(57)【要約】  本開示は、バリアントＯｍｐＧポリペプチド、ＯｍｐＧバリアントポリペプチドを含む組成物、および一本鎖核酸の配列を決定するために、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを、ナノポアとして使用するための方法を提供する。バリアントＯｍｐＧナノポアは、それらが由来する親ＯｍｐＧポリペプチドに対してイオン電流ノイズを低減し、それによって、単一ヌクレオチドの分解能を用いるポリヌクレオチドのシーケンシングを可能にする。低減されたイオン電流ノイズはまた、他の単一分子検出適用、例えば、タンパク質シーケンシングにおけるこれらのＯｍｐＧナノポアバリアントの使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧの単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体であって、前記バリアントがアミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａ、ならびにアミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つまたは複数の変異を含み、前記バリアントがナノポアを形成する能力を保持する、前記単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体。
【請求項２】
配列番号２の親ＯｍｐＧの単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体であって、前記バリアントがアミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａ、およびアミノ酸Ｄ２１５の欠失を含み、前記バリアントがナノポアを形成する能力を保持する、前記単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、およびＥ３１のうち１つまたは複数の変異をさらに含む、請求項２に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項４】
配列番号２中の前記１つまたは複数のアミノ酸の前記変異が、Ｒ２１１Ｎ、Ｒ６８Ｎ、Ｙ５０Ｋ、Ｙ５０Ｎ、およびＥ１７Ｋから選択される、請求項１または３に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項５】
前記１つまたは複数のアミノ酸の前記変異が、アミノ酸置換Ｙ５０Ｋである、請求項１または３に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項６】
前記バリアントＯｍｐＧと作動可能に連結されるポリメラーゼをさらに含む、請求項１または３に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項７】
脂質層中にナノポアを形成する能力を保持する、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項８】
配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記バリアントＯｍｐＧが、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａ、ならびに
（ｉ）アミノ酸Ｄ２１５の欠失および／または
（ｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つまたは複数の変異
を含む、前記単離された核酸。
【請求項９】
検出電極に隣接する膜中のバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して核酸試料をシーケンシングするための方法であって、
（ａ）タグ付きヌクレオチドを、前記ナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチドに連結されたタグを含み、タグが前記ナノポアを利用して検出可能である；
（ｂ）前記バリアントＯｍｐＧナノポアに連結された単一ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である伸長している鎖中に組み込むステップ；および
（ｃ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの際に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合される間に、前記タグが前記ナノポアを利用して検出される；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
核酸試料をシーケンシングするためのチップであって、請求項１から１１のいずれか一項に記載の複数のバリアントＯｍｐＧナノポアを含み、前記複数のＯｍｐＧナノポアが、電極に隣接して、または近接して配置され、前記ナノポアが、個々にアドレス可能であり、前記ナノポアに付けられた単一ポリメラーゼを有し、個々のナノポアが、前記ポリメラーゼにより伸長している核酸鎖中へのヌクレオチドの組込みの際にタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出する、前記チップ。
【請求項１１】
配列番号１６のリンカー−Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ構築物を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＯｍｐＧバリアント。
【請求項１２】
配列番号２の親ＯｍｐＧの単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体であって、前記バリアントが（ｉ）アミノ酸２１６〜２２７のうち１つもしくは複数の欠失、または（ｉｉ）アミノ酸置換Ｅ２２９Ａまたは（ｉｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、Ｅ３１のうち１つもしくは複数の変異を含み、前記バリアントがナノポアを形成する能力を保持する、前記単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体。
【請求項１３】
配列番号２の親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧの単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体であって、前記バリアントがタンパク質配列のＮ末端に移動された、親ＯｍｐＧの１つまたは複数のＣ末端β鎖を含み、前記バリアントがナノポアを形成する能力を保持する、前記単離されたＯｍｐＧバリアントまたはその相同体。
【請求項１４】
検出電極に隣接する膜中のバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して核酸試料をシーケンシングするための方法であって、
（ａ）タグ付きヌクレオチドを、前記ナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチドに連結されたタグを含み、タグが前記ナノポアを利用して検出可能である；
（ｂ）前記バリアントＯｍｐＧナノポアに連結された単一ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である伸長している鎖中に組み込むステップ；および
（ｃ）請求項２７から３２のいずれか一項に記載のバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの際に前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合される間に、前記タグが前記ナノポアを利用して検出される；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
核酸試料をシーケンシングするためのチップであって、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の複数のバリアントＯｍｐＧナノポアを含み、前記複数のＯｍｐＧナノポアが、電極に隣接して、または近接して配置され、前記ナノポアが、個々にアドレス可能であり、前記ナノポアに付けられた単一ポリメラーゼを有し、個々のナノポアが、前記ポリメラーゼによる成長している核酸鎖中へのヌクレオチドの組込みの際にタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出する、前記チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]核酸およびタンパク質の配列の決定において使用するための単量体ナノポアの操作されたバリアントを提供する。
【背景技術】
【０００２】
[002]タンパク質ナノポアは、化学および生物学における基礎的な問題の研究を可能にする強力な単一分子解析ツールとなった。特に、ナノポアは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの単一生体分子の検出および解析におけるその適用の可能性のために相当な注目を集めてきた。
【０００３】
[003]単一ナノポアを使用する分子検出は、加電圧の際に細孔を流れるイオン電流または細孔にわたる電圧の調節を観察することによって達成される。典型的には、不透過性膜にまたがるナノポアを、電解質を含有する２つのチャンバーの間に配置し、電極を使用して膜をわたって電圧が加えられる。これらの状態は、細孔を通るイオン流動につながる。核酸またはタンパク質分子は、細孔を通って駆動され得、生体分子の構造的特徴を、膜を越える電流または電圧の測定可能な変化として観察する。
【０００４】
[004]ナノポアシーケンシングの課題は、単一塩基レベルでヌクレオチド配列を分解することである。個々のヌクレオチド塩基の識別を邪魔する因子の１つは、ナノポアの構造に固有であるナノポアを流れるイオン電流の揺らぎである。
【発明の概要】
【０００５】
[005]本開示は、バリアント外膜タンパク質Ｇ（ＯｍｐＧ）ポリペプチド、ＯｍｐＧバリアントポリペプチドを含む組成物ならびにバリアントＯｍｐＧポリペプチドを、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）および／またはポリマー（例えば、タンパク質）シーケンシングおよびカウンティングのためのナノポアとして使用する方法を提供する。バリアントＯｍｐＧナノポアは、それらが由来する親ＯｍｐＧポリペプチドのイオン電流ノイズを低減する。
【０００６】
[006]一態様においては、本開示は、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを提供する。一実施形態においては、配列番号２の親ＯｍｐＧの単離されたバリアントまたはその相同体を提供し、バリアントは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａならびにアミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つまたは複数の変異を含み、前記バリアントは、ナノポアを形成する能力を保持する。いくつかの実施形態においては、ＯｍｐＧバリアントは、配列番号２のＯｍｐＧに対して少なくとも７０％の同一性を有する。他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、配列番号１６のリンカー−Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ構築物を含む。
【０００７】
[007]別の実施形態においては、配列番号２の親ＯｍｐＧの単離されたバリアントまたはその相同体を提供し、バリアントは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａおよびアミノ酸Ｄ２１５の欠失を含み、細孔を形成する能力を保持する。単離されたバリアントは、配列番号２のアミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つまたは複数の変異をさらに含み得る。いくつかの実施形態においては、ＯｍｐＧバリアントは、配列番号２のＯｍｐＧに対して少なくとも７０％の同一性を有する。他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、配列番号１６のリンカー−Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ構築物を含む。
【０００８】
[008]いくつかの実施形態においては、単離されたＯｍｐＧバリアントは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失および置換Ｙ５０Ｋを含む。他の実施形態においては、ＯｍｐＧバリアントは、Ｄ２１５の欠失をさらに含む。
【０００９】
[009]別の実施形態においては、単離されたＯｍｐＧバリアントは、親ＯｍｐＧの１つまたは複数のＣ末端β鎖が、タンパク質配列のＮ末端に移動されている「円順列」を含む。一実施形態においては、Ｃ末端β鎖がＮ末端に移動され、タンパク質の新規Ｃ末端として親ＯｍｐＧの最後から２番目のβ鎖を保持する。他の実施形態においては、２つ以上のβ鎖が、Ｎ末端に移動される。任意選択で、バリアントは、タグ配列（例えば、「Ｓｐｙタグ」または「Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ：配列を含み、任意選択で、親ＯｍｐＧの最後から２番目のβ鎖から下流のＣ末端に１つまたは複数のリンカー配列（例えば、配列番号１６）をさらに含む）を含む。任意選択で、バリアントは、親ＯｍｐＧのＣ末端から移動された新規Ｎ末端β鎖と、これまで親ＯｍｐＧのＮ末端にあったβ鎖の間にリンカー配列、例えば、ＧＳＧを含む。一実施形態においては、バリアントは、配列番号２に示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧのバリアントまたはその相同体である。一実施形態においては、バリアントは、配列番号２のＣ末端からＮ末端への配列番号２のアミノ酸残基２６７〜２８０の移動を含み、任意選択で、これまでの残基２８０と、配列番号２のＮ末端の間にリンカー、例えば、ＧＳＧを有し、任意選択で、これまでの残基２６７の前にバリアントのＮ末端にメチオニン（Ｍ）残基を有し、任意選択で、バリアントのＣ末端に配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態においては、バリアントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、脂質またはポリマー層中にナノポアを形成する能力を保持する。他の実施形態においては、ＯｍｐＧバリアントは、脂質二重層にわたって印加電圧がかけられる場合にイオン電流ノイズの低減を示す。他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、配列番号２アミノ酸配列を有する親大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧと比較して、イオン電流ノイズを低減した。さらに、バリアントＯｍｐＧは、遺伝子的ポリメラーゼ融合物をさらに含み得る、例えば、単離されたＯｍｐＧバリアントは、前記バリアントＯｍｐＧと作動可能に連結されている（連結後に依然として機能的である）ポリメラーゼを含む。
【００１１】
[0011]さらに他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、単一ヌクレオチドの分解能を用いる成長している核酸鎖への前記ポリメラーゼによるヌクレオチドの組込みの検出を可能にする。
【００１２】
[0012]別の態様においては、本開示は、バリアントＯｍｐＧポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一実施形態においては、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供し、前記バリアントＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａならびに（ｉ）アミノ酸Ｄ２１５の欠失および／または（ｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つもしくは複数の変異を含む。他の実施形態においては、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２のＯｍｐＧに対して少なくとも７０％の同一性を有するバリアントをコードする。他の実施形態においては、ポリヌクレオチド配列は、ＯｍｐＧ円順列バリアント、例えば、上記のような配列番号２の円順列バリアントまたはその相同体、例えば、配列番号１７をコードする。
【００１３】
[0013]別の態様においては、本明細書において開示されるようなバリアントＯｍｐＧポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態においては、発現ベクターは、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記バリアントＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａならびに（ｉ）アミノ酸Ｄ２１５の欠失、すなわちｄｅｌ２１５および／または（ｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つもしくは複数の変異を含む。別の実施形態においては、発現ベクターは、ＯｍｐＧ円順列バリアント、例えば、上記のような配列番号２の円順列バリアントまたはその相同体、例えば、配列番号１７をコードするポリヌクレオチド配列をコードする核酸を含む。
【００１４】
[0014]別の態様においては、本明細書において記載されるＯｍｐＧバリアントを発現する発現ベクターを含む宿主微生物を提供する。一実施形態においては、宿主微生物は、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含み、前記バリアントＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａならびに（ｉ）アミノ酸Ｄ２１５の欠失および／または（ｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つもしくは複数の変異を含む。別の実施形態においては、宿主微生物は、ＯｍｐＧ円順列バリアント、例えば、上記のような配列番号２の円順列バリアントまたはその相同体、例えば、配列番号１７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【００１５】
[0015]別の態様においては、宿主細胞においてバリアントＯｍｐＧを産生するための方法を提供する。一実施形態においては、方法は、ａ）宿主細胞を、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換するステップであって、前記バリアントＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数の欠失、アミノ酸置換Ｅ２２９Ａならびに（ｉ）アミノ酸Ｄ２１５の欠失および／または（ｉｉ）アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６およびＥ３１のうち１つもしくは複数の変異を含む、ステップと、ｂ）バリアントＯｍｐＧの産生に適した条件下で宿主細胞を培養するステップとを含む。別の実施形態においては、方法は、ａ）宿主細胞を、ＯｍｐＧ円順列バリアント、例えば、上記のような配列番号２の円順列バリアントまたはその相同体、例えば、配列番号１７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて形質転換するステップと、ｂ）バリアントＯｍｐＧの産生に適した条件下で宿主細胞を培養するステップとを含む。他の実施形態においては、方法は、産生されたバリアントを回収するステップをさらに含む。
【００１６】
[0016]別の態様においては、バリアントＯｍｐＧナノポアを利用して核酸試料をシーケンシングするための方法を提供する。一実施形態においては、方法は、（ａ）タグ付きヌクレオチドを、バリアントＯｍｐＧナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、このタグは、前記ナノポアを利用して検出可能である、ステップと、（ｂ）前記バリアントＯｍｐＧナノポアに連結された単一ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である成長している鎖中に組み込むステップと、（ｃ）バリアントＯｍｐＧナノポアを利用して、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの際に、個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合される間に、タグがバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して検出される、ステップとを含む。
【００１７】
[0017]別の態様においては、核酸試料をシーケンシングするためのチップを提供する。一実施形態においては、チップは、本明細書において開示される複数のバリアントＯｍｐＧナノポアを含み、複数のＯｍｐＧナノポアは、電極に隣接して、または近接して配置され、前記ナノポアは、個々にアドレス可能であり、ナノポアに付けられた単一ポリメラーゼを有し、個々のナノポアは、ポリメラーゼによる成長している核酸鎖中へのヌクレオチドの組込みの際に、タグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出する。
【００１８】
[0018]別の態様においては、組成物を提供する。一実施形態においては、組成物は、複数のポリメラーゼ酵素を含み、各々は、鋳型核酸と複合体を形成しており、各ポリメラーゼ酵素は、本明細書において開示されるようなバリアントＯｍｐＧナノポアに付けられているか、またはバリアントＯｍｐＧナノポアに近接して付けられており、核酸シーケンシング試薬は、少なくとも１つのタグ付きヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】[0019]図１Ａは、リボン構造としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する野生型ＯｍｐＧ細孔の構造を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、表面描写としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する野生型ＯｍｐＧ細孔の構造を示す図である。ＯｍｐＧナノポアの収縮帯域が示されている。
【図２】[0020]電気刺激を制御するための、および解析分子の電気性状を検出するためのナノポアデバイスにおいて使用される回路の実施形態の模式図である。
【図３Ａ】[0021]ナノポアデバイスアレイを含むチップの実施形態の模式図である。図３Ａには斜視図が示されている。
【図３Ｂ】ナノポアデバイスアレイを含むチップの実施形態の模式図である。図３Ｂには、チップの断面図が示されている。
【図４Ａ】[0022]アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ（ΔＬ６／Ｅ２２９Α）（（配列番号５）において示されるように）およびアミノ酸置換Ｙ５０Ｋ（配列番号６）を含むＯｍｐＧバリアントの、印加された定電圧で得られた単一チャネル電流トレースを示す図である。
【図４Ｂ】アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ（ΔＬ６／Ｅ２２９Α）（（配列番号５）において示されるように）およびアミノ酸置換Ｒ６８Ｎ（配列番号７）を含むＯｍｐＧバリアントの、印加された定電圧で得られた単一チャネル電流トレースを示す図である。
【図４Ｃ】アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ（ΔＬ６／Ｅ２２９Α）（（配列番号５）において示されるように）およびアミノ酸置換Ｒ２１１Ｎ（配列番号８）を含むＯｍｐＧバリアントの、印加された定電圧で得られた単一チャネル電流トレースを示す図である。
【図４Ｄ】アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ（ΔＬ６／Ｅ２２９Α）（（配列番号５）において示されるように）およびアミノ酸置換Ｅ１７Ｋ（配列番号９）を含むＯｍｐＧバリアントの、印加された定電圧で得られた単一チャネル電流トレースを示す図である。
【図４Ｅ】アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ（ΔＬ６／Ｅ２２９Α）（（配列番号５）において示されるように）およびアミノ酸欠失ｄｅｌ２１５（配列番号１０）を含むＯｍｐＧバリアントの、印加された定電圧で得られた単一チャネル電流トレースを示す図である。
【図５Ａ】[0023]ΔＬ６／Ｅ２２９Α（配列番号５）およびアミノ酸置換ΔＬ６／Ｅ２２９Α−Ｙ５０Ｋ（配列番号６）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ６８Ｎ（配列番号７）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ２１１Ｎ（配列番号８）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｅ１７Ｋ（配列番号９）およびアミノ酸欠失ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）；（ｄｅｌ２１５））；ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５−Ｙ５０Ｋ（配列番号１１）のＯｍｐＧバリアントの各々について決定された、平均開口チャネル（ＯＣ）電流（黒色バー）ならびに高い方向および低い方向の両方における平均開口チャネルの１標準偏差より大きい事象のパーセンテージを示す図である。
【図５Ｂ】ΔＬ６／Ｅ２２９Α（配列番号５）およびアミノ酸置換ΔＬ６／Ｅ２２９Α−Ｙ５０Ｋ（配列番号６）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ６８Ｎ（配列番号７）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ２１１Ｎ（配列番号８）、ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｅ１７Ｋ（配列番号９）およびアミノ酸欠失ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）；（ｄｅｌ２１５））；ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５−Ｙ５０Ｋ（配列番号１１）のＯｍｐＧバリアントの各々について決定された、黒（黒色バー）の平均開口チャネル電流および低い方向のみ（下降電流のみ）における平均開口チャネルの１標準偏差より大きい事象のパーセンテージを示す図である。
【図６】[0024]タグ付きヌクレオチドの各々が、バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって検出されるときの、ベースライン開口チャネル直流の変化として示される４種の異なるタグ付きヌクレオチドの混合物の単一ヌクレオチド分解能を示す図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図７Ａ】[0025]４種のタグ付きヌクレオチドの各々のベースライン開口チャネル電流の別個の変化として、バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって図６において検出されたタグ付きヌクレオチドの各々の同定を示す図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図７Ｂ】４種のタグ付きヌクレオチドの各々のベースライン開口チャネル電流の別個の変化として、バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって図６において検出されたタグ付きヌクレオチドの各々の同定を示す図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図７Ｃ】４種のタグ付きヌクレオチドの各々のベースライン開口チャネル電流の別個の変化として、バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって図６において検出されたタグ付きヌクレオチドの各々の同定を示す図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図７Ｄ】４種のタグ付きヌクレオチドの各々のベースライン開口チャネル電流の別個の変化として、バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって図６において検出されたタグ付きヌクレオチドの各々の同定を示す図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図８】[0026]バリアントＯｍｐＧナノポアΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）によって検出されるように図６において示される４種の異なるタグ付きヌクレオチドの混合物の単一ヌクレオチド分解能の拡大図である。測定は、直流（ＤＣ）を適用して行った。
【図９Ａ】[0027]大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯｍｐＧの細菌膜タンパク質相同体のタンパク質アラインメントを示す図である（出現の順に、それぞれ、配列番号１および１２〜１５）。
【図９Ｂ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯｍｐＧの細菌膜タンパク質相同体のタンパク質アラインメントを示す図である（出現の順に、それぞれ、配列番号１および１２〜１５）。
【図９Ｃ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯｍｐＧの細菌膜タンパク質相同体のタンパク質アラインメントを示す図である（出現の順に、それぞれ、配列番号１および１２〜１５）。
【図９Ｄ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯｍｐＧの細菌膜タンパク質相同体のタンパク質アラインメントを示す図である（出現の順に、それぞれ、配列番号１および１２〜１５）。
【図９Ｅ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯｍｐＧの細菌膜タンパク質相同体のタンパク質アラインメントを示す図である（出現の順に、それぞれ、配列番号１および１２〜１５）。
【図１０Ａ】[0028]図１０Ａは、ＯｍｐＧ逆平行β鎖を模式的に示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＯｍｐＧ逆平行β鎖の円順列バリアントの実施形態を模式的に示す図である。
【図１１】[0029]ナノポアタンパク質の収縮部位に対して、野生型親ＯｍｐＧ対本明細書において記載されるような円順列バリアントにおけるＯｍｐＧのＣ末端の配置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0030]本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細な説明を、本発明の原理を例示する添付の図面とともに以下に提供する。本発明は、このような実施形態に関連して記載されるが、本発明は、任意の実施形態に制限されない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ制限され、本発明は、多数の代替物、改変および等価物を包含する。多数の特定の詳細が、本発明の徹底的な理解を提供するために以下の説明に記載される。これらの詳細は、例を目的として提供され、本発明は、これらの特定の詳細の一部または全てを含まず、特許請求の範囲に従って実行され得る。明確にする目的のために、本発明が不必要に不明瞭にされないように、本発明と関連する技術的分野において公知である技術的材料は、詳述されていない。
【００２１】
[0031]グラム陰性菌の外膜（ＯＭ）は、細胞の成長および機能にとって必要なイオンおよび栄養物の取込みを媒介する多数のチャネルタンパク質を含有する。α−溶血素およびＣｌｙＡなどの他の多量体タンパク質性ナノポアと対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の外膜タンパク質Ｇ（ＯｍｐＧ）は、モノマーとして機能する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＯｍｐＧの結晶構造は、決定されている（Ｓｕｂｂａｒａｏおよびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３６０：７５０〜７５９［２００６］）。構造は、ＯｍｐＧバレルは、細胞外の側の７つの可動性ループによって接続された１４のβ鎖およびペリプラズム側の７つの短いターンからなることを示す（図１Ａ）。ＯｍｐＧチャネルは、ペリプラズム出口でその最大直径を有し（２０〜２２Å）、細胞外側の近くに位置する収縮に向けて次第に小さくなる（図１Ｂ）。収縮は、バレル壁の内向きの残基の側鎖によって形成され、内向きにフォールディングする表面ループによってではない。この構造は、丸い形状の約１３Åの直径を有する比較的大きな中心細孔を生じさせる。
【００２２】
[0032]電流が、野生型ＯｍｐＧナノポアを越えて測定される場合には、ナノポアは、加電圧の際に開口および閉鎖状態の間を自発的に移行し、これが、ちらつく単一チャネル電流を生じさせる。ＯｍｐＧの最長の細胞外ループ、ループ６は、低ｐＨで細孔を閉じ、高ｐＨで細孔を開放する主なゲート開閉ループとして認識された。
【００２３】
[0033]本開示は、バリアントＯｍｐＧポリペプチド、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを含む組成物およびバリアントＯｍｐＧポリペプチドを一本鎖核酸の配列を決定するためのナノポアとして使用するための方法を提供する。バリアントＯｍｐＧナノポアは、それらが由来する親ＯｍｐＧポリペプチドのイオン電流ノイズを低減し、それによって、単一ヌクレオチド分解能を用いるポリヌクレオチドのシーケンシングが可能になる。低減したイオン電流ノイズはまた、他の単一分子検出適用、例えば、タンパク質シーケンシングにおけるこれらのＯｍｐＧナノポアバリアントの使用も提供する。
【００２４】
[0034]定義
[0035]本明細書においては、「バリアント」という用語は、別の（すなわち、親の）ＯｍｐＧに由来し、親ＯｍｐＧと比較して１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸欠失、挿入または置換）を含有するＯｍｐＧを指す。
【００２５】
[0036]本明細書においては、「単離された」という用語は、通常、例えば分子の自然環境で会合している少なくとも１種の他の分子から分離されている分子、例えば、核酸分子を指す。単離された核酸分子としては、その核酸分子を通常発現する細胞に含有された核酸分子が挙げられるが、その核酸分子は、染色体外、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００２６】
[0037]本明細書においては、「変異」という用語は、親配列に導入された変更を指し、その変更としては、置換、挿入、欠失（切り詰めを含める）が挙げられるが、これらに限定されない。変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質では見出されない新しい特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
[0038]本明細書においては、「野生型」という用語は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
[0039]本明細書においては、「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素含有複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットを指す。塩基はグリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’位または５’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書においては典型的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼び、本明細書においては、左から右への方向が、５’末端から３’末端への従来の方向になっている式によって表す。
【００２８】
[0040]本明細書においては、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用され、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成されたポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【００２９】
[0041]本明細書においては、「ポリメラーゼ」という用語は、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素を指す。ポリメラーゼという用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を包含する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型と相補的であるデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。
【００３０】
[0042]本明細書においては、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えばプライマー延長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖が合成される核酸鎖を指す。
[0043]「鋳型依存的な方式」という用語は、鋳型依存的なプライマー分子の延長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、典型的には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対形成の周知の規則によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照のこと）。
【００３１】
[0044]「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい検出可能な部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができる。タグは、ナノポアを通る電流の流れを遮断し得る。
【００３２】
[0045]本明細書においては、「ナノポア」という用語は、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられた細孔、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜などの合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などの検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。一部の例においては、ナノポアは、０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。ＯｍｐＧは、タンパク質ナノポアの例である。
【００３３】
[0046]「自発性ゲート開閉」という用語は、チャネルの固有の構造変化と関連するイオン電流の変化を指す。例えば、平面状脂質二重層中のＯｍｐＧは、細孔の開口および閉鎖状態の間でｐＨ依存性の急速な揺らぎを受け、これは、電流記録の激しい「ちらつき」となっており、チャネルの全体的ノイズに寄与する。
【００３４】
[0047]本明細書においては、「ノイズ」および「イオン電流ノイズ」という用語は、互換的に使用され、自発性ゲート開閉によって寄与される電流揺らぎおよびナノポアバレルの固有の構造によって寄与される電流揺らぎを含む、電気シグナルのランダムな揺らぎを指す。例えば、ナノポアバレルの三次構成は、ナノポアによって感知されている解析物の２以上の認識部位を含み得、それによって、チャネルの全体的なノイズに寄与するさらなるシグナルを誘導する。
【００３５】
[0048]本明細書においては、「上昇ノイズ」という用語は、平均開口チャネル電流より大きいレベルへのイオン電流の揺らぎを指す。
[0049]本明細書においては、「下降ノイズ」という用語は、平均開口チャネル電流より低いレベルへのイオン電流の揺らぎを指す。
【００３６】
[0050]本明細書においては、「正電流」という用語は、正電荷、例えば、Ｋ＋が細孔を通ってトランスからシス側に移動する、または負電荷、例えば、Ｃｌ−がシスからトランス側に移動する電流を指す。例えば、図２を参照して、シスは、１０６に対応し、トランスは、１１６に対応する。
【００３７】
[0051]本明細書においては、「収縮アミノ酸」という用語は、収縮帯域でのＯｍｐＧ細孔の大きさを決定するアミノ酸を指す。収縮帯域は、野生型ＯｍｐＧの収縮帯域と同一であり得るか、または収縮帯域は、タンパク質工学を介して、もしくは分子アダプターの導入によって導入される収縮帯域であり得る。
【００３８】
[0052]本明細書においては、「親の」または「親」という用語は、本明細書において開示されるＯｍｐＧバリアントを産生するために修飾、例えば、置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、および／または切り詰め（複数可）が行われるＯｍｐＧを指す。この用語はまた、バリアントが比較され、整列されるポリペプチドを指す。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドであり得る、または親は、任意の適した手段によって調製されるそのバリアントであり得る。好ましい実施形態においては、「親の」タンパク質は、互いの相同体である。
【００３９】
[0053]本明細書においては、「精製された」という用語は、分子が、含有されている試料の少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在するポリペプチド、例えば、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを指す。
【００４０】
[0054]本明細書においては、「ヌクレオチド類似体」という用語は、一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミジンのヌクレオシド三リン酸の類似体、例えば、（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｇＮＴＰ）を指す（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７［２００６］）。また、ヌクレオシド四リン酸、ヌクレオシド五リン酸およびヌクレオシド六リン酸も包含される。
【００４１】
[0055]本明細書においては、「タグ付きヌクレオチド」という用語は、限定されるものではないが、ヌクレオチドのリン酸（例えば、末端リン酸）、糖または窒素含有塩基部分を含む、ヌクレオチドの任意の位置に連結したタグ（またはタグ種）を含むヌクレオチドを指す。タグは、１つもしくは複数の原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができ、その性状は、ナノポアを利用して検出することができる（ＵＳ２０１４／０１３６１６）。タグはまた、ＵＳ２０１４／０１３６１６の図１３に示されるようにポリリン酸に付けられ得る。
バリアントＯｍｐＧポリペプチド
[0056]一態様においては、本開示は、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを提供する。バリアントＯｍｐＧポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の親ＯｍｐＧ、例えば、配列番号２に示される親ＯｍｐＧから誘導され得る。親ＯｍｐＧは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の親ＯｍｐＧの相同体であり得る。
【００４２】
[0057]大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種Ｋ１２株ＯｍｐＧ（配列番号２）が、本明細書においてバリアントＯｍｐＧを論じるための出発点として使用されるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種Ｋ１２株ＯｍｐＧに対して高度の相同性を有する他のグラム陰性菌ＯｍｐＧは、本明細書において開示される組成物および方法の範囲内の親ＯｍｐＧとして役立ち得るということは認められよう。これは、本開示の対象である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種Ｋ１２株ＯｍｐＧと比較してわずかな配列相違しか含まず、置換、欠失、および／または挿入を含まない他の天然由来の細菌ＯｍｐＧに特に当てはまる。例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の種およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種において発現されるＯｍｐＧ相同体が、バリアント形態が誘導され得る親ＯｍｐＧポリペプチドとして使用され得る。いくつかの実施形態においては、ナノポアは、ミトコンドリア膜に由来する細孔である。
【００４３】
[0058]大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の親ＯｍｐＧの相同体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＯｍｐＧと配列同一性を共有し得る（少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列番号１）。例えば、バリアントＯｍｐＧは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の親ＯｍｐＧに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧの相同体に由来し得る。いくつかの実施形態においては、親ＯｍｐＧは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種Ｋ１２株由来のＯｍｐＧである。全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧのポリペプチド配列（配列番号１）ならびにシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（配列番号１２）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）（配列番号１３および１４）およびシトロバクター・ファルメリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆａｒｍｅｒｉ）（配列番号１５）由来の相同体の例を、図９に提供する。配列番号２は、配列番号１に示される全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧポリペプチドの成熟形態である。
【００４４】
[0059]いくつかの実施形態においては、親ポリペプチドは、野生型ＯｍｐＧポリペプチドである。他の実施形態においては、親ポリペプチドは、イオン電流ノイズを低減するＯｍｐＧポリペプチドの能力を改善するためにさらなる変異が導入され得るＯｍｐＧバリアントである。バリアントＯｍｐＧは、ナノポアを形成する能力を保持する。一実施形態においては、親ＯｍｐＧポリペプチドは、配列番号１の野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧポリペプチドまたはその成熟形態（配列番号２）である。Ｎ末端Ｍｅｔを有するバリアントＯｍｐＧポリペプチドが発現され得るということは理解される。
【００４５】
[0060]別の実施形態においては、親ＯｍｐＧポリペプチドは、ループ６を含むアミノ酸が欠失されるバリアントＯｍｐＧポリペプチドである。例えば、親ＯｍｐＧは、ループ６を含むアミノ酸が欠失されている配列番号２のＯｍｐＧである。配列番号３のＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７が欠失されており、アミノ酸２２９がＡｌａによって置換される、すなわち、Δ２１６〜２２７／Ｅ２２９Ａを含む野生型ＯｍｐＧ（配列番号２）の成熟形態である。配列番号３は、本明細書において別の場所で記載されるようなリンカー−Ｈｉｓ６−リンカー−Ｓｐｙタグ配列（配列番号１８として開示される「Ｈｉｓ６」）を示すアミノ酸の配列をＣ末端に含む。ループ６の欠失およびアミノ酸２２９でのＡｌａの置換、すなわち、Δ２１６〜２２７／Ｅ２２９Αを含むバリアントＯｍｐＧは、ΔＬ６／Ｅ２２９Αによって互換的に示される。いくつかの実施形態においては、ループ６の切り詰めは、配列番号２のアミノ酸２１６〜２２７のうち１つまたは複数を欠失することによって行われ得る。他の実施形態においては、アミノ酸２１６〜２２７（両端を含む）が欠失される。アミノ酸の番号付けは、配列番号２のアミノ酸位置を指す。
【００４６】
[0061]一実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、アミノ酸２１６〜２２７の欠失、すなわち、Δ２１６〜２２７を含む配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントである。さらなる実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、Ｅ２２９Ａを含む、すなわち、Δ２１６〜２２７／Ｅ２２９Ａを含む。なおさらなる実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、Ｄ２１５の欠失を含む、すなわち、Δ２１５〜２２７／Ｅ２２９Αを含む。
【００４７】
[0062]細胞外表面のＯｍｐＧ細孔の収縮帯域のアミノ酸（ナノポアの最小の「難点」）は、ＯｍｐＧの収縮の裏層の対称性および／または長さに寄与するとして同定される。いくつかの実施形態においては、収縮帯域アミノ酸は、収縮の長さおよび／または収縮の内径の幅でさえも短くするように変異され得る。収縮アミノ酸の突然変異誘発は、独特の収縮帯域を創造するように設計され得る。収縮帯域の変異は、バリアントが由来する親ＯｍｐＧと比較した場合に、バリアントＯｍｐＧのイオン電流ノイズを低減する。したがって、いくつかの実施形態においては、提供されるバリアントＯｍｐＧポリペプチドは、ＯｍｐＧナノポアの細胞外側の収縮帯域に位置するアミノ酸の１つまたは複数の変異を含む。他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧポリペプチドは、細孔中にありながら、細孔を通る解析物、例えば、ヌクレオチド塩基の移動を減速し、結果的に、解析物の同定の正確性を改善する分子アダプターと結合するようにさらに変異され得る（２００５年１２月３０日にオンラインで公開されたＡｓｔｉｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０．１０２１／ｊａ０５７１２３＋）。
【００４８】
[0063]いくつかの実施形態においては、収縮帯域における変異、例えば、配列番号２に示されるＯｍｐＧの変異は、アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、および／またはＥ３１から選択される。収縮帯域のアミノ酸の変異は、置換、欠失または挿入のうち１つまたは複数、例えば、アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、および／またはＥ３１のうち１つまたは複数の置換であり得る。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのアミノ酸変異は、ＯｍｐＧの収縮帯域中に位置する。他の実施形態においては、収縮帯域の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのアミノ酸が変異される。いくつかの実施形態においては、収縮帯域の少なくとも１つのアミノ酸変異は、置換Ｙ５０Ｋである。いくつかの他の実施形態においては、収縮帯域の少なくとも１つのアミノ酸変異は、置換Ｙ５０Ｎである。収縮帯域の少なくとも１つのアミノ酸変異は、ループ６のアミノ酸のうち１つまたは複数の欠失と組み合わされ得る。したがって、いくつかの実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、親ＯｍｐＧ、例えば、配列番号２に示されるＯｍｐＧに由来し、アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸２２９でのＡｌａの置換、すなわち、Δ２１６〜２２７／Ｅ２２９Αならびに野生型ＯｍｐＧの収縮帯域の少なくとも１つのアミノ酸の変異、例えば、アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、および／またはＥ３１のうち１つまたは複数の変異を含む。他の実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、ループ６の欠失、収縮帯域の１つまたは複数のアミノ酸の変異および欠失Ｄ２１５を含む。例えば、バリアントＯｍｐＧは、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントであり、アミノ酸２１６〜２２７の欠失およびアミノ酸２２９のＡｌａの置換、すなわちΔ２１６〜２２７／Ｅ２２９Ａ、収縮帯域のアミノ酸のうち少なくとも１つの変異、例えば、アミノ酸Ｒ２１１、Ｅ１５、Ｒ６８、Ｙ５０、Ｅ１５２、Ｅ１７４、Ｅ１７、Ｄ２１５、Ｙ２５９、Ｋ１１４、Ｅ１７４、Ｆ６６、および／またはＥ３１のうち１つまたは複数の変異ならびにｄｅｌ２１５を含む。一実施形態においては、バリアントＯｍｐＧは、配列番号２の親ＯｍｐＧのバリアントであり、アミノ酸２１６〜２２７の欠失、すなわちΔ２１６〜２２７、置換Ｅ２２９Ａ、Ｄ２１５の欠失およびアミノ酸置換Ｙ５０Ｋを含む。
【００４９】
[0064]いくつかの実施形態においては、親ＯｍｐＧのＣ末端β鎖が、タンパク質配列のＮ末端に移動され、親ＯｍｐＧの最後から２番目のβ鎖を、タンパク質の新規Ｃ末端として保持するＯｍｐＧの「円順列バリアント」を提供する。これは、図１０および１１において模式的に表されている。この方法におけるＣ末端β鎖の移動の結果は、バリアントの新規Ｃ末端が、バリアントが由来した親ＯｍｐＧにおけるものよりもナノポアの収縮部位に近いということである（図１１を参照のこと）。収縮点に近いことは、ナノポアによる解析分子の捕獲の改善を可能にするので有利である。この改善された捕獲は、ナノタグ（ＮａｎｏＴａｇ）を通り抜けるエネルギー障壁の低下によるものであり得る。脂質またはポリマー層の反対側にＮ末端およびＣ末端を配置することはまた、２種の核酸修飾酵素の結合、ナノポアを用いた機器のスループットを倍加することを可能にする。
【００５０】
[0065]任意選択で、本明細書において記載されるような円順列バリアントは、タグ配列（例えば、「Ｓｐｙタグ」または「Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ」配列を含み、任意選択で、１種または複数のリンカー配列（例えば、配列番号１６）をＣ末端、親ＯｍｐＧの最後から２番目のβ鎖の下流にさらに含む）を含む。任意選択で、バリアントは、親ＯｍｐＧのＣ末端から移動された新規Ｎ末端β鎖と、これまで親ＯｍｐＧのＮ末端にあったβ鎖の間にリンカー配列、例えば、ＧＳＧを含む。一実施形態においては、バリアントは、配列番号２に示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｍｐＧのバリアントまたはその相同体である。一実施形態においては、バリアントは、配列番号２のアミノ酸残基２６７〜２８０の、配列番号２のＮ末端への移動を含み、任意選択で、これまでの残基２８０と配列番号２のＮ末端の間にリンカー、例えば、ＧＳＧを有し、任意選択で、これまでの残基２６７の前にバリアントのＮ末端にメチオニン（Ｍ）残基を有し、任意選択で、バリアントのＣ末端に配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態においては、バリアントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
ＯｍｐＧバリアントをコードするＤＮＡ配列
[0066]親ＯｍｐＧをコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、問題のＯｍｐＧを産生する任意の細胞または微生物から単離され得る。第１に、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーは、研究されるべきＯｍｐＧを産生する生物に由来する染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使用して構築され得る。次いで、ＯｍｐＧのアミノ酸配列が公知である場合には、問題の生物から調製されたゲノムライブラリーからＯｍｐＧをコードするクローンを同定するために、相同の標識されたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、使用され得る。あるいは、既知ＯｍｐＧ遺伝子と相同の配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用してＯｍｐＧをコードするクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。
【００５２】
[0067]あるいは、ＯｍｐＧをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えば、Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜１８６２によって記載されるホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）法またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３（４）：８０１〜５によって記載される方法によって合成によって調製することができる。ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）法では、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーにおいてオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、適当なベクター中にライゲートし、クローニングする。
【００５３】
[0068]最後に、ＤＮＡ配列は、混合されたゲノムおよび合成起源、混合された合成およびｃＤＮＡ起源または混合されたゲノムおよびｃＤＮＡ起源のものであり得、標準技術に従って、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源の断片（必要に応じて、全ＤＮＡ配列の種々の部分に対応する断片）をライゲーションすることによって調製する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号またはＲ．Ｋ．Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９（４８３９）：４８９〜９１に記載されるような特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することができる。
【００５４】
部位特異的突然変異誘発
[0069]ひとたび、ＯｍｐＧをコードするＤＮＡ配列を単離し、変異のための所望の部位を同定すると、合成オリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位のそれぞれの両端に位置するヌクレオチド配列を含有し、オリゴヌクレオチド合成の間に変異体ヌクレオチドが挿入される。特定の方法においては、ＯｍｐＧ遺伝子を保持するベクター中に、ＯｍｐＧをコードする配列またはその一部を架橋するＤＮＡの一本鎖ギャップを創造する。次いで、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡの相同部分にアニーリングする。次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて残存するギャップを埋め、Ｔ４リガーゼを使用して構築物をライゲートする。この方法の具体例が、Ｍｏｒｉｎａｇａら（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：６３６〜６３９に記載されている。米国特許第４，７６０，０２５号には、カセットのわずかな変更を実施することによる複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入が開示されている。しかし、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入できるので、Ｍｏｒｉｎａｇａ法によってさらにより多くの種々の変異をどの時点においても導入することができる。部位特異的突然変異誘発を達成する他の方法として、Ｋｕｎｋｅｌ法、カセット突然変異誘発およびＰＣＲ部位特異的突然変異誘発が挙げられる。バリアントを提供するための代替法として、例えば、ＷＯ９５／２２６２５（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎ．Ｖ．からの）に、もしくはＷＯ９６／００３４３（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓからの）に記載されるような遺伝子シャッフリングまたは問題の変異（複数可）、例えば、置換（複数可）および／もしくは欠失（複数可）を含むハイブリッド酵素をもたらす他の対応する技術が挙げられる。
【００５５】
ＯｍｐＧバリアントの発現
[0070]ＯｍｐＧバリアントをコードするＤＮＡ配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意選択で、レプレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを使用して、バリアントＯｍｐＧを発現するために使用することができる。バリアントＯｍｐＧを発現するために使用できるベクターの例として、ｐＥＴ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ）のベクターが挙げられる。
【００５６】
[0071]ＯｍｐＧバリアントをコードするＤＮＡ配列を保持する組換え発現ベクターは、好都合なことに、組換えＤＮＡ手順に付され得る任意のベクターであり得、ベクターの選択は、ベクターが導入される予定の宿主細胞に応じて変わることが多い。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製と独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入された場合に、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製するものであり得る。
【００５７】
[0072]ＯｍｐＧバリアントをコードするＤＮＡ構築物をライゲーションするために、およびそれを複製に必要な情報を含有する適したベクター中に挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２０１２を参照のこと）。
【００５８】
[0073]ＯｍｐＧバリアントは、哺乳類または昆虫などの高等生物のものであり得るが、好ましくは微生物細胞、例えば、細菌または真菌（酵母を含む）細胞である細胞において産生することができる。適した細菌の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュラーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｒｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）もしくはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトマイセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）などのグラム陽性菌が挙げられる。酵母生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、例えば、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｙｚａｅ）もしくはクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などの糸状菌から選択され得る。宿主細胞は、典型的には、細菌であり、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００５９】
[0074]さらなる態様において、ＯｍｐＧバリアントを産生する方法が提供され、この方法は、上記のような宿主細胞をバリアントの産生に寄与する条件下で培養するステップならびに細胞および／または培養培地からバリアントを回収するステップを含む。細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を成長させ、ＯｍｐＧバリアントの発現を得るのに適した任意の従来培地であり得る。適した培地は、商業的供給業者から入手可能であり、または公開されたレシピ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されるような）に従って調製できる。
【００６０】
[0075]宿主細胞から分泌されるＯｍｐＧバリアントは、遠心分離またはろ過によって細胞を培地から分離するステップおよび硫酸アンモニウムなどの塩によって培地のタンパク質性成分を沈殿させるステップと、それに続く、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどといったクロマトグラフィー的手順の使用を含む周知の手順によって培養培地から回収できるので好都合である。いくつかの実施形態においては、バリアントＯｍｐＧの精製は、親和性タグに連結されたＯｍｐＧポリペプチドのアフィニティークロマトグラフィーによって得ることができる。ＯｍｐＧバリアントの精製において使用できるいくつかの親和性またはエピトープタグとして、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１８）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグ、ストレプトアビジン結合性ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合性ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、ＨＡタグおよびｃ−Ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの実施形態においては、ＯｍｐＧの精製においてヘキサヒスチジンタグ（配列番号１８）が使用される。親和性タグは、タンパク質リンカーによってバリアントＯｍｐＧポリペプチドに共有結合によって取付けられ得る。ナノポアのポリメラーゼとの連結において有用であると考慮される具体的なリンカーとして、（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号１９）、ＥＫＥＫＥＫＧＳ（配列番号２０）、Ｈｉｓ６−ＧＳＧＧＫ（配列番号２１）およびＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号２２）（Ｓｐｙタグ）が挙げられる。タンパク質リンカーは、バリアントＯｍｐＧをコードする配列を含む核酸によってコードされ得、融合タンパク質として発現され得る。例えば、バリアントＯｍｐＧは、例えば、配列番号３のアミノ酸２６９〜２９９として発現される、ＯｍｐＧ−（ＥＫ）３−ＨｉＳ６−ＧＳＧＧ−Ｓｐｙタグ（ＥＫ  ＥＫＥＫＧＳＨＨＨＨ  ＨＨＧＳＧＧＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号１６））として発現され得る。一部の例では、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１８）は、バリアントＯｍｐＧポリペプチドのＮ末端に発現される。
【００６１】
ナノポア構築
[0076]バリアントＯｍｐＧの特性決定は、測定可能な電気性状の変動を引き起こす分子の任意の特質を決定するステップを含み得る。例えば、ゲート開閉頻度の低減は、バリアントＯｍｐＧナノポアにわたって定電圧が印加される時の、ナノポアを通る上昇および／または下降ゲート開閉の低減の測定に由来し得る。さらに、バリアントＯｍｐＧの特性決定は、ＯｍｐＧナノポアの通過に近接して、またはＯｍｐＧナノポアの通過において、個々のヌクレオチドのタグが検出される時の、ナノポアを通るイオン電流フローの変動を測定するステップによって、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖と相補的である個々のタグ付きヌクレオチドのタグを同定するステップを含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のセグメントの塩基配列は、成長している核酸鎖が合成される時の、タグ付きヌクレオチドのタグの測定された電気性状（複数可）を比較し、関連付けるステップによって決定され得る。
【００６２】
[0077]典型的には、ＯｍｐＧナノポアを通るイオン電流フローの測定は、脂質膜中に再構成されているナノポアにわたって行われる。一部の例では、ＯｍｐＧナノポアは、膜に挿入される（例えば、エレクトロポレーションによって）。ナノポアは、電気刺激、圧力刺激、液体の流れ刺激、気泡刺激、音波処理、音、振動またはそれらの任意の組合せなどの刺激シグナルによって挿入され得る。一部の場合には、膜は、泡を利用して形成され、ナノポアは、電気刺激を利用して膜に挿入される。
【００６３】
[0078]脂質二重層を構築し、脂質二重層中にナノポアを形成し、核酸分子をシーケンシングする方法は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１１／０９７０２８およびＷＯ２０１５／０６１５１０に見出すことができる。
【００６４】
[0079]図２は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特性決定するために使用できるナノポアデバイス１００の模式図である。ナノポアデバイス１００は、伝導性固体基板１０６の脂質二重層適合性面１０４上で形成される脂質二重層１０２を含み、これでは、脂質二重層適合性面１０４は、脂質二重層不適合性面１０５によって単離され得、伝導性固体基板１０６は、絶縁材料１０７によって電気的に単離され得、脂質二重層１０２は、脂質二重層不適合性面１０５上に形成される非晶質脂質１０３によって囲まれ得る。ナノポアを含む脂質二重層は、ウェル上に配置され得、これでは、センサーはウェルの表面の一部を形成する。ウェル上の脂質二重層中のナノポアの位置の説明は、例えば、ＷＯ２０１５／０６１５０９に見出すことができる。脂質二重層１０２に、脂質二重層１０２の２つの側の間を特性決定されている分子１１２の少なくとも一部および／または小イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）が通過するために十分に大きいナノポア１１０を有する単一ナノポア構造１０８が埋め込まれている。水分子１１４の層は、脂質二重層適合性面１０４上に吸着され、脂質二重層１０２と脂質二重層適合性面１０４の間に挟まれ得る。親水性の脂質二重層適合性面１０４上に吸着された水性フィルム１１４は、脂質分子の秩序化を促進し、脂質二重層適合性面１０４上での脂質二重層の形成を容易にし得る。分子１１２の溶液を含有する試料チャンバー１１６は、特性決定のために分子１１２を導入するために脂質二重層１０２上に提供され得る。溶液は、電解質を含有する水溶液であり、最適イオン濃度に緩衝され、ナノポア１１０を開口で維持するように最適ｐＨで維持され得る。デバイスは、脂質二重層にわたって電気刺激（例えば、電圧バイアス）を提供するために、および脂質二重層の電気的特性（例えば、抵抗、容量およびイオン電流フロー）を検出するために可変性電源１２０と連結した電極１１８の対（負のノード１１８ａおよび正のノード１１８ｂを含む）を含む。正電極１１８ｂの表面は、脂質二重層適合性面１０４の一部である、またはそれを形成する。伝導性固体基板１０６は、電極１１８のうち１つの一部と連結され得る、またはそれを形成し得る。デバイス１００はまた、電気刺激を制御するために、および検出されたシグナルを処理するために電気回路１２２を含み得る。いくつかの実施形態においては、可変性電源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれる。電気回路（ｃｉｒｃｕｔｉｒｙ）１２２は、増幅器、インテグレーター、ノイズフィルター、フィードバック制御論理、および／または種々の他の構成要素を含み得る。電気回路（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）１２２は、シリコン基板１２８内に統合された、統合された電気回路（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）であり得、メモリ１２６に連結されたコンピュータプロセッサ１２４にさらに連結され得る。
【００６５】
[0080]一例において、図２のナノポアデバイス１００は、銅材料１０６上にコーティングされた脂質二重層適合性銀−金合金表面１０４上に形成された脂質二重層１０２中に埋め込まれた、単一ＯｍｐＧタンパク質１０８、例えば、本明細書において記載されるようなバリアントＯｍｐＧを有するＯｍｐＧナノポアデバイスである。脂質二重層適合性銀−金合金表面１０４は、脂質二重層不適合性窒化ケイ素表面１０５によって単離され、銅材料１０６は、窒化ケイ素材料１０７によって電気的に絶縁される。銅１０６は、シリコン基板１２８中に統合されている電気回路（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）１２２と連結される。チップ上に置かれた、またはカバー板１２８から下へ伸びている銀−塩化銀電極は、ｄｓＤＮＡ分子を含有する水溶液と接触する。
【００６６】
[0081]脂質二重層は、例えば、ジフィタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル、ＧＭ１ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはそれらの任意の組合せから選択されるリン脂質を含み得る、またはこれらからなり得る。
【００６７】
[0082]ナノポアは、アレイを形成し得る。本開示は、ナノポア検出器（またはセンサー）のアレイを提供する。図３Ａは、脂質二重層不適合性面１０５によって脂質二重層適合性面１０４が単離された、個々にアドレス可能なナノポアデバイス１００のアレイ３０２を有する、ナノポアチップ３００の実施形態の模式図の上面図である。各ナノポアデバイス１００は、シリコン基板１２８上に統合された制御回路１２２を備えている。いくつかの実施形態においては、各群が特性決定のために異なる試料を受け取ることができるように、ナノポアデバイス１００の群を分離する側壁１３６が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、ナノポアチップ３００は、カバー板１２８を含み得る。ナノポアチップ３００はまた、コンピュータプロセッサとインターフェースで接続するための複数のピン３０４を含み得る。いくつかの実施形態においては、ナノポアチップ３００は、例えば、脂質懸濁液、解析物溶液、および／または他の液体、懸濁液もしくは固体を送達するためのピペット、ロボットアーム、コンピュータプロセッサ、ならびに／あるいはメモリなどの解析物送達機構を含む、本発明のプロセスの種々の実施形態を実施する（例えば、自動的に実施する）ための種々の構成要素を含み得るナノポアワークステーション３０６に連結され得る（例えば、ドッキングされる）。図３Ｂは、ナノポアチップ３００の断面図である。図３Ａおよび３Ｂを参照して、複数のポリヌクレオチドは、ナノポア検出器のアレイで検出され得る。ここで、各ナノポア位置は、一部の場合には、本明細書において別の場所に記載されるようなポリメラーゼ酵素に付けられた、ナノポアを含む。各ナノポアは、個々にアドレス可能であり得る。
【００６８】
[0083]本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用の間に細孔を通過する電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態においては、核酸分子のシーケンシングは、直流を適用することを必要とし得る（例えば、分子がナノポアを通って移動する方向が逆転されないように）。しかし、直流を使用してナノポアセンサーを長期間操作するステップは、電極の組成を変化させ、ナノポアにわたるイオン濃度の平衡を失わせ、他の望ましくない効果を有し得る。交流電流（ＡＣ）波形を適用することで、これらの望ましくない効果を避けることができ、以下に記載されるような特定の利点を有し得る。タグ付きヌクレオチドを利用する本明細書において記載される核酸シーケンシング法は、ＡＣ印加電圧と十分に適合しており、したがって、前記利点を達成するためにＡＣが使用され得る。
【００６９】
[0084]膜貫通タンパク質細孔を通るイオン電流を測定するための適した条件は、当技術分野で公知であり、例は、本明細書において実験の節に提供されている。方法は、膜および細孔にわたって印加される電圧を用いて実施される。使用される電圧は、典型的には、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限ならびに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限を有する範囲にある。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは、１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にある。増大された加電圧を使用することによって本発明の細孔によって、異なるヌクレオチド間の識別を増大することが可能である。ＡＣ波形およびタグ付きヌクレオチドを使用して核酸をシーケンシングするステップは、その全文が参照により本明細書において組み込まれる２０１３年１１月６日に出願された、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」と題された米国特許公開ＵＳ２０１４／０１３４６１６に記載されている。ＵＳ２０１４／０１３４６１６に記載されたタグ付きヌクレオチドに加えて、シーケンシングは、５種の一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミジンの、糖または非環式部分、例えば、（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｇＮＴＰ）を欠くヌクレオチド類似体を使用して実施され得る（Ｈｏｒｈｏｔａら  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７［２００６］）。
【００７０】
ナノポア−ポリメラーゼ複合体
[0085]一部の場合においては、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を、ナノポアに付ける、および／またはナノポアに近接して位置付ける。ポリメラーゼは、ナノポアが膜中に組み込まれる前または後にナノポアに付けてもよい。一部の場合においては、ポリメラーゼを、ＯｍｐＧタンパク質モノマーに付け、次いで、ナノポアポリメラーゼ複合体を、膜中に挿入することができる。
【００７１】
[0086]ポリメラーゼをナノポアに付けるための例示的方法は、リンカー分子をＯｍｐＧモノマーに付けるステップまたは取付け部位もしくは取付けリンカーを有するようにＯｍｐＧを変異するステップ、次いで、ポリメラーゼを取付け部位もしくは取付けリンカーに付けるステップ（例えば、大量に、膜への挿入の前に）を含む。ポリメラーゼはまた、ナノポアを膜中に形成させた後に取付け部位または取付けリンカーに付けることもできる。一部の場合においては、複数のナノポア−ポリメラーゼ対を、バイオチップの複数の膜（例えば、ウェルおよび／または電極上に配置される）中に挿入し、それによって、本明細書において記載されるようなナノポアチップを形成する。一部の例においては、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を形成するポリメラーゼのナノポアへの取付けは、各電極の上のバイオチップ上で行う。
【００７２】
[0087]ポリメラーゼは、任意の適した化学（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いてナノポアに付けることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され、これは、Ｓｐｙタグペプチドを含むＯｍｐＧナノポアに共有結合され得る。一部の例においては、ポリメラーゼは、分子ステープル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｐｌｅ）を用いてナノポアに付けられる。一部の例においては、分子ステープルは、３種のアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣで示す）を含む。リンカーＡは、ＯｍｐＧポリペプチドから伸びることができ、リンカーＢは、ポリメラーゼから伸びることができ、その場合にリンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことによって）つなぐことができ、したがってポリメラーゼをナノポアとつなぐことができる。リンカーＣは、リンカーＡまたはリンカーＢの一部分となるよう構築することもでき、したがってリンカー分子の数は減る。
【００７３】
[0088]一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結する。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミル安息香酸エステル、芳香族アルデヒド）の間の反応とすることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いてナノポアに連結する。一部の場合においては、ＯｍｐＧ分子にジンクフィンガー変異を導入し、次に分子（例えば、ＤＮＡ中間体分子）を使用してポリメラーゼをＯｍｐＧのジンクフィンガー部位に連結する。
【００７４】
[0089]ポリメラーゼをナノポアに付けることにおいて使用することができる他のリンカーは、直接の遺伝子連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１−３アミノ酸リンカー（配列番号１９））、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号２３））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学連結である。本明細書において有用であると考えられる具体的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１−３（配列番号１９）、Ｎ末端のＫタグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号２３））、ΔＴＥＶ部位（１２〜２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２〜４９）である。
【００７５】
[0090]ポリメラーゼは、任意の好適な手段によってナノポアに連結してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を参照のこと。
【００７６】
[0091]一部の例においては、ナノポアおよびポリメラーゼは融合タンパク質（すなわち、単一のポリペプチド鎖）として産生され、そのようなものとして膜中に組み込まれる。
[0092]ポリメラーゼを、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖（例えば、成長している核酸鎖）中に組み込む速度を低減するように変異することができる。一部の場合においては、ヌクレオチドを核酸鎖中に組み込む速度は、ヌクレオチドおよび／または鋳型鎖に官能基付与して、例えば、鋳型核酸鎖のメチル化によって立体障害を提供することによって低減することができる。一部の例においては、速度を、メチル化ヌクレオチドを組み込むことによって低減する。
【００７７】
ポリヌクレオチドをシーケンシングするための方法
[0093]本明細書において記載されるバリアントＯｍｐＧポリペプチドを使用して特性決定されている分子は、帯電した分子または極性分子、例えば、帯電したポリマー分子または極性ポリマー分子を含む種々の種類のものであり得る。具体例として、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であっても二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子であってもよい。
【００７８】
[0094]一態様においては、即時ＯｍｐＧバリアントナノポアを使用する核酸をシーケンシングするための方法が提供される。本開示において提供されるＯｍｐＧバリアントを、当技術分野で公知のその他のナノポアシーケンシングプラットフォームに従って核酸の配列を決定するために使用することができる。例えば、本開示において提供されるＯｍｐＧバリアントは、Ｏｘｆｏｒｄナノポア（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）のエキソヌクレアーゼを用いた方法、ＮＡＢｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒｌ）のハイブリダイゼーションによるナノポアを用いたシーケンシング、ＮｏｂｌｅＧｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）の蛍光を用いた光学的ナノポアシーケンシング、イルミナ（ｌｌｌｕｍｉｎａ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳｔｒａｔｏｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）の拡大によるナノポアシーケンシングに従って核酸をシーケンシングするのに適したものであり得る。いくつかの実施形態においては、ＯｍｐＧバリアントを使用する核酸のシーケンシングを、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（その全文が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年１１月７日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」と題された）に記載されるように、タグ付きヌクレオチドを使用して実施することができる。例えば、１つもしくは複数の検出電極に隣接して、または検出において１つもしくは複数の検出電極に近接して膜（例えば、脂質二重層）中に置かれたバリアントＯｍｐＧナノポアは、ヌクレオチド塩基が、ポリヌクレオチド鎖中に組み込まれ、ヌクレオチドのタグがナノポアによって検出されるように、ポリメラーゼによるタグ付きヌクレオチドの組込みを検出することができる。ポリメラーゼを、上記のようなナノポアと関連付けることができる。
【００７９】
[0095]タグ付きヌクレオチドのタグは、ナノポアによって検出され得る化学基または分子を含み得る。タグ付きヌクレオチドを提供するために使用されるタグの例は、少なくともＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７の段落［０４１４］〜［０４５２］に記載されている。種々のヌクレオチドの混合物、例えば、Ｎが、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）であるタグ付きｄＮＴＰの混合物からヌクレオチドを組み込むことができる。あるいは、個々のタグ付きｄＮＴＰの交互溶液、すなわち、タグ付きｄＡＴＰとそれに続くタグ付きｄＣＴＰとそれに続くタグ付きｄＧＴＰなどからヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチド配列の決定は、タグがナノポアを通って流れるもしくはナノポアに隣接するときに、タグがナノポア中にあるときに、および／またはタグがナノポアに提示されるときに、ナノポアがタグを検出するように行うことができる。各タグ付きヌクレオチドのタグを、限定されるものではないが、ヌクレオチドのリン酸（例えば、γリン酸）、糖または窒素含有塩基部分を含む、任意の位置でヌクレオチド塩基に連結することができる。一部の場合においては、タグが、ヌクレオチドタグの組込みの際にポリメラーゼと会合される間に、タグが検出される。タグは、ヌクレオチド組込みならびにその後のタグの切断および／または放出後に、タグがナノポアを通って転位置するまで検出され続け得る。一部の場合においては、ヌクレオチド組込み事象は、タグ付きヌクレオチドからタグを放出し、タグは、ナノポアを通過し、検出される。タグは、ポリメラーゼによって放出され得、または限定されるものではないが、ポリメラーゼの近傍に位置する酵素による切断を含む任意の適した方法で切断／放出される。この方法では、独特のタグが、ヌクレオチドの各種（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）から放出されるので、組み込まれた塩基を同定することができる（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）。一部の状況では、ヌクレオチド組込み事象は、タグを放出しない。このような場合においては、組み込まれたヌクレオチドに連結されたタグは、ナノポアを利用して検出される。一部の例においては、タグは、ナノポアを通って、またはナノポアに近接して移動することができ、ナノポアを利用して検出され得る。
【００８０】
[0096]一部の場合においては、組み込まれていないタグ付きヌクレオチドが、ナノポアを通過する。方法は、ナノポアによってタグ付きヌクレオチドが検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていないヌクレオチドと会合されたタグと、組み込まれたヌクレオチドと会合されたタグの間を区別できる。一実施形態においては、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ミリ秒未満の間ナノポアによって検出され、組み込まれたヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒の間ナノポアによって検出される。
【００８１】
[0097]したがって、一態様においては、本開示は、バリアントＯｍｐＧナノポアを利用して核酸をシーケンシングするための方法を提供する。一実施形態においては、（ａ）タグ付きヌクレオチドを、ナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、タグがナノポアを利用して検出可能である、ステップと、（ｂ）ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である成長している鎖中に組み込むステップと、（ｃ）ナノポアを利用して、個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの間に、および／または組込みの際に個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合される間に、タグがナノポアを利用して検出される、ステップとによって、検出電極に隣接するバリアントＯｍｐＧナノポアを利用して核酸をシーケンシングするための方法が提供される。ポリヌクレオチドをシーケンシングするための本バリアントＯｍｐＧナノポアとともに、タグ付きヌクレオチドの使用を含むシーケンシング方法の他の実施形態は、その全文が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４７２７に提供される。
実施例
【実施例１】
【００８２】
ＯｍｐＧ−ＥＸＴの発現および精製
[0098]Ｇｒｏｓｓｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３：４８２６〜４８３８［２０１４］）によって記載されるΔＬ６ΙΙ構築物に基づいて、ループ６を欠き、置換Ｅ２２９Ａを有する成熟ＯｍｐＧタンパク質の形態をコードするＤＮＡ（残基２２〜３０１；ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ７６０４５）（ＯｍｐＧ−ＥＸＴ）を合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）。合成ＤＮＡ（ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Α）は、ループ６の欠失およびＣ末端配列：リンカー１−Ｈｉｓタグ−リンカー２−Ｓｐｙタグ（配列番号３）を有するＯｍｐＧ構築物をコードする。野生型配列（配列番号４）に由来し、ループ６の切り詰め（ΔＬ６）および置換Ｅ２２９Ａをコードする合成ＤＮＡ配列を、ｐＥＴ−２６ｂ  ベクターにクローニングし、封入体としてＯｍｐＧ欠損ＢＩ２１ＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生した（ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃ２５２７−ｂｌ２１  ｄｅ３−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ−ｅ−ｃｏｌｉ）。
【００８３】
[0099]ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａの発現を、約２４時間のＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において増殖するＢＩ２１ＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ  ＤＮＡのＩＰＴＧ誘導性転写によって得た。細胞を遠心分離し、次いでＴｒｉｓ５０ｍＭ、ＰＨ８．０（細胞ペレット１ｇに対してバッファー５ｍｌ）に再懸濁した。次いで、細胞を超音波処理し、溶解物を遠心分離した（１０，０００ｘｇ／２０分／４℃）。ペレットを遠心分離および再懸濁によって２回洗浄し、最終ペレットをＴｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ８．０に、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。封入体をアリコートし、−８０℃で保存した。
【００８４】
[00100]封入体を、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、尿素６ＭおよびＴＣＥＰ２．４ｍＭ中に６０℃で１０分間可溶化した。可溶化されていない封入体を遠心分離によって除去し、上清中に存在する可溶化されたタンパク質を、再フォールディングバッファー（Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、ｐＨ８．０、尿素１．８Ｍ、ＴＣＥＰ１ｍＭおよびβ−ＯＧ３％）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａタンパク質を、３７℃で１６時間再フォールディングし、次いで、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ２００ｍＭ、イミダゾール５ｍＭ、β−ＯＧ１％を使用して希釈して、β−ＯＧ１％および尿素０．８Ｍの最終濃度を得た。再フォールディングされたタンパク質を、ＴＡＬＯＮ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ２００ｍＭ、イミダゾール２００ｍＭおよびＴｗｅｅｎ−２０  ０．１％に溶出した。ＴＡＬＯＮは、コバルトを加えた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂であり、ニッケルが加えられた樹脂よりも高い特異性でｈｉｓタグ付きタンパク質と結合する。
【００８５】
[00101]ｐＥＴ−２６ｂベクター中のＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ構築物をコードするＤＮＡに基づいて、部位特異的突然変異誘発によってＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａタンパク質のバリアントを得た。上記のようにＯｍｐＧ−ΔＬ６について記載したように、全てのＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａバリアントを発現させ、精製した。
【実施例２】
【００８６】
ＯｍｐＧバリアントの特性決定
[00102]バリアントＯｍｐＧポリペプチドの、自発性ゲート開閉を低減する能力を実証するために、個々のバリアントを、半導体センサーチップ（ａ）上のウェルの上の脂質二重層中の細孔として再構成し、ＯｍｐＧバリアント細孔（ｂ）の各々について単一チャネル記録を得た。
【００８７】
[00103]（ａ）ＯｍｐＧバリアントの脂質二重層中への再構成
[00104]ループ６の欠失（ΔＬ６）およびアミノ酸置換Ｅ２２９Ａ、すなわち、ΔＬ６／Ｅ２２９Αを、Ｙ５０Ｋ、Ｙ５０Ｎ、Ｒ６８Ｎ、Ｒ２１１ＮもしくはＥ１７Ｋから選択されるアミノ酸置換のうち１種と組み合わせて、および／またはＤ２１５の欠失と組み合わせて含むバリアントＯｍｐＧタンパク質を、実施例１に記載されるように発現させ、精製した。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５３（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｉｐｓ」と題され、２０１４年１０月２２日に出願された）に記載されるように、脂質二重層が形成され、ナノポアが挿入された。
【００８８】
[00105]（ｂ）脂質二重層における単一チャネル記録
[00106]電流フローに対する変異の効果を決定するために、ＯｍｐＧ−ＥＸＴナノポアのバリアントを通過する電流について単一チャネル記録を作製した。ＯｍｐＧナノポアを通るイオン電流フローの測定は、ＤＣを使用して行った。
【００８９】
[00107]別に記載されない限り、チャンバーを、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＣａＣｌ２３ｍＭで満たした。社内で組み立てられたＧｅｎｉａＣｈｉｐ（商標）ＤＮＡシーケンサーを使用して電流を測定した。
【００９０】
[00108]ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｙ５０Ｋ（配列番号６）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ６８Ｎ（配列番号７）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ２１１Ｎ（配列番号８）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｅ１７Ｋ（配列番号９）およびＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）のチャネル電流トレースを、図４Ａ〜４Ｅに示す。トレースは、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ６８Ｎ（Ｂ）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ２１１Ｎ（Ｃ）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｅ１７Ｋ（Ｄ）が、相当なちらつき、すなわち、上昇および下降電流を呈することを示す。ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｙ５０Ｋ（Ａ）は、より少ないちらつきおよび約３０ｐＡのより低い開口チャネル電流レベルを呈す。ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（Ｅ）は、自発性ゲート開閉の最小レベルを示し、約３５ｐＡの開口チャネルレベルを維持する。
【００９１】
[00109]ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａバリアントについて、およびバリアントＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５−Ｙ５０Ｋについて測定された抵抗事象の数（図４Ａ〜４Ｅ）を解析して、ゲート開閉頻度に対する変異の効果を算出した。図５Ａは、開口チャネル（ＯＣ）電流ノイズ（上昇および下降電流）の平均およびＳ．Ｄ．を、平均測定値から１Ｓ．Ｄ．外側に生じた同一測定値のパーセントと関連付けるヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５（ｄｅｌ２１５）（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−ｄｅｌ２１５」）は、親ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６」）に対して、ならびにその他のバリアント：ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｙ５０Ｋ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−Ｙ５０Ｋ」）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ６８Ｎ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−Ｒ６８Ｎ」）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｒ２１１Ｎ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−Ｒ２１１Ｎ」）、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｅ１７Ｋ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−Ｅ１７Ｋ」）、およびＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５−Ｙ５０Ｋ（図５Ａおよび５Ｂ中、「ΔＬ６−Ｙ５０Ｋ」）と比較した場合に、最低量のノイズを有し、約３５ｐＡの開口チャネル電流を維持することを示す。
【００９２】
[00110]下降電流のみの平均およびＳ．Ｄ．を、図５Ｂに提供する。ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−Ｙ５０Ｋ、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５、およびＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５−Ｙ５０Ｋは、例えば、親ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａと比較した場合に最小量の下降電流を示した。
【実施例３】
【００９３】
ＯｍｐＧナノポアへのポリメラーゼの取付け
[00111]Ｈｉｓタグ付きポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列、ｐｏｌ６は、商業的供給源（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、次いで、そのＣ末端にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含むように操作した（Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：４２６（２）：３０９−３１７［２０１４］）。Ｐｏｌ６を、ｐＤ４４１ベクター（発現プラスミド）中にライゲーションし、続いて、これをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。グルコース０．２％およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ中で、スターター培養物１ｍｌを、約８時間。対数期のスターター培養物２５μｌを、９６ディープウェルプレートの発現培地１ｍｌ（グルコース０．２％、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを追加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）自己誘導培地）に移した。プレートを、２５０〜３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３６〜４０時間インキュベートした。
【００９４】
[00112]次に細胞を、４℃で３０分間、３２００×ｇにて遠心分離して収集した。デカントして培地を除き、細胞ペレットをあらかじめ冷却した溶解バッファー２００μｌ（リン酸カリウム２０ｍＭ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１００ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ、ＰＭＳＦ１ｍＭ、１×Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬、リゾチーム１００μｇ／ｍｌ、およびプロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁させ、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで１０倍ストックからの試薬２０μｌを、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ｉに加え、氷上で５〜１０分間インキュベートして溶解液を生成させた。溶解液に、１Ｍリン酸カリウム２００μｌ、ｐＨ７．５（最終濃度は、溶解液４００μｌ中の約０．５Ｍリン酸カリウムとなった）を追加し、４℃で１０分間、約１５００ｒｐｍにて遠心分離することによりＰａｌｌフィルタープレート（部品番号５０５３、３ミクロンフィルター）でろ過した。次いで、澄んだ溶解液を、平衡化した９６ウェルＨｉｓ−Ｐｕｒコバルトプレート（Ｐｉｅｒｃｅ部品番号９００９５）に入れ、１５〜３０分間結合させた。
【００９５】
[00113]流出液（ＦＴ）を、５００×ｇにて３分間遠心分離することによって収集した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー１（リン酸カリウム０．５Ｍ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１Ｍ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ、およびＴｗｅｅｎ２０  ０．５％）で３回洗浄した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー２（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール２０ｍＭ）で２回洗浄した。Ｐｏｌ６を、溶出バッファー２００μｌ（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール３００ｍＭ、グリセロール２５％）を使用して溶出させ、１〜２分のインキュベーション後に収集した。溶離液を２〜３回、同じＨｉｓ−Ｐｕｒプレートに再び入れて、濃縮したＰｏｌ６を得た。精製したポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合に９５％超の純度であった。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）によって評価した場合に約３ｕＭ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）であり、２６０／２８０比は０．６であった。ポリメラーゼ活性は、蛍光置換アッセイによって確認した。
【００９６】
[00114]Ｐｏｌ６−Ｈｉｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を、ＯｍｐＧ−ＥＸＴ−Ｈｉｓ−Ｓｐｙタグ（配列番号３）を含むＳｒＣｌ２３ｍＭ中４℃で一晩インキュベートして、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＳｐｙタグと共有結合させ、それによって、ＯｍｐＧ−ポリメラーゼ複合体を形成した。実施例４に記載されるように、ＯｍｐＧ−ポリメラーゼ複合体を、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、タグ付きヌクレオチドを捕獲し、同定する能力について試験した。
【実施例４】
【００９７】
ポリメラーゼ−バリアントＯｍｐＧ複合体によるヌクレオチド塩基の検出
[00115]ＯｍｐＧ−ＥＸＴ−ｄｅｌ２１５（配列番号１０）、すなわち、ＯｍｐＧ−ΔＬ６／Ｅ２２９Ａ−ｄｅｌ２１５の、ポリメラーゼによって捕獲されたヌクレオチドを同定する能力を、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、ｐＨ７．５中、ＤＮＡ鋳型ＪＡＭ１Ａの存在下で、ポリメラーゼＰｏｌ６と複合体形成しているＯｍｐＧ−ＥＸＴ−ｄｅｌ２１５を使用して評価した。鋳型ＪＡＭ１Ａは、アッセイに使用されるタグ付きチミジンヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙにより合成）と相補的であり、ポリメラーゼによって捕獲されるであろうアデニンヌクレオチド塩基を提供するＤＮＡ鋳型である。
【００９８】
[00116]印加された１００ｍＶの定電圧で１０分間、ＤＣ電流測定を行った。種々のセットのタグ付きヌクレオチドを使用した。図６は、ＯｍｐＧ−ＥＸＴ−ｄｅｌ２１５−ポリメラーゼ複合体が、ポリメラーゼによって捕獲された４種の異なるタグ付きヌクレオチド：Ｔ−Ｔ３０、Ｔ−ｄＳｐ３０、Ｔ−Ｔｍｐ６およびＴ−ｄＳｐ５を同定することを実証するトレースの例を示す。４種のヌクレオチドの各々の捕獲は、対応するヌクレオチドタグがナノポアによって検出されるときにＯｍｐＧ−ＥＸＴ−ｄｅｌ２１５ナノポアを通って流れる電流の４種の異なる変化によって反映される（図６）。矢印は、タグ付きヌクレオチドの４種のタグが、チャネル電流を４種の異なるレベルに減少することを示す。４種のヌクレオチドの各々を、ヌクレオチドを個々にナノポアに付加したときに電流を測定した同様の測定で同定した。図７は、対応するタグがナノポアによって検出された時の、開口チャネル電流の低減に対する対応するタグの個々の効果によるヌクレオチドの同定を示す。図８は、ＤＣ条件下で検出され、図６において矢印によって示された４種のヌクレオチドの捕獲の拡大図を示す。
配列表フリーテキスト
【００９９】
【化１】
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【０１００】
【化２】
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【０１０３】
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【０１０５】
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【化８】
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【０１０８】
【化１０】
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【０１１０】
【化１２】
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【０１１１】
【化１３】
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【０１１２】
【化１４】
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【０１１３】
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【０１１４】
【化１６】
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【０１１５】
【化１７】
2018531002.tif 000018
【０１１６】
先行技術文献
特許文献
[1] PCT/US2005/009702 (published as WO2006/028508 on 16 March 2006; President and Fellows of Harvard College; entitled METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING POLYNUCLEOTIDES.
[2] PCT/US2011/065640 (published as WO2012/083249 on 21 June 2012; Columbia University; entitled DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).
[3] PCT/US2013/068967 (published as WO2014/074727 on 15 May 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[4] US20140134616 (published on May 15 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[5] PCT/US2014/061853 (published AS WO2015/061510 on April 30, 2015; Genia Technologies; entitled METHODS FOR FORMING LIPID BILAYERS ON BIOCHIPS).
[6] PCT/US2011/000205 (Genia Technologies, Inc. entitled SYSTEMS FOR MANIPULATING A MOLECULE IN A NANOPORE, published August 11, 2011 as WO2011/097028) 
非特許文献
[1] Conlan and Bayley, Folding of a Monomeric Porin, OmpG, in Detergent Solution; Biochemistry 42;9453-9465 (2003).
[2] Subbarao and van den Berg, Crystal Structure of the monomeric Porin OmpG; J Mol Biol 360:750-759 (2006).
[3] Grosse et al., Structural and functional characterization of a synthetically modified OmpG; Bioorganic and Medicinal Chem18:7716-7723 (2010).
[4] Anbazhagan et al., Incorporation of Outer Membrane Protein OmpG in Lipid Membranes: Protein-lipid Interactions and β-Barrel Orientation; Biochemistry47:6189-698 (2008).
[5] Fahie et al., Resolved Single-Molecule Detection of Individual Species within a Mixture of anti-Biotin Antibodies using an Engineered Monomeric Nanopore; ACS Nano 9:1089-1098 (2015).
[6] Chen et al., Outer membrane protein G: Engineering a quiet pore for biosensing, Proc Natl Acad Sci 105:6272-6277 (2008).
[7] Grosse et al., Structure-based Engineering of a Minimal Porin Reveals Loop-Independent Channel closure; Biochemistry 53:4826-4838 (2014).
[8] Astier et al., J Am Chem Soc 10.1021/ja057123+, published online on December 30, 2005.
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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