(57)【要約】【課題】【解決手段】中空糸型バイオリアクターにおいて細胞を増殖する方法及びシステムに関する実施形態が記載される。実施形態において、細胞は、活性化剤に曝露されて、増殖が活性化される。前記細胞はＴ細胞を含む。前記活性化剤は、種々の形態をとり、例えば、抗原提示細胞或いは抗体によって機能化されたビーズである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球を含む第１の複数の細胞を、複数の中空糸を有する中空糸型バイオリアクターへ導入するステップと、
前記第１の複数の細胞を活性化剤へ曝露し、前記中空糸型バイオリアクターにおける前記第１の複数の細胞の増殖を活性化させるステップと、
前記中空糸型バイオリアクターの前記複数の中空糸において前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させて、第２の複数の増殖細胞を生成するステップと、
前記バイオリアクターから前記第２の複数の増殖細胞を取り出すステップと、
を有する細胞の増殖方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞のうちの前記一部の細胞は、Ｔ細胞を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項３】
請求項２記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、白血球アフェレーシスプロセスを用いて、生成されることを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項４】
請求項３記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、追加の精製処理を行わずに、前記中空糸型バイオリアクターに付加されることを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項５】
請求項４記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、赤血球を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項６】
請求項５記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、血小板を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項７】
請求項６記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、顆粒球を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項８】
請求項７記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞の前記活性化剤への前記曝露は、前記第１の複数の細胞を、表面に前記活性化剤を有するビーズへ曝露することを含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項９】
請求項７記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞の前記活性化剤への前記曝露は、前記第１の複数の細胞を、前記活性化剤を有する樹状細胞へ曝露することを含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記活性化剤は、１又は複数の抗原を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１１】
請求項８記載の細胞の増殖方法において、前記活性化剤は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択された１又は複数の抗体を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１２】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、前記ステップは、閉鎖系システムにおいて行われることを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させて、第２の複数の増殖細胞を生成する前記ステップは、前記中空糸型バイオリアクター内において培地を循環させるステップを有することを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の細胞の増殖方法において、前記培地は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、及びそれらの組み合わせのうちの１又は複数を含むことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項１５】
細胞を増殖するための細胞増殖システムであって、該システムは、
少なくとも両端部を有する第１流体流路を備える中空糸型バイオリアクターと、
前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路と、
前記第１流体流路において流体を循環させる第１ポンプと、
プロセッサと、
メモリと、
を備え、
前記プロセッサは命令を実行可能であり、
前記メモリは前記命令を記憶し、
前記第１流体流路の第１端部は、前記中空糸型バイオリアクターの第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸型バイオリアクターの第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管内側部分を有し、
前記流体入口路を介して、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入され、
前記命令は、前記プロセッサによって実行されるとき、
白血球を含む第１の複数の細胞を有する第１の流体を、前記中空糸型バイオリアクターの前記毛細管内側部分へ導入するステップと、
前記毛細管内側部分において前記第１の複数の細胞を第１の活性化剤へ曝露し、前記中空糸型バイオリアクターにおける前記第１の複数の細胞の増殖を活性化させるステップと、
培地を含む第２の流体を前記毛細管内側部分に導入し、前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させ、第２の複数の増殖細胞を生成するステップと、
前記中空糸型バイオリアクターから前記第２の複数の増殖細胞を取り出すステップと、
を有する方法を実行することを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項１６】
請求項１５記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞増殖システムは、閉鎖系システムであることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項１７】
請求項１６記載の細胞増殖システムにおいて、前記第２の複数の増殖細胞はＴ細胞を含むことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項１８】
請求項１４記載の細胞増殖システムにおいて、前記第１の流体は、前記第１の活性化剤を表面に有するビーズを含むことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項１９】
請求項１８記載の細胞増殖システムにおいて、前記第１の活性化剤は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択された１又は複数の抗体を含むことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項２０】
請求項１９記載の細胞増殖システムにおいて、前記培地は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択された１又は複数のサイトカインを含むことを特徴とする細胞増殖システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／１６１，１２８号明細書（タイトル：細胞の増殖）の優先権を主張するものであり、該米国特許仮出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）は、研究及び治療の目的のために用いられる種々の細胞を増殖・分化させるために使用される。一例として、Ｔ細胞療法（例えば、自己Ｔ細胞療法）は、多くの疾患を治療するための新しい技術である。例えば、生体外で遺伝子操作され増殖されたＴ細胞は、白血病（例えば、Ｂ細胞）やその他の癌の治療法として有望である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、Ｔ細胞の増殖は、バッグシステムやシステム内において行われているが、そのようなシステムは完全に自動化されておらず、また機能的に閉鎖されていない。
【０００４】
本発明の実施形態は、上記の点及び他の点を考慮してなされた。しかしながら、ここで記載される課題は、本発明の実施形態の用途を、制限するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本節は、本発明のいくつかの実施形態の態様を簡単な形式で説明するためのものであり、主張される本発明の重要な又は必須の要素を特定することを意図していないし、また、請求項の範囲を制限することを意図しているものでもない。
【０００６】
実施形態は、細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて細胞を成長させる細胞増殖システム（ＣＥＳ）及び方法に係る。実施形態では、中空糸型バイオリアクターのようなバイオリアクターにおいて細胞を増殖する。実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、複数の中空糸を含む中空糸型バイオリアクターに導入される。実施形態において、第１の複数の細胞は、活性化剤に曝露されて、前記中空糸型バイオリアクターにおける前記細胞の増殖が活性化される。実施形態において、前記活性化剤は、細胞又は（例えば、ビーズ上に）結合された抗原又は可溶性抗原である。細胞を活性化剤に曝露した後、前記細胞を増殖して、第２の複数の増殖細胞を生成する。そして、前記第２の増殖細胞は前記バイオリアクターから取り出される。
【０００７】
他の実施形態では、細胞を増殖するための細胞増殖システムが提供される。実施形態において、該システムは、少なくとも両端部を有する第１流体流路を備える中空糸型バイオリアクターを備える。前記第１流体流路の第１端部は、前記中空糸型バイオリアクターの第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸型バイオリアクターの第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管内側部分を有する。前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路を用いて、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入される。前記第１流体流路において流体を循環させるポンプがさらに設けられる。
【０００８】
システムは、命令を実行するプロセッサを有する。該プロセッサによって命令が実行されると、白血球を含む第１の複数の細胞を含む第１の流体を、前記中空糸型バイオリアクターの前記毛細管内側部分へ導入するステップを有する方法が実行される。該プロセッサはさらに、前記毛細管内側部分において前記第１の複数の細胞を第１の活性化剤へ曝露し、前記中空糸型バイオリアクターにおける前記第１の複数の細胞の増殖を活性化させるステップを行う命令を実行する。該プロセッサは、培地を含む第２の流体を前記毛細管内側部分に導入し、前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させ、第２の複数の増殖細胞を生成するステップを行うための命令を実行する。該プロセッサは、前記バイオリアクターから前記第２の複数の増殖細胞を取り出すステップを行うための命令を実行する。
【０００９】
非制限的且つ非包括的な実施形態が、添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る中空糸型バイオリアクターの斜視図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る、予め設けられた流体搬送装置を備えた細胞増殖システムの斜視図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る細胞増殖システムのハウジングの斜視図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態に係る、予め設けられる流体搬送装置の斜視図である。
【図５】図５は、本発明の実施形態に係る細胞増殖システムの概略図である。
【図６】図６は、細胞増殖システムの他の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る細胞増殖プロセスのフローチャートである。
【図８】図８は、本発明の実施形態を実施するために使用されるコンピュータシステムの構成要素を示す図である。
【図９】図９は、一実施形態に係る、培養中の種々の時点における総細胞数を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、一実施形態に係る、培養中の種々の時点における細胞生存率を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、一実施形態に係る、精製細胞の投入及び非精製細胞の投入に対する樹状細胞数を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、一実施形態に係る、培養中の種々の時点における（また細胞投入における種々の純度に対する）総細胞数を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、一実施形態に係る、培養中の種々の時点における（また細胞投入における種々の純度に対する）細胞生存率を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、一実施形態に係る、細胞の表現型分布（ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、一実施形態に係る、種々のサイトカインの組み合わせ及び種々の投与方法の比較を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、一実施形態に係る、異なる循環レート及び異なるリアクター動作における生存細胞数を示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、一実施形態に係る、異なるサイトカインの組み合わせで培養を行った場合の種々の時点における総収穫細胞数を示す棒グラフである。
【図１８】図１８は、一実施形態に係る、異なる活性化剤を用いた場合の細胞の収率を示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、一実施形態に係る、異なる活性化剤を用いた場合の細胞表現型を示す棒グラフである。
【図２０】図２０は、一実施形態に係る、サイトカインの産生を示すグラフである。
【図２１】図２１は、他の実施形態に係る、サイトカインの産生を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の原理は、以下の詳細な説明及び添付図面に示される実施形態を参照することで、さらに理解されよう。詳細な実施形態において具体的な特徴が示され説明されるが、本発明は、以下で説明される実施形態に限定されないと理解されるべきである。
【００１２】
以下では、添付図面に示される実施形態が詳細に言及され説明される。可能な限り、図面及び以下の記載において、同一又は同様な部分に対しては、同じ参照符号が使用される。
【００１３】
図１は、本発明と共に使用される中空糸型バイオリアクター１００の一例の正面図を示す。中空糸型バイオリアクター１００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、チャンバーハウジング１０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、チャンバーハウジング１０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を有する。
【００１４】
本開示の実施形態において、第１循環路内の流体は、中空糸型バイオリアクター１００の第１の長手方向端１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を通って中空糸型バイオリアクター１００に進入し、複数の中空糸１１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、中空糸型バイオリアクター１００の第２の長手方向端１２４に位置するＩＣ出口ポート１２０を通って中空糸型バイオリアクター１００の外に出る。ＩＣ入口ポート１０８とＩＣ出口ポート１２０との間の流体経路は、中空糸型バイオリアクター１００のＩＣ部分１２６を定義する。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート１２８を通って中空糸型バイオリアクター１００に進入し、中空糸１１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート１３２を通って中空糸型バイオリアクター１００の外に出る。ＥＣ入口ポート１２８とＥＣ出口ポート１３２との間の流体経路は、中空糸型バイオリアクター１００のＥＣ部分１３６を構成する。ＥＣ入口ポート１２８を通って中空糸型バイオリアクター１００に入った流体は、中空糸１１６の外側に接触する。小分子（例えば、イオン、水、酸素、乳酸等）は、中空糸１１６を通じて中空糸の内部すなわちＩＣ空間から外部すなわちＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸１１６のＩＣ空間内にとどまる。培地は、必要であれば交換補充してもよい。また、必要であれば、培地を、酸素供給装置又はガス移送モジュールを通じて循環させて、ガスを交換してもよい（例えば、細胞増殖システム５００（図５）や細胞増殖システム６００（図６）を参照）。細胞は、以下で説明されるように、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、該膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。
【００１５】
中空糸膜を作製するのに用いられる材料は、中空糸に加工可能な任意の生体適合性高分子材料でよい。本開示の実施形態において、使用可能な一材料としては、合成ポリスルホン系材料が挙げられる。細胞を中空糸の表面に付着させるため、該表面は、少なくとも細胞成長表面をフィブロネクチンやコラーゲンのようなタンパク質でコーティングしたり或いは該表面に放射線を照射したりするような方法で、改質されてよい。膜表面をガンマ線処理することによって、膜に対してフィブロネクチン等による追加コーティングを行わずに、接着性細胞を付着させることが可能になる。ガンマ線処理を行った膜で作製されたバイオリアクターは、再利用することができる。本開示の実施形態において、細胞付着のための他のコーティング及び／又は他の処理を用いてもよい。
【００１６】
図２において、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体を有する細胞増殖システム２００の一実施形態が示される。ＣＥＳ２００は、細胞増殖装置２０２を有する。細胞増殖装置２０２は、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６と係合するハッチ又は開閉可能なドア２０４を有する。細胞増殖装置２０２内の内部空間２０８は、バイオリアクター１００を含む予め設けられた流体輸送組立体２１０を受容し係合固定できるような特徴を有する。予め設けられた流体輸送組立体２１０は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体２１０を、新しい又は未使用の流体輸送組立体２１０に比較的迅速に交換できるようになっている。単一の細胞増殖装置２０２の動作によって、第１の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第１のセットを成長又は増殖させ、その後、第１の流体輸送組立体２１０を第２の流体輸送組立体２１０に交換する際に殺菌することなく、第２の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第２のセットを成長又は増殖させることができる。予め設けられた流体輸送組立体は、バイオリアクター１００と酸素供給器又はガス移送モジュール２１２を有する。実施形態において、流体輸送組立体２１０に接続される種々の培地用配管を受容する配管案内スロットが２１４として示される。
【００１７】
図３は、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体２１０（図２参照）を取り外し可能に取り付ける前の、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６を示す。開閉可能なドア２０４（図２参照）は、図３では省略されている。細胞増殖装置２０２の後側部分２０６には、流体輸送組立体２１０の構成要素と組み合わせて動作する複数の異なる構造が設けられている。詳細には、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、流体輸送組立体２１０におけるポンプループと協働する複数の蠕動ポンプ（ＩＣ循環ポンプ２１８、ＥＣ循環ポンプ２２０、ＩＣ入口ポンプ２２２、ＥＣ入口ポンプ２２４）を有する。また、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、複数のバルブ（ＩＣ循環バルブ２２６、試薬バルブ２２８、ＩＣ培地バルブ２３０、空気除去バルブ２３２、細胞入口バルブ２３４、洗浄バルブ２３６、分配バルブ２３８、ＥＣ培地バルブ２４０、ＩＣ廃棄バルブ２４２、ＥＣ廃棄バルブ２４４、収穫バルブ２４６）を有する。さらに、複数のセンサ（ＩＣ出口圧力センサ２４８、ＩＣ入口圧力／温度センサ２５０、ＥＣ入口圧力／温度センサ２５２、ＥＣ出口圧力センサ２５４）が、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に関連付けられる。さらに、空気除去チャンバーのための光学センサ２５６が示されている。
【００１８】
実施形態に係る、バイオリアクター１００を回転させるための軸又はロッカー制御部２５８が、図３に示されている。軸又はロッカー制御部２５８と関連付けられた軸嵌合部２６０によって、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部（例えば、配管収納部３００（図４）の開口部４２４（図４））の適切な位置合わせが行える。軸又はロッカー制御部２５８の回転によって、軸嵌合部２６０及びバイオリアクター１００に対して回転運動が付与される。従って、ＣＥＳ２００のオペレータ又はユーザが、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００（図４）を、細胞増殖装置２０２に取り付ける際、位置合わせは、軸嵌合部２６０に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部４２４（図４）を適切に方向付けるといった比較的簡単な作業となる。
【００１９】
図４は、取り付け・取り外し自在の予め取り付けられる流体輸送組立体４００の斜視図である。予め取り付けられる流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体４００を、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００に比較的迅速に交換できるようになっている。図４に示されるように、バイオリアクター１００は、軸嵌合部４０２を含むバイオリアクターカップリングに取り付けられる。軸嵌合部４０２は、細胞増殖装置２０２の軸（図３に示されている例えば、軸２５８）を係合させるための１以上の（付勢された腕部又はバネ部材４０４のような）軸締結機構を有する。
【００２０】
実施形態において、シャフトフィッティング４０２及びバネ部材４０４には、バイオリアクター１００を回転させる細胞増殖システムの機構が接続される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞増殖システムは、バイオリアクターを回転可能なＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ）（コロラド州、レイクウッド、テルモＢＣＴ社製）の一部であってもよい。バイオリアクターを回転可能な細胞増殖システムの例としては、少なくとも、２０１３年３月１９日発行の米国特許第８，３９９，２４５号明細書（タイトル：細胞増殖システムの細胞成長チャンバーのための回転システム及びその使用方法）、２０１３年２月１３日発行の米国特許第８，８０９，０４３号明細書（タイトル：細胞増殖システムの細胞成長チャンバーのための回転システム及びその使用方法）、及び２０１５年６月１６日発行の米国特許第９，０５７，０４５号明細書（タイトル：細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入及び分散方法）に記載されている。上記米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【００２１】
実施形態によれば、流体輸送組立体４００は、配管４０８Ａ、４０８Ｂ、４０８Ｃ、４０８Ｄ、４０８Ｅ等及び種々の管継手を有する。これらにより、以下で説明されるように、図５〜図９に示されるような流体路が提供される。ポンプループ４０６Ａ、４０６Ｂ、４０６Ｃも、ポンプ用に設けられる。細胞増殖装置２０２が配置される場所に、種々の培地が設けられてもよいが、実施形態において、プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２の外部に延在する程度に十分な長さの配管を有することで、該配管に対して培地バッグに関連付けられた配管が接合されてもよい。
【００２２】
図５は、細胞増殖システム５００の実施形態の概略図である。図６は、他の実施形態である細胞増殖システム６００の概略図である。図５及び図６に示される実施形態では、以下で説明するように、細胞は、ＩＣ空間で成長される。しかしながら、本発明は、そのような例に限定されない。他の実施形態では、細胞はＥＣ空間で成長されてもよい。
【００２３】
図５は、実施形態に係るＣＥＳ５００を示している。ＣＥＳ５００は、第１流体循環路５０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路５０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路５０６は、中空糸型バイオリアクター５０１に流体的に関連付けられて、少なくとも部分的に第１流体循環路５０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して中空糸型バイオリアクター５０１に流入し、中空糸型バイオリアクター５０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。圧力測定器５１０は、中空糸型バイオリアクター５０１を離れる培地の圧力を測定する。培地は、培地流量／循環流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ５１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ５１２は、第１方向（例えば、時計回り）又は第１方向の反対の第２方向（例えば、反時計回り）に、流体をポンピング可能である。出口ポート５０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループ５０２に流入する培地は、バルブ５１４を介して流入する。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ５００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、１以上の実施形態の範囲において、概略図は変形可能であると理解されるべきである。
【００２４】
ＩＣループ５０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５１６又はサンプルコイル５１８から得られる。第１流体循環路５０２に配置された圧力／温度測定器５２０によって、動作中において、培地の圧力及び温度が測定できる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート５０１Ａに戻って、流体循環路５０２を完了する。中空糸型バイオリアクター５０１で成長／増殖した細胞は、中空糸型バイオリアクター５０１から流し出され、バルブ５９８を通って収穫バッグ５９９に入るか、中空糸内に再分配され、さらに成長される。以下では、これが詳細に説明される。
【００２５】
第２流体循環路５０４において、流体は、ＥＣ入口ポート５０１Ｃを介して、中空糸型バイオリアクター５０１に入り、ＥＣ出口ポート５０１Ｄを介して中空糸型バイオリアクター５０１を離れる。ＥＣループ５０４では、培地は、中空糸型バイオリアクター５０１の中空糸の外側と接触し、それによって、小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００２６】
培地が中空糸型バイオリアクター５０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路５０４に配置された圧力／温度測定器５２４によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が中空糸型バイオリアクター５０１を離れた後、圧力測定器５２６によって、第２流体循環路５０４の培地の圧力が測定可能である。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００２７】
実施形態において、中空糸型バイオリアクター５０１のＥＣ出口ポート５０１Ｄを離れた後、第２流体循環路５０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ５２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に至る。ＥＣ循環ポンプ５２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路５２２は、酸素供給器入口ポート５３４及び酸素供給器出口ポート５３６を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、酸素供給器入口ポート５３４を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、酸素供給器出口ポート５３６を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、ＣＥＳ５００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路５０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、適当なサイズの任意の酸素供給器又はガス移送装置でよい。空気又はガスは、フィルタ５３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、フィルタ５４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置５３２から流出する。フィルタ５３８、５４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ５００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２を介して大気にベント可能である。
【００２８】
ＣＥＳ５００を図示した構成において、第１流体循環路５０２及び第２流体循環路５０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）中空糸型バイオリアクター５０１を流れる。ＣＥＳ５００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００２９】
少なくとも１つの実施形態において、（バッグ５６２からの）細胞を含む培地及び容器５４６からの流体培地は、第１流体流路５０６を介して第１流体循環路５０２に導入される。流体容器５６２（例えば、細胞投入バッグ又は空気をシステム外にプライミングするための生理食塩水プライミング流体）は、バルブ５６４を介して、第１流体流路５０６及び第１流体循環路５０２に流体的に関連付けられる。
【００３０】
流体容器、すなわち培地バッグ５４４（例えば、試薬）は、バルブ５４８を介して第１流体入口路５４２に流体的に関連付けられ、流体容器、すなわち培地バッグ５４６（例えば、ＩＣ培地）は、バルブ５５０を介して第１流体入口路５４２に流体的に関連付けられ、又はバッグ５４４、５４６は、バルブ５４８、５５０、５７０を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられる。また、滅菌され密封可能な第１及び第２入力プライミング路５０８、５０９が設けられる。空気除去チャンバー（ＡＲＣ）５５６が、第１循環路５０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー５５６は、１以上の超音波センサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー５５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー５５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ５００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー５５６と流体的に関連付けられたライン５５８を通って、エアバルブ５６０から大気中へベント可能である。
【００３１】
（バッグ５６８からの）ＥＣ培地又は（バッグ５６６からの）洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。流体容器５６６は、バルブ５７０と流体的に関連付けられる。バルブ５７０は、分配バルブ５７２及び第１流体入口路５４２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７０を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６６は、第２流体入口路５７４及びＥＣ入口路５８４を介して第２流体循環路５０４と流体的に関連付けることができる。同様に、流体容器５６８は、バルブ５７６と流体的に関連付けられる。バルブ５７６は、第１流体入口路５４２及び分配バルブ５７２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７６を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６８は、第２流体入口路５７４と流体的に関連付けることができる。オプションとして、培地試薬又は洗浄液の導入用に熱交換器５５２を設けてもよい。
【００３２】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ５５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ５７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器５８０がＥＣ入口路５８４と関連付けられてもよい。
【００３３】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路５０２、５０４は、廃棄ライン５８８と接続される。バルブ５９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して、廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に至る。同様に、バルブ５８２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に流れる。
【００３４】
実施形態において、細胞は、細胞収穫路５９６を介して収穫される。中空糸型バイオリアクター５０１からの細胞は、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路５９６及びバルブ５９８を介して、細胞収穫バッグ５９９に収穫される。
【００３５】
ＣＥＳ５００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。
【００３６】
図６は、細胞増殖システム６００の他の実施形態の概略図である。ＣＥＳ６００は、第１流体循環路６０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路６０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路６０６は、中空糸型バイオリアクター６０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路６０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート６０１Ａを介して中空糸型バイオリアクター６０１に流入し、中空糸型バイオリアクター６０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート６０１Ｂを介して流出する。圧力センサ６１０は、中空糸型バイオリアクター６０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、実施形態において、センサ６１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。
【００３７】
培地は、培地流量又は循環流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ６１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ６１２は、第１方向（例えば、反時計回り）又は第１方向の反対の第２方向（時計回り）に、流体をポンピング可能である。出口ポート６０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ６１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置することにより、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル６１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート６０１Ａに戻って、流体循環路６０２を完了する。
【００３８】
中空糸型バイオリアクター６０１で成長／増殖した細胞は、中空糸型バイオリアクター６０１から流し出され、バルブ６９８及びライン６９７を介して収穫バッグ６９９に入る。或いは、バルブ６９８が閉じている場合、細胞は、中空糸型バイオリアクター６０１に再分配され、さらに成長される。示される概略図は、ＣＥＳ６００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、概略図に対する変更は、１以上の実施形態の範囲において可能であると理解されるべきである。
【００３９】
第２流体循環路６０４において、流体は、ＥＣ入口ポート６０１Ｃを介して、中空糸型バイオリアクター６０１に入り、ＥＣ出口ポート６０１Ｄを介して中空糸型バイオリアクター６０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、中空糸型バイオリアクター６０１の中空糸の外側と接触し、それによって、一実施形態では、チャンバー６０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００４０】
培地が中空糸型バイオリアクター６０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路６０４に配置された圧力／温度センサ６２４によって、該培地の圧力及び温度を測定することができる。培地が中空糸型バイオリアクター６０１を離れた後に、センサ６２６によって、第２流体循環路６０４の培地の圧力及び／又は温度を測定することができる。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート６３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００４１】
中空糸型バイオリアクター６０１のＥＣ出口ポート６０１Ｄを離れた後、第２流体循環路６０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ６２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に至る。実施形態において、ＥＣ循環ポンプ６２８もまた、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路６２２は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２の入口ポート６３２Ａ及び出口ポート６３２Ｂを介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート６３２Ａを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、出口ポート６３２Ｂを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、ＣＥＳ６００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。
【００４２】
種々の実施形態において、第２流体循環路６０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、酸素供給又はガス移送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ６３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、フィルタ６４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置６３２から流出する。フィルタ６３８、６４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ６００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２を介して大気にベント可能である。
【００４３】
ＣＥＳ６００として示された該構成において、第１流体循環路６０２及び第２流体循環路６０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）中空糸型バイオリアクター６０１を流れる。ある実施形態において、ＣＥＳ６００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのような供給源からの）細胞を含む培地は、取り付け点６６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点６４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路６０６を介して第１流体循環路６０２に導入される。取り付け点６６２は、バルブ６６４を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。取り付け点６４６は、バルブ６５０を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点６４４に流体的に接続して、バルブ６４８を介して流体入口路６４２に関連付けてもよいし、又はバルブ６４８及び６７２を介して第２流体入口路６７４に関連付けてもよい。
【００４５】
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）６５６が、第１循環路６０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー６５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー６５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー６５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ６００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー６５６と流体的に関連付けられたライン６５８を通って、エアバルブ６６０から大気中へベント可能である。
【００４６】
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点６６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点６６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。取り付け点６６６は、バルブ６７０と流体的に関連付けられる。バルブ６７０は、バルブ６７２及び第１流体入口路６４２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７０を開け、バルブ６７２を閉じることにより、取り付け点６６６は、第２流体入口路６７４及び第２流体流路６８４を介して第２流体循環路６０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点６６８は、バルブ６７６と流体的に関連付けられる。バルブ６７６は、第１流体入口路６４２及びバルブ６７２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７６を開け、分配バルブ６７２を閉じることにより、流体容器６６８を、第２流体入口路６７４と流体的に関連付けることができる。
【００４７】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ６５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ６７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器６８０がＥＣ入口路６８４と関連付けられてもよい。
【００４８】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路６０２、６０４は、廃棄ライン６８８に接続される。バルブ６９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン６８８を通って、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に至る。同様に、バルブ６９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に流れる。
【００４９】
細胞が中空糸型バイオリアクター６０１にて成長された後、該細胞は、細胞収穫路６９７を介して収穫される。中空糸型バイオリアクター６０１からの細胞は、バルブ６９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路６９７を介して、細胞収穫バッグ６９９に収穫される。
【００５０】
ＣＥＳ６００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。さらに、実施形態において、ＣＥＳ６００とＣＥＳ５００（図５）の部品を組み合わせてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、本開示の範囲内において、図５及び図６に示される部品よりも少ない数の部品を含んでもよいし、多い数の部品を含んでもよい。実施形態において、ＣＥＳ５００、ＣＥＳ６００のある部分は、テルモＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）によって製造されるＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ）の１以上の特徴によって実施される。
【００５１】
ＣＥＳ６００を用いたある特定の実施形態において、Ｔ細胞がＣＥＳ６００において増殖される。この実施形態では、Ｔ細胞は、白血球アフェレーシスプロセスによって集められ、バイオリアクター６０１に導入される。Ｔ細胞はバイオリアクター６０１に導入されて、経路６０２に入る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、バイオリアクター６０１に導入する前に、精製される（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）。精製プロセスにおいては、遠心分離機及び／又は精製用カラムが使用される。精製プロセスでは、例えば、ミルテニーバイオテク社（ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハ）のＬＳカラム及び／又はビーズ（例えば、機能性ビーズ）が使用される。
【００５３】
しかしながら、ある実施形態では、Ｔ細胞は、白血球アフェレーシスプロセスによる集約後、精製過程を経ずに、直接、バイオリアクター６０１に付加される場合もある。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の成長は、他の細胞をＴ細胞と一緒にバイオリアクターへ導入することによって、増進されると考えられる。従って、Ｔ細胞は精製されずに、その他の赤血球、血小板、顆粒球、及び／又は白血球と一緒にバイオリアクターへ投入されてもよい。一実施形態では、未精製のＴ細胞を投入した場合、Ｔ細胞のほとんどが増殖し、その結果、増殖後にバイオリアクターから取り出した細胞のうちの約９０％を超える量、又は約９５％を超える量、又は約９８％を超える量、或いは約９９％を超える量、がＴ細胞であり、残りの細胞は、赤血球、血小板、顆粒球、他の白血球、及び／又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、未精製のＴ細胞を投入した場合、Ｔ細胞のほとんどが増殖し、その結果、増殖後にバイオリアクターから取り出した細胞のうちの約１００％未満、又は約９９％未満、又は約９８％未満、又は約９７％未満、又は約９６％未満、又は約９５％未満、又は約９４％未満、又は約９３％未満、又は約９２％未満、又は約９１％未満、又は約９０％未満、がＴ細胞である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、プライミング工程の後、バイオリアクター６０１に加えられる。理解されるように、いくつかのＴ細胞は非接着性であり、従って、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ／ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のために、バイオリアクター６０１の中空糸壁に付着する必要がない。これらの実施形態では、付着を促進するためのコーティング剤（例えば、フィブロネクチン）で、中空糸の内側をコートする必要がない。この場合、（精製又は未精製の）Ｔ細胞は、プライミング工程の後、バイオリアクターコーティング工程を行わずに、バイオリアクター６０１に導入される。
【００５５】
バイオリアクター６０１に入ると、細胞は、細胞の増殖を活性化するための活性化剤にさらされる。一例において、抗原提示細胞が、バイオリアクター６０１に予め導入される、或いはバイオリアクター６０１において予め成長される。一実施形態では、Ｔ細胞を加える前に、単球由来樹状細胞がバイオリアクター６０１において成長される。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞を使用する場合、抗原提示細胞の増殖のために最適化された条件下で最初に成長プロセスが行われる。
【００５６】
他の実施形態において、抗体で機能化されたビーズがバイオリアクター６０１に加えられる。他の実施形態では、そのようなビーズは、細胞がバイオリアクターに導入される前に、細胞を含む容器（例えば、Ｔ細胞の入ったバッグ）に加えられる。抗体はＴ細胞の増殖を活性化する。使用されるビーズの例としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（マサチューセッツ州、ウォルサム）製のビーズであるＤＹＮＡＢＥＡＤＳが挙げられる。いくつかの実施形態において、ビーズは、抗体によって表面が機能化される。制限はされないが、そのような抗体の例としては、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３４抗体等が挙げられる。
【００５７】
他の実施形態においては、活性化剤は、流体（例えば、溶液）の形態をとる。活性化剤含有流体は、１以上の活性化剤を含む（例えば、抗原）。抗原の他に、流体は、他の成分を含んでもよい。制限はされないが、例としては、タンパク質、界面活性剤、試薬、緩衝剤等が挙げられる。可溶性の共刺激シグナルを含む流体の一例は、ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞活性化剤（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ）である。
【００５８】
細胞が活性化剤に曝露された後（そして、継続して曝露されている間）、細胞はバイオリアクター６０１において増殖が行われる。増殖中、多くの数の物質が、バイオリアクター６０１へ加えられたり、バイオリアクター６０１から取り出されたりする。例えば、サイトカインを用いて、Ｔ細胞の増殖が刺激される。いくつかの実施形態において、単一のサイトカインが使用される。使用されるサイトカインとしては、以下に制限されないが、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、及びそれらの組み合わせ等が挙げられる。他の実施形態では、ＩＬ−２だけが用いられる。或いは、ＩＬ−２がＩＬ−７と一緒に用いられる。或いは、ＩＬ−７だけが用いられる。或いは、ＩＬ−７がＩＬ−１５と一緒に用いられる。他の実施形態では、ＩＬ−２がＩＬ−１５と一緒に用いられる。さらに他の実施形態では、ＩＬ−２とＩＬ−７とＩＬ−１５とが一緒に用いられる。いくつかの実施形態では、１を超えるサイトカインを使用する場合、サイトカインはそれぞれ同時に加えられてもよいし、異なるタイミングで加えられてもよいし、或いは組み合わせた状態で加えられてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、サイトカインは、例えば、ポート６１８を介して、バイオリアクター６０１に直接加えることもできる。しかしながら、他の実施形態では、サイトカインは、例えば、経路６０６を介して、サイトカインがバイオリアクター６０１内をかん流（ｐｅｒｆｕｓｅ）していくような場所で加えられる。いくつかの実施形態では、サイトカインをバイオリアクター６０１内にかん流させることによって、Ｔ細胞の成長が促進されると考えられる。
【００６０】
Ｔ細胞を刺激することに加えて、Ｔ細胞は、例えば、多数の栄養素を含む培地を付加することによって、栄養補給（フィーディング）されてもよい。いくつかの実施形態において、培地は市販の培地である。例えば、Ｔ細胞にフィーディングするために使用される培地は、ミルテニーバイオテク社（ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハ）から市販されているＴｅｘＭＡＣＳ培地を元にしたもの（製造された流体を部分的に変更したものでもよいし変更せずにそのままでもよい）である。他の実施形態では、培地は、セルジェニック社（ドイツ、フライブルグ）から市販されているＣＥＬＬＧＲＯ培地を元にしたもの（製造された流体を部分的に変更したものでもよいし変更せずにそのままでもよい）である。培地は、他の物質（例えば、塩、血清、タンパク質等）を添加することによって、部分的に変更されてもよい。
【００６１】
Ｔ細胞の増殖の一部として、温度、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等のその他の条件は、バイオリアクター６０１内で調節される。いくつかの実施形態において、ＥＣ側（例えば、経路６０４）の流量を用いて、種々のパラメータが制御される。例えば、細胞成長が行われているＩＣ側の排出物濃度又は代謝物濃度を減らしたい場合、ＥＣ側の流量を増やすことで、中空糸を通過するＩＣ側からＥＣ側への移動によって、排出物及び／又は代謝物をＩＣ側から確実に除去することができる。
【００６２】
Ｔ細胞を増殖させた後、該細胞は、バイオリアクター６０１から取り出される。Ｔ細胞は容器６９９に集められる。
【００６３】
本発明の実施形態は、ＣＥＳ６００を使用することによって、従来のプロセスに対して（Ｔ細胞の成長において）利点を持つ。例えば、中空糸を使用することにより、密接な細胞間コミュニケーションが可能となり、従って、Ｔ細胞の活性化及び刺激が増大され、増殖が始まり、継続する。また、バイオリアクター６０１のような中空糸型バイオリアクターを使用することにより、Ｔ細胞成長に対して大きな表面面積を提供することが可能となり、より高い濃度のＴ細胞又はより高い量のＴ細胞が産出される。
【００６４】
さらに、バイオリアクター６０１における条件（ＩＣ流量及びＥＣ流量を含む）は、ＣＥＳ６００の多数の部品・部材を用いて制御できる。また、ＣＥＳ６００では、様々な場所においてサイトカインを投入することが可能であり、サイトカインをバイオリアクター６０１に直接或いは間接的（例えば、潅流式（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ））に投入できる。
【００６５】
さらに、ＣＥＳ６００によって、閉鎖系システムが提供される。すなわち、Ｔ細胞を成長するためのステップを、周囲環境に直接曝露することなく、実行することができる。従って、周囲環境によってＴ細胞が汚染されたり、或いはＴ細胞やＴ細胞成長に使用される物質によって周囲環境が汚染されたりすることがない。いくつかの実施形態では、増殖のためのＴ細胞の開始濃度を、他の方法／システムに比べて、小さい量にすることができると考えられる。これらの実施形態では、Ｔ細胞増殖の収穫量を、他の方法／システムに比べて大きくできる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の有効量を成長させる時間が短縮されると考えられる。さらに他の実施形態では、他の方法／システムに較べて、（高価な）サイトカインのような物質の使用量を減らして、Ｔ細胞を成長できると考えられる。
【００６７】
図７は、実施形態に係る細胞成長のフローチャート７００を示す。以下では、フローチャート７００のステップを行うための特定の装置が説明されるが、本発明はそれらに限定されない。例えば、いくつかのステップは、細胞増殖システムの一部又は、プロセッサ実行可能命令として与えられるソフトウェアに基づいてステップを実行可能なプロセッサによって行われるように記載されてもよい。これらはあくまでも例示の目的で行われるものであり、フローチャート７００は、特定の装置によって行われることに制限されない。
【００６８】
フローチャート７００はステップ７０４で始まり、細胞を集めるオプションとしてのステップ７０８へ進む。一例として、ステップ７０８は、アフェレーシスプロセスを含んでよい。一実施形態では、白血球アフェレーシスプロセスが、ステップ７０８の一部として実行される。細胞を集めることが可能な装置としては、テルモＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）製のＣＯＢＥ（登録商標）スペクトラ・アフェレーシス・システムが挙げられる。
【００６９】
フローチャート７００は、ステップ７０８からステップ７１２へ進む。ステップ７１２では、細胞が細胞増殖システム（特に、細胞増殖システムのバイオリアクター）に投入される。上述のように、いくつかの実施形態では、フローチャート７００は、ステップ７１２から始まってもよい。実施形態において、バイオリアクターは、バイオリアクター１００（図１参照）のような中空糸型バイオリアクターである。これらの実施形態では、ステップ７１２では、細胞を１又は複数の中空糸に個別に流してもよい。ステップ７１２では、プロセッサ、ポンプ、バルブ、流体路等を用いて、細胞をバイオリアクターへ投入してもよい。一実施形態において、ステップ７１２は、バルブ（例えば、バルブ５６４、５１４、６６４、６１４）を開き、ポンプ（例えば、ポンプ５５４、６５４）を動作させてもよい。
【００７０】
ステップ７１２の後、フローチャート７００は、ステップ７１６へ進む。ステップ７１６では、細胞は活性化剤に曝露される。理解されるように、特定の細胞型は、増殖のための活性化を行う前に、例えば、特定のタンパク質に対する曝露による活性化が必要となる。この細胞型の例としては、Ｔ細胞がある。ステップ７１６では、細胞は、増殖・成長するために細胞を活性化させるのに必要な活性化剤に曝露される。
【００７１】
ステップ７１６は、ステップ７１６の一部として行われる或いはステップ７１６の前に行われる複数のステップを含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ７２０は、細胞増殖を活性化するために必要な活性化剤を提示する抗原提示細胞を成長するために行われる。一実施形態において、ステップ７２０は、ステップ７１６の前に、或いはさらにステップ７０８の前に行われてもよい。一例において、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）が成長される。これら実施形態では、ステップ７２０は、結果として抗原提示細胞がバイオリアクター内に存在することになる複数のステップ（例えば、抗原提示細胞への前駆細胞としての単球を集めるステップ）を含んでよい。抗原提示細胞は表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を有し、抗原提示細胞の表面には、他の細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示されると、該細胞の増殖を誘発する抗原が存在する。
【００７２】
他の実施形態において、ステップ７１６は、ステップ７２４を含んでもよい。ステップ７２４では、ビーズがバイオリアクターに加えられる。理解されるように、いくつかの実施形態において、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリマービーズ、ガラスビーズ、セラミックビーズ）は、ビーズ表面上に、細胞増殖を活性化させる特定の活性化剤が含まれるように、部分的に変更されてもよい。一例として、磁気ビーズは１又は複数の抗体によって機能化される。抗体の例としては、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３４抗体が挙げられる。細胞が抗体に曝露されると、他の物質の存在下において、該細胞は、増殖するように活性化される。いくつかの実施形態における使用に適したビーズとしては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（マサチューセッツ州、ウォルサム）製のビーズであるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）が挙げられる。
【００７３】
ステップ７１６の後、ステップ７２８へ進む。ステップ７２８では、細胞が増殖される。ステップ７２８は、複数のサブステップを有してよい。例えば、サブステップ７３２では、細胞は、例えば、サイトカインを用いて、刺激される。このような刺激によって、細胞増殖の継続が可能となる。
【００７４】
実施形態において、ステップ７２８は、数時間、又は数日間、又は数週間の期間にわたって行われる。この期間中、種々のサブステップ（例えば、７３２、７３６、及び／又は７４０）が種々の時点で行われてよい。例えば、この期間中、サイトカイン（例えば、インターロイキン）のような物質が付加され、バイオリアクターに分散（かん流）され或いは直接投入され、細胞増殖の刺激が継続されてもよい。使用されるサイトカインの非制限的な例としては、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。サイトカインは個別に、或いは組み合わせて使用され、例えば、一実施形態では、ＩＬ−７がＩＬ−１５と組み合わせて使用される。他の実施形態では、ＩＬ−２とＩＬ−７が一緒に使用される。さらに他の実施形態では、ＩＬ−２とＩＬ−１５が一緒に使用される。
【００７５】
ステップ７２８は、細胞フィーディングステップ７３６を有してもよい。ステップ７３６では、グルコース、リン酸塩、塩等を含む種々の栄養素が加えられてもよい。ステップ７３６では、栄養素濃度が検知され、比較的低い濃度測定値に応答して、バイオリアクターに栄養素が加えられるステップを含んでもよい。ステップ７３６は、プロセッサ、ポンプ、バルブ、流体路等を使用して、栄養素を加えることで細胞フィーディングを行うステップを有してもよい。或いは、グルコースのような栄養素の付加は、所定のスケジュールに基づいて行われてもよい。
【００７６】
ステップ７４０は、バイオリアクターの成長環境を制御するステップを含んでよい。理解されるように、栄養素に加えて、細胞成長を最適化するための環境としては、複数の異なるパラメータがある。例えば、温度、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等が、ステップ７４０の一部として、モニタ・制御される。一実施形態では、細胞増殖が行われている毛細管内側空間でのｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等の制御において、バイオリアクターの毛細管外側空間（ＥＣ）側を流れる流体の流量が利用される。
【００７７】
フローチャート７００は、ステップ７４０から、バイオリアクターから細胞を取り出すステップ７４４へ進む。ステップ７４４は、複数のサブステップを含んでよい。例えば、収穫プロセスはそれ自身で複数のステップを含むが、ステップ７４４の一部として行うことができる。実施形態において、ステップ７４４は、バイオリアクターの毛細管内側空間（ＩＣ）側及びＥＣ側の循環レートを変更するステップを含んでよい。他の実施形態において、ステップ７４４は、種々の物質を循環させ、中空糸の内側表面に付着した細胞を確実に剥離してバイオリアクターから取り出すステップを有してよい。一例として、プロテアーゼを付加することで、細胞が中空糸に結合することを助ける糖タンパク質のようなタンパク質が分解される。フローチャート７００はステップ７５２で終了する。
【００７８】
本開示の実施形態によれば、図７に示されるフローチャートにおいて記述された動作ステップは、あくまで例示の目的であり、変更されてもよく、他のステップと組み合わせてもよく、また他のステップと並行に行われてもよい。実施形態では、本開示の範囲から逸脱しなければ、ステップを減らしてもよいし、ステップを追加してもよい。また、例えば、ステップ（及びサブステップ）は、いくつかの実施形態では、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって、自動的に行ってもよい。ここでは、そのようなステップは、あくまでも例示の目的で提示されている。
【００７９】
フローチャート７００に対して、種々のステップをある特定の順序で列挙して説明を行ったが、本開示は、そのような順序に制限されない。他の実施形態において、ステップ及びサブステップは、異なる順序で、或いは並行して、或いは部分的には図７に示された順序で、或いは図７に示されたシーケンスで行われてもよい。また、ステップ又はサブステップは特定の特徴又は特定の構造によって行われるように記載したが、これは本発明を制限することを意図していない。むしろ、それら記載は、あくまでも例示の目的で行われている。他の実施形態において、上記されていない他の構造や特徴を用いて、フローチャート７００のステップのうちの１又は複数のステップを行ってもよい。さらに、フローチャート７００は、オプションとしてのステップを含んでもよい。しかしながら、オプションとして示されていない上述のステップは、本発明において必須と考えるべきではなく、ある実施形態では実行され、他の実施形態では実行されない場合もある。
【００８０】
図８は、本発明の実施形態が実行されるコンピュータシステム８００の構成要素例を示す。コンピュータシステム８００は、例えば、細胞増殖システムがプロセッサを用いて、（上述のフローチャート７００に示されたプロセスのように、プロセスの一部として行われるカスタムタスクや予めプログラムされたタスクのような）タスクを実行する実施形態において、使用される。
【００８１】
コンピュータシステム８００は、ユーザインターフェース８０２、処理システム８０４、及び／又は記憶装置８０６を有する。ユーザインターフェース８０２は、当業者であればわかるように、出力装置８０８、及び／又は入力装置８１０を有する。出力装置８０８は、１又は複数のタッチスクリーンを有してよい。タッチスクリーンは、１又は複数のアプリケーションウィンドウを提供するためのディスプレイ領域を有してよい。タッチスクリーンはまた、例えば、ユーザやオペレータからの物理的な接触を受容可能及び／又は取り込み可能な入力装置８１０であってもよい。タッチスクリーンは、当業者であれば理解できるように、処理システム８０４による接触位置の推定を可能とする静電容量構造の液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でもよい。この場合、処理システム８０４は、接触位置を、アプリケーションウィンドウの所定位置に表示されるユーザインターフェース（ＵＩ）要素に写すことができる。また、タッチスクリーンは、本発明に係る、１又は複数のその他の電子構造を介して接触を受容することもできる。他の出力装置８０８としては、プリンター、スピーカ等が挙げられる。その他の入力装置８１０としては、当業者であれば理解できるように、キーボード、その他のタッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等が挙げられる。
【００８２】
本発明の実施形態において、処理システム８０４は、処理ユニット８１２、及び／又はメモリ８１４を有してもよい。処理ユニット８１２は、メモリ８１４に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理ユニット８１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、実施形態では、各プロセッサは、個別に命令を読み込んで実行するための１又は複数のコアを有するマルチコアプロセッサでよい。プロセッサは、当業者であれば理解できるように、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
【００８３】
本発明の実施形態において、メモリ８１４は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の記憶装置を含んでよい。メモリ８１４は、当業者であれば理解できるように、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、当業者であれば理解できるように、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、その他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク記憶装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。
【００８４】
記憶装置８０６は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置８０６は、メモリ８１４と関連して記載されたシステムのうちの１又は複数のものを含んでよい。記憶装置８０６は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。一実施形態において、記憶装置８０６は、処理システム８０４によって生成された又は与えられたデータを記憶する。
【００８５】
実施例
実施形態を実施する方法／プロセス／プロトコルのいくつかの例が以下で記載される。特定の特徴（細胞型、サイトカイン、抗原提示等）がこれら実施例において記載されるが、それらはあくまでも例示の目的で行われる。本発明は以下の実施例に制限されない。
【００８６】
実施例１
ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ）の比較のためのベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を生成するため、白血球アフェレーシス生成物から純化した単球を樹状細胞に成熟させ、Ｗｏｌｆｌ（Ｗｏｌｆｌ中のｏの上には実際にはウムラルトがつくが、電子出願では使用できない文字なので省略してある。）とＧｒｅｅｎｂｅｒｇのプロトコル（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９巻、４号、２０１４年）に従って（白血球アフェレーシス生成物から凍結保存された）ドナー適合したＴ細胞と結びつける（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）。該プロトコルの全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【００８７】
最適な培養期間を決定するため、ドナー１細胞が２３日間培養された（５日間のＤＣ成熟と１８日間の共培養）。細胞増殖は、細胞培養の２０日目まで継続することが観察された。２０日目以降は、図９及び図１０に示されるように、細胞数及び生存率は減少した。
【００８８】
ドナー２を用いて、最適な単球純度及び最適な播種密度を決定した。単球は６井戸培養プレートに播種された。１つは、エルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）プロセスにおける第５分画から直接播種した約５０％純度のもの、もう１つは、ＣＤ１４マイクロビーズを用いて２つのＬＳカラム（ミルテニー）を通して行われる磁気ビーズ精製後の９９％純度のものである。上記２つの細胞純度条件で、１０Ｅ＋０６細胞数／ｍＬの密度から始まって、順次２倍希釈して３．１３Ｅ＋０５細胞数／ｍＬまでの密度で播種された。精製単球のための最適播種密度は、２．５Ｅ＋０６細胞数／ｍＬ及び純化されていない細胞に対して１．２５Ｅ＋０６において観察された（図１１参照）。
【００８９】
単球由来樹状細胞が、Ｔ細胞との共培養前の条件によってプールされ、Ｔ細胞は、単球由来樹状細胞と、比４：１で１９日間、共培養された。エルトリエーションプロセスから直接播種した細胞は、Ｔ細胞の増殖において、精製された単球と比べて、それ以上とは言わないまでも同程度にうまくいくことが観察された（図１２参照）。ドナー１と同様に、細胞生存率は、細胞増殖が横ばい状態になると、減少する（図１３参照）。
【００９０】
実施例２
Ｔ細胞は、以下の２つの方策でＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳにおいて良好に増殖される。すなわち、抗体機能化された常磁性ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（Ｑ１０７０）によるＣＤ３及びＣＤ２８の共刺激による方策、及び、オリジナルの白血球アフェレーシス生成物に存在する単球から成熟されたプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）である単球由来樹状細胞（ＤＣｓ）（Ｑ１０６９）による抗原提示による方策である。これら２つの方策は、Ｔ細胞培養の増殖に対して、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳにおいて初期の効果を発揮する（図１４参照）。
【００９１】
図１５は、概念実証（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ）のために、ＱＵＡＮＴＵＭシステムにおいて増殖された細胞の表現型分布を示す。ＤＣ刺激増殖及びビーズ刺激増殖の両方において、出発生成物及びＴ１７５フラスコで増殖させた細胞の両方に対して、表現型分布（ＣＤ４：ＣＤ８比）においてシフトが観察された。この初期データは、刺激の手法に関わらず、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録）ＣＥＳがＣＤ８Ｔ細胞増殖に有利であることを示唆する。
【００９２】
表１は、概念実証のための増殖における投入された細胞数及び収穫された細胞数を示す。
【００９３】
【表１】
2018519800.tif 000002
【００９４】
実施例３
多くのサイトカインは、Ｔ細胞増殖を促進する。そのようなサイトカインとしては、ＩＬ−２や、ＩＬ−７とＩＬ−１５との組み合わせ等がある。これらサイトカインを投与する方法として、適切なサイトカイン濃度含有の予め構成された培地のボーラス注入法（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と連続かん流法（ｃｏｎｔｉｎｕａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の２つの候補がある。これは、７群の研究によって調べられた。この研究では、ＩＬ−２のみ、ＩＬ−７とＩＬ−１５との組み合わせ、及びそれら３つのサイトカイン全ての組み合わせを上記２つの方法で、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳに供給して、直接比較した。この研究の対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、サイトカインを投入しない一群である。この調査から、ＩＬ−７とＩＬ−１５との組み合わせの連続かん流法において、より高い倍率の増殖が得られることが分かった（図１５参照）。図１５は、サイトカインの種々の組み合わせ及び２つの投与方法での比較のために行われたＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳの増殖における収穫数を示す。
【００９５】
実施例４
次のステップでは、細胞増殖中におけるＩＣ循環レートの増加及びバイオリアクターに対する６度揺動の付加を調べる。培養環境へのこれら新しい条件の適用は、Ｔ細胞増殖に対してネガティブな影響を与えることが分かった（図１６参照）。図１６は、対照群（バイオリアクター静止、循環レート５ｍｌ／ｍｉｎ）と揺動させながらＩＣ循環レートを増やす群（±６度の揺動、循環レート２０ｍｌ／ｍｉｎ）との収穫数の比較を示すグラフである。
【００９６】
実施例５
Ｔ細胞増殖は、組み換えヒトインターロイキン２（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＬ−２  ＩＳ）（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）と組み換えヒトインターロイキン７（ＩＬ−７）（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）とが補充されたＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰグレード培地（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）で促進される。Ｔ細胞増殖は、結合された共刺激シグナルすなわちＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ライフ・テクノロジーズ社、ニューヨーク州、グランドアイランド）又は可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）共刺激シグナルすなわちＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ）を用いて、開始される。ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳ（テルモＢＣＴ社、コロラド州、レイクウッド）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ロンザ社、スイス）でプライミングされ、システムから空気が除去される。プライミングシーケンスに従って、ＰＢＳは、ＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地に交換される。
【００９７】
新鮮で正常な末梢血白血球アフェレーシス製剤（ＬｅｕｋｏＰａｋ）は、ＣＯＢＥ（登録商標）スペクトラ・アフェレーシス・システム（テルモＢＣＴ社、レイクウッド、コロラド州）を用いて、単一ドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社、アラメダ、カリフォルニア州及びヘマケア社、ヴァン・ナイズ、カリフォルニア州）から得られる。ラボに到着したらすぐに、細胞濃度及び生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ベックマン・コールター社、ブレア、カリフォルニア州）によって測定される。また、リンパ球のパーセンテージが、コールターＡｃ−Ｔ  ｄｉｆｆ２（ベックマン・コールター社、ブレア、カリフォルニア州）血液分析器によって測定される。
【００９８】
白血球アフェレーシス製剤から１．０×１０8の一定分量のリンパ球が、細胞：ビーズ比２：１でＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）と、或いは１．０×１０6のリンパ球に対して２．５μｌでＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）と、が組み合わされ、さらに１．０×１０5ＩＵのＩＬ−２と２．５×１０3ｎｇのＩＬ−７とが組み合わされ、滅菌貯蔵ボトルにおいてＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地で１００ｍＬの容積にされる。細胞／サイトカイン／刺激ベクター液は処理されて、Ｃｅｌｌ  Ｉｎｌｅｔ  Ｂａｇ（テルモＢＣＴ社、レイクウッド、コロラド州）に入れられ、培地循環させながらバイオリアクターのＩＣ側へ投入され、中空糸において溶液が均一に分散される。
【００９９】
細胞投入後、ＴｅｘＭＡＣＳ培地を、ＩＣ側において１ｍＬ／ｍｉｎで、ＥＣ側において１００ｍＬ／ｍｉｎで循環させ、ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）とＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）とを伴う培地の連続かん流をバイオリアクターのＩＣインレットにて０．１ｍＬ／ｍｉｎで行う。バイオリアクターの方向は、３日目と６日目と９日目を除く増殖の最初の６日間は０°で静止している。３日目、６日目及び９日目では、ＩＣ循環及びＥＣ循環をそれぞれ１００ｍＬ／ｍｉｎに設定してＩＬ−２及びＩＬ−７を含む培地１５０ｍＬ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）増殖）のボーラス投与或いはＩＬ−２及びＩＬ−７及び可溶性共刺激シグナルを含む培地１５０ｍＬ（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）増殖）のボーラス投与をバイオリアクターのＩＣ側に対して３０ｍＬ／ｍｉｎで行い且つバイオリアクターを１秒の休止を挟んで−９０°と１８０°との間を連続揺動させる。ボーラス投与が完了すると、バイオリアクターは静止０°状態に戻され、インレット及び循環ポンプの設定は、増殖開始の値に戻される。
【０１００】
６日目から、バイオリアクターは、２４時間ごとに、０°と１８０°との間を１８０°反転される。ボーラス投与におけるＩＬ−２濃度及びＩＬ−７濃度は、投与ごとに変更される（表２参照）。各ボーラス投与後、細胞は均一な懸濁状態において、ＩＣサンプルループの一部は、ＴＳＣＤ（登録商標）ＩＩ無菌接合装置（テルモＢＣＴ社、レイクウッド、コロラド州）を用いて、切断・接合される。このサンプルは、増殖期間にわたって細胞濃度、生存率、細胞表現型及び分泌型サイトカインをモニタするために使用される。
【０１０１】
【表２】
2018519800.tif 000003
【０１０２】
細胞は、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳから、高密度洗い出し自動タスク（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｗａｓｈｏｕｔ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔａｓｋ）を用いて、増殖の７日目、１０日目、又は１２日目に収穫される。この収穫方法を促進するため、培地は、バイオリアクターを動かして（１秒間の休止を挟んだ−９０°と１８０°との間の連続揺動）良好に混合された細胞懸濁状態を達成しながら、ＩＣ側において、１００ｍＬ／ｍｉｎのレートで５分間循環させる。培地循環後、収穫バッグは、廃棄バッグの代わりに、廃棄ラインに接合される。高密度洗い出しのタスク設定値は、以下である：ＩＣインレット＝２００ｍＬ／ｍｉｎ、ＥＣ循環レート＝３００ｍＬ／ｍｉｎ及び停止条件＝１０００ｍＬ。サイトカイン無しの培地がこのタスクでは使用される。収穫後、細胞の生存度、絶対数、表現型特性が、フローサイトメトリーによって分析される。
【０１０３】
細胞は、Ｔ細胞として、ＣＤ３の発現によって特徴づけられる。また、ヘルパーサブセット、細胞傷害性サブセットは、それぞれＣＤ４、ＣＤ８の発現によって特徴づけられる。ＰｅｒＰＣ−Ｃｙ５．５（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）に結びついたＣＤ３のためのＵＣＨＴ１クローンを用いて、サンプルにおけるＣＤ３の表面受容体及び細胞内受容体の両方を色付けする。ＰＥ（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）に結びついたＣＤ４のＳＫ３クローンを用いて、サンプルにおけるＣＤ４の表面受容体を色付けする。ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ  ＦＩＴＣ（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）に結びついたＣＤ８のＢＷ１３５／８０クローンを用いて、サンプルにおけるＣＤ８の表面受容体を色付けする。非生存細胞は、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０細胞生死判定用色素（Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、分析から区別された。細胞表面及び細胞内の色付けは、ＦＩＸ  ＆  ＰＥＲＭ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフ・テクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）を用いて、なされた。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）において、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ソフトウェア  バージョン６．１．３（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて、解析された。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩは、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  ＣＳ＆Ｔ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）によってキャリブレーションされ、補正量は、ＢＤ  ＣｏｍｐＢｅａｄｓ（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）及びＡｒＣ（商標）アミン反応性色素用コンペンセーションビーズキット（Ａｍｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔ）（ライフ・テクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）を用いて、計算された。１サンプルに対して、１０，０００イベントが記録された。
【０１０４】
サンプルは、成熟中に、バイオリアクターのＩＣ側及びＥＣ側から周期的に取り出され、−２０°Ｃで保存された。その後、サンプルは室温に戻され、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイ（Ａｓｓａｙ）のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ８−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ（ライフ・テクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮγが分析された。該分析物は、ＭＡＧＰＩＸアナライザ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、オースチン、テキサス州）を用いてｘＰＯＮＥＮＴ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、オースチン、テキサス州）の収集・解析ソフトウェアを実行して、解析された。
【０１０５】
ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳにおいて、ＩＬ−２と共にＩＬ−７を使用することで、ＩＬ−２のみを用いた場合よりも、Ｔ細胞増殖が大きく増加することがわかる（図１７参照）。ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳにおいて、ビーズ結合ＣＤ３及びＣＤ２８共刺激抗体を用いたＴ細胞増殖は、可溶性共刺激抗体の増殖よりも優れている（図１８参照）。７日間後の増殖産生物は、ビーズによる増殖においてＣＤ３＋細胞が一貫して約９５％であり、可溶性に基づく増殖の大部分も同様のパーセンテージである（図１９参照）。しかしながら、増殖後の細胞産生物の生存率は、全てのドナーに対して、対応する可溶性に基づく増殖よりも一貫してビーズによる増殖の方が良好である（以下の表３参照）。表３において、＊＊＊は、システムの汚染により、増殖に対して測定不可だったことを示す。＊＊は、対応する対となる増殖に対して解析がなされたことを示す。全ての実験におけるサイトカインの解析は、ＩＬ−９の増加に伴うＴｈ１及び細胞傷害性サブセットに関連するサイトカインの増加を示す。ＩＬ−９は、培養培地へのＩＬ−７の付加によるＩＬ−２受容体群の刺激により、細胞増殖を促進し、細胞自然死を抑制することが知られてきた（図２０及び図２１）。
【０１０６】
ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＣＥＳは、アフェレーシス血液収集の一分画から５００倍を超えるＴ細胞を増殖することができる。自動化され且つ機能的に閉鎖されるシステムの製造プロセス制御によって、作業量を減らすことが可能となり、Ｔ細胞成熟における開放イベントも減らすことができる。その結果、細胞産生物の製造をより効率的に行える。
【０１０７】
【表３】
2018519800.tif 000004
【０１０８】
当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の方法及び構造に対して種々の変形及び変更を行えることは理解できよう。従って、本発明は、上記の特定の実施形態又は実施例に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、以下の請求項及びそれらの等価物の範囲内において、変形形態及び変更形態をも含むことが意図されている。
【０１０９】
本発明の実施形態及び適用例が示され説明されてきたが、本発明は、上記した構成に制限されないと理解されるべきである。当業者に明らかな種々の変形、変更等は、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の構成、動作、また方法及びシステムにおける詳細において行うことが可能である。
【図１】
2018519800.tif 000005
【図２】
2018519800.tif 000006
【図３】
2018519800.tif 000007
【図４】
2018519800.tif 000008
【図５】
2018519800.tif 000009
【図６】
2018519800.tif 000010
【図７】
2018519800.tif 000011
【図８】
2018519800.tif 000012
【図９】
2018519800.tif 000013
【図１０】
2018519800.tif 000014
【図１１】
2018519800.tif 000015
【図１２】
2018519800.tif 000016
【図１３】
2018519800.tif 000017
【図１４】
2018519800.tif 000018
【図１５】
2018519800.tif 000019
【図１６】
2018519800.tif 000020
【図１７】
2018519800.tif 000021
【図１８】
2018519800.tif 000022
【図１９】
2018519800.tif 000023
【図２０】
2018519800.tif 000024
【図２１】
2018519800.tif 000025
【国際調査報告】
2018519800.tif 000026
2018519800.tif 000027
2018519800.tif 000028
2018519800.tif 000029