(57)【要約】  本開示は、フコシル化経路が修飾されている細胞を得る方法であって、細胞から部分的にフコシル化された及びフコシル化されていないタンパク質生成物、特に抗体の生成がもたらされる方法に関する。本開示は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）技術を利用する。本開示の方法は、細胞内のＦｕｔ８遺伝子及びＧＭＤ遺伝子を標的とする。そのような生成物は、１０個の治療薬及びバイオマーカーの開発、及び疾患の診断及び予後において用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７から配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７から配列番号９３、及びその組み合わせからなる群より選択される配列を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項２】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、及び配列番号１７から配列番号３７が、Ｆｕｔ８遺伝子配列に結合し、また配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び配列番号４７から配列番号９３が、ＧＭＤ遺伝子配列に結合する、請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項３】
配列番号１３が配列番号１４に転写され、配列番号１５が配列番号１６に転写され、配列番号３７が配列番号３８に転写され、配列番号３９が配列番号４０に転写され、配列番号４１が配列番号４２に転写され、配列番号４３が配列番号４４に転写され、及び配列番号４５が配列番号４６に転写される、請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼを含む、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体。
【請求項５】
ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼである、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメインを含むベクター。
【請求項８】
ヌクレアーゼを更に含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０】
ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ  −ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップと、
ｄ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップと
を含む、フコースノックアウト細胞を得る方法。
【請求項１２】
ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップと、
ｅ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、０％から１００％の範囲のフコシル化活性を有する細胞を得るステップと、
ｆ）ステップ（ｂ）の細胞が発現したタンパク質を得るステップと
を含む、０％から１００％の範囲でフコシル化されたタンパク質を得る方法。
【請求項１３】
ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物が、請求項４に記載の複合体を提供し、前記複合体が、細胞内の遺伝子配列を切断し、前記遺伝子が、Ｆｕｔ８、ＧＭＤ、及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項１１及び１２に記載の方法。
【請求項１４】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＦｕｔ８遺伝子配列が、エクソン７において切断される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
α−ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ酵素をコードするＧＭＤ遺伝子配列が、エクソン３、エクソン４、及びその組み合わせからなる群より選択されるエクソンにおいて切断される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属に由来する昆虫細胞系からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質のフコシル化が０％であり、前記タンパク質が、前記細胞内のＦｕｔ８遺伝子の破壊により得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、０％から１００％フコシル化されており、前記タンパク質が、前記細胞内のＧＭＤ遺伝子の破壊により得られ、前記方法が、増殖培地内にＬ−フコースを添加するステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、内因性タンパク質を産生する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質をエンコードする遺伝子を前記細胞に導入し、前記タンパク質を得るステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１２に記載の方法により得られた、０％から１００％フコシル化されているタンパク質。
【請求項２４】
抗体である、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、請求項２３に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質が、抗体である、請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオテクノロジー、遺伝子工学、及び免疫学の分野に関する。特に、本開示は、特定の生物学的経路が改変される細胞系の開発に関する。そのような改変は、細胞の酵素、特にタンパク質のグリコシル化に関与する酵素内に存在する。本開示によれば、タンパク質グリカン鎖の特異的改変を実現するタンパク質発現系が開発される。グリカン鎖の特異的改変により、抗体を含め、部分的フコシル化及び非フコシル化タンパク質が生成する。そのような生成物は、治療薬及びバイオマーカーの開発、及び疾患の診断及び予後において用いられる。本開示は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）技術を利用する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景及び先行技術
真核生物におけるグリコシル化は、最も一般的な共有結合性の翻訳後タンパク質修飾機構として、数十年にわたり集中的に試験されてきた。ヒトトランスクリプトーム（約２５０〜５００個の糖鎖遺伝子）の約１〜２％が、グリコシル化に関与するタンパク質を翻訳するものと予測されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＹａｒｅｍａ、２００５年）。細胞タンパク質のグリコシル化は、多くの生物学的機能、例えばタンパク質フォールディング、安定性、細胞内及び細胞間の輸送、細胞−細胞及び細胞マトリックスの相互作用等において重要な役割を演じている。
【０００３】
糖タンパク質には４つの異なる群：Ｎ−結合型、Ｏ−結合型、グリコサミノグリカン、及びグリコシルフォスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質が存在する。Ｎ−結合型のグリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖アミド窒素を介して生ずる一方、Ｏ−結合型のグリコシル化は、セリン又はトレオニン残基の側鎖内の酸素原子を利用する。Ｎ−結合型のグリコシル化は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアミノ酸配列内で行われるが、この場合、Ｘは、プロリン及びアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸であり得る（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ及びＡｅｂｉ、２００４年）。
【０００４】
フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）は、脊椎動物、無脊椎動物、植物、及び細菌内に存在する多くの糖タンパク質及び糖脂質中に存在する単糖である。フコシル化は、フコース残基を様々なタンパク質及びオリゴ糖に転移させるプロセスである。フコシル化は、フコシルトランスフェラーゼ、グアノシンジホスファート（ＧＤＰ）−フコース合成酵素、及びＧＤＰ−フコーストランスポーター（複数可）を含むいくつかの分子により制御される。フコシル化糖タンパク質の多数は、細胞表面上の分泌タンパク質又は膜タンパク質である。
【０００５】
２０１４年には、全世界において、新規癌症例が１４１０万例、癌死亡例は８２０万例に登り、また３２６０万人が癌を抱えながら生きている（診断から５年以内）。癌の高死亡率は、より有効な療法に対するいまだ満たされないニーズを反映する。過去２０年における抗腫瘍薬開発の最も顕著な変化は、古典的な細胞傷害性薬から、「モノクローナル抗体」又はｍＡｂとして知られている、癌に関わるシグナリング路に影響を及ぼす薬物への移行であった。１０年前は、２つのｍＡｂが市販されていたに過ぎなかったが、現在では多様な治療手段からなる約３０ものＦＤＡ承認済みｍＡｂ、例えばアダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ等が存在する。ｍＡｂは、製薬業界において最も急速に成長しているセグメントであり、またこの急速な拡大は継続している。１００を超えるモノクローナル抗体に基づく生物学的製剤が、臨床トライアル中である。これらの多くは、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相トライアルであり、承認を求めて規制当局に提出されるであろう。本明細書に記載する技術を介してモノクローナル抗体治療を改善すれば、そのような改善は、患者にとってより良好な臨床転帰をもたらす道標となる。
【０００６】
ヒトＩｇＧ１抗体は、高度にフコシル化した糖タンパク質である。フコース、ガラクトース、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン、及びシアル酸が様々に付加したコアヘプタサッカライドからなる２つのＮ−結合型二分岐オリゴ糖が、ＩｇＧ１のＡｓｎ−２９７に存在する。抗体のグリコシル化は、「エフェクター機能」−抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られている特有の生物学的機能をもたらす。ＡＤＣＣは、細胞媒介型の免疫系であり、免疫細胞（ナチュラルキラー細胞等）が、細胞表面抗原に対する抗体を介して識別された標的細胞を溶解する。
【０００７】
ＩｇＧ分子のエフェクター機能は、抗体Ｆｃ領域とＦｃγＲとして知られている白血球受容体との相互作用、又は補体成分との相互作用により定義される。オリゴ糖構造の構成は、ＦｃγＲ結合を介したエフェクター機能にとってきわめて重要である（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年；Ｎｉｗａら、２００４年；Ｎｉｗａ、Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａら、２００４年；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、２００４年）。ヒトＩｇＧ１の結晶構造解析により、オリゴ糖鎖とＣＨ２ドメインとの複雑な相互作用が明らかにされた（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８年；Ｒａｄａｅｖら、２００１年）。
【０００８】
ＡＤＣＣ機構の効率は、抗体のフコシル化レベルに顕著に依存する。フコシル化度が低いほど、ＡＤＣＣの速度は高まる。従って、フコシル化の喪失は、重大な生物学的結果を引き起こす。喪失は、フコシルトランスフェラーゼ酵素の機能欠如に起因し、その結果、細胞タンパク質の非フコシル化を引き起こす。プライマリーＮ−アセチルグルコサミン由来のフコースが存在しないと、結果として、ＦｃγＲＩＩＩα受容体に対する結合親和力が高まったＩｇＧ１抗体が得られ、その結果ＡＤＣＣの効率が５０〜１００倍高まる。非フコシル化ＩｇＧによるＡＤＣＣの改善は、ＦｃγＲＩＩＩαに対するアフィニティーの上昇と直接比例し、非フコシル化ＩｇＧのＦｃが正常血清中の高濃度のフコシル化ＩｇＧとの競合を克服できるようにする。非フコシル化ＩｇＧのＦｃのＦｃγＲＩＩＩａに対するアフィニティー上昇に関する妥当な根拠として、受容体−リガンド界面における立体阻害の低下又は欠如を挙げることができる（Ｈａｒｒｉｓ、１９９８年；Ｒａｄａｅｖ、２００１年）。
【０００９】
哺乳動物発現系では、タンパク質内で、ＧＤＰ−フコースからＮ−グリカン鎖のＮ−アセチルグルコサミンにフコース部分が転移する際に、Ｆｕｔ８遺伝子によりコードされる酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、その転移に関与している（Ｍｉｙｏｓｈｉ、１９９９年）。様々な手段を介してこの遺伝子機能を破壊すると、抗体を含む非フコシル化タンパク質が生成する（Ｎａｏｋｏ  Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ、２００４年）。
【００１０】
ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）は、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）ファミリーの糖ヌクレオチド修飾サブファミリーメンバーである（Ｗｅｂｂ、Ｍｕｌｉｃｈａｋら、２００４年）。
【００１１】
哺乳動物発現系では、フコシル化に必須の基質であるＧＤＰ−フコースが、デノボ経路及びサルベージ経路を介して細胞質内で合成される。フコシル化のデノボ経路では、ＧＤＰ−フコースが、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を介して合成されるが、この合成は、酵素ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）により触媒される。このＧＤＰ−フコースは、次にゴルジ内部に輸送され、そして酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）によりタンパク質をフコシル化するための基質として用いられる。該酵素は、フコース部分を、ＧＤＰ−フコースからＮ−グリカン鎖のＮ−アセチルグルコサミンに転移させる（Ｍｉｙｏｓｈｉ、１９９９年）。これらの重要な酵素、ＧＤＰ−マンノース-４，６−デヒドラターゼ及びα−１，６−フコシルトランスフェラーゼは、ＧＭＤ遺伝子及びＦＵＴ８遺伝子によりそれぞれコードされる。
【００１２】
哺乳動物プラットフォームにおいて開発された治療抗体の非フコシル化形態は、フコースの生合成に障害が生じた場合に生ずるが、標的腫瘍細胞に対するＡＤＣＣの効率強化に起因して、フコシル化した形態よりも臨床的長所を有し得る。
【００１３】
歴史的には、遺伝子ノックアウトシステムは、相同的組換え（ＨＲ）により媒介される標的突然変異である欠損、及び／又は挿入に完全に依存した。ＨＲシステムは非常に特異的であるものの、１つの突然変異したクローンを見つけ出すのに数千ものクローンをスクリーニングする必要があるので非常に非効率的である。更に、対立遺伝子変異を除去するには、一層多くの時間がかかり、より大規模なスクリーニングとなる。いくつかの技術が過去１０年間において進化し、ＤＮＡ配列認識ドメインとヌクレアーゼドメインを併用した標的遺伝子改変を実現した。このようなシステムは、対象とする特定部位の識別、次にＤＮＡ鎖切断の導入において非常に効率的である。ゲノム標的座位におけるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ修復を活性化させるが、これは、遺伝子の改変に利用される。ＤＮＡ損傷応答は、真核細胞において高度に保存される。ＤＳＢに基づくゲノムエンジニアリングの概念は、高度に多様な生物の間で容易に移転可能である。二本鎖切断を形成すれば、相同的組換え及び非相同末端結合機構を介して、標的対象座位における遺伝子ノックアウトの頻度が千倍増加する。
【００１４】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、遺伝子破壊において最も頻繁に用いられる技術の１つである。同酵素は、ジンクフィンガータンデムアレイ毎に、ＤＮＡレベルの３つの塩基を必要とする。更に、ジンクフィンガーアレイ内の個々のフィンガー間で標的部位が重なり合い、そして相互応答するので、配列特異的ＺＦＮの生成は顕著に複雑化する。更に、ＺＦＮの主な欠点として、特異的ＤＮＡ配列認識に関するＺＦＮモチーフを識別するための、労力と時間のかかる実験的選択プロセスが挙げられる。
【００１５】
Ｆｕｔ８及びＧＭＤゲノム座位を破壊する方法が、先行技術に認められる。但し、そのいずれの方法も、ＣＲＩＳＰＲ技術により、ＦＵＴ８及びＧＭＤゲノム座位上の特定箇所を標的とするものではない。
【発明の概要】
【００１６】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ＦＵＴ８ゲノム座位又はＧＭＤゲノム座位上の特異的箇所を標的とすることにより、先行技術の方法と関連した欠点又は限界を克服するが、その結果、遺伝子及び関連機能が完全に破壊され、非フコシル化タンパク質を産生する細胞が得られる。
【００１７】
本開示の記載事項
従って、本開示は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７〜配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７〜配列番号９３、及びその組合せからなる群より選択される配列を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合ドメイン；上記のようなＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ複合体；上記のようなＤＮＡ結合ドメインを含むベクター；上記のようなベクターを含む細胞；フコースノックアウト細胞を得る方法であって、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップ、及びｂ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む上記方法；０％〜１００％の範囲でフコシル化されたタンパク質を得る方法であって、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップ、ｂ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、０％〜１００％の範囲のフコシル化活性を有する細胞を得るステップ、及びｃ）ステップ（ｂ）の細胞が発現したタンパク質を得るステップを含む上記方法；上記のような方法により得られた、０％〜１００％フコシル化されたタンパク質；並びに任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、上記のようなタンパク質を含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】Ｆｕｔ８遺伝子コード配列及びタンパク質配列を示す図である。
【図１Ｂ】ＧＭＤ遺伝子構造を示す図である。
【図２Ａ】ＣＨＯＫ１  Ｆｕｔ８アミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】ＧＭＤ遺伝子の全アミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベクター構築物ｐＤ１４０１ｇＲＮＡの構築マップを示す図である。
【図３Ｂ】Ｆｕｔ８エクソン７の標的配列を示す図である。
【図４Ａ】ＧＭＤ遺伝子のエクソン３を標的とするＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を示す図である。
【図４Ｂ】ＧＭＤ遺伝子のエクソン４を標的とするＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）を示す図である。
【図４Ｃ】ＧＭＤエクソン３の標的配列を示す図である。
【図４Ｄ】ＧＭＤエクソン４の標的配列を示す図である。
【図５】１日目に観察した、Ｆｕｔ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１対照細胞及びＣＨＯＫ１クローン細胞系を示す図である。
【図６Ａ】４日目に観察した、Ｆｕｔ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１対照細胞及びＣＨＯＫ１細胞系を示す図である。
【図６Ｂ】ＧＭＤ遺伝子エクソン３を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞系を示す図である。
【図７Ａ】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図７Ｂ】ＧＭＤエクソン３及び／又はエクソン４を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）若しくはｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）又はｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）＋ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図７Ｃ】ＧＭＤエクソン３を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図８Ａ】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイにおける蛍光プロファイルを示す図である。
【図８Ｂ】ＧＭＤエクソン３及び／又はエクソン４を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）若しくはｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）又はｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）＋ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイにおける蛍光プロファイルを示す図である。
【図８Ｃ】ＧＭＤエクソン３を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイの蛍光プロファイルを示す図である。
【図９Ａ】Ｆｕｔ８エクソン７のゲノム座位、それぞれのアミノ酸配列、重要な酵素モチーフ様ベータ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス及びＣＲＩＳＰＲ認識配列を示す図である。
【図９Ｂ】ＧＭＤエクソン３及びエクソン４のゲノム座位、対応するアミノ酸配列及びＣＲＩＳＰＲ認識配列を示す図である。
【図１０】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図１１】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイの蛍光プロファイルを示す図である。
【図１２】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイを示す図である。
【図１３Ａ】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞の増殖曲線を示す図である。
【図１３Ｂ】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞の増殖曲線を示す図である。
【図１３Ｃ】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞の増殖曲線を示す図である。
【図１４】ＦＵＴ８エクソン７を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物をトランスフェクトしたクローンＣＨＯＫ１細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー及びＳｔｒｅｐ−ＦＩＴＣアッセイによる比較を示す図である。
【図１５Ａ】１％アガロースゲルに泳動した場合の、代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｆｕｔ８クローン（ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２）のＰＣＲ増幅産物の代表的な図を示す図である。
【図１５Ｂ】１％アガロースゲルに泳動した場合の、代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＧＭＤクローン（ＧＭＤ＿１．１２及びＧＭＤ＿１．２７）のＰＣＲ増幅産物の代表的な図を示す図である。
【図１５Ｃ】ＧＭＤエクソン４座位に特異的なプライマーによるＧＭＤ２．３０クローン細胞系のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅での代表的な１％アガロースゲル泳動を示す図である。
【図１６Ａ】異なるノックアウト細胞系からインサートの存在を確認する、ｐＴＺ５７Ｒ／ＴベクターのＰＣＲ増幅産物の代表的な制限酵素消化を示す図である。
【図１６Ｂ】異なるノックアウト細胞系からインサートの存在を確認する、ｐＴＺ５７Ｒ／ＴベクターのＰＣＲ増幅産物の代表的な制限酵素消化を示す図である。
【図１６Ｃ】異なるノックアウト細胞系からインサートの存在を確認する、ｐＴＺ５７Ｒ／ＴベクターのＰＣＲ増幅産物の代表的な制限酵素消化を示す図である。
【図１７Ａ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｂ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｃ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｄ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｅ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｆ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｇ】ＦＵＴ８遺伝子配列のエクソン７において欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンの代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｈ】ＧＭＤノックアウトクローン細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｉ】ＧＭＤノックアウトクローン細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｊ】ＧＭＤノックアウトクローン細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｋ】ＧＭＤノックアウトクローン細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図１７Ｌ】ＧＭＤノックアウトクローン細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図１８Ａ】ＦＵＴ８エクソン７の標的座位において欠失、中途終止コドンをもたらす、ＦＵＴ８  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）を示す図である。
【図１８Ｂ】ＦＵＴ８エクソン７の標的座位において欠失、中途終止コドンをもたらす、ＦＵＴ８  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）を示す図である。
【図１８Ｃ】ＧＭＤエクソン３の標的座位において欠失、中途終止コドン及びフレームシフト突然変異をもたらす、ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を示す図である。
【図１８Ｄ】ＧＭＤエクソン３の標的座位において挿入、中途終止コドン及びフレームシフト突然変異をもたらす、ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を示す図である。
【図１８Ｅ】ＧＭＤエクソン３の標的座位において挿入、中途終止コドンをもたらす、ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を示す図である。
【図１８Ｆ】ＧＭＤエクソン４の標的座位において挿入、中途終止コドン及びフレームシフト突然変異をもたらす、ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）を示す図である。
【図１８Ｇ】ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）及びｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）の両方をトランスフェクトした細胞系から、エクソン４座位におけるアミノ酸の欠失並びにエクソン３座位が変化しないままであったことが明らかであることを示す図である。
【図１９】いくつかの真核生物におけるＦＵＴ８アミノ酸配列比較を示す図である。
【図２０】異なるプロトコールを使用するＣＨＯＫ１細胞系のトランスフェクション効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７〜配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７〜配列番号９３、及びその組合せからなる群より選択される配列を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合ドメインに関する。
【００２０】
本開示の一実施形態では、配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、及び配列番号１７〜配列番号３７が、Ｆｕｔ８遺伝子配列に結合し、また配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び配列番号４７〜配列番号９３が、ＧＭＤ遺伝子配列に結合する。
【００２１】
本開示の別の実施形態では、配列番号１３が配列番号１４に転写され、配列番号１５が配列番号１６に転写され、配列番号３７が配列番号３８に転写され、配列番号３９が配列番号４０に転写され、配列番号４１が配列番号４２に転写され、配列番号４３が配列番号４４に転写され、及び配列番号４５が配列番号４６に転写される。
【００２２】
本開示は、上記のようなＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ複合体とも関連する。
【００２３】
本開示の一実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。
【００２４】
本開示の別の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼである。
【００２５】
本開示は、上記のようなＤＮＡ結合ドメインを含むベクターとも関連する。
【００２６】
本開示の一実施形態では、ベクターは、ヌクレアーゼを更に含む。
【００２７】
本開示は、上記のようなベクターを含む細胞とも関連する。
【００２８】
本開示の一実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００２９】
本開示は、フコースノックアウト細胞を得る方法とも関連し、前記方法は、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップと
を含む。
【００３０】
本開示は、０％〜１００％の範囲でフコシル化されたタンパク質を得る方法とも関連し、前記方法は、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、０％〜１００％の範囲のフコシル化活性を有する細胞を得るステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞が発現したタンパク質を得るステップと
を含む。
【００３１】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物は、上記のような複合体を提供し、そして該複合体は、細胞内の遺伝子配列を切断し、前記遺伝子は、Ｆｕｔ８、ＧＭＤ、及びその組合せからなる群より選択される。
【００３２】
本開示の別の実施形態では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＦｕｔ８遺伝子配列は、エクソン７において切断される。
【００３３】
本開示のなおも別の実施形態では、α−ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ酵素をコーディングするＧＭＤ遺伝子配列は、エクソン３、エクソン４、及びその組合せからなる群より選択されるエクソンにおいて切断される。
【００３４】
本開示のまた別の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００３５】
本開示のまた別の実施形態では、タンパク質のフコシル化が０％であり、そしてタンパク質は、細胞内のＦｕｔ８遺伝子の破壊により得られる。
【００３６】
本開示のまた別の実施形態では、タンパク質は、０％〜１００％フコシル化されており、そしてタンパク質は、細胞内のＧＭＤ遺伝子の破壊により得られ、そして方法は、増殖培地内にＬ−フコースを添加するステップを更に含む。
【００３７】
本開示のまた別の実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【００３８】
本開示のまた別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３９】
本開示のまた別の実施形態では、細胞は、内因性タンパク質を産生する。
【００４０】
本開示のまた別の実施形態では、本方法は、タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して、タンパク質を得るステップを更に含む。
【００４１】
本開示は、上記のような方法により得られた、０％から１００％フコシル化されているタンパク質とも関連する。
【００４２】
本開示の一実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【００４３】
本開示は、任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、上記のようなタンパク質を含む組成物とも関連する。
【００４４】
本開示の一実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【００４５】
本開示は、非フコシル化抗体を含め、非フコシル化タンパク質を細胞から生成することに関する。
【００４６】
本開示は、部分的フコシル化抗体を含め、部分的フコシル化タンパク質を細胞から生成することに関する。
【００４７】
本開示は、ＧＤＰ−フコースが関係する重要な生化学ステップの上流及び下流にある遺伝子を標的とし、そして破壊するステップとも関連する。
【００４８】
本開示は、非フコシル化タンパク質を生成するのに、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用する。本開示では、フコシル化活性を有さない細胞は、「フコースノックアウト」又は「ＦＫＯ」細胞とも呼ばれる。
【００４９】
ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもって、クラスター化された、短鎖反復回文配列）システムは、順応性のある天然の免疫機構であり、多くの細菌で、ウイルス又はプラスミド等の外来核酸からその身を守るために用いられている。ＣＲＩＳＰＲは、塩基配列の短い反復を含有する原核生物ＤＮＡのセグメントであり、「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントがそれに続く。このスペーサーＤＮＡは、細菌ウイルス又はプラスミドに過去に曝露して得られた外来のＤＮＡである。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）酵素と呼ばれる一連の酵素は、これらのＣＲＩＳＰＲ配列に関連して見出され、Ｃａｓは、ＤＮＡを正確に剪断できるヌクレアーゼである。
【００５０】
バクテリアは、各スペーサーＤＮＡ内の遺伝物質をＲＮＡ分子にコピーする。Ｃａｓ酵素は、次にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子のうちの１つを取り込む。これらは共に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを形成する。システムが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと一致するウイルスに由来するＤＮＡに遭遇すると、ＲＮＡは、該ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、次にＣａｓ酵素はＤＮＡを２つに切断し、ウイルスの複製を阻止する。
【００５１】
ＣＲＩＳＰＲと連携して働く様々なＣａｓ酵素が存在するが、最も周知され、遺伝子工学で頻繁に利用されるのはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。ＣＲＩＳＰＲとＣａｓ酵素は、共にＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを形成する。
【００５２】
Ｃａｓ９は、特定のＣＲＩＳＰＲ機構、特に１つのＣａｓタンパク質のみを必要とするＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて重要な役割を演じていることが明らかにされている。このシステムでは、エンドヌクレアーゼＣａｓ９がｃｒＲＮＡのプロセシングに関与し、標的ＤＮＡの破壊を引き起こす。Ｃａｓ９の機能は、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわちタンパク質のアミノ末端に位置するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、及び中間領域内に存在するＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの存在に依存する。
【００５３】
部位特異的なＤＮＡの認識及び切断の場合、ヌクレアーゼＣａｓ９は、２つのＲＮＡ配列、すなわちｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）、及びｃｒＲＮＡに対して部分的に相補的な、別のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒＲＮＡ）と複合体形成しなければならない。ｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のプレｃｒＲＮＡをコードする一次転写物がｃｒＲＮＡに成熟するのに必要とされる。これは、ＲＮａｓｅＩＩＩ及びＣａｓ９の存在下で生ずる。標的ＤＮＡの切断期間中に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＨＮＨ及びＲｕｖＣ様のヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡ鎖を両方切断し、二本鎖切断物（ＤＳＢ）が生成する。認識部位は、関連するｃｒＲＮＡ転写物内の２０個のヌクレオチド標的配列により定義される。ＨＮＨドメインは、相補鎖を切断する一方、ＲｕｖＣドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性は、プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）として知られている短い保存性の配列、（２〜５ｎｔ）が、標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡ相補配列の３’側の直後に続くことも要件とする。ＰＡＭ配列要件は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能にとって必須である。
【００５４】
一般的に、２つのベクターシステム、１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、並びに２）ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ）からなる複合体が、ＣＲＩＳＰＲが関係する遺伝子編集に用いられる。これら２つの構築物が、哺乳動物細胞内で同時発現すると、複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、合体してキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成するが、これは、Ｃａｓ９が遺伝子配列を標的とするようにガイドするという機能と同じ機能を有する。
【００５５】
相同的組換えが関係する遺伝子編集技術は、遺伝子編集で用いられるその種の技術として最初に挙げられる。但し、ＨＲを用いたときの成功事象頻度は非常に稀であり、細胞３×１０４個につき１回である。
【００５６】
今日では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、より高い標的特異性を可能とし、突然変異体成功事象の頻度もより高いので、一般的となってきた。この方法は、ＤＮＡに結合し、部位特異的ＤＳＢを形成するヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡ結合タンパク質を利用する。有効ではあるが、このような方法は、成功させるために多岐にわたるタンパク質工学ツールを必要とし、これにより複雑なゲノム配列を標的とする際の自由度が制限される。ＣＲＩＳＰＲを哺乳動物細胞に適合させることにより、ゲノム編集は一新され、正確性は一層高まり、設計も容易となった。ＺＦＮとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、標的とされる遺伝子毎にタンパク質工学を必要としない。
【００５７】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするのに、いくつかの単純なＤＮＡ構築物を必要とするのみである。更に、複数の遺伝子が同時に標的対象とされる。本実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、フコース生合成経路内の２つの異なる遺伝子、ＦＵＴ８及びＧＭＤを標的とするために適用される。ＦＵＴ８遺伝子及びＧＭＤ遺伝子に対する個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いたノックアウトＣＨＯＫ細胞系の開発について情報が生成されるが、ＣＨＯＫ細胞系及びその他の関連する細胞系において、両方の遺伝子を同時にノックアウトするために、該複合体が共に用いられ得ることは明らかである。２０ｂｐのｇＲＮＡ配列が、ゲノム全体を通じて複数の部位で１００％の相同性を有するのは稀であるが、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体は、その標的内のいくつかのミスマッチについて寛容である。Ｃａｓ９は、ゲノム内の複数箇所で非特異的に結合することが報告されているが、但しそのような部位のごく一部においてのみＤＮＡ二本鎖切断が形成される。また、実験データより、ＤＮＡ標的部位にある程度のミスマッチが生じても、ＤＮＡ二本鎖切断が可能であることも示唆される。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの特異性を高める戦略が追及される。
【００５８】
１つのそのような観察所見として、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への突然変異という点突然変異が挙げられ、二本鎖切断ではなく、一本鎖切断（ニック）を引き起す。Ｃａｓ９突然変異体は、Ｃａｓ９ｎとして公知である。２つの隣接するＤＮＡ標的部位でＣａｓ９ｎを用いることにより、近接したＤＮＡニックの形成が可能となり、また、標的部位に適切な間隔が置かれる場合には、Ｃａｓ９ｎは二本鎖切断を形成する。
【００５９】
従って、ＤＳＢ形成の特異性はより高くなるが、該ＤＳＢは、ＮＨＥＪ機構により最終的に修復される。非特異的に結合したＣａｓ９ｎは、ニックのみを形成するが、該ニックは、ＨＲにより媒介される修復を介して一般的に修復され、また稀に突然変異又はオフターゲット効果を引き起こす。本開示では、Ｃａｓ９ｎ及びＣＲＩＳＰＲは、Ｆｕｔ８及びＧＭＤの両遺伝子をノックアウトするのに用いられる。１つのＧＭＤ標的座位では、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼも用いられる。
【００６０】
本開示では、細胞内での発現で得られるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供する。
【００６１】
本開示では、用語ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムとは、交換可能に用いられる。
【００６２】
本開示は、細胞内のフコシル化機構を破壊又は不活性化することにより、非フコシル化タンパク質を得る方法に関する。
【００６３】
本開示は、細胞内のフコシル化機構を破壊又は不活性化することにより、部分的にフコシル化したタンパク質を得る方法に関する。
【００６４】
一実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【００６５】
好ましい、但し非限定的な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００６６】
本開示では、用語「非フコシル化抗体」、「アフコシル化抗体」、「０％フコシル化抗体」、及び「１００％非フコシル化抗体」は交換可能に用いられ、同一の意味と範囲を有する。
【００６７】
本開示は、細胞内のＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子の破壊又は不活性化と特に関連する。本開示に記載するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物を用いて、ＦＵＴ８遺伝子及びＧＭＤ遺伝子の両方を、同一細胞系内で同時破壊して、フコースノックアウト細胞系を実現することが可能であることは、当業者の誰にも理解される。
【００６８】
ＦＵＴ８遺伝子は、酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする。ＧＭＤ遺伝子は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース-４，６−デヒドラターゼをコードする。
【００６９】
本開示の一実施形態では、細胞は、タンパク質を自然に産生する細胞である。
【００７０】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体を自然に産生する細胞である。
【００７１】
本開示の一実施形態では、細胞は、所与のタンパク質を自然に産生しない細胞であり、そのタンパク質をコードする遺伝子が該細胞に導入される。
【００７２】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体を自然に産生しない細胞であり、抗体をコードする遺伝子が該細胞に導入される。
【００７３】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体を自然に産生する細胞であり、また抗体をコードする遺伝子が該細胞に導入される。
【００７４】
一実施形態では、細胞は、真核細胞である。
【００７５】
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００７６】
非限定的な実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００７７】
非限定的な実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯＫ１）細胞である。
【００７８】
一実施形態では、ＣＨＯＫ１細胞は、抗体産生細胞である。
【００７９】
一実施形態では、本開示の方法により産生される抗体は、治療抗体である。
【００８０】
別の実施形態では、ＣＨＯＫ１細胞は、抗体産生細胞ではなく、抗体をコードする遺伝子が、細胞に導入される。
【００８１】
本開示の実施形態では、細胞系は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００８２】
本開示の非限定的な実施形態では、細胞は、グルタミンシンテターゼがノックアウトされた（ＧＳ−／−）細胞、好ましくはグルタミンシンテターゼがノックアウトされた（ＧＳ−／−）ＣＨＯＫ１細胞である。
【００８３】
一実施形態では、細胞は、「フコースノックアウト」細胞若しくは「ＦＫＯ」細胞、又は「フコースノックアウト」プラットフォーム若しくは「ＦＫＯ」プラットフォームと呼ばれる。
【００８４】
一実施形態では、細胞は、組換細胞と呼ばれる。
【００８５】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体が、細胞のフコシル化経路を破壊又は不活性化するのに用いられる。
【００８６】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体が、細胞のフコシル化経路の１つ又は複数の遺伝子を破壊又は不活性化するのに用いられる。
【００８７】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８遺伝子）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ遺伝子）、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ遺伝子）、ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ（ＧＥＰＰ遺伝子）、及びフコースキナーゼ遺伝子を含む群より選択される遺伝子を破壊又は不活性化する、又は突然変異させるのに用いられる。
【００８８】
一実施形態では、本開示は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体により、細胞内のＦｕｔ８遺伝子及びＧＭＤ遺伝子を組み合わせて破壊することに関する。
【００８９】
フコシル化のデノボ経路では、ＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を介して合成されるが、この合成は、酵素ＧＤＰ−マンノース−４、６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）により触媒される。このＧＤＰ−フコースは、次にゴルジ内部に輸送され、そして酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼによりタンパク質をフコシル化するための基質として用いられる。該酵素は、フコース部分をＧＤＰ−フコースからＮ−グリカン鎖のＮ−アセチルグルコサミンに転移させる。
【００９０】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体）が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＦｕｔ８遺伝子を破壊するのに用いられる。
【００９１】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体が、ＧＤＰ−マンノース−４、６−デヒドラターゼ酵素をコードするＧＭＤ遺伝子を破壊するのに用いられる。本開示の一実施形態では、フコシルトランスフェラーゼ酵素のＮ末端触媒領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体による標的とされる。
【００９２】
本開示の一実施形態では、ＧＤＰ−マンノース−４、６−デヒドラターゼ酵素の活性部位が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体による標的とされる。
【００９３】
特定の実施形態では、Ｆｕｔ８の遺伝子配列のエクソン７が、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）Ｃａｓ複合体による標的とされる。
【００９４】
本開示の一実施形態では、フコシルトランスフェラーゼ酵素が、エクソン７コーディング配列によりコードされるβ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸位置において突然変異する。得られたクローンは、翻訳が未成熟終止する場合があり、従って下流配列、例えばＡｒｇ−３６５、Ａｒｇ−３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、Ｓｅｒ−４６９、及びその組合せ等は存在しない。
【００９５】
特定の実施形態では、ＧＭＤの遺伝子配列のエクソン３又はエクソン４が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）構築物による標的とされる。
【００９６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物は、一般的に２つのベクターシステムとして設計される。１つの構築物はＣａｓ９エンドヌクレアーゼ発現をコードし、また第２のベクターは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡからなるｇＲＮＡを発現する。ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＰＡＭ配列、及びｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡの機能的複合体が正しく配置すると、それに応じて標的配列を認識する、長さがヌクレオチド２０個の断片として、ｃｒＲＮＡは通常設計される。場合によっては、１つの単一ベクターが、より高い活性及び利便性が得られるように、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の両方を発現する。標的認識特異性は、ｃｒＲＮＡ設計に由来する。
【００９７】
本開示の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ認識ドメインとも呼ばれる。
【００９８】
本開示の一実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をコードするポリヌクレオチドも、前記ポリヌクレオチドを含む細胞と同様に提供される。
【００９９】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドが提供される。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のヌクレアーゼドメインをコードするヌクレオチドが提供される。
【０１００】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【０１０１】
別の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ｎ（ニッカーゼ）Ｄ１０Ａ突然変異体である。
【０１０２】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子内の標的部位を認識する。本開示の一実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの特異性は、非天然の標的部位に結合するように工学的に作出可能であることも公知である。更に、代表的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅｌＹ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。その認識配列は公知である。
【０１０３】
一実施形態では、上記ヌクレアーゼのうちの１つ又は複数の組合せが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質複合体のＤＮＡ結合ドメインと共に用いられる。
【０１０４】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を細胞に導入するのに、トランスフェクションが用いられる。リポフェクションプロトコールが、代表的な実施形態として提供されるが、当業者にとって公知の任意のトランスフェクション法が、本開示の方法に同じように適用可能である。
【０１０５】
別の実施形態では、本開示は、任意の宿主細胞内で組換えタンパク質を生成する方法を提供し、該宿主細胞は内因性のＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子を発現しており、これがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術により標的とされ、本明細書に記載するように、内因性のＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子は破壊される。得られた細胞系は、ＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子の発現につき無効化されており、また対象とする遺伝子を発現させるために更に用いられる。
【０１０６】
本開示では、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体でトランスフェクトした後に生成した６０例に満たないクローン細胞系のスクリーニングから、１７例のＦＵＴ８ノックアウトクローン細胞系が生み出される。比較として、先行技術の報告によれば、約１２０，０００個のクローン細胞系から、たった３例のＦＵＴ８−／−細胞系が選択可能であった。
【０１０７】
本開示では、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体でトランスフェクトした後に、２００例に満たないクローン細胞系のスクリーニングから、３０例のＧＭＤノックアウトクローン細胞系が生み出される。
【０１０８】
特異性、安全、及びプロトコールの単純性は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び方法によりもたらされる、先行技術の方法に勝る長所の一部である。ＣＲＩＳＰＲにより媒介される遺伝子破壊により、カスタマイズされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、複雑性の度合いを問わずユーザー定義の標的配列を認識できるようにする、標的座位の特異性という特有の長所が得られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ゲノム編集効率に関してＺＦＮよりも効率的であり、また毒性は有意に低く、これにより特定の座位に対してより高い突然変異体クローン生成効率を可能にする。本開示では、ＦＵＴ８ゲノム座位及びＧＭＤゲノム座位は、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡを介して配列特異的改変を行うための標的となる。
【０１０９】
本明細書に記載する方法は、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系の生成において成功率２８％を超え（６０例未満のクローン細胞集団のスクリーニングから、１７例のＣＨＯＫ１ノックアウト細胞系）、またＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系の生成において成功率１５％を超える（２００例のクローン細胞集団から、３０例のＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系）効率を実現した。本開示の方法及び特異的ＣＲＩＳＰＲ構築物に続くこのような予期しない成果により、ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウト細胞系の開発は大いに改善した。
【０１１０】
また、本開示は、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８  ＤＮＡ配列内の非常に特異的な遺伝子位置、及びＣＨＯＫ１  ＧＭＤゲノム座位の２つの異なる部位を標的とする一揃いのＣＲＩＳＰＲ構築物のみが用いられた。驚くべきことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的とされたアミノ酸の破壊を引き起こすだけでなく、長い欠損も生成し、そのような欠損によりフレームシフト突然変異及び未成熟終止コドンが導入された。これにより、本開示は、標的座位ではＤＮＡ改変が極めて少ない一方、標的とされたＦＵＴ８座位及びＧＭＤ座位においてはゲノムレベルで大規模に改変された多くのＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系、及び複数のＧＭＤノックアウト細胞系を実現した。フコースノックアウト表現型についてスクリーニングされたクローン集団の数が少数であったことを考慮すれば、そのように多数のＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウト細胞系が生成するとは予想されない。この驚くべき成果により、複数のＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系及びＧＭＤノックアウト細胞系をスクリーニングして、モノクローナル抗体の発現に勝る最良のクローン細胞系を確立するステップが提供される。
【０１１１】
一実施形態では、対象とされる遺伝子は、対象とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを介して得られた細胞系に導入され、これにより組換えタンパク質が生成される。
【０１１２】
別の実施形態では、対象となる発現タンパク質として、モノクローナル抗体を含む抗体が挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＦＵＴ８遺伝子を不活性化すると、組換えタンパク質をより高いレベルで生成する細胞系が得られる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＧＭＤ遺伝子を不活性化すると、組換えタンパク質をより高いレベルで生成する細胞系が得られる。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＦＵＴ８遺伝子を不活性化すると、ＦＵＴ８遺伝子が不活性化されていない細胞内で産生されたタンパク質と比較して、タンパク質の１つ又は複数の活性（機能）が高まった細胞系が得られる。
【０１１６】
特定の実施形態では、ＧＭＤ遺伝子を不活性化すると、ＧＭＤ遺伝子が不活性化されていない細胞内で産生されたタンパク質と比較して、タンパク質の１つ又は複数の活性（機能）が高まった細胞系が得られる。
【０１１７】
一実施形態では、細胞により産生される非フコシル化タンパク質は、非フコシル化抗体である。
【０１１８】
非限定的な実施形態では、非フコシル化タンパク質は、非フコシル化ＩｇＧ１抗体であり、また好ましくは非フコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
【０１１９】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも優れたエフェクター機能を示す。
【０１２０】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも有効な治療特性を示す。
【０１２１】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも高い抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示す。
【０１２２】
本開示において、開示されるタンパク質に関する方法、調製、及び使用では、別途明示しない限り、分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び関連分野における従来技術が利用される。このような技術、その原理、及び要件は、文献で説明されており、当業者にとって公知である。核酸及びアミノ酸配列の同一性を判断する技術は当業者にとって公知である。
【０１２３】
フコシル化機構が破壊された細胞は、抗体を自然に産生する細胞、又はフコシル化を破壊する前又は後において、抗体をコードする遺伝子が導入された細胞である。
【０１２４】
タンパク質、ポリペプチド、又は核酸の「機能的断片」とは、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸とは同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同一の機能をなおも保持するタンパク質、ポリペプチド、又は核酸である。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「抗体」には、ポリクロナール抗体調製物及びモノクローナル抗体調製物の両方が含まれ、またキメラ抗体分子、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）断片、Ｆｖ分子、一本鎖Ｆｖ分子（ＳｃＦｖ）、二量体及び三量体抗体断片、ミニボディ、ヒト化モノクローナル抗体分子、ヒト抗体、抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、並びにこれらの分子から派生したあらゆる機能的断片も含まれ、この場合、派生分子は、親抗体分子の免疫学的機能性を保持する。
【０１２６】
本開示内の用語「モノクローナル抗体」は、均質な抗体母集団を有する抗体組成物を意味する。抗体は、抗体の種若しくは起源に、又は抗体の作製方式により制限を受けない。この用語には、免疫グロブリン全体の他、断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びその他の断片等、並びに親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示すキメラ及びヒト化均質抗体母集団が含まれる。
【０１２７】
本開示のクローン／細胞は、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２３等の用語で呼ばれるが、それは内部の名称であり、また細胞の何らかの具体的特性を表すものではないことに留意されたい。これらの細胞系は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて開発される。
【０１２８】
本開示のクローン／細胞は、Ｃ１ＧＭＤ１．１２、Ｃ１ＧＭＤ１．２７等の用語で呼ばれるが、それは内部の名称であり、また細胞の何らかの具体的特性を表すものではないことに留意されたい。これらの細胞系は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて開発される。
【０１２９】
本開示のクローン／細胞は、ＣＩＧＭＤ２．３０、ＣＩＧＭＤ２．３４等の用語で呼ばれるが、それは内部の名称であり、また細胞の何らかの具体的特性を表すものではないことに留意されたい。これらの細胞系は、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて開発される。
【０１３０】
本開示のクローン／細胞は、ＣＩＧＭＤ３．３６、ＣＩＧＭＤ３．４３等の用語で呼ばれるが、それは内部の名称であり、また細胞の何らかの具体的特性を表すものではないことに留意されたい。これらの細胞系は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体とｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体とを併用して開発される。
【０１３１】
一実施形態では、非フコシル化抗体を含む組成物は、任意選択的に、薬学的に許容される担体、又は添加物、又は添加剤と共に提供される。薬学的に許容される担体、又は添加物、又は添加剤は、投与される組成物により、並びに組成物を投与するのに用いられる具体的方法により決定されるが、また当業者にとって公知である。
【０１３２】
本開示に提示するすべての配列は、別途記載しない限り、５’から３’の方向で表記される。
【０１３３】
添加剤は、タンパク質の安定化を実現し、また生物学的製剤のその他の品質を改善する上で重要である。様々な添加剤が、タンパク質の安定化、抗菌剤としての作用、剤形の製造支援、薬物送達の制御又は標的化、及び注射時の疼痛を最低限に抑えることを目的として組成物に添加される。
【０１３４】
添加剤は、その作用機序に基づき、大きく５つのカテゴリーに分けることができる：
１．タンパク質安定剤：この添加剤は、タンパク質の本来の立体構造を安定化する。例として、ポリオール、糖、アミノ酸、アミン、及び塩析用の塩が挙げられる。スクロース及びトレハロースが、最も頻繁に用いられる糖であり、また大型のポリオールが、小型のポリオールよりも良好な安定剤である。
２．ポリマー及びタンパク質：親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、及び不活性タンパク質等が、タンパク質を安定化するのに非限定的に用いられ、またタンパク質の会合を増強する。例として、デキストラン、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＴＡ）、ＰＥＧ−４０００、及びゼラチンが挙げられる。
３．界面活性剤：非イオン性界面活性剤が、タンパク質の安定化、凝集の抑制、またタンパク質のリフォールディング支援を目的として幅広く用いられる。ポリソルベート８０及びポリソルベート２０は、それぞれツイーン８０及びツイーン２０として知られており、ｍＡｂ治療薬で一般的に用いられる。その他の例として、Ｂｒｉｊ３５、トリトンＸ−１０、プルロニックＦ１２７、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
４．アミノ酸：この添加剤は、様々な機構によりタンパク質を安定化させる。例としてヒスチジン、アルギニン、及びグリシンが挙げられる。処方物添加剤として用いられるその他のアミノ酸には、メチオニン、プロリン、リシン、グルタミン酸、及びアルギニン混合物が含まれる。
５．防腐剤：この化合物は、微生物の増殖を防止するために、処方物に含まれる。例として、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、及びフェノールが挙げられる。
【０１３５】
本開示で用いられる生体物質は、インド国外から得られる。
【０１３６】
ＦＵＴ８座位内の特定ゲノム配列を標的とする根拠
ＦＵＴ８は、３つのドメイン、すなわちＮ末端コイルドコイルドメイン、触媒ドメイン、及びＣ末端ＳＨ３ドメインを含む。
【０１３７】
Ｆｕｔ８タンパク質構造は、酵素のアミノ酸配列の機能的ドメインを理解するために、広範に研究されている。ＦＵＴ８酵素の３次元結晶構造から、１５個の鎖及び１６個のへリックスが明らかにされた。少なくとも３つの領域、すなわちＮ末端（６８〜１０７番残基）、Ｃ末端（５７３〜５７５）、及び不規則な３６８〜３７２番残基が存在する。
【０１３８】
ＦＵＴ８酵素の推定触媒ドメインは、２つのドメイン、すなわちオープンシートα／βドメイン、及びヌクレオチド結合領域として幅広く知られているロスマンフォールドから構成される。α／βドメインは、５つのへリックス及び３つのβ鎖から構成され、それぞれα４、３Ｈ１、３Ｈ２、３Ｈ３、β１、β２、及びβ３鎖である。ドメインは、タンパク質配列のＮ末端に位置する。Ｎ末端触媒ドメインがどのように酵素の機能性に関わるか、その様式について明確なエビデンスは存在しない。
【０１３９】
ロスマンフォールドは、３５９〜４９２番残基の下流に位置し、いくつかのαヘリックス及びβ鎖を含有する。一連の残基、Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、ＦＵＴ８酵素の触媒ドメインにおいて重要な役割を演ずる。
【０１４０】
ヒトＦＵＴ８酵素タンパク質の１０個のアミノ酸残基、Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、本開示の図１９で認められるように、脊椎動物、昆虫、線虫、及びホヤ類を含む様々な種の間で保存される。
【０１４１】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性におけるＦＵＴ８遺伝子内の特定アミノ酸配列の寄与を理解するために、ＦＵＴ８アミノ酸配列の領域が、複数の種間で比較される。アライメントにより、酵素配列は、β２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域において、高度に保存された諸アミノ酸残基を構成することが明らかである。従って、そのようなアミノ酸の位置は、本開示の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の標的となる。
【０１４２】
ＣＨＯＫ１細胞系内のＧＭＤ遺伝子及びＦＵＴ８遺伝子を標的とする根拠
フコースノックアウトプラットフォームは、非フコシル化モノクローナル抗体の分子開発を実現するのに有用である。多くの事例では、完全に非フコシル化された抗体を開発することが好ましい結果であり、従って、フコース生合成経路遺伝子の完全ノックアウトを生み出す戦略が、本開示において策定される。場合によっては、モノクローナル抗体治療医薬品は、自然には得られない部分的フコシル化を必要とする場合もある。治療を目的としてフコシル化モノクローナル抗体の設計バージョンを作製するには、ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系が非常に有用である。
【０１４３】
ＧＭＤ遺伝子は、ＦＵＴ８遺伝子の上流のフコシル化経路に含まれ、そしてＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を介してＧＤＰ−フコース合成に関係する。このステップは、デノボフコース生合成経路の重要なステップの１つである。ＧＤＰフコースも、サルベージ経路を介して細胞内で産生され、また細胞タンパク質のフコシル化に用いられる。サルベージ経路では、細胞は、増殖培地からフコースを摂取する。ＧＭＤ遺伝子がノックアウトされ、そして完全に機能喪失した場合、フコース生合成におけるデノボ経路は完全に停止する。ＧＤＰ−フコース生合成は、増殖培地にフコースが補充される場合には、サルベージ経路を介して活性な状態になおも留まる。従って、フコース生合成経路及び細胞タンパク質のフコシル化は、活性な状態になおも留まる。
【０１４４】
ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系は、特有の長所、すなわちモノクローナル抗体が１００％脱フコシル化する必要がある場合、ＧＭＤ二重ノックアウト細胞プラットフォームが用いられるという長所を提供する。モノクローナル抗体が特異的なレベルのフコシル化を必要とする場合には、増殖培地にＬ−フコースを補充することによって、ＧＤＰ−フコースを生成するサルベージ経路を利用する。実質的に、モノクローナル抗体のフコシル化レベルは、増殖培地内のＬ−フコースレベルを滴定することにより実現する。従って、ＧＭＤ  ＫＯ戦略は、ＣＨＯＫ１培地内のＬ−フコースについて単純な滴定を行うことにより、１００％非フコシル化生成物から、様々なレベルでフコシル化された生成物までを実現する。これが、ＣＨＯＫ１細胞内でモノクローナル抗体を産生させる際のフコシル化制御に関する特有の戦略である。
【０１４５】
一方、Ｆｕｔ８酵素は、ＧＤＰ−フコース生合成ステップの下流で機能し、またゴルジ内での細胞タンパク質のフコシル化における最後の酵素ステップである。デノボ経路及びサルベージ経路の両方に由来するフコシル化前駆体は、最終的なフコース部分の転移においてＦＵＴ８酵素を利用する。従って、Ｆｕｔ８遺伝子をノックアウトすると、細胞タンパク質のフコシル化におけるデノボ経路及びサルベージ経路の両方が実質的に停止する。このアプローチは、Ｆｕｔ８ノックアウトＣＨＯＫ１細胞系内で産生されたモノクローナル抗体の１００％完全脱フコシル化を引き起こす。
【０１４６】
ＧＭＤの活性部位の標的化：
酵素ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースの、中間体であるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースへの変換を触媒する。これは、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｌ−フコース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロース、及びＧＤＰジデオキシアミノ糖であるＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンを含むいくつかの異なるデオキシヘキソースに至る分岐点として機能する。これらの中でも、ＧＤＰ−Ｌ−フコースが、フコース生合成経路における重要な中間体である。ＧＭＤは、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）のＮＤＰ−糖修飾サブファミリーメンバーである。
【０１４７】
このサブファミリーメンバーとして、ＧＭＤは、コモングリシンリッチ領域が存在する分子のＮ末端部分にあるその補助因子ＮＡＤＰ（Ｈ）に結合する。触媒三残基は、Ｔｙｒ−ＸＸＸ−Ｌｙｓ及びＳｅｒ／Ｔｈｒとして同定されており、これらはすべて触媒反応にとって重要である。この群の酵素メンバーでは、アミノ酸配列の有意な変化が認められるものの、３次元構造上の類似性が存在する。
【０１４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られたＧＭＤの構造解析により、活性な分子は、二量体構成をとることが示唆される。一方、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来する同族体は四量体であり、またＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位が、四量体界面の形成に密接に関係している。真核生物内に存在するＧＭＤ酵素の機能的形態は、四量体構成から構成される可能性が最も高い。ＧＭＤは、単量体ユニット４個で結晶化し、単量体は互いに相互作用して触媒ドメインを形成する。対向する単量体は、Ａｓｎ１６３、Ａｒｇ１４７、Ｇｌｕ１６６、Ｔｙｒ１４５、及びＡｒｇ１４７の間の水素結合を介して相互作用する。ＧＭＤが四量体化すると、その結果、好適な補助因子結合部位（ＮＡＤＰＨ）が界面に生ずる。Ｓｅｒ８５は、活性部位のピロホスファートとの水素結合において重要な役割を演ずる。更に、ニコチンアミドリボースヒドロキシルが、触媒残基Ｔｙｒ１５０及びＬｙｓ１５４に等しい距離で水素結合内に存在し、その相互作用は、ＳＤＲ酵素において高度に保存的である。
【０１４９】
ＲＲループは、９個の残基（Ａｒｇ３５〜Ａｒｇ４３）からなるセグメントであり、隣接した単量体内まで延在し、タンパク質−タンパク質相互作用を生み出し、また隣接する補助因子と接触する。タンパク質−タンパク質相互作用には、Ａｒｇ３５とＳｅｒ８５及びＧｌｕ１８８との水素結合が含まれる。基質との結合では、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース相互作用は、Ｔｈｒ１２６、Ｓｅｒ１２７、及びＧｌｕ１２８との潜在的水素結合を形成する能力に依存し得ることが報告されている。また、触媒残基Ｔｈｒ１２６及びＴｙｒ１５０の両方、並びにＳｅｒ８５は、ヘキソースのＯ４ヒドロキシルと水素結合し得る。ＧＭＤについて提案された触媒機構は、とりわけＴｈｒ１２６、Ｓｅｒ１２７、Ｇｌｕ１２８、Ｔｙｒ１５０等のいくつかの重要な残基と関係する。
【０１５０】
これらの残基の重要性を考慮した上で、活性な酵素の四量体構成を乱し、並びに補助因子結合領域及び基質相互作用モチーフに影響を及ぼす可能性のある複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が標的とされる。１つのＣＲＩＳＰＲ構築物が、アミノ酸配列ＡＤＶＤＧＶＧＴＬＲＬＬの提案された二量体界面において設計される。この領域は、ＧＭＤ遺伝子のエクソン４の一部分である。ＣＲＩＳＰＲ構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを標的化してエクソン４における二本鎖ＤＮＡ切断を形成する。モチーフＡＤＶＤＧＶＧＴＬＲＬＬ内の改変はいずれもＧＭＤ酵素の触媒機構に直接影響を及ぼすと想定し、切断部位は、これらのアミノ酸内の重要なアミノ酸残基の前に位置させる。
【０１５１】
第２の一揃いのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、ＧＭＤ遺伝子のエクソン３において設計される。このＣＲＩＳＰＲデザインは、特異性が高い点で特有であり、この場合、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体（Ｃａｓ９ｎ）として知られている突然変異体Ｃａｓ９が選択され、ＤＮＡ一本鎖切断を生じさせる。２つの一本鎖ＤＮＡ切断を実現するように設計された２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、高レベルの特異性を可能にする。構築物は、提案された四量体界面のアミノ酸配列モチーフＹＧＤＬＴＤＳＴＣＬＶＫに対して設計される。２つの一本鎖切断は、ＮＨＥＪ機構によるＤＮＡ修復を可能にし、またこの領域内に突然変異を導入する。この突然変異は、四量体構成内の単量体相互作用の維持に関与する重要なＳｅｒ８５残基に影響を及ぼす。
【０１５２】
ＧＭＤ遺伝子のエクソン３及びエクソン４、並びにＣＲＩＳＰＲ標的箇所内の重要な構造的モチーフの位置を図９Ｂに示す。
【０１５３】
両ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデザインは特有であり、またフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の生成において、より高い能力を実現する。
【０１５４】
Ｆｕｔ８の活性部位の標的化：
本開示の最も重要な態様のうちの１つは、Ｆｕｔ８遺伝子によりコードされる酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの触媒部位を標的とすることである。Ｆｕｔ８タンパク質構造は、酵素アミノ酸配列の機能的ドメインを理解するために幅広く研究されている。ＦＵＴ８酵素の３次元結晶構造から、１５個の鎖及び１６個のへリックスが明らかとなった。少なくとも３つの領域、すなわちＮ末端（６８〜１０７番残基）、Ｃ末端（５７３〜５７５）、及び不規則な３６８〜３７２番残基が存在する。
【０１５５】
ＦＵＴ８酵素の推定触媒ドメインは、２つのドメイン、すなわちオープンシートα／βドメイン、及びヌクレオチド結合領域として幅広く知られているロスマンフォールドから構成される。α／βドメインは、５つのへリックス及び３つのβ鎖から構成され、それぞれα４、３Ｈ１、３Ｈ２、３Ｈ３、β１、β２、及びβ３鎖である。ドメインは、タンパク質配列のＮ末端に位置する。Ｎ末端触媒ドメインがどのように酵素の機能性に関わるか、その様式について明確なエビデンスは存在しない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的配列が、この領域において標的化される。Ｆｕｔ８エクソン７ゲノム座位、各アミノ酸配列、及び重要な構造的モチーフの位置、及びＣＲＩＳＰＲ標的箇所を図９Ａに示す。
【０１５６】
この標的化は、無作為選択ではなく、本開示では、遺伝子又は酵素上の極めて特異的な箇所を決定する実験法により、トランケートされた又は部分的に機能を有する酵素により引き起こされる部分的フコシル化が回避されることを確実とする、その破壊に達する。
【０１５７】
一方、ロスマンフォールドは、３５９〜４９２番残基の下流に位置し、いくつかのαヘリックス及びβ鎖を含有する。一連の残基Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、ＦＵＴ８酵素の触媒ドメインにおいて重要な役割を演ずる。
【０１５８】
従って、酵素活性部位と同等の領域を標的とすればＦｕｔ８遺伝子の完全破壊が確実となり、Ｆｕｔ８遺伝子上の正確な箇所を標的とすることが不可能な技術、又はＦｕｔ８遺伝子上の別の箇所を標的とするような技術は、Ｆｕｔ８遺伝子及び酵素活性の部分的破壊を引き起すおそれがあるが、そのような技術と比較して、それよりも効率的な結果が得られる。フコシル化機構が部分的に機能的である細胞は、非フコシル化タンパク質と比較して、それよりも低い治療機能を示す部分的フコシル化タンパク質を生成する。本開示の方法により生み出された細胞は、１００％非フコシル化された抗体を含む、完全に又は１００％非フコシル化されたタンパク質を産生する。
【０１５９】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を介して、ＦＵＴ８コドン配列の触媒部位に存在する重要なアミノ酸位置に突然変異を導入する。ＣＲＩＳＰＲデザインの狙いは、一本鎖切断を組み込むことにより、Ｎ末端触媒ドメイン、特にβ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域を主に標的とすることにある。細胞のＤＮＡ修復システムは、一本鎖切断の修復を行う間にヌクレオチド変化を導入し、非機能的ＦＵＴ８酵素を生ずる。
【０１６０】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、局所的に欠損及び挿入を引き起こすことが周知であり、従って標的とされるエクソン７においてフレームシフト突然変異が生じ、また終止コドンが挿入される。終止コドンが挿入されると、未成熟の翻訳終止が確実となり、下流のロスマンフォールドが酵素構造から除去され、その結果、非機能的ＦＵＴ８酵素が生み出される。
【０１６１】
本開示の一実施形態では、改変されたＣＨＯＫ１細胞系について、後続するゲノムＤＮＡ分析を行うことにより、欠損、挿入、終止コドン、並びにフレームシフト突然変異が明らかとなる。従って、本開示は、欠損、挿入、及び／又はフレームシフト突然変異を介して、β２鎖及び３Ｈ２ヘリックス内のアミノ酸位置を標的とすることによりＦｕｔ８遺伝子及びフコシルトランスフェラーゼ酵素が破壊されるものと予想する。
【０１６２】
得られたクローンは、未成熟の翻訳終止を引き起こすと考えられ、従って重要な下流配列、例えばＡｒｇ−３６５、Ａｒｇ−３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、Ｓｅｒ−４６９、及びその組合せ等において大規模な変化を引き起こす。
【０１６３】
本開示の図１９は、ラット、ヒト、マウス、ウシ、及びチャイニーズハムスターのＦＵＴ８アミノ酸配列のアライメントを表す。ロスマンフォールド内のアミノ酸３６５、３６６、３６８、３６９、及び３７３を、アスタリスクで明示する。影付き枠内のアミノ酸は、コンセンサス配列と一致しない残基を表す。エクソン７領域内のアミノ酸も明示する。ＣＲＩＳＰＲ認識配列を、太線で明示する。
【０１６４】
本開示では、ＣＨＯＫ１ゲノムデータベースから入手したＦＵＴ８アミノ酸配列を分析し、これらの重要なアミノ酸は、ＣＨＯＫ１細胞系に由来するＦＵＴ８遺伝子内でもやはり保存されていることを確認している。配列特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、これらのアミノ酸モチーフの上流にある遺伝子配列を標的として、ゲノム改変が導入されるように設計される。重要なＦＵＴ８酵素触媒ドメインの上流にあるアミノ酸配列を変化させると、酵素機能がどのように破壊されるか分析される。
【０１６５】
これらの重要なアミノ酸が突然変異すると、ＦＵＴ８遺伝子の機能性が完全に破壊されることが記載されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を利用する遺伝子標的化は、フコースノックアウト細胞系プラットフォームを形成するための新規アプローチである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓがトランスフェクトされた細胞について、ＦＵＴ８遺伝子の機能性アッセイ法を介してスクリーニングする。選択されたクローンは、突然変異についてゲノムＦＵＴ８座位を配列決定することにより確認される。突然変異体フコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系は、次に非フコシル化治療用モノクローナル抗体又は抗体の一部分を含め、非フコシル化治療用タンパク質を発現するのに用いられる。
【０１６６】
遺伝子位置内のアミノ酸コドン配列を特異的に標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物が設計され、及びＣａｓ９遺伝子の種類に応じて、発現ベクター、例えばｐＤ１４０１又はｐＤ１３０１にクローン化される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＣＨＯＫ１細胞中に一時的にトランスフェクトされ、該細胞は、単一コロニーを生成させるために９６ウェルプレートに播種される。各クローンは、次にレンズマメアグルチニンアッセイ法（ＬＣＡ）に基づく蛍光を用いて、細胞タンパク質のフコシル化についてスクリーニングされる。ＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子の破壊についてクローン陽性であれば、ＦＵＴ８遺伝子又はＧＭＤ遺伝子に関する突然変異体対立遺伝子の酵素アッセイ法及び反応速度論分析によって更に試験される。最終的に、ＦＵＴ８座位及びＧＭＤ座位におけるゲノム配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介して生じたあらゆる突然変異について分析される。この突然変異は、欠損又は挿入を含み、これによりＦＵＴ８及びＧＭＤコドン配列のフレームシフト突然変異が導入され、配列は破壊され、酵素は機能を失う。
【０１６７】
上記プロセスに由来するフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系は、治療を目的とするタンパク質、モノクローナル抗体、ペプチド、融合タンパク質の発現、バイオマーカー開発、診断及び予後における使用のための細胞系プラットフォームとして用いられる。
【０１６８】
本開示は、下記の実施例を参照しながら更に記載されるが、実施例は本質的に説明目的に限定され、いかなる場合でも、本開示の範囲に制限を加えるものと解釈されるべきではない。
【０１６９】
試薬の調製
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ完全増殖培地−５００ｍｌ
１．５０ｍｌ  ＦＢＳ（終濃度１０％）を５００ｍｌフィルターユニットの上部チャンバーに添加する。
２．１０ｍｌの２００ｍＭグルタミン（終濃度４ｍＭ）を添加する。
３．５ｍｌの１００Ｘ  Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液（終濃度１Ｘ）を添加する。
４．容積をａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地で５００ｍｌにする。
５．完全培地を０．２２μｍフィルターに通し濾過する。
６．上部チャンバーを解体し、リザーバー又は培地ビンを閉める。
７．培地は調製の３０日以内に使用できる。
８．培地は２℃〜８℃に保存し、連続的な感光を避ける。
９．ＬＣＡ選択培地を調製する場合、１０ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌストックＬＣＡ試薬を５００ｍｌの調製したＤＭＥＭ培地と混合し、ＤＭＥＭ培地中終濃度２００μｇ／ｍｌ  ＬＣＡにする。
材料＆道具
１．バイオセイフティーキャビネット
２．Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機
３．ウォーターバス
４．倒立位相差顕微鏡
５．ＣＯ２インキュベーター
６．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ８ＨＴ  ｅａｓｙＣｙｔｅベンチトップフローサイトメーター
７．Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ＸＲ生死細胞オートアナライザー
８．血球計算盤
９．冷蔵庫
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機
１１．マイクロピペット
１２．マイクロチップ
１３．９６ウェル組織培養プレート
１４．１２ウェル組織培養プレート
１５．６ウェル組織培養プレート
１６．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌピペット（１０ｍｌ、２５ｍｌ、及び５０ｍｌ）
１７．１０００ｍｌ濾過ユニット−孔径０．２２μｍ
１８．７０％エタノール
１９．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ
２０．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）
２１．ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）
２２．ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎｓｔｒｅｐ）
２３．グルタミン
２４．０．０５％トリプシンＥＤＴＡ
２５．０．４％トリパンブルー
２６．マイクロチューブ（１．５ｍｌ及び２ｍｌ）
２７．ファルコンチューブ（１５ｍｌ及び５０ｍｌ）
２８．ウシ血清アルブミン画分Ｖ
２９．フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）
３０．フルオレセインストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）
【表１】
2018502595.tif 000002
【表２】
2018502595.tif 000003
【実施例】
【０１７０】
（例１）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物の設計
本実施例の目的は、ＦＵＴ８及びＧＭＤ対立遺伝子の特異的な不活性化のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を設計することである。
【０１７１】
１．１−ＣＲＩＳＰＲ構築物
ＣＲＩＳＰＲは、化膿性連鎖球菌において見出された微生物の適応免疫系由来のＣａｓ９として公知のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのクラスに基づく。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってゲノム上の特異的部位へと導かれる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、編集する必要がある特異的遺伝子上の３ｂｐのプロトスペーサー活性化モチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧ又はＮＡＧが続く２０ｂｐの標的配列に結合する（Ｊｉｎｅｋ、２０１２年；Ｍａｌｉ、２０１３年）。したがって、この全複合体の結合は二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。
【０１７２】
改変する必要があるゲノム座位における標的ゲノム編集の重要なステップは、これらのＤＳＢの導入である。いったん、ＤＳＢが導入されると、それらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は組換えＤＮＡ修復（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
【０１７３】
ＮＨＥＪは、挿入／欠失突然変異（インデル）の効果的な導入が公知であり、続いて、標的コード配列の翻訳の読み枠又はプロモーター若しくはエンハンサーにおけるトランス作用因子の結合部位の破壊を引き起こす。一方、ＨＤＲ媒介型修復は、標的座位に特定の点突然変異又は配列を挿入し得る。したがって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するベクター及び特異的遺伝子座位を標的とするｇＲＮＡを細胞型にコトランスフェクションすると、標的遺伝子の発現を効果的にノックダウンすることができる。これらの特異的部位における突然変異の予期される頻度は、１％超〜５０％の範囲である（Ｓａｎｄｅｒ  ２０１４年）。
【０１７４】
突然変異体の選択は、薬剤耐性マーカー選択を使用せず、配列決定を使用する単純なスクリーニングによって実施する。遺伝子破壊の特異性を増加するため、本開示は、単一遺伝子座位のための２つのガイドＲＮＡによって誘導され、２つの一本鎖切断又はニックを導入する突然変異体Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）を使用する。これはまた、その他のランダムな部位での非特異的な結合の機会も減らす。Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ及び２つのｇＲＮＡをコードするベクターを使用し、効果的な遺伝子ノックアウトを引き起こす。
【０１７５】
ＧＭＤ及びＦｕｔ８ゲノム座位は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術によって配列特異的欠失の標的とされ、脱フコシル化哺乳動物発現システムを生成する。
１．２−ＣＲＩＳＰＲ構築物を得る全プロセスは以下のステップからなる：
１．ＣＲＩＳＰＲ設計。
２．プライマー設計。
３．オリゴヌクレオチドの合成。
４．ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）＋アンピシリンプレート上でのＣＲＩＳＰＲ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）によるトランスフォーメーション。
５．アンピシリンブロスを含むＬＢへのトランスフォームした細胞（ＣＲＩＳＰＲ構築物）の接種。
６．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞からの、プラスミドｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）の単離。
７．ＣＨＯＫ１細胞へのトランスフェクション；ＬＣＡアッセイによるスクリーニング及び選択。
８．ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキットを使用する選択したクローンのゲノムＤＮＡ単離。
９．分光光度法による定量。
１０．ＰＣＲ条件の最適化。
１１．ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ試料のクロスチェック。
１２．アガロースゲルでの電気泳動。
１３．Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅及びＴａｑポリメラーゼを使用するテーリング。
１４．ＱＩＡＧＥＮキットを使用するＰＣＲ産物のゲル溶出。
１５．ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターを使用するＴＡクローニング。
１６．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞のライゲートした試料ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ）によるトランスフォーメーション。
１７．アンピシリンブロスを含むＬＢへのトランスフォームした細胞（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の接種。
１８．ＱＩＡＧＥＮプラスミドＤＮＡ単離キットを使用するＤＨ５アルファ及びＤＨ１０Ｂ細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の単離。
１９．制限消化（部位）によるインサートの存在のクロスチェック。
２０．配列決定プライマー；及び
２１．配列決定によるＩＮＤＥＬの確認。
【０１７６】
本開示の図１Ａは、Ｆｕｔ８コード配列及びタンパク質配列を示す。ＦＵＴ８ゲノム配列はデータベース配列、配列ＩＤ  ＮＷ＿００３６１３８６０から分析する。ＦＵＴ８ゲノム配列は５７０１７１〜７３１８０４塩基にわたり、図中、Ｅ１〜Ｅ１１として示す１１個のエクソンを含有する。各エクソンの塩基対位置も示す。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３の一部は上流配列における非翻訳領域を構成し、Ｅ１１の一部も非翻訳領域の一部である。翻訳領域はＣＤＳ１〜ＣＤＳ９として記載される。各ＣＤＳの長さは、ＣＤＳ番号の下に示す。アミノ酸配列をコードするＣＤＳ１〜ＣＤＳ９は、３８個のアミノ酸〜１０５個のアミノ酸と様々である。
【０１７７】
チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）又はチャイニーズハムスターフコシルトランスフェラーゼ８（Ｆｕｔ８）ｍＲＮＡ（３１２６ｂｐ）は、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３５０１３７５．１に由来し、本開示の配列番号１によっても表す。
選択的エクソンは大文字及び小文字で表す。
【０１７８】
Ｆｕｔ８タンパク質構造は、酵素の機能ドメインを理解するために広く研究されている。ＦＵＴ８酵素の三次元結晶構造は１５個の鎖及び１６個のヘリックスを明らかにした。
【０１７９】
ＦＵＴ８遺伝子のアミノ酸配列を図２Ａに示す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ結合領域は、部位認識の特異性が高く、同時にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が意図したＤＮＡ一本鎖切断を実行するように設計される。
【０１８０】
一実施形態では、Ｃａｓ９ｎ（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＤ１０Ａ突然変異体）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に使用される。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。２つのＣＲＩＳＰＲ認識部位（５’認識部位と３’認識部位は５塩基対距離で間隔を取り、近接した２つの一本鎖切断を可能にする）。生じる切断によりＤＮＡ切断修復のＮＨＥＪプロセスが可能になり、この領域に突然変異を導入する。
【０１８１】
ＣＲＩＳＰＲ構築物は、ｇＲＮＡ配列の効果的な発現のためのＵ６プロモーターエレメントと縦列にｇＲＮＡ足場を両側に配置する、２つの特有の２０塩基対のＣＲＩＳＰＲ認識配列を有する。特有の設計は、１つの単一のベクターが、ゲノムＤＮＡ上の２つの別々のｇＲＮＡ足場及び２つの特有のＣＲＩＳＰＲ認識配列を発現することを可能にする。
【０１８２】
野生型Ｃａｓ９遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４で示す。
【０１８３】
Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び６で示す。
【０１８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ設計は、一本鎖切断を組み入れることにより、標的ベータ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域に特有に配置される。この設計は、近接した２つの一本鎖切断に対応し、それにより、これらの標的化ゲノム位置においてのみ起こるＮＨＥＪ修復メカニズムとして、標的認識のより高い特異性を与える。非特異的一本鎖切断は、生成された場合、正確であり、ほとんど任意の突然変異を生成しない相同組換えによって通常修復される。
【０１８５】
本開示の主な標的は、Ｎ末端触媒ドメイン、ベータ２鎖、及び３Ｈ２ヘリックスに突然変異を生成することである。この位置でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる挿入及び欠失は、ＦＵＴ８酵素を非機能的にする。さらに、フレームシフト突然変異も中途翻訳終止コドンを引き起こし、そうなると、この領域の下流にあるロスマンフォールドが発現しない。Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９など、ロスマンフォールドのアミノ酸残基は、ＦＵＴ８の機能性に非常に重要である。トランケートされた酵素は非機能的であり、フコースノックアウト細胞系をもたらす。
【０１８６】
本開示の図２Ａは、ＣＨＯＫ１  Ｆｕｔ８アミノ酸配列を示す。ＦＵＴ８遺伝子の全アミノ酸配列を示す。各ＣＤＳからのアミノ酸配列は、大きな矢印で示す。小さな矢印は、ＣＲＩＳＰＲ構築物によってＦｕｔ８遺伝子において標的とされるエクソン７（ＣＤＳ５）に存在する重要なアミノ酸を示す。
【０１８７】
Ｆｕｔ８遺伝子の受入番号ＮＷ＿００３６１３８６０を有するＣＨＯ全細胞ゲノムのショットガン配列決定データは全部で１６１６３４ｂｐに対応する。Ｆｕｔ８遺伝子のコード領域又はｍＲＮＡのＰｕｂｍｅｄ受入番号はＸＭ＿００３５０１７３５．１である。図１Ａに示すように、ｍＲＮＡ配列は、α−１，６フコシルトランスフェラーゼである、ＦＵＴ８遺伝子産物の発現のための全コード配列を包含する。
【０１８８】
Ｓｐｉｄｅｙアライメントツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/spideyweb.cgi）を使用して、ｍＲＮＡ配列をゲノムＤＮＡ配列とアラインすることによってゲノムＤＮＡにおけるエクソンを同定する。表３に示すように、境界を有する全部で１１個のエクソンが同定される。
【表３】
2018502595.tif 000004
【０１８９】
触媒ドメインの非常に重要なアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発研究により、ＦＵＴ８酵素の機能性が確かめられた。
【０１９０】
ゲノムＤＮＡとｍＲＮＡ配列の間に１００％同一性が観察された。１１個のエクソン全て及びエクソン７を標的とするｇＲＮＡの位置を示すＦｕｔ８８遺伝子の構造は、本開示の図１Ａに示す。突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９ｎ）を有する構築物を設計し、標的部位に一本鎖切断（ニック）を生成する。２つの別々のｇＲＮＡが近接した形でエクソン７中において設計され、最終的なＤＮＡ修復のための２つのニックを生成する。
【０１９１】
本開示において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の標的部位は、Ｆｕｔ８遺伝子の最初のいくつかのエクソンに局在する。これは、トランケートされた又は部分的に機能を有する酵素によって引き起こされ得る部分的なフコシル化を回避するために行われる。
【０１９２】
Ｆｕｔ８のエクソン−７（ＣＤＳ−５）ヌクレオチド配列は、本開示の配列番号７によって表す。
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０１９３】
ＣＨＯ細胞のＦｕｔ８のエクソン−７（ＣＤＳ−５）のアミノ酸配列は、本開示の配列番号８によって表される。タンパク質／ペプチド配列における標的アミノ酸位置は下線を引く。
【０１９４】
【化１】
2018502595.tif 000005
【０１９５】
Ｆｕｔ８遺伝子に関して上記に概説した戦略と同様に、Ｓｐｉｄｅｙアライメントツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/spideyweb.cgi）を使用して、ＧＭＤ  ｍＲＮＡ配列をゲノムＤＮＡ配列とアラインすることによってゲノムＤＮＡにおけるＧＭＤ遺伝子エクソンを同定する。５’非翻訳領域及びポリＡテールを有する全部で１０個のエクソンが同定され、表４に作表した。
【０１９６】
１０個のエクソン全てを示すＧＭＤ遺伝子の構造は、本開示の表４に示す。標的化が考えられる、ＧＭＤ遺伝子上のその他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的も、表６に示す。
【表４】
2018502595.tif 000006
【０１９７】
ＧＭＤエクソン−３ヌクレオチド配列は、本開示の配列番号９で表す。
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
【０１９８】
ＧＭＤエクソン−４ヌクレオチド配列は、本開示の配列番号１０で表す。
ＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＧ
【０１９９】
タンパク質／ペプチド配列における標的アミノ酸位置は、太字で示す（図２Ｂ）。ＧＭＤエクソン−３のアミノ酸配列は、本開示の配列番号１１によって表す。ＭＫＬＨＹＧＤＬＴＤＳＴＣＬＶＫＩＩＮＥＶＫＰＴＥＩＹＮＬＧＡＱＳＨＶＫ
【０２００】
ＧＭＤエクソン−４のアミノ酸配列は、本開示の配列番号１２によって表す。
ＩＳＦＤＬＡＥＹＴＡＤＶＤＧＶＧＴＬＲＬＬＤＡＩＫＴＣＧＬＩＮＳＶＫＦＹＱＡＳＴＳＥＬＹＧＫＶＱＥＩＰＱＫＥＴＴＰＦＹＰＲＳＰＹ
【０２０１】
ＣＲＳＰＲを使用して標的とされる、１．３−Ｆｕｔ８遺伝子中の対象とする配列
Ｆｕｔ８遺伝子のエクソン７において、以下に示す配列は標的ＤＮＡへの結合に使用される。
【０２０２】
ＣＲＩＳＰＲ認識配列１は、配列番号１３によって表す。
ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧ
【０２０３】
ｇＲＮＡ１は、配列番号１４によって表す。
ＡＡＵＵＧＧＣＧＣＵＡＵＧＣＵＡＣＵＧＧＡＧＧ
【０２０４】
ＣＲＩＳＰＲ認識配列２は、配列番号１５によって表す。
ＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴ
【０２０５】
ｇＲＮＡ２は、配列番号１６によって表す。
ＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＡＵＣＵＵＧＧＡＡＵ
【０２０６】
ＦＵＴ８及びＧＭＤゲノム配列全体にわたる複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ候補部位を設計する。以下の表はＦＵＴ８ゲノム配列の重要な部位を示す。
【表５−１】
2018502595.tif 000007
【表５−２】
2018502595.tif 000008
【０２０７】
これらの部位全てが特有であり、ＣＨＯ及びその他の細胞系における候補遺伝子ノックアウト戦略を作成するために使用される。上記の表における全ての配列は、５’から３’方向で表す。対応する２０塩基対の標的特異的ｃｒＲＮＡ配列は、上記表５に記載の各設計で示したＣＲＩＳＰＲ認識配列に由来する。
【０２０８】
本開示の表５は、ＣＲＩＳＰＲノックアウト標的化が考えられる異なるＦｕｔ８標的配列を列挙する。全部で２０個の異なる配列を最初に考える。ｇＲＮＡのいずれも、ｇＲＮＡを不活性にし得るようにエクソン−イントロン境界上に及ばないことを確認する。このアプローチに基づいて、エクソン７の５７ｂｐ長が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介型ノックアウト標的の標的として選択される。これは、２つのｇＲＮＡを含み、２つの単一鎖切断を引き起こす各鎖上のものである。
【０２０９】
本方法の実施形態で使用されるＦｕｔ８遺伝子における標的配列は、ｇＲＮＡ１１２０〜１１７６として本開示の以下の図３Ｂに示す。切断の部位は矢印で示す。２つのｇＲＮＡ間の距離は５塩基である。ｇＲＮＡ１１２０〜１１７６認識配列は、図３Ｂにおいて下線を引く。対応する合成断片をｐＤ１４０１ベクターに組み入れ、ｐＤ１４０１ｇＲＮＡ５１４〜５５３と名付け、その特徴は本開示に続いて記載する。
【０２１０】
本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＦｕｔ８ゲノム配列、エクソン７の標的化においてＣａｓ９ｎ（ニッカーゼ突然変異体）を使用する。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの逆鎖において一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成する。上鎖及び下鎖のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列は下線を引く。対応する一本鎖切断部位は黒い矢印で示す。３つのヌクレオチドＰＡＭ配列は太字で示す。
【０２１１】
本実施形態において、設計の１つがエクソン７  ｇＲＮＡ１１２０〜１１７６を標的化するために使用される。この設計のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベクター構築物は、ｐＤ１４０１ｇＲＮＡ（５１４〜５５３）と呼ばれる。
【０２１２】
５’及び３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列は小文字のイタリック体で示し、この認識配列に相補的な２つの別々の部位はＦＵＴ８ゲノム配列で認識される。太字で表した配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が結合するｇＲＮＡ足場配列を示す。
【０２１３】
【化２】
2018502595.tif 000009
【０２１４】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡにおける５’ＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号３７
ＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＴＣＧＣ
【０２１５】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）：配列番号３８
ＡＵＵＣＣＡＡＧＡＵＧＡＧＵＧＵＵＣＧＣ
【０２１６】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡにおける３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号３９
ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧ
【０２１７】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）：配列番号４０
ＡＡＵＵＧＧＣＧＣＵＡＵＧＣＵＡＣＵＧＧ
【０２１８】
【化３】
2018502595.tif 000010
【０２１９】
構築マップを図３Ａに示し、重要な配列領域をマークする。
【０２２０】
１．４−ＧＭＤ  ＣＲＩＳＰＲ構築物の設計
本開示の図９Ｂは、ＧＭＤゲノム座位及びＣＲＩＳＰＲ認識配列を示す。
【０２２１】
４４２２１５ｂｐからなるＧＭＤ遺伝子座位の受入番号ＮＷ＿００３６１３６３５．１のＣＨＯ全細胞ゲノムのショットガン配列決定データは、Ｐｕｂｍｅｄから得る。ＧＭＤ遺伝子のコード領域又はｍＲＮＡのＰｕｂｍｅｄ受入番号は、ＮＭ＿００１２４６６９６．１である。
【０２２２】
ＧＭＤは、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）のＮＤＰ−糖修飾サブファミリーのメンバーである。このサブファミリーのメンバーとして、ＧＭＤは、コモングリシンリッチ領域が存在する分子のＮ末端部分にあるその補助因子ＮＡＤＰ（Ｈ）に結合する。触媒三残基はＴｙｒ−ＸＸＸ−Ｌｙｓ及びＳｅｒ／Ｔｈｒとして同定されており、それらは全て触媒作用に重要である。大腸菌から得られたＧＭＤの構造分析により、活性な分子は、二量体構成をとることが示唆される。一方、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の相同体は四量体であり、ＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位が四量体界面の生成に密接に関与する。真核生物のＧＭＤ酵素の機能形態が四量体構成からなる可能性が最も高い。
【０２２３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ結合領域は、部位認識の特異性が高く、同時にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が意図したＤＮＡ一本鎖切断を実行するように設計される。
【０２２４】
一実施形態では、Ｃａｓ９ｎ（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＤ１０Ａ突然変異体）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に使用する。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。２つのＣＲＩＳＰＲ認識部位（５’認識部位及び３’認識部位は５塩基対距離で間隔を取り、近接した２つの一本鎖切断を可能にする）。生じた切断は、ＤＮＡ切断修復のＮＨＥＪプロセスを可能にし、この領域に突然変異を導入する。
【０２２５】
ＣＲＩＳＰＲ構築物は、ｇＲＮＡ配列の効果的な発現のためのＵ６プロモーターエレメントと縦列にｇＲＮＡ足場を両側に配置する、２つの特有の２０塩基対ＣＲＩＳＰＲ認識配列を有する。特有の設計は、１つの単一のベクターが、ゲノムＤＮＡにおいて２つの別々のｇＲＮＡ足場及び２つの特有のＣＲＩＳＰＲ認識配列を発現することを可能にする。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ設計は特有に配置され、ＧＭＤ多量体機能タンパク質構造の四量体界面を担うＹＧＤＬＴＤＳＴＣＬＶＫモチーフ及びＤＬＡＥＹＴモチーフを標的化する。この領域にＣａｓ９ｎエンドヌクレアーゼによって導入される２つの一本鎖切断は、ＮＨＥＪ媒介型ＤＮＡ修復を可能にする。ＤＮＡ修復の間に組み入れられる突然変異は、フレームシフト突然変異、欠失、挿入、並びに中途終止コドンをもたらす。そのような突然変異は四量体化の重要なモチーフを変更するだけでなく、四量体構成中の単量体の相互作用の維持に関与するＳｅｒ８５残基の下流にも突然変異を生成する。設計は、近接した２つの一本鎖切断に対応し、それにより、これらの標的化ゲノム位置においてのみ起こるＮＨＥＪ修復メカニズムとして、標的認識のより高い特異性を与える。非特異的一本鎖切断は、生成された場合、正確でほとんど任意の突然変異を生成しない相同組換えによって通常修復される。
【０２２６】
本開示の図１Ｂは、ＣＨＯＫ１  ＧＭＤゲノム構造を示す。
【０２２７】
ＧＭＤ遺伝子の全アミノ酸配列を図２Ｂに示す。各ＣＤＳからのアミノ酸配列は大きな矢印で示す。２つのＣＲＩＳＰＲ標的領域は、ＧＭＤ遺伝子において標的とするエクソン３及びエクソン４に下線を引く。各エクソンは矢印マークで表す。細い下線は、一本鎖切断位置のＣＲＩＳＰＲ認識部位を示し、太い破線は二本鎖切断位置のＣＲＩＳＰＲ認識部位を示す。
【０２２８】
遺伝子ノックアウトの２つの異なる戦略が使用され、１つは一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成する突然変異体Ｃａｓ９（Ｃａｓ９ｎ）の使用であり、２つ目は二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する野生型Ｃａｓ９を使用する。
【０２２９】
ＧＭＤエクソン３座位
本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＧＭＤゲノム配列、エクソン３の標的化において、Ｃａｓ９ｎ（ニッカーゼ突然変異体）を使用する。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの逆鎖において一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成する。構築物は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）と名付け、本開示の図４Ａに表す。
【０２３０】
５’及び３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列は小文字のイタリック体で示し、この配列に相補的な２つの別々の部位はＧＭＤゲノム配列で認識される。太字で表した配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が結合するｇＲＮＡ足場配列を示す。
【０２３１】
【化３】
2018502595.tif 000011
【０２３２】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡにおける５’ＣＲＩＳＰＲ認識配列＝配列番号４１
ＡＣＴＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＧＧＴ
【０２３３】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）：配列番号４２
ＡＣＵＡＧＧＣＡＧＧＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵ
【０２３４】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡにおける３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号４３−
ＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡ
【０２３５】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）：配列番号４４
ＣＡＵＣＡＡＵＧＡＡＧＵＣＡＡＡＣＣＵＡ
【０２３６】
ＧＭＤエクソン４座位
ＧＭＤ遺伝子のエクソン４は、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって標的とされる。この野生型Ｃａｓ９は、標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。構築物は、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）と名付け、本開示の図４Ｂに表す。
【０２３７】
ＣＲＩＳＰＲ認識配列は小文字のイタリック体で示す。二本鎖ゲノムＤＮＡ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによってこの配列に基づいて認識される。太字で表した配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が結合するｇＲＮＡ足場配列を示す。
【０２３８】
【化４】
2018502595.tif 000012
【０２３９】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号４５−
ＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＣ
【０２４０】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）：配列番号４６
ＡＧＵＵＧＧＣＡＣＣＵＵＧＣＧＧＣＵＵＣ
【０２４１】
ＧＭＤ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ認識配列
以下の表は、一本鎖切断部位の候補となる、ＧＭＤコード配列全体にわたるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列を表す。任意のこれらの認識配列が、Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼ媒介型一本鎖切断及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの修復戦略に使用され、ＧＭＤ遺伝子をノックアウトする。
【表６−１】
2018502595.tif 000013
【表６−２】
2018502595.tif 000014
【０２４２】
この場合に、ＧＭＤ遺伝子配列における全部で１９個の標的配列を、ＣＲＩＳＰＲ認識部位のために設計する。全ての配列は５’から３’方向で表し；対応する２０塩基対の標的特異的ｃｒＲＮＡ配列は、上記表６に記載の各設計において示したＣＲＩＳＰＲ認識配列に由来する。
【０２４３】
これらの上記設計の１つ、ｇＲＮＡ３９４〜４３４は、ＣＨＯＫ１細胞のトランスフェクションのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を生成するために使用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＧＭＤ遺伝子の認識されたコード配列の相補鎖に２つの一本鎖ＤＮＡ切断を生成する。標的部位でのＤＮＡ修復の成功は非機能的ＧＭＤ遺伝子を生成し、それによりフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系が開発される。ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）の特徴は、本開示において続いて記載する。
【０２４４】
本実施形態は設計の１つを使用するが、上記のＣＲＩＳＰＲ認識部位のいずれか１つは、非機能的ＧＭＤ遺伝子を生成する。したがって、これらの候補部位のいずれかのみ、又は組合せは、フコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の開発に使用される。
【０２４５】
本方法の実施形態において使用するＧＭＤエクソン３の標的配列は、ｇＲＮＡ３９４〜４３４として表６に述べる。図４Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ認識配列を記載する。切断の部位は矢印で示す。２つのｇＲＮＡ間の距離は、６塩基である。ｇＲＮＡ３９４〜４３４配列は図４Ｃにおいて下線を引く。対応する合成断片をｐＤ１４０１ベクターに組み入れ、ｐＤ１４０１ｇＲＮＡ１６７〜２０７と名付け、その特徴は本開示に続いて記載する。本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＧＭＤゲノム配列、エクソン３の標的化においてＣａｓ９ｎ（ニッカーゼ突然変異体）を使用する。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの逆鎖において一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成する。
【０２４６】
以下の表は、二本鎖切断部位の候補となる、ＧＭＤコード配列全体にわたるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列を表す。任意のこれらの認識配列を、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ媒介型二本鎖切断及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの修復戦略に使用し、ＧＭＤ遺伝子をノックアウトする。
【表７−１】
2018502595.tif 000015
【表７−２】
2018502595.tif 000016
【０２４７】
２３個の特有のＣＲＩＳＰＲ認識配列（ｇＲＮＡ）をＧＭＤ遺伝子配列全体にわたって設計する。全ての配列は５’から３’方向で表し；対応する２０塩基対の標的特異的ｃｒＲＮＡ配列は、上記表７に記載の各設計において示したＣＲＩＳＰＲ認識配列に由来する。
【０２４８】
これらの上記設計の１つ、ｇＲＮＡ３０６は、ＣＨＯＫ１細胞のトランスフェクションのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）を生成するために使用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＧＭＤ遺伝子の認識されたコード配列に１つの二本鎖ＤＮＡ切断を生成する。標的部位でのＤＮＡ修復の成功は非機能的ＧＭＤ遺伝子を生成し、それによりフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系が開発される。
【０２４９】
本実施形態において設計の１つを使用するが、上記のＣＲＩＳＰＲ認識部位のいずれか１つは、非機能的ＧＭＤ遺伝子を生成する。したがって、これらの候補部位のいずれかのみ、又は組合せは、フコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の開発に使用される。
【０２５０】
本方法の実施形態において使用するＧＭＤエクソン４の標的配列は、ｇＲＮＡ３０６として上記表７に示す。図４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ認識配列を記載する。切断の部位は矢印で示す。対応する合成断片をｐＤ１３０１ベクターに組み入れ、ｐＤ１３０１ｇＲＮＡ４０４と名付け、その特徴は本開示に続いて記載する。本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＧＭＤゲノム配列、エクソン４の標的化において野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する。野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの両鎖において二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。
【０２５１】
１．５−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体合成
ＣＲＩＳＰＲ技術は、化膿性連鎖球菌において見出された微生物の適応免疫系由来のＣａｓ９として公知のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのクラスに基づく。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってゲノム上の特異的部位へと導かれる。２つの成分が細胞又は生物に導入及び／又は発現して、ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集を実行しなければならない：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；及び「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）。
ｇＲＮＡの５’端における２０個のヌクレオチド認識配列は、標準的なＲＮＡ−ＤＮＡ相補性塩基対合則を使用して、Ｃａｓ９を特異的標的ＤＮＡ部位に導く。これらの標的部位は、限界構造５−ＮＧＧにマッチするＰＡＭ配列のすぐ５’側にあるべきである。
【０２５２】
本開示は、以下に記載するように本開示の２つの異なる種類のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する。両方の場合において、ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードする単一のトランスフェクションベクターを使用し、それによりＣＨＯＫ１細胞のトランスフェクション効率を上げる。
【０２５３】
ａ）ＣＡｓ９野生型ヌクレアーゼを、エクソン４でのＧＭＤ遺伝子標的化に使用する。構築物は、標的部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を可能にする。
ｂ）Ｃａｓ９ｎとして公知の突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｄ１０Ａ）を、ＧＭＤエクソン３座位及びＦｕｔ８エクソン７座位の標的化に使用し、構築物は二本鎖ＤＮＡ切断の代わりに一本鎖切断を生成する。この設計は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物の特異性を改善することを目的とする。
【０２５４】
一本鎖切断の場合、２つのＤＮＡ標的部位は近接した形で標的とされ、一本鎖切断又はニックは逆ＤＮＡ鎖で生じる。それにより、ＤＮＡ修復機構（ＮＨＥＪ）を導入し、ＤＮＡ損傷を修復する。ＤＮＡ修復を開始する特定の間隔で２つのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｎ複合体を導入することは、標的部位への特異性を改善する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｎ複合体が１つだけ無関係な部位に非特異的に結合する場合、突然変異の頻度が非常に低い相同組換えに基づく修復によって通常修復されるニックを引き起こす。したがって、このアプローチは、Ｆｕｔ８及びＧＭＤ遺伝子を標的とする特異性を上げる。
【０２５５】
両遺伝子の特有の領域は、酵素の触媒機能を廃止するように酵素の構造情報に基づき、又は高次構造を破壊することにより標的とされる。
【０２５６】
ベクターの重要な特徴は、
ａ）Ｃａｓ９−化膿性連鎖球菌のＣＲＩＳＰＲシステムの成分として最初に発見され、哺乳動物細胞での利用に適用されてきたヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９は、高い効率で哺乳動物細胞の内因性ゲノム座位に正確な二本鎖切断を効果的に導入することができる。
Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤ１０Ａ突然変異体（Ｃａｓ９ｎ）は一本鎖にニックを入れ、標的ゲノム座位の逆鎖に相補的な一対のオフセットガイドＲＮＡと組み合わせる。これは、野生型Ｃａｓ９に見られる非特異的な活性を減らすのに役立つ。
ｂ）キメラｇＲＮＡ足場−キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）足場は、２０個のヌクレオチドの標的特異的な相補性領域、４２個のヌクレオチドのＣａｓ９結合ＲＮＡ構造、及びゲノム改変のための標的部位へＣａｓ９ヌクレアーゼを導く、化膿性連鎖球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の４０個のヌクレオチドの転写ターミネーターからなる。この場合、２つのｇＲＮＡ足場があり、それぞれ各ｇＲＮＡ用である。
ｃ）カナマイシン−ｒ−それによりミスコードを引き起こすリボソーム転位を阻害する有効な抗細菌剤である。カナマイシン耐性をコードする遺伝子はネオマイシンリン酸転移酵素ＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ／Ｎｅｏ）である。カナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドでトランスフォームした大腸菌は、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地で増殖することができる。
ｄ）Ｐ＿ＣＭＶ−ＣＭＶプロモーターは、構成的な哺乳動物プロモーターであり、様々な細胞システムで強い発現を媒介する。
ｅ）Ｐ＿ｈＵ６．１−ＲＮＡ発現のためのヒトＡタイプ３コアプロモーター
【０２５７】
１．６−ＣＲＩＳＰＲ構築物を得る全プロセスは以下のステップからなる：
２２．ＣＲＩＳＰＲ標的の設計。
２３．２つの別々のベクター骨格を有するベクター構築物、すなわちｇＲＮＡインサートを有するｐＤ１４０１及びｐＤ１３０１ベクター。
２４．ＣＲＩＳＰＲ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）、及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）による、大腸菌コンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ）のトランスフォーメーション、及びカナマイシンを補足したＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）−アガーへのプレーティング。
２５．カナマイシンを含むＬＢブロス中へのトランスフォームした細胞（ＣＲＩＳＰＲ構築物）の接種。
２６．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞からのプラスミドＤＮＡ  ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）、及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）の単離。
２７．ＣＨＯＫ１細胞のトランスフェクション；ＬＣＡアッセイによるスクリーニング及び選択。
２８．ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用する選択したクローンのゲノムＤＮＡ単離。
２９．分光光度法による定量。
３０．ＰＣＲ条件の最適化。
３１．ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ試料のクロスチェック。
３２．アガロースゲルでの電気泳動。
３３．Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅及びＴａｑポリメラーゼを使用するテーリング。
３４．ＱＩＡＧＥＮキットを使用するＰＣＲ産物のゲル溶出。
３５．ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターを使用するＴＡクローニング。
３６．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞のライゲートした試料ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ）によるトランスフォーメーション。
３７．アンピシリンブロスを含むＬＢへのトランスフォームした細胞（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の接種。
３８．ＱＩＡＧＥＮプラスミドＤＮＡ単離キットを使用するＤＨ５アルファ及びＤＨ１０Ｂ細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の単離。
３９．制限酵素消化によるインサートの存在のクロスチェック。
４０．配列決定プライマー；及び
４１．配列決定によるＩＮＤＥＬの確認。
【０２５８】
（例２）
ＴＡＬＥＮ構築物による細胞のトランスフェクション
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ構築物によるＣＨＯＫ１細胞のトランスフェクションの手順を含む。ＣＲＩＳＰＲ技術、及びフローサイトメトリーに基づく機能アッセイによる陽性クローンの選択を使用するＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯＫ１細胞系を開発するための単一細胞の安定発現株の選択及び確認も提供する。
【０２５９】
トランスフェクションプロトコール
トランスフェクションは、接着型及び浮遊型両方のＣＨＯＫ１細胞を使用して最適化する。リポソーム及び修飾リポソーム媒介型トランスフェクション試薬は、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＰｌｕｓＴＭ試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｘ２、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ２０２０、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ２９３、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ＣＨＯトランスフェクションキットについて試験する。０．５μｇ〜５μｇの範囲のＤＮＡ濃度を、様々なインキュベーション時間、例えば４時間、２４時間、及び４８時間について試験する。複数のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比（μｇ：μｌ）も試験する。最適なトランスフェクション効率は、１：３のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比、２４時間のインキュベーション、及びＰｌｕｓＴＭ試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸを使用して達成される。最適化実験は、ＧＦＰ発現プラスミドＤＮＡで実施した。
【０２６０】
図２０は、本開示に記載したプロトコールを使用してＣＨＯＫ１細胞系のトランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は緑色蛍光タンパク質発現プラスミド構築物を使用して決定する。トランスフェクション後に観察された緑色細胞の数を全生存細胞数と比較し、確立されたプロトコールのトランスフェクション効率を決定する。パネルＡは明視野像を表し、パネルＢは赤色チャネル蛍光の同じ顕微鏡視野を表す。
トランスフェクション効率は以下の式によって計算する：
トランスフェクション効率＝（ＧＦＰ発現細胞の数／全細胞数）＊１００
最適化した一過性のトランスフェクション効率は、ＣＨＯＫ１細胞において４０〜５０％である。
【０２６１】
トランスフェクション：
ＣＨＯＫ１細胞は、９０％より高い生存率、６ウェル組織培養プレート中０．２５×１０６個の細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間接着させる。ＣＲＩＳＰＲ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）＋ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）の組合せを、ＰｌｕｓＴＭ試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸを使用するトランスフェクションに使用する。２．５μｇの構築物を１：３のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比で使用する。細胞を、トランスフェクション後２０〜２４時間インキュベートする。トランスフェクションの前に、ＤＮＡの量及び質を紫外分光光度法によって概算する。Ａ２６０／２８０値ＤＮＡは、質及びタンパク質の夾雑を表す。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の比を使用して、ＤＮＡの純度を評価する。Ａ２６０／２８０＞１．８は通常「純粋」又は質の良いＤＮＡとして許容される。３〜４μｌのＤＮＡ試料をマイクロキュベット上に置き、ＤＮＡ濃度をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｄ３０を使用して、好適なブランクに対して概算する。
【表８】
2018502595.tif 000017
【０２６２】
トランスフェクションの１時間前、無血清培地で細胞の培地交換をする。ＣＲＩＳＰＲ構築物及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ溶液を希釈し、優しく混合し、２０〜２５℃で５〜１０分間インキュベートする。ＤＮＡ及びトランスフェクション試薬の希釈物（３ｍｌ）を混合し、複合体形成のため、室温で２０〜３０分間インキュベートする。培地をウェルから吸引する。１．５ｍｌのＤＮＡ及びトランスフェクション試薬複合体をプレートした細胞に滴下添加する。
【０２６３】
細胞は５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベートする。完全培地を１．５ｍｌ／ウェルで添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２０〜２４時間インキュベートする。トランスフェクションの２０〜２４時間後、細胞をトリプシン処理し、単一細胞希釈を調製する。
【０２６４】
単一細胞希釈は、０．５個の細胞／１００μｌの濃度まで細胞の段階希釈によって得る。細胞数は血球計算盤を使用して数えた。細胞は、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で数日間増殖させる。プレートスキャンを行い、倒立位相差顕微鏡下で単一細胞コロニーを同定する。はっきりとした小さい単一コロニーへと増殖する細胞は、さらなる増幅のためにマークする。２〜３週間後、単一細胞クローンをトリプシン処理により、９６ウェルプレートの１ウェルから６ウェルプレートの１ウェルへと増幅する。細胞は、ＣＯ２インキュベーター中５％ＣＯ２で、３７℃で２〜３日間増殖させる。細胞は、さらなるスクリーニングのため、２４ウェルプレートの１ウェルから２ウェルにさらに増幅する（レプリカ平板法）。
【０２６５】
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ（レンズマメアグルチン−フルオレセインイソチオシアネート）結合アッセイ
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）はＬＣＡにコンジュゲートする蛍光色素である。したがって、対照のＣＨＯＫ１細胞の細胞膜上のフコシル化タンパク質の存在は、フルオレセインコンジュゲートＬＣＡによって認識される。これらの細胞は、特定のフローサイトメーターチャネルでより明るい蛍光を発する。観察される蛍光は、蛍光単位として表す。フコース経路が破壊された細胞、ノックアウト系は、フコシル化細胞タンパク質を産生することができず、したがって細胞膜タンパク質はフコシル化されていない。これらの細胞をフルオレセイン−ＬＣＡコンジュゲートで試験すると、バックグラウンドと同等の蛍光をもたらす。したがって、フコースノックアウト細胞は、対照のＣＨＯＫ１細胞系と比較してより低いレベル（１００ＲＦＵより小さい）の蛍光を発する。
【０２６６】
細胞をトリプシン処理し、マイクロチューブに移し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍ（毎分回転数）でスピンする。培地を除去し、新鮮な培地をチューブに添加する。トランスフェクトした、及びトランスフェクトしていないＣＨＯＫ１細胞両方を同時に処理する。細胞は、「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ８  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴ」ベンチトップフローサイトメーター使用してＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーに基づく分析を試験する。
【０２６７】
ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）のトランスフェクションからの５４個のクローンを、フコースノックアウトプロファイルに関してスクリーニングする。同様に、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）若しくはｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）又はｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）＋ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）の組合せのトランスフェクションからの２００個のクローンを、フコースノックアウトプロファイルに関してスクリーニングする。
【０２６８】
フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）ストック５ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中で再懸濁する。ＣＨＯＫ１対照細胞は、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液のみ（未染色対照）及び２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液（染色対照）中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、最終アッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。
【０２６９】
次いで、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに分取する。次いで、データ取得及び分析のためにプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴベンチトップフローサイトメーターにロードする。データ分析は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを使用して行う。いくつかの実験では、データ取得及び分析のためにＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用する。
【０２７０】
フルオレセイン−ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）陰性染色も実施する。フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）ストック５ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。フルオレセインストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）ストック１ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞懸濁液を二通り取り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、１つのチューブ内でペレットを２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液中で再懸濁し、試料は２μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液中に二通り分けた。ＣＨＯＫ１対照細胞は、アッセイ緩衝液のみ（未染色対照）、２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液（染色対照）、及び２μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液中で再懸濁する。
【０２７１】
全ての試料を希釈し、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。次いで、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに分取する。データ取得及び分析のためにプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴベンチトップフローサイトメーターにロードする。データ分析は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを使用して行う。いくつかの実験では、データ取得及び分析のためにＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用する。
【０２７２】
ＣＨＯＫ１細胞は、Ｆｕｔ８座位を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）構築物をトランスフェクトし、結果は以下に示す。
【表９−１】
2018502595.tif 000018
【表９−２】
2018502595.tif 000019
【０２７３】
結果−
上記の表に示すグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルは、本開示の図７Ａ及び図８Ａにも示す。図は、フローサイトメトリーに基づくＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイにおける、ＣＨＯＫ１細胞系、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃３７に関して観察されたグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルを示す。このフローサイトメトリーアッセイは、細胞表面上に存在するフコシル化タンパク質を検出する。したがって、多くのフコシル化タンパク質が対照ＣＨＯＫ１細胞系に存在するので、ＣＨＯＫ１対照細胞は高い蛍光を発する。トランスフェクトした細胞系においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体がＦＵＴ８遺伝子を破壊することができる場合、ＬＣＡ  ＦＩＴＣ蛍光は、これらの細胞系の表面上にフコシル化タンパク質がないので最小化される。図は、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃３４、及びＣＲ１ＫＯＴ１＃３７をこのアッセイで試験する場合の著しい蛍光の減少を明らかにし、これらの細胞系がＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系であることを示す。
【０２７４】
ＣＨＯＫ１細胞は、ＧＭＤ座位を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）＋ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）構築物をトランスフェクトし、結果は以下の表に示す。
【表１０】
2018502595.tif 000020
【０２７５】
上記の表に示すグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルは、本開示の図７Ｂ及び図８Ｂにも示す。図は、フローサイトメトリーに基づくＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイにおける、ＣＨＯＫ１、Ｃ１ＧＭＤ１．１２、Ｃ１ＧＭＤ１．２７、Ｃ１ＧＭＤ２．３０、Ｃ１ＧＭＤ２．３４、Ｃ１ＧＭＤ３．４、Ｃ１ＧＭＤ３．３６、Ｃ１ＧＭＤ３．４３、Ｃ１ＧＭＤ３．４９、Ｃ１ＧＭＤ３．５１に関して観察されたグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルを示す。このフローサイトメトリーアッセイは、細胞表面上に存在するフコシル化タンパク質を検出する。したがって、多くのフコシル化タンパク質が対照ＣＨＯＫ１細胞系に存在するので、ＣＨＯＫ１対照細胞は高い蛍光を発する。トランスフェクトした細胞系においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体がＧＭＤ遺伝子を破壊することができる場合、ＬＣＡ  ＦＩＴＣ蛍光は、これらの細胞系の表面上にフコシル化タンパク質がないので最小化される。図は、Ｃ１ＧＭＤ１．１２、Ｃ１ＧＭＤ１．２７、Ｃ１ＧＭＤ２．３０、Ｃ１ＧＭＤ３．４、Ｃ１ＧＭＤ３．３６、Ｃ１ＧＭＤ３．４３、Ｃ１ＧＭＤ３．４９、Ｃ１ＧＭＤ３．５１をこのアッセイで試験する場合の著しい蛍光の減少を明らかにし、これらの細胞系は候補ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系であることを示す。
【０２７６】
トランスフェクションの別のセットも、ＬＣＡ  ＦＩＴＣ蛍光アッセイで試験する。フローサイトメトリーデータは以下の表に示す。
【表１１】
2018502595.tif 000021
【０２７７】
上記の表に示すグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルは、本開示の図７Ｃ及び図８Ｃにも示す。図は、フローサイトメトリーに基づくＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイにおける、ＣＨＯＫ１、Ｃ１ＧＭＤ１．３７、Ｃ１ＧＭＤ１．４、Ｃ１ＧＭＤ１．４１、Ｃ１ＧＭＤ１．４３、及びＣ１ＧＭＤ１．４４に関して観察されたグラフィカルな結果及び蛍光プロファイルを示す。このフローサイトメトリーアッセイは、細胞表面上に存在するフコシル化タンパク質を検出する。したがって、多くのフコシル化タンパク質が対照ＣＨＯＫ１細胞系に存在するので、ＣＨＯＫ１対照細胞は高い蛍光を発する。トランスフェクトした細胞系においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体がＧＭＤ遺伝子を破壊することができる場合、ＬＣＡ  ＦＩＴＣ蛍光は、これらの細胞系の表面上にフコシル化タンパク質がないので最小化される。図は、Ｃ１ＧＭＤ１．３７、Ｃ１ＧＭＤ１．４、Ｃ１ＧＭＤ１．４１、Ｃ１ＧＭＤ１．４３、Ｃ１ＧＭＤ１．４４をこのアッセイで試験する場合の著しい蛍光の減少を明らかにし、これらの細胞系は候補ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系であることを示す。
【０２７８】
ＬＣＡ（レンズマメアグルチニン）選択アッセイ−
複数の単一細胞クローン細胞系集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクション後、レプリカプレートに分ける。次いで、これらの細胞系は、培養培地中の２００μｇ  ＬＣＡ試薬により試験する。細胞は毎日観察し、細胞の健康及び形態を確認し、適切な時点で写真を撮る。図５は、ＬＣＡ選択開始点後の培養の１日後に撮った写真を示し、図６Ａは培養の４日後に撮った写真を示す。本明細書に示した細胞系は、ＬＣＡ試薬の存在下で培養の４日後、大きなコロニーの細胞へと増加及び増殖した１日目の抵抗細胞によって示される、ＬＣＡに対する抵抗性を示す。細胞の形態は、顕微鏡によって観察し、観察は１日目及び４日目に記録する。
【０２７９】
細胞は、倒立位相差顕微鏡下で定期的に観察し、コロニーの形態をモニターする。２００μｇ／ｍｌ  ＬＣＡによるＬＣＡ選択アッセイの異なる時点で撮った写真は、培養の４日目にＣＨＯＫ１対照細胞が完全に死滅することをはっきりと示すが、選択したクローンは、培養の４日後でさえも連続的な細胞の増殖及び健康な細胞の形態を示す。
【０２８０】
以下のクローン−ＣＲ１ＫＯＴ１＃４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６１及びＣＲ１ＫＯＴ１＃６７は、２００μｇ／ｍｌ  ＬＣＡによる処置後でさえもコロニーの形態を維持することが、これらの図から観察される。したがって、これらのクローンは候補ＦＵＴ８ノックアウト表現型であると考えられる。
【０２８１】
ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）をトランスフェクトしたクローンのＬＣＡ選択の間に、本開示の図６Ｂにおいて、１日目、４日目、及び６日目のクローンの生存率を比較する。以下のクローン、Ｃ１ＧＭＤ１．１２、Ｃ１ＧＭＤ１．２７、Ｃ１ＧＭＤ１．４０、Ｃ１ＧＭＤ１．４１、Ｃ１ＧＭＤ１．４３及びＣ１ＧＭＤ１．４４は、２００μｇ／ｍｌ  ＬＣＡによる処置後でさえもコロニーの形態を維持することが、これらの図から観察される。したがって、これらのクローンは候補ＦＵＴ８ノックアウト表現型であると考えられる。
本明細書に示した細胞系は１日目までにＬＣＡに対する抵抗性を示し、ＬＣＡ試薬の存在下で培養の４日後及び６日後、大きなコロニーの細胞へと増加及び増殖する。細胞の形態は、顕微鏡によって観察し、観察は１日目、４日目、及び６日目に記録する。細胞は、倒立位相差顕微鏡下で定期的に観察し、コロニーの形態をモニターする。２００μｇ／ｍｌ  ＬＣＡによるＬＣＡ選択アッセイの異なる時点で撮った写真は、培養の４日目にＣＨＯＫ１対照細胞が完全に死滅することをはっきりと示すが、選択したクローンは、培養の４日後でさえも連続的な細胞の増殖及び健康な細胞の形態を示す。
【０２８２】
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイ：
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイの２つ目のセットに関して、以下のクローン、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６７がフコースノックアウトフローサイトメトリープロファイルを示した（図１０）。フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）ストック５ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中で再懸濁する。
【０２８３】
ＣＨＯＫ１対照細胞は、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液のみ（未染色対照）及び２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液（染色対照）中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、最終アッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。次いで、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに分取する。次いで、データ取得及び分析のためにプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴベンチトップフローサイトメーターにロードする。データ分析は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを使用して行う。
【表１２−１】
2018502595.tif 000022
【表１２−２】
2018502595.tif 000023
【０２８４】
上記の表に示した結果は、本開示の図１０のグラフィカルな表示及び図１１の蛍光プロファイルにも示す。
【０２８５】
図１０は、フローサイトメトリーに基づくＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイにおける、ＣＨＯＫ１細胞系、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６７に関して観察されたグラフィカルな結果を示す。図１１は、細胞系、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６７で観察される代表的な蛍光プロファイルを示す。全てのクローンは、この実験で分析する前にさらに数日間継代する。このフローサイトメトリーアッセイは、細胞表面上に存在するフコシル化タンパク質を検出する。したがって、多くのフコシル化タンパク質が対照ＣＨＯＫ１細胞系に存在するので、ＣＨＯＫ１対照細胞は高い蛍光を発する。トランスフェクトした細胞系においてＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓがＦＵＴ８遺伝子を破壊することができる場合、ＬＣＡ  ＦＩＴＣ蛍光は、これらの細胞系の表面上にフコシル化タンパク質がないので最小化される。図は、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃６７をこのアッセイで試験する場合の著しい蛍光の減少を明らかにし、これらの細胞系はＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系であることを示す。
【０２８６】
結論  −  ｆｕｔ８ノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の１７個の潜在的な候補が同定される。これらの１７個のクローンは以下の通りである：
ＣＲ１ＫＯＴ１＃００６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７。
【０２８７】
ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の１３個の潜在的な候補を同定する。クローンは以下の通りである：
Ｃ１ＧＭＤ１．１２、Ｃ１ＧＭＤ１．２７、Ｃ１ＧＭＤ１．３７、Ｃ１ＧＭＤ１．４、Ｃ１ＧＭＤ１．４１、Ｃ１ＧＭＤ１．４３、Ｃ１ＧＭＤ１．４４、Ｃ１ＧＭＤ２．３０、Ｃ１ＧＭＤ３．４、Ｃ１ＧＭＤ３．３６、Ｃ１ＧＭＤ３．４３、Ｃ１ＧＭＤ３．４９、Ｃ１ＧＭＤ３．５１
【０２８８】
（例３）
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイ
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイを使用する独立した反復実験でクローンのフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系を試験する。
【０２８９】
以下のクローン細胞系はＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイの再現性を試験する。
ＣＲ１ＫＯＴ１＃００６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７。
【０２９０】
フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）ストック５ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中で再懸濁する。ＣＨＯＫ１対照細胞は、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液のみ（未染色対照）及び２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液（染色対照）中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、最終アッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。次いで、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに分取する。次いで、データ取得及び分析のためにプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴベンチトップフローサイトメーターにロードする。データ分析は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを使用して行う。
【０２９１】
結果：
以下の表は、全ての選択したクローンに関してＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイのデータ再現性を記載する。
【表１３】
2018502595.tif 000024
【０２９２】
ＬＣＡ  ＦＩＴＣ結合アッセイの絵での描写を図１２に示す。データ分析は、クローンのフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の高度に再現できるＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合パターンを示唆する。これらのフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系は増殖特性をさらに試験し、トランスフェクトしていない親のＣＨＯＫ１細胞系と比較する。
【０２９３】
（例４）
ストレプトアビジン−ＦＩＴＣアッセイ
クローンのフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系をストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートにより試験し、ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合の特異的な相互作用を確かめる。
【０２９４】
クローンのストレプトアビジンコンジュゲートＦＩＴＣ（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）染色を実行し、ＦＩＴＣ色素の非特異的な結合がないことを確かめる。細胞膜タンパク質はストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートに結合しないが、フコシル化膜タンパク質はＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートに特異的に結合する。対照のＣＨＯＫ１細胞を、別々の反応でＬＣＡ−ＦＩＴＣ及びＳｔｒｅｐ−ＦＩＴＣの両方で染色し、この特異性を確認する。全てのクローンを、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ及びＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートにより同時に染色し、非特異的な結合を決定する。
本開示の図１４は、ＬＣＡフローサイトメトリーアッセイ、並びにそれぞれＬＣＡ−ＦＩＴＣ及びＳｔｒｅｐ−ＦＩＴＣアッセイによるクローンの比較を示す。以下のクローンに関して、フコースノックアウト表現型を観察した：ＣＲ１ＫＯＴ１＃００６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７。全てのクローンにおいて、対照と比較して蛍光の著しい減少が観察され、それにより、クローンに関して細胞表面上のフコシル化タンパク質の不在を証明する。このデータは、本開示の方法において複合体を使用して実行したＦＵＴ８遺伝子破壊により、これらの細胞系がフコシル化タンパク質を欠くことの、機能的な証明を提供する。
【０２９５】
フルオレセインストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ）ストック１ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して５分間１５００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを２μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中で再懸濁する。ＣＨＯＫ１対照細胞は、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液のみ（未染色対照）及び２μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液（染色対照）中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、最終アッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。次いで、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに分取する。次いで、データ取得及び分析のためにプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴベンチトップフローサイトメーターにロードする。データ分析は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを使用して行う。
【０２９６】
ストレプトアビジン−ＦＩＴＣによる比較を実行し、ＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートの特異的な相互作用を確かめる。データは、ＣＨＯＫ１対照細胞系及び任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをトランスフェクトした細胞系によって試験する場合、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートによって、バックグラウンド蛍光のみが観察されることを示唆する。
【０２９７】
図１４は、ＣＨＯＫ１フコースノックアウト細胞系をスクリーニングするために開発されたＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイの特異性を示す。フローサイトメトリー実験は、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートによって実行する。ストレプトアビジン−ＦＩＴＣは、ＣＨＯＫ１対照細胞系上の細胞表面タンパク質を認識せず、ＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートの特異的な相互作用を示している。さらに、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートは、ＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートによって同定された陽性及び陰性細胞系間の同様のレベルのバックグラウンド蛍光を明らかにする。図１４は、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートと比較する場合、本研究において使用するＬＣＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートの非特異的な相互作用を示さない。
【０２９８】
フコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の増殖曲線決定：
選択したクローンの増殖曲線決定を実施し、増殖プロファイルが、ノックアウト細胞系開発のプロセス中に野生型ＣＨＯＫ１細胞と比較して著しく変更されないことを確かめる。０．１×１０６個のＣＨＯＫ１細胞を６ウェル組織培養プレート中に播種する。各クローンに関して５時点で播種を行う。各時点で、三通りの播種を行う（例えば、５時点で１５ウェル）。各時点で、細胞数を三通り数える。生存細胞数は血球計算盤又はＶｉ−ｃｅｌｌ  ＸＲ生死細胞オートアナライザーのいずれかを使用して行う。それぞれの増殖曲線はエラーバーとしてＳＥＭで生成する。表１４は、ＦＵＴ８ノックアウト細胞系の１つからの代表的な増殖データを記載する。
【表１４】
2018502595.tif 000025
【０２９９】
結果：各細胞系の生存細胞数を試験し、増殖曲線決定に使用する。以下のクローンのフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系を増殖曲線開発に使用する：ＣＲ１ＫＯＴ１＃００６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７。
【０３００】
データを分析し、増殖曲線にプロットする。それぞれの細胞系の増殖曲線は本開示の図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃに示す。
【０３０１】
ほとんどのクローン細胞系は、ＣＨＯＫ１親細胞系に匹敵する増殖能を有することが図から観察される。これらのクローン細胞系は治療タンパク質及び／又はモノクローナル抗体の過剰発現に使用する。生存細胞数は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンターを使用して最適な増殖条件下で５日間毎日数える。少しのクローンフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞系、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５は、その他の細胞系と比較してわずかに低い増殖能を示した。
【０３０２】
（例５）
ゲノム配列決定アッセイ
機能アッセイ、主にＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって選択した、ＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたクローンをゲノム配列分析に使用する。チャイニーズハムスターのＦＵＴ８ゲノム座位は文献（ＮＷ＿００３６１３８６０）に十分に報告されており、各細胞系クローンにおいて遺伝子改変の型を理解するために野生型配列として使用される。同様に、チャイニーズハムスターのＧＭＤゲノム座位は、配列データベース、ＮＷ＿００３６１３６３５．１、ＮＰ＿００１２３３６２５．１、ＮＭ＿００１２４６６９６．１から得られ、各細胞系において遺伝子改変の型を理解するために野生型配列として使用される。本実施例の目的は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓをトランスフェクトしたＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系及びＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系から得られるゲノムＤＮＡ配列決定結果を分析することである。本明細書で報告する全ての細胞系は、クローン細胞系であり、ＬＣＡ媒体選択アッセイ及びＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイから選択される。
【０３０３】
簡潔に言えば、選択したクローン細胞系は、ゲノムＤＮＡ単離に適した増殖条件下で増殖し、精製したゲノムＤＮＡは、ＦＵＴ８及びＧＭＤ標的座位の両側のプライマーを使用するＰＣＲ増幅に使用し、次いでＰＣＲ増幅産物を精製し、大腸菌コンピテントセルを使用して好適なベクターにクローン化し、生じるアンピシリン耐性大腸菌コロニーを選択及び培養し、各細菌クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、およそ５〜１０個の個々の細菌コロニーを自動配列決定によってクローン細胞系ごとに試験し、ＦＵＴ８標的ゲノム座位において改変の型を理解する。
【０３０４】
以下の試薬及び溶液を使用し、選択したクローンのゲノム配列決定を実行する。
【０３０５】
全ゲノム配列決定プロトコールは以下の４つのプロセスに分けられる。
Ａ．選択したクローンからのゲノムＤＮＡ単離
Ｂ．各細胞系の特定のゲノム座位を増幅するＰＣＲ戦略
Ｃ．配列決定ベクターへのＰＣＲ産物のクローニング
Ｄ．配列データ分析及びＩＮＤＥＬの同定
【０３０６】
選択したクローンからのゲノムＤＮＡ単離
クローンＣＨＯＫ１細胞系は、Ｔ１７５フラスコで１０％ウシ胎仔血清、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地中、制御した条件のインキュベーター内で５％ＣＯ２及び７５％相対湿度の存在下、３７℃で増殖する。細胞の増殖は、毎日観察し、生存率をモニターする。細胞は、８０％の培養密度及び９５％より高い生存率で、トリプシン処理により回収する。単離の日、培養培地を除去し、接着細胞はまず１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、続いてトリプシン処理のため４ｍｌの０．０５％トリプシンＥＤＴＡ溶液を添加する。細胞を３７℃で２〜３分間インキュベートし、回収する。次いで細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳと混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。使用した培地を除去し、細胞ペレットを１０ｍｌ  ＤＰＢＳ中に再懸濁する。細胞は、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離を使用して再び洗浄する。ＤＰＢＳを吸引により完全に除去する。最後の細胞ペレットをゲノムＤＮＡ単離に使用する。
【０３０７】
ゲノムＤＮＡは、ＣＨＯＫ１対照細胞及びＬＣＡ耐性を示し、ＬＣＡフローサイトメトリーアッセイによって選択されるＣＨＯＫ１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをトランスフェクトしたクローン細胞系から単離する。製造業者のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを単離するために市販のＱＩＡＧＥＮ  ｇＤＮＡ抽出キットを使用する。
【０３０８】
ＰＣＲ戦略設計
チャイニーズハムスターのゲノムＤＮＡ配列を、一般に利用可能なデータベース配列ＮＷ＿００３６１３８６０から分析する。ＦＵＴ８エクソン７ＤＮＡ配列及び部分的なイントロン配列を、ＦＵＴ８標的座位を増幅するＰＣＲ戦略を設計するために使用する。
【０３０９】
ＧＭＤエクソン及びイントロン配列を、ＮＷ＿００３６１３６３５．１及びＮＭ＿００１２４６６９６．１から入手し、エクソン３及びエクソン４に関して配列分析を実行する。
【０３１０】
プライマーは、プライマー長、ＰＣＲ産物長、ＧＣ含量、融解温度、並びに候補ホモ二重鎖及びヘテロ二重鎖形成に基づいて設計する。以下に示すように、プライマーは、ＦＵＴ８標的座位の両側に設計する。増幅したＰＣＲ産物は、ＣＲＩＳＰＲ媒介型ＳＳＢ及び続くＤＮＡ修復による突然変異分析を意図する。以下のヌクレオチド配列は太字のプライマー配列による対象の領域を表す。
【０３１１】
【化６】
2018502595.tif 000026
【０３１２】
イントロンは、塩基２１〜塩基１０６及び塩基３４５〜塩基３７１に小文字で表す。エクソン７は塩基１０７〜塩基３４４に大文字で表す。左及び右のプライマー結合部位は下線を引く。
【０３１３】
ＰＣＲプライマー設計に使用するＧＭＤエクソン３及びエクソン４並びに関連イントロン配列：
【０３１４】
以下の配列を使用する。
【０３１５】
ＧＭＤエクソン３及び周辺イントロン
ｇａｔｃｃｔｔｃａｇｔｇｔｔｃｃａａｇｔａｃｔｇｇｇｔｔｔｇｃａｇｇｇｇｔｇｇｇｃａｇｔｃａｃａｃｃｔｇｇｇａａｃａｃｃａｇｔｔｔｇａｃｃｔｔｃａｔｔｔｔｃａｔａｔｇｔｇａａｔａａｔａｃａｔａｔｔｔｃａｇｔｔｔｔｇａｔａｔｔｇａａａｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｇｔｔａｔｃｔｃａｔａｔｃｔｔｇａｔｇａｔｃｔｔｔｔｔａｔａａａｔｃｔｔａａａｇＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧｇｔａａｇｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｔｇｃｃａｔｇｇｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｔｔｇｔａｇｔｇｔｔｃｔｃｔａｔｔｃａｃｔｃａｃａｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｃｔｃａａｔａｃａａｔａｇｃａａｃｃａｃｔａｇｔｔｃｔｔａｔｃａａｇｔｔｔａｇｔｃｔｔｃａｇｔａｔｔａｇｔｔｔｇｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｔａａｔａａａａａｔａｃｔｃａｔａａａｔｔｔｔｔａａｇｇｔｇａｇｇｔｔｔｃｔｇｔｔａｃｔｃａａｃａｇ
【０３１６】
イントロンは、塩基２３〜塩基１６６及び塩基２７７〜塩基４４７に小文字で表す。エクソン３は塩基１６７〜塩基２７６に大文字で表す。左及び右のプライマー結合部位は下線を引く。
【０３１７】
ＧＭＤエクソン４及び周辺イントロン
ｇａｃｇｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃｔａｔｔｃｔａｔａｃｔｇｇａａｇｔａｇａｔｇａｔａｔｔｃｔｃａｔｔｇｇａａａｔｔｃｔｇｔｔａｇｇａａｇｔａａｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔｃｔｔｃｔｔａｃｃｔｇｃａｔａｇａａｔｃｃｃａｇｇａｔａｔａａａａｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｔｃｇｃｃｃｔｔｇｃｃａｔｔｇｔｃｔｃｔｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇｃａｔｃｔｃａｔａｔｃｔｇｃｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｃａｇＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＧｇｔａａｇａａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｇｔａｔｇｔｇａｇｇｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｇｔｇｔｇｇｇｇａｔｇｔｔｔｃｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａｃ
【０３１８】
イントロンは、塩基２１〜塩基１８７及び塩基３８１〜塩基４３２に小文字で表す。エクソン４は塩基１８８〜塩基３８０に大文字で表す。左及び右のプライマー結合部位は下線を引く。
【０３１９】
ＰＣＲによってＩＮＤＥＬを同定するためのプライマー設計
ゲノムＰＣＲは、表１５に記載の以下のプライマーを使用するＱＩＡＧＥＮ  ｇＤＮＡ抽出キットを使用して実施する。
【表１５】
2018502595.tif 000027
【０３２０】
以下の節は、対照細胞系及びＬＣＡ選択クローン細胞系由来のＣＨＯＫ１ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物の生成、大腸菌コンピテントセルへのＰＣＲ産物のクローニング、及びクローン化ＰＣＲ産物の配列決定のための実験の詳細を提供する。
【０３２１】
ＰＣＲ条件の最適化−
実験を設計し、ＰＣＲ条件を標準化する。試験したパラメーターは、ゲノムＤＮＡ濃度（１００ｎｇ〜１０００ｎｇ）、プライマー濃度（２ｎｍｏｌｅ〜２０ｎｍｏｌｅ）、ＰＣＲアニーリング温度（５５．８℃〜６２．９℃）、及び時間（２０秒〜５０秒）、ＰＣＲ産物の伸長時間（３０秒〜６０秒）を含み、ＰＣＲサイクル数を３０サイクルに設定する。到達した最適化条件は以下の節に記載する。
【０３２２】
ＰＣＲ反応は、プルーフリーディングポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用して実行し、ＰＣＲ媒介型突然変異の制限を確実にする。ＰＣＲ増幅サイクルに続き、Ｔａｑポリメラーゼ酵素をテーリングの混合物に添加する。テーリングステップは重要である。ＰＣＲ産物に追加された余分な塩基が、次の節に記載する配列決定ベクターへの直接クローニングを可能にするからである。ＴＡクローニングベクターへのクローニングのために、ＰＣＲ産物にｄＡＴＰオーバーハングを付加するため、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ増幅産物を、７２℃で２０分間Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする。
【０３２３】
ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ試料のクロスチェック−
ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、産物長は分子量標準を使用して確認する。はっきりとした増幅プロファイルを有するＰＣＲ試料を、次の処理ステップに使用する。
【０３２４】
ＱＩＡＧＥＮキットを使用するＰＣＲ産物のゲル溶出−
増幅したＰＣＲ産物を、新しく調製した１％アガロースゲルにロードし、１００Ｖで１時間電気泳動して、増幅したＰＣＲ産物を、未使用のプライマー及び増幅プロセス中に生成された任意のその他の二量体から分離する。増幅した産物をゲルから切り取り、市販のＱｉａｇｅｎゲル溶出キットを使用して溶出する。ＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
【０３２５】
配列決定ベクターへのＰＣＲ産物のクローニング−
アガロースゲルで精製したＰＣＲ増幅産物は、次いでＤＮＡライゲーションプロセスによって市販のｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターにクローニングするために使用する。ＤＮＡライゲーションの条件は、以前に標準化されている。
【０３２６】
ＤＨ５アルファ大腸菌コンピテントセルの、ライゲートした試料ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ）によるトランスフォーメーション−
ライゲートしたＤＮＡにより、市販の大腸菌ＤＨ５アルファ  コンピテントセルをトランスフォームする。製造業者によって記載されるトランスフォーメーションプロトコールに従って、高レベルのトランスフォーメーション効率を達成する。トランスフォーメーション後、大腸菌細胞は、トランスフォームしたコロニーの増殖のため、アンピシリン抗生物質の存在下で増殖する。
【０３２７】
トランスフォームした細胞（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））のアンピシリンを含むＬＢ培地への接種−
各別々のコロニーを、５ｍｌ培養容積のＬＢ＋アンピシリンブロス中に接種し、プラスミドＤＮＡ単離のため一晩増殖する。
【０３２８】
ＤＨ５アルファのトランスフォームした細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の単離−
４．５ｍｌの一晩増殖した培養物を、製造業者のプロトコールに従って、市販のＱＩＡＧＥＮプラスミドＤＮＡ単離キットを使用するプラスミドＤＮＡ単離のために使用する。プラスミドＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
【０３２９】
４．３．５  インサートの存在に関してプラスミドのクロスチェック−
各プラスミド調製物は、好適な制限酵素消化後、続いてアガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在を試験する。インサートのサイズは、好適な分子量標準と比較する。
【０３３０】
配列データ分析及びＩＮＤＥＬの同定
配列決定−確認したプラスミドは、次いでｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格に存在する特異的な配列決定プライマーによって配列決定する。配列データは、適切なプロトコールに従って自動ＤＮＡ配列決定機器で生成する。配列決定は、フォワード及びリバース配列決定プライマー両方で実行し、正確な配列情報を確かめる。
【０３３１】
ＤＮＡ配列分析−全てのプラスミドからのＤＮＡ配列決定データを分析する。ＣＨＯＫ１対照細胞系及び様々なＣＲＩＳＰＲ媒介型ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯＫ１クローン細胞系、並びにＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系由来のプラスミドＤＮＡからのＤＮＡ配列を比較し、ＤＮＡ配列の違いを同定する。各ＣＨＯＫ１細胞系クローンから、ＰＣＲ産物を生成し、大腸菌へクローニングする。複数の大腸菌クローンは配列決定し、標的ゲノム座位において、ヌクレオチド配列の改変を確認する。
【０３３２】
配列データの合成分析を使用して、ＦＵＴ８及びＧＭＤゲノム標的座位が欠失及び／又は挿入によって改変される（ＩＮＤＥＬ）候補ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系を同定する。次いでＤＮＡ配列をアラインし、明らかな違いを示す。図１７Ａ〜１７Ｇは、ＣＨＯＫ１対照細胞系及びＦＵＴ８のヌクレオチド配列のアライメントを示し、図（１７Ｈ〜１７Ｌ）はＧＭＤノックアウトクローン細胞系及びＣＨＯＫ１対照細胞系とのヌクレオチド配列のアライメントを示す。ＤＮＡ配列情報を使用し、ＦＵＴ８遺伝子（エクソン７）のアミノ酸配列を割り当てる。ＧＭＤ遺伝子、エクソン３、及びエクソン４領域に関して標準的なコドン使用頻度を使用して分析する。次いで、アミノ酸配列をアラインし、特定の位置での欠失、フレームシフト突然変異、終止コドンの挿入、並びにアミノ酸置換を同定する。図１７Ａ〜１７Ｇは、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系において観察されるヌクレオチド改変の範囲を示し、図１７Ｈ〜１７Ｌは、ＣＨＯＫ１対照細胞系と比較した場合、ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系について示す。データは、複数のＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウト細胞系中のＦＵＴ８及びＧＭＤゲノムＤＮＡ構造を提示する。
【０３３３】
ＰＣＲ反応
まず、二本鎖ＤＮＡ鋳型を９４℃の高温で変性する。次いで、表１５に記載の配列特異的プライマーを標的配列の両側の部位にアニールする（６０．４℃）。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）によりアニールしたプライマーを伸長し（７２℃）、それにより最初のＤＮＡ配列の量を倍にする。次いでこの新しく合成された産物は、増幅の続くサイクルのさらなる鋳型になる。これらの３ステップを３０サイクル反復し、標的ＤＮＡ濃度の１０９倍の増加をもたらす。ＴＡクローニングベクターへのクローニングのために、ＰＣＲ産物にｄＡＴＰオーバーハングを付加するため、ＰＣＲ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ増幅産物を７２℃で２０分間Ｔａｑポリメラーゼとインキュベートする。
【表１６】
2018502595.tif 000028
【表１７】
2018502595.tif 000029
【０３３４】
本開示の図１５Ａは、１％アガロースゲルに泳動した場合の、代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｆｕｔ８クローン（ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２）のＰＣＲ増幅産物の代表的な図を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、標準化したＰＣＲ条件で、ＣＲＰ＿Ｐ１＿Ｆｗ及びＣＲＰ＿Ｐ０１＿Ｒｖプライマーにより増幅する。増幅産物は、１％アガロースゲルで電気泳動する。レーン１は、特異的プライマーによって増幅したＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２クローンのゲノムＤＮＡを示し、レーン２はＤＮＡ分子量標準を示す。
【０３３５】
結果は、増幅産物の予期される産物サイズを明らかにする。ＰＣＲ増幅産物は、ゲル精製及び細菌クローンにクローン化、並びに配列決定し、ゲノムＦＵＴ８の状態を確認する。
【０３３６】
本開示の図１５Ｂは、１％アガロースゲルに泳動した場合の、代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＧＭＤクローン（ＧＭＤ＿１．１２及びＧＭＤ＿１．２７）のＰＣＲ増幅産物の代表的な図を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、それぞれ標準化したＰＣＲ条件で、ＧＭＤ＿Ｐ０１＿ＦｗとＧＭＤ＿Ｐ０１＿Ｒｖのプライマーセット及びＧＭＤ＿Ｐ０３＿ＦｗとＧＭＤ＿Ｐ０３＿Ｒｖのプライマーセットにより増幅する。増幅産物は、１％アガロースゲルで電気泳動する。結果は、増幅産物の予期される産物サイズを明らかにする。ＰＣＲ増幅産物は、ゲル精製及び細菌クローンにクローン化、並びに配列決定し、ゲノムＧＭＤエクソン３及びエクソン４配列の状態を確認する。
【０３３７】
図１５Ｂにおいて、レーン１は、特異的プライマーによって増幅したＧＭＤ＿１．１２クローンのゲノムＤＮＡを示し、レーン２は、特異的プライマーによって増幅したＧＭＤ＿１．２７クローンのゲノムＤＮＡを示し、レーン３は、ＤＮＡ分子量標準１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒを示し、レーン４は、ＤＮＡ分子量標準１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒを示す。
【０３３８】
この代表的な図は、表１５のプライマー配列及びＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用する、標的ＦＵＴ８及びＧＭＤゲノム座位のＰＣＲ増幅を記載する。ＰＣＲ産物はさらに、テーリングのためのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって修飾する。最終ＰＣＲ産物は、次いで、増幅断片の溶出のためにアガロースゲルで電気泳動する。
【０３３９】
図１５Ｃは、ＧＭＤエクソン４座位に特異的なプライマーによるＧＭＤ２．３０クローン細胞系のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅での代表的な１％アガロースゲル泳動を示す。レーン１は、ＤＮＡ分子量標準１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒを示し、レーン２は、ＤＮＡ分子量標準１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒを示し、レーン３は、特異的プライマーで増幅したＧＭＤ＿２．３０クローンのゲノムＤＮＡを示す。
【０３４０】
図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、ゲル溶出のために電気泳動した適切なサイズの増幅したＰＣＲ産物を明らかにする。同じプロセスを適用して、ＣＨＯＫ１対照並びにＦＵＴ８ノックアウト及びＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１クローン細胞系からのＰＣＲ増幅産物を増幅し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キットを使用してゲル抽出する。
【０３４１】
ライゲーション
ＰＣＲ増幅及びゲル溶出産物は市販のｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターにライゲートする。ライゲーションプロトコールを以下に記載する。
【表１８】
2018502595.tif 000030
【０３４２】
上記のライゲーションン混合物を４℃で一晩インキュベートし、ライゲートした混合物の５０％はヒートショック法によってＤＨ５アルファ大腸菌コンピテントセルをトランスフォームする。
【０３４３】
ヒートショック法によって、ライゲートした試料による細菌細胞のトランスフォーメーション
細菌細胞をトランスフォームする目的は、プラスミドＤＮＡをクローン化し増やすことである。コンピテント大腸菌セル（ＤＨ５アルファ）の２０μＬ分取物を−８０℃の冷凍庫から取り出し、５分間氷上で溶かす。ライゲートした試料（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の５０％をコンピテントセルに添加し、優しく混合し、２０分間氷上でインキュベートする。混合物を含有するチューブを５０秒間４２℃でウォーターバス／ドライバスに置く。チューブを２分間氷上に戻す。０．９５０ｍｌの３７℃に温めたＬＢブロス（アンピシリン抗生物質なし）を、シェイカー中２２０ｒｐｍで１時間、３７℃でインキュベートする。生じた培養物の１００μＬを温めたＬＢ＋アンピシリン培養プレート上に広げる。プレートは３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートする。
【０３４４】
ＱＩＡＰｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐを使用する細菌細胞からのプラスミドＤＮＡ単離
本手順の目的は、以下の実験に使用する特異的ＤＮＡプラスミドを含有する細菌を増殖／培養することである。５ｍｌのＬＢ＋アンピシリンブロスを、オートクレーブ処理したチューブに添加し、単離した細菌コロニーを培養プレートからＬＢブロス＋アンピシリン培養チューブに接種する。チューブは、２２０ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートする（細菌の増殖に応じて、およそ１６〜１８時間）。４．５ｍｌの一晩培養した培養物を１３ｒｐｍで１分間遠心分離する。プラスミドＤＮＡは、市販のＱＩＡＧＥＮプラスミド単離キットを使用して単離する。プラスミドＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出し、さらなる使用まで、−２０℃の冷凍庫に保管する。
【０３４５】
ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ酵素による制限消化を使用する陽性クローンの選択
したがって、単離したプラスミドＤＮＡはインサート、この場合はＰＣＲ増幅断片の存在を試験する。ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターは、クローン化ＰＣＲ産物の両側に複数の制限酵素部位を含有する。制限部位ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを以下の表に記載するように制限消化のために選択する。反応は、プラスミドＤＮＡの完全な消化のために３７℃で２時間実行する。制限消化に続いて、混合物を１％アガロースゲルで１時間電気泳動する。ＰＣＲ産物インサートは、存在する場合、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格から分離され、確認された細菌クローンをＤＮＡ配列決定のために使用する。
【表１９】
2018502595.tif 000031
【０３４６】
本開示の図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、ｐＴＺ５７Ｒ／ＴベクターにおけるＰＣＲ増幅産物の代表的な制限酵素消化を示し、異なるノックアウト細胞系由来のインサートの存在を確認する。別々の細菌クローンからのプラスミドＤＮＡ調製物は、ベクターにクローン化したＰＣＲ断片の両側のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって消化し、混合物は１％アガロースゲルで電気泳動する。生じたＤＮＡ断片のサイズはＤＮＡ分子量標準から推定する。
【０３４７】
図１６Ａは、ＰＣＲ産物インサートを有するｐＴＺ５７Ｒ／Ｔプラスミドの制限消化の代表的な１％アガロースゲルでの泳動を示す。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化は５００ｂｐのインサートを生じる。インサートは、ＦＵＴ８エクソン７座位に特異的なプライマーによるＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２細胞系ゲノムＤＮＡの増幅から得られたＰＣＲ産物を表す。
【０３４８】
図中、
レーン１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン２  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２＃ａ［ＥｃｏＲＩ−ＨＦ＆ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ］
レーン３  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２＃ｂ［ＥｃｏＲＩ−ＨＦ＆ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ］
レーン４  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２＃ｃ［ＥｃｏＲＩ−ＨＦ＆ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ］
レーン５  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２＃ｄ［ＥｃｏＲＩ−ＨＦ＆ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ］
レーン６  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲ１−ＫＯ−Ｔ１＃０２２＃ｄ［未切断］
【０３４９】
図１６Ｂは、ＰＣＲ産物インサートを有するｐＴＺ５７Ｒ／Ｔプラスミドの制限消化の代表的な１％アガロースゲルでの泳動を示す。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化は約５００ｂｐのインサートを生じる。インサートは、ＧＭＤエクソン３座位に特異的なプライマーによるＧＭＤ１．２７細胞系ゲノムＤＮＡの増幅から得られたＰＣＲ産物を表す。
【０３５０】
図中、
レーン１  ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
レーン２  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＣＨＯ＿ＧＭＤ＿１．２７）＃ａ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン３  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＣＨＯ＿ＧＭＤ＿１．２７）＃ｂ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン４  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＣＨＯ＿ＧＭＤ＿１．２７）＃ｃ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン５  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＣＨＯ＿ＧＭＤ＿１．２７）＃ｄ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン６  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＣＨＯ＿ＧＭＤ＿１．２７）＃ｄ［未切断］
【０３５１】
図１６Ｃは、ＰＣＲ産物インサートを有するｐＴＺ５７Ｒ／Ｔプラスミドの制限消化の代表的な１％アガロースゲルでの泳動を示す。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化は約５００ｂｐのインサートを生じる。インサートは、ＧＭＤエクソン４座位に特異的なプライマーによるＧＭＤ２．３０細胞系ゲノムＤＮＡの増幅から得られたＰＣＲ産物を表す。
【０３５２】
図中、
レーン１  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＧＭＤ＿２．３０）＃ａ［未切断］
レーン２  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＧＭＤ＿２．３０）＃ａ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン３  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＧＭＤ＿２．３０）＃ｂ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン４  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＧＭＤ＿２．３０）＃ｃ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン５  ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋（ＧＭＤ＿２．３０）＃ｄ［ＢａｍＨＩ−ＨＦ＆ＸｂａＩ］
レーン６  １ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
【０３５３】
結果から、全ての試験したクローンは、予測される長さのＰＣＲ産物インサートを持つことが明らかである。ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格は、およそ５．４Ｋｂのバンドの位置で観察される断片によって表される。このデータに基づき、個々のプラスミドＤＮＡ試料を選択し、ＤＮＡ配列決定のために使用する。同じプロセスをｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターにクローニングした全てのＰＣＲ産物に適用し、確認したクローンをＤＮＡ配列決定のために選択する。結果は、ベクター骨格に存在する配列決定プライマーによって配列決定されるインサートの存在を示す。
【０３５４】
（例６）
配列決定によるＩＮＤＥＬの確認
選択した細菌のプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定は、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格に位置する上流及び下流配列決定プライマーによって実施する。配列決定データは両プライマーを使用して集め、正確なＤＮＡ配列情報を分析する。複数の細菌のプラスミドを配列決定し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって達成された、ＣＨＯＫ１対照細胞系及びクローンＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウト細胞系のＦＵＴ８及びＧＭＤ標的ゲノム座位における複合体ＤＮＡ配列情報を生成する。
【０３５５】
以下に示すのは、ＣＨＯＫ１対照細胞系及びＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８及びＧＭＤノックアウトクローン細胞系由来のゲノムＤＮＡ配列であり、本開示の方法につき、それぞれＣＲＩＳＰＲ構築物によって、Ｆｕｔ８遺伝子及びＧＭＤ遺伝子の挿入及び／又は欠失突然変異の存在を確認する。ＣＨＯＫ１対照細胞系を含む各細胞系から増幅した標的ゲノム座位は、複数の別々の細菌クローンにおいてＰＣＲ産物としてクローン化する。配列の検証は、複数の別々の細菌クローン（５〜１５の範囲）から、フォワード及びリバース配列決定プライマー両方によって実行し、ＦＵＴ８及びＧＭＤ標的座位の対立遺伝子の変異性を理解する。以下のＤＮＡ配列データは、様々なＦＵＴ８ノックアウト細胞系の標的ＦＵＴ８座位のゲノム配列の代表例である。
【０３５６】
ＤＮＡ配列分析
ＣＨＯＫ１対照細胞系（野生型）−ＦＵＴ８遺伝子のエクソン−７の配列は大文字である。イントロン配列は小文字であり、下線を引く。
ａａｇａａａｔａａｇｃｔｇａａｔｃａｇｃｔｃｔｇａｃｔｔａｔｔｇｔｇｔｇａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｇｔｇａｃｃａａａａｔｇａｇａａｇｔｔａａｃｔｃｃｔｔａｔａｔｃｔｔｔａｔｃｔｔａｔｔｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｇａａｇＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧｇｔａａｇｇａｇｃａｔｇｔｇｃａｃｃａｔｇａａａｇａｔｃｔｃｔｇｇｔｔａｇｇｔｃａｇａｔｔａｇｃａｃ
【０３５７】
ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウトクローン細胞系の配列を以下に示す。エクソン７の配列は細胞系において突然変異されることが観察される。
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＡＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５９
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０３５８】
ＦＵＴ８遺伝子配列における欠失を示すＦＵＴ８ノックアウト細胞系クローンにおける代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを、本開示の図１７に示す。図１７Ａ〜１７Ｇは、Ｆｕｔ８エクソン７標的座位におけるヌクレオチド配列分析を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをトランスフェクトした、選択したＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウトクローン及びＣＨＯＫ１対照細胞系のゲノムＤＮＡを、ゲノムＦＵＴ８座位を標的とするＰＣＲ増幅に使用する。フォワード及びリバース配列決定プライマー両方によって配列決定した５〜１５個の別々の細菌クローンの分析から配列データを収集する。配列決定データは、ＣＨＯＫ１対照細胞系と比較した複数のクローンにおける様々な長さの欠失を示唆する。塩基の最大の欠失は、クローンＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１において観察され、最少の欠失はクローンＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５における２塩基のみである。全ての欠失はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的部位に位置する。
【０３５９】
図１７Ａにおいて、左及び右のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＤＮＡ結合部位を中抜きの四角で示す。図１７Ｂ〜１７Ｇは、配列データがＣＨＯＫ１対照細胞系と比較して新しいＤＮＡ配列の挿入が明らかである複数のクローンを示す。図１７Ｂ及び図１７Ｆは、ＣＨＯＫ１ゲノム配列と比較して配列の挿入及び欠失の両方が明らかなクローン番号ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２を表す。クローン番号ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７（図１７Ｅ）は、ＣＨＯＫ１ゲノム配列と比較して塩基の特有の挿入及び広範なミスマッチが明らかである。塩基の挿入は、図１７Ｂ〜１７Ｇに示すように、長さも様々である。
【０３６０】
データは、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系におけるＦＵＴ８ゲノム座位に存在する様々なＩＮＤＥＬを示唆する。多くの場合、標的塩基に非常に特異的な改変があることが観察され、その他の場合には変更が幅広く、より長いＤＮＡの領域を含む。
【０３６１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によるゲノム改変のそのような多様性は、近接した内因性ＤＮＡ一本鎖切断及び非相同末端結合による修復によって可能である。これらの細胞系の全ては、機能スクリーニングアッセイ、主にＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって選択する。結果は、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系を単離及び同定する高効率の機能アッセイも意味する。
【０３６２】
本開示に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の設計が特有であることも明らかである。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼを含むこの一対のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、ＣＨＯＫ１細胞系の標的ＦＵＴ８座位における非常に配列特異的な遺伝子変化をもたらすからである。
【０３６３】
ＧＭＤ遺伝子のエクソン３を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞のＤＮＡ配列分析
ＣＨＯＫ１対照細胞系（野生型）−ＧＭＤ遺伝子のエクソン３の配列は大文字である。イントロン配列は小文字であり下線を引く。
ｇａｔｃｃｔｔｃａｇｔｇｔｔｃｃａａｇｔａｃｔｇｇｇｔｔｔｇｃａｇｇｇｇｔｇｇｇｃａｇｔｃａｃａｃｃｔｇｇｇａａｃａｃｃａｇｔｔｔｇａｃｃｔｔｃａｔｔｔｔｃａｔａｔｇｔｇａａｔａａｔａｃａｔａｔｔｔｃａｇｔｔｔｔｇａｔａｔｔｇａａａｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｇｔｔａｔｃｔｃａｔａｔｃｔｔｇａｔｇａｔｃｔｔｔｔｔａｔａａａｔｃｔｔａａａｇＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧｇｔａａｇｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｔｇｃｃａｔｇｇｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｔｔｇｔａｇｔｇｔｔｃｔｃｔａｔｔｃａｃｔｃａｃａｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｃｔｃａａｔａｃａａｔａｇｃａａｃｃａｃｔａｇｔｔｃｔｔａｔｃａａｇｔｔｔａｇｔｃｔｔｃａｇｔａｔｔａｇｔｔｔｇｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｔａａｔａａａａａｔａｃｔｃａｔａａａｔｔｔｔｔａａｇｇｔｇａｇｇｔｔｔｃｔｇｔｔａｃｔｃａａｃａｇ
【０３６４】
ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウトクローン細胞系の配列を以下に示す。エクソン３の配列は細胞系において突然変異されることが観察される。
ＧＭＤ＿１．１２
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＴＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＴＡＡＣＧＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
ＧＭＤ＿１．２７
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
ＧＭＤ＿１．３７
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
ＧＭＤ＿１．４１
ＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＡＧＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
ＧＭＤ＿１．４３
ＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
ＧＭＤ＿１．４４
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
【０３６５】
ＧＭＤ遺伝子のエクソン４を標的とするｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞のＤＮＡ配列分析
ＣＨＯＫ１対照細胞系（野生型）−ＧＭＤ遺伝子のエクソン−４の配列は大文字である。イントロン配列は小文字であり、プライマー位置は下線を引く。
ｇａｃｇｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃｔａｔｔｃｔａｔａｃｔｇｇａａｇｔａｇａｔｇａｔａｔｔｃｔｃａｔｔｇｇａａａｔｔｃｔｇｔｔａｇｇａａｇｔａａｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔｃｔｔｃｔｔａｃｃｔｇｃａｔａｇａａｔｃｃｃａｇｇａｔａｔａａａａｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｔｃｇｃｃｃｔｔｇｃｃａｔｔｇｔｃｔｃｔｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇｃａｔｃｔｃａｔａｔｃｔｇｃｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｃａｇＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＧｇｔａａｇａａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｇｔａｔｇｔｇａｇｇｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｇｔｇｔｇｇｇｇａｔｇｔｔｔｃｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａｃ
【０３６６】
ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウトクローン細胞系の配列を以下に示す。エクソン４の配列はクローン細胞系において突然変異されることが観察される。
ＧＭＤ＿２．３０
ＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＧ
【０３６７】
ＧＭＤ遺伝子のエクソン３及びエクソン４を標的とするｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体両方をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞のＤＮＡ配列分析
ＣＨＯＫ１ＧＭＤノックアウトクローン細胞系の配列を以下に示す。両方のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクトしたが、ヌクレオチドの突然変異はエクソン４においてのみ観察されることが観察される。エクソン３の配列の分析は、クローンノックアウト細胞系における野生型エクソン３を明らかにする。
【０３６８】
ＧＭＤ＿３．５１
エクソン３の配列−
ＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧ
【０３６９】
エクソン４の配列−
ＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＧ
【０３７０】
表は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のトランスフェクションにより開発したクローンＧＭＤノックアウト細胞系の配列のリストを示す。
【表２０】
2018502595.tif 000032
【０３７１】
表は、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のトランスフェクションにより開発したクローンＧＭＤノックアウト細胞系の配列のリストを示す。
【表２１】
2018502595.tif 000033
【０３７２】
表は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体両方のトランスフェクションにより開発したクローンＧＭＤノックアウト細胞系の配列のリストを示す。
【表２２】
2018502595.tif 000034
【０３７３】
ＧＭＤ遺伝子配列における欠失を示すＧＭＤ  ＣＨＯＫ１ノックアウト細胞系クローンにおける代表的なゲノムＤＮＡ配列のアライメントを、本開示の図１７Ｈ〜１７Ｌに示す。図１７Ｈ〜１７Ｌは、ＧＭＤ標的座位におけるヌクレオチド配列分析を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをトランスフェクトした、選択したＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウトクローン及びＣＨＯＫ１対照細胞系のゲノムＤＮＡを、ゲノムＧＭＤ座位、エクソン３及びエクソン４両方の配列を標的とするＰＣＲ増幅に使用する。フォワード及びリバース配列決定プライマー両方によって配列決定した５〜１５個の別々の細菌クローンの分析から配列データを収集する。配列決定データは、ＣＨＯＫ１対照細胞系と比較した複数のクローンにおける様々な長さの欠失を示唆する。塩基の最大の欠失は、クローンＧＭＤ１．４１において観察され、８塩基の最少の欠失は、クローンＧＭＤ２．３０において観察される。全ての欠失はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的部位に位置する。
【０３７４】
図１７Ｈにおいて、左及び右のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＤＮＡ結合部位を中抜きの四角で示す。図１７Ｋにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ結合部位を中抜きの四角で示す。図１７Ｉ〜１７Ｊは、配列データによりＣＨＯＫ１対照細胞系と比較して新しいＤＮＡ配列の挿入が明らかであるクローンを示す。図１７Ｋは、二本鎖ＤＮＡ切断の結果であるｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓインサートによるＧＭＤエクソン４標的部位における小さな欠失を明らかにする。図１７Ｌは、ＧＭＤエクソン４の配列のみが３６塩基対の欠失によって改変される、２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）をトランスフェクトしたＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系からの配列データを示す。
データは、ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系におけるＧＭＤゲノム座位に存在する様々なＩＮＤＥＬを示唆する。多くの場合、標的塩基に非常に特異的な改変があることが観察され、その他の場合には変更が幅広くより長いＤＮＡの領域を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によるゲノム改変のそのような多様性は、内因性ＤＮＡ一本鎖切断及びＤＮＡ二本鎖切断並びに続くＤＮＡ修復によって可能である。これらの細胞系の全ては、機能スクリーニングアッセイ、主にＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって選択する。結果は、ＣＨＯＫ１  ＧＭＤノックアウト細胞系を単離及び同定する高効率の機能アッセイも意味する。
【０３７５】
本開示に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の設計が特有であることも明らかである。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼを含むこの一対のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、ＣＨＯＫ１細胞系の標的ＧＭＤ座位における非常に配列特異的な遺伝子変化をもたらすからである。
【０３７６】
ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系のアミノ酸配列分析
ＣＨＯＫ１対照及びＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系のＦＵＴ８ゲノムＤＮＡ配列をさらに分析し、ＦＵＴ８タンパク質状態におけるＤＮＡ配列ＩＮＤＥＬの影響を理解する。標的ＦＵＴ８座位のＤＮＡ配列は、脊椎動物のコドンバイアスを使用してアミノ酸配列へと翻訳される。エクソン７領域のアミノ酸配列を厳密に研究し、結果は表２３に要約する。ＣＨＯＫ１対照細胞系と比較した場合、ＦＵＴ８ノックアウト細胞系は、アミノ酸の欠失及び挿入並びに終止コドン及びフレームシフト突然変異の導入を含む改変が明らかである。ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８タンパク質配列と比較して１０個のアミノ酸又はそれより長い領域のアミノ酸配列の欠失が得られることが観察される。
【０３７７】
多くの例では、ＦＵＴ８タンパク質のＣ末端領域を変更し、それを非機能的な酵素にするフレームシフト突然変異が観察される。さらに、いくつかの例では、終止コドンは、フレームシフト突然変異の影響で導入され、それによりＦＵＴ８タンパク質がトランケートされ、これらのクローンにおいて非機能的である。
【表２３−１】
2018502595.tif 000035
【表２３−２】
2018502595.tif 000036
【０３７８】
さらに、ＦＵＴ８タンパク質配列における標的アミノ酸の選択が非常に有効であることが観察される。１対のみのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体による野生型ＦＵＴ８タンパク質の位置に保存されたアミノ酸の標的化は、複数のノックアウト細胞系において標的座位に突然変異を生成する。
【０３７９】
ＦＵＴ８遺伝子配列における欠失を示すＣＨＯＫ１対照及びＣＨＯＫ１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをトランスフェクトした細胞系おける代表的なアミノ酸配列のアライメントを、本開示の図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。標準的なコドン使用頻度を使用して、翻訳されたアミノ酸配列を予測する。データは、観察されるヌクレオチド欠失及び／又は挿入による、ＦＵＴ８アミノ酸配列上の様々な効果を示す。クローンＣＲ１ＫＯＴ１＃０１８、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０４４、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６１、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５５、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０６７及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０５１は、特定のアミノ酸位置の標的とした欠失が明らかである。クローン番号ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２２、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０３６、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０５９、ＣＲ１ＫＯＴ１＃０２３及びＣＲ１ＫＯＴ１＃０３７において、標的領域におけるアミノ酸の付加が見られる（図１８Ｂ）。いくつかのクローンは、欠失に続くフレームシフト突然変異が明らかであり、早い終止コドンをもたらす。これらの改変全てが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓをトランスフェクトしたＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系において非機能的ＦＵＴ８タンパク質を示す。
【０３８０】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ロスマンフォールド内に重要なモチーフＩＩ及びモチーフＩＩＩを含有するＦＵＴ８酵素のＣ末端領域を破壊する、フレームシフト突然変異に続く終止コドンを生成する。ＦＵＴ８酵素の触媒ドメインに含まれる特定のアミノ酸位置Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９は、したがって、ＦＵＴ８遺伝子のこれらのトランケート版においては発現しない。これらの重要な突然変異の最終結果は、非機能的α−１，６フコシルトランスフェラーゼ酵素、ＣＨＯＫ１  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系におけるＦＵＴ８遺伝子のタンパク質産物である。
【０３８１】
ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクトしたクローン細胞系におけるＧＭＤ遺伝子エクソン３座位の分析。
クローンノックアウト細胞系から、標的領域のＧＭＤ遺伝子タンパク質配列において、異なる種類の突然変異が明らかである。以下の表は、ＧＭＤノックアウトクローン細胞系において観察される全ての突然変異を列挙する。
【表２４】
2018502595.tif 000037
【０３８２】
ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をトランスフェクトしたクローン細胞系におけるＧＭＤ遺伝子エクソン４座位の分析：
クローンノックアウト細胞系は、標的領域のＧＭＤ遺伝子タンパク質配列において突然変異が明らかである。以下の表は、ＧＭＤノックアウトクローン細胞系において観察される全ての突然変異を列挙する。
【表２５】
2018502595.tif 000038
【０３８３】
ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体両方をトランスフェクトしたクローン細胞系におけるＧＭＤ遺伝子エクソン３及びエクソン４座位の分析：
クローンノックアウト細胞系は、標的領域中のＧＭＤ遺伝子エクソン４タンパク質配列においてのみ突然変異が明らかである。以下の表は、ＧＭＤノックアウトクローン細胞系において観察される全ての突然変異を列挙する。
【表２６】
2018502595.tif 000039
【０３８４】
図１８Ｃは、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）を使用して生成したＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１クローンのアミノ酸分析を表す。標的ＧＭＤエクソン３座位における複数の型の突然変異が観察され、アミノ酸残基の欠失、置換、並びに中途終止コドンを含む。そのような改変は、ＧＭＤ遺伝子を非機能的にし、それにより、フコースノックアウト細胞系を生じる。クローン番号ＧＭＤ１．１２及びＧＭＤ１．３７から、中途終止コドンを導入するアミノ酸残基及びフレームシフト突然変異の挿入が明らかである（図１８Ｄ及び１８Ｅ）。クローンＧＭＤ２．３０の場合、ｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）はＤＮＡ二本鎖切断を導入するために使用し、標的ＧＭＤエクソン４座位において挿入及びフレームシフト突然変異が明らかである（図１８Ｆ）。同様に、クローンＧＭＤ３．５１において（図１８Ｇ）、細胞系はｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ１６７〜２０７）及びｐＤ１３０１（ｇＲＮＡ４０４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物両方をトランスフェクトすることにより生成するが、データは、ＧＭＤエクソン４のみでアミノ酸の欠失を明らかにする。
【０３８５】
このデータは、ＧＭＤ遺伝子の２つの特異的なエクソン標的部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ設計が非常に特異的であり、両構築物が特異的標的化に有効であることを明らかにする。したがって、開発されたＧＭＤ  ＣＨＯＫ１ノックアウト細胞系は、非フコシル化モノクローナル抗体の開発に使用される。
【０３８６】
（例７）
部分的なフコシル化及び非フコシル化抗体を産生するためのフコースノックアウト細胞系の使用
フコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞発現プラットフォームを、非フコシル化抗体、特に非フコシル化モノクローナル抗体の発現に使用する。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする抗体遺伝子を好適な遺伝子発現プラスミドにクローン化し、上記の実施例に記載のフコースノックアウトＣＨＯＫ１細胞プラットフォームにトランスフェクトする。このプラットフォーム／方法を使用して産生したモノクローナル抗体は、非フコシル化抗体として発現する。産物を、確立されたプロトコール及びガイドラインに従って精製し、治療用途のためのバイオベターモノクローナル抗体産物を開発する。このプラットフォームを使用して産生された非フコシル化バイオベター抗体は、高レベルのＡＤＣＣ及びそれによるより良い治療成績をもたらす。
【０３８７】
本開示のＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーデータ及びさらなる配列決定実験により、ＦＫＯ系が膜タンパク質をフコシル化できないことを確認する。したがって、本開示で得た細胞は、非フコシル化タンパク質、特に非フコシル化抗体を産生する。非フコシル化抗体の特徴的な性質及び治療的な利点、例えばより高いＡＤＣＣなどは当業者に公知である。
【０３８８】
ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系は、非フコシル化モノクローナル抗体開発プログラムにおける特有の適用に有用である。ＧＭＤ遺伝子は、フコース生合成経路における重要なＧＤＰ−フコースステップの上流にある。ＧＤＰフコースは、ＧＭＤ遺伝子機能に完全に依存する新生経路によるか、ＧＭＤ遺伝子機能によらないが、増殖培地中にＬ−フコースの存在を必要とする再生経路によるかのいずれかで、ＣＨＯＫ１細胞において産生することができる。したがって、ＧＭＤノックアウト細胞系において産生したモノクローナル抗体のフコシル化の条件制御を達成することが可能である。
【０３８９】
シナリオ１：増殖培地中にいかなるＬ−フコースも含まない、ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞におけるモノクローナル抗体遺伝子の発現。産生したモノクローナル抗体は１００％脱フコシル化されている。この場合、新生及び再生フコース生合成経路は非機能的である。
【０３９０】
シナリオ２：増殖培地中に最適なＬ−フコースを含む、ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞におけるモノクローナル抗体遺伝子の発現。産生したモノクローナル抗体は１００％フコシル化されている。この場合、新生経路は完全に遮断されるが、再生経路は機能性である。これは、ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞系において産生されるモノクローナル抗体遺伝子の完全なフコシル化を可能にする。
【０３９１】
シナリオ３：増殖培地中に様々なレベルのＬ−フコースを含む、ＧＭＤノックアウトＣＨＯＫ１細胞におけるモノクローナル抗体遺伝子の発現。この条件下で産生したモノクローナル抗体は部分的にフコシル化されている。増殖培地中のＬ−フコースの用量がモノクローナル抗体のフコシル化のレベルを決定する。培養条件中にこの用量を滴定し、モノクローナル抗体フコシル化のレベルを確かめ、その後再び滴定し、標的モノクローナル抗体のフコシル化の臨界値を達成するために微調整する。
【０３９２】
これは、ＧＭＤ遺伝子ノックアウトＣＨＯＫ１細胞系の特有の利点であり、この性質は本開示に一意的に記載する。
【０３９３】
開示及び例証は、明確さ及び理解の目的のための例示及び実施例によって提供されるが、本開示の目的又は範囲を逸脱することなく様々な変更及び修飾が実施され得ることが当業者には明らかである。したがって、以前の記載及び実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３９４】
本開示の範囲は、この詳細な記載によってではなく、本明細書に添付の特許請求の範囲によって限定されることを意図する。以下の特許請求の範囲が、本明細書に記載の本開示の全ての一般的な又は特異的な性質にわたることを意図することも理解される。
【０３９５】
上記の教示に照らして、多くの修飾及び変化が可能である。したがって、請求する主題は、特別に記載する以外の方法でも実施され得ることが理解される。単数形の、例えば文字「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、又は「前記（ｓａｉｄ）」を使用する、特許請求の範囲の要素への任意の言及は、本開示を限定するものとして解釈されない。
【０３９６】
本開示の実施形態の記載は、現在の知識を適用することによる様々な適用の修飾及び／又は適応に容易に適する実施形態の一般的な性質を明らかにする。本開示のそのような特定の実施形態は、類概念から逸脱することなく、及び、したがって、そのような適応及び修飾は、開示する実施形態に等価の意味及び範囲内であると理解され、考えられると意図されるべきであり、且つ意図される。
【０３９７】
本明細書に用いる語句又は用語は、記載の目的のためであり、いかなる限定も意図しないことも理解される。本開示全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形を使用する場合はいつでも、記載した要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の包含を意味するが、任意のその他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の除外を意味しないことが理解される。
【０３９８】
数値制限又は範囲が本明細書に記載される場合、終点が含まれる。また、数値制限又は範囲内の値及び部分範囲もはっきりと記されているかのように明確に含む。
【０３９９】
本開示の任意の複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は適用に適切であると考えられる場合、複数から単数及び／又は単数から複数へと変換することができる。様々な単数／複数の並べ替えが、明確さのために明示的に本明細書において規定され得る。
【０４００】
本明細書に含めた文献、作用、材料、装置、論文などの任意の議論は、単に本開示の文脈を提供する目的のためである。本出願の優先日の前にどこにでもあるように、これらの事柄のいずれか又は全てが、先行技術基準の一部を形成する、又は本開示に該当する技術分野の常識であることを承認として考えるべきではない。
【０４０１】
本明細書全体にわたって引用された全ての参照、特許及び公開された特許出願の文脈は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2018502595.tif 000040
【図１Ｂ】
2018502595.tif 000041
【図２Ａ】
2018502595.tif 000042
【図２Ｂ】
2018502595.tif 000043
【図３Ａ】
2018502595.tif 000044
【図３Ｂ】
2018502595.tif 000045
【図４Ａ】
2018502595.tif 000046
【図４Ｂ】
2018502595.tif 000047
【図４Ｃ】
2018502595.tif 000048
【図４Ｄ】
2018502595.tif 000049
【図５】
2018502595.tif 000050
【図６Ａ】
2018502595.tif 000051
【図６Ｂ】
2018502595.tif 000052
【図７Ａ】
2018502595.tif 000053
【図７Ｂ】
2018502595.tif 000054
【図７Ｃ】
2018502595.tif 000055
【図８Ａ】
2018502595.tif 000056
【図８Ｂ】
2018502595.tif 000057
【図８Ｃ】
2018502595.tif 000058
【図９Ａ】
2018502595.tif 000059
【図９Ｂ】
2018502595.tif 000060
【図１０】
2018502595.tif 000061
【図１１】
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【図１２】
2018502595.tif 000063
【図１３Ａ】
2018502595.tif 000064
【図１３Ｂ】
2018502595.tif 000065
【図１３Ｃ】
2018502595.tif 000066
【図１４】
2018502595.tif 000067
【図１５Ａ】
2018502595.tif 000068
【図１５Ｂ】
2018502595.tif 000069
【図１５Ｃ】
2018502595.tif 000070
【図１６Ａ】
2018502595.tif 000071
【図１６Ｂ】
2018502595.tif 000072
【図１６Ｃ】
2018502595.tif 000073
【図１７Ａ】
2018502595.tif 000074
【図１７Ｂ】
2018502595.tif 000075
【図１７Ｃ】
2018502595.tif 000076
【図１７Ｄ】
2018502595.tif 000077
【図１７Ｅ】
2018502595.tif 000078
【図１７Ｆ】
2018502595.tif 000079
【図１７Ｇ】
2018502595.tif 000080
【図１７Ｈ】
2018502595.tif 000081
【図１７Ｉ】
2018502595.tif 000082
【図１７Ｊ】
2018502595.tif 000083
【図１７Ｋ】
2018502595.tif 000084
【図１７Ｌ】
2018502595.tif 000085
【図１８Ａ】
2018502595.tif 000086
【図１８Ｂ】
2018502595.tif 000087
【図１８Ｃ】
2018502595.tif 000088
【図１８Ｄ】
2018502595.tif 000089
【図１８Ｅ】
2018502595.tif 000090
【図１８Ｆ】
2018502595.tif 000091
【図１８Ｇ】
2018502595.tif 000092
【図１９】
2018502595.tif 000093
【図２０−１】
2018502595.tif 000094
【図２０−２】
2018502595.tif 000095
【図２０−３】
2018502595.tif 000096
【配列表】
2018502595000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月11日(2017.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７から配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５及びその組み合わせからなる群より選択される配列を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項２】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号３９、及び配列番号１７から配列番号３７から転写されるＲＮＡ配列が、Ｆｕｔ８遺伝子配列に結合し、また配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５から転写されるＲＮＡ配列が、ＧＭＤ遺伝子配列に結合し、
配列番号１３が配列番号１４に転写され、配列番号１５が配列番号１６に転写され、配列番号３７が配列番号３８に転写され、配列番号３９が配列番号４０に転写され、配列番号４１が配列番号４２に転写され、配列番号４３が配列番号４４に転写され、及び配列番号４５が配列番号４６に転写される、
請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼを含む、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体。
【請求項４】
ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣａｓ９ｎエンドヌクレアーゼである、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメインを含むベクター。
【請求項６】
ヌクレアーゼをエンコードする核酸配列を更に含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
ＣＯＳ；ＣＨＯ−Ｓ；ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）；ＣＨＯ−ＤＧ４４；ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１；ＣＨＯ−ＤＵＫＸ；ＣＨＯＫ１ＳＶ；ＶＥＲＯ；ＭＤＣＫ；Ｗ１３８；Ｖ７９；Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３；ＢＨＫ；ＨａＫ；ＮＳ０；ＳＰ２／０−Ａｇ１４；ＨｅＬａ；ＨＥＫ２９３−Ｆ；ＨＥＫ２９３−Ｈ；ＨＥＫ２９３−Ｔ；ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０；ｐｅｒＣ６；抗体産生ハイブリドーマ細胞；胚性幹細胞；ナマルバ細胞；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ａ）請求項１に記載のＤＮＡ結合ドメインをエンコードする核酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物を得るステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップ
を含む、フコースノックアウト細胞を得る方法。
【請求項１０】
ａ）０％から１００％の範囲のフコシル化活性を有する、請求項９に記載の細胞を培養するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の細胞が発現したタンパク質を得るステップと
を含む、０％から１００％の範囲でフコシル化されたタンパク質を得る方法。
【請求項１１】
ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物が、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ複合体を提供し、
前記複合体が、細胞内の遺伝子配列を切断し、
前記遺伝子が、Ｆｕｔ８、ＧＭＤ、及びその組み合わせからなる群より選択され、
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＦｕｔ８遺伝子配列が、エクソン７において切断され、
α−ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ酵素をコードするＧＭＤ遺伝子配列が、エクソン３、エクソン４、及びその組み合わせからなる群より選択されるエクソンにおいて切断され、そして
細胞が、ＣＯＳ；ＣＨＯ−Ｓ；ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）；ＣＨＯ−ＤＧ４４；ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１；ＣＨＯ−ＤＵＫＸ；ＣＨＯＫ１ＳＶ；ＶＥＲＯ；ＭＤＣＫ；Ｗ１３８；Ｖ７９；Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３；ＢＨＫ；ＨａＫ；ＮＳ０；ＳＰ２／０−Ａｇ１４；ＨｅＬａ；ＨＥＫ２９３−Ｆ；ＨＥＫ２９３−Ｈ；ＨＥＫ２９３−Ｔ；ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０；ｐｅｒＣ６；抗体産生ハイブリドーマ細胞；胚性幹細胞；ナマルバ細胞；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属に由来する昆虫細胞系からなる群より選択される、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、０％から１００％フコシル化されており、そして前記タンパク質が、前記細胞内のＦｕｔ８遺伝子の破壊により得られ、又は前記細胞内のＧＭＤ遺伝子の破壊により得られ；そしてＧＭＤ遺伝子の破壊される方法において、増殖培地内にＬ−フコースが添加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、抗体であり；抗体がモノクローナル抗体であり；そして、前記細胞が、内因性タンパク質又は細胞に導入された遺伝子にエンコードされるタンパク質を産生する；請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法により得られた、０％から１００％フコシル化されているタンパク質。
【請求項１５】
任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、請求項１４に記載のタンパク質を含む組成物。
【国際調査報告】
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