(57)【要約】  チンパンジーアデノウイルスに由来するマイコバクテリア抗原をコードするアデノウイルスベクター及び関連する態様が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的な誘導体が、全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(e)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、及び
(f)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む組換えアデノウイルスであって、マイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は宿主細胞中の前記マイコバクテリア抗原の発現を指示する1つ以上の配列に作動可能に連結される、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
請求項1に記載の組換えアデノウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項1又は2に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、配列番号2による配列を有する、請求項3に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードし、機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６】
機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも89.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.6%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７】
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８】
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
並びに
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項９】
配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項7又は8に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１０】
配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項7から9のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドが、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項1又は2に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、配列番号5によるポリヌクレオチド配列を有する、請求項11に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１３】
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項11又は12に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１４】
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
並びに
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項11又は12に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１５】
配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.4%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項13又は14に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１６】
配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項13から15のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１７】
ポリペプチドが、配列番号1によるアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１８】
ポリペプチドが、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体であり、機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項１９】
機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも89.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.6%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項18に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２０】
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をさらに含む、請求項17から19のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２１】
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
並びに
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をさらに含む、請求項17から19のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２２】
配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項20又は21に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２３】
配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項20から22のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２４】
ポリペプチドが、配列番号1によるアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２５】
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をさらに含む、請求項24に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２６】
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
並びに
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
をさらに含む、請求項24に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２７】
配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.4%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項25又は26に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２８】
配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項25から27のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドが、以下:
(a)アデノウイルス5'末端、好ましくは、アデノウイルス5'逆方向末端反復、
(b)アデノウイルスElA領域、又はE1A_280R及びE1A_243R領域の中から選択されるその断片、
(c)アデノウイルスElB若しくはIX領域、又はE1B_19K、E1B_55K又はIX領域からなる群の中から選択されるその断片、
(d)アデノウイルスE2b領域、又はE2B_pTP、E2B_ポリメラーゼ及びE2B_IVa2領域からなる群の中から選択されるその断片、
(e)アデノウイルスL1領域、又はL1_13.6kタンパク質、L1_52k及びL1_IIIaタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(f)アデノウイルスL2領域、又はL2ペントンタンパク質、L2_pVII、L2_V、及びL2_pXタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(g)アデノウイルスL3領域、又はL3_pVIタンパク質、L3_ヘキソンタンパク質及びL3_プロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(h)アデノウイルスE2A領域、
(i)アデノウイルスL4領域、又はL4_100kタンパク質、L4_33kタンパク質及びタンパク質L4_VIIIからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(j)アデノウイルスE3領域、又はE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、及びE3 ORF9からなる群から選択されるその断片、
(k)アデノウイルスL5領域、又はL5_ファイバーファイバータンパク質をコードするその断片、
(1)アデノウイルスE4領域、又はE4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2、及びE4 ORF1からなる群から選択されるその断片、
(m)アデノウイルス3'末端、好ましくは、アデノウイルス3'逆方向末端反復、及び/又は
(n)アデノウイルスVAI又はVAII RNA領域、好ましくは、ChAd155以外のアデノウイルスからの、より好ましくはAd5からのアデノウイルスVAI又はVAII RNA領域
の少なくとも1つを含む、請求項1から28のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドが、以下:
(a)アデノウイルス5'末端、好ましくは、アデノウイルス5'逆方向末端反復、
(e)アデノウイルスL1領域、又はL1_13.6kタンパク質、L1_52k及びL1_IIIaタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(f)アデノウイルスL2領域、又はL2_ペントンタンパク質、L2_pVII、L2_V、及びL2_pXタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(g)アデノウイルスL3領域、又はL3_pVIタンパク質、L3_ヘキソンヘキソンタンパク質及びL3_プロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(i)アデノウイルスL4領域、又はL4_100kタンパク質、L4_33kタンパク質及びタンパク質L4_VIIIからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片、
(k)アデノウイルスL5領域、又はL5_ファイバーファイバータンパク質をコードするその断片、
(m)アデノウイルス3'末端、好ましくは、アデノウイルス3'逆方向末端反復
の少なくとも1つを含む、請求項29に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドが、アデノウイルスVAI又はVAII RNA領域を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３２】
VAI又はVAII RNA領域が、ChAd155以外のアデノウイルスからである、請求項31に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３３】
VAI又はVAII RNA領域が、Ad5からである、請求項32に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドが、その全体長にわたって本質的に配列番号6、7又は8からなる参照配列に対して少なくとも98.6%同一であるポリヌクレオチドを含む、又はそれからなる、請求項1から28のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３５】
ポリヌクレオチドが、その全体長にわたって参照配列に対して少なくとも99%同一であるポリヌクレオチドを含む、又はそれからなる、請求項34に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドが、その全体長にわたって参照配列に対して、少なくとも99.5%同一であるポリヌクレオチドを含む、又はそれからなる、請求項35に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドが、その全体長にわたって参照配列に対して同一であるポリヌクレオチドを含む、又はそれからなる、請求項34から46のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３８】
参照配列が配列番号7である、請求項37に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項３９】
参照配列が配列番号8である、請求項37に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４０】
参照配列が配列番号8又は9である、請求項37に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドが、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4からなる群から選択されるゲノム領域の少なくとも1つの遺伝子を非機能的とする変異又は欠失を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドが、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及び/又はE4からなる群から選択されるゲノム領域の少なくとも1つの遺伝子を欠く、請求項41に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４３】
ゲノム領域がE1A及び/又はE1Bである、請求項41又は42に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４４】
組換えアデノウイルスが複製可能である、請求項1から43のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４５】
組換えアデノウイルスが複製不能である、請求項1から43のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４６】
核酸配列が、H37RvからのRv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875のうちの少なくとも1つ又は別のマイコバクテリウム若しくは結核菌の別の株からのそのホモログに由来するマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から45のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４７】
核酸配列が、H37RvからのRv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875のうちの少なくとも1つ又は結核菌の別の株からのそのホモログに由来するマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から45のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４８】
核酸配列が、H37RvからのRv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875のうち少なくとも1つに由来するマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から45のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項４９】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875のうち少なくとも1つを含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５０】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386及びRv3616のうち少なくとも1つを含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項49に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５１】
核酸配列が、Rv0125及びRv1196のうち少なくとも1つを含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項50に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５２】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804又はRv3875に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５３】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386又はRv3616に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項52に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５４】
核酸配列が、Rv0125又はRv1196に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項53に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５５】
マイコバクテリア抗原が、参照配列に対して少なくとも90%同一性、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%同一性を有する配列を含む、請求項52から54のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５６】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804又はRv3875の免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５７】
核酸配列が、Rv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386又はRv3616の免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項52に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５８】
核酸配列が、Rv0125又はRv1196の免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項53に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項５９】
マイコバクテリア抗原が、参照配列からの少なくとも20アミノ酸残基、例えば、少なくとも50アミノ酸残基の免疫原性断片である配列を含む、請求項56から58のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６０】
マイコバクテリア抗原が、参照配列の全長の少なくとも20%、例えば、参照配列残基の全長の少なくとも30%、特に参照配列残基の全長の少なくとも40%、特に参照配列残基の全長の少なくとも50%、例えば参照配列の全長の少なくとも75%の免疫原性断片である配列を含む、請求項56から58のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６１】
核酸配列が、配列番号39から68のうち少なくとも1つを含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６２】
核酸配列が、配列番号65から68のうち少なくとも1つを含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項61に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６３】
核酸配列が、配列番号70を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項61に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６４】
核酸配列が、配列番号39から68のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６５】
核酸配列が、配列番号65から68のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項64に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６６】
核酸配列が、配列番号70に対して少なくとも80%同一性を有する配列を含むマイコバクテリア抗原をコードする、請求項64に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６７】
マイコバクテリア抗原が、参照配列に対して少なくとも90%同一性、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%同一性を有する配列を含む、請求項64から66のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６８】
核酸配列が、配列番号39から68のいずれかの免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項1から48のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項６９】
核酸配列が、配列番号65から68のいずれかの免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項68に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７０】
核酸配列が、配列番号70の免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする、請求項68に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７１】
マイコバクテリア抗原が、参照配列からの少なくとも20アミノ酸残基、例えば、少なくとも50アミノ酸残基の免疫原性断片である配列を含む、請求項68から70のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７２】
マイコバクテリア抗原が、参照配列の全長の少なくとも20%、例えば、参照配列残基の全長の少なくとも30%、特に参照配列残基の全長の少なくとも40%、特に参照配列残基の全長の少なくとも50%、例えば参照配列の全長の少なくとも75%の免疫原性断片である配列を含む、請求項68から70のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７３】
宿主細胞における産物の発現を指示する1つ以上の配列が、転写開始、転写終結、プロモーター及びエンハンサー配列からなる群の1つ以上から選択される配列を含む、請求項1から72のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７４】
宿主細胞における前記産物の発現を指示する1つ以上の配列が、プロモーター配列を含む、請求項73に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７５】
プロモーター配列が、内部プロモーター、ネイティブプロモーター、RSV LTRプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、PGKプロモーター、EF1aプロモーター及びCASIプロモーターからなる群から選択される、請求項74に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７６】
アデノウイルスが、ヒト対象において10%未満の血清有病率を有する、好ましくはヒト対象において血清有病率を有さない、請求項1から75のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７７】
アデノウイルスが、哺乳動物細胞に感染する能力がある、請求項1から76のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項７８】
無機アジュバント(例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機アジュバント(例えば、サポニン、例えば、QS21、又はスクアレン)、油性ベースアジュバント(例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント)、サイトカイン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ)、粒子性アジュバント(例えば、免疫刺激性複合体(ISCOMS)、リポソーム、又は生分解性ミクロスフェア)、ビロゾーム、細菌性アジュバント(例えば、モノホスホリル脂質A、例えば、3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、又は合成脂質A)、合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えば、ポリアルギニン又はポリリジン)及び非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチド又はそのようなアジュバントの混合物からなるリストから選択されるアジュバントを含む、請求項2から77のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
アジュバントが3D-MPL及び/又はQS21である、請求項78に記載の組成物。
【請求項８０】
医薬としての使用のための、請求項1から79のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８１】
免疫応答の刺激における使用のための、請求項80に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８２】
ワクチンとしての使用のための、請求項80に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８３】
結核菌などのマイコバクテリア感染の予防における使用のための、請求項80に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８４】
結核菌などのマイコバクテリア感染の治療における使用のための、請求項80に記載のアデノウイルス又は組成物。
【請求項８５】
マイコバクテリア感染の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1から79のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物の使用。
【請求項８６】
請求項1から79のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を誘導する方法。
【請求項８７】
少なくとも配列番号3のペントン、配列番号5のヘキソン又は配列番号1のファイバーを含有し、Rv1196又はRv0125関連抗原をコードする導入遺伝子を含む、非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項８８】
ChAd155からのペントン(配列番号3)、ヘキソン(配列番号5)及びファイバー(配列番号1)タンパク質を含む、請求項87に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項８９】
コードされる抗原が、配列番号70に対して少なくとも90%同一性を有する配列を含む、請求項87又は88に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９０】
コードされる抗原が、配列番号70の2〜723などの長さが少なくとも450アミノ酸である配列番号70の断片を含む、請求項87又は88に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９１】
複製欠損性アデノウイルスである、請求項87から90のいずれか一項に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９２】
アデノウイルスが、E1遺伝子の機能の不活化(例えば、欠失)を含む、請求項87から91のいずれか一項に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９３】
アデノウイルスが、E4遺伝子の機能の不活化(例えば、欠失)を含む、請求項97から92のいずれか一項に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９４】
アデノウイルスが、E3遺伝子の機能の不活化(例えば、欠失)を含む、請求項87から93のいずれか一項に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【請求項９５】
アデノウイルスが、Ad5E4orf6遺伝子置換を含む、請求項87から94のいずれか一項に記載の非ヒトサルアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリア抗原をコードするアデノウイルスベクターに関し、より詳細にはチンパンジーアデノウイルスChAd155に由来するアデノウイルスベクター、及び関連する態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核(TB)は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び他のマイコバクテリア属種(Mycobacterium species)の感染によって引き起こされる慢性感染症である。結核は、発展途上国における主要な疾患であり、世界の発展途上領域において増加している問題である。
【０００３】
ワクチン接種は、感染性疾患を予防する。又は治療するための最も有効な方法の1つである。アデノウイルスは、種々の標的組織における効率の高い遺伝子導入及び大規模な導入遺伝子能力を達成するその能力に起因して、遺伝子導入適用に広く使用されている。慣習的には、アデノウイルスのE1遺伝子が欠失され、選択されたプロモーター、目的とする遺伝子のcDNA配列及びポリAシグナルからなる導入遺伝子カセットによって置き換えられて、複製欠損性組換えウイルスが生じる。
【０００４】
組換えアデノウイルスは、遺伝子治療に有用であり、またワクチンとして有用である。チンパンジーアデノウイルスに基づくウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためヒト由来アデノウイルス(Ad)ベクターを使用する際の代替物を代表する。チンパンジーから単離されたアデノウイルスは、それらがヒト起源の細胞中で効率的に繁殖することによって実証されるとおり、ヒトから単離されたアデノウイルスと緊密に関連する。しかしながら、ヒト及びチンパンジーアデノウイルスは近い同類であるので、2つのウイルス種の間の血清学的な交差反応性が可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
標的に分子を効果的に送達し、集団中の選択されたアデノウイルス血清型に対する既存の免疫の影響を最小化するベクターについて需要がある。ヒトにおいて観察される既存の免疫の1つの形態は、アデノウイルスタンパク質に対して特異的である抗体を産生し、持続性をもたらすことができる、液性免疫である。アデノウイルスによって誘発された体液性応答は、3つの主要な構造上のカプシドタンパク質であるファイバー、ペントン及びヘキソンを主に対象とする。
【０００６】
有効性が高く、安全、簡便で、対費用効果が高く、持続的であり、広域の免疫応答を誘導する、結核に対して免疫する新規の方法についての必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のベクター、組成物及び方法は、限定されないが、高い生産性、改善された免疫原性及び増加した導入遺伝子発現を含む、先行技術に対して1つ以上の以下の改善された特徴を有し得る。
【０００８】
本発明は、以下:
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的な誘導体が、全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(e)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、及び
(f)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む組換えアデノウイルスであって、マイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は宿主細胞中の前記マイコバクテリア抗原の発現を指示する、1つ以上の配列に作動可能に連結される、組換えアデノウイルスを提供する。
【０００９】
組換えアデノウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も提供される。
【００１０】
組換えアデノウイルス及び組成物は、特に、マイコバクテリア感染、例えば、結核菌感染に対する免疫応答の刺激のための医薬として使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】図１Ａ−Ｃ：示されるサルアデノウイルスからのファイバータンパク質配列のアライメントの図である。ChAd3(配列番号27)、PanAd3(配列番号28)、ChAd17(配列番号29)、ChAd19(配列番号30)、ChAd24(配列番号31)、ChAd155(配列番号1)、ChAd11(配列番号32)、ChAd20(配列番号33)、ChAd31(配列番号34)、PanAd1(配列番号35)、PanAd2(配列番号36)。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図２】特定のChAd155 BAC及びプラスミドベクターの産生のためのフロー図である。
【図３】種C BACシャトル#1365の模式図である。
【図４】pArsChAd155 Ad5E4orf6-2(#1490)の模式図である。
【図５】pChAd155/RSVの模式図である。
【図６】BAC ChAd155/RSVの模式図である。
【図７】HIV Gag導入遺伝子を発現するChAd3及びChAd155ベクターの生産性(実験1)の図である。
【図８】HIV Gag導入遺伝子を発現するChAd3及びChAd155ベクターの生産性(実験2)の図である。
【図９】RSV導入遺伝子を発現するPanAd3及びChAd155ベクターの生産性の図である。
【図１０】HIV Gag導入遺伝子を発現するChAd3及びChAd155ベクターの発現レベルの図である。
【図１１】HIV Gag導入遺伝子を発現するPanAd3及びChAd155ベクターの発現レベルの図である(ウェスタンブロット)。
【図１２】HIV Gag導入遺伝子を発現するChAd3及びChAd155ベクターの免疫原性(IFN-ガンマ  ELISpot)の図である。
【図１３】HIV Gag導入遺伝子を発現するPanAd3及びChAd155ベクターの免疫原性(IFNガンマ  ELISpot)の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
(配列の説明)
配列番号1  ChAd155ファイバーのポリペプチド配列
配列番号2  ChAd155ファイバーをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号3  ChAd155ペントンのポリペプチド配列
配列番号4  ChAd155ペントンをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号5  ChAd155ヘキソンのポリペプチド配列
配列番号6  ChAd155ヘキソンをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号7  ChAd155#1434をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号8  ChAd155#1390をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号9  ChAd155#1375をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号10  野生型ChAd155をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号11  ChAd155/RSVをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号12  CASIプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号13  Ad5orf6プライマー1ポリヌクレオチド配列
配列番号14  Ad5orf6プライマー2ポリヌクレオチド配列
配列番号15  BAC/CHAd155ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kanaプライマー1ポリヌクレオチド配列
配列番号16  BAC/CHAd155ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana(#1375)プライマー2ポリヌクレオチド配列
配列番号17  1021-FW E4 Del Step1プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号18  1022-RW E4 Del Step1プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号19  1025-FW E4 Del Step2プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号20  1026-RW E4 Del Step2プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号21  91-SubMonte FWプライマーポリヌクレオチド配列
配列番号22  890-BghPolyA RWプライマーポリヌクレオチド配列
配列番号23  CMVforプライマーポリヌクレオチド配列
配列番号24  CMVrevプライマーポリヌクレオチド配列
配列番号25  CMVFAM-TAMRA qPCRプローブポリヌクレオチド配列
配列番号26  マーモット肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)ポリヌクレオチド配列
配列番号27  ChAd3のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号28  PanAd3のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号29  ChAd17のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号30  ChAd19のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号31  ChAd24のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号32  ChAd11のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号33  ChAd20のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号34  ChAd31のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号35  PanAd1のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号36  PanAd2のファイバータンパク質に関するアミノ酸配列
配列番号37  RSV FΔTMアミノ酸配列
配列番号38  HIV Gagポリヌクレオチド配列
配列番号39  Rv1174(Mtb8.4)のポリペプチド配列
配列番号40  Rv0287(Mtb9.8)のポリペプチド配列
配列番号41  Rv1793(Mtb9.9)のポリペプチド配列
配列番号42  Rv0915(Mtb41)のポリペプチド配列
配列番号43  Rv3875(ESAT-6)のポリペプチド配列
配列番号44  Rv3804(Ag85A)のポリペプチド配列
配列番号45  Rv1886(Ag85B)のポリペプチド配列
配列番号46  Rv2031(アルファクリスタリン)のポリペプチド配列
配列番号47  Rv1980(Mpt64)のポリペプチド配列
配列番号48  Rv0288(TB10.4)のポリペプチド配列
配列番号49  Rv1753のポリペプチド配列
配列番号50  Rv2386のポリペプチド配列
配列番号51  Rv3616(Mtb40)のポリペプチド配列
配列番号52  Rv3407のポリペプチド配列
配列番号53  Rv2660のポリペプチド配列
配列番号54  Rv2608のポリペプチド配列
配列番号55  Rv3619のポリペプチド配列
配列番号56  Rv3620のポリペプチド配列
配列番号57  Rv1813のポリペプチド配列
配列番号58  Rv1009(RpfB)のポリペプチド配列
配列番号59  Rv2389(RpfD)のポリペプチド配列
配列番号60  Rv2626のポリペプチド配列
配列番号61  Rv1733のポリペプチド配列
配列番号62  Rv3136(PPE51)のポリペプチド配列
配列番号63  Rv0475(HBHA)のポリペプチド配列
配列番号64  Rv0125のポリペプチド配列
配列番号65  Ser/Ala変異成熟Rv0125のポリペプチド配列
配列番号66  Ra12のポリペプチド配列
配列番号67  Ra35のポリペプチド配列
配列番号68  Rv1196のポリペプチド配列
配列番号69  Mtb72fのポリペプチド配列
配列番号70  M72のポリペプチド配列。
【００１３】
結核
結核(TB)は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び他のマイコバクテリア属種(Mycobacterium species)の感染によって引き起こされる慢性感染症である。結核は、発展途上国における主要な疾患であり、世界の発展途上領域において増加している問題である。世界人口の約三分の一は潜伏的にTB菌に感染していると考えられており、各年約900万の新しいケースの活動性TB及び150万の死亡者がいる。TB菌に感染する者の約10%が活動性TBを発症し、各人は年毎に平均10から15の他人に感染する活動性TBを有する(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2014)。
【００１４】
結核菌は、呼吸経路を通して個体に感染する。肺胞マクロファージは細菌を飲み込むが、細菌は酸性リソソームとのファゴソーム融合を阻害することによって生存し、増殖できる。CD4+及びCD8+T細胞が関与する複合的な免疫応答は、肉芽腫の形成を究極的には生じる。病原体としての結核菌の成功の中心をなすことは、単離されるが根絶されない細菌が長期間持続し得、活動性TBの後の発症に対して個体が脆弱のままで放置されているとの事実である。
【００１５】
感染した個体の5%未満は、感染後の初年度中に活動性TBを発症する。肉芽腫は、数十年間も持続することができ、休止状態、酸素及び栄養の貧しい状態において生きた結核菌を含有すると考えられる。しかしながら、休止状態における大多数の細菌が、非マクロファージ細胞タイプに位置し、体を通して伝播されることが示唆されている(Locht et al、Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677)。活動性TBの発症は、免疫抑制イベントの結果としてなどの、宿主の自然免疫と病原体の間のバランスが変化する場合に、生じる(Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1):7-13;Ehlers S Infection 2009 37(2):87-95)。
【００１６】
潜伏性TBと活動性TBの間のバランスを記載している有力な仮説も、提案されている(Cardona P-J Inflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39;Cardona P-J Infection 2009 37(2):80-86)。
【００１７】
感染が相当な期間で無症候性であり得るにもかかわらず、活動性疾患は、肺の急性炎症として最も一般に顕在化し、疲労、体重減少、発熱及び持続性の咳が生じる。未治療である場合に、重大な合併症及び死亡が典型的な結果である。
【００１８】
結核は一般的に延長される抗生物質療法を用いて制御することができるにもかかわらず、このような治療は疾患の伝播を防ぐには十分ではない。活動性に感染した個体は大部分は無症候性であり得るが、時おり伝染性である。加えて、治療レジメンでのコンプライアンス(典型的には6ケ月以上持続する)は極めて重要であるにもかかわらず、患者行動をモニターすることは困難である。幾つかの患者は治療コースを完了しないことから、治療の無効及び薬物抵抗性の発症に至る可能性がある。
【００１９】
多剤耐性TB(MDR-TB)は、第一線の薬物療法に対する応答に失敗する一形態である。2013年に、推定で480,000の人々が、MDR-TBを発症した。MDR-TBは、第二線の薬物を用いて治療可能である。しかしながら、第二線の治療オプションは限定され、推奨される薬は、必ずしも利用可能であるとは限らない。必要とされる広範な化学療法(治療2年まで)は費用が高くつき、患者において重篤で有害な薬物反応を生じ得る。
【００２０】
薬剤耐性TB(XDR-TB)は、広範に、第二線の薬物療法に対する抵抗性が第一線の薬物療法に対する抵抗性に迫って発症する場合に生じる。約9.0%のMDR-TBケースがXDR-TBを有することが推定される(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2014)。
【００２１】
抗生物質治療の完全コースが意図されるとしても、結核菌(M.tuberculosis)での感染は感染した個体から根絶されないことがあり得、再活性化され得る潜伏性感染として残り得る。結果的に、疾患の正確且つ早期の診断は、最高度に重要なものである。
【００２２】
現在、弱毒化された生菌でのワクチン接種は、防御免疫を誘導するため、最も広く使用される方法である。この目的のため採用されている最も一般的なマイコバクテリア属(Mycobacterium)は、60年以上前に最初に開発されたM.ボウビス(M.bovis)の非病原株である、カルメット-ゲラン菌(BCG)である。それは、TB流行地域においては出生時に投与される。しかしながら、BCGの安全性及び有効性は論議の種である(小児における重篤な疾患徴候に対しては防御するが、成人における疾患に対するBCGの有効性は可変性である)。加えて、幾つかの国、例えば米国は、この剤で一般大衆をワクチン接種しない。
【００２３】
結核菌感染の早期ステージの間に強く発現される幾つかのタンパク質は、動物ワクチン接種モデルにおいて防御有効性を提供することが示されている。しかしながら、感染の早期ステージの間に高度に発現される、抗原でのワクチン接種は、感染の後期ステージに対処するため、至適な免疫応答を提供しない場合がある。潜伏性感染の間の適切な対照は、その時点で発現される、特定の抗原に特異的であるT細胞を必要とし得る。休眠状態の持続性細菌を直接的に標的にする曝露後ワクチンは、TB再活性化に対する防御を援助し、これによりTB制御が増強される、又はさらに感染のクリアランスが可能になる。したがって、潜伏性TBを標的化するワクチンは、全体的なTB感染率を有意に且つ経済的に減少させるであろう。
【００２４】
後期ステージ抗原に基づくワクチンも、早期ステージ抗原との組合せにおいて利用されてマルチフェーズワクチンが提供されるであろう。或いは、早期及び/又は後期ステージ抗原が使用されてBCGワクチン接種が補完及び改善されるであろう。
【００２５】
典型的に、本発明の方法の目的は、防御免疫応答を誘導することである(すなわち、関連する病原体に対して対象を免疫する、又はワクチン接種する)。したがって、本発明は、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)又は結核菌、特に結核菌による感染などのマイコバクテリアによる感染の予防、治療又は寛解のため適用し得る。
【００２６】
本発明は、以下の目的のために提供され得る:
-  例えば、未感染の対象又は代替的に潜伏性感染を有する対象に投与することによる、感染(すなわち、一次結核)又は再活性化(すなわち、二次結核)に起因する活動性結核の予防、
-  例えば、未感染の対象に投与することによる、潜伏性結核の予防、
-  潜伏性結核を治療すること、
-  例えば、数ケ月、数年又は無期限の期間による、結核の再活性化を予防すること、又は遅延させること、特に再活性化を遅延させること、或いは
-  (例えば、化学療法処置のための必要性を減少させるため、例えば、化学療法処置の期間の減少、薬物レジメンの複雑性又は化学療法処置の投薬量、代替的に化学療法処置に続く後の再発のリスクを減少させるため)活動性結核を治療すること。
【００２７】
誘発された免疫応答は、抗原特異的なT細胞応答であり得る(これは全身性及び/又は局所反応であり得る)。全身性応答は、例えば、全血のサンプルから検出され得る。局所性応答(例えば、肺における局所反応)は、組織(例えば、肺組織)の適切なサンプル又は他の局所的に焦点を合わせたサンプル調査法(例えば、気管支肺胞洗浄)から検出され得る。抗原特異的なT細胞応答は、複数のサイトカイン(例えば、IFNガンマ、TNFアルファ又はIL2、特にIFNガンマ、TNFアルファ及びIL2)を発現するCD4+T細胞が関与する応答などの、CD4+T細胞応答を含み得る。或いは又は加えて、抗原特異的なT細胞応答は、複数のサイトカイン(例えば、IFNガンマ、TNFアルファ又はIL2、特にIFNガンマ、TNFアルファ及びIL2)を発現するCD8+T細胞が関与する応答などの、CD8+T細胞応答を含む。
【００２８】
「活動性感染」という用語は、疾患症状及び/又は傷害が顕在化された、適切には疾患症状が顕在化された、結核菌による感染などの感染を指す。
【００２９】
「不活動性感染」、「休眠状態感染」又は「潜伏性感染」又は「潜伏性結核」という用語は、疾患症状及び/又は傷害が顕在化されない、適切には疾患症状が顕在化されない、結核菌による感染などの感染を指す。潜伏性感染の対象は、適切には、例えば、ツベルクリン皮膚テスト(TST)又はインターフェロンガンマ放出アッセイ(IGRAs)により感染について試験陽性であるが、活動性感染に関連する疾患症状及び/又は傷害が実証されていない。
【００３０】
「一次結核」という用語は、感染、例えば、結核菌による感染に直接的に続く疾患症状の徴候などの臨床上の疾病を指す。Harrison's Principles of Internal Medicine、Chapter 150、pp. 953-966 (16th ed.、Braunwald、et al.、eds.、2005)を参照されたい。
【００３１】
「二次結核」又は「一次後結核」という用語は、休眠状態、不活動性又は潜伏性感染、例えば、結核菌による感染の再活性化を指す。Harrison's Principles of Internal Medicine、Chapter 150、pp. 953-966 (16th ed.、Braunwald、et al.、eds.、2005)を参照されたい。
【００３２】
「結核再活性化」という用語は、(例えば、ツベルクリン皮膚テスト(TST)又はインターフェロンガンマ放出アッセイ(IGRAs)により)感染について試験陽性であるが、見かけの疾患症状を有していない個体における疾患症状の後の徴候を指す。適切には、個体は、感染に再曝露されていない。個体が感染するが、十分に治療されてきて結核を不活動性又は潜伏性に状態化させた、活動性の疾患症状が個体において以前に顕在化していてもよく又はしていなくてもよいことを陽性の診断試験は示す。
【００３３】
適切には、本方法は未感染の対象又はマイコバクテリアによる潜伏性感染、例えば、結核菌による感染を有する対象に適用される。一実施形態において、方法は、結核菌(ヒト対象に関連して)又はウシ結核菌(ウシ対象に関連して)による感染を有していない対象に適用される。別の実施形態において、方法は、マイコバクテリア、例えば、結核菌(ヒト対象に関連して)又はウシ結核菌(ウシ対象に関連して)による潜伏性感染を有する対象に適用される。
【００３４】
幾つかの実施形態において、対象は、BCGで以前にワクチン接種されている。本発明のアプローチは、例えば、BCGワクチン接種の少なくとも1年後、例えば、BCGワクチン接種の少なくとも2年後、例えば、BCGワクチン接種の少なくとも5年後に対象において利用され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、対象は、結核菌で以前に感染されている。
【００３６】
本発明における使用の抗原
マイコバクテリア抗原は、抗原性配列(すなわち、少なくとも1つのB又はT細胞エピトープを含むマイコバクテリアのタンパク質からの配列)である。適切には、マイコバクテリア抗原は、少なくとも1つのT細胞エピトープを含む。
【００３７】
本発明において特に目的とするマイコバクテリア抗原は、以下に由来するものである:
(i)Mtb8.4(DPV及びRv1174としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO97/09428の配列番号102(配列番号101においてcDNA)に及びColer et al Journal of Immunology 1998 161:2356-2364に記載される。特に目的とするものは、成熟Mtb8.4配列であり、これはリーディングシグナルペプチド(すなわち、WO97/09428の配列番号102からのアミノ酸残基15〜96)を欠く。Rv1174の完全長ポリペプチド配列は、配列番号39に示される。
(ii)Mtb9.8(MSL及びRv0287としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO98/53075の配列番号109(MSLの断片は、WO98/53075の配列番号110-124に開示され、配列番号119及び120が特に目的とするものである)に及びColer et al Vaccine 2009 27:223-233(特に、その図2中に示される反応性断片)にも記載される。Rv0287に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号41に示される。
(iii)Mtb9.9(Mtb9.9A、MTI、MTI-A及びRv1793としても知られる)、そのポリペプチド配列は、WO98/53075の配列番号19に及びAlderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7:551-559(MTIの断片は、WO98/53075の配列番号17及び51〜66に開示され、配列番号17、51、52、53、56及び62〜65が特に目的とするものである)に記載される。MTIの幾つかのポリペプチドバリアントは、WO98/53075の配列番号21、23、25、27、29及び31に並びにAlderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7:551-559に記載される。Rv1793に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号41に示される。
(iv)Mtb41(MTCC2及びRv0915としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO98/53075の配列番号142(配列番号140においてcDNA)に及びSkeiky et al Journal of Immunology 2000 165:7140-7149に記載される。Rv0915に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号42に示される。
(v)ESAT-6(esxA及びRv3875としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO97/09428の配列番号103(配列番号104においてcDNA)に及びSorensen et al Infection and Immunity 1995 63(5):1710-1717に記載される。Rv3875に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号43に示される。
(vi)Ag85複合体抗原(例えば、Ag85A、fbpA及びRv3804としても知られる;又はAg85B、fbpB及びRv1886としても知られる)、これらは、例えば、Content et al Infection and Immunity 1991 59:3205-3212に及びHuygen et al Nature Medicine 1996 2(8):893-898に論じられる。Rv3804/Ag85Aに関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号44(残基43〜338の成熟タンパク質、すなわちシグナルペプチドを欠くものが特に目的とするものである)に示される。Ag85Bに関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号45(残基41〜325の成熟タンパク質、すなわちシグナルペプチドを欠くものが特に目的とするものである)に示される。
(vii)アルファクリスタリン(hspX及びRv2031としても知られる)、これはVerbon et al Journal of Bacteriology 1992 174:1352-1359に及びFriscia et al Clinical and Experimental Immunology 1995 102:53-57(特に目的とするものは、残基71〜91、21〜40、91〜110及び111〜130に対応する断片である)に記載される。Rv2031に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号46に示される。
(viii)Mpt64(Rv1980としても知られる)、これはRoche et al Scandinavian Journal of Immunology 1996 43:662-670に記載される。Mpt64に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号47(残基24〜228の成熟タンパク質、すなわちシグナルペプチドを欠くものが特に目的とするものである)に示される。
(ix)TB10.4(cfp7及びRv0288としても知られる)、これは、例えば、Skjot et al. Infect Immun 2002 70: 5446-5453、Dietrich et al. J Immunol 2005 174:6332-6339及びElvang et al. PLoS One 2009;4(4):e5139に記載される。Rv0288に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号48に示される。
(x)RV1753、例えば、これはWO2010010180の配列番号1及び2〜7に記載される。結核菌株CからのRv1753に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号49に示される。
(xi)Rv2386c、WO2010010179の配列番号1及び2〜7。結核菌H37RvからのRv2386cに関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号50に示される、及び/又は
(xii)Mtb40(HTCC1及びRv3616としても知られる)、これは例えばWO2011092253に記載される、例えばWO2011092253の配列番号1及び2〜7から選択される天然Rv3616配列又はWO2011092253の配列番号161から169、179及び180から選択されるものなどの改変されたRv3616配列。WO2011092253の配列番号127、128、130、131〜133、135、143〜148又は150〜156から選択されるRv3616断片が、特に目的とするものである。Rv3616に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号51に示される。
(xiii)Rv3407、Rv3407に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号52に示される。
(xiv)Rv2660、Rv2660に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号53に示される。
(xv)Rv2608、Rv2608に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号54に示される。
(xvi)Rv3619、Rv3619に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号55に示される。
(xvii)Rv3620、Rv3620に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号56に示される。
(xviii)Rv1813、Rv1813に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号57に示される。
(xix)Rv1009、RpfBとしても知られる、Rv1009に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号58に示される。
(xx)Rv2389、RpfDとしても知られる、Rv2389に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号59に示される。
(xxi)Rv2626、Rv2626に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号60に示される。
(xxii)Rv1733、Rv1733に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号61に示される。
(xxiii)Rv3136、PPE51としても知られる、Rv3136に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号62に示される。
(xxiv)Rv0475、HBHAとしても知られ、WO97044463、WO03044048及びWO2010149657に記載される、Rv0475に関する完全長ポリペプチド配列は配列番号63に示される。
(xxv)Mtb32A(Rv0125としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO01/98460の配列番号2(完全長)及び配列番号4(成熟)の残基8〜330に記載され、特に少なくとも1つの触媒三残基の変異(例えば、触媒性セリン残基、これは例えばアラニンに変異され得る)を有するバリアントが記載される。Rv0125に関する成熟ポリペプチド配列は、配列番号64に示される。Ser/Ala変異を有するMtb32Aの成熟形態は、配列番号65に示される。特に目的とするRv0125の断片は、Ra12(Mtb32A C末端抗原としても知られる)を含み、そのポリペプチド配列はWO01/98460の配列番号10に及びSkeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682に記載される。Ra12に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号66に示される。特に目的とするRv0125の別の断片は、Ra35(Mtb32A N末端抗原としても知られる)であり、そのポリペプチド配列はWO01/98460の配列番号8に及びSkeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682に記載される。Ra35に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号67に示される、並びに
(xxvi)TbH9(Mtb39、Mtb39A、TbH9FL及びRv1196としても知られる)、そのポリペプチド配列はWO97/09428の配列番号107に並びにDillon et al Infection and Immunity 1999 67(6):2941-2950及びSkeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682にも記載される。Rv1196に関する完全長ポリペプチド配列は、配列番号68に示される。
【００３８】
マイコバクテリア抗原の組合せも、利用し得る。このようなケースにおいて、マイコバクテリア抗原は、個々に又は1つ以上の融合タンパク質の一部としてコードされ得る。「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、直接的に又はアミノ酸リンカーを介してのいずれかで共有結合性により連結された、少なくとも2つの異種性ポリペプチド(例えば、少なくとも2つのマイコバクテリウム属種ポリペプチド)を有するタンパク質を指す。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であってもよい。
【００３９】
(適切には、単一の融合タンパク質の形態において)コードされ得る抗原の組合せは、
(a)Ag85B配列及びESAT-6配列(例えば、H1融合タンパク質抗原)、
(b)Ag85B配列及びTB10.4配列(例えば、H4融合タンパク質抗原)、
(c)Ag85B配列、ESAT-6配列及びRv2660配列(例えば、H56融合タンパク質抗原)、
(d)Rv2608配列、Rv3619配列、Rv3620配列及びRv1813配列(例えば、ID93融合タンパク質抗原)、
(e)Ag85A配列、Ag85B配列及びRv3407配列、
(f)Rv1733配列及びRv2626配列、例えば、
(f-i)Rv1733配列、Rv2626配列及びESAT-6配列、
(f-i-a)Rv1733配列、Rv2626配列、ESAT-6配列及びRpfD配列、例えば、
(f-i-a-i)Rv1733配列、Rv2626配列、ESAT-6配列、RpfD配列及びAg85B配列、
(f-i-b)Rv1733配列、Rv2626配列、ESAT-6配列及びRpfb配列、例えば、
(f-i-b-i)Rv1733配列、Rv2626配列、ESAT-6配列、RpfB配列及びAg85B配列、
(f-ii)Rv1733配列、Rv2626配列及びRv3407配列、例えば、
(f-ii-a)Rv1733配列、Rv2626配列、Rv3407配列及びRpfD配列、
(f-ii-b)Rv1733配列、Rv2626配列、Rv3407配列及びRpfB配列、
(f-iii)Rv1733配列、Rv2626配列及びPPE51配列、例えば、
(f-iii-a)Rv1733配列、Rv2626配列、PPE51配列及びRpfD配列、
(f-iii-b)Rv1733配列、Rv2626配列、PPE51配列及びRpfB配列を含む。
【００４０】
当業者は、組合せが上記(i)〜(xxvi)に記載される特定の配列に依存する必要のないこと、並びに記載された配列の少なくとも80%同一性、例えば少なくとも90%同一性、特に少なくとも95%同一性、特に少なくとも98%同一性を有するバリアント又は免疫原性断片(例えば、完全長抗原の少なくとも20%、例えば、抗原の少なくとも40%、特に少なくとも50%、特に少なくとも75%)を代替的に使用することができることを認識する。
【００４１】
したがって、アデノウイルスは、単一の融合タンパク質などに、(a)から(f)の任意の組合せをコードし得、ここで、各々の成分は、記載された配列(これは任意の順番であってもよい)の少なくとも80%同一性、例えば、少なくとも90%同一性、特に少なくとも95%同一性、特に少なくとも98%同一性を有する、又は免疫原性断片(例えば、完全長抗原の少なくとも20%、例えば、抗原の少なくとも40%、特に少なくとも50%、特に少なくとも75%)である。
【００４２】
特に適切な組合せは、Rv1196配列及びRv0125配列、例えば、Mtb72f融合タンパク質抗原又はM72融合タンパク質抗原を含むものである。
【００４３】
Rv1196(例えば、Dillon et al Infection and Immunity 1999 67(6): 2941-2950において名称Mtb39aにより記載される)は高度に保存され、H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、94-M4241A、98-R604INH-RIF-EM、KZN605、KZN1435、KZN4207、KZNR506株、及び単一点突然変異Q30Kを有するF11株にわたって100%配列同一性を有する(大部分の他の臨床単離体は、H37Rvに対して90%同一性超を有する)。Rv1196関連抗原をコードするアデノウイルスは、Lewinsohn et al Am J Respir Crit Care Med 2002 116:843-848に記載される。
【００４４】
Rv0125(例えば、Skeiky et al Infection and Immunity 1999 67(8): 3998-4007において名称Mtb32aにより記載される)も高度に保存され、多くの株にわたって100%配列同一性を有する。Rv0125関連抗原をコードするアデノウイルス(ヒトAd5)は、Zhang et al Human Vaccines & Therapeutics 2015 11(7):1803-1813 doi: 10.1080/21645515.2015.1042193に記載される。完全長Rv0125はN末端シグナル配列を含み、これが切断されて成熟タンパク質が提供される。
【００４５】
Mtb72fは、幾つかの動物モデルにおいて防御を提供することが示されている(例えば:Brandt et al Infect. Immun. 2004 72(11):6622-6632;Skeiky et al J. Immunol. 2004 172:7618-7628;Tsenova et al Infect. Immun. 2006 74(4):2392-2401を参照されたい)。Mtb72fも、臨床研究の対象である(Von Eschen et al 2009 Human Vaccines 5(7):475-482)。M72は、Mtb72fと比較して、単一のセリンからアラニン変異が組み込まれた改善された抗原であり、改善された安定性特徴が生じる。M72関連抗原は、潜伏性TBモデル(本明細書中に参照によって組み込まれる、国際特許出願WO2006/117240)において価値のあることも示されている。以前の前臨床及び臨床研究により、0,1月スケジュールにおいて10ug M72ポリペプチド、25ug 3D-MPL及び25ug QS21を用いる、ヒトにおいて免疫刺激剤3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL)と共に投与されるM72並びにリポソーム製剤におけるQS21が導かれた(例えば、Leroux-Roels et al Vaccine 2013 31 2196-2206、Montoya et al J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375;Thacher EG et al AIDS 2014 28(12):1769-1781;Idoko OT et al Tuberculosis (Edinb) 2014 94(6):564-578;Penn-Nicholson A、et al Vaccine 2015 33(32):4025-4034 doi:10.1016/j.vaccine.2015.05.088を参照されたい)。
【００４６】
本発明の実施形態において、アデノウイルスは、少なくとも1つのRv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875、特に少なくとも1つのRv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386及びRv3616、特に少なくとも1つのRv0125及びRv1196に由来するマイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含む。
【００４７】
RvNNNNという用語は、結核菌のH37Rv株から又は別のマイコバクテリウム、例えばウシ結核菌から、若しくは特に結核菌の別の株からのそのホモログから同定される遺伝子番号NNNNによってコードされるタンパク質を意味する。H37Rvからのタンパク質に関する配列は、当技術分野において知られており、例えばTuberculist(http://tuberculist.epfl.ch/)から得られ得る。
【００４８】
アデノウイルスは、少なくとも1つのRv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804及びRv3875、特に少なくとも1つのRv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386及びRv3616、特に少なくとも1つのRv0125及びRv1196を含む、マイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含み得る。
【００４９】
アデノウイルスは、Rv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804又はRv3875、特にRv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386又はRv3616、特に少なくとも1つのRv0125又はRv1196に対して少なくとも80%同一性を有する配列を含む、マイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含み得る。適切には、マイコバクテリア抗原は、参照配列に対して少なくとも90%、特に少なくとも95%、例えば少なくとも98%の同一性を有する配列を含む。
【００５０】
アデノウイルスは、Rv0125、Rv0287、Rv0288、Rv0475、Rv0915、Rv1009、Rv1174、Rv1196、Rv1733、Rv1753、Rv1793、Rv1813、Rv1886、Rv1980、Rv2031、Rv2386、Rv2389、Rv2608、Rv2626、Rv2660、Rv3136、Rv3407、Rv3616、Rv3619、Rv3620、Rv3804又はRv3875、特にRv0125、Rv0287、Rv0915、Rv1174、Rv1196、Rv1753、Rv1793、Rv2386又はRv3616、特に少なくとも1つのRv0125又はRv1196の免疫原性断片である配列を含むマイコバクテリア抗原(例えば、1つ以上のT細胞エピトープを含む)をコードする核酸配列を含み得る。適切には、マイコバクテリア抗原は、参照配列からの少なくとも20アミノ酸残基、例えば少なくとも50アミノ酸残基の免疫原性断片である配列を含む。或いは、マイコバクテリア抗原は、参照配列の全長の少なくとも20%、例えば、参照配列残基の全長の少なくとも30%、特に参照配列残基の全長の少なくとも40%、特に参照配列残基の全長の少なくとも50%、例えば参照配列の全長の少なくとも75%の免疫原性断片である、配列を含む。
【００５１】
本発明の実施形態において、アデノウイルスは、少なくとも1つの配列番号39から68、特に配列番号65から68、特に配列番号70に由来するマイコバクテリア抗原をコードする核酸配列を含む。
【００５２】
各々の上記個々の抗原配列も、Cole et al Nature 1998 393:537-544及びCamus Microbiology 2002 148:2967-2973に開示される。結核菌H37Rvのゲノムは、例えば、Welcome Trust Sanger研究所ウェブサイト(www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/)及び他で好適に利用可能である。
【００５３】
適切には、マイコバクテリア抗原は、2500アミノ酸残基以下、例えば1500アミノ酸残基以下、特に1200アミノ酸残基以下、特に1000アミノ酸残基以下、典型的には800アミノ酸残基以下を含有する。
【００５４】
T細胞エピトープは、T細胞(例えば、CD4+又はCD8+T細胞)により認識される短い連続するストレッチのアミノ酸である。T細胞エピトープの同定は、当業者に知られているエピトープマッピング実験により達成され得る(例えば、Paul、Fundamental Immunology、3rd ed.、243-247 (1993);Beiβbarth et al Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1):i29-i37を参照されたい)。ヒトなどの多様な非近交系集団において、異なるHLAタイプは、特定のエピトープが全てのメンバーの集団によって認識されない可能性があることを意味する。結核におけるT細胞応答の重大な関与の結果として、認識のレベル及び免疫応答のスケールを最大化するため、参照配列の免疫原性誘導体は、望ましくは大多数の(又は適切には全ての)T細胞エピトープをインタクトに含有するものである。Mortier et al BMC Immunology 2015 16:63は、Mtb72f及びM72結核候補ワクチン抗原に関して、配列保存分析及びin silicoヒト白血球抗原-ペプチド結合予測に着手した。
【００５５】
単一アミノ酸又は低パーセンテージのアミノ酸を変更する、付加する、又は欠失させる、タンパク質に対する個々の置換、欠失又は付加が、改変(複数可)が機能上類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換又は免疫原性機能に実質的に影響を及ぼさない残基の置換/欠失/付加をもたらす「免疫原性誘導体」であることを当業者は認識する。
【００５６】
機能上類似するアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは、当技術分野で周知である。一般に、このような保存的置換は、以下に特定されるアミノ酸グループ分けの1つの範囲内にあるが、幾つかの環境下において、他の置換が抗原の免疫原性特性に実質的に影響することなく可能であり得る。以下の8つのグループは、互いに典型的な保存的置換であるアミノ酸を各々含む:
1)アラニン(A)、グリシン(G)、
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、
4)アルギニン(R)、リシン(K)、
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、
7)セリン(S)、トレオニン(T)、及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton、Proteins 1984を参照されたい)。
【００５７】
適切には、このような置換は、エピトープの領域中には生じない、したがって、抗原の免疫原性特性に顕著な影響を有さない。
【００５８】
免疫原性誘導体は、追加アミノ酸が参照配列と比較して挿入されるものも含み得る。適切には、このような挿入は、エピトープの領域中には生じない、したがって、抗原の免疫原性特性に顕著な影響を有さない。挿入の一例には、対象とする抗原の発現及び/又は精製を援助する、短いストレッチのヒスチジン残基(例えば、2〜6残基)が含まれる。
【００５９】
免疫原性誘導体は、参照配列と比較してアミノ酸が欠失されているものを含む。適切には、このような欠失は、エピトープの領域中には生じない、したがって、抗原の免疫原性特性に顕著な影響を有さない。特定の免疫原性誘導体が、置換、欠失及び付加(又はその任意の組合せ)を含み得ることを当業者は認識する。
【００６０】
2つ以上の抗原配列の文脈において、「同一」若しくは「同一性」パーセンテージという用語は、比較ウインドウ、又は以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて又は手作業のアラインメント及び視覚的な点検により測定されるような指定領域に対する最大一致について比較及び整列される場合に、同じである、又は同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基を有する2つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。この定義は、試験配列の相補性も指す。場合により、同一性は、長さが少なくとも200アミノ酸、例えば、少なくとも300アミノ酸又は少なくとも400アミノ酸である領域にわたって存在する。適切には、比較は、参照配列の全体長に対応するウインドウに対して行われる(派生的配列とは対照的)。
【００６１】
配列比較について、1つの配列は、試験配列を比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合には、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができる、又は代替パラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、試験配列を参照配列と比較するため、配列同一性パーセンテージを計算する。
【００６２】
本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、2つの配列が至適に整列された後に、配列が、同数の隣接する位置の参照配列と比較され得るセグメントを指す。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の至適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカル相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性探索法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータ実行によって、又は手作業のアラインメント及び視覚的な点検によって実施することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.、eds. 1995 supplement)を参照されたい)。
【００６３】
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、進行性ペアワイズアラインメントを用いて、関連配列の群から多重配列アラインメントを作り出して関連性及び配列同一性パーセントを示す。PILEUPは、アラインメントを作り出すため使用されるクラスタリング関連性を示すツリー又はデンドログラムもプロットする。PILEUPは、Feng & Doolittle、J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の進行性アラインメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp、CABIOS 5:151-153 (1989)によって記載される方法に類似する。そのプログラムは、各々の最大長5,000ヌクレオチド又はアミノ酸を300配列まで整列することができる。マルチプルアラインメント手順は、2つの最も類似する配列のペアワイズアラインメントで開始され、2つの整列された配列のクラスターを生成する。次に、このクラスターは、整列された配列の次に最も関連する配列又はクラスターと整列される。配列の2つのクラスターは、2つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な伸長によって整列される。最終的なアラインメントは、一連の進行性ペアワイズアラインメントによって達成される。プログラムは、配列比較の領域に対して特定の配列及びそれらのアミノ酸座標を指定すること並びにプログラムパラメータを指定することによって実行される。PILEUPを用いて、参照配列は、他の試験配列と比較されて、以下のパラメータを用いて配列同一性関連性パーセントが決定される:デフォルトギャップウェイト(3.00)、デフォルトギャップ長ウェイト(0.10)、及び重みつきエンドギャップ。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン7.0(Devereaux et al.、Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984))から得ることができる。
【００６４】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するため適切であるアルゴリズムの別の例は、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al.、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)及びAltschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)にそれぞれ記載される。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(www.ncbi.nlm.nih.gov/のウェブサイト)を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムでは、データベース配列中に同じ長さのワードで整列した場合、ある程度ポジティブな閾値スコアT(some positive-valued threshold score T)とマッチする、又は満足するクエリー配列中の短ワード長W(short words of length W)を同定することによって高スコア配列ペア(HSP)を同定することが、最初に関与する。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al、上記)。これらの最初の隣接ワードヒットは、より長いHSPを含むものを見出すための探索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコア(cumulative alignment score)が増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてパラメータM(マッチする残基のペアに関する報酬スコア;常に>0)及びN(ミスマッチする残基に関するペナルティースコア;常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の場合に停止される:累積アラインメントスコアがその最大到達値から量X減少した場合;1つ以上の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが0以下となった場合;又はいずれかの配列の端に到達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、T及びXは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列に関して)は、デフォルトとして11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして3のワード長及び10の期待値(E)、及び50のBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)アラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。
【００６５】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性の統計分析も行う(例えば、Karlin & Altschul、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの基準は、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する、最小合計確率(P(N))である。例えば、核酸は、計算核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合には、参照配列に対して類似すると考えられる。
【００６６】
いずれにしても、ポリペプチド配列の免疫原性誘導体は、参照配列と本質的に同じ活性を通常有する。本質的に同じ活性は、PBMC、全血、肺組織又は気管支肺胞洗浄物の特異的な抗原でのインビトロ再刺激アッセイ(例えば、数時間から2週まで、例えば、1日まで、1日から1週又は1から2週の間の期間の再刺激)における参照配列の少なくとも50%、適切には少なくとも75%、特に少なくとも90%活性を意味し、このアッセイはリンパ球増殖を介した細胞の活性化、培養の上清中のサイトカインの産生(ELISA、CBAなどにより測定)或いは細胞内及び細胞外染色(例えば、免疫マーカー、例えば、CD3、CD4、CD8、IL2、TNF-アルファ、IFN-ガンマ、IL-17、CD40L、CD69などに特異的な抗体を用いて)によるT及びB細胞応答の特徴付けを測定するアッセイであり、フローサイトメーターでの分析が続く。適切には、本質的に同じ活性は、T細胞増殖及び/又はIFN-ガンマ産生アッセイにおける参照配列の少なくとも50%、適切には少なくとも75%、特に少なくとも90%活性を意味する。
【００６７】
一実施形態において、コードされる抗原は、Rv1196関連抗原である。「Rv1196関連抗原」という用語は、配列番号68において提供される、Rv1196タンパク質又はその免疫原性誘導体を指す。本明細書で使用する「誘導体」という用語は、参照配列と比較して改変された抗原を指す。免疫原性誘導体は、参照配列の免疫原性特性を実質的に保持するため、参照配列に対して十分に類似し、参照配列に対して上昇される免疫応答を可能にする能力が残る。免疫原性誘導体は、例えば、参照配列の改変されたバージョンを含み得る、又は代替的に参照配列の改変されたバージョンからなり得る。
【００６８】
Rv1196関連抗原は、例えば、2500アミノ酸残基以下、例えば1500アミノ酸残基以下、特に1200アミノ酸残基以下、特に1000アミノ酸残基以下、典型的には800アミノ酸残基以下を含有し得る。
【００６９】
適切には、Rv1196関連抗原は、配列番号68に対して、少なくとも70%同一性、例えば、少なくとも80%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%、例えば、少なくとも99%同一性を有する配列を含む、例えば、その配列からなる。
【００７０】
Rv1196関連抗原の特定の例は、配列番号68に提供されるような、結核菌株H37RvからのRv1196である。結果的に、本発明の一実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号68を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号68からなるタンパク質である。
【００７１】
典型的なRv1196関連抗原は、少数の欠失、挿入及び又は置換を有する配列番号68の免疫原性誘導体を含む(例えば、それからなる)。例は、0〜5の位置で5残基までの欠失、0〜5の位置で5残基までの挿入、及び20残基までの置換を有するものである。
【００７２】
Rv1196の他の免疫原性誘導体は、配列番号68の断片を含む(例えば、それからなる)ものであり、これは長さが少なくとも200アミノ酸、例えば、長さが少なくとも250アミノ酸、特に長さが少なくとも300アミノ酸、特に長さが少なくとも350アミノ酸である。
【００７３】
一実施形態において、ポリペプチド抗原及びコードされる抗原は、Rv0125関連抗原である。「Rv0125関連抗原」という用語は、配列番号64において提供される、Rv0125タンパク質又はその免疫原性誘導体を指す。本明細書で使用する「誘導体」という用語は、参照配列と比較して改変された抗原を指す。免疫原性誘導体は、参照配列の免疫原性特性を実質的に保持するため、参照配列に対して十分に類似し、参照配列に対して上昇される免疫応答を可能にする能力が残る。免疫原性誘導体は、例えば、参照配列の改変されたバージョンを含み得る、又は代替的に参照配列の改変されたバージョンからなり得る。
【００７４】
Rv0125関連抗原は、例えば、2500アミノ酸残基以下、例えば1500アミノ酸残基以下、特に1200アミノ酸残基以下、特に1000アミノ酸残基以下、典型的には800アミノ酸残基以下を含有し得る。
【００７５】
適切には、Rv0125関連抗原は、配列番号64に対して、少なくとも70%同一性、例えば、少なくとも80%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%、例えば、少なくとも99%同一性を有する配列を含む、例えば、その配列からなる。
【００７６】
Rv0125関連抗原の特定の例は、配列番号64に提供されるような、結核菌株H37RvからのRv0125である。結果的に、本発明の一実施形態において、Rv0125関連抗原は、配列番号64を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv0125関連抗原は、配列番号64からなるタンパク質である。
【００７７】
典型的なRv0125関連抗原は、少数の欠失、挿入及び又は置換を有する配列番号64の免疫原性誘導体を含む(例えば、それからなる)。例は、0〜5の位置で5残基までの欠失、0〜5の位置で5残基までの挿入、及び20残基までの置換を有するものである。
【００７８】
Rv0125の他の免疫原性誘導体は、配列番号64の断片を含む(例えば、それからなる)ものであり、これは長さが少なくとも150アミノ酸、例えば、少なくとも長さが200アミノ酸、特に長さが少なくとも250アミノ酸、特に長さが少なくとも300アミノ酸である。Rv0125の特定の免疫原性誘導体は、配列番号3の残基1〜195に対応する配列番号64の断片を含む(例えば、それからなる)ものである。さらにRv1196の特定の免疫原性誘導体は、配列番号64の残基192〜323に対応する配列番号64の断片を含む(例えば、それからなる)ものである。
【００７９】
特に好ましいRv0125関連抗原は、配列番号64の誘導体であり、ここで、少なくとも1つの(例えば1つの、2つの又はさらに3つ全ての)触媒三残基は、プロテアーゼ活性が減少し、タンパク質がより容易に産生されるように、置換又は欠失されており、すなわち触媒性セリン残基は欠失又は置換され得(例えば、アラニンで置換される)及び/又は触媒性ヒスチジン残基は欠失又は置換及び/又は置換され得、触媒性アスパラギン酸残基は欠失又は置換され得る。特に目的とするものは、配列番号64の誘導体であり、ここで、触媒性セリン残基は置換されている(例えば、アラニンで置換される)。また目的とするものは、配列番号64に対して少なくとも70%同一性、例えば、少なくとも80%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%、例えば、少なくとも99%同一性を有する配列を含む、例えば、その配列からなるRv0125関連抗原であり、ここで、少なくとも1つの触媒三残基は置換又は欠失されており或いは配列番号64の断片を含む、例えば、その配列からなるものであり、これは長さが少なくとも150アミノ酸、例えば、長さが少なくとも200アミノ酸、特に長さが少なくとも250アミノ酸、特に長さが少なくとも300アミノ酸であり、ここで、少なくとも1つの触媒三残基は置換又は欠失されている。さらにRv0125の免疫原性誘導体は、配列番号64の残基192〜323に対応する配列番号64の断片を含む(例えば、それからなる)ものであり、ここで、少なくとも1つの(例えば1つの、2つの又はさらに3つ全ての)触媒三残基は置換又は欠失されている。Rv1196の特定の免疫原性誘導体は、配列番号64の残基1〜195に対応する配列番号64の断片を含む(例えば、それからなる)ものであり、ここで、触媒性セリン残基(配列番号64の176位)は置換されている(例えば、アラニンで置換される)。
【００８０】
特定の実施形態において、マイコバクテリア抗原は、Rv1196及びRv0125関連抗原、例えば、M72関連抗原である。M72タンパク質の特定の誘導体は、N末端での追加のHis残基(例えば、2つのHis残基、又は5つの若しくは特に6つのHis残基のポリヒスチジンタグ、これはニッケル親和性精製について使用され得る)を有するものを含む。M72において変異されられている元のセリン残基を含有するMtb72fはM72のさらなる誘導体であり、Mtb72fタンパク質はN-末端での追加のHis残基(例えば、2つのHis残基、又は5つの若しくは特に6つのHis残基のポリヒスチジンタグ、これはニッケル親和性精製について使用され得る)を有する。
【００８１】
幾つかの実施形態において、単一のアデノウイルスは、1つはRv1196関連抗原であり、1つはRv0125関連抗原である、2つの別個のポリペプチドをコードし得る。
【００８２】
適切には、M72関連抗原は、配列番号70に対して、少なくとも70%同一性、例えば、少なくとも80%、特に少なくとも90%、特に少なくとも95%、例えば、少なくとも98%、例えば、少なくとも99%同一性を有する配列を含む、例えば、その配列からなる。
【００８３】
典型的なM72関連抗原は、少数の欠失、挿入及び又は置換を有する配列番号70の誘導体を含む、例えば、その誘導体からなる。例は、0〜5の位置で5残基までの欠失、0〜5の位置で5残基までの挿入、及び20残基までの置換を有するものである。
【００８４】
M72の他の誘導体は、配列番号70の断片を含む、例えば、その断片からなるものであり、これは長さが少なくとも450アミノ酸、例えば、長さが少なくとも500アミノ酸、例えば、長さが少なくとも550アミノ酸、例えば、長さが少なくとも600アミノ酸、例えば、長さが少なくとも650アミノ酸又は長さが少なくとも700アミノ酸である。M72は2つの個々の抗原に由来する融合タンパク質であるので、少なくとも450残基の任意の断片は完全長配列からの複数のエピトープを含む(Skeiky et al J. Immunol. 2004 172:7618-7628;Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8):3998-4007;Dillon Infect. Immun. 1999 67(6):2941-2950)。
【００８５】
特定の実施形態において、M72関連抗原は、配列番号70の残基2〜723を含む、例えば、配列番号70を含む(又はそれからなる)。
【００８６】
アデノウイルス
アデノウイルスは、3つの主要なタンパク質、ヘキソン(II)、ペントンベース(III)及びノブのついたファイバー(IV)の他に幾つかの他の微量なタンパク質、VI、VIII、IX、IlIa及びIVa2を含む正二十面体カプシドの特徴的な形態を有する。ウイルスゲノムは、直鎖状で、二本鎖のDNAである。ウイルスDNAは、高度に塩基性のタンパク質VII及びスモールペプチドpX(以前はmuと称された)と密接に関連する。別のタンパク質Vは、このDNA-タンパク質複合体でパッケージングされ、タンパク質VIを介してカプシドに対する構造上の連結が提供される。ウイルスはウイルスによりコードされるプロテアーゼも含有し、これは成熟感染性ウイルスを産生する構造タンパク質の幾つかのプロセシングに必要である。
【００８７】
アデノウイルスゲノムは、よく特徴付けられている。例えば、各ウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及びL5遺伝子の位置に同様に位置する特異的なオープンリーディングフレームに関するアデノウイルスゲノムの全体の組織化において、一般的な保存性が存在する。アデノウイルスゲノムの各末端は、ウイルス複製に必要な逆方向末端反復(ITR)として知られる配列を含む。ウイルスはウイルスによりコードされるプロテアーゼも含み、これは感染性ビリオンを産生するため必要とされる構造タンパク質の幾つかのプロセシングに必要である。アデノウイルスゲノムの構造は、ウイルス遺伝子が宿主細胞形質導入に発現される順番に基づいて記載される。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写がDNA複製の開始の前又は後に生じるかどうかにより早期(E)又は後期(L)遺伝子と呼ばれる。形質導入の初期フェーズにおいて、アデノウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4遺伝子は、宿主細胞をウイルス複製のために準備させるように発現される。感染の後期フェーズの間に、ウイルス粒子の構造上の成分をコードする、後期遺伝子L1-L5の発現が活性化される。
【００８８】
アデノウイルスは種特異的であり、異なる血清型、すなわち、抗体によって交差中和されないウイルスのタイプが、種々の哺乳動物の種から単離されている。例えば、50以上の血清型がヒトから単離されており、これは6つのサブグループ(A-F;Bは、B1及びB2に細分される)に配列相同性及び赤血球を凝集させるそれらの能力に基づいて分けられる(Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。多数のアデノウイルスは、非ヒトサル、例えば、チンパンジー、ボノボ、アカゲザル及びゴリラから単離されており、それらは、ヘキソン又はファイバー配列に基づく系統的類縁関係に基づいて同じヒトグループに分類される(Colloca et al. (2012) ScienceTranslational Medicine 4:1-9;Roy et al. (2004) Virology 324: 361-372;Roy et al. (2010) Journal of Gene Medicine 13:17-25)。
【００８９】
ファイバータンパク質を含むアデノウイルスカプシドタンパク質及びこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記において概説されたように、アデノウイルスカプシドは、三種の主要なタンパク質、ヘキソン、ペントン及びファイバーを含む。ヘキソンはカプシドの大多数の構造上の成分を占め、これは240の三量体ヘキソンキャプソメア及び12のペントンベースからなる。ヘキソンは3つの保存されたダブルバレルを有し、その上部に3つのタワーを有し、各タワーはカプシドの大部分を形成する各サブユニットからのループを含有する。ヘキソンのベースは、アデノウイルスの血清型の間で高度に保存されるが、表面ループは可変性である(Tatsis及びErtl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。
【００９０】
ペントンは、ファイバーが結合する五量体のベースを形成する、別のアデノウイルスカプシドタンパク質である。三量体ファイバータンパク質は、カプシドの12の頂点の各々でペントンベースから突出する、ノブのついた桿体様構造である。大部分の他の正二十面体ウイルスの表面と比較して、アデノウイルスカプシドの表面における著しい差は、長く、薄いファイバータンパク質の存在である。ファイバータンパク質の主な役割は、その細胞受容体との相互作用を介してウイルスカプシドと細胞表面を係留することである。
【００９１】
多くのアデノウイルス血清型のファイバータンパク質は、共通の構造物であるN末端尾部、反復する配列から作られる中心シャフト、及びC末端球状ノブドメイン(又は「頭部」)を共有する。中心シャフトドメインは、可変数のベータリピートからなる。ベータリピートは連結して、高度に強固で安定な3つの結び付くらせん状鎖の細長い構造を形成する。シャフトは、N末端尾部と球状ノブ構造を連結し、これは標的細胞受容体との相互作用を担う。アデノウイルスノブドメインの球状の性質により、側方及び先端で受容体に結合するための大きい表面が提示される。この構造物の効果は、ウイルスカプシドから遠くに受容体結合部位を突出することであり、したがって、相対的に平坦なカプシド表面によって提示される立体的な拘束からウイルスを解放する。
【００９２】
多くのアデノウイルス血清型のファイバーが同じ全体構造を有するにもかかわらず、ファイバーはそれらの機能並びに構造に影響する可変性アミノ酸配列を有する。例えば、ファイバーノブの表面上の幾つかの曝露された領域は、容易に適合性の受容体結合部位を提示する。ファイバーノブの球状形状は、受容体が、ノブの側方で又はファイバーノブの上方に結合することを可能にする。典型的には、これらの結合部位は、ヒトアデノウイルスの間での保存性が不十分であるベータ鎖を連結する表面曝露ループに横たわる。これらのループ上の曝露された側鎖はノブに種々の表面特性を与えると同時に、三次及び四次構造を保存する。例えば、ノブ表面での静電ポテンシャル及び電荷分布は、ファイバーノブ配列中の広範囲の等電点に起因して、Ad8、Ad19、及びAd37についてのpI約9からサブグループBアデノウイルスについてのpI約5まで変動することができる。構造的に複雑なウイルスリガンドとして、ファイバータンパク質により、ウイルスカプシドからの幾つかの配向及び距離(シャフト)における種々の結合表面(ノブ)の提示が可能である。
【００９３】
幾つかの血清型の間の最も明白な変動の1つは、ファイバーの長さである。研究は、ファイバーシャフトの長さが、ノブ及びウイルスとその標的受容体の相互作用に強く影響することを示す。さらに、血清型間のファイバータンパク質はまた、それらの屈曲する能力において変動することができる。シャフト中のベータリピートが高度に安定で且つ規則的な構造を形成するにもかかわらず、電子顕微鏡(EM)研究はファイバー中の別個のヒンジを示している。幾つかのアデノウイルス血清型ファイバーからのタンパク質配列の分析により、N末端尾部からの第三のベータリピートでのシャフトの反復する配列中の崩壊する位置が示され、これはEMによって示されるように、シャフト中のヒンジの1つと強く相関する。ファイバー中のヒンジは、ノブが、ウイルスカプシドと比較して種々の配向を採用することを可能にし、これによりノブ上の受容体結合部位の正確な提示を必要とする受容体関与に対する立体的な障害が避けられ得る。したがって、例えば、サブグループD Adsの強固なファイバーは、ウイルス結合に関する可動性受容体又は事前に配置されるものを必要とする、というのも、それらはそれら自体で屈曲できないからである。(Nicklin et al Molecular Therapy 2005 12:384-393)
【００９４】
異なるAd血清型に対する特異的な細胞受容体の同定及びどのようにしてそれらが組織向性に寄与するかについての知識は、ファイバーシュードタイピング技術の使用によって達成されている。幾つかのサブグループのAdsが一次受容体としてCARを使用するにもかかわらず、多くのAdsが交代性一次受容体を使用することが明確になり、インビトロ及びインビボで大いに異なる向性がもたらされる。これらの血清型のファイバーは、ファイバーノブ内の正味の電荷における差と共に、それらの一次及び三次構造、例えば、ファイバーシャフト強剛性、ファイバーシャフトの長さ、及びCAR結合部位の欠乏及び/又は推定上のHSPG結合モチーフにおいて明確な差を示す。したがって、Ad5粒子を交代性ファイバーシャフト及びノブでシュードタイピングすることにより、重要な細胞結合ドメインを除去する機会が提供され、加えて、Ad5で達成されるものと比較して、規定の細胞タイプへの、より効率的な(及び潜在的に、より細胞選択的な)導入遺伝子送達を可能にし得る。使用されるファイバーが、ベクターの投与の成功に有利に働く状況である、ヒト又は実験モデルにおけるより低い血清有病率を有するAds由来である場合に、ファイバーをシュードタイピングしたAd粒子の中和も減少させ得る(Nicklin et al Molecular Therapy (2005) 12:384-393)。さらに、完全長ファイバー並びに単離されたファイバーノブ領域は、樹状細胞成熟を誘導する能力がある(しかし、ヘキソン又はペントン単独は能力がない)、また強力なCD8+T細胞応答の誘導に関連する(Molinier-Frenkel et al. J. Biol. Chem. (2003) 278:37175-37182)。まとめると、アデノウイルスファイバーは、少なくとも受容体結合及びアデノウイルスベクターの免疫原性において重要な役割を果たす。
【００９５】
グループCサルアデノウイルスのファイバータンパク質の間の差の例示は、図1に提供されるアラインメントである。これらのアデノウイルスのファイバー配列が、長いファイバー、例えば、ChAd155、又は短いファイバー、例えば、ChAd3を有することについて広くグループ分けできることが著しい特性である。この長さの差は、長いファイバーと比較して、短いファイバーにおける約321位での36アミノ酸欠失に起因する。加えて、短いファイバーと長いファイバーのサブグループの間で異なる幾つかのアミノ酸置換が存在するが、各サブグループ内では一貫性がある。これらの差の正確な機能はまだ解明されていないが、ファイバーの機能及び免疫原性から判断して、それらは重要である可能性が高い。ウイルス向性の決定因子の1つが、ファイバーシャフトの長さであることが示されている。より短いシャフトを有するAd5が、CAR受容体へのより低い効率の結合及びより低い感染力を有することが実証されている(Ambriovic-Ristov A. et al.: Virology. (2003) 312(2):425-33)。この損傷は、細胞受容体への効率的な付着の低下をもたらす、より短いファイバーの強剛性の増加の結果であることが推測されている(Wu、E et al.: J Virol. (2003) 77(13): 7225-7235)。これらの研究は、より短いシャフトを有するファイバーを保持する、以前に記載されたChAd3及びPanAd3と比較して、より長く且つより可動性のファイバーを保持するChAd155の改善された特性を説明し得る。
【００９６】
本発明の一態様において、チンパンジーアデノウイルスChAd155の単離されたファイバー、ペントン及びヘキソンカプシドポリペプチド並びにチンパンジーアデノウイルスChAd155のファイバー、ペントン及びヘキソンカプシドポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００９７】
三種全てのカプシドタンパク質は、低い血清有病率に寄与することが予想され、したがって、既存の中和抗体に対するアデノウイルスの親和性を抑制するため、例えば、減少した血清有病率の組換えアデノウイルスを製造するため、互いに独立して又は組み合わせて使用することができる。そのような組換えアデノウイルスは、少なくともChAd155由来のファイバータンパク質を有する異なる血清型由来のカプシドタンパク質を有する、キメラアデノウイルスであり得る。
【００９８】
ChAd155ファイバーポリペプチド配列は、配列番号1に提供される。
ChAd155ペントンポリペプチド配列は、配列番号3に提供される。
ChAd155ヘキソンポリペプチド配列は、配列番号5に提供される。
【００９９】
組換えアデノウイルス又はChAd155ファイバーのポリペプチド配列若しくはその機能的な誘導体を含む組成物
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１００】
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体である、ポリヌクレオチドを含む。適切には、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一、例えば、少なくとも85.0%同一、例えば、少なくとも90%同一、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.2%同一、例えば、少なくとも99.4%同一、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号1と比較して、130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１０１】
適切には、本発明による組換えアデノウイルス又は組成物は:
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
及び/又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をさらに含む。
【０１０２】
適切には、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、99.7%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号3と比較して、300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１０３】
適切には、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、99.7%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号5と比較して、500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１０４】
組換えアデノウイルス又はChAd155ペントンのポリペプチド配列を含む組成物
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１０５】
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は:
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
及び/又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をさらに含む。
【０１０６】
適切には、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%同一、例えば、少なくとも70.0%同一、例えば、少なくとも80.0%同一、例えば、少なくとも85.0%同一、例えば、少なくとも87.0%同一、例えば、少なくとも89.0%同一、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号1と比較して、130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１０７】
適切には、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも95.0%、例えば、少なくとも97.0%、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号5と比較して、500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１０８】
組換えアデノウイルス又はChAd155ファイバーをコードするポリヌクレオチド若しくはその機能的な誘導体を含む組成物
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。適切には、ポリヌクレオチドは、配列番号2による配列を有する。
【０１０９】
或いは、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的な誘導体が、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチドを含む。適切には、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一、例えば、少なくとも85.0%同一、例えば、少なくとも90%同一、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%同一、例えば、少なくとも99%同一、例えば、少なくとも99.4%同一、例えば、少なくとも99.6%同一、例えば、少なくとも99.8%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号1と比較して、130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１１０】
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は:
(a)配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも50.0%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体、
及び/又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的な誘導体が、全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド
をさらに含む。
【０１１１】
適切には、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、少なくとも99.6%、例えば、少なくとも99.8%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号3と比較して、300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１１２】
適切には、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも95.0%、例えば、少なくとも97.0%、例えば、少なくとも98.0%、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、99.7%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号5と比較して、500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１１３】
組換えアデノウイルス又はChAd155ペントンをコードするポリヌクレオチドを含む組成物
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は、配列番号3によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。適切には、ポリヌクレオチドは、配列番号4による配列を有する。
【０１１４】
適切には、本発明の組換えアデノウイルス又は組成物は:
(a)配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体
及び/又は
(a)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(b)配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的な誘導体が、全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド
をさらに含む。
【０１１５】
適切には、配列番号1によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%同一、例えば、少なくとも70.0%同一、例えば、少なくとも80.0%同一、例えば、少なくとも85.0%同一、例えば、少なくとも87.0%同一、例えば、少なくとも89.0%同一、例えば、少なくとも91.0%同一、例えば、少なくとも93.0%同一、例えば、少なくとも95.0%同一、例えば、少なくとも97.0%同一、例えば、少なくとも98.0%同一、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、99.7%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号1と比較して、130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１１６】
適切には、配列番号5によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的な誘導体は、その全体長にわたって配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60.0%、例えば、少なくとも70.0%、例えば、少なくとも80.0%、例えば、少なくとも85.0%、例えば、少なくとも90.0%、例えば、少なくとも95.0%、例えば、少なくとも97.0%、例えば、少なくとも98.0%、例えば、少なくとも99.0%、例えば、少なくとも99.2%、例えば、少なくとも99.4%、例えば、99.5%同一、例えば、少なくとも99.6%、例えば、99.7%同一、例えば、少なくとも99.8%同一、例えば、99.9%同一であるアミノ酸配列を有する。或いは、機能的な誘導体は、配列番号5と比較して、500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
【０１１７】
ChAd155バックボーン
本出願は、野生型、未改変ChAd155(配列番号10)及びChAd155の改変されたバックボーン構築物のものを含む、チンパンジーアデノウイルスChAd155の単離されたポリヌクレオチド配列を記載する。これらの改変されたバックボーン構築物は、ChAd155#1434(配列番号7)、ChAd155#1390(配列番号8)及びChAd155#1375(配列番号9)を含む。ChAd155バックボーンは、導入遺伝子の送達のための、組換え複製可能又は複製不能アデノウイルスの構築において使用され得る。
【０１１８】
ChAd155野生型配列(配列番号10)のアノテーションは、以下に提供される。
2018521666.tif 000002
2018521666.tif 000003
2018521666.tif 000004
2018521666.tif 000005
2018521666.tif 000006
2018521666.tif 000007
2018521666.tif 000008
【０１１９】
定義
組換えは、ポリヌクレオチドが、少なくとも1つのクローニング、制限又はライゲーションステップ、又は天然に見出されるポリヌクレオチドとは別個であるポリヌクレオチドをもたらす他の手順の産物であることを意味する。組換えアデノウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むアデノウイルスである。
【０１２０】
典型的には、「異種性」は、比較される実体の残りのもの由来の遺伝子型的に別個の実体に由来することを意味する。異種性核酸配列は、アデノウイルスベクターの天然で生じる核酸配列から単離されていない、これに由来しない、又はこれに基づかない任意の核酸配列を指す。「天然で生じる」は、天然に見出され、合成で調製されない又は改変されない配列を意味する。供給源から単離されるが、適切には、供給源遺伝子の正常な機能を破壊しないように、(例えば、欠失、置換(変異)、挿入、又は他の改変により)改変される場合に、配列は供給源「に由来する」。
【０１２１】
ポリペプチドの「機能的な誘導体」は、例えば、ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が、欠失、挿入、改変及び/又は置換され得る、ポリペプチドの改変されたバージョンを適切に指す。未改変アデノウイルスカプシドタンパク質の誘導体は、例えば、以下の場合に、機能的であると考えられる:
(a)未改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、自身のカプシド内に実質的に同じ又はより低い血清有病率を保持する誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルス及び/又は
(b)未改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、自身のカプシド内に実質的に同じ又はより高い宿主細胞感染力を保持する誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルス及び/又は
(c)未改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、自身のカプシド内に実質的に同じ又はより高い免疫原性を保持する誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルス及び/又は
(d)未改変カプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、自身のカプシド内に実質的に同じ又はより高いレベルの導入遺伝子生産性を保持する誘導体カプシドタンパク質を含むアデノウイルス。
【０１２２】
上記特性(a)〜(d)は、以下の実施例セクションに記載される方法を用いて適切に測定され得る。
【０１２３】
適切には、組換えアデノウイルスは、ヒト集団において低い血清有病率を有する。「低い血清有病率」は、ヒトアデノウイルス5(Ad5)と比較して、低い既存の中和抗体レベルを有することを意味し得る。同様に又は代替的に、「低い血清有病率」は、約20%血清有病率未満、約15%血清有病率未満、約10%血清有病率未満、約5%血清有病率未満、約4%血清有病率未満、約3%血清有病率未満、約2%血清有病率未満、約1%血清有病率未満又は検出可能な血清有病率なしを意味し得る。血清有病率は、Aste-Amezaga et al.、Hum. Gene Ther. (2004) 15(3):293-304に記載されるような方法を用いて、臨床的に関連性のある中和力価(50%中和力価>200と規定される)を有する個体のパーセンテージとして測定することができる。
【０１２４】
ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質という用語は、本明細書中で互換的に使用される。
【０１２５】
「サル」という用語は、典型的に、非ヒト霊長類、例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿及びギボンを包含することを意味する。特に、サルは、非ヒト類人猿、例えば、チンパンジー(Pan troglodyte)、ボノボ(Pan paniscus)及びゴリラ(ゴリラ属)を指してもよい。非類人猿のサルは、アカゲザル(Macaca mulatta)を含み得る。
【０１２６】
アデノウイルス配列比較
2つの緊密に関連したポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を比較する目的のため、第一配列と第二の配列の間の「%同一性」は、標準設定を用いるアラインメントプログラム、例えば、BLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govで利用可能、最終アクセス2015年3月9日)を用いて計算し得る。%同一性は、同一残基を参照配列中の残基の数で除し、100を乗じた数である。上記及び請求項を参照した%同一性数は、この方法により計算されるパーセンテージである。%同一性の代わりの定義は、同一残基を整列した残基の数で除し、100を乗じた数である。代替法は、アラインメント中のギャップ、例えば、他の配列と比較したある配列中の欠失が、スコアリングパラメータにおいてギャップスコア又はギャップコストにおいて計算されるギャップ法を用いることを含む。さらなる情報に関しては、ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf、(最終アクセス2015年3月9日)で利用可能なBLAST(登録商標)ファクトシートを参照されたい。
【０１２７】
コードするポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能を保存する配列は、より緊密に同一である可能性が高い。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、それらがそれらの全体長に対して100%配列同一性を共有する場合に、他のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列と同じ又は同一であるといえる。
【０１２８】
配列の間の「差」は、第一配列と比較して、第二の配列の位置において単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す。2つのポリペプチド配列は、1つ以上のこのようなアミノ酸差を含有することができる。第一配列と比較して、別のやり方で同一(100%配列同一性)である第二の配列における挿入、欠失  又は置換は、配列同一性パーセントの低下をもたらす。例えば、同一配列が9アミノ酸残基長である場合に、第二の配列における1つの置換が88.9%の配列同一性をもたらす。同一配列が17アミノ酸残基長である場合に、第二の配列における2つの置換が88.2%の配列同一性をもたらす。同一配列が7アミノ酸残基長である場合に、第二の配列における3つの置換が57.1%の配列同一性をもたらす。第一及び第二のポリペプチド配列が9アミノ酸残基長であり、6つの同一残基を共有する場合に、第一及び第二のポリペプチド配列は66%超の同一性を共有する(第一及び第二のポリペプチド配列は66.7%同一性を共有する)。第一及び第二のポリペプチド配列が17アミノ酸残基長であり、16の同一残基を共有する場合に、第一及び第二のポリペプチド配列は94%超の同一性を共有する(第一及び第二のポリペプチド配列は94.1%同一性を共有する)。第一及び第二のポリペプチド配列が7アミノ酸残基長であり、3つの同一残基を共有する場合に、第一及び第二のポリペプチド配列は42%超の同一性を共有する(第一及び第二のポリペプチド配列は42.9%同一性を共有する)。
【０１２９】
或いは、第一の参照ポリペプチド配列と第二の比較ポリペプチド配列を比較する目的のため、第一の配列に施して第二の配列を産生する、幾つかの付加、置換及び/又は欠失の数が確認されてもよい。付加は、第一のポリペプチドの配列への1つのアミノ酸残基の付加である(第一のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む)。置換は、第一のポリペプチドの配列中の1つのアミノ酸残基の1つの異なるアミノ酸残基での置換である。欠失は、第一のポリペプチドの配列からの1つのアミノ酸残基の欠失である(第一のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む)。
【０１３０】
第一の参照ポリヌクレオチド配列と第二の比較ポリヌクレオチド配列を比較する目的のため、第一の配列に施して第二の配列を産生する、幾つかの付加、置換及び/又は欠失の数が確認されてもよい。付加は、第一のポリヌクレオチドの配列への1つのヌクレオチド残基の付加である(第一のポリヌクレオチドのいずれかの末端での付加を含む)。置換は、第一のポリヌクレオチドの配列中の1つのヌクレオチド残基の1つの異なるポリヌクレオチド残基での置換である。欠失は、第一のポリヌクレオチドの配列からの1つのヌクレオチド残基の欠失である(第一のポリヌクレオチドのいずれかの末端での欠失を含む)。
【０１３１】
適切には、本発明の配列における置換は、保存的置換であってもよい。保存的置換は、置換されるアミノ酸に対して類似する化学的な性質を有する別のアミノ酸でのアミノ酸の置換を含む(例えば、Stryer et al、Biochemistry、5th Edition 2002、pages 44-49を参照されたい)。好ましくは、保存された置換は:
(i)塩基性アミノ酸の別の異なる塩基性アミノ酸での置換、(ii)酸性アミノ酸の別の異なる酸性アミノ酸での置換、(iii)芳香族アミノ酸の別の異なる芳香族アミノ酸での置換、(iv)非極性脂肪族アミノ酸の別の異なる非極性脂肪族アミノ酸での置換、及び(v)極性無電荷アミノ酸の別の異なる極性無電荷アミノ酸での置換からなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、好ましくはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択される。極性無電荷アミノ酸は、好ましくはセリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択される。保存されたアミノ酸置換とは対照的に、非保存のアミノ酸置換は、上記概説される保存的置換(i)から(v)に該当しない任意のアミノ酸での1つのアミノ酸の交換である。
【０１３２】
組換えアデノウイルス
ChAd155配列は、治療薬として並びに種々のベクターシステム、組換えアデノウイルス及び宿主細胞の構築において有用である。適切には、「ベクター」という用語は、細胞(例えば、宿主細胞)に導入される場合、野生型配列と比較して、実質的に変更されており及び/又は異種性配列、すなわち、異なる供給源から得られる核酸を組み込み(「挿入」とも呼ばれる)、及び挿入されたポリヌクレオチド配列を複製する及び/又は発現する核酸(例えば、欠失及び/又は不活化されている遺伝子又は機能的な領域)を指す。例えば、挿入は、本明細書において記載されるChAd155配列の全て又は一部であってもよい。加えて又は代替的に、ChAd155ベクターは、本明細書において記載される、ウイルス遺伝子、例えば、E1又は他のウイルス遺伝子又は機能的な領域の1つ以上の欠失又は不活化を含むChAd155アデノウイルスであってもよい。そのようなChAd155は、異種性配列を含んでもよく又は含まなくてもよく、「バックボーン」としばしばと呼ばれ、現状のままで使用されてもよく又はベクターに対する追加の改変のための出発点として使用されてもよい。
【０１３３】
ベクターは、ネイキッドDNA、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージベクター、例えば、ラムダベクター、人工染色体、例えば、BAC(細菌性人工染色体)、又はエピソームを含む、任意の適切な核酸分子であってもよい。或いは、ベクターは、無細胞インビトロ転写又は発現、例えば、T7-適合性システムのための、転写及び/又は発現単位であってもよい。ベクターは、単独で又は他のアデノウイルス配列若しくは断片と組み合わせて、又は非アデノウイルス配列由来の因子と組み合わせて使用してもよい。ChAd155配列は、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、又はワクチンベクターにおいても有用である。したがって、ChAd155配列を含有する遺伝子送達ベクター及び宿主細胞が、さらに提供される。
【０１３４】
「複製可能」アデノウイルスという用語は、細胞中に含まれる任意の組換えヘルパータンパク質の不在下で宿主細胞を複製することができるアデノウイルスを指す。適切には、「複製可能」アデノウイルスは、以下のインタクト又は機能的な必須な早期遺伝子:E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4を含む。特定の動物から単離された野生型アデノウイルスは、その動物において複製可能である。
【０１３５】
「複製不能」又は「複製欠損性」アデノウイルスという用語は、少なくとも機能的な欠失(又は「機能喪失」変異)、すなわち、全体的に遺伝子除去することなく遺伝子の機能を損なう欠失又は変異、例えば、人工的な中止コドンの導入、活性化部位又は相互作用ドメインの欠失又は変異、遺伝子の制御配列の変異又は欠失など、或いはウイルス複製に必須である遺伝子産物をコードする遺伝子、例えば、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4(例えば、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及び/又はE4 ORF1)から選択される1つ以上のアデノウイルス遺伝子の完全な除去を含むよう操作されているとの理由で複製の能力がないアデノウイルスを指す。特に適切には、E1並びに場合によりE3及び/又はE4が欠失される。欠失される場合、上述の欠失遺伝子領域は、適切には、別の配列に関して%同一性を決定するときにアラインメントにおいて考慮されない。
【０１３６】
本発明は、治療又はワクチン目的でマイコバクテリア抗原を細胞に送達する組換えアデノウイルスを提供する。ベクターは、ネイキッドDNA、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド、又はウイルスを含む、任意の遺伝因子を含み得る。そのようなベクターは、本明細書において開示されるようなChAd155のDNA及びミニ遺伝子を含有する。「ミニ遺伝子」(又は「発現カセット」)は、宿主細胞における遺伝子産物の翻訳、転写及び/又は発現を駆動するため必要な選択された異種性遺伝子(導入遺伝子)及び他の調節因子の組合せを意味する。
【０１３７】
典型的には、ChAd155-由来アデノウイルスベクターは、ミニ遺伝子が、選択されたアデノウイルス遺伝子に対してネイティブな領域中に他のアデノウイルス配列を含有する核酸分子中に位置するように設計される。ミニ遺伝子は、所望であれば、その領域の機能を破壊するため、現存する遺伝子領域に挿入され得る。或いは、ミニ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失させたアデノウイルス遺伝子の部位に挿入され得る。例えば、ミニ遺伝子は、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4からなる群から選択されるゲノム領域の少なくとも1つの遺伝子を非機能的とする変異、挿入又は欠失の部位に位置し得る。「非機能的とする」という用語は、十分な量の遺伝子領域が、除去され又はさもなければ破壊されて、遺伝子領域が遺伝子発現の機能的な産物を産生する能力がもはやないことを意味する。所望であれば、全遺伝子領域が除去され得る(また適切には、ミニ遺伝子で置き換えられる)。
【０１３８】
例えば、組換えウイルスの生成に有用なベクターを産生するため、ベクターは、ミニ遺伝子及びアデノウイルスゲノムの5'末端又はアデノウイルスゲノムの3'末端のいずれか、又はアデノウイルスゲノムの5'末端及び3'末端の両方を含有し得る。アデノウイルスゲノムの5'末端は、パッケージング及び複製に必要な5'シス因子、すなわち、5'ITR配列(複製起点として機能する)及びネイティブ5'パッケージングエンハンサードメイン(直鎖状Adゲノム及びE1プロモーターに対するエンハンサー因子をパッケージングするため必要な配列を含有する)を含有する。アデノウイルスゲノムの3'末端は、パッケージング及びキャプシド形成に必要な3'シス因子(ITRを含む)を含む。適切には、組換えアデノウイルスは両方の5'及び3'アデノウイルスのシス因子を含有し、ミニ遺伝子(適切には導入遺伝子を含有)は5'と3'アデノウイルス配列の間に位置する。ChAd155-ベースアデノウイルスベクターは、追加のアデノウイルス配列も含有し得る。
【０１３９】
適切には、ChAd155-ベースベクターは、アデノウイルスChAd155ゲノムに由来する1つ以上のアデノウイルス因子を含有する。一実施形態において、ベクターは、ChAd155からのアデノウイルスITR及び同じアデノウイルス血清型からの追加のアデノウイルス配列を含有する。別の実施形態において、ベクターは、ITRを提供するものとは異なるアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルス配列を含有する。
【０１４０】
本明細書において規定されるように、シュードタイピングしたアデノウイルスは、アデノウイルスのカプシドタンパク質が、ITRを提供するアデノウイルスとは異なるアデノウイルスに由来するアデノウイルスを指す。
【０１４１】
さらに、キメラ又はハイブリッドアデノウイルスは、当業者に公知の技術(例えば、US7,291,498)を用いて本明細書において記載されるアデノウイルスを用いて構築され得る。
【０１４２】
ITR及び任意の他のアデノウイルス配列は、多くの供給源から得られ得るベクター中に存在する。種々のアデノウイルス株は、American Type Culture Collection(Manassas、Virginia)から利用可能である、又は種々の市販及び施設の供給源からの依頼によって利用可能である。さらに、多くのそのような株の配列は、例えば、PubMed及びGenBankを含む種々のデータベースから利用可能である。他のチンパンジーから又はヒトアデノウイルスから調製された相同的なアデノウイルスベクターは、公開された文献(例えば、US5,240,846)に記載される。幾つかのアデノウイルスタイプのDNA配列は、タイプAd5(GenBank受託番号M73370)を含むGenBankから利用可能である。アデノウイルス配列は、例えば、血清型2、3、4、7、12及び40、並びにさらに任意の現在同定されたヒトタイプを含めた、任意の公知のアデノウイルス血清型から得られ得る。同様に、非ヒト動物(例えば、サル)に感染することが知られているアデノウイルスも、本発明のベクター構築物に採用され得る(例えば、US6,083,716)。ウイルス配列、ヘルパーウイルス(必要な場合)、及び組換えウイルス粒子、及び他のベクター成分及び本明細書において記載されるベクターの構築に採用される配列は、以下に記載されるように得られ得る。
【０１４３】
配列、ベクター及びアデノウイルス産生
配列は、組換え産生、化学合成、又は他の合成手段を含む、任意の適切な手段によって産生され得る。適切な生産技術は、当業者に周知である。或いは、ペプチドは、周知の固相ペプチド合成法によっても合成することができる。
【０１４４】
アデノウイルスプラスミド(又は他のベクター)は、アデノウイルスベクターを産生するため、使用され得る。一実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製不能なアデノウイルス粒子である。一実施形態において、アデノウイルス粒子は、E1A及び/又はE1B遺伝子における欠失によって複製不能とされる。或いは、アデノウイルスは、場合によりE1A及び/又はE1B遺伝子を保持する間に、別の手段によって複製不能とされる。同様に、幾つかの実施形態において、ベクターへの免疫応答の低下は、E2B及び/又はDNAポリメラーゼ遺伝子における欠失によって達成され得る。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムへの他の変異、例えば、温度感受性変異又は他の遺伝子における欠失も含有することができる。他の実施形態において、アデノウイルスベクターにおいてインタクトなE1A及び/又はE1B領域を保持することが望ましい。そのようなインタクトなE1領域は、アデノウイルスゲノム中のそのネイティブな位置に位置又はネイティブなアデノウイルスゲノムにおける欠失の部位(例えば、E3領域中)に配置され得る。
【０１４５】
哺乳動物(例えば、ヒト)細胞への遺伝子の送達に関するアデノウイルスベクターの構築において、ある範囲の改変されたアデノウイルス核酸配列をベクターにおいて採用することができる。例えば、アデノウイルス遅延性初期遺伝子E3の全て又は一部は、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から消失されてもよい。E3の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び産生と無関係であると考えられる。アデノウイルスベクターはまた、E4遺伝子の少なくともORF6領域、より望ましくはこの領域の機能における重複性が理由で、全E4領域の欠失を有するように構築され得る。本発明のさらに別のベクターは、遅延性初期遺伝子E2Aにおける欠失を含有する。欠失は、アデノウイルスゲノムの任意の遅発型遺伝子L1からL5においてなされ得る。同様に、中期遺伝子IX及びIVa2は、幾つかの目的について有用であり得る。他の欠失は、他の構造的又は非構造的アデノウイルス遺伝子においてなされ得る。上記に論じられた欠失は個々に使用されてもよい、すなわち、本明細書において記載されるような使用のためのアデノウイルス配列は、単一領域のみにおける欠失を含有し得る。或いは、それらの生物活性を破壊するため有効である全遺伝子又はその一部の欠失は、任意の組合せにおいて使用され得る。例えば、1つの例示的なベクターにおいて、アデノウイルス配列は、E3などの欠失の存在下又は不在下で、E1遺伝子及びE4遺伝子の、又はE1、E2A及びE3遺伝子の、又はE1及びE3遺伝子の、又はE1、E2A及びE4遺伝子の欠失を有し得る。任意の1つ以上のE遺伝子は、異なる株のアデノウイルスから供給される、E遺伝子(又は1つ以上のE遺伝子オープンリーディングフレーム)で適切に置き換えられ得る。特に適切には、ChAd155 E1及びE3遺伝子は欠失され、ChAd155E4遺伝子はE4Ad5orf6で置き換えられる。上記に論じられたように、そのような欠失及び/又は置換は、所望の結果を達成するため、他の変異、例えば、温度感受性変異との組合せにおいて使用され得る。
【０１４６】
1つ以上の必須なアデノウイルス配列(例えば、E1A、E1B、E2A、E2B、E4 ORF6、L1、L2、L3、L4及びL5)を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルス感染力及びアデノウイルス粒子の繁殖に必要とされる、欠けているアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養され得る。これらのヘルパー機能は、1つ以上のヘルパー構築物(例えば、プラスミド又はウイルス)又はパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスベクターを培養することによって提供され得る。
【０１４７】
複製不能ベクターの補完
上に記載される任意の遺伝子を欠失させた組換えアデノウイルスを生成するため、ウイルスの複製及び感染力に必須である場合には、欠失させた遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルス又は細胞株、すなわち、補完又はパッケージング細胞株によって、組換えウイルスが供給されなければならない。
【０１４８】
ヘルパーウイルス
ミニ遺伝子を保有するため採用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子内容物に依存して、ヘルパーアデノウイルス又は非複製ウイルス断片は、ミニ遺伝子を含有する感染性組換えウイルス粒子を産生するのに必要な十分なアデノウイルス遺伝子配列を提供するため使用され得る。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中には存在しない及び/又はベクターがトランスフェクトされたパッケージング細胞株によって発現されない、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一実施形態において、ヘルパーウイルスは、複製欠損性であり、適切には、本明細書において記載される1つ以上の配列に加えて、アデノウイルス遺伝子を含有する。そのようなヘルパーウイルスは、E1発現(及び場合により、加えてE3発現)細胞株との組合せにおいて適切に使用される。
【０１４９】
ヘルパーウイルスは、レポーター遺伝子を場合により含有し得る。幾つかのそのようなレポーター遺伝子は、当技術分野において公知であり並びに本明細書において記載される。アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子とは異なるヘルパーウイルスにおけるレポーター遺伝子の存在により、アデノウイルスベクター及びヘルパーウイルスの両方を独立にモニターすることを可能にする。このレポーターは、精製に際して生じる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能にするため使用される。
【０１５０】
補完細胞株
多くの環境下において、ヒトE1などのウイルスの複製及び感染力に必須である1つ以上の欠けている遺伝子を発現する細胞株は、チンパンジーアデノウイルスベクターをトランス補完するため使用することができる。これは特に有利であり、その理由は、本発明のチンパンジーアデノウイルス配列と現在利用可能なパッケージング細胞中に見出されるヒトアデノウイルス配列の間の多様性に起因して、現行のヒトE1含有細胞の使用により、複製及び産生プロセスの間の複製可能アデノウイルスの生成が予防されるからである。
【０１５１】
或いは、所望であれば、選択された親細胞株における発現のためのプロモーターの転写調節下でChAd155から少なくともE1遺伝子を発現するパッケージング細胞又は細胞株を生成するため、本明細書において提供される配列が使用され得る。誘導性又は構成的なプロモーターは、この目的のため採用され得る。そのようなプロモーターの例は、この文書中の他で詳細に記載される。親細胞は、任意の所望のChAd155遺伝子を発現する新規細胞株の生成に関して選択される。制限なく、そのような親細胞株は、とりわけ、HeLa[ATCC受託番号CCL2]、A549[ATCC受託番号CCL185]、HEK293、KB[CCL17]、Detroit[例えば、Detroit 510、CCL72]及びWI-38[CCL75]細胞であってもよい。これらの細胞株は、American Type Culture Collection(10801 University Boulevard、Manassas、Virginia 20110-2209)から全て利用可能である。
【０１５２】
そのようなE1発現細胞株は、組換えアデノウイルスE1欠失ベクターの生成において有用である。加えて又は或いは、1つ以上のアデノウイルス遺伝子産物、例えば、E1A、E1B、E2A、E3及び/又はEE4を発現する細胞株は、組換えウイルスベクターの生成において使用されるような本質的に同じ手順を用いて構築することができる。そのような細胞株は、それらの産物をコードする必須遺伝子において欠失させたアデノウイルスベクターをトランス補完するため又はヘルパー依存性ウイルス(例えば、アデノ関連ウイルス)のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するため利用することができる。宿主細胞の調製には、選択されたDNA配列の組立などの技術が関与する。
【０１５３】
別の代替において、必須のアデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクター及び/又はヘルパーウイルスによってトランスにおいて提供される。そのような実例において、適切な宿主細胞は、原核生物(例えば、細菌)細胞を含む並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核生物細胞を含む、任意の生物体から選択することができる。
【０１５４】
宿主細胞は、制限なく、細胞、例えば、A549、WEHI、3T3、1011/2、HEK293細胞又はPer.C6(両方が機能的なアデノウイルスE1を発現する)[Fallaux、FJ et al、(1998)、Hum Gene Ther、9:1909-1917]、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及び初代線維芽細胞、肝細胞及びヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターを含む哺乳動物に由来する筋芽細胞を含む、任意の哺乳動物の種の中から選択され得る。
【０１５５】
特に適切な補完細胞株は、Procell92細胞株である。Procell92細胞株は、アデノウイルスE1遺伝子を発現するHEK293細胞に基づき、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーターの制御下のTetリプレッサー及びG418抵抗性遺伝子でトランスフェクトされた(Vitelli et al. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Procell92.Sは懸濁状態における増殖に適合され、アデノウイルスベクター発現毒性タンパク質を産生させるため、有用である(www.okairos.com/e/inners.php?m=00084、最終アクセス2015年4月13日)。
【０１５６】
ウイルス粒子の組立及び細胞株のトランスフェクション
一般に、トランスフェクションによってミニ遺伝子を含むベクターを送達する場合に、ベクターは、約5μgから約100μg DNA、好ましくは約10から約50μg DNAから約1x104個細胞から約1x1013個細胞、好ましくは約105細胞の量で送達される。しかしながら、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞などの因子を考慮に入れて、宿主細胞に対するベクターDNAの相対量は調節され得る。
【０１５７】
ベクターの宿主細胞への導入は、トランスフェクション及び感染を含む、当技術分野において公知である任意の手段によって達成され得る。1つ以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る、エピソームとして安定的に発現され得る、又は一過性に発現され得る。遺伝子産物は全てエピソームに一過性に発現され得る、又は安定的に組み込まれ得る、又は幾つかの遺伝子産物は安定的に発現され得るが、他は一過性に発現される。
【０１５８】
ベクターの宿主細胞への導入はまた、当業者に公知である技術を用いて達成され得る。適切には、標準トランスフェクション技術は、例えば、CaPCトランスフェクション又はエレクトロポレーションを使用する。
【０１５９】
アデノウイルスの選択されたDNA配列(並びに導入遺伝子及び他のベクター因子)の様々な中間プラスミドへの組立並びに組換えウイルス粒子を産生するプラスミド及びベクターの使用は、全て従来技術を用いて達成される。そのような技術は、従来のcDNAのクローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応法、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法を含む。標準トランスフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、CaPC沈殿技術が採用される。採用される他の従来方法は、ウイルスゲノムの相同組換え、寒天オーバーレイ中でのウイルスのプラーク化、シグナル生成の測定の方法等を含む。
【０１６０】
例えば、所望のミニ遺伝子含有ウイルスベクターの構築及び組立後に、ベクターは、ヘルパーウイルスの存在下、インビトロでパッケージング細胞株にトランスフェクトされた。相同組換えはヘルパーとベクター配列の間に生じ、これによりベクター中のアデノウイルス導入遺伝子配列が複製され、ビリオンカプシドに複製されパッケージングされるのを可能とし、組換えウイルスベクター粒子が生じる。生じる組換えアデノウイルスは、選択された導入遺伝子の選択された細胞への転移に有用である。パッケージング細胞株において増殖させた組換えウイルスでのインビボ実験において、本発明のE1欠失組換えアデノウイルスベクターは、非サル哺乳動物、好ましくはヒト細胞に導入遺伝子の転移における有用性を実証する。
【０１６１】
導入遺伝子
導入遺伝子は、目的とするタンパク質をコードする、導入遺伝子を挟むベクター配列に対して異種性である核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞において導入遺伝子の転写、翻訳、及び/又は発現を可能とする様式で調節成分に作動可能に連結される。
【０１６２】
導入遺伝子配列の組成は、生じるベクターが向けられる使用に依存する。例えば、導入遺伝子は、治療導入遺伝子又は免疫原性導入遺伝子であってもよい。或いは、導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを産生する、レポーター配列を含み得る。そのようなレポーター配列は、制限なく、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、例えば、CD2、CD4、CD8、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質、及び当技術分野で周知である他のものを含む膜結合タンパク質(それを対象とする高親和性抗体が存在する、又は従来の手段によって産生することができる)、及びとりわけ赤血球凝集素又はMycからの抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするDNA配列を含む。これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節因子に関連する場合に、酵素、X線撮影、比色、蛍光又は他の分光アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。
【０１６３】
一実施形態において、導入遺伝子は、生物学及び医学に有用である、例えば、治療導入遺伝子又は免疫原性導入遺伝子、例えば、タンパク質、RNA、酵素、又は触媒性RNAである、産物をコードする非マーカー配列である。望ましいRNA分子は、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒性RNA、及びアンチセンスRNAを含む。有用なRNA配列の一例は、治療される動物における標的にする核酸配列の発現を失わせる配列である。
【０１６４】
導入遺伝子は、治療、例えば、ワクチンとして、免疫応答の誘導に関して、及び/又は予防的なワクチン目的のために使用し得る。本明細書で使用する、免疫応答の誘導は、タンパク質に対してT細胞及び/又は体液性免疫応答を誘導するタンパク質の能力を指す。
【０１６５】
調節因子
導入遺伝子に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた又は本発明によって産生されたウイルスで感染された細胞において、その転写、翻訳及び/又は発現を可能とする様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御因子も含む。本明細書で使用する「作動可能に連結された」配列は、目的とする遺伝子に隣接する発現制御配列及び目的とする遺伝子を制御するため、トランスで又はある距離をおいて機能する発現制御配列の両方を含む。
【０１６６】
発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化(ポリA)シグナル、これにはウサギβグロビンポリAが含まれる;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(例えば、Kozakコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;並びに所望される場合、コードされる産物の分泌を増強する配列を含む。他の配列の中でも、キメライントロンが使用され得る。
【０１６７】
幾つかの実施形態において、マーモット肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)(Zuffrey et al. (1999) J Virol; 73(4):2886-9)は、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的なWPREは、配列番号26に提供される。
【０１６８】
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合を可能とし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に近接する、遺伝子の5'非コード領域に配置される。転写の開始において機能するプロモーター内の配列因子は、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例には、細菌、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)からのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。内部の、ネイティブの、構成的な、誘導性の及び/又は組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列は、当技術分野において公知であり、使用され得る。
【０１６９】
構成的なプロモーターの例には、制限なく、TBGプロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター(場合によりエンハンサーを伴う)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(場合によりCMVエンハンサーを伴う、例えば、Boshart et al、Cell、41:521-530 (1985)を参照されたい)、CASIプロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、及びEF1aプロモーター(Invitrogen)が含まれる。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、プロモーターは、CASIプロモーターである(例えば、WO2012/115980を参照されたい)。CASIプロモーターは、CMVエンハンサーの一部、ニワトリベータアクチンプロモーターの一部、及びUBCエンハンサーの一部を含有する、合成プロモーターである。幾つかの実施形態において、CASIプロモーターは、配列番号12に対して少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態において、プロモーターは、配列番号12の核酸配列を含む、又はそれからなる。
【０１７１】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外因性に供給される化合物、環境因子、例えば、温度、又は急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞のみにおいてなどの特定の生理的な状態の存在によって制御することができる。誘導性プロモーター及び誘導性システムは、制限なく、Invitrogen、Clontech及びAriadを含む、種々の市販の供給源から利用可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者によって容易に選択することができる。例えば、誘導性プロモーターは、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン(metallothionine)(MT)プロモーター及びデキサメサゾン(Dex)-誘導性マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーターを含む。他の誘導性システムには、T7ポリメラーゼプロモーターシステム(WO98/10088);エクジソン昆虫プロモーター(No et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:3346-3351 (1996))、テトラサイクリン抑圧システム(Gossen et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:5547-5551 (1992))、テトラサイクリン誘導性システム(Gossen et al、Science、378:1766-1769 (1995)、Harvey et al、Curr. Opin. Chem. Biol、2:512-518 (1998)も参照されたい)が含まれる。他のシステムには、FK506二量体、カストラジオール(castradiol)を用いるVP16又はp65、ジフェノールムリスレロン(diphenol murislerone)、RU486-誘導性システム(Wang et al、Nat. Biotech.、15:239-243 (1997)及びWang et al、Gene Ther.、4:432-441 (1997))及びラパマイシン誘導性システム(Magari et al、J. Clin. Invest.、100:2865-2872 (1997))が含まれる。幾つかの誘導性プロモーターの有効性は、長期にわたり増加する。幾つかのケースにおいて、IRESによってTetRをTetRに連結するなど、複数のリプレッサーをタンデムに挿入することによって、そのようなシステムの有効性を増強することができる。
【０１７２】
別の実施形態において、導入遺伝子に対するネイティブプロモーターが使用される。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブ発現を模倣すべきことが所望される場合に、好適であり得る。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的に又は発生的に、又は組織特異的な様式において、又は特異的な転写刺激への応答において制御されなければならない場合に使用され得る。さらなる一実施形態において、他のネイティブ発現制御因子、例えば、エンハンサー因子、ポリアデニル化部位又はKozakコンセンサス配列はまた、ネイティブ発現を模倣するため使用され得る。
【０１７３】
導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、骨格筋中の発現が所望される場合に、筋肉中で活性なプロモーターが使用されるべきである。これらには、骨格βアクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼ、並びに天然で生じるプロモーターより高い活性を有する、合成筋肉プロモーターをコードする遺伝子からのプロモーターが含まれる(Li et al、Nat. Biotech.、17:241-245 (1999)を参照されたい)。組織特異的なプロモーターの例は、とりわけ、肝臓(アルブミン、Miyatake et al、J. Virol、71:5124-32 (1997);B型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al、Gene Ther.、3:1002-9 (1996);アルファ-フェトプロテイン(AFP)、Arbuthnot et al.、Hum. Gene Ther.、7: 1503-14 (1996))、骨オステオカルシン(Stein et al、Mol. Biol. Rep.、24:185-96 (1997));骨シアロタンパク質(Chen et al.、J. Bone Miner. Res.、11:654-64 (1996))、リンパ球(CD2、Hansal et al、J. Immunol、161:1063-8 (1998);免疫グロブリン重鎖;T細胞受容体鎖)、ニューロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター(Andersen et al、Cell. Mol. Neurobiol、13:503-15 (1993))、神経フィラメント軽鎖遺伝子(Piccioli et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:5611-5 (1991))、及びニューロン特異的vgf遺伝子(Piccioli et al、Neuron、15:373-84 (1995))について公知である。
【０１７４】
場合により、治療上有用な又は免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を保持するベクターは、とりわけ、ジェネテシン、ハイグロマイシン(hygromicin)又はピューリマイシン(purimycin)抵抗性をコードする配列を含み得る、選択可能なマーカー又はレポーター遺伝子も含み得る。そのような選択可能なレポーター又はマーカー遺伝子(好ましくは、ウイルス粒子にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に配置される)は、細菌細胞中のプラスミド、例えば、アンピシリン抵抗性の存在をシグナルするため、使用することができる。ベクターの他の成分には、複製起点が含まれ得る。
【０１７５】
これらのベクターは、本明細書において提供される技術及び配列を当業者に公知の技術と共に用いて生成される。そのような技術は、テキストに記載されるものなどの、従来のcDNAのクローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応法、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法を含む。
【０１７６】
治療及び予防
組換えChAd155ベースベクターは、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでのヒト又は非サル哺乳動物への遺伝子導入に有用である。
【０１７７】
本明細書において記載される組換えアデノウイルスベクターは、インビトロで異種性導入遺伝子によってコードされる産物の産生のための発現ベクターとして使用することができる。例えば、導入遺伝子を含有する組換え複製不能アデノウイルスは、上に記載されるように、補完細胞株にトランスフェクトされ得る。
【０１７８】
ChAd155由来組換えアデノウイルスベクターは、生物が1つ以上のアデノウイルス血清型に対する中和抗体を有する場合でも、インビボ又はエクスビボで選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞に送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルを提供する。一実施形態において、ベクター及び細胞は、エクスビボで混合され、感染された細胞は、従来の方法論を用いて培養され、及び形質導入された細胞は患者に再注入される。これらの技術は、防御免疫を誘導することを含む、治療目的のための及び免疫化目的のための、遺伝子送達に特によく適する。
【０１７９】
免疫原性導入遺伝子
組換えChAd155ベクターはまた、免疫原性組成物に投入され得る。本明細書において記載されるような免疫原性組成物は、哺乳動物、適切にはヒトに送達された後にベクターによって送達される導入遺伝子産物に対する免疫応答、例えば、体液性(例えば、抗体)及び/又は細胞性(例えば、細胞傷害性T細胞)応答を誘導する能力のある、1つ以上の組換えChAd155ベクターを含む組成物である。組換えアデノウイルスは、所望の免疫原をコードする遺伝子を(適切には、任意のその遺伝子欠失において)含んでもよく、したがって、ワクチンにおいて使用され得る。
【０１８０】
そのようなワクチン又は他の免疫原性組成物は、適切な送達ビヒクル中に製剤化され得る。一般に、免疫原性組成物についての用量は、以下の「送達方法及び投薬量」において規定される範囲である。選択された遺伝子の免疫のレベルは、もしあればブースターについて、必要性を決定するためモニターすることができる。血清中の抗体力価の評価後に、任意選択のブースター免疫が所望され得る。
【０１８１】
場合により、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、例えば、アジュバント、安定化剤、pH調整剤、保存剤等を含む、他の成分を含有するように製剤化され得る。適切なアジュバントの例は、以下の「アジュバント」に提供される。そのようなアジュバントは、抗原のみをコードするDNAワクチンでのプライミングに際して発生した免疫応答と比較して、抗原特異的な免疫応答を増強する抗原をコードするプライミングDNAワクチンと共に投与することができる。或いは、そのようなアジュバントは、(以下の「投与レジメン」に記載されるように)本発明のChAd155ベクターが関与する投与レジメンにおいて投与される、ポリペプチド抗原と共に投与することができる。
【０１８２】
組換えアデノウイルスは免疫原量で投与され、その量は、所望の標的細胞をトランスフェクトする投与の経路において有効であり、免疫応答を誘導する選択された遺伝子の十分なレベルの発現を提供する、組換えアデノウイルスの量である。防御免疫が提供される場合、組換えアデノウイルスは、感染及び/又は再発性疾患の予防において有用なワクチン組成物であると考えられる。
【０１８３】
本明細書において記載される組換えベクターは、細胞溶解性T細胞及びベクターによって発現される挿入された異種性の抗原性タンパク質を対象とする抗体の誘導に高度に有効であると予想される。
【０１８４】
アジュバント
本明細書で使用する「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を増強する組成物を指す。そのようなアジュバントの例には、無機アジュバント(例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機アジュバント(例えば、サポニン、例えば、QS21、又はスクアレン)、油性ベースアジュバント(例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント)、サイトカイン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ)粒子性アジュバント(例えば、免疫刺激性複合体(ISCOMS)、リポソーム、又は生分解性ミクロスフェア)、ビロゾーム、細菌性アジュバント(例えば、モノホスホリル脂質A、例えば、3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、又は合成脂質A)、合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えば、ポリアルギニン又はポリリジン)及び非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８５】
1つの適切なアジュバントは、モノホスホリル脂質A(MPL)、特に3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL)である。それは、化学的に4、5、又は6アシル化鎖のいずれかを有する3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質Aの混合物としてしばしば供給される。それはGB2122204Bで教示される方法によって精製及び調製することができ、この参照はジホスホリル脂質A、及びその3-O-脱アシル化バリアントの調製も開示する。他の精製及び合成リポ多糖は、(米国特許第6,005,099号及びEP0729473B1;Hilgers et al.、1986、Int.Arch.Allergy.Immunol.、79(4):392-6;Hilgers et al.、1987、Immunology、60(1):141-6;及びEP0549074B1l)に記載されている。
【０１８６】
サポニンも、適切なアジュバントである(Lacaille-Dubois、M and Wagner H、A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386 (1996)を参照されたい)。例えば、サポニンQuil A(南アメリカ樹木キラヤサポナリアモリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来)、及びその画分は、米国特許第5,057,540号及びKensil、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.、1996、12:1-55;及びEP0362279B1に記載される。Quil Aの精製された画分は免疫刺激剤、例えば、QS21及びQS17としても公知であり、それらの産生の方法は米国特許第5,057,540号及びEP0362279B1に開示される。QS7(Quil-Aの非溶血性画分)も、これらの参照に記載される。QS21の使用は、Kensil et al. (1991、J. Immunology、146: 431-437)にさらに記載される。QS21及びポリソルベート又はシクロデキストリンの組合せも公知である(WO99/10008)。QuilA、例えば、QS21及びQS7の画分を含む粒子性アジュバントシステムは、WO96/33739及びWO96/11711に記載される。
【０１８７】
別のアジュバントは、非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドである(Krieg、Nature 374:546 (1995))。CpGは、DNAに存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフに対する略語である。CpGは、全身性及び粘膜経路の両方によって投与される場合に、アジュバントとして公知である(WO96/02555、EP468520、Davis et al、J.Immunol、1998、160:870-876;McCluskie and Davis、J.Immunol.、1998、161:4463-6)。ワクチンに製剤化される場合に、CpGは、遊離抗原(WO96/02555)と一緒に遊離溶液中に投入され得る、又は抗原(WO98/16247)に共有結合性にコンジュゲートされ得る、又は担体、例えば、水酸化アルミニウムで製剤化され得る(Brazolot-Millan et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA、1998、95:15553-8)。
【０１８８】
上に記載されるものなどのアジュバントは、担体、例えば、リポソーム、水中油エマルジョン剤、及び/又は金属塩(アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムを含む)と一緒に製剤化され得る。例えば、3D-MPLは水酸化アルミニウム(EP0689454)又は水中油エマルジョン剤(WO95/17210)で製剤化され得る;QS21は、コレステロール含有リポソーム(WO96/33739)、水中油エマルジョン剤(WO95/17210)又はアラム(WO98/15287)で製剤化され得る;CpGは、アラム(Brazolot-Millan、上記)で又は他の陽イオン性担体で製剤化され得る。
【０１８９】
アジュバントの組合せは本発明に使用され得、特にモノホスホリル脂質A及びサポニン誘導体の組合せ(例えば、WO94/00153;WO95/17210;WO96/33739;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241を参照されたい)、より一層特にWO94/00153に開示されるようなQS21及び3D-MPLの組合せ、又はWO96/33739において開示されるようなQS21がコレステロール含有リポソーム(DQ)においてクエンチされる組成物である。或いは、CpGプラスサポニンの組合せ、例えば、QS21は、本発明における使用のため適切なアジュバントである。水中油エマルジョンにおけるQS21、3D-MPL&トコフェロールが関与する強力なアジュバント製剤は、WO95/17210に記載され、本発明における使用のための別の製剤である。サポニンアジュバントは、リポソーム中に製剤化され、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと組み合わせられ得る。したがって、適切なアジュバントシステムには、例えば、モノホスホリル脂質A、好ましくは3D-MPLとアルミニウム塩(例えば、WO00/23105に記載されるような)と一緒の組合せが含まれる。さらに例示的なアジュバントには、QS21及び/又はMPL及び/又はCpGが含まれる。QS21は、WO96/33739において開示されるようなコレステロール含有リポソームにおいてクエンチされ得る。
【０１９０】
他の適切なアジュバントには、アルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、例えば、WO9850399又は米国特許第6,303,347号(AGPの調製のための方法も開示される)において開示されるもの、又は米国特許第6,764,840号において開示されるようなAGPの薬学的に許容される塩が含まれる。幾つかのAGPはTLR4アゴニストであり、幾つかはTLR4アンタゴニストである。両方が、アジュバントとして有用と考えられる。
【０１９１】
ワクチン接種に使用される発現システムによって含まれる抗原に対するインバリアント鎖の融合が、アデノウイルスと共に投与される場合に、前記抗原に対する免疫応答を増加させることが見出されている(WO2007/062656、これはUS2011/0293704として公開され、インバリアント鎖配列を開示する目的で参照によって組み込まれる)。したがって、本発明の一実施形態において、免疫原性導入遺伝子は、組換えChAd155ウイルスベクター中のインバリアント鎖と共に同時発現され得る。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明は、免疫調節効果応答を誘導するための又は対象にChAd155  カプシドを送達することによって別の活性剤に対する細胞傷害性T細胞応答を増強する、又はアジュバントするための、ChAd155のカプシドの使用(場合により、インタクトな又は組換えウイルス粒子又は空のカプシドが使用される)を提供する。ChAd155カプシドは、単独で又はそれに対する免疫応答を増強する活性剤との組合せレジメンで送達することができる。有利には、所望の効果は、アデノウイルスで宿主を感染させることなしに達成することができる。
【０１９３】
投与レジメン
一般に、ChAd155組換えアデノウイルスベクターは、治療又は免疫原性分子(例えば、タンパク質)の送達に使用される。両方の適用について、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクターの反復送達が関与するレジメンの使用に特によく適することが容易に理解される。典型的には、そのようなレジメンは、ウイルスカプシドが代替される、一連のウイルスベクターの送達に関与する。ウイルスカプシドは、各々の引き続く投与、又は事前に選択した数の特定の血清型カプシド(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ以上)の投与に関して変化させ得る。したがって、レジメンは、第一のカプシドでの組換えアデノウイルスの送達、第二のカプシドでの組換えアデノウイルスの送達、及び第三のカプシドでの組換えアデノウイルスの送達に関与し得る。本発明のアデノウイルスカプシドを、単独で、互いに組み合わせて、又は他のアデノウイルス(これは好ましくは免疫学的に非交差反応性である)と組み合わせて使用する各種の他のレジメンは、当業者に明らかである。場合により、そのようなレジメンは、本明細書において記載されるような、他の非ヒト霊長類アデノウイルス、ヒトアデノウイルス、又は人工的な配列のカプシドでの組換えアデノウイルスの投与に関与し得る。
【０１９４】
本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の複数のアデノウイルス媒介性送達が所望される治療レジメンに関して、例えば、同じ導入遺伝子の再送達が関与するレジメンにおいて又は他の導入遺伝子の送達が関与する組合せレジメンにおいて特に適する。そのようなレジメンは、ChAd155アデノウイルスベクターの投与、続いて同じ血清型アデノウイルスからのベクターでの再投与が関与する。特に望ましいレジメンは、第一の投与において送達されるベクターのアデノウイルスカプシド配列の供給源が、1つ以上の引き続く投与に使用されるウイルスベクターのアデノウイルスカプシド配列の供給源と異なる、ChAd155アデノウイルスベクターの投与が関与する。例えば、治療レジメンは、ChAd155ベクターの投与及び同じ又は異なる血清型の1つ以上のアデノウイルスベクターでの反復投与が関与する。
【０１９５】
別の例において、治療レジメンは、アデノウイルスベクターの投与、続いて最初に送達されるアデノウイルスベクター中のカプシドの供給源と異なるカプシドを有するChAd155ベクターでの反復投与、及び場合により、前の投与ステップにおけるベクターのアデノウイルスカプシドの供給源と同じ又は好ましくは異なる別のベクターでのさらなる投与が関与する。これらのレジメンは、ChAd155配列を用いて構築されるアデノウイルスベクターの送達に限定されない。むしろ、これらのレジメンは、制限なく、ChAd155ベクターと組み合わせて、他の非ヒト霊長類アデノウイルス配列、又はヒトアデノウイルス配列を含む、他のアデノウイルス配列を容易に使用することができる。
【０１９６】
さらなる例において、治療レジメンは、(i)1つ以上のChAd155アデノウイルスベクター及び(ii)さらなる成分、例えば、非アデノウイルスベクター、非ウイルスベクター、及び/又は各種の他の治療上有用な化合物又は分子、例えば、場合によりアジュバントと共に同時に投与される抗原性タンパク質の同時の(例えば、同時投与)又は経時的な(例えば、プライムブースト)送達のいずれかが関与し得る。同時投与の例には、同側同時投与及び対側同時投与が含まれる(以下の「送達方法及び投薬量」においてさらに記載される)。
【０１９７】
1つ以上のChAd155アデノウイルスベクターを同時の又は特に経時的な送達(例えば、プライムブースト)において使用するための、適切な非アデノウイルスベクターには、1つ以上のポックスウイルスベクターが含まれる。適切には、ポックスウイルスベクターは、脊椎動物ポックスウイルス亜科(chordopoxvirinae)に、より適切にはオルソポックス(orthopox)、パラポックス(parapox)、ヤタポックス(yatapox)、アビポックス(avipox)(適切には、カナリポックス(canarypox)(ALVAC)又は伝染性上皮腫(FPV))及びモルシポックス(molluscipox)からなる群から選択される前記亜科における属に属する。さらにより適切には、ポックスウイルスベクターはオルソポックスに属し、ワクシニアウイルス、NYVAC(ワクシニアのCopenhagen株に由来)、改変されたワクシニア  Ankara(MVA)、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスからなる群から選択される。最も適切には、ポックスウイルスベクターはMVAである。
【０１９８】
適切には、「同時」投与は、同じく進行中の免疫応答を指す。好ましくは、両方の成分は、同じ時間(例えば、DNA及びタンパク質の両方の同時投与)に投与されるが、1つの成分は、数時間内、数分間内(例えば、同じ医療アポイントメント又は医師の訪問時)で投与されるであろう。そのような投与も、同時投与として呼ばれる。幾つかの実施形態において、同時投与は、アデノウイルスベクター、アジュバント及びタンパク質成分の投与を指してもよい。他の実施形態において、同時投与は、アデノウイルスベクター及び別のウイルスベクター、例えば、第二のアデノウイルスベクター又はポックスウイルス、例えば、MVAの投与を指す。他の実施形態において、同時投与は、場合によりアジュバントされる、アデノウイルスベクター及びタンパク質成分の投与を指す。
【０１９９】
プライムブーストレジメンが使用され得る。プライムブーストは、(i)免疫系の初期のプライミング、続いて(ii)一次免疫応答が確立された後の、多くの週又は月での免疫系の二次又はブーストの2つの分離した免疫応答を指す。
【０２００】
そのようなレジメンは、伝統的な抗原、例えば、タンパク質(場合によりアジュバントと共に同時投与される)、又はそのような抗原をコードする配列を保持する組換えウイルス(例えば、WO00/11140)での第二の(ブースター)投与に対して、免疫系をプライミングするため、組換えChAd155ベクターの投与が関与し得る。或いは、免疫レジメンは、抗原をコードするベクター(ウイルス性又はDNAベースのいずれか)に対する免疫応答をブーストする、組換えChAd155ベクターの投与が関与し得る。別の代替において、免疫レジメンは、タンパク質の投与、続いて抗原をコードする組換えChAd155ベクターでのブースターが関与する。一例において、プライムブーストレジメンは、抗原が由来するウイルス、細菌又は他の生物に対する防御免疫応答を提供することができる。別の実施形態において、プライムブーストレジメンは、治療が投与される状態の存在の検出のための従来アッセイを用いて測定することができる治療効果を提供する。
【０２０１】
好ましくは、ブースト組成物は、プライミング組成物を対象に投与後約2から約27週投与される。ブースト組成物の投与は、プライミングワクチンによって投与されるのと同じ抗原又は異なる抗原を含有する。又は送達する能力のある有効量のブースト組成物を用いて達成される。ブースト組成物は、同じウイルス供給源に又は別の供給源に由来する組換えウイルスベクターから構成され得る。或いは、ブースト組成物は、プライミングワクチンにおいてコードされるのと同じ抗原を含有する組成物であってもよいが、タンパク質の形態においてであり、この組成物は、宿主において免疫応答を誘導する。ブースト組成物の主たる要件は、組成物の抗原が、プライミング組成物によってコードされるものと同じ抗原である、又は交差反応性抗原であることである。
【０２０２】
送達方法及び投薬量
ベクターは、薬学的に又は生理的に許容される担体、例えば、等張性食塩水中に懸濁させること又は溶解させることによって投与のため調製され得、等張性塩溶液又は他の製剤は当業者には明らかである。適切な担体は当業者に明白であり、投与の経路に大部分において依存する。本明細書において記載される組成物は、生分解性生体適合性ポリマーを用いる徐放性製剤又はミセル、ゲル及びリポソームを用いるオンサイトによる徐放性製剤において哺乳動物に投与され得る。
【０２０３】
幾つかの実施形態において、本発明の組換えアデノウイルスは、筋肉内注射、腟内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮膚上投与、皮内投与、経鼻投与又は経口投与によって対象に投与される。結核関連において特に目的とするものは、筋肉内注射、皮下注射、皮内投与、経鼻投与又はエアロゾル投与、特に筋肉内注射、経鼻又はエアロゾル投与である。
【０２０４】
治療レジメンに、異なる組成物中に各々製剤化された、1つ以上のChAd155アデノウイルスベクター及びさらなる成分の同時投与が関与する場合、それらは同じ部位に又は同じ部位の近くに同位置に有利に投与される。例えば、成分は、同じ側又は末端(「同側」投与)に対して又は逆側又は末端(「対側」投与)に対して、(例えば、筋肉内、経皮、皮内、皮下から選択される投与経路を介して)投与することができる。
【０２０５】
ウイルスベクターの投薬量は、治療される状態、患者の年齢、体重及び健康などの因子に主として依存するので、患者の間で変動し得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効な成体ヒト又は獣医学的投薬量は、1x105から1x1015ウイルス粒子、例えば、1x108から1x1012(例えば、1x108、2.5x108、5x108、1x109、1.5x109、2.5x109、5x109、1x1010、1.5x1010、2.5x1010、5x1010、1x1011、1.5x1011、2.5x1011、5x1011、1x1012粒子)を一般に含有する。或いは、ウイルスベクターは、典型的には1x105から1x1010プラーク形成単位(PFU)、例えば、1x105 PFU、2.5x105 PFU、5x105 PFU、1x106 PFU、2.5x106 PFU、5x106 PFU,1x107 PFU、2.5x107 PFU、5x107 PFU、1x108 PFU、2.5x108 PFU、5x108 PFU、1x109 PFU、2.5x109 PFU、5x109 PFU、又は1x1010 PFUである用量で投与することができる。投薬量は、動物のサイズ及び投与の経路に依存して変動する。例えば、筋肉内注射のための適切なヒト又は獣医学的投薬量(約80kg動物に対して)は、単一部位に対して、1mL当たり約1x109から約5x1012粒子の範囲である。場合により、複数部位の投与が使用され得る。別の例において、適切なヒト又は獣医学的投薬量は、経口製剤に関して約1x1011から約1x1015粒子の範囲であり得る。
【０２０６】
ウイルスベクターは、定量的PCR分析(Q-PCR)、例えば、HCMVプロモーターを含む発現カセットでベクターゲノムを含有するプラスミドDNAの段階希釈標準曲線として用いてCMVプロモーター領域において設計されるプライマー及びプローブによって定量することができる。試験サンプル中のコピー数は、平行線分析法により決定される。ベクター粒子定量に関する代替法は、分析用HPLC又はA260nmに基づく分光光度法であってもよい。
【０２０７】
免疫学的な有効量の核酸は、適切には1ngと100mgの間であり得る。例えば、適切な量は、1μgから100mgであってもよい。適切な量の特定の核酸(例えば、ベクター)は、当業者によって容易に決定することができる。例示的な有効量の核酸成分は、1ngと100μgの間、例えば、1ngと1μgの間(例えば、100ng〜1μg)、又は1μgと100μgの間、例えば、10ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、500ng、750ng、又は1μgであってもよい。核酸の有効量はまた、1μgから500μg、例えば、1μgと200μgの間、例えば、10と100μgの間、例えば、1μg、2μg、5μg、10μg、20μg、50μg、75μg、100μg、150μg、又は200μgを含むことができる。或いは、例示的な有効量の核酸は、100μgと1mgの間、例えば、100μgから500μg、例えば、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg又は1mgであってもよい。
【０２０８】
一般に、ヒト用量は、0.1mlと2mlの間の容量である。したがって、本明細書において記載される組成物は、個々又は組み合わせた免疫原性成分当たり、例えば、0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5又は2.0mlヒト用量の容量に製剤化されてもよい。
【０２０９】
当業者は、投与の経路及び組換えベクターが採用される治療又はワクチン適用に応じて、これらの用量を調整し得る。導入遺伝子の発現のレベル、又はアジュバントに関して、循環抗体のレベルは、投薬量投与の頻度を決定するため、モニターすることができる。
【０２１０】
1つ以上のプライミング及び/又はブーストステップが使用される場合、このステップは毎時間、毎日、毎週又は毎月、又は毎年投与される単一用量を含み得る。例として、哺乳動物は、担体中に約10μgから約50μgのプラスミドを含有する一回又は二回用量を受け取り得る。送達の量又は部位は、哺乳動物の個性及び状態に基づき適切に選択される。
【０２１１】
選択された導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する免疫応答の治療レベル又はレベルは、もしあればブースターについての必要性を決定するためにモニターされてもよい。血清中のCD8+T細胞応答又は場合により抗体力価の評価後に、任意選択のブースター免疫が所望され得る。場合により、組換えChAd155ベクターは、単一投与又は様々な組合せレジメンにおいて、例えば、他の活性成分が関与する、あるレジメン又は治療のコースでの組合せにおいて又はプライムブーストレジメンにおいて送達され得る。
【０２１２】
本発明は、以下の非限定例の手段によって以下にさらに記載される。
【０２１３】
[実施例]
[実施例1]
ChAd155の単離
野生型チンパンジーアデノウイルスタイプ155(ChAd155)を、アデノウイルスの単離及び特性決定技術を記載する目的のため本明細書に参照によって組み込まれる、Colloca et al. (2012)及びWO2010086189に記載されるような標準手順を用いて、New Iberia Research Center facility(New Iberia Research Center; The University of Louisiana at Lafayette)に収容された健常若齢チンパンジーから単離した。
【０２１４】
[実施例2]
ChAd155ベクター構築
次に、ChAd155ウイルスゲノムを、プラスミドに又はBACベクターにクローニングし、引き続いて改変(図2)して、ChAd155ウイルスゲノムの異なる領域における以下の改変を保持させた:
a)ウイルスゲノムのE1領域(bp449からbp3529)の欠失、
b)ウイルスゲノムのE4領域(bp34731からbp37449)の欠失、
c)ヒトAd5に由来するE4orf6の挿入。
【０２１５】
2.1:E1領域の欠失:BAC/ChAd155ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana#1375の構築
ChAd155ウイルスゲノムを、ChAd155ウイルスDNA及びサブグループC BACシャトル(#1365)で同時形質転換された、大腸菌(E.coli)株BJ5183エレクトロポレーションコンピテント細胞(Stratageneカタログ番号2000154)における相同組換えによってBACベクターにクローニングした。図3の模式図に示されるように、サブグループCシャトルは、pBeloBAC11(GenBank U51113、NEB)に由来するBACベクターであり、これは種Cに属するChAdのクローニングに供される、したがって、種C ChAdウイルスの右及び左端(右及び左ITRを含む)に由来するpIX遺伝子及びDNA断片を含有する。
【０２１６】
種C BACシャトルはまた、左端とpIX遺伝子の間に挿入されたRpsL-Kanaカセットを含有する。加えて、ISceI制限部位によってを挟まれるAmp-LacZ-SacB選択カセットは、ウイルスゲノムのpIX遺伝子と右端の間に存在する。特に、BACシャトルには、以下の特性を含んだ:左ITR:bp27から139、hCMV(tetO)RpsL-Kanaカセット:bp493から3396、pIX遺伝子:bp3508から3972、ISceI制限部位:bp3990及び7481、Amp-LacZ-SacB選択カセット:bp4000から7471、右ITR:bp7805から7917。
【０２１７】
BJ5183細胞を、ISceI制限酵素で消化したChAd155精製ウイルスDNA及びサブグループC BACシャトルベクターでエレクトロポレーションによって同時形質転換し、次にゲルから精製した。pIX遺伝子及び右ITR配列(種C BACシャトル直線化DNAの端に存在する)及びChAd155ウイルスDNAに存在する相同配列の間に生じる相同組換えにより、BACシャトルベクターにChAd155ウイルスゲノムDNAの挿入が導かれる。同時に、ウイルスE1領域を欠失させ、RpsL-Kanaカセットによって置換し、BAC/ChAd155ΔE1/TetO hCMV RpsL-Kana#1375を生成させた。
【０２１８】
2.2:大腸菌BJ5183における相同組換えによるプラスミド構築
2.2.1:E4領域の欠失  -  pChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana(#1434)の構築
ベクターの繁殖を改善するため、ヌクレオチド34731〜37449(ChAd155野生型配列)にわたるE4領域の欠失を、幾つかのステップのクローニング及び大腸菌における相同組換えが関与する戦略を用いてAd5 E4orf6コード配列でネイティブE4領域を置き換えることによってベクターバックボーンに導入した。E4コード領域は完全に欠失させたが、E4ネイティブプロモーター及びポリアデニル化シグナルは保存させた。この目的のため、シャトルベクターを構築して、以下に詳記するように、大腸菌BJ5183における相同組換えによってChAd155ネイティブE4領域を置き換えることによってAd5orf6の挿入を可能にした。
【０２１９】
pARS種C Ad5E4orf6-1の構築
Ad5orf6を含有するDNA断片を、オリゴヌクレオチド5'-ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-3'(配列番号13)及び5'-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3'(配列番号14)でAd5 DNAを鋳型として用いるPCRによって得た。PCR断片を、BglII及びSpeIで消化し、BglII及びSpeIで消化した種C RLD-EGFPシャトルにクローニングして、プラスミドpARS種C Ad5orf6-1を生成した。シャトルに関する詳細は、Colloca et al、Sci. Transl. Med. (2012) 4:115raにおいて見出すことができる。
【０２２０】
pARS種C Ad5E4orf6-2の構築
E4領域を除去するため、ChAd155 wt配列(配列番号10)のbp34586からbp34730にわたる177bp DNA断片を、以下のオリゴヌクレオチド:5'-ATTCAGTGTACAGGCGCGCCAAAGCATGACGCTGTTGATTTGATTC-3'(配列番号15)及び5'-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3'(配列番号16)でプラスミドBAC/ChAd155ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana(#1375)を鋳型として用いるPCRによって増幅した。PCR断片を、BsrGI及びSpeIで消化し、BsrGI及びSpeIで消化したpARS SubGroupC Ad5orf6-1にクローニングして、プラスミドpARS種C Ad5orf6-2(#1490)を生成した。このシャトルプラスミドの模式図は、図4に提供される。特に、シャトルプラスミドは以下の特性を含んだ:左ITR:bp1から113、種C最初の460bp:bp1から460、ChAd155 wt(配列番号10のbp34587からbp34724):bp516から650、Ad5 orf6:bp680及び1561、種C最後の393bp:bp1567から1969、右ITR:bp1857から1969。
【０２２１】
pChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana(#1434)の構築
次に、生じるプラスミドpARS SubGroupC Ad5orf6-2を使用して、ChAd155バックボーン内でAd5orf6でE4領域を置き換えた。この目的のため、プラスミドBAC/ChAd155ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana(#1375)を、PacI/PmeIで消化し、消化したプラスミドpARS SubGroupC Ad5orf6-2 BsrGI/AscIを有するBJ5183細胞に同時形質転換して、pChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana(#1434)プレ-アデノプラスミドを得た。
【０２２２】
2.2.2:RSV発現カセットの挿入  -  pChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RSVの構築
RSVカセットを、HCMVプロモーターとBGH polyA配列の間に現存する相同性を利用することによって大腸菌における相同組換えを介して直線化したプレ-アデノアクセプターベクターにクローニングした。プラスミドpvjTetOhCMV-bghpolyA_RSVを、SfiI及びSpeIで切断して、tetO、RSV及びBGHpolyA配列と共にHCMVプロモーターを含有する4,65Kb断片を切除した。生じるRSV 4,65Kb断片を、HCMV及びBGHpAの制御下で、RpsL-Kana選択カセットを保持するpChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana(#1434)アクセプターベクターに相同組換えによってクローニングした。アクセプタープレ-アデノプラスミドを、制限酵素SnaBIで直線化した。生じる構築物は、pChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMVエンドヌクレアーゼRSVベクター(図5)であった。
【０２２３】
2.3:リコンビニアリング(recombineering)によるBACベクター構築
2.3.1:E4領域の欠失  -  BAC/ChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana#1390の構築
ChAd155wt配列のヌクレオチド34731〜37449にわたるE4領域の欠失を、2つの異なるステップの大腸菌SW102コンピテント細胞におけるリコンビニアリングが関与する戦略を用いてAd5 E4orf6コード配列でこのネイティブE4領域を置き換えることによってベクターバックボーンに導入した。
【０２２４】
第一のステップは、組換え体のポジティブ/ネガティブ選択の目的のため、ChAd155のE4領域において自殺遺伝子SacB、アンピシリン-R遺伝子及びlacZを含む選択カセット(Amp-LacZ-SacB選択カセット)の挿入をもたらした。
【０２２５】
第一のステップ  -  Amp-LacZ-SacB選択カセットでのChAd155ネイティブE4領域の置換
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、以下に提供されるE4フランキング配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって増幅して相同組換えを可能にした:1021-FW E4 Del Step1(5'-TTAATAGACACAGTAGCTTAATAGACCCAGTAGTGCAAAGCCCCATTCTAGCTTATAACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3')(配列番号17)及び1022-RW E4 Del Step1(5'-ATATATACTCTCTCGGCACTTGGCCTTTTACACTGCGAAGTGTTGGTGCTGGTGCTGCGTTGAGAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3')(配列番号18)。
【０２２６】
PCR産物を使用して、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155(DE1) tetO hCMV - RpsLKana#1375を含有する大腸菌SW102コンピテント細胞を形質転換した。SW102細胞の形質転換により、ラムダ(λ)Red-媒介性相同組換えを介してChAd155のE4領域における選択カセットの挿入を可能にして、BAC/ChAd155(DE1) TetOhCMV-RpsL Kana#1379(ChAd155ネイティブE4領域を置換することによるAmp-LacZ-SacBカセットを含む)を得た。
【０２２７】
第二のステップ  -  Ad5E4orf6領域でのAmp-lacZ-SacB選択カセットの置換
生じるプラスミドBAC/ChAd155(DE1) TetOhCMV-RpsL Kana#1379(ChAd155 E4領域の代わりにAmp-LacZ-SacBカセットを伴う)を、次に操作して、ChAd155バックボーン内でAmp-lacZ-SacB選択カセットをAd5orf6で置き換えた。この目的のため、Ad5orf6領域を含有するDNA断片を、オリゴヌクレオチド1025-FW E4 Del Step2 (5'-TTAATAGACACAGTAGCTTAATA-3')(配列番号19)及び1026-RW E4 Del Step2(5'-GGAAGGGAGTGTCTAGTGTT-3')(配列番号20)を用いるPCRによって得た。生じるDNA断片を、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155(DE1) TetOhCMV-RpsL Kana)#1379を含有する大腸菌SW102コンピテント細胞に導入し、ネイティブChAd155 E4領域を置換するAd5orf6を含有する、最終的なプラスミドBAC/ChAd155(ΔE1、E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV-RpsL Kana#1390をもたらした。
【０２２８】
2.3.2:RSV発現カセットの挿入:BAC/ChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetOhCMV RSV#1393の構築
RSV導入遺伝子を、RpsL-Kana選択カセットを置換することによってBAC/ChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetOhCMV RSV#1393ベクターにクローニングした。構築戦略は、大腸菌SW102コンピテント細胞におけるリコンビニアリングの2つの異なるステップに基づいていた。
【０２２９】
第一のステップ  -  Amp-LacZ-SacB選択カセットでのRpsL-Kanaカセットの置換
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、オリゴヌクレオチド91-SubMonte FW(5'-CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC-3')(配列番号21)及び890-BghPolyA RW(5'-CAGCATGCCTGCTATTGTC-3')(配列番号22)を用いるPCRによってプラスミドBAC/ChAd155 (DE1) TetO hCMV Amp-LacZ-SacB#1342から得た。産物により、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155(DE1、E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV-RpsL Kana#1390を含有する大腸菌SW102コンピテント細胞を形質転換して、BAC/ChAd155(DE1、E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV-Amp-LacZ-SacB#1386をもたらした。
【０２３０】
第二のステップ  -  RSV導入遺伝子でのAmp-lacZ-SacB選択カセットの置換
RSV導入遺伝子を、相同組換えによってAmp-lacZ-SacB選択カセットを置き換えることによって、プラスミドBAC/ChAd155(DE1、E4 Ad5E4orf6)TetOhCMV-Amp-LacZ-SacB#1386に挿入した。この目的のため、プラスミドpvjTetOhCMV-bghpolyA_RSV#1080(RSV発現カセットを含有)を、SpeI及びSfiIで切断して、HCMVプロモーター、RSV及びBGHpolyAを含む4.4Kb断片を切除した。生じるRSV4.4Kb断片により、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155(DE1、E4 Adr5E4orf6)TetOhCMV-Amp-LacZ-SacB#1386を含有する大腸菌SW102コンピテント細胞を形質転換して、最終的なプラスミドBAC/ChAd155ΔE1、E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV Kana#1390をもたらした。ChAd155/RSV(配列番号11)を保持するBACの構造は、図6に例示される。特に、ChAd155/RSVは以下の特性を含んだ:種C  左ITR:bp1から113、hCMV(tetO) bp467から1311、RSV遺伝子:bp1348から4785、bghpolyA:bp4815から5032、Ad5E4orf6:bp36270から37151、種C  右ITR:bp37447から37559。
【０２３１】
[実施例3]
ベクター産生
ChAd155の生産性を、Procell92細胞株においてChAd3及びPanAd3と比較して評価した。
【０２３２】
3.1:HIV Gag導入遺伝子を含むベクターの産生
HIV Gagタンパク質を発現するベクターを、上に記載(ChAd155/GAG)に又は以前に記載(ChAd3/GAG Colloca et al、Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra)されるように調製した。ChAd3/GAG及びChAd155/GAGをレスキューし、Procell92中で継代3(P3)まで増幅した。P3溶解物を使用して、各ベクターで単層に培養されたProcell92の2つのT75フラスコを感染させた。多数の100vp/細胞の感染効率(MOI)を、両方の感染実験に使用した。感染させた細胞を、完全CPEが明白(感染後72時間)である場合に採取し、プールした。ウイルスを3サイクルの凍結/解凍(-70°/37℃)によって感染させた細胞から放出させ、次に溶解物を遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、CMVプロモーター領域に対して相補的なプライマー及びプローブでの定量的PCR分析によって定量した。オリゴヌクレオチド配列は、以下である:CMVfor 5'-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3'(配列番号23)、CMVrev 5'-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3'(配列番号24)、CMVFAM-TAMRAプローブ  5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3'(配列番号25)(QPCRを、ABI Prism 7900配列検出器  - Applied Biosystemで実行した)。清澄化した溶解物において測定され、生じた容量力価(vp/ml)及び細胞当たりのウイルス粒子(vp/細胞)で表現される特異的生産性は、以下の表1に提供され、図7に例示される。
【０２３３】
【表１】
2018521666.tif 000009
【０２３４】
HIV Gag導入遺伝子を発現するChAd155ベクターのより高い生産性を確認するため、第二の実験を精製したウイルスを接種物として用いることによって行った。この目的のため、Procell92細胞を、T25フラスコに播種し、細胞のコンフルエンスが約80%であったときに、MOI=100vp/感染細胞を用いて、ChAd3/GAG及びChAd155/GAGで感染させた。完全CPEが明白であるときに、感染させた細胞を採取した。ウイルスを、凍結/解凍によって感染させた細胞から放出させ、遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、以下のプライマー及びプローブを用いることによる定量的PCR分析によって定量した:CMVプロモーター領域に対して相補的である、CMVfor 5'-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3'(配列番号23)、CMV rev GACTTGGAAATCCCCGTGAGT(配列番号24)、CMV FAM-TAMRAプローブ  5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3'(配列番号25)(サンプルをABI Prism 7900配列検出器- Applied Biosystemsにおいて分析した)。清澄化した溶解物において測定され、生じた容量力価(vp/ml)及び細胞当たりのウイルス粒子(vp/細胞)で表現される特異的生産性は、以下の表2に提供され、図8に例示される。
【０２３５】
【表２】
2018521666.tif 000010
【０２３６】
3.2:RSV導入遺伝子を含むベクターの産生
実験の異なるセットを、懸濁液中で培養されたProcell92.SにおけるRSVワクチンベクターの生産性を評価するため行った。実験は、5x105個細胞/mlの細胞密度でProcell92.Sを感染させることによってPanAd3/RSV (WO2012/089833に記載される)及びChAd155/RSVを並行して比較した。感染させた細胞を、感染後3日で採取した。ウイルスを3サイクルの凍結/解凍によって感染させた細胞から放出させ、溶解物を遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、次に上記報告のように、定量的PCR分析によって定量した。容量生産性及び細胞特異的生産性は、以下の表3に提供され、図9に例示される。
【０２３７】
【表３】
2018521666.tif 000011
【０２３８】
[実施例4]
導入遺伝子発現レベル
4.1:HIV Gag導入遺伝子の発現レベル
発現レベルを、HIV Gag導入遺伝子を含むChAd3及びChAd155ベクターでHeLa細胞を感染させることによる並行実験において比較した。HeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、MOI=250vp/細胞を用いて、ChAd3/GAG及びChAd155/GAG精製ウイルスで二連で感染させた。HeLa感染細胞の上清を、感染後48時間で採取し、分泌されるHIV GAGタンパク質の産生を、市販のELISAキット(HIV-1 p24 ELISA Kit、PerkinElmer Life Science)を用いることによって定量した。定量を、HIV-1 p24抗原標準曲線を用いることによって製造者の説明書に従って行った。結果は、pg/mlのGAGタンパク質で表され、図10に例示される。
【０２３９】
4.1:RSV F導入遺伝子の発現レベル
発現レベルを、RSV F導入遺伝子を含む上記PanAd3及びChAd155ベクターでHeLa細胞を感染させることによる並行実験において比較した。この目的のため、HeLa細胞を、6ウェルプレートに播種し、MOI=500vp/細胞を用いて、PanAd3/RSV及びChAd155/RSV精製ウイルスで二連で感染させた。上清を感染後48時間で採取し、分泌されるRSV Fタンパク質の産生をELISAによって定量した。上清の5つの異なる希釈を、市販のマウス抗-RSV Fモノクローナル抗体で被覆されたマイクロプレートウェルに移した。捕捉された抗原を、二次抗RSV Fウサギ抗血清、続いてビオチンコンジュゲート抗ウサギIgGを用いて、次にストレプトアビジン-APコンジュゲート(BD Pharmingen  カタログ番号554065)を添加することによって明らかにした。定量を、RSV Fタンパク質(Sino Biological  カタログ番号11049-V08B)標準曲線を用いることによって行った。得られた結果は、ug/mlのRSV Fタンパク質として表され、以下の表4に提供される。
【０２４０】
【表４】
2018521666.tif 000012
【０２４１】
ウェスタンブロット分析も、PanAd3 RSVベクターと比較して、ChAd155 RSVベクターによって提供されるより高いレベルの導入遺伝子発現を確認するため行った。6ウェルプレートにプレートされたHeLa細胞を、MOI=250及び500vp/細胞を用いて、PanAd3/RSV及びChAd155/RSV精製ウイルスで感染させた。HeLa感染細胞の上清を採取し、分泌されたRSV Fタンパク質の産生を非還元SDSゲル、続いてウェスタンブロット分析によって分析した。上清の同等量を、非還元SDSゲルに載せた。電気泳動分離後、タンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、抗RSV Fマウスモノクローナル抗体(クローンRSV-F-3  カタログ番号ABIN308230、antibodies-online.comで利用可能(最終アクセス2015年4月13日))でプローブした。一次抗体でのインキュベーション後、膜を洗浄し、次に抗マウスHRPコンジュゲート二次抗体でインキュベートした。最終的に、アッセイを、標準的な技術(ECL検出試薬Pierce  カタログ番号W3252282)を用いる電気化学発光によって発色させた。ウェスタンブロット結果は、図11に示される。矢印によって示される約170kDのバンドを、Fタンパク質に対して上昇するモノクローナル抗体mAb13によって明らかにした、これは三量体Fタンパク質の予想重量に対応する。ChAd155 RSVベクターが、より濃いバンドをMOI=250及び500vp/細胞の両方で産生させることを示すことができる。
【０２４２】
[実施例5]
マウス免疫実験による免疫効力の評価
5.1:HIV Gag導入遺伝子を含むベクターの免疫原性
ChAd155/GAGベクターの免疫原性を、BALB/cマウス(1群当たり5)においてChAd3/GAGベクターと並行して評価した。実験を、106ウイルス粒子を筋肉内に注射することによって行った。T細胞応答を、BALB/cマウス中にマップされるGAG CD8+T細胞エピトープを用いてエクスビボIFN-ガンマ酵素結合イムノスポット(ELISpot)によって免疫の3週後に測定した。結果は図12に示され、脾細胞100万個当たりのIFN-ガンマスポット形成細胞(SFC)として表される。各ドットは一匹のマウスにおける応答を表し、線は各用量群についての平均に対応する。ウイルス粒子の数における注射用量及びCD8免疫優性ペプチドに対して陽性のマウスの頻度は、X軸に示される。
【０２４３】
5.2:RSV導入遺伝子を含むベクターの免疫原性
PanAd3/RSV及びChAd155/RSVベクターの免疫効力を、BALB/cマウスにおいて評価した。両ベクターは、108、107及び3X106vpの用量で筋肉内に注射される。ワクチン接種の3週後、免疫したマウスの脾細胞を単離し、抗原としてBALB/cマウス中にマップされる免疫優性ペプチドF及びMエピトープを用いるIFN-ガンマ-ELISpotによって分析した。免疫応答のレベルは、(予想されるように)投薬量の低減に沿って低下したが、免疫応答は、PanAd3/RSVワクチンで免疫したマウスの同等な群と比較して、ChAd155/RSVベクターで免疫したマウスの群において明確により高かった(図13)。図13において、記号は、3つの免疫優性エピトープ(F51-66 F85-93及びM2-1282-290)に対する応答の合計として計算され、バックグラウンドについて補正され、IFN-ガンマスポット形成細胞(SFC)/脾細胞100万個として表される、個々のマウスデータを示す。水平な線は、各用量群に対するIFN-ガンマSFC/脾細胞100万個の平均数を表す。
【０２４４】
結論
まとめると、上記報告の結果は、ChAd155が、ChAd3及びPanAd3ベクターと比較して、改善されたアデノウイルスベクターであることを実証した。ChAd155は、より増殖性であることが示されているので、製造プロセスを促進し、インビトロで及びインビボでも、導入遺伝子をより高いレベルで発現でき、動物モデルにおいて発現される抗原に対するより強いT細胞応答が提供される。
【図１−１】
2018521666.tif 000013
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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