(57)【要約】  包含されるのは、腫瘍を有する患者にＲＡＲαアゴニストを、少なくとも一種の他の治療と組み合わせて投与する工程を含む抗腫瘍免疫を増強する方法と、少なくとも一種の他の治療と組み合わせてＲＡＲαアゴニストを投与する工程を含む患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法である。【選択図】図１Ａ
2018512396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者において抗腫瘍免疫を増強する方法であって、
ａ．  ＲＡＲαアゴニストを、腫瘍を有する前記患者に投与する工程、及び
ｂ．  前記腫瘍を治療するために少なくとも一種の他の治療法を前記患者に提供する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも一種の他の治療法が、
ｉ．  腫瘍を有する前記患者へのチェックポイント阻害剤の投与；
ｉｉ．  腫瘍を有する前記患者へのワクチンの投与；及び
ｉｉｉ．  Ｔ細胞ベースの治療法での前記患者の治療
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＡＲαアゴニストが、
ａ．  ＡＴＲＡ
ｂ．  ＡＭ５８０
ｃ．  ＡＭ８０（タミバロテン）
ｄ．  ＢＭＳ７５３
ｅ．  ＢＤ４
ｆ．  ＡＣ−９３２５３
ｇ．  ＡＲ７
ｈ．  次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000014
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり、−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＡＲアゴニストがＲＡＭＢＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＲＡＭＢＡが、ケトコナゾール、リアロゾール、及びタラロゾールから選択される少なくとも一つである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＲＡＲαアゴニストが、同時の化学療法を伴わないで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも一種の他の治療法が、ＩＬ−１２、ＳＴＡＴ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＮ−γ、Ｒｕｎｘ３、ＩＬ−４リプレッサー、Ｇａｔａ−３リプレッサー、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、及びＤＬＬから選択されるＴｈ１分化治療薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一種の他の治療法がチェックポイント阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒチェックポイント阻害剤から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
チェックポイント阻害剤がＳＴＡＴ３枯渇を引き起こす、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、アゴニスト抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体から選択される抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一種の他の治療法が、抗原、腫瘍抗原、及び／又はがんワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも一種の他の治療法が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
二重特異性抗体が二重特異性Ｔ細胞誘導抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
二重特異性抗体が、抗ＣＤ２０と抗ＣＤ３；抗ＣＤ３と抗ＣＤ１９；抗ＥｐＣＡＭと抗ＣＤ３；並びに抗ＣＥＡと抗ＣＤ３から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも一種の他の治療法が、Ｔ細胞ベースの治療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞ベースの治療法が、エクスビボ細胞ベースの治療法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者が、黒色腫、腎細胞がん、非小細胞肺がん（扁平上皮がん及び／又は腺癌を含む）、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び頭頸部がんの少なくとも一つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
患者が、副腎皮質癌；エイズ関連がん（カポジ肉腫、リンパ腫）；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；非定型奇形腫様／横紋筋様腫瘍；基底細胞癌；胆管がん（例えば、肝外胆管がん）；膀胱がん；骨がん；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫；脳がん；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系胚細胞腫瘍；頭蓋咽頭腫；上衣腫；乳がん；気管支腫瘍；カルチノイド腫瘍；心（心臓）腫瘍；リンパ腫，原発性；子宮頸がん；脊索腫；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性骨髄増殖性腫瘍；結腸がん；結腸直腸がん；乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）；胚芽腫、子宮内膜がん；食道がん；感覚神経芽腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍（例えば、卵巣、精巣）；妊娠性絨毛性疾患；神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；下咽頭がん；膵島腫瘍、膵がん（例えば、膵神経内分泌腫瘍）；腎がん（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍）；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；口唇及び口腔がん；肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞、セザリー症候群、ホジキン、非ホジキン）；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）；男性乳がん；中皮腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮がん；ｎｕｔ遺伝子を含む正中線癌；口腔がん（mouth cancer）；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；鼻腔及び副鼻腔がん；鼻咽腔がん；神経芽細胞腫；口腔がん（oral cancer）；口腔咽頭がん；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍、低悪性度腫瘍）；乳頭腫症；傍神経節腫；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；胸膜肺芽腫；妊娠期乳がん（pregnancy and breast cancer）；原発性腹膜がん；前立腺がん（例えば、去勢抵抗性前立腺がん）；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫（子宮）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫）；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺がん；腎盂及び尿管の移行細胞がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がん、膣がん；外陰がん；又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
がんが、急性骨髄性白血病、胆管がん、膀胱がん；脳がん；乳がん；気管支腫瘍；子宮頸がん；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸直腸がん；子宮内膜がん；食道がん；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；腎（例えば、腎細胞）がん；肺がん（非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞）；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍）；膵がん；前立腺がん（去勢抵抗性前立腺がんを含む）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌）；小腸がん；扁平上皮癌；精巣がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がんから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者が、ＲＡＲα転座急性骨髄性白血病を有していない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＡＲαアゴニストがオールトランスレチノイン酸ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法であって、ＲＡＲαアゴニストと少なくとも一種の他の治療法を患者に施すことを含む方法。
【請求項２４】
患者が自己免疫疾患を有し、前記方法が自己免疫疾患を治療する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＦＮｇ＋及び／又はＩＬ１７＋シグネチャーを有するＴｈ１７細胞が抑制される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＡＲαアゴニストが、
ａ．  ＡＴＲＡ
ｂ．  ＡＭ５８０
ｃ．  ＡＭ８０（タミバロテン）
ｄ．  ＢＭＳ７５３
ｅ．  ＢＤ４
ｆ．  ＡＣ−９３２５３
ｇ．  ＡＲ７
ｈ．  次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000015
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物、及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＡＲαアゴニストが、Ｔ細胞抑制剤と共に共投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＡＲαアゴニストが、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アザチオプリン、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴルタクロリムス、コルチコステロイド（プレドニゾン等）、ジメチルフマレート、エタネルセプト、フィンゴリモド、酢酸グラチラマー、ゴリムマブ、ヒドロキシクロロキン、インフリキシマブ、レフルノミド、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ナタリズマブ、リツキシマブ、スルファサラジン、テリフルノミド、トシリズマブ、トファシチニブ、又はベドリズマブと共に共投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
自己免疫疾患が、ＩＦＮｇ＋ＩＬ１７＋Ｔ細胞シグネチャーを有する自己免疫疾患から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
自己免疫疾患が、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、又は多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）から選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年３月９日に出願され、その全体が出典明示により援用される、米国仮出願第６２／１３０２４０号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
［分野］
免疫療法を使用するがん及び自己免疫疾患の治療
【背景技術】
【０００３】
悪性疾患を標的とする免疫療法戦略は、トランスレーショナル臨床研究の活発な領域であり、数十年にわたり続いている。従前の手法で幾つかの肯定的試験データが示されてはいるが、臨床的に有効な更なる治療戦略が探られるべきである。当該技術分野では、特に、現在利用可能な治療法よりも幅広い範囲の患者に適用されるがん治療法が望まれている。同様に、自己免疫疾患に対する更に効果的な治療法もまた望まれている。
【０００４】
がん免疫療法（Ｉ−Ｏ）コミュニティは、ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４／ワクチン標的療法の有効性を増強するアプローチ及び治療薬を模索している。これら治療薬は、腫瘍抗原に対する生産的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を駆動することが知られており、がん患者に臨床的有用性をもたらす。ここに記載の新規な発見は、ＲＡＲαアゴニストがＴｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を駆動することと、単剤療法として又は他のＩ−Ｏ剤と組み合わせてのそれらの使用は直接的な腫瘍細胞分化剤としてのＲＡＲαアゴニストの使用とは異なることである。
【０００５】
ビタミンＡとその誘導体（レチノイド）は、レチノイン酸受容体のアゴニストであり、細胞増殖、分化及びアポトーシスに活性を有する。３種のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ−α、β、及びγ）があり、これら受容体は相補的レチノイドＸ受容体ファミリーのメンバー（ＲＸＲ−α、β、及びγ）とヘテロ二量体を形成する。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）はＲＡＲ受容体のみのアゴニストである。ベキサロテン及び１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）はＲＸＲ受容体にのみ結合する。ＡＴＲＡ及びベキサロテンは、ヒトのがん治療用に承認されている。
【０００６】
ＲＡＲα、β、及びγ受容体アゴニストであるＡＴＲＡは、急性骨髄性白血病のサブセット、特にＲＡＲα転座を有する急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）患者を全身的に治療するために使用されている。ＡＰＬでは、ＲＡＲα遺伝子は融合パートナー、典型的にはＡＰＬ遺伝子に異常に融合し、生じたタンパク質はＤＮＡに結合し、白血病の発症のもとである顆粒球分化を損なう転写コレプレッサーを補充する。ＡＴＲＡを用いた治療は、ＤＮＡからのコレプレッサーの放出を引き起こし、分化の抑制を解除し、顆粒球を正常に分化させる。しかしながら、この治療は、ＲＡＲα転座が起こったときにのみ適応が示され、よって非常に限られた範囲である。この狭い適応症は、ＡＭＬにおけるＡＴＲＡの有用性が、融合タンパク質に対する直接的な効果に関連し、その腫瘍細胞に融合タンパク質を伴う患者に限定されないであろうヘルパーＴ細胞に対する他の効果には関連しないことを明らかに示している。ＡＴＲＡの広範な使用に対する主要な制約の一つは、その多くの重度の毒性であり、これはＲＡＲβ又はＲＡＲγに対するそのアゴニスト作用のためでありうる。而して、選択的ＲＡＲαアゴニストは毒性が減少し、より広い有用性を有するであろう。ＡＴＲＡで観察される毒性には、潜在的に致命的な分化症候群、心毒性及び皮膚毒性が含まれる。
【０００７】
ＡＴＲＡは、過去では、パクリタキセルと組み合わせて投与される場合、乳がん研究において活性を示さなかった。細胞傷害性化学療法と併用した肺がんにおけるＡＴＲＡの臨床研究が進行中であるが、これらは、（典型的にはバイオマーカーとして測定される）ＲＡＲβの刺激による可能性が高い、細胞死に対するＡＴＲＡの直接的効果を利用することを狙っており、よって、一般にＴ細胞応答を抑制することが認められている細胞傷害性化学療法と組み合わせた使用である。
【０００８】
合成ＲＸＲアゴニストであるベキサロテンは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の全身治療用に承認されている。ベキサロテンは、他のヒト腫瘍における活性について臨床的に試験されているが、肺がん（化学療法と組み合わせた第３相治験）又は乳がんにおいて活性の確かな証拠は示されなかった。別のＲＸＲアゴニストである１３−シスＲＡは、前悪性口腔白板症の治療において試験されており、直接の病変縮小を誘導することが示されたが、メタアナリシスでは日常的な使用を支持するためには証拠が不十分であると示唆された。１３−シスＲＡはまた乳がんにおける単剤療法として納得できる活性を示さなかった。
【０００９】
また関係づけられている重要なＴｈ１サイトカインであるインターフェロン−γと共に、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞が生産的抗腫瘍免疫の発達にとって重要であることは十分に立証されている。腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞と共同して、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化及び安定化の促進が抗腫瘍免疫を増強することは広く示されている。Ｔｈ１細胞生物学におけるＲＡＲの役割はこれまで明らかにされておらず、がんの治療への意義は認識されていない。現在の研究でのみ、その経路が解明された。加えて、先行技術では、ＡＴＲＡは、一般にＴ細胞応答を抑制する細胞傷害性化学療法と併用されて投与されている。本発見でのみ、ＡＴＲＡ又は他のＲＡＲαアゴニストと免疫抑制性細胞傷害性剤の共投与が、一般にＴ細胞応答を抑制するＲＡＲαアゴニストの有益な影響を実際には減少させる（すなわち、これまでは知られていなかった免疫調節効果が生じるのを抑制又は完全に防止する）ことが明らかになる。ＲＡＲαアゴニストによる単剤療法アプローチ、又は免疫調節治療薬との併用は、これまでに記載されていない。
【００１０】
ある種のレチノイドは、自己免疫疾患の治療に使用しようと試みられているが、副作用及び催奇形性に関する潜在的な懸念によって制限されている。この研究で、ＡＴＲＡ及び他のＲＡＲアゴニストの免疫効果が、ＲＡＲβ又はＲＡＲγではなく、ＲＡＲαを介して起こることが今や理解される。而して、ＲＡＲαに特異的なアゴニストを用いて治療する方法は、有用性をもたらし、ＲＡＲβ又はＲＡＲγに関連する特定の副作用を排除することができる。
【００１１】
ここで、我々は、ＲＡ−ＲＡＲαがＴｈ１細胞系譜の維持に有用であることを示す。Ｔｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の喪失は、ハイブリッドＴｈ１−Ｔｈ１７及びＴｈ１７エフェクター細胞の出現をもたらした。ＲＡＲα結合及びエンハンサーマッピングの網羅的解析により、ＲＡ−ＲＡＲαが、Ｔｈ１７細胞運命を駆動する遺伝子を抑制しながら、Ｔｈ１７細胞系譜決定遺伝子におけるエンハンサー活性を直接調節したことを明らかにした。ＲＡシグナル伝達が存在しない場合、感染性及び経口抗原誘発性炎症は、Ｔｈ１７細胞表現型への逸脱を伴うＴｈ１細胞応答障害をもたらした。これらの知見は、Ｔｈ１７細胞運命を抑制しながらＴｈ１細胞応答を維持するように作用する調節ノードとしてＲＡ−ＲＡＲαを同定する。従って、ＲＡＲαアゴニストは、Ｔｈ１細胞応答を促進することによってがんを治療するために使用することができ、またＴｈ１７細胞を抑制することによって自己免疫疾患を治療するために使用することもできる。
【発明の概要】
【００１２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原刺激時に表現型が異なるヘルパーＴ細胞に分化する。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞系譜間の可塑性の調節は、免疫ホメオスタシス及び自己免疫疾患の予防に有用である。しかしながら、系譜安定性を調節する因子はほとんど不明である。ここで、我々は、伝統的に最も表現型的に安定したＴｈサブセットと考えられるヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞を使用して、系譜安定性の調節におけるレチノイン酸（ＲＡ）の役割を調べる。我々は、ＲＡが、その受容体ＲＡＲαを介して、Ｔｈ１７細胞運命を指示する遺伝子を抑制するだけでなく、Ｔｈ１系譜を特定する遺伝子の安定発現を維持することを見出した。ＲＡシグナル伝達は、Ｔｈ１細胞のＴｈ１７エフェクターへの変換を制限するため、並びに病原性Ｔｈ１７応答をインビボで妨げるために有用である。我々の研究は、Ｔｈ１細胞運命の維持及び可塑性を支配する制御ネットワークの構成要素としてＲＡ−ＲＡＲαを同定し、Ｔｈ１７細胞の発生の更なる経路を定める。
【００１３】
本説明に従えば、抗腫瘍免疫を増強する方法は、腫瘍を有する患者にＲＡＲαアゴニストを投与する工程と、腫瘍を治療するために患者に少なくとも一種の他の治療法を提供する工程を含む。このような少なくとも一種の他の治療法は、腫瘍を有する患者にチェックポイント阻害剤を投与すること、腫瘍を有する患者にワクチンを投与すること、及びＴ細胞ベースの治療法で患者を治療することから選択されうる。
【００１４】
別の実施態様では、患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法は、患者にＲＡＲαアゴニスト並びに少なくとも一種の他の治療法を施すことを含む。
【００１５】
更なる目的及び利点は、部分的には以下の説明に記載され、また部分的にはその説明から明らかになるか、又は実施によって知得ことができる。該目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素及び組み合わせによって実現され、達成されるであろう。
【００１６】
前述の一般的な説明と次の詳細な説明は双方とも例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００１７】
本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する添付図面は、一つの（幾つかの）実施態様を例証し、明細書と共に、ここに記載の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ−Ｃ】ＲＡは、Ｔｈ１エフェクター細胞とＴｈ１７エフェクター細胞との間のバランスを制御する。（Ａ）ｄｎＲａｒａ及び野生型同腹仔対照マウス（ＷＴ）マウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞。数字は、ＣＤ４＋細胞にゲーティングされたＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ細胞（左上）又はＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＴ細胞（右下）のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス（１群当たりｎ＝３〜４）のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉの頻度と全数（Ｃ）。
【図１Ｄ−Ｆ】（Ｄ）ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激した後の脾臓ＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉＴ細胞における細胞内ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａ発現。（Ｅ）（Ｄ）の細胞からの統計データ。（Ｆ）フローサイトメトリーによって選別された脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｏＣＤ４４ｈｉ細胞（１Ａの）におけるＴｂｘ２１、Ｒｏｒｃ及びＧａｔａ３の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。データは同様の結果の２回又は３回の独立した実験から得られた。平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図９も参照のこと。
【００１９】
【図２Ａ−Ｂ】Ｔｈ１７細胞分化及びＴｈ１細胞前駆体におけるＴｈ１７細胞運命の抑制に必要とされるＲＡシグナル伝達。ｄｎＲａｒａ又はＷＴマウス由来の選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で６日間培養した。（Ａ）ＰＭＡ及びイオノマイシンでの刺激後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの細胞内発現。（Ｂ）Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲγｔ発現。灰色のヒストグラムは、Ｔｂｘ２１−／−（左パネル）又はアイソタイプ対照抗体（右パネル）の染色を示す。数字はＭＦＩを示す。象限中の数字は、それぞれのＴ細胞のパーセントを表す。
【図２Ｃ−Ｄ】（Ｃ）マルチプレックスビーズアレイによって測定した、α−ＣＤ３及びα−ＣＤ２８を用いて（Ａ）の細胞を２４時間再刺激した後の上清中のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２及びＩＬ−１０の量。三通りの培養ウェル。（Ｄ）ＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激した後のＴｈ１及びＴｈ１７細胞シグネチャーサイトカイン及びＴＦ遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。
【図２Ｅ】（Ｅ）ｄｎＲａｒａ−ＩｆｎｇｅＹＦＰ及びＩｆｎｇｅＹＦＰマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で培養した。ＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激した後７日目にＩＦＮ−γ（ｅＹＦＰ＋）細胞を選別した。選択されたサイトカイン又はサイトカイン受容体（上パネル）及びＴＦ（下パネル）について差次的に発現された遺伝子の倍率変化（倍率変化＞１．５、ｐ＜０．０５）を示すヒートマップ。３回の独立した実験からのサンプル。少なくとも３回（Ａ、Ｂ）又は２回（Ｃ−Ｄ）の独立した実験の代表的データ。平均値±ＳＥＭ。図１０も参照のこと。
【００２０】
【図３Ａ−Ｂ】ＲＡは後期Ｔ−ｂｅｔ発現に必要とされる。（Ａ）ｄｎＲａｒａ及びＷＴマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ抗体の組み合わせを用いたＴｈ１条件下で分化させた。示された時点において分析されたＴ−ｂｅｔ発現。ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティングされたヒストグラム。（Ｂ）Ｔｈ１条件下で分化したｄｎＲａｒａ及びＷＴマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ４リン酸化のフローサイトメトリー分析。細胞を２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２で３０分間処理した後（実線）又は処理なし（破線）の３日後（左パネル）又は６日目（右パネル）に培養物から直接分析した。網掛けヒストグラムはＴｈ０条件下で培養された細胞におけるｐＳＴＡＴ４染色を示す。
【図３Ｃ−Ｄ】（Ｃ）培養６日目におけるＩＬ−１２Ｒβ２の細胞表面発現。（Ｄ）６日目のＩｌ１２ｒｂ１及びＩｌ１２ｒｂ２の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。
【図３Ｅ−Ｇ】（Ｅ）示された時点でのＴｈ１極性化細胞におけるＳｔａｔ４の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した発現。（Ｆ）Ｔｈ１培養の６日目の全ＳＴＡＴ４タンパク質のウェスタンブロット分析。（Ｇ）ｄｎＲａｒａ−ＩｆｎｇｅＹＦＰ及び対照マウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で活性化させた。生存ＣＤ４＋にゲーティングされた、示された時点におけるＩＦＮ−γ＋（ｅＹＦＰ＋）細胞の頻度。２ないし３回の独立した実験を代表するデータ。平均値±ＳＥＭ。図１１も参照のこと。
【００２１】
【図４Ａ−Ｂ】完全にコミットされたＴｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の喪失はＴｈ１可塑性及びＴｈ１７系譜への分岐をもたらす。（Ａ）ｄｎＲａｒａｌｓ１／ｌｓｌマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で分化させた。５日目及び７日目にＴｈ１細胞にＴＡＴ−Ｃｒｅを形質導入し、Ｔｈ１条件下で更に５日間再極性化した。Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲγｔの細胞内発現。（Ｂ）ＩｆｎｇｅＹＦＰマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で分化させた。ＩＦＮ−γ（ｅＹＦＰ＋）細胞を７日目に選別し、Ｔｈ１条件下で５日間、Ｖｅｈ又はＲＡｉの存在下で再刺激した。Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲγｔの細胞内発現。２回の独立した実験を代表するデータ。図１２も参照のこと。
【００２２】
【図５Ａ】ＲＡ−ＲＡＲαはＴｈ１系譜関連遺伝子座におけるエンハンサー活性を調節し、Ｔｈ１７遺伝子を抑制する。ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で６日間培養した後、クロマチン沈殿及び転写プロファイリングを行った。（Ａ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合は、ＷＴ Ｔｈ１細胞並びにＷＴ及びｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるｐ３００結合、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾においてＲＡＲαについてＴｂｘ２１遺伝子座を追跡する。
【図５Ｂ−Ｅ】（Ｂ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによるＷＴ Ｔｈ１細胞におけるＲＡＲα結合領域の検証。Ｕｎｔｒ６領域は負の対照となる。１０００細胞当たりの結合事象は「濃縮」として表示される。（Ｃ）Ｔｂｘ２１遺伝子座におけるｐ３００及びＨ３ｋ２７ａｃ存在量に対するｄｎＲａｒａ発現の効果を、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって検証した。（Ｄ）０、２４、４８、７２時間、Ｔｈ１細胞条件下で分化させたｄｎＲａｒａ又はＷＴ細胞由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢａｔｆ、Ｉｒｆ４及びＩｒｆ８ ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。平均値±ＳＥＭ、ウェル複製。（Ｅ）マイクロアレイ解析によって測定された遺伝子発現における倍率変化のＬｏｇ２値。平均倍率変化を示す。
【図５Ｆ】（Ｆ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合は（Ａ）のような細胞についてＩｒｆ８遺伝子座を追跡する。
【図５Ｇ】（Ｇ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによるＲＡＲα ＣｈＩＰ−ｓｅｑ領域の検証。
【図５Ｈ−Ｋ】（Ｈ−Ｊ）選択された遺伝子座におけるｐ３００及びＨ３Ｋ２７ａｃのＣｈＩＰ分析。（Ｋ）ＲＯＲｃ遺伝子座におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ分析。Ａｃｔｂ遺伝子座は負の対照となる。３回の独立した実験（Ｅ）又は２回の独立した実験（Ｂ−Ｄ、Ｇ−Ｋ）を代表するデータ。別段の記載がない限り、平均値±ＳＤ。略語：ｐｒｏ，プロモーター。図１３も参照のこと。
【００２３】
【図６Ａ−Ｂ】リステリア・モノサイトゲネス感染中でのＴｈ１７細胞産生を防止するために必要とされるＲＡシグナル伝達。（Ａ）リステリア・モノサイトゲネスの弱毒株（Ｌｍ−２Ｗ）での感染から７日後のｄｎＲａｒａ及びＷＴマウスの脾臓から単離されたＬＬＯｐ：Ｉ−ＡｂＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度。ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティング。（Ｂ）（Ａ）におけるようなＬＬＯｐ：Ｉ−ＡｂＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数。
【図６Ｃ−Ｄ】（Ｃ）ＬＬＯｐ：Ｉ−ＡｂＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティングされた細胞内Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲγｔ発現。（Ｄ）Ｌｍ−２Ｗでの感染の７日後に６時間ＬＬＯｐを用いて脾細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの細胞内染色。ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティング。右パネルは、３回の独立した実験（１群あたり３〜６匹のマウス）からプールされた統計データを示す。少なくとも３回（Ａ、Ｂ）又は２回の独立した実験（Ｃ）の代表的なデータ。平均値±ＳＥＭ。図１４も参照のこと。
【００２４】
【図７Ａ−Ｄ】ＲＡシグナル伝達の喪失は、腸炎症モデルにおいてＴｈ１及びＴｈ１７応答の調節不全及び病原性増加を引き起こす。（Ａ）養子移植実験の概略図。（Ｂ）移植７日後に（Ａ）のようなマウスの脾臓（Ｓｐ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び固有層のリンパ球（ＬＰＬ）からのＣＤ４＋細胞の中でのＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γの細胞内発現。（Ｃ）ＭＬＮ及びＳｐにおける（Ｂ）のようなＩＦＮ−γ＋、ＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１７＋細胞の頻度に対する統計データ。（Ｄ）（Ａ）のように処置されたＲａｇ１−／−レシピエント（１群当たりｎ＝５〜７）における元の体重のパーセンタイル変化。平均値±ＳＤ。
【図７Ｅ−Ｆ】（Ｅ）（Ａ）のようなＲａｇ１−／−レシピエント（ＯＴＩＩレシピエント ｎ＝３、ＯＴ−ＩＩ（ｄｎＲａｒａ）レシピエント ｎ＝５）の中の下痢のないマウスの頻度。（Ｆ）移植の９日後（ｎ＝１群当たり５〜６）の（Ａ）のようなマウスのＳｐ、ＭＬＮ、ＬＰＬ及びＩＥＬから単離したＣＤ４＋細胞におけるＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＦｏｘｐ３の頻度。１回の実験（Ｂ−Ｃ）、２回の独立した実験（Ｄ、Ｆ）からプールされた、又は２回の独立した実験（Ｅ）を代表するデータ。平均値±ＳＥＭ。
【００２５】
【図８】図８はグラフィカルな要約を提供する。レチノイン酸（ＲＡ）は炎症部位で産生される。Ｔｈ１指令サイトカインの存在下で、ＲＡは、部分的にはＩＲＦ８発現の誘導とＩＬ−６ＲＡの抑制を介して、Ｔｈ１７細胞へのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を抑制する。ＲＡは、Ｔ−ｂｅｔ発現を維持し、Ｒｕｎｘ１を抑制することによって、Ｔｈ１表現型を更に安定化させる。
【００２６】
【図９Ａ−Ｂ】図１に関連。ＲＡ ｓｉｇｎａｌｉｎｋａｔｅ７Ｅｇが欠損したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現。（Ａ）野生型同腹仔対照（ＷＴ）及びｄｎＲａｒａマウスの脾臓、胸腺及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の細胞内発現。（Ｂ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウスの脾臓（上パネル）及び胸腺（下パネル）におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の全数。データは２回の独立した実験を代表する。平均値±ＳＥＭ。
【００２７】
【図１０Ａ−Ｃ】図２に関連。ＲＡシグナル伝達の非存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及び分化。（Ａ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭで標識し、Ｔｈ１条件下で５日間培養した。生存ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティングされた色素希釈を示すフローサイトメトリー。（Ｂ）Ｔｈ１条件下で５日間培養したＷＴ又はｄｎＲａｒａマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４４及びＣＤ２５の細胞表面発現。（Ｃ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ０又はＴｈ２条件下で６日間培養した。細胞を、細胞内ＲＯＲγｔの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティングされた。
【図１０Ｄ−Ｅ】（Ｄ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス由来の選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１７条件下で６日間培養した。ＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激後の細胞内ＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γ発現。（Ｅ）ｄｎＲａｒａ−ＩｆｎｇｅＹＦＰ及びＩｆｎｇｅＹＦＰマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で培養した。７日目に選別されたＩＦＮ−γ（ｅＹＦＰ＋）細胞由来のＣｘｃｒ３及びＩｌ１２ｒｂ２の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。３回の独立した実験からのサンプル。２ないし３回の独立した実験（Ａ〜Ｄ）からの代表的なデータ。平均値±ＳＥＭ。
【００２８】
【図１１Ａ−Ｂ】図３に関連。ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１分化細胞におけるＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４活性。（Ａ）Ｔｈ１条件下で分化されたｄｎＲａｒａ及びＷＴマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４リン酸化のフローサイトメトリー分析。２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３で３０分間処理した６日後に細胞を分析。破線は未処理の細胞を表す。（Ｂ）棒グラフは、ＭＦＩによって評価されたｐＳＴＡＴ３／ｐＳＴＡＴ４シグナル伝達の比を示す。
【００２９】
【図１２Ａ−Ｂ】図４に関連。Ｔｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の時間的阻害後のサイトカイン分析。（Ａ）ｄｎＲａｒａｌｓ１／ｌｓ１マウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で培養した。５日目及び７日目にＴｈ１細胞にＴＡＴ−Ｃｒｅを形質導入し、Ｔｈ１条件下で更に５日間再極性化させた。ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの細胞内発現。（Ｂ）ＩｆｎｇｅＹＦＰマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で分化させた。ＩＦＮ−γ（ｅＹＦＰ＋）細胞を７日目に選別し、回収された細胞は、Ｖｅｈ又はＲＡｉの存在下、Ｔｈ１条件下で５日間二次再極性化を受けた。ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの細胞内発現。データは２回の独立した実験を代表する。
【００３０】
【図１３Ａ】図５に関連。ＲＡ−ＲＡＲαは、Ｔｈ１遺伝子においてエンハンサーを調節し、Ｔｈ１７系譜規定遺伝子を抑制する。ｄｎＲａｒａ及びＷＴマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、図５のようにＴｈ１条件下で培養した。６日後、ＣｈＩＰを特定の抗体で実施し、選択部位でのリアルタイムＰＣＲ分析（Ｂ-Ｃ）又は配列決定（Ａ）を続けた。（Ａ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合は、ＷＴ Ｔｈ１極性化細胞並びにＷＴ及びｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるｐ３００結合、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾においてＲＡＲαについてＳｔａｔ４及びＩｆｎｇ遺伝子座を追跡する。
【図１３Ｂ−Ｃ】（Ｂ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによる（Ａ）のＲＡＲα ＣｈＩＰ−ｓｅｑ領域の検証。Ｕｎｔｒ６領域は負の対照となる。表されたデータは入力に対して正規化された。（Ｃ）ＷＴ及びｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞における（Ｂ）の遺伝子座におけるｐ３００の存在量のＣｈＩＰ解析。表されたデータは入力に対して正規化された。
【図１３Ｄ−Ｆ】（Ｄ）Ｔｂｘ２１エンハンサーにおけるＳＴＡＴ４結合のＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析とＷＴ及びＳＴＡＴ４−／−Ｔｈ１細胞におけるｐ３００結合の比較。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータ（Vahedi等 2012及び Wei等, 2010）を、Ｔｂｘ２１遺伝子座におけるＲＡＲαのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合トラックと共にＵＣＳＣゲノムブラウザを用いてＤｅｃ．２０１１（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）マウスゲノムアセンブリにマッピングした。（Ｅ）（Ａ）のような細胞のゲノムワイド転写プロファイリング解析で差次的に発現したと同定された選択遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。平均値±ＳＥＭ。（Ｆ）示された時点でのナイーブｄｎＲａｒａ及びＷＴ ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーによるＩＬ６−Ｒαの細胞表面発現。灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照の染色を示す。データ（Ｂ〜Ｆ）は２ないし３回の独立した実験を代表する。特に記載のない限り、平均値±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００３１】
【図１４Ａ−Ｃ】図６に関連。リステリア・モノサイトゲネス感染後のｄｎＲＡＲａ Ｔ細胞によるサイトカイン産生。（Ａ）Ｌｍ−２Ｗに感染したｄｎＲａｒａ及びＷＴマウスからの脾細胞をＬＬＯｐで２４時間再刺激した。上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−４の濃度をマルチプレックスビーズアレイ（Biorad）によって測定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の全数に対してデータを正規化した。１群当たりｎ＝３〜４匹のマウス。（Ｂ）リステリア・モノサイトゲネス感染の７日後に６時間ＬＬＯｐを用いて脾細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の細胞内染色。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティング。（Ｃ）リステリア・モノサイトゲネス感染の７日後にｄｎＲａｒａ又はＷＴマウスの脾臓から単離されたＬＬＯｐ：Ｉ−ＡｂＣＤ４＋Ｔ細胞に対するフローサイトメトリーによるＩＬ−６Ｒαの細胞表面発現。４匹のプールマウスからのデータ。数字はＭＦＩを示す。２ないし３回の独立した実験を代表するデータ。平均値±ＳＥＭ。
【００３２】
【図１５】図７に関連。ｄｎＲａｒａ−ＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞における腸ホーミング。養子移植の９日後に、ＲＡＧ−／−レシピエントのＬＰＬ、ＩＥＬ、ＭＬＮ及び脾臓から回収されたＯＴＩＩ又はＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）ＣＤ４＋細胞の割合（１群当たりｎ＝３〜４）。２回の独立した実験を代表するデータ。平均値±ＳＥＭ。
【００３３】
配列の説明
表１は、ここで参照される所定の配列のリストを提供する。
2018512396.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［実施態様の説明］
Ｉ．ＲＡＲαアゴニスト
ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲを活性化するか、又はＲＡＲにおけるその活性が増加するようにレチノイン酸を維持する任意の薬剤を含みうる。これには、受容体と組み合わされたときに生理応答を開始させる物質と、レチノイド（例えば、レチノイン酸）の異化（又は分解）を防ぎ、レチノイン酸自体からのシグナルの増加を許容する物質とが含まれる。非限定的なリストとして、ＲＡＲαアゴニストには、ＡＴＲＡ、ＡＭ５８０、ＡＭ８０（タミバロテン）、ＢＭＳ７５３、ＢＤ４、ＡＣ−９３２５３、及びＡＲ７が含まれるが、これらに限定されない。更なるＲＡＲαアゴニストには、その更なるＲＡＲαアゴニストの化学構造の教示について出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２０１２／０１４９７３７号に提供されているものが含まれる。例えば、ＲＡＲアゴニストは、次の式の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含みうる：
2018512396.tif 000004
【００３５】
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、及びその塩、水和物、及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
【００３６】
幾つかの実施態様では、ＲＡＲαアゴニストはＲＡＲαに対して選択的であり、ＲＡＲβ又はＲＡＲγに対しては有意なアゴニスト効果をもたらさない。ある場合には、ＲＡＲβ又はＲＡＲγへの組み合わせた影響と比較して、アゴニスト効果の約１００％あるいは少なくとも約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、８５％、８０％、７０％、又は６０％がＲＡＲαに影響する。
【００３７】
幾つかの実施態様では、ＲＡＲαアゴニストは、レチノイン酸（例えば、レチノイン酸）の異化（又は分解）を防止し、レチノイン酸自体からのシグナルの増加を許容する少なくとも一種の物質である。そのような薬剤には、レチノイドの異化を阻害する薬剤であるレチノイン酸代謝遮断剤（ＲＡＭＢＡ）が含まれうる。ＲＡＭＢＡは、オールトランスレチノイン酸（オールトランスＲＡ）の内因性レベルをインビボで一時的に上昇させる。その際、それらは局所的なレチノイド効果を誘導し、過度の全身的レチノイド曝露を回避し、それによってレチノイン酸アゴニストに関連する毒性の問題の幾つかを回避する。ＲＡＭＢＡは、ＲＡＲαアゴニストとして作用するであろう。
【００３８】
幾つかの実施態様では、ＲＡＭＢＡには、ケトコナゾール、リアロゾール（liarozol）及び／又はタラロゾールが含まれる。
【００３９】
ＩＩ．がんを治療する方法
抗腫瘍免疫を増強する方法は、腫瘍を有する患者にＲＡＲαアゴニストを投与することによって探求されうる。所定の態様では、該方法は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｈ１分化状態を強固にし及び／又は維持する。幾つかの実施態様では、抗腫瘍免疫を増強する方法は、腫瘍を有する患者に免疫増強剤と共にＲＡＲαアゴニストを投与することを含む。
【００４０】
幾つかの実施態様では、患者は、ＲＡＲα転座急性骨髄性白血病を有していない。幾つかの実施態様では、患者はＲＡＲα転座を有していない。幾つかの実施態様では、ＲＡＲαアゴニストはオールトランスレチノイン酸ではない。
【００４１】
幾つかの実施態様では、ＲＡＲαアゴニストは、Ｔ細胞応答を一般に抑制する細胞傷害性効果を生じる伝統的な小分子化学療法薬を伴わないなど、併用の化学療法薬なしに投与される。一部の患者では、患者は先の化学療法は受けていない。他の患者では、患者は少なくとも約２週間、１、２又は３ヶ月以内は化学療法を受けていない。一部の患者では、任意にはＲＡＲαアゴニストが治療効果を示す限り、患者は少なくとも約２週間、１、２又は３ヶ月以内は、その後の化学療法を受けないであろう。
【００４２】
理論に束縛されるものではないが、我々は、ＲＡＲαアゴニストがＴＨ１細胞になりつつあるＴＨ０細胞を安定させ、またＴＨ１細胞の維持をもたらすことを発見した。従って、このアプローチは、単剤療法に使用されてもよく、又はＴＨ０からＴＨ１への分化経路を誘導する薬剤と組み合わせて使用されてもよい。
【００４３】
Ａ．がんの種類
幾つかの実施態様では、治療されるがんには、副腎皮質癌；エイズ関連がん（カポジ肉腫、リンパ腫）；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；非定型奇形腫様／横紋筋様腫瘍；基底細胞癌；胆管がん（例えば、肝外胆管がん）；膀胱がん；骨がん；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫；脳がん；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系胚細胞腫瘍；頭蓋咽頭腫；上衣腫；乳がん；気管支腫瘍；カルチノイド腫瘍；心（心臓）腫瘍；リンパ腫，原発性；子宮頸がん；脊索腫；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性骨髄増殖性腫瘍；結腸がん；結腸直腸がん；乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）；胚芽腫、子宮内膜がん；食道がん；感覚神経芽腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍（例えば、卵巣、精巣）；妊娠性絨毛性疾患；神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；下咽頭がん；膵島腫瘍、膵がん（例えば、膵神経内分泌腫瘍）；腎がん（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍）；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；口唇及び口腔がん；肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞、セザリー症候群、ホジキン、非ホジキン）；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）；男性乳がん；中皮腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮がん；ｎｕｔ遺伝子を含む正中線癌；口腔がん（mouth cancer）；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；鼻腔及び副鼻腔がん；鼻咽腔がん；神経芽細胞腫；口腔がん（oral cancer）；口腔咽頭がん；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍、低悪性度腫瘍）；乳頭腫症；傍神経節腫；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；胸膜肺芽腫；妊娠期乳がん（pregnancy and breast cancer）；原発性腹膜がん；前立腺がん（例えば、去勢抵抗性前立腺がん）；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫（子宮）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫）；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺がん；腎盂及び尿管の移行細胞がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がん、膣がん；外陰がん；又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症の少なくとも一つが含まれる。
【００４４】
幾つかの実施態様では、がんは、急性骨髄性白血病、胆管がん、膀胱がん；脳がん；乳がん；気管支腫瘍；子宮頸がん；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸直腸癌；子宮内膜がん；食道がん；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；腎（例えば、腎細胞）がん；肺がん（非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞）；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍）；膵がん；前立腺がん（去勢抵抗性前立腺がんを含む）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌）；小腸がん；扁平上皮癌；精巣がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がんである。
【００４５】
Ａ．がんのための併用療法アプローチ
ある態様では、ＲＡＲαアゴニストは、がん免疫療法剤（immuno-oncology agent）、すなわち免疫増強剤のような少なくとも一種の他の治療法と組み合わせて投与される。
【００４６】
幾つかの実施態様では、少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１分化を促進する。少なくとも一種の他の治療法を使用して、Ｔｈ１免疫応答を維持することができる。少なくとも一種の他の治療法を使用して、Ｔｈ１免疫応答を再導入することができる。幾つかの態様では、Ｔｈ１免疫応答は、腫瘍により発現される抗原に対するＴｈ１免疫応答である。
【００４７】
幾つかの実施態様では、少なくとも一種の他の治療法はＴｈ１分化治療薬である。Ｔｈ１分化治療薬は、限定しないが、ＩＬ−１２、ＳＴＡＴ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＮ−γ、Ｒｕｎｘ３、ＩＬ−４リプレッサー、Ｇａｔａ−３リプレッサー、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、及びＤＬＬの少なくとも一つから選択されうる。
【００４８】
幾つかの態様では、少なくとも一種の他の治療法はチェックポイント阻害剤である。例えば、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒチェックポイント阻害剤の少なくとも一つから選択されうる。チェックポイント阻害剤はまたＳＴＡＴ３枯渇を引き起こしうる。ＳＴＡＴ３枯渇は、細胞表面受容体阻害剤、キナーゼ阻害剤、及び直接的ＳＴＡＴ３阻害剤（ＳＴＡＴ３ ＳＨ２ドメイン阻害剤及びＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合ドメイン阻害剤を含む）を含む、アンチセンス技術又は小分子阻害剤によって達成されうる。ＳＴＡＴ３阻害剤は、ＳＴＡＴ３阻害剤の開示に対してその全体がここに援用されるFurtek等, ACS Chem. Biol. 11:308-318 (2016)に記載されている。
【００４９】
場合によっては、チェックポイント阻害剤は抗体である。このような抗体は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、アゴニスト抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体から選択されうる。
【００５０】
幾つかの態様では、チェックポイント阻害剤は、治療的Ｔｈ１応答を誘導し及び／又は維持するのを助ける。
【００５１】
幾つかの実施態様では、前記少なくとも一種の他の治療法は、腫瘍によって発現されるか又は発現される可能性のある一又は複数の抗原を含むワクチンである。ワクチンは、限定しないが、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、ウイルス様粒子、又は細胞ベースのベクターを含む様々な送達方法に基づくものでありうる。そのようなワクチンを投与して、腫瘍に対して免疫応答を媒介するであろう抗体又はＴ細胞を抗原に対して産生するように患者を刺激することができる。そのような併用療法では、ＲＡＲαアゴニストが、ワクチンで投与された抗原に対する応答を増強する。例えば、抗原がＴ細胞応答を誘導することが意図された場合、同時投与されるＲＡＲαアゴニストがＴｈ１促進「アジュバント」となり、更なる治療的有用性をもたらす。
【００５２】
幾つかの実施態様では、がん免疫療法剤は二重特異性抗体である。幾つかの実施態様では、がん免疫療法剤はＢＩＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）である。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０と抗ＣＤ３；抗ＣＤ３と抗ＣＤ１９；抗ＥｐＣＡＭと抗ＣＤ３；又は抗ＣＥＡと抗ＣＤ３を含む。
【００５３】
幾つかの実施態様では、併用療法は、エクスビボ細胞ベースの治療法のようなＴ細胞ベースの治療法である。Ｔ細胞受容体技術は、腫瘍上の特異的な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）及びペプチド構造を認識することができるＴ細胞受容体を伴うＴ細胞の培養又は操作を可能にする。例えば、Ｔ細胞を、抗体又はその結合断片を発現するように操作することができ、そこで、抗体又は断片は腫瘍細胞によって発現される抗原に対して特異的である。これは、Ｔ細胞が患者のがん細胞を標的とすることを可能にする。この培養又は操作はエクスビボで行うことができ、本方法において組み合わせるために細胞を患者に移植し戻すことができる。Ｔ細胞受容体治療法の開示についてその全体がここに援用されるKim等, Arch. Pharm. Res., DOI 10.1007/s12272-016-0719-7 (2016年2月19日にオンライン出版)を参照のこと。
【００５４】
Ｃ．自己免疫疾患を治療する方法
所定の実施態様では、患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法は、ＲＡＲαアゴニストを投与することを含む。そのような治療は、自己免疫疾患を有する患者において生じうる。幾つかの実施態様では、ＩＦＮｇ＋及び／又はＩＬ１７＋シグネチャーを有するＴｈ１７細胞が抑制される。
【００５５】
理論に束縛されるものではないが、我々は、ＲＡＲαアゴニストがＴＨ１７細胞の産生から逸脱しＴＨ１細胞に向かって駆動することを見出した。
【００５６】
Ｄ．自己免疫疾患のタイプ
幾つかの態様では、自己免疫疾患は、ＩＦＮｇ＋ＩＬ１７＋Ｔ細胞シグネチャーを有する自己免疫疾患から選択される。幾つかの実施態様では、自己免疫疾患は、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、又は多発性硬化症でありうる。
【００５７】
所定の形態では、自己免疫疾患は、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、又は多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）から選択される。
【００５８】
一実施態様では、自己免疫疾患は、乾癬及び／又はループスではない。
【００５９】
Ｅ．自己免疫疾患のための併用療法
所定の実施態様では、併用療法アプローチは、自己免疫疾患に対する既知の治療のような、Ｔ細胞を抑制するように機能する一又は複数の化合物をまた投与することによって利用されうる。
【００６０】
潜在的な併用療法剤には、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アザチオプリン、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴルタクロリムス、コルチコステロイド（プレドニゾン等）、ジメチルフマレート、エタネルセプト、フィンゴリモド、酢酸グラチラマー、ゴリムマブ、ヒドロキシクロロキン、インフリキシマブ、レフルノミド、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ナタリズマブ、リツキシマブ、スルファサラジン、テリフルノミド、トシリズマブ、トファシチニブ、ベドリズマブが含まれる。
【００６１】
更なる態様は、次の非限定的な実施例を通して提供される。
【実施例】
【００６２】
実施例１．ＲＡ−ＲＡＲαはＴｈ１細胞とＴｈ１７細胞との間のバランスを調節する
インビボでのＴｈ細胞分化におけるＲＡの役割を直接的に評価するため、我々は、ｌｏｘＰ隣接「ｓｔｏｐ」（ｌｓｌ）カセットの下流のＲＯＳＡ２６を標的にしたＲＡ受容体ＲＡＲαのドミナントネガティブ型（ＲＡＲα４０３）をコードする配列を有するマウスを使用した。
【００６３】
Ｃ５７Ｂｌ／６ｄｎＲａｒａマウスは以前に記載されている（Pino-Lagos等, 2011）。マウスはチャールス・リバー・ラボラトリー（英国）において病原体除去条件下で飼育され、維持された。全ての動物実験は、ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ１９８６に従って実施した。
【００６４】
以前に示されたように（Pino-Lagos等, 2011）、Ｃｄ４プロモーターからＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとの交配は、Ｔ細胞コンパートメント内でＲＡシグナル伝達が消失しているＣｄ４ｃｒｅｄｎＲａｒａｌｓ１／ｌｓ１子孫（ｄｎＲａｒａマウス）を産生する。Ｒａｒａ−／−マウスとは対照的に、このｄｎＲＡＲαの発現は、ＲＡＲαのＲＡ依存性活性を、リガンド非依存性効果を保持しながら破壊し、ＲＡ依存性機能の特異的解析を可能にする。
【００６５】
定常状態条件下でのＴｈ細胞サブセットの生成におけるＲＡの役割を調べるために、活性化ＣＤ４４ｈｉ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞内のサイトカインの発現を決定した。選別精製されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２ＬｈｉＴ細胞を、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞関連サブセットに対して極性化条件下でＴ細胞枯渇脾細胞（ＡＰＣ）及び抗ＣＤ３と共に培養した。
【００６６】
実験条件は次の通りであった。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４４ｌｏＣＤ６２ＬｈｉＴ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞ネガティブ選択キット（Miltenyi Biotec）を用いた濃縮後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）による細胞選別によって単離した。Ｔ細胞枯渇脾細胞は、ＣＤ３＋マイクロビーズ選択キット（Miltenyi Biotec）を使用し、続いて３０００ｒａｄで照射して調製した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ０細胞条件（１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、各１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）及び抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２））；Ｔｈ１細胞条件（１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、及び抗ＩＬ−４）；Ｔｈ２細胞条件（１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、抗ＩＬ−１２（Ｃ１７．８）、及び抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２））；又はＴｈ１７細胞条件、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、抗ＩＬ−４、及び抗ＩＦＮ−γ）下、１：５の比で照射Ｔ細胞枯渇脾細胞と共に、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）の存在下で３日間培養した。細胞を更に３〜４日間増殖させた。示されている場合、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γを添加した。二次再極性化アッセイでは、特定されている場合、ＬＥ５４０（１μＭ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル対照）を培地に加えた。サイトカインはＲ＆Ｄ製であった。抗ＣＤ３はＢｉｏＸｃｅｌｌ製であり、他の抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。全ての細胞培養は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５５μＭのβ−メルカプトエタノール、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む完全ＲＰＭＩ中で実施した。
【００６７】
サイトカイン産生の分析のために、細胞を、組織培養インキュベーター中、３７℃で４〜５時間、モネンシンの存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及び５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンで再刺激した。細胞表面染色を、２％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で実施した。生細胞分析又は細胞選別のために、死細胞をＳＹＴＯＸブルー（Invitrogen）で染色することによって除外した。細胞内染色のために、細胞を最初にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ又は近ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色し、続いて細胞表面マーカーを染色し、ついで固定／透過処理溶液（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット又は転写因子緩衝液キット；BD Bioscences）に再懸濁させた。細胞内染色は、製造業者の説明書に従って実施した。細胞内リン酸化ＳＴＡＴタンパク質を、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ、及びＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で製造業者のプロトコルに従って染色した。データをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で収集し、結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）で解析した。細胞表面マーカー、サイトカイン又は転写因子を染色するための全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００６８】
上清中のサイトカインレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭａｐ３Ｄシステム（Luminex Corporation）でマルチプレックスビーズベースアッセイ（Bio-Rad Laboratories）を使用して測定した。
【００６９】
発現解析を次の通りに実施した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを細胞から抽出し、Ｑｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（Quanta）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的遺伝子発現解析は、表２に列挙したＴａｑｍａｎプライマープローブセット（Applied Biosystems）を使用して実施した。標的遺伝子の発現はβ−アクチンに対して正規化した。
2018512396.tif 000005
【００７０】
ｄｎＲａｒａ又はＷＴマウス由来の選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１条件下で極性化させた。培養６日目に細胞を収集し、マイクロアレイ研究又はＣｈＩＰのために全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ単離、マイクロアレイ及びデータ処理はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃによって実施した。ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１データセットの遺伝子発現解析のために、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイチップを使用した。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Life Technologies）に溶解した細胞から抽出した。ＲＮＡの品質はＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies）で評価し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００ＵＶ分光光度計（NanoDrop Technologies）で定量した。
【００７１】
トランスクリプトーム解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ８Ｘ６０Ｋを、製造業者のプロトコルに従って使用して実施した。データ解析は、Ｒ／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ及びソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）又はＭＳ−Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ（Microsoft Inc.）を使用して実施した。バックグラウンド補正された強度値は、クォンタイル正規化を使用してアレイ間で正規化した。品質管理には、強度プロファイルの比較とグローバル相関分析が含まれる。差次的に発現された遺伝子は、スチューデントｔ検定（両側、等分散）を使用して正規化された（バックグラウンド補正されクォンタイル正規化された）ｌｏｇ２変換蛍光強度に対する統計的群比較によって同定した。ｐ値≦０．０５及び発現の倍率変化中央値≧１．５又は≦−１．５を示すレポーターを、改変された遺伝子発現の信頼できる候補と考えた。加えて、より高発現の群の複製サンプルの少なくとも２つは、０．０１以下の検出ｐ値を有することを要求した。
【００７２】
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた独立両側スチューデントｔ検定によって統計的有意性を計算した。ｐ値＜０．０５を有意と考えた。ｐ値は、数値で、*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１；***、ｐ＜０．００１；****、ｐ＜０．０００１と表される。
【００７３】
末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントの検査により、８週齢のｄｎＲａｒａマウス及びＣｒｅ野生型同腹仔対照（ＷＴ）におけるＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ｌｏＣＤ４＋記憶細胞の等価な頻度及び絶対数が明らかになった（図１Ａ〜Ｃ）。ｄｎＲａｒａエフェクター細胞は、ＩＬ−１７＋細胞の頻度が＞５倍増加したそのＷＴ対応細胞と比較してＩＦＮ−γの産生減少を示した（図１Ｄ〜Ｅ）。シグネチャー系譜決定ＴＦの転写物の検査は、ｄｎＲａｒａエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｂｘ２１のｍＲＮＡ発現の減少とＲｏｒｃの有意に高い発現を示した（図１Ｆ）。ＲＡシグナル伝達の喪失はＴｈ２エフェクターには影響がなく、ｄｎＲａｒａマウスとＷＴマウスの間でＧＡＴＡ３発現は等価なレベル（図１Ｆ）で、ＩＬ−４産生ＣＤ４＋Ｔ細胞は同様の頻度であった（データを示さず）。
【００７４】
ｄｎＲａｒａマウスの末梢及び胸腺におけるＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の頻度と数は対照マウスと類似しており（図９Ａ−Ｂ）、Ｔｈ１７細胞における増加はＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｈ１７細胞のＲＡによる相反的調節の結果ではなかったことを示している（Mucida等, 2007）。従って、定常状態条件下でＲＡはＴｈ１細胞の分化に関与しており、Ｔｈ１７細胞の分化も制限する可能性がある。
【００７５】
実施例２．ＲＡはＴｈ１細胞分化を促進し、Ｔｈ１細胞前駆体からのＴｈ１７細胞の発生を阻害する
我々は、ｄｎＲａｒａマウスが、増強されたＴｈ１７細胞と並行して、記憶エフェクターＴｈ１細胞の減少をなぜ示すかについて二通りの代替的な説明を検討した。第１の可能性は、ＲＡは、Ｔｈ１７細胞の初代分化を独立して抑制しながら、Ｔｈ１細胞の発生に必要とされるということであった。別の可能性は、ＲＡがＴｈ１細胞のＴｈ１７細胞への変換の抑制に関与しているということであった。これらの２つの可能性を解決するために、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１又はＴｈ１７極性化サイトカインの存在下で分化させた。Ｔｈ１細胞条件下で分化したｄｎＲａｒａ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ産生能が著しく低下していた（図２Ａ）。サイトカイン産生の減少は、Ｔｈ１細胞条件下で分化したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＷＴ細胞と同等の強い増殖を示したので、増殖応答障害の結果ではなかった（図１０Ａ）。加えて、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ４４のアップレギュレーションは、ｄｎＲａｒａ Ｔ細胞がエフェクター細胞に分化するその能力が損なわれていなかったことを示した（図１０Ｂ）。ＴＦ発現の解析は、ＲＡシグナル伝達を除去することにより、Ｔｈ１細胞条件下で分化したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現が劇的に減少することを示した（図２Ｂ）。驚くべきことに、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞のかなりの割合がＲＯＲγｔを発現し、Ｔ−ｂｅｔとＲＯＲγｔの同時発現が単一細胞レベルで観察された。ホルボールミリステート（ＰＭＡ）とイオノマイシンで短時間刺激した後には細胞中に細胞内ＩＬ−１７Ａは観察されなかったが、非極性化培地中、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８被覆プレートで２４時間培養した培養６日目に再活性化されたＴｈ１極性化細胞の上清の分析は、他のＴｈ１７細胞関連サイトカイン（ＩＬ−２１及びＩＬ−２２）と並んでＩＬ−１７Ａの発現の増加を示した（図２Ｃ）。更に、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１極性化細胞のｍＲＮＡ分析は、所定のシグネチャーＴｈ１７細胞遺伝子の発現の劇的な増加を明らかにした（図２Ｄ）。注目すべきことに、これらのＴｈ１細胞は、Ｉｌ２３ｒの発現量が高いがＩＬ２３ｍＲＮＡ及びタンパク質の量は減少した病原性Ｔｈ１７細胞の特徴を示した（図２Ｃ及び２Ｄ）（Basu等, 2013）。
【００７６】
Ｔｈ１７応答の増強が、ＲＡシグナル伝達が破壊されたＣＤ４＋Ｔ細胞の一般的特徴であったかどうかを評価するために、ｄｎＲａｒａマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１７極性化条件下で分化させた。上記の我々の観察とは対照的に、Ｔｈ１７細胞への初代分化の間においてｄｎＲａｒａマウス中のＩＬ−１７＋細胞の頻度の増加は観察されず（図１０Ｃ）、ＲＡがＴｈ１極性化サイトカイン環境という状況の中でのみＴｈ１７細胞分化を抑制することを示唆している。これを支持して、Ｔｈ０又はＴｈ２条件下で分化したｄｎＲａｒａ発現ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＲＯＲγｔの発現は観察されなかった（図１０Ｄ）。
【００７７】
ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるＲＯＲγｔとＴ−ｂｅｔの同時発現は、ＲＡ−ＲＡＲαが、Ｔｈ１コミットメント細胞のＴｈ１７細胞系譜への逸脱を制限するように作用しているかもしれないことを示唆した。ＲＯＲγｔ＋細胞がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞又は以前にコミットされたＴｈ１細胞から直接生じた別個のＴ細胞集団を表していたかどうかを決定するために、ＩｆｎｇｅＹＦＰ（Ｇｒｅａｔ）レポーターマウスをｄｎＲａｒａマウスと交配させてＩＦＮ−γ＋細胞のトラッキングを可能にした。
【００７８】
ｄｎＲａｒａ−ＩｆｎｇｅＹＦＰ又は同腹仔対照マウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１極性化条件下で活性化させた。ＩｆｎｇｅＹＦＰ（ＧＲＥＡＴ）マウスはジャクソン研究所から購入した。培養７日目に、ＰＭＡとイオノマイシンによる再刺激後、ｅＹＦＰ＋細胞を選別し、全ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ ２．０ ＳＴアレイを使用して転写プロファイリングのために抽出した。遺伝子発現データの前処理及び統計解析はＰａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ ６．６を使用して行った。ＣＥＬファイルをインポートし、発現強度を要約し、正規化し、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅアルゴリズムを使用して変換した。事前の再刺激なしに選別したｅＹＦＰ＋ｄｎＲａｒａ又は野生型細胞由来の２つの更なるサンプルを正規化に含めた。これらのサンプルは、差次的に発現された遺伝子の解析には含まれていなかった。差次的に発現された遺伝子は、倍率変化及びｔ検定解析を使用して検出した。Ｐ値＜０．０５と≧１．５又は≦１．５の発現の倍率変化を有意と考えた。
【００７９】
Ｔｈ１７細胞サイトカイン及びＴｈ１７細胞分化を促進するサイトカインの受容体（Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ２１、Ｉｌ１ｒ１、Ｉｌ６ｒａ、及びＩｌ２３ｒ）を含む所定のシグネチャーＴｈ１７細胞遺伝子は、ＷＴマウスと比較してｄｎＲａｒａ ＩＦＮ−γ発現細胞において高度に発現しており、ハイブリッドＴｈ１−Ｔｈ１７細胞表現型を確認した（図２Ｅ）。注目すべきことに、これらのＴｈ１−Ｔｈ１７細胞は、Ｉｌ２３ｒをまた発現しながら、ＷＴ Ｔｈ１細胞と同等のＩｌ１２ｒｂ２及びＣｘｃｒ３ ｍＲＮＡの高発現を保持した（図１０Ｅ）。ＧＡＴＡ３及びＩｌ４のようなＴｈ２細胞サブセットに関連する遺伝子もまた、ＧＡＴＡ３の抑制におけるＴ−ｂｅｔの役割と一致してｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞において調節不全であった（Zhu等, 2012）。これらの知見は、ＲＡシグナル伝達がない場合、コミットされたＴｈ１細胞前駆体がＴｈ１７細胞発現シグネチャーを有する細胞を生じうることを示しており、Ｔｈ１−Ｔｈ１７細胞の起源に関する新たな側面を提供する。まとめると、これらのデータは、ＲＡがＴｈ１細胞分化に必要とされるばかりでなく、Ｔｈ１極性化細胞においてＴｈ１７細胞の発達を抑制することにも関与していることを示している。
【００８０】
実施例３．ＲＡ−ＲＡＲαはＴｈ１細胞における後期のＳＴＡＴ４依存性Ｔ−ｂｅｔ発現に必要とされる
ＴＣＲ活性化後のＴ−ｂｅｔの初期発現はＩＦＮ−γに依存性であるのに対し、Ｔ−ｂｅｔの後期発現（ＴＣＲシグナル伝達の終了後）はＩＬ−１２に依存性であることが示されている（Schulz等, 2009）。Ｔｈ１細胞コミットメントにおけるＲＡシグナル伝達の必要性をＴｈ１細胞運命の維持から区別するために、Ｔｈ１極性化条件下で培養されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現の動態を調べた。
【００８１】
分化したＴｈ１細胞のウェスタンブロット分析は次の通りであった。分化したＴｈ１細胞を、プロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。ライセートを１０％ゲルで電気泳動し（Biorad）、ニトロセルロースに移し、抗ＳＴＡＴ４又は抗アクチン、ついで抗ウサギ−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体でブロットした。全ての抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であった。
【００８２】
Ｔ−ｂｅｔの誘導は、培養３日目にＷＴ細胞とｄｎＲａｒａ Ｔ細胞との間の同等量のＴ−ｂｅｔ発現で観察され、ＲＡ−ＲＡＲαシグナル伝達が初期Ｔｈ１系譜コミットメントに必要とされないことを示している（図３Ａ）。しかし、Ｔ−ｂｅｔ発現はｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞では持続せず、培養の５日目までにＴ−ｂｅｔの発現は相当減少した。ＩＦＮ−γがＴ−ｂｅｔ発現を促進することを考慮して、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ産生の減少により引き起こされる潜在的な間接的影響を避けるために、組換えＩＦＮ−γの存在下でＴ−ｂｅｔの発現を調べた。外因性ＩＦＮ−γは、ｄｎＲａｒａ及びＷＴ Ｔｈ１細胞の両方で初期のＴ−ｂｅｔ発現を増強したが、Ｔ−ｂｅｔ発現における後期（＞７２時間）の障害を救済しなかった（図３Ａ）。ＳＴＡＴ１リン酸化によって測定されるＩＦＮ−γシグナル伝達は、何れの時点においても損なわれなかった（データは示さず）。
【００８３】
遮断ＩＦＮ−γ抗体の存在下で観察されたＴ−ｂｅｔ発現の後期ＩＬ−１２依存性ピークは、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞極性化細胞において排除されており（図３Ａ）、損なわれたＳＴＡＴ４活性を示唆している。培養３日目に、ｄｎＲａｒａマウスとＷＴマウスとの間で同等量のリン酸化ＳＴＡＴ４（ｐＳＴＡＴ４）が観察された。対照的に、培養６日目にＩＬ−１２誘導ｐＳＴＡＴ４は、同等のＩＬ−１２Ｒβ２ｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現並びにＩｌ１２ｒｂ１ ｍＲＮＡの発現増加にもかかわらず（図４Ｃ及び４Ｄ）、ｄｎＲａｒａ Ｔ細胞において著しく損なわれた（図３Ｂ）。Ｓｔａｔ４発現の解析は、ＲＡシグナル伝達の非存在下で全ＳＴＡＴ４タンパク質の量の減少を伴う（図４Ｆ）Ｓｔａｔ４の誘導障害を実証した（図４Ｅ）。これらの知見は、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるｐＳＴＡＴ４の観察された減少が、ＳＴＡＴ４発現の減少の結果であることを示唆している。Ｔｈ１７細胞系譜への逸脱と一致して、我々は、ｐＳＴＡＴ３／ｐＳＴＡＴ４の比率の増加を伴うＴｈ１細胞極性化ｄｎＲａｒａ細胞におけるｐＳＴＡＴ３活性の増強を観察した（図１１Ａ）。
【００８４】
Ｔ−ｂｅｔ及びＳＴＡＴ４発現の障害がＩＦＮ−γの変化と相関したかどうかを評価するために、Ｔｈ１細胞極性化の開始後のＩＦＮ−γ発現の時間経過を、ナイーブｄｎＲａｒａ−ＩｆｎｇｅＹＦＰ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞において分析した。ｅＹＦＰ＋細胞の頻度で測定したＩＦＮ−γ誘導の動態は、培養の最初の７２時間の間のＷＴ細胞を密接に反映したが、ＲＡシグナル伝達の非存在下では発現は持続しなかった（図３Ｇ）。まとめると、これらのデータは、ＲＡが、Ｔｈ１分化において時間的な役割を果たし、Ｔ−ｂｅｔ及びＳＴＡＴ４の調節を介してＴｈ１細胞コミットメントを維持することを示している。
【００８５】
実施例４．ＲＡ−ＲＡＲαはＴｈ１細胞の可塑性を調節する
系譜決定ＴＦの安定した発現の変化が、Ｔｈ細胞の安定性又は可塑性の根底にあると考えられる。Ｔｈ１−Ｔｈ１７細胞の出現とＴ−ｂｅｔ発現の喪失は、Ｔｈ１細胞の可塑性の調節におけるＲＡの役割を示唆した。しかし、初代Ｔｈ１細胞分化の３日目からのＴ−ｂｅｔ及びＳＴＡＴ４活性の低下は、完全に分化したＴｈ１細胞における系譜安定性の評価を妨げた。ＲＡ−ＲＡＲαが長期のＴｈ１細胞運命に必要とされたかどうかを判定するために、我々は、Ｔｈ１細胞条件下でｄｎＲａｒａｌｓ１／ｌｓ１マウスからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分化させ、５日目及び７日目にそれらをＴＡＴ−Ｃｒｅで処理し（Wadia等, 2004）、更に５日間、それらをＴｈ１細胞条件下で再刺激した。
【００８６】
ＴＡＴ−Ｃｒｅを用いた処理条件は次の通りであった。選別精製されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１条件下で分化させた。５日後、細胞を無血清培地で２回洗浄した後、５０μｇ／ｍｌのＴＡＴ−Ｃｒｅ（Millipore）又は培地単独（モック処理）で処理した。細胞を３７℃で４５分間インキュベートした。２０％のＦＢＳを含む培地で反応を停止させ、更なる洗浄を続けた。細胞を２日間増殖させた後、以前と同様にＴＡＴ−Ｃｒｅ又は培地で再処理した。ついで細胞をＴｈ１細胞条件下で３日間再刺激し、分析前に更に２日間増殖させた。
【００８７】
Ｔｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の時間的な喪失は、ＲＯＲγｔ発現の相反的増加と共にＴ−ｂｅｔ発現の減少をもたらした（図４Ａ）。〜５０％の細胞がＲＯＲγｔを発現したが、これは進行中のＲＡ−ＲＡＲα活性がＴ−ｂｅｔの維持及びＴｈ１７細胞運命の抑制に関与していることを示唆している。系譜決定ＴＦにおける変化は、サイトカイン表現型に影響しなかった（図１２Ａ）。これは、Ｔｈ１細胞発達の後期におけるＩｆｎｇ遺伝子座のＴ−ｂｅｔ非依存性調節を部分的に反映している可能性がある。
【００８８】
Ｔｈ１細胞の安定性におけるＲＡの役割を更に調べるために、ＩｆｎｇｅＹＦＰマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１細胞極性化条件下で分化させた。培養７日目にｅＹＦＰ＋（ＩＦＮ−γ＋）細胞をＦＡＣＳ選別し、ＲＡＲ阻害剤ＬＥ５４０（ＲＡｉ）又はビヒクル対照（Ｖｅｈ）の存在下、Ｔｈ１細胞条件下で再刺激した。Ｔｈ１条件下で更に５日間増殖させた完全にコミットされたＴｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の阻害は、Ｔ−ｂｅｔのダウンレギュレーションとＲＯＲγｔを同時発現する細胞の出現をもたらした（図４Ｂ）。Ｔ−ｂｅｔ発現の減少は、ＩＦＮ−γ発現の中程度の減少と関連していた（図１２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、完全にコミットされたＴｈ１細胞におけるＲＡシグナル伝達の喪失が、Ｔｈ１７系譜の特徴を有する子孫への分化転換をもたらすことを確立し、ＲＡがＴｈ１細胞の後期可塑性を制限するモデルを支持する。
【００８９】
実施例５．ＲＡ−ＲＡＲαは系譜決定Ｔｈ１細胞遺伝子におけるエンハンサー活性を調節する
ＲＡＲαがＴｈ細胞運命を調節する分子機構をよりよく理解するため、我々は、ＲＡＲαの機能的な標的を同定するためにｄｎＲａｒａ発現Ｔｈ１細胞の転写プロファイリングと組み合わせたＣｈＩＰ−ＳｅｑによるＷＴ Ｔｈ１細胞におけるＲＡＲα結合のゲノムワイド解析を実施した。
【００９０】
免疫沈降及びＤＮＡ配列決定は、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Carlsbad, CA）によって実施した。次の抗体を使用した：抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０７−４４９）、抗ｐ３００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−５５１Ｘ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ ３９２８７）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｖｅ ３９１５９）、抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ ３９１３３）、抗ＲＡＲα（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｃ１５３１０１５５）。ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーをＣｈＩＰ及び入力ＤＮＡから調製した。ＣｈＩＰｑ−ＰＣＲでは、濃縮をＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆの正規化スキームを使用して１０００細胞あたりの結合事象として計算した。
【００９１】
実験手順は次の通りであった。Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆの細胞固定プロトコル（ｗｗｗ．ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／１８４８．ｐｄｆ）に従って、ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウス由来の２千万から６千万個のＴｈ１極性化細胞を固定し、洗浄し、スナップ凍結させた。溶解緩衝液を添加し、続いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで破壊することにより、クロマチンを単離した。ライセートを超音波処理し、ＤＮＡを３００〜５００ｂｐの平均長までせん断した。クロマチンのアリコートをＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ及び脱架橋のために熱で処理し、続いてエタノール沈殿させることによって、ゲノムＤＮＡ（入力）を調製した。ペレットを再懸濁させ、得られたＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で定量した。元のクロマチン体積への外挿により、全クロマチン収量の定量が可能になった。クロマチンのアリコートをプロテインＡアガロースビーズ（Invitrogen）で予め清澄化した。特定の抗体を用いた免疫沈降後、複合体を洗浄し、ビーズからＳＤＳ緩衝液で溶出させ、ＲＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫ処理に供した。６５℃で一晩インキュベートすることにより架橋を逆転させ、ＣｈＩＰ ＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングライブラリーの調製及びＣｈＩＰｑＰＣＲ解析に使用した。
【００９２】
Ａ．ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Bio-Rad）を使用して特異的ゲノム領域上で３組実施した。プライマーの詳細については表３を参照のこと。得られたシグナルを、入力ＤＮＡを使用して各プライマー対についてｑＰＣＲを実施することによって、プライマー効率について正規化した。既知量のＤＮＡの標準を使用することにより、試験部位のそれぞれについてプルダウンされたゲノムコピーの数を計算することができ、よって「濃縮」として表される開始細胞数当たりのプルダウンコピーを計算することができた。ＲＡＲαＣｈＩＰ ｑＰＣＲでは、染色体６（Ｕｎｔｒ６）上の遺伝子砂漠を負の対照部位に使用した（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆカタログ番号７１０１１）。
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【００９３】
Ｂ．ＣｈＩＰシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
標準的な手順を使用して、ＣｈＩＰ及び入力ＤＮＡからＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーを調製し、ＨｉＳｅｑ２５００でライブラリーを配列決定した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びマイクロアレイデータは、ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ６０３５６で入手可能である。
【００９４】
Ｃ．ＣｈｉｐＳｅｑ解析
各サンプルについて、シーケンサーからのＦａｓｔＱフォーマットの５０ｂｐのＳＥ読み取りデータを、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ ｖ２．０７．１１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ）を使用してマウス参照ゲノム（ｍｍ１０）に整列させた。得られたアライメントファイルを、ｓａｍｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してＢＡＭフォーマットに変換し、ｐｉｃａｒｄツール（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用してＰＣＲ複製物を除去した。更なる分析のために、各サンプルから一意的にマッピングされた読み取りデータのみが選択された。バックグラウンド補正のため入力サンプルを使用して、ＭＡＣＳ ｖ２．０．１０＿２０１３１２１６（Zhang等 2008, Feng J等 2011）（ｑ＝０．１０）で、各サンプルから有意に濃縮された領域を同定した。ある場合には、目視検査によりピークを同定し、ＣｈＩＰ ｑＰＣＲによって確認した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３サンプルの場合、近くの濃縮領域をマージするために「−ｂｒｏａｄ」設定を使用した。可視化の目的で、入力シグナルを各ＣｈＩＰサンプルから差し引き、ＵＣＳＣツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｕｔｉｌ．ｈｔｍｌ）の「ｂｅｄＧｒａｐｈＴｏＢｉｇＷｉｇ」ユーティリティを使用してｂｉｇＷｉｇフォーマットに変換した。同定された有意に濃縮された領域には、ＵＳｅｑパッケージ（ｕｓｅｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）からの「ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇＧｅｎｅｓ」ユーティリティを使用して関連遺伝子を見つけるために注釈を付けた。関連遺伝子は、ピークの中心から最も近い転写開始部位を表す。
【００９５】
Ｄ．ＣｈｉｐＳｅｑの結果
選択された遺伝子座をＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって検証した。ＲＡＲα結合は、１５６７遺伝子の１７６６部位で同定された。ＲＡＲα結合は、ＲＡシグナル伝達の非存在下でダウンレギュレートされた遺伝子の１０．３％（表４）（以下、正に調節されたものと呼ぶ）（７４０遺伝子のうち７６個）とアップレギュレートされた遺伝子の４．８％（表５）（１１６９のうち５６個）において検出された。転写活性化の正の調節因子としてのその古典的役割と一致して、ＲＡによって正に調節される遺伝子においてＲＡＲα結合の有意な濃縮があった（フィッシャー直接確率法、ｐ＜０．０００１）。しかしながら、負に調節された遺伝子のサブセットにおけるＲＡＲαの存在は、ＲＡ−ＲＡＲαがまたＴｈ１細胞内の転写抑制において役割を果たすことを示している。
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【００９６】
ＲＡ−ＲＡＲα依存性遺伝子座は、Ｔｈ１細胞系譜規定遺伝子（Ｔｂｘ２１及びＳｔａｔ４−Ｓｔａｔ１）を含んでいた。Ｔｂｘ２１プロモーターの標的化（図５Ａ及び図５Ｃ）に加えて、転写開始部位（ＴＳＳ）の１２ｋｂ上流の保存されたＴ−ｂｅｔエンハンサーエレメントにおいて、中程度のＲＡＲα結合が観察された（Yang等, 2007）。これは、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって確認された（図５Ｃ）。遺伝子間ＲＡＲαはまたＳｔａｔ４−Ｓｔａｔ１遺伝子座及びＩｆｎｇエンハンサーエレメントにおいて検出された（図１３Ａ〜Ｂ）。
【００９７】
核ＲＡＲαへのＲＡ結合は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００及びＣＢＰを含むコアクチベーター複合体の動員をもたらす（Kamei等, 1996）。ｐ３００は、活性エンハンサーのマーカーであるＨ３Ｋ２７をアセチル化するエンハンサー領域において高度に濃縮されており（Rada-Iglesias等, 2010）、エンハンサー活性の調節におけるＲＡ−ＲＡＲαの可能な役割を示唆している。これを試験するために、我々は、ｄＮＲａｒａ及びＷＴ Ｔｈ１細胞におけるｐ３００、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃヒストン修飾のゲノムワイド結合をマッピングし、ＣｈＩＰ ｑ−ＰＣＲによって選択された領域を確認した。活性エンハンサーは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３が低いか又は存在せず、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、ｐ３００及びＨ３Ｋ２７ａｃの強度が増加した領域として作用的に定義された（Rada-Iglesias等, 2010）。
【００９８】
Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ４及びＩｆｎｇ遺伝子座におけるＲＡＲα結合は、エンハンサー領域でのｐ３００結合と共局在化した（図５Ａ及び１３Ａ）。ｄｎＲＡＲαは、コアクチベーターのＲＡ依存性補充に必要とされる活性化機能２（ＡＦ２）ドメインを欠く。これと一致して、ｄｎＲａｒａ発現Ｔ細胞は、Ｔｂｘ２１エンハンサーにおけるｐ３００占有率及びＨ３Ｋ２７ａｃ沈着の有意な減少を示し、ＲＡ−ＲＡＲαによるエンハンサー活性の直接の調節を支持する（図５Ａ及び５Ｃ）。Ｉｆｎｇ及び推定Ｓｔａｔ４遺伝子間エンハンサーにおけるｐ３００結合もＲＡ−ＲＡＲαに依存性であった（図１３Ａ及び１３Ｃ）。ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞におけるＳｔａｔ４−Ｓｔａｔ１遺伝子間エンハンサーにおけるｐ３００結合の喪失は、Ｓｔａｔ４転写物の減少と相関したが、Ｓｔａｔ１発現は実際に増加し、このエンハンサーエレメントがＳｔａｔ４転写を調節したことを示唆している。最近の研究により、Ｔｈ１エンハンサーの調節におけるＳＴＡＴ４の役割が同定された（Vahedi等, 2012）。ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞においてＳＴＡＴ４発現が減少したことを考慮すると、ｐ３００の喪失は部分的にはＳＴＡＴ４の発現の減少によるものであった可能性がある。この問題に取り組むために、我々は、ＷＴ Ｔｈ１細胞においてＳＴＡＴ４の結合を評価し、公に利用可能なＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを使用してＷＴ及びＳｔａｔ４−／−Ｔｈ１細胞におけるｐ３００占有率を比較した（表６）（Vahedi等, 2012；Wei等, 2010）。ＳＴＡＴ４結合がＴｂｘ２１エンハンサーにおいて観察されたが、ＳＴＡＴ４の喪失は、ｐ３００結合の明らかな差異とは関連しておらず（図１３Ｄ）、ｐ３００動員及びエンハンサー活性へのＲＡＲαの直接的な寄与を支持している。まとめると、これらのデータは、ＲＡがエンハンサー領域のリモデリングを通して所定のＴｈ１細胞系譜遺伝子の発現を調節することを示している。
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【００９９】
実施例６．ＲＡ−ＲＡＲαはＴｈ１７細胞遺伝子の直接的調節を通じてＴｈ１細胞におけるＴｈ１７細胞運命を抑制する
Ｔｈ１細胞がＲＡシグナル伝達の非存在下でＴｈ１７細胞の特徴を獲得したという先の知見により、我々はＲＡ−ＲＡＲαによるＴｈ１７細胞指令遺伝子の直接的な調節を評価することにした。我々は、先ず、Ｔｈ１７細胞パイオニア因子ＢＡＴＦ及びＩＲＦ４に対するＲＡの影響を調べた。以前に報告されたように（Basu等, 2013）、これらの遺伝子はＷＴ Ｔｈ１細胞において発現された。驚くべきことに、Ｔｈ１細胞条件下で刺激されたナイーブ細胞におけるＢａｔｆ及びＩｒｆ４発現の動態解析は、ｄｎＲａｒａ及びＷＴ細胞間の同等の発現と共にＴｈ１細胞極性化の初期段階の間のＩＲＦ４の劇的なアップレギュレーション（４０〜６０倍）を明らかにした（図５Ｄ）。ＲＡシグナル伝達の喪失は、ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４標的遺伝子、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ２３ｒ、Ｉｌ２２、Ｉｌ２１及びＩｌ１２ｒｂ１の抑制解除をもたらした（図５Ｅ）。これは、Ｔｈ１７細胞遺伝子におけるＢＡＴＦ−ＩＲＦ４複合体の作用を制限するために、ＲＡ依存性の形で「平衡化」因子が誘導されなければならないことを示唆している。Ｔｈ１７分化を抑制することが以前に示されているＩＲＦ４の別の結合パートナーであるＩＲＦ８（Ouyang等, 2011）は、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞において最も抑制されたＲＡＲα標的遺伝子の一つであった。ＷＴ Ｔｈ１細胞において、Ｉｒｆ８発現の誘導は、Ｉｒｆ４発現と同等であった。しかし、ｄｎＲａｒａ細胞において、Ｉｒｆ８発現は２４時間を超えて持続しなかった（図５Ｄ）。ＲＡＲαは推定上流エンハンサーに結合し（図５Ｆ−Ｇ）、ＲＡシグナル伝達の非存在下で、ｐ３００及びＨ３Ｋ２７ａｃの減少がこの遺伝子座で観察された（図５Ｈ−Ｉ）。これらのデータは共に、ＲＡがＴｈ１分化細胞におけるＩＲＦ８の発現を直接調節し、ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４活性が初期Ｔｈ１細胞内に限定される可能性のある機構を示唆していることを示す。
【０１００】
ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４標的遺伝子の転写活性化は、ＳＴＡＴ３及びＲＯＲγｔに依存性である（Ciofani等, 2012）。ＳＴＡＴ３活性化に関連するサイトカイン及びサイトカイン受容体の様々な遺伝子（Ｉｌ２１、Ｉｌ１ｒ１、Ｉｌ６ｒａ及びＩｌ２３ｒ）は、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞において抑制解除された（図５Ｅ）。ＲＡＲαは、プロモーターとＩｌ６ｒａ遺伝子座における上流エンハンサーを標的とし（図５Ｇ）、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞のエンハンサーエレメントには増加したＨ３ｋ２７ａｃが観察された（図５Ｊ）。これと一致して、ｄｎＲａｒａ Ｔｈ１細胞はＴｈ１極性化の間にｍＲＮＡ及び細胞表面ＩＬ６−Ｒαの発現をダウンレギュレートすることに失敗した（図１３Ｅ及び１３Ｆ）。これらの知見は、ＲＡが、部分的にはＩＬ−６に対する応答性を抑制することによって、Ｔｈ１細胞の可塑性を調節することを示唆している。
【０１０１】
ＲＯＲγｔはＲＡＲαの直接の標的ではなかった。しかし、ＲＡシグナル伝達の破壊は、Ｒｏｒｃのトランス活性化に関連するＴＦであるＲｕｎｘ１の発現を増加させた（図１３Ｅ）（Zhang等, 2008）。ＣｈＩＰ解析により、ＲＡ−ＲＡＲαによる長短Ｒｕｎｘ１アイソフォームプロモーターの直接的調節が確認された（図５Ｇ）。Ｔｈ１細胞において、Ｒｏｒｃ遺伝子座はＴ−ｂｅｔによって後成的に発現抑制される（Mukasa等, 2010）。しかし、ｄｎＲａｒａ細胞では、抑制的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークは、Ｔ−ｂｅｔの喪失と一致して、ＲＯＲγｔアイソフォーム特異的エキソンで減少した（図５Ｊ）。これらの知見は、ＲＡＲαシグナル伝達の非存在下でのＲＯＲγｔ発現の増加は、部分的にはＲｏｒｃ遺伝子座のアクセシビリティの増加に起因し、Ｒｕｎｘ１による抑制されない活性化によるものであることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＲＡ−ＲＡＲαが、Ｔｈ１７細胞遺伝子プログラムを直接的及び間接的に抑制するようにＴＦ（ＩＲＦ４、ＢＡＴＦ、ＳＴＡＴ３及びＲＯＲγｔ）に指令するコアＴｈ１７細胞の活性をアンタゴナイズすることを示している。注目すべきことに、Ｔｈ２細胞関連遺伝子は、ＲＡＲαの標的として同定されておらず（表５及び４）、ＲＡ−ＲＡＲαによる別の細胞運命の直接的抑制がＴｈ１７細胞プログラムに特異的であることを示唆している。
【０１０２】
実施例７．ＲＡシグナル伝達の非存在下でリステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）による感染の間にＴｈ１様Ｔｈ１７細胞が現れる
インビボでの免疫応答に対するこれらの知見の重要性を評価するために、ＷＴ及びｄｎＲａｒａマウスに、リステリオリジンＯペプチドＬＬＯ１９０−２０１（ＬＬＯｐ）に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のトラッキングを可能にするリステリア・モノサイトゲネス（ΔＡｃｔＡ）の弱毒株Ｌｍ−２Ｗを静脈内感染させた。
【０１０３】
ＬＬＯ１９０−２０１は、ＰｉＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓによって合成され、ＨＰＬＣにより決定して＞９５％純度であった。ＬＬＯ：Ｉ−Ａｂモノマーは、ＮＩＨ Ｃｏｒｅ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって提供された。ＰＥ標識ＬＬＯ：Ｉ−Ａｂデキストラマーは、Ｉｍｍｕｄｅｘによって合成された。組換えＬｍ−２Ｗ株は、Ｍａｒｃ Ｊｅｎｋｉｎ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって提供された。ＬＥ５４０はＡｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【０１０４】
マウスに１×１０６ｃｆｕのリステリア・モノサイトゲネスを静脈内感染させ、脾臓を７日後に収集した。ＦＡＣＳ解析のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞ネガティブ選択マイクロビーズキット（Miltenyi Biotec）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞について単一細胞懸濁液を濃縮し、ＰＥ標識ＬＬＯ：Ｉ−Ａｂデキストラマー（Immudex）及び細胞表面抗体で染色した。サイトカイン産生の分析のために、上清を、１０μｇ／ｍｌのＬＬＯペプチド（PiProteomics）で２４時間再刺激した脾細胞から採取し、又はモネンシンの存在下でＬＬＯペプチドで６時間刺激した後に細胞内サイトカイン染色を実施した。
【０１０５】
応答のピーク時に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を脾臓から単離し、ＬＬＯｐ抗原特異的Ｔ細胞を、サイトカイン及びＴＦ、Ｔ−ｂｅｔ及びＲＯＲγｔの発現についてアッセイした。ｄｎＲａｒａマウスは、同等の頻度及び総数のＣＤ４４ｈｉＬＬＯｐ：Ｉ−Ａｂ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を伴い、ＷＴマウスと同様の大きさのエフェクターＴ細胞応答を開始した（図６Ａ−Ｂ）。ＷＴマウスでは、Ｌｍ−２Ｗは、ＬＬＯｐ特異的Ｔ細胞画分内の高いＴ−ｂｅｔ発現によって証明されるように、Ｔｈ１細胞制限応答を誘導した（図６Ｃ）。ｄｎＲａｒａマウス由来のＬＬＯｐ：Ｉ−Ａｂ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より少ない量のＴ−ｂｅｔを発現し、かなりの割合がＲＯＲγｔを発現し、細胞のあるサブセットにおいてこれらＴＦの同時発現が観察された（図６Ｃ）。感染後７日目に、ｄｎＲａｒａマウスの脾臓から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のかなりの割合がＩＬ−１７＋又は二重ＩＬ−１７Ａ＋ＩＦＮ−γ＋であり、ＩＦＮ−γ＋細胞の頻度が減少する傾向があった（図６Ｄ）。ＬＬＯｐで再刺激した脾細胞からのサイトカインタンパク質濃度の測定により、ＩＦＮ−γの量の減少及びＩＬ−１７Ａの付随する増加を確認した（図１４Ａ）。我々は、細胞内染色又はタンパク質分泌によるＩＬ−４産生を検出しなかった（図１４Ａ〜Ｂ）。ＷＴ Ｔｈ１細胞上のＩＬ６−Ｒαのダウンレギュレーションを示す我々のインビトロデータと一致して、細胞表面ＩＬ−６Ｒαは、ＷＴ ＬＬＯｐ：Ｉ−Ａｂ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞上では検出可能ではなかった。しかし、ｄｎＲａｒａ ＬＬＯｐ：Ｉ−Ａｂ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−６Ｒαの発現を保持しており（図１４Ｃ）、Ｔｈ１細胞可塑性の調節におけるＩＬ−６シグナル伝達の潜在的役割を支持している。これらの知見により、Ｔ細胞におけるＲＡ−ＲＡＲαシグナル伝達が、インビボでのＴＨ１細胞指令微小環境におけるＴｈ１７細胞の出現を制限することが確立される。
【０１０６】
実施例８．ＲＡは腸内のＴｈ１−Ｔｈ１７細胞系を調節し、小腸炎症の発症を予防する
ＲＡは、腸内のＤＣのサブセットによって構成的に合成される。病原性腸内ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節におけるＲＡシグナル伝達の生理学的重要性に取り組むために、我々はｄｎＲａｒａマウスを、オバルブミン（ＯＶＡ）特異的ＴＣＲをトランスジェニック発現するＯＴＩＩマウスと交配させ、ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）又はＷＴ ＯＴＩＩマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＲａｇ１−／−宿主に導入した。Ｃ５７Ｂｌ／６ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）、ＯＴＩＩ及びＲａｇ１−／−マウスを飼育し、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ大学の特定病原体除去動物施設で維持した。レシピエントは、導入された細胞内の分化及び腸組織への移動を誘導するために、ＯＶＡ含有食餌で７日間維持した。感染実験と一致して、ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）レシピエントマウスへＯＶＡを給餌すると、導入７日後、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、固有層リンパ球（ＬＰＬ）及び脾臓（Ｓｐ）においてＩＦＮ−γ産生細胞の欠乏及びＩＬ−１７＋及び二重ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１７＋細胞の頻度増加を伴い、Ｔｈ１−Ｔｈ１７細胞バランスの変動が生じた（図７Ｂ及び７Ｃ）。ｄｎＲａｒａ Ｔ細胞における調節不全サイトカイン応答の機能的意義に取り組むために、マウスにＯＶＡを経口投与し、小腸炎症及び下痢の発症について評価した（図７Ａ）。
【０１０７】
Ｒａｇ１−／−マウスをサルファトリム含有食餌で維持し、オートクレーブ処理された供給物にのみ曝露した。ナイーブＯＴＩＩ ＣＤ４細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｖｂ５＋Ｖａ２＋ＣＤ４４−として定義される）を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞選別機（Becton Dickinson）を使用し、８〜１２週齢の雌Ｃ５７Ｂ１６ ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）又はＣ５７Ｂ１６６ ＯＴＩＩマウスから選別し、１００μｌのＰＢＳ中の２×１０６個の細胞を１２週齢のＲａｇ１−／−雌に後眼窩に移植した。養子移植の１２時間後、飲料水を７日間、１％のグレードＩＩオバルブミン（OVA, Sigma）及び０．５％のＳｐｌｅｎｄａ（McNeil Nutritionals）溶液で置換した。体重を毎日午後５時に測定した。下痢発症のモニタリングのために、ＯＶＡの７日後、９日目及び１０日目に２００μｌのＰＢＳ中の５０ｍｇのグレードＩＩＩ ＯＶＡ（Sigma）の強制経口投与の２時間後、及び更なる投与を伴わないで１２日目に糞便テクスチャを分析した。糞便が特徴的な柔らかく明るい外観を２回連続して有する場合、マウスは下痢と診断した。単一強制経口投与実験では、マウスに９日目のみに投与し、糞便を２時間後に分析した。Ｔ細胞頻度を決定するために、レシピエントマウスの経口ＯＶＡ暴露の開始後、７日目に（腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び脾臓のみから）又は９日目に（腸上皮、固有層、ＭＬＮ及び脾臓から）リンパ球を、過去に記載されたようにして（Mucida等, 2007）単離した。サイトカイン染色のために、単離したリンパ球を、抗体とのインキュベーション前に、１０％のＦＢＳ、５５μＭのβ−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma）、５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Sigma）及び１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma）を補充したＲＰＭＩ培地で３時間刺激した。細胞を、Ｔ細胞表面マーカーに対する抗体で最初に染色し、続いてサイトカイン染色のためにＦｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（BD Pharmingen）を使用するか、又はＦｏｘｐ３染色のためのＦｏｘｐ３マウス調節Ｔ細胞染色キット（eBioscience）を使用して透過処理した。使用した蛍光色素結合抗体は、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（抗ＣＤ４，５５０９５４；抗ＣＤ２５，５５３８６６；抗ＩＬ−１７ａ，５５９５０２；抗Ｖｂ５，５５３１９０）又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（抗ＣＤ４４，５６−０４４１；抗ＣＤ４５．２，４７−０４５４；抗ＴＣＲ−β，４７−５９６１；抗ＩＦＮ−γ，２５−７３１１；抗Ｆｏｘｐ３，１７−５７７３；抗Ｖα２，４８−５８１２）から取得した。染色した細胞を、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用して分析し、集団頻度を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）を使用して決定した。
【０１０８】
ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）細胞のレシピエントは、ＷＴ ＯＴＩＩ細胞を受け入れたマウスと比較して、加速された消耗疾患を発症した（図７Ｄ）。ＯＴＩＩ（ｄｎＲａｒａ）細胞のレシピエントの全てが１２日目までに重度の下痢を発症したが（図７Ｅ）、ＷＴ細胞のレシピエントは下痢のないままであった。サイトカイン産生もまた、最初の強制経口投与後に評価し、ＩＦＮ−γ＋細胞の減少が付随するＩＬ−１７＋細胞の頻度の増加を確認した。特に、ＩＬ−１７応答の増強は、Ｆｏｘｐ３＋変換の障害の結果ではなかった（図７Ｅ）。腸への移植細胞のホーミングは、このモデルでは影響を受けず、同様の頻度のＣＤ４＋Ｔ細胞が腸組織で検出された（図１５Ａ）。我々は、ＲＡシグナル伝達の喪失が、これらＴｈ１７細胞が顕著な小腸炎症に関連している腸及び末梢の両方において、Ｔｈ１表現型からＴｈ１７表現型への逸脱をもたらすと結論付ける。
【０１０９】
実施例９．考察
調節不全のＴｈ細胞応答が自己免疫及びアレルギー疾患の病因の根底にある。制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞及びＴｈ１７細胞とは対照的に、Ｔｈ１細胞系譜は比較的安定であると考えられている。しかし、Ｔｈ１細胞系譜の維持を制御する因子はこれまで知られていなかった。この研究では、Ｔｈ１細胞安定性を支配する転写制御ネットワークにおける中心的な調節ノードであるとＲＡ−ＲＡＲαを同定している。我々は、ＲＡ−ＲＡＲαがナイーブＴ細胞分化の間に系譜を決定するＴｈ１細胞関連遺伝子の発現を直接維持し、またシグネチャーＴｈ１７細胞関連遺伝子を抑制することを見出した。Ｔｈ１コミットメント細胞におけるＲＡシグナル伝達の喪失は、Ｔｈ１７細胞表現型への逸脱を伴うＴｈ１細胞可塑性の増強をもたらした。調節エレメントを同定するためにＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用し、我々は、ＲＡＲαがエンハンサーに結合し、これらの領域へのｐ３００の動員がＲＡシグナル伝達に依存性であることを見出した。インビボでは、Ｔｈ１７細胞とＴｈ１−Ｔｈ１７細胞の両方が、リステリア・モノサイトゲネスでの感染中及び経口寛容モデルにおいて出現した。後者では、それらの存在は重要な病理と関連していた。
【０１１０】
エンハンサーは、系譜を規定する遺伝子の調節を通じて細胞運命を方向づける役割を果たす。ＷＴ及びｄｎＲａｒａ Ｔ細胞におけるエンハンサープロファイリングにより、Ｔｈ１同一性に関与する遺伝子（Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ及びＩｒｆ８）におけるエンハンサーのＲＡ依存性活性化が明らかになった。ｐ３００及びＨ３Ｋ２７ａｃのＲＡ依存性変化は転写レベルで反映されており、転写調節因子としてのその古典的役割に加えて、ＲＡはエンハンサー依存的に遺伝子発現を調節することが示唆された。ｐ３００−ＣＢＰ複合体をヌクレオソームに標的化するＲＡ−ＲＡＲαの能力は十分に確立されているが、ＲＡによるエンハンサーの調節は広くは研究されていない。我々は、エンハンサーエレメントにおけるリガンド非結合のＲＡＲαがゲートキーパーとして働き、Ｔ細胞が微小環境においてＲＡを感知するとエンハンサー活性化の開始を可能にすることを提案する。同様の役割がＳＴＡＴタンパク質についても証明されており（Vahedi等, 2012）、環境要因がエンハンサー活性化の開始及びＴ細胞運命のチェックポイントとして作用することを示唆している。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１修飾は、Ｔ細胞分化の初期の時点で存在するが、「活性」状態への転換にはＨ３Ｋ２７ａｃの獲得を必要とし、これは分化の後期まで明らかでないことが多い（Larjo等, 2013）。遺伝子発現の維持におけるエンハンサーの時間的役割と一致して、ＲＡシグナル伝達は標的遺伝子の転写の開始には必要とされず、むしろその発現を維持するように作用した。これらのデータは、細胞の同一性及び可塑性の維持におけるエンハンサーの重要性を強調している。エンハンサーのＲＡ−ＲＡＲα調節が、ＲＡが細胞運命を調節する主な機構である可能性がある。最近の研究では、胚性幹細胞のエンハンサーでのＲＡＲαの濃縮が確認されている（Chen等, 2012）。ＲＡ−ＲＡＲα系が、胚形成及び細胞分化の間の細胞運命規定を調節する役割を果たす高度に保存されたシグナル伝達経路であることを考慮すると、別のＴｈ細胞サブセットと免疫系外の両方において、エンハンサー機能の調節におけるＲＡ−ＲＡＲαのより広い役割を評価することは重要であろう。
【０１１１】
Ｔｈ１細胞関連遺伝子の発現を維持することに加えて、我々は、ＲＡがＴｈ１７細胞分化に関与する遺伝子を活発にサイレンシングすることを見出した。Ｔｈ１７細胞プログラムを調節することが知られている遺伝子の中で、Ｒｕｎｘ１とＩｌ６ｒａがＲＡ−ＲＡＲαによって直接的に抑制された。加えて、ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４標的遺伝子はＲＡシグナル伝達の非存在下で抑制解除された。Ｔｈ１７細胞では、ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４複合体が所定のＴｈ１７遺伝子のパイオニア因子として協同的に作用し（Ciofani等, 2012）、クロマチンアクセシビリティを調節してＳＴＡＴ３とＲＯＲγｔの結合を促進する。別のＴｈ細胞サブセットにおけるそれらの発現に基づいて、ＢＡＴＦ−ＩＲＦ４複合体が系譜特異的ＴＦの結合を確立する上で普遍的な役割を果たすことが示唆されている（Ciofani等, 2012）。しかし、ＢＡＴＦ欠損はＴｈ１細胞分化には影響しない（Schraml等, 2009）。別のモデルは、ＢＡＴＦとＩＲＦ４のアップレギュレーションが初期Ｔｈ１細胞において可塑性を付与し、Ｔｈ１７細胞関連遺伝子において特異的にクロマチンを転写準備状態にするというものである。ＢＡＴＦの別の結合パートナーであるＩＲＦ８は、Ｔｈ１７細胞分化を負に調節する（Ouyang等, 2011）。我々の結果では、ＩＲＦ８は、その発現がＲＡシグナル伝達に依存性であったＴｈ１細胞転写制御ネットワークのメンバーとして同定された。ＩＲＦ８の誘導は、もしかするとＢＡＴＦへの結合に対する競合により、Ｔｈ１７分化を抑制することによってＴｈ１細胞の可塑性を制限すると予想される。Ｔｈ１−Ｔｈ１７系の調節におけるＩＲＦ８の役割の裏付けとして、ＩＲＦ８に変異を有する患者ではＴｈ１応答障害があり（Hambleton等, 2011）、Ｉｒｆ８における一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１７細胞が病原体の役割を果たす幾つかの自己免疫疾患に関連している（Franke等, 2010；Graham等, 2011）。Ｔｈ１細胞におけるＢＡＴＦ、ＩＲＦ４及びＩＲＦ８の転写標的を同定することは興味深い。
【０１１２】
ＲＡシグナル伝達は、適切なＴｈ１細胞応答を維持し、ＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ１７＋細胞の発達を抑制することができた。ハイブリッドＴｈ１−Ｔｈ１７細胞は、幾つかの自己免疫疾患の病因に関与している。それらの発達はＴｈ１７細胞の可塑性に起因している。我々の知見は、これらの細胞が代わりにＴｈ１可塑性を反映し、Ｔｈ１７細胞の新規な発達経路を示唆しているかもしれないことを示唆している。Ｔｈ１由来の「Ｔｈ１７」細胞は、Ｔｈ１７病原性の決定因子であるＩＬ−２３の受容体を高レベルで発現し（Basu等, 2013）、経口免疫寛容モデルにおける重大な腸炎症及び病理に関連していた。自己免疫において生じる病原性Ｔｈ１７及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１７＋細胞は、ＲＡが欠損しているか又はそのシグナル伝達が乱されているときにＴｈ１細胞から出現するという予測を試験するために更なる実験が必要とされる。
【０１１３】
ある範囲の炎症性刺激は、免疫応答過程の間、ＲＡ合成及びシグナル伝達を誘導することができる。我々の結果は、Ｔｈ１細胞指令微小環境において、ＲＡのドミナントな作用はＴｈ１７細胞運命を抑制し、Ｔｈ１細胞応答を促進することであることを示唆している。我々は、初代Ｔｈ１７細胞分化の間にＴｈ１７細胞応答の増強を観察しなかったが、これは、Ｔ細胞安定性に対するＲＡの影響が時間的にも組織間でも変わりうることを示唆している。以前に、我々は、皮膚同種移植片拒絶のモデルにおいて、ｄｎＲａｒａマウスにおけるＴｈ１応答障害にはＴｈ２細胞サイトカインの増加が伴っていることを示した（Pino-Lagos等, 2011）。我々は、ＲＡＲαによるＴｈ２細胞関連遺伝子の直接的な抑制を同定しなかった。しかし、Ｔ−ｂｅｔはＧＡＴＡ３を抑制し（Zhu等, 2012）、皮膚などのＴｈ２歪み微小環境の存在下で、ＲＡシグナル伝達の非存在下でのＴ−ｂｅｔの発現障害は、細胞がＴｈ２逸脱をしやすくする。よって、Ｔ細胞運命に対するＲＡの効果は、Ｔ細胞極性を形成する外因子及び内因子に依存する可能性が高い。要約すると、我々は、ＲＡシグナル伝達がＴｈ１細胞の安定性及び機能的可塑性を調節する役割を果たすことを示す。ＲＡ−ＲＡＲαによる系譜決定遺伝子でのエンハンサー活性の調節は、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞プログラムの相互調節の機構的証拠を提供する。ＲＡシグナル伝達の非存在下において、Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ４及びＩＦＮ−γの発現低下及びＴｈ１７細胞遺伝子の抑制の喪失は、Ｔｈ１細胞のＴｈ１７細胞への分化転換のための許容される環境を作り出す。この研究は、ＲＡ−ＲＡＲα系を、Ｔｈ１−Ｔｈ１７細胞系の調節不全が観察される疾患における介入のための潜在的なノードであると同定する。
【０１１４】
実施例１０．ここに記載の実施態様
次の実施態様は、ここに記載の技術及びアプローチの態様の幾つかの概要を述べるものである。
【０１１５】
実施態様１  腫瘍を有する患者において抗腫瘍免疫を増強する方法であって、
【０１１６】
（ａ）腫瘍を有する患者にＲＡＲαアゴニストを投与する工程と
【０１１７】
（ｂ）腫瘍を治療するために患者に少なくとも一種の他の治療法を提供する工程
を含む、方法。
【０１１８】
実施態様２  実施態様１に記載の方法であって、前記少なくとも一種の他の治療法が、
【０１１９】
（ａ）腫瘍を有する患者へのチェックポイント阻害剤の投与；
【０１２０】
（ｂ）腫瘍を有する患者へのワクチンの投与；及び
【０１２１】
（ｃ）Ｔ細胞ベースの治療法での患者の治療
から選択される、方法。
【０１２２】
実施態様３  実施態様１−２の何れか一項に記載の方法であって、ＲＡＲαアゴニストが、
【０１２３】
（ａ）ＡＴＲＡ
【０１２４】
（ｂ）ＡＭ５８０
【０１２５】
（ｃ）ＡＭ８０（タミバロテン）
【０１２６】
（ｄ）ＢＭＳ７５３
【０１２７】
（ｅ）ＢＤ４
【０１２８】
（ｆ）ＡＣ−９３２５３
【０１２９】
（ｇ）ＡＲ７
【０１３０】
（ｈ）次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000010
【０１３１】
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、方法。
【０１３２】
実施態様４  ＲＡＲアゴニストがＲＡＭＢＡである、実施態様１−３の何れか一項に記載の方法。
【０１３３】
実施態様５  ＲＡＭＢＡが、ケトコナゾール、リアロゾール、及びタラロゾールから選択される少なくとも一つである、実施態様４に記載の方法。
【０１３４】
実施態様６  方法がＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴｈ１分化状態を強固にし、及び／又は維持する、実施態様１−５の何れか一項に記載の方法。
【０１３５】
実施態様７  ＲＡＲαアゴニストが、同時の化学療法を伴わないで投与される、実施態様１−６の何れか一項に記載の方法。
【０１３６】
実施態様８  患者が先に化学療法を受けていない、実施態様７に記載の方法。
【０１３７】
実施態様９  患者が少なくとも約２週間、１、２、又は３ヶ月以内に化学療法を受けていない、実施態様７に記載の方法。
【０１３８】
実施態様１０  患者が少なくとも約２週間、１、２、又は３ヶ月以内に将来の化学療法を受けない、実施態様７−９の何れか一項に記載の方法。
【０１３９】
実施態様１１  少なくとも一種の他の治療法が免疫増強剤である、実施態様１−１０の何れか一項に記載の方法。
【０１４０】
実施態様１２  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１分化を促進する、実施態様１−１１の何れか一項に記載の方法。
【０１４１】
実施態様１３  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１免疫応答を維持するために使用される、実施態様１−１２の何れか一項に記載の方法。
【０１４２】
実施態様１４  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１免疫応答を再導入するために使用される、実施態様１−１３の何れか一項に記載の方法。
【０１４３】
実施態様１５  Ｔｈ１免疫応答が、腫瘍によって発現される抗原に対するＴｈ１免疫応答である、実施態様１−１４の何れか一項に記載の方法。
【０１４４】
実施態様１６  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１分化治療薬である、実施態様１−１５の何れか一項に記載の方法。
【０１４５】
実施態様１７  Ｔｈ１分化治療薬が、ＩＬ−１２、ＳＴＡＴ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＮ−γ、Ｒｕｎｘ３、ＩＬ−４リプレッサー、Ｇａｔａ−３リプレッサー、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、及びＤＬＬから選択される、実施態様１６に記載の方法。
【０１４６】
実施態様１８  少なくとも一種の他の治療法がチェックポイント阻害剤である、実施態様１−１７の何れか一項に記載の方法。
【０１４７】
実施態様１９  チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒチェックポイント阻害剤から選択される、実施態様１８に記載の方法。
【０１４８】
実施態様２０  チェックポイント阻害剤がＳＴＡＴ３枯渇を引き起こす、実施態様１８に記載の方法。
【０１４９】
実施態様２１  チェックポイント阻害剤が抗体である、実施態様１８に記載の方法。
【０１５０】
実施態様２２  抗体チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、アゴニスト抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＫＩＲ、抗Ｂ７．１（抗ＣＤ８０としても知られる）、抗ＧＩＴＲ、抗ＳＴＡＴ３、抗ＣＤ１３７（抗４−１ＢＢとしても知られる）、抗ＶＩＳＴＡ、及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体から選択される、実施態様１９に記載の方法。
【０１５１】
実施態様２３  チェックポイント阻害剤が治療的Ｔｈ１応答を誘導及び／又は維持するのを助ける、実施態様１８−２２の何れか一項に記載の方法。
【０１５２】
実施態様２４  少なくとも一種の他の治療法が、抗原、腫瘍抗原、及び／又はがんワクチンである、実施態様１−２３の何れか一項に記載の方法。
【０１５３】
実施態様２５  少なくとも一種の他の治療法が二重特異性抗体である、実施態様１−２４の何れか一項に記載の方法。
【０１５４】
実施態様２６  二重特異性抗体が二重特異性Ｔ細胞誘導抗体である、実施態様２５に記載の方法。
【０１５５】
実施態様２７  二重特異性抗体が、抗ＣＤ２０と抗ＣＤ３；抗ＣＤ３と抗ＣＤ１９；抗ＥｐＣＡＭと抗ＣＤ３；並びに抗ＣＥＡと抗ＣＤ３から選択される、実施態様２６に記載の方法。
【０１５６】
実施態様２８  少なくとも一種の他の治療法がＴ細胞ベースの治療法である、実施態様１−２７の何れか一項に記載の方法。
【０１５７】
実施態様２９  Ｔ細胞ベースの治療法が、エクスビボ細胞ベースの治療法である、実施態様２８に記載の方法。
【０１５８】
実施態様３０  患者が、黒色腫、腎細胞がん、非小細胞肺がん（扁平上皮細胞がん及び／又は腺癌を含む）、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び頭頚部がんの少なくとも一つを有する、実施態様１−２９の何れか一項に記載の方法。
【０１５９】
実施態様３１  患者が、副腎皮質癌；エイズ関連がん（カポジ肉腫、リンパ腫）；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；非定型奇形腫様／横紋筋様腫瘍；基底細胞癌；胆管がん（例えば、肝外胆管がん）；膀胱がん；骨がん；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫；脳がん；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系胚細胞腫瘍；頭蓋咽頭腫；上衣腫；乳がん；気管支腫瘍；カルチノイド腫瘍；心（心臓）腫瘍；リンパ腫，原発性；子宮頸がん；脊索腫；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性骨髄増殖性腫瘍；結腸がん；結腸直腸がん；乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）；胚芽腫、子宮内膜がん；食道がん；感覚神経芽腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍（例えば、卵巣、精巣）；妊娠性絨毛性疾患；神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；下咽頭がん；膵島腫瘍、膵がん（例えば、膵神経内分泌腫瘍）；腎がん（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍）；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；口唇及び口腔がん；肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞、セザリー症候群、ホジキン、非ホジキン）；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）；男性乳がん；中皮腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮がん；ｎｕｔ遺伝子を含む正中線癌；口腔がん；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；鼻腔及び副鼻腔がん；鼻咽腔がん；神経芽細胞腫；口腔がん；口腔咽頭がん；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍、低悪性度腫瘍）；乳頭腫症；傍神経節腫；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；胸膜肺芽腫；妊娠期乳がん；原発性腹膜がん；前立腺がん（例えば、去勢抵抗性前立腺がん）；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫（子宮）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫）；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺がん；腎盂及び尿管の移行細胞がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がん、膣がん；外陰がん；又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する、実施態様１−２９の何れか一項に記載の方法。
【０１６０】
実施態様３２  がんが、急性骨髄性白血病、胆管がん、膀胱がん；脳がん；乳がん；気管支腫瘍；子宮頸がん；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸直腸がん；子宮内膜がん；食道がん；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；腎（例えば、腎細胞）がん；肺がん（非小細胞、小細胞）；リンパ腫（例えば、Ｂ細胞）；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；卵巣がん（例えば、上皮腫瘍）；膵がん；前立腺がん（去勢抵抗性前立腺がんを含む）；皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌）；小腸がん；扁平上皮癌；精巣がん；原発不明がん；尿道がん；子宮がんから選択される、実施態様３１に記載の方法。
【０１６１】
実施態様３３  患者が、ＲＡＲα転座急性骨髄性白血病を有していない、実施態様１−３２の何れか一項に記載の方法。
【０１６２】
実施態様３４  ＲＡＲαアゴニストがオールトランスレチノイン酸ではない、実施態様１−３３の何れか一項に記載の方法。
【０１６３】
実施態様３５  患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法であって、ＲＡＲαアゴニストと少なくとも一種の他の治療法を患者に施すことを含む方法。
【０１６４】
実施態様３６  患者が自己免疫疾患を有し、前記方法が自己免疫疾患を治療する、実施態様３５に記載の方法。
【０１６５】
実施態様３７  ＩＦＮｇ＋及び／又はＩＬ１７＋シグネチャーを有するＴｈ１７細胞が抑制される、実施態様３５−３６の何れか一項に記載の方法。
【０１６６】
実施態様３８  実施態様３５−３７の何れか一項に記載の方法であって、ＲＡＲαアゴニストが、
【０１６７】
（ａ）ＡＴＲＡ
【０１６８】
（ｂ）ＡＭ５８０
【０１６９】
（ｃ）ＡＭ８０（タミバロテン）
【０１７０】
（ｄ）ＢＭＳ７５３
【０１７１】
（ｅ）ＢＤ４
【０１７２】
（ｆ）ＡＣ−９３２５３
【０１７３】
（ｇ）ＡＲ７
【０１７４】
（ｈ）次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000011
【０１７５】
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、方法。
【０１７６】
実施態様３９  ＲＡＲαアゴニストが、Ｔ細胞抑制剤と共に共投与される、実施態様３５−３８の何れか一項に記載の方法。
【０１７７】
実施態様４０  ＲＡＲαアゴニストが、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アザチオプリン、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴルタクロリムス、コルチコステロイド（プレドニゾン等）、ジメチルフマレート、エタネルセプト、フィンゴリモド、酢酸グラチラマー、ゴリムマブ、ヒドロキシクロロキン、インフリキシマブ、レフルノミド、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ナタリズマブ、リツキシマブ、スルファサラジン、テリフルノミド、トシリズマブ、トファシチニブ、又はベドリズマブと共に共投与される、実施態様３５−３９の何れか一項に記載の方法。
【０１７８】
実施態様４１  自己免疫疾患が、ＩＦＮｇ＋ＩＬ１７＋Ｔ細胞シグネチャーを有する自己免疫疾患から選択される、実施態様３５−４０の何れか一項に記載の方法。
【０１７９】
実施態様４２  自己免疫疾患が、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、及び多発性硬化症から選択される、実施態様３５−４１の何れか一項に記載の方法。
【０１８０】
実施態様４３  自己免疫疾患が、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、又は多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）から選択される、実施態様３５−４２の何れか一項に記載の方法。
【０１８１】
実施例１１．ここに記載の事項
限定するわけではないが、所定の項を、出願を通して、また以下の項の一覧に記載する：
【０１８２】
第１項  腫瘍を有する患者にＲＡＲαアゴニストを投与することを含む、抗腫瘍免疫を増強する方法。
【０１８３】
第２項  ＲＡＲαアゴニストが、
ａ．  ＡＴＲＡ
ｂ．  ＡＭ５８０
ｃ．  ＡＭ８０（タミバロテン）
ｄ．  ＢＭＳ７５３
ｅ．  ＢＤ４
ｆ．  ＡＣ−９３２５３
ｇ．  ＡＲ７
ｈ．  次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000012
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、第１項に記載の方法。
【０１８４】
第３項  方法がＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴｈ１分化状態を強固にし、及び／又は維持する、第１−２項の何れか一項に記載の方法。
【０１８５】
第４項  ＲＡＲαアゴニストが、同時の化学療法を伴わないで投与される、第１−３項の何れか一項に記載の方法。
【０１８６】
第５項  患者が先に化学療法を受けていない、第４項に記載の方法。
【０１８７】
第６項  患者が少なくとも約２週間、１、２、又は３ヶ月以内に化学療法を受けていない、第４項に記載の方法。
【０１８８】
第７項  患者が少なくとも約２週間、１、２、又は３ヶ月以内に将来の化学療法を受けない、第４−６項の何れか一項に記載の方法。
【０１８９】
第８項  ＲＡＲαアゴニストが少なくとも一種の他の治療法と組み合わせて投与される、第１−７項の何れか一項に記載の方法。
【０１９０】
第９項  少なくとも一種の他の治療法が免疫増強剤である、第８項に記載の方法。
【０１９１】
第１０項  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１分化を促進する、第８−９項の何れか一項に記載の方法。
【０１９２】
第１１項  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１免疫応答を維持するために使用される、第１０項に記載の方法。
【０１９３】
第１２項  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１免疫応答を再導入するために使用される、第９−１１項の何れか一項に記載の方法。
【０１９４】
第１３項  Ｔｈ１免疫応答が、腫瘍によって発現される抗原に対するＴｈ１免疫応答である、第１１−１２項の何れか一項に記載の方法。
【０１９５】
第１４項  少なくとも一種の他の治療法がＴｈ１分化治療薬である、第８−１３項の何れか一項に記載の方法。
【０１９６】
第１５項  Ｔｈ１分化治療薬が、ＩＬ−１２、ＳＴＡＴ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＮ−γ、Ｒｕｎｘ３、ＩＬ−４リプレッサー、Ｇａｔａ−３リプレッサー、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、及びＤＬＬから選択される、第１４項に記載の方法。
【０１９７】
第１６項  少なくとも一種の他の治療法がチェックポイント阻害剤である、第８−１５項の何れか一項に記載の方法。
【０１９８】
第１７項  チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７Ｈ３、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１阻害剤、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＡＬ９、抗ＴＩＭ３、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０Ｌ及び抗ＯＸ４０チェックポイント阻害剤から選択される、第１６項に記載の方法。
【０１９９】
第１８項  チェックポイント阻害剤が抗体である、第１７項に記載の方法。
【０２００】
第１９項  チェックポイント阻害剤が治療的Ｔｈ１応答を誘導及び／又は維持するのを助ける、第１６−１８項の何れか一項に記載の方法。
【０２０１】
第２０項  少なくとも一種の他の治療法が、抗原、腫瘍抗原、及び／又はがんワクチンである、第８−１９項の何れか一項に記載の方法。
【０２０２】
第２１項  患者が、黒色腫、腎細胞がん、非小細胞肺がん（扁平上皮細胞がん及び／又は腺癌を含む）、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び頭頚部がんの少なくとも一つを有する、第１−２０項の何れか一項に記載の方法。
【０２０３】
第２２項  患者が、副腎皮質癌；エイズ関連がん（カポジ肉腫、リンパ腫）；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；非定型奇形腫様／横紋筋様腫瘍；基底細胞癌；胆管がん；膀胱がん；骨がん；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫；脳腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系胚細胞腫瘍；頭蓋咽頭腫；上衣腫；乳がん；気管支腫瘍；カルチノイド腫瘍；心（心臓）腫瘍；リンパ腫，原発性；子宮頸がん；脊索腫；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性骨髄増殖性腫瘍；結腸がん；結腸直腸がん；肝外胆管（Duct, Bile, Extrahepatic）；乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）；胚芽腫、子宮内膜がん；食道がん；感覚神経芽腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼がん（眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；卵管がん；胆嚢がん；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍（卵巣、精巣）；妊娠性絨毛性疾患；神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝）がん；下咽頭がん；膵島腫瘍、膵神経内分泌腫瘍；腎臓（腎細胞、ウィルムス腫瘍）；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；口唇及び口腔がん；肺がん（非小細胞、小細胞）；リンパ腫（バーキット、皮膚Ｔ細胞、セザリー症候群、ホジキン、非ホジキン）；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）；男性乳がん；中皮腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮がん；ＮＵＴ遺伝子を含む正中線癌；口腔がん（Mouth Cancer）；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；鼻腔及び副鼻腔がん；鼻咽腔がん；神経芽細胞腫；口腔がん（Oral Cancer）；口腔咽頭がん；卵巣がん（上皮腫瘍、低悪性度腫瘍）；乳頭腫症；傍神経節腫；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；胸膜肺芽腫；妊娠期乳がん（Pregnancy and Breast Cancer）；原発性腹膜がん；前立腺がん；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫（子宮）；皮膚がん（黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫）；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺がん；腎盂及び尿管の移行細胞がん；原発不明；尿道がん；子宮がん、膣がん；外陰がん；又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する、第１−２０項の何れか一項に記載の方法。
【０２０４】
第２３項  患者が、ＲＡＲα転座急性骨髄性白血病を有していない、第１−１２項の何れか一項に記載の方法。
【０２０５】
第２４項  ＲＡＲαアゴニストがオールトランスレチノイン酸ではない、第１−２３項の何れか一項に記載の方法。
【０２０６】
第２５項  ＲＡＲαアゴニストを投与することを含む、患者におけるＴｈ１７応答を抑制する方法。
【０２０７】
第２６項  患者が自己免疫疾患を有する、第２５項に記載の方法。
【０２０８】
第２７項  ＩＦＮｇ＋及び／又はＩＬ１７＋シグネチャーを有するＴｈ１７細胞が抑制される、第２５−２６項の何れか一項に記載の方法。
【０２０９】
第２８項  ＲＡＲαアゴニストが、
ａ．  ＡＴＲＡ
ｂ．  ＡＭ５８０
ｃ．  ＡＭ８０（タミバロテン）
ｄ．  ＢＭＳ７５３
ｅ．  ＢＤ４
ｆ．  ＡＣ−９３２５３
ｇ．  ＡＲ７
ｈ．  次の式の化合物又はその薬学的に許容される塩
2018512396.tif 000013
｛上式中、−Ｒ１は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ２は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；−Ｒ３は独立して−Ｘ、−ＲＸ、−Ｏ−ＲＸ、−Ｏ−ＲＡ、−Ｏ−ＲＣ、−Ｏ−Ｌ−ＲＣ、−Ｏ−ＲＡＲ、又は−Ｏ−Ｌ−ＲＡＲであり；但し、−Ｒ１、−Ｒ２、及び−Ｒ３の全てが−Ｏ−ＲＡであることはなく；各−Ｘは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は-Ｉであり；各−ＲＡは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＸは飽和脂肪族Ｃ１−６ハロアルキルであり；各−ＲＣは飽和Ｃ３−７シクロアルキルであり；各−ＲＡＲはフェニル又はＣ５−６ヘテロアリールであり；各−Ｌ−は飽和脂肪族Ｃ１−３アルキレンであり；−Ｊ−は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＮ-であり；−ＲＮは独立して−Ｈ又は−Ｈ又は−ＲＮＮであり；−ＲＮＮは飽和脂肪族Ｃ１−４アルキルであり；＝Ｙ−は＝ＣＲＹ−であり、−Ｚ＝は−ＣＲＺ＝であり；−ＲＹは-Ｈであり；−ＲＺは独立して−Ｈ又は−ＲＺＺであり；−ＲＺＺは独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ１−４アルキル、又は飽和脂肪族Ｃ１−４ハロアルキルであり；＝Ｗ−は＝ＣＲＷ−であり；−ＲＷは−Ｈであり；−ＲＯは独立して−ＯＨ、−ＯＲＥ、−ＮＨ２、−ＮＨＲＴ１、−ＮＲＴ１ＲＴ１又は−ＮＲＴ２ＲＴ３であり；−ＲＥは飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；各−ＲＴ１は飽和脂肪族Ｃ１−６アルキルであり；−ＮＲＴ２ＲＴ３は独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ−（Ｃ１−３アルキル）ピペリジノ、又はモルホリノであり；但し、化合物は次の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物から選択される化合物ではない：４−（３，５−ジクロロ−４−エトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０２）；及び４−（３，５−ジクロロ−４−メトキシ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（ＰＰ−０３）｝
から選択される、第２５−２７項の何れか一項に記載の方法。
【０２１０】
第２９項  ＲＡＲαアゴニストが、Ｔ細胞抑制剤と共に共投与される、第２５−２８項の何れか一項に記載の方法。
【０２１１】
第３０項  ＲＡＲαアゴニストが、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アザチオプリン、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴルタクロリムス、コルチコステロイド（プレドニゾン等）、ジメチルフマレート、エタネルセプト、フィンゴリモド、酢酸グラチラマー、ゴリムマブ、ヒドロキシクロロキン、インフリキシマブ、レフルノミド、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ナタリズマブ、リツキシマブ、スルファサラジン、テリフルノミド、トシリズマブ、トファシチニブ、又はベドリズマブと共に共投与される、第２５−２９項の何れか一項に記載の方法。
【０２１２】
第３１項  自己免疫疾患が、ＩＦＮｇ＋ＩＬ１７＋Ｔ細胞シグネチャーを有する自己免疫疾患から選択される、第２５−３０項の何れか一項に記載の方法。
【０２１３】
第３２項  自己免疫疾患が、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、及び多発性硬化症から選択される、第２５−３１項の何れか一項に記載の方法。
【０２１４】
第３３項  自己免疫疾患が、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）から選択される、第２５−３２項の何れか一項に記載の方法。
【０２１５】
［参考文献］
Annunziato, F., Cosmi, L., Santarlasci, V., Maggi, L., Liotta, F., Mazzinghi, B., Parente, E., Fili, L., Ferri, S., Frosali, F.等 (2007). Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, 1849-1861。
【０２１６】
Aoyama, K., Saha, A., Tolar, J., Riddle, M.J., Veenstra, R.G., Taylor, P.A., Blomhoff, R., Panoskaltsis-Mortari, A., Klebanoff, C.A., Socie, G.等 (2013). Inhibiting retinoic acid signaling ameliorates graft-versus-host disease by modifying T-cell differentiation and intestinal migration. Blood 122, 2125-2134。
【０２１７】
Basu, R. Hatton, R., Weaver, C. (2013) The Th17 family: flexibility follows function. Immunol Rev 252, 89-103。
【０２１８】
Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N.N.及びKeller, G. (2013). Retinoic Acid Signaling Is Essential for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development. Cell 155, 215-227。
【０２１９】
Chen, C., Morris, Q.及びMitchell, J.A. (2012). Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics 13, 152-170。
【０２２０】
Ciofani, M., Madar, A., Galan, C., Sellars, M., Mace, K., Pauli, F., Agarwal, A., Huang, W., Parkurst, C., Muratet M.等 (2012). A Validated Regulatory Network for Th17 Cell Specification: Cell 151, 289-303。
【０２２１】
Feng, J., Liu, T.及びZhang, Y. (2011) Using MACS to Identify Peaks from ChIP-Seq Data. Current Protocols in Bioinformatics. 34:2.14:2.14.1-2.14.14。
【０２２２】
Franke, A., McGovern, D.P.B., Barrett, J.C., Wang, K., Radford-Smith, G.L., Ahmad, T., Lees, C.W., Balschun, T., Lee, J., Roberts, R.等(2010). Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci. Nat Genet 42, 1118-1125。
【０２２３】
Graham, D.S.C., Morris, D.L., Bhangale, T.R., Criswell, L.A., Syvanen, A.-C., Ronnblom, L., Behrens, T.W., Graham, R.R.及びVyse, T.J. (2011). Association of NCF2, IKZF1, IRF8, IFIH1, and TYK2 with Systemic Lupus Erythematosus. PLoS Genet 7, e1002341。
【０２２４】
Hall, J.A., Cannons, J.L., Grainger, J.R., Santos, Dos, L.M., Hand, T.W., Naik, S., Wohlfert, E.A., Chou, D.B., Oldenhove, G., Robinson, M.等 (2011). Essential Role for Retinoic Acid in the Promotion of CD4+ T-cell Effector Responses via Retinoic Acid Receptor Alpha. Immunity 34, 435-447。
【０２２５】
Hambleton, S., Salem, S., Bustamante, J., Bigley, V., Boisson-Dupuis, S., Azevedo, J., Fortin, A., Haniffa, M., Ceron-Gutierrez, L., Bacon, C.M.等 (2011). IRF8 Mutations and Human Dendritic-Cell Immunodeficiency. N Engl J Med 365, 127-138。
【０２２６】
Irvin, C., Zafar, I., Good, J., Rollins, D., Christianson, C., Gorska, M.M., Martin, R.J.及びAlam, R. (2014). Increased frequency of dual-positive TH2/TH17 cells in bronchoalveolar lavage fluid characterizes a population of patients with severe asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 134, 1175-1186。
【０２２７】
Kamei, Y., Xu, L., Heinzel, Y.等 (1996). A CBP Integrator Complex Mediates Transcriptional Activation and AP-1 Inhibition by Nuclear Receptors, Cell, 85, 403-414。
【０２２８】
Kashyap, V., Laursen, K.B., Brenet, F., Viale, A.J., Scandura, J.M.及びGudas, L.J. (2013). RARγ is essential for retinoic acid induced chromatin remodeling and transcriptional activation in embryonic stem cells. J Cell Sci. 126, 999-1008。
【０２２９】
Kebir, H., Ifergan, I., Alvarez, J.I., Bernard, M., Poirier, J., Arbour, N., Duquette, P.及びPrat, A. (2009). Preferential recruitment of interferon-gamma-expressing TH17 cells in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 66, 390-402。
【０２３０】
Klebanoff, C.A., Spencer, S.P., Torabi-Parizi, P., Grainger, J.R., Roychoudhuri, R., Ji, Y., Sukumar, M., Muranski, P., Scott, C.D., Hall, J.A.等 (2013). Retinoic acid controls the homeostasis of pre-cDC-derived splenic and intestinal dendritic cells. J Exp Med. 210, 1961-1976。
【０２３１】
Komatsu, N., Okamoto, K., Sawa, S., Nakashima, T., Oh-hora, M., Kodama, T., Tanaka, S., Bluestone, J.A.及びTakayanagi, H. (2014). Pathogenic conversion of Foxp3+ T-cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nat Med. 20, 62-68。
【０２３２】
Larjo, A., Tripathi, S.K., Wagner, U., Luu, Y.及びLonnberg, T. (2013). Global Chromatin State Analysis Reveals Lineage-Specific Enhancers during the Initiation of Human T helper 1 and T helper 2 Cell Polarization: Immunity 38, 1271-1284。
【０２３３】
Mucida, D., Park, Y., Kim, G., Turovskaya, O., Scott, I., Kronenberg, M.及びCheroutre, H. (2007). Reciprocal TH17 and regulatory T-cell differentiation mediated by retinoic acid. Science 317, 256。
【０２３４】
Mukasa, R., Balasubramani, A., Lee, Y.K.及びWhitley, S.K. (2010). Epigenetic Instability of Cytokine and Transcription Factor Gene Loci Underlies Plasticity of the T Helper 17 Cell Lineage. Immunity 28, 616-27。
【０２３５】
Nistala, K., Adams, S., Cambrook, H., Ursu, S., Olivito, B., de Jager, W., Evans, J.G., Cimaz, R., Bajaj-Elliott, M.及びWedderburn, L.R. (2010). Th17 plasticity in human autoimmune arthritis is driven by the inflammatory environment. Proc Natl Acad Sci 107, 14751-6。
【０２３６】
Ouyang, X., Zhang, R., Yang, J., Li, Q., Qin, L., Zhu, C., Liu, J., Ning, H., Shin, M.S., Gupta, M., et al. (2011). Transcription factor IRF8 directs a silencing programme for TH17 cell differentiation. Nat Commun. 2, 314.
【０２３７】
Pino-Lagos, K., Guo, Y., Brown, C., Alexander, M.P., Elgueta, R., Bennett, K.A., De Vries, V., Nowak, E., Blomhoff, R., Sockanathan, S.等 (2011). A retinoic acid-dependent checkpoint in the development of CD4+ T-cell-mediated immunity. J Exp Med. 208, 1767-1775。
【０２３８】
Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A.及びWysocka, J. (2010). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283。
【０２３９】
Reis, B.S., Rogoz, A., Costa-Pinto, F.A., Taniuchi, I.及びMucida, D. (2013). Mutual expression of the transcription factors Runx3 and ThPOK regulates intestinal CD4+ T-cell immunity. Nat Immunol. 14, 271-280。
【０２４０】
Schraml, B.U., Hildner, K., Ise, W., Lee, W.-L., Smith, W.A.E., Solomon, B., Sahota, G., Sim, J., Mukasa, R., Cemerski, S.等 (2009). The AP-1 transcription factor Batf controls TH17 differentiation. Nature 460, 405-409。
【０２４１】
Schulz, E.G., Mariani, L., Radbruch, A.及びHo fer, T. (2009). Sequential polarization and imprinting of type 1 T helper lymphocytes by interferon-gamma and interleukin-12. Immunity 30, 673-683
【０２４２】
Spencer, S.P., Wilhelm, C., Yang, Q., Hall, J.A., Bouladoux, N., Boyd, A., Nutman, T.B., Urban, J.F., Wang, J., Ramalingam, T.R.等 (2014). Adaptation of Innate Lymphoid Cells to a Micronutrient Deficiency Promotes Type 2 Barrier Immunity. Science 343, 432-437。
【０２４３】
Takahashi, H., Kanno, T., Nakayamada, S., Hirahara, K., Egrave, G.S., Muljo, S.A., Kuchen, S., Casellas, R., Wei, L., Kanno, Y.等(2012). TGF-b and retinoic acid induce the microRNA miR-10a, which targets Bcl-6 and constrains the plasticity of helper T-cells. Nat Immunol. 13, 587-95。
【０２４４】
Urvalek, A.M.及びGudas, L.J. (2014). Retinoic Acid and Histone Deacetylases Regulate Epigenetic Changes in Embryonic Stem Cells. J Biol Chem. 289, 19519-19530。
【０２４５】
Vahedi, G., Takahashi, H., Nakayamada, S., Sun, H.-W., Sartorelli, V., Kanno, Y.及びO'shea, J.J. (2012). STATs shape the active enhancer landscape of T-cell populations. Cell 151, 981-993。
【０２４６】
Wadia, J., Stan, R., Dowdy, S. (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat Med. 10,310-5。
【０２４７】
Wei, L., Vahedi, G., Sun, H.-W., Watford, W.T., Takatori, H., Ramos, H.L., Takahashi, H., Liang, J., Gutierrez-Cruz, G., Zang, C.等(2010). Discrete roles of STAT4 and STAT6 transcription factors in tuning epigenetic modifications and transcription during T helper cell differentiation. Immunity 32, 840-851。
【０２４８】
Xiao, S., Jin, H., Korn, T., Liu, S.M., Oukka, M., Lim, B.及びKuchroo, V.K. (2008). Retinoic acid increases Foxp3+ regulatory T-cells and inhibits development of Th17 cells by enhancing TGF-beta-driven Smad3 signaling and inhibiting IL-6 and IL-23 receptor expression. J Immunol. 181, 2277-2284。
【０２４９】
Yang, Y., Ochando, J.C., Bromberg, J.S.及びDing, Y. (2007). Identification of a distant T-bet enhancer responsive to IL-12/Stat4 and IFN /Stat1 signals. Blood 110, 2494-2500。
【０２５０】
Zhang, F., Meng, G.及びStrober, W. (2008). Interactions among the transcription factors Runx1, RORgt and Foxp3 regulate the differentiation of interleukin 17-producing T-cells. Nat Immunol. 9, 1297-1306。
【０２５１】
Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C.A., Eeckhoute, J., Johnson, D.S., Bernstein, B.E., Nusbaum, C., Myers, R.M., Brown, M., Li, W.及びLiu, X.S. (2008) Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9:R 137。
【０２５２】
Zhou, L., Ivanov, I.I., Spolski, R., Min, R., Shenderov, K., Egawa, T., Levy, D.E., Leonard, W.J.及びLittman, D.R. (2007). IL-6 programs TH-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat. Immunol 13, 587-95。
【０２５３】
Zhu, J., Jankovic, D., Oler, A.J., Wei, G., Sharma, S., Hu, G., Guo, L., Yagi, R., Yamane, H., Punkosdy, G.等 (2012). The Transcription Factor T-bet Is Induced by Multiple Pathways and Prevents an Endogenous Th2 Cell Program during Th1 Cell Responses. Immunity 37, 660-673。
【０２５４】
均等物
前述の文書の明細書は、当業者が実施態様を実施するのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、所定の実施態様を詳述し、本発明者が考える最良の形態を記載している。しかしながら、前述のことが如何に詳細に本文に記載されていても、実施態様は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲とその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【０２５５】
ここで使用される場合、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が記載値と同等であると考える（例えば、同じ機能又は結果を有する）数値の範囲（例えば、記載範囲の＋／−５〜１０％）を意味する。少なくとも及び約のような用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリストにおいて提供される値又は範囲の全てを修飾している。幾つかの例では、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含みうる。
【図１Ａ−Ｃ】
2018512396.tif 000016
【図１Ｄ−Ｆ】
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【図２Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000018
【図２Ｃ−Ｄ】
2018512396.tif 000019
【図２Ｅ】
2018512396.tif 000020
【図３Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000021
【図３Ｃ−Ｄ】
2018512396.tif 000022
【図３Ｅ−Ｇ】
2018512396.tif 000023
【図４Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000024
【図５Ａ】
2018512396.tif 000025
【図５Ｂ−Ｅ】
2018512396.tif 000026
【図５Ｆ】
2018512396.tif 000027
【図５Ｇ】
2018512396.tif 000028
【図５Ｈ−Ｋ】
2018512396.tif 000029
【図６Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000030
【図６Ｃ−Ｄ】
2018512396.tif 000031
【図７Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000032
【図７Ｃ−Ｄ】
2018512396.tif 000033
【図７Ｅ−Ｆ】
2018512396.tif 000034
【図８】
2018512396.tif 000035
【図９Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000036
【図１０Ａ−Ｃ】
2018512396.tif 000037
【図１０Ｄ−Ｅ】
2018512396.tif 000038
【図１１Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000039
【図１２Ａ−Ｂ】
2018512396.tif 000040
【図１３Ａ】
2018512396.tif 000041
【図１３Ｂ−Ｃ】
2018512396.tif 000042
【図１３Ｄ−Ｆ】
2018512396.tif 000043
【図１４Ａ−Ｃ】
2018512396.tif 000044
【図１５】
2018512396.tif 000045
【配列表】
2018512396000001.app
【国際調査報告】
2018512396.tif 000046
2018512396.tif 000047
2018512396.tif 000048