(57)【要約】式Ｉ化合物の共結晶およびその医薬組成物は疾患（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、およびがん）の治療のための新規な治療薬である。式Ｉ化合物の対応するトシレート塩体と比較して、該共結晶は酸化および水性分解に対してより安定であり、より良い薬物動態プロファイルを有し、および優れた生物学的活性を持つ。
2018502090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの成分：
（Ａ）式Ｉ
【化１】
2018502090.tif 000024
Ｉ
の化合物または医薬的に許容されるその立体異性体または互変異性体；および
（Ｂ）共結晶形成体
を含む共結晶。
【請求項２】
該共結晶形成体がフマル酸、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸、およびグリコール酸からなる群から選択される、請求項１に記載の共結晶。
【請求項３】
該共結晶形成体がグルタル酸である、請求項２に記載の共結晶。
【請求項４】
該共結晶が式Ｉの化合物およびマロン酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項５】
該共結晶が式Ｉの化合物およびフマル酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項６】
該共結晶が式Ｉの化合物およびグルタル酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項７】
該共結晶が式Ｉの化合物およびアジピン酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項８】
該共結晶が式Ｉの化合物および２−アミノ安息香酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項９】
該共結晶が式Ｉの化合物およびα−ケトグルタル酸を含む、請求項１に記載の共結晶。
【請求項１０】
式Ｉの化合物および共結晶形成体が該共結晶内において、１：１、１：２、または２：１の比で存在する、請求項１に記載の共結晶。
【請求項１１】
該グルタル酸共結晶が回折角２θ  ５．９、８．１、１１．３、１１．９、１２．４、１５．７、１７．８、１８．３、１８．９、２０．６、２０．８、２１．６、２２．４、２４．２、２４．６、２５．４、２５．６、２６．５、および２８．６に粉末Ｘ線回折ピークを有する、請求項６に記載の共結晶。
【請求項１２】
医薬的に許容される担体または希釈剤、および少なくとも２つの成分：
（Ａ）式Ｉ
【化２】
2018502090.tif 000025
Ｉ
の化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体；および
（Ｂ）共結晶形成体；
を含む共結晶
を含む医薬組成物。
【請求項１３】
該共結晶形成体がグルタル酸である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
その必要がある対象に治療的有効量の請求項１に記載の共結晶を投与することを含み、該共結晶は更に（Ａ）式Ｉ
【化３】
2018502090.tif 000026
Ｉ
の化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体；および
（Ｂ）共結晶形成体；
を含む、疾患または状態を治療するための方法。
【請求項１５】
該疾患または状態ががん、炎症、またはＢ型肝炎感染から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該疾患または状態がＢ型肝炎感染である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１の共結晶が抗生物質、制吐剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、ポリメラーゼ阻害剤、およびトール受容体様モジュレーターからなる群から選択される第２の治療薬の治療的有効量と組み合わせて投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１の共結晶が治療的有効量のα−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、またはペグ化β−インターフェロンと組み合わせて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
下記の工程を含む、共結晶を合成する方法：
（ｉ）共結晶形成体の溶液を式Ｉ
【化４】
2018502090.tif 000027
Ｉ
の化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体の溶液と混合して共結晶化混合物得る；または
（ｉｉ）共結晶形成体の懸濁液を式Ｉ
【化５】
2018502090.tif 000028
Ｉ
の化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体の懸濁液と混合して共結晶化混合物を得る；および
（ｉｉｉ）共結晶の形成を開始させるために該共結晶化混合物を過飽和させる。
【請求項２０】
該共結晶形成体の溶液および該式Ｉの化合物の溶液が有機溶媒、水、または水および有機溶媒の混合物を用いて得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、またはそれらの組合せから選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートと有機酸の共結晶、該共結晶の合成、および病理的疾患、特にＢ型肝炎（ＨＢＶ）感染の治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシドアナログは、ＤＮＡ合成において天然ヌクレオシドのようにまたはこれによく似た作動をする分子である。当該カテゴリー「ヌクレオシドアナログ」に含まれる化合物はがん、ウイルス感染、および免疫抑制疾患の重要な治療薬である。ヌクレオシドアナログはＤＮＡ合成を阻害することによって、その治療効果を発揮する。細胞に入ると、ヌクレオシドアナログはその対応する一リン酸、二リン酸、または三リン酸にリン酸化される。三リン酸のヌクレオシドアナログはＤＮＡ転写を打ち切ることによって、細胞分裂を阻害する。
【０００３】
ヌクレオシドアナログはまた、いくつかのヌクレオシドアナログが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、およびがんのような疾患の治療について現在承認を受けているといった、確立された承認歴がある。
【０００４】
該Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はタバコに次ぐヒトがんの原因である。ＨＢＶががんを誘導するメカニズムは分かっていない。ＨＢＶ感染が直接腫瘍成長を引き起こす、あるいは、該感染に関連する慢性炎症、肝硬変、および細胞の再生を介して間接的に腫瘍成長を引き起こしていることが想定されている。ＨＢＶ感染者は急性肝炎や肝障害を患い、腹痛、黄疸および特定の肝臓酵素の血中レベルの上昇という結果を引き起こす。患者は通常急性ＨＢＶ感染からは回復するが、該ウイルスは無期限に複製し続けることができ、肝細胞がん、原発性肝がんの主原因の一つである慢性持続性肝炎を引き起こす。
【０００５】
３ＴＣ（ラミブジン）、インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ヘプセラ（アデホビルピボキシル）、バラクルード（エンテカビル）、およびＴｙｚｅｋａ（テルビブジン）はＨＢＶ感染の治療薬として現在ＦＤＡで承認されている。しかしながら、これらの薬剤の多くは重い副作用があり、また、これらの薬剤で治療を受けた患者ではウイルス抵抗性が急速に進む。市販のヌクレオシドアナログの他のデメリットには、これらに限定される訳ではないが、保存中の安定性に関する課題および宿主細胞を損傷することなしにウイルス複製を阻害する能力に関する課題に加え、時間も費用もかかる精製工程が必要な複数工程の合成プロトコルが用いられており、製造関連の困難性も挙げられる。
【発明の概要】
【０００６】
本願発明は疾患および障害（例えば、がん、ウイルス感染、および不適切な免疫機能に関連する障害）の治療薬としての共結晶を提供する。
【０００７】
一つの実施形態において、本願発明は少なくとも２つの成分：
（Ａ）式Ｉの化合物または医薬的に許容されるその立体異性体または互変異性体
【化１】
2018502090.tif 000003
Ｉ
；および
（Ｂ）共結晶形成体
を含む共結晶を提供する。
【０００８】
該共結晶形成体は有機酸である。共結晶形成体として使用できる有機酸の例は、フマル酸、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸およびアントラニル酸である。一つの実施形態に従って該共結晶形成体はグルタル酸であり、他の実施形態において該共結晶形成体はマロン酸、アジピン酸、またはフマル酸から選択される有機酸でありうる。
【０００９】
本願発明の共結晶は式Ｉ化合物およびマロン酸、式Ｉ化合物およびフマル酸、式Ｉ化合物およびグルタル酸、式Ｉ化合物およびアジピン酸、式Ｉ化合物およびアントラニル酸、または式Ｉ化合物およびα−ケトグルタル酸を含むことができる。本発明の共結晶における式Ｉ化合物の共結晶形成体に対する比は１：１、１：２、または２：１でありうる。
【００１０】
本発明の共結晶は結晶性であり、テーブル２に示される回折角２θに特徴的な粉末Ｘ線回折ピークを有する。本発明の共結晶はＩＲ吸光分光法によりさらに特徴づけられた。
【００１１】
一つの実施形態において、本願発明は医薬的に許容される担体または希釈剤および共結晶（少なくとも２つの成分：（Ａ）式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体および（Ｂ）共結晶形成体；を含む）を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態に従って、本発明にかかる医薬組成物の共結晶は、式Ｉ化合物および共結晶形成体としてグルタル酸を含む。
【００１２】
別の実施形態に従って、本願発明はその必要がある対象に治療的有効量の請求項１の該共結晶を投与することにより疾患または状態を治療する方法を提供する。本発明にかかる共結晶を用いて治療される疾患または状態の例として、がん、炎症、またはＢ型肝炎感染から選択されるものが挙げられる。
【００１３】
本方法の実施形態に従って、該共結晶は、抗生物質、制吐剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、ポリメラーゼ阻害剤、およびトール受容体様モジュレーターからなる群から選択される第２の治療薬の治療的有効量と組み合わせて投与される。
【００１４】
本願発明の共結晶は、共結晶形成体の溶液または懸濁液を式Ｉ化合物またはその医薬的に許容される立体異性体または互変異性体の溶液または懸濁液と混合（combining）し、共結晶化溶液を得て、該共結晶化溶液を過飽和させて共結晶の形成を開始することによって合成される。
【００１５】
共結晶形成体、式Ｉ化合物を可溶化するのに使用される溶媒として、有機溶媒、水、または水および有機溶媒の混合物が挙げられる。共結晶形成体を可溶化するのに適する該クラス有機溶媒の例として、これらに限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、またはそれらの組合せが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の例示グルタル酸共結晶のインビボ薬物動態。式Ｉ化合物のグルタル酸共結晶またはトシレート塩を１０ｍｇ／Ｋｇの容量で経口投与したときのカニクイザルの平均血漿中濃度を示す。
【００１７】
【図２】式Ｉ化合物および例示共結晶の合成の例示プロトコル。
【００１８】
【図３Ａ】生物学的に活性な種（Ｒ０６８７１７６５）のＨＢＶ複製に対する影響。分泌されたＨＢＶ ＤＮＡ（■）の濃度およびＨＢｓＡｇ（●）の濃度をそれぞれリアルタイムＰＣＲおよびＣＬＩＡアッセイを用いて測定することによって、ＨＢＶ複製をモニタリングした。細胞の生存は細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（▲）により測定した。
【００１９】
【図３Ｂ】ペグ化インターフェロン−α−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））のＨＢＶ複製に対する影響。分泌されたＨＢｓＡｇ（白）およびＨＢＶ ＤＮＡ（グレイ）の濃度をそれぞれＣＬＩＡおよびリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて測定することによって、ＨＢＶ複製をモニタリングした。細胞の生存は細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（黒）によって測定した。
【００２０】
【図４】ＤＭＳＯまたはＲ０６８７１７６５刺激ＰＢＭＣ馴化培地のＨＢＶ複製に対する影響。ＤＭＳＯ馴化培地−グラフ（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）。Ｒ０６８７１７６５（１００μＭ）刺激ＰＢＭＣ馴化培地−グラフ（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）。分泌されたＨＢＶ ＤＮＡ（■）およびＨＢｓＡｇ（●）の濃度をそれぞれリアルタイムＰＣＲおよびＣＬＩＡアッセイを用いて測定することによって、ＨＢＶ複製をモニタリングした。細胞の生存は細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（▲）により測定した。
【００２１】
【図５】ＩＦＮ−α２ａ（ロフェロン−Ａ）、図５Ａ；ＩＬ−６、図５Ｂ；ＴＮＦ−α、図５Ｃ；およびＩＰ−１０、図５Ｄ；のＨＢＶ複製に対する影響。分泌されたＨＢＶ ＤＮＡ（■）およびＨＢｓＡｇ（●）の濃度をそれぞれリアルタイムＰＣＲおよびＣＬＩＡアッセイを用いて測定することによって、ＨＢＶ複製をモニタリングした。細胞の生存は細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（▲）により測定した。詳細な説明
【００２２】
本願発明は式Ｉ化合物および共結晶形成体としての有機酸を含む共結晶を提供する。本発明の共結晶およびその医薬組成物は、ウイルス感染、がん、および不適切な免疫機能に関連する疾患または状態の治療または予防に有用である。
【００２３】
用語「含む（comprising）」（およびその文法的バリエーション）は「有する（having）」または「含む（including）」の包含的な意味で使用されるのであって、「のみからなる（consisting only of）」の排他的な意味では使用されるものではない。本明細書で使用される用語「a」、「an」、および「the」は複数と単数を包含するものと理解される。
【００２４】
該用語「医薬有効成分」または「ＡＰＩ」は物質、例えば医薬組成物中の生物学的活性を生じさせる化合物または生物製剤を意味する。
【００２５】
本願発明において、用語「共結晶」は２またはそれ以上の化合物からなる結晶性分子複合体を意味する。医薬共結晶は、同一結晶内に存在する医薬物質および１またはそれ以上の付加的な分子を含有する。共結晶の当該２またはそれ以上の化合物は室温で固体であることができる。各化合物は、独自の特徴的な物理的特性、例えば構造、融点および融解熱を持っている。用語「共結晶」はまた、各々は室温で液状であるかもしれないが、共結晶化を促進する条件下で混合されたときは結晶性物質を形成する、２またはそれ以上の化合物からなる結晶性物質を意味する。本願発明の共結晶はさらに、室温で固体である化合物を室温で液体である化合物と共結晶化を促進するのに適した条件下で混合することによって得られる結晶性物質を包含する。本願発明いくつかの態様において、本発明の共結晶は共結晶化を促進するのに適した条件下で、式Ｉ化合物の溶媒和物を共結晶形成体と混合することによって、または式Ｉ化合物を共結晶形成体の溶媒和物と混合することによって得られる。
【００２６】
用語「共結晶形成体」は、共結晶の同一結晶性分子複合体内で、薬物と一緒に存在する付加的な化合物またはゲスト化合物を意味する。該薬物とのドナーアクセプター相互作用に関与することができる分子はいずれも、共結晶形成体として使用されうる。当該クラス「共結晶形成体」の化合物の例には、これらに限定されないが、有機酸、有機塩基類、アルコール類、フェノール類  エステル類、およびシクロデキストリン類が挙げられる。例えば、共結晶形成体はサッカリン、ニコチンアミド  ４−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸、グルタル酸、フマル酸、マロン酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸、アントラニル酸、またはメチルパラベンでありうる。
【００２７】
本発明のコンテキストの範囲において、用語「免疫調節剤」は、刺激または抑制を介して正常または異常な免疫システムを修正することができる天然または合成産物を意味する。
【００２８】
用語「予防する（preventing）」とは、その疾患を有すると診断された患者、または、そのような疾患が進行するリスクのある患者において、本願発明の化合物または組成物が、本明細書において認定された疾患を予防する能力を意味する。当該用語はまた、そのような疾患を既に患っている、または、そのような疾患の症状がある患者において当該疾患の更なる進行を防ぐことも包含する。
【００２９】
用語「患者」または「対象」は動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等）または哺乳動物（好ましくはヒト）を意味し、キメラおよびトランスジェニックの動物および哺乳動物を含む。
【００３０】
用語「治療的有効量」は、疾患の治療または予防における有用性を提供するのに十分な、疾患に関連する症状を遅らせるまたは抑えるのにするのに十分な、または疾患または感染またはそれらの原因を治療または改善するのに十分な本願発明の化合物の量を意味する。特に、治療的有効量はインビボで治療的有用性を提供するのに十分な量を意味する。本発明の化合物の量に関連して使用されるとき、当該用語は、好ましくは全体的に治療を改善し、疾患の症状または原因を軽減または回避し、または別の治療薬と共に治療効果を増強もしくは相乗効果を発揮する、毒性のない量を包含する。
【００３１】
用語「治療する（treat）」、「治療している（treating）」および「治療（treatment）」は、疾患に関連する疾患または症状の改善または根絶を意味する。ある実施形態において、上記用語はある疾患を有する患者に１またはそれ以上の予防または治療薬を投与することにより生じた、疾患の拡散または悪化を抑制することを意味する。
【００３２】
本明細書において記載されるいくつかの化合物は不斉中心を有し得、それ故、光学異性体エナンチオマーおよびジアステレオマーとして存在しうる。本願発明の化合物は、単一のエナンチオマー（光学異性体）、ジアステレオマー、またはエナンチオマーの混合物（ラセミ混合物を含む）の形態であり得る。本願発明の化合物の光学異性体は、既知の方法（例えば不斉合成、キラルクロマトグラフィー、または光学活性分割剤を利用する立体異性体の化学的分離）によって得ることができる。
【００３３】
別段の指示がない限り、「立体異性体」は、化合物の１つの立体異性体であって、その化合物の他の立体異性体は実質的に含まれないものを意味する。従って、一つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な（stereomerically pure）化合物は、該化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まない。２つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は他の該化合物ジアステレオマーを実質的に含まない。代表的な立体異性体的に純粋な化合物は、該化合物の１つの立体異性体を約８０重量％より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約２０重量％より少なく含み、例えば、該化合物の１つの立体異性体を約９０重量％より多く含みかつおよび該化合物の他の立体異性体を約１０重量％より少なく含み、または該化合物の１つの立体異性体を約９５重量％より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約５重量％より少なく含み、または該化合物の１つの立体異性体を約９７重量％より多く含みかつ該化合物の他の立体異性体を約３重量％より少なく含む。
【００３４】
描かれた構造とその構造につけられたの名前に相違がある場合、構造を優先する。さらに、構造または構造の一部の立体化学が、例えば太い線または破線で表示されていない場合、該構造または該構造の一部は、その全ての立体異性体を包含するものと理解される。有機合成分野の当業者は、製造するのに用いられた方法から該化合物が単一のエナンチオマーとして製造されたかどうか理解するであろう。
共結晶
【００３５】
下記式Ｉで示される５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートは、遊離塩基体の非晶質粉末として存在する３’−デオキシアデノシンアナログである。
【化２】
2018502090.tif 000004
Ｉ
【００３６】
該遊離塩基は化学安定性が乏しく、コンスタントに医薬グレードの原料を合成する適切な製造方法がないため、該遊離塩基は医薬としては適さない。これらの欠点に対処するため、該遊離塩基のｐ−トルエンスルホン酸（トシレート）塩が合成されたことが米国特許番号７，９２８，０８５号に記載される。この特許の開示のとおり、該トシレート塩の結晶は該遊離塩基と比べてメリットがあり、例えば、該トシレート塩は該遊離塩基と比較して安定性および水溶解性が高い。そのため、該トシレート塩は該遊離塩基よりも残留溶媒量の低い医薬組成物を製造するのに適切な剤であると考えられた。
【００３７】
当該５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートのトシレート塩体は該遊離塩基より有利な特性を有するものの、該トシレート塩の合成には困難が伴う。例えば、合成には発がん性物質として知られるｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）が必要である。該トシレート塩の商業規模での合成は、副産物として遺伝毒性物質−エチル−４−メチルベンゼン  スルホネート（エチルトシレート）およびイソプロピル−４−メチルベンゼン  スルホネート（イソプロピルトシレート）が形成されるという見解があり、さらに複雑である。
【００３８】
エチルトシレートおよびイソプロピルトシレートの生物学的毒性のために、該トシレート塩の商業規模での製造においては、時間がかかりコストもかかる精製方法が使用されなければならない。すなわち、該遺伝毒性の副産物の濃度を、医薬品処方での使用の際に要求される百万分率（ｐｐｍ）レベルの一桁にまで除去または減少させることができる精製プロトコルが、治療薬としての使用に適するトシレート塩を得るには必要である。合成の困難性に加えて、該５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートのトシレート塩を含有する医薬組成物の製造も困難である。
【００３９】
下記のプロトコルを用いて合成される本発明の共結晶は、ＨＢＶおよびＨＣＶ感染の治療剤として該トシレート塩を合成するおよび医薬開発をするのに付随するいくつかの欠点および困難性に対処する。以下にさらに記載するとおり、本発明の共結晶は５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート（式Ｉ化合物）と少なくとも１つの共結晶形成体とを接触させることによって合成される。
【００４０】
式Ｉ化合物の溶媒和物および塩もまた、共結晶形成体と混合されると共結晶を形成することができる。このような目的に向かって、いくつかの有機酸が共結晶形成体として評価された。共結晶形成体の例として、これらに限定されないが、シュウ酸、Ｌ−アスパラギン酸、マレイン酸、サッカリン、２−アミノ安息香酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、４−アミノ安息香酸、α−ケトグルタル酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、マロン酸、ゲンチシン酸、サリチル酸、Ｌ−（＋）−酒石酸、フマル酸、ガラクタル酸、クエン酸、Ｄ−グルクロン酸、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、４−アミノサリチル酸、ニコチンアミド、Ｌ（−）−リンゴ酸、馬尿酸、グリコール酸、Ｌ（−）ピログルタミン酸、γ−シクロデキストリン、安息香酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、４−ヒドロキシ安息香酸、（＋）カンファー酸、ソルビン酸、ニコチン酸、オロチン酸、尿素、メチルパラベン、プロピルパラベン、Ｌ（−）−ラクトアミド  、Ｌ−アスコルビン酸、桂皮酸、Ｄ、Ｌ−マンデル酸、バニリン酸、およびメチル−４−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
【００４１】
上記の有機酸に加え、本願発明はまた、該共結晶形成体が第２の薬物または第２の医薬有効成分（ＡＰＩ）である共結晶を提供する。該カテゴリー「第２の薬物」または「第２のＡＰＩ」の例として、抗生物質、制吐剤、抗鬱剤、抗真菌薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、またはトール受容体様モジュレーターを含む治療薬が挙げられる。
【００４２】
テーブル１は式Ｉ化合物および有機酸共結晶形成体を含む本願発明の例示共結晶の物理的特性を示す。テーブル１および下記に説明するとおり、例示共結晶の多くは優れた水溶解性を有するのでBiopharmaceutics Regulatory Systems（ＢＣＳ）分類体系に基づいたクラスＩ薬物として表示できる。
テーブル１
【表１】
2018502090.tif 000005
【００４３】
本発明の共結晶は粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、光学顕微鏡および赤外線（ＩＲ）分光法を用いてさらに特徴づけられた。この結果、グルタル酸共結晶のパラフィンオイル中懸濁液の偏光光学顕微鏡は結晶性固体を示した。当該現行技術に従って、固体ＮＭＲ分析は式Ｉグルタル酸共結晶を確認し、液相ＮＭＲ分析は、共結晶に関し、２：１、式Ｉ化合物のグルタル酸（共結晶形成体）に対する化学量論を確認する。例示グルタル酸共結晶のエタノール溶液（０．２７ｍｇ／ｍＬ）のＵＶ−分光光度法試験は２２２ｎｍ、２４８ｎｍおよび３１６ｎｍに３つの吸収ピークを示した。加えて、本発明の共結晶を特徴づけるために粉末Ｘ線回折試験が行れた。本願発明のいくつかの共結晶の粉末Ｘ線回折分析の２θ値がテーブル２に示される。
テーブル２
【表２】
2018502090.tif 000006
【００４４】
本願発明者らが驚いたことに、本願発明の共結晶は式Ｉ化合物の該トシレート塩と比較していくつかのメリットを有する。例えば、下記の合成プロトコルを用いる共結晶の合成はあまり時間を必要としない。本発明にかかる合成方法は容易にスケールアップに対応でき、商業的合成および共結晶の単離を可能とする。本発明の共結晶の精製はコスト効率がよく、かつ速い。医薬としての使用に適する共結晶を得るのに単純なろ過および洗浄で十分である。本発明の共結晶の合成は、さらに、該トシレート塩の製造には付随していた遺伝毒性の副産物の産生がない。
【００４５】
上記のメリットに加え、本発明の共結晶は化学安定性が増し、５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートの非晶質遊離塩基またはトシレート塩よりも加水分解による分解に対して感受性が低い。そのため、本発明の共結晶は室温で長期間保存できるが、当該対応するｐ−トルエンスルホン酸塩は吸湿性であり、かつ分解を防ぐために低温での保存が必要である。
【００４６】
別のメリットは、本願発明の共結晶は残留溶媒の量が非常に少ない。このことは、残留溶媒は（あったとしても）非常に少ない、本発明の共結晶の医薬組成物の製造を可能にする。加えて、水に対する高い溶解性は医薬組成物の製造には望ましいところ、溶解性試験により本発明の共結晶は水に対し高い溶解性を有することが示唆された。この高い水溶解性により、該共結晶はBiopharmaceutics Regulatory Systems（ＢＣＳ）ガイドラインに基づいてクラスＩ薬物に分類される。
【００４７】
該塩ファクター（Ｓ）（これは塩またはエステルの形状にある薬物の投与量の割合（fraction）を意味する）は、薬物動態および生体内分布に影響する。例えば、塩ファクター（Ｓ）は他のファクターの中で、薬物の血漿中濃度、定常状態での該ＡＰＩの血漿中濃度を達成するのに必要な投与量、該ＡＰＩのバイオアベイラビリティ、および薬物の生体内分布に影響する。本願発明者らが驚いたことに、式Ｉ化合物の共結晶は、当該対応する式Ｉ化合物のトシレート塩と比較して、より低い値の「Ｓ」（医薬的塩ファクター）を持つ。例えば、例示グルタル酸共結晶の塩ファクター（Ｓ）は１．２である。式Ｉ化合物（５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート）のトシレート塩の（Ｓ）塩ファクターはより大きくて、約１．５３である。従って、該グルタル酸の共結晶の各グラムには、該対応するトシレート塩のグラムと比較して、より多い５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート遊離塩基が含まれる。
【００４８】
つまり、グルタル酸共結晶を含む医薬組成物は、各単位用量により多い５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート遊離塩基を含む。その結果として、毎日の患者に投与されるべき該共結晶の医薬組成物の投与量は少なくなり、このことは治療における患者の服薬順守を高めるのに有利である。
【００４９】
単なる例示として、５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート遊離塩基の一日用量は約１６００ｍｇ／日とされる。経口製剤（錠剤）が製造されるとき、各錠剤の最大重量は１０００ｍｇを超えず、および各錠中に存在しうる５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート遊離塩基の最大量は錠剤の７０重量％を超えず、標的の一日用量１６００ｍｇ遊離塩基を達成するのに必要とされる患者に投与されるべき錠剤の総数は、（Ａ）錠剤の製造に使用される式Ｉ化合物の特定の構造、および
（Ｂ）式Ｉ化合物の特定の構造に関連する塩ファクター（Ｓ）に異存する。
【００５０】
テーブル３に示されるとおり、式Ｉ化合物の特定の構造の塩ファクター（Ｓ）は標的の一日用量１６００ｍｇ遊離塩基を達成するのに必要とされる錠剤の数に影響する。経口製剤が式Ｉ化合物の該遊離塩基または該グルタレート共結晶を含むとき、標的の一日用量を達成するのに必要とされる錠剤は少ない。式Ｉ化合物の遊離塩基を含む錠剤の総重量が７７０ｍｇであるとき（該遊離塩基の塩ファクター（Ｓ）は１．０）、各錠剤は５３９ｍｇの該遊離塩基（０．７ｘ７７０ｍｇ）を含有する。該遊離塩基を商業的スケールで合成および精製するのは難しく、上述のとおり該遊離塩基を含む錠剤は安定性が悪く、保存可能期間が短いため、該遊離塩基の錠剤は商業化には適さない。
【００５１】
比較すると、標的の一日用量である式Ｉ化合物の該遊離塩基１６００ｍｇを達成するのに必要とされる該トシレート塩の錠剤は４錠である。例えば、単位用量あたりの重さ（ｍｇ）、すなわち、式Ｉ化合物の該トシレート塩を含有する錠剤の重さが８７５ｍｇであって、かつ該塩ファクター（Ｓ）が１．５３であるとき、各８７５ｍｇ錠剤は６１２．５ｍｇ（該錠剤の総重量の７０％）の該トシレート塩を含有し、これは錠剤あたり該対応する遊離塩基４００ｍｇ（６１２．５／１．５３）に相当する。従って、該トシレート塩の錠剤４錠が標的の一日用量１６００ｍｇ遊離塩基を達成するために患者投与される必要がある。従って、該トシレート塩が薬物として使用される場合、患者はより多くの錠剤を摂取する必要があるだけでなく、はるかに大きい錠剤を飲み込む必要があり、これは子供やおよび老人の患者には困難であり得る。
【００５２】
該トシレート塩と比較して本発明の共結晶の塩ファクターの値は低いため１日に必要とされる該共結晶を含有する錠剤数は減る。例えば、該グルタル酸共結晶を含有する錠剤の重さが９３０ｍｇであるとき、そのような錠剤は重さ６１２．５ｍｇ（９３０ｍｇの７０％）の該グルタル酸共結晶を含む。従って、各錠剤中の該遊離塩基の量は５３３．７ｍｇ（６１２．５／１．２２）である。上記の議論からグルタル酸共結晶を含有する錠剤は、該対応するトシレート塩を含有する錠剤と比較して、より多量の該遊離塩基（すなわち、遊離塩基重さｍｇ／単位用量）を含有することが明かである。従って、テーブル３に示されるとおり、該標的の一日用量１６００ｍｇを達成するのに必要とされる該共結晶の錠剤は少なくなる。
テーブル３
【表３】
2018502090.tif 000007
医薬組成物および投与量
【００５３】
本願発明はまた、本発明の共結晶の医薬製剤および疾患状態（例えばがん、ウイルス感染、または不適切な免疫機能に関連する疾患）の治療のための当該医薬製剤の使用に関する。従って、一つの態様において、本願発明は式Ｉ化合物または医薬的に許容される立体異性体、互変異性体、または溶媒和物および少なくとも１つの共結晶形成体を含む共結晶ならびに医薬的に許容される賦形剤を含む医薬製剤に関する。
【００５４】
本発明にかかる組成物は、一般に受け入れられている医薬配合のプラクティスに従って、さらに１またはそれ以上の付加的な治療薬、医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、安定剤、乳化剤、保存料、着色料、緩衝剤、または香味料（flavor imparting agents）を含有しうる。適当な賦形剤は薬学分野の当業者によく知られており、適当な賦形剤の例がこれらに限定されるものではないが、ここに挙げられる。ある特定の賦形剤が医薬組成物または製剤に組み入れるのに適するかどうかは、当該技術分野でよく知られたさまざまなファクターに、これに限定されるものではないが、例えば当該製剤の患者への投与方法に異存する。例えば、経口製剤（例えば錠剤）は非経口製剤への使用には適さない賦形剤を含み得る。ある特定の賦形剤が適合するかどうかはまた、該製剤中の特定の有効成分に依存しうる。
【００５５】
本発明の共結晶および医薬的に許容される担体を含む単一単位投与剤に適する医薬組成物はまた本開示の範囲内に包含される。本願発明の医薬製剤および単一単位投与剤は、経口投与、粘膜投与（舌下、口腔、直腸、鼻、または膣が挙げられる）、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、ボーラス投与、動脈内投与、または静脈投与が挙げられる）、経皮投与、または局所投与に適しうる。本発明にかかる共結晶の無菌製剤もまた考慮される。
【００５６】
医薬製剤および単一単位投与剤は、さまざまな量の該共結晶、その医薬的に許容される塩、または互変異性体を含み得る。例えば、該医薬製剤および単一単位投与剤中の該共結晶の量は約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。ある製剤および単一の製剤に関し、該共結晶の量は約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【００５７】
本願発明の共結晶を含む無水の医薬組成物もまた本開示の範囲内に含まれる。水分および／または湿度は医薬製剤の製造、保存、取り扱い、パッケージング、輸送および使用の際に常に直面するので、該製剤分野の当業者に知られた無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を用いる、本開示の無水の医薬組成物および製剤を製造する方法は本開示の範囲内である。
【００５８】
該共結晶の医薬組成物の無水の特性を維持するために、本発明にかかる医薬製剤はその無水の特性を維持する条件下でパッケージングおよび保存されるべきである。従って、無水の組成物は好ましくは水への曝露を防ぐことが知られている材料を用いてパッケージングされる。適当なパッケージングの例には、これらに限定されないが、密閉シールの金属箔、プラスティック、単位用量の容器（例えばバイアル）、ブリスター・パック、およびストリップ包装が挙げられる。
【００５９】
本願発明の共結晶は不適切な細胞分裂、不適切な免疫機能に関連する疾患または障害、またはウイルス感染の治療剤である。治療が必要な患者または対象に本発明の共結晶の１またはそれ以上の治療有効用量を投与することよって達成されうる。
経口製剤
【００６０】
経口使用に適する当該発明の組成物は医薬組成物の製造の分野において知られるいずれかの方法によって調整されうる。一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を参照。当該経口製剤は少なくとも１つの賦形剤と緊密に混合された所定量の有効成分を含有する。本発明の共結晶の医薬的に洗練されていて口当たりの良い調剤物を得るために、液体製剤は甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤をさらに含有することができる。
【００６１】
本願発明の適当な経口組成物には、これらに限定されないが、錠剤、トローチ、ローゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末剤または顆粒剤、乳濁液、硬または軟カプセル、シロップまたはエリキシル剤が挙げられる。投与、保存、およびパッケージングがしやすいでの、錠剤、およびカプセルは最も有利な経口単位投与剤であり、それらには固体賦形剤が使用される。必要に応じて、錠剤は標準的な水性または非水性技術によってコートされることができる。一般に、医薬組成物および製剤は、有効成分、すなわち該共結晶を液体担体、微粉化された固体担体、または両方と均一および緊密に混合し、その後必要であれば望みの見栄えに成形することによって調製される。
【００６２】
錠剤組成物の関し、該有効成分は毒性のない医薬的に許容される賦形剤と混合されて錠剤の製造に使用される。当該賦形剤の例には、これらに限定されないが、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）；結合剤（例えばスターチ、ゼラチン、ゴム（例えばアラビアゴム））；および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）が挙げられる。本願発明の医薬組成物に使用される結合剤または増量剤は通常、医薬組成物または製剤の約５０〜約９９重量％で含まれる。
【００６３】
錠剤は圧縮または成形（molding）によって製造されることができ、および無コートであってよく、または消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それにより望ましい時間にわたって持続的な治療効果を得るためにコートされていてもよい。時間遅延物質の例には、これらに限定されないが、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００６４】
経口用製剤は、該有効成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合される硬ゼラチンカプセルであることができ、または該有効成分が水またはオイル媒体（例えばピーナッツオイル、液体パラフィンまたはオリーブ油）と混合される軟ゼラチンカプセルであることができる。
【００６５】
錠剤およびカプセルに加えて、本願発明の共結晶は経口投与に適するシロップ、懸濁液、分散性粉末剤および顆粒剤として製剤化されうる。経口懸濁液として製剤化されるとき、該医薬組成物は分散剤または湿潤剤、例えば天然のホスファチド（例えばレシチン）、またはアルキレンオキサイドと脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、もしくは脂肪酸の部分エステルとの縮合生成物を含むことができる。そのような生成物の例として、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、ヘキシトール（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。経口懸濁液はまた１またはそれ以上の保存料、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１またはそれ以上の着色剤、１またはそれ以上の香味剤、および１またはそれ以上の甘味剤（例えばスクロースまたはサッカリン）を含み得る。シロップおよびエリキシル剤はまた甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースでもって製剤化されうる。これらの製剤は鎮痛薬、保存料、香味料および着色剤を含んでいてもよい。
遅延放出性製剤
【００６６】
本発明の共結晶は当該技術分野の当業者によく知られる制御放出法または送達手段によって投与されることができる。これらに限定されないが、例として、米国特許：３，８４５，７７０；３，９１６，８９９；３，５３６，８０９；３，５９８，１２３；および４，００８，７１９、５，６７４，５３３、５，０５９，５９５、５，５９１，７６７、５，１２０，５４８、５，０７３，５４３、５，６３９，４７６、５，３５４，５５６、および５，７３３，５６６（これらは各々引用することによって本願明書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。このような製剤は１またはそれ以上の有効成分の持続放出または制御放出を提供するために使用されることができ、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性の膜、浸透圧性のシステム、多層皮膜、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはそれらの組合せを用いて様々な割合の放出特性が提供される。適当な制御放出製剤は当該製剤分野の当業者に知られている。従って、当該開示は、経口投与に適する単一単位投与剤、例えば、これらに限定されないが、制御放出に適している錠剤、カプセル、ジェルカプセル、およびカプレットを包含する。
【００６７】
全ての制御放出医薬製品は、非制御放出のもの以上であるように薬物治療を改良するという共通の目的を持っている。理想的には、制御放出製剤の医学的治療における使用は、予め決められた時間間隔（例えば２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、または２−１２箇月、３−１２箇月、４−１２箇月、５−１２箇月、６−１２箇月、７−１２箇月、８−１２箇月、９−１２箇月、１０−１２箇月、１１−１２箇月、または１年）で既知量の該活性成分が投与されることを特徴とする。制御放出製剤の利点として、該薬物の活性の延長、投与頻度の減少、および患者の服薬順守の向上が挙げられる。加えて、制御放出製剤は作用の開始時間または他の特性、例えば該薬物の血中濃度に影響を及ぼすために使用されることができ、その結果副作用（例えば、有害影響）の発生に影響することができる。
【００６８】
大抵の制御放出製剤は所望の治療効果を迅速に生み出す薬物（有効成分）量を最初に放出し、および徐々におよび持続的に同一または別量の薬物を放出して、長期間にわたって同一レベルの治療または予防効果を維持するように設計されている。体内でこの一定濃度の薬物を維持するために、該薬物は、代謝されかつ体から排出される薬物の量を置き換える速度で、製剤から放出されなければならない。有効成分の制御放出は、これらに限定されないが例えば、ｐＨ、温度、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは化合物といった様々な条件によってによって刺激され得る。
非経口製剤
【００６９】
非経口製剤は様々な方法、これらに限定されないが例えば、皮下投与、静脈投与（ボーラス投与を含む）、筋肉内投与、および動脈注射、によって患者に投与されることができる。それらの投与は通常患者の汚染に対する自然防御能を回避してしまうので、非経口製剤は無菌であるかまたは患者に投与される前に滅菌できることが好ましい。非経口製剤の例には、これらに限定されないが、例えば、注射用の溶液、注射用に医薬的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁されて使用される乾燥および／または凍結乾燥された生産物（再構成可能な粉末）、注射用の懸濁液、およびエマルションが挙げられる。
【００７０】
本開示の非経口製剤を提供するために使用されることができる適当なビヒクルは当業者に周知である。これらに限定されないが、例として：注射ＵＳＰ用水；水性ビヒクル（これらに限定されないが例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、ブドウ糖注射、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射、および乳酸リンゲル注射）；水混和性ビヒクル（これらに限定されないが例えば、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール；および非水性ビヒクル（これらに限定されないが例えば、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジル）が挙げられる。非経口製剤は１またはそれ以上の該医薬有効成分または本発明にかかる共結晶の溶解性を向上する化合物を含むことができる。
キット
【００７１】
本開示は本発明の共結晶を含む１またはそれ以上の容器を含み、任意に医薬的に許容される担体を含む１またはそれ以上の容器を含み得る医薬パックまたはキットを提供する。他の実施形態において、本開示は本発明の共結晶を含む１またはそれ以上の容器、付加的な治療薬を含む１またはそれ以上の容器、および医薬的に許容される担体を含む１またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
【００７２】
本願発明のキットまたはパックは、本発明にかかる共結晶を投与に適する医薬組成物にするのに必要な１またはそれ以上の医薬成分を含む１またはそれ以上の容器または小包、およびデバイス（例えばｆ本発明にかかる共結晶の医薬組成物を投与するための１またはそれ以上の注射器）を含み得る。
【００７３】
キットまたはパックは送達および生体内分布を改良するように親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を変えるために医薬担体および化合物の浸透圧を調整する緩衝剤、化合物を含み得る。任意にキットまたはパックに含まれる容器に付随して、通知は薬事または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定された書式であることができ、その通知はヒト投与に関する製造、使用または販売の当該機関による承認を反映する。
併用療法
【００７４】
一つの態様において、治療的に有効な用量の本願発明の共結晶は治療的に有効な用量の組合せ薬物（付加的な治療薬）と併せて治療が必要な患者または対象に投与され得る。当業者は該共結晶の１回量は別々に、例えば該組合せ薬物の投与前または投与後の数秒内、数分内、数時間内に投与されても、当該２つが一緒に投与されてもよいことを認識するであろう。該付加的な治療薬として、これらに限定されないが、抗生物質、制吐剤、抗鬱剤、および抗真菌薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗がん剤、免疫調節剤、α−インターフェロンｓ、β−インターフェロンｓ、ペグ化α−インターフェロン、ペグ化β−インターフェロン、リバビリン、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、またはトール受容体様モジュレーターが挙げられる。
【００７５】
上記の治療薬に加えて、本願発明は、共結晶と治療的有効量のポリメラーゼ阻害剤、例えば、ラミブジン、アデホビル、エンテカビルおよびテルビブジンとの併用を含む、併用療法レジメンを包含する。３つの薬物の組合せを含む治療レジメンもまた本発明の範囲に包含される。例えば、そのようなレジメンは治療的に有効な用量の該共結晶、ポリメラーゼ阻害剤およびインターフェロンまたはペグ化インターフェロンの投与を包含することができる。
【００７６】
組成物に含まれる各化合物またはその医薬的に許容される塩または互変異性体のパーセンテージもまた変動することができる。例えば、いくつかの実施形態において、該組成物は該共結晶または医薬的に許容される塩または互変異性体を約１％〜約９８％（重量／重量）の範囲を含むことができる。該組成物は本発明にかかる共結晶またはその医薬的に許容される塩または互変異性体を約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１５％〜約６０％、約２０％〜約５０％および約３０％〜約４０％（重量／重量）の範囲で含むことができる。
【００７７】
該第２の治療薬として抗生物質が使用される場合、例示的な化合物としてこれらに限定されないが、
マクロライド系薬（例えば、トブラマイシン（Tobi（登録商標）））、
セファロスポリン（例えば、セファレキシン（Keflex（登録商標））、セフラジン（Velosef（登録商標））、セフロキシム（Ｃｅｆｔｉｎ（登録商標））、セフプロジル（Cefzil（登録商標））、セファクロル（Ceclor（登録商標））、セフィキシム（Suprax（登録商標））またはセファドロキシル（Duricef（登録商標）））、
クラリスロマイシン（例えば、クラリスロマイシン（Biaxin（登録商標）））、
エリスロマイシン（例えば、エリスロマイシン（EMycin（登録商標）））、
ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ（V-Cillin K（登録商標）またはPen Vee K（登録商標）））または
キノロン（例えば、オフロキサシン（Floxin（登録商標））、シプロフロキサシン（Cipro(登録商標))またはノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、
アミノグリコシド抗生物質（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート（undecylenate）、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン）、アンフェニコール抗生物質（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン抗生物質（例えば、リファミドおよびリファンピン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、ビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリンｓ（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム）、セファマイシン（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム（tigemonam））、
オキサセフェム系薬（例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム）、ペニシリン系薬（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸（benzylpenicillinic acid）、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェベニシリン（fenbenicillin）、フロキサシリン、ペナムクシリン（penamccillin）、ペネタメートヨウ化水素酸塩（penethamate hydriodide）、ペニシリンｏ−ベネタミン（penicillin o-benethamine）、ペニシリン０、ペニシリンＶ、ペニシリンＶ  ベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリン、およびフェネチシリンカリウム（phencihicillin potassium））、リンコサミド系薬（例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン）、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンドゥラシジン（enduracidin）、エンビオマイシン、テトラサイクリン系薬（例えば、アピサイクリン（apicycline）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン）、２，４−ジアミノピリミジン系薬（例えば、ブロジモプリム）、ニトロフラン系薬（例えば、フラルタドン（furaltadone）、および塩化フラゾリウム（furazolium chloride））、キノロンおよびそのアナログ（例えば、シノキサシン、、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパフロキサシン（grepagloxacin））、スルホンアミド系薬（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド（benzylsulfamide）、ノプリルスルファミド（noprylsulfamide）、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン（sulfachrysoidine）、およびスルファシチン（sulfacytine））、
スルホン系薬（例えば、ジアチモスルホン（diathymosulfone）、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン（solasulfone））、
サイクロセリン、ムピロシン、およびツベリンが挙げられる。
【００７８】
本発明にかかる共結晶は他の抗ウイルス剤も組み合わせて投与または製剤化されることができる。有用な抗ウイルス剤として、これらに限定されないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシドアナログが挙げられる。該抗ウイルス剤として、これらに限定されないが、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、コンビビル、アバカビル、アデホビル、ジピボキシル、シドホビル、リバビリンおよびそのアナログ、、レボビリン（levovirin）、ビラミジン、イサトリビン（isatoribine）、ピルフェニドン、またはそのアナログ、アシクロビル、（gangcycloviｒ）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、該α−インターフェロン類；β−インターフェロン類；クレブジン（clevadine）、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
【００７９】
付加的な治療薬として、腫瘍壊死因子アンタゴニスト、例えばエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブ）、チモシン−．アルファ．（Ｚａｄａｘｉｎ．ＴＭ．）、インターフェロン受容体アゴニスト、α−グルコシダーゼ阻害剤、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、ＮＳ３ヘリカーゼ阻害剤、ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤（例えばＧＳ−９１９０、ＭＫ−３２８１、ＶＣＨ−７５９（ＶＸ−７５９）、ＶＣＨ−９１６、ＡＢＴ−３３３、ＢＭＳ−７９１３２５、ＰＦ−００８６８５５４、ＩＤＸ−１８４、Ｒ１６２６、ＰＳＩ−７８５１、ＶＣＨ−２２２（ＶＸ−２２２）、ＡＢＴ−０７２、およびＢＩ２０７１２７）およびＮＳ５Ａタンパク質の阻害剤（例えばＢＭＳ−７９００５２、Ａ−８３１、およびＡＺＤ２８３６）を挙げることができる。
【００８０】
本発明にかかる共結晶は、ウイルス性ＮＳ３プロテアーゼを阻害する剤、例えば、ＶＸ−９５０およびＳＣＨ５０３０３４、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）修飾薬（例えばＩＭＯ−２１２５、およびＰＦ−０４８７８６９１）；
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ阻害剤；リボザイム（例えばＨｅｐｔａｚｙｍｅ（商標）およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、これらはＨＢＶタンパク質配列を補完し、ウイルスのコアタンパク質の発現を阻害する）と組み合わせて投与または製剤化されることができる。
【００８１】
別法として、本願発明の共結晶は免疫調節剤と組み合わせて投与または製剤化されることができる。免疫調節剤として、これらに限定されないが、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスパガリン、ブレキナル、マロノニトリロアミンデ（malononitriloaminde）（例えば、レフルノミド（leflunamide））、Ｔ細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーター、ペプチド模倣薬、および抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖｓ、ＳｃＦｖｓ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメントまたはエピトープ結合フラグメント）、核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子および３重らせん体）、低分子、有機化合物、および無機化合物が挙げられる。Ｔ細胞受容体モジュレーターの例には、これらに限定去されないが、抗Ｔ細胞受容体抗体（例えば、抗ＣＤ４抗体（例えば、ｃＭ−Ｔ４１２（Boehringer）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１（登録商標）（ＩＤＥＣおよびＳＫＢ）、ｍＡＢ  ４１６２Ｗ９４、オルソクローンおよびＯＫＴｃｄｒ４ａ（Janssen-Cilag））、抗ＣＤ３抗体（例えば、ヌヴィオン（Product Design Labs）、ＯＫＴ３（Johnsｏn ＆ Johnson）、またはリツキサン（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５抗体（例えば、抗ＣＤ５  リシン結合イムノコンジュゲート）、抗ＣＤ７抗体（例えば、ＣＨＨ−３８０（Novartis））、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、CAMPATH 1H（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、ザネリン（Genentech））、抗Ｂ７抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ））、ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン、およびｔｏｌｌ受容体様（ＴＬＲ）修飾薬が挙げられる。サイトカイン受容体モジュレーターの例には、これらに限定されないが、可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＴＮＦ−α受容体の細胞外領域またはそのフラグメント、ＩＬ−１β受容体の細胞外領域またはそのフラグメント、およびＩＬ−６受容体の細胞外領域またはそのフラグメント）、サイトカインまたはそのフラグメント（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ）、抗サイトカイン受容体抗体（例えば、抗ＩＦＮ受容体抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（例えば、Zenapax（Protein Design Labs））、抗ＩＬ−４受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＩＬ−１０受容体抗体、および抗ＩＬ−１２受容体抗体）、抗サイトカイン抗体（例えば、抗ＩＦＮ抗体、抗ＴＮＦ−α  抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体（例えば、ＡＢＸ−ＩＬ−８（Abgenix））、および抗ＩＬ−１２抗体）が挙げられる。
【００８２】
付加的な治療薬と組み合わせて投与されるとき、該共結晶および該他の治療薬は相加的に、または、より好ましくは相乗的に作用することができる。一つの実施形態において、本開示の共結晶を含む組成物は別の治療薬の投与と一斉に投与され、当該別の治療薬は同一組成物の一部であっても、または本開示の化合物を含む組成物とは違う組成物にあってもよい。別の実施形態において、該共結晶は別の治療薬の前にまたはそれに引き続いて投与されうる。また別の実施形態において、本開示の共結晶は別の治療薬（特に抗ウイルス剤）でこれまでに治療を受けたことがない、または現在は受けていない患者に投与される。
【実施例】
【００８３】
Ｉ．適合性試験
本発明の共結晶の医薬的に許容される賦形剤との適合性を典型的な適合性アッセイ（ＣＯＭＰＡＳＳ）により試験をした。この方法に従って、本発明にかかるグルタル酸共結晶を単一の医薬賦形剤と物理的に混合して二成分混合物を得るか、または本発明にかかるグルタル酸共結晶を２またはそれ以上の賦形剤を含む混合物と物理的に混合することによって（三成分混合物）、賦形剤適合性が調査された。三成分混合物中の式Ｉ化合物の重量％は５０％であったのに対して、各二成分混合物は式Ｉ化合物を５重量％含有した。テスト混合物を、５０℃で４週間保存するか、または温度４０℃および相対湿度７５％で４週間保存した。
【００８４】
本発明の共結晶は医薬組成物の製造に通常使用される増量剤および／または賦形剤に適合する。テーブル４は本発明にかかる式Ｉ化合物のグルタル酸共結晶の三成分混合物の適合性試験の結果を示す。テーブル５は式Ｉ化合物の該トシレート塩の三成分混合物を使った同様の試験の結果を示す。
【表４】
2018502090.tif 000008
【表５】
2018502090.tif 000009
【００８５】
本発明にかかるグルタル酸共結晶または式Ｉ化合物の該トシレート塩を含む三成分混合物は、下記の賦形剤を下記のテーブル６に示される割合で含有した。
テーブル６
【表６】
2018502090.tif 000010
【００８６】
適合性試験の結果、テーブル４および５は、本発明にかかるグルタル酸共結晶は医薬的に許容される製剤の製造の間に通常使用される医薬賦形剤および増量剤とよりよい適合性があることを明確に示した。しかし、対応するトシレート塩は通常使用される賦形剤および／または増量剤に対し不安定であることが認められた。
【００８７】
例えば、グルタル酸共結晶および医薬増量剤または賦形剤を含む三成分混合物を５０℃で４週間、または４０℃／７５％相対湿度で４週間保存したとき、式Ｉ化合物はほんの少ししか分解しなかった。典型的な分解の割合の範囲は５０℃で約０．０２％〜０．０９８％であった。湿度の存在は本発明にかかる共結晶の三成分混合物の適合性および／または安定性に不利な影響を与えず、４０℃および７５％相対湿度の存在下、式Ｉ化合物の分解の割合に増加はなかった。
【００８８】
対照的に式Ｉ化合物の該トシレート塩および２またはそれ以上の医薬増量剤または賦形剤を含む三成分混合物の式Ｉ化合物の分解の割合は、より大きかった。水分の存在が該トシレート塩を含有する三成分混合物の適合性を損なうことは明白である。テーブル５に示されるとおり、湿度の存在は該三成分混合物の分解を増加する。該トシレート塩に関し、湿度の存在下で、三成分混合物２は、同様の本発明のグルタル酸共結晶の三成分混合物の分解が０．０２％であったのに対して、約１０％分解を示した。
【００８９】
これらのデータは明白に本発明にかかるグルタル酸共結晶は、該トシレート塩と比較して、医薬製剤の製造に通常使用される賦形剤および増量剤に対してより適合性があることを示す。
ＩＩ．  安定性試験
【００９０】
該共結晶のテストサンプルを様々な温度および様々な相対湿度で１〜３箇月間保存することによって、固体状態の安定性試験を行った。安定性は該テスト共結晶のウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）分析によって判断した。該共結晶のテストサンプル中のＡＰＩの分解の割合は下記の様に計算した：
％分解＝（標準試料のＡＰＩの％ＡＵＣ−テストサンプルのＡＰＩの％ＡＵＣ）／（標準試料のＡＰＩの％ＡＵＣ）×１００
【００９１】
本願発明の共結晶は本試験に使用された温度範囲にわたってかなり安定である。湿度の存在下（７５％相対湿度（Ｒ．Ｈ．））での保存は本発明の共結晶の分解の割合を増加しなかった。特定の理論に帰するものではないが、結晶化度は本願発明の共結晶の安定性に寄与しているかもしれない。テーブル７は広範囲の温度にわたっての、また７５％相対湿度・４０℃下での本願発明の式Ｉグルタル酸共結晶の安定性データを示す。
テーブル７
【表７】
2018502090.tif 000011
【表８】
2018502090.tif 000012
【００９２】
テーブル７に示されるとおり、式Ｉ化合物の該グルタル酸共結晶は広範囲の保存温度でおよび湿度の存在下で優れた安定性を示す。
テーブル８に示されるとおり、結晶化度は式Ｉ化合物の遊離塩基の非晶質形を式Ｉ化合物の結晶形と比較することによって示された安定性の向上に寄与するという仮説をさらに支持する。
上記の結果より、該結晶形は、対応する非晶質形と比較して、特に水分の存在下で、分解に対してより安定であるので、結晶化度は安定性に重要な影響を持つことが示唆される。従って、結晶化度はまた本発明の共結晶のもつ改善された安定性に寄与しているかもしれない。
【００９３】
本発明の共結晶の持つ改善された安定性はメリットを有する。より良い安定性は、特に該共結晶の商業的スケールの製造および該共結晶の医薬製剤の商業的スケールの製造の間の該共結晶のより良いハンドリング、および使用のし易さを可能にし得る。向上した安定性はまた、固体医薬組成物（例えば該共結晶を含有する錠剤）の保存可能期間の増加に寄与しうる。
【００９４】
該結晶形は溶液中、すなわち共結晶が溶媒に溶解したときには保持されないので、溶液安定性への影響に関与するのは式Ｉ化合物と該溶媒との相互作用のみである。従って、該共結晶、該トシレート塩、または該遊離塩基の該結晶形の溶液は、同一実験条件下では同等な溶液安定性を示すことが予想される。
ＩＩＩ．薬物動態についての製剤の開発＆該共結晶の毒性学的試験
【００９５】
試験により、該共結晶は水および緩衝化溶媒に溶解することが示された。これらの試験により、該溶媒のｐＨは該共結晶の溶解性に影響することが明らかになった。溶解性は、低ｐＨ、例えばｐＨ１．０またはｐＨ２．０の緩衝液では最も大きく、および緩衝液のｐＨが高まるにつれ、該溶解性は低下した。グルタル酸共結晶のｐＨ１．０の緩衝液のＵＰＬＣ分析は、６０ｍｇより多くの式Ｉ化合物の遊離塩基体が緩衝液ミリリットルあたりに存在することを示す。しかしながら、ＵＰＬＣ分析によれば、ｐＨ７．０緩衝液のミリリットルあたりにははるかに少ない量の式Ｉ化合物の遊離塩基体約２２ｍｇが存在する。興味深いことに、恐らく式Ｉ化合物の両性イオン体の形成に起因して、ｐＨ４．０の緩衝液で溶解性が最も低く、約８ｍｇの遊離塩基体が該緩衝液ミリリットルあたりに存在する。
【００９６】
室温で２４時間放置した後の分析では該緩衝化共結晶溶液に分解はなかった。該トシレート塩とは違い、本発明の共結晶の溶液中、遺伝毒性の副産物は形成されなかった。多形スクリーニング（Polymorph screening）により更に、固体状態フォームＡと特徴づけられた例示グルタル酸共結晶に関し単一の多形が示された。
Ａ．  薬物動態
【００９７】
試験はグルタル酸共結晶の薬物動態（ＰＫ）を式Ｉ化合物のトシレート塩のＰＫと比較するために行われた。３％Blanose 7LF PM（保存料なし）溶液を使用して、グルタル酸共結晶およびトシレート塩を調製した。カニクイザルにおける薬物動態学的試験の結果は、各化合物の経口投与後、グルタル酸共結晶の血漿中濃度は対応するトシレート塩よりも高いことを示す。
【００９８】
この試験において、各化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でカニクイザル経口投与した。投与後、０分、６０分、１２０分および１８０分に各試験対象から血液を採取した。全血から血漿を分離し、各血漿サンプルの一部を７０％エタノールを加えることによって変性した。変性したタンパク質を遠心分離によってペレットにし、上清を集めて、乾燥窒素ガスを流して乾燥した。得られた該ペレットを０．１％ギ酸を含有する水で再構成し、該再構成された混合物をＨＳＳ−Ｔ３（高強度シリカ）カラムまたはＹＭＣ  ＴｒｉａｒｔＣ−１８カラムを用いるＵＰＬＣで分析した。０．１％  ＨＣＯＯＨ含有水（移動相Ａ）および０．１％  ＨＣＯＯＨ含有アセトニトリル（移動相Ｂ）の混合を用いるグラディエント溶離を薬物動態（ＰＫ）試料の分析に使用した。
【００９９】
図１に示されるとおり、グルタル酸共結晶の経口投与は、循環血漿において高濃度の共結晶を提供した。実際のところ、グルタル酸共結晶の経口投与後測定された式Ｉ化合物の脱アセチル化型の血漿中濃度は、トシレート塩の経口投与後に測定された式Ｉ化合物の脱アセチル化型の血漿中濃度と比較して、約２倍の高さであった。
【０１００】
該共結晶の経口投与後の高濃度な式Ｉ化合物の該脱アセチル化型は、高濃度な活性医薬種、すなわち、式Ｉ化合物の脱アセチル化、酸化型ももたらす。スキーム１を参照。式Ｉの化合物は二重のプロドラッグであり、下記のスキーム１に示されるように、酵素的に生物学的に活性な医薬５−アミノ−３−（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−３ａ，７ａ−ジヒドロチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７（３Ｈ，６Ｈ）−ジオンに変換される。
スキーム１
【化３】
2018502090.tif 000013
【０１０１】
対照的に、対応するトシレート塩１０ｍｇ／ｋｇを経口投与されたサルでは式Ｉ化合物の脱アセチル化型および生物学的に活性な種の血漿濃度は低い。いくつかのファクターがプロドラッグおよび活性種の血漿濃度の違いの原因となり得る。特定の理論に縛られることなく、対応するトシレート塩と比較して、共結晶の安定性は高く、生体媒質における共結晶の溶解性は高く、および肝臓および腎臓による共結晶のクリアランス速度が低いことがグルタル酸共結晶製剤の経口投与に脱アセチル化および活性種の血漿濃度が高いことに起因しているかもしれないというのが一つの仮説である。
【０１０２】
該ＰＫ結果に基づいて、本発明の共結晶はがん、ＨＢＶ感染を含むウイルスの感染を標的にした治療の開発のためのより良い候補治療剤であると考えられる。
Ｂ．  経口ＧＬＰ毒性学的試験
【０１０３】
３つのビヒクル、Blanose 7LF PM（カルボキシルメチルセルロースナトリウム）（保存料なし）、Pluronic F60、およびポリビニルアルコールを本発明の共結晶のための医薬担体として試験した。該共結晶は良好な水溶解性を示したため、界面活性剤は共結晶含有医薬製剤には加えなかった。
【０１０４】
本発明の共結晶を様々な量（濃度）で含有する製剤を用いて毒性学的試験を行った。簡潔に言えば、該遊離塩基（式Ｉ化合物）１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬを含有する製剤が得られるように、既知量のグルタル酸共結晶を各担体に溶解した。各試験製剤を３等分に分け、室温、２−８℃および−２０℃で保存した。７日間保存した後、含有量および純度についてはウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって、および粒子径については光学顕微鏡によって、各製剤を分析した。各製剤のｐＨも測定した。
【０１０５】
該製剤のｐＨは担体によって影響されず、７日間の試験期間にわたって同一であった。使用する担体に依存して、ｐＨの測定値は試験製剤について全ての保存温度で４．０〜５．６の範囲であった。全ての試験製剤である程度の分解が認められたが、分解の割合は医薬的に許容される範囲内であった。しかしながら、他の２つの担体を用いて作成した製剤と比較して、Blanose 7LF PMを含有する製剤は分解の割合が最も高かった。
【０１０６】
テーブル９に示すとおり、二重のプロドラッグ（式Ｉ化合物グルタル酸共結晶）から式Ｉ化合物の単一のプロドラッグ（非アセチル化）型への脱アセチル化が試験製剤の多くで認められた。
テーブル９
【表９】
2018502090.tif 000014
【０１０７】
脱アセチル化はBlanose 7LF PM製剤で多く認められ、およびPluronic F60製剤では少なかった。これらの結果は、担体の性質が、該活性医薬の分解速度と分解の程度、認められる沈降の程度、および保存後の固体ケーキ様物質の形成に影響しうることを示す。
堆積および固体ケーキ様産物の形成がＰＶＡ製剤およびPluronic F60製剤で多く認められた。ＰＶＡ製剤で形成された堆積物とは違って、Pluronic F60製剤で形成された堆積物は震とうすることで容易に分散できた。堆積物形成はBlanose製剤では相対的に低かった。しかしながら、Blanose製剤で固体ケーキが一旦形成されると、該固体は撹拌しても震とうしても容易に懸濁できなかった。
【０１０８】
室温で１箇月の保存した後、ハンドリングが容易であり、長期保存の後でさえ安定性は増加していたので、１０％Pluronic F60製剤をインビトロおよび／またはインビボ効力試験の担体として選択した。
ＩＶ．  製造方法
【０１０９】
式Ｉ化合物および少なくとも１つの共結晶形成体を含む共結晶は該共結晶形成体の溶液を式Ｉ化合物の溶液と混ぜ合わせることによって合成されることができる。具体的には、当該２つの溶液を、共結晶化を促進する共結晶形成体の式Ｉ化合物に対するモル比で混ぜ合わせる。
【０１１０】
一つの本発明にかかる方法の実施形態に従って、共結晶形成体および式Ｉ化合物をモル比１：２で混ぜ合わせる。そのように得られた共結晶化溶液を過飽和にし、共結晶の形成を開始させる。共結晶化溶液を過飽和し、および共結晶形成を開始するために、冷却、溶媒の蒸発、または抗溶媒（anti-solvent）の添加が使用されうる。式Ｉ化合物および少なくとも１つの共結晶形成体を含む共結晶は、ろ過または化学分野で知られる他の適当な方法によって共結晶化溶液から単離されうる。
【０１１１】
共結晶の形成は式Ｉ化合物と共結晶形成体間の接触を必要とするので、一つの実施形態において、式Ｉ化合物および共結晶形成体は一緒にすりつぶされ、得られた固体混合物を融解（melting）して、冷却して共結晶を形成させる。別法として、結晶形成体は式Ｉとの接触の前に融解されることができ、得られた混合物は共結晶化することができる。本発明の共結晶は、共結晶化を促進するのに適当な条件下で、式Ｉ化合物の溶媒和物を共結晶形成体と混ぜ合わせることによって、または式Ｉ化合物を共結晶形成体の溶媒和物と混ぜ合わせることによって得ることができる。
【０１１２】
共結晶の存在についての該固体混合物の試験は当該技術分野で知られる従来の方法によって行われ得る。例えば、結晶化混合物中の共結晶の存在を調べるために粉末Ｘ線回折法を使用することは便利であり、一般的である。類似の方法で使用される他の方法には、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、熱重量分析法（ＴＧＡ）およびラマン分光法が挙げられる。単一の結晶Ｘ線回折法および固体ＮＭＲ法が共結晶構造を特定するのに特に有用である。
【０１１３】
図２は例示共結晶形成体として式Ｉ化合物およびグルタル酸を含む共結晶の合成を示す。比較するために、図２はまた、５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテートのｐ−トルエンスルホン酸塩の製造方法を示す。示されるとおり、該合成方法は共結晶の商業的生産として操作上シンプルで、ロバストで、効率的で、およびスケーラブルである。さらに、該方法は費用効率が高く、良好な収率で共結晶の製造が可能である。
【０１１４】
簡潔に言えば、デオキシアデノシン（２）は酸性条件下で脱プリン化される。一つの実施形態において、脱プリン反応は化合物２を無水酢酸、酢酸カリウムおよび氷酢酸と接触させ（３Ｒ、５Ｓ）−５−（メチルアセトキシテトラヒドロフラン）−２、３−ジイル  ジアセテート（３）を形成することにより達成される。
【化４】
2018502090.tif 000015
ついで化合物３を５−アミノ−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン（４）  ［Wolfe et al. J. Org. Chem. 1997, 62, 1754-1759の方法に従って調製］とテトラメチルシリル  トリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）の存在下で結合させ化合物５を得る。化合物３と化合物４の結合ための酸触媒の例としてＴＭＳＯＴｆが挙げられるが、他の酸触媒、例えばＡｌＣｌ３、ＳｎＣｌ４およびＴｉＣｌ４をシリル化試薬（silating reagent：例えばＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（「ＢＳＡ」）またはトリメチルシリルクロリド）と共に、を使用することもできる。通常、化合物３および４の化学量論量が当該カップリング反応に使用される。しかしながら、わずかに超過量の５−アミノ−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン（４）を化合物５の当該合成に使用することができる。ある態様に従って、５−アミノ−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン（４）の化合物３に対するモル比の範囲は、約１．２：１〜約１０：１、約１．２：１〜約９：１、約１．２：１〜約８：１、約１．２：１〜約７：１、約１．２：１〜約６：１、約１．２：１〜約５：１、約１．２：１〜約４：１、約１．２：１〜約３：１、または約１．２：１〜約２：１である。
【０１１５】
該５−メチルアセトキシ基の選択的脱アセチル化は化合物５をリポザイム４３５とインキュベートすることによって達成される。
【化５】
2018502090.tif 000016
酵素触媒による脱アセチル化は該酵素の緩衝液を化合物５の有機溶液に加えることによって行われる。別法として、該酵素は固体支持体と共有結合していてもよく、選択的脱アセチル化は該固体支持酵素を化合物５の有機溶液と接触させることによって達成される。固体支持酵素の使用は、該酵素の効率的な再利用を可能とし、反応時間を短縮するというメリットがある。
【０１１６】
化合物５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート（６）は取扱いが難しい。反応混合物からの反応溶媒の蒸発または化合物６の沈降は難しく、さらに、共結晶形成には不適な順最適な産物を生み出す。本開示の方法は、反応混合物が純度の高い状態の化合物６を共結晶を引き起こすのに適する溶媒混合物中に含有するため、化合物６の単離の必要性を排除する。従って、本発明の共結晶は、化合物６を含有する反応混合物を共結晶形成体（固体）または共結晶形成体の溶液と接触させることによって容易に製造することができる。
【０１１７】
一つの実施形態に従って、化合物６と共結晶形成体を含む反応混合物を環境温度でエイジングすることによって共結晶の形成は引き起こされる。例えば、反応混合物は温度約−１０℃〜約３５℃、約１０℃〜約２５℃、または温度約１０℃〜約２０℃でエイジングされ得る。
【０１１８】
共結晶形成を引き起こすために冷却が必要な場合、共結晶化混合物の温度は毎分約１℃、毎分約０．５℃、または毎分約０．２５℃のペースで冷却されうる。いくつかの実施形態について、該冷反応混合物の温度は約−２０℃〜約２０℃、例えば約−２０℃〜約−１０℃、約−１０℃〜約０℃、約０℃〜約５℃、または約０℃〜約１０℃の範囲である。
【０１１９】
本願発明の共結晶の他の製造方法として、これらに限定されないが、機械的共結晶合成、ソルボサーマル共結晶合成、共結晶合成のための溶媒蒸発の使用、共結晶合成のための固体状態粉砕法（solid state grinding method）、および共結晶合成のための溶媒滴下粉砕法（solvent drop grinding method）が挙げられる。
【０１２０】
該溶媒蒸発法による共結晶の合成には、式Ｉ化合物の溶液と適当な共結晶形成体の溶液を別々に調製し、式Ｉ化合物の溶液の化学量論量を共結晶形成体の溶液の化学量論量と混合し、および共結晶形成を引き起こすのに適する温度で該反応混合物を保存することによって式Ｉ化合物および共結晶形成体を含む生じた反応混合物を過飽和させることが含まれる。
【０１２１】
一つの実施形態に従って、本発明の共結晶は溶媒滴下粉砕法によって得られた。簡潔に言えば、触媒として機能すると考えられる適当な共結晶化溶媒が少量存在するもとで、式Ｉ化合物（化合物６）および該共結晶形成体を一緒に粉砕した。
【０１２２】
共結晶形成に適する溶媒には、例えば、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸イソプロピル、ＴＨＦおよびそれらの混合物が挙げられる。一つの実施形態において、グルタル酸のエタノール溶液が化合物６のトルエン−エタノール溶液に添加された。次いで、得られた過飽和反応混合物を冷却して５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−５−ヒドロキシメチル  テトラヒドロフラン−３−イル  アセテート  グルタル酸共結晶を形成した。
【化６】
2018502090.tif 000017
【０１２３】
通常、等モル量のまたはより大きなモル量の共結晶形成体が共結晶を合成するために使用される。反応化学量論に依存して、共結晶形成体の式Ｉ化合物に対するモル比は約１：１、１：２、または約２：１であることができる。化合物６の溶液および共結晶形成体の溶液の濃度は約５０ミリモーラー〜約２．０モーラーとさまざまであることができ、例えば  約２５０ミリモーラー、約５００ミリモーラー、約６００ミリモーラー、約７００ミリモーラー、約８００ミリモーラー、約９００ミリモーラー、約１モーラー、約１．２モーラー、約１．４モーラー、約１．６モーラー、約１．８モーラーまたは約２．０モーラーが挙げられる。
【０１２４】
共結晶の形成は共結晶形成体の溶液の濃度、式Ｉ化合物の溶液の濃度、共結晶形成を引き起こすのに適する温度での反応物（共結晶形成体および式Ｉ化合物）および反応混合物の生成物（共結晶）の溶解性に依存する。典型的な共結晶化時間は約１０分間〜約４８時間、約１０分間〜約２４時間、約１０分間〜約１２時間、約１０分間〜約１０時間、約１０分間〜約８時間、約１０分間〜約６時間、約１０分間〜約４時間、約１０分間〜約２時間、または約１０分間〜約１時間とさまざまであることができる。
【０１２５】
このように形成された共結晶は重力ろ過、真空ろ過し、単離された共結晶を洗浄し乾燥させることによって単離されることができる。共結晶はまた該反応混合物から溶媒を蒸発させることによって単離されうる。通常、単離された共結晶は温度約３０℃〜約７０℃または約４０℃〜約６０℃で乾燥される。乾燥は大気圧または減圧（真空）下、例えば、減圧範囲約０．１〜約１０水銀柱ミリメートルでおこわなれ得る。
【０１２６】
上記の方法は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の純度を有する本願発明の共結晶を提供した。下記の例示共結晶は本発明の方法を用いて合成された。
実施例
【０１２７】
下記の合成プロトコル例は説明のみを目的とするものであり、本願請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２８】
以下に記載される合成スキームにおいて、別段の指示がない限り、全ての温度はセルシウス度で記載され、全ての部分およびパーセンテージは重量による。試薬は商業的サプライヤーから購入し、別段の指示がない限り、追加の精製なしに使用した。全ての溶媒は商業的サプライヤーから購入し、受け取ったままで使用した。
【０１２９】
以下に記載する反応は、概して窒素またはアルゴンの陽圧下、環境温度（別段の記載がない限り）、無水の溶媒中で行われ、反応フラスコは基質および試薬のシリンジでの導入用にゴム隔膜を装着された。ガラス器具はオーブンで乾燥および／または加熱乾燥した。反応はＴＬＣで試験され、および／またはＬＣ−ＭＳで分析され、および出発物質の消費で判断されて終わらされた。ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）による分析はHigh Strength Silica（ＨＳＳ）カラムまたはＹＭＣカラム（Waterｓ（登録商標））を用いて行った。典型的な流量は０．７ｍＬ〜１．０ｍＬ／分であり、注入量は約２〜５μＬである。
【０１３０】
分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をシリカゲルで予めコートされたガラスプレート６０Ｆ２５４０．２５ｍｍプレート（EMD Chemicals）上で行い、シリカゲル上ＵＶ光（２５４ｎｍ）および／またはヨウ素、および／またはＴＬＣ染色（例えばエタノール性リンモリブデン酸、ニンヒドリン溶液、過マンガン酸カリウム溶液、または硫酸セリウム（ceric sulfate）溶液）と共に加熱して可視化してもよい。
【０１３１】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲをBruker Avance II（登録商標）分光計を６００ＭＨｚで操作して記録した。ＮＭＲスペクトルはクロロホルムを参照標準（プロトンについては７．２７ｐｐｍ、炭素については７７．００ｐｐｍ）として用いるＣＤＣｌ３溶液（ｐｐｍで示す）として、プロトンの参照標準として３．４ｐｐｍおよび４．８ｐｐｍおよび炭素の参照標準として４９．３ｐｐｍを用いるＣＤ３ＯＤ溶液として、ＤＭＳＯ−ｄ６（プロトンについて２．４９ｐｐｍ）、または適切な場合には内部標準のテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を用いて得られた。必要に応じて他のＮＭＲ溶媒も使用した。ピーク多重度を報告するのに、下記の略語：ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（ブロード）、ｂｓ（ブロードな一重線）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｄｔ（三重線の二重線）を使用した。カップリング定数は測定時、ヘルツ（Ｈｚ）で表した。
５−アミノ−３−（２’−Ｏ−アセチル−３’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−チアゾロ［４、５］ピリミジン−２−オン）のグルタル酸共結晶の合成
Ａ．カップリング反応−（２Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−４−アセトキシ−５−（５−アミノ−２−オキソチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３（２Ｈ）−イル−テトラヒドロフラン−２−イル−メチル  アセテート（５）の合成
【化７】
2018502090.tif 000018
【０１３２】
化合物５をＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００８１４０５４９に記載のプロトコルに従って合成した。簡潔に言えば、温度プローブ、冷却器および窒素注入口を装着した三つ口フラスコに５−アミノ−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン（化合物４）およびアセトニトリルを入れる。Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）を化合物４の該溶液に漏斗を使って加え、４０℃、窒素雰囲気下で９０分間撹拌した。５℃に冷却した後、１、２、５−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（化合物３）のアセトニトリル溶液を加え、次いでＴＭＳＯＴｆを加える。
【０１３３】
次いで反応混合物を７５℃に加熱し、この温度で１０時間保持した。加熱後、該反応混合物が入ったフラスコをゆっくり１５℃に冷却した。次いで、該反応混合物の温度を１５℃に維持しながら、水を１ｍＬずつ該冷反応混合物に加え、反応をクエンチした。該クエンチされた反応混合物をセライトと混合し、水酸化ナトリウムを用いて中和した。セライトを除去して得られたろ液を重炭酸ナトリウム水溶液および固体塩化ナトリウムと混合し、分液ロートに移して、アセトニトリルで抽出した。有機層を濃縮して所望の生成物、化合物５を得た。化合物５の同定およびその純度を認証済み（authentic）物質を標準品として使用してＨＰＬＣで測定した。
Ｂ．選択的脱アセチル化−化合物６の合成
【化８】
2018502090.tif 000019
【０１３４】
化合物５のアセトニトリル溶液を固体担体に固定化されているCandida antarctica、タイプＢ（Biocatalyticｓカタログ番号ＩＭＢ−１１１）リパーゼの重炭酸塩水溶液に加える。該反応混合物（懸濁液）を３６時間撹拌し、続いて当該担体結合の酵素をろ過した。ろ液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水の硫酸マグネシウムで乾燥し、Ｎｏｒｉｔ  ２１１で９０分間撹拌し、ついでセライトフィルターエイドでろ過して、所望のアルコール（６）を得た。化合物６の同定およびその純度を認証済み（authentic）な物質を標準品として使用してＨＰＬＣで測定した。
Ｃ．共結晶形成
【０１３５】
１７．２ｇの化合物（６）［５２．７ミリモル］を含有する酢酸エチル溶液（４７．４ｍＬ）を、１８０ミリバールの減圧下６０℃でロータリーエバポレーションにかけて溶媒を除去した。このように得られた残渣をエタノール（１１０ｍＬ）に溶解し、減圧（６０℃、１８０ミリバール）下で濃縮した。ついで新たにエタノール（８３ｍＬ）を丸底フラスコに入った反応混合物に加え、この混合物を化合物（６）の澄明黄色エタノール溶液が得られるまで室温で撹拌した。
【０１３６】
グルタル酸を１５ｍＬのエタノールに溶解してグルタル酸（３．６２ｇ、２７．４ミリモル）溶液を調製した。ついでこの透明無色溶液を、グルタル酸の添加の間に加熱されて温度５０℃に維持されたエタノール溶液化合物（６）（撹拌されながら）に、１５分間かけて滴加した。ついで該共結晶化混合物を０．２５℃／分の速度で３０℃に冷却し、共結晶形成が開始した。該冷却共結晶化混合物を撹拌した後に形成される結晶はなかった。
【０１３７】
該共結晶化混合物を撹拌しながら５０℃に再加熱した。１０ｍｇの式Ｉ化合物のグルタル酸共結晶を共結晶形成を引き起こすための種として該共結晶化混合物に添加し、該混合物を０．２５℃／分の速度で冷却した。温度が下がると、撹拌できない粘度の高い懸濁液が形成された。該共結晶化混合物を５５℃に再び加熱し、この温度で容易に撹拌できる懸濁液が得られるまで維持した。
【０１３８】
ついで該熱懸濁液を撹拌しながら０．２５℃／分のペースで約０℃まで徐々に冷却した。該共結晶化混合物の温度を０℃〜５℃に維持しながら、該冷共結晶化混合物を終夜撹拌した。該共結晶の懸濁液を吸引ろ過して集め、冷エタノール（４３ｍＬ）で洗浄し、および真空オーブン（５ｍｂａｒ）中、温度４０℃で乾燥した。収量−１８．２４ｇ（８８．１％）のグルタル酸共結晶を白色固体として得た。該共結晶の純度をＨＰＬＣで測定したところ、純度９９．７５％であった。
【０１３９】
テーブル１０は実施例１で開示されたものと同様のプロトコルを用いて合成された例示共結晶および例示共結晶の対応する物理的特性を示す。
テーブル１０
【表１０】
2018502090.tif 000020
【０１４０】
上記に説明するとおり、本発明の共結晶の塩ファクター（Ｓ）は、式Ｉ化合物のトシレート塩の塩ファクター（ＳＴｏｓは１．５３である）よりも低い。それらの低いＳ値により、該共結晶を含む組成物はより少ない経口投与量で式Ｉ化合物のより高い定常状態での血漿中濃度を達成する。結果として、式Ｉ化合物の治療的に適当な血漿中濃度を達成するために、治療を受けている患者は、式Ｉ化合物の該トシレート塩の組成物を投与されている患者と比べて、より少ない経口投与量の該共結晶の組成物しか必要としないであろう。
Ｖ．ＨＢＶウイルスのレプリコン複製活性の阻害
【０１４１】
ＨＢＶ感染は急性および慢性肝疾患の主要な原因の一つである。現在のＨＢＶ治療は血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を低下するのに効果的であるものの、低いウイルス排除率ではこれらの治療薬の効果は限定的であって、しばしば長期の使用を必要とし、重い毒性の副作用を引き起こす。本願発明はＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ−７）（これは未成熟樹状細胞に発現する）のアゴニストとして式Ｉ化合物の共結晶を提供する。
ＴＬＲは宿主中のサイトカインおよびケモカインの放出を刺激することによって免疫応答を活性化する病原体認識受容体のファミリーである。宿主の免疫システムが活性化して放出されたサイトカインおよびケモカインは効果的な抗ウイルス剤であり、これは主にそれらのウイルス感染細胞を認識し殺傷する能力によるものである。従って、式Ｉ化合物の共結晶（二重のプロドラッグ）、単一のプロドラッグ（脱アセチル化式Ｉ化合物または酸化型の式Ｉ化合物）および非アセチル化・酸化型の式Ｉ化合物（生物活性種）をＨＢＶ複製を阻害する能力についてインビトロで評価した。スキーム１（上記）は該二重のプロドラッグの構造、該単一のプロドラッグの構造および該生物活性種を示す。
【０１４２】
ウイルスの複製の直接的な阻害を、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞を含有する培養物中の分泌されたＨＢＶ ＤＮＡ濃度およびＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）濃度をモニタリングすることによって評価した。また、培養物におけるウイルスの複製の阻害をＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞を該非アセチル化・酸化型の式Ｉ化合物（生物活性種）（これは選択的ＴＬＲ−７アゴニストである）で刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の馴化培地に曝露することによって間接的に評価した。
ＨＥＰＡＲＧ細胞株の生成
【０１４３】
ＨｅｐａＲＧ細胞（Ｃａｔ＃  ＨＰＲ１０１）、ＨｅｐａＲＧ成長培地サプリメント（Ｃａｔ＃  ＡＤＤ７１０）、およびＨｅｐａＲＧ分化培地培地サプリメント（Ｃａｔ＃  ＡＤＤ７２０）をBiopredics International（レンヌ、フランス）から購入した。該成長培地サプリメント中にはＤＭＳＯは含まれず、該分化培地サプリメントは２％ＤＭＳＯを含む。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２湿度環境で、成長培地サプリメント含有ウィリアムズＥ培地（ＷＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。分化を引き起こすために、成長培地を分化培地（分化培地サプリメント含有ＷＥＭ）と１：１の比で混合し、コンフルエントなＨｅｐａＲＧ細胞に加えた。
【０１４４】
３日間の培養後、混合培地を分化培地で置き換え、細胞を分化培地中でさらに２〜４週間維持した。培養期間をとおして、分化培地を２〜３日間毎に取り替えた。分化されたＨｅｐａＲＧ細胞（ＨｅｐａＲＧｄ）は胆汁性様（biliary-like）細胞の単層で取り囲まれた肝細胞様細胞島（island）を示す。ＨＢＶ感染および化合物処置の前に、ＨｅｐａＲＧｄ細胞をコラーゲンＩでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃  Ａ１１４２８−０３）に５０，０００〜６０，０００細胞／ウェルで播種した。ＨＢＶ感染に先だって、９６ウェルプレート中播種後少なくとも１週間で細胞は分化した表現型を回復した。
ＨＢＶ感染
【０１４５】
Sells M.A., et al., PNAS, 84(4): 1005-1009に開示されるように、ＨＢＶ接種源をＨｅｐＧ２．２．１５培養細胞（ＨＢＶ（遺伝子型Ｄ、ａｙｗ株）複製およびビリオン分泌物をサポートする細胞株）から採取した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、コラーゲンＩ（BD Biosciences）で予めコートされたハイパーフラスコ（コーニング）を用いて、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（インビトロジェン）、１０％ＦＢＳ、および０．２５ｍｇ／ｍＬＧ−４１８（インビトロジェン）を含有するＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（インビトロジェン）中で維持した。コンフルエンシーに達したら、ＨｅｐＧ２．２．１５培養培地を１ｘＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２．５％ＦＢＳ、および１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉで３日間置き換え、その後１ｘＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉで置き換えた。該１％ＤＭＳＯ含有培地を３〜４日間毎に２週間かけて集め、Ｔｉ４５ベックマンローター中、２０％スクロースクッションを介して、４５，０００ｒｐｍ、４℃で、３時間超遠心分離して、ＨＢＶ感染性ビリオンおよびウイルス成分粒子をでペレット状にした。該ペレットを、プラスミドＤＮＡを含有する遺伝子型Ｄ  ＨＢＶを内部標準として用いて下記に記載のようにリアルタイムＰＣＲで測定した１０８−１０９ゲノム当量（ＧＥ）／ｍＬの濃度でＷＥＭ中に再懸濁した。該接種源の感染力を評価するために、９６ウェルプレート中ＨｅｐａＲＧｄ細胞を５０〜２００ＧＥ／細胞および４％ＰＥＧ８０００（ポリエチレングリコール８０００、シグマ、Ｃａｔ＃  Ｐ５４１３−５００Ｇ）を含有する分化培地で３７℃で１６時間感染させた。感染の最後に、ＨＢＶ接種源を取り除き、細胞を分化培地で３回洗浄した。分化培地を２〜３日間毎に補充し、およびＨＢＶ複製を分泌されたＨＢＶ ＤＮＡ、Ｂ型肝炎表面（ＨＢｓＡｇ）抗原および／またはｅ（ＨＢｅＡｇ）抗原を測定することによってモニタリングした。
分泌されたＨＢＶ抗原およびＨＢＶ ＤＮＡの測定
【０１４６】
ＨＢｓＡｇを、ＨＢｓＡｇ化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）キットを製造者（Autobio Diagnostics Co.、鄭州、中国）が勧める方法に従って用いて、５０μＬのＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧの上清から測定した。ＨＢＶ ＤＮＡを、MagNA Pure 96 DNAおよびViral NA Small Volume Kit（Roche、Cat＃ 05 467 497 001）を用いて、５０μＬのＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄの上清から抽出した。EagleTaq Master Mix Kit（Roche、Cat＃ 05529026 190）を用いて、フォワードプライマーＣＴＧ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  Ｔ、リバースプライマーＡＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＡＡ、およびプローブ５６−ＦＡＭ−ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ／ＺＥＮ／ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３ＩＡＢｋＦＱ（IDT DNA）で、加熱／冷却サイクル条件：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルで、コア領域をカバーする９９ヌクレオチドフラグメントを増幅した。全てのＰＣＲ反応はＶｉｉＡ７  リアルタイムＰＣＲシステム（Life Technologies）を用いて行った。
ＨＢＶウイルスの複製の阻害
【０１４７】
本願発明の式Ｉ化合物の共結晶は二重のプロドラッグであり、上記のスキーム１に記載されるとおりインビボで酵素的に生物学的に活性な種５−アミノ−３−（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−３ａ，７ａ−ジヒドロチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７（３Ｈ，６Ｈ）−ジオンに変換される。これらの化合物はＴｏｌｌ様受容体、特にＴＬＲ−７、を刺激してサイトカインおよびケモカインを放出させることにより抗ウイルス活性を発揮するとみられている。ウイルスの複製阻害活性を測定するために、グルタル酸共結晶（二重のプロドラッグ）、式Ｉ化合物の脱アセチル化型（単一のプロドラッグ）および生物学的に活性な種（ＲＯ６８７１７６５）を合成した。
【０１４８】
ＨＢＶ複製の直接的なおよび間接的な阻害活性の両方を測定した。当該試験の薬物なしのコントロールとしてロフェロン−Ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＰ−１０またはＤＭＳＯを使用した。直接的試験のために、グルタル酸共結晶、式Ｉ化合物の脱アセチル化型、および生物学的に活性な種（ＲＯ６８７１７６５）の原液、ならびにコントロール薬剤をＷＥＭ成長培地中、最終容量１２０μＬおよびＤＭＳＯ濃度２％（ｖ／ｖ）で調製した。これらの試薬のアリコートを感染後４日にＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞を含有する９６ウェル培養プレートの各ウェルに加えた。各ウェルのＤＭＳＯ最終濃度は２％であった。阻害試験で使用されたＨｅｐａＲＧｄ細胞を２％ＤＭＳＯ含有分化培地で維持した。ＨＢＶ複製の間接的阻害活性を評価するために、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞を、ＤＭＳＯ（コントロール）またはＲＯ６８７１７６５（１００μＭ）刺激ＰＢＭＣから採取され、分化培地で段階希釈された馴化培地と共にインキュベートした。
【０１４９】
テスト化合物を含有する分化培地の既知のアリコートまたは馴化培地のアリコートを培養物中のＨＢＶ感染細胞に加えることによって、ＨＢＶウイルスの複製阻害活性を行った。テスト化合物を含有する分化培地の既知のアリコートまたは馴化培地を２〜３日間毎に培養物中のＨＢＶ感染細胞に計７日間加えた。処置の７日目（感染後１１日）に、上清５０μＬを使用して、分泌されたＨＢＶ抗原またはＨＢＶ ＤＮＡの濃度をそれぞれ上記と様にＣＬＩＡまたはリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。細胞の生存はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７１）を用いて測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ（La Jolla、ＣＡ）を用いて用量応答曲線を得た。用量応答曲線からＥＣ５０（５０％阻害を引き起こす有効濃度）およびＣＣ５０（未処理細胞対照）値を薬物なしコントロールと比較してＨＢＶウイルスの複製活性の５０％減少が認められるテスト化合物の濃度または馴化培地の濃度（ｌｏｇ希釈として）を算出した。ＥＣ５０およびＣＣ５０値は２〜４個の独立したＨＢＶ感染試験（各々２重に行われた）に由来した。
ＨＢＶ複製に対するＲＯ６８７１７６５の直接的影響
【０１５０】
これまでのウイルスの阻害試験は該グルタル酸共結晶（二重のプロドラッグ）、および式Ｉ化合物の該脱アセチル化型（単一のプロドラッグ）は培養されたＨｅｐａＲＧ細胞でウイルスの複製を阻害しないことを示した。ＲＯ６８７１７６５（生物学的に活性な種）がＨｅｐａＲＧ細胞中でＨＢＶウイルスの複製を阻害するかどうかを評価するために、感染細胞を感染後４日目に既知濃度のＲＯ６８７１７６５と共にインキュベートした。ＲＯ６８７１７６５の２００μＭ原液を段階希釈して、試験溶液を調製した。ウイルスの阻害試験で試験したＲＯ６８７１７６５の濃度は２００μＭ、６６．６７μＭ、２２．２２μＭ、７．４１μＭ、２．４７μＭおよび０．８２μＭであった。細胞培地に既知濃度のＲＯ６８７１７６５または２％ＤＭＳＯ（コントロール細胞）を含有する新しい培地を３日間毎に補充した。ペグ化インターフェロン−アルファ２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））の３つの異なる濃度（５６ｐＭ、１６７ｐＭ、および５００ｐＭ）で処理したＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞ををポジティブコントロールとして使用した。
【０１５１】
処置の７日目（細胞感染１１日後）に分泌されたＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの濃度を測定した。図３Ａに示されるとおり、ＲＯ６８７１７６５は直接的な抗ＨＢＶ効果は示さなかった。最高濃度の（２００μＭ）ＲＯ６８７１７６５でインキュベートした細胞に関し、ＨＢＶ ＤＮＡまたはＨＢｓＡｇの濃度の変化は検出されなかった。従って、ＲＯ６８７１７６５のＥＣ５０は２００μＭより高い（図３Ａ、テーブル１１）。ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞がＲＯ６８７１７６５で試験されたとき、著しい細胞傷害性は認められなかった（ＣＣ５０＞２００μＭ、生存における最大減少はＲＯ６８７１７６５の最高濃度で約１７％である）。
テーブル１１
【表１１】
2018502090.tif 000021
【０１５２】
対照的に、ペグ化インターフェロン−アルファ２ａで処理されたＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞はＨＢＶ複製の著しい減少を示した。試験された最高濃度で分泌されたＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇの濃度はそれぞれ７６．９％±１４．８％および４６．０％±６．３％まで減少した（５００ｐＭ；図３Ｂ、テーブル１２を参照）。
テーブル１２
【表１２】
2018502090.tif 000022
【０１５３】
これらの結果はＲＯ６８７１７６５が抗ウイルス活性が低いことを示す。しかしながら発明者らが驚いたことに、ＲＯ６８７１７６５刺激ＰＢＭＣから得られた馴化培地はＨＢＶ感染培養ＨｅｐａＲＧ細胞からのＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ分泌の両方を著しく減少させ、これはＲＯ６８７１７６５によるＨＢＶウイルス複製の間接的阻害のサポートを提供する。
ＲＯ６８７１７６５のＨＢＶ複製に対する間接的影響
【０１５４】
ＴＬＲ−７アゴニストはヒトＰＢＭＣからの産生サイトカインおよびケモカインを刺激する。培養されたＰＢＭＣをＤＭＳＯ（コントロール）または１００μＭのＲＯ６８７１７６５（薬物）を接触させることによって得られた馴化培地をＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞と接触させた。
ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞を健康なドナー−ドナー７０６１５（グラフＡ−Ｄ）およびドナー７７７２６（グラフＥ、Ｆ）から単離されたＰＢＭＣから採取された様々に希釈した馴化培地と共にインキュベートした。各ドナーのＰＢＭＣをＤＭＳＯ（グラフＡ、Ｃ、Ｅ）または１００μＭのＲＯ６８７１７６５（グラフＢ、Ｄ、Ｆ）のいずれかで刺激した。図４Ａ、４Ｃおよび４ＥはＤＭＳＯ刺激ＰＢＭＣを用いたＨＢＶウイルス複製阻害に対応し、図４Ｂ、４Ｄおよび４ＦはＲＯ６８７１７６５刺激ＰＢＭＣを用いたＨＢＶウイルス複製阻害に対応する。３つの実験を行った。第１の実験において（図４Ａ、４Ｂ）、ＰＢＭＣ（ドナー７０６１５）からの馴化培地を分化培地を用いてまず１０倍に希釈し、次いで該希釈馴化培地をＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞に添加する前に３倍ずつ段階希釈した。第２の実験において（図４Ｃ、４Ｄ）、ＰＢＭＣ（ドナー７０６１５）からの馴化培地をまず分化培地を用いて５倍に希釈し、次いでＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞に添加する前に５倍ずつ段階希釈した。第３の実験において（図４Ｅ、４Ｆ）、ＰＢＭＣ（ドナー７７７２６）からの馴化培地を分化培地を用いてまず５倍に希釈し、次いでＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞に添加する前に５倍ずつ段階希釈した。コントロールおよびＲＯ６８７１７６５処理細胞について、培養培地中で分泌されたＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇの濃度をモニタリングすることでＨＢＶ複製阻害活性を測定した。
【０１５５】
図４に示すように、ＤＭＳＯで処理されたＰＢＭＣからの馴化培地は有意な抗ウイルス効果を誘導しなかった（図４Ａ、４Ｃおよび４Ｅおよびテーブル１３を参照）。対照的に、ＲＯ６８７１７６５で処理されたＰＢＭＣからの馴化培地の存在下では分泌されたＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ濃度の両方の用量依存的減少が認められた（図４Ｂ、４Ｄおよび４Ｆ、テーブル１３を参照）。ＨＢＶ ＤＮＡに対するＲＯ６８７１７６５の平均ＥＣ５０値は−２．５±０．４ｌｏｇ１０であり、これはＲＯ６８７１７６５刺激馴化培地の１：３１８希釈に相当する（テーブル１３）。該ＲＯ６８７１７６５刺激馴化培地のＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）分泌に対する平均ＥＣ５０値は−１．２ｌｏｇ１０であり、これは１：１６希釈に相当する（テーブル１３）。細胞生存アッセイはＤＭＳＯ処理ＰＢＭＣからの馴化培地は有意な細胞傷害性効果を示さなかったが、ＲＯ６８７１７６５刺激ＰＢＭＣからの希釈馴化培地（１０倍および５倍希釈）で処理されたＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧｄ細胞はそれぞれ１４％および１９％の細胞生存の若干の減少を示した（図４、テーブル１３）ことを示した。
テーブル１３
【表１３】
2018502090.tif 000023
【０１５６】
ＲＯ６８７１７６５で処理された培養ＰＢＭＣから得られた馴化培地の抗ウイルス効果は大抵ＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカインの放出によるものである。馴化培地からのサイトカインプロファイリング試験はＲＯ６８７１７６５はインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、およびＩＦＮγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）の放出を誘導し、ＰＢＭＣがＤＭＳＯで処理されたときはこれらのサイトカインの放出は認められなかったことを示した。
【０１５７】
ＩＦＮ−アルファ２ａ（ロフェロン−Ａ）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＰ−１０のＨＢＶ複製に対する影響を調べるために、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞アッセイを用いて、これらのサイトカインの各々の用量依存的滴定を行った。試験された最高濃度は、ロフェロン−Ａについては  −  １０００ＩＵ／ｍｌ、およびＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０については１０００ｎｇ／ｍｌであり、これらはその後、比較のためにモル濃度に変換された。
【０１５８】
図５に示すように、ロフェロン−ＡおよびＩＬ−６の両者は、分泌されたＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの用量依存的阻害を示した。ＨＢＶ ＤＮＡ分泌に対するロフェロン−ＡおよびＩＬ−６のＥＣ５０値はそれぞれ１．０±０．３ｐＭおよび０．０２７±０．００７３ｎＭである。ロフェロン−ＡおよびＩＬ−６はまたＨＢｓＡｇの分泌をそれぞれ０．０３３±０．０２２ｎＭおよび０．２６±０．０２０ｎＭのＥＣ５０値で阻害する。ＴＮＦ−αはＨＢＶ複製を阻害するように見えるが、このサイトカインは約１ｎＭの濃度でさえ細胞傷害性である。ＴＮＦ−αのＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ分泌に対するＥＣ５０値はそれぞれ０．０８５±０．０４６ｎＭおよび０．３２であった。ケモカインＩＰ−１０に関し試験した最高濃度でさえ細胞毒性もＨＢＶ複製阻害作用も認められなかった（ＥＣ／ＣＣ５０＞１１５ｎＭ、図５を参照）。これらのデータは合わせて、ＲＯ６８７１７６５刺激ＰＢＭＣ馴化培地が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ類およびサイトカインの放出を媒介する間接メカニズムを介してＨＢＶ複製を阻害したこと強く示唆する。
【図１】
2018502090.tif 000029
【図２】
2018502090.tif 000030
【図３Ａ】
2018502090.tif 000031
【図３Ｂ】
2018502090.tif 000032
【図４】
2018502090.tif 000033
【図５】
2018502090.tif 000034
【国際調査報告】
2018502090.tif 000035
2018502090.tif 000036