(57)【要約】本発明は、ナノ粒子、及びナノ複合体材料、特にバイオナノ複合体材料を形成するためのナノ粒子の使用に関し、詳細には、上記ナノ粒子は、セルロース系材料及び／又はセルロース由来材料の足場に結合した植物ウイルスを使用して形成され、特に、上記セルロース系材料は、植物細胞構成要素、例えば、ヘミセルロース、ペクチン、タンパク質又はそれらの組み合わせをさらに含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウイルス足場を含むナノ複合体材料であって、前記非ウイルス足場に、少なくとも１種のウイルス粒子又はウイルス構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体であり、前記粒子の表面に官能性ペプチド又は全タンパク質又は酵素を提示するように修飾された、ウイルス粒子又はウイルス構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体が与えられる、ナノ複合体材料。
【請求項２】
非ウイルス足場に、少なくとも１種のウイルス粒子又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体であって、前記粒子の表面に官能性ペプチド又は全タンパク質又は酵素を提示するように修飾された、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体を与えるステップを含む、ナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項３】
前記足場を、前記少なくとも１種のウイルス粒子又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体と混合して、足場−ウイルス粒子混合物を用意するステップと、
前記混合物を乾燥させて、前記ナノ複合体を形成するステップと
を含む、請求項２に記載のナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項４】
前記足場が、セルロース系材料、セルロースの誘導体、セルロースナノ粒子若しくはナノセルロース、セルロースミクロフィブリル又はセルロースナノ結晶を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項５】
前記セルロース系材料が、ヘミセルロース、ペクチン、タンパク質、又はそれらの組み合わせから選択される、植物細胞構成要素をさらに含む、請求項４に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項６】
前記足場が、膜様層、ウェブ様層、又は架橋繊維マトリックスから選択される、２次元構造体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項７】
前記足場が、多層又は積層構造体を形成するために、２次元足場の第１の層、及び前記第１の層の上に形成された２次元足場の第２の層によって形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項８】
前記足場が、炭素繊維、カーボンナノチューブ、ガラス繊維、絹繊維、アラミド繊維、又は天然繊維（コイヤ、大麻、亜麻、黄麻、木質繊維、サイザル、わら、セルロースなどを含む）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項９】
前記非ウイルス足場が、セルロースナノ繊維／ミクロフィブリルの網状組織から構成される複数のセルロース断片、セルロースナノ繊維／ミクロフィブリルの前記網状組織内に位置する１種又は複数の親水性結合剤、及び前記複数のセルロース断片を封入するために前記親水性結合剤と相互作用するように配置された１種又は複数の疎水性結合剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１０】
前記非ウイルス足場が、複数の繊維で強化されたバイオ複合体材料を含み、前記バイオ複合体材料は、セルロースミクロフィブリルの網状組織から構成される１種又は複数のセルロース断片、セルロースミクロフィブリル／ナノ繊維の前記網状組織内に位置する１種又は複数の親水性結合剤、及び前記１種又は複数のセルロース断片を封入するために前記親水性結合剤と相互作用するように配置された１種又は複数の疎水性結合剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１１】
前記非ウイルス足場が、セルロース小板を含む、ナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法において、前記セルロース小板が、乾燥重量で少なくとも６０％のセルロース、乾燥重量で１０％未満のペクチン、及び乾燥重量で少なくとも５％のヘミセルロースを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１２】
前記非ウイルス足場が、３０重量％未満の抽出可能グルコース；及び開始植物材料中の抽出可能キシロースの量の少なくとも５％の量の抽出可能キシロースを含む植物由来セルロース粒子状材料を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１３】
前記ウイルス粒子、又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体が、前記ウイルス粒子、又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体の表面上の官能性ペプチドによる金属の還元から形成されたナノ粒子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１４】
前記ウイルス粒子、ウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体、又はそれらから形成されたナノ粒子が、植物ウイルス、非エンベロープ動物ウイルス、又はバクテリオファージである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１５】
前記ウイルス粒子、ウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体、又はそれらから形成されたナノ粒子が、植物ウイルスである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１６】
前記ウイルス粒子、又はウイルスタンパク質構成要素から形成されたウイルス様粒子若しくは構造体が、官能化されて、
ａ）金属イオンに結合し、又はそれを還元して、金属ナノ粒子の生成を可能にする、
ｂ）カルシウム及び／又はリン酸塩に結合する、
ｃ）化学反応で触媒活性を与え、又は抗菌若しくは抗バイオフィルム活性を与える、
ｄ）セルロース又はナノセルロース系材料に結合する、或いはａ）〜ｄ）を組み合わせる、ように構成された表面提示ペプチドを与える、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のナノ複合体材料又はナノ複合体材料を形成する方法。
【請求項１７】
塗料、コーティング、コンクリート、掘削流体、オプトエレクトロニクス、医薬品、バイオ医薬品、触媒又は触媒担体として、燃料電池技術、バイオリアクタ、電解質膜、センサ技術、特にバイオチップ、組織修復用３Ｄ足場材料、化粧品、骨修復、及びパーソナルケア製品の少なくとも１つにおける、請求項１、若しくは４〜１６のいずれか一項に記載の、又は請求項２〜１６のいずれか一項に記載のナノ複合体材料を形成する方法によって提供される、ナノ複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子、及びナノ複合体材料、特にバイオナノ複合体材料を形成するための、ナノ粒子の使用に関し、詳細には、ここで、ナノ粒子は、セルロース、セルロース系材料及び／又はセルロース由来材料の足場に結合した植物ウイルスを使用して形成される。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーナノ複合体に含まれるナノ粒子は、工業界が既存の材料に追加の特性を与えることによって材料を改善することを追求してきたので、ますます関心のある分野になっている。これは、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．Ｖａｉａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｏｄａｙ  ２００４，７，３２−３７で検討されている。
【０００３】
植物ウイルス及び植物ウイルスの自己集合性構成要素は、Ａｌａａ，Ａ．Ａ．Ａｌｊａｂａｌｉ，Ｊ．Ｅｌａｉｎｅ  Ｂａｒｃｌａｙ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｐ．Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１０，２，２５９６−２６００により検討されたとおりに、新規な材料及び金属ナノ粒子のためのテンプレートとして使用され得る見込みのあるナノ構築ブロックとして検討されてきた。官能化ウイルスは完全ウイルスから形成された足場構造体の一部として以前に提供されたが、これは、形成され得る構造体の点で限定的であった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ウイルス又はウイルス様構造体（例えば、ウルスの核酸を含まない、ウイルスの構造構成要素、又はウイルスからの構造構成要素から形成されたナノ粒子）を含むナノ材料及びナノ複合体材料であって、ウイルス又はウイルス様構造体が、ペプチド配列を含み得るか、或いは反応を可能にし、及び／或いはウイルス若しくはウイルス様構造体、又は非ウイルス足場材料若しくは構造体上に配置されたウイルス若しくはウイルス様構造から形成されたナノ粒子、への材料の結合を促進し得るようなペプチド若しくは全タンパク質（例えば、酵素）に縮合され得る、ナノ材料及びナノ複合体材料を決定している。これは、足場材料が広範囲に官能化されることを可能にし、及びより制御されたナノ複合体材料のナノ構造体又はミクロ構造体が形成されることを可能にする。例えば、強さ、剛性又は靭性の増加した機械的特性を有するナノ複合体材料を形成することによって、改善された官能性を足場材料に与えることができる。
【０００５】
本発明者らは、ウイルス粒子又はウイルスの構造構成要素によって形成されたウイルス様粒子若しくは他のナノ粒子であって、それらの表面上に、特定の官能性ペプチド又は全タンパク質（酵素を含む）を提示するように化学的又は遺伝的手段によって修飾された、ウイルス粒子又はウイルスの構造構成要素によって形成されたウイルス様粒子若しくは他のナノ粒子、特に植物ウイルス若しくはバクテリオファージ又はウイルス様粒子が、非ウイルス基材足場、例えば、セルロース由来足場と組み合わせて使用され、足場の上又は足場の中にウイルス粒子を有する足場を与えて、ナノ複合体材料を形成し得ることを決定している。特に、本発明者らは、植物材料からのナノセルロースが、その上又は中に官能化ウイルス（及びそれから形成されたナノ粒子）を配置することができる足場として用いられ得ることを決定した。これらのナノ複合体セルロース系材料は、種々の特性を有するセルロース系材料を与えることができ、及び様々な目的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ナノセルロースのみで行われたＳＥＭ分析を例示する。
【図２】非修飾ウイルスで官能化されたナノセルロースで行われたＳＥＭ分析を例示する。
【図３】ナノセルロースにおけるイムノゴールド標識非修飾ウイルスのＴＥＭ断面を例示する。
【図４】ＴＥＭ−ＭＢＰ官能化試料における銀ナノ粒子形成を例示する。
【図５】非修飾ＴＭＶ試料における銀ナノ粒子形成を例示する。
【図６】ヒドロキシアパタイト前駆体に露出されたナノセルース膜のＳＥＭを例示する。
【図７】ヒドロキシアパタイト前駆体で処理後の非修飾ウイルスで官能化されたナノセルロースで行われたＳＥＭ分析を例示する。
【図８】ヒドロキシアパタイト前駆体で処理後のＭＩＰ３修飾ウイルスで官能化されたナノセルロースで行われたＳＥＭ分析を例示する。
【図９】粘度（ＣＰ）に対するせん断速度ｓ−１を例示する。
【図１０】粘度（ＣＰ）に対するせん断速度ｓ−１を例示する。
【図１１】セルロースのみ（ａ）又はＳＰを有するセルロース（ｂ）又は球形粒子−ウシ腸アルカリホスファターゼを有するセルロース（ＳＰ−ＣＩＰ）（ｃ）から構成された乾燥膜が、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）と共にＣＩＰ基材（ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニル−ホスフェート）で洗浄された場合に観察される色変化を例示する。セルロースのみ（ａ）又はＳＰを有するセルロース（ｂ）から構成されるセルロース膜は、白色から暗青色への色変化なしにより示されるとおりに反応性をまったく示さなかった（図１１ａ、図１１ｂ）。対照的に、暗青色への強い色変化が、ＳＰ−ＣＩＰ酵素を含むナノセルロース膜で検出された（図１１ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、少なくとも１種のウイルス粒子であって、ウイルス粒子の表面に官能性ペプチドを提示するように修飾された少なくとも１種のウイルス粒子、を与えられている非ウイルス足場を含むナノ複合体材料を提供する。特定の実施形態において、ウイルス粒子及び非ウイルス足場は、非ウイルス足場又はウイルス粒子のいずれか単独でもたらされる特性と異なる特性を有するナノ複合体を与える。
【０００８】
実施形態において、官能性ペプチドは、目的の反応をできるようにさせるか、又は特定の基質、リガンド若しくは分子、例えば、抗体、金属イオン、カルシウムイオン若しくはＰＯ４３−をウイルスで結合させる、ウイルスの表面に設けられたペプチド配列であり得る。実施形態において、ペプチド配列は、全タンパク質、特に酵素を含むことができる。
【０００９】
ウイルス粒子は、ウイルス、又はウイルス様粒子若しくは構造体又はウイルスの構造構成要素から形成されたナノ粒子、例えば、核酸成分を含まないので感染性でないが、ペプチドを表面提示することができるウイルス粒子、を形成し得る、ウイルスの構造構成要素であってもよいことが適当である。例えば、ボビンパピローマウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＢＰＶ）のコートタンパク質は、様々な官能基を提示するために使用され得る球形ナノスケール構造体に自己集合することができる（Ｌｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍａｔｉｃ，Ｓ．，Ｎｏｒｉｓ，Ｅ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｔａｌｉａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｅ．２０１２．Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｐｌａｎｔａ  ２３６，１３０５−１３１３）。同様に、例えば、カウピーモザイクウイルス（Ｃａｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）及びヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）などの他のウイルスのコートタンパク質は、このような有用性を有する。さらに、一部の球形ＲＮＡ不含ナノ粒子も、ロッド形状ウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＭＶ）のコートタンパク質によって形成することができる。
【００１０】
本発明の第２の態様によれば、非ウイルス足場を含むナノ複合体材料を形成する方法であって、ウイルス粒子の表面に官能性ペプチドを提示するように修飾された、少なくとも１種のウイルス粒子、それからのウイルス様粒子又はナノ粒子を、非ウイルス足場に与えるステップを含む、方法が提供される。実施形態において、本発明の第１の態様のナノ複合体材料を形成する方法は、足場を修飾ウイルス粒子と混合して、足場−ウイルス粒子混合物を用意するステップと、この混合物を乾燥させて、ナノ複合体を形成するステップとを含む。
【００１１】
実施形態において、ナノ複合体材料は、多構成要素材料であり、ここで、構成要素のあるものは、１００ｎｍ未満の１つ、２つ又は３つの寸法を有する。典型的には、ナノ複合体は、構成要素材料の官能性と際立って異なる。
【００１２】
足場
実施形態において、足場は、高いアスペクト比、長い長さ及び制御可能な幅、例えば、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも１ミクロン、少なくとも２ミクロン、少なくとも３ミクロン、少なくとも４ミクロン、少なくとも５ミクロン又は５ミクロン超の長さを有する、非ウイルス繊維又は構造体、例えば、ポリマーロッド、カーボンナノチューブなどであり得る。
【００１３】
実施形態において、足場は、２次元構造体、例えば、膜様層、ウェブ様層又は架橋繊維マトリックス、を形成するように配置された、２種以上の非ウイルス繊維又は構造体を含み得る。実施形態において、２次元足場は、分離プロトコル、濃縮プロトコル、濾過プロトコルなどの用途のための大きな表面積を与える架橋非ウイルス繊維を含み得る。実施形態において、足場は、直鎖、分岐、超分岐ポリマー又はそれらの組み合わせを含む、ポリマー足場であり得る。
【００１４】
実施形態において、２次元足場構造体は、さらなる２次元足場構造体と組み合わされて、多層フィルム、又は積層構造体を与え得る。したがって、非ウイルス繊維及び／又は２次元足場構造体は、３次元足場の構築ブロックを形成し得る。実施形態において、足場は、第１の層を用意し、次いで、第１の層の上に第２の層を形成することによって形成されてもよい。
【００１５】
実施形態において、非ウイルス足場は、有機又は無機の足場を含み得る。特定の例において、足場は、炭素繊維、カーボンナノチューブ、ガラス繊維、絹繊維、アラミド繊維、大麻繊維、若しくは亜麻繊維又はそれらの組み合わせを含み得る。実施形態において、非ウイルス足場は、プラスチック又はセラミックを含み得る。
【００１６】
実施形態において、非ウイルス足場は、有機基材、例えば、有機ポリマーを含み得、例えば実施形態において、非ウイルス足場は、天然繊維ポリマーを含み得る。実施形態において、天然繊維ポリマーは、植物繊維、例えば、コイヤ（ｃｏｉｒ）、大麻、黄麻、木質繊維、サイザル、わら（ｓｔｒａｗ）、セルロースなどを含み得る。実施形態において、足場は、セルロース材料、例えば、セルロースの誘導体、セルロースナノ粒子、セルロースナノフィブリル又はナノ結晶を含み得る。
【００１７】
このようなセルロース系材料は、微結晶性セルロースと異なることが当業者によって理解される。実施形態において、本明細書で検討されるセルロース系材料は、セルロース系材料が、植物材料であって、セルロース系材料が植物材料から誘導される、植物材料からの植物細胞壁のさらなる構成要素を含む、例えば、ヘミセルロース、ペクチン、タンパク質又はそれらの組み合わせをさらに含む点で、微結晶性セルロースと異なることが適当である。これは、セルロース系材料を抽出するために使用される方法から明らかである。適当な実施形態において、植物細胞壁材料は、セルロース、ヘミセルロース（例えば、キシログルカン、キシラン、マンナン及びグルコマンナン）、ペクチン、及びタンパク質、例えば、糖タンパク質を含み得る。このような実施形態において、足場材料は、植物細胞、植物細胞壁若しくはその部分、関連植物細胞ポリマー構成要素、又はそれらの組み合わせを含み得、例えば、セルロース系材料を含む足場は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン及びタンパク質を含んでもよい。
【００１８】
実施形態において、足場は、モノリシック構造体であり得る。他の実施形態において、足場は、積層構造体であり得る。さらなる実施形態において、足場は、繊維状又はフィラメント状又は格子構造であり得る。ウイルス粒子及びそのナノ粒子は、足場によって秩序化単層（単数）又は秩序化単層（複数）を与えるように、足場に結合してもよいことが適当である。代わりに、ウイルス粒子及び／又はそのナノ粒子は、足場の全部又は部分にわたって分布されてもよい。足場の中又は上でのウイルス粒子の分布は、足場へのウイルス粒子及びそのナノ粒子の用意又は適用によって影響され得る。
【００１９】
本発明における使用のための非ウイルス足場はいくつかの異なる処理経路によって、生成され得る。例えば、非ウイルス足場がセルロース又はセルロース系材料を含む場合、それは、木系植物、例えば、木又は草木性植物、例えば、根菜から生成され得る。開始材料及び所望の最終生成物の性質に応じてセルロース足場を生成させるために一連の抽出方法が使用され得る。例えば、草木性植物材料からセルロース足場を生成させる抽出方法は、典型的には根菜開始材料に基づく抽出方法と異なる。しかしながら、抽出方法は、一般に１）酸抽出−例えば、５０〜９０℃で０．３Ｍ硫酸、２）アルカリ抽出−例えば、９０℃で０．１〜１Ｍ  ＮａＯＨ、３）酵素抽出、４）９０℃で過酸化水素抽出、５）漂白抽出、例えば、６０℃で次亜塩素酸ナトリウム、６）９０〜１１０℃での熱処理、７）均質化−高せん断又は高圧、から選択される工程を含んでもよい。
【００２０】
セルロースナノ繊維も、細菌から生産され得る。これは、細菌セルロースとして公知である。細菌の培養は、ナノ繊維構造を有する大量のセルロース材料の生産を可能にし得る（国際公開第２０１４１３３２４９号）。例えば、適当な微生物菌株が培地で培養されて、第１のセルロースゲルを調製してもよい。このセルロースゲルを、粉砕して、微粉化セルロースを得てもよい。微粉化セルロースにゲル化工程を受けさせて、第２のセルロースのゲルを得てもよい。実施形態において、第２のセルロースゲルは、第１のセルロースゲルと比較してより微粉化された繊維長さを有してもよいが、同様の水分含量又は密度を有してもよい。
【００２１】
これらの方法は、セルロースの所望の純度、及び足場を形成するために使用される最終セルロース生成物の所望の粒子サイズに依存して個別に、又は組み合わせて使用されてもよい。多くの場合、他の細胞壁構成要素が有用な官能性を加え得るので、不純なセルロースを有することが有利であり得る。例えば、キシログルカンなどのヘミセルロースが抽出材料中に有意な量でなお存在する場合、粘弾性処方のために有利であることが決定されている。これらの追加のポリマーは、セルロース単独よりもより良好な水素結合部位を与え得ると考えられる。
【００２２】
足場構造として作用し得るセルロース系材料は、いくつかの異なるプロセス経路によって作製することができ、種々の純度のセルロース及び種々の構造単位を有する材料をもたらす。適当な実施形態において、セルロース系材料は、それがセルロース単独よりもむしろ、植物細胞壁の構成要素を含むように与えられ、例えば、セルロース系材料は、セルロース、ヘミセルロース（例えば、キシログルカン、キシラン、マンナン及びグルコマンナン）、ペクチン、及びタンパク質、例えば、糖タンパク質を含み得る。このような実施形態において、セルロース系材料は、植物細胞、植物細胞壁若しくはその部分、関連植物細胞ポリマー構成要素、又はそれらの組み合わせを含み得、例えば、セルロース系材料を含む足場は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン及びタンパク質を含んでもよい。実施形態において、セルロース系材料は、少なくとも７０％のセルロース、１０％未満のペクチン及び少なくとも５％のヘミセルロースを粒子状セルロース材料の乾燥重量で含有する粒子状セルロース材料である、実質セルロースを含み得、ここで、粒子状材料は、光回折法により測定して２５〜７５マイクロメートルの範囲、好ましくは３５〜６５マイクロメートルの体積重み付けメジアン主要粒子寸法を有する。粒子の直径は、１２０マイクロメートル未満であるのが好ましく、１１０マイクロメートル未満であるのがより好ましい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、ナノセルロースは、限定されないが、ミクロフィブリル化セルロース（セルロースミクロフィブリル）、ナノフィブリル化セルロース、微結晶性セルロース、ナノ結晶性セルロース（セルロースナノ結晶）、及び粒状化又はフィブリル化された木材由来パルプを含めて、一連のセルロース系材料及びセルロースの誘導体を含むように広く定義される。典型的には、本明細書で提供されるとおりのナノセルロースは、ナノメートルスケールで少なくとも１つの長さ寸法（例えば、直径）を有する粒子を含む。本明細書で使用される場合のナノセルロース、ナノフィブリル化セルロース又はセルロースナノフィブリルは、ナノメートルサイズであり得るか、又はミクロン及びナノメートルサイズの両方の部分を有し得るセルロース繊維又は粒子も包含する。
【００２４】
実施形態において、ナノセルロースは、木材加工から供給され得る。実施形態において、ナノセルロースは、廃棄植物材料から供給され得る。実施形態において、植物材料は、ニンジン、カブラ、ルタバガ（ｓｗｅｄｅ）、リンゴ、テンサイ、ビートルート（ｂｅｅｔｒｏｏｔ）、ジャガイモ又はオニオンから選択されてもよい。
【００２５】
ナノセルロースは、繊維を機械的にせん断して、ミクロフィブリルを遊離させることによって供給されてもよいことが適当である。機械的せん断は、高圧均質化又は高せん断均質化によって行われてもよい。前処理、例えば、機械的切断、酸加水分解、アルカリ処理、酵素前処理、カルボキシメチル化、漂白処理、過酸化水素処理、又は２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）媒介酸化が用いられてもよいことが適当である。
【００２６】
セルロースミクロフィブリル若しくはナノ粒子、又はそれらから与えられるセルロースのナノ結晶は、本発明の足場を形成するために使用されてもよいことが適当である。実施形態において、セルロースミクロフィブリル又はナノ粒子は、それらの表面で化学修飾されて、それらの表面ヒドロキシル基の１つ又は複数を変更してもよい。
【００２７】
実施形態において、セルロース足場は、フィブリル化植物繊維から形成され得る。それは、繊維構造内でミクロフィブリルを部分的に分離するために、化学的及び機械的に処理されている植物繊維である。この効果は、まさに繊維の表面上であっても、構造により深く入り込んでもよい。
【００２８】
実施形態において、セルロース足場は、ミクロンサイズのセルロース小板から形成されてもよいが、上記小板の範囲内のナノスケール構造によって形成されてもよい。実施形態において、非ウイルス足場構造体は、複数のセルロース断片を含み得、各断片は、セルロースミクロフィブリルの網状組織から作られており、例えば、近接会合によるセルロース断片は、材料の本体にわたってセルロースミクロフィブリルのより大きな網状組織を構成し得る。実施形態において、非ウイルス足場は、細胞壁材料の足場を与えるために熱処理及び均質化された草木性植物組織を含み得る。実施形態において、セルロース足場は、本明細書で検討されるとおりのセルロース材料から形成され得（例えば、セルロース系材料がそれに由来する植物材料からの植物細胞壁の構成要素をさらに含み、植物細胞壁材料は、セルロース、ヘミセルロース（例えば、キシログルカン、キシラン、マンナン及びグルコマンナン）、ペクチン及び糖タンパク質などのタンパク質を含み得ることが適当である）、特にセルロース足場は、少なくとも７０％のセルロース、１０％未満のペクチン及び少なくとも５％のヘミセルロースを粒子状セルロース材料の乾燥重量で含有する粒子状セルロース材料である、実質セルロースを含み得、ここで、粒子状材料は、光回折法により測定して２５〜７５マイクロメートルの範囲、好ましくは３５〜６５マイクロメートルの体積重み付けメジアン主要粒子寸法を有する。粒子は、１２０マイクロメートル未満の直径を有することが好ましく、１１０マイクロメートル未満がより好ましい。
【００２９】
実施形態において、セルロース足場は、個別のセルロースナノ繊維から形成され得る。
【００３０】
実施形態において、非ウイルス足場構造体は、国際特許出願国際公開第２００６／０５６７３７号により記載されたとおりに、セルロースナノ繊維／ミクロフィブリルの網状組織から作られた複数のセルロース断片、セルロースナノ繊維／ミクロフィブリルの網状組織内に位置する１種又は複数の親水性結合剤、及び複数のセルロース断片を封入するために親水性結合剤と相互作用するように配置された１種又は複数の疎水性結合剤を含む、バイオ複合体材料を含み得る。このような実施形態において、親水性結合剤は、親水性又は実質的に親水性のポリマーを含み得る。親水性ポリマーは、ヘミセルロース、アクリル樹脂又は代わりに部分加水分解ポリビニルアセテートを含んでもよい。親水性ポリマーは、生物学的親水性ポリマー、例えば、ゼラチン及びグアールガムを含み得ることが任意選択である。
【００３１】
疎水性結合剤は、疎水性ポリマーを含み得ることが任意選択である。疎水性ポリマーは、エポキシ、例えば、ビスフェノール−Ａ又は変性ビスフェノールＡエポキシを含んでもよい。代わりに、疎水性結合剤は、ポリウレタン樹脂、フェノール樹脂、アクリル樹脂及びシロキサン樹脂を含む群から選択される結合剤を含み得る。他の適当な親水性及び疎水性結合剤は、当業者に公知である。
【００３２】
実施形態において、非ウイルス足場構造体は、複数の繊維で強化されたバイオ複合体材料を含む、繊維強化材料を含み得、ここで、バイオ複合体材料は、国際特許出願国際公開第２００７／１０４９９０号により記載されたとおりに、セルロースミクロフィブリルの網状組織から作られた１種又は複数のセルロース断片、セルロースミクロフィブリル／ナノ繊維の網状組織内に位置する１種又は複数の親水性結合剤、及び複数のセルロース断片を封入するために親水性結合剤と相互作用するように配置された１種又は複数の疎水性結合剤を含む。
【００３３】
実施形態において、非ウイルス足場構造体は、１０ミクロン超の直径及び１ミクロン未満の厚さを有するセルロース小板を含み得、セルロース小板は、国際特許出願国際公開第２０１３／１２８１９６号により記載されたとおりに、乾燥重量で少なくとも６０％のセルロース、乾燥重量で１０％未満のペクチン、及び乾燥重量で少なくとも５％のヘミセルロースを含むことを特徴とする。
【００３４】
実施形態において、非ウイルス足場構造体は、３０重量％未満の抽出可能グルコース；及び開始植物材料中の抽出可能キシロースの量の少なくとも５％の量の抽出可能キシロースを含む、植物由来セルロース粒子状材料を含み得る。このような実施形態において、植物由来セルロース粒子状材料は、６０重量％未満のセルロースを含むことが適当である。この材料は、本明細書で実施例の節で提供されるレオロジー材料実施例に記載されるとおりに生成させ、この構成要素の抽出可能性は、本明細書に示されるとおりの酸加水分解法を使用することによって決定された。材料は、国際公開第２０１４／１４７３９２号又は国際公開第２０１４／１４７３９３号に示されたとおりの方法を使用して提供されてもよいことが適当である。
【００３５】
実施形態において、植物由来セルロース粒子状材料は、本明細書に記載されるとおりの酸加水分解の抽出技術によって定義されるとおりに、開始植物材料中の抽出可能キシロースの量の５％〜１０％の量で抽出可能キシロースを含み得る。
【００３６】
実施形態において、植物由来セルロースは、セルロースミクロフィブリル化材料であり得、ここで、非晶質セルロースの領域及び関連の機械的特性は保持され、この材料を高性能複合体材料における使用に適するようにさせる。セルロースミクロフィブリル化材料は、１種又は複数のマトリックス多糖を保持することも特徴とし得る。したがって、この材料は、セルロースミクロフィブリル、並びにホモガラクツロナン、（１→４）−β−Ｄ−（ガラクト）マンナン、（１→４）−β−Ｄ（ガラクト）（グルコ）マンナン、（１→４）−β−Ｄ−（グルコ）マンナン、（１−４）−β−Ｄ−ガラクタン、キシログルカン、（１−４）−β−Ｄ−キシラン、及び（１−４）−β−Ｄ−アラビノキシランから選択される１種又は複数のマトリックス多糖を含み得る。
【００３７】
草木性植物材料からセルロースミクロフィブリルを調製するための方法は、草木性植物バイオマスを、単一酵素、又は少なくとも１つのｅｎｄｏ−グルカナーゼを含む酵素組成物；及び／若しくはｅｎｄｏポリガラクツロナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ｅｎｄｏ−アラビナナーゼ、ｅｎｄｏ−ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼ、又はキシラナーゼからの１種又は複数の多糖ヒドロラーゼと接触させて、酵素処理バイオマスを形成することと；酵素処理バイオマスを機械的に処理して、セルロースミクロフィブリルを生成させることと、を含み得る。このような方法は、例えば、米国特許出願公開第２００９／２２１８１２号、国際公開第２０１３／１８８６５７号、国際公開第２０１１／００４２８４号に記載されている。
【００３８】
この方法の実施形態において、足場は、ウイルス、ウイルス様粒子又はウイルス由来ナノ粒子に固体として与えることができる。代わりの実施形態において、足場は、ウイルス又はナノ粒子に液体として与えることができる。実施形態において、固体足場は、おそらくはそれが複合体を形成するように樹脂／結合剤の添加とともの、液体足場組成物の乾燥バージョンであり得る。樹脂結合剤は、有利には足場の強さ、剛性、靭性及びまた耐水性を増強し得る。足場組成物が、液体、例えば、液体セルロース小板組成物として与えられ、特に、ここで、足場組成物は、キシロース抽出可能性によって、又は足場組成物が塗料処方物などの水ベースの系に添加され、容易に分散性であり得るようにレオロジー調整剤に関して定義される。これらの足場組成物中への金属粒子、例えば、分散性触媒、又は殺生物作用を有する分散性レオロジー調整剤の取り込みは、足場組成物の官能性を増加させると考えられる。
【００３９】
代わりの実施形態において、ナノ複合体材料は、ウイルスをセルロース足場に結合させ、次いで、それが良好な多孔性を保持することを可能にするように足場を乾燥又は部分的に乾燥させることによって形成され得る。次いで、足場構造体は、部分乾燥された足場を通して金属塩を含む水で浸透させることができる。この方法論は、足場上の金属粒子の濃縮の速度を速め得ると考えられる。
【００４０】
実施形態において、足場は、その上にウイルス粒子結合領域を与えるために修飾され得る。例えば、足場基材は、基材の中又は上で官能化されて、ウイルス粒子又はそのナノ粒子がそれに結合し得る領域を与えてもよい。代わりに、ウイルス粒子は、修飾されて、ウイルスの表面に足場基材結合官能性を有するウイルス粒子を与えてもよい。
【００４１】
ウイルス粒子又はそのナノ粒子は、共有結合によって足場構造体に結合されてもよいことが適当である。ウイルス粒子は、非共有結合、例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワール力などによって、足場構造体に結合されてもよいことが適当である。実施形態において、ウイルス粒子も、足場も、足場にウイルス粒子の結合を与えるためのいかなる修飾も必要としないことが有利である。
【００４２】
実施形態において、足場の上又は中でのウイルス粒子又はそのナノ粒子と一緒のナノセルロース足場は、材料が乾燥される場合、ウイルス又はそれからのナノ粒子を含まないセルロース足場を上回る増強された機械的特性、例えば、増加した剛性、強さ及び靭性を与え得る。セルロースナノ繊維は、炭素繊維材料のオーダのものである、１００ＧＰａ超の剛性及び２ＧＰａ超の強さを有し得ることが適当である。実施形態において、ナノセルロース足場は、多孔性であり得、このような足場におけるナノ繊維間の距離は、数百ｎｍのオーダである。このような実施形態において、細孔サイズは、例えば、制御された乾燥方法によって制御され得ることが適当である。実施形態において、凍結乾燥が、足場に細孔を与えるために使用されてもよい。実施形態において、遅速空気乾燥、例えば、室温（１０〜３０℃）で０〜２４時間にわたる空気乾燥が、足場に細孔を与えるために使用されてもよい。凍結乾燥は、典型的には空気乾燥よりも大きな細孔を与える。
【００４３】
ウイルス
ウイルス粒子又はその構造構成要素、例えば、足場に与えることができる、核酸を含まないウイルス様粒子は、当技術分野で公知の任意の適当な手段によって修飾されてもよく、特にウイルス粒子又はウイルス様粒子は、化学的に又は遺伝的手段によって修飾されてもよい。実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は、官能性ペプチドを表面提示するために遺伝的に修飾され得るか、又は化学的手法が、ウイルス表面上の特定の残基（複数可）に官能性ペプチド若しくは全タンパク質（酵素）を共有結合的若しくは非共有結合的に連結するために採用され得る（すなわち、例えば、リシン基へのＮ−末端カルボキシベンジル保護ペプチドのＥＤＣ／ＮＨＳ連結）。官能基は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の表面に与えられてもよく、例えば、ここで、官能基は、ウイルス粒子が金属塩などに結合し、減少させることを可能にする。
【００４４】
適当なウイルス粒子の例には、カプシドコート、例えば、らせん状カプシド、フィラメント状カプシド、又は正２０面体カプシドを有する、非エンベロープウイルスが含まれる。実施形態において、ウイルス粒子は、らせん状（ロッド形状）ウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコラトルウイルス（ＴＲＶ）、ムギ微斑モザイクウイルス（ＢＳＭＶ）、及びピーナッツクランプウイルス（ＩＰＣＶ）；フィラメント状ウイルス、例えば、カンキツトリステザウイルス（ＣＴＶ）、エボラウイルス及びジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、又は正２０面体ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、ジャガイモリーフロールウイルス（ＰＬＲＶ）、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ポリオウイルス、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ブルータングウイルスなど、又はウイルスの構造構成要素により形成された他のナノ粒子、例えば、ロッド形状タバコモザイクウイルスのコートタンパク質により形成された球形粒子から選択され得る。
【００４５】
特定の実施形態において、ウイルス粒子は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）粒子であり得る。代わりの実施形態において、ウイルス粒子は、バクテリオファージであり得る。実施形態において、バクテリオファージは、線状ｄｓＤＮＡ（ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）及びポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ））、円形ｄｓＤＮＡ（ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）及びコルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ））、円形一本鎖ＤＮＡ（ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ））、線状ｓｓＲＮＡ（レヴィウイルス科）又はｄｓＲＮＡ（フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ））を含み得る。実施形態において、本発明のための利用性のあるバクテリオファージは、アイソメトリック（コルチコウイルス科）、レモン形状（フセロウイルス科）、卵形（グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ））、ボトル形状（アンプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ））、ロッド形状（ルディウイルス科）、フィラメント状（イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ））及び多形（プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ））形態を有し得る。実施形態において、利用性のあるバクテリオファージは、（マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ））を有してもよいか、又は収縮性尾（シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ））を有さなくてもよい。このようなバクテリオファージは、ペプチドを提示するために修飾されてもよいことが適当である。例えば、Ｍ１３フィラメント状バクテリオファージは、一端でＰ９及びＰ７タンパク質の表面露出配列でキャップされ、他端はＰ３及びＰ６タンパク質で被覆されている核酸の周囲に配置された主要コートタンパク質（Ｐ８）の２７００コピーを含む外部表面を有する。このような例において、当技術分野で知られたとおりの技術を使用して（Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ．２００１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍ１３  ｆｏｒ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．２００１  Ｓｅｐ；１８（２）：５７−６３）、コートタンパク質は、追加の官能性を含むように修飾されてもよい。
【００４６】
実施形態において、ウイルス粒子又はそれから形成されたナノ粒子は、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、適当には約１０ｎｍ〜約９００ｎｍ、適当には約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、特に約３５０ｎｍ、特に約１００ｎｍ、特に約８５ｎｍ、又は約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、又は１５ｎｍ超、２５ｎｍ超、３０ｎｍ超、４０ｎｍ超、５０ｎｍ超、７０ｎｍ超、若しくは８０ｎｍ超にサイズ化され得る。実施形態において、ウイルス粒子は、１８ｎｍ〜９００ｎｍ、適当には１８ｎｍ〜３００ｎｍ、例えば、特に３００ｎｍ〜９００ｎｍの寸法を有し得る。
【００４７】
実施形態において、ウイルス粒子から形成されたナノ粒子は、例えば、球形、ロッド、角柱、六角形、及び混合プリズム、並びに他の形状から選択される形状を有し得る。
【００４８】
ウイルス粒子は、適当には非ウイルス足場の上又は中に与えられてもよく、ここで、足場は、テンプレート構造体として作用して、ウイルス粒子を位置付ける。実施形態において、ウイルス粒子の官能化は、ウイルス粒子の表面提示ペプチドが金属イオンを還元することを可能にして、金属ナノ粒子の生成を可能にさせ得る。他の実施形態において、ウイルス粒子の官能化は、ウイルス粒子の表面提示ペプチドが、カルシウム及び／若しくはリン酸塩に結合することを可能にするか、又はウイルス粒子への別の要素若しくは物質の連結、例えば、抗体若しくはその断片の共有結合を可能にし得る。ウイルス粒子が、ウイルス粒子にウイルス粒子の表面に反応基を与えるために修飾されてもよいことが適当である。化学修飾、官能化及び／又は遺伝的修飾が、粒子の外側表面に露出された、ウイルス粒子のコートタンパク質のアミノ酸を修飾するために用いられてもよい。追加的又は代わりに、化学修飾、官能化及び／又は遺伝的修飾が、ウイルス粒子内部空洞環境を修飾するために使用されてもよい。物質が、足場の中又は上へのウイルス粒子の取り込みの前に、ウイルス粒子の上又は官能化ウイルス粒子に与えられてもよい。代わりに、ウイルス粒子は、足場の中又は上へ与えられ、次いで、物質、例えば、金属イオン、リン酸塩又はカルシウムイオンを与えられてもよい。理解されるように、ウイルス粒子は、その表面上にペプチドの複数のコピーを含み得、したがって、ウイルス粒子は、ウイルス粒子当たり少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００のペプチドの付加によって官能化されてもよい。
【００４９】
実施形態において、ウイルス粒子は、植物ウイルス粒子であり得る。実施形態において、金属に結合することができ、リン（ＰＯ４３−）に結合することができ、カルシウム（Ｃａ２＋）若しくは他の骨ミネラルに結合することができ、還元活性を与えることができ、及び／又は触媒として作用することができるペプチドの付加によって、植物ウイルス粒子はその表面で修飾され得る。
【００５０】
実施形態において、ウイルス粒子、特に植物ウイルスは、その表面に官能性トリペプチドＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕを与えるために修飾され得、ここで、官能性ペプチドは、アルデヒドとニトロオレフィンの間の共役付加反応のための有効な触媒として作用し得る（このような反応は、例えば、Ｗｉｅｓｎｅｒ  Ｍ，Ｗｅｎｎｅｍｅｒｓ  Ｈ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｏｌｅｆｉｎｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２０１０，１５６８−１５７１；Ｗｉｅｓｎｅｒ  Ｍ，Ｒｅｖｅｌｌ  ＪＤ，Ｗｅｎｎｅｍｅｒｓ  Ｈ．  Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  １，４−ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｏｌｅｆｉｎｓ−ａ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７：１８７１−１８７４によって検討されている）。代わりの実施形態において、ペプチドは、エノレートをアルデヒド若しくはケトンと結合させるために適当なウイルス粒子上に与えられて、β−ヒドロキシカルボニル化合物をもたらすことができるか、又はニトロオレフィンへのケトンの付加を与えることができる。代わりの実施形態において、ペプチドは、ウイルス粒子上に与えられてもよく、ここで、ペプチドは、分子内Ｓｔｅｔｔｅｒ反応における競合性Ｎ−ヘテロ環式カルベン有機触媒として、並びにまた、酸化、スルフィニル転位及びリン酸化反応における触媒として作用し得る［Ｄａｖｉｅ  ＥＡＣ，Ｍｅｎｎｅｎ  ＳＭ，Ｘｕ  Ｙ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＪ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００７，１０７（１２），ｐｐ５７５９−５８１２］。代わりの実施形態において、ウイルス粒子は、アニオン及びカチオンを封鎖し、種々のイオンを還元することができる能力を有するペプチドを与えられてもよい。ペプチドはまた、機能性生物活性、例えば、Ｄｏｍｅｎｙｕｋ  Ｖ，Ｌｕｓｈｋｕｔｏｖ  Ａ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＳＡ，Ｄｉｅｈｎｅｌｔ  ＣＷ．２０１３．Ａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｙｎｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｉｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１，８．で検討されたとおりの抗菌能力を有してもよく、したがって、これら、リガンド／受容体結合性（例えば、抗体）、細胞接着因子活性、例えば、インテグリン結合性を許容するＲＧＤペプチド（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．ＲＧＤ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．１９９６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：６９７−７１５）、及び細胞増殖／分化能力（例えば、ジスラプチン（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎ）と名付けられたペプチドは、上皮増殖因子受容体を分解し、腫瘍増殖を阻害し得る（Ａｈｓａｎ  Ａ．Ｒａｙ  Ｄ，Ｒａｍａｎａｎｄ  ＳＧ，Ｈｅｇｄｅ  Ａ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｃ，Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ  Ａ，Ｍｏ���ｉｓｈｉｍａ  Ｙ，Ｐｒａｔｔ  ＷＢ，Ｏｓａｗａ  Ｙ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＴＳ，Ｎｙａｔｉ  ＭＫ．２０１３．Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＥＧＦＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８８，２６８７９−２６８８６）を有してもよい。さらなる実施形態において、ウイルス粒子は、欧州特許第２４３１０４８号に記載されたとおりに、フェノール樹脂に強く結合する能力［これは、色素（タンニン及びアントシアニン）に結合する際及び抗酸化性ポリフェノール樹脂を封鎖する際に利用性を有し得る）］を有するペプチド、例えば、フェノール結合性ペプチドを含み得る。
【００５１】
特定の実施形態において、ウイルス粒子は、粒子の表面でペプチドに結合し、還元する金属を与えられてもよい。このようなウイルス粒子は、非ウイルス足場、例えば、有機足場、適当にはセルロース又はセルロース系材料の足場、特にナノセルロース足場に金属を取り込むために使用され得ることが有利である。ある実施形態において、ウイルス粒子のペプチドに結合し、還元する金属は、足場上で結合する時、金属化網状組織を生成させるために金属塩と直接混合され得る。このような実施形態において、金属塩又は他の無機物質は、足場、例えば、セルロース又はセルロース系材料及びウイルスのマトリックスを通過させて、無機材料の急速な蓄積を与えてもよい。代わりの実施形態において、金属結合性ペプチドを提示する表面を有するウイルス粒子は、金属又は金属イオンに結合されて、足場、例えばセルロース／セルロース系材料の足場、特にナノセルロースマトリックスの中への取り込み前に金属ナノ粒子（又は金属化ウイルス）を形成してもよい。
【００５２】
実施形態において、ウイルス粒子の表面での金属結合性及び還元性ペプチドの包含は、ウイルス粒子、例えば、ＴＭＶ修飾ウイルス粒子をナノセルロース足場などの足場上に与えるために使用され得る。次いで、ウイルス粒子を含む足場（ナノセルロース足場）は、金属塩溶液、例えば、銀塩溶液に混合するか又は与えることができ、その結果、金属ナノ粒子、例えば、銀ナノ粒子が、足場、例えば、ナノセルロース足場に与えられる。
【００５３】
実施形態において、還元され得る金属イオン、又は金属は、表面修飾ウイルス粒子上に与えられたペプチドにより結合され得る。金属イオン又は金属は、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｇｅ及びＳｎ、銀、金、鉄、銅、インジウム、白金、パラジウム、ロジウム、マンガン、亜鉛、モリブデン、イリジウム、コバルトなどを含む、遷移金属を含む群から選択され得、適当には銀、金、鉄、インジウム、白金、パラジウム、ロジウム、コバルト又はイリジウムから選択され得る。
【００５４】
ウイルス粒子は、それが１．５Ｖ〜−０．４４Ｖの範囲の還元電位を与え得るように、表面修飾ウイルス上にペプチドを与えられてもよいことが適当である。所与のペプチドについて、金属イオンから金属ナノ粒子への変換は、正の還元電位を有する金属に有利に作用することが期待される。所与のペプチドについての還元能力は、様々な抗酸化剤アッセイ（例えば、ＦＲＡＰ）を使用して試験され得る。実施形態において、ＭＢＰペプチド（金属還元性及び結合性）で官能化されたＴＭＶは、１．５Ｖの還元電位を有する金属イオン（金（ＩＩＩ））から金属ナノ粒子を生成し得る（金（ＩＩＩ）から−０．４４Ｖ（鉄（ＩＩ））。
【００５５】
ウイルスに結合した、金属結合性及び金属イオン結合性並びに還元性ペプチドは、ナノ粒子の形成を可能にするのみならず、金属が足場に優先的に堆積されること、例えば、金属被覆ウイルス粒子がナノセルロースマトリックスの上又は中に与えられることを可能にし得る。足場、例えば、セルロース又はセルロース系材料、例えば、ナノセルロースマトリックスに結合したコバルト、金及び銀被覆ウイルス粒子は、化学触媒を可能にするために与えることができ；例えば、金官能化は、炭素−炭素カップリング反応又はアルコール若しくはＣＯ酸化を促進し得、銀官能化は、ＣＯへのＣＯ２の変換を促進し得る。白金又はコバルト官能化／被覆加工は、燃料電池における水素ガス発生のための水光分解を促進し得る。
【００５６】
代わりの実施形態において、ウイルス粒子は、ＰＯ４３−及び／又はＣａ２＋結合性ペプチドを粒子の表面に与えられてもよい。このようなウイルス粒子は、リン酸塩及び／又はカルシウムを非ウイルス足場、例えば、有機足場、特にナノセルロース足場に取り込み、骨ミネラル（ヒドロキシアパタイト、ＨＡ）の堆積を可能にするために使用され得ることが有利である。これは、骨ミネラルにおいて被覆された網状組織又はマトリックスに類似し得る足場の生成を可能にし、これは、骨修復及び／又は組織工学に用いられてもよい。このようなナノ複合体は、足場構造体中への細胞移入及び結合を含めて、骨形成の促進の際に有用であり得る。
【００５７】
実施形態において、ウイルス粒子は、粒子が感染性であろうとなかろうと、任意の非エンベロープウイルス粒子であり得る。実施形態において、ウイルスは、植物ウイルスであり得る。
【００５８】
特定の実施形態において、ウイルス表面に提示された官能基は、金属キレート性及び還元性能力、又は抗微生物活性、又はＣａ２＋及びリン酸封鎖性及び結合性の活性を有し得る。このような官能性は、装飾ウイルスが上記ナノセルロースマトリックスに取り込まれる場合に、金属ナノ粒子／金属被覆表面の生成（ナノ粒子合成及び新型バッテリ）、抗微生物被覆加工（抗バイオフィルム及び殺菌性表面）及び骨修復用途のために、それぞれ、使用され得る。
【００５９】
ファージなどの他のウイルスが、官能基を表面提示するために同様に利用されてもよい。ウイルス粒子は、足場、例えば、セルロース又はナノセルロースの中又は上に、ウイルスの変化を必要とすることなく結合され得ることが決定されている。結合は、任意の適当な手段、例えば、水素結合、金属配位、ファンデルワールス及び／若しくは疎水性相互作用、又は結合の組み合わせによって生じると考えられる。実施形態において、マトリックス中へのウイルスの取り込みは、ウイルスに対する上記結合形成のために導電性である、ナノセルロースの特定の処方物を使用することによって促進されてもよい。さらなる実施形態において、ウイルス構造体中へのセルロース結合性ペプチドの包含が、ウイルスとセルロース足場、例えば、ナノセルロース足場との相互作用を促進するために使用されてもよい。実施形態において、ウイルスとナノセルロースの間の共有結合は、当技術分野で公知であるような化学的手法、例えば、Ａｒｏｌａら、２０１２に従って促進され得る（Ａｒｏｌａ  Ｓ，Ｔａｍｍｅｌｉｎ  Ｔ，Ｓｅｔａｌａ  Ｈ，Ｔｕｌｌｉｌａ  Ａ，Ｌｉｎｄｅｒ  ＭＢ．２０１２．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｆｉｌｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２，１３，５９４−６０３）。実施形態において、ウイルスは、セルロース又はナノセルロース結合性活性を、それに起因する他の官能性（現技術の遺伝的及び化学的方法を使用して生成された）と一緒に有してもよく、これは、そして次に、セルロース構造体に結合し、マトリックスに所望の反応性並びに他の物理的及び化学的特性を付与し得る。実施形態において、種々のナノセルロース組成物、ナノセルロースの化学的修飾、並びにウイルス構造体の様々な化学的及び遺伝的修飾が、コンビナトリアルケミスリーによって使用されて、所望の特性を有するナノセルロースを生成してもよい。
【００６０】
ウイルスの構造構成要素により形成された他のナノ粒子、例えば、タバコモザイクウイルスのコートタンパク質により形成された球形粒子（特許国際公開第２０１２０７８０６９号；Ｔｒｉｆｏｎｏｖａ  Ｅ，Ｎｉｋｉｔｉｎ  Ｎ，Ｇｍｙｌ  Ａ，Ｌａｚａｒｅｖａ  Ｅ，Ｋａｒｐｏｖａ  Ｏ，Ａｔａｂｅｋｏｖ  Ｊ．Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｆｒｏｍ  ＴＭＶ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｖｉｒｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｎａｔｕｒｅ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ．２０１４；３２（８）：１１９３−１２０１）はまた、官能基を表面提示するために同様に利用されてもよい。このようなナノ粒子は、様々な官能性ペプチド又は全タンパク質（酵素）に共有的又は非共有的に結合し得ることが決定されている。
【００６１】
植物、細菌、酵母又は昆虫細胞を使用して生成されてもよい（国際公開第２０１４／０４５０５５号により検討されたとおりに）、本発明で使用される官能化ウイルス及びウイルス様構造体（ウイルス又は他のナノ粒子に自己集合しているが、核酸を欠いているコートタンパク質）は、足場基材中に取り込まれてもよいナノ粒子である、化学的前駆体から生じ；したがって、ナノ粒子で装飾された、又は埋め込まれた足場を形成し得る。さらに又は代わりに、官能化ウイルス及びウイルス様粒子は、足場基材に取り込まれて、新規な機能、例えば、足場基材上での金属堆積、又は前駆体の適用後の基材表面に遠位の遊離金属ナノ粒子の形成の促進を与えてもよい。足場による使用のためのナノ粒子を形成する従来の方法と違って、新規な手法は、ナノ粒子形態中への、化学基の還元のための有害な化学薬品（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）又は新鮮植物抽出物の添加を必要としない方法で金属ナノ粒子又は金属化マトリックスの形成を許容する。
【００６２】
Ｃａ及びＰＯ４イオンに関して、セルロース足場、例えば、ヒドロキシアパタイト形成性ペプチドで官能化されたウイルスを含むナノセルロース足場は、セルロース足場、例えば、ナノセルロース足場中へのＨＡのかなりの及び制御された堆積をもたらすと決定されている。セルロース足場、特にナノセルロース及びヒドロキシアパタイト形成性ペプチド（ＭＩＰ３）で官能化されたウイルスを含む、このようなナノ複合体は、骨組織工学での用途のために使用され得る。
【００６３】
非ウイルス足場上に与えられたウイルス粒子は、足場基材の中又は上でのナノスケール粒子の包含を可能にする。ウイルス粒子の使用は、このようなナノスケール粒子が、明確で、均一なサイズ分布を有するのを可能にすることが有利である。均一なによって、試料中の大部分の粒子が実質的に同じサイズであることが意味される。さらに、ナノスケール粒子は、均一な形状を有してもよく、ここで、大部分の粒子は、実質的に同じ形状のものである。実施形態において、足場へのウイルス結合の方法は、制御されるべきナノ粒子間の距離を可能にし、制御されるべき足場の機能的多孔性を可能にすることができる。
【００６４】
実施形態において、官能化ウイルス足場構造体を形成するために、足場基材、例えば、セルロース足場２５０μｌ当たり１００ｎｇ〜１０ｍｇのウイルスの濃度を用いることができる。実施形態において、ナノセルロース２５０μｌ当たり２２０μｇのウイルスが用いられてもよい。当業者によって理解されるように、特定の用途において、低濃度のウイルス粒子が、足場基材に与えられてもよく、その結果、ウイルス粒子は、足場に間隔を置いて与えられ、例えば、金属触媒は、非常に低濃度で、例えば、２５０μｌ当たり１００ｎｇで単に必要とされてもよい。代わりに、殺生物剤が、足場基材上に非常に低濃度で、例えば、２５０μｌ当たり１００ｎｇで与えられることが単に必要とされてもよい。実施形態において、ナノセルロース足場が用いられ、及び足場がセルロース系材料の小板から形成される場合、ウイルスは優先的には小板の外側に位置していてもよい。また、本発明者らは、必要に応じてそれらを小板の内側又は外側のいずれかに位置付けさせる賢明な方法を考え出すことができ得る。
【００６５】
実施形態において、ウイルスは、足場構造体、例えば、セルロース系材料、又はナノセルロースに直接添加し、次いで、直ちに乾燥させる、例えば、空気乾燥させることができる。
【００６６】
実施形態において、この方法は、乾燥前に混合物をインキュベートするステップをさらに含んでもよい。ウイルス及び足場構造体は、０〜２５℃の温度範囲で数時間、数日又は数週間保存／インキュベートされて、足場構造体ウイルス粒子混合物を与えてもよいことが適当である。一部の場合、インキュベーション時間は、ウイルス／足場構造体、例えば、セルロース又はセルロース系材料、特にナノセルロースの会合が起こることを可能にするために必要とされ得る。実施形態において、ほぼ２５℃及びそれより高い温度でのインキュベーションは、長時間後に細菌又は真菌汚染をもたらし得る。代わりに、ウイルス／セルロース、特にセルロース系材料又はナノセルロースミックスは、２５℃〜６０℃、２５℃〜７０℃、２５℃〜８０℃、又は２５℃〜９０℃で様々な期間インキュベートされてもよい。例えば、タバコモザイクウイルスは、８０℃に加熱後になお安定であり、したがって、官能性は、この温度で保存されるはずである。
【００６７】
足場構造体−ウイルス粒子混合物を形成するために、混合技術、例えば、振とう、攪拌、ボルテックス、反転、及び低増幅超音波処理（これは、ウイルス及びセルロース系材料、特にナノセルロースの構造及び官能性をせん断し、及び潜在的に変える傾向は弱い）が使用され得る。他の状況において、ウイルスが、セルロース結合性ペプチドの作用によって、既に形成された乾燥セルロース、特にセルロース系材料又はナノセルロース膜の表面に付着し得るので、混合は必要とされなくてもよい（必要に応じて、特定の場合）。
【００６８】
実施形態において、足場は、織り方（ｗｅａｖｅ）、又は積層の特定の部分にウイルス粒子を位置付けるように足場材料を織ること、又は積層することによって形成されてもよい。実施形態において、足場は、繊維を含んでもよく、繊維、例えば、セルロース、特にセルロース系材料又はナノセルロース繊維は、紡績され、織られて、３次元構造を有する足場を形成し得る。このような実施形態において、ウイルス粒子が繊維に与えられる場合、繊維は、糸に紡績することができ、足場構造体及び材料は、織り方法によって形成され得る。実施形態において、印刷又はアレイング（ａｒｒａｙｉｎｇ）が使用されて、ミクロンレベルで構造体及び官能基を形成し、したがって、特定の特性を有する材料の生成をもたらし得る。
【００６９】
本発明の第３の態様によれば、塗料、コーティング、コンクリート、掘削流体、オプトエレクトロニクス、医薬品、バイオ医薬品、触媒又は触媒担体として、燃料電池技術、バイオリアクタ、電解質膜、センサ技術、特にバイオチップ、組織修復用３Ｄ足場材料、化粧品、骨修復、及びパーソナルケア製品の少なくとも１つで、本発明の第１の態様の、又は本発明の第２の態様の方法によって提供されるとおりのナノ複合体の使用が提供される。
【００７０】
実施形態において、足場は、一連の種々の修飾ウイルス粒子を提示するために使用することができ、ここで、種々の修飾ウイルスは、足場に少なくとも２個の異なる官能基を与え得る。足場の中又は上での、官能化ウイルス、又はそのウイルスナノ粒子と一緒の足場は、別の足場の上に重ね合わされて、異なる官能性領域を有するマトリックスを生成してもよい。例えば、実施形態において、第１の足場層は、足場上のバイオフィルム形成を阻止するウイルスに結合したタンパク質及びペプチドで官能化することができ、及び細菌を能動的に死滅させ得る抗微生物ペプチドを含むウイルスで官能化された第２の足場層は、第１の足場層に隣接して与えることができる。このような例において、水及び他の溶液中の微生物を死滅させるためのフィルタが形成され得る。代わりに、足場、例えば、セルロース又はセルロース系材料、特にナノセルロース足場は、足場に結合したウイルスを介してヒドロキシアパタイト（ＨＡ）で被覆することができ、ここで、ウイルスは、それらがＣａ及びＰＯ４イオンを封鎖するように官能化されている。この足場は、細胞接着及び骨形成を促進するＨＡ結合性活性及びペプチドの両方を提示するウイルスを使用してさらに官能化されてもよい。このような実施形態において、足場は、統合及び治癒を促進する骨材料を有効に形成する。
【００７１】
さらなる実施形態において、官能化ウイルスは、足場に対して金属化（又は金属ナノ粒子による装飾）、例えばナノセルロース足場の金属化を与えることができ、例えば、その結果、金属タイプ（同じ金属タイプ又は少なくとも２種の異なる金属タイプ）の層を足場に与えることができる。このような足場は、燃料電池、バッテリ及び導電体並びに触媒材料で用いられてもよい。ウイルスは、足場を通して、均等に分布していることができ、又は上で検討されたとおり、層化は、修飾ウイルス及びそれらの官能基の分布を空間的に制御するために使用され得る。
【００７２】
当業者に理解されるように、化学的触媒ペプチドを表面提示するウイルスで官能化された、足場、例えば、セルロース、特にセルロース系材料、特にナノセルロースの足場構造体は、触媒作用反応のための高い表面積膜を提供し得る。実施形態において、細胞増殖因子及び細胞接着ペプチドをさらに含むウイルス又はナノ粒子を取り込んでいる足場、例えば、セルロース由来足場、例えば、セルロース系材料、特にナノセルロースは、ドレッシング又は３Ｄ足場として骨及び組織修復用途で用いることができる。
【００７３】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴及び実施形態は、文脈が別に要求しない限り、変更すべきところは変更して他の態様のそれぞれに関して同様である。
【００７４】
本文で引用されたそれぞれの文書、参考文献、特許出願又は特許は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれ、これは、本文の一部として読者によって読まれ、及び考慮されるべきであることを意味する。本文で引用された文書、参考文献、特許出願又は特許が本文で繰り返されないことは、単に簡潔さのためである。
【００７５】
本文に含まれる引用資料又は情報への言及は、その資料又は情報が、共通一般知識の一部であったか又はいずれの国でも公知であったことの譲歩と理解されるべきでない。
【００７６】
本明細書の全体を通して、文脈が別に要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｌｕｄｅｓ）」若しくは「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）又は整数の群の包含を意味するが、いかなる他の整数又は整数の群の排除も意味しないことが理解される。
【００７７】
本発明の実施形態はこれから、添付の図面を参照して、例としてのみ提供される。
【実施例】
【００７８】
実施例１
タバコモザイクウイルスの遺伝的修飾
金属結合性及び還元性ペプチド（ＭＢＰ）、（ＭＢＰ；Ｔａｎ，Ｙ．Ｎ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｉ．Ｃ，２０１０．Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２，５６７７−５６８６．）ＳＥＫＬＷＷＧＡＳＬ（配列番号：１）、又はヒドロキシアパタイト堆積ペプチド（ＭＩＰ３），（ＭＩＰ３；Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｌｅｅ  Ｊ．Ｙ．，Ｓｕｈ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｇ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｊ．２０１３．Ｔｈｅ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｎｔｉｎ  ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ，１０１（２），５９０−８．）ＳＥＳＤＳＳＤＳＤＳＫＳ（配列番号：２）のような小ペプチドが、コートタンパク質の表面露出領域に挿入されるように、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を遺伝的に修飾した（Ｔｕｒｐｅｎ，Ｔ．Ｈ．，Ｒｅｉｎｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｆａｌｌａｒｍｅ，Ｖ．，Ｇｒｉｌｌ，Ｌ．Ｋ．１９９５．Ｍａｌａｒｉａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３（１），５３−５７．）及び（Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｋａｒｒｅｒ，Ｅ．，Ｂｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．１９９９．Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｖｉｒｕｓ−ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９０（１），９−２０．）。ペプチド挿入は、ビリオン形成を損なわなかった。さらに、これらのウイルスは、植物を使用して高収率まで得ることができた（＞１ｇ／ｋｇ新鮮組織重量）。
【００７９】
この方法は、既に存在しているか、又はＴＭＶの表面露出領域の核酸配列中に工学操作されている制限部位を用いることができ、例えば、ＰｐｕＭＩ制限部位は、コートタンパク質の表面露出Ｃ末端への配列の挿入を許容し；又は代わりに、ＮｇｏＭＩＶ／ＢｓｔＺ１７１制限部位が、コートタンパク質の１９５−２１０塩基対間にある、コートタンパク質の表面露出ループに配列を導入するために使用されてもよい。
【００８０】
この領域への目的の配列の挿入前に、表面提示のための領域でのＴＭＶベクターの適当な制限酵素消化が、以下のとおりに行われてもよい。例えば、２００ｎｇのＴＭＶベクターを、２．５単位のＮｇｏＭＩＶ及びＢｓｔＺ１７１並びに自社ブランドの１×ｃｕｔ  ｓｍａｒｔ緩衝溶液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；２４０  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｒｏａｄ  Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と合わせ、その後、３７℃で４時間インキュベートした。その後、次いで、その反応物に２０単位のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＣＩＰを添加し、インキュベーションを３７℃でさらに３時間継続して、切除部位でリン酸塩を除去した。この反応物を１％寒天１ＸＴＢＥゲルでゲル電気泳動させ、これを１００ｖで４時間実行した。ゲル上でのバンドを分解後、線形化プラスミドをゲルから切除し、ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ  ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｔｒａｓｓｅ  １  ４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。次いで、精製消化及び脱リン酸化されたプラスミドを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのプロトコルのとおり、ＤＮＡリガーゼ及びリガーゼ緩衝液を使用してリン酸化アニールオリゴヌクレオチドプライマー（以下の配列参照）に連結した。アニールオリゴヌクレオチドは、目的のペプチドに対応する配列のインフレーム連結を許容する相補的オーバハングを含む。この手順は、例えば、生物又はインビトロ系で発現される場合、目的の官能性ペプチド配列を提示するウイルスコートタンパク質を生成させるＤＮＡ配列を生じさせ、ペプチドは、比較的大きなウイルス又はウイルス様構造体に自己集合した後でさえも、その官能性及び利用可能性を依然として保持する。
【００８１】
ＭＩＰ３プライマー
Ｆ：５’ＣＣＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＡ（配列番号：３）
Ｒ：５’ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＡＧＡ  Ｇ（配列番号：４）
【００８２】
ＭＢＰプライマー
Ｆ：５’ＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡ（配列番号：５）
Ｒ：５’ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧ（配列番号：６）
【００８３】
このような操作で使用されるＴＭＶベクターは、インビトロ転写を可能にするためにＴ７転写プロモータを含んでもよいことが適当であり、この転写は感染性ＲＮＡ転写産物の形成をもたらし、ＲＮＡ転写産物は、その後、ニコチニア・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）などの植物上で擦られて、ウイルスを増幅させ得る。ウイルスは、感染葉材料を水性緩衝液の存在下で微細粉砕することによって高収率に容易に抽出することができ、これは、次いで、ポリエチレングリコール及び塩の存在下で様々な段階の低速遠心分離を受け、得られた純粋ペレットを、Ｇｏｏｄｉｎｇ及びＨｅｒｂｅｒｔ（Ｇｏｏｄｉｎｇ，ＧＶ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｅｒｔ，ＴＴ．１９６７．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍａｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ：５７  Ｉｓｓｕｅ：１１Ｐａｇｅｓ：１２８５）に従って適切なリン酸緩衝液に再懸濁させる。
【００８４】
実施例２
ウイルスを使用しての官能化ナノセルロース膜の調製
ＭＢＰ及びＭＩＰ３ペプチドで修飾されたＴＭＶを使用して、ナノセルロース足場を官能化した。粘性精製ナノセルロース分散液、及び細胞壁粒子含有ナノセルロース繊維の分散液を、異なる抽出技術によって、廃棄植物材料から生成させ、ここで、植物材料は、ＮａＯＨ処理（例えば、国際公開第２０１３／１２８１９６号で特定されたとおりの、ここで、例えば、根菜廃棄物、例えば、既存の工業プロセスからのニンジン又はテンサイは、水中重量で０．１％〜１０％の固形分の濃度を有する混合物を形成するように加工することができる。この溶液に０．５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加し、溶液のｐＨを上昇させ、ｐＨ１４で維持し、その結果、ＮａＯＨの添加により、かなりの割合のヘミセルロース及び大部分のペクチンが混合物内の細胞のセルロースから抽出される。次いで、この混合物を９０℃に５時間加熱し、１１ｍ／秒（６）の速度で回転する混合器ブ＋レードによって合計で１時間加熱期間中に定期的に均質化し、続いて、加熱期間の最後に、３０ｍ／秒（８）の速度で回転する混合器ブレードによって、５分間均質化した。均質化は、細胞を中葉の線に沿って分離し、次いで、分離された細胞を小板に破壊する。得られたセルロース小板は、元の分離された細胞よりもおおよそ１０倍小さく、次いで、得られた混合物は濾過されて、溶解された材料を８重量％未満の固形分まで除去することができる）、過酸化物処理（例えば国際公開第２０１４／１４７３９２号又は国際公開第２０１４／１４７３９３号で特定されたとおりの、ここで、３５％水性過酸化物溶液が、草木性植物材料（乾燥含量）の重量の０．５重量％以下の量で添加されて、過酸化物処理工程は、過酸化物の実質的にすべてが消費され、次いで、少なくとも２５００ｃｐｓ（１重量％の固体濃度で）の粘度を有する粒子状セルロース材料が得られるまで行われる）、又は酵素処理のいずれかで処理した。
【００８５】
ＴＭＶウイルスストック溶液（野性型及び修飾型）を、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液中で調製した。
１．２５０μｌのセルロース分散液を１０μｌの野性型又は修飾型ＴＭＶ（２２ｍｇ／ｍｌ；反応物当たり全ウイルスは２２０μｇである）と混合して、セルロース混合物を与える。
２．室温（２０℃〜２５℃）で２時間インキュベーション後、セルロース分散液をピペット採取し、柔軟プラスチックシート上の１ｃｍ２面積上に広げた。
３．セルロース分散液を、そのままにして、無塵の場所で室温にて一晩乾燥させて、乾燥試料を形成した。
４．乾燥試料をプラスチックシートから剥がし、蒸留水で数回洗浄し、その後、電子顕微鏡法を使用しての分析のために、又は金属若しくはヒドロキシアパタイト触媒実験に含めるために再乾燥させた。
【００８６】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、ナノセルロース、及び粒子のみを含むナノセルロースは、ナノセルロース繊維の網状組織、又はナノセルロース膜若しくは膜を形成したが（図１）、一方でＴＭＶを含む試料は、膜（ｆｉｌｍ）又は膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）表面上に提示された相当量のウイルスを有した（図２）。
【００８７】
実施例３
ナノセルロース膜中のＴＭＶの保存免疫反応性の試験
ナノセルロース構造体に一体化されたタバコモザイクウイルスは、ウイルスに対する金粒子−抗体コンジュゲートの局在化により示されるとおりに、ウイルスに特異的な抗体に対して交差反応性であった（図３）。これは、ナノセルロース基材中へのウイルス構造体の取り込みが、それらの免疫原性能力を損なわないことを実証する。ウイルス及びウイルス様粒子が多様な病原体からの免疫原性領域を提示するために表面修飾され得ることを考慮すると（Ｔｈｕｅｎｅｍａｎｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｌｅｎｚｉ，Ｐ．，Ｌｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，Ｔａｌｉａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｅｃａｒｅｓ，Ｍ．，Ｚｕｎｉｇａ，  Ｓ．，Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｚａｈｍａｎｏｖａ，Ｇ．Ｇ．，Ｍｉｎｋｏｖ，Ｉ．Ｎ．，Ｍａｔｉｃ，Ｓ．，Ｎｏｒｉｓ，Ｅ．，Ｍｅｙｅｒｓ，Ａ．，Ｈａｔｔｉｎｇｈ，Ａ．，Ｒｙｂｉｃｋｉ，Ｅ．Ｐ．，Ｋｉｓｅｌｅｖ，Ｏ．Ｉ．，Ｒａｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．，Ｅｌｄａｒｏｖ，Ｍ．Ａ．，Ｓｋｒｙａｂｉｎ，Ｋ．Ｇ．ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．２０１３．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９，５５６４−５５７３．）、これらが、ナノセルロース網状組織中への取り込み後に適切な抗体によって認識可能であるとも思われる。ウイルス及びウイルス様粒子が多様な病原体の免疫原性領域を提示するためにそれらによって修飾され得る、基材の柔軟性及び容易さの組み合わせは、新規な診断デバイスの製造での有用性を与える。
【００８８】
ウイルスの取り込みの確認後、ウイルス官能化膜の有用性を、ウイルスの官能性に依存していくつかの異なる触媒反応で試験した。
【００８９】
実施例４
金属ナノ粒子形成の試験
ＴＭＶ−ＭＢＰ官能化され、洗浄されたナノセルロース膜を、エッペンドルフ管に入れ、５００μｌのＡｇＮＯ３（２．９×１０−３Ｍ）金属塩を添加した。ＴＥＭ分析により、相当量の銀ナノ粒子が、ＴＭＶ−ＭＢＰ官能化試料中で１時間以内に上清中で形成し（図４）、非修飾ＴＭＶ試料ではほとんど又はまったく形成しなかったことがわかった（図５）。
【００９０】
実施例５
ヒドロキシアパタイト堆積の試験
ウイルスの２倍の量（ナノセルロース２５０μｌ当たり４４０μｇ）を使用した以外は、ナノセルロース膜を上記のとおりのＴＭＶ−ＭＩＰ３又はＴＭＶで生成させた。
【００９１】
洗浄された膜を１００ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ４．８３）中１７時間インキュベートした。その後、膜を蒸留水で洗浄し、６０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．３６）中わずかに攪拌しながらインキュベートした。洗浄及びその後のＨＡ前駆体（ＣａＣｌ２及びＮａ２ＨＰＯ４）によるインキュベーションのプロセスをもう一度繰り返し、最終洗浄工程後に最終的に乾燥させた。ＳＥＭ分析を行い、ＨＡ前駆体に露出させていた、ナノセルロースのみ（図６）及び非修飾ウイルスで官能化されたナノセルロース（図７）は非常に少ししかＨＡ堆積を示さないことがわかった。対照的に、ＴＭＶ−ＭＩＰ３で官能化されていたナノセルロースで相当のＨＡ堆積が認められた（図８）。
【００９２】
全タンパク質／酵素の提示のための、ウイルスタンパク質構成要素から形成された構造体の作製
ペプチド又は全タンパク質／酵素の表面提示のための新規なプラットフォームが、植物ウイルス、例えば、ＴＭＶの熱リモデリングにより生成されることを決定した。ＴＭＶロッド形状ウイルスの９４℃で５分間の加熱は、ナノスケール球形粒子（ＳＰ）の形成をもたらし（特許国際公開第２０１２０７８０６９号）、この球形粒子は、ＲＮＡを含まず、官能性複合体の形成のためにいずれのペプチド又は全タンパク質／酵素にも結合することができる。ＴＭＶ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を使用して、直径約２００〜５００ｎｍのＳＰを調製した。溶液中のＳＰ（１００μｌ中０．１ｍｇ）を、ウシ−腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（６μｌ中０．０２ｍｇ）と混合し；この混合物を室温で１時間インキュベートし、次いで、遠心分離にかけて（２３００ｇ、５分）、未結合タンパク質を分離した。得られたペレットを１００μｌのミリ−Ｑ水に再懸濁させた。ＣＩＰで装飾されたＳＰ（ＳＰ−ＣＩＰ）を、１００μｌのナノセルロース懸濁液と混合し、放置して、薄膜に室温で乾燥させた。セルロース単独、又は同量のＳＰを含むセルロースを含む、薄膜を負の対照として使用した。
【００９３】
乾燥セルロース膜を水で数回洗浄した。ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）と共のＣＩＰ基材（ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート））を、洗浄されたセルロース膜に添加し、色変化を観察した。セルロースのみ又はＳＰと一緒のセルロースから構成された膜は、白色から暗青色への色変化がないことにより示されるとおりに何らの反応性も示さなかった（図ａ、図ｂ）。対照的に、暗青色への強い色変化が、ＳＰ−ＣＩＰ酵素を含有するナノセルロース膜で検出され（図ｃ）、ナノセルロース膜における酵素活性が、乾燥及び洗浄後でさえも保存されることを実証した。したがって、酵素で装飾されたプラットフォームの取り込みは、安定であるナノセルロースマトリックスに官能性を与える。
【００９４】
実施例６
塗料処方物を作製するために、ナノセルロース含有粒子を使用する、塗料試験
２組の塗料処方物を構成した（以下の表１及び表２参照）。一方はエポキシ樹脂系を使用して、他方はアクリル樹脂系を使用して作製した。各組について、以下のレオロジー処方の段落で概略される方法によって作製した種々の量のＣｕｒｒａｎ（ナノセルロース含有粒子）を含む、いくつかのバッチを作製した。エポキシ及びアクリル処方物の両方におけるすべての添加剤の重量は、水及び粘度調整剤を除いて、バッチごとに一定に保った。粘度調整剤の重量は、処方物粘度に対する種々の添加レベルの効果を試験するために、バッチごとに変えた。全処方重量を一定に保つために、バッチに添加した水の重量も、粘度調整剤の添加レベルに応じて調整し、その結果、水に加えての粘度調整剤の重量は、バッチごとに一定であった。
【００９５】
セルロース含有粒子を押圧して、含水量を２５％固形物まで減少させ、次いで、パルメザンチーズおろし器を使用して粗粉末におろした。Ｄｉｓｐｅｒｍａｔ塗料混合器を使用して、３０００ｒｐｍで回転させた４ｃｍ直径の鋸歯ブレードによって、各処方の成分を室温で一緒に混合した。混合を１時間行って、すべての成分が十分に分散していることを保証した。混合処方物を１日間放置させた。次いで、各試料の粘度を、レオメータを使用して一連のせん断速度にわたってスキャンした。
【００９６】
エポキシ処方物について、周知のベントナイトクレーレオロジー調整剤であったベンチマークを使用して、細胞壁材料との比較を可能にした。このベンチマークを処方物中に、全処方物重量で０．２５％の濃度で混入させた。
【００９７】
同様に、アクリル処方物について、Ａｃｒｙｓｏｌ会合性増粘剤であった適当なベンチマークを比較のために使用した。このベンチマークを処方物中に全処方物重量の０．６％で混入させた。
【表１】
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【００９８】
粘度調整剤（ここで、標識Ａ）として添加した様々な量のセルロース含有粒子を有するエポキシ塗料処方物についてせん断速度の関数として粘度を示し、ベントナイトクレー粘度調整剤（標識Ｂｅｎｔｏｎｅ  ＥＷ）と比較したグラフを、図９に示す。０．１５％セルロース含有粒子の使用が、特に低せん断速度で、ベントナイトクレーよりもエポキシ処方物においてより高い粘度を生じることがわかる。
【表２】
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【００９９】
粘度調整剤（ここで、標識Ａ）として添加した様々な量のセルロース含有粒子を有するアクリル塗料処方物についてせん断速度の関数として粘度を示し、粘度調整剤（Ａｃｒｙｓｏｌ）として作用する会合性増粘剤と比較したグラフを、図１０に示す。このデータは、セルロース含有粒子が、Ａｃｒｙｓｏｌよりもせん断薄化性（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）であり、低せん断速度で高い粘度を与えるのに特に有効であることを示す。
【０１００】
実施例７
セメント質材料／コンクリート  コンクリート中の添加剤としてのナノセルロース含有粒子の使用
本明細書でレオロジー処方物の節に記載したプロセスにより生成させたセルロース粒子状材料を、複合材料、特にコンクリート及びモルタルなどのセメント質材料におけるその適合性について試験した。
【０１０１】
セルロース粒子状材料を以下に示すとおりの１重量％、５重量％及び１０重量％の量でモルタルミックス中に取り込んだ。使用したモルタルは、Ｍｅｒｃａｒｄｉｅｒから入手可能なＥｎｄｕｉｔ  Ｂｅｔｏｎ  Ｃｏｌｏｒｅと呼ばれる装飾用モルタルであった。
組成：
４．３ｋｇ  セメント粉末
１ｋｇ  アクリル樹脂結合剤
１重量％又は５重量％  セルロース粒子状材料（ＣＰＭ）
【０１０２】
複合材料の圧痕強度を、材料の２ｍｍ厚試料を使用して試験した。試験は、１ｃｍ直径のパンチダイを有する６２．５ＭＰａパンチを使用した。結果を以下の表３に示す：
【表３】
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【０１０３】
このデータは、本明細書に記載されたセルロース粒子状材料を５重量％まで含むことが、材料の強さの改善をもたらすことを示し、セルロース粒子状材料が、コンクリートなどの無機複合材料を強化（ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎ）又は強化する（ｒｅｉｎｆｏｒｃｅ）ことができることを実証する。
【０１０４】
実施例８
紙組成物  紙への添加剤としてのナノセルロース含有粒子の使用
以下のレオロジー材料処方物の節に記載されるプロセスによって生成される種々の量のセルロース粒子状材料（ＣＰＭ）を含む紙組成物を、不透明度及び多孔度について試験した。
【０１０５】
本明細書に記載されるセルロース粒子状材料を含むことは、標準的セルロースから形成される基紙に比べて多孔度を低下させた。紙組成物の多孔度を低下させると、気体、微生物及び他の物質の透過が望ましくない、食品、化粧品及び香料タイプの包装に対して利点が得られる。
【０１０６】
上記実施例から、本明細書に記載されるセルロース粒子状材料、及びこのようなセルロース粒子状材料を生成させるための方法は、多くの異なる用途で有用性を見出すことが分かる。
【０１０７】
本発明のセルロース足場組成物を形成及び分析する実施例がこれから記載される。
【０１０８】
実施例９
複合体処方物  複合体を作製するためのナノセルロース含有粒子の使用
３０ｋｇのニンジンの皮を剥き、粉々に細断し、次いで、等量の水道水が入っている調理用鍋の中に添加し、柔らかくなるまで９５℃で３時間調理した。次いで、この材料を、シルバーソンＦＸインタンクホモジナイザを使用して均質化した。粗媒体及び微細ビーズをホモジナイザで使用して、ほぼ１００ミクロンの平均粒子サイズが達成されるまで粒子サイズを徐々に減少させた。次いで、水酸化ナトリウムを、ＮａＯＨ２部対植物材料固形物１部の比で添加した。次いで、材料を、連続的に攪拌しながら、９０℃に再加熱した。攪拌材料を９０℃で８時間保持した。次いで、材料を冷却し、重力式濾過器を使用して濾過した。ｐＨが７に達するまで、清浄水を材料の中に通して数回洗浄した。次いで、材料をポリベニルアルコール／アセテート及び水系エポキシ樹脂＋硬化剤と、植物材料８５％、エポキシ＋硬化剤１０％及びＰＶＡ５％（固体基準で）の比で混合した。最初に液体ＰＶＡ（ほぼ７０％の水を含有する）を植物材料に添加することによってＰＶＡを混入させ、３０分間十分に混合し、次いで、材料を７．７％固形物まで押圧した（大部分のＰＶＡは、この押圧中に植物ミックスに捕捉されたままである）。押圧は、材料をフィルタ材料の多孔性バッグに入れ、バッグ中の固形物が７．７％に達するまで、材料を２枚の金属プレート間で油圧式フィルタプレスにおいて押圧することによって行った。次いで、水系エポキシ樹脂（分散液又はエマルジョンのいずれか）を、ドウミキサを使用して植物材料＋ＰＶＡに混入させた。用途に応じて追加の水を加えることができる。得られた材料は乾燥されると収縮し、硬質のバイオ複合体材料を形成する。植物材料＋ＰＶＡ＋エポキシ及び硬化剤＋水が液体であり、この液体をプラスチックトレイに注ぎ入れ、材料を乾燥させると、シートを形成することができる。
【０１０９】
当業者により理解されるように、ＰＶＡエポキシ及び硬化剤と混合される植物材料は、代わりの処理で作製することができる。他の例には、限定されないが、９０℃での過酸化水素による植物材料の処理又は酵素による植物材料の処理が含まれる。
【０１１０】
実施例１０
レオロジー材料処方物  レオロジー調整剤を作製するためのナノセルロース含有粒子の使用
９００ｇのテンサイペレットを洗浄し、それらを温水に添加することによって水和し、汚水は、篩を通して流出させた。このテンサイ水和物を過剰の水で大きなバケツに入れ、攪拌し、その後、水切り器ですくい出し、水で洗浄して、石／砂が次の加工段階に入らないことを確実にした。
【０１１１】
洗浄したテンサイを１００℃で３時間調理し、その後、初期の粗いスタータスクリーンを備え、小さい穴開き乳化剤スクリーンに移動するシルバーソンＦＸホモジナイザを使用して均質化した（各スクリーンについて１５分のプロセス時間）。固形物を、Ｏｘｆｏｒｄ固形物メータを使用して測定し、混合物を清浄水の添加によって２％の固形物に調整した。
【０１１２】
次いで、ミックスを２５リットルのガラス反応容器に入れ、容器中の乾燥固形分を計算した。過酸化物水溶液（３５％での）対乾燥固形物０．２５：１の比に基づく過酸化物を、ミックスの加熱時に添加した。温度を９０℃で２時間維持し（ミックスが９０℃に達すると直ぐに）、その時間までにｐＨは、ほぼ５から３．５に降下した。
【０１１３】
次いで、反応液体を容器から除去し、洗浄し、その後、漂白した。
【０１１４】
次いで、洗浄した材料を清浄水に再懸濁させ、それを容器に入れ戻すことによって、漂白を行った。漂白は、２：１漂白（１０％活性塩素を有する漂白溶液２部対固形物１部、３０分間）によって、６０℃で行った。
【０１１５】
次いで、材料を洗浄し、シルバーソンＦＸホモジナイザの微細スロット化スタータスクリーン上で３０分間均質化させた。
【０１１６】
次いで、材料を、フィルタに通して流出させ、所望の最終固形分に吸収布間で押圧した。１重量％の固形物で固形物を水に再懸濁させることにより、４６００ｃｐｓの粘度（前に記載したとおりに測定した）がもたらされた。
【０１１７】
実施例１１
酸加水分解抽出を使用して、（実施例１０、及び国際公開第２０１４／１４７３９２号又は国際公開第２０１４／１４７３９３号に記載されたとおりに、過酸化物抽出により生成された）セルロース含有粒子の分析
このプロセスの３段階（開始；過酸化物処理後；次亜塩素酸ナトリウム処理後）からの乾燥材料を、抽出可能な単糖／多糖含有量について分析した。試験した開始植物材料は、テンサイ及びニンジンであった。
【０１１８】
試験手順は、以下の標準２工程プロトコルに従って行い、このプロトコルは、試料を８０％アルコール溶液中沸騰させることによる多糖からの単糖及びオリゴ糖の分離に基づく。単糖及びオリゴ糖は、アルコール溶液に可溶性であるが、多糖及び繊維は、不溶性である。可溶性成分は、濾過又は遠心分離により不溶性成分から分離することができる。次いで、２つの画分（可溶性及び不溶性）を乾燥させ、秤量して、それらの濃度を決定することができる。
【０１１９】
次いで、乾燥材料を、ＨＰＬＣによる分析、続いて酸加水分解のために使用することができる。
【０１２０】
（ｉ）アルコール可溶性成分及び不溶性成分の分離
材料
・乾燥試料
・８０％エタノール
・圧縮窒素
【０１２１】
方法
各材料試料について、５０ｍｇを、それぞれ９５℃水浴中キャップ付きガラス管中で試料を１０分間沸騰させることによって、５ｍｌの８０％エタノールで３回抽出した。各抽出後、管を５０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、３つの抽出の上清を糖分析のために合わせた。
【０１２２】
残渣及び上清をオーブン乾燥させ、その後、酸加水分解した。トリフルオロ酢酸を使用しての酸加水分解は、ペクチン、ヘミセルロース、及びセルロースの高度非晶質領域を分解する一方で、７２％（重量／容積）硫酸を使用しての酸加水分解は、セルロースの高度結晶質領域を除いて、すべての多糖を分解する。
【０１２３】
（ｉｉ）（ａ）マトリックス多糖の分析  トリフルオロ酢酸加水分解
材料
・乾燥試料
・スクリューキャップ管
・２Ｍトリフルオロ酢酸＝５０ｍｌ中１１．４ｇ（又は３ｍｌの９９．５％ＴＦＡ及び１７ｍｌのｄＨ２Ｏ）
・圧縮窒素
・単糖標準
３種の単糖（グルコース、フルクトース、キシロース）の標準糖混合物。各糖は、１０ｍＭ原液（１００×）中である。標準の調製は、スクリューキャップバイアルに２５０、５００、及び７５０μｌをピペット採取し、蒸発乾固させることによって行なう。続けて、試料と同様に同じ方法で加水分解を行う。
【０１２４】
方法
１日目
・工程（ｉ）からのアルコール不溶性画分５ｍｇをスクリューキャップ管に秤量する。
・試料及び単糖標準（２５０μｌ、５００μｌ、７５０μｌ）をすべて乾燥させる。
【０１２５】
２日目
・ドラフトチャンバ中で、０．５ｍｌの２Ｍ  ＴＦＡを添加することによって加水分解する。バイアルを乾燥窒素でフラッシュし、キャップを置き、十分に混合する。窒素ノズルを試料間で、エタノールティッシュで拭き取って、汚染を予防する。
・バイアルを１００℃で４時間加熱し、加水分解中に数回混合する。
・遠心エバポレータ中、又は窒素フラッシュ下で完全に蒸発させ、一晩ヒューム抽出した。
【０１２６】
３日目
・プロパン−２−オール５００μｌを添加し、混合し、蒸発させる。
・繰り返す。
・試料及び標準を２００μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁させる。十分に混合する。
・遠心分離にかけ、上清を新しい管に移す。
・上清を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルタに通して濾過し、その後、ＨＰＬＣ分析する。
【０１２７】
（ｉｉ）（ｂ）マトリックス多糖の分析  硫酸加水分解
材料
・硫酸７２％（重量／容積）（ＡＲ）
・水酸化バリウム（１５０ｍＭ）
・ブロモフェノールブルー（水中１％溶液）
・０．４５μｍフィルタ
・ＳＰＥ逆相（スチレンジビニルベンゼン）；例えば、Ｓｔｒａｔａ−Ｘ  ３０ｍｇ，１ｍｌ容積
【０１２８】
方法
・工程（ｉ）からのアルコール不溶性画分４ｍｇを２．０ｍｌのスクリュートップミクロ遠心分離管に正確に秤量する。代わりに、マトリックス糖消化からの乾燥残渣を使用する。
・７０μｌの７２％（重量／容積）硫酸をスクリュートップバイアルに添加する。固形物が分散／溶解するまで混合する。
・水浴中３０℃で２時間インキュベートする。試料を１５分ごとに混合する。
・水を添加して、硫酸濃度を４．６％（重量／重量）に低下させる。１５３０μｌの水を添加する。
・十分に混合し、ブロックヒータ中１２１℃で４時間加熱する。３０分ごとにボルテックスする。
・室温に冷却する。（試料は、この時点で冷蔵庫中２週間まで保存してもよい）
・３００μｌを新しい管に取り、１μｌの１％ブロモフェノールブルーを添加する。１５０ｍＭ水酸化バリウムを０．８ｍｌ付加することによって部分的に中和する。炭酸バリウム粉末を添加することにより終了する。指示薬は青色になる。
・遠心分離にかけて、沈降硫酸バリウムを除去する（１００００×ｇで１０分）。上清を新しい管に移す。凍結融解して、沈降を終わらせ、遠心分離を繰り返す（合計容積１０５０μｌ）。
・ＨＰＬＣ前に、試料（７００μｌ  ａｌｉｑｕｏｔ）を逆相カラム（例えば、ｓｔｒａｔａ  Ｘ３０ｍｇ）上に通し、０．４５μｍフィルタに通して濾過する。
【０１２９】
キシロース含有量及びグルコース含有量に関して、これらの分析の結果を表４に示す。当技術分野でのルーチンであるとおりの、基準単糖、例えば、グルコース又はキシロースの既知量、並びに国際公開第２０１４０１７９１１号（実施例  ＣｅｌｌｕＣｏｍｐ  ８〜１０）に開示されたものなどの比較材料の既知量の注入によって、定量データを得ることができる。
【０１３０】
本発明を、特定の実施例を参照して特に示し、説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変化が、それらの中でなされてもよいことが当業者によって理解される。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018519791.tif 000021
2018519791.tif 000022
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