(57)【要約】  本発明は、アミノアラビナーゼグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）の阻害剤または拮抗剤の特定、および組成物、薬剤耐性グラム陰性感染の治療または予防の方法、あるいはポリミキシン系抗生物質に耐性なグラム陰性細菌感染の増加の阻害におけるこれらの利用に関する。特定の態様では、当該阻害剤または拮抗剤は１種類以上の抗細菌剤と併用して投与することができる。【選択図】図１Ａ
2018534303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるグラム陰性感染を治療、予防、または阻害する方法であって、
【化１】
2018534303.tif 000088
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化２】
2018534303.tif 000089
式中、Ｒ１は
【化３】
2018534303.tif 000090
および
【化４】
2018534303.tif 000091
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化５】
2018534303.tif 000092
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化６】
2018534303.tif 000093
【化７】
2018534303.tif 000094
【化８】
2018534303.tif 000095
および
【化９】
2018534303.tif 000096
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化１０】
2018534303.tif 000097
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの効果的な量を、当該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
少なくとも１種類の追加抗細菌剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類の追加抗細菌剤がポリミキシン系抗生物質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリミキシンがポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グラム陰性感染が、腸内細菌科またはガンマプロテオバクテリア網由来の１種類以上の細菌によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腸内細菌科が、サルモネラ属、エシェリシア属、エルシニア属、クレブシエラ属、シゲラ属、プロテウス属、エンテロバクター属、セラチア属、またはシトロバクター属由来の１種類以上の生物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記属が、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、プロテウス・ブルガリス、サルモネラ・ティフィムリウム、およびセラチア・マルセセンスを含む少なくとも１種類の種である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガンマプロテオバクテリア網が、アシネトバクター属またはシュードモナス属由来の１種類以上の生物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記属が、Ａ．バウマンニまたはＰ．アエルギノサを含む少なくとも１種類の種である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物の医薬品として効果的な量を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種類の薬剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加するための方法であって、
【化１１】
2018534303.tif 000098
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化１２】
2018534303.tif 000099
式中、Ｒ１は
【化１３】
2018534303.tif 000100
および
【化１４】
2018534303.tif 000101
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化１５】
2018534303.tif 000102
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化１６】
2018534303.tif 000103
【化１７】
2018534303.tif 000104
【化１８】
2018534303.tif 000105
および
【化１９】
2018534303.tif 000106
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化２０】
2018534303.tif 000107
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの効果的な量と、当該少なくとも１種類のグラム陰性細菌を接触させることを含む、方法。
【請求項１３】
グラム陰性細菌種のアミノアラビナーゼグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）を阻害するための方法であって、
【化２１】
2018534303.tif 000108
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化２２】
2018534303.tif 000109
式中、Ｒ１は
【化２３】
2018534303.tif 000110
および
【化２４】
2018534303.tif 000111
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化２５】
2018534303.tif 000112
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化２６】
2018534303.tif 000113
【化２７】
2018534303.tif 000114
【化２８】
2018534303.tif 000115
および
【化２９】
2018534303.tif 000116
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化３０】
2018534303.tif 000117
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグと、ＡｒｎＴ活性部位に結合するＬ−Ａｒａ４Ｎをブロッキングするのに効果的な量で、当該細菌を接触させることを含む、方法。
【請求項１４】
共薬または医薬品としての使用のため、
４−［（４−クロロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
５−メチル−４−［（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）−（４−プロパン−２−イルフェニル）メチル］−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
４−［（Ｓ）−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−オレート、
４−［（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−プロピルベンゼンスルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］ナフタレン−２−スルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
２−［（５Ｅ）−５−［（２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
２−［（５Ｚ）−４−オキソ−５−（キノリン−４−イルメチリデン）−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
２−［（５Ｚ）−５−［（３，４−ジクロロフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］酢酸、
３−［（５Ｅ）−５−［［（２Ｓ）−２−メチル−２Ｈ−クロメン−３−イル］メチリデン］−２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］プロパン酸、
（２Ｓ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−［（４−メチルベンゾイル）アミノ］プロパノエート、
（２Ｓ）−２−［（２，４−ジフルオロベンゾイル）アミノ］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノエート、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグを含む、化合物。
【請求項１５】
前記医薬品が少なくとも１種類の薬剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加する、請求項１４に記載の化合物、またはこの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグ。
【請求項１６】
少なくとも１種類の追加の抗細菌性薬剤または化合物をさらに含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
１種類以上の薬剤耐性グラム陰性生物の増殖を阻害するための医薬組成物の調製における、
【化３１】
2018534303.tif 000118
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化３２】
2018534303.tif 000119
式中、Ｒ１は
【化３３】
2018534303.tif 000120
および
【化３４】
2018534303.tif 000121
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化３５】
2018534303.tif 000122
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化３６】
2018534303.tif 000123
【化３７】
2018534303.tif 000124
【化３８】
2018534303.tif 000125
および
【化３９】
2018534303.tif 000126
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化４０】
2018534303.tif 000127
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの、使用。
【請求項１８】
少なくとも１種類のグラム陰性生物による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防のための医薬組成物の調製における、
【化４１】
2018534303.tif 000128
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化４２】
2018534303.tif 000129
式中、Ｒ１は
【化４３】
2018534303.tif 000130
および
【化４４】
2018534303.tif 000131
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化４５】
2018534303.tif 000132
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化４６】
2018534303.tif 000133
【化４７】
2018534303.tif 000134
【化４８】
2018534303.tif 000135
および
【化４９】
2018534303.tif 000136
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化５０】
2018534303.tif 000137
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの、使用。
【請求項１９】
少なくとも１種類のグラム陰性生物による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防の方法であって、
【化５１】
2018534303.tif 000138
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化５２】
2018534303.tif 000139
式中、Ｒ１は
【化５３】
2018534303.tif 000140
および
【化５４】
2018534303.tif 000141
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化５５】
2018534303.tif 000142
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化５６】
2018534303.tif 000143
【化５７】
2018534303.tif 000144
【化５８】
2018534303.tif 000145
および
【化５９】
2018534303.tif 000146
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化６０】
2018534303.tif 000147
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの治療上効果的な量を、少なくとも１種類の追加の抗細菌性薬剤または化合物と併用して、この方法を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
少なくとも１種類の多剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加することができる化合物をスクリーニング／特定するための方法であって、Ｌ−Ａｒａ４Ｎの構造的ホモログとして化合物を特定し、当該化合物を少なくとも１種類のグラム陰性生物のポリミキシンに対する感受性を回復する能力について試験し、ポリミキシンに対する当該生物の感受性を増加するものを実際的な化合物として選択することを含む、方法。
【請求項２１】
組成物であって、
【化６１】
2018534303.tif 000148
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化６２】
2018534303.tif 000149
式中、Ｒ１は
【化６３】
2018534303.tif 000150
および
【化６４】
2018534303.tif 000151
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化６５】
2018534303.tif 000152
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化６６】
2018534303.tif 000153
【化６７】
2018534303.tif 000154
【化６８】
2018534303.tif 000155
および
【化６９】
2018534303.tif 000156
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化７０】
2018534303.tif 000157
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
である第一化合物、またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグを、少なくとも１種類の追加の抗細菌性薬剤または化合物と組み合わせて含む、組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種類の追加抗細菌性薬剤がポリミキシン系抗生物質を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリミキシンがポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第一化合物が、
４−［（４−クロロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
５−メチル−４−［（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）−（４−プロパン−２−イルフェニル）メチル］−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
４−［（Ｓ）−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−オレート、
４−［（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−プロピルベンゼンスルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］ナフタレン−２−スルホノヒドラジド、
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
２−［（５Ｅ）−５−［（２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
２−［（５Ｚ）−４−オキソ−５−（キノリン−４−イルメチリデン）−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
２−［（５Ｚ）−５−［（３，４−ジクロロフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］酢酸、
３−［（５Ｅ）−５−［［（２Ｓ）−２−メチル−２Ｈ−クロメン−３−イル］メチリデン］−２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］プロパン酸、
（２Ｓ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−［（４−メチルベンゾイル）アミノ］プロパノエート、
（２Ｓ）−２−［（２，４−ジフルオロベンゾイル）アミノ］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノエート、
またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１２日出願、米国特許仮出願第６２／２５４，４８１号の優先権を主張し、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府支援の説明
本発明は国立衛生研究所によって承認された認可番号ＮＩＨ−ＧＭ０９５３１５およびＧＭ１１１９８０の下で政府支援によってなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、アミノアラビナーゼグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）の阻害剤または拮抗剤の特定、ならびに薬剤耐性グラム陰性感染の治療または予防の方法、またはポリミキシン系抗生物質に耐性であるグラム陰性細菌感染の増加の阻害におけるこれらの利用に関する。特定の態様では、阻害剤または拮抗剤は１種類以上の抗細菌剤と併用して投与することができる。
【背景技術】
【０００４】
世界保健機構は抗生物質耐性をヒトの健康に対する三大脅威の一つとして特定しており、もはや単なる将来の懸念ではなく、一般的な感染症さえ治療する能力を危険にさらす、現在の急速に増大している世界的な健康への挑戦であることを強調している［Ａ１、Ａ２］。疾病管理予防センターは、抗生物質耐性菌がすでに年間２百万人の米国人に重篤な感染症をもたらし、結果として２．３万人を死亡させていると推定している［Ａ３］。一方、１９８０年代以来、新規抗生物質の発見が著しく低下しており、痩せたパイプラインは新規なものとして数年に極くわずかしか公表しない［Ａ４］。状況は特に病原体の多くの多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陰性（ＧＮ）株の出現によって深刻であり、クレブシエラ、アシネトバクター、シュードモナス・アエルギノサ、エンテロバクター（特にサルモネラ）、および大腸菌が挙げられ、これらはますます耐性となる院内および非院内感染症に関与している［Ａ５〜Ａ８］。危ういことに、ＭＤＲ  ＧＮ病原体は現在、汎薬剤耐性に進化している（抗微生物剤のすべての系に対する感受性の低下）［Ａ９］。この状況は、米国感染症学会によって強調されるように、ＭＤＲ  ＧＮ細菌に特異的な新しい治療選択肢の必要性が差し迫っていることを示す［Ａ１０］。
【０００５】
ポリミキシンはグラム陰性細菌による多剤耐性感染症と戦うために最近復活を示している、最後の頼みとなる抗生物質である（Ａ１、Ａ２）。これらは、グラム陰性細菌の膜を、外膜中でリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と結合した後に透過することによって作用すると考えられる。この関係はポリミキシンのアミノ基と、外膜の外側リーフレット内にＬＰＳを固定する両親媒性糖脂質であるリピドＡの骨格グルコサミンおよびＫｄｏ糖の負電荷部との間の静電相互作用によって最初に達成される（Ａ３）。この系の抗生物質に対する耐性は、リピドＡの活発な修飾によって発達し、負膜電荷の低下をもたらすグルコサミン糖リン酸のキャッピングを生じる（Ａ４）。このプロセスは自然発生的なカチオン性抗微生物ペプチドに対抗するためにグラム陰性細菌によって使用される回避戦略とも関連する（Ａ５、Ａ６）。現在、ポリミキシン耐性細菌感染の治療に利用可能な薬剤はない。そのため、ＭＤＲ  ＧＮ細菌に対して特異的な新規治療選択肢、およびこのような化合物を特定して設計するためのスクリーニング方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
特定の実施形態では、本明細書で説明される結果は、ポリミキシンに対する耐性を防止または逆転させることができる化合物（複数可）の作製が可能であり、特定の実施形態では、１種類または追加の抗生物質製剤または化合物とともに共薬として投与することができる。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明は患者における薬剤耐性グラム陰性感染を治療、予防、回復、または阻害する方法に関するものであり、
【化１】
2018534303.tif 000003
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化２】
2018534303.tif 000004
式中、Ｒ１は
【化３】
2018534303.tif 000005
および
【化４】
2018534303.tif 000006
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化５】
2018534303.tif 000007
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化６】
2018534303.tif 000008
【化７】
2018534303.tif 000009
【化８】
2018534303.tif 000010
および
【化９】
2018534303.tif 000011
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化１０】
2018534303.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの効果的な量を、患者に投与することを含む。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は少なくとも１種類の薬剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加するための方法に関するものであり、
【化１１】
2018534303.tif 000013
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化１２】
2018534303.tif 000014
式中、Ｒ１は
【化１３】
2018534303.tif 000015
および
【化１４】
2018534303.tif 000016
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化１５】
2018534303.tif 000017
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化１６】
2018534303.tif 000018
【化１７】
2018534303.tif 000019
【化１８】
2018534303.tif 000020
および
【化１９】
2018534303.tif 000021
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化２０】
2018534303.tif 000022
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの効果的な量と、少なくとも１種類のグラム陰性細菌を接触させることを含む。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明はグラム陰性細菌種のアミノアラビナーゼグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）を阻害するための方法に関するものであり、
【化２１】
2018534303.tif 000023
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化２２】
2018534303.tif 000024
式中、Ｒ１は
【化２３】
2018534303.tif 000025
および
【化２４】
2018534303.tif 000026
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化２５】
2018534303.tif 000027
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化２６】
2018534303.tif 000028
【化２７】
2018534303.tif 000029
【化２８】
2018534303.tif 000030
および
【化２９】
2018534303.tif 000031
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化３０】
2018534303.tif 000032
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグと、ＡｒｎＴ活性部位に結合するＬ−Ａｒａ４Ｎをブロッキングするのに効果的な量で、当該細菌を接触させることを含む。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明は共薬または医薬品として使用するための化合物４，４’−［（４−クロロフェニル）メチレン］ビス（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、あるいはこの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグに関する。特定の実施形態では、医薬品は少なくとも１種類の薬剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加する。特定の実施形態では、少なくとも１種類の薬剤耐性グラム陰性生物は多剤耐性である。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物の増殖を阻害するための医薬組成物の調製における、
【化３１】
2018534303.tif 000033
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化３２】
2018534303.tif 000034
式中、Ｒ１は
【化３３】
2018534303.tif 000035
および
【化３４】
2018534303.tif 000036
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化３５】
2018534303.tif 000037
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化３６】
2018534303.tif 000038
【化３７】
2018534303.tif 000039
【化３８】
2018534303.tif 000040
および
【化３９】
2018534303.tif 000041
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化４０】
2018534303.tif 000042
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの使用に関する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は少なくとも１種類のグラム陰性生物による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防のための医薬組成物の調製における、
【化４１】
2018534303.tif 000043
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化４２】
2018534303.tif 000044
式中、Ｒ１は
【化４３】
2018534303.tif 000045
および
【化４４】
2018534303.tif 000046
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化４５】
2018534303.tif 000047
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化４６】
2018534303.tif 000048
【化４７】
2018534303.tif 000049
【化４８】
2018534303.tif 000050
および
【化４９】
2018534303.tif 000051
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化５０】
2018534303.tif 000052
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
または少なくとも１種類のグラム陰性生物による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防のためのこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの使用に関する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は少なくとも１種類のグラム陰性生物による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防のための方法に関するものであり、
【化５１】
2018534303.tif 000053
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉを有する化合物、
【化５２】
2018534303.tif 000054
式中、Ｒ１は
【化５３】
2018534303.tif 000055
および
【化５４】
2018534303.tif 000056
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩを有する化合物、
【化５５】
2018534303.tif 000057
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化５６】
2018534303.tif 000058
【化５７】
2018534303.tif 000059
、
【化５８】
2018534303.tif 000060
および
【化５９】
2018534303.tif 000061
の群の部分から選択される、式ＩＩＩを有する化合物、
または
【化６０】
2018534303.tif 000062
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶを有する化合物、
またはこれらのいずれかの組み合わせ、あるいはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、またはプロドラッグの治療上効果的な量を、この方法を必要とする患者に、少なくとも１種類の追加の抗細菌性薬剤または化合物と併用して投与することを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、本化合物は、４−［（４−クロロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、５−メチル−４−［（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）−（４−プロパン−２−イルフェニル）メチル］−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、４−［（Ｓ）−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−オレート、４−［（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−プロピルベンゼンスルホノヒドラジド、Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］ナフタレン−２−スルホノヒドラジド、Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
２−［（５Ｅ）−５−［（２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、２−［（５Ｚ）−４−オキソ−５−（キノリン−４−イルメチリデン）−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、２−［（５Ｚ）−５−［（３，４−ジクロロフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］酢酸、３−［（５Ｅ）−５−［［（２Ｓ）−２−メチル−２Ｈ−クロメン−３−イル］メチリデン］−２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］プロパン酸、（２Ｓ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−［（４−メチルベンゾイル）アミノ］プロパノエート、（２Ｓ）−２−［（２，４−ジフルオロベンゾイル）アミノ］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノエート、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本化合物はさらに少なくとも１種類の追加の抗細菌性薬剤または化合物を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本方法はさらに少なくとも１種類の追加抗菌剤を投与することを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種類の追加抗菌剤はポリミキシン系抗生物質を含む。さらなる実施形態では、ポリミキシンはポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである。さらなる実施形態では、グラム陰性感染は、腸内細菌科またはガンマプロテオバクテリア網由来の１種類以上の細菌によって生じる。さらなる実施形態では、腸内細菌科はサルモネラ属、エシェリシア属、エルシニア属、クレブシエラ属、シゲラ属、プロテウス属、エンテロバクター属、セラチア属、またはシトロバクター属由来の１種類以上の生物を含む。よりさらなる実施形態では、当該属は大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、プロテウス・ブルガリス、サルモネラ・ティフィムリウム、およびセラチア・マルセセンスを含む少なくとも１種類の種である。さらなる実施形態では、ガンマプロテオバクテリア網はアシネトバクター属またはシュードモナス属由来である１種類以上の生物を含む。さらなる実施形態では、当該属はＡ．バウマンニまたはＰ．アエルギノサを含む少なくとも１種類の種を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、患者は哺乳動物である。さらなる実施形態では、本方法はさらに本化合物を医薬品として効果的な量投与することを含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は少なくとも１種類の多剤耐性グラム陰性生物のポリミキシン系抗生物質に対する感受性を増加することができる化合物をスクリーニング／特定するための方法に関するものであり、化合物をＬ−Ａｒａ４Ｎの構造的ホモログまたはアナログとして特定し、この化合物について少なくとも１種類のグラム陰性生物のポリミキシンに対する感受性を回復させる能力を試験し、この生物のポリミキシンに対する感受性を増加させる実際的な化合物として選択することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ−Ｂ】ＡｒｎＴによって触媒される反応を示し、ＡｒｎＴがポリミキシンに対する耐性における主要な標的であることを説明する図である。糖４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース（Ｌ−Ａｒａ４Ｎ）がキャリアウンデカプレニルリン酸（ＵｎｄＰ）からリピドＡに移動される。リピドＡの１および４’リン酸位置が印されている。
【図２Ａ−Ｄ】ＡｒｎＴＣｍの機能的特徴付けを示すグラフおよびブロットを示す図である。図２ＡはＡｒｎＴＣｍを発現する大腸菌ＷＤ１０１ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ株から精製されたリピドＡの陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを示す。１９２８．０の主ピークは、４’位（左図、赤色で示す）または１位（右図、赤色で示す）アクセプター位置のいずれかで加えられたＬ−Ａｒａ４Ｎによって修飾されたリピドＡに相当する。１７９７．０の第二ピークはビスリン酸化ヘキサ−アシル化リピドＡに相当する。図２ＢはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｒｎＴノックアウト大腸菌株へのＡｒｎＴＳｔおよびＡｒｎＴＣｍの導入の影響を示す棒グラフである。ＡｒｎＴＳｔのみがポリミキシン耐性を奪回することができる。ここではＡｒｎＴＣｍはｐＭＣＳＧ７ベクターを用いて発現されたが、結晶解析関連タンパク質産生に使用されるｐＮＹＣＯＭＰＳ−Ｎｔｅｒｍでは発現されず、これは前者ベクターの抗生物質耐性がＡｒｎＴＳｔ発現に使用されたｐＥＴ２１と一致するためである。図２Ｃは、ＷＤ１０１株（ＰＭＸＢ耐性）およびΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ二重変異体（ＰＭＸＢ感受性）におけるポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）の最小阻害濃度を示す表である。ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡにおけるＡｒｎＴＣｍの発現はＰＭＸＢに対する耐性を奪回しない。図２Ｄは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による３２Ｐ標識リピドＡの展開した分析を示すブロットである。Ｗ３１１０株におけるリピドＡはピロリン酸修飾（１−ＰＰ）のみ有し、ポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）に対して感受性である。ＷＤ１０１はＡｒａ４Ｎおよびホスホエタノールアミン（ｐＥｔＮ）によって二重修飾されたリピドＡを生じる。ａｒｎＴおよびｅｐｔＡ（リピドＡの１リン酸基へのホスホエタノールアミン付加のために必要とされる遺伝子）の両方が存在しないと、ＡｒｎＴＳｔはＬ−Ａｒａ４Ｎを１および４’リン酸の両方に加え、単一および二重修飾されたリピドＡスポットをもたらす（二重修飾されたＬ−Ａｒａ４ＮリピドＡを赤色矢印で示す）。これに反し、ＡｒｎＴＣｍは単一修飾されたリピドＡ種のみ生じる。さらに、ΔａｒｎＴ単一ノックアウト株では、ＡｒｎＴＣｍはリピドＡを修飾することができない。結論として、ＡｒｎＴＣｍはリピドＡの１リン酸基に立体特異的である。ＰＭＸＢ（０．１μｇ／ｍＬ）による前誘発は、リピドＡ修飾の量および／または性質を有意には変化しなかった。
【図３Ａ−Ｂ】カプリアビダス・メタリデュランス由来のＡｒｎＴの初めての原子レベル構造を示す図である。図３Ａはリガンドと結合していない（アポ、図３Ａ）、および図３ＢはＵｎｄＰと結合したＡｒｎＴＣｍ構造の概略を示す。ＰＤおよびＴＭＤはそれぞれペリプラズムおよび膜貫通領域を意味する。リピドＡおよびＵｎｄＰキャリアの結合用キャビティーを破線と濃淡で示す。２つのキャビティーの結合地点に位置するＬ−ＡｒａＮポケットを破線で囲む。
【図４Ａ−Ｃ】ポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）増殖アッセイを用いて試験した、ＵｎｄＰのヘッド基の周りの残基の機能的な重要性を示すリボン図である（図４Ａおよび図４Ｃ、およびグラフ（図４Ｂ））。図４Ｃは推定的Ｌ−Ａｒａ４Ｎ結合ポケットにおけるＬ−Ａｒａ４Ｎ糖のコンピュータによる結合の結果を示す。
【図５Ａ−Ｄ】ＡｒｎＴの触媒メカニズムを示す図である。図５ＡはＡｒｎＴＣｍの基質結合誘発された構造変化および触媒サイクルの概略図である。図５ＢはＡｒｎＴＣｍの活性部位の構造透視図を示す。結合によって解析されたアミノアラビノース糖に関する推定的位置を示す。保存されたＤ５５およびＤ１５８がＵｎｄＰ／Ｌ−Ａｒａ４Ｎとキャビティー１の結合部位間に位置し、これらの距離が示される。Ｐ１（赤紫色）は実験的に測定されたＵｎｄＰのリン酸であり、一方、Ｐ２（ヘテロ原子）はモデル化されたＬ−Ａｒａ４Ｎ−リン酸由来のリン酸である。残基２７４〜２７８位をモデルから取り除いて活性部位の明確な図を得た。図５ＣはＡｒｎＴＳｔに関するＤ３２およびＫ１８０の機能的な重要性を示す。機能はポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）増殖アッセイを用いて試験した。図５ＤはリピドＡ由来のアクセプターリン酸がＤ５５およびＤ１５８によって配位され、アラビノース環のＣ１原子に直接的な求核攻撃を実施する推定的な触媒機構を示す。
【図６Ａ−Ｃ】化合物のスクリーニングで使用される株の挙動を実証する対照であるポリミキシン増殖アッセイの結果をグラフによって示す図である。図６ＡはポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）の存在または不存在における大腸菌ＢＬ２１株の増殖を示す。大腸菌ＢＬ２１は、内因性大腸菌ＡｒｎＴ遺伝子を有し、ポリミキシンＢに本来耐性である。大腸菌ＢＬ２１株を使用して大腸菌ＡｒｎＴタンパク質に対する試験化合物の効能を試験する。図６ＢはポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）の存在および不存在における大腸菌ＢＬ２１ΔＡｒｎＴ株の増殖を示す。大腸菌ＢＬ２１ΔＡｒｎＴでは、内因性大腸菌ＡｒｎＴ遺伝子は欠失されており、このため、大腸菌ＢＬ２１ΔＡｒｎＴ株をポリミキシンＢに対して感受性にする（ＰＭＸＢの存在下で増殖しなくなる）。図６ＣはＰＭＸＢの存在および不存在におけるＧｉ２４株の増殖を示す。Ｇｉ２４は大腸菌ＢＬ２１ΔＡｒｎＴであり、野生型サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴを発現するプラスミドｐＧｉ２４で形質転換されている。野生型サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴの発現はポリミキシンＢに対する耐性を回復させ、ＰＭＸＢの存在におけるＧｉ２４株の増殖によって実証される。Ｇｉ２４株を使用して、サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴタンパク質に対する試験化合物の効能を試験する。
【図７Ａ−Ｂ】５種のクラスＩ化合物ならびにこれらの化学名、参考／出典情報、効果のまとめ、および化学構造を説明する表を示す図である。観察された効果の定量的評価を、＋、＋＋、＋＋＋のシステムを用いて示して陽性効果を説明し（プラスの数が観察された効果の重度の評価を示す）、±は小さな効果または効果のないことを示すが、効果の存在が完全には排除できず、−は効果が全くないことを示す。
【図８Ａ−Ｊ】標的に基づいた実際のスクリーニングによって得られた５種のクラスＩ化合物におけるポリミキシン増殖アッセイの結果をグラフによって示す図である。ポリミキシン増殖アッセイにおける化合物試験の結果を示すこの図およびその後のすべての図では、４つの曲線は、（ｉ）ＰＭＸＢの不存在における試験株（大腸菌ＡｒｎＴを標的にするＢＬ２１またはＳ．ティフィムリウムＡｒｎＴを標的にするＧｉ２４）の増殖（−ＰＭＸＢ、白抜き丸で表示）、（ｉｉ）ＰＭＸＢの存在における試験株の増殖（＋ＰＭＸＢ、白抜き正方形で表示）、（ｉｉｉ）ＰＭＸＢの不存在および試験化合物の存在における試験株の増殖（−ＰＭＸＢ、＋Ｃｍｐｄ、白抜き菱形で表示）、（ｉｖ）ＰＭＸＢおよび試験化合物の存在における試験株の増殖（＋ＰＭＸＢ＋Ｃｍｐｄ、白抜き正方形で表示）を示す。曲線の各ポイントは、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の６回測定の平均を示す（２回の独立した実験から得られた三重測定サンプル）。標準偏差は示されていないが、一般的に０．００１〜０．１の範囲だった。大腸菌ＢＬ２１株（大腸菌ＡｒｎＴを有する）の増殖を、クラスＩ化合物２０、１４、１５、１９、またはＵ２の存在中で測定した（それぞれ図８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｇ、および８Ｉ）。大腸菌Ｇｉ２４株（Ｓ．ティフィムリウムＡｒｎＴを有する）の増殖を、クラスＩ化合物２０、１４、１５、１９、またはＵ２の存在中で測定した（それぞれ図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈ、および８Ｊ）。化合物はすべて０．５ｍＭの最終濃度で試験した。
【図９】４種のクラスＩＩ化合物ならびにこれらの化学名、参考／出典情報、効果のまとめ、および化学構造を説明する表を示す図である。評価システムは図７Ａ〜Ｂで説明される定義に従う。
【図１０Ａ−Ｈ】標的に基づいた実際のスクリーニングによって得られた４種のクラスＩＩ化合物におけるポリミキシン増殖アッセイの結果をグラフによって示す図である。各グラフは図８Ａ〜Ｊで説明されたように４種の曲線を示す。大腸菌ＢＬ２１株（大腸菌ＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＩ化合物３６、３７、Ｕ５、またはＵ６の存在中で測定した（それぞれ図１０Ａ、１０Ｃ、１０Ｅ、および１０Ｇ）。大腸菌Ｇｉ２４株（Ｓ．ティフィムリウムＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＩ化合物３６、３７、Ｕ５、またはＵ６の存在中で測定した（それぞれ図１０Ｂ、１０Ｄ、１０Ｆ、および１０Ｈ）。曲線の各ポイントは、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の６回測定の平均を示す（２回の独立した実験から得られた三重測定サンプル）。標準偏差は示されていないが、一般的に０．００１〜０．２の範囲だった。化合物はすべて０．５ｍＭの最終濃度で試験した。
【図１１】４種のクラスＩＩＩ化合物ならびにこれらの化学名、参考／出典情報、効果のまとめ、および化学構造を説明する表を示す図である。評価システムは図７Ａ〜Ｂで説明される定義に従う。
【図１２Ａ−Ｆ】標的に基づいた実際のスクリーニングによって得られた３種のクラスＩＩＩ化合物におけるポリミキシン増殖アッセイの結果をグラフによって示す図である。各グラフは図８Ａ〜Ｊで説明されたように４種の曲線を示す。大腸菌ＢＬ２１株（大腸菌ＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＩＩ化合物３、Ｕ４、またはＵ７の存在中で測定した（それぞれ図１２Ａ、１２Ｃ、および１２Ｅ）。大腸菌Ｇｉ２４株（Ｓ．ティフィムリウムＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＩＩ化合物３、Ｕ４、またはＵ７の存在中で測定した（それぞれ図１２Ｂ、１２Ｄ、および１２Ｆ）。化合物６の結果は、乏しい溶解性による不規則な増殖によって、得られたデータの確信ある解釈ができないため除外した。この化合物の量的評価のみを図１１に含めた。曲線の各ポイントは、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の６回測定の平均を示す（２回の独立した実験から得られた三重測定サンプル）。標準偏差は示されていないが、一般的に０．００１〜０．１の範囲だった。化合物はすべて０．５ｍＭの最終濃度で試験した。
【図１３】２種のクラスＩＶ化合物ならびにこれらの化学名、参考／出典情報、効果のまとめ、および化学構造を説明する表を示す図である。評価システムは図７Ａ〜Ｂで説明される定義に従う。
【図１４Ａ−Ｄ】標的に基づいた実際のスクリーニングによって得られた２種のクラスＩＶ化合物におけるポリミキシン増殖アッセイの結果をグラフによって示す図である。各グラフは図８Ａ〜Ｊで説明されたように４種の曲線を示す。大腸菌ＢＬ２１株（大腸菌ＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＶ化合物２または９の存在中で測定した（それぞれ図１４Ａおよび１４Ｃ）。大腸菌Ｇｉ２４株（Ｓ．ティフィムリウムＡｒｎＴを有する）の増殖をクラスＩＩＩ化合物２または９の存在中で測定した（それぞれ図１４Ｂおよび１４Ｄ）。曲線の各ポイントは、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の６回測定の平均を示す（２回の独立した実験から得られた三重測定サンプル）。標準偏差は示されていないが、一般的に０．００１〜０．１の範囲だった。化合物はすべて０．５ｍＭの最終濃度で試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特定の態様では、Ｃ．メタリデュランス由来のＡｒｎＴの結晶構造を遺伝子および機能分析と組み合わせて使用して、ポリミキシン系抗生物質に対する耐性を防止または逆転させる共薬の開発のための合理的薬物設計を実施する。本結果は、ポリミキシンに対する耐性に対抗する新規クラスの抗生物質のため、薬剤標的としてＡｒｎＴを展開することを説明する。この最終目的に向け、分子レベルでのサルモネラ・エンテリカおよび大腸菌におけるＡｒｎＴによるリピドＡグリコシル化の機構が本明細書で説明されるように解明され、そして構造情報に基づいた薬剤の発見および設計のために使用して、ポリミキシンに対する耐性を改善することができる小分子を特定する。カプリアビダス・メタリデュランスＣＨ３４由来のＡｒｎＴの初めての構造は、そのアポ状態および基質結合状態の両方で決定されており、ポリミキシンに対する耐性に対抗する抗生物質の新規クラスにおける薬剤標的としてＡｒｎＴを展開するための独自ツールをもたらす。
【００２１】
理論に拘束されることなく、本発明はアミノアラビノースグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）の初めての高分解能構造、特にグラム陰性細菌であるカプリアビダス・メタリデュランスＣＨ３４由来のアミノアラビノースグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）の２種の異なる状態に相当する構造の決定に部分的に基づいている。ＡｒｎＴは細菌の外膜でリピドＡにアミノアラビノースを結合させるグラム陰性細菌における酵素であり、このため、膜の負電荷を低下させ、カチオン性ポリミキシン抗生物質の結合を妨げる。グラム陰性細菌のアミノアラビノース生合成経路における最後の酵素としてＡｒｎＴは、その機能を妨げて、最終的にポリミキシン耐性を防止または逆転する小分子を設計する上で有用な標的である。本明細書で説明されるように、ＡｒｎＴのアポおよび脂質−キャリア結合構造は、ＡｒｎＴを標的にする合理的薬物設計のための鋳型として利用することができる。特定の実施形態では、本発明はグラム陰性細菌におけるＡｒｎＴに対する拮抗剤または競合拮抗剤として作用し得る薬剤のために、非常に多くの化合物を高性能スクリーニングするための工程に関する。
【００２２】
ポリミキシンはＭＤＲグラム陰性感染症治療の最後の一線である。世界中の臨床医はますます、ポリミキシン以外のすべての利用可能な抗生物質に耐性であるＧＮ病原体による感染の現実に直面させられる［Ａ１１、Ａ１２］。２種のポリミキシンであるポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（すなわち、コリスチン）が１９６０年代に臨床使用のために利用可能になっている。これらは主としてＧＮ細菌に対する狭い抗菌スペクトルであり、ほとんどの現在のＭＤＲ  ＧＮ病原体に対して有効である［Ａ１３、Ａ１４］。しかし、ポリミキシンの臨床使用は、静脈内投与後の腎臓毒性および神経毒性の報告によって１９７０年代に減少した［Ａ１３、Ａ１４］。他系のすべての抗生物質に対する耐性の急速な増加がこれらの復活を必要としており、これらはＭＤＲ  ＧＮ感染症のために最後の頼れる治療として現在幅広く使用されている。ポリミキシンは生理学的ｐＨでポリカチオン性である非リボソームリポペプチドである（図１Ａ）。グラム陰性細菌におけるポリミキシンＢの作用メカニズムを図１Ｃおよび図４Ａに示す。正電荷アミノ基を＋印で示す。図１Ｂは大腸菌由来のリピドＡを示す。負電荷リン酸基を破線（−）で示す。図１Ｃは、グラム陰性菌の膜で作用するポリミキシンの作用メカニズムの概略を示す図である。２つのメカニズムは、膜溶解（Ｉ）および小胞−小胞接触（ＩＩ）を説明する。ポリミキシンおよびリピドＡからのそれぞれ正電荷および負電荷が示される。ＯＭ、ＩＭ、およびＰは外膜、内膜、およびペリプラズムを意味する（Ａ１８）。
【００２３】
ポリミキシンは主としてＧＮ細菌膜を透過することによって作用するが［Ａ１５］、外膜と内膜の間の脂質交換を通して進行する異なるメカニズムも提唱されている［Ａ１６〜１８］。ポリミキシンのカチオン性アミノ基とリピドＡのアニオン性リン酸基の間では、両親媒性糖脂質が外膜の外側リーフレット内でＬＰＳを固定する（図１Ａ〜Ｂ）［Ａ１９］。危ういことに、ポリミキシンに対する耐性がインビトロで自然に出現し得［Ａ２０〜Ａ２２］、準最適化使用の症例患者で認められている［Ａ１０、Ａ２３］。この耐性はグルコサミン糖リン酸をキャッピングするリピドＡの酵素的な修飾を通して主に獲得され、細菌膜における負電荷の低下をもたらす［Ａ２４］。このメカニズムは自然発生の抗微生物カチオン性ペプチドに対して効果的なＧＮ細菌の回避戦略でもある［Ａ２５、Ａ２６］。ポリミキシンに対する耐性の発生はまだ限定されているが、より強い耐性に対する不安傾向が世界中で認められ、ＭＤＲ  ＧＮ感染症と戦う我々の能力を脅かす［Ａ２７］。本明細書で説明されるように、ポリミキシン耐性獲得のこのメカニズムは、ポリミキシンに対する感受性を回復することができる薬剤の開発にとって魅力的な標的である。
【００２４】
薬剤耐性グラム陰性感染症を治療、予防、回復、または阻害する化合物および戦略が、本明細書で説明されるように、限定されないが、例として下記に示されるある種の生物のＭＤＲ  ＧＮ感染症に広範に適用可能であることが期待される。
【００２５】
アシネトバクターはガンマプロテオバクテリアの広い網に属するグラム陰性細菌の属である。健常な個体では、皮膚におけるアシネトバクターコロニーはアレルギーの低い発生率と関連し、アシネトバクターはアレルギー防護性であると考えられる。Ａ．バウマンニはヒトにおいて２番目に最も一般的に分離されている非発酵性細菌である。免疫無防備状態の個体では、いくつかのアシネトバクター種は生命を脅かす感染症を生じ得る。このような種は比較的広い範囲の抗生物質耐性も示す。
【００２６】
アシネトバクターはしばしば院内感染で分離され、特に集中治療室で流行し、散発性症例および伝染性で地方的な発生の両方が一般的である。Ａ．バウマンニは院内肺炎、特に「遅発性」の換気装置関連肺炎の高頻度な原因である。これは皮膚および創傷感染、菌血症、ならびに髄膜炎を含む様々な他の感染症を生じ得るが、Ａ．ルオフィイは後者に最も関与する。Ａ．バウマンニはヒト皮膚または乾燥表面で数週間生存することができる。
【００２７】
シュードモナスはグラム陰性、好気性ガンマプロテオバクテリアの属であり、正当に報告された１９１種を含むシュードモナス科に属する。この属のメンバーは多くの代謝多様性を示し、結果として、幅広い範囲の微小環境にコロニー形成することができる。これらのインビトロでの培養の容易さ、および増加した数のシュードモナス株ゲノム配列の利用可能性が、この属を科学研究のための優れた照準にしており、最も研究された種には、日和見性のヒト病原体として、その役割におけるＰ．アエルギノサが含まれる。
【００２８】
グラム陰性細菌であるため、ほとんどのシュードモナス種はペニシリンおよび多くの関連したベータラクタム抗生物質に本来的に耐性であるが、いくつかはピペラシリン、イミペネム、チカルシリン、またはシプロフロキサシンに感受性である。トブラマイシン、ゲンタマイシン、およびアミカシンのようなアミノグリコシドは、治療のための他の選択肢である。厳しい条件で生育するこの能力は、ポリンを含むこれらの頑強な細胞壁の結果である。ほとんどの抗生物質に対するこれらの耐性は、ある種の抗生物質をこれらが作用し得る前に送り出す排出ポンプに帰される。
【００２９】
シュードモナス・アエルギノサは臨床関連の出現性日和見病原体としてますます認識されている。その最も不安な性質の一つは、その低い抗生物質感受性である。この低感受性は、多剤排出ポンプと染色体にコードされた抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭ、ｍｅｘＸＹ、など）との協調した作用、および細菌細胞エンベロープの低い透過性に帰することができる。
【００３０】
また、１種類以上のグラム陰性細菌のアミノアラビノースグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）を阻害するための方法が提供され、１種類以上のグラム陰性細菌を、本明細書で示される構造を有する化合物、あるいはこれらのいずれかの医薬品として許容可能な塩または立体異性体、あるいはこれらのいずれかのこの生理学的に機能的な誘導体と、１種類以上のグラム陰性細菌のＡｒｎＴを阻害するのに効果的な量で接触させることを含む。
【００３１】
一つの実施形態では、「患者」または「被験体」は哺乳動物を意味し、ヒトおよび獣医学被験体を含む。特定の実施形態では、被験体は哺乳類である。
【００３２】
一つの実施形態では、本化合物は医薬品として許容可能な担体を含む組成物で投与される。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は１種類以上のグラム陰性細菌による感染によって仲介される障害または疾患の治療または予防の方法に関するものであり、
【化６１】
2018534303.tif 000063
式中、Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロである、式Ｉの化合物、
【化６２】
2018534303.tif 000064
式中、Ｒ１は
【化６３】
2018534303.tif 000065
および
【化６４】
2018534303.tif 000066
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＩの化合物、
【化６５】
2018534303.tif 000067
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化６６】
2018534303.tif 000068
【化６７】
2018534303.tif 000069
、
【化６８】
2018534303.tif 000070
および
【化６９】
2018534303.tif 000071
の群の部分から選択される、式ＩＩＩの化合物、
または
【化７０】
2018534303.tif 000072
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される、式ＩＶの化合物、
もしくはこれらのいずれかの組み合わせ、またはこれらの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、多型、互変異性体、もしくはプロドラッグ、あるいはそれらの医薬組成物の治療上効果的な量を、この方法を必要とする患者に、少なくとも１種類の追加抗細菌剤と併用して投与することを含む。
【００３４】
また、１種類以上のグラム陰性細菌のＡｒｎＴを阻害するための方法が提供され、１種類以上のグラム陰性細菌を、本明細書で示される構造を有する化合物、あるいはこれらのいずれかの医薬品として許容可能な塩または立体異性体、あるいはこれらのいずれかのこの生理学的に機能的な誘導体と、１種類以上のグラム陰性細菌のＡｒｎＴを阻害するのに効果的な量で接触させることを含む。
【００３５】
医薬化合物
本発明の方法で使用される化合物は、本発明によって使用される化合物のすべての水和物、溶媒和物、および複合体を含む。キラル中心または異性体中心の別の型が本発明の化合物に存在する場合、エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む、このような異性体または複数の異性体のすべての型は、本明細書に網羅されることが意図されている。キラル中心を含む化合物は、鏡像異性体として豊富な混合物であるラセミ混合物として使用され得、あるいは、ラセミ混合物は良く知られた技術を用いて分離され得、個別エナンチオマーが単独で使用され得る。本発明で説明される化合物は、ラセミ型または個別エナンチオマーとしてのものである。エナンチオマーは、Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６９，１４６９−１４７４，（１９９７）ＩＵＰＡＣで報告されているような、既知の技術を用いて分離することができる。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）異性体の両方が本発明の範囲内である。化合物がケト−エノール互変異性体のような互変異性型で存在し得る場合、各互変異性型は平衡または主として１つの型で存在するいずれでも本発明内に含まれるものと考えられる。
【００３６】
本発明で使用される化合物の構造が不斉炭素原子を含むとき、このような化合物はラセミ体、ラセミ混合物、および分離された単一エナンチオマーとして生じ得る。これらの化合物のこのようなすべての異性体型は、明確に本発明に含まれる。各ステレオジェニック炭素はＲまたはＳ配位のものであり得る。従って、このような不斉から生じる異性体（例えば、すべてのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は、他に指示がない限り、本発明の範囲内に含まれると理解される。このような異性体は、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ，およびＳ．Ｗｉｌｅｎによる”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（エナンチオマー、ラセミ体、および分割）”，Ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９８１で報告されているような、従来の分離技術および立体化学的に制御された合成によってほとんど純粋な型で得ることができる。例えば、分割はキラルカラムの分取クロマトグラフィーによって実施し得る。
【００３７】
本発明は、本明細書で開示される化合物で生じる原子のすべての同位体の使用を含むことも意図されている。同位体には、同一原子番号だが異なる質量数を有する原子が含まれる。一般的な例として、限定されないが、水素の同位体にはトリチウムおよび重水素が含まれる。炭素の同位体には炭素−１３および炭素−１４が含まれる。
【００３８】
本出願全体を通して、構造における炭素のいずれかの表記は、さらなる表記がなく使用されるとき、１２Ｃ、１３Ｃ、または１４Ｃのような炭素のすべての同位体を表すことが意図されることに留意する。さらに、１３Ｃまたは１４Ｃを含むいずれかの化合物は、本明細書で開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。
【００３９】
本出願全体を通して、構造における水素のいずれかの表記は、さらなる表記がなく使用されるとき、１Ｈ、２Ｈ、または３Ｈのような水素のすべての同位体を表すことが意図されることにも留意する。さらに、２Ｈまたは３Ｈを含むいずれかの化合物は、本明細書で開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。
【００４０】
同位体による標識化合物は、一般的に、従来技術の当業者によって知られている通常の技術によって、または使用される非標識試薬の代わりに適切に同位体標識された試薬を用いて本明細書で開示される例で説明されるものと類似したプロセスによって調製することができる。
【００４１】
本発明の化合物は塩型であり得る。本明細書で使用されるとき、「塩」は、酸または塩基を調製することによって修飾されている本化合物の１つの塩、複数化合物の複数の塩である。癌の治療に使用される化合物の場合、塩は医薬品として許容可能である。医薬品として許容可能な塩の例には、限定されないが、ミネラルまたはアミンのような塩基残基の有機酸塩、アルカリまたはフェノールのような酸性残基の有機塩が含まれる。塩は有機または無機酸を用いて調製することができる。このような酸塩は、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩などである。フェノレート塩は、アルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウムまたはリチウムのものである。用語「医薬品として許容可能な塩」はこの観点において、本発明の化合物の比較的非毒性である無機酸および有機酸または塩基付加塩を意味する。これらの塩は本発明の化合物の最終的な分離および精製の際にその場で、あるいは遊離塩基または遊離酸型の本発明の精製した化合物を適切な有機または無機の酸または塩基とともに別々に処理し、このようにして生成された塩を分離することによって、調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプチレート（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシレート、グルコヘプトン酸、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７）”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ（医薬塩）”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照する）。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」は、特定数の炭素原子を有する分枝および直鎖の両飽和脂肪族炭化水素基を含み、非置換または置換であり得る。アルキルはＣ１〜Ｃ１０アルキル、あるいはこのサブセットまたは個々である。非限定的な例では、アルキルが「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」としてＣ１〜Ｃ５であるとき、直鎖または分枝配列で１、２、３、４、または５個の炭素を有する基を含むことが定められ、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびペンチルを含む。アルキルは任意にフェニルまたは置換フェニルで置換されて、置換または非置換ベンジルをもたらし得る。
【００４３】
ヘテロシクリルは、炭素または窒素から選択される３〜８員環原子、好ましくは５〜６員環原子を含むがピロリジンに限定されない、飽和または部分的に不飽和な単環ラジカルを意味する。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は５〜１５個の炭素原子を含む芳香族単環または多環基を意味する。アリール基は、限定されないが、非置換または置換フェニルのような基を含む。アリールが置換されていることを意味するとき、置換は本発明の化合物の他の環系への結合地点以外の、環のいずれかの位置であり得る。従って、アリール環上のいずれかの水素原子は本発明によって定められる置換基で置換され得る。アリールがフェニル環である実施形態では、置換は結合地点に対してメタ−および／またはオルト−および／またはパラ−位であり得る。アリールは、ピロリジニル−Ｃ（Ｏ）部分を含むヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）部分によって任意に置換され得る。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」は、各環に原子が１０個までの安定した単環、二環、または多環を表し、ここで少なくとも１つの環は芳香族であり、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子、または特に１〜２個のヘテロ原子を含む。二環芳香族ヘテロアリール基はフェニル、ピリジン、ピリミジン、またはピリダジン環を含み、（ａ）１個の窒素原子を有する６員芳香族（不飽和）ヘテロシクリル環に融合、（ｂ）２個の窒素原子を有する５または６員芳香族（不飽和）ヘテロシクリル環に融合、（ｃ）１個の酸素または１個のイオウ原子のいずれかとともに１個の窒素原子を有する５員芳香族（不飽和）ヘテロシクリル環に融合、あるいは（ｄ）Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１個のヘテロ原子を有する５員芳香族（不飽和）ヘテロシクリル環に融合されている。この定義の範囲内のヘテロアリール基には、限定されないが、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラ−ヒドロキノリンが含まれる。ヘテロアリール置換基が二環であり、１つの環は非芳香族であるか、またはヘテロ原子を含まない場合、結合はそれぞれ芳香族環、またはヘテロ原子含有環を介していると理解される。ヘテロアリールが窒素原子を含む場合、これに相当するＮ−オキシドも本定義に包含されると理解される。
【００４６】
本発明の化合物において、アルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、１個以上の水素原子を代替の非水素基に交換することによってさらに置換することができる。これらには、限定されないが、アルキル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、シアノ、およびカルバモイルから選択される１〜４つの基を含む。
【００４７】
用語「置換された」は、前述のような官能基を意味し、そこに含まれる水素原子との１つ以上の結合が非水素または非炭素原子との結合によって交換され、通常の原子価が維持され、置換が安定した化合物をもたらすことが示される。置換基はまた、炭素（複数可）または水素（複数可）の原子との１つ以上の結合がヘテロ原子との二重または三重結合を含む１つ以上の結合によって交換されている基を含む。置換基の例には、前述の官能基、および特に、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）；メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロプリル（ｐｒｏｐｒｙｌ）、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、およびトリフルオロメチルのようなアルキル基；ヒドロキシル；メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、およびイソプロポキシのようなアルコキシ基；フェノキシのようなアリールオキシ基、ベンジルオキシ（フェニルメトキシ）およびｐ−トリフルオロメチルベンジルオキシ（４−トリフルオロメチルフェニルメトキシ）のようなアリールアルキルオキシ；ヘテロアリールオキシ基；トリフルオロメタンスルホニル、メタンスルホニル、およびｐ−トルエンスルホニルのようなスルホニル基；ニトロ、ニトロシル；メルカプト；メチルスルファニル、エチルスルファニル、およびプロピルスルファニルのようなスルファニル基、シアノ；ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）部分；アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、およびジエチルアミノのようなアミノ基、ならびにカルボキシルが含まれる。多置換部分が開示または請求される場合、置換化合物は開示または請求される単一または複数による置換部分の１つ以上によって独立して置換され得る。独立して置換されることによって、（２つ以上の）置換基は同一または異なり得ることが意味される。
【００４８】
本発明の化合物における置換基および置換パターンは、従来技術の当業者によって選択されて化学的に安定な化合物をもたらすことができ、従来技術で知られている技法、ならびに後述の方法によって、容易に利用可能な開始材料から容易に合成することができると理解される。置換基が１つを超える基でそれ自体が置換されている場合、これらの複数の基は安定な構造が得られる限り、同一炭素または異なる炭素におけるものであり得ると理解される。
【００４９】
本発明の化合物を選択する上で、従来技術の当業者は、様々な置換基、すなわちＲ１、Ｒ２などが化学的構造結合性の良く知られている原理に準拠して選択されるべきであることを認識するであろう。さらに、水素が本明細書における炭素ベースの構造で示されない場合、表示されない水素が必要とされる原子価を完全にすると理解される。
【００５０】
本明細書において数値範囲がいずれかのパラメータについて示されるとき、その数値範囲のすべての数値サブセット、および含まれるすべての個別整数値は、本発明の一部として示されると理解される。このため、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルは、１〜３個の炭素原子であるアルキルのサブセット、２〜５個の炭素原子であるアルキルのサブセットなど、ならびに１個の炭素原子を有するアルキル、３個の炭素原子を有するアルキル、１０個の炭素原子を有するアルキルなどを含む。
【００５１】
一つの実施形態では、本明細書で考察されるプリンはアデノシン、イノシン、ヒポキサンチン、またはアデニンの１種類以上である。一つの実施形態では、本明細書で使用される「測定する」は、実験的に測定することを意味する。
【００５２】
用語「組成物」は、医薬組成物において、有効成分（複数可）、および担体を構成する不活性原料（複数可）（医薬品として許容可能な添加剤）を含む調製物、ならびにいずれかの２種類以上の原料の組み合わせ、複合体化、または集合から、あるいは１種類以上の原料の解離から、あるいは１種類以上の原料の他のタイプの反応または相互作用から直接的または間接的に生じるいずれかの調製物を包含することが意図される。従って、本発明の医薬組成物は、本明細書で説明される化合物のいずれかの１種類または組み合わせ、および医薬品として許容可能な添加剤を混合することによって調製される任意に組成物を包含する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「任意に」は、その後に説明される事象（複数可）が生じ得る、または生じ得ない、そして生じる事象（複数可）および生じない事象の両方を含むことを意味する。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「１つ以上の基で置換された」は、置換基の数が明確に記載されていない限り、すべての水素原子を可能な同一または異なる置換基で交換するまでの多置換度で指定された、１つの置換基または複数の置換基による置換を意味する。置換基の数が明確に記載されていない場合、１つ以上の基が意図される。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「本発明の化合物」は、本明細書で説明される化合物のいずれか、あるいはこれらの塩、溶媒和物、または生理学的に機能的な誘導体を含む。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「溶媒和物」は溶質（または本明細書で説明される化合物のいずれか、この塩）および溶媒によって生成される可変的な化学量論の複合体を意味する。本発明の目的のためのこのような溶媒和物は、溶質の生物学的活性を妨げ得ない。適切な溶媒の例には、限定されないが、水、アセトン、メタノール、エタノール、および酢酸が含まれる。好ましくは、使用される溶媒は医薬品として許容可能な溶媒である。適切な医薬品として許容可能な溶媒の例には、水、エタノール、および酢酸が含まれる。最も好ましくは、溶媒は水である。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「生理学的に機能的な誘導体」は、インビボで変換されて本明細書で説明される化合物、あるいは当該化合物の医薬品として許容可能な塩、水和物、または溶媒和物のいずれかを生じる化合物（例えば、薬剤前駆体）を意味する。変換は、例えば、血液における加水分解によるなど、様々なメカニズム（例えば、代謝または化学的過程による）によって生じ得る。プロドラッグはこのような誘導体であり、プロドラッグの使用の考察は、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＷ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（新しい送達系としてのプロドラッグ），”Ｖｏｌ．１４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、ならびにＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（薬剤設計における生体可逆性担体），ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７によって示される。
【００５８】
本明細書で説明される様々な構成要素のすべての組み合わせは、本明細書において指示されていない、または文脈によって明確に否定されていない限り、本発明の範囲内である。各変数での実施形態は、一般的に各変数について別々に前述で示されているが、本発明はいくつかまたはそれぞれの実施形態が前述で示された実施形態のそれぞれから選択されている化合物も含む。従って、本発明は各変数での実施形態のすべての組み合わせを含むことが意図される。
【００５９】
塩、溶媒和物、およびこの生理学的に機能的な誘導体を含む本明細書で説明される化合物は、アミノアラビナーゼグリコシルトランスフェラーゼ（ＡｒｎＴ）の阻害剤であると考えられ、このため、多剤耐性生物（ＭＤＲ）を含む耐性グラム陰性生物による感染と関連する疾患、障害、および症状の予防または治療に有用な可能性がある。特定の例では、本明細書で説明される化合物のいずれか１種類または組み合わせは、薬剤耐性症状を防止するために予防的に使用することができる。
【００６０】
本明細書で説明される化合物のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせ、またはその医薬品として許容可能な塩および医薬組成物は、１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物による感染によって仲介される様々な症状または疾患を治療または予防するために使用することができる。同様に、抗細菌剤（すなわち、ポリミキシン抗生物質）のような１種類以上の追加薬剤が、本明細書で説明される化合物またはその医薬品として許容可能な塩のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせと併用して加えられ得、医薬組成物は１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物による感染によって仲介される様々な症状または疾患を治療または予防するために使用することができる。
【００６１】
このため、本発明は治療法、特に多剤耐性生物を含む、１種類以上の耐性グラム陰性生物による暴露または感染によって仲介される疾患および症状の治療における使用のために、本明細書で説明される化合物、ならびにこの塩、溶媒和物、および生理学的に機能的な誘導体のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせを提供する。
【００６２】
さらなる実施形態では、本発明は１種類以上の薬剤耐性グラム陰性生物による感染によって仲介される障害を有する患者の治療方法を提供し、本明細書で説明される化合物、あるいはこの医薬品として許容可能な塩、溶媒和物、または生理学的に機能的な誘導体のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせの効果的な量を患者に投与することを含む。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明は多剤耐性生物を含む１種類以上の薬剤耐性グラム陰性生物による感染によって仲介される障害の治療のための医薬品の調製において、本明細書で説明される化合物、あるいはこの医薬品として許容可能な塩または溶媒和物、あるいはこの生理学的に機能的な誘導体のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせの使用を提供する。
【００６４】
治療における使用のため、本明細書で説明される化合物、ならびにこの塩、溶媒和物、および生理学的に機能的な誘導体のいずれかは原化学物質として投与され得るが、医薬組成物として有効成分を提供することも可能である。従って、本発明はさらに医薬組成物を提供し、本明細書で説明される化合物、この塩、溶媒和物、および生理学的に機能的な誘導体のいずれか、ならびに１種類以上の医薬品として許容可能な担体、希釈剤、または添加剤を含む。本明細書で説明される化合物、この塩、溶媒和物、および生理学的に機能的な誘導体のいずれかは、前述の通りである。担体（複数可）、希釈剤（複数可）、または添加剤（複数可）は製剤の他の原料と適合性である点で許容可能でなければならず、この受容者に対して有害であってはならない。本発明の別の態様により、医薬組成物の調製のための工程も提供され、本明細書で説明される化合物、またはこの塩、溶媒和物、および生理学的に機能的な誘導体のいずれか１種類または２種類以上の組み合わせを、１種類以上の医薬品として許容可能な担体、希釈剤、または添加剤と混合することを含む。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、単位用量あたりの有効成分所定量を含む単位投与剤形で提供され得る。このような単位は、治療される症状、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、および症状に応じて、本明細書で説明される化合物のいずれかを、例えば、５μｇ〜１ｇ、好ましくは１〜７００ｍｇ、より好ましくは５〜１００ｍｇ含み得る。従って、このような単位用量は１日に１回を超えて投与され得る。好ましい単位投与組成物は、有効成分を本明細書における前述のように、１日用量または分割用量（１日に１回を超える投与用）、あるいはこの適切な割合を含むものである。さらに、このような医薬組成物は製薬技術で良く知られている方法のいずれかによって調製され得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、いずれかの適切な経路、例えば経口（口腔または舌下を含む）、吸入、鼻腔、眼、または非経口（静脈内および筋肉内を含む）経路による投与に適応され得る。このような組成物は製薬技術で知られているいずれかの方法によって調製され得、例えば、有効成分を担体（複数可）または添加剤（複数可）と混合することによってもたらされる。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明は、経口経路による投与、１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物による感染と関連する疾患および症状の治療に適応される医薬組成物を提供する。
【００６８】
経口投与に適応される本発明の医薬組成物は、カプセルまたは錠剤、粉末または顆粒、水性または非水性液体における溶液または懸濁液、食用フォームまたはホイップ、あるいは水中油液体エマルションまたは油中水液体エマルションのような個別単位として提供され得る。
【００６９】
例えば、錠剤またはカプセルの剤形における経口投与では、有効薬剤成分はエタノール、グリセロール、水などのような経口用で非毒性の医薬品として許容可能な不活性担体と混合することができる。粉末は本化合物を適切な微細サイズに粉砕し、デンプンまたはマンニトールなどの食用炭水化物のような、同様に粉砕された医薬用担体と混合することによって調製する。香料、保存剤、分散剤、および着色剤も存在することができる。
【００７０】
カプセルは前述のような粉末混合物を調製し、成型されたゼラチンシースに充填することによって作製する。コロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、または固形ポリエチレングリコールのような滑剤および滑沢剤を粉末混合物に、充填操作前に添加することができる。また、寒天、炭酸カルシウム、または炭酸ナトリウムのような崩壊剤または可溶化剤を加えて、カプセルが摂取されたときに医薬品の利用能を向上させることができる。
【００７１】
さらに、所望または必要なとき、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤も混合物に組み込むことができる。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータ−ラクトースのような天然糖、コーンシロップ、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの投与剤形に使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、顆粒化またはスラッギングし、滑沢剤および崩壊剤を加え、錠剤に圧縮することによって製剤化する。粉末混合物は、適切に粉砕された本化合物を前述のような希釈剤またはベースとともに、任意にカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、またはポリビニルピロリドンのような結合剤、パラフィンのような溶液抑制剤、四級塩のような再吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリン、またはリン酸二カルシウムのような吸収剤とともに、混合することによって調製する。粉末混合物はシロップ、デンプンペースト、アラビアゴム粘液、あるいはセルロースまたはポリマー材の溶液のような結合剤によって湿潤させ、スクリーンに通すことによって顆粒化することができる。顆粒化に代えて、粉末混合物は錠剤製造装置を使用することができ、顆粒に分解された不完全成型の小塊を得る。顆粒は、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、またはミネラルオイルの添加によって、滑沢化して錠剤成型金型への付着を防ぐことができる。そして滑沢化混合物を錠剤に圧縮する。本発明の化合物は、自由流動性の不活性担体と混合して、顆粒化またはスラッギング工程を通さずに直接的に錠剤に圧縮することもできる。シェラックのシーリングコート、糖またはポリマー材のコーティング、およびワックスのポリッシュコーティングからなる透明または不透明な保護コーティングを加えることができる。色素をこれらのコーティングに加えて異なる単位投与量を区別することができる。
【００７２】
溶液、シロップ、およびエリキシルのような経口流体を、対象量が本化合物の所定量を含むように、投与単位剤形に調製することができる。シロップは本化合物を適切に味付けした水性溶液に溶解することによって調製することができ、一方、エリキシルは非毒性アルコール性賦形剤の使用によって調製する。懸濁液は本化合物を非毒性賦形剤に分散させることによって製剤化することができる。エトキシル化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルのような可溶化剤および乳化剤、保存剤、ペパーミントオイルのような香料添加剤、あるいは天然甘味料またはサッカリンまたは他の人工甘味料なども添加することができる。
【００７３】
特に前述された原料に加え、本組成物は本製剤のタイプと関連する従来技術で一般的な他の薬剤を含み得、例えば、経口投与に適したものは香料を含み得ると理解されるべきである。
【００７４】
本発明の化合物の治療上効果的な量は、例えば、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な症状およびその重篤度、製剤の性質、ならびに投与経路を含む多くの要因に依存し、最終的に担当医師または獣医師の判断である。しかし、１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物と関連する疾患または症状の治療のための本明細書で説明される化合物のいずれかの効果的な量は、一般的には、１日あたり５μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ受容者（哺乳動物）体重、より一般的には１日あたり５μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。この量は１日に１回またはより一般的には１日の全量が同一であるように１日あたり多くの分割用量（２、３、４、５、または６回など）で与え得る。この塩または溶媒和物の効果的な量は、本化合物それ自体の効果的な量の比率として判断され得る。
【００７５】
本発明の化合物、これらの塩および溶媒和物、ならびにこれらの生理学的に機能的な誘導体は、単独で、またはより一般的には、１種類以上の多剤耐性グラム陰性生物による感染と関連する疾患および症状の治療のための他の治療剤と併用して、使用され得る。このため、本発明による併用療法は、少なくとも１種類の化合物、あるいはこの医薬品として許容可能な塩または溶媒和物、あるいはこの生理学的に機能的な誘導体の投与、および少なくとも１種類の他の医薬品として有効な薬剤の使用を含む。本化合物（複数可）および他の医薬品として有効な薬剤（複数可）は、一緒または別々に投与され得、別々に投与されるとき、これは同時または任意の順序で連続的に行われ得る。本化合物（複数可）および他の医薬品として有効な薬剤（複数可）の量、ならびに投与の相対的な時機は、所望の併用治療効果を達成するために選択される。
【００７６】
適切な場合、他の治療成分（複数可）が塩、例えば、アルカリ金属またはアミン塩、あるいは酸付加塩、またはプロドラッグ、またはエステル、例えば低級アルキルエステル、または溶媒和物、例えば水和物、の形態で使用されて、治療成分の活性および／または安定性および／または溶解性などの物理的性質を最適化し得ることは、従来技術の当業者には明らかであろう。また、適切な場合、治療成分は光学的に純粋な形態で使用され得ることも明らかであろう。
【００７７】
前述の併用は、医薬組成物の剤形で使用するために通常提供され得、このため、医薬品として許容可能な希釈剤または担体とともに前述の組み合わせを含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を示す。
【００７８】
このような併用の個別化合物は、別々または組み合わせた医薬組成物で連続してまたは同時に投与され得る。好ましくは、個別化合物は組み合わせた医薬組成物で同時に投与される。既知の治療剤の適切な用量は、従来技術の当業者によって容易に認識される。
【００７９】
本発明の化合物は標準的な化学を含む様々な方法によって調製され得る。本明細書で使用される化合物は、表１に示す多くの異なる供給元から購入した。既に定められた変数は、指示がない限り、先に定義された意味を有し続ける。
【００８０】
本発明の化合物は、有機合成の技術で知られている方法によって調製され得る。感受性または反応性の基のための保護基を、化学の一般的な原理に従って必要な場合に使用することが十分理解されている。保護基は有機合成の標準的な方法（Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（１９９１）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（有機合成における保護基），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に従って操作される。これらの基は従来技術の当業者によって容易に明らかである方法を用いて、化合物合成の都合の良い段階で取り除かれる。保護基の選択ならびに反応条件および反応段階の順序は、本発明の化合物の調製と矛盾しない。従来技術の当業者は、立体中心が本発明の化合物に存在するかどうか認識するであろう。従って、本発明はすべての可能性がある立体異性体を含み、立体異性体（ラセミ化合物など）の混合物だけでなく、個別の立体異性体も同様に含む。化合物が単一エナンチオマーとして所望されるとき、立体特異的合成によって、あるいは最終生成物またはいずれかの都合の良い中間体の分離によって得ることができる。最終生成物、中間体、または開始材料の分析は、従来技術で知られている適切な方法によって達成され得る。例えば、Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，およびＬ．Ｎ．ＭａｎｄｅｒによるＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（有機化合物の立体化学）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４）を参照する。
【表１】
2018534303.tif 000073
【００８１】
分子生物学
分子生物学の標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２＆１９８９  ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１  ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、実験室マニュアル），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング），３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（組換えＤＮＡ），Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されている。標準的方法は、Ａｕｓｂｅｌ，ら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル），Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹでも示され、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異形成（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、グリコ共役体およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびに生物情報学（Ｖｏｌ．４）を説明している。
【００８２】
免疫沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製に関する方法が報告されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（タンパク質科学における最新プロトコル），Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後改変、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化も報告されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（タンパク質科学における最新プロトコル），Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル），Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（生命科学研究のための製品），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｐｐ．４５−８９、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ（バイオディレクトリ），Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照する）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生、精製、およびフラグメント化が報告されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における最新プロトコル），Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（抗体の利用），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，上記）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における最新プロトコル），Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照する）。
【００８３】
状態、障害、または症状の「治療する」または「治療」は、（１）状態、障害、または症状を有し得る、あるいはその素因を有し得るが状態、障害、または症状の臨床的症候をまだ経験または示していない者で発症する状態、障害、または症状の臨床的症候の出現を予防または遅延させる、（２）状態、障害、または症状を阻害する、すなわち、疾患またはその再発（維持治療の場合）、あるいはその少なくとも１つの臨床的症候、徴候、または検査の発症を止める、低下させる、遅延させる、あるいは（３）疾患を軽減する、すなわち、状態、障害、または症状、あるいは少なくとも１つのその臨床的または亜臨床的な症候または徴候の回復をもたらす、ことを含む。
【００８４】
治療される被験体に対する効果は、統計的に有意である、あるいは患者または医師に少なくとも認知可能であることのいずれかである。
【００８５】
「患者」または「被験体」は哺乳動物を意味し、ヒトおよび獣医学被験体を含む。特定の獣医学被験体は鳥類の種を含み得る。
【００８６】
「予防上効果的な量」は、所望の予防的結果を、必要とされる投与および期間で達成するのに効果的な量を意味する。一般的には、予防的用量は疾患の前または早期に被験体で使用されるため、予防上効果的な量は治療上効果的な量よりも少ない。
【００８７】
治療使用のための許容可能な添加剤、希釈剤、および担体は医薬品技術で良く知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（薬学の科学および実際），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．２００５）で説明されている。医薬品用添加剤、希釈剤、および担体の選択は、投与の意図された経路および標準的な医薬品の実施に関連して選ぶことができる。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、フレーズ「医薬品として許容可能な」は、例えば生理学的に容認でき、ヒトに投与されるとき、アレルギーまたは同様な有害反応、例えば異常亢進、めまいなどを一般的に生ぜず、「安全と全般的に考えられる」分子実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されるとき、用語「医薬品として許容可能な」は、連邦または州政府の当局によって承認されている、あるいは米国薬局方、または動物、より特定的にはヒトに使用するために一般的に容認されている他の薬局方に記載されていることを意味する。
【００８９】
本発明は、後述の実験詳細からさらに理解されるであろう。しかし、従来技術の当業者は、考察される特定の方法および結果は、後述の請求でより完全に記載される本発明の単なる説明であることを容易に認識するであろう。
【００９０】
キット
本発明はまた、本発明の構成要素をキット形態で含むキットを提供する。本発明のキットは、１種類以上の構成要素を含み、限定されないが、本明細書で考察されるＡｒｎＴ阻害剤化合物を、限定されないが、本明細書で考察されるような、医薬品として許容可能な担体および／または１種類以上の抗細菌性薬剤または化合物を含む１種類以上の追加成分とともに含む。ＡｒｎＴ阻害剤化合物、組成物、および／または治療剤は、医薬組成物において純粋な組成物として、または医薬品として許容可能な担体と組み合わせて製剤化することができる。
【００９１】
一つの実施形態では、キットは本発明のＡｒｎＴ阻害剤化合物／組成物またはこの医薬組成物を１つの容器（例えば、無菌ガラス、チューブ、またはプラスチックバイアル）に、そしてこの医薬組成物および／または１種類以上の抗細菌性薬剤または化合物を別の容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル）に含む。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、キットはＡｒｎＴ阻害剤化合物の１種またはいずれかの組み合わせを、医薬品として許容可能な担体とともに、任意に、１種類以上の抗細菌性薬剤または化合物のような１種類以上の治療剤成分と組み合わせて、任意に、単一の共通容器で医薬組成物に一緒に製剤化されて含む。
【００９３】
キットは医薬組成物および投与剤形に関する情報を含むパッケージインサートをキットに含むことができる。一般的に、このような情報は、封入された医薬組成物および投与剤形を効率的および安全に使用する上で患者および医師に役立つ。例えば、本発明の併用に関する情報として、薬物動態、薬力学、臨床試験、効能パラメータ、適応症および使用法、禁忌、警告、用法注意、有害反応、過剰投与、適正投与量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造業者／販売業者情報、および特許情報がインサートで提供され得る。
【００９４】
例
グラム陰性細菌では、大腸菌およびサルモネラ・ティフィムリウムによって代表されるように、膜負電荷の低下に最も効果的な修飾は、リピドＡリン酸基へのカチオン性糖４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース（Ｌ−Ａｒａ４Ｎ）の１位および４’位での結合である（７）。Ｌ−Ａｒａ４Ｎはウンデカプレニルリン酸（ＵｎｄＰ）キャリア分子によってもたらされる。反応は、一体型膜脂質対脂質グリコシルトランスフェラーゼであり、グラム陰性細菌に共通するアミノアラビノース生合成経路で作用する最終酵素であるＡｒｎＴ（ＰｍｒＫとしても知られている）によって、内膜のペリプラズム側で触媒される（４、７、８）（図１Ａ〜Ｂ）。危ういことに、大腸菌では、リピドＡ１−リン酸基もＥｐｔＡによって修飾され（ＰｍｒＣ）、この部位にリン酸エタノールアミン（ｐＥｔＮ）を加え、１−リン酸特異性に対してＡｒｎＴ酵素と競合する（９、１０）。
【００９５】
ＡｎｔＴ機能の構造および機構的基本を洞察するために、界面活性剤での発現および安定性について、ゲノム空間の幅広い領域を網羅するために選択された種由来の１２種の原核生物の推定的ＡｒｎＴをスクリーニングして、結晶化に適した候補を見つけ出した（１１）。大腸菌由来のＡｒｎＴ（ＡｒｎＴＥｃ）およびＳ．ティフィムリウム由来のＡｒｎＴ（ＡｒｎＴＳｔ）と約２５％の全体的な対配列同一性割合を有するカプリアビダス・メタリデュランスＣＨ３４（ＡｒｎＴＣｍ）由来のＡｎｒＴが、界面活性剤中での発現量およびサイズ排除クロマトグラフィーにおける挙動に基づいて最も有望なものとして出現した。実際、このタンパク質は脂質立方相（ＬＣＰ）で結晶化し（１２）、これらの結晶は構造決定に適した。
【００９６】
従って、本発明者らはＡｒｎＴＣｍの触媒活性を特徴付けすることを試み、Ｌ−Ａｒａ４ＮをリピドＡに移動することができるＡｒｎＴ酵素としてのその機能を実証した。大腸菌から分離された３２Ｐ標識リピドＡの薄層クロマトグラフィーは、内因性ａｒｎＴおよびｅｐｔＡを欠如する大腸菌株（ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ）におけるＡｒｎＴＣｍの異種発現がＬ−Ａｒａ４ＮによるリピドＡ修飾をもたらしたことを示した。移動した糖の特定を、陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーを用いて確認した。実際、ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡにおけるＡｒｎＴＣｍの発現は２つの主ピークを生じ、第一はＬ−Ａｒａ４Ｎ修飾リピドＡに相当する１９２８．０であり、第二は未修飾であるビスリン酸化ヘキサ−アシル化リピドＡに相当する１７９７．０だった（図２Ａ）。
【００９７】
ＡｒｎＴＣｍの機能的特徴付け
次に、ポリミキシンに対する耐性を付与するＡｒｎＴＣｍの能力を試験した。驚くべきことに、ＡｒｎＴｓｔと異なり、大腸菌で発現されたＡｒｎＴＣｍはＬ−Ａｒａ４ＮをリピドＡに移動させるその能力にも関わらず、ΔａｒｎＴ（１３、１４）（図２Ｂ）、およびΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ（図２Ｃ）におけるポリミキシンに対する耐性を奪回できなかった。しかし、ＡｒｎＴＳｔはＬ−Ａｒａ４ＮをリピドＡの１および４’リン酸の両方に加えることが知られているが（７）、ＡｒｎＴＣｍは１−リン酸位置で修飾された単一リピドＡ種を生じるだけのように思われる（図２Ｄ）。
【００９８】
特に、図２ＡはＡｒｎＴＣｍを発現する大腸菌ＷＤ１０１ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ株から精製されたリピドＡの陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを示す。１９２８．０の主ピークは、４’位（左図で示す）または１位（右図で示す）アクセプター位置のいずれかで加えられたＬ−Ａｒａ４Ｎによって修飾されたリピドＡに相当する。１７９７．０の第二ピークはビスリン酸化ヘキサ−アシル化リピドＡに相当する。
【００９９】
図２ＢはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｒｎＴノックアウト大腸菌株へのＡｒｎＴｓｔおよびＡｒｎＴＣｍの導入の効果を示す棒グラフである。ＡｒｎＴＳｔのみがポリミキシン耐性を奪回することができる。ここではＡｒｎＴＣｍはｐＭＣＳＧ７ベクターを用いて発現され、結晶法関連タンパク質産生で使用されたｐＮＹＣＯＭＰＳ−Ｎｔｅｒｍでは発現されず、これはＡｒｎＴＳｔ発現に使用されたｐＥＴ２１と前述のベクターの抗生物質耐性が一致するためである。
【０１００】
図２ＣはＷＤ１０１株（ＰＭＸＢ耐性）およびΔａｒｎＴΔｅｐｔＡ二重変異体（ＰＭＸＢ感受性）におけるポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）の最小阻害濃度の測定を示す。ΔａｒｎＴΔｅｐｔＡにおけるＡｒｎＴＣｍの発現はＰＭＸＢに対する耐性を奪回しない。
【０１０１】
図２Ｄは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による３２Ｐ標識リピドＡの展開分析を示す。Ｗ３１１０株におけるリピドＡはピロリン酸修飾（１−ＰＰ）のみ有してポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）に感受性である。ＷＤ１０１はＡｒａ４Ｎおよびホスホエタノールアミン（ｐＥｔＮ）を有する二重修飾リピドＡを産生する。ａｒｎＴおよびｅｐｔＡ（リピドＡの１リン酸基へのホスホエタノールアミンの添加に必要とされる遺伝子）の両方の不存在では、ＡｒｎＴＳｔはＬ−Ａｒａ４Ｎを１および４’リン酸の両方に加えて、単一および二重の両修飾リピドＡスポット（赤色矢印で示される二重修飾Ｌ−Ａｒａ４ＮリピドＡ）をもたらす。これに反し、ＡｒｎＴＣｍは単一修飾リピドＡ種のみを生じる。さらに、ΔａｒｎＴ単一ノックアウト株では、ＡｒｎＴＣｍはリピドＡを修飾することができない。結論として、ＡｒｎＴＣｍはリピドＡの１リン酸基に対して立体特異的である。ＰＭＸＢ（０．１μｇ／ｍＬ）との前インキュベーションは、リピドＡ修飾の量および／または性質を有意に変化しなかった。
【０１０２】
これらのデータは、１位での修飾が大腸菌におけるこの抗生物質に対する防護を付与しないことを示唆し、他の種で認められるポリミキシン耐性付与における４’−リン酸の除去または修飾の優位性と一致する（１５、１６）。従って、本発明者らはＡｒｎＴＳｔについて大腸菌で既に確立されているポリミキシン増殖アッセイ（１３、１４）、およびＣ．メタリデュランスＡｒｎＴの構造から引き出される構造仮説を利用して、後述のように、Ｓ．ティフィムリウム酵素を試験した。ＡｒｎＴＳｔとＡｒｎＴＣｍの間の全体の対配列同一性は２５％であるが、活性のための主領域および周辺における保存度はかなり高く、これらの構造および機能が保存されている可能性を示唆する。
【０１０３】
野生型ＡｒｎＴＣｍの構造を、ＳｅＭｅｔ置換タンパク質を用いた単波長異常分散法によって２．８Åの分解能まで決定した（表２）。ＡｒｎＴＣｍは、膜貫通（ＴＭ）領域、およびその上に位置する可溶性ペリプラズム領域（ＰＤ）からなるモノマーとして結晶化した（図３Ａ〜Ｂ）。明確に区別可能な疎水性ベルトによって囲まれたＴＭ領域は、バークホルデリア・セノセパシア由来のＡｒｎＴで最近予測されているもの（１７）と同様に、１３本のＴＭへリックスを複雑な配列で示す。本構造は３本の膜近傍（ＪＭ）へリックス（ＪＭ１〜３）を有する。ＪＭ１およびＪＭ２は第一ペリプラズムループの両部分であり、互いに垂直であり、特有の交差型構造を生じる（図３Ａ〜Ｂ）。ＪＭ３は、機能的に重要であることが既に示されているＴＭ７とＴＭ８の間のフレキシブルなペリプラズムループに通じる（１３）。ＴＭ１３はＰＤに通じ、ＰＤは、７本のへリックス（α１〜７）と２１３５４の順の４本の平行ベータストランド（β１〜４）および逆平行のβ５とからなるα／β／α配列を有する。
【０１０４】
ＡｒｎＴは、グリコシルトランスフェラーゼのＧＴ−Ｃフォールドを示すものとして分類することができる（１８）。このタンパク質はカンピロバクター・ラリ由来の細菌性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）（ＰｇｌＢ）およびアーキオグロブス・フルギダス由来の古細菌ＯＳＴ（ＡｇｌＢ）とフォールドで類似している（１９、２０）。ＴＭ領域のトポロジーは３種のタンパク質間で異なるが、ＡｇｌＢのＴＭ領域の内部コアは、ＡｒｎＴＣｍのものと十分同じ配置である。さらに、ＡｒｎＴＣｍとＰｇｌＢのペリプラズム領域の一部は構造的に類似している。フォールドにおけるこれらの類似性は、３種のタンパク質間の進化的関係を強調し得るが、これらの機能は著しく異なる。ＡｒｎＴに特有だが、グリコシルアクセプターが脂質（リピドＡ）である。両基質が脂質成分を有するため、ＡｒｎＴは両方を膜内から触媒反応用の活性部位にもたらすことができるものと予測される。
【０１０５】
ＡｒｎＴの３つの大型キャビティーおよび金属結合領域
ＡｒｎＴの構造は３つの大型キャビティーを示し（図３Ａ）、これらの静電的性質は異なる。はるかに最も大きい（膜内で３，０００Å３超）キャビティー１は、膜より低い位置にある主に疎水性の下部および親水性の上部を有する両親媒性である。本発明者らは、キャビティー１でリピドＡが酵素と結合すると仮定している。興味深いことに、キャビティー１の疎水性部分は内膜の外側リーフレットから直接的に接近可能であり、リピドＡのアシル鎖およびグルコサミン糖骨格と一致する容積を有する。このことは、膜からの親油性基質補充のメカニズムを示唆するが、キャビティー１への導入はＴＭ７とＴＭ８を接続するペリプラズムループによって妨げられるように思われる（図３Ａ）。リピドＡのＫｄｏ糖はキャビティーの親水性上部と結合することができ、ＰＤと相互作用する可能性がある。小さいキャビティー２は、少なくとも部分的に膜の境界の下にあるにも関わらず、主に親水性である（図３Ａ）。キャビティー１と２は狭い通路を通して接続され、キャビティー２をＬ−Ａｒａ４Ｎ部分と結合するための誘引的な候補にしている。最後に、キャビティー３は本分子の細胞質側に接近して位置し、完全に疎水性である（図３Ａ）。
【０１０６】
本データはまた、ＡｒｎＴが金属と結合することを示す。亜鉛に相当する可能性がある変則的な密度が、へリックス７と８を接続させるペリプラズムループとＪＭ１の間で認められる。Ｚｎ２＋イオンがＥ８４（二座）、Ｈ２６５、およびＨ２６７、ならびにおそらく水分子による５点三方両錐体配位で結合され（図３Ａ〜Ｂ）、対称関連分子からカルボキシ端によって本発明者らによる結晶中で置換される。３つすべての金属配位残基は、変異されたときにＡｒｎＴＳｔにおけるポリミキシン耐性の欠如によって認められるように、機能のために重要であると考えられる。しかし、ＡｒｎＴＳｔにおいてＨ２６５はバリン（Ｖ２４１）であり、従って、その金属配位は異なるに違いないが、おそらく暗示的には、Ｖ２４１のヒスチジンへの変異は、ＡｒｎＴＣｍで認められるように、増殖アッセイにおいて機能的であり、一方、システインへのその変異は機能的ではない（１３）。
【０１０７】
ＡｒｎＴＣｍのＵｎｄＰとの共結晶化
ＡｒｎＴがその脂質基質とどのように相互作用するか検討するため、この疎水性化合物をＬＣＰ混合物に取り込むことによって、ＡｒｎＴＣｍをＵｎｄＰとともに共結晶化させた。モノオレイン／ＵｎｄＰ混合物とともに成長した結晶から得られるＡｒｎＴＣｍの構造を３．２Åで解析し（表２）、ポリ−プレニルリガンドと一致する２つの不連続的密度が形成され、ＡｒｎＴＣｍ構造にキャリア脂質を配置することができた（図３Ａ）。第一密度（図６Ａ）は、内側キャビティー２から生じ、リン酸ヘッド基および５個のプレニル基と一致する（図４Ａ）。これらのデータから、触媒反応のためにポリプレニルキャリアのリン酸に結合される、Ｌ−Ａｒａ４Ｎ基のキャビティー２内のおおよその位置を定めることができ、このキャビティー内で認められる親水性ライニングを説明することができる。ＵｎｄＰの４つのプレニル基に相当する密度の第二領域は、キャビティー３から伸長し、脂質テイルに適合するための理想的な環境をもたらす疎水性残基でライニングされる。この領域内のアラニンまたはトレオニンへの変異、またはトリプトファン変異導入によってキャビティー３への接近をブロッキングする試みは、ＡｒｎＴＳｔ機能にわずかな効果のみを有した。これらの結果は、活性部位から離れたＵｎｄＰ結合方式のフレキシビリティーを示し得る。
【０１０８】
際立ったことに、ＵｎｄＰ結合構造では、ＴＭ７と８の間のペリプラズムループの構造的再配列が認められ、活性部位の近くに配置され、既に機能的関連を有することが示されている（１３）。コイルからへリックスへの転移は２回のフルターンによるＪＭ３の伸長を生じ、ＵｎｄＰの周りのいくつかの残基の再配置、および金属配位の喪失をもたらす。Ｚｎ＋２配位の性質は、ＵｎｄＰ基質を結合させることができる構造でループを固定する役割と一致している。ＵｎｄＰ結合構造で認められる構造は、ＪＭ３の伸長が基質のヘッドを覆うとき、キャビティー２の容積を著しく低下させる。さらに、キャビティー１の容積はわずかに変わるだけだが、ＵｎｄＰ仲介構造再配列はキャビティー１表面からＴＭ７−ＴＭ８ループを解くことができ、リピドＡに接近できる可能性がある。
【０１０９】
ＵｎｄＰのリン酸はＫ８５およびＲ２７０によって配位され、一方、ホスホジエステル結合の酸素はＹ３４５との水素結合に加わる（図４Ａ）。これらの３つの残基は絶対的に保存され、ＡｒｎＴＳｔにおけるこれらの変異は機能の完全な欠如をもたらす（図４Ｂおよび（１３））。興味深いことに、ＡｇｌＢに存在する硫酸イオンは、ＵｎｄＰリン酸の位置を占有すると考えられ（２０）、本発明者らによる構造中でＵｎｄＰのリン酸と重ねることができ、ドナー基質方向に関する共通の様式を示唆する。
【０１１０】
ＡｒｎＴＣｍ構造におけるＬ−Ａｒａ４Ｎ−トリ−プレニルリン酸位置へのナイーブ結合は、一致したポーズのいくつかのファミリーを生じた。最も低いエネルギーならびに実験的に観察されたＵｎｄＰと比べたリン酸および３つの含まれるプレニル基の位置に基づいて、高い集合性の１つのポーズを選択した。このポーズは、基質と相互作用する可能性がある３つのさらなる保存残基（Ｙ５９、Ｙ８２、およびＥ５０６）を示した。本発明者らは、ＡｒｎＴＳｔ機能におけるＹ５９およびＹ８２の重要性を確証した（図４Ｂ）。さらに、Ｙ５９、Ｋ８５、Ｒ２７０、およびＥ５０６に相当する残基は、バークホルデリア・セノセパシア由来のＡｒｎＴと機能的に関連することが認められている（１７）。興味深いことに、アポ構造で金属配位に加わるＥ８４は、この場合、Ｌ−Ａｒａ４Ｎのアミノ基と結合するように思われ、基質結合型への移行におけるこの残基の役割の可能性を示唆する（図４Ｃ）。
【０１１１】
カプリアビダス・メタリデュランス（Ｃｍｅ）由来ＡｒｎＴの単独およびＵｎｄＰと結合する他のこれらの結晶構造が、それぞれ２．８Åおよび３．２Åの分解能で、経膜構成およびＡｒｎＴの触媒機構に関する最初の分子的洞察をもたらしている（図３Ａ〜Ｂ）。この構造は、リピドＡおよびＵｎｄＰキャリアの両基質のための各結合キャビティー，ならびにＬＡｒａ４Ｎが実際に移動され、２つのキャビティーが集まる活性部位の原子レベルでの詳細を示した（図３Ａ〜Ｂ）。これらの構造はＵｎｄＰキャビティー内部および活性部位内の主要な機能的残基を特定してマッピングするための基礎をもたらし、２つの高度に保存されたＡｓｐ残基が求核攻撃のためにリピドＡリン酸基を「活性化」する触媒メカニズムを提唱する。重要なこととして、Ｃｍｅ由来のＡｒｎＴと、大腸菌またはＳ．ティフィムリウム由来のＡｒｎＴの間の全体的な対配列同一性は約２５％であるが、保存はキャビティーまたは活性部位をライニングする残基でかなり高く、特定された主要残基は３つの種にわたって保存されている（図３Ａ〜Ｂ）。さらにこれらのデータは、ＡｒｎＴの阻害剤を設計するため、そしてＭＤＲグラム陰性感染のための化合物および治療を開発するために基礎を提供する。
【０１１２】
ＡｒｎＴのための反応メカニズム
これらのデータに基づき、本発明者らはＡｒｎＴに関して可能性がある反応メカニズムを提唱する。全体として、アポおよびＵｎｄＰ結合ＡｒｎＴＣｍの構造は、基質の結合はＵｎｄＰ−α−Ｌ−Ａｒａ４ＮがリピドＡに先行することで連続的であり得、リピドＡが膜から新たに暴露されるキャビティー１に接近し得ることを示唆する（図５Ａ）。２つの基質キャビティーの接点である活性部位は、ＵｎｄＰ結合でのみ伸長されるＪＭ３へリックスの構成要素によって完了される（図３Ａ〜Ｂおよび図５Ａ）。結合したＵｎｄＰおよびモデル化Ｌ−Ａｒａ４Ｎを有する活性部位の構造は、可能性がある触媒メカニズムも示唆する。２つの保存アスパラギン酸残基であるＤ５５およびＤ１５８は、キャビティー１と２の間の接点で７．１ÅのＣγ−Ｃγ距離で空間的に隣接して配置され、保存された正電荷残基（それぞれＲ５８およびＫ２０３）による塩ブリッジにそれぞれ含まれる（図５Ｂ）。Ｄ５５またはＫ２０３の変異は活性の欠如をもたらす（図５Ｃ）。本発明者らは、２つのアスパラギン酸が、正電荷側鎖によるこれらの結合によって局在される電荷を有し、アクセプターリピドＡリン酸の酸素原子の２つを配位し得、正味の負電荷を有する第三の酸素原子を放出することを提唱する。本発明者らは、この荷電酸素原子がＵｎｄＰ−α−Ｌ−Ａｒａ４Ｎドナー糖環のＣ１炭素に求核攻撃を実施することを提唱する（図５Ｄ）。このメカニズムは、リピドＡとのＬ−Ａｒａ４Ｎ結合について報告されている、グリコシド結合の反転と一致する（２１）。求核物質として作用するリン酸の例が過去に報告されており、例えばグルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼでは、グルコース−１−リン酸およびＵＴＰからＵＤＰ−グルコースの生成を触媒する（２２）。ＰｇｌＢでは、触媒反応がアクセプターアミドによる求核攻撃に依存することが示唆されている（１９、２３）。活性部位Ｍｇ２＋は、アクセプターアミドを配位させるアスパラギン酸およびグルタミン酸の電荷を局在化させるように思われる。ＡｒｎＴでは、本発明者らはこの機能がＲ５８およびＫ２０３によってＤ５５およびＤ１５８で終了され、そしてこれら２つのアスパラギン酸がアクセプターリン酸を配位することを提唱する。
【０１１３】
Ｌ−Ａｒａ４Ｎから引き出されるＳ．ティフィムリウムおよび大腸菌ＡｒｎＴ阻害剤の設計
現在まで、ＡｒｎＴによるリピドＡへのＬ−Ａｒａ４Ｎ移動を低下することが報告されている唯一の小分子はＬＡｒａ４Ｎのアナログであり［Ａ５７］、阻害剤開発のための攻撃標的としてＬ−Ａｒａ４Ｎ結合ポケットを確認している。ＬＡｒａ４ＮのアナログはＡｒｎＴの阻害剤としての能力はなく、改良された化合物の必要性を示す。ＡｒｎＴＣｍｅの構造はＬ−Ａｒａ４Ｎポケットの原子的な詳細を、そのアポおよびＵｎｄＰ結合構造の両方において示している。重要なことには、Ｌ−Ａｒａ４Ｎポケット内の残基は、Ｃｍｅ、大腸菌、およびＳ．ティフィムリウムで高度に保存されている（図３Ａ〜Ｂ）。
【０１１４】
新規ＡｒｎＴ阻害剤を設計するために、コンピュータ技法、インビボ機能アッセイ、変異形成、および共結晶化実験を組み合わせて、Ｌ−Ａｒａ４Ｎのその結合ポケットとの相互作用およびそのアナログ間の構造−活性関係の綿密な理解を進める。最初の段階では、実験データが利用可能であるＬ−Ａｒａ４ＮおよびそのアナログのＡｒｎＴ結合方式がコンピュータによる結合を用いて予測される。化合物と相互作用するポケット残基は、定方向突然変異実験を用いて検証される。予備的な結果として、この方法はＵｎｄＰのリン酸および最初の３個のプレニル基の結晶学的な位置と非常に一致するＬ−Ａｒａ４Ｎ−トリ−プレニルリン酸の結合方式の予測を可能にする。さらに、Ｌ−Ａｒａ４Ｎ部分の結合に含まれる特定残基を指し示す。これらの残基のいくつかでは、機能的な重要性がＢ．セノセパシア［Ａ５８］さらにＳ．ティフィムリウムにおける最近の研究で実験的に確認されている。この反復工程をコンピュータ計算と実験の間で使用して、新規Ｌ−Ａｒａ４Ｎアナログ結合方式の予測を精密化して検証する。検証した結合方式は、今度は試験した化合物に関する構造−活性関係を説明するだけでなく、さらに重要なことには、最適化された新規化合物の設計を誘導するのに役立つ。新規のＬ−Ａｒａ４Ｎ由来ＡｒｎＴ阻害剤の化学的最適化を効率的に誘導するために、最新のコンピュータ処理方法（いわゆる自由エネルギー摂動プラス）と組み合わせたこれらの高分解能データおよび機能アッセイを用いて、ポリミキシンＢに対するＭＤＲ／耐性グラム陰性細菌の感受性を回復し、おそらく特定のグラム陰性細菌の増殖を阻害または停止する他の抗生物質との併用に有効である、一連の新規化合物を生じることが期待される。
【０１１５】
さらに、特定の実施形態では、本明細書で説明されるＡｒｎＴ阻害剤は、特定のグラム陰性細菌の増殖を阻害または停止するために単一薬剤として有効であり得ることが期待される。さらなる実施形態では、本明細書で説明されるＡｒｎＴ阻害剤の少なくとも２種類の任意の組み合わせも、特定のグラム陰性細菌の増殖を阻害または停止する追加の有効薬剤なしで有効であり得る。
【０１１６】
Ｓ．ティフィムリウムおよび大腸菌ＡｒｎＴの新規阻害剤スクリーニング
ある種のＡｒｎＴ阻害活性を有する小分子が１つだけこれまでに報告されている［５７］。ポリミキシン増殖アッセイは、大腸菌およびＳ．ティフィムリウムの両方から得られるＡｒｎＴにおける化合物の阻害活性を試験することができる。強力なＬ−Ａｒａ４Ｎ由来阻害剤の設計（前述）と平行して、さらなる開発の基礎として役立てることができる、より多様な小分子を見つけ出すため、新規ＡｒｎＴ阻害剤のための大スケール構造誘導探索を実施する。２２００万種を超える化合物を含む小分子の施設内バーチャルライブラリーを、精度増加を伴う３つの連続的な結合段階からなる高性能コンピュータ利用パイプラインと組み合わせて利用して、ＡｒｎＴの阻害剤の可能性がある小分子について標的に基づいたスクリーニングを実施する。Ｌ−Ａｒａ４Ｎポケットは触媒部位と隣接して「創薬可能な」キャビティーを形成する時に特異的に標的にされる。アポおよびＵｎｄＰ結合構造におけるＡｒｎＴＣｍの高分解能構造は、両者とも阻害の機能的状態と関連するため、共に構造的標的として役立つ。本明細書で説明される方法から得られる構造は、さらに構造的標的として使用される。Ｌ−Ａｒａ４ＮポケットのアポおよびＵｎｄＰ結合の両構造について約２百万種の化合物に関する最初のバーチャルスクリーニングが実施されている。１５００種を超える高スコアのバーチャルヒットが得られており、ほとんどはＵｎｄＰ結合におけるものだが、アポ構造でも多い。化学的類似性に基づいたこれらのバーチャルヒットを集めることによって、これらの一部はポケットの本来の基質であるＬ−Ａｒａ４Ｎと類似しているが、様々な新規の化学的スキャホルドが特定された。さらにフィルタリングおよび選別を実施した。最も多く収集された化学群における化合物は最初の試験で特に魅力的な候補であるが、また、少数収集された群から化合物を選択して、得られたバーチャルヒットの化学的多様性を確実にした。８０種の化合物の非常に少ない第一リストがこの工程によって選別されている。スクリーニングおよび試験結果は、クラスＩ化合物２０と名付けられ、４，４’−［（４−クロロフェニル）メチレン］ビス（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールという次の化合物
【化７１】
2018534303.tif 000074
が、特に強いＡｒｎＴ阻害活性を示すことを認める（図８Ａ〜Ｂ）。
【０１１７】
全体として、１５種の代表的な具体的化合物を有する４クラスの化合物が、図７、９、１１、および１３の表でリスト化されるように特定されている。化合物の構造の詳細は次の通りである。
【０１１８】
【化７２】
2018534303.tif 000075
全般的に、クラスＩ化合物は次のように包含され、ここで、
Ｒ１はクロロ、フルオロ、ＯＨ、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ならびに式−ＮＲ３Ｒ４でＲ３およびＲ４は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択されるジアルキルアミノから選択され、
Ｒ２は１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルであり、
Ｒ３はＨ、１〜３個の炭素原子の直鎖および分枝アルキル、ＯＨ、ならびにニトロであり、
あるいはこの医薬品として許容可能な塩である。
【０１１９】
式Ｉの化合物は、従来技術の当業者に知られている方法を用いて、無機または有機の医薬品として許容可能な塩として得ることができる（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（広範な有機変換），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４１１−４１５，１９８９）。限定されないが、無機塩を含む適切な塩が従来技術の当業者に良く知られており、ナトリウム、カルシウム、カリウム、またはマグネシウムなどのもの、あるいはこれらの同等物、または塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、または硫酸塩などであり得る。
【０１２０】
式Ｉ／クラスＩ化合物の具体的な例（図７Ａ〜Ｂにも示す）として、
化合物２０：
４−［（４−クロロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
化合物１４：
５−メチル−４−［（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）−（４−プロパン−２−イルフェニル）メチル］−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
化合物１５：
４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
化合物１９：
４−［（Ｓ）−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−オレート、および
化合物Ｕ２：
４−［（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）−（３−メチル−５−オキソ−１，２−ジヒドロピラゾール−４−イル）メチル］−５−メチル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、
を含む。
【０１２１】
【化７３】
2018534303.tif 000076
全般的にクラスＩＩ化合物は上記またはこの医薬品として許容可能な塩であり、ここで、
Ｒ１は
【化７４】
2018534303.tif 000077
および
【化７５】
2018534303.tif 000078
からなる群から選択される部分であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、ニトロ、ならびに−ＮＲ６Ｒ７から選択され、ここでＲ６およびＲ７は独立して水素、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される。
【０１２２】
式ＩＩの化合物は、従来技術の当業者に知られている方法を用いて、無機または有機の医薬品として許容可能な塩として得ることができる（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（広範な有機変換），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４１１−４１５，１９８９）。限定されないが、無機塩を含む適切な塩が従来技術の当業者に良く知られており、ナトリウム、カルシウム、カリウム、またはマグネシウムなどのもの、あるいはこれらの同等物、または塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、または硫酸塩などであり得る。
【０１２３】
式ＩＩ／クラスＩＩ化合物の具体的な例（図９に示す）として、
化合物３６：
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−プロピルベンゼンスルホノヒドラジド、
化合物３７：
Ｎ’−［（３−ヒドロキシ−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
化合物Ｕ５：
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］ナフタレン−２−スルホノヒドラジド、および
化合物Ｕ６：
Ｎ’−［（５−ヒドロキシ−６−オキソシクロヘキサ−２，４−ジエン−１−イリデン）メチル］−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンスルホノヒドラジド、
を含む。
【０１２４】
【化７６】
2018534303.tif 000079
全般的にクラスＩＩＩ化合物は上記、またはこの医薬品として許容可能な塩であり、ここで、
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ部分でｎは１〜３であり、
Ｒ２は、
【化７７】
2018534303.tif 000080
【化７８】
2018534303.tif 000081
【化７９】
2018534303.tif 000082
および
【化８０】
2018534303.tif 000083
の群の部分から選択される。
【０１２５】
クラスＩＩＩ／式ＩＩＩの化合物は、従来技術の当業者に知られている方法を用いて、無機または有機の医薬品として許容可能な塩として得ることができる（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（広範な有機変換），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４１１−４１５，１９８９）。限定されないが、無機塩を含む適切な塩が従来技術の当業者に良く知られており、ナトリウム、カルシウム、カリウム、またはマグネシウムなどのもの、あるいはこれらの同等物、または塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、または硫酸塩などであり得る。
【０１２６】
式ＩＩＩ／クラスＩＩＩ化合物の具体的な例（図１１に示す）として、
化合物３：
２−［（５Ｅ）−５−［（２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
化合物６：
２−［（５Ｚ）−４−オキソ−５−（キノリン−４−イルメチリデン）−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］アセテート、
化合物Ｕ４：
２−［（５Ｚ）−５−［（３，４−ジクロロフェニル）メチリデン］−４−オキソ−２−スルファニリデン−１，３−チアゾリジン−３−イル］酢酸、および
化合物Ｕ７：
３−［（５Ｅ）−５−［［（２Ｓ）−２−メチル−２Ｈ−クロメン−３−イル］メチリデン］−２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］プロパン酸、
を含む。
【０１２７】
【化８１】
2018534303.tif 000084
全般的にクラスＩＶ化合物は上記、またはこの医薬品として許容可能な塩であり、ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、独立して水素、フルオロ、クロロ、１〜６個の炭素原子の直鎖アルキル、３〜７個の炭素原子の分枝鎖アルキル、および−ＮＲ３Ｒ４から選択され、ここでＲ３およびＲ４は独立して水素、ならびに１〜６個の炭素原子の直鎖および分枝アルキルから選択される。
【０１２８】
式ＩＶの化合物は、従来技術の当業者に知られている方法を用いて、無機または有機の医薬品として許容可能な塩として得ることができる（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（広範な有機変換），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４１１−４１５，１９８９）。限定されないが、無機塩を含む適切な塩が従来技術の当業者に良く知られており、ナトリウム、カルシウム、カリウム、またはマグネシウムなどのもの、あるいはこれらの同等物、または塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、または硫酸塩などであり得る。
【０１２９】
式ＩＶ／クラスＩＶ化合物の具体的な例（図１３に示す）として、
化合物２：
（２Ｓ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−［（４−メチルベンゾイル）アミノ］プロパノエート、および
化合物９：
（２Ｓ）−２−［（２，４−ジフルオロベンゾイル）アミノ］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノエート、
を含む。
【０１３０】
化合物スクリーニングに使用されるポリミキシン増殖アッセイの目的は、グラム陰性細菌におけるポリミキシン系抗生物質に対する耐性を逆転することができる化合物を特定することである。このため、ポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）の存在におけるポリミキシン耐性株（ＢＬ２１およびＧｉ２４）の増殖の阻止は、グラム陰性細菌にポリミキシン耐性を付与することに大きく関与するＡｒｎＴタンパク質に対して有効である化合物を特定するために使用される、重要な特質である。この特性は、化合物クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶについて、それぞれ図８、１０、１２、および１４で示される増殖結果における変化度を、ＰＭＸＢおよび相当する化合物の両方が存在するときに、時間における増殖曲線の右への移動として認めることができる。さらに、いわゆる「オフターゲット」効果はポリミキシン耐性株の増殖における化合物それ自体（ＰＭＸＢが存在しない）の部分的作用を示し、ＡｒｎＴ阻害剤としてのこれらの活性に加えて存在する、化合物の「抗生物質様」効果に相当し得る。本明細書で説明される化合物クラスの効能を増加するために設計されるヒット最適化戦略を通したこれらの効果（特異的およびオフターゲット）のさらなる探求が、ポリミキシン耐性を逆転することができる派生的な化合物をもたらし、そのため単独またはポリミキシン系抗生物質の併用のいずれかで使用されるとき、臨床症状にある感染の消失をもたらすことが期待される。
【０１３１】
ＡｒｎＴ阻害剤のこの構造に基づいた薬剤設計は、医薬品化学技術と組み合わされ、耐性ＧＮ病原体におけるポリミキシン感受性を回復するための新規化合物を開発するのに役立つ。重要なことには、この作業から得られる実際的な結果は、大腸菌およびＳ．ティフィムリウムのような細菌由来の薬剤耐性／ＭＤＲ感染だけでなく、例えば、腸内細菌科およびガンマプロテオバクテリア由来のものを含むＧＮ細菌の広いスペクトルと戦うために有効であることが予測される。
【０１３２】
材料および方法
標的特定およびクローニング
幅広いゲノムバックグランドに応じた１２種の標的ＡｒｎＴ遺伝子が、バイオインフォマティックス法に基づいて特定された（２６）。ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）を使用して、標的を４種の異なるＬＩＣ適応発現ベクター（ｐＮＹＣＯＭＰＳ−Ｎｔｅｒｍ、ｐＮＹＣＯＭＰＳ−Ｃｔｅｒｍ、ｐＭＣＳＧ７、ｐＭＣＳＧ２８）にクローニングし、金属アフィニティークロマトグラフィーをベースとした精製のため、プロテアーゼ切断可能なデカヒスチジンタグをすべてが有した。すべてのクローニングおよび最初のタンパク質特徴付けは、膜タンパク質構造に関するニューヨーク協会（ＮＹＣＯＭＰＳ）のタンパク質産生コア施設で実施された（２７）。
【０１３３】
タンパク質発現および精製
ｐＮＹＣＯＭＰＳ−Ｎｔｅｒｍベクターでクローニングされたカプリアビダス・メタリデュランス由来のＡｒｎＴ（ＡｒｎＴＣｍ）によってＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌コンピテント細胞を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した２×ＹＴ培地において、３７℃で振とう（２４０ｒｐｍ）しながら一晩増殖させた。翌日、同一培地の８００ｍＬ（大スケール）または８ｍＬ（試験発現の小スケール）を、開始培養を用いて１：１００比で接種して３７℃で振とう（２４０ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００が１．０（約３時間）に達するまで増殖させた。そして温度を２２℃まで低下させ、タンパク質発現を０．２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発し、培養を振とう（２４０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベーションした。細胞を４℃で遠心分離（３，７００ｒｐｍで１５分間）によって収集し、１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、再度遠心分離して固体ペレットを得、必要になるまで−８０℃で保存した。セレノメチオニン置換タンパク質の発現のため、細胞をキット（Ｍ９  ＳｅＭｅｔ  Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ  Ｋｉｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｍｅｄｉｃｉｌｏｎ  Ｉｎｃ．）を用いてＭ９塩の最少培地で増殖させた。セレノメチオニンを、キットによって提供された量を超えて、培地１リットル当たりさらに１５０ｍｇ加えた。他の増殖条件は、本来のタンパク質の発現で報告されているものと同様とした。
【０１３４】
小スケール精製試験を既に報告されているように実施した（１１）。ＡｒｎＴＣｍの大スケール精製では、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩ、８μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡ、１ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、および製造業者の取扱説明書に従って使用したコンプリートミニＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁させた。８００ｍＬ培養（細胞が約６ｇ）から得た細胞ペレットあたり約４０ｍＬの容量において、細胞をＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いて溶解し、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を最終濃度１％（ｗ／ｖ）で添加して溶解物を１．５〜２時間可溶化した。不溶性物質を４℃で３４，０００ｒｐｍ、３０分の超遠心分離によって取り除き、タンパク質を上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、上清を前平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（８００ｍＬ培養から得たペレットあたり０．７ｍＬ）とともに一晩インキュベーションした。そしてビーズをカラムに充填し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール、および０．１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭの１０カラム容量で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、および０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭの４カラム容量で溶出させた。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、１ｍＭのＴＣＥＰ（最終タンパク質緩衝液）に緩衝液交換することによって、溶出したタンパク質からイミダゾールを除去した。続いて、タンパク質を４℃で２〜２．５時間ＴＥＶプロテアーゼ処理して（２８）、デカヒスチジンタグを切断した（８００ｍＬの冒頭の細菌培養から得られる等量のペレットあたり約０．５ｍｇのＴＥＶプロテアーゼを添加）。そしてサンプルをＮｉ−ＮＴＡビーズを含むカラムに再度通して切断されたデカヒスチジンタグ、ＴＥＶプロテアーゼ、および未切断タンパク質を除去した。タンパク質小分けを、２４ｍＬベッド容量Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）またはＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍカラム（ＴＯＳＯＨバイオサイエンス）のいずれかを用いて最終タンパク質緩衝液中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施し、精製したサンプルの質を評価した。タンパク質は、Ａ２８０をモニタリングして認められるシャープな単分散ピークとして典型的に溶出された。０．７〜１ｍｇの精製タンパク質を冒頭の細菌培養の８００ｍＬから一般的に得ることができた。セレノメチオニン置換タンパク質を本来のタンパク質と同一プロトコルを用いて精製し、収量は同等だった。
【０１３５】
結晶化。濃縮したタンパク質をホスト脂質と、タンパク質：脂質が１：１．５（ｗ／ｗ）の比で、連結したシリンジを用いて混合することによって、室温で脂質立方相（ＬＣＰ）（１２）混合物を調製した。すべての精製したタンパク質（ＳＥＣは未実施）を１００ｋＤａのＭＷカットオフによる遠心濃縮装置（ミリポア）を用いて３０〜３５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、異なるホスト脂質と次のように混合した。ａ）「アポ」構造では、本来のタンパク質を０．８％デカプレニルリン酸（ＤｅｃａＰ、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ）および９９．２％モノオレイン（ＮｕＣｈｅｋ  Ｐｒｅｐ）を含む脂質混合物と混合した。ｂ）ＵｎｄＰ−ＡｒｎＴＣｍ構造では、本来のタンパク質を１％ウンデカプレニルリン酸（ＵｎｄＰ、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ）および９９％モノオレインを含む脂質混合物と混合した。そして、ｃ）セレノメチオニン置換タンパク質を１００％モノオレインと混合した。ホスト脂質混合物は、クロロホルムメタノール混合物（ＵｎｄＰではクロロホルム：メタノールが１：１、ｄｅｃａＰではクロロホルム：メタノール：水が７４：２３：３）に両脂質を適切な量溶解し、均一になるまでこれらを混合して調製した。そして混合物を窒素ガス下で蒸発させて、真空デシケーター中で一晩乾燥させた。ＬＣＰ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボット（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、９６ウェルガラスプレートにタンパク質／脂質混合物を５０ｎＬおよび沈殿剤溶液を７５０ｎＬ分注し、ガラスカバースリップによってシールし、２２℃インキュベーターに保存した。結晶は一般的には１〜２日後に現れて約１週間で完全なサイズに成長した。最初の結晶化の試みはＭｅｍＭｅｓｏ  ＨＴスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を用いて設定した。結晶は、（ａ）３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ  ４００、０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化マグネシウム六水和物、（ｂ）３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ  ５００  ＤＭＥ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化マグネシウム六水和物、および（ｃ）３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ  ５００  ＤＭＥ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化カルシウム二水和物、で成長させた。これらの条件をさらに最適化して最高品質の結晶を得た。セレノメチオニン置換タンパク質結晶は、沈殿剤としてＰＥＧ  ４００に対する選好性を示した。タングステンカーバイドガラスカッター（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してガラスカバースリップを切断し、結晶を液体窒素でさらに凍結保護することなく直接的に瞬間冷凍させた。ＡｒｎＴＣｍおよびＵｎｄＰ−ＡｒｎＴＣｍの両方が、非対称ユニットにおける４つのモノマーによって空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１で結晶化した。単位格子パラメータを表２に示す（４６）。
【表２】
2018534303.tif 000085
2018534303.tif 000086
2018534303.tif 000087
最高分解能シェルに関する統計値を括弧で示す。
【０１３６】
データコレクションおよび構造決定。Ｘ線回析データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）でＮＥＣＡＴビームライン２４−ＩＤ−Ｃおよび２４−ＩＤ−Ｅにおいて収集した。構造決定のため、セレノメチオニン置換タンパク質結晶から収集した６つのデータセットを、ＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥを用いて一緒にスケーリングした（２９）。２１ヶ所のセレン部位を、ＨＫＬ２ＭＡＰソフトウェアを介してＳＨＥＬＸＤを使用するこれらのデータを用いて配置した（３０、３１）。部位をＳＡＤ位相決定用のプログラムＰＨＡＳＥＲ（３２）に入力した。ＰＨＡＳＥＲは６つの追加部位を配置することができた。得られる位相は電子密度マップにおいてラセン状の特徴を示した。最初の位相はプログラムＭＯＬＲＥＰ（３３）を用いた電子密度マップにおけるＰＤＢエントリー３ＷＡＪから得られるモデルを配置することによって改善された。分子の１コピーは電子密度マップに明確に配置することができる。セレン部位および配置されたモデルを一緒に用いて、ＰＨＡＳＥＲをもう一度実施した。得られる位相に、プログラムＲＥＳＯＬＶＥ（３４）を用いて密度修正を実施し、電子密度マップにおいて分子を追跡することができる優れた質の位相を得た。
【０１３７】
「アポ」構造に関する５例の同形結晶、およびＵｎｄＰ結合構造に関する１例の結晶からデータを収集した。ＸＤＳ（２９）およびＡＩＭＬＥＳＳ（３５）を用いて、データセットを指数付け、集積化、スケーリング、マージした。最初のモデルはＰＨＥＮＩＸ結晶学的ソフトウェアパッケージ（３６）を用いて最終データセットに剛体フィッティングさせた。モデルはＣｏｏｔ（３７）を用いてマニュアルで補正して完全にし、ＰＨＥＮＩＸを用いて精密化し、Ｃｏｏｔにおけるマニュアルによる作製とＰＨＥＮＩＸにおける精密化のサイクル間を交互させた。両構造に関する電子密度マップは、モノオレインとおそらく一致する可能性が最も高い多くの部分的に規則的な脂質分子を特徴とした。ヘッド基および特定的な特徴は密度では認識できず、すべての未特定化脂質を分離されたアルキル鎖としてモデル化し、すべての未特定リガンドに対するＰＤＢ推奨コードである残基コードＵＮＬと名付けた。ＵｎｄＰ結合データセットは、ＵｎｄＰのヘッドおよびテイルに関する密度を含んだ。「アポ」データセットもｄｅｃａＰの２個の末端プレニルまたは内因性ポリプレニルリガンドに相当するキャビティー３内部の密度を有した（データは示さないが、ホスト脂質としてモノオレインのみを用いて調製された結晶から同様な密度が真の「アポ」データセットで認められている）。ＳｅＭｅｔデータセットは同様な密度の特徴を有さなかった。ＵｎｄＰはＳＭＩＬＥＳストリングから作製され、プログラムｅＬＢＯＷ（ＰＨＥＮＩＸのセット）を用いて作製された幾何学的な制限を有した。これはＰＨＥＮＩＸを用いたモデルの規則的な精密化の間に最適化された密度および位置にマニュアルでフィッティングさせた。結合データセットにおけるＵｎｄＰを残基コード５ＴＲに割り当てた。多くの規則的な水分子が「アポ」構造およびＵｎｄＰデータセットにおけるいくつかで認めることができ、各モデルに加えられている。最終的なＡｒｎＴＣｍモデルは０．２１／０．２６のＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅを有し、最終的なＵｎｄＰ−ＡｒｎＴＣｍモデルは０．２２／０．２６のＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅを有する。すべてのタンパク質構造形状はＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ（３８）を用いて作製した。
【０１３８】
結合構造におけるＵｎｄＰリガンドを作製するために使用され提示された密度は、ＵｎｄＰに関する特徴を高めたオミットマップに相当する。偏りの可能性を取り除くため、ＵｎｄＰリガンドを占有なしで設定し、得られるモデルの配位をｐｈｅｎｉｘ．ｄｙｎａｍｉｃｓを用いて摂動させた。そしてモデルをＵｎｄＰ結合データセットに対して精密化して、特性増強マップをＰＨＥＮＩＸで計算した。
【０１３９】
コンピュータによる分子結合
４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース−リン酸に関する最初の構造を、それに結合した０、１、２、または３個のプレニル基（複数可）とともに、ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈを用いて作製した。これらの４種の最初の構造は、Ｌｉｇｐｅｒｐ（バージョン２．９、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．）を用いてＯＰＬＳ２．１力場での結合用に用意した。約ｐＨ７（±２）でのリン酸およびアミン基の可能性があるイオン化状態を、Ｅｐｉｋオプションを用いて計算した。
【０１４０】
用意したリガンド構造を、Ｇｌｉｄｅ（バージョン６．２、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．）を用いてＡｒｎＴＣｍ構造（ＵｎｄＰ結合構造）に結合させた。標準的な精度のフレキシブル結合手順を使用し、複数リガンド構造の作製および結合を可能にした。探索空間は、Ａｓｐ５５、Ａｓｐ１５８、およびＴｙｒ５９残基の質量の中央で中心化された３６Å辺長の立方体として定められた。標準的なＧｌｉｄｅ探索アルゴリズムの一部として、各リガンドの直径中央点は小さい同中心の立方体内（１６Å辺長で設定されたサイズ）に留まらなければならなかった。リガンドの非極性部分のポテンシャルは、０．１５よりも小さい部分的電荷を有する原子のファンデルワールス半径を、０．８５の係数で縮小することによって「軟化」させた。
【０１４１】
最後に、最善のエネルギーを有するポーズが維持され、結合後の最小化が実施された。得られたポーズの数は、プレニルなし（糖−リン酸のみ）が５７、プレニル基１個が３７、プレニル基２個が４８、およびプレニル基３個が３８である。プレニル基３個を含むリガンドから得られたポーズは、ＵｎｄＰのリン酸および最初の３個のプレニル基の実験的に得られた位置と最善のマッチングを示す。
【０１４２】
標識リピドＡの分離
一晩細菌培養を５ｍＬのＬＢブロス中でＯＤ６００が０．０５まで希釈し、２．５μＣｉ／ｍｌの３２Ｐｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で標識した。細胞をＯＤ６００で１．０まで収集した。標識した３２Ｐ−リピドＡの単離、分離、および視覚化を既に報告されているように実施した（９）。
【０１４３】
リピドＡの単離およびマススペクトロメトリー
５００ｍＬの細菌培養すべてをＬＢ培地において３７℃で増殖させた。培養がＯＤ６００で１．０に達したとき、細胞を１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって収集した。リピドＡを穏やかな酸性加水分解によって調製した（３９）。リピドＡ種を溶媒系としてクロロホルム／ピリジン／８８％ギ酸／水（５０：５０：１６：５）を用いたシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。リピドＡを既に報告されている（７）ように精製し、また既に報告されているように（９）、陰イオンリニアモードにおけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（ＡＢＩ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）マススペクトロメーターを用いて分析した。
【０１４４】
ポリミキシンＢ最小阻害濃度（ＭＩＣ）の測定
一晩培養を新鮮なＬＢ培地で１００倍に希釈し、ＯＤ６００が０．５に達するまで増殖させた。ＭＩＣ値を測定するため、これらの培養を抗微生物ペプチド濃度の範囲を含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．０５まで再度希釈した。培養を３７℃、２００ｒｐｍで３時間インキュベーションした。ＭＩＣは、ポリミキシンＢを添加しないＬＢにおける増殖と比べて５０％まで細胞増殖（Ａ６００）を低下させたポリミキシンＢの最低濃度として定めた。図２Ｃの表は、３回の生物学的反復後のＭＩＣ範囲を示す。
【０１４５】
変異原性およびポリミキシンＢ増殖アッセイ
ＡｒｎＴＳｔの変異をＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および特注プライマーを用いて全プラスミドＰＣＲによって作製した。使用した「野生型」ＡｒｎＴＳｔは、バックグランド変異Ｐ５４７Ａを有する（注：これらの方法は変異原性機能実験で使用されるポリミキシン増殖アッセイのためだけに適用する。後述のように、薬剤スクリーニングのためのポリミキシン増殖アッセイの実施は、Ｓ．ティフィムリウムＡｒｎＴの発現のために真の野生型ＡｒｎＴＳｔ遺伝子を使用する）。この変異は精製タンパク質の収率を改善することが認められており（１３）、ポリミキシンＢ増殖アッセイを用いてここで試験されるすべての変異体に存在する。認められるすべての変異体が全ＡｒｎＴＳｔタンパク質発現について試験されており、すべて匹敵する量を発現する。ＡｒｎＴＳｔ変異体の機能を評価するために使用されたインビボでのポリミキシンＢ増殖アッセイが既に報告されている（１３、１４）。簡単に説明すると、変異体ＡｒｎＴＳｔタンパク質をコードするプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｒｎＴ大腸菌細胞にエレクトロポレーションし、ＬＢ／アンピシリンプレートに加え、３７℃で一晩増殖させた。単一コロニーから得る１０５個の細胞を２ｍＬのＬＢ／アンピシリンに接種して、２μｇ／ｍＬポリミキシンの存在または不存在において、３７℃で振とうしながら一晩インキュベーションした。増殖は、Ｖａｒｉｏｓｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた６００ｎｍの分光測定によって連続的に定量した。アッセイは各変異について、二重測定で２回実施した。空ベクター（ｐＥＴ２１）およびＰ５４７Ａ  ＡｒｎＴＳｔ（野生型）を、それぞれポリミキシン感受性およびポリミキシン耐性のコントロールとしてすべての実験に含めた。棒グラフにおけるすべての誤差バーは標準偏差を示す。
【０１４６】
化合物スクリーニングのためのポリミキシンＢ増殖アッセイの９６ウェルプレートでの実施
９６ウェルプレート方式における化合物スクリーニングのため、ポリミキシンＢ増殖アッセイの実施に次の３種の株を使用した。（１）ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（ＢＬ２１と呼ばれる）。ＢＬ２１株は本来ポリミキシンＢに耐性であり、内因性大腸菌ＡｒｎＴ遺伝子を有する。大腸菌ＢＬ２１株は、大腸菌ＡｒｎＴタンパク質に対する試験化合物の効能を試験するために使用される。（２）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔＡｒｎＴ。内因性大腸菌ＡｒｎＴ遺伝子が欠失されており、そのため、大腸菌ＢＬ２１ΔＡｒｎＴ株はポリミキシンＢに感受性にされている（ΔＡｒｎＴと呼ばれる）。（３）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔＡｒｎＴ。野生型サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴを発現するプラスミドｐＧｉ２４で形質転換されている（Ｇｉ２４と呼ばれる）。野生型サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴの発現はポリミキシンＢに対する耐性を回復し、ＰＭＸＢの存在におけるＧｉ２４株の増殖によって実証される。Ｇｉ２４株はサルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴタンパク質に対する試験化合物の効能を試験するために使用される。
【０１４７】
３種の株の一晩培養を使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリン単独（ＰＭＸＢ−）または１００μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ＋）を含むＬＢ培地に、適切に１：２０００希釈で接種した。スクリーニングする化合物をＤＭＳＯに１００ｍＭのストック濃度に溶解し、ＰＭＸＢ−およびＰＭＸＢ＋のＬＢ培地の異なる株の小分けで０．５ｍＭの最終濃度に希釈した。ＰＭＸＢ−およびＰＭＸＢ＋のＬＢ培地に試験化合物を添加して、得られる試験株（ＢＬ２１およびＧｉ２４）の小分けを９６ウェルプレートに移し、各サンプルを三重測定で記載された方法で加えた。各ウェルに適切な組成物（株／化合物／ＰＭＸＢ）を１５０μｌ加えた。９６ウェルプレートをＥｐｏｃｈ  ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）に移し、３７℃で連続的に振とうさせた。増殖を６００ｎｍの吸光度測定によって連続的に定量した。各化合物は、試験株（ＢＬ２１およびＧｉ２４）の増殖の阻止について２回の独立した実験で試験した。
【０１４８】
考察
ＡｒｎＴＣｍは脂質対脂質グリコシルトランスフェラーゼの初めての構造を示し、分子詳細におけるＡｒｎＴの機能を理解するための構造的フレームワークをもたらす。全体として、本明細書で説明される構造は、両親媒性二層組み込み基質が一体型膜酵素によってどのように利用されるかの洞察をもたらし、ＡｒｎＴファミリーに関するメカニズムを説明する。これらの構造は、ポリミキシン系抗生物質に対する耐性を逆転することを標的にする新規化合物の情報による設計を可能にする。
【０１４９】
「Ａ」参考文献
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Ａ４．Ｐａｙｎｅ  ＤＪ，Ｇｗｙｎｎ  ＭＮ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＤＪ，Ｐｏｍｐｌｉａｎｏ  ＤＬ．２００７．Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｂａｄ  ｂｕｇｓ：ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（病原体の薬剤：抗細菌剤発見の挑戦に立ちはだかる）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６：２９−４０．
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Ａ６．Ｃｕｒｃｉｏ  Ｄ．２０１４．Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ａｒｅ  ｙｏｕ  ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ？（多剤耐性グラム陰性細菌感染症：挑戦の用意はされているか？）  Ｃｕｒｒ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ９：２７−３８．
Ａ７．Ｐｏｐ−Ｖｉｃａｓ  Ａ，Ｏｐａｌ  ＳＭ．２０１４．Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ（敗血性ショックの管理における多剤耐性グラム陰性桿菌の臨床的影響）．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ５：２０６−１２．
Ａ８．Ｖｉａｌｅ  Ｐ，Ｇｉａｎｎｅｌｌａ  Ｍ，Ｔｅｄｅｓｃｈｉ  Ｓ，Ｌｅｗｉｓ  Ｒ．２０１５．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＤＲ−Ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ：ａ  ｎｅｖｅｒ  ｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｒｅａｔ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（２１世紀におけるＭＤＲグラム陰性感染症の治療：臨床医にとって終わりのない脅威）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４：３０−７．
Ａ１１．Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ  ＫＫ，Ｔｏｌｅｍａｎ  ＭＡ，Ｗａｌｓｈ  ＴＲ，Ｂａｇａｒｉａ  Ｊ，Ｂｕｔｔ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｉｎｄｉａ，Ｐａｋｉｓｔａｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵＫ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ（インド、パキスタン、および英国における新しい抗生物質耐性メカニズムの出現：分子的、生物学的、および疫学的研究）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １０：５９７−６０２．
Ａ１２．Ｖｅｌｋｏｖ  Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＫＤ，Ｎａｔｉｏｎ  ＲＬ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＰＥ，Ｌｉ  Ｊ．２０１３．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ：ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ’ｏｌｄ’  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（ポリミキシンの薬理学：抗生物質の「旧」系に対する新たな洞察）．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：７１１−２４．
Ａ１３．Ｌｉ  Ｊ，Ｎａｔｉｏｎ  ＲＬ，Ｔｕｒｎｉｄｇｅ  ＪＤ，Ｍｉｌｎｅ  ＲＷ，Ｃｏｕｌｔｈａｒｄ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｃｏｌｉｓｔｉｎ：ｔｈｅ  ｒｅ−ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（コリスチン：多剤耐性グラム陰性細菌感染のために再出現した抗生物質）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ６：５８９−６０１．
Ａ１４．Ｂｅｒｇｅｎ  ＰＪ，Ｌａｎｄｅｒｓｄｏｒｆｅｒ  ＣＢ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｏ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＨＪ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ’ｏｌｄ’  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ：ｗｈａｔ  ｉｓ  ｎｅｗ？（「旧」ポリミキシンの薬物動態学および薬物動力学：何が新しいか？）  Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ７４：２１３−２３．
Ａ１５．Ｖｅｌｋｏｖ  Ｔ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＰＥ，Ｎａｔｉｏｎ  ＲＬ，Ｌｉ  Ｊ．２０１０．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（ポリミキシン抗生物質の構造−活性関係）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５３：１８９８−９１６．
Ａ１６．Ｃａｊａｌ  Ｙ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ，Ｂｅｒｇ  ＯＧ，Ｊａｉｎ  ＭＫ．１９９６．Ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔａｃｔｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ（リン脂質の交換を仲介するポリミキシンＢによる膜内分子接触）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２９９−３０８．
Ａ１７．Ｃｌａｕｓｅｌｌ  Ａ，Ｇａｒｃｉａ−Ｓｕｂｉｒａｔｓ  Ｍ，Ｐｕｊｏｌ  Ｍ，Ｂｕｓｑｕｅｔｓ  ＭＡ，Ｒａｂａｎａｌ  Ｆ，Ｃａｊａｌ  Ｙ．２００７．Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｏｕｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ：ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ（グラム陰性外膜および内膜モデル：環状カチオン性リポペプチドの挿入）．Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｂ  １１１：５５１−６３．
Ａ１８．Ｚｈｉｌｉａｎｇ  Ｙ，Ｗａｎｇｒｏｎｇ  Ｑ，Ｊｉａｎｘｕｎ  Ｌ，Ｓｈｉｓｏｎｇ  Ｆ，Ｊｕａｎｐｉｎｇ  Ｑ．２０１５．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ポリミキシンの抗細菌メカニズムおよび細菌耐性）．ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．
Ａ１９．Ｍａｒｅｓ  Ｊ，Ｋｕｍａｒａｎ  Ｓ，Ｇｏｂｂｏ  Ｍ，Ｚｅｒｂｅ  Ｏ．２００９．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＮＭＲスペクトロスコピーによって研究されたリポポリサッカライドとポリミキシンの相互作用）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：１１４９８−５０６．
Ａ２０．Ｔａｎ  ＣＨ，Ｌｉ  Ｊ，Ｎａｔｉｏｎ  ＲＬ．２００７．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｌｉｓｔｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ（ヘテロ耐性アシネトバクター・バウマンニに対するコリスチンの活性およびインビトロ薬動態学的／薬物動力学的モデルにおける耐性の出現）．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５１：３４１３−５．
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Ａ２２．Ｐｏｕｄｙａｌ  Ａ，Ｈｏｗｄｅｎ  ＢＰ，Ｂｅｌｌ  ＪＭ，Ｇａｏ  Ｗ，Ｏｗｅｎ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｌｉｓｔｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（多剤耐性クレブシエラ・ニューモニエに対するコリスチンのインビトロ薬物動力学）．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ６２：１３１１−８．
Ａ２３．Ｍａｔｔｈａｉｏｕ  ＤＫ，Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  Ａ，Ｒａｆａｉｌｉｄｉｓ  ＰＩ，Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ  ＤＥ，Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｉｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ａ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ（コリスチン耐性グラム陰性細菌の分離と関連する危険因子：対症例対照研究）．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３６：８０７−１１．
Ａ２４．Ｒａｅｔｚ  ＣＲ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＣＭ，Ｔｒｅｎｔ  ＭＳ，Ｂｉｓｈｏｐ  ＲＥ．２００７．Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ（グラム陰性細菌におけるリピドＡ修飾システム）．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：２９５−３２９．
Ａ２５．Ｂｒｏｇｄｅｎ  ＫＡ．２００５．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍｅｒｓ  ｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ？（抗微生物ペプチド：細菌における孔形成剤または代謝阻害剤？）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：２３８−５０．
Ａ２６．Ｎｅｅｄｈａｍ  ＢＤ，Ｔｒｅｎｔ  ＭＳ．２０１３．Ｆｏｒｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｒｒｉｅｒ：ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ（障壁の強化：細菌病因におけるリピドＡリモデリングの影響）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１：４６７−８１．
Ａ２７．Ｇａｌｅｓ  ＡＣ，Ｊｏｎｅｓ  ＲＮ，Ｓａｄｅｒ  ＨＳ．２０１１．Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｌｉｓｔｉｎ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＳＥＮＴＲＹ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（グラム陰性病原体の世界的コレクションに対するコリスチンおよびポリミキシンＢの最近の活性：ＳＥＮＴＲＹ抗微生物サーベイランスプログラムの結果）（２００６−０９）．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ６６：２０７０−４．
Ａ５７．Ｋｌｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ４−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ４−ｄｅｏｘｙ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（細菌性ポリミキシン耐性の阻害剤の可能性がある４−置換４−デオキシアラビノースアナログによるリピドＡ修飾の合成および評価）．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００８．１８（４）：ｐ．１５０７−１０．
Ａ５８．Ｔａｖａｒｅｓ−Ｃａｒｒｅｏｎ，Ｆ．，Ｋ．Ｂ．Ｐａｔｅｌ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｖａｌｖａｎｏ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＡｒｎＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙ−ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｈａｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（膜トポロジーおよび機能的アミノ酸を共有する４−アミノ−４−デオキシ−ｌ−アラビノースをリポポリサッカライドに移すバークホルデリア・セノセパシアおよびサルモネラ・エンテリカＡｒｎＴタンパク質）．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１５．５：ｐ．１０７７３．
【０１５０】
参考文献
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８．Ｍ．Ｓ．Ｔｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｉｎｏ  ｓｕｇａｒ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍ（ポリミキシン耐性サルモネラ・ティフィムリウムおよび大腸菌におけるポリイソプレン結合アミノ糖の蓄積：構造的特徴付けおよびペリプラズムにおけるリピドＡへの移動）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３１３２−４３１４４（２００１）．
９．Ｃ．Ｍ．Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｊ．Ｖ．Ｈａｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｓ．Ｔｒｅｎｔ，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰｍｒＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＬｐｘＴ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ（抗微生物ペプチドに対する耐性を促進するリピドＡのＬｐｘＴ依存性リン酸化を阻害するＰｍｒＡの活性化）．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６，１４４４−１４６０（２０１０）．
１０．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｆ．−Ｆ．Ｈｓｕ，Ｊ．Ｔｕｒｋ，Ｅ．Ａ．Ｇｒｏｉｓｍａｎ，Ｔｈｅ  ＰｍｒＡ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｍｒＣ  ｇｅｎｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（サルモネラ・エンテリカにおけるリピドＡのホスホエタノールアミン修飾およびポリミキシン耐性を仲介するＰｍｒＡ制御されたｐｍｒＣ遺伝子）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６，４１２４−４１３３（２００４）．
１１．Ｆ．Ｍａｎｃｉａ，Ｊ．Ｌｏｖｅ，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（膜タンパク質のハイスループット発現および精製）．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７２，８５−９３（２０１０）．
１２．Ｍ．Ｃａｆｆｒｅｙ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｉｃ  Ｍｅｓｏｐｈａｓｅｓ（構造決定のための膜タンパク質の結晶化：脂質メソフェーズの利用）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８，２９−５１（２００９）．
１３．Ｎ．Ａ．Ｉｍｐｅｌｌｉｔｔｅｒｉ，Ｊ．Ａ．Ｍｅｒｔｅｎ，Ｌ．Ｅ．Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｃ．Ｓ．Ｋｌｕｇ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｌｏｏｐ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＡｒｎＴ（サルモネラ・ティフィムリウムＡｒｎＴにおける機能的に重要なループの特定）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，２９−３５（２０１０）．
１４．Ｌ．Ｅ．Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｔ．Ｍｏｒｒｅｌｌ，Ａ．Ｌ．Ｆｕｎｋ，Ｃ．Ｓ．Ｋｌｕｇ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ−Ａｒａ４Ｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡｒｎＴ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（サルモネラ・ティフィムリウム由来Ｌ−Ａｒａ４Ｎトランスフェラーゼタンパク質ＡｒｎＴの精製および特徴付け）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４６，３３−３９（２００６）．
１５．Ｔ．Ｗ．Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ：ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ（ヘリコバクター・ピロリ対ホスト：胃粘膜における生存のために必要とされる細菌外膜のリモデリング）．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．７，ｅ１００２４５４（２０１１）．
１６．Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ＭｃＧｒａｔｈ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｈ．Ｒａｅｔｚ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ４′−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＬｐｘＦ（フランシセラ・ノビサイダのリピドＡ４’−ホスファターゼＬｐｘＦの発現クローニングおよびペリプラズム適応）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，９３２１−９３３０（２００６）．
１７．Ｆ．Ｔａｖａｒｅｓ−Ｃａｒｒｅｏｎ，Ｋ．Ｂ．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ａ．Ｖａｌｖａｎｏ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＡｒｎＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙ−ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｈａｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（膜トポロジーおよび機能的アミノ酸を共有する、４−アミノ−４−デオキシ−ｌ−アラビノースをリポポリサッカライドに移すバークホルデリア・セノセパシアおよびサルモネラ・エンテリカＡｒｎＴタンパク質）．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０７７３．
１８．Ｌ．Ｌ．Ｌａｉｒｓｏｎ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｇ．Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｇ．Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ（グリコシルトランスフェラーゼ：構造、機能、およびメカニズム）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７，５２１−５５５（２００８）．
１９．Ｃ．Ｌｉｚａｋ，Ｓ．Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ｎｕｍａｏ，Ｍ．Ａｅｂｉ，Ｋ．Ｐ．Ｌｏｃｈｅｒ，Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（細菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼのＸ線構造）．Ｎａｔｕｒｅ．４７４，３５０−３５５（２０１１）．
２０．Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｃｈａｅａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ（Ｎ−結合タンパク質グリコシル化の触媒サイクルに洞察をもたらす古細菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼの結晶構造）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０，１７８６８−１７８７３（２０１３）．
２１．Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ａ．Ａ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｃ．Ｒ．Ｈ．Ｒａｅｔｚ，Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙ−ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ＮＨ４ＶＯ３−ｔｒｅａｔｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｅｒｓｕｓ  ｋｄｓＡ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（４−アミノ−４−デオキシ−ｌ−アラビノースおよびホスホエタノールアミン置換基を含むリピドＡ分子の高分解能ＮＭＲスペクトロスコピー。ＮＨ４ＶＯ３処理大腸菌由来のリピドＡ分子対サルモネラ・ティフィムリウムのｋｄｓＡ変異体における異なる結合部位）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１３５４２−１３５５１（２０００）．
２２．Ｊ．Ｂ．Ｔｈｏｄｅｎ，Ｈ．Ｍ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｕｒｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの活性部位幾何学）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１６，１３７９−１３８８（２００７）．
２３．Ｃ．Ｌｉｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ（細菌Ｎ−結合タンパク質グリコシル化におけるカルボキサミド活性化の予想外の反応性およびメカニズム）．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４（２０１３），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ３６２７．
２４．Ｍ．Ａ．Ｌｏｍｉｚｅ，Ｉ．Ｄ．Ｐｏｇｏｚｈｅｖａ，Ｈ．Ｊｏｏ，Ｈ．Ｉ．Ｍｏｓｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．Ｌｏｍｉｚｅ，ＯＰＭ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ＰＰＭ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ：ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＯＰＭデータベースおよびＰＰＭウェブサーバー：膜におけるタンパク質の配置のための資源）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０，Ｄ３７０−Ｄ３７６（２０１２）．
２５．Ｎ．Ｒ．Ｖｏｓｓ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，３Ｖ：ｃａｖｉｔｙ，ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  ｃｌｅｆｔ  ｖｏｌｕｍｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（３Ｖ：キャビティー、チャンネル、およびクレフト容積計算ツールおよび抽出ツール）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８，Ｗ５５５−Ｗ５６２（２０１０）．
２６．Ｍ．Ｐｕｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（膜タンパク質構造に関するニューヨーク協会のための選択を標的にする構造的ゲノミクス）．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１０，２５５−２６８（２００９）．
２７．Ｊ．Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＮＹＣＯＭＰＳ）：ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（膜タンパク質構造に関するニューヨーク協会（ＮＹＣＯＭＰＳ）：一体型膜タンパク質の構造ゲノミクスのための高性能プラットホーム）．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１１，１９１−１９９（２０１０）．
２８．Ｒ．Ｂ．Ｋａｐｕｓｔ，Ｊ．Ｔｏｚｓｅｒ，Ｔ．Ｄ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｄ．Ｓ．Ｗａｕｇｈ，Ｔｈｅ  Ｐ１′  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼのＰ１’特異性）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９４，９４９−９５５（２００２）．
２９．Ｗ．Ｋａｂｓｃｈ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｓｃａｌｉｎｇ，ｓｐａｃｅ−ｇｒｏｕｐ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（集積化、スケーリング、空間群登録、および精密化後）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，１３３−１４４（２０１０）．
３０．Ｇ．Ｍ．Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ＳＨＥＬＸ（ＳＨＥＬＸの小史）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ．６４，１１２−１２２（２００８）．
３１．Ｔ．Ｐａｐｅ，Ｔ．Ｒ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ＨＫＬ２ＭＡＰ：ａ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｕｓｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＳＨＥＬＸ  ｐｒｏｇｒａｍｓ（ＨＫＬ２ＭＡＰ：ＳＨＥＬＸプログラムによるマクロ分子位相化のためのグラフィカルユーザーインターフェース）．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．３７，８４３−８４４（２００４）．
３２．Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｈａｓｅｒ結晶学ソフトウェア）．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４０，６５８−６７４（２００７）．
３３．Ａ．Ｖａｇｉｎ，Ａ．Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＭＯＬＲＥＰ（ＭＯＬＲＥＰによる分子置換）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，２２−２５（２０１０）．
３４．Ｔ．Ｃ．Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（最大限の可能性がある密度修正）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５６，９６５−９７２（２０００）．
３５．Ｐ．Ｒ．Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ｎ．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｈｏｗ  ｇｏｏｄ  ａｒｅ  ｍｙ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ？（自分のデータはどの程度優れ、分解能とは何か？）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９，１２０４−１２１４（２０１３）．
３６．Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＨＥＮＩＸ：マクロ分子構造解析のための広範なＰｙｔｈｏｎベースシステム）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，２１３−２２１（２０１０）．
３７．Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ，Ｂ．Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｗ．Ｇ．Ｓｃｏｔｔ，Ｋ．Ｃｏｗｔａｎ，Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ（Ｃｏｏｔの特徴および開発）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，４８６−５０１（２０１０）．
３８．Ｅ．Ｆ．Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ−−ａ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ−探査研究および分析のための可視化システム）．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２５，１６０５−１６１２（２００４）．
３９．Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｓ．Ｌｉｎ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｒａｅｔｚ，Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＮＨ４ＶＯ３  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ａｍｉｎｏ−４−ｄｅｏｘｙ−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ（大腸菌Ｋ１２におけるＮＨ４ＶＯ３によって誘発されるサルモネラ・ティフィムリウムのリピドＡ修飾特性。４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース、ホスホエタノールアミン、およびパルミチン酸の検出）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１８５０３−１８５１４（１９９９）．
４０．Ｍ．Ｌａｉｔａｏｊａ，Ｊ．Ｖａｌｊａｋｋａ，Ｊ．Ｊａｎｉｓ，Ｚｉｎｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｐｈｅｒｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（タンパク質構造における亜鉛配位球体）．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２，１０９８３−１０９９１（２０１３）．
４１．Ｋ．Ｋａｔｏｈ，Ｈ．Ｔｏｈ，Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＡＦＦＴ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＭＡＦＦＴ多配列配置プログラムにおける最新開発）．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．９，２８６−２９８（２００８）．
４２．Ｍ．Ａ．Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  バージョン２．０）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２３，２９４７−２９４８（２００７）．
４３．Ｄ．Ｈ．Ｈｕｓｏｎ，Ｃ．Ｓｃｏｒｎａｖａｃｃａ，Ｄｅｎｄｒｏｓｃｏｐｅ  ３：Ａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｒｏｏｔｅｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒｅｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ（Ｄｅｎｄｒｏｓｃｏｐｅ  ３：有根系統樹およびネットワークのための対話型ツール）．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．６１，１０６１−１０６７（２０１２）．
４４．Ｊ．Ｐｅｉ，Ｂ．−Ｈ．Ｋｉｍ，Ｎ．Ｖ．Ｇｒｉｓｈｉｎ，ＰＲＯＭＡＬＳ３Ｄ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ＰＲＯＭＡＬＳ３Ｄ：多重タンパク質配列および構造アライメントのためのツール）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６，２２９５−２３００（２００８）．
４５．Ｇ．Ｅ．Ｃｒｏｏｋｓ，Ｇ．Ｈｏｎ，Ｊ．−Ｍ．Ｃｈａｎｄｏｎｉａ，Ｓ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，ＷｅｂＬｏｇｏ：Ａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｏｇｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＷｅｂＬｏｇｏ：シークエンスロゴ作成プログラム）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４，１１８８−１１９０（２００４）．
４６．Ｖ．Ｉ．Ｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＡｒｎＴ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ（リピドＡグリコシル化の分子基本を示唆するアミノアラビノーストランスフェラーゼＡｒｎＴの構造）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５１，６０８−６１２（２０１６）．
【０１５１】
従来技術の当業者に明らかなように、本発明の多くの改良および変更がその精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本発明は添付の請求の用語によって定められ、このような請求が表題とされる均等物の全範囲を伴う。本明細書で説明される具体的な実施形態は、それに続く例を含め、例としてのみ提示され、これらの詳細によって本発明の範囲は制限されない。
【０１５２】
本発明で引用されるすべての参考は、各個別刊行物、データベース登録（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願、または特許が参考によって組み込まれることが具体的および個別に示されたのと同じ範囲まで参考に組み込まれる。参考による組み込みのこの言明は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って、それぞれの、そしてすべての個別出願、データベース登録（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願、または特許と関連することが出願者によって意図され、そのそれぞれは、たとえ当該引用が参考による組み込みの提示された言明と直近でなくとも、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明白に特定される。参考による組み込みの提示された言明の包含が本明細書内にあるとしても、参考による組み込みのこの全般的な言明を弱めない。本明細書における参考の引用は、参考が関連する従来技術であるという容認として意図されておらず、これらの公開または文書の内容物または日付に関するいかなる容認も構成しない。
【０１５３】
本発明は本明細書で説明される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書で説明されるものに加えて、本発明の様々な改良は、前述の説明および付随する図から従来技術の当業者には明白である。このような改良は添付された請求の範囲内であることが意図される。
【０１５４】
前述の明細書は、従来技術の当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分なものであると考えられる。本明細書で示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改良が前述の説明から従来技術の当業者に明らかとなり、添付の請求の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2018534303.tif 000189
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【国際調査報告】
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