(57)【要約】  ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物から単離する方法を開示する。ポリメラーゼ複合体は、単離されたナノポア配列決定用複合体を供給するためにナノポアを含み得る。その方法は、ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体のポジティブおよびネガティブ単離に関する。また、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、該核酸アダプターを含むポリメラーゼ複合体、および該核酸アダプターを使用して活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法が開示される。【選択図】図４
2018534939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法であって、
（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分にコンジュゲートされた捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固相支持体に結合すること、
（ｃ）前記活性ポリメラーゼ複合体のポリメラーゼの活性によって鋳型相補ポリヌクレオチド合成を可能にするためのヌクレオチドを含む試薬を供給して、伸長された相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、ならびに、
（ｄ）伸長された相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていない相補配列および捕捉オリゴヌクレオチドを含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離し、それにより、前記活性ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ複合体構成成分から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ複合体をポジティブに単離する方法であって、
（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合すること、ならびに、
（ｃ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ複合体構成成分から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項３】
ポリメラーゼ複合体を、未結合のポリメラーゼ複合体構成成分の混合集団からネガティブに単離する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリヌクレオチド鋳型に結合されたポリメラーゼ酵素を含む複数のポリメラーゼ複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）未結合のポリメラーゼ酵素を、精製部分を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合して、捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を形成すること、ならびに、
（ｃ）前記捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合し、それにより、前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体構成成分から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法に従ってポリメラーゼ複合体を単離すること、および、
（ｂ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成したナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、
を含む、前記方法。
【請求項５】
バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法に従ってポリメラーゼ複合体を単離すること、ここで、前記ポリメラーゼ複合体はナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給するためにナノポアをさらに含むものである、および、
（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップであって、請求項５に従って調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含む、前記バイオチップ。
【請求項７】
ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法であって、
（ａ）請求項４または５に従ってバイオチップを調製すること、
（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、前記タグ付けされたヌクレオチドのタグが前記ナノポアを用いて検出可能なものである、
（ｃ）前記ナノポア配列決定用複合体において前記ナノポアにカップリングされた前記ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な伸長中の鎖に組み込むこと、および、
（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグを検出すること、ここで、前記タグが前記ナノポアを用いて検出される一方で、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合し、それにより、前記核酸試料の配列を提供する、
を含む、前記方法。
【請求項８】
活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプターであって、
プライマー認識配列、該プライマー認識配列に対して５’に位置するランウェイ配列、および該ランウェイ配列に対して５’に位置するポリメラーゼ終結配列を含む一本鎖領域を有し、
前記ランウェイ配列が、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの４つのヌクレオチド塩基のうちの３つ以下から選択される２〜５０個の連続したヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド配列を含み、該ランウェイ配列に含有されないヌクレオチド塩基が、停止塩基と称され、前記ランウェイ配列が、ポリメラーゼ駆動プライマー伸長用の鋳型として機能し、
前記ポリメラーゼ終結反応配列が、任意のかかるポリメラーゼ駆動プライマー伸長を終結させるのに有効である少なくとも１つの停止塩基を含む、
前記アダプター。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸アダプター、
該アダプターのプライマー認識配列に特異的なプライマー、および、
ポリメラーゼ酵素、
を含む、ポリメラーゼ複合体。
【請求項１０】
活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法であって、
（ａ）請求項２に従って単離されるポリメラーゼ複合体および核酸試料を含む反応混合物を供給すること、ここで、該ポリメラーゼ複合体のアダプターが、前記核酸試料にライゲーションされる、
（ｂ）該アダプターのランウェイ配列において含有されるヌクレオチド塩基に相補的であるｄＮＴＰのみを含むデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物を供給すること、ここで、該ｄＮＴＰの１つまたは複数が、結合パートナーに対して親和性を有する捕捉部分を含むように修飾される、
（ｃ）該ポリメラーゼの活性によって該ランウェイ配列に相補的なポリヌクレオチド配列の合成を可能にするように該反応混合物および該ｄＮＴＰ混合物を組み合わせて、その中に組み込まれた修飾ｄＮＴＰを有する伸長されたランウェイ相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、
（ｄ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、固相支持体に結合すること、ここで、該修飾ｄＮＴＰの捕捉部分が、該固相支持体上の結合パートナーに結合される、および、
（ｅ）伸長されたランウェイ相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていないランウェイ相補配列を含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の方法に従って活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、および、
（ｂ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成されたナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の方法に従って活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、ここで、前記活性ポリメラーゼ複合体が、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給するためにナノポアをさらに含むものである、および、
（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップであって、請求項１２に従って調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含む、前記バイオチップ。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法であって、
（ａ）請求項１１または１２に従ってバイオチップを調製すること、
（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、前記タグ付けされたヌクレオチドのタグが、前記ナノポアを用いて検出可能なものである、
（ｃ）前記ナノポア配列決定用複合体において前記ナノポアにカップリングされた前記ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを、試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な伸長中の鎖に組み込むこと、および、
（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグを検出すること、ここで、前記タグは前記ナノポアを用いて検出される一方で、前記ヌクレオチドは前記ポリメラーゼと会合し、それにより、前記核酸試料の配列を提供する、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド鋳型が一本鎖ＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]ポリヌクレオチドのナノポア配列決定を可能にするように、続いてバイオチップの膜に組み込まれるポリメラーゼ複合体を単離する方法が開示される。また、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、核酸アダプターを含むポリメラーゼ複合体、および核酸アダプターを使用して活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ナノポアバイオチップは、溶液中の分子を、ナノスケールのポアを通って電気泳動的に駆動させることによって達成される単一分子検出および分析能力を提供するデバイスである。ナノポアは、非常に閉鎖された空間を提供し、その内部で、単一核酸ポリマーは、様々な手段の１つによってハイスループットで分析することができ、狭いポアにおいて強制され得る完璧な処理能力は、ポリヌクレオチドにおける核酸塩基の自然の順序が、検出されるシグナルの配列において反映されることを保証する。キロベース長のポリマー（一本鎖ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）または小分子（例えば、ヌクレオシド）は、増幅または標識を伴わずに同定および特徴付けることができ、それは安価で迅速なＤＮＡ配列決定を可能にさせる特有の分析能力である。
【０００３】
[0003]ＤＮＡポリメラーゼは、ナノポアと併用されて、ナノポアを通るＤＮＡ転座の割合を制御してきた。ナノポアにカップリングされた酵素モーターは、２つの理由で魅力的である：（１）ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体は、バルク溶液中で形成して、それを、ナノポア中で電気泳動的に捕捉させることが可能であること；（２）ポリメラーゼは、ナノポアを通ってＤＮＡ分子を前進させるため、比較的小さくて制御された動きが観察されること。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]ポリメラーゼによるポリヌクレオチドの動きの制御を改良する別個の機能および特性を有する操作されたＤＮＡポリメラーゼを提供することにおいて、進歩が成されてきた。しかしながら、ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体に機能的にカップリングされる高密度の個々にアドレス可能なナノポアを提供するナノポアバイオチップを製作することにおいて、いまだ課題が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物から単離する方法が開示される。ポリメラーゼ複合体は、単離されたナノポア配列決定用複合体を供給するためにナノポアを含み得る。その方法は、ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体のポジティブおよびネガティブ単離に関する。
【０００６】
[0006]一態様では、活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分にコンジュゲートされた捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固相支持体に結合すること、（ｃ）前記活性ポリメラーゼ複合体のポリメラーゼの活性によって鋳型相補ポリヌクレオチド合成を可能にするためのヌクレオチドを含む試薬を供給して、伸長された相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、ならびに、（ｄ）伸長された相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていない相補配列を含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離し、それにより、前記活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、を含む。伸長されていない相補配列を有する不活性ポリメラーゼ複合体は、固相支持体に結合されたままであり、伸長された相補配列を有する活性ポリメラーゼ複合体は、ポリメラーゼの活性によって、捕捉複合体から放出される。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、線状または環状鋳型であり、捕捉複合体はそれぞれ、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、自己プライミング（self-priming）鋳型である。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態では、その方法は、未結合のポリメラーゼ構成成分を、固相支持体に結合される捕捉複合体から除去することをさらに含む。
[0009]いくつかの実施形態では、捕捉複合体の、固相媒体への結合は、可逆的である。
【０００９】
[0010]いくつかの実施形態では、精製部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであり、精製部分結合化合物は、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含み、ビオチン結合化合物は、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む。
【００１０】
[0011]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である。
【００１１】
[0012]いくつかの実施形態では、単離されたポリメラーゼ複合体はそれぞれ、ナノポアを含む。いくつかの実施形態では、ナノポアは、野生型ナノポアまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、ナノポアは、ＨＬもしくはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体である。
【００１２】
[0013]別の態様では、ポリメラーゼ複合体をポジティブに単離する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合すること、ならびに、（ｃ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ複合体構成成分から単離すること、を含む。
【００１３】
[0014]いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、線状または連続的鋳型であり、捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドプライマーである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、自己プライミング鋳型であり、前記自己プライミング鋳型は、精製部分をさらに含む。
【００１４】
[0015]いくつかの実施形態では、その方法は、前記ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体を、固相支持体から放出させることをさらに含む。
[0016]いくつかの実施形態では、その方法は、未結合のポリメラーゼ構成成分を、固相支持体に結合される捕捉複合体から除去することをさらに含む。
【００１５】
[0017]いくつかの実施形態では、捕捉複合体の、固相媒体への結合は、可逆的である。
[0018]いくつかの実施形態では、精製部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであり、精製部分結合化合物は、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含み、ビオチン結合化合物は、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む。
【００１６】
[0019]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である。
【００１７】
[0020]いくつかの実施形態では、単離されたポリメラーゼ複合体はそれぞれ、ナノポアを含む。いくつかの実施形態では、ナノポアは、野生型ナノポアまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、ナノポアは、ＨＬもしくはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体形態である。
【００１８】
[0021]別の態様では、ポリメラーゼ複合体を、未結合のポリメラーゼ複合体構成成分の混合集団からネガティブに単離する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）ポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリヌクレオチド鋳型に結合されたポリメラーゼ酵素を含む複数のポリメラーゼ複合体を含む反応混合物を供給すること、（ｂ）未結合のポリメラーゼ酵素を、精製部分を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合して、捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を形成すること、ならびに、（ｃ）前記捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合し、それにより、前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体構成成分から単離すること、を含む。
【００１９】
[0022]いくつかの実施形態では、捕捉複合体の、固相媒体への結合は、可逆的である。
[0023]いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、線状または環状鋳型であり、捕捉複合体はそれぞれ、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、自己プライミング鋳型である。
【００２０】
[0024]いくつかの実施形態では、精製部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであり、精製部分結合化合物は、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含み、ビオチン結合化合物は、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む。
【００２１】
[0025]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である。
【００２２】
[0026]いくつかの実施形態では、単離されたポリメラーゼ複合体はそれぞれ、ナノポアを含む。いくつかの実施形態では、ナノポアは、野生型ナノポアまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、ナノポアは、ＨＬもしくはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体形態である。
【００２３】
[0027]別の態様では、バイオチップを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従ってポリメラーゼ複合体を単離すること、および、（ｂ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成されたナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、を含む。いくつかの実施形態では、膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。
【００２４】
[0028]他の実施形態では、バイオチップを調製するのに提供される方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従ってポリメラーゼ複合体を単離すること、ここで、前記ポリメラーゼ複合体が、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給するためにナノポアをさらに含むものである、および、（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、を含む。いくつかの実施形態では、膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。
【００２５】
[0029]別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップが、本明細書中で提供される。バイオチップは、本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従って調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含む。
【００２６】
[0030]別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法が提供される。配列決定する方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従ってバイオチップを調製すること、（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、前記タグ付けされたヌクレオチドのタグが、前記ナノポアを用いて検出可能なものである、（ｃ）前記ナノポア配列決定用複合体の前記ナノポアにカップリングされた前記ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを、試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な成長中の鎖に組み込むこと、および、（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付けされたヌクレオチドと会合されたタグを検出すること、ここで、前記タグは前記ナノポアを用いて検出される一方で、前記ヌクレオチドは前記ポリメラーゼと会合し、それにより、前記核酸試料の配列を提供する、を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、一本鎖ＤＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、二本鎖ＤＮＡである。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、ＲＮＡである。
【００２７】
活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプターおよびその使用方法
[0031]活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、ポリメラーゼ複合体を含む核酸アダプター、および核酸アダプターを使用して活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法が開示される。ポリヌクレオチドのナノポア配列決定を可能にするように、続いて、単離されたポリメラーゼ複合体は、バイオチップの膜に組み込まれて、ポリヌクレオチドのナノポア配列決定を可能にする。
【００２８】
[0032]一態様では、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプターが提供される。いくつかの実施形態では、アダプターは、プライマー認識配列、該プライマー認識配列に対して５’に位置するランウェイ配列、および該ランウェイ配列に対して５’に位置するポリメラーゼ終結配列を含む一本鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、ランウェイ配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの４つのヌクレオチド塩基のうちの３つ以下から選択される２〜５０個の連続したヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド配列を含み、ランウェイ配列に含有されないヌクレオチド塩基は、停止塩基と称され、ランウェイ配列は、ポリメラーゼ駆動プライマー伸長用の鋳型として機能する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ終結反応配列は、任意のかかるポリメラーゼ駆動プライマー伸長を終結させるのに有効である少なくとも１つの停止塩基を含む。
【００２９】
[0033]いくつかの実施形態では、ランウェイ配列は、８〜１２ヌクレオチド塩基長である。
[0034]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ終結配列は、１〜１０ヌクレオチド塩基長である。
【００３０】
[0035]別の態様では、ポリメラーゼ複合体が提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ複合体は、本明細書中に記載するような核酸アダプター、前記アダプターの前記プライマー認識配列に特異的なプライマー、およびポリメラーゼ酵素を含む。
【００３１】
[0036]別の態様では、活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）本明細書中に記載するようなポリメラーゼ複合体および核酸試料を含む反応混合物を供給すること、ここで、該ポリメラーゼ複合体のアダプターが前記核酸試料にライゲーションされる、（ｂ）該アダプターのランウェイ配列において含有されるヌクレオチド塩基に相補的であるｄＮＴＰのみを含むデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物を供給すること、ここで、該ｄＮＴＰの１つまたは複数が、結合パートナーに対して親和性を有する捕捉部分を含むように修飾される、（ｃ）該ポリメラーゼの活性によって該ランウェイ配列に相補的なポリヌクレオチド配列の合成を可能にするように該反応混合物および該ｄＮＴＰ混合物を組み合わせて、その中に組み込まれた修飾ｄＮＴＰを有する伸長されたランウェイ相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、（ｄ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、固相支持体に結合すること、ここで、該修飾ｄＮＴＰの捕捉部分が、該固相支持体上の結合パートナーに結合される、ならびに、（ｅ）伸長されたランウェイ相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていないランウェイ相補配列を含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離すること、を含む。
【００３２】
[0037]いくつかの実施形態では、核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料である。
[0038]いくつかの実施形態では、単離するステップは、該不活性ポリメラーゼ複合体を洗い流して、固相支持体に結合された活性ポリメラーゼ複合体を得ることを含む。
【００３３】
[0039]いくつかの実施形態では、単離するステップは、前記不活性ポリメラーゼ複合体を洗い流して、固相支持体に結合された活性ポリメラーゼ複合体を得るステップ、およびその後、活性ポリメラーゼ複合体を固相支持体から溶出することを含む。
【００３４】
[0040]いくつかの実施形態では、アダプターの一本鎖領域は、線状または環状鋳型である。
[0041]いくつかの実施形態では、活性ポリメラーゼ複合体の、固相支持体への結合ステップは、可逆的である。
【００３５】
[0042]いくつかの実施形態では、捕捉部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであり、結合パートナーは、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含み、結合パートナーは、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む。
【００３６】
[0043]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である。
【００３７】
[0044]いくつかの実施形態では、単離された活性ポリメラーゼ複合体はそれぞれ、ナノポアを含む。いくつかの実施形態では、ナノポアは、野生型ナノポアまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、ナノポアは、ＨＬまたはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体である。
【００３８】
[0045]別の態様では、バイオチップを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従って活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、および、（ｂ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成されたナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、を含む。いくつかの実施形態では、膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。
【００３９】
[0046]他の実施形態では、バイオチップを調製する方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従って活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、ここで、該活性ポリメラーゼ複合体が、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給するためにナノポアをさらに含むものである、および、（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、を含む。いくつかの実施形態では、膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。
【００４０】
[0047]別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップが、本明細書中で提供される。バイオチップは、本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従って調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含む。
【００４１】
[0048]別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法が提供される。前記配列決定する方法は、（ａ）本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従ってバイオチップを調製すること、（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、該ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、該タグ付けされたヌクレオチドのタグが、該ナノポアを用いて検出可能なものである、（ｃ）該ナノポア配列決定用複合体の該ナノポアにカップリングされた該ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、該タグ付けされたヌクレオチドの個々のヌクレオチドを、試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な伸長中の鎖に組み込むこと、および、（ｄ）該ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に該個々のタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグを検出すること、ここで、該タグは該ナノポアを用いて検出される一方で、該ヌクレオチドは該ポリメラーゼと会合し、それにより、該核酸試料の配列を提供する、を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、一本鎖ＤＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、二本鎖ＤＮＡである。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型はＲＮＡである。
【００４２】
[0049]本発明の態様を説明する目的で、本発明のある特定の実施形態が、図面中に表される。しかしながら、本発明は、図面中に表される実施形態の正確な配置および手段に限定されない。さらに、提供される場合、図面中に含有される同様の参照番号は、類似するか、または同一の要素を同定すると意味される。
【００４３】
[0050]本特許のファイルは、少なくとも１つ図面をカラーで含有する。カラー図面（複数可）を伴う本特許または特許出願の複製は、請求および必要な料金の支払いによって特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】[0051]ナノポアタンパク質、酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼ、および基質鋳型、例えばＤＮＡの混合物由来の脂質二重層に挿入される３つの考え得るナノポア構造を表す：むき出しのナノポア（Ａ）、ポリメラーゼに結合されたナノポア（Ｂ）および鋳型結合ポリメラーゼに結合されたナノポア（Ｃ）。
【図２】[0052]捕捉オリゴヌクレオチドの活性転置による活性ポリメラーゼ複合体の獲得に関するプロセスを表す。
【図３】[0053]自己プライミングされたポリヌクレオチドおよび捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉複合体の形成を示す。
【図４】[0054]活性ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物から単離するプロセスを示す。
【図５】[0055]ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物からポジティブに単離するプロセスを示す。
【図６】[0056]ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物からポジティブに単離するプロセスの実施形態を示す。
【図７】[0057]ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物からネガティブに単離するプロセスを示す。
【図８】[0058]活性ポリメラーゼ複合体の単離プロセスにおける様々な分画の尿素ゲルを示す。実施例１を参照されたい。
【図９】[0059]ポリメラーゼ複合体をポジティブに単離するプロセスにおける様々な分画の尿素ゲルを示す。実施例２を参照されたい。
【図１０】[0060]図８に示すプロセスによって単離された複合体のポリメラーゼの活性を示す尿素ゲルを示す。実施例２を参照されたい。
【図１１】[0061]（Ａ）ナノポアが、図８に示されるように、予め形成されたポリメラーゼ複合体において含まれる場合の、ならびに（Ｂ）および（Ｃ）ポリメラーゼ複合体の成分が混合されて、予め形成されたポリメラーゼ複合体の事前の単離を伴わずに、膜に挿入させる場合の、バイオチップの膜に挿入されたナノポアの数の比較を示す。実施例２を参照されたい。
【図１２】[0062]図１０（Ａ）、図（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように挿入されたナノポアに相当する活性細胞の数を示す。実施例２を参照されたい。
【図１３】[0063]バイオチップ上に存在する細胞の総数に対する、図１０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように挿入されたナノポアに相当する活性細胞の数に関して得られた配列決定収率パーセントを示す。実施例２を参照されたい
【図１４】[0064]本明細書中に記載するポジティブ単離方法に従って単離されたポリメラーゼ複合体を含むバイオチップ上でポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定するステップの例示的なカレントトレース（current trace）を示す。４つの異なる塩基は、矢印によって示されるような４つの異なるカラーで示される。
【図１５】[0065]活性ポリメラーゼ複合体を単離するための本明細書中で提供する核酸アダプターの１つの実施形態を示す。図示するように、アダプターは、試料ＤＮＡにライゲーションされる。アダプターはまた、アダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーおよびプライマー伸長に先立ってアダプターと会合されたポリメラーゼ酵素を有することが示される。図は、配列番号３を開示する。
【図１６】[0066]活性ポリメラーゼ複合体を単離するための本明細書中で提供する核酸アダプターの１つの実施形態を示す。図示するように、アダプターは、試料ＤＮＡにライゲーションされる。アダプターはまた、アダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーおよびランウェイ配列に相補的な伸長された配列を有することが示される。また、アダプターに会合されたポリメラーゼ酵素も示される。図は、出現の順序でそれぞれ、配列番号３および配列番号４を開示する。
【図１７】[0067]活性ポリメラーゼ複合体を単離するための本明細書中で提供する核酸アダプターの１つの実施形態を示す。図示するように、アダプターは、試料ＤＮＡにライゲーションされる。アダプターは線状であり、また、アダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーを有することが示される。実施形態（１）は、ランウェイ配列の富化伸長前のアダプターを示す。実施形態（２）は、ランウェイ配列の富化伸長後のアダプターを示す。図は、出現の順序でそれぞれ、配列番号５および配列番号５を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
[0068]ここで、本発明は、下記の定義および実施例を使用して、単なる参照の目的でより詳細に記載する。本明細書中に言及される全ての特許および刊行物（かかる特許および刊行物内に開示される全ての配列を含む）は、明らかに参照により組み込まれる。
【００４６】
[0069]本明細書において他の箇所で定義されない限りは、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９４年）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１年）は、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書中に記載する方法および材料に類似するか、または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または実験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。実施者は特に、当該技術分野の定義および用語に関して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３年を対象にする。本発明は、記載する特定の方法論、プロトコールおよび試薬が多様であり得るため、本発明は、これらに限定されない。
【００４７】
[0070]数値範囲は、範囲を規定する数を含める。約という用語は、値の＋または−１０パーセント（１０％）を意味するのに本明細書中で使用される。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００４８】
[0071]別記しない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’への配向性で、左から右へと描かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの配向性で、左から右へと描かれる。
[0072]本明細書中で提供する見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではなく、それらは、全体として明細書に対する言及によって成され得る。したがって、すぐ下で定義する用語は、全体として明細書に対する言及によって、より完全に定義される。
【００４９】
[0073]本明細書中で言及される全ての特許および刊行物（かかる特許および刊行物内に開示される全ての配列を含む）は、参照により明らかに組み込まれる。
[0074]ポリマー、例えばポリヌクレオチドおよびタンパク質のナノポア配列決定に関する方法は、バイオチップの膜、例えば脂質二重層に位置される酵素−ナノポア−ポリマー複合体を要する。
【００５０】
[0075]酵素−ナノポア−ポリマー複合体を供給する現在の方法は、ナノポアタンパク質、ポリマー、および酵素をインキュベートして、構成成分の会合を可能にすること、反応混合物を膜上へ流動させること、および、得られた構造を膜へと能動的にまたは受動定期に再構成すること、を含む。膜へと挿入されるようになる３つの考え得る構造は、ナノポア単独、酵素と会合されたナノポア、ならびに酵素およびポリマーと会合されたナノポアである。例えば、図１に示すように、ナノポアを二重層へ挿入させる条件、例えば電気穿孔下で、結合構成成分（１０２）を含むナノポア（１０１）、結合構成成分（１０４）を含むポリマー酵素（Ｐｏｌ）（１０３）およびポリヌクレオチド（１０５）の反応混合物（１００）を、脂質二重層上へ流動することにより、（Ａ）二重層に挿入されているナノポア単独、（Ｂ）二重層に挿入されているポリメラーゼと会合されたナノポア（酵素−ナノポア複合体）、および（Ｃ）二重層に挿入されているナノポア−ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド鋳型、例えばＤＮＡの複合体をもたらす。電気穿孔効率、即ち、ナノポア−ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体の拡散が、膜に拡散して、かつ挿入されるプロセスの効率は、ナノポア複合体のサイズに依存する。複合体がより大きいほど、電気穿孔効率はより小さい。したがって、図１に示す３つの考え得る構造のうち、ナノポア単独（Ａ）は、（Ｂ）ナノポア−ポリメラーゼ複合体よりも容易に、膜へと拡散し、次にそれは、（Ｃ）ナノポアーポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体よりも容易に拡散する。効率は、複合体のサイズと電荷の比に依存する。構造Ａおよび構造Ｂは、どれらも、ポリマー、例えばＤＮＡの配列を決定するのに必要である３つ全ての構成成分を含まないため、機能的ではない。さらに、ＡおよびＢは、バイオチップ上の空間を占有して、それによりバイオチップ上の機能性酵素−ナノポア−ポリマー複合体の密度を減少させる。さらに、構造Ｃを有する複合体の少なくとも一部は、活性ではない可能性があるポリメラーゼ酵素を含む。電気穿孔は、任意のサイズにおいて効率的であり得るが、拡散は、分子を膜表面へ移動させると考えられ、その結果、電気穿孔は、ポアが二重層に進入するのに必要とされるエネルギーを低下させる。
【００５１】
[0076]ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体、即ちポリメラーゼ複合体を、未結合の複合体構成成分の混合物から選択／単離して、脂質二重層において不完全および／不活性なポリメラーゼ複合体の形成を最低限に抑え、それによりナノポア配列決定方法の効率を増加させる方法が本明細書中で提供される。本明細書中で提供する方法は、ポリメラーゼ複合体を単離するのに使用することができ、それは続いて、バイオチップの膜へ挿入されたナノポアに結合させて、ナノポア配列決定用複合体を形成することができる。さらに、本明細書中で提供する方法は、ポリメラーゼに結合されたナノポアをさらに含むポリメラーゼ複合体を単離して、続いてバイオチップの膜へ挿入することができるナノポア配列決定用複合体を形成するのに使用することができる。
【００５２】
定義：
[0077]「ｄＮＴＰ」という用語は、デオキシヌクレオシド三リン酸を指す。プリン塩基（Ｐｕ）として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）ならびにそれらの誘導体および類似体が挙げられる。ピリミジン塩基（Ｐｙ）として、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）ならびにそれらの誘導体および類似体が挙げられる。かかる誘導体または類似体の例は、実例として、レポーター基で修飾されたもの、ビオチン化されたもの、アミン修飾されたもの、放射標識されたもの、アルキル化されたもの等であり、またホスホロチオエート、ホスファイト、環原子修飾誘導体等を含むが、限定されない。レポーター基は、フルオレセインなどの蛍光基、ルミノールなどの化学発光基、遅延蛍光による検出が可能であるＮ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸などのテルビウムキレーター等であり得る。
【００５３】
[0078]本明細書中の「ポリメラーゼ複合体」という用語は、ポリメラーゼ酵素およびポリヌクレオチド鋳型基質の会合によって形成される複合体を指す。自己プライミングではないポリヌクレオチド鋳型は、鎖伸長を開始させるのにオリゴヌクレオチドプライマーを要する。したがって、自己プライミングポリヌクレオチドが不在の場合、ポリメラーゼ複合体は、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含み得る。
【００５４】
[0079]本明細書中の「活性ポリメラーゼ複合体」という用語は、鎖伸長が可能な活性ポリメラーゼおよびポリヌクレオチド鋳型を含む複合体を指す。活性ポリメラーゼ複合体は、活性ナノポア配列決定用複合体を供給するために活性ポリメラーゼに連結されるナノポアをさらに含むことができる。
【００５５】
[0080]本明細書中の「ナノポア配列決定用複合体」という用語は、ポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型基質、およびナノポアの会合によって形成される複合体を指す。自己プライミングではないポリヌクレオチド鋳型は、鎖伸長を開始させるのにオリゴヌクレオチドプライマーを要する。したがって、自己プライミングポリヌクレオチドが不在の場合、ナノポア配列決定用複合体は、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含み得る。
【００５６】
[0081]本明細書中の「捕捉オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリメラーゼ複合体、ナノポア配列決定用複合体、または未結合のポリメラーゼおよびポリメラーゼナノポア複合体を、固体支持体に固定化するのに役立つ精製部分を含むオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、精製部分は、ビオチンまたは精製ビオチンであってもよく、それは、固体支持体上の精製部分結合パートナー、例えばストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンに結合する。
【００５７】
[0082]「機能性」という用語は、本明細書中のナノポア配列決定用複合体に関連して使用される場合、３つの構成成分：膜に挿入されるナノポア、酵素と会合されたポリマー、および膜におけるナノポアに結合されるポリマー会合酵素の複合体を指す。機能性ナノポア配列決定用複合体は、ポリヌクレオチドの配列、例えばヌクレオチド塩基の構成成分を検出する。
【００５８】
[0083]本明細書中の「ポリメラーゼ」という用語は、ヌクレオチドの重合（即ち、ポリメラーゼ活性）を触媒する酵素を指す。ポリメラーゼという用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を包含する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型に相補的であるデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。
【００５９】
[0084]「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびｃＤＮＡ分子を指すのに、本明細書中で交換可能に使用される。
【００６０】
[0085]本明細書中の「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、相補核酸鎖が、例えばプライマー伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって合成される核酸の鎖を指す。
[0086]本明細書中の「試料ポリヌクレオチド」という用語は、試料、例えば生物学的試料から得られるポリヌクレオチドを指す。
【００６１】
[0087]「鋳型依存性様式」という用語は、プライマー分子の鋳型依存性伸長を含むプロセス（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を指す。「鋳型依存性様式」という用語は通常、ポリヌクレオチドの新たに合成された鎖の配列が、相補塩基対形成の周知の規則によって指示されるＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指す（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、メンロパーク、Ｃａｌｉｆ．（１９８７年）を参照）。
【００６２】
[0088]本明細書中の「自己プライミング」という用語は、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによる鋳型依存性伸長用のプライマーとして作用することができる自己相補配列を生成するポリヌクレオチド鋳型を指す。ヘアピン鋳型は、自己プライミング鋳型の例である。
【００６３】
[0089]「ナノポア」または「ポア」という用語は概して、本明細書中で使用する場合、膜において形成されるか、もしくは他の場合では供給されるポア、チャネルまたは通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜、またはポリマー材料から形成される膜などの合成膜であり得る。膜は、ポリマー材料であり得る。ナノポアは、検出回路、または例えば相補型酸化金属半導体（ＣＭＯＳ）もしくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などの検出回路に連結された電極に隣接して、あるいはそれに近接して配置され得る。いくつかの例において、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍほどの特徴的な幅または直径を有する。いくつかのナノポアは、タンパク質である。アルファ−ヘモリジンは、タンパク質ナノポアの例である。
【００６４】
[0090]本明細書中の「モノマーナノポア」という用語は、単一サブユニットで構成されるナノポアタンパク質を指す。
[0091]本明細書中の「オリゴマーナノポア」という用語は、多重の同一サブユニット、多重の別個のサブユニット、または同一および別個のサブユニットの混合物で構成され得るナノポアを指す。同一サブユニットを有するナノポアを、「ホモオリゴマーナノポア」と称する。２つまたはそれ以上の別個のポリペプチドサブユニットを含有するナノポアを、「ヘテロオリゴマーナノポア」と称する。
【００６５】
[0092]本明細書中の「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離される場合に、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
[0093]本明細書中の「変異体」という用語は、親タンパク質と比較した場合に、変更された特徴、例えば変更されたイオンコンダクタンス、変更された通すまでの時間（time to thread）等を示す修飾タンパク質を指す。
【００６６】
[0094]本明細書中の「修飾変異体」という用語は、他のタンパク質とのその物理的相互作用を変更するようにさらに修飾された変異体タンパク質を指す。例えば、修飾変異体タンパク質は、サブユニット間相互作用に影響を及ぼすようにさらに突然変異された多量体変異体ナノポアであり得る。
【００６７】
[0095]本明細書中の「通すまでの時間」または「ＴＴＴ」という用語は、ポリメラーゼ−タグ複合体が、タグをナノポアに通すのにかかる時間を指す。
[0096]「ノイズ」および「イオン電流ノイズ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、自発的なゲーティングによって寄与される電流変動およびナノポアの固有の構造によって寄与される電流変動を含む、電気シグナルの不規則変動を指す。例えば、ナノポアの三次構造は、ナノポアによって検出される分析物に関する１つよりも多い認識部位を含むことができ、それにより、チャネルの全体的なノイズに寄与するさらなるシグナルを誘導する。
【００６８】
[0097]本明細書中の「収縮アミノ酸」という用語は、収縮帯域でナノポアのサイズを決定するアミノ酸を指す。収縮帯域は、野生型ナノポアの収縮帯域と同じであり得るか、またはそれは、タンパク質工学を介して、もしくは分子アダプターの導入によって導入される収縮帯域であり得る。
【００６９】
[0098]「アルファ−ヘモリジン」、「α−ヘモリジン」、「ａＨＬ」、「αＨＬ」、「ａ−ＨＬ」および「α−ＨＬ」という用語は、交換可能に使用され、本明細書中では、モノマー、モノマーのコンカテマー、またはモノマーおよびモノマーのコンカテマーの組合せ由来の７量体の水で満たされた膜貫通型チャネルへと自己集合するタンパク質を指す。
【００７０】
[0099]本明細書中の「結合構成成分」という用語は、酵素−ポリマー複合体、例えばポリメラーゼ複合体の酵素、例えばポリメラーゼを、ナノポアに結合させる構造、例えばリンカーを指す。
【００７１】
[00100]本明細書中の「ポリヌクレオチド鋳型」および「ポリヌクレオチド基質鋳型」という用語は、相補核酸鎖が、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって合成されるポリヌクレオチド分子を指す。ポリヌクレオチド鋳型は、線状、ヘアピン、または連続的であり得る。連続的鋳型は、環状またはダンベルであり得る。ヘアピン鋳型は、自己プライミング鋳型であり得る。
【００７２】
[00101]本明細書中の「ポリメラーゼ複合体構成成分」という用語は、ポリメラーゼ複合体を形成するのに要される未結合の構成成分を指す。構成成分は、ポリヌクレオチド鋳型およびポリメラーゼを含み、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはナノポアをさらに含み得る。
【００７３】
[00102]本明細書中の「単離された」という用語は、複合体が通常形成されるその未結合の構成成分の少なくとも１つから分離されるポリメラーゼ複合体またはナノポア配列決定用複合体を指す。
【００７４】
[00103]本明細書中の「精製された」という用語は、分子が含有される試料の少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在する分子を指す。
[00104]「精製すること」という用語は概して、ポリメラーゼ複合体またはナノポア配列決定用複合体を、アフィニティクロマトグラフィーによる生化学的精製に付すことを指す。
【００７５】
[00105]本明細書中の「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸エステル、および窒素複素環塩基で構成されるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位を指す。塩基は、グリコシド炭素（五炭糖の１’炭素）を介して糖部分に連結され、塩基および糖の当該組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、五炭糖の３’または５’位に結合されたリン酸エステル基を含有する場合、それをヌクレオチドと称する。作動的に連結されたヌクレオチドの配列は通常、本明細書中では「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と称し、本明細書中では、左から右への配向性が、５’末端から３’末端の従来の方向で存在する式によって表される。
【００７６】
[00106]本明細書中の「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体またはタグ付けされたヌクレオチドを指す。
[00107]本明細書中の「ヌクレオチド類似体」という用語は、ヌクレオシド三リン酸の類似体、例えば、一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミジンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｇＮＴＰ）を指す（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第８巻：５３４５〜５３４７頁［２００６年］）。
【００７７】
[00108]本明細書中の「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または原子または分子の一群であり得る検出可能な部分を指す。タグは、ナノポアを用いて検出され得る光学的、電気化学的、磁気的または静電気的（例えば、誘導性、容量性）特徴を提供し得る。
【００７８】
[00109]本明細書中の「ポジティブに単離すること」という語句は、ポリメラーゼ複合体またはナノポア配列決定用複合体を、複合体を固相支持体に結合することによって単離して、未結合の構成成分を除去するプロセスを指す。
【００７９】
[00110]本明細書中の「ネガティブに単離すること」という語句は、ポリメラーゼ複合体構成成分を、ポリメラーゼ複合体およびポリメラーゼ複合体構成成分を含む反応混合物から単離して、構成成分を固相支持体に結合して、それによりポリメラーゼ複合体を単離するプロセスを指す。
【００８０】
[00111]「ビオチン」という用語は、本明細書中で使用する場合、ビオチン（シスヘキサヒドロ−２オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４］イミダゾール−４−ペンタン酸）ならびに任意のビオチン誘導体および類似体を指すと意図される。かかる誘導体および類似体は、自然もしくは修飾ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン結合ポケットと複合体を形成する物質である。かかる化合物として、例えば、イミノビオチン、デスチオビオチンおよびストレプトアビジン親和性ペプチドが挙げられ、またビオチン−イプシロン−Ｎ−リジン、ビオサイジンヒドラジド、２−イミノビオチンのアミノまたはスルフィドリル誘導体およびビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、スルホ−サクシンイミド−イミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオチン、３−（Ｎ−マレイミドプロピオニル）ビオサイジンが挙げられる。本発明で使用されるべきビオチンの好ましい誘導体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ；製品番号Ｄ２０６５８で市販されるデスチオビオチンまたはその誘導体ＤＳＢ−Ｘ  Ｂｉｏｔｉｎである。
【００８１】
[00112]本明細書中の「ビオチン化」という用語は、修飾ビオチンまたはビオチン類似体と、精製部分などの他の部分、例えば核酸分子（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ分子、核酸類似体、およびヌクレオチド配列を含有するか、または組み込む任意の分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその任意の修飾を含む）、タンパク質（糖タンパク質、酵素、ペプチドライブラリーまたはディスプレイ産物および抗体またはそれらの誘導体を含む）、ペプチド、炭水化物または多糖、脂質等とのコンジュゲートを指し、ここで、部分は、修飾ビオチンまたはビオチン類似体に共有結合される。多くのビオチン化リガンドは、市販されるか、または標準的な方法によって調製することができる。生体分子、例えば核酸分子またはタンパク質分子を、ビオチンにカップリングするプロセスは、当該技術分野で周知である（ＢａｙｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０巻、１４３頁、１９９２年）。
【００８２】
[00113]「結合パートナー」という用語は、別の生物学的分子との特異的もしくは非特異的な結合または相互作用が可能な任意の生物学的または他の有機分子として定義され、その結合または相互作用は、「リガンド」結合または相互作用と称される場合があり、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害剤、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、担体タンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクターもしくはリプレッサー／誘導因子の結合または相互作用によって例示されるが、これらに限定されない。本明細書中の「結合パートナー」という用語は、本明細書中に記載する単離方法において使用される親和性複合体、例えば、修飾ビオチン−修飾ビオチン結合パートナーのパートナーを指す。
【００８３】
[00114]「コンジュゲート」という用語は、本明細書中で使用する場合、ビオチン化合物およびビオチン結合化合物が非共有結合によって連結される、ビオチン化合物およびビオチン結合化合物を含む任意のコンジュゲートを指す。通常、ビオチンは、１つまたは複数の、好ましくは１つの生物学的または化学的物質、例えば生体分子に結合または連結される。上記で説明するように、他の物質に連結されるビオチンを含有するかかるビオチン化合物はまた、本明細書中で「ビオチン化」精製部分とも称される。
【００８４】
[00115]「ビオチン結合」化合物という用語は、本明細書中で使用する場合、ビオチンまたは任意のビオチン化合物に堅固であるが、非共有結合的に結合することが可能である任意の化合物を包含すると意図される。好ましいビオチン結合化合物として、修飾ストレプトアビジンおよびアビジン、ならびにそれらの誘導体および類似体、例えばニトロ−ストレプトアビジンが挙げられる。
【００８５】
[00116]「アビジン」という用語は、本明細書中で使用する場合、自然卵白糖タンパク質アビジン、ならびにアビジンの脱グリコシル化もしくは組換え形態などのその誘導体または等価体、例えば、Ｎ−アシルアビジン、例えばＮ−アセチル、Ｎ−フタリルおよびＮ−サクシニルアビジン、および市販用製品ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ  ＡｖｉｄｉｎおよびＣａｐｔＡｖｉｄｉｎを指す。
【００８６】
[00117]「ストレプトアビジン」という用語は、本明細書中で使用する場合、ストレプトマイセス属（Streptomyces）の選択株、例えば、ストレプトマイセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）によって産生される細菌ストレプトアビジン、ならびに例えば「コア」ストレプトアビジンなどの組換えおよび切断型ストレプトアビジンなどのそれらの誘導体または等価体を指す。
【００８７】
[00118]「可逆的」および「放出可能な」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、親和性複合体、例えば修飾ビオチン−修飾ビオチン結合パートナーのパートナーの物理的分離または脱離または解離を意味すると意図される。修飾ビオチンと修飾ビオチン結合パートナーとの間の連結が崩壊または破壊されて、各々の物質の分離を可能にすることが必要である。
【００８８】
[00119]本明細書中の「転置物（displacer）」という用語は、親和性複合体、例えば、修飾ビオチン−修飾ビオチン結合パートナーのパートナー間の連結を、それが切断または逆転されるのを可能にするのに十分な様式で、物理的に破壊または不安定化する可能性があり、したがって２つの連結物質を分離させる分子（例えば、遊離ビオチン）を指す。
【００８９】
[00120]本明細書中の「ランウェイ」または「ランウェイ配列」という用語は、４つのヌクレオチドのうちの３つ（即ち、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣから選択される３つのヌクレオチドの任意の組合せ）で構成されるヌクレオチド配列を指す。このランウェイセクションは、３〜５０塩基長、好ましくは８〜１２塩基であり得る。
【００９０】
[00121]一態様では、本発明は、活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法であって、
（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分にコンジュゲートされた捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固相支持体に結合すること、
（ｃ）前記活性ポリメラーゼ複合体のポリメラーゼの活性によって鋳型相補ポリヌクレオチド合成を可能にするためのヌクレオチドを含む試薬を供給して、伸長された相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、ならびに、
（ｄ）伸長された相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていない相補配列および捕捉オリゴヌクレオチドを含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離し、それにより、前記活性ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ複合体構成成分から単離すること、
を含む方法を提供する。
【００９１】
伸長されていない相補配列を有する不活性ポリメラーゼ複合体は、前記固相支持体に結合されたままである可能性があり、伸長された相補配列を有する活性ポリメラーゼ複合体は、前記ポリメラーゼの活性によって、前記捕捉複合体から放出され得る。
【００９２】
第２の態様では、本発明は、ポリメラーゼ複合体をポジティブに単離する方法であって、
（ａ）未結合のポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、および精製部分を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含む複数の捕捉複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）前記捕捉複合体を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合すること、ならびに、
（ｃ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ複合体構成成分から単離すること、
を含む方法を提供する。
【００９３】
前記ポリヌクレオチド鋳型は、線状または連続的鋳型であってもよく、捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。前記鋳型はまた、自己プライミング鋳型であり、前記自己プライミング鋳型は、精製部分をさらに含む。その方法はまた、前記ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体を、前記固相支持体から放出させることをさらに含むステップを含み得る。
【００９４】
第３の態様では、本発明は、ポリメラーゼ複合体を、未結合のポリメラーゼ複合体構成成分の混合集団からネガティブに単離する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ複合体構成成分、ならびにそれぞれがポリヌクレオチド鋳型に結合されたポリメラーゼ酵素を含む複数のポリメラーゼ複合体を含む反応混合物を供給すること、
（ｂ）未結合のポリメラーゼ酵素を、精製部分を含む任意選択で二本鎖の捕捉オリゴヌクレオチドに結合して、捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を形成すること、ならびに、
（ｃ）前記捕捉オリゴヌクレオチドポリメラーゼ酵素複合材を、精製部分結合化合物を含む固体支持体に結合し、それにより、前記ポリメラーゼ複合体を、前記ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体構成成分から単離すること、
を含む方法を提供する。
【００９５】
その方法に従うポリヌクレオチド鋳型は、線状または環状鋳型であってもよく、捕捉複合体はそれぞれ、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含み得る。ポリヌクレオチド鋳型はまた、自己プライミング鋳型であり得る。その方法は、未結合のポリメラーゼ構成成分を、前記固相支持体に結合された前記捕捉複合体から除去するステップをさらに含んでもよい。前記捕捉複合体の、前記固相媒体への結合は、可逆的であり得る。精製部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであってもよく、前記精製部分結合化合物は、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンであってもよい。前記ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含んでもよく、前記ビオチン結合化合物は、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含んでもよい。ポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼとしての、もしくはその変異体としてのＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼであり得る。単離されたポリメラーゼ複合体はそれぞれ、ナノポアを含んでもよく、それは、ＨＬもしくはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体などの野生型ナノポアまたはその変異体であってもよい。
【００９６】
第４の態様では、本発明は、バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）上記で開示する方法のいずれか１つに従ってポリメラーゼ複合体を単離すること、
（ｂ）前記ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成されたナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、または
（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、
を含む方法を提供する。
【００９７】
前記膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有し得る。ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。
【００９８】
バイオチップは、上記で開示するように調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含むポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップであり得る。
第５の態様では、本発明は、ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法であって、
（ａ）請求項２０または２１のいずれか１つに従ってバイオチップを調製すること、
（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、前記タグ付けされたヌクレオチドのタグが、前記ナノポアを用いて検出可能なものである、
（ｃ）前記ナノポア配列決定用複合体において前記ナノポアにカップリングされた前記ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを、試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な成長中の鎖に組み込むこと、
（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグを検出すること、ここで、前記タグは前記ナノポアを用いて検出される一方で、前記ヌクレオチドは前記ポリメラーゼと会合し、それにより、前記核酸試料の配列を提供する、
を含む方法を提供する。
【００９９】
ポリヌクレオチド鋳型は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。
第６の態様では、本発明は、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプターを提供し、前記アダプターが、プライマー認識配列、該プライマー認識配列に対して５’に位置するランウェイ配列、および該ランウェイ配列に対して５’に位置するポリメラーゼ終結配列を含む一本鎖領域を有し、ここで、前記ランウェイ配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの４つのヌクレオチド塩基のうちの３つ以下から選択される２〜５０個の連続したヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド配列を含み、ランウェイ配列に含有されないヌクレオチド塩基は、停止塩基と称され、前記ランウェイ配列は、ポリメラーゼ駆動プライマー伸長用の鋳型として機能し、前記ポリメラーゼ終結反応配列は、任意のかかるポリメラーゼ駆動プライマー伸長を終結させるのに有効である少なくとも１つの停止塩基を含む。
【０１００】
ランウェイ配列は、８〜１２ヌクレオチド塩基長であり得る一方で、ポリメラーゼ終結配列は、１〜１０ヌクレオチド塩基長であり得る。
核酸アダプターは、アダプターのプライマー認識配列に特異的なプライマー、およびポリメラーゼ酵素をさらに含むポリメラーゼ複合体の一部であり得る。
【０１０１】
第７の態様では、本発明は、活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法であって、
（ａ）上記で開示するように単離されるポリメラーゼ複合体および核酸ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を含む反応混合物を供給すること、ここで、該ポリメラーゼ複合体のアダプターが、前記核酸試料にライゲーションされる、
（ｂ）該アダプターのランウェイ配列において含有されるヌクレオチド塩基に相補的であるｄＮＴＰのみを含むデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物を供給すること、ここで、該ｄＮＴＰの１つまたは複数が、結合パートナーに対して親和性を有する捕捉部分を含むように修飾される、
（ｃ）該ポリメラーゼの活性によって該ランウェイ配列に相補的なポリヌクレオチド配列の合成を可能にするように該反応混合物および該ｄＮＴＰ混合物を組み合わせて、その中に組み込まれた修飾ｄＮＴＰを有する伸長されたランウェイ相補配列を含む複数の活性ポリメラーゼ複合体を得ること、
（ｄ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、固相支持体に結合すること、ここで、該修飾ｄＮＴＰの捕捉部分が、該固相支持体上の結合パートナーに結合される、ならびに、
（ｅ）伸長されたランウェイ相補配列を有する前記活性ポリメラーゼ複合体を、伸長されていないランウェイ相補配列を含む不活性ポリメラーゼ複合体から単離すること、
を含む方法を提供する。
【０１０２】
その方法は、不活性ポリメラーゼ複合体を洗い流して、固相支持体に結合された活性ポリメラーゼ複合体を得るステップを含み得る。その後、活性ポリメラーゼ複合体は、固相支持体から溶出され得る。アダプターの前記一本鎖領域は、線状または環状鋳型であり得る。前記活性ポリメラーゼの、前記固相支持体への結合は、可逆的であり得る。捕捉部分は、ビオチンまたは修飾ビオチンであってもよく、前記結合パートナーは、ストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンであってもよい。例えば、前記ビオチン化合物は、デスチオビオチンまたはその誘導体を含んでもよく、前記結合パートナーは、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含んでもよい。ポリメラーゼは、野生型もしくは変異体のＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡポリメラーゼであり得る。単離された活性ポリメラーゼ複合体はそれぞれ、例えば、ＨＬまたはＯｍｐＧナノポアの野生型または変異体ナノポアを含み得る。
【０１０３】
第８の態様では、本発明は、バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）上記で開示するように活性ポリメラーゼ複合体を単離すること、
（ｂ）前記活性ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜において予め形成されたナノポアに結合させて、ナノポア−ポリメラーゼ複合体を供給すること、または
（ｂ）前記ナノポア−ポリメラーゼ複合体を、前記バイオチップの膜に挿入すること、
を含む方法を提供する。
【０１０４】
膜は、１ｍｍ２に少なくとも５００，０００個のナノポア配列決定用複合体の前記ナノポア配列決定用複合体の密度を有し得る。ナノポア−ポリメラーゼ複合体の少なくとも７０％が、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体であるはずである。
【０１０５】
本発明はまた、上記で開示するように調製されるナノポア−ポリメラーゼ複合体のアレイを含む、ポリヌクレオチド鋳型を配列決定するためのバイオチップに関する。
最終的な態様では、本発明は、ポリヌクレオチド鋳型をナノポア配列決定する方法であって、
（ａ）上記で開示するようにバイオチップを調製すること、
（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記ナノポア配列決定用複合体に供給すること、ここで、前記タグ付けされたヌクレオチドのタグが、前記ナノポアを用いて検出可能なものである、
（ｃ）前記ナノポア配列決定用複合体において前記ナノポアにカップリングされた前記ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、前記タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを、試料ポリヌクレオチド鋳型に相補的な伸長中の鎖に組み込むこと、ならびに、
（ｄ）前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付けされたヌクレオチドと会合されたタグを検出すること、ここで、前記タグは前記ナノポアを用いて検出される一方で、前記ヌクレオチドは前記ポリメラーゼと会合し、それにより、前記核酸試料の配列を提供する、
を含む方法を提供する。
【０１０６】
ポリヌクレオチド鋳型は、二本鎖ＤＮＡであり得るか、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。
ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体を単離する方法
転置精製−活性ポリメラーゼ複合体および／または活性ナノポア配列決定用複合体を単離する方法：
[00122]一態様では、ポリヌクレオチド鋳型と会合された活性ポリメラーゼを含む活性ナノポア配列決定用複合体、即ち活性ポリメラーゼ複合体を調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ複合体の活性ポリメラーゼは、ナノポアに結合される。活性ナノポア複合体は、混合物として供給されるその構成成分の結合によって形成される。活性ポリメラーゼ複合体は、ポリマー鋳型基質、例えばポリヌクレオチド鋳型、および鋳型に結合された活性ポリメラーゼを含む。活性ポリメラーゼ複合体は、活性ポリメラーゼに結合されるナノポアをさらに含み得る。続いて、形成された活性ポリメラーゼ複合体は、未結合のポリメラーゼ複合体構成成分および不活性ポリメラーゼ複合体の混合物から単離される。未結合のポリメラーゼ構成成分は、別個のポリメラーゼ酵素分子、鋳型分子、およびナノポアタンパク質、およびポリメラーゼ酵素と会合しているが、鋳型分子とは会合していないナノポアタンパク質を含む。活性ポリメラーゼ複合体は、ポリメラーゼの、鋳型依存性配列でヌクレオチドをポリヌクレオチドの鎖に組み込む能力によって、不活性ポリメラーゼ複合体から単離され、それは、ポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズされる捕捉オリゴヌクレオチドを転置する。ポリヌクレオチド鋳型からの捕捉オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ依存性転置を図２に示す。
【０１０７】
[00123]図２は、自己プライミング鋳型（２０１）および自己プライミング鋳型の二本鎖部分に結合されたポリメラーゼ（２０２）を含むポリメラーゼ複合体を示す。第１のステップ（ｉ）では、ポリメラーゼ複合体は、捕捉オリゴヌクレオチド（２０３）と組み合わさり、それは、ポリヌクレオチド（２０４）および精製部分（２０５）を含み、ステップ（ｉｉ）において捕捉複合体（２０６）を形成する。捕捉複合体は、ステップ（ｉｉｉ）において捕捉オリゴヌクレオチド（２０３）の精製部分を用いて、固相（２０７）に係留／結合される。捕捉オリゴヌクレオチドと、ポリメラーゼ複合体との相互作用は、鋳型およびオリゴヌクレオチド上の配列のハイブリダイゼーションによって起きる。ステップ（ｉｖ）において、ヌクレオチドおよびＭｇＣｌ２を含む触媒条件下で、活性ポリメラーゼ（２０８）は、自己プライミング鋳型を伸長し、それが、結合された捕捉オリゴヌクレオチドに到達すると、それは、ステップ（ｖ）に示すように、捕捉オリゴヌクレオチドを捕捉複合体から転置する。遊離捕捉オリゴヌクレオチド（２０３）は、固相支持体に結合されたままであり、活性ポリメラーゼ複合体（２０９）は、不活性ポリメラーゼ複合体および放出された捕捉オリゴヌクレオチドから単離される。不活性ポリメラーゼ複合体は、自己プライミング鋳型を伸長することはできず、ポリメラーゼ複合体は、（ｉｉｉ）に示すように、捕捉オリゴヌクレオチドに結合されたままである。
【０１０８】
[00124]図２に提供する捕捉複合体の構造を、図３に詳細に示す。この例示的な説明において、自己プライミングヘアピンポリヌクレオチド鋳型（３００）は、捕捉オリゴヌクレオチド（３０１）にハイブリダイズされて、鋳型−捕捉オリゴヌクレオチド複合体（３１１）を形成する。ポリヌクレオチド鋳型（３００）は、自己相補二本鎖領域（３０２）および５’オーバーハング配列（３０３）の領域を含み、５’−オーバーハング配列（３０３）は、第１（３０４）、第２（３０５）および第３（３０６）の配列を含む。第１の配列（３０４）は、鋳型の３’末端の相補的な伸長を指示する鋳型配列として役立つ。第２の配列（３０５）は、捕捉オリゴヌクレオチドの配列３０７のヌクレオチド塩基に相補的であるヌクレオチドを含む。第３の配列（３０６）は、相補鎖のポリメラーゼ合成を休止するのに役立つ４つの公知のヌクレオチド塩基を含む。捕捉オリゴヌクレオチド（３０１）は、捕捉オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするポリヌクレオチド鋳型の第２の配列（３０５）に相補的である第１の配列（３０７）、および第２のリンカー配列（３０８）を含み、捕捉ヌクレオチド（３０１）は、その３’末端に精製部分（３１０）を含む。精製部分は、鋳型−捕捉オリゴヌクレオチド複合体を精製部分（３１０）に連結／係留する。図１に関して記載するように、ポリメラーゼ酵素は、二本鎖鋳型領域（３０２）と会合して、触媒条件下で、活性ポリメラーゼは、鋳型の３’末端を伸長して、配列３０４の塩基に相補的であるヌクレオチド塩基を組み込む。活性ポリメラーゼが、捕捉オリゴヌクレオチド（３０７）と鋳型（３０５）との間のハイブリダイゼーションの領域に達する場合、捕捉オリゴヌクレオチドは、活性ポリメラーゼ−鋳型複合体から転置される。不活性ポリメラーゼは、鋳型の３’末端を伸長せず、捕捉オリゴヌクレオチドを転置することができない。次に、精製部分は、固相媒体に結合されて、それにより不活性ポリメラーゼ−鋳型複合体および転置された捕捉オリゴヌクレオチドを、残存する活性−ポリメラーゼ複合体から単離する。
【０１０９】
[00125]鋳型ポリヌクレオチドの配列３０６は、活性ポリメラーゼ−鋳型複合体の活性ポリメラーゼの活性を休止するように設計／使用される停止配列を含む。停止配列は、４つのヌクレオチド塩基の配列であってもよく、ここで、第４の塩基は、最初の３つの塩基と異なる。ポリメラーゼが停止配列に達する場合、相当する鋳型塩基の最初の３つに相補的であるヌクレオチド塩基のみが、活性ポリメラーゼを休止させるように供給される。続いて、活性−ポリメラーゼ−鋳型複合体は、バイオチップの膜に挿入されて、そこで、それは、停止配列（３０７）の第４の塩基に相補的であるヌクレオチド塩基を供給することによって再活性化されて、鋳型のナノポア配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、活性配列決定用複合体は、ナノポアを含み、活性ポリメラーゼは、ナノポアに予め結合され、続いて、ナノポア−ポリメラーゼ−鋳型複合体は、バイオチップの膜に挿入される。他の実施形態では、活性ポリメラーゼは、ナノポアに予め結合されず、ポリメラーゼ−鋳型複合体は、バイオチップの膜に予め挿入されるナノポアに結合される。
【０１１０】
[00126]図４は、活性ナノポア配列決定用複合体を調製する方法の例を示す。この例において、ポリヌクレオチド鋳型は、連続的ポリヌクレオチド鋳型であり、それは、ダンベルの形態で存在する。ポリヌクレオチド鋳型構造は、線状、連続的、例えば環状、またはヘアピンであり得る。線状および環状鋳型は、相補鎖の重合をプライミングするためのプライマーオリゴヌクレオチドを要するのに対して、ヘアピン鋳型は、自己プライミングであり、プライマーオリゴヌクレオチドを要さない。その方法は、ポリメラーゼ酵素（４０１）、ポリヌクレオチド鋳型（４０２）、オリゴヌクレオチドプライマー（４０３）、捕捉オリゴヌクレオチド（４０４）、および任意選択で、ナノポア（４０５）の混合物（４００）を含む溶液を供給するステップ（ｉ）を含む。ナノポアは、このステップで供給される場合、ナノポア−ポリメラーゼ複合体（４０６）としてポリメラーゼに結合され得る。ポリヌクレオチド鋳型は、オリゴヌクレオチドプライマー（４０３）のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列（４０７）、および捕捉オリゴヌクレオチド（４０４）の配列の一部（４０９）に相補的である第２のヌクレオチド配列（４０８）を含む。任意選択で、鋳型は、活性ポリメラーゼによる相補鎖の重合を停止する停止配列（４０９）をコードするヌクレオチド配列を含む。捕捉オリゴヌクレオチドは、その３’末端に、下記に記載するように不活性ポリメラーゼ−鋳型複合体の除去を可能にする精製部分（４１０）を含む。
【０１１１】
[00127]（ｉｉ）において、マグネシウムおよびｄＮＴＰの非存在下で、即ち、非触媒条件下で、ポリヌクレオチド鋳型、オリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ酵素、および捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉複合体（４１１）が形成される。いくつかの実施形態では、捕捉複合体は、ナノポアを含まない。
【０１１２】
[00128]（ｉｉｉ）において、ナノポア配列決定用複合体は、固相媒体（４１２）に結合され、それは、捕捉オリゴヌクレオチドによって固相媒体（４１２）に係留される。複合体形成されていない構成成分、即ち、ナノポア、ポリメラーゼおよびナノポア結合ポリメラーゼは除去され、触媒条件、例えばＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰ下で、活性ポリメラーゼは、（ｉｖ）に示すように、プライマー配列を伸長し、固相結合捕捉オリゴヌクレオチド（４１３）を転置させる。重合が停止／休止されるまで、鎖合成は進行する。図４に示す例示的なプロセスでは、重合は、ＥＤＴＡで休止させることができる。あるいは、重合は、図３に示すように、ポリヌクレオチド鋳型に含まれる停止配列によって休止させることができる。続いて、活性ナノポア配列決定用複合体（４１４）は、固相結合捕捉オリゴヌクレオチド（４１３）から単離されて、鋳型のナノポア配列決定が実施されるバイオチップの膜、例えば脂質膜に挿入される。いくつかの実施形態では、単離された活性ポリメラーゼ−複合体は、ナノポアを含まず、単離された活性ポリメラーゼ複合体は、バイオチップの膜において予め挿入されるナノポアに結合される。
【０１１３】
ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体のポジティブ単離：
[00129]別の態様では、ポリメラーゼ複合体は、複合体を固相支持体に結合することによりポリメラーゼ複合体をポジティブに単離することによって、その構成成分から単離される。この例において、ポリメラーゼ複合体は、捕捉複合体の一部である。ポリメラーゼ複合体をポジティブに単離する方法の例を図５に示す。
【０１１４】
[00130]第１のステップ（ｉ）において、ポリメラーゼ複合体構成成分は、反応混合物中に供給されて、それらの会合を可能にするようにインキュベートして、ポリメラーゼ複合体を形成する。いくつかの実施形態では、反応混合物中の構成成分は、ポリヌクレオチド鋳型（５０１）およびポリメラーゼ酵素（５０２）を含む。他の実施形態では、反応混合物の構成成分は、ナノポアタンパク質（５０３）をさらに含む。ポリヌクレオチド鋳型が自己プライミング鋳型である実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、反応混合物中に含まれず、精製部分は、鋳型の５’末端に結合される。ポリヌクレオチド鋳型が線状または環状である実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー（５０４）が含まれる。オリゴヌクレオチドプライマーは、精製部分（５０５）を含む。精製部分結合化合物を含む固相支持体（５０６）は、このステップで添加され得るか、またはそれは、続くステップ（ｉｉ）において添加され得る。図５は、捕捉オリゴヌクレオチドとしてオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法を示す。
【０１１５】
[00131]次に（ｉｉ）、ポリメラーゼ複合体（５０７）は、ポリヌクレオチド鋳型、精製部分を含むオリゴヌクレオチドプライマー、および二本鎖鋳型−プライマー領域に結合されたポリメラーゼ酵素の会合によって形成される。いくつかの実施形態では、図５に示すように、複合体のポリメラーゼ酵素は、ナノポアタンパク質（５０３）に連結される。ナノポアとポリメラーゼとの間の会合が起き、ナノポア−ポリメラーゼ複合体（５０８）を形成することができ、それは、ポリメラーゼ複合体に組み込まれない場合がある。
【０１１６】
[00132]（ｉｉｉ）において示すように、ポリメラーゼ複合体は、固相支持体（５０６）に結合することによって、ポリメラーゼ構成成分から精製される。非会合／非結合構成成分は除去され、固相支持体に結合されたポリメラーゼ複合体を残し、それは、固相支持体から溶出されて、単離されたポリメラーゼ複合体（５０９）を得ることができる。続いて、ポリメラーゼ酵素構成成分に結合されたナノポアを有するポリメラーゼ複合体は、本明細書中の他の箇所で記載するように鋳型の配列決定が進行し得るバイオチップの膜に挿入させることができる。あるいは、ナノポアを欠如するポリメラーゼ複合体は、バイオチップの膜に予め挿入されるナノポアに結合させることができる。
【０１１７】
[00133]図６は、図５に記載するポジティブ単離プロセスの実施形態を示す。図６に示すプロセスでは、ストレプトアビジンでコーティングされた固相支持体、例えば磁気ビーズ（５０１）を、デスチオビオチン精製部分を有するポリヌクレオチド鋳型、およびポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼと反応させる（６０２）。ポリメラーゼ酵素およびポアと複合体形成される鋳型（６０３）は、ストレプトアビジンビーズに結合する。未結合のポリメラーゼ複合体構成成分を洗い流して（６０５）、鋳型、ポリメラーゼおよびナノポアを含むポリメラーゼ複合体を、ストレプトアビジンビーズから溶出させて（６０６）、精製されたナノポア配列決定用複合体、即ち、純粋な三元複合体を供給する（６０７）。図６は、固相支持体が、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物中に添加され得ることを示す。したがって、ポリメラーゼ複合体の形成が、固相支持体を添加する前に行わせることは、任意選択的である。
ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体のネガティブ単離：
[00134]別の態様では、ポリメラーゼ複合体は、非会合複合体構成成分を固相支持体に結合することと、ポリメラーゼ複合体を、反応混合物の未結合の分画から収集することとによりポリメラーゼ複合体をネガティブに単離することによって、その構成成分から単離される。この例において、ポリメラーゼ構成成分は、捕捉複合体の一部である。ポリメラーゼ複合体をネガティブに単離する方法の例を図７に示す。
【０１１８】
[00135]第１のステップ（ｉ）において、ポリメラーゼ複合体構成成分は、反応混合物中に供給されて、それらの会合を可能にするようにインキュベートして、ポリメラーゼ複合体を形成する。いくつかの実施形態では、反応混合物中の構成成分は、ポリヌクレオチド鋳型（７０１）およびポリメラーゼ酵素（７０２）を含む。他の実施形態では、反応混合物の構成成分は、ナノポアタンパク質（７０３）をさらに含む。ポリヌクレオチド鋳型が自己プライミング鋳型、例えばヘアピン鋳型である実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、反応混合物中に含まれない。ポリヌクレオチド鋳型が線状または連続的、例えば環状である実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー（７０４）が含まれる。図７は、捕捉オリゴヌクレオチドとしてオリゴヌクレオチドを使用する方法を示す。捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素構成成分と会合する自己プライミングポリヌクレオチドであり得る。
【０１１９】
[00136]ポリメラーゼ複合体構成成分の会合は、ポリヌクレオチド鋳型およびポリメラーゼ酵素を含むポリメラーゼ複合体の形成をもたらす。図７（ｉｉ）において示す例において、鋳型は連続的であり、ポリメラーゼ複合体は、オリゴヌクレオチドプライマー（７０５）をさらに含む。反応混合物中に存在する場合、ナノポア構成成分は、遊離ポリメラーゼ構成成分と会合して、遊離ナノポア−ポリメラーゼ複合体を形成することができる（６０６）。次に、図７（ｉｉｉ）に示すように、精製部分（７０８）および固相支持体（７０９）を含む捕捉オリゴヌクレオチド（７０７）が反応混合物に添加される。捕捉オリゴヌクレオチドは、遊離ポリメラーゼ酵素構成成分と、および／またはナノポアが反応混合物中に含まれる場合にはポリメラーゼ−ナノポア複合体と会合して、それぞれ捕捉複合体（７１０）および（７１１）を形成する自己プライミングポリヌクレオチドであり得る。固相支持体（７０９）は、捕捉複合体の精製部分を結合して、ポリメラーゼ複合体（７０５）で富化されている未結合の分画を供給する。
【０１２０】
[00137]次に、ポリメラーゼ酵素に結合されたナノポア（７１３）を含むポリメラーゼ複合体は、本明細書中の他の箇所で記載するように鋳型の配列決定が進行し得るバイオチップの膜に挿入させることができる。あるいは、ナノポアを欠如するポリメラーゼ複合体は、バイオチップの膜に予め挿入されるナノポアに結合させることができる。
【０１２１】
精製部分および精製部分結合パートナー／リガンド：
[00138]ポリメラーゼ複合体を、遊離または未結合のポリメラーゼ複合体構成成分から単離する方法として、親和性精製としても公知であるアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１２２】
[00139]いくつかの実施形態では、親和性精製は、ポリメラーゼ複合体のポジティブ単離のプロセスで用いられ、それにより、ポリメラーゼ複合体は、固相支持体上でのポリメラーゼ複合体の精製部分の、精製部分結合パートナーへの結合を介して固体支持体へカップリングされる。遊離または未結合の複合体構成成分を洗い流し、続いて、固体支持体結合ポリメラーゼ複合体は、固体支持体から溶出されて、精製されたポリメラーゼ複合体分画を供給する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ複合体の、固相支持体への結合は、可逆的である。プロセスは、ｂを参照して記載される。
【０１２３】
[00140]他の実施形態では、親和性精製は、ポリメラーゼ複合体構成成分のネガティブ単離のプロセスにおいて用いられ、それにより、ポリメラーゼ複合体の望ましくない未結合の構成成分は、未結合の構成成分の精製部分の、固相支持体の精製部分結合リガンドへの結合によって、望ましいポリメラーゼ複合体から除去される。いくつかの実施形態では、望ましくない未結合のポリメラーゼ複合体構成成分の、固相支持体への結合は、可逆的である。他の実施形態では、結合は不可逆的である。プロセスは、例えば、図２、図３、図４および図７を参照して記載される。
【０１２４】
[00141]いくつかの実施形態では、精製部分および精製部分結合パートナーはそれぞれ、互いにハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列である。
[00142]いくつかの実施形態では、精製部分はビオチンであり、固相支持体の精製部分結合パートナーは、アビジンまたはストレプトアビジンである。アビジン−ビオチン系、特にストレプトアビジン−ビオチン系は、分子アッセイ、免疫学的アッセイおよび細胞アッセイにおいて最も広く使用される親和性結合の１つである。概して、混合物から単離されるべきである標的分子は、ビオチンに直接的に、またはビオチン化された中間体に結合される。かかる中間体は、標的分子と複合体形成するか、または標的分子にコンジュゲートするほぼ任意の分子または巨大分子であり得る。
【０１２５】
[00143]ポリメラーゼ複合体のポジティブ単離のプロセスの実施形態では、ビオチンまたはビオチン化された中間体に結合される標的分子は、ポリメラーゼ複合体である（図５）。転置精製のプロセスの実施形態では、活性および不活性ポリメラーゼ複合体は、ビオチンまたはビオチン化された中間体に結合される標的である（図４）。ポリメラーゼ複合体のネガティブ単離のプロセスの実施形態では、ビオチンまたはビオチン化された中間体に結合される標的分子は、未結合のポリメラーゼ構成成分、例えば未結合のポリメラーゼ酵素、および未結合のポリメラーゼ−ナノポア複合体のいずれか１つである（図７）。全ての実施形態において、ビオチン化された標的は、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの類似体および誘導体に結合されて、それらは、単離しやすくするために固相に結合され得る。
【０１２６】
[00144]ストレプトアビジンまたはアビジンに対するビオチンの高い親和性は、ビオチン会合標的の検出および単離に関する多くの確立された手順の基盤を提供する。アビジンとビオチンとの間の結合（親和性定数、ｋおよそ１０〜１５Ｍ）は、公知の最強の非共有結合的生物学的相互作用の１つとみなされる（Ｎ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４巻：５１〜６７頁、１９９０年）。この強力な結合は、結合パートナーの一方または両方が、他の材料に共有結合される場合でさえ維持される。結合は、非常に迅速に形成して、幅広いｐＨ、温度および他の変性条件下で安定であるとみなされる（Ｓａｖａｇｅら、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９２年：１〜２３頁、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。ビオチンのストレプトアビジンからの解離は、ビオチンのアビジンからの解離よりも約３０倍速いと報告されている（Ｐｉｒａｎ＆Ｒｉｏｒｄａｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３３巻、１４１〜１４３頁、１９９０年）。
【０１２７】
[00145]ビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）連結を使用するいくつかの用途は、２つの結合パートナーの本質的に不可逆的な結合に依存する。例えば、不可逆的な結合は、ネガティブ単離の方法において利用することができ、それにより、所望のポリメラーゼ複合体は、固相支持体に結合されず、未結合のポリメラーゼ構成成分が激減される分画中に単離されたままである。本明細書中で提供する他の方法では、所望のポリメラーゼ複合体の単離は、結合パートナーの可逆的な結合に依存し、それにより、ビオチン化された精製部分と精製部分結合パートナーとの間の相互作用は、転置物リガンドによって放出される。例えば、可逆的な結合は、ポジティブ単離の方法において利用することができ、それにより、所望のポリメラーゼ複合体は、固相支持体に結合され、それによって未結合のポリメラーゼ複合体構成成分から単離される。
【０１２８】
[00146]いくつかの実施形態では、結合パートナーの放出可能な結合は、修飾ビオチンおよびその誘導体を使用することによって得ることができる。例えば、いくつかの実施形態では、精製結合部分は、精製部分としてのデチオビオチン、結合パートナーとしてのストレプトアビジンであり、デチオビオチンよりもストレプトアビジンに対して高い親和性定数を有するビオチンを、転置物リガンドとして使用することができる。適切な転置物リガンドの例として、ビオチン、デチオビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンが挙げられる。ビオチンは、好ましい転置物リガンドである。連結を含有する試料は好ましくは、水性試料であり、そこに転置物リガンドが添加され、反応混合物は、転置物リガンドを結合させる時間間隔の間、適切な条件下で静置させて、続いて連結の構成成分の一方または両方が分離され得る。適切な放出可能なリガンドの例として、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能基化されたアゾ色素、ストレプトアビジン、サクシニル化アビジンおよびアビジンが挙げられる。デチオビオチンが好ましい。米国特許第５，３３２，６７９号。精製結合部分として使用することができる他のビオチン類似体として、ビオチンスルホン、ならびにカプロイルアミドビオチンおよびビオサイジンを含むビオチン誘導体が挙げられる。米国特許第４，６５６，２５２号；同第４，４７８，９１４号；および同第４，２８２，２８７号。
【０１２９】
[00147]他の実施形態では、精製結合部分は、デスチオビオチンの誘導体である。修飾ビオチン誘導体は、ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンという名称で市販されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）。ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンは、安定なビオチン前駆体であるデスチオビオチンの誘導体である。ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンは、７原子スペーサーを利用して、ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンコンジュゲートの、ストレプトアビジンまたはアビジンの深いビオチン結合ポケットにおいて結合する能力を高めることができる。誘導体は、アビジンおよびストレプトアビジンに関して中程度の親和性を有する。それらの相互作用は、中性ｐＨおよび室温で低濃度の遊離ビオチンまたはデスチオビオチンにより迅速に逆転される。ＤＳＢ−Ｘビオチン標識された分子と複合体形成された標的は、アビジンまたはストレプトアビジンコンジュゲートを用いて選択的に検出することができるか、または親和性マトリクス上で単離することができ、続いて穏やかな条件下で、ＤＳＢ−Ｘビオチン標識された生体分子を放出させる（Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０８巻、３４３〜３５７頁、２００２年）。ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンは、標的の固定化用のストレプトアビジンまたはアビジンでコーティングされた固相を用いて、様々な分子にコンジュゲートさせることができるか、またはＤＥＳ−Ｘ（商標）でコーティングされた固相およびストレプトアビジンまたはアビジンで標識された分子を使用してもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓは、ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンならびにＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンアガロースの様々な抗体コンジュゲートを提供する。
【０１３０】
[00148]放出可能なストレプトアビジンービオチンまたはアビジン−ビオチンコンジュゲートはまた、例えば、ビオチンを結合パートナーに連結する化学的な切断可能なリンカーを使用することによって得ることができる。Ｓｈｉｍｋｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、２５９３〜２５９７頁、１９８５年）は、ヌクレオチドをアビジン−アガロースカラムに可逆的に結合するための手段として、ビオチンをピリミジン環のＣ−５に結合したリンカーにおけるジスルフィド結合の使用について記載している。この原理はまた、米国特許第４，７７２，６９１号にも記載されている。他の実施形態では、酵素的または化学的作用物質によって特異的に切断可能である連結、例えば、各種ペプチダーゼによって切断可能なペプチド結合、二糖分解酵素によって切断可能な二糖連結、または穏やかな還元、酸化、酸性もしくは塩基性条件下で選択的に破壊させることができる化学的結合を、ビオチン分子と結合パートナー間に導入することができる（米国特許第５，２１５，９２７号）。例えば、かかるリンカーの１つであるＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンは、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）。市販のＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ、製品番号１１５．３３）は、標的放出用の切断可能な部位を提供するためのＤＮＡリンカーを介した、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを含有する。放出は、室温で１５分間のＤＮＡ分解酵素とのインキュベーションによって起きる。光解離性連結または光切断可能なビオチンホスホルアミダイト（Ｏｌｅｊｎｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻：３６１〜３６６頁、１９９６年）または温度もしくはｐＨ依存性放出をもたらすストレプトアビジン突然変異体と一緒のポリマーコンジュゲートの使用もまた使用され得る（Ｄｉｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０巻：３９５〜４００頁［１９９９年］；Ｂｕｌｍｕｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１巻：７８〜８３頁［２０００年］）。好ましい実施形態では、固相は、磁気粒子を含み、磁気粒子および結合された構成成分またはポリメラーゼ複合体は、磁気凝集によって構成成分および複合体の混合集団から単離される。
【０１３１】
[00149]本明細書中に記載する結合および放出系に関与するパラメーターは全て、単離されるべき標的、使用するリガンド系、使用する修飾ビオチンおよびアビジンもしくは修飾アビジン、またはストレプトアビジン、および同様に、使用する固相のタイプ、例えば磁気ビーズのサイズに依存して様々であり得る。使用する条件は全て、使用する任意の所定の標的および結合対に関して当業者によって容易に決定され得る。
【０１３２】
[00150]他の実施形態では、本明細書中で提供する方法は、モノマーアビジンの使用（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ．）、ビオチンまたはストレプトアビジンの切断およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド−イミノビオチンおよびアミドビオチンのようなビオチン類似体の使用を含む。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド−イミノビオチン（ＮＨＳ−イミノビオチン）は、ストレプトアビジンに対するｐＨ感受性結合親和性を有するＮＨＳ−ビオチンのグアニド類似体である。
【０１３３】
[00151]いくつかの実施形態では、精製部分結合パートナー／リガンドは、アビジンまたはストレプトアビジンであり、それは、組換えであってもよく、または化学的に修飾されてもよく、ビオチンまたはその類似体への安定な結合を形成することができる。例えば、Ｋｕｌｏｍａａらによる刊行物国際公開第０１／０５９７７号は、特異的なトリプトファン残基をリジンと置き換えて、可逆的なビオチン結合特性を示す安定な二量体を産生する、アビジンおよびストレプトアビジンの両方における突然変異を開示している。ビオチンに対する低減された親和性を有し、また本明細書中で提供する精製方法における精製部分結合パートナーとして使用することができる他の修飾アビジンおよびストレプトアビジンは、例えば、米国特許第６，０２２，９５１号；同第６，３９１，５７１号；同第６，３１２，９１６号；同第６，４１７，３３１号；同第６，１６５，７５０号および同第６，１５６，４９３号に記載される。さらに、天然ストレプトアビジンに実質的に免疫学的に等価であり、かつビオチンまたはビオチン誘導体もしくは類似体に結合することが可能であるポリペプチドもまた、本明細書中で提供する方法において、精製部分結合パートナーとして使用することができる（米国特許第５，１６８，０４９号）。
【０１３４】
[00152]いくつかの実施形態では、リガンド、即ち、精製部分結合パートナーは、精製部分に対して誘導される抗体である。抗体はまた、精製部分に連結される別の抗体（即ち、抗抗体）に対して誘導され得る。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を使用することができ、それらは、分子全体またはそれらの様々な断片であり得る。特定のリガンドに特異的な抗体は、当該技術分野で周知であり、かつ文書化された方法によって産生され得る。本発明の方法における使用のための抗体は、かかる抗体が、特定の結合パートナーと連結を形成することが可能であり、修飾ビオチンでビオチン化され得ることを提供する任意の種、種類またはサブタイプであり得る。したがって、本発明における使用のための抗体は、免疫グロブリンの様々な種類またはサブクラスのいずれか、例えば、任意の動物に由来するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、無傷抗体または抗体の「断片」、モノクローナルまたはポリクローナル、キメラ抗体、または合成的に作製されるか、もしくは変更される抗体様構造を含む。また、抗体の機能性誘導体または「等価体」、例えば、単鎖抗体が含まれる。
【０１３５】
[00153]修飾ビオチン結合化合物（例えば、ニトロ−ストレプトアビジンまたはアビジン）または修飾ビオチンは、望ましい場合、当該技術分野で周知の方法によって、基質表面上の反応性基を通じて適切な支持体に共有結合され得る。
【０１３６】
[00154]固相支持体は、化学的または生化学的手順において、固定化、分離等に現在広く使用されるか、もしくは提唱される周知の支持体またはマトリクスのいずれかであり得る。これらは、粒子、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、超極細繊維片、チューブ、ウェルもしくはプレート、線維もしくはキャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイもしくはチップまたはそれらの組合せの形態を取ってもよく、利便性よくポリマー材料、例えばアガロース、セファロース、セルロース、ニトロセルロース、アルギン塩、テフロン（登録商標）、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン膜、プラスチック、ポリスチレン、ガラスまたはシリカまたは金属で作製され得る。多数の適切な固体支持体が市販されている。好ましい固体支持体は、修飾ビオチンまたは修飾ビオチン結合化合物の結合のために高表面積を提示する材料である。かかる支持体は概して、不規則な表面を有し、例えば、多孔質または粒状、例えば、粒子、線維、ウェブ、焼結物またはふるいであり得る。粒状材料、例えばビーズ、特にポリマービーズ／粒子は概して、それらのより大きな結合容量に起因して好ましい。
【０１３７】
[00155]いくつかの実施形態では、本明細書中で提供する方法に従って使用する粒状固体支持体は、球状ビーズを含む。ビーズのサイズは重要ではないが、それらは、例えば少なくとも０．０１μｍほどの直径を有し、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは６μｍ以下の最大直径を有し得る。例えば、直径１．０μｍ、２．８μｍおよび４．５μｍのビーズは、良好に機能することが示されている。単分散粒子、即ちサイズが実質的に一様であるもの（例えば、５％未満の直径標準偏差を有するサイズ）は、それらが反応の非常に一様な再現性を提供するという利点を有する。米国特許第４，３３６，１７３号に記載される技法によって産生される単分散ポリマー粒子もまた、適切である。
【０１３８】
[00156]本発明の方法における使用に適した非磁気ポリマービーズは、商標ＤＹＮＯＳＰＨＥＲＥＳの元でＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ（オスロ、ノルウェー）から、ならびにＱｉａｇｅｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｓｅｒａｄｙｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｐａｉｎｔ、Ｃｈｅｍａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｒｏｌａｂｏ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｇｏｗａおよびＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である。
【０１３９】
[00157]しかしながら、固定化材料の操作および分離を助長するために、また必要に応じて自動化を促進するために、磁化可能な（「磁気」）ビーズが好ましい。「磁気」という用語は本明細書中で使用する場合、支持体が、磁場に配置されると、それに付与される磁気モーメントを有することが可能であり、したがって、当該場の作用下で転置可能であることを意味する。換言すると、磁気粒子を含む支持体は、磁気凝集によって試料の他の構成成分から容易に除去される可能性があり、それは、任意の修飾ビオチンまたは修飾ビオチン化部分の結合後に粒子を分離する迅速、簡素かつ効率的な方法を提供する。
【０１４０】
[00158]したがって、修飾ビオチン結合化合物、例えばニトロ−ストレプトアビジン（アビジン）に、コンジュゲーションを介して結合させた修飾ビオチンまたは修飾ビオチン化部分を有する磁気粒子は、例えば永久磁石を使用して、磁場の印加によって適切な表面上へ除去され得る。通常、試料混合物を含有する容器の側面にマグネットを適用して、粒子を容器の壁に凝集させて、試料の残部を除去することで十分であり、その結果、残存試料および／または粒子は、任意の所望のさらなるステップに利用可能である。商標ＤＹＮＡＢＥＡＤＳの元でＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ（オスロ、ノルウェー）によって販売される周知の単分散ポリマー超常磁性ビーズは、本発明に従って使用され得るか、または使用のために修飾され得る例示的な市販の磁気粒子である。
【０１４１】
酵素−ポリマー複合体および酵素−ナノポア複合体の酵素：
[00159]ポリメラーゼ複合体およびナノポア配列決定用複合体の酵素として、ポリヌクレオチドプロセシング酵素、例えばＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ならびに逆転写酵素が挙げられる。ポリメラーゼ複合体およびナノポア配列決定用複合体の酵素は、野生型酵素であってもよく、またはそれは、野生型酵素の変異体形態であってもよい。変異体酵素は、親酵素の特徴に対して変更される特徴を保有するように操作され得る。いくつかの実施形態では、変更される酵素−ポリマー複合体の酵素は、ポリメラーゼである。ポリメラーゼ酵素の変更される特徴として、酵素活性、フィデリティー、処理能力、伸長速度、安定性または溶解度の変化が挙げられる。ポリメラーゼは、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖（例えば、成長中の核酸鎖）に組み込む速度を低減するように突然変異され得る。速さの低減（感受性の改善）は、ナノポアタンパク質の部位特異的な突然変異誘発およびＤＮＡプロセシング酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼの、ナノポアへの組み込みの組合せによって達成することができる。
【０１４２】
[00160]ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体において鋳型基質と複合体形成され得るＤＮＡポリメラーゼ酵素の例として、クロストリジウム属（Clostridium）ファージｐｈｉＣＰＶ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦＨ２７１１３．１）、および枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼＰｈｉ２９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ５３３７１）由来のＰｏｌ６  ＤＮＡポリメラーゼの野生型または変異体が挙げられるが、限定されない。野生型および変異体ポリメラーゼは好ましくは、本明細書中に開示する変更された特徴の少なくとも１つを示す。
【０１４３】
[00161]いくつかの場合において、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれる速度は、例えば鋳型核酸鎖のメチル化などにより、立体障害を提供するようにヌクレオチドおよび／または鋳型鎖を官能基化することによって低減され得る。いくつかの例では、メチル化されたヌクレオチドを組み込むことで、速度が低減される。
【０１４４】
[00162]ポリメラーゼ複合体およびナノポア配列決定用複合体の酵素は、ポリメラーゼ複合体の酵素を、バイオチップの膜へ挿入されるナノポアに連結するのに役立つ１つまたは複数の結合構成成分および／または結合部位を含むように修飾され得る。あるいは、ポリメラーゼ複合体およびナノポア配列決定用複合体の酵素は、ポリメラーゼ複合体の酵素を、バイオチップの膜へ挿入されるナノポア配列決定用複合体を形成するためのナノポアに連結するのに役立つ１つまたは複数の結合構成成分および／または結合部位を含むように修飾され得る。同様に、ポリメラーゼ複合体および／またはナノポア配列決定用複合体のナノポアはまた、ナノポアを、酵素−ポリマー複合体を連結するために１つまたは複数の結合構成成分および／または結合部位を含むように修飾され得る。
【０１４５】
ナノポア：
[00163]ナノポア配列決定用複合体のナノポアとして、生物学的ナノポア、固体状態ナノポア、およびハイブリッド生物学的−固体状態ナノポアが挙げられるが、限定されない。ナノポア配列決定用複合体の生物学的ナノポアとして、大腸菌（E. coli）種、サルモネラ属（Salmonella）種、シゲラ属（Shigella）種、およびシュードモナス属（Pseudomonas）種由来のＯｍｐＧ、ならびに黄色ブドウ球菌（S. aureus）種由来のアルファヘモリジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）種由来のＭｓｐＡが挙げられる。ナノポアは、野生型ナノポア、変異体ナノポア、または修飾変異体ナノポアであり得る。
【０１４６】
[00164]変異体ナノポアは、親酵素の特徴に対して変更される特徴を保有するように操作され得る。いくつかの実施形態では、ナノポア配列決定用複合体の変異体ナノポアは、それが由来する親ナノポアのイオン電流ノイズを低減するように操作される。変更された特徴を有する変異体ナノポアの例は、収縮部位で１つまたは複数の突然変異を有するＯｍｐＧナノポアであり、それは、親ＯｍｐＧのイオンノイズレベルに対してイオンノイズレベルを減少する。低減されたイオン電流ノイズは、ポリヌクレオチドおよびタンパク質の単一分子検出におけるこれらのＯｍｐＧナノポア変異体の使用を提供する。他の実施形態では、変異体ＯｍｐＧポリペプチドは、分子アダプターを結合するようにさらに突然変異させることができ、それは、ポア中に内在する間、分析物、例えばヌクレオチド塩基の、ポアを通る移動を遅くして、その結果として、分析物の同定の精度を改善する（Ａｓｔｉｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０．１０２１／ｊａ０５７１２３＋、２００５年１２月３０日にオンラインで公開）。
【０１４７】
[00165]修飾変異体ナノポアは通常、サブユニットが、サブユニット間の相互作用に影響を及ぼすように操作された多量体ナノポアである。変更されたサブユニット相互作用を用いて、モノマーがオリゴマー形成して、脂質二重層において多量体ナノポアを形成する配列および順序を特定することができる。この技法は、ナノポアを形成するサブユニットの化学量論の制御を提供する。サブユニットが、オリゴマー形成中にサブユニットの相互作用の配列を決定するように修飾され得る多量体ナノポアの例は、ＨＬナノポアである。
【０１４８】
ナノポアをポリメラーゼに連結させる：
[00166]ポリメラーゼ複合体、例えばポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体は、任意の適切な方法でナノポアに結合させることができる。ポリメラーゼ複合体をナノポアに結合させることは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチド系（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０〜Ｅ６９７［２０１２年］）、自然化学的ライゲーション（Ｔｈａｐａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９巻：１４４６１〜１４４８３［２０１４年］）、ソルターゼ系（ＷｕおよびＧｕｏ、Ｊ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ  ３１巻：４８〜６６頁［２０１２年］；Ｈｅｃｋら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９７巻：４６１〜４７５頁［２０１３年］）、トランスグルタミナーゼ系（Ｄｅｎｎｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２５巻：５６９〜５７８頁［２０１４年］）、ホルミルグリセリン連結（Ｒａｓｈｉｄｉａｎ ｅｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４巻：１２７７〜１２９４頁［２０１３］）、または当該技術分野で公知の他の化学的ライゲーション技法を使用して達成され得る。
【０１４９】
[00167]いくつかの例において、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を使用してナノポアに連結される。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミル安息香酸塩、芳香族アルデヒド）との間の反応であり得る。いくつかの例において、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学を使用して（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）、ナノポアに連結される。
【０１５０】
[00168]いくつかの場合において、ジンクフィンガー突然変異は、ナノポア、例えばα−ヘモリジン分子に導入されて、続いて分子を使用して（例えば、ＤＮＡ中間体分子）、ポリメラーゼをヘモリジン上のジンクフィンガー部位に連結する。
【０１５１】
[00169]さらに、ポリメラーゼ複合体は、結合部位でナノポアに結合されるリンカー分子を用いて、ナノポア、例えば、ＨＬ、ＯｍｐＧに結合させることができる。いくつかの場合において、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体は、分子ステープルでナノポアに結合される。いくつかの例において、分子ステープルは、３つのアミノ酸配列を含む（リンカーＡ、ＢおよびＣを表す）。リンカーＡは、ナノポアモノマーから伸長させることができ、リンカーＢは、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体のポリメラーゼから伸長させることができ、続いてリンカーＣは、リンカーＡおよびＢを（例えば、リンカーＡおよびリンカーＢの両方の周囲を包み込むことによって）、したがって、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体のポリメラーゼをナノポアに結合することができる。リンカーＣはまた、リンカーＡまたはリンカーＢの一部であるように構築させることもでき、したがってリンカー分子の数を低減させる。
【０１５２】
[00170]ポリメラーゼをナノポアに結合させる際に利用を見出し得る他のリンカーは、直接的な遺伝的連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１〜３アミノ酸リンカー（配列番号１））、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号２））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学的連結である。本明細書中で有用であると意図される具体的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号１）、Ｎ末端上のＫ−タグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号２））、ΔＴＥＶ部位（１２〜２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２〜４９）である。
【０１５３】
[00171]膜においてポリメラーゼ複合体をナノポアに結合させる例示的な方法は、リンカー分子を、ナノポアに結合させること、または結合部位を有するようにナノポアを突然変異させること、続いてポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体を、結合部位または結合リンカーに結合させることを含む。ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体は、ナノポアが膜に挿入された後、結合部位または結合リンカーに結合される。いくつかの場合において、ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体は、膜へ挿入される複数のナノポアそれぞれに結合されて、バイオチップのウェルおよび／または電極にわたって配置される。
【０１５４】
[00172]いくつかの例において、酵素−ポリマー複合体の酵素は、リンカーペプチドを含む融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、酵素−ポリマー複合体の酵素であり、ポリヌクレオチドは、ポリマーである。ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体のポリメラーゼは、ＳｐｙＣａｔｈｅｒポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され、それは、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むナノポアに共有結合され得る（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０〜Ｅ６９７［２０１２年］）。
【０１５５】
[00173]ポリメラーゼ複合体は、例えば、ＰＣＴ/ＵＳ２０１３/０６８９６７号（国際公開第２０１４／０７４７２７号として公開；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ/ＵＳ２００５／００９７０２号（国際公開第２００６／０２８５０８号として公開；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ/ＵＳ２０１１／０６５６４０号（国際公開第２０１２／０８３２４９号として公開；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に記載する方法を使用してナノポアに結合され得る。
【０１５６】
化学量論：
[00174]ポリメラーゼ複合体の酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、酵素−ポリマー複合体を、膜へ挿入されたナノポアに連結するのに役立つ１つまたは複数の結合構成成分および／または結合部位を含むように修飾され得る。同様に、ポリメラーゼ複合体が結合されるナノポアはまた、ナノポアを、ポリメラーゼ複合体に連結させるために１つまたは複数の結合構成成分および／または結合部位を有するように修飾され得る。
【０１５７】
[00175]いくつかの実施形態では、単一ポリメラーゼ複合体は、膜においてナノポアに結合される。他の実施形態では、２つまたはそれ以上のポリメラーゼ複合体は、膜においてナノポアに結合される。単一ポリメラーゼ複合体は、ナノポアタンパク質上に存在する１つまたは複数の結合部位でナノポアに結合され得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼ複合体は、モノマーナノポアタンパク質、例えば、ＯｍｐＧナノポアに結合される。他の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼ複合体は、少なくとも２つのナノポアサブユニット、例えば７量体ＨＬナノポアを含む多量体ナノポアタンパク質に結合される。ポリメラーゼ複合体は、多量体ナノポアの単一サブユニット上の結合部位に結合され得る。あるいは、ポリメラーゼ複合体は、多量体ナノポアの２つまたはそれ以上のサブユニットそれぞれ上に存在する２つまたはそれ以上の結合部位で、多量体ナノポアに結合され得る。
【０１５８】
[00176]ポリメラーゼ複合体は、ホモオリゴマーもしくはヘテロオリゴマーナノポアの１つまたは複数のサブユニットに結合され得る。例えば、ポリメラーゼ複合体は、野生型、変異体または修飾変異体であり得る７つの同一サブユニットで構成されるＨＬナノポアにカップリングされ得る。あるいは、ポリメラーゼ複合体は、１つまたは複数が修飾され得る少なくとも２つの異なるサブユニットで構成されるＨＬナノポアにカップリングされ得る。
【０１５９】
[00177]オリゴマーナノポア、例えばＨＬは、モノマー、モノマーのコンカテマー、またはモノマーおよびモノマーのコンカテマーの組合せであるサブユニットから自己集合し得るタンパク質である。モノマーのコンカテマーであるサブユニットは、リンカーによって互いに連結されるか、または融合タンパク質として単一ポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる２つ、３つまたはそれ以上のモノマーを含み得る。したがって、ポリメラーゼ複合体は、モノマーサブユニットに、またはオリゴマーナノポアのモノマーサブユニットのコンカテマーに結合され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ複合体は、野生型または変更された特徴を有する変異体であり得る、モノマーナノポア、例えばＯｍｐＧに結合されるＤＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型複合体である。他の実施形態では、ポリメラーゼ複合体は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーナノポア、例えばＨＬナノポアであってもよく、また野生型、変異体または修飾変異体ナノポアであり得るオリゴマーナノポアに結合されるＤＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型複合体である。
【０１６０】
バイオチップ上に二重層を形成する：
[00178]バイオチップにおいてナノポアを含む脂質二重層を創出する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５４号（国際公開第２０１５／０６１５１１号として公開、Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）における少なくともパラグラフ［００１３１］〜［００１９６］で記載される。脂質二重層は、個々に制御される電極のアレイを構成する多重電極のそれぞれ１つの最上部上に創出させることができ、単一ナノポアは、個々に制御される電極のアレイにおける各電極上で各二重層へ挿入させることができる。
【０１６１】
[00179]いくつかの実施形態では、配列決定用ナノポア複合体は、多重電極を有する半導体チップ上に形成され、そこへ、脂質溶液が適用されて、脂質二重層を創出する。脂質溶液は、有機溶媒、例えば、デカン、ヘキサン、トリデカン等、およびジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰｃ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−フタニル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル；ＧＭ１ガングリオシド、またはそれらの任意の組合せなどの脂質分子の溶液であり得る。脂質溶液を適用して、脂質二重層を形成する方法は、国際公開第２０１５／０６１５１０号の少なくともパラグラフ［００１４８］〜［００１５２］に記載されている。
【０１６２】
ナノポアを挿入する：
[00180]いくつかの場合において、ナノポアは、膜に挿入される（例えば、電気穿孔によって）。膜においてナノポアを挿入する方法は、国際公開第２０１５／０６１５１０号の少なくともパラグラフ［００１９７］〜［００２０３］に提供される。ナノポアは、電気刺激、圧力刺激、液体流刺激、気泡刺激、超音波処理、音、振動、またはそれらの任意の組合せなどの刺激シグナルによって挿入することができる。
【０１６３】
[00181]いくつかの実施形態では、ナノポアを挿入することは、刺激（例えば、電気穿孔パルス）を電極（複数可）に通じて印加して、前記ナノポアの挿入を容易にすることを含む。いくつかの場合において、この後に、前記脂質二重層における前記ナノポアの挿入を検出するための第２の電気検出パルスが続く。いくつかの場合において、ポアが検出パルス中に検出されるまで、刺激電圧、続く検出電圧の印加は、規模を徐々に増加させる刺激電圧を用いて繰り返される。次に、電極は、機能せず、さらなるパルスは印加されない。他の実施形態では、ナノポアは、膜へそれ自身を挿入する。
【０１６４】
[00182]本明細書中に記載するナノポア配列決定用複合体のナノポアは、膜、例えば脂質二重層に挿入され、ナノポアベースのセンサー、例えばバイオチップの集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して、または近接して配置され得る。ナノポアは、膜に挿入されて、バイオチップにおいてウェルおよび／または検出電極に配置され得る。多重ナノポアセンサーは、アレイとして供給され得る。バイオチップおよびバイオチップを作製する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５４号（国際公開第２０１５／０６１５１１号として公開、Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
【０１６５】
配列決定する方法：
[00183]本明細書中に記載するナノポア配列決定用複合体のナノポアを使用して特徴付けられる分子は、荷電または極性ポリマー分子などの荷電または極性分子を含む、様々なタイプであり得る。具体例として、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子であり得る。
【０１６６】
[00184]一態様では、本明細書中に記載するナノポア配列決定用複合体を使用して、核酸を配列決定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は、本明細書中に記載する方法のいずれか１つに従って、ポリメラーゼ複合体を、ポリメラーゼ複合体構成成分の混合物から単離することと、単離されたポリメラーゼ複合体を、バイオチップの脂質膜に挿入されたナノポアに結合させることとを含む。他の実施形態では、配列決定する方法は、ナノポア配列決定用複合体を、複合体構成成分の混合物から単離することと単離されたナノポア配列決定用複合体を、バイオチップの液体膜に挿入することとを含む。本明細書中に記載するように調製されるナノポア配列決定用複合体は、ポリヌクレオチドの配列決定において酵素を利用する当該技術分野で公知の他のナノポア配列決定プラットフォームに従って核酸の配列を決定するのに使用することができる。例えば、ナノポア配列決定用複合体は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（オクスフォード、ＵＫ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（サンディエゴ、ＣＡ）のヘリカーゼおよびエキソヌクレアーゼベースの方法、ならびにＳｔｒａｔｏｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（シアトル、ＷＡ）のナノポアシーケンシングバイエクスパンションに従って核酸を配列決定する本明細書中に記載する方法に従って調製され得る。
【０１６７】
[00185]いくつかの実施形態では、核酸の配列決定は、本明細書中に記載するようにナノポア配列決定用複合体を調製することと、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号（２０１３年１１月７日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」という表題、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようにタグ付けされたヌクレオチドを使用してポリヌクレオチド配列を決定することとを含む。例えば、１つまたは複数の検出電極に隣接して、または検出近接して、膜（例えば、脂質二重層）において位置されるナノポア配列決定用複合体は、ヌクレオチド塩基が、ポリメラーゼと会合したポリヌクレオチドの鎖に相補的である鎖へ組み込まれて、ヌクレオチドのタグが、ナノポアによって検出される場合に、タグ付けされたヌクレオチドの、ポリメラーゼによる組み込みを検出することができる。ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体は、上述するようにナノポアに結合させることができる。
【０１６８】
[00186]タグ付けされたヌクレオチドのタグは、ナノポアによって検出されることが可能である化学基または分子を含み得る。タグ付けされたヌクレオチドを供給するのに使用されるタグの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号の少なくともパラグラフ［０４１４］〜［０４５２］に記載されている。ヌクレオチドは、種々のヌクレオチドの混合物、例えば、Ｎが、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）であるタグ付けされたｄＮＴＰの混合物から組み込まれ得る。あるいは、ヌクレオチドは、個々のタグ付けされたｄＮＴＰ、即ち、タグ付けされたｄＡＴＰ、続くタグ付けされたｄＣＴＰ、続いてタグ付けされたｄＧＴＰ等の交互溶液から組み込まれ得る。ポリヌクレオチド配列の決定は、それらが、ナノポアを通って流れるか、もしくはナノポアに隣接する場合、タグが、ナノポア中に内在する場合、および／またはタグが、ナノポアに提示される場合にナノポアがタグを検出すると行われ得る。タグ付けされたヌクレオチドそれぞれのタグは、ヌクレオチドのリン酸エステル（例えば、ガンマリン酸エステル）、糖または窒素塩基部分を含むが、これらに限定されない任意の位置で、ヌクレオチド塩基にカップリングさせることができる。いくつかの場合において、タグがヌクレオチドタグの組み込み中にポリメラーゼと会合されると同時に、タグは検出される。タグが、タグのヌクレオチド組み込みならびに続く切断および／または放出後に、ナノポアを通って移動するまで検出され続け得る。いくつかの場合において、ヌクレオチド組み込み事象は、タグを、タグ付けされたヌクレオチドから放出し、タグは、ナノポアを通過して、検出される。タグは、ポリメラーゼによって放出され得るか、またはポリメラーゼ付近に位置する酵素による切断を含むがこれに限定されない任意の適切な様式で、切断／放出される。このようにして、特有のタグが、ヌクレオチドのタイプそれぞれ（即ち、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）から放出されるため、組み込まれた塩基が同定され得る（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）。いくつかの状況において、ヌクレオチド組み込み事象は、タグを放出しない。かかる場合において、組み込まれたヌクレオチドにカップリングされたタグは、ナノポアを用いて検出される。いくつかの例において、タグは、ナノポアを通って、またはそれに近接して移動することができ、ナノポアを用いて検出され得る。
【０１６９】
[00187]いくつかの場合において、組み込まれないタグ付けされたヌクレオチドは、ナノポアを通過する。その方法は、タグ付けされたヌクレオチドが、ナノポアによって検出される時間の長さに基づいて、組み込まれないヌクレオチドと会合されたタグと、組み込まれたヌクレオチドと会合されたタグとの間で区別することができる。一実施形態では、組み込まれないヌクレオチドは、約１ミリ秒未満の間、ナノポアによって検出され、組み込まれたヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒の間、ナノポアによって検出される。
【０１７０】
[00188]したがって、一態様では、本開示は、ナノポア配列決定用複合体を用いて、生物学的試料由来のポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供する。試料ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼと組み合わせて、ナノポア配列決定用複合体の酵素−ポリマー複合体部分を供給する。一実施形態では、試料ポリヌクレオチドは、試料ｓｓＤＮＡ鎖であり、それを、ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて、ＤＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を供給する。続いて、ＤＮＡポリメラーゼ−試料ｓｓＤＮＡ鎖を、膜、例えば脂質二重層へ挿入されたナノポアに結合させて、ナノポア配列決定用複合体を供給する。配列決定用複合体のナノポア部分は、本明細書中の他の箇所で記載するように、検出電極に隣接して、または近接して、膜において配置される。得られたナノポア配列決定用複合体は、本明細書中の他の箇所で記載するように、試料ＤＮＡのヌクレオチド塩基の配列を決定することが可能である。他の実施形態では、ナノポア配列決定用複合体は、二本鎖ＤＮＡの配列を決定する。さらに他の実施形態では、ナノポア配列決定用複合体は、ＲＮＡの配列を決定する。
【０１７１】
[00189]一実施形態では、その方法は、検出電極に隣接するナノポア配列決定用複合体を用いる、試料ポリヌクレオチドの配列決定を提供し、（ａ）ポリメラーゼ複合体を単離し、ポリメラーゼ複合体を、バイオチップの脂質膜に挿入されたナノポアに結合させることによって、ナノポア配列決定用複合体を調製することを含む。あるいは、その方法は、ナノポア配列決定用複合体を、複合体構成成分の混合物から単離すること、および、バイオチップの脂質膜においてナノポア配列決定用複合体を挿入すること、を含む。その方法は、（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドを、ナノポア配列決定用複合体を含む反応チャンバーに供給すること、ここで、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けられたヌクレオチドが、ヌクレオチドにカップリングされたタグを含有し、そのタグが、ナノポアを用いて検出可能である、（ｃ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行し、それにより、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを、核酸試料からの一本鎖核酸分子に相補的な伸長中の鎖へ組み込むこと、および、（ｄ）個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中および／または時に、ナノポアを用いて、個々のタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグを検出すること、ここで、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合すると、ナノポアを用いてタグが検出される、をさらに含む。ポリヌクレオチドを配列決定するために本発明のナノポア配列決定用複合体を用いた、タグ付けされたヌクレオチドの使用を含む、配列決定方法の他の実施形態は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０７４７２７号において提供される。
【０１７２】
[00190]ＡＣ波形およびタグ付けされたヌクレオチドを使用して、核酸を配列決定することは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年１１月６日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」という表題の米国特許出願ＵＳ２０１４／０１３４６１６号において記載されている。ＵＳ２０１４／０１３４６１６号において記載されるタグ付けされたヌクレオチドの他に、配列決定は、５つの一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミジンの糖または非環状部分を欠如するヌクレオチド類似体、例えば、（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を使用して実施することができる（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８巻：５３４５〜５３４７頁［２００６年］）。
【０１７３】
活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター：
[00191]上述するように、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、該核酸アダプターを含むポリメラーゼ複合体、および該核酸アダプターを使用して活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法もまた開示される。続いて、単離されたポリメラーゼ複合体は、バイオチップの膜へ組み込まれて、ポリヌクレオチドのナノポア配列決定を可能にする。
【０１７４】
[00192]本開示の他の方法および実施形態に関して、上記で本明細書において論述する態様はまた、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、該核酸アダプターを含むポリメラーゼ複合体、該核酸アダプターを使用して活性ポリメラーゼ複合体を単離する方法、および該核酸アダプターを用いることで可能となる本明細書において論述する他の方法に関しても適用可能である。したがって、かかる態様は、このセクションにおいて再び述べられておらず、当業者は、かかるこれまでに論述した態様および実施形態が、核酸アダプターおよびその関連方法に関連し得ることを容易に理解することができる。
ビオチン標識およびストレプトアビジンビーズ捕捉を介した活性分画の富化
[00193]特に本開示が、ビオチン標識およびストレプトアビジンビーズ捕捉を介した活性分画の富化に関する場合の本開示の核酸アダプターの実施形態の様々な態様の説明を以下に提供する。
【０１７５】
[00194]一実施形態では、アダプターは、４つのヌクレオチドのうちの３つで構成されるランウェイセクション（配列）を含有する。このランウェイセクションは、２〜５０塩基長、好ましくは８〜１２塩基であり得る。
【０１７６】
[00195]アダプターのより詳細な実施形態では、ランウェイ塩基の１つは、塩基の４〜６倍または大きな割合で存在し得る。逆に、ランウェイにおける塩基の１つは、非常にわずかであり得る（例えば、１〜２塩基）。
【０１７７】
[00196]アダプターおよびランウェイ配列は、試料ＤＮＡまたはＲＮＡにライゲーションされて、ポア／ポリメラーゼ／試料ＤＮＡまたはポリメラーゼ／ＤＮＡ複合体の一部を成す。
【０１７８】
[00197]機能性（活性）ポリメラーゼ複合体に関して富化するために、適切な緩衝液、塩、ヌクレオチド（即ち、ランウェイ配列の４つのヌクレオチドのうちの３つに相補的である４つのヌクレオチド塩基のうちの３つ）、および酵素活性に要される二価金属の混合物を使用して、ランウェイ配列の４つのヌクレオチドのうちの３つに相補的な４つのヌクレオチド塩基のうちの３つを含む新たなヌクレオチド鎖の伸長を可能にする。混合物中の３つのヌクレオチドの１つまたは複数は、このビオチンを妨害しない塩基または塩基上の位置に結合させた捕捉部分を有することができる。捕捉部分は、別の分子に対して親和性を有する任意の分子であり得る。上述するように、アダプターは、ランウェイ配列後に停止領域を含む。停止領域は、ランウェイ配列を構成する３つのヌクレオチド塩基（例えば、チミン、グアニン、アデニン）のうちの１つとして含まれず、また混合物中の４つのヌクレオチド塩基のうちの３つのいずれにも相補的でないヌクレオチド塩基（例えば、シトシン）を含む。活性ポリメラーゼが、ひとたびランウェイ配列の末端に達すると、それは、停止領域に遭遇して、その時点で、ポリメラーゼは、鎖を伸長するのに必要とされる適切なヌクレオチドの欠如のため、停止しなければならない。
【０１７９】
[00198]活性酵素三元複合体は、新たなコピー鎖を伸長して、ビオチン標識されたヌクレオチドを組み込む。適合ヌクレオチドが混合物中に存在しない場合、酵素がランウェイ上の位置に達すると、それは停止する。三元複合体またはポリメラーゼ／ＤＮＡは標識されている。
【０１８０】
[00199]ビオチン標識された複合体は、活性ポリメラーゼを有する複合体を表す。非活性ポリメラーゼ複合体は、標識されない。
[00200]標識用部分に対して親和性を有する分子（単数または複数）に官能基化もしくは結合されたビーズまたは固体表面支持体を混合物に添加して、標識された分子は、ビーズ／固体支持体によって攻撃および捕捉される。非標識不活性複合体を洗い流して、残存する活性複合体を、ビーズ／固体支持体から溶出させて、チップ上に流す。あるいは、活性複合体は、ビーズまたは固体支持体に結合させたままの状態であってもよく、続いてチップ上に流され得る。
【０１８１】
[00201]結果は、試料複合体混合物である；ポア／ポリメラーゼ／鋳型ＤＮＡ／プライマーまたはポリメラーゼ／鋳型／プライマーは、上記複合体の活性ポリメラーゼバージョンに関して富化されている。
【０１８２】
[00202]図１５に示す図は、活性ポリメラーゼ複合体を単離するために本明細書中で提供する核酸アダプターの一実施形態を示す。図示するように、アダプターは、試料ＤＮＡにライゲーションされる。アダプターはまた、アダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーおよびプライマー伸長前にアダプターと会合されたポリメラーゼ酵素を有することが示される。図示するように、ランウェイ配列は、１２ヌクレオチド塩基長であり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、およびチミジン（Ｔ）ヌクレオチド塩基のみを含むのに対して、停止領域は、２つのシトシン（Ｃ）ヌクレオチド塩基のみを含む。
【０１８３】
[00203]図１６に示す図は、図１５に示すのと同じ核酸アダプターを示す。しかしながら、図１６に図示するように、アダプターはまた、アダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーおよびランウェイ配列に相補的な伸長配列を有することが示される。伸長配列は、１２ヌクレオチド塩基長であり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、およびチミジン（Ｔ）ヌクレオチド塩基のみを含む。また、アダプターと会合されたポリメラーゼ酵素も示す。さらに、伸長配列のシトシン（Ｃ）ヌクレオチド塩基はまた、ビオチンまたはデスチオ−ビオチン部分を含む。
【０１８４】
[00204]以下のものは、下記のように、図１５および図１６に示すランウェイ配列を有するアダプターを使用して、プライマーの伸長を促進するように添加される試薬混合物の例である。
【０１８５】
【表１】
2018534939.tif 000003
【０１８６】
[00205]この方法は、簡素であり、ビーズ結合容量および標識されたｄＣＴＰおよび鋳型濃度を最適化することによって、チップまたは膜への有効な富化および適用が達成され得る。
【０１８７】
[00206]富化された複合体が、ひとたびチップ上に負荷されて、ポア／ポリメラーゼ／鋳型ＤＮＡ／プライマー複合体が、電極／壁にわたって設定されると、残存する複合体および試薬は、チップから洗浄されて、ヌクレオチドタグの完全な組およびＧｅｎｉａヌクレオチドタグを用いた合成によって配列決定を実施するのに必要な試薬で置き換える。
【０１８８】
[00207]停止塩基にある予測開始部位を予想することができるため、得られた配列の分析は、より簡単になる。
[00208]ポリメラーゼが、環状鋳型全体の周囲で相補配列を伸長した場合、それは、プライマーに戻り、それが合成を続ける場合にそれを転置させる。ビオチンまたはデスチオ−ビオチン標識された塩基もまた転置され、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡ周囲の第２のまたは続く通過の一部ではない。
【０１８９】
[00209]ビオチンまたはデスチオ−ビオチン標識／富化はまた、線状鋳型上でも実施され得る。
[00210]図１７に示す図は、活性ポリメラーゼ複合体を単離するために本明細書中で提供する核酸アダプターの一実施形態を示す。図示するように、アダプターは、試料ＤＮＡにライゲーションされる。アダプターは線状であり、またアダプターのプライマー認識配列にアニーリングされたプライマーを有することが示される。実施形態（１）は、ランウェイ配列の富化伸長前のアダプターを示す。実施形態（２）は、ランウェイ配列の富化伸長後のアダプターを示す。ランウェイ上の伸長産物を有さない線状試料は、標識されず、続いて、富化において洗い流される。
【実施例】
【０１９０】
【実施例１】
【０１９１】
転置精製−活性ポリメラーゼ複合体の単離
[00211]この実施例は、活性ポリメラーゼ−鋳型複合体を精製する方法に関する。活性複合体は、自己プライミングされたＤＮＡ鋳型と会合される活性ポリメラーゼを含む。環状ＤＮＡもまた、鋳型の続くナノポア配列決定において伸長され得るオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で使用することができる。
【０１９２】
[00212]その方法によれば、活性複合体は、本明細書中の他の箇所で記載するように、ポリメラーゼの活性により不活性複合体から精製された。
[00213]三元複合体は、第１の反応混合物（１）中で、自己プライミングＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ、およびビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって調製された。環状ＤＮＡ鋳型が使用される場合、プライマーオリゴヌクレオチドは、三元複合体の構成成分として含まれる。モノマーアビジン磁気ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．サンディエゴ、ＣＡからのＢｃＭａｇ（商標））は、製造業者の指示書に従って、ビーズを１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで処理して、続いて、ビーズを洗浄緩衝液７５ｍＭ  ＫＧｌｕ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＩｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０１％ツイーン２０、ｐＨ８．０で洗浄することにより過剰のＢＳＡを除去することによって調製された。アビジンビーズの調製に関する詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｌｏｎｅ．ｕｓ／ｆｉｌｅｓ／ＢｃＭａｇ＿Ｍｏｎｏｍｅｒ＿Ａｖｉｄｉｎ＿Ｍａｇｎｅｔｉｃ＿Ｂｅａｄｓ．ｐｄｆ．にて製造業者によって提供されている。
【０１９３】
[00214]三元複合体を含む反応混合物（１）２００マイクロリットルを、調製したビーズとともに、室温で３０分間インキュベートした。反応混合物（１）を磁気分離器上に配置して、未結合の複合体構成成分を含有する上清を除去した。
【０１９４】
[00215]ビーズに結合された三元複合体を洗浄した後、伸長緩衝液７５ｍＭ  ＫＧｌｕ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０１％ツイーン２０、ｐＨ８．０を用いて、室温で５分間再懸濁させて、自己プライミングされた鋳型の伸長を可能にした。活性ポリメラーゼを含む複合体は、捕捉オリゴヌクレオチドから解離されるため、ビーズを磁気分離器上に配置して、上清を収集した。
【０１９５】
[00216]活性ポリメラーゼ複合体の精製は、ＳＹＢＲ金染色で染色した尿素−ＴＢＥゲルを使用して可視化させた（図８）。レーン１は、分子量マーカーを示す。レーン２は、ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドとカップリングさせた自己プライミング鋳型を示す。レーン３は、ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド単独を示す。レーン７は、未結合の分画を示す。レーン８は、ビーズの第１の洗浄後の分画を示す。レーン９は、活性ポリメラーゼ複合体を含有する伸長ＤＮＡ鋳型を有する精製した活性ポリメラーゼ複合体を含有する分画を示す。レーン１０は、第２の洗浄からの分画を示す。レーン１１およびレーン１２は、ビオチン化オリゴヌクレオチドと複合体形成された伸長されていないＤＮＡ鋳型は、アビジンビーズに結合されたままであったことを示す。レーン１２は、この実験において、活性ポリメラーゼおよび会合された伸長ＤＮＡ鋳型の幾らかが、ビーズから溶出されていなかったことを示す。
【０１９６】
[00217]これらのデータにより、活性ポリメラーゼ複合体は、本明細書中に記載する転置精製方法に従って単離することができることが示される。
【実施例２】
【０１９７】
ポジティブ富化−ポリメラーゼ複合体の単離
[00218]この実施例は、順にポリヌクレオチド鋳型に会合されるポリメラーゼに結合させたナノポアを含む配列決定用複合体を精製する方法に関する。ポジティブ富化方法において、親和性精製は、活性ナノポア−ポリメラーゼ−鋳型の複合体を有する。
【０１９８】
[00219]プロセスの図を図５および図６に提供する。
[00220]簡潔に述べると、製造業者の指示書に従って、自己プライミングヘアピンＤＮＡ鋳型を、ＴＥＧリンカーを有するデスチオビオチン化（ＤＥＳ）プライマーにアニーリングした。ＤＥＳプライマーは、それを、ＰａｃＢｉｏ溶出緩衝液（カタログ番号１００−１５９−８００）を用いてストックから５０μＭへ希釈すること、次にそれを８０℃でインキュベートすること、続いてそれを４℃に冷却することによって調整した。調整したプライマーを、２０℃で３０分間、鋳型ＤＮＡにアニーリングした後、即時の使用のためには４℃に、または保管のためには−２０℃に冷却した。ビオチン化鋳型を、Ｆｌｏｗ  Ｃｏｍｐ  Ｆｌｅｘｉビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）８０μｌ中で０．１μＭ  Ｐｏｌ２ポリメラーゼとともに、氷上で１時間インキュベートした。０．１μＭ  ＨＬナノポアタンパク質を鋳型ポリメラーゼ混合物に添加して、４０分間インキュベートさせた。反応チューブを磁気分離器上に配置して、上清を除去して、廃棄した。ビーズを、７５ｍＭ  ＫＧｌｕ、０，０１％ツイーン２０、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＳｒＣＬ２および５ｍＭ  ＴＣＥＰで洗浄した。ビーズ結合三元複合体を、５００ｍＭ  ＫＧｌｕ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭビオチン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＳｒＣＬ２、０．０００１％ツイーン２０および６ｍＭのブロックされたヌクレオチド中でビーズから溶出させた。上清を収集して、ビーズを、放出緩衝液中で再び洗浄して、残留三元複合体を収集した。（Ｗ１）および溶出分画（Ｅ１およびＥ２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した（図９を参照）。
【０１９９】
[00221]三元複合体が富化された分画のポリメラーゼ活性は、ｄＮＴＰの存在下で鋳型を伸長するその能力に関してアッセイし、伸長産物を、尿素−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した（図１０を参照）。ポジティブ富化方法によって得られるポリメラーゼ活性を、鋳型、ポリメラーゼおよびナノポアの混合物を使用して、ポリメラーゼ複合体を形成するが、ポリメラーゼ複合体を未結合の構成成分から単離することによって富化分画を含まない標準的な方法（Ｅｉｎｔｏｆ）によって得られるポリメラーゼ複合体のポリメラーゼ活性と比較した。結果は図１０に示し、それは、ポリメラーゼ伸長の産物が、ポジティブ富化に従ってアビジンビーズを使用して富化された分画中で可視的であったことを示す。伸長産物は、富化されていない方法（Ｅｉｎｔｏｆ）の使用から得られる混合物中では可視化されなかった。
【０２００】
[00222]ダンベル形状のＤＮＡ鋳型を供給するためにアダプター二量体を使用して、実験を繰り返した。プロセスの図を図５に提供する。
[00223]この例において、オリゴヌクレオチドプライマーをデスチオビオチンで標識して、鋳型、ポリメラーゼおよびナノポアとともにインキュベートした。モノマーストレプトアビジンビーズを精製に使用した。富化プロトコールは、鋳型としてのＤＮＡアダプター二量体、Ｐｏｌ２ポリメラーゼ、およびＨＬナノポアを、０．１：０．１：０．１の等モル比で使用した。構成成分を４℃で１．５時間反応させた。富化されていない混合物の２つの調製物（Ｅｉｎｔｏｆ）を対照として使用した。第１の富化されていない混合物は、アダプター二量体ＤＮＡ鋳型、Ｐｏｌ２ポリメラーゼ、およびＨＬを、０．４：０．２：０．１の等モル比で含んでおり、第２の富化されていない混合物は、線状ＤＮＡ鋳型ＪＡＭ１Ａ（９９塩基）、Ｐｏｌ２ポリメラーゼ、およびＨＬナノポアを、０．４：０．２：０．１の等モル比で含んだ。富化されていない混合物の構成成分を、４℃で一晩インキュベートした。ポジティブ富化方法によって得られる三元複合体を含む富化された分画を、バイオチップの膜上へ適用させて、活性細胞の単一ポア挿入数および配列決定収率を、標準的なＥｉｎｔｏｆ方法の富化されていない混合物中に存在するポリメラーゼ複合体を使用して得られるものと比較した。
【０２０１】
[00224]ポジティブ単離方法によって得られる挿入されたナノポア（単一ポア挿入）の数を、ＧＡＤ鋳型基質またはＪＡＭ１Ａと複合体形成される場合の富化されていない分画の標準的なＥｉｎｔｏｆ混合物を使用して得られるポア挿入の数と比較した。結果は、図１１および表１Ａに示す。
【０２０２】
[00225]ポジティブ単離方法によって得られる活性細胞の数を、ＧＡＤ鋳型基質またはＪＡＭ１Ａと複合体形成される場合の富化されていない分画の標準的なＥｉｎｔｏｆ混合物を使用して得られるポア挿入の数と比較した。結果は、図１２および表１Ｂに示す。
【０２０３】
[00226]存在する細胞の総数（６１４３個）のうちの活性細胞のパーセントとして測定される配列決定収率パーセントを、ＧＡＤ鋳型基質またはＪＡＭ１Ａと複合体形成される場合の富化されていない分画の標準的なＥｉｎｔｏｆ混合物を使用して得られる配列決定収率パーセントと比較した。結果は、図１３および表１Ｃに示す。ポジティブ単離方法によって富化されたポリメラーゼ複合体を含む試料は、標準的な混合物Ｅｉｎｔｏｆ方法を使用して得られるものの約２．３倍の増加を示した。
【０２０４】
[00227]データの概要を表２に提供する。
[00228]単離したポリメラーゼ複合体を使用して得られるカレントトレースの例を図１４に付与する。鋳型依存性ＤＮＡ鎖に組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドのタグを、緑色、黒色、青色および赤色で示す。タグを使用して配列決定するのに使用する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号（２０１３年１１月７日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」という表題、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２０５】
[00229]データは、本明細書中に記載するポジティブ単離方法によって得られるポリメラーゼ複合体において富化された分画を使用して得られるポア挿入の数、活性細胞の数、および配列決定収率パーセントが、標準的なＥｉｎｔｏｆ方法によって供給される混合物において得られるポリメラーゼ複合体に関して測定した同じパラメーターよりも少なくとも１００％高かったことを示す。
【０２０６】
【表２】
2018534939.tif 000004
【０２０７】
【表３】
2018534939.tif 000005
【実施例３】
【０２０８】
ネガティブ富化−ポリメラーゼ複合体の単離
[00230]この実施例は、所望の複合体、即ち、ナノポア配列決定用複合体またはポリメラーゼ複合体を、複合体構成成分の混合物からネガティブに単離することによって、ナノポア配列決定用複合体またはポリメラーゼ複合体を精製する方法に関する。複合体構成成分は、それらを固相支持体に結合させて、未結合の分画中に所望の複合体を残すことによってポジティブに単離される。
【０２０９】
[00231]プロセスの図を図７に提供する。
【０２１０】
引用リスト
特許文献：
[00232]ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２０１４／０７４７２７  ｏｎ  １５  Ｍａｙ  ２０１４；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＵＳＩＮＧ  ＴＡＧＳ）．
[00233]ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２００６／０２８５０８  ｏｎ  １６  Ｍａｒｃｈ  ２００６；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＦＯＲ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＩＮＧ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ．
[00234]ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２０１２／０８３２４９；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＢＹ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＥＬＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ）．
[00235]ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５４（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２０１５／０６１５１１，Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ  ＷＥＬＬ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ）．
[00236]ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５３（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２０１５／０６１５１０，Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＦＯＲＭＩＮＧ  ＬＩＰＩＤ  ＢＩＬＡＹＥＲＳ  ＯＮ  ＢＩＯＣＨＩＰＳ）．
[00237]米国特許出願１４／０７３，４４５（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＵＳ２０１４／０１３４６１６，Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＵＳＩＮＧ  ＴＡＧＳ．
[00238]ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  ＷＯ２０１２／０８３２４９；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＢＹ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＥＬＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ）．
[00239]米国特許第６，０２２，９５１号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ  ＭＵＴＡＮＴＳ．
[00240]米国特許第６，３９１，５７１号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ  ＭＵＴＡＮＴＳ．
[00241]米国特許第６，３１２，９１６号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ  ＭＵＴＡＮＴＳ．
[00242]米国特許第６，４１７，３３１号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ  ＭＵＴＡＮＴＳ．
[00243]米国特許第６，１６５，７５０号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ．
[00244]米国特許第６，１５６，４９３号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ．
[00245]米国特許第５，１６８，０４９号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ−ＬＩＫＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ．
[00246]米国特許第４，６５６，２５２号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＡＭＩＤＯＢＩＯＴＩＮ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＩＮ  Ａ  ＡＶＩＤＩＮ−ＢＩＯＴＩＮ  ＬＡＹＥＲＩＮＧ  ＰＲＯＣＥＳＳ．
[00247]米国特許第４，４７８，９１４号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＰＰＬＹＩＮＧ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＬＡＹＥＲＳ  ＯＦ  Ａ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＮＤ  Ａ  ＬＩＧＡＮＤ  ＥＸＴＥＮＤＥＲ  ＴＯ  Ａ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＡＮＤ  ＴＯ  ＴＨＥ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ−ＬＡＹＥＲ  ＳＹＳＴＥＭ．
[00248]米国特許第４，２８２，２８７号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＶＩＤＩＮ−ＢＩＯＴＩＮ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ−ＬＡＹＥＲ  ＳＹＳＴＥＭ．
[00249]米国特許第５，２１５，９２７号ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＯＳＥＬＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＥＬＬＳ  ＵＳＩＮＧ  ＡＶＩＤＩＮ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＩＮ．
非特許文献：
[00250]Ａｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｏｗａｒｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｄｉｒｅｃｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｄａｐｔｅｒ”，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８：１７０５−１７１０［２００６］．
[00251]Ｚａｋｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔａｇ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎ”，ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０−Ｅ６９７［２０１２］．
[00252]Ｔｈａｐａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ”：Ａ  Ｂｏｏｎ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９：１４４６１−１４４８３［２０１４］．
[00253]Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｕｏ，“Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｉｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ  ３１：４８−６６［２０１２］．
[00254]Ｈｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９７：４６１−４７５［２０１３］．
[00255]Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｈｅｍｏ−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｙｉｅｌｄｓ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｅｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２５：５６９−５７８［２０１４］．
[00256]Ｒａｓｈｉｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：１２７７−１２９４［２０１３］．
[00257]Ｈｏｒｈｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，８：５３４５−５３４７［２００６］．
[00258]Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｆｏｒ  ５’−ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３６１−３６６  １９９６］．
[00259]Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：３９５−４００［１９９９］．
[00260]Ｂｕｌｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｐＨ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７８−８３［２０００］．
[00261]Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅａｓｉｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ａｖｉｄｉｎ，ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ”，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０８，３４３−３５７［２００２］．
[00262]Ｐｉｒａｎ  ＆  Ｒｉｏｒｄａｎ．Ｊ．“Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３３，１４１−１４３［１９９０］．
[00263]Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｈｅｋ，“Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉｄｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１４３．［１９９２］．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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