(57)【要約】本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲを含有するＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を含むＫＭＡ発現悪性腫瘍を処置するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、サイトカインおよび抗体を含む他の抗腫瘍作用物質を共発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含む方法および組成物を提供する。本発明は、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）に特異的であるが、抗ＫＭＡ  Ｔ細胞反応を誘発することができる細胞内シグナル伝達ドメインを含有するキメラ抗体受容体（ＣＡＲ）、そのようなＣＡＲを含有するＴ細胞、およびＫＭＡ特異的ＣＡＲを投与することにより多発性骨髄腫および関連障害を処置する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインは、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）を特異的に認識する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインである、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインである、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４−１ＢＢドメインである、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
４−１ＢＢドメインをさらに含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＫａｐｐａＭＡｂ  ＣＤＲは、配列番号３〜８を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂからのＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含み、前記ＶＬ鎖は、配列番号２を含み、ＶＨ鎖は、配列番号１を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
ＫａｐｐａＭａｂからの前記ＶＬ鎖およびＶＨ鎖は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している、請求項１１に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記ｓｃＦｖは、スペーサーを介して前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはＣＤ８α鎖である、請求項１６に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む、請求項１８に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項１９に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１９または２０に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
前記スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介して前記ｓｃＦＶに結合している、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項２３に記載のＣＡＲ。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するように操作された、遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項２６】
１つ以上の追加の生体分子を発現するようにさらに操作された、請求項２５に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項２７】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３ＣまたはＳＡＮＴ７の１つ以上を含む、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項２８】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２であり、前記ＩＬ−１２は、柔軟性リンカーにより繋がった１つのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよび１つのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖ポリペプチドにより発現される、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項２９】
前記柔軟性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーである、請求項２８に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３０】
柔軟性リンカーにより繋がった１つのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよび１つのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む前記一本鎖ポリペプチドは、生物活性ｐ７０  ＩＬ−１２ヘテロ二量体を形成する、請求項２９に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３１】
ＩＬ−１２および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３２】
ＳＡＮＴ−７を発現するように操作された、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３３】
ＳＡＮＴ−７および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３４】
ＳＡＮＴ７を発現するようにさらに操作された、請求項３１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３５】
ＧＡＬ３Ｃを発現するように操作された、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３６】
ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項２６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３７】
ＧＡＬ３Ｃを発現するようにさらに操作された、請求項３１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３８】
ＧＡＬ３ＣおよびＳＡＮＴ７を発現するようにさらに操作された、請求項３１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項３９】
ＧＡＬ３Ｃを発現するようにさらに操作された、請求項３３に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項４０】
遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための方法であって、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードする発現ベクターをＴ細胞に導入することを含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）を特異的に認識する方法。
【請求項４１】
前記発現ベクターは、転位ベクター発現系である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記発現ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現系である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記導入することは、エレクトロポレーションを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＡＲは、ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４−１ＢＢドメインである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＣＡＲは、４−１ＢＢドメインをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＡＲは、ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識するｓｃＦｖを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＣＤＲは、配列番号３〜８を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含み、前記ＶＬ鎖は、配列番号２を含み、前記ＶＨ鎖は、配列番号１を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＶＬ  ＣＤＲおよびＶＨ  ＣＤＲは、グリシン−セリンリンカーを介して結合している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｓｃＦｖは、スペーサーを介して前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはＣＤ８α鎖である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介して前記ｓｃＦＶに結合している、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項６５】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項６６】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項２３に記載のＣＡＲ。
【請求項６７】
１つ以上の追加の生体分子を発現することができる１つ以上の追加の発現ベクターを導入することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３ＣまたはＳＡＮＴ７の１つ以上を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２であり、前記ＩＬ−１２は、柔軟性リンカーにより繋がったＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよびＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖コンストラクトにより発現される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記柔軟性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
柔軟性リンカーにより繋がったＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよびＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む前記一本鎖コンストラクトは、生物活性ｐ７０  ＩＬ−１２ヘテロ二量体を形成する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
１つ以上の追加の生物学的作用物質は、選択可能マーカーをさらにコードするコンストラクトを介して発現される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記コンストラクトは、ＩＬ−１２および選択可能マーカーをコードし、前記選択可能マーカーおよびＩＬ−１２のコード配列は、２Ａリボソームスキップをコードする配列により繋がっている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記コンストラクトは、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーをコードし、前記選択可能マーカーおよびＳＡＮＴ７のコード配列は、２Ａリボソームスキップをコードする配列により繋がっている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記コンストラクトは、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーをコードし、前記選択可能マーカーおよびＧＡＬ３Ｃのコード配列は、リボソームスキップをコードする配列により繋がっている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記コンストラクトは、ＧＡＬ３Ｃをさらにコードし、ＧＡＬ３Ｃのコード配列は、追加の２Ａリボソームスキップを介して、コンストラクト内のＳＡＮＴ７のコード配列に繋がっている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記コンストラクトは、ＳＡＮＴ７をさらにコードし、ＳＡＮＴ７のコード配列は、２Ａリボソームスキップの追加のコード配列を介して、コンストラクト内のＩＬ−１２のコード配列に繋がっている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記コンストラクトは、ＧＡＬ３Ｃをさらにコードし、ＧＡＬ３Ｃのコード配列は、２Ａリボソームスキップの追加のコード配列を介して、コンストラクト内のＩＬ−１２のコード配列に繋がっている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記コンストラクトは、ＳＡＮＴ７をさらにコードし、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび前記選択可能マーカーのそれぞれのコード配列は、２Ａリボソームスキップを介して繋がっている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
それを必要とする対象におけるＫＭＡ発現悪性腫瘍を処置する方法であって、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外抗原結合ドメインを発現するように操作された遺伝子改変Ｔ細胞を投与することを含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）を特異的に認識する方法。
【請求項８１】
前記ＫＭＡ発現悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはアミロイドーシスである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４１−ＢＢドメインである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
４１−ＢＢドメインをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識するｓｃＦｖを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｓｃＦｖは、ＫＭＡを認識し、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＣＤＲは、配列番号３〜８を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含み、前記ＶＬ鎖は、配列番号２を含み、前記ＶＨ鎖は、配列番号１を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記配列番号２のＶＬおよび配列番号１のＶＨは、グリシン−セリンリンカーを介して結合している、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｓｃＦｖは、スペーサーを介して前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはＣＤ８α鎖である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介して前記ｓｃＦＶに結合している、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０２】
前記グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである、請求項１０１に記載のＣＡＲ。
【請求項１０３】
前記１５アミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む、請求項１０２に記載のＣＡＲ。
【請求項１０４】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、１つ以上の追加の生体分子を発現するようにさらに操作された、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０５】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３ＣまたはＳＡＮＴ７の１つ以上を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＩＬ−１２であり、前記ＩＬ−１２は、柔軟性リンカーにより繋がったＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよびＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖ポリペプチドとして発現される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記柔軟性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
柔軟性リンカーにより繋がったＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよびＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む前記一本鎖ポリペプチドは、生物活性ｐ７０  ＩＬ−１２ヘテロ二量体を形成する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７、ＩＬ−１２および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃ、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現するように操作された、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１６】
１つ以上の追加の生物学的または薬学的に活性な薬剤を投与することをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項１１７】
前記１つ以上の追加の生物学的に活性な薬剤は、ＩＬ−１２、ＩＬ−６受容体拮抗薬またはＳＡＮＴ７を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記追加の薬学的に活性な薬剤は、１つ以上の化学療法剤を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記追加の薬学的に活性な薬剤は、免疫調節薬である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記免疫調節薬は、サリドマイドまたはその類似体である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記サリドマイド類似体は、アクチミド、レナリドミドまたはポマリドミドである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記追加の薬学的に活性な薬剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬は、パノビノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、デプシペプチド、フェニル酪酸、バルプロ酸、ベリノスタット、ＬＡＱ８２４、エンチノスタット、ＣＩ９４４、またはモセチノスタットである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記１つ以上の追加の生物学的または薬学的に活性な薬剤は、遺伝子改変Ｔ細胞による処置の前、その間、またはその後に投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２５】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、静脈内投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項１２６】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、患者に由来する、請求項８０に記載の方法。
【請求項１２７】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、患者に由来するものではない、請求項８０に記載の方法。
【請求項１２８】
ＨＧＦ結合タンパク質を発現するようにさらに操作された、請求項２６または２７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項１２９】
前記ＨＧＦ結合タンパク質は、ＨＧＦ抗体またはその断片である、請求項１２８に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
【請求項１３０】
前記１つ以上の追加の生体分子は、ＨＧＦ結合タンパク質である、請求項６７または１０４に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＨＧＦ結合タンパク質は、抗体またはその断片である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、幹細胞移植の前、その間またはその後に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記幹細胞移植は、同種幹細胞移植である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記幹細胞移植は、同種異系幹細胞移植である、請求項１３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国仮特許出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，９６８号、および２０１５年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１５８，４０７号からの優先権を主張し、これらはそれぞれ、全ての目的において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＨＭＬＸ＿００２＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約６３ＫＢであり、２０１６年４月２２日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、治療における最近の進展にも関わらず未だに治癒不能である、骨髄形質細胞の悪性腫瘍である。その臨床経過は、治療に対する初期の反応に続いて、最終的に全ての形態の処置に対する耐性を伴う度重なる再発を特徴とする。これはまた、重篤な病的状態および障害に関連するが、これらは共に、疾患自体および利用可能な処置からの毒性に起因する。
【０００４】
多発性骨髄腫は、カッパまたはラムダ軽鎖制限モノクローナルパラプロテインのいずれかを分泌する悪性形質細胞を特徴とする。カッパ制限は、骨髄腫患者の６０％に生じ、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）の発現は、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪性腫瘍に大きく制限される。ＫａｐｐａＭａｂは、第１相および第２相臨床試験において安全性および効能を示したＫＭＡ特異的モノクローナル抗体である。
【０００５】
モノクローナル抗体単独による処置は、治癒的ではなく、腫瘍の不完全な根絶を伴い、最終的には再発をもたらす。これは、（受動拡散による）腫瘍内への抗体の不十分な貫通、腫瘍細胞上での抗原発現の不均一性、または抗体依存的細胞毒性のメカニズムに対する腫瘍細胞の抵抗性に起因し得る。したがって、長期的疾患治癒を提供し得る、毒性の低い効果的な治療法が必要とされている。
【０００６】
キメラ抗原受容体を保持するＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、この問題に対する解決策となる可能性がある。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、モノクローナル抗体の抗原結合ドメインを、Ｔ細胞の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と合わせ、局所的な腫瘍特異的免疫反応を生成する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍内に活発に移動する、抗原を保持する腫瘍細胞に応答して増殖する、免疫応答の他のアームを動員する因子を分泌する、および長期的に生存して再発からの持続的保護を提供し得るといった、モノクローナル抗体に勝るいくつかの利点を有する。同じ抗原を標的化する抗体治療に勝るＣＡＲ−Ｔ細胞の別の利益は、ＣＡＲ  Ｔ細胞がまた、安全性および機能を向上させるためにさらに改質され得るという点である。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞特異性、およびＴ細胞（複数可）ががん細胞もしくは腫瘍に浸潤する能力を向上させるホーミング受容体の発現を含むように改質され得るか、または、それらは、毒性が生じた場合に細胞を排除するように機能し得る「オフスイッチ」を含んでもよい。さらに、ならびに多発性骨髄腫およびの関連障害の処置に重要なことに、Ｔ細胞は、例えば腫瘍抑制サイトカイン等の抗腫瘍反応を向上させ得る、追加の生物学的に活性または薬学的に活性な分子を発現するように改質されてもよい。本明細書に記載のように、本発明者は、ＭＭ細胞上にのみ発現した特定の立体構造ＫＭＡエピトープに特異的に結合することができる、新規ＣＡＲコンストラクトを設計し、またこのエピトープに特異的な細胞外抗原結合ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを単独で、または抗腫瘍免疫メディエーターの発現と組み合わせて発現するように、ＣＡＲ  Ｔ細胞を操作した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、カッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）に特異的であるが、抗ＫＭＡ  Ｔ細胞反応を誘発することができる細胞内シグナル伝達ドメインを含有するキメラ抗体受容体（ＣＡＲ）、そのようなＣＡＲを含有するＴ細胞、およびＫＭＡ特異的ＣＡＲを投与することにより多発性骨髄腫および関連障害を処置する方法を対象とする。得られるＣＡＲ  Ｔ細胞は、モノクローナル抗体および／または抗腫瘍サイトカインの全身送達に関連した望ましくない副作用を回避しながら、がん細胞に対する標的化された免疫反応を媒介することができる。
【０００８】
一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびカッパ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）を特異的に認識する細胞外抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインである。別の実施形態において、１つ以上の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である。一実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインを含む。別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。
【０００９】
一実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２１のＶＬ領域を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２２のＶＨ領域を含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲおよび配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域を含む。一実施形態において、配列番号２のＶＬ鎖および配列番号１のＶＨ鎖は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。一実施形態において、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。さらに別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘであり、式中、Ｘは、１〜５である。さらに別の実施形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。さらに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。一実施形態において、ｓｃＦｖは、スペーサーにより１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、免疫グロブリン定常領域を含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む。具体的実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ８αドメインを含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介してｓｃＦＶに結合している。さらに別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘであり、式中、Ｘは、１〜５である。さらに別の実施形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。さらに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を提供する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むＣＡＲを含む。具体的実施形態において、細胞外結合ドメインは、カッパ骨髄腫抗原を特異的に認識する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の追加の生体分子を発現するようにさらに操作される。一実施形態において、追加の１つ以上の分子は、ＩＬ−１２および／またはＳＡＮＴ７および／またはガレクチン−３Ｃ（ＧＡＬ３Ｃ）を含む。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、柔軟性リンカーにより繋がった１つのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよび１つのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖ポリペプチドを発現する。一実施形態において、ＩＬ−１２  ｐ３５およびＩＬ−１２  ｐ４０は、（Ｇ４Ｓ）３リンカーにより繋がっている。一実施形態において、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドは、生物活性ＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ二量体を形成する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、１つ以上の生体分子は、ＳＡＮＴ７である。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２およびＧＡＬ３Ｃを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７を発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。
【００１１】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）シグナル伝達およびエフェクター機能を阻害することができるＨＧＦ結合タンパク質を発現する。一態様において、ＨＧＦ結合タンパク質は、抗体またはその断片である。
【００１２】
一態様において、本発明は、遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための方法であって、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードする発現ベクターをＴ細胞に導入することを含む方法を提供する。具体的実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識する。一実施形態において、発現ベクターは、転位ベクター発現系である。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターである。別の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。一実施形態において、発現ベクターは、エレクトロポレーションにより細胞内に導入される。一実施形態において、ＣＡＲ内の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインである。別の実施形態において、１つ以上の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である。一実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインを含む。別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。一実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２１のＶＬ領域を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２２のＶＨ領域を含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲおよび配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域を含む。一実施形態において、配列番号２のＶＬ鎖および配列番号１のＶＨ鎖は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。一実施形態において、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。さらに別の実施形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。��らに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。一実施形態において、ｓｃＦｖは、スペーサーにより１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、免疫グロブリン定常領域を含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む。具体的実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ８αドメインを含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介してｓｃＦＶに結合している。さらに別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘであり、式中、Ｘは、１〜５である。さらに別の実施形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。さらに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。一実施形態において、方法は、１つ以上の追加の生体分子を発現するように操作された１つ以上の追加の発現ベクターを導入することをさらに含む。一実施形態において、追加の１つ以上の分子は、ＩＬ−１２および／またはＳＡＮＴ７および／またはＧＡＬ３Ｃを含む。一実施形態において、１つ以上の追加の発現ベクターは、柔軟性リンカーにより繋がった１つのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよび１つのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。一実施形態において、ＩＬ−１２  ｐ３５およびＩＬ−１２  ｐ４０は、（Ｇ４Ｓ）３リンカーにより繋がっている。一実施形態において、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする配列は、生物活性ＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ二量体をコードする。一実施形態において、１つ以上の生物学的に活性な薬剤を発現する発現ベクターはまた、選択可能マーカーを含む。一実施形態において、発現ベクターは、柔軟性リンカーにより繋がったＩＬ−１２  ｐ３５およびＩＬ−１２  ｐ４０を含む一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチド、ならびに２Ａリボソームスキップにより一本鎖ＩＬ−１２に繋がった選択可能マーカーをコードする配列を含む。一実施形態において、１つ以上の生体分子は、ＳＡＮＴ７である。一実施形態において、１つ以上の生物学的に活性な薬剤を発現する発現ベクターは、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーをコードする配列は、２Ａリボソームスキップ配列により繋がっている。一実施形態において、１つ以上の生物学的に活性な薬剤を発現する���現ベクターは、ＧＡＬ３ｃおよび選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーをコードする配列は、リボソームスキップ配列により繋がっている。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＩＬ−１２をコードする配列は、２Ａリボソームスキップを介して選択可能マーカーに連結され、ＳＡＮＴ７をコードする配列は、追加の２ＡリボソームスキップによりＩＬ−１２をコードする配列に接続されている。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃ、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＧＡＬ３Ｃをコードする配列は、２Ａリボソームスキップを介して選択可能マーカーに連結され、ＳＡＮＴ７をコードする配列は、追加の２ＡリボソームスキップによりＧＡＬ３Ｃをコードする配列に接続されている。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＩＬ−１２をコードする配列は、２Ａリボソームスキップを介して選択可能マーカーに連結され、ＧＡＬ３Ｃをコードする配列は、追加の２ＡリボソームスキップによりＩＬ−１２をコードする配列に接続されている。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃ、ＳＡＮＴ７、ＩＬ−１２および選択可能マーカーを含む。一実施形態において、ＧＡＬ３Ｃ、ＳＡＮＴ７、ＩＬ−１２および選択可能マーカーのそれぞれをコードする配列は、２Ａリボソームスキップ配列を介して接続される。
【００１３】
一実施形態において、ＫＭＡ発現悪性腫瘍を処置するための方法が提供される。一実施形態において、ＫＭＡ発現悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。さらなる実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはアミロイドーシスである。具体的実施形態において、方法は、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、アミロイドーシス、またはＫＭＡを発現する別のＢ細胞悪性腫瘍に罹患した対象に、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＫＭＡを特異的に認識する細胞外抗原結合ドメインを発現するように操作された遺伝子改変Ｔ細胞を投与することを含む。一実施形態において、ＣＡＲ内の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激エンドドメインである。別の実施形態において、１つ以上の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインもしくはＯＸ−４０ドメインまたはそれらの組み合わせの１つ以上である。一実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＣＤ２８ドメインを含む。別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＯＸ−４０ドメインを含む。一実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＫＭＡを特異的に認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＫａｐｐａＭａｂに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２１のＶＬ領域を含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦＶは、配列番号２２のＶＨ領域を含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲおよび配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域を含む。一実施形態において、配列番号２のＶＬ鎖および配列番号１のＶＨ鎖は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。一実施形態において、配列番号２１のＶＬ領域および配列番号２２のＶＨ領域は、グリシン−セリンリンカーを介して結合している。さらに別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘであり、式中、Ｘは、１〜５である。さらに別の実��形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。さらに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。一実施形態において、ｓｃＦｖは、スペーサーにより１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合している。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、免疫グロブリン定常領域を含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの１つ以上を含む。具体的実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンヒンジドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ８αドメインを含むスペーサーにより１つ以上の細胞内ドメインに結合している。一実施形態において、スペーサーは、グリシン−セリンリンカーを介してｓｃＦＶに結合している。さらに別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘであり、式中、Ｘは、１〜５である。さらに別の実施形態において、グリシン−セリンリンカーは、１５〜２０アミノ酸リンカーである。さらに別の実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸グリシンセリンリンカーであり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。一実施形態において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、配列番号２３である。別の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、１つ以上の追加の生体分子を発現するようにさらに操作される。一実施形態において、追加の１つ以上の分子は、ＩＬ−１２および／またはＳＡＮＴ７および／またはＧＡＬ３Ｃを含む。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、柔軟性リンカーにより繋がった１つのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよび１つのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを含む一本鎖ポリペプチドを発現する。一実施形態において、ＩＬ−１２  ｐ３５およびＩＬ−１２  ｐ４０は、（Ｇ４Ｓ）３リンカーにより繋がっている。一実施形態において、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドは、生物活性ＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ二量体を形成する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、１つ以上の生体分子は、ＳＡＮＴ７である。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、選択可能マーカーは、ＧＡＬ３Ｃである。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７および選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７���ＧＡＬ３Ｃおよび選択可能マーカーを発現する。
【００１４】
さらなる実施形態において、方法は、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、アミロイドーシス、またはＫＭＡを発現する別のＢ細胞悪性腫瘍に罹患した患者に、ＨＧＦ結合タンパク質をさらに投与することを含む。一実施形態において、ＨＧＦ結合タンパク質は、抗体またはその断片である。一実施形態において、得られるＣＡＲ  Ｔ細胞がＨＧＦ結合タンパク質も発現するように、ＨＧＦ結合タンパク質を含む発現ベクターが、ＣＡＲコンストラクトをコードする発現ベクターと共にＴ細胞内に共トランスフェクトされる。
【００１５】
別の実施形態において、方法は、１つ以上の追加の生物学的または薬学的に活性な薬剤を投与することを含む。一実施形態において、１つ以上の追加の薬学的に活性な薬剤は、化学療法剤である。別の実施形態において、１つ以上の薬学的に活性な薬剤は、免疫調節薬である。具体的実施形態において、免疫調節薬は、サリドマイドまたはその類似体である。さらに別の実施形態において、サリドマイド類似体は、アクチミド、レナリドミドまたはポマリドミドである。さらに別の実施形態において、追加の薬学的に活性な薬剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬である。さらに別の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬は、パノビノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、デプシペプチド、フェニル酪酸、バルプロ酸、ベリノスタット、ＬＡＱ８２４、エンチノスタット、ＣＩ９４４、またはモセチノスタットである。さらに別の実施形態において、１つ以上の追加の生物学的または薬学的に活性な薬剤は、上記遺伝子改変Ｔ細胞による処置の前、その間、またはその後に投与される。さらに別の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、静脈内投与される。さらに別の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、上記患者に由来する。さらに別の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、上記患者に由来するものではない。
【００１６】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、同種幹細胞移植の前、その間またはその後に投与される。さらに別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、同種幹細胞移植の前、その間またはその後に投与される。
【００１７】
本発明の上記で特徴付けられたこれらの態様、および他の態様は、いくつかの解説された実践および応用において例示されるが、そのいくつかが図に示され、続く特許請求の範囲のセクションにおいて特徴付けられる。しかしながら、上記概要は、本発明のそれぞれの解説された実施形態または全ての実践を説明することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の新規な特徴は、付属する特許請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態、および添付の図面を参照することにより得られる。
【００１９】
【図１】免疫グロブリン（ＩｇＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するＣＡＲの構造的関係を示す図である。図１Ａは、ポリペプチドリンカーにより重鎖可変領域（ＶＨ）に繋がった親抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が、ＣＡＲに抗原特異性を付与することを示している。柔軟なヒンジが、ｓｃＦｖを、ＣＤ３ゼータが続くＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＯＸ−４０等の共刺激分子の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに接続する。図１Ｂは、ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞が、標的抗原（Ａｇ）を保持する遭遇する腫瘍細胞上で活性化され、腫瘍細胞溶解をもたらすことを示す。
【図２】キメラ抗原受容体機能の構造的決定因子を示す図である。
【図３】原発性骨髄腫細胞上でのＫＭＡ発現を示す図である。
【図４Ａ】ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ機能を示す図である。図４Ａは、様々な細胞株上のＫＭＡ発現のフローサイトメトリー分析であり、図４Ｂは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入（上のプロット）および非形質導入（下のプロット）ＣＤ８＋  Ｔ細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）発現である。図４Ｃは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入Ｔ細胞によるＫＭＡ陽性および陰性細胞株の特異的溶解を示す図である。
【図４Ｂ】ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ機能を示す図である。図４Ａは、様々な細胞株上のＫＭＡ発現のフローサイトメトリー分析であり、図４Ｂは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入（上のプロット）および非形質導入（下のプロット）ＣＤ８＋  Ｔ細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）発現である。図４Ｃは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入Ｔ細胞によるＫＭＡ陽性および陰性細胞株の特異的溶解を示す図である。
【図４Ｃ】ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ機能を示す図である。図４Ａは、様々な細胞株上のＫＭＡ発現のフローサイトメトリー分析であり、図４Ｂは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入（上のプロット）および非形質導入（下のプロット）ＣＤ８＋  Ｔ細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）発現である。図４Ｃは、ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚ形質導入Ｔ細胞によるＫＭＡ陽性および陰性細胞株の特異的溶解を示す図である。
【図５Ａ】５×１０５〜５×１０６の骨髄腫細胞を注射されたＲＰＭＩ−Ｒａｇマウスを示す図である。
【図５Ｂ】ＣＤ１３８＋  ＲＰＭＩ９２２６細胞による骨髄および脾臓の浸潤を示す図である。
【図５Ｃ】進行性疾患に対する血清ヒトラムダ軽鎖の上昇したレベルを示す図である。
【図５Ｄ】骨髄内のＣＤ１３８＋／細胞質ラムダ軽鎖陽性細胞を示す図である。
【図５Ｅ】治療モデルとしてのＲＰＭＩ−Ｒａｇマウスを示す図である。
【図６Ａ】ＫＭＡ．ＣＡＲの最適化を示す図である。図６Ａは、初期ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚコンストラクトを示し、図６Ｂは、Ｉｇ重鎖ヒンジおよびＣＨ３またはヒンジのみを有するコンストラクトを示す。図６Ｃは、最適ヒンジ領域（ｏｐｔｉ）を、様々な共刺激分子エンドドメインおよびＣＤ３ゼータの組み合わせと組み合わせたコンストラクトを示す。
【図６Ｂ】ＫＭＡ．ＣＡＲの最適化を示す図である。図６Ａは、初期ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚコンストラクトを示し、図６Ｂは、Ｉｇ重鎖ヒンジおよびＣＨ３またはヒンジのみを有するコンストラクトを示す。図６Ｃは、最適ヒンジ領域（ｏｐｔｉ）を、様々な共刺激分子エンドドメインおよびＣＤ３ゼータの組み合わせと組み合わせたコンストラクトを示す。
【図６Ｃ】ＫＭＡ．ＣＡＲの最適化を示す図である。図６Ａは、初期ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚコンストラクトを示し、図６Ｂは、Ｉｇ重鎖ヒンジおよびＣＨ３またはヒンジのみを有するコンストラクトを示す。図６Ｃは、最適ヒンジ領域（ｏｐｔｉ）を、様々な共刺激分子エンドドメインおよびＣＤ３ゼータの組み合わせと組み合わせたコンストラクトを示す。
【図７】ＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７ベクターを示す図である。
【図８Ａ】実施例３に記載のコンストラクトによるＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞増加およびＣＡＲ発現を示す図である。図８Ａは、ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞株の添加あり（左）およびなし（右）での、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物中の全細胞の増加を示す。図８Ｂは、ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞株あり（上のプロット）およびなし（下のプロット）での培養物中のＧＦＰにより測定されるＣＡＲ発現を示す。ｈＣＨ２ＣＨ３＝ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ  Ｔ細胞、ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＝ＫＭ．ＣＡＲ  ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞、ｈ＝ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞、ＣＤ８ａ＝  ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞。
【図８Ｂ】実施例３に記載のコンストラクトによるＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞増加およびＣＡＲ発現を示す図である。図８Ａは、ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞株の添加あり（左）およびなし（右）での、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物中の全細胞の増加を示す。図８Ｂは、ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞株あり（上のプロット）およびなし（下のプロット）での培養物中のＧＦＰにより測定されるＣＡＲ発現を示す。ｈＣＨ２ＣＨ３＝ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ  Ｔ細胞、ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＝ＫＭ．ＣＡＲ  ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞、ｈ＝ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞、ＣＤ８ａ＝  ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞。
【図９】活性化誘導性トランスポゾンカセットの構造を示す図である。ＩＲ＝逆方向反復、Ｉｎｓ＝遺伝子挿入の２つの末端に隣接するインシュレーター、ＮＦＡＴｐｒｏ＝活性化誘導性プロモーター、ＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＥＦ１α＝ヒト延長因子−１アルファプロモーター、ＲＱＲ８＝マーカー、ＳＶ４０＝シミアンウイルス後期ポリアデニル化シグナル。
【図１０】活性化誘導プロモーター制御下でのｅＧＦＰの発現を示す図である。ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激された形質導入ＰＢＭＣ（右プロット）を、ＲＱＲ８（ｘ軸）およびｅＧＦＰ（ｙ軸）の同時発現に関して評価し、非刺激対照（左プロット）と比較した。形質導入された細胞は、刺激の非存在下ではｅＧＦＰを発現しなかった。形質導入された細胞の５０パーセントは、刺激によりｅＧＦＰを発現した。
【図１１】ＣＡＲおよび生物製剤を有する活性化誘導性トランスポゾンカセットの構造を示す図である。ＩＲ＝逆方向反復、Ｉｎｓ＝遺伝子挿入の２つの末端に隣接するインシュレーター、ＮＦＡＴｐｒｏ＝活性化誘導性プロモーター、ＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＥＦ１α＝ヒト延長因子−１アルファプロモーター、ＳＶ４０＝シミアンウイルス後期ポリアデニル化シグナル。
【図１２Ａ】ＫＭＡ＋およびＫＭＡ−細胞株を用いたＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ  Ｔ細胞（図１２Ａ）またはＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）標準クロム放出アッセイの、ＫＭＡ特異的インターフェロンガンマ生成および細胞毒性を示す図である。使用されたＫＭＡ陽性細胞株は、ＪＪＮ３、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＮＣＩ−Ｈ９２９を含んでおり、一方ＫＭＡ陰性細胞株は、Ｎａｌｍ−６およびＭｏｌｔを含んでいた。
【図１２Ｂ】ＫＭＡ＋およびＫＭＡ−細胞株を用いたＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ  Ｔ細胞（図１２Ａ）またはＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）標準クロム放出アッセイの、ＫＭＡ特異的インターフェロンガンマ生成および細胞毒性を示す図である。使用されたＫＭＡ陽性細胞株は、ＪＪＮ３、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＮＣＩ−Ｈ９２９を含んでおり、一方ＫＭＡ陰性細胞株は、Ｎａｌｍ−６およびＭｏｌｔを含んでいた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は全て、本発明が関連する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で説明されているのと同様または等価のいかなる方法および材料も、本発明の試験の実践において使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書において説明される。本発明を説明および請求する上で、以下の定義が使用される。また、本明細書において使用される専門用語は、限定を意図せず、むしろ具体的実施形態を説明するために本明細書において使用されることが理解される。
【００２１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的な目的語の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つまたは１つ以上）を指すように使用される。
【００２２】
「発現ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、発現される核酸配列に動作可能に連結した少なくとも１つの発現制御配列を含む組み換え核酸配列を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に要する全ての必要なシス作用要素を含む。発現ベクターの例は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、および発現される組み換えポリヌクレオチドをコードするウイルスを含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ゲノム、例えばＰｉｇｇｙＢａｃ発現系に統合することができる転位因子を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、宿主ゲノム内への発現ベクターの内容の統合を可能にするウイルスベクター、例えばレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターである。
【００２３】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作された受容体を意味する。ＣＡＲの最も一般的な種類は、Ｔ細胞共受容体の膜貫通および細胞内ドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、例えばＣＤ３ζ鎖を含むが、本明細書に記載の発明は、これらのドメインに限定されない。むしろ、本明細書において使用される場合、「キメラ抗体受容体」または「ＣＡＲ」は、発現するように操作された任意の受容体、および任意の細胞内シグナル伝達分子に融合または連結した細胞外抗原結合ドメインを指す。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴリンパ球を指す。ＣＡＲ  Ｔ細胞の定義は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびエフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞等を含むＴリンパ球の全てのクラスおよびサブクラスを包含する。遺伝子改変されたＴリンパ球は、遺伝子改変Ｔ細胞を使用した処置を受ける対象に「由来する」、もしくはその対象から「得られた」ものであってもよく、または、それらは、異なる対象に「由来する」、もしくはその対象から「得られた」ものであってもよい。
【００２５】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、Ｔ細胞内に見られる、または見られるように操作されているＣＡＲの部分を意味する。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、Ｔ細胞の形質膜にＣＡＲを固定する「膜貫通ドメイン」もまた含有してもよく、または含有しなくてもよい。一実施形態において、「膜貫通ドメイン」および「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、同じタンパク質に由来し（例えばＣＤ３ζ）、他の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインは、異なるタンパク質に由来する（例えば、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインおよびＣＤ２８分子の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその逆も成り立つ）。
【００２６】
「共刺激エンドドメイン」とは、Ｔ細胞共刺激分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその断片を意味する。Ｔ細胞共刺激分子の限定されないリストは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７０、ＣＤ３０およびＩＣＯＳを含む。共刺激エンドドメインは、同じまたは異なる共刺激エンドドメインからの膜貫通ドメインを含んでもよく、または含まなくてもよい。
【００２７】
「細胞外抗原結合ドメイン」とは、対象となる抗原を特異的に認識しそれに結合するＣＡＲの部分を意味する。「細胞外結合ドメイン」は、モノクローナル抗体に由来してもよい。例えば、「細胞外結合ドメイン」は、モノクローナル抗体からのＦａｂドメインの全てまたは一部を含んでもよい。ある特定の実施形態において、「細胞外結合ドメイン」は、特定のモノクローナル抗体の相補性決定領域を含む。さらに別の実施形態において、「細胞外結合ドメイン」は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００２８】
「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体の可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖の融合タンパク質を意味し、ＶＬとＶＨとの間にペプチドリンカーを有する。リンカーの長さおよび組成は、使用される抗体部分に依存して変動するが、一般に、約１０から約２５アミノ酸の間の長さである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、柔軟性を提供するためにグリシンに富む。いくつかの実施形態において、リンカーはまた、理論に束縛されないが、溶解度に役立ち得るセリンおよび／またはトレオニンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号２３を有するアミノ酸である。ＳｃＦｖは、免疫グロブリン重鎖を有さないにも関わらず、可変鎖が由来した親抗体の抗原結合特異性を保持するように設計される。いくつかの実施形態において、ＶＨおよびＶＬからの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが、ｓｃＦＶにおいて使用される。いくつかの実施形態において、ＶＬおよびＶＨ鎖全体が使用される。
【００２９】
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源または組み換え源に由来する無傷免疫グロブリンであってもよく、また無傷免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む、様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｉｎ：  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語はまた、抗体断片を包含する。
【００３０】
「抗体断片」という用語は、無傷抗体の一部を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例は、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、直鎖抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３１】
「抗体重鎖」は、本明細書において使用される場合、その自然発生的立体構造における全ての抗体分子に存在する２種のポリペプチド鎖の大きい方を指す。
【００３２】
「抗体軽鎖」は、本明細書において使用される場合、その自然発生的立体構造における全ての抗体分子に存在する２種のポリペプチド鎖の小さい方を指す。κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、特定の抗原を認識しそれに結合する抗体の２つの可変鎖（重鎖および軽鎖）の一部を指す。ＣＤＲは、可変鎖の最も可変の部分であり、抗体にその特異性を提供する。可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖のそれぞれにおいて３つのＣＤＲが存在し、したがって、抗体分子当たり合計６つのＣＤＲが存在する。
【００３４】
「ＫａｐｐａＭａｂ」とは、以前にＩＳＴ−１０９７またはＭＤＸ−１０９７と呼ばれていたモノクローナル抗体を意味する。さらに、本明細書において使用される場合、ＫａｐｐａＭａｂは、ＫａｐｐａＭａｂ抗体の完全抗体配列を指してもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３４４，７１５号および米国特許第７，５５６，８０３号を参照されたい）。さらに、「ＫａｐｐａＭａｂ」という用語は、本明細書において使用される場合、配列番号３〜８のＣＤＲ配列、および／または配列番号２のＶＬ配列、および配列番号１のＶＨ配列を含有する任意のポリペプチドを包含するように使用される。  「ＫａｐｐａＭａｂ」という用語は、本明細書において使用される場合、配列番号２１のＶＬ配列および配列番号２２のＶＨ配列を含有する任意のポリペプチドを包含し得る。本発明の組成物および方法において、ＫａｐｐａＭａｂは、完全モノクローナル抗体、またはＦａｂおよびｓｃＦｖを含むその任意の抗原結合断片を含んでもよい。
【００３５】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体／免疫グロブリン）により認識される分子として定義される。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫反応を惹起する分子である。この免疫反応は、抗体生成、あるいは特定の免疫適格細胞の活性化、細胞毒性メディエーター、または免疫刺激もしくは制御性サイトカインの放出のいずれかを含み得る。当業者には、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として機能し得ることが理解される。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」または「特異的に認識する」という用語は、抗体、抗体断片またはＣＡＲに関連して使用される際には、特定の抗原を認識するが試料中の他の分子を実質的に認識しない、またはそれに結合しない抗体、抗体断片またはＣＡＲを指す。
【００３７】
「リボソームスキップ」とは、特定のペプチドが、細胞のリボソームが新たに挿入されたアミノ酸を共有結合的に連結するのを防止し、その代わりに翻訳を継続させ、したがってポリタンパク質の共翻訳開裂をもたらす、代替の翻訳メカニズムを意味する。このプロセスは、「２Ａリボソームスキップ」要素またはシス作用加水分解酵素要素（例えばＣＨＹＳＥＬ配列）により誘導される。いくつかの実施形態において、この配列は、強いアルファ螺旋傾向を有する非保存アミノ酸配列に続いてコンセンサス配列−Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ  Ｐ（式中、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。ＧとＰとの間で明らかな開裂が生じる。いくつかの実施形態において、リボソームスキップ要素は、２Ａリボソームスキップ要素である。２Ａリボソームスキップ要素は、５’Ｔ２Ａリボソームスキップ要素であってもよい。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「免疫調節薬」または「ＩＭｉＤ」は、サリドマイドおよびその類似体を構成する薬物のクラスである。サリドマイド類似体は、レナリドミド、ポマリドミドおよびアプレミラストを含む。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬」または「ＨＤＡＣ阻害薬」または「ＨＤＩ」は、ヒストン脱アセチル化酵素の機能に干渉する化合物のクラスを指す。ＨＤＩの例は、これらに限定されないが、例えばトリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）を含むヒロキサム酸（ｈｙｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）；例えばデプシペプチドおよびタポキシン（ｔａｐｏｘｉｎ）Ｂを含む環状トリペプチド；例えばエンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）を含むベンズアミド；求電子性ケトン；ならびに例えばフェニルブチレートおよびバルプロ酸等の脂肪族化合物を含む。
【００４０】
カッパ骨髄腫抗原および抗体
カッパ骨髄腫抗原またはＫＭＡは、骨髄腫細胞の表面上に見られる細胞膜抗原である。具体的には、ＫＭＡは、細胞膜上のアクチンと非共有結合的に関連した遊離カッパ軽鎖からなる（Ｇｏｏｄｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１２７６）。ＫＭＡに特異的に結合する任意の抗体が、本明細書に従って使用され得るが、好ましい実施形態において、ＫａｐｐａＭａｂモノクローナル抗体は、本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインの基礎として使用される。ＫａｐｐａＭａｂとして指定される（以前はＩＳＴ−１０９７として指定されていた、ＭＤＸ−１０９７としても知られる）モノクローナル抗体は、カッパ鎖が重鎖に関連していない、したがって無傷カッパ鎖含有ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＡに結合していない場合にのみ利用可能である、ヒトカッパ遊離軽鎖のスイッチ領域における立体構造エピトープに結合する（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。患者の骨髄生検に由来する原発性骨髄腫細胞上のＫＭＡの典型的な発現は、図３においてＫａｐｐａＭａｂ結合により示されている。ＫａｐｐａＭａｂ抗体は、配列番号１のＶＨ鎖および配列番号２のＶＬ鎖を含み得る。より具体的には、ＫａｐｐａＭａｂ  ＶＨ鎖は、配列番号３〜５のＣＤＲ、および配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲを含み得る。さらに、ＫａｐｐａＭａｂは、配列番号２２のＶＨ領域および配列番号２１のＶＬ領域を含み得る。
【００４１】
キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、一連のリンカー（複数可）およびスペーサー（複数可）により互いに保持された、モノクローナル抗体の腫瘍抗原結合領域、および単一ポリペプチド鎖におけるＴ細胞受容体複合体の細胞内活性化部分からなる、人工的受容体である（図１Ａ〜１Ｂ）。最も一般的には、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインに融合した一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）の融合タンパク質である。しかしながら、ＣＤ２８、４１−ＢＢおよびＯｘ４０等の他の細胞内シグナル伝達ドメインが、様々な組み合わせで使用され、所望の細胞内シグナルを生じてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲは、Ｉｇ重鎖リーダーペプチドを含む。リーダーペプチドは、配列番号２０であってもよい。
【００４２】
Ｉ．細胞外抗原結合ドメイン
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＭＭ細胞上に発現した１つ以上のＫＭＡエピトープに特異的であるモノクローナル抗体からの細胞外抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＫａｐｐａＭａｂからの細胞外抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、細胞外結合ドメインは、配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲおよび配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲを含む。具体的実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＫａｐｐａＭａｂのＶＬ（配列番号２）ドメインおよびＶＨ（配列番号１）ドメインを含むｓｃＦｖである。別の実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＫａｐｐａＭａｂのＶＬ（配列番号２１）ドメインおよびＶＨ（配列番号２２）ドメインを含むｓｃＦｖである。
【００４３】
ＩＩ．ＫａｐｐａＭａｂ  ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカー
さらなる実施形態において、ＫａｐｐａＭａｂ  ＶＬは、柔軟性リンカーを介してＫａｐｐａＭａｂ  ＶＨに連結している。具体的には、柔軟性リンカーは、約１０〜３０アミノ酸（例えば、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸）のグリシン／セリンリンカーであり、構造（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。具体的実施形態において、リンカーは、１５アミノ酸の長さである。リンカーの長さは、ＣＡＲの重要な決定因子である。理論に束縛されないが、より短いリンカーは、親和性を向上させ得るが、同時に細胞内多量体形成をもたらし、したがってＣＡＲの発現を低下させ得、一方、より長いリンカーは、ＶＬおよびＶＨ  ＣＤＲを空間的により遠くに移動させることにより、抗原親和性を減少させる傾向を有する。
【００４４】
ＩＩＩ．細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間のスペーサー
細胞外抗原結合ドメイン（例えばＫａｐｐａＭａｂ  ｓｃＦｖ）は、「スペーサー」の使用により、細胞内シグナル伝達ドメインに連結している。スペーサーは、抗原認識および結合を促進するような様式での抗原結合ドメインの配向を可能にするのに十分に柔軟となるように設計される。スペーサーは、免疫グロブリン自体に由来してもよく、またＩｇＧ１ヒンジ領域、またはＩｇＧのＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域を含み得る。代替として、ヒンジは、ＣＤ８α鎖の全てまたは一部を含んでもよい。スペーサー（複数可）の長さおよび柔軟性は、抗原認識ドメインおよび細胞内結合領域の両方に依存し、１つのＣＡＲコンストラクトに対して機能的および／または最適となり得るものは、別のＣＡＲに対してはそうではない可能性がある。ある特定の場合において、最適なスペーサーの識別および長さが、使用される細胞外結合部分および選択される細胞内シグナル伝達ドメインに依存して変動することを示すために、スペーサーは、本明細書において「ｏｐｔｉ」として指定され得る（例えば図６Ａ〜６Ｃ）。ある特定の実施形態において、ＩｇＧヒンジのみが使用される。他の実施形態において、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインの全てまたは一部と共に使用される。他の実施形態において、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの全てまたは一部と共に使用される。他の実施形態において、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方の全てまたは一部と共に使用される。他の実施形態において、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインの全てまたは一部が使用される。他の実施形態において、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの全てまたは一部が使用される。さらに他の実施形態において、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方の全てまたは一部が使用される。一実施形態において、本明細書で提供されるコンストラクトのいずれかにおいて使用されるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７のアミノ酸位置１０３におけるヒンジ領域でのＣからＰの突然変異を含む。一実施形態において、本明細書で提供されるコンストラクトのいずれかにおいて使用されるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、配列番号２４である。別の実施形態において、ヒンジは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方の全てまたは一部と共に使用され、Ｆｃ受容体とのＣＨ２相互作用に重要なアミノ酸において突然変異が導入される。これらの突然変異は、本明細書で提供されるＣＡＲ  Ｔ細胞とのＦｃ相互作用を減少させることにより、改善された注入後生存率を媒介し得る。これらの突然変異の例は、本明細書で提供されるような実施例３において示されるＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚコンストラクトにおいて確認され得る。さらなる実施形態において、ＣＤ８αポリペプチドが使用される。さらなる実施形態において、スペーサー（例えば、本明細書に記載のような免疫グロブリンドメインに由来する）は、柔軟性リンカーを介してｓｃＦＶに結合してもよい。具体的には、柔軟性リンカーは、約１０〜３０アミノ酸（例えば、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸）のグリシン／セリンリンカーであり、構造（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ（式中、Ｘは、１〜５である）を含む。他の実施形態において、グリシン／セリンリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。
【００４５】
ＩＶ．細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖の全てまたは一部を含む。ＣＤ２４７としても知られるＣＤ３ζは、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞共受容体のいずれかと共に、細胞外抗原認識を細胞内シグナル伝達カスケードに連結することを担う。一実施形態において、本明細書で提供されるコンストラクトのいずれかにおいて使用されるＣＤ３ζは、配列番号２６である。
【００４６】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むことに加えて、共刺激分子の含有は、マウスモデルおよび臨床試験におけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性を向上させることが示されている。ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２７０、ＣＤ３０およびＯＸ−４０を含むいくつかが調査されている。本発明のＣＡＲは、ＫａｐｐａＭａｂ  ｓｃＦｖ、柔軟性リンカー、最適ヒンジおよびＣＤ３ζ鎖を含むことに加えて、例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２７０、ＣＤ３０および／またはＯＸ−４０からの１つ以上の追加の共刺激ドメインも含む。これらの共刺激ドメインは、得られるＣＡＲ  Ｔ細胞の所望の機能性に基づいて選択される。例示的な組み合わせが、例えば図６Ａ〜６Ｃに示されている。細胞外ヒンジの長さを変更することに加えて、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ）の特定の組み合わせの含有もまた、ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖および生存を向上させる。一実施形態において、本明細書で提供されるコンストラクトのいずれかにおいて使用されるＣＤ２８ドメインは、配列番号２５である。
【００４７】
生物学的に活性な分子の同時発現
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＫａｐｐａＭＡｂ単独の使用と比較して、組成物の抗腫瘍機能および／または安全性を向上させるために追加の生物学的に活性な分子を含有するようにさらに改変可能である追加的利益を有する。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全身毒性を回避しながら腫瘍微小環境／がん細胞への集中的な送達を可能にする、抗腫瘍サイトカインを生成するようにさらに遺伝子改変され得る。本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍反応を向上させ得る追加の生物学的に活性な分子の例は、これらに限定されないが、ＩＬ−１２、炭水化物結合タンパク質ガレクチン−３（ＧＡＬ３）またはその切断形態ＧＡＬ３Ｃ、およびサイトカイン受容体超拮抗薬ＳＡＮＴ７を含む。別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）結合タンパク質を発現するプラスミドと同時形質導入されてもよい。一実施形態において肝細胞成長因子タンパク質は、ＨＧＦに結合してその機能を阻害し得る抗体またはその断片である。
【００４８】
ＩＬ−１２は、腫瘍成長および血管形成を減少させ、腫瘍特異的免疫反応を向上させる、強力な腫瘍抑制サイトカインである。多発性骨髄腫細胞は、ＩＬ−１２受容体の発現を維持し、骨髄腫保持マウスへのＩＬ−１２の投与は、単剤として腫瘍進行を減少させ、プロテアソーム阻害薬ボルテゾミブと相乗的に作用する（Ａｉｒｏｌｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ，  １１２（３）：７５０−７５９、Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，  ２５（３）：  ２８２−２８８）。ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＬ−１２の発現は、固形腫瘍を根絶するその能力を劇的に向上させるが、このアプローチは、多発性骨髄腫においてはまだ調査されていない（Ｐｅｇｒａｍ，（２０１２）Ｂｌｏｏｄ，  １１９（１８０：４１３３−４１４１およびＺｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９（４）：７５１−７５９）。
【００４９】
ＳＡＮＴ７は、サイトカイン受容体超拮抗薬である。これは、ＩＬ−６受容体αサブユニットへの結合を７０倍向上させるように遺伝子改変されたＩＬ−６の類似体であり、ｇｐ１３０シグナル伝達サブユニットとの相互作用は事実上ない。ＳＡＮＴ７は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでＩＬ−６依存性骨髄腫細胞株におけるアポトーシスを誘導し、ｉｎ−ｖｉｔｒｏおよびマウスモデルにおいてデキサメタゾンに対する間質媒介耐性を克服し、ＮＦκＢ阻害薬と組み合わせてアポトーシスに対する耐性を完全に克服する。ＩＬ−６は、多発性骨髄腫、肺がん、結腸直腸がん、乳がんおよびその他を含む様々な腫瘍の成長および生存において役割を担うサイトカインである。ＩＬ−６のその受容体への結合は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化し、その後、アポトーシスに対する耐性をもたらす、ＢＣＬ−ＸＬおよびｐ５３等のアポトーシス関連遺伝子の発現を調節するＳＴＡＴ３のリン酸化を伴う。ＩＬ−６はまた、骨髄腫細胞上でのＩＬ−１２受容体の下方制御を促進し、ＩＬ−１２の腫瘍抑制特性を減少させる（Ａｉｒｏｌｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ，  １１２（３）：７５０−７５９）。ＩＬ−６受容体は、骨髄腫において上方制御され、ＩＬ−６の上昇した全身レベルは、不良な予後に相関している（Ｒａｗｓｔｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６（１２）３８８０−３８８６、Ｌｕｄｗｉｇ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ，  ７７（１２）：２７９４−２７９５）。ＩＬ−６に対するモノクローナル抗体が、臨床的使用に開発されているが、骨髄腫における初期の臨床試験は測定可能な生物学的効果を示したものの、抗体は、循環ＩＬ−６と複合体を形成し、クリアランスの低減およびその効用の潜在的な制限をもたらすと思われる（Ｂａｔａｉｌｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ，  ８６（２）：  ６８５−６９１）。最近、キメラＩＬ−６特異的モノクローナル抗体シルツキシマブが、再発性および難治性多発性骨髄腫における第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験において評価された。シルツキシマブ単独に対する反応はなかったが、治療関連感染症を経験した過半数において血液毒性が共通していた。
【００５０】
ガレクチン−３は、腫瘍接着および浸潤において役割を担い得る炭水化物結合タンパク質である。ガレクチン−３の切断された形態であるＧａｌ３Ｃは、ドミナントネガティブ型として機能し、骨髄腫細胞成長および浸潤を阻害し得る。活性化誘導分泌のためのＧａｌ３Ｃコンストラクトは、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ９（６）：２３７４−８３およびＭｉｒａｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ６（７）：ｅ２１８１１に基づいて設計された。これは、その炭水化物結合特性を保持するが、リガンド架橋に必要なＮ末端アミノ酸を有さない１４３アミノ酸カルボキシ末端からなる。コンストラクトはまた、分泌を誘導するためのＣＤ８−アルファリーダーペプチド、および検出のための６ｘＨｉｓタグを含有する。
【００５１】
ある特定の実施形態において、上述のＣＡＲコンストラクトを含有する発現ベクターに加えて、Ｔ細胞は、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７および／またはＧＡＬ３Ｃを含む１つ以上の発現ベクターでさらに改変される。具体的には、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットに連結したＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットを含む一本鎖ＩＬ−１２を発現する発現コンストラクトは、得られるタンパク質が完全に生物活性であるＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ二量体であるという点で特に有用であるが、単鎖ポリペプチドとして発現される。一実施形態において、Ｆｌｅｘｉ−１２と呼ばれる一本鎖ＩＬ−１２コンストラクトは、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８（９）：１１２５−３５において説明され、使用される。ＩＬ−１２一本鎖コンストラクトは、ＣＡＲコンストラクトと同じ発現ベクターにおいて発現されてもよく、または、別個の発現ベクターにおいて発現され、Ｔ細胞内に同時形質導入されてもよい。同様に、上述のＣＡＲコンストラクトで形質導入されたＴ細胞は、ＳＡＮＴ７および／またはＧＡＬ３Ｃを含む追加の発現ベクターで同時形質導入されてもよく、代替として、１つの発現ベクターを使用して、ＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃの単独または組み合わせ、ならびに上述のＣＡＲコンストラクトの両方でＴ細胞が形質導入されてもよい。別の実施形態において、１つはＣＡＲコンストラクトを発現し、１つは一本鎖ＩＬ−１２コンストラクトを発現し、１つはＳＡＮＴ７コンストラクトを発現する３つの発現ベクターが使用されてもよい。同様の戦略を使用して、ＧＡＬ３ＣをＩＬ−１２および／またはＳＡＮＴ７と同時発現させてもよい。代替として、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび／またはＳＡＮＴ７コンストラクトは、単一の発現ベクターを介して発現されてもよく、一方ＣＡＲコンストラクトは、それ自身の発現ベクターにより発現される。当業者には、同じＴ細胞におけるこれらの分子の発現の異なる組み合わせおよび可能性が理解される。
【００５２】
ＨＧＦ結合タンパク質
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）およびその受容体であるＭＥＴは、がんの発生および進行、特に腫瘍浸潤および転移性疾患への進行に関与している。多発性骨髄腫は、ＨＧＦおよびＭＥＴの両方を発現し、したがって自己分泌および傍分泌ループの両方を形成する一方で、正常な形質細胞はＨＧＦを発現しない（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｂｏｒｓｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）。さらに、ＨＧＦ濃度は、多発性骨髄腫に罹患した血漿患者の血液および骨髄中で著しく増加し、血清ＨＧＦレベルは、進行期の疾患および広範囲の骨病変に相関する（Ｓｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｗａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、Ａｌｅｘａｎｄｒａｋｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。さらに、ＫａｐｐａＭａｂによる第１相臨床試験における患者の血清バイオマーカー分析では、対照と比較して、ＫａｐｐａＭａｂによる処置後の血清ＨＧＦにおける統計的に有意な用量関連減少が示されている。血清ＨＧＦにおけるこの低減を向上させるために、ある特定の実施形態において、ＨＧＦ結合タンパク質が、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞において発現される。具体的実施形態において、発現されるＨＧＦ結合タンパク質は、抗体またはその断片である。具体的実施形態において、抗ＨＧＦ結合タンパク質は、抗体、ジアボディ、ｓｃＦｖまたはＦａｂである。一実施形態において、ＨＧＦ結合タンパク質は、ＣＡＲコンストラクトと同じ発現ベクターにおいて発現される。さらなる実施形態において、ＨＧＦ結合タンパク質は、別個の発現ベクターにおいて発現されるが、ＣＡＲコンストラクトと同時形質導入される。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質およびＩＬ−１２を発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質およびＳＡＮＴ７を発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質およびＧＡＬ３Ｃを発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質およびＩＬ−１２およびＧＡＬ３Ｃを発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質およびＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃを発現する。さらに別の実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、抗ＨＧＦ結合タンパク質、ＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７を発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ、ＨＧＦ結合タンパク質、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃを発現する。
【００５３】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法
一態様において、本明細書に記載のＣＡＲ（複数可）、ならびに任意選択で１つ以上の抗腫瘍サイトカイン（例えばＩＬ−１２および／もしくはＳＡＮＴ７）、ならびに／または１つ以上のＨＧＦ結合タンパク質を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するための方法が提供される。本発明のＣＡＲおよび抗腫瘍サイトカイン／抗体を含有する発現ベクターを構築する好ましい方法が本明細書に記載されるが、これらの構成成分を発現するためにＴ細胞を形質導入することができる任意の方法が使用され得ることが、当業者に容易に理解される。
【００５４】
一実施形態において、Ｔ細胞は、静脈穿刺、骨髄の吸引、定常状態の白血球除去輸血またはサイトカイン刺激白血球除去輸血、およびその後の密度勾配分離を使用したＴ細胞を含む末梢血単核細胞の単離により、対象の血液から得られる。ある特定の実施形態において、赤血球の溶解後、Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより分類され、またはＴ細胞および磁性ビーズ上に発現された抗原に対する抗体を使用して精製され、純粋なＴ細胞の集団が得られる。具体的実施形態において、Ｔ細胞は、そのＣＤ３の発現に基づいて分類され、完全Ｔ細胞分画が得られる。別の実施形態において、Ｔ細胞は、そのＣＤ４またはＣＤ８の発現に基づいて分類され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団が得られる。具体的実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療を必要とする対象から得られる。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の意図される受容者ではないドナー対象から得られる。
【００５５】
一実施形態において、分離されたＴ細胞は、その生存に好適な条件下でｉｎ  ｖｉｖｏで培養され、本明細書に記載のＣＡＲならびに／またはＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７、ＧＡＬ３Ｃおよび／もしくはＨＧＦ結合タンパク質の発現に必要な配列を含有する発現ベクターで形質導入される。一実施形態において、発現ベクターは、転位ベクター発現系である。具体的実施形態において、発現ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）である。一実施形態において、例えば本明細書で提供される実施例に記載のＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド等のＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドが誘導可能である。一実施形態において、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現プラスミドは、構成的に活性なプロモーターおよび／または活性化誘導性プロモーターを含む。構成的に活性なプロモーターは、延長因子−１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーターであってもよい。活性化誘導性プロモーターは、（ＮＦＡＴ  ｐｒｏ）プロモーターであってもよい。一実施形態において、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現プラスミドが使用され、ＣＡＲ、ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ−７、ＧＡＬ３Ｃおよび／またはＨＧＦ結合タンパク質をコードする配列を切断してＴ細胞のゲノム内にペーストすることにより、ＣＡＲの永久的統合を生成する。具体的実施形態において、本発明の発現ベクターは、１つ以上の発現ベクターで成功裏に形質導入されたＴ細胞の識別を可能にする、検出可能マーカーをさらに含む。一実施形態において、検出可能マーカーは、ＣＤ３４またはＣＤ２０または別の表面タンパク質等の細胞表面マーカー、フルオレセインイソチオシアネート、または例えばレーザー等によってより高いエネルギー状態に励起された場合に光を放出する任意の他の蛍光染料等のフルオロフォア、およびカナマイシン耐性、アンピシリン耐性、または形質導入されたＴ細胞が培養される培地中に含有される抗生物質に対する耐性を付与する任意の他のカセット等の抗生物質耐性カセットからなる群から選択される。一実施形態において、検出可能マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、向上したＧＦＰ、例えば本明細書で提供される実施例において示されるコンストラクト等であってもよい。具体的実施形態において、使用される各発現ベクター（例えば、１つの発現ベクターはＣＡＲを含み、１つはＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび／またはＳＡＮＴ−７を含み、１つはＨＧＦ結合タンパク質を含む）は、固有の検出可能マーカーを含む。一実施形態において、発現ベクターは、選択された発現ベクター（複数可）に好適な方法により、Ｔ細胞内に形質導入される。一実施形態において、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターは、エレクトロポレーションによりＴ細胞内に形質導入される。
【００５６】
適切な発現ベクターの導入後、Ｔ細胞は、自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および適切な成長因子との共培養によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養および増加され、さらに１つ以上の検出可能マーカーの存在に関してさらにスクリーニングされてもよい。選択された発現ベクターの適切な検出可能マーカーを発現する細胞は、次いで、本発明の方法における使用のために分類および精製されてもよい。
【００５７】
ＫＭＡ発現悪性腫瘍を処置する方法
一態様において、本明細書で提供されるＣＡＲ  Ｔ細胞により、それを必要とする対象を処置するための方法が提供される。具体的態様において、それを必要とする対象は、ＫＭＡを発現する悪性腫瘍、例えばＫＭＡを発現するＢ細胞悪性腫瘍を有すると診断された、またはそれを有することが疑われるヒト対象である。ある特定の実施形態において、患者は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはアミロイドーシスを有する、または有することが疑われる。ＫＭＡを発現するＢ細胞悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびアミロイドーシスを診断するための方法は、当技術分野において知られており、したがって本明細書において詳細には説明されない。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独で、または多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、アミロイドーシスもしくはＫＭＡを発現する別のＢ細胞悪性腫瘍の処置のための他の治療有効薬剤と組み合わせて使用され得る。ある特定の態様において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、静脈内送達に好適な医薬製剤として投与される。
【００５８】
ある特定の態様において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の免疫調節薬の前、その間またはその後に投与される。具体的態様において、１つ以上の免疫調節薬は、サリドマイドまたはサリドマイド類似体、例えばレノリドミド（ｌｅｎｏｌｉｄｏｍｉｄｅ）またはポマリドミド等である。
【００５９】
本発明のある特定の態様において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の免疫調節薬と共に投与された場合、相乗的に作用する。
【００６０】
さらなる実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、パノビノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、デプシペプチド、フェニル酪酸、バルプロ酸、ベリノスタット、ＬＡＱ８２４、エンチノスタット、ＣＩ９４４またはモセチノスタット等の１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害薬による処置の前、その間、またはその後に投与される。
【００６１】
本発明のある特定の態様において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害薬と組み合わせて投与された場合、相乗的に作用する。
【００６２】
本発明のある特定の態様において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、中間または高用量の化学療法剤と組み合わせて投与された場合、および自己または同種ヒト血液幹細胞の投与後に、相乗的に作用する。
【００６３】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、同種幹細胞移植の前、その間またはその後に投与される。さらに別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、同種幹細胞移植の前、その間またはその後に投与される。理論に束縛されないが、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、自己または同種異系幹細胞移植と組み合わせて投与された場合、幹細胞移植前の骨髄の不完全なアブレーションにより、またはＫＭＡを発現する悪性Ｂ細胞クローンの再発により生じ得る最小限の残存疾患の出現を防止する。
【００６４】
本明細書において引用される全ての特許、特許出願および出版物は、参照により全ての目的においてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００６５】
本発明は、以下の実験的実施例を参照して、より詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、別段に指定されない限り、限定を意図しない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果明らかとなるありとあらゆる変形例を包含するように解釈されるべきである。
【００６６】
さらに説明することなく、当業者は、上記の説明および以下の実施例を使用して、本発明の化合物を作製および利用し、請求される方法を実践することができると考えられる。したがって、以下の実例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６７】
実施例１：ＫＭＡ．ＣＡＲ−２８ｚの生成
ＫａｐｐａＭａｂの可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号９および１０）に基づいて、ｓｃＦｖを設計し、免疫グロブリン重鎖ヒンジ、ＣＤ２８共刺激ドメインおよびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含有するＣＡＲコンストラクト内にクローニングした（図６Ａ）。コンストラクトは、Ｈａｅｍａｌｏｇｉｘ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．により提供された抗体可変領域の遺伝子配列を使用して、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅ  ９（Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において設計した。このコンストラクト（すなわちＫＭ．ＣＡＲ−ｈＣＨ２ＣＨ３−２８ｚ、図６Ａ）の一部の５’から３’のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００６８】
Ｉｇ重鎖リーダーペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１７６４）は、ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＲ（配列番号２０）である。
【００６９】
ＫａｐｐａＭａｂ抗体軽鎖可変領域は、ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＴＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２１）である。
【００７０】
重鎖可変領域は、ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧＫＡＴＩＩＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＹＨＤＹＤＧＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＹＶＴＶＳＳ（配列番号２２）である。
【００７１】
（Ｇ４Ｓ）３  柔軟性リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）である。
【００７２】
アミノ酸位置１０３におけるヒンジ領域でのＣ＞Ｐ突然変異を有するＩｇＧ１定常領域（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７）のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、ＹＶＴＶＳＳＱＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫ（配列番号２４）である。
【００７３】
ＣＤ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０７４７）の膜貫通および細胞内ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２５）である。
【００７４】
ヒトＣＤ３ゼータ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２０６９３）の細胞内ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２６）である。
【００７５】
全長アミノ酸配列は、以下の通りである。
【化１】
2018519356.tif 000002
【００７６】
このアミノ酸配列（配列番号２７）は、以下のＤＮＡ配列によりコードされる。
【００７７】
【化２−１】
2018519356.tif 000003
【化２−２】
2018519356.tif 000004
【００７８】
このコンストラクトの構築に関して、５’  ＥｃｏＲＩ制限酵素部位、５’  Ｋｏｚａｋ配列、リーダーペプチド、一本鎖可変断片およびＡｌｅＩ制限酵素部位を組み込んだＩｇＧ１定常領域の一部からなる遺伝子配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成し、配列を検証し、次いでｐＩＲＩＩ−ＣＡＲ．ＣＤ１９−２８ｚ  ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現プラスミド内にクローニングした。次いでこれを、安定な統合を媒介するためのＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼプラスミドとの共エレクトロポレーションにより、２つの正常ドナーからのドナーＴ細胞内に導入した。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン／トランスポザーゼ系は、対象となる遺伝子を切断し、標的細胞ゲノム内にペーストすることにより、ＣＡＲの永久的統合を生成する。ＰｉｇｇｙＢａｃ発現系は、レトロウイルスベクターのコストの断片での高レベルの永久的遺伝子改変を生成することができるため、選択された。しかしながら、レトロウイルスベクターを含む他の発現系もまた本発明に従って使用され得ることが、当業者に理解される。
【００７９】
ＫＭ．ＣＡＲ−ｈＣＨ２ＣＨ３−２８ｚ発現Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を添加した自己末梢血単核（ＰＢＭＣ）フィーダー細胞との共培養により、我々の最適化されたプロトコルに従って増加させた。毎週ＰＢＭＣを交換し、ＩＬ−１５を週に２〜３回補充して３週間培養した後、Ｔ細胞を回収し、表現型およびＣＡＲ発現に関してフローサイトメトリーにより、ＫＭＡ特異的機能に関してＫＭＡ＋およびＫＭＡ−細胞株での刺激後のインターフェロンガンマ細胞内サイトカインフローサイトメトリーにより（図４Ａ）、ならびに同じ細胞株の細胞毒性に関してクロム放出アッセイにおいて評価した。
【００８０】
３週間の終わりにおいて、培養物は主にＣＡＲ発現ＣＤ３＋  Ｔ細胞であり（生存細胞の５５％および７０％）、ＫＭＡ＋骨髄腫およびＢ細胞株に反応してインターフェロンガンマを発現し（図４Ｂ）、ＫＭＡ特異的細胞毒性を示した（図４Ｃ）。
【００８１】
実施例２：ヒト骨髄腫異種移植片マウスモデルの確立。
多発性骨髄腫のマウスへのヒト骨髄腫の異種移植モデルを確立した。ＲＰＭＩ８２２６または代替の骨髄腫細胞株を、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスに静脈内接種し、Ｒａｇ  ＭＭモデルを形成した（図５Ａ〜５Ｄ）。Ｒａｇ２−／−γｃ−／−（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスは、マウスリンパ球（Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞）を有さず、ヒト異種移植試験の受容宿主である。このモデルは、新規抗体と組み合わせてボルテゾミブ等の新規治療薬を試験するために成功裏に使用されている（図５Ｅ）。我々は、ＫＭＡ．ＣＡＲ  Ｔ細胞を試験およびさらに最適化するために、このＭＭモデルを使用する。
【００８２】
実施例３：最適化されたＫＭＡ．ＣＡＲコンストラクト
実施例１に記載のコンストラクトに基づいて、可変長スペーサー領域および共刺激エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７−Ｕｎｉｐｏｒｔ  Ｑ０７０１１））を有する実施例１に記載のＫＭ  ｓｃＦｖを含有する６つのＣＡＲコンストラクトをＣＤ３ゼータエンドドメインと共に構築した（図２および図６Ｂ〜６Ｄ）。スペーサー長を変化させることにより、Ｔ細胞と標的細胞との間の距離が改変され、スペーサーが短いほど、標的細胞溶解を向上させることができた。全てのコンストラクトにおいて、ＫＭＡ．ＣＡＲの安定なＴ細胞表面発現を確実とするために、ＣＤ２８膜貫通ドメインを使用した。スペーサーとしてＩｇＧ１重鎖定常領域の成分が使用された全ての場合において、第２の（Ｇ４Ｓ）３柔軟性リンカーをｓｃＦｖとスペーサー領域との間に配置した。これらのＣＡＲは、ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより商業的に合成され、さらなる試験のために、ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド内にクローニングされた。
【００８３】
６つのＫＭ．ＣＡＲコンストラクトのうちの３つは、ＣＤ２８共刺激エンドドメインを含有しており、以下の通りであった。
【００８４】
この群の第１のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ３＿２８ｚコンストラクトであったが、これは、スペーサーとしてＩｇＧ１重鎖定常領域のヒンジおよびＣＨ３ドメインのみを含有し、その核酸配列は以下の通りである。
【００８５】
【化３−１】
2018519356.tif 000005
【化３−２】
2018519356.tif 000006
【００８６】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号２９）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、第２の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ３定常領域ドメイン、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。このコンストラクトの図を、図６Ｂに示す。
【００８７】
この群の第２のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ｚコンストラクトであるが、これは、スペーサーとしてＩｇＧ１重鎖定常領域のヒンジドメインのみを含有し、その核酸配列は以下の通りである。
【００８８】
【化４】
2018519356.tif 000007
【００８９】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３０）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、第２の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＩｇＧ１ヒンジ定常領域ドメイン、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。このコンストラクトの図を、図６Ｂに示す。
【００９０】
この群の第３のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ＣＤ８ａ＿２８ｚコンストラクトであったが、これは、スペーサーとしてＣＤ８アルファストーク（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１７３２、アミノ酸１３８〜１８２）を含有し、その核酸配列は以下の通りである。
【００９１】
【化５】
2018519356.tif 000008
【００９２】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３１）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、ＣＤ８アルファストーク、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。
【００９３】
この実施例に記載の６つのＫＭ．ＣＡＲコンストラクトのうちの残りの３つは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激エンドドメインを含有し、以下の通りであった。
【００９４】
この群の第１のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚであり、これは、スペーサーとしてＩｇＧ１重鎖定常領域のヒンジドメインのみを含有し、ＣＤ２８の細胞内ドメインが４−１ＢＢ共刺激分子の細胞内ドメインで置き換えられており、その核酸配列は以下の通りである。
【００９５】
【化６−１】
2018519356.tif 000009
【化６−２】
2018519356.tif 000010
【００９６】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３２）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、第２の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＩｇＧヒンジ定常領域ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。
【００９７】
この群の第２のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚであり、これは、スペーサーとしてＣＤ８アルファストーク（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１７３２、アミノ酸１３８〜１８２）を含有し、ＣＤ２８の細胞内ドメインが４−１ＢＢ共刺激分子の細胞内ドメインで置き換えられており、その核酸配列は以下の通りである。
【００９８】
【化７】
2018519356.tif 000011
【００９９】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３３）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、ＣＤ８アルファストーク、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。
【０１００】
この群の第３のコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚであり、これは、スペーサーとしてＩｇＧ１重鎖定常領域のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有し、Ｆｃ受容体とのＣＨ２相互作用に重要なアミノ酸において突然変異が導入されており（３〜６）、これは、細網内皮系におけるＣＡＲ  Ｔ細胞のクリアランスにより、ｉｎ−ｖｉｖｏでの低減されたＣＡＲ  Ｔ細胞生存を媒介し得る（３、６、７）。核酸配列は、以下の通りである。
【０１０１】
【化８−１】
2018519356.tif 000012
【化８−２】
2018519356.tif 000013
【０１０２】
５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３４）は、リーダーペプチド、ＫａｐｐａＭａｂ軽鎖可変領域、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、ＫａｐｐａＭａｂ重鎖可変領域、第２の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、突然変異ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する。突然変異ＩｇＧ１ヒンジドメインは、５’から３’まで、このコンストラクト（配列番号３４）の影付きのボックス内で強調される、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６−、Ｓ２５４Ａ、Ｄ２６５Ｎ、およびＮ２９７Ａ突然変異を有する。これらの部位における突然変異（Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６−、Ｓ２５４Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ａ）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞とのＦｃ相互作用を減少させ、改善された注入後の生存を可能にし得る。
【０１０３】
２Ａリボソームスキップ要素およびｅＧＦＰのＫＭ．ＣＡＲへの追加
【０１０４】
上述のＣＡＲのそれぞれを発現するＴ細胞の検出の容易性のために、重複配列を有する５’  Ｔ２Ａリボソームスキップ要素を有するｅＧＦＰを、ＣＡＲ−ＣＤ３ゼータエンドドメインおよびプラスミド骨格を用いて合成した。次いで、これを制限酵素分解およびｐＶＡＸ１  ＰＢトランスポゾンプラスミドを含有するＣＡＲへのライゲーションによりクローニングして、以下を形成した。
【０１０５】
２８ｚエンドドメイン＿２Ａ＿ＧＦＰ含有コンストラクト：
【０１０６】
１．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１０７】
２．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ３＿２８ｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１０８】
３．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１０９】
４．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１１０】
４１ＢＢｚエンドドメイン＿２Ａ＿ＧＦＰ含有コンストラクト：
【０１１１】
１．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１１２】
２．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１１３】
３．  ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ
【０１１４】
４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成
【０１１５】
予備のＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚと４−１ＢＢ含有ＣＡＲとの間の比較を行った。本明細書において前述したような、および当技術分野（２）において説明されているようなＰｉｇｇｙＢａｃ系を使用したエレクトロポレーションにより、ＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成した。健常ドナーからの４００万の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステムにより、２４００Ｖで２０ｍｓの単一パルスで、それぞれ５ｕｇのＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼおよびＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドの存在下でエレクトロポレーションした。試験したＫＭＡ．ＣＡＲコンストラクトは、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ、ＫＭ．ＣＡＲ＿８ａ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰ、またはＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ＿２Ａ＿ＧＦＰを含んでいた。
【０１１６】
エレクトロポレーションされたＰＢＭＣ（ＣＡＲ−ＰＢＭＣ）を、１０％ウシ胎仔血清を含むＡＩＭＶ（ＡＩＭ−Ｖ  ＣＭ）中で一晩静置し、回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ  ＣＭ中に１×１０６／ｍｌで再懸濁させた。ＣＡＲ−ＰＢＭＣを、５：１ＣＡＲ−ＰＢＭＣ：ＪＪＮ３比での照射ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞あり、またはなしで、自己照射ＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養した。インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を、３日毎に１０ｎｇ／ｍｌで添加した。トリパンブルー排除により細胞を計数し、新鮮な照射刺激／フィーダー細胞を７日毎に添加した。
【０１１７】
ＫＭ．ＣＡＲ発現の評価
【０１１８】
培養開始時（１日目）、１５日目および２１日目に、フローサイトメトリーによりＫＭ．ＣＡＲ発現を評価した（図８Ａ〜８Ｂ）。ＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体で表面染色し、ＣＡＲ発現をＧＦＰ発現により評価した。
【０１１９】
ＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで存続するためにカッパ骨髄腫抗原を必要とする
【０１２０】
ＫＭＡ発現ＪＪＮ３細胞株を含有する培養物は、ＰＢＭＣのみでの培養物と比較して、より高い全体的増加、増加したＫＭ．ＣＡＲ発現のいずれか、またはその両方を示した（図８Ａ〜８Ｂ）。ＩｇＧ定常領域−ＣＨ２ドメインのＦｃ−受容体との既知の相互作用と一致して、ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３＿２８ｚ発現Ｔ細胞は、ＰＢＭＣのみの存在下で高濃度であった（２８％のＣＤ３＋Ｔ細胞）が、ＪＪＮ３細胞の追加によってより高い増加および高濃度化を示した（２９％のＣＡＲ発現の６倍増加と比較して、３８％のＣＡＲ発現の１５倍増加）。
【０１２１】
ＫＭ．ＣＡＲ＿ｈＣＨ２ＣＨ３ｍｕｔ＿２８ＴＭ＿４１ＢＢｚ発現Ｔ細胞は、ＪＪＮ３との共培養（２６％のＣＡＲ発現および１７倍の増加）と比較して、ＰＢＭＣのみでは低レベルのＣＡＲ発現（６％）および増加（６倍）を示すのみであった。ＩｇＧ１ヒンジのみのスペーサーを含有するＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同様の増加を示した（ＪＪＮ３ありでは５倍、ＪＪＮ３なしでは６倍）が、ＣＡＲ発現は増加した（ＪＪＮ３ありでは１７％、なしでは９％）。ＣＤ８アルファ鎖スペーサーを含有するＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞のみは、ＪＪＮ３細胞の存在下で増加または高濃度化のいかなる向上も示さなかった（ＪＪＮ３なしでの５倍の増加および５％のＣＡＲ発現と比較して、ＪＪＮ３の存在下では８倍の増加および５％のＣＡＲ発現）。
【０１２２】
ＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的評価
【０１２３】
ＫＭＡ特異的インターフェロンガンマ生成およびＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を、以前に説明されたプロトコル（２）を使用して、ＫＭＡ＋およびＫＭＡ−細胞株での細胞内サイトカインフローサイトメトリーおよび標準クロム放出アッセイにより評価した。使用したＫＭＡ陽性細胞株は、ＪＪＮ３、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＮＣＩ−Ｈ９２９を含んでいた。ＫＭＡ陰性細胞株は、Ｎａｌｍ−６およびＭｏｌｔを含んでいた（図１２Ａ〜１２Ｂ）．
【０１２４】
サイトカインフローサイトメトリーのために、２×１０５のＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１：１の比で標的細胞と共に５時間刺激した。１時間後、モネンシン（２μＭ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｕｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で非特異的に活性化し、非刺激細胞を陽性および陰性対照として使用した。次いで、ＣＡＲ  Ｔ細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８に関して表面染色した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｃｙｔｏｆｉｘおよびｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理し、抗インターフェロンガンマ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、続いてｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液でさらに洗浄した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターを使用して、少なくとも３０，０００イベントの取得で、染色された細胞を分析した。
【０１２５】
標準クロム（５１Ｃｒ）放出アッセイを使用して、ＫＭＡ特異的細胞毒性を評価した。クロム酸ナトリウム（Ｎａ２５１ＣｒＯ４）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で標的細胞を標識化した。ＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞をＫ５６２細胞株と共に１：１の比で事前にインキュベートし、ＮＫ細胞活性を吸収させた。クロム標識化標的細胞を、４０：１から１．２５：１の範囲のエフェクター：標的比でＫＭ．ＣＡＲ  Ｔ細胞に３回添加し、３７℃、５％  ＣＯ２で４時間でインキュベートした。３回分の標的を、１０％のドデシル硫酸ナトリウムで溶解して最大放出を決定し、エフェクターを有さない３回分の標的を使用して、自然放出を評価した。上澄みを吸引し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して読み出した。標準的な式−％特異的溶解＝（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００を使用して、特異的溶解のパーセンテージを計算した。
【０１２６】
実施例４：活性化誘導性プロモーターによるＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドの生成
構成的に活性なプロモーター（ＥＦ１アルファ）および活性化誘導性プロモーター（ＮＦＡＴｐｒｏ）を含有する単一トランスポゾンカセットを設計し、クローニングした。活性化誘導性遺伝子発現カセットは、Ｆｉｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（８）に基づき、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅ  ９（Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してＮＦＡＴｐｒｏを設計することにより生成した。これは、第４染色体上に見られる、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）が結合した３０塩基対ＤＮＡ配列の６つのコピー（反応要素−ＲＥ）−ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ（配列番号３５）に続く、最小ＩＬ−２プロモーター−  ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧ（配列番号３６）を含む（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１６７７９．１）。
【０１２７】
活性化誘導遺伝子発現の検出を可能にするために、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ＤＮＡ配列に続くウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル（９〜１１）を、ＮＦＡＴｐｒｏの３’に配置した。この遺伝子カセットのＤＮＡ配列は、以下の通りである。
【０１２８】
【化９】
2018519356.tif 000014
【０１２９】
５’から３’まで、このコンストラクトは、ＮＦＡＴ−ＲＥ、ＩＬ−２最小プロモーター、ｅＧＦＰ、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルを含有する。
【０１３０】
このカセットは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより商業的に合成され、５’  ｃＨＳ４インシュレーター（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ７８７７５．２）（１２）とヒト延長因子１プロモーターとの間のｐＶＡＸ１ＰＢトランスポゾンプラスミド内にクローニングされた。最初の実験において形質導入されたＴ細胞を識別するために、ＱＢＥｎｄ１０モノクローナル抗体により認識されるＣＤ３４のエピトープ、およびＣＤ２０特異的モノクローナル抗体リツキシマブ（１３）のミモトープからなるキメラＲＱＲ８マーカーを、トランスポゾンマルチクローニングサイト内にクローニングし、図９に示されるトランスポゾン遺伝子挿入を生成した（ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＮＦＡＴＧＦＰ−ＲＱＲ８プラスミド）。ｐＶＡＸ１ＰＢ  ＮＦＡＴＧＦＰ−ＲＱＲ８トランスポゾンプラスミドおよびｐＶＡＸ１  ＰＢａｓｅトランスポザーゼプラスミドを含有する活性化誘導性遺伝子カセットの共エレクトロポレーションは、図９に見られるＮＦＡＴＧＦＰ−ＲＱＲ８遺伝子挿入の永久的統合をもたらす。
【０１３１】
活性化誘導性遺伝子含有トランスポゾンの機能の実証
実施例４からのｐＶＡＸ１ＰＢ  ＮＦＡＴＧＦＰ−ＲＱＲ８トランスポゾン（図９を参照されたい）の機能を実証するために、４×１０６のＰＢＭＣを、それぞれ５ｕｇのトランスポゾンおよびトランスポザーゼプラスミドの存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞を２４時間静置し、次いで５０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｕｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩非特異的に刺激し、非刺激対照と比較した。形質導入された細胞を、ＲＱＲ８マーカー発現に関してＱＢＥｎｄ１０染色により識別し、活性化誘導遺伝子発現（ｅＧＦＰ）を１９時間で評価した。その時点において、形質導入細胞の５０％が、ｅＧＦＰを発現することが確認された（図１０）。
【０１３２】
実施例５：ＫＭ．ＣＡＲ制御生物学的療法の設計
ＩＬ−１２および／またはインターロイキン−６受容体拮抗薬ＳＡＮＴ７を含有し、また活性化誘導性プロモーターの制御下でＩＬ−１２および／またはＳＡＮＴ７の発現を有する最適化されたキメラ抗原受容体を含有する発現プラスミド（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）もまた構築した。ＳＡＮＴ−７配列は、Ｐｒｏｆ  Ｒｏｃｃｏ  Ｓａｖｉｎｏにより提供され、Ｓａｖｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９４およびＳｐｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９６（１４〜１７）に従い提供される野生型ＩＬ−６遺伝子配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００６００．４）の突然変異に基づいていた。配列を、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅ  ９（Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にインポートし、ＥＬＩＳＡによる上澄み中での検出のために６×Ｈｉｓタグを追加した。
【０１３３】
ＳＡＮＴ−７のヌクレオチド配列は、以下で強調および列挙され、下線が付されたアミノ酸置換により提供される。
【０１３４】
【化１０】
2018519356.tif 000015
（配列番号：３８）。ヌクレオチド置換は、Ｙ３１Ｄ、Ｇ３５Ｆ、Ｌ５７Ｄ、Ｅ５９Ｆ、Ｎ６０Ｗ、Ｑ７５Ｙ、Ｓ７６Ｋ、Ｓ１１８Ｒ、Ｖ１２１Ｄに対応する。提供された配列はまた、公開された配列には列挙されていないＱ２１１Ａ置換を含有していた。
【０１３５】
このアミノ酸配列（すなわち配列番号：３８）に対応するＤＮＡ配列は、以下の通りである。
【０１３６】
【化１１】
2018519356.tif 000016
【０１３７】
一本鎖インターロイキン−１２（Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２）コンストラクトは、ＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５サブユニット（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２９４５９およびＰ２９４６０）をＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌおよびＣｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ（１８、１９）と同様の柔軟性（Ｇ４Ｓ）３リンカーに繋げることにより設計し（これにより、両方のサブユニットは、生物活性ｐ７０ヘテロ二量体を容易に形成する単一ペプチド鎖として発現することができる）、使用した。Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２コンストラクトを合成し、ＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７を含有するコンストラクトを、本明細書に記載され図１１に示される活性化誘導性トランスポゾンカセット内にクローニングした。
【０１３８】
さらに、Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２コンストラクトを合成することができ、２Ａリボソームスキップ要素により隔てられたＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７を含有するコンストラクトを、本明細書に記載され図７に示されるＰｉｇｇｙＢａｃプラスミド内にクローニングすることができた。
【０１３９】
Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１４０】
【化１２】
2018519356.tif 000017
【０１４１】
５’から３’まで、Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２コンストラクトは、リーダーペプチド、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニット、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、およびＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットを含有する。
【０１４２】
上記アミノ酸配列（すなわち配列番号：４０）に対応するＤＮＡ配列は、以下の通りである。
【０１４３】
【化１３】
2018519356.tif 000018
【０１４４】
さらに、ガレクチン−３の切断されたドミナントネガティブ型であるＧＡＬ３Ｃもまた構築される。コンストラクトは、分泌を誘導するためのＣＤ８−アルファリーダーペプチド、および検出のための６ｘＨｉｓタグを含有する。ＧＡＬ３Ｃのアミノ酸配列を、以下に列挙する。
【０１４５】
【化１４】
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【０１４６】
ＧＡＬ  ３Ｃコンストラクトの対応するＤＮＡ配列を、以下に記載する。
【０１４７】
【化１５】
2018519356.tif 000020
【０１４８】
ＣＡＲおよび「生物製剤」トランスポゾンプラスミドは、ＩＬ−１２のみ、ＳＡＮＴ７のみ、ＧＡＬ３Ｃのみ、またはＩＬ−１２およびＳＡＮＴ７の両方、またはＩＬ１２およびＧＡＬ３Ｃの両方、またはＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃの両方、またはＩＬ−１２の３つ全てのいずれかを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するために核酸注入される。ＳＡＮＴ７およびＧＡＬ３Ｃ。「生物製剤」コンストラクトで成功裏に形質導入された細胞は、選択可能マーカー発現により、例えばフローサイトメトリーにより識別され得る。ＩＬ−１２、ＳＡＮＴ７のレベル。およびまたはＧＡＬ３Ｃは、サイトカインフローサイトメトリーにより細胞内で測定され、市販のキットおよび試薬を使用してＥＬＩＳＡによりＣＡＲ  Ｔ細胞培養物の上澄み中で測定され、ＣＡＲのみを発現する対照Ｔ細胞と比較される。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、機能に関して上述のサイトカインフローサイトメトリーおよび細胞毒性アッセイにより、ならびに腫瘍成長の阻害を評価するために骨髄腫細胞株との共培養アッセイにより評価される。実験は３回行われ、識別される２つの最適ＣＡＲコンストラクトは、ＩＬ−１２、ＧＡＬ３Ｃおよび／またはＳＡＮＴ７発現あり、およびなしでのマウスモデルにおいて評価されるように選択される。
【０１４９】
以前に確立されたＲＰＭＩ−Ｒａｇヒト骨髄腫マウス異種移植片モデルに基づいて、我々のＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ−ｖｉｖｏでの機能を評価するために、ＲＰＭＩ−Ｒａｇ−Ｌｕｃ（ＫＭＡ−）およびＪＪＮ３−Ｒａｇ−Ｌｕｃ（ＫＭＡ＋）モデルが開発される。ＪＪＮ３およびＲＰＭＩ８２２６細胞が、Ｌｕｃ−１で形質導入され、次いでＲａｇ２−／−γｃ−／−（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスに静脈内接種され、ＪＪＮ３−  Ｒａｇ−ＬｕｃおよびＲＰＭＩ−Ｒａｇ−Ｌｕｃ  ＭＭモデルが形成される。生着および疾患レベルは、ルシフェリンのＩＰ注射後の光学的画像化により監視され、血清ヒトカッパ（ＪＪＮ３）およびラムダ（ＲＰＭＩ）軽鎖のレベルのレベルと関連付けられる。候補ＣＡＲ  Ｔ細胞の接種の最適時間は、通常は５〜８週目からの後肢麻痺の発生前に光学的画像化を使用して確立される。６匹のＪＪＮ３−Ｒａｇ−ＬｕｃおよびＲＰＭＩ−Ｒａｇ−Ｌｕｃマウスのコホートが、１×１０６の全細胞から開始する増加用量のＣＡＲ  Ｔ細胞（ＩＬ−１２／ＳＡＮＴ７発現あり、およびなし）でＩＶ接種され、治療用量が確立される。０日目、＋１日目、＋３日目、＋８日目およびその後毎週、マウスは、後肢麻痺の発生、血清不含軽鎖（ＳＦＬＣ）の増加または他の施設のガイドラインにより決定される疾患進行の発達まで画像化される。骨髄および髄外腫瘍が収集され、ＭＭ細胞およびＣＡＲ  Ｔ細胞の分布に関して組織学的に検査される。対照と比較して反応および生存を画像化することにより、効能が決定される。
【０１５０】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2018519356.tif 000027
【図５Ｂ】
2018519356.tif 000028
【図５Ｃ】
2018519356.tif 000029
【図５Ｄ】
2018519356.tif 000030
【図５Ｅ】
2018519356.tif 000031
【図６Ａ】
2018519356.tif 000032
【図６Ｂ】
2018519356.tif 000033
【図６Ｃ】
2018519356.tif 000034
【図７】
2018519356.tif 000035
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2018519356.tif 000039
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018519356.tif 000044
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