(57)【要約】  本開示は、神経変性状態の治療方法、ならびに神経変性状態を発症するリスクの評価方法およびＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである対象における治療効果の評価方法を提供する。また、神経変性障害の診断方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における神経変性障害を治療するための方法であって、
前記対象から生体試料を得ることと、
前記対象がＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアであるかを識別することと、
前記対象がＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである場合、治療に有効な量のＰＫＣ活性化因子を前記対象に投与することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パーキンソン病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルツハイマー病が、散発性アルツハイマー病または遅発性アルツハイマー病である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が、皮膚細胞、繊維芽細胞、血球、嗅覚ニューロン、および頬粘膜細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＫＣ活性化因子が、大環状ラクトン、ブリオログ、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、成長因子、多価不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、ならびに脂肪酸エステルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記大環状ラクトンが、ブリオスタチンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ブリオスタチンが、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、またはブリオスタチン−１８から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＫＣ活性化因子を、約５〜２０μｇ／ｓｑ．ｍ／週の用量で前記対象に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＫＣ活性化因子を、約２週間から約４週間の範囲の期間、毎週投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、アポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子のホモ接合キャリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、アポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子のヘテロ接合キャリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
対象における神経変性疾患の治療効果を評価する方法であって、
神経変性疾患に罹患している前記対象に１種以上の治療に有効な活性剤を投与することと、
前記対象から第１の生体試料および第２の生体試料を得ることであって、前記第１および第２の生体試料を、治療中の異なる時点で得ることと、
前記第１および第２の試料中のＰＫＣ−εのレベルを測定することと、
前記第１および第２の試料中のＰＫＣ−εのレベルを比較することと
を含み、前記第１の試料に比べて前記第２の試料中のより高レベルのＰＫＣ−εが、治療効果の指標になる、方法。
【請求項１４】
前記第１の生体試料を、治療投与の前に得、前記第２の生体試料を、治療投与の後に得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療投与が、２週間、３週間、４週間、５週間、および６週間から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性剤がＰＫＣ活性化因子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＫＣ活性化因子が、大環状ラクトン、ブリオログ、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、成長因子、多価不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、ならびに脂肪酸エステルから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
大環状ラクトンがブリオスタチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象における神経変性障害を診断する方法であって、
前記対象から生体試料を得ることと、
前記生体試料を溶解して溶解物を得ることと、
前記溶解物を差次的に分別して細胞質分画および核分画を得ることと、
前記核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６対全ＨＤＡＣの比を測定することと
を含み、ＨＤＡＣ４対全核ＨＤＡＣの比またはＨＤＡＣ６対全核ＨＤＡＣの比が、０．５から０．９５の範囲内である場合、前記対象が神経変性障害に罹患している、方法。
【請求項２０】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パーキンソン病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象における神経変性状態の発症リスクを評価する方法であって、
前記対象から生体試料を得ることと、
前記生体試料を溶解して溶解物を得ることと、
前記溶解物を差次的に分別して細胞質分画および核分画を得ることと、
前記細胞質分画および前記核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルを測定することと
を含み、前記細胞質分画よりも前記核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルが高ければ、神経変性状態の発症リスクがより高いことを示す、方法。
【請求項２２】
前記核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルが、前記細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルよりも１．５倍から２．５倍高い、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
[001]本出願は、参照によりその全内容がここに組み込まれる、２０１５年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／１５９，６９１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
[002]アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子（ＡｐｏＥ４）は、散発性および遅発性アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）、ならびにその他の神経変性状態の主要危険因子である。アルツハイマー病（ＡＤ）および健康な高齢対照において、ＡｐｏＥ４レベルは、海馬中の樹状突起棘密度に逆相関する。実際、ＡＤのリスクは、１個のＡｐｏＥ４対立遺伝子を有する患者では２〜３倍高くなり、２個のＡｐｏＥ４対立遺伝子を有する患者では１２倍高くなる（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  Ｄ．Ｍ．、ＡＰＯＥ  ｅｐｓｉｌｏｎ４：ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｙｅｔ  ｕｎｄｅｒｓｔｕｄｉｅｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ、１０：８６１〜８６８、２０１４）。両タイプの患者、例えば１個の対立遺伝子または２個の対立遺伝子のキャリア、例えばホモ接合および／またはヘテロ接合は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである。
【０００３】
[003]脳内のＡｐｏＥは、主に星状膠細胞中で生成され、コレステロール輸送タンパク質であり、シナプス形成および再形成の主要決定基である（Ｐｆｒｉｅｇｅｒ，Ｆ．Ｗ．、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、６０：１１５８〜１１７１、２００３；Ｂｕ，Ｇ．、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｗａｙｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１０：３３３〜３４４、２００９）。ＡｐｏＥは、リポタンパク質受容体の配位子でもあり、したがって血液脳関門または血液ＣＳＦ関門を通してアミロイド−β（Ａβ）除去を促進する役割を有し得る。ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４間には多くの機能差がある。例えば、ＡｐｏＥ４は、脳内のＡβ沈着を増加し（Ｖｅｒｇｈｅｓｅら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、１０：２４１〜２５２、２０１１；Ｌｉｕら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｉｓｋ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．、９：１０６〜１１８、２０１３）、ヒトＡｐｏＥ４対立遺伝子を含有するノックイン遺伝子導入マウスは、ヒトＡｐｏＥ３対立遺伝子を有するマウスと比べて減少したシナプス伝達を示した（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ４  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７１：１２６５〜１２７２、２０１０）。トランスクリプトーム全体の差次的遺伝子発現解析は、ＡｐｏＥ４が、ＬＯＡＤに罹患している患者に見られるものと同様に、遺伝子発現に変化をもたらすことをさらに示した。（Ｒｈｉｎｎら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＡＰＯＥ  ｅｐｓｉｌｏｎ４  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、５００：４５〜５０、２０１３）。本発明者らによる先行研究は、ＡｐｏＥ３が、プロテインキナーゼＣε（ＰＫＣε）を介して作用してＡβ誘発細胞死に対する一次ニューロンを保護し、シナプス形成を誘発するが、ＡｐｏＥ４はこれらを行わないことを示す（Ｓｅｎら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ３（ＡｐｏＥ３）  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＡｐｏＥ４  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｏｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７：１５９４７〜１５９５８、２０１２）。
【０００４】
[004]脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、シナプス修復および可塑性の関連因子である。ＡＤにおけるＢＤＮＦ多型の証拠は依然として決定的でないが、シナプス消失はＡＤの唯一の最重要関連要因である。低レベルのＢＤＮＦは、多くの型の認知症に一般的な無気力非認知的症状を伴うＡＤの症例において、ＡｐｏＥ４と関連する（Ａｌｖａｒｅｚら、Ａｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ＡＰＯＥ４  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤＮＦ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．、４２：１３４７〜１３５５、２０１４）。ＢＤＮＦ発現は、少なくとも９つのプロモーターによって調節され（Ａｉｄら、Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  ＢＤＮＦ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、８５：５２５〜５３５、２００７；Ｐｒｕｕｎｓｉｌｄら、Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＢＤＮＦ  ｌｏｃｕｓ：ｂｉｄｅｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９０：３９７〜４０６、２００７）、そのうちのプロモーターＩＶ（ＰＩＶ）は、ニューロン活動に最も応答する（Ｔａｏら、Ｃａ２  ｉｎｆｌｕｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＢＤＮＦ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ＣＲＥＢ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、Ｎｅｕｒｏｎ、２０：７０９〜７２６、１９９８）。ＡＤにおいて減少するＰＫＣε（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、ＰＫＣ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｏｓｓ，Ａｂｅｔａ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３１：６３０〜６４３、２０１１；Ｋｈａｎら、ＰＫＣｅｐｓｉｌｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．、４３：４９１〜５０９、２０１５）は、ＢＤＮＦ発現も調節する（ＬｉｍおよびＡｌｋｏｎ、２０１２；Ｃｏｒｂｅｔｔら、２０１３；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、ＰＫＣ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｓｐｉｎｅ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｇｅｄ  ｒａｔ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、５５：４４〜６２、２０１３；Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＢＤＮＦ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｏｒ  ＰＫＣ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｈａｔ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．、３５：１２１〜１３０、２０１５）。ＢＤＮＦ発現はまた、エクソン特異的なエピジェネティック修飾に���っても部分的に調節される。
【０００５】
[005]近年の研究は、ヒストンのアセチル化および脱アセチル化が、ＡＤを含めた幾つかの神経変性状態において異常であることを示す（Ｓａｈａら、ＨＡＴｓ  ａｎｄ  ＨＤＡＣｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１３：５３９〜５５０、２００６；Ｋｒａｍｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４１：９６〜１０７、２００９；Ｍａｉら、Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｈｏｌｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．、１５：３９４０〜３９５７、２００９；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ＨＤＡＣ（ｓ）  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、３１：６０５〜６１７、２０１０；Ｇｒａｅｆｆら、Ａｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｂｒａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４８３：２２２〜２２６、２０１２）。死後研究は、ヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）が、ＡＤ患者の海馬中で増加することを報告した（Ｇｒａｅｆｆら、２０１２）。クラスＩＩ  ＨＤＡＣ６のレベルも、ＡＤ皮質および海馬中で上昇する（Ｄｉｎｇら、Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ６  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｕ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１０６：２１１９〜２１３０、２００８）。核染色は、ＣＡ１ニューロン中のＨＤＡＣ４のレベルが、ＡＤ重篤度の上昇に伴って増加することを示した（Ｈｅｒｒｕｐら、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＴＭ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ：ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ、ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）、１２：６００〜６０４、２０１３）。これに応じて、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＢＤＮＦ遺伝子プロモーターのヒストンＨ３およびＨ４アセチル化を誘発することによって（Ｂｒｅｄｙら、Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｒｏｕｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＢＤＮＦ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｆｅａｒ、Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ．、１４：２６８〜２７６、２００７；Ｉｓｈｉｍａｒｕら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＤＮＦ  ａｎｄ  ＮＴ−３  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ５−ａｚａ−２−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏ−２ａ  ｃｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３９４：１７３〜１７７、２０１０；Ｂｏｕｌｌｅら、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＤＮＦ  ｇｅｎｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１７：５８４〜５９６、２０１２）、記憶および認知を改善することが報告されている（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、４４７：１７８〜１８２、２００７；Ｋｉｌｇｏｒｅら、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  １  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３５：８７０〜８８０、２０１０）。それに加えて、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤は、ＢＤＮＦ  ＰＩＶ活動も誘発する（ＫｏｐｐｅｌおよびＴｉｍｍｕｓｋ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＤＮＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ｃｌａｓｓ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７５：１０６〜１１５、２０１３）。
【０００６】
[006]本発明者らは、ここで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤを模倣するために、アミロイド−βアミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の存在下または不在下、神経細胞中でのＨＤＡＣの核転座およびＢＤＮＦ発現におけるＡｐｏＥアイソフォームおよびＰＫＣの役割を調べた。ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４は、脳内のＨＤＡＣを通してヒストンアセチル化を調整することによって、ＡＤ中の遺伝子転写を差次的に調節する。結果として、本開示は、ＰＫＣεの生成および／または処理が不足している患者、例えばＡｐｏＥ４のホモまたはヘテロ接合の患者における、１種以上のＰＫＣ活性化因子、例えば大環状ラクトンによる治療をサポートする。治療結果は、ＰＫＣε生成、ｍＲＮＡタンパク質レベル、および膜結合性を高めた。これにより増加したＢＤＮＦおよび他のシナプス成長因子は、シナプス形成を増加し、認知機能を増強した。
【０００７】
[007]本発明は、神経変性障害の治療方法ならびに神経変性疾患の治療効果の評価方法、神経変性障害の診断方法および神経変性状態を発症するリスクの評価方法に関し、また神経変性障害、例えばアルツハイマー病の治療のための療法としてのＰＫＣ活性化因子の使用に関する。
【０００８】
[008]一態様において、対象における神経変性障害の治療方法は、対象から生体試料を得ることと、対象がＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアであるかを識別することと、対象がＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである場合、治療に有効な量のＰＫＣ活性化因子を対象に投与することとを含む。
【０００９】
[009]この方法によって治療される神経変性障害は、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パーキンソン病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷である。一態様において、治療は、アルツハイマー病に罹患している人、例えば散発性アルツハイマー病または遅発性アルツハイマー病に罹患している人に有効である。
【００１０】
[0010]本発明の方法で使用される生体試料は、皮膚細胞、線維芽細胞、血球、嗅覚ニューロン、および頬粘膜細胞から選択することができる。
【００１１】
[0011]本開示の方法による治療は、治療に有効な量のＰＫＣ活性化因子を、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである対象に投与することによって達成される。一態様によれば、ＰＫＣ活性化因子は、大環状ラクトン、ブリオログ、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダール（iripallidal）、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、成長因子、多価不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、ならびに脂肪酸エステルから選択される化合物である。
【００１２】
[0012]この態様の側面によれば、ＰＫＣ活性化因子は、大環状ラクトンブリオスタチンである。一態様において、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、またはブリオスタチン−１８から選択される。
【００１３】
[0013]ＰＫＣ活性化因子は、アポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子のホモ接合キャリアである対象またはアポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子のヘテロ接合キャリアである対象に、約２週間から約４週間の範囲の期間、毎週、投与することができる。ＰＫＣ活性化因子の治療に有効な用量は、約５〜２０μｇ／ｓｑ．ｍ／週である。
【００１４】
[0014]別の態様によれば、本開示は、神経変性疾患に罹患している対象に１種以上の治療に有効な活性剤を投与し、次いで対象から第１の生体試料および第２の生体試料を治療中の異なる時点で得、後続して第１および第２の試料中のＰＫＣ−εレベルを測定し、次いで第１および第２の試料中のＰＫＣ−εレベルを比較し、ここで第１の試料に比べて第２の試料中のより高レベルのＰＫＣ−εを、治療効果の指標にすることによって、対象における神経変性疾患の治療効果を評価する方法を提供する。
【００１５】
[0015]この方法の態様において、第１の生体試料は、投与治療の前に得、第２の生体試料は、投与治療の後に得る。
【００１６】
[0016]この方法のさらなる態様によれば、治療は、２週間、３週間、４週間、５週間、および６週間にわたる期間、投与される。
【００１７】
[0017]一態様において、活性剤は、ＰＫＣ活性化因子である。本開示の方法における使用に適した例示的なＰＫＣ活性化因子には、大環状ラクトン、ブリオログ、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、成長因子、多価不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、ならびに脂肪酸エステルが挙げられる。
【００１８】
[0018]一態様において、ＰＫＣ活性化因子は、大環状ラクトンブリオスタチンである。
【００１９】
[0019]さらに別の態様では、本開示は、対象から生体試料を得、次いで生体試料を溶解して溶解物を得、溶解物を差次的に分別して細胞質分画および核分画を得た後、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６対全ＨＤＡＣの比を測定することによって、対象における神経変性障害を診断する方法を提供する。この方法によれば、対象は、ＨＤＡＣ４対全核ＨＤＡＣの比またはＨＤＡＣ６対全核ＨＤＡＣの比が、０．５から０．９５の範囲内である場合、神経変性障害に罹患している。
【００２０】
[0020]さらに別の態様では、本開示は、対象から生体試料を得、次いで生体試料を溶解して溶解物を得、溶解物を差次的に分別して細胞質分画および核分画を得た後、細胞質分画および核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルを測定することによって、対象における神経変性状態の発症リスクを評価する方法を提供する。この方法によれば、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルが、細胞質分画中のそれらに対応するレベルよりも高い場合、神経変性状態の発症リスクは高くなる。
【００２１】
[0021]一態様において、神経変性状態を発症するリスクがある対象の核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルは、細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルよりも１．５倍から２．５倍高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】[0022]ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４およびヒストン３アセチル化の比較。
【図１Ｂ】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４およびヒストン３アセチル化の比較。
【図２Ａ】[0023]ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６転座の比較。
【図２Ｂ】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６転座の比較。
【図２Ｃ】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６転座の比較。
【図３】[0024]ヒト一次ニューロン中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６転座の比較。
【図４Ａ】[0025]遺伝子導入マウスの海馬中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６核局在化の比較。
【図４Ｂ】遺伝子導入マウスの海馬中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６核局在化の比較。
【図５】[0026]受容体結合タンパク質ＲＡＰで前処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６核転座の比較。
【図６】[0027]ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４を有するまたは有さない、コレステロールで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＰＫＣε、ＰＫＣα、およびＰＫＣδ  ｍＲＮＡレベル。
【図７】[0028]ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＢＤＮＦ発現。
【図８】[0029]ＡＳＰＤの存在下または不在下で、コレステロールおよびＡｐｏＥ３またはコレステロールおよびＡｐｏＥ４で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。
【図９】[0030]遺伝子発現のＡｐｏＥアイソフォーム介在調節。
【図１０】[0031]ＢＲ−１２２は、一次ニューロン中のＰＫＣを活性化する。
【図１１】[0032]ブリオスタチンは、マウスの脳内のＰＫＣεを活性化する。
【図１２】[0033]第ＩＩａ相臨床試験は、ブリオスタチンがＰＫＣεの合成を促進することを示す。
【図１３】[0034]ブリオスタチンを投与してから１時間後のＰＫＣεの血中濃度。
【図１４】[0035]第ＩＩａ相臨床試験は、ブリオスタチンの注入を開始してから１時間後の高レベルのＰＫＣεを示す。図面の赤色箇所は、１時間後のピークまでに上昇するＰＫＣε線の勾配を例示している。
【図１５Ａ】[0036]粉末分画中の全ＰＫＣのパーセンテージ（２８．６±１．１％、平均値±ＳＥ）が、ヒトＡｐｏＥ４（２１．６±１．０％）または野生型マウス（２３．５±０．５％）を発現する遺伝子導入マウスに比べて高いことによって示されるように、ＰＫＣは、ｈＡｐｏＥ３を発現するマウスにおいて、構成的により活性化された。
【図１５Ｂ】粉末分画中の全ＰＫＣのパーセンテージ（２８．６±１．１％、平均値±ＳＥ）が、ヒトＡｐｏＥ４（２１．６±１．０％）または野生型マウス（２３．５±０．５％）を発現する遺伝子導入マウスに比べて高いことによって示されるように、ＰＫＣは、ｈＡｐｏＥ３を発現するマウスにおいて、構成的により活性化された。
【図１６】[0037]ブリオスタチン注入は、小認知機能検査スコア（ＭＭＳＥ）を上げることによって認知を改善する。
【説明】
【００２３】
[0038]ここで使用する場合、単数形の「ある１つの（ａ）」、「ある１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の言及を含む。
【００２４】
[0039]ここで使用する場合、「プロテインキナーゼＣ活性化因子」または「ＰＫＣ活性化因子」は、ＰＫＣによって触媒された反応の速度を上げる物質を指す。ＰＫＣ活性化因子は、非特異的または特異的活性化因子であってよい。特異的活性化因子は、一ＰＫＣアイソフォーム、例えばＰＫＣ−ε（エプシロン）を、別のＰＫＣアイソフォームより大幅に検出可能な程度まで活性化する。
【００２５】
[0040]ここで使用する場合、「脂肪酸」という用語は、炭化水素鎖で構成され、末端が遊離酸、酸性塩、またはエステルである化合物を指す。指定されないとき、「脂肪酸」という用語は、３つの形態すべてを包含することを意味する。当業者は、特定の表現は区別なく使えることを理解している。例えば、「リノレン酸のメチルエステル」は、「リノレン酸メチルエステル」と同じであり、これは「メチルエステル形態のリノレン酸」と同じである。
【００２６】
[0041]ここで使用する場合、「シクロプロパン化」または「ＣＰ」という用語は、分子中の少なくとも１つの炭素−炭素二重結合が、シクロプロパン基と置きかえられた化合物を指す。シクロプロパン基は、シスまたはトランス配置をとってよい。別段の指定がない限り、シクロプロパン基が、シス配置をとることを理解すべきである。複数の炭素−炭素二重結合を有する化合物は、多くのシクロプロパン化の形態を有する。例えば、多価不飽和化合物は、１つの二重結合だけシクロプロパン化されており、「ＣＰ１型」と呼ばれることが考えられる。同様に、「ＣＰ６型」は、６つの二重結合がシクロプロパン化されていることを示す。
【００２７】
[0042]例えば、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）メチルエステルは、６つの炭素−炭素二重結合を有し、したがって１つ〜６つのシクロプロパン環を有することができる。以下にＣＰ１およびＣＰ６型を示す。完全にはシクロプロパン化されていない化合物（例えば、ＤＨＡ−ＣＰ１）に関して、シクロプロパン基は、いずれかの炭素−炭素二重結合で出現することができる。
【００２８】
【化１】
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【００２９】
[0043]ここで使用する場合、「コレステロール」という単語は、コレステロールおよびその誘導体を指す。例えば、「コレステロール」は、ジヒドロコレステロール種を含むと理解される。
【００３０】
[0044]ここで使用する場合、「シナプス形成」という単語は、シナプスの形成に関与するプロセスを指す。
【００３１】
[0045]ここで使用する場合、「シナプスネットワーク」という単語は、多数のニューロンおよび個々のニューロン間のシナプス結合を指す。シナプスネットワークは、多重干渉を有する広範の分枝を含み得る。シナプスネットワークは、例えば、共焦点可視化、電子顕微鏡による可視化、および電気生理学的記録によって認識され得る。
【００３２】
[0046]「薬学的に許容される」という語句は、生理的に耐えられ、対象に投与されたとき、典型的に有害反応を起こさない分子的実体および組成物を指す。例えば、ここで使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、特に、ヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認定されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に承認されている薬局方で列挙されていることを意味する。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、有効成分を組み合わせることができ、組み合わせた後に使用して有効成分を対象に投与することができ、希釈剤、補助剤、賦形剤、または化合物を投与するための媒体を指すことができる化学組成物を意味する。
【００３３】
[0047]「治療に有効な用量」または「有効量」という用語は、測定可能な治療反応をもたらす治療薬の量を指す。治療反応は、使用者（例えば、臨床医）が、症状の改善および代わりの臨床的指標を含めた、治療に効果的な反応として認識する任意の応答でよい。よって、治療反応は、一般に、疾患または状態の１種以上の症状の緩和または阻害となるであろう。測定可能な治療反応は、また、その治療薬によって症状または疾患が、予防される、または発症が遅延される、またはそれ以外の仕方で減衰されるという発見を含む。
【００３４】
[0048]「およそ」および「約」という用語は、言及される数または値とほぼ同じであることを意味し、これには、測定の性質または精度から判断して測定された量について許容される程度の誤差を含む。ここで使用する場合、「およそ」および「約」という用語は、一般的に、指定の量、頻度または値の±２０％を包含するものと理解すべきである。ここで挙げる数量は、別段の規定がない限り、近似であり、「約」または「およそ」という用語が、明確に規定されない場合は推定可能であることを意味する。
【００３５】
[0049]「投与する」、「投与」、または「投与すること」という用語は、ここで使用する場合、（１）健康開業医もしくは彼の委任代理人のいずれかによってまたは彼の指示下で、本開示による組成物を供給すること、与えること、投薬すること、かつ／または処方すること、および（２）患者または人間彼自身または彼女自身によって本開示による組成物を注入する、服用するまたは消費することを指す。ここで使用する場合、組成物の「投与」は、経口、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内を含めた、任意の投与経路を含む。
【００３６】
[0050]本開示は、神経変性障害、例えばアルツハイマー病（例えば、散発性または遅発性）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パーキンソン病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷の治療および／または発症リスクの低減のための方法に関する。生きているヒトの脳に直接アクセスすることは不可能なため、対象における神経変性状態の発症リスクの評価は困難である。
【００３７】
[0051]神経変性状態の発症の早期診断は、さらにより困難である。本発明は、対象における神経変性状態の発症リスクの評価方法および神経変性障害の診断方法を提供する。本開示の方法は、１つ以上のＡｐｏＥ４対立遺伝子コピーを保有する患者の、ＡＤ、特に遅発性アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）の発症リスクが高いという発見に基づく。
【００３８】
[0052]また、神経変性疾患の診断を受けた患者の治療方法および神経変性疾患に罹患している患者における治療効果の評価方法も記載する。
【００３９】
[0053]アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、血液脳関門または血液ＣＳＦ関門を通してアミロイド−β（Ａβ）除去を促進することが知られている。ＡｐｏＥ３アイソフォームが、一次ニューロンをＡβ誘発細胞死から保護し、シナプス形成を促進する一方、ＡｐｏＥ４アイソフォームレベルは、脳内のＡβ沈着およびアルツハイマー病（ＡＤ）の発症リスクの上昇と相関することが知られている。実際に、ＡＤの発症リスクは、１つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を保有する患者で２〜３倍高く、２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を保有する患者では約１２倍高くなる。
【００４０】
[0054]一側面において、本開示は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアであると確認されている対象に、治療に有効な量のＰＫＣ活性化因子を投与することによって、対象における神経変性障害を治療する方法を提供する。
【００４１】
[0055]本開示の方法によって治療される神経変性障害には、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パーキンソン病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷が挙げられる。好ましい側面において、神経変性障害は、アルツハイマー病、例えば、散発性アルツハイマー病または遅発性アルツハイマー病である。
【００４２】
[0056]本開示の方法は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のヘテロ接合キャリアである対象またはＡｐｏＥ４対立遺伝子のホモ接合キャリアである対象の治療に適している。対立遺伝子のホモ接合キャリアである対象は、疾患の進行のリスクが高い。
【００４３】
[0057]本開示はまた、治療中に２つの異なる時点で対象から得た第１および第２の生体試料中のＰＫＣ−εのレベルを比較することによって治療効果を評価する方法も提供する。この方法の一側面では、第１の試料に比べて第２の試料中のより高レベルのＰＫＣ−εが、治療効果の指標になる。
【００４４】
[0058]この方法に従ってＰＫＣ活性化因子を使用した治療は、１週間または数週間もしくは数ヶ月にわたって行うことができる。一態様において、ＰＫＣ活性化因子は、ブリオスタチンである。図１０および１１に示す通り、ＢＲ−１２２、ブリオスタチンの類似体の投与は、一次ニューロン中のＰＫＣ−εレベルを増加させる。同様に、マウスへのブリオスタチンの投与は、マウスの脳内のＰＫＣ−εレベルを増加させた。
【００４５】
[0059]別の態様では、本開示は、対象の生体試料由来の細胞の核中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６対全ＨＤＡＣの核比に基づいて、対象における神経変性障害を診断する方法を提供する。
【００４６】
[0060]一態様において、ＨＤＡＣ４対全核ＨＤＡＣの比またはＨＤＡＣ６対全核ＨＤＡＣの比が０．５〜０．９５の範囲内であるとき、神経変性障害の診断が確定される。一態様において、ＨＤＡＣ４対全核ＨＤＡＣの比またはＨＤＡＣ６対全核ＨＤＡＣの比は、０．６〜０．９５、０．７〜０．９５、または０．８〜０．９５の範囲内である。
【００４７】
[0061]この態様の側面によれば、ＨＤＡＣ４対全核ＨＤＡＣの比またはＨＤＡＣ６対全核ＨＤＡＣの比は、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５または０．９である。
【００４８】
[0062]さらに別の側面では、本開示の神経変性障害のリスクを評価する方法は、このような状態の発症リスクがある患者から生体試料を得ることと、生体試料の溶解物の細胞質分画および核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルを測定することとを含む。
【００４９】
[0063]一態様において、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルが、細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルより約１．５倍、１．７５倍、１．８０倍、１．８５倍、１．９倍、１．９５倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、または２．５倍高いとき、神経変性障害の発症リスクが高い。
【００５０】
[0064]一態様において、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルは、細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルより１．５倍高い。
【００５１】
[0065]別の態様では、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルは、細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルより２．０倍高い。
【００５２】
[0066]さらに別の態様では、核分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルは、細胞質分画中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルより２．５倍高い。
【００５３】
[0067]生体試料は、任意の生存細胞、すなわち、生体ドナーから得た細胞、試料組織または培養細胞であってよい。例えば、生体組織を得、関連技術分野で公知の方法によって組織から細胞を分離する。例示的な生体試料には、非限定的には、皮膚試料細胞、線維芽細胞、血球、嗅覚ニューロン、頬粘膜細胞、または任意の末梢組織細胞が挙げられ、非侵襲的方法によって得られる。しかし、生体試料は、低侵襲的手技、例えば脊椎穿刺または腰椎穿刺を用いて患者から得た組織または細胞であってもよい。
【００５４】
[0068]ある態様において、細胞は、対象の末梢静脈から採血することによって得られる血球である。カテゴリー「血球」の実例は、赤血球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球を含むリンパ球、および血小板である。
【００５５】
[0069]別の態様によれば、パンチ皮膚生検を用いて対象から皮膚線維芽細胞が得られる。生体試料中の細胞密度は、コールターカウンターを使用して容易に決定され、必要に応じて、トリパンブルー色素排除法によって細胞の生存が決定される。
神経変性疾患のリスク低下におけるＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の役割
[0070]ＡｐｏＥ４は、神経変性状態、例えばＡＤの発症リスクを評価するためのバイオマーカーである。例えば、本開示は、神経変性状態の発症リスクが、１つのＡｐｏＥ４対立遺伝子コピーを保有する患者に比べて、２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子コピーを保有する患者において約１０倍であるという観察に関する。
【００５６】
[0071]したがって、神経変性状態の治療方法および／またはリスク低下の方法を開示する。ＡＤの発症および進行の正確な機構はあまり理解されていないが、ニューロン中のヒストンＨ３の脱アセチル化が疾患病因に関与すると見なされている。
【００５７】
[0072]驚くべきことに、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４は、ニューロン中のヒストン、例えばヒストンＨ３のアセチル化の状態を差次的に調節する。図１Ａおよび１Ｂは、コレステロール、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３＋コレステロール（ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ）、またはＡｐｏＥ４＋コレステロール（ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ）で処置されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞のヒストン３中のリジン９／１４のアセチル化（Ｈ３Ｋ９／１４ａｃ）のレベルを例示している。
【００５８】
[0073]図１に例示するように、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞のＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌでの２４時間にわたる処置は、対照のコレステロールで処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｆ(5,12)＝７．３３；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００２３）に比べて、Ｈ３Ｋ９／１４ａｃを８９％増加したのに対して、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌで処置した細胞中のＨ３Ｋ９／１４ａｃのレベルは２５％低減した。実際、アセチル化Ｈ３Ｋ９／１４は、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ処置細胞よりＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ処置細胞で２．４倍高かった（ｔ検定、ｐ＜０．００５；図１Ｂ）。コレステロール、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４単体による培養ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞の処置は、Ｈ３Ｋ９／１４のアセチル化には一切効果がなかった。
【００５９】
[0074]ヒストンのアセチル化の状態が少なくとも部分的にその局在性によって決まるか、すなわち、ヒストンがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞質または核中に存在するかをさらに調べるために、コレステロール、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ、またはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌで２４時間にわたって前処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用して細胞質および核分画を調製した。脳内で発現したクラスＩ  ＨＤＡＣ、すなわちＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３、ならびにクラスＩＩ  ＨＤＡＣ、すなわちＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５およびＨＤＡＣ６の免疫ブロット解析は、クラスＩ  ＨＤＡＣが、主に核に局在することを示した。ＨＤＡＣ１の核局在率は９０％であり、一方、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３の核局在率は、それぞれ８０％および５０％である。その上、クラスＩ  ＨＤＡＣは、ＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌまたはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌによる処置に応じて局在化挙動に有意な変化を示さなかった（データは図示せず）。
【００６０】
[0075]対照的に、核転座の増加が、クラスＩＩ  ＨＤＡＣで観察された（図２Ａ参照）。例えば、核転座の有意な増加は、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ（３２．４±３．８％；ｐ＜０．００５）およびコレステロール（４５．３±４．４％；ｐ＜０．０５）で処置した細胞に比べて、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ処置細胞（５５．３±１．４％）中のＨＤＡＣ４（Ｆ(2,8)＝１１．０１；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）で観察された（図２Ｂ参照）。ＨＤＡＣ５は、処置によって局在化に有意な変化を示さなかった（データは図示せず）が、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ（２３．８±３．１％；ｐ＜０．０１）およびコレステロール単体（２９．６±２．８％）で処置した細胞に比べて、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌは、ＨＤＡＣ６の核転座を２倍増加させた（４７．２±５．６％、Ｆ(2,8)＝９．２；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１；図２Ｃ）。コレステロール、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４単体で処置した細胞中では、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６の核転座に測定可能な変化は観察されなかった（図２Ａ参照）。ヒト一次ニューロン中のＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ誘発ＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ４の核転座についてのさらなる証拠が、共焦点顕微鏡法によって得られた。ヒト一次ニューロンを、コレステロール、ＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌまたはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌのいずれかで２４時間処置した。ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌで処置した細胞の共焦点顕微鏡検査は、ＨＤＡＣ６の核蛍光で３２％の増加を示した（１５５．８±１８．２８、ｎ＝３０の細胞数）。対照的に、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置した細胞は、ＨＤＡＣ６の核蛍光の減少を示した。ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置した細胞の核蛍光強度における低減率は、対照として使用したコレステロール処置細胞（１１７．４±１０．３９、ｎ＝２８）に比べて、４１％だった（６９．２２±５．８７、ｎ＝３１の細胞数；図３Ａ）。
【００６１】
[0076]共焦点顕微鏡検査の結果は、全体的に、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ処置ニューロン（６４．７±３．３９％；ｐ＜０．００１、ｎ＝８の実験回数、４０の細胞数）に比べて、またはコレステロール処置神経細胞（５０．４±３．０％；Ｆ(2,21)＝２１．６；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１、ｎ＝８の実験回数、４０の細胞数）に比べて、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ処置ニューロン（３７．７±２．１４％；ｐ＜０．００５、ｎ＝８の実験回数、４０の細胞数）の核に局在するＨＤＡＣ６が少数であることを示す（図３Ｂ）。同様の結果がＨＤＡＣ４で観察され、共焦点顕微鏡検査は、コレステロール単体またはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌで処置したニューロンに比べて、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置したニューロンにおけるＨＤＡＣ４の局在化が少数であることを示した（コレステロール単体＝５７．７±２．８％；ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ＝６９．２±４．８％；ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ＝３７．８±３．１％、Ｆ(2,21)＝１８．２；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１、ｎ＝８の実験回数、４０の細胞数；図３Ｃ、Ｄ参照）。
【００６２】
[0077]クラスＩＩ  ＨＤＡＣの核への転座を促進する上でのＡｐｏＥ４の役割に対するさらなるサポートは、遺伝子導入Ｃ５７ＢＬ／６マウスに関与する研究から生まれる。この研究に２つのマウス群を使用した。第１のマウス群は、ヒトＡｐｏＥ３対立遺伝子のキャリアであり、第２のマウス群は、ヒトＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアだった。図４Ａに例示するように、ＡｐｏＥ４遺伝子導入マウス（７３．３±３．３％核、ｎ＝３）の海馬中の核ＨＤＡＣ４の総量は、ＡｐｏＥ３遺伝子導入マウス（４８．５±１．４％、ｎ＝３；ｔ検定、ｐ＜０．００３）または対照マウス（５６．６±０．７％、ｎ＝３；ｔ検定、ｐ＜０．００４）の海馬中の核ＨＤＡＣ４の総量より多かった（図４Ａ）。同様に、核ＨＤＡＣ６の総量は、ＡｐｏＥ３遺伝子導入マウス（２７．９±１．３％；ｔ検定、ｐ＜０．００５）および対照マウス（３４．９±６．３％；ｔ検定、ｐ＜０．０５）に比べて、ＡｐｏＥ４遺伝子導入マウス（５４．５±５．４％）で多かった（図４Ｂ）。これらの結果から、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４は、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６の核−細胞質間輸送に差動効果を及ぼす。本発明の方法の特定の側面において、生体試料の細胞の核中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ６のレベルが、全核ＨＤＡＣの５０％より高い場合、全核ＨＤＡＣの５５％より高い場合、全核ＨＤＡＣの６０％より高い場合、全核ＨＤＡＣの６５％より高い場合、全核ＨＤＡＣの７０％より高い場合、全核ＨＤＡＣの７５％より高い場合、全核ＨＤＡＣの８０％より高い場合、全核ＨＤＡＣの８５％より高い場合、全核ＨＤＡＣの９０％より高い場合、または全核ＨＤＡＣの９５％より高い場合、神経変性障害のリスクは高くなる。
【００６３】
[0078]この側面によれば、核中のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５のレベルは、免疫測定法、例えばラジオ免疫測定法、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光検査法、酵素免疫測定法、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫電気泳動検査法、化学発光アッセイ、ドットブロットアッセイまたはスロットブロットアッセイによって決定される。
【００６４】
[0079]特定の側面において、神経変性障害のリスクは、患者をＰＫＣ活性化因子で治療することによって低下する。特定の態様において、ＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣを刺激するように作用する大環状ラクトン、例えばブリオスタチンおよびネリスタチンクラスである。大環状ラクトン（マクロライドとしても知られる）は、一般的に、１４、１５または１６員ラクトン環を含む。マクロライドは、天然産物のポリケチドクラスに属する。大環状ラクトンおよびその誘導体は、例えば、それぞれその全内容が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，１８７，５６８号；同第６，０４３，２７０号；同第５，３９３，８９７号；同第５，０７２，００４号；同第５，１９６，４４７号；同第４，８３３，２５７号；および同第４，６１１，０６６号；および同第４，５６０，７７４号に記載されている。これらの特許は、さまざまな化合物および抗炎症剤または抗腫瘍薬としての使用を含めた大環状ラクトンのさまざまな用途を記載している。また、それぞれその全内容が参照によりここに組み込まれる、Ｓｚａｌｌａｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）、ｖｏｌ．２６９、ｐｐ．２１１８〜２１２４；Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９６）、ｖｏｌ．５６、ｐｐ．８０２〜８０８；Ｈｅｎｎｉｎｇｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９８７）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．１３４３〜１３４６；Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０００）、ｖｏｌ．６、ｐｐ．８２５〜８２８；Ｍｕｔｔｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０００）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．１８４１〜１８６０も参照されたい。
【００６５】
[0080]化合物のブリオスタチンクラスの中でも、ブリオスタチン−１は特に興味深い。これは、腫瘍を促進することなく、ＰＫＣを活性化することが示されている。さらに、この用量反応曲線は、二相性である。それに加えて、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−εを含めたＰＫＣアイソフォームの特異的制御を実証している。この可能性を考慮して、ブリオスタチン−１には、動物およびヒトにおける毒性および安全性の研究がなされ、他の抗がん剤候補と併用する補助剤としての抗がん剤として積極的に調べられている。
【００６６】
[0081]クラスとしてのブリオスタチンは、Ｃ１ａ部位（ＤＡＧ結合部位の１つ）に結合し、ホルボールエステルのような転座を生じるが、ホルボールエステルとは異なって腫瘍を促進しないと考えられている。ブリオスタチン−１は、３５μｇ／週を超える使用で筋肉痛を伴い得るが、２０μｇ／週で毒性を示さない。ラットにおいて、ブリオスタチン−１の急性ＬＤ50値は６８μｇ／ｋｇであり、急性ＬＤ10値は４５μｇ／ｋｇである。高用量での死は、出血に起因する。
【００６７】
[0082]ブリオスタチンは、血液脳関門を越え、脳からゆっくり排除され、低速の解離速度（ｔ1/2＞１２時間）を示す。血流中、ブリオスタチンは、短半減期（ｔ1/2＝１時間）を有する。しかし、初回用量（静脈注射による）のうち、１％が１００時間で血液中にあり、単回投与後１４日間、血液中で検出可能である。ブリオスタチンは、脂肪組織中で蓄積する傾向があり、ＯＨ基の解糖および他の周知の生体異物の解毒経路を通して解毒されると考えられる。
【００６８】
[0083]本開示の一態様において、大環状ラクトンはブリオスタチンである。ブリオスタチンには、例えば、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、およびブリオスタチン−１８が挙げられる。
【００６９】
[0084]少なくとも一態様において、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−１（以下に示す）である。
【００７０】
【化２】
2018521113.tif 000003
【００７１】
別の態様では、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−２（以下に示す；Ｒ＝ＣＯＣ7Ｈ11、Ｒ’＝Ｈ）である。
【００７２】
【化３】
2018521113.tif 000004
【００７３】
[0085]本開示の一態様において、大環状ラクトンは、ネリスタチンである。一態様では、ネリスタチンは、ネリスタチン−１から選択される。別の態様では、大環状ラクトンは、シクロプロパン化ＰＵＦＡの大環状誘導体、例えば２４−オクタヘプタシクロノナコサン−２５−オン（環状ＤＨＡ−ＣＰ６）（以下に示す）から選択される。
【００７４】
【化４】
2018521113.tif 000005
【００７５】
[0086]別の態様において、大環状ラクトンは、ブリオログである。ブリオログ（ブリオスタチンの類似体）は、本開示における使用に適した別のクラスのＰＫＣ活性化因子である。ブリオログは、化学的に合成することも、特定の細菌によって生成することもできる。例えば、環Ａ、ＢおよびＣ（上図に示すブリオスタチン−１を参照）ならびにさまざまな置換基を修飾する、異なるブリオログが存在する。一般的な概要として、ブリオログは、ブリオスタチンより特異性が低く、作用も弱いが、調製がより容易であると考えられている。Ｃ環は、ＰＫＣへの結合に重要であり、Ａ環が、非腫瘍形成に重要であることが判明している。さらに、疎水性の末端が、膜結合に重要であるように思われる。
【００７６】
[0087]表１は、いくつかのブリオログの構造の特徴をまとめ、ＰＫＣに対するその親和性における変動（０．２５ｎＭ〜１０μＭの範囲）を実証する。構造的に、これらはすべて類似している。ブリオスタチン−１は、２つのピラン環および１つの６員環状アセタールを有するが、ほとんどのブリオログでは、ブリオスタチン−１のピランのうちの１つは、第２の６員アセタール環と置きかえられる。この修飾は、例えば強酸または塩基の両方で、ブリオスタチン−１と比べて、ブリオログの安定性を低下するが、生理的ｐＨではさほど顕著でない。ブリオログはまた、ブリオスタチン−１（９８８）に比べて低分子量（約６００ｇ／ｍｏｌ〜７５５ｇ／ｍｏｌの範囲）でもあり、血液脳関門を越える輸送を促進する性質を有する。
【００７７】
【表１】
2018521113.tif 000006
【００７８】
[0088]類似体１は、最も高いＰＫＣ親和性を示す。Ｗｅｎｄｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）、ｖｏｌ．１、ｐｐ．１〜１１；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）、ｖｏｌ．９５、ｐｐ．６６２５〜６６２９；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）、ｖｏｌ．１２４、ｐｐ．１３６４８〜１３６４９、それぞれ、その全内容が参照によりここに組み込まれる。類似体１のみ、ブリオスタチン−１より高いＰＫＣ親和性を示す。ブリオスタチン−１のＡ環がない類似体２は、高ＰＫＣ親和性を維持する最も単純な類似体である。活性ブリオログに加えて、２６位でアセチル化された類似体７ｄは、実質的にＰＫＣ親和性がない。
【００７９】
【化５】
2018521113.tif 000007
【００８０】
[0089]Ｂ環ブリオログも本開示で使用可能である。これらの合成ブリオログは、低ナノモル範囲の親和性を有する。参照によりその全内容がここに組み込まれる、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．（２００６）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．５２９９〜５３０２。Ｂ環ブリオログは、完全に合成される利点を有し、天然源からの精製を必要としない。
【００８１】
【化６】
2018521113.tif 000008
【００８２】
[0090]第３のクラスの好適なブリオスタチン類似体は、Ａ環ブリオログである。これらのブリオログは、ブリオスタチン−１より若干低いＰＫＣ親和性（ブリオログ３、４および５につき、それぞれ６．５ｎＭ、２．３ｎＭおよび１．９ｎＭ）および低分子量を有する。Ａ環置換基は、非腫瘍形成に重要である。
【００８３】
[0091]ブリオスタチン類似体は、例えば、米国特許第６，６２４，１８９号および同第７，２５６，２８６号に記載されている。大環状ラクトンを使用して認識能力を改善する方法も、米国特許第６，８２５，２２９号（Ｂ２）に記載されている。
【００８４】
[0092]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣに結合し活性化するジアシルグリセロールの誘導体である。例えば、Ｎｉｅｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８３）、ｖｏｌ．８０、ｐｐ．３６〜４０；Ｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）、ｖｏｌ．９１、ｐｐ．４２７〜４３１；Ｋａｉｂｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）、ｖｏｌ．２５８、ｐｐ．６７０１〜６７０４を参照されたい。ジアシルグリセロールによるＰＫＣの活性化は一時的であるが、その理由は、これがジアシルグリセロールキナーゼおよびリパーゼによって急速に代謝されるからである。参照によりその全内容がここに組み込まれる、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）、ｖｏｌ．２６１、ｐｐ．６９９３〜７０００；Ｃｈｕａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）、ｖｏｌ．２６５、ｐｐ．Ｃ９２７〜Ｃ９３３。ジアシルグリセロール誘導体の脂肪酸置換基は、活性化の強度を決定する。不飽和脂肪酸を有するジアシルグリセロールが最も活性である。立体異性体配置は重要であり；１，２ｓｎ配置を有する脂肪酸は活性であるが、２，３−ｓｎ−ジアシルグリセロールおよび１，３−ジアシルグリセロールはＰＫＣに結合しない。シス不飽和脂肪酸は、ジアシルグリセロールと相乗作用し得る。少なくとも１つの態様において、「ＰＫＣ活性化因子」という用語は、明らかにＤＡＧまたはＤＡＧ誘導体を除外する。
【００８５】
[0093]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、イソプレノイドである。例えば、ファルネシルチオトリアゾールは、Ｋdが２．５μＭのＰＫＣを活性化する合成イソプレノイドである。例えば、ファルネシルチオトリアゾールは、ジオレオイルグリセロールと等電位であるが、脂肪酸の加水分解性エステルを保有しない。参照によりその全内容がここに組み込まれる、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）、ｖｏｌ．３４、ｐｐ．３９１６〜３９２０。ファルネシルチオトリアゾールおよび関連の化合物は、安定性の持続的なＰＫＣ活性化因子の代表例である。その低分子量（３０５．５ｇ／ｍｏｌ）および荷電基の不在により、ファルネシルチオトリアゾールは、容易に血液脳関門を越えることが予想される。
【００８６】
【化７】
2018521113.tif 000009
【００８７】
[0094]さらに別のクラスの活性化因子として、オクチルインドラクタムＶ、グニジマクリン、およびインゲノールが挙げられる。オクチルインドラクタムＶは、テレオシジンに関連する非ホルボールプロテインキナーゼＣ活性化因子である。オクチルインドラクタムＶ（具体的に（−）−鏡像異性体）の利点として、高い代謝安定性、高力価（ＥＣ50＝２９ｎＭ）および血液脳関門を越える輸送を促進する低分子量が挙げられる。それぞれ参照によりその全内容がここに組み込まれる、Ｆｕｊｉｋｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８７）、ｖｏｌ．４９、ｐｐ．２２３〜２６４；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８２）、ｖｏｌ．１０４、ｐｐ．１１５９〜４１６６。
【００８８】
【化８】
2018521113.tif 000010
【００８９】
[0095]グニジマクリンは、ネズミ白血病および固形腫瘍に対して０．１ｎＭ〜１ｎＭの濃度で強力な抗腫瘍作用を発揮するダフナン型ジテルペンである。これは、Ｋ５６２細胞中、０．３ｎＭの濃度でＰＫＣ活性化因子として作用し、Ｃｄｃ２５Ａの抑制および後続するサイクリン依存性キナーゼ２（Ｃｄｋ２）の阻害（５ｎｇ／ｍｌで１００％の阻害が達成）を通してＧ１／Ｓ相で細胞周期の進行を調節する。グニジマクリンは、ブリオスタチン−１に類似の複素環式天然産物であるが、多少小サイズ（ＭＷ＝７７４．９ｇ／ｍｏｌ）である。
【００９０】
[0096]イリパリダールは、アイリスパリーダ（Iris pallida）から単離される二環式トリテルペノイドである。イリパリダールは、マイクロモルからナノモルの範囲のＧＩ50（増殖を５０％阻害するために必要な濃度）値で遮蔽されているＮＣＩ６０細胞株中で抗増殖作用を示す。これは、抗親和性（Ｋｉ＝７５．６ｎＭ）のＰＫＣαに結合する。これは、ＲａｓＧＲＰ３依存的にＥｒｋ１／２のリン酸化を誘発する。この分子量は、４８６．７ｇ／ｍｏｌである。イリパリダールは、ブリオスタチン−１のほぼ半分のサイズであり、荷電基がない。
【００９１】
【化９】
2018521113.tif 000011
【００９２】
[0097]インゲノールは、ホルボールに関連するジテルペノイドであるが、毒性は少ない。これは、トウワタ属植物チャボタイゲキ（Euphorbia peplus）に由来する。インゲノール３，２０−ジベンゾエートは、ＰＫＣ（Ｋi＝２４０ｎＭ）に結合するために、例えば、［３Ｈ］ホルボール二酪酸と競合する。参照によりここに組み込まれる、Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）、ｖｏｌ．６０、ｐｐ．１３８１〜１３９０。インゲノール−３−アンゲラートは、局所的に使用したとき、扁平上皮細胞癌および黒色腫に対して抗腫瘍作用を示す。参照によりここに組み込まれる、Ｏｇｂｏｕｒｎｅら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ（２００７）、ｖｏｌ．１８、ｐｐ．３５７〜３６２。
【００９３】
【化１０】
2018521113.tif 000012
【００９４】
[0098]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、Ｎ−（ｎ−ヘプチル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミド（ＳＣ−１０）およびＮ−（６−フェニルヘキシル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミドを含めたナフタレンスルホンアミドである。ＳＣ−１０は、ホスファチジルセリンのそれと同様の機構を用いて、カルシウム依存的にＰＫＣを活性化する。参照によりここに組み込まれる、Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）、ｖｏｌ．２５、ｐｐ．４１７９〜４１８４。ナフタレンスルホンアミドは、ブリオスタチンとは異なる機構によって作用し、ブリオスタチンまたは別のクラスのＰＫＣ活性化因子のメンバーと相乗効果を示し得る。構造的に、ナフタレンスルホンアミドは、カルモデュリン（ＣａＭ）拮抗薬Ｗ−７に類似しているが、ＣａＭキナーゼに影響がないことが報告されている。
【００９５】
[0099]さらに別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、間接的にＰＫＣを活性化するジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤である。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤の例として、これらに限定されないが、６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）および［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）が挙げられる。
【００９６】
[00100]さらに別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣ経路を通して機能する成長因子、例えば線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）およびインスリン成長因子である。ＦＧＦ−１８発現は、学習において上方制御され、インスリン成長因子の受容体が学習に関与した。これらのまたはその他の成長因子によるＰＫＣシグナル経路の活性化は、活性化ＰＫＣの追加の電位手段を実現する。
【００９７】
[00101]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、成長因子、例えばＮＧＦおよびＢＤＮＦの合成および／または活性化を刺激し、またＰＫＣならびにシナプス形成および／または神経分枝に関与する集束経路も活性化する、４−メチルカテコール酢酸（ＭＣＢＡ）のような４−メチルカテコール誘導体を含めた、ホルモンおよび成長因子活性剤である。
【００９８】
[00102]ＰＫＣ活性化因子のさらなる例として、多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）が挙げられる。これらの化合物は、神経系の必須成分であり、健康上、多数の効用がある。一般的に、ＰＵＦＡは、膜流動性を高め、迅速に酸性化して高度に生物活性の生成物を生成し、さまざまな炎症およびホルモン効果をもたらし、急速に分解および代謝される。炎症効果および急速な代謝は、その活性炭素−炭素二重結合の結果と思われる。こうした化合物は、最も可能性が高いＰＳ部位への結合により、ＰＫＣの強力な活性化因子であり得る。
【００９９】
[00103]一態様において、ＰＵＦＡは、リノール酸（以下に示す）から選択される。
【０１００】
【化１１】
2018521113.tif 000013
【０１０１】
[00104]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ誘導体、特にシクロプロパン化誘導体である。特定のシクロプロパン化ＰＵＦＡ、例えばＤＣＰＬＡ（すなわち、両方の二重結合にシクロプロパンを有するリノール酸）は、選択的にＰＫＣ−εを活性化することができ得る。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、２８４（５０）：３４５１４〜３４５２１参照；また、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５号（Ａ１）も参照されたい。その親分子と同様に、ＰＵＦＡ誘導体は、ＰＳ部位への結合によってＰＫＣを活性化すると考えられている。
【０１０２】
[00105]シクロプロパン化脂肪酸は、低毒性を示し、それが長半減期（ｔ1/2）を示す脳内に容易に移入される。二重結合のシクロプロパン環への変換は、炎症性副生成物への酸化および代謝を防止し、より剛性のＵ形３Ｄ構造を作製し、より高いＰＫＣ活性化をもたらすことができる。その上、このＵ形は、より高いアイソフォーム特異性をもたらし得る。例えば、シクロプロパン化脂肪酸は、強力かつ選択的なＰＫＣ−εの活性化を示し得る。
【０１０３】
[00106]シモンズ−スミスシクロプロパン化反応は、二重結合をシクロプロパン基に変換する有効な方法である。この反応は、カルベノイド中間体を通して作用し、親分子のシス−立体化学を保護する。したがって、ＰＫＣ活性化特性は増強され、一方で生物反応性エイコサノイド、トロンボキサン、またはプロスタグランジンのような他の分子への代謝は防止される。
【０１０４】
[00107]一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−３ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−３ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸、シクロプロパン化ルメレン酸、シクロプロパン化パリナリン酸、およびシクロプロパン化リノレン酸（以下に示すＣＰ３型）から選択される。
【０１０５】
【化１２】
2018521113.tif 000014
【０１０６】
[00108]別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化リノール酸（「ＤＣＰＬＡ」、以下に示すＣＰ２型）、
【０１０７】
【化１３】
2018521113.tif 000015
【０１０８】
シクロプロパン化アラキドン酸、シクロプロパン化エイコサジエン酸、シクロプロパン化ジホモガンマリノレン酸、シクロプロパン化ドコサジエン酸、シクロプロパン化アドレン酸、シクロプロパン化カレンド酸、シクロプロパン化ドコサペンタエン酸、シクロプロパン化ジャカル酸、シクロプロパン化ピノレン酸、シクロプロパン化ポドカルプ酸、シクロプロパン化テトラコサテトラエン酸、およびシクロプロパン化テトラコサペンタエン酸から選択される。
【０１０９】
[00109]ベルノリン酸は、天然由来の化合物である。しかし、これは、リノール酸のエポキシ誘導体であり、したがって、ここで使用する場合、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体と見なされる。ベルノリン酸に加えて、シクロプロパン化ベルノリン酸（以下に示す）は、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。
【０１１０】
【化１４】
2018521113.tif 000016
【０１１１】
[00110]別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化エイコセン酸、シクロプロパン化ミード酸、シクロプロパン化エルカ酸、およびシクロプロパン化ネルボン酸から選択される。
【０１１２】
[00111]さらに別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸（「ＭＵＦＡ」）誘導体である。一態様において、ＭＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化オレイン酸（以下に示す）
【０１１３】
【化１５】
2018521113.tif 000017
【０１１４】
およびシクロプロパン化エライジン酸（以下に示す）
【０１１５】
【化１６】
2018521113.tif 000018
【０１１６】
から選択される。
【０１１７】
[00112]ＰＫＣ活性化ＭＵＦＡ誘導体には、エポキシ化化合物、例えばトランス−９，１０−エポキシステアリン酸（以下に示す）
【０１１８】
【化１７】
2018521113.tif 000019
【０１１９】
が挙げられる。
【０１２０】
[00113]別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ルーメン酸、シクロプロパン化α−エレオステアリン酸（elostearic acid）、シクロプロパン化カタルプ酸、およびシクロプロパン化プニカ酸から選択される。
【０１２１】
[00114]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、脂肪酸アルコールおよびその誘導体、例えばシクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪アルコールである。これらのアルコールは、ＰＳ部位に結合することによってＰＫＣを活性化すると考えられている。これらのアルコールは、異なるクラスの脂肪酸から誘導することができる。
【０１２２】
[00115]一態様において、ＰＫＣ活性化脂肪アルコールは、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、およびＭＵＦＡ、特に上記の脂肪酸から誘導される。一態様において、脂肪アルコールは、シクロプロパン化リノレニルアルコール（以下に示すＣＰ３型）、
【０１２３】
【化１８】
2018521113.tif 000020
【０１２４】
シクロプロパン化リノレイルアルコール（以下に示すＣＰ２型）、
【０１２５】
【化１９】
2018521113.tif 000021
【０１２６】
シクロプロパン化エライジルアルコール（以下に示す）、
【０１２７】
【化２０】
2018521113.tif 000022
【０１２８】
シクロプロパン化ＤＣＰＬＡアルコール、およびシクロプロパン化オレイルアルコールから選択される。
【０１２９】
[00116]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、脂肪酸エステルおよびその誘導体、例えばシクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪エステルである。一態様において、シクロプロパン化脂肪エステルは、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、オメガ−５ＰＵＦＡ、およびオメガ−７ＰＵＦＡに由来する。これらの化合物は、ＰＳ部位に結合することを通してＰＫＣを活性化すると考えられている。このようなエステルの一利点は、それらが、一般的に、その遊離酸の対応物より安定性があると見なされることである。
【０１３０】
[00117]一態様において、オメガ−３ＰＵＦＡ由来のＰＫＣ活性化脂肪酸エステルは、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸メチルエステル（以下に示すＣＰ５型）、
【０１３１】
【化２１】
2018521113.tif 000023
【０１３２】
およびシクロプロパン化リノレン酸メチルエステル（以下に示すＣＰ３型）
【０１３３】
【化２２】
2018521113.tif 000024
【０１３４】
から選択される。
【０１３５】
[00118]別の態様において、オメガ−３ＰＵＦＡエステルは、ＤＨＡ−ＣＰ６ならびに脂肪族および芳香族アルコールのエステルから選択される。一態様において、エステルは、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸メチルエステル（以下に示すＣＰ６型）である。
【０１３６】
【化２３】
2018521113.tif 000025
【０１３７】
ＤＨＡ−ＣＰ６は、実際、１０ｎＭの濃度で効力があることが示されている。例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５号を参照されたい。
【０１３８】
[00119]一態様において、オメガ−６ＰＵＦＡ由来のＰＫＣ活性化脂肪エステルは、シクロプロパン化アラキドン酸メチルエステル（以下に示すＣＰ４型）、
【０１３９】
【化２４】
2018521113.tif 000026
【０１４０】
シクロプロパン化ベルノリン酸メチルエステル（以下に示すＣＰ１型）、
【０１４１】
【化２５】
2018521113.tif 000027
【０１４２】
およびベルノリン酸メチルエステル（以下に示す）
【０１４３】
【化２６】
2018521113.tif 000028
【０１４４】
から選択される。
【０１４５】
[00120]特に興味深い一クラスのエステルは、ＤＣＰＬＡ（ＣＰ６−リノール酸）の誘導体である。例えば、米国仮特許出願第６１／５５９，１１７号およびその主張する出願優先権を参照されたい。一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルは、アルキルエステルである。ＤＣＰＬＡアルキルエステルのアルキル基は、直鎖状、分枝状、および／または環状でよい。アルキル基は、飽和でも不飽和でもよい。アルキル基が不飽和環状アルキル基であるとき、環状アルキル基は芳香族でよい。一態様において、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えばイソプロピル）、およびブチル（例えばｔｅｒｔ−ブチル）エステルから選択してよい。メチルエステル形態のＤＣＰＬＡ（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）を以下に示す。
【０１４６】
【化２７】
2018521113.tif 000029
【０１４７】
[00121]別の態様において、ＤＣＰＬＡのエステルは、ベンジルアルコール（以下に示す無置換ベンジルアルコールエステル）に由来する。さらに別の態様では、ＤＣＰＬＡのエステルは、芳香族アルコール、例えば酸化防止剤として使用されるフェノールおよび学習促進能力を有する天然フェノールに由来する。いくつかの特定の例として、エストラジオール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レスベラトロル、ポリヒドロキシル化芳香族化合物、およびクルクミンが挙げられる。
【０１４８】
【化２８】
2018521113.tif 000030
【０１４９】
[00122]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、シクロプロパン化ＭＵＦＡ由来の脂肪エステルである。一態様において、シクロプロパン化ＭＵＦＡエステルは、シクロプロパン化エライジン酸メチルエステル（以下に示す）、
【０１５０】
【化２９】
2018521113.tif 000031
【０１５１】
およびシクロプロパン化オレイン酸メチルエステル（以下に示す）
【０１５２】
【化３０】
2018521113.tif 000032
【０１５３】
から選択される。
【０１５４】
[00123]別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、およびこれらの誘導体に由来するサルフェートおよびホスフェートである。一態様において、サルフェートは、ＤＣＰＬＡサルフェートおよびＤＨＡサルフェート（以下に示すＣＰ６型）から選択される。
【０１５５】
【化３１】
2018521113.tif 000033
【０１５６】
一態様において、ホスフェートは、ＤＣＰＬＡホスフェートおよびＤＨＡホスフェート（以下に示すＣＰ６型）
【０１５７】
【化３２】
2018521113.tif 000034
【０１５８】
から選択される。
【０１５９】
[00124]一態様において、ＰＫＣ活性化因子は、大環状ラクトン、ブリオログ、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、成長因子、多価不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、または脂肪酸エステルである。
ＡｐｏＥは、ＬＲＰ−１およびＰＫＣεを通してＨＤＡＣ核−細胞質間輸送を調節する
[00125]脳内において、ＡｐｏＥは、星状膠細胞中で生成され、ＡｐｏＥ受容体、例えば低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）群およびＬＲＰ−１と相互作用することによってコレステロールをニューロンに輸送する（Ｋｏｒｙａｋｉｎａ  Ａら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＦＥＢＳ  Ｊ、２７６：２６４５〜２６５５、２００９；Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＤＭら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｏｒｍａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．、２：ａ００６３１２、２０１２；Ｌｉｕ  ＣＣら、２０１３）。本発明者らによる先行研究は、ＡｐｏＥ３が、ＬＲＰ−１との相互作用を通してＡＳＰＤ誘発シナプス損傷から保護することを示した（Ｓｅｎ  Ａら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ３（ＡｐｏＥ３）  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＡｐｏＥ４  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｏｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７：１５９４７〜１５９５８、２０１２）。ニューロンのＡｐｏＥ介在保護およびＨＤＡＣのＡｐｏＥ介在核転座におけるＬＲＰ−１の役割をさらにサポートすることは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を３０分間、ＡｐｏＥ受容体結合タンパク質、例えばＲＡＰで前処理し（１００ｎＭ；Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉら、Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｔｓ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：１７９８６〜１７９９２、２００３）、後続してこれらの細胞をＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌまたはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌで２４時間処理すると、両方の処置群におけるＨＤＡＣの核転座の防止が観察されることである（図５Ａ）。実際、ＬＲＰ−１をＲＡＰでブロックすると、ＨＤＡＣ（図５Ｂ）およびＨＤＡＣ６（図５Ｃ）の核転座に及ぼすＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌおよびＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌの影響を止めた。
【０１６０】
[00126]ＬＲＰ−１がＡｐｏＥ介在ＨＤＡＣ転座を調節するさらなる証拠は、ＬＲＰ−１  ｓｉＲＮＡを取り込んでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＬＲＰ−１レベルを低下させた研究から得られた。図５Ｄに示す通り、ＬＲＰ−１  ｓｉＲＮＡ１およびＬＲＰ−１  ｓｉＲＮＡ２による遺伝子サイレンシングは、細胞ＬＲＰ−１レベルを、対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に比べて約８０％低下させた。ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ（３８．８±４．５％）およびＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ（４１．６±６．３％）は、コレステロールで処置した対照細胞（４０．２±４．３％）に比べて、ＬＲＰ−１下方制御細胞（図５Ｅ）中の核へのＨＤＡＣ４転座に何らの影響もなかった。ＬＲＰ−１下方制御はまた、ＨＤＡＣ６のＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌを介した核転座も防止した（図５Ｆ）。これらの結果は、ＡｐｏＥが、ＬＲＰ−１受容体を介して、ＨＤＡＣ４の核−細胞質間輸送を調節するように作用することを示す。
【０１６１】
[00127]ＡｐｏＥを介したＨＤＡＣ核−細胞質間輸送は、神経変性状態の決定要因である。本発明者らによる先行研究は、ＡｐｏＥの神経保護およびシナプス形成効果が、ＰＫＣεおよびＬＲＰ−１を介するものであり、実際、ＡｐｏＥ４でなくＡｐｏＥ３が、ＰＫＣε転写を誘発し、したがって対照とＡＳＰＤ処置細胞の両方でＰＫＣεレベルを上げる（Ｓｅｎら、２０１２）ことを示した。したがって、本発明者らは、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４の存在下、コレステロールで処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＰＫＣε、ＰＫＣα、およびＰＫＣδ  ｍＲＮＡの量を測定することによって、ＰＫＣεが、ＡｐｏＥを介したＨＤＡＣ核転座を調節するかを調査した。
【０１６２】
[00128]図６Ａに例示したように、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、コレステロール処置細胞に比べて、ＰＫＣε  ｍＲＮＡの発現が２．５倍増加した。一方、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌは、ＰＫＣε  ｍＲＮＡレベルの発現を低減した。しかし、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌは、ＬＲＰ−１下方制御細胞中のＰＫＣε  ｍＲＮＡを増加できず（図６Ｂ）、ＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌまたはＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ処置細胞中、ＰＫＣαまたはＰＫＣδのいずれの転写レベルにも変化が観察されなかった（図６Ｃ、Ｄ）。
【０１６３】
[00129]ＰＫＣε過剰発現（図６Ｅ）は、核ＨＤＡＣ４を、対照細胞に比べて１．８３倍さらに低減した（４０．９±２．８％対２２．３±１．６％；ｔ検定、ｐ＜０．００５；図６Ｆ）。ＰＫＣεの過剰発現も、対照細胞に比べて核ＨＤＡＣ６レベルを５４％低減した（２９．９±１．４％対１６．３±３．２％；ｔ検定、ｐ＜０．００５；図６Ｇ）。しかし、細胞ＰＫＣε発現（ＰＫＣεノックダウン）の阻害は、核ＨＤＡＣ４レベルには何の影響もなかったが、核中のＨＤＡＣ６レベルを、対照細胞に比べて１．４倍増加した（４３．３±３．８％対２９．９±１．４％；ｔ検定、ｐ＜０．０５；図６Ｇ）。上記のデータは、ＰＫＣεがＨＤＡＣ４の核保持に関与すると同時に、ＰＫＣεが細胞質ゾル中のＨＤＡＣ６の保持に必要とされることを示している。
【０１６４】
[00130]ＰＫＣε遺伝子サイレンシングの研究は、ＡｐｏＥを介したＨＤＡＣの核−細胞質間輸送がＰＫＣεによって調節されるさらなる証拠を提供した。ＰＫＣε−ｓｉＲＮＡをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入した。これらのＰＫＣεノックダウン細胞をＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置した。
【０１６５】
[00131]図６Ｈに例示したように、ＡｐｏＥ３＋ＣｈｏｌによるＨＤＡＣ４核輸出（正常細胞中の５２．６±５．４％；ｔ検定、ｐ＜０．０１対２６．６±３．８％）を、ＰＫＣεノックダウンにおいて止めた。遺伝子サイレンシングによる細胞ＰＫＣε合成の阻害は、核中のＨＤＡＣ６レベルに及ぼすＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌの影響も止めた（正常細胞中の３７．９±２．１％；ｔ検定、ｐ＜０．００２対１９．７±１．１％；図６Ｉ）。
【０１６６】
[00132]ブリオスタチンおよびＢＲ−１２２（ブリオスタチンの類似体）は、ＰＫＣの活性化因子である。ＢＲ−１２２は、一次ニューロン中のＰＫＣεレベルを増加させたが、ブリオスタチンの単回静脈注射が、ＰＫＣε発現を活性化し、マウスの脳内のＰＫＣεレベルを増加させるかを観察した。図１０および１１それぞれを参照されたい。
【０１６７】
[00133]相ＩＩａ臨床試験からのデータは、ブリオスタチンの投与が、ＰＫＣεの合成を増加させることを示した。図１２および１３に例示したように、ＰＫＣεレベルは、ブリオスタチンを投与してから１時間後に最も高い。具体的に、図１４に例示したように、ＰＫＣεレベルの増加は、ブリオスタチン注射を受けた対象におけるブリオスタチンレベルの生理的増加と相関する。
【０１６８】
[00134]さらなる研究は、ｈＡｐｏＥ３を発現するマウスにおいて、全ＰＫＣパーセンテージの上昇によって示されるように、ＰＫＣが構造的に活性化されたことを示した。図１５を参照されたい。一方、全ＰＫＣレベルは、ｈＡｐｏＥ４を発現するマウスではかなり低かった。
ＡｐｏＥ３はＢＤＮＦ発現を調節する−神経変性病理の軽減における影響
[00135]ＢＤＮＦは、神経保護の役割を果たすことが知られている。実際、近年の研究は、記憶に関連する障害におけるＡｐｏＥおよびＢＤＮＦに対する追加の効果を示した（Ｋａｕｐｐｉら、Ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＡＰＯＥ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ、８９：３０６〜３１３、２０１４；Ｌｉｍら、ＡＰＯＥ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２０１４）。
【０１６９】
[00136]上記の通り、ＡｐｏＥ３は、ラットの一次ニューロン（Ｓｅｎら、２０１２）およびヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中でＰＫＣε発現を誘発する。しかし、ＰＫＣεは、ＢＤＮＦ発現を調節することが知られている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１；ＬｉｍおよびＡｌｋｏｎ、２０１２；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１３；ならびにＮｅｕｍａｎｎら、２０１５）。これらの発見から、本発明者らは、ＡｐｏＥ３が、ＢＤＮＦ発現の調節に関与し得ると仮定した。
【０１７０】
[00137]ＡｐｏＥアイソフォーム、ＰＫＣε、ＨＤＡＣおよびＢＤＮＦの間の結合を描写するために、本発明者らは、半定量ＲＴ−ＰＣＲ（完全長；図７Ａ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ（図７Ｂ）によってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のプライマーを使用してＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現を測定した。コレステロール単体で処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＢＤＮＦ発現に変化を示さなかった（図７Ａ）。しかし、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌで処置した細胞は、ＢＤＮＦ発現の増加を示したが（１．７６＿０．１３；ｔ検定、ｐ＿０．００１）、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌは、ＢＤＮＦ発現を下方制御した（０．７４＿０．０５；ｐ＿０．０２；図７Ｂ）。
【０１７１】
[00138]ＰＫＣεが、ＢＤＮＦ発現を調節する上でＡｐｏＥ３と同じくらい有効である、さらなるサポートが、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、すなわち、ＰＫＣε特異的活性化因子（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９；Ｓｅｎら、２０１２）が、コレステロール処置細胞（１．９１±０．２１倍）中のＢＤＮＦ発現を上方制御するという観察によって提供される。実際、ＢＤＮＦ発現は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥによって、ＡｐｏＥ３とほぼ同程度まで上方制御された。
【０１７２】
[00139]本発明者らによるさらなる研究は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥが、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処置した細胞中でのＢＤＮＦ下方制御を防止した（０．９５±０．１；ｐ＜０．０５）ことを示した。結果として、本開示は、ＡｐｏＥ調節に関連した神経変性状態の作用を減弱させるまたは治療するための医療としてＰＫＣ活性化因子を使用する。
【０１７３】
[00140]さらなる実験の中で、ＡｐｏＥ３およびＤＣＰＬＡ−ＭＥの組み合わせで細胞を処置し、この実験は、ＡｐｏＥ３およびＤＣＰＬＡ−ＭＥへの効果を促進するＢＤＮＦ発現が、追加されなかったことを示した。
【０１７４】
[00141]先行研究は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子を保有する患者のＢＤＮＦレベルが低下したことを示した（Ｍａｉｏｌｉら、２０１２；Ａｌｖａｒｅｚら、２０１４）。しかし、ＡｐｏＥ４がニューロン中のＢＤＮＦ発現を下方制御するための機構は知られていなかった。本発明者らは、ＡｐｏＥ４が、ＨＤＡＣ６−ＢＤＮＦ  ＰＩＩＩ／ＰＩＶ会合を誘発することによってニューロン中のＢＤＮＦ発現を下方制御するかを探査した。ＡｐｏＥによるＢＤＮＦ発現の調節におけるＢＤＮＦプロモーターの役割を解明するために、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６またはＩｇＧ（対照）を使用して、コレステロール、ＡｐｏＥアイソフォーム、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥで処置したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から染色体免疫沈降を行った。固定比率（２％）の全未沈降ＤＮＡ（陽性対照使用、結果の正規化のために使用）または１００％のＨＤＡＣもしくはＩｇＧ免疫沈降ＤＮＡが、ＢＤＮＦプロモーターＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶおよびＰＩＸに対するＰＣＲによって増幅された。ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６（図７Ｃ）は、ＰＩ、ＰＩＩまたはＰＩＸへの会合を示さなかった。コレステロールのみで処置した細胞（１．０±０．０４；Ｆ(5,24)＝５１．８；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）と比べて、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌは、ＨＤＡＣ６−ＰＩＩＩ会合を低減し（０．４１±０．０５；ｐ＜０．００１）、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌはこれを増加した（１．９±０．１３；ｐ＜０．００１）（図７Ｄ）。ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌは、ＨＤＡＣ６−ＰＩＶ会合も増加し、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌはこれも低減した。（コレステロールのみ＝１±０．１３；ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ＝０．６１±０．１０、ｐ＜０．０５；ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ＝２．１±０．２０；ｐ＜０．００１；Ｆ(5,30)＝１８．６；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１；図７Ｅ）。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＨＤＡＣ６−ＰＩＩＩおよびＨＤＡＣ６−ＰＩＶ会合におけるＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ誘発増加をブロックしたが、ＡｐｏＥ３には効果がなかった（図７Ｄ、Ｅ）。これは、ＰＫＣε合成を直接的または間接的のいずれかで阻害するＡｐｏＥ４と一致し、ＰＫＣεは、プロモーターを結合できる核へのＨＤＡＣ６輸送を阻害する。
【０１７５】
[00142]ＨＤＡＣ４はまた、ＢＤＮＦ  ＰＩＩＩおよびＰＩＶと免疫共沈降したが、処置群間の結合に有意な違いは見出されなかった（ＨＤＡＣ４−ＰＩＩＩ＝Ｆ(5,24)＝１．１；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．４；ＨＤＡＣ４−ＰＩＶ＝Ｒ(5,24)＝０．９８；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．４６；結果は示さず）。このことから、ＰＫＣε活性は、核へのＨＤＡＣ４輸送をブロックし、これによりＨＤＡＣ４がＢＤＮＦプロモーターＩＩＩおよびＩＶに結合するのを防止するが、ＨＤＡＣ４は、プロモーターに直接結合せず、転写因子、例えばＭＥＦ２ＣおよびＭＥＦ２Ｄを介して間接的に結合する。ＡｐｏＥ４は、ＰＫＣεを誘発せず、それによりＨＤＡＣを核に入れて（間接的に）ＢＤＮＦプロモーターに結合させ、それによりＢＤＮＦ発現を抑圧する。
【０１７６】
[00143]ＢＤＮＦ発現に与えるＨＤＡＣ６−ＰＩＩＩ／ＰＩＶ会合の影響を決定するために、ＢＤＮＦ−エクソンＩＩＩおよびＩＶの発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＢＤＮＦ−エクソンＩＶ発現は、ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌによって増加し、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌによって低減した（それぞれ、１．５４±０．０７倍；ｐ＜０．００２７および０．４７±０．０４倍；ｐ＜０．０００５；図７Ｇ）。ＢＤＮＦ−エクソンＩＩＩ発現は、ＡｐｏＥ４を加えたとき、低い発現に向かう傾向を示したが、統計的に有意でなかった（図７Ｆ）。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、３つすべての処置においてほぼ同じパーセンテージでエクソンＩＶ発現を増加した（Ｆ(5,21)＝４０．０；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１；ＤＣＰＬＡ−ＭＥ＋Ｃｈｏｌ＝１．８５±０．２７倍、ｐ＜０．０３５；ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ＝１．９８±０．１３、ｐ＜０．０５対ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌ；ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ＝０．７４±０．０１、ｐ＜０．０００５対ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌ；図７Ｇ）。ＡｐｏＥ４は、低減されたＢＤＮＦ発現をもたらす、ＨＤＡＣ６およびＢＤＮＦ−ＰＩＶ間の相互作用を誘発する。ＰＫＣ活性化因子は、ＢＤＮＦエクソンＩＶ発現を増加したが、エクソンＩＩＩ発現への効果はさほどなく、エクソンＩＶがＰＫＣに応答するがエクソンＩＩＩは応答しないことを示す。
【０１７７】
[00144]ＡｐｏＥ４は、ＨＤＡＣのＡＳＰＤ誘発核転座を増加させる。免疫ブロット法を用いて、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６核内への輸送に及ぼす、ＡＤ脳内に存在するＡβの神経毒形態ＡＳＰＤの効果を調べた。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＡＳＰＤの存在下または不在下で、コレステロールおよびＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４で処置した。ＡＳＰＤは、ＨＤＡＣ４とＨＤＡＣ６の両方の移入を増加させた。ＡｐｏＥ３＋Ｃｈｏｌの添加は、核内のＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６染色パーセンテージを有意に低減した（−４８．４±９．７％；ｐ＜０．０２６および−２９．３±６．９％；ｐ＜０．０１；図８Ａ）。対照的に、ＡｐｏＥ４＋Ｃｈｏｌは、ＡＳＰＤの存在下、ＨＤＡＣ４の核内輸送には効果がなく（＋５．７±１３％変化；図８Ｂ）、ＨＤＡＣ６の輸送を増加した（＋３９．４±１６．９％変化、ｐ＜０．０４）（図８Ｃ）。ＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４（１０ｎＭ）の両方およびコレステロールで処置した細胞は、中間レベルの核ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６を示した（ＨＤＡＣ４＝Ｆ(2,8)＝１４．２；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００５およびＨＤＡＣ６＝Ｆ(2,8)＝７．１５；ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０３；図８Ｂ、Ｃ）。ＡｐｏＥ３は、ＨＤＡＣの核転座へのＡＳＰＤの効果を阻害するが、ＡｐｏＥ４は阻害しない。ヒト脳海馬由来の核ＨＤＡＣ６の量も分析した。剖検で確認されたＡＤ症例は、年齢適合対照に比べて増加した核ＨＤＡＣ６を示した（ＡＤ＝７０．４±５．３％および非ＡＤ＝５６．９±２．９；ｐ＜０．０５；図８Ｄ）。
【０１７８】
[00145]ＰＫＣε活性化は、ＨＤＡＣのＡｐｏＥ４誘発核転座を阻害する。ＰＫＣε活性化の、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６のＡｐｏＥ４＋ＡＳＰＤ誘発核転座への効果を探査するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＡＳＰＤ、コレステロール、およびＡｐｏＥ４の組み合わせで２４時間処置し、免疫ブロット法によって細胞質および核内のＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６レベルを測定した。ＡＳＰＤおよびＡｐｏＥ４は、ＨＤＡＣ６に相乗効果を有していた（Ｃｈｏｌ＝１２．９±３．０％；ＡＳＰＤ＋ＡＰＯＥ４＋Ｃｈｏｌ＝３９．７±３．３％、ｐ＜０．００５；ＡＳＰＤ＋Ｃｈｏｌ＝２１．７±２．８％、ｐ＜０．０５）が、ＨＤＡＣ４にはなかった（図８Ｅ、Ｆ）。ＤＣＰＬＡ−ＭＥまたはブリオスタチン−１によるＰＫＣε活性化は、ＨＤＡＣ４の核内輸送を、それぞれ３５±６．９％（ｐ＜０．０１５）および４０±８．４％（ｐ＜０．０１３）低減した（Ｆ(6,14)＝１１．６；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１；図８Ｅ）。核ＨＤＡＣ６における同様の低減も、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（５６±５．９％低減、ｐ＜０．００５）またはブリオスタチン−１（４６±９．２％低減、ｐ＜０．０５；図８Ｆ）によって生じた。いずれの場合も、ＡＳＰＤ、ＡｐｏＥ４、または両方の組み合わせを使用したかにかかわらず、ＰＫＣ活性化は、正常以下のレベルまでＨＤＡＣ移入を低減した。
【０１７９】
[00146]最後に、ＰＫＣεおよびＢＤＮＦ  ｍＲＮＡ発現のレベル（ｑＲＴ−ＰＣＲ使用）を、これらのＡＳＰＤ処置細胞中で測定した。ＰＫＣεレベルは、ＡＳＰＤ＋Ｃｈｏｌによって下方制御された（０．５８±０．０６倍；ｐ＜０．００５）。ＡｐｏＥ３は、ＰＫＣε発現を正常まで回復したが、ＡｐｏＥ４はしなかった（０．５６±０．０９倍；ｐ＜０．０２）。ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン−１は、ＡＳＰＤ＋ＡｐｏＥ４を介したＰＫＣεの損失を打ち消した（それぞれ０．９５±０．０９倍および１．１９±０．１４％；図８Ｇ）。ＢＤＮＦも［［ＡＳＰＤ＿Ｃｈｏｌ］］ＡＳＰＤ＋Ｃｈｏｌによって下方制御された（０．６２±０．０５倍；ｐ＜０．０４；図８Ｈ）。ＡｐｏＥ４の添加は、ＡＳＰＤの効果を増加しなかった。ＡｐｏＥ３は、ＡＳＰＤによるＢＤＮＦ下方制御を防止した（１．３２±０．１９倍；ｐ＜０．０２５対ＡＳＰＤ＋Ｃｈｏｌ）。ＰＫＣε活性化は、これらの細胞中のＢＤＮＦ損失も防止した（図８Ｈ）。ＰＫＣε活性化は、ＡｐｏＥ４を介したＨＤＡＣの核転座を逆転し、それによりＢＤＮＦ合成を正常レベルまで回復する。ここで、ブリオスタチンおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥは、誘発神経変性病状の場合におけるＰＫＣεの欠失を修正した（例えばＡＳＰＤ＋ＣｈｏｌおよびＡＳＰＤ＋Ｃｈｏｌ＋ＡｐｏＥ４）。これは、ＡｐｏＥ調節と関連した神経変性状態の作用を減弱させるまたは治療する医療としてのＰＫＣ活性化因子の使用をさらに証明する。
【０１８０】
[00147]図１６は、ＰＫＣ活性化因子ブリオスタチンを受けた対象における認知の改善を例示している。例示されるように、ブリオスタチン処置対照の小認知機能検査スコア（ＭＭＳＥ）は、プラセボ処置対照のＭＭＳＥスコアより少なくとも２倍高かった。これらの結果は、ブリオスタチンが、静脈内投与後に血液脳関門を越えることができることをさらに例示する。
【０１８１】
[00148]１種以上のＰＫＣ活性化因子または一ＰＫＣ活性化因子の組み合わせを、従来の方法、例えば経口、非経口、経粘膜、経鼻、吸入、または経皮投与によって、それを必要とする患者／対象に投与してよい。非経口投与には、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、髄腔内、ＩＣＶ、嚢内注射または注入および頭蓋内投与が挙げられる。
【０１８２】
[00149]本開示は、１種以上のプロテインキナーゼＣ活性化因子またはその組み合わせおよび担体を含む組成物に関する。本開示は、少なくとも１種のプロテインキナーゼＣ活性化因子および担体からなる組成物ならびに少なくとも１種の組み合わせおよび担体からなる組成物にさらに関し、２つの組成物は、それを必要とする患者に併用投与される。一態様において、少なくとも１種のプロテインキナーゼＣ活性化因子からなる組成物は、それを必要とする患者に、組み合わせからなる組成物を投与した前後に投与してよい。
【０１８３】
[00150]ここに記載する組成物の製剤は、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって調製されてよい。一般的に、このような調製方法は、少なくとも１種の有効成分を担体と会合させることを含む。必要または要望に応じて、結果として得られる生成物は、所望の単回または反復投与用量単位に成形または包装することができる。
【０１８４】
[00151]ここで提供される組成物の説明は、原則的にヒトへの処方薬の投与に適した組成物を対象とするが、当業者は、このような組成物が、一般的に、あらゆる種類の動物への投与に適していることを理解するであろう。ヒトへの投与に適したまたはさまざまな動物への投与に適した組成物にするのに適した医薬組成物の修飾は、よく理解され、一般の熟練した獣医薬理学者は、このような修飾を、何かあるとしてもごく普通の実験によって、設計し、実行することができる。本開示の組成物を投与することが企図される対象には、これらに限定されないが、ヒトおよび他の霊長類、ならびにその他の哺乳動物が挙げられる。
【０１８５】
[00152]ここで考察されるように、担体には、これらに限定されないが、以下：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；防腐剤；生理的に分解性の組成物、例えばゼラチン；水性媒体および溶媒；油性媒体および溶媒；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、鎮痛剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗カビ剤；安定剤；ならびに薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料のうちの１つ以上が挙げられる。本開示の組成物に含むことができるその他の追加の成分は、一般的に当技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９８５、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．２０００に記載され得、両方とも参照によりここに組み込まれる。
【０１８６】
[00153]一態様において、担体は、水性または親水性担体である。さらなる態様では、担体は、水、生理食塩水、またはジメチルスルホキシドであってよい。別の態様では、担体は、疎水性担体である。疎水性担体には、包接錯体、分散体（例えば、ミセル、マイクロエマルション、およびエマルション）、ならびにリポソームが挙げられる。例示的な疎水性担体には、包接錯体、ミセル、およびリポソームが挙げられる。例えば、参照によりここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄ．、ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００３を参照されたい。これに加えて、例えば製剤を安定化させるために、他の化合物を、疎水性担体または溶液中のいずれかに含めてもよい。
【０１８７】
[00154]ここで開示する組成物は、経口、非経口、経粘膜、経鼻、吸入、または経皮経路を含めた任意の好適な経路によって、それを必要とする患者に投与してもよい。非経口経路には、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、髄腔内、および頭蓋内投与が挙げられる。好適な投与経路を選択して、血液脳関門を越えることを可能にすることができる。例えば、参照によりここに組み込まれる、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２００１）ｖｏｌ．４２、ｐｐ．６７８〜６８５を参照されたい。
【０１８８】
[00155]一態様において、ここに記載する組成物は、経口剤形に製剤化してよい。経口投与の場合、組成物は、例えば、担体、例えば結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いた従来の手段によって調製される、錠剤またはカプセルの形態をとってよい。錠剤は、当技術分野で一般に知られている方法によってコーティングされてよい。
【０１８９】
[00156]別の態様では、ここの組成物は、液体処方に製剤化される。このような処方は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってもよく、または使用前に水もしくは他の好適な媒体と構成させる乾燥製品として提示されてもよい。このような液体処方は、例えば、薬学的に許容される担体、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）を用いた従来の手段によって調製することができる。処方は、適切な緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤も含んでよい。一態様において、液体処方は、経口投与用である。
【０１９０】
[00157]本開示の別の態様では、ここの組成物は、非経口投与、例えばボーラス注入または持続注入用に製剤化されてよい。注射用の製剤は、単位剤形、例えばアンプル剤、または反復投与用量容器中に、防腐剤を添加して供給されたものでよい。組成物は、油性または水性媒体中に懸濁液、溶液、分散体、またはエマルションのような該形態をとってよく、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤を含有してよい。
【０１９１】
[00158]別の態様において、ここの組成物は、デポー製剤として製剤化してよい。このような製剤は、内移植（例えば、皮下または筋肉内）により、または筋肉内注射により投与してよい。例えば、組成物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションなど）またはイオン交換樹脂と一緒に、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化してよい。
【０１９２】
[00159]別の態様において、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせは、小胞、例えばミセル、リポソーム、または人工低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子中に送達される。例えば、米国特許第７，６８２，６２７号を参照されたい。
【０１９３】
[00160]さらなる態様において、それを必要とする患者への投与用量は、約１ｍｇ〜約１０ｇ、例えば約５ｍｇ〜約５ｇ、約５０ｍｇ〜約２ｇ、約１００ｍｇ〜約１．５ｇ、約１５０ｍｇ〜約１ｇ、または約２５０ｍｇ〜約５００ｍｇの少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせを送達するように適宜準備してよい。
【０１９４】
[00161]一態様において、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせは、組成物中に、最終製剤の約０．０１重量％〜約１００重量％、約０．１重量％〜約９０重量％、約０．１重量％〜約６０重量％、約０．１重量％〜約３０重量％、または約１重量％〜約１０重量％の範囲の量で存在してよい。別の態様では、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせは、組成物中に、約０．０１％〜約１００％、約０．１％〜約９５％、約１％〜約９０％、約５％〜約８５％、約１０％〜約８０％、および約２５％〜約７５％の範囲の量で存在してよい。
【０１９５】
[00162]本開示は、さらに、１種以上のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせを別個でまたは単一の組成物中に組み合わせて、対象に投与するために利用できるキットに関する。
【０１９６】
[00163]キットは、貯蔵および／または投与のためのデバイスを含んでよい。例えば、キットは、注射器、針、無針注射器具、滅菌パッド、スワブ、バイアル、アンプル剤、カートリッジ、瓶などを含んでよい。貯蔵および／または投与デバイスを、例えば、容量の測定を可能にするために目盛ってよい。一態様において、キットは、システム中の他の成分と分けた容器中の少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を含む。別の態様では、キットは、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子および少なくとも１つの組み合わせを別々に合わせる手段を含む。さらに別の態様では、キットは、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子およびその組み合わせを含む容器を含む。
【０１９７】
[00164]キットは、１種以上の麻酔薬、例えば局所麻酔薬も含んでよい。一態様において、麻酔薬は、すぐに使える製剤、例えば注射製剤（任意で１つ以上のあらかじめ導入された注射器中）、または局所に適用され得る製剤である。麻酔薬の局所製剤は、パッド、スワブ、タオレット、使い捨てナプキン、布、パッチ、包帯、ガーゼ、綿球、Ｑ−ｔｉｐ（商標）に適用される麻酔薬、軟膏、クリーム、ジェル、ペースト、リキッド、または任意の他の局所適用製剤の形態でよい。本開示で使用される麻酔薬には、これらに限定されないが、リドカイン、マーカイン、コカイン、およびキシロカインを挙げることができる。
【０１９８】
[00165]キットは、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子およびその組み合わせの使用に関する取扱説明書も含有してよい。別の態様では、キットは、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせの製剤の混合、希釈、または調製手順に関する取扱説明書を含有してよい。取扱説明書は、混合後、投与前に、所望のｐＨもしくはｐＨ範囲および／または所望の比活性度および／またはタンパク質濃度を得るために、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせからなる製剤を適切に希釈する指示も含み得る。取扱説明書は、服用情報も含み得る。取扱説明書は、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子またはその組み合わせで治療する対象を選択する方法を対象とする材料も含んでよい。
【０１９９】
[00166]ＰＫＣ活性化因子は、好適な用量単位の単体で製剤化することができ、製剤は、各投与経路に適した、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、補助剤および媒体を含有する。医薬組成物は、さらに、神経変性疾患の治療に、または神経変性障害の発症リスクの低下に認定されている、他の治療に有効な化合物を含んでよい。
【０２００】
[00167]適当なＰＫＣ活性化因子の投与量は、一般的に、約０．００１〜１０μｇ／ｍ2／週であり、単回または反復投与で投与することができる。例えば、投与量レベルは、約０．０１〜約２５μｇ／ｍ2／週、約１〜約２０μｇ／ｍ2／週、約５〜約２０μｇ／ｍ2／週、または約１０〜約２０μｇ／ｍ2／週になる。好適な投与量は、約５μｇ／ｍ2／週、約１０μｇ／ｍ2／週、約１５μｇ／ｍ2／週、または約２０μｇ／ｍ2／週でよい。
【０２０１】
[00168]経口投与の場合、組成物は、好ましくは、約１〜１０００マイクログラムの有効成分、特に約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７５０、８００、９００、および１０００マイクログラムの有効成分、例えばＰＫＣ活性化因子を含有する錠剤の形態で提供される。
【０２０２】
[00169]本発明による医薬組成物は、例えば、組成物を週に２、３、４または５回投与することを含む投薬計画を用いて、週に１回より多く投与することができる。特定の神経変性状態では、医薬組成物は、毎日、例えば、１日に１回、１日に２回、または定期的に、例えば毎週または隔週、２週間毎、３週間毎または４週間毎に、投与される。
【０２０３】
[00170]しかし、任意の特定の患者に向けた特定の用量および投与頻度は変動し得、製剤化した化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用の長さ、年齢、体重、総体的な健康、性別、食事、投与方法および時間、排泄率、使用した複合薬、および特定の神経変性状態の重篤度を含めたさまざまな要因によって決まる。
【０２０４】
[00171]本開示で列挙されるすべての参考文献、特許および刊行物は、参照によりそれらの全内容がこの出願に組み込まれる。
【０２０５】
[00172]以下の例は、本発明の特に好ましい態様をさらに説明するための例示目的で提供されるものであり、本発明を制限することを意図しない。
【０２０６】
［実施例］
ａ．  材料
[00173]細胞培養の培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｆ１２Ｋ、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、およびＢ２７）およびＫ．Ｄ．Ｍｅｄｉｃａｌ（ＭＥＭ）から購入した。ブリオスタチン−１は、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。ＤＣＰＬＡメチルエステル（ＤＣＰＬＡ−ＭＥ）は、前述の方法を用いて合成した（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．、３４：１３６〜１４５、２００９）。ＡｐｏＥ３（ｒｈ−ＡｐｏＥ３）、ＡｐｏＥ４（ｒｈ−ＡｐｏＥ３）、およびその他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ａβ1〜42は、Ａｎａｓｐｅｃから購入した。組み換えヒト受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓから購入し、アセチル化ヒストン３、ヒストン３、β−アクチン、ラミンＢ、およびＰＫＣεに対する一次抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、およびＨＤＡＣ６に対する一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したのに対し、すべての二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【０２０７】
ｂ．  ＡＳＰＤの合成
[00174]ＡＳＰＤは、前述の通りに調製した（Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ，ｔｏｘｉｃ，ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｂｅｔａ）ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｒｏｍ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８４：３２８９５〜３２９０５、２００９；およびＳｅｎら、２０１２、上記）。簡潔に言うと、Ａβ1〜42を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに溶解し、４℃で終夜インキュベートした。次いで、溶液を３７℃まで温め、この温度で３時間維持した。溶解したＡβ1〜42を凍結乾燥して４０ｎｍｏｌ／管を得た。凍結乾燥したＡβを、Ｃａ2+またはＭｇ2+を含まないＰＢＳに溶解して、濃度Ａβが５０μＭ未満の溶液を得た。このＰＢＳ溶液を４℃で１４時間回転し、結果として得られたＡＳＰＤ溶液を、１００ｋＤａ分子量カットオフフィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ；ミリポア）を使用して精製した。
【０２０８】
ｃ．  細胞培養および処置
[00175]ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、４５％Ｆ１２Ｋ、４５％ＭＥＭ、および１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞をコレステロール、ＡＳＰＤ、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４＋コレステロール、またはＰＫＣ活性化因子で２４時間処置した。コレステロールをエタノールに溶解した。ＡｐｏＥ（２０ｎＭ）およびコレステロール（１００μＭ）を混合して別々に培養に入れた。ＡｐｏＥ受容体をブロックするために、ＡｐｏＥを添加する前に、細胞をＲＡＰで３０分間処置した。ヒト一次ニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ポリ−Ｌ−リジンで被覆した板の上にめっきし、神経細胞成長補給剤（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が補充されたニューロンの培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で維持した。培地の半分は、３日ごとに変更され、培地が変更されるたびに、毎回、新鮮な活性化因子を添加して、生存可能なニューロンを維持した。
【０２０９】
ｄ．  遺伝子導入マウス
[00176]ＡｐｏＥ標的の置きかえのためのＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍから入手した。内在性ネズミＡｐｏＥ遺伝子を、ＡｐｏＥ３（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅtm2(APOE*3)MaeＮ８）またはＡｐｏＥ４（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅtm3(APOE*4)MaeＮ８）のヒト対立遺伝子と置きかえた。すべての実験は、年齢を適合させた雄の動物で実施した。すべての動物は、バリアー施設に入れられ、食餌および水が不断給餌され、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って維持された。
【０２１０】
ｅ．  ヒト脳組織
[00177]新鮮な凍結ヒト脳組織を、Ｆｒａｎｃｉｎｅ  Ｍ．Ｂｅｎｅの研究の承認を得た後で、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した（表２）。インフォームドコンセントをすべての患者または法定代理人から得た。ＡＤの病理学的診断は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｔｏ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＥＲＡＤ）に従って実施された。本研究は、ヒトに関与する実験についてのＣｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ヘルシンキ宣言）に従って実施された。
【０２１１】
【表２】
2018521113.tif 000035
【０２１２】
ｆ．  細胞溶解および核分画
[00178]ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞５×１０6のＰＢＳ溶液を遠心分離にかけ、結果として得られた細胞ペレットを再懸濁し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞ペレットを５００μｌの低張緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。次に、２５μｌの１０％  ＮＰ−４０を細胞懸濁液に添加し、試料を１０秒間ボルテックスした。ホモジネートを４℃で１０００×ｇにて１０分間遠心分離にかけて、細胞質分画（上澄み）および核分画（ペレット）を得た。上澄みを除去した後、核ペレットを５０μｌの完全細胞抽出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＮａＦ、０．５％デオキシコレート、２０ｍＭ  Ｎａ4Ｐ2Ｏ7、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で再懸濁し、１０分間隔でボルテックスしながら、氷上で３０分間インキュベートした。核溶解物を４℃で１４，０００×ｇにて３０分間遠心分離にかけて、核分画（上澄み）を得た。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。
【０２１３】
ｇ．  免疫ブロット解析
[00179]上澄みおよび核分画の試料中のタンパク質を、４〜２０％の勾配のトリス−グリシンジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＳＤＳＰＡＧＥによって分離した。次いでタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、室温で、ＢＳＡによって１５分間ブロックし、４℃で終夜、一次抗体と一緒にインキュベートした。インキュベートした後、膜をＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、１：１０，０００の希釈で、アルカリホスファターゼ共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒に４５分間さらにインキュベートした。インキュベートした後、膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１段階ＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して展開した。ラミンＢを核充填対照（nuclear loading control）として使用し、β−アクチンを細胞質充填対照として使用した。免疫ブロットタンパク質は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出し、我々の機関で開発されたＩＭＡＬソフトウェアを使用してデンシトメトリー定量化を実施した。転座アッセイでは、核へのＨＤＡＣ転座は、核内の全タンパク質のパーセンテージ［核／（細胞質−核）］として表した。
【０２１４】
ｈ．  免疫蛍光検査法および共焦点顕微鏡法
[00180]ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞は、８室のスライド（Ｎｕｎｃ）中で成長させた。免疫蛍光染色では、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定後、細胞をブロックし、５％血清および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１×ＰＢＳ）で３０分間透過処理した。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００希釈で３時間、一次抗体を用いてインキュベートした。インキュベートした後、スライドを再度、１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いでＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧで、１時間、１：４００希釈にてインキュベートした。インキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｐｒｏ  Ｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄアンチフェードマウンティング溶液（antifade mounting solution）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウントした。励起波長３５０ｎｍおよび４８８ｎｍを使用し、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染色）およびＦＩＴＣの発光をそれぞれ４７０ｎｍおよび５２５ｎｍで測定し、染色細胞をＬＳＭ７１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下で見た。８個の独立したウェルそれぞれからの約５〜６個の個々の細胞を、倍率６３倍でＺｅｎ２００９（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析した。核内の全タンパク質のパーセンテージを測定するために、全神経細胞体および核を、別個で、対象の領域として選択した。各チャネル、ＤＡＰＩ，およびＨＤＡＣにおける平均蛍光強度を、核およびニューロン全体について測定した。核内のＨＤＡＣ率は、核内のＨＤＡＣ（ＤＡＰＩに対して正規化）／全細胞体中のＨＤＡＣ（ＤＡＰＩに対して正規化）として表す。
【０２１５】
ｉ．  ノックダウンおよび過剰発現
[00181]ＲＮＡｉによるＬＲＰ−１の抑制は、Ｏｒｉｇｅｎｅによって設計および合成された二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｔｒｉｌｅｎｃｅｒ−２７）をヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞にトランスフェクトすることによって実施した。対照トランスフェクションは、Ｏｒｉｇｅｎｅによって提供される確定された非標的ｓｉＲＮＡと、トランスフェクション試薬のみを含有する非ヌクレオチド対照の両方を含んでいた。ＰＫＣεノックダウンは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製の３３ｎＭの３つの標的特異性１９〜２５ヌクレオチドＰＫＣεｓｉＲＮＡ構築物を使用して実施した。ＰＫＣεの過剰発現は、ヒトＰＫＣε  ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を含有するｐＣＭＶ６−ＥＮＴＲＹベクターをトランスフェクトすることによって実現した。トランスフェクションは、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から提供される指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して実施した。リポフェクタミンを添加してから６時間後に媒体を変更した。ＬＲＰ−１およびＰＫＣ発現は、トランスフェクションの７２時間後に測定した。
【０２１６】
ｊ．  ｑＲＴ−ＰＣＲ
[00182]ｑＲＴ−ＰＣＲを実行し、前述の通りに結果を分析した（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎら、Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｄａｔａ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ（Ｔ）  ｍｅｔｈｏｄ、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、３：１１０１〜１１０８、２００８；Ｓｅｎら、２０１２、上記）。オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０℃で１時間使用して全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写した。製造業者のプロトコールに従ってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）ＰＣＲ機およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用してｃＤＮＡ生成物を分析した。ＰＫＣε（フォワードプライマー：ＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＣＣ、リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＴＴ）、ＰＫＣα（フォワード：ＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＣＴＣ、リバース：ＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣ）、ＰＫＣδ（フォワード：ＡＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＡＣＴ、リバース：ＣＣＧＡＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧ）、ＧＡＰＤＨ（フォワード：ＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧ、リバース：ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡ）、およびＢＤＮＦ（フォワード：ＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧ、リバース：ＧＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣ）のプライマー（Ｏｒｉｇｅｎｅ）。
【０２１７】
[00183]ＢＤＮＦプロモーターおよびエクソン特異的プライマーを、前述の通りに使用した（Ｐｒｕｕｎｓｉｌｄら、Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＢＤＮＦ  ｌｏｃｕｓ：ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９０：３９７〜４０６、２００７）。ＢＤＮＦ−プロモーターＩ（ＰＩ）（フォワード：ＧＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＧＡＡＧ、リバース：ＣＣＧＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＣＣＡＧ）、ＢＤＮＦ−プロモーターＩＩ（ＰＩＩ）（フォワード：ＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡ、リバース：ＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＣＣＴ）、ＢＤＮＦ−プロモーターＩＩＩ（ＰＩＩＩ）（フォワード：ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧ、リバース：ＡＡＣＣＣＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＡＡＣ）、ＢＤＮＦ−プロモーターＩＶ（ＰＩＶ）（フォワード：ＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣ、リバース：ＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＣＧＣＴＧＴＣＡＴ）、ＢＤＮＦ−プロモーターＩＸ（ＰＩＸ）（フォワード：ＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＡ、リバース：ＧＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製だった。ＢＤＮＦエクソンは、ＢＤＮＦエクソン特異的フォワードプライマー（ＢＤＮＦ−エクソンＩＩＩフォワード：ＡＧＴＴＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＴＡＧＡＧ；エクソンＩＶフォワード：ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡ）およびエクソンＩＸリバースプライマー（エクソンＩＸリバース：ＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣ）を使用して増幅した。
【０２１８】
ｋ．  ＣｈＩＰ
[00184]製造業者のプロトコールに従ってＳｉｍｐｌｅＣｈＩＰ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ＩＰキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＣｈＩＰを実施した。免疫沈降を４℃で一次抗体（対照としてのＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＩｇＧ抗体）によって終夜実施した。免疫沈降したＤＮＡを、ヒトＢＤＮＦプロモーターに特異的なプライマーを使用したリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲにかけた。各単位複製配列についての累積蛍光量をｉｎｐｕｔ  ＤＮＡに正規化した。ＣｈＩＰ−ＰＣＲの生成物を、臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する２％のアガロースゲル上で分離して、増幅を検証した。
【０２１９】
ｌ．  統計分析
[00185]すべての実験は、図面の説明文に注記するように、少なくとも３通りで実行した。共焦点像では、３つの独立した実験からの６つ以上のランダムな領域を分析の対象とした。データを、平均±ＳＥＭで示す。すべてのデータは、一方向性ＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較事後試験によって分析した。有意に異なる群は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用したスチューデントｔ検定によってさらに分析した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【図１Ａ】
2018521113.tif 000036
【図１Ｂ】
2018521113.tif 000037
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2018521113.tif 000042
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018521113.tif 000048
【図１０】
2018521113.tif 000049
【図１１】
2018521113.tif 000050
【図１２】
2018521113.tif 000051
【図１３】
2018521113.tif 000052
【図１４】
2018521113.tif 000053
【図１５Ａ】
2018521113.tif 000054
【図１５Ｂ】
2018521113.tif 000055
【図１６】
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【国際調査報告】
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2018521113.tif 000058
2018521113.tif 000059
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