(57)【要約】  本発明は、電磁放射線を使用したサンプル中の分析物の検出方法であって、（ｉ）分析物または分析物の類似体と標識とを結合させることができる結合部位を有する標識された試薬であって、当該標識が電磁放射線を吸収して無放射減衰によりエネルギーを発生させることができるものである、標識された試薬を提供すること；（ｉｉ）電磁放射線の一連のパルスを発生させるために適応させた放射線源、無放射減衰により発生したエネルギーを電気シグナルへと変換させることができる、焦電気性または圧電性の素子および電極を有する変換器、電気シグナルを検出することができる検出器、電磁放射線源および検出器を制御するための制御器を有する装置であって、第一および第二チャンバーを有し、当該第一チャンバーは、変換器に近接した第一試薬を含有し、当該第一試薬は、分析物を介した標識された試薬の第一試薬への結合が分析物の濃度に直接比例するように分析物に結合することができ、当該第二チャンバーは、変換器に近接した第二試薬を含有し、当該第二試薬は、標識された試薬の第二試薬への結合が分析物の濃度に反比例するように分析物を模倣する、装置を提供すること；（ｉｉｉ）変換器にサンプルを曝露すること；（ｉｖ）サンプルを電磁放射線で照射し、かつ電気シグナルを検出することを含む検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電磁放射線を使用したサンプル中の分析物の検出方法であって、
（ｉ）分析物または分析物の類似体と標識とを結合させることができる結合部位を有する標識された試薬であって、該標識が電磁放射線を吸収して無放射減衰によりエネルギーを発生させることができるものである、標識された試薬を提供すること；
（ｉｉ）電磁放射線の一連のパルスを発生させるために適応させた放射線源、無放射減衰により発生したエネルギーを電気シグナルへと変換させることができる、焦電気性または圧電性の素子および電極を有する変換器、電気シグナルを検出することができる検出器、電磁放射線源および検出器を制御するための制御器を有する装置であって、
第一および第二チャンバーを有し、
該第一チャンバーは、変換器に近接した第一試薬を含有し、
該第一試薬は、分析物を介した標識された試薬の第一試薬への結合が分析物の濃度に直接比例するように分析物に結合することができ、
該第二チャンバーは、変換器に近接した第二試薬を含有し、
該第二試薬は、標識された試薬の第二試薬への結合が分析物の濃度に反比例するように分析物を模倣する、装置を提供すること；
（ｉｉｉ）変換器にサンプルを曝露すること；
（ｉｖ）サンプルを電磁放射線で照射し、かつ電気シグナルを検出することを含む検出方法。
【請求項２】
前記装置が、アッセイの条件下で、第一試薬の分析物に対する親和性よりも分析物または標識された試薬への低い親和性を有する第三試薬を含む第三チャンバーをさらに備えてなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一または第二試薬の分析物または標識された試薬への結合が分析物濃度に依存し、かつ前記第三試薬の分析物または標識された試薬への結合が分析物濃度に依存しない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第三試薬が、アッセイの条件下で、分析物または標識された試薬への親和性を本質的に有しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一、第二および第三試薬が、非共有結合を介して変換器に付着している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第一試薬が抗体であり、前記分析物が抗原である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標識された試薬が標識された抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識された試薬が標識を含み、該標識が、色素分子、金粒子、有色ポリマー粒子、蛍光性分子、酵素、赤血球、ヘモグロビン分子、磁気粒子および炭素粒子から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、サンプルを変換器に曝露する工程とサンプルを照射する工程との間意に変換器からサンプルを取り出すことなく実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置および標識された試薬を備えてなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物の検出方法、特に  およびイムノアッセイのダイナミックレンジおよび／または感度を拡張する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイは、サンプル中の分析物の濃度を測定するためにしばしば使用する。しかしながら、それらは、検出の下限、検出の上限およびダイナミック測定レンジの点から制限的でもある。 
【０００３】
典型的なサンドイッチイムノアッセイでは、目的の抗原に特異的な抗体は、１枚のポリ塩化ビニルまたはポリスチレン等のポリマー支持体に付着している。一滴の細胞抽出物あるいは血清または尿のサンプルがシート上に置かれ、このシートは、抗体抗原複合体が形成された後に洗浄する。その後、抗原上の異なる部位に特異的な抗体を添加し、シートを再び洗浄する。この二次抗体は、高感度で検出されるように標識を持つ。シートに結合した二次抗体の量は、サンプル中の抗原の量に比例する。このアッセイおよびこの種のアッセイに対する他の変異形は公知であり、例えば、「The Immunoassay Handbook, 2nd Ed.」を参照のこと。 
【０００４】
イムノアッセイの検出の上限は、通常使用する試薬の合計量によって制限されている。支持体上で不動化できる抗体の量は、支持体の有限な表面積によって制限されている。サンプル中に過剰な分析物が存在している場合、抗体結合部位がすべて分析物で遮断され（使用する抗体の親和定数に依存して）、かつ未結合分析物が流出するため、システムは飽和する。したがって、システムは、飽和を超えた濃度、典型的には１μΜ〜１００ｍＭの濃度の分析物を区別することができない。研究チャンバーの分析器において、この問題はサンプルを希釈してアッセイを再度実行することによって対応する。しかしながら、サンプル希釈はポイントオブケアアッセイには非実用的である。 
【０００５】
均質のサンドイッチアッセイにおいて、一次抗体、分析物および二次抗体はすべて、同時にインキュベートし、洗浄工程はない。分析物濃度が増加するにつれ、飽和に到達するまで、検出シグナルは増加する。飽和を超えた分析物の濃度では、分析物は、一次および二次抗体に別々に結合する。その結果として、シートに結合した二次抗体の量は、もはやサンプル中の抗原の量に比例せず、かつ検出シグナルは低減する−この効果は「高用量フック」として知られている。この結果は、アッセイのダイナミックレンジを低減することができる。
【０００６】
したがって、サンドイッチアッセイのダイナミックレンジおよび／または感度を拡張するために、アッセイ飽和および／または高用量フックの問題の解決策を提供する必要がある。 
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明は、サンプル中の分析物の検出方法であって、
（ｉ）分析物または分析物の類似体と標識とを結合させることができる結合部位を有する標識された試薬であって、当該標識が電磁放射線を吸収して無放射減衰によりエネルギーを発生させることができるものである、標識された試薬を提供すること；
（ｉｉ）電磁放射線の一連のパルスを発生させるために適応させた放射線源、無放射減衰により発生したエネルギーを電気シグナルへと変換させることができる、焦電気性または圧電性の素子および電極を有する変換器、電気シグナルを検出することができる検出器、電磁放射線源および検出器を制御するための制御器を有する装置であって、
第一および第二チャンバーを有し、
当該第一チャンバーは、変換器に近接した第一試薬を含有し、当該第一試薬は、分析物を介した標識された試薬の第一試薬への結合が分析物の濃度に直接比例するように分析物に結合することができ、当該第二チャンバーは、変換器に近接した第二試薬を含有し、当該第二試薬は、標識された試薬の第二試薬への結合が分析物の濃度に反比例するように分析物を模倣する、装置を提供すること；
（ｉｉｉ）変換器にサンプルを曝露すること；
（ｉｖ）サンプルを電磁放射線で照射し、かつ電気シグナルを検出することを含む検出方法を提供する。
【０００８】
したがって、本発明は、競合アッセイを同時に実行し結果を合わせることにより、アッセイのダイナミックレンジおよび／または感度を拡張することができるサンドイッチアッセイを実行する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明を、以下の図を参照して説明する。
【００１０】
【図１】図１は、本発明と共に使用するWO 2004/090512の化学センシング装置の概略図である。
【図２】図２は、本発明の装置を使用した、サンドイッチイムノアッセイを示す図である。
【図３】図３は、本発明によるカートリッジを示す図である。
【図４】図４は、対照を使用していない、個々のスポット２カウントを示す図である。
【図５】図５は、個々のスポット３カウントを示す図である。
【図６】図６は、陽性および陰性対照の両方を使用した、用量−応答曲線を示す図である。
【００１１】
本発明の方法は、サンプル中の分析物を検出するために使用する。本方法は、電磁放射線の一連のパルスを発生させるために適応させた放射線源；  無放射減衰により発生したエネルギーを電気シグナルへと変換させることができる、焦電気性または圧電性の素子および電極を有する変換器；および変換器により発生した電気シグナルを検出することができる検出器を有する装置を提供する。 本発明の装置は、WO 2004/090512に記載された装置に基づく。
【００１２】
図１は、電磁放射線で標識２を照射した際の標識２中の熱発生に依存する、本発明で使用するための化学センシング装置１を示す図である。簡潔さを期すために、標識は図１にのみ示す（本発明の装置の残余成分は、より詳細に以下に記載する）。図１は、標識２の存在下での化学センシング装置１を示す図である。装置１は、電極被覆４、５を有する焦電気性または圧電性の変換器３を備えてなる。好ましくは、変換器３は分極したポリフッ化ビニリデンフィルムである。電極被覆４、５は、好ましくは透明であり、最も好ましくはインジウムスズ酸化物から形成される。電極の厚さは好ましくは約２０〜３０ｎｍであるが、導電率が低すぎる最低１ｎｍ未満から、光の透過が低すぎる最高２００ｎｍ超まで、ほぼ任意の厚さが可能である（８０％Ｔ未満であってはならない）。好ましくは、変換器はインジウムスズ酸化物でコーティングしたポリフッ化ビニリデンフィルムである。
【００１３】
標識２は、結合事象によって、変換器３に近位に保持される。本発明の好ましい特徴は、電磁放射線  （典型的には「光」と称する）６、好ましくは可視光線の源によって照射された際に、標識２が熱を発生させるということである。光源は、例えばＬＥＤでもよい。光源６は、適切な波長の光（例えば、補色）で標識２を照射する。理論による拘束は望まないものの、標識２は光を吸収し、図１中の曲線によって示された励起状態を発生させ、その後無放射減衰を経ることでエネルギーを発生させる。このエネルギーは、主として熱の形態（即ち、環境中の熱運動）であるが、他の形態のエネルギー（例えば衝撃波）が生成されてもよい。しかしながら、エネルギーは変換器によって検出され、電気シグナルに変換される。本発明の装置は測定される特定の標識のためにキャリブレーションされるため、無放射減衰によって生成されたエネルギーの正確な形態を決定する必要はない。別段の指定がない限り、本明細書において、用語「熱」は、無放射減衰によって生成されたエネルギーの意味で使用する。光源６は標識２を照射するように配置する。好ましくは、光源６は変換器３および電極４、５の反対に配置し、かつ標識２は変換器３、電極４、５を通して照射される。光源は、変換器内の内部光源であってもよく、当該光源は、導波系である。導波管は変換器自体であってもよく、また導波管は変換器に付着させた追加層であってもよい。照射の波長は、使用する標識に依存する；例えば、４０ｎｍの金標識に好ましい波長は５２５ｎｍであり、炭素標識に好ましい波長は６９０ｎｍである。
【００１４】
標識２によって生成されたエネルギーは、変換器３によって検出され、電気シグナルに変換される。電気シグナルは検出器７によって検出される。光源６および検出器７は、両方とも制御器８の制御下にある。光源６は、「断続光（chopped light）」と称される光の一連のパルスを生成する（特定の波長が言及されない限り、本明細書で使用する用語「光」は、任意の形態の電磁放射線を意味する）。原則的に、単一の閃光（即ち、電磁放射線の１つのパルス）であれば、変換器３からシグナルを発生するのに十分であろう。しかしながら、再現性のあるシグナルを得るためには、複数の閃光が使用され、実際のところ断続光が必要である。電磁放射線のパルスが適用される周波数は可変的でもよい。下限値では、パルス間の遅延時間は、各パルスと電気シグナルの発生との間の遅延時間を判断するのに十分である必要がある。上限値では、それぞれのパルスの間の時間遅延は、データを記録するために掛かる期間が不当に延長されるほど大きくあってはならない。好ましくは、パルスの周波数は、１〜５０Ｈｚ、より好ましくは１〜１０Ｈｚ最も好ましくは２Ｈｚである。これは、それぞれパルス間の遅延時間、２０〜１，０００ｍｓ、１００〜１，０００ｍｓおよび５００ｍｓに相当する。さらに、いわゆる「マーク対スペース」比、即ち、オンシグナルのオフシグナルに対する比、は１であることが好ましいが、他の比を使用しても悪影響はない。次のパルスがシステムを摂動させる前にシステムが熱平衡へ近づくことを可能にするために、より短いオンパルスとより長いオフシグナルを使用することにはいくつかの利点がある。一つの実施態様において、１〜５０ｍｓ、好ましくは８ｍｓの光パルス、続けて１０〜５００ｍｓ、好ましくは２５０ｍｓの緩和時間は、表面に直接結合した粒子のより正確な測定を可能にする。当技術分野において、異なるチョッピングの頻度又は異なるマーク対スペース比で断続光を発生する電磁放射線源は既知である。検出器７は、光源６からの光の各パルス間の遅延時間、および変換器３からの、検出器７によって検出された対応する電気シグナルを決定する。出願人は、この遅延時間が距離ｄの関数であることを見出した。シグナルは、２〜７ｍｓから測定することが好ましい。
【００１５】
光の各パルス間の遅延時間、および対応する電気シグナルを決定する方法としては任意の方法を使用してもよく、それによって再現性のある結果がもたらされる。好ましくは、遅延時間は、光の各パルスの開始から、結合標識からの熱の吸収に対応する最大の電気シグナルが検出器７で検出される時点まで測定される。
【００１６】
当業者であれば、熱が周囲の媒質に分散されるため、変換器３では検出不能であるか、少なくとも変換器は意味のあるシグナルを受け取らないと予想するであろうことから、標識２が変換器表面から分離され得ること、およびシグナルが依然として検出されることを見出したことは驚くべきことである。驚くべきことに、シグナルはエネルギーを変換器３へ伝達させる中間媒質を介して検出可能であることだけではなく、異なる距離ｄは区別され得（これは、「深さプロファイリング」と称される）、受領したシグナルの強度は、変換器３の表面からの特定の距離ｄでの標識２の濃度に比例することを見出した。さらに、媒質自体の性質が遅延時間および所定の時間でのシグナルの大きさに影響を及ぼすことが見出された。本発明において、検出器は、変換器の付近で発生する無放射減衰に対応する電気シグナルのみを検出するために配置する。 
【００１７】
本発明の基礎となる原理を説明することを目的として、図２は、本発明の装置を使用した典型的な捕捉抗体アッセイを示す図である（ただし、第一試薬のみが示されている）。装置には、変換器３、中に存在する分析物１１を含むサンプル１０を保持するためのチャンバー９および変換器表面付近の捕捉試薬１２が含まれる。変換器は、捕捉試薬１２、図において、それに付着した抗体を有する。この捕捉試薬１２の結合は、表面上への共有結合または非共有結合の吸着、例えば水素結合を介したものでもよい。追加層は、パリレンポリマー層のように、捕捉試薬１２および変換器３を分離してもよく、または抗体は不活性粒子に付着してもよく、その後不活性粒子は変換器３に付着してもよい。あるいは、変換器３の表面上にコーティングされたゲル層内に捕捉試薬１２を取り込むことができる。
【００１８】
使用において、サンプルチャンバーには、分析物１１を含有している液体１０（または任意の流体）が充填される。その後、分析物１１は第一試薬１２に結合する。追加の標識sされた試薬１３は、液体中に存在し、第一試薬１２、分析物１１と標識された試薬１３との間にいわゆる「サンドイッチ」複合体が形成される。結合抗原１１がすべてサンドイッチ複合体を形成するように、過剰の標識された試薬１３を含める。したがって、サンプルは結合標識された試薬１３ａおよび溶液中で遊離の未結合標識された試薬１３ｂを含有している。
【００１９】
サンドイッチ複合体の形成の間またはその後、光等の電磁放射線の一連のパルスを使用してサンプルを照射する。各パルス間の遅延時間および変換器３による電気シグナルの生成は、検出器によって検出される。適切な遅延時間を選択して、最初に、結合標識された試薬１３ａによって生じた熱を測定する。遅延時間は変換器３からの標識の距離の関数であるため、結合標識された試薬１３ａを未結合標識された試薬１３ｂから区別し得る。これは、洗浄工程の必要性を無くすという点で従来のサンドイッチイムノアッセイに対する有意な利点をもたらす。従来のサンドイッチイムノアッセイにおいて、未結合標識された試薬が結合標識された試薬によって生じたシグナルに干渉するため、未結合標識された試薬は、一切の測定を行う前に結合標識された試薬から分離させなければならない。しかしながら、本発明が提供する「深さプロファイリング」を理由に、結合および未結合標識された試薬は区別され得る。確かに、変換器（即ち、結合）付近の標識と、バルク溶液（即ち、未結合）中の標識とを区別する能力は、本発明の特有の利点である。 
【００２０】
また、本発明の方法は、発生したエネルギーを電気シグナルへ変換し、電気シグナルを検出して、サンプルを本明細書に記載された装置へ曝露することを含む。好ましくは、方法はサンプルを変換器に曝露する工程とエネルギーを電気シグナルへ変換する工程との間に、サンプルを変換器から取り出すことなく実行される、即ち、方法は均一アッセイである。  
【００２１】
本発明は、測定システムの構成要素（焦電気性センサー材料、ＬＥＤ光源および増幅器回路を含む）における自然な変異性を補正する対照、測定するサンプル中の変異性、および測定中の環境条件における変異性を提供する。これは変換器の表面上で試薬にサンプルを曝露することにより達成することができる。異なる試薬は、概して変換器表面の異なる領域に位置し、これら領域は異なる試薬でコーティングされている。これら対照は、陰性対照は分析物の不在下で予想シグナルに近似すべきであり、かつ陽性対照は分析物がシステムを飽和した際に予想シグナルに近似すべきであるという意味で、「陽性」および「陰性」の対照と定義される。好ましい実施態様において、本発明の装置は、WO 2012/137009に記載の装置、およびそれに記載された対照に基づくものである。WO 2012/137009は、そのような対照の使用が、WO 2004/090512に記載の装置を使用して実行されたアッセイの正確性および精度をどのように改善するか記載している。
【００２２】
これらの対照で検出を達成するために、本発明の装置は、変換器の付近に、第一、第二および第三の試薬をそれぞれ含有する第一、第二および第三のチャンバーを備えてなる。 
【００２３】
第一試薬は分析物に結合することができる結合部位を有する。その後、標識された試薬は、分析物を介した標識された試薬の第一試薬への結合が、分析物の濃度に正比例するように分析物結合する。このように、分析物は２つの異なるエピトープを有する。このため、第一チャンバーはサンドイッチイムノアッセイを備えてなる。
【００２４】
標識された試薬の第一試薬への結合度合いを決定することは、サンプル中の分析物の濃度の測定をもたらす。
【００２５】
第二試薬は分析物を模倣し、分析物の類似体である（共有結合または非共有結合の相互作用のいずれかを通じて変換器表面に結合するため、類似体である）。標識された試薬は、第二試薬に直接結合する。第二試薬は、標識された試薬の第二試薬への結合がサンプル中の分析物の濃度に反比例するように、標識された試薬の結合のためにサンプル中の任意の遊離分析物と競争するだろう。サンプル中に分析物がない場合、標識された試薬は排他的に第二試薬に結合し、高シグナルが検出される。サンプル中に存在する分析物の濃度が増加するにつれ、標識された試薬の第二試薬への結合は比例して低下し、シグナルの落ち込みが検出される。このため、第二チャンバーは競合イムノアッセイを備えてなる。したがって、サンドイッチおよび競合イムノアッセイの両方を使用してサンプル中の分析物を検出するため、本発明は組合わせアッセイである。
【００２６】
分析物濃度の関数としての競合アッセイの感度は、標識された試薬の母集団および第二試薬の表面濃度を含む多くの要因に依存する。これらの要因を調節することによって、競合アッセイの感度を「調整」することが可能である。 
【００２７】
１つの実施態様において、競合アッセイを調製して、サンドイッチアッセイより分析物濃度への感度を低くする。このように、サンプル中に存在する分析物の濃度が増加するにつれ、第一サンプルチャンバーからのシグナルは急激に上昇する一方、第二チャンバーからのシグナルは緩やかに下降する。これら2つの出力を数学的に合わせることによって、サンドイッチアッセイの検出限界を維持しながら、同時に実施している感度がより低い競合アッセイを使用することによりアッセイのダイナミックレンジを拡張させることが可能である。 
【００２８】
第二の実施態様において、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイは類似の感度を有し、それ故にそれらは類似の濃度で飽和する。この場合では、アッセイのダイナミックレンジは上昇しないが、反対のモードに機能している２つのアッセイを組合わせることで検出限界は改善される。 
【００２９】
好ましくは、装置は、変換器の付近で、第三試薬を含む第三チャンバーを備えてなり、この第三試薬は、アッセイの条件下で、第一試薬の分析物に対する親和性よりも分析物または標識された試薬への低い親和性を有する。親和性はアッセイの条件下で考慮することが重要である。その理由としては、第一試薬の標識された試薬への親和性は、分析物の存在によって媒介されるためである。したがって、分析物の不在下において、第一試薬も第三試薬も標識された試薬への親和性を有しない。しかしながら、分析物の存在下においては、第三試薬は第一試薬より低い標識された試薬への親和性を有する。 
【００３０】
第三試薬は、第一および第二試薬が不動化する表面を模倣する不活性表面である。一つの実施態様において、第三試薬は多糖類、例えばデキストランである。代替の実施態様において、第三試薬はアイソタイプの対照抗体である。第三試薬は、典型的には第一試薬と類似した化学的および物理的特性を有するが、アッセイの条件下で標識された試薬に対して少しの親和性を提供するか親和性を提供しない。特に好ましい実施態様において、第三試薬はアッセイの条件下で標識された試薬に対して本質的に親和性を有しない。好ましくは、第三試薬は、本質的に分析物に親和性を提供しない。即ち、標識された試薬、または適切な場合、分析物の、第三試薬に対する結合は、非特異的である。このように、第三試薬は、標識された試薬の第一試薬への非特異的結合を補填することができ、同様に、測定方法に干渉し得る、重力下での沈殿作用等による変換器に対する標識された試薬の所望しない移動も補填することができる。
【００３１】
サンプルチャンバーからの電気シグナルは数学的に操作される。電気シグナルの数学的な操作はWO 2012/137009に記載のものと同一である。好ましい実施態様において、本発明の方法は、第一および第二チャンバーの電気シグナルから第三チャンバーの電気シグナルを差し引いてベースライン補正電気シグナルを得ること、および第一チャンバーのベースライン補正電気シグナルを第二チャンバーのベースライン補正電気シグナルで割ることを含む。
【００３２】
本発明において、第一および第二試薬は互いにとって「動的な」対照として機能すると見なすことができる一方、WO 2012/137009では「静的な」陽性対照が使用されている。そのような静的な陽性対照を使用する場合、アルゴリズム的出力はほぼ０．０００〜１．０００の間に介在するように制限されている。  
【００３３】
本発明において、低濃度の分析物では、検出器の出力を調べることで、０．０００〜１．０００のレシオメトリックな比が得られ、これは第二および第三試薬への結合（即ち、それぞれ陽性および陰性対照）に対する、第一試薬への結合（即ち、測定シグナル）からのシグナルの大きさを定義する。
【００３４】
一つの実施態様において、高濃度の分析物では、レシオメトリックなシグナルは１．０００を超えて増加する、即ち、第一試薬への結合からのシグナルが、第二試薬への結合からのシグナルを超過する。これは、第二試薬（陽性対照）への結合からのシグナルが、穏やかに低下する一方で、第一試薬（測定シグナル）への結合からのシグナルが急激に増加するために発生する。この実施態様において、第二試薬への結合からのシグナルの低下は、低い感度の競合アッセイの使用のおかげで定常である。分析物での標識された試薬の飽和のおかげで、第二試薬への結合からのシグナルが０．０００に接近するまで、レシオメトリックなシグナルは１．０００を超えて増加し続ける。このように、第一チャンバーにおけるサンドイッチのダイナミックレンジを拡張し、かつ分析物のより低い濃度で通常は観察されるであろう飽和および／または高用量フックの開始を遅延させるために、第一および第二試薬は互いに結びついて機能している。第一および第二試薬は、互いにとって対照として機能していると考えることができる。第一および第二試薬は、第三試薬との組合わせで、アッセイの感度を損なわずに、サンドイッチアッセイのダイナミックレンジを増加させるために作用している。
【００３５】
好ましい実施態様において、第一および第二試薬の分析物または標識された試薬への結合は、分析物濃度および第三試薬の分析物への結合に依存し、または標識された試薬は、分析物濃度に依存しない。したがって、第二試薬（陽性対照）は可変的である一方、第三試薬（陰性対照）は一定である。本発明は、「静的な」陽性対照の要件を取り除くものの、そのような対照は害することなく含まれていてもよい。
【００３６】
第一、第二および第三試薬は、当技術分野で既知の技術を用いて変換器に付着させてもよい。好ましくは、付着は、非共有結合を介したものであり、例として、ストレプトアビジンまたはポリストレプトアビジン等の一次層は、変換器上で吸収され、試薬は結合事象によって一次層に付着する。
【００３７】
また、アッセイは、標識された試薬の存在を要求する。「標識された」試薬とは、標識に付着した試薬を意味し、その標識は、無放射減衰によるエネルギーを発生させるための放射源によって発生した電磁放射線を吸収することができる。変換器によって電気シグナルへ変換されるのはこの無放射減衰である。  
【００３８】
したがって、標識は、このように電磁放射線と相互作用が可能なあらゆる材料からなっていてもよい。好ましくは、標識は、制限することなく、炭素粒子、有色ポリマー粒子（例えば、有色ラテックス）、色素分子、酵素、蛍光性分子、金属（例えば、金）粒子、ヘモグロビン分子、赤血球、磁気粒子、非導電コア材料および少なくとも１つの金属シェル層を有するナノ粒子、ポリピロールまたはその誘導体からなる粒子ならびにそれらの組合わせから選択される。好ましくは、標識は炭素粒子または金粒子であり、最も好ましくは炭素粒子である。
【００３９】
磁気粒子の場合、電磁放射線は高周波である。以上に言及された他の標識はすべてＩＲまたはＵＶ放射を含み得る光を使用する。金粒子は市販されたものであるか、または、既知の方法（例えば、G. Frens, Nature, 241 , 20-22 (1973)を参照のこと）を使用して調製してもよい。ナノ粒子標識のより詳細な説明については、US 6,344,272およびWO 2007/141581を参照のこと。
【００４０】
好ましくは、本発明では、粒径２０〜１０００ｎｍ、より好ましくは１００〜５００ｎｍの粒子を使用する。粒径とは、粒子の最も広い地点での直径を意味する。粒子の密度は、アッセイの種類に依存するであろう。アッセイが拡散制御されている場合、粒子の密度は好ましくは０．５〜３．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５〜２．０ｇ／ｍＬ、最も好ましくは１．８ｇ／ｍＬである。このアッセイタイプでは、粒子は前述の粒径および密度を有する炭素粒子である。アッセイが重力アシストである場合、粒子の密度は、好ましくは１．５〜２３ｇ／ｍＬ、より好ましくは１５〜２０ｇ／ｍＬ、最も好ましくは１９ｇ／ｍＬである。このアッセイタイプでは、粒子は前述の粒径および密度を有する金粒子である。
【００４１】
結合事象が発生した場合、標識は変換器に近位である。すなわち、標識は、サンプルを照射した上での標識により生成されたエネルギーを変換器が検出することができるように変換器の表面に十分に接近している。しかしながら、標識と変換器の表面の間の実際の距離は、標識のサイズおよび性質、抗体および分析物のサイズおよび性質、サンプル媒質の性質、電磁放射線の性質ならびに検出器の対応する設定等の多くの変数に依存するであろう。本発明の装置は、電磁放射線の一連のパルスを生成するのに適応させた放射線源を含んでいてもよく、検出器は放射源からの電磁放射線の各パルス間の遅延時間を決定するために適応され、かつそれによる電気シグナルの生成は、図１に関して説明したように、変換器に対する標識の位置の正確な測定を可能にする。 
【００４２】
第一、第二および第三試薬、同様に標識された試薬の性質は、分析物の性質に依存するであろう。特に好ましい実施態様において、標識された試薬は、分析物あるいは分析物の複合体または誘導体に対して産生された抗体を含み、第一試薬は分析物あるいは分析物の複合体または誘導体に対して産生された抗体であり、第二試薬は分析物の類似体であり、第三試薬は中性の表面である。原則として、各試薬に単一の分子を使用することができるが、実際上、第一、第二および第三試薬、同様に標識された試薬は分子の母集団である。用語「抗体」は、好ましくはその範囲内にＦａｂフラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および組換え結合フラグメントを含む。 
【００４３】
抗体−抗原反応の代替として、試薬および分析物は、第一および第二核酸が相補的である第一および第二核酸でもよく、あるいはアビジンまたはその誘導体を含有している試薬、あるいはビオチンまたはその誘導体を含有している分析物、あるいはその逆であってもよい。また、試薬はアプタマーであってもよい。また、システムは生物学的アッセイに制限されず、例えば、水中の重金属の検出に応用してもよい。また、システムは液体に制限されず、任意の流体系を使用してもよい、例えば、大気中での酵素、細胞、ウィルス等の検出など。
【００４４】
観察可能な最大のシグナルは、標識の表面への結合をモニタリングした際に達成することができる最大のシグナルである。代替の物質移行現象（例えば、対流、磁気移動、浮力、沈殿等）の不在下において、粒子の変換器への結合は、分析物および標識された試薬の拡散率により制御され、それはこれら成分の流体力学半径およびサンプルの粘度／温度によって大きく制御される。陰性対照は、測定する分析物の存在または不在に依存しないシグナルを提供すべきである。
【００４５】
免疫測定（即ち、サンドイッチまたは試薬過剰）アッセイについては、（標識された試薬上の抗体を認識する）陽性対照として分析物の類似体を使用し、かつ陰性対照として非反応性表面を使用することによって性能の改善が達成され得ることが見出された。  併用して使用した際に、これらの対照はシステムの測定範囲の上限および下限を定義する。したがって、システムからの出力は、測定がこれらの２つの限界間に介在する比として定義される。驚くべきことに、この組合わせは、システム構成（例えば、変換器を形成している材料）、環境条件、サンプル変異性および組合わせにおける所望しない粒子移動（例えば、沈殿）における変異の説明をするために使用してもよい。本発明が提供する対照は、これらのすべてのパラメーターを同時に補填することが見出された。
【００４６】
異なる濃度、または異なる親和性にて異なる抗体で異なる試薬スポットを組み入れることにより、および異なる標識の混合物を使用することにより、他の方法を使用してアッセイのダイナミックレンジを増加させることができる。しかしながら、これは、システムの複雑さを大幅に増大させ、さらなる反応チャンバーが必要であり、かつサンプルの異なる部位を異なる試薬および／または標識と混合するためにサンプルを分割することが必要となり得る。
【００４７】
目的の分析物を含有していると思われるサンプルは、一般に流体サンプル、例えば液体サンプルであり、また通常は体液、例えば血液、血漿、唾液、血清または尿等の生体サンプルとなるだろう。サンプルは懸濁粒子を含有していてもよく、一層のこと全血であってもよい。本発明の方法の利点は、過度にアッセイの結果に影響を及ぼさずに、懸濁粒子を含有しているサンプルにアッセイを実行し得ることである。サンプルは、通常、マイクロリットルの規模である（例えば、１〜１００μＬ、好ましくは、１〜１０μＬ）。流体サンプルを保持するために、変換器は、好ましくは１つ以上の側壁、上部表面および下部表面を備えるサンプルチャンバーに位置する。このため、本発明の装置は、分析物あるいは分析物の複合体または誘導体を含有している液体サンプルを保持するための変換器に接触しているチャンバーをさらに備えてなることが好ましい。好ましい実施態様において、変換器はチャンバーに一体化している、即ち、それは、チャンバーを定義する側壁のうちの１つあるいは上部または下部表面を形成する。好ましくは、変換器は図３に示されるように上部表面を形成する。明らかに、第一、第二および第三試薬ならびに標識された試薬は、サンプルとの接触を可能にするためにチャンバーの内部表面上に存在するであろう。サンプルは、単に、例えば、毛管路の内側の表面張力により保持される場合がある。 
【００４８】
装置は、第一試薬を含有している第一チャンバー、第二試薬を含有している第二チャンバー、および第三試薬を含有している第三チャンバーを含んでいる。第一、第二および第三試薬は変換器に近位である。第一、第二および第三チャンバーは、好ましくは流体連通であり、サンプルと標識された試薬の混合物は逐次的な方法で３つのチャンバーを充填できる。３つのチャンバーの中の各々のサンプルおよび標識された試薬は、本発明において同一であることに留意すべきである。装置は、好ましくは装置の外部と接触するサンプル回収端部および図３の中のコア２１に示されるように、サンプルチャンバー（複数可）と流体連通したサンプル送出端部を有する毛管路をさらに含んでいる。 
【００４９】
標識された試薬および任意の１種以上の追加試薬は、本発明の装置に組み入れられたチャンバーに保存することが好ましい。また標識された試薬は、装置および標識された試薬を組み入れたキットの一部として供給してもよい。このため、本発明はまた、本明細書に記載の装置および標識された試薬を含むキットを提供する。標識された試薬は、変換器の表面上に置いてもよい。
【００５０】
本発明の装置はたった１つの分析物を検出することに制限されず、検出される異なる分析物あるいは分析物の誘導体または複合体の各々を選択的に結び付ける異なる第一試薬を使用することで異なる分析物が検出されるかもしれない。変換器の異なる位置を逐次的に照射し、出力を逐次的に問い合わせることにより、変換器への電気接続をたった１つ使用するだけで複数の試験を実施することができる。
【００５１】
見込みのある追加的なバックグランド干渉源は、サンプルの標識された試薬および細胞性成分を含む、圧電性/焦電気性変換器の表面上への懸濁粒子の沈降である。この干渉源は、変換器をバルク溶液の上（例えば、反応チャンバーの上部表面）に配置することで低減させ得る。したがって、万が一沈降が発生した場合には変換器に干渉しない。あるいは、粒子は媒質より密度が低くてもよく、それ故に、変換器の表面上で沈降するよりむしろバルク溶液の表面で浮かぶかもしれない。このことおよび他の改良は本発明の範囲に含まれている。
【００５２】
好ましい実施態様において、本発明の装置は、本質的に上記特徴からなる。「本質的に」とは、アッセイを実施するために他の特徴が必要とされないことを意味する。装置は、個別の読取機およびカートリッジ、または一体化装置の形態をとってもよい。前者では、装置は読取機およびカートリッジから形成され、このカートリッジは読取機と解放可能に係合可能であり、かつこの読取機は放射線源および検出器を組み込み、かつこのカートリッジは変換器ならびに第一、第二および第三試薬を組み込む。読取機は、好ましくは持ち運び可能な読取機である。本発明はまた、本明細書に定義された変換器、第一、第二および第三試薬を備えてなるカートリッジを提供する。カートリッジは、好ましくは使い捨てのカートリッジである。 
【００５３】
本発明を、制限することを意図していない次の例を参照して記載する。 
【実施例】
【００５４】
ＰＶＤＦフィルム
以下の例において、インジウムスズ酸化物でコーティングした分極した圧電性／焦電気性ポリフッ化ビニリデンフィルム（ＰＶＤＦ）バイモルフィルムをセンシング装置として使用した。インジウムスズ酸化物表面を、気相ガス堆積法によってパリレン（厚さおよそ１ミクロンの）の層でコーティングした。この方法は、パラシクロファン前駆体の昇華およびその後の熱分解、その後の表面上での遊離基重合を伴うもであった。さらなる詳細については、WO 2009/141637を参照のこと。その後、結果として得られたパリレン層を、２時間にわたる受動的吸着によってビオチン化されたウシ血清アルブミン（１０ｍＭリン酸緩衝液中１０μｇ／ｍＬ）の層でコーティングした。表面を洗浄し、次いで、一晩室温でのインキュベーションによってポリストレプトアビジン溶液（ＫＣＩ  ２．７  ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣＩ  １３７  ｍｍｏｌ／Ｌおよび０．０５％ Tweenを含有しているＰＢＳ−１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液中１０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。Tischerら（米国特第５，０６１，６４０号）によって記述されるように、ポリストレプトアビジンを調製した。
【００５５】
材料
J. R. BirchおよびE. S. Lennox, Wiley-Blackwell, 1995による「Monoclonal Antibodies: Properties, Manufacture and Applications」の記載に基づきモノクローナル抗体を産生し、当技術分野において既知の方法によってビオチン化した。炭素標識レポーターコンジュゲートは、Van Doonらの記載（米国特第５，６４１  ，６８９号）に基づき調製した。
【００５６】
カートリッジの調製
上記のように、普遍的なストレプトアビジンコーティングで、ＰＶＤＦの焦電性ポリマーフィルムのストリップの３つの個別領域をコーティングした。３つの領域は、センサーの表面へ付着させた粘着性スペーサーによって分離され、その後の試薬の各領域へのインキュベーションが表面の相互汚染なく可能となる。３つの表面（標識されたスポット１、スポット２およびスポット３）は、３つの異なるビオチン化された試薬でコーティングし、洗浄し、次いでショ糖安定化剤の存在下で乾燥させた。
【００５７】
図３に示されるように、カートリッジ１４はアッセイを実施するために製造した。カートリッジ１４は、補強剤１６上で支持した抗体でコーティングした圧電性／焦電性フィルム１５から製造した。３つのサンプルチャンバー１８を形成するために、ダイス切断の感圧接着剤でコーティングしたポリエステルフィルム１７を表面に適用した。発生した電荷を検出するための、圧電性／焦電性フィルム１５の上部および底部表面への電気接続を可能にするために設備を作成した。次いで、標識２０を適用した上部カバー１９とコア２１およびシール２２と底部カバー２３の間に上記成分を挟むことによってカートリッジ１４を形成した。
【００５８】
アッセイ
コア２１中の毛管路を通してサンプルをサンプルチャンバーに充填することでアッセイを実行した。カートリッジに装填する前にサンプルを標識された炭素粒子と事前混合するか、または、炭素粒子（および任意の追加試薬）をカートリッジの導管内下で乾燥させた。その後、サンプルは、機器中の変位ポンプによってカートリッジの導管を通って汲まれることにより、試薬と混合させた。測定チャンバーが充填された後、それらを次いで断続ＬＥＤ光で逐次的に照射した（上部カバー１９の孔を通って）。各ＬＥＤパルスについて、増幅器およびアナログ・デジタル（ＡＤＣ）変換器を使用して、圧電性／焦電性フィルム１５にわたって測定した。ＡＤＣシグナルの変化は経時的に計算した。各スポットからの最終出力は時間の関数としてのＡＤＣからのシグナルの変化率である。  
【００５９】
例１（比較例）および実施例２（本発明）
ＩｇＥについて異なる２つのタイプのアッセイを実施した。各アッセイに、３つの測定チャンバー、表示スポット１（陰性対照）、スポット２（サンドイッチアッセイ）およびスポット３（陽性対照）を使用した。スポット１および２におけるコーティングは各アッセイについて同一であった。スポット１は、濃度１  ｐｇ／ｍｌ  でビオチンコンジュゲートした７０ｋＤａアミノ−デキストラン（Fleet Bioprocessing）  でコーティングし、かつスポット２は、濃度４ｇｍｌでビオチン化した抗ｌｇＥ  Ｈｙｔｅｓｔマウス抗体（クローン４Ｆ４）でコーティングした。スポット３でのコーティングは各アッセイに特異的であった。例１（比較例）において、固定の陽性対照で、スポット３をビオチン化したヤギ抗−マウスＩｇＧでコーティングした。実施例２（本発明）において、ビオチン化ＩｇＥを、１０ｇ／ｍｌの濃度でスポット３上にコーティングした。一致する抗ｌｇＥ抗体、Ｈｙｔｅｓｔ  ４Ｆ４、でコーティングした炭素粒子をシステムにおいて標識として使用した。混乱を回避するために、スポット２の表面（上記で第一チャンバーと記載されている）は、第一試薬と同等であり、スポット３の表面（上記で第二チャンバーと記載されている）は、第二試薬と同等であり、スポット１の表面（上記で第三チャンバーと記載されている）は、第三試薬と同等である。繰り返し測定を、４つの異なるＩｇＥ濃度（０、１５６、５４７、１４７１  ｌＵ／ｍＬ）で新規の血液サンプルに実施した（各濃度について６回）。各カートリッジについては、スポット１からの出力を、スポット２およびスポット３（即ち、両方の測定は補正基線であった）の両方の出力から差し引いた。その後、スポット２での基線補正測定を、スポット３での基線補正測定で割った。その後、平均最終アッセイカウント（および標準偏差）を各濃度で作動させたカートリッジから計算した。結果は表１に記載されている。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
図４は、例１（比較例）の個別スポット２カウントが、本発明の動的対照を使用せずに、ＩｇＥ濃度５４７〜１４７１  ｌＵ／ｍＬで、飽和および若干のフッキングを上昇させることを示す図である。
【００６２】
図５は、例１（比較例）および実施例２（本発明）の個別スポット３カウントを比較する図である。結果は、例１（比較例）のスポット３カウントは、分析物濃度と無関係に高いままであり、かつ実施例２（本発明）のスポット３カウントは、分析物濃度の増加とともに減少することを示している。
【００６３】
図６は、両方の対照を使用したデータの用量−応答曲線を示す図である。例１（比較例）は、はるかに狭いダイナミックレンジ（約２００  ｌＵ／ｍＬで飽和）を示す一方、実施例２（本発明）は、最大１５００  ｌＵ／ｍＬまで測定した、はるかに広いダイナミックレンジを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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