞死の欠如は、ゲノムにおける不正確な（標的化されていない）挿入およびＣＭＶプロモーター下の誘導性カスパーゼ９発現の推定的欠如と関連していると考えられた（図１Ｇ、レーン４；レーン１はマーカー）。他方、ＧＦＰ（低）における細胞死の欠如は、ｉＰＳＣにおける正確な標的挿入にもかかわらず、ＣＭＶプロモーター下の誘導性カスパーゼ９遺伝子の発現が減少したことと関連していると考えられた（図１Ｇ、レーン５）。すなわち、ＣＭＶプロモーターにより制御されるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー標的化誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子は、ＡＰ１９０３によって活性化された場合、おそらくは組込みのための細胞型およびゲノムにおける組込み部位に依存して、一様でない応答を誘起する。
【０２７１】
実施例３：ｈｉＰＳＣにおける、種々の内在性プロモーターおよび外来性プロモーター下の、セーフ・ハーバー遺伝子座を標的とした誘導性カスパーゼ９の挿入
先の研究で、ＡＡＶＳ１プロモーター下のピューロマイシンによるセレクションは、セレクション中の生存度および増殖を維持すると強く表現されたため、次は、誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトを、挿入後に誘導性カスパーゼ９遺伝子発現を駆動する内在性ＡＡＶＳ１プロモーター（およびＧＦＰ、およびピューロマイシンマーカー遺伝子）を有する、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計した（図２Ａ）。ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＡＡＶＳ１内在性プロモーターの制御下の誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの３日後に開始し、２０日間続けた。その後、ピューロマイシン耐性細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、ＧＦＰ発現を有することが示された（図２Ｂ）。次に、増殖させたピューロマイシン耐性ｉＰＳＣをＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）処理に２４時間曝した。処理された細胞を回収し、７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤ陰性細胞（すなわち生細胞）の割合を、各処理に対してプロットした。しかし、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＣａｓｐ９の標的挿入および内在性ＡＡＶＳ１プロモーターによる制御されたＣａｓｐ９発現を有するｉＰＳＣでは、全ての処理において、ＡＰ１９０３によって仲介される細胞死は検出されなかった（図２Ｃ）。ピューロマイシン耐性プールから得られたゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲは、この集団における、ＡＡＶＳ１遺伝子座へのドナーベクターの標的挿入を示した（図２Ｄ）。従って、内在性ＡＡＶＳ１プロモーターにより制御されるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー標的化誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１遺伝子座における正確な挿入にもかかわらず、誘導性カスパーゼ９発現を誘起しなかったと思われる。ＧＦＰ発現強度に基づくと、再度、低レベル発現は誘導性カスパーゼ９介在性細胞死に十分ではないと思われる。
【０２７２】
個々の細胞あたり複数の遺伝子コピーが導入されるレンチウイルスを介した導入遺伝子組込み等の他の遺伝子導入戦略と異なり、遺伝子座特異的な標的化法では、異なるプロモーターの特性が機能的アウトプットにおいて重要な役割を果たすと思われる。どのプロモーターが所望のレベルでのロバストな発現を維持しているかを調べるため、コンストラクトを今度は、種々の外来性プロモーターが誘導性カスパーゼ９発現を駆動し、ＡＡＶＳ１内在性プロモーターがＧＦＰおよびピューロマイシンマーカー遺伝子を駆動し、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計した（図２Ｅ）。試験された外来性プロモーターはＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＣＡＧを含んだ。ｈｉＰＳＣに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよび選択された外来性プロモーターのうちの１つの制御下にある誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの３日後に開始し、２０日間継続した後、ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。ＥＦ１α、およびＣＡＧの制御下にある誘導性カスパーゼ９を含むコンストラクト（配列番号１を参照）をトランスフェクトされたｈｉＰＳＣは、トランスフェクション後に高いＧＦＰ発現を示し、ＣＡＧ単独はロバストな発現を示すことが認められた（図２Ｆおよび表１）。さらなる解析のために、これら２つの戦略を選んだ。
【０２７３】
実施例４：ｉＰＳＣにおけるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバーへのＥＦ１αプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９の標的挿入
ＥＦ１α駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトを、図２Ｅに従って、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計した。ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＥＦ１ａ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトされたｈｉＰＳＣを、ピューロマイシンによるセレクションに２０日間かけ、その後、ＡＰ１９０３処理した。フローサイトメトリー解析を示す図３Ａにおけるゲートをかけられた領域は、標的挿入を有するＧＦＰ陽性ｉＰＳＣ細胞をハイライトしているが、ＡＰ１９０３細胞死誘導に応答したものはわずかであった。これらのＧＦＰ陽性集団を濃縮および維持できるかを確かめるため、ＴＲＡ１８１陽性（万能性且つ未分化状態を示すマーカー）且つＧＦＰ陽性（誘導性カスパーゼ９発現の指標）のｈｉＰＳＣを、セレクション後１６日目あたりに、バルク選別するか、または９６ウェルプレート内で個別選別した（図３Ｂ）。ＧＦＰ陽性のバルク選別されたｈｉＰＳＣを、ピューロマイシン非含有培地中でさらなる時間維持して、長期にわたる集団特性を確かめた（図３Ｃ）。ＴＲＡ１８１およびＧＦＰを共に高発現する細胞の割合の、長い期間（例えば、選別後２日目から選別後１６日目まで）をかけた減少が観察された。このデータは、ＥＦ１ａは高レベルの発現を示したが、その発現を維持することができなかったことを示差しており、これは、万能性状態におけるサイレンシングが原因である可能性が最も高い。ロバストなＥＦ１ａ介在性発現を有する個々のｈｉＰＳＣが存在し得るかを確かめるため、個々のｈｉＰＳＣ選別細胞をスクリーニングした。単一細胞に選別されたＴＲＡ１８１およびＧＦＰ細胞に由来するクローナルなｈｉＰＳＣの明視野（bright filed）画像により、単一に選別された細胞に由来するｈｉＰＳＣコロニーの形態が示された（図３Ｄ）。ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的挿入ＥＦ１α駆動型誘導性カスパーゼ９を有するクローナルなｈｉＰＳＣを、次に、増殖させ、ＧＦＰ発現について評価した。しかし、全てのコロニーが増殖後に様々な程度でＧＦＰ発現を失い、これは、ＥＦ１αプロモーターが挿入後の増殖中にｈｉＰＳＣにおいて発現を維持できなかったことを示唆している（図３Ｅ参照、例えば、ＥＦ１αクローンＣ１およびＣ２３）。まとめると、バルク選別および個別選別のレベルにおいて、ＥＦ１ａは、ＧＦＰ発現をロバストに維持できず、ひいては誘導性カスパーゼ９発現も維持できなかった。
【０２７４】
実施例５：ｈｉＰＳＣにおけるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバーへのＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９の標的挿入
いくつかの内在性プロモーターは、ｈｉＰＳＣのクローン増殖中に誘導性カスパーゼ９の持続的発現を駆動することが分かったが、測定されたその発現レベルは、ＡＰ１９０３処理に効果的に応答するには低すぎるものであった。種々の外来性プロモーターの制御下にある誘導性カスパーゼ９の発現も、長期のｈｉＰＳＣクローン増殖の間に失われることが示され、ＡＰ１９０３誘導性細胞死を駆動できなかった。ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトされたｈｉＰＳＣを次に評価した（図２Ｅおよび表１）。
【０２７５】
ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの３日後に開始し、１６日間継続した。その後、ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてバルク選別するか、または９６ウェルプレート内で個別選別した。ｉＰＳＣ増殖中にＧＦＰ高発現を維持できるかどうかを明らかにするために、標的化およびピューロマイシンによるセレクションの後の、ＧＦＰ陽性のバルク選別されたｉＰＳＣを、ピューロマイシン非含有培地中で２１日間維持し、その後フローサイトメトリーで解析した。図４Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞の割合が長期の増殖中に維持されるだけでなく、ＧＦＰ陽性細胞の割合が９９％を超えていたことを示している。これは、複数のコピーがゲノム中に挿入されるレンチウイルス法の維持と同様に、特定の遺伝子座に標的化されたプロモーターがロバストな発現を維持できたことの、初めての知見である。次に、９９％ＧＦＰ発現を維持するバルク選別物の誘導性カスパーゼ９遺伝子応答を調べた。図４Ｃは、ＡＰ１９０３で処理された場合に、ＧＦＰ陽性細胞が誘導性細胞死を起こし、処理後に７ＡＡＤ染色陽性になったことを示している。ＣＡＧバルク集団が効率的な誘導性カスパーゼ９介在性細胞死に繋がるロバストな発現を示したため、次に、個々のクローンを評価した。今度は、ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆９６ウェルプレートにクローナルに選別されたピューロマイシン耐性ｉＰＳＣを、評価した。個別選別後の典型的なコロニーの明視野（bright-filed）画像は、高品質の万能性形態を示している（図４Ｄ）。単一細胞に由来するコロニーを、個別に増殖させ、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現およびＴＲＡ１８１発現について評価した。全ての選択されたコロニー（例えば、ＣＡＧ−Ｃ５、ＣＡＧ−Ｃ８、ＣＡＧ−Ｃ１２、ＣＡＧ−Ｃ３８）が、増殖中に、高い割合のＧＦＰ発現およびＴＲＡ１８１発現を維持したことが示された（図４Ｅ）。選択されたクローンの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を図４Ｆに示す。図４Ｆから、ＣＡＧ−Ｃ５は最も高いＭＦＩ（１５００）を有し、ＣＡＧ−Ｃ３８は４つのクローンの中で相対的に最も低いＭＦＩ（８５８）を有する。全ての選択されたＧＦＰ＋クローンを用いて、ゲノムＤＮＡのジャンクションＰＣＲを行い、ドナーコンストラクトおよびＡＡＶＳ１遺伝子座の相同組換えを検出した。親ｈｉＰＳＣはトランスフェクション前の元のｈｉＰＳＣ株を意味する。
【０２７６】
ＣＡＧ  ｈｉＰＳＣ集団プールは、標的化トランスフェクションおよび１６日間のピューロマイシンによるセレクションの後の集団を意味する。ゲノムＤＮＡの質を保証するために、ＧＡＰＤＨゲノム配列を増幅した。全ての選択されたＧＦＰ陽性クローンが、ＡＡＶＳ１遺伝子座における正しい挿入を示した（図４Ｇ）。すなわち、上記のデータは、ＣＡＧが、ｈｉＰＳＣ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化された後に、ｉＰＳＣ増殖中にその制御下にある前記遺伝子の高レベル発現をロバストに維持する能力がある、唯一のプロモーターであることを示唆するものであった。
【０２７７】
トランスフェクション（トランスフェクション後の２〜３日目）、ピューロマイシンによるセレクション後の維持（ピューロマイシンによるセレクション後の２０日目）、およびＡＰ１９０３処理後の機能的応答の際の、さらなるプロモーターの性能を、同様に評価した。下記の表１は、外来性プロモーターであるＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＣＡＧ、およびＰＧＫ、並びに内在性プロモーターであるＡＡＶＳ１の性能を要約している。表１において、自殺遺伝子応答は、ＡＰ１９０３処理に対し応答性のＧＦＰ陽性細胞の数に基づいて定量化されている。
【表２】
2018531612.tif 000003
【０２７８】
すなわち、全ての選択されたプロモーターの中で、ＣＡＧがあらゆる点で最も高い性能を示す。以下、ＣＡＧ−ｉＰＳＣクローンをさらに評価した。
【０２７９】
実施例６：ＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンの万能性評価
全ての選択されたＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンを、万能性評価のために解析した。図５Ａは、無フィーダー培養で維持されたＣＡＧクローンＣ３８を示す画像であり、個々の細胞が高い核対細胞質比で構成されているｈｉＰＳＣの均一な培養物を示している。図５Ｂにおける、万能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の蛍光免疫染色は、ＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンが万能性であり、且つ分化していないことを示している。また、選択されたＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローン（ＣＡＧ−Ｃ５、ＣＡＧ−Ｃ８、ＣＡＧ−Ｃ１２、ＣＡＧ−Ｃ３８、およびＣＡＧ−Ｃ４０）の万能性状態を示すため、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１、ＤＰＰＡ２、およびＭＹＣを含む種々の内在性万能性マーカーの発現について、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。全てのＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンにおいて、ＮＡＮＯＧ発現は親ｉＰＳＣよりも低いことが示されている。ＴＲＡ１８１、ＳＳＥＡ３およびＣＤ３０マーカー発現についてのフローサイトメトリー解析も行った。次に、選択されたＣＡＧクローンを、胚葉特異的分化へと方向付け、胚葉マーカーについて評価した。図５Ｄは、選択されたＣＡＧクローンが分化へと方向付けられた後の、外胚葉マーカーであるネスチン；中胚葉マーカーであるαＳＭＡ；および内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の発現を示している。ＣＡＧ−ｉＰＳＣクローンの１つであるＣＡＧ−Ｃ３８を、種々の系譜からなる奇形腫を生じる能力について、さらに評価した。図５Ｅは、注射の６週間後に採取した奇形腫であるが、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉または外胚葉）を示している。これらのデータは、ＣＡＧ−ｉＰＳＣクローンが万能性および全系譜の非万能性細胞への分化能を保持したことを示している。
【０２８０】
実施例７：ＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９がＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化された、万能性状態および分化状態の両方におけるｈｉＰＳＣクローンの、誘導性の自殺遺伝子を介した死滅
２０種のＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを、ＡＰ１９０３（またはＤＭＳＯコントロール）で２４時間処理し、その後７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーでＧＦＰおよび７ＡＡＤ染色について解析した。全てのクローンが、ＡＰ１９０３処理後に９５％超の７ＡＡＤ染色陽性を示した（図６Ａ）。２つの代表的なクローン（ＣＡＧ−Ｃ５およびＣＡＧ−Ｃ３８）から得られたフローサイトメトリープロットはまた、ＣＡＧ−ｉＰＳＣクローンの万能性状態におけるＣａｓｐ９遺伝子応答を表すことも示された（図６Ａ）。１５種のＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｉＰＳＣクローンを１２ウェルプレート内の３連ウェルで培養した。コンフルエント後、１つのウェルはアルカリホスファターゼ染色して写真を撮り、他の２つのウェルはＡＰ１９０３（１０ｎＭ）で４８時間処理した。処理後のウェルをＰＢＳで洗浄し、残留生細胞を回復させるために新鮮な培地を加えた。８日間回復させたウェルをアルカリホスファターゼ染色し、撮影して、ｉＰＳＣクローンの生存を記録した。１５種のクローンのうち、ＣＡＧ−Ｃ１４クローンのみが生存クローンを含有した、すなわち、誘導死を回避した（図６Ｂ）。他の１４種のクローンは染色を示さなかったが、これはＣａｓｐ９の誘導発現後に生存した細胞が無かったことを示している。図６Ｃによって、ＡＰ１９０３（１０ｎＭ）処理後の１０ｃｍディッシュ上のＣＡＧ−Ｃ５クローン生細胞による被覆率の動態が示された。生細胞は処理の約８分後から死に始め、ＡＰ１９０３処理の１２分後にはほぼ全ての生細胞が死滅した。次に、ＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを誘導して三胚葉（内胚葉、中胚葉または外胚葉）からの細胞に分化させて、それぞれをＡＰ１９０３で４８時間処理し、分化培地中で５日間回復させた。処理前および回復後のレプリケートウェルをクリスタルバイオレットで染色したところ、図６Ｄに示されるような画像となった。ＣＡＧ−Ｃ５クローンから得られた画像を代表として示したが、全ての系譜の細胞がＡＰ１９０３処理後に死滅したことを示している。最後に、ＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９標的化ｈｉＰＳＣクローンを誘導してＣＤ３４＋細胞に分化させ、ＡＰ１９０３で４８時間処理し、細胞死についてフローサイトメトリー解析した。図６Ｅに示される７ＡＡＤ染色の亢進によって、ＡＰ１９０３処理後のＣＤ３４＋細胞死が示された。エピジェネティックな細胞状態を問わず（すなわち、万能性状態か、外胚葉、内胚葉もしくは中胚葉、またはＣＤ３４陽性細胞等の細胞型特異的な状態か）、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化されたＣＡＧは誘導性カスパーゼ９の発現をロバストに維持することを、データは示している。
【０２８１】
実施例８：誘導性カスパーゼ９−ｉＰＳＣクローン由来奇形腫のＡＰ１９０３誘導性退縮のインビボにおける実証
誘導性カスパーゼ９の発現および誘導を介した細胞死をインビボで示すための、ＮＳＧマウス試験における皮下注射の位置を、図７Ａに示した。親ｈｉＰＳＣ株およびＣＡＧ−Ｃ３８クローンを、４Ｅ６細胞で注射し（０日目）、７〜１１日目にＡＰ１９０３（腹腔内、計２００μｇ）で処理した。３４日目に、奇形腫を採取およびイメージングして、サイズを示した（図７Ｂ）。ＣＡＧ−Ｃ３８採取物のうち、１つの注射部位は腫瘍を含有しておらず、その他は大部分脂肪様細胞からなっていた。また、採取された奇形腫を体積測定した（図７Ｃ）。採取された腫瘍の中で、ＣＡＧ−３８  ｈｉＰＳＣを供給源とする奇形腫は、検出されないか、または、それらの親コントロールよりもかなり小さく見えた。採取された奇形腫をヘマトキシリン・エオシン染色した。その染色結果により、親ｉＰＳＣクローンとＣＡＧ−ｈｉＰＳＣクローンとの間の組織像の違いが示される（図７Ｄ）。親ｈｉＰＳＣ株は多数の三胚葉分化細胞型を示したが、ＣＡＧ−Ｃ３８は、おそらくはマウス由来である、大部分が高度に組織化された脂肪様細胞からなっているように見える。次に、親ｈｉＰＳＣ株およびＣＡＧクローンを、４Ｅ６細胞で注射し、４０〜４６日目にＡＰ１９０３（腹腔内、計２００μｇ）で処理した。全ての腫瘍を定期的に体積測定したところ、ＣＡＧ−ｉＰＳＣはＣａｓｐ９遺伝子発現に対しなお応答性であり、選択されたＣＡＧ−ｉＰＳＣクローンのいずれかを注射したマウスでは腫瘍体積の減少が生じた。まとめると、前記データは、インビトロおよびインビボにおける、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化されたＣＡＧプロモーターのロバストな発現を示している。
【０２８２】
実施例９：誘導性カスパーゼ９の標的化挿入またはヌクレアーゼ非依存的挿入にＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９を用いる、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座のゲノム編集
他の標的化戦略とセーフ・ハーバー遺伝子座との相乗作用を調べるため、この実験では、ｉＰＳＣゲノムの異なる内在性遺伝子座を、ＣＡＧプロモーターによって駆動される外来遺伝子のヌクレアーゼ非依存的標的挿入の可能性について調べた。コンストラクトは、図９Ａに示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／カスパーゼ９を有し、ＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とするように設計した。ｈｉＰＳＣに、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に特異的なｇＲＮＡ／カスパーゼ９−ＲＦＰプラスミドおよびＣＡＧ駆動型誘導性カスパーゼ９を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞集団を、細胞内のＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析して、トランスフェクション効率を求めたところ、約８０％〜約８５％であることが示された（図９Ｂ）。ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの３日後に開始し、２０日間継続した後、ピューロマイシン耐性細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーで解析した。ＧＦＰ発現はｉＰＳＣ増殖中に維持された（図９Ｂ）。下記の表２は、図９Ａに示すコンストラクトによる、ｉＰＳＣの発現レベルおよび機能的応答を要約している。
【表３】
2018531612.tif 000004
【０２８３】
表２は、ＣＡＧ駆動型標的化外来遺伝子挿入が、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対してだけでなく、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に対しても適しており、ＺＦＮ戦略およびＣＲＩＳＰＲ戦略の両方によって仲介可能であることを示している。また、ホモロジーアームを利用することで、ヌクレアーゼ非依存的な戦略によりＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とするような、さらなるコンストラクト設計を採用して、戦略の実行可能性を調べた。ヌクレアーゼ非依存的なＲＯＳＡ２６遺伝子座のためのコンストラクトは、ＧＦＰおよび誘導性カスパーゼ９を駆動するＣＡＧプロモーターからなり、一方、ＲＦＰは非特異的な組込みを示す（図９Ｃ）。図９Ｃのコンストラクトをトランスフェクトされピューロマイシンによるセレクションを受けた２９３Ｔ細胞およびｈｉＰＳＣを、標的細胞についてそれぞれ濃縮した（図９Ｄおよび図９Ｅ）。データは、ヌクレアーゼ非依存的戦略が、標的ｈｉＰＳＣを効率的に作製するための現行のプラットフォームにも適用可能であることを示している。
【０２８４】
要約すると、ＣＡＧプロモーターは、標的化戦略、遺伝子座、または種々の分化状態を問わず、ｈｉＰＳＣの長期クローン増殖中、高レベルの誘導性カスパーゼ９発現を維持した。さらに、これらの誘導性カスパーゼ９を組み込まれたクローナルな系統は、ＡＰ１９０３の存在下で急速な細胞死を引き起こし、培養物を二量体化分子の非存在下で回復させた場合、残存する細胞生存は認められなかった。さらに、ｈｉＰＳＣクローンをインビトロで３つの体細胞系に分化させたところ、ＡＰ１９０３誘導性細胞死を十分に受け易いことが分かった。クローンはまた、造血細胞へと特異的に分化させたところ、ＡＰ１９０３処理による細胞死の完全な誘導を示した。ＮＳＧマウスに注射して奇形腫を形成させた場合、同様の細胞死を介した応答がインビボで観察された。ｉＰＳＣにおける無ヌクレアーゼＣＡＧ駆動型標的組込みでも、同様の結果が見られた。すなわち、効率的、正確、且つ持続可能であることに加えて、本明細書にて提供されるＣＡＧ駆動型標的組込み系は、インビトロおよびインビボの両方において、ｉＰＳＣ、増殖したｉＰＳＣ、またはｉＰＳＣ由来分化細胞における自殺遺伝子を介した応答を抑止するであろう、他のプロモーターおよび／またはコンストラクトではしばしば見られるエピジェネティック・ランドスケープの改変を引き起こさないように思われることから、信頼性もある。他の外来遺伝子も、および／または異なる選択された遺伝子座においても、このプラットフォームに適用できる。例えば、ＧＦＰおよび誘導性カスパーゼ９を含有するコンストラクトを作製することに加えて、機能性が異なる遺伝子を前記コンストラクトに組み込むことができる。キメラ抗原受容体または改変Ｔ細胞受容体等の標的化モダリティも、特定の遺伝子座に導入できる。別の実施例では、特定の遺伝子座への種々の遺伝子の標的化を、その時または再プログラム化において、実行できる。前述の通り、ｈｉＰＳＣプラットフォームは、様々な特性を有する個々の細胞を選択することができ、これらの特性は、特定の遺伝子座に導入された所望の遺伝子を含む、再プログラム化が成功したｈｉＰＳＣを含み得る。
【０２８５】
特に、あるｈｉＰＳＣクローンが、ある特定の稀な細胞を含み、誘導性細胞死を回避したことから、このクローンおよびこれらの稀な細胞を特徴付けして、回避の分子機構を評価した。
【０２８６】
実施例１０：回避クローンの特徴付けによる、全ての増殖クローンにおける単一点変異の解明
ＡＰ１９０３処理から生存したクローンのピッキングおよび増殖により、ＡＰ１９０３処理後の生存クローンを見つけるために使用された手順を増進した（図８Ａ）。示されたように、全ての回避クローンは、ジャンクションＰＣＲによって示される正しい標的挿入を有する。配列変異が回避クローンに見られるかどうかを確かめるため、誘導性カスパーゼ９導入遺伝子のＰＣＲ増幅を行った後、精製およびゲノム配列決定を行った（図８Ｂ）。それらの回避クローンの誘導性カスパーゼ９導入遺伝子の配列は、配列決定された全てのクローンにおいて単一点変異Ｋ１８９Ｅを示した（図８Ｃ）。Ｋ１８９Ｅが不応性クローンの直接の原因かどうかを確かめるため、誘導性カスパーゼ９変異型を図２Ｅに従って作製し、トランスフェクションに使用し、得られた標的化ｉＰＳＣ細胞を調べた。図８Ｅは、ＣＡＳ−誘導性カスパーゼ９野生型ｉＰＳＣ細胞との比較において、ＧＦＰを発現するＣＡＳ−誘導性カスパーゼ９変異型ｉＰＳＣ細胞がＡＰ１９０３処理に応答性でないこと、および、全ての細胞が同一の高レベルＧＦＰ発現を伴って処理後に生存したこと、を示している。
【０２８７】
実施例１１：共通単一点変異を含む回避クローンをレスキューするためのアプローチ
上記実施例により、単一の不応性株に由来するインビトロ処理耐性クローンが、全ての試験されたクローンにおいて、誘導性カスパーゼ９に共通の不活性化点変異を含むことが示された。しかしながら、両対立遺伝子誘導性カスパーゼ９挿入を有するｈｉＰＳＣクローンの選別によって、インビトロおよびインビボにおいて、死滅動態が向上し、耐性率が減少した。従って、単一の誘導性安全システム（single inducible safety system）に対して耐性が生じる可能性を避けるため、独自のセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれた誘導性カスパーゼ９および単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼを含む、複数の条件自殺遺伝子を含むｈｉＰＳＣクローンの作製およびセレクションを調査した。インビトロおよびインビボにおいて、二重の安全監視システム（dual safe guard system）を、単一の誘導性カスパーゼ９安全スイッチ（single iCasp9 safety switch）と比較して、移植細胞の安全性および効率的除去を評価した。
【０２８８】
実施例１２：ｈｉＰＳＣにおけるＡＡＶＳ１セーフ・ハーバーへのＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９の標的挿入のコピー数
ＣＡＧプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ９クローンにおける、定量ＰＣＲに基づいた導入遺伝子（誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰ）コピー数の評価により、少数のクローンが２コピー以上の導入遺伝子を有していることが明らかになった。図１０Ａに示されているように、コピー数１は単一対立遺伝子誘導性カスパーゼ９組込みを示唆し、コピー数２は両対立遺伝子誘導性カスパーゼ９組込みを示唆し、他方、２を超えるものはランダムインテグレーションの可能性を示唆する。図１０Ｂに示される、単一対立遺伝子誘導性カスパーゼ９標的挿入または両対立遺伝子誘導性カスパーゼ９標的挿入を有する、選別プール培養物またはクローンにおける、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、導入遺伝子発現レベルがコピー数と対応しており、コピー数が多いほどＭＦＩの読み取り値も高くなることを示している。標的化プール細胞およびクローンにおけるＡＡＶＳ１−導入遺伝子接合部と重なるプライマーを用いた導入遺伝子組込みのＰＣＲ分析により、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰ導入遺伝子のＡＡＶＳ１遺伝子座への特異的組込みが確認された（図１０Ｃ）。ＡＡＶＳ１組込み部位に特異的なプライマーを用いて、標的組込みを有する対立遺伝子の数を調べた。バンドが無いのは、両ＡＡＶＳ１対立遺伝子における組込み部位が破壊されていたこと、すなわち両対立遺伝子挿入、を示唆しており、一方、バンドが在るのは、一方または両方の対立遺伝子が破壊されていないことを示唆している（図１０Ｄ）。図１０Ｃおよび図１０Ｄによって示されるように、ＣＡＧ−Ｃ５クローンおよびＣＡＧ−Ｃ３５クローンは、２コピーの導入遺伝子の両対立遺伝子挿入を有し、一方、ＣＡＧ−Ｃ３８クローンは、１つの対立遺伝子の標的位置に挿入された１つのコピーを有する。生細胞イメージングを用いて、１０ｎＭ  ＡＰ１９０３を添加した直後にプレート表面被覆率を評価した。図１０Ｅに示されるように、未選別標的化プール細胞（組込まれた、および、組み込まれていない）は最も小さい誘導性死滅能を有し、一方、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰについて選別された標的化プール細胞（標的化されたランダムな組込み、コピー数が一様でない）は、わずかにより良い誘導性死滅能を示した。クローナルなＣＡＧ−Ｃ３８細胞株（単一対立遺伝子標的挿入）およびＣＡＧ−Ｃ５細胞株（両対立遺伝子標的挿入）は、プール細胞と比較した場合、かなりより高い死滅速度および死滅効率を有する。
【０２８９】
実施例１３：インビボにおける、移植された両対立遺伝子誘導性カスパーゼ９クローンおよび単一対立遺伝子誘導性カスパーゼ９クローンの、誘導性死滅および奇形腫退縮の比較
皮下位置注射を伴うＮＳＧマウス試験は、図１１Ａにおいて、ＣＡＧ−Ｃ３８クローン、ＣＡＧ−プール、ＰＧＫ−プール（ＰＧＫ−誘導性カスパーゼ９導入遺伝子）、ＵＢＣ−プール（ＵＢＣ−誘導性カスパーゼ９導入遺伝子）およびＣＭＶ−プール（ＣＭＶ−誘導性カスパーゼ９導入遺伝子）における誘導性カスパーゼ９の発現および誘導を介したインビボ細胞死を示すことが示された。ＣＡＧ−Ｃ３８クローンおよびプールを、３つのＮＳＧマウス群（ｎ＝２）に、４Ｅ６細胞で０日目に注射し、１９〜２５日目にＡＰ１９０３（腹腔内１２５μｇ）でマウスを処置した。２８日目に、奇形腫を採取およびイメージングして、サイズを示した。ＡＰ１９０３投与前（図１１Ｂ、上段パネル）およびＡＰ１９０３投与終了の３日後（図１１Ｂ、下段パネル）の、３つのＮＳＧマウス群の生物発光画像法により、外来性ＣＡＧプロモーターのみが、樹立ｉＰＳＣ由来奇形腫の誘導性カスパーゼ９介在性除去を可能にしたことが示された。この知見は図１１Ｃ〜図１１Ｇにおいてさらに示された。発光量（光子／秒）は、図１１Ｂにおける奇形腫サイズの知見で確認された、図１１Ｃにおいて平均値およびＳＤとして示される、表示される細胞型由来の奇形腫中の腫瘍細胞量を示す。表示される細胞型についての、処置前の発光量（平均値±ＳＤ）に対する処置後の発光量の比を、図１１Ｄに示した。クローナルなＣＡＧ−Ｃ３８およびＣＡＧプール細胞を注射されたマウスについての両方の結果を、より高い解像度で、図１１Ｅに別にプロットした。２８日目の表示される細胞型に由来する奇形腫の末期体積測定値を、図１１Ｆに示した。図１１Ｇは、２８日目の、表示される細胞型に由来する奇形腫の画像を示している。ＣＡＧ−Ｃ３８クローンまたはＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９プール細胞を注射された側からは、奇形腫は検出されなかった。まとめると、これらのデータによって、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰ導入遺伝子の発現を駆動する様々なプロモーターのインビトロ研究が確認され、インビトロおよびインビボにおいて、試験されたものの中でＣＡＧプロモーターが最も有効であることが示された。これらデータはまた、ＣＡＧ−Ｃ３８クローンが、誘導性カスパーゼ９−ＧＦＰが単一対立遺伝子性であるのにもかかわらず、自殺遺伝子誘導後の奇形腫除去において、ＣＡＧプール細胞よりも有効であることを示している。
【０２９０】
さらに、移植された両対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンの誘導性死滅を試験し、単一対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンの誘導性死滅と比較した。皮下位置注射を伴うＮＳＧマウス試験は、図１２Ａにおいて、親細胞、ＣＡＧ−Ｃ５クローン、およびＣＡＧ−Ｃ３８クローンにおける誘導性カスパーゼ９の発現および誘導を介したインビボ細胞死を示すことが示された。それぞれの細胞型を、４つのＮＳＧマウス群（ｎ＝２）に０日目に注射し、７〜１３日目にＡＰ１９０３（腹腔内１２５μｇ）でマウスを処置した。７日目、１４日目、および４２日目に、奇形腫をイメージングした。４２日目に、奇形腫を採取およびイメージングして、サイズを示した。
【０２９１】
ｉＰＳＣ移植後７日目、１４日目および４２日目の、表示される細胞型（両対立遺伝子性ＣＡＧ−Ｃ５クローン、単一対立遺伝子性ＣＡＧ−Ｃ３８クローンおよび親ｉＰＳＣ）を移植されたＮＳＧマウスの生物発光画像法（図１２Ｂ）。７日目のイメージングはＡＰ１９０３投与（腹腔内１２５μｇ；７〜１３日目）の直前に行った。中段のパネルは、１４日目の、存在した場合の、採取された奇形腫の画像を示しており、下段のパネルは、４２日目の、存在した場合の、採取された奇形腫の画像を示している。示されているように、ＣＡＧ−Ｃ５およびＣＡＧ−Ｃ３８の両方が、全ての試験されたマウスにおいて、１４日目に奇形腫を除去可能である。しかし、奇形腫は４２日目までにＣＡＧ−Ｃ３８を移植されたマウスにおいて退行し、一方、ＡＧ−Ｃ５を移植されたマウスにおける除去された奇形腫は再成長しなかった。図１２Ｃは、４２日目の、表示される細胞型に由来する奇形腫の画像を示している。図１２Ｂおよび図１２Ｃにおける画像データで確認された、図１２Ｄにおいて平均値およびＳＤとして示される、表示される群由来の奇形腫の発光量（光子／秒）。まとめると、これらのデータにより、単一対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンの誘導性死滅と比較した場合の、移植された両対立遺伝子性誘導性カスパーゼ９クローンのより有効な誘導性死滅が示された。
【０２９２】
実施例１４：別々のセーフ・ハーバー遺伝子座に標的化された二重の自殺遺伝子による安全監視システムの作製
単一細胞レベルでの高分解度精密改変の性能および有効性を示すために、別々のセーフ・ハーバー遺伝子座に標的化された二重自殺遺伝子による安全監視システムを有するクローンｉＰＳＣを作製した。本明細書に記載の標的挿入法を用いて、ＣＡＧ−Ｃ３８クローンｉＰＳＣにおいて、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれたＣＡＧ−誘導性カスパーゼ９に加えて、ＣＡＧ−ｓｒ３９ＴＫをＨ１１セーフ・ハーバーに組み込んだ。図１３Ａに示されるように、ＰＣＲ分析により、ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして用い、ｓｒ３９ＴＫ、ｓｒ３９ＴＫ−ブラストサイジン（Ｂｓｄ）接合部または内在性Ｈ１１配列−導入遺伝子接合部に特異的なプライマーを用いて、Ｈ１１セーフ・ハーバー遺伝子座へのｓｒ３９ＴＫの特異的なゲノム組込みを確認した。Ｈ１１遺伝子座にｓｒ３９ＴＫの標的挿入を有する誘導性カスパーゼ９  ｉＰＳＣクローン（ｓｒ３９ＴＫについてクローナルではない）を、最初の２日間の１０ｎＭ  ＡＰ１９０３処理有りまたは無しで、２５μｇ／ｍＬガンシクロビル（ＧＣＶ）で９日間処理した。ＡＰ１９０３単独での２日間のＣＡＧ−Ｃ３８  誘導性カスパーゼ９クローン（誘導性カスパーゼ９について単一対立遺伝子性）の処理は、ほとんどの細胞の誘導性死滅をもたらしたが、わずかに細胞が残った（図１３Ｂ（ｉｉ））。ＧＣＶ処理単独での９日間のＣＡＧ−Ｃ３８  誘導性カスパーゼ９クローンの処理は、ＧＣＶ不応性細胞の増殖をもたらした（図１３Ｂ（ｉｉｉ））。しかし、ＡＰ１９０３およびＧＣＶの両方による併用処理、全ての不応性細胞が効果的に除去され、このことは、二重の自殺安全監視システムの使用が、いずれかの誘導性自殺遺伝子下で回避した残留細胞を死滅させることにより、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子単独の使用よりも効果的であることを示している。
【０２９３】
また、本明細書において、目的遺伝子の制御可能な発現のための、セーフ・ハーバー遺伝子座に誘導性カセットを含むｉＰＳＣの設計が提供される。誘導性カセットの遺伝子座特異的挿入はｉＰＳＣレベルで起こる。目的遺伝子（ここではＣＡＲが一例として示される）の発現は、２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた翻訳終止コドンによって不活性化される。Ｃｒｅリコンビナーゼ（図３３Ａ）またはドキシサイクリン（図３３Ｂ）による単回誘導の後、終止コドンが結果として除去され、ＣＡＲ発現が活性化される。前記誘導物質は、エキソビボｉＰＳＣ分化中のあらゆる選択された段階で投与可能であり、分化手順の最適化を促す。ＣＡＲは、強力な構成的プロモーターによって高レベルに駆動され、ｉＴまたはｉＮＫ等の、最終産物での発現を持続する。
【０２９４】
ｈｉＰＳＣ集団において、遺伝子特異的破壊に最適な遺伝子座を唯一標的としながら、新たな目的遺伝子を同時に挿入し、その後、ハイスループットに単一細胞に選別して、挿入された遺伝子のただ１つのコピー数、標的遺伝子の機能的破壊、および非特異的な作用が無いこと、を含む全ての要求基準を有するｈｉＰＳＣクローンを選択するための、新規戦略も開発された。図３４Ａは、マイナス鎖およびプラス鎖指向性ヌクレアーゼ結合を含有する標的ベクター、並びに、破壊用の遺伝子の一例であるＢ２Ｍ、および破壊された遺伝子座における挿入のための目的遺伝子（例えば、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＧおよびＰＤＬ１）に対するホモロジーアームを含有するドナーベクター、のコンストラクト設計を示している。図３４Ｂは、最適な遺伝子座に最適な遺伝子を含有するクローン集団に対する遺伝子編集後のｈｉＰＳＣセレクションの一例を示している。
【０２９５】
実施例１５：Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（Ｂ２Ｍ−／−）ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣおよびその改変物の作製
ＨＬＡ複合体改変を達成するための、単一細胞遺伝子編集の実行可能性を示すために、野生型カスパーゼ９と比較して非特異的な作用が少なくなるように改変された、カスパーゼ９ニッカーゼを発現するプラスミドにおけるＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ対をｉＰＳＣ株にトランスフェクトした。図１４Ａにより、トランスフェクション前（左パネル）およびトランスフェクション後（中央パネル）のＧＦＰ発現およびＢ２Ｍ／ＨＬＡ−Ｉ発現のフローサイトメトリー解析が示された。同じ色素に結合させた、Ｂ２Ｍ特異的抗体およびＨＬＡ−Ｉ特異的抗体を用いて、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｉを同時に検出した。Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｉの両方について陰性の細胞（囲われた集団）を、バルク選別（図１４Ａ）または９６ウェルプレート内でクローナルに選別して、クローナルな株を作製した（図１４Ｂ）。標的編集を用いたＢ２Ｍ−／−且つＨＬＡ−Ｉ欠損クローンを、クローンゲノムＤＮＡ塩基配列決定法によってさらに解析し、Ｂ２Ｍノックアウト表現型をもたらす小さな欠失または挿入を有することを確かめた。
【０２９６】
ＨＬＡクラスＩ欠損ｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−ｉＰＳＣ、別名ＨＬＡ−ＩヌルｉＰＳＣ）を、次に、ＨＬＡ−Ｉ欠損細胞をさらに改変することを目的として、例えば、レンチウイルスを用いてＨＬＡ−Ｅ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質を導入することにより、遺伝子改変した。改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ｉＰＳＣ）の品質（すなわち、万能性状態）を、万能性マーカーであるＴＲＡ−１８１およびＳＳＥＡ４、並びにＨＬＡ−Ｅの発現について、フローサイトメトリーで評価した。図１６Ａは、改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣが細胞表面上にＨＬＡ−Ｅを発現しており、万能性表現型を維持していることを示している。ＨＬＡ−Ｅ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質を発現するヌクレオチドがＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣに組み込まれた場合も、レンチウイルス形質導入から得られた結果との比較において、同様の結果が見られた。
【０２９７】
次に、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ｉＰＳＣを、ＰＤＬ１タンパク質を含有するように遺伝子改変して、改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ＰＤＬ１  ｉＰＳＣ）を作製した。加えて、Ｂ２Ｍ−／−ｉＰＳＣを、ＨＬＡ−Ｇ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質を含有するように遺伝子改変し、その後に、ＰＤＬ１タンパク質を含有するように遺伝子改変して、別のＨＬＡ−Ｉ改変Ｂ２ＭヌルｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｇ  ＰＤＬ１  ｉＰＳＣ）を作製した。図２１Ａは、改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの細胞表面上のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＧおよびＰＤＬ１の発現を示している。ＨＬＡ−Ｇ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質を発現するヌクレオチドがＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣに組み込まれた場合も、同様の結果が見られた。
【０２９８】
改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣが血球分化能を維持するかどうかを確かめるため、本明細書で使用されるｉＣＤ３４分化プロトコルを用いて、様々な改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ／ＰＤＬ１、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−ＧおよびＢ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｇ／ＰＤＬ１）をそれぞれＣＤ３４＋ＨＥに分化させた。図２１Ｂは、全ての改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣが、分化の１０日後のフローサイトメトリーによって分かる通り、ＣＤ３４＋ＨＥに分化可能であることを示している。ＣＤ３４＋細胞を単離し、ｉＮＫまたはｉＴリンパ系分化培養液に播種した。図２２は、遺伝子改変免疫抵抗性モダリティ（例えば、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＧまたはＰＤＬ１）を介したＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの改変が、フローサイトメトリーによって分かる通り、ｉＣＤ３４細胞の、さらなる１０日間の分化後にプロＮＫ細胞（ＮＫ前駆細胞；ＣＤ４５＋ＣＤ５６）およびプロＴ細胞（Ｔ細胞前駆細胞；ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋）を生じる能力を撹乱しないことを示している。ＰＤＬ１融合タンパク質を発現するヌクレオチドがＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣに組み込まれた場合も、同様の結果が見られた。
【０２９９】
遺伝子改変免疫抵抗性タンパク質の発現が血球分化中に維持されるかどうかを確かめるために、改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ＣＤ３４＋細胞から２０日間分化させたｉＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって、細胞表面上のＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＧおよびＰＤＬ１の発現について評価した。図２３Ａは、ＰＤＬ１発現が維持されている間、ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質が存在しないことを示している。ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質が血球分化中に細胞表面から切断されるかどうかを確かめるため、２０日目のｉＮＫ細胞および２０日目の培地上清から得られたタンパク質可溶化液を、ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現について、ウエスタンブロット解析で調べた。図２３Ｂは、ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質が上清画分中に存在することを示しており、故に、ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質がｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面から分断されると結論付けられる。
【０３００】
改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣ由来リンパ系エフェクター細胞の増強された残留性を維持するために、ＨＬＡ−Ｅ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質およびＨＬＡ−Ｇ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質の切断耐性型を設計し（図２４Ａ）、Ｂ２Ｍ−／−ｉＰＳＣを、切断不可なＨＬＡ−Ｇ／ＨＬＡ−Ａ３融合タンパク質を含有するように遺伝子改変した。図２４Ｂは、ＨＬＡ−Ｇ／ＨＬＡ−Ａ３切断不可タンパク質が細胞表面上に発現されていることを、ＨＬＡ−Ｇの発現についてのフローサイトメトリーにより示しており、さらに、万能性タンパク質（ＴＲＡ−１８１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４）の発現によって分かる通り、前記タンパク質がｉＰＳＣの品質に影響を与えていないことを示している。
【０３０１】
ＨＬＡクラスＩ欠損ｉＰＳＣを作製するための別の方法は、ＨＬＡクラスＩ分子上へのペプチドの積載に関与している、ペプチドローディング複合体（peptide loading complex）（ＰＬＣ）を破壊することである。抗原ペプチド輸送体（transporter associated with antigen processing）（ＴＡＰ）は、ＰＬＣの不可欠なメンバーであり、その遺伝子の破壊は、細胞表面上の安定なＨＬＡクラスＩ分子の著しい減少をもたらす。しかしながら、ＴＡＰ２ｎｕｌｌ（ＴＡＰ２−／−）ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣがｉＰＳＣの分化能または残留性に影響を与えるかどうかは分かっていない。ＴＡＰ２ｎｕｌｌｉＰＳＣ株を作製するため、ＦＴｉ１２１  ｉＰＳＣに、カスパーゼ９ニッカーゼを発現するプラスミド中のＴＡＰ２  ｇＲＮＡ対をトランスフェクトした。ＨＬＡ−Ｉ陰性／低発現細胞を、９６ウェルプレートにクローナルに選別し、クローナルな株を作製した。図２５Ａは、親ＦＴｉ１２１と比較して、ＨＬＡクラスＩ発現において著しい減少を示す２つの選択されたクローンのフローサイトメトリー解析を示している。ＩＦＮγによるｉＰＳＣの処理は、表面上のＨＬＡクラスＩ分子の発現上昇を誘導する。図２５Ｂは、ＩＦＮγ処理の後、ＴＡＰ２−／−クローンが、野生型ＦＴｉ１２１と比較して、ＨＬＡクラスＩの発現の減少を示したことを示しており、これは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方による検出から逃れるための、ＨＬＡ複合体発現の最適レベルを特定するための、ユニークな戦略を示唆している。
【０３０２】
実施例１６：Ｂ２Ｍ−／−且つＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣは向上した残留性を有する
ＨＬＡ−Ｉの不在が、Ｂ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣがＴリンパ系応答から逃れることを可能にするかどうかを確かめるため、末梢血Ｔ細胞を、ｈｉＰＳＣと一緒に１０日間共培養することにより予備刺激した。１０日後、増殖し予備刺激されたＴ細胞を回収し、細胞傷害性エフェクター細胞として使用した。野生型ｈｉＰＳＣ（ＷＴ）またはＢ２Ｍ−／−（改変型）ｈｉＰＳＣ標的細胞を、単独で、または予備刺激されたＴ細胞との１：３の比の共培養系として、播種した。ウェル当たりの標的細胞の数を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍを用いて５日間に亘って測定した。図１５Ａに示されるように、ＷＴ  ｈｉＰＳＣ標的細胞は予備刺激されたＴ細胞によって認識および死滅されたが、一方、改変ｈｉＰＳＣは影響を受けなかった。
【０３０３】
Ｂ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣがＴ細胞による認識および殺滅を回避可能であることが示されたが、ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩを欠く細胞（この場合、細胞はＢ２Ｍを欠いている）によって活性化されることが知られているため、これらの細胞がＮＫ細胞によってより効率的に死滅されるかもしれず、もしそうであるならば、インビボにおける拒絶の一因となり得る、という懸念があった。Ｂ２ｍ−／−ｈｉＰＳＣの、ＮＫ細胞による認識が増加するかどうかを調べるため、Ｋ５６２細胞、野生型ｉＰＳＣ（ＷＴ）から分化したＣＤ４５＋細胞、またはＢ２Ｍ−／−ｉＰＳＣ（Ｂ２Ｍ−／−）から分化したＣＤ４５＋細胞を、それぞれＣＦＳＥ、ｅ６７０増殖色素（イー・バイオサイエンス社（eBioscience））、またはｅ４５０増殖色素（イー・バイオサイエンス社）で、別々に標識した。３つ全ての標識標的細胞を等比で混合し、単一ウェル内のＮＫ細胞エフェクターに表示される比で加えた（図１５Ｂ）。あるいは、３つの標識標的細胞を、それぞれ別々のウェル内で、ＮＫ細胞エフェクターにそれぞれ加えた（図１５Ｃ）。細胞を４時間インキュベートし、その後、フローサイトメトリーに基づく細胞傷害活性の定量化を行った。図１５Ｂおよび図１５Ｃに示されるように、陽性対照として含まれる公知のＮＫ細胞の標的であるＫ５６２細胞の死滅と比較して、Ｂ２Ｍ−／−細胞およびＷＴ  ｈｉＰＳＣ  ＣＤ４５＋細胞の両方が同じ割合で死滅しており、且つ、両方とも比較的低いレベルであり、インビトロにおいてＮＫ細胞認識は増加しなかったと思われる。すなわち、このデータにより、このＢ２Ｍ−／−ｉＰＳＣ株がＮＫ細胞認識を低減させることなくＴ細胞介在性死滅を回避できることが示差され、これは、残留性が向上した普遍的にドナー／レシピエント適合性のｈｉＰＳＣクローン株を示している。
【０３０４】
普遍的Ｂ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣクローン株の残留性の向上をインビボでさらに評価した。インビボの応答性の免疫系の存在下で、ＨＬＡ−Ａの不在が残留性を増加させるかどうかを確かめるため、ルシフェラーゼを導入した（luciferized）ＷＴ  ｈｉＰＳＣ（ＷＴ）およびＢ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣ（改変型）を、免疫無防備状態のＮＳＧレシピエントマウス（図１５Ｄ左）または免疫応答性のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウス（図１５Ｄ右）の皮下且つ両側に注射して、奇形腫を形成させた。９６時間後、これらのマウスに対し生物発光ＩＶＩＳイメージングを行って、奇形腫を検出した。ＮＳＧレシピエントではＷＴ奇形腫および改変型奇形腫の両方が等しい強度で検出され、一方、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは改変型Ｂ２Ｍ−／−ｈｉＰＳＣがＷＴ  ｈｉＰＳＣとの比較において残留性の増加を示した。
【０３０５】
実施例１７：ｉＰＳＣ上のＨＬＡクラスＩの調節はインビボにおいてｉＰＳＣの残留性を増加させる
改変型ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣがインビボにおいて増加された残留性を有するかどうかを確かめるため、ルシフェラーゼを導入した野生型ｉＰＳＣおよびＢ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ｉＰＳＣを、奇形腫アッセイにおける十分に免疫応答性のＣ５７ＢＬ／６レシピエントの対立する側腹部に皮下注射した。マウスを毎日、ルシフェリン注射と併せたＩＶＩＳイメージングで分析し、発達してゆく奇形腫を可視化した。図１６Ｂには、注射後７２〜１４４時間の時点で、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ｉＰＳＣは野生型ｉＰＳＣと比較して約６倍の量的残留性の増加を示すことが示されている。また、Ｂ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｅ  ｉＰＳＣ奇形腫を有する、増強されたルシフェリンイメージングを示す３匹の代表的なマウスを図１６Ｂに示した。ＨＬＡ−Ｅの代わりにＨＬＡ−Ｇを使用した場合も同様の残留性向上が観察された。加えて、上記のように、切断を回避するための改変型のＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇを適用することで、ＨＬＡクラスＩ改変ｉＰＳＣのインビボ残留性はさらに増強される。興味深いことに、ＣＭＶ＋ドナーから得られたＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現を示す、すなわち活性型である、いくつかのシナリオの中で、ＨＬＡ−Ｅ細胞表面発現がＮＫＧ２Ｃをむしろ活性化し、そうすることで、ＮＫ細胞認識およびその結果起るＨＬＡ−Ｅ発現細胞の死滅を含む有害作用をもたらすことが認められた。ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａを発現する場合とは対照的に、これらのＮＫ細胞はＨＬＡ−Ｅを表面に発現するｉＰＳＣおよび分化した子孫によって不活性化されることがあり、それによって、これらのＨＬＡ−Ｅ表面発現細胞の残留性が増強される。
【０３０６】
宿主免疫応答のどの成分が野生型レシピエントマウスにおける強化された改変ＨＬＡ−Ｉ欠損ｉＰＳＣの拒絶に関与しているかを確かめるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、それぞれ抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８ａ抗体および抗ＮＫ１．１抗体の注射により各々枯渇させた。図２６Ａは、抗体注射の３日後のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の不在を示している。抗体を介した枯渇の３日後、ルシフェラーゼを導入したＢ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｉ改変ｉＰＳＣを、免疫応答性のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射し、奇形腫を形成させた。マウスを毎日、ルシフェリン注射と併せたＩＶＩＳイメージングで分析し、発達してゆく奇形腫を可視化した。図２６Ｂは、ｉＰＳＣ注射後１２０時間の時点で、ＩｇＧコントロール処置動物との比較において、ＮＫ細胞を枯渇されたマウスが腫瘍拒絶への最も高い耐性を示したことを示している。
【０３０７】
インビトロにおいて遺伝子改変ＨＬＡ−Ｉ改変ｉＰＳＣが増加された残留性および耐性を有するかどうかを確かめるため、Ｂ２Ｍ−／−ＰＤＬ１  ＨＬＡ−Ｉ改変ｉＰＳＣを３日間懸濁培養し、その後ＩＦＮγで２４時間処理してＨＬＡクラスＩの発現を誘導した。処理されたｉＰＳＣを次に、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で事前に標識された、同種他家由来の精製されたＴ細胞（図２７Ａ）、全末梢血単核球（ＰＢＭＣ、図２７Ｂおよび図２７Ｃ）中に含有される同種他家由来のＴ細胞およびＮＫ細胞と共培養で播種して、細胞増殖をモニターした。Ｔ細胞／ＰＢＭＣ単独（非刺激）、並びに、活性化および増殖を誘導するために抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激したＴ細胞／ＰＢＭＣ（刺激）を、コントロールとして使用した。共培養の開始から１２日後、細胞のフローサイトメトリー評価により、ＨＬＡ−Ｉ改変ｉＰＳＣ由来細胞を認識しそれに応答する能力の指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖量を求めた。図２７Ａおよび図２７Ｂは、野生型ｉＰＳＣ由来細胞と共培養されたＴ細胞との比較において、Ｂ２Ｍ−／−、およびさらにＢ２Ｍ−／−ＨＬＡ−Ｉ−改変ｉＰＳＣ由来細胞と共培養されたＴ細胞が、ＣＴＶ増殖色素の希釈によって示されるように、より少ない増殖を示したことを示している。図２７Ｃは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する免疫耐性を増強するＨＬＡクラスＩ改変体の能力をまとめて増強するする、ＮＫ細胞増殖に対する同様の作用を示している。
【０３０８】
実施例１８：編集追加による特性が増強されたｉＰＳＣの作製
現行の分化プラットフォームを介して得られた誘導リンパ球を用いる免疫療法で望ましい特性を増強するために、ｉＰＳＣレベルで改変または調節された分子が使用され得る。これらの分子には、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補；または、ｉＰＳＣもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、免疫応答の制御および調節、並びに／もしくは生存を促進するタンパク質が包含され得る。Ｂ２Ｍ／ＨＬＡ−ＩおよびＨＬＡ−Ｅ／Ｇに加えて、所望の特性に寄与する標的分子として、ＣＤ１６受容体および４１ＢＢＬ副刺激分子、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子、エンゲージャー、並びに二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーを結合するための表面上誘発受容体がさらに包含されるが、これらに限定されない。より具体的には、ｉＰＳＣにおける標的分子の遺伝子改変は、以下のうちの一つまたは複数を包含する：Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域内のあらゆる遺伝子の発現の欠失または減少；ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＡＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、または二重特異性もしくは多重特異性もしくは普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体の導入または発現増加。標的分子の発現の増加または減少は、永続的でも、一過的でも、時間的でも、または誘導性であってもよく、内在性プロモーターに制御されるものでも、または外来性プロモーターに制御されるものでもよい。
【０３０９】
これらの所望のモダリティーは当該技術分野において公知の様々な送達法を用いてｉＰＳＣに導入され得る。この典型的な例として、ｉＰＳＣを、高親和性切断不可ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）および４１ＢＢＬ共起刺激分子を含有するように遺伝子改変して、細胞毒性が増強されたｉＰＳＣを作製した。図１７Ａは、フローサイトメトリー解析による、レンチウイルス形質導入後のｉＰＳＣ表面上のｈｎＣＤ１６および４１ＢＢＬの効率的な発現を示している。図１７Ｂは、１０日間の分化の後に、ｈｎＣＤ１６および４１ＢＢＬの発現が、維持され、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞を生じるｉＰＳＣの能力を撹乱しないことを示している。
【０３１０】
ｈｎＣＤ１６（高親和性切断不可ＣＤ１６受容体）タンパク質の発現が改変ｉＰＳＣの血球分化に影響を与えるかどうかを評価するため、ｈｎＣＤ１６／４１ＢＢＬ遺伝子改変ｉＰＳＣのプールを９６ウェルプレートにクローナルに選別した。３種の陽性クローンを選択し、１０日間分化させてｉＣＤ３４＋細胞を生じさせた。図２８Ａは、フローサイトメトリーで示された、ＣＤ３４＋ＨＥ上のｈｎＣＤ１６および４１ＢＢＬの均質な（homogenous）発現を示している。ＣＤ３４＋細胞を単離し、ＮＫ促進条件（NK promoting condition）下でさらに１０日間分化させて、プロＮＫ細胞を生じさせた。図２８Ａは、ＣＤ５６＋ＮＫ前駆細胞が高レベルのｈｎＣＤ１６タンパク質発現を維持していることを示しており、ｈｎＣＤ１６および４１ＢＢＬの発現が改変ｉＰＳＣの血球分化能を撹乱しないことを示している。
【０３１１】
ＮＫ細胞によって発現される内在性ＣＤ１６受容体は、ＮＫ細胞の活性化後に細胞表面から切断される。ｈｎＣＤ１６改変タンパク質が切断されないことを確かめるため、ｈｎＣＤ１６を発現するｉＮＫ細胞および末梢血（ＰＢ）由来ＮＫ細胞を、以下の条件で培養した：１）恒常的培養（homeostatic culture）下、２）ＣＤ１６切断を抑制するＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ阻害剤の存在下もしくは存在下での恒常的培養下、または、３）ＮＫ細胞の活性化およびその後のＣＤ１６分断を促進するためのＫ５６２標的細胞による刺激下。刺激無しのＰＢ由来ＮＫ細胞およびｉＮＫ細胞は恒常性調節を示す。図２８Ｂは、ＰＢ由来ＮＫ細胞の恒常的培養中のＣＤ１６発現の消失がＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ阻害剤によって低減または阻害されること、および、Ｋ５６２標的細胞との共培養後、ＣＤ１６発現の消失が増強されること、を示している。対照的に、ｈｎＣＤ１６改変ｉＮＫ上のＣＤ１６の発現は、Ｋ５６２標的細胞によるｉＮＫ細胞活性化の後も一定のままであり、これにより、切断不可な高親和性ＣＤ１６受容体の完全性が確認される。
【０３１２】
ｈｎＣＤ１６受容体の増強された機能性を評価するため、ｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞を、未刺激のままにするか、または、５ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ１６で刺激するか、または、１：１比のＰ８１５細胞で、単独でもしくは５ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ１６と組み合わせて刺激した。ｉＮＫ細胞を、ＮＫ細胞活性化の特徴である炎症誘発性サイトカイン放出および脱顆粒について、フローサイトメトリーで評価した。図２９Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ３−画分にゲートをかけたｉＮＫ細胞を示しており、ＩＦＮ□、ＴＮＦ□、およびＣＤ１０７ａの細胞表面発現を示している。ｈｎＣＤ１６を発現するｉＮＫ細胞は抗ＣＤ１６抗体に応答してＴＮＦαおよびＣＤ１０７ａが発現増加されており、これは、Ｐ８１５細胞および抗ＣＤ１６との共培養によってさらに増強可能である。これらのデータにより、ｈｎＣＤ１６受容体がｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞上で機能的であることが示された。
【０３１３】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体で被覆された標的細胞へのＣＤ１６の結合を通じた、ＮＫ細胞によって媒介される性溶機構である。ＡＤＣＣ機能を評価するため、ｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞を、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｄで標識されたＳＫＯＶ標的細胞と、ハーセプチン抗体を加えてまたは加えずに、１２０時間共培養した。標的細胞の定量化を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  ＺＯＯＭ細胞解析システム（エッセン・バイオサイエンス社（Essen BioScience）、ミシガン州アナーバー）で、２時間毎に解析した。図２９Ｂは、ｈｎＣＤ１６を発現するｉＮＫ細胞が、ハーセプチン抗体存在下で強力なＡＤＣＣを有することを示しており、これは、改変ｉＮＫ細胞の増強された機能性にさらなる証拠を与える。
【０３１４】
さらに、ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞の質を評価するため、以下の増殖促進条件下で、培養物を播種した。ＣＤ３４＋細胞からのｉＮＫ分化の１８日目に、ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ５６＋（約６６％）が得られた。細胞（２．５×１０＾５／ｍＬ）を、毎週、同数の被照射Ｋ５６２／ｍｂＩＬ−２１／４１ＢＢＬフィーダーと、２５０Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２と一緒に、培養した。各回のフィーダー追加の後、３日目に新鮮な培地（Ｂ０）＋ＩＬ−２を加えた。５日目に細胞を２．５×１０＾５／ｍＬに希釈し、新鮮培地およびＩＬ−２（２５０Ｕ／ｍＬ）を加えた。細胞計数およびフローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞の増殖倍率を求めた。図３０は、ｉＮＫ細胞が１５日間の増殖中に４９５倍の増殖を起こすことを示している。
【０３１５】
適宜、ｉＰＳＣは、ヌルまたは低発現のＢ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅ／Ｇ、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ヌルまたは低発現のＬＡＧ３、ヌルまたは低発現のＴＩＭ３、ヌルまたは低発現のＴＡＰ１、ヌルまたは低発現のＴＡＰ２、ヌルまたは低発現のタパシン、ヌルまたは低発現のＮＬＲＣ５、ヌルまたは低発現のＰＤ１、ヌルまたは低発現のＲＦＫＡＮＫ、ヌルまたは低発現のＣＩＩＴＡ、ヌルまたは低発現のＲＦＸ５およびヌルまたは低発現のＲＦＸＡＰのうちの一つまたは複数を含むように作製される。改変ＨＬＡクラスＩおよび／または改変ＨＬＡクラスＩＩを有するこれらの細胞は、免疫検出に対する耐性が増加していることから、インビボ残留性の向上を示す。さらに、そのような細胞は、養子細胞療法におけるＨＬＡ適合要求を回避可能であることから、普遍的な、既製の治療用投与計画の源を与える。
【０３１６】
免疫エフェクター能を向上させる、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、およびＴＣＲ、のうちの一つまたは複数を含むｉＰＳＣも作製される。
【０３１７】
実施例１９：ＣＡＲ−Ｔ由来ｉＰＳＣはＣＡＲを保持する
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、特異性をＴ細胞またはＮＫ細胞等の免疫エフェクター細胞上に向ける働きをする、改変された膜貫通受容体である。ＣＡＲは、典型的には、抗原認識を与えるためのモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、および免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを与えるための細胞内シグナル伝達ドメインの組み合わせからなる融合タンパク質である。ＣＡＲ−免疫エフェクター細胞は、あらゆる腫瘍関連抗原を認識するように改変可能であり、それ故、ＨＬＡ適合の必要なく、改変された免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞のみに標的化可能であることから、ＣＡＲには強力な普遍的がん免疫療法として大いなる可能性がある。
【０３１８】
供給源細胞の同一の遺伝的インプリント、すなわち同一のキメラ抗原受容体、を保持するｉＰＳＣへのＣＡＲ−Ｔ細胞の再プログラム化を示した（図１８）。ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲの共通識別子としての切断型ＬＮＧＦＲ細胞表面マーカーを発現するよう遺伝子改変されたｉＰＳＣは、ｉＣＤ３４細胞への分化を通じて発現を保持する（図１８）。
【０３１９】
また、内在性ＴＣＲ遺伝子座にＣＡＲを含むｉＰＳＣも本明細書で提供される。Ｔ細胞のレベルにおいて遺伝子座に特異的なＣＡＲ挿入を達成し、後にそれを、ＣＡＲの標的挿入を含むｉＰＳＣに再プログラム化した。あるいは、ＣＡＲの遺伝子座特異的挿入はｉＰＳＣレベルで起こり得る。発現性のＴＣＲ遺伝子座はただ１つであるため、発現性のＣＡＲ挿入のコピー数は遺伝子座特異的挿入を通じた制御下にある。さらに、ＣＡＲはＴＣＲの定常領域内に挿入される。ＴＣＲ定常領域の切断はＴＣＲノックアウトをもたらし、これにより、細胞療法におけるＨＬＡ適合要求が排除される。さらに、ＣＡＲ発現はＴＣＲ内在性プロモーターによる制御を受けるため、ＴＣＲと同レベルで、且つＴＣＲと同じ発生段階に存在する。内在性ＴＣＲを模倣する制御されたＣＡＲ発現は、ｉＰＳＣ分化の過程において分化能が影響を受ける可能性を避ける。図２０は、親株におけるＴＣＲ発現と比較して同等レベルでのＣＡＲの発現、並びに、改変された細胞株におけるＴＣＲの発現および機能の両方の除去を示している。改変されたＴ細胞を次に、内在性ＴＣＲ遺伝子座にＣＡＲを含むｉＰＳＣに再プログラム化する。
【０３２０】
加えて、ドキシサイクリン誘導性ＣＡＲ発現を有するｉＰＳＣ株を作製した。テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）、ＣＤ１９  ＣＡＲおよび共通識別子としての切断型ＬＮＧＦＲ表面マーカーを含有するレンチウイルスを導入することにより、ｉＰＳＣを遺伝子改変した。また、Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を含有する別のレンチウイルスもｉＰＳＣに導入して、ＴｅｔＣＡＲ  ｉＰＳＣを作製した。ドキシサイクリン誘導系ＴｅｔＣＡＲの効率を求めるため、ｉＰＳＣをドキシサイクリン有りまたは無しで培養し、ＣＡＲおよびＬＮＧＦＲマーカーの発現をフローサイトメトリーで評価した。加えて、そのｉＰＳＣのＴｒａ−１８１を染色して、ｉＰＳＣの万能性の質を評価した。図３２Ａは、ドキシサイクリン処理の後、ｉＰＳＣの約６５％が、Ｔｒａ−１８１発現を維持しつつ、ＣＡＲおよびＬＮＧＦＲの発現について陽性であることを示している。
【０３２１】
ＴｅｔＣＡＲ  ｉＰＳＣが増強された機能性を有するかどうかを確かめるため、ＴｅｔＣＡＲ  ｉＰＳＣを１０日間分化させてＣＤ３４＋ＨＥを生じさせた。ＣＤ３４＋ＨＥを単離し、その細胞を追加で３０日間分化させ、ｉＮＫ細胞を生じさせた。ｉＮＫ細胞をドキシサイクリンで２４時間処理して、ＣＡＲ発現を誘導した。次に、ｉＮＫ細胞毒性を、ＣＤ１９を発現するＲａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫株、ＣＤ１９発現が無いＫ５６２細胞、またはヒトＣＤ１９を発現するよう改変されたＫ５６２細胞との２４時間の共培養によって評価した。ｉＮＫ媒介性細胞毒性を、標的細胞上のカスパーゼ−３の発現についてのフローサイトメトリーにより評価した。図３２Ｂは、ドキシサイクリンで処理されたＴｅｔＣＡＲ  ｉＮＫ細胞が、非処理のコントロールと比較して増加された細胞毒性を示したことを示しており、ＣＡＲがｉＰＳＣ由来リンパ系エフェクター細胞に増強された機能を与えることが確認された。
【０３２２】
実施例２０：標的化特異性を向上させるための普遍的エンゲージャーを含むｉＰＳＣの作製
ｉＰＳＣ、並びに、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、および好中球を含む派生リンパ系エフェクター細胞の細胞傷害活性は、エフェクター細胞を標的腫瘍細胞に向け直すことが可能な二重特異性または多重特異性エンゲージャーを結合することにより、さらに増強できる。一般的に、二重特異的または多重特異的結合の概念は、腫瘍関連抗原およびエフェクター細胞の表面にある活性化受容体を同時に標的とする二重特異性または多重特異性抗体を用いる、エフェクター細胞の特定の腫瘍細胞への再標的化が焦点となる。また、この二重特異的結合はエフェクター細胞機能を刺激し、有効なエフェクター細胞活性化をもたらし、最終的には腫瘍細胞の破壊をもたらす。エフェクター細胞活性化および腫瘍細胞死滅は、エフェクターおよび標的細胞が二重特異性エンゲージャーによって架橋結合された時にのみ起るため、安全制御機構が与えられる。さらに、この再標的化エンゲージャーを通じて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束的な活性化が回避される。
【０３２３】
腫瘍細胞側で、二重特異性エンゲージャー結合に使用できる確立された腫瘍関連抗原としては、固形腫瘍に関しては、造血器腫瘍のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ３０；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ（ヒト上皮増殖因子受容体２）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２（エリスロポエチン産生肝細胞癌Ａ２）およびＣＥＡ（癌胎児性抗原（carcinoembrantigen））が挙げられるがこれらに限定されない。加えて、表面二重特異性抗体／エンゲージャーはさらに、二重特異的な会合および結合を増強するためのビオチン化タンパク質、長期の表面提示のための表面膜アンカードメイン、二重特異的相互作用後のシグナル伝達を増強するための同時刺激ドメイン、並びにエンゲージャーの誘導性または時間的発現制御のためのオンオフスイッチ機構等の、さらなる特徴を含み得る。
【０３２４】
二重特異性エンゲージャーを介したエフェクター細胞の再標的化は、エフェクター細胞の面上の表面受容体の結合を含む。天然に存在する表面受容体として、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および好中球上にそれぞれ発現される、ＣＤ３、ＦｃｇＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃｇＲＩ（ＣＤ６４）、およびＦｃａＲ（ＣＤ８９）が挙げられるが、これらに限定はされない。加えて、エンゲージャー結合の再標的化を目的として、エフェクター細胞の表面上に発現するように、改変された表面上誘発受容体を導入することができる。遺伝子改変された表面上誘発受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは無関係に、二重特異性抗体または多重特異性抗体による、エフェクター細胞と特異的な標的細胞との間の結合を促進する。このアプローチを用いて、本明細書で開示される方法により普遍的な表面上誘発受容体を含むｉＰＳＣを作製した後、係るｉＰＳＣを普遍的な表面上誘発受容体を発現する種々のエフェクター細胞型の集団に分化させることが可能である。一般に、改変された普遍的な表面上誘発受容体は、抗エピトープと、共刺激ドメインとを含有する。表面上誘発受容体の抗エピトープは、該受容体を発現しているあらゆるエフェクター細胞の、一方の端に適合するエピトープを有する二重特異性または多重特異性エンゲージャーとの結合を方向付ける。他方の端のエンゲージャーの標的特異性は、死滅を目的に、結合したエフェクター細胞を特異的抗原を有する腫瘍細胞に方向付ける。普遍的な表面上誘発受容体において、１つの実施例では、共刺激ドメインがＩＬ２タンパク質またはその一部を含むことで、標準もしくは非標準の細胞活性化が達成され得る、および／または、エフェクター細胞型に関わらずエフェクター細胞機能が増強され得る。
【０３２５】
実施例２１：ｉＰＳＣ由来細胞性産物はより大きな増殖能、生存能および残留性に典型的なより長いテロメア長を有する
テロメアの短縮は、細胞の加齢に伴って起こり、幹細胞の機能障害および細胞老化と関連している。ｉＰＳＣ由来細胞療法の重要な誘因は、ｉＰＳＣ由来細胞性産物が、より大きな増殖能に典型的なより長いテロメア長を有するであろうことである。ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞のテロメア完全性を評価するため、２７日間のｉＮＫ細胞培養物および成熟ＰＢ由来ＮＫ細胞から、ＣＤ５６＋細胞を単離した。精製後、各試料を、等しい数の参照細胞、３０ｋｂを超えるテロメアを有するヒトＴ細胞白血病細胞株（１３０１細胞株）、と組み合わせた。各々の試料／参照細胞混合物について、プローブを含まないハイブリダイゼーション液の存在下で、または、フルオレセイン結合型ペプチド核酸（ＰＮＡ）テロメアプローブ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ＰＮＡ  ｋｉｔ、ダコ社（Dako Inc））を含有するハイブリダイゼーション液中で、ＤＮＡを変性させた。試料／参照細胞混合物を暗所、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートし、次いで洗浄して未結合のプローブを除去した。ＤＮＡ染色液を全試料に加えた後、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤバイオサイエンス社）で取得を行った。１３０１細胞株と比較した相対テロメア長は、Ｇ０／１期のＤＮＡ指数に対する補正を伴う、各試料のテロメアシグナルと参照細胞（１３０１細胞株）のテロメアシグナルとの間の比として算出した。図３１は、ｉＮＫ細胞が、２種の別々の成熟ＮＫ細胞ドナーと比べてより長いテロメア長を有するが、ｉＰＳＣコントロールと比べるとより短いテロメア長を有すること、を示しており、これは、ドナーＮＫ細胞との比較における、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の、より大きな増殖能、生存能および残留性を示している。
【０３２６】
実施例２２：凍結保存されたｉＰＳＣ由来細胞性産物は機能細胞として分化能および遺伝的インプリントを維持する
一例としてｉＰＳＣ由来プロＴ（Ｔ前駆細胞）を用いて、ｉＰＳＣ由来細胞性産物の凍結保存能；および、ｉＰＳＣ由来前駆細胞産物に関して、完全分化細胞へのさらなる分化能を維持する能力を評価した。ｉＰＳＣ由来の選別ＣＤ３４＋細胞を、Ｔ細胞分化培養液中でさらに１０日間分化させた。１０＋１０日目に、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋プロＴ細胞をＦＡＣＳで単離し、２種の別々の凍結保存培地中で凍結保存した。プロＴ細胞を、凍結保存後、解凍してＴ細胞分化培養液に植え戻した。図３５は、フローサイトメトリーによる、プロＴ細胞の単離前（Ａ）、および解凍から３日後（ＢおよびＣ）の、ＣＤ３４およびＣＤ７の発現を示している。１０＋１３日目、凍結保存したプロＴ細胞は、凍結保存されなかったプロＴ細胞（Ｂ）と比較して、同じように、ＣＤ３４−ＣＤ４５＋ＣＤ７＋細胞へのさらなる分化を起こす（Ｃ）。図３５はさらに、これらのプロＴ細胞が解凍後も生存可能であること（Ｄ）を示しており、Ｔ細胞分化培地中で培養された場合の細胞増殖の増加（Ｅ）を示している。
【０３２７】
Ｔ細胞の発生において、造血前駆細胞が骨髄から胸腺に移動し、プロＴ細胞に分化する。ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞のさらなる特徴付けのために、胸腺で発現されて発生中のＴ細胞をリクルートすることが知られているケモカインへと向かうｉＰＳＣ由来プロＴ細胞の移動能を評価した。１０＋１０日目、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞を、ＦＡＣＳでマーカーＣＤ４５＋ＣＤ７＋について単離し、ケモカインのＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５およびＳＤＦと一緒に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走アッセイにて播種した。４時間後、ケモカインに向かって遊走した生存プロＴ細胞の数を、Ａｃｃｕｃｏｕｎｔ定量化粒子（スフェロテック社（Spherotech）、イリノイ州レークフォレスト）を用いるフローサイトメトリーで定量化した。図３６Ａは、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞がＣＣＬ２１およびＳＤＦに向かって首尾よく移動可能であることを示しており、これは、Ｔ細胞分化系列決定のさらなる証拠となる。胸腺に進入した後、プロＴ細胞は胸腺環境に応答して、サイトカインのＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２を分泌する。ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞の胸腺環境への応答能を評価するため、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞、ＣＢ由来プロＴ細胞および末梢血Ｔ細胞を、未刺激、またはＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激に４時間曝した。４時間後、細胞を収集し、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２について染色した。図３６Ｂは、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞が、応答によって、サイトカインのＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生および分泌可能であることを示している。
【０３２８】
機能的プロＴ細胞のもう１つの特徴は、ＴＣＲγ遺伝子座のＶＤＪ組換えの惹起による、機能的Ｔ細胞受容体の生成である。ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞が惹起されたＶＤＪ組換えを有するかどうかを確かめるため、ゲノムＤＮＡを単離した。生殖系列ＤＮＡの対照として、ＴＣＲ遺伝子組換え後に失われるゲノム領域（Ｖ−ＪγおよびＶ−ＤＪβ）を、ｑＰＣＲによって増幅した。生殖系列ＤＮＡの対照として、未変化のままである別の領域（Ｃβ２）も増幅した。線維芽細胞株から得られたゲノムＤＮＡを検量線作成のために使用した。生殖系列配置で残っているＴＣＲγ遺伝子座またはＴＣＲβ遺伝子座のパーセントを、Ｖ−ＪγまたはＶ−ＤＪβのコピー数をそれぞれＣβ２のコピー数と比較することにより算出した。ＦＴｉ１２１  ｉＰＳＣ、およびＴ細胞から再プログラム化されたｉＰＳＣ（ＴｉＰＳ  Ｃ９．１）は、それぞれ、ネガティブコントロールとポジティブコントロールの役割を果たす。図３７は、ＦＴｉ１２１  ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞が、ＦＴｉ１２１およびＴｉＰＳ  Ｃ９．１と比較した場合に、ＴＣＲγ遺伝子座から残る生殖系列の割合を減少させていることを示しており、これは、ＦＴｉ１２１がＴＣＲ遺伝子座の再配置を始めており、Ｔ細胞系統に運命決定されていることを示している。
【０３２９】
当業者であれば、本明細書に記載の方法、組成物、および製品が、例示的な実施形態の代表的なものであり、本発明の範囲に対する限定を意図していないことを、容易に理解するだろう。本発明の範囲および精神から逸脱しない範囲で、本明細書にて開示される本開示に様々な置換および変更を加えてよいことは、当業者には容易に理解される。
【０３３０】
明細書に記載した特許及び公報の全てが、本開示が属する技術分野の当業者のレベルを示唆している。特許及び公報の全ては、個々の公報が参照することによって組み入れられるように、あたかもそれぞれ明確かつ独立に示したかのように、同程度に参照することによって本明細書に組み入れられるものである。
【０３３１】
本明細書に例示的に記載した本開示は、本明細書に明文で開示されていない、任意のある要素又は要素、ある限定又は限定が欠如している状態で、適宜実施してもよい。すなわち、例えば本明細書の各例において、用語「含む」、「本質的に〜からなる」及び「からなる」のいずれか１つは、他の２つのうちのいずれかと置換することができる。使用した用語及び表現は、説明の点で用いたものであって限定するためではなく、またかかる用語及び表現の使用において、図示又は記載した特徴又はその一部分についてのあらゆる均等物の除外を意図しているものではないが、請求する本開示の範囲内で様々な変形が可能であるものと考える。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び選択自由な特徴によって明確に開示したが、本明細書で開示した概念の変形及び変化物が、当業者によって主張されてもよいこと、またかかる変形及び変化物は、添付の請求項によって規定されるこの発明の範囲内として考えられるものであることとを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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