(57)【要約】  本発明は、癌治療と組み合わせてＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ＣＴＬＡ４−遮断抗体）を投与することによって抗腫瘍応答を高めるための組成物及び方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法であって、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後にＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
腫瘍を有する対象を処置する方法であって：
（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップ；
（ｂ）前記対象におけるマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；及び
（ｃ）化学療法又は放射線治療を前記対象に実施するステップを含む、方法。
【請求項３】
腫瘍を有する対象を処置する方法であって：
（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップ；
（ｂ）前記対象におけるマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；及び
（ｃ）抗ＩＬ４抗体及び化学療法又は放射線治療を前記対象に実施するステップを含む、方法。
【請求項４】
腫瘍を有する対象を処置する方法であって：
（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップ；
（ｂ）前記対象におけるマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；
（ｃ）化学療法を前記対象に実施するステップ；
（ｄ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップ；及び
（ｅ）化学療法又は放射線治療を前記対象に実施するステップを含む、方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｂ）及び（ｄ）が、抗ＩＬ−４抗体の同時投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、化学療法耐性又は放射線治療耐性腫瘍を有すると確認される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍の成長を遅延又は鈍化させる、腫瘍サイズを減少させる、及び／又は前記対象の生存期間を延長する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が、化学耐性又は放射線治療耐性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が、非免疫原性又は低免疫原性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、ＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤性が低い、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、膵臓癌又は膵臓腺癌を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が、膵臓癌又は膵臓腺癌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法が、ゲムシタビンを投与するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＯＸ４０アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＯＸ４０抗体が、ＯＸ８６、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、及び９Ｂ１２の１つ以上である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＯＸ４０アゴニストが、ＯＸ４０融合タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、９Ｄ９及びトレメリムマブの１つ以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記療法が、免疫細胞の分化が腫瘍環境で減少したときに実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫細胞が、マクロファージ又はＴ細胞の１つ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
マクロファージの分化の減少が、マクロファージでのアルギナーゼの発現の減少によって決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法又は前記放射線治療が、前記ＯＸ４０アゴニスト及び前記抗ＣＴＬＡ４抗体の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、又は６日後に実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＩＬ４抗体が、腫瘍環境でのＣＤ４  Ｔ細胞の分化を減少させる、請求項３又は５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＯＸ４０アゴニスト、前記抗ＣＴＬＡ４抗体、及び前記療法を前記対象に２回以上投与又は実施するステップを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
化学療法の前に前記ＯＸ４０アゴニスト及び前記抗ＣＴＬＡ４抗体を投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
放射線治療の前に前記ＯＸ４０アゴニスト及び前記抗ＣＴＬＡ４抗体を投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が大腸癌を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
大腸癌を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法であって、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後に抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
大腸癌を有する対象を処置する方法であって：
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与するステップ；及び
（ｂ）放射線治療を前記対象に実施するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、９Ｄ９及びトレメリムマブの１つ以上である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法又は前記放射線治療が、前記抗ＣＴＬＡ４抗体の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、又は７日後に実施される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学療法又は前記放射線治療が、前記抗ＣＴＬＡ４抗体の投与の１日前、２日前、３日前、又は４日前に実施される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
大腸癌を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法であって、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後にＯＸ４０アゴニストを対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３３】
大腸癌を有する対象を処置する方法であって：
（ａ）放射線治療を前記対象に実施するステップ；及び
（ｂ）ＯＸ４０アゴニストを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記ＯＸ４０アゴニストが抗ＯＸ４０抗体である、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＯＸ４０抗体が、ＯＸ８６、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、及び９Ｂ１２の１つ以上である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＯＸ４０アゴニストが、ＯＸ４０融合タンパク質である、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＯＸ４０アゴニストが、化学療法又は放射線治療の実施の１日後又は２日後に投与される、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が大腸腫瘍を有する、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
腫瘍の成長を遅延又は鈍化させる、腫瘍サイズを減少させる、及び／又は前記対象の生存期間を延長する、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
膵臓癌の全ステージでの１年生存率は、約２０％であり、５年生存率は僅か６％であると推定される。これらの低い生存率の一因は、診断時に、多くの患者が、既に膵臓を越えて広がり、外科的切除が不可能な部位まで転移した腫瘍を有するという事実によるものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、Ｔ細胞の浸潤の減少のみ、又はこのＴ細胞の浸潤の減少とマクロファージ浸潤の増加との組み合わせが、膵臓癌の患者を含め、様々な癌の生存期間の減少に相関することが報告された。これらの後ろ向き研究では、患者は、化学療法、放射線、及び外科的切除を含む従来の癌治療で処置され、Ｔ細胞及びマクロファージの腫瘍への浸潤が、従来の治療に対する応答の結果に影響を与えることを示唆している。
【０００３】
過去数年の間に、従来の細胞傷害性腫瘍学的治療に対する新規な補助療法として免疫療法に関心が高まってきている。黒色腫におけるチェックポイント阻害剤、例えば、イピリムマブの臨床的な成功により、広範囲の悪性腫瘍に対する免疫療法の適用における幅広い関心が存在する。臨床的適応の増加により、放射線又は化学療法と共に免疫療法を利用する集学的治療がより一般的である。しかしながら、組み合わせ利用が、広く普及するようになってきているにもかかわらず、各作用物質の投与のタイミングに基づいて治療効率を最適化するように設計された研究が殆どない（Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの官報，２００９．１５（１７）：５３７９−８８）。従って、従来の癌治療に対する応答を改善することによって生存率を高める方法が緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの官報，２００９．１５（１７）：５３７９−８８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以下に説明されるように、本発明は、化学療法剤及び／又は化学療法レジメンと組み合わせてＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）及び抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ＣＴＬＡ４−遮断抗体）を投与することによって抗腫瘍応答を高めるための組成物及び方法に関する。本発明は、このような作用物質の組み合わせが、従来の治療計画に対して高い耐性を有する腫瘍（例えば、膵臓腫瘍）の処置に特に有効であるという発見に少なくともある程度は基づいている。従って、本発明は、ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を含む免疫治療組成物、癌（例えば、膵臓癌）の治療のために癌治療（例えば、化学療法及び／又は放射線治療）と組み合わせてＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４を投与する方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本明細書の開示は、腫瘍を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法を提供し、この方法は、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後にＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップを含む。
【０００７】
別の態様では、本明細書の開示は、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供し、この方法は：（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップ；（ｂ）対象でのマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；並びに（ｃ）化学療法又は放射線治療を対象に実施するステップを含む。
【０００８】
更なる一態様では、本明細書の開示は、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供し、この方法は：（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップ；（ｂ）対象でのマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；並びに（ｃ）抗ＩＬ４抗体及び化学療法又は放射線治療を対象に実施するステップを含む。
【０００９】
なお更なる態様では、本明細書の開示は、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供し、この方法は：（ａ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップ；対象におけるマクロファージの分化の減少を示唆する細胞の測定値を得るステップ；（ｂ）化学療法を対象に実施するステップ；（ｃ）ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップ；並びに（ｄ）化学療法又は放射線治療を対象に実施するステップを含む。
【００１０】
なお別の態様では、本明細書の開示は、大腸癌を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法を提供し、この方法は、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後に抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップを含む。
【００１１】
なお別の態様では、本明細書の開示は、大腸腫瘍を有する対象を処置する方法を提供し、この方法は、：（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体を対象に投与するステップ；及び（ｂ）放射線治療を対象に実施するステップを含む。
【００１２】
なお別の態様では、本明細書の開示は、大腸癌を有する対象における化学療法又は放射線治療の有効性を高める方法を提供し、この方法は、化学療法又は放射線治療の最中又は後にＯＸ４０アゴニストを対象に投与するステップを含む。
【００１３】
なお別の態様では、本明細書の開示は、大腸癌を有する対象を処置する方法を提供し、この方法は、（ａ）放射線治療を対象に実施するステップ；及び（ｂ）ＯＸ４０アゴニストを対象に投与するステップを含む。
【００１４】
本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、９Ｄ９及びトレメリムマブの１つ以上である。本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、化学療法又は放射線治療は、抗ＣＴＬＡ４抗体の投与の約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、又は７日後に実施される。本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、化学療法又は放射線治療は、抗ＣＴＬＡ４抗体の投与の約１日前、２日前、３日前、又は４日前に実施される。
【００１５】
本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体である。様々な実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ８６、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、及び９Ｂ１２の１つ以上である。様々な実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０融合タンパク質である。本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、化学療法又は放射線治療の実施の約１日後又は２日後に投与される。
【００１６】
本明細書で詳細に説明される任意の態様の様々な実施形態では、この方法は、腫瘍の成長を遅延又は鈍化させる、腫瘍サイズを減少させる、かつ／又は対象の生存期間を向上させる。特定の実施形態では、対象は、大腸腫瘍を有する。
【００１７】
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１８】
定義
特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明の属する分野の技術者が一般に理解する意味を有する。以下の参照文献は、本発明で使用される多数の用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ａｎｄ  Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される以下の用語は、特段の記載がない限り、以下のこれらの用語が持つ意味を有する。
【００１９】
「ＯＸ４０ポリペプチド」は、抗原活性化哺乳動物ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面に発現される受容体の多数のＴＮＦＲスーパーファミリーを意味する、例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，１２８１−１２９０（１９８７）；Ｍａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ９，１０６３−１０６８（１９９０）；ａｎｄ  Ｃａｌｄｅｒｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１，５２６１−５２７１（１９９３））を参照されたい。ＯＸ４０は、ＣＤ１３４、ＡＣＴ−４、及びＡＣＴ３５とも呼ばれる。ＯＸ４０受容体の配列は、当分野で公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＢ３３９４４又はＣＡＥ１１７５７で提供される。
【００２０】
例示的なヒトＯＸ４０の配列は、以下に示される：
【化１】
2018512397.tif 000003
【００２１】
「ＯＸ４０アゴニスト」とは、ＯＸ４０受容体と特異的に相互作用して、このＯＸ４０受容体の生物学的活性を高めるＯＸ４０リガンドのことである。望ましくは、生物学的活性は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約１００％も増加される。特定の態様では、本明細書に開示されるＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０結合ポリペプチド、例えば、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）、ＯＸ４０リガンド、又はこれらの分子の断片又は誘導体を含む。
【００２２】
「ＯＸ４０抗体」とは、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体のことである。ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０及びその抗原結合断片に特異的であるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。特定の態様では、本明細書で説明される抗ＯＸ４０抗体は、モノクローナル抗体（又はその抗原結合断片）、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又は完全なヒトモノクローナル抗体である。
【００２３】
「ＣＴＬＡ４ポリペプチド」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ０７４７３．１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又はＴ細胞阻害活性を有するその断片のことである。ＡＡＬ０７４７３．１の配列は、以下に示される：
【化２】
2018512397.tif 000004
【００２４】
「抗ＣＴＬＡ４抗体」とは、ＣＴＬＡ４ポリペプチドに選択的に結合する抗体のことである。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体は、９Ｄ９及びトレメリムマブを含む。
【００２５】
「ＩＬ４ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００５８０に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は免疫細胞（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞）分化活性を有するその断片のことである。ＮＰ＿０００５８０の配列は以下に示される：
【化３】
2018512397.tif 000005
【００２６】
「抗ＩＬ４抗体」とは、ＩＬ４ポリペプチドに選択的に結合する抗体のことである。１１Ｂ１１は、例示的な抗ＩＬ４抗体である。
【００２７】
「抗体」とは、標的を認識してその標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子のことである。本明細書で使用される用語「抗体」は、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、多重特異性抗体、例えば、少なくとも２つの無傷抗体から作製される二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗体が所望の生物学的活性を示すのであれば抗原認識部位を含むその他の改変免疫グロブリン分子を含む。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれるそれぞれの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び３次元配置を有する。
【００２８】
用語「抗体結合ドメイン」、「抗体結合断片」、及び「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的な結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。例えば、抗原が大きい場合、抗原結合ドメインは、抗原の一部のみに結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的な相互作用に関与する抗原分子の一部は、「エピトープ」又は「抗原決定基」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしも両方を含まなくてもよい。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片は、ＶＨドメインのみからなるが、無傷抗体の一部の抗原結合機能をなお維持する。
【００２９】
「改善する」とは、疾患の発症又は進行を、低下させる、抑制する、弱める、軽減する、阻む、又は一定に保つことである。
【００３０】
「抗原結合断片」とは、抗原に結合する無傷抗体の一部のことである。特に、用語、抗原結合断片は、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得る。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
「癌」とは、過剰な増殖又はアポトーシスの減少によって特徴付けられる疾患又は障害のことである。例えば、本発明の組成物及び方法は、膵臓癌の処置に有用である。
【００３２】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法でこれらの用語が持つ意味を有し得、かつ「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に米国特許法で持つ意味を有し、かつこの用語は、非限定であり、記載されるものの基本的又は新規な特徴が記載されるものを超える存在によって変更されないのであれば、この記載されるものを超える存在を可能にするが、従来技術の実施形態は排除する。
【００３３】
「検出」は、検出されるべき分析物の存在、非存在、又は量を特定することを指す。
【００３４】
「高める」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の肯定的な変化のことである。
【００３５】
用語「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見られる通常は伴う成分を様々な程度に含まない物質を指す。「単離する」は、起源又は周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」は、単離を超える程度の分離を意味する。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も、この生物学的特性に著しく影響を与えない、又は他の悪影響を与えないように他の物質を多くは含まない。即ち、本発明の核酸又はペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって作製されるときの細胞物質、ウイルス物質、若しくは培地、又は化学合成されるときの化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に１つのバンドを生じさせることを意味し得る。修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化を受け得るタンパク質では、異なる修飾が、別個に精製され得る異なる単離タンパク質を生じさせ得る。
【００３６】
「単離ポリペプチド」とは、自然に伴う成分から分離された本発明のポリペプチドのことである。典型的には、ポリペプチドは、タンパク質及び自然に結合した天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含まない場合に単離されている。好ましくは、製剤は、本発明のポリペプチドが少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。本発明の単離ポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出によって、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；又はタンパク質の化学合成によって得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００３７】
「弱める」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の否定的な変化のことである。
【００３８】
「参照」とは、標準条件又は対照条件のことである。
【００３９】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される規定された配列のことである。「参照配列」は、特定の配列；例えば、完全長ｃＤＮＡ配列若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ配列若しくは遺伝子配列のサブセット若しくは全体であり得る。ポリペプチドでは、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５のアミノ酸、更に一層好ましくは約３５のアミノ酸、約５０のアミノ酸、又は約１００のアミノ酸の長さとなる。核酸では、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５のヌクレオチド、更に一層好ましくは約１００のヌクレオチド、又は約３００のヌクレオチド、又はその付近若しくはその間の任意の整数のヌクレオチドの長さとなる。
【００４０】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、本発明のポリペプチドを自然に含むサンプル、例えば、生物学的サンプル中の他の分子は実質的に認識せず結合しない化合物又は抗体のことである。
【００４１】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）又は参照核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子のことである。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベル又は核酸において少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、更に好ましくは９０％、９５％、又は９９％も同一である。
【００４２】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５，ＢＬＡＳＴ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の改変に対して相同性の程度を決定することによって同一又は同様の配列を一致させる。保存的な置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを、密接に関連する配列を示唆するｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアを用いて使用することができる。
【００４３】
「対象」とは、限定されるものではないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、若しくはネコを含む哺乳動物のことである。
【００４４】
抗体の「可変領域」は、単独又は組み合わせられた、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＷ領域に近接して一緒に維持され、他の鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定する技術が少なくとも２つ存在する：（１）異種間配列変化に基づいたアプローチ（即ち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいたアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。加えて、これらの２つのアプローチの組み合わせは、時々、当分野でＣＤＲを決定する際に使用される。
【００４５】
本明細書で示される範囲は、範囲内の値の全てについての省略表現であることを理解されたい。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むことを理解されたい。
【００４６】
本明細書で使用される用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、障害及び／又は障害に関連した症状を弱める又は改善することを指す。除外されるものではないが、障害又は状態を処置することは、障害、状態、又はこれに関連した症状が完全になくなることが要求されるものではないことを理解されたい。
【００４７】
特段の記載がない、又は文脈から明確でない場合は、本明細書で使用される用語「又は、若しくは（ｏｒ）」は、包含的であることを理解されたい。特段の記載がない、又は文脈から明確でない場合は、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、単数形又は複数形であることを理解されたい。
【００４８】
特段の記載がない、又は文脈から明確でない場合は、本明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当分野で通常許容される範囲内、例えば、平均値の標準偏差が２以内であることを理解されたい。約は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％の範囲内であると理解することができる。文脈から明確ではない場合は、本明細書で提供される全ての数値は、用語、約によって変更される。
【００４９】
本明細書の変数のどの定義における化学基のリストの記載も、列記された基の任意の１つの基又は組み合わせとしてその変数の定義を含む。本明細書の変数又は態様についての実施形態の記載は、任意の１つの実施形態としての実施形態、又はその他の実施形態又はその一部との組み合わせられた実施形態を含む。
【００５０】
本明細書で提供されるどの組成物及び方法も、本明細書で提供される他の組成物及び方法のいずれか１つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、腫瘍マクロファージの適応免疫再構築を示している。Ｐａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のまま放置された（ＮＴ）、又は１４日目及び１７日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）に１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンで処置され（ＧＺ）、次いで、２１日目に腫瘍が回収された。図１Ａは、Ｆ４／８０＋マクロファージ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫組織学を示す２つの画像を示している。腫瘍全体の端から端までの概観を作成するために腫瘍に亘る複数の画像が組み合わせられた。腫瘍の端は、白い矢印で示されている。図１Ｂは、２つの散布図を示している。１４日目にＰａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のまま放置された、又は２５０μｇの抗ＯＸ４０、２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４、又はこれらの組み合わせで処置された。免疫療法から４日目又は８日目に腫瘍が回収され、単一細胞懸濁液が、染色され、フローサイトメトリーによって選別され、パネル（ｉ）ＣＤ１１ｂ＋細胞のグラフ及びパネル（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ＋集団内のＧｒ１ｌｏＩＡ＋細胞のグラフでゲーティングされた。図１Ｃは、溶解されて、アルギナーゼＩ及びＧＡＰｄＨの発現についてウェスタンブロットされた選別腫瘍マクロファージを示すウェスタンブロットの画像を示している。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、予備免疫療法が、化学療法を改善したことを示している。図２Ａは、線形グラフ（パネルｉ）及び散布図（パネルｉｉ）を示している。Ｐａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のまま放置された、又は１４日目に２５０μｇの抗ＯＸ４０、２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４、又はこれらの組み合わせで処置された（赤色の破線）。１８日目に、マウスが、ランダム化されて、更なる処置がされない、又は３週間に亘って週２回ゲムシタビンで処置された（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）。図２Ａのパネル（ｉ）では、グラフは、１群当たり６〜７匹のマウスの各群の平均腫瘍面積を示している。図２Ａのパネル（ｉｉ）では、グラフは、化学療法を受けた群の３９日目の腫瘍面積を示している。各記号は、１匹の動物を表している。図２Ｂは、明確にするために一度に２つの群を比較している、図２Ａのように処置されたマウスの生存曲線を示す５つのグラフ（パネルｉ〜ｖ）を示している。注：ＮＳは有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】図３は、予備免疫療法後の腫瘍浸潤免疫細胞を示す３つの散布図を示している。Ｐａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のまま放置された、又は１４日目に２５０μｇの抗ＯＸ４０及び２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４で処置された。腫瘍が、処置から４日目又は７日目に回収され、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネル（ｉ））；ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネル（ｉｉ））；又はＣＤ１１ｂ＋（パネル（ｉｉｉ））、骨髄細胞のフローサイトメトリーによって浸潤細胞集団について分析された。各記号は、１つの腫瘍を表している。注：ＮＳは有意ではない；＊ｐ＜０．０５。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｅは、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化を誘導する組み合わせ療法を示している。図４Ａは、未処置のまま放置された、又は１４日目に２５０μｇの抗ＯＸ４０、２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４、又はこれらの組み合わせで処置されたＰａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスを示している。リンパ節が、７日後に回収され、細胞集団のフローサイトメトリーによって分析された。図４Ａは、ＣＤ４  Ｔ細胞（パネル（ｉ））；ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（パネル（ｉｉ））；ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞（パネル（ｉｉｉ））；及びＣＤ８  Ｔ細胞（パネル（ｉｖ））の数を示す４つのグラフを示している。図４Ｂは、未処置マウス（パネル（ｉ））、又は抗ＣＴＬＡ４（パネル（ｉｉ））；抗ＯＸ４０（パネル（ｉｉｉ）、若しくは抗ＣＴＬＡ４及び抗ＯＸ４０（パネルｉｖ）で処置されたマウスからのＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞中の転写因子Ｔｂｅｔ及びＧＡＴＡ３の細胞内染色の例を示す４つのグラフを示している。図４Ｃは、ＧＡＴＡ３＋Ｔｂｅｔ−（パネル（ｉ））又はＧＡＴＡ３−Ｔｂｅｔ＋（パネル（ｉｉ））であるＦｏｘＰ３−ＣＤ４  Ｔ細胞の比率を示す図４Ｂのようにデータの要約を示す２つのグラフを示している。各記号は、１匹のマウスを表している。図４Ｄは、分泌阻害剤の存在下、４時間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プレート結合抗ＣＤ３で刺激された図４Ａでのように回収されたリンパ節細胞を示している。細胞が表面染色され、次いで細胞内のサイトカインが染色された。図４Ｄは、ＩＬ−４＋ＩＦＮγ−（パネル（ｉ））又はＩＬ−４−ＩＦＮγ＋（パネル（ｉｉ））であるＦｏｘＰ３−ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を示す２つのグラフを示している。図４Ｅは、転写因子Ｅｏｍｅｓ（パネル（ｉ））が細胞内染色され、図４Ｄのように刺激され、ＩＦＮγ（パネル（ｉｉ））が染色された図４Ａでのように回収されたリンパ節ＣＤ８  Ｔ細胞を示す２つのグラフを示している。注：ＮＳは有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の遮断が腫瘍制御を改善したことを示している。図５Ａは、未処置のまま放置された、又は１４日目に２５０μｇの抗ＯＸ４０及び２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４で処置されたＰａｎｃ０２腫瘍を有する免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスを示す２つのグラフを示している。１８日目に、マウスが、ランダム化されて、更なる処置がされない、又は３週間に亘って週２回ゲムシタビンで処置され（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）、そして更にランダム化されて、更なる処置を受けない（パネル（ｉ））、又はゲムシタビン注射（パネル（ｉｉ））と同時に１００μｇの抗ＩＬ−４が腹腔内投与（ｉ．ｐ．）された。グラフは、１群当たり６〜７匹のマウスの各群の平均腫瘍面積を示している。図５Ｂは、図５Ａでのように組み合わせ処置を受けた群の３５日目の腫瘍面積を示すグラフを示している。各記号は、１匹の動物を表している。注：ＮＳは有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｃは、免疫化学療法の反復サイクルでの有効性の改善を示している。図６Ａは、化学免疫療法のサイクルの後の末梢血免疫細胞の分析であり、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞（パネル（ｉ））；ゲーティングされたＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞におけるＧｒ１ＨＩ好中球（パネル（ｉｉ））；ゲーティングされたＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞におけるＧｒ１ｌｏＭＨＣＩＩ＋単球（パネル（ｉｉｉ））；ゲーティングされたＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞におけるＬｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−（パネル（ｉｖ））；ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞（パネル（ｖ））；並びにＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（パネル（ｖｉ））の代表的なゲーティングを示す６つのグラフを示している。図６Ｂは、化学免疫療法の１回のサイクルの後の全末梢血における、図６Ａでのようにゲーティングされた集団の定量分析を示す６つの散布図を示している。各記号は、１匹のマウスを表している。図６Ｃは、未処置のまま放置された、又は１４日目に抗ＯＸ４０（２５０μｇ）及び抗ＣＴＬＡ４（２５０μｇ）で処置されたＰａｎｃ０２腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを表す６つのグラフを示している。１８日目に、マウスが、ランダム化されて、更なる処置がされない、又は２週間に亘って週２回ゲムシタビンで処置された（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）。ゲムシタビンの最後の投与の３日後に、選択された群に、抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４の別の投与がされる、又は処置されず、続いて２週間に亘って週２回のゲムシタビンの別のサイクルが行われた（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）。グラフは、１群当たり６〜７匹のマウスでの個々のマウスの腫瘍面積を示している。注：ＮＳは有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７】図７は、化学療法の代替のタイミングを示す３つのグラフを示している。Ｐａｎｃ０２腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のまま放置された、又は１１日目（７日目）若しくは１８日目（０日目）に２５０μｇの抗ＯＸ４０及び２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４で処置された。マウスが、ランダム化されて、更なる処置がされない、又は１８日目から３週間に亘り週２回ゲムシタビンで処置された（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇのＧＺ）。グラフは、ＮＴ対ＧＺのみ（パネル（ｉ））；ＧＺのみ対抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４と０日目のＧＺ（パネル（ｉｉ））；並びにＧＺのみ対抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４と７日目のＧＺ（パネル（ｉｉｉ））についての、１群当たり６〜７匹のマウスでのマウスの生存曲線を示している。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、ＣＴ２６大腸腫瘍の抗ＣＴＬＡ４前処置を伴う放射線の有効性の改善を示している。図８Ａは、平均腫瘍サイズ（パネル（ｉ））及び全生存期間（パネル（ｉｉ））を示すグラフを示している。マウスは、腫瘍の直径が１２ｍｍを超えたとき又は身体的悪化を示したときに安楽死された。図８Ｂは、以下の群における個々のマウスからの腫瘍の測定値を示すグラフを示している：未処置の群（パネル（ｉ））、又は抗７日目にＣＴＬＡ４で処置された群（パネル（ｉｉ））；１４日目に２０Ｇｙの放射線治療（ＲＴ）で処置された群（パネル（ｉｉｉ））；７日目に抗ＣＴＬＡ４＋１４日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｉｖ））；１５日目に抗ＣＴＬＡ４＋１４日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｖ））；１９日目の抗ＣＴＬＡ４＋１４日目の２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｖｉ））。代表的な実験は、１群当たりｎ＝６のマウスで示された。実験は、少なくとも２回繰り返された。
【図９】図９は、４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける抗ＣＴＬＡ４前処置の効果を示すグラフである。４Ｔ１腫瘍は、ステージ４の乳癌の動物モデルである。未処置の群（パネル（ｉ））、又は７日目に抗ＣＴＬＡ４で処置された群（パネル（ｉｉ））；１４日目、１５日目、及び１６日目に２０Ｇｙの放射線治療（ＲＴ）で処置された群（パネル（ｉｉｉ））；７日目に抗ＣＴＬＡ４＋１４日目、１５日目、及び１６日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｉｖ））；１７日目に抗ＣＴＬＡ４＋１４日目、１５日目、及び１６日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｖ））における個々のマウスからの腫瘍測定値。実験は、少なくとも２回繰り返された。
【図１０】図１０は、ＣＴ２６大腸腫瘍を有するマウスの全生存期間のグラフであり、放射線治療後の抗ＯＸ４０免疫療法の最適なタイミングを示している。右肢にＣＴ２６腫瘍を有するマウスが、未処置のまま放置された、又は２０Ｇｙの局所放射線で処置された。マウスが、ランダム化されて、７日目、１５日目、又は１９日目に２５０μｇの抗ＯＸ４０が投与された。マウスは、腫瘍の直径が１２ｍｍを超えたとき又は身体的悪化を示したときに安楽死された。データは、３つの実験の組み合わせであり、１群当たり合計ｎ＝１２〜１８匹のマウスであった。
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、放射線の有効性が、制御性Ｔ細胞の事前の枯渇によって改善されたことを示している。右肢にＣＴ２６腫瘍を有するマウスが、ランダム化されて、処置されない、又は７日目にＣＤ４枯渇抗体若しくはＣＤ２５枯渇抗体が投与された。マウスは、更にランダム化されて、未処置のまま放置された、又は１４日目に２０Ｇｙの局所放射線で処置された。図１１Ａは、対照（パネル（ｉ））及びＣＤ４枯渇マウス（パネル（ｉｉ））におけるＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞を示すためにゲーティングされた末梢血リンパ球、並びに対照（パネル（ｉｉｉ））及びＣＤ２５枯渇マウス（パネル（ｉｖ））におけるＣＤ２５＋Ｔ細胞を示すためにゲーティングされたＣＤ４  Ｔ細胞の細胞選別を示している。図１１Ｂは、以下の群の個々のマウスからの腫瘍測定値を示すグラフを示している：未処置の群（パネル（ｉ））、又は抗ＣＤ４で処置された群（パネル（ｉｉ））；抗ＣＤ２５で処置された群（パネル（ｉｉｉ））；放射線治療（ＲＴ）で処置された群（パネル（ｉｖ））；抗ＣＤ４＋ＲＴで処置された群（パネル（ｖ））；抗ＣＤ２５＋ＲＴで処置された群（パネル（ｖｉ））。図１１Ｃは、全生存期間を示すグラフである。マウスは、腫瘍の直径が１２ｍｍを超えたとき又は身体的悪化を示したときに安楽死された。代表的な実験は、１群当たりｎ＝６のマウスで示された。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、異なる抗ＣＴＬＡ４クローンの比較を示している。右肢にＣＴ２６腫瘍を有するマウスが、未処置のまま放置された、又は７日目に２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４クローン９Ｄ９若しくは２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４クローンＵＣ１０で処置された。マウスは、更にランダム化されて、未処置のまま放置された、又は１４日目に２０Ｇｙの局所放射線で処置された。図１２Ａは、平均腫瘍サイズ（パネル（ｉ））及び全生存期間（パネル（ｉｉ））を示すグラフを示している。マウスは、腫瘍の直径が１２ｍｍを超えたとき又は身体的悪化を示したときに安楽死された。図１２Ｂは、以下の群の個々のマウスからの腫瘍測定値を示すグラフである：未処置の群（パネル（ｉ））、又は７日目に抗ＣＴＬＡ４（９Ｄ９）で処置された群（パネル（ｉｉ））；７日目に抗ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０）で処置された群（パネル（ｉｉｉ））；１４日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｉｖ））；７日目に抗ＣＴＬＡ４（９Ｄ９）＋１４日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｖ））；７日目に抗ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０）＋１４日目に２０ＧｙのＲＴで処置された群（パネル（ｖｉ））。代表的な実験は、１群当たりｎ＝６のマウスで示された。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書の開示は、癌化学療法の有効性を高めるのに有用な方法を提示する。
【００５３】
本明細書の開示は、樹立したマウス膵臓腺癌腫瘍のマウスへのアゴニスト抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＴＬＡ４抗体の併用投与により、腫瘍中のマクロファージの再分極に関連した一過性の表現型の変化が起きるという発見を提示する。マクロファージの再分極と同時のゲムシタビンの投与により、化学療法又は組み合わせ免疫療法のみと比較して腫瘍制御が著しく改善された。この免疫化学療法の治療可能期間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）は短かった。腫瘍抑制環境の復帰は、流入領域リンパ節中のＣＤ４Ｔ細胞のＴｈ２分極、腫瘍のＣＤ４浸潤の増加、及び腫瘍マクロファージのＭ２分化の逆戻りに関連していた。ＩＬ−４遮断抗体の投与により、免疫化学療法による腫瘍制御が改善された。重要なことに、マウスが、化学療法の後に免疫機能を維持し、免疫化学療法の追加のサイクルが、腫瘍制御を改善することができた。これらのデータは、免疫療法及び化学療法に対して高い耐性を有する前臨床腫瘍モデルでは、予備免疫療法を用いて、従来の化学療法に対して腫瘍制御を改善することができることを実証している。
【００５４】
更に、抗ＣＴＬＡ４を用いる免疫療法の後に行われた放射線療法により、樹立した大腸癌腫瘍のマウスで腫瘍が１００％治癒した。抗ＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、放射線の翌日に送達されたときに最適であった（ＲＴのみの５０日では生存期間中央値に達しなかった、ｐ＜０．０５）。抗ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞の枯渇によって部分的に媒介され、放射線の前に与えられたときに極めて有効であり、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗原放出及び抗原提示の増加のタイミングに一致して、放射線の直後に送達されたときに極めて有効であった。これらのデータは、免疫療法と放射線の併用により、治療の有効性が向上すること；及び放射線と投与の理想的なタイミングが、利用される免疫療法の種類によって決まることを実証している。
【００５５】
更なる実施形態では、本明細書で開示される免疫療法は、限定されるものではないが、乳癌、膵臓癌、及び肺癌を含む処置に使用することができる。
【００５６】
腫瘍免疫環境
腫瘍の免疫環境は、従来の療法後の結果を予測するものである。膵臓癌のマウスモデルでは、腫瘍関連マクロファージの浸潤を減少させる治療が、化学療法への応答を改善した。マウス乳癌モデルでも、同様の結果が観察された。
【００５７】
腫瘍の成長を促進する免疫環境を有する患者に対しては、免疫療法によって腫瘍環境を改善して従来の治療での結果を改善する機会を得ることが提案される。ＯＸ４０又はＣＴＬＡ４を標的とする免疫療法は、Ｔ細胞の浸潤の変化によって腫瘍環境を再構築することが示されている。ＯＸ４０のアゴニスト抗体での免疫療法は、腫瘍を再構築することができ、これによりＣＤ８の浸潤が増加し、結果としてマクロファージの浸潤が減少した（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：５２０６−１５）。同様に、ＣＴＬＡ−４の抗体の遮断により、マウスモデル（Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０；１０７：４２７５−８０）及び患者（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１；１７：４１０１−９）の両方でＴ細胞の腫瘍への浸潤が増加したことが示された。しかしながら、患者でのこれらの浸潤の単なる存在が、必ずしも治療の成功に関連するものではなかった（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１；１７：４１０１−９）。腫瘍免疫環境におけるマクロファージは、それらの表現型を適応免疫促進性のＭ１分化から創傷治癒促進性のＭ２分化に迅速に変化させることができ、Ｔ細胞治療の後の初期炎症を解消することが示されている（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２；１３６：４３７−４７）。それでもなお、全身免疫療法後の初期のＴ細胞の腫瘍への浸潤は、化学療法の有効性が効率の悪い薬物送達によって制限されるため、例えば、効率の悪い血管新生脈管構造（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を再構築又は標準化することによって一過性に腫瘍環境を再構築するのに十分であり得る（Ｇａｎｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２：１４６２−７０）。特定の理論に拘束されるものではないが、免疫療法による腫瘍再構築が、他の腫瘍免疫環境における化学療法による影響を腫瘍がより受けやすくする可能性を有するという仮説を立てた。
【００５８】
この仮説を試すために、免疫適格マウスでの高い化学耐性及び放射線耐性腫瘍を形成する膵臓腺癌のＰａｎｃ０２マウスモデルを使用すると、より免疫原性の高い腫瘍と比較して広範に間質浸潤し、薬物浸透が減少した。本明細書で実証されるように、全身免疫療法は、アルギナーゼの発現の減少によって決定される、腫瘍におけるマクロファージの分極を一過性に変化させた。変化したマクロファージの分極の期間中でのゲムシタビン化学療法の送達により、腫瘍制御及び生存期間が十分に改善された。加えて、これらの腫瘍を有するマウスにおけるＴ細胞の分化が、この免疫化学療法では最適でなかったことを実証した。これにより、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞によるインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生に関連した２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化が起きた。ｉｎ  ｖｉｖｏでのインターロイキン−４（ＩＬ−４）の阻害により、免疫化学療法の有効性が著しく改善された。最終的に、マウス免疫細胞は、化学療法後にも機能を維持し、これにより、追加の免疫化学療法が、腫瘍制御及び生存期間を著しく向上させたことを示した。これらのデータは、免疫療法及び化学療法の順番及びタイミングが、腫瘍の微小環境及び腫瘍応答に対して著しい影響を有し得ることを実証している。予備免疫療法は、免疫環境が不十分な場合の化学療法の有効性を改善する可能性を持つ新規な処置の選択肢であり、免疫学的に陰性の癌における奏効率を増加させることができる。
【００５９】
放射線治療は、患者の免疫系に影響を及ぼし、免疫系は、放射線治療に対する応答に影響を及ぼす（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２．４（２）：１２５−８）。腫瘍の放射線治療により、ＭＨＣクラスＩの発現における用量反応性が増加し（Ｒｅｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６．２０３（５）：１２５９−７１）、高線量放射線から２日以内の抗原提示の期間が短くなった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７．２０４（１）：４９−５５）。従って、Ｔ細胞を標的とする多数の前臨床及び臨床免疫療法が、放射線照射の直後に共刺激又は免疫アジュバントを適用する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９．１１４（３）：５８９−５９５；Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０．３３（８）：７９８−８０９；Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．１１（２  Ｐｔ  １）：７２８−３４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１４．１２４（２）：６８７−９５；Ｓｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１２．４（１３７）：１３７ｒａ７４）。これらのアプローチは、様々な程度に、腫瘍抗原特異的免疫反応を増加させ、照射された放射線のクリアランス及び遠く離れた未処置の腫瘍を改善し、かつ後の腫瘍の問題から治癒した動物を保護することを示した。しかしながら、一連の関心のある事例研究により、イピリムマブ（ヒト抗ＣＴＬＡ４抗体）での免疫療法、及びこれに続く放射線は、黒色腫に広範な腫瘍退縮をもたらし得、腫瘍抗原特異的反応が増加した（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．３６６（１０）：９２５−３１；Ｈｉｎｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２．５（６）：４０４−４０７）。これらの患者では、放射線療法は、イピリムマブ研究に既に参加している患者の個々の病変に緩和的に送達された。イピリムマブ療法は、患者の腫瘍が抗体療法に対する応答を示すか否かにかかわらず、Ｔ細胞の患者の腫瘍への浸潤を増加させることを示した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１．１７（１２）：４１０１−９）。従って、免疫療法後に送達される局所姑息的照射で局所疾患及び遠く離れた疾患の管理を達成した患者は、改善された腫瘍環境に対する処置を受けた可能性が高いであろう。イピリムマブ及び放射線で処置された患者の検討で、Ｂａｒｋｅｒらは、「維持期」において、放射線治療の後に放射線で処置された患者が、「誘導期」中に放射線で処置された生存期間よりも著しく有利な生存期間を示すことを見出した（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１３．１（２）：９２−８）。これらのデータは、抗ＣＴＬＡ４及び放射線治療のスケジューリングをタイミングの最適化によって改善できることを示唆している。
【００６０】
今日まで、免疫療法が最初に行われるような免疫療法と放射線のタイミングを合理的に最適化した研究が殆どなかった。ＴＧＦβ阻害剤での前処置が、余病の免疫制御を改善することによって放射線治療に対する応答を改善することが、近年、放射線治療の前臨床マウスモデルで実証された（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４）。特定の理論に拘束されるものではないが、放射線治療の前の抗ＣＴＬＡ４抗体での前処置が、放射線治療後と比較して腫瘍制御を改善するであろうという仮説を立てた。免疫適格マウスでの大腸癌の前臨床モデルでは、抗ＣＴＬＡ４抗体での前処置が、最適な腫瘍制御を提供した。しかしながら、最近活性化されたＴ細胞を標的とする、抗ＯＸ４０での代替免疫療法は、放射線治療の直後に行われると最適であった。特定の理論に拘束されるものではないが、抗ＣＴＬＡ４前処置の有効性は、制御性Ｔ細胞を枯渇させるその能力にあり得る。本明細書で説明されるこの結果は、最適な組み合わせ処置をいつクリニックに移すかを判断するための重要な前臨床証拠を提供し、特に、免疫療法の作用機序が、放射線との最適なタイミングを決定し得る。
【００６１】
抗腫瘍療法
他の癌処置と組み合わせた、ＯＸ４０アゴニスト又は抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の投与を含む癌を処置するための方法が本明細書で提供される。抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の投与により、腫瘍環境の変化（例えば、マクロファージの分化の抑制）が起こり、この免疫療法の実施により、化学療法の抗腫瘍効果、例えば、様々なレベルの腫瘍の退縮、縮小が増加する、又は疾患の進行が停止する。
【００６２】
本開示の一態様は、処置を必要する患者に、有効量の抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体及び１つ以上の化学療法剤を投与することを含む、癌を処置するための方法を提供する。適切な化学療法剤及び毒素が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、及びＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）に記載されている。他の適切な毒素及び／又は化学療法剤は、当業者に公知である。
【００６３】
抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の投与により、腫瘍関連マクロファージにおけるアルギナーゼ発現レベルの低下によって示されるように、腫瘍におけるマクロファージの分化が抑制された。腫瘍関連マクロファージの分化の抑制が、化学療法による抗腫瘍効果が腫瘍で観察された期間に起きたが、その他は、従来の療法に対して耐性を有していた。従って、本発明の特定の実施形態では、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン、５ＦＵ、ドセタキセル、パクリタキセル、又はＣＰＴ１１）が、マクロファージの分化が減少したときに一度に投与される。抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び抗ＣＴＬＡ４抗体の投与は、マクロファージの分化を促進するＩＬ４を分泌するＴ細胞のＴｈ２分化にも関連していた。免疫療法での抗ＩＬ４抗体の投与は、Ｔｈ２細胞によるＩＬ４の分泌に応答したマクロファージの分化を抑制した。従って、特定の実施形態では、抗ＩＬ４抗体の使用は、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＯＸ４０アゴニスト抗体）及び抗ＣＴＬＡ４を用いる抗腫瘍レジメンに含められる。
【００６４】
望ましくは、ＯＸ４０アゴニスト及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の投与が、腫瘍再構築、マクロファージの分化の抑制、及び／又はＴ細胞の分化の抑制の１つ以上を引き起こす。従って、ＯＸ４０アゴニスト及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の投与を使用して、例えば、化学療法及び放射線治療を含む従来の癌治療の抗腫瘍効果を高めることができる。ＯＸ４０アゴニスト及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体は、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後に投与することができる。投与されるべきＯＸ４０アゴニスト及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体の有効量は、当業者によって周知の方法で決定することができる。癌治療の毒性が、対象によって許容される（例えば、低いリンパ球毒性を有する）場合、２回以上の本発明の方法による免疫化学療法を使用することができる。
【００６５】
ＯＸ４０アゴニストの投与に対する臨床反応は、限定されるものではないが、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線イメージング、コンピューター断層（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉眼所見、並びに、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び化学療法によって検出可能な変化を含む血液化学を含め、臨床医に公知の診断技術を用いて評価することができる。一例では、ＯＸ４０アゴニスト及び抗ＣＴＬ４抗体は、マクロファージの分化を減少させ、これは、（例えば、本明細書で説明される方法を用いて）マクロファージ内でのアルギナーゼの発現の減少によって測定することができる。
【００６６】
ＯＸ４０アゴニスト及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体を含む癌治療での有効な処置としては、例えば、原発腫瘍の部位又は１つ以上の転移における癌の進行速度の低下、腫瘍又は転移の成長の遅延又は安定化、腫瘍の縮小、及び／又は腫瘍退縮が挙げられる。
【００６７】
本明細書で以下に報告されるように、ＯＸ４０アゴニスト及びＩＤＯ阻害剤の投与は、腫瘍抗原を含む免疫原性組成物の有効性を予想外に高める。
【００６８】
ＯＸ４０アゴニスト
ＯＸ４０アゴニストは、抗原によるプライミングの最中又は直後にＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０受容体と相互作用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原に対する応答が増加する。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０受容体と相互作用するＯＸ４０アゴニストは、抗原のみに対する応答と比較してＴ細胞の増殖を増加させ得る。抗原に対する応答の上昇は、ＯＸ４０アゴニストの非存在下でよりも実質的に長い期間に亘って維持され得る。従って、ＯＸ４０アゴニストによる刺激は、抗原、例えば、腫瘍細胞のＴ細胞認識をブーストすることによって抗原特異的免疫応答を促進する。ＯＸ４０アゴニストは、例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，３１２，７００号明細書、同第７，５０４，１０１号明細書、同第７，６２２，４４４号明細書、及び同第７，９５９，９２５号明細書に記載されている。癌治療でのこのようなアゴニストの使用方法は、例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１３／１１９２０２号パンフレット及び同第２０１３／１３０１０２号パンフレットに記載されている。
【００６９】
ＯＸ４０アゴニストは、限定されるものではないが、ＯＸ４０結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＯＸ４０リガンド（「ＯＸ４０Ｌ」）、又はそのＯＸ４０結合断片、変異体、又は誘導体、例えば、可溶性細胞外リガンドドメイン及びＯＸ４０Ｌ融合タンパク質、並びに抗ＯＸ４０抗体（例えば、モノクローナル抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体）、又はその抗原結合断片、変異体、又は誘導体を含む。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体の例は、例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３２号明細書及び同第６，１５６，８７８号明細書に記載されている。特定の実施形態では、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２９，５７５−５８５（２００６）に記載されている、９Ｂ１２、又はその抗原結合断片、変異体、又は誘導体である。
【００７０】
特定の態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号２９又は配列番号３２の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
特定の態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号２９または配列番号３２を含む。
【００７２】
本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を更に提供し、ＶＨは、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、これらのアミノ酸配列は、配列番号８のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１５、若しくは配列番号１６のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２５、配列番号２６、若しくは配列番号２７のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、又はこれらのＶＨ−ＣＤＲＳの１つ以上における８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、若しくは１つの単一アミノ酸の置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一である。
【００７３】
本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を更に提供し、ＶＨは、以下の式のアミノ酸配列を含み：
ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４
式中、ＨＦＷ１は配列番号６又は配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は配列番号８であり、ＨＦＷ２は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２は配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６であり、ＨＦＷ３は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７であり、かつＨＦＷ４は配列番号２８である。特定の態様では、ＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３である。特定の態様では、ＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４である。
【００７４】
更に、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、又は配列番号６７の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
一態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含むその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＨは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
特定の態様では、本開示は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体、又は抗体重鎖若しくはその断片及び抗体軽鎖若しくはその断片を含むその抗原結合断片を提供し、重鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
他の実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ｍＡｂ  ９Ｂ１２と同じＯＸ４０エピトープに結合する。
【００７８】
例示的なヒト化ＯＸ４０抗体は、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｙ  ２００７；４４（１２）：３１１２-３１２１によって説明され、以下の配列を有する：
【化４】
2018512397.tif 000006
【００７９】
９Ｂ１２は、マウスＩｇＧ１、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインに対する抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＣＤ１３４）である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２９，５７５−５８５（２００６））。９Ｂ１２は、ＯＸ４０のシグナル伝達のためにアゴニスト応答を誘発するその能力、安定性、及びハイブリドーマによる高レベルの産生能力から、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体のパネルから選択された。臨床応用での使用では、９Ｂ１２  ｍＡｂは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ  ７．０で平衡にし、その濃度を、透析濾過によって５．０ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００８０】
「ＯＸ４０リガンド」（「ＯＸ４０Ｌ」）（また、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４、ｇｐ３４、ＴＡＸ転写活性化糖タンパク質−１、及びＣＤ２５２と様々に呼ばれる）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に多く見られ、活性化Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、形質球様ＤＣ（ｐｌａｍａｃｙｔｏｉｄ  ＤＣ）、及びマクロファージに誘導され得る（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．，（２０１０）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：５７−７８）。活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞を含む他の細胞は、炎症性サイトカイン（Ｉｄ．）に反応してＯＸ４０Ｌを発現し得る。ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０受容体に特異的に結合する。ヒトタンパク質は、ＰＣＴ国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されている。マウスＯＸ４０Ｌは、米国特許第５，４５７，０３５号明細書に記載されている。ＯＸ４０Ｌは、細胞の表面で発現され、かつ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外受容体結合ドメインを含む。機能的に活性な可溶型のＯＸ４０Ｌは、例えば、あらゆる目的のためにそれぞれの開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，４５７，０３５号明細書、同第６，３１２，７００号明細書、及び国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されているように細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを除去することによって作製することができる。ＯＸ４０Ｌの機能的に活性な型は、ＯＸ４０に特異的に結合する能力を維持する、即ち、ＯＸ４０「受容体結合ドメイン」を有する型である。
【００８１】
関連する一実施形態では、本開示は、ヒトＯＸ４０Ｌの受容体結合ドメインの１８０位のフェニルアラニンがアラニンで置換されている（Ｆ１８０Ａ）、ＯＸ４０に特異的に結合する能力を喪失したＯＸ４０Ｌの変異体、例えば、配列番号９６のアミノ酸５１〜１８３を提供する。
【化５】
2018512397.tif 000007
【００８２】
ＯＸ４０Ｌ分子又は誘導体のＯＸ４０に特異的に結合する能力を決定する方法が以下に論じられる。ＯＸ４０Ｌ及びその誘導体（ＯＸ４０結合ドメインを含む誘導体）の作製及び使用方法が、国際公開第９５／２１９１５号パンフレットに記載されており、このパンフレットには、ＯＸ４０リガンドの培養細胞からの精製を促進するため、又は哺乳動物へのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の後の分子の安定性を高めるために作製することができる、他のペプチド、例えば、ヒト免疫グロブリン（「Ｉｇ」）Ｆｃ領域に結合したＯＸ４０Ｌの可溶型を含むタンパク質も記載されている（また、共に参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第５，４５７，０３５号明細書及びＰＣＴ国際公開第２００６／１２１８１０号パンフレットも参照されたい）。
【００８３】
ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０Ｌの１つ以上のドメインが１つ以上の追加のタンパク質ドメインに共有結合した融合タンパク質を含む。ＯＸ４０アゴニストとして使用することができる例示的なＯＸ４０Ｌ融合タンパク質は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，３１２，７００号明細書に記載されている。一実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、多量体（例えば、三量体又は六量体）ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に自己構築するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，９５９，９２５号明細書に記載されている。
【００８４】
特定の実施形態では、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ―ＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチドサブユニット又は多量体融合タンパク質である。上記のＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットは、三量体又は六量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に自己構築することができる。従って、本開示は、上記の６つのポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質を提供する。１つの例示的なポリペプチドサブユニットは、「ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質」として本明細書で呼ばれる六量体タンパク質に自己構築する。具体的に記載される場合を除いて、本明細書で使用される用語「ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質」は、ヒトＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を指す。六量体タンパク質ＯＸ４０  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質に自己構築するポリペプチドサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号９８で示される。それでもなお、当業者であれば、多数の他の配列も、六量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の本明細書で説明される基準を満たすことを理解されよう。
【００８５】
本開示は、ＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド、又は本明細書で提供される六量体タンパク質、例えば、ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質を更に提供する。ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする例示的なポリヌクレオチド配列が、配列番号９７によって表されている。特定の態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインをコードする核酸配列、三量体形成ドメインをコードする核酸配列、及びＯＸ４０Ｌ受容体結合ドメインをコードする核酸配列は、５’から３’の向きに結合されている、例えば、５’から３’の向きに連続的に連結されている。他の態様では、提供されるポリヌクレオチドは、例えば分泌シグナルペプチドをコードするシグナル配列又は膜局在化配列をさらに含み得る。あらゆるＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドサブユニットをコードするポリヌクレオチド、又はこれらのサブユニットを含む多量体、例えば、六量体タンパク質が、本開示によって提供される。
【００８６】
特定の態様では、本開示は、ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。特定の態様では、この核酸配列は配列番号９７を含む。本開示は、本明細書で提供される制御タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、ＨｕＩｇＧ−４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ  Ｆ１８０Ａをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。特定の態様では、この核酸は、配列番号９９を含み、そして本明細書ではｈｕＩｇＧＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ  Ｆ１８０Ａとも呼ばれるこの構築物からの発現産物は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【００８７】
配列番号９７：ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０ＬのＤＮＡ配列（５’から３’のオープンリーディングフレーム）
【化６】
2018512397.tif 000008
【００８８】
配列番号９８：ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端）
【化７】
2018512397.tif 000009
【００８９】
ｈｕＩｇＧ４ＦｃＰＴＦ２ＯＸ４０Ｌ  Ｆ１８０ＡのＤＮＡ配列（５’から３’のオープンリーディングフレーム）（配列番号９９）
【化８】
2018512397.tif 000010
【００９０】
ｈｕＩｇＧ４ＰＦｃＴＦ２ＯＸ４０Ｌ  Ｆ１８０Ａのアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端）（配列番号１００）
【化９】
2018512397.tif 000011
【００９１】
多量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質は、高い安定性の三量体及び六量体を自然に構築するその能力により、対象、特にヒト対象での抗原特異的免疫応答の促進において高い有効性を示す。
【００９２】
別の実施形態では、多量体型を構築することができるＯＸ４０アゴニストは、Ｎ末端からＣ末端方向に：Ｆｃドメインを含む免疫グロブリンドメイン、コイルドコイル三量体化ドメインを含む三量体化ドメイン、及び受容体結合ドメインを含む融合ポリペプチドを含み、この受容体結合ドメインは、ＯＸ４０受容体結合ドメイン、例えば、ＯＸ４０Ｌ、又はそのＯＸ４０結合断片、変異体、又は誘導体であり、この融合ポリペプチドは、三量体融合タンパク質に自己構築することができる。一態様では、多量体型に構築することができるＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０受容体に結合して、少なくとも１つのＯＸ４０媒介活性を刺激することができる。特定の態様では、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０リガンドの細胞外ドメインを含む。
【００９３】
多量体型に構築することができるＯＸ４０アゴニストの三量体化ドメインは、個々のＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチド分子の三量体タンパク質への自己構築を促進するように機能する。従って、三量体化ドメインを有するＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチドは、三量体ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に自己構築する。一態様では、三量体化ドメインは、イソロイシンジッパードメイン又は他のコイルドコイルポリペプチド構造である。例示的なコイルドコイル三量体化ドメインは：ＴＲＡＦ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｑ１２９３３、アミノ酸２９９〜３４８；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  １（アクセッション番号ＰＯ７９９６、アミノ酸２９１〜３１４；Ｍａｔｒｉｌｉｎ−４（アクセッション番号Ｏ９５４６０、アミノ酸５９４〜６１８；ＣＭＰ（ｍａｔｒｉｌｉｎ−１）（アクセッション番号ＮＰ-００２３７０、アミノ酸４６３〜４９６；ＨＳＦ１（アクセッション番号ＡＡＸ４２２１１、アミノ酸１６５〜１９１；及びＣｕｂｉｌｉｎ（アクセッション番号ＮＰ-００１０７２、アミノ酸１０４〜１３８。ある特定の態様では、三量体化ドメインは、ＴＲＡＦ２三量体化ドメイン、Ｍａｔｒｉｌｉｎ−４三量体化ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む。
【００９４】
特定の実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、その血中半減期を延長するために修飾される。例えば、ＯＸ４０アゴニストの血中半減期は、異種分子、例えば、血清アルブミン、抗体Ｆｃ領域、又はＰＥＧへの結合によって延長することができる。特定の実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、免疫複合体及び／又は融合タンパク質を形成するために他の治療薬又は毒素に結合させることができる。
【００９５】
特定の態様では、ＯＸ４０アゴニストは、投与を容易にし、かつ活性剤の安定性を高めるために調合することができる。特定の態様では、本開示に従った医薬組成物は、薬学的に許容され得る非毒性の滅菌担体、例えば、生理食塩水、非毒性緩衝液、及び防腐剤などを含む。本明細書に開示される処置方法に使用するのに適した調合は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【００９６】
抗ＣＴＬＡ４抗体
ＣＴＬＡ４に特異的に結合してＣＴＬＡ４活性を阻害する抗体が、抗腫瘍免疫応答を強めるのに有用である。本明細書で提供される方法に使用されるトレメリムマブ（又はその抗原結合断片）についての情報は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，６８２，７３６号明細書（この明細書では、トレメリムマブは１１．２．１と呼ばれる）で確認することができる。トレメリムマブ（ＣＰ−６７５、２０６、ＣＰ−６７５、ＣＰ−６７５２０６、及びチシリムマブとしても知られる）は、ＣＴＬＡ４に対して選択性が高く、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）への結合を阻害するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫が活性化することが示され、トレメリムマブで処置された一部の患者は、腫瘍退縮を示した。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，６８２，７３６号明細書；同第７，１０９，００３号明細書；同第７，１２３，２８１号明細書；同第７，４１１，０５７号明細書；同第７，８２４，６７９号明細書；同第８，１４３，３７９号明細書；同第７，８０７，７９７号明細書；及び同第８，４９１，８９５号明細書（これらの明細書では、トレメリムマブは１１．２．１である）に記載されている。トレメリムマブは、例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体である。トレメリムマブ配列は、以下に示される（米国特許第６，６８２，７３６号明細書を参照されたい。
【００９７】
トレメリムマブＶＨ
【化１０】
2018512397.tif 000012
【００９８】
トレメリムマブＶＬ
【化１１】
2018512397.tif 000013
【００９９】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ１
ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１０３）
【０１００】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ２
ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶ（配列番号１０４）
【０１０１】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ３
ＤＰＲＧＡＴＬＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１０５）
【０１０２】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＩＮＳＹＬＤ（配列番号１０６）
【０１０３】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ２
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１０７）
【０１０４】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ３
ＱＱＹＹＳＴＰＦＴ（配列番号１０８）
【０１０５】
本明細書で提供される方法に使用されるトレメリムマブは、重鎖及び軽鎖、又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書で提供される方法に使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、上記のように本明細書で示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び上記のように本明細書で示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書で提供される方法に使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域は、上記のように本明細書で示された、Ｋａｂａｔ定義ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含み、この軽鎖可変領域は、上記のように本明細書で示された、Ｋａｂａｔ定義ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む。当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義、又は当業者に公知の他のＣＤＲの定義を容易に識別することができるであろう。特定の態様では、本明細書で提供される方法に使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，６８２，７３６号明細書に開示されている１１．２．１抗体の可変重鎖及び可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１０６】
他の抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国特許出願公開第２００７０２４３１８４号明細書に記載されている。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＭＤＸ−０１０；ＢＭＳ−７３４０１６とも呼ばれるイピリムマブである。
【０１０７】
抗体
ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４、又はＩＬ４に選択的に結合してそれぞれ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４、及びＩＬ４の結合性又は活性を阻害する抗体は、本発明の方法に有用である。免疫療法を含む処置を受けている対象に、当分野で公知の実質的にあらゆる抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、又は抗ＩＬ４抗体を投与することができる。適切な抗体としては、例えば、既知の抗体、市販の抗体、又は当分野で周知の方法を用いて開発された抗体が挙げられる。
【０１０８】
本発明で有用な抗体は、免疫グロブリン、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を示す抗体断片（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。特に、抗体は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、例えば、少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子を含む。
【０１０９】
本発明の抗体は、モノクローナルヒト抗体、モノクローナルヒト化抗体、又はモノクローナルキメラ抗体を含む。本発明の組成物及び方法に使用される抗体は、裸抗体、免疫複合体、又は融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプを有するヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体、特に、ヒト集団で見られるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４ヒトアイソタイプ、又は任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４対立遺伝子である。ヒトＩｇＧクラスの抗体は、有利な機能特性、例えば、血清中での長い半減期、及び様々なエフェクター機能を媒介する能力を有する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  （１９９５））。ヒトＩｇＧクラス抗体は、次の４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に更に分類される。ＩｇＧ１サブクラスは、ヒトにおいて高いＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））。他の実施形態では、抗体は、既知の抗体のアイソタイプスイッチ変異体である。
【０１１０】
医薬組成物
腫瘍又は固形癌の処置用の化合物又は化合物の組み合わせの投与は、他の成分と組み合わせられると、抗腫瘍効果を有する、又は化学療法の抗腫瘍効果（例えば、様々なレベルの腫瘍の退縮、縮小、又は疾患の進行の停止）を高める濃度の治療薬となる任意の適切な手段によって行うことができる。化合物は、任意の適切な担体物質中に任意の適切な量で含めることができる。組成物は、非経口（例えば、腹腔内）投与経路に適した剤形で提供することができる。医薬組成物は、従来の薬務に従って調合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。ヒトへの投与量は、当業者であれば、動物モデルと比較してヒトへの用量を修正することが当分野でルーチンであることを理解されるように、マウスで使用される化合物の量から外挿することによって最初に決定することができる。
【０１１１】
非経口用の組成物は、単位剤形（例えば、単回投与アンプル）で、又は複数回の用量を含むバイアルで提供することができ、かつ適切な防腐剤を添加することができる（以下を参照）。活性剤とは別に、組成物は、適切な非経口的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含み得る。更に、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、及び／又は分散剤を含み得る。
【０１１２】
上に示されているように、本発明に従った医薬組成物は、滅菌注入に適した形態にすることができる。このような組成物を用意するために、適切な活性治療薬が、非経口的に許容される液体ビヒクル中に溶解又は懸濁される。利用することができる適切なビヒクル及び溶媒の中には、水、適切な量の塩酸の添加によって適切なｐＨに調整された水、水酸化ナトリウム、又は適切な緩衝液、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、並びに等張性の塩化ナトリウム溶液及びデキストロース溶液が含まれる。水性調合物は、１つ以上の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、又はｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）も含み得る。化合物の１つが、難溶性又は水にほんの少ししか溶けない場合は、溶解促進剤又は可溶化剤を添加してもよいし、又は溶媒が、１０〜６０ｗ／ｗ％のプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【０１１３】
併用療法
特定の実施形態では、本明細書で提示される開示は、大腸癌を有する対象における化学療法又は放射線治療効果を高める方法であり、この方法は、化学療法又は放射線治療の前、最中、又は後で抗ＣＴＬＡ４抗体及び／又はＯＸ４０アゴニストを対象に投与することを含む。
【０１１４】
免疫療法と化学療法との間の潜在的な相互作用が、多数の研究者によって追跡されている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｅｍｅｎｓ，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ２０１３；６２：２０３−１６）。重要なことに、従来の研究は、非小細胞肺癌の患者でのワクチン療法の後の化学療法に対して予想外に高い奏効率を実証した（Ａｎｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６；１２：８７８−８７）。この研究では、ワクチンのみでは、抗原特異的Ｔ細胞応答を生じさせるのに有効であったが、患者の大多数では疾患の進行に影響を与えなかった。しかしながら、ワクチン療法は、化学療法と常に相乗作用して結果を改善するものではなかった。抗ＣＴＬＡ４とダカルバジンの同時送達の化学療法は、転移性黒色腫を有する患者でのダカルバジンのみと比較して応答が改善されたが（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；３６４：２５１７−２６）、奏効率は、事前に処置された患者での抗ＣＴＬＡ４のみで見られる奏効率に一致していた（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９；１５：５５９１−８；Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１０；３６３：７１１−２３）。６回のパクリタキセル及びカルボプラチンが投与された非小細胞肺癌の患者では、最初の４回の化学療法の投与と同時の抗ＣＴＬＡ４の添加は、化学療法のみに対して生存期間を改善しなかったが、最後の４回の化学療法の投与と同時の抗ＣＴＬＡ４の添加は、無進行生存期間を改善した。しかしながら、どちらの併用療法も、全生存期間に影響を与えなかった（Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ；３０：２０４６−５４）。同様の結果が、広範な疾患の小細胞肺癌の患者に見られ、このとき、化学療法の後半の投与と同時の抗ＣＴＬＡ４は、化学療法のみに対して無進行性生存期間を改善したが、全生存期間に影響を与えなかった（Ｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１３；２４：７５−８３）。従って、いずれの臨床試験でも、現在の前臨床試験で観察される治療可能期間を利用するために免疫療法及び化学療法のタイミングを変更していない。
【０１１５】
研究者が、化学療法及び放射線治療の両方が、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）及び共刺激受容体の調節によって癌細胞が免疫破壊を受けやすくすることができることを実証した（Ｒｅｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００６；２０３：１２５９−７１；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：４３２８−３７；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２０１０；１２０：１１１１−２４）。加えて化学療法によって引き起こされる細胞死が、処置後の新たな腫瘍抗原特異的免疫応答を誘導することが提唱された（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｅｍｅｎｓ，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ２０１３；６２：２０３−１６；Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８；８：５９−７３）。免疫療法はまた、他の機構によって化学療法に対する応答に影響を与えることができる。化学療法の有効性は、癌細胞への有効量を制限する薬物浸透によって制限される。免疫療法は、血管新生脈管構造を標準化することによって腫瘍の血管構築（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を改善することができ（（Ｇａｎｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２：１４６２−７０）、そして興味深いことに、免疫療法はまた、標準化された脈管構造によってより効果的であった（Ｈａｍｚａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５３：４１０−４）。これらのデータは、腫瘍の免疫状態と治療に対する応答との間の複雑な相互作用が存在し得ること、及び免疫療法により、患者の腫瘍を操作してそれらの化学療法に対する感受性を向上させる機会が存在することを示唆している。
【０１１６】
様々な全身化学療法は、それらの全身免疫細胞に対する影響が大きく異なる。化学療法のＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸカクテルは、転移性膵臓癌患者における結果を改善するが、同様のゲムシタビンは、持続的な治癒とはならないという証拠が増えてきた（Ｃｏｎｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；３６４：１８１７−２５）。しかしながら、このカクテルは、ゲムシタビンよりも著しくリンパ球毒性が高かった。臨床承認への動きがある数々の免疫療法を用いる腫瘍の免疫環境を強化できるとすると、最適な化学療法パートナーは、新たな基準での再評価が必要であろう。現在、腫瘍内の免疫環境が従来の療法に対する結果に著しい影響を与えることが多種多様な悪性腫瘍で示されているため、免疫療法による腫瘍内の免疫環境の改善が様々な従来の療法に対する結果を改善するはずであるという仮説は妥当である。これは、優れた免疫環境を有する患者には大きな影響を与えないであろう。例えば、全てのステージに亘り、良好な「免疫スコア」を有する大腸癌患者は、優れた予後を有していた（Ｇａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６；３１３：１９６０−４）。しかしながら、（腫瘍促進免疫環境を有する患者では、ステージにかかわらず、予後は不良であった（Ｇａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６；３１３：１９６０−４）。予備免疫療法から最も利益を得ることができるのはこれらの患者であろう。このアプローチは、腫瘍が、強い腫瘍促進免疫環境を有し、従来の療法に対して高い耐性を有し、かつ患者の予後が不良である膵臓腺癌などの癌の種類で最も大きな効果を上げることができる。
【０１１７】
本明細書で定義される抗腫瘍処置は、単独療法として適用してもよいし、又は本発明の化合物に加えて、従来の外科手術、骨髄及び抹消血幹細胞移植、化学療法、及び／又は放射線治療を含んでもよい。
【０１１８】
キット
本発明は、腫瘍及び固形癌の処置用のキットを提供する。一実施形態では、このキットは、抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。さらなる実施形態では、キットは、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）を含む。追加の実施形態では、キットは、抗ＩＬ４抗体を含む。一部の実施形態では、キットは、治療用又は予防用の細胞成分を含む滅菌容器を含み；このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は当分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、又は薬剤を保持するのに適した他の材料から製造することができる。所望に応じて、本発明の抗体（例えば、抗ＯＸ４０、抗ＣＴＬＡ４、抗ＩＬ４）が、固形腫瘍を有する対象への抗体の投与についての取扱説明書と共に提供される。
【０１１９】
特定の実施形態では、取扱説明書は、以下の少なくとも１つを含む：治療薬の説明；ＳＣＬＣ又はその症状の処置についての投与計画及び投与；事前注意；警告；適応症；非適応症（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）；過剰投与情報；副作用；動物薬理学；臨床試験；及び／又は参考文献。取扱説明書は、（容器が存在する場合は）容器に直接印刷してもよいし、又は容器に貼付されたラベルとして、又は容器内に若しくは容器と共に提供される別個のシート、パンフレット、カード、若しくはホルダーとしてもよい。
【０１２０】
本発明の実施は、特段の記載がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を利用し、これらの技術は、十分に当業者の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの作製に適用可能であり、従って、本発明の作成及び実施で考慮することができる。特定の実施形態に特に有用な技術は、以下のセクションで論じられる。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのように作成して使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：免疫療法が化学療法に対する応答を改善した
免疫療法が化学療法に対する応答を改善できるか否かを調べるために、膵臓腺癌のＰａｎｃ０２マウスモデルを使用した。このモデルは、患者の膵臓腺癌と同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで他の細胞株と同様のレベルで細胞毒性薬の影響を受けやすいが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化学療法及び放射線治療に対しては高い耐性を有する（Ｐｒｉｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９２；２９：４８５−９；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１４）。Ｐａｎｃ０２腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージによって高度に浸潤され、Ｐａｎｃ０２腫瘍でのマクロファージの分化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線治療の効果を制限する重要な因子であることを実証された（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ３９２９５）。
【０１２３】
腫瘍内のマクロファージに対する化学療法の効果を決定するために、樹立したＰａｎｃ０２腫瘍を有するマウスを、ゲムシタビン化学療法で処置し、そして処置の１週間後に腫瘍を回収した。免疫蛍光組織学により、広範囲のマクロファージが、未処置腫瘍の全体、特に侵襲縁に集中するが、腫瘍全体にも拡散するように浸潤することが実証された（図１Ａ）。化学療法の後に、マクロファージの浸潤が、腫瘍全体で増加し（図１Ａ）、他のマウス膵臓癌細胞株（Ｍｉｔｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；７３：１１２８−４１）及びマウス乳癌モデル（ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１１；１：５４−６７）からのデータに一致する。免疫療法が、Ｐａｎｃ０２腫瘍でのマクロファージの分化を調節し得るか否かを決定するために、樹立したＰａｎｃ０２腫瘍を有するマウスを、抗ＯＸ４０、抗ＣＴＬＡ４、又は抗ＯＸ４０と抗ＣＴＬＡ４との組み合わせで処置した。腫瘍マクロファージを、免疫療法の４日後又は７日後にフローサイトメトリーによって単離し（図１Ｂ）、次いで、抑制／修復分化（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ／ｒｅｐａｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のマーカーとしてのアルギナーゼについてウェスタンブロット法によって分析した。抗体の組み合わせは、４日目に腫瘍マクロファージでのアルギナーゼの発現を減少させたが、これは、７日目にはアルギナーゼの発現の上昇によって元に戻った（図１Ｃ）。誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）は、あらゆる処置下、腫瘍マクロファージでのウェスタンブロット法によって検出されず、炎症誘発状態に完全には変換されなかったことを示唆している。興味深いことに、Ｔ細胞標的免疫療法での以前の結果は、腫瘍マクロファージによって誘導された活発な炎症の消散により、Ｔ細胞の浸潤の一過性の効果が抑制されたことを示した（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２；１３６：４３７−４７）。特定の理論に拘束されるものではないが、これは、腫瘍での免疫媒介再構築の有限期間を示している。従って、抗ＯＸ４０と抗ＣＴＬＡとの組み合わせは、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルでマクロファージの分化を抑制した。
【０１２４】
実施例２：抗ＯＸ４０と抗ＣＴＬＡ４との組み合わせでの前処置により、化学療法での腫瘍制御が著しく改善された
マクロファージの分化のこのタイミングに基づいて、免疫療法の４日後に開始され送達される化学療法の効果を試験した。免疫療法のみは、このモデルの腫瘍処置では効果がなかったが、ゲムシタビン化学療法は、一過性の腫瘍の遅滞をもたらし（図２Ａ、パネル（ｉ））、生存期間を著しく延長した（図２Ｂ、パネル（ｉｉ））。単剤としての抗ＯＸ４０又は抗ＣＴＬＡ４での前処置は、化学療法に対する応答を変化させなかった。しかしながら、化学療法と組み合わせた抗体での前処置は、化学療法での腫瘍制御を著しく改善し（図２Ａ、パネル（ｉｉ））、化学療法又は抗体の組み合わせのみと比較して生存期間を改善した（図２Ｂ）。この効果がタイミングに対して如何に影響を受けるかを決定するために、抗体免疫療法と同日又は７日後に開始された化学療法の効果を試験した。いずれの場合も、生存期間は、化学療法単独と異ならず（図７）、この免疫療法の効果が、タイミングによる影響を受けることを示唆している。
【０１２５】
実施例３：異なる時点における腫瘍環境に対する免疫療法の効果
これらの時点における腫瘍環境に対する免疫療法の効果を試験するために、腫瘍を採取し、浸潤細胞集団のフローサイトメトリーを行った。処置の組み合わせは、骨髄細胞集団を変化させず、驚くべきことに、処置後に、腫瘍におけるＣＤ８Ｔ細胞の全体の比率に統計的有意差が存在しなかった（図３）。免疫療法に応答したＣＤ８Ｔ細胞のこの不十分な浸潤は、より免疫原性の高い腫瘍型での免疫療法に対する応答とは異なり（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：５２０６−１５；Ｒｅｄｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３；２：１４２−５３）、Ｐａｎｃ０２腫瘍が免疫療法のみに対してなぜ応答が弱いかを潜在的に説明する。ＣＤ８  Ｔ細胞と同様に、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞は、比率が変化せず、免疫療法によって引き起こされる各細胞集団での変化が、比率ではなく分化であったことを示唆している。組み合わせ療法の７日後にＣＤ４  Ｔ細胞の浸潤に著しい増加があり（図３）、ＣＤ４  Ｔ細胞の浸潤は、ＩＬ−４の分泌によりマクロファージに腫瘍促進表現型及び免疫抑制表現型を誘導することが示された。他の腫瘍モデルでは、抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４免疫療法が、相乗作用によりＣＤ４  Ｔ細胞を２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）分化経路に誘導し、ＩＬ−４の分泌を誘導し得ることが実証された（Ｒｅｄｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３；２：１４２−５３；Ｌｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３：ｅ２８２４５）。これらのデータは、ＩＬ−４が、マクロファージでのアルギナーゼの発現の最も有力な誘導因子（ｄｒｉｖｅｒ）の１つであるため、腫瘍マクロファージでのアルギナーゼのリバウンドを潜在的に説明し得る（図１Ｃ）。
【０１２６】
実施例４：免疫療法により、Ｐａｎｃ０２マウスモデルにおける２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化が増加した
免疫療法が、このモデルでの２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化を誘導するか否かを決定するために、抗ＯＸ４０、抗ＣＴＬＡ４、またはこれらの組み合わせで処置されたＰａｎｃ０２腫瘍を有するマウスからのリンパ節を分離し、Ｔ細胞の分化を分析した。組み合わせ処置は、リンパ節でのＣＤ４及び制御性Ｔ細胞の数を著しく増加させたが、ＣＤ８  Ｔ細胞の数はほんの僅かしか増加しなかった（図４Ａ）。非調節性（ＦｏｘＰ３−）ＣＤ４  Ｔ細胞の転写因子の分析により、Ｇａｔａ３の発現の誘導における抗ＯＸ４０と抗ＣＴＬＡ４との間の相乗作用が実証され（図４Ｂ及び図４Ｃ）、これは、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化を示唆している。１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）関連転写因子Ｔｂｅｔも上方制御されたが、そのレベルは低く、組み合わせでの相乗作用と言うよりも追加的のようであった（図４Ｃ）。これらのデータを確認するために、処置動物からのリンパ節Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＣＤ３  を用いて刺激し、細胞内サイトカインの産生を測定した。抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４で処置したマウスからの非制御性ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＩＬ４の産生の相乗作用の誘導、及び転写因子のデータに厳密に一致するインターフェロンγ（ＩＦＮγ、図４Ｄ）の追加的な誘導を実証した。興味深いことに、ＣＤ８  Ｔ細胞では、組み合わせ療法により、Ｅｏｍｅｓの著しい上方制御が実証され（Ｒｅｄｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３；２：１４２−５３）、組み合わせ療法が、この時点でエフェクターＴ細胞の分化ではなく記憶Ｔ細胞の分化を誘導することを示唆している。
【０１２７】
実施例５：ＩＬ−４の２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の産生が、抗ＯＸ４０／抗ＣＴＬＡ４の処置と組み合わせられた化学療法の効果を制限した
このＩＬ−４の２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の産生が、このモデルでの化学療法の効果を制限していたか否かを決定するために、マウスを抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４で処置し、４日後にゲムシタビン化学療法を開始した。マウスの対応群に、化学療法の各実施時にＩＬ−４遮断抗体を投与した。抗ＩＬ−４の追加は、腫瘍の成長に影響を与えるだけではなく、化学療法と免疫療法との組み合わせの影響を増加させた（図５Ａ）。抗ＩＬ−４と共に送達される化学療法の後に抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４の前処置が実施された群は、他の全ての群と比較して、処置期間の最後での腫瘍制御を著しく改善することを示した（図５Ｂ）。上に示されているように、化学療法及び抗ＩＬ−４の両方の停止処置（ｈａｌｔｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）では、腫瘍制御が、腫瘍が急速な成長を再開するまで約１週間持続した。
【０１２８】
実施例６：適応免疫系は、組み合わせ処置と化学療法によって十分に機能的であり、追加の組み合わせ療法は、生存期間を改善した。
様々な化学療法は、造血細胞集団に対して非常に様々な効果を有し得る。ゲムシタビンは、より強い骨髄毒又はリンパ球毒化学療法の１つであるだけではなく、化学療法がエフェクター集団を死滅させることによって免疫療法の有効性を制限し得る可能性がある。免疫細胞に対する処置の効果を決定するために、免疫化学療法後に血液に対して定量的フローサイトメトリーを行った。様々な表現型マーカーを用いて部分集団を識別することにより（図６Ａ）、ゲムシタビンが、末梢血中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｈｉ好中球及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇｌｏ未熟骨髄細胞を著しく減少させることが実証された（図６Ｂ）。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１−ＭＨＣＩＩ＋単球は、免疫療法によって増加し、化学療法後に減少する傾向にあったが、その変化は、統計的に有意ではなかった。Ｔ細胞集団は、化学療法後に減少しなかったが、対照的に、ＣＤ８、ＣＤ４、及び制御性Ｔ細胞の数が全て、未処置対照と比較して、組み合わせ処置と化学療法で増加した（図６Ｂ）。これらのデータは、適応免疫系が、ゲムシタビン化学療法で処置されたマウスで無傷で残ったことを示唆している。この場合、追加の免疫療法が、化学療法に対する応答のブーストに役立ち得るか否かを試験した。この実験では、マウスを、組み合わせ免疫療法で処置し、４日後に化学療法を行ったが、２週間の短いコースとした。処置コースは、全てのマウスが２回目の処置を受けられるように短くした。マウスをランダム化して、２回目の組み合わせ免疫療法を行い、４日後に、２回目の２週間の化学療法を行った。２回目の免疫療法を受けたマウスは、免疫療法のみ、化学療法のみ、又は１回だけの免疫療法を受けたマウスと比較して、著しく改善された生存期間を示した（図６Ｃ）。これらのデータは、適応免疫系が、化学療法によって十分に機能的であり、進行中の処置の有効性を同様に高める追加のブーストが可能であることを実証している。
【０１２９】
これらのデータは、予備免疫療法が、化学療法に対する応答を改善し、化学療法に対する応答の改善が、腫瘍関連マクロファージの再分極に一致したことを実証している。絶好の機会は短く、治療可能期間の終了は、腫瘍マクロファージでの２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の出現及びアルギナーゼＩの上方制御に相関した。２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の遮断により、エフェクターサイトカインＩＬ−４が、免疫化学療法の有効性を向上させ、そして重要なことに、免疫系が、化学療法によって十分な機能性を維持し、少なくとも１回の追加の免疫化学療法が可能であった。
【０１３０】
膵臓腺癌は、高度に抑制性の免疫環境を有することが知られており、また、患者及び動物モデルでの化学療法に対する応答が不良である。この障害の一部は、高度に線維性の腫瘍環境及び非効率的な血管新生脈管構造の結果としての化学療法の癌細胞への極めて不十分な送達によるものと考えられる。特定の腫瘍モデルでは、ＯＸ４０に対するアゴニスト抗体又はＣＴＬＡ４に対する遮断抗体は、腫瘍環境を再構築する上で十分に有効である（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：５２０６−１５）。しかしながら、ここで試験される膵臓腺癌のモデルでは、化学療法に対する効果は、組み合わせ療法でのみ観察された。抗ＣＴＬＡ４のみで腫瘍の成長を遅延させることができる免疫原性がより高いモデルでは、抗ＣＴＬＡ４は、化学療法に対する応答を向上させるのに十分であった（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３；８：ｅ６１８９５；Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ２０１３；６２：１５３３−４５）。免疫原性の低いルイス肺癌（３ＬＬ）腫瘍モデルでは、ゲムシタビン化学療法での抗ＣＴＬＡ４の反復投与は、いずれの作用物質も単独では有効でない場合に延命効果をもたらすことができた（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３；  ８：ｅ６１８９５）。
【０１３１】
様々な化学療法のタイミングを、免疫療法後に試験したが、スケジュールが変更された免疫療養は試験しなかった。例えば、腫瘍制御が、抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４の免疫療法の時間差投与によって他のモデルで実証された（Ｒｅｄｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３；２：１４２−５３）。処置サイクルの数を増やして他の作用物質、例えば、抗ＰＤ１、抗４１ＢＢ、又は開発中の他の共刺激分子を追加する処置計画の最適化には、かなりの余地が残っている。他の作用物質の使用も、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）パターンから離れたＣＤ４  Ｔ細胞の分化及びＩＬ−４の産生を誘導して腫瘍制御を最大化するために利用することができる。
【０１３２】
実施例７：放射線治療の前の抗ＣＴＬＡ４免疫療法は、腫瘍量を減少させ、全生存期間を延長した
免疫療法は、ますます、応答を強めるために放射線と組み合わせられている。しかしながら、組み合わせ療法の理想的なタイミングについてのデータは比較的僅かしか存在しない。事例報告が、抗ＣＴＬＡ４療法を受けている患者への姑息的放射線照射により、全身の治療応答をもたらすことを実証している（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．３６６（１０）：９２５−３１；Ｈｉｎｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２．５（６）：４０４−４０７）。これらの報告が、抗ＣＴＬＡ４療法を放射と同時に又は放射線後に行われる大部分の臨床試験設計と一致していないことから、抗ＣＴＬＡ４免疫療法の放射線に対するタイミングの影響を調べた。
【０１３３】
ＣＴ２６大腸腫瘍を、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスの右後肢に定着させ、７日目、１５日目、又は１９日目に抗ＣＴＬＡ４抗体でマウスを処置し；２０Ｇｙの放射線を１４日目のみ腫瘍に照射した。７日目の抗ＣＴＬＡ４処置のみは、僅かな延命効果があり、未処置（ＮＴ）対照群での２８日に対して３２日の生存期間中央値となった（ｐ＝０．０３）（図８Ａ及び図８Ｂ、パネル（ｉ）及び（ｉｉ））。放射線のみでは、一過性の腫瘍制御となり、腫瘍負荷の後の全ての腫瘍の再成長により、安楽死をさせることになり、生存期間中央値は４７日間であった（ＮＴに対してｐ＝０．００１４）（図８Ａ及び図８Ｂ、パネル（ｉｉｉ））。放射線の７日前に抗ＣＴＬＡ４が投与された腫瘍を有するマウスは、腫瘍が消失し、生存期間中央値は不明確であった（放射線のみに対してｐ＝０．００２）（図８Ａ及び図８Ｂ、パネル（ｉｖ））。対照マウスに対する、抗ＣＴＬＡ４で前処置されたマウスの腫瘍の平均サイズは、放射線治療の時点で著しくは異なっていなかった。放射線後に抗ＣＴＬＡ４が投与された腫瘍を有するマウスの半数で、腫瘍が消失し、１５日目の投与では生存期間中央値が９２日間であり（放射線のみに対してｐ＝０．００２）、１９日目の投与では５３日間であった（放射線のみに対してｐ＝０．０７）（図８Ａ及び図８Ｂ、パネル（ｖ）及び（ｖｉ））。重要なことに、組み合わせ療法によって腫瘍が治癒した全てのマウスは、ＣＴ２６腫瘍の再移植に対して耐性を有していたが、異なる腫瘍の影響は受けやすいままであり、長期間の抗原特異的免疫が達成されたことを示唆している（以下の表１）。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
ＣＴ２６腫瘍が治癒した腫瘍を有するマウスに、１００日後にＣＴ２６及び４Ｔ１を相反する側面に再移植した。結果として生じた腫瘍の成長は、ＣＴ２６が治癒した全てのマウスは、ＣＴ２６の再移植を拒絶したが、同系であるが免疫学的に異なる４Ｔ１腫瘍には罹患したことを実証した。これらのデータは、放射線治療に抗ＣＴＬＡ４を追加すると、全てのタイミングで生存期間を改善するが、放射線の前に送達されると特に有効であることを実証した。
【０１３６】
従来の報告は、４Ｔ１哺乳動物腫瘍モデルにおいて放射線の後に抗ＣＴＬＡ４が投与された場合の腫瘍の成長の制御の改善を実証した（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．１１（２  Ｐｔ  １）：７２８−３４；Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９．１５（１７）：５３７９−８８）。タイミングの影響がこのモデルで同様であったか否かを決定するために、抗ＣＴＬＡ４の投与と放射線のタイミングを、４Ｔ１腫瘍モデルで繰り返した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに４Ｔ１細胞を移植し、７日目又は１７日目に抗ＣＴＬＡ４を投与すると共に、１４日目、１５日目、及び１６日目に２０Ｇｙの放射線を照射し、４Ｔ１の放射線量及びタイミングは従来の研究に基づいた（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３．８（７）：ｅ６９５２７）。肺転移後の身体状態の悪化により全ての群のマウスを安楽死させたため、抗ＣＴＬＡ４療法の延命効果を決定することができなかったが、放射線のみと比較して、著しく小さい原発腫瘍が、放射線前に抗ＣＴＬＡ４が投与されたマウスで観察された（ｐ＜０．０５、図９、パネル（ｉ）〜（ｖ））。このモデルにおいて、放射線後の抗ＣＴＬＡ４の投与では、放射線のみと比較して腫瘍サイズの改善が検出されなかった（図９、パネル（ｉｉｉ）及び（ｖ））。この放射線後の応答は、以前に報告されたものよりも有効性が低かったが（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．１１（２  Ｐｔ  １）：７２８−３４；Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９．１５（１７）：５３７９−８８）、タイミングの効果を厳密に試験するために、この研究は、以前に試験されたように繰り返し投与するのではなく、抗ＣＴＬＡ４の単回投与に制限された（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．１１（２  Ｐｔ  １）：７２８−３４；Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９．１５（１７）：５３７９−８８））。しかしながら、生存期間が報告される場合、ＲＴ後の繰り返し投与でさえも、抗ＣＴＬＡ４は、放射線のみと比較して、４Ｔ１腫瘍を有する野生型マウスで延命効果を示さず（Ｐｉｌｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００９．１５（２）：５９７−６０６）、既存のデータに一致していた。
【０１３７】
実施例７：放射線後のＯＸ４０免疫療法は全生存期間を延長した
抗ＣＴＬＡ４免疫療法のタイミングが、抗ＣＴＬＡ４の作用機序に一意的に基づいているか否かを決定するために、抗ＯＸ４０免疫療法と放射線の理想的なタイミングを評価した。抗ＯＸ４０は、抗原曝露の直後にＴ細胞に誘導され（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．１６７（１２）：６８０４−１１）、放射線治療後の抗ＯＸ４０の送達は、３ＬＬ肺腺癌モデルで生存期間を著しく延長する（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０．３３（８）：７９８−８０９；Ｙｏｋｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２００８．９９（２）：３６１−７）。ＣＴ２６大腸腫瘍を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの後肢に定着させ、７日目、１５日目、又は１９日目に抗ＯＸ４０アゴニスト抗体を送達し；２０Ｇｙの放射線を、１４日目のみに送達した。放射線と組み合わせられた抗ＣＴＬＡ４療法で観察されたものに反して、抗ＯＸ４０抗体での前処置は、放射線のみに対して一切の治療上の利点を提供しなかった（４８日間に対して５５日間の生存期間中央値、ｐ＝０．２３）（図１０）。１９日目の大幅に遅れた抗ＯＸ４０の投与も、放射線のみに対して利点を提供しなかった（４１日間の生存期間中央値、ｐ＝０．６）。しかしながら、放射線の１日後に送達された抗ＯＸ４０により、約５０％の腫瘍が消失した（１１６．５日間、放射線のみに対してｐ＝０．０００６）（図１０）。このタイミングは、抗ＯＸ４０が、Ｔ細胞上のＯＸ４０の上方制御に一致するように抗原曝露後の１２〜２４時間の重要な期間中に存在しなければならないことを実証する従来の研究（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．１６７（１２）：６８０４−１１）、及び放射線治療後の約２日間の腫瘍抗原の提示の証拠に合致し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７．２０４（１）：４９−５５）、放射線治療の５日後は、この治療可能時間の範囲外であることを示唆している。重要なことに、最適なタイミングによって腫瘍が治癒した全てのマウスは、ＣＴ２６腫瘍の再移植に耐性を有していたが、同種の抗原性の異なる腫瘍の影響は受けやすいままであり、長期間の抗原特異的免疫が達成されたことを示唆している（表１）。
【０１３８】
実施例７：放射線前の抗ＣＴＬＡ４の放射線有効性の向上は、制御性Ｔ細胞の枯渇にある程度基づいている
近年の報告は、抗ＣＴＬＡ４抗体が、腫瘍でのＦｃ依存性の制御性Ｔ細胞の枯渇を引き起こすことが実証され（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（９）：１６９５−７１０）、放射線治療と同時又は後の制御性Ｔ細胞の枯渇により、腫瘍制御が促進されることが示された（Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（１１）：２４３５−６６；Ｓｈａｒａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４）。放射線前の抗ＣＴＬＡ４の放射線有効性の向上が、制御性Ｔ細胞の枯渇によって説明できるか否かを決定するために、ＣＴ２６腫瘍を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの後肢に定着させ、７日目に抗ＣＤ４で処置して全てのＣＤ４  Ｔ細胞を枯渇させた、又は抗ＣＤ２５で制御性Ｔ細胞を枯渇させた。上記のように、１４日目にマウスを放射線治療で処置した。抗体処置により、マウスのＣＤ４＋及びＣＤ２５＋細胞が効率的に枯渇した（図１１Ａ）。ＣＤ４の枯渇は、腫瘍の成長のみ又は後続の放射線治療との組み合わせに影響を与えなかった（図１１Ｂ）。ＣＤ２５の枯渇は、腫瘍の成長のみに影響を与えただけではなく、その後に放射線治療が行われると、マウスの半数で腫瘍が治癒した（図１１Ｃ）。重要なことに、ＣＤ２５の枯渇はまた、抗ＣＴＬＡ４前処置を用いた従来の研究でも機能せず（図８Ａ及び図８Ｂを参照）、制御性Ｔ細胞の枯渇を含む全ＣＤ４の枯渇は有効でなかった。特定の理論に拘束されるものではないが、これは、抗ＣＴＬＡ４が、制御性Ｔ細胞の枯渇に加えて効果を提供すること、及び非制御性ＣＤ４細胞が、ＣＤ２５が枯渇した動物での治癒に重要であることを示唆している。しかしながら、放射線治療後に、抗原応答性ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞の比率の増加が腫瘍を再定着させ（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０．３３（８）：７９８−８０９）、これらの細胞も、抗ＣＤ２５処置によって枯渇され得ることが既に実証されている。特定の理論に拘束されるものではないが、抗ＣＴＬＡ４療法が、既存の制御性Ｔ細胞の除去、及びＣＤ４及びＣＤ８エフェクターＴ細胞のＣＴＬＡ４媒介抑制を遮断する従来の効果の両方によって二重の役割を果たし、放射線治療後の残存癌細胞の除去の改善を可能にする可能性が高い。
【０１３９】
異なる抗ＣＴＬＡ４クローンが、制御性Ｔ細胞の枯渇の点で異なることを示したため、異なるクローンを、放射線治療と組み合わせて試験した：非常に枯渇している９Ｄ９クローン、及びそれほど枯渇していないＵＣ１０クローン（Ｓｉｍｐｓｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（９）：１６９５−７１０）。前述と同様に、ＣＴ２６腫瘍を、免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスの後肢に定着させ、７日目に９Ｄ９クローン又はＵＣ１０クローンを投与し、１４日目に放射線を照射した。９Ｄ９及び放射線で処置した全てのマウスは、それらの腫瘍が消失し、ＵＣ１０クローンで処置されたマウスの６７％が、それらの腫瘍が消失した（図１２）。総合すると、これらのデータは、制御性Ｔ細胞の枯渇が腫瘍の消失を促進するが、抗ＣＴＬＡ前処置と放射線との間に見られる相乗作用にのみ関与するものではないことを示唆している。
【０１４０】
この研究では、放射線と組み合わせられる抗ＣＴＬＡ４遮断又は抗ＯＸ４０アゴニスト療法の理想的なタイミングは、それらの変動作用機序によって異なる。抗ＣＴＬＡ４遮断及びこれに続く放射線での腫瘍の前処置により、マウスの大腸腫瘍が消失することが見出された。これらの結果は、イピリムマブ療法を受け、引き続いて姑息的放射線を受け、そして全身のアブスコパル反応（ａｂｓｃｏｐａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を有し、無病で長期間生存した転移性黒色腫の患者の事例報告に一致している（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．３６６（１０）：９２５−３１；Ｈｉｎｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２．５（６）：４０４−４０７）。更に、姑息的放射線を既に受けてイピルミマブ（ｉｐｉｌｕｍｉｍａｂ）が投与されている患者の遡及的検討では、誘導イピルミマブに対して維持中に放射線が照射された場合に全生存期間が改善され、前処置が結果を改善したことを更に実証している（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１３．１（２）：９２−８）。マウスモデルでは、ＲＴと同時及びＲＴ後の抗ＣＴＬＡ４での処置は、腫瘍の成長を制御することを示したが（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．１１（２  Ｐｔ  １）：７２８−３４；Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９．１５（１７）：５３７９−８８）、全生存期間に対しては限定された影響であり、抗ＣＴＬＡ４及びＲＴとの組み合わせでは０％（Ｐｉｌｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００９．１５（２）：５９７−６０６）〜２０％（Ｂｅｌｃａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１４．９（７）：ｅ１０１７６４）の全生存期間であった。抗ＣＴＬＡ４の作用機序は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞を枯渇させる能力に関連し（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｆ．Ｌｉ，Ｗ．Ｍｏｎｔａｌｖｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｍ．Ａ．Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ，Ｋ．Ｂｅｒｇｅｒｈｏｆｆ，Ｆ．Ａｒｃｅ，Ｃ．Ｒｏｄｄｉｅ，Ｊ．Ｙ．Ｈｅｎｒｙ，Ｈ．Ｙａｇｉｔａ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｋ．Ｓ．Ｐｅｇｇｓ，Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｑｕｅｚａｄａ，Ｆｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（９）：１６９５−７１０）、ＲＴと同時又はＲＴ後の制御性Ｔ細胞の枯渇は、放射線治療による腫瘍制御を改善することが示された（Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（１１）：２４３５−６６；Ｓｈａｒａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４）。本明細書に記載される結果は、放射線後の抗ＣＴＬＡ４遮断は、放射線の有効性を向上させたが、前処置と同程度ではなく、制御性Ｔ細胞の前処置の枯渇も、放射線に対する応答を改善し得ることを実証している。これらの結果は、イピリムマブと放射線を組み合わせる進行中の臨床試験の大部分が、放射線と同時及び／又は放射線後にイピリムマブを送達することを考えると重要であり、この送達は、結果を改善することができるが、相乗作用の可能性を完全には最大化することができない。
【０１４１】
多くの化学療法剤がユニークな機序によって作用するのと同様に、免疫療法薬は、異なる作用機序を有する。異なるクラスの免疫療法薬が、異なる理想的なタイミングとなり得るか否かを調べた。Ｔ細胞共刺激剤として作用する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体が、放射線の直後に送達される場合に放射線の有効性を改善することが見出された。組み合わせ療法の有効性の改善は、少分割放射線後の抗原提示の期間と一致している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７．２０４（１）：４９−５５）。ＯＸ４０分子は、抗原結合後の限られた時間、Ｔ細胞上で迅速に上方制御され、アゴニスト抗体は、有効なＴ細胞刺激の期間中は存在しなければならない（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．１６７（１２）：６８０４−１１）。ＯＸ４０は、制御性Ｔ細胞で発現されるが、腫瘍を有するマウスへの抗ＯＸ４０の投与は、腫瘍制御性Ｔ細胞の枯渇をもたらさない（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００８．６８（１３）：５２０６−１５）。抗ＯＸ４０抗体は、最近、第１相臨床試験で有望さが示され（Ｃｕｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１３．７３（２４）：７１８９−９８）、現在は、第１相臨床試験で、最適なタイミングを使用する放射線との組み合わせで評価されている。
【０１４２】
結論として、放射線と組み合わせられた免疫療法のタイミングが結果に影響を与えることが見出された。特定の免疫療法薬の理想的なタイミングは、それらの作用機序に一致し、機序に関する前臨床データは、作用物質を組み合わせるとき及びクリニックに移すときに考慮するべきである。
【０１４３】
上で本明細書に記載された結果を、以下の材料及び方法を用いて達成した。
【０１４４】
動物及び細胞株
Ｐａｎｃ０２マウス膵臓腺癌細胞株（Ｐｒｉｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；２９：４８５−９．Ｃ５７ＢＬ／６）は、親切にもＤｒ．Ｗｏｏ（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＮＹ）によって提供された。これらの実験に使用するために６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。全ての動物のプロトコルは、ＥＡＣＲＩ  ＩＡＣＵＣ（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  Ｎｏ．Ａ３９１３−０１）によって承認された。
【０１４５】
ＣＴ２６マウス大腸癌（Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９８０．４０（７）：２１４２−６）及び４Ｔ１哺乳動物癌細胞株（Ａｓｌａｋｓｏｎ．ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２．５２（６）：１３９９−４０５）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞を増殖させた。試験した全ての細胞株は、マイコプラズマ陰性であった。ＢＡＬＢ／ｃは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。全ての動物のプロトコルは、Ｅａｒｌｅ  Ａ．Ｃｈｉｌｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＩＡＣＵＣ（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  Ｎｏ．Ａ３９１３−０１）によって承認された。
【０１４６】
免疫化学療法
１０〜１４日経過した腫瘍を有するマウスを、抗ＯＸ４０（ＯＸ８６、腹腔内に２５０μｇ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）、抗ＣＴＬＡ４（９Ｄ９、腹腔内に２５０μｇ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、又はこれらの組み合わせで処置した。化学療法は、２週間又は３週間に亘る１週間に２回の腹腔内への１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からなる。抗インターロイキン−４（抗ＩＬ−４、１１Ｂ１１、腹腔内に１００μｇ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、３週間に亘って１週間に２回腹腔内に送達した。
【０１４７】
抗体及び試薬
蛍光結合抗体ＣＤ１１ｂ−ＡＦ７００、Ｇｒ１−ＰＥ−Ｃｙ７、ＩＡ（主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ）−ｅ７８０、Ｌｙ６Ｇ−ＰＥ−Ｃｙ７、Ｌｙ６Ｃ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ｅ４５０、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＦｏｘＰ３−ｅ４５０、ＣＤ２５−ＡＰＣ、及びＣＤ８−ＦＩＴＣを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＣＤ４−ｖ５００及びＬｙ６Ｇ−ＦＩＴＣを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手した。ＣＤ８−ＰＥ−ＴｘＲＤを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。ラット抗Ｆ４／８０を、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から入手した。使用したウェスタンブロット法用抗体は、アルギナーゼＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＧＡＰｄＨ、抗マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及び抗ウサギ−ＨＲＰ（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を含んでいた。
【０１４８】
蛍光結合抗体ＣＤ４−ｅ４５０、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＣＤ８−ＰＥ−ＴｘＲＤをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。治療用抗ＣＴＬＡ４（クローン９Ｄ９又はＵＣ１０）、抗ＯＸ４０（クローンＯＸ８６）、抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、及び抗ＣＤ２５（クローンＰＣ．６１．５．３）抗体を、ＢｉｏＸｃｅｌｌ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）から入手し、１ｍｇ／ｍＬの濃度で滅菌ＰＢＳに再懸濁した。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線治療モデル
１００μＬのＰＢＳ中、１×１０４のＣＴ２６細胞又は５×１０４の４Ｔ１細胞を、免疫適格ＢＡＬＢ／ｃマウスの右後肢に皮下注射した。２５０μｇ（抗ＯＸ４０及び抗ＣＴＬＡ４）又は１００μｇ（抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５）の抗体を腹腔内投与した。抗体療法は、各手順で示される指定の時点で実施した。放射線は、重要な臓器を保護するためのハーフビームブロック及び腫瘍への線量を増加させるための１．０ｃｍのボーラスを用いる臨床用線形加速器（６ＭＶ  ｐｈｏｔｏｎｓ，Ｅｌｅｋｔａ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｌｉｎｅａｒ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）で照射した。ＣＴ２６腫瘍の場合は、１４日目に２０Ｇｙを１回照射し（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４）；４Ｔ１腫瘍の場合は、１４〜１６日目に２０Ｇｙを３回照射した（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３．８（７）：ｅ６９５２７）。ＣＴ２６腫瘍が治癒したマウスでは、マウスの相反する側面に５×１０４の４Ｔ１腫瘍及び１×１０４のＣＴ２６腫瘍を再移植して腫瘍特異的免疫を評価した。
【０１５０】
免疫組織学
免疫組織学では、腫瘍は、Ｚ７亜鉛ベース固定液で一晩固定した（Ｌｙｋｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；３５：ｅ８５）。次いで、組織を、段階的濃度のアルコールによって、そしてキシレンで脱水し、溶融パラフィン中でインキュベートし、次いでパラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）を切断して、分析のために封入した。組織切片を、抗原の回収のために適宜、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で煮沸した。一次抗体の結合を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で視覚化し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で封入して核物質を染色した。Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｓ落射蛍光顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ  ＤｓＦｉ１デジタルカメラ、及びＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ―Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像ソフトウェアで画像を取得した。腫瘍に亘る複数の画像を高解像度で撮影し、デジタル処理で組み合わせて腫瘍の端から端までの１つの概観画像を作成した。原稿に示される画像は、腫瘍全体及びそれぞれの実験コホートの代表である。
【０１５１】
腫瘍マクロファージのウェスタンブロット法
腫瘍細胞懸濁液を、既に記載されたように（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；６８：５２０６−１５；Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ；７：ｅ３９２９５）、ＣＤ１１ｂ、ＩＡ（主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ）、及びＧｒ１に特異的な抗体で染色し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｌｏＩＡ＋腫瘍マクロファージを、ＢＤ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）Ａｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて９８％を超える純度まで選別した。細胞を、放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）緩衝液中で溶解し、β２−メルカプトエタノールを含むドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ローディング緩衝液で変性させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動にかけ、そしてニトロセルロースに移した。遮断されたブロットを、一次抗体で、４℃で一晩プローブし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体でプローブした。Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて結合を検出し、膜に曝露した。
【０１５２】
腫瘍、血液、及びリンパ節のフローサイトメトリー
腫瘍浸潤細胞の分析のために、腫瘍を約２ｍｍの断片に切断し、続いて、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び２０ｍｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中、室温で１時間撹拌した。消化物を、１００μｍのナイロンメッシュで濾過して肉眼で見える砕片を除去した。浸潤細胞のフローサイトメトリー分析では、細胞懸濁液を洗い流し、直接結合した蛍光抗体で染色した。リンパ節の分析では、リンパ節を粉砕し、洗浄し、表面染色し、そして細胞を洗い流して、制御性Ｔ細胞染色キット（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、転写因子を染色した。サイトカインの応答を測定するために、リンパ節の細胞を、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３がプレコートされたウェルに４時間プレーティングした。次いで、細胞を、表面染色し、洗い流し、制御性Ｔ細胞染色キット（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定してから、細胞内サイトカインを染色した。血中の細胞数の分析のために、生きているマウスの伏在静脈から全血を採取して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）管に入れ、そして５〜２５μｌの新鮮な血液を、蛍光抗体カクテルで直接染色した（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３．８（７）：ｅ６９５２７を参照されたい）。既知の数のＡｃｃｕＣｈｅｃｋ蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各サンプルに添加し、次いで、赤血球を、Ｃａｌ−Ｌｙｓｅ全血溶解溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解し、そしてサンプルをＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメトリーで分析した。サンプル中の細胞の絶対数を、細胞事象とビーズ事象との比較に基づいて決定した（細胞／μｌ）。
【０１５３】
統計学
データを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて分析しグラフ化した。個々のデータセットを、スチューデントｔ検定を用いて比較した。複数の群に亘る分析を、それぞれの群がＴｕｋｅｙ’ｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎを用いて評価されるＡＮＯＶＡを用いて行った。カプランマイヤー生存曲線を、ログランク検定を用いて比較した。
【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
【表５】
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【０１５８】
【表６】
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【０１５９】
【表７】
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【０１６０】
【表８】
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【０１６１】
【表９】
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【０１６２】
【表１０】
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【０１６３】
【表１１】
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【０１６４】
【表１２】
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【０１６５】
他の実施形態
前述の説明から、様々な使用及び条件に適応するように本明細書に記載の発明に対する変更及び修正が可能であることは明らかであろう。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【０１６６】
本明細書の変数の任意の定義における要素のリストの記述には、任意の単一の要素又は列記された要素の組み合わせ（若しくは部分組み合わせ）としてのその変数の定義が含まれる。本明細書の実施形態の記述には、任意の単一の実施形態として、又はその他の実施形態若しくはその一部との組み合わせとしてのその実施形態が含まれる。
【０１６７】
本明細書で述べられた全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が、具体的かつ個々に示されて参照により本明細書に組み入れられる場合と同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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