(57)【要約】本開示は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、Ｅ１及びＥ２ポリペプチドの一方または両方がアフィニティタグを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。本開示は、タグなしＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを作製する方法を提供する。本開示は、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー、それを含む組成物、及びＨＣＶに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。【選択図】図６
2018533934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、
を含み、前記ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも１つがアフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２】
前記アフィニティタグポリペプチドと前記ＨＣＶ  Ｅ１またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入されたタンパク質分解切断可能なリンカーを含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項３】
ａ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；
ｂ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；
ｃ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；または
ｄ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）を含み、切断は、アルギニン残基のすぐＣ末端側で起こる；または
ｅ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む、請求項２に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項４】
前記アフィニティタグは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、ハイブリッドプロテインＡ-プロテインＧポリペプチド、プロテインＬポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項５】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項６】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７】
前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む、請求項６に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項８】
前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む、請求項６に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項９】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１０】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む、請求項１０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む、請求項１０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１４】
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドと
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１５】
ａ）前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含み、
ｂ）前記ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む、請求項１４に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１６】
ａ）前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含み、
ｂ）前記ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む、請求項１４に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂの１つに表されるＥ２ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドは、図５Ａ〜５Ｃに表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２０】
アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含み、前記ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２から１５のアミノ酸、
ｉｉ）前記アフィニティタグポリペプチド、
ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及び
ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド
を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２１】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の前記２から１５のアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、及びＳＴから選択されるジペプチドである、請求項２０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２２】
ａ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；
ｂ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；
ｃ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；
ｄ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）を含み、切断は、アルギニン残基のすぐＣ末端側で起こる；または
ｅ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む、請求項２０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及び前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、同じ遺伝子型のものである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及び前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、異なる遺伝子型のものである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、遺伝子型１、２、３、４、５、６、または７のものである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、遺伝子型１、２、３、４、５、６、または７のものである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項２７】
ａ）請求項１〜２６のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２８】
ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と
を含む、核酸であって、前記ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも１つは、アフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、核酸。
【請求項２９】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）  タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端から２から１５のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼＥ１／Ｅ２接合部切断部位が前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドの間に挿入される、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３２】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３３】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３４】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位が前記アフィニティタグポリペプチドと前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に形成されるよう、前記アフィニティタグポリペプチドと前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３６】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端から２から１５のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼＥ１／Ｅ２接合部切断部位が前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドの間に挿入される、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３８】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位が前記アフィニティタグポリペプチドと前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に形成されるよう、前記アフィニティタグポリペプチドと前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記ポリタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターと機能可能に連結される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４０】
前記アフィニティタグポリペプチドは、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドである、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４１】
前記Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドは、図５Ａ〜５Ｃに表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の前記２から１５のアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、及びＳＴから選択されるジペプチドである、請求項３０または請求項３６に記載の核酸。
【請求項４３】
ａ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；
ｂ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；
ｃ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；
ｄ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）を含み、切断は、アルギニン残基のすぐＣ末端側で起こる；または
ｅ）前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４４】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂの１つに表されるＥ２ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４５】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４６】
請求項２８〜４５のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項４７】
請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の核酸または請求項４６に記載の組換え発現ベクターを含む、遺伝子改変インビトロホスト細胞。
【請求項４８】
前記ホスト細胞は、真核細胞である、請求項４７に記載の遺伝子改変ホスト細胞。
【請求項４９】
前記ホスト細胞は、哺乳動物細胞である、請求項４８に記載の遺伝子改変ホスト細胞。
【請求項５０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーが細胞中で産生されるような条件下において請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の遺伝子改変ホスト細胞を培養することと、
ｂ）前記細胞を溶解させて、前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを含む細胞ライセートを形成することと
を含む、方法。
【請求項５１】
ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法であって、
ａ）請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の遺伝子改変ホスト細胞のライセートを不溶性の支持体に固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと接触させることであって、前記ライセート中に存在する前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、前記固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと結合し、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを形成する、前記接触させることと、
ｂ）前記固定されたＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを、前記固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマー中に存在する前記タンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それにより前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを前記アフィニティタグから遊離させることと、
ｃ）前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを回収することと
を含む、方法。
【請求項５２】
前記遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも５０％純粋である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アフィニティタグポリペプチドは、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドであり、前記アフィニティタグ結合ポリペプチドは、Ｆｃ結合ポリペプチドである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｆｃ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと
を含む、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；
ｉｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー；及び
ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド
を含む、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項５６】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドであり、前記ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、前記Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、前記Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、及び前記ＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項５７】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドであり、前記ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、前記Ｈ７７  Ｅ２ポリペプチド、前記Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、及び前記ＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項５８】
アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列は、５’から３’に、機能可能な結合で、
ａ）アミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を有する組織プラスミノーゲンシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）ＱＴ及びＥＴから選択されるジペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
ｄ）アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含み、前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；
ｉｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー；及び
ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド
を含む、核酸。
【請求項５９】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドであり、前記ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、前記Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、前記Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、及び前記ＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の核酸。
【請求項６０】
前記ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドであり、前記ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、前記Ｈ７７  Ｅ２ポリペプチド、前記Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、及び前記ＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の核酸。
【請求項６１】
図７または図８に表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の核酸。
【請求項６２】
請求項５８から６１のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項６３】
請求項５８から６１のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクターを伴う遺伝子改変哺乳動物ホスト細胞。
【請求項６４】
ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法であって、
ａ）請求項６３に記載の遺伝子改変ホスト細胞のライセートを、不溶性の支持体に固定されたプロテインＡまたはプロテインＧポリペプチドと接触させることであって、前記ライセート中に存在する前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、前記固定されたプロテインＡまたはプロテインＧと結合し、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを形成することと、
ｂ）前記固定されたＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを、前記固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマー中に存在する前記タンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それにより前記ＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを前記アフィニティタグから遊離させることと、
ｃ）前記遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを回収することと
を含む、方法。
【請求項６５】
前記遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも５０％純粋である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸；及び
ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド
を含む、修飾Ｅ２ポリペプチドと
を含むか、または
ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸；及び
ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド
を含む修飾Ｅ１ポリペプチドと
を含む、ヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項６７】
前記１から６の異種アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項６６に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項６８】
前記１から６の異種アミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙである、請求項６６に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項６９】
前記１から６の異種アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒである、請求項６６に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７０】
ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；及び
ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸
を含む、修飾Ｅ２ポリペプチドと
を含むか、または
ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、
ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及び
ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸
を含む修飾Ｅ１ポリペプチドと
を含む、ヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７１】
前記１から６の異種アミノ酸は、ＤＤＤＤＫ（配列番号３）である、請求項７０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７２】
前記１から６の異種アミノ酸は、ＬＥＶＬＦＱ（配列番号７）である、請求項７０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７３】
前記１から６の異種アミノ酸は、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号８）である、請求項７０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７４】
前記１から６の異種アミノ酸は、ＬＶＰＲ（配列番号４）またはＩ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）である、請求項７０に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
【請求項７５】
ａ）請求項６６〜７４のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチドと、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、組成物。
【請求項７６】
前記薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントを含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記アジュバントは、ＭＦ５９、ミョウバン、ポリ（ＤＬ−ラクチドｃｏ−グリコリド）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、キーホールリンペットヘモシアニン、または３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  ２１（ＱＳ２１）を含むリポソームの懸濁液を含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
個体におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法であって、前記個体に有効量の請求項６６〜７４のいずれか１項に記載のヘテロダイマーポリペプチドまたは請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記投与することは、筋肉内投与による、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記投与することは、皮下投与による、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２３９，１５７号、及び２０１６年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３３７，２１２号の利益を主張するものであり、これらの出願は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
緒言
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で１５０〜２００百万の人々が感染していると推定される血液媒介病原体である。ＨＣＶによる感染は徴候を示さない場合もあり、医学的介入なしに患者によって排除される場合もある。しかしながら、患者の大部分が慢性ＨＣＶ感染症を発症し、これは、肝炎、瘢痕化、さらには肝不全または肝癌に至る場合もある。米国単独で３百万を超える人々が慢性感染症を有する。
【０００３】
ＨＣＶビリオンは、約９．５ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを含む。このゲノムは、３，０１０から３，０３０のアミノ酸から成る１つのポリタンパク質をコードする。この構造タンパク質は、ウイルスヌクレオカプシドを形成するコアタンパク質と、２つのエンベロープ糖タンパク質、Ｅ１及びＥ２とを含む。
【０００４】
当該技術分野にはＨＣＶに対する免疫応答を誘発するための組成物及び方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、アフィニティ精製タグ、例えば、Ｅ２のＮ末端と融合した（ヒトまたはその他の種由来）免疫グロブリンのヒトフラグメントの結晶化可能な領域（Ｆｃ領域）を使用したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２糖タンパク質ヘテロダイマーの大規模精製を促進するための方法を提供する。（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧまたはプロテインＬアフィニティカラムを使用した）Ｅ１Ｅ２ヘテロダイマー複合体のアフィニティ精製後、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの下流に位置するタンパク質分解切断部位における適切なプロテアーゼによる消化によってＥ１Ｅ２複合体から除去することができる。通常は、Ｅ１Ｅ２の大規模精製は困難であり、それがヒトにおけるＨＣＶワクチンとしてのその使用を制限する。本開示は、この難題に対処する。本開示はまた、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むさまざまなアフィニティ精製タグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、Ｅ１及びＥ２ポリペプチドの一方または両方がアフィニティ精製タグを含むヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。本開示は、タグなしＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。本開示はまた、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを含む組成物、及びＨＣＶに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、変異ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドまたは変異ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含み、変異Ｅ１またはＥ２ポリペプチドは、タンパク質分解切断可能なリンカー由来の１から６のアミノ酸を含む。
【０００６】
本開示は、ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも１つは、アフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドを提供する。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ１またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入されたタンパク質分解切断可能なリンカーを含む。ある場合には、ａ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；ｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；ｃ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；またはｄ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲ（配列番号４）を含む（例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む）。ある場合には、アフィニティタグは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、ハイブリッドプロテインＡ-プロテインＧポリペプチド、プロテインＬポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  ���２ポリペプチドを含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ある場合には、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含み、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。ある場合には、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含み、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂの１つに表されるＥ２ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドは、図５Ａ〜５Ｃに表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドは、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含み、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２から１５のアミノ酸、ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２から１５のアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、及びＳＴから選択されるジペプチドである。ある場合には、ａ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；ｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；ｃ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；またはｄ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲ（配列番号４）を含む（例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列���号５）を含む）。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、同じ遺伝子型のものである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、異なる遺伝子型のものである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、遺伝子型１、２、３、または７のものである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、遺伝子型１、２、３、または７のものである。
【０００７】
本開示は、ａ）本明細書の上または別の場所に記載されているヘテロダイマーポリペプチドと、ｂ）緩衝剤とを含む組成物を提供する。本組成物は、プロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。
【０００８】
本開示は、ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む核酸であって、ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも１つは、アフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、核酸を提供する。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端から２から１５のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼＥ１／Ｅ２接合部切断部位がＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとアフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとアフィニティタグポリペプチドの間に挿入される。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位がアフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に形成されるよう、アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端から２から１５のアミノ酸をコードす���ヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼＥ１／Ｅ２接合部切断部位がＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとアフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとアフィニティタグポリペプチドの間に挿入される。ある場合には、核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位がアフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に形成されるよう、アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される。ある場合には、ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと機能可能に連結される。ある場合には、アフィニティタグポリペプチドは、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドである。ある場合には、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドは、図５Ａ〜５Ｃに表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２から１５のアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、及びＳＴから選択されるジペプチドである。ある場合には、ａ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる；ｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる；ｃ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号３）を含み、切断は、リシン残基のすぐＣ末端側で起こる；またはｄ）タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲ（配列番号４）を含む（例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む）。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂの１つに表されるＥ２ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、及び図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドと少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本開示は、本明細書の上または別の場所に記載されている核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本開示は、本明細書の上または別の場所に記載されている核酸を含む遺伝子改変インビトロホスト細胞を提供する。本開示は、本明細書の上または別の場所に記載されている組換え発現ベクターを含む遺伝子改変インビトロホスト細胞を提供する。ある場合には、ホスト細胞は、真核細胞である。ある場合には、ホスト細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１０】
本開示は、本明細書の上または別の場所に記載されているアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドを作製する方法であって、ａ）アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーが細胞中で産生されるような条件下において、本明細書の上または別の場所に記載されている遺伝子改変ホスト細胞を培養することと、ｂ）細胞を溶解させて、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを含む細胞ライセートを形成することとを含む、方法を提供する。
【００１１】
本開示は、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法であって、ａ）本明細書の上または別の場所に記載されている遺伝子改変ホスト細胞のライセートを、不溶性の支持体に固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと接触させることであって、ライセート中に存在するアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと結合し、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを形成する、接触させることと、ｂ）固定されたＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマー中に存在するタンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それによりＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーをアフィニティタグから遊離させることと、ｃ）遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを回収することとを含む、方法を提供する。ある場合には、遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも５０％純粋である。ある場合には、アフィニティタグポリペプチドは、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドであり、アフィニティタグ結合ポリペプチドは、Ｆｃ結合ポリペプチドである。ある場合には、Ｆｃ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合物である。
【００１２】
本開示は、ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、ｉｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドを提供する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドであり、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、及びＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドであり、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ２ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、及びＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本開示は、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ヌクレオチド配列は、５’から３’に、機能可能な結合で、ａ）アミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を有する組織プラスミノーゲンシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と、ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ｃ）ＱＴ及びＥＴから選択されるジペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ｄ）アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、ｉｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む、核酸を提供する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドであり、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ１ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ１ポリペプチド、及びＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ１ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ１ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、またはＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドであり、ＡＶＩ１ａ１２９  Ｅ２ポリペプチド、Ｈ７７  Ｅ２ポリペプチド、Ｓ５２  Ｅ２ポリペプチド、及びＡＶＩ３ａ１７７  Ｅ２ポリペプチドは、図７及び図８に表されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、核酸は、図７または図８に表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。本開示は、本核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本開示は、本核酸を含む組換え発現ベクターにより遺伝子改変された哺乳動物ホスト細胞を提供する。本開示は、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法であって、ａ）遺伝子改変ホスト細胞のライセートを、不溶性の支持体に固定されたプロテインＡまたはプロテインＧポリペプチドと接触させることであって、ライセート中に存在するアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧと結合し、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを形成する、接触させることと、ｂ）固定されたＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを、固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマー中に存在するタンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それによりＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーをアフィニティタグから遊離させることと、ｃ）遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーを回収することとを含む、方法を提供する。ある場合には、遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも５０％純粋である。ある場合には、遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも７５％純粋である。ある場合には、遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも９０％純粋であ��。ある場合には、遊離したＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２ヘテロダイマーは、少なくとも９５％純粋である。
【００１４】
本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む修飾Ｅ２ポリペプチドとを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む修飾Ｅ１ポリペプチドとを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏである。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙである。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒである。本開示は、ａ）ヘテロダイマーポリペプチドと、ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントを含む。ある場合には、アジュバントは、ＭＦ５９、ミョウバン、ポリ（ＤＬ−ラクチドｃｏ−グリコリド）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、キーホールリンペットヘモシアニン、または３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  ２１（ＱＳ２１）を含むリポソームの懸濁液である。
【００１５】
本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸を含む修飾Ｅ２ポリペプチドとを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸を含む修飾Ｅ１ポリペプチドとを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、ＤＤＤＤＫ（配列番号３）である。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、ＬＥＶＬＦＱ（配列番号７）である。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号８）である。ある場合には、１から６の異種アミノ酸は、ＬＶＰＲ（配列番号４）である。本開示は、ａ）ヘテロダイマーポリペプチドと、ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントを含む。ある場合には、アジュバントは、ＭＦ５９、ミョウバン、ポリ（ＤＬ−ラクチドｃｏ−グリコリド）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、キーホールリンペットヘモシアニン、または３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  ２１（ＱＳ２１）を含むリポソームの懸濁液である。
【００１６】
本開示は、個体においてＨＣＶポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法であって、個体に有効量の本明細書の上または別の場所に記載されているヘテロダイマーポリペプチド、または本明細書の上もしくは別の場所に記載されているヘテロダイマーポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。ある場合には、投与することは、筋肉内投与による。ある場合には、投与することは、皮下投与による。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＨＣＶ遺伝子型１ウイルス、特に代表的なＨＣＶ  １Ａ、１Ｂ及び１Ｃ遺伝子型のコア-Ｅ１-Ｅ２コード領域の例のアミノ酸配列アライメントを示す。コード領域コア-Ｅ１-Ｅ２に関するＧｅｎｂａｎｋデータベース配列は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアｖ５．６．４を使用してアライメントした。アミノ酸のナンバリングは、菌株ＮＰ＿６７１９４１（Ｈ７７）に準じる。コンセンサス：配列番号４６；ＡＶＩ１ａ１２９：配列番号４７；ＮＰ＿６７１４９１（Ｈ７７）：配列番号４８；ＥＵ１５５２６９：配列番号４９；ＥＵ７８１８１０：配列番号５０；ＥＵ７８１７７１：配列番号５１；ＡＢ５２０６１０：配列番号５２；ＥＵ７８１７５２：配列番号５３；ＥＵ７８１７５９：配列番号５４；ＥＦ４０７４３９：配列番号５５；ＥＦ４０７４２７：配列番号５６；ＥＵ３６２９０５：配列番号５７；ＥＦ４０７４１３：配列番号５８；ＥＵ７８１８０８：配列番号５９；ＥＵ７８１７９０：配列番号６０；ＡＪ２３８７９９（Ｃｏｎ１）：配列番号６１；ＡＡＫ９７７４４：配列番号６２；ＡＦ１３９５９４：配列番号６３；ＡＦ１７６５７３：配列番号６４；ＢＡＡ１９６２５：配列番号６５；ＢＡＡ２５０７６：配列番号６６；ＢＡＣ５４８９６：配列番号６７；ＢＡＤ９１３８６：配列番号６８；ＢＡＦ４６７６４：配列番号６９；ＢＡＧ３０９５０：配列番号７０；ＣＡＢ４１９５１：配列番号７１；ＡＡＫ９５８３２：配列番号７２；ＡＡＴ６９９６８：配列番号７３；及びＢＡＡ０３５８１：配列番号７４。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、代表的なＨＣＶ  ２Ａ及びＨＣＶ  ２Ｂ亜型のコア-Ｅ１-Ｅ２コード領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。コード領域コア-Ｅ１-Ｅ２に関するＧｅｎｂａｎｋデータベース配列は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアｖ５．６．４を使用してアライメントした。示されるアミノ酸ナンバリングは、ＨＣＶ  ２Ａ及びＨＣＶ  ２Ｂに対して一般的なＨＣＶ菌株、それぞれＡＢＯ４７６３９（ＪＦＨ１）及びＨＰＣＪ８Ｇ−Ｊ８（Ｊ８）に準じる。コンセンサス：配列番号７５；ＡＢ０４７６３９（ＪＦＨ１）：配列番号７６；ＡＢ０４７６４５：配列番号７７；ＡＦ１６９００５：配列番号７９；ＡＦ２３８４８２：配列番号７８；ＡＹ７４６４６０：配列番号８０；ＨＰＣＰＯＬＰ：配列番号８１；ＮＣ＿００９８２３：配列番号８２；ＨＰＣＪ８Ｇ  ＨＣ−Ｊ８：配列番号８３；ＡＢ０３０９０７：配列番号８６；ＡＹ２３２７３０：配列番号８４；ＡＹ２３２７４７：配列番号８５；及びＤＱ４３０８１７：配列番号８７。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、代表的なＨＣＶ  ３Ａ、３Ｂ及び３Ｋ遺伝子型に関するコア-Ｅ１-Ｅ２コード領域のアミノ酸配列アライメントを示す。コード領域コア-Ｅ１-Ｅ２に関するＧｅｎｂａｎｋデータベース配列は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアｖ５．６．４を使用してアライメントした。コンセンサス：配列番号８８；ＡＶＩ３ａ１７７：配列番号８９；ＡＤＦ９７２３２（Ｓ５２）：配列番号９０；ＹＰ＿００１４６９６：配列番号９１；ＣＡＡ５４２４４：配列番号９２；ＡＡＣ０３０５８：配列番号９３；ＡＡＹ２９６４２：配列番号９４；ＡＢＤ８５０６２：配列番号９５；ＡＢＤ８５０６３：配列番号９６；ＡＢＤ９７１０４：配列番号９７；ＢＡＡ０６０４４：配列番号９８；ＢＡＡ０８３７２：配列番号９９；及びＢＡＡ０９８９０：配列番号１００。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＨＣＶ遺伝子型７ａ関するコア-Ｅ１-Ｅ２コード領域のアミノ酸配列を示す。遺伝子型７ａのコード領域コア-Ｅ１-Ｅ２に関するアミノ酸配列（分離株ＱＣ６９；Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＮ０５２２６．１；配列番号１０１）は、参照菌株、ＮＰ＿６７１９４１（Ｈ７７）のナンバリング方式に準じて示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列を示す。３Ｓ７Ｇ＿Ａ：配列番号１０２；ＡＡＮ７６０４４：配列番号１０３；ＡＡＷ６５９４７：配列番号１０４；ＡＡＡ５２７７０：配列番号１０５；０３０８２２１Ａ：配列番号１０６；Ｐ０１８７６：配列番号１０７；１Ｆ６Ａ＿Ｂ：配列番号１０８及びＰ０１８６１：配列番号１０９。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、完全長Ｅ１-Ｅ２コンストラクト中のＦｃタグ付きＥ２ポリペプチドの略図（図６Ａ）、及びＦｃタグ付きＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーを発現するＣＨＯ抽出物からのタグなしＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの精製を示すゲルを示す。配列上から下へ：配列番号１１０〜１１６。
【図７】Ｈ７７（配列番号１１８）及びアルバータ分離株Ａｖｉ１ａ１２９（配列番号１１７）のＦｃタグ付きＥ１-Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【図８】Ｓ５２（配列番号１１９）及びアルバータ分離株Ａｖｉ３ａ１７７（配列番号１２０）のＦｃタグ付きＥ１-Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【図９】本開示の方法により生成された組換えＥ１／Ｅ２抗原との中和抗ＨＣＶ  Ｅ２モノクローナル抗体の結合を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、プロテインＡ（配列番号１２１）、プロテインＧ（配列番号１２２）、及びプロテインＬ（配列番号１２３）ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、Ｆｃタグ付き前駆体からのＥ１Ｅ２ヘテロダイマーの精製を示す。図１１Ａは、タンパク質分解切断可能なリンカーＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、野生型（ＷＴ）Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー及びＦｃタグ由来（Ｆｃ−ｄ）ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの接種による中和抗体の誘導を示す。
【図１３】同種（遺伝子型１ａ）及び異種（遺伝子型５ａ）ＨＣＶポリタンパク質（ＨＣＶｐｐ）に対する中和抗体の比較を示す。
【図１４】野生型（ＷＴ）またはＦｃタグ由来（Ｆｃ−ｄ）ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーとの結合に関するＨＣＶ交差中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むマウス抗血清による競合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
「Ｃ型肝炎ウイルス」（「ＨＣＶ」）という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｃ型肝炎ウイルスの多くの異なる遺伝子型及び分離株のいずれか１つを指す。このように、「ＨＣＶ」は、例えば、遺伝子型１、２、３、４、６、７など及び亜型（例えば、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４ａ、４ｃなど）、ならびに疑似種を含むＨＣＶの多くの遺伝子型、亜型または疑似種の任意のものを包含する。代表的なＨＣＶ遺伝子型及び分離株としては、以下が挙げられる：「Ｃｈｉｒｏｎ」分離株ＨＣＶ−１、Ｈ７７、Ｊ６、Ｃｏｎ１、分離株１、ＢＫ、ＥＣ１、ＥＣ１０、ＨＣ−Ｊ２、ＨＣ−Ｊ５；ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７、ＨＣ−Ｊ８、ＨＣ−ＪＴ、ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２７、ＨＣＶ−４７６、ＨＣＶ−ＫＦ、「Ｈｕｎａｎ」、「Ｊａｐａｎｅｓｅ」、「Ｔａｉｗａｎ」、ＴＨ、１型、１ａ型、Ｈ７７  １ｂ型、１ｃ型、１ｄ型、１ｅ型、１ｆ型、１０型、２型、２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、２ｄ型、２ｆ型、３型、３ａ型、３ｂ型、３ｇ型、４型、４ａ型、４ｃ型、４ｄ型、４ｆ型、４ｈ型、４ｋ型、５型、５ａ型、６型及び６ａ型。
【００１９】
「個体」、「ホスト」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では同義に使用され、非ヒト霊長類（例えば、類人猿）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、及びヒトを含むが、それらに限定されない哺乳動物を指す。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドに関する「単離された」という用語は、ポリペプチドが天然に生じる環境とは異なる環境にあるポリペプチドを指す。単離ポリペプチドは、精製されてもよい。「精製された」とは、目的とする化合物（例えば、ポリペプチド）が自然状態でそれに伴う成分から分離されたことを意味する。「精製された」はまた、（例えば、インビトロにおける合成中など）ポリペプチドの生成中にそれに伴う可能性がある成分から分離されたポリペプチドを指すために使用される場合がある。いくつかの実施形態において、ポリペプチド（またはポリペプチドの混合物）は、もともと関連するか、または生成中に関連する有機分子を含まないポリペプチドが少なくとも６０重量％または少なくとも７５重量％である場合、ポリペプチド（またはポリペプチドの混合物）は実質的に純粋である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、３０％から６０％純粋である。いくつかの実施形態において、ポリペプチド（またはポリペプチドの混合物）は、少なくとも６０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも重量９５％、または少なくとも９９重量％純粋である。例えば、ある場合には、ポリペプチド（複数可）がもともと関連するか、または生成中に関連する有機分子を含まないＥ１、Ｅ１-Ｆｃ、Ｅ２、またはＥ２-Ｆｃポリペプチド（またはそのようなポリペプチドのヘテロダイマー）が少なくとも６０重量％または少なくとも７５重量％である場合、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ１-Ｆｃポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、もしくはＥ２-Ｆｃポリペプチド（またはそのようなポリペプチドを含むヘテロダイマー）は実質的に純粋である。
【００２１】
本明細書では同義に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、重合形態の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。このように、この用語は、以下に限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ある場合には、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。ある場合には、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。「ポリヌクレオチド」は、ウイルスベクターまたは細菌ベクターに組み込まれている核酸を含む。
【００２２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義に使用され、重合形態の任意の長さのアミノ酸を指し、これは、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含んでもよい。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化ポリペプチドを含む。
【００２３】
「異種の」という用語は、異なる供給源由来の構造体によって定義される２つの構成要素を指す。例えば、「異種の」がポリペプチドと関連して使用される場合、ポリペプチドは、１つ以上の異なるポリペプチド由来であってもよい機能可能に連結されたアミノ酸配列、例えば、自然状態ではポリペプチドと機能可能に連結されていないアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本発明をさらに記載する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然、変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することは意図しないことも理解されるべきである。
【００２５】
値の範囲が提供される場合、当然のことながら、文脈が明らかに別のことを規定していない限り、下限の単位の１／１０までのその範囲の上限値と下限値の間にある値のそれぞれ、ならびにその他の任意の指定された値またはその指定された範囲の間にある値が本発明の範囲内に包含される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、独立してより狭い範囲に含まれる場合もあり、これもまた本発明の範囲内に包含され、指定された範囲内の任意の特に除外された限界値に依存する。指定された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれか、または両方を含まない範囲も本発明に含まれる。
【００２６】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書中で示されるものと同様もしくは同等の任意の方法及び材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料は次に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物は、関連して刊行物が引用された方法及び／または材料を開示し、説明するために参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の指示対象を含むことが留意されるべきである。このように、例えば、「ａ  ＨＣＶ  Ｅ１（１つのＨＣＶ  Ｅ１）」の言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｇｅｄ  ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ（前記アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー）」の言及は、１つ以上のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの言及及び当業者に既知のその等価物などを含む、などである。請求項は、あらゆる任意の要素を除外するよう立案されてもよいことがさらに留意される。したがって、この表現は、請求項の要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」などのような排他的な術語の使用または「否定的な」限定の使用のための先行詞として働くことが意図される。
【００２８】
明瞭化のために個別の実施形態の文脈で記載されている本発明の特定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために１つの実施形態に関連して記載されている本発明のさまざまな特徴はまた、単独または任意の適した下位の組み合わせで提供されてもよい。本発明に属する実施形態のすべての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、それぞれ及びすべての組み合わせが個別に、明確に開示されているかのように本明細書中で開示される。さらに、各種実施形態及びその要素のすべての下位の組み合わせも本発明に具体的に包含され、それぞれ及びすべてのそのような下位の組み合わせが個別に、明確に本明細書中で開示されたかのように本明細書中で開示される。
【００２９】
本明細書において述べられている刊行物は、単に本出願の出願日に先立つそれらの開示に関して提供される。その中の何も、本発明が先行発明の理由でそのような刊行物に先行する権利が与えられないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、実際の公開日とは異なることもあり、自主的に確認する必要がある場合もある。
【００３０】
詳細な説明
本開示は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１ポリペプチドと、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、Ｅ１及びＥ２ポリペプチドの一方または両方が、ワクチンとしてのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの送達のためのＥ１Ｅ２ヘテロダイマーの商業的なスケールアップした精製及び生成を容易にするアフィニティ精製タグを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。本開示は、ワクチンとして使用するのに適した（タグなし）ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。
【００３１】
アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー
本開示は、例えば、Ｅ２のＮ末端と融合したヒトＦｃ免疫グロブリンドメインなどのアフィニティ精製タグを使用したＥ１Ｅ２糖タンパク質ヘテロダイマーの大規模精製を促進するための方法を提供する。Ｅ１Ｅ２ヘテロダイマー複合体の精製後、ヒトＦｃドメインは、Ｆｃドメインの下流に位置するタンパク質切断部位における適切なプロテアーゼを用いた消化によりＥ１Ｅ２複合体から除去することができる。通常は、Ｅ１Ｅ２の大規模精製は、非常に困難であり、ヒトへのＨＣＶワクチンとしてのその使用を厳しく制限する。本開示は、この難題に対処するため、及びワクチンとして使用するのに適したＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するための方法を提供する。本開示はまた、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド、またはｃ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドを提供する。ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドのアフィニティタグ部分は、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドのＮ末端、またはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。同様に、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドのアフィニティタグ部分も、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端、またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。
【００３２】
適したアフィニティタグ（本明細書において「アフィニティ精製タグ」とも呼ばれる）としては、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ハイブリッドプロテインＡ-プロテインＧポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。精製は、例としてプロテインＡ固定化カラムまたはプロテインＧ固定化カラム（Ｉｇタグ付きＥ１Ｅ２の場合）、プロテインＬ固定化カラム（Ｉｇ軽鎖タグ付きＥ１Ｅ２の場合）、Ｉｇ固定化カラム（プロテインＡまたはプロテインＧタグ付きＥ１Ｅ２の場合）、Ｎｉカラム（Ｈｉｓタグ付きＥ１Ｅ２の場合）、またはグルタチオン固定化カラム（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ付きＥ１Ｅ２の場合）を使用して達成することができる。
【００３３】
本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチド、またはｃ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド及びＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドを含むヘテロダイマーポリペプチドを提供する。ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分は、ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。同様に、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ部分も、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。
【００３４】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、同じＨＣＶ遺伝子型のものであっても、または異なるＨＣＶ遺伝子型のものであってもよい。
【００３５】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型１のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型２のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型３のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型４のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型５のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型６のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、遺伝子型７のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。
【００３６】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、完全長ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドである。本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、完全長ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチドであり、アフィニティタグ（Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド）及び任意のリンカー以外は、いかなる異種ポリペプチドも含まない。
【００３７】
ある場合には、アフィニティタグが、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２０から５０のアミノ酸と置き換わってもよい。例えば、ある場合には、アフィニティタグが、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２０アミノ酸（ａａ）から２５ａａ、２５ａａから３０ａａ、３０ａａから３５ａａ、３５ａａから４０ａａ、または４０ａａから５０ａａと置き換わってもよい。例えば、ある場合には、アフィニティタグが、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の３０のアミノ酸と置き換わってもよい。
【００３８】
Ｅ２ポリペプチド
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、約２００アミノ酸（ａａ）から約２５０ａａ、約２５０ａａから約２７５ａａ、約２７５ａａから約３００ａａ、約３００ａａから約３２５ａａ、約３２５ａａから約３５０ａａ、または約３５０ａａから約３６５ａａの長さを有してもよい。ある場合には、本開示のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、ＨＣＶ  Ｅ２エクトドメインポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーに含めるのに適したＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、完全長ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドである。
【００３９】
図１Ａ〜１Ｃにおいて、Ｅ２のアミノ酸配列は、アミノ酸３８４からアミノ酸７４６である。図２Ａ〜２Ｂにおいて、Ｅ２のアミノ酸配列は、アミノ酸３８４からアミノ酸７５１である。図３Ａ〜３Ｃにおいて、Ｅ２のアミノ酸配列は、アミノ酸３８５からアミノ酸７５４である。図４Ａ〜４Ｂにおいて、Ｅ２のアミノ酸配列は、アミノ酸３８４からアミノ酸７５０である。本明細書中で使用される場合、「Ｅ２ポリペプチド」は、シグナル配列を含む前駆体Ｅ２タンパク質を含み、この配列がない成熟Ｅ２ポリペプチドを含み、異種のシグナル配列を伴うＥ２ポリペプチドを含む。Ｅ２ポリペプチドは、およそアミノ酸位置７１５〜７３０に生じるＣ末端膜アンカー配列を含んでもよく、およそアミノ酸残基７４６まで伸びる場合もある（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：５０６３−５０７３を参照）。
【００４０】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、そのＣ末端領域の部分、例えば、アミノ酸約７１５からＣ末端まで、アミノ酸約６２５からＣ末端まで、アミノ酸約６６１からＣ末端まで、アミノ酸約６５５からＣ末端まで、アミノ酸約５００からＣ末端までがない。ここでは、アミノ酸ナンバリングは、図１Ａ〜１Ｃのナンバリングを基準にしている。例えば、米国特許第６，５２１，４２３号を参照。
【００４１】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、または図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本開示のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、または図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４２】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１のＥ２ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７４６と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＡのＥ２ポリペプチドは、１Ａと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７４６と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＢのＥ２ポリペプチドは、１Ｂと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７４６と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＣのＥ２ポリペプチドは、１Ｃと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７４６と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４３】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｃに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、Ｅ２ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７５１と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型２ＡのＥ２ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｃに表される「コンセンサス」アミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７５１と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型２ＢのＥ２ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｃに表される「コンセンサス」アミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７５１と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４４】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｃに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型３のＥ２ポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８５〜７５４と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型３ＡのＥ２ポリペプチドは、３Ａと特定され、図３Ａ〜３Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８５〜７５４と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型３ＢのＥ２ポリペプチドは、３Ｂと特定され、図３Ａ〜３Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８５〜７５４と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型３ＫのＥ２ポリペプチドは、３Ｋと特定され、図３Ａ〜３Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８５〜７５４と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４５】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＥ２ポリペプチドは、図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型７ＡのＥ２ポリペプチドは、図４Ａ〜４Ｂに表されるアミノ酸配列のアミノ酸３８４〜７５０と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４６】
Ｅ１ポリペプチド
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、約１５０アミノ酸（ａａ）から約１７５ａａ、約１７５ａａから約１９５ａａ、約１３１ａａから約１７５ａａ、または約１７５ａａから約１９３ａａの長さを有してもよい。ある場合には、本開示のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、ＨＣＶ  Ｅ１エクトドメインポリペプチドである。ある場合には、本開示のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適したＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、完全長ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドである。
【００４７】
図１Ａ〜１Ｃにおいて、Ｅ１のアミノ酸配列は、アミノ酸１９２からアミノ酸３８３である。図２Ａ〜２Ｃにおいて、Ｅ１のアミノ酸配列は、アミノ酸１９２からアミノ酸３８３である。図３Ａ〜３Ｃにおいて、Ｅ１のアミノ酸配列は、アミノ酸１９２からアミノ酸３８４である。図４Ａ〜４Ｂにおいて、Ｅ１のアミノ酸配列は、アミノ酸１９２からアミノ酸３８３である。およそ１７０からおよそ１９１のアミノ酸がＥ１に対するシグナル配列として働く。本明細書中で使用される場合、「Ｅ１ポリペプチド」は、シグナル配列を含む前駆体Ｅ１タンパク質を含み、この配列がない成熟Ｅ１ポリペプチドを含み、異種のシグナル配列を伴うＥ１ポリペプチドを含む。Ｅ１ポリペプチドは、およそアミノ酸位置３６０〜３８３に生じるＣ末端膜アンカー配列を含んでもよい（例えば、ＷＯ９６／０４３０１を参照）。ある場合には、適したＥ１ポリペプチドは、膜貫通領域を含むＣ末端部分がない。例えば、ある場合には、適したＥ１ポリペプチドは、アミノ酸３３０からアミノ酸３８４、またはアミノ酸３６０からアミノ酸３８４のＣ末端部分がない。Ｅ１ポリペプチドは、ＨＣＶのいかなる遺伝子型、亜型または分離株のＥ１ポリペプチドであってもよい。遺伝子型１のＥ１ポリペプチド及び遺伝子型３のＥ１ポリペプチドは、本開示のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーに含まれる。
【００４８】
Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃ、図３Ａ〜３Ｃ、または図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４９】
Ｅ１ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｃに表されるＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＡのＥ１ポリペプチドは、１Ａと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＢのＥ１ポリペプチドは、１Ｂと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ＣのＥ１ポリペプチドは、１Ｃと特定され、図１Ａ〜１Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５０】
Ｅ１ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｃに表されるＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型２ＡのＥ１ポリペプチドは、２Ａと特定され、図２Ａ〜２Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型２ＢのＥ１ポリペプチドは、２Ｂと特定され、図２Ａ〜２Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５１】
Ｅ１ポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｃに表されるコンセンサスＥ１ポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型３Ａ、３Ｂ、または３ＫのＥ１ポリペプチドは、それぞれ３Ａ、３Ｂ、または３Ｋと特定され、図３Ａ〜３Ｃに表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列のアミノ１９２〜３８４と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５２】
Ｅ１ポリペプチドは、図４Ａ〜４Ｂに表されるＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型７ＡのＥ１ポリペプチドは、図４Ａ〜４Ｂに表されるアミノ酸配列のアミノ酸１９２〜３８３と少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５３】
アフィニティタグ
適したアフィニティタグ（本明細書において「アフィニティ精製タグ」とも呼ばれる）としては、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ハイブリッドプロテインＡ-プロテインＧポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００５４】
Ｆｃポリペプチド
さまざまなＩｇ  Ｆｃポリペプチドが、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含めるのに適している。Ｆｃ領域（Ｆｃポリペプチド）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃなどであってもよい。Ｆｃポリペプチドは、非ヒト種由来のＦｃポリペプチドであってもよい。
【００５５】
ある場合には、Ｆｃ領域は、図５Ａ〜５Ｃに表されるＦｃ領域のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｆｃ領域は、図５Ａに表されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｆｃ領域は、図５Ａに表されるヒトＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Ｆｃ領域は、図５Ａに表されるヒトＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドのアミノ酸９９〜３２５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｆｃ領域は、図５Ａに表されるヒトＩｇＧ３  Ｆｃポリペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Ｆｃ領域は、図５Ａに表されるヒトＩｇＧ３  Ｆｃポリペプチドのアミノ酸１９〜２４６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
ある場合には、Ｆｃ領域は、図５Ｃに表されるヒトＩｇＧ４  Ｆｃポリペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Ｆｃ領域は、図５Ｃに表されるヒトＩｇＧ４  Ｆｃポリペプチドのアミノ酸１００〜３２７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
プロテインＡ
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に含まれるアフィニティタグポリペプチドは、プロテインＡポリペプチドである。適したプロテインＡポリペプチドは、図１０Ａに表されるアミノ酸２７から２２７プロテインＡアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、１５０から２００アミノ酸の長さを有してもよい。適したプロテインＡポリペプチドは、図１０Ａに表されるアミノ酸２７から２２７プロテインＡアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、２００アミノ酸の長さを有してもよい。
【００５８】
プロテインＧ
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、プロテインＧポリペプチドである。適したプロテインＧポリペプチドは、図１０Ｂに表されるアミノ酸３７〜４４８プロテインＧアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、３５０アミノ酸から４１１アミノ酸の長さを有してもよい。
【００５９】
プロテインＬ
プロテインＬは、抗体のカッパ軽鎖、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、及びＦａｂフラグメントと結合する。適したプロテインＬポリペプチドは、図１０Ｃに表されるプロテインＬアミノ酸配列のアミノ酸２５〜９９２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。適したプロテインＬポリペプチドは、図１０Ｃに表されるプロテインＬアミノ酸配列のアミノ酸２５〜９９２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、８００アミノ酸から９６８アミノ酸の長さを有してもよい。
【００６０】
ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチドである。適したポリ（ヒスチジン）トラクト含有ポリペプチドは、約２５アミノ酸から約５００アミノ酸、例えば、約２５アミノ酸（ａａ）から３０ａａ、３０ａａから３５ａａ、３５ａａから４０ａａ、４０ａａから５０ａａ、５０ａａから７５ａａ、７５ａａから１００ａａ、１００ａａから１５０ａａ、１５０ａａから２００ａａ、２００ａａから２５０ａａ、２５０ａａから３００ａａ、３００ａａから３５０ａａ、３５０ａａから４００ａａ、４００ａａから４５０ａａ、または４５０ａａから５００ａａの長さを有してもよい。ポリ（ヒスチジン）トラクトは、４から２０の連続的なヒスチジン、例えば、４から６の連続的なヒスチジン、６から１０の連続的なヒスチジン、１０から１５の連続的なヒスチジン、または１５から２０の連続的なヒスチジンであってもよい。例えば、適したアフィニティタグポリペプチドは、約５０アミノ酸の長さであってもよく、（Ｈｉｓ）６ヒスチジントラクトを含んでもよい。
【００６１】
軽鎖
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖、またはＩｇ軽鎖含有ポリペプチドである。例えば、Ｉｇ軽鎖含有ポリペプチドは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、または任意のその他のＩｇ軽鎖含有ポリペプチドであってもよい。ある場合には、Ｉｇ軽鎖含有ポリペプチドは、Ｉｇカッパ軽鎖、例えば、ヒトＩｇカッパ軽鎖を含む。Ｉｇ軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野において知られている。
【００６２】
リンカー
ある場合には、リンカーは、アフィニティタグ（例えば、Ｉｇ  Ｆｃ）とＨＣＶ  Ｅ１またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入されてもよい。リンカーペプチドは、任意のさまざまなアミノ酸配列を有してもよい。リンカーは、約６から約４０の間のアミノ酸長、または約６から約２５の間のアミノ酸長のペプチドであってもよい。こうしたリンカーは、タンパク質をつなぐためにリンカーをコードする合成のオリゴヌクレオチドを使用することによって作製することができる。ある程度の柔軟性を可能にするペプチドリンカーが、使用されてもよい。連結ペプチドは、適切なリンカーが一般に柔軟なペプチドをもたらす配列を有することになることを留意して実質的にいかなるアミノ酸配列を有してもよい。グリシン及びアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドを作り出す際に役立つ。そのような配列の作製は、当業者には通常のものである。
【００６３】
適切なリンカーは、容易に選択することができ、４から１０のアミノ酸、５から９のアミノ酸、６から８のアミノ酸、または７から８のアミノ酸を含む１（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒ）から２０のアミノ酸、２から１５のアミノ酸、３から１２のアミノ酸などの任意の適したさまざまな長さであってもよく、１，２、３、４、５、６、または７のアミノ酸であってもよい。
【００６４】
例となる柔軟なリンカーとしては、グリシン重合体（Ｇ）ｎ、グリシン−セリン重合体（例えば、ｎが少なくとも１の整数の（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号９）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）を含む）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、及び当該技術分野において知られているその他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン−セリン重合体が対象のものであり、それは、これらのアミノ酸はともに比較的組織化されず、よって構成要素の間でニュートラルな鎖として働くことができるためである。グリシンは、アラニンよりもさらに著しくファイ−プサイ空間に接近し、より長い側鎖をもつ残基よりもはるかに制限されないため、グリシン重合体は特に対象となる（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照）。例となる柔軟なリンカーとしては、ＧＧＳＧ（配列番号１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号１６）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者は、上記の任意の要素と結合したペプチドの設計は、リンカーが柔軟なリンカーならびにあまり柔軟でない構造を与える１つ以上の部分を含んでもよいよう、すべてが柔軟なまたは部分的に柔軟なリンカーを含んでもよいことを認識するであろう。
【００６５】
Ｅ１-Ｆｃ融合／Ｅ２ヘテロダイマー
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【００６６】
Ｆｃポリペプチドは、直接またはリンカーを介してＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）と結合していてもよい。言い換えると、ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。場合によって、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、ｉｉ）リンカー、及びｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。
【００６７】
Ｆｃポリペプチドは、直接またはリンカーを介してＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）と結合していてもよい。言い換えると、ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、ｉｉ）リンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む
【００６８】
Ｅ１／Ｅ２-Ｆｃ融合ヘテロダイマー
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【００６９】
Ｆｃポリペプチドは、直接またはリンカーを介してＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＣ末端と結合していてもよい。言い換えると、ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、ｉｉ）リンカー、及びｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含む。
【００７０】
Ｆｃポリペプチドは、直接またはリンカーを介してＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端と結合していてもよい。言い換えると、ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド、ｉｉ）リンカー、及びｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００７１】
Ｅ１-Ｆｃ融合／Ｅ２-Ｆｃ融合ヘテロダイマー
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。
【００７２】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド、及びｉｉ）Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド、及びｉｉ）Ｆｃポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。
【００７３】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ａ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｆｃポリペプチド、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。
【００７４】
タンパク質分解切断可能なリンカー
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー中に存在するアフィニティタグは、精製中に切断され除かれて、アフィニティタグを含まないＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを形成する。この目的を達成するために、タンパク質分解切断可能なリンカーは、アフィニティタグと、ＨＣＶ  Ｅ１及び／またはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に配置することができる。
【００７５】
したがって、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含み、アフィニティタグ付きＥ１ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグ（例えば、Ｆｃポリペプチド）、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。
【００７６】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含み、アフィニティタグ付きＥ２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグ（例えば、Ｆｃポリペプチド）、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００７７】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含み、アフィニティタグ付きＥ１ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグ（例えば、Ｆｃポリペプチド）、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含み、アフィニティタグ付きＥ２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグ（例えば、Ｆｃポリペプチド）、ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー、及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００７８】
タンパク質分解切断可能なリンカーは、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａアスタシン、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、癌プロコアグラント、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリクシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、ライソゾームのプロＸカルボキシペプチダーゼ、リジルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、粘液細菌、ナーディライシン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン２Ａ、ピコルナイン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ルスセリリシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノンビンＡ、ベノンビンＡＢ、及びＸａａ−ｐｒｏアミノペプチダーゼから成る群から選択されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識配列を含んでもよい。
【００７９】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位、例えば、コラゲナーゼ−１、−２、及び−３（ＭＭＰ−１、−８、及び−１３）、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及び−９）、ストロメライシン１、２、及び３（ＭＭＰ−３、−１０、及び−１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、ならびに膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰに対する切断部位を含んでもよい。例えば、ＭＭＰ−９の切断配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（Ｘは任意の残基を、Ｈｙは疎水性残基を表す）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号１７）またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（配列番号１８）である。プロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノーゲン活性化因子切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位である。適切なプロテアーゼ切断部位の別の例は、プロラクチン切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の特定の例としては、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が挙げられる。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）であり、このプロテアーゼは、グルタミンとセリンの間を切断する。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、エンテロキナーゼ切断部位、例えば、ＤＤＤＤＫ（配列番号３）であり、切断はリシン残基の後で起こる。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、トロンビン切断部位、例えば、ＬＶＰＲ（配列番号４）である（例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む）。プロテアーゼ切断部位を含むさらなる適切なリンカーとしては、１つ以上の以下のアミノ酸配列を含むリンカーが挙げられる：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６０１）により切断されるＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）；トロンビン切断部位、例えば、ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号１９）；カテプシンＢにより切断される；ＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号２０）またはＳＬＬＩＡＲＲＭＰＮＦＮ（配列番号２１）；エプスタインバーウイルスプロテアーゼにより切断されるＳＫＬＶＱＡＳＡＳＧＶＮ（配列番号２２）またはＳＳＹＬＫＡＳＤＡＰＤＮ（配列番号２３）；ＭＭＰ−３（ストロメライシン）により切断されるＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＮ（配列番号２４）；ＭＭＰ−７（マトリライシン）により切断されるＳＬＲＰＬＡＬＷＲＳＦＮ（配列番号２５）；ＭＭＰ−９により切断されるＳＰＱＧＩＡＧＱＲＮＦＮ（配列番号２６）；サーモリシン様ＭＭＰにより切断されるＤＶＤＥＲＤＶＲＧＦＡＳＦＬ（配列番号２７）；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）により��断されるＳＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ（配列番号２８）；カテスピンＬにより切断されるＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号２９）；カテプシンＤにより切断されるＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号３０）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）により切断されるＳＬＧＰＱＧＩＷＧＱＦＮ（配列番号３１）；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子により切断されるＫＫＳＰＧＲＶＶＧＧＳＶ（配列番号３２）；膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ−ＭＭＰ）により切断されるＰＱＧＬＬＧＡＰＧＩＬＧ（配列番号３３）；ストロメライシン３（すなわちＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメライシン−１により切断されるＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号３４）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ−３）により切断されるＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号３５）；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）により切断されるＧＧＳＧＱＲＧＲＫＡＬＥ（配列番号３６）；ヒト前立腺特異抗原により切断されるＳＬＳＡＬＬＳＳＤＩＦＮ（配列番号３７）；カリクレイン（ｈＫ３）により切断されるＳＬＰＲＦＫＩＩＧＧＦＮ（配列番号３８）；好中球エラスターゼにより切断されるＳＬＬＧＩＡＶＰＧＮＦＮ（配列番号３９）；及びカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）により切断されるＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（配列番号４０）。
【００８０】
Ｅ１−Ｅ２接合部
真核（例えば、哺乳類）細胞における野生型ＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２ポリタンパク質のプロセッシングの間に、内在性のプロテアーゼがＥ２タンパク質からＥ１タンパク質を切断し；内在性のプロテアーゼがＥ１−Ｅ２接合部を認識し、接合部にて切断する。哺乳類細胞におけるポリタンパク質前駆体からの本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの合成及びプロセッシングの間に、野生型Ｅ１−Ｅ２接合部が繰り返されることができるので、Ｅ２のＮ末端に由来するアミノ酸（例えば、２から１５のアミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ））が、図６Ａで描かれるようにアフィニティタグのＮ末端で繰り返される。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸がアフィニティタグのＮ末端に位置する。ある場合には、ジペプチドＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴがアフィニティタグのＮ末端に位置する。Ｅ１Ｅ２の遺伝子型及び特定の分離株に応じて、Ｅ２の最初の２つのアミノ酸の２つ組はシグナルペプチダーゼ（ＳＰ）によるプロセッシングに続いてＥ２のＮ末端で作り出される望ましくないアミノ酸を生じてもよい（図６Ａ）。アミノ末端でのそのようなアミノ酸にはアスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）またはシステイン（Ｃ）が挙げられる。そのようなアミノ酸はＮ末端則経路を介したプロテアソームが介在する分解についてタンパク質を標的とすることができる（Ｔａｓａｋｉ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１，２６１−２８９で概説された）。この場合、特定の遺伝子型についてのいずれかのコンセンサス配列に従って代替のアミノ酸が選択されることができ、または特定の遺伝子型サブクラスが選択されることになる。
【００８１】
従って、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｅ２ポリペプチドのＮ末端の２から１５のアミノ酸（例えば、２アミノ酸（ａａ）、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）と；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチドと；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーと；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８２】
例えば、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＥＴ（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ）と；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチドと；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８３】
別の例として、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＧＴ（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）と；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチドと；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーと；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８４】
別の例として、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＴＴ（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）と；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチドと；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーと；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８５】
別の例として、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドと；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチドと；ｉｉｉ）切断可能なリンカーＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）と；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８６】
別の例として、ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドと；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドと；ｉｉｉ）切断可能なリンカーＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）と；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。
【００８７】
核酸、組換え発現ベクター及びホスト細胞
本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、本核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。したがって、本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。本開示は、本開示の核酸または組換え発現ベクターによって遺伝子改変されたホスト細胞を提供する。
【００８８】
ある場合には、本開示の核酸は、ａ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｂ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド；ｃ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｄ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；またはｅ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー（例えば、ヘテロダイマーの双方のポリペプチドが単一の核酸にコードされる場合）を含む。したがって、ある場合には、本開示の核酸は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの一方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
ある場合には、本開示の核酸は、ａ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｂ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド；ｃ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｄ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチド；またはｅ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー（例えば、ヘテロダイマーの双方のポリペプチドが単一の核酸にコードされる場合）を含む。したがって、ある場合には、本開示の核酸は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの一方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
本開示の核酸が、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの一方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む場合、該ヌクレオチド配列はプロモーター、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結することができる。他の例では、本開示の核酸は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの双方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含み；該ヌクレオチド配列はプロモーター、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結することができる。
【００９１】
本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸とを含む組成物を提供し、その際、ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも一方はアフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸とを含む組成物を提供し、その際、ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも一方はＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
【００９２】
本開示の核酸が、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの双方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む場合、該ヌクレオチド配列はプロモーター、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結することができる。本開示の核酸が、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの双方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む場合、本核酸はＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列と、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むことができ、その際、Ｅ１ポリペプチド及びＥ２ポリペプチドの一方または双方はＦｃポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。ある場合には、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。ある場合には、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列はリボソームスキップ配列（例えば、２Ａペプチド（例えば、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４１）をコードするヌクレオチド配列、例えば、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ（２００４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１６７３を参照のこと）によって分離される。
【００９３】
ある場合には、本開示の核酸は発現ベクターに挿入されて、組換え発現ベクターを形成する。したがって、本開示は、ａ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｂ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド；ｃ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｄ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチド；またはｅ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー（例えば、ヘテロダイマーの双方のポリペプチドが単一の核酸にコードされる場合）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００９４】
ある場合には、ａ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｂ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド；ｃ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｄ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチド；またはｅ）本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えば、プロモーター、例えば、真核細胞で機能的なプロモーターに機能可能に連結される。
【００９５】
ある場合には、本開示の組換え発現ベクターは本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの一方のポリペプチド鎖だけをコードするヌクレオチド配列を含む。本開示は、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組換え発現ベクターと、ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え発現ベクターとを含む組成物を提供し、その際、ＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの少なくとも一方はＩｇ  Ｆｃポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。第１のポリペプチド鎖（ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ１-Ｆｃ融合ポリペプチド）または第２のポリペプチド鎖（ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ２-Ｆｃ融合ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列はプロモーター、例えば、真核細胞で機能的なプロモーターに機能可能に連結することができる。
【００９６】
ある場合には、本開示の組換え発現ベクターは本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの双方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合では、ヌクレオチド配列はプロモーター、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結される。本開示の組換え発現ベクターが本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの双方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む場合、該組換え発現ベクターはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列と、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含むことができ、その際、Ｅ１ポリペプチド及びＥ２ポリペプチドの一方または双方はアフィニティタグを含む融合ポリペプチド（例えば、Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド）である。ある場合には、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。ある場合には、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列はリボソームスキップ配列（例えば、２Ａペプチド（例えば、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４１）をコードするヌクレオチド配列、例えば、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ（２００４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１６７３を参照のこと）によって分離される。
【００９７】
本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、ｉ）Ｅ１ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；ｉｉ）Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；またはｉｉｉ）Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドを含む。ある場合には、タンパク質分解切断可能なリンカーをコードするヌクレオチド配列はＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とアフィニティタグとの間に挿入される。
【００９８】
タンパク質分解切断可能なリンカーは、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａアスタシン、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、癌プロコアグラント、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリクシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、ライソゾームのプロ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、リジルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、粘液細菌、ナーディライシン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン２Ａ、ピコルナイン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ルスセリリシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノンビンＡ、ベノンビンＡＢ、及びＸａａ−ｐｒｏアミノペプチダーゼから成る群から選択されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識配列を含んでもよい。
【００９９】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位、例えば、コラゲナーゼ−１、−２、及び−３（ＭＭＰ−１、−８、及び−１３）、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及び−９）、ストロメライシン１、２、及び３（ＭＭＰ−３、−１０、及び−１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、ならびに膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰに対する切断部位を含んでもよい。例えば、ＭＭＰ−９の切断配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（Ｘは任意の残基を、Ｈｙは疎水性残基を表す）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号１７）またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（配列番号１８）である。プロテアーゼ切断部位の別の例はプラスミノーゲン活性化因子切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位である。適切なプロテアーゼ切断部位の別の例はプロラクチン切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の特定の例としては、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が挙げられる。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２）であり、このプロテアーゼはグルタミンとセリンの間を切断する。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例はエンテロキナーゼ切断部位、例えば、ＤＤＤＤＫ（配列番号３）であり、切断はリシン残基の後で起こる。タンパク質分解切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例はトロンビン切断部位、例えば、ＬＶＰＲ（配列番号４）である（例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）を含む）。プロテアーゼ切断部位を含むさらなる適切なリンカーとしては、１つ以上の以下のアミノ酸配列を含むリンカーが挙げられる：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６０１）により切断されるＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）；トロンビン切断部位、例えば、ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号１９）；カテプシンＢにより切断されるＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号２０）またはＳＬＬＩＡＲＲＭＰＮＦＮ（配列番号：２１）；エプスタインバーウイルスプロテアーゼにより切断されるＳＫＬＶＱＡＳＡＳＧＶＮ（配列番号２２）またはＳＳＹＬＫＡＳＤＡＰＤＮ（配列番号：２３）；ＭＭＰ−３（ストロメライシン）により切断されるＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＮ（配列番号２４）；ＭＭＰ−７（マトリライシン）により切断されるＳＬＲＰＬＡＬＷＲＳＦＮ（配列番号２５）；ＭＭＰ−９により切断されるＳＰＱＧＩＡＧＱＲＮＦＮ（配列番号２６）；サーモリシン様ＭＭＰにより切断されるＤＶＤＥＲＤＶＲＧＦＡＳＦＬ配列番号２７）；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）により切断される��ＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ（配列番号２８）；カテスピンＬにより切断されるＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号２９）；カテプシンＤにより切断されるＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号３０）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）により切断されるＳＬＧＰＱＧＩＷＧＱＦＮ（配列番号３１）；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子により切断されるＫＫＳＰＧＲＶＶＧＧＳＶ（配列番号３２）；膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ−ＭＭＰ）により切断されるＰＱＧＬＬＧＡＰＧＩＬＧ（配列番号３３）；ストロメライシン３（すなわちＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメライシン−１により切断されるＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号３４）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ−３）により切断されるＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号３５）；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）により切断されるＧＧＳＧＱＲＧＲＫＡＬＥ（配列番号３６）；ヒト前立腺特異抗原により切断されるＳＬＳＡＬＬＳＳＤＩＦＮ（配列番号３７）；カリクレイン（ｈＫ３）により切断されるＳＬＰＲＦＫＩＩＧＧＦＮ（配列番号３８）；好中球エラスターゼにより切断されるＳＬＬＧＩＡＶＰＧＮＦＮ（配列番号３９）；及びカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）により切断されるＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（配列番号４０）。
【０１００】
上記で言及したように、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの一方または双方のポリペプチドをコードする核酸は発現ベクターにて存在することができる。好適な発現ベクターには、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌性人工染色体、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、ヘルペス単純ウイルスに基づくウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくレンチウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＶＬ）に基づくガンマレトロウイルスベクター、等）、Ｐ１に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び対象とする特定のホスト（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、哺乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞）に特異的な任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好適な発現ベクターには、複製欠損アデノウイルスベクター；複製欠損ワクシニアウイルスベクター；レンチウイルスベクター（例えば、自己不活化レンチウイルスベクター）；レトロウイルスベクター（例えば、自己不活化レトロウイルスベクター）；アデノ関連ウイルスベクター；等が挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、ベクターは修飾されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ベクターまたはＭＶＡに基づくベクターである（例えば、Ｖｅｒｈｅｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２６２３を参照のこと）。
【０１０１】
本開示は、遺伝子改変されたホスト細胞を提供し、その際、遺伝子改変されたホスト細胞は本開示の核酸（複数可）または組換え発現ベクター（複数可）によって遺伝子改変される。
【０１０２】
好適なホスト細胞には、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞のような真核細胞が挙げられる。ある場合には、ホスト細胞は哺乳類細胞株の細胞である。好適な哺乳類細胞株にはヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（マウス、ラット）細胞株等が挙げられる。好適な哺乳類細胞株には、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＭＲＣ４線維芽細胞、等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
核酸のホスト細胞への導入の方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法等が挙げられる。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定な発現を提供するために導入の方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝するエピソーム性の要素（例えば、プラスミド）として提供することができ、またはゲノムに組み込むことができる。
【０１０４】
１）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-Ｅ２ポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸はＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１０５】
ある場合には、本開示の核酸はＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１０６】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）とｉｉｉ）アフィニティタグとｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列は転写制御要素、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結される。好適なプロモーターには、例えば、上述のようなＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。好適なタンパク質分解切断可能なリンカーは上記に記載されている。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１０７】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｉｉ）アフィニティタグ；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｖ）アフィニティタグ；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１０８】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；プロラクチンシグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１０９】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｉｉ）アフィニティタグ；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｖ）アフィニティタグ；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１１０】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１１１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＥＴ（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＥＴ（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１１２】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＧＴ（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＧＴ（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１１３】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＴＴ（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＴＴ（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１１４】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｖ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含むタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含むタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１１５】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）プロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を有するシグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ジペプチドＱＴまたはＥＴ；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を有するシグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ジペプチドＱＴまたはＥＴ；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を有するタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１１６】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）プロモーターと、ｂ）図７または図８に描かれているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１１７】
２）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-Ｅ２-アフィニティタグポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。
【０１１８】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｖ）アフィニティタグポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１９】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｉｖ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２０】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１２１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー及びｉｖ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２２】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｉｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２３】
３）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-Ｅ２ポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際に、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１２４】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２６】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１２７】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２８】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１２９】
４）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-Ｅ２ポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。
【０１３０】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチドは、アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される。
【０１３１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｖ）シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖ）シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチド；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１３２】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１３３】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１３４】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）Ｆｃポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）Ｆｃポリペプチド；及びｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１３５】
ヌクレオチド配列が２つのシグナルペプチドをコードする場合、ある場合には、２つのシグナルペプチドは２つの異なるシグナルペプチドである。
【０１３６】
５）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含み、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１３７】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）とｉｖ）アフィニティタグとｖ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えば、真核細胞にて機能的であるプロモーターに機能可能に連結される。好適なプロモーターには、例えば、上述のようなＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。好適なタンパク質分解切断可能なリンカーは上記に記載されている。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１３８】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖｉ）アフィニティタグ；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１３９】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１４０】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖ）アフィニティタグ；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖ）アフィニティタグ；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、アフィニティタグはＩｇ  Ｆｃポリペプチドである。他の場合では、アフィニティタグはプロテインＡ、プロテインＧ、ポリ（ヒスチジン）トラクトを含むポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチドである。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１４１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１４２】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＥＴ（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＥＴ（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１４３】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＧＴ（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＧＴ（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１４４】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＴＴ（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するＴＴ（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）ジペプチド；ｖｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。
【０１４５】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含むタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、ポリタンパク質はシグナルペプチドを含む。したがって、例えば、ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来する２アミノ酸から１５アミノ酸（ａａ）（例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、または１５ａａ）；ｖｉ）Ｉｇ  Ｆｃポリペプチド；ｖｉｉ）アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）を含むタンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、核酸は発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター等）に存在する。ある場合には、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸は、ＱＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＧＴ、ＴＴ、ＲＨ、ＮＴ、ＡＹ、ＶＩ、またはＳＴのジペプチドである。
【０１４６】
６）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含み、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。
【０１４７】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｖ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｖｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチドがアフィニティタグポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの間に挿入される。
【０１４８】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｖ）シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖ）シグナラーゼ切断部位を含むシグナルペプチド；ｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１４９】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１５０】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１５１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）Ｆｃポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）Ｆｃポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１５２】
ヌクレオチド配列が２つのシグナルペプチドをコードする場合、ある場合には、２つのシグナルペプチドは２つの異なるシグナルペプチドである。ヌクレオチド配列が２つのアフィニティタグポリペプチドをコードする場合、ある場合には、２つのアフィニティタグポリペプチドは同一である。ヌクレオチド配列が２つのアフィニティタグポリペプチドをコードする場合、ある場合には、２つのアフィニティタグポリペプチドは２つの異なるアフィニティタグポリペプチドである。
【０１５３】
７）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含み、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドアとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。
【０１５４】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｖ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｖｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５５】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１５６】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１５７】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｖｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）ＣＭＶプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１５８】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；及びｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）Ｆｃポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｖ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド；ｖｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉ）アフィニティタグポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【０１５９】
８）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｃ末端でアフィニティタグ付きのＥ１）とＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド（Ｎ末端でアフィニティタグ付きのＥ２）とを含むアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成するためのＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ-ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグポリタンパク質をコードする核酸
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含み、ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとを含む。そのように産生されたＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１６０】
ある場合には、本開示の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチドとｉｖ）アフィニティタグポリペプチドとｖ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６１】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｉｉ）アフィニティタグポリペプチド；ｉｖ）アフィニティタグポリペプチド；ｖ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は第１のアフィニティタグポリペプチドと第２のアフィニティタグポリペプチドとの間に挿入される。
【０１６２】
ある場合には、本開示の核酸は、５’から３’に順番に、機能可能な結合で、ａ）真核細胞にて機能的であるプロモーターと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）第１のシグナルペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド；ｉｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；ｉｖ）第１のアフィニティタグポリペプチド；ｖ）第２のシグナルペプチド；ｖｉ）第２のアフィニティタグポリペプチド；ｖｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカー；及びｖｉｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ある場合には、第１と第２のアフィニティタグポリペプチドは２つの異なるアフィニティタグポリペプチドである。ある場合には、第１と第２のシグナルペプチドは２つの異なるシグナルペプチドである。
【０１６３】
好適なシグナルペプチドには、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド；Ｉｇカッパ軽鎖前駆体シグナルペプチド；血清アルブミンプレプロタンパク質シグナルペプチド；免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド；アズロシジンプレプロタンパク質シグナルペプチド；シスタチン−Ｓ前駆体シグナルペプチド；トリプシノーゲン−２前駆体シグナルペプチド；キモトリプシノーゲン前駆体シグナルペプチド；等が挙げられる（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０  ７８３−７９５；Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１０（４）１１６４−１１７３）。好適なシグナルペプチドはシグナラーゼ切断部位を含むので、シグナルペプチドを含むポリタンパク質は細胞内プロセッシングの間に、シグナラーゼ切断部位にて切断される。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＱＥＩＨＡＲＦＲＲＧＡＲＳ（配列番号４２）を含む。ある場合には、好適なシグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ（配列番号６）を含む。
【０１６４】
ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの生成方法
本開示は、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの生成方法を提供する。本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖は任意の好適な方法、例えば、組換え法及び非組換え法（例えば、化学合成）を用いて生成することができる。本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖が組換え法によって生成される場合、２つのポリペプチド鎖は別々のホスト細胞または同一のホスト細胞にて生成することができる。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖は同一のホスト細胞にて生成される。
【０１６５】
本開示はアフィニティタグが付いていないＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの生成方法を提供する。方法には一般に、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成することと、アフィニティタグの固定結合相手において本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを固定することと、アフィニティタグとＨＣＶ  Ｅ１またはＥ２ポリペプチドとの間のリンカーを切断することと、それによってタグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを遊離することと、タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを回収することとが関与する。
【０１６６】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖が組換え法によって生成される場合、任意の好適なコンストラクトと原核細胞（例えば、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞）または真核細胞であることができる任意の好適なホスト細胞とを用いてポリペプチドは細胞内タンパク質または分泌されるタンパク質として生成されてもよい。好適な真核細胞には、例えば、酵母ホスト細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、糸状菌、及び植物細胞が挙げられる。好適な酵母細胞には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【０１６７】
好適な哺乳類細胞にはヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株等が挙げられる。好適な哺乳類細胞株には、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＭＲＣ５細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１７１）、等が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類ホスト細胞が使用される場合、そのようなホスト細胞には、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）；ＭＲＣ４細胞；及びハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が挙げられてもよい。
【０１６８】
当該技術で既知の標準の手順に従って、ポリペプチドの発現に好適な種々のホスト／ベクター系が採用されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９９９）Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｊａｍｅｓ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）”（２０１２）Ｊａｍｅｓ  Ｌ．Ｈａｒｔｌｅｙ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；及び“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２００５）Ｇｅｒｄ  Ｇｅｌｌｉｓｅｎ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨを参照のこと。核酸のホスト細胞への導入方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法等が挙げられる。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定な発現を提供するように導入の方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸を遺伝するエピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供することができ、またはゲノムに組み込むことができる。対象とするペプチドの生成で使用するための種々の適当なベクターが市販されている。
【０１６９】
好適な発現ベクターには、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルスに基づくウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくレンチウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＶＬ）に基づくガンマレトロウイルスベクター、等）、Ｐ１に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び対象とする特定のホスト（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、哺乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞）に特異的な任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、適当なＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びＥ２ポリペプチド（例えば、Ｅ１ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを適当なホスト細胞に導入することによって生成することができ、その際、ホスト細胞はコードされたポリペプチドを産生する。発現ベクターでは、適当なＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２ポリペプチド（Ｅ１ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含むポリヌクレオチドが適宜、調節配列に連結されて所望の発現特性を得る。これらの調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー及びインデューサーを挙げることができる。プロモーターは調節することができ、または構成的であることができる。発現ベクターは一般にプロモーター配列の近傍に位置する好都合な制限部位を有して対象とするタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現ホスト細胞にて作動する選択可能なマーカーが存在してもよい。
【０１７１】
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのポリペプチド（例えば、Ｅ１ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド）は、真核ホスト細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＭＲＣ５細胞のような哺乳類細胞、等）での発現に好適な組換え発現ベクターにコードされる。ある場合には、組換え発現ベクターは、Ｅ１及びＥ２のポリペプチド（その一方または双方がアフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである）を単一のポリペプチド鎖としてコードするヌクレオチド配列を含み；組換え発現ベクターは真核ホスト細胞に導入されて遺伝子改変ホスト細胞を形成する。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖は同一ホスト細胞にてまたは別々のホスト細胞にて単一のポリペプチド鎖として最初に産生される。本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーのポリペプチド（例えば、Ｅ１ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド；Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド）が同一ホスト細胞にて産生される場合、別々のＥ１及びＥ２のポリペプチド（その一方または双方がアフィニティタグを含む）が小胞体（ＥＲ）にてヘテロダイマー（例えば、非共有結合したヘテロダイマー）を形成することができる。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖が単一のポリペプチド鎖として最初に産生され、それが遺伝子改変ホスト細胞のＥＲにて切断されて別々のＥ１及びＥ２のポリペプチド（その一方または双方がアフィニティタグを含む）を生じる。別々のＥ１及びＥ２のポリペプチド（例えば、Ｅ１＋Ｅ２-アフィニティタグ；Ｅ２-アフィニティタグ＋Ｅ１；Ｅ１-アフィニティタグ＋Ｅ２-アフィニティタグ）はＥＲにてヘテロダイマー（例えば、非共有結合したヘテロダイマー）を形成することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を用いた溶解によって、または凍結融解法を用いてアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを遺伝子改変ホスト細胞から単離することができる。例えば、Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：６３６７を参照のこと。サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等、またはそのような方法の組み合わせを含む任意の種々の方法を用いてＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーを細胞ライセート及び／または細胞培養培地から精製することができる。ある場合には、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ（ＧＮＡ）レクチンアフィニティクロマトグラフィを用いてアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを細胞ライセート及び／または細胞培養培地から精製する。ある場合には、アフィニティタグがＩｇ  Ｆｃである場合、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは固定されたＦｃ結合部分を含むアフィニティカラムにて精製される。ある場合には、アフィニティタグがプロテインＡまたはプロテインＧポリペプチドである場合、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは固定されたプロテインＡまたはプロテインＧ結合部分を含むアフィニティカラムにて精製される。ある場合には、アフィニティタグがＩｇ軽鎖を含有するポリペプチドである場合、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは固定されたプロテインＬポリペプチドを含むアフィニティカラムにて精製される。ある場合には、アフィニティタグがＧＳＴポリペプチドである場合、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは固定されたＧＳＴ結合部分を含むアフィニティカラムにて精製される。ある場合には、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは細胞ライセートから精製される。ある場合には、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは細胞から分泌され、細胞培養培地から精製される。本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを精製するために使用することができる好適な方法は、例えば、米国特許第６，１２１，０２０号；米国特許第６，２７４，１４８号；及びＭａｚｚｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１１３２９に記載されている。例えば、ある場合には、アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、細胞の粉砕と微量濾過による細胞残渣の除去と、その後の３つの次のクロマトグラフィ工程：レクチンアフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィを用いた精製とを含む方法にて調製することができる。
【０１７２】
ホスト細胞（複数可）における産生の後、本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの２つのポリペプチド鎖（例えば、別々のポリペプチドとして、またはヘテロダイマーとして）はホスト細胞（複数可）から精製することができる。組換えで産生されたポリペプチドのホスト細胞からの精製方法は当該技術で既知であり、それには、例えば、界面活性剤溶解（例えば、非イオン性界面活性剤による）または凍結融解溶解、その後のサイズ排除クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等の１以上が挙げられる。
【０１７３】
タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成すること
ある場合には、タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー開示の生成方法は、ａ）遺伝子改変ホスト細胞（遺伝子改変ホスト細胞が本開示のアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー（例えば、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチド；ＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＥ１ポリペプチド；またはＨＣＶ  Ｅ１-アフィニティタグ融合ポリペプチドとＨＣＶ  Ｅ２-アフィニティタグ融合ポリペプチド）を産生する場合）のライセートを不溶性の支持体上に固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドに接触させ、その際、ライセートに存在するアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドに結合して固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを生成することと、ｂ）アフィニティタグとアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１及び／またはＥ２ポリペプチドとの間で切断する酵素に固定されたアフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを接触させ、それによってタグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを遊離し、遊離されたタグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを回収することとを含む。ある場合には、タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは１以上のさらなる精製工程に供される。
【０１７４】
アフィニティタグがＩｇ  Ｆｃポリペプチドである場合、好適なＩｇ  Ｆｃ結合部分には、プロテインＡ（Ｇｒａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５３９９）；プロテインＧ（Ｓｊｏｂｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３９９）及びプロテインＡ／Ｇ融合ポリペプチド（Ｅｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４３２３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
Ｉｇ  Ｆｃ結合部分は固体支持体に固定することができ、その際、固体支持体は、種々の形態、例えば、ビーズ、磁気ビーズ、プレート等のいずれかであることができる。固体支持体は、ポリスチレン、アガロース、ポリエステル、ポリエチレン等を含むが、これらに限定されない種々の物質のいずれかで作ることができる。
【０１７６】
タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは、タグなしのＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーが少なくとも６０％純粋、少なくとも６５％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋、または９９％を超えて純粋であるように精製することができる。
【０１７７】
ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー
本開示は、本開示の方法を用いて生成されるＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを提供する。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ２ポリペプチドのＮ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ２ポリペプチドのＣ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ１ポリペプチドのＮ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ１ポリペプチドのＣ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーは修飾されたＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及び修飾されたＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。
【０１７８】
Ｎ末端で異種アミノ酸を伴うＥ２
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ２ポリペプチドのＮ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む修飾Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１７９】
タンパク質分解切断可能なリンカーは上述のとおりである。上述のように前駆体ポリペプチドのタンパク質分解切断に続いて、修飾Ｅ２ポリペプチドが形成され、修飾Ｅ２ポリペプチドはそのＮ末端にてタンパク質分解切断可能なリンカーの中にあるプロテアーゼ切断部位に対してＣ末端側であるアミノ酸を含む。
【０１８０】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーがＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ；配列番号１）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙ−Ｐｒｏとｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１８１】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ；配列番号２）を含む場合、切断がグルタミンとセリンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｓｅｒとｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１８２】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号４３）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙとｂ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１８３】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ；配列番号５）を含む場合、切断がアルギニンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙ−ＳｅｒとＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１８４】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーが第Ｘａ因子切断部位（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲＸ、Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である；配列番号４４）を含む場合、切断がアルギニンとＸの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｘ（Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である）とＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１８５】
Ｎ末端で異種アミノ酸を伴うＥ１
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ１ポリペプチドのＮ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＣ末端側にある１から６の異種アミノ酸及びｉｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む修飾Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１８６】
タンパク質分解切断可能なリンカーは上述のとおりである。前駆体ポリペプチド（例えば、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＦｃポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｃ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む前駆体ポリペプチド）のタンパク質分解切断に続いて、修飾Ｅ１ポリペプチドが形成され、修飾Ｅ１ポリペプチドはそのＮ末端にてタンパク質分解切断可能なリンカーの中にあるプロテアーゼ切断部位に対してＣ末端側であるアミノ酸を含む。
【０１８７】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーがＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ；配列番号１）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙ−Ｐｒｏとｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１８８】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ；配列番号２）を含む場合、切断がグルタミンとセリンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｓｅｒとｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１８９】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号４３）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙとｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１９０】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ；配列番号５）を含む場合、切断がアルギニンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｇｌｙ−Ｓｅｒとｂ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１９１】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーが第Ｘａ因子切断部位（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲＸ、Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である；配列番号４４）を含む場合、切断がアルギニンとＸの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）Ｘ（Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である）とＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０１９２】
Ｃ末端で異種アミノ酸を伴うＥ２
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ２ポリペプチドのＣ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチド及びｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸を含む修飾Ｅ２ポリペプチドとを含む。
【０１９３】
タンパク質分解切断可能なリンカーは上述のとおりである。前駆体ポリペプチド（例えば、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｃ）ＦｃポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとを含む前駆体ポリペプチド）のタンパク質分解切断に続いて、修飾Ｅ２ポリペプチドが形成され、修飾Ｅ２ポリペプチドはそのＣ末端にてタンパク質分解切断可能なリンカーの中にあるプロテアーゼ切断部位に対してＮ末端側であるアミノ酸を含む。
【０１９４】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーがＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ；配列番号１）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）ＬＥＶＬＦＱ（配列番号７）とを含む。
【０１９５】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ；配列番号３）を含む場合、切断がＬｙｓに対してＣ末端で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）ＤＤＤＤＫ（配列番号３）とを含む。
【０１９６】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号４３）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）ＥＮＬＹＦＱ（配列番号８）とを含む。
【０１９７】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ；配列番号５）を含む場合、切断がアルギニンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）ＬＶＰＲ（配列番号４）とを含む。
【０１９８】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーが第Ｘａ因子切断部位（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲＸ、Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である；配列番号４４）を含む場合、切断がアルギニンとＸの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ２ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとｂ）Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）とを含む。
【０１９９】
Ｃ末端で異種アミノ酸を伴うＥ１
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーはＥ１ポリペプチドのＣ末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する１から６のアミノ酸を伴う修飾されたＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはａ）ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に順番に、ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチド及びｉｉ）タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のＮ末端側にある１から６の異種アミノ酸を含む修飾Ｅ１ポリペプチドとを含む。
【０２００】
タンパク質分解切断可能なリンカーは上述のとおりである。前駆体ポリペプチド（例えば、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｂ）タンパク質分解切断可能なリンカーとｃ）ＦｃポリペプチドまたはＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとを含む前駆体ポリペプチド）のタンパク質分解切断に続いて、修飾Ｅ１ポリペプチドが形成され、修飾Ｅ１ポリペプチドはそのＣ末端にてタンパク質分解切断可能なリンカーの中にあるプロテアーゼ切断部位に対してＮ末端側であるアミノ酸を含む。
【０２０１】
例えば、タンパク質分解切断可能なリンカーがＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ；配列番号１）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｂ）ＬＥＶＬＦＱ（配列番号７）とを含む。
【０２０２】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ；配列番号３）を含む場合、切断がＬｙｓに対してＣ末端で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｂ）ＤＤＤＤＫ（配列番号３）とを含む。
【０２０３】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号４３）を含む場合、切断がグルタミンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｂ）ＥＮＬＹＦＱ（配列番号８）とを含む。
【０２０４】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーがトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ；配列番号５）を含む場合、切断がアルギニンとグリシンの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとｂ）ＬＶＰＲ（配列番号４）とを含む。
【０２０５】
別の例として、タンパク質分解切断可能なリンカーが第Ｘａ因子切断部位（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲＸ、Ｘはアルギニンまたはプロリンを除く任意のアミノ酸である；配列番号４４）を含む場合、切断がアルギニンとＸの間で起きれば、本開示のヘテロダイマーポリペプチドに存在する修飾Ｅ１ポリペプチドはＮ末端からＣ末端に順番に、ａ）ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドとＩ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号４５）とを含む。
【０２０６】
医薬製剤
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーポリペプチドは薬学的に許容される賦形剤（複数可）と共に製剤化されて免疫原性組成物を形成することができる。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術で知られており、本明細書で詳細に述べる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．を含む種々の出版物で十分に記載されている。
【０２０７】
ある場合には、本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドは水性緩衝液にて製剤化される。好適な水性緩衝液には、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で変化する酢酸、コハク酸、クエン酸及びリン酸の緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、水性緩衝液には等張溶液を提供する試薬が含まれる。そのような試薬には、塩化ナトリウム、及び糖、例えば、マンニトール、デキストロース、スクロース等が挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、水性緩衝液にはさらに、例えば、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）またはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）のような非イオン性界面活性剤が含まれる。例えば、水性緩衝液におけるＥ１ポリペプチド及び変異Ｅ２ポリペプチドの製剤は、例えば、約０．０１〜約０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）非イオン性界面活性剤を含むことができる。任意で製剤はさらに保存剤を含んでもよい。好適な保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合では、製剤は約４℃で保存される。製剤はまた凍結乾燥されてもよく、その場合、それらは一般に、例えば、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトール等のような凍結保護剤を含む。凍結乾燥された製剤は常温でさえも長期間にわたって保存することができる。ある場合には、水性緩衝液はさらに非イオン性界面活性剤を含む。ある場合には、水性緩衝液には非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、例えば、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００が含まれる。
【０２０８】
本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドは、水性溶媒または、例えば、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルもしくはプロピレングリコールのような非水性溶媒にて；且つ所望であれば、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び保存剤のような従来の添加剤と共にヘテロダイマーを溶解し、懸濁し、または乳化することによって注射用製剤に製剤化することができる。
【０２０９】
本開示の免疫原性組成物は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カーボネート等を含むことができる。組成物は、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のような生理的条件を近似するのに必要とされるような薬学的に許容される補助的な物質を含有してもよい。
【０２１０】
製剤における本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドの濃度は広く変化することができ（重量で約０．１％未満〜少なくとも約２％、２０％〜５０％以上まで多く）、液量、粘性、選択される投与の特定の様式及び患者のニーズに従った患者に基づく因子に主として基づいて選択することができる。
【０２１１】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーポリペプチドを含有する製剤は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアロゾル等の形態で提供することができる。経口投与は消化からの組成物の保護を必要とし得ることが認識される。このことは通常、酸性加水分解及び酵素加水分解に耐性にする作用剤との組成物の会合によって、または適宜耐性であるキャリアに組成物をパッケージすることによって達成される。消化から保護する手段は当該技術で周知である。
【０２１２】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーポリペプチドポリペプチドを含有する製剤はまた、投与に続くヘテロダイマーの血清半減期を向上させるために提供され得る。例えば、本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドが注射用に製剤化される場合、ヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドはリポソーム製剤で提供されてもよく、コロイドとしてまたは血清半減期を延長する他の従来の技法で調製されてもよい。例えば、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号及び同第４，８３７，０２８号に記載されているようにリポソームを調製するには種々の方法が利用可能である。製剤は制御放出または徐放性の形態で提供されてもよい。
【０２１３】
アジュバント
本開示の免疫原性組成物は、本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドに加えてアジュバントを含むことができる。ヒトで使用することができる既知の好適なアジュバントの例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（商標）、０．５％ｗ／ｖのＳｐａｎ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていない）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、インターロイキン等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。実験動物については、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ｄｉｐ−アルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及び細菌から抽出された３つの成分を含有するＲＩＢＩ、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸及び２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中の細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を使用することができる。別の好適なアジュバントはＡＳ０１、３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含むリポソームの懸濁液及びＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ２１（ＱＳ２１）である。ある場合には、アジュバントはＭＦ５９、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ミョウバン、水酸化アルミニウム、及びリン酸アルミニウムから選択される。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原またはその抗原エピトープに対して向けられた抗体の量を測定すること、抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球の応答を測定すること、及び抗原に対するヘルパーＴ細胞の応答を測定することの１以上によって判定されてもよい。
【０２１４】
組成物の有効性を高めるためのさらなる例となるアジュバントには、（１）水中油エマルション製剤（ムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤の有無にかかわらず）、例えば、ａ）マイクロ流動化剤を用いてサブミクロン粒子に製剤化された５％スクアレンと０．５％Ｔｗｅｅｎ８０と０．５％Ｓｐａｎ８５（任意でＭＴＰ−ＰＥを含有する）を含有するＭＦ５９ＴＭ（例えば、ＷＯ９０／１４８３７を参照のこと）、ｂ）サブミクロンのエマルションにマイクロ流動化した、またはボルテックスで撹拌してさらに大きな粒度のエマルションを形成した１０％スクアレンと０．４％Ｔｗｅｅｎ８０と５％プロニックでブロックしたポリマーＬ１２１とｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、及びｃ）２％スクアレンと０．２％Ｔｗｅｅｎ８０とモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）のような１以上の細菌細胞壁成分とを含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、例えば、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ  ＴＭ）；（２）サポニンアジュバント、例えば、使用されてもよいＱＳ２１  またはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）または追加の界面活性剤を欠いてもよいＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれから形成される粒子、例えば、ＷＯ００／０７６２１；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）、等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等；（５）肺炎球菌サッカリドと共に使用する場合任意でミョウバンの実質的非存在下での、例えば、ＷＯ００／５６３５８でのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）３ｄＭＰＬの、例えば、ＱＳ２１及び／または水中油エマルションとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１を参照のこと）；（７）シトシンがメチル化されていない少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有するＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９及びＷＯ９８／５２５８１を参照のこと）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照のこと）；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、または例えば、オクトキシノールのような少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエス���ル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニンと免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫刺激剤と金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照のこと）；（１２）サポニンと水中油エマルション（例えば、ＷＯ９９／１１２４１を参照のこと）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意でステロールを含む）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９を参照のこと）；（１４）組成物の有効性を高めるように免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン  ＭＴＰ−ＰＥ）、等が挙げられる。使用に好適なのはまたＭａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）であり；Ｍａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）は、Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンとコレステロールとリン脂質を含む４０ｎｍのナノ粒子を含むアジュバントである。ヒトへの投与に好適なアジュバントには特に関心がある。ある場合には、アジュバントは免疫原へのＣＤ４＋Ｔヘルパーの応答を高めるものである。
【０２１５】
ある場合では、アジュバントはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有無にかかわらずＭＦ５９である。他の場合では、アジュバントはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有無にかかわらずミョウバンである。他の場合では、アジュバントはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有無にかかわらずポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である。他の場合では、アジュバントはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有無にかかわらずＭＰＬである。ある場合には、アジュバントはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有無にかかわらずＭａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）である。ある場合には、アジュバントはキーホールリンペットヘモシアニンである。ある場合では、アジュバントは、ＡＳ０１、３’−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ２１（ＱＳ２１）を含むリポソームの懸濁液である、ＡＳ０１である。ある場合には、アジュバントはＭＰＬ＋ミョウバンである。
【０２１６】
ＨＣＶに対する免疫応答の誘導方法
本開示は、哺乳類対象において少なくとも１つのＨＣＶ遺伝子型に対する免疫応答（例えば、防御的免疫応答）を誘導する方法を提供する。ある場合には、方法は、それを必要とする個体に有効量の本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドまたは本開示のヘテロダイマーＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ポリペプチドを含む組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与することを含む。他の場合では、方法は、それを必要とする個体に有効量の本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）（例えば、組換え発現ベクター）を投与することを含む。
【０２１７】
本開示のＨＣＶ免疫原性組成物、または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）は一般に、疾患またはその合併症の発症を防ぐまたは少なくとも部分的に停止させるために、ＨＣＶ感染を有するまたはＨＣＶに感染するリスクがある（例えば、一般の集団よりもＨＣＶに感染する高いリスクがある）ヒト対象に投与される。これを達成するのに適する量を「治療上有用な用量」または「治療上有効な量」として定義する。主題の免疫原性組成物の「予防上」の使用は、一般に、ＨＣＶに感染していない個体への投与を指す。主題の免疫原性組成物の「治療上」の使用は「予防上」の使用（ＨＣＶに感染していない個体への投与）及び／またはＨＣＶ感染を有する個体への投与を指すことができる。本開示の免疫原性組成物の「治療上有効な量」は、ＨＣＶに感染していない個体に１以上の用量で投与した場合、個体にてＨＣＶに対する免疫応答を誘導するのに有効である量であることができる。本開示の免疫原性組成物の「治療上有効な量」は、ＨＣＶに感染している個体に１以上の用量で投与した場合、個体にてＨＣＶに対する免疫応答を高めるのに有効である量であることができる。
【０２１８】
治療上の使用で有効な量は、例えば、免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）、投与の方法、患者の体重及び一般的な健康状態、及び主治医の判断に左右されるであろう。主題の免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の単回用量または複数回用量は、患者によって必要とされ且つ忍容される投与量や頻度、及び投与の経路に応じて投与することができる。
【０２１９】
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、個体にてＨＣＶに対する抗体反応（例えば、中和抗体反応）を誘導するのに有効である量である。例えば、ＨＣＶ（例えば、細胞外ＨＣＶ）に対する抗体、及び／またはＨＣＶ感染細胞に対する抗体を誘導することができる。
【０２２０】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量は、１以上の用量で個体に投与される場合、種々の遺伝子型（例えば、遺伝子型１；遺伝子型３等）のＨＣＶに対する中和抗体反応を誘導するのに有効である量であることができる。中和抗体反応はＨＣＶに対する１以上のホスト受容体へのＨＣＶの結合を低下させ、細胞へのＨＣＶの侵入を阻害する。
【０２２１】
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、ＨＣＶに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を誘導するのに有効である量である。例えば、ＨＣＶ感染細胞に対するＣＴＬ応答を誘導することができる。
【０２２２】
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、個体におけるＨＣＶに対するヘルパーＴリンパ球（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を誘導するのに有効である量である。
【０２２３】
ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、ＨＣＶの遺伝子型１に対する抗体反応（例えば、中和抗体反応）及び／またはＣＴＬの応答及び／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導するのに有効である量である。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、ＨＣＶの遺伝子型３に対する抗体反応（例えば、中和抗体反応）及び／またはＣＴＬの応答及び／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導するのに有効である量である。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、ＨＣＶの遺伝子型１及びＨＣＶの遺伝子型３に対する抗体反応（例えば、中和抗体反応）及び／またはＣＴＬの応答及び／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導するのに有効である量である。ある場合には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）の有効量（例えば、治療上有効な量）は、１以上の用量で個体に投与される場合、任意の遺伝子型のＨＣＶに対する抗体反応（例えば、中和抗体反応）及び／またはＣＴＬの応答及び／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導するのに有効である量である。
【０２２４】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）は一般に、哺乳類対象にて免疫応答、例えば、液性免疫応答（例えば、抗体反応）及び／またはＣＴＬの応答を引き出すのに有効な量で投与される。免疫付与のための有効量は変化するであろうし、一般に７０ｋｇの患者当たり約１μｇ〜１００μｇ、例えば、約５μｇ／７０ｋｇ〜約５０μｇ／７０ｋｇに及ぶことができる。経口、経鼻または局所の投与経路には実質的に高い用量（例えば、１０ｍｇ〜１００ｍｇ以上）が好適であってもよい。当初の投与には、同一のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または異なるＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物の追加免疫が続くことができる。ある場合では、免疫応答を誘導する主題の方法には、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物の当初の投与とそれに続く少なくとも１回の追加免疫が関与し、ある場合では、２回以上（例えば、３、４または５回の）追加免疫が関与する。当初の投与と追加免疫の間または所与の追加免疫とそれに続く追加免疫の間の間隔は、約１週間〜約１２週間、例えば、約１週間〜約２週間、約２週間〜約４週間、約４週間〜約６週間、約６週間〜約８週間、約８週間〜約１０週間、または約１０週間〜約１２週間であることができる。
【０２２５】
一般に、免疫付与は、経口、経鼻、鼻咽頭、非経口、経腸、経胃、局所、経皮、皮下、筋肉内での組成物の投与を含む任意の好適な経路によって、添加される賦形剤の有無にかかわりなく錠剤、固形物、粉末化形態、液体、エアロゾル形態で局所にまたは全身性に、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物または本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）を投与することによって達成することができる。非経口で投与できる組成物を調製する実際の方法は、当業者に既知であろうし、または明らかであろうが、それらはＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）のような出版物にてさらに詳細に記載されている。ある場合では、免疫付与は、本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物の筋肉内注射によって達成される。
【０２２６】
ある場合には、個体にてＨＣＶに対する免疫応答を誘導するための本開示の方法は、有効量の本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）を個体に投与することを含む。ある場合には、核酸は発現ベクターに存在する。好適な発現ベクターには、複製欠損のアデノウイルスベクター、複製欠損のワクシニアウイルスベクター；レンチウイルスベクター（例えば、自己不活化レンチウイルスベクター）；レトロウイルスベクター（例えば、自己不活化レトロウイルスベクター）；アデノ関連ウイルスベクター；等が挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、ベクターは修飾されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ベクターまたはＭＶＡに基づくベクター（例えば、Ｖｅｒｈｅｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２６２３を参照のこと）である。
【０２２７】
ある場合には、個体にてＨＣＶに対する免疫応答を誘導するための本開示の方法は、有効量の本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）を個体に投与することを含む。ある場合には、核酸は本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。例えば、Ｗｅｉｎｅｒ（２０１３）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１：５０６；及びＵｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４４１４を参照のこと。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（例えば、単一のｍＲＮＡ分子、または２つのｍＲＮＡ分子）はリポソームで製剤化される。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（例えば、単一のｍＲＮＡ分子、または２つのｍＲＮＡ分子）はプロタミンと共に複合体化される。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（例えば、単一のｍＲＮＡ分子、または２つのｍＲＮＡ分子）は１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ）と共に複合体化される。
【０２２８】
投与に好適な個体
本開示のＨＣＶ組成物による投与に好適である個体には免疫学的にナイーブな個体（例えば、ＨＣＶに感染したことがない及び／またはＨＣＶワクチンの投与を受けたことがない個体）が挙げられる。
【０２２９】
本開示のＨＣＶ組成物による投与に好適である個体には、一般集団よりもＨＣＶに感染するリスクが高い個体が挙げられ、その際、そのような個体には、例えば、静注薬物使用者；別の（ドナー）個体からの血液または血液製剤のレシピエントまたは予想されるレシピエントである個体；別の（ドナー）個体からの非自己の細胞、組織または臓器のレシピエントまたは予想されるレシピエントである個体；医療従事者；救急の医療及び非医療の職員（例えば、第一対応者、消防士、救急医療チームの職員等）等が挙げられる。
【０２３０】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物による投与に好適である個体には、最近ＨＣＶにさらされたまたは最近ＨＣＶに感染した個体が挙げられる。例えば、主題の免疫原性組成物は、考えられるもしくは疑われるＨＣＶへの曝露に続いて、またはＨＣＶの感染に続いて約２４時間〜約４８時間以内に、約４８時間〜約１週間以内に、または約１週間〜約４週間以内に個体に投与することができる。
【０２３１】
本開示のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２免疫原性組成物による投与に好適である個体にはＨＣＶ感染を有すると診断されている個体が挙げられ、慢性的に感染した個体が挙げられる。ある場合には、ＨＣＶ感染を有すると診断されている個体は抗ウイルス剤及び主題のＨＣＶ免疫原性組成物によって治療される。ＨＣＶ感染を治療するのに好適な抗ウイルス剤には、例えば、リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）；インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）（その際「ＩＦＮ−α」にはＩＦＮ−α２ａ；ＩＦＮ−α２ｂ；ポリ（エチレングリコール）と結合しているＩＦＮ−α（ペグ化ＩＦＮ−α）が含まれ、ペグ化ＩＦＮ−αはペグ化ＩＦＮ−α２ａまたはペグ化ＩＦＮ−α２ｂであることができる）；ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（例えば、ボセプレビル；テラプレビル）；及びＨＣＶ  ＮＳ５プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。ある場合には、ＨＣＶ感染を有すると診断されている個体は、例えば、１）ＩＦＮ−α＋リバビリン；及び主題のＨＣＶ免疫原性組成物；または２）ＩＦＮ−α＋リバビリン＋ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤（例えば、ボセプレビルまたはテラプレビル）；及び主題のＨＣＶ免疫原性組成物によって治療される。ＨＣＶ感染を治療するのに好適な抗ウイルス剤には、単独でのまたはペグ化ＩＦＮ−α及びリバビリンとの併用でのソバルディ（ソフォスブビル；ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤として機能するヌクレオチド類似体）が挙げられる。ＨＣＶ感染を治療するのに好適な抗ウイルス剤にはソバルディが挙げられる。ＨＣＶ感染を治療するのに好適な抗ウイルス剤には、Ｈａｒｖｏｎｉ（登録商標）（レジパスビル９０ｍｇ＋ソフォスブビル４００ｍｇ）が挙げられる。レジパスビルはＨＣＶ  ＮＳ５Ａの阻害剤である。Ｈａｒｖｏｎｉ（登録商標）はリバビリンの有無にかかわらず投与することができる。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定するようには意図されないし、以下の実験は実施された実験のすべてまたは実施された実験のみであることを表すようには意図されない。使用された数（例えば、量、温度等）に関して精度を確保するように努力してきたが、一部の実験的な誤差及び偏差は説明されるべきである。指示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、圧は大気圧またはほぼ大気圧である。標準的な略記、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内で（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内で（に）；ｓ．ｃ．、皮下で（に）等が使用されてもよい。
【０２３３】
実施例１：アフィニティタグ付きＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの生成、及びタグなしＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの生成と性状分析
図６Ａ．完全長Ｅ１Ｅ２ポリペプチドのコンストラクトにおけるＥ２のＮ末端へのＦｃタグ挿入の模式図
Ｅ１Ｅ２ポリペプチドはＣＭＶプロモーター（ＰＣＭＶ）の制御下で発現させ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）に由来するシグナル配列を含める。代表的なＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２配列：Ｈ７７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿６７１９４１）、ＪＦＨ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＯ４７６３９；遺伝子型２Ａ）、Ｓ５２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＤＦ９７２３２．１；遺伝子型３ａ）、及び分離株ＱＣ６９（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＮ０５２２６．１；遺伝子型７Ａ）について挿入部位を示す。ポリペプチド領域のサイズは上に示す（ａａ＝アミノ酸）。Ｅ２のＮ末端にて、特定の遺伝子型に対してそれぞれ２つ組のＥ２のＮ末端アミノ酸が挿入され（例えば、Ｈ７７についてＥＴの付加；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿６７１９４１）、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｆｃ）及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＰＰ）認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）がそれに続く。遺伝子型及びＥ１Ｅ２の具体的な分離株に応じて、Ｅ２の最初の２つのアミノ酸の２つ組が、シグナルペプチダーゼ（ＳＰ）によるプロセッシングに続いてＥ２のＮ末端で作り出される望ましくないアミノ酸を生じてもよい（図６Ａ）。アミノ末端でのそのようなアミノ酸にはアスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）またはシステイン（Ｃ）が挙げられる。そのようなアミノ酸はＮ末端則経路を介してプロテアソームが介在する分解についてタンパク質を標的とすることができる（Ｔａｓａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１  ２６１−２８９にて概説された）。この場合、特定の遺伝子型についてのコンセンサス配列のいずれかに従って代替のアミノ酸が選択されてもよく、または特定の遺伝子型のサブクラスが選択される。ポリペプチドの発現に続いて、シグナルペプチダーゼ（ＳＰ）の切断は示されている下流のＥ１及びＥ２のポリペプチドを生じる。Ｅ１及びＥ２のポリペプチドは相互作用してヘテロダイマーを形成する。精製目的では、Ｆｃタグ付きのＥ１Ｅ２がプロテインＡまたはプロテインＧの樹脂に固定され、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＰＰ）によって消化されて（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）配列におけるＱとＧの間での切断）タグなしのＥ１Ｅ２ヘテロダイマーを遊離する。
【０２３４】
図６Ｂ．Ｆｃタグ付きのＥ１Ｅ２  Ｈ７７を発現しているＣＨＯ細胞抽出物からのＥ１Ｅ２ヘテロダイマーの精製
（Ａ）にて略図に表したようなＦｃタグ付きのＥ１Ｅ２  Ｈ７７コンストラクトを発現しているＣＨＯ細胞の抽出物をプロテインＧセファロース４ファストフローに固定し、ＧＳＴ−ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＳＴ−ＰＰ）で消化してＦｃタグを外した。ＧＳＴ−ＰＰによる消化及びタグなしＥ１Ｅ２の遊離に続いて、グルタチオンセファロース４ＢによってＧＳＴ−ＰＰを取り除いた。次いでタグなしＥ１Ｅ２タンパク質濃縮物をＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイト（（Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ）２）Ｉ型（ＨＡＰ）カラムに適用した。最終的なＥ１Ｅ２ヘテロダイマーを含有するＨＡＰ通過分画を回収し、試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルに負荷した。電気泳動の後、ゲルを染色した、またはブロットし次いで抗体によって探査した。（１）抗Ｅ１（Ａ４）及び抗Ｅ２（Ｈ５２）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるウエスタンブロット（レーン当たり０．５μｇ負荷した）。（２）コロイド状クマシーブリリアントブルーＧ２５０染色したゲル（レーン当たり２μｇ負荷した）。
【０２３５】
図７．Ｈ７７及びＡｌｂｅｒｔａ分離株Ａｖｉ１ａ１２９（遺伝子型１Ａ）についてのＦｃタグ付きのＥ１Ｅ２ポリペプチドの配列比較。Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアｖ５．６.４を用いてＡｌｂｅｒｔａ分離株（Ａｖｉ１ａ１２９）及びＨ７７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿６７１９４１）についてのｔＰａ−Ｅ１−Ｆｃ−ＰＰ−Ｅ２コンストラクト（図６Ａにて略図で表した）のコーディング領域のアミノ酸配列を並べた。矢印は、Ｆｃ−ＰＰタグに先行する２つ組Ｎ末端Ｅ２残基（Ａｖｉ１ａ１２９：ＱＴ及びＨ７７：ＥＴ）の挿入を示す。
【０２３６】
図８．Ｓ５２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＤＦ９７２３２．１）及びＡｌｂｅｒｔａ分離株Ａｖｉ３ａ１７７（遺伝子型３Ａ）についてのＦｃタグ付きのＥ１Ｅ２ポリペプチドの配列比較。Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアｖ５．６.４を用いてＡｌｂｅｒｔａ分離株（Ａｖｉ３ａ１７７）及びＳ５２についてのｔＰａ−Ｅ１−Ｆｃ−ＰＰ−Ｅ２コンストラクト（図６Ａにて略図で表した）のコーディング領域のアミノ酸配列を並べた。矢印は、Ｆｃ−ＰＰタグに先行する２つ組Ｎ末端Ｅ２残基（Ａｖｉ３ａ１７７及びＳ５２双方についてＥＴ）の挿入を示す。
【０２３７】
図９．組換えＥ１Ｅ２抗原へのＨＣＶ中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合。組換えＥ１Ｅ２（Ｈ７７）抗原は、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓアガロース（ＧＮＡアガロース）（タグなしＥ１Ｅ２：ピンク色で塗りつぶした丸）またはプロテインＧセファロース（その後Ｆｃタグを除去するＦｃタグ付きＥ１Ｅ２：白抜きの紫色の丸）によって精製した。Ｅ１Ｅ２抗原の適正な折り畳みを決定するために、ＨＣＶの感染性を中和するように構築したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって調べた。組換えＥ１Ｅ２抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、Ｅ１（ＩＧＨ５２６）、Ｅ２（ＡＰ３３、ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６、１：７、ＡＲ３Ｂ）またはＥ１Ｅ２（ＡＲ４Ａ、ＡＲ５Ａ）に向けられた漸増量の８種の異なる中和ＨＣＶ  ｍＡｂを使用した。クローンＢ６（ヒトＩｇＧ１）及びマウスＩｇＧ１を陰性対照として使用した。結果は、双方の方法によって単離されたＥ１Ｅ２抗原が調べたｍＡｂのパネルに対して同等の親和性を示すことを示している。
【０２３８】
実施例２：アフィニティタグに由来するＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーの性状分析
材料及び方法
細胞培養及び抗体
遺伝子型１ａ  Ｈ７７ｃ株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００９６０６）に由来する組換えＥ１Ｅ２コンストラクトを安定して発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と０．１ｍＭ／０．０１６ｍＭのヒポキサンチンナトリウム／チミジン（ＨＴサプリメント；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と０．００２ｍＭのメソトレキセートと１００単位／ｍＬのペニシリンと１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とを含有するＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて増殖させた。Ｈｕｈ−７．５細胞は、１０％熱非働化ウシ胎児血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）と０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とペニシリンとストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて増殖させた。ｍＡｂマウス抗分化抗原群８１（ＣＤ８１）クローンＪＳ−８１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、抗ＨＣＶｍＡｂ（ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６、ＡＲ３Ｂ、ＡＲ４Ａ及びＡＲ５Ａ）及びヒト抗ＨＩＶ抗体Ｂ６は記載されている。
【０２３９】
組換えＥ１Ｅ２抗原の発現及び精製
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のシグナルペプチド配列が先行する、Ｈ７７ｃ（遺伝子型１ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ００９６０６；アミノ酸１９２−７４６）に由来するＥ１Ｅ２糖タンパク質のコーディング領域を、ＩＲＥＳ−ＡｃＧＦＰレポーターを持つｐＴＲＩＰレンチウイルスベクターのＳｐｅＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入した。Ｆｃタグ付きのＥ１Ｅ２コンストラクトについては、２つ組のアミノ酸３８４〜３８５（ＥＴ）がＥ２のＮ末端に挿入され、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（２２７アミノ酸）とＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ／ヒトのライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ（ＨＲＶ３Ｃ）配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）がそれに続いた（図１１Ａ）。以前の方法（Ｓｃｈｏｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４８１）に従ってレンチウイルス粒子をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にて形成し、パッケージしたレンチウイルスでＣＨＯ細胞に形質導入した。ＷＴのまたはＦｃタグ付きの組換えＥ１Ｅ２を発現しているＧＦＰ陽性のＣＨＯ細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別し、次いで２５０ｍｌの振盪器フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）にて６％ＦＢＳを伴ったＰＲＯＣＨＯ４培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）にて浮遊適合させ、３Ｌのスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）にて増殖させた。
【０２４０】
以前の研究（Ｒａｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６７５３）に従ってＧＮＡ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＨＯ細胞抽出物から組換えＷＴ  Ｅ１Ｅ２を精製した。ＧＮＡ溶出分画をヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ；１５８−８０００）に負荷し、５０，０００の分子量カットオフ遠心フィルターユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で通過分画を濃縮した。Ｆｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２については、ＣＨＯ細胞抽出物をプロテインＧセファロース４ファストフロー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に適用し、１０ｍＭのリン酸ナトリウムと８０ｍＭのＮａＣｌと０．１％ＴＸ−１００、ｐＨ６．８とで洗浄し、樹脂をＨｉｓ６−ＧＳＴ−ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４℃にて一晩消化した。消化した物質をグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用してプロテアーゼを取り除き、通過分画をＷＴ  Ｅ１Ｅ２について記載されているように最終濃度でＨＡＰに適用した。
【０２４１】
マウスの免疫付与及び血清試料
ワクチン接種実験に使用したメスＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）（５〜７週齢）はカナダ動物管理指針評議会に従って飼育した。実験方法はＡｌｂｅｒｔａ大学保健科学、動物福祉委員会によって検閲され、認可された。組換えＥ１Ｅ２  Ｈ７７抗原（２μｇ）を１：１の比で７５μｇのミョウバン及び７．５μｇのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ  Ｖａｃｃｉｇｒａｄｅ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合した（３０μＬの最終注射容量）。０、１４及び２８日目に筋肉内でマウスに注射した。ワクチン接種前の血清を０日目に採取し、ワクチン接種後の血清（最終採血）を４２日目に得た。５０００ｇで１５分間の試料の遠心分離の後、血清を回収した。５６℃で３０分間インキュベートすることによって血清を熱非働化し、使用まで−８０℃にてアリコートで保存した。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡ
（ｉ）Ｅ１Ｅ２のＥＬＩＳＡ：炭酸緩衝液（１５ｍＭの炭酸ナトリウム、３５ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）（ＰＢＳＴ）中のＥ１Ｅ２抗原（１００ｎｇ／ウェル）でマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を４℃にて一晩コーティングした。０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄し、ＰＢＳＴ中の４％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で１時間ブロックした。Ｅ２に特異的なｍＡｂ（ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６、及びＡＲ３Ｂ）（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：２５；Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７：３７；及びＫｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ８：ｅ１００２６５３）、Ｅ１Ｅ２に特異的なｍＡｂ（ＡＲ４Ａ及びＡＲ５Ａ）（１５）、または対照（Ｂ６）（１６）ｍＡｂ（５０μＬ／ウェル）を１時間加え、抗ヒトアルカリホスファターゼを結合した二次抗体（１：１０，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）とリン酸ｐ−ニトロフェニル（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）基質によって検出した。Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて吸光度（４０５〜４９５ｎｍ）を読み取った。
【０２４３】
（ｉｉ）Ｅ２のＥＬＩＳＡ：Ｅ２（アミノ酸３８４〜６６１）ＨＣＶ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ６２３２１．１）でマイクロタイタープレートをコーティングし、Ｅ１Ｅ２のＥＬＩＳＡで記載されたように４％のウシ血清アルブミンでブロックした。ワクチン接種したマウスの抗血清（最終の採血）をＰＢＳＴで希釈し、プレートに１時間加えた（５０μＬ／ウェル）。マウス抗血清に由来するＥ２に特異的な抗体は、西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウス二次抗体（１：１０，０００；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）とペルオキシダーゼの基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ，ＵＳＡ）によって検出した。吸光度は４５０〜５７０ｎｍで読み取った。３つの独立した実験に由来する吸光度の値は平均値±ＳＥＭとして表す。
【０２４４】
（ｉｉｉ）競合ＥＬＩＳＡ：以前記載された方法（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８：１４２７８）に従ってＥ１Ｅ２の結合に対する構造特異的なＥ２  ｍＡｂとの競合についてマウスの抗血清（最終の採血）を評価した。手短には、炭酸緩衝液中のＧＮＡ精製したＷＴ  Ｅ１Ｅ２  Ｈ７７ｃでマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を４℃にて一晩コーティングし、ＰＢＳＴ中１％のカゼイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロックした。Ｅ１Ｅ２コーティングしたウェルで希釈したマウス抗血清を１時間インキュベートした。普通７０％の最大結合を生じる濃度でＨＣＶ特異的なｍＡｂ（ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６、ＡＲ３Ｂ、ＡＲ４Ａ及びＡＲ５Ａ）及び対照ｍＡｂ（Ｂ６抗ＨＩＶ）を加えた。ＨＣＶ特異的なｍＡｂの結合を抗ヒトアルカリホスファターゼ結合二次抗体（１：１０，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とリン酸ｐ−ニトロフェニル（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）基質によって検出した。吸光度は４０５〜４９５ｎｍで読み取った。値は、抗血清の非存在下で結合したｍＡｂに対するｍＡｂの結合のパーセンテージとして算出した。データは３回の独立した実験の平均値±平均値の標準誤差としてプロットした。
【０２４５】
ＨＣＶ偽型ウイルス（ＨＣＶｐｐ）の産生及び中和アッセイ
以前記載された（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：７２７１）ように、ルシフェラーゼレポーターを発現しているＨＣＶｐｐを形成した。中和アッセイについては、ポリリシンをコーティングした９６穴プレートにヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７．５）を感染の１日前に入れた。ＨＣＶｐｐは１：１０に希釈し、熱非働化した希釈血清と３７℃で１時間予め混合し、その後Ｈｕｈ７．５細胞に加えた。感染の６時間後に、抗体／ウイルスの植菌を新しい培養培地で置き換えた。Ｂｒｉｇｈｔ−ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて感染後４８時間に細胞を処理した。Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光を測定した。中和活性は以下の式を用いて算出したが：中和％＝（ｐｒｅ−ｐｏｓｔ）／ｐｒｅ×１００、式中ｐｒｅ／ｐｏｓｔはワクチン接種前（ｐｒｅ−）またはワクチン接種後（ｐｏｓｔ−）血清のいずれかでインキュベートした後、与えられたルシフェラーゼ活性を表す。ＩＤ５０の力価については、１：２５〜１：１６００の血清の２倍希釈を調べた。力価はウイルスの５０％を中和するように算出された希釈の逆数として表される。調べた最高濃度（１：２５）で５０％中和が達成されなかったら、その時は次に最高の濃度（すなわち、１：１２．５）を試料に割り当てた。同様に、調べた最低希釈（１：１６００）が＞５０％中和を生じたら、我々は次の希釈（すなわち、１：３２００）をこの試料に割り当てた。
【０２４６】
結果
結果は図１１〜１４に描かれている。
【０２４７】
Ｆｃタグ付きの前駆体からのＥ１Ｅ２の精製
Ｅ１Ｅ２の発現に使用されたコンストラクトを図１１Ａにて示す。Ｈ７７ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ００９６０６）に由来する完全長のＥ１Ｅ２の配列をｔＰＡリーダー配列とＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。Ｅ１Ｅ２のアフィニティタグ付き形態を形成するために、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインをＥ１とＥ２の間の接合部で挿入した。ＷＴ及びＦｃ−Ｅ１Ｅ２の双方がＧＮＡによって沈殿できるのに対して後者のみがプロテインＧセファロースによって沈殿した（図１１Ｂ）。重要なことに、沈殿したＦｃ−Ｅ２がＥ１と会合したということはＦｃタグはヘテロダイマー形成を妨害しないことを実証している。
【０２４８】
上記の材料及び方法にて要点が述べられているように、Ｆｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２（Ｆｃタグが取り外された）を精製し、ＧＮＡで単離したＷＴ  Ｅ１Ｅ２と比較した。双方の方法は、混入タンパク質の軽微な分画を含有する高度に濃縮されたＥ１Ｅ２抗原を生じた（図１１Ｃ）。２つの方法の間での収量は実施された単離の尺度で類似していた（１００ｇのＣＨＯ細胞当たり約１ｍｇのＥ１Ｅ２）。非還元に対比させた還元のＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの解析は、単離されたＥ１Ｅ２抗原の大半が非共有結合した複合体であることを支持していた（図１１Ｄ）。
【０２４９】
図１１Ａ〜１１Ｄ：Ｆｃタグ付きの前駆体からのＥ１Ｅ２の精製
（Ａ）野生型（ＷＴ）及びＦｃタグ付きのコンストラクト及びポリペプチドのプロセッシングの模式図である。Ｅ１Ｅ２  Ｈ７７ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ００９６０６）ポリペプチドはＣＭＶプロモーター（ＰＣＭＶ）の制御下で発現され、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）に由来するシグナル配列が先行する。Ｆｃタグ付きのＥ１Ｅ２については、２つ組のＥ２Ｎ末端アミノ酸（３８４〜３８５）（ＥＴ）が挿入され、その後にヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｆｃ）とＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＰＰ）認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１）が続く。ポリペプチド領域のサイズは、シグナルペプチダーゼ（ＳＰ）による切断部位と同様に上にて示す（ａａ＝アミノ酸）。（Ｂ）ＣＨＯ細胞抽出物に由来する野生型（ＷＴ）のまたはＦｃタグ由来（Ｆｃ−ｄ）のＥ１Ｅ２の捕捉をそれぞれＧＮＡ及びプロテインＧセファロースで行い、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｅ１（Ａ４）及び抗Ｅ２（Ｈ５２）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でブロットした。（Ｃ）精製したＥ１Ｅ２抗原（Ｆｃ−ｄについてはＰＰが介在するＦｃタグ除去工程を伴って）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。左のパネル：ウエスタンブロット：抗Ｅ１（Ａ４）及び抗Ｅ２（Ｈ５２）ｍＡｂ（レーン当たり１μｇの負荷）。右のパネル：クマシーブリリアントブルーＧ２５０（レーン当たり２μｇの負荷）。（Ｄ）野生型（ＷＴ）の及びＦｃタグ由来（Ｆｃ−ｄ）のＥ１Ｅ２抗原（１μｇ／レーン）を１％β−メルカプトエタノールと共に（Ｒ）またはそれを伴わずに（ＮＲ）Ｌａｅｍｅｌｌｉ緩衝液にて９５℃で５分間変性させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｅ１（Ａ４）及び抗Ｅ２（Ｈ５２）ｍＡｂでブロットした。
【０２５０】
精製したＥ１Ｅ２ヘテロダイマーへのＨＣＶ交差中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合
Ｅ１Ｅ２抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、Ｅ２に特異的な（ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６及びＡＲ３Ｂ）及びＥ１Ｅ２に特異的な（ＡＲ４Ａ及びＡＲ５Ａ）交差中和ｍＡｂを用いて調べた。ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６及びＡＲ３Ｂは、ＣＤ８１受容体結合部位（ＣＤ８１ｂｓ）を形成するＥ２の完全に異なる領域を標的とし、可溶性Ｅ２と結合することができる。ＨＣ３３．４はＥ２の線状エピトープ（ａａ４０９〜４２３）を認識する。ＡＲ３Ｂ及びＨＣ８４．２６は構造特異的なＥ２のエピトープに向けられている。しかしながら、ＨＣ８４．２６はさらにＥ２の線状合成ペプチド（ａａ４３３〜４４７）を認識する。ＡＲ４Ａ及びＡＲ５ＡはＣＤ８１ｄｓの外側の独特の構造エピトープを認識し、ネイティブのＥ１Ｅ２と結合することができるが、Ｅ２またはＥ１と単独では結合できない。ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２抗原はほぼ同一の方法でＥ２特異的な及びＥ１Ｅ２特異的な抗体と結合した。これらのデータは、ＷＴに類似して、Ｆｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２が正確な折り畳みを維持し、構造特異的なＥ２及びＥ１Ｅ２交差中和エピトープを提示することを支持している。
【０２５１】
Ｆｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２ヘテロダイマーはマウスにて中和抗体（ｎＡｂ）を引き出す
８匹のＣＢ６Ｆ１マウスを１：１の比でアジュバント（７５μｇのミョウバン及び７．５μｇのＭＰＬＡ）と共にＷＴまたはＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２（注射当たり２μｇ）で免疫した。４匹の動物には対照としてアジュバントを含有する緩衝液を注射した。動物は２週間間隔で合計３回の注射を受けた。最終の採血から得た血清を、組換えＥ２  ＨＣＶ１（１ａ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートによって同種抗Ｅ２活性について調べた。ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２でワクチン接種した血清は調べた希釈すべて（１０００、５０００及び１０，０００倍）においてＥ２  ＨＣＶ１について強い抗Ｅ２の力価を示した（図１２Ａ）。調べた各希釈について、ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２でワクチン接種したマウスに由来する血清は対照から統計的に上昇した（ｐ＜０．０５；一元ＡＮＯＶＡ；Ｔｕｋｅｙの事後検定）（図１２Ａ）。ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２でワクチン接種したマウスに由来する血清間の平均吸光度の値は調べた各希釈で統計的な差異を示さなかった。
【０２５２】
Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶｐｐ  Ｈ７７の感染性を阻害する能力についてワクチン接種前と後の血清試料を評価した。血清の２倍連続希釈（１：２５〜１：１６００）を調べ、５０％の中和（ＩＤ５０）を達成する阻害用量を希釈の逆数値として表した（図１２Ｂ）。ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２は、それぞれ１４１２±５４１及び１１３４±４２８の類似する群平均ＩＤ５０値を示し、それらはそれぞれ対照群から有意だった。Ｆｃ−ｄでワクチン接種したマウスはＷＴ群（最小３９；最大３２００）よりもＩＤ５０値で少ない変動性を示した（最小３６０；最大３２００）。同種遺伝子型１ａ（Ｈ７７）の異種遺伝子型５ａ（ＳＡ１３）ＨＣＶｐｐに対する中和反応を比較した。１：５０希釈した血清では、ＷＴ群及びＦｃ−ｄ群はそれぞれ７８．３±７．２％及び８０．２±２．０％でのＨＣＶｐｐ  Ｈ７７の非常に類似した平均中和を示した（図１３）。Ｆｃ−ｄでワクチン接種した動物は対照からのＨＣＶｐｐ  ＳＡ１３の有意な中和（平均３１±９％）を示した。しかしながら、ＷＴ群は対照群から有意であるＳＡ１３に向けた中和を示さなかった（図１３）。血清のさらなる希釈を用いたＦｃ−ｄ群の範囲内で中和活性は検出されなかった。
【０２５３】
図１２Ａ〜１２Ｂ：野生型（ＷＴ）及びＦｃタグによるワクチン接種によって誘導された中和抗体
（Ａ）組換えＥ２  ＨＣＶ１（１ａ）（アミノ酸３８４〜６６１：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ６２３２１．１）を３つ組でのＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ワクチン接種後のマウス血清で調べた。対照ワクチン接種血清（１０００倍希釈）と比較したＷＴ及びＦｃタグ由来（Ｆｃ−ｄ）のＥ１Ｅ２でワクチン接種したマウス血清（１０００、５０００、１０，０００倍希釈）におけるＥ２特異的な抗体の結合は、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とペルオキシダーゼ基質によって検出した。３回の独立した実験に由来するＯＤ４５０〜５０７ｎｍでの値（平均値及びＳＥＭ）を血清希釈に対してプロットして示す。（Ｂ）２倍連続希釈（１：２５〜１：１６００）のワクチン接種前及び後の血清を用いてＨＣＶｐｐ  Ｈ７７ｃ（１ａ）エントリーの中和を行い、ＩＤ５０値を決定した（５０％の中和を達成する希釈の逆数値として示される）。２回の独立した実験の代表からＳＥＭを伴った群の平均値を示す。ワクチン接種したマウスの群：対照（Ｃ）：緩衝液＋ミョウバン／ＭＰＬ；ＷＴ（ＧＮＡアガロース由来のＥ１Ｅ２  Ｈ７７ｃ＋ミョウバン／ＭＰＬ；Ｆｃ−ｄ（Ｆｃタグ由来のＥ１Ｅ２  Ｈ７７ｃ＋ミョウバン／ＭＰＬ）。（＊）一元ＡＮＯＶＡ；Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ、Ｄｕｎｎの事後検定による対照（Ｃ）に対するｐ＜０．０５を表す。
【０２５４】
図１３：同種（１ａ）及び異種（５ａ）のＨＣＶｐｐに向けた中和抗体の比較
同種ＨＣＶｐｐ  Ｈ７７（１ａ）及び異種ＨＣＶｐｐ  ＳＡ１３（５ａ）の中和を、ワクチン接種前及び後の血清（１：５０）を用いて行い、２回の独立した実験の代表からＳＥＭを伴った群の平均値をプロットした。陽性対照：抗ＣＤ８１ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）。（＊）は一元ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの事後検定による対照（Ｃ）に対するｐ＜０．０５を表す。
【０２５５】
Ｅ１Ｅ２でワクチン接種したマウスに由来する抗血清はＥ１／Ｅ２への結合について交差中和ＨＣＶｍＡｂと競合する
ＨＣＶｐｐ  Ｈ７７（１ａ）及びＨＣＶｐｐ  ＳＡ１３（５ａ）についてＷＴ及びＦｃ−ｄでワクチン接種したマウスの観察された中和反応は同種（１ａ）Ｅ１Ｅ２エピトープに向けた優越性を示した。ＷＴ及びＦｃ−ｄのＥ１Ｅ２でワクチン接種した動物に由来する抗Ｅ１Ｅ２抗体が十分に特徴付けられたＨＣＶ中和ｍＡｂに対する保存されたエピトープを標的としたかどうかを判定するために、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）上記に従って競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。対照動物の抗血清は調べたｍＡｂそれぞれとの無視できる競合しか示さなかった：＞９０％のｍＡｂの結合（任意の血清の非存在下での最大結合に対して正規化した）（図１４）。ＷＴ及びＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２によるワクチン接種は対照血清に比べてＡＲ３Ｂ、ＡＲ４Ａ、ＡＲ５Ａ、及びＨＣ８４．２６の結合を有意に低下させた（ｐ＜０．０５；一元ＡＮＯＶＡ；Ｔｕｋｅｙの事後検定）。ＨＣ３３．４については、ＷＴ  Ｅ１Ｅ２群もＦｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２群も対照に比べてこのｍＡｂの結合を有意に損傷しなかった。
【０２５６】
ＡＲ４Ａ及びＨＣ８４．２６ｍＡｂの双方については、結合はＷＴ及びＦｃ由来のＥ１Ｅ２でワクチン接種した動物にて類似する程度に低下した（ＷＴ群及びＦｃ群についてそれぞれＡＲ４Ａ：平均８３．４及び７８．８％；ＨＣ８４．２６：平均７２．３及び６３．８％）。ＡＲ３Ｂ及びＡＲ５Ａについては、Ｆｃ−ｄ  Ｅ１Ｅ２でワクチン接種した群はＷＴ  Ｅ１Ｅ２でワクチン接種した群よりも大きな程度でｍＡｂの結合を損傷した（ＷＴ群及びＦｃ群についてそれぞれＡＲ３Ｂ：平均６８．６及び５１．５％；ＡＲ５Ａ：平均６９．８及び５５．９％）（ｐ＜０．０５；一元ＡＮＯＶＡ；Ｔｕｋｅｙの事後検定）。これらの知見はＷＴ及びＦｃ−ｄのマウスが保存された中和エピトープを標的とする抗ＨＣＶ抗体を引き出したことを示唆している。しかしながら、異種ＨＣＶｐｐ  ＳＡ１３（５ａ）の中和がＷＴ及びＦｃ-ｄ群の血清に由来するＨＣＶｐｐ  Ｈ７７（１ａ）に比べてかなり低いので（図１３）、我々の競合ＥＬＩＳＡは高い感度を示す可能性があることが言及される。
【０２５７】
図１４：マウスの抗血清はＥ１Ｅ２に対するＨＣＶ交差中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合について競合する
マウス抗血清及び交差中和ヒトＨＣＶ抗体のパネルによる競合試験。ＧＮＡ精製したＥ１Ｅ２  Ｈ７７ｃを含有するマイクロタイターウェルを希釈したワクチン接種後の抗血清（１：１００）と共に３つ組で１時間インキュベートし、その後、示したｍＡｂと共にインキュベートした。抗ヒトアルカリホスファターゼ結合二次抗体によってｍＡｂの結合を検出した。ｍＡｂ結合のパーセンテージは抗血清の非存在下で結合したｍＡｂの量と比べて算出した。示されるのは、２回の独立した実験に由来する各群についての平均値±範囲である。ワクチン接種したマウスの群：対照（Ｃ）：緩衝液＋ミョウバン／ＭＰＬ；ＷＴ（ＧＮＡアガロース由来のＥ１Ｅ２  Ｈ７７ｃ＋ミョウバン／ＭＰＬ；Ｆｃ−ｄ（Ｆｃタグ由来のＥ１Ｅ２  Ｈ７７ｃ＋ミョウバン／ＭＰＬ）。Ｅ２特異的な抗体：ＨＣ３３．４、ＨＣ８４．２６、ＡＲ３Ｂ。Ｅ１Ｅ２特異的な抗体：ＡＲ４Ａ、ＡＲ５Ａ。（＊）は一元ＡＮＯＶＡ；Ｔｕｋｅｙの事後検定によるｐ＜０．０５を表す。ｎ＝２ＳＥＭを伴うのは実際、範囲と同じである。
【０２５８】
本発明がその具体的な実施形態を参照して記載されてきた一方で、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく種々の変更が行われてもよく、同等物が置き換えられてもよいことが当業者によって理解されるべきである。加えて、多数の改変を行って、本発明の目的、精神及び範囲に対して特定の状況、物質、物質の組成物、方法、方法の工程（単数）及び工程（複数）を適合させてもよい。そのような改変はすべて本明細書に添付のクレームの範囲内にあるように意図される。
【図１Ａ】
2018533934.tif 000003
【図１Ｂ】
2018533934.tif 000004
【図１Ｃ】
2018533934.tif 000005
【図２Ａ】
2018533934.tif 000006
【図２Ｂ】
2018533934.tif 000007
【図２Ｃ】
2018533934.tif 000008
【図３Ａ】
2018533934.tif 000009
【図３Ｂ】
2018533934.tif 000010
【図３Ｃ】
2018533934.tif 000011
【図４Ａ】
2018533934.tif 000012
【図４Ｂ】
2018533934.tif 000013
【図５Ａ】
2018533934.tif 000014
【図５Ｂ】
2018533934.tif 000015
【図５Ｃ】
2018533934.tif 000016
【図６】
2018533934.tif 000017
【図７】
2018533934.tif 000018
【図８】
2018533934.tif 000019
【図９】
2018533934.tif 000020
【図１０−１】
2018533934.tif 000021
【図１０−２】
2018533934.tif 000022
【図１１】
2018533934.tif 000023
【図１２】
2018533934.tif 000024
【図１３】
2018533934.tif 000025
【図１４】
2018533934.tif 000026
【配列表】
2018533934000001.app
【国際調査報告】
2018533934.tif 000027
2018533934.tif 000028
2018533934.tif 000029
2018533934.tif 000030
2018533934.tif 000031