(57)【要約】本発明は、グラム陰性細菌の表面発現されるリポタンパク質のＮ末端部分を含む融合タンパク質の一部として発現される病原体の抗原を提示しているグラム陰性外膜小胞に基づくワクチン組成物、及びワクチン接種におけるそのような組成物の使用に関する。本発明は、グラム陰性細菌の表面発現されるリポタンパク質のＮ末端部分及びリポタンパク質のＮ末端部分に融合された病原体の抗原を含む融合リポタンパク質、この融合リポタンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物及び細菌宿主細胞、並びに融合リポタンパク質を提示する外膜小胞を産生する方法に更に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーを含む融合リポタンパク質であって、
ａ）前記Ｎ末端融合パートナーが、ＮからＣ末端の順序に：
ｉ）脂質化Ｎ末端システイン；
ｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖、好ましくは前記係留鎖が脂質化Ｎ末端システインに隣接して位置する；及び好ましくは、
ｉｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列の係留鎖のＣ末端に位置する少なくとも５、１０又は１７個の一続きの連続するアミノ酸；を含み、
前記Ｎ末端融合パートナーが、グラム陰性細菌における発現に際して細胞外外膜表面における融合リポタンパク質の発現を引き起こし；
ｂ）前記Ｃ末端融合パートナーが、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連する抗原のエピトープを少なくとも１つ含み、
前記融合リポタンパク質のアミノ酸配列が天然に存在しない、融合リポタンパク質。
【請求項２】
前記Ｎ末端融合パートナーが、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質由来のＮ末端断片を含み、前記グラム陰性細菌において発現される場合、前記断片が、前記融合リポタンパク質の表面発現を引き起こす、請求項１に記載の融合リポタンパク質。
【請求項３】
前記グラム陰性細菌が、ナイセリア属、好ましくはナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノロエエ又はＮ．ラクタミカであり、好ましくは前記表面露出リポタンパク質が、ｆＨｂｐ、ＬｐｂＢ、ＴｂｐＢ、ＮＨＢＡ及びＡｇ４７３からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の融合リポタンパク質。
【請求項４】
Ｎ末端融合パートナーが、
ａ）配列番号１の２０〜３８位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号１の２０〜５０位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２の２１〜６１位又は２１〜６３位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号２の２１〜７３位又は２１〜７５位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｃ）配列番号３の２３〜５１位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号３の２３〜６３位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合リポタンパク質。
【請求項５】
前記Ｃ末端融合パートナーが、前記Ｎ末端融合パートナーの前記配列が得られる前記表面露出リポタンパク質由来のアミノ酸配列を欠き、好ましくは前記Ｃ末端融合パートナーが、感染性因子若しくは腫瘍のタンパク質性抗原由来の表面露出エピトープを含む又はそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合リポタンパク質。
【請求項６】
前記Ｃ末端融合パートナーが、表面露出細菌タンパク質若しくはリポタンパク質、好ましくはＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＦ、ＶｌｓＥ、ＢｂＣＲＡＳＰ１、Ｖｓｐ１、Ｐ３５（ＢＢＫ３２）、Ｐ３７（ＢＢＫ５０）、Ｐ３９、Ｐ６６、ＤｐｂＡ及びＢＢ０１７からなる群から選択されるボレリア表面リポタンパク質の表面露出ドメインを含む又はそれからなり、より好ましくは前記ボレリア表面リポタンパク質が、配列番号４のアミノ酸２９〜２７３、配列番号５８のアミノ酸２９〜２７３又は配列番号５９のアミノ酸１３６〜２１０を含む、請求項５に記載の融合リポタンパク質。
【請求項７】
ＯＭＶが、好ましくは界面活性剤抽出されたＯＭＶではなく、好ましくは前記ＯＭＶが、上清のＯＭＶ又は天然のＯＭＶであり、天然のＯＭＶが最も好ましい、請求項１〜６のいずれか一項において定義した融合リポタンパク質を含むＯＭＶ。
【請求項８】
ＯＭＶが、
ａ）グラム陰性細菌に毒性が減少したＬＰＳの産生を引き起こす遺伝子修飾であり、好ましくはｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２及びｌｐｘＫ遺伝子若しくはその相同体のうちの少なくとも１つの発現を減少させる又は排除し、並びに／或いはｌｐｘＥ、ｌｐｘＦ及びｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増加させる前記遺伝子修飾；
ｂ）小胞形成を増加させる遺伝子修飾であり、好ましくはｏｍｐＡ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除し、より好ましくはｒｍｐＭ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する前記遺伝子修飾；及び
ｃ）細胞表面露出リポタンパク質のタンパク質分解性遊離を防止する遺伝子修飾であり、好ましくはｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する前記遺伝子修飾、からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子修飾を有するグラム陰性細菌から入手できる、請求項７に記載のＯＭＶ。
【請求項９】
前記グラム陰性細菌が、ナイセリア、ボルデテラ、エシェリキア及びサルモネラからなる群から選択される属に属し、より好ましくは、前記細菌が、ナイセリア・メニンギティディス、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカからなる群から選択される種に属する、請求項７又は８に記載のＯＭＶ。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のＯＭＶ及び薬学的に受け入れられる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のＯＭＶ又は医薬用の請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
抗原と関連する感染性疾患若しくは腫瘍の防止又は処置用の、請求項１１に記載のＯＭＶ又は医薬組成物であって、好ましくは前記感染性疾患がボレリア感染であり、より好ましくはボレリア・ブルグドルフェリ感染である、ＯＭＶ又は医薬組成物。
【請求項１３】
グラム陰性細菌におけるプレプロ融合リポタンパク質の発現と同時に、前記プレプロ融合リポタンパク質が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合リポタンパク質に成熟するプレプロ融合リポタンパク質をコードする核酸分子であって、好ましくは、前記核酸分子が、グラム陰性細菌において前記プレプロ融合リポタンパク質を発現するための発現構築物である、核酸分子。
【請求項１４】
好ましくは、前記グラム陰性細菌が、ナイセリア、ボルデテラ、エシェリキア及びサルモネラからなる群から選択される属に属し、より好ましくは、前記細菌が、ナイセリア・メニンギティディス、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカからなる群から選択される種に属する、請求項１３に記載の核酸分子又は発現構築物を含むグラム陰性細菌宿主細胞。
【請求項１５】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のＯＭＶを産生する方法であって、
ｉ）請求項１４に記載の宿主細胞を培養するステップと；
ｉｉ）任意選択で前記ＯＭＶを抽出するステップと；
ｉｉｉ）前記ＯＭＶを回収し、前記回収がＯＭＶからの前記細菌の除去を少なくとも含むステップとを含み、
好ましくは前記方法が、界面活性剤を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野、特にワクチン学、医微生物学、細菌学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、病原体の抗原、好ましくはボレリア抗原を提示するグラム陰性外膜小胞に基づくワクチン組成物、及びワクチン接種におけるこれら組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外膜小胞（ＯＭＶ）は、グラム陰性細菌によって自発的に産生される外膜（ＯＭ）の球形出芽である。外膜小胞は、ＯＭタンパク質、ＬＰＳ、リン脂質で構成され、ペリプラズム成分を封入している。ＯＭＶの優れた免疫賦活特性（１〜３）及び産生の容易さから、ＯＭＶはワクチン候補として益々注目を集めている。マウスにおける免疫化研究により、ＯＭＶが、様々な病原性細菌による攻撃に対して防御し得ることが実証された（４〜１２）。ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の場合、ＯＭＶワクチンは、臨床試験において徹底的に調査され、ナイセリア属（ＭｅｎＢｖａｃ及びＭｅＮＺＢ）に対する２つのＯＭＶ性ワクチンが、ヒト用として既に利用可能である（１３、１４）。
【０００３】
ＯＭＶの内的アジュバント特性のため、異種抗原に対する送達媒体としてのＯＭＶの使用が、多くの関心を得ている（１５）。いくつかの研究により、宿主のシグナルペプチド若しくは担体タンパク質と異種タンパク質との融合によって、グラム陰性細菌のペリプラズム又はＯＭにおける異種抗原の発現が、ＯＭＶへの異種抗原の封入を導き得ることが実証された（１〜３、１６〜１９）。重要なことに、そのような組換えＯＭＶは、免疫したマウスにおいて異種抗原に対する免疫応答を誘導することができ（２、３、１２、１７、１８）、抗原の起源である病原体による致死的な攻撃から免疫したマウスを防御することさえもできる（３、１７）。
【０００４】
ＯＭＶ（ペリプラズム／ＯＭ内側／ＯＭ外側）内の異種抗原の特定の位置が免疫応答にどの程度影響を及ぼすかは、依然として未解決の問題である。理論的には、ＯＭＶの外表面が、Ｂ細胞受容体を結合するのに最良の接触性を提供するので、最良の選択肢であるように見える（１７）。表面露出抗原が優れた免疫応答を惹起するという証拠は、実際蓄積されており（２０〜２４）、これにより、特定対象のＯＭＶ表面へ異種抗原は正確に標的化される。
【０００５】
細菌細胞の外表面へ異種タンパク質の発現を特異的に標的化する様々な発現系が、開発されている（総説については［２５〜２９］を参照のこと）。しかしながら、これら系の多くは、タンパク質の小さい部分しか提示することができず、また低い発現レベルに悩まされる（３０）。最も用途が広い２つの手法は、氷核形成タンパク質（２５、３１）又は自己輸送体（２１、３２〜３５）と異種タンパク質（の部分）を融合し、細胞表面に到達させることである。近年では、両方の系を使用して、複数の酵素／抗原でＯＭＶの表面を装飾している（２１、３１）。
【０００６】
リポタンパク質は、優れた免疫賦活特性及び毒性因子としての役割のため、防御免疫の重要な標的として浮上している膜結合タンパク質である。例えば、ＯｓｐＡ（ボレリア・ブルグドルフェリ［Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ］）及びｆＨｂｐ（Ｎ．メニンギティディス ［Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ］）の両方が、それぞれライム病（３６〜３９）及び髄膜炎（４０、４１）に対するワクチン成分として徹底的に研究されてきた。しかしながら、ＯＭＶにおける異種リポタンパク質の表面発現は、これまで調べられてこなかった。
【０００７】
リポタンパク質は、Ｎ末端システインに脂質修飾を保有し、疎水性膜における親水性タンパク質の係留を容易にする。この高度に保存されているタンパク質脂質化モチーフは、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ２によって哺乳動物の生来の免疫系により認識され、リポタンパク質に優れた免疫賦活特性を与える（４４、４５）。グラム陰性細菌において、大部分のリポタンパク質は、内又は外膜のペリプラズム側に見られる。リポタンパク質は、Ｌｏｌ（リポタンパク質局在）機構により内膜から外膜に移動する（４６）。外膜の細胞外側に位置するリポタンパク質はあまり一般的でなく、外膜を通る移動を誘導する系又はシグナルは、まだ解明されていない。
【０００８】
ボレリアにおいて、リポタンパク質は、既定で外膜の外側へ移動するようであり、従ってこのスピロヘータの表面は、リポタンパク質に異常に富んでいる（４７）。表面局在するボレリアリポタンパク質の１例はＯｓｐＡであり、ＯｓｐＡは、ライム病に対するワクチン成分として徹底的に調査されてきたので、ＯｓｐＡの免疫原性及び構造に関する詳細な知見が利用可能である。
【０００９】
ライム病は、ヨーロッパ及び米国において最も一般的な、ベクター伝播性の疾患である。ライム病は、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のスピロヘータの感染により引き起こす複数の系に及ぶ炎症性障害、広義には感染しているマダニによる刺咬の結果の症候群である。感染は、抗生物質で処置されない場合、重篤な病理の慢性疾患に最終的に進行し得る。ヒト用として間もなく利用可能な唯一のワクチン（Ｌｙｍｅｒｉｘ）は、組換え脂質化ＯｓｐＡに基づいたものだった。自己免疫副作用に関する申し立てに起因する低い売上のため、このワクチンは、導入後わずか３年間で、２００２年に市場から自主的に回収された（４９）。しかしながら、副作用の申し立ては根拠がないことが後に判明し（５０）、最近のＬｙｍｅワクチン開発は、非常に議論のあったエピトープを除去し、ＯｓｐＡをなお標的としている（３８、３９）。
【００１０】
しかしながら、ボレリア抗原など、表面に病原体の抗原を提示しているグラム陰性外膜小胞に基づく改善されたワクチン組成物及び例えばライム病に対するワクチン接種における改善されたワクチン組成物の使用が、当業者になお必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
第一の態様において、本発明は、ａ）Ｎ末端融合パートナーが、ＮからＣ末端の順序に：ｉ）脂質化Ｎ末端システイン；ｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖、好ましくは、係留鎖は脂質化Ｎ末端システインに隣接して位置する；及び好ましくは、ｉｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列の係留鎖のＣ末端に位置する少なくとも５、１０又は１７個の一続きの連続するアミノ酸；を含み、Ｎ末端融合パートナーが、グラム陰性細菌における発現に際して細胞外外膜表面における融合リポタンパク質の発現を引き起こし；ｂ）Ｃ末端融合パートナーが、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連する抗原のエピトープを少なくとも１つ含み、好ましくは融合リポタンパク質のアミノ酸配列が天然に存在しない、Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーを含む融合リポタンパク質に関する。融合リポタンパク質において、Ｎ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質由来のＮ末端断片を含み、グラム陰性細菌において発現される場合、断片は、融合リポタンパク質の表面発現を引き起こすことが好ましい。Ｎ末端断片は、ナイセリア属、好ましくはナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノロエエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）又はＮ．ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）のグラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質由来であることが好ましく、より好ましくは表面露出リポタンパク質は、ｆＨｂｐ、ＬｐｂＢ、ＴｂｐＢ、ＨｐｕＡ、ＮＨＢＡ及びＡｇ４７３からなる群から選択される。
【００１２】
本発明による好ましい融合リポタンパク質において、Ｎ末端融合パートナーは、ａ）配列番号１の２０〜３８位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号１の２０〜５０位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２の２１〜６１位又は２１〜６３位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号２の２１〜７３位又は２１〜７５位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；又はｃ）配列番号３の２３〜５１位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号３の２３〜６３位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含む。
【００１３】
本発明による融合リポタンパク質において、Ｃ末端融合パートナーは、Ｎ末端融合パートナーの配列が得られる表面露出リポタンパク質からのアミノ酸配列を欠くことが好ましい。
【００１４】
本発明の融合リポタンパク質中のＣ末端融合パートナーは、好ましくは感染性因子若しくは腫瘍のタンパク質性抗原由来の表面露出エピトープを含む又はそれからなる。Ｃ末端融合パートナーは、表面露出細菌タンパク質又はリポタンパク質の表面露出ドメインを含む又はそれからなることがより好ましい。表面露出細菌タンパク質又はリポタンパク質は、好ましくはボレリア表面リポタンパク質であり、好ましくはＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＦ、ＶｌｓＥ、ＢｂＣＲＡＳＰ１、Ｖｓｐ１、Ｐ３５（ＢＢＫ３２）、Ｐ３７（ＢＢＫ５０）、Ｐ３９、Ｐ６６、ＤｐｂＡ及びＢＢ０１７からなる群から選択される。ボレリア表面リポタンパク質は、配列番号４のアミノ酸２９〜２７３若しくは配列番号５８のアミノ酸２９〜２７３若しくは配列番号５９のアミノ酸１３６〜２１０を含む又はそれからなることがより好ましい。
【００１５】
第２の態様において、本発明は、本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶに関し、ここで、ＯＭＶは、好ましくは界面活性剤抽出されたＯＭＶでない。界面活性剤抽出されていない適切なＯＭＶは、上清のＯＭＶ又は天然のＯＭＶであり、好ましくはＯＭＶは、天然のＯＭＶである。
【００１６】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶは、ａ）細菌に毒性が減少したＬＰＳの産生を引き起こす遺伝子修飾であり、好ましくはｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２及びｌｐｘＫ遺伝子若しくはその相同体のうちの少なくとも１つの発現を減少させる又は排除し、並びに／或いはｌｐｘＥ、ｌｐｘＦ及びｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増加させる遺伝子修飾；ｂ）小胞形成を増加させる遺伝子修飾であり、好ましくはｏｍｐＡ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除し、より好ましくはｒｍｐＭ遺伝子若しくはその相同体を減少させる又は排除する遺伝子修飾；及びｃ）細胞表面露出リポタンパク質のタンパク質分解性遊離を防止する遺伝子修飾であり、好ましくはｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾、からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子修飾を有するグラム陰性細菌から好ましくは得られる／入手できる。本発明のＯＭＶが産生されるグラム陰性細菌は、ナイセリア、ボルデテラ、エシェリキア及びサルモネラからなる群から選択される属に好ましくは属し、より好ましくは、細菌は、ナイセリア・メニンギティディス、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）からなる群から選択される種に属する。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、本発明のＯＭＶ及び薬学的に認められた賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
第４の態様において、本発明は、本発明によるＯＭＶ又は医薬用のＯＭＶを含む医薬組成物に関する。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、本発明によるＯＭＶ、或いは抗原と関連する感染性疾患若しくは腫瘍の防止又は処置用のＯＭＶを含む医薬組成物に関し、ここで、感染性疾患は、好ましくはボレリア感染であり、より好ましくはボレリアブルグドルフェリ感染である。
【００２０】
第６の態様において、本発明は、プレプロ融合リポタンパク質をコードしている核酸分子に関し、ここで、プレプロ融合リポタンパク質は、グラム陰性細菌における発現と同時に本発明の融合リポタンパク質に成熟し、好ましくは、核酸分子は、グラム陰性細菌においてプレプロ融合リポタンパク質を発現するための発現構築物である。
【００２１】
第７の態様において、本発明は、プレプロ融合リポタンパク質をコードしている核酸配列を含む核酸分子又は発現構築物を含むグラム陰性細菌宿主細胞に関し、ここで、好ましくは、グラム陰性細菌は、ナイセリア、ボルデテラ、エシェリキア及びサルモネラからなる群から選択される属に属し、より好ましくは、細菌は、ナイセリア・メニンギティディス、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカからなる群から選択される種に属する。
【００２２】
第８の態様において、本発明は、本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生する方法に関し、上記方法は：ｉ）プレプロ融合リポタンパク質をコードしている核酸配列を含む核酸分子又は発現構築物を含むグラム陰性細菌宿主細胞を培養するステップと；ｉｉ）任意選択でＯＭＶを抽出するステップと；ｉｉｉ）ＯＭＶを回収し、回収がＯＭＶからの細菌の除去を少なくとも含むステップとを含み、好ましくは上記方法は、界面活性剤を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】ｆＨｂｐ（斜線）、ＯｓｐＡ（白色）及び融合構築物の図式的概観である。ｆＨｂｐ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド、α１＝後のループを含めたｆＨｂｐのＮ末端αヘリックス、β１−４＝ｆＨｂｐの最初の４つのＮ末端βシート。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。いくつかの構築物に組み込まれた人工リンカー（６）を、白色で示す。構築物ｆＡ１を、構築物ｆＡ３ｂ及びｆＡ５ｃを作製する鋳型として使用した点に注意されたい。
【図１−２】ｆＨｂｐ（斜線）、ＯｓｐＡ（白色）及び融合構築物の図式的概観である。ｆＨｂｐ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド、α１＝後のループを含めたｆＨｂｐのＮ末端αヘリックス、β１−４＝ｆＨｂｐの最初の４つのＮ末端βシート。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。いくつかの構築物に組み込まれた人工リンカー（６）を、白色で示す。構築物ｆＡ１を、構築物ｆＡ３ｂ及びｆＡ５ｃを作製する鋳型として使用した点に注意されたい。
【図１−３】ｆＨｂｐ（斜線）、ＯｓｐＡ（白色）及び融合構築物の図式的概観である。ｆＨｂｐ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド、α１＝後のループを含めたｆＨｂｐのＮ末端αヘリックス、β１−４＝ｆＨｂｐの最初の４つのＮ末端βシート。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。いくつかの構築物に組み込まれた人工リンカー（６）を、白色で示す。構築物ｆＡ１を、構築物ｆＡ３ｂ及びｆＡ５ｃを作製する鋳型として使用した点に注意されたい。
【図２】Ｎ．メニンギティディス細胞（ａ）又はＯｓｐＡ若しくは融合構築物を保有するｎＯＭＶ（ｂ）におけるＯｓｐＡ発現のウェスタンブロット解析を示す図である。細胞及びｎＯＭＶを、ＯＤ６００及びタンパク質含有量に基づいてそれぞれ標準化した。異なる構築物の予想される分子量を、ｋＤａ（括弧内）で示す。矢印は、全長タンパク質を示す。ｗｔ：「空の」プラスミドｐＥＮ１１−Ｉｍｐ（材料及び方法を参照のこと）を保有するＮ．メニンギティディス細胞（又はこれらの細胞から回収したｎＯＭＶ）。
【図３ａ】マウス血清のウェスタンブロット解析を示す図である。レーンは、ｐＥＮ１１−ＯｓｐＡ（「ＯｓｐＡ」）又はｐＥＮ１１−Ｉｍｐ（「Ｉｍｐ」）を保有する大腸菌をロードした。（ａ）左から右に；（１）約２８ｋＤａの予想されるバンドを示す抗ＯｓｐＡの対照ブロット及び（２）ＰＢＳ、（３）高用量の空のｎＯＭＶ、（４）高用量のＯｓｐＡ  ｎＯＭＶ、（５）高用量のｆＡ１  ｎＯＭＶ、（６）低及び（７）高用量のｆＡ４ｂ  ｎＯＭＶ、並びに（８）低及び（９）高用量のｆＡ６  ｎＯＭＶで免疫した５匹のマウス群のプールした血清によるブロット。
【図３ｂ】マウス血清のウェスタンブロット解析を示す図である。レーンは、ｐＥＮ１１−ＯｓｐＡ（「ＯｓｐＡ」）又はｐＥＮ１１−Ｉｍｐ（「Ｉｍｐ」）を保有する大腸菌をロードした。（ｂ）高用量のｆＡ６  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウスの血清によるブロット（この群のプールした血清は、図４Ａの右端である）。矢印は、ＯｓｐＡ（約２８ｋＤａ）と類似の分子量を持つバンドを示す。
【図４ａ】構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６又はｆＡ７を保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウスの血清に対するＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。空ベクターｐＥＮ１１−Ｉｍｐを保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫したマウスのプールした血清を、陰性対照として使用し、プロットする前にデータから差し引いた。ここで試験したｆＡ６で免疫したマウスの血清は、図４ｂに示したウェスタンブロットにおける血清と同じものであり、個体＃２の低い応答性に反映されている点に注意されたい。
【図４ｂ】構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６又はｆＡ７を保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウスの血清に対するＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。空ベクターｐＥＮ１１−Ｉｍｐを保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫したマウスのプールした血清を、陰性対照として使用し、プロットする前にデータから差し引いた。ここで試験したｆＡ６で免疫したマウスの血清は、図４ｂに示したウェスタンブロットにおける血清と同じものであり、個体＃２の低い応答性に反映されている点に注意されたい。
【図４ｃ】構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６又はｆＡ７を保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウスの血清に対するＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。空ベクターｐＥＮ１１−Ｉｍｐを保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫したマウスのプールした血清を、陰性対照として使用し、プロットする前にデータから差し引いた。ここで試験したｆＡ６で免疫したマウスの血清は、図４ｂに示したウェスタンブロットにおける血清と同じものであり、個体＃２の低い応答性に反映されている点に注意されたい。
【図４ｄ】構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６又はｆＡ７を保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウスの血清に対するＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。空ベクターｐＥＮ１１−Ｉｍｐを保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫したマウスのプールした血清を、陰性対照として使用し、プロットする前にデータから差し引いた。ここで試験したｆＡ６で免疫したマウスの血清は、図４ｂに示したウェスタンブロットにおける血清と同じものであり、個体＃２の低い応答性に反映されている点に注意されたい。
【図５−１】ＴｂｐＢ（斜線）及びＯｓｐＡ（白色）融合構築物の図式的概観である。ＴｂｐＢ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。
【図５−２】ＴｂｐＢ（斜線）及びＯｓｐＡ（白色）融合構築物の図式的概観である。ＴｂｐＢ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。
【図６】ＯｓｐＡポリクローナル（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した、構築物ｆＴＡ１−４を保有するＮ．メニンギティディス細胞におけるＯｓｐＡ発現のウェスタンブロット解析を示す図である。異なる構築物の予想される分子質量を、ｋＤａ（括弧内）で示す。矢印は、全長タンパク質を示す。
【図７Ａ】ｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ並びにＴｂｐＢ−ＯｓｐＡ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ａ）構築物の図式的概観。ｆＨｂｐ断片は斜線、ＯｓｐＡ断片は灰色、ＴｂｐＢ断片は白色である。ｆＨｂｐ、ＴｂｐＢ及びＯｓｐＡのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。
【図７Ｂ】ｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ並びにＴｂｐＢ−ＯｓｐＡ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ｂ）ＯｓｐＡモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した構築物ｆＡ１０及びｆＴＡ５を保有するＮ．メニンギティディス細胞におけるＯｓｐＡ発現のウェスタンブロット解析。異なる構築物の予想される分子質量を、ｋＤａ（括弧内）で示す。矢印は、全長タンパク質を示す。
【図８Ａ】ｆＨｂｐ−ＯｓｐＣ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ａ）構築物の図式的概観。ｆＨｂｐ断片は斜線、ＯｓｐＣ断片は白色である。ｆＨｂｐ及びＯｓｐＣのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。
【図８Ｂ】ｆＨｂｐ−ＯｓｐＣ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ｂ）構築物ｆＣ９及びＯｓｐＣを持つＮ．メニンギティディス細胞におけるＯｓｐＣ発現のウェスタンブロット解析。ＯｓｐＣの明らかな発現は、観察されなかった。異なる構築物の予想される分子質量を、ｋＤａ（括弧内）で示す。構築物ｆＣ９は、ホモ二量体を形成しない。
【図９Ａ】ｆＨｂｐ−ＲｍｐＭ並びにＴｂｐＢ−ＲｍｐＭ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ａ）構築物の図式的概観。ｆＨｂｐ断片は斜線、ＲｍｐＭ断片は灰色、ＴｂｐＢ断片は白色である。ｆＨｂｐ、ＴｂｐＢ及びＲｍｐＭのアミノ酸番号を、囲み範囲に示す。Ｓ．ｐ．＝シグナルペプチド。付番された矢印は、表１に挙げたプライマーを指し、フォワードプライマーを図式的に（融合）遺伝子の上に示し、リバースプライマーを下に示し、矢じりの位置は、３’末端のおよその位置を反映している。
【図９Ｂ】ｆＨｂｐ−ＲｍｐＭ並びにＴｂｐＢ−ＲｍｐＭ融合構築物の図式的概観及びウェスタンブロット解析を示す図である。Ｂ）構築物ｆＲ１及びｆＴＲ１を持つＮ．メニンギティディスΔＲｍｐＭ細胞におけるＲｍｐＭ発現のウェスタンブロット解析。異なる構築物の予想される分子質量を、ｋＤａ（括弧内）で示す。矢印は、全長タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書において互換的に使用される。配列同一性は、配列を比較することにより決定される２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係と本明細書において定義される。当技術分野において、「同一性」は、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味し、場合によっては一連のそのような配列間の一致により決定される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及び保存されているアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。
【００２５】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル若しくはローカルアライメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド又は２つの核酸配列のアライメントにより決定することができる。類似した長さの配列は、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバルアライメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して好ましくは整列され、一方で実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して好ましくは整列される。配列が、少なくとも一定の最小限のパーセンテージの配列同一性（以下で定義する）を共有する場合（初期設定パラメーターを使用して例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列した場合）、その後配列を、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と称することができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列の全長（完全長）にわたって整列し、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。２つの配列が類似の長さを有する場合、グローバルアライメントを適切に使用して、配列同一性を決定する。一般に、ギャップクリエイションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）でＧＡＰ初期設定パラメーターが使用される。ヌクレオチドの場合、使用される初期設定スコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、初期設定スコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９頁）。パーセンテージ配列同一性の配列アライメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから利用可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラムを使用して、又は上のＧＡＰの場合と同じパラメーター若しくは既定の設定を使用してＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０にあるプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（局所Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して決定することができる（「ｎｅｅｄｌｅ」と「ｗａｔｅｒ」両方について、タンパク質とＤＮＡ両方のアライメントに対して、初期設定Ｇａｐオープニングペナルティは１０．０、及び初期設定ギャップエクステンションペナルティは０．５であり；初期設定スコア行列は、タンパク質の場合Ｂｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡの場合ＤＮＡＦｕｌｌである）。全体の配列長が、実質的に異なる場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するなどローカルアライメントが好ましい。
【００２６】
別法として、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して、公開データベースに対して検索することにより決定することができる。従って、本発明の核酸及びタンパク質配列を、「問い合わせ配列」として更に使用して公開データベースに対する検索を実行し、例えば、それにより他のファミリーメンバー又は関連配列を同定することができる。公開データベースに対する検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁）のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行して、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子に相同な核酸配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップありのアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）の初期設定パラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で米国バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照のこと。
【００２７】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者は、当業者にとって明らかになるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することもできる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リシン、アルギニン及びヒスチジンであり；含硫側鎖を有する一群のアミノ酸は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換群は以下の通りである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミン。本明細書に開示したアミノ酸配列の置換型バリアントは、開示した配列の少なくとも１つの残基が除去され、除去された場所に異なる残基が挿入されたバリアントである。アミノ酸変化は保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについて好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２８】
本明細書では、用語「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的にハイブリダイズする」及び類似の用語は、互いに少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％相同な核酸配列が一般に互いにハイブリダイズし続けるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件について記述することを目的とする。即ち、そのようなハイブリダイズしている配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することができる。
【００２９】
そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましく、非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳ）中で約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃及び更により好ましくは約６５℃での１回又は複数回の洗浄である。
【００３０】
非常に厳しい条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／１．０％  ＳＤＳ中で約６８℃でのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で室温での洗浄がある。別法として、洗浄は４２℃で実行することができる。
【００３１】
当業者は、厳しい及び非常に厳しいハイブリダイゼーション条件にどの条件を適用するかについて知っている。ハイブリダイゼーション条件に関する追加の指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）」において当技術分野ですぐに利用可能である。
【００３２】
当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）区域など）又は相補的区間のＴ（又はＵ）残基だけにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）区間若しくはその相補部を含有するどんな核酸分子（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にもハイブリダイズすることになるので、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズさせるために使用する本発明のポリヌクレオチドに含めることはできない。
【００３３】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」が、組換えＤＮＡ技術の使用に起因する人為的な核酸分子を意味することは、本明細書において理解される。従って、用語「核酸構築物」は、天然に存在する核酸分子を含まない。但し核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の部分）を含むことができる。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、そのような配列に適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を達成し得る核酸配列を指す。遺伝子の発現を達成し得る発現ベクターは、少なくとも適切な転写調節配列、及び任意選択で３’転写終結シグナルを一般に含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現を達成するのに必要な又は有用な追加の因子も存在し得る。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養においてコード配列の発現を達成することになる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適切であることになる。
【００３４】
本明細書では、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、１つ若しくは複数のコード配列の転写を制御するために機能する核酸断片を指し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位を含むがそれには限らない他の任意のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写量を調節するために直接又は間接的に作用する当業者に公知の他の任意のヌクレオチドの配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、殆どの生理的及び発生条件下で殆どの組織において活性であるプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、例えば化学誘導物質の適用により、生理的又は発生上調節されるプロモーターである。
【００３５】
用語「選択可能なマーカー」は、当業者によく知られている用語であり、発現した際に、選択可能なマーカーを含有する細胞（単数）又は細胞（複数）を選択するために使用できる任意の遺伝的実体について記述するために本明細書で使用される。用語「レポータ」は、マーカーと互換的に使用することができるが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など可視マーカーを指すために主に使用される。選択可能なマーカーは、優性又は劣性又は双方向性でありえる。
【００３６】
本明細書では、用語「作動的に連結された」とは、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸が、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸は「作動的に連結されている」。例として、転写調節配列が、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、転写調節配列はコード配列に作動的に連結されている。作動的に連結されているは、連結されているＤＮＡ配列が一般に連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合には、連続し且つ読み枠が合っていることを意味する。
【００３７】
本明細書では用語「ペプチド」は、アミノ酸残基の鎖と定義され、通常定義された配列を有する。本明細書では、用語ペプチドは、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」と互換性がある。本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、修飾又は無修飾のペプチド結合によって連結されている少なくとも２つのアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質と定義される。用語「ペプチド」とは、オリゴペプチド若しくはオリゴマーなどの短鎖分子又はタンパク質などの長鎖分子を指す。タンパク質／ペプチドは、線状、分枝状又は環状であり得る。ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸又はそれらの組み合わせを含むことができる。本発明によるペプチドは、修飾アミノ酸を含むことができる。従ってまた、本発明のペプチドは、転写後修飾などの天然のプロセス又は化学的プロセスにより修飾され得る。転写後修飾のいくつかの例は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合性結合形成、ヘムとの共有結合性結合形成、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との共有結合性結合形成、修飾又は無修飾炭水化物部分に対する共有結合性結合形成、脂質又は脂質誘導体との結合形成、ホスファチジルイノシトールとの共有結合性結合形成、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、システイン分子形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、酸化、リン酸化、ラセミ化、ヒドロキシル化等である。従って、ペプチドの免疫原性排除による効果がないペプチドの任意の修飾は、本発明の範囲に網羅される。
【００３８】
用語「遺伝子」は、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含む、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動的に連結されたＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）などいくつかの作動的に連結された断片を通常含むことになる。「遺伝子の発現」とは、適当な調節領域、特にプロモーターに作動的に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性がある、即ち生物学的に活性があるタンパク質又はペプチドに翻訳され得るＲＮＡに転写されるプロセスを指す。用語「同種の」は、所与の（組換え）核酸若しくはポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との関係を示すために使用される場合、核酸若しくはポリペプチド分子が、同種、好ましくは同じ品種若しくは株の宿主細胞又は生物によって天然では産生されることを意味すると理解される。宿主細胞と同種である場合、ポリペプチドをコードしている核酸配列が、天然の環境とは別の（異種）プロモーター配列、並びに適用できる場合には、別の（異種）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に一般に（必然ではないが）作動的に連結されることになる。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列等はまた、宿主細胞と同種であってもよいと理解される。本文脈において、「同種」配列エレメントだけを使用することが、「自己クローニングされた」遺伝子操作生物（ＧＭＯ）の構築を可能にする（自己クローニングは、ＥｕｒｏｐｅａｎＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ９８／８１／ＥＣ Ａｎｎｅｘ ＩＩのように、本明細書において定義する）。２つの核酸配列の関連性を示すために使用する場合、用語「同種」は、１つの１本鎖核酸配列が、相補的な１本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量並びに後述する温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含めたいくつかの因子によって決まり得る。
【００３９】
用語「異種」及び「外来性」とは、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用する場合、その核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質が存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の一部として天然には存在しない、或いは天然に見いだされるものとは異なる細胞又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列中の位置（単数）若しくは位置（複数）に見いだされる核酸若しくはタンパク質を指す。異種及び外来性核酸又はタンパク質は、導入された細胞には内在していないが、別の細胞から得られたか、又は合成若しくは組換えによって産生された。一般に、必須ではないが、外来性核酸は、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって通常産生されないタンパク質、即ち外来性タンパク質をコードする。同様に、外来性ＲＮＡは、外来性ＲＮＡが存在する細胞において通常発現されないタンパク質をコードする。異種／外来性核酸及びタンパク質は、外来性核酸又はタンパク質と称することもできる。当業者が、発現する細胞にとって外来性であると認識し得る任意の核酸又はタンパク質は、異種又は外来性核酸若しくはタンパク質という用語によって本明細書に包含される。用語異種及び外来性は、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、即ち組み合わせた配列の少なくとも２つが互いに関して外来性である組み合わせにも適用される。
【００４０】
本明細書では用語「免疫応答」とは、特定の抗原性実体に対して作られる抗体、並びに／或いは特定の抗原性実体の分解及び／又は阻害を助ける、表面で抗原及び／若しくは抗原性エピトープを保有及び／又は発現又は提示する細胞（Ｔリンパ球など）の産生を指す。本発明の目的のための成句「有効な免疫防御応答」、「免疫防御」、及び類する用語は、ワクチン接種した対象において病原体による感染又はがんに対して防御するために、病原体、病原体に感染した細胞又はがん細胞の抗原性エピトープの１つ若しくは複数に対して起こる免疫応答を意味する。本発明の目的のために、病原体による感染に対する防御又はがんに対する防御は、感染又はがんの完全な防止だけでなく、例えばワクチン接種していない感染した対象と比較して、ワクチン接種した対象における病原体による感染又はがんの程度若しくは率の任意の検出可能な減少、或いは病原体による感染又はがんに起因する疾患の重症度又は任意の症候若しくは状態の任意の検出可能な減少も含む。がん症例における有効な免疫防御応答は、がん細胞を取り除き、それによりがんのサイズを減少又は更にがんを消滅させることも含む。有効な免疫防御応答を実現するためのワクチン接種を、治療ワクチン接種とも呼ぶ。別法として、有効な免疫防御応答は、ワクチン接種時点で以前に病原体に感染したことがない及び／若しくは病原体に感染していない又はまだがんを患っていない対象に誘導することができ、そのようなワクチン接種を、予防ワクチン接種と称することができる。
【００４１】
本発明によると、用語「抗原」の本明細書における一般的な使用は、抗体に特異的に結合する任意の分子を指す。用語は、ＭＨＣ分子によって結合され、Ｔ細胞受容体に提示され得る任意の分子又は分子断片のことも指す。例えば抗原は、任意選択で炭水化物部分及び／又は脂質部分などの非タンパク質性基を含むタンパク質性分子、即ちポリアミノ酸配列であることができ、又は例えば抗原は、炭水化物などタンパク質性でない分子であることもできる。例えば、抗原は、タンパク質の任意の部分（ペプチド、部分的タンパク質、全長タンパク質）であることができ、タンパク質は、天然に存在する若しくは合成によって得られる、細胞性組成物（全細胞、細胞溶解物又は破壊された細胞）、生物（全生物、溶解物又は破壊された細胞）又は炭水化物又は他の分子、或いはその一部分であり、特定の対象において抗原特異的免疫応答（体液性及び／又は細胞性免疫応答）を生じさせることができ、抗原特異的免疫応答は、好ましくはアッセイ又は方法によって測定可能である。
【００４２】
本明細書において用語「抗原」は、適応免疫応答の受容体に対する標的として働く構造物質と理解される。従って抗原は、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）又はＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）又はＢＣＲの分泌形態、即ち抗体に対する標的として働く。従って抗原は、例えば細胞又はビリオンなどのより大きな構造の通常は一部であるタンパク質、ペプチド、炭水化物又は他のハプテンであり得る。抗原は、体内（「自己」）又は外部環境（「非自己」）が起源であってもよい。免疫系は、胸腺におけるＴ細胞の負の選択のため正常条件下では「自己」抗原に対して通常無反応性であり、外界からの「非自己」侵入物又は例えば疾患条件下で体内に存在する修飾された／有害な物質だけを識別し、攻撃することになる。細胞性免疫応答の標的である抗原構造は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、プロセシングされた抗原性ペプチドの形態で組織適合性分子を介して適応免疫系のＴ細胞へ提示される。提示される抗原及び組織適合性分子の型に応じて、いくつかの型のＴ細胞が活性になり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）認識の場合、抗原は、細胞内部で小さいペプチド断片にプロセシングされ、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりＴ細胞受容体に提示される。
【００４３】
用語「免疫原」は、対象に好ましくは適当なアジュバントと一緒に投与した際に、対象においてエピトープ及びエピトープを含む抗原に対する特定の体液性並びに／若しくは細胞性免疫応答を生じさせるような抗原のエピトープを少なくとも１つ含む又はコードする実体について記述するために本明細書で使用される。免疫原は、抗原と同一であることができ、又は抗原の一部、例えば抗原のエピトープを含む部分を少なくとも含む。従って、一実施形態において、対象に特定の抗原に対するワクチン接種するということは、抗原のエピトープを少なくとも１つ含む免疫原の投与の結果として、抗原又はその免疫原性部分に対する免疫応答が生じることを意味する。ワクチン接種は、好ましくは防御又は治療効果をもたらし、抗原（又は抗原の供給源）へのワクチン接種後の曝露は、抗原（又は供給源）に対する免疫応答を生じさせ、免疫応答は、対象において疾患若しくは症状を減少させる又は防止する。ワクチン接種の概念は、当技術分野において周知である。本発明の予防的又は治療的組成物の投与により生じる免疫応答は、ワクチンの投与なしと比較した免疫状態の任意の局面における任意の検出可能な変化（例えば、細胞性応答、体液性応答、サイトカイン産生）であることができる。
【００４４】
「エピトープ」は、対象において免疫応答を生じさせるのに十分な、所与の抗原内の単一の免疫原性部位と本明細書において定義される。当業技術者は、Ｔ細胞エピトープが、サイズ及び組成物においてＢ細胞エピトープと異なっており、クラスＩ  ＭＨＣ経路によって提示されるＴ細胞エピトープが、クラスＩＩ  ＭＨＣ経路によって提示されるエピトープと異なることを認識することになる。エピトープは、免疫応答の型に応じて直線配列又は立体配座エピトープ（保存されている結合領域）であることができる。抗原は、単一のエピトープと同程度に小さい又はより大きいことができ、複数のエピトープを含むこともできる。このように、抗原のサイズは、約５〜１２アミノ酸（例えば、ペプチド）と同程度に小さい及び多量体タンパク質、タンパク質複合体、ビリオン、粒子、全細胞、全微生物又はその部分（例えば、全細胞の溶解物又は微生物の抽出物）を含めた完全長タンパク質と同程度に大きいことができる。
【００４５】
ＯＭＶ（泡状突起とも称される）は、通常球形の、直径２０〜２５０ｎｍ（時には１０〜５００ｎｍ）の範囲であるグラム陰性細菌の外膜からくびれ切れる二重層膜構造である。ＯＭＶ膜は、様々な位置で膜タンパク質と混合しているリン脂質（ＰＬ）を内側に並びにリポ多糖（ＬＰＳ）及びＰＬを外側に含有し、くびれ切れた細菌外膜の構造を主に反映している。ＯＭＶの内腔は、タンパク質、ＲＮＡ／ＤＮＡ及びペプチドグリカン（ＰＧ）など、ペリプラズム又は細胞質由来の様々な化合物を含有することができるが、細菌細胞とは異なりＯＭＶには自己複製の能力がない。本発明の文脈において、産生方法に応じて３つの型のＯＭＶが、区別され得る。ｓＯＭＶは、すでに形成されているＯＭＶから完全な細胞を分離することによって培養上清から精製され、濃縮される自然発生的な又は天然のＯＭＶである。界面活性剤ＯＭＶ、ｄＯＭＶは、デオキシコール酸などの界面活性剤により細胞から抽出され、界面活性剤はまた、反応原性ＬＰＳ（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ  ＬＰＳ）及びリポタンパク質の含有量を減少させる。界面活性剤抽出後、ｄＯＭＶは、細胞及び細胞残屑から分離され、更に精製され、濃縮される。最後に、用語天然のｎＯＭＶは、非界面活性剤細胞破砕技術で濃縮死細胞から生成される又は他の（非破壊的）界面活性剤を含まない方法で細胞から抽出されるＯＭＶに関して本明細書で使用され、野生型の自然発生的なＯＭＶ及び界面活性剤抽出されたｄＯＭＶと明確に区別できる。
【００４６】
公共配列データベースにおいて利用可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列への本明細書における任意の参照は、本文書の出願日に利用可能な配列登録のバージョンを指す。
【００４７】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ワクチン接種目的の抗原のエピトープを含む、表面露出している融合リポタンパク質を含むグラム陰性ＯＭＶに関する。表面リポタンパク質は、従来通りの界面活性剤に基づくＬＰＳ除去の間にＯＭＶから通常除去される。しかしながら、最近の生物工学の発達により、例えばナイセリア属から、表面露出しているリポタンパク質をＯＭＶに付着させたままにすることを潜在的に可能にする界面活性剤を含まないＯＭＶ抽出プロセスが得られている（４２、４３）。本発明者らは、異種リポタンパク質を含むいわゆる天然のＯＭＶ（ｎＯＭＶ）における抗原性リポタンパク質の表面発現の可能性について調査した。特に、本発明者らは、ナイセリアｎＯＭＶにおけるボレリアＯｓｐＡリポタンパク質の異種発現について試験した。ボレリアにおけるＯｓｐＡリポタンパク質の表面局在並びにＯｓｐＡリポタンパク質の免疫原性及び構造に関する詳細な知見のため、ＯｓｐＡは、試験に適切なリポタンパク質になった。
【００４８】
本発明者らは、Ｎ．メニンギティディス細胞及びｎＯＭＶにおいてＯｓｐＡを発現させることができたが、髄膜炎菌の細胞表面においてＯｓｐＡを検出することはできなかった。上記の結果は、ペリプラズム又はＯＭのペリプラズム側への誤局在を示している。リポタンパク質のそのような宿主−スイッチ誘導誤局在は、珍しくなく、おそらく代理宿主の選別規則の順守に起因している（５１）。
【００４９】
驚くべきことに、よく研究されている髄膜炎菌表面リポタンパク質であるｆＨｂｐの異なる部分とＯｓｐＡの球状ドメインとを融合させることにより、ナイセリアの細胞表面にＯｓｐＡを向け直すことができた（４１、４８）。ｆＨｂｐの特定のＮ末端部分との融合が、ｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合構築物の表面発現を可能にすることを示す。更に、これらの表面露出したｆＨｂｐ−ＯｓｐＡハイブリッドを発現しているナイセリアｎＯＭＶが、免疫したマウスにおいて強力な抗体応答を生じさせることを実証する。
【００５０】
第２に、構造レベルでよく特徴づけられており、鉄取り込みに関係する補助受容体であるトランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）の異なる部分とＯｓｐＡの球状ドメインとを融合させることにより、ナイセリアの細胞表面にＯｓｐＡを向け直すこともできた（６３）。
【００５１】
第３に、ナイセリアの細胞表面に、非ボレリア並びに非リポタンパク質を含めたＯｓｐＣ及びＲｍｐＭなど、他のタンパク質を向け直すことができた（ＲｍｐＭなど）。
【００５２】
第１の態様において、本発明は融合リポタンパク質に関係する。融合リポタンパク質は、好ましくはＮ末端及びＣ末端融合パートナーを少なくとも含む。
【００５３】
融合リポタンパク質中のＮ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の外膜の細胞外表面における融合タンパク質の発現を達成することを目的とし、外膜の細胞外表面で融合タンパク質は発現され、共有結合的に付加された脂質を介して膜に係留される。上記目的のために、融合リポタンパク質中のＮ末端融合パートナーは、好ましくはＮからＣ末端の順序で、ｉ）脂質化Ｎ末端システイン；ｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖、好ましくは係留鎖は脂質化Ｎ末端システインに（直接）隣接して位置する；及び好ましくは、ｉｉｉ）グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列の係留鎖のＣ末端近くに位置する少なくとも１つ又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２８又は３０個の一続きの連続するアミノ酸、を好ましくは少なくとも含む。
【００５４】
グラム陰性細菌において発現される場合、Ｎ末端融合パートナーは、細胞外外膜表面における融合リポタンパク質の表面発現を好ましくは引き起こす。融合リポタンパク質の細胞外外膜表面における表面発現を引き起こすＮ末端融合パートナーの能力は、結合している抗体が、例えば本明細書の実施例１．５及び２．３に記載の免疫蛍光により好ましくは検出される例えば融合リポタンパク質に対する抗体、好ましくはＣ末端融合パートナーに対する抗体を使用して、グラム陰性細菌における融合リポタンパク質の発現及びグラム陰性細菌の外側での融合リポタンパク質の検出によりアッセイすることができる。Ｎ末端融合パートナーが表面発現を引き起こす能力を決定するのに好ましいアッセイにおいて、Ｎ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の細胞外外膜表面でリポタンパク質の（一部）として表面発現できる公知のＣ末端融合パートナーと融合される。
【００５５】
この目的のために適切なＣ末端融合パートナーは、例えばボレリアＯｓｐＡリポタンパク質の球状ドメイン、好ましくはボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡリポタンパク質の球状ドメインであり、そのため、好ましくは本明細書の実施例において使用される通り、球状ドメインは、ＯｓｐＡリポタンパク質の２９〜２７３位のアミノ酸配列、例えば配列番号４の２９〜２７３位のアミノ酸配列からなる。
【００５６】
Ｎ末端融合パートナーが表面発現を引き起こす能力を試験するのに適切な別のＣ末端融合パートナーは、例えばボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）ＯｓｐＡリポタンパク質の球状ドメインを含む又はそれからなり、そのため、好ましくは本明細書の実施例において使用される通り、球状ドメインは、例えば配列番号５８の２９〜２７３位のアミノ酸配列からなる。
【００５７】
Ｎ末端融合パートナーが表面発現を引き起こす能力を試験するのに適切な更に別のＣ末端融合パートナーは、例えばボレリアＯｓｐＣリポタンパク質の球状ドメイン（の断片）、好ましくはＢ．ブルグドルフェリＯｓｐＣリポタンパク質を含む又はそれからなり、そのため、好ましくは本明細書の実施例において使用される通り、断片は、ＯｓｐＣリポタンパク質の１３６〜２１０位のアミノ酸配列、例えば配列番号５９の１３６〜２１０位のアミノ酸配列からなる。
【００５８】
別法として、Ｎ末端融合パートナーが表面発現を引き起こす能力を試験するためのＣ末端融合パートナーは、ペリプラズム細菌タンパク質のドメインを好ましくは含む又はそれからなる。ペリプラズム細菌タンパク質のドメインは、ボルデテラ、ボレリア、コキシエラ、ナイセリアからなる属及び上記とは別の病原性細菌属のいずれかから選択される細菌由来であることが好ましい。ペリプラズム細菌タンパク質のドメインは、ペプチドグリカンと好ましくは結びついており及び／又は好ましくはタンパク質のＣ末端ドメインである。本明細書の実施例において使用される通り、ペリプラズムナイセリアタンパク質のドメインは、ＲｍｐＭから得られることがより好ましく、より好ましくは、ナイセリアペリプラズムタンパク質は、配列番号７のアミノ酸９０〜２４２を含む又はそれからなる。
【００５９】
Ｎ末端融合パートナーが表面発現を引き起こす能力を決定するのに好ましいアッセイにおいて、融合リポタンパク質は、Ｎ末端融合パートナーにおいて配列の大多数を得られる／入手できる細菌、即ちＮ末端融合パートナーに最も多くの個々のアミノ酸を提供している細菌、と同じ種のものであるグラム陰性細菌宿主細胞において発現される。従って、Ｎ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌における発現において、配列番号４の２９〜２７３位のアミノ酸配列（又は代わりに配列番号５８の２９〜２７３位のアミノ酸配列若しくは配列番号５９の１３６〜２１０位のアミノ酸配列若しくは配列番号７の９０〜２４２位のアミノ酸配列）と（Ｃ末端で）融合されているＮ末端融合パートナーからなる融合リポタンパク質のグラム陰性細菌の細胞外外膜表面における発現を少なくとも引き起こすことが好ましく、そのため、グラム陰性細菌は、Ｎ末端融合パートナーにおいて配列の大多数を入手できる細菌と同じ種のものである。この融合リポタンパク質の表面発現は、抗ＯｓｐＡ（ポリクローナル）抗体、例えばＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、  ＰＡ  １９４６８，  ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｒｏｃｋｌａｎｄ−ｉｎｃ．ｃｏｍ）から利用可能な抗ＯｓｐＡ（ウサギ）抗体２００−４０１−Ｃ１３Ｓを用いて免疫蛍光顕微鏡により検出されることが好ましい。更に、ＯｓｐＣ融合リポタンパク質の表面発現は、抗ＯｓｐＣ（ポリクローナル）抗体、例えばＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から利用可能な抗ＯｓｐＣ抗体２００−４０１−Ｃ１１Ｓを用いて好ましくは検出される。ＲｍｐＭ融合リポタンパク質の表面発現は、国立公衆衛生環境研究所、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから利用可能な抗ＲｍｐＭ抗体ＭＮ２Ｄ６Ｄを用いて好ましくは検出される。
【００６０】
脂質化システインは、好ましくは本発明の成熟した融合リポタンパク質において最もＮ末端のアミノ酸である。細菌リポタンパク質は、プレプロリポタンパク質として最初に翻訳され、プレプロリポタンパク質タンパク質は、分泌タンパク質のシグナルペプチドの典型的な特色を持つ約２０アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを有する（Ｉｎｏｕｙｅら、１９７７年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７４：１００４〜１００８頁）。リポボックス（ｌｉｐｏｂｏｘ）、［ＬＶＩ］［ＡＳＴＶＩ］［ＧＡＳ］Ｃと称されるシグナルペプチドのＣ末端領域で保存されている配列は、不可欠なシステイン残基の側鎖にあるチオール基へのジアシルグリセロール部分の共有結合性付加によって修飾される（Ｂａｂｕら、２００６年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：２７６１〜２７７３頁）。この修飾は、酵素、リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼにより触媒され、チオエステル結合によりタンパク質に連結されたジアシルグリセロール部分からなるプロリポタンパク質が得られる。プロリポタンパク質は次に、シグナルペプチドを切り離すリポタンパク質シグナルペプチダーゼによりプロセシングされ、新たなＮ末端残基として脂質化システインが残り、成熟したリポタンパク質が形成される。成熟したリポタンパク質は、リポタンパク質Ｎ−アシルトランスフェラーゼによってＮ末端システイン残基に付加される追加のアミド連結された脂肪酸を有することができる。
【００６１】
脂質化システインの下流（ＮからＣ末端の順序）のＮ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖を好ましくは含み、そのため、係留鎖は、Ｎ末端脂質化システインに直接隣接して位置することが好ましく、このことはＮ末端脂質化システインと係留鎖の間に追加のアミノ酸が存在しないことを意味する。グラム陰性表面リポタンパク質の係留鎖は通常、αへリックス又はβ鎖又はβシートなどの二次構造を形成する傾向が低い５〜５０アミノ酸の区間であり、露出している構造タンパク質の残りに無秩序で可動性のリポペプチド係留鎖を提供する。理論に束縛されるものではないが、係留鎖は、リポタンパク質の位置、例えばリポタンパク質局在機構（Ｌｏｌ）によって外膜に向けられるか又は内膜に保持されるかを決定するのに重要であると更に考えられる。特に＋２位、即ちＮ末端脂質化システインに直接隣接しているアミノ酸の同一性は、普遍的な規則とは思われず、また係留鎖中のより下流にある他のアミノ酸がリポタンパク質を位置付けるのに役割を果たす可能性もあるが、この同一性が、リポタンパク質の位置を決定するのに重要であることが報告されている（Ｋｏｖａｃｓ−Ｓｉｍｏｎら、２０１１年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７９：５４８〜５６１頁）。更にまた、本発明者らによっても示される通り、リポタンパク質の表面発現を達成する係留鎖の能力は、種特異的であり得る。従って、融合タンパク質の係留鎖は、細菌属、より好ましくは融合リポタンパク質が発現される本発明の細菌宿主細胞と同じ細菌種の表面発現されるリポタンパク質からの係留鎖であることが好ましい。従って融合リポタンパク質の係留鎖は、融合リポタンパク質が発現される本発明の宿主細胞と好ましくは同種である。
【００６２】
ナイセリア宿主細胞における本発明の融合リポタンパク質の発現に好ましい係留鎖は、例えばＮ．メニンギティディス、Ｎ．ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びＮ．ラクタミカなどのナイセリアのｆＨｂｐ（Ｈ因子結合タンパク質）、ＬｐｂＢ（ラクトフェリン結合タンパク質）、ＴｂｐＢ（トランスフェリン結合タンパク質）、ＨｐｕＡ（ヘモグロビンハプトグロビン利用タンパク質）、ＮＨＢＡ（ナイセリアヘパリン結合抗原、ＧＮＡ２１３２）及びＡｇ４７３（Ｃｈｕら、２０１２年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（７）：ｅ４０８７３；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿２７４４７７．１）など表面発現されるナイセリアリポタンパク質由来の係留鎖である。従って、ナイセリア宿主細胞における本発明の融合リポタンパク質の発現にとって好ましい係留鎖は、ａ）配列番号１の２０〜３３位のアミノ酸配列と少なくとも６０、６９、７６、８４、９２又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）配列番号２の２１〜５６位若しくは２１〜５８位のアミノ酸配列と少なくとも６０、６８、７５、８１、８７、９３又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、ＴｂｐＢ、ＭＣ５８株から得られる）又は配列番号６０の２１〜５６位若しくは２１〜５８位のアミノ酸配列と少なくとも６０、６８、７５、８１、８７、９３又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、ＴｂｐＢ、Ｈ４４／７６株から得られる）；及びｃ）配列番号３の２３〜４６位のアミノ酸配列と少なくとも６０、６６、７０、７５、７９、８３、８７、９１、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される係留鎖であり、好ましくは、係留鎖は、表面発現されるグラム陰性リポタンパク質中に天然に存在するアミノ酸配列を有する。Ｎ末端脂質化システインは、上のａ）、ｂ）及びｃ）の係留鎖におけるアミノ酸配列の定義に含まれるものと理解される。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の融合リポタンパク質におけるＮ末端パートナーは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質由来の更なる配列を含む。本発明者らは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の追加のアミノ酸配列を含むＮ末端融合パートナーが、例えばｆＡ１融合リポタンパク質により例証されるように、融合リポタンパク質の表面発現のレベルを有意に増加させ得ることを見出した。従って、Ｎ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つ又は複数の連続するアミノ酸を好ましくは含み、１つ又は複数の連続するアミノ酸が得られる表面露出リポタンパク質において、好ましくは１つ又は複数の連続するアミノ酸は、係留鎖のＣ末端に近くに存在する。１つ又は複数の連続するアミノ酸の区間の長さは、好ましくは上述の通りである。
【００６４】
好ましい実施形態において、表面露出リポタンパク質由来アミノ酸の追加の区間は、αへリックス、β鎖又はβプリーツシートなどの二次構造若しくはその一部の局所エレメント若しくはセグメントを形成する傾向があるアミノ酸配列を含む。融合リポタンパク質の表面発現のレベルを増加させるために含め得る表面露出リポタンパク質由来アミノ酸の好ましい追加の区間は、ナイセリアｆＨｂｐタンパク質、より好ましくはＮ．メニンギティディスｆＨｂｐタンパク質の３４〜５０位のアミノ酸配列から選び取られる少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７アミノ酸の連続する区間であり、最も好ましくは連続する区間は、配列番号１の３４〜５０位のアミノ酸配列から選び取る。区間が、ナイセリアｆＨｂｐタンパク質のアミノ酸配列中の係留鎖のＣ末端近くに位置するように、３４位のアミノ酸は、ナイセリアｆＨｂｐタンパク質の３４〜５０位のアミノ酸配列から選び取られる連続する区間に含まれることが好ましい。
【００６５】
本発明の融合リポタンパク質のＮ末端パートナーにおいて、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖及びグラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列由来の１つ又は複数の連続するアミノ酸、即ち上のエレメントｉｉ）及びｉｉｉ）は、異なる２つの表面露出リポタンパク質（２つの異なるグラム陰性細菌由来の可能性もある）のアミノ酸配列から得られる／入手できるが、好ましくは表面露出リポタンパク質は、同一の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列から得られる／入手できる。
【００６６】
一実施形態において、本発明の融合リポタンパク質において、リポタンパク質中のＮ末端融合パートナーは、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質由来のＮ末端断片を含み、Ｎ末端断片は、脂質化システインを少なくとも含む。リポタンパク質中のＮ末端融合パートナーは、成熟した表面露出リポタンパク質由来のＮ末端断片を含むことが好ましく、成熟したリポタンパク質は、Ｎ末端として脂質化システインを有すると理解される。リポタンパク質のＮ末端融合パートナーは、断片のＮ末端にある脂質化システインを含めて、脂質化システインから始めて少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２８、３０、３１、３２、３５、３８又は４０個連続する、成熟した表面露出リポタンパク質のＮ末端断片由来のアミノ酸を含むことが好ましい。グラム陰性細菌において発現される場合、Ｎ末端断片は、融合リポタンパク質の表面発現を引き起こすことが好ましい。融合リポタンパク質の表面発現を達成するＮ末端断片の能力は、上記の通りアッセイできる。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の融合リポタンパク質は、ナイセリア宿主細胞における発現に使用できる融合リポタンパク質である。そのような融合リポタンパク質のＮ末端パートナーにおいて、グラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質の係留鎖及びグラム陰性細菌の表面露出リポタンパク質のアミノ酸配列由来の１つ若しくは複数の連続するアミノ酸、即ち上のエレメントｉｉ）及びｉｉｉ）、並びに／又は上で定義したＮ末端断片は、ナイセリア属、好ましくはナイセリアメニンギティディス又はナイセリアゴノレエ又はＮ．ラクタミカの細菌のアミノ酸配列から得られる／入手できることが好ましい。Ｎ末端融合パートナーのアミノ酸配列が得られる／入手できるナイセリア表面露出リポタンパク質は、ｆＨｂｐ、ＬｐｂＢ、ＴｂｐＢ、ＨｐｕＡ、ＮＨＢＡ及びＡｇ４７３からなる群から選択されることがより好ましい。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、ナイセリア宿主細胞における発現に使用できる本発明の融合リポタンパク質において、融合リポタンパク質のＮ末端パートナーは、ａ）配列番号１の２０位〜３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０位のうちの１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）配列番号２の２１位〜５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４及び７５位のうちの１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；又はｃ）配列番号３の２３位〜４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３位のうちの１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含む。
【００６９】
融合リポタンパク質におけるＣ末端融合パートナーは、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連する抗原の少なくとも１つのエピトープに対する免疫応答を生成することを好ましくは目的とし、エピトープは、Ｃ末端融合パートナーに存在する。融合リポタンパク質におけるＣ末端融合パートナーは、原理的には少なくとも１つのエピトープを含む任意のアミノ酸配列であることができる。
【００７０】
本発明の融合リポタンパク質は、好ましくは、Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーが、グラム陰性宿主細胞における正常なタンパク質合成によって融合され、融合リポタンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーをそれぞれコードしている核酸配列の翻訳により発現され（下記参照）、そのコード配列が、標準的な組換えＤＮＡ技術によりフレームを合わせて作動的に連結されている、融合タンパク質であることは本明細書で理解される。任意選択で、Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーは、リンカーアミノ酸配列を介して融合され、この場合コード配列は、Ｎ末端及びＣ末端融合パートナーをコードしているそれぞれの核酸配列とフレームを合わせて作動的に連結される。リンカーアミノ酸配列は、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５又は２０アミノ酸のアミノ酸配列である。好ましいリンカーは、アミノ酸グリシン、プロリン、セリン及びアラニンで構成されるアミノ酸配列を含む。リンカーは、アミノ酸配列ＰＧＧＳＧＡ（配列番号５）、又はその（部分）反復を含むことがより好ましい。
【００７１】
融合リポタンパク質のＣ末端融合パートナーは、原理的には少なくとも１つのエピトープを含む任意のアミノ酸配列であることができる。Ｃ末端融合パートナーは、少なくとも５、１０、１５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０若しくは４００アミノ酸及び／又は８００、７００、６００、５００若しくは４５０以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含むことが好ましい。グラム陰性細菌において発現される場合、本発明の融合リポタンパク質中のＣ末端融合パートナーは、融合リポタンパク質の表面発現に適合することが好ましい。Ｃ末端融合パートナーの、融合リポタンパク質の表面発現との適合性は、上記の通りアッセイできる。
【００７２】
一実施形態において、本発明の融合リポタンパク質におけるＣ末端融合パートナーは、Ｎ末端融合パートナーに対して異種である。Ｎ末端融合パートナーに対して異種であるＣ末端融合パートナーは、Ｃ末端融合パートナーのアミノ酸配列が、Ｎ末端融合パートナーのアミノ酸配列の起源であるタンパク質とは異なる１つ又は複数のタンパク質を起源とすることを意味すると理解される。異種Ｃ末端融合パートナーは、Ｎ末端融合パートナーと同じ生物が起源であることができ、又はＮ及びＣ末端融合パートナーはそれぞれ異なる生物由来であることもできる。本発明による融合リポタンパク質において、Ｃ末端融合パートナーは、Ｎ末端融合パートナーの配列が得られる表面露出リポタンパク質からのアミノ酸配列を欠くことが好ましい。Ｃ末端融合パートナーは、Ｎ末端融合パートナーの配列が得られる表面露出リポタンパク質由来のアミノ酸の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５個又は少なくとも２０個の（連続する）アミノ酸配列を欠くことがより好ましい。従って、好ましくは、Ｃ末端融合パートナーは、表面露出リポタンパク質を起源とするＮ末端融合パートナーのアミノ配列とは異なる１つ若しくは複数のタンパク質性抗原を起源とするアミノ酸配列を含む又はそれからなる。
【００７３】
本発明の融合リポタンパク質におけるＣ末端融合パートナーは、エピトープを含む抗原に対する免疫応答を誘導及び／又は増大させるためのエピトープを好ましくは少なくとも１つ含む。Ｂ細胞、体液性又は抗体応答は、Ｃ末端融合パートナーにあるエピトープにより生じることが好ましい。Ｃ末端融合パートナーにあるエピトープは、防御及び／又は中和抗体応答を生じさせることが好ましい。別法として及び／又は更に、Ｃ末端融合パートナーは、Ｔ細胞応答を生じさせるエピトープを含む。免疫原性ペプチドによって誘導及び／又は増大される好ましいＴ細胞応答は、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答及びＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ応答のうちの少なくとも一方を含む。Ｔ細胞応答は、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答と同時にＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ応答の両方からなることがより好ましく、Ｂ細胞応答を伴うことが有利になり得る。
【００７４】
融合リポタンパク質におけるＣ末端融合パートナーは、病原体（感染性因子）及び／又は腫瘍の広範な抗原からのエピトープを１つ若しくは複数含むことができる。例えば、Ｃ末端融合パートナーは、ウイルス、細菌、真菌及び原生動物などの病原体並びに感染性因子由来の抗原のエピトープを１つ又は複数含むことができる。抗原からエピトープを得ることができる感染又は腫瘍を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例には：肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ及びＣＭＶ、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス（中皮腫を引き起こす）、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶウイルス；例えば、Ｉ及びＩＩ型）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）がある。抗原からエピトープを得ることができる感染を引き起こす病原性細菌のいくつかの例には：ボレリア属、リステリア属、エシェリキア属、クラミジア属、コキシエラ属、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、肺炎球菌属、髄膜炎菌属、淋菌属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラシア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア、サルモネラ、バシラス、ボルデテラ、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、脾脱疽、ペスト、レプトスピラ症、百日咳及びライム病を引き起こす細菌がある。抗原からエピトープを得ることができる感染を引き起こす病原性真菌のいくつかの例には：カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、アルビカンス［ａｌｂｉｃａｎｓ］、クルーセイ［ｋｒｕｓｅｉ］、グラブラータ［ｇｌａｂｒａｔａ］、トロピカリス［ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ］）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、フミガーツス［ｆｕｍｉｇａｔｕｓ］、ニガー［ｎｉｇｅｒ］）、ケカビ目（ケカビ属、アブシディア属、クモノスカビ属）の真菌、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス  イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）がある。抗原からエピトープを得ることができる感染を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例には：赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、フォーラー・ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカン���アメーバｓｐ．（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐ．）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウムｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｌｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ブルース・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）及びプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）がある。
【００７５】
加えて、Ｃ末端融合は、例えばＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＴ−抗原、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ｐ５３、ＸＡＧＥ及びＰＲＡＭＥを含めた広範な腫瘍抗原、だけでなくヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カボジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、エプスタインバーウイルスに誘導されるリンパ腫（ＥＢＶ）を含めたウイルスに誘導される悪性腫瘍からのエピトープを１つ若しくは複数含み得る。本発明用のエピトープを得ることができる腫瘍抗原の他の例は、がんと関連することが公知の遍在的に発現される様々な自己抗原であり、例えば、ｐ５３、ＭＤＭ−２、ＨＤＭ２及びｐ５３経路において役割を果たす他のタンパク質、サバイビン、テロメラーゼ、シトクロムＰ４５０アイソフォーム１Ｂ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＣＤ１９などの分子並びに全てのいわゆるハウスホルドタンパク質がある。本発明によって処置し得るがんは、肺、結腸、食道、卵巣、膵臓、皮膚、胃、頭頸部、膀胱、肉腫、前立腺、肝細胞、脳、副腎、胸部、子宮内膜、中皮腫、腎臓、甲状腺、血液学的、類癌腫、黒色腫、副甲状腺、頸部、神経芽細胞腫、ウィルムス、精巣、下垂体及び褐色細胞腫がんの中から選択される。
【００７６】
一実施形態において、Ｃ末端融合パートナーは、感染性因子若しくは腫瘍のタンパク質性抗原からの１つ若しくは複数の表面露出エピトープを含む又はそれからなる。Ｃ末端融合パートナーは、例えば、感染性因子若しくは腫瘍のタンパク質性抗原の細胞外及び／若しくは表面露出ドメインを含む又はそれからなることができる。
【００７７】
好ましい実施形態において、Ｃ末端融合パートナーは、表面露出細菌タンパク質又はリポタンパク質の表面露出ドメインを含む又はそれからなる。細菌由来表面露出タンパク質又はリポタンパク質の表面露出ドメインは、ボルデテラ、ボレリア、コキシエラ、ナイセリアからなる属及び上記とは別の病原性細菌属のいずれかから選択されることが好ましい。Ｓｃｈｕｉｊｔら（２０１１年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．２７（１）：４０〜７頁）、Ｓｔｅｅｒｅ及びＬｉｖｅｙ（２０１３年；参照リストの４９）、Ｅｍｂｅｒｓ及びＮａｒａｓｉｍｈａｎ（２０１３年、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．３：６頁）並びにＳｍａｌｌら（２０１４年、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．９（２）：ｅ８８２４５頁）のうちの１つ又は複数に記載の通り、表面露出ドメインは、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＦ、ＶｌｓＥ、ＢｂＣＲＡＳＰ１、Ｖｓｐ１、Ｐ３５（ＢＢＫ３２）、Ｐ３７（ＢＢＫ５０）、Ｐ３９、Ｐ６６、ＤｐｂＡ及びＢＢ０１７からなる群から選択される表面露出ボレリアタンパク質又はリポタンパク質であることがより好ましい。表面露出ドメインは、配列番号４のアミノ酸２９〜２７３、配列番号５８のアミノ酸２９〜２７３若しくは配列番号５９のアミノ酸１３６〜２１０を含む又はそれからなることが最も好ましい。
【００７８】
Ｃ末端融合パートナーのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸２９〜２７３、配列番号５８のアミノ酸２９〜２７３の配列又は配列番号５９のアミノ酸１３６〜２１０と３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有することもできる。
【００７９】
第２の態様において、本発明は、本明細書において上で定義される融合リポタンパク質を含むＯＭＶに関係する。ワクチン用のＯＭＶ（別名「泡状突起」）は、界面活性剤抽出（ｄＯＭＶ精製プロセス）により、伝統的に調製され、デオキシコール酸のような界面活性剤を使用してＬＰＳを除去し、小胞遊離を増加させる。Ｎ．メニンギティディスなど殆どのグラム陰性細菌のＬＰＳは、毒性が高いが、残存量（およそ１％）は、ＯＭＶの小胞構造を維持するため及びアジュバント活性に必要である。しかし、界面活性剤抽出プロセスは、殆どのＬＰＳとともにリポタンパク質も除去し、従って本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生するのに適切ではない。従って、本発明による融合リポタンパク質を含むＯＭＶは、好ましくは界面活性剤抽出されたＯＭＶではない。しかし界面活性剤抽出されたＯＭＶではないＯＭＶを調製するプロセスは、いかなる界面活性剤の使用も除外するものではないことは理解されよう。例えば、同じ培養の同量からの自然発生的又は上清ＯＭＶに存在する融合リポタンパク質の量と比較して本発明による融合リポタンパク質の殆ど、即ち融合リポタンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％が維持されているならば、低濃度の界面活性剤の使用及び／又は穏やかな界面活性剤の使用は除外されない。
【００８０】
本発明の融合リポタンパク質を含む好ましいＯＭＶは、上清又は自然発生的ＯＭＶ、即ち本明細書において上で定義されるｓＯＭＶ又は天然のＯＭＶ、即ち本明細書において上で定義されるｎＯＭＶである。ｎＯＭＶは、本明細書の実施例１．６に記載の通り調製することができる。ｎＯＭＶを調製する更なる方法は、例えばＳａｕｎｄｅｒｓら（１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、６７、１１３〜１１９頁）、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、３０：３６８３〜３６９０頁）、及び国際公開第２０１３００６０５５号に記述されており、ｓＯＭＶを調製する方法は、例えばＶａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１３年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、８（１）：ｅ５４３１４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４３１４）及びＬｅｅら（２００７年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、７：３１４３〜３１５３頁）に記述されており、そのすべてを参照により本明細書に組み込む。
【００８１】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶは、（ｉ）好ましくはエンドトキシン及び反応原性が少ないバリアントを得るために、リポ多糖（ＬＰＳ）生合成経路を改変する遺伝子修飾、；（ｉｉ）正常に分泌された抗原の外膜保持を引き起こす遺伝子修飾；（ｉｉｉ）外膜アンカータンパク質を除去することによりＯＭＶ産生を増加させる遺伝子修飾；（ｉｖ）望ましくない型の免疫応答を誘発する可能性がある免疫変調成分を除去する遺伝子修飾；及び（ｖ）宿主ＯＭＶ産生株以外の病原体由来の異種抗原の発現を導入する遺伝子修飾、からなる群から選択される遺伝子修飾を有するグラム陰性細菌から好ましくは得られる／入手できる。
【００８２】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶは、細菌に毒性が減少したＬＰＳの産生を引き起こすが、毒性が減少したＬＰＳがアジュバント活性の少なくとも一部を保持する遺伝子修飾を有するグラム陰性細菌から好ましくは得られる／入手でき、好ましくは遺伝子修飾が、ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２及びｌｐｘＫ遺伝子若しくはその相同体のうちの少なくとも１つの発現を減少させる又は排除し、並びに／或いはｌｐｘＥ、ｌｐｘＦ及び／又はｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。グラム陰性細菌は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するｌｐｘＬ１遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を有することがより好ましい。
【００８３】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを得られる／入手できるグラム陰性細菌は、小胞形成を増加させ、それによってＯＭＶ収量を増加させるために、外膜とペプチドグリカンの間のアンカータンパク質をコードする遺伝子の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を更に好ましくは含む。ＯＭＶ収量を増加させるために適切な遺伝子修飾は、例えば、グラム陰性細菌、例えばナイセリアのＲｍｐＭタンパク質に一般に見られるＯｍｐＡ相同体の発現を減少させる又は排除する（Ｓｔｅｅｇｈｓら、２００２年Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４：５９９〜６１１頁；Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら、２０１０年Ｖａｃｃｉｎｅ、２８：４８１０〜４８１６頁）。従って、好ましくはグラム陰性細菌は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するｒｍｐＭ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を有する。
【００８４】
一実施形態において、本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶは、ｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を有するグラム陰性から好ましくは得られる／入手できる。ＮａｌＰプロテアーゼは、ナイセリアにおけるＬｂｐＢ細胞表面露出リポタンパク質のタンパク質分解性遊離に関与するとして同定された（Ｒｏｕｓｓｅｌ−Ｊａｚｅｄｅら、２０１０年、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７８：３０８３〜３０８９頁）。本発明の融合リポタンパク質のタンパク質分解性遊離を防止するために、本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生するグラム陰性宿主は、ｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を有することが好ましい。グラム陰性宿主においてｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少又は排除して、融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生することがより好ましく、Ｎ末端融合パートナーは、ＬｂｐＢアミノ酸配列を含む。従って、グラム陰性細菌は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するｎａｌＰ遺伝子若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する遺伝子修飾を有することが好ましい。
【００８５】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生するグラム陰性細菌宿主細胞は、ｃｐｓ、ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｅｘｂＢ、ｅｘｂＤ、ｆｒｐＢ、ｇａｌＥ、ｈｔｒＢ、ｍｓｂＢ、ｌｐｂＢ、ｌｐｘＫ、ｌｐｘＬ１、ｎｍｂ００３３、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｒｍｐＭ、ｐｈｏＰ、ｐｉｌＣ、ｐｍｒＥ、ｐｍｒＦ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｓｉａＡ、ｓｉａＢ、ｓｉａＣ、ｓｉａＤ  ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｔｂｐＡ、及びｔｂｐＢからなる群から選択される遺伝子、若しくはその相同体の発現を減少させる又は排除する１つ若しくは複数の遺伝子修飾を更に有することができ；これらの突然変異の多数は、国際公開第０２／０９７４６号に概説されている。
【００８６】
本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生するグラム陰性細菌宿主細胞は、好ましくはナイセリア、ボルデテラ、エシェリキア及びサルモネラからなる群から選択される属に属する細菌宿主細胞であり、より好ましくは、ナイセリア・メニンギティディス、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカからなる群から選択される種に属する細菌宿主細胞である。
【００８７】
更なる態様において、本発明は、本明細書において上で定義されるＯＭＶを含み、本発明による融合リポタンパク質を含む医薬組成物に関する。組成物は、従来通りに当技術分野において公知の薬学的に許容可能な担体、培地又は送達媒体を更に好ましくは含む（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅら編、第７版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照のこと）。薬学的に許容される安定剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤などを医薬組成物に組み込むこともできる。好ましい形態は、投与及び治療適用の意図される様式によって決まる。医薬用担体は、患者に有効成分、即ち本発明の融合タンパク質を含むＯＭＶを送達するのに適切な任意の適合する非毒性物質であることができる。
【００８８】
非経口送達用の薬学的に許容可能な担体は、任意選択で、２０％アルブミンで補充した無菌の緩衝した０．９％  ＮａＣｌ又は５％グルコースにより例示される。別法として、融合タンパク質を含むＯＭＶは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁することができる。非経口投与用の調製物は、無菌でなければならない。本発明の融合タンパク質を含むＯＭＶを投与するための非経口経路は、公知の方法に従って、例えば静脈内、腹膜内、筋肉内、動脈内又は病巣内経路による注射若しくは注入による。筋肉内注射用として典型的な医薬組成物は、例えば、本発明の融合タンパク質を含む有効用量のＯＭＶを含むリン酸緩衝食塩水１〜１０ｍＬを含有するように作ることができる。非経口的投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ編、第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を含めた様々な出典に更に詳細に記述されている。
【００８９】
別の態様において、本発明は、医薬用の本発明の融合タンパク質又は前記ＯＭＶを含む医薬組成物を含むＯＭＶに関係する。
【００９０】
別の態様において、本明細書において上で定義されるように、本発明は、本発明の融合タンパク質を含むＯＭＶ或いは抗原と関連する感染性疾患若しくは腫瘍の防止又は処置用として前記ＯＭＶを含む医薬組成物に関係する。感染性疾患は、ボレリア感染であることが好ましく、より好ましくはボレリアブルグドルフェリ感染である。
【００９１】
本態様において、従って、本発明は、予防又は治療を必要とする対象に本発明の融合タンパク質を含むＯＭＶ（を含む医薬組成物）の治療的若しくは予防的有効量を投与することによる、感染性疾患若しくは腫瘍に対するワクチン接種、或いは感染性疾患若しくは腫瘍の予防又は治療の方法に関する。本発明は、医薬用として、好ましくは、感染性疾患若しくは腫瘍に対するワクチン接種、或いは感染性疾患若しくは腫瘍の予防又は治療用としての医薬として、本発明の融合タンパク質を含むＯＭＶにも関する。
【００９２】
更に別の態様において、本発明は、プレプロ融合リポタンパク質をコードしている核酸分子に関し、ここで、プレプロ融合リポタンパク質は、グラム陰性細菌における発現と同時に本明細書において上で定義される融合リポタンパク質に成熟し、好ましくは、核酸分子は、グラム陰性細菌においてプレプロ融合リポタンパク質を発現するための発現構築物である。タンパク質グラム陰性細菌の発現用の発現構築物を構築する手段及び方法は、一般に当技術分野において周知である。
【００９３】
再び更なる態様において、本発明は、上で定義した核酸分子又は発現構築物を含むグラム陰性宿主細胞に関する。宿主細胞は、上で定義した属又は種に属している細菌宿主細胞であることが好ましい。
【００９４】
最後の態様において、本発明は、本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生する方法に関する。方法は、ａ）プレプロ融合リポタンパク質を宿主細胞において発現させるために上で定義した核酸分子又は発現構築物を含むグラム陰性宿主細胞を培養し、プレプロ融合リポタンパク質が、グラム陰性宿主細胞における発現と同時に本明細書において上で定義される融合リポタンパク質に成熟するステップと、ｃ）ＯＭＶを回収し、回収がＯＭＶからの細菌の除去を少なくとも含むステップとを好ましくは含む。本方法において、ステップｃ）におけるＯＭＶの回収が、ステップｂ）の後にあり、ＯＭＶが抽出されることが好ましい。本発明の融合リポタンパク質を含むＯＭＶを産生する方法は、更に好ましくは本明細書に定義され、上述した界面活性剤を含まない方法である。
【００９５】
本文書及び本文書の請求項において、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用型は、非限定的な意味において、その単語に続く項目を含むが、具体的に記載されていない項目を除外しないことを意味するために使用される。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、要素が１つある及び１つしかないと文脈が明らかに求めない限り、１つより多くの要素が存在する可能性を除外しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００９６】
本明細書において引用される特許及び文献参照の全ては、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００９７】
以下の実施例は、例証目的のためだけに提供され、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
１．  材料及び方法
１．１  抗生物質
アンピシリン（Ａｍｐ）及びクロラムフェニコール（Ｃａｍ）は、Ｓｉｇｍａから購入した。保存溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（ＭＱ）水に調製し、０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用してフィルター滅菌し、４℃で貯蔵した。
【００９９】
１．２  細菌株及び成長条件
大腸菌株ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、それぞれベクターｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ及びｐＥＮ１１を含むクローニングステップに使用した。両方の株を、１５ｇ／Ｌ寒天及び適当な抗生物質（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙには５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ及びｐＥＮ１１には２５μｇ／ｍＬ  Ｃａｍ）で補充したルリアベルターニ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）上で、３７℃で成長させた。ＪＭ１０９の青色／白色スクリーニングのために、プレートを、５０μｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）及び０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充した。液体培養を、３７℃及び２００ＲＰＭで成長させた。
【０１００】
ｌｐｘＬ１欠失を保有するナイセリア・メニンギティディス株ＨＢ−１（５２）を、ＩｓｏＶｉｔａｌｅＸで補充したＤｉｆｃｏ  ＧＣ基礎培地（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で、５％  ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気中で、３７℃で成長させた。ｐＥＮ１１による形質転換の場合、プレートを３μｇ／ｍＬ  Ｃａｍで補充した。液体培養を、３μｇ／ｍＬ  Ｃａｍ及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むトリプチックソイブロス（ＴＳＢ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で３７℃、１５０ＲＰＭで成長させた。
【０１０１】
ボレリア・ブルグドルフェリ株Ｂ３１は、Ｊ．Ｈｏｖｉｕｓ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ）の研究室により好意で提供された。Ｂ．ブルグドルフェリのゲノムＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。
【０１０２】
１．３  組換えＤＮＡ技術
本研究において使用したプライマーの全てを、表１に示す。ハイブリッドを、ｆＨｂｐ（Ｎ．メニンギティディス）、ＴｂｐＢ（Ｎ．メニンギティディス）、ＯｓｐＡ（Ｂ．ブルグドルフェリ又はＢ．アフゼリ［Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ］）、ＯｓｐＣ（Ｂ．ブルグドルフェリ）及びＲｍｐＭ（Ｎ．メニンギティディス）で作った。全てのハイブリッドを、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（５３）を使用して構築した。高い増幅忠実度及び３’Ａ−突出の追加を確実にするために、全てのＰＣＲを、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。異なる構築物の図式的概観については、図１及び図５を参照のこと。
【０１０３】
【表１】
2018521632.tif 000002
2018521632.tif 000003
2018521632.tif 000004
【０１０４】
アンプリコンを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に平滑末端ライゲートし、次に製造業者の使用説明書に従って大腸菌ＪＭ１０９細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）に熱ショック形質転換した。形質転換体を、プライマーＭ１３−Ｆ及びＭ１３−Ｒを使用して正しい長さの挿入物についてスクリーニングした（表１を参照のこと）。プラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して陽性ＪＭ１０９形質転換体の終夜培養液から単離した。単離したプラスミドを、制限酵素ＡａｔＩＩ及びＮｄｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して消化した。得られた断片を、次いでゲル電気泳動により分離し、次にＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してゲル精製した。汎用プラスミドｐＥＮ１１（５４）を、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でＡａｔＩＩ及びＮｄｅＩによる消化後にベクターとして使用した。挿入物及びベクターを、製造業者の使用説明書に従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してライゲートし、次いで得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に熱ショック形質転換した。形質転換体を、プライマーｐＥＮ１１−Ｆ及びそれぞれの構築物のリバースプライマーを使用して正しい長さの挿入物についてスクリーニングした。ＯｓｐＡ又はｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合を保有する単離したｐＥＮ１１プラスミド（前に述べた単離手順）およそ１μｇを、Ｎ．メニンギティディス細胞（ＯＤ６００≒０．２）の懸濁液１ｍＬに添加し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で補充したＴＳＢ中で、３７℃で６時間（振盪なし）成長させた。次いで細菌を、３μｇ／ｍＬ  Ｃａｍを含有するＧＣプレート上で平板培養した。２４〜４８時間後にコロニーを単離し、前述の通り正しい挿入物を含むｐＥＮ１１の存在についてスクリーニングした。
【０１０５】
１．４  Ｎ．メニンギティディス細胞及びｎＯＭＶにおける構築物の発現
Ｎ．メニンギティディス細胞を、ＧＣ  ＩＩプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に画線し、記述した通り終夜成長させた。翌日、コロニーを無菌綿棒で回収し、１ｍＭ  ＩＰＴＧ及び３μｇ／ｍＬ  Ｃａｍを含有するＴＳＢに懸濁し、補充を含む同じブロス５ｍＬにＯＤ６００  ０．２になるように更に希釈した。細胞を、３７℃及び１７０ＲＰＭで４時間成長させ、成長後にＯＤ６００を再び決定し、４．０×１０８ＣＦＵに相当するアリコートを、１３０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで細胞を、前述の通り遠心分離し、遠心分離後に得られたペレットをＭＱ  ４０μＬに溶解し、５×サンプル緩衝液（５０％グリセロール、０．２５％  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％ジチオスレイトール及び０．０５％ブロモフェノールブルー）１０μＬと組み合わせ、１０分間煮沸した。サンプルを、更なる解析のために−２０℃で次いで貯蔵した。
【０１０６】
Ｎ．メニンギティディスの天然のＯＭＶ（ｎＯＭＶ）を、ＰＢＳに１ｍＬ当たり合計タンパク質２０μｇとなるように希釈し、希釈後にｎＯＭＶ懸濁液４０μＬを、前述の通り５×サンプル緩衝液１０μＬと共に煮沸した。
【０１０７】
ｎＯＭＶの細胞のタンパク質サンプルを、１２％  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離したタンパク質を、０．４５μｍニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に、次いで転写した。膜を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、１．５４Ｍ  ＮａＣｌ及び５％  Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する緩衝液中の抗ＯｓｐＡ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）１：１０００希釈中で、回転台上で１時間インキュベートした。膜を、０．５％  Ｐｒｏｔｉｆａｒ（Ｎｕｔｒｉｃｉａ）で補充した同じ緩衝液中のヤギ−抗ウサギＩｇＧ  ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏＴｅｃｈ）１：２０００希釈に次いで移動させた。ブロットを、ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して発色させた。
【０１０８】
１．５  免疫染色
様々な構築物を含むｐＥＮ１１を保有するＮ．メニンギティディス細胞を、ポリ−ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされているカバーグラスに固定化した。細胞を、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中でブロッキングした後、カバーグラスを、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の抗ＯｓｐＡ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）及び抗ｆＨｂｐ（バリアント１、ＮＩＢＳＣ）の混合物１：３００希釈中で最初にインキュベートした。洗浄後に、インキュベートしたカバーグラスを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ−抗ウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物１：３００希釈中でインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド中で後定着させ、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１蛍光顕微鏡下で、適当なフィルターを使用して４０×倍率で検鏡した。
【０１０９】
１．６  ｎＯＭＶワクチンの精製
免疫化実験用として選択したクローンのグリセロール−貯蔵物を、ＧＣ  ＩＩプレートに画線し、上述した条件下で終夜成長させた。翌日、コロニーを回収し、使用して、１Ｍ  ＩＰＴＧ及び３μｇ／ｍＬ  Ｃａｍを含むＴＳＢ中でＯＤ６００＝０．０５の２００ｍＬ培養を開始した。これらの培養を、３７℃、１３０ＲＰＭで成長させ、ＯＤ６００を、一定の間隔で測定した。培養が、ＯＤ６００  １．５に達したら（約６時間後）、培養を氷上に置き、次に３５００ＲＰＭ、４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．６）に再懸濁し、水平振盪台上で３０分間インキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液は、ＯＭを不安定化するキレート剤（ＥＤＴＡ）を含有するので、ＯＭＶの遊離が刺激される。懸濁液を１３０００ＲＰＭで３０分間遠心分離し、上清をＳｔｅｒｉｆｌｉｐ  ０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して滅菌した。滅菌した上清を４００００ＲＰＭで６５分間次いで遠心分離し、遠心分離後に得られたＯＭＶペレットをスクロース緩衝液１ｍＬに再懸濁する前に乾燥させた。懸濁液を、前述の通り再濾過し、４℃で貯蔵した。
【０１１０】
上記のｎＯＭＶ単離手順を開発して、溶解による他の細胞性タンパク質をヒッチハイクすることなくできるだけ多くのｎＯＭＶを回収した。それぞれの培養を１２時間成長させておくことにより、この手順を使用して回収されるｎＯＭＶ中のＯｓｐＡ、ｆＡ１、ｆＡ２ｂ、ｆＡ３ｂ及びｆＡ５ｃの発現を、他の細菌タンパク質のヒッチハイクを有意に増加させることなく増加させ得る（データ不掲載）ことに注目したので、従って、これらの構築物に対して別の単離手順を使用して、可能な限り構築物の発現を均一にすることを決定した。
【０１１１】
単離したｎＯＭＶの合計タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定し、次いでｎＯＭＶを、ワクチン接種の日に１ｍＬ当たり合計タンパク質５又は２０μｇとなるようにＰＢＳで更に希釈した。
【０１１２】
１．７  マウス及び免疫化
雌、ＢＡＬＢ／ｃＯｌａＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ）６〜８週齢５匹の群に、低濃度（５μｇ／ｍＬ）又は高濃度（２０μｇ／ｍＬ）いずれかのｎＯＭＶ  ２００μＬを皮下に免疫した。ＯｓｐＡ（２群）又はｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合（１６群）を「ロード」したｎＯＭＶを与えた群とは別に、「空の」ｎＯＭＶを与えた２つの対照群を、ｏｓｐＡ構築物（５４）をｉｍｐ遺伝子で置き換えたｐＥＮ１１プラスミドを保有する細胞から回収した。追加の対照群をＰＢＳで免疫し、合計２１個の群を得た。マウスを０日及び２８日目に免疫し、最後の免疫化の１４日後に屠殺した。血液を、Ｖａｃｕｅｔｔｅ  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に採取し、２０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。次に、血清を採取し、更なる解析のために−２０℃で貯蔵した。
【０１１３】
１．８  血清の解析
血清を、群単位（５匹のマウス）で先ずプールし、ウェスタンブロットにより抗体の存在について分析した。膜に、ｐＥＮ１１−Ｉｍｐ又はｐＥＮ１１−ＯｓｐＡのいずれかを保有する大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞由来タンパク質をロードした。膜を、Ｔｒｉｓ緩衝液（以前に記述した）に１：１０００希釈したプールされた血清と共に回転台上で１時間インキュベートし、続いて同じ緩衝液中の二次抗体（ヤギ−抗マウスＩｇＧ  ＡＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏＴｅｃｈ）１：２０００希釈中でインキュベートし、以前に記述した通りブロットを現像した。最も強く反応した２つの群（２０μｇ／ｍＬ  ｆＡ４ｂ及び２０μｇ／ｍＬ  ｆＡ６）からの全マウスの個々の血清１０個を、同じ様式で分析した。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡの場合、ＰＢＳに希釈した０．５μｇ／ｍＬ  ＯｓｐＡ対照タンパク質（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｌｏｎ  ９６ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ）のウェル表面にコーティングし、室温（ＲＴ）で終夜インキュベートした。翌日、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％  Ｐｒｏｔｉｆａｒ  ２００μＬを添加することによりブロッキングし、続いてＲＴで３０分間インキュベートした。次いでプレートを、洗浄緩衝液（０．０５％  ｔｗｅｅｎ−８０を含む水）で３回洗浄した。個々のマウス血清を、０．１％  ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳに適切に希釈し、１ウェル当たり１００μＬを添加し、続いてＲＴで１時間インキュベートした。次いでプレートを、洗浄緩衝液中で３回再び洗浄し、洗浄後にヤギ−抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）１００μＬを添加した（０．１％  ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳに１：４０００希釈した）。１時間インキュベーションした後、プレートを、前述の通り洗浄し、ＴＭＢ  １００μＬを添加した。次いでプレートを、１０分間インキュベートし、インキュベート後に発色を２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μＬで停止させた。次にＯＤ４５０を、ＳｙｎｅｒｇｙＭｘプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。
【０１１５】
２．  結果
２．１  ｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合遺伝子の構築
特徴づけられたリポタンパク質の殆どは、脂質化Ｎ末端システインに隣接して二次構造の形成に対する傾向が低いアミノ酸の区間を含有する。このいわゆる「係留鎖」は、脂質「アンカー」（脂質化システイン）とタンパク質の構造的に制限されている部分との間で可動性リンカーとして作用すると考えられる（５５）。リンカー領域の欠失は、外膜内側への表面露出リポタンパク質の誤局在をもたらし得るので、係留鎖は、外膜を通るリポタンパク質の輸送にも役割を果たしている（５５）。
【０１１６】
ナイセリアにおいて発現されるＯｓｐＡの表面曝露の証拠を見いだせなかったので、細菌宿主のスイッチが、外膜の内側へのタンパク質の誤局在をもたらすと仮定した。表面露出しているナイセリアリポタンパク質であるｆＨｂｐの部分の付加が、外膜の内側への誤局在を修正する可能性があるかどうか、次いで試験しようと試みた。ナイセリアにおける外膜を通る輸送の選別規則がまだ説明されていなかったので、ｆＨｂｐの様々な部分をＯｓｐＡの球状ドメインと組み合わせたハイブリッド遺伝子を設計した。
【０１１７】
ｆＨｂｐ及びＯｓｐＡ並びにオーバーラップエクステンションＰＣＲによりｆＨｂｐ及びＯｓｐＡ遺伝子から作製した融合遺伝子の図式的概観を図１に与える。リポタンパク質間の構造に関する情報は、公開されている結晶構造から得られた（４８、５６）。ｆＨｂｐとＯｓｐＡの両方が、シグナルペプチド（内膜を通る輸送後に切断される）及び係留鎖領域を含有する。ｆＨｂｐの球状ドメインは、１５アミノ酸リンカーにより分離されているＮ末端及びＣ末端ドメインからなる。
【０１１８】
Ｎ．メニンギティディス４４／７６株のゲノムＤＮＡを、ｆＨｂｐの部分の増幅を含む全てのＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ｆＨｂｐ−Ｆプライマーは、ｆＨｂｐプロモーター（５７）の上流にアニールし、従って全ての融合遺伝子は、ｆＨｂｐプロモーターを含有する。ＯｓｐＡは、プライマーＯｓｐＡ−Ｆ及びＯｓｐＡ−Ｒ（表１）を使用してＢ．ブルグドルフェリＢ３１株のゲノムＤＮＡから増幅され、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’においてＩＰＴＧ誘導可能なｔａｃ−ｌａｃＵＶ５プロモーター（５４）を含有するｐＥＮ１１プラスミドから正しく発現された。
【０１１９】
構築物ｆＡ２ｂ、ｆＡ３ｂ及びｆＡ４ｂに導入された６アミノ酸のリンカーペプチドを事前に使用して、ＯｓｐＡをカルモジュリン（５８）に正しく連結した。
【０１２０】
ｆＨｂｐとＯｓｐＡの間で８つの異なる融合構築物を作製した。今後これらの構築物を「ｆＡ」と呼ぶ。融合遺伝子の構築に使用したプライマーを、図１の略図遺伝子の上（フォワードプライマー）又は下（リバースプライマー）に示す（プライマー番号は、表１を参照のこと）。全ての融合遺伝子を、オーバーラップエクステンションＰＣＲ、２段階ＰＣＲプロトコル（５３）により作製した。つまり、融合しようとする遺伝子部分を、部分的に重なり合うプライマーを使用して先ず別々に増幅し、増幅後に両方の部分（互いにアニールすることができる）を、融合遺伝子をもたらす２回目の反応の鋳型として使用した。例えば、構築物ｆＡ１の第１ステップＰＣＲには、プライマー対１−１０（Ｎ．メニンギティディスゲノムからｆＨｂｐプロモーター、シグナルペプチド及び係留鎖を増幅する）及び４−９（Ｂ．ブルグドルフェリゲノムからＯｓｐＡの球状ドメインを増幅する）を使用した。得られたＰＣＲ産物を次いで混合し、２回目のＰＣＲ反応における鋳型として使用した。この２回目の反応において、両方のＰＣＲ産物は互いにアニールし、同時に全長ＰＣＲ産物ｆＡ１をもたらすプライマー対１−４の鋳型として働く。他の全ての融合遺伝子も、同じ方法を使用して作製した。構築物ｆＡ１が、ｆＡ３ｂ及びｆＡ５ｃの構築の鋳型として働く点に注意されたい。
【０１２１】
ｆＡ１において、ｆＨｂｐのシグナルペプチド及び係留鎖を、ＯｓｐＡの球状ドメインと融合した。構築物ｆＡ２ｂ及びｆＡ３ｂにおいて、ｆＨｂｐのＣ末端ドメイン（ｆＡ２ｂ）又はＮ末端ドメイン（ｆＡ３ｂ）を、ＯｓｐＡの球状ドメインにより置き換え、人工リンカー（ＰＧＧＳＧＡ）を介して接続した。構築物ｆＡ４ｂ及びｆＡ４ｃにおいて、完全なｆＨｂｐ遺伝子を、人工リンカー（ｆＡ４ｂ）又はＯｓｐＡ係留鎖（ｆＡ４ｃ）を使用してＯｓｐＡの球状ドメインに連結した。構築物ｆＡ５ｃは、ｆＨｂｐ係留鎖を介してｆＨｂｐの球状ドメインに連結されたｆＡ１である。構築物ｆＡ６は、ｆＡ１と類似しているが、シグナルペプチド及び係留鎖に加えて、ｆＨｂｐのＮ末端ドメインの第１のαヘリックス、及びαヘリックスに続くループを含有する。構築物ｆＡ７は、ｆＡ６と類似しているが、ｆＨｂｐのＮ末端ドメインの最初の４つのβシートを更に含有する。全ての構築物は、ナイセリアに形質転換する前に大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’においてｐＥＮ１１から正しく発現された（データ不掲載）。
【０１２２】
２．２  ＴｂｐＢ−ＯｓｐＡ融合遺伝子の構築
Ｎ．メニンギティディスＨ４４／７６のＴｂｐＢは、シグナルペプチド（残基１〜２０）、３８アミノ酸の可動性リンカー又は「係留鎖」（残基２１〜５８）、及び大きな球状ドメイン（残基５９〜６９１）を含有する。ＯｓｐＡとＴｂｐＢのＮ末端部分との融合が、Ｎ．メニンギティディスにおいてＯｓｐＡの表面発現を救済できるか試験するために、４つのＴｂｐＢ−ＯｓｐＡ融合構築物を設計した。ＴｂｐＢは、鉄調節性プロモーターを有するので、ＴｂｐＢプロモーターを、プライマー１、２５−２７を用いるオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用して構成的なｆＨｂｐプロモーターに先ず交換した（表１を参照のこと）。得られた構築物（「ｆＨｂｐプロモーターを持つＴｂｐＢ」、図５を参照のこと）を、ＴｂｐＢとＯｓｐＡとの融合ＰＣＲの鋳型として次いで使用した。
【０１２３】
構築物ｆＴＡ１〜４の概要を、図５に見ることができ、オーバーラップエクステンションＰＣＲのプライマーを、表１に見ることができる。ナイセリア・メニンギティディスＨ４４／７６のゲノムＤＮＡを、ＴｂｐＢ部分の増幅の鋳型として使用し、ボレリア・ブルグドルフェリＢ３１株のゲノムＤＮＡを、ＯｓｐＡ部分の鋳型として使用した。
【０１２４】
構築物ｆＴＡ１は、ＯｓｐＡの残基１７〜２７３（係留鎖及び球状ドメイン）と融合したＴｂｐＢの残基１〜２０（シグナルペプチド）を含有した。構築物ｆＴＡ２は、ＯｓｐＡの残基２９〜２７３（球状ドメイン）と融合したＴｂｐＢの残基１〜５８（シグナルペプチド及び係留鎖）を含有した。構築物ｆＴＡ３は、ＯｓｐＡの残基２９〜２７３（球状ドメイン）と融合したＴｂｐＢの残基１〜７５（球状ドメインのシグナルペプチド、係留鎖及び最初の１７個のＮ末端アミノ酸）を含有した。構築物ｆＴＡ４は、ＯｓｐＡの残基２９〜２７３（球状ドメイン）と融合したＴｂｐＢの残基１〜９９（球状ドメインのシグナルペプチド、係留鎖及び最初の４１個のＮ末端アミノ酸）を含有した。ｆＴＡ３及びｆＴＡ４のＴｂｐＢ融合点を、ＴｂｐＢ結晶構造（６３）に基づく二次構造エレメント間のループ内に選んだ。
【０１２５】
血清型１以外のＯｓｐＡ血清型（Ｂ．ブルグドルフェリＢ３１）が、ｆＨｂｐ又はＴｂｐＢのＮ末端部分の助けを借りて髄膜炎菌の細胞表面へ輸送され得るかどうか試験するために、ｆＡ６及びｆＴＡ２と類似の融合構築物を作った。差異は、融合構築物がボレリアアフゼリＰＫｏ由来ＯｓｐＡ血清型２の球状ドメイン（残基２９〜２７３）を含有することだけであった。全ての構築物は、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより作った、詳細については図７及び表１を参照のこと。
【０１２６】
２．３  ｆＨｂｐ−ＯｓｐＣ融合遺伝子の構築
ＯｓｐＣは、表面露出したボレリアリポタンパク質である。ＯｓｐＣは、ＯｓｐＡ後の最も興味深いワクチン源と一般に考えられている（６４）。しかしながら、ボレリア外膜において大きな多量体複合体の形態で存在するおそらく凝集する傾向のため、大腸菌におけるシグナル配列を含めた全長ＯｓｐＣの発現は、困難であることが立証されている（６５）。大腸菌及びＮ．メニンギティディス両方における全長ＯｓｐＣの発現は、以前にも類似の問題を招き、ウェスタンブロットにおいて弱い発現が得られた（データ不掲載）。
【０１２７】
ボレリアにおいて、殆どの場合Ｎ末端α１へリックス間の相互作用により、ＯｓｐＣは細胞表面においてホモ二量体を形成する（６６、６７）。マウス及びヒトＯｓｐＣエピトープの殆どは、タンパク質のＣ末端側に位置するので（６８、６９）、以前に記述したｆＨｂｐのＮ末端部分（ｆＡ６で使用した）とＯｓｐＣのＣ末端残基１３６〜２１０を組み合わせた融合構築物ｆＣ９（図８）を生成した（図８を参照のこと）。この目的のために、Ｎ．メニンギティディスＨ４４／７６株のゲノムＤＮＡを、ｆＨｂｐの増幅の鋳型として使用し、Ｂ．ブルグドルフェリＢ３１株のゲノムＤＮＡを、ＯｓｐＣの増幅に使用した。
【０１２８】
２．４  ｆＨｂｐ−ＲｍｐＭ及びＴｂｐＢ−ＲｍｐＭ融合遺伝子の構築
ＲｍｐＭは、ペプチドグリカン層と非共有結合的に会合すると考えられるＮ．メニンギティディスの外膜タンパク質である（７０）。ＲｍｐＭは、シグナルペプチド、可動性Ｎ末端ドメイン（外膜内在性タンパク質に結合する）及びＯｍｐＡ様Ｃ末端ドメイン（ペプチドグリカンと会合すると考えられる）からなる。ＲｍｐＭは、殆どの場合ペリプラズムにあると一般に見なされているので、Ｎ．メニンギティディスの細胞表面でＲｍｐＭを発現させようと試みた。シグナルペプチド及び非構造性Ｎ末端ドメインからなる最初の８９残基を削除することを決定した。残りのＣ末端ドメイン（残基９０〜２４２）を、ＯｓｐＡの正しい表面局在のために以前に使用したｆＨｂｐのＮ末端部分（残基１〜５０）及びＴｂｐＢ（残基１〜５８）と融合した。Ｎ．メニンギティディスＨ４４／７６株のゲノムＤＮＡを、ｆＨｂｐ、ＴｂｐＢ及びＲｍｐＭの増幅の鋳型として使用した。構築物を、ｆＲ１及びｆＴＲ１と命名した（図９を参照のこと）。
【０１２９】
２．５  ＯｓｐＡ及びｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合は、Ｎ．メニンギティディス細胞及びｎＯＭＶにおいて発現される
Ｎ．メニンギティディスにおける異なる構築物の発現を図２Ａに示し、Ｎ．メニンギティディスの細胞から回収されるｎＯＭＶ中の発現を図２Ｂに示す。Ｎ．メニンギティディス細胞における発現レベルは、異なる構築物間で明らかに変化しており、構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７の高い発現レベルと類似の変動が、ｎＯＭＶに観察される。いくつかの構築物は、明らかに分解傾向がある。いくつかの構築物（ｆＡ３ｂ、ｆＡ５ｃ）の場合、分解は、細胞と比較してｎＯＭＶにおいて増幅されるようである。
【０１３０】
２．６  少なくとも４つのｆＨｂｐ−ＯｓｐＡハイブリッドが、表面露出される
ＯｓｐＡ及び８つのｆＨｂｐ−ＯｓｐＡ融合がＮ．メニンギティディスにおいて表面局在しているかどうかを、免疫染色を使用して試験した。簡潔には、様々な構築物を含むプラスミドｐＥＮ１１を含有する細胞を、抗ＯｓｐＡ及び抗ｆＨｂｐ（陽性対照）の混合物とインキュベートし、続いて蛍光二次抗体（ＯｓｐＡには緑色、ｆＨｂｐには赤色）とインキュベートした。構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７を含有する細胞は、明らかな緑色蛍光を示し、このことは、構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７の表面曝露を示している（データ不掲載）。緑色蛍光は、ＯｓｐＡ又は他の構築物のいずれにも観察されなかった（データ不掲載）、このことは、ＯｓｐＡの低い発現レベルのためという可能性もあるが、ＯｓｐＡが表面露出されなかったことを示す（図２Ａを参照のこと）。
【０１３１】
２．７  発現及び表面曝露ＴｂｐＢ−ＯｓｐＡハイブリッド
大腸菌及びＮ．メニンギティディスにおける４つ全ての構築物の正しい発現を、ＯｓｐＡに対するポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロットにより確認した（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ナイセリアウェスタンブロットについては図６を参照のこと）。免疫染色（上記の通り）は、構築物ｆＴＡ１に対するシグナルを示さなかったが、構築物ｆＴＡ２、ｆＴＡ３及びｆＴＡ４に対しては強力なシグナルを示した（データ不掲載）。このことは、ＴｂｐＢのＮ末端部分を、ＯｓｐＡの表面局在に使用することができ、少なくともシグナルペプチド及び係留鎖がＯｓｐＡの表面局在に必要であることを証明している。
【０１３２】
２．８  別のＣタンパク質融合パートナーの発現及び表面曝露
２．８．１  別のＯｓｐＡ血清型の発現及び表面曝露
大腸菌及びＮ．メニンギティディスにおける両方の構築物の正しい発現を、ＯｓｐＡに対するポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロットにより確認した（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ナイセリアウェスタンブロットについては図７を参照のこと）。ＯｓｐＡポリクローナル（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による免疫染色が、困難であることが証明され、最も確からしくは、抗血清（Ｂ．ブルグドルフェリの血清型１  ＯｓｐＡに対して生産した）が、Ｂ．アフゼリＯｓｐＡに対してかなり弱い結合を示すためであった。従って、ＯｓｐＡモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、免疫染色に使用した。ＯｓｐＡモノクローナルを免疫染色に使用した場合、構築物ｆＡ１０及びｆＴＡ５を発現するＮ．メニンギティディス細胞は強力なシグナルを示し（データ不掲載）、このことは血清型２  ＯｓｐＡが、細胞表面で実際に正しく発現されたことを示す。
【０１３３】
２．８．２  ＯｓｐＣの発現及び表面曝露
Ｎ．メニンギティディスにおける弱い発現（図８）にもかかわらず、驚くべきことに、ｆＣ９構築物を保有する細胞は、免疫染色でシグナルを示した（データ不掲載）。このことは、ｆＨｂｐのＮ末端部分（ｆＡ６において以前に記述した）を、ＯｓｐＣの少なくともＣ末端部分の表面局在に使用し得ることを示す。
【０１３４】
２．８．３  非ボレリア、非リポタンパク質ＲｍｐＭの発現及び表面曝露
両方の構築物（ｆＲ１及びｆＴＲ１と命名した、図１１を参照のこと）は、大腸菌及びＮ．メニンギティディスにおいて正しく発現された。
【０１３５】
免疫染色は、両方の構築物で明るいシグナルを発生したが、陰性対照（構築物を含まないＮ．メニンギティディス細胞）も同様に明るい蛍光を示した。このことは、ナイセリア細胞に対するＭＮ２Ｄ６Ｄモノクローナル抗体の非特異的結合（a-specific binding）又はＲｍｐＭ（部分）の予期しない表面局在のいずれかを示した。従って、ＲｍｐＭノックアウトを、プラスミドｐＣＦ１３を使用して作製した（７１）。構築物ｆＲ１及びｆＴＲ１を保有するプラスミドを、前述の通りΔＲｍｐＭ株に形質転換し、両方の構築物の正しい発現を、ウェスタンブロットによって決定した（図１２を参照のこと）。
【０１３６】
Ｎ．メニンギティディス細胞の免疫染色及びＲｍｐＭノックアウトは、高い抗体濃度でＲｍｐＭ抗体の非特異的結合がある（１：３００希釈でノックアウトの強い染色及び１：２０００希釈でノックアウトの弱い染色、データ不掲載）ことを示したが、ノックアウトの低抗体濃度（１：１００００）染色では、完全に消えた（データ不掲載）。しかしながら、いくつかの正常ナイセリア細胞は、低濃度でも染色を依然として示し（データ不掲載）、このことは、細胞の少なくとも一部においてＲｍｐＭが（部分的に）表面露出している可能性を示した。
【０１３７】
ＲｍｐＭノックアウトバックグラウンドに置いた場合、ｆＲ１とｆＴＲ１の両方が、最低の抗体濃度（１：１００００）で蛍光シグナルを示したが、最低の抗体濃度において、染色は、構築物を含まないＲｍｐＭノックアウトで完全に存在しなかった（データ不掲載）。このことは、ＯｓｐＡの表面局在に以前に使用したｆＨｂｐ及びＴｂｐＢ両方のＮ末端部分を、ナイセリア・メニンギティディスの非リポタンパク質の表面さもなければ（支配的に）ペリプラズム局在のためにも使用できることを示している。
【０１３８】
２．９  ＯｓｐＡ及びｆＨｂｐ−ＯｓｐＡハイブリッドを保有するｎＯＭＶの免疫原性
次に、ウェスタンブロットを使用して異種（融合）タンパク質を保有するｎＯＭＶで免疫したマウスの血清を調査した。２１群全てのプールした血清を、ｐＥＮ１１−ＯｓｐＡ又はｐＥＮ１１−Ｉｍｐのいずれかを含む大腸菌の総タンパク質内容物をロードした膜にブロットした（２１群のいくつかについては図３Ａを参照のこと）。構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７を低及び高用量で保有するｎＯＭＶで免疫した群のプールした血清は全て、ＯｓｐＡ（約２８ｋＤａ）の分子質量を有する強いバンドを示し、このことは強い抗体応答を示した。加えて、２０μｇ／ｍＬ用量のＯｓｐＡを保有するｎＯＭＶで免疫した群のプールした血清は、約２８ｋＤａに非常に弱いバンドを示した（データ不掲載）。他の全ての群は、検出可能な応答を示さなかった。
【０１３９】
個々のマウス全てが、ＯｓｐＡ特異的抗体を生産したかどうか見るために、応答性の高い２群（２０μｇ／ｍＬ  ｆＡ４ｂ及び２０μｇ／ｍＬ  ｆＡ６）の個々のマウス１０匹全ての血清をブロットした。全ての場合において、約２８ｋＤａのバンドを検出した（２０μｇ／ｍＬ  ｆＡ６で免疫した５匹のマウスについては図３Ｂを参照のこと、ｆＡ４ｂのデータ不掲載）。このことは、プールした血清において観察されたシグナルが、群内の単一の過剰反応物によるものではないことを示している。高用量ｆＡ６群のプールした血清における約３６ｋＤａのバックグラウンドシグナル（図３Ａ）は、単一の個体（図４Ｂにおけるマウス＃４）により明らかに引き起こされる点に注意されたい。
【０１４０】
免疫応答を定量化するために、構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６又はｆＡ７を保有する２０μｇ／ｍＬ  ｎＯＭＶで免疫した個々のマウス全ての血清を、精製したＯｓｐＡタンパク質に対する結合能力について試験した。構築物ｆＡ４ｂ及びｆＡ６の結果を、図４に示す。ｆＡ４ｂの検出されたシグナルは、ｆＡ６及びｆＡ７に対して観察されたシグナルより約１．５倍高く、ｆＡ４ｃに対して観察されたシグナルより約２．５倍高かった（データ不掲載）。
【０１４１】
３．  考察
ＯＭＶは、多くの細菌疾患に対する強力で、操作可能なワクチンのプラットフォームとして注目を増している。それらのワクチンの潜在性を認識するにつれて、ＯＭＶの異種発現に対する関心は、盛んになっている。ＯＭＶにおける異種発現に関する未解決の問題の１つは、異種抗原の位置（内腔、ＯＭ内側、ＯＭ外側）が、異種抗原が誘起する免疫応答に影響を及ぼすかどうかである。全細胞の場合、いくつかの研究は、異種抗原が細胞表面の下にある場合より細胞表面に位置する場合の方が、異種抗原がより免疫原性であることを示し（５９、６０）、同じ事が、ＯＭＶについても真であり得ることが示唆された（２１）。これは、特定の対象のＯＭＶ表面に異種タンパク質を提示させる。
【０１４２】
ここで、ＯＭＶにおける異種抗原を表面提示する新規の手法を実証する。表面露出しているリポタンパク質をＯＭＶに付着させたままにできる界面活性剤を含まないＯＭＶ抽出プロセスが、ナイセリア属で最近開発された。この新たな抽出プロトコルは、異種リポタンパク質でナイセリアＯＭＶの表面を装飾する可能性を開く。従って、Ｎ．メニンギティディスにおいてＯｓｐＡ、ボレリア表面リポタンパク質を発現させた。ＯｓｐＡは、ナイセリア細胞及びＯＭＶにおいて検出できるが、ＯｓｐＡの表面曝露の証拠は見いだせなかった。ＯｓｐＡとｆＨｂｐ、髄膜炎菌表面リポタンパク質との融合を次いで構築した。ＯｓｐＡと連結したｆＨｂｐのＮ末端部分からなるこれら構築物のいくつかは、免疫染色を使用して細胞表面で検出することができる。更にまた、リポタンパク質媒介性表面発現は、ＴｂｐＢなど他のリポタンパク質のＮ末端部分によっても媒介され得るので、本技術をより広く適用し得ることを実証した。加えて、様々な抗原性タンパク質を、ＲｍｐＭなど非ボレリア非リポタンパク質を含めたリポタンパク質のＮ末端部分への融合により表面発現できることを実証した。このため、本技術を、特定の抗原の表面発現を媒介するのに広く適用し得ることを示した。抗原は、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連することができる。本発明の融合タンパク質は、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連する抗原の、例えばＯＭＶ上での、表面発現を引き起こし、感染性疾患及び／又は腫瘍と関連する抗原は、免疫応答を誘発し、抗原と関連する感染性疾患若しくは腫瘍の防止又は処置をもたらす。
【０１４３】
この点において、ＯＭＶ上での表面発現を引き起こす構築物を保有するＯＭＶは、免疫したマウスにおいて強力な免疫応答を生じさせたが、表面曝露の証拠を示さなかった構築物を保有するＯＭＶでは生じなかった。
【０１４４】
３．１  外膜移行
ＯＭを通るリポタンパク質の移行を支配する因子の知見は乏しく、不完全である。ボレリアにおいて、いくつかの表面リポタンパク質（ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ及びＶｓｐ）のリポタンパク質係留鎖（Ｎ末端システインに隣接する非構造性領域）のアミノ酸の欠失又は突然変異が、表面下局在を導き得るので、この領域は、ＯＭ移行のために必須な情報を含有するようである。更にまた、ボレリアにおいて、赤色蛍光タンパク質とＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ並びにＶｓｐリポタンパク質のシグナルペプチド及び係留鎖との融合は、融合しなければペリプラズムにあるレポータ−タンパク質の表面局在を導く（４７、５１、５５）。
【０１４５】
ナイセリアは、表面リポタンパク質をいくつかしか持っておらず、ＯＭを通るリポタンパク質の移行に影響を及ぼす要因は不明である。データは、少なくともｆＨｂｐの場合、移行に影響を及ぼす因子がボレリアに見られる因子とは異なることを示している。
【０１４６】
我々の知る限りでは、Ｎ．メニンギティディスにおけるＯｓｐＡの発現は、ペリプラズム又は外膜のペリプラズム側における誤局在を導く。おそらく宿主因子が局在規則を定義する（５１）ので、このことは、別の宿主におけるリポタンパク質の発現が誤局在を導き得るという以前の発見と合致する。ナイセリア様ｆＨｂｐ又はＴｂｐＢの自己由来表面露出リポタンパク質とのハイブリダイゼーションが、この誤局在を救済する可能性があると結論し、従って、ＯｓｐＡとｆＨｂｐ又はＴｂｐＢの異なる部分との融合を構築した。ＯｓｐＡシグナルペプチド及び係留鎖のｆＨｂｐのシグナルペプチド及び係留鎖による置きかえ（構築物ｆＡ１）は、ＯｓｐＡ表面局在を回復しなかった。しかしながら、この融合遺伝子のｆＨｂｐ部分を、ｆＨｂｐの球状ドメインの最初の１７個のＮ末端アミノ酸（第１のαヘリックス及びαヘリックス後のループからなる）で延長した場合、得られた構築物（ｆＡ６）は、細胞表面で検出することができた。ナイセリアにおいて外膜移行に影響を及ぼす領域は、係留鎖領域を超えて伸びるようなので、選別規則が、ナイセリアとボレリアの間で異なる可能性があることを示す。
【０１４７】
ｆＡ６におけるｆＨｂｐのＮ末端部分より長いｆＨｂｐのＮ末端部分とＯｓｐＡとの融合からなる構築物の殆ど全てが、細胞表面で検出された（ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ７）。唯一の例外は構築物ｆＡ２ｂであり、人工リンカーを介してＯｓｐＡとカップリングされているｆＨｂｐのアミノ酸１〜１５２（いわゆるＮ末端ドメイン）を含有する。しかしながら、細胞におけるｆＡ２ｂの極めて弱い発現レベルを考えると、ストレスを加えることが重要であり（図２Ａを参照のこと）、免疫染色後のシグナルの不足が、表面局在か又は弱い発現に起因したかどうかは、判別することができない。この局在−発現問題について以下で更に議論する。ＯｓｐＡを、ｆＨｂｐのＮ末端とＣ末端部の間に置いた構築物（ｆＡ３ｂ、ｆＡ５ｃ）は、細胞表面で検出されなかった。
【０１４８】
３．２  免疫原性に対する抗原位置の効果
ナイセリア細胞における構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７の表面曝露の証拠を見いだした。これと一致して、構築物ｆＡ４ｂ、ｆＡ４ｃ、ｆＡ６及びｆＡ７を保有するＯＭＶは、免疫したマウスにおいて強力な抗体応答を生じさせる唯一のものであった。このことは、ＯＭＶの表面に位置する抗原だけが抗体応答を生じさせ得ることを示唆している。しかしながら、細胞及びｎＯＭＶ両方において４つの「表面」構築物の発現レベルが、他の構築物より明らかに高いことを認識することは重要である（図２を参照のこと）。従って、免疫染色後に特定の構築物を検出できなかったことは、表面局在ではなく低発現レベルに起因する可能性もある。細胞において非常に低い発現レベルを有する構築物、例えばｆＡ１及びｆＡ２ｂについてこの筋書きを除外することはできない。しかしながら、ＯｓｐＡ、ｆＡ３ｂ又はｆＡ５ｃを発現する細胞は、かなり高い発現レベルを有するので、ＯｓｐＡ、ｆＡ３ｂ又はｆＡ５ｃが表面露出した場合に、免疫染色後に観察できないとは考えられない。
【０１４９】
高用量ＯｓｐＡ及び低用量ｆＡ６を保有するＯＭＶで免疫したマウス群のウェスタンブロットを比較した場合（図２Ａ、左からブロット４及び５）、免疫原性の明らかな差異は、ＯＭＶにおいて観察した構築物ＯｓｐＡ及びｆＡ６の発現レベルに基づいて予想したよりもずっと高い（図２Ｂ）。このことは、ＯＭＶにおける異種抗原の表面提示が、免疫原性の増大を確かに導き得ることを示す。
【０１５０】
３．３  ワクチンの可能性
現在開発中のボレリアワクチンは、様々な組換え脂質化ＯｓｐＡ血清型に基づくサブユニットワクチンである（３８、３９）。しかしながら、サブユニットワクチンは弱い免疫原性に悩まされ、アジュバントを使用する必要がある。ナイセリアｎＯＭＶの表面におけるＯｓｐＡの提示は、ｎＯＭＶの内的アジュバント活性及びＯｓｐＡの天然の立体配座での抗原の提示により、より優れた免疫原性を得ることができる。
【０１５１】
特に、リポタンパク質との融合による非リポタンパク質の脂質化が、免疫原性を増大させ得ることが示されたので（６２）、本ＯＭＶ表面提示方法は、非リポタンパク質も含めた病原体由来の他の抗原性タンパク質に一般に適用できる。更にまた、複数の異種抗原の発現及びＯＭＶ表面提示を組み合わせて、多価異種ＯＭＶの産生を容易にすることが可能である。
【０１５２】
［参照文献］
1.    Ellis TN, Kuehn MJ.Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2010;74(1):81-94.
2.    Chen DJ, OsterriederN, Metzger SM, Buckles E, Doody AM, DeLisa MP, et al. Delivery of foreignantigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.2010;107(7):3099-104.
3.    Muralinath M, KuehnMJ, Roland KL, Curtiss R, 3rd. Immunization with Salmonella enterica serovarTyphimurium-derived outer membrane vesicles delivering the pneumococcal proteinPspA confers protection against challenge with Streptococcus pneumoniae.Infection and immunity. 2011;79(2):887-94.
4.    Alaniz RC, DeatherageBL, Lara JC, Cookson BT. Membrane vesicles are immunogenic facsimiles ofSalmonella typhimurium that potently activate dendritic cells, prime B and Tcell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol.2007;179(11):7692-701.
5.    Gaillard ME, Bottero,D., Errea, A. Acellular pertussis vaccine based on outer membrane vesiclescapable of conferring both long-lasting immunity and protection againstdifferent strain genotypes. Vaccine. 2014;32:931-7.
6.    Zollinger WD, DonetsMA, Schmiel DH, Pinto VB, Labrie JE, 3rd, Moran EE, et al. Design and evaluationin mice of a broadly protective meningococcal group B native outer membranevesicle vaccine. Vaccine. 2010;28(31):5057-67.
7.    Nieves W, Petersen H,Judy BM, Blumentritt CA, Russell-Lodrigue K, Roy CJ, et al. A Burkholderiapseudomallei outer membrane vesicle vaccine provides protection against lethalsepsis. Clinical and vaccine immunology : CVI. 2014;21(5):747-54.
8.    Camacho AI, de SouzaJ, Sanchez-Gomez S, Pardo-Ros M, Irache JM, Gamazo C. Mucosal immunization withShigella flexneri outer membrane vesicles induced protection in mice. Vaccine.2011;29(46):8222-9.
9.    Kim OY, Hong BS, ParkKS, Yoon YJ, Choi SJ, Lee WH, et al. Immunization with Escherichia coli outermembrane vesicles protects bacteria-induced lethality via Th1 and Th17 cellresponses. J Immunol. 2013;190(8):4092-102.
10.   Keenan JI, Rijpkema SG,Durrani Z, Roake JA. Differences in immunogenicity andprotection in mice and guinea pigs following intranasal immunization withHelicobacter pylori outer membrane antigens. FEMS immunology and medicalmicrobiology. 2003;36(3):199-205.
11.  Roberts R, Moreno G, Bottero D,Gaillard ME, Fingermann M, Graieb A, et al. Outer membrane vesicles asacellular vaccine against pertussis. Vaccine. 2008;26(36):4639-46.
12.   Bartolini E, Ianni E,Frigimelica E, Petracca R, Galli G, Berlanda Scorza F, et al. Recombinant outermembrane vesicles carrying Chlamydia muridarum HtrA induce antibodies thatneutralize chlamydial infection in vitro. Journal of extracellular vesicles.2013;2.
13.   Holst J, Martin D, ArnoldR, Huergo CC, Oster P, O'Hallahan J, et al. Properties and clinical performanceof vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis.Vaccine. 2009;27 Suppl 2:B3-12.
14.   Nokleby H, Aavitsland P,O'Hallahan J, Feiring B, Tilman S, Oster P. Safety review: two outer membranevesicle (OMV) vaccines against systemic Neisseria meningitidis serogroup Bdisease. Vaccine. 2007;25(16):3080-4.
15.   Acevedo R, Fernandez S,Zayas C, Acosta A, Sarmiento ME, Ferro VA, et al. Bacterial Outer MembraneVesicles and Vaccine Applications. Frontiers in immunology. 2014;5:121.
16.   Kesty NC, Kuehn MJ.Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins intoEscherichia coli outer membrane vesicles. The Journal of biological chemistry.2004;279(3):2069-76.
17.   Fantappie L, de Santis M,Chiarot E, Carboni F, Bensi G, Jousson O, et al. Antibody-mediated immunityinduced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens intheir lumen. Journal of extracellular vesicles. 2014;3.
18.   Schild S, Nelson EJ, BishopAL, Camilli A. Characterization of Vibrio cholerae outer membrane vesicles as acandidate vaccine for cholera. Infection and immunity. 2009;77(1):472-84.
19.   Kim JY, Doody AM, Chen DJ,Cremona GH, Shuler ML, Putnam D, et al. Engineered bacterial outer membranevesicles with enhanced functionality. Journal of molecular biology.2008;380(1):51-66.
20.   Barat S, Willer Y, Rizos K,Claudi B, Maze A, Schemmer AK, et al. Immunity to intracellular Salmonelladepends on surface-associated antigens. PLoS pathogens.2012;8(10):e1002966.
21.   Daleke-Schermerhorn MH, FelixT, Soprova Z, Ten Hagen-Jongman CM, Vikstrom D, Majlessi L, et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens byusing an autotransporter approach. Applied and environmental microbiology.2014;80(18):5854-65.
22.   Galen JE, Curtiss R, 3rd.The delicate balance in genetically engineering live vaccines. Vaccine.2014;32(35):4376-85.
23.   Hess J, Gentschev I, MikoD, Welzel M, Ladel C, Goebel W, et al. Superior efficacy of secreted oversomatic antigen display in recombinant Salmonella vaccine induced protectionagainst listeriosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America. 1996;93(4):1458-63.
24.   Kang HY, Curtiss R, 3rd.Immune responses dependent on antigen location in recombinant attenuatedSalmonella typhimurium vaccines following oral immunization. FEMS immunologyand medical microbiology. 2003;37(2-3):99-104.
25.   Cornelis P. Expressinggenes in different Escherichia coli compartments. Current opinion inbiotechnology. 2000;11(5):450-4.
26.   Georgiou G, Stathopoulos C,Daugherty PS, Nayak AR, Iverson BL, Curtiss R, 3rd. Display of heterologousproteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatoriallibraries to live recombinant vaccines. Naturebiotechnology. 1997;15(1):29-34.
27.   van Bloois E, Winter RT,Kolmar H, Fraaije MW. Decorating microbes: surfacedisplay of proteins on Escherichia coli. Trends in biotechnology.2011;29(2):79-86.
28.   Lee SY, Choi JH, Xu Z.Microbial cell-surface display. Trends in biotechnology. 2003;21(1):45-52.
29.   Samuelson P, GunneriussonE, Nygren PA, Stahl S. Display of proteins on bacteria. Journalof biotechnology. 2002;96(2):129-54.
30.   Jong W, Daleke-SchermerhornMH, Vikstrom D, Ten Hagen-Jongman CM, de Punder K, van der Wel NN, et al. An autotransporter display platform for the development ofmultivalent recombinant bacterial vector vaccines. Microbial cell factories.2014;13(1):162.
31.   Park M, Sun Q, Liu F,DeLisa MP, Chen W. Positional assembly of enzymes on bacterial outer membranevesicles for cascade reactions. PloS one. 2014;9(5):e97103.
32.   Schroeder J, Aebischer T.Recombinant outer membrane vesicles to augment antigen-specific live vaccineresponses. Vaccine. 2009;27(48):6748-54.
33.   Jong WS, Sauri A, LuirinkJ. Extracellular production of recombinant proteins using bacterialautotransporters. Current opinion in biotechnology. 2010;21(5):646-52.
34.   Jose J, Meyer TF. Theautodisplay story, from discovery to biotechnical and biomedical applications.Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2007;71(4):600-19.
35.   Jung HC, Lebeault JM, PanJG. Surface display of Zymomonas mobilis levansucrase by using theice-nucleation protein of Pseudomonas syringae. Nature biotechnology.1998;16(6):576-80.
36.   Sigal LH, Zahradnik JM,Lavin P, Patella SJ, Bryant G, Haselby R, et al. A vaccine consisting ofrecombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lymedisease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine StudyConsortium. The New England journal of medicine. 1998;339(4):216-22.
37.   Steere AC, Sikand VK,Meurice F, Parenti DL, Fikrig E, Schoen RT, et al. Vaccination against Lymedisease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A withadjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group. The New England journal ofmedicine. 1998;339(4):209-15.
38.   Wressnigg N, Barrett PN,Pollabauer EM, O'Rourke M, Portsmouth D, Schwendinger MG, et al. A NovelMultivalent OspA Vaccine against Lyme Borreliosis Is Safe and Immunogenic in anAdult Population Previously Infected with Borrelia burgdorferi Sensu Lato.Clinical and vaccine immunology : CVI. 2014;21(11):1490-9.
39.   Comstedt P, Hanner M,Schuler W, Meinke A, Lundberg U. Design and Development of a Novel Vaccine forProtection against Lyme Borreliosis. PloS one. 2014;9(11):e113294.
40.   Fletcher LD, Bernfield L,Barniak V, Farley JE, Howell A, Knauf M, et al. Vaccine Potential of theNeisseria meningitidis 2086 Lipoprotein. Infection and immunity.2004;72(4):2088-100.
41.   Masignani V, Comanducci M,Giuliani MM, Bambini S, Adu-Bobie J, Arico B, et al. Vaccination againstNeisseria meningitidis using three variants of the lipoprotein GNA1870. TheJournal of experimental medicine. 2003;197(6):789-99.
42.   Koeberling O, Seubert A,Granoff DM. Bactericidal antibody responses elicited by a meningococcal outermembrane vesicle vaccine with overexpressed factor H-binding protein andgenetically attenuated endotoxin. The Journal ofinfectious diseases. 2008;198(2):262-70.
43.   van de Waterbeemd B,Streefland M, van der Ley P, Zomer B, van Dijken H, Martens D, et al. Improved OMV vaccine against Neisseria meningitidis usinggenetically engineered strains and a detergent-free purification process.Vaccine. 2010;28(30):4810-6.
44.   Brightbill HD, Libraty DH,Krutzik SR, Yang RB, Belisle JT, Bleharski JR, et al. Host defense mechanismstriggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science.1999;285(5428):732-6.
45.   Thoma-Uszynski S, Stenger S,Takeuchi O, Ochoa MT, Engele M, Sieling PA, et al. Induction of directantimicrobial activity through mammalian toll-like receptors. Science.2001;291(5508):1544-7.
46.   Okuda S, Tokuda H.Lipoprotein sorting in bacteria. Annual review of microbiology. 2011;65:239-59.
47.   Schulze RJ, Zuckert WR.Borrelia burgdorferi lipoproteins are secreted to the outer surface by default.Molecular microbiology. 2006;59(5):1473-84.
48.   Mascioni A, Bentley BE,Camarda R, Dilts DA, Fink P, Gusarova V, et al. Structural Basis for theImmunogenic Properties of the Meningococcal Vaccine Candidate LP2086. TheJournal of biological chemistry. 2009;284(13):8738-46.
49.   Steere AC, Livey I. Lymedisease vaccines. Plotkin SA, Orenstein WA, editors. Saunders, PA, USA2013.
50.   Poland GA. Vaccines againstLyme disease: What happened and what lessons can we learn. Clinical infectious diseases : an officialpublication of the Infectious Diseases Society of America. 2011;52 Suppl3:s253-8.
51.   Kumru OS. Surfacelocalization determinants of Borrelia burgdorferi lipoproteins. Kansas:University of Kansas; 2011.
52.   van der Ley P, Steeghs L,Hamstra HJ, ten Hove J, Zomer B, van Alphen L. Modification of lipid Abiosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants: influence onlipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infection andimmunity. 2001;69(10):5981-90.
53.   Horton RM, Hunt HD, Ho SN,Pullen JK, Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restrictionenzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 1989;77(1):61-8.
54.   Bos MP, Tefsen B, GeurtsenJ, Tommassen J. Identification of an outer membrane protein required for thetransport of lipopolysaccharide to the bacterial cell surface. Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America.2004;101(25):9417-22.
55.   Schulze RJ, Chen S, KumruOS, Zuckert WR. Translocation of Borrelia burgdorferi surface lipoprotein OspAthrough the outer membrane requires an unfolded conformation and can initiateat the C-terminus. Molecular microbiology. 2010;76(5):1266-78.
56.   Li H, Dunn JJ, Luft BJ,Lawson CL. Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein Acomplexed with an Fab. Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America. 1997;94(8):3584-9.
57.   Oriente F, Scarlato V,Delany I. Expression of factor H binding protein of meningococcus responds tooxygen limitation through a dedicated FNR-regulated promoter. Journal ofbacteriology. 2010;192(3):691-701.
58.   Chen S, Zuckert WR. Probingthe Borrelia burgdorferi surface lipoprotein secretion pathway using aconditionally folding protein domain. Journal of bacteriology.2011;193(23):6724-32.
59.   Lee JS, Shin KS, Pan JG,Kim CJ. Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine. Naturebiotechnology. 2000;18(6):645-8.
60.   Rizos K, Lattemann CT,Bumann D, Meyer TF, Aebischer T. Autodisplay: efficacious surface exposure ofantigenic UreA fragments from Helicobacter pylori in Salmonella vaccinestrains. Infection and immunity. 2003;71(11):6320-8.
61.   Lee SJ, Liang L, Juarez S,Nanton MR, Gondwe EN, Msefula CL, et al. Identification of a common immunesignature in murine and human systemic Salmonellosis. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. 2012;109(13):4998-5003.
62.   Cote-Sierra J, Bredan A,Toldos CM, Stijlemans B, Brys L, Cornelis P, et al. Bacteriallipoprotein-based vaccines induce tumour necrosis factor-dependent type 1protective immunity against Leishmania major. Infection and immunity.2002;70(1):240-8.
63.   Noinaj N, Easley NC, Oke M,Mizuno N, Gumbart J, Boura E, et al. Structural basis for iron piracy bypathogenic Neisseria. Nature. 2012;483(7387):53-8.
64.   Steere AC, Livey I. Lymedisease vaccines. In: Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA, editors. Vaccines.6th ed: Saunders, and imprint of Elsevier Inc.; 2013. p. 1122-32.
65.   Probst C, Ott A, Scheper T,Meyer W, Stocker W, Komorowski L. N-terminal disulfide-bridging of Borreliaouter surface protein C increases its diagnostic and vaccine potentials. Ticksand tick-borne diseases. 2012;3(1):1-7.
66.   Eicken C, Sharma V,Klabunde T, Owens RT, Pikas DS, Hook M, et al. Crystalstructure of Lyme disease antigen outer surface protein C from Borreliaburgdorferi. The Journal of biological chemistry. 2001;276(13):10010-5.
67.   Kumaran D, Eswaramoorthy S,Luft BJ, Koide S, Dunn JJ, Lawson CL, et al. Crystal structure of outer surfaceprotein C (OspC) from the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. TheEMBO journal. 2001;20(5):971-8.
68.   Buckles EL, Earnhart CG,Marconi RT. Analysis of antibody response in humans to the type A OspC loop 5domain and assessment of the potential utility of the loop 5 epitope in Lymedisease vaccine development. Clinical and vaccine immunology : CVI.2006;13(10):1162-5.
69.   Earnhart CG, Buckles EL,Dumler JS, Marconi RT. Demonstration of OspC type diversity in invasive humanlyme disease isolates and identification of previously uncharacterized epitopesthat define the specificity of the OspC murine antibody response. Infection andimmunity. 2005;73(12):7869-77.
70.   Grizot S, Buchanan SK.Structure of the OmpA-like domain of RmpM from Neisseria meningitidis. Molecular microbiology. 2004;51(4):1027-37.
71.   van der Voort ER, van der LeyP, van der Biezen J, George S, Tunnela O, van Dijken H, et al. Specificity of human bactericidal antibodies against PorA P1.7,16induced with a hexavalent meningococcal outer membrane vesicle vaccine.Infection and immunity. 1996;64(7):2745-51.
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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