(57)【要約】本発明は、トランスジェニック植物の雄性生殖組織における転写可能なポリヌクレオチド分子または組換えタンパク質の発現を選択的に調節するための、新規組換えＤＮＡ分子、組成物及び方法を提供する。本発明はまた、このようなＤＮＡ分子及び組成物を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物部分、種子及びコモディティ製品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、２、５〜８、１０〜１２、１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含むｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子であって、前記ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントが、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記異種転写可能ポリヌクレオチド分子が、植物において除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記異種転写可能なポリヌクレオチド分子が、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを異種の転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結することを含む組換えＤＮＡ分子を産生する方法。
【請求項５】
前記ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントが、配列番号：１、２、５〜８、１０〜１２、１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子をそのゲノムに含むトランスジェニック植物またはその一部。
【請求項７】
前記ＤＮＡ分子を含む請求項６に記載のトランスジェニック植物の種子。
【請求項８】
前記植物が単子葉植物である請求項６に記載の植物。
【請求項９】
前記植物がトウモロコシ植物である請求項８に記載の植物。
【請求項１０】
前記トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質の発現を選択的に調節する方法であって、前記トランスジェニック植物において、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を発現させることを含む前記方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を含む請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
トランスジェニック植物において雄性不稔性を誘発する方法であって、
ａ）配列番号：１、２、５〜８、１０〜１２、１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含むｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントであって、少なくとも第１の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている前記ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を成長させること；及び
ｂ）前記トランスジェニック植物に有効量の前記除草剤を散布し、この除草剤の散布が、前記トランスジェニック植物の雄性生殖組織の発育に先立って、またはそれと同時に行われ、これにより前記トランスジェニック植物に雄性不稔性を誘発すること；
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記異種転写可能ポリヌクレオチド分子が、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記除草剤がグリホサートである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記除草剤の有効量が、１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカー当たり約８ポンド酸当量のグリホサートである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効量の除草剤が、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１３及びＶ１４段階からなる群から選択される発育段階に散布される請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ハイブリッド種子を生産する方法であって、
ａ）配列番号：１、２、５〜８、１０〜１２、１６、２３〜９２及びそれらの相補体からなる群より選択される配列を含むｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物に、有効量の除草剤を散布し、且つ前記ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントが、少なくとも第一の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結され、且つ前記除草剤の散布が、前記トランスジェニック植物の雄性生殖組織の発育に先立って、またはそれと同時に行われ、これにより前記トランスジェニック植物に雄性不稔性を誘発すること；
ｂ）前記トランスジェニック植物を第２の植物からの花粉で受粉させること；及び
ｃ）前記トランスジェニック植物からハイブリッド種子を形成させること；
を含む前記方法。
【請求項１８】
前記受粉することが、風媒受粉を起こさせることを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種転写可能ポリヌクレオチド分子が、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記除草剤がグリホサートである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリホサートが、１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカー当たり約８ポンド酸当量の有効量で、発育と同時に散布される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法によって生産されたハイブリッド種子であって、前記組換えＤＮＡ分子を含む前記ハイブリッド種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０１５年７月２２日に出願された米国仮出願第６２／１９５，５４６号の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
「ＭＯＮＳ３９２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイルに含まれる配列リストは、２６．３キロバイト（オペレーティングシステムＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）であり、２０１６年６月２８日に作成され、本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、農業、植物育種及び分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質発現を選択的に調節するための方法及び組成物、並びにこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
ハイブリッド種子（雑種種子）は、密接に関連する植物のハイブリダイゼーション（雑種形成）または交雑受粉によって産生され、いずれかの親植物が所有していない形質の望ましい組み合わせを有する子孫ハイブリッド植物に生育させることができる。ハイブリッド植物は、植物の寸法、収量、栄養組成、病害抵抗性、除草剤耐性、ストレス耐性、気候適応、及び他の望ましい形質の改善などの優れた農業的特徴を示し得る。効率的なハイブリッド種子の生産には、植物自身の花粉が植物を自家受粉することが認められていないことが必要である。多くの作物のハイブリッド種子の生産を制限する主なものは、植物を雄性不稔性にし、自家受粉不能にする、単純で信頼性が高く経済的な方法の欠如である。
【０００５】
ハイブリッド種子生産では、自家受粉ではなく雌の異花受粉を促進するために、雌親植物において花粉生産及び花粉放出を防止することができる。このような防止法としては、例えば、花粉含有構造の手動除去（例えば、トウモロコシにおける手作業または機械的雄穂除去）、受粉制御の遺伝的手段の使用（例えば、細胞質雄性不稔性または核雄性不稔性技術）、化学物質の使用、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。これは、労働集約的であり、従って高価なプロセスであり得る。例えば、トウモロコシでは、典型的には、雄穂除去は２つの工程で行われる：機械的雄穂除去とそれに続く手動雄穂除去。化学物質ガメトシドを単独で使用するハイブリッド種子の商業的生産は、一般に、配偶子の選択性の欠如、及び植物の他の部分に対するそれらの効果の欠如によって制限される。従って、ハイブリッド種子生産の効率を改善する方法が非常に望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、一般に、トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質発現を選択的に調節する方法、このような方法に有用な組換えＤＮＡ分子、ならびにこのような組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、細胞、及び種子に関する。本発明は、転写可能なポリヌクレオチド分子によってコードされたタンパク質の発現の改善された選択的調節を提供することができる雄性組織特異的ｓｉＲＮＡ（ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ）標的エレメントを提供することにより、当該技術を超えた改善を提供し、そしてこのようなｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子及び組成物、及びこのようなｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを、ハイブリッド種子の生産のためのトランスジェニック植物において雄性不稔性を誘発するために使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された３’非翻訳領域内に含まれる。別の実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、異種転写可能ポリヌクレオチド分子と、３’非翻訳領域の一部である作動可能に連結されたポリアデニル化配列との間に位置する。一実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、配列番号：１〜１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、異種転写可能ポリヌクレオチド分子は、除草剤耐性、例えば栄養型除草剤耐性、を植物に付与する。さらなる実施形態では、異種転写可能ポリヌクレオチド分子は、雄性生殖除草剤耐性を植物に付与しない。別の実施形態では、異種転写可能なポリヌクレオチド分子は、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（５−ｅｎｏｌｙｐｙｒｕｖｙｌ  ｓｈｉｋｉｍａｔｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＥＰＳＰＳ）である。
【０００８】
別の態様では、本発明は、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された本発明のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結することを含む組換えＤＮＡ分子を産生する方法を提供する。一実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、配列番号：１〜１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、本発明のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含むトランスジェニック植物を提供する。一実施形態では、トランスジェニック植物は、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む。さらなる実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、配列番号：１〜１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群より選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物は、異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子またはＤＮＡ構築物で植物を形質転換することによって産生される。さらなる態様において、本発明は、このようなトランスジェニック植物の、種子、細胞または一部を提供する。一実施形態では、植物は単子葉植物である。別の実施形態では、植物はトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）植物である。
【００１１】
さらなる態様では、本発明はまた、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子をトランスジェニック植物において発現させることによって、トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質の発現を選択的に調節する方法も提供する。一実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、配列番号：１〜１６、２３〜９２及びこれらの相補体からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、異種転写可能ポリヌクレオチド分子は、除草剤耐性、例えば栄養型除草剤耐性、を植物に付与する。さらなる実施形態では、異種転写可能ポリヌクレオチド分子は、雄性生殖除草剤耐性を植物に付与しない。別の実施形態では、異種転写可能なポリヌクレオチド分子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳである。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも第１の除草剤に対する耐性をトランスジェニック植物に付与する異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に、作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を、そのゲノムに有するトランスジェニック植物に、除草剤を散布する工程を含む、トランスジェニック植物に雄性不稔性を誘発する方法であって、除草剤は、トランスジェニック植物の雄性生殖組織の発育に先立って、またはそれと同時に散布され、これによりトランスジェニック植物における雄性不稔性を誘発する方法を提供する。一実施形態では、異種転写可能ポリヌクレオチド分子は、トランスジェニック植物に、栄養型除草剤耐性を付与するが、雄性生殖除草剤耐性を付与しない。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物である。さらなる実施形態では、除草剤の散布によりトランスジェニック植物における少なくとも花粉の発育、花粉の放出、または葯の押出しを防止する。別の実施形態では、除草剤が散布されている間の雄性生殖組織の発育段階は、トウモロコシ植物の成長の、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１３及びＶ１４段階からなる群より選択される段階である。別の実施形態では、除草剤は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤、４−ヒドロキシフェニルジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤、及び合成オーキシンからなる群より選択される。別の実施形態では、除草剤はグリホサートであり、異種転写可能なポリヌクレオチドはグリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードする。
【００１３】
一態様では、本発明はまた、異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子をそのゲノム中に含むトランスジェニック植物に、有効量の除草剤を散布することを含む、ハイブリッド種子を生産する方法であって、トランスジェニック植物の雄性生殖組織の発達に先立って、またはこれと同時に、除草剤を散布し、トランスジェニック植物における雄性不稔性を誘発し、そしてトランスジェニック植物を第２の植物からの花粉で受精させ；そしてハイブリッド種子がトランスジェニック植物から形成することを可能にする方法を提供する。一実施形態では、トランスジェニック植物はトウモロコシである。別の実施形態では、除草剤はグリホサートであり、異種転写可能なポリヌクレオチド分子はグリホサート耐性ＥＰＳＰＳである。別の実施形態において、グリホサートは、１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカー当たり約８ポンド酸当量の有効量で、発育と同時に散布される。別の態様では、本発明は、このような方法によって生産されたハイブリッド種子を提供する。一実施形態では、ハイブリッド種子は組換えＤＮＡ分子を含む。
【００１４】
本発明の他の特定の実施形態は、以下の詳細な説明において開示される。本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈を別段必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、記載された整数、要素またはステップ、或いは整数、要素またはステップのグループを含むことを単に示しており、他の、整数、要素またはステップ、或いは整数、要素またはステップのグループを除外するものではないことを理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】花粉発育段階を示す葯断面の下部のパネルの写真により、房サイズと形態を示す、房成長段階Ｔ２のＶ７、Ｔ４のＶ８／Ｖ９、Ｔ５のＶ１０／Ｖ１１、Ｔ６のＶ１２、及びＴ７のＶＴ。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ分子の同定のために小ＲＮＡ分子を単離するための従来技術で以前使用された段階（Ｖ１０／Ｖ１１及びＶ１２）は、実線のボックスで示されている；小ＲＮＡ分子を単離するための本明細書に記載の段階（Ｖ７、Ｖ８／Ｖ９、Ｖ１０／Ｖ１１及びＶ１２）は、破線の枠で示されている。
【００１６】
【図２】配列番号：１７として提供されるｃＤＮＡ配列上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のアラインメントのグラフ表示。ｃＤＮＡ配列はヌクレオチド１〜１８２６により示され、短い線は個々のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の相補鎖のアライメントを、或いは隣接するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列またはオーバーラップするｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（比較的長い線）のｃＤＮＡ配列への伸長を表す。ｃＤＮＡと同じ鎖であるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列は示されていない。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡの正規化された相対発現レベルは、左側に示されている。枠内領域は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的が豊富なｃＤＮＡ配列の領域を表す。
【００１７】
【図３】二本鎖ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ内のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列、及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントとして有用な多数のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列を有する、ｍＲＮＡの領域を示す図。
【００１８】
【図４】ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント（配列番号：２）に作動可能に連結されたグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む二重コピートランスジェニック植物からＡｌｅｘａｎｄａｒ染色で染色されたＲ０トウモロコシの房及び花粉の写真。事象１〜４には、Ｖ５その後Ｖ８期に、０．７５ポンド／エーカーのグリホサート除草剤を噴霧し、そして開花無し、及び目に見える花粉粒子も葯中に検出される花粉粒子もないと定義される完全雄性不稔性を有する房を示した。対照植物は、グリホサート散布を受けず、正常開花及び花粉放出を示し、顕微鏡観察は正常な花粉粒子を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号：１−配列番号：１７として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１４２９〜１６２８と９５％の配列同一性を有するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２０】
配列番号：２−配列番号：１７として本明細書に提供されたｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１４２９〜１６２８と９５％の配列同一性を有し、かつ配列番号：１に対して単一ヌクレオチド変化（Ｔ６９Ａ）を有するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２１】
配列番号：３−配列番号：１８として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２３９〜４３３に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２２】
配列番号：４−配列番号：１８として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置４７７〜６９７に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２３】
配列番号：５−配列番号：１９として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２３９〜４３３に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２４】
配列番号：６−配列番号：１９として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置３７０〜４７７に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２５】
配列番号：７−配列番号：２０として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１３５７〜１５６２に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２６】
配列番号：８−配列番号：２１として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２４７〜４４１に対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２７】
配列番号：９−３つのヌクレオチドミスマッチ（Ｃ３１４Ａ、Ａ３５０Ｇ、及びＧ４０８Ａ）を有する配列番号：２２として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１９１〜４９０と９９％の配列同一性を有するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列の逆相補体。
【００２８】
配列番号：１０〜１６−組換えｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列。
【００２９】
配列番号：１７：−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：１及び配列番号：２によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：２３〜３１のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３０】
配列番号：１８−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：３及び配列番号：４で表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：３２〜４２のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３１】
配列番号：１９−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：５及び配列番号：６によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：４３〜５２のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３２】
配列番号：２０−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：７によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：５３〜６０のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３３】
配列番号：２１−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：８によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：６１〜６９のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３４】
配列番号：２２−少なくとも１つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列リッチ領域を含むｃＤＮＡ配列。配列番号：９によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含み、配列番号：７０〜８７のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に整列する。
【００３５】
配列番号：２３〜９２−本発明のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であって、配列番号：１７〜２２として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列に整列するＤＮＡ配列。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は、トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質発現、例えば異種転写可能ポリヌクレオチド分子の発現、を選択的に調節するための、組換えＤＮＡ分子、組成物及び方法、並びにその使用を提供する。一態様では、本発明は、異種転写可能ポリヌクレオチドに作動可能に連結された雄性組織特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ）標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。このような組換えＤＮＡ分子は、トランスジェニック植物の雄性生殖組織における異種転写可能ポリヌクレオチドの発現を選択的に調節するために有用である。核酸配列は、規定されているように（当業者に知られているように、一方の開示は必然的に他方を定義する）、ＤＮＡまたはＲＮＡとして提供することができる。さらに、所与の核酸配列の開示は、当業者に知られているように、必然的にその配列の相補体を定義し、包含する。
【００３７】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、長さが約１８〜２６ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ｎｔ）のＲＮＡ分子のクラスである。ｓｉＲＮＡ配列は、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、及びウラシル（Ｕ）からなるＲＮＡヌクレオチド配列を用いて、またはグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）からなる等価のＤＮＡヌクレオチド配列を用いて表すことができる。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内で機能して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解を引き起こし、その結果、遺伝子発現の破壊及び遺伝子によってコードされるタンパク質のダウンレギュレーションをもたらす。
【００３８】
「雄性組織特異的ｓｉＲＮＡ」または「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ」は、植物の雄性生殖組織（複数可）（例えば、雄性花序）において富化されるか、または特異的に発現されるｓｉＲＮＡであり、従って雄性組織特異的発現パターンを有する、。雄性組織特異的ｓｉＲＮＡは、植物において同定されており、低分子量のノーザン分析のような当該分野で公知の技術を用いて検出することができる。「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列」は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡの核酸配列である。二本鎖ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ分子の対応するＤＮＡ配列の形態のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の例は、本明細書において配列番号：２３〜９２として提供される。
【００３９】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列は、本明細書では「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的」と呼ばれる。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的は遺伝子のＤＮＡ配列に含まれ、対応するｍＲＮＡ分子のＲＮＡ配列に転写される。次いで、二本鎖ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ分子の一本鎖は、典型的な生理学的条件下でｍＲＮＡ分子中のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的に結合またはハイブリダイズすることができる。図３を参照。核酸配列は、２つの核酸配列のアラインメントが、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の長さにわたって、完全一致（ミスマッチなし、すなわち完全相補）、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、または３つのミスマッチを生じる場合、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に相補的である。相補的配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則（すなわち、シトシンとのグアニンペア（Ｇ：Ｃ）、及びアデニンとのチミンペア（Ａ：Ｔ）またはアデニンとのウラシルペア（Ａ：Ｕ）のいずれか）に従い、互いに塩基対を形成することができる。「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列」は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的の核酸配列である。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列の例は、本明細書において配列番号：２３〜９２として提供される。
【００４０】
１つを超えるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的を一緒にクラスター化することができるか、または単一のＤＮＡ分子内に重複することさえできる。１つを超えるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的を含むＤＮＡ分子は、本明細書では「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント」と呼ばれる。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、５００ヌクレオチド配列ウィンドウ内に少なくとも２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的を含む。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、約３０ヌクレオチド（ｎｔ）、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約６０ｎｔ、約７０ｎｔ、約８０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約３００ｎｔ、約３５０ｎｔ、約４００ｎｔ、約４５０ｎｔ、または約５００ｎｔ等の任意の長さである。「ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列」は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの核酸配列である。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列の例は、本明細書において配列番号：１〜１６として提供される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「組換え」ＤＮＡ分子、ポリペプチド、タンパク質、細胞、または生物は、天然に存在しなくてもよく、即ち遺伝子工学のツールを使用して人為的に作製されてもよく、それ自体人間活動の産物であり、そうでなければ通常では自然界に存在しない。「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介在なしに自然には一緒に存在しないＤＮＡ配列または分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子を指す。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子、天然に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝的形質転換によって宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であり得る。一実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つの転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含むＤＮＡ分子であり、例えば転写可能なポリヌクレオチド分子はｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに対して異種である。本明細書中で使用される場合、「組換え」分子または細胞もしくは生物は、人工のものを指し得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるように、用語「異種」とは、２つ以上のＤＮＡ分子またはタンパク質の組合せを指すが、それは、このような組合せが通常天然には見出されない場合、またはこのような組合せが、自然界に見出されるものとは異なる配向または順序で提供される場合においてである。例えば、２つのＤＮＡ分子は、異なる種に由来するか、または合成的に作製されてもよく、及び／または２つのＤＮＡ分子は異なる遺伝子、例えば同じ種の異なる遺伝子または異なる種の同じ遺伝子、から誘発されてもよい。一例では、調節エレメントまたはｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子に関して異種であり得るが、それは、このような組み合わせが通常自然界には見出されない、すなわち、転写可能なポリヌクレオチド分子が、調節エレメントまたはｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されていない、場合においてあり得る。一実施形態では、このような異種の組み合わせは、植物由来であっても化学合成されていてもよく、そして、転写可能なポリヌクレオチド分子、例えば除草剤耐性のためのタンパク質、例えばｃｐ４−ＥＰＳＰＳ（例えば、配列番号：９３として本明細書に提供されるように）、をコードする細菌導入遺伝子に作動可能に連結され得る、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含み得る。さらに、特定の配列は、それが導入される細胞または生物に関して「異種」であり得る（例えば、その特定の細胞または生物において天然には存在しない配列）。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、その自然状態でそれに典型的に会合している他の分子から分離されたことを意味する。例えば、単離されたＤＮＡ分子は、単独でまたは他の組成物と混合されて存在するが、それの天然のゲノム位置または状態では存在しない分子である。一実施形態では、「単離された」という用語は、自然状態で通常ＤＮＡ分子に隣接する核酸から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、単離されたＤＮＡ分子は、相互に異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子であり得る。別の例において、単離されたＤＮＡ分子は、遺伝子形質転換によって宿主細胞中の新規なゲノム位置に組み込まれたＤＮＡ分子であり得る。従って、本質的に結合しないであろう１つ以上の他のＤＮＡ分子（複数可）に融合または作動可能に連結されたＤＮＡ分子（例えば組換えＤＮＡまたは植物形質転換技術の結果として）は、本明細書において単離されたとみなされる。このような分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている場合でも、または他のＤＮＡ分子を有する核酸溶液中に存在する場合でも単離されたとみなされる。
【００４４】
用語「作動可能に連結された」は、一方が他方の機能に影響を及ぼすように配置または連結された少なくとも２つのヌクレオチド分子を指す。２つのヌクレオチド分子は、単一の連続したヌクレオチド分子の一部であってよく、隣接していても、または分離していてもよい。例えば、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、転写可能なポリヌクレオチド分子と作動可能に連結され得る。一実施形態では、作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写、翻訳、または発現に影響を及ぼすことができる。例えば、雄性生殖組織細胞において転写後に、ｍＲＮＡ分子中のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの存在が、内因性ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ及びＲＩＳＣ経路によって誘発された細胞内での転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調節する場合、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント及び転写可能なポリヌクレオチド分子の作動可能な連結は、例えば、転写可能なポリヌクレオチド分子に隣接する（例えば、転写可能なポリヌクレオチド分子の５’または３’に位置するが、必ずしも連続した連結ではない）、ポリヌクレオチド分子の非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ中、またはその隣に位置するような）及び／または転写可能なポリヌクレオチド分子の３’側及びポリアデニル化シグナルの５’の中であるか、または隣接する、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの組み込みにより、達成され得る。一実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、転写可能なポリヌクレオチド分子とポリアデニル化配列との間に、すなわち転写可能なポリヌクレオチド分子の３’に隣接して配置される。別の実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、転写可能なポリヌクレオチド分子の停止コドンとポリアデニル化配列との間に位置する。別の実施形態では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、転写可能なポリヌクレオチド分子に隣接する３’ＵＴＲ配列内に位置する。
【００４５】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的、及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの同定の例は、本明細書に提供され、そして当業者に公知の方法、例えば、植物ｓＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーのバイオインフォマティクス分析によって同定することができる。特に、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡをｓＲＮＡライブラリーから同定し、配列決定することができる。同定されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列をｃＤＮＡ及び／またはゲノム配列コレクションと比較して、本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子及び構築物の開発に有用なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを同定することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、インビトロで作製、合成、または修飾される。例えば、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、より多い、より少ない、または異なるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列を含むように、または１つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列（複数可）の相対位置を再編成するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、このような修飾は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの効果を増加または減少させるのに有益であり得る。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの作製、合成またはインビトロ修飾のための方法、及び調節を所望のレベルにするための最適な変更を決定する方法は、当業者に公知である。組換えｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの例は、２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的、２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント、２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的リッチｃＤＮＡ領域、または１つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的及び２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的リッチｃＤＮＡ領域の断片の、ＤＮＡ配列またはこれらの断片を組み合わせることによって作製することができ、例えば、配列番号：１〜９として本明細書で提供される２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの全部または断片を組み合わせることによって、本明細書で配列番号：２３〜９２として提供される２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列を組み合わせることによって、または本明細書で配列番号：１〜９として提供される２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの全部または断片と、配列番号：２３〜９２として本明細書で提供される１つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列とを組み合わせることによって、作製することができる。このような例の組換えｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、本明細書において配列番号：１０〜１６として提供される。
【００４７】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントのＤＮＡ配列はまた、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列に１〜３個のヌクレオチドミスマッチを組み込むことによって変化させることができる（所定のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列と比較して）。別の実施形態では、本発明は、本発明の、ＤＮＡ分子、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント（例えば、配列番号：１〜９）、組換えｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント（例えば、配列番号：１０〜１６）、またはｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号：１７〜２２）のいずれかと、配列同一性が少なくとも約８０％（パーセント）、配列同一性が約８５％、配列同一性が約９０％、配列同一性が約９１％、配列同一性が約９２％、配列同一性が約９３％、配列同一性が約９４％、配列同一性が約９５％、配列同一性が約９６％、配列同一性が約９７％、配列同一性が約９８％、配列同一性が約９９％である、組換えＤＮＡ分子またはｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを包含する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるＤＮＡ分子の断片を提供する。このような断片は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントとして有用であり得るか、または上記のように組換えｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを構築するための、他のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント、ｍｔ−ｓｉＲＮＡ配列、またはその断片と組み合わせられ得る。特定の実施形態では、このような断片は、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも  約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の長さの本明細書開示のＤＮＡ分子（例えば、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的要素またはｃＤＮＡ配列）を含む。出発ＤＮＡ分子からこのような断片を産生する方法は、当該技術分野において周知である。
【００４９】
特定の転写可能なポリヌクレオチド分子の所望の発現の側面に対する本明細書に記載の修飾、重複、欠失または再編成の有効性は、本明細書の実施例に記載されているものなどの、安定で一過性の植物アッセイにおいて経験的に試験することができ、出発ＤＮＡ分子において生じた変化及び変化の目的に依存して変化し得るとの結果が確認されている。
【００５０】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、いずれの方向にも機能することができ、それは非方向性であることを意味し、そしてこれ自体、組換えＤＮＡ分子またはＤＮＡ構築物において５’から３’方向または３’から５’方向のいずれかで使用することができる。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「転写可能なポリヌクレオチド分子の発現」または「タンパク質の発現」とは、細胞における、転写可能なポリヌクレオチド分子及び得られた転写物（ｍＲＮＡ）からのタンパク質の産生を指す。従って、用語「タンパク質発現」は、転写されたＲＮＡ分子のタンパク質分子への翻訳の任意のパターンを指す。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発育的、または形態学的性質、ならびに定量的または定性的徴候によって特徴付けられ得る。一実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子を用いて、トランスジェニック植物の雄性生殖組織におけるタンパク質または転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を選択的に調節することができる。このような実施形態では、トランスジェニック植物における組換えＤＮＡ分子の発現は、少なくとも栄養組織においては動作可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現をもたらし得るが、雄性生殖組織では発現しない。特定の実施形態では、このようなタンパク質発現の調節は、抑制または低減を意味し、例えばＲＮＡｉ−媒介性の転写後遺伝子調節を介して例えば細胞内で、産生されるタンパク質のレベルを抑制または低減することができる。
【００５２】
本明細書で使用されるタンパク質発現の選択的調節とは、参照細胞または組織と比較して、細胞または組織におけるタンパク質産生を、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％減少させること（すなわち、完全な減少）である。参照細胞または組織は、例えば、タンパク質をコードする類似の導入遺伝子を有するトランスジェニック植物由来のタンパク質または細胞または組織を発現する同じまたは類似のトランスジェニック植物由来の栄養細胞または組織であり得るが、作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを欠いている。タンパク質発現の調節は、当該技術者に公知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析などの技術を用いて細胞または組織試料中のタンパク質蓄積を直接測定することにより、タンパク質の酵素活性を測定することにより、またはタンパク質発現を表現型的に決定することにより、決定することができる。一実施形態では、タンパク質発現の選択的調節とは、除草剤が誘発不稔性スプレーとして散布されたトランスジェニック植物において変化した雄性稔性能の検出可能な表現型をもたらすために、トランスジェニック植物の雄性組織に除草剤耐性を付与することができるタンパク質の発現を十分に低下させることを指す。従って、このようなトランスジェニック植物における変化した雄性稔性能の検出は、タンパク質発現の選択的調節を示すであろう。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「組換えタンパク質をコードする導入遺伝子」または「転写可能なポリヌクレオチド分子」は、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を有するものを含むが、これらに限定されないＲＮＡ分子に転写され得る任意のヌクレオチド分子を指す。条件に応じて、ヌクレオチド配列は、細胞内のポリペプチド分子に実際に翻訳されても、されなくてもよい。導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド分子の境界は、一般に、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳終止コドンによって定められる。
【００５４】
用語「導入遺伝子」は、植物の形質転換法などによるヒトの介入の結果として、生物または細胞の現在または以前の世代において、生物または宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック」は導入遺伝子を含むことを意味し、例えば「トランスジェニック植物」はそのゲノムに導入遺伝子を含む植物を指し、「トランスジェニック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の存在によって伝達されるか、または付与される特徴または表現型を指す。このようなゲノム改変の結果として、トランスジェニック植物は、関連する野生型植物とは明らかに異なるものであり、トランスジェニック形質は、野生型植物において天然に見出されない形質である。本発明のトランスジェニック植物は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含む。
【００５５】
本発明の導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド分子には、植物形態、生理学、成長、発育、収量、栄養特性、病害抵抗性、病虫害抵抗性、除草剤耐性、ストレス耐性、環境ストレス耐性、または化学耐性と関連する所望の特性を提供する導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド分子が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の転写可能なポリヌクレオチド分子は、トランスジェニック植物で発現する場合、少なくともタンパク質発現が生じる細胞及び／または組織で除草剤耐性を付与するタンパク質をコードし；トランスジェニック植物の雄性生殖組織において除草剤耐性タンパク質を、除草剤の適時散布と関連して選択的に調節することにより、少なくとも減少した雄性稔性または誘発性雄性不稔性をもたらす。
【００５６】
ハイブリッド種子の生産効率を高めるために、例えば、ハイブリッド種子生産の間に所定の交雑で雌として使用されるトウモロコシ植物から物理的に雄しべを取る必要性を排除または低減することによって、このような誘発性の雄性不稔性を使用することができる。除草剤誘発性雄性不稔システムは、例えば、米国特許第６，７６２，３４４号；米国特許第８，６１８，３５８号；及び米国特許公報第２０１３／０００７９０８号に記載されている。本発明の実施に有用な除草剤の例としては、限定されないが、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（例えば、ｆｏｐ及びｄｉｍ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤（例えば、スルホニルウレア（ＳＵ）及びイミダゾリノン（ＩＭＩ））、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）阻害剤（例えば、トリアジン及びフェニルエーテル）、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤（例えば、フルミオキサジン及びフォメサフェン）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤（例えば、イソキサフルトール、及びメソトリオン等のトリケトン）、５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤（例えば、グリホサート）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）阻害剤（例えば、グルホシネート及びホスフィノトリシン）、合成オーキシン（例えば、２，４−Ｄ及びジカンバ）が挙げられる。本発明の実施に使用するための導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド分子の例としては、限定されないが、ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、除草剤非感受性ＨＰＰＤ）、グルホシネートに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ｐａｔ及びｂａｒ）、グリホサート耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号：９３として本明細書で提供されるｃｐ４−ｅｐｓｐｓのようなグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ等）、及びジカンバのような合成オーキシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ））、及び２，４−Ｄ（例えば、（Ｒ）−ジクロロプロップジオキシゲナーゼ遺伝子（ｒｄｐＡ））が挙げられる。
【００５７】
本発明の組換えＤＮＡ構築物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含み得るものであり、当該技術分野で公知の技術及び様々な実施形態によって作製され、植物形質転換ベクター、プラスミド、または色素体ＤＮＡに含まれる。このような組換えＤＮＡ構築物は、トランスジェニック植物及び／または細胞を産生するために有用であり、これ自体がトランスジェニック植物、種子、細胞または植物部分の、ゲノムＤＮＡに含まれ得る。従って、本発明は、組換えＤＮＡ構築物が、植物形質転換ベクター内に、または植物細胞を形質転換するための遺伝子銃粒子上に、またはトランスジェニック植物細胞の染色体もしくはプラスチド内に、またはトランスジェニック細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物種子、トランスジェニック花粉粒、またはトランスジェニックもしくは部分的にトランスジェニック（例えば、移植された）植物内に、位置する実施形態を包含する。ベクターは、植物形質転換、すなわち細胞へのＤＮＡの導入の目的で使用され得る任意のＤＮＡ分子である。本発明の組換えＤＮＡ構築物は、例えば、植物形質転換ベクターに挿入され、トランスジェニック植物、種子及び細胞を生産するための植物形質転換に使用され得る。植物形質転換ベクターを構築するための方法としては、当該技術分野で周知である。本発明の植物形質転換ベクターは、一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ、作動可能に連結された組換えＤＮＡ構築物、及びポリアデニル化シグナル（３’ＵＴＲ配列に含まれ得る）の発現のための適切なプロモーターを含むが、これらに限定されない。本発明の実施に有用なプロモーターには、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現のために植物において機能するプロモーターが含まれる。このようなプロモーターは、当該技術分野において、改変され、よく知られており、誘発性、ウイルス性、合成性、構成的であるもの、時間的に調節され、空間的に調節され、及び／または時空間的に調節されるものを含む。追加の任意成分としては、以下の標的：５’ＵＴＲ、エンハンサー、シス作用標的、イントロン、シグナル配列、トランジットペプチド配列、及び１つ以上の選択マーカー遺伝子、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、植物形質転換ベクターは、組換えＤＮＡ構築物を含む。
【００５８】
本発明の組換えＤＮＡ構築物及び植物形質転換ベクターは、例えば、所望の発現のタイプ、所望の導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド分子、及び組換えＤＮＡ構築物が発現されるべき植物における使用の便宜性などを考慮して、意図する用途に適した任意の方法によって作製される。組換えＤＮＡ構築物及び植物形質転換ベクターを作製及び使用するためにＤＮＡ分子を操作するための有用な一般的方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．  Ｇｒｅｅｎ及びＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ“（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）ＩＳＢＮ：９７８−１−９３６１１３−４２−２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（２０１２）等のハンドブック及び実験室用マニュアルに詳細に記載されている。
【００５９】
本発明の組換えＤＮＡ分子及び構築物は、当技術分野で公知の方法によって、完全にまたは部分的に、例えばＤＮＡ操作（例えば、制限酵素認識部位または組換えに基づくクローニング部位）の利便性を高めるために、または植物に好ましい配列（植物コドン使用またはコザックコンセンサス配列など）を含むように、または組換えＤＮＡ分子及び構築物設計（スペーサーまたはリンカー配列など）に有用な配列を含むように、修飾することができる。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子及び構築物のＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ分子または構築物が発現されるべき植物に対してコドン最適化されたＤＮＡ配列を含む。例えば、植物中で発現される組換えＤＮＡ分子または構築物は、当該技術分野で公知の方法によって植物中での発現のためにコドン最適化されたその配列の全部または一部を有することができる。本発明の組換えＤＮＡ分子または構築物を、さらなる形質（例えば、形質転換植物の場合、除草剤耐性、害虫抵抗性、低温発芽寛容性、水不足耐性を含む形質など）を付与するために、他の組換えＤＮＡ分子またはトランスジェニック事象と、例えば、他の遺伝子を発現または調節することによって、積み重ねることができる。
【００６０】
本発明の態様は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、及びトランスジェニック植物または種子を含む。本発明のさらなる態様は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む人工または組換え植物染色体を含む。本発明で使用される宿主植物細胞の形質転換のための適切な方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができ（例えば、組換えＤＮＡ分子が植物染色体に安定に組み込まれる）、当該技術で周知である任意の方法が、実質的に含まれる。組換えＤＮＡ分子を植物に導入するための例示的かつ広く利用されている方法は、当業者に周知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系である。組換えＤＮＡ分子を植物に導入するための別の方法の例としては、組換えＤＮＡ分子を部位特異的組込みの方法によって所定の部位で植物ゲノムに挿入することである。部位特異的組込みは、当該技術で公知の任意の方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、遺伝子操作されたまたは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘発エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）の使用、により達成し得る。トランスジェニック植物は、植物細胞培養の方法によって、形質転換された植物細胞から再生され得る。導入遺伝子に関してホモ接合のトランスジェニック植物は、それ自体に単一の外因性遺伝子配列を含む独立した分離トランスジェニック植物、例えば、Ｒ１またはＦ１種子を産生するためにＲ０またはＦ０植物、を有性交配（自家受粉）することによって得ることができる。生産されたＲ１またはＦ１種子の４分の１は、導入遺伝子に関してホモ接合性である。発芽したＲ１またはＦ１種子から生育した植物は、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体との間の区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合アッセイ）を用いて、ヘテロ接合性について試験することができる。
【００６１】
本発明は、アルファルファ、ワタ、トウモロコシ、アブラナ、コメ、ダイズ及びコムギ（但しこれらに限定されない）を含む、本発明の組換えＤＮＡ分子をゲノム中に有するトランスジェニック植物を提供する。本発明はまた、トランスジェニック植物細胞、植物部分、及びこのようなトランスジェニック植物の子孫も提供する。本明細書で使用される場合、「子孫」は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む植物、種子、植物細胞、及び／または植物部分から産生されるか、またはこれらから再生される、任意の植物、種子、植物細胞及び／または植物部分を含む。このような植物から生産されたトランスジェニック植物、細胞、部分、子孫植物及び種子は、本発明の組換えＤＮＡ分子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。本発明の植物部分には、葉、茎、根、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の植物部分は、生存可能、生存不可、再生可能、または再生不可能であり得る。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞を含むものであり、また提供するものである。本発明の形質転換またはトランスジェニック植物細胞は、再生可能及び再生不可能な植物細胞を含む。
【００６２】
本発明には、組換えＤＮＡ分子が、本発明のトランスジェニック植物、種子または植物部分から生産されたコモディティ製品中に存在するとの実施形態が含まれる；このようなコモディティ製品には、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む、植物の収穫部分、粉砕されたまたは全体の穀物または植物の種子、または任意の食品または非食品が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明は、（ａ）ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結された除草剤耐性を付与する異種転写可能ポリヌクレオチド分子を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を成長させること、及び（ｂ）前記トランスジェニック植物を、有効量の除草剤をトランスジェニック植物に散布して、雄性不稔性を誘発すること、を含むトランスジェニック植物において雄性不稔性を誘発する方法を提供する。有効量の除草剤とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を雄性不稔性にするのに十分な量である。一実施形態では、グリホサートの有効量は、１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカー当たり約８ポンド酸当量である。除草剤の散布は、トウモロコシ植物発育のＶ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１３及びＶ１４段階からなる群から選択される段階のような雄性生殖組織の発育の前または間に適用されてもよく、少なくとも花粉の発育、花粉の放出または葯の押出を防止することができる。
【００６４】
一実施形態では、花粉の発育、花粉の放出、または葯の押出の防止は、雄性不稔性からもたらすことができ、従って、花粉発育、花粉放出または葯の押出の無いことが、雄性不稔性の指標であり得る。しかしながら、場合によっては、雄性不稔植物は依然として少量の花粉を発育する可能性がある。従って、特定の実施形態において、少量の花粉の存在が、必ずしも雄性稔性植物を示す、または雄性不稔の欠如を示すとはいえない。
【００６５】
植物発育は、しばしば、植物発育に基づく段階のスケールによって決定される。トウモロコシについては、当該技術分野で使用されている一般的な植物発育スケールは、Ｖ段階として知られている。Ｖ段階は、葉のカラー（ｃｏｌｌａｒ）が見える最上の葉に従って定義される。ＶＥは発芽に対応し、Ｖ１は第１の葉に対応し、Ｖ２は第２の葉に対応し、Ｖ３は第３の葉に対応し、Ｖ（ｎ）はｎ番目の葉に対応する。ＶＴは、房の最後の枝が見えるが、トウモロコシの毛（絹糸）が現れる前の時である。トウモロコシの畑を段階分けする場合、各特定のＶ段階は、畑の植物の５０％以上が、その段階内にあるかその段階を超えている場合にのみ定義される。他の生育スケールは当業者に公知であり、本発明の方法と共に使用することができる。
【００６６】
トウモロコシの成長と発育の段階を予測し推定するためのもう一つの一般的なツールは、Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｄｅｇｒｅｅ  Ｕｎｉｔｓ（ＧＤＵ）である。トウモロコシの成長と発育の要因は熱である。熱は、典型的には単一の時点で測定され、温度として表されるが、ある期間にわたって測定され、加熱単位として表され得る。これらの加熱単位は、一般にＧＤＵと呼ばれる。ＧＤＵは、日々の気温の平均と特定の制限を受けた選択された基準温度との差として定義することができる。ＧＤＵは、下記式：成長度単位＝｛（Ｈ＋Ｌ）／２｝−Ｂ（但し、Ｈは日々の最高気温（８６゜Ｆを超えない）であり、Ｌは日々の最低気温（５０°Ｆ未満）であり、Ｂは５０°Ｆのベースである）を用いて計算される。温度が８６°Ｆより上または５０°Ｆよりも低い場合、トウモロコシの成長はわずかであるため、公式で使用される日々の最高気温及び最低気温に制限が設定される。日々のより低い気温のカットオフは、負の値の計算を防止している。従って、仮に日々の最高気温が８６°Ｆを超える場合、ＧＤＵの式で使用される日々の最高気温は８６°Ｆに設定される。逆に、日々の最低気温が５０°Ｆより下がると、ＧＤＵの式で使用される日々の最低気温は５０°Ｆに設定される。日々の最高気温が５０°Ｆを超えない場合、その日にＧＤＵは記録されない。１日にトウモロコシ植物が蓄積できる最大ＧＤＵは３６であり、最小値は０である。トウモロコシ植物の成熟度は、特定の期間にわたる日々のＧＤＵ値の合計によって特定される。大部分のトウモロコシ種子生産者が使用する期間は、植え付け時点から、生理的成熟期まで、または穀粒の登熟が事実上完了した時点までである。例えば、ほとんどの米国の州では、蓄積されたＧＤＵはほとんどの地理的領域で保持されており、ＵＳＤＡ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ＳｅｒｖｉｃｅまたはＳｔａｔｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手できる。さらに、特定の場所でＧＤＵ情報を取得するための手段は、米国特許第６，９６７，６５６号にも記載されており、その全体が本明細書に参考として援用される。
【００６７】
雄性不稔性を誘発する除草剤散布のタイミングを決定するための房発育を予測する別の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６１８，３５８号に記載されている。
【００６８】
本発明で使用される除草剤としては、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、グルタミン合成酵素（ＧＳ）阻害剤、及び合成オーキシンに対して活性なものを含む任意の除草剤が挙げられる。除草剤は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｕｌｒｉｃｈ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊｅｓｃｈｋｅ，Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｗｉｔｓｃｈｅｌ，ＩＳＢＮ：９７８３５２７３２９６５６，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧａＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ（２０１２）に記載されている。一実施形態では、除草剤はグリホサートである。
【００６９】
ハイブリッド種子は、（ａ）ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結された除草剤耐性を付与する異種転写可能ポリヌクレオチド分子を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物に除草剤を散布して、且つ除草剤の散布をトランスジェニック植物の雄性生殖組織の発育中に行い、これによりトランスジェニック植物に雄性不稔性を誘発すること；（ｂ）トランスジェニック植物を第２の植物からの花粉で受精させること；及び（ｃ）トランスジェニック植物からハイブリッド種子を採取すること、を含む方法を用いて生産することができる。一実施形態では、トランスジェニック植物はトウモロコシである。一実施形態では、除草剤はグリホサートであり、異種転写可能ポリヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質はグリホサート耐性ＥＰＳＰＳである。一実施形態では、グリホサートは、１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカー当たり約８ポンド酸当量の有効量で、発育中に散布される。別の実施形態では、受粉の工程は、例えば自然受粉、例えば風媒受粉、によって達成され得るか、または機械的または手動による受粉を含み得る。
【００７０】
ハイブリッド種子は、第２の植物由来の花粉で受精された雄性不稔性トランスジェニック植物から採取することができ、この雄性不稔性トランスジェニック植物は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結された除草剤耐性を付与する異種転写可能ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含み、そしてこのトランスジェニック植物は、雄性生殖組織の発育中に有効量の除草剤を散布することによって雄性不稔性であるように誘発されている。１つの例において、除草剤はグリホサートであり、それは１エーカーあたり約０．１２５ポンド酸当量〜１エーカーあたり約８ポンド酸当量の有効量で発育中に散布され、少なくとも花粉発育、花粉放出または葯押出を防止する。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、当該技術分野で提供されるものよりもハイブリッド種子生産が改善していることを記載している。このような改善には、初期段階の花粉発育停止をもたらし、その結果、広範な生殖質全体にわたって生存可能な花粉粒子が存在しないようにするための、組換えＤＮＡ分子及びトランスジェニック植物で使用される新規なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント、及び関連する使用方法が含まれている。以下の実施例は、本発明の実施形態を実証するために提供される。
【００７２】
実施例１：ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的の同定
小分子ＲＮＡは、トウモロコシ房の４つの別個の成長段階及びトウモロコシ穂の３つの別々の成長段階から単離された。表１参照。房リッチの小分子ＲＮＡは、非常に早期の房発育段階（Ｖ７、Ｖ８／Ｖ９、Ｖ１０／Ｖ１１、及びＶ１２）で単離された（図１参照）。これは、房リッチの小分子ＲＮＡ配列を得るために従来技術で使用されていたものよりも若い雄性組織から小分子ＲＮＡを産生した。
【００７３】
単離された小分子ＲＮＡを用いて小分子ＲＮＡライブラリーを調製し、ライブラリーに対して高処理小分子ＲＮＡ配列解読  （ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。バイオインフォマティクス分析を用いて、これらの房及び穂ライブラリーの配列を、様々な成長段階で収集した葉、苗全体、様々な成長段階で収集した根、胚乳及び穀粒を含む他のトウモロコシ組織から調製した小分子ＲＮＡライブラリーの配列と比較した。この差次的なバイオインフォマティクス解析により、数千の房リッチ小分子ＲＮＡ配列が、２５万あたり１０から６６５の転写物（ｔｐｑ）の範囲の正規化された発現を有することが同定された。同定された房リッチ小分子ＲＮＡ配列は、その長さ（１８〜２６ヌクレオチド）及びｄｓＲＮＡ前駆体由来の予想される起点のためにｓｉＲＮＡである可能性が高い。これらの房リッチ小分子ＲＮＡ配列は、雄性組織特異性のために、本明細書では雄性組織特異的ｓｉＲＮＡ（ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
【表１】
2018521658.tif 000002
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列が房で特異的に発現したことを同定及び確認した。リッチ小分子ＲＮＡを含む全ＲＮＡを表１に示す組織から抽出し、３’末端にｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列に相補的な８ｎｔと、５’末端に３５ｎｔの普遍的配列とからなる逆転写プライマーを用いてｃＤＮＡを合成するために使用した。ｃＤＮＡ合成後、フォワードプライマーの一方の配列（１４〜１８ｎｔ）がｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の５’末端と同一であり、リバースプライマーがユニバーサルプライマーである、リアルタイムＰＣＲを行った。内部標準として、１８Ｓ  ＲＮＡを増幅し、これを用いてｍｔｓ−ｓｉＲＮＡレベルを正規化した。リアルタイムＰＣＲからのデータを使用して、房で濃縮されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の数を絞り込んだ。
【００７５】
差次的なバイオインフォマティクス分析から同定された数千のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列から選択された１，２００個の配列を有するＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（ヒューストン、テキサス州、米国）によって提供されたμＰａｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓチップを用いて、ｓｉＲＮＡプロファイリングマイクロアレイアッセイを行った。マイクロアレイチップは、１，２００個のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の各々に対して相補的な配列の３つのプローブを含んでいた。ＬＨ２４４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１７３）または０１ＤＫＤ２（Ｉ２９４２１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５９）近交系植物のいずれかからの２６のトウモロコシ組織プール（２重または３重の組織プール）から、全ＲＮＡを精製した。表２を参照。２６個のＲＮＡサンプルのそれぞれを、１，２００のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ用のプローブを含むマイクロアレイチップでハイブリダイズした。ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂレーザースキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてハイブリダイゼーション画像を収集し、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ画像分析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてデジタル化した。相対的なシグナル値は、バックグラウンド除去及び正規化によって得た。差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現されたシグナルは、ｐ＜０．０５でｔ検定によって決定した。マイクロアレイ分析から、１，２００由来の約５００ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡが高度に房特異的であると同定された。
【表２】
2018521658.tif 000003
【００７６】
トウモロコシｃＤＮＡ配列のユニジーンコレクションに対して高度な房特異的であると同定された５００ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列を比較するために、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）またはＳＨｏｒｔ  Ｒｅａｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＳＨＲｉＭＰ）（Ｒｕｍｂｌｅ，２００９）のような配列アライメントツールを用いて、バイオインフォマティクス分析を行った。このＢＬＡＳＴ分析は、多くのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列が整列しているトウモロコシｃＤＮＡ配列が、完全またはほぼ完全に一致する多数のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のクラスター化された重複アライメントを有する同定可能なＤＮＡ配列領域をもたらすことを明らかにした。６つのｃＤＮＡ配列は、この分析から、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列に富むこのような１つ以上の領域を含むものであると同定された。これらの６つのｃＤＮＡ配列は、本明細書において配列番号：１７；配列番号：１８；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；及び配列番号：２２として提供される。一例として、図２は、配列番号：１７として提供されるｃＤＮＡ上の多数のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のアラインメントのグラフ表示を示す。複数の短い線は、ｃＤＮＡに整列するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列の相対位置（したがって、転写されたｍＲＮＡ分子におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡの結合部位の位置）を表す。Ｙ軸は、マイクロアレイ分析で検出された雄性組織におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡの正規化された発現レベルを表す。枠内は、配列番号：１及び配列番号：２のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列に対応するｃＤＮＡ配列番号：１７の領域を表す。
【００７７】
６つのｃＤＮＡ配列の１つに整列する選択されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列を、さらなるマイクロアレイ分析に用いて、トウモロコシ組織全体の差次的発現を決定した。トウモロコシの生殖質ＬＨ２４４及び０１ＤＫＤ２について、Ｖ８−Ｖ９房、Ｖ１０−Ｖ１２房の正規化シグナル値、または他の組織からの合計シグナルのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のマイクロアレイ分析を表３〜１０に示す。各表は、配列番号：１７；配列番号：１８；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；及び配列番号：２２として本明細書で提供された６つのｃＤＮＡ配列の１つに整列すると同定されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のサブセットを示す。シグナル値の結果は相対シグナル値として測定され、標準誤差（ｐ＜０．０５）は（ＳＴＤＲ）で表される。マイクロアレイの結果は、代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列が、房（Ｖ８−Ｖ９及びＶ１０−Ｖ１２）において高いシグナルを与え、そして他の組織における低いシグナルを与えていることを示しており、これらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡの内在性発現が房において高度に富化されていることを表す。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列中の対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対応する。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列のアラインメント部分と単一ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドのミスマッチを有し得、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に整列し得る。本明細書で提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列は、異なるトウモロコシの生殖質全体にわたって見出される。
【００７８】
表３は、配列番号：１及び配列番号：２によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：１７として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列に整列する代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：２３〜３１として本明細書で提供される）についての相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４及び０１ＤＫＤ２の両方について、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。表３に示されるマイクロアレイの結果は、配列番号：１７として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用され得ることを示す。
【表３】
2018521658.tif 000004
【００７９】
表４は、配列番号：３で表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：１８として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する、代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：３２〜３８として本明細書で提供される）についての相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４については、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。生殖質０１ＤＫＤ２の場合、Ｖ８−Ｖ９房または他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりもＶ１０−Ｖ１２房のこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルの方が高い。
【表４】
2018521658.tif 000005
【００８０】
表５は、配列番号：４によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：１８として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する、代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：３９〜４２として本明細書で提供される）についての相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４については、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。生殖質０１ＤＫＤ２については、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、Ｖ８−Ｖ９房または他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりもＶ１０−Ｖ１２房の方が高い。表４及び表５に示されるマイクロアレイの結果は、配列番号：１８として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用され得ることを示す。
【表５】
2018521658.tif 000006
【００８１】
表６は、配列番号：５によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：１９として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する、代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４３〜４６として本明細書で提供される）についての相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４については、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。生殖質０１ＤＫＤ２の場合、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４３〜４４）のシグナルは、Ｖ８−Ｖ９房または他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりもＶ１０−Ｖ１２房においての方が高く；及びｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４５〜４６）のシグナルは、他の組織サンプルと比較して、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房の両方におけるこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルが高い。
【表６】
2018521658.tif 000007
【００８２】
表７は、配列番号：６によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：１９として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４７〜５２として本明細書で提供される）に関する相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４については、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。生殖質０１ＤＫＤ２の場合、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、Ｖ８−Ｖ９房または他の組織サンプル中のこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも、Ｖ１０−Ｖ１２房における方が高い；ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４７及び配列番号：４８）のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルと比較して、Ｖ８−Ｖ９房においてやや高い；ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：５２）のシグナルは、他の組織サンプルのこのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルと比較して、Ｖ８−Ｖ９房において有意に高い；そしてｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：４９、配列番号：５０及び配列番号：５１）のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルと有意には異ならない。表６及び表７に示されるマイクロアレイの結果は、配列番号：１９として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用され得ることを示す。
【表７】
2018521658.tif 000008
【００８３】
表８は、配列番号：７で表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：２０として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：５３〜６０として本明細書で提供される）についての相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４及び０１ＤＫＤ２の両方について、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。表８に示すマイクロアレイの結果は、配列番号：２０として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用できることを示している。
【表８】
2018521658.tif 000009
【００８４】
表９は、配列番号：８によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：２１として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：６１〜６９として本明細書で提供される）に関する相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４及び０１ＤＫＤ２の両方について、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い。表９に示すマイクロアレイの結果は、配列番号：２１として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用できることを示す。
【表９】
2018521658.tif 000010
【００８５】
表１０は、配列番号：９によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列を含む配列番号：２２として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列に整列する代表的なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：７０〜８７として本明細書で提供される）に関する相対的なマイクロアレイシグナル結果を示す。生殖質ＬＨ２４４については、Ｖ８−Ｖ９房及びＶ１０−Ｖ１２房におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：７０、７１、７３、７５〜８１、８３〜８７）のシグナルは、他の組織サンプルのこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高い；そして他の組織におけるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：７２、７４、８２）のシグナルは、Ｖ８−Ｖ９房またはＶ１０−Ｖ１２房のいずれかにおけるこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりも高かった。生殖質０１ＤＫＤ２の場合、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列（配列番号：７０〜８７）のシグナルは、Ｖ８−Ｖ９房または他の組織サンプル中のこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列のシグナルよりもＶ１０−Ｖ１２房において高い。表１０に示されるマイクロアレイの結果は、配列番号：２２として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ分子のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計するための供給源として使用され得ることを示す。
【表１０】
2018521658.tif 000011
【００８６】
これらの分析により、６つのｃＤＮＡ配列（配列番号：１７〜２２）はｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列が豊富であり、対応するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡが高い房特異性を示すことが確認された。従って、これらのｃＤＮＡ配列は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ媒介導入遺伝子サイレンシングを与えることができるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を作製するための分子生物学の方法に有用な配列を含んでいる。
【００８７】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含有する対応するゲノム配列の分析は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの存在及び任意の配列変異を確認するために交配雑種で雌として典型的に使用される３２種の異なるトウモロコシ生殖質（相対成熟度（ＲＭ）は８０〜１２０日間）について実施した。配列番号：１及び配列番号：２として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントについて、３組の熱増幅プライマー対を、本明細書で配列番号：１７として提供されるｃＤＮＡ配列内で対応する配列を増幅するように設計した。これらのプライマーを用いて、各生殖質の組織から抽出したゲノムＤＮＡ中にＰＣＲ単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生じさせた。単位複製配列は、試験したすべての生殖質から産生された。３２の生殖質にわたる単位複製配列の配列は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列と１００％同一であったか、または最小数の一塩基多型を含んでいた（９５％まで同一）。これらのデータは、配列番号：１または配列番号：２として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結された組換えタンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物で作製されたトランスジェニック植物が、大部分のトウモロコシの生殖質にわたって組換えタンパク質の発現の雄性組織特異的調節を有するであろうことを示している。導入遺伝子が、グリホサート耐性を付与する組換えタンパク質をコードする場合、ほとんどのトウモロコシの生殖質のいたるところの房が、グリホサート誘発性の雄性不稔を有するであろう。
【００８８】
実施例２：組換えＤＮＡ構築物及び植物形質転換ベクター
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列が豊富であると同定された６つのｃＤＮＡ配列の領域に対応するＤＮＡ配列を用いて、組換えＤＮＡ構築物及び植物形質転換ベクターを作製した。組換えＤＮＡ構築物及び植物形質転換ベクターは、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子の房特異的サイレンシングがｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングを介して生じる、トランスジェニック植物の生産に有用であるように設計された。
【００８９】
６つのｃＤＮＡ配列の分析の結果を用いて、９つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを設計した。各ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、異なるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡが結合し得る多数の重複するｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列を含むＤＮＡ配列を有するように設計された。本明細書において配列番号：１として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：１７として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１４２９〜１６２８に対して９５％の配列同一性を有する。本明細書で配列番号：２として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：１に対して単一のｎｔ変化（Ｔ６９Ａ）を有する。本明細書において配列番号：３として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：１８として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２３９〜４３３に対応する。配列番号：４として本明細書で提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、本明細書において配列番号：１８として提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置４７７〜６９７に対応する。配列番号：５として本明細書で提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：１９として本明細書に提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２３９〜４３３に対応する。本明細書において配列番号：６として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：１９として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置３７０〜４７７に対応する。配列番号：７として本明細書で提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、本明細書において配列番号：２０として提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１３５７〜１５６２に対応する。配列番号：８として本明細書で提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列は、配列番号：２１として本明細書で提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２４７〜４４１に対応する。配列番号：９によって表されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列の逆相補体は、本明細書において配列番号：２２として提供されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置１９１〜４９０と９９％の配列同一性を有するが、配列番号：９の逆相補体の配列に対して配列番号：２２の３つのｎｔミスマッチ（ｃ３１４Ａ、Ａ３５０Ｇ、及びＧ４０８Ａ）を有する。さらなるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、異なるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントのＤＮＡ配列、または２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的リッチｃＤＮＡ領域の断片を、組み合わせることによって、例えば、本明細書において配列番号：１〜９として提供される２つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント及び／または本明細書中で配列番号：２３〜９２として提供される１つ以上のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ配列の、全てまたは断片を組み合わせることによって、作製することができる。２１〜１７０ヌクレオチド長の範囲のこれらのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの異なる断片を組み合わせ、そして当該技術分野で知られているＤＮＡ合成の方法を用いて新規のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを生産し、そして、配列番号：１０〜１６として提供される。
【００９０】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントは、このｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントをｃｐ４−ｅｐｓｐｓ遺伝子（配列番号：９３）のオープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に連結し、グリホサート耐性のためのＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質、及び作動可能に連結された３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）の５’をコードすることにより、組換えＤＮＡ構築物にサブクローニングされた。組換えＤＮＡ構築物はまた、３つの異なるプロモーター／イントロン／エンハンサーの組み合わせの１つと葉緑体輸送ペプチド配列との作動可能に連結された組合せを含んでいた。発現カセット構成はｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的効果を試験するための形質転換ベクターを含んでいた。
【００９１】
実施例３：植物形質転換及び効力試験
組換えＤＮＡ構築物を含有する形質転換ベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに基づく形質転換方法及びトウモロコシ未成熟胚及び当該技術分野で公知の技術とともに使用した。Ｒ０植物の葉の試料を収集し、分子分析を、組換えＤＮＡ構築物の単一コピー（１つの挿入物）または２重コピー（２つの独立した挿入物）を含み、ベクター骨格の存在しないトランスジェニック植物を選択するために行った。単一コピー事象はグリホサートを噴霧されず、自家受粉してＲ１種子収集に向けられ、一方２重コピーはＲ０グリホサート噴霧に使用して、栄養耐性を評価し、雄性不稔性を誘発した。グリホサートを噴霧されなかったトランスジェニック植物は、アレクサンドル染色及び顕微鏡観察によって決定される正常開花、正常花粉放出及び正常花粉発育を有していた。
【００９２】
単一コピーホモ接合性事象を見積もるために、二重コピーＲ０事象を試験に用いた。組換えＤＮＡ構築物中のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの存在が、栄養グリホサート耐性及びグリホサート誘発房不稔性を与えるかどうかを決定するために、植物に、２つの異なる成長段階でグリホサートを噴霧した。Ｖ５段階に１×グリホサート（０．７５ポンドａｅ／エーカー（ｌｂ  ａｅ／ａｃｒｅ））で散布、続いてＶ８段階に１×グリホサート（０．７５ポンドａｅ／エーカー）で、温室において植物に噴霧した。Ｖ５段階のグリホサート散布の７日後、植物の栄養障害について採点し、栄養性グリホサート耐性（栄養耐性％）を示すと考えられる≦１０％傷害の点数を示した。雄性不稔性は２通りの方法で測定した。栄養性グリホサート耐性を示した植物を、Ｖ８段階でグリホサート散布後、Ｓ９０＋１２段階まで葯押出し無しとして測定される完全グリホサート誘発雄性不稔性について採点した（％完全に雄性不稔性）。その後、葯を収集し、顕微鏡で花粉の発育を観察するために解剖した。各事象の葯は、顕微鏡観察下でアレクサンドル染色によって検出される産生した生存花粉粒の無いことについて試験され、生存可能な花粉を産生しない（％花粉無し）と評価された。グリホサートを散布していない植物では、房発育、葯押出し、及び花粉の発育は正常であった。
【００９３】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを、多数の形質転換ベクター構成で試験した。各形質転換ベクターは、多数のＲ０植物を産生するために使用され、その各Ｒ０植物は、同じ形質転換ベクターを使用して作製された独特なトランスジェニック事象を表している。３つの異なる形質転換ベクター構成のデータを表１１及び表１２に示す。
【００９４】
１２のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを第１のベクター構成（Ａ）で試験し、その結果を表１１に示した。驚くべきことに、栄養性グリホサート耐性を示す植物のパーセンテージは、８０〜１００％の範囲であったが、完全なグリホサート誘発性雄性不稔性を示すパーセンテージ（％）（誘発された雄性不稔は、生存不能花粉及び花粉生産なしの両方を含む）は、０〜１００％の範囲であった。表１１を参照。例えば、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５によってコードされるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む形質転換ベクターを用いて生産された植物は、栄養性グリホサート耐性を示す高い数字を有したが（試験した植物の９０〜１００％の範囲）、トランスジェニック事象のいずれも完全なグリホサート誘発性の雄性不稔性を示さなかった；配列番号：５または配列番号：９によりコードされるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む形質転換ベクターを用いて生産された植物は、栄養性グリホサート耐性を示す高い数値（試験した植物の９０〜１００％の範囲）及びグリホサート誘発性の雄性不稔性を示す中程度の数値（試験した植物の５０〜４０％の範囲）を有した；及び配列番号：２、配列番号：７、または配列番号：８によってコードされるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む形質転換ベクターを用いて生産された植物は、栄養性グリホサート耐性を示す高い数字（試験した植物の８８〜１００％の範囲）及びグリホサート誘発性の雄性不稔性を示す高い数字（試験した植物の８２〜１００％の範囲）を有した。花粉の発生はアレキサンダー染色によって評価した。配列番号：２として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを含む形質転換ベクターを用いて作製された４つの事象を含み、そしてグリホサートを噴霧して雄性不稔性を誘発した植物は、発育不全の花粉粒子がほとんどないか、または花粉粒子が検出されなかった。グリホサートの散布を受けなかった植物は正常な花粉を有していた。図４を参照。
【表１１】
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【００９５】
４つの他のｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを第２及び第３のベクター構成（それぞれＢ及びＣ）で試験し、その結果を表１２に示した。栄養性グリホサート耐性を示す植物のパーセンテージ及び完全なグリホサート誘発性雄性不稔性のパーセンテージの両方における差異は、２つのベクター構成の間で観察された。ベクター構成Ｂは、試験した全てのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントについて、栄養性グリホサート耐性を示す植物の割合を増加させた。完全なグリホサート誘発雄性不稔性を示すパーセンテージについて、試験したｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの２つ（配列番号：１０及び配列番号：１１）は、ベクター構成Ｃにおいてより良好に実施され、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの１つ（配列番号：１２）は、ベクター構成Ｂにおいてより良好に実施され、そしてｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの１つ（配列番号：１）は、両方の構成Ｂ及びＣにおいて１００％完全グリホサート誘発性雄不稔を提供した。
【表１２】
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【００９６】
栄養性グリホサート耐性を示す植物のうち、生存花粉を含まないグリホサート誘発性雄性不稔植物のパーセンテージは、０〜１００％の範囲であった。栄養性グリホサート耐性及び完全なグリホサート誘発性雄性不稔性を示す、試験された植物の６０％を超える形質転換ベクターを用いて生産された植物について、生存花粉のない植物のパーセンテージは０〜１００％の範囲であった。２つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント（ベクター構成Ｂの配列番号：１及びベクター構成Ａの配列番号：２）は、それぞれ１００％及び８２％が生存花粉無しであった。これらの２つのｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント（配列番号：１及び配列番号：２）は１つのヌクレオチドだけ異なり、同じｃＤＮＡ配列（配列番号：１７）に由来する。
【００９７】
実施例４：房におけるＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質の免疫局在化
トランスジェニック植物の房のＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質の免疫局在化を用いて、細胞及び組織レベルでのタンパク質発現を分析して、作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの存在による花粉中のＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質発現の喪失を確認した。配列番号：１に作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子または作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを有さないｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含むＲ３世代のトランスジェニック植物も、温室内で生育させた。Ｖ２段階で１×グリホセート（０．７５ポンドａｅ／エーカー）を植物に噴霧し、栄養耐性を確認した。１ｃｍ〜１７ｃｍの房を、葯組織が小胞子母細胞に存在し、自由小胞期であるＶ８〜Ｖ１２段階で収穫した。葯を、解剖用鉗子を用いて房小穂から取り出し、穏やかな真空下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３．７％ホルムアルデヒドの中で直ちに固定した。ＰＢＳで洗浄した後、組織を包埋培地に入れ、直ちに凍結させた。凍結した組織ブロックを−８０℃で保存したのち、−２０℃のミクロトームで切片化し、帯電したスライド上に集めた。
【００９８】
組織切片をブロッキング剤（ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清、５％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で２時間ブロックした。切片を抗ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ抗体（ＰＢＳ中１／５００）と共にインキュベートした。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、組織切片を、二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。陰性対照は、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ抗体インキュベーションを省略することによって調製した。一次及び二次抗体の両方を室温で２〜４時間インキュベートし、さらに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、組織を、励起用に４８８ｎｍレーザーと発光フィルターセット用に５００〜５５０ｎｍ（緑色チャンネル）を使用して、Ｚｅｉｓｓレーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ）５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡で画像化した。同じ画像化パラメータを、対照を含む試料全体にわたって適用した。各セクションから、蛍光及び明視野画像を走査し、その後ＬＳＭソフトウェアを用いて統合し、構造情報を示した。陰性対照のデータは、予想されたシグナルの欠如を示した。配列番号：１に作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物のデータは、葯の壁、タペータム及び花粉の発生中の葯の花粉小胞子における低いＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質発現を示す低い蛍光シグナルを示した。対照トランスジェニック植物（作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントを有さないｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含むもの）のデータは、葯壁、タペータム及び花粉の発生中の葯の花粉小胞子において高いＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質発現を示す高い蛍光シグナルを示した。
【００９９】
配列番号：１として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含有する植物における花粉中のＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質発現の喪失は、これらの植物における観察された完全なグリホサート誘発雄性不稔性と相関する。このデータにより、観察された完全なグリホサート誘発性の雄性不稔性が、配列番号：１として提供される作動可能に連結されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントの存在に起因する花粉中のＣＰ４−ＥＰＳＰＳタンパク質発現の喪失の結果であることを確認した。
【０１００】
実施例５  フィールド試験
ハイブリッド生産における最適な使用のためには、栄養性除草剤耐性（低作物害により測定される）と組み合わされて、除草剤の散布後のフィールド条件下における非常に低い葯押出しを有することが望ましい。ハイブリッドトウモロコシの生産の他の側面、例えば、植物の高さ及び収量も望ましい。これを評価するために、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を、フィールド条件下で高度な世代で試験し、多数のパラメータを測定した。
【０１０１】
配列番号：１として提供されたｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含むＲ３世代植物のフィールド試験を多数の場所で行い、栄養グリホサート耐性及び房特異的グリホサート感受性を評価した。フィールド試験では、異なるゲノム位置に同じトランスジェニックインサートを含むＲ３世代の植物を試験した。試験した植物は、配列番号：１として提供されるｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含む同じ植物形質転換ベクターを使用して作製された４つの固有のトランスジェニック事象の内の１つの単一コピーを含有していた。完全乱塊法を用いて試験を行った。フィールド試験のシーズンの間に、多数の形質の効力及び農業的パラメータが得られ、シーズン終了時に収量が決定された。形質効率フィールド試験は、Ｖ７で０．７５ポンドａｅ／エーカーのグリホサート除草剤を、次いでＶ９で０．７５ポンドａｅ／エーカーを施用し、ＶＴ段階で作物傷害率（ＣＩＰＶＴ）、Ｓ９０＋８段階での平均葯押し出し率（ＡＥＳ９Ｅ）、及びシーズンの最後での収量（１エーカーあたりのブッシェル（ｂｕ／ａｃｒｅ）として測定された）を評価することにより行われた。フィールド試験には、グリホサート耐性トランスジェニック事象ＮＫ６０３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２４７８０）が、グリホサート誘発雄性不稔性の陰性対照として、及びグリホサートに対する栄養耐性の陽性対照として含まれていた。ＮＫ６０３事象を含む植物は、商業レベルの栄養グリホサート耐性を示し、完全なグリホサート耐性房を産生する。すべてのデータはｐ＜０．０５で分離した分散及び平均（ＬＳＤ）の分析を受けた。
【表１３】
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【０１０２】
ＮＫ６０３事象を含む対照植物についてのＶＴ段階での平均作物傷害は１．２５であった。事象１、事象２、事象３及び事象４を含む植物の平均作物傷害は、それぞれ１．２５、３．７５、０及び０であった。０．０５での作物傷害最小有意差（ＬＳＤ）は、試験した全ての事象について１０．２５であった。これらの結果は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列番号：１を含む４つのトランスジェニック事象を含む植物は、０．７５ポンドａｅ／エーカーのグリホサートをＶ７、続いてＶ９で散布すると、ＮＫ６０３事象を含む対照植物と同様に、ゼロから極めて低い作物傷害を有するものであることを示した。
【０１０３】
ＮＫ６０３事象を含む対照植物についてのＳ９０＋８段階での平均葯押出しは９５であった。事象１、事象２、事象３及び事象４を含む植物についてのＳ９０＋８での平均葯押出しは、それぞれ０、３．２５、４、及び１．７５であった。試験した全ての事象について、０．０５でのＳ９０＋８ＬＳＤにおける平均葯押出しは４２．７１であった。これらの結果は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列配列番号：１を含む４つのトランスジェニック事象を含む植物は、ＮＫ６０３事象を含む対照植物と比較して、Ｖ７、続くＶ９でのグリホサート０．７５ポンドａｅ／エーカーの散布でゼロから極めて低い葯押出しを有し、これらはグリホサート散布後に完全雄性稔性であることを示した。
【０１０４】
シーズンの終わりに、これらのフィールド試験からトウモロコシを収穫し、収量を決定した。ＮＫ６０３事象を含む対照植物の平均収量は９６．７４ブッシェル／エーカー（ｂｕ／ａｃｒｅ）であった。事象１、事象２、事象３及び事象４を含む植物の平均収量は、それぞれ１０２．１７ブッシェル／エーカー、９６．４８ブッシェル／エーカー、９７．５９ブッシェル／エーカー、及び９５．８ブッシェル／エーカーであった。試験した全ての事象について、０．０５の収量ＬＳＤは２６．２５ブッシェル／エーカーであった。表１４を参照。これらの結果は、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列配列番号：１を含む４つのトランスジェニック事象を含む植物が、ＮＫ６０３と同等の収量を有することを示している。
【表１４】
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【０１０５】
様々なｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子を含むＲ２世代以上の近交系植物のフィールド試験を、栄養グリホサート耐性及び房特異的グリホサート感受性を評価するために多数の場所で実施した。フィールド試験では、ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列番号：１、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８（各々が形質転換ベクター構成Ａである）に作動可能に連結されたｃｐ４−ｅｐｓｐｓ導入遺伝子の単一コピーを含むＲ２世代以上の近交系植物を試験した。グループブロック設計を用いて試験を行い、グループ化因子は、形質転換ベクター、または特定の形質転換ベクターの事象番号が低い場合の形質転換ベクターのグループのいずれかであった。フィールド試験シーズンの間、多数の形質の効力及び農業的パラメータが得られ、シーズン終了時に収量が決定された。形質効率フィールド試験は、Ｖ２トウモロコシに１．５ポンドａｅ／エーカーのグリホサートが散布され、続いてＶ８トウモロコシ（８７５成長度日）に０．７５ポンドａｅ／エーカーのグリホサートが散布され、続いてＶ１０トウモロコシ（１０２５の成長度日）に０．７５ポンドａｅ／エーカーのグリホサートが散布されることにより実施された。ＶＴ段階（ＣＩＰＶＴ）での作物傷害率、Ｓ９０＋８段階での平均葯押出率（ＡＥＳ９０＋８）、平均植物高さ（インチで）及び収量（シーズンの終わりにブッシェル／エーカーで測定）、の評価。フィールド試験には、グリホサート耐性トランスジェニック事象ＮＫ６０３が、グリホサート誘発性雄性不稔性の陰性対照として、及びグリホサートに対する栄養耐性の陽性対照として含まれていた。３つのバックグラウンドのハイブリッド生殖質からなる雄性花粉媒介体のグリホサート耐性ミックスを３区画（ｏｐｌｏｔ）ごとに配置し、試験全体を囲んで試験項目の花粉源として機能させた。除草剤処理は、除草剤キャリヤーとして水を用い、エアー誘発Ｔｅｅｊｅｔ（登録商標）ＴＴＩノズル（ＴｅｅＪｅｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用した、エーカー当たり１５ガロン（ＧＰＡ）を送達するように較正された、ＣＯ２バックパックまたはトラクターに取り付けられた噴霧器を用いて行った。すべてのデータをｐ＜０．０５で分離した分散及び平均分析（ＬＳＤ）に付した。結果を表１５に示す。
【０１０６】
ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列番号：１、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８を含む試験された植物について、対照ＮＫ６０３と比較してＶＴ（ＣＩＰＶＴ）または平均植物高さにおける作物傷害パーセントに有意差は見られなかった。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含む植物はまた、対照ＮＫ６０３と比較して、種子収量において有意な減少を有していなかった。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的配列配列番号：１または配列番号：７を含む植物は、葯押出しが非常に低いか、または全くなく、それぞれ、０〜２．７５％及び０〜１．５％のＡＥＳ９０＋８値であった。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメント配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：８を含む植物は、対照植物と比較して葯の押出しを有意に減少させ、ＡＥＳ９０＋８値は１０％〜２５％であった。
【表１５】
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【０１０７】
実施例６  ．ハイブリッド種子の生産
本発明のトランスジェニック植物及び種子は、ハイブリッド種子生産を含む育種目的で使用することができる。ｍｔｓ−ｓｉＲＮＡ標的エレメントに作動可能に連結されたグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックトウモロコシ植物は、田畑などの領域に植え付けられる。他の親トウモロコシ植物（複数可）は、同じ区域に存在しても存在しなくてもよい。種子生産中の雑草防除のために、グリホサートは、Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）農産物ラベルに指示された栄養段階でトランスジェニックトウモロコシ植物に散布され得る。
【０１０８】
ハイブリッド種子生産は、Ｖ７からＶ１３の範囲のトウモロコシ栄養成長段階で、房生育の直前または間に、トランスジェニックトウモロコシ植物（雌）にグリホサートを散布することによって行うことができる。グリホサートの散布は、トランスジェニックトウモロコシ植物における組織選択的グリホサート耐性を介して誘発された雄性不稔性表現型を生成する。誘発された雄性不稔性トランスジェニックトウモロコシ植物は、他の花粉ドナー植物（雄）で受粉し、組織選択的グリホサート耐性のための組換えＤＮＡ構築物を担持する成長可能なハイブリッドトウモロコシ種子を生じる。花粉提供植物は、同じ地域に存在しても存在しなくてもよく、トランスジェニックトウモロコシ植物であってもなくてもよい。受粉は、植物の近接配置または手作業による受粉を含む、当該技術分野で公知の任意の手段によって達成することができる。ハイブリッド種子は、トランスジェニックトウモロコシ植物から収穫される。
【０１０９】
本発明の原理を例示し説明したので、当業者には、そのような原理から逸脱することなく、本発明を構成及び詳細において変更することができることは明らかである。我々は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にあるすべての変更は正しいものと主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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