(57)【要約】例えば、高親和性ＣＤ３結合ドメインが高親和性Ｆｃ結合ドメインに融合されている、合理的に設計された可溶性ユニバーサルＡＤＣＣエンハンサータンパク質（ＳＵＡＥＰ）により、ＡＤＣＣ応答を増強するまたは可能にする、新規合成生物学に基づくＡＤＣＣ技術が提供されている。ＳＵＡＥＰ技術を使用して、がん、感染性、炎症性または自己免疫性疾患および罹病細胞の排除が望ましい他の疾患を防止または処置することができる。この新たなアダプター分子は、可溶性であり、患者の血液に注射して、大部分の組織区画にアクセスすることができる。
2018502068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高親和性Ｆｃ結合ドメインと、高親和性ＣＤ３結合ドメインとを含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記高親和性Ｆｃ結合ドメインが、ＣＤ６４のエクトドメイン、高親和性ＣＤ１６改変体およびヒトＦｃに対し高親和性を有する抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
高親和性ＣＤ３結合ドメインが、ＯＫＴ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＯＫＴ３モノクローナル抗体が、ｄｈＯＫＴ３である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の融合タンパク質と、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項６】
処置の必要性のある被験体を、ある状態について治療的に処置する方法であって、前記被験体に治療上有効な量の請求項５に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項７】
前記状態を示す少なくとも１種の細胞表面抗原に対する治療用抗体を投与する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４と実質的に同様のＦｃ領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記状態が、がん、炎症性疾患、自己免疫性疾患、移植片拒絶および感染からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
処置の必要性のある被験体を、ある状態について予防的に処置する方法であって、前記被験体に予防上有効な量の請求項５に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記状態に対するワクチンを投与する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記状態が、がんである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１４年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０８９，０９７号、および２０１５年８月３日に出願された同第６２／２００，５５７号に対する優先権および利益を主張し、その両方は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞、が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介することを可能とするように使用され得る合成生物学的生成物およびプロセス、ならびにがん、感染性疾患、炎症性および自己免疫疾患ならびに他の疾患の処置および防止においてそれらを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物、特に高等脊椎動物（ヒトを含む）は、複数の機構およびエフェクターを使用して、外来病原体ならびに罹病したかもしくはストレスを受けた自己由来細胞を検出、破壊もしくは少なくとも封じ込める、非常に複雑な免疫系を発達させた。これらの罹病細胞は、ウイルスもしくは細菌によって感染した可能性があるか、またはがんになった可能性がある。
【０００４】
免疫系が罹病宿主細胞および侵入している細胞内微生物（例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生生物）を認識および排除する機構のうちの１つは、細胞媒介性細胞傷害性を通してであり、これは、多くの白血球およびタンパク質によって行われ得る。これら潜在的に細胞傷害性のエフェクターとしては、以下が挙げられる：リンパ球系統からはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）；ならびに骨髄系統からはマクロファージ、好中球および好酸球。
【０００５】
免疫系が細胞媒介性細胞傷害性を発揮させる（ｕｎｌｅａｓｈ）ための重要な方法は、抗体に依拠する。過去１０年間にわたって、腫瘍特異的細胞表面タンパク質を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、がんに対する普及した治療アプローチになった。いくつかのｍＡｂは、リツキシマブ（リツキサン、マブセラ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）およびセツキシマブ（アービタックス）を含め、慣用的な臨床実践に入った。ｍＡｂの人気は、それらの二機能性の性質の結果である。抗体の一方の末端（Ｆａｂ）は、腫瘍細胞を死滅させる種々のエフェクター細胞およびタンパク質を動員する他方の末端（Ｆｃ）を変化させることなく、特定の腫瘍タンパク質に精巧に特異的にされ得る。
【０００６】
具体的には、まず、標的細胞の表面にある抗原を認識および結合した後、抗体は、アダプターとして作用し、免疫エフェクター細胞上のある種のレセプターとの第２の結合を通じて免疫エフェクター細胞の細胞傷害性能力の活性化にすすむ。これは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）といわれる。例えば、がんに対する先天的免疫の状況において、ＡＤＣＣは主に、標的の罹病細胞（例えば、腫瘍細胞）上で多価抗原を覆っている抗体のＦｃフラグメントと結合した際にのみ活性化される、相対的に低親和性のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａとしても公知））を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（およびより低い程度には、好中球、単球およびマクロファージ）によって媒介される。この結合は、パーフォリンおよびグランザイム（ならびにＩＦＮ−γを含む多くのサイトカイン）のような細胞傷害性顆粒の放出の引き金となり、標的細胞の溶解をもたらす。ＡＤＣＣの重要性は、インビトロで、および動物研究での両方において示されてきた。さらに、いくつかの臨床研究は、より低い親和性のＣＤ１６改変体（Ｆ１５８）を有する患者がより悪い臨床転帰を有することを示した。
【０００７】
しかし、ＡＤＣＣ効力は、内因性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって主に媒介されるので、以下に説明されるとおりの多くの生理学的および病理学的な理由に起因して、身体では制限されている（内因性細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍クリアランスに少しでも参加し、それらの効力もまた、非常に限られており、欠けていると見出された程度に）。
【０００８】
第１に、ＡＤＣＣに関与する大部分の細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）は、それらが活性化されるときに増殖する傾向にない。ＮＫ細胞はまた、活性化に応じた増殖能力が制限されており、それらはまた、急速に死に絶えてしまう。従って、身体における天然のＡＤＣＣ応答は、ＡＤＣＣエフェクターが罹病細胞を覆う抗体を認識するとしても、疾患進行（例えば、ウイルス感染、がん）によって圧倒されるリスクがある。
【０００９】
第２に、ＡＤＣＣエフェクター細胞の多くはまた、それらの免疫応答性を低下させる阻害性レセプターを発現し、それによってバランスおよびチェックのシステムを設けている。これらレセプターとしては、ＣＤ５６ｌｏｗ  ＮＫ細胞に対する阻害性ＫＩＲ（キラー免疫グロブリン様レセプター）、単球およびＢ細胞上のＦｃγＲＩＩｂ、ならびにＴ細胞に対するＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）およびＰＤ−１（プログラム死−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ−Ｄｅａｔｈ−１）、ＣＤ２７９）が挙げられる。がん細胞およびウイルスは、このような阻害経路を異常に増幅することによって身体のＡＤＣＣベースの防御システムに逆らう。
【００１０】
第３に、ＡＤＣＣエフェクター細胞上の主要ＦｃレセプターであるＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、抗体に対して比較的低い親和性（Ｋｄ  約１０−６Ｍ）を有する−−さらに、上記レセプターのＶ１５８改変体は、上記レセプターの無効なＦ１５８形態と比較して、２倍高いに過ぎない親和性を有する。これは、細胞表面標的の密度がいったんあるレベル未満に落ちた後、がん細胞が、一部の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に抵抗性になる１つの機構である。
【００１１】
増殖および親和性におけるその天然の限界、ならびに疾患（例えば、がんもしくは他の疾患）の設定において阻害性Ｆｃレセプターによるさらなる低下に鑑みれば、身体のＡＤＣＣ機能は、決して十分には理解されていない大きな潜在能力を有する。従って合成生物学は、ヒト疾患の防止および処置においてＡＤＣＣ活性の十分な潜在能力を発揮させる、新規かつ非常に望ましいアプローチを表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
本発明により新たなアプローチがもたらされ、がん、感染および他の疾患に対する免疫系の防御が改善される。本発明は、Ｔ細胞の細胞傷害性および増殖ポテンシャルを抗体に基づく治療法に結び付ける、新規の自由に会合する（ｆｒｅｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーを考案する。
【００１３】
本発明によれば、罹病細胞（例えば、腫瘍細胞）を標的とする抗体をＣＤ３＋  Ｔ細胞と接触させる、自由に会合し循環するアダプターとして融合タンパク質が提供される。この新たなアダプター分子は、可溶性であり、患者の血液に注射して、大部分の組織区画にアクセスすることができる。このアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーは、次の通り２種の構成成分を有する：（ａ）高親和性Ｆｃ結合ドメイン；および（ｂ）高親和性ＣＤ３結合ドメイン。このアプローチの理論的根拠を次に示す：このアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーは、１またはそれより多くの治療用抗体で既にコーティングされた腫瘍細胞に結合する、およびこのエンハンサーは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞に結合することもできる。Ｔ細胞にごく接近するとまたはこれと接触すると、腫瘍細胞をコーティングする抗体は、Ｔ細胞の表面でＣＤ３の架橋を引き起こし、Ｔ細胞の活性化および最終的に腫瘍細胞の溶解をもたらす。
【００１４】
本発明のＡＤＣＣエンハンサーは、抗体療法と組み合わせて、または単独で使用して、天然起源の抗体によって認識または結合された罹病細胞を標的とすることができる。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、野生型ヒトＣＤ１６（例えば、最も一般的な形態のヒトＣＤ１６、すなわち、一般的なＦ１５８改変体）よりも高い、天然抗体に対する親和性を有するものなど、高親和性Ｆｃレセプターまたは抗体フラグメントを構築しようと試みる。レセプター（以下、より伝統的な細胞表面レセプターに似た実施形態および抗体フラグメント（複数可）に基づく実施形態を包含する用語として使用される）は、部分的にまたは全体的に、免疫系における別の高分子から借用してもよいし、または新たに操作によるものでもよい。高親和性Ｆｃレセプターを有することは、多種多様な細胞表面抗原、したがって、多種多様な疾患および徴候を標的とする抗体の共有のＦｃフラグメントとの効率的な結合を可能にする。これは、各特異的抗原に対して異なる抗体が構築される必要がある抗原依存性免疫療法と比較して、大きな利点である。
【００１６】
別の態様では、可溶性アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの構築に着目して、高親和性ＣＤ３結合ドメインを、第１の態様に記載されている高親和性Ｆｃ結合ドメインまたはレセプターに融合させる。かかる高親和性ＣＤ３結合ドメインの例として、ＯＫＴ３および新規抗ＣＤ３  ｓｃＦｖが挙げられる。高親和性Ｆｃ結合ドメインは、様々な実施形態において、ＣＤ６４のエクトドメイン、高親和性ＣＤ１６改変体およびヒトＦｃに対し高親和性を有する抗体フラグメントからなる群より選択され得る。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供し、この融合タンパク質は、高親和性Ｆｃ結合ドメインおよび高親和性ＣＤ３結合ドメインを含む。薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む。
【００１８】
関連する態様では、本発明は、処置の必要性のある被験体を、ある状態について治療的に処置する方法であって、上記被験体に治療上有効な量の本発明の薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。方法は、上記状態を示す少なくとも１種の細胞表面抗原に対する治療用抗体を投与する工程をさらに含むことができる。一実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４と実質的に同様のＦｃ領域を含む。処置されている状態は、がん、炎症性疾患、自己免疫性疾患、移植片拒絶および感染等であり得る。
【００１９】
なお別の態様では、本発明は、処置の必要性のある被験体を、ある状態について予防的に処置する方法であって、上記被験体に予防上有効な量の本発明の薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。方法は、上記状態に対するワクチンを投与する工程をさらに含むことができる。一実施形態では、状態は、がんである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明に従うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーを模式的に示す。
【００２１】
【図２】図２は、ＣＤ６４およびＣＤ１６のエキソンを模式的に示す。ＣＤ６４は、細胞外領域における追加的な免疫グロブリン折りたたみ、およびしたがって、エキソンを有する。この追加的な折りたたみによって、ＣＤ６４がより高いＦｃ親和性となる。
【００２２】
【図３】図３は、本発明の実施形態に従うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーのＦｃ結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）を記載する。特に、この実施形態におけるドメインは、エキソン境界に基づきＣＤ６４のエクトドメインを含む。
【００２３】
【図４】図４は、本発明の実施形態に従うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの抗ＣＤ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）を記載する。特に、この実施形態におけるドメインは、２個のスペーサー／リンカー配列（下線）およびヒト化バージョンのＯＫＴ３配列を含む。
【００２４】
【図５】図５は、図３および図４に表す実施形態に従うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサー全体のアミノ酸配列（配列番号３）を記載する。
【００２５】
【図６】図６は、図５に表す実施形態に従うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサー全体のＤＮＡ配列（配列番号４）を記載する。
【００２６】
【図７】図７は、Ｅｘｐｉ２９３細胞における２バージョンの可溶性アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの過剰発現の時間経過を示すイムノブロット（ウエスタンブロット）の写真画像である。両方のバージョンは、同じＣＤ６４−ＯＫＴ３融合タンパク質配列を有し、それぞれのヌクレオチド配列のみが異なる（レーン１および２）。タンパク質は、培地に分泌されていた。予測される分子量は５８ｋＤａであった；抗ＣＤ６４抗体は、おそらくグリコシル化により、７５ｋＤａにバンドをなした。
【００２７】
【図８】図８は、市販のヒトＩｇＧカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した、可溶性ＡＤＣＣエンハンサーの精製を例証するクーマシー（ｃｏｏｍａｓｉｅ）染色したゲルの写真画像である。複数の遠心分離工程と続く限外濾過により、トランスフェクトした細胞を培養上清から完全に除去した。中性バッファーにおいてカラムを平衡化し、上清をロードし、続いてフロースルーした（完全な結合を確実にするため）。ｐＨを減少させる段階的勾配により、タンパク質を精製した。高モル濃度アルカリ性Ｔｒｉｓバッファーにおいて、精製されたタンパク質を直ちに中和した。連続的透析またはＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルターによる反復限外濾過のいずれかにより、精製されたタンパク質をＰＢＳ中に交換した。右側のゲルにおけるレーンは、洗浄バッファーがｐＨ３．０５の場合の様々な溶出画分を表す。
【００２８】
【図９】図９は、ＣＤ３＋免疫エフェクター細胞に結合する本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの能力を検査するための、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用したアッセイを模式的に示す。
【００２９】
【図１０】図１０は、図９に従うアッセイにおいて、精製前（「試料ロード」）および精製後（「精製されたタンパク質」）のＪｕｒｋａｔ細胞および本発明のＡＤＣＣエンハンサーの間の結合を示すＦＡＣＳデータを例証する。空白の曲線は、陰性対照を表す。本実験およびあらゆるその後の実験において、精製されたＡＤＣＣエンハンサーは、他に記載がなければ１０〜２０ｎｇ／マイクロリットルで使用される。
【００３０】
【図１１】図１１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞および様々な濃度の本発明のＡＤＣＣエンハンサーの間の結合の力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を示すＦＡＣＳデータを例証する。マイクロリットル単位のエンハンサーの容量を上の６個の図表の右上隅に、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３および１．５６マイクロリットルとして示す。下の図表は、データを要約する。ＣＤ３＋  Ｊｕｒｋａｔ細胞を、様々な量のエンハンサーと共にインキュベートし、ＰＢＳにおいて細胞を洗浄することにより過剰なエンハンサーを除去し、蛍光抗ヒトＣＤ６４抗体を使用して、結合したエンハンサータンパク質を検出した。
【００３１】
【図１２】図１２は、リツキサンでコーティングされたＣＤ２０＋標的細胞に結合する本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの能力を検査するために、Ｄａｕｄｉ細胞を使用したアッセイを模式的に示す。
【００３２】
【図１３】図１３は、図１２に従うアッセイにおいて、精製前（「試料ロード」）および精製後（「精製されたタンパク質」）のＤａｕｄｉ細胞および本発明のＡＤＣＣエンハンサーの間の結合を示すＦＡＣＳデータを例証する。
【００３３】
【図１４】図１４は、Ｄａｕｄｉ細胞および様々な濃度の本発明のＡＤＣＣエンハンサーの間の結合の力価測定を示すＦＡＣＳデータを例証する。マイクロリットル単位のエンハンサーの容量を上の６個の図表の右上隅に、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３および１．５６マイクロリットルとして示す。下の図表は、データを要約する。ＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞をリツキサン（抗ＣＤ２０抗体）でコーティングし、ＰＢＳで細胞を洗浄することにより過剰なリツキサンを除去した。リツキサンでコーティングされた細胞を、様々な量のエンハンサーと共にインキュベートし、ＰＢＳにおいて細胞を洗浄することにより過剰なエンハンサーを除去した。蛍光抗ヒトＣＤ６４抗体を使用して、結合したエンハンサータンパク質を検出した。ＣＤ２０と比較して、ＡＤＣＣエンハンサーでは、抗体に対するおよそ３０倍高い親和性が観察された。
【００３４】
【図１５】図１５は、標的がん細胞に対する細胞傷害性を媒介および増幅する本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの能力を検査するために、リツキサンでコーティングされたＤａｕｄｉ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を使用したアッセイを模式的に示す。
【００３５】
【図１６】図１６は、図１５に従うアッセイにおける標的（Ｄａｕｄｉ）細胞（上クラスター）およびエフェクターＴ細胞（下クラスター）の検出を示すＦＡＣＳデータを例証する。データは、本発明のエンハンサーが、Ｔ細胞を動員して、Ｔ細胞生存率を縮小することなくＤａｕｄｉ細胞集団の多くを溶解することができたことを示す（右の図表）。この実験およびあらゆるその後の実験において、Ｅ：Ｔ（エフェクター細胞対標的細胞）比は１０であった。
【００３６】
【図１７】図１７は、２種の濃度のリツキサン（抗ＣＤ２０）、ＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および本発明のエンハンサーに係る細胞傷害性実験のデータを例証する。データは、エンハンサーが、Ｔ細胞の標的細胞殺傷を増加させ、この殺傷が、リツキサンおよびエンハンサー濃度の両方に依存したことを示す。１日目および２日目の間のデータが示す通り、より長い曝露における殺傷増加も見られた（時間依存性ＡＤＣＣ）。０．１μｇ／ｍｌ（１０×）または０．０１μｇ／ｍｌ（１×）でリツキサンを使用した。１２．５マイクロリットル（＋）または５０マイクロリットル（＋＋＋）でエンハンサーを使用した。
【００３７】
【図１８】図１８は、２種の濃度のリツキサン、Ｒａｊｉ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および本発明のエンハンサーに係る細胞傷害性実験のデータを例証する。データは、同じ濃度のリツキサンおよびエンハンサーにおいて、図１７におけるものと同様の結果を示す。
【００３８】
【図１９】図１９は、２種の濃度のハーセプチン、ＨＥＲ＋  ＳＫ−ＢＲ３細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および本発明のエンハンサーに係る細胞傷害性実験のデータを例証する。データは、エンハンサーが加えられた場合のさらにより明白な細胞傷害性効果を示す（図１８における結果と比較して）。１μｇ／ｍｌ（１０×）または０．１μｇ／ｍｌ（１×）でハーセプチンを使用した。５０マイクロリットル（＋＋＋）でエンハンサーを使用した。
【００３９】
【図２０】図２０は、本発明の実施例に従う異なる乳がん細胞におけるＨＥＲ２発現を測定する仕方を模式的に示す。
【００４０】
【図２１】図２１は、３種の異なる乳がん系統：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ３の間のＨＥＲ２発現レベルを比較する。左端ピークは、非染色対照を表し、続いてそれぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ３細胞のピークを表す。データは、この３種のうち、ＳＫ−ＢＲ３が、最高のＨＥＲ２発現レベルを有する一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が、最低レベルを有することを示す。
【００４１】
【図２２】図２２は、ハーセプチン、ＨＥＲ−ｈｉ  ＳＫ−ＢＲ３細胞、ＨＥＲ−ｌｏ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および本発明のエンハンサーに係る細胞傷害性実験のデータを例証する。データは、両方の種類の乳がん細胞におけるハーセプチンの殺傷能を増幅するエンハンサーの能力を示す。データはまた、ＳＫ−ＢＲ３細胞におけるより著明な効果を示し、この効果が、ＨＥＲ２の発現レベルに依存することを示す。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を殺傷する能力は、本発明のエンハンサーを使用して、低ＨＥＲ２発現腫瘍であってもハーセプチンに感作させることができることを示す。これらの実験において５０マイクロリットルでエンハンサーを使用した。
【００４２】
【図２３】図２３は、ニボルマブ（抗ＰＤ１）、ＰＤ１をトランスジェニックにより発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（「２９３Ｔ−ＰＤ１」）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および本発明のエンハンサーに係る細胞傷害性実験のデータを例証する。親である未改変のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（「２９３Ｔ」）およびＩｇＧ４対照を対照として含めた。ＰＤ−１を発現する細胞が、エンハンサーの存在下でニボルマブに曝露された場合にのみ、顕著な標的細胞溶解が観察された。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、左端の対照を含む、示されているあらゆる試料に存在した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
別段示されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版，２０００  （ＩＳＢＮ
０１９８７９２７６Ｘ）；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（編）；  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより出版，１９９４  （ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．により出版，  １９９５（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似の技術的参考文献に見出され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの、ある）」もしくは「ａｎ（１つの、ある）」とは、１またはそれより多くを意味し得る。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する、含有する）」とともに使用される場合、本明細書で使用されるとおり、用語「ａ（１つの、ある）」もしくは「ａｎ（１つの、ある）」とは、１もしくは１より多くを意味し得る。本明細書で使用される場合、「ａｎｏｔｈｅｒ（別の、もう１つの）」とは、少なくとも第２のもしくはより多くを意味し得る。さらに、文脈から別段必要とされなければ、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「約」とは、明示されていようが明示されていまいが、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含めた数値をいう。用語「約」は一般に、当業者がその記載される値と均等である（例えば、同じ機能もしくは結果を有する）とみなすある数値範囲（例えば、記載される値の±５〜１０％）をいう。いくつかの場合には、用語「約」とは、最も近い有効数字へと四捨五入される数値を含み得る。
【００４６】
用語「抗体」または「Ａｂ」は、本明細書において使用する場合、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖で構成された任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特色を保持するその任意の機能フラグメント、変異体、改変体もしくは派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）を広く指す。かかる変異体、改変体または派生抗体フォーマットは、当該技術分野で公知であり、そのようなものとして、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメインその他が挙げられるがこれらに限定されない。その非限定的な実施形態について後述する。
【００４７】
ＣＤ１６は、２つの異なる形態（ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂ）として発現され、これらは、２つの異なるが非常に相同性の高い遺伝子の生成物である。ＣＤ１６ａは、ポリペプチドアンカーがある膜貫通タンパク質である一方で、ＣＤ１６ｂは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーがあるタンパク質である。本明細書で使用される場合、ＣＤ１６は、当業者に明らかであるように、不適切でなければ、上記タンパク質の両方をいう。
【００４８】
本発明の実施に有用なエフェクター細胞は、自己由来であっても、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）であっても、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）であってもよく、選択は、処置される予定の疾患および利用可能な手段に依存する。
ＩＩ．組成物
【００４９】
本発明は、理論上は普遍的に適用して抗体の治療効力を増強することができる、既製の（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）アダプター様可溶性ユニバーサルＡＤＣＣ増強タンパク質を提供する可溶性ユニバーサルＡＤＣＣエンハンサータンパク質（ＳＵＡＥＰ）技術を開示する。増強機構は、少なくとも次の態様を含むことができる：
【００５０】
１．ＡＤＣＣは、抗体療法（例えば、リツキサン（登録商標）またはハーセプチン（登録商標）処置）の効力に重要である。いくつかの研究は、ＣＤ１６の低親和性改変体（１５８Ｆ）がホモ接合型の患者の予後がより不良であることを示した。
【００５１】
２．相対的に高親和性改変体のＣＤ１６を有する患者であっても、種々の理由により、例えば、免疫抑制的環境、阻害性レセプターの係合またはエフェクター細胞が増殖できないことにより、先に記述される通り、ＡＤＣＣは抑制され得る。
【００５２】
３．補体系は、またリツキサン（登録商標）（リツキシマブ）効力に重要である。例えば、ＣＬＬは、無痛性Ｂ細胞がんであるが、患者は、補体が欠損しているため、またはリツキサン（登録商標）処置の開始直後に補体が枯渇されるため、リツキサン（登録商標）に対し不応性であることが多い（Ｘｕら、２０１１年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８巻：２１９３〜２２０１頁；Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２巻（５号）３２８０〜３２８８頁）。
【００５３】
これらの事例の全てにおいて、ＡＤＣＣエンハンサーを加えることにより、問題を回避し、がん細胞に細胞傷害性Ｔ細胞を動員することができる。
【００５４】
加えて、本発明によって提供されるＳＵＡＥＰ技術は、療法に使用される必要がある抗体の量の低下において有用であり、これにより、（ａ）抗体の非特異的副作用を最小化し；（ｂ）抗抗体応答の発生確率を低下させる。完全ヒト抗体であっても、免疫応答を誘発し得る特有のＣＤＲ３を有することに留意されたい。療法において使用される抗体の量の低下は、この応答を誘発する確率を低下させる。
Ｔ細胞のためのアダプター
【００５５】
本発明の実施形態によれば、循環し自由に会合するアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーとして機能する融合タンパク質は、２種の構成成分を有する：抗体にカップリングする高親和性Ｆｃ結合ドメイン、およびＴ細胞に係合する高親和性ＣＤ３結合ドメイン（図３）。
（ａ）Ｆｃ結合ドメイン
【００５６】
アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーのＦｃ結合ドメインは、次のものを含む複数の供給源に由来することができる：
【００５７】
（ｉ）ＣＤ６４（ＦｃγＲ１）のエクトドメイン：
【００５８】
ＦｃγＲ１は、マクロファージおよび好中球上に存在する高親和性Ｆｃレセプター（ＫｄはＩｇＧ１およびＩｇＧ３に関して約１０−９Ｍ）であり、抗体媒介性ファゴサイトーシスおよびメディエーター放出に関わっている。ＦｃγＲＩは、糖タンパク質α鎖を含み、その細胞外ドメインは、抗体への結合に関わる３個の免疫グロブリンドメインで構成されている。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインの部分または全体を、適したＣＤ３結合ドメインに融合して、ＡＤＣＣを媒介するアダプター様エンハンサーを作製する。有利なことに、このエクトドメインは身体にとってネイティブであることで、この実施形態におけるエンハンサーは、同系であり、したがって、非免疫原性である。
【００６０】
（ｉｉ）ＣＤ１６の高親和性改変体：
【００６１】
本発明の別の実施形態では、本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーのＦｃ結合ドメインは、抗体のＦｃフラグメントに対し改善された親和性を有するＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）改変体のエクトドメインの部分または全体を取り込む。ある実施形態では、Ｆｃ結合ドメインの配列は、ＦｃγＲＩＩＩａの結合領域のランダム変異誘発により作製され、ベンチマーク対照として最も一般的なＣＤ１６改変体（Ｆ１５８）を使用することにより選択される。
【００６２】
（ｉｉｉ）高親和性ＳｃＦｖ：
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明のＦｃ結合ドメインは、Ｆｃ（好ましくはヒトＦｃ）に対する高親和性を有する操作された抗体フラグメントを組み込んでいる。ある実施形態では、抗体フラグメントは、ＳｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）である。代替的な実施形態では、フラグメントは、Ｆａｂ（抗原結合性フラグメント）である。抗体フラグメントは、ベンチマークレセプター、例えば、ＣＤ１６よりも高いＦｃ親和性を示すべきである。かかる抗体フラグメントを操作するための方法は、当業者に周知であり、例えば、市販のハイブリドーマの使用による。例えば、ヒトＦｃドメインは、ある期間にわたって実験動物（例えば、マウス）に注射される。動物の脾臓から単離されたＢ細胞は、骨髄腫細胞と融合され、Ｆｃドメインに対する高親和性モノクローナル抗体を産生するクローンに関してスクリーニングされる。これらの候補抗体は、標準方法により、ヒト化、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）されていてもよく、および／またはＦａｂもしくはＳｃＦｖバージョンに変換されてもよい。あるいは、高親和性クローンに関してライブラリー（例えば、ファージディスプレイ、酵母または哺乳動物細胞に基づくライブラリー）をスクリーニングすることによりまたはヒト化された免疫系を有する動物由来のモノクローナル抗体により完全ヒト抗体を得ることができる。
（ｂ）ＣＤ３結合ドメイン
【００６４】
好ましくは高親和性を有するＣＤ３結合ドメインは、複数の供給源から作製することもできる。
【００６５】
例えば、このドメインは、１９８６年にヒト使用について承認された最初のモノクローナルであった抗ＣＤ３モノクローナル抗体である、ＯＫＴ３に由来することができる。これは、マウスモノクローナル抗体であり、数年間で、これは、ヒト化すると共に、免疫原性を低くする（脱免疫化する）ように複数回改変された。一実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＯＫＴ３抗体、好ましくは脱免疫化、ヒト化（ｄｈＯＫＴ３）バージョンのｓｃＦｖ部分を含む。
【００６６】
本発明の他の実施形態では、新規抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、高親和性Ｆｃ結合ｓｃＦｖに関する上述のセクション（ａ）（ｉｉｉ）に記載されている方法と同様の方法を使用して作製することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーは、ＣＤ６４エクトドメインがｄｈＯＫＴ３  ｓｃＦｖにカップリングされた融合タンパク質である。
【００６８】
この治療薬を使用して、市販の抗がん抗体の効力を増強することができることに留意されたい。しかし、この治療薬は、単独療法として使用して、患者の先天的低ＡＤＣＣ活性のために腫瘍を排除することができない身体の天然抗体の効力を増強することもできる。
ＩＩＩ．治療薬およびワクチン
【００６９】
がん処置のためのＡＤＣＣエンハンサーの臨床的意味は、市販の治療用抗体と併せてヒトがん細胞を使用して検査することができる。例えば、Ｄａｕｄｉ細胞は、（１）リンパ腫、自己免疫性疾患および移植片拒絶に関係づけられるＣＤ２０を標的とし、エフェクター細胞の活性化、脱顆粒および増殖をもたらす抗体である、リツキシマブ（商品名リツキサン（登録商標））、（２）ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ならびに（３）本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーで処理される。一実施形態では、本発明のＡＤＣＣエンハンサーは、リツキシマブなど、既存の治療用抗体と組み合わせて使用される。標的細胞殺傷もまた、観察される。インビボ試験は、非常に少ないＴ細胞およびＢ細胞を有しかつＮＫ細胞を有さない市販のＮＯＤ．ｓｃｉｄ．ＩＬ２Ｒγ−／−マウスを使用して行われる。あるいは、非常に低いＴ細胞およびＢ細胞を有し、低下したＮＫ細胞を有するＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスが、使用される。これらマウスは、標識されたＤａｕｄｉ細胞が移植され、任意の適切な画像化技術を使用して腫瘍増殖が観察および測定される。リツキシマブおよび本発明のＡＤＣＣエンハンサーで形質導入された免疫エフェクター細胞を受容するマウスにおいて、継続した期間の腫瘍寛解、退縮、もしくは長期にわたって進行しないことが観察される。
【００７０】
別の例では、ＳＫ−ＢＲ−３もしくはＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、（１）ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、（２）本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーならびに（３）乳がんに関わるＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とし、エフェクター細胞活性化、脱顆粒および増殖を生じるトラスツズマブ（商用名ハーセプチン（登録商標））で処理される。標的細胞殺傷もまた、観察される。上記ＡＤＣＣエンハンサーのインビボ抗腫瘍有効性は、直ぐ上に記載される例に類似のマウスモデルで観察される。
【００７１】
自己免疫における本発明のＡＤＣＣエンハンサーの臨床上の使用は、それぞれの具体的な疾患に関して十分確立されたマウスモデルのうちの１つを使用して試験され得る。例えば、抗体媒介性Ｂ細胞枯渇は、ＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病を防止およびさらには逆転させることが示された。しかし、この効果は、Ｆｃレセプターの低親和性によって制限される（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７，  １１７（１２）：３８５７−６７；  Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８，  １８０（５）：２８６３−７５）。コントロールマウスは、抗ＣＤ１９抗体もしくは抗ＣＤ２０抗体のいずれかのみ、または本発明のＡＤＣＣエンハンサーを組み合わせて受容するマウスと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するマウスは、疾患の発現の遅延または症状の継続した逆転を示す。
【００７２】
類似の実験は、抗体媒介性枯渇が、多発性硬化症もしくは実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１２，  ２０９（５）：  １００１−１０））、関節炎（Ｙａｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７，  １７９（２）：  １３６９−８０）などのような疾患に影響を及ぼすことが示された他のマウスモデルにおいて行われ得る。
【００７３】
ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）における上記ＡＤＣＣエンハンサーの臨床上の使用は、抗体の組み合わせでの処置がＨＩＶ複製をコントロールすることが示された（Ｎａｔｕｒｅ，  ２０１２，  ４９２（７４２７）：  １１８−２２）十分に確立されたヒト化マウスモデルを使用して試験され得る。ヒト化マウスは、ＮＯＤ．ＲＡＧ１−／−．ＩＬ２Ｒγ−／−マウスをヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成することによってまず生成される。これらマウスは、完全にヒトの免疫系を有し、ＨＩＶによって感染され得、ヒト抗体に対して負に（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）反応しない。感染したコントロールマウスは、中和抗体カクテル単独もしくは本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーを伴うヒト免疫エフェクター細胞との組み合わせのいずれかを受容するマウスと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するマウスは、ウイルス血症の継続した低減およびＴ細胞数の回復を示す。
【００７４】
上記ＡＤＣＣエンハンサーの臨床効力を試験するための代替のモデルシステムは、中和抗体が疾患の急激な発症を防止することが示されたサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染アカゲザル幼獣モデルである（Ｊａｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１３，  ８７（１９）：  １０４４７−５９）。感染したコントロールアカゲザルは、中和抗体カクテル単独もしくは本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーとの組み合わせのいずれかを受容するアカゲザルと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するアカゲザルは同様に、ウイルス血症の継続した低減およびＴ細胞数の回復を示す。
【００７５】
本発明のＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物は、当業者に公知の技術を使用して被験体への投与のために製剤化され得る。上記ＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物を含む製剤は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上記製剤に含まれる賦形剤は、例えば、使用される遺伝子構築物もしくはエフェクター細胞の種類、および投与様式に依存して種々の目的を有する。一般に使用される賦形剤の例としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、バッファーおよび保存剤、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、増量剤、ならびに滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、本発明のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの医薬製剤は、患者に投与される。例示的な投与様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ）、心内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、および髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）（脳脊髄液）が挙げられるが、これらに限定されない。上記製剤の非経口注射もしくは注入のために有用な任意の公知のデバイスは、このような投与をもたらすために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「ｔｒｅａｔ（処置する、処理する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（処置する、処理する）」、および「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（処置、処理）」は、それらの通常のおよび慣習的な意味を有し、以下のうちの１以上を含む：被験体における疾患（例えば、がん）の症状を、重篤度および／もしくは頻度において、ブロック、改善もしくは低下させること、ならびに／あるいは被験体におけるがん細胞の成長、分裂、拡散もしくは増殖、またはがんの進行（例えば、新たな腫瘍の出現）を阻害すること。処置とは、本発明の方法が実施されなかった被験体と比較して約１％〜約１００％、ブロック、改善、低減もしくは阻害することを意味する。好ましくは、ブロック、改善、低減もしくは阻害は、本発明の方法が実施されなかった被験体と比較して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくは１％である。
【００７７】
本発明のＡＤＣＣエンハンサーの治療剤および予防剤の両方としての臨床有効性は、樹状細胞（ＤＣ）の使用を通じて、必要に応じて増強され得る。リンパ系器官において、ＤＣは、Ｔヘルパー細胞に抗原を提示し、これは次に、ＣＴＬ、Ｂ細胞、マクロファージ、好酸球およびＮＫ細胞を含む免疫エフェクターを調節する。ＨＩＶ抗原を発現するように操作されたかまたは外来のＨＩＶタンパク質をパルス添加された自己由来ＤＣが、ＨＩＶに対してインビトロでＣＴＬをプライミングし得ることが報告された（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９９，  １６２：３０７０−７８）。従って、本発明の一実施形態において、ＤＣは、被験体患者からまず単離され、次いで、標的抗原（例えば、ある種の腫瘍関連抗原または被験体患者もしくは外来の供給源に由来し得る疾患の他の表面マーカー）の供給源とともにインキュベートすることを通じてエキソビボでプライミングされる。これらＤＣは、自己由来ＣＴＬおよび／もしくは本発明のＡＤＣＣ増強システムでトランスフェクトされた他のエフェクター細胞によるか、または上記ＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物を含む製剤による処置の前に、上記患者へと最終的には注入し戻される。これは、ＤＣの助けを借りて、上記ＡＤＣＣエンハンサーを使用する増強された処置およびワクチンのモデルを提供する。
【００７８】
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤とともにある量のアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーをコードする遺伝子構築物で満たされた１もしくはそれより多くの容器を含むキットを提供する。上記キットはまた、使用説明書を含み得る。医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関によって指定された形態の注意書きがさらに、上記キットと関連づけられ得、この注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売についての上記機関による承認を反映する。
【実施例】
【００７９】
ＩＶ．実施例
（１）Ｔ細胞アダプター構築
本発明の様々な実施形態によって、アダプター様ＡＤＣＣエンハンサー、すなわち、高親和性ＣＤ３結合ドメインに連結された高親和性Ｆｃ結合ドメインを有する融合タンパク質を開発し、検査した。
【００８０】
特に、抗ＣＤ３抗体である脱免疫化およびヒト化ｓｃＦｖバージョンのＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３としても公知）にＣＤ６４のＦｃ結合エクトドメインが融合されたアダプター様ＡＤＣＣエンハンサー（または可溶性の自由に会合し循環するＴ細胞アダプター）を産生するための遺伝子材料として、合成ＣＤ６４−ｄｈＯＫＴ３  ＤＮＡを化学合成により先ず作製した。
【００８１】
本発明の他の実施形態では、例えば、他のＦｃレセプター（例えば、ＣＤ３２およびＣＤ１６）のエクトドメイン、すなわち、細胞外ドメインに基づく、他のＦｃ結合ドメインを使用することもできる。しかし、ＣＤ６４（すなわち、ＦｃγＲＩ）は、ＣＤ１６よりも、抗体のＦｃ領域に対し約１００〜１０００倍高い親和性を有し、このことは、抗体結合に関わるＣＤ６４の部分であるＣＤ６４のエクトドメインを、融合タンパク質におけるＦｃ結合ドメインに好ましい候補とする。
【００８２】
本来のタンパク質のエキソン境界により、タンパク質融合体の接合部を決定した（図２を参照）。このように融合タンパク質のために得たＣＤ６４ドメインは、分泌シグナルをコードする２個のエキソンと、続くエクトドメインをコードする３個のエキソンを含み、これを配列番号１として図３に示す。しかし、分泌シグナル配列は、ＣＤ６４に由来する必要はなく、他の適した分泌シグナル配列によって置き換えることができる。さらに、代替的な実施形態では、タンパク質融合体の接合部は、本来のタンパク質のエクトドメインおよび膜貫通ドメインの間の予測されるアミノ酸境界に基づく。エキソンに基づく融合体と比較して、このアプローチは、融合タンパク質部分に、例えば２個の本来のドメインの間にリンカー配列を加える。
【００８３】
２個のスペーサー配列およびＯＫＴ３配列を含む融合タンパク質（配列番号２）の残りを図４に示す。ＯＫＴ３は本来、マウス細胞に由来するが、ヒト化されている、すなわち、多くのグループによりヒト由来の抗体により近づくように変換または変異されている。抗体または抗体フラグメントのヒト化は、当業者に公知の標準手順である。可動性セリン−グリシンリンカーを介してＣＤ６４の細胞外部分が脱免疫化およびヒト化ＯＫＴ３（ｄｈＯＫＴ３）と融合されたアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの完全な配列（配列番号３）を図５に示す。代替的な実施形態では、ヒト化ＴＲ６６など、他のアゴニスト抗ＣＤ３配列を使用することができる。
【００８４】
そこで図６を参照すると、ＣＤ６４−ｄｈＯＫＴ３融合タンパク質を逆翻訳し（ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｅ）、配列最適化して、図に示すＤＮＡ配列（配列番号４）を作製した。最適化は、より頻繁にヒトに現れる個々のアミノ酸のコドンを選択することならびに反復領域および二次構造を潜在的に形成し得る領域を除去することの組み合わせに頼った。
【００８５】
本発明の代替の実施形態は、精製を容易にするためのタグ（例えば、ＭｙｃまたはＨｉｓ）の付加を含む。別の選択肢は、タグから干渉を受けることなく、療法において精製されたタンパク質を使用することができるように、タグを切断可能にすることである。両方の実施形態は、当業者に周知の標準手順を使用して実施することができ、これについては本明細書では詳述しない。
（２）発現および精製
【００８６】
ＣＤ６４−ｄｈＯＫＴ３融合タンパク質の合成遺伝子を化学合成し、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（登録商標）から市販されているベクターｐＶＩＴＲＯ２−ＭＣＳを使用したが、同じ機能を果たすことができる多くの一般的なベクターが存在する。発現のため、メーカーの説明書に従ってＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販）に組換え発現ベクターをトランスフェクトした。得られた細胞株は、可溶性分泌タンパク質を産生した（図７および図８）。簡潔に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３発現培地においてＥｘｐｉ２９３細胞を育成し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの１６〜２０時間後に、合成されたＡＤＣＣ−エンハンサー１および２（図７）を培養物に添加し、トランスフェクションの２〜７日後に上清を収集した。本発明の代替の実施形態では、他の発現系、例えば、ＣＨＯ細胞が使用される。代替の実施形態では、発現カセットは、細胞株のゲノムに安定に組み込んで、融合タンパク質を産生する安定した派生体を作製することができる。
【００８７】
市販のＩｇＧセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）など、一般的に公知の方法を使用して、ＡＤＣＣ−エンハンサータンパク質を親和性精製した（図８）。簡潔に説明すると、トランスフェクトした細胞に由来する上清を、ヒトＩｇＧと架橋したセファロースビーズを充填したカラムにロードした。次に、中性ｐＨバッファーおよび段階的勾配のより低いｐＨのクエン酸塩−リン酸塩バッファーでカラムを洗浄した。低ｐＨ（ほぼｐＨ３）でＡＤＣＣ−エンハンサータンパク質を溶出させ、１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）において直ちに中和した。透析または限外濾過によりバッファーを交換した。
【００８８】
脱塩カラム等の他の標準精製方法を使用することもできる。別の代替の実施形態は、タンパク質Ｌに基づく親和性カラムを使用する。タンパク質Ｌは、本明細書における融合タンパク質のＯＫＴ３部分など、ｓｃＦｖのものを含む多くの種のカッパ鎖に結合する。タグ付けされていないタンパク質を精製するための他の標準方法、例えば、イオン交換、サイズ排除等も、本発明において単独でまたは組み合わせて使用することができる。あるいは、また、先に言及された通り、融合タンパク質は、適切な親和性カラムを使用した容易な精製のために標準タグでタグ付けすることができる。これらの工程をつなげて使用して、より高純度タンパク質を得ることもできる。
【００８９】
（３）結合親和性
【００９０】
ＦｃおよびＣＤ３に結合するＣＤ６４−抗ＣＤ３融合タンパク質の能力は、いくつかの方法で上清または精製されたタンパク質を直接的に使用して検査することができる。例えば、図９に示す通り、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３を発現するＴリンパ球細胞であるため、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して、かかる親和性を検査することができる。一例によれば、２×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳにおいて洗浄し、５０μｌの培養上清（発現ベクターで数日間トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞由来）または精製融合タンパク質において、３０分間、４℃でインキュベートした。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、市販の蛍光タグ付き抗ＣＤ６４抗体を使用して、結合したＡＤＣＣエンハンサーを検出した（図１０）。図１１において、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合の力価測定を行ったところ、結果は、結合およびエンハンサー濃度の間の相関を示す。
【００９１】
タグ付けされたタンパク質により、蛍光タグ付けされた抗タグ抗体を使用して、結合親和性を検出することもできる。このアプローチを使用して、リツキシマブでコーティングされたＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞によるＣＤ６４ドメインの結合を検出することもできる（図１２を参照）。簡潔に説明すると、１０６個のＤａｕｄｉ細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、０．１μｇ／ｍｌのリツキシマブ（ＣＤ２０に対する抗体、リツキサン、ＭａｂＴｈｅｒａおよびＺｙｔｕｘとしても公知）と共に３０分間４℃でインキュベートした。ＰＢＳにおいて細胞を再度洗浄し、続いて上述の通り上清または精製されたタンパク質と共にインキュベートした（図１３）。図１４において、Ｄａｕｄｉ細胞への結合の力価測定を行ったところ、結果は、結合およびエンハンサー濃度の間の大きな相関を示す。実際に、アダプター様ＡＤＣＣエンハンサーによるＦｃまたは抗体結合は、エンハンサーの他端由来のＣＤ３結合よりも約３０倍強いと思われる。
【００９２】
代替の実施形態では、結合親和性の指標として、共培養系においてリツキシマブでコーティングされたＤａｕｄｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞の間の異種性凝集を試験する。ＤａｕｄｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞をそれぞれ、標準方法を使用してＣＦＳＥもしくはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄなどの生細胞染色で標識する、および／またはＧＦＰなどの蛍光タンパク質を発現するように操作する。次に、細胞をリツキシマブおよび本発明の可溶性ＡＤＣＣエンハンサーと共にコインキュベートする。両方の色が陽性であるダブレットに関してＦＡＣＳデータを試験する。当業者であれば容易に理解できる通り、本明細書に記載されている実施形態における細胞株の選択は、ＪｕｒｋａｔおよびＤａｕｄｉ細胞に限定されない。本発明は、適切な抗体と組み合わせた種々の細胞株または初代細胞の使用を企図する。
【００９３】
ＦｃおよびＣＤ３に結合するＣＤ６４−抗ＣＤ３融合タンパク質の能力は、表面プラズモン共鳴または他の標準的な生化学的もしくは細胞に基づくアッセイにより検査することもできる。
（４）細胞傷害性増強
【００９４】
標準手順を使用して、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ８  Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、献血された血液からナイーブ初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、続いて抗ＣＤ３／ＣＤ２８により増幅した。あるいは、総Ｔ細胞またはＰＢＭＣにより同様の実験を行うことができる。これらの細胞のいずれか１種を使用して、本発明のエンハンサーが活性化、増殖を引き起こし、細胞傷害性、特に、ＡＤＣＣを誘発する能力を検査した。特に、Ｔ細胞増殖は、フローサイトメトリーまたは他の伝統的方法、例えば、チミジン取り込み、ＣＦＳＥ希釈などにより測定することができる。活性化は、種々の公知の活性化マーカー、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ６９などを検出することにより測定することができる。典型的には、これらの実験について、エンハンサーは、単独で機能することができるが、次のものを含めてまたは含めずに追加的な実験を行った：
【００９５】
（Ａ）５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２；
【００９６】
（Ｂ）標的細胞；および／または
【００９７】
（Ｃ）適切な抗体。
【００９８】
標的細胞を含む場合、これは、マイトマイシンＣにより事前処理して、増殖を止め、過密の効果を最小化することができる。また、リソソーム結合膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１もしくはＣＤ１０７ａ）は、刺激後の溶解顆粒（ｌｙｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅ）のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞脱顆粒のマーカーとして記載されてきた。したがって、上記の共存培養実験では、ＣＤ１０７ａ＋  Ｔ細胞のレベルを、脱顆粒の尺度としてフローサイトメトリーによって分析し得る。
【００９９】
細胞傷害性を評価するために、Ｔ細胞を、適切な治療用抗体の存在下で、ＣｅｌｌＴｒａｃｅタグ化標的細胞とともに１日または２日間にわたって共存培養した。図１５〜図２３に数例の結果および設定を示し、種々のがん細胞に対する抗体依存性細胞傷害性を誘発、増強または増幅するアダプター様エンハンサーの能力の圧倒的な証拠を提供する。これらの図に提示されているデータは、Ｂリンパ芽球細胞（ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ）、乳がん細胞（ＳＫ−ＢＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）およびＰＤ−１を発現する細胞（２９３−ＰＤ１）の有効な殺傷に関与する。
【０１００】
例えば、図１５および図１６に提示されているデータおよび機構は、本発明のエンハンサーが、ＡＤＣＣに影響を与えるようにＴ細胞を動員することにより、リツキサンの存在下でＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞集団の多くを殺傷することができたことを示す。別の例として、図１９に提示されているデータは、おそらく、エンハンサーによりＴ細胞が動員されてＡＤＣＣを増強したため、本発明のエンハンサーが、ＳＫ−ＢＲ３乳がん細胞において、乳がん細胞上のＨＥＲ２レセプターに対して設計された抗体であるハーセプチンの殺傷能を誘発することを示す。
【０１０１】
他のがん系統および設定において他の抗体により追加的な検査を行うことができ、例えば：（ａ）抗ＣＤ３３抗体（ＷＭ−５３）で処理したＣＤ３３＋  ＡＭＬ系統（例えば、ＨＬ−６０、ＭＯＬＭ−１３およびＴＨＰ−１）；（ｂ）抗ＣＤ１９抗体（ＨＩＢ１９）で処理したＣＤ１９＋系統（例えば、ＮＡＬＭ−６およびＭＥＣ−１）；および（ｃ）抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＨＥＡ−１２５）で処理したＥｐＣＡＭ＋系統（例えば、ＳＷ４８０）が挙げられる。
【０１０２】
そこで図２３を参照すると、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＰＤ１をトランスジェニックにより発現させたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ラージＴ抗原を発現するヒト胎児由来腎臓細胞）（「２９３Ｔ−ＰＤ１」）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および本発明のエンハンサーを伴う細胞傷害性実験である。親の未改変ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（「２９３Ｔ」）およびＩｇＧ４対照を対照として含めた。ニボルマブは、いかなるＡＤＣＣ活性も持たないようなＩｇＧ４抗体として開発された。しかし、その後の実験は、ＡＤＣＣおよびＰＤ１抗体が、一緒にするとより良く機能し得ることを示した。ＣＤ１６とは異なり、ＣＤ６４は、Ｔ細胞などの他の免疫エフェクター細胞から追加的な援助を動員するために、ＩｇＧ４に結合し、ニボルマブなどの本来はＡＤＣＣ陰性の抗体をＡＤＣＣ陽性に変換する能力を有する。図に示す通り、単独では、ニボルマブは、その濃度が１０倍増加された場合であっても、依然として、標的２９３Ｔ−ＰＤ１細胞においてごく限定された殺傷能を有したが、これは約７５％の標的生存を示す。しかし、本発明のアダプター様エンハンサーが混合物に添加された場合、標的細胞生存率は、５％未満に急落した。これは、ＩｇＧ４抗体またはそうでなければＡＤＣＣ能力を保持しない他の免疫エフェクター細胞と組み合わせたまたはこれと併せた、本発明のエンハンサーの有望な治療使用のための基盤を提供する。
【０１０３】
本明細書に含有されるデータは、抗体投薬量を低下させ、副作用および抗抗体応答を低下させるその機能を増強するために、リツキサンおよびハーセプチンなどの抗体を伴うアダプター様ＡＤＣＣエンハンサーの使用を支持する。
【０１０４】
これは、がんの処置だけではなく自己免疫の処置においても機能する。例えば、リツキサンまたはリツキシマブは、自己免疫性患者の処置において混合的な結果を生じた：これは、ＲＡにおいて十分に機能するが、ＳＬＥにおいてはごく僅かにしか機能しなかった。その理由の１つは、マクロファージ媒介性Ｂ細胞枯渇が、ＳＬＥ患者において飽和していることである。Ｔ細胞アダプターとしてのＡＤＣＣエンハンサーを使用してＴ細胞にＢ細胞殺傷を向け直すことは、この問題を回避する。
【０１０５】
さらに、エンハンサーは、低親和性バージョンのＣＤ１６（１５８Ｆ）を有する患者、またはＡＤＣＣ／ＣＤＣが何らかの形で抑制された患者、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者およびがん処置を受けている他の患者において使用することができる。
【０１０６】
抗体が診療所で利用されるまでＡＤＣＣの役割が認められなかった多くの抗体、例えば、トラスツズマブ、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４などが存在する。これらの抗体の多くは、ＩｇＧ４抗体である。上述の通り、エンハンサーのＣＤ６４部分は、上で示した通り、ＩｇＧ４に結合し、本来はＡＤＣＣ陰性抗体をＡＤＣＣ陽性に変換することができる。
【０１０７】
種々の改変およびバリエーションが、本発明の範囲もしくは趣旨から逸脱することなく本発明において行われ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮することから、および本明細書で開示される発明の実施から、当業者に明らかである。本明細書および実施例は、例示と見做されるに過ぎず、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０１０８】
本願全体を通じて、種々の刊行物、特許、および／もしくは特許出願が、本発明が属する分野の技術水準をより十分に記載するために参照される。これら刊行物、特許、および／もしくは特許出願の開示は、各個々の刊行物、特許、および／もしくは特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度に、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月8日(2017.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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