(57)【要約】  本明細書において、タンパク質の溶解性および精製を改善するための新しい多用途の融合タンパク質ツール（タグ）が提示される。特に、融合タグは、洗浄剤が存在する場合でも単一段階のタンパク質精製のために使用される、実質的に全長（約２３ｋＤ）のリカバリン分子（ＴａｇＲ）である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製される対象のタンパク質をコードする配列と、ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質ファミリーのタンパク質をコードするタグポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド分子であって、前記ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質がカルシウムの存在下または非存在下で立体構造変化を受ける、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記立体構造変化がカルシウムの存在下での疎水性アミノ酸の押出を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記コード化タグタンパク質が少なくとも約４０％のリカバリンとの同一性を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記コード化タグタンパク質が少なくとも約６０％のリカバリンとの同一性を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記コード化タグタンパク質が、リカバリンの３Ｄ構造と比較したときに２．５Å未満の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＲＭＳＤが２Å未満である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質が、リカバリン、ＧＣＡＰ１、ＧＣＡＰ２、ＧＣＡＰ３、ＧＣＩＰ、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２、カルセニリン／ＤＲＥＡＭ、ＮＣＳ１／フリクエニン、ニューロカルシンデルタ、ヒポカルシン、およびＶＩＬＩＰ−からなる群から選択される神経カルシウムセンサータンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記タグポリヌクレオチドがリカバリンをコードする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
コード化リカバリンタグが実質的に全長である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記コード化リカバリンタグが約２３ｋＤの分子量を有する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記コード化リカバリンが配列番号２または４によって定義される、請求項８〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記タグポリヌクレオチドが、前記タグタンパク質の末端におけるタンパク質分解的切断部位をさらにコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記タンパク質分解的切断部位がプロテアーゼによって切断される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶおよびＨＲＶ  Ｃ３からなる群から選択される、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記プロテアーゼ切断部位の配列がＬＶＰＲＧＳ、ＥＮＬＹＦ（Ｑ／Ｇ）およびＬＥＶＬＦ（Ｑ／Ｇ）Ｐから選択される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記タグポリヌクレオチドが配列番号１に対して約９０％以上の核酸同一性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３によって定義される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
制限部位をコードする１つまたは複数の配列を、前記ポリヌクレオチドのＮ末端もしくはＣ末端の一方においてまたはその近くにおいて前記ポリヌクレオチド中に導入している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記制限部位がＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩまたは両方の制限部位の組み合わせを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記対象のタンパク質が前記タグ分子のＣ末端に位置する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
プラスミドを含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記プラスミドが、ｐＥＴ１１ａおよびｐＧＥＸ−４Ｔ−３ＰＥＸからなる群から選択される、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
発現宿主細胞内で機能性の転写開始領域と、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドと、
前記発現宿主細胞内で機能性の転写終結領域と
を含む発現カセット。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項２６】
対象のタンパク質を発現させるための方法であって、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２４に記載の発現カセットを含む発現系において、リカバリンタグ（ＴａｇＲ）に融合された前記対象のタンパク質を発現させるステップを含む方法。
【請求項２７】
対象のタンパク質の発現の方法であって、請求項２５に記載の宿主細胞においてリカバリンタグ（ＴａｇＲ）に融合された前記対象のタンパク質を発現させるステップを含む方法。
【請求項２８】
前記タンパク質の前記発現が、前記タグタンパク質の折り畳みを可能にするために最少成長培地を用いて実行される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象のタンパク質を生産するための方法であって、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を成長させることを含み、前記細胞が、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のベクター、または
請求項２４に記載の発現カセット
を含む、方法。
【請求項３０】
対象のタンパク質を精製するための方法であって、
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の前記対象のタンパク質を発現させるステップ、または
請求項２９に記載の前記対象のタンパク質を生産するステップと、
カルシウムの存在下で疎水性親和性クロマトグラフィにおいて前記融合タンパク質を不要な成分から分離することにより、前記融合タンパク質を精製するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記精製ステップが、カルシウムキレート剤の存在下で前記融合タンパク質を疎水性親和性カラムから溶出させることと、任意選択的に、前記タグから切断された前記対象の精製タンパク質を得るために、前記溶出した融合分子を切断することとによって実行される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記精製ステップが、前記対象の融合タンパク質を前記タグから切断して、前記切断されたタンパク質および前記タグを含む混合物を得ることと、カルシウムキレート剤の存在下で前記切断されたタンパク質を前記疎水性親和性カラムにおいて溶出させることにより、前記切断された対象のタンパク質を前記タグから分離することとによって実行される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記カルシウムキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＢＡＰＴＡからなる群から選択される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記カルシウムキレート剤がＥＧＴＡである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質ファミリーのタンパク質に融合された対象のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質がカルシウムの存在下または非存在下で立体構造変化を受ける、融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質。
【請求項３７】
前記タグタンパク質が少なくとも約４０％のリカバリンとの同一性を含む、請求項３６に記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記コード化タグタンパク質が少なくとも約６０％のリカバリンとの同一性を含む、請求項３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記タグが配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３８に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記タグが配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記タグが配列番号４によって定義される、請求項４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
前記コード化タンパク質タグがミリストイル化されていない、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４３】
さらなるタグ分子を含む、請求項４２に記載のタンパク質。
【請求項４４】
前記さらなるタグ分子がポリ−ヒスチジンタグまたはリカバリンタグ（ＴａｇＲ）から選択される、請求項４３に記載のタンパク質。
【請求項４５】
Ｎ末端位置に位置する２つのリカバリン分子を含む、請求項４３または４４に記載のタンパク質。
【請求項４６】
対象のタンパク質の発現および精製のためのキットであって、
・請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；および
・前記ポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入する方法についての説明書；および／または
・前記ベクターを宿主細胞に形質転換する方法についての説明書；および／または
・組換え融合タンパク質を前記宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または
・請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の前記組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書
を含むキット。
【請求項４７】
対象のタンパク質の発現および精製のためのキットであって、
・請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２４に記載の発現カセット；および
・前記ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする方法についての説明書；および／または
・組換え融合タンパク質を前記宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または
・請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って前記組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書
を含むキット。
【請求項４８】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＥＦハンドカルシウム結合ファミリーからのタンパク質の、タンパク質精製のためのタグとしての使用。
【請求項４９】
タンパク質精製のためのタグとして使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＥＦハンドカルシウム結合ファミリーからのタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の発現、溶解性および精製を改善するための新しい多用途の融合タンパク質ツール（タグ）に関する。特に、融合タグは、実質的に全長のリカバリン分子、および神経カルシウムセンサータンパク質のＥＦハンドファミリーの他のメンバーであり、これらはカルシウムに結合し、洗浄剤が存在する場合でも単一段階のタンパク質精製のために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
多数の生物のゲノム配列が利用可能であるため、組換え技術により、種々の宿主細胞型を用いて多数のタンパク質の同定、修飾、産生、および精製が可能になった１−１３。その結果として、治療的および診断的使用を含む様々な用途のための組換えタンパク質の使用が大幅に増加している２。加えて、多数の研究室が、その構造および機能を決定するため、またはその治療的可能性を発見するために新規のタンパク質を発現させている。同様に、製薬会社は、治療を目的としてタンパク質の大規模生産に関与している。従って、これらの要求を満たすために高いタンパク質純度が必要である。しかしながら、その内在特性を用いてタンパク質を精製することは非常に困難である。従って、タンパク質精製を促進するために融合タグの使用が広範囲に広がっている。
【０００３】
組換えタンパク質の産生は、封入体の形成、宿主細胞毒性、低レベルの発現、または不適切なタンパク質の折り畳みをもたらすことが多い２。これらの問題は、多くの場合、発現系、宿主細胞型を変えることにより、または融合タグを用いることにより解決することができる２。多くの融合タグが利用可能であり１１、新しいタグまたは新しいタギング手順が連続的に提供されている１４−１７。これらのタグは対象のタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置することができるが、最適なタグの選択は、各タンパク質の特定の特性に依存する。
【０００４】
最も一般的に使用される小さい親和性タグは、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）である。これは、固定化金属親和性クロマトグラフィによるタンパク質の精製を可能にする。これは、通常、ヘキサヒスチジンから作られるが、デカヒスチジンは、単一段階のタンパク質精製のためにより効率的であることが多い。しかしながら、このタグは、対象のタンパク質の収率の改善および溶解性の増大を可能にしない。従って、最も広範に使用されるタンパク質タグは、「ゴールドスタンダード」であると考えられるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である１８。これは２６ｋＤａのタンパク質であり、グルタチオンに対して高親和性で結合する。ＧＳＴは対象のタンパク質の収率および溶解性を増大させることができ、精製は、固体担体に固定化されたグルタチオンへのＧＳＴタグ化タンパク質の結合により達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＧＳＴタグは、いくつかの対象のタンパク質の溶解性および精製を改善するために非常に有用であることが見出されたが、いくつかの欠点がある。例えば、ＧＳＴタグ化タンパク質の精製は、洗浄剤の存在下で達成することができない１９。さらに、対象のタンパク質をその切断後にＧＳＴから分離することは、ＧＳＴに対するグルタチオンの高親和性のために容易に達成するのが困難であり、従って、切断をカラム上で実施することができなければ付加的な透析ステップが必要とされる。従って、対象のタンパク質の溶解性を改善し、精製を促進するための新しいタンパク質タグが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様によると、精製される対象のタンパク質をコードする配列と、ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質ファミリーのタンパク質をコードするタグポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド分子が提供され、ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質は、カルシウムの存在下または非存在下で立体構造変化を受ける。特に、立体構造変化は、カルシウムの存在下での疎水性アミノ酸の押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）を含む。より具体的には、タグは、神経カルシウムセンサータンパク質のＥＦハンドカルシウム結合ファミリーのメンバーである。
【０００７】
さらに特定の態様によると、本発明は、プロモーターに作動可能に連結されている、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０００８】
本発明の特定の態様によると、発現宿主細胞内で機能性の転写開始領域と、本明細書で定義される組換えポリヌクレオチドと、発現宿主細胞内で機能性の転写終結領域とを含む発現カセットが提供される。
【０００９】
本発明の特定の態様によると、本明細書で定義される発現カセットを含む宿主細胞が提供される。
【００１０】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質を発現させるための方法が提供され、本方法は、本明細書で定義されるベクターまたは発現カセットを含む発現系において、リカバリンタグ（ＴａｇＲ）に融合された対象のタンパク質を発現させるステップを含む。
【００１１】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質の発現の方法が提供され、本方法は、本明細書で定義される宿主細胞においてリカバリンタグ（ＴａｇＲ）に融合された対象のタンパク質を発現させるステップを含む。この方法の本発明のより詳細な態様によると、タンパク質の発現は、タグタンパク質の折り畳みを可能にするために最少成長培地を用いて実行される。
【００１２】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質を生産するための方法が提供され、本方法は、本明細書で定義されるタンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を成長させることを含み、細胞は、ポリヌクレオチド、またはベクター、または発現カセット（全て本明細書で定義される）を含む。
【００１３】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質を精製するための方法が提供され、本方法は、本明細書で定義される対象のタンパク質を発現させるステップ、または本明細書で定義される対象のタンパク質を生産するステップと、カルシウムの存在下で疎水性親和性クロマトグラフィにおいて融合タンパク質を不要な成分から分離することにより、融合タンパク質を精製するステップとを含む。特に、精製ステップは、カルシウムキレート剤の存在下で融合タンパク質を疎水性親和性カラムから溶出させることと、任意選択的に、タグから切断された対象の精製タンパク質を得るために、溶出した融合分子を切断することとによって実行される。あるいは、精製ステップは、対象の融合タンパク質をタグから切断して、切断されたタンパク質およびタグを含む混合物を得すことと、カルシウムキレート剤の存在下で切断されたタンパク質を疎水性親和性カラムにおいて溶出させることにより、切断された対象のタンパク質をタグから分離することとによって実行される。
【００１４】
本発明の特定の態様によると、ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質ファミリーのタンパク質に融合された対象のタンパク質を含む融合タンパク質が提供され、ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質は、カルシウムの存在下または非存在下で立体構造変化を受ける。
【００１５】
本発明の特定の態様によると、本明細書で定義されるポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質が提供される。特定の態様によると、コード化タンパク質タグは、ミリストイル化されていない。
【００１６】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質の発現および精製のためのキットが提供され、本キットは、本明細書で定義されるポリヌクレオチド；およびポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入する方法についての説明書；および／またはベクターを宿主細胞に形質転換する方法についての説明書；および／または組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または本明細書で定義される組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書を含む。
【００１７】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質の発現および精製のためのキットが提供され、本キットは、いずれも本明細書で定義されるベクターまたは発現カセット；およびベクターを宿主細胞にトランスフェクトする方法についての説明書；および／または組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または本明細書で定義される方法に従って組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書を含む。
【００１８】
本発明の特定の態様によると、本明細書で定義されるＥＦハンドカルシウム結合ファミリーからのタンパク質の、タンパク質の発現および／または可溶化および／または精製のためのタグとしての使用が提供される。
【００１９】
本発明の特定の態様によると、タンパク質の発現および／または可溶化および／または精製のためのタンパク質タグとして使用するための、本明細書で定義されるＥＦハンドカルシウム結合ファミリーからのタンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】リカバリン（ＴａｇＲ）の大きい立体構造変化は、カルシウムの結合によって誘発される。Ａ）その４つのＥＦハンドのうちの２つによるカルシウムの結合は、そのミリストイル基およびいくつかの疎水性アミノ酸の押出を誘発する。Ｂ）ＴａｇＲのミリストイル基およびいくつかの疎水性残基は、カルシウムの非存在下（ＥＧＴＡの存在下）では、疎水性ポケット内に隔離される。この大きい立体構造変化は、疎水性クロマトグラフィを用いるＴａｇＲの精製を可能にする。実際に、ＴａｇＲはカルシウムの存在下（Ａ）で疎水性樹脂に結合し、カラムを徹底的に洗浄することにより汚染タンパク質の除去を可能にする。ＥＧＴＡの添加（Ｂ）により、疎水性アミノ酸はＴａｇＲ内部に隔離され、ＴａｇＲのカラムからの溶出が可能になる。この特性は、このタンパク質の高純度の達成を可能にすることが示された４２。
【図２】ｐＧＥＸ  ４Ｔ−３およびｐＥＴ１１ａベクターにおける２１℃で１６時間のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの発現レベルの比較である。レーン１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３。レーン２、ｐＥＴ１１ａ。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図３】ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターにおける２１℃で１６時間のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴおよびＧＳＴ−ｔＬＲＡＴの発現レベルの比較である。レーン１、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ。レーン２、ＧＳＴ−ｔＬＲＡＴ。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図４】ｐＥＴ１１ａにおけるＴａｇＲ−ＲＰ２の溶解性およびｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＧＳＴ−ＲＰ２の溶解性の比較である。レーン１、２および３、ＴａｇＲ−ＲＰ２；レーン４、５および６、ＧＳＴ−ＲＰ２；レーン１および５、全ライセート。レーン２および４、４℃において２０，０００ｘｇで３０分間の全ライセートの遠心分離後の上澄み。レーン３および６、遠心分離後のペレット。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図５Ａ】ｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの溶解性（レーン１、３および５）およびＧＳＴ−ｔＬＲＡＴの溶解性（レーン２、４および６）の比較である。レーン１および２、全ライセート。レーン３および４、４℃において２０，０００ｘｇで３０分間の全ライセートの遠心分離後の上澄み。レーン５および６、遠心分離後のペレット。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図５Ｂ】ＬＢ（レーン１〜３）および最少（レーン４〜６）成長培地における２１℃で１６時間のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの発現レベルおよび溶解性の比較である。レーン１および４、全ライセート。レーン２および５、４℃において２０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離後の上澄み。レーン３および６、ペレット。矢印は、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの位置を示す。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図６】ＴａｇＲ−ＲＰ２の精製および切断、ならびにその切断されたＴａｇＲ融合パートナーからのＲＰ２の分離である。レーン１、カラムに結合しなかったタンパク質。レーン２、カルシウムの存在下でのカラムの徹底的な洗浄。レーン３、カルシウムの非存在下（ＥＧＴＡの存在下）で単一段階において高度に精製されたＴａｇＲ−ＲＰ２の溶出。レーン４、プロテアーゼトロンビンを用いたＲＰ２のＴａｇＲからの定量的切断。レーン５、切断サンプルを同じカラム（フェニルセファロース）に負荷させた後、カルシウムの存在下でのＲＰ２の溶出。レーン６、ＥＧＴＡの存在下でのＴａｇＲの溶出。レーン「ａ」、分子質量標準。ＴａｇＲ−ＲＰ２の切断はカラム上で実施することもできる。トロンビンは、Ｈｉｔｒａｐ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＦＦセファロースカラムをフェニルセファロースカラムに接続することにより除去される。
【図７】ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製および切断、ならびにその切断されたＴａｇＲ融合パートナーからのｔＬＲＡＴの精製である。レーン１、最少成長培地で培養された細菌を用いた全細菌ライセート（矢印は、ｔＬＲＡＴに対応するバンドを示す）。レーン２、全ライセートの遠心分離後の上澄み（可溶性画分）。レーン３、遠心分離後のペレット（不溶性画分）。レーン４、カラムに結合しなかったタンパク質。レーン５、カラムの洗浄。レーン６、カルシウムの非存在下（ＥＧＴＡの存在下）で単一段階において高度に精製されたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの溶出。４℃で３６時間のトロンビンを用いたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの切断の結果は示されない。レーン７、切断サンプルを同じカラムに負荷させた後、カルシウムの存在下でのＴａｇＲの溶出。レーン８、純水を用いたｔＬＲＡＴの溶出。レーン「ａ」、分子質量標準。強調しなければならないのは、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製を示す電気泳動ゲル（レーン６）が、他のゲルでは１５％であるのと比べて、１２％のアクリルアミドを含有し、従って、そのそれぞれの分子質量標準（レーン「ａ」）に基づいてレーン１および６のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの分子質量（矢印を参照）が同じであることである。
【図８】ＳＤＳの存在下でのＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの疎水性フェニルセファロースカラムへの結合および融合タンパク質の精製である。レーン１、細菌ライセート。レーン２、遠心分離後の上澄み（可溶性画分）。レーン３、遠心分離後のペレット（不溶性画分）。レーン４、カラムに結合しなかったタンパク質。レーン５、ＳＤＳを含有しない緩衝液Ａによるカラムの洗浄。レーン６、図７（レーン６）に示されるデータと同様に、ＥＧＴＡの存在下で単一段階において高度に精製されたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの溶出。レーン「ａ」、分子質量標準。
【図９】ニッケル樹脂上のＳＤＳの存在下におけるＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲの切断、およびｔＬＲＡＴの精製である。レーン１、細菌ライセート。レーン２、遠心分離後の上澄み（可溶性画分）。レーン３、カラムに結合しなかったタンパク質。ＳＤＳはトロンビンの作用を妨げるため、そのあらゆる痕跡を除去するためにカラムの徹底的な洗浄を実施した。ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの切断は、トロンビンを用いて４０時間にわたりカラム上で直接行った。レーン４、０．１％のＳＤＳを用いた純粋なｔＬＲＡＴの溶出（矢印を参照）。レーン５、１５０ｍＭのイミダゾールを用いた切断ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲと一緒の非切断ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの溶出。レーン「ａ」、分子質量標準。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
略語および定義
略語
ＢＡＰＴＡ：１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸；ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸；ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸；ｔＬＲＡＴ：切断型レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ；ＲＰ２：網膜色素変性（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）２；およびＴａｇＲ：リカバリンタンパク質タグ。
【００２２】
ＧＣＡＰ：グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質；ＧＣＩＰ：グアニル酸シクラーゼ阻害タンパク質；ＫＣｈＩＰ：カリウムチャネル相互作用タンパク質；ＮＣＳ１：神経カルシウムセンサー１；ＶＩＬＩＰ−１：ビジニン様タンパク質。
【００２３】
ＴＥＶ：タバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ）ウィルス；ＨＲＶ  ３Ｃ：ヒトライノウィルス３Ｃ。
【００２４】
定義
本明細書で使用される「約」という用語は、表示された数の＋または−１０％の範囲を指す。正確を期するために、例えば、９０％と共に使用される場合の約という用語は、９０％＋／−９％、すなわち８１％〜９９％を意味する。より正確には、約という用語は、表示された数の＋または−５％を指し、例えば、９０％は、９０％＋／−４．５％、すなわち８６．５％〜９４．５％を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」への言及は複数のこのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つまたは複数の培養物および当業者に知られているその均等物への言及を含み、その他も同様である。本明細書で使用される全ての科学技術用語は、他に明確に示さない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含んでいる」（および含んでいるの任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など）、「有している」（および有しているの任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」など）、「包含している」（および包含しているの任意の形態、例えば、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など）、または「含有している」（および含有しているの任意の形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」など）という語は包括的またはオープンエンドであり、列挙されていない付加的な要素または方法ステップを排除しない。
【００２７】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、プロモーターおよび５’調節領域、コード配列および非翻訳３’領域（ポリアデニル化部位を含む）など、いくつかの作動可能に連結されたＤＮＡ断片を含む任意のＤＮＡ配列を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「発現カセット」という用語は、１つのＤＮＡ座位からの正確な除去および別の座位への挿入を容易にする、１つまたは複数の制限部位または他の部位と隣接するキメラ遺伝子を含むＤＮＡの伝達性領域を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「対象のタンパク質」という用語は、その小規模または大規模生産に当業者が関心を示し得る任意のタンパク質を意味する。
【００３０】
特定の実施形態の詳細な説明
リカバリン（全長または実質的に全長）は、タンパク質タグに適した特性を有することが現在見出されている。リカバリンは約２３ｋＤａの分子量を有し、高溶解性（＞３０ｍｇ／ｍｌ）であり、単一段階で高度に精製することができ、細菌におけるその発現レベルは非常に高い（＞３０ｍｇ／Ｌ培養物）２０。このタンパク質ファミリーの同様の機能および特性に基づいて、カルシウムに結合する神経カルシウムセンサータンパク質のＥＦハンドファミリーの他のメンバーも精製のための適切なタンパク質タグとして振る舞うことが予測される。
【００３１】
他のタンパク質タグ
リカバリンに加えて、神経カルシウムセンサータンパク質ファミリーには、ＧＣＡＰ１、ＧＣＡＰ２またはＧＣＡＰ３（グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質）、ＧＣＩＰ（グアニル酸シクラーゼ阻害タンパク質）、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２（カリウムチャネル相互作用タンパク質）、カルセニリン／ＤＲＥＡＭ、ＮＣＳ１／フリクエニン（神経カルシウムセンサー１）、ニューロカルシンデルタ、ヒポカルシン、ＶＩＬＩＰ−１（ビジニン様タンパク質）が含まれる。このタンパク質ファミリーの異なるメンバー間には大きいアミノ酸配列同一性がある。例えば、フリクエニンとニューロカルシンデルタとの間には６１％の同一性があり、フリクエニンとリカバリンとの間には４１％の同一性がある６１。
【００３２】
従って、本発明の特定の態様によると、本明細書で定義されるポリヌクレオチドが提供され、コード化タグタンパク質はリカバリンと少なくとも約４０％の同一性を含み、より具体的には、コード化タグタンパク質はリカバリンと少なくとも約６０％の同一性を含む。
【００３３】
同様に、このタンパク質ファミリーのメンバーの全体構造間には高い類似性があり、これは、平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の値を用いて推定することができる。ＲＭＳＤは、重ね合わされたタンパク質の骨格原子間の平均距離の尺度である。フリクエニンおよびニューロカルシンデルタの折り畳み全体を比較したときに１．３Åという非常に小さいＲＭＳＤ値が得られ、リクエニンおよびリカバリン間では１．７Åが得られた。同様に、Ｃａ２＋結合非ミリストイル化ＧＣＡＰ２の全体構造は、Ｃａ２＋結合非ミリストイル化リカバリンの全体構造とよく類似している（１．９ÅのＲＭＳＤ）６２。従って、ＮＣＳタンパク質ファミリーの他のメンバーは、潜在的に、リカバリンについてここで実証されるものと同様の目的のためのタグとしての機能を果たし得る。５Åよりも大きいＲＭＳＤは非相同タンパク質であると推定され、およそ２．５Åよりも小さいＲＭＳＤは相同タンパク質であると推定されている６３。
【００３４】
本発明の特定の態様によると、本明細書で定義されるポリヌクレオチドが提供され、タグタンパク質は、リカバリンの３Ｄ構造と比較したときに２．５Å未満の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む。より具体的には、本発明は、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを提供し、ＲＭＳＤは２Å未満である。
【００３５】
従って、特定の実施形態によると、タンパク質ＧＣＡＰ１、ＧＣＡＰ２およびＧＣＡＰ３、ＧＣＩＰ、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２、カルセニリン／ＤＲＥＡＭ、ＮＣＳ１／フリクエニン、ニューロカルシンデルタ、ヒポカルシン、ＶＩＬＩＰ−１は、リカバリンの場合のようにタグとして使用され得る。
【００３６】
タグ
本発明の特定の態様によると、リカバリンタグ（ＴａｇＲ）ｃＤＮＡは、新たに解剖したウシ網膜からクローン化することができるが、他の生物からのリカバリンも有用であるとみなされる。ＲＮＡは、逆転写反応のために単離して使用することができる。次に、第１のストランドｃＤＮＡは、リカバリンｃＤＮＡのコード配列を増幅するように、および特に制限部位、より具体的にはＮｄｅＩおよび／またはＢａｍＨＩ制限部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲのためのテンプレートとして使用することができる。
【００３７】
本発明の特定の態様によると、実質的に全長または全長のリカバリンｃＤＮＡは、プラスミド内に連結させて、リカバリン発現ベクターを作成することができる。
【００３８】
本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲの天然配列内のＥｃｏＲＩ部位は、サイレント変異に変化され得る。より具体的には、天然リカバリンの配列内のＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）は、部位特異的変異誘発によってＧＡＧＴＴＣ（サイレント変異）に変化され得る。
【００３９】
本出願人は、その融合パートナーを伴うＴａｇＲの精製をミリストイル基の存在が改善しないことを見出した。従って、本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲは、そのミリストイル基を伴わずに発現される。
【００４０】
本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質は、タグの主要な立体構造変化がＮ末端で生じるようにするためにタンパク質タグのＣ末端に位置する。
【００４１】
本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲは、例えば、ｔＬＲＡＴおよびＲＰ２から選択されるがこれらに限定されない対象のタンパク質のＮ末端に位置する。
【００４２】
タグのエンジニアリング
このタンパク質タグは、組換え、発現、可溶化および精製のためのタグとしてのその使用を容易にするためにさらに操作される。
【００４３】
本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲは、融合ｃＤＮＡ配列の構築を容易にするために、例えばＮｄｅＩおよび／またはＢａｍＨＩなどの制限部位をコードする１つまたは複数の配列をそのヌクレオチド配列内に導入している。
【００４４】
あるいは、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの構築中、ＥｃｏＲＩ部位に特異的な制限酵素による切断を回避するために、ＧＡＡＴＴＣにおけるサイレント変異（例えば、コード配列内で５’から位置３３０におけるＴからＣへの突然変異）を含む。
【００４５】
本発明の特定の態様によると、結果として得られるタンパク質を精製中にその融合パートナーから分離するのを容易にするために、タンパク質分解的切断部位に対応するヌクレオチド配列がＴａｇＲヌクレオチド配列に導入される。
【００４６】
特に、対象のタンパク質のｃＤＮＡの前に、特定のトロンビン切断部位をコードするヌクレオチド配列（ＬＶＰＲＧＳ）がタグＲ配列に挿入される。あるいは、例えば、ＥＮＬＹＦＱ／Ｇに対応するＴＥＶ切断部位またはＬＥＶＬＦＱ／ＧＰに対応するＨＲＶ  Ｃ３切断部位などの他のタンパク質分解的切断部位を導入することができる。
【００４７】
本発明の特定の態様によると、ミリストイル化のための酵素および基質で系が補完されていない限り、原核生物発現系において発現される場合、ＴａｇＲタンパク質はミリストイル化されない４２。本出願人は、その融合パートナーを伴うＴａｇＲの精製をミリストイル基の存在が改善しないことを見出した。従って、本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲは、ミリストイル化を可能にするために系を補完する必要もなく、基本的な原核生物発現系において発現させることができる。
【００４８】
本発明の特定の態様によると、ＴａｇＲが他のタグと共に使用可能であることを示すために、ＴａｇＲタンパク質は、対象のタンパク質のＮ末端に位置するポリＨｉｓタグにより補完される。
【００４９】
本発明の特定の態様によると、得られる融合タンパク質の溶解性をさらに高めるために、ＴａｇＲタンパク質は、第１のＴａｇＲのＮ末端に位置するさらなるＴａｇＲにより補完される。このような手順は、高度に不溶性のタンパク質の発現および精製のために有用であり得る。
【００５０】
核酸
本発明の特定の態様によると、タグポリペプチドはリカバリンをコードし、特に、リカバリンは配列番号１に対して少なくとも約９０％の核酸同一性、より具体的には、少なくとも９４％の核酸同一性を有する。より具体的には、リカバリンは実質的に全長であるか、あるいは約２３ｋＤである。
【００５１】
本発明の特定の態様によると、ポリヌクレオチドは、例えば、ＮｄｅＩおよび／またはＢａｍＨＩなどの制限部位をコードする１つまたは複数の配列がその中に導入している。あるいは、ポリヌクレオチドは、ＧＡＡＴＴＣにおけるサイレント変異を含む（例えば、コード配列内のＥｃｏＲＩ部位：５’から位置３３０におけるＴからＣへの突然変異）。
【００５２】
ベクターおよび発現系
さらに特定の態様によると、本発明は、プロモーターに作動可能に連結されている、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５３】
さらなる態様によると、本発明は、発現宿主細胞内で機能性の転写開始領域、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、および発現宿主細胞内で機能性の転写終結領域を含む発現カセットをさらに提供する。
【００５４】
最後に、本発明のこの特定の態様によると、上記において本明細書で定義される発現カセットを含む宿主細胞が提供される。
【００５５】
本発明の特定の態様によると、実質的に全長または全長のリカバリンｃＤＮＡは、プラスミド内に連結させて、リカバリン発現ベクターを作成することができる。特に、プラスミドは、ｐＥＴ１１ａ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ＰＥＸから選択され得る。さらに、プラスミドは、ｐＢＡＣ、ｐＡＫ、ＢＪ、ＭＰ、ｐＧＰＤ、ＭＷ、ｐＵＣＰ、ＣＹ、ＭＡＴ、ｐＭＳＰ、ＳＮＸ、ＰＭなどの当該技術分野においてよく知れられている一連のものから選択され得る。より具体的には、プラスミドは、ａｄｄｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）、ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）、ｐｒｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃａ）、ＥＭＢＬ（ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔなど、当業者によく知られているいくつかのカタログから選択され得る。
【００５６】
タンパク質
さらなる態様によると、本発明は、本明細書で定義されるポリヌクレオチドによりコードされる単離された組換えポリペプチド、特に本明細書で定義されるポリヌクレオチドによりコードされるタグを含む組換えタンパク質をさらに提供する。
【００５７】
あるいは、本発明は、配列番号２と少なくとも約４０％同一である、特に少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質タグを提供する。
【００５８】
さらに、あるいは、本発明は、配列番号４と少なくとも約９０％同一である、特に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質タグを提供する。さらにより具体的には、タンパク質タグは、配列番号４によって定義される通りである。
【００５９】
またあるいは、タグタンパク質はその天然のミリストイル基を欠いており、これは、その融合パートナーを伴うＴａｇＲの精製にとって必須でないことが分かった。従って、特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３に定義される通りである。
【００６０】
方法
リカバリンの精製は、カルシウムと可逆的に結合するその特性に基づく。リカバリンは、カルシウムと結合すると大きい立体構造変化を受ける２１−２４（図１）。カルシウムのない状態では、リカバリンのミリストイル基およびいくつかの疎水性残基は、深い疎水性ボックス内に隔離される（図１Ｂ）。しかしながら、その４つのＥＦハンドのうちの２つへのカルシウム結合は、このミリストイル基およびいくつかの疎水性残基の押出を誘発する２４（図１Ａ）。カルシウムの存在は、その疎水性アミノ酸の押出の結果としてカラムへのＴａｇＲの結合を可能にする。しかしながら、注目すべきことに、本発明者らは、このミリストイル基の存在が、その融合パートナーを伴うＴａｇＲの精製を改善しないことを見出した。
【００６１】
逆に、ＥＧＴＡによるカルシウムイオンのキレート化は、ＴａｇＲの大きい立体構造変化をもたらし、タンパク質内部のその疎水性残基の隔離を引き起こす（図１Ｂ）。
【００６２】
従って、本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質の精製は、純粋なリカバリンの場合のように単一段階の疎水性クロマトグラフィで実行することができる２０。本出願人は、カラムからのその溶出を可能にするためにＥＧＴＡを用いてカルシウムが除去されたときに、ＴａｇＲのＣ末端における対象のタンパク質の融合が、リカバリンの典型的な大きい立体構造変化の発生を妨げないことを見出した。
【００６３】
従って、対象のタンパク質は、タンパク質分解により、特にトロンビンを用いてＴａｇＲから切断および分離することができる。次に、対象のタンパク質は、切断サンプルに単にカルシウムを添加することによってＴａｇＲから分離される。結果として、リカバリンはその疎水性アミノ酸を露出させ、それにより、疎水性樹脂に対するその結合が可能になる。これにより、そのＴａｇＲ融合パートナーを含まない、精製された対象のタンパク質の溶出が可能になる。次に、ＴａｇＲは、例えば、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡまたはＢＡＰＴＡなどのカルシウムキレート剤を含有する緩衝液を用いて個別に溶出される。
【００６４】
従って、本発明の特定の態様によると、対象のタンパク質の発現および精製のための方法が提供され、本方法は、発現系において実質的に全長のＴａｇＲに融合されたタンパク質を発現させるステップと、融合タンパク質を精製するステップとを含む。特に、精製ステップは、カルシウムキレート剤の存在下で融合タンパク質を疎水性親和性カラムから溶出させることと、任意選択的に、ＴａｇＲから切断された対象の精製タンパク質を得るために、溶出した融合分子を切断することとによって実行される。さらに、特に精製ステップは、対象の融合タンパク質をＴａｇＲから切断して、切断されたタンパク質／タグ混合物を得ることと、カルシウムの存在下で切断された対象のタンパク質／タグ混合物を疎水性親和性カラムにおいて溶出させることにより、切断された対象のタンパク質をタグから分離することとによって実行される。
【００６５】
特定の態様によると、本発明は、対象のタンパク質を生産するための方法も提供し、本方法は、対象のタンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を成長させることを含み、細胞は、本明細書で定義されるポリペプチド、または本明細書で定義されるベクター、または本明細書で定義される発現カセットを含む。
【００６６】
特定の実施形態によると、本発明の融合ポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞を、通常のＬＢ成長培地よりも最少成長培地で培養したときに、著しく高レベルの発現および溶解性が得られる（成長培地を除いて培養条件は全て同じである）。実際に、いくつかの不溶性タンパク質は最少成長培地中でより強く発現され、より可溶性である。従って、特定の態様によると、本発明は、対象のタンパク質、特に不溶性タンパク質を生産するための方法も提供し、本方法は、本明細書で定義される細胞を、不溶性タンパク質のより良好な折り畳みを可能にするために最少成長条下で成長させることを含む。
【００６７】
洗浄剤の存在
また、ＴａｇＲは、洗浄剤の存在下で高度に不溶性のタンパク質の精製も可能にし、これは、ＧＳＴを用いて達成することはできない。実際に、ＳＤＳは、精製に使用されるカラムに対する融合ＴａｇＲ−タンパク質の結合を妨げない。
【００６８】
キット
特定の態様によると、本発明は、対象のタンパク質の発現および精製のためのキットも提供し、本キットは、本明細書で定義されるポリヌクレオチド；および／またはタンパク質を適切なベクターに挿入する方法についての説明書；および／またはベクターを宿主細胞に形質転換する方法についての説明書；および／または組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書を含む。
【００６９】
あるいは、対象のタンパク質の発現および精製のためのキットは、本明細書で定義されるベクターまたは本明細書で定義される発現カセット；および／またはベクターを宿主細胞に形質転換する方法についての説明書；および／または組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する方法についての説明書；および／または本発明の方法に従って組換え融合タンパク質を精製する方法についての説明書を含む。
【００７０】
以下の実施例は、本発明の製造および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提示されるものであり、本発明者らがその発明であると考えるものの範囲を限定することは意図されず、また、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であると示すことも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、割合は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００７１】
従って、融合タンパク質パートナーの発現および溶解性を改善するリカバリンの特性を以下の実施例においてＧＳＴタグの場合と比較した。
【実施例】
【００７２】
実施例１  −  材料および方法
１．１  ｔＬＲＡＴ、ＲＰ２およびリカバリンのクローニング
本研究では、２つの対象のタンパク質：切断型レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ｔＬＲＡＴ、アミノ酸３１〜１９６）および網膜色素変性２（ＲＰ２）を使用した。ヒトｔＬＲＡＴは、既に記載されたように、プラスミドｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてクローン化されている４７，４８。簡単に言うと、新たに解剖したヒト網膜色素上皮からのＲＮＡをＴｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）により単離し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（登録商標）Ｈ  ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いる逆転写反応のために使用した。一方向性のクローニングを保証するために、付加的なＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２  Ｉ制限部位を各プライマーの５’端部に取り付けた。次に、ＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２  ＩによりｐＥＴ１１ａベクターを直線化し、続いて、ｔＬＲＡＴに対応する精製ＰＣＲ産物と連結させた。
【００７３】
ＧＳＴ融合タンパク質を発現させるためにｐＧＥＸ−４Ｔ−３プラスミドにおいてクローン化されたヒトＲＰ２構築物は、Ｄｒ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｗｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの贈呈物であった。リカバリン（ＴａｇＲ）ｃＤＮＡは、既に記載されたように、ｐＥＴ１１ａ−Ｒｅｃベクターを作るために、新たに解剖したウシ網膜からクローン化されている４２。ＲＮＡをＴｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔにより単離し、逆転写反応のために使用した（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄキット）。次に、第１のストランドｃＤＮＡを、リカバリンｃＤＮＡのコード配列を増幅するように、かつＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。次に、リカバリンの全長ウシｃＤＮＡをｐＥＴ１１ａプラスミド内に連結させた。
【００７４】
１．２  ｐＥＴ１１ａおよびｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＴａｇＲまたはＧＳＴと融合された、またはＰｏｌｙＨｉｓタグと共に融合されたｔＬＲＡＴおよびＲＰ２の異なる構築物の調製
ｔＬＲＡＴまたはＲＰ２のコード領域は、ｐＥＴ１１ａ−Ｒｅｃベクター（終止コドンを持たない）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入された。ＴａｇＲの配列内に、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ，Ａｇｉｌｅｎｔ）によってＧＡＧＴＴＣ（サイレント変異）に変化されているＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）が存在したことは注目すべきである。さらに、ｔＬＲＡＴまたはＲＰ２のｃＤＮＡの前に、５つのグリシン、および次に特異的トロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）を挿入した。最終構築物は次の通りである：ＢａｍＨＩ−ＴａｇＲ−５グリシン−トロンビン切断部位−ｔＬＲＡＴまたはＲＰ２−ＥｃｏＲＩ。ＲＰ２は、ＧＳＴと融合して提供した（ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、上記を参照）。これには、ｐＥＴ１１ａについて上で説明されたように、５グリシンおよびトロンビン切断部位が含まれた。ｔＬＲＡＴコード配列は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入された。従って、ＴａｇＲおよびＧＳＴタグは、ｔＬＲＡＴおよびＲＰ２のＮ末端に位置した。上に記載されるＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ構築物を用いて、ｐｏｌｙＨｉｓ（１０ヒスチジン）タグもＴａｇＲと共に使用した。従って、１０ヒスチジンおよび５グリシンは、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ構築物を生産するために適切なプライマーを用いるＰＣＲによってＴａｇＲのＮ末端に付加されている。
【００７５】
１．３  ＴａｇＲ−ＲＰ２、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ、ＧＳＴ−ＲＰ２およびＧＳＴ−ｔＬＲＡＴの発現
ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ、ＴａｇＲ−ＲＰ２、ＧＳＴ−ｔＬＲＡＴおよびＧＳＴ−ＲＰ２のプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｌ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、ＬＢ培地中で飽和状態になるまで一晩成長させた。次に、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有する新しいＬＢに形質転換培養物を播種し、攪拌（２５０ｒｐｍ）下、Ａ６００ｎｍ＝０．６になるまで３７℃でインキュベートした。次に、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）（ｐＥＴ１１ａまたはｐＧＥＸベクターにおける構築物のそれぞれについて０．５および０．１ｍＭ）によりその発現を誘発した後、２１℃で１６時間インキュベーションを行った。次に、３，２７５ｇで２５分間の遠心分離により細菌を沈降させた。まず、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル、プロテアーゼ阻害剤）を含む４ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチーム２５０μｌを用いて細菌溶解を行った。再懸濁した細胞を氷上に３０分間保持した。次に細胞を超音波処理し、４℃において２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。この基の存在が、その融合パートナーを伴うＴａｇＲの精製を改善しないことを本発明者らが見出したように、そのミリストイル基がなくてもＴａｇＲが発現されたことは注目すべきである４２（図１）。いくつかの実験は、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ベタイン、Ｎａ２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、０．２％のグルコース、チアミンおよびＭｇＳＯ４およびＳｔｕｄｉｅｒ４９の塩を含有する最少成長培地において２１℃で１６時間にわたり融合タンパク質を発現させることによっても実行された（比較のため、ＬＢ培地は、はるかに多い量の栄養物：トリプトンおよび酵母抽出物およびＮａＣｌを含有する）。
【００７６】
１．４  ＴａｇＲ−ＲＰ２およびＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製
ＴａｇＲ−ＲＰ２またはＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの発現から得られた５０ｍｌの細菌培養物からのペレットは、それぞれ４．７５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）または緩衝液Ｂ（５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中に再懸濁された。細菌溶解（実施例１．３を参照）および遠心分離（４℃において２０，０００ｇで３０分間）後、透明化されたライセートを、緩衝液Ａ（ＴａｇＲ−ＲＰ２）またはＢ（ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ）により予め平衡化された５ｍｌのフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ  ｓｕｂ  樹脂；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに負荷した。これらの融合タンパク質の精製は４℃で実施した。１ｍＭのカルシウムの存在は、その疎水性アミノ酸の押出（図１Ａ）の結果としてＴａｇＲのカラムへの結合を可能にする。次に、少なくとも１０カラム体積の緩衝液Ａ（ＴａｇＲ−ＲＰ２）またはＢ（ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ）でカラムを洗浄して、非特異的に吸着したタンパク質を除去した。次に、ｐＨ７．５の５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭのＥＧＴＡを含有する緩衝液Ｃを用いて融合タンパク質を溶出させた。実際に、ＥＧＴＡによるカルシウムイオンのキレート化は、ＴａｇＲの大きい立体構造変化をもたらし、その結果、その疎水性残基がタンパク質内部に隔離される（図１Ｂ）。次に、トロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて溶液中でＴａｇＲのその融合パートナーからの切断を達成した。１つの切断単位は、穏やかに攪拌しながら４℃で４８時間にわたり１００μｇの融合タンパク質を消化する。次に、切断された融合タンパク質に１０ｍＭのＣａＣｌ２を添加し、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝液Ａ（ＴａｇＲ−ＲＰ２）またはＢ（ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ）により予め平衡化された同じカラムに負荷した。精製されたＲＰ２はカラムに結合せず、第１の画分中に捕集される。Ｈｉｔｒａｐ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＦＦセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をフェニルセファロースカラムに接続することによりトロンビンを溶離液から除去し；ベンズアミジンは、樹脂に共有結合したトロンビンの合成阻害剤である。ＴａｇＲおよび最終的に残存する非切断ＴａｇＲ−ＲＰ２融合タンパク質は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するカラムに結合する。５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液Ｄを用いてＴａｇＲおよび融合タンパク質を溶出させた。対照的に、切断されたｔＬＲＡＴはその疎水性のために疎水性カラムに強力に結合する（実施例５．１を参照）。カラムを緩衝液Ｄによる洗浄（これによりトロンビンが除去され、ＴａｇＲおよび最終的に残存する非切断ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ融合タンパク質が溶出される）後、純粋なｔＬＲＡＴを純水で溶出させた。次に、濃縮ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）およびクエン酸緩衝液を直ちに精製ｔＬＲＡＴに添加し、その沈殿を回避するためにそれぞれ０．０５％および１０ｍＭの最終濃度に到達させた。
【００７７】
１．５  ＳＤＳの存在下におけるＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの疎水性カラムへの結合、および融合タンパク質の精製
ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ融合タンパク質は、０．０５％のＳＤＳも含有する（これにより融合タンパク質の徹底的な可溶化が可能になった）緩衝液Ａ（実施例１．４）中に細菌培養物を再懸濁させたことを除いて、実施例１．３に記載されるように発現された。遠心分離の上澄みをｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに負荷した。タンパク質の最大部分が０．０５％ＳＤＳの存在下でカラムに結合し、これはＧＳＴタグに当てはまらない。次に、少なくとも２０カラム体積のＳＤＳを含まない（融合タンパク質の切断は、ＳＤＳの存在下ではトロンビンにより達成することができない）同じ緩衝液によりカラムを洗浄した。緩衝液Ｃ（実施例１．４を参照）を用いてＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴを溶出させた。これらの特定の実験ではＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの切断をアッセイしなかったが、実施例１．６に記載されるようなカラムにおいて直接実施するか、または融合タンパク質の溶出後に実施することができる。精製されたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴは、ＳＤＳの非存在下において可溶性のままである。
【００７８】
１．６  ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの発現、精製、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲの切断、およびｔＬＲＡＴの精製
ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ融合タンパク質は、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴについて記載されるように（実施例１．３を参照）発現された。５０ｍｌの細菌培養物からのペレットを１０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１．４μｇ／μｌアプロチニン）中に再懸濁する。まず、細菌を３サイクルの凍結−融解により破壊し、次に細胞懸濁液を氷上で３分間（５秒サイクル）超音波処理した。次に、細菌を１３，０００ｘｇで３０分間にわたり遠心分離した。上澄みを廃棄し、ローディング緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ７．８）中に膜ペレットを再懸濁した。次に、上澄みをＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。５００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、３０ｍＭのイミダゾールおよび１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２００ｍｌの緩衝液、および次に５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮＤＳＢ２０１（３−（１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホナート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する付加的な緩衝液によりカラムを順次洗浄した。次に、トロンビンをカラム上で直接用いて、室温で４０時間にわたりＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲをｔＬＲＡＴから切断した。さらに、６カラム体積の切断に使用した緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮＤＳＢ２０１、１ｍＭのＣａＣｌ２）（これはトロンビンの除去を可能にする）によりカラムを洗浄した。次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＳＤＳおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液を用いてｔＬＲＡＴを溶出させた。最後に、５００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭのイミダゾールおよび０．１％のＳＤＳを含有する緩衝液を用いて、切断されたＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲおよび非切断融合タンパク質を溶出させた。
【００７９】
１．７  ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット
タンパク質の発現レベルおよび純度の分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動セルにおいて実行した。１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアシルアミドゲル電気泳動）（または１２％アクリルアミド、実施例４．２および図７を参照）を用いてタンパク質サンプルを分離した。次に、電気泳動法ゲルをクマシー染色し、染色済みタンパク質分子質量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質の同定を実施した。ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ、ＧＳＴ−ｔＬＲＡＴ、ＴａｇＲ−ＲＰ２およびＧＳＴ−ＲＰ２、ならびに精製ｔＬＲＡＴおよびＲＰ２に帰属されるバンドの同一性は、これらの特異的タンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロットにより、かつ精製ｔＬＲＡＴ、ＲＰ２およびリカバリンについては質量分析により確認した。
【００８０】
実施例２  −  ベクターおよび融合タグの種類に対するタンパク質発現レベルの依存性の比較
２．１  異なるベクターを用いてＴａｇＲと融合したタンパク質発現の比較
融合タグは、その発現を改善し、その分解を低減することにより、対象のタンパク質の全収率を潜在的に増大させることができる２。しかしながら、タンパク質発現レベルは、クローニングベクター中に存在するプロモーターに高度に依存する。従って、ｐＥＴ１１ａおよびｐＧＥＸ−４Ｔ−３発現ベクター内のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの発現は、同じ培養条件を用いて実施した。次に、その発現レベルは、細菌溶解後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した。図２に示されるように、ｐＥＴ１１ａまたはｐＧＥＸ−４Ｔ−３においてクローン化したときにＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴにより同様のレベルの発現が得られた（矢印を参照）。実際に、これらの２つのベクターを用いて発現させたときに、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴのバンドの強度は同様である。ＴａｇＲ−ＲＰ２を用いて同じ実験を実行し、同様の結果を得た。従って、ｐＥＴ１１ａおよびｐＧＥＸ−４Ｔ−３は、本発明者らの実験で対象のタンパク質を発現させるために等しく使用することができる。
【００８１】
２．２  同じベクターを用いてＴａｇＲおよびＧＳＴと融合したタンパク質発現の比較
同じ条件を用いてベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３においてＴａｇＲまたはＧＳＴのいずれかと融合してｔＬＲＡＴを発現させた。図３に示される溶解細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見られるように、ＴａｇＲと融合したｔＬＲＡＴの発現レベルは、ＧＳＴと融合したものと同様である。実際に、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴのバンドの強度は、対応するＧＳＴ−ｔＬＲＡＴと同様である（矢印参照）。従って、ＴａｇＲまたはＧＳＴと融合したこれらの２つの対象のタンパク質の発現レベル間に有意な差はない。従って、これに関連して、ＴａｇＲは、これらの２つのタンパク質の発現を改善するその能力に関してＧＳＴと類似した特性を有すると結論付けることができる。
【００８２】
実施例３  −  ＴａｇＲおよびＧＳＴタグを用いた融合タンパク質の溶解性の比較
３．１  ＲＰ２の溶解性はＧＳＴと融合するよりもＴａｇＲと融合した場合にはるかに大きい
ｐＥＴ１１ａまたはｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターを用いた同じ融合タンパク質（図２）、ならびに同じベクターにおいてＴａｇＲまたはＧＳＴと融合した同じ対象のタンパク質（図３）について同様のレベルの発現が得られた。従って、ｐＥＴ１１ａにおけるＴａｇＲ−ＲＰ２およびｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＧＳＴ−ＲＰ２は、その発現レベルを比較するために同じ条件を用いて発現させた。図４は、細菌の溶解後、ＧＳＴ−ＲＰ２（レーン５）の方がＴａｇＲ−ＲＰ２（レーン１）よりも大きい発現レベルが得られることを示す（ＴａｇＲ−ＲＰ２およびＧＳＴ−ＲＰ２に対応するバンドの矢印を参照）。しかしながら、ＴａｇＲ−ＲＰ２はＧＳＴ−ＲＰ２よりも溶解性が高い。実際に、溶解細菌の遠心分離により、上澄み（可溶性画分、レーン２および４）およびペレット（不溶性画分、レーン３および６）の分析が可能になった。不溶性ＴａｇＲ−ＲＰ２（レーン３）の量は、ペレットのＧＳＴ−ＲＰ２（レーン６）の量と比べて非常に小さいことが分かる。従って、可溶性ＴａｇＲ−ＲＰ２（レーン２）の量と不溶性ＴａｇＲ−ＲＰ２（レーン３）の量との比は、ＧＳＴ−ＲＰ２（レーン４とレーン６とを比較）の場合よりもはるかに大きい。従って、ＴａｇＲは、ＧＳＴの場合よりもはるかに良好なＲＰ２の溶解性を提供する。
【００８３】
３．２  ＴａｇＲまたはＧＳＴと融合されたｔＬＲＡＴと、異なる成長培地において融合されたｔＬＲＡＴとの溶解性の比較
ｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴまたはＧＳＴ−ｔＬＲＡＴについて同様の溶解性が得られた。実際に、図５Ａにおいて分かるように、上澄み中の可溶性ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ（レーン３）の量は、ＧＳＴ−ｔＬＲＡＴ（レーン４）の量と同様である。従って、同様の量の不溶性ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ（レーン５）およびＧＳＴ−ｔＬＲＡＴ（レーン６）が得られた。また図５Ａは、細菌溶解後、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ（レーン１）またはＧＳＴ−ｔＬＲＡＴ（レーン２）と融合した、同様のレベルのｔＬＲＡＴの発現が得られたことも示し、これは、図３に示されるデータとも一致する。従って、ＴａｇＲおよびＧＳＴは、同様であるが低いｔＬＲＡＴの溶解性を提供する。従って、これらのデータは、ｔＬＲＡＴを可溶化するためにＴａｇＲおよびＧＳＴタグを同等に使用することができるが、これらの融合パートナーがｔＬＲＡＴを可溶化するためにあまり効率的でないことを示唆する。これは、このタンパク質の高疎水性と一致する（実施例５．１を参照）。しかしながら、タンパク質が最少成長培地を用いて発現される場合、ＴａｇＲはＧＳＴよりも良好に機能する（図５Ｂ）。
【００８４】
図５Ｂにおいて分かるように、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３におけるＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴが通常のＬＢ成長培地よりも最少成長培地で培養される場合、著しく大きいレベルの発現および溶解性が得られる（培養条件は成長培地を除いて全て同じである）。実際に、最少成長培地のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴのバンドの強度（レーン４）は、通常のＬＢ成長培地（レーン１）よりもはるかに高い。従って、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴは、最少成長培地においてより強力に発現される。加えて、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの溶解性は、最少成長培地で成長させた場合（レーン５）、通常のＬＢ成長培地で成長させた場合（レーン２）よりもはるかに高い。レーン２および５の可溶性タンパク質のそれぞれの量を比較すると、最少成長培地（レーン６）よりも通常のＬＢ成長培地（レーン３）を用いてより大量の不溶性ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴが産生される。ｔＬＲＡＴの完全な可溶化は、ＳＤＳの存在を必要とする（実施例５．１を参照）。対照的に、最少成長培地におけるＧＳＴ−ｔＬＲＡＴについては発現が得られなかった。従って、ＬＢおよび最少成長培地を用いるＧＳＴ−ｔＬＲＡＴの発現および溶解性は、比較することができず、従ってこれらの結果は示されない。
【００８５】
実施例４  −  ＴａｇＲ融合タンパク質の精製、ＴａｇＲの切断、および対象のタンパク質の精製
４．１  ＴａｇＲ−ＲＰ２の精製、ＴａｇＲの切断、およびＲＰ２の精製
図６は、フェニルセファロースにおける単一段階の疎水性クロマトグラフィを用いて高度に精製されたＴａｇＲ−ＲＰ２が得られたことを示す。純粋なリカバリンの場合のように、ＥＧＴＡを用いて、高度に精製されたＴａｇＲ−ＲＰ２が溶出された（レーン３、矢印を参照）４２。従って、これらのデータは、ＲＰ２のリカバリンとの融合が、ＥＧＴＡを用いてカルシウムが除去されたときに起こるリカバリンの大きい立体構造変化（図１Ｂ）を妨げず、カラムからのその溶出を可能にすることを示唆する。さらに、タンパク質の切断後に融合タンパク質が残らない（レーン４）ため、トロンビンを用いるタンパク質分解時に定量的な切断が得られる。次に、カルシウムを切断サンプルに添加することにより純粋なＲＰ２をＴａｇＲから分離した。結果として、ＴａｇＲは、その疎水性アミノ酸を露出させ（図１Ａ）、それにより、そのフェニルセファロース樹脂への結合が可能になる。これは、そのＴａｇＲ融合パートナーを含まない精製ＲＰ２の溶出を可能にする（レーン５、矢印を参照）。次に、ＴａｇＲは、ＥＧＴＡを含有する緩衝液を用いて溶出される（レーン６、矢印を参照）。従って、ＴａｇＲとの融合でＲＰ２を高度に発現させることができ、ＴａｇＲ融合パートナーを良好に切断することができ、汚染物質を含まない精製ＲＰ２が得られる。これに関して、ＴａｇＲ（本発明のデータ）およびＧＳＴ５０は、ＲＰ２を発現および精製するために同様に機能する。しかしながら、ＴａｇＲはカラム上および溶液中の両方で切断を可能にするが、ＧＳＴの場合、結合グルタチオンの透析を回避するために、切断はカラム上で実施されなければならない。
【００８６】
４．２  ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製、ＴａｇＲの切断、およびｔＬＲＡＴの精製
図７は、フェニルセファロースにおける単一段階の疎水性クロマトグラフィを用いて高度に精製されたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴが得られたことと、この融合タンパク質の切断およびｔＬＲＡＴの精製を達成できたこととを示す。図５Ｂに示されるように、最少成長培地で培養された細菌で発現される場合、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの大部分は可溶性である。ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴが、細菌ライセートから完全に可溶化されるためにＳＤＳの存在を必要とすることは注目すべきである（実施例５．１を参照）。それにもかかわらず、図７において、全ライセート中のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴのバンドの同一性（レーン１、矢印を参照）は、全ライセートの遠心分離後の上澄み中のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ（レーン２）と同様であるが、ペレット中にごくわずかなＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ（存在する場合）のみを見出し得る（レーン３）ことが分かる。従って、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴは高溶解性である。カラムの徹底的な洗浄（レーン５）後、純粋なＴａｇＲ−ＲＰ２の場合（実施例４．１を参照）のように、ＥＧＴＡを用いて、高度に精製されたＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴが溶出された（レーン６、矢印を参照）。さらに、次にトロンビンを用いてＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴを切断した（データは示さず）。ＥＧＴＡを含有する緩衝液を用いてＴａｇＲを溶出させたが（レーン７、矢印を参照）、そのＴａｇＲ融合パートナーを含まない精製ｔＬＲＡＴは、純水を用いて溶出させた（レーン８、矢印を参照）。なぜなら、恐らくそれが非常に高度に疎水性のタンパク質であり、恐らくｔＬＲＡＴの疎水性カラムへの強力な結合をもたらすからである。ＳＤＳを含有する緩衝液を用いてｔＬＲＡＴが溶出され得ないことは注目すべきである。タンパク質の沈殿を回避するために、精製されたｔＬＲＡＴ画分にＳＤＳを直ちに添加しなければならないことを強調する必要がある。
【００８７】
実施例５  −  ＴａｇＲ融合タグが単独でまたは別のタグと共にＳＤＳの存在下でタンパク質精製を可能にし得ることの実証
５．１  ＳＤＳの存在下でのＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの疎水性カラムへの結合、および融合タンパク質の精製
ｔＬＲＡＴは非常に疎水性のタンパク質であり、高溶解性の融合パートナーの非存在下では、その可溶化のために洗浄剤の存在を必要とする。本発明者らは、実際に、アッセイした多数の洗浄剤の中でＳＤＳ（０．０５％ｐ／ｖ；ｃｍｃ  約０．１７〜０．２３％）のみがｔＬＲＡＴの完全な可溶化を可能にしたことを示した４８。高濃度のＳＤＳは、タンパク質の変性をもたらし得る５１。従って、本発明者らは、ｔＬＲＡＴの酵素活性が０．０５％〜１％のＳＤＳでは変化しないままであること、およびこの活性が文献４８で報告される最大活性よりも５５，０００倍高いことを実証した。従って、この濃度範囲のＳＤＳはｔＬＲＡＴに有害な影響を与えないと結論付けることができる。図８に示されるように、０．０５％のＳＤＳを細菌ライセートに添加すると、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの最大部分の可溶化が可能になった（レーン１）。ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴは、遠心分離後、ほとんど上澄み中にのみ見出すことができる（それぞれレーン２および３の可溶性画分および不溶性画分のＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴのバンドの強度と比較、矢印を参照）。ペレットは、実際に融合タンパク質をほとんど含有しない（レーン３）。図８は、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの大部分がＳＤＳの存在下でフェニルセファロースカラムに結合する（レーン４）が、ＧＳＴのグルタチオンカラムへの結合はＳＤＳの存在下で観察されない４１ことを実証する。ＳＤＳのあらゆる痕跡を除去して、トロンビンを用いるカラム上でのＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの切断を可能にする（本実験ではアッセイなし）ため、カラムを徹底的に洗浄した（レーン５）。最後に、ＳＤＳの非存在下でＥＧＴＡ緩衝液を用いてＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴを溶出させた（レーン６）。
【００８８】
５．２  ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの精製、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲの切断、およびｔＬＲＡＴの精製
デュアルタグ、またはタンデム精製手順が近年開発されている１，４，９，１１，１２，２２，２３。これは、両方がＮ末端もしくはＣ末端において、または一方がＮ末端および他方がＣ末端においてクローン化され得る２つの異なるタグからなる。しかしながら、これらのタグは、対象のタンパク質の単一の端部に位置する場合により容易に切断することができる。デュアルタグは、好ましくは、可溶化および精製タグを含むべきである。単一の精製ステップはクローニング戦略が適切に設計される場合に達成することができるが、これは、現在までほとんど達成されていない。本発明者らの実験では、ｔＬＲＡＴと融合したＴａｇＲのＮ末端にＰｏｌｙＨｉｓタグをクローン化して、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの構築を生じさせた。精製は、ＳＤＳの存在下でＰｏｌｙＨｉｓタグの結合を可能にする固定化金属親和性クロマトグラフィを用いて達成された。また、精製は、恐らく、図８に示されるようにＳＤＳの存在下で疎水性フェニルセファロース樹脂に結合するＴａｇＲの特性を用いても実施され得る。ＳＤＳは、ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴ融合タンパク質の徹底的な可溶化を可能にする（図９のレーン１および２を比較）。カラムを徹底的に洗浄した後、トロンビンをカラムに注入し、３６時間インキュベートした。それにより、ｔＬＲＡＴがＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲタグから切断された。次に、ＳＤＳを用いて純粋なｔＬＲＡＴをカラムから溶出させた（レーン４）。非切断融合タンパク質および切断ＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲは、最後にイミダゾールを用いて溶出させた（レーン５）。
【００８９】
実施例６  −  デュアルＴａｇｓＲタグ化タンパク質
デュアルＴａｇｓＲは、疎水性フェニルセファロース樹脂に結合するその特性を妥協することなく、対象のタンパク質の溶解性をさらに高めるために使用される。このために、第１のリカバリン融合パートナーのＣ末端に第２のリカバリン分子がクローン化される。発現および精製は、既に記載されたように実行される。
【００９０】
考察
ＴａｇＲおよびＧＳＴの特性を比較したとき、本発明者らは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３で形質転換された細菌のペレットが、通常、ｐＥＴ１１ａで得られるよりもはるかに多いことを観察した。しかしながら、これは、図２において観察されるように、より多量の対象のタンパク質の発現をほとんどもたらさなかった。しかしながら、ｐＥＴ１１ａ中のＴａｇＲ−ＲＰ２よりも高いｐＧＥＸ−４Ｔ−３中のＧＳＴ−ＲＰ２の発現が観察されたが、これはＴａｇＲ−ＲＰ２よりも少ない可溶性ＧＳＴ−ＲＰ２の部分をもたらした（図４）。
【００９１】
タンパク質発現の増大は興味深い結果であるが、主要な課題は、可溶性タンパク質を得ることである。実際に、タンパク質の高発現は、タンパク質の溶解性に有害であり得る。実際に、高発現率では、タンパク質の折り畳みは、より低い発現率で実施される場合ほど効率的でない可能性がある。これは、通常のＬＢ培地および最少発現成長培地で細菌を培養したときに可溶性タンパク質の産生を比較した図５Ｂにおいて十分に認識することができる。データは、少量の栄養物を含有する最少発現成長培地によってタンパク質の産生が減速される場合、より可溶性で恐らくより良好に折り畳まれたタンパク質が産生されることを明らかに示す１４。
【００９２】
本発明者らは、意図的に、可溶化するのが困難なタンパク質のｔＬＲＡＴを用いて実験の大部分を実施することを選択した。実際に、ｔＬＲＡＴは、図５Ａに示されるように、ＧＳＴまたはＴａｇＲ融合パートナーのいずれを用いても溶解性が低い。しかしながら、上述したように、ＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴは、最少成長培地で培養した細菌を用いるとはるかにより可溶性になるが（図５Ｂ）、ＧＳＴ−ｔＬＲＡＴのタンパク質発現は、これらの条件下で得ることができない。従って、これは、ＧＳＴと比べてＴａｇＲ技術の明らかな利点である。また、ＴａｇＲは洗浄剤の存在下におけるｔＬＲＡＴの精製も可能にし、これは、ＧＳＴを用いて達成することができない。実際に、ＳＤＳは、その精製に使用されるカラムに対するＴａｇＲ−ｔＬＲＡＴの結合を妨げないが（図８）、同じ洗浄剤の存在下でＧＳＴ融合タンパク質のグルタチオン樹脂への結合は観察できない４１。産業界からの主要な関心は、この技術が、低分子質量タンパク質から高分子質量タンパク質までの広範な対象のタンパク質の可溶化を可能にするはずであることである。
【００９３】
本発明者らは、デュアルＴａｇＲ（１つのＴａｇＲが別のＴａｇＲのＣ末端においてクローン化される）融合パートナーが、疎水性フェニルセファロース樹脂に結合するその特性を妥協することなく対象のタンパク質の溶解性をさらに高めることを可能にし得ると予測した。次に、デュアルＴａｇＲは、「可溶化が困難な」対象のタンパク質の可溶化に関して改善された技術を表し得る。最も重要なのは、その可溶化のために洗浄剤を使用しなければならない場合でも、対象のタンパク質の精製を達成可能なことであり得る。これは、融合パートナーとしてＴａｇＲを用いる場合に可能であることが示された（図８）。
【００９４】
産業界からの付加的な関心は、その融合パートナーからのその切断後に可溶性の対象のタンパク質の産生である。ＲＰ２およびｔＬＲＡＴは、ＴａｇＲからのその切断後に可溶性のままであることが示された（図６および７）。ＳＤＳは、ｔＬＲＡＴの沈殿の防止を可能にする（図７および９）。従って、本発明者らは、その切断および精製後も可溶性のままである「可溶化が困難な」対象のタンパク質（ｔＬＲＡＴ）を精製することに成功し、それにより産業界の関心を満足させる。
【００９５】
デュアルタギング方法は、近年、例えば、溶解性向上タグおよび精製タグを組み合わせることによって使用されている。しかしながら、この手順は、構築物を慎重に計画しないとタグの除去を複雑にする。従って、本発明者らは、ＰｏｌｙＨｉｓタグをＴａｇＲのＮ末端に付加して、これらがタンデムに使用できるかどうか見極めた。このアプローチにより、ＴａｇＲを単独で使用した場合（図７）のように、ｔＬＲＡＴの精製およびＰｏｌｙＨｉｓ−ＴａｇＲタグの除去を同時に行うことが可能になった（図９）。
【００９６】
ＧＳＴは、その高溶解性のため、また、通常、そのグルタチオン基質と共有結合する樹脂を用いる単一段階の親和性クロマトグラフィを使用してタンパク質精製を可能にするため、圧倒的に最も広く使用されるタンパク質タグである。しかしながら、洗浄剤の使用は、ＧＳＴタグのグルタチオン樹脂への結合を防げ４１、従って、これにより広範なタンパク質、特に膜に関連するタンパク質（これらは、その可溶化のために通常洗浄剤を必要とするため）に対するその使用が制限される。加えて、グルタチオンに対するＧＳＴの高親和性は、プロテアーゼ消化後に切断されたＧＳＴからの対象のタンパク質の直接的な精製を妨げる。実際に、グルタチオンをＧＳＴから除去するためにまず透析が実施されなければならず、これにより精製手順が長くなり、通常、タンパク質の収率の低下が起こる。対照的に、洗浄剤の存在は、アッセイしたＴａｇＲ融合タンパク質のタンパク質精製を妨げない。さらに、ＧＳＴのその樹脂への結合の緩徐な速度論に関する懸念が生じており、これは、非常に時間のかかる細胞ライセートのクロマトグラフィカラムへの負荷がもたらす５２。
【００９７】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）５３は、２番目に多く使用されるタンパク質タグである。これは、いくつかの対象のタンパク質の溶解性を増大させることが示されている５４，５５。また、これはＭＢＰのアミロース基質と共有結合する低コストの樹脂による親和性精製を可能にするため、魅力的であることも見出された。しかしながら、本発明者らおよび他者らは５６−５８、ＭＢＰ融合タンパク質がアミロース樹脂に適切に結合できないことを見出した。従って、ＭＢＰは、その融合パートナーの精製を達成するために他のタグと組み合わせて使用されることが多いが、これにより精製手順が長くなり、タンパク質の収率の低下およびこれらの実験のコストの増大が起こる２。従って、安価な技術であるが、親和性クロマトグラフィを用いて単一段階でその融合タンパク質パートナーの精製を達成するのが困難であることは、このタンパク質タグに対する関心を低下させている。
【００９８】
チオレドキシン５９およびユビキチン様調節剤（ＳＵＭＯ）６０は溶解性を高めるが、精製タグではないため、あまり関心を引いていない。従って、これらは、タンパク質精製を達成するために小さい精製タグと組み合わせて使用されなければならず、手順が複雑になる。また、ＳＵＭＯ技術は非常に高価であることも注目すべきである。従って、これらのタンパク質タグはあまり魅力的でない。
【００９９】
本明細書において示されるように、ＴａｇＲ技術は、ＧＳＴよりも効率的なその融合パートナーの発現および可溶化を可能にする。さらに、融合パートナーの精製および切断を可能にする。加えて、ＧＳＴおよび非常に一般的な小さいＰｏｌｙＨｉｓタグよりも使用が安価である。実際に、ＧＳＴ、ＰｏｌｙＨｉｓおよびＴａｇＲの精製に使用される市販の樹脂は１０ｍｇのタンパク質を精製するために、それぞれ６２＄、４３＄および３４＄かかる。従って、ＴａｇＲは、対象のタンパク質の発現および溶解性を改善するための新しい魅力的な技術と思われる。さらに、ＴａｇＲはその融合パートナーの精製を可能にし、タンパク質分解的切断によって容易に除去することができる。
【０１００】
結論
本発明者らは、対象のタンパク質の溶解性および精製を改善するために、本明細書において新しいタンパク質タグを提示している。この新しいタンパク質タグは、ＴａｇＲと呼ばれている。これは、広く研究された２３ｋＤａタンパク質リカバリンであり、タンパク質タグに特有の特性を有する。実際に、リカバリンは高溶解性（＞３０ｍｇ／ｍｌ）であり、単一段階で高度に精製することができ、細菌におけるその発現レベルは非常に高い（＞３０ｍｇ／Ｌ培養物）４２。その精製は、カルシウム−ミリストイルスイッチによりカルシウムに可逆的に結合するその特性に基づく。リカバリンは、カルシウム結合時に大きい立体構造変化を受ける４３−４６。実際に、その４つのＥＦハンドのうちの２つへのカルシウム結合は、そのミリストイル基およびいくつかの疎水性残基の押出を誘発する（図１Ａ）４６。カルシウムを含まない状態では、リカバリンのミリストイル基およびいくつかの疎水性残基は、深い疎水性ポケット内に隔離される（図１Ｂ）。従って、精製は疎水性クロマトグラフィを用いて実施され、カルシウム結合リカバリンは樹脂に強力に結合するが、カルシウムを含まないタンパク質は汚染物質を含まずに溶出され得る４２。
【０１０１】
本発明者らは、高純度のリカバリンを達成するためにミリストイル基の存在が必要でないことを既に示した４２。従って、融合タンパク質パートナーの溶解性を改善し、その精製を可能にするＴａｇＲの特性は、ＧＳＴタグを用いた同じ対象のタンパク質と比較された。
【０１０２】
本発明はその特定の実施形態に関連して説明されたが、さらなる修正形態が可能であることと、本出願が、一般に本発明の原理に従い、かつ本発明が関係する技術分野において既知のまたは習慣的な実施の範囲内にあるもの、および上記の本明細書中の本質的な特徴に適用可能であるもの、および添付の特許請求の範囲に従うものなどの本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変化形態、使用、または適応形態を包含することが意図されることが理解されるであろう。
【０１０３】
本明細書において言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、それぞれ独立した特許、特許出願、または刊行物が参照によって援用されると具体的および個別に示された場合と同じ程度まで、参照によって本明細書中に援用される。
【０１０４】
参考文献
［１］Ａｒｎａｕ，Ｊ，Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ，Ｃ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，ＧＥ，ａｎｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ａｎｄ  ｔａｇ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４８，１−１３．
［２］Ｂｅｌｌ，ＭＲ，Ｅｎｇｌｅｋａ，ＭＪ，Ｍａｌｉｋ，Ａ，ａｎｄ  Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ，ＪＥ．（２０１３）Ｔｏ  ｆｕｓｅ  ｏｒ  ｎｏｔ  ｔｏ  ｆｕｓｅ：ｗｈａｔ  ｉｓ  ｙｏｕｒ  ｐｕｒｐｏｓｅ？，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２２，１４６６−１４７７．
［３］Ｃｈｅｎ，Ｒ．（２０１２）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ３０，１１０２−１１０７．
［４］Ｃｏｓｔａ，Ｓ，Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ，Ｃａｓｔｒｏ，Ａ，ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，Ｌ．（２０１４）Ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ：ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｈ８  ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５，６３．
［５］Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｄ，ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，ＤＫ．（２００６）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，３５３−３５８．
［６］Ｌｉｃｈｔｙ，ＪＪ，Ｍａｌｅｃｋｉ，ＪＬ，Ａｇｎｅｗ，ＨＤ，Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，ＤＪ，ａｎｄ  Ｔａｎ，Ｓ．（２００５）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４１，９８−１０５．
［７］Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ａ．（２００９）Ｔａｇｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４６３，２３９−２５８．
［８］Ｐａｐａｎｅｏｐｈｙｔｏｕ，ＣＰ，ａｎｄ  Ｋｏｎｔｏｐｉｄｉｓ，Ｇ．（２０１４）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ９４，２２−３２．
［９］Ｐｉｎａ，ＡＳ，Ｌｏｗｅ，ＣＲ，ａｎｄ  Ｒｏｑｕｅ，ＡＣ．（２０１４）Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ３２，３６６−３８１．
［１０］Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．（２００３）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ：ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｔｏ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６０，５２３−５３３．
［１１］Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（２００５）Ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，３１６−３２０．
［１２］Ｙｏｕｎｇ，ＣＬ，Ｂｒｉｔｔｏｎ，ＺＴ，ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＡＳ．（２０１２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ７，６２０−６３４．
［１３］Ｚｈａｏ，Ｘ，Ｌｉ，Ｇ，ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ，Ｓ．（２０１３）Ｓｅｖｅｒａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇｓ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｈｅｍ  ２０１３，５８１０９３．
［１４］Ａｌｍｏ，ＳＣ，ａｎｄ  Ｌｏｖｅ，ＪＤ．（２０１４）Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｆａｓｔｅｒ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２６，３９−４３．
［１５］Ｘｉａｏ，Ｓ，Ｓｈｉｌｏａｃｈ，Ｊ，ａｎｄ  Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，ＭＪ．（２０１４）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２６，３２−３８．
［１６］Ｈａｎｎｉｇ，Ｇ，ａｎｄ  Ｍａｋｒｉｄｅｓ，ＳＣ．（１９９８）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６，５４−６０．
［１７］Ｄｅｍａｉｎ，ＡＬ，ａｎｄ  Ｖａｉｓｈｎａｖ，Ｐ．（２００９）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２７，２９７−３０６．
［１８］Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ，ＡＤ，ａｎｄ  Ａｌｍｏ，ＳＣ．（２０１４）Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８８，２５３−２６０．
［１９］Ａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｃ，ａｎｄ  Ｊｉｎ，ＪＰ．（２０１５）Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇｓ  ｔｏ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅ  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ  ２２，８８５−８９２．
［２０］Ｇｕａｎ，Ｄ，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｚ．（２０１４）Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｇ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３６，１３９１−１４０６．
［２１］Ｇｕｚｚｏ，  ＣＭ，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，ＤＣ．（２００７）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｓｐａｒｔｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ５４，１６６−１７５．
［２２］Ｋｉｍｐｌｅ，ＭＥ，Ｂｒｉｌｌ，ＡＬ，ａｎｄ  Ｐａｓｋｅｒ，ＲＬ．  （２０１３）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７３，Ｕｎｉｔ  ９  ９．
［２３］Ｌｉ，Ｙ．（２０１０）Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｕｓｅｄ  ｔａｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｎｄｅｍ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５，７３−８３．
［２４］Ｐｉｎａ，ＡＳ，Ｂａｔａｌｈａ，ＩＬ，ａｎｄ  Ｒｏｑｕｅ，ＡＣ．  （２０１４）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１２９，１４７−１６８．
［２５］Ｓｕｎ，Ｐ，Ｔｒｏｐｅａ，ＪＥ，ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（２０１１）Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７０５，２５９−２７４．
［２６］Ｗａｌｌｓ，Ｄ，ａｎｄ  Ｌｏｕｇｈｒａｎ，ＳＴ．（２０１１）Ｔａｇｇｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６８１，１５１−１７５．
［２７］Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＰＴ．（２０１５）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８０，６  １  １−３５．
［２８］Ｗｏｏｄ，ＤＷ．（２０１４）Ｎｅｗ  ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２６，５４−６１．
［２９］Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ，Ａ，ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｏ，  ＭＭ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２５，１３８５−１３９５．
［３０］Ｓｔｅｖｅｎｓ，ＲＣ．（２０００）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８，Ｒ１７７−１８５．
［３１］Ｓｏｎｇ，ＪＭ，Ａｎ，ＹＪ，Ｋａｎｇ，ＭＨ，Ｌｅｅ，ＹＨ，ａｎｄ  Ｃｈａ，ＳＳ．（２０１２）Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｔ  ６−１０  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｔｈｅ  ｉｎｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ８２，２９７−３０１．
［３２］Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＨＰ，ａｎｄ  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，ＫＫ．（２００５）Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ４，１．
［３３］Ｏｈａｎａ，ＲＦ，ａｎｄ  Ｈｕｒｓｔ，Ｒ．（２０１５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＨａｌｏＴａｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１０，１０  ３１  １１−１０  ３１  １５．
［３４］Ｚｏｒｄａｎ，ＲＥ，Ｂｅｌｉｖｅａｕ，ＢＪ，Ｔｒｏｗ，ＪＡ，Ｃｒａｉｇ，ＮＬ，ａｎｄ  Ｃｏｒｍａｃｋ，ＢＰ．（２０１５）Ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｄｓ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｔｎ７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００，４７−５８．
［３５］Ｍｏｏｎｅｙ，ＪＴ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ，ＤＰ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ，Ｂｒｕｕｎ  Ｓｃｈｉｏｄｔ，Ｃ，ａｎｄ  Ｈｅａｒｎ，ＭＴ．（２０１５）Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｔａｇｇｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ＩＭＡＣ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．
［３６］Ｌｉｕ，Ｘ，Ｈｕａｎｇ，Ａ，Ｌｕｏ，Ｄ，Ｌｉｕ，Ｈ，Ｈａｎ，Ｈ，Ｘｕ，Ｙ，ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ，Ｐ．（２０１５）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｔａｇ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  １０９，７９−８４．
［３７］Ｃｏｓｔａ，ＳＪ，Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ，Ｃａｓｔｒｏ，Ａ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，Ｌ，ａｎｄ  Ｂｅｓｉｒ，Ｈ．（２０１３）Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｈ８  ａｎｄ  Ｈ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９７，６７７９−６７９１．
［３８］Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｉ，ａｎｄ  Ｂｅｌｆｒａｇｅ，Ｇ．（１９７５）Ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５８，５９８−５９９．
［３９］Ｋｕｏ，ＷＨ，ａｎｄ  Ｃｈａｓｅ，ＨＡ．（２０１１）Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３３，１０７５−１０８４．
［４０］Ｓｍｉｔｈ，ＤＢ，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＳ．（１９８８）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０．
［４１］Ｂｏｉｓｓｅｌｉｅｒ，Ｅ，Ａｕｄｅｔ，ＭＬ，Ｃａｎｔｉｎ，Ｌ，ａｎｄ  Ｓａｌｅｓｓｅ，Ｃ．（２０１１）Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５１，１９３−１９４．
［４２］Ｄｅｓｍｅｕｌｅｓ，Ｐ，Ｐｅｎｎｅｙ，ＳＥ，ａｎｄ  Ｓａｌｅｓｓｅ，Ｃ．（２００６）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４９，２５−３２．
［４３］Ｆｌａｈｅｒｔｙ，ＫＭ，Ｚｏｚｕｌｙａ，Ｓ，Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ，ａｎｄ  ＭｃＫａｙ，ＤＢ．（１９９３）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ，ａ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｎｓｏｒ  ｉｎ  ｖｉｓｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  ７５，７０９−７１６．
［４４］Ｔａｎａｋａ，Ｔ，Ａｍｅｓ，ＪＢ，Ｈａｒｖｅｙ，ＴＳ，Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ，ａｎｄ  Ｉｋｕｒａ，Ｍ．（１９９５）Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｔａｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６，４４４−４４７．
［４５］Ｈｕｇｈｅｓ，ＲＥ，Ｂｒｚｏｖｉｃ，ＰＳ，Ｋｌｅｖｉｔ，ＲＥ，ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ，ＪＢ．（１９９５）Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１４１０−１１４１６．
［４６］Ａｍｅｓ，ＪＢ，Ｉｓｈｉｍａ，Ｒ，Ｔａｎａｋａ，Ｔ，Ｇｏｒｄｏｎ，ＪＩ，Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ，ａｎｄ  Ｉｋｕｒａ，Ｍ．（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，１９８−２０２．
［４７］Ｂｕｓｓｉeｒｅｓ，Ｓ，Ｂｕｆｆｅｔｅａｕ，Ｔ，Ｄｅｓｂａｔ，Ｂ，Ｂｒｅｔｏｎ，Ｒ，ａｎｄ  Ｓａｌｅｓｓｅ，Ｃ．（２００８）Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌｅｃｉｔｈｉｎ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７７８，１３２４−１３３４．
［４８］Ｈｏｒｃｈａｎｉ，Ｈ，Ｂｕｓｓｉｅｒｅｓ，Ｓ，Ｃａｎｔｉｎ，Ｌ，Ｌｈｏｒ，Ｍ，Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ−Ｇｅｍｍｅ，ＪＳ，Ｂｒｅｔｏｎ，Ｒ，ａｎｄ  Ｓａｌｅｓｓｅ，Ｃ．（２０１４）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｃｉｔｈｉｎ：ｒｅｔｉｎｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｉｋｅｌｙ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４４，１１２８−１１３６．
［４９］Ｓｔｕｄｉｅｒ，ＦＷ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４１，２０７−２３４．
［５０］Ｄｅｍｅｒｓ，Ｅ，Ｂｏｉｓｓｅｌｉｅｒ，Ｅ，Ｈｏｒｃｈａｎｉ，Ｈ，Ｂｌａｕｄｅｚ，Ｄ，Ｃａｌｖｅｚ，Ｐ，Ｃａｎｔｉｎ，Ｌ，Ｂｅｌｌｅｙ，Ｎ，Ｃｈａｍｐａｇｎｅ，Ｓ，Ｄｅｓｂａｔ，Ｂ，ａｎｄ  Ｓａｌｅｓｓｅ，Ｃ．（２０１５）Ｌｉｐｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎａｃｙｌａｔｅｄ  ＲＰ２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４，２５６０−２５７０．
［５１］Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ．（１９７０）Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５．
［５２］Ｈｕｎｔ，Ｉ．（２００５）Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４０，１−２２．
［５３］ｄｉ  Ｇｕａｎ，Ｃ，Ｌｉ，Ｐ，Ｒｉｇｇｓ，ＰＤ，ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｈ．（１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｇｅｎｅ  ６７，２１−３０．
［５４］Ｋａｐｕｓｔ，ＲＢ，ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（１９９９）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｕｎｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｔ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｗｈｉｃｈ  ｉｔ  ｉｓ  ｆｕｓｅｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，１６６８−１６７４．
［５５］Ｆｏｘ，ＪＤ，Ｒｏｕｔｚａｈｎ，ＫＭ，Ｂｕｃｈｅｒ，ＭＨ，ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（２００３）Ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５３７，５３−５７．
［５６］Ｂｕｃｈｅｒ，ＭＨ，Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖ，ＡＧ，ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（２００２）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５８，３９２−３９７．
［５７］Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．（１９９９）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０，４１１−４２１．
［５８］Ｒｏｕｔｚａｈｎ，ＫＭ，ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，ＤＳ．（２００２）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＭＢＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２，８３−９２．
［５９］ＬａＶａｌｌｉｅ，ＥＲ，ＤｉＢｌａｓｉｏ，ＥＡ，Ｋｏｖａｃｉｃ，Ｓ，Ｇｒａｎｔ，ＫＬ，Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，ＰＦ，ａｎｄ  ＭｃＣｏｙ，ＪＭ．（１９９３）Ａ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）１１，１８７−１９３．
［６０］Ｐａｎａｖａｓ，Ｔ，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｃ，ａｎｄ  Ｂｕｔｔ，ＴＲ．（２００９）ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４９７，３０３−３１７．
［６１］Ｂｏｕｒｎｅ  ｅ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１１９４９−１１９５５）．
［６２］Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１２１４９−１２１６１）（ＰＭＩＤ：１１０１５１９３）．
［６３］Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：８７  （ＰＭＩＤ：２４６６９７８８）．
【０１０５】
配列表
配列番号１
核酸配列  −  全長天然リカバリン
【化１】
2018521690.tif 000003
【０１０６】
配列番号２
アミノ酸配列  −  全長天然リカバリン（開始Ｍｅｔは除去される）
【化２】
2018521690.tif 000004
【０１０７】
配列番号３
核酸配列  −  変異リカバリン（＋ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、＋サイレント変異、ミリストイル基なし）
Ｎｄｅ１部位
【化３】
2018521690.tif 000005
【０１０８】
ＴからＣへ：サイレント変異
ＥｃｏＲ１部位はＧＡＡＴＴＣをＧＡＧＴＴＣに変化させた：サイレント変異
末端の５グリシン（ＧＧＣまたはＧＧＴ）＋トロンビン切断部位（Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ：Ｌ（ＣＴＧ），Ｖ（ＧＴＴ），Ｐ（ＣＣＧ），Ｒ（ＣＧＴ），Ｇ（ＧＧＡ），Ｓ（ＴＣＣ））
終止コドンはＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＴＣ）により除去および置換され、これはトロンビン認識部位からのグリシンおよびセリンにも対応する。
【０１０９】
配列番号４
アミノ酸配列  −  変異リカバリン（＋ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、＋サイレント変異、ミリストイル基なし）
【化４】
2018521690.tif 000006
【図１】
2018521690.tif 000007
【図２】
2018521690.tif 000008
【図３】
2018521690.tif 000009
【図４】
2018521690.tif 000010
【図５Ａ】
2018521690.tif 000011
【図５Ｂ】
2018521690.tif 000012
【図６】
2018521690.tif 000013
【図７】
2018521690.tif 000014
【図８】
2018521690.tif 000015
【図９】
2018521690.tif 000016
【配列表】
2018521690000001.app
【国際調査報告】
2018521690.tif 000017
2018521690.tif 000018
2018521690.tif 000019