(57)【要約】樹状細胞集団の投与を含む、被験体に標的化免疫応答を提供する方法が提供される。いくつかの態様において、樹状細胞は、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共に投与され、及び／または疾患組織の近接する組織部位に投与される。治療上の樹状細胞組成物も同様に提供される。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患細胞集団を有する被験体に免疫応答を提供する方法であって、
（ａ）疾患細胞集団に特異的な少なくとも１つの抗原で細胞が初回刺激されている、初回刺激された樹状細胞集団を得ること；及び
（ｂ）初回刺激された樹状細胞集団を被験体に有効量投与することであって、初回刺激された樹状細胞集団が：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１と共に；及び
（ｉｉ）被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に、投与されること、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１と共に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、Ｉ型ＩＮＦと共に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｉ型ＩＮＦがＩＮＦ−αである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記初回刺激された樹状細胞集団がＴＬＲ−７アゴニストと共に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ−７アゴニストが、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、ＧＳ−９６２０、Ｐｏｌｙ（ｄＴ）、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、ロキソリビン、及びｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、ＴＬＲ−９アゴニストと共に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ−９アゴニストがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記初回刺激された樹状細胞集団がＡＩＭｐ１と共に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはＡＩＭｐ１が、初回刺激された樹状細胞集団の前または実質的に同時に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはＡＩＭｐ１が、初回刺激された樹状細胞集団の後に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはＡＩＭｐ１が、初回刺激された樹状細胞集団の約１週間、１日、８時間、４時間、２時間または１時間以内に投与される請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、前記初回刺激された樹状細胞集団及び前記Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはＡＩＭｐ１を有効量で含む組成物を、前記被験体に投与することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、免疫チェックポイント阻害剤を被験体に投与することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１と共に投与され、且つ前記初回刺激された樹状細胞集団が、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に投与される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ組織部位が、前記疾患細胞集団を取り囲む組織を排出するリンパ組織である請求項１７載の方法。
【請求項２０】
前記被験体が、癌、及び自己免疫疾患または感染性疾患を有する請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患細胞集団が腫瘍である請求項２０載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍が、脳腫瘍、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、または慢性リンパ球性白血病である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）抗原で初回刺激された樹状細胞、及び（ｉｉ）Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１を含む免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記抗原で初回刺激された樹状細胞が、癌、自己免疫疾患または感染性疾患に関連する抗原で初回刺激されている請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗原で初回刺激された樹状細胞が、少なくとも１つの腫瘍抗原で初回刺激されている請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍が、脳腫瘍、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、または慢性リンパ球性白血病である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｉ型ＩＮＦを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｉ型ＩＮＦがＩＮＦ−αである請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ＴＬＲ−７アゴニストを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＴＬＲ−７アゴニストが、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、ＧＳ−９６２０、Ｐｏｌｙ（ｄＴ）、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、ロキソリビン、及びｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＴＬＲ−９アゴニストを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＴＬＲ−９アゴニストがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ＡＩＭｐ１を含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
さらに、免疫チェックポイント阻害剤を含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
抗原特異的Ｔ細胞を培養する方法であって、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を、少なくとも第１抗原で初回刺激された抗原提示細胞の集団の存在下で培養する工程を含み、且つ前記培養がＡＩＭｐ１の存在下になされる前記方法。
【請求項３８】
さらに、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボでの増殖のための方法として定義される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記樹状細胞が相同的に抗原を負荷される請求項１９に記載の方法。
【請求項４１】
前記樹状細胞集団が１次樹状細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養が、被験体に対する免疫チェックポイント阻害剤の存在下で行われる請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
疾患細胞集団を有する被験体に免疫応答を提供する方法であって、
（ａ）細胞が疾患細胞集団に特異的な少なくとも１つの抗原で初回刺激されている、初回刺激された樹状細胞集団を得ること；及び
（ｂ）初回刺激された樹状細胞集団を被験体に有効量投与することであって、初回刺激された樹状細胞集団が、
（ｉ）ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共に；及び
（ｉｉ）被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に、投与される前記方法。
【請求項４６】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、ＴＬＲ−３アゴニストと共に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＴＬＲアゴニストが、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））またはＲＧＣ１００である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記初回刺激された樹状細胞集団が、ＲＩＧ−１様受容体リガンドと共に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＩＧ−１様受容体リガンドが、さらに、ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、またはＩＰＳ−１リガンドとして定義される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＩＧ−１様受容体リガンドが、ＭＤＡ５リガンド、ＬＧＰ２リガンド、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群から選択される請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記初回刺激された樹状細胞集団がＣＤＳレセプターリガンドと共に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣＤＳ受容体リガンドが、さらに、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドとして定義される請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドが細菌性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＬＲ−３アゴニスト、ＲＩＧ−１様受容体リガンド、またはＣＤＳ受容体リガンドが、初回刺激された樹状細胞集団の前または実質的に同時に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＬＲ−３アゴニスト、ＲＩＧ−１様受容体リガンド、またはＣＤＳ受容体リガンドが、初回刺激された樹状細胞集団の後に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＬＲ−３アゴニスト、ＲＩＧ−１様受容体リガンド、またはＣＤＳ受容体リガンドが、初回刺激された樹状細胞集団の約１週間、１日、８時間、４時間、２時間または１時間以内に投与される請求項４５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
さらに、免疫チェックポイント阻害剤を被験体に投与することを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記リンパ組織部位が、前記疾患細胞集団を取り囲む組織を排出するリンパ組織である請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体が、癌、及び自己免疫疾患または感染性疾患を有する請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記疾患細胞集団が腫瘍である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記腫瘍が、脳腫瘍、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、または慢性リンパ球性白血病である請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ｉ）抗原で初回刺激された樹状細胞及び（ｉｉ）ＴＬＲ−３アゴニスト、ＲＩＧ−１様受容体リガンド、またはＣＤＳ受容体リガンドを含む免疫原性組成物。
【請求項６５】
前記抗原で初回刺激された樹状細胞が、癌、自己免疫疾患または感染性疾患に関連する抗原で初回刺激されている請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記抗原で初回刺激された樹状細胞が、少なくとも１つの腫瘍抗原で初回刺激されている請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記腫瘍が脳腫瘍、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、または慢性リンパ球性白血病である請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
ＴＬＲ−３アゴニストを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＴＬＲ−３がＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＲＧＣ１００である請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
ＲＩＧ−１様受容体リガンドを含む請求項６４に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＲＩＧ−１様受容体リガンドが、ＭＤＡ５リガンド、ＬＧＰ２リガンド、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群から選択される請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
ＣＤＳ受容体リガンドを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＣＤＳ受容体リガンドが細菌ＣＤＮである請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
さらに、免疫チェックポイント阻害剤を含む請求項６４に記載の組成物。
【請求項７５】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項７４に記載の組成物。
【請求項７７】
抗原特異的Ｔ細胞を培養する方法であって、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を、少なくとも第１抗原で初回刺激された抗原提示細胞の集団の存在下で培養することを含み、且つ前記培養がＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の存在下になされる前記方法。
【請求項７８】
さらに、前記抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボでの増殖のための方法として定義される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗原提示細胞が樹状細胞を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記樹状細胞が相同的に抗原を負荷される請求項６１に記載の方法。
【請求項８１】
前記樹状細胞集団が１次樹状細胞を含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記培養が、被験体に対する免疫チェックポイント阻害剤の存在下に行われる請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４アンタゴニストである請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである請求項８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１５８，２３７号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金番号ＡＩ０３６２１１、ＣＡ１２５１２３及びＲＲ０２４５７４の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の登録
「ＢＡＣＭＰ０００４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイルに含まれる配列リストは、（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定されるように）４ＫＢであり、２０１６年４月１９日に作成され、電子提出により本明細書と共に提出され、参照により本明細書中に取り込まれている。
１．発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学、免疫学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、被験体に免疫応答を提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
重要なＴＨ１関連エフェクターとして、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、それらのエフェクター機能が抗ウイルス及び抗腫瘍免疫に重要であり、また、それ自体宿主の生存に非常に重要であることから、治療的介入のための魅力的な標的である（Ｄｕｄｄａら、２０１３）。Ｔ細胞活性化には、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用が必要であるが、このＡＰＣの樹状細胞（ＤＣ）は、抗原処理及び提示、リンパ球同時刺激、及びサイトカインの生成、及び末梢Ｔ細胞分化を調節する他の炎症性メディエーターの生成において最も高度に特殊化されている（Ｌｏｔｚｅら、２００１）。ＤＣは、Ｔ細胞分極を促進するだけでなく、ＴＨ１自体が極性化する（例えば、ＤＣ１）ようになる（Ｈｏｋｅｙら、２００５）。ＤＣ１分極は、炎症性サイトカイン（Ｈｉｌｋｅｎｓら、１９９７）、インターフェロン（Ｌｏｎｇｈｉら、２００９）及びトール様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストの様々な組み合わせによって促進され得るが（Ｓｐｒａｎｇｅｒら、２０１０）、ＴＬＲ−／−、ＭｙＤ８８−／−、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）−／−及びＩ型ＩＦＮＲ−／−系に由来する交絡データは、ＤＣ分極を制御する追加の未確認メカニズムを示唆している（Ａｈｍｅｄら、２００９；Ｃａｒｖａｌｈｏら、２０１１；Ｌｏｐｅｚら、２００３；Ｌｏｐｅｚら、２００６Ａ；Ｌｏｐｅｚら、２００６Ｂ；Ｔａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｃｋ、２００９）。さらに、免疫原性異種クラスＩＩペプチド（Ｊｏｎｅｓら、１９９９；Ｒｏｓａら、２００４）の使用によるＴ細胞ヘルプ及びＤＣライセンスを増強する試みは、ＣＤ４０シグナル伝達を首尾よく強化したが、逆説的にいくつかのモデル抗原特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬも強化した（Ｈｕｎｇら、２００７；Ｋｉｍら、２００８；Ｒｅｓｓｉｎｇら、２０００）。他の研究では、インフルエンザ特異的ＴＨ１免疫は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠くマウスでは正常に産生することができるが（Ａｌｌａｎら、１９９０）、ＭＨＣクラスＩＩを欠くマウスでは不完全である（Ｔｒｉｐｐら、１９９５）ことが示されており、これはＴＨ分極におけるＭＨＣの潜在的役割を示唆している。樹状細胞抗原の提示及び機能を調節する因子についての機構学者の意義深い調査にもかかわらず、樹状細胞の抗原提示が免疫刺激を増強するためにどのように調節されるかは依然として不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｕｄｄａら、２０１３
【非特許文献２】Ｌｏｔｚｅら、２００１
【非特許文献３】Ｈｏｋｅｙら、２００５
【非特許文献４】Ｈｉｌｋｅｎｓら、１９９７
【非特許文献５】Ｌｏｎｇｈｉら、２００９
【非特許文献６】Ｓｐｒａｎｇｅｒら、２０１０
【非特許文献７】Ａｈｍｅｄら、２００９
【非特許文献８】Ｃａｒｖａｌｈｏら、２０１１
【非特許文献９】Ｌｏｐｅｚら、２００３
【非特許文献１０】Ｌｏｐｅｚら、２００６Ａ
【非特許文献１１】Ｌｏｐｅｚら、２００６Ｂ
【非特許文献１２】Ｔａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｃｋ、２００９
【非特許文献１３】Ｊｏｎｅｓら、１９９９
【非特許文献１４】Ｒｏｓａら、２００４
【非特許文献１５】Ｈｕｎｇら、２００７
【非特許文献１６】Ｋｉｍら、２００８
【非特許文献１７】Ｒｅｓｓｉｎｇら、２０００
【非特許文献１８】Ａｌｌａｎら、１９９０
【非特許文献１９】Ｔｒｉｐｐら、１９９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の実施形態では、本発明は、疾患細胞集団を有する被験体に免疫応答を提供する方法であって、疾患細胞集団に特異的な少なくとも１つの抗原で初回刺激されている、初回刺激された樹状細胞集団を得ること、及び前記初回刺激された樹状細胞集団を被験体に有効量投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの態様では、初回刺激された樹状細胞集団を、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共に投与される。さらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ様組織部位に投与される。なおさらなる態様では、初回刺激された樹状細胞集団が、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共にと共に、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に投与される。
【０００７】
実施形態のいくつかの態様は、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、またはこれらの混合物と併せての初回刺激樹状細胞集団の投与に関する。例えば、ある場合には、初回刺激樹状細胞集団は、Ｉ型ＩＮＦと共に投与される。いくつかの態様において、Ｉ型ＩＮＦは、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−ε、ＩＮＦ−κまたはＩＮＦ−ωであり得る。さらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＴＬＲ−７アゴニストと共に投与される。いくつかの態様において、ＴＬＲ−７アゴニストは、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、ＧＳ−９６２０、ポリ（ｄＴ）、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、ロキソリビン及びｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる群より選択され得る。さらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＴＬＲ−９アゴニストと共に投与される。例えば、場合によっては、ＴＬＲ−９アゴニストはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であり得る。なおさらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＡＩＭｐ１ポリペプチドと共に投与される（例えば、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００１１３５８８７．１及びＮＰ＿００１１３５８８８．１参照、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。いくつかの態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＴＬＲ−３アゴニストと共に投与される。特定の態様において、ＴＬＲ−３アゴニストはポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））またはＲＧＣ１００である。特定の態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＲＩＧ−１様受容体リガンドと共に投与される。いくつかの態様では、ＲＩＧ−１様受容体リガンドは、さらに、ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、またはＩＰＳ−１リガンドとして定義される。例えば、ＲＩＧ−１様受容体リガンドは、ＭＤＡ５リガンド、ＬＧＰ２リガンド、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群より選択される。特定の態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＣＤＳ受容体リガンドと共に投与される。いくつかの態様において、ＣＤＳ受容体リガンドは、さらに、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドとして定義される。例えば、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドは細菌性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。
【０００８】
ある態様において、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドは、初回刺激樹状細胞集団（の投与）の前、後または実質的に同時に投与される。いくつかの態様では、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１を全身投与し、樹状細胞集団を局所投与する。さらなる態様において、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１及び樹状細胞集団が、両方とも、被験体の疾患細胞集団に近接する部位等に、局所的に投与される。特定の態様において、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１は、初回刺激樹状細胞集団（の投与）の約１週間、１日、８時間、４時間、２時間または１時間以内に投与される。特定の態様では、初回刺激された樹状細胞集団が投与される被験体は、以前に治療されており、現在Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１で治療中である。いくつかの態様では、本方法は、さらに、初回刺激された樹状細胞集団及びＩ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはＡＩＭｐ１を有効量で含む組成物を被験体に投与することを含む。
【０００９】
なおさらなる態様において、実施形態の方法は、さらに、免疫チェックポイント阻害剤を（初回刺激された樹状細胞組成物と共に）被験体に投与することを含む。例えば、いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストである。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に特異的な小分子阻害剤または阻害剤核酸である。特定の態様において、阻害性核酸はＲＮＡである。さらなる態様において、ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。さらなる態様において、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４結合抗体である。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４結合抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡの、遺伝的に改変されたＩｇＧアイソタイプであってもよく、またはその抗原結合断片でもよい。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ａＦ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、二重特異性抗体または単一ドメイン抗体であってもよい。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、または脱免疫化抗体であってもよい。なおさらなる態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである。
【００１０】
実施形態の特定の態様では、初回刺激された樹状細胞集団を、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に投与する。さらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、Ｉ型ＩＮＦ、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共に投与され、そして初回刺激された樹状細胞集団は、被験体の疾患細胞集団に近接するリンパ組織部位に投与される。特定の態様において、前記リンパ組織部位は、疾患細胞集団を取り囲む組織を排出するリンパ組織である。例えば、初回刺激された樹状細胞集団は、いくつかの態様において、疾患細胞集団を取り囲む組織を排出するリンパ節に投与される。いくつかの特定の態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、亜区分、分節区分、葉状区分、耳葉間、臀部、縦隔、肩下咽頭、腸骨窩、側腹、胸部、肩甲骨、中間鎖、鎖骨下、表在性鼠径部、深部鼠径部、膝窩、顔面頬筋、顔面鼻唇、前立腺、下顎、顎下、後頭部、乳房／後腓骨、耳下腺、深部前胸部、深部胸部、深部内頸部、深部頸部、深部前頸部、前気管内、気管内、喉頭前部、甲状腺、深部外側子宮頸部、上顎深部子宮頸部、下顎深部頸部、後咽頭、胃十二指腸、前頚部、側頸部、腹腔内、後大動脈、側方大動脈、腹腔、胃、肝臓、脾臓、上腸間膜、腸間膜、回腸炎、腸間膜炎、下腸間膜または全腸リンパ節に投与される。いくつかの態様において、樹状細胞集団は、リンパ節への直接注射によって投与される。
【００１１】
特定の態様では、実施形態による治療被験体は、癌、自己免疫疾患または感染症を有する。自己免疫疾患の例として、限定されないが、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ（ＲＡ）、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、トロンボバンサイトウイルスタラン、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、慢性腎炎、筋萎縮性側索硬化症、背側索、巨細胞性動脈炎／多麻痺、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬及び線維化肺胞炎が挙げられる。感染症の例としては、限定されないが、炭疽菌、水痘、ジフテリア、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ＨＩＢ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ライム病、季節性インフルエンザ、脳炎、マラリア、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、百日咳、ポリオ、狂犬病、風疹、帯状疱疹、天然痘、破傷風、結核及び黄熱病が挙げられる。
【００１２】
実施形態のいくつかの態様では、実施形態の方法及び組成物によって治療される疾患細胞集団は癌細胞である。実施形態に従って治療することができる癌細胞としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮の細胞が挙げられる。いくつかの態様において、癌は、悪性新生物；癌腫；癌腫；未分化癌；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化癌；移行細胞癌；乳頭状移行細胞癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌及び胆管癌を合わさったもの；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；家族性ポリポーシス大腸菌の腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；分岐腺−肺胞腺癌；乳頭腺癌；発色腺癌；アシドフィル癌；親水性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状及び濾胞性腺癌；非内皮性硬化性癌腫；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；梅毒性腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺腫；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺腫；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗ／ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性肉腫；悪性顆粒膜細胞腫瘍；悪性男性ホルモン産生細胞腫；セルトリ細胞癌；ライディヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；糸球体肉腫；悪性黒色腫；無メラニン性黒色腫；表在性の拡散性メラノーマ；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；歯槽横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミューラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；胚芽腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎症；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍;エナメル上皮歯牙肉腫、悪性エナメル上皮腫、エナメル上皮線維肉腫、悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；プロトプラスト性星細胞腫；繊維性星状細胞腫；星状細胞腫；神経膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；神経芽細胞腫；小リンパ球悪性リンパ腫；大細胞、びまん性悪性リンパ腫；悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病;；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；毛様細胞白血病であり得る。さらなる態様において、癌は脳腫瘍（例えば神経膠腫）、前立腺癌、乳癌（例えば三重陰性乳癌）、膵臓癌（例えば膵管腺癌）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、メラノーマ、腎細胞癌または慢性リンパ球性白血病である。
【００１３】
特定の態様において、疾患細胞集団は、固形腫瘍等の腫瘍である。さらなる態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、腫瘍を排出するリンパ節に投与される。特定の態様において、腫瘍は転移性腫瘍であり、初回刺激された樹状細胞集団は、原発腫瘍の部位を排出するリンパ節に投与される。さらなる態様において、癌は、脳腫瘍（例えば、神経膠腫）、前立腺腫瘍、乳房腫瘍（例えば、三重陰性乳癌）、膵臓腫瘍（例えば、膵管腺癌）または腎細胞腫瘍である。
【００１４】
さらなる態様において、実施形態の方法は、本発明の組成物を被験体に１回より多く、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回またはそれ以上、投与することをさらに含むことができる。
【００１５】
実施形態による治療被験体は、いくつかの態様において、哺乳動物被験体である。例えば、被験体は、ヒトのような霊長類であり得る。さらなる態様において、被験体は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタまたは動物園の動物のような非ヒト哺乳動物である。
【００１６】
さらなる実施形態では、（ｉ）抗原で初回刺激された樹状細胞及び（ｉｉ）Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＡＩＭｐ１、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドを含む免疫原性組成物が提供される。いくつかの態様において、抗原で初回刺激された樹状細胞は、癌、自己免疫疾患または感染性疾患に関連する抗原で初回刺激されている。特定の態様において、抗原で初回刺激された樹状細胞は、少なくとも１つの腫瘍抗原で初回刺激されている。
【００１７】
従って、特定の態様において、実施形態の組成物は、初回刺激された樹状細胞集団及びＩ型ＩＮＦを含む。いくつかの態様において、Ｉ型ＩＮＦは、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κまたはＩＦＮ−ωであり得る。他の態様において、組成物は、初回刺激された樹状細胞集団及びＴＬＲ−７アゴニストを含む。いくつかの態様において、ＴＬＲ−７アゴニストは、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、ＧＳ−９６２０、Ｐｏｌｙ（ｄＴ）、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、ロキソリビン及びｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる群より選択され得る。さらなる態様において、組成物は、初回刺激された樹状細胞集団及びＴＬＲ−９アゴニストを含む。場合によっては、ＴＬＲ−９アゴニストはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であり得る。なおさらなる態様において、実施形態の組成物は、初回刺激された樹状細胞集団及びＡＩＭｐ１を含む。
【００１８】
別の実施形態は、（ｉ）抗原で初回刺激された樹状細胞及び（ｉｉ）ＴＬＲ−３アゴニスト、ＲＩＧ−１様受容体リガンド、またはＣＤＳ受容体リガンドを含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの態様において、抗原で初回刺激された樹状細胞は、癌、自己免疫疾患または感染性疾患に関連する抗原で初回刺激されている。特定の態様において、抗原で初回刺激された樹状細胞は、少なくとも１つの腫瘍抗原で初回刺激されている。いくつかの態様において、腫瘍は、脳腫瘍、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの態様において、組成物は、ＴＬＲ−３アゴニストを含む。特定の態様において、ＴＬＲ−３アゴニストはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＲＧＣ１００である。いくつかの態様では、組成物はＲＩＧ−１様受容体リガンドを含む。いくつかの態様では、ＲＩＧ−１様受容体リガンドは、ＭＤＡ５リガンド、ＬＧＰ２リガンド、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群より選択される。特定の態様では、組成物はＣＤＳ受容体リガンドを含む。例えば、ＣＤＳ受容体リガンドは細菌性ＣＤＮである。
【００１９】
本発明のなおさらなる実施形態では、抗原提示細胞集団の存在下にＴ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を培養することを含む、抗原特異的Ｔ細胞を培養するための方法であって、培養をＡＩＭｐ１の存在下で行う方法が提供される。いくつかの態様では、抗原提示細胞集団は、初回刺激された樹状細胞集団である。他の態様では、抗原提示細胞集団は、（例えば、照射によって）不活性化された細胞等の人工抗原提示細胞であり得る。いくつかの態様では、この方法は、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボでの増殖のための方法としてさらに定義される。特定の態様において、樹状細胞集団は、原発性樹状細胞を含む。さらなる態様において、前記培養は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト等の免疫チェックポイント阻害剤の存在下で行われる。特定の態様において、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に特異的な阻害剤核酸である。特定の態様において、阻害性核酸はＲＮＡである。さらなる態様において、ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。他の態様において、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４結合抗体である。
【００２０】
さらに別の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を、抗原提示細胞の集団の存在下で培養することを含む抗原特異的Ｔ細胞を培養する方法であって、この培養をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の存在下で初回刺激する前記方法が提供される。いくつかの態様では、この方法は、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボでの増殖のための方法としてさらに定義される。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞を含む。特定の態様において、樹状細胞は、抗原が相同的に負荷される。いくつかの態様において、樹状細胞集団は、原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）樹状細胞を含む。いくつかの態様において、培養は、被験体に対する免疫チェックポイント阻害剤の存在下で行われる。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストである。特定の態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、特定の成分に関して「実質的に含まない」とは、特定の成分のいずれも意図的に組成物中に配合されていない、及び／または汚染物質としてまたは痕跡量でのみ存在することを意味するために本明細書中では使用される。従って、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、０．０５％より十分に低い。最も好ましい組成物は、特定の成分の量が標準的な分析方法で検出することができないものである。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上であることを意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上であること意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「別の」または「さらなる」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味し得る。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「約」は、値が、装置の誤差の固有の変動を含むことを示すために使用され、その方法は研究対象の間に存在する値または変動を決定するために使用される方法である。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の特定の実施形態を示すけれども、例示のみを目的として与えられたものであり、本発明の主旨及び範囲内の様々な変更及び改変はこの詳細な説明から当業者には明らかである。
【００２５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、さらに本発明の特定の態様を示すために包含されている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】図１Ａ−Ｆ：  抗原的に関連するＭＨＣクラスＩ及びＩＩの決定基の同時負荷は、マウスＤＣのＴＨ１分極を促進する。（Ａ）ＥＬＩＳＡでアッセイしたように、脾臓細胞と共培養した場合に、同種のｍＲＮＡ（電気穿孔）及び溶解物（インキュベーション）を合わせて負荷されたマウスＤＣは、選択的に負荷されたＤＣよりも有意に多くＩＬ−１２ｐ７０を分泌した。この効果は、ＡＩＭｐ１のｓｉＲＮＡノックダウンによって無効にされた。抗原は、ＲＡＷ２６４．７細胞株由来であった。異種クラスＩＩ抗原は、４Ｔ１乳癌細胞株に由来した。Ｙ軸：無負荷（ＵＬ）ＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０分泌の倍数変化。（Ｂ）共培養の前に、相同的に負荷されたＤＣは、異種の決定基が負荷されたＤＣ、そうでない場合は４８時間の細胞培養上清のウエスタンブロットによってアッセイして単独負荷されたＤＣよりも有意に多くのＡＩＭｐ１を分泌した。上のパネル：ＲＡＷ２６４．７抗原決定基による相同性負荷後のＡＩＭｐ１放出。４Ｔ１に由来する異種の溶解物。下のパネル：一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ＳＶ抗原決定基による相同負荷後のＡＩＭｐ１放出。原発性前立腺由来異種溶解物。（Ｃ）相同的に負荷されたＤＣも、ｓＣＴＬＡ−４分泌の有意な減少を示した。示されたこと：ｓＣＴＬＡ−４放出は、ＲＡＷ２６４．７抗原決定基による相同性負荷後である。４Ｔ１に由来する異種の溶解物。（Ｄ）相同性負荷ＤＣにおけるＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡノックダウンは、ｓＣＴＬＡ−４分泌を、Ｂ１６メラノーマ決定因子（左パネル）及び一次ＳＶ決定因子（右パネル）を相同的に負荷したＤＣからのベースラインに回復させた。示されたデータは、＞７０％の典型的なＡＩＭｐ１ノックダウンを示す。（Ｅ）生成したＳＶ決定基で相同的に負荷されたＤＣは、他の方法で負荷されたＤＣと比較して、自己脾細胞とのインビトロ共培養の間のＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞増殖を有意に増加させた。この効果は、ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡによる相同性負荷ＤＣの処理によって排除された。異種の溶解物は原発性前立腺癌であった。Ｙ軸：無負荷（ＵＬ）ＤＣと比較した総細胞数の倍数変化。（Ｆ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）ＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｄ結合エピトープ及び生成されたＯＶＡタンパク質全体が相同的に負荷されたＤＣは、他の方法で負荷されたＤＣと比較して、インビボでＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞増殖を有意に増加させた。この効果は、ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡを用いた相同性負荷ＤＣの処理によって排除され、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣでは観察されなかった。異種クラスＩＩ抗原は一次ＳＶ溶解物であった。Ｙ軸：無負荷（ＵＬ）ＤＣと比較した倍率変化％。すべての実験について、ｓｉＮＴまたはＮＴ＝非標的ｓｉＲＮＡ。ｓｉＡＩＭｐ１＝ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡ。
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図２−１】図２Ａ−Ｆ：  同種クラスＩ及びＩＩ抗原決定基は、ＰＲＲアゴニズムとは独立した様式でＴＨ１分極ＤＣを生成する。（Ａ）ＧＦＰ発現アデノウイルスによる形質導入後、ｒＧＦＰタンパク質とのインキュベーション後、またはその両方の形質導入後の、またはいずれも行わなかった後の、ヒトＤＣ培養上清のｓＣＴＬＡ−４  ＥＬＩＳＡ。無関係な抗原であるネズミＩＬ−４を用いて、同様に異種負荷も表された。（Ｃ）２つの異なるタンパク質濃度での、ＧＦＰ−ｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーション後、ｒＧＦＰタンパク質とのインキュベーション後、またはその両方の後の、またはいずれも行わなかった後の、ヒトＤＣ培養上清のＡＩＭｐ１ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。５つの内１つの代表的な実験が示されている。（Ｃ）クラスＩインフルエンザＨＡペプチドによるエレクトロポレーション後及び重複（同種）または非重複（異種）クラスＩＩインフルエンザＨＡペプチドによるインキュベーション後のヒトＤＣ培養上清のｓＣＴＬＡ−４及びＡＩＭｐ１ウエスタンブロット。（Ｄ）様々なＴＬＲアゴニスト刺激の存在下で同種または異種クラスＩ及びＩＩペプチド対を負荷した後のヒトＤＣ培養上清のｓＣＴＬＡ−４及びＡＩＭｐ１ウエスタンブロット。３つの内の代表的な実験が示されている。（Ｅ）３つの独立した実験に対する（ｄ）に示されたデータのＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比のデンシトメトリー定量。（Ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ分析は、同種インフルエンザＨＡペプチド対（Ｂ８−１６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）／ＤＲ３−１６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及びＡ２−４４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）／ＤＲ３−４４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））（Ｄｅｃｋｅｒら、２００９）によるＤＣの負荷は、ＣＴＬＡ−４及びｓＣＴＬＡ−４  ｍＲＮＡ転写物を有意にダウンレギュレートしたことを示している。無負荷、一重負荷、及び異種負荷のＤＣは、ＣＴＬＡ−４を発現し続けた。負荷制御として示されるＧＡＰＤＨ増幅。（＊）＝異種ペプチド対の負荷＋／−クラスＩペプチドのエレクトロポレーションは、ＣＬＴＡ−４発現に影響を及ぼさなかった。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【図３−１】図３Ａ−Ｇ：  ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４モジュレーションは、同種クラスＩ及びＩＩペプチドのＭＨＣへの結合に依存する。ＳＶ  ｍＲＮＡ及び溶解物を用いた単一、同種または異種の負荷の後の、野生型（上）及びＨ２−ＤＭ−／−（下）ネズミＤＣ培養上清についての（Ａ）ｓＣＴＬＡ−４（右）及びＡＩＭｐ１（左）ウエスタンブロット。示されたのは代表的な実験。（Ｂ）（ａ）に示されたデータのＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比のデンシトメトリー定量を３回の独立した実験にわたって行った。上部パネル：野生型ＤＣ。下部パネル：Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣ。（Ｃ）ＣＬＩＰに対するアミノ酸配列相同性を有するクラスＩ  Ｈ−２ＤｂペプチドによるＨ２−ＤＭ−／−ＤＣの負荷は、ＡＩＭｐ１及びｓＣＴＬＡ−４（Ｉｉ  ＣＬＩＰ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；Ｈ２−Ｄｂ  ＣＬＩＰ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の適切な調節を再現する。（Ｄ）活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増強された発達によって証明されるように、クラスＩ  Ｈ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰによるＨ２−ＤＭ−／−ＤＣの相同負荷に応答する高いＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４分泌比は、自己脾細胞を用いたＨ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰ負荷Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣの共培養後にインビトロでのＴＨ１応答の下流増強を仲介した。（Ｅ）クラスＩまたはクラスＩＩ結合ペプチドのいずれかに導入されたアミノ酸置換（ＧｌｙからＭｅｔ）は、３つのアミノ酸への連続相同性の領域を制限して、ペプチド負荷に対応する高いＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４分泌比を消失するのに十分であった。同族ペプチドへの代償的置換の導入、それにより延長された相同性の再現は、高いＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４分泌比を救済するのに十分であった。示されたこと：１６の内の代表的実験。（グリシン対：クラスＩ=ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、クラスＩＩ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；メチオニン対：クラスＩ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、クラスＩＩ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。（Ｆ）（ｅ）に提示されたデータのデンシトメトリー定量。１６の独立した実験の平均値。＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）ＡＩＭｐ１  ｃｏＩＰは、ＡＩＭｐ１とＭＨＣとの相互作用は、ＤＣに相同的ペプチドを負荷した場合に実質的に消失し、分泌ＡＩＭｐ１がＭＨＣ結合ＡＩＭｐ１に由来し得ることを示唆した。（異種ペプチド＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；同種ペプチド=ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；クラスＩＩペプチド＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；クラスＩペプチド＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図４−１】図４Ａ−Ｅ：同種の抗原決定基によって極性化されたＤＣは、末梢寛容を克服し、精嚢を切除する。（Ａ）アジュバント単独またはＳＶ負荷同種ＤＣワクチン＋アジュバントを注射した雄のＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した精嚢の肉眼像（右）及び肉眼では見えない像（左）。（Ｂ）６ヶ月の期間にわたってＳＶのアブレーションを示す３Ｄ縦方向ＭＲＩ。（Ｃ）ワクチン接種後６ヶ月でＨ＆Ｅ染色したＳＶは、アジュバントのみを投与したマウスと比較して、ワクチン接種したマウスにおいて線維症を主に含む残留ＳＶを示した。（Ｄ）治療後１ヶ月で、抗ＣＤ８によるＩＨＣ染色は、アジュバントのみを投与したマウスと比較して、ワクチン接種したマウスにおいて有意なＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す。（Ｅ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を反応性ＳＶワクチン接種動物からナイーブ受容者に養子移植することにより、移植から６週間以内にＳＶ破壊が再現された。偽ワクチン接種された動物またはアジュバントのみの動物からのＰＢＬの養子移植は、正常なＳＶ組織病理に影響を与えなかった（上のパネル）。二次養子移植は同じ効果をもたらした（下のパネル）。全ＳＶ反応性＝２５／４２（６０％）。
【図４−２】同上
【図５】図５Ａ−Ｊ：  同種の抗原決定基によって極性化されたＤＣは、前立腺及び精嚢を特異的かつ差別的に切除する。正常前立腺（上）及び相同的に負荷されたＤＣ前立腺ワクチンを接種した動物由来の前立腺（下）についてのＭＲＩ（Ａ＆Ｄ）及び肉眼（Ｂ＆Ｅ）画像。ワクチン接種及びアジュバントのみの動物のＨ＆Ｅ染色は、（Ｃ）アジュバントのみの動物の正常前葉及び（Ｆ）ワクチン接種動物の前葉における明確な肥大及び炎症を示す。時間とともに、ワクチン接種動物における前立腺葉は、アジュバント単独動物（Ｇ）と比較してワクチン接種動物（Ｈ）の不在下垂体前葉の画像によって示されるように、収縮して消失する傾向があった。ＳＶと前立腺は近接しているが、ワクチン接種は、（Ｉ）前立腺ワクチン接種動物における正常ＳＶと併用した前立腺の炎症病理ならびに（Ｊ）ＳＶワクチン接種動物における正常な前立腺と併用したＳＶの特徴的な炎症病理によって示されたように、きわめて特徴的であった。全前立腺反応性＝８／１７（４７％）。
【図６−１】図６Ａ−Ｊ：  同種ワクチン接種は、腫瘍性自己から正常を識別し、生理学的モデル系において前立腺腺癌を制御する。Ｐｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１マウス（Ｃａｒｓｔｅｎｓら、２０１４）に由来する前立腺腺癌決定基を、腺癌の段階でＰｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１動物のさらなるコホートにワクチン接種するために使用した。データは、（Ａ）腺癌負荷ワクチン及びアジュバントは、正常な前立腺との明らかな交差反応性をほとんど示さなかったが、（Ｂ）腺癌病期に誘導されたマウスは、ワクチン接種したときに最もｍＰＩＮを連想させる病理所見を示し、またワクチン接種されていないかまたは非癌性のマウスには見られないリンパ球浸潤腺房（Ｂ．１差し込み図）を示した。アジュバントのみを投与された誘導マウス（Ｃ）は、Ｐｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１腺癌の典型的な病理学的特徴を示した。（Ｄ）病理学的スコアリング（実験手順で定義される）は、ワクチン接種マウスとアジュバントのみで処置した誘導マウスとの間の病理学的表現型において統計的に有意な差を示した。Ｙ軸：組織病理学的スコア。ＤＣ（Ｅ＆Ｆ）を受けなかった、１×１０５ＤＣ（Ｇ＆Ｈ）及び４×１０５ＤＣ（Ｉ＆Ｊ）を受けた、誘導動物（Ｅ、Ｇ、Ｉ）と非誘導対照動物（Ｆ、Ｈ、Ｊ）との間で観察されたように、ワクチン接種はまた用量応答効果を与えるようであった。基準バー＝１００μＭ。
【図６−２】同上
【図７】図７Ａ−Ｈ：  同種のワクチン接種は、自然発生的なＣＮＳ悪性腫瘍の大きな動物モデルにおいて可能であり、有効性がある。ＣＮＳ悪性腫瘍の診断時に、非無作為化第Ｉ相獣医試験のために、２頭の大きな（＞２５ｋｇ）イヌ患者を募集した。脳の臨床ＭＲイメージングは、診断時（Ａ＆Ｅ）、保存的腫瘍切除の直前（Ｂ＆Ｆ）、切除直後（Ｃ＆Ｇ）、及びワクチン接種プロトコールの開始後５週間（Ｄ＆Ｈ）の、２匹の動物の腫瘍を示す。矢印は腫瘍の領域を示す。第１の動物（上の４つのパネル）は、１回のワクチン注射後に５０％の腫瘍体積の減少を示した（Ｃ＆Ｄ参照）、一方、第２の動物（下の４つのパネル）は、３回のワクチン注射後７９％の腫瘍体積の減少を示した（Ｇ＆Ｈ参照）。
【図８】図８Ａ−Ｂ：  ＡＩＭｐ１はＤＣの同種負荷後に早期にかつ成熟前に放出されるが、ｓＣＴＬＡ−４分泌のアブレーションは下流で生じる。（Ａ）ＡＩＭｐ１分泌の開始は、同種クラスＩ及びＩＩペプチドによるＤＣ負荷の３時間後に早期に観察されたが、ｓＣＴＬＡ−４分泌はこの初期の時点では影響を受けなかった。ｓＣＴＬＡ−４分泌のアブレーションは、成熟後の遅い時点まで見られなかった（例えば、負荷の４８時間後に示されるように）。（Ｂ）不適合異種ペプチド（薄灰色）または重複同種ペプチド（濃灰色）を負荷したＤＣからの、負荷の３時間後及び４８時間後のＡＩＭｐ１及びｓＣＴＬＡ−４分泌の定量。Ｙ軸：ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比。
【図９】図９：  ＡＩＭｐ１  ｃｏＩＰ及び相反するＭＨＣクラスＩのｃｏＩＰは、ＡＩＭｐ１とＭＨＣとの間の、特に成熟ＤＣにおける強い相互作用を示す。結果は、タンデム質量分析によって確認した（示さず）。ＩＰ＝免疫沈降に使用される抗体の特異性。ＩＢ＝検出に使用される抗体の特異性。３つの内の代表的な実験を示す。
【図１０】図１０：  ＭＨＣへのＡＩＭｐ１結合は、同種の抗原決定基（ｍＲＮＡ及び溶解物）によるＤＣの負荷に依存する。同種クラスＩ及びＩＩペプチド対を負荷したＤＣと同様のやり方で、ＡＩＭｐ１  ｃｏＩＰは、以下、即ちＡＩＭｐ１とＭＨＣクラスＩＩ及びクラスＩ（示さず）との相互作用が、ＤＣに相同ｍＲＮＡ及び溶解物調製物を負荷した場合に実質的に破壊されたので、これは分泌されたＡＩＭｐ１がＭＨＣ結合ＡＩＭｐ１に由来し得ること示していること、を示唆した。興味深いことに、異種調製物の使用によるクラスＩ（ｍＲＮＡ）及びクラスＩＩ（溶解物）の決定基間における増加した抗原性異種性の導入は、ＭＨＣへのＡＩＭｐ１結合を増強するようであった。３つの内の代表的な実験を示す。
【図１１】図１１Ａ−Ｂ：  β２−ミクログロブリンまたはＨＬＡ−ＤＭのｓｉＲＮＡノックダウンによるＭＨＣ負荷の無効化は、ヒトＤＣが同種のペプチド負荷に応答してＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４分泌を調節する能力を排除する。（Ａ）２つの異なる対の同種ペプチド（野生型インフルエンザＨＡ及びｇｌｙ−ｔｏ−ｍｅｔ置換ＨＡ）を負荷したＤＣは、非標的（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで処理した場合、ＡＩＭｐ１分泌を増強し、ｓＣＴＬＡ−４分泌を減少させた；しかしながら、β２−ミクログロブリンまたはＨＬＡ−ＤＭ  ｓｉＲＮＡのいずれかを用いた治療は、ＡＩＭｐ１及びｓＣＴＬＡ−４を調節する能力を無効にし、分泌されたＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比を無負荷、単回負荷または異種負荷ＤＣと区別できなくした。４つの代表的実験を示す。（Ｂ）（ａ）で提示されたデータのデンシトメトリー定量。４回の独立した実験の平均値。＊ｐ＜０．０５
【図１２】図１２：  免疫学的自己のインビボ標的化のためのＤＣ同種負荷の模式的アウトライン方法論。
【図１３】図１３：  養子移転のスケジュールと分析のタイムラインの図式概略。
【図１４】図１４：  部分的ＨＬＡ適合ヒトＤＣの相同性負荷により、ＷＰＭＹ−１正常前立腺を特異的に溶解する能力が増強されたＣＴＬが生成する。ＷＰＭＹ−１正常ヒト前立腺細胞株由来の決定基を負荷したヒトＤＣを用いて、自己リンパ球を初回刺激し、そして増殖させた。３回の刺激の後、Ｔ細胞を採取し、以前に記載されたように５０、溶解特異性をＣｒ溶解アッセイ５１によって試験した。データは、ＷＰＭＹ−１  ｍＲＮＡ及びＷＰＭＹ−１溶解物の両方を負荷したＤＣが、ＷＰＭＹ−１溶解物またはＷＰＭＹ−１  ｍＲＮＡいずれかのみで負荷されたＤＣより実質的に優れた特異的ＣＴＬ活性を生み出したことを示した。Ｙ軸：特異的溶解％。Ｘ軸：Ｅ：Ｔ比。
【図１５】図１５Ａ−Ｄ：  同種の抗原負荷によって生成したワクチンは、ＣＤ８＋細胞に依存するやり方で、確立された４Ｔ１乳癌腫瘍の増殖及び転移拡大を阻害する。（Ａ）ルシフェラーゼ発現４Ｔ−１腫瘍の異所的樹立の８日後に、マウスに、相同的に負荷された樹状細胞をワクチン接種するか、または偽ワクチン接種及び全身アジュバントで処置した。ＩＶＩＳにより腫瘍の転移性拡大がモニターされた。示されるように、偽ワクチン接種されたマウスは、肝臓、肺、及び脳への遠隔転移を発症し、移植後１ヶ月で死亡し始めた。ワクチン接種したマウスは転移性疾患を発症せず、原発性腫瘍は良好に制御されたままであった。同種負荷のための抗原性物質は、ルシフェラーゼを発現しない４Ｔ１細胞株に由来した。代表的なマウスを示す。コホートのサイズ＝グループあたり６。（Ｂ）（Ａ）で示されたデータのカプラン−マイヤー生存率分析。５６日目にｐ＜０．００１。（Ｃ）ＣＤ８＋細胞への依存性を実証するために、非担癌マウスのコホートに同種ワクチンを２回ワクチン接種した。単一のコホートのＣＤ８枯渇後、脾細胞を採取し、腫瘍を有するマウスのコホートに養子移入した。データは、同種ワクチン接種したアイソタイプ枯渇脾細胞で養子移入されたマウスが腫瘍コントロールを維持し、転移拡大を示さなかったが、相同ワクチン接種したＣＤ８枯渇脾細胞で養子移入したマウスは、最終的に病気で死んだことを示した。異種ワクチン接種されたアイソタイプ枯渇脾細胞を養子移入したマウスは、うまくいかず、おそらく同種ワクチン接種により生成した追加のＣＤ８−エフェクターの存在を示していた。代表的なマウスを示す。コホートのサイズ＝１グループにつき５。（Ｄ）（Ｃ）で示したデータのカプラン−マイヤー生存分析。４３日目に、わずか２０％の同種ワクチン接種宿主由来のアイソタイプ枯渇脾細胞を養子移入したマウスに対して、８０％の同種ワクチン接種宿主由来のアイソタイプ枯渇脾細胞を養子移入したマウスが生存していた。アイソタイプが枯渇し異種ワクチン接種された宿主に由来する脾細胞で養子移入した全てのマウスは、３２日目までに腫瘍で死亡した。４３日目でｐ＜０．００１.
【図１６】図１６：  組換えＡＩＭｐ１（ｐ４３）は、ＴＨ１応答の生成を増強する。ヒトＤＣに、示されたペプチドの組み合わせを負荷し、ヒトＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＡＩＭｐ１（ｐ４３）の存在下または非存在下で自己Ｔ細胞を初回刺激するために使用した。試験したすべての条件下で、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージはＡＩＭｐ１の存在下で５０％〜１５０％増強された。試験した各対の状態についてｐ＜０．０５であった。ｒＡＩＭｐ１間の最も強固な増加は、抗原を相同的に負荷したＤＣで観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．本発明の実施形態
樹状細胞は高度に特化したクラスの抗原提示細胞を含む。以前の研究では、樹状細胞が、癌細胞等の被験体の細胞集団を特異的に標的とするＴ細胞応答を刺激するために効果的に初回刺激され得ることが実証されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７２８，８０６号参照）。しかしながら、樹状細胞組成物の有効性を高め、これにより、より強固な免疫応答を提供する方法の必要性が依然として残っていた。
【００２８】
本明細書に提示される研究は、共刺激分子と樹状細胞適用部位の両方が細胞組成物の有効性に顕著に影響し得ることを初めて実証する。特に、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＮＦα）、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはＡＩＭｐ１等の補助刺激剤と組み合わせた樹状細胞の投与により、Ｔ細胞応答を顕著に高めることが見出され、これは初回刺激された（Ｐｒｉｍｅｄ）樹状細胞組成物によって提供される。同様に、ＴＬＲ−３アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンドと共に投与された初回刺激樹状細胞により、高められたＴ細胞応答を達成することができた。さらに、樹状細胞の適用部位は、Ｔ細胞刺激の有効性を顕著に変化させることが見出された。特に、作用機序の特定の理論に拘束されるものではないが、樹状細胞は、好ましくは、標的疾患組織（例えば、腫瘍）の部位の近傍にあるＴ細胞に曝露されるべきであると考えられている。従って、いくつかの好ましい態様において、樹状細胞組成物は、腫瘍等の疾患細胞集団の部位を排出するリンパ組織へ直接導入することによって、被験体に投与される。このように、共刺激分子の併用と初回刺激された樹状細胞の疾患組織に近い部位への投与により、極めて強固な免疫応答を誘導することができる。
【００２９】
ＩＩ．実施形態の樹状細胞集団
単離培養し、及び樹状細胞を初回刺激するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７２８，８０６号には、実施形態の組成物及び方法において使用され得る抗原初回刺激された樹状細胞を提供するための詳細な方法が提供される。特定の態様では、実施形態に従って使用される樹状細胞は、実施形態の方法によって治療されるべき被験体から単離される。他の態様では、樹状細胞は、ＨＬＡ適合ドナー等の異なる被験体からのものであってもよい。特定の態様において、樹状細胞は、規定されたＨＬＡタイピングを有する樹状細胞のバンク（ｂａｎｋ）に由来する。好ましい態様において、実施形態に従って使用される初回刺激された樹状細胞は、本明細書及び米国特許第８，７２８，８０６号に詳述されているように抗原が相同的に負荷される。
【００３０】
血液及び骨髄等の様々な供給源由来の樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞のために富化される細胞集団を単離するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、ヘパリン化血液の採取により、アフェレーシスまたは白血球搬出により、バフィーコートの調製、ロゼット形成（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ)、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えばＦｉｃｏｌｌ（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標）を使用）、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）（非透析性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコーティングされたコロイドシリカ粒子（直径１５〜３０ｍｍ））、スクロース等）、細胞の微分溶解、濾過等により、単離され得る。特定の実施形態では、白血球集団は、例えば、被験体から血液を採取し、血小板を除去するために脱繊維素し、赤血球を溶解する等により調製することができる。樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配による遠心分離によって、単球樹状細胞前駆体のために任意に富化することができる。他の態様において、樹状細胞前駆体は、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血のＣＤ１４選択を使用して選択することができる。
【００３１】
樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、場合により、閉鎖された無菌系で調製することができる。本明細書で使用される「閉鎖された無菌系」または「閉鎖系」という用語は、非滅菌、周囲空気、または循環空気または他の非滅菌条件への暴露が最小化または排除されるシステムを指す。樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞を単離するための閉鎖系では、一般に、開放トップチューブにおける密度勾配遠心分離、細胞の野外送達、組織培養プレートまたは未閉鎖フラスコ中の細胞培養等は排除される。典型的な実施形態では、閉鎖系は、非滅菌空気に暴露することなく、樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞を初期収集容器から閉鎖可能な組織培養容器に無菌的に移動させる。
【００３２】
特定の実施形態において、単球樹状細胞前駆体は、単球結合基質への付着によって単離される。例えば、白血球の集団（例えば、白血球搬出によって単離された）を、単球性樹状細胞前駆体付着基材と接触させることができる。白血球の集団が基質と接触すると、白血球集団における単球性樹状細胞前駆体が基質に優先的に付着する。他の白血球（他の可能性のある樹状細胞前駆体を含む）は、基質に対する低下した結合親和性を示し、これにより単球樹状細胞前駆体を基質の表面上に優先的に富化させる。
【００３３】
好適な基材としては、例えば、体積に対する表面積の比が大きいものが挙げられる。このような基材は、例えば、粒子状または繊維状基材であり得る。適切な粒状基材としては、例えば、ガラス粒子、プラスチック粒子、ガラス被覆プラスチック粒子、ガラス被覆ポリスチレン粒子、及びタンパク質吸収に適した他のビーズが挙げられる。適切な繊維質基材には、微小毛細管及び微繊膜が含まれる。粒状または繊維状の基質は、通常、付着（接着）した細胞の生存率を実質的に低下させることなく、付着した単球性樹状細胞前駆体を溶出させる。粒状または繊維状基質は、基質からの単球性樹状細胞前駆体または樹状細胞の溶出を容易にするために、実質的に非多孔性であり得る。「実質的に非多孔性の」基材は、基材中に存在する細孔の少なくとも大部分が基材中の捕捉細胞を最小にするために細胞よりも小さい基材である。
【００３４】
単球性樹状細胞前駆体の基材への付着は、結合媒体の添加によって任意に増強することができる。適切な結合媒体としては、例えばサイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、またはインターロイキン１３（ＩＬ−１３））、血漿、血清（例えば、自己血清または同種血清のようなヒト血清）、血清アルブミン等の精製タンパク質、二価陽イオン（例えば、カルシウム及び／またはマグネシウムイオン）及び単球性樹状細胞前駆体の基質への特異的付着を助ける、または非単球性樹状細胞前駆体の基質への付着を防止する他の分子などの精製タンパク質を、個々にまたは任意の組み合わせで補充された、単球性樹状細胞前駆体培養培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）等）が挙げられる。特定の実施形態では、血漿または血清を加熱不活性化することができる。加熱不活性化血漿は、白血球に対して自己由来であっても異種であってもよい。
【００３５】
単球性樹状細胞前駆体の基材への付着に続いて、非付着性白血球を単球性樹状細胞前駆体／基質複合体から分離する。任意の適切な手段を用いて、非付着細胞を複合体から分離することができる。例えば、非付着性白血球と複合体の混合物を沈降させ、非付着性白血球及び培地をデカントまたは排出させることができる。あるいは、混合物を遠心分離し、非付着性白血球を含有する上清を、ペレット複合体からデカントまたは排出させることができる。
【００３６】
単離された樹状細胞前駆体は、分化、成熟及び／または増殖のためにエクスビボで培養することができる。（本明細書中で使用されるように、単離された未成熟樹状細胞、樹状細胞前駆体、Ｔ細胞、及び他の細胞は、ヒトの手によって自然環境とは別に存在し、従って自然の産物ではない細胞をいう。単離された細胞は、精製された形態で、半精製された形態で、または非天然環境で、存在し得る。）簡潔には、エキソビボ分化は、典型的には、１つ以上の分化剤の存在下で、樹状細胞前駆体または樹状細胞前駆体を有する細胞の集団を培養することを含む。適切な分化剤は、例えば細胞増殖因子（例えば、（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、及び／またはそれらの組み合わせ等のサイトカイン）であり得る。特定の実施形態において、単球性樹状細胞前駆体は、単球由来未成熟樹状細胞を形成するように分化される。
【００３７】
樹状細胞前駆体は、適切な培養条件で培養し、分化させることができる。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）等が挙げられる。細胞の分化を容易にするために、組織培養培地に、血清、アミノ酸、ビタミン、ＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−４等のサイトカイン、二価カチオン等を補充することができる。特定の実施形態において、樹状細胞前駆体は、無血清培地中で培養することができる。このような培養条件は、動物由来の生成物を任意に排除することができる。典型的な樹状細胞培養培地中の典型的なサイトカインの組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で、それぞれ約５００単位／ｍｌである。樹状細胞前駆体は、分化して未成熟樹状細胞を形成する場合、表現型的には皮膚ランゲルハンス細胞に類似している。未成熟樹状細胞は、典型的にはＣＤ１４−及びＣＤ１１ｃ＋であり、低レベルのＣＤ８６及びＣＤ８３を発現し、特殊エンドサイトーシスを介して可溶性抗原を捕捉することができる。未成熟ＤＣは非常に高レベルのＣＤ８６を発現した。また、集団は、ＣＤ１４及びＣＤ１１Ｃと混合された。大多数はＣＤ１１ｃ＋であったが、ＣＤ１１ｃ−及びＣＤ１４＋である別個の亜集団もあった。
【００３８】
未成熟樹状細胞は成熟して成熟樹状細胞を形成する。成熟ＤＣは、抗原を取り込んで、共刺激細胞表面分子及び種々のサイトカインの上方制御発現を示す能力を失う。具体的には、成熟ＤＣは未成熟樹状細胞よりも高いレベルのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ抗原を発現し、成熟樹状細胞は一般にＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋及びＣＤ１４−と同定される。より大きなＭＨＣ発現は、ＤＣ表面上の抗原密度を増加させ、一方、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御（ｕｐ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、Ｔ細胞上のＣＤ２８等の共刺激分子の対応部分を介してＴ細胞活性化シグナルを強化する。
【００３９】
本発明の成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞を、有効な量または濃度の核酸組成物及び腫瘍抗原組成物と接触させることによって調製（即ち、成熟）することができる。核酸組成物の有効量は、典型的には、培養皿あたりまたは細胞あたり、多くとも、少なくとも、または約０．０１、０．１、１、５、１０、１０まで、１５、２０、５０、１００ｎｇまたはｍｇの核酸であり、これらの間にあるすべての値と範囲を含む。腫瘍抗原組成物の有効量は、典型的には、培養皿あたりまたは細胞あたり、多くとも、少なくとも、または約０．０１、０．１、１、５、１０、１０まで、１５、２０、５０、１００ｎｇまたはｍｇのタンパク質である。特定の態様では、０．００１ｎｇの腫瘍抗原／細胞〜１μｇの腫瘍抗原／百万細胞）を使用することができる。腫瘍抗原組成物は、任意で、樹状細胞との接触前に熱失活させるか、または処理する（例えば、プロテアーゼに曝露する）ことができる。未成熟樹状細胞を核酸組成物及び腫瘍抗原組成物で成熟させることにより、成熟樹状細胞は１型（Ｔｈ−１）応答のために初回刺激される。
【００４０】
未成熟ＤＣは、典型的には、有効量の核酸組成物及び腫瘍抗原組成物と、多くとも、少なくとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０まで、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４分、時間、または日の間、接触する。未成熟樹状細胞は、適切な成熟培養条件で培養及び成熟させることができる。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）等が挙げられる。細胞の成熟を促進するために、組織培養培地にアミノ酸、ビタミン、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−４、二価カチオン等を補充することができる。
【００４１】
樹状細胞の成熟は、当該分野で公知の方法によってモニターすることができる。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学等の、当技術分野でよく知られているアッセイにおいて検出することができる。細胞はまた、サイトカイン産生についてモニターすることもできる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、または他の免疫アッセイにより）。樹状細胞前駆体、未成熟樹状細胞、及び成熟樹状細胞（抗原性を有するものまたは非抗原性のもの）は、後日使用するために凍結保存することができる。凍結保存のための方法は当該技術分野において周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７８８，９６３号を参照。
【００４２】
Ａ．遺伝的に改変された樹状細胞
実施形態の特定の態様は、遺伝子改変された樹状細胞に関する。いくつかの態様では、遺伝子改変は、阻害性核酸等の細胞内に外因性導入遺伝子を導入することを含む。さらなる態様において、導入遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で、チミジンキナーゼをコードする遺伝子等の自殺遺伝子であり得る。従って、いくつかの態様において、免疫応答を刺激した後、投与された樹状細胞は、自殺遺伝子の発現を制御するプロモーターの誘導によって死滅させることができる。
【００４３】
さらなる態様において、遺伝子改変は、細胞集団におけるゲノム欠失または挿入を含む。例えば、１つ以上のＨＬＡ遺伝子を破壊して、樹状細胞を治療すべき被験体の有効なＨＬＡ適合物とすることができる。
【００４４】
実施形態のさらなる態様は、例えば、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように、遺伝子改変された樹状細胞に関する。いくつかの態様において、遺伝子改変は、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性阻害性核酸の導入を含む。特定の態様において、阻害性核酸は、樹状細胞中のＤＮＡベクターから発現されるＲＮＡ等のＲＮＡである。さらなる態様において、阻害性核酸は、樹状細胞に導入されるｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。このようなＲＮＡの詳細な開示は前記で提供されている。
【００４５】
さらなる態様において、遺伝子改変は、ＣＴＬＡ−４を減少させる細胞集団におけるゲノム欠失または挿入を含む。他の態様において、樹状細胞は、ＣＴＬＡ−４遺伝子内の半接合性またはホモ接合性の欠失を含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現が阻害されるように、樹状細胞のＣＴＬＡ−４遺伝子の一方または両方のコピーを完全にまたは部分的に欠失させることができる。いくつかの態様では、１つ以上のＣＴＬＡ−４遺伝子を発現しないように細胞を改変することは、ＣＴＬＡ−４遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを細胞に導入することを含み得る。様々な態様において、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得る。様々な態様において、細胞に人工ヌクレアーゼを導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含み得る。
【００４６】
ＩＩＩ．併用療法
実施形態の樹状細胞療法の有効性を高めるために、これらの組成物を目的の疾患の治療に有効な他の薬剤と組み合わせることが望ましい場合がある。
【００４７】
いくつかの態様において、樹状細胞療法は、ＴＬＲアゴニスト、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ）、ＡＩＭｐ１、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−１）様受容体リガンドまたは細胞質ゾルＤＮＡ（ＣＤＳ）受容体リガンド等の分子と共に投与される。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９アゴニストであり得る。タイプＩ  ＩＮＦは、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κまたはＩＦＮ−ωであり得る。例えば、ＴＬＲ−７アゴニストは、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、ＧＳ−９６２０、Ｐｏｌｙ（ｄＴ）、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、ロキソリビン及びｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる群より選択され得る。ＴＬＲ−９アゴニストの例としては、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）が含まれる。他のＴＬＲアゴニストは、例えば、米国特許公開第２０１４／０００５２５５号に記載されており；これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
当技術分野で公知のＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）リガンドは、ＲＩＧ−１、Ｍｄａ５、ならびにＬＧＰ２シグナル伝達の活性化因子を指す。これらのリガンドとしては、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、及び５’−三リン酸ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＩＧ−Ｉ様受容体リガンドはまた、ＲＬＲ様生物学的活性をもたらす、ＲＩＧ−Ｉ、Ｍｄａ５及びＬＧＰ２の結合及び活性化を導くことができる、ＲＮＡ分子に導入された任意の改変（修飾）を言う。いくつかの態様では、ＲＬＲリガンドは、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡまたはＣＡＲＤＩＦとしても知られるＩＰＳ−１等の共通アダプタータンパク質のモジュレーターであり得る。例えば、ＲＩＧ−１様受容体リガンドは、ＭＤＡ５リガンド、ＬＧＰ２リガンド、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群より選択される。
【００４９】
特定の態様において、初回刺激された樹状細胞集団は、ＣＤＳ受容体リガンドと共に投与される。いくつかの態様において、ＣＤＳ受容体リガンドは、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドとしてさらに定義される。例えば、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧリガンドは細菌性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。核酸、タンパク質、ペプチド、または小分子等の他のｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧアゴニストは、例えば国際特許公開ＷＯ２０１５／０７７３５４に記載されている。
【００５０】
非限定的な例として、癌の治療は、他の抗癌剤と共に本実施形態の初回刺激された樹状細胞組成物により実施することができる。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させること、癌細胞においてアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを縮小すること、がんの成長を阻害すること、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させること、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答の促進すること、癌の進行の予防または抑制すること、または癌を有する被験体の寿命の延長することにより、被験体における癌に負に影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の増殖を中止または阻害するのに有効な組合せ量で提供される。このプロセスは、細胞を、抗癌ペプチドまたはナノ粒子複合体と、薬剤または複数因子とに同時に接触させることを含み得る。これは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤を細胞に接触させることによって、または同時に、２つの異なる組成物又は製剤（一方の組成物が樹状細胞組成物を含み、他方が第二の薬剤を含む）と細胞を接触させることによって、達成することができる。
【００５１】
樹状細胞組成物での処置は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置の前または後に行なうことができる。他の薬剤及び樹状細胞組成物が被験体に別々に適用される実施形態では、薬剤と樹状細胞組成物が依然として細胞に対して有利な組み合わせ効果を及ぼすことができるように、各送達の時間の間においてかなりの期間が期限切れとならないことが一般的には保証されるであろう。このような場合、相互に約１２〜２４時間以内、より好ましくは相互に約６〜１２時間以内に両方の方法で細胞と接触し得ることが企図される。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日間（例えば、２、３、４、５、６または７日）から数週間（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８週間）経過した時点で、治療の期間を有意に延長することが望ましい場合がある。
【００５２】
樹状細胞療法が「Ａ」であり、放射線療法、化学療法または抗炎症剤のような第２の薬剤が「Ｂ」である様々な組合せを採用することができる。
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
特定の実施形態において、本実施形態の樹状細胞治療の患者への投与は、もしあればベクターの、毒性を考慮に入れて、化学療法剤の投与のための一般的なプロトコールに従う。必要に応じて治療サイクルを繰り返すことが期待される。記載された過剰増殖性細胞療法と組み合わせて、種々の標準的な療法及び外科的介入を適用することも考えられる。
【００５３】
Ａ．化学療法
癌療法には、様々な併用療法も含まれる。いくつかの態様では、実施形態の樹状細胞組成物は、化学療法剤と共に投与（または処方）される。例えば、いくつかの態様において、化学療法剤は、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＡＫＴ、Ｅｒｂ１、Ｅｒｂ２、ＥｒｂＢ、Ｓｙｋ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＪＡＫ、Ｓｒｃ、ＧＳＫ−３、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫＫ、ｍＴＯＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ｅｐｈ受容体またはＢＲＡＦ阻害剤等のタンパク質キナーゼ阻害剤である。タンパク質キナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、アファチニブ、アキシニブ、ベバシズマブ、ボスチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、サラカチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ＡＰ２３４５１、ベムラフェニブ、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、Ａ−４４３６５４、ＶＱＤ−００２、ミルテフォシン、ペリフオシン、ＣＡＬ１０１、ＰＸ−８６６、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、アルボシジブ、ゲニステイン、セルメチニブ、ＡＺＤ−６２４４、バタラニブ、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＡＧ−０２４３２２、ＺＤ１８３９、Ｐ２７６−００、ＧＷ５７２０１６またはこれらの混合物が挙げられる。
【００５４】
さらに別の併用化学療法としては、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ等のアジリジン；エチレンイミン、及びアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチローロメラミンを含むメチルアメラアミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）等のニトロソ尿素；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩ及びカリケアマイシンオメガＩ１；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラマイシン；並びに、ネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗代謝物；デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体；カロテストロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；ミトタン、トリロスタン等の抗副腎；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルチミシン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロゾキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ”」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノヴァントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、及び上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書で提供される組成物は、ゲフィチニブと組み合わせて使用され得る。他の実施形態では、本実施形態は、グリーバクと組み合わせて実施することができる（例えば、約４００〜約８００ｍｇ／日のグリーバクを患者に投与することができる）。特定の実施形態では、１つ以上の化学療法剤を、本明細書で提供される組成物と組み合わせて使用してもよい。
【００５５】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されてきた他の因子としては、通常、γ線、Ｘ線として知られているもの、及び／または腫瘍細胞への放射性同位元素の指向性送達が挙げられる。マイクロ波及びＵＶ照射等のＤＮＡ損傷因子の他の形態も考えられる。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、及び染色体のアセンブリ及び維持に対して広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）で、１日用量が５０〜２００レントゲンの範囲から、２０００〜６０００レントゲンの単回用量までの範囲がある。放射性同位元素の投与量範囲は広く変化し、同位体の半減期、放出される放射線の強さ及びタイプ、腫瘍細胞による取り込みに依存して変わる。
【００５６】
用語「接触した」及び「曝露された」は、細胞に適用された場合、本明細書では、そのプロセスよって治療組成物及び化学療法剤または放射線治療剤が、標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接的に並んで配置される、当該プロセスを記載するために使用される。細胞死滅または停滞を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺すか、または細胞が分裂するのを防ぐのに、有効な合わせた総量で細胞に送達される。
【００５７】
Ｃ．遺伝子治療
さらに別の実施形態において、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが治療用組成物の前、後、または同時に投与される遺伝子治療である。遺伝子産物発現のためのウイルスベクターは当技術分野では周知であり、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス、ＳＶ４０等のパピローマウイルスなどの真核生物発現系を含む。あるいは、発現構築物の投与は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞等の脂質ベースのベクターを用いて達成することができる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９８；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９６参照）。
【００５８】
Ｄ．手術
癌を有する人の約６０％は、予防、診断または病期診断、治癒的及び緩和的手術を含む何らかのタイプの手術を受ける。治癒手術は、本明細書で提供される治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法等の他の療法と併用し得る癌治療である。
【００５９】
治癒手術には、癌組織の全部または一部を物理的に除去、摘出及び／または破壊する切除が含まれる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。手術による治療には、腫瘍切除の他、レーザー手術、凍結手術、電気外科、及びマスク制御の手術（モース手術）が含まれる。さらに、本発明の実施形態は、表在性癌、前癌状態、または付随する量の正常組織の除去と併せて使用され得ると考えられる。いくつかの態様では、腫瘍切除後、実施形態の樹状細胞組成物を、以前の腫瘍部位を排出したリンパ組織に投与する。
【実施例】
【００６０】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために記載される。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能する、発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施の好ましい態様を構成すると考えることができることは、当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、そしてまた同様のまたは類似の結果が得られることを認識するべきである。
【００６１】
実施例１−材料及び方法
下記の実施例で使用されるように、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ及びＦＶＢマウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）またはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＨ２−ＤＭノックアウトマウスは、チャペルヒルのノースカロライナ大学のＪｅｎｎｙ  Ｔｉｎｇ博士からの親切な贈り物であった。ＦＶＢバックグラウンドのＰｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１トランスジェニックマウスは、記載されているように（Ｃａｒｓｔｅｎｓら，２０１４）、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＤａｖｉｄ  Ｓｐｅｎｃｅｒ博士の実験室で作製された。すべてのマウスは、ベイラー医科大学の特定のＩＡＣＵＣ要件に従って維持された。
【００６２】
ワクチン材料の調製、ＤＣの負荷及びインビトロでの共培養  −  １０週齢の雄マウスから膣小胞（ＳＶ）及び前立腺を採取し、直ちに−８０℃で凍結した。ＲＡＷ２６４．７、Ｂ１６−Ｆ１０，４Ｔ１、及びＷＰＭＹ−１細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、Ｔ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中にて３７℃、５％ＣＯ２で、コンフルエントになるまで増殖させ、採取し、直ぐに−８０℃で凍結させた。ペプチドを８０：２０のｄＨ２Ｏ：ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に再構成し、−８０℃で保存した。ＭＨＣクラスＩ（ｍＲＮＡ）またはＩＩ（溶解物）決定基を形成するために、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１２００Ｅ組織ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｉｎｃ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用いて、組織画分を最初に破壊した。細胞溶解物を形成するために、ホモジナイズした組織懸濁液をＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で５０ｍｇ／ｍｌに希釈し、反復凍結融解サイクルに付し、−２０℃で保存した。ｍＲＮＡを形成するために、メーカーの指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ホモジナイズした組織から全ＲＮＡを単離し、そしてｍＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って全ＲＮＡから単離した。ｍＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、完全性をゲル電気泳動で確認した。ヒト（Ｄｅｃｋｅｒら，２００６；Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）及び野生型マウス（Ｋｏｎｄｕｒｉら，２０１３）の樹状細胞を、記載のように調製し、負荷し、成熟させた。ｓｉＲＮＡの使用は、製造元の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に従って実施した。Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣの成熟カクテルにさらに１μｇ／ｍｌのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を補充した。インビトロ共培養は以前に記載されたように行った（Ｄｅｃｋｅｒら，２００６；Ｄｅｃｋｅｒら，２００９；Ｋｏｎｄｕｒｉら，２０１３）。
【００６３】
ワクチン接種  −  治療的にワクチン接種した全てのマウスに、５×１０４〜５×１０５のＤＣを腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与し、及び２０％ＤＭＳＯ／８０％ＡＩＭ−Ｖに懸濁されたが可溶化されていない０．５ｍｇのイミキモド（ＬＣ  Ｌａｂｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）も腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。マウスに図１２に示すように１〜４回ワクチン接種した。異なるワクチン処理は、ｍＲＮＡが負荷したＤＣ、溶解物が負荷したＤＣ、同種または異種のｍＲＮＡのいずれかと溶解物が同時に負荷したＤＣ、同種ｍＲＮＡ及び溶解物及びＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡが負荷したＤＣ、及び無負荷ＤＣを包含した。多数のワクチン接種を１０日間隔で行った。ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）／Ｏｖａ負荷ＤＣがワクチン接種されたマウスは、フットパッドでワクチン接種され、イミキモドを受けなかった。
【００６４】
組織学的及び総体的分析  −  オリンパスＤＰ７０デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を有するオリンパスＣＸ４１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を使用する光学顕微鏡による肉眼的組織学的分析のために、パラフィン切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。前立腺癌の盲目組織病理学的スコアリングは、奥行きの異なる２つの区画で観察された、前部、腹部、背外側のすべてのフィールドの間に存在する病気の優勢段階に基づく４点スケールからなるものであった：０＝正常、１＝過形成、２＝ＰＩＮ、３＝腺癌、４＝過渡期。優勢な段階を見分けることができなかった場合、半分の点数が許容された。
【００６５】
ＭＲＩ分析  −  前立腺及び精嚢のＭＲＩは、３５ｍｍ容積の共鳴器（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を有する９．４Ｔ、２１ｃｍボア水平スキャナを用いて行った。リラクゼーション強調（ＲＡＲＥ）画像を用いて３次元（３Ｄ）ターボ迅速取得を得るために使用された画像化パラメータは、以下の通りであった：ＴＲ＝３０００ｍｓ；有効ＴＥ＝３０ｍｓ；ＦＯＶ＝３０ｍｍ３；マトリックス＝１２８×１２８×１２８；ＲＡＲＥファクター＝８；平均数＝１。画像はＰａｒａｖｉｓｉｏｎソフトウェアバージョン５（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）を用いて得た。画像化の間、マウスを、酸素と混合した０．２５％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で麻酔し、コア温度を３７℃に維持した。ＭＲＩ画像をＡｍｉｒａ  ３．１ソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析した。
【００６６】
ＣＴＬＡ−４／ｓＣＴＬＡ−４  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ  −  負荷され成熟したＤＣを１ｍＬ当たりＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍＬ当たり＜１×１０７の細胞で再懸濁し、全ＲＮＡを製造業者の指示に従って抽出した。ＲＮＡを１μｇ／μｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮａｓｅで処理されたＲＮＡサンプルから合成し、ＣＴＬＡ−４  Ｆｗｄプライマー：ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＣＴＬＡ−４  Ｒｅｖプライマー：ＴＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を用いて５５℃のアニーリング温度にて３５サイクルＰＣＲで増幅した。可溶性及び膜結合ＣＴＬＡ−４アイソフォームの両方に対応する転写物を増幅するようにプライマーを設計した。
【００６７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ画像の定量  −  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ化学発光シグナルを、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアバージョン２．０．１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を実行するＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳデジタルイメージングシステムを使用して検出した。すべてのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色膜の濃度測定によって定量した。細胞死からの残存細胞溶解物または破片による上清の汚染は、抗−β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫染色及び追加の濃度測定によって制御された。濃度測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて行った。単一膜上のｓＣＴＬＡ−４及びＡＩＭｐ１の両方の検出のために、膜を、最初に抗ＣＴＬＡ−４で典型的にプローブし、その後、製造者の指示に従ってＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｒｅｓｔｏｒｅバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で剥がし、抗ＡＩＭｐ１で再プローブした。
【００６８】
Ｐｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１前立腺癌治療モデル  −  Ｐｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１マウスを、承認されたＩＡＣＵＣプロトコールに従って病原体を含まない施設に収容した。二重トランスジェニックマウスを作製し、記述したように遺伝子型を決定した（Ｃａｒｓｔｅｎｓら，２０１４）。マウスの治療を、６週齢から隔週で、薬物希釈剤（１６．７％プロパンジオール、２２．５％  ＰＥＧ４００、１．２５％  ＴＷＥＥＮ  ８０）中２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１００μｌをマウス腹腔中（ｉ．ｐ．）に注射することにより、開始した。マウスは、ＡＰ２０１８７処置して２４週間後に、１００μｌの２０％  ＤＭＳＯ中の５×１０４〜４×１０５負荷ＤＣ＋０．５ｍｇの微粒子イミキモド（ＬＣ  ＬＡＢＳ）を用いて、または０．５ｍｇのイミキモドのみを、泌尿生殖器下部領域に、腹腔中（ｉ．ｐ．）ワクチン注射した。マウスに１０日間間隔で４回のワクチン  ＋  イミキモド注射を与えた。ＡＰ２０１８７注射は、犠牲になるまで隔週で維持した。
【００６９】
自発的イヌ乏突起膠腫治療モデル  −  臨床ＭＲイメージングによるＣＮＳ悪性腫瘍の診断時に、大きい（＞２５ｋｇ）のイヌ患者が、翻訳ゲノム研究所（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により確立されたＩＡＣＵＣプロトコールにより所有者のインフォームドコンセントを得て非ランダム化第Ｉ相試験に登録された。犬の患者は開頭術及び保存的腫瘍切除を受け、その後切除された腫瘍は液体窒素中で急速凍結された。ワクチン抗原を調製するために、解凍した腫瘍標本を可溶性溶解物及びｍＲＮＡ成分に細分し、上記のように抗原画分を調製した。続いて、患者をＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）で動員し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で採取した。１０％イヌ血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）、１％  ａｎｔｉ−ａｎｔｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３０ｎｇ／ｍｌのｒｃＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＬ−４（ともにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を補充したＡＩＭ−Ｖ培地中での６日間の培養により、付着性単球画分からイヌＤＣを生成した。上記の腫瘍抗原を負荷した後、記載のものと同じであるが、１０ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＬ−１β、１５ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌのｒｃＴＮＦ−α（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）及び１μｇ／ｍｌ  ＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充された同じ培地を用いて負荷ＤＣを成熟させた。その後、ＤＣを採取し、超音波ソノグラフィーによる深部頸部リンパ節の近傍への両側注射のために２×５００μｌアリコートＰＢＳに再懸濁させた。複数の用量を投与する場合、注射は２週間間隔で行った。処置の間に、動物に１２週間のヒトＩＦＮ−αをアジュバント添加し、その後１週間に３回、用量当たり２〜８００万単位で皮下投与した。腫瘍体積は、デジタルＭＲＩ測定から次の式：体積＝４／３π（最小半径）２×（最大半径／最小半径）、によって決定した。
【００７０】
統計的分析  −  統計的有意性は、ｐ＜０．０５（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）として定義され、統計学的に適切な１つまたは２つの裾を有するスチューデントの非対応または対応ｔ−検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｒ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）によって決定された。複数の群間の統計的差異は、一元または二元配置のＡＮＯＶＡによって検証された。統計試験は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈバージョン１２．０のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００８で実行された。特に断らない限り、全ての正規化定量グラフは、３つの独立した実験からエラーバー＝＋／−ＳＤを用いて得た。
【００７１】
試薬  −  抗体：αＨｕｍａｎ  ＣＴＬＡ−４（ＥＬＩＳＡ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；αヒト／マウスＣＴＬＡ−４（ＷＢ）（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）；αヒト／マウスＡＩＭＰ１（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）；αＭｏｕｓｅ  ＩＬ−１２ｐ７０（ＥＬＩＳＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；αＨｕｍａｎ  ＣＤ８（ＩＣＨ）（Ｂｉｏｒｂｙｔ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、αＭｏｕｓｅ  ＣＤ８（フローサイトメトリー）、αＭｏｕｓｅ  ＣＤ２５，αＭｏｕｓｅ  ＣＤ３，及びαＭｏｕｓｅ  ＣＤ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；αＭｏｕｓｅ  ＣＤ８（インビボ枯渇）及びアイソタイプ対照（ＢｉｏＸＣｅｌｌ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）。αヒト／マウスβ-アクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。αＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した。ＨＬＡタイピング抗体：αＨＬＡ−Ａ２−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、αＨＬＡ−Ｂ８−ビオチン（Ａｂｃａｍ）及び非コンジュゲート化αＨＬＡ−ＤＲ３／ＤＲ６（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＴＬＲアゴニスト：ＴＬＲ−３アゴニストｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）−ローダミン、ＴＬＲ−９アゴニストＣｐＧ  ＯＤＮ−ＦＩＴＣ、及びＴＬＲ−５アゴニストフラジェリンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。ＴＬＲ−４アゴニストＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）−ローダミン及びＣｐＧ−ＦＩＴＣのＤＣ取り込みを確認し、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーにより定量し、ＭａｃＩｎｔｏｓｈのＦｌｏｗＪｏバージョン１０．０．００００３（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。すべてのＴＬＲアゴニストを１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ペプチド：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｎｅｗ  ＣａｌｅｄｏｎｉａヘマグルチニンペプチドＷＬＴＧＫＮＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＶＬＬＥＮＥＲＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（Ｄｅｃｋｅｒら，２００９に前述した）、並びにメチオニンをグリシンに置換した置換体ＷＬＴＭＫＮＭＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＲＮＬＬＷＬＴＭＫＮＭＬＹＰＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をＵｎｉｔｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）により合成した。オボアルブミンＨ−２Ｋｂ免疫優性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によって合成された。Ｈ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰ−重複ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成された。組換えオボアルブミンタンパク質はＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。組換えｅＧＦＰタンパク質はＢｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｍｏｕｔａｉｎｖ��ｅｗ，ＣＡ）から購入した。その他：ＡＩＭｐ１（ＳＣＹＥ１、マウス及びヒト）、β２−ミクログロブリン（マウス及びヒト）、及びＨＬＡ−ＤＭ（ヒト）ｓｉＧｅｎｏｍｅ  ＳＭＡＲＴプール及び非標的化ｓｉＲＮＡプールはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）から購入した。精製されたＧＦＰ  ｍＲＮＡは、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。
【００７２】
共免疫沈降アッセイ  −  ＤＣを指示通りに負荷し、１％ＮＰ−４０緩衝液＋プロテアーゼカクテル阻害剤（両者ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）で溶解する前に２日間熟成した。デブリを卓上微量遠心機で４℃、１４，０００ｒｐｍにて２０分間でペレット化し、その後の細胞溶解物を４℃で１時間、プロテインＧ＋アガロースビーズ懸濁液ＩＰ０４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で予め澄んだ状態にした。その後、溶解物を、抗ＡＩＭｐ１（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で被覆されたプロテインＧプラスビーズを用いて４℃で一晩回転させた。次いで、ビーズを、１％ＮＰ−４０緩衝液で３回、ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）変性緩衝液中で煮沸して免疫沈降物を回収した後、ＰＡＧＥによる分析を行った。
【００７３】
５１Ｃｒ溶解アッセイ  −  ５１Ｃｒ溶解アッセイは、以前に記載されたように実施した（Ｄｅｃｋｅｒら，２００６）。
【００７４】
４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍モデル  −  ４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍細胞を、ｐＧＬ４．１０からｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｈｙｇｒｏ発現ベクターへのＰＣＲ−増幅ｌｕｃ２カセットのクローニングにより調製した。線状化ベクターを４Ｔ１親細胞にエレクトロポレーションし、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシン選択を２週間にわたり適用した。腫瘍を生成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２．５×１０５個の４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞を皮内接種した。腫瘍の成長は、１日おきにキャリパー測定及びＩＶＩＳによってモニターされた。１００μｌの希釈剤中の０．５ｍｇのｄ−ルフィシリン（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射に続いてＩＶＩｓ画像を取得した。
【００７５】
実施例２−マウスＤＣのＡＩＭｐ１放出及びＴＨ１分極の特性評価
以前の研究では、抗原的に相同なＭＨＣクラスＩ及びＩＩの決定基を負荷することによって開始されたＤＣ  ＴＨ１分極のＴＬＲ及びＩＦＮ非依存性機構の存在が示唆された（Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）。ＡＩＭｐ１がこのプロセスにおいて役割を果たすかどうかを決定するために、本発明者らはＤＣに同種クラスＩ及びＩＩ抗原決定基を負荷し、ＴＨ１分極及びＡＩＭｐ１放出についてアッセイした。マウスＤＣは、細胞株または一次組織決定因子（ｍＲＮＡ及び溶解産物）を相同的に負荷した場合、単独または異種負荷されたＤＣ（図１Ｂ）と比較して、１０倍以上のＩＬ−１２ｐ７０（図１Ａ）並びにより著しく多いＡＩＭｐ１を分泌した。増強されたＡＩＭｐ１放出に加えて、クラスＩ及びＩＩの決定基が相同である場合、ＴＨ１  ＤＣはｓＣＴＬＡ−４を有意に分泌しなかった（図１Ｃ）。ＴＨ１分極におけるＡＩＭｐ１の役割を示す研究と一致して、ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡノックダウンは、同種負荷（図１Ａ）に応じてＩＬ−１２分泌を劇的に低下させ、そしてｓＣＴＬＡ−４分泌を復活させた（図１Ｄ）。従って、相同的に負荷されたＤＣは、ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡで電気穿孔された異種負荷のＤＣまたは同種負荷されたＤＣのいずれよりも、インビトロで有意により多くの活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した（図１Ｅ）。本発明者らは次に、インビボでこの同じ現象を探索するために、相同クラスＩＩ抗原の供給源としてＨ−２ＫｂクラスＩオボアルブミン（Ｏｖａ）エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ及び全Ｏｖａタンパク質を使用した。インビトロ実験と同様に、ＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋、及び特にＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋集団の拡大は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで電気穿孔され、同時にＯｖａを負荷されたＤＣにおいてのみ観察された。対照的に、単独負荷ＤＣ、異種負荷ＤＣ、またはＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡで処理した同種負荷ＤＣは、関連するＴ細胞集団に差異を示さなかった（図１Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＤＣ  ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの抗原的に関連する決定基による負荷は、分泌されたＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比の増加、ＩＬ−１２の下流放出、及び活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の産生増強を含むＴＨ１スキューを促進することを示す。
【００７６】
実施例３−ヒト系ＤＣ  ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４放出
ヒトＤＣにモデルＧＦＰ抗原（ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及び組換えＧＦＰタンパク質）を相同的に負荷すると、ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比の有意な増加が観察された（図２Ａ〜Ｂ）。次に、本発明者らは、マルチエピトープ系から以前特徴付けられたＭＨＣ結合ペプチドに移行した（Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）。クラスＩ及びＩＩペプチドがアミノ酸配列において重複する場合、ｓＣＴＬＡ−４分泌の減少及びＡＩＭｐ１分泌の増加は、負荷されたＤＣから日常的に観察された（図２Ｃ〜Ｅ）。ｓＣＴＬＡ−４分泌の差は、成熟前に観察されなかったが、重複ペプチドを負荷したＤＣからのＡＩＭｐ１放出は、ほぼ直ちにそして成熟前に開始し（図８）、これは、ＡＩＭｐ１放出の初期の上流の役割を示唆する。すべてのペプチドは、同一に調製され、そして単独または異種の様式で添加されかつ既知のＰＲＲリガンドを有さない場合、ＡＩＭｐ１及びｓＣＴＬＡ−４分泌に影響を与えなかったことから、ＡＩＭｐ１分泌／ｓＣＴＬＡ−４アブレーションのメカニズムが、ＰＲＲアゴニズムではなく、同時の同種ＭＨＣ負荷により実際に誘発されたと考えられた。それにもかかわらず、これらの実験を様々なＴＬＲアゴニストの存在下で繰り返した。抗原負荷がない場合、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、フラジェリン、またはＣｐＧ−ＯＤＮは、マウス（図示せず）またはヒトＤＣ（図２Ｄ〜Ｅ）からのｓＣＴＬＡ−４またはＡＩＭｐ１分泌を変化させなかった。さらに、種々の同種クラスＩ及びＩＩ結合ペプチドの使用は、ＤＣに同時に添加した場合、ＣＴＬＡ−４及びその対応するｍＲＮＡの両方をアブレーションしたが、単一または異種のクラスＩ及びＩＩ結合ペプチドを添加してもそのような効果はなかった（図２Ｆ）。ＡＩＭｐ１は、抗原負荷にかかわらずｍＲＮＡレベルで差を示さなかった。
【００７７】
この独自のＴＨ偏光キューの機能に対するＭＨＣ結合の重要性を確認するために、本発明者らはＨ２−ＤＭ−／−ＤＣを利用した。Ｈ２−ＤＭ分子シャペロンは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットから不変鎖のＣＬＩＰペプチドを除去する役割を担う。Ｈ２−ＤＭの非存在下では、ＣＬＩＰはＩ−ＡｂハプロタイプのクラスＩＩ結合ポケットにほぼ不可逆的に結合し、それによって外因性抗原を負荷する能力を排除する（Ｍａｒｔｉｎら，１９９６；Ｍｉｙａｚａｋｉら，１９９６）。外因性抗原を負荷することができないということは、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣの一次分子欠損である。Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣは、ＴＬＲ、ＮＬＲ、または他のＰＲＲにおいて既知の欠陥を有さず、ＴＬＲアゴニズムに適切に応答することが以前に示されている（Ｓｔｒｏｎｇら，１９９７）。非常に興味深いことに、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣは、結合したＣＬＩＰペプチドの存在に物理的に依存するＴＨ２極性表現型を示すことも報告されている（Ｒｏｈｎら，２００４）。同種のｍＲＮＡ及び溶解物を負荷した場合、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＯｖａを負荷した際に、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣはインビボでＡＩＭｐ１またはｓＣＴＬＡ−４の分泌を示さず、また活性化されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の増強された産生も刺激しなかった（図３Ａ〜Ｂ及び図１Ｆ）。むしろ、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣは、低レベルのＡＩＭｐ１及び高レベルのｓＣＴＬＡ−４を構成的及び不変的に分泌した（図３Ａ〜Ｂ）。ＤＣ  ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４放出及び下流ＴＨ１応答は、ＭＨＣ結合ペプチドの配列相同性を介して調節された。
【００７８】
Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内でＣＬＩＰを永続的に維持するので、本明細書に記載されるキューによってＨ２−ＤＭ−／−ＤＣにおけるＴＨ１分極を刺激する唯一の理論的方法は、ＣＬＩＰとの有意な相同性、すなわちＭＨＣクラスＩＩ結合−ＣＬＩＰ配列ＬＰＫＳＡＫＰＶＳＱＭＲＭＡＴＰＬＬＭＲＰＭＳＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）と重複するアミノ酸配列、を有するクラスＩ結合ペプチドの負荷によるであろう（Ｇｈｏｓｈら，１９９５）。この仮説を試験するために、本発明者らは、Ｈ−２Ｄｂに結合すると予測され、且つＣＬＩＰ（ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と完全な配列重複を有するクラスＩペプチドを設計した。次いで、本発明者らは、このＣＬＩＰ特異的Ｈ−２ＤｂクラスＩペプチドまたは十分に確立されたＨ−２ｂクラスＩ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）ペプチドのいずれかを対照としてＨ２−ＤＭ−／−ＤＣに負荷した。実質的なＡＩＭｐ１放出は、Ｈ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰを負荷した細胞からのみ、用量依存した態様で観察された（図３Ｃ）。同様に、ｓＣＴＬＡ−４分泌の減少は、再び用量依存した態様でＨ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰを負荷したＨ２−ＤＭ−／−ＤＣからのみ観察された。野生型の同系脾臓細胞が負荷されたＨ２−ＤＭ−／−ＤＣの続く共培養は、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣにＨ−２Ｄｂ  ＣＬＩＰを負荷した場合にのみＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加をもたらした（図３Ｄ）。これらのデータは、以前の結果を検証し、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩに同時に結合したペプチドのアミノ酸配列に匹敵する内因性ＤＣ機構プロセスの高いレベルの特異性を示唆する。
【００７９】
ＡＩＭｐ１及びｓＣＴＬＡ−４分泌の摂動に必要なクラスＩ及びＩＩ配列相同性の程度を決定するために、本発明者らは、２つの非アンカーグリシン残基のメチオニン置換を除いて同一である相同結合ペプチドの２つの異なる対を利用した（図３Ｅ）。ヒトＤＣへのこれらのペプチド対の負荷は、一方または他方のＨＬＡクラスＩまたはＩＩ結合ペプチドの置換がＣＴＬＡ−４分泌の阻止及びＡＩＭｐ１分泌の増大を防止するのに十分であり、相補的ペプチドに対する代償的置換は、以前に見られた同種の表現型を回復させるのに十分であったことを示した（図３Ｅ〜Ｆ）。ｃｏＩＰ及びウエスタンブロットにより検証されたタンデム質量分析（図示せず）は、ＡＩＭｐ１がＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の両方と、特に成熟ＤＣ内で、顕著に相互作用することを示した（図９）。その後、発明者等は、同種及び異種のペプチド対を使用して、ＡＩＭｐ１／ＭＨＣ相互作用が同種クラスＩ及びＩＩペプチドが負荷された場合にのみ有意に減少し（図３Ｇ）、細胞からのＡＩＭｐ１分泌の増加との良好な相関関係が観察されることを、ＡＩＭｐ１  ｃｏＩＰにより実証した。複数のクラスＩ、クラスＩＩ、または異種クラスＩ及びＩＩペプチドが負荷された場合、同様の所見は観察されなかった。ｍＲＮＡ及び溶解物を用いた実験は、同一の結果を生じた：ＡＩＭｐ１は、単独の、または異種ｍＲＮＡ及び溶解物を負荷した、ＤＣ中のＭＨＣに結合したままであったが、同種のｍＲＮＡ及び溶解物を負荷したＤＣでは、ほとんどＡＩＭｐ１がＭＨＣに結合していなかった（図１０）。
【００８０】
ヒトの系において、クラスＩ及びＩＩエピトープ間の配列重複からもたらされるＴＨ１分極が伝統的なＭＨＣ結合と無関係に生じ得るかどうかをさらに決定するために、本発明者らは、β２−ミクログロブリンまたはＨＬＡ−ＤＭに対するｓｉＲＮＡを利用するが、これらはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩにそれぞれにペプチド抗原を負荷する能力に有意に影響する。クラスＩまたはクラスＩＩのいずれかを負荷する能力が妨げられた場合、ＤＣは、同種クラスＩ及びＩＩペプチド負荷に依存してＡＩＭｐ１及びＣＴＬＡ−４分泌を調節する能力を失った（図１１Ａ〜Ｂ）が、これはマウス由来の以前のデータと一致する所見である（図１Ｆ及び３）。全体として、このデータは、ＤＣが、重要なシグナル伝達分子の放出を調節するＴＬＲ非依存性の抗原性配列依存機構を有し、その摂動は下流ＴＨ分極及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に著しく影響を及ぼすとの仮説を堅く支持している（Ｄｅｃｋｅｒら，２００６；Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）。
【００８１】
実施例４−配列依存性機構の生理学的関連性
この新たに特徴付けられた機構の生理的関連性を確認するために、本発明者らは、正常な免疫学的自己への耐性を破壊する相同抗原負荷の能力を特性化した。本発明者らは、ＭＲＩによって容易に視覚化される、精巣小胞（ＳＶ）及び前立腺、絡み合っているが抗原的に異なる泌尿生殖器官を含む野生型組織に対する複数の相同性負荷ＤＣワクチンを作製した。野生型マウスには、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）の刺激によりウイルス感染の環境を模倣するアジュバントであるイン・サイチュのイミキモド（ｉｍｑ）と共にＳＶ  ｍＲＮＡ及び溶解物を負荷した０．５〜２．０×１０５ＤＣを１〜４回、腹腔内(ｉ．ｐ)注射（図１２）により与えた。処置の１ヶ月以内に、ＳＶ負荷ＤＣを注射したマウスは、線維症及び壊死、平滑筋及び上皮過形成、内腔の拡張及び凝集、及び混合系統の炎症性浸潤を含む特徴的な病理学的変化を示した（図４Ａ）。ＳＶ撲滅は、ＭＲＩによって縦方向にモニターすることができ、１ヶ月の治療後にＭＲ画像化可能な組織の区画化された喪失が観察された（図４Ｂ）。ワクチン接種後６ヶ月までに、ＳＶ負荷ＤＣを受けたマウスは、主に線維化組織からなる残留構造のみを保持した（図４Ｃ）。免疫組織化学によってＣＤ８＋浸潤を確認した（図４Ｄ）。ワクチンの特異性及び記憶を実証するために、脾臓細胞を、ワクチン接種後２ヶ月で、コントロールしたマウス、またはＳＶワクチンを接種したマウスのいずれかから採取し、追加のアジュバント接種なしにナイーブマウスに養子移入した（図１３）。６週間以内に、養子移入したマウスのＳＶは、一次ワクチン接種を受けたマウスと同じ特徴的な免疫病理を示した（図４Ｅ）。
【００８２】
前立腺は、ＳＶに隣接して位置し、その前方及び側方の葉に沿って境界を共有する。野生型前立腺ｍＲＮＡ及び溶解物を相同的に負荷したＤＣを投与し（図１２）、マウスをＭＲＩでモニターした。正常な病状を維持した対照マウス（図５Ａ〜Ｃ）と比較して、ワクチン処置マウスは組織損失（図５Ｅ）に対応するより弱い前立腺ＭＲＩシグナル（図５Ｄ）を示し、ワクチン接種したＳＶ（図５Ｆ）と類似した疫病理を示した。前立腺ワクチン接種の結果として線維化は観察されず、むしろ前立腺組織は完全に消失する傾向があった（図５Ｇ〜Ｈ）。本発明者らは、さらに、部分的ＨＬＡ適合ヒトＤＣにＷＰＭＹ−１抗原決定基を相同負荷すること（図１４）による、ヒト正常前立腺細胞株ＷＰＭＹ−１に対する増強されたＣＤ８＋応答を生成する能力を示し、これはヒト治療への潜在的適用性を示唆することを示した。
【００８３】
２つの抗原的及び空間的に関連する自己組織系に対するワクチン特異性の形成は、免疫学的特異性の識別を可能にした。示されるように、マウスが前立腺負荷ＤＣで処置された場合、病理は専ら前立腺特異的であった（図５Ｉ）。反対に、マウスにＳＶ負荷ＤＣを投与した場合は、病変は専らＳＶ特異的であった（図５Ｊ）。実際、異なる用量の範囲にわたった免疫学的自己に対する６９匹のマウスのワクチン接種は、観察可能な的外れ効果を生じなかった（示さず）。集団的には、適切なワクチン反応性が、相同負荷ＤＣ（３７／６３）をワクチン接種したマウスの５９％において観察されたが、組織溶解物負荷ＤＣ（ｎ＝３５、ｐ＜０．００１）をワクチン接種されたマウスでは０％、及び組織ｍＲＮＡ（ｎ＝１２、ｐ＜０．００１）をワクチン接種されたマウスでは０％であった。
【００８４】
実施例５−生理的新形成の研究
生理学的新生物に対処するこの戦略の能力を決定するために、本発明者らは様々な異なるモデル系を利用した。４Ｔ１乳癌モデルでは、８日目に確立された４Ｔ１  ｌｕｃ２発現腫瘍を有するマウスのコホートに、同種ワクチン（親、ｌｕｃ２−４Ｔ１細胞由来）またはアジュバントのみの単回投与を与えた。６匹のアジュバント処置マウスのうち５匹が転移を起こして死亡したが、ワクチン接種したマウスは比較的小さな腫瘍を維持し、実験の終了時に明らかな罹患状態を示さなかった（図１５Ａ〜Ｂ）。このモデルにおけるＣＤ８＋細胞（従ってＴＨ１免疫）に対する腫瘍制御の依存性を実証するために、ナイーブ動物に２回用量の同種ワクチンを投与し、次いでＣＤ８＋細胞を枯渇させた。その後、脾細胞を回収し、２．５×１０５個の４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍細胞を予め接種した同系動物に養子移入した。示されたように（図１５Ｃ〜Ｄ）、アイソタイプ枯渇脾細胞が養子移入されたマウスは、ＣＤ８枯渇脾細胞が養子移入されたマウスよりも有意に高い生存率有意性を示し、ＣＤ８＋細胞が原発腫瘍の制御及び転移の広がりの両方の制御において決定的な役割を果たすことが示された。興味深いことに、異種ワクチン接種（４Ｔ１  ｍＲＮＡ／Ｂ１６．Ｆ１０溶解物）動物に由来するアイソタイプ枯渇脾細胞を用いて養子移入されたマウスは、最悪の状況に陥った。
【００８５】
高い生理学的関連性のモデルにおける同種ワクチン接種の効果を決定するために、本発明者らは、前立腺上皮における誘導ＦＧＦＲ１及びβ−カテニンシグナル伝達の際に生理学的自己複製前立腺癌が発生する遺伝子組換えＰｒｏ−Ｃａｔ／ＪＯＣＫ１モデルを利用した（Ｃａｒｓｔｅｎｓら，２０１４）。このモデルでは、マウスは前立腺肥大（８週）から前立腺上皮内新形成（ｍＰＩＮ、１２週）、腺癌（２４週）、及び遷延性肉腫（６０週）の段階に進行する。前立腺腺癌を２４週間誘導した後、マウスを屠殺し、癌性前立腺を切除して腺癌段階の抗原製剤を作製した。続いてマウスのコホートを２４週間誘導し、相同性を有するワクチンでワクチン接種治療した。追加の４ヶ月後にワクチン接種したマウスを屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色された前立腺の盲検病理学的スコアリングによって癌の進行を判定した。腺癌期の抗原を負荷したＤＣを受けたマウスは、過形成により進行したが、ｍＰＩＮではほとんど停止し、比較的小さい病理組織学的腺癌を示した（図６Ｂ及び６Ｄ）。さらに、ワクチン接種されたマウスは、ワクチン接種を受けていない、対照ワクチン接種された、またはアジュバントのみのグループでは観察されなかったリンパ球浸潤腺房（例えば、図６Ｂ．１挿入図）を示した。アジュバントのみを投与された誘導マウスは、典型的な腺癌を示した（図６Ｃ）。完全なワクチン療法を受けた誘導されていない対照マウスは、正常な前立腺との交差反応性を示さなかった（図６Ａ）。さらに、ワクチン接種は用量反応効果を示すようであった（図６Ｅ〜Ｊ）。
【００８６】
最後に、本発明者らは、大型動物系における自発性脳腫瘍に対するこのアプローチを、臨床的獣医学の背景におけるこのアプローチの実現可能性及び安全性を実証するために試験した。簡単に言えば、ＭＲＩによるＣＮＳ悪性腫瘍の診断時に、２匹の大きな（＞２５ｋｇ）イヌの獣医学的患者が、オーナーのインフォームドコンセントの同意を得て募集された。緩和ケアのステロイドの標準を受ける代わりに、イヌは開頭術と保存的腫瘍切除を受けた。腫瘍試料を可溶性溶解物及びｍＲＮＡ成分に細分化した。続いて、イヌ患者をＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）で動員させ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。付着性単球画分をＤＣに分化させ、同時に腫瘍溶解物及びｍＲＮＡ亜分画を負荷し、成熟させた。その後ＤＣを採取し、超音波ソノグラフィーを用いて深頸部リンパ節の近傍に注射するためにＰＢＳに再懸濁した。ワクチン接種と併せて、動物に、ヒトＩＦＮ−αを１週間に３回、用量当たり２〜８００万単位で１２週間皮下投与して、アジュバントした。このアプローチの安全性及び実行可能性を実証することに加えて、各動物はワクチン接種の開始時に迅速かつ有意な腫瘍収縮も示した。第１の動物は、５×１０５個のワクチン細胞の単回投与を受け、１ヶ月の追跡調査で５０％の腫瘍退縮を示した（図７Ａ〜Ｄ）。第２の動物は、３回の投与の間に５×１０６個のワクチン細胞を受け、１ヶ月の追跡調査で約８０％の腫瘍退縮を示した（図７Ｅ〜Ｈ）。２００日の中央生存期間は、比較可能な歴史的対照（Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌら，２０１３）のそれ（６９日）の３倍近くであった。
【００８７】
これらの実施例では、本発明者らは、以前は認識されていない予期せぬＤＣ制御チェックポイントの機構的基礎を特定したが、その完全な解明はワクチン免疫療法の領域内で臨床的目標を達成するために決定的に重要であろう。以前及び現在の研究は、同種クラスＩ及びＩＩ抗原によるＤＣの同時負荷が、インビトロ及びインビボでのＤＣ  ＴＨ１分極及び下流のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加を誘導することを示している（Ｄｅｃｋｅｒら，２００６；Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）。本発明者らは、この現象が、公知のＴＨ１分極機能を有する重要なサイトカインであるＡＩＭｐ１の上方制御された分泌に機械的に関連し、その放出がＣＴＬＡ−４及びその対応するｍＲＮＡ転写物の付随する下方制御分泌を伴ってＩＬ−１２分泌をアップレギュレートすることを実証している。ＡＩＭｐ１は、ＡＩＭｐ１  ｓｉＲＮＡノックダウン及び速度論的研究によって示されるように、ｓＣＴＬＡ−４及びＩＬ−１２の両方の上流で作用すると思われる。重要なことに、本発明者らは、相同な抗原負荷に応答するＡＩＭｐ１の放出がＴＬＲ非依存的に進行することを実証した。ＴＬＲアゴニズムは、ＡＩＭｐ１放出を増大させることができず、またはＣＴＬＡ−４分泌を減少させることができず、異種様式で添加した場合に、このような応答を刺激することができる同一のペプチド決定基も同様に作製されなかった。β２−ミクログルブリンまたはＨＬＡ−ＤＭのｓｉＲＮＡノックダウンは、同種のクラスＩ及びＩＩ結合ペプチドに応答するＤＣの能力を排除した。さらに、Ｈ２−ＤＭを欠き、従って外因性抗原を負荷することができないネズミＤＣは、ＭＨＣが無傷であり、パターン認識受容体は機能したままであった（Ｓｔｒｏｎｇら，２０１１）が、極性化することも、または下流ＣＤ８＋応答を増強することもできなかった。しかしながら、Ｉｉ  ＣＬＩＰのアミノ酸配列と重複する合成クラスＩ結合ペプチドによる、理論的にはこれらの細胞のクラスＩ及びＩＩを相同的様式で負荷する唯一の可能な方法での、Ｈ２−ＤＭ−／−ＤＣの負荷は、野生型比のＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４及び生成されたＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を用量反応的様式で放出した。これらの結果は、以前には記載されていない独特の方法である、ＴＨ１分極のこの方法におけるＭＨＣのペプチド結合の役割を強く示唆している。先天性ＰＲＲではなく抗原相同性に依存するＴＨ１分極をさらに実証するために、本発明者らは、以前に特徴付けられた（Ｄｅｃｋｅｒら，２００９）クラスＩＩ結合ペプチドにおいて２つの非アンカーアミノ酸置換を加え、これにより３つ以上のアミノ酸の連続クラスＩ及びＩＩ配列相同性が中断された。相同性のこのわずかな破壊が、分極化ＡＩＭｐ１／ｓＣＴＬＡ−４比を排除するのに十分であった。相補的アミノ酸置換をクラスＩペプチドに適用し、これによって完全な配列相同性を回復させることは、高いＡＩＭｐ１／ＣＴＬＡ−４比を回復させるのに十分であった。まとめると、これらのデータは、ＭＨＣクラスＩとＩＩ結合ペプチドとの間の高度の配列相同性に依存するＤＣにおける独特のＴＨ１極性化チェックポイントを示唆する。本発明者らは、このメカニズムが依存する重要なエフェクター分子を同定することに���えて、野生型マウスにおいて免疫寛容を破壊し、正常な免疫学的自己を根絶する組織特異的ワクチンの生成（以前に報告されていない現象）により生理学的関連性を実証した。更なる実験はまた、自発的な異系交配イヌモデルにおける乏突起膠腫に対する活性を示唆する実験を含む、３つの異なるモデル系における新生物に対する有意な活性も示した。
【００８８】
全体として、本発明者らは、全細胞系、単一抗原系、及び重複クラスＩ及びＩＩ  ＭＨＣ結合エピトープの複数の対を含む２９の異なるモデル系（表１）を使用して、相同性負荷ＤＣが異なるサイトカイン分泌、表面マーカー発現、全体的な転写改変、及びＣＤ８＋ＣＴＬの生成を増強する能力を含む様々なＴＨ１関連特性を示すこと（表２）を実証した。これらの２９種類の系のそれぞれにおいて、ＴＨ１分極を示す群の間の唯一の共通性は、ＤＣが負荷されたクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原との間の高度な抗原性またはアミノ酸配列の相同性であった。
【００８９】
表１．使用した抗原系、試験した種、及びＤＣへの抗原送達の方法の概要。＊＝以前に公開されたシステム。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００９０】
表２：同種ＤＣ負荷のマーカー及び発現を選択する。
【表２】
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【００９１】
本明細書に開示され、特許請求された方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく作り出され、実施され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、当業者には、本発明の概念、主旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法及び工程、または記載された方法の工程の順序を変更させることができることは明らかであろう。より具体的には、化学的に及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えて、同じまたは類似の結果を達成することができることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換及び改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の主旨、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
【００９２】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的手順または他の詳細を提供する限り、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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