(57)【要約】  本開示は、概して、ヒト対象における癌を治療するための療法を選択し、続いて対象における癌を治療するための方法を提供し、本方法は、癌を有するヒト対象から癌細胞を単離することと、細胞中のＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳの機能活性を判定することと、細胞中のＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳの機能活性に基づいて癌に対する療法を選択することと、を含む。ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳの機能活性が細胞中に欠損していると判定された場合、選択される療法は、ＳＴＩＮＧ欠損及び／またはｃＧＡＳ欠損癌細胞を死滅させるのに有効であるもの、例えば、腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む療法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において癌を治療するための方法であって、
癌を有するヒト対象から試料を単離するステップと、
前記試料中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップと、
前記試料中の前記ＳＴＩＮＧの前記機能活性に基づき前記癌に対する療法を選択するステップと、
前記選択された療法を用いて前記対象を治療するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
ＳＴＩＮＧの前記機能活性が、前記細胞中で欠損していると判定され、前記選択された療法が、ＳＴＩＮＧ欠損癌細胞を死滅させるのに有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、少なくとも１つの化学療法レジメンに失敗している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法レジメンが、ＤＮＡ変異を引き起こす薬剤を前記対象に投与することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択された療法が、前記対象に腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または水痘帯状疱疹ウイルスに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中のＳＴＩＮＧの前記機能活性を判定する前記ステップが、前記細胞中のｃＧＡＳの量を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒト対象において癌を治療するための方法であって、
試料中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップと、
前記試料がＳＴＩＮＧ活性欠損を有する場合、腫瘍溶解性ウイルスを前記対象に投与するステップと、を含む、方法。
【請求項９】
前記試料中のＳＴＩＮＧの前記機能活性を判定する前記ステップが、前記細胞中のｃＧＡＳの量を分析することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト対象において癌を治療するための方法であって、
前記癌を有する前記対象に由来する試料中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップと、
前記試料がＳＴＩＮＧ活性欠損を有しない場合、ＤＮＡ変異を引き起こさない癌治療を前記対象に施すステップと、を含む、方法。
【請求項１１】
ヒト対象において癌を治療するための方法であって、
癌を有するヒト対象から試料を単離するステップと、
前記試料中のｃＧＡＳの機能活性を判定するステップと、
前記試料中の前記ｃＧＡＳの前記機能活性に基づき前記癌に対する療法を選択するステップと、
前記対象に前記選択された療法を施すステップと、を含む、方法。
【請求項１２】
癌を治療するための方法であって、
ａ）対象に腫瘍溶解性ウイルス療法を施すことと、
ｂ）前記対象に由来する試料中のＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳのレベルを判定することであって、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ活性の減少が腫瘍溶解性療法の陽性効果を予測する、判定することと、
ｃ）ｉ）前記対象中のＳＴＩＮＧのレベルが低い場合、腫瘍溶解性療法を継続すること、または
ｉｉ）ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳレベルが正常もしくは部分的に活性である場合、腫瘍溶解性ウイルス療法を中断し、かつ／または前記腫瘍溶解性ウイルス療法の前記効果を改善させるために前記対象中のＳＴＩＮＧレベルを上昇させることができる第２の薬剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性ウイルス療法が、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、またはワクシニアウイルスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、大腸癌、大腸炎関連癌、及び黒色腫から成る群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、体液、細胞、組織試料、生検、組織印刷、皮膚、毛髪、細胞調製物の可溶性画分、または細胞が育てられた培地である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記体液が、血液、尿、血漿、唾液、または脳脊髄液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＴＩＮＧ活性またはｃＧＡＳ活性を欠いている前記癌における免疫応答が、腫瘍溶解性ウイルスの投与によって強化される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が、Ｔ細胞活性の調整、樹状細胞活性の調整、または免疫サイトカインの調整を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記療法が、増加した腫瘍細胞死及び／または遅延した腫瘍成長をもたらす、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月１１日出願の米国仮特許出願第６２／１７４，３７４号の優先権の利益を主張するものであり、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
該当なし。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別の部分として、コンピューターに読み込み可能な形式の配列表を含み、その全体が参照により組み込まれ、次のように識別される：ファイル名：４９７２０＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：２，３１３バイト、製作日：２０１６年６月１３日。
【０００４】
本開示は、概して、分子生物学、免疫学、生化学、癌、及び医学の分野に関する。より具体的には、本開示は、細胞タンパク質の使用による癌の診断及び治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
癌は、アメリカ合衆国及びその他の国における主な死因である。効果を改善させるための新たな治療及び診断法が必要とされている。
【０００６】
大腸癌（ＣＲＣ）は、米国の約１２０万の人々を冒し、毎年約１５０，０００の新たな症例が診断されている。実際に、ＣＲＣは、世界的に肺癌及び乳癌に続いて３番目に多い癌の原因であり、成人における２番目に多い癌の主な死因である（ＤｅＳａｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。腸関連悪性疾患はしばしば、細胞成長の制御に関与する重要な遺伝子中に遺伝子変化を蓄積する結腸上皮細胞から発症する。多段階ゲノム損傷によって悪化した変化は、発癌物質を含む環境的要因、またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉを含む遺伝毒性病原性微生物に由来し得る（Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，２０１４、Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。かかる遺伝子修正はしばしば、ｋ−ｒａｓの変異を介して、ならびにｐ５３及び腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）等の極めて重要な腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）の変異またはエピジェネティックなサイレンシングを介して、細胞成長シグナル伝達の活性化に関与することが多い。ＡＰＣ等の変異したＴＳＧも受け継がれ得、このため、ＣＲＣの危険性を著しく増加させる（Ｆｅａｒｏｎ，２０１１）。
【０００７】
ＤＮＡ付加体形成アゾキシメタン（ＡＯＭ）等の経口投与される発癌物質は、胃腸上皮細胞中に、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路の活性化を誘起し得る事象であるゲノム変化を誘発する。これらの応答は、ＤＮＡ切断の修復及び塩基ミスマッチの排除を含むが、これらは、損傷部分に対する免疫監視系に警告し、創傷の修復を促進する炎症促進性サイトカインの産生を活性化させることも含み得る。例えば、マウスモデルを使用し、ＡＯＭ及び続く炎症性薬物デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の投与は、上皮細胞にＩＬ−１β及びＩＬ−１８を産生させ得ることが実証されており、これらは、ＮＬＲＰ３及びＮＬＲＰ６等のヌクレオチド結合性オリゴマー形成ドメインタンパク質様受容体（ＮＬＲ）、ならびに分泌のためＣＡＲＤを含有するアポトーシス性スペック（ｓｐｅｃｋ）タンパク質（ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ）及びカスパーゼ−１を含む、多タンパク質複合物である、インフラマソームによって処理される（Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｅｌｉｎａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＩＬ−１８は、例えば、結腸樹状細胞に結合し、ＭｙＤ８８を通して成長阻害性ＩＬ−２２結合タンパク質（ＩＬ−２２ＢＰ）の産生を阻むシグナルを出すことができ、制御されていないＩＬ−２２が組織の修復を刺激することを可能にする（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。このため、ＡＳＣまたはカスパーゼ−１等の重要なインフラマソーム関連分子を欠損しているマウスは、発癌物質誘発性大腸炎関連癌（ＣＡＣ）に対して感受性である。同様に、ＩＬ１−Ｒシグナル伝達に必要とされるＭｙＤ８８等の重要なアダプター分子を損失している場合、ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性ＣＡＣに対して感受性である。もっともらしく、修復されていない傷害は、炎症性プロセスを慢性的に悪化させ得る、高められた遺伝毒性能力を有する微生物の浸潤、及びＤＮＡ損傷ラジカル酸素種（ＲＯＳ）の産生を可能にする。
【０００８】
インフラマソームは、ＩＬ１β及びＩＬ−１８等の炎症促進性サイトカインを処理するために重要であると示されているが、かかる創傷修復タンパク質が、実際のゲノム損傷に応答してどのように転写的に活性化されるのかは、依然として完全に解明されていない。しかしながら、近年、先天性免疫調節因子ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激物質）を欠いているマウスも、ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性ＣＡＣに罹患し易いことが示されている（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＳＴＩＮＧは、造血細胞ならびに内皮細胞及び上皮細胞内の小胞体（ＥＲ）内に存在し、細胞内細菌から発生した環状−ジ−ＡＭＰ（ｃ−ジ−ＡＭＰ）等の環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の検出に応答して、Ｉ型ＩＦＮ等の多数の宿主防御遺伝子、ならびにＩＬ１−βを含む炎症促進性遺伝子の誘発を制御する（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，２００８、Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＳＴＩＮＧは、ｃＧＡＳ（Ｍａｂ−２１ドメイン含有タンパク質及びＣ６ｏｒｆ１５０とも称される環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ）と称される細胞ヌクレオチジルトランスフェラーゼから産生されるＣＤＮに対するセンサでもある（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＨＳＶ−１等の病原体に侵入するゲノムを構成し得る細胞質ＤＮＡ種、またはもっともらしく、細胞核から漏出した自己ＤＮＡは、ｃＧＡＳに結合し、１つの２’−５’リン酸ジエステル結合及び標準的な３−５’結合（ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）を含有する非標準的な（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ｃＧＡＭＰを生成できる。ＳＴＩＮＧ経路は、腸損傷への早期応答中に損傷したＤＮＡを認識することができ、ＩＬ１β及びＩＬ−１８に関与する組織修復経路に活性化するのに極めて重要であり得る（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＳＴＩＮＧは、近年、死滅している腫瘍細胞の樹状細胞認識、及び抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答のプライミングにおいて極めて重要な役割を担うことも報告されている（Ｃｏｒｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。このため、ＳＴＩＮＧの損失は、創傷修復を阻むことにより、及び腫瘍特異性ＣＴＬの産生を阻むことにより、腫瘍形成を促進し得るが、ヒト腫瘍におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達の有効性は不明のままである。
【発明の概要】
【０００９】
ＳＴＩＮＧに媒介される先天性免疫シグナル伝達は、ヒト結腸癌及び多くの他のタイプのヒト癌において大部分が正常に機能しないことが本明細書において報告される。多くの場合、これは、ＳＴＩＮＧのサイレンシング、及び／またはエピジェネティック過剰メチル化プロセスによるシンターゼｃＧＡＳ発現によって実現された。この結果は、ＳＴＩＮＧ経路が、結腸腫瘍形成の抑制において主要な機能を有し得ること、及びこの経路におけるＳＴＩＮＧ機能の阻害が、癌発生中に選択的に抑制され得ることを示唆する。さらに、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の欠損は、癌細胞を腫瘍溶解性ウイルス感染に対して感受性にすることが発見されている。したがって、癌中のＳＴＩＮＧ活性の検査は、選択した癌療法の効果を明らかにするだろうアッセイの開発に繋がり得る。
【００１０】
ＤＮＡ損傷剤またはＤＮＡウイルスによって産生される細胞質ＤＮＡに対する先天性免疫応答を制御する細胞タンパク質ＳＴＩＮＧが、多種多様の癌細胞中に欠損していることが発見された。ＳＴＩＮＧシグナル伝達の欠損は、腫瘍細胞が免疫系による除去を回避し、腫瘍形成の共通機構を構成することを補助し得る。腫瘍中のＳＴＩＮＧ発現の検査は、疾患の転帰の予測を可能にし、選択した抗腫瘍療法への応答の予測における極めて重要な予後マーカーを提供する。ＳＴＩＮＧを欠損した（ＳＴＩＮＧノックアウトまたはＳＫＯ）マウスが、ＤＮＡ損傷剤及び催炎剤によって誘発される大腸炎関連癌（ＣＡＣ）になり易いことを示す実験が本明細書に開示される。腫瘍を持つＳＫＯマウスは、結腸に関連する腫瘍形成を阻むための重要なサイトカインを有する正常なマウスと比較して、低いレベルの腫瘍抑制ＩＬ２２結合タンパク質（ＩＬ２２−ＢＰ）を示した。ヒト結腸癌細胞及び黒色腫等の多様な他の癌細胞の分析は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の幅広い欠損を示し、これはしばしば、ＳＴＩＮＧ及び／またはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ’ｓ）を生成するシンターゼである環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の全損を含んだ。かかる腫瘍細胞は、腫瘍溶解性ウイルス療法に対して高度の感受性を示した。
【００１１】
哺乳動物（例えば、ヒト）対象中の癌を治療するための療法を選択し、選択された療法を用いて対象を治療するための方法が、本明細書に開示される。１つのかかる方法は、癌を有するヒト対象から試料を単離するステップと、試料中のＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳの機能活性を判定するステップと、試料中のＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳの機能活性に基づいて癌に対する療法を選択するステップと、選択された療法を用いて対象を治療するステップと、を含む。ＩＬ−２２のＩＬ−２２ＢＰの抑制レベル、ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２２の細胞レベルの測定も企図される。ＩＬ−１β、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２２ＢＰのレベルの減少は、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳシグナル伝達欠損を示し得る。
【００１２】
様々な実施形態では、試料は、体液、細胞、組織試料、生検、組織印刷、皮膚、毛髪、細胞調製物の可溶性画分、または細胞が育てられた培地である。体液は、血液、尿、血漿、唾液、または脳脊髄液であることが企図される。
【００１３】
ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳの機能活性が試料中に欠損していると判定される場合、選択される療法は、ＳＴＩＮＧ欠損及び／またはｃＧＡＳ欠損癌細胞を死滅させるのに有効であるもの（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、またはワクシニアウイルス（ＶＶ）を含む、ｄｓＤＮＡゲノムを有するもの等の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む療法）である。ｄｓＤＮＡゲノムを有する例示的なウイルス科には、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科、マラコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、アスコウイルス科、アスファウイルス科、バキュロウイルス科、バイカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科、フセロウイルス科、グロブロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科、マルセイユウイルス科（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ）、ミミウイルス科、ヌディウイルス科（Ｎｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、ニマウイルス科、パンドラウイルス科（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、スファエロリポウイルス科（Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科、及びトゥッリウイルス科（Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
様々な実施形態では、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の検査は、ＨＳＶ１または他のウイルスに基づく抗癌療法が、悪性疾患の治療に効果的であるかどうかに対する有用な予後マーカーである。
【００１５】
本明細書に記載される方法において、対象は、少なくとも１つの化学療法レジメン（例えば、ＤＮＡ変異を引き起こす薬剤を対象に投与することを含む化学療法レジメン）に失敗している対象であり得、細胞中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップは、細胞中のｃＧＡＳの量を分析することを含み得る。
【００１６】
様々な実施形態では、選択される療法、例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、化学治療薬等の第２の治療薬と併せて投与されることが企図される。例示的な化学治療薬は、発明を実施するための形態において以下に記載されている。
【００１７】
癌を構成する細胞中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップと、細胞がＳＴＩＮＧ活性欠損を有しない場合、ＤＮＡ変異を引き起こさない癌治療を対象に施すステップと、を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）対象において癌を治療するための方法も本明細書に開示される。
【００１８】
癌を有するヒト対象から試料を単離するステップと、インビトロで腫瘍溶解性ウイルスによって死滅されることに対する癌の感受性を判定するステップと、癌が、この様式での死滅されることに対して感受性がある場合、腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するステップと、を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）対象において癌を治療するための方法が本明細書にさらに開示される。様々な実施形態では、試料中のＳＴＩＮＧの機能活性を判定するステップは、細胞中のｃＧＡＳの量を分析することを含む。ＩＬ−２２のＩＬ−２２ＢＰの抑制レベル、ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２２の細胞レベルの測定も企図される。ＩＬ−１β、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２２ＢＰのレベルの減少は、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳシグナル伝達欠損を示し得る。
【００１９】
様々な実施形態では、癌は、大腸癌、大腸炎関連癌、または黒色腫である。本明細書において治療に対して企図されるさらなる例示的な癌が、発明を実施するための形態に示される。
【００２０】
様々な実施形態では、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の存在または不在の測定は、ある特定の癌を有する患者の腫瘍溶解性ウイルス療法に対する応答の予測である。様々な実施形態では、応答の測定は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ならびにＳＴＩＮＧ及び／もしくはｃＧＡＳタンパク質またはＲＮＡ発現の分析を使用して行われ得、ｃＧＡＳもしくはＳＴＩＮＧの存在または不在に応じて腫瘍溶解性ウイルス療法の効果を予測する。
【００２１】
腫瘍溶解性ウイルス療法を対象に施すことと、対象中のＳＴＩＮＧもしくはｃＧＡＳのレベルを判定することであって、ＳＴＩＮＧもしくはｃＧＡＳ活性の減少が腫瘍溶解性療法の陽性効果を予測する、判定することと、ｉ）対象中のＳＴＩＮＧもしくはｃＧＡＳのレベルが低い場合、腫瘍溶解性療法を継続すること、またはｉｉ）ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳレベルが正常もしくは部分的に活性である場合、腫瘍溶解性ウイルス療法を中断し、かつ／または腫瘍溶解性ウイルス療法の効果を改善させるために対象中のＳＴＩＮＧレベルを上昇させることができる第２の薬剤を投与することと、を含む、癌を治療するための方法が本明細書に提供される。
【００２２】
様々な実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス療法は、ヘルペスウイルス、ＶＺＶ、またはワクシニアウイルスを含む。
【００２３】
様々な実施形態では、判定することは、対象から試料を得ることと、試料中のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、または本明細書で企図される他のバイオマーカー（例えば、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２２ＢＰ、ＩＬ−１β、ＩＦＮβ、Ｉ型ＩＦＮ）のレベルを測定することと、を含む。試料は、血液、尿、血漿、唾液、もしくは脳脊髄液等の体液；細胞；組織；組織印刷；指紋、皮膚、または毛髪等；細胞調製物の可溶性画分または細胞が育てられた培地；細胞から単離もしくは抽出された染色体、細胞小器官、または膜；ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、または溶液中もしくは基質に結合するｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチドであることが企図される。
【００２４】
様々な実施形態では、ＳＴＩＮＧ活性またはｃＧＡＳ活性を欠いている癌における免疫応答が、腫瘍溶解性ウイルスの投与によって強化される。１つの実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞活性の調整、樹状細胞活性の調整、または免疫サイトカインの調整を含む。
【００２５】
様々な実施形態では、療法は、対象において増加した腫瘍細胞死及び／または遅延した腫瘍成長をもたらす。
【００２６】
本明細書に記載される各特徴もしくは実施形態または組み合わせは、本発明の態様のうちのいずれかの非限定的な実例であり、したがって、本明細書に記載される任意の他の特徴もしくは実施形態または組み合わせと組み合わせ可能であることを意図していることが理解される。例えば、特徴が、「１つの実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、「特定の例示的な実施形態」、及び／または「別の実施形態」等の言葉を用いて記載される場合、実施形態のこれらのタイプの各々は、全ての可能な組み合わせを列記することなく、本明細書に記載される任意の他の特徴または特徴の組み合わせと組み合わせることを意図している特徴の非限定的な例である。かかる特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のうちのいずれかに適用する。範囲内に収まる値の例が開示される場合、これらの例のうちのいずれかが範囲の可能な終点であると企図され、かかる終点間の任意及び全ての数値が企図され、上の終点及び下の終点の任意の及び全ての組み合わせが想起される。
【００２７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本発明が属する当該術分野の当業者に通常理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が、本発明の実践または試験において使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、以下で考察される特定の実施形態は、例示に過ぎず、制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】［図１Ａ〜１Ｅ］アゾキシメタン（ＡＯＭ）によるＳＴＩＮＧ依存性遺伝子の活性化（図１Ａ）０．１４ｍＭのＡＯＭを用いて８時間（左）及び１ｍＭの１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を用いて８時間（右）治療された野生型（ＷＴ）及びＳＴＩＮＧ欠損（ＳＫＯ）マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の遺伝子アレイ分析。最も可変可能な遺伝子が示される。横列は個々の遺伝子を表し、縦列は個々の試料を表す。グレースケールは、平均未満、平均と同等、または平均を超える転写レベルを示す。スケールは、遺伝子発現の強度を表す（ｌｏｇ２スケールは、−２．４〜２．４の範囲である）。（図１Ｂ）図１Ａと同様にＡＯＭ及びＤＭＨを用いて治療されたＭＥＦ中のＣｘｃｌ１０及びＩｆｉｔ３のｑＰＣＲ分析。（図１Ｃ）１ｍＭのＡＯＭ及びＤＭＨを用いて２４時間治療されたヒト上皮細胞（ＦＨＣ）中のＣｘｃｌ１０のｑＰＣＲ分析。（図１Ｄ）ＦＨＣ細胞は、ＳＴＩＮＧまたは対照ｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトされ、続いて図１Ｃと同様にＡＯＭ及びＤＭＨで治療されて、次いでＣｘｃｌ０  ｍＲＮＡ発現に供された（左）。ｓｉＲＮＡ治療後のＳＴＩＮＧ発現レベルは、ｑＰＣＲによって判定された（右）。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。＊、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。（図１Ｅ）ＷＴ及びＳＫＯマウス（左）ならびにヒトの結腸組織のＳＴＩＮＧ免疫組織化学染色。全ての画像を元の倍率（２００倍）で示した。
【図２】［図２Ａ〜２Ｅ］ＳＴＩＮＧの損失は、マウスをＣＡＣに対して感受性にする。（図２Ａ）ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性大腸炎モデルの概略図。ＷＴ（ｎ＝７）及びＳＫＯ（ｎ＝７）マウスは、１日目にＡＯＭを静脈内注射され、続いて、４回のＤＳＳサイクルで飲料水中にデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を７日間投与された。対照群に対して正常な飲料水を使用した。（図２Ｂ）ＡＯＭ／ＤＳＳで治療された、または正常な水で治療されたＷＴ（ｎ＝７）及びＳＫＯ（ｎ＝７）マウスの結腸腫瘍のマイクロ内視鏡の代表的写真（左）及びＨ＆Ｅ染色（右）。図２Ｂのポリープの数（図２Ｃ）及び炎症スコア（図２Ｄ、０：正常〜３：最も重篤）。（図２Ｅ）図２Ａと同様に治療されたＷＴ及びＳＫＯマウスの結腸組織の遺伝子アレイ分析。最も可変可能な遺伝子リストが示される（右表）。横列は個々の遺伝子を表し、縦列は個々の試料を表す。グレースケールは、平均未満、平均と同等（黒）、または平均を超える転写レベルを示す。スケールは、遺伝子発現の強度を表す（ｌｏｇ２スケールは、−２．４〜２．４の範囲である）。
【図３】［図３Ａ〜３Ｃ］ＳＴＩＮＧ欠損マウスにおけるＩＬ２２ＢＰ発現の抑制。（図３Ａ）４ｕｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０及びＩＦＮβを８時間かけて投与されたＷＴ及びＳＫＯのＭＥＦ中のＩｌ１８の遺伝子アレイ分析の倍数変化（左）。４μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０及び環状−ジ−ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）で８時間かけてトランスフェクトされたＷＴ及びＳＫＯのＭＥＦ中のＩｌ１８のｑＰＣＲ分析（中央）。ＷＴ及びＳＫＯマウスの樹状細胞（ＢＭＤＣ）に由来する骨髄中のＩｌ１８のｑＰＣＲ分析。ＢＭＤＣは、１ｍＭのＡＯＭ及び１ｍＭのＤＭＨを用いて８時間かけて治療された（右）。（図３Ｂ）５日間にわたるＤＳＳ投与に続いて２日間の正常な水の１サイクルの間の、ＷＴ及びＳＫＯの結腸のＩＬ１８、ＩＬ２２ｂｐ、及びＩＬ２２の概略図、体重、及びｑＰＣＲ分析。（図３Ｃ）図２のＷＴ及びＳＫＯの結腸組織のＩＬ１８、ＩＬ２２ｂｐ、及びＩＬ２２のｑＰＣＲ分析。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。＊、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図４】［図４Ａ〜４Ｆ］細胞質ＤＮＡに誘発される先天性免疫シグナル伝達は、ヒト結腸癌細胞中にほとんど欠損していた。（図４Ａ）様々なタイプの一連のヒト結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧの免疫ブロット。ｈＴＥＲＴ及び正常なヒト結腸上皮細胞株ＦＨＣが、陽性対照として含まれた。１レーン当たり２０μｇの全タンパク質を装填し、ウサギ抗ＳＴＩＮＧポリクローナル抗体で分析した。β−アクチンが、負荷対照として使用された。（図４Ｂ）３μｇ／ｍｌで１６時間にわたるポリＩ：ＣまたはｄｓＤＮＡ９０のトランスフェクションに続いて、（図４Ａ）と同様の細胞の培地中でのヒトインターフェロンβ産生のＥＬＩＳＡ分析。リポフェクタミン２０００が、単独でモックトランスフェクションとして使用された。（図４Ｃ）Ａと同様の細胞が、モックトランスフェクトされたか、または３μｇ／ｍｌのポリＩ：ＣまたはｄｓＤＮＡ９０で３時間トランスフェクトされた。全ＲＮＡが抽出され、ＩＦＮＢ発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図４Ｄ）図４Ｃと同様のＲＮＡが、ＣＸＣＬ１０発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図４Ｇ）図４Ｃと同様のＲＮＡが、ＩＬ１Ｂ発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図４Ｅ）モックトランスフェクトされたか、または３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で３時間トランスフェクトされた、正常細胞または結腸癌細胞の遺伝子アレイ分析。最も可変可能な遺伝子が示される。横列は個々の遺伝子を表し、縦列は個々の試料を表す。グレースケールの凡例は、平均未満、平均と同等、または平均を超える転写レベルを示す。スケールは、遺伝子発現の強度を表す（ｌｏｇ１０スケールは、−３〜３の範囲である）。（図４Ｆ）図４Ｅに示される最も可変可能な遺伝子のリストならびにそれらのｄｓＤＮＡ９０刺激後の倍数誘発値。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図５】［図５Ａ〜５Ｆ］結腸癌細胞中においてＳＴＩＮＧ活性化及び細胞質ＤＮＡ経路は、ほとんど欠損していた。一連の結腸癌細胞ならびに正常細胞対照は、モックトランスフェクトされたか、または３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で３時間トランスフェクトされ、ＳＴＩＮＧ転座（図５Ａ）、ＩＲＦ３転座（図５Ｂ）、及びｐ６５転座（図５Ｃ）に関して免疫蛍光顕微鏡検査法によって分析された。（図５Ｄ）上述のものと同じ細胞が、モックトランスフェクトされたか、または指示される期間にわたり３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされ、続いてＳＴＩＮＧのリン酸エステル化、ならびにＴＢＫ１、ＩＲＦ３、及びｐ６５のリン酸エステル化に関して免疫ブロット分析が行われた。β−アクチンが、負荷対照として使用された。（図５Ｅ）上述のものと同じ細胞が、ｃＧＡＳ発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図５Ｆ）Ｅにおいて検出不可能なレベルのｃＧＡＳを有する細胞は、１μＭの５−アザシチジンで７日間治療され、続いてｃＧＡＳ発現に関してｑＰＣＲ分析が行われた。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図６】［図６Ａ〜６Ｄ］ＨＳＶ１ウイルス産生は、ＳＴＩＮＧ先天性免疫経路を欠損している結腸癌細胞内でより有効である。（図６Ａ）一連の結腸癌細胞ならびに正常細胞対照を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１または５で２４時間かけてＨＳＶ−ｌｕｃに感染させた。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性に関して分析した。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。（図６Ｂ）図６Ａと同じ細胞を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で６時間かけてＨＳＶ−ｌｕｃに感染させた。次いで、全ＲＮＡが抽出され、続いてＩＦＮＢ産生に関してｑＰＣＲ分析が行われた。（図６Ｃ）図６Ｂと同じＲＮＡが、ＣＸＣＬ１０産生に関してｑＰＣＲ分析で分析された。（図６Ｄ）図６Ａと同じ細胞を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１で６時間かけてＨＳＶ１γ３４．５欠失変異体に感染させ、続いて、ＩＦＮＢ産生に関してｑＰＣＲ分析が行われた。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表する。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図７】［図７Ａ〜７Ｂ］図１Ａに示されるイルミナアレイの遺伝子発現倍数変化。
【図８】［図８Ａ〜８Ｃ］３ｍＭのＡＯＭまたは３ｍＭのＤＭＨで治療されたＷＴ及びＳＫＯのＭＥＦ中のＤＡＰＩ染色（図８Ａ）、ならびに３ｍＭのＡＯＭまたは３ｍＭのＤＭＨで４８時間治療されたヒトの正常な結腸上皮細胞（ＦＨＣ）中の抗ｄｓＤＮＡ染色及び細胞核への細胞質の割り当て（図８Ｂ）の蛍光顕微鏡検査分析（図１に関する）。（図８Ｃ）図８Ａと同じＡＯＭ及びＤＭＨで４８時間治療されたＦＨＣの、ｐ６５またはＩＲＦ３抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡検査分析。画像は、元の倍率（１６０倍）で示した。
【図９】［図９Ａ〜９Ｂ］図９Ａは、ポリープの数を示し、図９Ｂは、図２Ａ〜２Ｅの炎症スコアを示す。
【図１０】［図１０Ａ〜１０Ｂ］ＳＴＩＮＧ及び／またはｐ５３を欠いている初代ＭＥＦ細胞は、ヒトＨ−Ｒａｓ１２Ｖまたはヒトｃ−Ｍｙｃをコードするレトロウイルスを形質導入された。ピューロマイシン及びハイグロマイシンの薬物選択後、細胞は、軟寒天中で培養された。１４日後、結腸は写真撮影され（図１０Ａ）、１ウェル中のコロニー数（ｎ＝３）が計測された（図１０Ｂ）。エラーバーは、標準偏差を示した。
【図１１】ＩＬ１８プロモーター領域は、複数の先天性免疫遺伝子転写因子に対する結合部位を含む。ＩＬ１８遺伝子プロモーター中の推定転写因子結合部位が、列記され、強調される。
【図１２】結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の要約が示される。
【図１３】［図１３Ａ〜１３Ｄ］ヒト結腸癌細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）ならびにｈＴＥＲＴ細胞が、１ｕＭの５アザシチジンで７日間治療され、続いて３μｇ／ｍｌで３時間かけてｄｓＤＮＡ９０トランスフェクションが行われた。全ＲＮＡが抽出され、ｃＧＡｓ（図１３Ａ）及びＩＦＮＢ（図１３Ｂ）発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図１３Ｃ）多くの結腸癌において、ｃＧＡＳ産生は脱調節されている。５個の正常なヒト結腸組織及び様々な段階の４３個のヒト結腸癌からのｃＤＮＡが、ｃＧＡＳ発現に関してｑＰＣＲで分析された。（図１３Ｄ）上述のものと同じ正常細胞及びヒト結腸癌細胞内のｃＧＡＳ発現の免疫ブロット（上）及びｑＰＣＲ分析（下）。
【図１４】［図１４Ａ〜１４Ｃ］図１４Ａ、様々な形質転換された、または癌由来のヒト細胞株中のＳＴＩＮＧの免疫ブロット。ＨＵＶＥＣは陽性対照であった。図１４Ｂ、図１４Ａの細胞株中のＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。ＨＵＶＥＣは陽性対照であった。図１４Ｃ、１６時間かけて３μｇ／ｍｌのポリＩ：ＣもしくはｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされた、またはモックトランスフェクトされた細胞の培地中のＩＦＮＢ産生のＥＬＩＳＡ分析。ＰＡＳＭＣ、ＮＨＤＦ−ａｄ、及びｈＴＥＲＴが、陽性対照として含まれた。
【図１５】［図１５Ａ〜１５Ｆ］ｃＧＡＳ発現は、多くのヒト結腸癌細胞株中で抑制され、ＤＮＡ脱メチル化を通して部分的に繰り返され得る。図１５Ａ、上述のものと同じ正常細胞及びヒト結腸癌細胞内のｃＧＡＳ発現の免疫ブロット（上）及びｑＰＣＲ分析（下）。図１５Ｂ、モック治療された、または１μＭの５−アザシチジン（５ＡＺＡＤＣ）を用いて５日間治療された、ｃＧＡＳ陰性結腸細胞株中でのｃＧＡＳ発現のｑＰＣＲ分析。図１５Ｃ、モック治療された、または１μＭの５−アザシチジン（５ＡＺＡＤＣ）を用いて５日間治療され、続いて指示される期間にわたり３μｇ／ｍｌでｄｓＤＮＡ９０トランスフェクションが行われた細胞（図１５Ｂから選択される）中のＳＴＩＮＧシグナル活性化の免疫ブロット分析。図１５Ｄ、上述のものと同じ５ＡＺＡＤＣを用いて治療され、続いて、３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で３時間かけてｄｓＤＮＡトランスフェクションが行われた、ＳＷ４８０及びＨＴ１１６細胞中のＩＲＦ３転座の免疫蛍光顕微鏡検査分析。元の倍率、１２６０倍。図１５Ｅ、上述のものと同じ５ＡＺＡＤＣを用いて治療され、続いて、３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で３時間かけてｄｓＤＮＡトランスフェクションが行われた細胞（図１５Ｃと同じ）のＩＦＮＢ  ｑＰＣＲ分析。図１５Ｆ、図１５Ｅと同じ細胞のＩＬ１Ｂ  ｑＰＣＲ分析。エラーバーは、標準偏差を示す。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を示す。
【図１６】［図１６Ａ〜１６Ｆ］ＳＴＩＮＧシグナルの欠損は、ＤＮＡウイルス感染に対してより感受性の結腸癌細胞をもたらす。図１６Ａ、細胞（図４Ａ〜４Ｆと同じ）を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．５で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、感染の３時間後、ヒトＩＦＮＢ誘発をｑＰＣＲで分析した。図１６Ｂ、正常なヒトｈＴＥＲＴ細胞及び選択されたヒト結腸癌細胞株（ｃＧＡＳ陽性：ＳＷ１１１６、ＨＴ２９、ｃＧＡＳ陰性：ＳＷ４８０、ＨＴ１１６）を、指示されるＭ．Ｏ．Ｉ．で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、ＨＳＶ１γ３４．５の滴定を２４時間後にベロ細胞中において標準プラークアッセイで分析した。図１６Ｃ、細胞（図１６Ｂと同じ）を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、２４時間後及び４８時間後、細胞生存率をトリパンブルー染色で分析した。図１６Ｄ、細胞（図１６Ａと同じ）を、指示されるＭ．Ｏ．Ｉ．で１時間かけてＨＳＶ１−Ｌｕｃに感染させ、２４時間後にルシフェラーゼ活性を分析した。図１６Ｅ、結腸癌細胞を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１００でワクシニアウイルスに感染させ、感染の３時間後、ＩＦＮＢ発現に関してｑＰＣＲで分析した。図１６Ｆ、図１６Ｅと同じ細胞が、ＣＸＣＬ１０発現に関してｑＰＣＲで分析された。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１７】［図１７Ａ〜１７Ｈ］ヒト結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳのＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析及び結腸癌組織マイクロアレイ。図１７Ａ、正常細胞株及びヒト結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現のＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＦＩＳＨ）分析。画像は、１２６０倍で示される。図１７Ｂ、モック治療された、または１μＭの５ＡＺＡＤＣで５日間治療されたＳＷ４８０及びＨＴ１１６中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現のＲＮＡ  ＦＩＳＨ分析。画像は、１２６０倍で示される。図１７Ｃ、図１７ＡのＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ＲＮＡコピー数の定量化。図１７Ｄ、図１７ＢのｃＧＡＳ  ＲＮＡコピー数の定量化。図１７Ｅ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された正常細胞株及びヒト結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現が、色原体ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＣＩＳＨ）で分析された。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ＲＮＡコピー数の定量化が、バーグラフで示される。エラーバーは、標準偏差を示す。図１７Ｆ、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ＲＮＡ  ＣＩＳＨ分析の代表的画像が、６００倍で示される。図１７Ｇ、ＦＦＰＥヒト結腸癌組織マイクロアレイにおけるＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現のＲＮＡ  ＣＩＳＨ分析。合計１２個の正常組織及び８０個の癌組織が分析され、ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳを有する検出された組織の数が表に要約されている。図１７Ｈ、図１７ＧのＲＮＡ  ＣＩＳＨの代表画像が、４００倍で示される。
【図１８】［図１８Ａ〜１８Ｅ］インビボでＳＴＩＮＧシグナルが正常に機能しない結腸癌細胞中において、上昇したＨＳＶ１γ３４．５腫瘍溶解効果が観察された。図１８Ａ、ヌードマウスへの異種移植腫瘍上でのＨＳＶ１γ３４．５治療のスキーム。指示された異種移植腫瘍（ＳＷ１１６、図１８Ｂ；ＨＴ２９、図１８Ｃ；ＳＷ４８０、図１８Ｄ；ＨＴ１１６、図１８Ｅ）が、ヌードＢａｌｂ／ｃマウスの右脇腹内に発生した。腫瘍が直径約０．５ｃｍに達すると、腫瘍は、一日おきに合計３回（矢印）、５０μｌのＰＢＳ中１Ｅ７  ＰＦＵ  ＨＳＶ１γ３４．５（Ｎ＝７）または５０μｌのＰＢＳのみ（Ｎ＝３）を注射され、腫瘍成長が一日おきに測定された。対になっていないスチューデントのｔ検定を使用して、最後の時点の２つの治療群を比較する統計分析が行われた。Ｐ値は、示される通りである。
【図１９】蛍光顕微鏡検査法において、リポフェクタミン２０００トランスフェクションの３時間後、ＦＩＴＣ−ｄｓＤＮＡ９０を用いて監視される、結腸癌細胞株中へのｄｓＤＮＡ９０トランスフェクション効率を示す。画像は、４００倍で示す。
【図２０】［図２０Ａ〜２０Ｄ］正常細胞及び結腸癌細胞細胞は、非特異性ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＴ）またはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＳＴＩＮＧ）を用いて３日間治療され、続いて、３μｇ／ｍｌで３時間かけてｄｓＤＮＡ９０トランスフェクションが行われた。次いで、細胞は、ＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡ効率に関して免疫ブロット（図２０Ａ）によって、ＩＦＮＢ発現（図２０Ｂ）及びＣＸＣＬ１０発現（図２０Ｃ）に関してｑＰＣＲによって分析された。図２０Ｄ、細胞を上述と同様にｓｉＲＮＡを用いて治療し、続いて、ＭＯＩ５で３時間かけてＨＳＶγ３４．５に感染させた。次いで、細胞は、ＩＦＮＢ発現に関してｑＰＣＲで分析された。
【図２１】［図２１Ａ〜２１Ｃ］図２１Ａ、ｃＧＡＳの近位プロモーター領域内に位置するＣｐＧアイランドの概略図。図２１Ｂ、ｃＧＡＳプロモーター領域のバイサルファイト配列分析。各ボックスは、下部の位置マーカーによって示されるプロモーター領域内に位置する１つのＣｐＧジヌクレオチドを表す。グレースケールは、メチル化、非メチル化、及び配列決定されていないものを対比する。図２１Ｃ、結腸癌細胞は、１μＭの５ＡＺＡＤＣ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＳＡＨＡ（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、及びＢＩＸ０１２９４（ヒストン−リジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）を用いて５日間治療された。次いで、ｃＧＡＳ発現がｑＰＣＲで検査された。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図２２】正常細胞及び結腸癌細胞は、１５ｍＭのＡＯＭまたはＤＭＨを用いて２０時間治療された。ＩＦＮＢ誘発が、ｑＰＣＲで分析された。ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、及びＮＦ−ｋＢ転座が検査された：＋、転座；−、転座なし。
【図２３】［図２３Ａ〜２３Ｃ］図２３Ａ、様々な形質転換された、または癌由来のヒト細胞株中のＳＴＩＮＧの免疫ブロット。ＨＵＶＥＣが、陽性対照として使用された。図２３Ｂ、細胞株中のＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。図２３Ｃ、１６時間かけて３μｇ／ｍｌのポリＩ：ＣもしくはｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされた、またはモックトランスフェクトされた細胞の培地中のＩＦＮＢ産生のＥＬＩＳＡ分析。ＰＡＳＭＣ、ＮＨＤＦ−ａｄ、及びｈＴＥＲＴが、陽性対照として使用された。
【図２４】結腸癌細胞株中のＳＴＩＮＧのシークエンシングを示す。
【図２５】結腸癌細胞株中のｃＧＡＳのシークエンシングを示す。
【図２６】［図２６Ａ〜２６Ｄ］ＳＴＩＮＧ発現は、抑制され、ｄｓＤＮＡに誘発される先天性免疫活性化は、ヒト黒色腫細胞株の大半において正常に機能しない。図２６Ａ、ｈＴＥＲＴ線維芽細胞、正常なヒト上皮性メラニン形成細胞（ＨＥＭａ）、及び一連のヒト黒色腫細胞株が、ＳＴＩＮＧ発現に関して免疫ブロット（上）によって、及びｃＧＡＳ発現に関してｑＰＣＲ（下）によって分析された。図２６Ｂ、１６時間かけて３μｇ／ｍｌのポリＩＣもしくはｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされた、またはモックトランスフェクトされた細胞（Ａと同じ）の培地中のヒトインターフェロンβ産生のＥＬＩＳＡ分析。３時間かけて３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされた、またはモックトランスフェクトされた細胞（図２６Ａと同じ）中のヒトＣＸＣＬ１０（図２６Ｃ）及びＩＦＮＢ（図２６Ｄ）誘発のｑＰＣＲ分析。
【図２７】［図２７Ａ〜２７Ｄ］ｄｓＤＮＡに誘発されるＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、ヒト黒色腫細胞株の大半において欠損している。３時間かけて３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトされた、またはモックトランスフェクトされた正常細胞株及びヒト黒色腫細胞株中のＳＴＩＮＧ転座（図２７Ａ）、ＩＲＦ３転座（図２７Ｂ）、及びｐ６５転座（図２７Ｃ）の免疫蛍光顕微鏡検査分析。元の倍率、１２６０倍。バーサイズ、１μｍ。図２７Ｄ、３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で指示される期間にわたりトランスフェクトされた細胞（上述のものと同じ）中のＳＴＩＮＧシグナル活性化の免疫ブロット分析。
【図２８】［図２８Ａ〜２８Ｃ］ヒト黒色腫細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳのＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び免疫組織化学分析。図２８Ａ、正常細胞株及びヒト黒色腫細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現のＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＦＩＳＨ）分析。代表画像が、１２６０倍で示される。バーサイズ、５００ｎｍ。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ＲＮＡコピー数の定量化が、バーグラフで示される。図２８Ｂ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された正常細胞株及びヒト黒色腫細胞株中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現の色原体ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＣＩＳＨ）分析。代表画像が、６００倍で示される。バーサイズ、１μｍ。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ＲＮＡコピー数の定量化が、バーグラフで示される。図２８Ｃ、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現の免疫組織化学分析。画像は、４００倍で示された。バーサイズ、２０μｍ。
【図２９】ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現は、ヒト黒色腫内において高い割合で抑制される。正常なヒト上皮組織及びヒト黒色腫組織を含有するヒト黒色腫組織マイクロアレイにおけるＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの免疫組織化学分析。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳに関して染色された正常なヒト上皮性組織及びヒト黒色腫組織の代表画像。画像は、４００倍で示される。バーサイズ、５０μｍ。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現ステータスが、下部のパネル内に要約され、示される。
【図３０】［図３０Ａ〜３０Ｇ］ヒト黒色腫細胞株中の、ＤＮＡ脱メチル化で部分的に繰り返されるＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現。図３０Ａ、モック治療された、または１μＭの５−アザシチジン（５ＡＺＡＤＣ）を用いて５日間治療された、指示されたヒト黒色腫細胞内のｃＧＡＳ発現のｑＰＣＲ分析。図３０Ｂ、上述と同様に治療された、指示されたヒト黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧの免疫ブロット分析。図３０Ｃ、上述と同様に５ＡＺＡＤＣを用いて治療された細胞（上述のものと同じ）中のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳのＲＮＡ  ＦＩＳＨ分析。代表画像が、１２６０倍で示される。バーサイズ、４００ｎｍ。５ＡＺＡＤＣを用いて治療され、続いて、３μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ９０で３時間かけてｄｓＤＮＡトランスフェクションが行われた細胞（上述のものと同じ）中のＩＦＮＢ（図３０Ｄ）及びＣＸＣＬ１０（図３０Ｅ）のｑＰＣＲ分析。図３０Ｄと同様に治療された指示される細胞内のＩＲＦ３転座（図３０Ｆ）及びＳＴＩＮＧ転座（図３０Ｇ）の免疫蛍光顕微鏡検査分析。代表画像が、１２６０倍で示される。バーサイズ、５００ｎｍ。
【図３１】［図３１Ａ〜３１Ｄ］ＳＴＩＮＧシグナルの欠損は、ＨＳＶ１感染に対してより感受性の黒色腫細胞をもたらす。細胞（図１と同じ）を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．５で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、感染の３時間後、ヒトＩＦＮＢ（図３１Ａ）及びＣＸＣＬ１０（図３１Ｂ）誘発をｑＰＣＲで分析した。図３１Ｃ、正常なヒトｈＴＥＲＴ細胞及び選択されたヒト黒色腫細胞株を、指示されるＭ．Ｏ．Ｉ．またはＭ．Ｏ．Ｉ．１０で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、ＨＳＶ１γ３４．５の滴定を２４時間後にベロ細胞内で、標準プラークアッセイで分析した。図３１Ｄ、細胞（図３１Ｃと同じ）を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させ、２４時間後及び４８時間後、細胞生存率をトリパンブルー染色で分析した。
【図３２】［図３２Ａ〜３２Ｄ］インビボでＳＴＩＮＧシグナルが正常に機能しない黒色腫異種移植中において、上昇したＨＳＶ１γ３４．５腫瘍溶解効果が観察された。図３２Ａ、Ａ３７５；図３２Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５；図３２Ｃ、ＲＰＭＩ７９５１；及び図３２Ｄ、ＳＫ−ＭＥＬ−３の黒色腫異種移植が、ヌードＢａｌｂ／ｃマウスの右脇腹内に発生した。腫瘍が直径約０．５ｃｍに達すると、腫瘍は、一日おきに合計３回（矢印）、５０μｌのＰＢＳ中１Ｅ７  ＰＦＵ  ＨＳＶ１γ３４．５または５０μｌのＰＢＳのみを注射され、腫瘍成長が一日おきに測定された。対になっていないスチューデントのｔ検定を使用して、最後の時点の２つの治療群を比較する統計分析が行われた。Ｐ値は、示される通りである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、ＳＴＩＮＧ活性に関して癌の細胞を評定することを含む、癌治療の療法を選択するための方法、及び指示される療法を用いて癌を治療するための方法を提供する。以下に記載される実施形態は、これらの方法の代表例を例示する。それでもなお、これらの実施形態の説明から、本発明の他の態様が、以下に提供される説明に基づいて行われ得るか、及び／または実践され得る。
【００３０】
一般的方法
従来の免疫学的技法及び分子生物学的技法を含む方法が本明細書に記載される。免疫学的方法は、当該術分野で一般的に既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等の方法論の論文に記載されている。分子生物学の技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等の論文において詳細に記載されている。医学的治療の一般的方法は、ＭｃＰｈｅｅ  ａｎｄ  Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ２０１０，４９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，２０１０、及びＦａｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００８に記載されている。
【００３１】
結腸癌細胞中のＳＴＩＮＧの機能の分析が行われ、ＳＴＩＮＧはしばしば発現されたが、ＳＴＩＮＧ機能は、分析された細胞（ｎ＝１２）中で約８６％取り除かれたことが発見された。しかしながら、ｃＧＡＳは、分析された細胞の３０〜５０％で検出不可能であった。ｃＧＡＳを欠いている結腸癌細胞内では、ＳＴＩＮＧ機能は、完全に取り除かれた。検出可能なｃＧＡＳを有する癌結腸細胞内では、ＳＴＩＮＧ機能は、劇的に減少した。ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳが、黒色腫を含む多様な他の癌において消失していたことも認めた。
【００３２】
先天性免疫系は、病原体感染に対する防御の第一線を提供するが、腫瘍形成を制御できる経路に影響を与えることもできる。例えば、先天性免疫応答におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）シグナル伝達経路を促進する細胞アダプターＭｙＤ８８（骨髄分化一次応答遺伝子８８）は、ＮＦ−κＢ活性化、サイトカイン分泌、及び炎症性応答の制御を通して腫瘍形成を制御することができることが知られている。ＭｙＤ８８を欠いているマウスは、薬物、アゾキシメタン（ＡＯＭ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発される大腸炎関連発癌（ＣＡＣ）に対して感受性である。この状況では、ＭｙＤ８８は、ＩＬ−２２結合タンパク質（ＩＬ−２２−ＢＰ）の樹状細胞産生を下方制御する、上皮細胞内のＩＬ−１８の産生を促進することによって部分的に保護効果を付与する。ＩＬ−２２−ＢＰは、細胞／組織損傷に応答して先天性リンパ細胞から産生され、腸上皮細胞の増殖を強く刺激するＩＬ−２２の機能を抑制する。
【００３３】
アゾキシメタン（ＡＯＭ）は、１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）の代謝産物であり、メチルアゾキシメタノール（ＭＡＭ）に変換され、これはＤＮＡ損傷応答を誘起するＯ−メチル−グアニン形成を媒介する。マウスへのＡＯＭの単回注射、及び続いて飲料水を介した催炎剤デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の投与は、ほぼ１００％結腸癌を誘発する。細胞タンパク質ＳＴＩＮＧ（細胞遺伝子の刺激物質）は、Ｔｏｌｌ−受容体９またはＤＮＡセンサＡＩＭ  ＩＩと独立して、細胞質ＤＮＡ誘起性先天性免疫シグナル伝達経路を促進することが以前に実証されている。ヒトにおいて、ＳＴＩＮＧは、上皮細胞ならびに造血系譜の細胞内で優勢に発現される３４８アミノ酸小胞体（ＥＲ）関連分子であり、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）等のウイルス、及びさらには細菌による感染に応答する先天性免疫シグナル伝達経路の誘起において重要な役割を果たすことが示されている。ＳＴＩＮＧは、血管及び肺の症候群、恐らく重篤な全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の形態であり得るアイカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）等の自己ＤＮＡ誘発性炎症性疾患の誘起に関与することも示されている。ＳＴＩＮＧは、ｄｓＤＮＡ種に直接関連付けられ得、ある特定の細菌によって、またはｃＧＡＳ（環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ、Ｃ６ｏｒｆ１５０、Ｍａｂ−２１ドメイン含有タンパク質）と称されるシンターゼの活性化を誘起する細胞質ゾルｄｓＤＮＡによって発生した環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）により高度に活性化される。
【００３４】
ＳＴＩＮＧが、多様な炎症によって引き起こされる事象の制御において極めて重要な役割を果たすように見えることを考慮して、本明細書に記載される方法は、炎症によって悪化した癌におけるＳＴＩＮＧの役割に対処する。ＡＯＭ／ＤＳＳモデルを使用するＭｙＤ８８と同様の観察では、ＳＴＩＮＧ欠損マウス（ＳＫＯ）はＣＡＣに罹患し易く、腫瘍形成におけるＳＴＩＮＧの保護の役割を示唆する。その後の分析は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達及びサイトカイン産生が、分析された多数の結腸癌細胞内で取り除かれたことを示した。データは、ＳＴＩＮＧが、損傷した腸上皮細胞の排除を容易にする重要なセンサであり得ることを示す。ＳＴＩＮＧシグナル伝達の損失は、結腸関連癌における共通事象であり得、かかる細胞が免疫系の監視を逃れることを可能にし得る事象である。
【００３５】
定義
「約」または「およそ」という用語は、当業者による決定時、特定の値に対する許容可能な誤差範囲を意味し、これは部分的に、どのように値が測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に左右されるだろう。例えば、「約」は、当該技術分野の実践毎に１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、及びより好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、本用語は、値の好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内の規模を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲内に記載される場合、別途定められない限り、その特定の値に関して許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が、想定されるべきである。
【００３６】
「免疫応答を誘発または強化する」という用語は、治療法が施されていない対照試料に対して、統計的に測定可能な免疫応答の誘発または増加が生じることを意味する。好ましくは、免疫応答の誘発または強化は、対象において予防的または治療的応答をもたらす。免疫応答の例は、増加したＩ型ＩＦＮの産生、交互の病原体によるウイルス型及び他の型の感染に対する増加した抵抗である。腫瘍に対する免疫応答（抗腫瘍応答）の強化またはワクチンの開発は、腫瘍を阻むか、または既存の腫瘍を排除する。
【００３７】
「ＳＴＩＮＧ」という用語は、制限することなく、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、センス及びアンチセンスポリヌクレオチド鎖、相補的配列、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、相同及び／またはオルソロガスＳＴＩＮＧ分子、アイソフォーム、前駆体、変異体、バリアント、誘導体、スプライスバリアント、対立遺伝子、異なる種、ならびにこれらの活性断片を含むことを意味する。ＳＴＩＮＧポリヌクレオチド及びポリペプチドは、米国特許公開第２０１３／００３９９３３号及び同第２０１１／０２６２４８５号に記載されている。
【００３８】
「機能性ＳＴＩＮＧ遺伝子を欠く」という用語は、遺伝子導入動物が、ＳＴＩＮＧをコードする遺伝子を欠く、またはＳＴＩＮＧの発現に必要とされる他の遺伝子成分（例えばプロモーター）を欠くことを意味する。
【００３９】
別途指示がない限り、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用されるが、典型的には、それらは異なる大きさのペプチド配列を指す。
【００４０】
「バリアント」という用語は、ポリヌクレオチド配列に照らして使用される場合、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義は、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、「多型」バリアントも含み得る。スプライスバリアントは、参照分子に対する有意な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセシング中のエクソンの選択的スプライシングにより、一般的により多いまたはより少ない数のポリヌクレオチドを有するだろう。対応するポリペプチドは、追加の機能ドメインまたはドメインの不在を処理し得る。種バリアントは、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。野生型遺伝子産物バリアントは、本発明において特に実用的である。バリアントは、核酸配列中の少なくとも１つの変異から生じ得、変化したｍＲＮＡｓ、またはその構造もしくは機能が変化され得るか、または変化され得ないポリペプチドを生じ得る。任意の所与の天然または組換え遺伝子は、対立形質を有し得ない、１つの対立形質を有し得る、または多くの対立形質を有し得る。バリアントを生じさせる共通の変異変化は、一般的に、ヌクレオチドの自然欠失、追加、または置換に帰する。これらのタイプの変化の各々は、所与の配列において１回以上、単独で、または他と組み合わせて生じ得る。
【００４１】
結果として生じるポリペプチドは、概して、互いに対して有意なアミノ酸同一性を有するだろう。多型バリアントは、所与の種の個体間における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変形である。多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が一塩基だけ異なる「一塩基多型」（ＳＮＰ）または一塩基変異も包含し得る。ＳＮＰの存在は、例えば、これは抵抗に対して感受性である、疾患状態の傾向を有するある特定の集団を示し得る。
【００４２】
誘導体ポリヌクレオチドは、化学修飾、例えば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換に供される核酸を含む。誘導体、例えば、誘導体オリゴヌクレオチドは、変化した糖部分または糖間結合等の天然に生じない部分を含み得る。これらの例は、ホスホロチオエート及び当該技術分野で既知の種を含有する他の硫黄である。誘導体核酸は、標識も含有し得、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体剤、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。
【００４３】
「誘導体」ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸エステル化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学カップリング、または軽度のホルマリン処理によって修飾されたものである。誘導体はまた、放射性同位体、蛍光、及び酵素標識が挙げられるが、これらに限定されない、直接または間接的に検出可能な標識を含有するように修飾され得る。
【００４４】
「免疫調節性」という用語は、免疫原性（すなわち、免疫応答を刺激するか、もしくは増加させる）であるか、または免疫抑制（すなわち、免疫応答を低減させるか、もしくは抑制する）である、化合物、組成物、または物質を意味する。
【００４５】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞の活性化が可能な細胞であり、モノサイト／マクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、リンパ組織または非リンパ組織中で発見される形態学的に同様の細胞型の任意の数の多様な集団を指す。これらの細胞は、それらのはっきりと異なる形態の高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現を特徴とする。ＤＣは、いくつかの組織源から単離され得る。ＤＣは、ＭＨＣ制限Ｔ細胞を感受性にする高い能力を有し、ｉｎ  ｓｉｔｕでＴ細胞に抗原を提示するのに非常に有効である。抗原は、Ｔ細胞発生中に発現され、耐性がある自己抗原であってもよく、正常な免疫プロセス中に存在する外来抗原であってもよい。
【００４６】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部に対する核酸コード配列を含有するベクターを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子が、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の産生において翻訳されていない。発現ベクターは、特定の宿主生物中の操作的に連結されたコード配列の転写及び場合によっては翻訳に必要である核酸配列を指す、多様な制御配列を含有し得る。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、同様に他の機能を果たす核酸配列を含有し得る。
【００４７】
特定の核酸に関する「コード化」または「コードされる」、「コードする」とは、翻訳のための情報を特定のタンパク質中に含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでもよく、またはそのような介在する非翻訳配列を欠いてもよい（例えば、ｃＤＮＡ中にあるように）。それによりタンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により指定される。典型的には、アミノ酸配列は、「ユニバーサル」遺伝コードを使用して核酸によってコードされる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、核酸に関して「異種性」とは、外来種に由来する核酸、または同種の場合、故意のヒトの介在によって組成物及び／もしくはゲノム遺伝子座中で、その天然型から実質的に修飾される核酸である。例えば、異種構造遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターは、その構造遺伝子を得たものとは異なる種に由来するものであるか、または同種に由来する場合、一方または両方がそれらの原型から実質的に修飾されている。異種タンパク質は、外来種に由来し得るか、または同種に由来する場合、故意のヒトの介在によってその原型から実質的に修飾される。
【００４９】
「試料」は、その最も広い意味で本明細書において使用される。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体等を含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性画分または細胞が育てられた培地；染色体、細胞小器官、または細胞から単離もしくは抽出された膜；ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、または溶液中もしくは基質に結合するｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド；細胞；組織；組織印刷；指紋、皮膚、または毛髪等を含み得る。
【００５０】
「患者」、「対象」、または「個体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、治療される哺乳動物対象を指し、ヒト患者が好ましい。場合によっては、本開示の方法は、実験動物において、獣医学用途において、及び疾患用の動物モデルの開発において使用され、マウス、ラット、及びハムスターを含む齧歯動物、霊長動物、ネコ、及びイヌを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
「診断の」または「診断された」とは、病態の存在または性質を特定することを意味する。診断方法は、それらの感受性及び特異性において異なる。診断アッセイの「感受性」とは、陽性の試験結果を有する疾患のある個体の割合（「真陽性」のパーセント）である。そのアッセイによって検出されない疾患のある個体は、「偽陰性」である。疾患のない、アッセイにおいて陰性の試験結果を有する対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」とは、１から偽陽性率を引いたものであり、「偽陽性」率は、陽性の試験結果を有する、疾患を有しない個体の比率と定義される。特定の診断方法は、病状の決定的な診断を提供しないことがあるが、その方法が診断を補助する陽性指示を提供する場合、それは十分役割を果たす。
【００５２】
「治療する」、「治療される」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、本明細書の方法に関して使用される場合、事象、疾患、または病状の臨床症状、兆候、または発症を一時的または永続的に、部分的または完全に、排除する、低減させる、抑制する、または回復させることを指す。かかる治療は、有用であることが確実である必要はない。治療を必要とするものは、既に障害を有するもの、ならびに障害が阻まれるものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は、腫瘍細胞の病理を直接減少させ得るか、または腫瘍細胞を他の治療薬、例えば、放射線及び／または化学療法による治療に対してより感受性にし得る。本明細書で使用される場合、「回復させる」または「治療」とは、正常化値（例えば、健常な患者または個体中で得られる値）に近付く症状を指し、例えば、週間的な統計検定を使用する判定時、正常化値と５０％未満異なる、好ましくは、正常化値から約２５％未満異なる、より好ましくは、正常化値から１０％未満異なる、及びさらにより好ましくは、正常化値と有意差がない。例えば、腫瘍細胞に関して「治療する」または「治療すること」という用語は、該細胞の発達を停止させること、成長を遅延させること、退行を誘発すること、または該細胞の存在に関連付けられる症状の回復を指す。感染性病原生物に冒されている個体の治療は、個体からの病原生物の減少及び排除を指す。例えば、プラーク形成単位またはＥＬＩＳＡ等の他の自動診断方法によって測定される、ウイルス粒子の減少。
【００５３】
「癌の治療」とは、次の効果：（１）（ｉ）遅延及び（ｉｉ）完全な成長停止を含む、ある程度までの腫瘍成長の阻害、（２）腫瘍細胞の数の低減、（３）腫瘍サイズの維持、（４）腫瘍サイズの低減、（５）末梢器官中への腫瘍細胞の浸潤の（ｉ）低減、（ｉｉ）遅延、もしくは（ｉｉｉ）完全な予防を含む、阻害、（６）転移の（ｉ）低減、（ｉｉ）遅延、もしくは（ｉｉｉ）完全な予防を含む、阻害、（７）（ｉ）腫瘍サイズの維持、（ｉｉ）腫瘍サイズの低減、（ｉｉｉ）腫瘍の成長の遅延、（ｉｖ）侵入の低減、遅延、もしくは予防をもたらし得る、抗腫瘍免疫応答の強化、ならびに／または（８）障害に関連付けられる１つ以上の症状の重篤度もしくは数のある程度までの軽減のうちの１つ以上を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「安全及び有効な量」という用語は、本発明の様式で使用される場合に、妥当な利益／危険性比率に見合う、過度の副作用（毒性、刺激、またはアレルギー応答等）を伴わずに所望の治療応答を得るのに十分である成分の数量を指す。「治療有効量」とは、所望の治療応答を得るのに有効な本発明の化合物の量を意味する。例えば、癌の成長もしくは癌の発生を遅らせる、または癌を縮退する、または転移を予防するのに有効な量。特定の安全及び有効な量または治療有効量は、治療される特定の病状、患者の身体状態、治療される哺乳動物または動物の種類、治療の期間、同時療法の性質（存在する場合）、ならびに用いられる特定の製剤及び化合物またはその誘導体の構造といった要因によって異なるだろう。
【００５５】
「免疫系の細胞」または「免疫細胞」は、Ｂ細胞とも称されるＢリンパ球、Ｔ細胞とも称されるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、モノサイト、マクロファージ、好中球、顆粒球、マスト細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤性（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含む遺伝子修飾免疫細胞、薬物修飾免疫細胞、及び上述の細胞型の誘導体、前駆体、または前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない、アッセイされ得る免疫系の任意の細胞を含むことを意味する。
【００５６】
「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合可能な細胞を指し、これは抗原に対して選択性の免疫応答を媒介する。これらの細胞には、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）、モノサイト、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えば、腫瘍、炎症、または他の浸潤物からのＣＴＬ株、ＣＴＬクローン、及びＣＴＬが挙げられるが、これらに限定されない、
【００５７】
「免疫関連分子」とは、静止している（「刺激されていない」）状態または活性化状態であるかどうかが任意の免疫細胞中で特定される任意の分子を指し、任意の受容体、リガンド、細胞表面分子、核酸分子、ポリペプチド、バリアント、及びそれらの断片を含む。
【００５８】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、胸腺に由来し、ＣＤ３複合物のタンパク質に関連付けられるヘテロ二量体受容体（例えば、再配列されたＴ細胞受容体、つまり細胞の抗原／ＭＨＣ特異性に関与するＴ細胞表面上のヘテロ二量体タンパク質）を有する、リンパ球の一部である。Ｔ細胞応答は、他の細胞に対するそれらの効果に対して（例えば、標的細胞死滅、Ｂ細胞等の他の免疫細胞の活性化）、またはそれらが産生するサイトカインに対して、アッセイによって検出され得る。
【００５９】
「Ｔ細胞応答」という語句は、Ｔ細胞に関与する免疫学的応答を意味する。「活性化された」Ｔ細胞は、抗原特異的メモリＴ細胞または抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を産生するように分かれる。細胞傷害性Ｔ細胞は、抗原を含有すると認識された細胞に結合し、それを破壊する。メモリＴ細胞は、抗原によって活性化され、このため、既に遭遇した抗原への応答を提供する。抗原に対するこの全体応答は、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、腫瘍特異的である。
【００６０】
「二次免疫応答」または「適応性免疫応答」は、能動的または受動的であってもよく、体液性（抗体由来）または細胞性であってもよく、動物の寿命の間に確立され、誘発抗原に対して特異的であり、該抗原を伴う繰り返される遭遇において強化された免疫応答を特徴とする。適応性免疫系のＴリンパ球の重要な特徴は、細胞表面上のＭＨＣ分子によって提示される、微量濃度の病原体由来のペプチドを検出するそれらの能力である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、ヒト及び哺乳動物を含む対象動物への投与に適した組成物を指す。薬学的組成物は、薬理学的有効量の本発明のウイルスまたは抗原組成物を含み、薬学的に許容される担体も含む。薬学的組成物は、活性成分（複数可）、及び薬学的に許容される担体を構成する不活性成分（複数可）、ならびに成分のうちの任意の２つ以上の組み合わせ、錯体形成、または凝集から直接もしくは間接的に生じる任意の産物を含む組成物を包含する。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物または複合体を薬学的に許容される担体に混ぜることによって作製される任意の組成物を包含する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロースもしくはマンニトールの５％水溶液、及び油／水もしくは水／油エマルション等のエマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤及び／またはアジュバント等の任意の及び全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬及び抗真菌薬、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに賦形剤を含む。好適な薬学的担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。組成物に有用な薬学的担体は、活性剤の意図される投与方法に左右される。典型的な投与方法には、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、もしくは経粘膜投与）が挙げられるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される塩」は、薬学的用途のために化合物または複合体に製剤化され得る塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）及びアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、生物学的ではないか、さもなければ望ましくなくはない材料を指し、すなわち、材料は、任意の望ましくない生物学的効果を生じることなく、または組成物中にそれが含有されるか、もしくは以下に記載される当該技術分野で周知の経路を使用して組成物が投与される場合、組成物の成分のうちのいずれかと有害な様式で相互左右することなく、個体に投与され得る。
【００６４】
「検出可能部分」または「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、及び抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分は、しばしば、放射性、色原体、または蛍光シグナル等の測定可能なシグナルを生成し、それを使用して試料中の検出可能部分に結合される量を定量化することができる。
【００６５】
標識
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、または他の分子は、その検出を促進するために標識される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明での使用に好適な標識には、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射性標識をハプテンもしくはペプチド中に組み込むことによって検出可能され得るか、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用され得るタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明での使用に好適な標識の例には、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローダミン等）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるその他のもの）、及びコロイド金、着色ガラス、もしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）等の比色分析標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
標識は、当該技術分野で周知の方法に従って所望の成分に直接または間接的に結合され得る。好ましくは、１つの実施形態における標識は、本発明に従って活性剤の複合体化のためのイソシアネート試薬を使用して、分子に共有結合される。本発明の一態様では、本発明の二機能性イソシアネート試薬を使用して、標識を標的分子に複合体化させ、そこに結合される活性剤を伴わずに、標識標的分子複合体を形成することができる。標識標的分子複合体は、本発明に従って標識される複合体の合成のための中間物として使用され得るか、または標的分子複合体を検出するために使用され得る。上述のように、多種多様の標識を使用することができ、必要とされる感受性、所望の成分との複合体化の容易さ、安定性要件、利用可能な器具類、及び廃棄規定に応じて標識が選択される。非放射性標識はしばしば、間接的手段によって結合される。概して、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、標的分子に共有結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物等のシグナルシステムに共有結合されている、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。
【００６８】
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、または本方法での使用が本明細書で企図される他の分子も、例えば、酵素またはフルオロフォアとの複合体化によって、シグナル生成化合物と直接複合体化され得る。標識としての使用に好適な酵素には、加水分解酵素、具体的にはホスファターゼ、エステラーゼ、及びグリコシダーゼ、または酸化酵素、具体的にはペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわち、フルオロフォアには、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられるが、これらに限定されない。好適なフルオロフォアのさらなる例には、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂ塩化スルホニルエリスロセイン（ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な化学発光化合物には、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用され得る様々な標識システムまたはシグナル生成システムの概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【００６９】
標識を検出するための手段は、当業者に周知である。このため、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段には、オートラジオグラフィーにおけるシンチレーションカウンターまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、適切な光の波長を有する蛍光色素を励起し、結果として得られる蛍光を検出することによって、検出され得る。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管等の電子検出器の使用により視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、結果として得られる反応産物を検出することによって、検出され得る。比色分析標識または化学発光標識は、標識に関連付けられる色を観察することによって単純に検出され得る。本発明の方法における使用に好適な他の標識システム及び検出システムは、当業者に容易に明らかであるだろう。かかる標識された調整物質及びリガンドは、疾患または健康状態の診断において使用され得る。
【００７０】
薬学的組成物の製剤
本開示の組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、活性剤を、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物中に製剤化することが好ましい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、以下に記載される当該技術分野で周知の経路を使用して投与される場合、アレルギー反応または他の副作用を産生しない分子実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬及び抗真菌薬、等張及び吸収遅延剤等を含む。
【００７１】
加えて、化合物は、水または共通有機溶媒との溶媒和物を形成し得る。かかる溶媒和物も同様に企図される。
【００７２】
組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所治療が望まれる場合、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与される。非経口注入には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下投与を含む。好ましくは、投薬は、投与が短期間であるか、または長期間であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射により行われる。局所、具体的には、経皮、経粘膜、直腸、経口、または例えば、所望の部位の近くに設置されるカテーテルを通した局所投与を含む、他の投与方法が企図される。
【００７３】
本明細書に記載される活性剤を含有する本開示の薬学的組成物は、投与の経路に応じて薬学的に許容される担体または添加剤を含有し得る。かかる担体または添加剤の例には、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリルナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤等が挙げられる。使用される添加剤は、本開示の剤形に応じて、必要に応じて上述のものまたはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【００７４】
薬学的組成物の製剤は、選択される投与の経路に従って異なるだろう（例えば、溶液、エマルション）。投与される組成物を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製され得る。溶液またはエマルションに関して、好適な担体には、例えば、水性またはアルコール溶液／水溶液、エマルション、または生理食塩水及び緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル油、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、様々な添加剤、防腐剤、または流体、栄養物、または電解質補充薬が挙げられる。
【００７５】
多様な水性担体、例えば、無菌のリン酸緩衝生理食塩水、静菌水、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等は、軽度の化学修飾等に供されるアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の、安定性が強化された他のタンパク質を含み得る。
【００７６】
治療用製剤は、所望の純度を有する活性剤を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００７７】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の効能のために、必要に応じて２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。かかる分子は、好適に、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在し得る。
【００７８】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、もしくはマイクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルへ封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００７９】
インビボ投与用に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【００８０】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混ぜることによって活性化合物を含有し得る。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、及びアカシアガムであり、分散剤または湿潤剤は、自然発生ホスファチド、例えば、レシチン、もしくは脂肪酸によるアルキレンオキシドの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、もしくは長鎖脂肪族アルコールによるエチレンオキシドの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシカタノール、もしくは脂肪酸に由来する部分エステル及びポリオキシエチレンソルビトールモノオレート等のヘキシトールとのエチレンオキシドの縮合物、または脂肪酸に由来する部分エステル及び無水ヘキシトール、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレートによるエチレンオキシドの縮合物であり得る。水性懸濁液は、１つ以上の防腐剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートも含有し得る。
【００８１】
本明細書に記載される活性剤は、保管用に凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得る。この技法は、従来の免疫グロブリンに有効であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥技法及び再構成技法は、用いられ得る。凍結乾燥及び再構成は、異なる度合いの抗体活性損失をもたらし得ること、及び使用レベルは、平衡するように調整されなければならない可能性があることが当業者に理解されるだろう。
【００８２】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び１つ以上の防腐剤と混ぜることによって活性化合物を提供する。好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤は、既に上で言及されたもので例示されている。
【００８３】
これらの製剤中の活性剤の濃度は、例えば、約０．５重量％未満、通常約１重量％または少なくとも約１重量％から１５もしくは２０重量％まで大きく異なり得、選択される特定の投与方法に従って、主に液量、粘度等に基づいて選択されるだろう。このため、非経口注射用の典型的な薬学的組成物は、１ｍｌの無菌緩衝用水及び５０ｍｇの活性剤を含有するように構成され得る。静脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液及び１５０ｍｇの抗体を含有するように構成され得る。非経口で投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に周知であるか、または明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）により詳細に記載されている。活性剤の有効投薬量は、１投与当たり、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。
【００８４】
薬学的組成物は、無菌注射可能水性、油性懸濁液、分散物の形態、または無菌注射可能溶液もしくは分散物の即時調製用の無菌粉末であり得る。懸濁液は、既知の当該技術に従って、上で言及されている好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して製剤化され得る。無菌注射可能調製物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でもあり得る。担体は、例えば、水、エタノール、プリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、植物油、リンゲル溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液を含有する溶媒または分散媒であり得る。加えて、無菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として従来用いられている。このために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激不揮発性油が用いられ得る。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は、注射可能物の調製において使用される。
【００８５】
全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、注射が容易な程度まで流体でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び菌類等の微生物の汚染活動に対して保護されていなければならない。微生物の活動の予防は、様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましいだろう。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物中において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【００８６】
投与に有用な組成物は、それらの有効性を上昇させるために取込みまたは吸収エンハンサーとともに製剤化され得る。かかるエンハンサーには、例えば、サリチル酸塩、グリココール酸塩／リノール酸塩、グリコール酸塩、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプリン酸塩等が挙げられる。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２−１２８５（１９９６））及びＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１−５４４（１９９３））を参照されたい。
【００８７】
加えて、本開示での使用が企図される組成物の親水性及び疎水性の特性は、良好に均衡が保たれており、それにより、かかる均衡性を欠いている他の組成物が、実質的に実用性が少ないものであっても、インビトロ及び特にインビボの両方での使用に対するそれらの実用性を強化する。具体的には、本開示での使用が企図される組成物は、身体中での吸収及び生物学的利用能を可能にする水媒体中で適切な可溶度を有し、同時に、化合物が推定される活動部位へ細胞膜を通過することを可能にする脂質中での可溶度も有する。このため、企図される抗体組成物は、それらが標的抗原活性の部位へ送達され得るとき、最大限に有効である。
【００８８】
投与及び投薬
１つの態様では、本開示の方法は、薬学的組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無菌組成物である。
【００８９】
本開示の方法は、注射、経口摂取、鼻腔内、局所、経皮、非経口、吸入噴霧、膣式、または直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない、治療法を直接または間接的に哺乳動物対象へ導入するための任意の医学的に許容可能な手段を使用して実施される。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、及び嚢内注射、ならびにカテーテルまたは注入技法を含む。皮内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射及びまたは特定の部位での外科移植による投与も同様に企図される。
【００９０】
１つの実施形態では、投与は、部位内への直接注射によって、または製剤を内部に送達できる持続送達もしくは持続放出機構を介して、治療を必要としている癌の部位または影響を及ぼされる組織において実施される。例えば、生体分解性マイクロスフェアもしくはカプセルまたは組成物の持続送達が可能な他の生体分解性ポリマー構造（例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）が、癌の近くまたは癌の部位に植え込まれる本開示の製剤中に含まれ得る。
【００９１】
治療用組成物はまた、複数の部位でも患者に送達され得る。複数投与は、同時に与えられてもよく、またはある期間にわたって投与されてもよい。ある特定の場合には、治療用組成物の連続流を提供することが有益である。追加の療法が、定期的に、例えば、毎時間、毎日、一日おき、週２回、週３回、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、またはより長い間隔で施されてもよい。
【００９２】
化学治療薬を含むが、これに限定されない本明細書に記載される第２の薬剤と併せて、活性剤組成物等の複数の薬剤の投与も、本開示において企図される。好適な化学治療薬には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシン（前掲のＲｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６））ならびに以下の表に列記されるものが挙げられる。
【表１−１】
2018519278.tif 000002
【表１−２】
2018519278.tif 000003
【表１−３】
2018519278.tif 000004
【００９３】
所与の投薬量における活性剤組成物の量は、療法が施される個体の大きさならびに治療される障害の特徴によって異なり得る。例示的な治療では、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、または１０００ｍｇ／日を投与する必要があり得る。これらの濃度は、単一剤形として、または複数回用量として投与され得る。最初に動物モデル、次いで臨床試験における標準用量応答研究は、特定の疾患状態及び患者集団に対して最適な投薬量を明らかにする。
【００９４】
所与の投薬量における活性剤の量は、療法が施される個体の大きさならびに治療される障害の特徴によって異なり得ることも本開示において企図される。従来の治療法が本開示の治療法と組み合わせて施される場合、投薬が変更され得ることも明らかになるだろう。
【００９５】
本方法を使用して治療され得る例示的な病状または障害には、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌、線維性癌、グリオーマ、悪性グリオーマ、びまん性内在性橋グリオーマ、再発性小児脳腫瘍腎細胞癌、明細胞転移性腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗前立腺癌、ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫等の癌；ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫；ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平細胞非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行性Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人急性骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）を有する成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）を有する成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を有する成人急性骨髄性白血病；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）を有する成人急性骨髄性白血病；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）を有する成人急性前骨髄球性白血病；ＰＭＬ−ＲＡＲＡ；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、リヒター症候群；ワルデンストレームマクログロブリン血症、成人グリオブラストーマ；成人神経膠肉腫、再発性グリオブラストーマ、再発性小児期横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性原始神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽細胞腫；再発性骨肉腫、大腸癌、ＭＳＩ陽性大腸癌；ＭＳＩ陰性大腸癌、鼻咽頭非角質化癌腫；再発性鼻咽頭未分化癌、子宮頸管腺癌；子宮頸管腺扁平上皮癌；子宮頸管扁平細胞癌；再発性子宮頸癌；ＩＶＡ期子宮頸管癌；ＩＶＢ期子宮頸管癌、肛門管扁平細胞癌；転移性肛門管癌；再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌；癌腫、頭頸部の扁平細胞、頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌、進行性ＧＩ癌、胃腺癌；胃食道接合部腺癌、骨腫瘍、軟組織肉腫；骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌；ＩＩＩ期メルケル細胞癌；ＩＶ期メルケル細胞癌、及び骨髄異形成症候群が挙げられる。
【００９６】
実施例１
ＡＯＭによるＳＴＩＮＧ依存性遺伝子の活性化。
【００９７】
慢性炎症は結腸癌を悪化させることが既知であることと、ＳＴＩＮＧは、特に細胞質ゾル自体または病原体に関連するＤＮＡによって引き起こされる炎症性応答に影響を与えることが示されているということと、を考慮して、炎症性大腸炎関連発癌（ＣＡＣ）の制御におけるＳＴＩＮＧの役割を検査した。これらの目的に対して、上述のＡＯＭ／ＤＳＳモデルを利用し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達におけるＡＯＭ及び前駆体ＤＭＨの効果を分析した。主として、野生型（ＷＴ）またはＳＴＩＮＧ欠損（ＳＫＯ）マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をインビトロでＤＭＨまたは代謝産物ＡＯＭを用いて８時間かけて治療し、マイクロアレイ分析を実施して、遺伝子発現に対する因果関係を分析した。この研究は、ＡＯＭが、ＩＦＩＴ３及びＣｘｃｌ２を含む、ＷＴ細胞内で多様な先天性免疫関連遺伝子のｍＲＮＡ産生を活性化したことを示した（図１Ａ、図７）。しかしながら、ＳＴＩＮＧを欠いている細胞（ＳＫＯ）中では同じ遺伝子の産生が著しく減少され、ＡＯＭが、実際にＳＴＩＮＧ経路を活性化できたことを示す（図１Ａ、左パネル）。ＤＭＨを用いた細胞の治療後、同様の効果が観察された（図１Ａ、右パネル）。Ｃｘｃｌ１０及びＩＦＩＴ３等の選択ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析後に、観察されたＳＴＩＮＧ依存性遺伝子発現が確認された（図１Ｂ）。同様に正常なヒト結腸上皮細胞（ＦＨＣ）をＡＯＭで治療し、Ｃｘｃｌ１０を含む、ＳＴＩＮＧによって制御された先天性免疫遺伝子の同様の誘発を観察した（図１Ｃ）。ＡＯＭによるＣｘｃｌ１０の産生は、ＳＴＩＮＧと同様にＲＮＡｉで治療されたＦＨＣ中で減少した（図１Ｄ）。このように、ＤＮＡ損傷剤ＤＭＨ／ＡＯＭは、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達をもたらし得る。
【００９８】
ＤＭＨ／ＡＯＭ誘発性ＳＴＩＮＧ活性の原因を強調する機構の判定を始めるために、ＭＥＦまたはＦＨＣ細胞をこれらの薬物を用いて治療し、ＤＡＰＩ染色及び抗ｄｓＤＮＡ抗体を使用する免疫蛍光（ＩＦ）の２つの異なる手法によって、細胞質ゾル内へのＤＮＡの漏出を観察した（図８Ａ及び８Ｂ）。細胞質ＤＮＡは、ＳＴＩＮＧを活性化し、サイトカイン産生を誘起する転写因子ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢを持つエンドソーム領域への自食作用を介してＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１トラフィッキングを刺激する。このため、これらの重要な転写因子を活性化するＳＴＩＮＧの能力に対するＤＭＨ／ＡＯＭ治療の因果関係を判定するために、これらの薬物で治療されたＦＨＣ上でＩＦ分析を行った。この研究は、ＤＭＨ／ＡＯＭが、治療される細胞内でＩＲＦ３／ＮＦ−κＢの転座を引き起こし得ることを示した（図８Ｃ）。このことから、ＤＭＨ／ＡＯＭは、恐らく細胞質ゾル内へのＤＮＡの漏出を通して、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達を誘発する（図１Ａ；図８Ａ、及び８Ｂ）。
【００９９】
ＳＴＩＮＧの損失は、マウスをＣＡＣに対して感受性にする：データは、ＤＭＨ／ＡＯＭがインビトロでＳＴＩＮＧを活性化できることを示す。インビボでのこの因果関係を検査するために、ＡＯＭを用いて一度、続いてＤＳＳを用いて経口で４回、マウスを治療した。この前に、小腸でのＳＴＩＮＧ発現をＩＨＣで分析した。この研究は、ＳＴＩＮＧが、固有層細胞ならびに胃腸管の内皮細胞及び上皮細胞中で発現されたことを示した（図１Ｅ）。１３週間後、結腸内での腫瘍発生に関してマウスを分析した。驚くべきことに、ＳＴＩＮＧを欠いているマウス（ＳＫＯ）は、野生型マウス（ＷＴ）と比較してはるかに高い頻度で結腸腫瘍を発症した（図２Ａ〜Ｃ、図９Ａ）。実際に、同じ期間内において、７／７のＳＫＯと比べて４／７のＷＴマウスが腫瘍形成を呈し（図２Ａ及び２Ｂ、図９Ａ）、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）分析は、ＡＯＭ／ＤＳＳで治療されたＳＫＯマウスが、ＷＴマウスと比べて有意な炎症性細胞浸潤及び結腸内の腺癌の発生を呈したことを裏付けた（図２Ｂ、図９Ｂ）。しかしながら、マイクロアレイ分析は、ＷＴマウスの腫瘍が、ＳＫＯマウスから取り出された腫瘍と比べてより高いレベルのＣｘｃｌ１３及びＣｃｒ６等の選択遺伝子発現を呈したことを示し、これはもしかすると、ＳＴＩＮＧの損失が免疫調整性転写事象を抑制したためである（図２Ｅ）。ＳＴＩＮＧは、損傷したＤＮＡを認識し、組織修復を容易にし得るか、または免疫系を刺激して、かかる細胞を全滅させるだろうサイトカインの産生を活性化し得ることが想定される。このため、ＳＴＩＮＧの損失は、損傷した細胞が、免疫監視プロセスを逃れ、より容易に腫瘍に進行することを可能にし得る。
【０１００】
慢性ＳＴＩＮＧ活性化は、炎症性腸疾患に関与する。ＡＯＭ及びデキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）等の細胞損傷剤に応答する一過性のＳＴＩＮＧ活性化は、創傷治癒を促進する。このため、ＳＴＩＮＧの損失は、結腸修復の損失、及びＳＴＩＮＧとは無関係の炎症性応答を悪化させる遺伝毒性微生物叢の浸潤を引き起こし得る。しかしながら、ＤＳＳ等の薬剤による野生型マウスにおけるＳＴＩＮＧの慢性刺激は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を引き起こし得る。このため、阻害剤／薬物／化合物によるＳＴＩＮＧ活性の抑制は、クローン病及び潰瘍性大腸炎等のＩＢＤの低減をもたらし得る。
【０１０１】
ＳＴＩＮＧ欠損マウスにおけるＩＬ２２ＢＰ発現の抑制。ＳＴＩＮＧの損失が結腸癌発生を促進したことの実証において、ＳＴＩＮＧ活性に関連付けられる腫瘍抑制機構は、依然として解明されていない。ＳＴＩＮＧが、腫瘍抑制因子ｐ５３と同様の直接腫瘍抑制、成長阻害性、またはアポトーシス促進特性を付与し得るというのが依然として妥当である。さらに、ＡＯＭ治療は、細胞形質転換を促進し得る、ＳＴＩＮＧの損失に関連する頻繁なＲａｓ変異を誘発することが知られている。ｐ５３機能を損失している環境での発癌性Ｒａｓの発現は、正常細胞を軟寒天中における病巣形成能にし、腫瘍形成性になる。この可能性を評価するために、ＷＴ、ＳＫＯ、またはｐ５３欠損ＭＥＦを、陽性対照としてＭｙｃまたは活性化Ｒａｓでトランスフェクトし、細胞形質転換を監視した。ｐ５３を欠いているＭＥＦは、Ｍｙｃまたは活性化Ｒａｓの導入によって容易に形質転換されることが発見された。しかしながら、ＳＴＩＮＧを欠いているＭＥＦは、Ｍｙｃの過剰発現または活性化Ｒａｓの形質転換に目に見えて反応し易いようには見えなかった。このため、ＳＴＩＮＧの不在は、少なくともインビトロでは、または細胞形質転換プロセスにおいてＭｙｃまたはＲａｓと協働して、発癌性刺激を付与するようには見えない。
【０１０２】
しかしながら、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、または先天性免疫アダプターＭｙＤ８８等のある特定のサイトカインを欠いているマウスは、同様にＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性ＣＡＣに対して感受性にすることが実証されている。この状況では、ＭｙＤ８８は、ＩＬ−１８Ｒを通してＩＬ−１８の産生を促進することによって保護効果を付与し、これはＩＬ−２２ＢＰを阻害するために必要とされる。ＩＬ−２２ＢＰは、発癌物質または催炎剤による損傷後の腸上皮細胞の増殖を容易にし得るＩＬ−２２機能を抑制するために必要である。ＩＬ−１８またはＩＬ−２２ＢＰを欠いているマウスは、ＳＴＩＮＧ欠損マウスと同様に、ＣＡＣに対して高度の感受性を示す。マイクロアレイ分析から、ＳＴＩＮＧ活性化ｄｓＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ９０塩基対）で治療されたＳＫＯ  ＭＥＦ中で、ＩＬ−１８レベルが低減されたことが分かった（図３Ａ）。したがって、ＩＬ−１８／ＩＬ−２２ＢＰ軸の潜在的な調節におけるＳＴＩＮＧの関与の調査を行った。このサイトカインのプロモーターが、ＳＴＡＴ１、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ７等の転写因子を活性化する先天性免疫遺伝子によって認識される多数の部位を持つことが知られていることをさらに認めたため、まず、ＩＬ−１８発現におけるＳＴＩＮＧの影響を確認した。分析は、ｄｓＤＮＡまたはＳＴＩＮＧ活性化ＣＤＮ（ｃＧＡＭＰ）によるＭＥＦ細胞の治療後の判定時、多種多様の細胞型中に発現されるＩＬ−１８が、ＳＴＩＮＧ誘発性遺伝子であることを示した（図３Ａ）。同様の研究は、ＤＭＨ／ＡＯＭも、ＳＴＩＮＧ依存性の様式で、樹状細胞内でＩＬ−１８の産生を誘起し得ることを示し、ＩＬ−１８が、ＳＴＩＮＧ経路を通して実際に誘発され得ることを裏付けた。
【０１０３】
確認後、ＤＳＳ治療が、インビボでのＩＬ−１８及びＩＬ−２２ＢＰ発現に影響を及ぼし得るかどうかを検査した。７日間のＤＳＳ治療後、結腸をＷＴまたはＳＫＯマウスから取り出し、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２ＢＰ、またはＩＬ−２２発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この研究は、２日間の治療後、ＳＴＩＮＧを欠いているマウス（ＳＫＯ）中でＩＬ−１８発現が低減されたことを示した（図３Ｂ）。しかしながら、ＷＴマウスと比較して、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞から優勢に発現されたタンパク質である、ＩＬ−２２ＢＰ発現のはるかにより顕著な減少が、ＳＫＯマウスにおいて観察された（図３Ｂ）。対照的にＩＬ−２２の発現は、比較的影響を受けていないままであった。ＩＬ−２２ＢＰレベルが、ＩＬ−１８レベルも比較的低いことが認められるＳＴＩＮＧの不在下で抑制されたことが認められたことは驚くべきことであった。しかしながら、ＩＬ２２−ＢＰの下方調節は、ＩＬ−１８の不在下であっても生じ得ることが報告されており、他のＳＴＩＮＧ依存性因子もＩＬ−２２ＢＰの調節に寄与し得ることを示す。この研究を補完するために、対照マウスまたはＳＫＯマウスをＡＯＭ／ＤＳＳレジームを用いて治療し、１３週間後、治療されたマウスから採取した正常組織または腫瘍組織中のＩＬ−２２ＢＰ発現レベルを再分析した。ＤＳＳ治療単独と類似して、観察により、ＷＴマウスと比較して、ＳＫＯマウスの腫瘍中で大きく低減されたＩＬ−２２ＢＰの発現を認めた（図３Ｃ）。しかしながら、ＩＬ−１８及びＩＬ−２２レベルは、劇的には影響を及ぼされていないように見えた。まとめると、（例えば、ＤＳＳによる）ＤＮＡ損傷、または腸損傷後に結腸組織に侵入し得る微生物リガンドの検知は、ＩＬ−１８の産生をもたらすＳＴＩＮＧ活性を誘起し得ることが考えられる。この事象は、ＩＬ−２２ＢＰ産生を抑制し、ＩＬ−２２が、組織修復を促進することを可能にするだろう。しかしながら、長期にわたるＳＴＩＮＧ機能の損失は、ＩＬ−２２の成長刺激物質特性の制御に極めて重要であるＩＬ−２２ＢＰ産生にも影響を与えると思われる。この事象は、ＩＬ−２２ＢＰ産生を制御するＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫経路を誘起する微生物によって媒介され得る。このように、データは、ＭｙＤ８８、ＩＬ−１８、またはＩＬ−２２ＢＰを欠いているマウスと同様に、ＳＴＩＮＧ欠損マウスもＡＯＭ／ＤＳＳによって誘発されるＣＡＣになり易いことを示す。
【０１０４】
ＳＴＩＮＧ活性は、結腸腫瘍細胞内で抑制される。データは、ＳＴＩＮＧが、発癌物質、及びもしかすると炎症によって引き起こされるＣＡＣを促進する微生物に対する保護に必要であることを示す。ＳＴＩＮＧは、恐らくＤＮＡ損傷を検知し、抗腫瘍免疫監視細胞に事象をシグナル伝達する。ＣＤ８αＤＣ等の樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍細胞または壊死腫瘍細胞残屑を貪食し、貪食された細胞または残屑のＤＮＡは、ＤＣ内でＳＴＩＮＧを外的に活性化する。これは、抗腫瘍Ｔ細胞応答に必須のサイトカインの産生をもたらす。これを考慮して、ＳＴＩＮＧ機能の欠損により、損傷した細胞が免疫系を回避できることが実現可能であったため、ヒト結腸細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達を分析した。このように、ヒト結腸癌細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達を評価するために、ｈＴＥＲＴ及び対照として（ＦＨＣ）腸上皮細胞内のＳＴＩＮＧ発現を検査した。ＳＴＩＮＧは、これらの細胞内で発現され、トランスフェクトされた細胞質ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ９０塩基対）に応答してＩ型ＩＦＮを産生することが発見され、これは、ＳＴＩＮＧ依存性事象として知られている（図４Ａ〜Ｃ）。ｄｓＤＮＡによる同様の誘発性効果が、同じく高度にｄｓＤＮＡ誘発性である、ＳＴＩＮＧ調節遺伝子であるＣｘｃｌ１０による測定によって認められた（図４Ｄ）。次に、様々な段階の結腸癌から単離された多様な腫瘍細胞内でのＳＴＩＮＧの発現の検査を行い、１０／１１個の細胞株がＳＴＩＮＧを発現したことが分かった（図４Ａ、図１２）。しかしながら、ＳＴＩＮＧ経路は、分析される細胞の大半（８０％超）に欠損しており、かかる細胞は、細胞質ゾルｄｓＤＮＡに応答してＩ型ＩＦＮを効率的に産生することができなかった（図４Ａ〜Ｃ）。細胞質ＤＮＡ刺激に応答して多少のみＩ型ＩＦＮを産生することが可能に見えた、１１個の細胞株中２つのみを分析した（ＳＷ１１６及びＬＳ１２３）。対照的に、トランスフェクトされた合成ｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）は、３個を除いて全ての癌細胞においてＩ型ＩＦＮの産生を比較的良好に刺激することが可能であり、恐らくＲＩＧＩ／ＭＤＡ５経路が機能性であったことを示す。この分析を裏付けるために、トランスフェクトされた細胞質ＤＮＡを使用するＳＴＩＮＧ経路の刺激に続いて結腸癌細胞上でＤＮＡマイクロアレイ分析を行った。このデータは、Ｉ型ＩＦＮ、ならびにＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＣｌ５等の他の重要な先天性免疫調整遺伝子の宿主を含む、分析された結腸癌細胞内でのＳＴＩＮＧ依存性一次先天性免疫遺伝子活性化の大幅な抑制を示した（図４Ｅ及び４Ｆ）。ＬｏＶｏ細胞は、細胞質ＤＮＡ誘発性細胞を誘発する多少の能力を保持することが観察され、一方ＨＴ１１６細胞は、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達を著しく欠損しているように見えた。データは、ＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫経路が、結腸腫瘍株中で優先的に脱調節されるように見えることを示す。
【０１０５】
ＳＴＩＮＧ不活性化の機構を分析するために、正常細胞または結腸腫瘍細胞上で免疫組織化学（ＩＨＣ）分析をさらに行った。細胞質ＤＮＡの存在下で、ＳＴＩＮＧは、活性化され、転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３（インターフェロン調節３）の活性化に必要とされる非標準的な自食作用関連プロセスを介して転座することが以前に示されていた。このため、ブレフェルジンＡの使用を介する、または重要な自食作用調整物質ＶＰＳ３４の抑制を介するＳＴＩＮＧ転座の妨害は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達機能を阻害する。このため、正常細胞またはヒト結腸癌細胞をｄｓＤＮＡでトランスフェクトして、ＳＴＩＮＧを活性化し、４／１１個の細胞株のみ（ＬＳ１２３、ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、及びＨＴ２９）がＳＴＩＮＧトラフィッキングの証明を提示したことを観察した（図５Ａ）。次いで、この研究は、ＩＨＣ技法を使用して同様に治療された細胞内の転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の転座を分析することによって完了した。ＩＲＦ３が、ＳＷ４８０を除いて、ＳＴＩＮＧトラフィッキングを促進した細胞内で転座可能であったことが観察された（図５Ｂ）。これは、ＬｏＶｏ等のマイクロアレイによって分析された細胞のいくつかにおける先天性免疫遺伝子の部分的な刺激を部分的に説明し得る。しかしながら、細胞の２つのみ（ＬＳ１１１６、ＬＳ１２３）が、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５の転座を呈した（図５Ｃ）。ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの両方がＩ型ＩＦＮの最適な転写を必要とするため、細胞質ＤＮＡでの治療後に、ＬＳ１１１６及びＬＳ１２３は、Ｉ型ＩＦＮ産生を刺激することが部分的に可能なままであったが、残りは可能でなかった理由を説明することができる（図４Ｂ及び４Ｃ）。しかしながら、示されるように、細胞質ＤＮＡ依存性のＳＴＩＮＧに制御されるシグナル伝達は、検査された全ての結腸癌型において激しく欠損しているままであった（図４）。
【０１０６】
これらの結果を拡大するために、さらに正常細胞または結腸腫瘍細胞上で免疫ブロット分析を行った。細胞質ＤＮＡの存在下において、ＳＴＩＮＧはリン酸エステル化を経て、次いで分解され、これは、恐らくはＩＲＦ３をリン酸エステル化するＴＢＫ１の放出を介してその活性を促進する事象である。まず、活性化後、ＳＴＩＮＧのリン酸エステル化／分解は、分析された多くの細胞株内で妨げられ、これはＳＴＩＮＧ機能（例えば、ＬＳ１２３、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＨＴ１１６）に影響を及ぼし得る（図５Ｄ）。多少のＳＴＩＮＧトラフィッキング（ＬＳ１１１６、ＬＳ１２３、ＬｏＶｏ、及びＨＴ２９）を呈した腫瘍細胞内で、ＩＲＦ３キナーゼ活性化剤Ｔａｎｋ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）が、細胞質ＤＮＡの存在下でリン酸エステル化を経たことを確認した（図５Ｄ）。したがって、活性ＴＢＫ１を有する細胞内のリン−ＩＲＦ３活性を観察した（図５Ｄ）。ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、及びＨＴ１１６等の残りの腫瘍細胞は、恐らくＳＴＩＮＧが自食作用を経ることができないため、またはＳＷ４８の場合のように、ＳＴＩＮＧ発現が全く存在しなかったため、リン−ＴＢＫ１活性またはＩＲＦ３転座を呈しなかった（図５Ｄ。）驚くべきことに、観察は、細胞の大多数がｐ６５転座を欠いたことを示し、ｐ６５のリン酸エステル化は明らかであった（例えば、ＬｏＶｏ、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、及びＳＷ１４１７）。これは、ＮＦ−κＢシグナル伝達が、ｐ６５転座のレベルにおいて欠損している可能性があることを示唆し得る。まとめると、この研究は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達が、検査された多種多様の結腸癌細胞内に欠損していることを明白に示す。
【０１０７】
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）が、ＳＴＩＮＧを活性化することが示されている。ＣＤＮは、ｃＧＡＳ（環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ、Ｃ６ｏｒｆ１５０、Ｍａｂ−２１ドメイン含有タンパク質）と称されるシンターゼの活性化を誘起する細胞質ゾルｄｓＤＮＡ種によって発生することが示されている。このため、ｃＧＡＳの損失は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達に影響を及ぼすことが示されている。上述の研究を補完するために、結腸癌細胞株内のｃＧＡＳの発現を検査した。この分析は、５／１１個の結腸癌細胞が、ＳＴＩＮＧ転座及びＴＢＫ１／ＩＲＦ３活性の損失と相関性がある事象である検出不可能なレベルのｃＧＡＳ発現を有したことを示した（破線または枠線によって強調される図５Ｄ及び５Ｅ）。興味深いことに、ｃＧＡＳ発現の損失は、脱メチル化剤の株（ＳＷ４８０、ＨＴ１１６）を使用して救出することができ、いくつかの細胞が抑制されたｃＧＡＳプロモーター活性を呈したことを示す（図５Ｆ）。しかしながら、ｃＧＡＳ発現の救出は、判定時にＳＴＩＮＧ活性を確実には救出せず（図１３Ａ及び１３Ｂ）、これらの細胞内にＳＴＩＮＧシグナル伝達のさらなる欠損が存在し得ることを示す。これらの結果を考慮して、腫瘍形成の様々な段階で、４７のヒト結腸癌内のｃＧＡＳの発現の検査を分析した（図１３Ｃ）。ｃＧＡＳの発現は、分析された細胞の約３０％において低いまたは検出不可能であった。このため、ｃＧＡＳもしくはＳＴＩＮＧ発現またはシグナル伝達の欠損は、腫瘍結腸癌細胞株の大多数において欠損しているように見え、腫瘍形成の主な原因となり得る。しかしながら、同様に、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損は、検査された多種多様の他の腫瘍細胞内にも発見され、ＳＴＩＮＧ機能の欠損は、結腸細胞以外の細胞にも共通し得ることを示すことに留意されたい（図１４）。
【０１０８】
ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有する癌細胞は、ウイルス性腫瘍崩壊に感受性である。多数の癌細胞は、抗ウイルス性応答を欠損していることが示されているが、その機構は、依然として完全には決定されていない。実際に現在、ｄｓＤＮＡゲノムを持つ単純ヘルペス１（ＨＳＶ１）を含む多様なウイルスが、抗腫瘍治療法としてのそれらの有効性を判定するために臨床で使用されている。ＨＳＶ１は、ＳＴＩＮＧの活性化を通して先天性免疫応答を強く誘起することが示されている。ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損マウスは、それらがＩ型ＩＦＮの生成を含む、適切な先天性免疫応答を開始する能力を欠くため、致死性ＨＳＶ１感染に極めて罹患し易い。ＳＴＩＮＧシグナル伝達が大多数の癌細胞内に欠損しているという結果を考慮して、それらのＨＳＶ１感染に対する感受性を検査した。まず、ルシフェラーゼ（ＨＳＶ１−Ｌｕｃ）を発現する組換えＨＳＶ１に対する応答を分析した。この分析は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を呈する結腸癌細胞が、高レベルのＨＳＶ１−Ｌｕｃ発現が可能であったことを示した（図６Ａ）。しかしながら、部分的なＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫応答を呈した２つの癌細胞株（ＳＷ１１６及びＬＳ１２３）（図４Ｂ−Ｄ）、ならびに対照ｈＴＥＲＴ及びＦＨＣは、強いＨＳＶ−Ｌｕｃ遺伝子発現を促進しなかった（図６Ａ）。これは、ｄｓＤＮＡに対するそれらの応答と同様に、ＣＸＣＬ１０を産生することによって感染に応答する正常細胞ならびにＳＷ１１６及びＬＳ１２３と合致していた（図６Ｂ及び６Ｃ、図４Ｃ）。重篤なＳＴＩＮＧ機能欠損を持つ腫瘍細胞のいずれも、感染後にＩ型ＩＦＮを強く産生することができなかった。この研究を拡大するために、γ３４．５遺伝子（ＨＳＶ１  γ３４．５）を欠くＨＳＶ構築物を使用し、これは一部には宿主細胞翻訳遮断を阻むことよって宿主防御を阻害することが報告されているウイルス性タンパク質をコードする。γ３４．５を欠く同様のウイルスが、抗癌剤として臨床で検査されている。ＳＴＩＮＧシグナル伝達を欠損している結腸癌細胞は、ＨＳＶ１  γ３４．５での感染後、効率的なＩ型ＩＦＮ応答を開始することができなかったことが観察された（図６Ｄ）。このため、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の検査は、ＨＳＶ１または他のウイルスに基づく抗癌療法が、悪性疾患の治療に効果的であるかどうかに対する有用な予後マーカーであり得る。
【０１０９】
実験手順
マウス：ＳＴＩＮＧノックアウトマウス（ＳＫＯ、Ｓｔｉｎｇ−／−）をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて生成した（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ２００８）。対照群として野生型マウス（ＷＴ）を使用した。マウスの世話及び研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉａｍｉのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の認可の下で行った。
【０１１０】
急性ＤＳＳ大腸炎。６〜８週齢のＷＴ及びＳＫＯマウスを実験群及び対照群に分けた。実験群のマウスは、３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ１６０１１０；ＭＷ３６０００−５０００）を５日間、続いて通常の飲料水を２日間与えられた。対照群マウスには蒸留水を投与した。
【０１１１】
ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性大腸炎関連腫瘍の誘発：ＷＴ及びＳＫＯマウスに、アゾキシメタン（ＡＯＭ；ＭＰ１８０１３９；ＭＷ７４．０８）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に注射した。５％のＤＳＳを飲料水中に３週間毎７日間投与した。ＤＳＳサイクルを４回繰り返した。９１日目に、ポリープの数を計測するためにマイクロ内視鏡手順を盲検様式で実施した。１２１日目にマウスを屠殺して結腸を切除し、ＰＢＳを流し、組織学検査用にホルマリン中に固定し、ＲＮＡ発現分析用に凍結した。
【０１１２】
初代細胞培養：マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を記載される標準的手順によってｅ１５胚から得た。８〜１０週齢マウスの後肢大腿骨から骨髄由来樹状細胞を単離した。簡潔に、骨髄細胞を２３ゲージ針で、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて骨外に流し出し、３７℃で４時間インキュベートした。浮遊細胞の採取後、約２×１０７の細胞を、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に対する１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む完全ＤＭＥＭの１０ｃｍ皿内に播種した。１週間後、骨髄由来樹状細胞を得た。正常なヒト結腸上皮細胞及び結腸癌細胞株をＡＴＣＣから購入し、ＡＴＣＣの指示に従ってそれらの適切な成長培地中で培養した。培地及び補充物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１テロメラーゼ線維芽細胞（ｈＴＥＲＴ）を元はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、３７℃及び５％ＣＯ２加湿環境下で、４：１の比率のＤＭＥＭ：Ｍｅｄｉｕｍ１９９補充物（１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む）中で培養した。
【０１１３】
遺伝子アレイ分析：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（７４１０４，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを細胞または組織から単離した。Ｂｉｏｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）によってＲＮＡ品質を分析した。Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）によって遺伝子アレイ分析を検査した。イルミナアレイからの未加工の強度値を、ＡｇｉｌｅｎｔのＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）ソフトウェアにアップロードする。値を、Ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化し、全試料の中央値にｌｏｇ２を変換する。はっきりと差次的に発現される遺伝子をスチューデントのｔ検定を使用して計算し、Ｐ値≦０．０５の閾値を使用して選択する。Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎの距離法を使用して、選択された差次的に発現される遺伝子の階層的クラスタリング及び可視化をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ上で実施し、Ｗａｒｄ法を使用して繋がりを計算した。Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉで、遺伝子発現プロファイルを処理し、統計分析を実施した。
【０１１４】
病理組織学。マウスを屠殺し、結腸組織を４８時間かけて１０％ホルマリン中に固定した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉのｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで、パラフィンブロックの全プロセスならびにヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を実施した。
【０１１５】
統計分析：指示がない限り、スチューデントのｔ検定によって全統計分析を実施した。データは、Ｐ＜０．０５のとき、有意差があると見なされた。
【０１１６】
補足情報
【０１１７】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）：全ＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逆転写した。Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、先天性免疫遺伝子及び炎症性サイトカイン（Ｃｘｃｌ１０：Ｍｍ００４４５２３５、Ｉｆｉｔ３：Ｍｍ０１７０８４６）に対してリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１１８】
免疫ブロット分析：等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で解析し、次いで、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。５％ブロッキング試薬でブロッキングした後、様々な一次抗体（及び適切な二次抗体）を用いて膜をインキュベートした。強化化学発光システムＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像を解析し、オートラジオグラフィーによって検出した。抗体：ＳＴＩＮＧに対するウサギポリクローナル抗体を研究室で作製し、他の抗体を以下の供給源から得た：β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−ＩＲＦ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＩＲＦ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ＴＢＫ１、ＴＢＫ１、ｐ−ｐ６５、ｐ６５。
【０１１９】
インターフェロンβＥｌｉｓａ分析：インターフェロンβ（ＩＦＮＢ、ＩＦＮβ）Ｅｌｉｓａを、製造業者のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＩＦＮβ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ＫｉｔまたはＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＳｏｕｒｃｅのＨｕｍａｎ  ＩＦＮβ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔのいずれかを使用して実施した。
【０１２０】
免疫蛍光顕微鏡検査法：細胞を培養し、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライド上でそれらの適切な培地中で治療した。細胞を３７℃で１５分間にわたり４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で５分間にわたり０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。ウサギ抗ＳＴＩＮＧポリクローナル、続いて蛍光複合体化された二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ−抗ウサギ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、免疫染色を実施した。Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉにおいて、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。
【０１２１】
ノーザンブロット分析：ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ（登録商標）−Ｇｌｙ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、５μｇのポリＡ  ＲＮＡを用いてノーザンブロットを実施した。簡潔に、ＲＮＡを１％グリオキサールゲル中で解析し、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ（登録商標）−Ｐｌｕｓ  Ｎｙｌｏｎに転写した。
【０１２２】
考察
【０１２３】
ＡＯＭ／ＤＳＳ発癌物質による治療によって誘発されるＣＡＣの予防におけるＳＴＩＮＧの保護の役割が本明細書で実証される。データは、この事象の大部分が、ＩＬ−２２ＢＰの産生を制御するＳＴＩＮＧの能力を通して生じ得ることを示す。例えば、ＤＳＳによる組織損傷後、ＩＬ−２２が誘発され、組織再生の促進を含む、保護的な創傷治癒効果が現れる。しかしながら、未制御のままであると、ＩＬ−２２は、腫瘍発生も支援し得る。このため、ＩＬ−２２は、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞によって発現されるＩＬ−２２ＢＰの分泌によって堅く調節される。ＩＬ−２２の制御におけるＩＬ−２２ＢＰの重要性は、ＩＬ−２２ＢＰ欠損マウスが、ＳＴＩＮＧ欠損マウスと同様にＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性ＣＡＣに対して感受性であることの観察を通して強調されている。それにもかかわらず、ＩＬ−２２を欠いているマウスは、ＤＳＳで繰り返し治療される場合、強化された炎症性応答を呈したことも報告されているため、ＩＬ−２２は二重機能を有し得、この妥当な理由としては、ＩＬ−２２の全損が腸修復の遅延を引き起こす可能性があり、それが次いで、炎症性プロセスを実際に悪化させ得るためである。ＩＬ−２２ＢＰの産生は、ＩＬ−１８によって抑制することができ、これはＤＳＳ誘発性腸損傷後早期に誘発されることが知られている。したがって、ＩＬ−１８欠損マウスも、推定されるように、未調節のＩＬ−２２ＢＰによるＩＬ−２２活性の慢性的抑制によって結腸癌に対して感受性であり、ＩＬ−２２欠損マウスにおいて観察される状況を模倣し得る。それにもかかわらず、ＩＬ−２２ＢＰの下方調節がＩＬ−１８の不在下で生じることも報告されているため、ＩＬ−２２ＢＰの制御は、依然として完全には解明されていない。加えて、ＴＬＲ及びＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８ＲアダプターＭｙＤ８８の損失も、一部にはＩＬ−１８Ｒシグナル伝達の損失に起因して、マウスをＣＡＣに罹患し易くすることが知られている。最後に、ＡＯＭ／ＤＤＳ誘発性ＣＡＣに対する感受性は、推定されるように、上皮細胞または樹状細胞によって産生されるＰｒｏ−ＩＬ−１８が、活性形態へ分泌される前に開裂を必要とするため、カスパーゼ−１、アダプターＰＹＣＡＲＤ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質；ＡＳＣ）またはヌクレオチド結合ドメイン、ロイシンリッチリピート及びパイリンドメインを含有するタンパク質３及び６（ＮＬＲＰ３／６）を欠いているマウスにおいて強化されることが示されている。
【０１２４】
本明細書のデータは、ＩＬ−１８が、ｄｓＤＮＡもしくはＣＤＮによって、またはＳＴＩＮＧ依存性の様式でＡＯＭ／ＤＭＨによって、誘発可能であることを示す。ＩＬ−２２における状況と同様に、腸損傷がＳＴＩＮＧ活性を誘起する（ＤＮＡ損傷の結果、またはさらにＣＤＮまたはＤＮＡ等の微生物リガンドによる）ことが提案される。これは、ＩＬ−１８の上方調節及びＩＬ−２２ＢＰの下方調節をもたらし、ＩＬ−２２が、組織修復を容易にすることを可能にするだろう。しかしながら、ＩＬ−２２における状況と同様に、ＳＴＩＮＧの長期損失は、創傷修復を遅延させ、微生物の侵入が誘起する炎症を促進する可能性があり、これは腫瘍形成を実際に悪化させるだろう。ＩＬ−１８発現は、ＳＫＯマウスの腫瘍内で完全には取り除かれなかったことが認められ、これは、このサイトカインの発現が他の経路によって誘発され得るためであると推定された。これに反して、ＩＬ−２２ＢＰレベルは、ＳＫＯマウス中で低いままであり、ＩＬ−２２ＢＰ調節におけるＳＴＩＮＧの重要性を示した。まとめると、データは、ＳＴＩＮＧが、ＩＬ−２２ＢＰによるＩＬ−２２の抑制の調節を介して、腸組織損傷及びＣＡＣの制御において重要な役割を果たすことを示す。
【０１２５】
ＳＴＩＮＧの損失が、少なくとも一部には、組織修復を一時的に容易にできないことによって、またはサイトカインの分泌を介してＤＮＡ損傷事象を免疫系にシグナル伝達できないことによって、腫瘍形成を促す状態をもたらすことを考慮して、正常細胞及び癌関連結腸細胞内のＳＴＩＮＧの発現及び機能を調査した。研究は、ＳＴＩＮＧが、分析された結腸癌細胞の大半で発現されたことを示した。しかしながら、ＳＴＩＮＧ機能は、検査された細胞の８０％超においてほぼ完全に欠損していたことが観察された。ＳＴＩＮＧシグナル伝達の欠損も、研究された多種多様の他の腫瘍細胞において観察された（図１４）。ＳＴＩＮＧは核酸に関連付けることができ、ＣＤＮは、ＳＴＩＮＧ活性の強力な刺激物質である。細胞質ＤＮＡは、シンターゼｃＧＡＳに結合してＣＤＮを生成することができ、これは次いで、ＳＴＩＮＧに結合して活性化させる。この事象は、非標準的な自食作用プロセスを介してＴＢＫ１を伴って、転写因子ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢを持つエンドソーム領域へのＳＴＩＮＧトラフィッキングをもたらし、サイトカイン活性化をもたらす。データは、ＳＴＩＮＧが、トランスフェクトされたＤＮＡに応答せず、多くの場合、転座に失敗したことを示す。これらの状況では、ＩＲＦ３活性及び転座の損失が観察された。興味深いことに、ＳＴＩＮＧトラフィッキングの損失は、ｃＧＡＳ発現の損失と合致しており（症例の３０％超において）、ＣＤＮがＳＴＩＮＧ機能を促進することができなかったためであると推定された。他の状況では、ＮＦ−κＢ活性の欠損が観察された。ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３活性の両方が、Ｉ型ＩＦＮ及び他のサイトカインの最適な産生に必要とされるため、これらの経路の片方または両方の損失は、効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答に必要とされるＩＬ−１８またはＩ型ＩＦＮ等の宿主防御遺伝子の転写を刺激するＳＴＩＮＧの能力に有害作用を有するだろう。ＳＴＩＮＧシグナル伝達の損失は、ＤＮＡ損傷した細胞が免疫監視を逃れ、さらには、微生物の侵入に対して脆弱であり得る損傷した腸壁を修復することができないため、炎症性事象を容易にすることを可能にし得ることが提案される。
【０１２６】
最後に、ＳＴＩＮＧは、ＤＮＡウイルス感染に対する保護において重要な役割を果たすことが以前に示されている。ＳＴＩＮＧ機能が、これまでに検査されたほぼ全ての腫瘍細胞株内で取り除かれたことが観察されたため、ＨＳＶ１及びワクシニアウイルス（ＶＶ）感染に対するこれらの細胞の感受性を検査した。この研究は、ＳＴＩＮＧ機能の欠損を持つ結腸癌細胞が、ＨＳＶ１及びワクシニアウイルス感染に非常に反応し易いことを示した。ＨＳＶ１を含むいくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、臨床において抗腫瘍治療法と見なされているが、その活性機構の理解は、依然として完全には決定されていない。本明細書のデータは、腸腫瘍形成の原因に対する情報を提供し、腫瘍溶解性ウイルス療法の成功、及びさらには化学治療用治療に対する応答を含む疾患の転帰を決定付けるための予後情報を提供し得る。
【０１２７】
実施例２
結腸直腸腺癌におけるＳＴＩＮＧ機能
結腸直腸腺癌細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損：ＳＴＩＮＧ欠損マウスは、ＡＯＭ／ＤＳＳ関連ＣＡＣになり易いことが報告されている。しかしながら、ＳＴＩＮＧ機能が、ヒト結腸直腸腺癌（ＣＡ）内で少しでも脱調節されたかどうかは、不明である。この評価を始めるために、Ｄｕｋｅシステムによって記載されるように様々な段階で診断された癌から生成した多様なＣＡ細胞内のＳＴＩＮＧ発現を免疫ブロットで検査した。結果は、異なるレベルではあるが、検査された細胞株の１１個中１０個においてＳＴＩＮＧが発現されたことを示した（図４Ａ）。発現レベルをＳＴＩＮＧ機能と相関させるために、細胞をｄｓＤＮＡでトランスフェクトしてＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化するか、またはｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）でトランスフェクトしてＲＩＧ−Ｉ様経路を活性化した。ＳＴＩＮＧ誘発性であることが知られているＩ型ＩＦＮ発現をＥＬＩＳＡで測定した。全１１個のＣＡ細胞が、ｄｓＤＮＡ誘起性のＩ型ＩＦＮ産生に十分に応答しなかったことを認めた（図４Ｂ）。ＦＩＴＣ標識ｄｓＤＮＡ活性化剤及び免疫蛍光分析を使用して、全ての細胞が適切にトランスフェクトされたことを確認した（図１８）。これは、ｄｓＤＮＡでトランスフェクトされた際にＩＦＮβを発現した対照ｈＴＥＲＴ細胞または正常な結腸上皮細胞（ＦＨＣ）とは対照的であった。対照的に、１１個中８個のＣＡ細胞は、ｄｓＲＮＡに応答して様々な量でＩ型ＩＦＮを産生することができ、ＲＩＧ−Ｉ様経路が、検査された症例の大半において機能を保持したことを示す（図４Ｂ）。同様の結果がＲＴ−ＰＣＲによるＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ産生の検査において認められたが、ＳＴＩＮＧ依存性ｄｓＤＮＡトランスフェクションに応答してＬｏＶｏ及びＨＴ２９において、多少のＣＸＣＬ１０が低レベルではあるが検出された（図４Ｄ）。発癌物質に誘起されるＤＮＡ損傷が、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を介してＩＬ−１βを誘発し得ることが既に認められているため、これらの結果をさらに拡大するためにＣＡ細胞内のＩＬ−１β産生を測定した。ＩＬ−１βの損失は、創傷治癒応答が正常に機能しないため、マウスをＣＡＣに対して感受性にすることが示されている。この研究は、ＩＬ−１βが、正常なｈＴＥＲＴ及びＦＨＣ細胞内でｄｓＤＮＡによって産生されたことを示し、このプロセスにおけるＳＴＩＮＧ活性の重要性を示した。しかしながら、１１個中たった３個のＣＡ細胞が、ｄｓＤＮＡ治療に応答してＩＬ−１βを産生可能であると思われ、検査されたＣＡ細胞の大半においてＳＴＩＮＧ機能が欠損していることを再び示唆した（図４Ｇ）。ＳＴＩＮＧ発現を欠いたＳＷ４８は、いかなる程度にもｄｓＤＮＡトランスフェクションに応答性であるようには見えなかった。ＲＮＡｉ治療は、これらのサイトカインの上方調節がＳＴＩＮＧ依存性であったことを裏付けた（図１９Ａ〜Ｃ）。このデータを考慮して、ＣＡ細胞内のｄｓＤＮＡ依存性ＳＴＩＮＧシグナル伝達のより詳細な分析を、マイクロアレイ分析によって実施した。多少のＳＴＩＮＧ機能を呈するか、または呈しないそれらの能力に基づいてＣＡ細胞を選択した。例えば、図４Ｄのデータは、ＨＴ２９細胞及びＬｏＶｏ細胞が、ｄｓＤＮＡに応答してＣＸＣＬ１０���部分的に産生可能であったことを示した。対照的に、ＳＷ４８０及びＨＴ１１６は、いかなる有意なレベルにもＣＸＣＬ１０を産生できなかったことを認めた。マイクロアレイ分析は、検査されたＣＡ細胞の全てが、対照ＦＨＣ細胞ほど効率的にはｄｓＤＮＡシグナル伝達に応答しなかったことを明らかにし、ＲＴ−ＰＣＲ分析で確認した（図４Ｅ、４Ｆ）。例えば、対照ＦＨＣ細胞内のＣＸＣＬ１０のレベルは、分析されたＣＡ細胞に比べて著しく高かった。しかしながら、ＨＴ２９細胞は、検査された他のＣＡ細胞のうちのいずれかよりも多く、特にＳＷ４８０またはＨＴ１１６と比較した際、細胞質ゾルｄｓＤＮＡに対する多少の応答を保持することができたように見えた（図４Ｅ、Ｆ）。ＨＴ２９は、マイクロアレイ分析での判定時、ＩＦＮβを適度に産生することができたが、ＩＦＮβタンパク質産生は、ＥＬＩＳＡでは容易に判断することはできず、これは、ＦＨＣ対照内であっても同様に観察された低レベルの発現に起因し得る（図４Ｂ）。それでもなお、まとめると、データは、ＣＡ細胞の大半が、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達欠損を呈することを示し、ＳＷ１１１６、ＬＳ１２３、ＬｏＶｏ、及びＨＴ２９のみが、多少の低レベル活性を呈する。
【０１２８】
ＣＡ細胞内のＩＲＦ３機能の損失：ＣＡ細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損の程度を検査するために、免疫蛍光及び免疫ブロット分析を実施し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３機能を評価した。ｄｓＤＮＡの存在下で、ＳＴＩＮＧは、自食作用に類似しているプロセスにおいて、ＴＢＫ１を伴ってＥＲからＮＦ−ｋＢ及びＩＲＦ３を含有する核周辺関連エンドソーム領域まで急速にトラフィッキングを経る（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，２００８、Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この事象は、ＳＴＩＮＧリン酸エステル化及び分解が伴い、炎症を生じ得る持続的なＳＴＩＮＧ活性化サイトカイン産生を避ける可能性が高い。この手法により、ＳＴＩＮＧは、ｄｓＤＮＡでの治療後、対照ｈＴＥＲＴ細胞及びＦＨＣ細胞内でトラフィッキングし、リン酸エステル化及び分解を経ることができることを確認した（図５Ａ及び５Ｄ、左パネル）。これらの細胞内で、ＴＢＫ１、ならびにその同種標的ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットは、リン酸エステル化される（図５Ｄ、左パネル）。ＩＲＦ３及びｐ６５は、予想通り、細胞核に転座したことも認めた（図５Ｂ、５Ｃ）。適度のｄｓＤＮＡ依存性ＩＬ−１β誘発を呈したＳＷ１１１６及びＬＳ１２３  ＣＡ細胞を使用して、同等の効果を観察し、ＳＴＩＮＧ経路が、これらの２つの細胞内で多少の機能を保持したことを確認した（図５Ａ〜Ｄ及び図４Ｃ、Ｄ）。同様に、ＨＴ２９及びＬｏＶｏは、同様のＩＲＦ３転座を示したが、ｐ６５転座を欠いていた。これは、ｄｓＤＮＡに媒介される先天性免疫遺伝子の誘発の欠損は、ＳＴＩＮＧがｐ６５転座を誘起できないことを原因とすることをもっともらしく説明した（図５Ａ〜Ｄ及び図４Ｅ、４Ｆ）。しかしながら、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、及びＨＴ１１６等の他のＣＡ細胞が、極めて少ないＳＴＩＮＧ活性またはトラフィッキングを呈したことも認めた。同様に、ＴＢＫ１またはＩＲＦ３リン酸エステル化／転座の証明は、ほとんど認められなかった。例えば、ＳＷ４８０内でｐ６５リン酸エステル化の多少の兆候が現れたが、この転写因子の転座は、これらの細胞のいずれにおいても明白ではなかった。上述のように、ＳＴＩＮＧ発現は、ＳＷ４８細胞内で観察されなかった（図４Ａ、５Ａ、５Ｄ）。このデータは、ｄｓＤＮＡシグナル伝達が、ＳＴＩＮＧ経路の様々な点で影響を受けることを示す。例えば、ＳＴＩＮＧは、ＨＴ２９またはＬｏＶｏ細胞内で見られるように、多少の活性、及びＴＢＫ１からＩＲＦ３にトラフィッキングし、同伴する能力を保持するが、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達が影響を受ける。対照的に、ＳＴＩＮＧは、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、またはＨＴ１１６細胞内において、いかなるリン酸エステル化またはトラフィッキングを経るようには見えず、ＳＴＩＮＧ機能が、ＩＲＦ３／ＮＦ−ｋＢ相互作用の上流において妨げられることを示した。
【０１２９】
ＣＡ細胞は、欠損しているｃＧＡＳ発現を呈する：ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、またはＨＴ１１６細胞内のＳＴＩＮＧトラフィッキングの損失は、恐らくＳＴＩＮＧをＣＤＮと相互作用できなくするだろう変異に関連する、ＥＲ内のＳＴＩＮＧ機能の問題を示し得る。反対に、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の破綻は上流で生じ、ＳＴＩＮＧ機能を増大するための、ｄｓＤＮＡと関連した後ＣＤＮを生成するシンターゼｃＧＡＳを含み得る。これを評価するために、全１１個のＣＡ細胞内の全てのＳＴＩＮＧゲノムを配列決定した（イントロン及びエクソンは、染色体５ｑ３１．２上で約７．２ｋｂを構成する）。配列分析は、１１個中２個のＣＡ細胞（ＬｏＶｏ及びＳＷ４８０）が、集団の約２０％で生じ、２９３Ｔ細胞内で過剰発現されるとき、部分的に欠損していることが報告されているが、ＣＤＮの存在下で正常に機能可能である、以前に報告されているＨＡＱ  ＳＴＩＮＧバリアント（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を呈したことを示した（図２３）。分析されたＳＴＩＮＧ遺伝子の残りは、機能に任意の欠損を付与することが報告されておらず、集団の約８５％を表す、Ｒ２７２コード産物を表した。まとめると、これらの結果は、ＣＡ細胞内に含まれるＳＴＩＮＧ遺伝子における主要な変異の存在を示唆せず、ＳＴＩＮＧの上流、例えば、ｃＧＡＳのレベルでの欠損が広く蔓延している可能性が高いことを示唆する。このため、本発明者らは、ＣＡ細胞内のｃＧＡＳの発現及び活性の検査を開始した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを行い、ｃＧＡＳ  ｍＲＮＡレベルを主として測定した。結果は、検査された１１個のＣＡ細胞中、５個（５５％）においてｃＧＡＳ発現が不在であったことを示した（ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、及びＨＴ１１６）（図１３Ａ）。ｃＧＡＳに対する抗体を使用する免疫ブロット及び免疫組織化学分析によって、このデータを確認した（図１３Ａ、図１３Ｃ）。４８個のヒト結腸腺癌試料のｑＰＣＲ検査は、同様に、４８個中１５個の試料（３１％）において低いまたは検出不可能なレベルのｃＧＡＳを示した（補足図１３Ｂ）。本発明者らの結果は、ｃＧＡＳ遺伝子の損失により説明され得る。しかしながら、配列分析は、同様に、主要な変異または欠失が、ｃＧＡＳ遺伝子をコードするゲノム内に存在しないことを示した（図２４）。これを考慮して、ｃＧＡＳ発現が、ｃＧＡＳプロモーター領域の過剰メチル化等、エピジェネティックな現象によって抑制されたかどうかを検査した（Ｌａｏ  ａｎｄ  Ｇｒａｄｙ，２０１１、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。実際に、データバンク分析は、ｃＧＡＳプロモーター領域内の多量のＣｐＧアイランドの存在を示した（図２０Ａ）。このため、対照ｈＴＥＲＴ、またはｃＧＡＳを欠損しているＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８、もしくはＨＴ１１６細胞を、脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ＡＺＡＤＣ）で５日間治療し、ｃＧＡＳ  ｍＲＮＡレベルを再評価した。この研究は、検査された細胞の５個中２個（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）において、ｃＧＡＳ発現が救出されたことを示した（図１３Ｂ）。正常細胞及びＣＡ細胞か��取り出した、バイサルファイト変換されたゲノムＤＮＡの配列は、ｃＧＡＳ発現が抑制されたＣＡ細胞内のｃＧＡＳプロモーター領域内の有意な過剰メチル化を確認した（図２０Ｂ）。ｃＧＡＳの発現レベルが、なぜ残りのＣＡ細胞（ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ１４１７、ＳＷ４８）において弱められるのかはまだ明らかではないが、抑制は、ヒストン修飾等の他のエピジェネティック修飾に関与することが推測され得る（Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，２０１３）。したがって、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストン−リジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いるこれらの細胞の治療は、検査されたＣＡ細胞内のｃＧＡＳ  ｍＲＮＡ発現を部分的に救出した（図２０Ｃ）。ｍｉＲＮＡに関与するもの等、ｃＧＡＳ抑制の代替機構が存在したことも明らかであり得る。ｃＧＡＳ発現の再構成が、ＳＴＩＮＧ依存性ｄｓＤＮＡシグナル伝達を救出したかどうかを判定するために、対照ｈＴＥＲＴ、またはＳＷ４８０、ＨＴ１１６（５ＡＺＡＤＣによって救出されたｃＧＡＳ）、もしくはＬＳ１７４Ｔ（５ＡＺＡＤＣによって救出されなかったｃＧＡＳ）ＣＡ細胞を検査した。５ＡＺＡＤＣで治療されたｃＧＡＳで救出されたＳＷ４８０及びＨＴ１１６ＣＡ細胞は、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸エステル化、及び同時のリン−ＩＲＦ３転座を取り戻したが、ＬＳ１７４Ｔ細胞は取り戻さなかったことが観察された（図１５Ｃ、Ｄ）。これらの効果は、５ＡＺＡＤＣで治療されたＳＷ４８０及びＨＴ１１６ＣＡ細胞内のＩ型ＩＦＮ及びＩＬ−１βの適度な発現に反映された（図１５Ｅ、Ｆ）。このため、脱メチル化剤は、選択されたＣＡ内のＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫遺伝子の誘発を部分的に救出することが可能であり得る。
【０１３０】
なぜＳＴＩＮＧシグナル伝達経路が結腸腺癌内で阻害され得るのかという疑問が生じる。直近、ＳＴＩＮＧ欠損細胞及びマウスは、ＡＯＭ誘発性ＤＮＡ損傷に反応し易いことが示された。この状況において、ＳＴＩＮＧ経路は、ＤＮＡ損傷応答経路内で、組織修復または損傷した細胞の除去を促進するサイトカインの産生を誘発する役割を果たし得る（Ｃｈａｔｚｉｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｋｉｄａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｌｏｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，２０１２）。そのため、ＤＮＡ損傷剤に応答するＣＡ細胞の先天性免疫誘発を検査した。図２１に示されるように、発癌物質ＡＯＭ及びＤＭＨは、正常な結腸上皮（ＣＣＤ８４１）内及びＬＳ１２３内（これは部分的なＳＴＩＮＧ活性を呈した；図４Ｃ及び４Ｄ）でＩ型ＩＦＮの産生を誘発することができた。しかしながら、ＳＴＩＮＧ活性化ＩＲＦ３またはＮＦ−ｋＢ活性の欠損を呈したＣＡ細胞は、ＡＯＭまたはＤＭＨに応答してＩ型ＩＦＮを生成することができなかった。このため、ＳＴＩＮＧ経路の阻害は、変異を持つＤＮＡ損傷した細胞が、ＤＮＡ損傷応答及び免疫監視機構の一部を逃れることを可能にし、腫瘍形成性状態へ進行させ得る。
【０１３１】
ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有する腫瘍は、ウイルス性腫瘍崩壊に反応し易い：本発明者らは、インビトロまたはインビボでのＳＴＩＮＧシグナル伝達の損失が、それぞれ細胞またはマウスを単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染に極めて罹患し易くすることを前に示した。３７５ｋｂのｄｓＤＮＡゲノムを含有するＨＳＶは、現在、治験において癌治療のための治療薬として評価されている（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ−Ｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、腫瘍崩壊の機構は、依然として完全には決定されておらず、現在、ＨＳＶ抗腫瘍治療の有効性を判定するための評価は存在しない。ＳＴＩＮＧシグナル伝達が、ＨＳＶ感染に対する宿主防御応答における極めて重要な役割を果たすこと、及び多数のＣＡ細胞内でＳＴＩＮＧ活性が欠損していることが以前に示されたことを考慮して、ＳＴＩＮＧのシグナル伝達能力が、ＨＳＶ療法に対する効果に影響を及ぼし得ることが想定された。これに対する取り組みを開始するために、ＣＡ細胞または対照ｈＴＥＲＴ及びＦＨＣを、現在結腸癌ならびに黒色腫への対抗を含む腫瘍溶解剤として評価されている、λ３４．５コード産物を欠いているＨＳＶ１に感染させた。λ３４．５ウイルスタンパク質は、宿主防御応答を抑制することが提案されているが、その機構は依然として完全には解明されていない。このため、ＨＳＶ１λ３４．５は、先天性免疫シグナル伝達事象を強く抑止せず、Ｉ型ＩＦＮを含むＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫遺伝子の誘発を強く誘起する。この分析は、本発明者らのｄｓＤＮＡトランスフェクション結果と同様に、ＨＳＶ１λ３４．５が、対照ｈＴＥＲＴ及びＦＨＣ細胞ならびにＳＷ１１１６及びＬＳ１２３ＣＡ細胞内で、ＩＦＮβ  ｍＲＮＡの産生を著しく誘発したことを示した（図１６Ａ）。しかしながら、ｃＧＡＳ発現を欠損しているＳＷ４８０及びＨＴ１１６を含む残りのＣＡ細胞内では、Ｉ型ＩＦＮは、ほとんど誘発されなかった。Ｉ型ＩＦＮを誘発する能力は、誘発された抗ウイルス効果により、ＨＳＶ１λ３４．５複製と逆の相関関係がある（図１６Ｂ）。さらに、ＳＷ４８０及びＨＴ１１６等の細胞は、恐らくは強いウイルス複製に起因して、急速な細胞死を経たが、対照細胞及び部分的にＳＴＩＮＧ機能を有する細胞（ＳＷ１１１６及びＨＴ２９）は、はるかにより不応性であった（図１５Ｃ）。実験は、続いて、ＣＡ細胞を、λ３４．５を含有するルシフェラーゼ遺伝子を発現するＨＳＶ（ＨＳＶ−Ｌｕｃ）に感染させた。このデータは、ＳＷ４８０及びＨＴ１１６等のＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を呈するＣＡ細胞が、ウイルス誘発性のルシフェラーゼ発現がより可能であったことを裏付けた（図１６Ｄ）。ｓｉＲＮＡ治療は、ＩＦＮβ応答が、ＨＳＶ１λ３４．５によって通常に誘発され、ＳＴＩＮＧ機能性ＣＡ細胞が、ＳＴＩＮＧ依存性であることをさらに裏付けた（図１９Ｄ）。注目すべきは、ＨＳＶ１が、癌を治療するための腫瘍溶解性治療薬として見なされる唯一のＤＮＡウイルスではないことである。結腸癌に対する治療法として検討中の他のウイルス候補は、感染した細胞の細胞質内で複製する１９０ｋｂゲノムのｄｓＤＮＡウイルスである、ワクシニアウイルス（ＶＶ）を含む。ＶＶが、機能性ＳＴＩＮＧシグナル伝達の不在下で宿主先天性免疫応答を誘起し得るかどうかを評価するために、本発明者らは、部分的にＳＴＩＮＧシグナル伝達能力を有するＣＡ細胞（ＳＷ１１６及びＨＴ２９）または完全にＳＴＩＮＧシグナル伝達を欠損したＣＡ細胞（ＳＷ４８０、ＨＴ１１６）をＶＶに感染させた。ＨＳＶ１λ３４．５を使用する状況と同様に、ＶＶがＩ型ＩＦＮ及びＣＸＣＬ１０産生を誘起したのは、対照細胞または部分的にＳＴＩＮＧシグナル伝達能力を有するＣＡ細胞内のみで、ＳＴＩＮＧ機能を損失した細胞内（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）では誘起しなかった（図１６Ｅ、Ｆ）。本明細書のデータは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有するＣＡ細胞が、ＨＳＶ１及びＶＶ腫瘍溶解性活性に対して高度の感受性を示すことを示す。このため、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の存在または不在が測定可能であることは、ある特定の癌を有する患者の腫瘍溶解性ウイルス療法に対する応答の予測を補助し得ることが妥当である。
【０１３２】
腫瘍溶解性ウイルス療法に対する効果の予測。本データは、ＨＳＶ１等のＤＮＡ由来のウイルスを含む腫瘍溶解性ウイルス療法の効果が、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の存在または不在によって予測され得ることを示す。ＳＴＩＮＧ経路が、機能するためにＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの存在を本来必要とするため、及びＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳが、結腸癌の３０〜５５％において不在の可能性があることが観察されているため、これら２つの遺伝子産物の存在が測定可能であることは、したがって、ＤＮＡ−ウイルス性腫瘍療法の有効性を示し得る。これは、ＲＴ−ＰＣＲ方法論を使用して実現され得るが、生検組織は、正常なＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を含有する浸潤造血細胞を含有し得る。このため、癌細胞自体内のＳＴＩＮＧ及び／もしくはｃＧＡＳタンパク質またはＲＮＡ発現の分析が、ＳＴＩＮＧ機能のステータスに関するより正確な情報を提供するだろう。ｃＧＡＳタンパク質の検出に有効な抗体が特定されていなかったため、個体細胞内のｍＲＮＡの単一コピーレベルを検出できるＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を使用して、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを設計した。ＳＴＩＮＧプローブを緑（ＦＩＴＣ）及びｃＧＡＳプローブを赤（Ｃｙ５）で標識することによって、両方のプローブが、同じアッセイにおいて検出可能であり、同一細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳのｍＲＮＡレベルを効果的に定量化することができた。アッセイを試験するために、対照細胞またはｃＧＡＳ陽性ＣＡ細胞（ＳＷ１１１６またはＨＴ２９）もしくは陰性ＣＡ細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）を、ｃＧＡＳ（赤）またはＳＴＩＮＧ（緑）ｍＲＮＡを認識するＲＮＡプローブでインキュベートした。この研究は、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現が、ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して、対照（ｈＴＥＲＴ及びＦＨＣ）ならびにＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ陽性（ＳＷ１１１６またはＨＴ２９）ＣＡ細胞内で検出及び定量化され得たことを示した（図１７Ａ、Ｃ）。しかしながら、ＳＴＩＮＧのみが、ｃＧＡＳ陰性（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）ＣＡ細胞内で観察された（図１７Ａ、Ｃ）。ＳＴＩＮＧは、予想通り、このアッセイを使用しては、ＳＷ４８細胞内で検出不可能であった（図５Ａ及び１７Ａ、Ｃ）。このデータは、本発明者らの、ＲＴ−ＰＣＲによるこれらの細胞内のｃＧＡＳの以前の発現分析とも相関性がある（図１３Ａ）。さらに、５ＡＺＡＤＣでの治療後にｃＧＡＳ  ｍＲＮＡ産生が救出されたＣＡ細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）内のｃＧＡＳ発現を、ＲＮＡｓｃｏｐｅによって観察した（図１７Ｂ、Ｄ）。このようにして、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析は、ｃＧＡＳまたはＳＴＩＮＧの存在または不在に応じて腫瘍溶解性ウイルス療法に対する効果を予測することが可能であり得る。
【０１３３】
このアッセイをさらに進めるため、正常なｈＴＥＲＴ、またはｃＧＡＳ陽性ＣＡ細胞（ＳＷ１１１６またはＨＴ２９）もしくは陰性ＣＡ細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）、ならびにｃＧＡＳ及びＳＴＩＮＧ発現の両方が不足しているＳＷ４８をパラフィン包埋した。この状況は、生検及びパラフィン包埋された患者由来の材料が分析に必要とされる状況を模倣することができる。実験は、ＲＮＡプローブを使用して、対照細胞、ＳＷ１１１６細胞、及びＨＴ２９細胞内ではＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ発現の両方、また以前の通り、ｃＧＡＳ陰性ＳＷ４８０及びＨＴ１１６ＣＡ細胞内ではＳＴＩＮＧのみを、再び容易に検出することができた（図１７Ｅ、Ｆ）。二重陰性ＳＷ４８株内では、ｃＧＡＳまたはＳＴＩＮＧのいずれも観察されなかった（図４Ａ、及び１７Ｅ、Ｆ）。このアッセイを、パラフィン包埋組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）において１２個の正常試料及び８０個のＣＡ試料上でさらに試験し、ＣＡ試料の１４％がＳＴＩＮＧを損失しており、ＣＡ試料の１５％がｃＧＡＳを損失していたことを観察した。ＣＡ試料の９％が、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方を損失していた（図１７Ｇ、Ｈ）。しかしながら、ＳＴＩＮＧ発現及び／または機能は、多様な他の腫瘍内で不在であったことが認められ、この経路の抑制が、ヒト癌において広範囲にわたり得ることを示された（図２３）。このようにして、パラフィン包埋組織からのＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ二重発現のＲＮＡｓｃｏｐｅ分析は、次に判定される、インビボでの選択した腫瘍溶解性ウイルス療法の効果の予測を補助し得る。
【０１３４】
ＨＳＶ１λ３４．５療法に対するＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有するＣＡ細胞のインビボ分析。インビボでのＨＳＶ１λ３４．５のインビトロ腫瘍溶解効果を相関させるために、ヌードマウスに、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を部分的に持つ（ＳＷ１１１６もしくはＨＴ２９）または欠損している（ＳＷ４８０及びＨＴ１１６）ＣＡ細胞を皮下接種した。次いで、ＨＳＶ１λ３４．５を腫瘍内に投与した（図１８Ａ）。部分的なＳＴＩＮＧシグナル伝達を呈する腫瘍（ＳＷ１１１６及びＨＴ２９）は、ウイルス腫瘍溶解性治療に対して不応性であったことが観察された（図１８Ｂ、Ｃ）。しかしながら、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有するＣＡ細胞に由来する腫瘍は、ウイルス治療に対して極めて感受性であることが認められた（図１８Ｄ、Ｅ）。このデータは、ＳＴＩＮＧ経路の活性が、結腸ならびに他の癌に対するＨＳＶ関連腫瘍溶解性療法の効果を予測し得ることを示す。
【０１３５】
考察
【０１３６】
ＳＴＩＮＧで制御されるシグナル伝達経路は、細胞質ＤＮＡ種の認識に応答する先天性免疫遺伝子転写の促進に不可欠である。ＳＴＩＮＧ活性は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等の細胞内細菌から産生される環状−ジ−ＡＭＰもしくは環状−ジ−ＧＭＰ等のＣＤＮによって、または細胞質ゾルｄｓＤＮＡ種と関連した後シンターゼｃＧＡＳによって製造される、環状−ジ−ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）によって誘起され得る（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。かかるＤＮＡは、ＨＳＶ−１またはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の細菌等のＤＮＡ病原体のゲノム、ならびにＤＮＡ損傷した細胞の細胞核から漏出した自己ＤＮＡを表し得る。ＳＴＩＮＧ欠損マウスは、生存能力があるが、多様な病原体による致死性感染に極めて罹患し易い。しかしながら、慢性のＳＴＩＮＧ活性は、炎症促進性サイトカインの過剰産生によって、多様な自己炎症性疾患を引き起こすことが示されている。実際に、ＳＴＩＮＧの不適切な過剰刺激は、炎症によって引き起こされる皮膚癌を悪化させることがさらに示されている（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、一過性のＳＴＩＮＧ活性は、抗腫瘍Ｔ細胞応答の生成の媒介に必須であることが示されている。データは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＣＤ８＋樹状細胞）内のＳＴＩＮＧは、貪食された死亡腫瘍細胞のＤＮＡによって外的に活性化され、Ｉ型ＩＦＮ等のサイトカインの誘起をもたらし、交差提示及びＣＴＬプライミングを促進することを示唆する。相応に、腫瘍内へのＣＤＮの治療用投与は、腫瘍成長を抑止することが示されており、これはＤＣ依存性ＣＴＬ産生を促進することによるものであると推定される（Ｃｏｒｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＳＴＩＮＧは、ＰＤ１等のチェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果に対する影響においても役割を果たし得るが、その機構は、依然として決定されていない。
【０１３７】
近年、本発明者らは、ＳＴＩＮＧ欠損マウスが、発癌物質によって悪化したＣＡＣに対して感受性であることも実証した（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この状況では、証明は、もしかすると細胞核の漏出によって、または依然として解明されていない他の機構を介して、損傷したＤＮＡが、ＳＴＩＮＧ内因性活性を誘起し得ることを示す。この事象は、推定上は、損傷した細胞（複数可）に免疫系を引き付けるだろうサイトカイン産生を増大するだろう。かかる細胞の根絶だけではなく、サイトカインの刺激及び成長因子依存性組織修復が続いて生じ得る。データは、ＳＴＩＮＧが、ＩＬ−１β等の腸内で創傷修復を促進するサイトカインの産生を誘起し得ることを示唆する。かかるサイトカインは、インフラマソーム関連ＡＳＣ及びカスパーゼ−１と相互作用してＩＬ−１β及びＩＬ−１８を処理するＮＬＲＰ３及びＮＬＲＰ６等のヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメインタンパク質様受容体（ＮＬＲ）によって処理される。これらの炎症促進性サイトカインは、分泌され、シグナル伝達のためにＭｙＤ８８を主に必要とする受容体に結合する。ＩＬ−１８産生は、ＩＬ−２２の創傷修復活性の阻害に関与するＩＬ−２２ＢＰを抑制し得る。ＡＳＣ、カスパーゼ−Ｉ、ＭｙＤ８８、またはＩＬ２２ＢＰの損失は、ＳＴＩＮＧの損失と同様に、大腸炎関連結腸癌モデル内において腫瘍形成を増加し得る（Ｅｌｉｎａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。このため、ＳＴＩＮＧは、インフラマソームプロセシングと協調して作用し得る。
【０１３８】
このため、ＳＴＩＮＧの損失は、組織治癒を抑制し、損傷した粘膜内層は、強化された遺伝毒性能力を有する細菌の浸潤及び増殖を可能にし得、これは、ＳＴＩＮＧとは無関係の炎症性応答を悪化させるだろう。過剰活性の浸潤免疫細胞によるＲＯＳの生成は、ＤＮＡ損傷プロセスを強化し、ＴＳＧの変異性不活性化またはｋ−ｒａｓ等の成長刺激タンパク質の変異性活性化を促進し得る。このため、内因性ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＤＮＡ損傷への応答による癌発生の予防及び免疫監視機構への警告において重要な役割を果たし得る。加えて、ＤＣ内の外因性ＳＴＩＮＧ活性も、抗腫瘍ＣＴＬの生成に必要とされる。これは、ＳＴＩＮＧを、宿主抗癌防御手段（ａｒｓｅｎａｌ）において極めて重要な役割に据える。
【０１３９】
これを考慮して、結腸癌内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の発現及び調節を分析し、ＳＴＩＮＧ活性の頻繁な抑制を発見した。これらの事象は、ＤＮＡ損傷依存性サイトカインの産生を阻害し、損傷した細胞が免疫監視系の注意を逃れることを可能にし得た。かかる細胞は根絶を回避することができ、腫瘍形成プロセスを強化するさらなる遺伝子突然変異事象が生じ得る。主にＳＴＩＮＧ発現の抑制、またはシンターゼｃＧＡＳの抑制に関与する、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の阻害が観察された。ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ遺伝子に関与する著しい変異または欠失事象は観察されなかったが、むしろ、プロモーター領域の過剰メチル化を含む頻繁な転写抑制が観察された。細胞質ＤＮＡシグナル伝達は、脱メチル化剤を使用して部分的に救出され、一部のＣＡ細胞内ではｃＧＡＳ発現を取り戻したが、一部のＣＡ細胞内では取り戻さなかった。しかしながら、癌細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の救出が、抗癌剤へのより良好な応答を提供可能であるかどうかは、不明のままである。さらに、ｃＧＡＳ、及び場合によってはＳＴＩＮＧ発現が、脱メチル化剤によって救出されなかったことは、さらなる特性評価を必要とする他の形態のエピジェネティックサイレンシングを示し得る。他のＣＡ型では、転写因子ＮＦ−κＢまたはＩＲＦ３を活性化するＳＴＩＮＧの能力が、同じく依然として決定されていない分子機構によって正常に機能しなかったことが観察された。ミスマッチ修復タンパク質ＭＨＳ２及びＭＬＨ１等の、ＤＮＡ修復に関与するいくつかの他の遺伝子も、結腸癌内でしばしば発現停止されることが報告されていることは注目に値する（Ｃｈａｔｚｉｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｌｏｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，２０１２）。このため、ＤＮＡ修復機構を標的とすることは、癌発生において共通の必須要件であり得る。まとめると、検査された結腸関連腫瘍の約８０％以上において、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達が欠損していたことが観察された。これは、ＳＴＩＮＧ機能の抑制も腫瘍形成プロセスにおいて重要な義務であることを示し得る。
【０１４０】
ＳＴＩＮＧの損失は、腫瘍内で共通している可能性があり、さらに抗癌療法に対する効果を予測し得るため、本発明者らは、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方の発現レベルを評価するアッセイを開発した。これら２つのタンパク質のいずれかの損失が、細胞質ＤＮＡに媒介される先天性免疫シグナル伝達を抑止すると思われる。ｉｎ  ｓｉｔｕでのＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ｍＲＮＡ発現、及び抗体を使用してＳＴＩＮＧタンパク質発現を測定する本能力は、本発明者らが、ＣＡＣの４０％超においてこれらのタンパク質のどちらかの損失を示すスクリーンを開発することを可能にした。かかるアッセイは、選択した治療的介入に対する癌の有効な応答率の予測において有用であり得る。さらに、新規の抗腫瘍遺伝子療法のアプローチによる腫瘍内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の繰り返しは、かかる細胞が宿主抗腫瘍免疫を再活性化することを可能にする可能性がある。
【０１４１】
したがって、ＣＡ細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の損失が、ＨＳＶ１等のＤＮＡ由来ウイルスの強い複製を可能にしたことが分かった。ＨＳＶ１及びワクシニアウイルス等のウイルスは、現在、癌治療用の腫瘍溶解剤として使用されている。かかるウイルスは、溶解によって腫瘍細胞を直接破壊できるだけではなく、ＣＴＬの生成のＡＰＣによる貪食のための腫瘍抗原源を作製することもできる。データは、ＳＴＩＮＧが、これらのプロセスの両方において重要な役割を果たすことを示す。しかしながら、原因が不明なままであるため、成功する腫瘍ウイルス療法の有効性は低いままである。主として、治療効果の予測を補助し得る分子的洞察に基づくアッセイは開発されていない。これは、正常細胞ではなくむしろ、癌細胞内の腫瘍崩壊を説明する分子機構が、依然として完全に評価されていないためである。証明は、抗ウイルス活性を付与する先天性免疫シグナル伝達経路が、癌細胞内で欠損している可能性があることを示唆する。本明細書で示される本発明者らのデータは、その中でも初めて、先天性シグナル伝達経路の損失が、腫瘍ウイルス療法に対する効果を予測し得ることを明確に示すものである。このため、本明細書で描かれたものと同様の分子バイオマーカーアッセイの利用は、癌治療のための微生物の使用に対する応答をより予測可能にし得る。かかるアッセイは、ＣＤＮに基づく他のＳＴＩＮＧ依存性抗腫瘍療法、またはさらにＤＮＡ付加体由来の化学治療用レジームが機能するかどうかについての洞察ももたらし得る（Ｍａｎｓｏｕｒ，２０１４、Ｒｏｗｅ  ａｎｄ  Ｃｅｎ，２０１４）。この点に関して、本発明者らは、近年、シスプラチン及びエトポシド等の化学治療薬の使用による免疫学的利益が、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路に著しく関与したことを説明している。このため、癌内のＳＴＩＮＧの調節及び機能に関するさらなる研究は、腫瘍形成の分子機構に関する識見を提供するだけではなく、同様に癌治療を補助し得る治療用標的を提供し得る。
【０１４２】
実験手順
材料。全ての試薬は、指示がない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、またはＳｉｇｍａから得た。
【０１４３】
細胞培養。正常なヒト細胞及びヒト癌細胞株をそれぞれＬｏｚｎａ及びＡＴＣＣから購入し、その指示に従ってそれらの適切な成長培地中で培養した。培地及び補充物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１テロメラーゼ線維芽細胞（ｈＴＥＲＴ）を元はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、３７℃及び５％ＣＯ２加湿環境下で、４：１の比率のＤＭＥＭ：Ｍｅｄｉｕｍ１９９補充物（１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む）中で培養した。
【０１４４】
免疫ブロット分析。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で解析し、次いで、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。５％ブロッキング試薬でブロッキングした後、様々な一次抗体（及び適切な二次抗体）を用いて膜をインキュベートした。強化化学発光システムＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像を解像し、オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ）によって検出した。抗体：Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００８に既に記載されているように、ＳＴＩＮＧに対するウサギポリクローナル抗体を本発明者らの研究室で作製し、他の抗体を以下の供給源から得た：β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−ＩＲＦ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＩＲＦ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−ＴＢＫ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＴＢＫ１（Ａｂｃａｍ）、ｃＧＡＳ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０１４５】
インターフェロンβＥｌｉｓａ分析。インターフェロンβＥｌｉｓａを、製造業者のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＩＦＮβ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ＫｉｔまたはＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＳｏｕｒｃｅのＨｕｍａｎ  ＩＦＮβ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔのいずれかを使用して実施した。
【０１４６】
免疫蛍光顕微鏡検査法。細胞を培養し、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライド上でそれらの適切な培地中で治療した。細胞を３７℃で１５分間にわたり４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で５分間にわたり０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。ウサギ抗ＳＴＩＮＧポリクローナル、ウサギ抗ＩＲＦ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはウサギ抗ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、続いて、蛍光複合体化された二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ−抗ウサギ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、免疫染色を実施した。Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉにおいて、Ｌｅｉｋａ  ＬＳＭ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。
【０１４７】
マイクロアレイ分析。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを細胞または組織から単離した。Ｂｉｏｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ６０００Ｎａｎｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＲＮＡ品質を分析した。Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２＿Ｖ４＿Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ）によって遺伝子アレイ分析を検査した。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉで、遺伝子発現プロファイルを処理し、統計分析を実施した。簡潔に、イルミナアレイからの未加工の強度値を、ＡｇｉｌｅｎｔのＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）ソフトウェアにアップロードする。値を、Ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化し、全試料の中央値にｌｏｇ２変換する。２クラスの比較からはっきりと差次的に発現される遺伝子をスチューデントのｔ検定を使用して計算し、Ｐ値≦０．０５の閾値を使用して選択する。Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎの距離法を使用して、選択された差次的に発現される遺伝子の階層的クラスタリング及び可視化をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ上で実施し、Ｗａｒｄ法を使用して繋がりを計算した。２群間で倍数変化分析を実施し、差次的に発現される遺伝子を倍数変化の閾値に基づいて選択した。
【０１４８】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１４９】
免疫組織化学及び組織学的分析。Ｏｒｉｇｅｎｅから組織マイクロアレイを購入した。標準プロトコルに従ってウサギ−抗ｃＧＡＳ抗体を用いて免疫組織化学染色を実施した。
【０１５０】
ＨＳＶ１γ３４．５増幅、精製、滴定、及び感染。標準プロトコルに従って、ＨＳＶ１γ３４．５をベロ細胞内で増幅し、スクロース勾配超遠心分離によって精製した。段階希釈ウイルスを使用するプラークアッセイを、標準プロトコルに従ってベロ細胞内で実施した。細胞を、特定のＭ．Ｏ．Ｉ．で１時間かけてＨＳＶ１γ３４．５に感染させて洗浄し、次いで、特定のアッセイ検査用に指定された期間インキュベートした。
【０１５１】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＲＮＡプローブされたＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳは、ＡＣＤによって特注設計されており、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、製造業者の指示に従って、培養細胞に対してＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用し、ＦＦＰＥ細胞及び組織に対して２−ｐｌｅｘ  ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して、実施した。
【０１５２】
マウス治療。Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒからＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスを購入した。腫瘍細胞を、適切な腫瘍細胞の２Ｅ１０６の皮下注射によってＢａｌｂ／ｃヌードマウスの脇腹内に導入し、腫瘍を約０．５ｃｍの平均直径まで発達させた。次いで、ＨＳＶ１γ３４．５を一日おきに合計３回、適切な投薬量（すなわち、１Ｅ７で５０μｌ）で腫瘍内に注射した。ビヒクル対照としてＰＢＳを使用した。腫瘍成長における効果を監視した。腫瘍直径が１０ｍｍを超えると、マウスを安楽死させた。
【０１５３】
バイサルファイト配列分析。Ｚｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＥＺＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換を実施し、続いてＰＣＲ増幅を行った。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、配列決定した。
【０１５４】
統計分析。指示がない限り、スチューデントのｔ検定によって全統計分析を実施した。データは、Ｐ＜０．０５のとき、有意差があると見なされた。
【０１５５】
実施例３
黒色腫内のＳＴＩＮＧ機能
上記結果を考慮し、一部には、かかる癌がウイルス腫瘍溶解性治療に対して感受性であるように見え、これは先天性免疫経路における欠損を示唆するため、研究を黒色腫内のＳＴＩＮＧ機能の評価に拡大した。本明細書において、ＳＴＩＮＧに媒介される先天性免疫シグナル伝達は、ヒト黒色腫由来細胞及び一次患者の黒色腫由来組織の両方においてほとんどが正常に機能しないことが報告される。黒色腫内のＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳ発現の損失は、主にエピジェネティックな過剰メチル化サイレンシングを通して、反復的に発見された。これらの結果は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の抑制が、腫瘍発生の重要な部分であり得ることを示唆する。その上、ＳＴＩＮＧ機能の損失は、黒色腫細胞をＨＳＶ１及びワクシニアウイルス媒介性の腫瘍崩壊に対してより感受性にした。したがって、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現の測定が可能である予後アッセイの開発は、ウイルス腫瘍溶解性治療の有効性のより良好な示度をもたらし得る。
【０１５６】
ヒト黒色腫由来細胞株内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の周期的損失。ＳＴＩＮＧに制御される先天性免疫経路は、ヒト結腸癌内でほとんど正常に機能せず、これは腫瘍形成を促進し得る事象であることが報告されている（Ｘｉａ  Ｔ，Ｋｏｎｎｏ  Ｈ，Ａｈｎ  Ｊ，Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ．Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｓ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６；１４：２８２−９７）。この重要な経路が、他のタイプの癌において同様に欠損しているかどうかを評価するために、ＳＴＩＮＧ発現を、ヒト悪性黒色腫のパネルにおける免疫ブロットによってさらに検査した。これらの結果は、ＳＴＩＮＧ発現が、検査された細胞株の１１個中３個（Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、及びＳＫ−ＭＥＬ−５）において検出不可能であり、ＳＴＩＮＧ発現レベルが、さらなる３個の細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、及びＷＭ１１５）において劇的に抑制されたことを示した（図２６Ａ）。シンターゼｃＧＡＳは、ＳＴＩＮＧの上流に存在し、ＳＴＩＮＧ機能を誘起することができるＣＤＮを生成する。次に、免疫ブロットによるｃＧＡＳの発現を検査し、このシンターゼが、検査された細胞株の１１個中４個（Ａ３７５、Ｇ３６１、ＳＫ−ＭＥＬ−５、及びＳＫ−ＭＥＬ−２４）において不在であったことが分かった（図２６Ａ）。ｃＧＡＳプローブを使用するリアルタイムＰＣＲ分析によって、ｃＧＡＳが、Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ−５内で検出不可能であったが、Ｇ３６１及びＳＫ−ＭＥＬ−２４内で低レベルのｃＧＡＳが検出されたことを確認した（図２６Ａ）。ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現分析を機能性ＳＴＩＮＧシグナル伝達と相関させるために、細胞をｄｓＤＮＡでトランスフェクトしてＳＴＩＮＧ依存性サイトカイン産生を活性化するか、またはｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）でトランスフェクトしてＳＴＩＮＧとは無関係のＲＩＧ−Ｉ様シグナル伝達経路を活性化し、ＥＬＩＳＡによってＩ型ＩＦＮ発現を測定した（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。この研究は、全１１個の黒色腫細胞が、ＳＴＩＮＧ依存性のｄｓＤＮＡ誘起性Ｉ型ＩＦＮ産生に十分に応答しなかったことを示した。蛍光顕微鏡検査分析を使用して、全ての細胞が、ＦＩＴＣ標識ｄｓＤＮＡ活性化剤で実際にトランスフェクトされたことを確認した。しかしながら、対照ｈＴＥＲＴ細胞及び正常ヒトメラニン形成細胞（ＨＥＭａ）は、ｄｓＤＮＡでトランスフェクトされた場合に高レベルのＩＦＮβを発現することができ、これは、ＳＴＩＮＧに媒介されるＩ型インターフェロン応答が、黒色腫細胞内で特異的に抑制されたことを示唆した（図２６Ｂ）。この結果は、ｄｓＤＮＡがＩＦＮＢを刺激し、ＣＸＣＬ１０誘発が、検査された黒色腫細胞の大部分において抑制されたが、弱い活性がＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１細胞内で検出されたリアルタイムＰＣＲ分析によって、さらに支持された（図２６Ｃ〜Ｄ）。対照的に、１１個中６個の黒色腫細胞は、様々なレベルではあるが、ｄｓＲＮＡに応答して���型ＩＦＮ及びＣＸＣＬ１０を産生することができ、ＲＩＧ−Ｉ−様ＲＮＡシグナル経路が、検査された黒色腫細胞の大部分においてほとんど損なわれていなかったことを示した（図２６Ｃ〜Ｄ）。ｓｉＲＮＡ治療を使用して、正常細胞及び部分的なＳＴＩＮＧ活性を保持するように見える２個の黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＳＫ−ＭＥＬ３１）内のＳＴＩＮＧ発現をノックダウンして、これらのｄｓＤＮＡ誘発性サイトカインの上方調節がＳＴＩＮＧ依存性であったことを確認した。まとめると、本発明者らのデータは、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達は、黒色腫細胞の大部分においてほとんどが正常に機能せず、ＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１のみが、弱いＳＴＩＮＧ活性を呈したことを示す。
【０１５７】
黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ依存性ＴＢＫ１−ＩＲＦ３活性化の損失。黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損の程度を検査するために、免疫蛍光顕微鏡検査法及び免疫ブロット分析によって、ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢ活性化を評価した。ｄｓＤＮＡで刺激されると、ＳＴＩＮＧは、自食作用と同様の手順で、ＴＢＫ１を伴ってＥＲからＮＦ−ｋＢ及びＩＲＦ３を含有する核周辺関連エンドソーム領域まで急速に転座を経る（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この出来事は、ＳＴＩＮＧリン酸エステル化及び分解を伴い、慢性炎症を招くことが現在分かっている持続的なＳＴＩＮＧ誘発性サイトカイン産生をほぼ確実に避ける（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本発明者らの結果は、正常ｈＴＥＲＴ細胞内でのｄｓＤＮＡ治療後、ＳＴＩＮＧが、核周辺領域へ転座してリン酸エステル化及び分解事象を経たことを裏付けた（図２７Ａ及び２７Ｄ、左パネル）。このプロセス中、ＴＢＫ１、ならびにその同種標的ＩＲＦ３及びＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットは、ｈＴＥＲＴ細胞内でリン酸エステル化された（図２７Ｄ）。細胞核へのＩＲＦ３及びｐ６５転座も観察され、正常な活性化を示した（図２７Ｂ、Ｃ、及びＤ）。同様の効果が、部分的なｄｓＤＮＡ依存性サイトカイン産生を呈したＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１細胞において観察され、これら２つの細胞株が、多少のＳＴＩＮＧ機能を保持したことを確認した（図２７Ａ〜Ｄ及び図２６Ｂ〜Ｄ）。しかしながら、ＲＰＭＩ７９５１及びＳＫ−ＭＥＬ−３は、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を保持し、ｄｓＤＮＡ治療時に同様のＩＲＦ３活性化を示したが、これらの細胞はｐ６５転座を欠いていた。この観察は、なぜｄｓＤＮＡが、その転写活性化にＩＲＦ３及びＮＦ−ｋＢの両方を必要とするＩ型ＩＦＮ産生を誘起できなかったのかを説明するだろう（図２７Ａ〜Ｄ及び図２６Ｂ〜Ｄ）。加えて、ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳ発現が検出されなかった細胞（Ａ３７５、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、及びＳＫ−ＭＥＬ−５等）において、ＴＢＫ１またはＩＲＦ３リン酸エステル化／転座の証明は、ｄｓＤＮＡ治療後にこれらの細胞内で検出されなかった（枠線によって強調される）（図２７Ｂ、Ｄ）。リン酸エステル化されたｐ６５が観察されたが、この転写因子の細胞核への転座は、ＲＰＭＩ７９５１、ＳＫ−ＭＥＬ−３、Ａ３７５、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞のいずれにおいても明らかではなかった（図２７Ｃ〜Ｄ）。これらの結果は、ｄｓＤＮＡに誘発されるＳＴＩＮＧシグナル伝達が、検査された黒色腫細胞株の多くにおいて経路に沿って様々な点で脱調節されることを示す。例えば、ＳＴＩＮＧは、ＲＰＭＩ７９５１及びＳＫ−ＭＥＬ−３細胞内で見られるように、多少のシグナル伝達活性、及びＩＲＦ３の転座を誘発する能力を保持したが、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達が影響を受けることが観察された。対照的に、ＳＴＩＮＧは、Ａ３７５、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内において、いかなるリン酸エステル化または転座も経るようには見えず、ＳＴＩＮＧ機能が、恐らくＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳ発現の損失に起因して、ＩＲＦ３／ＮＦ−ｋＢ活��化の上流で影響を受けたことを示唆した。
【０１５８】
ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現のＲＮＡｓｃｏｐｅ及びＩＨＣ分析。ＳＴＩＮＧ経路が、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの存在を必要とするため、及びＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳ発現が、検査された黒色腫細胞の約４０％において不在であったことが観察されたため、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの存在が測定可能であることは、黒色腫内の機能性ＳＴＩＮＧシグナル伝達の予測において有用であり得る。免疫ブロット及びＲＴ−ＰＣＲ方法論は、培養細胞株内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の検査において有効であるが、生検組織はしばしば、腫瘍細胞だけではなく、正常なＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を保持し得る浸潤免疫細胞を含む、他の細胞型も含有する（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。このため、癌細胞自体内のＳＴＩＮＧ及び／もしくはｃＧＡＳタンパク質またはＲＮＡ発現の分析が、これらの産物の存在の正確な評価には必要である。上述のように、個体細胞内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ  ｍＲＮＡコピーを効率的に検出可能なＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を使用するＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ。ＦＩＴＣ標識ＳＴＩＮＧプローブ（緑）及びＣｙ５標識ｃＧＡＳプローブ（赤）を使用することによって、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＦＩＳＨ）を使用して黒色腫細胞を検査した。結果は、同じアッセイ内で組み合わせた両方のプローブが、対照ＨＥＭａ細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ｍＲＮＡを効果的に検出したことを示した。ＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡは、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、及びＳＫ−ＭＥＬ−３１細胞内でも検出されたが、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内では検出されなかった一方、ｃＧＡＳ  ｍＲＮＡは、Ａ３７５またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内で検出されなかった（図２８Ａ）。本発明者らの発現分析を使用して得た本発明者らの以前の結果と一致している結果を用いて、ｍＲＮＡコピー数を定量化した（図２６Ａ、２８Ａ）。このようにして、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析は、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を単一細胞内で同時に効果的に定量化することができた。
【０１５９】
パラフィン包埋された黒色腫細胞の色原体蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＣＩＳＨ）によって、ｍＲＮＡ発現も評価した。この状況は、バイオマーカー分析に生検及びパラフィン包埋された患者由来の材料が一般的に使用される状況を模倣することができる。この研究は、以前の通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ｍＲＮＡ発現の両方の検出及び定量化が可能であった。Ａ３７５細胞内では、ＳＴＩＮＧのみが検出されたが、ｃＧＡＳは存在しなかった。ＳＴＩＮＧは、Ｇ３６１またはＭｅＷｏ細胞内では検出されなかった。ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内では、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方が存在しなかった（図２８Ｂ）。ＲＮＡ  ＣＩＳＨ分析全体は、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ評価と同様の結果を生成した。
【０１６０】
ｃＧＡＳ及びＳＴＩＮＧに対する抗体を使用して、パラフィン包埋された細胞上で免疫組織化学（ＩＨＣ）分析も実施し、本発明者らの免疫ブロット及びＲＮＡｓｃｏｐｅ研究と一致するｃＧＡＳ及びＳＴＩＮＧタンパク質発現ステータスを確認した（図２８Ｃ）。
【０１６１】
黒色腫ＴＭＡ内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現のＩＨＣ分析。患者由来の黒色腫試料内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を評価するために、本発明者らは、続いて、８個の正常皮膚組織、８個の良性母斑組織、５６個の悪性黒色腫組織、及び２４個の転移性黒色腫組織を含有するパラフィン包埋された黒色腫組織マイクロアレイ（ＴＭＡ、ＭＥＬ９６１、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ）をＩＨＣ分析によって検査した。全ての正常組織がＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方を発現したことが観察された。ｃＧＡＳは、２個の良性母斑組織内では検出されなかったが、ＳＴＩＮＧは、全８個の母斑内に存在したことに注目した。悪性黒色腫組織内では、黒色腫試料の２３．２％が、ＳＴＩＮＧ発現を損失していたが、黒色腫試料の１６．１％は、ｃＧＡＳを発現せず、黒色腫組織の１４．３％において、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方が存在しなかった。より進行した転移性黒色腫組織では、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方の損失がより深刻であった（４１．７％）（図２９）。このデータを考慮すると、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現の抑制は、ヒト黒色腫、及びもっともらしく他のヒト癌においてもよく生じ得る（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。要約すると、本発明者らのＩＨＣ手順は、ＦＦＰＥで保存された臨床腫瘍試料内のｃＧＡＳ及びＳＴＩＮＧ発現の分析に有用であり得る。
【０１６２】
ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現は、黒色腫細胞内のＤＮＡ過剰メチル化によって抑制され得る。ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の損失は、遺伝子変化または変異のいずれかを通して生じ得る。黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの遺伝子ステータスを評価するために、本発明者らは、全１１個の黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ遺伝子を配列決定した。全ＳＴＩＮＧ遺伝子（イントロン及びエクソンは、染色体５ｑ３１．２上で約７．２ｋｂを構成する）の配列分析は、１１個中７個の黒色腫細胞が、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧバリアントを呈したことを示し（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３）、これは、集団の約２０％において生じることが以前に報告されている。全黒色腫細胞ならびに正常ＨＥＭａ細胞内のＳＴＩＮＧ遺伝子は、Ｒ２７２多型を含有し、これは集団の約８５％を表すが、ＳＴＩＮＧ機能にいかなる欠損も付与しないことが報告されている。まとめると、配列分析は、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ遺伝子のいかなる主要な遺伝子欠損も明らかにしなかった。ｃＧＡＳエクソン上でも同様の配列分析を行った。しかしながら、主要な変異または欠失は認められなかった。まとめると、遺伝子突然変異または欠失は、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現欠損に関与するようには見えない。
【０１６３】
これを考慮して、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現が、プロモーター領域の過剰メチル化等のエピジェネティックプロセスによって抑制されたかどうかを検査した（２０、２１）。実際に、データバンク分析は、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳプロモーター領域内の多量のＣｐＧアイランドの存在を示した。したがって、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現のいずれかを欠いている黒色腫細胞を、脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ＡＺＡＤＣ）で５日間治療し、ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現の繰り返しを評価した。リアルタイムＰＣＲ分析は、ｃＧＡＳ発現が、Ａ３７５細胞において、ならびに低い程度ではあるがＳＫ−ＭＥＬ−５細胞において回復したことを示した。ＳＫ−ＭＥＬ−２４は、ＲＴ−ＰＣＲによって低いｃＧＡＳ発現を呈したが、５ＡＺＡＤＣ治療は、ＳＫ−ＭＥＬ−２４細胞のｃＧＡＳ発現レベルに有意に影響を及ぼすようには見えなかった（図３０Ａ）。この結果は、ｃＧＡＳ発現が、５ＡＺＡＤＣ脱メチル化の後、Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内で一見したところ繰り返された、免疫ブロット及びＲＮＡ  ＦＩＳＨ分析の両方によって再び確認された（図３０Ｂ〜Ｃ）。ＭｅＷｏ細胞内では、ＳＴＩＮＧ発現は、免疫ブロット及びＲＮＡ  ＦＩＳＨ分析の両方によって示されるように、５ＡＺＡＤＣ治療によって復活した。しかしながら、ＳＴＩＮＧは、同様に治療されたＧ３６１細胞ならびにＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内で不在のままであったが、ｃＧＡＳ発現は、同じく治療されたＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内において部分的に復活した（図３０Ａ〜Ｃ）。したがって、ＤＮＡ過剰メチル化は、いくつかの黒色腫細胞（Ａ３７５及びＭｅＷｏ）内のＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ発現のサイレンシングに関与している。しかしながら、ＳＴＩＮＧの発現レベルが、なぜ残りの黒色腫細胞（Ｇ３６１、ＳＫ−ＭＥＬ−５）内で弱められるのかは、まだ明らかにはなっていない。ヒストン修飾等の他のエピジェネティックな修飾またはｍｉＲＮＡ等の他の転写調節因子は、ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳ発現の抑制に関与し得る（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｙａｒｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現の再構成が、ＳＴＩＮＧ依存性ｄｓＤＮＡシグナル伝達を救出したかどうかを判定するために、ｄｓＤＮＡ刺激の後、５ＡＺＡＤＣで治療された黒色腫細胞内のＩＦＮＢ及びＣＸＣＬ１０誘発を検査した。ＩＦＮＢ及びＣＸＣＬ１０産生の両方の誘発が、ｃＧＡＳが救出されたＡ３７５細胞内で観察され、同様に、ＳＴＩＮＧが救出されたＭｅＷｏ細胞内のＩＦＮＢの適度の発現が、ＩＲＦ３及びＳＴＩＮＧ転座と同時に観察された（図３０Ｄ〜Ｇ）。５ＡＺＡＤＣ治療後、Ｇ３６１またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞内でＳＴＩＮＧ機能が観察されなかったが、ＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方が、ｄｓＤＮＡに刺激されるサイトカイン産生に必要であることが確認された（図３０Ｄ〜Ｅ）。このため、脱メチル化剤は、選択された黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫遺伝子の誘発を部分的に救出することが可能であり得る。
【０１６４】
ＳＴＩＮＧシグナルの欠損は、黒色腫細胞をＤＮＡウイルス感染に対して感受性にする。ＳＴＩＮＧ先天性免疫シグナル伝達は、ＤＮＡウイルスに対する宿主防御応答において極めて重要な役割を果たす。例えば、ＳＴＩＮＧを欠いているマウスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染に極めて罹患し易い（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（ＯｎｃｏＶｅｘ、Ｔ−ＶＥＣ）と称されるγ３４．５遺伝子を欠いているＨＳＶ１の株は、現在、治験において黒色腫を含む癌治療のための治療薬として評価されている（Ａｎｄｔｂａｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｌａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｋｏｌｏｄｋｉｎ−Ｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、腫瘍崩壊の機構は、依然として完全には決定されておらず、現在、ＨＳＶ由来の抗腫瘍治療の有効性を適当に判定するための評価は存在しない。ＳＴＩＮＧ活性が、多数の結腸癌細胞内で欠損しており、これは細胞を、ＨＳＶ１を含むＤＮＡウイルス感染に罹患し易くすることが以前に示されていた。本発明者らは、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ機能の損失が、ＤＮＡウイルス感染及び複製に対する感受性の上昇と相関し得ることを想定した。もっともらしく、ＳＴＩＮＧの効果的にシグナル伝達する能力は、ＨＳＶ由来の腫瘍ウイルス療法に影響を及ぼし得る。これに対する取り組みを開始するために、本発明者らは、黒色腫細胞または対照ｈＴＥＲＴ及びＨＥＭａを、ヒト黒色腫に対する腫瘍溶解剤として現在調査されている株と同様のγ３４．５遺伝子を欠いているＨＳＶ１に感染させた。γ３４．５ウイルスタンパク質は、宿主防御応答を抑制することが提案されているが、その機構が完全に解明される必要がある。このため、ＨＳＶ１γ３４．５は、宿主先天性免疫シグナル伝達の強い抑止を伴わずに、Ｉ型ＩＦＮ産生を含む、ＳＴＩＮＧ依存性の先天性免疫活性化を強く誘起することができる（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｄｓＤＮＡ治療と同様に、ＨＳＶ１γ３４．５は、対照ｈＴＥＲＴ及びＨＥＭａ細胞内、ならびに部分的なＳＴＩＮＧシグナル伝達を保持したＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１細胞内で、ＩＦＮＢ及びＣＸＣｌ１０  ｍＲＮＡｓの強い産生を誘発した（図３１Ａ〜Ｂ）。しかしながら、残りの黒色腫細胞内では、Ｉ型ＩＦＮ産生はほとんど観察されなかった。Ｉ型ＩＦＮを誘発する能力の損失は、ＨＳＶ１γ３４．５複製の増加と相関しており、特にＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を欠いている黒色腫細胞（Ａ３７５、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、及びＳＫ−ＭＥＬ−５）において、これは正常に機能しない抗ウイルス効果に起因する可能性が高かった（図３１Ｃ）。さらに、ＳＴＩＮＧシグナルを欠損している細胞が、恐らくは強いウイルス複製に起因して、急速な細胞死を経た一方、対照細胞及び部分的なＳＴＩＮＧ機能を有する細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２４及びＳＫ−ＭＥＬ−３１）は、はるかにより抵抗力があった（図３１Ｄ）。このデータは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を呈する黒色腫細胞が、より多くのＨＳＶ１複製及び溶解が可能であったことを裏付けた。
【０１６５】
黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ機能の不在下で宿主先天性免疫シグナル伝達を活性化するワクシニアウイルス（ＶＶ）の能力も検査した。感染した細胞の細胞質内で複製する１９０ｋｂゲノムを有するｄｓＤＮＡウイルスであるＶＶは、癌を治療するための腫瘍溶解性治療薬として現在評価中のＤＮＡウイルスの別の候補である（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＨＳＶ１γ３４．５下での本発明者らの観察と同様に、ＶＶは、対照細胞及び部分的なＳＴＩＮＧ機能を有する黒色腫細胞内でのみＩ型ＩＦＮ及びＣＸＣＬ１０産生を誘起し、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を損失している細胞内では誘起しなかった（Ａ３７５、Ｇ３６１、ＭｅＷｏ、及びＳＫ−ＭＥＬ−５）。本発明者らの結果は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有する黒色腫細胞が、ＨＳＶ１及びＶＶ感染に対して高度の感受性を示すことを示す。このため、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現を欠いている黒色腫は、ＤＮＡウイルス腫瘍溶解性活性により反応し易く、黒色腫組織内のＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現が測定可能であることは、選択された腫瘍溶解性ウイルス療法に対する患者の応答の予測を補助し得るということが妥当である。
【０１６６】
ＨＳＶ１γ３４．５療法に対する黒色腫細胞のインビボ分析。本発明者らのインビトロ分析は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の損失が、選択した腫瘍ウイルス療法の効果に影響を及ぼし得ることを示した（図３１Ａ〜Ｄ）。この可能性をさらに評価するために、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を部分的に持つ（ＲＰＭＩ７９５１及びＳＫ−ＭＥＬ−３）、またはＳＴＩＮＧシグナル伝達を欠損している（Ａ３７５、ＭｅＷｏ、及びＳＫ−ＭＥＬ−５）黒色腫細胞をヌードマウスに皮下接種することによって、インビボで黒色腫異種移植を生成した。次いで、ＨＳＶ１γ３４．５を腫瘍内に投与し、腫瘍成長を監視した（図３２）。結果は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達欠損を有する黒色腫細胞に由来する腫瘍が、ＨＳＶ１γ３４．５治療に対して極めて感受性であったことを示した（図３２Ａ〜Ｂ）。腫瘍サイズは、ＨＳＶ１γ３４．５治療後に急速に減少した。６個中４個のＡ３７５腫瘍及び５個中３個のＳＫ−ＭＥＬ−５腫瘍は、治療の２〜３週間後に縮小した（図３２Ａ〜Ｂ）。対照的に、部分的なＳＴＩＮＧシグナル伝達を呈する黒色腫細胞に由来する腫瘍（ＲＰＭＩ７９５１及びＳＫ−ＭＥＬ−３）は、ウイルス腫瘍溶解性治療に不応性であった（図３２Ｃ〜Ｄ）。これらの腫瘍はインビボでゆっくりと成長するが、マウスの大半は、ＨＳＶ１γ３４．５療法に全く応答せず、動物は、腫瘍組織量が著しく増加した後に処分した。したがって、本発明者らの結果は、本発明者らの以前の研究を補足し、黒色腫内のＳＴＩＮＧ機能を測定する能力が、ヒト黒色腫及びもしかすると他の型の癌に対するＤＮＡウイルス関連腫瘍溶解性療法の効果を予測し得ることを示す。
【０１６７】
考察
【０１６８】
上記で報告されるように、ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ヒト結腸癌内でしばしば抑制される。言及されるように、内因性のＳＴＩＮＧシグナルの損失は、ＤＮＡ損傷への応答及び免疫監視機構への警告ができないため、癌発生の予防において重要な役割を果たし得る（Ｃｈａｔｚｉｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらの研究を拡大するために、黒色腫内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の発現及び調節を分析し、ＳＴＩＮＧ依存性のサイトカイン産生がヒト黒色腫内でしばしば抑制されることを同様に発見した。ＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳ遺伝子に関与する有意な変異または欠失事象は観察されなかったが、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の阻害は、主にＳＴＩＮＧ及びまたはｃＧＡＳ発現のエピジェネティックな抑制を通して生じることが分かった。細胞質ＤＮＡに媒介されるＳＴＩＮＧシグナル伝達が、一部のＳＴＩＮＧを欠損している黒色腫細胞内において脱メチル化剤（５ＡＺＡＤＣ）治療によって部分的に救出されたため、ＤＮＡ過剰メチル化が、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ抑制の機構のうちの１つであることを示唆した。しかしながら、一部のＳＴＩＮＧを欠損している黒色腫細胞内では、脱メチル化は、ＳＴＩＮＧ発現を復活可能であるかにおいて有効ではなかった。ＳＴＩＮＧ及び／またはｃＧＡＳは、選択的に、様々な段階の癌発生における抑制、またはＳＴＩＮＧ機能を妨げるのに十分であることの抑制の標的になり得る。いくつかの黒色腫細胞内において、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳの両方が発現されたが、転写因子ＮＦ−κＢまたはＩＲＦ３を効果的に活性化するＳＴＩＮＧの能力が、依然として決定されていない分子機構によって正常に機能しなかったことも分かった。このため、ＳＴＩＮＧ機能は、シグナル伝達経路に沿った異なるステップにおいて正常に機能しない可能性があるが、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現のいずれかのエピジェネティックな抑制が、よく見られるようである。まとめると、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達が、多数の黒色腫内で欠損していたことが観察され、ＳＴＩＮＧ機能の阻害が、黒色腫の発生のための重要な義務であり得、もっともらしく、かかる細胞が免疫系を回避することを可能にすることを示した。
【０１６９】
ＳＴＩＮＧの損失は、腫瘍内で共通している可能性があり、さらに抗癌療法に対する効果を予測し得る。したがって、いずれかの損失がＳＴＩＮＧ機能に影響を及ぼすだろうＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳの両方の発現レベルを評価するためのアッセイを本明細書において開発した。これらのアッセイは、黒色腫において有効であり、ＲＮＡｉｓｈに基づくアッセイ及びＩＨＣに基づくアッセイの両方が、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を正確かつより高感度に測定可能であったことを示した。ＩＨＣを使用して、黒色腫ＴＭＡをスクリーンすると、悪性黒色腫の５０％超及び転移性黒色腫の６０％超においてＳＴＩＮＧまたはｃＧＡＳのいずれかの損失を示した。ＳＴＩＮＧ機能の損失は、重要な腫瘍発症要因ではない可能性がある。しかしながら、ＳＴＩＮＧは、確かにＤＮＡ損傷に応答するサイトカインの生成において重要であるように見える（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＳＴＩＮＧ機能の損失は、免疫監視及び特に腫瘍転移に有益である宿主抗腫瘍免疫を逃れるため、後期の癌発生においてほぼ確実に重要である。記載されるアッセイは、選択した治療的介入に対する癌の有効な応答率の予測において有用であり得る。さらに、新規の抗腫瘍遺伝子療法のアプローチによる腫瘍内のＳＴＩＮＧシグナル伝達の繰り返しは、逃れた腫瘍細胞に対して宿主抗腫瘍免疫を再活性化し得る。
【０１７０】
したがって、黒色腫細胞内のＳＴＩＮＧ機能の損失が、ＤＮＡウイルス媒介性腫瘍溶解効果（ＨＳＶ１等）に対して細胞を非常に反応し易くしたことが分かった。腫瘍溶解性ＨＳＶ１は、臨床用途におけるウイルス性治療薬の１つである。例えば、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｔ−ＶＥＣ）（Ａｍｇｅｎ）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現して免疫認識を上昇させるように操作された、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に基づくＯＶである。Ｔ−ＶＥＣは、進行性黒色腫のための従来の免疫療法に対して改善された効果を示しているが、全応答率は依然として限定されている。この現象は、黒色腫症例間の多様なＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ発現ステータスによる可能性がある。腫瘍溶解性ウイルスは、溶解によって腫瘍細胞を直接破壊できるだけではなく、抗腫瘍免疫応答の活性化のための腫瘍抗原源を作製することもできる（Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＳＴＩＮＧは、これらのプロセスの両方において重要な役割を果たし得る。したがって、分子バイオマーカーとしてＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳを利用することは、癌治療のための微生物の使用に対する応答をより予測可能にし得る。かかるアッセイは、ＣＤＮに基づく他のＳＴＩＮＧ依存性抗腫瘍療法、またはさらにＤＮＡ付加体由来の化学治療用レジームの有効性についての洞察ももたらし得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳステータスの修飾を含む遺伝子療法は、宿主先天性及び適応性防御機構を利用し、従来の抗腫瘍療法と組み合わせて抗腫瘍効果を促進する利点を提供し得る。このため、癌発生におけるＳＴＩＮＧシグナルに関する更なる研究は、ヒト発癌の分子機構に関する洞察を提供するだけではなく、新規の抗腫瘍治療アプローチを提供する。
【０１７１】
実験手順
材料。全ての試薬は、指示がない限り、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＳｉｇｍａから得た。
【０１７２】
細胞培養。正常なヒトメラニン形成細胞（ＨＥＭａ）及びヒト黒色腫細胞株を、それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＡＴＣＣから購入し、その指示に従ってそれらの適切な成長培地中で培養した。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１テロメラーゼ線維芽細胞（ｈＴＥＲＴ）を元はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、３７℃及び５％ＣＯ２加湿環境下で、４：１の比率のＤＭＥＭ：Ｍｅｄｉｕｍ１９９補充物（１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む）中で培養した。
【０１７３】
免疫ブロット分析。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で解析し、次いで、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。５％ブロッキング試薬でブロッキングした後、様々な一次抗体（及び適切な二次抗体）を用いて膜をインキュベートした。強化化学発光システムＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像を解像し、オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ）によって検出した。抗体：Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００８に既に記載されているように、ＳＴＩＮＧに対するウサギポリクローナル抗体を本発明者らの研究室で作製し、他の抗体を以下の供給源から得た：β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐ−ＩＲＦ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＩＲＦ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−ＴＢＫ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＴＢＫ１（Ａｂｃａｍ）、ｃＧＡＳ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０１７４】
インターフェロンβＥｌｉｓａ分析。上述のようにインターフェロンβＥｌｉｓａを実施した。
【０１７５】
免疫蛍光顕微鏡検査法。細胞を培養し、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライド上でそれらの適切な培地中で治療した。細胞を３７℃で１５分間にわたり４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で５分間にわたり０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。ウサギ−抗ＳＴＩＮＧポリクローナル、ウサギ−抗ＩＲＦ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはウサギ−抗ｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、続いて、蛍光複合体化された二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ−抗ウサギ）を用いて、免疫染色を実施した。Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉにおいて、Ｌｅｉｋａ  ＬＳＭ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。
【０１７６】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１７７】
免疫組織化学及び組織学的分析。Ｐａｎｔｏｍｉｃｓから組織マイクロアレイを購入した。標準プロトコルに従ってウサギ−抗ｃＧＡＳ抗体またはウサギ−抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いて免疫組織化学染色を実施した。
【０１７８】
ウイルス増幅、精製、滴定、及び感染。ＨＳＶ−１γ３４．５は、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒｏｉｚｍａｎより提供頂いた。ワクシニアウイルス（ｖＴＦ７−３）は、Ｊｏｈｎ  Ｒｏｓｅより提供頂いた。標準プロトコルに従って、ウイルスをベロ細胞内で増幅し、スクロース勾配超遠心分離によって精製した。段階希釈ウイルスを使用するプラークアッセイを、標準プロトコルに従ってベロ細胞内で実施した。細胞を、特定のＭ．Ｏ．Ｉ．で１時間かけてウイルスに感染させて洗浄し、次いで、特定のアッセイ検査用に指定された期間インキュベートした。
【０１７９】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＲＮＡプローブされたＳＴＩＮＧ及びｃＧＡＳは、ＡＣＤによって特注設計されており、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、製造業者の指示に従って、培養細胞に対してＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用し、ＦＦＰＥ細胞及び組織に対して２−ｐｌｅｘ  ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して、実施した。
【０１８０】
マウス治療。Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒからＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスを購入し、ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＤＶＲ）で維持した。ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の認可の下、かつＩＡＣＵＣガイドラインに従って、全ての実験を実施した。腫瘍細胞を、適切な腫瘍細胞の２Ｅ１０６の皮下注射によってＢａｌｂ／ｃヌードマウスの脇腹内に導入し、腫瘍を約０．５ｃｍの平均直径まで発達させた。次いで、ＨＳＶ１γ３４．５を一日おきに合計３回、１Ｅ７ＰＦＵで腫瘍内に注射した。ビヒクル対照としてＰＢＳを使用した。腫瘍成長における効果を監視した。腫瘍直径が１０ｍｍを超えると、マウスを安楽死させた。
【０１８１】
ゲノムＤＮＡの配列決定。ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを使用して黒色腫細胞ならびに正常細胞から抽出し、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用して特定の遺伝子座を配列決定した。
【０１８２】
統計分析。指示がない限り、スチューデントのｔ検定によって全統計分析を実施した。データは、Ｐ＜０．０５のとき、有意差があると見なされた。
【０１８３】
本発明は、その発明を実施するための形態と併せて記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、その範囲を制限しないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。
参考文献
Ａｈｎ，Ｊ．，Ｇｕｔｍａｎ，Ｄ．，Ｓａｉｊｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２０１２）．ＳＴＩＮＧ  ｍａｎｉｆｅｓｔｓ  ｓｅｌｆ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１９３８６−１９３９１．
Ａｈｎ，Ｊ．，Ｋｏｎｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２０１５）．Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．
Ａｈｎ，Ｊ．，Ｘｉａ，Ｔ．，Ｋｏｎｎｏ，Ｈ．，Ｋｏｎｎｏ，Ｋ．，Ｒｕｉｚ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２０１４）．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＳＴＩＮＧ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，５１６６．
Ａｌｌｅｎ，Ｉ．Ｃ．，ＴｅＫｉｐｐｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｗｏｏｄｆｏｒｄ，Ｒ．Ｍ．，Ｕｒｏｎｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｏｌｌ，Ｅ．Ｋ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ａ．Ｂ．，Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｈ．Ｈ．，Ｊｏｂｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ＮＬＲＰ３  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｌｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ２０７，１０４５−１０５６．
Ａｎｄｔｂａｃｋａ  ＲＨ，Ｋａｕｆｍａｎ  ＨＬ，Ｃｏｌｌｉｃｈｉｏ  Ｆ，Ａｍａｔｒｕｄａ  Ｔ，Ｓｅｎｚｅｒ  Ｎ，Ｃｈｅｓｎｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｄｕｒａｂｌｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒａｔｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５
Ａｒｔｈｕｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｈａｒａｉｂｅｈ，Ｒ．Ｚ．，Ｍｕｈｌｂａｕｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｅｚ−Ｃｈａｎｏｎａ，Ｅ．，Ｕｒｏｎｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｆｏｄｏｒ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  Ｊｏｂｉｎ，Ｃ．（２０１４）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，４７２４．
Ａｒｔｈｕｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｅｒｅｚ−Ｃｈａｎｏｎａ，Ｅ．，Ｍｕｈｌｂａｕｅｒ，Ｍ．，Ｔｏｍｋｏｖｉｃｈ，Ｓ．，Ｕｒｏｎｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｆａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｂ．Ｊ．，Ａｂｕｊａｍｅｌ，Ｔ．，Ｄｏｇａｎ，Ｂ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３８，１２０−１２３．
Ｂｕｒｄｅｔｔｅ，Ｄ．Ｌ．，Ｍｏｎｒｏｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｏｔｅｌｏ−Ｔｒｏｈａ，Ｋ．，Ｉｗｉｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｃｋｅｒｔ，Ｂ．，Ｈｙｏｄｏ，Ｍ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．（２０１１）．ＳＴＩＮＧ  ｉｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉ−ＧＭＰ．Ｎａｔｕｒｅ４７８，５１５−５１８．
Ｃａｉ，Ｘ．，Ｃｈｉｕ，Ｙ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｊ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ｃＧＡＳ−ｃＧＡＭＰ−ＳＴＩＮＧ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ５４，２８９−２９６．
Ｃａｔａｉｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｈａｋｉｍ，Ｓ．，Ｍｏｆｆｉｔｔ，Ｂ．Ａ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌ．，Ｙｉ，Ｍ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．，Ｄａｉ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｙａｋｈ，Ｌ．，Ｓｃｈｅｎｔｅｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＩＬ−１Ｒ−ＭｙＤ８８  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ２０９，１６８９−１７０２．
Ｃｈａｔｚｉｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｇ．，Ｋａｒａｋａｓｉｌｉｏｔｉ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｇａｒｉｎｉｓ，Ｇ．Ａ．（２０１４）．ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｌｉｎｋｓ  ａｎｄ  ｔｒａｄｅ−ｏｆｆｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３５，４２９−４３５．
Ｃｏｒｒａｌｅｓ，Ｌ．，Ｇｌｉｃｋｍａｎ，Ｌ．Ｈ．，ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｋａｎｎｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｓｉｖｉｃｋ，Ｋ．Ｅ．，Ｋａｔｉｂａｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｗｏｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｅｍｍｅｎｓ，Ｅ．，Ｂａｎｄａ，Ｔ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ１１，１０１８−１０３０．
Ｃｏｒｔｈａｙ，Ａ．（２０１４）．Ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ？Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ５，１９７．
Ｄｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ，Ｍ．，Ｍａｓｓｉ，Ｅ．，Ｐｏｅｔａ，Ｍ．Ｌ．，Ｃａｒｏｔｔｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｎｉ，Ｓ．，Ｃｅｃｃｈｅｔｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｓｉｇｎｏｒｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｆａｚｉｏ，Ｖ．Ｍ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ＡＯＭ／ＤＳＳ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ１０，９．
ＤｅＳａｎｔｉｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｍａｒｉｏｔｔｏ，Ａ．Ｂ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ａｌｔｅｒｉ，Ｒ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｊｅｍａｌ，Ａ．（２０１４）．Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉｐ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１４．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ６４，２５２−２７１．
Ｅｌｉｎａｖ，Ｅ．，Ｓｔｒｏｗｉｇ，Ｔ．，Ｋａｕ，Ａ．Ｌ．，Ｈｅｎａｏ−Ｍｅｊｉａ，Ｊ．，Ｔｈａｉｓｓ，Ｃ．Ａ．，Ｂｏｏｔｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｐｅａｐｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｂｅｒｔｉｎ，Ｊ．，Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．（２０１１）．ＮＬＲＰ６  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｃｅｌｌ１４５，７４５−７５７．
Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．（２０１１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ６，４７９−５０７．
Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｗｏｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｙ．Ｘ．，ａｎｄ  Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｔ．Ｆ．（２０１３）．Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３４，６７−７３．
Ｆｕｋａｔａ，Ｍ．，Ｖａｍａｄｅｖａｎ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ａｂｒｅｕ，Ｍ．Ｔ．（２００９）．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）  ａｎｄ  Ｎｏｄ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＮＬＲｓ）  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２１，２４２−２５３．
Ｇａｌｌ，Ａ．，Ｔｒｅｕｔｉｎｇ，Ｐ．，Ｅｌｋｏｎ，Ｋ．Ｂ．，Ｌｏｏ，Ｙ．Ｍ．，Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｔｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．（２０１２）．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ｖｉａ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３６，１２０−１３１．
Ｇｏｌｄｓｚｍｉｄ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｐｒｉｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３，９３２−９３８．Ｈｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２０１２）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７９７，２１７−２３８．
Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．，Ｇａｇｌｉａｎｉ，Ｎ．，Ｚｅｎｅｗｉｃｚ，Ｌ．Ａ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｆ．Ｊ．，Ｂｏｓｕｒｇｉ，Ｌ．，Ｈｕ，Ｂ．，Ｈｅｄｌ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｗ．，Ｊｒ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＩＬ−２２ＢＰ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ４９１，２５９−２６３．
Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２００８）．ＳＴＩＮＧ  ｉｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｄａｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ４５５，６７４−６７８．
Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｍａ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２００９）．ＳＴＩＮＧ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ４６１，７８８−７９２．
Ｊａｃｏｂｙ，Ｒ．Ｆ．，Ｌｌｏｒ，Ｘ．，Ｔｅｎｇ，Ｂ．Ｂ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｂｒａｓｉｔｕｓ，Ｔ．Ａ．（１９９１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｋ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  １，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｒａｔ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｕｃｏｓａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ８７，６２４−６３０．
Ｊｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．（２０１３）．ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ７５４，３−２９．
Ｊｉｎ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｌ．Ｇ．，Ｙａｎｇ，Ｉ．Ｖ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ａ．，Ｗｕｒｆｅｌ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃａｍｂｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．（２０１１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＭＰＹＳ  ｖａｒｉａｎｔ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ１２，２６３−２６９．
Ｋａｕｒ，Ｂ．，Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒｉｐｅ，Ｔ．Ｐ．（２０１２）．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ＨＳＶ−１  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１３，１８４２−１８５１．
Ｋｉｄａｎｅ，Ｄ．，Ｃｈａｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｚｏｃｈｏｒ，Ｊ．，Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋ．Ａ．，Ｇｌａｚｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｗｅａｓｙ，Ｊ．Ｂ．（２０１４）．Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ４９，１１６−１３９．
Ｋｉｍ，Ｅ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｋ．（２０１４）．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ  ｒｉｓｋ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ：ＷＪＧ２０，９８７２−９８８１．
Ｋｏｌｏｄｋｉｎ−Ｇａｌ，Ｄ．，Ｅｄｄｅｎ，Ｙ．，Ｈａｒｔｓｈｔａｒｋ，Ｚ．，Ｉｌａｎ，Ｌ．，Ｋｈａｌａｉｌｅｈ，Ａ．，Ｐｉｋａｒｓｋｙ，Ａ．Ｊ．，Ｐｉｋａｒｓｋｙ，Ｅ．，Ｒａｂｋｉｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｐａｎｅｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｚａｍｉｒ，Ｇ．（２００９）．Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ１６，９０５−９１５．
Ｋｏｎｄｏ  Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，Ｓａｉｔｏｈ  Ｔ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｉ  ＫＪ，Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ＭＲＥ１１  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＳＴＩＮＧ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２０１３；１１０：２９６９−７４
Ｋｏｎｎｏ，Ｈ．，Ｋｏｎｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２０１３）．Ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ＵＬＫ１（ＡＴＧ１）ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ１５５，６８８−６９８．
Ｌａｗｌｅｒ  ＳＥ，Ｃｈｉｏｃｃａ  ＥＡ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５；３３：２８１２−４
Ｌａｏ，Ｖ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｇｒａｄｙ，Ｗ．Ｍ．（２０１１）．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ８，６８６−７００．
Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｊｅｓｕｓ，Ａ．Ａ．，Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｒａｍｓｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｍｏｎｔｅａｌｅｇｒｅ  Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｇ．Ａ．，Ｔｅｎｂｒｏｃｋ，Ｋ．，Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｉ，Ｈ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｏ．Ｙ．，Ｋｕｅｈｎ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＩＮＧ  ｉｎ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３７１，５０７−５１８．
Ｌｏｒｄ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，Ａ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ４８１，２８７−２９４．
Ｌｏｕｉｓ，Ｐ．，Ｈｏｌｄ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｆｌｉｎｔ，Ｈ．Ｊ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１２，６６１−６７２．
Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｈ．（２０１４）．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ５，１８２．
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｄｒｅｗ，Ｈ．Ｒ．，Ｈｏ，Ｔ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｎ．Ｆ．，Ｄｕｅｓｉｎｇ，Ｋ．Ｒ．，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｄｕｎｎｅ，Ｒ．，Ｂｅｅｔｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ１４，５４．
Ｎａｍｊｏｕ，Ｂ．，Ｋｏｔｈａｒｉ，Ｐ．Ｈ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ａ．，Ｇｌｅｎｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｏｊｗａｎｇ，Ｊ．Ｏ．，Ａｄｌｅｒ，Ａ．，Ａｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｇａｌｌａｎｔ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｏａｃｋｌｅ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒｉｓｗｅｌｌ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＲＥＸ１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｍｕｌｔｉ−ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｌｕｐｕｓ  ｃｏｈｏｒｔ．Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  １２，２７０−２７９．
Ｎｏｗａｒｓｋｉ，Ｒ．，Ｇａｇｌｉａｎｉ，Ｎ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ１，７７−８４．
Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００７）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｙＤ８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７，１２４−１２７．
Ｒｏｗｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｅｎ，Ｐ．（２０１４）．ＴｒｏＶａｘ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１０，３１９６−３２００．
Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｗｏｒｓｃｈｅｃｈ，Ａ．，Ｃａｒｄｏｎｅ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｙ．，Ｇｙｕｌａｉ，Ｚ．，Ｄａｉ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．，Ｍａ，Ｗ．，Ｈａｉｎｅｓ，Ｄ．，Ｏ’ＨＵｉｇｉｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．ＭｙＤ８８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ２０７，１６２５−１６３６．
Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｃａｔａｉｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｈａｓａｎ，Ｕ．，Ｙｕｓｐａ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．（２０１３）．ＭｙＤ８８  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｔｏｌｌ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３４，３７９−３８９．
Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ａ．Ｗ．，ＭｃＣｕｒｒａｃｈ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｅａｃｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．（１９９７）．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒａｓ  ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｎｄ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ．Ｃｅｌｌ８８，５９３−６０２．
Ｓｕｎ，Ｌ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｄｕ，Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｊ．（２０１３）．Ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ＡＭＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，７８６−７９１．
Ｓｗａｎｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｖｅｓｅｌｙ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｉｌｖａ，Ａ．，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｊ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．（２００８）．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，６５２−６５６．
Ｗｏｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｃｏｒｒａｌｅｓ，Ｌ．，Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｆｕｒｄｙｎａ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｄｕｇｇａｎ，Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＳＴＩＮＧ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４１，８３０−８４２．
Ｗｏｏ  ＳＲ，Ｃｏｒｒａｌｅｓ  Ｌ，Ｇａｊｅｗｓｋｉ  ＴＦ．Ｔｈｅ  ＳＴＩＮＧ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５；３６：２５０−６
Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｉａｖａｒｏｎｅ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．（２０１０）．ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａ  ｈｏｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２８，１７０３−１７０５．
Ｘｉａ  Ｔ，Ｋｏｎｎｏ  Ｈ，Ａｈｎ  Ｊ，Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ．Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｓ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６；１４：２８２−９７．
Ｙａｒｂｒｏｕｇｈ  ＭＬ，Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  Ｒ，Ｆｏｒｓｔ  ＣＶ，Ｐｏｓｎｅｒ  ＢＡ，Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉＲ−５７６−３ｐ  ｓｅｔｓ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１４；５：４９６３
Ｙｉ，Ｇ．，Ｂｒｅｎｄｅｌ，Ｖ．Ｐ．，Ｓｈｕ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｐａｌａｎａｔｈａｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋａｏ，Ｃ．（２０１３）．Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ  ｃａｎ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ７７８４６．
Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．（２０１０）．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ２０，４−２２．
Ｚｅｎｅｗｉｃｚ，Ｌ．Ａ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．（２００８）．Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２９，９４７−９５７．
Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ，Ｇａｌｌｕｚｚｉ  Ｌ，Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，Ｋｒｏｅｍｅｒ  Ｇ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：ｒｅｉｎｓｔａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３；３９：７４−８８．
【図１Ａ】
2018519278.tif 000005
【図１Ｂ】
2018519278.tif 000006
【図１Ｃ】
2018519278.tif 000007
【図１Ｄ】
2018519278.tif 000008
【図１Ｅ】
2018519278.tif 000009
【図２ＡＢＣＤ】
2018519278.tif 000010
【図２Ｅ−１】
2018519278.tif 000011
【図２Ｅ−２】
2018519278.tif 000012
【図３Ａ】
2018519278.tif 000013
【図３Ｂ】
2018519278.tif 000014
【図３Ｃ】
2018519278.tif 000015
【図４Ａ】
2018519278.tif 000016
【図４Ｂ】
2018519278.tif 000017
【図４Ｃ】
2018519278.tif 000018
【図４Ｄ】
2018519278.tif 000019
【図４Ｅ】
2018519278.tif 000020
【図４Ｆ】
2018519278.tif 000021
【図４Ｇ】
2018519278.tif 000022
【図５Ａ】
2018519278.tif 000023
【図５Ｂ】
2018519278.tif 000024
【図５Ｃ】
2018519278.tif 000025
【図５Ｄ】
2018519278.tif 000026
【図５Ｅ】
2018519278.tif 000027
【図５Ｆ】
2018519278.tif 000028
【図６Ａ】
2018519278.tif 000029
【図６Ｂ】
2018519278.tif 000030
【図６Ｃ】
2018519278.tif 000031
【図６Ｄ】
2018519278.tif 000032
【図７Ａ】
2018519278.tif 000033
【図７Ｂ】
2018519278.tif 000034
【図８Ａ】
2018519278.tif 000035
【図８Ｂ】
2018519278.tif 000036
【図８Ｃ】
2018519278.tif 000037
【図９Ａ】
2018519278.tif 000038
【図９Ｂ】
2018519278.tif 000039
【図１０Ａ】
2018519278.tif 000040
【図１０Ｂ】
2018519278.tif 000041
【図１１】
2018519278.tif 000042
【図１２】
2018519278.tif 000043
【図１３Ａ】
2018519278.tif 000044
【図１３Ｂ】
2018519278.tif 000045
【図１３Ｃ】
2018519278.tif 000046
【図１３Ｄ】
2018519278.tif 000047
【図１４Ａ】
2018519278.tif 000048
【図１４Ｂ】
2018519278.tif 000049
【図１４Ｃ】
2018519278.tif 000050
【図１５Ａ】
2018519278.tif 000051
【図１５Ｂ】
2018519278.tif 000052
【図１５Ｃ】
2018519278.tif 000053
【図１５Ｄ】
2018519278.tif 000054
【図１５Ｅ】
2018519278.tif 000055
【図１６Ａ】
2018519278.tif 000056
【図１６Ｂ】
2018519278.tif 000057
【図１６Ｃ】
2018519278.tif 000058
【図１６Ｄ】
2018519278.tif 000059
【図１６Ｅ】
2018519278.tif 000060
【図１６Ｆ】
2018519278.tif 000061
【図１７ＡＢ】
2018519278.tif 000062
【図１７Ｃ】
2018519278.tif 000063
【図１７Ｄ】
2018519278.tif 000064
【図１７Ｅ】
2018519278.tif 000065
【図１７Ｆ】
2018519278.tif 000066
【図１７Ｇ】
2018519278.tif 000067
【図１７Ｈ】
2018519278.tif 000068
【図１８Ａ】
2018519278.tif 000069
【図１８ＢＣ】
2018519278.tif 000070
【図１８ＤＥ】
2018519278.tif 000071
【図１９】
2018519278.tif 000072
【図２０Ａ】
2018519278.tif 000073
【図２０Ｂ】
2018519278.tif 000074
【図２０Ｃ】
2018519278.tif 000075
【図２０Ｄ】
2018519278.tif 000076
【図２１Ａ】
2018519278.tif 000077
【図２１Ｂ】
2018519278.tif 000078
【図２１Ｃ】
2018519278.tif 000079
【図２２】
2018519278.tif 000080
【図２３Ａ】
2018519278.tif 000081
【図２３Ｂ】
2018519278.tif 000082
【図２３Ｃ】
2018519278.tif 000083
【図２４】
2018519278.tif 000084
【図２５】
2018519278.tif 000085
【図２６Ａ】
2018519278.tif 000086
【図２６Ｂ】
2018519278.tif 000087
【図２６Ｃ】
2018519278.tif 000088
【図２６Ｄ】
2018519278.tif 000089
【図２７Ａ】
2018519278.tif 000090
【図２７Ｂ】
2018519278.tif 000091
【図２７Ｃ】
2018519278.tif 000092
【図２７Ｄ】
2018519278.tif 000093
【図２８Ａ】
2018519278.tif 000094
【図２８Ｂ】
2018519278.tif 000095
【図２８Ｃ】
2018519278.tif 000096
【図２９】
2018519278.tif 000097
【図３０Ａ】
2018519278.tif 000098
【図３０Ｂ】
2018519278.tif 000099
【図３０Ｃ】
2018519278.tif 000100
【図３０Ｄ】
2018519278.tif 000101
【図３０Ｅ】
2018519278.tif 000102
【図３０ＦＧ】
2018519278.tif 000103
【図３１Ａ】
2018519278.tif 000104
【図３１Ｂ】
2018519278.tif 000105
【図３１Ｃ】
2018519278.tif 000106
【図３１Ｄ】
2018519278.tif 000107
【図３２Ａ】
2018519278.tif 000108
【図３２Ｂ】
2018519278.tif 000109
【図３２Ｃ】
2018519278.tif 000110
【図３２Ｄ】
2018519278.tif 000111
【配列表】
2018519278000001.app
【国際調査報告】
2018519278.tif 000112
2018519278.tif 000113
2018519278.tif 000114
2018519278.tif 000115