(57)【要約】  本明細書には、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌制御によって皮膚美白に効能のある皮膚美白用組成物及び皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法が開示される。前記皮膚美白用組成物は、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量を抑制させることでメラニン形成細胞の細胞死滅を増加させることができ、このようなメラニン形成細胞の細胞死滅によって結果的にメラニン生成を阻害して美白効能が奏される効果がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分泌量を抑制するエクソソーム抑制剤を有効成分として含む、皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記エクソソーム抑制剤は、ＧＷ４８６９及びｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μからなる群より選択される１以上である、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記有効成分はメラニン生成を抑制する、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
前記有効成分は、しみ、そばかす、ほくろ、母斑、黒色腫、薬物による色素沈着、炎症後色素沈着、及び皮膚炎から発生する色素沈着からなる群より選択される１以上の皮膚色素沈着疾患を予防、改善又は治療する、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項５】
メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に対し試験物質を処理してから紫外線を照射するか、又はメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に対し紫外線を照射してから試験物質を処理する段階；
前記メラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の相対的な分泌量を確認する段階を含む、皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項６】
前記エクソソームの相対的な分泌量は、対照群であるメラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量と比較して確認し、前記対照群は、試験物質を処理することなく紫外線を照射したメラニン形成細胞である、請求項５に記載の皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
前記エクソソームの相対的な分泌量を確認した後、エクソソームの相対的な分泌量を減少させた試験物質を皮膚美白効能物質として選別する段階を含む、請求項５に記載の皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
前記紫外線としてはＵＶＢを２０〜３０ｍＪ／ｃｍ２で照射する、請求項５に記載の皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
前記メラニン形成細胞に対し試験物質を処理する時間は１０〜２４時間である、請求項５に記載の皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
前記エクソソームの分泌量は、ＣＤ８１又はＨＳＰ９０の発現量で確認する、請求項５に記載の皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法に従い皮膚美白効能物質として選別された物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、皮膚美白用組成物及び皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
大半の動物細胞は、多様な大きさと成分を有する細胞内起源の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌することができる能力を持っており、このような細胞外小胞は血液、小便、唾液及び細胞培養液を含むあらゆる生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ）から発見される（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
細胞外小胞は、最小直径約２０ｎｍから最大直径約５μｍの大きさを有する膜構造の小胞体であって、その大きさと構成で異質性があり、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、マイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、アポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｙ）などの多数の相違した種を含む。
【０００４】
このような細胞外小胞は、分泌する起源細胞（供与細胞）の状態を反映し、どの細胞から分泌されたかによって様々な生物学的活性を示し、細胞間で遺伝物質とタンパク質を移しながら細胞間相互作用において重要な役割を果たす。
【０００５】
また、メラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）は、黒い色素とタンパク質との複合体形態を持つフェノール類の生体高分子物質であって、リンゴ、じゃがいも、バナナの切断された表面が空気中に露出したときに発生する褐変または動物の外皮毛、皮膚、頭部、眼部などで観察される。メラニンが過剰産生すると皮膚に沈着してしみやそばかすなどができ且つ皮膚老化も促進され、皮膚癌を誘発することもある。
【０００６】
人体においてメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）は外部から入ってくる紫外線に対する防御機作の一環としてメラニンを合成する細胞であって、皮膚が紫外線によって死滅することを防ぐ役割をするものである。外部からの紫外線に皮膚が晒されると、皮膚組織細胞のうちメラニン形成細胞が紫外線と反応してメラニンを合成するようになる。
【０００７】
紫外線によるメラニン合成では、紫外線によってメラニン細胞刺激ホルモン（ｍｅｌａｎｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＭＳＨ）が分泌され、該ＭＳＨは、ＭＣ１Ｒという受容体と反応してメラニン形成細胞内においてｃＡＭＰを向上させてメラニン合成のための遺伝子の反応を誘導することでメラニンを合成し、合成されたメラニンは、メラニン形成細胞の外部へ分泌され、紫外線から皮膚を保護する役割をするようになる。メラニンの生合成に関与するタンパク質としては、ｍｉｔｆ、ｔｙｒ、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２などが知られている。
【０００８】
しかし、従来、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量とメラニン形成細胞の細胞死滅との関連性については報告されたことがない。美白活性を持つ物質をスクリーニングする方法に係る先行技術は特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０８４０１４４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１８８６２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM, Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases, Circ Res 2014; 114: 345-53
【非特許文献２】Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65: 398-401
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一側面において、本明細書は、メラニン形成細胞からのエクソソームの排出制御によって皮膚美白に効果がある組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
他の側面において、本明細書は、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量を確認して皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分泌量を抑制するエクソソーム抑制剤を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【００１４】
例示的な一具現例において、前記エクソソーム抑制剤は、ＧＷ４８６９及びｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μからなる群より選択される１以上であってよい。
【００１５】
例示的な一具現例において、前記有効成分は、メラニン生成を抑制するものであってよい。
【００１６】
例示的な一具現例において、前記有効成分は、しみ、そばかす、ほくろ、母斑、黒色腫、薬物による色素沈着、炎症後の色素沈着、及び皮膚炎から発生する色素沈着からなる群より選択される１以上の皮膚色素沈着疾患を予防、改善又は治療するものであってよい。
【００１７】
他の側面において、本明細書に開示された技術は、対象に有効量のエクソソーム抑制剤を含む組成物を適用することを含む皮膚美白増進方法を提供する。
また他の側面において、メラニン過多生成による疾患の予防、改善又は治療に有効な量のエクソソーム抑制剤を含む組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む、メラニン過多生成による疾患の予防、改善又は治療方法を提供する。
【００１８】
例示的な一具現例において、前記方法は、組成物を薬学組成物、化粧料組成物又は食品組成物の形態で適用することを含んでいてよい。
【００１９】
例示的な一具現例において、前記方法は、組成物を対象の皮膚に適用することを含んでいてよい。
【００２０】
また他の側面において、本明細書に開示された技術は、対象の皮膚美白増進のためのエクソソーム抑制剤を提供する。
【００２１】
また他の側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン過多生成による疾患の予防、改善又は治療のためのエクソソーム抑制剤を提供する。
【００２２】
また他の側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に対し試験物質を処理してから紫外線を照射するか、又はメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に紫外線を照射してから試験物質を処理する段階；及び前記メラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の相対的な分泌量を確認する段階を含む皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００２３】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの相対的な分泌量は、対照群であるメラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量と比較して確認し、前記対照群は、試験物質を処理することなく紫外線を照射したメラニン形成細胞であってよい。
【００２４】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの相対的な分泌量を確認した後、エクソソームの相対的な分泌量を減少させた試験物質を皮膚美白効能物質として選別する段階を含んでいてよい。
【００２５】
例示的な一具現例において、前記紫外線としてはＵＶＢを２０〜３０ｍＪ／ｃｍ２で照射していてよい。
【００２６】
例示的な一具現例において、前記メラニン形成細胞に対し試験物質を処理する時間は、１０〜２４時間であってよい。
【００２７】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの分泌量は、ＣＤ８１又はＨＳＰ９０の発現量で確認していてよい。
【００２８】
また他の側面において、本明細書に開示された技術は、前記方法によって皮膚美白効能物質として選別された物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
一側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞からのエクソソームの排出制御によって皮膚美白に効果のある組成物を提供する効果がある。
【００３０】
他の側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量を確認して皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本明細書の一実験例に従う、メラニン形成細胞から放出されたエクソソームの平均大きさを確認した結果である。
【図２】本明細書の一実験例に従う、紫外線の照射時に増加したエクソソームの分泌量がエクソソーム抑制剤の処理により減少したことを確認した結果である。
【図３】本明細書の一実験例に従う、エクソソーム抑制剤が紫外線照射されたメラニン形成細胞の生存力に及ぼす影響を確認した結果である。
【図４】本明細書の一実験例に従う、ＵＶＢを照射していないメラニン形成細胞ではエクソソームによる細胞生存力に大きな差がないことを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３３】
一側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分泌量を抑制するエクソソーム抑制剤を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【００３４】
本明細書において「エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、細胞から分泌されて細胞外空間に放出されたナノ大きさの細胞外小胞、すなわち、細胞外ベジクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を意味するものであって、エクソソームは膜構造小胞体で内部と外部とが区分され、他の細胞及び組織に結合して膜構成要素、タンパク質（成長ホルモン、サイトカインなど）、ＲＮＡなどを伝達して細胞-細胞間の疎通を媒介するなどの多様な役割を果たすものと知られている。一方、メラニン形成細胞の周辺にはメラニン形成細胞を取り囲んでいる細胞及び細胞間物質が存在する。具体的に、メラニン形成細胞から所定の半径、例えば、２ｍｍ以内には角質形成細胞又は線維芽細胞及び／又はコラーゲンなどのような細胞間物質が存在していてよく、メラニン形成細胞は細胞外基質でエクソソームを分泌する。
【００３５】
一側面において、前記エクソソームは、２０〜４００ｎｍの直径を有する細胞外ベジクルであってよい。
【００３６】
本明細書において「エクソソーム抑制剤」とは、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量を抑制する物質を意味するものであって、メラニン形成細胞内のエクソソームの生成、メラニン形成細胞からのエクソソームの分泌又は放出を抑制する物質を意味する最広義の概念である。
【００３７】
例示的な一具現例において、前記エクソソーム抑制剤は、ＧＷ４８６９及びｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μからなる群より選択される１以上であってよい。
【００３８】
「ＧＷ４８６９」は分子式Ｃ３０Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ６Ｏ２を有するｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ（Ｓｍａｓｅ）抑制剤であって、下記化学式１で表される（ＣＡＳ  ６８２３-６９-４）になる。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅはスフィンゴミエリンを加水分解してセラミド及びホスホコリンを生成させるスフィンゴミエリン-特異的ホスホリパーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ）Ｃである。
【００３９】
【化１】
2018521038.tif 000003
【００４０】
「ピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）-μ」は、分子式Ｃ８Ｈ７ＮＯ２Ｓを有するｐ５３抑制剤であって、下記化学式２で表される（ＣＡＳ  ６４９８４-３１-２）。ｐ５３は細胞が不要に増殖しないように制御する癌制御遺伝子である。しかし、異常的に過度にｐ５３が活性化すると細胞の生存に致命的であり、ピフィスリンは、放射線治療中において正常細胞は保護したまま、癌細胞の死滅を増大させる化合物と同定された。
【００４１】
【化２】
2018521038.tif 000004
【００４２】
例示的な一具現例において、前記有効成分は、メラニン形成細胞の増加と直接又は間接的に関連している皮膚損傷又は皮膚疾患を予防、治療又は改善する効果がある。すなわち、前記有効成分は、メラニン生成を効果的に抑制するので、メラニン過多生成による疾患を予防、治療又は改善する効果がある。
【００４３】
前記メラニン過多生成による疾患は、しみ、そばかす、老人性しみ、細かいほこり、表皮メラニン細胞性病変（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ）、カフェオレ斑（Ｃａｆｅ'ｓ  ａｕ  ｌａｉｔ  ｍａｃｕｌｅｓ）、ベッカー母斑（Ｂｅｃｋｅｒ'ｓ  Ｎｅｖｕｓ）、扁平母斑（Ｎｅｖｕｓ  Ｓｐｉｌｕｓ）、黒子（Ｌｅｎｔｉｇｉｎｅｓ）、真皮メラニン細胞性病変（Ｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ）、蒙古斑（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  ｓｐｏｔ）、太田母斑（Ｎｅｖｕｓ  ｏｆ  Ｏｔａ）、遅発性両側性太田母斑様色素斑（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｎｅｖｕｓ  ｏｆ  Ｏｔａ−ｌｉｋｅ ｍａｃｕｌｅｓ）、伊藤母斑（Ｎｅｖｕｓ  ｏｆ  Ｉｔｏ）、青色母斑（Ｂｌｕｅ  ｎｅｖｕｓ）、メラニン形成細胞性母斑（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｎｅｖｕｓ）、境界性母斑（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｅｖｕｓ）、複合性母斑（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｎｅｖｕｓ）、真皮内母斑（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｎｅｖｕｓ）、暈状母斑（Ｈａｌｏ  ｎｅｖｕｓ）、先天性メラニン細胞性母斑（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｖｏｃｙｔｉｃ  ｎｅｖｕｓ）、スピッツ母斑（Ｓｐｉｔｚ  ｎｅｖｕｓ）、異形成母斑（Ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｎｅｖｕｓ）、黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍａ）、悪性黒字型黒色腫（Ｌｅｎｔｉｇｏ  ｍａｌｉｇｎａ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、表在拡大型黒色腫（Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、末端性黒子性黒色腫（Ａｃｒａｌ  ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、結節型黒色腫（Ｎｏｄｕｌａｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、色素性基底細胞癌（ｐｉｇｍｅｎｔ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、色素性皮膚線維腫（ｄｅｒｍａｔｏｆｉｂｒｏｍａｓ）、色素性類皮嚢胞（ｄｅｒｍｏｉｄ  ｃｙｓｔ）、色素性ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）及び色素性角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃａｎｔｈｏｍａｓ）からなる群より選択される１以上であってよい。
【００４４】
例示的な一具現例において、前記組成物は、メラニン生成増加で皮膚に局所的にできるしみ、そばかす、ほくろ、母斑、黒色腫、薬物による色素沈着、炎症後色素沈着、及び皮膚炎から発生する色素沈着からなる群より選択される１以上の皮膚色素沈着疾患を予防、改善又は治療するものであってよい。
【００４５】
他の側面において、本明細書に開示された技術は、メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に対し試験物質を処理してから紫外線を照射するか、又はメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）に対し紫外線を照射してから試験物質を処理する段階；及び前記メラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の相対的な分泌量を確認する段階を含む皮膚美白効能物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００４６】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの相対的な分泌量は、対照群であるメラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量と比較して確認し、前記対照群は、試験物質を処理することなく紫外線を照射したメラニン形成細胞であってよい。
【００４７】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの相対的な分泌量を確認した後、エクソソームの相対的な分泌量を減少させた試験物質を皮膚美白効能物質として選別する段階を含んでいてよい。
【００４８】
例示的な一具現例において、前記紫外線としてはＵＶＢを２０〜３０ｍＪ／ｃｍ２で照射していてよい。
【００４９】
例示的な一具現例において、前記メラニン形成細胞に対し試験物質を処理する時間は、１０〜２４時間であってよい。
【００５０】
例示的な一具現例において、前記エクソソームの分泌量は、例えば、同じ細胞数から同一の分離法にて分離されたエクソソームを定量分析装備Ｑ−Ｎａｎｏ或いはＮａｎｏＳｉｇｈｔ機器を利用し、ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）でパーティクル（ｐａｒｔｉｃｌｅ）数を数えるか、又はエクソソーム表面のタンパク質、脂質またはエクソソーム内部のタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、代謝物質などの定量によって確認することができ、定量したい対象に応じてウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、ドットブロット（ｄｏｔ  ｂｌｏｔ）、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、ＰＣＲ、ＲＴ-ｑＰＣＲ、ＧＣ-ＭＳ、ＬＣ-ＭＳ、ＮＭＲ、放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫沈降アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、ＦＡＣＳ、及びタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）などの方法を当業者が適宜選択すればよい。例えば、本明細書の実施例では、エクソソーム表面のＣＤ８１又はエクソソーム内部のＨＳＰ９０を定量マーカーとして利用してウエスタンブロットによってエクソソームの量を視覚的に相対評価したが、これに制限されるものではない。
【００５１】
メラニン形成細胞から細胞外基質として分泌されるエクソソームは、紫外線照射されたメラニン形成細胞の細胞死滅を抑制する。よって、メラニン形成細胞から分泌されるエクソソームの分泌量を抑制させることでメラニン形成細胞の細胞死滅を増加させることができ、このようなメラニン形成細胞の細胞死滅によって結果的にメラニン生成を阻害して美白効能が奏される効果がある（Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Jun;22(3):307-318）。
【００５２】
また、メラニン形成細胞からのエクソソームの分泌を抑制又は増加させる物質は、メラニン形成細胞の細胞死滅を促進（分泌抑制物質）又は減少（分泌増加物質）させてメラニン生成を調節することができる。これにより、紫外線処理の前または後に皮膚美白効能候補物質をメラニン形成細胞に対し処理しメラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム分泌量を確認することによって皮膚色素沈着を調節する物質をスクリーニングする効果がある。
【００５３】
また他の側面において、本明細書に開示された技術は、前記方法によって皮膚美白効能物質として選別された物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【００５４】
例示的な一具現例によると、前記組成物は薬学組成物であってよい。
【００５５】
前記薬学組成物は、エクソソーム抑制剤の他、防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、並びにその他治療的に有用な物質をさらに含んでいてよく、通常的な方法によって多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化していてよい。
【００５６】
前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがあり、これらの剤形は、有効成分の他、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有していてよい。錠剤は、さらに、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリジンといった結合剤を含有していてよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味料などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されていてよい。
【００５７】
また、前記非経口投与形態として、経皮投与型剤形であってよく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
前記薬学組成物は、非経口、直腸、局所、経皮、皮下などに投与されていてよい。
【００５９】
前記有効成分の投与量の決定は、当業者の水準内にあり、薬物の１日投与量は、投与しようとする対象の進行程度、発症時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因に応じて異なるが、成人を基準としたとき、一側面において、前記組成物１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、他の側面において、５０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇを、１日１〜３回に分割して投与していてよく、前記投与量は、いかなる方法であれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
前記薬学組成物は皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤とは、外皮に塗布されるものであればいずれも含み得る組成物の総称であって、多様な剤形の医薬品がこれに含まれ得る。
【００６１】
例示的な一具現例によると、前記組成物は化粧料組成物であってよい。
【００６２】
前記化粧料組成物には、エクソソーム抑制剤の他、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選択された成分を含んでいてよい。その他含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００６３】
前記化粧料組成物は、その剤形が特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択すればよい。例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、及びボディークレンザーからなる群より選択されたいずれか一つ以上の剤形で製造されていてよいが、これらに制限されるものではない。
【００６４】
本発明の剤形がペースト、クリーム、又はゲルである場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられていてよい。
【００６５】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００６６】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００６７】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール、又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられていてよい。
【００６８】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられていてよい。
【００６９】
例示的な一具現例によると、前記組成物は食品組成物であってよい。
【００７０】
前記食品組成物は、液状又は固体状態の剤形であってよく、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態で使用されていてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が困難なく適宜選定して配合していてもよく、他の原料と同時に適用した場合に相乗効果が奏されることがある。
【００７１】
本明細書に開示された有効成分の他に含有し得る液体成分には特に制限点がなく、通常の飲料と同様に種々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでいてよい。前記天然炭水化物の例としては、葡萄糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類及びデキストリン、シクロデキストリンなどの通常的な糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールがある。前記香味剤としては、天然香味剤(ソーマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど))及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を有利に使用していてよい。前記天然炭水化物の割合は、本明細書に開示された組成物１００ｍｌ当たり一般的に約１〜２０ｇ、一側面において、約５〜１２ｇであってよい。
【００７２】
前記食品組成物は、一側面において、多様な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでいてよい。他の側面において、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでいてよい。これらの成分は、独立的にまたは組み合わせて使用していてよい。前記添加剤の割合は種々であってよいが、本明細書に開示された組成物１００重量部当たり０．００１〜約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００７３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００７４】
実験例
（１）細胞培養及び物質
正常ヒトメラニン形成細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）は、ヒトメラニン形成細胞成長補充剤（Ｃａｓｃａｄｅ）が含有されたＭ-２５４培地（Ｃａｓｃａｄｅ）で保管した。ＧＷ４８６９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）-μ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）はＤＭＳＯに溶解させて利用した。
【００７５】
（２）エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分離
エクソソームの分離のために融合性メラニン形成細胞をＰＢＳで洗浄してＭ-２５４で４８時間培養した。ならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を収集して１０分間５００×ｇ、２０分間３,０００×ｇ、及び２時間１００,０００×ｇで遠心分離した。収得されたエクソソーム含有ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、−８０℃で保存した。また、ならし培地を０．４５μｍの空隙フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）にてろ過して精製し、１００ｋＤａのカットオフスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濃縮した。エクソソームは、ＥｘｏＱｕｉｃｋ-ＴＣキット（ＳＢＩ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して製造元の指示に従って分離した。分離されたエクソソーム２０μｌは、ウエスタンブロット及び銀染色法にて分析を行った。
【００７６】
（３）ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の分析
エクソソームの径は、散乱強度１０×３０ｓで６３３ｎｍのレーザーが具備されたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ.、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を利用して測定した。
【００７７】
（４）ゲル内タンパク質の分離
エクソソームタンパク質はＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを１０片に切断し、既に公知の方法（Bahk YY, Kim SA, Kim JS et al., (2004) Antigens secreted from Mycobacterium tuberculosis: identification by proteomics approach and test for diagnostic marker. Proteomics 4:3299-307.）によってトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を利用してゲル内分離を行った。要約すると、ゲル片を１：１のアセトニトリル（ＡＣＮ）／２５ｍＭアンモニウムバイカーボネート（ＡＢＣ）で４〜５回洗浄し、１００％  ＡＣＮで脱水及び乾燥させた。４５分間、５６℃で１００ｍＭ  ＡＢＣと共に１００ｍＭ  ＤＴＴで還元し、次いで３０分間光が遮られた常温で１００ｍＭ  ＡＢＣと共に５５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した後、該片を１００％  ＡＣＮで乾燥させ、３７℃で２０時間、２０ｎｇトリプシンを含有する３２５ｍＭ  ＡＢＣで再度水和した。液体を新しいチューブに移し、残存するペプチドは３０℃で４０分間０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリルを用いてゲルから抽出した。複合上澄液を蒸発させ、質量分析のために０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む５％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル溶液に溶解させた。
【００７８】
（５）ＬＣ-ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定
分離されたペプチドは、既に公知の方法（Zuo X, Echan L, Hembach P, et al., (2001), Towards global analysis of mammalian proteomes using sample prefractionation prior to narrow pH range two-dimensional gels and using one-dimensional gels for insoluble and large proteins. Electrophoresis 22:1603-15.）に若干の変形を加えてＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオン-トラップ質量分析計（ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）に直結された逆相毛細管ＨＰＬＣを利用して分析を行った。ペプチドは、１０分間トラッピングカラムに結合され、５０分間、０．２μｌ／ｍｉｎの流量速度で０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む５〜８０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリルで傾斜溶離された。Ｔａｎｄｅｍ  ＭＳはｍ／ｚ＝４５０〜２０００Ｄａで遂行され、各スペクトルはＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｑｕｅｓｔ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して処理された。収得されたピーク目録はＭＡＳＣＯＴプログラム（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｏｍ）を利用してＭＳＤＢまたはＮＣＢＩデータベースを照会するのに用いられた。
【００７９】
（６）ウエスタンブロット及び銀染色法
細胞または分離されたエクソソームをプロテアーゼ抑制剤（Ｓｉｇｍａ）が含有された溶解バッファ（１％  ＮＰ-４０、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２）を利用して溶解させた。タンパク質の濃度はＢＣＡアッセイで分析し、サンプルはＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、ＣＤ８１（ＳＢＩ）に対する抗体で分析を行った。一方、銀染色のためにＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを製造元の指示に従って銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に適用して実験を行った。
【００８０】
（７）細胞毒性試験
メラニン形成細胞を６-ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルの密度で分注した。翌日、同じ細胞数から分離されたエクソソーム１０μｌを処理した。細胞を１５分間ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定させ、ＰＢＳで洗浄し、２０分間０．１％クリスタルバイオレットで染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を乾燥させ、１０％酢酸で溶解させた。分光光度計を利用して５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８１】
（８）定量的リアルタイム（ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ）ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を利用してｃＤＮＡに逆転写させた。遺伝子発現分析はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ： Ｈｓ００３６５０５２_ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して行った。
【００８２】
（９）統計的分析
ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ-ｔｅｓｔが２グループ間の差異点を分析するのに用いられた。データは３回の実験に対するｍｅａｎ±ＳＤ（***；ｐ＜０．００５、**；ｐ＜０．０５）で表した。
【００８３】
実験結果１．メラニン形成細胞から分泌されたエクソソームの確認
メラニン形成細胞はエクソソームを分泌して放出し、分離されたエクソソームの大きさを分析（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）した結果、メラニン形成細胞から放出されたエクソソームは、２０６．９０±２２．１８ｎｍの平均径を有することを確認した（図１参照）。
【００８４】
実験結果２．紫外線の照射によるメラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム分泌量の変化
メラニン形成細胞にＵＶＢ（２０ｍＪ／ｃｍ２）を照射し、２４時間培養した結果、紫外線に晒したとき、エクソソームの分泌量が増加することが分かった。
【００８５】
また、ＵＶＢに晒す前に、１２時間、エクソソームの生成／分泌阻害剤である１０μＭの ＧＷ４８６９（Ｓｍａｓｅ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）抑制剤）又は１０μＭのピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）-μ（ｐ５３抑制剤）で処理した場合、エクソソームのマーカーであるＣＤ８１発現量が減少することが分かった（図２参照）。
【００８６】
これにより、メラニン形成細胞は、紫外線に晒されると、放出されるエクソソームの量が増加し、また、紫外線に晒されてもエクソソームの生成／分泌阻害剤を加える処理を施した場合、放出されるエクソソームの量が減少することを確認した。
【００８７】
実験結果３．エクソソーム抑制剤が紫外線照射されたメラニン形成細胞の生存力に及ぼす影響
ＵＶＢ非処理のメラニン形成細胞、ＵＶＢ処理済みのメラニン形成細胞、ＵＶＢ＋ＧＷ４８６９処理済みのメラニン形成細胞から得たそれぞれのエクソソームを、メラニン形成細胞と共にＵＶＢ（２０ｍＪ／ｃｍ２）で照射し３日間培養した結果、図３に見られるように紫外線に晒されたメラニン形成細胞由来エクソソームは紫外線損傷を受けたメラニン形成細胞の生存力を増加させることが分かった。このようなメラニン形成細胞の生存力増進効果は、エクソソーム分泌阻害物質であるＧＷ４８６９、ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μが紫外線と共に処理されたメラニン形成細胞由来エクソソームによって減少された。一方、前記したような方法にてＵＶＢ非処理のメラニン形成細胞、ＵＶＢ処理済みのメラニン形成細胞から得たそれぞれのエクソソームをメラニン形成細胞と共に培養するが、メラニン形成細胞にＵＶＢを照射しない条件で培養した場合は、メラニン形成細胞の生存力に大きな差がないと示された（図４参照）。
【００８８】
したがって、紫外線に晒されたメラニン形成細胞由来エクソソームは、紫外線損傷を受けたメラニン形成細胞の生存力を増加させ、且つＵＶ照射時にメラニン形成細胞から排出されるエクソソームがメラニン形成細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する効能を有することが分かった。
【００８９】
その結果、メラニン形成細胞からのエクソソームの排出を抑制又は増加させる物質は、メラニン形成細胞のアポトーシスを促進（排出抑制物質）又は減少（排出増加物質）させてメラニン生成を調節することができることを確認した。
【００９０】
以下、本発明の一側面に係る組成物の剤形例について説明するが、他の様々な剤形への応用も可能であり、且つ、これらは本発明を限定するためのものではない、単に具体的に説明するためのものである。
【００９１】
［剤形例１］軟質カプセル剤
ＧＷ４８６９又はｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μ５０ｍｇ、Ｌ-カルニチン８０〜１４０ｍｇ、大豆油１８０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法に従って、１カプセルあたり４００ｍｇずつ充填して軟質カプセルを製造した。
【００９２】
［剤形例２］錠剤
ＧＷ４８６９又はｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μ５０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ  ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。
【００９３】
［剤形例３］顆粒剤
ＧＷ４８６９又はｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μ５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造した。
【００９４】
［剤形例４］ドリンク剤
ＧＷ４８６９又はｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-μ５０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつ充填した。瓶に充填した後、１３０℃で４〜５秒間殺菌して、ドリンク剤飲料を製造した。
【００９５】
［剤形例５］ローション
下記の表１に記載された組成にて通常の方法によりローションを製造した。
【００９６】
【表１】
2018521038.tif 000005
【００９７】
［剤形例６］クリーム
下記の表２に記載された組成にて通常の方法によりクリームを製造した。
【００９８】
【表２】
2018521038.tif 000006
【００９９】
［剤形例７］パック
下記の表３に記載された組成にて通常の方法によりパックを製造した。
【０１００】
【表３】
2018521038.tif 000007
【０１０１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好適な実施態様であるに過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
2018521038.tif 000008
【図２】
2018521038.tif 000009
【図３】
2018521038.tif 000010
【図４】
2018521038.tif 000011
【国際調査報告】
2018521038.tif 000012
2018521038.tif 000013
2018521038.tif 000014
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