(57)【要約】  本発明は、そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む遺伝子操作された標的ポリペプチド（ＴＰ）を調製する方法であって、昆虫細胞株（ＩＣＬ）において前記ＴＰを発現させることによる、および前記ＩＣＬにおいて新規直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対を発現させることによる方法、前記直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡの遺伝情報を前記ＩＬＣに導入するのに適しているバキュロウイルスのシャトルベクター（バクミド）、前記ＩＬＣにおいて前記の特定のｔＲＮＡを発現させるための特定の発現カセット、前記方法によって得られたＴＰならびに前記ＴＰを調製するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む標的ポリペプチド（ＴＰ）を調製する方法であって、
ａ）前記の１個以上のｎｃＡＡの存在下で、昆虫細胞株（ＩＣＬ）において前記ＴＰを発現させるステップを含み、このステップにおいてＴＰをコードするヌクレオチド配列（ＣＳＴＰ）が、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクターコドンを含み；同時にまたは任意の順序で逐次的に、
ｂ）前記ＩＣＬにおいて、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基を、前記ＴＰのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、１種以上の直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ）対を発現させるステップを含み、このステップにおいて前記の１種以上の細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡのコード配列（ＣＳｔＲＮＡｎｃＡＡ）は、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下にあり；
ｃ）任意選択で、発現されたＴＰを回収するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＣＬが、前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現させるのに必要な遺伝情報を保持する、１種以上のバキュロウイルスのベクターを用いてトランスフェクトされる、または形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＳＩＣが、
ａ）昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の調節配列、および
ｂ）昆虫ｔＲＮＡ遺伝子の調節配列、特に、Ｈ１調節配列
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＳＩＣが、Ｕ６プロモーターを含み、前記Ｕ６プロモーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか１種の部分配列を含むその機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＣＬが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）またはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、特に、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株、好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２  Ｒ＋（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＤＧＲＣ）ストック番号１５０）から選択される、請求項の１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１種以上の直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡ  シンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ）対のコード配列を含むバキュロウイルスのベクターであって、前記細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列（ＣＳｔＲＮＡｎｃＡＡ）が、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下に置かれる、ベクター。
【請求項７】
前記ＲＳＩＣが、Ｕ６プロモーターを含み、前記Ｕ６プロモーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
１個以上のｎｃＡＡ残基を、前記ＩＣＬによって同時発現されるＴＰのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、１種以上の直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ  Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現可能な昆虫細胞株（ＩＣＬ）であって、各細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列が、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下で発現される、昆虫細胞株（ＩＣＬ）。
【請求項９】
前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現させるのに必要な遺伝情報を保持する１種以上のバキュロウイルスのベクター、特に、請求項６および７のいずれか一項に定義される１種以上のベクターを用いてトランスフェクトされる、または形質導入される、請求項８に記載のＩＣＬ。
【請求項１０】
前記ＲＳＩＣが、Ｕ６プロモーターを含み、前記Ｕ６プロモーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項８または９に記載のＩＣＬ。
【請求項１１】
前記ＩＣＬが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）、またはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、特に、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株、好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２  Ｒ＋（ＤＧＲＣ  １５０）から選択される、請求項８から１０のいずれか一項に記載のＩＣＬ。
【請求項１２】
配列番号１〜８のＵ６−１〜Ｕ６−８から選択されるｔＲＮＡｐｙｌをコードする発現カセットまたは昆虫細胞において細菌性のｔＲＮＡｐｙｌを機能的に発現するその能力を保持する、少なくとも４０％の配列同一性の程度を有する配列。
【請求項１３】
そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む標的タンパク質（ＴＰ）であって、前記の１個以上のｎｃＡＡの存在下で、昆虫細胞株（ＩＣＬ）においてＴＰをコードするヌクレオチド配列（ＣＳＴＰ）を発現させることによって得られ、前記ＣＳＴＰが、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクターコドンを含み、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られ、任意選択で、そのアミノ酸配列中に含有される前記の少なくとも１個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基とクリック反応を実施することによってさらに化学的に修飾される、標的タンパク質。
【請求項１４】
１個以上のｎｃＡＡ残基を有する組換え標的ポリペプチドＴＰを調製するためのキットであって、少なくとも１個のｎｃＡＡまたはその塩を含み、請求項６または７に記載の少なくとも１種のバキュロウイルスのベクターをさらに含む、キット。
【請求項１５】
プロモーター配列が、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む遺伝子操作された標的ポリペプチド（ＴＰ）を調製する方法であって、昆虫細胞株（ＩＣＬ）において前記ＴＰを発現させることによる、および前記ＩＣＬにおいて新規直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対を発現させることによる方法、前記直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡの遺伝情報を、前記ＩＬＣ中に導入するのに適しているバキュロウイルスのシャトルベクター（バクミド）、前記ＩＬＣにおいて前記の特定のｔＲＮＡを発現させるための特定の発現カセット、前記方法によって得られたＴＰ、ならびに前記ＴＰを調製するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の組込みは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および真核細胞におけるタンパク質の機能付与のための主要なツールである。遺伝暗号拡張は、数十年前から使用されており、その間に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ならびに哺乳動物（非特許文献１）、酵母（非特許文献２）またはキイロショウジョウバエ（非特許文献３）のような真核細胞系において十分に確立されている。この系は、タンパク質中に非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を部位特異的に組み込むために使用される。種々の官能基を有する非標準アミノ酸の導入は、例えば、単一分子研究もしくは超分解能顕微鏡観察のためのタンパク質の標識、タンパクの架橋または最適な翻訳後修飾の結合において適用される。この目的のために、シンセターゼ／ｔＲＮＡ対（発現宿主に対して直交性である）が、対象のタンパク質とともに同時トランスフェクトされなくてはならない。シンセターゼは、非標準アミノ酸を認識することができ、これは、アンバー停止コドンに応じて伸長されるタンパク質鎖中に挿入される。いくつかの系、例えば、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＴｙｒまたはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌがすでに存在する（非特許文献４）。
【０００３】
アンバー停止コドン、ＵＡＧは、天然アミノ酸の組込みを指示するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成系において、およびアフリカツメガエル卵母細胞において成功裏に使用されてきた。３種の停止コドンの中でも、ＵＡＧは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において最も使用されない停止コドンである。いくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ＵＡＧを認識し、天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含有する。さらに、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは、従来のタンパク質突然変異誘発において使用されてきた。
【０００４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、小さいおよび中程度の大きさのタンパク質は、多量に容易に発現され得る。しかし、このような簡単な実験用宿主は、理想的に天然の真核細胞翻訳後タンパク質修飾を有する大きな多タンパク質複合体の発現には十分に適していない。特に、真核生物に起因する、高分子量タンパク質またはタンパク質複合体の発現のためには、その他の発現宿主、例えば、哺乳動物培養物が好ましい。大きさの限界に加えて、ほとんどの翻訳後修飾も、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって発現されるタンパク質中には存在しない。
【０００５】
Ｍｕｋａｉら（上記を参照のこと）は、ｎｃＡＡを特定の部位でタンパク質中に組み込むためのキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞ベースの系を開発した。原核生物のｔＲＮＡＴｙｒを含む種々の発現系を構築し、Ｓ２細胞において調べた。キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｕ６プロモーター２番の制御下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡＴｙｒを含むＵ６−ＥＹＲと名付けられた発現系が、最良に作動した。３コピーのＵ６−ＥＹＲおよび３−ヨード−Ｌ−チロシンに特異的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳのコード配列を保持するプラスミドベクターを、Ｓ２細胞を安定にトランスフェクトするために使用した。さらに、類似に、Ｃｈｉｎらは、メタノサルシナピロリジンｔＲＮＡ／ＲＳ対を、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞および動物において使用できることを示した（非特許文献５および非特許文献６）。
【０００６】
しかし、上記の先行技術に記載されたような遺伝子操作されたタンパク質の真核細胞タンパク質発現は、依然として満足のいくものではない。
【０００７】
したがって、本発明によって解決されるべき問題は、昆虫細胞株において、発現されたタンパク質の翻訳後修飾が達成され得るように、その配列内に非標準アミノ酸残基を保持する適切にプロセシングされた真核細胞タンパク質または複数のタンパク質の費用効率の高い大規模発現を可能にする新規方法およびツールを開発することであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、ＰＮＡＳ  ２０１３年、第１１０巻、第２９号：１１８０３〜１１８０８頁
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．、Ｃｒｏｐｐ，Ｔ．Ａ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｍ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３０１巻、９６４〜９６７頁
【非特許文献３】Ｍｕｋａｉ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０年、第１９巻：４４０〜４４８頁
【非特許文献４】Ｌｉｕ，Ｃ．Ｃ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２０１０年）．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第７９巻、４１３〜４４４頁
【非特許文献５】Ｂｉａｎｃｏ，Ａ．、Ｔｏｗｎｓｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．、Ｇｒｅｉｓｓ，Ｓ．、Ｌａｎｇ，Ｋ．およびＣｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．（２０１２年）．  ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ第８巻、７４８〜７５０頁
【非特許文献６】Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．Ｓ．、Ｔｏｗｎｓｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｉａｎｃｏ，Ａ．、Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｊ．、Ｓａｃｈｄｅｖａ，Ａ．、Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ｓ．Ｊ．、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｌａｎｇ，Ｋ．、Ｐｉｓａ，Ｒ．、Ｇｒｅｉｓｓ，Ｓ．ら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３２巻、４６５〜４７２頁
【発明の概要】
【０００９】
本発明の問題は、驚くべきことに、改訂バキュロウイルスベクターと組み合わせて、昆虫細胞株において、特に、Ｓｆ２１細胞において遺伝暗号拡張を確立することによって解決された。特に、本発明者らは、直交性シンセターゼＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対を、広く使用されるバクミドベクター中に組み換え、その結果、新規ＤＨ１０  Ｂａｃ−ＴＡＧ細胞を得た。特に、大きなタンパク質集合体を容易に作製し、真核生物においてそれらを発現させるための多用途のプラットフォームであるＭｕｌｔｉＢａｃ系が適用される。本発明者らは、前記方法によって、ｎｃＡＡを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）中ならびにいくつかの異なる多タンパク質複合体中に導入することに成功した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、種々の生物（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））由来のｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子（配列番号１０〜１４）を示す図である。ヒトおよびショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来のｓｎＲＮＡ遺伝子はｇｅｎＢａｎｋから引き出され、ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のｓｎＲＮＡ  Ｕ６アイソフォームＥ．および第１のカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）  ｓｎＲＮＡが示されており、配列はゲノム配列から取得された。すべての遺伝子は、互いに高度に類似しており、ヌクレオチドのわずかな割合のみが異なっている（下線を引くことによって強調されている）。また、配列は長さが等しく、わずかに、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）アイソフォームＥが、Ｎ末端（５’末端）で１５ヌクレオチドを喪失し、Ｃ末端（３’末端）で１３ヌクレオチドおよびポリＴテールを有するだけである。
【図２】図２は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＵ６プロモーター、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６および３’末端にアラインされた、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子（下線を引くことによって強調されている）および対応する上流Ｕ６プロモーター領域および対応する下流３’終結シグナルのアラインメントを示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．らＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ第２３巻、２９４７〜２９４８頁（２００７年）。Ｇｏｕｊｏｎ，Ｍ．らＡ  ｎｅｗ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ａｔ  ＥＭＢＬ−ＥＢＩ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ第３８巻、Ｗ６９５〜６９９（２０１０年））を使用して行ったアラインメントは、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子が十分保存されていることを示す。プロモーター領域は、特に、ｓｎＲＮＡ遺伝子に近い領域で同様に見え、同じことが３’終結シグナルに当てはまる。Ｕ６−１およびＵ６−３配列のみは、その他のものと比較してより高い程度のミスアラインメントを示す。
【図３】図３は、種々のｔＲＮＡＰｙｌ構築物およびこれらの構築物を用いてトランスフェクトされたＳｆ２１細胞のＦＡＣＳ結果を示す。  Ａ：種々の生物（ヒト、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）およびスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ））のＵ６プロモーター配列、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）に由来するｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子の上流と、それに続く対応する各ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の下流３’終結シグナルが例示されている。  Ｂ：種々のＵ６−ｔＲＮＡ構築物およびリポーター構築物（ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳＷＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（タグ）を用いてトランスフェクトされたＳｆ２１細胞のＦＡＣＳ結果を示す（図３Ｂ−１〜３Ｂ−４）。各解析は、３つのプロットによって表される。上部右側は、散乱データおよび選択されたゲートを示し、黒色エクリプスを用いて記されるような生存細胞を含有する。より低い右側プロットでは、黒色エクリプスを用いて単一細胞が選択されている。最終データは、左側の図において示され、４つのゲートに分割されている。上部左側のものは、ｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する細胞（ｍＣｈｅｒｒｙのみ）のデータ点を示し、下部左側のものは、ｍＣｈｅｒｒｙもＧＦＰも発現しない細胞（二重陰性）を示す。下部右側ゲートは、ＧＦＰ発現細胞のみの細胞カウントを含有する（ＧＦＰのみ）。上部右側ゲートでは、ｍＣｈｅｒｒｙならびにＧＦＰを発現する、いわゆる、二重陽性細胞が示されている。上部パネルは、ＰｒＫを用いた発現結果を示し、下部のものは、ｎｃＡＡを有さないものを示す。図３Ｂ−１：ヒトＵ６−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ構築物。図３Ｂ−２：キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｄｍ）由来Ｕ６プロモーター。図３Ｂ−３、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（Ｂｍ）由来Ｕ６プロモーターが使用された。図３Ｂ−４は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）由来Ｕ６プロモーターを使用する発現パターンを示す。  Ｃ：この図は、種々のＵ６−ｔＲＮＡＰｙｌ構築物（プロモーター−ｔＲＮＡＰｙｌ  Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）−終結シグナル）の、種々の起源（ヒト、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｄｍ）およびカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）（Ｂｍ））のプロモーターおよび終結シグナルとの配列−アラインメントベースの比較を示す；ヨトウガ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）について、Ｕ６−２調節配列が示されている。
【図４】図４−１および４−２は、ｎｃＡＡを有するおよび有さない、ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（タグ）およびｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（１ｘ）またはｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（４ｘ）を用いてトランスフェクトされたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞のフローサイトメトリー解析を示す。各解析は、３つのプロットによって表されている。上部右側のものは、散乱データおよび選択されたゲートを示し、黒色エクリプスを用いて記されるような生存細胞を含有する。より低い右側プロットでは、黒色エクリプスを用いて単一細胞が選択されている。最後のデータは、左側の図において示され、４つのゲートに分割されている。上部左側のものは、ｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する細胞（ｍＣｈｅｒｒｙのみ）のデータ点を示し、下部左側のものは、ｍＣｈｅｒｒｙもＧＦＰも発現しない細胞（二重陰性）を示す。下部右側ゲートは、ＧＦＰ発現細胞のみの細胞カウントを含有する（ＧＦＰのみ）。上部右側ゲートでは、ｍＣｈｅｒｒｙならびにＧＦＰを発現する、いわゆる、二重陽性細胞が示されている。Ａ（図４−１）：１ｍＭ  ＰｒＫを用いた１ｘ  ｔＲＮＡカセットを用いてトランスフェクトされたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞。Ｂ（図４−２）：このトランスフェクションには４ｘｔＲＮＡカセットを使用した；Ｃ（図４−１）：Ａと同一であるが、ＰｒＫを用いない；Ｄ（図４−２）：Ｂと同一であるが、ＰｒＫを用いない。
【図５】図５は、パネルＡ〜Ｆにおいて、Ｓｆ２１およびＳ２Ｒ＋細胞の一過性トランスフェクションに、ならびにＳｆ２１細胞におけるバキュロウイルス系に使用されるプラスミドのプラスミドマップを示す。すべての耐性遺伝子（ｇｅｎｓ）、複製起点、その他の特徴ならびにタンパク質またはｔＲＮＡコーディング遺伝子が強調されている。  Ａ：Ｕ６（Ｓｆ２１）−２プロモーターの下、Ｕ６−３’終結シグナルをコードするＭｍ  ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子（ｇｅｎ）を含有するｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍのプラスミドマップ。Ｂ：このプラスミドは、ＯｐＥＩ２プロモーターの下のＭｍ  ＰｙｌＲＳ遺伝子およびＯｐＥＩ１プロモーターの下のリポーター構築物ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）で組み立てられている。Ｃ：ｐＵＣＤＭ−ＰｙｌＲＳ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍのプラスミドマップは、ｐ１０プロモーターの下のＭｍ  ＰｙｌＲＳ遺伝子（ｇｅｎ）およびＵ６（Ｓｆ２１）−２プロモーターの下のｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子（ｇｅｎ）と、それに続く、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２の３’終結シグナルを示す。Ｄ：ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓの遺伝子は、プラスミドｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ中に、ＰＨプロモーターの下にクローニングされており、さらに、プラスミドは、バクミドへの組込みのための２つのＴｎ７サイド（ｓｉｄｅ）、１つのＴｎ７Ｌおよび１つのＴｎ７Ｒを含有する。Ｅ：ｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ−ヘルセプチン−６Ｈｉｓは、ヘルセプチンのＦａｂ断片、ＰＨプロモーターの下の軽鎖（可変および定常領域）およびｐ１０プロモーターの下の重鎖（可変および定常領域）およびＣ末端６Ｈｉｓタグを含有する。このプラスミドはまた、Ｔｎ７サイドも含有する。Ｆ：ＴＡＦ１１およびＴＡＦ１３からなるＴＡＦ複合体は、ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄｕａｌプラスミド中に、それぞれ、ｐ１０およびＰＨプロモーターの下にクローニングされている。マップ中にＴｎ７サイドが含まれる。Ｇ：プラスミドｐＢＡＤ−ＴＢＰ−インテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにＴＢＰ遺伝子を含み、これは、Ａｒａプロモーターの下にインテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓタグを、および対応するＡｒａＣ遺伝子を有する。
【図６】図６は、ＤＨ１０ＢａｃＴＡＧを使用する、一次抗体として抗ＰｙｌＲＳおよび二次抗体として抗Ｒａｔ−ＨＲＰコンジュゲートを使用するＶ１ステージにおけるＭｍ  ＰｙｌＲＳの発現のウエスタンブロットを示す。マーカーレーンは、プロッティング後に手作業で描かれており、分子量は、ｋＤａで示されている。バクミドＶ１世代１〜８は、使用された８種の異なるバクミド−ＤＮＡ調製物に対応する。対照として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、標準ニッケル精製プロトコールを用いて精製されたＰｙｌＲＳ−６Ｈｉｓをロードした（ＰｙｌＲＳ  ｃｔｒｌ．）。
【図７】図７は、ＧＦＰ（Ｙ３９ＰｒＫ）の質量分析解析を示す。  ＧＦＰ（Ｙ３９ＰｒＫ）は、ＤＨ１０Ｂａｃ−タグ細胞から調製された、ＭＭ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴおよびｔＲＮＡＰｙｌ発現カセットを有するバクミド−ＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＳｆ２１細胞において発現された。Ａ：トリプシンを使用するペプチド消化の結果およびＧＦＰの位置Ｙ３９でのＰｒＫの組込みを示す対応するペプチド配列。Ｂ：タンパク質配列におけるＰｒＫの組込みを明確に示す天然質量結果。
【図８】図８は、ＧＦＰ（Ｙ３９ＳＣＯ）の質量分析解析を示す。  ＧＦＰ（Ｙ３９ＳＣＯ）は、ＤＨ１０Ｂａｃ−タグ細胞から調製された、ＭＭ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦおよびｔＲＮＡＰｙｌ発現カセットを有するバクミド−ＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＳｆ２１細胞において発現された。Ａ：ＧＦＰ配列の適用範囲を示す、トリプシンを使用するペプチド消化の結果。Ｂ：タンパク質配列におけるＳＣＯの組込みを明確に示す天然質量結果。
【図９】図９は、ヘルセプチン１２１ＰｒＫの質量分析解析を示す図である。  ヘルセプチン（１２１ＰｒＫ）は、ＤＨ１０Ｂａｃ−タグ細胞から調製された、ＭＭ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴおよびｔＲＮＡＰｙｌ発現カセットを有するバクミド−ＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＳｆ２１細胞において発現された。Ａ：位置１２１でのヘルセプチンの重鎖へのＰｒＫの組込みおよびヘルセプチンの軽鎖の適用範囲を示す、トリプシンを使用するペプチド消化の結果。Ｂ（図９Ｂ−１〜９Ｂ−５）：天然質量結果は、軽鎖（２３６１７）および重鎖（２５８３６）の天然質量に対応する２つの主なピーク（９．２１および９．５２）を示す。
【図１０】図１０は、ＴＡＭＲＡ−Ｈ−テトラジンおよびヘルセプチンＦａｂ野生型と反応させたヘルセプチンＦａｂ突然変異体１２１ＳＣＯのＳＰＡＣＣクリック反応の結果を示す図である。Ａ：蛍光スキャン；Ｂ：クーマシーブルーを用いるタンパク質染色。見られるように、Ｈｅｒ１２１ＳＣＯが選択的に記されている。
【図１１】図１１Ａ〜Ｈ、ＫおよびＬは、本発明の関連において適用されるような種々のプラスミドのマップを示す。
【図１２】図１２は、プロパルギル−リシン（ＰｒＫ）およびＳＣＯ−Ｌ−リシンの存在下または不在下での、ＧＦＰのアンバー突然変異体（Ｙ３９ＴＡＧ）の発現を例示し；クーマシーブルーで染色された対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されている。
【図１３】図１３Ａは、ＰｒＫを有するまたは有さない重鎖の位置１２１または１３２にアンバー停止コドンを保持するヘルセプチンＦａｂ断片のＳｆ２１細胞発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。図１３Ｂは、ＢＯＣ−リシンを有するまたは有さない同一突然変異体の発現を示す図であり；図１３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、野生型と比較した、ヘルセプチンＦａｂ断片１３２ＰｒＫ突然変異体の選択的アルキン-アジド環化付加反応を例示する（左パネル；突然変異体の特異的環化付加；右パネル非特異的クーマシーブルー染色）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ａ．一般定義および略語
１．定義
別に記載されない場合には、ヌクレオチド配列（ＮＳ）は、本明細書において５’→３’方向に表される。別に記載されない場合には、アミノ酸配列（ＡＳ）は、本明細書においてＮ末端→Ｃ末端方向に表される。
【００１２】
用語「ｎｃＡＡ」とは、一般に、２２種の天然に存在するタンパク質原性アミノ酸の中にはない、任意の非標準または非天然アミノ酸またはアミノ酸残基を指す。多数のｎｃＡＡは、当技術分野で周知である（概説については、Ｌｉｕ，Ｃ．Ｃ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２０１０年）Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第７９巻、４１３〜４４４頁；Ｌｅｍｋｅ，Ｅ．Ａ．（２０１４年）．  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ：ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ第１５巻、１６９１〜１６９４頁を参照のこと）。特に好ましいｎｃＡＡとは、翻訳後さらに修飾され得るものである。
【００１３】
用語「翻訳系」とは、一般に、成長するポリペプチド鎖（タンパク質）中に天然に存在するアミノ酸を組み込むために必要な成分のセットを指す。翻訳系の成分は、例えば、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）、ｍＲＮＡなどを含み得る。
【００１４】
アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）は、アミノ酸またはアミノ酸類似体を用いてｔＲＮＡをアシル化可能な酵素である。本発明のプロセスにおいて使用されるＲＳは、対応するｎｃＡＡを用いてｔＲＮＡをアシル化可能、すなわち、アシル化ｔＲＮＡｎｃＡＡである。
【００１５】
用語「直交性」とは、本明細書において、対象の翻訳系（例えば、細胞）によって低減された効率で使用される分子（例えば、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および／または直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ））を指す。「直交性」とは、対象の翻訳系の、それぞれ、内因性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼまたは内因性ｔＲＮＡを用いる場合の機能に対して、直交性ｔＲＮＡまたは直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの機能できないことまたは低減された効率、例えば、２０％未満しか効率でない、１０％未満しか効率でない、５％未満しか効率的でない、または例えば、１％未満しか効率的でないことを指す。
【００１６】
例えば、対象の翻訳系における直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は、内因性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによる内因性ｔＲＮＡのアシル化と比較した場合に、低減された効率またはゼロ効率で対象の翻訳系の任意の内因性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによってアシル化される。別の例では、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）は、内因性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによる内因性ｔＲＮＡのアシル化と比較して低減された効率またはゼロ効率で対象の翻訳系において任意の内因性ｔＲＮＡをアシル化する。
【００１７】
本発明のプロセスにおいて使用される「直交性ＲＳ／ｔＲＮＡ対」または「Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対」は、好ましくは、以下の特性を有する：Ｏ−ｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによって本発明の非天然アミノ酸を用いて「優先的にアシル化される」。さらに、直交性対は、対象の翻訳系において機能する、例えば、翻訳系は、非天然アミノ酸（ｎｃＡＡ）アシル化Ｏ−ｔＲＮＡを使用して、非天然アミノ酸（ｎｃＡＡ）をポリペプチド鎖中に組み込む。組込みは、鎖特異的に起こる、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡは、ポリペプチドのｍＲＮＡコーディングにおいて「セレクターコドン」、例えば、アンバー停止コドンを認識する。限定されない例として、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＴｙｒ；Ｂ．スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＴｒｐＲＳ／ｔＲＮＡＴｒｐまたはＭ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）由来のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌを挙げ得る。
【００１８】
用語「優先的にアシル化された」とは、Ｏ−ＲＳが、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（ｎｃＡＡ）を用いてアシル化する、対象の翻訳系の内因性ｔＲＮＡまたはアミノ酸と比較して、例えば、約５０％効率的な、約７０％効率的な、約７５％効率的な、約８５％効率的な、約９０％効率的な、約９５％効率的な、または約９９％またはそれ以上効率的な効率を指す。次いで、ｎｃＡＡは、高い忠実度で、例えば、所与のセレクターコドンについて約７５％超の効率で、所与のセレクターコドンについて約８０％超の効率で、所与のセレクターコドンについて約９０％超の効率で、所与のセレクターコドンについて約９５％超の効率で、または所与のセレクターコドンについて約９９％超の効率で成長するポリペプチド鎖中に組み込まれる。
【００１９】
用語「セレクターコドン」とは、翻訳プロセスにおいてＯ−ｔＲＮＡによって認識される、および内因性ｔＲＮＡによって認識されない任意のコドン（任意の停止コドン、任意のコーディングコドンまたはクアドルプレットコドン）を指す。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸、例えば、ｎｃＡＡをポリペプチド中のこの部位に組み込む。セレクターコドンとして、例えば、アンバー、オーカーおよびオパールコドンなどのナンセンスコドンなどの停止コドン、４塩基以上のコドン、天然または非天然塩基対由来のコドンなどが挙げられる。所与の系については、セレクターコドンはまた、天然３塩基コドン（すなわち、天然トリプレット）のうち１種を含む場合もあり、これでは、内因性の系が前記の天然トリプレットを使用しない、例えば、その天然トリプレットを認識するｔＲＮＡを欠いている系または天然トリプレットが稀なコドンである系。
【００２０】
「アンチコドン」は、対応するコドンの逆相補体配列を有する。
【００２１】
「Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ」対は、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡなどおよびＯ−ＲＳから構成される。  
「サプレッサーｔＲＮＡ」は、所与の翻訳系におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変更するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、停止コドン、４塩基コドンまたは稀なコドンを読み通すことができる。
Ｏ−ｔＲＮＡは、内因性シンセターゼによってアシル化されず、本明細書において記載されるようなセレクターコドンをデコード可能である。Ｏ−ＲＳは、例えば、拡張されたアンチコドンループを有するＯ−ｔＲＮＡを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（ｎｃＡＡ）を用いて優先的にアシル化する。
【００２２】
本発明に関連して「細菌性の」は、広く理解されなくてはならず、バクテリア（Ｂａｃｔｅｒｉａ）綱の、例えば、球菌科（Ｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バクテリア科（Ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、スピリルム科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）の、または藍藻綱（Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａ）の細菌；ならびにカルディスフェラ科（Ｃａｌｄｉｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ）、ケナルカエウム科（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｃｅａｅ）、デスルフロコックス科（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ピロディクティウム科（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉａｃｅａｅ）、スルフォロブス科（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｃｅａｅ）、サーモプロテウス科（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｃｅａｅ）、サーモフィルム科（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌａｃｅａｅ）、ニトロソスパエラ科（Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ）、アーケオグロブス科（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂａｃｅａｅ）、ハロバクテリウム科（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メタノバクテリウム科（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メタノテルムス科（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ）、メタノカルドコッカス科（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、メタノコッカス科（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、メタノケッラ科（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｃｅａｅ）メタノコルプスクルム科（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｃｅａｅ）、メタノミクロビウム科（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、メタノスピリルム科（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、メタノサエタ科（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｃｅａｅ）、メタノサルシナ科（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ）、メテルミコックス科（Ｍｅｔｈｅｒｍｉｃｏｃｃａｃｅａｅ）、メタノピュルス科（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｃｅａｅ）、サーモコッカス科（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、フェロプラズマ科（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、ピクロフィルス科（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）またはサーモプラズマ科（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）のような古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）（古細菌（Ａｒｃｈａｅａ））を包含する。
【００２３】
本発明に関連して「アンバーサプレッション」は、広く理解されなければならず、別に記載されない場合には、ポリペプチドまたはタンパク質中へのｎｃＡＡの導入を目的とする、任意の種類の再プログラミング化任意コドン（天然コドン、クアドルプレットコドンなど）として理解される。より狭くは、前記の用語は、用語停止コドンサプレッションと同義的に使用される。
【００２４】
「遺伝暗号拡張」とは、ポリペプチドまたはタンパク質へのｎｃＡＡの導入を目的として、任意のコドンを再プログラム化することを指す。
【００２５】
「アンバーサプレッサー」とは、その遺伝子産物が、細胞において、アンバー突然変異、特に、早期の停止コドンの生成をもたらす突然変異の作用を抑制する遺伝子を指す。アンバーサプレッサーの存在下では、細胞は、完全に機能的な生化学的に活性なポリペプチドを再度合成する。本発明に関連してアンバーサプレッサーは、そのアンチコドンが、アミノ酸コドンとしてアンバー（停止）コドンを、ここでは、天然に存在しないアミノ酸（ｎｃＡＡ）のコドンを認識するｔＲＮＡである。したがって、アンバーコドンは、遺伝子産物の生合成の際に早期の鎖終結をもはやもたらさない。
【００２６】
「ｓｎＲＮＡ」とは、１００〜３００残基の配列長を有する小核リボ核酸を指し、それらは、細胞核中に局在し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩによって産生される。いくつかの異なる種類のｓｎＲＮＡがあり、ｓｎＲＮＡ  Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ６およびＵ５は、ｍＲＮＡスプライシングプロセスに関与している。ｓｎＲＮＡは、触媒的に活性であり、細胞核においてプレｍＲＮＡのイントロンのスプライシングを担っている。
【００２７】
「バキュロウイルス」（「バクミド」）とは、いくつかの有利な特徴を示す発現ベクター系を指す：特に、細胞内タンパク質についてその他の真核生物発現系と比較して高レベルの異種遺伝子発現が達成されることが多い。多くの場合には、組換えタンパク質は可溶性であり、翻訳後修飾され、宿主タンパク質合成が減少される感染の終わりには、感染細胞から容易に回収される。増殖のために使用された細胞株は、懸濁培養で良好に成長し、大規模バイオリアクターにおける組換えタンパク質の製造を可能にする。ヘテロ−オリゴマータンパク質複合体の発現は、細胞に２種以上のウイルスを同時感染させることによって、または細胞に、２種以上の発現カセットを含有する組換えウイルスを感染させることによって達成できる。バキュロウイルスは、特定の無脊椎動物種に限定された、制限された宿主域を有する。それらは、脊椎動物には非感染性であるので、ほとんどの哺乳動物ウイルスを用いる場合よりも安全に働く。特定のバキュロウイルスベクターとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および昆虫細胞の両方において増殖させることができるシャトルベクターがある。バキュロウイルスベクター系は、一般に、公知であり、市販されている。例えば、多重遺伝子適用に特別に適している、いわゆる、ｍｕｌｔｉｂａｃ（登録商標）発現系が言及され、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるレシピエントＤＮＡの特定の部位への、複数のコード配列の簡単な迅速な導入を可能にする、改変されたバキュロウイルスレシピエントＤＮＡおよびバキュロウイルス導入用ベクターのセットを含む。前記のこのように改変されたバキュロウイルスレシピエントＤＮＡを、増殖させ、単離し、次いで、タンパク質発現が実施される適した宿主のトランスフェクションのためのベクターとして適用してもよい。「バキュロウイルス」（「バクミド」）ベクターは、単離されたバキュロウイルスＤＮＡならびにそれを保持するウイルスベクターを包含する。
【００２８】
「昆虫細胞由来」とは、昆虫細胞または昆虫細胞株中に天然に含有される、またはそれによって産生される遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００２９】
「トランスフェクション」とは、例えば、昆虫細胞のような真核細胞への直接遺伝子導入（例えば、ウイルスＤＮＡの）を指す。前記用語は、広く理解されなくてはならず、また、「形質導入」のプロセスによる、すなわち、ウイルス感染による、例えば、昆虫細胞のような真核細胞への遺伝子導入も包含する。
【００３０】
２．略語
ＴＰ                標的ポリペプチド
ｎｃＡＡ            非標準アミノ酸残基
ＩＣＬ              昆虫細胞株
ＣＳＴＰ            ヌクレオチド配列をコードするＴＰ
Ｏ−ＲＳ            直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ
Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ    直交性細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡ
ＣＳ  ｔＲＮＡｎｃＡＡ  前記の１種以上の細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡのコード配列
ＲＳＩＣ              昆虫細胞由来調節配列および
ｓｎＲＮＡ          小核リボ核酸
ｔＲＮＡ            トランスファーリボ核酸
ｔＲＮＡＰｙｌ        ピロリシルｔＲＮＡ
ＰｙｌＲＳ          ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ
ＰｙｌＲＳ  ＷＴ    ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ野生型
ＰｙｌＲＳ  ＡＦ    ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ突然変異体
Ｐｙｌ              ピロリシン
ＳＣＯ              リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
ＴＣＯ              リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
ＴＯＣ＊            リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
ＢＯＣ              ブトキシカルボニルリシン
ＰｒＫ              リシンの特定のプロピニル誘導体
ＧＦＰ              緑色フルオロフォア（オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質）
ｍＣｈｅｒｒｙ      赤色フルオロフォア（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来、単量体形態）
【００３１】
Ｂ．特定の実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態に関する。
【００３２】
１．特に、そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる、好ましくは、１〜５個の、最も好ましくは、１、２または３個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む遺伝子操作された標的ポリペプチド（ＴＰ）を調製する方法であって、
ａ）前記の１種以上のｎｃＡＡの存在下で昆虫細胞株（ＩＣＬ）において前記ＴＰを発現させるステップを含み、ＴＰをコードするヌクレオチド配列（ＣＳＴＰ）が、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基をコードする、１つ以上の、好ましくは、１〜５つの、最も好ましくは、１、２または３つのセレクターコドンを含み；同時にまたは任意の順序で逐次的に、
ｂ）前記ＩＣＬにおいて、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基を、前記ＴＰのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、１種以上の、好ましくは、１〜５種の、最も好ましくは、１、２または３種の直交性細菌性の、特に、古細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ）対を発現させるステップを含み、前記の１種以上の細菌性の、特に、古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡのコード配列（ＣＳｔＲＮＡｎｃＡＡ）は、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下にあり、
ｃ）任意選択で、発現されたＴＰを回収するステップを含む、方法。
【００３３】
前記ＴＰは、天然のまたは親の真核生物または原核生物ポリペプチドに対応し、その天然のまたは親のポリペプチドは、ｎｃＡＡを含有しないという点でＴＰと区別する。ＴＰは、１つの単一のまたは複数の同一または異なるポリペプチド鎖から構成され得る。発現されるＴＰは、そのポリペプチド鎖が、非共有結合（例えば、イオン性および／または疎水性相互作用）によって一緒に接着するか、または例えば、ジスルフィド橋を介して共有結合によって連結されるホモ−またはヘテロオリゴマータンパク質複合体（凝集体）の形態であり得る。
【００３４】
好ましい古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡとして、特に、種々のｎｃＡＡを用いてアミノアシル化され得、その結果、特に、アンバー停止コドンのようなセレクターコドン、種々のｎｃＡＡのセットから選択されるｎｃＡＡが、発現されるべきＴＰの対応する配列位置中に挿入され得る、いわゆる多特異性ｔＲＮＡｎｃＡがある。限定されない例として、Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）由来のｔＲＮＡＰｙｌまたはＢ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のｔＲＮＡＴｙｒがある。
【００３５】
２．前記ＩＣＬが、前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現させるのに必要な遺伝情報（コード配列および調節配列）を保持する、１〜５つの、好ましくは、１、２または３つの、最も好ましくは、１または２つのような１種以上のベクターを用いて一過性にまたは安定に、好ましくは、安定にトランスフェクトされる、実施形態１の方法。
【００３６】
３．前記ＩＣＬが、前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現させるのに必要な遺伝情報（コード配列および調節配列）を保持する、１〜５つの、好ましくは、１、２または３つの、最も好ましくは、１または２つのような１種以上のバキュロウイルスベクターを用いてトランスフェクトされる、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００３７】
４．前記ＲＳＩＣおよび前記ＩＣＬが、同一の昆虫種、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００３８】
５．前記ＲＳＩＣが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００３９】
６．前記ＲＳＩＣが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、特に、昆虫ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（にとって機能的である）調節配列から選択される、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００４０】
７．前記ＲＳＩＣが、
ａ）昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の調節配列および
ｂ）昆虫ｔＲＮＡ遺伝子の調節配列、特に、Ｈ１調節配列
から選択され、
実施形態ａ）が好ましい、実施形態４の方法。
【００４１】
８．前記ＲＳＩＣが、少なくとも１種の、好ましくは、１種の、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列のＵ６プロモーター配列５’下流、特に、図１に表されるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流を含む、前記の実施形態のうち１つの方法。
【００４２】
９．前記のＵ６プロモーターが、連続ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか１種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態８の方法。
【００４３】
好ましくは、前記Ｕ６プロモーターは、群ｂ）またはｃ）の配列から、より好ましくは、ｂ）またはｃ）、配列番号４、５、６、７または８から選択され得る。
【００４４】
日常的な実験によって、任意選択で、例えば、図３Ｃに表わされるもののような関連配列の適した配列アラインメントのようなさらなる適した配列情報に基づいて、熟練した読者ならば、過度の実験を行わずに、調節の意図される（ｉｎｔｅｎｄｅｎｔ）プロモーター活性を保持しながら、実施形態９の項目ａ）、ｂ）およびｃ）の下で記載されたものとは配列が異なり、ｔＲＮＡｎｃＡＡの意図される発現が、前記の機能的断片の制御下にある、さらなる適したプロモーター配列を提供可能である。
【００４５】
例えば、プロモーターの適した機能的断片は、意図されるプロモーター活性にとって必要な１つ以上の機能的部分エレメントを含む、連続する５’下流残基の単一断片であり得るか、または、２つ以上の部分配列を包含し得る、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、４００個未満の連続ヌクレオチド残基、３００個未満の、２５０個未満の、２００個未満の、１５０個未満の、または１００個未満の、かつ少なくとも２０個の、少なくとも３０個の、少なくとも４０個の、少なくとも５０個の、少なくとも６０個の、少なくとも７０個のまたは少なくとも８０個の、または少なくとも９０個のヌクレオチド残基を含み得る。このような機能的部分エレメントの限定されない例として、当技術分野において記載されたようなＴＡＴＡボックスまたはＰＳＥＡエレメントに言及できる。
【００４６】
例えば、プロモーターの適した機能的断片は、２０、３０、４０または２０〜３５０、２０〜３００、２０〜２５０、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜１００のような、もしくは３０〜３５０、３０〜３００、３０〜２５０、３０〜２００、３０〜１５０、３０〜１００のような、もしくは４０〜３５０、４０〜３００、４０〜２５０、４０〜２００、４０〜１５０、４０〜１００のような、もしくは５０〜３５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００のヌクレオチド残基のような、もしくは１００〜３５０、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜２００、１００〜１５０のヌクレオチド残基のような、もしくは８０〜３５０、８０〜３００、８０〜２５０、８０〜２００、８０〜１５０、８０〜１００のヌクレオチド残基のような５０〜３９９の配列長を有し得る。
【００４７】
１０．前記ＲＳＩＣが、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、特に、図１に表わされるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’−上流にＵ６終結配列を含む、前記の実施形態のうち１つの方法。
【００４８】
１１．前記Ｕ６ターミネーターが、連続ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の４７０〜５６９、
ｂ）配列番号２の４６２〜５６１、
ｃ）配列番号３〜８の４５５〜５５４
ｄ）好ましくは、ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態１０の方法。
【００４９】
好ましくは、前記Ｕ６プロモーターは、群ｂ）またはｃ）の配列から、より好ましくは、ｂ）またはｃ）、配列番号４、５、６、７または８から選択され得る。
【００５０】
日常的な実験によって、任意選択で、例えば、図３Ｃに表わされるもののような関連配列の適した配列アラインメントのようなさらなる適した配列情報に基づいて、熟練した読者ならば、過度の実験を行わずに、調節の意図される（ｉｎｔｅｎｄｅｎｔ）ターミネーター活性を保持しながら、実施例１１の項目ａ）、ｂ）およびｃ）の下で記載されたものとは配列が異なり、ｔＲＮＡｎｃＡＡの意図される発現が、前記の機能的断片の制御下にある、さらなる適したターミネーター配列を提供可能である。
【００５１】
例えば、ターミネーターの適した機能的断片は、意図されるターミネーター活性にとって必要な１つ以上の機能的部分エレメントを含む、連続３’上流残基の単一断片であり得るか、または、２つ以上の部分配列を包含し得る、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’下流に、１００個未満の連続ヌクレオチド残基、７５個未満の、５０個未満の（ｌｅｓｔ  ｔｈａｎ）、４０個未満の、３０個未満の、３０個未満かつ少なくとも１０個の、少なくとも１５個の、少なくとも２０個の、少なくとも３０個のヌクレオチド残基を含み得る。
【００５２】
例えば、プロモーターの適した機能的断片は、１０、２０、３０、４０または１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０のような、もしくは２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０のような、もしくは３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０のヌクレオチド残基のような５０〜９９の配列長を有し得る。
【００５３】
１２．以下のスキーム：
５’下流Ｕ６プロモーター／ｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列／３’上流Ｕ６ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡのための発現カセットが適用される、実施形態１の方法。
【００５４】
１３．細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、古細菌起源のもの、特に、Ｍ．Ｍ．ハフニエンス（ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、Ｍ．バケリ（ｂａｋｅｒｉ）およびＭ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）、好ましくは、Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）のようなメタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）の細菌のものである、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００５５】
１４．前記の細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００５６】
１５．前記の細菌性のｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号１〜８のＵ６−１〜Ｕ６−８から選択されるヌクレオチド配列または少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有し、昆虫細胞において、特に、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、好ましくは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株において、細菌性、特に、古細菌性のｔＲＮＡｐｙｌを機能的に発現するその能力を保持する配列を含む発現カセットによってコードされる、実施形態１４の方法。
【００５７】
１６．前記ｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号９のヌクレオチド配列またはｔＲＮＡＰｙｌ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有する配列を含む、実施形態１４または１５の方法。
【００５８】
１７．前記の細菌性のＯ−ＲＳが、古細菌起源のものであり、好ましくは、配列番号２７またはＰｙｌＲＳ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％のような配列同一性の程度を有する配列、特に、ＰｙｌＲＳ  ＷＴ配列番号２７またはＰｙｌＲＳ  ＡＦ配列番号３０のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳである、前記の実施形態のうちの１つの方法。
【００５９】
１８．前記ＩＣＬが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）、またはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、特に、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株、好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２Ｒ＋（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＤＧＲＣ）ストック番号１５０）またはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６３）から選択される、前記の実施形態のうちの１つの方法。好ましくは、前記ＩＣＬは、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、より好ましくは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、最も好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）から選択される。さらなる前記ＩＬＣは、トリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）細胞株、好ましくは、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＢＴＩ−Ｔｎ−５Ｂ１−４（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から選択され得る。
【００６０】
１９．１種以上の直交性細菌性、特に、古細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ）対のコード配列を含む、バキュロウイルスのシャトルベクター（バクミド）（単離されたバキュロウイルスのＤＮＡまたは前記ＤＮＡを保持する対応するウイルスベクターを包含する）であって、前記細菌性、特に、古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列（ＣＳｔＲＮＡｎｃＡＡ）が、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下に置かれる、ベクター。
【００６１】
２０．前記ＲＳＩＣが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、特に、昆虫ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（にとって機能的である）調節配列から選択される、実施形態１９のベクター。
【００６２】
２１．前記ＲＳＩＣが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．  ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する、実施形態１９または２０のうち１つのベクター。
【００６３】
２２．前記ＲＳＩＣが、
ａ）昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の調節配列および
ｂ）昆虫ｔＲＮＡ遺伝子の調節配列、特に、Ｈ１調節配列
から選択され、実施形態ａ）が好ましい、実施形態１９から２１のうち１つのベクター。
【００６４】
２３．前記ＲＳＩＣが、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、特に、図１に表わされるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、Ｕ６プロモーター配列を含む、実施形態１９から２２のうち１つのベクター。
【００６５】
２４．前記Ｕ６プロモーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態２３のベクター。
【００６６】
さらなる機能的断片の提供に関しては、上記の実施形態９が言及される。
【００６７】
２５．前記ＲＳＩＣが、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、特に、図１に表わされるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流にＵ６終結配列を含む、実施形態１９から２４のうちの１つのベクター。
【００６８】
２６．前記Ｕ６ターミネーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の４７０〜５６９
ｂ）配列番号２の４６２〜５６１
ｃ）配列番号３〜８の４５５〜５５４
ｄ）好ましくは、ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態２５のベクター。
【００６９】
さらなる機能的断片の提供に関しては、上記の実施形態１１が言及される。
【００７０】
２７．以下のスキーム：
５’下流Ｕ６プロモーター／ｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列／３’上流Ｕ６ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡの発現カセットを含む、実施形態１９から２６のいずれか１つのベクター。
【００７１】
２８．細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、古細菌起源のもの、特に、Ｍ．Ｍ．ハフニエンス（ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、Ｍ．バケリ（ｂａｋｅｒｉ）およびＭ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）、好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）の細菌のものである、実施形態１９から２７のいずれか１つのベクター。
【００７２】
２９．前記の細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である、実施形態１９から２８のいずれか１つのベクター。
【００７３】
３０．前記の細菌性のｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号１〜８のＵ６−１〜Ｕ６−８から選択されるヌクレオチド配列または少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有し、昆虫細胞において、特に、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．  ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株において、細菌性のｔＲＮＡＰｙｌを機能的に発現する能力を保持する配列を含む発現カセットによってコードされる、実施形態１９から２９のいずれか１つのベクター。
【００７４】
３１．前記ｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号９のヌクレオチド配列またはｔＲＮＡＰｙｌ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有する配列を含む、実施形態２９または３０のベクター。
【００７５】
３２．前記の細菌性のＯ−ＲＳシンセターゼが、古細菌起源のものであり、好ましくは、配列番号２７またはｔＲＮＡＰｙｌ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％のような配列同一性の程度を有する配列、特に、ＰｙｌＲＳ  ＷＴ配列番号２７またはＰｙｌＲＳ  ＡＦ配列番号３０のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳである、実施形態１９から３１のいずれか１つのベクター。
【００７６】
３３．１個以上のｎｃＡＡ残基を、前記ＩＣＬによって同時発現されるべきＴＰのアミノ酸配列中に導入することにとって必要な、１種以上の直交性細菌性のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡｎｃＡＡ  Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現可能な昆虫細胞株または昆虫細胞（ＩＣＬ）であって、各細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列が、昆虫細胞由来調節配列（ＲＳＩＣ）の制御下で発現される、昆虫細胞株または昆虫細胞（ＩＣＬ）。
【００７７】
３４．前記Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現するのに必要な遺伝情報を保持する１種以上のベクターを用いて、一過性にまたは安定にトランスフェクトされる、実施形態３３のＩＣＬ。
【００７８】
３５．前記ＩＣＬが、前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現するのに必要な遺伝情報を保持する１種以上のバキュロウイルスを用いてトランスフェクトされる、実施形態３３および３４の１つのＩＣＬ。
【００７９】
３６．前記ＲＳＩＣおよび前記ＩＣＬが、同一昆虫種に由来する、実施形態３３から３５のいずれか１つのＩＣＬ。
【００８０】
３７．前記ＲＳＩＣが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する、実施形態３３または３６のうちの１つのＩＣＬ。
【００８１】
３８．前記ＲＳＩＣが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、特に、昆虫ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（にとって機能的である）調節配列から選択される、実施形態３３から３７のうちの１つのＩＣＬ。
【００８２】
３９．前記ＲＳＩＣが、
ａ）昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の調節配列および
ｂ）昆虫ｔＲＮＡ遺伝子の調節配列、特に、Ｈ１調節配列
から選択され、実施形態ａ）が好ましい、実施形態３８のＩＣＬ。
【００８３】
４０．前記ＲＳＩＣが、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、特に、図１に表わされるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、Ｕ６プロモーター配列を含む、実施形態３３から３９のうちの１つのＩＣＬ。
【００８４】
４１．前記Ｕ６ターミネーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態４０のＩＣＬ。
【００８５】
さらなる機能的断片の提供に関しては、上記の実施形態９が言及される。
【００８６】
４２．前記ＲＳＩＣが、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流にＵ６終結配列を含む、実施形態３３から４１のうち１つのＩＣＬ。
【００８７】
４３．前記Ｕ６ターミネーターが、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の４７０〜５６９
ｂ）配列番号２の４６２〜５６１
ｃ）配列番号３〜８の４５５〜５５４
ｄ）好ましくは、ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のいずれか１種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態４２のＩＬＣ。
【００８８】
さらなる機能的断片の提供に関しては、上記の実施形態１１が言及される。
【００８９】
４４．以下のスキーム：
５’下流Ｕ６プロモーター／ｔＲＮＡｎｃＡＡコード配列／３’上流Ｕ６ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡの発現カセットを含む、実施形態３３から４３のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９０】
４５．細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、古細菌起源のもの、特に、Ｍ．ハフニエンス（ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、Ｍ．バケリ（ｂａｋｅｒｉ）およびＭ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）、好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）の細菌のものである、実施形態３３から４４のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９１】
４６．前記の細菌性のｔＲＮＡｎｃＡＡが、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である、実施形態３３から４５のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９２】
４７．前記の細菌性のｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号１〜８のＵ６−１〜Ｕ６−８から選択されるヌクレオチド配列または少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有し、昆虫細胞において、特に、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、好ましくは、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．  ＡＣＣ１１９）のようなヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株において、細菌性のｔＲＮＡＰｙｌを機能的に発現する能力を保持する配列を含む発現カセットによってコードされる、実施形態３３から４６のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９３】
４８．前記ｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号９のヌクレオチド配列またはｔＲＮＡＰｙｌ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有する配列を含む、実施形態３３から４７のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９４】
４９．前記の細菌性のＯ−ＲＳシンセターゼが、古細菌起源のものであり、好ましくは、配列番号２７またはｔＲＮＡＰｙｌ機能を保持しながら、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％のような配列同一性の程度を有する配列、特に、ＰｙｌＲＳ  ＷＴ配列番号２７またはＰｙｌＲＳ  ＡＦ配列番号３０のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳである、実施形態３３から４８のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９５】
５０．前記ＩＣＬが、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）、またはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、特に、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株、好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２Ｒ＋（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＤＧＲＣ）ストック番号１５０）から選択される、実施形態３３から４９のいずれか１つのＩＣＬ。好ましくは、前記ＩＣＬは、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、より好ましくは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、最も好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．  ＡＣＣ１１９）から選択される。さらなる前記ＩＬＣは、トリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）細胞株、好ましくは、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＢＴＩ−Ｔｎ−５Ｂ１−４（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から選択され得る。
【００９６】
５１．バキュロウイルスベクターを用いてトランスフェクトされる、実施形態３３から５０のいずれか１つのＩＣＬ。
【００９７】
５２．前記ベクターが、実施形態１９から３２のいずれか１つに定義されるとおりである、実施形態５１のＩＣＬ。
【００９８】
５３．配列番号１〜８のＵ６−１〜Ｕ６−８または少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のような配列同一性の程度を有し、昆虫細胞において、細菌性のｔＲＮＡＰｙｌを機能的に発現するその能力を保持する配列から選択されるｔＲＮＡＰｙｌをコードする発現カセット。
【００９９】
５４．（遺伝子操作された）標的タンパク質（ＴＰ）であって、そのアミノ酸配列中に、１個以上の同一または異なる非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含み、昆虫細胞株（ＩＣＬ）において、前記の１種以上のｎｃＡＡの存在下で、ＴＰをコードするヌクレオチド配列（ＣＳＴＰ）を発現させることによって得られ、前記ＣＳＴＰが、前記の１個以上のｎｃＡＡ残基をコードする１種以上のセレクターコドンを含む、（遺伝子操作された）標的タンパク質（ＴＰ）。
【０１００】
５５．実施形態１から１３のいずれか１つの方法によって得られ、任意選択で、そのアミノ酸配列中に含有される前記の少なくとも１個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を用いてクリック反応を実施することによってさらに化学的に修飾される、実施形態５４のＴＰ。
【０１０１】
５６．前記ｎｃＡＡが、クリック反応可能な官能基付与された側鎖、例えば、ＰｒＫ、ＳＣＯ、ＴＣＯ、ＴＣＯ＊、ＢＯＣ（ブトキシカルボニルリシン）および誘導体を含有する、実施形態５５のＴＰ。
【０１０２】
５７．遺伝子操作された原核生物の、または、特に、真核生物の、特に、免疫グロブリン分子、フルオロフォア、細胞性マーカータンパク質および転写因子のようなポリペプチド、タンパク質または酵素から選択される、実施形態５４から５６のいずれか１つのＴＰ。
【０１０３】
５８．少なくとも１個のｎｃＡＡまたはその塩を含み、実施形態１９から３２のうち１つの少なくとも１種のバキュロウイルスベクターをさらに含む、１個以上のｎｃＡＡ残基を有する組換え標的ポリペプチドＴＰを調製するためのキット。
【０１０４】
５９．プロモーター配列は、ヌクレオチド残基
ａ）配列番号１の１〜４００
ｂ）配列番号２の１〜３９２
ｃ）配列番号３〜８の１〜３８５
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか１種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるｔＲＮＡｎｃＡＡの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される。
【０１０５】
さらなる機能的断片の提供に関しては、上記の実施形態９が言及される。
【０１０６】
例えば、プロモーターの適した機能的断片は、意図されるプロモーター活性にとって必要な１つ以上の機能的部分エレメントを含む、連続する５’下流残基の単一断片であり得るか、または、１つより多い部分配列を包含し得る、好ましくは、配列番号１２の昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の５’下流に、４００個未満の連続ヌクレオチド残基、３００個未満の、２５０個未満の、２００個未満の、１５０個未満の、または１００個未満の、かつ少なくとも２０個の、少なくとも３０個の、少なくとも４０個の、少なくとも５０個の、少なくとも６０個の、少なくとも７０個のまたは少なくとも８０個の、または少なくとも９０個のヌクレオチド残基を含み得る。このような機能的部分エレメントの限定されない例として、当技術分野において記載されたようなＴＡＴＡボックスまたはＰＳＥＡエレメントに言及できる。
【０１０７】
例えば、プロモーターの適した機能的断片は、２０、３０、４０または２０〜３５０、２０〜３００、２０〜２５０、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜１００のような、もしくは３０〜３５０、３０〜３００、３０〜２５０、３０〜２００、３０〜１５０、３０〜１００のような、もしくは４０〜３５０、４０〜３００、４０〜２５０、４０〜２００、４０〜１５０、４０〜１００のような、もしくは５０〜３５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００のヌクレオチド残基のような５０〜３９９の配列長を有し得る。
【０１０８】
上記の方法、細胞株、ベクターおよび発現カセットの極めて特定の実施形態によれば、以下の好ましい意味が個別に、または組み合わせて当てはまる：
−前記ＩＣＬは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）である、
−前記ＩＣＬは、前記ＴＰおよび前記の１種以上のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を発現させるのに必要な遺伝情報（コード配列および調節配列）を保持する１種または２種のバキュロウイルスベクターを用いて安定にトランスフェクトされる、
−前記のｔＲＮＡｎｃＡＡは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である、および
−前記ＲＳＩＣは、昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、特に、図１に表わされるような昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、好ましくは、配列番号１２の配列をコードする昆虫ｓｎＲＮＡ  Ｕ６コード配列の３’上流に、最も好ましくは、配列番号１の連続ヌクレオチド残基１〜４００、配列番号２の１〜３９２または配列番号３〜８の１〜３８５に対応するヌクレオチド配列から選択されるＵ６終結配列を含む。
【０１０９】
Ｃ．本発明のさらなる実施形態
１．酵素、標的ポリペプチド（ＴＰ）およびその機能的同等物および突然変異体
本発明は、本明細書において具体的に開示される、または記載される特定のタンパク質または酵素（アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、標的ポリペプチドのような）に制限されず、むしろ、その機能的同等物または類似体に広がる。
【０１１０】
具体的に開示される酵素または標的ポリペプチドの「機能的同等物」または類似体は、本発明の範囲内にある。このような機能的同等物は、例えば、ｔＲＮＡシンセターゼ活性のような所望の生物活性をさらに有する。
【０１１１】
例えば、「機能的同等物」は、本明細書において具体的に定義されるアミノ酸配列を含む、酵素の少なくとも１％、特に、少なくとも約５〜１０％、例えば、少なくとも１０％または少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％または７５％または９０％高いまたは低い活性を有する酵素および突然変異体を含むと理解される。
【０１１２】
「機能的同等物」の活性情報は、本明細書において、別に記載されない限り、熟練した読者によって容易に定義され得る標準化された条件下で、参照基質（例えば、特定のｎｃＡＡ）を用いて実施される活性決定を指す。
【０１１３】
「機能的同等物」はさらに、例えば、ｐＨ４〜１１の間で安定であり得、有利には、ｐＨ５〜１０の範囲に、例えば、特に、６．５〜９．５または７〜８または約７．５でｐＨ最適を有し、１５℃〜８０℃または２０℃〜７０℃の範囲に、例えば、約３０〜６０℃または約３５〜４５℃、例えば、４０℃に温度最適を有する。
【０１１４】
「機能的同等物」は、本発明によれば、特に、特定のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置に、具体的に記載されるもの以外であるが、上記の生物活性のうち１つを有するアミノ酸を有する「突然変異体」も含むと理解されるべきである。
【０１１５】
「機能的同等物」は、それらが、本発明の特性プロフィールを有する突然変異体につながる限り、記載された変化が任意の配列位置で起こり得る、１つ以上の、例えば、１〜５０、２〜３０、２〜１５、４〜１２または５〜１０の「さらなる突然変異」、例えば、アミノ酸付加、置換、欠失および／または逆位によって得ることができる突然変異体を含む。機能的同等物は、特に、突然変異体および変更されていないポリペプチド間の反応性プロフィールが、質的に一致する、例えば、同一基質が異なる割合で使用される場合に存在する。
適したアミノ酸置換の制限しない例が、以下の表に示されている：
【０１１６】
【表１】
2018534943.tif 000002
【０１１７】
上記の意味で「機能的同等物」としてまた、記載されるポリペプチドの「前駆体」ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」がある。
【０１１８】
「前駆体」は、所望の生物活性を有するまたは有さないポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【０１１９】
用語「塩」は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加の塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で製造可能で、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩ならびに有機塩基を有する塩、例えば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどを含む。酸付加の塩、例えば、無機酸を有する塩、例えば、塩酸または硫酸および有機酸を有する塩、例えば、酢酸およびシュウ酸も、本発明の対象である。
【０１２０】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、公知の技術によって、機能的アミノ酸側鎖で、またはそのＮもしくはＣ末端で生成され得る。この種の誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアとの、もしくは第一級もしくは第二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基のアミド、アシル基との反応によって生成する遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル基との反応によって生成する遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。
【０１２１】
「機能的同等物」は、天然に、その他の生物から近づくことができるポリペプチドおよびその天然に存在する変異体も含む。例えば、配列比較によって相同配列領域の区域を確立でき、同等酵素を、本発明の具体的な情報に基づいて決定できる。
【０１２２】
「機能的同等物」はまた、例えば、所望の生物機能を有する、本発明のポリペプチドの断片、好ましくは、個々のドメインまたは配列モチーフも含む。
【０１２３】
「機能的同等物」は、さらに、上記のポリペプチド配列のうち１種またはそれに由来する機能的同等物および機能的ＮまたはＣ末端連結中の（すなわち、融合タンパク質対の相互の実質的に機能的な機能障害を伴わない）少なくとも１種のさらなるそれとは機能的に異なる異種配列を有する融合タンパク質である。この種の異種配列の例として、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素がある。
【０１２４】
本発明に従って含まれる「機能的同等物」は、具体的に開示されるタンパク質に対する相同体である。これらは、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７５％、特に、少なくとも８５％、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎのアルゴリズム、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）第８５巻（第８号）、１９８８年、２４４４〜２４４８頁を使用して算出された、具体的に開示されるアミノ酸配列のうち１種に対する相同性（または同一性）を有する。本発明の相同ポリペプチドの相同性または同一性パーセンテージとは、特に、本明細書において具体的に記載されるアミノ酸配列のうちの１種の全長に対するアミノ酸残基の同一性パーセンテージを意味する。
【０１２５】
同一性パーセンテージの値はまた、ＢＬＡＳＴアラインメント、ｂｌａｓｔｐアルゴリズム（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）に基づいて、または以下に示されるＣｌｕｓｔａｌ設定を使用して決定できる。
【０１２６】
可能性あるタンパク質グリコシル化の場合には、本発明の「機能的同等物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化された形態ならびにグリコシル化パターンを変更することによって得られる修飾された形態の上記で指名された種類のタンパク質を含む。
【０１２７】
本発明に従って使用される、または調製されるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、タンパク質を延長または短縮する、突然変異誘発によって、例えば、点突然変異によって製造できる。
【０１２８】
本発明に従うタンパク質の相同体は、突然変異体、例えば、短縮された突然変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることによって同定できる。例えば、タンパク質変異体の変化に富んだデータベースを、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結によって製造できる。縮重されたオリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のデータベースを製造するために使用できる極めて多数の方法がある。縮重された遺伝子配列の化学的合成を、自動ＤＮＡシンセサイザーで実施でき、次いで、合成遺伝子を適した発現ベクター中にライゲーションできる。遺伝子の縮重されたセットの使用によって、可能性あるタンパク質配列の所望のセットをコードするすべての配列を１つの混合物中に提供することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドの合成のための方法は、当業者には公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３年）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ第３９巻：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５３巻：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第１９８巻：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１１巻：４７７）。
【０１２９】
点突然変異または短縮によって製造されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物をスクリーニングするための、または選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡデータベースをスクリーニングするためのいくつかの技術は、先行技術において公知である。これらの技術は、本発明に従う相同体のコンビナトリアル突然変異誘発によって製造された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適応できる。ハイスループット解析の基礎として、大きな遺伝子バンクをスクリーニングするために最も頻繁に使用された技術は、遺伝子バンクを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、適した細胞を得られたベクターバンクを用いて形質転換することおよび所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件においてコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰的アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）、データベース中の機能的突然変異体の頻度を増大する技術を、スクリーニング試験と組み合わせて使用して、相同体を同定できる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）  ＰＮＡＳ  第８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第６巻（第３号）：３２７〜３３１頁）。
【０１３０】
２．核酸および構築物
２．１核酸およびその機能的同等物
本発明はまた、調節核酸配列（プロモーターおよびターミネーター配列のような）および上記のような酵素もしくは標的ポリペプチドもしくはｔＲＮＡをコードする核酸配列またはその突然変異体もしくは機能的同等物に関する。
【０１３１】
本発明はまた、本明細書において記載される具体的な配列に対して特定の程度の同一性を有するヌクレオチド配列／核酸に関する。
【０１３２】
２種の核酸間の「同一性」とは、核酸の全長にわたる各場合におけるヌクレオチドの同一性、特に、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ、Ｓｈａｒｐ  ＰＭ．  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １９８９年４月；第５巻（２号）：１５１〜１頁）を使用し、以下のパラメータを設定するＩｎｆｏｒｍａｘ（ＵＳＡ）社製のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアによる比較によって算出される同一性を意味する：
マルチプルアラインメントパラメータ：
ギャップ開始ペナルティー（Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）    １０
ギャップ伸張ペナルティー（Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）    １０
ギャップ分離ペナルティー範囲（Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｒａｎｇｅ）    ８
ギャップ分離ペナルティー（Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）    オフ
アラインメント遅延の同一性％    ４０
残基特異的ギャップ    オフ
親水性残基ギャップ    オフ
トランジション加重（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）    ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム    オン
Ｋ−タプルサイズ（ｔｕｐｌｅｓｉｚｅ）    １
ギャップペナルティー    ３
ウィンドウサイズ    ５
最良対角線の数（Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｂｅｓｔ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ）    ５
【０１３３】
代替法として、同一性はまた、インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃によるＣｈｅｎｎａ、Ｒａｍｕ、Ｓｕｇａｗａｒａ、Ｈｉｄｅａｋｉ、Ｋｏｉｋｅ、Ｔａｄａｓｈｉ、Ｌｏｐｅｚ、Ｒｏｄｒｉｇｏ、Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔｏｂｙ  Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄｅｓｍｏｎｄ  Ｇ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  （２００３年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第３１巻（１３号）：３４９７〜５００頁に従って、および以下のパラメータを用いて決定できる：
【０１３４】
ＤＮＡギャップ開始ペナルティー（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ）    １５．０
ＤＮＡギャップ伸張ペナルティー（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ）    ６．６６
ＤＮＡマトリックス    同一性
タンパク質ギャップ開始ペナルティー（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ）    １０．０
タンパク質ギャップ伸張ペナルティー（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ）    ０．２
タンパク質マトリックス    ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）
タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ    −１
タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ    ４
【０１３５】
本明細書において記載されるすべての核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学的合成によって、例えば、二重らせんの個々のオーバーラップする相補的核酸ビルディングブロックの断片縮合によって、それ自体公知の方法で製造できる。オリゴヌクレオチドの化学的合成は、例えば、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）技術（Ｖｏｅｔ、Ｖｏｅｔ、第２版、Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、８９６〜８９７頁）によって公知の方法で実施できる。合成オリゴヌクレオチドの付加およびＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を使用してギャップを埋めることおよび連結反応ならびに一般的なクローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１３６】
本発明はまた、例えば、人工ヌクレオチド類似体を使用して到達できる、上記のポリペプチド、酵素またはｔＲＮＡおよびその機能的同等物のうち１種をコードするヌクレオチド配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）に関する。
【０１３７】
本発明は、本発明に従うポリペプチド、酵素またはｔＲＮＡをコードする単離された核酸分子またはその生物学的に活性なセグメントに、ならびに例えば、本発明に従うコーディング核酸の同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸断片に関する。
【０１３８】
本発明に従う核酸分子は、さらに、コーディング遺伝子領域の３’および／または５’末端の非翻訳配列を含有し得る。
【０１３９】
本発明は、具体的に記載されるヌクレオチド配列またはそのセグメントと相補的である核酸分子をさらに含む。
【０１４０】
本発明に従うヌクレオチド配列は、その他の細胞種および生物における相同配列の同定および／またはクローニングに使用可能なプローブおよびプライマーを製造することを可能にする。前記のプローブまたはプライマーは、通常、「ストリンジェント」な条件（以下を参照のこと）下で、本発明に従う核酸配列のセンス鎖の、または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは、少なくとも約２５、例えば、約４０、５０または７５の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１４１】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されており、さらに、組換え技術によって製造される場合には、その他の細胞性材料または培養培地を本質的に含まない場合もあり、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体またはその他の化学物質を含まない。
【０１４２】
本発明に従う核酸分子は、分子生物学の標準技術および本発明に従って提供される配列情報によって単離できる。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして具体的に開示される完全配列またはそのセグメントのうち１種を、および標準ハイブリダイゼーション技術を使用して適したｃＤＮＡバンクから単離できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年において記載されるように）。さらに、開示される配列のうちの１種またはそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。このようにした増幅した核酸を、適したベクター中にクローニングでき、ＤＮＡ配列解析によって特性決定できる。本発明に従うオリゴヌクレオチドは、さらに、合成の標準法によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造できる。
【０１４３】
本発明に従うヌクレオチド配列またはその誘導体、これらの配列の相同体または一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術を用いて、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡデータベースを介して、昆虫、細菌、古細菌のようなその他の原核または真核生物から単離できる。これらのＤＮＡ配列は、本発明に従う配列と標準条件下でハイブリダイズする。
【０１４４】
「ハイブリダイゼーション」とは、ポリ−またはオリゴヌクレオチドの、標準条件下でほぼ相補的な配列と結合するが、これらの条件下では、非相補的パートナー間の非特異的結合が起こらない能力を意味する。このために、配列は、最大９０〜１００％相補的であり得る。互いに特異的に結合可能な相補的配列の特性を、例えば、ノーザンまたはサザンブロッティングにおいて、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用する。
【０１４５】
保存された領域の短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションのために有利に使用される。しかし、本発明に従う核酸のより長い断片または完全配列もまた、ハイブリダイゼーションに使用できる。これらの標準条件は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全配列）に応じて、またはどの種類の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡがハイブリダイゼーションに使用されるかに応じて変わる。したがって、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同一長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのものよりもおよそ１０℃低い。
【０１４６】
標準条件とは、例えば、核酸に応じて、０．１〜５ｘＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度を有する水性バッファー溶液において、またはさらに５０％ホルムアミドの存在下で４２から５８℃の間の温度、例えば、５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中、４２℃を意味する。有利なことに、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１ｘＳＳＣおよび約２０℃〜４５℃の間、好ましくは、約３０℃〜４５℃の間の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には、０．１ｘＳＳＣおよび約３０℃〜５５℃の間、好ましくは、約４５℃〜５５℃の間の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの標準温度は、例えば、およそ１００ヌクレオチドの長さおよびホルムアミドの不在下で５０％のＧ＋Ｃ含量を有する核酸の算出された融解温度値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、遺伝学に関する関連教本、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９中に記載されており、当業者に公知の式を使用して、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類またはＧ＋Ｃ含量応じて算出できる。ハイブリダイゼーションに関するさらなる情報は、当業者によって、以下の教本から得ることができる：Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）、１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；  Ｂｒｏｗｎ（編）、１９９１年、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ。
【０１４７】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件で起こり得る。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．  ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、９．３１〜９．５７によって、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６において記載されている。
【０１４８】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、特に：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌ未変性のせん断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃で一晩のインキュベーションと、それに続く、６５℃の０．１ｘＳＳＣを用いてフィルターを洗浄するステップを意味する。
【０１４９】
本発明はまた、具体的に開示されるか、または誘導可能なヌクレオチド配列の誘導体にも関する。
【０１５０】
したがって、本発明に従うさらなるヌクレオチド配列は、本明細書において言及される特定の配列から誘導でき、それらとは、単一または数個の、例えば、１〜５０の、２〜３０の、２〜１５の、４〜１２のまたは５〜１０のようなヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によって異なるが、さらに、例えば、１〜５０の、２〜３０の、２〜１５の、４〜１２のまたは５〜１０のような、所望の特性プロフィールを有するポリペプチド、酵素またはｔＲＮＡをコードする。
【０１５１】
本発明はまた、例えば、１〜５０の、２〜３０の、２〜１５の、４〜１２のまたは５〜１０のようないわゆるサイレント突然変異を含むヌクレオチド配列も含み、具体的に記載される配列ならびにその天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体と比較して、特定の本来のまたは宿主生物のコドン使用に対応して変更される。
【０１５２】
例えば、１〜５０の、２〜３０の、２〜１５の、４〜１２のまたは５〜１０のような、保存的ヌクレオチド置換によって得ることができる配列（すなわち、その結果として、問題の対応するアミノ酸が、同一荷電、大きさ、極性および／または溶解度のアミノ酸と置換される）にも関する。
【０１５３】
本発明はまた、具体的に開示される核酸から配列多形によって誘導される分子に関する。これらの遺伝的多形性は、天然の変動のために集団内の個体間に存在し得る。これらの天然の変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜５％の変化を引き起こす。
【０１５４】
本発明に従うヌクレオチド配列の誘導体は、例えば、誘導されたアミノ酸レベルで、全配列領域にわたって少なくとも６０％の相同性、好ましくは、少なくとも８０％の相同性、極めて特に好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する対立遺伝子変異体を含む（アミノ酸レベルでの相同性に関して、ポリペプチドに関する上記の報告を参照しなくてはならない）。相同体は、配列の部分領域にわたってより高度であり得ることが有利である。
【０１５５】
さらに、誘導体はまた、本発明に従うヌクレオチド配列の相同体、例えば、真菌の、または細菌の、哺乳動物または昆虫相同体、短縮化配列、コーディングおよび非コーディングＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【０１５６】
プロモーターまたはターミネーター配列のような本発明の調節配列は、プロモーターの機能性または有効性が損なわれずに、少なくとも１つのヌクレオチド交換、例えば、１〜５０の、２〜３０の、２〜１５の、４〜１２のまたは５〜１０のような、少なくとも１つの挿入、逆位および／または欠失によって変更できる。
【０１５７】
２．２  機能的突然変異体の作製
さらに、本発明に従う酵素または標的ポリペプチドの機能的突然変異体を製造するための方法は、当業者に公知である。
【０１５８】
使用される技術に応じて、当業者は、完全にランダムな、またはより指示された突然変異でさえ遺伝子または非コーディング核酸領域（例えば、発現の調節にとって重要である）中に導入し、次いで、遺伝子ライブラリーを調製できる。分子生物学の必要な方法は、当業者によって公知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１に記載されている。
【０１５９】
遺伝子を変更するための、従って、それらがコードするタンパク質を変更するための方法は、当業者によって長く精通されており、例えば、
−遺伝子の単一またはいくつかのヌクレオチドが計画的に交換される、部位特異的突然変異誘発（Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（編）  １９９６年；  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、
−任意のアミノ酸のコドンが、遺伝子の任意の点で交換または付加され得る、飽和突然変異誘発（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ  ＤＭ、Ｄｏｃｋｔｏｒ  ＣＭ、ＤｉＭａｉｏ  Ｄ（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ第２２巻：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ  Ｄ、Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ  Ｍ、Ｖａｌｃａｒｅｌ  Ｒ、Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ第２２巻：５４１；Ｂａｒｉｋ  Ｓ（１９９５年）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ第３巻：１）、
−ヌクレオチド配列が、エラー−プローンＤＮＡポリメラーゼによって突然変異される、エラー−プローンポリメラーゼ連鎖反応（エラー−プローンＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ  ＫＡ、Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ（１９９０年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ第１８巻：３７３９）、
−好ましい交換が、ポリメラーゼによって妨げられる、ＳｅＳａＭ法（配列飽和法）、Ｓｃｈｅｎｋら、Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ、第３巻、２００６年、２７７〜２７９頁
−例えば、防御的ＤＮＡ修復機序のために、ヌクレオチド配列の突然変異率の増大がある、ミューテーター株における遺伝子の継代（Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（編）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ中の、Ｇｒｅｅｎｅｒ  Ａ、Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｍ、Ｊｅｒｐｓｅｔｈ  Ｂ（１９９６）  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ．）または
−密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、断片が、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、鎖を分離することおよび再度一緒にすることの反復によって、最終的に、全長のモザイク遺伝子が生成する、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ  （１９９４年）  Ｎａｔｕｒｅ第３７０巻：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ  （１９９４年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９１巻：１０７４７）。
【０１６０】
いわゆる方向づけられた進化を使用して（例えば、Ｄｅｍａｉｎ  ＡＬ、Ｄａｖｉｅｓ  ＪＥ  （編）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ中の、Ｒｅｅｔｚ  ＭＴおよびＪａｅｇｅｒ  Ｋ−Ｅ  （１９９９年）、Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ第２００巻：３１；Ｚｈａｏ  Ｈ、Ｍｏｏｒｅ  ＪＣ、Ｖｏｌｋｏｖ  ＡＡ、Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ  （１９９９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎに記載される）、当業者は、方向づけられた方法で、大規模で機能的突然変異体を製造できる。このために、第１のステップにおいて、例えば、上記で示された方法を使用して、それぞれのタンパク質の遺伝子ライブラリーをまず製造する。遺伝子ライブラリーを、適した方法で、例えば、細菌によって、またはファージディスプレイ系によって発現させる。
【０１６１】
所望の特性と大部分は対応する特性を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子を、突然変異の別のラウンドに付し得る。本機能的突然変異体が所望の特性を十分な程度に有するまで、突然変異および選択またはスクリーニングのステップを繰り返し反復できる。この繰り返し手順を使用して、ステージにおいて制限された数の突然変異、例えば、１、２、３、４または５つの突然変異を達成でき、問題の酵素特性に対するその影響について評価し、選択できる。次いで、選択された突然変異体を、同一方法でさらなる突然変異ステップに付し得る。この方法で、調べられるべき個々の突然変異体の数を、大幅に低減し得る。
【０１６２】
本発明に従う結果はまた、所望の修飾された特性を有するさらなる酵素または標的ポリペプチドを計画的に作製するために必要である、関連酵素の構造および配列に関連する重要な情報も提供する。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち、標的化された突然変異を導入することによって酵素特性を修飾するのに適している可能性がある配列セグメントを定義し得る。
【０１６３】
おそらくは、酵素活性に対してほとんど効果を有さないはずであり、可能性ある「サイレント突然変異」として設計できる突然変異を実施できる領域においては、アミノ酸配列位置に関する情報を低減することも可能である。
【０１６４】
２．３  核酸構築物
本発明は、さらに、特に、本明細書において定義される調節核酸配列の遺伝制御の下に、ポリペプチド、酵素またはｔＲＮＡの核酸配列コーディングを含有する組換え発現構築物または発現カセットに関する。本発明はまた、特に、これらの発現構築物のうち少なくとも１種を含む組換えベクターに関する。
【０１６５】
「発現単位」は、本発明によれば、本明細書において定義されるプロモーターを含み、発現されるべき核酸または遺伝子との機能的連結後に、前記核酸または前記遺伝子の発現、すなわち、転写および翻訳を調節する発現活性を有する核酸を意味する。したがって、これに関連して、「調節性核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、その他の調節エレメント、例えば、エンハンサーも存在し得る。
【０１６６】
「発現カセット」または「発現構築物」は、本発明によれば、発現されるべき核酸または発現されるべき遺伝子に機能的に連結される発現単位を意味する。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質またはｔＲＮＡとして発現されるべき核酸配列も含む。
【０１６７】
用語「発現」または「過剰発現」は、本発明に関連して、対応するＤＮＡによってコードされる、微生物または本明細書において記載されるような昆虫細胞のようなその他の細胞における１種以上の酵素の生成またはその細胞内活性の増大を説明する。このために、例えば、遺伝子を生物中に導入すること、既存の遺伝子を別の遺伝子と置換すること、遺伝子（単数または複数）のコピー数を増大すること、強力なプロモーターを使用することまたは高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、任意選択で、これらの尺度を組み合わせることができる。
【０１６８】
好ましくは、本発明に従う前記構築物は、コード配列と作動可能に連結される各場合において、それぞれのコード配列の５’上流のプロモーターおよび３’下流のターミネーター配列および任意選択で、その他の通常の調節エレメントを含む。
【０１６９】
「プロモーター」または「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」のは、本発明によれば、転写されるべき核酸に機能的に連結され、前記核酸の転写を調節する核酸を意味する。
【０１７０】
「機能的」または「作動的」連結とは、これに関連して、例えば、プロモーター活性を有する核酸の１種の、および転写されるべき核酸配列の、および任意選択で、さらなる調節エレメント、例えば、核酸の転写を確実にする核酸配列および例えば、ターミネーターの、調節エレメントの各々が、核酸配列の転写の際にその機能を発揮できるような方法での連続的配置を意味する。これは必ずしも、化学的な意味での直接連結を必要としない。遺伝制御配列、例えば、エンハンサー配列は、より遠隔位置から、またはその他のＤＮＡ分子からであっても標的配列に対してその機能を発揮できる。転写されるべき核酸配列が、プロモーター配列の後に（すなわち、その３’末端に）位置し、その結果、２つの配列が共有結合によって一緒に接続される配置が好ましい。プロモーター配列と発現されるべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対よりも小さいもの、または１００塩基対よりも小さい、または５０塩基対よりも小さい場合もある。
【０１７１】
プロモーターおよびターミネーターに加えて、その他の調節エレメントの例として以下を言及可能である：ターゲッティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点など。適した調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  （１９９０年）に記載されている。
【０１７２】
本発明に従う核酸構築物は、特に、有利なことに、遺伝子発現を制御するための、例えば、増大するための１種以上の調節シグナルと作動可能にまたは機能的に連結されているｔＲＮＡｐｙｌのコード配列を含む配列番号１〜８およびそれから誘導可能な核酸配列を含む。
【０１７３】
特定のＵ６−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ配列（配列番号１〜８）を以下に表す：
【０１７４】
イタリック体のプロモーター配列
下線を引いたｔＲＮＡ配列
二重の下線を引いた３’終結シグナル
【０１７５】
Ｕ６−１（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−１）（配列番号１）
【０１７６】
【化１】
2018534943.tif 000003
【０１７７】
Ｕ６−２（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−２）（配列番号２）
【０１７８】
【化２】
2018534943.tif 000004
【０１７９】
Ｕ６−３（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−３）（配列番号３）
【０１８０】
【化３】
2018534943.tif 000005
【０１８１】
Ｕ６−４（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−４）（配列番号４）
【０１８２】
【化４】
2018534943.tif 000006
【０１８３】
Ｕ６−５（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−５）（配列番号５）
【０１８４】
【化５】
2018534943.tif 000007
【０１８５】
Ｕ６−６（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−６）（配列番号６）
【０１８６】
【化６】
2018534943.tif 000008
【０１８７】
Ｕ６−７（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−７）（配列番号７）
【０１８８】
【化７】
2018534943.tif 000009
【０１８９】
Ｕ６−８（Ｓｆ２１）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３ｔｅｒｍ（Ｕ６−８）（配列番号８）
【０１９０】
【化８】
2018534943.tif 000010
【０１９１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然調節が、実際の構造遺伝子の前に依然として存在する場合があり、任意選択で、天然調節が切られ、遺伝子の発現が増大されているように遺伝子変更しておいてもよい。しかし、核酸構築物は、より簡単な構築物、すなわち、コード配列および天然プロモーターの前にさらなる調節シグナルが挿入されておらず、その調節は除去されていないものであってもよい。代わりに、調節は、もはや起こらず、遺伝子発現が増大されるように天然調節配列が突然変異される。
【０１９２】
特定の核酸構築物はまた、プロモーターと機能的に連結された、核酸配列の発現の増大を可能にする１つ以上の「エンハンサー」配列を含有し得る。さらなる調節エレメントまたはターミネーターなどのさらなる有利な配列をまた、ＤＮＡ配列の３’末端に挿入できる。本発明に従う核酸の１以上のコピーを、構築物中に含めることができる。構築物はまた、任意選択で、構築物での選択のために、抗生物質耐性または栄養要求性補完遺伝子などのその他のマーカーを含有できる。
【０１９３】
ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６−、λ−ＰＲなどのプロモーター中に、またはλ−ＰＬ−プロモーター中に、適した調節配列の例が含有され、これは、有利なことに、グラム陰性菌における適用を見い出す。さらなる有利な調節配列が、例えば、グラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２中に、酵母または真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ中に含有される。人工プロモーターもまた、調節のために使用できる。
【０１９４】
宿主生物における発現のためには、核酸構築物が、ベクター、例えば、プラスミドまたはファージ、特に好ましくは、ウイルス中に、より特には、バキュロウイルスのベクター中に挿入されることが有利であり、これは、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする。プラスミドおよびファージとは別に、ベクターはまた、当業者に公知のすべてのその他のベクター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミドおよび線形または環状ＤＮＡとして理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物において自己複製され得る、または染色体性に複製され得る。これらのベクターは、本発明のさらなる実施形態に相当する。
【０１９５】
適したプラスミドは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩ中に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１中に、バチルスｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４中に、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７中に、真菌ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６中に、酵母２アルファＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３中に、または植物ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１中にある。記載されたプラスミドは、あり得るプラスミドの小さい選択に相当する。さらなるプラスミドが、当業者に周知であり、例えば、教本Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら編Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年、ＩＳＢＮ  ０４４４９０４０１８）に見い出し得る。
【０１９６】
ベクターの別の実施形態では、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸を含有するベクターを、有利なことに、線形ＤＮＡの形態で、微生物中に導入でき、異種または相同組換えを介して宿主生物のゲノム中に組み込まれる。この線形ＤＮＡは、プラスミドなどの線形化ベクターから、または本発明に従う核酸構築物または核酸のみからなり得る。
【０１９７】
生物における異種遺伝子の最適発現のために、その生物において使用される特定の「コドン使用」に対応する核酸配列を変更することが有利である。「コドン使用」は、問題の生物のその他の既知遺伝子のコンピュータ評価に基づいて容易に決定できる。
【０１９８】
本発明に従う発現カセットを、適したプロモーターの、適したコーディングヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルの融合によって製造する。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  （１９８９年）に、ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）に、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）に記載されるような一般的な組換えおよびクローニング技術を使用する。
【０１９９】
適した宿主生物における発現のために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物が、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクター中に挿入されることは有利である。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、「クローニングベクター」で与えられる（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）。
【０２００】
３．微生物宿主細胞
文脈に応じて、用語「微生物」または「宿主」は、広く理解されるべきであり、野生型微生物または遺伝子変更された組換え微生物または両方を意味することもあり、適した発現ベクターを作成するために適用され得る、または本発明の標的ポリペプチドを作成するために適用され得る、原核生物または真核生物微生物ならびにより高等な真核生物の細胞株、特に、昆虫細胞株にも及び得る。
【０２０１】
本発明に従うベクターを使用して、例えば、本発明に従う少なくとも１種のベクターを用いて形質転換され、本発明に従うポリペプチドを製造するために使用できる組換え微生物を製造できる。本発明に従う、上記の組換え構築物を、適した宿主系中に導入し、発現させることが有利である。好ましくは、それぞれの発現系において記載された核酸を発現させるために、当業者に公知の一般的なクローニングおよびトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを使用する。適した系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７年またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年に記載されている。
【０２０２】
原則として、すべての原核生物または真核生物を、本発明に従う核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物として考えてもよい。細菌、真菌または酵母などの微生物を、宿主生物として使用する。細菌は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）またはノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の細菌、特に好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）またはロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌のような、グラム陽性であっても、グラム陰性菌であってもよい。属および種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が極めて特に好ましい。
【０２０３】
本発明に従う宿主生物は、好ましくは、本発明において記載される核酸配列、核酸構築物またはベクターのうち少なくとも１種を含有する。
【０２０４】
宿主生物に応じて、本発明に従う方法において使用される生物を、当業者に公知の方法で成長させるまたは培養する。微生物は、概して、一般に、糖の形態の炭素供給源、一般に、酵母エキスまたは硫酸アンモニウムなどの塩などの有機窒素供給源の形態の窒素供給源、鉄、マンガンおよびマグネシウム塩などの微量元素および任意選択で、ビタミンを含有する液体培地中で、０℃から１００℃の間、好ましくは、１０℃から６０℃の間の温度で、酸素通気を用いて成長させる。液体栄養分のｐＨは、固定値で維持できる、すなわち、培養の間、調節されるまたは調節されない。培養は、バッチ式、セミバッチ式または連続であり得る。栄養分は、発酵の開始時に存在してもよく、または後に半連続的にまたは連続的に供給してもよい。
【０２０５】
４．標的ポリペプチドの組換え製造
本発明はさらに、本明細書において定義される標的ポリペプチドを組換え製造するための方法であって、ポリペプチド産生微生物を培養し、任意選択で、ポリペプチドの発現を誘導し、これらを培養物から単離する方法に関する。
【０２０６】
公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．  Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１年））による教本に、またはＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ  ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４年））による教本に見い出し得る。
【０２０７】
使用されるべき培養培地は、それぞれの株の必要条件を適宜満たさなくてはならない。種々の微生物のための培養培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙのマニュアル「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．  Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）中に示されている。
【０２０８】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１種以上の炭素供給源、窒素供給源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０２０９】
好ましい炭素供給源として、単糖、二糖または多糖などの糖がある。きわめて良好な炭素供給源として、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースがある。糖は、糖蜜などの複合化合物またはその他の糖精製の副生成物によって培地に添加してもよい。種々の炭素供給源の混合物を添加することが有利であり得る。その他の可能性ある炭素供給源としてオイルおよび脂肪、例えば、ダイズオイル、サンフラワーオイル、ピーナッツオイルおよびココナッツオイル、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール、例えば、グリセロール、メタノールまたはエタノールおよび有機酸、例えば、酢酸または乳酸がある。
【０２１０】
窒素供給源は、通常、有機または無機窒素化合物またはこれらの化合物を含有する材料である。窒素供給源の例は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸、尿素、アミノ酸またはコーンスティープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキス他などの複合窒素供給源を含む。窒素供給源は単独でまたは混合物として使用してもよい。
【０２１１】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リンまたは硫酸塩を含む。
【０２１２】
無機硫黄含有化合物、例えば、硫酸、亜硫酸、亜ジチオン酸、テトラチオン酸、チオ硫酸、硫化物ならびにメルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物を、硫黄供給源として使用できる。
【０２１３】
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を、リン供給源として使用できる。
【０２１４】
培地イオンを溶液中に維持するためにキレート化剤を培地に添加してもよい。特に適したキレート化剤は、カテコールもしくはプロトカテキュ酸などのジヒドロキシフェノールまたはクエン酸などの有機酸を含む。
【０２１５】
本発明に従って使用される発酵培地は、通常、ビタミンまたは成長促進物質などのその他の増殖因子も含有し、これとして、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが挙げられる。増殖因子および塩は、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどといった複合培地の成分に起因することが多い。さらに、適した前駆体を培養培地に添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は、それぞれの実験に強く左右され、各特定の場合のために個別に決定する。培地最適化に関する情報は、教本「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）５３〜７３頁、ＩＳＢＮ  ０１９９６３５７７３）中に見い出し得る。標準１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（脳心臓注入、ＤＩＦＣＯ）などといった成長培地はまた、市販の供給業者から得ることもできる。
【０２１６】
培地のすべての成分を、熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分）によって、または滅菌濾過のいずれかによって滅菌する。成分は、一緒に滅菌してもよく、または必要に応じて個別に滅菌してもよい。培地のすべての成分は、培養の開始時に存在してもよく、または連続的にまたはバッチ式のいずれかで添加してもよい。
【０２１７】
培養温度は、通常、１５℃から４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃の間であり、実験の間、変更しても、一定に維持してもよい。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲、好ましくは、およそ７．０でなくてはならない。成長するためのｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって成長の間、制御できる。泡沫化を制御するために、消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、適した選択物質、例えば、抗生物質を培地に添加してもよい。好気条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば、周囲空気を培養物中に送る。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃の範囲である。最大の目的生成物が形成されるまで培養を継続する。この目標は、通常、１０時間〜１６０時間内に到達される。
【０２１８】
次いで、発酵培養液をさらに処理する。必要条件に応じて、分離技術、例えば、遠心分離、濾過、デカントまたはこれらの方法の組合せによって、発酵培養液からバイオマスを完全にもしくは部分的に回収できる、または完全に残すことができる。
【０２１９】
ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合には、細胞を溶解してもよく、溶解物から、タンパク質の単離のための公知の方法によって生成物を得てもよい。細胞を、任意選択で、高周波数超音波、高圧によって、例えば、フレンチプレスにおいて、オスモリシス（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）によって、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーによってまたは上記の方法のいくつかの組合せによって破壊できる。
【０２２０】
発現されたポリペプチドを、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）など、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー技術によって、限外濾過、結晶化、塩析、透析および未変性ゲル電気泳動などのその他の通常の技術を用いて精製してもよい。適した方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ  ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ］、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに、またはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０２２１】
組換えタンパク質の単離については、定義されたヌクレオチド配列によってｃＤＮＡを伸ばし、従って、変更されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、例えば、より容易な精製のために働くベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。この種の適した修飾は、例えば、アンカーとしてのいわゆる「タグ」官能基付与、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーまたは抗体の抗原として認識され得るエピトープとして知られる修飾である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （Ｎ．Ｙ．）  Ｐｒｅｓｓにおいて記載される）。これらのアンカーは、タンパク質を固体担体、例えば、クロマトグラフィーカラムにおいて充填剤として使用され得るポリマーマトリックスに結合するために、またはマイクロタイタープレート上で、またはいくつかのその他の担体上で役立ち得る。
【０２２２】
同時に、これらのアンカーはまた、タンパク質の認識のために使用できる。タンパク質の認識のために、さらに、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカーまたは放射活性マーカーなどの通常のマーカーを、単独でまたはタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用することも可能である。
【０２２３】
５．ｎｃＡＡ
用語「ｎｃＡＡ」とは、一般に、２２種の天然に存在するタンパク質原性アミノ酸の中にない、任意の非標準または非天然アミノ酸またはアミノ酸残基を指す。この用語は、このようなｎｃＡＡの対応する塩の形態も包含する。
【０２２４】
本発明は、ｎｃＡＡピロリシン（ｐｙｌ）を適用する発現系を用いてより詳細に例示されているが、本発明は、前記の特定のｎｃＡＡに制限されない。特に好ましいｎｃＡＡとして、移行後（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ）さらに修飾され得るものがある。
【０２２５】
その他の翻訳後修飾可能な残基の限定されない例として、以下がある：
【０２２６】
【表２】
2018534943.tif 000011
【０２２７】
特定のクラスのｎｃＡＡとして、ＷＯ２０１２／１０４４２２またはＷＯ２０１５／１０７０６４に記載されたようなものもある。その中にｎｃＡＡ、特に、銅不含クリック反応としても知られ、ＷＯ２０１２／１０４４２２またはＷＯ２０１５／１０７０６４にさらに記載されたような特に好都合な翻訳後修飾反応に適したシクロオクチニルまたはトランスシクロオクチニル類似体基を含む、リシンベースのｎｃＡＡが記載されている。
【０２２８】
種々の形態のクリック化学に関しては、Ｂｌａｃｋｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８年、第１３０巻、１３５１８〜１３５１９頁；Ｋｏｌｂら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００１年、第４０巻：２００４；Ｄｅｖａｒａｊら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００９年、第４８巻：７０１３；Ｄｅｖａｒａｊら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２００８年、第１９巻：２２９７；Ｄｅｖａｒａｊら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１０年、第４９巻：２８６９；ＷＯ２０１０／１１９３８９  Ａ２；ＷＯ２０１０／０５１５３０  Ａ２；Ａｇａｒｄら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００４、１２６：１５０４６；  ＷＯ２００６／０５０２６２  Ａ２；Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０年、第１０７巻：１８２１；Ｎｅｅｆ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００９年、第４８巻：１４９８が参照され得る。
【０２２９】
６．遺伝子操作された標的ポリペプチド（ＴＰ）の調製
本発明はまた、１以上のｎｃＡＡ基を有する標的ポリペプチド（ＴＰ）を調製するためのプロセスであって、
ａ）（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）ｎｃＡＡまたはその塩、
（ｉｉｉ）セレクターコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡまたは前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＴＰをコードし、１つまたは２つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
を含む翻訳系を提供し、
アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ｉ）が、化合物または塩（ｉｉ）を用いてｔＲＮＡ（ｉｉｉ）を特異的にアシル化可能であることと、
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能にすることと
ｃ）任意選択で、得られたポリペプチドを回収することと
を含む、プロセスに関する。
【０２３０】
本方法において適用されるような「アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ」および「ｔＲＮＡ」および「ｎｃＡＡ」の意味および好ましい実施形態に関しては、上記で本明細書における対応する節が参照される。
【０２３１】
用語「翻訳系」は、一般に上記で定義される意味を有する。翻訳系は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系であり得る。
【０２３２】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳」系は、細胞不含翻訳系であり得る。「細胞不含」翻訳系は、例えば、細胞抽出物の形態でｍＲＮＡ翻訳に必要なタンパク質因子を得ることと、それに続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの反応を再構成することによって、所望のタンパク質を合成するための系である。このような無細胞系およびタンパク質合成のためのその使用は、当技術分野で公知である。例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の抽出物、コムギ胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球ライセート（ＳｐｉｒｉｎおよびＳｗａｒｔｚ、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００８年）が挙げられる。
【０２３３】
好ましくは、本発明のプロセスにおいて使用される翻訳系は、「ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系」である。ｖｉｖｏ翻訳系は、細胞、例えば、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は、細菌性の細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞、例えば、酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、植物細胞または動物細胞、例えば、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１または哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞であり得る。ポリペプチド発現に使用される真核細胞は、単細胞または多細胞生物の一部、好ましくは、単細胞であり得る。
【０２３４】
特定の実施形態によれば、翻訳系は、特に、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫細胞、好ましくは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、最も好ましくは、Ｓｆ２１（ＤＳＭＺ  Ｎｒ．ＡＣＣ１１９）である。
【０２３５】
本発明のＴＰの調製にとって有用な翻訳系は、特に、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｎｃＡＡまたはその塩、セレクターコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡまたは前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、本発明のＴＰをコードし、そのコード配列中に１つもしくは２つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む。
【０２３６】
例えば、当技術分野で公知のトランスフェクション／形質転換法によって、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、ｔＲＮＡおよび本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、細胞中に導入してもよい。
【０２３７】
本発明のプロセスは、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ（ＲＳ／ｔＲＮＡ）対を利用する。好ましくは、本発明のプロセスにおいて使用されるＲＳ／ｔＲＮＡ対は、翻訳系に対して「直交性」である。
【０２３８】
本発明のプロセスにおいて使用されるｔＲＮＡおよびＲＳは、天然に存在するものである場合も、種々の生物に由来する天然に存在するｔＲＮＡおよび／またはＲＳの突然変異によって誘導される場合もある。種々の実施形態では、ｔＲＮＡおよびＲＳは、少なくとも１種の生物に由来する。別の実施形態では、ｔＲＮＡは、第１の生物の天然に存在するｔＲＮＡまたは突然変異された天然に存在するｔＲＮＡに由来し、ＲＳは、第２の生物の天然に存在するＲＳまたは突然変異された天然に存在するＲＳに由来する。
【０２３９】
適したｔＲＮＡ／ＲＳ対は、突然変異体ｔＲＮＡおよびＲＳのライブラリーから、例えば、ライブラリースクリーニングの結果に基づいて選択され得る。あるいは、適したｔＲＮＡ／ＲＳ対は、供給源種から翻訳系に移入される異種ｔＲＮＡ／シンセターゼ対であり得る。好ましくは、翻訳系として使用される細胞は、前記供給源種から異なっている。
【０２４０】
ｔＲＮＡ／ＲＳ対を進化させるための方法は、例えば、ＷＯ０２／０８５９２３およびＷＯ０２／０６０７５に記載されている。
【０２４１】
好ましくは、ＲＳは、ｔＲＮＡを、ｎｃＡＡピロリシンまたは関連するｎｃＡＡを用いてアシル化可能なピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＰｙｌＲＳ）である。
【０２４２】
本発明のプロセスにおいて使用されるピロリシルｔＲＮＡシンセターゼは、野生型または遺伝子操作されたＰｙｌＲＳであり得る。野生型ＰｙｌＲＳの例として、限定されるものではないが、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ）、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、メタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびデスルフィトバクテリウム・ハフニエンセ（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）などの古細菌および真正細菌、好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のＰｙｌＲＳが挙げられる。
【０２４３】
遺伝子操作されたＰｙｌＲＳは、例えば、Ｎｅｕｍａｎｎら（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ第４巻：２３２、２００８年）によって、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００８年、第１５巻：１１８７）によって、およびＥＰ２１９２１８５Ａ１）において記載されている。
【０２４４】
特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドの調製のために使用されるピロリシルｔＲＮＡシンセターゼは、Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）に由来する野生型ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼである。
【０２４５】
特定の実施形態によれば、ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼは、配列番号２７に示される野生型Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸配列またはその機能的類似体を含む。
【０２４６】
配列番号２７
【０２４７】
【化９】
2018534943.tif 000012
【０２４８】
別の特定の実施形態によれば、ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼは、好ましくは、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆから選択される１つまたは２つ以上アミノ酸変更を含むＭ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡシンセターゼである。
【０２４９】
特定の実施形態によれば、ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼは、配列番号３０に示される突然変異体Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
【０２５０】
配列番号３０
【０２５１】
【化１０】
2018534943.tif 000013
【０２５２】
本明細書において記載される任意のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを、ｎｃＡＡを用いるｔＲＮＡのアシル化のために使用してもよい。
【０２５３】
好ましい具体例によれば、野生型Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼが、ＷＯ２０１２／１０４４２２またはＷＯ２０１５／１０７０６４に記載されるもののような、特に、以下の式
【０２５４】
【化１１】
2018534943.tif 000014
【０２５５】
を用いる、または以下の式
【０２５６】
【化１２】
2018534943.tif 000015
【０２５７】
で示される化合物またはその塩を用いるｔＲＮＡのアシル化のために使用される。
【０２５８】
別の好ましい実施形態によれば、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆを含む突然変異体Ｍ．マゼイ（ｍａｚｅｉ）ピロリシルｔＲＮＡシンセターゼが、ＷＯ２０１２／１０４４２２またはＷＯ２０１５／１０７０６４に記載されるもののような、特に、以下の式
【０２５９】
【化１３】
2018534943.tif 000016
【０２６０】
を用いる、または以下の式
【０２６１】
【化１４】
2018534943.tif 000017
【０２６２】
で示される化合物またはその塩を用いるｔＲＮＡのアシル化のために使用される。
【０２６３】
ＰｙｌＲＳ（ｔＲＮＡＰｙｌ）と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、野生型または遺伝子操作されたｔＲＮＡであり得る。野生型ｔＲＮＡＰｙｌの例として、限定されるものではないが、上記で記載されるものなどの古細菌および真正細菌由来のｔＲＮＡが挙げられ、ピロリシル残基の翻訳性組込みを促進する。
【０２６４】
本発明のプロセスにおいて利用されるセレクターコドンは、使用される翻訳系のタンパク質生合成機構の遺伝子コドン枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンは、例えば、独特の３塩基コドン、停止コドン、例えば、アンバーコドンまたはオパールコドンなどのナンセンスコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基コドンなどを含む。例えば、１以上の、２以上の、３以上のなど、いくつかのセレクターコドンをＴＰをコードするポリヌクレオチド中に導入できる。
【０２６５】
一実施形態では、方法は、本発明の化合物の組込みのために停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、停止コドン、好ましくは、アンバー停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡが作製され、ｎｃＡＡを用いてＯ−ＲＳによってアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在するアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されない。
【０２６６】
従来の部位特異的突然変異誘発を使用して、停止コドン、例えば、アンバー停止コドンを、ＴＰをコードするポリヌクレオチド配列中に対象の部位に導入できる。翻訳系においてＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび突然変異体遺伝子が組み合わされる場合に、アンバー停止コドンに応じて非天然アミノ酸が組み込まれ、非天然アミノ酸類似体、すなわち、本発明の化合物を特定の位置（単数または複数）に含有するポリペプチドが得られる。
【０２６７】
特定の実施形態によれば、本発明のプロセスにおいて使用されるｔＲＮＡＰｙｌは、アンバー停止コドンに対するＣＵＡアンチコドンを含む。
【０２６８】
本発明の化合物をコードするのに有用なその他のセレクターコドンとして、稀なコドンがある。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成反応物におけるアルギニン濃度が低下している場合には、稀なアルギニンコドン、ＡＧＧが、アラニンを用いる合成ｔＲＮＡアシル化によるＡｌａの挿入にとって効率的であると証明されている。この場合には、合成ｔＲＮＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において少数種として存在する天然に存在するｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生物は、すべてのトリプレットコドンを使用しない。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物におけるアミノ酸の挿入のために、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）において割り当てられていないコドンＡＧＡが利用された。したがって、本発明のプロセスにおいて適用される翻訳系によって使用されない任意のトリプレットコドンは、セレクターコドンとして働き得る。
【０２６９】
翻訳系は、リボソームによる本発明のポリペプチドの形成を可能にする条件で適した時間維持される。ＴＰをコードし、１つまたは２つ以上のセレクターコドンを含むｍＲＮＡが、リボソームによって結合される。次いで、ＴＰが、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡと結合される、コドンによってコードされる位置でのアミノ酸の段階的な結合によって形成される。したがって、ｎｃＡＡが、セレクターコドンによってコードされる位置（単数または複数）でＴＰ中に組み込まれる。
【０２７０】
翻訳系によるＴＰの翻訳は、当技術分野で周知の手順によって達成可能である。効率的な翻訳を促進するために、翻訳系の成分を混合してもよい。翻訳系として使用される細胞を、ＴＰを産生するのに適した条件下で、適した時間、適した発現培地において都合よく培養し、維持する。ＴＰ遺伝子の転写を可能にする、アラビノース、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）またはテトラサイクリンなどの化合物の添加によって、発現を誘導することが必要であり得る。
【０２７１】
任意選択で、翻訳後に、ＴＰを翻訳系から回収してもよい。この目的のために、当業者に公知の、当業者によって使用される手順に従って、ＴＰを回収し、部分的に、または実質的に均一性に精製できる。当技術分野で周知の標準手順として、例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸性または塩基性抽出、カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる。要望通りに、正しくフォールディングされた成熟タンパク質の作製においてタンパク質再フォールディングステップを使用できる。高純度が望まれる最終精製ステップにおいて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィーまたはその他の適した方法を使用できる。本発明の非天然アミノ酸またはポリペプチドに対して作製された抗体を、精製試薬として、すなわち、ポリペプチドの親和性ベースの精製のために使用できる。
【０２７２】
例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ  （１９９３年）；およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０年）；およびそこで引用された参考文献に示されたものを含む、種々の精製／タンパク質フォールディング法が当技術分野で周知である。
【実施例】
【０２７３】
本発明を、ここで、特定の制限されない実施形態またはその後の実験の節を参照することによってより詳細に説明する。
【０２７４】
実験部分
Ａ．材料および一般的な方法：
別に記載しない限り、組換えタンパク質のクローニングおよび発現を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年に記載されるような標準法によって実施する。
【０２７５】
１．プラスミドおよび細胞株
１．１  プラスミド
プラスミドマップが、図１１Ａ〜Ｌに示されている。
ｐＩＥＸ−ｃｃｄｂ：供給源：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
ｐＩＤＫ：供給源：Ｉｍｒｅ  Ｂｅｒｇｅｒ、ＥＭＢＬ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ
ｐＩＺＴ−Ｖ５／Ｈｉｓ：供給源：Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓベクターキット
ｐＵＣＤＭ：供給源：Ｉｍｒｅ  Ｂｅｒｇｅｒ、ＥＭＢＬ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ
ｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ：供給源：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄｕａｌ：Ｉｍｒｅ  Ｂｅｒｇｅｒ、ＥＭＢＬ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ
ｐＢＡＤ−Ｉｎｔｅｉｎ−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓ：供給源：Ｐｌａｓｓ  Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ  Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｃ．、Ｌｅｍｋｅ  ＥＡ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  第５０巻、３８７８〜８１頁（２０１１年）
ｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴ：供給源：Ｐｌａｓｓ  Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ  Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｃ．、Ｌｅｍｋｅ  ＥＡ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．第５０巻、３８７８〜８１頁（２０１１年）
ｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦ：供給源：Ｐｌａｓｓ  Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ  Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｃ．、Ｌｅｍｋｅ  ＥＡ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．第５０巻、３８７８〜８１頁（２０１１年）
ｐＢＡＤ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ−６Ｈｉｓ）：供給源：Ｐｌａｓｓ  Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ  Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｃ．、Ｌｅｍｋｅ  ＥＡ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．第５０巻、３８７８〜８１頁（２０１１年）
【０２７６】
１．２  細胞株
１．２．１  昆虫細胞：
【０２７７】
【表３】
2018534943.tif 000018
【０２７８】
１．２．２  細菌性の細胞
【０２７９】
【表４】
2018534943.tif 000019
【０２８０】
２．  細胞培養
２．１  ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ２１
標準バキュロウイルスプロトコール（Ｎｉｅ，Ｙ．、Ｂｉｅｎｉｏｓｓｅｋ，Ｃ．  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｉ．  ＡＣＥＭＢＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ．  バージョン０９．１１（２００９年））に従い、Ｓｆ２１細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１１９）を、エルレンマイヤーフラスコ中、２７℃、１８０ｒｐｍで振盪しながら、Ｓｆ−９００（商標）  ＩＩＩ  ＳＦＭ培地を使用して培養した。細胞を毎日０．６＊１０６個細胞／ｍｌに、または３日目毎に０．３＊１０６個細胞／ｍｌにわけた。
【０２８１】
バクミドトランスフェクションのために、６ウェルマルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ  Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてウェルあたり３ｍｌの０．３＊１０６個細胞／ｍｌを播種した。バクミド−ＤＮＡを調製し、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＳｆ２１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後にＶ０ウイルスが回収され、Ｖ１世代が開始した。小規模試験発現のために、０．６＊１０６個細胞／ｍｌの１００ｍｌのＳｆ２１細胞を、１ｍｌのＶ１ウイルスを用いてトランスフェクトし、１ｍＭのそれぞれのｎｃＡＡを添加した。陰性対照として、同一方法であるがｎｃＡＡを用いない、１００ｍｌの培養物を設定した。細胞増殖が停止した後、培養物を２７℃で１８０ｒｐｍで振盪しながら、さらに４８〜６０時間維持した。細胞を５００ｒｐｍで１０分間回収し、ペレットを―２０℃で保存した。
【０２８２】
一過性トランスフェクションのために、Ｓｆ２１細胞を０．３＊１０６個細胞／ｍｌの密度で６ウェルマルチディッシュ中にトランスフェクションの１５分前に播種した。２００μｌの培地を伴う３μｇの総ＤＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬と混合した。１５分間インキュベートした後、ＤＮＡ混合物を滴加法でウェルに入れた。必要に応じて、ウェルあたり１ｍＭの最終濃度にｎｃＡＡを添加した。２種のプラスミドの同時トランスフェクションのために、１：１の比を使用した。
【０２８３】
２．２  キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２Ｒ＋細胞
細胞培養ディッシュ（１０ｍｍ）中でＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２Ｒ＋細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＤＧＲＣ））（ＤｅＲｅｎｚｉ  ｌａｂ、ＥＭＢＬ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を培養するために、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、１００万個細胞／ｍｌの密度で維持した。トランスフェクションのために、０．５＊１０６個細胞／ｍｌの密度で細胞を播種し、次いで、トランスフェクションした。６ウェルマルチディッシュを利用して、２μｇのＤＮＡを、２００μｌの培地および１２μｌのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬と混合し、１５〜２０分間インキュベートし、各ウェルに滴加した。２種のプラスミドの同時トランスフェクションの割合は常に１：１とした。２日後、顕微鏡またはフローサイトメトリーによってトランスフェクションを解析した。
【０２８４】
１．Ｓｆ２１ゲノム解析：
標準プロトコールを使用してヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のゲノムＤＮＡを抽出し、ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇのｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙによってゲノムを配列決定した。
【０２８５】
クエリー配列としてカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）  ｓｎＲＮＡ  Ｕ６アイソフォームＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６４９３８１．１）を使用して、８種のＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｕ６−１〜Ｕ６−８）（補足図１参照のこと）および少なくとも４００ｂｐ上流（プロモーター領域）および１００ｂｐ下流配列（終結シグナル）を見い出すことができた（補足図２）。本発明者らは、見い出された、第２のスキャフォールド（１７０１１＿２９６２＿３０３６＿＋）からのＵ６プロモーターおよび３’終結シグナルを用いて作動すると決定し、このＵ６プロモーターは、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２と呼んだ。
【０２８６】
４．  フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析を、ＢＤ  ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。従って、６ウェルマルチディッシュにおいてＳｆ２１またはＳ２細胞を、ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ（図５Ｂ参照のこと）およびｔＲＮＡ発現のためのプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。２日のインキュベーション時間の後、細胞を、５００ｒｐｍで１０分間、４℃で回収し、５００μｌの滅菌１ｘＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を、セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、７０μｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過し、測定まで氷上で維持した。各サンプルの５００万個の細胞のデータを獲得し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｘソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ）を用いて解析した。
【０２８７】
Ｂ．  一過性トランスフェクションのためのプラスミド調製
一過性トランスフェクションにおけるメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡＰｙｌの発現のために、種々のＵ６  プロモーターを試験した。種々のｔＲＮＡＰｙｌ発現構築物の配列が、図３Ａに示されている（配列番号１５〜１８）。
【０２８８】
実施例Ｂ．１：Ｕ６ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
Ｕ６（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））プロモーターを、Ｍｍ  ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子の前に、続いて、短い３’終結シグナルをプラスミド  ｐＩＥｘ−ｃｃｄＢ（配列番号５０）中にクローニングし、ｐＩＥｘ−Ｕ６（ヒト）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍプラスミド（配列番号１９）となった。
【０２８９】
実施例Ｂ．２：Ｕ６キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）
プラスミドｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（配列番号２０）を、Ｂｉａｎｃｏら２０１２１．  Ｂｉａｎｃｏ，Ａ．、Ｔｏｗｎｓｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．、Ｇｒｅｉｓｓ，Ｓ．、Ｌａｎｇ，Ｋ．  ＆  Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｗ．  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ第８巻、７４８〜７５０頁（２０１２年）におけるクローニング戦略に従って構築した。Ｕ６（Ｄｍ）−２プロモーターを有する４回ｔＲＮＡ発現カセットをクローニングして、プラスミドｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ  ４ｘを達成した（配列番号２１）。
【０２９０】
実施例Ｂ．３：Ｕ６カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）
Ｕ６−２プロモーター  カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）と、それに続くカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子およびｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子の３’終結シグナルから構成されるｔＲＮＡカセットが、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃから順序付けられた。この５８６ｂｐ断片を、プラスミドｐＩＤＫ（配列番号２２）中のＣｌａＩおよびＮｃｏＩ部位の間にクローニングし、ｐＩＤＫ−Ｕ６（Ｂｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（配列番号２３）が得られた。
【０２９１】
実施例Ｂ．４：Ｕ６ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）
ａ）プラスミドｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍの調製
ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＵ６プロモーターを使用する一過性な系においてアンバーサプレッションを試験するために、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２プロモーター配列（ｓｎＲＮＡ  Ｕ６  ｇｅｎの４００ｂｐ上流）に、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子を続け、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６  遺伝子の対応する３’終結シグナル（配列番号２）で終わった。ＰＣＲによって、順序付けられた遺伝子（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．）からメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡ構築物を取り出し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いて消化し、ｐＩＥｘ−ｃｃｄｂプラスミド（配列番号５０）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中にライゲーションし、これは、ＩＥ１と呼ばれるプロモーターの前のエンハンサーおよびクローニングの間、バックグラウンドを低く維持するのに役立つｃｃｄＢ  遺伝子からなるものであった。このプラスミドを、同一酵素を用いて事前に切断し、プラスミドｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（図５Ａ）（配列番号２４）を得た。種々のＵ６（Ｓｆ２１）プロモーター（Ｕ６（ＳＦ２１）１−８）を比較するために、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２  ｔＲＮＡ構築物についてと同一のクローニング戦略を使用した。
【０２９２】
ｂ）プラスミドｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓの調製
プラスミドｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ  （図５Ｂ）（配列番号２５）を作成するために、第１に、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ構築物を、アンピシリンに対する耐性遺伝子を変更した後、制限酵素としてＮｃｏＩおよびＳａｌＩを使用して、ＯｐＩＥ１プロモーターの下、ｐＩＺＴ−Ｖ５／Ｈｉｓプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ベクターキット）中にクローニングし、第２のステップにおいて、ＰＣＲならびにＫｐｎＩおよびＸｂａＩを使用する従来の制限酵素クローニングによって、ｐＥｖｏｌ−ＰｙｌＲＳからメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ＰｙｌＲＳ  ＷＴ遺伝子（配列番号２６）を取り出して、ＯｐＩＥ２プロモーターの下で発現される遺伝子を得た。ｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞においてアンバーサプレッションのために使用され、構成プロモーターの下のｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子に加えて、２つのメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）ＰｙｌＲＳ遺伝子を、１つは構成プロモーターの下に（ｇｌｎＳ）、１つはアラビノース誘導プロモーターの下に含有するプラスミドである。ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（ＷＴ）（配列番号２８）を同一方法で構築した。
【０２９３】
Ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換のためのプラスミド調製
リポーター構築物ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６ＨｉｓならびにｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴおよびｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦのプラスミドコーディングを、これまでに記載されたようにクローニングした（Ｐｌａｓｓ  Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ  Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｃ．、Ｌｅｍｋｅ  ＥＡ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．第５０巻、３８７８〜８１頁（２０１１年））。プラスミドｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦは、プラスミドｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴと同一要素を含有するが、ＰｙｌＲＳ遺伝子は、２つの点突然変異（Ｙ３４６ＡおよびＹ３８４Ｆ）を含む（配列番号２９）。
【０２９４】
プラスミドｐＢＡＤ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ（配列番号３１）は、アラビノース誘導プロモーターの下に、位置Ｙ３９にアンバー突然変異およびＣ末端６Ｈｉｓ−タグを有するＧＦＰ遺伝子を含有する。
【０２９５】
Ｄ．ＤＨ１０Ｂａｃタグ細胞株の調製
実施例Ｄ．１：アンバーサプレッションバクミド（ＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ）の構築
アンバーサプレッションのためにＰｙｌＲＳシンセターゼおよびｔＲＮＡＰｙｌを含有するバクミドを作成するために、本発明者らは、第１に、制限酵素としてＣｌａＩおよびＸｂａＩを使用して、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（配列番号２）を、ｐＵＣＤＭ（Ｉｍｒｅ  Ｂｅｒｇｅｒ、ＥＭＢＬ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ）（配列番号３２）プラスミド中にクローニングし、続いて、ＭＭ  ＰｙｌＲＳまたはＭＭ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦをｐ１０プロモーターの下に付加し、ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを用いて切断した。ｐＵＣＤＭを、バクミド骨格の修飾においてトランスファープラスミドとして使用し、２種の遺伝子の並行発現のために２つの昆虫プロモーターを含有する。ｐＵＣＤＭプラスミドのすべてのクローニングステップのために、ＢＷ２３４７４細胞を増殖のために使用した。得られるベクターｐＵＣＤＭ−ＰｙｌＲＳＷＴ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（図５Ｃ）（配列番号３３）（Ｕ６−ｔＲＮＡ  カセット５’→３’およびＰｙｌＲＳ遺伝子３’→５’）を、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｉ．、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．  ＆  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ第２２巻、１５８３〜１５８７頁（２００４年）およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．ら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ第３巻、１０２１〜１０３２頁（２００６年）のプロトコールに従ってエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃＣｒｅ細胞（Ｉｍｒｅ  Ｂｅｒｇｅｒ、ＥＭＢＬ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ）中に形質転換した。
【０２９６】
８個の青色コロニーを選び取り、バクミド−ＤＮＡを調製し、Ｓｆ２１細胞を、Ｃｒａｉｇ，Ａ．  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｉ．  ＡＣＥＭＢＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＭｕｌｔｉＢａｃＴｕｒｂｏ、Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ、Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ．バージョン３．０（２０１１年）に記載されるようにトランスフェクトした。並行して、８個の選び取ったコロニーの各々からグリセロールストックを調製した。６０時間のインキュベーション後にＶ０ウイルスが回収され、Ｖ１世代が開始した。さらに６０時間後、細胞増殖が停止した後、細胞を回収した。細胞ペレットを４ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ８）中に取り入れ、その結果、１００万個細胞／ｍｌとした。１０μｌのサンプルを、同量のＳＤＳローディングダイと混合し、９５℃で１０分間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでロードし、その後、一次抗体として抗ＰｙｌＲＳ（Ｒａｔ；Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を使用するウエスタンブロットを実施した（図６）。対照として、事前に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、標準精製プロトコールを使用して精製されたＰｙｌＲＳ−６Ｈｉｓをロードした。バクミド番号２に対応するグリセロールストックから、エレクトロコンピテント細胞を調製した、いわゆるＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ（ＷＴ）。この手順を、ＰｙｌＲＳ  ＷＴを含有するｐＵＣＤＭ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ（ＡＦ）につながる、ＰｙｌＲＳ  ＡＦ変異体ベクターｐＵＣＤＭ−ＰｙｌＲＳＡＦ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（配列番号３４）（ＰｙｌＲＳ遺伝子５’→３’、Ｕ６−ｔＲＮＡカセット３’→５’）（示されていないウエスタンブロット）の両方について行った。
【０２９７】
Ｅ．安定した（バクミド）トランスフェクションのためのプラスミド調製
アンバー突然変異タンパク質を発現させるために種々のプラスミドを構築した。
【０２９８】
実施例Ｅ１：ｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ
リポータープラスミドを構築し、従って、制限酵素としてＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを使用して、ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓを、ＰＨ（ポリヘドリン（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ））プロモーターの下、ｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ−プラスミド（配列番号３５）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ，  ＥＭＢＬ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中にクローニングした。得られたｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ（配列番号３６）（図５Ｄ）を、ＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ（ＷＴ）およびＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ（ＡＦ）中に形質転換し（実施例Ｄ１を参照のこと）、それによって、Ｔｎ７サイド（ｓｉｄｅ）中に組み込まれた。
【０２９９】
実施例Ｅ２：ｐＡＣＥＢａｃ−デュアル−ヘルセプチン−６Ｈｉｓ
ヘルセプチン（抗Ｈｅｒ）の重鎖（配列番号３７）および軽鎖（配列番号３９）の可変および定常領域のコード配列から構成されるＦａｂ断片ｇｅｎは、Ｓｆ２１細胞に対して最適化された順序付けられたコドンであり、重鎖のＣ末端６Ｈｉｓ−タグとともに、それぞれ、ｐ１０プロモーターおよびＰＨプロモーターの下、ｐＡＣＥＢａｃ−デュアルプラスミド中にクローニングした。重鎖の位置Ａ１２１およびＡ１３２の２つのアンバー突然変異を、クイックチェンジ（ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ）ＰＣＲによって個別に挿入し、プラスミド、ｐＡＣＥＢａｃ−Ｄｕａｌ−ヘルセプチン−６Ｈｉｓ（配列番号４１）（ヘルセプチン軽鎖５’→３’、重鎖３’→５’）（図５Ｅ）が得られた。
【０３００】
実施例Ｅ３：ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄｕａｌ−６ＨｉｓＴＡＦ１１／ＴＡＦ１３
制限酵素としてＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、ＴＡＦ１１（転写開始因子ＴＦＩＩＤサブユニット１１）遺伝子配列番号４３をＮ末端６Ｈｉｓ−タグとともに、ＰＨプロモーターの下、ｐＦａｓｔＢａｃ−デュアルプラスミド中に、ならびにＴＡＦ１３（転写開始因子ＴＦＩＩＤサブユニット１３）配列番号４５を、得られたプラスミド中、ｐ１０プロモーターの後ろにクローニングすることによって、ｐＦａｓｔＢａｃ−デュアル−６ＨｉｓＴＡＦ１１／ＴＡＦ１３（図５Ｆ）（配列番号４２）（ＴＡＦ１１  ５’→３’およびＴＡＦ１３  ３’→５’）を作製した。クイックチェンジ（ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ）ＰＣＲを実施して、単一アンバー停止コドンを、位置Ｒ３０、Ｅ３４およびＲ３５でＴＡＦ１３遺伝子中に導入した。
【０３０１】
実施例Ｅ４：ｐＢＡＤ−ＴＢＰ−インテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓ
酵素としてＮｃｏＩおよびＳｐｅＩを使用する従来の制限部位クローニングによって、ＴＡＴＡ−Ｂｏｘ結合タンパク質（ＴＢＰ）（配列番号４８）の残基１５５〜３３３を、ｐＢＡＤ−インテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓプラスミド中にクローニングし、ｐＢＡＤ−ＴＢＰ−インテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓ（図５Ｇ）（配列番号４９）が得られた。
【０３０２】
Ｆ．タンパク質発現および精製
実施例Ｆ．１  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）の発現および精製
ＧＦＰ（ｐＢＡＤ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ−６Ｈｉｓ）のアンバー突然変異体（Ｙ３９ＴＡＧ）のプラスミドコーディングを、それぞれ、ｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＷＴまたはｐＥｖｏｌ  ＰｙｌＲＳ  ＡＦとともに同時形質転換し、ＴＢ−ＦＢ培地で、３７℃で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ細胞において発現させた。０．２のＯＤ６００が達成された時点でｎｃＡＡを添加し、ＯＤ６００＝０．４で、０．０２％アラビノースを用いて発現を誘導した。６〜８時間後、細胞を回収し、ペレットを凍結し、−２０℃で保存した。
【０３０３】
細胞ペレットを、１ｌの発現培養物あたり１０ｍｌの４ｘＰＢＳバッファー（１ｍＭ  ＰＭＳＦ、９０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ、５  ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、３０秒間超音波処理した。１５０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心沈殿させた後、可溶性画分をニッケルビーズで少なくとも３０分間インキュベートした。１０ｍＭイミダゾールを含む４ｘＰＢＳを用いて洗浄することによって不純物を除去し、最後に、４ｘＰＢＳバッファー中５００ｍＭイミダゾールを用いてタンパク質を溶出した。ＮｕＰＡＧＥ勾配ゲル（４〜２０％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質をロードし、ＭＯＰＳバッファーで流した。必要に応じて、ゲル濾過カラムにわたってタンパク質をさらに精製した。
【０３０４】
実施例Ｆ．２  バキュロウイルス系におけるＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）の発現：
ＧＦＰのアンバー突然変異体（Ｙ３９ＴＡＧ）をコードするプラスミドｐＡＣＥＢａｃ−デュアル−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ（図５Ｄを参照のこと）を、実施例Ｅ１に従って調製されたようなＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ細胞（ＷＴおよびＡＦ変異体）中に形質転換し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧならびにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する青／白選択プレート上にプレーティングした。４つの白色コロニーを選び取り、バクミド−ＤＮＡを調製した。本明細書において先に記載されたようにＳｆ２１細胞にトランスフェクトした後、６０時間後に４種のＶ０ウイルス調製物を回収した。４種のＶ０ウイルスすべてを使用してＶ１ウイルスを並行して製造し、各１ｍｌのウイルスを１００ｍｌの新鮮Ｓｆ２１細胞に添加した。５種の培養物を同一方法で設定した、すなわち１ｍＭの最終濃度のｎｃＡＡが添加された、４種のＶ１ウイルスのうち各々について１種および最初のバクミド−ＤＮＡに起因するＶ１ウイルスが添加された陰性対照としてのｎｃＡＡを用いない１種の培養物。細胞増殖が停止した後、細胞をさらなる４８〜６０時間後に回収した。
【０３０５】
精製は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたＧＦＰと同一としたが、１つの相違があった。超音波処理ステップ後、ライセートを、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機（ＳＷ  Ｔｉ６０ローター）を使用して４０．０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。プロパルギル−リシン  （ＰｒＫ）およびＳＣＯ−Ｌ−リシンの組込み後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製成功を解析した（図１２）。
【０３０６】
プロパギル−リシン（ＰｒＫ）およびＳＣＯ-Ｌ−リシンを用いるＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）の質量分析解析によって、これらの非天然アミノ酸の、タンパク質ＧＦＰ（図７および８）ならびにヘルセプチン（図９）への組込みが確認される。
【０３０７】
実施例Ｆ．３  バキュロウイルス系におけるヘルセプチンＦａｂ断片の発現および精製：
重鎖中の位置１２１または１３２にアンバー停止コドンを有するヘルセプチンＦａｂ断片の発現のために、プラスミドｐＡＣＥＢａｃ−デュアル−ヘルセプチン−６Ｈｉｓ（図５Ｅを参照のこと）を、バキュロウイルス系におけるＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）発現と同一プロトコールに従って、実施例Ｅ２）に従って調製されたようなＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ  ＷＴおよびＡＦ中に形質転換し、発現は、ＰｒＫを用いておよび用いずに、ならびにＢＯＣ−リシンを用いておよび用いずに実施した。また、この精製のために、本発明者らは、ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓプロトコールについてと同一のプロトコールをたどり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を解析した。図１３Ａは、ＰｒＫを用いるまたは用いない発現を示し、図１３Ｂは、ＢＯＣ−リシンを用いるまたは用いない発現を示す。
【０３０８】
実施例Ｆ．４  バキュロウイルス系におけるＴＡＦ複合体（ＴＡＦ１１／ＴＡＦ１３）の発現および精製：
ＴＡＦ複合体を発現させるために、本発明者らは、プラスミドｐＡＣＥＢａｃ−デュアル−６ＨｉｓＴＡＦ１１／ＴＡＦ１３（図５Ｆを参照のこと）を、実施例Ｅ３に従って調製されたようなＤＨ１０ＢａｃＴＡＧ  ＡＦ変異体中に形質転換した。これは、ＴＡＦ１１／ＴＡＦ１３  ＷＴ複合体について、ならびにアンバー突然変異体について行った。本発明者らは、バキュロウイルス系においてＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）−６Ｈｉｓ発現についてと同一の発現プロトコールをたどった。
【０３０９】
細胞ペレットを、１リットルの発現培養物あたり１５０ｍｌのＴｒｉｓバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、完全プロテアーゼ阻害薬ミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ロイペプチンおよびペプスタチン）に再懸濁した。数ラウンドの瞬間凍結および解凍によって、細胞を溶解する。細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で遠心沈殿させる（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷＴｉ６０ローター）。上清をニッケルビーズ上で１〜２時間インキュベートし、漸増するイミダゾール濃度を用いる数回の洗浄ステップ後にタンパク質を溶出する。バッファー交換後、タンパク質をＱ−セファロースカラムにロードした。精製手順を仕上げるために、タンパク質をセファデックスカラム上に注入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【０３１０】
実施例Ｆ．５  ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、残基１５５〜３３３の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現および精製：
ｐＢＡＤ−ＴＢＰ−インテイン−ＣＢＤ−１２Ｈｉｓ（図５Ｇを参照のこと；実施例Ｅ４において調製されたような）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ細胞に形質転換し、ＴＢ−ＦＰ培地において、１８℃で一晩発現させた。遠心分離（４５００ｒｐｍ、２０分、４℃）によって細胞を回収し、−２０℃で保存した。
【０３１１】
超音波処理器を使用して、２０ｍｌ  ＴＢＰ溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８）中で、１リットルの発現培養物の細胞を溶解した。不溶性画分を遠心沈殿した後、清澄化された上清を、事前に平衡化したＮｉカラム上にロードした。漸増濃度のイミダゾールを用いて洗浄を実施し、タンパク質を最終的に溶出した。インテイン−ＣＤＢ−１２Ｈｉｓタグを切断するために、タンパク質を１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）とともにＲＴで一晩インキュベートした。その後の透析ステップによって、バッファーをイミダゾールを有さないＴＢＰ溶解バッファーに戻し、タンパク質を、Ｎｉビーズを用いてさらに精製した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって調べた。
【０３１２】
実施例Ｆ．６  Ｓ２細胞の一過性トランスフェクションおよびフローサイトメトリー解析
対照測定として、本発明者らは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞においてキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｕ６−ｔＲＮＡ構築物（Ｕ６（Ｄｍ））を調べた。したがって、本発明者らは、ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）を用いる同時トランスフェクションにおいてｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍならびにｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ（４ｘ）を使用して一過性トランスフェクションを実施した。発現収率をフローサイトメトリーによって解析した（図４参照のこと）。ＧＦＰシグナルは、緑色チャネルにおいてｎｃＡＡを用いるおよび用いないシグナルを比較して明確に示される、作動しているアンバーサプレッション系を報告する。
【０３１３】
実施例Ｆ．７  Ｓｆ２１細胞の一過性トランスフェクションおよびフローサイトメトリー解析
Ｓｆ２１細胞を、ＰｙｌＲＳ遺伝子（ｐＩＺＴ−ＰｙｌＲＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ（Ｙ３９ＴＡＧ）ならびに４種のｔＲＮＡ発現プラスミドのうち１種も含むリポータープラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。これらのプラスミドは、ｐＩＥｘ−Ｕ６（ヒト）−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ、ｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｄｍ）−ｔＲＮＳＰｙｌ−３’ｔｅｒｍ、ｐＩＤＫ−Ｕ６（Ｂｍ）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍおよびｐＩＥｘ−Ｕ６（Ｓｆ２１）−２−ｔＲＮＡＰｙｌ−３’ｔｅｒｍであり、それらすべてが、ｔＲＮＡＰｙｌの遺伝子、Ｕ６プロモーターおよび３’終結シグナルを含有している。本発明者らは、Ｕ６（Ｓｆ２１）−２プロモーターを含有するｔＲＮＡ発現カセットが使用される場合には、一過性系においてＳｆ２１細胞におけるアンバーサプレッションは、唯一作動しており、その他のプロモーター配列の内１種がトランスフェクトされる場合またはｎｃＡＡが添加されない場合には、アンバーサプレッションはないことを示す。この結果は、フローサイトメーターにおいてＧＦＰシグナルを解析することによって得られる（図３Ｂ）。
【０３１４】
Ｇ．  クリック反応
実施例Ｇ．１  銅によって触媒されるアルキン−アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）：
ｎｃＡＡ（プロパルギルリジン、ＰｒＫ）を含有し、アンバー停止コドンサイド（ｓｉｄｅ）にアルキル基が組み込まれている精製タンパク質を、１ｘＰＢＳバッファーｐＨ７．５（０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に交換し、Ｔｙａｇｉ，ＳおよびＬｅｍｋｅ，Ｅ．Ａ．  Ｔｙａｇｉ，Ｓ．  ＆  Ｌｅｍｋｅ，Ｅ．Ａ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＲＥＴ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１１３巻、１６９〜１８７頁（２０１３年）におけるプロトコールに従って、５ｎｍｏｌをクリック反応に使用した。環化付加（Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｏｎ）反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってフォローアップした（ヘルセプチンＦａｂ断片１３２ＰｒＫ突然変異体については図１３Ｃ参照のこと）。
【０３１５】
実施例Ｇ．２  株によって促進されるアルキン−アジド環化付加  （ＳＰＡＡＣ）：
１ｍＭのＳＣＯ−Ｌ−リシン（Ｓｉｃｈｅｍ）の存在下で発現されたタンパク質を精製し、１ｘＰＢＳバッファー（ｐＨ８）に交換した。標識反応のために、２５ｎｍｏｌのＴＡＭＲＡ−Ｈ−テトラジン（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した５ｎｍｏｌのタンパク質を、室温で一晩インキュベートした。Ｐｌａｓｓ，Ｔ．、Ｍｉｌｌｅｓ，Ｓ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃ．  ＆  Ｌｅｍｋｅ，Ｅ．Ａ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ第５０巻、３８７８〜３８８１頁（２０１１年）。標識反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光スキャンによって確認した。図１０は、ＴＡＭＲＡ−Ｈ−テトラジンおよびヘルセプチンＦａｂ野生型と反応させた、ヘルセプチンＦａｂ  １２１ＳＣＯのＳＰＡＣＣ反応の結果を示す（図１０Ａ蛍光スキャン、図１０Ｂクーマシーブルー用いるタンパク質染色）。見られるように、Ｈｅｒ１２１ＳＣＯは、選択的に印がつけられている。
【０３１６】
本明細書において引用されたような文書は、参照によりすべて組み込まれる。
【０３１７】
【表５−１】
2018534943.tif 000020
【０３１８】
【表５−１】
2018534943.tif 000021
【図１】
2018534943.tif 000022
2018534943.tif 000023
【図２】
2018534943.tif 000024
【図３Ａ】
2018534943.tif 000025
【図３Ｂ−１】
2018534943.tif 000026
【図３Ｂ−２】
2018534943.tif 000027
【図３Ｂ−３】
2018534943.tif 000028
【図３Ｂ−４】
2018534943.tif 000029
【図３Ｃ】
2018534943.tif 000030
【図４−１】
2018534943.tif 000031
【図４−２】
2018534943.tif 000032
【図５Ａ−Ｂ】
2018534943.tif 000033
【図５Ｃ−Ｄ】
2018534943.tif 000034
【図５Ｅ−Ｆ】
2018534943.tif 000035
【図５Ｇ】
2018534943.tif 000036
【図６】
2018534943.tif 000037
【図７Ａ】
2018534943.tif 000038
【図７Ｂ】
2018534943.tif 000039
【図８Ａ】
2018534943.tif 000040
【図８Ｂ】
2018534943.tif 000041
【図９Ａ】
2018534943.tif 000042
【図９Ｂ−１】
2018534943.tif 000043
【図９Ｂ−２】
2018534943.tif 000044
【図９Ｂ−３】
2018534943.tif 000045
【図９Ｂ−４】
2018534943.tif 000046
【図９Ｂ−５】
2018534943.tif 000047
【図１０Ａ】
2018534943.tif 000048
【図１０Ｂ】
2018534943.tif 000049
【図１１Ａ】
2018534943.tif 000050
【図１１Ｂ】
2018534943.tif 000051
【図１１Ｃ】
2018534943.tif 000052
【図１１Ｄ】
2018534943.tif 000053
【図１１Ｅ】
2018534943.tif 000054
【図１１Ｆ】
2018534943.tif 000055
【図１１Ｇ】
2018534943.tif 000056
【図１１Ｈ】
2018534943.tif 000057
【図１１Ｋ】
2018534943.tif 000058
【図１１Ｌ】
2018534943.tif 000059
【図１２Ａ】
2018534943.tif 000060
【図１２Ｂ】
2018534943.tif 000061
【図１２Ｃ】
2018534943.tif 000062
【図１３Ａ】
2018534943.tif 000063
【図１３Ｂ】
2018534943.tif 000064
【図１３Ｃ】
2018534943.tif 000065
【配列表】
2018534943000001.app
【国際調査報告】
2018534943.tif 000066
2018534943.tif 000067
2018534943.tif 000068
2018534943.tif 000069