(57)【要約】分泌組織のセーフハーバー遺伝子座から抗体を発現させるためのヌクレアーゼおよびこれらのヌクレアーゼを使用する方法、ならびにそれに由来するクローンおよび動物。本明細書で、抗体導入遺伝子の標的化挿入および部分配列発現、例えば肝臓などの分泌組織からの抗体の発現のための方法および組成物が開示される。一態様では、抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、イントラボディなど）は、肝細胞のセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン遺伝子）へのヌクレアーゼ媒介標的化組込みの後にｉｎ  ｖｉｖｏの細胞中で発現される。
2018533966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん抗原、細胞受容体、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、キナーゼ阻害剤、インテグリン、α−シヌクレイン、アミロイドタンパク質および補体タンパク質の群から選択されるタンパク質に結合する抗体を細胞内で発現させる方法であって、
該細胞が該抗体を生成するように、該抗体をコードする導入遺伝子を該細胞のセーフハーバー遺伝子座に組み込むこと
を含む、方法。
【請求項２】
前記セーフハーバー遺伝子座がアルブミン遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記導入遺伝子の発現が内因性のプロモーターによって駆動される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記導入遺伝子が、該導入遺伝子によってコードされるアミノ酸、および該導入遺伝子が組み込まれた内因性の前記セーフハーバー遺伝子座によってコードされるアミノ酸を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、肝臓細胞、筋肉細胞および幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が造血幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、イントラボディまたはダイアボディを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が被験体の細胞において発現され、さらに該抗体が、がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎を処置および／または予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が前記被験体の肝臓、血清および／または脳において発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入遺伝子がウイルスベクターを使用して前記細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の方法によって産生される、遺伝子改変細胞。
【請求項１３】
前記導入遺伝子が生きている被験体の細胞に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記導入遺伝子が単離細胞に組み込まれ、生きている被験体に該単離細胞を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、前記被験体において、がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎を処置および／または予防する、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎を処置する方法で使用するための１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数の抗体コード導入遺伝子であって、該方法は、それを必要とする被験体に該１つまたは複数のヌクレアーゼおよび該１つまたは複数の導入遺伝子を投与して該抗体を生成する細胞を生成することを含み、ここで、該抗体は、該がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎に関与するタンパク質に結合し、該導入遺伝子は天然に存在しないヌクレアーゼを使用して該細胞の内因性アルブミン遺伝子座に組み込まれ、該細胞は該抗体を産生する、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数の抗体コード導入遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月２３日に出願された米国仮出願第６２／２５８，８６４号および２０１６年１０月７日に出願されたた米国仮出願第６２／４０５，５２１号の利益を主張し、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本開示は、ゲノム編集の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は、ヒト治療学の新しい時代の莫大な潜在性を秘める。これらの方法論は、標準医療行為によって対処可能ではなかった状態のための処置を可能にする。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊もしくは補正、および導入遺伝子に融合させた特異的外因性プロモーターによって、またはゲノムへの挿入部位で見出される内因性プロモーターによって制御することができる発現可能な導入遺伝子の挿入などの、ゲノム編集技術の多くの変形を含むことができる。
【０００４】
導入遺伝子の送達および挿入は、この技術のいかなる真の実施のために解決されなければならない障害物の例である。例えば、様々な遺伝子送達方法が治療的使用のために潜在的に利用可能であるが、全ては安全性、耐久性と発現レベルとの間の実質的なトレードオフを伴う。エピソームとして導入遺伝子を提供する方法（例えば、塩基性アデノウイルス、ＡＡＶおよびプラスミドをベースとした系）は一般的に安全であり、高い初期の発現レベルを得ることができるが、これらの方法は堅牢なエピソーム複製を欠き、そのことは有糸分裂が活発な組織における発現の持続時間を制限する可能性がある。対照的に、所望の導入遺伝子のランダムな組込みをもたらす送達方法（例えば、レンチウイルスの組込み）はより永続的な発現を提供するが、ランダムな挿入の非標的化的性質のために、レシピエント細胞における調節されない成長を引き起こすことがあり、ランダムに組み込まれた導入遺伝子カセットの近くでのオンコジーンの活性化を通して悪性疾患をもたらすおそれがある。さらに、導入遺伝子の組込みが、複製によって駆動される喪失を回避するとしても、それは導入遺伝子に融合した外因性プロモーターの最終的なサイレンシングを防止しない。時間がたつと、そのようなサイレンシングは、大多数のランダム挿入事象の導入遺伝子発現の低減をもたらす。さらに、導入遺伝子の組込みがあらゆる標的細胞において起こることは稀であり、そのことは、所望の治療効果を達成するために目的の導入遺伝子の十分に高い発現レベルを達成することを困難にする可能性がある。
【０００５】
近年、選択されたゲノム遺伝子座への挿入を偏らせるための部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、特異的切断をガイドするための工学的に操作された（engineered）ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系など）による切断を使用する、導入遺伝子組込みのための新しい戦略が開発された。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；９，２００，２６６号；９，０４５，７６３号；９，００５，９７３号；９，１５０，８４７号；８，９５６，８２８号；８，９４５，８６８号；８，７０３，４８９号；８，５８６，５２６号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，５０３，７１７号；６，６８９，５５８号；７，０６７，３１７号；７，２６２，０５４号；７，８８８，１２１号；７，９７２，８５４号；７，９１４，７９６号；７，９５１，９２５号；８，１１０，３７９号；８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；２００５０２０８４８９号；２００５００２６１５７号；２００５００６４４７４号；２００６００６３２３１号；２００８０１５９９９６号；２０１０００２１８２６４号；２０１２００１７２９０号；２０１１０２６５１９８号；２０１３０１３７１０４号；２０１３０１２２５９１号；２０１３０１７７９８３号；２０１３０１９６３７３号；２０１４０１２０６２２号；２０１５００５６７０５号；２０１５０３３５７０８号；２０１６００３０４７７号および２０１６００２４４７４号を参照のこと。さらに、標的化ヌクレアーゼはアルゴノート系に基づいて開発されており（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Swartsら（２０１４年）Nature  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁を参照のこと）、それは、ゲノム編集および遺伝子治療における使用のための可能性も有し得る。古典的な組込みアプローチと比較して、導入遺伝子組込みへのこのヌクレアーゼ媒介アプローチは、改善された導入遺伝子発現、安全性の増加および発現の持続性の見込みを提供するが、その理由は、それが、遺伝子サイレンシングまたは近くのオンコジーンの活性化のリスクが最小限であるために、正確な導入遺伝子の配置を可能にするからである。
【０００６】
１つのアプローチは、その同族遺伝子座への導入遺伝子の組込み、例えば、変異体遺伝子を補正するための内因性遺伝子座への野生型導入遺伝子の挿入を含む。あるいは、導入遺伝子は、その有益な特性のために特異的に選択される非同族遺伝子座に挿入することができる。例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）導入遺伝子の標的化挿入に関する、米国特許出願公開第２０１２０１２８６３５号を参照のこと。内因性調節エレメントによって発揮される発現制御をなお維持しつつ、内因性遺伝子の発現を導入遺伝子で置き換えることを望む場合は、同族遺伝子座を標的にすることが有益であり得る。内因性遺伝子座の中でまたはその近くで切断する特異的ヌクレアーゼを使用することができ、相同組換え修復（ＨＤＲ）を通して、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の間の末端捕捉によって、導入遺伝子を切断部位に組み込むことができる。組込みプロセスは、ドナーと内因性遺伝子座との間の導入遺伝子ドナーにおける相同領域の使用または不使用によって決定される。
【０００７】
あるいは、導入遺伝子は、そのセーフハーバー遺伝子座で見出されるプロモーターを利用することができるか、または、挿入の前に導入遺伝子に融合される外因性プロモーターによる導入遺伝子の発現調節を可能にすることができる、ゲノム中の特異的「セーフハーバー」位置に挿入することができる。マウス細胞におけるＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、Ｒｏｓａ２６およびアルブミンを含むいくつかのそのような「セーフハーバー」遺伝子座が記載されている（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；８，７７１，９８５号；８，１１０，３７９号；７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１００２１８２６４号；２０１１０２６５１９８号；２０１３０１３７１０４号；２０１３０１２２５９１号；２０１３０１７７９８３号；２０１３０１７７９６０号；２０１５００５６７０５号および２０１５０１５９１７２号を参照のこと）。上記のように、セーフハーバー遺伝子に特異的なヌクレアーゼは、導入遺伝子構築物がＨＤＲまたはＮＨＥＪのいずれかによって駆動されるプロセスによって挿入されるように利用することができる。
【０００８】
ワクチン接種または受動免疫を通した工学的に操作された免疫の分野は、ヒトの健康における莫大な進歩につながった。集団のワクチン接種だけでも、痘瘡の地球規模の根絶をもたらし、ジフテリア、麻疹、おたふく風邪、百日咳、灰白髄炎、風疹および破傷風の発生率を低下させた。受動免疫は、一時的な免疫のためにナイーブ患者への血清または精製抗体の投与を含み（DealおよびBalazs（２０１５年）Curr  Opin  in  Immunol  ３５巻：１１３〜１２２頁）、狂犬病またはヘビ毒などの脅威への曝露を迅速に処置するために使用されている。
【０００９】
抗体は、多様な範囲の治療の開発のためにその結合柔軟性が活用されている、分泌タンパク質生成物である。治療抗体は、疾患を直接的に引き起こす標的タンパク質（例えば、黄斑変性症におけるＶＥＧＦ）の中和、ならびにその持続性および複製が宿主を危険にさらす細胞（例えばがん細胞、ならびに自己免疫疾患におけるある特定の免疫細胞またはウイルス感染細胞）の高度に選択的な殺滅のために使用することができる。そのような適用では、治療抗体は、抗体の標的抗原を有する標的タンパク質または細胞の選択的殺滅、中和またはクリアランスを達成するために、それ自身の抗体への体の正常な応答を利用する。したがって、抗体療法は、腫瘍学、リウマチ学、移植および眼の疾患を含む多くのヒトの状態に広く適用されている。抗体治療薬の例には、黄斑変性症の処置のためのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、非ホジキンリンパ腫の処置のためのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）および乳がんの処置のためのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。
【００１０】
現代の治療抗体には、様々な構成がある。モノクローナル抗体は、典型的には、標準の２本の軽鎖、２本の重鎖ＩｇＧタイプの分子の正確なコピーである。他の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ２およびＦａｂ３抗体断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ラクダ抗体に基づく抗体、およびトランスフェリン構造などの他のドメインを分子の基礎として使用する新規「抗体」が含まれる（Goswamiら（２０１３年）Antibodies（２巻）：４５２頁）。単一のオープンリーディングフレームによってコードされる抗体の１タイプは、単鎖抗体または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。これらのｓｃＦｖは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域がフレキシブルリンカーによって連結されるように、伝統的なモノクローナル抗体の最小の抗原結合ドメインを含む（図１）。ｓｃＦｖは標準のモノクローナル抗体よりはるかに小さく、高い標的結合親和性を有して工学的に操作することができ、したがって、固形腫瘍および脳などの他の複雑な組織をより容易に貫通することができる。ｓｃＦｖのライブラリーが酵母およびファージに存在し、高度に特異的である抗体の選択を可能にし、これらの高度に特異的な抗体をコードする遺伝子は、ウイルス形質導入ベクターに挿入することができる。別の単鎖抗体タイプはｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体であり、ここで、抗体上のＶＬおよびＶＨコード部分は単一のオープンリーディングフレームにクローニングされる。このタイプの抗体は、ｓｃＦｖの特徴（組織貫通性、単一のポリペプチド鎖）を有するのに十分小さいという利点を有するが、そのタンパク質が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの典型的な抗体依存性プロセスを刺激することを可能にする抗体のＦｃ部分も有する（例えば、Hongら、（２０１２年）Immune  Network  １２巻（１号）：３３頁を参照のこと）。
【００１１】
しかし、現在の抗体療法は、それらの欠点を有する。治療抗体はしばしば哺乳動物細胞の大規模培養で産生しなければならず、広範の精製技術にかけなければならないので、それらの産生費用はかなり高くなり得る。治療的処置は、相当な量の抗体（例えば、１用量につき６〜１２ｇのリツキシマブ）をしばしば必要とする。治療抗体の一部の機能的限界には、不十分な薬物動態および組織到達可能性、ならびに免疫系との相互作用の減少が含まれる（Chamesら（２００９年）Br.  J  Pharm  １５７巻：２２０頁）。
【００１２】
アルブミンは、肝臓で産生され、血液中に分泌されるタンパク質である。ヒトでは、血清アルブミンは血液で見出されるタンパク質の６０％を占め、その機能はコロイド浸透圧を調節することによって血液量（blood  volume）を調節することのようである。それは、低い溶解性の分子、例えば、脂溶性ホルモン、胆汁酸塩、遊離脂肪酸、カルシウムおよびトランスフェリンのためのキャリアとしての役目もする。さらに、血清アルブミンは、ワルファリン、フェノブタゾン、クロフィブレートおよびフェニトインを含む治療薬を運ぶ。ヒトでは、アルブミン遺伝子座は高度に発現され、毎日概ね１５ｇのアルブミンタンパク質の生成をもたらす。アルブミンはオートクリン機能を有さず、単一対立遺伝子性ノックアウトに関連したいかなる表現型はないようであり、二対立遺伝子のノックアウトについて軽度の表現型の観察だけが見出される（Watkinsら（１９９４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９１巻：９４１７頁を参照のこと）。
【００１３】
治療薬の血清中半減期を増加させるために治療試薬にカップリングさせる場合にも、アルブミンが使用されている。例えば、Osbornら（J  Pharm  Exp  Thera（２００２年）３０３巻（２号）：５４０頁）は、血清アルブミン−インターフェロンアルファ融合タンパク質の薬物動態を開示しており、融合タンパク質がおよそ１４０倍遅いクリアランスを有し、そのため融合物の半減期がインターフェロンアルファタンパク質単独より１８倍長かったことを実証している。最近開発中のアルブミン融合物である治療的タンパク質の他の例には、Ａｌｂｕｌｉｎ−Ｇ（商標）、Ｃａｒｄｅｖａ（商標）およびＡｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、それぞれインスリン、ｂタイプナトリウム利尿薬またはＧＣＳＦに融合）、Ｓｙｎｃｒｉａ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、グルカゴン様ペプチド−１に融合）およびＡｌｂｕｆｅｒｏｎ  α−２Ｂ、ＩＦＮ−アルファに融合、が含まれる（Current  Opinion  in  Drug  Discovery  and  Development、（２００９年）、第１２巻、２号、２８８頁を参照のこと）。これらの場合、Ａｌｂｕｌｉｎ−Ｇ（商標）、Ｃａｒｄｅｖａ（商標）およびＳｙｎｃｒｉａ（登録商標）は、全て、アルブミンが融合物のＮ末端で見出される融合タンパク質であるが、Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）およびＡｌｂｕｆｅｒｏｎアルファ２Ｇは、アルブミンが融合物のＣ末端にある融合物である。
したがって、所望の抗体導入遺伝子を発現させるために使用することができるさらなる方法および組成物の必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第９，２５５，２５０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書で、抗体導入遺伝子の標的化挿入および部分配列発現、例えば肝臓などの分泌組織からの抗体の発現のための方法および組成物が開示される。一態様では、抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、イントラボディなど）は、肝細胞のセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン遺伝子）へのヌクレアーゼ媒介標的化組込みの後にｉｎ  ｖｉｖｏの細胞中で発現される。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系などであってよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、Ｒｏｓａ、アルブミン）中の標的部位、例えば、表１に示す順番の認識ヘリックスドメインを有するアルブミン標的化ジンクフィンガータンパク質または表３に示すアルブミン標的化シングルガイドＲＮＡを認識するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥまたはシングルガイドＲＮＡ）を含む。したがって、本明細書で、細胞（例えば、肝細胞、筋肉細胞、または幹細胞、例えば造血幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）の中で、がん抗原、細胞受容体、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、キナーゼ阻害剤、インテグリン、α−シヌクレイン、アミロイドタンパク質および補体タンパク質の群から選択されるタンパク質に結合する抗体（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、イントラボディまたはダイアボディ）を発現させる方法であって、細胞が抗体を産生するように、抗体をコードする導入遺伝子を細胞のセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子）に組み込むことを含む方法が開示される。導入遺伝子の発現は、内因性プロモーターまたは外因性プロモーター（例えば、導入遺伝子の一部である）によって駆動させることができる。導入遺伝子は、内因性セーフハーバー（例えば、アルブミン配列）と発現させることができ、および／またはアルブミンコード配列を含むことができる。被験体の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで（生きている被験体中で）またはｅｘ  ｖｉｖｏ（導入遺伝子は単離細胞に組み込まれ、単離細胞は生きている被験体に投与される）で改変することができる。導入遺伝子は、非ウイルス性の（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡ）ベクターまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、Ａｄなど）を使用して送達することができる。本明細書に記載される方法によって産生される遺伝子改変細胞も提供され、その細胞は、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた抗体をコードする導入遺伝子を含む。本明細書に記載される方法（ｅｘ  ｖｉｖｏ、または、ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれでも、抗体は被験体の細胞または組織（例えば、肝臓、血清および／または脳）で発現され、さらに、抗体はがん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／もしくは骨関節炎を処置ならびに／または予防する。がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎を処置する方法で使用するための１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数の抗体コード導入遺伝子も提供され、この方法は、それを必要とする被験体に１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数の導入遺伝子を投与して、抗体を産生する細胞を生成することを含み、ここで、抗体は、がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／または骨関節炎に関与するタンパク質に結合し、導入遺伝子は天然に存在しないヌクレアーゼを使用して細胞の内因性セーフハーバー（例えば、アルブミン）遺伝子座に組み込まれ、細胞は抗体を産生する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、抗体コード導入遺伝子の標的化組込みのために使用される組成物は、１つまたは複数のジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（または、ヌクレアーゼの１つまたは複数の構成成分をコードするポリヌクレオチド）を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む。ヌクレアーゼ（その構成成分）および／または導入遺伝子は、ポリヌクレオチドの形で、ｍＲＮＡとして、またはプラスミドの形で細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に送達することができる。一部の態様では、ｍＲＮＡは化学改変されてもよい（例えば、Kormannら、（２０１１年）Nature  Biotechnology  ２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照のこと）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含むことができる（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照のこと）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未改変のおよび改変されたヌクレオチドの混合物を含むことができる（米国特許出願公開第２０１２０１９５９３６号を参照のこと）。なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、ＷＰＲＥエレメントを含むことができる（米国特許出願第１５／１４１，３３３号を参照のこと）。
【００１７】
ヌクレアーゼ（または、その構成成分）は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の発現ベクターを使用して送達することもできる。一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。一態様では、ウイルスベクターは、組織特異的向性を呈示する。
【００１８】
別の態様では、本明細書で、ヌクレアーゼを使用してセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン）に組み込まれた抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、イントラボディなど）をコードする導入遺伝子を含む、遺伝子改変宿主細胞が記載される。抗体は、例えばがん抗原、細胞受容体、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、キナーゼ阻害剤、インテグリン、α−シヌクレイン、アミロイドタンパク質および補体タンパク質の群から選択されるタンパク質を含む任意の標的（抗原）に結合して、がん、自己免疫疾患、神経障害、疼痛および／もしくは骨関節炎を処置ならびに／または予防することができる。宿主細胞は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび導入遺伝子（複数可）によって、安定して形質転換すること、もしくは一時的にトランスフェクトすること、またはその組合せが可能である。ヌクレアーゼおよび導入遺伝子（複数可）（ドナー（複数可）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に導入することができる。一実施形態では、宿主細胞は胚性幹細胞である。抗体コード導入遺伝子が組み込まれる好適な細胞の非限定的な例には、真核生物の細胞または細胞株、例えば、分泌細胞（例えば、肝細胞、粘膜細胞、だ液せん細胞、下垂体細胞など）、血液細胞（例えば、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、幹細胞などが含まれる。本明細書に記載される実施形態のいずれでも、宿主細胞は、非ヒト胚細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物の胚細胞を含むことができる。ある特定の実施形態では、抗体コード配列（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、イントラボディなど）は、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）標的部位（複数可）および／または切断部位でまたはその近くで、例えばヌクレアーゼ標的部位（米国特許第９，３９４，５４５号；９，１５０，８４７号；米国特許出願公開第２０１６００６０６５６号および配列番号１１、１２、１３、１５、１７、１９、２１に示すヌクレアーゼ標的部位を限定されずに含む）もしくは切断部位の中で、またはヌクレアーゼおよび／もしくは切断部位の１〜５０塩基対（または、その間の任意の値）の中で、アルブミン遺伝子に導入される。
【００１９】
別の態様では、本明細書で、抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、イントラボディなど）をコードする導入遺伝子を、細胞中のセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン遺伝子）に導入する方法であって、細胞に、（ｉ）セーフハーバー（例えば、アルブミン遺伝子）中の標的部位に結合する１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）導入遺伝子を、ヌクレアーゼ（複数可）が発現され、導入遺伝子がセーフハーバー（例えば、アルブミン遺伝子）に組み込まれるような条件下で導入することを含む方法が記載される。
【００２０】
導入遺伝子（ドナー）配列は、別個のベクター（例えば、ｍＲＮＡ、Ａｄ、ＡＡＶまたはＬＶベクター）に存在するヌクレアーゼを含む送達ベクターに存在することができるか、または、代わりに、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することができる。標的遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子など）へのドナーヌクレオチド配列のそのような挿入は、標的遺伝子座（例えば、アルブミン）の遺伝子制御エレメントの制御下でドナーが運ぶ抗体導入遺伝子の発現をもたらすことができる。一部の態様では、導入遺伝子は外因性プロモーターの制御下にあるが、他の態様では、導入遺伝子は挿入部位のプロモーター（例えば、アルブミン遺伝子に挿入されるときはアルブミンプロモーター）の制御下にある。他の態様では、例えばアルブミン遺伝子への抗体導入遺伝子の挿入は、インタクトな外因性抗体タンパク質配列の発現をもたらし、内因的に（例えば、アルブミン）コードされるいかなるアミノ酸も欠く。他の態様では、発現される外因性抗体タンパク質は融合タンパク質であり、抗体導入遺伝子およびセーフハーバー（例えば、ｎアルブミン）遺伝子（例えば、内因性の標的遺伝子座からの、または代わりに、導入遺伝子上のアルブミンコード配列からの）によってコードされるアミノ酸を含む。一部の場合には、アルブミン配列は外因性抗体タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在するが、他の場合には、アルブミン配列は外因性抗体タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する。他の場合には、アルブミン配列は外因性抗体タンパク質のＮおよびＣ末端部分両方に存在する。アルブミン配列は完全長野生型または変異体アルブミン配列を含むことができるか、または代わりに、部分的アルブミンアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、アルブミン配列（完全長または部分的）は、それが融合する抗体導入遺伝子によって発現される抗体の血清中半減期を増加させる役目をし、および／またはキャリアとしての役目をする。一部の態様では、抗体導入遺伝子は、Ｔ細胞またはＢ細胞中においてセーフハーバー（例えば、アルブミン遺伝子）に挿入される。一部の実施形態では、抗体導入遺伝子は、Ｔ細胞またはＢ細胞特異的プロモーターによって調節される。好ましい実施形態では、抗体導入遺伝子はＢ細胞のセーフハーバー（例えば、アルブミン）に挿入され、Ｂ細胞特異的プロモーター（例えば、ＣＤ１９もしくはＢ２９または免疫グロブリンカッパ軽鎖）によって調節される。他の好ましい実施形態では、抗体導入遺伝子はＴ細胞のセーフハーバーに挿入され、Ｔ細胞特異的プロモーター（例えば、Ｐｍｅｄ１、ＴＲＢＣ）によって調節される（Heusohnら（２００２年）J.  Immunol  １６８巻：２８５７頁）。一部の実施形態では、抗体導入遺伝子は、造血幹細胞に挿入され、ここで、導入遺伝子構築物は、導入遺伝子が幹細胞分化の後に発現されるように細胞型特異的プロモーターを含む。他の実施形態では、Ｔおよび／またはＢ細胞はドナーから収集され、抗体導入遺伝子構築物がｅｘ  ｖｉｖｏで導入され、次に、工学的に操作された細胞はドナーに、またはそれを必要とする患者に再導入して戻される。好ましい実施形態では、導入遺伝子構築物��、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）によって駆動される標的化組込みを使用して、Ｔおよび／またはＢ細胞のゲノムに組み込まれる。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン）プロモーター（例えば、内因性のプロモーターまたは導入遺伝子の一部である外因性のプロモーター）の制御下で抗体導入遺伝子を発現させるために使用することができる方法および組成物を記載する。一部の態様では、抗体導入遺伝子は、治療抗体、例えば、その標的（抗原）に結合するときに障害を有する被験体において臨床上の（治療的）利点を提供する抗体をコードすることができる。ある特定の実施形態では、抗体はがん抗原を認識し、がんの処置および／または予防をもたらすことができる。がん抗原の非限定例には、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＣＲ４、ＷＴ−１、ＨＥＲ２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＰＣＡＭ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍｕｃ１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）およびチロシナーゼが含まれる（より広範なリストについては、PolanskiおよびAnderson（２００６年）Biomarker  Insights  ２巻：１〜４８頁を参照のこと）。さらに、腫瘍学適用のために有益な抗体には、ＰＤ１およびＣＴＬＡ４などのチェックポイント阻害剤が含まれる（Sureshら（２０１４年）J  Hematol  Oncol  ７巻：５８頁）。他のがん標的には、例示のためだけであるが、多数のＣＴ抗原のうちのほんのいくつかを挙げると、ＭＡＧＥ−Ａ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ１、ＣＴ７．ＮＨ−ＳＡＲ−３５、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＬＣＯ６Ａ１、ＰＡＳＤ１、ＣＡＧＥ−１、ＫＫ−ＬＣ−１を含む、がん／精巣（ＣＴ）抗原が含まれる（CabelleroおよびChen（２００９年）Cancer  Sci  １００巻（１１号）：２０１４〜２０２１頁）。他の実施形態では、組み込まれた導入遺伝子によってコードされる抗体は、炎症性応答調節因子を認識し、自己免疫療法のために有益である。これらの抗体によって処置することができる状態には、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎、喘息、乾癬、糖尿病性網膜症、グレーブス病、橋本病、多発性硬化症、ループス、Ｉ型糖尿病、緑内障、視神経脊髄炎、血管炎および強皮症が少なくとも含まれる。炎症性状態の処置のために有益な抗体標的の非限定例には、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２６、ＲＡＮＫＬ）、Ｊａｋキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β、α４β７インテグリン、α４β１インテグリン、ＴＮＦα、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＣＤ２０、アネキシンＡ２およびＣ１ｑを含む古典的補体経路が含まれる（Tanidaら（２０１５年）World  J  Gastro  ２１巻（２９号）：８７７６〜８６頁；Neurath（２０１４年）Nature  ７巻（１号）：６頁；Riceら（２０１５年）J  Clin  Invest  １２５巻（７号）：２７９５頁；Palmer（２０１３年）Br  J  Clin  Pharm  ７８巻（１号）：３３〜４３頁）。
【００２２】
一部の実施形態では、抗体は治療抗体であり、受容体を標的にし（結合し）、がんの処置のために有益である（Zhuら（２０１５年）Lancet  １６巻（１５号）ｅ５４３〜ｅ５５４頁）。一部の実施形態では、治療抗体は、他の細胞受容体を標的にする（例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体（Wuら（２０１０年）Nature  ４６４巻：１０５２〜１０５７頁）、Ｇタンパク質共役受容体（Joら、（２０１６年）Exp  Mol  Med.４８巻（２号））。他の実施形態では、抗体は増殖因子受容体を認識し（結合し）、がん、神経障害および精神障害のために有益である（Turnerら（２０１５年）Semin  Cell  Dev  Biol.、１０月８日、pii:  S1084-9521(15)00188-3.  doi:  10.1016/j.semcdb.2015.10.003）。一部の実施形態では、抗体はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的にし、がんの処置のために有益である（Sasadaら（２０１６年）Front  Pharmacol.７巻：４０５頁、eCollection  2016）。他の非限定的な抗体標的例には、パーキンソン病および多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーの処置のためのα−シヌクレイン、アルツハイマー病のためのアミロイドβ（Ａβ）（Liuら（２０１５年）J  Neuroinflam  １２巻：１５３頁）、疼痛および／またはアルツハイマー病の処置のためのＮＧＦおよびＴｒｋＡ（Hiroseら（２０１５年）、Pain  Pract  doi:10.1111）、慢性疼痛および片頭痛のためのＣＧＲＰ（Bigalら（２０１５年）Lancet  Neurology  １４巻（１１号）：１０９１頁、ならびに骨関節炎のためのＮＧＦ（Gowら（２０１５年）Arthritis  Res  Ther  doi:10.1186）が含まれる。
【００２３】
他の実施形態では、抗体は自己認識マーカーに結合し、移植の間の治療のために有益である。例えば、van  den  Hoogen（２０１１年）Immunotherapy  ３巻（７号）：８７１〜８０頁を参照されたい。抗体処置のために有益なさらなる治療領域には、喘息、乾癬、心臓虚血、ウイルス感染症およびヘモグロビン尿症が含まれる（Susukiら（２０１５年）J  Tox  Pathol  ２８巻：１３３頁を参照のこと）。治療抗体の他の使用には、薬物習慣性の処置が含まれる（Stevensら（２０１４年）mAbs  ６巻：２号：５４７頁；Harrisら（２０１５年）PLOS  ONE  doi:10.1371/journal.pone.0118787）。
【００２４】
したがって、本方法は、抗体の供給によって処置および／または予防することができる任意の障害を処置および／または予防するｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法を含む。ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、抗体が被験体において発現されるように、セーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン）を標的にした１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数の治療抗体コード導入遺伝子を被験体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、抗体は第１の部位（例えば、肝臓）に投与され、被験体の１つまたは複数の二次性の部位（例えば、脳、血清、骨格筋、心臓など）においても見出される。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、導入遺伝子によって産生される抗体は、工学的に操作された細胞内抗体断片（イントラボディ）である。そのようなイントラボディは、タンパク質によって媒介される細胞内プロセスを阻害するのに有益である。例えば、本発明の方法および組成物によって産生されるイントラボディは、変異体α１−抗トリプシンを標的にし、その重合を防止することができ、こうして関連する肝傷害を予防または処置することができ（Ordonezら（２０１５年）FASEB  J  ２９巻：２６６７頁を参照のこと）、または、プロテアーゼ阻害剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンおよび感染性ウイルスを標的にして、耐性Ｃ型肝炎の複製を阻害することができる。
【００２６】
一部の態様では、抗体をコードする導入遺伝子は、単一のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖が単一のポリペプチドにコードされ、切断配列（例えば、２ａペプチド）によって分断される。一部の実施形態では、切断に続いて、露出したポリペプチド配列は、コンジュゲーション反応に関与するために利用可能である。好ましい実施形態では、コンジュゲーション反応は、抗体の発現、切断およびコンジュゲーションの際に、抗体−小分子コンジュゲートが産生されて、分泌されるように、抗体鎖に低分子を連結することに関与する。
【００２７】
他の実施形態では、導入遺伝子ポリペプチドは、ｓｃＦｖ抗体をコードする。なおさらなる実施形態では、ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体をコードする。一部の実施形態では、２つのｓｃＦｖ抗体が産生されるように、２つの導入遺伝子が挿入される。他の実施形態では、抗体は２つの融合ｓｃＦｖを含み、ここで、１つのｓｃＦｖは目的の抗原（例えば、がん抗原）を認識し、他はＴ細胞抗原、いわゆる「ＢｉＴＥ」または二重特異的Ｔ細胞エンゲージャーを認識し、こうしてがん細胞のＴ細胞によって駆動される溶解を再誘導する（例えば、HoffmanおよびGore（２０１４年）Front  Oncol  ４巻：６３頁を参照のこと）。他の実施形態では、抗体をコードする導入遺伝子は、単鎖ダイアボディをコードする。これらは、３つのリンカーによって接続される同じかまたは２つの抗体の可変重鎖および軽鎖ドメインで構成される組換え分子である（Storkら（２００９年）J  Biol  Chem  ２８４巻（３８号）：２５６１２〜２５６１９頁）。一部の場合には、ダイアボディは二重特異的ダイアボディである（KontermannおよびBrinkmann（２０１５年）Drug  Dis  Today  ２０巻（７号）：３８頁）。
【００２８】
一部の態様では、抗体コードドナーは、抗体の発現を調節するためのスイッチをさらに含む。一部の実施形態では、スイッチは、小分子の調節可能なリボザイムの使用を含む。一部の実施形態では、リボザイムは安全スイッチとして作用し、導入遺伝子ドナーの３’末端に付加される。リボザイムは小分子によって調節され、小分子の存在下ではリボザイムは自己切断から阻害される（Kennedyら（２０１４年）NAR  ４２巻（１９号）：１２３０６頁を参照のこと）。他の実施形態では、スイッチは誘導性プロモーターへのリガンドアプタマーの結合を含み、リガンドの存在下ではプロモーターの発現がオンにされる。なおさらなる実施形態では、遺伝子発現の誘導のためにトランス活性化因子の結合に依存する遺伝子スイッチ系を使用することができ、ここで、トランス活性化因子の結合はテトラサイクリンもしくはドキシクライン（ｔｅｔ  ＯＦＦ）などの小分子への結合によって阻害され、または、トランス活性化因子の結合は、プロモーター領域に首尾よく結合するために小分子に依存する（ｔｅｔ−ＯＮ）。
【００２９】
一部の態様では、本発明は、それを必要とする被験体における状態を予防または処置するのに有用であり得る組成物を記載する。一部の実施形態では、組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの染色体への組込みのための標的化ヌクレアーゼおよび特異的導入遺伝子を含むウイルスベクター送達系を含む。他の実施形態では、導入遺伝子の発現が体内への調節因子の導入によって制御可能であるように、導入遺伝子は調節スイッチを含む。好ましい実施形態では、調節因子は小分子である。一部の実施形態では、処置される状態は、がんである。他の実施形態では、状態は、ウイルス障害または自己免疫障害である。さらなる実施形態では、状態は周期的（「再燃する」）であり、状態の症状は被験体の生存期間（数週、数ケ月、数年）にわたって増減する。一部の実施形態では、導入遺伝子は疾患再燃（disease  flare）の初期期間中に、遺伝子スイッチの活性化によってオンにされる。処置または予防することができる再燃している状態の非限定例には、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、喘息、大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤおよび湿疹が含まれる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、細胞外の因子を検出して細胞による応答をもたらす、膜貫通センサーをコードする。一部の場合には、センサーは、疾患再燃の間に生成される因子を検出する。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明の方法は、トランスジェニック動物系においてｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。一部の態様では、トランスジェニック動物は、モデルの開発で使用することができ、そこでは、導入遺伝子は慢性状態を処置するために使用されるであろう抗体をコードする。一部の場合には、トランスジェニック動物は、疾患（例えば、がん）に関係があるモデル系であってよい。そのようなトランスジェニックモデルは、状態の処置または予防（treatment  of  prevention）のためにこれらの抗体の治療的使用を評価するために使用することができる。他の態様では、トランスジェニック動物は、産生目的のために、例えば抗体を産生するために使用することができる。ある特定の実施形態では、動物は小さい哺乳動物、例えば、イヌ、ウサギ、またはラット、マウスもしくはモルモットなどのげっ歯動物である。他の実施形態では、動物は非ヒト霊長類である。まだその上さらなる実施形態では、動物は、ウシ、ヤギまたはブタなどの家畜である。一部の態様では、抗体導入遺伝子は、選択された遺伝子座（例えば、アルブミン）に、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝臓の幹細胞など）に、または本明細書に記載される方法のいずれかによって得た動物の胚に組み込まれ、その後、生きた動物が生まれるように胚が植え込まれる。動物は、次に性的成熟まで育てられて子孫を生むことができ、ここで、子孫の少なくとも一部は組み込まれた抗体導入遺伝子を含む。
【００３１】
なおさらなる態様では、本明細書で、染色体の内因性遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子）、例えば胚の染色体への、抗体をコードする核酸配列の部位特異的な組込みのための方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）胚に、（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡベクターであって、組み込まれる抗体をコードする核酸配列に隣接している上流配列および下流配列を含むＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）標的遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）における組込み部位を認識するジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を注射するステップ、および（ｂ）ジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの発現を可能にするために胚を培養するステップであって、核酸配列を染色体に組み込むように、ヌクレアーゼによって組込み部位に導入される二本鎖切断が、ＤＮＡベクターによる相同組換えを通して修復される、培養するステップ、を含む。
【００３２】
適する胚は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類および魚類の種を含む、いくつかの異なる脊椎動物種に由来することができる。一般的に言って、適する胚は、ヌクレアーゼの発現を可能にするために収集し、注射し、培養することができる胚である。一部の実施形態では、適する胚には、小さい哺乳動物（例えば、げっ歯動物、ウサギなど）、伴侶動物、畜産動物および霊長類からの胚を含めることができる。げっ歯動物の非限定例には、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミおよびモルモットを含めることができる。伴侶動物の非限定例には、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットを含めることができる。畜産動物の非限定例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカおよびウシを含めることができる。霊長類の非限定例には、ノドジロオマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびベルベットサルを含めることができる。他の実施形態では、適する胚には、魚類、爬虫類、両生類または鳥類からの胚を含めることができる。あるいは、適する胚は、昆虫の胚、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚またはカの胚であってもよい。
【００３３】
本明細書に記載される方法または組成物のいずれでも、工学的に操作された遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）を含有する細胞は、幹細胞であってよい。本発明の方法および組成物で使用することができる具体的な幹細胞型には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および肝性または肝臓の幹細胞が含まれる。ｉＰＳＣは、患者試料に由来するおよび正常対照に由来することができ、ここで、患者由来のｉＰＳＣは目的の遺伝子において正常な遺伝子配列へと変異させることができ、または、正常細胞は目的の遺伝子において公知の疾患対立遺伝子へと変更することができる。同様に、肝性幹細胞は、患者から単離することができる。これらの細胞は、目的の導入遺伝子を発現するように次に工学的に操作され、拡張され、次に患者に再導入される。
【００３４】
一部の実施形態では、本方法および組成物は、抗体の産生および分泌のために細胞株を工学的に操作するために使用される。これらの細胞株は、治療的使用、診断的使用または工業的使用のために多量の抗体を産生するために使用される。一部の実施形態では、細胞はマウス細胞であり、他の実施形態では、それらはハムスター細胞である。さらなる実施形態では、細胞が由来する動物系は、その目的のために最適のものである。一部の実施形態では、抗体は細胞から分泌される。他の実施形態では、抗体は細胞の中に保持される（それらは抗体を単離するために溶解することができ、または、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療で患者に投与することができる）。
【００３５】
少なくとも１つのＤＮＡベクターを含む胚も提供され、ここで、ＤＮＡベクターは、組み込まれる抗体をコードする核酸配列に隣接している上流配列および下流配列、ならびに組込みの染色体部位を認識するヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。本明細書に記載される胚のいずれかに由来する生物体も提供される（例えば、性的成熟まで発達させ、後代を産むことが可能な胚）。
【００３６】
別の態様では、本発明の方法および組成物は、障害、例えば抗体を使用して処置および／または予防することができる障害に罹患した動物の処置で使用するための、薬物ライブラリーおよび／または他の治療組成物（すなわち、抗体、構造的ＲＮＡなど）のスクリーニングにおける細胞、細胞株および動物（例えば、トランスジェニック動物）の使用を提供する。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用い細胞レベルで開始することができ、動物全体（例えば、ヒト）の処置のレベルまで進行することができる。
【００３７】
抗体コード導入遺伝子および／またはヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含むキットも、提供される。キットは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、適する発現ベクターに含有されるヌクレアーゼ（複数可）をコードするＲＮＡ分子遺伝子）をコードする核酸、ドナー導入遺伝子分子、適する宿主細胞株、本発明の方法を実行するための指示などを含むことができる。
【００３８】
これらおよび他の態様は、全体として開示に照らして当業者にとって容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、抗体構造の簡略化された概観を表す。略記号の意味は、図の最下部に示す。
【００４０】
【図２】図２は、内因性セーフハーバー遺伝子座における工学的に操作された抗体の工学的に操作されたヌクレアーゼ媒介挿入を表す概略図である。「ＳＡ」は、スプライスアクセプター部位を指す。「ｐＡ」は、ポリアデニル化シグナルを指す。「Ｅｘ１」は、内因性セーフハーバー（例えば、アルブミン）遺伝子座のエクソン１を指す。「ＳｃＦｖ」は単鎖可変断片を指し、「ＳｃＦｖ−Ａｌｂ」は、ＳｃＦｖ配列ならびにアルブミン配列を含むキメラタンパク質を指す。「ＢｉＴＥ」は、二重特異的Ｔ細胞エンゲージャーを指す。
【００４１】
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、例示的な抗体ドナーおよびヌクレアーゼデザインを表す一連の概略図である。図３Ａは、ドナー分子の例示的な単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）デザインを示す。図３Ｂは、ダイアボディドナーの例示的なデザインを示す。図３Ｃは、ＳｃＦｖ−アルブミン融合ドナーの例示的なデザインを示す。図３Ｄは、ダイアボディ−アルブミン融合ドナーの例示的なデザインを示す。図３Ａ〜３Ｄに表す抗体ドナーは、プロモーター／エンハンサー領域を欠く。図３Ｅは、Ｃ末端の血液脳関門標的化モチーフを有する例示的なＳｃＦｖドナーデザインを示し、この例では、ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００低密度リポタンパク質の残基３３７１〜３４０９を使用した。「ＩＴＲ」は、ＡＡＶウイルスベクター由来の逆方向末端反復を指す。「ＨＡ」はホモロジーアームを指し、「ＳＡ」はスプライスアクセプター配列を指す。「ＶＨ」および「ＶＬ」は、それぞれ抗体重鎖または軽鎖由来の抗体可変領域を指す。「（ＧｘＳ）ｎ」は、２つの可変ドメインの間のリンカー配列を指す。「ＡｐｏＢ  ＬＤＬＲ」は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００低密度リポタンパク質（ＡｐｏＢ  ＬＤＬ）残基３３７１〜３４０９であり、「ｐＡ」はポリアデニル化シグナルを指す。
【００４２】
【図４】図４は、ヌクレアーゼデザインを表す概略図を示す。抗体ドナーの標的化組込みのためのセーフハーバー切断のために使用される対の各ＺＦＮのための別個のベクターのデザイン。「ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ」は、ＡｐｏＥエンハンサー配列に融合させるｈＡＡＴプロモーターを指す。全ての他の略記号は、図３における通りである。
【００４３】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、内因性アルブミン遺伝子座への示された抗体コード導入遺伝子ドナーの標的化組込みの後の、工学的に操作された抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を示すグラフを表す。図５Ａは、Ｈｅｐａ１−６細胞へのアルブミン標的化ＺＦＮおよび抗体ドナーの投与の後の、Ｈｅｐａ１−６細胞上清において検出される工学的に操作された抗体の全レベルを示す。この実験では、Ｈｅｒ２  Ｃ６．５ダイアボディを、工学的に操作された抗体ドナーとして使用した。図５ＢはＨｅｒ２に結合するＨｅｒ２  Ｃ６．５ダイアボディを表すグラフであり、アルブミン遺伝子座から産生された抗体が適切に折り畳まれ、目的の標的に結合したことを実証する。ＺＦＮ：ドナーについて示されたデータは、ｎ＝３の生物学的反復のデータである。エラーバーは、技術的反復の標準偏差を表す。
【００４４】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、内因性アルブミン遺伝子座への示された抗体コード導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介組込みの後の、工学的に操作された抗体−アルブミン融合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を示すグラフである。図６Ａは、Ｈｅｐａ１−６細胞へのアルブミン標的化ＺＦＮおよび抗体−アルブミンドナーの投与の後の、Ｈｅｐａ１−６細胞上清において検出される工学的に操作された抗体−アルブミン融合物の全レベルを示す。この実験では、Ｈｅｒ２  Ｃ６．５ダイアボディ−ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）融合物を、抗体ドナーとして使用した。図６ＢはＨｅｒ２に結合するＨｅｒ２  Ｃ６．５ダイアボディ−ＭＳＡを表すグラフであり、アルブミン遺伝子座から産生された抗体が適切に折り畳まれ、目的の標的に結合することを実証する。ＺＦＮ：ドナーについて示されたデータは、ｎ＝３の生物学的反復のデータである。エラーバーは、技術的反復の標準偏差を表す。
【００４５】
【図７】図７は、内因性アルブミン遺伝子座への示した抗体コード導入遺伝子の標的化組込みの後の、工学的に操作されたアルファ−シヌクレイン抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を表すグラフである。Ｈｅｐａ１−６細胞へのアルブミン標的化ＺＦＮおよび抗体ドナーの投与の後の、Ｈｅｐａ１−６細胞上清において検出される工学的に操作された抗体の全レベル。この例では、アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ（Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅ）ＳｃＦｖの様々なバージョンを、工学的に操作された抗体ドナーとして使用した。Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅ  ＡｐｏＢ  ＬＤＬは、Ｃ末端のヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００低密度リポタンパク質ペプチド、ＬＤＬペプチド、Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅリンカー、Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅを含有し、Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅ  ｍｙｃ−３Ｘ  ＦｌａｇはＣ末端のＡｐｏＢ  ＬＤＬペプチドを含有しない。Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅリンカーは、Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅ  ＡｐｏＢ  ＬＤＬドナーに存在するＣ末端のリンカーを保持するが、Ｓｙｎ  Ｄ５ＥおよびＳｙｎ  Ｄ５Ｅ  ｍｙｃ−３Ｘ  Ｆｌａｇは保持しない。Ｓｙｎ  Ｄ５Ｅ  ３Ｘ  Ｆｌａｇ構築物は、おそらくＥＬＩＳＡレベルアッセイにおける３Ｘ  Ｆｌａｇの増加した結合能力のために、より大きなレベルをもたらす。ＺＦＮ：ドナーについて示されたデータは、ｎ＝３の生物学的反復のデータである。エラーバーは、技術的反復の標準偏差を表す。
【００４６】
【図８】図８Ａ〜８Ｅは、内因性マウスアルブミン遺伝子座への抗体コード導入遺伝子の標的化組込みの後の、工学的に操作された抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を示すグラフである。図８Ａは、マウスへのアルブミン標的化ＺＦＮおよび様々なＣ６．５抗体ドナーの投与の後の、様々な工学的に操作されたＣ６．５抗体のレベルを表すグラフである。表１に表すように、ＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよびＡＡＶ２／８−ドナーを投与した（実施例を参照のこと）。血漿収集スケジュールは、表５に概説した（実施例を参照のこと）。図８Ｂ（Ｃ６．５ダイアボディ導入遺伝子）、８Ｃ（Ｃ６．５  ＳｃＦｖ−ＭＳＡドナー導入遺伝子）、８Ｄ（Ｃ６．５ダイアボディ−ＭＳＡ）および８Ｅ（Ｃ６．５ダイアボディ−ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）導入遺伝子）は、様々な工学的に操作されたＣ６．５抗体ドナーのレベルを経時的に表すグラフである。
【００４７】
【図９】図９は、示した抗体コード導入遺伝子ドナーのｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ媒介導入の後の、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子改変（％インデル）のレベルを表すグラフである。示されたデータは、試験品投与から２８日後のマウス研究の％インデルを反映する。
【００４８】
【図１０】図１０は、示した抗体コード導入遺伝子ドナーのｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ媒介導入の後の、ｉｎ  ｖｉｖｏ内因性アルブミン工学的に操作された抗体転写物のレベルを表すグラフであり、ここで、内因性アルブミン−Ｃ６．５  ｍＲＮＡのレベルは定量的ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。５’プライマーおよびプローブは内因性マウスアルブミン遺伝子座の中に位置し、３’プライマーは工学的に操作された抗体ドナーの中に位置する。
【００４９】
【図１１】図１１は、実施例３に記載される研究で使用された全てのｉｎ  ｖｉｖｏ投与群を示す表である。
【００５０】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、例示的な抗体ドナーおよびｃＤＮＡ構築物を表す概略図である。図１２Ａは、Ｃ末端の血液脳関門標的化モチーフを有する例示的な単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）デザインを示し、この例示的な構築物では、ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００低密度リポタンパク質の残基３３７１〜３４０９を使用した。この例は、アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ  ＳｃＦｖを表す。図１２Ｂは、例示的なＳｃＦｖ−ＧＢＡ融合物のデザインを示す。この例示的な構築物では、アルファ−シヌクレインＳｃＦｖは、ＧＢＡに融合させた。図１２Ｃは例示的なＳｃＦｖ  ｃＤＮＡを表し、それは、エンハンサー（ＣＲＭＳＢＳ２）、プロモーター（ＴＴＲｍ）およびイントロン（ＳＢＲＩｎｔｒｏｎ  ３）を含む、肝臓特異的プロモーターモジュールによって駆動されるｃＤＮＡ骨格中のアルファ−シヌクレインＳｃＦｖ  Ｄ５Ｅを含む。シグナルペプチドは、この例ではアルブミンに由来する。ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルである。図１２Ｄは例示的なＳｃＦｖ  ＧＢＡ  ｃＤＮＡを示し、そこでは、アルファ−シヌクレインＳｃＦｖ  Ｄ５Ｅは、エンハンサー（ＣＲＭＳＢＳ２）、プロモーター（ＴＴＲｍ）およびイントロン（ＳＢＲＩｎｔｒｏｎ  ３）を含む、肝臓特異的プロモーターモジュールによって駆動されるｃＤＮＡ骨格の中にある。ＳｃＦｖは、ＧＢＡに融合される。シグナルペプチドは、この例ではアルブミンに由来する。ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルである。ＣＲＭは、シス調節モジュールを指す。ＳＢＳ１／２は、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １および２を指す。ＴＴＲｍは、トランスチレチン最小プロモーターを指す。ＳＢＳは、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを指す。ＳＰは、シグナルペプチドを指す。ＩＴＲは、逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは、合成ポリアデニル化配列を指す。ＧＢＡは、グルコセレブロシダーゼを指す。使用される肝臓特異的構築物は、米国特許出願第１５／２０９，３６３号に詳述される。
【００５１】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、内因性アルブミン遺伝子座への標的化組込みの後の、工学的に操作されたアルファ−シヌクレイン単鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を表すグラフである。図１３Ａは、マウスへのアルブミン標的化ＺＦＮおよびアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体ドナーの投与の後の、工学的に操作されたアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体の循環血漿中レベルを表すグラフである。表６に表すように、ＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよびＡＡＶ２／８−ドナーを投与した。血漿収集スケジュールは、表７に概説した。図１３Ｂは、マウスへのアルブミン標的化ＺＦＮおよびアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体ドナーの投与の後の、工学的に操作されたアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ  ＧＢＡ抗体の循環血漿中レベルを表すグラフである。ＧＢＡは、グルコセレブロシダーゼを指す。表６に表すように、ＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよびＡＡＶ２／８−ドナーを投与した。血漿収集スケジュールは、表７に概説した。
【００５２】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子改変（％インデル）のレベルを表すグラフである。図１４Ａは、２８日および試験品投与後のマウス研究の％インデルを示し、図１４Ｂは試験品投与の５６日後の％インデルを示す。コホート１（２８日目）およびコホート２（５６日目）を、表８に概説する。
【００５３】
【図１５】図１５は、示された処置（ドナーおよび／またはＺＦＮ）を受けたアルファ−シヌクレイントランスジェニックｌｉｎｅ６１マウスからの皮質の代表的な免疫組織化学像を示す。切片をＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）で、続いてＨＲＰコンジュゲート二次抗体で染色し、ＤＡＢで可視化した。アストログリオーシスの疾患エンドポイント、ＧＦＡＰの低減は、本明細書に記載されるドナーおよび／またはＺＦＮ処置を受けたマウスで示される。
【００５４】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、Ｄ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）抗体転写物のｉｎ  ｖｉｖｏレベルを表すグラフである。図１６Ａは、肝臓において発現されるＤ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）抗体ｍＲＮＡのレベルが、抗体の重鎖内に含有されるプライマー／プローブを使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたことを示す。図１６Ｂは、肝臓において発現される内因性アルブミン−Ｄ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）融合物のｍＲＮＡのレベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたことを示す。５’プライマーおよびプローブは内因性マウスアルブミン遺伝子座の中に位置し、３’プライマーは工学的に操作されたＤ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）抗体ドナー重鎖の中に位置する。Ｄ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）抗体ｃＤＮＡはアルブミンシグナルペプチドを含有し、したがって、プライマープローブは、組み込まれた抗体からのハイブリッドアルブミン−Ｄ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）ｍＲＮＡと、Ｄ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）ｃＤＮＡ  ｍＲＮＡの両方も検出する。
【００５５】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、抗体レベルと皮質神経網および線条体における低減したアルファ−シヌクレインとの間の相関を示すグラフである。図１７Ａは、皮質神経網におけるアルファ−シヌクレインの補正された光学密度と皮質における抗体レベル（ｍｙｃによって表す）との間の比較を表すグラフである。製剤群を分析に含めた（除くと、有意性は増加した）ｐ値＝０．０４４８。図１７Ｂは、線条体におけるアルファ−シヌクレインの補正された光学密度と線条体における抗体レベル（ｍｙｃによって表す）との間の比較を表すグラフである。製剤群を分析に含めた（除くと、有意性は増加した）ｐ値＝０．０３９９。
【００５６】
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、アルファ−シヌクレイン陽性細胞およびアストログリオーシスマーカーＧＦＡＰのＣＮＳ蓄積の低減を示すグラフである。図１８Ａは、皮質中のアルファ−シヌクレイン陽性ニューロンの分析を示す。ｃＤＮＡ抗体処置群の両方について皮質中のアルファ−シヌクレイン陽性ニューロンの総数の低減があったが、これはＤ５Ｅ  ＧＢＡ抗体ｃＤＮＡ群においてのみ統計的に有意であった。統計的差（＊）は、事後分析による一元配置ＡＮＯＶＡで決定されたｐ＜０．０５。図１８Ｂは、アストログリオーシスマーカーＧＦＡＰを調べた、全ＣＮＳの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。両ｃＤＮＡ群についてＧＦＡＰの低減があったが、Ｄ５Ｅ  ＧＢＡ抗体ｃＤＮＡ群においてのみ統計的に有意であった。ｐ値＝０．０２１。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書で、内因性遺伝子座で、例えばアルブミン遺伝子などのセーフハーバー遺伝子において抗体を発現させるための組成物および方法が開示される。トランスジェニック抗体は血流への分泌のために肝臓中のアルブミン遺伝子座で発現させることができ、または、イントラボディとして細胞の中で維持することができる。抗体の発現の調節は、発現スイッチによって調節することができる。抗体は、治療上の恩恵を提供する抗体を含む、任意の抗体をコードすることができる。
【００５８】
したがって、本発明の方法および組成物は、分泌組織中の高度に発現される遺伝子座から治療的に有益な抗体タンパク質を（導入遺伝子から）発現させるために使用することができる。例えば、抗体導入遺伝子は、例えば血液の障害、および様々な他の一遺伝子性疾患の処置または予防のために有用な抗体としてコードすることができる。一部の実施形態では、抗体導入遺伝子は、抗体導入遺伝子の発現がアルブミン発現制御エレメントによって制御され、導入遺伝子でコードされる抗体の高い濃度での肝臓特異的発現をもたらすように、内因性アルブミン遺伝子座に挿入することができる。発現させることができる抗体は、腫瘍学、リウマチ学、移植および眼の疾患の処置において有用な、ある特定の抗原を標的にすることができる。
【００５９】
さらに、分泌組織への最終的な植え込みで使用するために、任意の導入遺伝子を患者由来の細胞に、例えば患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または他のタイプの幹細胞（非限定的なセットとして、胚性、造血性、神経または間葉性）に導入することができる。導入遺伝子は、アルブミン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子を限定されずに含むこれらの細胞中の、任意の目的領域に導入することができる。これらの改変された幹細胞は、例えば肝細胞に分化させて、肝臓に植え込むことができる。あるいは、導入遺伝子は、特異的組織を標的にするウイルス送達系または他の送達系を用いることにより、所望により分泌組織に向かわせることができる。例えば、送達ビヒクルとしての肝臓栄養（liver-trophic）アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＡＡＶ８の使用は、特異的ヌクレアーゼが導入遺伝子と共送達されるときに所望の遺伝子座での導入遺伝子の組込みをもたらすことができる。
一般
【００６０】
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当技術分野の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献において詳細に説明される。例えば、Sambrookら、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年および第３版、２００１年；Ausubelら、CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７年および定期の最新版；シリーズMETHODS  IN  ENZYMOLOGY、Academic  Press、San  Diego；Wolffe、CHROMATIN  STRUCTURE  AND  FUNCTION、第３版、Academic  Press、San  Diego、１９９８年；METHODS  IN  ENZYMOLOGY、第３０４巻、「Chromatin」（P.M.  WassarmanおよびA.  P.  Wolffe編）、Academic  Press、San  Diego、１９９９年；およびMETHODS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、第１１９巻、「Chromatin  Protocols」（P.B.  Becker編）、Humana  Press、Totowa、１９９９年を参照のこと。
定義
【００６１】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、直鎖状または環状の立体配座の、および一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものと解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されるヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
【００６２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６３】
「結合」は、巨大分子の間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有結合的相互作用を指す。結合相互作用が全体として配列特異的である限り、該結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要があるわけではない。そのような相互作用は、１０−６Ｍ−１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）によって一般的に特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指す。結合親和性の増加はより低いＫｄと相関する。
【００６４】
「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合で結合することができるタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合性タンパク質の場合、それはそれ自体に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）、および／またはそれは1つまたは複数の異なるタンパク質の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性タンパク質は、１つより多いタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質はＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００６５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または、結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定する結合ドメインの中のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質の中のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとしてしばしば略される。
【００６６】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、そのコグネイト標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復（repeat）」とも呼ばれる）は、長さが一般的に３３〜３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくとも一部の配列相同性を示す。参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。
【００６７】
ジンクフィンガードメインおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば天然に存在するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の工学操作（engineering）（１つまたは複数のアミノ酸を改変する）を通して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学的に操作する」ことができる。したがって、工学的に操作されたＤＮＡ結合性タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合性タンパク質を工学操作するための方法の非限定例は、デザインおよび選択である。デザインされたＤＮＡ結合性タンパク質は、そのデザイン／組成物が合理的な基準から主に生じる、天然に存在しないタンパク質である。デザインの合理的な基準には、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥデザインおよび結合性データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；および６，５３４，２６１号を参照のこと；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６および米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号も参照。
【００６８】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験プロセスから主に生じる、天然に見出されないタンパク質である。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８；ＵＳ５，９２５，５２３；ＵＳ６，００７，９８８；ＵＳ６，０１３，４５３；ＵＳ６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４および米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。
【００６９】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。この開示のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構による細胞中の二本鎖切断の修復の間に起こるそのような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知であるが、その理由は、それがドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすからである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むことなく、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、ドナーが標的の一部になる遺伝情報を再合成するために使用される「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連したプロセスに関与することができる。そのような特殊化したＨＲは標的分子の配列の変更をしばしばもたらし、そのため、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに組み入れられる。
【００７０】
本開示の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定部位の標的配列（例えば、細胞クロマチン）において二本鎖切断を生じさせ、切断領域のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在により、ドナー配列の組込みを促進することが示された。ドナー配列は物理的に組み込まれてもよいし、または代わりに、ドナーポリヌクレオチドを、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用し、細胞クロマチンへのドナーの場合のようにヌクレオチド配列の全部または一部の導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列を改変することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列へと変換することができる。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列の、別のものによる置き換え（すなわち、情報の意味での配列の置き換え）を表し、１つのポリヌクレオチドの、別のものによる物理的または化学的置き換えを必ずしも必要とするものではないことを理解することができる。
【００７１】
本明細書に記載される方法のいずれでも、細胞の中のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対を使用することができる。
【００７２】
細胞クロマチン中の目的領域における配列の標的化組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えによって変更される。切断の領域に相同性の配列が存在するならば、そのような相同組換えは細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
【００７３】
本明細書に記載される方法のいずれでも、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的領域のゲノム配列に相同的であるが同一でない配列を含有することができ、それによって相同組換えを刺激して、目的領域の中に同一でない配列を挿入することができる。したがって、ある特定の実施形態では、目的領域の配列に相同性であるドナー配列の部分は、置き換えられたゲノム配列と約８０から９９％（または、その間の任意の値）の間の配列同一性を呈示する。他の実施形態では、例えば、１０１個の連続した塩基対にわたってドナー配列とゲノム配列との間で１ヌクレオチドだけが異なる場合は、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある特定の場合には、新しい配列が目的領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的領域に存在しない配列を含有することができる。これらの場合には、非相同配列は、目的領域の配列に相同性または同一である、１０〜１，０００塩基対（または、その間の任意の整数値）または１，０００を超える任意数の塩基対の配列に一般的に隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は第１の配列に非相同性であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入されている。
【００７４】
本明細書に記載される方法のいずれも、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化組込みによる、細胞における１つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も、提供される。
【００７５】
さらに、本明細書に記載される標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性配列を組み込むために使用することもできる。外因性核酸配列は、例えば、１つまたは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つまたは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含むことができる。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生することができる。
【００７６】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を限定されずに含む、様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために融合ポリペプチドが使用される。
【００７７】
「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一のまたは異なる）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断半ドメイン」、「＋および−切断半ドメイン」ならびに「右および左切断半ドメイン」は互換的に使用されて、二量体化する切断半ドメインの対を指す。
【００７８】
「工学的に操作された切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の工学的に操作された切断半ドメイン）と絶対ヘテロダイマー（obligate  heterodimer）を形成するように改変された切断半ドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第８，６２３，６１８号；８，４０９，８６１号；８，０３４，５９８号；７，９１４，７９６号；および７，８８８，１２１号も参照されたい。
【００７９】
用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；直鎖状、環状または分枝状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２から１０，０００ヌクレオチド（または、その間のもしくはその上の任意の整数値）の間の長さ、好ましくは約１００から１，０００ヌクレオチド（または、その間の任意の整数）の間の長さ、より好ましくは約２００から５００ヌクレオチドの間の長さであってよい。
【００８０】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造物である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。大多数の真核生物の細胞クロマチンはヌクレオソームの形で存在し、ここで、ヌクレオソームコアはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の各々２つを含む八量体に会合した概ね１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体によって様々な長さの）がヌクレオソームコアの間に延びる。ヒストンＨ１の分子は、リンカーＤＮＡに一般的に会合している。本開示のために、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全てのタイプの細胞核タンパク質の包含を意味するものである。細胞クロマチンには、染色体およびエピソームの両方のクロマチンが含まれる。
【００８１】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合である、その核型によってしばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含むことができる。
【００８２】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００８３】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在することを条件に、結合性分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。
【００８４】
「外因性」分子は、細胞に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞における正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発達の間だけに存在する分子は、成体の筋細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能バージョンまたは正常機能内因性分子の機能不全バージョンを含むことができる。
【００８５】
外因性分子は、とりわけ、小分子、例えばコンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの、または巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の改変誘導体、または上記の分子の１つまたは複数を含む任意の複合体であってよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であってよく、直鎖状、分枝状または環状であってよく、任意の長さであってよい。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ  トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが限定されずに含まれる。
【００８６】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染性のウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞に通常は存在しない染色体を含むことができる。細胞への外因性分子の導入のための方法は当業者に公知であり、脂質媒介伝達（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介伝達およびウイルスベクター媒介伝達が限定されずに含まれる。外因性分子は内因性分子と同じ種類の分子であってもよいが、細胞が由来する種と異なる種に由来してもよい。例えば、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株に、ヒト核酸配列を導入することができる。
【００８７】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階の特定の細胞に通常存在するものである。例えば、内因性の核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、クロロプラストもしくは他のオルガネラ、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含めることができる。
【００８８】
「融合」分子は、２つまたはそれより多いサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結される分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってよいか、または異なる化学的タイプの分子であってよい。第１のタイプの融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）、切断ドメインと作用的に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）との間の融合、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が限定されずに含まれる。
【００８９】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じることができ、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて融合タンパク質を生成する。細胞におけるタンパク質の発現において、トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションが関与することもできる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法は、本開示の他の場所で提示される。
【００９０】
本開示のために、「遺伝子」は、遺伝子生成物（下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子生成物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されずに、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレータ、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域を含む。
【００９１】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子生成物への変換を指す。遺伝子生成物は、遺伝子の直接転写生成物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質であってよい。遺伝子生成物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化およびグリコシル化によって改変されるタンパク質も含まれる。
【００９２】
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制を限定されずに含めることができる。発現をモジュレートするために、ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較したときの、遺伝子発現のいかなる低減も指す。したがって、遺伝子不活性化は部分的であるか、または完全であってもよい。
【００９３】
「目的領域」は、外因性分子を結合させることが望ましい、例えば、遺伝子または遺伝子の中のもしくはそれに隣接した非コード配列などの細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えのためであってもよい。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または、例えば感染性ウイルスゲノムに存在することができる。目的領域は、遺伝子のコード領域の中、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域の中、または、コード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域の中にあってもよい。目的領域は、単一のヌクレオチド対と同じくらい小さくてもよく、または最高２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
【００９４】
「真核生物」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が限定されずに含まれる。
【００９５】
「分泌組織」は、生成物を分泌する組織である。胃腸管に局在化する分泌組織の例には、腸、膵臓および胆嚢を覆う細胞が含まれる。他の分泌組織には、肝臓、Ｂ細胞、目と関連した組織および粘膜、例えば唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体および内分泌系の他のメンバーが含まれる。さらに、分泌組織には、分泌が可能である組織型の個々の細胞が含まれる。
【００９６】
用語「抗体」は、別の分子（例えば、抗原）またはその一部に結合することが可能な（本発明により、タンパク質に結合することが可能な）特異的タンパク質を指す。本用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ、ＳｃＦｖ−Ｆｃなど）、ダイアボディ、イントラボディなどが限定されずに含まれる。
【００９７】
用語「作用的連結」および「作用的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結する」（または、「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結する」）は、２つまたはそれより多い構成成分（配列エレメントなど）の並置に関して互換的に使用され、ここで、構成成分は、両構成成分が正常に機能して、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つにおいて発現する機能を媒介することができるということを可能にするように配置される。例証として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１つまたは複数の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写のレベルを制御するならば、コード配列に作用的に連結されている。転写調節配列はコード配列と一般的にｃｉｓで作用的に連結するが、それと直接的に隣接する必要がない。例えば、たとえそれらが近接していなくても、エンハンサーはコード配列に作用的に連結している転写調節配列である。
【００９８】
融合ポリペプチドに関して、用語「作用的に連結する」は、構成成分の各々が、そのように連結していない場合にそれがするだろうものと同じ機能を、他の構成成分と連結して実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは作用的に連結している。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドの場合は、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作用的に連結している。
【００９９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は対応する天然分子より多くの、より少ないまたは同じ数の残基を保有することができ、および／または１つまたは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合性機能は、例えば、フィルター結合性、電気泳動移動性−シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって試験することができる。上記、Ausubelらを参照のこと。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、２ハイブリッドアッセイまたは遺伝子的および生化学的の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Fieldsら（１９８９年）Nature  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
【０１００】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現に誘導することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、本用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込みベクターを含む。
【０１０１】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、好ましくはルーチンのアッセイにおいてとは限らないが、容易に測定されるタンパク質生成物を産生する任意の配列を指す。適するレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光性または発光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光性タンパク質、強化された緑色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が限定されずに含まれる。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結することができるレポーターをコードする配列が含まれる。
【０１０２】
「スイッチ」または「遺伝子スイッチ」は、導入遺伝子の発現を調節するために使用される任意の系を指す。一部の遺伝子スイッチは、小分子によってオンまたはオフのいずれかへ調節することができる。遺伝子スイッチの最も良く知られている例の１つは、ｔｅｔ−ＯＮおよびｔｅｔ−ＯＦＦとして知られるテトラサイクリン依存性の調節可能な遺伝子発現系である。これらの系では、導入遺伝子の発現調節は、２つのエレメントの相互作用によって制御される：目的の導入遺伝子の上流に挿入されるテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）。ＴｅｔＲはウイルスのトランス活性化因子ＶＰ１６に融合され、ｔｅｔＲを活性化因子ｔＴＡに変換する。ｔＴＡは小分子インデューサー、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンに応答性であり、インデューサーの存在下で、ｔＴＡ−インデューサーはＴＲＥに結合して発現を活性化すること（ｔｅｔ−ＯＮ）ができるか、または、ｔＴＡ−インデューサーはＴＲＥに結合することができない（ｔｅｔ−ＯＦＦ）。そのようなスイッチ系のｉｎ  ｖｉｖｏ使用は、導入遺伝子の発現が小分子の存在によって制御されることを可能にする（Goverdhanaら（２００５年）Mol  Ther  １２巻（２号）：１８９〜２１１頁を参照のこと）。
別のスイッチ系は、そのリガンドに結合したときに立体配座を変更する小分子結合アプタマーを利用し、ｔｅｔ−ＯＦＦ系と一緒に働く。細胞内で作用するようにデザインされるアプタマーはイントラマーとも呼ばれ、一部の実施形態では、イントラマー系の使用はｉｎ  ｖｉｖｏで導入遺伝子を調節することができる。イントラマーは、そのリガンド（例えばテオフィリン）の存在下で、ｔＴＡおよびＴＲＥの相互作用を破壊し、したがって導入遺伝子の発現を阻害する核酸配列である（Auslanderら（２０１１年）NAR  ３９巻（２２号）：ｅ１５５頁）。
ヌクレアーゼ
【０１０３】
本明細書で、導入遺伝子の挿入のための遺伝子を標的にするのに有益である組成物、特にヌクレアーゼ、例えばアルブミンに特異的なヌクレアーゼが記載される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて工学的に操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、コグネイト結合部位とは異なる部位に結合するように工学的に操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは異種ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系および／またはＴｔａｇｏ系）。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
【０１０４】
本明細書に開示される方法において、任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように工学的に操作されている点で、天然に存在しない。例えば、Beerliら（２００２年）Nature  Biotechnol.２０巻：１３５〜１４１頁；Paboら（２００１年）Ann.  Rev.  Biochem.７０巻：３１３〜３４０頁；Isalanら（２００１年）Nature  Biotechnol.１９巻：６５６〜６６０頁；Segalら（２００１年）Curr.  Opin.  Biotechnol.１２巻：６３２〜６３７頁；Chooら（２０００年）Curr.  Opin.  Struct.  Biol.１０巻：４１１〜４１６頁を参照のこと。工学的に操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。工学操作する方法には、合理的なデザインおよび種々のタイプの選択が限定されずに含まれる。合理的なデザインには、例えば、三つ組（または、四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、共同所有される米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照のこと。
【０１０５】
ファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；および６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の増強が、例えば、共同所有されるＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１０６】
標的部位の選択；融合タンパク質（および、それをコードするポリヌクレオチド）のデザインおよび構築のためのＺＦＰおよび方法は当業者に公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【０１０７】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質には、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム中の目的領域への結合のために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに一般的に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３７９〜３３８８頁；Dujonら（１９８９年）Gene  ８２巻：１１５〜１１８頁；Perlerら（１９９４年）Nucleic  Acids  Res.２２巻、１１２５〜１１２７頁；Jasin（１９９６年）Trends  Genet.１２巻：２２４〜２２８頁；Gimbleら（１９９６年）J.  Mol.  Biol.２６３巻：１６３〜１８０頁；Argastら（１９９８年）J.  Mol.  Biol.２８０巻：３４５〜３５３頁およびNew  England  Biolabsカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように工学的に操作することができる。例えば、Chevalierら（２００２年）Molec.  Cell  １０巻：８９５〜９０５頁；Epinatら（２００３年）Nucleic  Acids  Res.３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ashworthら（２００６年）Nature  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Paquesら（２００７年）Current  Gene  Therapy  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体との関連で変更することができ（すなわち、ヌクレアーゼがコグネイト切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合することができる。
【０１０９】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物で使用されるヌクレアーゼの１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するかまたは工学的に操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原細菌は、重要な作物植物における多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。植物転写活性化因子を模倣して植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、これらの注入されるタンパク質の１つである（Kayら（２００７年）Science  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も良く特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．ＶｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３である（Bonasら（１９８９年）Mol  Gen  Genet  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと）。ＴＡＬエフェクターはタンデムリピートの集中型ドメイン（centralized  domain）を含有し、各リピートは概ね３４アミノ酸を含有し、それらはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。さらに、それらは核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（レビューについては、Schornack  Sら（２００６年）J  Plant  Physiol  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照のこと）。さらに、植物病原細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および次亜種４菌株ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同性である、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と呼ばれる２つの遺伝子が見出された（Heuerら（２００７年）Appl  and  Envir  Micro  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照のこと）。これらの遺伝子はヌクレオチド配列がお互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復配列ドメインにおける１，５７５ｂｐが欠失している点で異なる。しかし、両遺伝子生成物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。
【０１１０】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。反復配列は概ね１０２ｂｐを含み、そのリピートはお互いと典型的にはに９１〜１００％相同である（Bonasら、同上）。そのリピートの多型は通常１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（hypervariable  diresidues）（ＲＶＤ）の同一性とＴＡＬエフェクターの標的配列の中の近接したヌクレオチドの同一性の間に１対１の対応があるようである（MoscouおよびBogdanove、（２００９年）Science  ３２６巻：１５０１頁およびBochら（２００９年）Science  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照のこと）。実験的に、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードを決定した。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用して、植物細胞中の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製するために、新しい組合せおよび多数のリピートを有するタンパク質に組み立てられた（Bochら、同上）。ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を得るために、工学的に操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断半ドメインに連結した。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Christianら（２０１０年）＜Genetics  epub  10.1534/genetics.110.120717）を参照のこと。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されるようにＮ−キャップおよび／またはＣ−キャップを含む。なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単鎖融合タンパク質である。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関して位置する場所に依存して、融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖切断を生じることができる（Beurdeleyら（２０１３年）Nat  Comm：１〜８頁、DOI:  10.1038/ncomms2782を参照のこと）。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部、例えばＤＮＡ標的に結合するシングルガイドＲＮＡである。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照のこと。その系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的散在性ショートパリンドロームリピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansenら、２００２年、Mol.  Microbiol.４３巻：１５６５〜１５７５頁；Makarovaら、２００２年、Nucleic  Acids  Res.３０巻：４８２〜４９６頁；Makarovaら、２００６年、Biol.  Direct  １巻：７頁；Haftら、２００５年、PLoSComput.  Biol.１巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントを含有する。
【０１１２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。先ず、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対合を通して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向けるが、これは、標的認識のためのさらなる要件である。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップで構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイへのエイリアンＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）エイリアン核酸に対するＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、エイリアンＤＮＡの挿入などの機能における役割を果たすなどである。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、天然配列の断片、天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が限定されずに含まれるが、ただし、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有する。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性改変物およびその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適する誘導体またはその断片には、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合物、共有結合性改変物またはその断片が限定されずに含まれる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から、または化学して得ることができるか、あるいはこれらの２つの手順を組み合わせて得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、または、Ｃａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝子操作されているか、もしくは、内因性Ｃａｓと同じであるかまたは異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってよい。一部の場合には、細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Swartsら、同上；Shengら、同上を参照のこと）。真核生物では、遺伝子サイレンシングはアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さい（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、小ＲＮＡと標的の間のワトソン−クリック型塩基対を通して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的分解で（endonucleolytically）切断する（Vogel（２０１４年）Science  ３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核生物のＡｇｏタンパク質は小さい一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来の（しばしばウイルスの）ＤＮＡを検出し、除去する機能をおそらく果たす（Yuanら、（２００５年）Mol.  Cell  １９巻、４０５頁；Olovnikovら、（２０１３年）Mol.  Cell  ５１巻、５９４頁；Swartsら、同上）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質には、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものが含まれる。
【０１１５】
最も良く特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものである（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同上）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基で１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏに結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体がＤＮＡの第三者分子中のワトソン−クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように誘導する役目をする。これらのガイドＤＮＡ中の配列情報が標的ＤＮＡの同定を可能にしたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを切断する。そのような機構は、その標的ＤＮＡに結合する間、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G.  Shengら、同上）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからのＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Olivnikovら、同上）。
【０１１６】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質にロードすることができる（Swartsら、同上）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向づけられるので、外因性の、調査者によって指定されたガイドＤＮＡで形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を相補的な調査者によって指定された標的ＤＮＡに導く。この様に、ＤＮＡにおいて標的化二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または、他の生物体からのオルソログのＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞の中でゲノムＤＮＡの標的化切断を可能にする。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であってよい。哺乳動物のゲノムＤＮＡの切断のために、哺乳動物細胞での発現のために最適化されるバージョンのＴｔＡｇｏコドンを使用するのが好ましいであろう。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが好ましい場合があり、ここで、ＴｔＡｇｏタンパク質は細胞貫通性ペプチドに融合される。さらに、３７℃で改善された活性を有するように変異誘発を通して変更された、ＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断は、遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子補正、ＤＮＡ切断の活用のための当技術分野で標準の技術を使用した標的化遺伝子欠失を含む転帰の一式を実行するために使用できた。
Ｂ．切断ドメイン
【０１１７】
本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）も含む。ヌクレアーゼ（複数可）は、標的ＤＮＡにおいて二本鎖（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態では、２つのニッカーゼを使用して２つのニックを導入することによりＤＳＢを生じさせる。一部の場合には、ニッカーゼはＺＦＮであり、他の場合には、ニッカーゼはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。
【０１１８】
本明細書に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを得ることができる例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが限定されずに含まれる。例えば、２００２〜２００３年のカタログ、New  England  Biolabs、Beverly、MA；およびBelfortら（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linnら（編）Nucleases、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９３年も参照）。これらの酵素の１つまたは複数（または、その機能的断片）は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として使用することができる。
【０１１９】
同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断半ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合は、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。あるいは、２つの切断半ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断半ドメインは同じエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができ、または、各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができる。
【０１２０】
さらに、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、切断半ドメインを、お互いとの空間配向に置き、切断半ドメインが例えば二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質のための標的部位が、好ましくはお互いに関して配置される。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド分離している。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入することができる（例えば、２から５０ヌクレオチド対、またはそれより多い）。一般に、切断部位は標的部位の間にあるが、切断部位から１〜５０塩基対（または、その間の任意の値）、１〜１００塩基対（または、その間の任意の値）、１００〜５００塩基対（または、その間の任意の値）、５００〜１０００塩基対（または、その間の任意の値）またはなお１ｋｂ超の値を含む、切断部位から１キロベースまたはそれより大きいキロベース離れて存在することができる。
【０１２１】
上記したように、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインなど、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを誘導することができる例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが限定されずに含まれる。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓のＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。これらの酵素の１つまたは複数（または、それらの機能的断片）は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として使用することができる。
【０１２２】
同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断半ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来することができる。一般に、２つの融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合は、該２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。あるいは、２つの切断半ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断半ドメインは同じエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができ、または、各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができる。さらに、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、切断半ドメインを、お互いとの空間配向に置き、切断半ドメインが、例えば二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質のための標的部位が、好ましくはお互いに関して配置される。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド分離している。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入することができる（例えば、２から５０ヌクレオチド対、またはそれより多い）。一般に、切断の部位は、標的部位の間にある。
【０１２３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位で）に配列特異的に結合すること、および結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、１本の鎖の上のその認識部位から９ヌクレオチドの位置、および他の鎖の上のその認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにLiら（１９９２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Liら（１９９３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Kimら（１９９４ａ）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９１巻：８８３〜８８７頁；Kimら（１９９４ｂ）J.  Biol.  Chem.２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、工学的に操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または、切断半ドメイン）、および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１２４】
その切断ドメインは結合ドメインと分離できる例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ  Ｉである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である。Bitinaiteら（１９９８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示のために、開示される融合タンパク質で使用されるＦｏｋ  Ｉ酵素の部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合物を使用した標的化二本鎖切断および／または細胞配列の標的化置き換えのために、各々Ｆｏｋ  Ｉ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更のパラメータは、この開示の他の場所で提供される。
【０１２５】
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってよい。
【０１２６】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載される。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Robertsら（２００３年）Nucleic  Acids  Res.３１巻：４１８〜４２０頁を参照のこと。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、その全ての開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第８，６２３，６１８号；８，４０９，８６１号；８，０３４，５９８号；７，９１４，７９６号；および７，８８８，１２１号に記載される通り、ホモ二量体化を最小にするかまたは防止する１つまたは複数の工学的に操作された切断半ドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。Ｆｏｋ  Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、全て、Ｆｏｋ  Ｉ切断半ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。
【０１２８】
絶対ヘテロダイマーを形成するＦｏｋ  Ｉの例示的な工学的に操作された切断半ドメインは、第１の切断半ドメインがＦｏｋ  Ｉの４９０および５３８位のアミノ酸残基の変異を含み、第２の切断半ドメインがアミノ酸残基４８６および４９９の変異を含む対を含む。
【０１２９】
したがって、一実施形態では、４９０での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載される工学的に操作された切断半ドメインは、１つの切断半ドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる工学的に操作された切断半ドメインを産生すること、ならびに、別の切断半ドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる工学的に操作された切断半ドメインを産生することによって調製された。本明細書に記載される工学的に操作された切断半ドメインは、異常な切断を最小にするかまたは無効にする絶対ヘテロダイマー変異体である。例えば、その開示は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと。
【０１３０】
１つより多い変異を有する切断ドメインを使用することができ、例えば、１つの切断半ドメインにおける４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）の変異による、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる工学的に操作された切断半ドメインを生成すること、ならびに、別の切断半ドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる工学的に操作された切断半ドメインを生成することによる；４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）；４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされる）における変異を含む工学的に操作された切断半ドメイン；例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）；ならびに／または、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされる）における変異を含む工学的に操作された切断半ドメイン、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）。例えば、その開示は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号を参照のこと。他の実施形態では、工学的に操作された切断半ドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Guoら、（２０１０年）J.  Mol.  Biol.４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照のこと）。
【０１３１】
あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して核酸標的部位にｉｎ  ｖｉｖｏで組み立てることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現構築物の上で発現させることができるか、または１つのオープンリーディングフレームの中に連結させることもでき、ここで、個々の構成成分は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。
【０１３２】
ヌクレアーゼは、使用前に、例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母をベースとした染色体系において、活性についてスクリーニングすることができる。
【０１３３】
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成成分を含む：ｔｒａｃｒＲＮＡおよび同一のダイレクトリピート（ＤＲ）が間に入るヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイ。ゲノム工学操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Congら、（２０１３年）Sciencexpress  １／１０．１１２６／science  １２３１１４３を参照のこと）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を通して、または別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、そこでは、工学的に操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合して、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（シングルガイドＲＮＡとも呼ばれる）を生み出す。（Jinek（２０１２年）Science  ３３７巻（６０９６号）：８１６〜２１頁およびCong（２０１３年）Science  ３３９巻（６１２１号）：８１９〜２３頁を参照のこと）。
標的部位
【０１３４】
上で詳細に記載されているように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えばアルブミン遺伝子または他のセーフハーバー遺伝子の選択された任意の配列に結合するように工学的に操作することができる。工学的に操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有することができる。工学操作方法には、合理的なデザインおよび様々な種類の選択が限定されずに含まれる。合理的なデザインには、例えば、三つ組（または、四つ組）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、共同所有される米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照のこと。ＴＡＬ−エフェクタードメインの合理的なデザインを、実行することもできる。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。
【０１３５】
ＤＮＡ結合ドメインに適用可能なファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；および６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
【０１３６】
標的部位の選択；融合タンパク質（および、それをコードするポリヌクレオチド）のデザインおよび構築のためのヌクレアーゼおよび方法は当業者に公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【０１３７】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号を参照のこと。本明細書に記載されるタンパク質には、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメインの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
ドナー
【０１３８】
上記のように、例えば、変異体遺伝子の補正のための、あるいは野生型遺伝子の発現増加、または、好ましくは、１つもしくは複数の外因性抗体をコードする１つもしくは複数の導入遺伝子の組込みのための、障害の処置および／または予防のための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入。本開示の方法および組成物において使用することができる抗体の非限定例には、以下のものが含まれる：がん抗原を認識する抗体；自己免疫状態、例えば関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎、喘息、乾癬、糖尿病性網膜症、グレーブス病、橋本病、多発性硬化症、ループス、Ｉ型糖尿病、緑内障、視神経脊髄炎、血管炎および強皮症に関与するタンパク質を認識する抗体；増殖因子に結合する抗体ならびに／または神経学的および精神病学的障害（例えば、シヌクレイノパチー、例えばパーキンソン病および多系統萎縮、ならびにアルツハイマー病の処置のためのα−シヌクレイン）、疼痛（慢性疼痛および片頭痛を含む）、および／または骨関節炎に関与するタンパク質に結合する抗体。
【０１３９】
したがって、これらの状態を処置するのに有用な抗体標的（導入遺伝子から発現される抗体が結合する）の非限定例には、以下のものに結合する抗体が含まれる：１つまたは複数のがん抗原（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＣＲ４、ＷＴ−１、ＨＥＲ２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＰＣＡＭ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍｕｃ１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ（より広範なリストについては、PolanskiおよびAnderson（２００６年）Biomarker  Insights  ２巻：１〜４８頁を参照のこと）；ＰＤ１およびＣＴＬＡ４（Sureshら（２０１４年）J  Hematol  Oncol  ７巻：５８頁）、がん／精巣（ＣＴ）抗原（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ１、ＣＴ７．ＮＨ−ＳＡＲ−３５、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＬＣＯ６Ａ１、ＰＡＳＤ１、ＣＡＧＥ−１、ＫＫ−ＬＣ−１）；サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２６、ＲＡＮＫＬ）、Ｊａｋキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β、α４β７インテグリン、α４β１インテグリン、ＴＮＦα、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＣＤ２０、アネキシンＡ２、Ｃ１ｑを含む古典的補体経路に関与するタンパク質、増殖因子および／または脳および他の組織に見出されるタンパク質、例えばα−シヌクレイン、アミロイドβ（Ａβ）、ＮＧＦ、ＴｒｋＡ、ＣＧＲＰおよび／もしくはＮＧＦ。例えば、Tanidaら（２０１５年）World  J  Gastro  ２１巻（２９号）：８７７６〜８６頁；Neurath（２０１４年）Nature  ７巻（１号）：６頁；Riceら（２０１５年）J  Clin  Invest  １２５巻（７号）：２７９５頁；Palmer（２０１３年）Br  J  Clin  Pharm  ７８巻（１号）：３３〜４３頁；Turnerら（２０１５年）Semin  Cell  Dev  Biol.１０月８日、pii:  S1084-9521(15)00188-3.  doi:  10.1016/j.semcdb.2015.10.003）；Liuら（２０１５年）J  Neuroinflam  １２巻：１５３頁）；Hiroseら（２０１５年）、Pain  Pract  doi:10.1111；Bigalら（２０１５年）Lancet  Neurology  １４巻（１１号）：１０９１頁、Gowら（２０１５年）Arthritis  Res  Ther  doi:10.1186）；CabelleroおよびChen（２００９年）Cancer  Sci  １００巻（１１号）：２０１４〜２０２１頁を参照のこと。抗体標的は、処置および／または予防すべき状態を有する被験体において異常に発現されてもまたは発現されなくてもく、例えばがん抗原およびα−シヌクレインなどのようなタンパク質が、がんまたはシヌクレイノパチーを有する被験体において異常に発現され得る。
【０１４０】
ドナー配列はそれが置かれるゲノム配列と一般的に同一でないことは、容易に明らかである。ドナー配列は、目的の位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同領域が隣接した非相同性の配列を含有することができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチンの目的領域に相同性でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同性のいくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、通常は目的領域に存在しない配列の標的化挿入については、前記配列がドナー核酸分子に存在して、目的領域の配列に相同性の領域に隣接することができる。
【０１４１】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、直鎖状または環状の形で細胞に導入することができる。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および第９，２５５，２５９号を参照のこと。直鎖状の形態で導入される場合は、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ的分解による（exonucleolytic）分解から）保護することができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが片方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Changら（１９８７年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８４巻：４９５９〜４９６３頁；Nehlsら（１９９６年）Science  ２７２巻：８８６〜８８９頁を参照のこと。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法には、末端アミノ基（複数可）の付加および改変されたヌクレオチド間連結の使用、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などが限定されずに含まれる。
【０１４２】
さらなる配列、例えば複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などを有するベクター分子の一部として、ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの作用物質（agent）と複合体を形成した核酸として導入することができるか、または、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
【０１４３】
ドナーは、一般的にその発現が組込み部位で内因性プロモーターによって、すなわち、アルブミン遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかし、ドナーはプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含むことができることは明らかである。
【０１４４】
内因性遺伝子の全てか一部が発現されるかまたはそのいずれも発現されないように、ドナー分子を内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、内因性アルブミン配列の一部が例えば導入遺伝子との融合物として発現されるか、またはいずれも発現されないように、本明細書に記載される導入遺伝子をアルブミン遺伝子座に挿入することができる。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、アルブミンコード配列を有するまたは有さない）は、任意の内因性遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号；第２００８０１５９９９６号および第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。
【０１４５】
アルブミン配列（内因性または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子で発現されるとき、アルブミン配列は完全長配列（野生型または変異体）または部分配列であってよい。好ましくは、アルブミン配列は機能的である。これらの完全長または部分的アルブミン配列の機能の非限定例には、導入遺伝子（例えば、治療的遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清中半減期を増加させること、および／またはキャリアとして作用することが含まれる。
【０１４６】
さらに、発現のために必要とされないが、外因性配列には、転写または翻訳の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレータ、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含めることもできる。
送達
【０１４７】
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適する手段によってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達することができる。
【０１４８】
本明細書に記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、その全ての開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，４５３，２４２号；６，５０３，７１７号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，６０７，８８２号；６，６８９，５５８号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；および７，１６３，８２４号に記載される。
【０１４９】
本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを限定されずに含む、任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；および７，１６３，８２４号も参照。さらに、これらのベクターのいずれも、処置のために必要とされる配列の１つまたは複数を含むことができることは明らかである。したがって、１つまたは複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞に導入するとき、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは同じベクターで、または異なるベクターで運ぶことができる。複数のベクターを使用するとき、各ベクターは１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含むことができる。
【０１５０】
ヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー構築物を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために、従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用することができる。非ウイルス性のベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれ、それらは、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson、Science  ２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；NabelおよびFelgner、TIBTECH  １１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；MitaniおよびCaskey、TIBTECH  １１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Dillon、TIBTECH  １１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Miller、Nature  ３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Van  Brunt、Biotechnology  ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Vigne、Restorative  Neurology  and  Neuroscience  ８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；KremerおよびPerricaudet、British  Medical  Bulletin  ５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Haddadaら、Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology  Doerfler  and  Boehm（編）（１９９５年）；およびYuら、Gene  Therapy  １巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照のこと。
【０１５１】
核酸の非ウイルス性の送達方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオンおよび作用物質によって強化されたＤＮＡの取込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションを、核酸の送達のために使用することもできる。
【０１５２】
さらなる例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが含まれる、（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；４，９４６，７８７号；および４，８９７，３５５号に記載され、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションのために適するカチオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。
【０１５３】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science  ２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Blaeseら、Cancer  Gene  Ther.２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Behrら、Bioconjugate  Chem.５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Remyら、Bioconjugate  Chem.５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Gaoら、Gene  Therapy  ２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ahmadら、Cancer  Res.５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号および４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０１５４】
送達のさらなる方法には、送達する核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージすることの使用が含まれる。これらのＥＤＶは、二重特異的抗体の１つのアームが標的組織への特異性を有し、他方がＥＤＶへの特異性を有する二重特異的抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞表面に運び、次に、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。細胞に入ると、内容物は放出される（MacDiarmidら（２００９年）Nature  Biotechnology  ２７巻（７号）：６４３頁を参照されたい）。
【０１５５】
工学的に操作されたＺＦＰをコードする核酸の送達のための、ＲＮＡウイルスベースのまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、体内の特異的細胞にウイルスを向かわせて、核にウイルスのペイロードを輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接的に（ｉｎ  ｖｉｖｏで）投与することができるか、または、それらは細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に（ｅｘ  ｖｉｖｏで）投与される。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ワクシニアベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが限定されずに含まれる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、挿入される導入遺伝子の長期発現をしばしばもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察された。
【０１５６】
外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を拡張することによって、レトロウイルスの向性を変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させ、高いウイルス力価を一般的にもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最高６〜１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能力を有するシス作用性ロングターミナルリピートで構成される。ベクターの複製およびパッケージングのために最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、それらは次に、恒久的導入遺伝子発現を提供するために標的細胞の中に治療的遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくものおよびそれらの組合せが含まれる（例えば、Buchscherら、J.  Virol.６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Johannら、J.  Virol.６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Sommerfeltら、Virol.１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Wilsonら、J.  Virol.６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Millerら、J.  Virol.６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０１５７】
一過性の発現が好まれる適用では、アデノウイルスをベースにした系を使用することができる。アデノウイルスをベースにしたベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターで、高い力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するためにも使用される（例えば、Westら、Virology  １６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin、Human  Gene  Therapy  ５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Muzyczka、J.  Clin.  Invest.９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら、Mol.  Cell.  Biol.５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Tratschinら、Mol.  Cell.  Biol.４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；HermonatおよびMuzyczka、PNAS  ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；およびSamulskiら、J.  Virol.６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含む、いくつかの刊行物に記載されている。
【０１５８】
臨床試験での遺伝子導入のために少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが今日利用でき、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用する。
【０１５９】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されたレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら、Blood  ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Kohnら、Nat.  Med.１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Malechら、PNAS  ９４巻：２２  １２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療的ベクターであった。（Blaeseら、Science  ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターで、５０％またはそれより高い形質導入効率が観察された。（Ellemら、Immunol  Immunother.４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Dranoffら、Hum.  Gene  Ther.１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。
【０１６０】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ  １４５ｂｐ逆方向末端反復だけを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特徴である。（Wagnerら、Lancet  ３５１巻：９１１７  １７０２〜３頁（１９９８年）、Kearnsら、Gene  Ther.９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型化ＡＡＶを含む他のＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することもできる。
【０１６１】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように工学的に操作され、その後、複製欠損ベクターは欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉において見出されるものなどの非分裂、分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入させることができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Stermanら、Hum.  Gene  Ther.７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneckerら、Infection  ２４巻：１  ５〜１０頁（１９９６年）；Stermanら、Hum.  Gene  Ther.９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Welshら、Hum.  Gene  Ther.２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Alvarezら、Hum.  Gene  Ther.５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Topfら、Gene  Ther.５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Stermanら、Hum.  Gene  Ther.７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が含まれる。
【０１６２】
パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージするプロデューサー細胞株によって通常生成される。ベクターは、パッケージングおよび以降の宿主への組込み（適用可能な場合）のために必要とされる最小限のウイルス配列を一般的に含有し、他のウイルス配列は発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠落しているウイルスの機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みのために必要であるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を一般的に所有するだけである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、有意な量でパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性である熱処理によって低減することができる。
【０１６３】
多くの遺伝子治療適用では、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外部表面のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって所与の細胞型に対して特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが公知である受容体に親和性を有するように選択される。例えば、Hanら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができること、および組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、選択される事実上いかなる細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように、工学的に操作することができる。上の記載はウイルスベクターに主に適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取込みを有利にする、特異的取込み配列を含有するように工学的に操作することができる。
【０１６４】
遺伝子治療ベクターは、下記のように、一般的に全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所適用による、個々の患者への投与によってｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞に、例えば個々の患者から外植される細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）、または汎用性ドナー造血幹細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達することができ、続いて、通常ベクターを取り込んだ細胞の選択の後に、細胞を患者に再移植することができる。
【０１６５】
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物体に直接的に投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を導入して血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションを限定されずに含む経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者に利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路より速く（immediate）、より有効な反応をしばしば提供することができる。
【０１６６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの導入のために好適なベクターには、非組込み型のレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Oryら（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Dullら（１９９８年）J.  Virol.７２巻：８４６３〜８４７１頁；Zufferyら（１９９８年）J.  Virol.７２巻：９８７３〜９８８０頁；Follenziら（２０００年）Nature  Genetics  ２５巻：２１７〜２２２頁；米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照のこと。
【０１６７】
薬学的に許容されるキャリアは、一部において、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、下記のように、医薬組成物の多様な、適する製剤が利用可能である（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１７版、１９８９年を参照のこと）。
【０１６８】
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物は、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドはプラスミドによって運ぶことができ、一方、１つまたは複数のヌクレアーゼはＡＡＶベクターによって運ぶことができる。さらに、異なるベクターは、同じまたは異なる経路によって投与することができる（筋肉内注射、肝臓に直接的に（例えば、尾静脈注射）、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）。ベクターは、同時に、または任意の逐次的な順序で送達することができる。
【０１６９】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ投与の両方のための製剤には、液体または乳化液体の懸濁液が含まれる。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に適合する賦形剤としばしば混合される。好適な賦形剤には、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。さらに、組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を増強する他の試薬を含有することができる。
適用
【０１７０】
本発明の方法および組成物は、任意の状況において使用することができ、ここで、抗体が膜貫通ドメインに接続した標的化細胞から分泌され、および／または標的細胞の中のイントラボディとして発現されるように、抗体をコードする導入遺伝子を供給することが望ましい。したがって、この技術は、患者が治療抗体で予防または処置できる状態を有する状態で有用である。患者の免疫系をがん細胞に向かわせるのを助けるために、および免疫モジュレータを弱めるために抗体療法が使用される免疫障害において、がん抗原に対する抗体の発現が本発明で特に有益である。好ましい実施形態には、抗体導入遺伝子の発現を調節するための、小分子制御発現スイッチの使用が含まれる。このタイプの構築物は、定期的な再発によって特徴付けられる疾患の場合に利用することができ、そこにおいて、抗体の発現をオンにすることは再発の重症度および持続時間を減弱させるのを助け得る。他の好ましい実施形態では、抗体は、抗体が血液脳関門を通過するのを可能にするペプチドを含む。これらの抗体は、タウオパチー（例えばアルツハイマー病）、パーキンソン病、多系統萎縮またはリソソーム蓄積症に関連した症状などの脳障害の処置のために有用であり得る。
【０１７１】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは例示だけが目的であること、ならびに、他のヌクレアーゼを、例えばＴＡＬＥＮと、工学的に操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然に存在するもしくは工学的に操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（naturally  occurring  of  engineered  homing  endonucleases）（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインと異種切断ドメインの融合物を使用することができることが理解される。
【実施例】
【０１７２】
（実施例１）
アルブミン遺伝子を標的にした工学的に操作されたヌクレアーゼのデザイン、構築および特徴付け
ジンクフィンガータンパク質は、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１内の切断部位を標的にするようにデザインされた（米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および第２０１６００６０６５６号を参照のこと、下の表１にも示す）。基本的にUrnovら（２００５年）Nature  ４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁、Perezら（２００８年）Nature  Biotechnology  ２６巻（７号）：８０８〜８１６頁に記載の通りに、および米国特許第６，５３４，２６１号に記載の通りに、対応する発現構築物を組み立てて、プラスミド、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクターに組み入れた。表１は、例示的なマウスアルブミン特異的ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックスを示し、表２はこれらのＺＦＰのための標的部位を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスに接触する標的部位のヌクレオチドは、大文字で示され、接触しないヌクレオチドは小文字で示される。
【０１７３】
ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１を標的にするために、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のためのガイドＲＮＡも構築した。さらなるアルブミン標的化ガイドＲＮＡについては、米国特許出願公開第２０１５００５６６７０５号も参照されたい。下の表３に、アルブミン遺伝子中の標的配列ならびにガイドＲＮＡ配列が示される。他のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮなど）を表３に示す標的部位に対してデザインすることもできることは明らかである。
【表１】
2018533966.tif 000003
【表２】
2018533966.tif 000004
【表３】
2018533966.tif 000005
（実施例２）
アルブミン特異的ヌクレアーゼの活性
【０１７４】
マウス細胞の内因性標的配列を切断する能力について表１のＺＦＮ対を試験し、活性であることが示された（米国特許出願公開第２０１６００６０６５６号）。
【０１７５】
ヒトアルブミン特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ヒトＫ５６２細胞で試験した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の活性は、ＭｉＳｅｑ分析によって測定した。Ｃａｓ９による内因性アルブミンＤＮＡ配列の切断は、ハイスループット配列決定（Ｍｉｓｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってアッセイし、結果は下の表４に示す。結果は「パーセントインデル」で表し、ここで、「インデル」は、ヌクレアーゼ誘導二本鎖切断部位での誤りがちなＮＨＥＪ修復プロセスの結果として見出される小さい挿入および／または欠失を意味する。
【０１７６】
これらの実験において、Ｃａｓ９はｐＶＡＸプラスミドに供給され、ｓｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下でプラスミドに供給された。プラスミドは各々１００ｎｇまたは各々４００ｎｇで混合し、一回につき２ｅ５細胞と混合した。細胞は、Ａｍａｘａ系を使用してトランスフェクトさせた。簡潔には、Ａｍａｘａトランスフェクションキットを使用し、標準のＡｍａｘａシャトルプロトコールを使用して核酸をトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を室温で１０分の間静止させ、その後予め温めておいたたＲＰＭＩに再懸濁した。次に、細胞を、３７℃の標準条件で増殖させた。トランスフェクションの７日後にゲノムＤＮＡを単離し、ＭｉＳｅｑ分析にかけ、結果は下の表４に示す。
【０１７７】
データから分かるように、異なるガイドＲＮＡの活性は、標的化部位での切断を全て誘導した。
【表４】
2018533966.tif 000006
（実施例３）
マウスアルブミン遺伝子座への組換えｓｃＦｖの挿入
【０１７８】
Ｃ６．５抗体ドナー構築物は、ヒト抗ｃ−ｅｒｂＢ−２免疫グロブリン重鎖Ｖ領域についてはＧｅｎｂａｎｋ配列Ｕ３６５４２．１に基づき、ヒト抗ｃ−ｅｒｂＢ−２免疫グロブリン軽鎖Ｖ領域についてはＵ３６５４１．１に、ならびに特許出願公開ＷＯ１９９７０００２７１に基づいた。（Schierら（１９９５年）、Immunotechnology、７３〜８１頁；Schierら、（１９９６年）J.  Mol.  Biol.、２５５巻、２８〜４３頁；Schierら、（１９９６年）J  Mol.  Biol.、２６３巻、５５１〜５６７頁も参照）。全体的Ｃ６．５抗体ドナー構造は、左右のマウスアルブミンイントロンホモロジーアーム、スプライスアクセプター、ポリＡ、ならびにＣ末端のｍｙｃおよびＦｌａｇエピトープタグを含んで、図２から３に概説した通りであった。Ｃ末端のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物またはＣ末端のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合物（図３Ｃおよび３Ｄを参照のこと）については、ＭＳＡまたはＨＳＡがＣ末端のｍｙｃ−Ｆｌａｇタグの後に付加された。ＭＳＡまたはＨＳＡは、成熟したアルブミンコード領域（プロペプチドおよびシグナルペプチドを欠く）をコードした。
【０１７９】
アルファ−シヌクレイン抗体ドナー構築物は、アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ単鎖抗体についてはＧｅｎｂａｎｋ配列ＪＸ４４２９８０．１に、ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００低密度リポタンパク質（ＡｐｏＢ  ＬＤＬ）残基３３７１〜３４０９についてはＧｅｎｂａｎｋ  Ｘ０５０６．１およびＳｗｉ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０４１１４．２に基づいた。アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ構築物は、ＡｐｏＢ  ＬＤＬＲの後にＣ末端のｍｙｃ−Ｆｌａｇタグを全て有し、一例では、Ｆｌａｇは３Ｘ−Ｆｌａｇで置き換えられた。ＡｐｏＢ  ＬＤＬＲをコードする核酸配列および得られたアミノ酸配列は、以下の通りである：
【０１８０】
核酸配列：
５’ＴＣＡＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＧＴ（配列番号２５）
【０１８１】
アミノ酸配列：
Ｎ’ＳＳＶＩＤＡＬＱＹＫＬＥＧＴＴＲＬＴＲＫＲＧＬＫＬＡＴＡＬＳＬＳＮＫＦＶＥＧＳ（配列番号２６）。
【０１８２】
次に、標準技術により、ドナーをＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／８粒子にパッケージした。
【０１８３】
発現された抗体の検出のために、Ｈｅｐａ１−６細胞上清またはマウス血漿中に分泌されたＣ６．５抗体のレベルは、Ｃ６．５抗体ドナーの上のＣ末端のｍｙｃ−Ｆｌａｇタグを利用するカスタム仕様のＥＬＩＳＡを使用して決定した。ｐＨ９．４の０．２Ｍ炭酸塩重炭酸塩緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）中の４μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ＦｌａｇＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用い、１ウェル当たり１００μＬ（最終４００ｎｇ／ウェル）を使用して、９６ウェルストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を４℃で一晩コーティングした。
【０１８４】
翌日、１×ＴＢＳＴ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）を使用して、プレートを洗浄した。ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を使用して、９６ウェルプレートを次に室温で２時間ブロッキングし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｈｅｐａ１−６細胞からの上清（または、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では血漿）をプレートに加え、振盪しながら室温で２時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ウサギモノクローナルｍｙｃ−ビオチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ  ＭＡ）を加え（ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈した）、室温で１時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ポリ−ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を加え（ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈した、最終１００ｎｇ／ｍＬ）、室温で１時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢウルトラ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を加え、１０分間進展させ、停止液で反応を停止し、プレートリーダーを使用して４５０ｎＭで吸光度を読み取った。バックグラウンド吸光度読取りは、無視できた（一般的に０）。
【０１８５】
Ｈｅｒ２標的へのＣ６．５分泌抗体の結合は、カスタム仕様のＥＬＩＳＡを使用して決定した。ｐＨ９．４の０．２Ｍ炭酸塩重炭酸塩緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）中の１μｇ／ｍＬのＨｅｒ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）残基２３〜６５２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ  ＣＯ）を用い、１ウェル当たり１００μＬ（最終１００ｎｇ／ウェル）を使用して、９６ウェルストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を４℃で一晩コーティングした。翌日、１×ＴＢＳＴ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）を使用して、プレートを洗浄した。ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を使用して、９６ウェルプレートを次に室温で１．５時間ブロッキングし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｈｅｐａ１−６細胞からの上清をプレートに加え、振盪しながら室温で２時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ウサギモノクローナルｍｙｃ−ビオチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ  ＭＡ）をブロッキング緩衝液で１：１０００希釈して加え、室温で１時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ポリ−ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を加え（ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈した、最終１００ｎｇ／ｍＬ）、室温で１時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢウルトラ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を加え、１０分間進展させ、停止液で反応を停止し、プレートリーダーを使用して４５０ｎＭで吸光度を読み取った。バックグラウンド吸光度読取りは、無視できた（一般的に０）。
【０１８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために、製造業者のガイドライン（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）により、マウスＨｅｐａ１−６細胞を維持した。実験日に、Ｈｅｐａ１−６細胞を洗浄し、トリプシン処理し、計数した。使用したＺＦＮは、マウスアルブミンイントロン遺伝子座、左のＳＢＳ４８６４１および右のＳＢＳ３１５２３に対するものであった。製造業者の推奨（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）に従ってｍＭｅｓｓａｇｅマシンキットを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＺＦＮ  ｍＲＮＡを転写した。ＺＦＮはエレクトロポレーション（Ａｍａｘａ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）またはトランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）のいずれかによってｍＲＮＡとして送達し、続いて時間０と表したその後まもなく、ＡＡＶ２／６  Ｃ６．５抗体ドナーを添加した。使用した一般的な反応は、２４ウェルディッシュの１ウェル当たり２Ｅ＋０５細胞について、２５〜２００ｎｇのＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびＡＡＶ２／６  Ｃ６．５抗体ドナーＭＯＩ  ６０Ｋ〜２４００Ｋであった。翌日、培地を交換した。ＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびＡＡＶ２／６ドナーの添加後ｔ４からｔ１０日までの範囲の様々な時点で上記のレベルおよび／またはＨｅｒ２結合ＥＬＩＳＡを使用して、分泌されたＣ６．５抗体について上清を分析した。
【０１８７】
結果は図５、６および７に表し、ここで、図５は抗体単独として産生された抗体を示し、図６はｓｃＦｖ−アルブミンまたはダイアボディ−アルブミン融合タンパク質として産生された抗体を示す。図７は、この系における抗シヌクレイン抗体の良好な発現を表す。結果は、これらの細胞のアルブミン遺伝子座から抗体が発現されて、細胞培地に分泌されたことを実証する。
【０１８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために８から１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用し、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子（図１１では「試験品」で表した）を投与した。研究は、動物の人道的管理と使用のための動物福祉法に従った。投与の前に試験品を室温で解凍し、図１１に概説される通り、全ての動物は２００μＬの単一の静脈内（ＩＶ）注射を受けた。使用したＺＦＮは、マウスアルブミンイントロン遺伝子座、左のＳＢＳ４８６４１および右のＳＢＳ３１５２３に対するものであった（上の表１）。Ｃ６．５抗体ドナーは図１１に概説され、これらの構築物のアセンブリーは上に記載される。用量は１：１：８（ＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナー）であり、１．５Ｅ＋１１が各ＺＦＮのために使用され、１．２Ｅ＋１２がドナー、全てのＡＡＶ２／８ウイルスのために使用された。全ての動物は、０日目および１４日目にシクロホスファミドの２００μＬのフォローアップ腹腔内注射を受けた。下の表５に概説するように非最終（non-terminal）および最終血液採取を実行し、処理手順を下に記載する。
【表５】
2018533966.tif 000007
【０１８９】
血漿  −  ７日目（非最終）および２８日目（最終）に全てのマウスから血液を採取した。１４、２１および２７日目に、第１群の三匹（３匹）のマウスおよび第２〜７群の四匹（４匹）のマウスから血液を採取した。１７および２４日目に、第１群の残りの三匹（３匹）のマウスおよび第２〜７群の残りの四匹（４匹）のマウスから血液を採取した。クエン酸ナトリウムを含有するチューブに全ての血液を採取し、血漿へと処理した。非最終血液採取物は、下顎骨下静脈または後眼窩洞を通して採取した。屠殺時の血液採取物は、心臓穿刺または大静脈を通して採取した。血漿を分離し、上記のＥＬＩＳＡアッセイで使用するまで−６０〜−８０℃で保存した。
【０１９０】
肝臓  −  全ての動物は２８日目に屠殺し、肝臓および脾臓を採取して計量した。肝臓の左外側葉を分離し、３つの断片に分割し、肝臓の残りとは別に液体窒素中で急速冷凍した。残りの肝葉および脾臓（全体）を、液体窒素中で急速冷凍した。ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出のために処理するまで、冷凍検体を−６０〜−８０℃で保存した。
【０１９１】
結果（図８を参照のこと）は、組換え抗Ｈｅｒ２抗体がマウスの血清で検出可能なことを実証した。ゲノム変更の量（ＮＨＥＪ活性ならびにドナー配列の組込みを含むことができるインデルとして測定した）を決定するためにも肝臓組織を研究し、それは、工学的に操作されたヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡの両方を受けたマウスにおいて、インデルが概ね５０％までのレベルで存在したことを示した。
【０１９２】
したがって、抗体コード導入遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の後に発現された。
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
Ａ．方法
【０１９３】
マウス：Ｌｉｎｅ６１アルファ−シヌクレイントランスジェニックマウスモデルは、全ての脳領域におけるＴｈｙ１プロモーターによって駆動されるヒトアルファ−シヌクレインの過剰発現によって特徴付けられる。系統のバックグラウンドは、Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡである。Ｌｉｎｅ６１からのマウスは、脳全体に分布する、パーキンソン病（ＰＤ）および散在性レビー小体病（ＤＬＢ）患者の脳で観察されるものと類似の神経細胞内アルファ−シヌクレイン封入体を発生させる。
【０１９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究（試験品は表６に表す）のために、概ね２〜３ケ月齢のＬｉｎｅ６１アルファ−シヌクレイントランスジェニックマウスを使用した。
【表６−１】
2018533966.tif 000008
【表６−２】
2018533966.tif 000009
【０１９５】
研究は、動物の人道的管理と使用のための動物福祉法に従った。投与の前に試験品を室温で解凍し、表６に概説される通り、類似の試験品を使用した以前の研究によって使用された方法を反映するためにＩＰ（腹腔内）注射された陽性対照を除いて、全ての動物は２００μＬの単一の静脈内（ＩＶ）注射を受けた（Spencerら、Molecular  Therapy  ２０１４年）。
【０１９６】
使用したＺＦＮは、マウスアルブミンイントロン遺伝子座、左のＳＢＳ４８６４１および右のＳＢＳ３１５２３に対するものであった。例えば、米国特許出願公開第２０１６００６０６５６号を参照のこと。アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ  ＳｃＦｖ抗体ドナーおよびアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ  ＳｃＦｖ  ｃＤＮＡは、図１２に概説する。用量は１：１：８（ＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナー）であり、１．５Ｅ＋１１ｖｇ／マウスが各ＺＦＮのために使用され、１．２Ｅ＋１２ｖｇ／マウスがドナー、全てのＡＡＶ２／８ウイルスのために使用された。ｃＤＮＡの用量は、１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウスであった。表７に概説するように、非最終および最終血液採取を行った。ＶＧは、ベクターゲノムを表す。陽性対照は、Spencerら、同上、で使用された試験品に基づいた。
【表７−１】
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【表７−２】
2018533966.tif 000011
【０１９７】
免疫染色：マウス屠殺の後に、脳を取り出し、矢状方向に（sagitally）分割し、半分を瞬間冷凍し、半分を４％パラホルムアルデヒドに固定した。固定した脳をビブラトームにより４０μｍ厚の切片にし、抗α−シヌクレイン（ＳＹＮ１）、抗ＧＦＡＰ、抗ＮｅｕＮまたは抗ｍｙｃでプローブした（工学的に操作されたアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体を検出するために）。切片をＺｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｅｒ  Ａ２で画像化し、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアで光学密度を決定した。共免疫蛍光については、０．２３μｍ光学切片を用いる共焦分析のために、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２を使用した。各マウスについて、合計３つの切片を分析し、各切片について３視野を調べた。ばらつきを低減するために、全ての切片は同じ条件の下で同時に処理した。
【０１９８】
血漿採取：表６に概説するように非最終および最終血液採取を実行した。７、２１、２８、４２、５６日目に、非最終血液（約５０〜１００μＬ）をマウスから採取した。２８日目（コホート１について）および５６日目（コホート２について）に、最終血液を採取した。Ｋ２−ＥＤＴＡを含有するチューブ（紫色のチューブ）に全ての血液を採取し、血漿へと処理した。非最終血液採取物は、下顎（mandibal）を通して採取した。屠殺時の血液採取物は、下顎（manidibal）を通して採取した（２００〜５００μＬ）。採取した血液の概ね半分である血漿は、−６０℃から−８０℃で保存し、循環するアルファ−シヌクレイン単鎖抗体レベルを測定するために使用した。非最終採取のための血漿容量は概ね５０〜１００μＬであり、急速冷凍してから−６０℃から−８０℃で保存した。
【０１９９】
百分率（％）インデル（挿入および／または欠失）：ＦａｓｔＰｒｅｐ  ａｎｄ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ  ＣＡ）を製造業者の指示通りに使用して、マウス組織を溶解した。ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキットを製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）通りに使用して、マウス組織からＲＮＡ／ＤＮＡを単離した。抽出したＤＮＡをＰＣＲおよびディープシークエンシングのために使用して、マウスアルブミン遺伝子座でインデルを測定した。表８は、コホート１（２８日目に屠殺）およびコホート２（５６日目に屠殺）を示す。
【表８】
2018533966.tif 000012
Ｂ．結果
【０２００】
図１３に示すように、マウスへのアルブミン標的化ＺＦＮおよびアルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体コードドナーのｉｎ  ｖｉｖｏ投与の後の、アルファ−シヌクレインＤ５Ｅ抗体の循環血漿中レベルは、全ての処置被験体で増加した。さらに、２８日および５６日に、ＺＦＮおよびアルファシヌクレインドナーの両方を受けた被験体において、ゲノム改変（％インデルで決定された）が見られた。図１４を参照のこと。
【０２０１】
免疫組織化学は、視床のニューロンによるアルファ−シヌクレイン単鎖抗体の取込みを示した。特に、アルファ−シヌクレイン単鎖抗体（ＳｃＦｖはｍｙｃタグ付きである）およびＮｅｕＮを検出するための、ｍｙｃを有するアルファ−シヌクレイントランスジェニックＬｉｎｅ６１マウスからの視床の二重免疫蛍光染色は、ＺＦＮ−アルファシヌクレインドナーのニューロンがアルファ−シヌクレインＳｃＦｖ（ｍｙｃ陽性）およびＮｅｕＮの両方を含むことを示した。さらに、図１５に示すように、アルブミン標的化アルファ−シヌクレインドナーを有するマウスは、アストログリオーシス疾患エンドポイント、ＧＦＡＰの低減を示した。図１６は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される通り、肝臓におけるＤ５Ｅ（＋／−ＧＢＡ）抗体転写物のｉｎ  ｖｉｖｏレベルの増加を示し、図１７は、抗体レベルと皮質神経網および線条体における低減したアルファ−シヌクレインレベルとの間の相関を示す。図１８は、Ｄ５Ｅ  ＧＢＡ抗体ｃＤＮＡ処置群における、アストログリオーシスマーカーＧＦＡＰのアルファ−シヌクレイン陽性細胞のＣＮＳ蓄積の低減、および皮質におけるアルファ−シヌクレイン陽性ニューロンの総数の低減を示す。したがって、ＳｃＦＶをコードする遺伝子の付加は、肝臓細胞から発現および放出され、脳に移動して治療的利益を提供することができる。
【０２０２】
したがって、本明細書に記載される抗体（例えば、単鎖抗体）導入遺伝子の標的化送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏで臨床上の（治療的）利益を提供する。
【０２０３】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願および公開は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０２０４】
理解の明快性のために開示は例証および例として多少詳細に提供されたが、本開示の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更および改変を実施することができることは当業者に明らかである。したがって、上記の記載および実施例は限定するものと解釈されるべきでない。
【図１】
2018533966.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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