(57)【要約】  本明細書で開示されているのは、遺伝子編集によるヒトジストロフィン遺伝子の修正用の治療標的および使用方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項２】
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含むＤＮＡターゲティング組成物であって、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、ＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項３】
前記第１のｇＲＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号４１であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号４２である、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項４】
前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項５】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉｉ）配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項６】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質をさらに含む、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項７】
前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９分子を含む、請求項６に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子を含む、請求項６に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号８３のヌクレオチド配列、配列番号８４のヌクレオチド配列、配列番号３７のヌクレオチド配列および／または配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のｇＲＮＡ分子を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のｇＲＮＡを含むベクター。
【請求項１２】
請求項６に記載のＤＮＡターゲティング組成物を含むベクター。
【請求項１３】
（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、
（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子、および
（ｃ）ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子
をコードするベクターであって、
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、ベクター。
【請求項１４】
前記ベクターは、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成されている、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号４１であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号４２である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１６】
前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１７】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ベクターは、前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子および／または前記Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項２２】
前記組織特異的プロモーターは筋肉特異的プロモーターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１に記載のｇＲＮＡを含む細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載のｇＲＮＡを含むキット。
【請求項２５】
細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、請求項１に記載のｇＲＮＡを細胞に投与することを含む方法。
【請求項２６】
対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、請求項１に記載のｇＲＮＡを含むゲノム編集用組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記ゲノム編集用組成物を前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記変異ジストロフィン遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、請求項１に記載のｇＲＮＡを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項３０】
対象中での変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の改変アデノ随伴ウイルスベクターであって、請求項１に記載のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９分子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む改変アデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項３１】
前記改変アデノ随伴ウイルスベクターは配列番号３９または配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の改変アデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項３２】
ジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１を含むセグメントの欠失用の組成物であって、
（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および
（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクター
を含み、
前記第１および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれがヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１のイントロン中でおよび第２のイオントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１を含むセグメントが欠失される、組成物。
【請求項３３】
前記セグメントは約５０個の塩基対〜約２，０００個の塩基対の長さを有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記セグメントは、約１１８個の塩基対、約２３３個の塩基対、約３２６個の塩基対、約７６６個の塩基対、約８０５個の塩基対または約１６１１個の塩基対の長さを有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は同一である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は異なる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第１のＣａｓ９分子または前記第２のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１のＣａｓ９分子および／または前記第２のＣａｓ９分子は、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＳａＣａｓ９分子を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターはウイルスベクターである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ジストロフィン遺伝子はヒトジストロフィン遺伝子である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記第１のｇＲＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記第１のベクターは配列番号３９に記載のヌクレオチド配列を含み、前記第２のベクターは配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項５０】
薬物での使用のための請求項３２に記載の組成物。
【請求項５１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置での使用のための請求項３２に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項３２に記載の組成物を含む細胞。
【請求項５３】
細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記細胞に、
（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および
（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含み、
前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中に第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される、方法。
【請求項５４】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊された読み枠、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切り詰め型遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、前記読み枠を破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容部位の破壊もしくはスプライス供与配列の破壊によるスプライシングの改変を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はエクソン５１の欠失を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は相同組換え修復を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞にドナーＤＮＡを投与することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞は筋芽細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象に由来する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しているヒト対象由来の筋芽細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および
（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクター
を投与することを含み、
前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される、方法。
【請求項６８】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１のベクターおよび第２のベクターを前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
エクソン５２が欠失した（Δ５２）ヒトジストロフィン遺伝子（ｈＤＭＤ）を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法であって、請求項１に記載のｇＲＮＡを齧歯動物胚に投与することを含む方法。
【請求項７２】
前記齧歯動物胚はマウス胚である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記遺伝子導入齧歯動物胚はヘテロ接合性ｈＤＭＤまたはヘテロ接合性ｈＤＭＤ−Δ５２である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子と配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子とを前記齧歯動物胚に投与して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２を欠失させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質を前記齧歯動物胚に投与することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
請求項７１に記載の方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚。
【請求項７７】
請求項７１に記載の遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６０，７１２号明細書および２０１６年５月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３３０，３３６号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利の陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐ  Ｐｒｏｇｒａｍによる賞の下で政府の支援を受けて行なわれた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９に基づくシステムおよびウイルス送達システムを使用する遺伝子発現の改変、遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野に関する。本開示はまた、筋肉（例えば骨格筋および心筋）での遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野にも関する。
【背景技術】
【０００４】
合成転写因子は、哺乳動物システムにおける多くの異なる医学的用途および科学的用途（例えば、組織再生の刺激、薬物スクリーニング、遺伝的欠陥の補償、抑制された腫瘍抑制因子の活性化、幹細胞分化の制御、遺伝子スクリーニングの実施および合成遺伝子回路の作成）のために遺伝子発現を制御するように操作されている。これらの転写因子は、内因性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーを標的とし得る、または導入遺伝子の調節のために哺乳動物のゲノムに直交する配列を認識するように意図的に設計され得る。ユーザーにより定義される配列を標的とする新規転写因子を設計するための最も一般的な戦略は、ジンクフィンガータンパク質および転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインをベースとしている。これらのアプローチの両方は、これらのドメインのタンパク質−ＤＮＡ相互作用の原理を、独自のＤＮＡ結合特異性を有する新規のタンパク質の設計に適用することが含まれる。これらの方法は多くの用途で広く成功しているが、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を操作するために必要なタンパク質工学は面倒な可能性があり、且つ専門知識を必要とする。
【０００５】
加えて、この新規のタンパク質は必ずしも有効であるとは限らない。この理由はまだ分かっていないが、ゲノム標的部位へのタンパク質結合に対するエピジェネティックな改変およびクロマチン状態の効果に関連している可能性がある。加えて、この新規のタンパク質および他の成分が各細胞に送達されることを確実にすることには課題が存在する。この新規のタンパク質およびその複数の成分を送達するための既存の方法として、コピー数の差異に起因して各細胞中での高度に可変な発現レベルに至る別々のプラスミドおよびベクターの細胞への送達が挙げられる。加えて、遺伝子導入後の遺伝子活性化はプラスミドＤＮＡの希釈に起因して一過性であり、一時的な遺伝子発現は、治療効果を誘導するのに十分ではない可能性がある。さらに、このアプローチは、容易には遺伝子導入されない細胞型には適していない。そのため、この新規のタンパク質の別の制限は転写活性化の効力である。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを使用して、標的とするゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。このＤＮＡ開裂は天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、２種の可能な修復経路のうちの一方に至る。ドナー鋳型の非存在下では、この切断は、ＤＮＡの小さい挿入または欠失が起こるエラーが発生し易い修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。この方法を使用して、標的とする遺伝子配列の読み枠を意図的に破壊し得る、欠失させ得る、または改変し得る。しかしながら、ドナー鋳型がヌクレアーゼと共に提供される場合、細胞機構は、この切断を相同組換えにより修復し、この相同組換えは、ＤＮＡ切断の存在下では桁違いに増強される。この方法を使用して、標的部位でＤＮＡ配列中に特定の変化を導入することができる。遺伝子操作されたヌクレアーゼは、様々なヒト幹細胞および細胞株での遺伝子編集ならびにマウス肝臓での遺伝子編集に使用されている。しかしながら、これらの技術の実施での大きな障害は、有効で効率的であり且つゲノム改変の成功を容易にする方法によるインビボでの特定の組織への送達である。
【０００７】
遺伝する遺伝性疾患は、米国において子供に破壊的な影響を及ぼす。これらの疾患は現在、治療法がなく、症状を緩和する試みによってのみ管理され得る。数十年にわたり、遺伝子治療の分野では、この疾患の治療法が約束されている。しかしながら、治療用遺伝子の細胞および患者への安全且つ効率的な送達に関する技術的な障害により、このアプローチは制限されている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、機能するジストロフィンの喪失に起因して、筋肉疲労、歩行の喪失および典型的には生後３０年での死亡を臨床的な特徴とする致命的な遺伝性疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中での遺伝的なまたは自発的な変異な結果である。ＤＭＤを引き起こすほとんどの変異はエクソンの欠失の結果であり、翻訳読み枠を枠外に押し出す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節に関与するタンパク質複合体の重要な構成要素である。ＤＭＤ患者は概して、小児期には自身を身体的に支える能力を失い、十代にはますます弱まり、二十代には死亡する。ＤＭＤのための現在の実験的遺伝子治療戦略は、一過性の遺伝子送達媒体の反復投与を必要とする、または外来遺伝子物質のゲノムＤＮＡへの永続的な組込みに依存する。これらの方法は両方とも、安全性に深刻な懸念を有する。さらに、これらの戦略は、大きく且つ複雑なジストロフィン遺伝子配列を送達することができないことにより制限されている。ジストロフィン遺伝子中に変異を有する患者を直すまたは処置するための、より正確で効率的な遺伝子編集ツールが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を対象とする。
【００１０】
本発明はまた、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含むＤＮＡターゲティング組成物も対象とする。この第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含む。この第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、異なるターゲティングドメインを含む。
【００１１】
本発明はまた、上記で説明したｇＲＮＡ分子または上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物を含む単離ポリヌクレオチドも対象とする。
【００１２】
本発明は、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物または上記で説明した単離ポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。
【００１３】
本発明はまた、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物を含むベクターも対象とする。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子、および（ｃ）ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子をコードするベクターも対象とする。この第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含む。この第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む。
【００１５】
本発明はまた、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物、上記で説明した単離ポリヌクレオチドまたは上記で説明したベクターを含む細胞も対象とする。
【００１６】
本発明はまた、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティングシステム、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクターまたは上記で説明した細胞と、任意選択で使用するための説明書とを含むキットも対象とする。
【００１７】
本発明はまた、細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法も対象とする。この方法は、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティングシステム、上記で説明した単離ポリヌクレオチドまたは上記で説明したベクターを細胞に投与することを含む。
【００１８】
本発明はまた、対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法も対象とする。この方法は、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティングシステム、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクターまたは上記で説明した細胞を含むゲノム編集用組成物を対象に投与することを含む。
【００１９】
本発明はまた、変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法も対象とする。この方法は、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティングシステム、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクターまたは上記で説明した細胞を対象に投与することを含む。
【００２０】
本発明はまた、対象中での変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の改変アデノ随伴ウイルスベクターであって、上記で説明したｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９分子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む改変アデノ随伴ウイルスベクターも対象とする。
【００２１】
本発明はまた、ジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１を含むセグメントの欠失用組成物であって、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを含む組成物も対象とする。第１および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれがヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される。
【００２２】
本発明はまた、上記で説明した組成物を含む細胞も対象とする。
【００２３】
本発明はまた、細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、この細胞に、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含む方法も対象とする。第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される。
【００２４】
本発明はまた、変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法も対象とする。この方法は、対象に、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含む。第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される。
【００２５】
本発明はまた、エクソン５２が欠失した（Δ５２）ヒトジストロフィン遺伝子（ｈＤＭＤ）を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法も対象とする。この方法は、上記で説明したｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティングシステム、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクター、上記で説明した改変アデノ随伴ウイルスベクターまたは上記で説明した組成物を齧歯動物胚に投与し、それにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２が欠失される、投与すること、およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２の欠失を有する遺伝子導入齧歯動物胚を選択することであって、この齧歯動物胚は正常なヒトジストロフィン遺伝子を含む、選択することを含む。
【００２６】
本発明はまた、上記で説明した方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚も対象とする。
【００２７】
本発明はまた、上記で説明した遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物も対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより決定した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のヒトジストロフィン遺伝子（野生型ジストロフィン遺伝子）ならびにＤＭＤ患者の筋芽細胞株（ＤＭＤ  ８０３６およびＤＭＤ  ６５９４、これらのそれぞれは、ジストロフィン遺伝子の変異型を有する）を標的とする個々のｇＲＮＡ  ＪＣＲ８９およびＪＣＲ９１の活性を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】ＳａＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ  ＪＣＲ８９およびＪＣＲ９１による同時処理に起因する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ならびにＤＭＤ筋芽細胞（ＤＭＤ  ８０３６およびＤＭＤ  ６５９４）のゲノムＤＮＡ中でのエクソン５１の欠失（図２Ａ）ならびにＤＭＤ筋芽細胞由来のｃＤＮＡ中でのエクソン５１の欠失（図２Ｂ）を示す。
【図３】２種のウイルスベクターによるＳａＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ  ＪＣＲ８９およびＪＣＲ９１の筋肉組織への同時送達に関するＡＡＶに基づくインビボシステムを示す。
【図４】ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡを担持するウイルスベクターの前脛骨（ＴＡ）筋への局所的ＡＡＶ８送達後の、ヒトＤＭＤ遺伝子を担持する遺伝子導入マウス（ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウス）でのヒトエクソン５１の欠失の検出を示す。
【図５】尾静脈注射による全身ＡＡＶ８送達後の、ｈＤＭＤ遺伝子を担持する遺伝子導入マウスでのヒトエクソン５１の欠失の検出を示す。
【図６】ヒトゲノムとアカゲザルゲノムとの間で保存されている様々なｇＲＮＡ標的を示す（表２中のｇＲＮＡの配列を参照されたい）。各ｇＲＮＡの位置を、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と関連させて示す。
【図７】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより決定した、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子導入後の個々のｇＲＮＡの活性を示す。
【図８】ＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒプログラム（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０：１４７３−１４７５）を使用して予測した候補ｇＲＮＡの特異性を示す。
【図９】ゲノムＤＮＡのＰＣＲにより決定した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるおよびＤＭＤ  ６５９４細胞中におけるｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０によるエクソン５１の欠失を示す。
【図１０】以下の様々な標的長：１９個、２０個、２１個、２２個および２３個のヌクレオチドのｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７の（Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより決定した）活性を示す。
【図１１】以下の様々な標的長：１９個、２０個、２１個、２２個および２３個のヌクレオチドのｇＲＮＡ  ＪＣＲ１６０の（Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより決定した）活性を示す。
【図１２】ゲノムＤＮＡのＰＣＲにより決定した、様々な長さ（２１個、２２個または２３個のヌクレオチド）のＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０を組み合わせることにより生じた欠失を示す。
【図１３】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによる、インビトロでのオンターゲットヌクレアーゼ活性を示す。
【図１４】ゲノムＤＮＡ中でのエクソン５１のインビトロでの欠失を示す。
【図１５】７日にわたり分化したヒトＤＭＤ筋芽細胞におけるｃＤＮＡ中でのエクソン５１のインビトロでの欠失を示す。
【図１６】ＤＭＤ患者筋芽細胞のｃＤＮＡ中におけるインビトロでのエクソン４７〜５２の接合を示す。
【図１７】健康なｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスから始まるΔ５２／ｍｄｘマウスの設計を示す。
【図１８】インビトロでのガイド検証を示す：個々（Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ）を示す。
【図１９】インビトロでのガイド検証を示す：対：ｇＲＮＡの対を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ中でのエクソン５１の欠失が生じた。
【図２０】ＤＮＡマイクロインジェクションプロトコルの概要を示す。
【図２１】マウス繁殖の概要を示す。
【図２２】ファウンダーマウスの遺伝子型同定の結果を示す。
【図２３】ファウンダーマウス７、６３および７６の配列決定の結果の一部を示す。
【図２４】さらなるマウス繁殖の概要を示す。
【図２５】ファウンダー雄７６＋ｍｄｘ／ｍｄｘ繁殖結果からの同腹仔５（雄のみ）の遺伝子型同定を示す。「６３」はファウンダー雄である（しかし、この場合には親ではなかった）。「２９３」は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡ対照を表す。
【図２６】ファウンダー雄６３＋ｍｄｘ／ｍｄｘの繁殖結果からの同腹仔１の遺伝子型同定を示す。
【図２７】仔５４４９７および５４４９８の３９２ｂｐの配列決定の読み取りの一部を示す。
【図２８】仔５４４９７および５４４９８からの心臓およびＴＡの免疫組織化学的染色を示す。
【図２９】Δ５２／ｍｄｘマウスがジストロフィンタンパク質を欠くことを示す。
【図３０】Δ５２／ｍｄｘマウスは、ＤＭＤ遺伝子型と一致するジストロフィンタンパク質を欠くが、健康なｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスはジストロフィンを発現することを示すウエスタンブロットを示す。
【図３１】自発運動および探索により示す、ｍｄｘマウスおよびｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスと比較したΔ５２／ｍｄｘマウスの全体的な活動性を示す。
【図３２】除去のためにイントロン領域中のエクソン５１の上流および下流をｇＲＮＡが標的とすることによる、エクソン５１をスキップするためにＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡを使用するΔ５２／ｍｄｘマウスの修正戦略を示す。
【図３３】ＳａＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ  ＪＣＲ１７９およびＪＣＲ１８３を使用する、ＤＭＤ患者筋芽細胞（ＤＭＤ  ６５９４細胞）中でのエクソン５１欠失からのジストロフィンタンパク質のインビトロでの回復を示す。
【図３４】ｇＲＮＡおよびＳａＣａｓ９システムを使用してΔ５２／ｍｄｘマウスを処理するための実験設計を示す。
【図３５】右ＴＡ筋中でのインビボでのエクソン５１欠失を示す。
【図３６】右ＴＡ筋中でのインビボでのエクソン５１欠失を示す。
【図３７】処理ＴＡ筋中におけるインビボでのジストロフィンタンパク質の回復を示す。
【図３８】処理ＴＡ筋中におけるインビボでのジストロフィンタンパク質の回復を示す。
【図３９】移動した総距離に関する全ての時点の平均を示す。
【図４０】後ろ足で立っている姿勢の合計に関する全ての時点の平均を示す。
【図４１】１６週の未処理マウスおよび処理マウスの握力を示す。
【図４２】心臓組織のｃＤＮＡ  ＰＣＲ結果を示す。
【図４３】図４２の増幅ｃＤＮＡ  ＰＣＲバンドの配列決定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書で説明されているように、特定の方法および操作されたｇＲＮＡは、発現の変更、ゲノム操作、および遺伝性疾患（例えばＤＭＤ）に関与するジストロフィン遺伝子での変異の効果の修正または低減のためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９に基づく遺伝子編集システムで有用であることを発見している。本開示のｇＲＮＡを、臨床翻訳により適している標的部位に生成した。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードする遺伝子は、他の全ての必要な調節配列が含まれる場合には筋肉への全身性遺伝子送達に使用されるベクターであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により送達されるには大きすぎる。その代わりに、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳｓＣａｓ９）（ＳｐＣａｓ９と比べて約１ｋｂ小さい）と共に使用するために、本開示のｇＲＮＡを選択してスクリーニングした。標的選択を、ヒトゲノムとアカゲザルゲノムとの間で保存された配列上の、ＳａＣａｓ９に適合する標的であるかに関してスクリーニングし、これにより、可能な遺伝子標的の数が大きく制限される。この選択基準を、非ヒト霊長類モデルにおける前臨床試験を容易にするためにヒトおよびアカゲザルの両方で活性であり得るｇＲＮＡ候補を考慮するように選択した。本開示のｇＲＮＡ（ヒトおよびアカゲザルの両方のジストロフィン遺伝子配列を標的とする）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムと共に使用して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の周囲のイントロン領域を標的とし得、この領域のゲノム欠失が生じて、ＤＭＤ患者由来の細胞において機能するジストロフィンの発現が回復される。
【００３０】
また、本明細書で説明されているのは、ジストロフィン遺伝子を標的とすべく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムおよび複数のｇＲＮＡを送達するための遺伝子コンストラクト、組成物および方法でもある。本開示の主題はまた、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を骨格筋および心筋に送達する方法も提供する。このベクターはＡＡＶ（例えば改変ＡＡＶベクター）であることができる。本開示の主題は、効果的で効率的であり且つゲノム改変の成功を容易にする、骨格筋または心筋へのこのクラスの治療剤の活性型を送達する方法を説明し、さらには、治療用途のためにヒトゲノムを書き直す手段および基礎科学用途のための標的モデル種を提供する。
【００３１】
このセクションおよび本明細書での開示全体で使用するセクションの表題は、単に構成を目的とするだけであり、限定することを意図するものではない。
【００３２】
１．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に説明されているが、本明細書で説明されたものと類似のまたは等価の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００３３】
用語「含む」、「含まれる」、「有すること」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびこれらの異形は、本明細書で使用する場合、追加の作用または構造可能性を排除しない、制約のない移り変わる語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。本開示はまた、明確に説明してもしなくても、本明細書で提供される実施態様または要素を「含む」、「〜からなる」、および「本質的に〜からなる」、他の実施態様を意図する。
【００３４】
本明細書の数値範囲の列挙については、それぞれその間にある数が、同じ程度の正確性で、明確に意図される。例えば、６〜９の範囲については、６および９に加えて、数値７および８が意図され、範囲６．０〜７．０については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明確に意図される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容される誤差範囲内を意味し、この誤差範囲は、この値がどのようにして測定されるかまたは決定されるか（即ち、測定システムの限界）によってある程度決まるだろう。例えば、「約」は、当分野での慣習に従って、３または３超の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％の範囲を意味し得、好ましくは最大１０％の範囲を意味し得、より好ましくは最大５％の範囲を意味し得、より好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁内を意味し得、好ましくは５倍以内を意味し得、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
【００３６】
本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種を感染させる、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する、小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、現在、疾患を引き起こすことが知られておらず、したがって、ウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。
【００３７】
本明細書で使用される「結合領域」は、ヌクレアーゼによって認識および結合される、ヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。
【００３８】
本明細書において互換的に使用される「心筋（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）」または「心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ）」は、心臓の壁および組織学的基礎で見られる一種の不随意性の横紋筋（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））を意味する。心筋は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）で作られている。心筋細胞は骨格筋細胞上の条線と同様の条線を示すが、多核骨格筋とは異なり唯一の固有の核を含む。特定の実施態様では、「心筋状態」は、心筋に関連する状態（例えば、心筋症、心不全、不整脈および炎症性心疾患）を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「コード配列」または「コードする核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個人または哺乳類の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、コドン最適化することができる。
【００４０】
本明細書で使用される「相補体」または「相補的」は、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を生じることができることを意味する。「相補性」は、互いに逆平行に整列させた時に各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるような、２つの核酸配列間に共有される性質を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「修正すること」、「ゲノム編集すること」、および「修復すること」は、切り詰め型タンパク質をコードするまたはタンパク質をまったくコードしない変異遺伝子を、完全長の機能性または部分的に完全長の機能性タンパク質発現が得られるように変化させることを指す。変異遺伝子を修正することまたは修復することは、変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または変異遺伝子全体を、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）などの修復機構を用いて、変異を有しない遺伝子のコピーと置き換えることを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、遺伝子内の二本鎖切断をもたらし、次いでこの遺伝子を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復することによって、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位をもたらすフレームシフト変異を修復することを含むことができる。ＮＨＥＪは、修復中に少なくとも１つの塩基対を付加または欠失させることができ、これは、適切な読み枠を修復するおよび未成熟終止コドンを除去することができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、異所性スプライス受容部位またはスプライスドナー配列を破壊することを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去することによって、適切な読み枠を修復するために、同じＤＮＡ鎖上での２種のヌクレアーゼの同時作用によって、非必須遺伝子セグメントを欠失させることと、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することとを含むことができる。
【００４２】
本明細書で互換的に使用される「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」、および「修復鋳型」は、対象となる遺伝子の少なくとも一部分を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能性のタンパク質または部分的に機能性のタンパク質をコードすることができる。
【００４３】
本明細書で互換的に使用される「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋変性および最終的に死をもたらす、劣性遺伝の致死的なＸ連鎖性障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性の単一遺伝子性疾患であり、男性の３５００人に１人に発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子のナンセンスまたはフレームシフト変異をもたらす、遺伝性変異または自然突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、ジストロフィン遺伝子において読み枠を破壊して早期翻訳終結を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、一般的に、小児期に自分自身の身体を支える能力を失い、１０代の間に次第に筋力が低下するようになり、２０代で死亡する。
【００４４】
本明細書で使用される「ジストロフィン」は、筋線維の細胞骨格を細胞膜を通して周囲の細胞外基質に連結するタンパク質複合体の一部である、棒状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節を担う細胞膜のジストログリカン複合体に、構造安定性を提供する。本明細書で互換的に使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１の２．２メガ塩基である。一次転写物は、約２，４００ｋｂであり、成熟したｍＲＮＡは、約１４ｋｂである。７９エクソンが、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。
【００４５】
本明細書で使用される「エクソン５１」は、ジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者では、フレーム破壊欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングについての臨床試験において標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンについての臨床試験は、最近、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維を伴う、４８週にわたる有意な機能性の利益を報告した。エクソン５１の変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。
【００４６】
本明細書で互換的に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つ以上のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡ内のコドンの読み枠のずれをもたらす、遺伝子変異の種類を指す。読み枠のずれは、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどの、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変更をもたらす可能性がある。
【００４７】
本明細書で使用される「機能性」および「完全に機能性」は、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、元々は別のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子の連結を介して作製されたキメラタンパク質を指す。融合体遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性をもつ単一のポリペプチドをもたらす。
【００４９】
本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個人の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されることとなるような、タンパク質をコードするコード配列に、作動可能に連結された必須の調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。
【００５０】
本明細書で使用される「遺伝性疾患」は、ゲノム内の１つ以上の異常によって、部分的にまたは完全に、直接的にまたは間接的に引き起こされる疾患、特に、生まれつき存在する状態を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、限定はされないが、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性の障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、地中海貧血症、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得る。
【００５１】
本明細書で互換的に使用される「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、大抵は細胞周期のＧ２およびＳ期において、ＤＮＡの相同の断片が核内に存在する場合に、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための、細胞における機構を指す。ＨＤＲは、修復を誘導するためのドナーＤＮＡ鋳型を使用し、また、ゲノムに対する特定の配列変化（全遺伝子の標的とされる付加を含めて）を作り出すために使用することができる。ドナー鋳型が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムと共に提供される場合、細胞機構は、相同組換えによって切断を修復することとなり、これは、ＤＮＡ切断の存在下で、数桁増強される。相同のＤＮＡ断片が存在しない場合、代わりに非相同末端結合が起こり得る。
【００５２】
本明細書で使用される「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは修復することを含むことができる。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含むことができる。ゲノム編集は、対象となる遺伝子を変化させることによって、疾患を治療する、または筋肉修復を増強するために使用することができる。
【００５３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況で本明細書で使用される「同一な」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域にわたって同一である、特定の割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適に整列させ、これらの２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一な残基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を出し、マッチ位置の数を、特定の領域における位置の総数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性の割合を出すことによって算出することができる。２つの配列が異なる長さのものである、または整列によって１つ以上の粘着末端が生じて比較の特定の領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、等しいとみなすことができる。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって実施することができる。
【００５４】
本明細書で互換的に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異を受けている遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書で使用される「破壊された遺伝子」は、未成熟終止コドンをもたらす変異を有する、変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較すると切り詰め型である。
【００５５】
本明細書で使用される「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同の鋳型を必要とせずに、切断末端を直接的に連結することによって、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによる、鋳型に依存しないＤＮＡ末端の再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する、確率的な、誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされる遺伝子配列を意図的に破壊する、欠失させる、または読み枠を変更するために使用することができる。ＮＨＥＪは、一般的に、修復を誘導するための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同のＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、しばしば、二本鎖切断の末端の単鎖オーバーハング中に存在する。このオーバーハングが完璧に適合する場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復し、一方で、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、これは、オーバーハングが適合しない場合にははるかに一般的である。
【００５６】
本明細書で使用される「正常遺伝子」は、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
【００５７】
本明細書で使用される「ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ」は、Ｃａｓ９分子などのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。
【００５８】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって共に連結された、少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。単鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写した単鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同一の目的のために、核酸の多くのバリアントを使用することができる。したがって、核酸は実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
【００５９】
核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るし、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することもできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン  ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。
【００６０】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結されたプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御するプロモーターと遺伝子との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知であるように、この距離のバリエーションは、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応させることができる。
【００６１】
本明細書で使用される「部分的に機能性」は、変異遺伝子によってコードされ、かつ、機能性タンパク質よりも低い生物活性を有するが、非機能性タンパク質よりも高い生物活性を有する、タンパク質を説明する。
【００６２】
本明細書で互換的に使用される「未成熟終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、野生型遺伝子には通常見られない位置での終止コドンをもたらす、ＤＮＡの配列内のナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、完全長型のタンパク質と比較して切断されているまたは短いタンパク質をもたらす可能性がある。
【００６３】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または促進することが可能である、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するための、かつ／または、空間的発現および／または同じものの時間的発現を変更するための、１つ以上の特異的な転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた起源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、原体、金属イオン、または誘発物質などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的または変動的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターおよびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用される「骨格筋」は、体性神経系の制御下にあり、かつ腱として公知のコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の種類を指す。骨格筋は、時として口語的に「筋線維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）」と呼ばれる、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）として公知の個々の成分、または「筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）」で構成されている。筋細胞は、筋形成として公知のプロセスにおいて、発達性の筋芽細胞（筋肉細胞をもたらす、ある種類の胚性前駆細胞）の融合体から形成される。これらの長い円柱形の多核細胞は、筋線維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）とも呼ばれる。
【００６５】
本明細書で使用される「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、老化、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または筋萎縮症などの、骨格筋に関連する状態を指す。
【００６６】
本明細書で互換的に使用される「対象」および「患者」は、限定はされないが、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、およびヒト）を含めた、あらゆる脊椎動物を指す。いくつかの実施態様では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
【００６７】
「標的遺伝子」は、本明細書で使用される場合、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝性疾患に関与する変異遺伝子であることができる。特定の実施態様では、標的遺伝子はヒトジストロフィン遺伝子である。特定の実施態様では、標的遺伝子は変異ヒトジストロフィン遺伝子である。
【００６８】
「標的領域」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが結合して開裂するように設計されている標的遺伝子の領域を指す。
【００６９】
本明細書で使用される「導入遺伝子」は、ある生物から単離されており、別の生物に導入される、遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持することもできるし、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常な機能を変えることもできる。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。
【００７０】
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参考ヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参考ヌクレオチド配列の相補体、もしくはその一部；（ｉｉｉ）参考核酸と実質的に同一である核酸、もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参考核酸とハイブリッド形成する核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列を意味する。
【００７１】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参考タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸と置き換えることは、微小な変化を一般的に伴うものと当技術分野で認識されている。これらの微小な変化は、当技術分野で理解されている通り、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性指標のアミノ酸が置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドという状況でのアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生体機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。
【００７２】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、このベクターは、Ｃａｓ９タンパク質および少なくとも１種のｇＲＮＡ分子（例えば、配列番号１〜１９、４１、４２のいずれか１つのターゲティングドメインまたはその相補体を含むｇＲＮＡ）をコードすることができる。いくつかの実施態様では、このＣａｓ９タンパク質は、配列番号２７、配列番号３３または配列番号４５のアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施態様では、このＣａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（例えば、配列番号３３または４５のアミノ酸配列を有するＳａＣａｓ９）であることができる。いくつかの実施態様では、このＣａｓ９タンパク質は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４３または配列番号４４の核酸配列を含む核酸配列によりコードされる。
【００７３】
本明細書で別に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される、あらゆる学術用語、およびこれらの技術は、周知でありかつ当技術分野で普通に使用されるものである。用語の意味および範囲は、明確であるべきである；しかし、いずれかの潜在的あいまい性の場合には、本明細書で提供する定義が、あらゆる辞書または外部の定義よりも先行する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語には、複数形が含まれるものとし、複数の用語には、単数形が含まれるものとする。
【００７４】
２．ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト
本発明は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のゲノム編集、ゲノム改変またはゲノム発現の変更のための遺伝子コンストラクトを対象とする。この遺伝子コンストラクトは、ヒトおよびアカゲザルの両方のジストロフィン遺伝子配列（例えば、ＳａＣａｓ９に適合する標的）を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。本開示のｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の周囲のイントロン領域を標的とするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム（例えば、ＳａＣａｓ９を使用するシステム）に含まれ得、この領域のゲノム欠失を引き起こして、ＤＭＤ患者由来の細胞中で機能するジストロフィンの発現を回復させる。
【００７５】
ａ．ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、細胞膜を介して筋繊維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとをつなぐタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１で２．２ベガ塩基である。一次転写は約２，４００ｋｂを測定し、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９種のエクソンは、３５００個を超えるアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織には、わずかな量のジストロフィンしか含まれないが、このジストロフィンの異常な発現の欠如により、重度且つ不治の症状が発症する。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では不完全なジストロフィンおよび重度のジストロフィー表現型が産生される。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では、部分的に機能するジストロフィンタンパク質および非常に軽度のジストロフィー表現型がもたらされる。
【００７６】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中でナンセンス変異またはフレームシフト変異を引き起こす遺伝的なまたは自発的な変異の結果である。天然に存在する変異およびその結果は、ＤＭＤに関して比較的よく理解されている。ロッドドメインに含まれるエクソン４５〜５５領域（例えばエクソン５１）中で起こるインフレーム欠失により、高度に機能するジストロフィンタンパク質が産生され得、多くの保有者は無症状であるか軽度の症状を呈することが知られている。さらに、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的とする（例えばエクソン５１を標的とする）ことにより、理論的には患者の６０％超を処置することができる。ｍＲＮＡのスプライシングの最中に非必須エクソンをスキップさせて（例えば、エクソン５１をスキップさせて）、内部的には欠失しているが機能するジストロフィンタンパク質を産生することにより、ＤＭＤ患者の破壊されたジストロフィン読み枠を回復させる努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（例えば、エクソン５１の欠失）により、適切な読み枠が保持されるものの比較的軽度のベッカー型筋ジストロフィー（即ちＢＭＤ）が引き起こされる。ベッカー型筋ジストロフィー（即ちＢＭＤ）遺伝子型は、ジストロフィン遺伝子中に欠失が存在するという点でＤＭＤと類似する。しかしながら、この欠失は読み枠を無傷に保つ。そのため、内部的には切り詰められるが部分的に機能するジストロフィンタンパク質が作られる。ＢＭＤは幅広い表現型を有するが、多くの場合、ジストロフィンのエクソン４５〜５５の間に欠失が存在する場合には、この表現型はＤＭＤと比べてはるかに軽度である。そのため、ＤＭＤ遺伝子型をＢＭＤ遺伝子型へと変更することは、ジストロフィンを修正するための一般的な戦略である。ジストロフィンを修正するための多くの戦略が存在し、これらの多くは、内因性ジストロフィンの読み枠の回復に依存する。これにより、疾患の遺伝子型がＤＭＤからベッカー型筋ジストロフィーへとシフトする。多くのＢＭＤ患者は、翻訳読み枠を維持する遺伝子内欠失を有し、より短いが大部分が機能するジストロフィンタンパク質が生じる。
【００７７】
特定の実施態様では、読み枠を回復させるためのエクソン５１の改変（例えば、例えばＮＨＥＪによるエクソン５１の欠失または排除）により、欠失変異を有するＤＭＤ対象等の表現型ＤＭＤ対象が改善される。特定の実施態様では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１はジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１はＤＭＤ患者のフレーム破壊性欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングの臨床試験で標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンの臨床試験では、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性繊維を伴い４８週にわたり有意な機能的利点が報告された。エクソン５１での変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。
【００７８】
本開示のベクターは、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）中で欠失を生じさせることができる。特定の実施態様では、このベクターは、ジストロフィン遺伝子の標的位置に隣接する２つのイントロン（第１のイントロンおよび第２のイントロン）中で２つの二本鎖切断（第１の二本鎖切断および第２の二本鎖切断）を形成し、それにより、ジストロフィン遺伝子においてジストロフィン標的位置を含むセグメントが欠失されるように構成されている。「ジストロフィン標的位置」は、本明細書で説明したジストロフィンのエクソン標的位置またはジストロフィンのエクソン内標的位置であることができる。ジストロフィンのエクソン標的位置の欠失により、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している患者のジストロフィン配列が最適化され得、例えば、コードされるジストロフィンタンパク質の機能もしくは活性が増加され得る、または対象の疾患状態が改善される。特定の実施態様では、ジストロフィンのエクソン標的位置の排除により読み枠が回復される。このジストロフィンのエクソン標的位置は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンを含むことができる。特定の実施態様では、このジストロフィン標的位置は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１を含む。
【００７９】
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１での高効率の遺伝子編集を媒介することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中でのジストロフィンタンパク質の発現を回復させる。
【００８０】
エクソン５１は、ＤＭＤでのフレーム破壊性欠失に頻繁に隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写産物からのエクソン５１の除去を使用して、全ＤＭＤ患者の約１５％を処置することができる。このクラスのジストロフィン変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な修正に理想的に適している。本明細書で説明された遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン５１の標的型改変用に開発されている。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）はヒトＤＭＤ細胞中に遺伝子導入され、読み枠を修正するための効率的な遺伝子改変および遺伝子変換を媒介する。タンパク質の回復はフレーム回復と同時であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムで処理された細胞の大部分で検出される。
【００８１】
ｂ．ＣＲＩＳＰＲシステム
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）に特異的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする。「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、本明細書で互換的に使用される場合、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノムで見られる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ノンコーディングＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短い部分が、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（本明細書で互換的に「ｇＲＮＡ」とも称される）の３’末端との複合体を形成し、このタンパク質−ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ定義された２０ｂｐ  ＤＮＡ配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム上の標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内のコードされた領域を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に誘導される。ノンコーディングＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート内で転写および切断されて、個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡとなり、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導する。発現されるｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ゲノム上の新しい標的に誘導することができるようになる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと同様の方式で外来性遺伝因子を認識および発現停止させるために使用される。
【００８２】
３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型エフェクター系）が公知である。ＩＩ型エフェクター系は、単一のエフェクター酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの連続的ステップで、標的ＤＮＡ二本鎖破壊を行って、ｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核細胞などの代替状況において機能することができる。ＩＩ型エフェクター系は、長い前駆‐ｃｒＲＮＡ（これは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される）、Ｃａｓ９タンパク質、およびｔｒａｃｒＲＮＡ（これは、前駆‐ｃｒＲＮＡプロセシングに関与する）からなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、前駆‐ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てている反復領域とハイブリッド形成し、したがって、内在性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断に、Ｃａｓ９による各スペーサー内の第２の切断現象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と結合されたままである成熟ｃｒＲＮＡが産生され、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。
【００８３】
Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二重鎖をほどき、ｃｒＲＮＡとの配列マッチングを探索して切断する。標的認識は、標的ＤＮＡ内の「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡ内の残存するスペーサー配列との間の相補性の検出時に発生する。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーターゲティングについては、配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちＤＮＡ切断に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列の直後でなければならない。別のＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ系は、５’−ＮＲＧ−３’（ここで、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかである）としての、かつ、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける、このＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のためのＰＡＭ配列を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの独自の能力は、２つ以上のｓｇＲＮＡを伴う単一のＣａｓ９タンパク質を同時発現させることによって、複数の異なるゲノム上遺伝子座を同時に標的にする、直接的な能力である。例えば、遺伝子改変された系において、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型系は、本来は「ＮＧＧ」配列（ここで、「Ｎ」は、いずれかのヌクレオチドであり得る）を使用することを好むが、「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れられる（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴという天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ  ＰＡＭを含めた様々なＰＡＭにわたって活性を有する（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８１）。
【００８４】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２２）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２３）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２４）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。上述の実施態様では、Ｎは任意のヌクレオチド残基であり得、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであり得る。Ｃａｓ９分子を操作して、このＣａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
【００８５】
（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム
化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子改変された形態のＩＩ型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Ｃａｓ９タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、また、本明細書ではキメラ一本鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と互換的に使用され、一般に、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  およびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を不要にするｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である）によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。本明細書で提供するのは、ゲノム編集、および遺伝性疾患の治療における使用のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく編集システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく編集システムは、遺伝性疾患、老化、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含めた、あらゆる遺伝子を標的にするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質と、少なくとも１つのｇＲＮＡとを含むことができる。特定の実施態様では、システムは２種のｇＲＮＡ分子を含む。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、トランス活性化ドメインなどの、Ｃａｓ９にとって内在性であるものとは異なる活性を有するドメインを含むことができる。
【００８６】
標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子、例えばヒトジストロフィン遺伝子）は、細胞の分化にもしくは遺伝子の活性化が所望され得る任意の他のプロセスに関与し得る、または変異（例えばフレームシフト変異もしくはナンセンス変異）を有し得る。この標的遺伝子が、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を生じる変異を有する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを、この未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識してこの配列に結合するように設計することができる。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づくシステムを使用して、スプライス受容体またはスプライス供与体を標的として未成熟終止コドンのスキッピングを誘導することによりまたは破壊された読み枠を回復させることにより正常な遺伝子スプライシングを破壊することもできる。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、ゲノムのタンパク質コード領域へのオフターゲット変化を媒介する場合もあるし媒介しない場合もある。
【００８７】
（ａ）Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は核酸を開裂するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によりコードされ、且つＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、以下が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる細菌または古細菌の種に由来し得る：化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、アシドボラックス・アヴェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレン（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ���、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアセアエ・バクテリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サブドリグラヌルム種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）。特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子（本明細書では「ＳｐＣａｓ９」とも称される）である。特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子（本明細書では「ＳａＣａｓ９」とも称される）である。
【００８８】
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質は、１種または複数種のｇＲＮＡ分子と相互作用し得、このｇＲＮＡ分子と共同して、標的ドメインを含む部位に局在化し、特定の実施態様ではＰＡＭ配列に局在化する。Ｃａｓ９分子またはＣａ９融合タンパク質のＰＡＭ配列を認識する能力を、例えば既に説明されている形質転換アッセイ（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）を使用して決定することができる。
【００８９】
特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質の標的核酸と相互作用してこの標的核酸を開裂する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。特定の実施態様では、標的核酸の開裂はＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種由来のＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えばＰＡＭ配列）を認識することができる。特定の実施態様では、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａ９分子は配列モチーフＮＧＧを認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＭａｌｉ  ２０１３を参照されたい）。特定の実施態様では、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧＮＧ（配列番号３６）および／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）（配列番号２０）を認識し、これらの配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＨｏｒｖａｔｈ  ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。特定の実施態様では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２１）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＤｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２２）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２３）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２４）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、この配列の１〜１０（例えば３〜５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。上述の実施態様では、Ｎはあらゆるヌクレオチド残基であり得、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであり得る。Ｃａｓ９分子を操作して、このＣａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
【００９０】
特定の実施態様では、ベクターは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子をコードする。特定の実施態様では、この少なくとも１種のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施態様では、この少なくとも１種のＣａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。
【００９１】
Ｃａｓタンパク質を、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変異させることができる。エンドヌクレアーゼ活性を有しない不活性化Ｃａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、「ｄＣａｓ９」とも称される）は最近、立体障害を介して遺伝子発現を抑制するために、ｇＲＮＡによって細菌、酵母およびヒト細胞において遺伝子を標的としている。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列に関連する例示的な変異として、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に関連する例示的な変異として、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施態様では、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子はＤ１０Ａ変異を含む。この変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を配列番号３４に示し、以下に記載する：
【化１】
2018534950.tif 000002
【化２】
2018534950.tif 000003
【００９２】
特定の実施態様では、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子はＮ５８０Ａ変異を含む。この変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列を配列番号３５に示し、以下に記載する：
【化３】
2018534950.tif 000004
【化４】
2018534950.tif 000005
【化５】
2018534950.tif 000006
【００９３】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸は合成核酸配列であることができる。例えば、この合成核酸分子を化学的に改変することができる。この合成核酸配列はコドン最適化され得、例えば、少なくとも１つの非共通（ｎｏｎ−ｃｏｍｍｏｎ）コドンまたは低共通（ｌｅｓｓ−ｃｏｍｍｏｎ）コドンが共通コドンで置き換えられている。例えば、この合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡ（例えば、例えば本明細書で説明されている哺乳類の発現系での発現に最適化されている）の合成を指示することができる。
【００９４】
加えて、またはあるいは、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は核局在化配列（ＮＬＳ）を含むことができる。核局在化配列は当分野で既知である。
【００９５】
化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列を配列番号２６示し、以下に記載する。
【化６】
2018534950.tif 000007
【化７】
2018534950.tif 000008
【化８】
2018534950.tif 000009
【００９６】
化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列を配列番号２７に示し、以下に記載する。
【化９】
2018534950.tif 000010
【００９７】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードし且つ任意選択で核局在化配列（ＮＬＳ）を含む例示的なコドン最適化核酸配列を配列番号２８〜３２、４３および４４に示し、以下に記載する。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする別の例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号８３のヌクレオチドヌクレオチド１２９３〜４４５１を含む。
【００９８】
配列番号２８を以下に記載する。
【化１０】
2018534950.tif 000011
【化１１】
2018534950.tif 000012
【化１２】
2018534950.tif 000013
【００９９】
配列番号２９を以下に記載する。
【化１３】
2018534950.tif 000014
【化１４】
2018534950.tif 000015
【０１００】
配列番号３０を以下に記載する。
【化１５】
2018534950.tif 000016
【化１６】
2018534950.tif 000017
【化１７】
2018534950.tif 000018
【０１０１】
配列番号３１を以下に記載する。
【化１８】
2018534950.tif 000019
【化１９】
2018534950.tif 000020
【０１０２】
配列番号３２を以下に記載する。
【化２０】
2018534950.tif 000021
【化２１】
2018534950.tif 000022
【化２２】
2018534950.tif 000023
【０１０３】
配列番号４３を以下に記載する。
【化２３】
2018534950.tif 000024
【化２４】
2018534950.tif 000025
【０１０４】
いくつかの実施態様では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列は配列番号４４のヌクレオチド配列を含み、配列番号４４を以下に記載する。
【化２５】
2018534950.tif 000026
【化２６】
2018534950.tif 000027
【０１０５】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を配列番号３３に示し、以下に記載する。
【化２７】
2018534950.tif 000028
【０１０６】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を配列番号４５に示し、以下に記載する。
【化２８】
2018534950.tif 000029
【０１０７】
あるいは、または加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは融合タンパク質を含むことができる。この融合タンパク質は２種の異種ポリペプチドドメインを含み得、第１のポリペプチドドメインはＣａｓタンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインは活性（例えば、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性またはデメチラーゼ活性）を有する。この融合タンパク質は、活性（例えば、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性もしくはデメチラーゼ活性）を有する別のポリペプチドドメインに融合したＣａｓ９タンパク質または変異Ｃａｓ９タンパク質を含むことができる。
【０１０８】
（ａ）転写活性化活性
第２のポリペプチドドメインは転写活性化活性（即ちトランス活性化ドメイン）を有することができる。例えば、ｇＲＮＡの組み合わせを介してｉＣａｓ９とトランス活性化ドメインとの融合タンパク質の標的を哺乳類のプロモーターに定めることにより、内因性の哺乳類遺伝子（例えばヒト遺伝子）の遺伝子発現を活性化することができる。このトランス活性化ドメインは、１つのＶＰ１６タンパク質、複数のＶＰ１６タンパク質（例えばＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメイン）、またはＮＦカッパＢ転写活性化因子活性のｐ６５ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質はｉＣａｓ９−ＶＰ６４であることができる。
【０１０９】
（ｂ）転写抑制活性
第２のポリペプチドドメインは転写抑制活性を有することができる。この第２のポリペプチドドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス活性（例えばＫＲＡＢドメイン）、ＥＲＦ抑制因子ドメイン活性、Ｍｘｉｌ抑制因子ドメイン活性、ＳＩＤ４Ｘ抑制因子ドメイン活性、Ｍａｄ−ＳＩＤ抑制因子ドメイン活性またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有することができる。例えば、融合タンパク質はｄＣａｓ９−ＫＲＡＢであることができる。
【０１１０】
（ｃ）転写終結因子活性
第２のポリペプチドドメインは転写終結因子活性を有することができる。この第２のポリペプチドは、真核性終結因子１（ＥＲＦ１）活性または真核性終結因子３（ＥＦＲ３）活性を有することができる。
【０１１１】
（ｄ）ヒストン修飾活性
第２のポリペプチドドメインはヒストン修飾活性を有することができる。この第２のポリペプチドドメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することができる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００もしくはＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質またはその断片であることができる。例えば、融合タンパク質はｄＣａｓ９−ｐ３００であることができる。
【０１１２】
（ｅ）ヌクレアーゼ活性
この第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性とは異なるヌクレアーゼ活性を有することができる。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは通常、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼにさらに分類されるが、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリーにも属することができる。よく知られているヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。
【０１１３】
（ｆ）核酸会合活性
第２のポリペプチドドメインは核酸会合活性を有し得る、または核酸結合タンパク質−ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含む独立に折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識し得る、またはＤＮＡに対して一般的な親和性を有し得る。以下からなる群から選択される核酸会合領域：ヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ロイシンジッパー領域、翼状ヘリックス領域、翼状ヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ヘリックス−ループ−ヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ジンクフィンガー、ＨＭＧ−ボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン。
【０１１４】
（ｇ）メチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはメチラーゼ活性を有し得、このメチラーゼ活性は、メチル基のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシンまたはアデニンへの転移に関与する。この第２のポリペプチドドメインはＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むことができる。
【０１１５】
（ｈ）デメチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはデメチラーゼ活性を有することができる。この第２のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質（特にヒストン）および他の分子からメチル（ＣＨ３−）基を除去する酵素を含むことができる。あるいは、この第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機序において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに変換することができる。この第２のポリペプチドはこの反応を触媒することができる。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドはＴｅｔ１であることができる。
【０１１６】
（ｂ）ジストロフィン遺伝子を標的とするｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子（例えば２種のｇＲＮＡ分子）を含む。このｇＲＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが標的とされる。このｇＲＮＡは、以下の２つの非コードＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合である。このｓｇＲＮＡは、任意の所望のＤＮＡ標的との相補的塩基対形成により標的化特異性を付与する２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を交換することにより、この所望のＤＮＡ配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与する、天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣する。この二本鎖（例えば、４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る）は、Ｃａｓ９が標的核酸を切断するためのガイドとして作用する。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書で互換的に使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが標的とする標的遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは少なくとも１種のｇＲＮＡを含み得、これらのｇＲＮＡは異なるＤＮＡ配列を標的とする。これらの標的ＤＮＡ配列は重複することができる。この標的配列またはプロトスペーサーに続いて、このプロトスペーサーの３’末端でＰＡＭ配列が存在する。ＩＩ型システムが異なると、必要とされるＰＡＭも異なる。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型システムは「ＮＧＧ」配列を使用し、「Ｎ」はあらゆるヌクレオチドであることができる。いくつかの実施態様では、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であり得、「Ｎ」はあらゆるヌクレオチドであり得る。いくつかの実施態様では、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）であってもよいしＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）であってもよい。
【０１１７】
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）によりコードされるｇＲＮＡ分子の数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡまたは少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡであることができる。本開示のベクターによりコードされるｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも１６個の異なるｇＮＲＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ〜少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、または８個の異なるｇＲＮＡ〜少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡであることができる。特定の実施態様では、この遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）は、１種のｇＲＮＡ分子（即ち第１のｇＲＮＡ分子）と任意選択でＣａｓ９分子とをコードする。特定の実施態様では、第１の遺伝子コンストラクト（例えば第１のＡＡＶベクター）は１種のｇＲＮＡ分子（即ち第１のｇＲＮＡ分子）と任意選択でＣａｓ９分子とをコードし、第２の遺伝子コンストラクト（例えば第２のＡＡＶベクター）は１種のｇＲＮＡ分子（即ち第２のｇＲＮＡ分子）と任意選択でＣａｓ９分子とをコードする。
【０１１８】
本ｇＲＮＡ分子はターゲティングドメインを含み、このターゲティングドメインは、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の相補ポリヌクレオチド配列である。このｇＲＮＡは、ターゲッティングドメインまたは相補ポリヌクレオチド配列の５’末端で「Ｇ」を含むことができる。ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の少なくとも１０個の塩基対の、少なくとも１１個の塩基対の少なくとも１２個の塩基対の、少なくとも１３個の塩基対の、少なくとも１４個の塩基対の、少なくとも１５個の塩基対の、少なくとも１６個の塩基対の、少なくとも１７個の塩基対の、少なくとも１８個の塩基対の、少なくとも１９個の塩基対の、少なくとも２０個の塩基対の、少なくとも２１個の塩基対の、少なくとも２２個の塩基対の、少なくとも２３個の塩基対の、少なくとも２４個の塩基対の、少なくとも２５個の塩基対の、少なくとも３０個の塩基対の、または少なくとも３５個の塩基対の相補ポリヌクレオチド配列を含むことができる。特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する。特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２０個のヌクレオチドの長さである。特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２１個のヌクレオチドの長さである。特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２２個のヌクレオチドの長さである。特定の実施態様では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２３個のヌクレオチドの長さである。
【０１１９】
本ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）のある領域を標的とするすることができる。特定の実施態様では、このｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン、イントロン、プロモーター領域、エンハンサー領域、転写領域のうちの少なくとも１つを標的とすることができる。特定の実施態様では、このｇＲＮＡ分子はヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５０を標的とする。特定の実施態様では、このｇＲＮＡ分子はヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５１を標的とする。特定の実施態様では、このｇＲＮＡ分子はヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的とする。このｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むことができる。
【０１２０】
単一のまたは多重のｇＲＮＡを、エクソン５１での変異ホットスポットを標的とすることにより、またはおよびエクソン内の小さい挿入および欠失を導入することにより、またはエクソン５１の排除により、ジストロフィン読み枠を回復させるように設計することができる。本開示のベクターによる処理後、インビトロで、デュシェンヌ患者の筋肉細胞中においてジストロフィン発現を回復させることができる。遺伝的に修正された患者細胞の免疫不全マウスへの移植後に、ヒトジストロフィンをインビボで検出した。意義深いことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの特有の多重遺伝子編集能力は、普遍的なまたは患者特異的な遺伝子編集アプローチにより患者の変異の最大６２％を修正し得る、この変異ホットスポット領域の大きな欠失を効率的に生じさせることを可能にする。いくつかの実施態様では、候補ｇＲＮＡを、ｓｕｒｖｅｙｏｒにより測定したオフターゲット活性、オンターゲット活性に基づいて、ならびにエクソンからの距離に基づいて、評価して選択する。
【０１２１】
３．ＤＮＡターゲティング組成物
本発明はまた、そのような遺伝子コンストラクトを含むＤＮＡターゲティング組成物も対象とする。このＤＮＡターゲティング組成物は、上記で説明したようにジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子（例えば２種のｇＲＮＡ分子）を含む。この少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除によりスプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
【０１２２】
特定の実施態様では、本開示のＤＮＡターゲティング組成物は第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含む。特定の実施態様では、第１のｇＲＮＡ分子におよび第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む。特定の実施態様では、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５であり、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９である。特定の実施態様では、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される。
【０１２３】
特定の実施態様では、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉｉ）配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
特定の実施態様では、ＤＮＡターゲティング組成物は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのＰＡＭを認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、このＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号８３または配列番号８４に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様では、ベクターは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中でそれぞれ第１および第２の二本鎖切断を形成し、それによりジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントを欠失させるように構成されている。
【０１２５】
本開示のベクターの欠失効率は、欠失サイズ（即ち、このベクターにより欠失されるセグメントのサイズ）に関連することができる。特定の実施態様では、特異的欠失の長さまたはサイズは、標的とされる遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）中のＰＡＭ配列間の距離により決定される。特定の実施態様では、ジストロフィン遺伝子のセグメントの特異的欠失（このセグメントの長さおよびこのセグメントが含む配列（例えばエクソン５１）に関して定義される）は、標的遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）内の特異的ＰＡＭ配列に隣接して作られた切断の結果である。
【０１２６】
特定の実施態様では、この欠失サイズは約５０〜約２，０００個の塩基対（ｂｐ）であり、例えば、約５０〜約１９９９ｂｐ、約５０〜約１９００ｂｐ、約５０〜約１８００ｂｐ、約５０〜約１７００ｂｐ、約５０〜約１６５０ｂｐ、約５０〜約１６００ｂｐ、約５０〜約１５００ｂｐ、約５０〜約１４００ｂｐ、約５０〜約１３００ｂｐ、約５０〜約１２００ｂｐ、約５０〜約１１５０ｂｐ、約５０〜約１１００ｂｐ、約５０〜約１０００ｂｐ、約５０〜約９００ｂｐ、約５０〜約８５０ｂｐ、約５０〜約８００ｂｐ、約５０〜約７５０ｂｐ、約５０〜約７００ｂｐ、約５０〜約６００ｂｐ、約５０〜約５００ｂｐ、約５０〜約４００ｂｐ、約５０〜約３５０ｂｐ、約５０〜約３００ｂｐ、約５０〜約２５０ｂｐ、約５０〜約２００ｂｐ、約５０〜約１５０ｂｐ、約５０〜約１００ｂｐ、約１００〜約１９９９ｂｐ、約１００〜約１９００ｂｐ、約１００〜約１８００ｂｐ、約１００〜約１７００ｂｐ、約１００〜約１６５０ｂｐ、約１００〜約１６００ｂｐ、約１００〜約１５００ｂｐ、約１００〜約１４００ｂｐ、約１００〜約１３００ｂｐ、約１００〜約１２００ｂｐ、約１００〜約１１５０ｂｐ、約１００〜約１１００ｂｐ、約１００〜約１０００ｂｐ、約１００〜約９００ｂｐ、約１００〜約８５０ｂｐ、約１００〜約８００ｂｐ、約１００〜約７５０ｂｐ、約１００〜約７００ｂｐ、約１００〜約６００ｂｐ、約１００〜約１０００ｂｐ、約１００〜約４００ｂｐ、約１００〜約３５０ｂｐ、約１００〜約３００ｂｐ、約１００〜約２５０ｂｐ、約１００〜約２００ｂｐ、約１００〜約１５０ｂｐ、約２００〜約１９９９ｂｐ、約２００〜約１９００ｂｐ、約２００〜約１８００ｂｐ、約２００〜約１７００ｂｐ、約２００〜約１６５０ｂｐ、約２００〜約１６００ｂｐ、約２００〜約１５００ｂｐ、約２００〜約１４００ｂｐ、約２００〜約１３００ｂｐ、約２００〜約１２００ｂｐ、約２００〜約１１５０ｂｐ、約２００〜約１１００ｂｐ、約２００〜約１０００ｂｐ、約２００〜約９００ｂｐ、約２００〜約８５０ｂｐ、約２００〜約８００ｂｐ、約２００〜約７５０ｂｐ、約２００〜約７００ｂｐ、約２００〜約６００ｂｐ、約２００〜約２０００ｂｐ、約２００〜約４００ｂｐ、約２００〜約３５０ｂｐ、約２００〜約３００ｂｐ、約２００〜約２５０ｂｐ、約３００〜約１９９９ｂｐ、約３００〜約１９００ｂｐ、約３００〜約１８００ｂｐ、約３００〜約１７００ｂｐ、約３００〜約１６５０ｂｐ、約３００〜約１６００ｂｐ、約３００〜約１５００ｂｐ、約３００〜約１４００ｂｐ、約３００〜約１３００ｂｐ、約３００〜約１２００ｂｐ、約３００〜約１１５０ｂｐ、約３００〜約１１００ｂｐ、約３００〜約１０００ｂｐ、約３００〜約９００ｂｐ、約３００〜約８５０ｂｐ、約３００〜約８００ｂｐ、約３００〜約７５０ｂｐ、約３００〜約７００ｂｐ、約３００〜約６００ｂｐ、約３００〜約３０００ｂｐ、約３００〜約４００ｂｐまたは約３００〜約３５０ｂｐである。特定の実施態様では、この欠失サイズは、約１１８個の塩基対、約２３３個の塩基対、約３２６個の塩基対、約７６６個の塩基対、約８０５個の塩基対または約１６１１個の塩基対であることができる。
【０１２７】
４．筋肉中での遺伝子編集用組成物
本発明は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での標的遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはその組成物を対象とする。この組成物は、改変ＡＡＶベクターと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム（例えばｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子）をコードするヌクレオチド配列とを含む。この組成物は、活性型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達する。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）を、遺伝性疾患および／または他の骨格筋もしくは心筋の状態（例えばＤＭＤ）に関与するジストロフィン遺伝子中での変異の影響の修正または低減で使用することができる。この組成物は、ドナーＤＮＡまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。この組成物を、ゲノム編集、ゲノム操作、ならびに遺伝性疾患および／または他の骨格筋もしくは心筋の状態に関与する遺伝子中での変異の影響の修正また低減で使用することができる。
【０１２８】
ａ．ジストロフィンのターゲティング用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム
本明細書では、ジストロフィン遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが開示されている。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９と、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも１種のｇＲＮＡとを含むことができる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域または、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除により、スプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
【０１２９】
このｇＲＮＡは、配列番号１〜１９、４１、４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体を標的とすることができる。例えば、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを操作して、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１でのより高い効率の遺伝子編集を媒介させた。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、ＤＭＤ患者由来の細胞中でジストロフィンタンパク質発現を回復させた。いくつかの実施態様では、ＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列、配列番号３８に記載のヌクレオチド配列、配列番号８３に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号８４に記載のヌクレオチド配列を含む。例えば、ＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列、配列番号３８に記載のヌクレオチド配列および配列番号８３に記載のヌクレオチド配列を含む、またはＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列、配列番号３８に記載のヌクレオチド配列および配列番号８４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【０１３０】
ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター
この組成物はウイルス送達システムも含むことができる。特定の実施態様では、このベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。このＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小型ウイルスである。ＡＡＶベクターを使用して、様々なコンストラクト構造を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを送達することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、別々ベクター上のまたは同一のベクター上のＣａｓ９およびｇＲＮＡ発現カセットを送達することができる。あるいは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等の種に由来する小さいＣａｓ９タンパク質を使用する場合、Ｃａｓ９と最大２つのｇＲＮＡ発現カセットとの両方を、４．７ｋｂのパッケージング限度内で単一のＡＡＶベクター中で組み合わせることができる。
【０１３１】
特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは改変ＡＡＶベクターである。この改変ＡＡＶベクターは、心筋および骨格筋の組織向性の増強を有することができる。この改変ＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの送達および発現を可能にすることができる。例えば、この改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクターであることができる（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：６３５-６４６）。この改変ＡＡＶベクターは、インビボで骨格筋および心筋にヌクレアーゼを送達することができる。この改変ＡＡＶベクターは、いくつかのカプシド型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）のうちの１つまたは複数をベースとすることができる。この改変ＡＡＶベクターは、代替の筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型をベースとすることができ、例えば、全身送達および局所送達により骨格筋または心筋を効率的に遺伝子導入するＡＡＶ２／１ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、ＡＡＶ２／９ベクター、ＡＡＶ２．５ベクターおよびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターをベースとすることができる（Ｓｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９−１５１）。この改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ｉ８Ｇ９であることができる（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）２８８：２８８１４−２８８２３）。いくつかの実施態様では、組成物は、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列を含む第１のベクターと、配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含む。
【０１３２】
５．筋肉中での遺伝子編集の方法
本開示は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集の方法を対象とする。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。このゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含むことができる。変異遺伝子を修正することは、この変異遺伝子を欠失させること、再編集することまたは置き換えることを含むことができる。変異異遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪまたはＨＤＲを含むことができる。
【０１３３】
６．変異遺伝子を修正して対象を処置する方法
本開示の主題は、細胞中で変異遺伝子（例えば変異ジストロフィン遺伝子、例えば変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修正し、遺伝性疾患（例えばＤＭＤ）に罹患している対象を処置する方法を提供する。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞または対象に投与すること含むことができる。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用の本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物の使用により、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体またはこの変異を含む領域を置き換えることができる）と共に、完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質の発現を回復させることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを使用して、標的とされるゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが標的ＤＮＡ配列に結合し、それにより標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。このＤＮＡ開裂は天然のＤＮＡ修復機構を刺激し得、以下の２つの可能な修復経路のうちの１つをもたらす：相同組換え修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路。
【０１３４】
本開示は、修復鋳型を伴わないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムによる遺伝子編集を対象とし、この遺伝子編集により、読み枠を効率的に修正し、遺伝性疾患に関与する機能的タンパク質の発現を回復させることができる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を受け入れない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）の使用を含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの迅速且つ頑強なアセンブリを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位または異所性スプライス受容部位を生じる非必須コード領域中の変異により生じる遺伝性疾患の処置に効率的な遺伝子編集方法と統合する。
【０１３５】
ａ．ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合
内因性の変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型なしのＮＨＥＪ介在性のＤＮＡ修復によるものであることができる。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過性の方法とは対照的に、過渡的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子読み枠の修正により、それぞれ改変された細胞およびその後代の全てによって、永久に回復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。特定の実施態様では、ＮＨＥＪはヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪであり、このヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪは、特定の実施態様では、Ｃａｓ９分子により開始されて二本鎖ＤＮＡを切断するＮＨＥＪを指す。この方法は、骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集のために、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。
【０１３６】
ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ遺伝子修正は、変異した標的遺伝子を修正し、ＨＤＲ経路に勝る、いくつかの潜在的利点を提供することができる。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入変異をもたらす可能性があるドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲと対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期の全ての期において効率的に作動するので、循環と、有糸分裂後の細胞（筋線維など）との両方において効率的に利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピング、または終止コドンの薬物によって強いられるリードスルーに代わる、頑強な永続的な遺伝子修復を提供し、理論上はわずか１つの薬物治療しか必要としない可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム、ならびにメガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを含めた他の遺伝子改変されたヌクレアーゼを使用する、ＮＨＥＪに基づく遺伝子修正は、本明細書に記載したプラスミド電気穿孔手法に加えて、細胞および遺伝子に基づく療法のための他の既存のエクスビボおよびインビボプラットフォームと組み合わせることができる。例えば、ｍＲＮＡに基づく遺伝子導入による、または、精製された細胞透過性タンパク質としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの送達は、挿入変異のいかなる可能性も回避するであろうＤＮＡフリーのゲノム編集手法を可能にすることができる。
【０１３７】
ｂ．相同組換え修復
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト（ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる）、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。
【０１３８】
ｃ．変異遺伝子を修正してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて対象を処置する方法
本開示はまた、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる）を用いる、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムが、ｇＲＮＡを使用して標的ＤＮＡ配列に結合し、それによって標的ＤＮＡの切断が可能になる場合にもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、可能性のある２つの修復経路：相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１つをもたらすことができる。例えば、ジストロフィン遺伝子に誘導されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、配列番号１〜１９、４１、４２のいずれか１つの核酸配列またはその相補体を有するｇＲＮＡを含むことができる。
【０１３９】
本開示は、読み枠を効率的に修正し、かつ遺伝性疾患に関与する機能性タンパク質の発現を修復することができる、修復鋳型を伴わない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムおよび方法は、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を適用できない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）を使用することを含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの迅速かつ頑強なアセンブリを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位、または異所性スプライス受容部位をもたらす非必須コード領域の変異によって引き起こされる遺伝性疾患の治療のための効率的な遺伝子編集方法と統合する。
【０１４０】
本開示は、細胞における変異遺伝子を修正し、ＤＭＤなどの遺伝性疾患を患う対象を治療する方法を提供する。この方法は、上に記載した通りに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。この方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを投与すること、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、またはヌクレアーゼ活性を有する第２のドメインを含有するＣａｓ９融合タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および／または少なくとも１種のｇＲＮＡ（ここで、ｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的にする）を投与することを含むことができる。これらの標的ＤＮＡ配列は、オーバーラップしていることが可能である。細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、上に記載した通りの、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号１〜１９、４１、４２、またはその相補体のうちの少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。この方法は、相同組換え修復または非相同末端結合を含むことができる。
【０１４１】
７．疾患を処置する方法
本開示は、必要とする対象を処置する方法を対象とする。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。特定の実施態様では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。特定の実施態様では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の静脈に投与することを含むことができる。特定の実施態様では、この対象は、変性または衰弱または遺伝性疾患を引き起こす骨格筋または心筋の状態に罹患している。例えば、この対象は、上記で説明したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。
【０１４２】
ａ．デュシェンヌ型筋ジストロフィー
上記で説明した方法を使用して、ジストロフィン遺伝子を修正して前記変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質発現を回復させることができる。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者におけるＤＭＤの影響（例えば臨床症状／適応症）を低減する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてＤＭＤを処置する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてＤＭＤを予防する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてＤＭＤのさらなる悪化を予防する方法を提供する。
【０１４３】
８．Δ５２ｈＤＭＤを有する遺伝子導入齧歯動物を作成する方法
本開示は、エクソン５２が欠失しているヒトジストロフィン遺伝子を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法を対象とする。この方法は、本ｇＲＮＡを齧歯動物胚に投与し、それによりヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２を欠失させること、およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２が欠失している遺伝子導入齧歯動物胚を選択することであって、この齧歯動物胚は正常なヒトジストロフィン遺伝子を含む、選択することを含む。いくつかの実施態様では、この齧歯動物胚はマウス胚である。いくつかの実施態様では、この遺伝子導入齧歯動物胚は、ヘテロ接合性ｈＤＭＤまたはヘテロ接合性ｈＤＭＤ−Δ５２である。いくつかの実施態様では、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子と、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子とをこの齧歯動物胚に投与して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２を欠失させる。いくつかの実施態様では、この方法は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質をこの齧歯動物胚に投与することをさらに含む。本開示は、この方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚を対象とする。本開示はまた、この遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物も対象とする。
【０１４４】
９．コンストラクトおよびプラスミド
上記で説明した組成物は、本明細書で開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。この遺伝子コンストラクト（例えばプラスミド）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム（例えばＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ９融合タンパク質および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１つ）をコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、改変ＡＡＶベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書で開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列とを含むことができる。この遺伝子コンストラクト（例えばプラスミド）は、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、本明細書で開示した改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。
【０１４５】
この遺伝子コンストラクト（例えば組換えプラスミドまたは組換えウイルス粒子）は、Ｃａｓ９融合タンパク質および少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。いくつかの実施態様では、この遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓ９融合タンパク質および少なくとも２つの異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。いくつかの実施態様では、この遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓ９融合タンパク質および２つ超の異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。いくつかの実施態様では、この遺伝子コンストラクトは、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。いくつかの実施態様では、このプロモーターは、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。この遺伝子コンストラクトは、機能する染色体外分子として細胞中に存在することができる。この遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体、例えばセントロメア、テロメアまたはプラスミドまたはコスミドであることができる。
【０１４６】
遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１４７】
いくつかの実施態様では、この遺伝子コンストラクトはベクターである。このベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは少なくとも１種のＣａｓ９分子および少なくとも１種のｇＲＮＡ分子をコードし、このベクターは、哺乳動物の細胞中で少なくとも１種のＣａｓ９分子および少なくともｇＲＮＡ分子の発現が可能である。このベクターはプラスミドであることができる。このベクターを、インビボでの遺伝子治療に使用することができる。このベクターは組換えであることができる。このベクターは、融合タンパク質（例えばＣａｓ９融合タンパク質）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする異種核酸を含むことができる。このベクターはプラスミドであることができる。このベクターは、Ｃａｓ９融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を細胞に遺伝子導入するのに有用であり得、形質転換された宿主細胞を、Ｃａｓ９融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの発現が起こる条件下で培養して維持する。
【０１４８】
コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある場合では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。
【０１４９】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする異種の核酸を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムコード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムコード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、例えばヒトＵ６プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例が米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書および同第２００４０１９２５９３号明細書で説明されており、これらの明細書の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。筋肉特異的プロモーターの例として、Ｓｐｃ５−１２プロモーター（米国特許出願公開第２００４０１９２５９３号明細書で説明されており、この明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれる；Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４００２；およびＬａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．（２０１４）２３（１２）：３１８９-３１９９）、ＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００７）１５：３２０−３２９で説明されている）、ＣＫ８プロモーター（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１５）１０（４）：ｅ０１２４９１４で説明されている）、ならびにＣＫ８ｅプロモーター（Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４０２５で説明されている）が挙げられる。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質の発現がｔＲＮＡにより駆動される。
【０１５０】
ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列の各々はそれぞれ、プロモーターに作動可能に連結され得る。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子に作動可能に連結されているプロモーターは同一のプロモーターであってもよい。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子に作動可能に連結されているプロモーターは異なるプロモーターであってもよい。このプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターまたは調節性プロモーターであることができる。
【０１５１】
ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１５２】
ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質、もしくはＣａｓ９融合タンパク質コード配列、もしくはｓｇＲＮＡの、上流のエンハンサー、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞において、ベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。
【０１５３】
ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたは系であり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。いくつかの実施態様では、このベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列を含むことができ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１〜１９、４１，４２のうちの少なくとも１つの核酸配列またはその相補体を含む少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質は、配列番号２６のいずれか１つの核酸配列によりコードされる。いくつかの実施態様では、このベクターは、配列番号３９または配列番号４０の核酸配列を含む。
【０１５４】
１０．医薬組成物
本開示の主題は、上記で説明した遺伝子コンストラクトを含む組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、この医薬組成物は無菌であり、パイロジェンフリーであり且つ粒子状物質フリーである。等張性製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によって、等張性溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）が好ましい。安定剤としてゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、この製剤に血管収縮剤が添加される。
【０１５５】
前記組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能性分子であり得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、遺伝子導入促進剤（これには界面活性剤が含まれ得る）、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤であり得る。
【０１５６】
遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。遺伝子導入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集のための組成物中に、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。遺伝子導入促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレンを含むことができ、また、遺伝子コンストラクトと共に、ヒアルロン酸も使用することができる。いくつかの実施態様では、前記組成物をコードするＤＮＡベクターはまた、遺伝子導入促進剤、例えば脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、または、当技術分野で公知の他のリポソームを含めて）、ＤＮＡ−リポソーム混合物としてのもの（例えば国際公開第０９３２４６４０号パンフレット参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤を含むことができる。好ましくは、遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。
【０１５７】
１１．送達の方法
本明細書で提供されるのは、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはその組成物を細胞に送達する方法である。この組成物の送達は、この細胞中で発現され且つこの細胞の表面に送達される核酸分子としてのこの組成物の遺伝子導入または電気穿孔であることができる。この核酸分子を、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌデバイスまたはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩｂデバイスを使用して電気穿孔することができる。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水  製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（ＯＭ）またはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）等のいくつかの異なる緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００等の遺伝子導入試薬を含むことができる。
【０１５８】
本開示の遺伝子コンストラクトまたは組成物が組織に送達され、その結果として哺乳類の細胞中にベクターが送達されると、この遺伝子導入された細胞はｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を発現する。この遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳類に投与して、遺伝子発現を変更することができる、またはゲノムを再編集するもしくは変更することができる。例えば、この遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳類に投与して、哺乳類中でジストロフィン遺伝子を修正することができる。この哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラットまたはニワトリであり得、好ましくはヒト、ウシ、ブタまたはニワトリであり得る。
【０１５９】
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードする遺伝子コンストラクト（例えばベクター）を、インビボでの電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、ならびに／または組換えベクターにより哺乳類に送達することができる。この組換えベクターを任意のウイルス型により送達することができる。このウイルス型は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
【０１６０】
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞に導入して、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を遺伝的に修正することができる。特定の実施態様では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、ＤＭＤ患者由来の筋芽細胞に導入する。特定の実施態様では、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞に導入し、遺伝的に修正された繊維芽細胞をＭｙｏＤで処理して筋芽細胞への分化を誘導し得、この筋芽細胞を対象（例えば、対象の損傷を受けた筋肉）に移植して、修正されたジストロフィンタンパク質が機能することを検証し得る、および／または対象を処置し得る。この改変された細胞は、幹細胞（例えば、誘導された多能性幹細胞）、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中胚葉性血管芽細胞（ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞であることもできる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、誘導された多能性幹細胞のニューロン分化または筋原性分化を引き起こすことができる。
【０１６１】
１２．投与の経路
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、様々な経路（例えば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせ）により対象に投与することができる。特定の実施態様では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、対象（例えばＤＭＤを罹患している対象）に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する。獣医学的使用の場合、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適している投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。この組成物を、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎ）」、または他の物理的方法（例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」または超音波）により投与することができる。
【０１６２】
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、いくつかの技術（例えば、インビボでの電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、組換えベクター（例えば組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルス関連ウイルス））により哺乳類に送達することができる。この組成物を骨格筋または心筋に注射することができる。例えば、この組成物は、前脛骨筋または尾に注射することができる。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、１）成体マウスへの尾静脈注射（全身）により、２）筋肉内注射により、例えば、成体マウスにおける筋肉（例えばＴＡまたは腓腹筋）への局所注射により、３）Ｐ２マウスへの腹腔内注射により、または４）Ｐ２マウスへの顔面静脈注射（全身）により投与する。
【０１６４】
１３．細胞型
これらの送達方法および／または送達の経路のいずれかを無数の細胞型（例えば、ＤＭＤの細胞に基づく治療用に現在研究中の細胞型）と共に利用することができ、この細胞型として以下が挙げられるがこれらに限定されない：不死化筋芽細胞、例えば野生型およびＤＭＤ患者由来の株、例えばΔ４８−５０  ＤＭＤ、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８−５０）、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８−５０）、Ｃ２５Ｃ１４およびＤＭＤ−７７９６細胞株、原発性ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血性幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞。ヒト筋原性細胞の不死化を使用して、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローンを誘導することができる。細胞をエクスビボで改変して、遺伝的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み且つゲノムのタンパク質コード領域中に他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離して増殖させることができる。あるいは、非ウイルスまたは非組込みウイルスの遺伝子導入によるまたは精製タンパク質および細胞浸透モチーフを含むｇＲＮＡの直接送達によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムのインビボでの一時的な送達により、外因性ＤＮＡ組込みのリスクが最低限なまたはないインサイチュでの高度に特異的な修正が可能になり得る。
【０１６５】
１４．キット
本明細書で提供されるのは、変異ジストロフィン遺伝子を修正するのに使用され得るキットである。このキットは、変異ジストロフィン遺伝子の修正用のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを使用するための説明書とを少なくとも含む。また、本明細書で提供されるのは、骨格筋中でのまたは心筋中でのジストロフィン遺伝子のゲノム編集に使用され得るキットでもある。このキットは、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含む。
【０１６６】
キットに含まれる説明書は、包装材料に貼り付けることもできるし、パッケージ挿入物として含めることもできる。説明書は、一般的に、書面のまたは印刷された素材であるが、これに限定されない。こうした説明書を保管する、また、これらをエンドユーザーに伝えることが可能なあらゆる媒体が、本開示によって企図される。こうした媒体としては、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１６７】
骨格筋中でのまたは心筋中での変異ジストロフィンの修正用のまたはジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子のある領域に特異的に結合して切断する、上記で説明したｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を含む改変ベクターを含むことができる。変異ジストロフィン遺伝子中の特定の領域に特異的に結合してこの領域を標的とするために、上記で説明したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムをキットに含めることができる。このキットは、上記で説明したドナーＤＮＡ、別のｇＲＮＡまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。
【実施例】
【０１６８】
１５．実施例
本明細書で説明された本開示の方法の他の適切な改変および適応が容易に適用可能であり且つ認識可能であり、ならびに本開示または本明細書で開示された態様および実施態様の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して行なわれ得ることが当業者に容易に明らかであるだろう。これまで本開示を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより本開示がより明確に理解されるだろう。この実施例は、本開示のいくつかの態様および実施態様を説明することのみを単に意図しており、本開示の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
本発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により説明される。
【０１７０】
実施例１
ヒトジストロフィン遺伝子のターゲティング
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを使用して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的としてこのエクソン５１を欠失させた。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と比べて約１ｋｂ小さい）をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と共に使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを送達した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列を、配列番号４３または配列番号４４に記載する。図３は、２種のウイルスベクターによるＳａＣａｓ９および２種のｇＲＮＡの筋肉組織へのＡＡＶに基づくインビボ同時送達の概略を示す。各ベクターは、それぞれＣＭＶプロモーターおよびｈＵ６プロモーターにより駆動されるＳａＣａｓ９および１種のｇＲＮＡのコピーを有した（ＰＴ３６６−１７９（配列番号３９）およびＰＴ３６６−１８３（配列番号４０））。
【０１７１】
ヒトジストロフィン遺伝子を標的とする個々のｇＲＮＡ、ＪＣＲ８９（エクソン５１の上流を標的とする）およびＪＣＲ９１（エクソン５１の下流を標的とする）（ヒトゲノムに対して設定した）の活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ジストロフィン遺伝子の正常なバージョンを有する）ならびにＤＭＤ患者の筋芽細胞株（ＤＭＤ８０３６およびＤＭＤ６５９４、それぞれはジストロフィン遺伝子の変異型を有する）でのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイで決定した（図１を参照されたい）。ＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイはゲノムＤＮＡ中のミスマッチを検出し、このミスマッチはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システム由来の挿入欠失を示す。ＪＣＲ８９の場合、親バンドサイズは５５５ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ａａｇｔｔａｃｔｔｇｔｃｃａｇｇｃａｔｇａ（配列番号９１）；およびリバースプライマー−ｇａａａａａｃｔｔｃｔｇｃｃａａｃｔｔｔｔａｔｃａ（配列番号９２）。予想される切断バンドサイズは１３４ｎｔおよび４２１ｎｔであった。ＪＣＲ９１の場合、親バンドサイズは６３２ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ｔｇｃａａａｔａａｃａａａａｇｔａｇｃｃａｔａｃａ（配列番号９３）；およびリバースプライマー−ｔｃｔｔｔａｇａａａｇｇｃｔｔｇａａａｇｃｔｇ（配列番号９４）。予想される切断バンドサイズは２１０ｎｔおよび４２２ｎｔであった。
【０１７２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ならびにＤＭＤ筋芽細胞（ＤＭＤ８０３６およびＤＭＤ６５９４）を、ＳｃＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ  ＪＣＲ８９およびＪＣＲ９１（配列番号３７および配列番号３８）で同時処理した。ゲノムＤＮＡを、フォワードプライマー−ｃｔｔｃａｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｇｔｔｔａ（配列番号９５）およびリバースプライマー−ｔｃｔｔｔａｇａａａｇｇｃｔｔｇａａａｇｃｔｇ（配列番号９４）で増幅させた。予想される親バンドサイズは１６４６ｎｔであり、予想される「完全な」欠失バンドは７６６ｎｔであった（ｇＲＮＡ切断部位間の実際の欠失サイズは、挿入欠失の発生に起因して７６６ｎｔとは異なった）。図２Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＤＭＤ筋芽細胞のゲノムＤＮＡ中のエクソン５１の欠失を示す。図２Ｂは、ＤＭＤ筋芽細胞からのｃＤＮＡ中のエクソン５１の欠失を示す。「Ｎｏ  ＲＴ」は、逆転写酵素を添加しなかった陰性対照である。
【０１７３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを、ヒトＤＭＤ遺伝子を担持する遺伝子導入マウス（ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウス）に注射し、エクソン５１を欠失させた。ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡを担持するウイルスベクターの局所ＡＡＶ８送達を前脛骨（ＴＡ）筋に適用した。表１を参照されたい。以下のように３匹のマウスにＡＡＶ８を注射した：１匹のマウスに両方のＴＡで高用量のＡＡＶ８を注射し（「ＨＨ」）、１匹のマウスに両方のＴＡで低用量のＡＡＶ８を注射し（「ＬＬ」）、１匹のマウスに左ＴＡで低用量を注射し且つ右ＴＡで高用量を注射した（「ＬＨ」）。用量を表１の第２列に列挙する。処理の８週後にマウスを屠殺し（「ＰＴ週」）、分析用に組織を摘出した。ネスト化ＰＣＲにより、ＨＨマウスの両方の肢、ＬＬマウスの右ＴＡおよびＬＨマウスの右肢でのエクソン５１の欠失が明らかになった。
【０１７４】
【表１】
2018534950.tif 000030
【０１７５】
マウスＴＡ筋から採取したゲノムＤＮＡを、フォワードプライマー：ｃｔｔｃａｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｇｔｔｔａ（配列番号９５）およびリバースプライマー：ｔｃｔｔｔａｇａａａｇｇｃｔｔｇａａａｇｃｔｇ（配列番号９４）を使用する第１のＰＣＲ反応で増幅させた。このＰＣＲ産物１〜３μＬを、フォワードプライマー−ａａｇｔｔａｃｔｔｇｔｃｃａｇｇｃａｔｇａ（配列番号９１）；およびリバースプライマー−ｔｔｇａａｃａｔｇｇｃａｔｔｇｃａｔａａＡ（配列番号９６）を使用する第２のＰＣＲ反応（２×ｇＤＮＡ  ＰＣＲ）で使用した。この第２のＰＣＲは、１０８９ｎｔの予想される親バンドと、３２３ｎｔの予想される欠失バンド（ｇＲＮＡ切断部位間の実際の欠失サイズは、挿入欠失の発生に起因して３２３ｎｔとは異なった）とを有した。図４は第２のＰＣＲの結果を示す。「Ｌ」レーンは左ＴＡ筋での結果を示し、この左ＴＡ筋を対照として使用して生理食塩水を投与した。「Ｒ」レーンは右ＴＡ筋での結果を示し、この右ＴＡ筋に、等量でプレミックスした２種のウイルスベクターを注射した。全身ＡＡＶ８送達によりｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスの尾静脈にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムも注射した（図５を参照されたい）。マウスの肝臓から採取したゲノムＤＮＡ（図５−左側のパネル）およびマウスの心臓から採取したゲノムＤＮＡ（図５−右側のパネル）も、図４と同じプロトコルを使用して増幅させた。約３００個のヌクレオチドの予想バンドは、エクソン５１の欠失を示した。
【０１７６】
ヒトおよびアカゲザルのジストロフィン遺伝子配列またはヒトジストロフィン遺伝子配列を標的とするさらなるｇＲＮＡを生成して選択した（図６および表２を参照されたい）。表２は、ｇＲＮＡの一般的な標的、認識されるゲノム鎖、ｇＲＮＡ配列、およびこのｇＲＮＡに関連するＰＡＭ配列を列挙する。ｇＲＮＡの標的ゲノム配列（ゲノムプラス鎖で示す）を表３に列挙する。これらのｇＲＮＡを培養ヒト細胞で試験し、欠失を生じる最適な活性およびｇＲＮＡの組み合わせを発見した。選択したｇＲＮＡもヒトゲノムで予想される特異性に基づいて優先順位を付け（図８）、１９〜２３個のヌクレオチドの様々な最適標的配列長に関してスクリーニングした（図１０および１１）。図６は、ヒトゲノムとアカゲザルゲノムとの間で保存されている、表２に列挙した様々なｇＲＮＡ標的を示す。各ｇＲＮＡの位置を、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に関連して示す。
【０１７７】
【表２−１】
2018534950.tif 000031
【表２−２】
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【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
表２に列挙した個々の候補ｇＲＮＡをヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。これら候補ｇＲＮＡの活性をＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイで決定した（図７を参照されたい）。ＪＣＲ１６０の場合、親バンドサイズは４８３ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｃａｇａａｃｔｔａｃ（配列番号９７）；およびリバースプライマー−ｃｔｇｃｇｔａｇｔｇｃｃａａａａｃａａａ（配列番号９８）。予想される切断バンドサイズは１９２ｎｔおよび２９１ｎｔであった。ＪＣＲ１５７の場合、親バンドサイズは６３１ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ｇａｇａｔｇｔｃｔｔｔｔｇｃａｇｃｔｔｔｃｃ（配列番号９９）；およびリバースプライマー−ｇｇｇａｃｃｔｔｇｇｔａａａｇｃｃａｃａ（配列番号１００）。予想される切断バンドサイズは１４７ｎｔおよび４８４ｎｔであった。
【０１８０】
これらの候補ｇＲＮＡの特異性を、ＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒプログラム（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０：１４７３−１４７５；図８を参照されたい）を使用して予測した。候補ｇＲＮＡを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイで測定したオフターゲット活性、オンターゲット活性およびエクソンからの距離に基づいて評価して選択した。ｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０は低い予測オフターゲット活性を有し、これらをさらなる試験に使用した。
【０１８１】
ｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７を含む改変ｐＤＯ２４０プラスミド、ｇＲＮＡ  ＪＣＲ１６０を含む改変ｐＤＯ２４０プラスミド、およびＳａＣａｓ９を含むプラスミド（ｐＤＯ２４２；配列番号８３）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、ＤＭＤ６５９４細胞に電気穿孔した。親バンドは２４５１ｎｔであると予想し、欠失バンドは約８４０〜８５０ｎｔであると予想する。図９は、フォワードプライマー−ｔｇｃｃｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｇｔｔｔｃｇ（配列番号１０１）およびリバースプライマー−ａｇａａｇｇｃａａａｔｔｇｇｃａｃａｇａ（配列番号１０２）を使用するゲノムＤＮＡ（約８５０個のヌクレオチド）のＰＣＲにより決定したエクソン５１の欠失を示す。ｇＲＮＡ切断部位間に作成された欠失は約１６１１ｎｔであった。
【０１８２】
図１０は、図７においてＪＣＲ１５７に使用したプライマーおよびＰＣＲ条件を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイで決定した様々な標的長のｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７（１９個、２０個、２１個、２２個および２３個のヌクレオチド）の活性を示す。図１１は、フォワードプライマー−ｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｃａｇａａｃｔｔａｃ（配列番号９７）；およびリバースプライマー−ｃｔｇｃｇｔａｇｔｇｃｃａａａａｃａａａ（配列番号９８）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイで決定した様々な標的長のｇＲＮＡ  ＪＣＲ１６０（１９個、２０個、２１個、２２個および２３個のヌクレオチド）の活性を示す。親バンドサイズは４８３ｎｔであると予想し、予想される切断バンドサイズは２０９ｎｔおよび２７４ｎｔであった。
【０１８３】
図９で使用した条件を使用して、様々な標的長のｇＲＮＡ  ＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０（２１個、２２個または２３個のヌクレオチド）の組み合わせをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で使用した。図１２はゲノムＤＮＡのＰＣＲを示す。２３個のヌクレオチド標的をそれぞれ有するＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０の組み合わせは、ほぼ５０％の欠失を有した。
【０１８４】
２３ｎｔの標的配列を使用して、エクソン５１に隣接する各ｇＲＮＡ（上流ＪＣＲ１７９および下流ＪＣＲ１８３）をＳａＣａｓ９と共に個別に実施し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での（「２９３ｓ」）およびＤＭＤ６５９４細胞中での（「ＤＭＤ６５９４ｓ」）オンターゲットヌクレアーゼ活性を実証した（図１３を参照されたい）。ＪＣＲ１７９の場合、親バンドサイズは５９４ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ｔｇｃｃｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｇｔｔｔｃｇ（配列番号１０１）；およびリバースプライマー−ａａｇｇｃｃｃｃａａａａｔｇｔｇａａａｔ（配列番号１０３）。予想される切断バンドサイズは５９４ｎｔおよび１３０ｎｔであった。ＪＣＲ１８３の場合、親バンドサイズは７３１ｎｔであり、使用したプライマーは以下であった：フォワードプライマー−ｇａｇｔｔｔｇｇｃｔｃａａａｔｔｇｔｔａｃｔｃｔｔ（配列番号１０４）；およびリバースプライマー−ｃｔｇｃｇｔａｇｔｇｃｃａａａａｃａａａ（配列番号９８）。予想される切断バンドサイズは４４０ｎｔおよび２９１ｎｔであった。図１３は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによるインビトロでのオンターゲットヌクレアーゼ活性を示す。
【０１８５】
ＳａＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ  ＪＣＲ１７９およびＪＣＲ１８３（ＪＣＲ１５７およびＪＣＲ１６０の２３ｎｔの標的；配列番号３７および配列番号３８）を含むプラスミドをヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、ＤＭＤ筋芽細胞（ＤＭＤ６５９４ｓ）に電気穿孔した。ＤＭＤ６５９４細胞は、エクソン４８〜５０を既に欠いている不死化ＤＭＤ患者筋芽細胞である。親バンドは２４５１ｎｔであると予想し、欠失バンドは約８２３ｎｔであると予想する。図１４は、フォワードプライマー−ｔｇｃｃｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｇｔｔｔｃｇ（配列番号１０１）およびリバースプライマー−ａｇａａｇｇｃａａａｔｔｇｇｃａｃａｇａ（配列番号１０２）を使用するゲノムＤＮＡのＰＣＲにより決定したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞での（左側のパネル）およびＤＭＤ６５９４ｓ細胞での（右側のパネル）ゲノムＤＮＡ中のエクソン５１のインビトロでの欠失を示す。ｇＲＮＡ切断部位間に作成された欠失は約１６２８ｎｔであった。上部のパネルはＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＤＭＤ６５９４細胞での上流および下流のｇＲＮＡの標的遺伝子の概略を示し、紫色は正常にプロセシングされたエクソンを示し、黄色は変異エクソンを示す。中間のパネルはゲノム欠失領域に横切るＰＣＲの結果を示し、アスタリスクは欠失を示す。底部のパネルはゲノムＤＮＡのドロップレットデジタルＰＣＲを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ｇＲＮＡおよびＳａＣａｓ９は１６％の欠失を有し、ＤＭＤ細胞６５９４細胞は約１０％の編集を有した。
【０１８６】
ゲノムＤＮＡ中の変化がＲＮＡに転写されたかどうかを決定するために、ＳａＣａｓ９および両方のｇＲＮＡを同時に遺伝子導入して７日にわたり分化させたＤＭＤ筋芽細胞からＲＮＡを採取した（図１５を参照されたい）。当分野で既知の標準的方法を使用して、このＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、このｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。図１５において、底部の左側のパネルは、フォワードプライマー−ｔｇｇｃｇｇｃｇｔｔｔｔｃａｔｔａｔ（配列番号１０５）およびリバースプライマー−ＴＴＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ（配列番号１０６）を使用したエクソン４４〜エクソン５２のＰＣＲ増幅を示す。親バンドは９４８ｎｔであると予想し、欠失バンドは約７１５ｎｔであると予想する。図１５は、ＳａＣａｓ９および両方のｇＲＮＡで処理した細胞でのみ欠失バンドを示す。底部の右側のパネルは、ｃＤＮＡの約１４％の編集を明らかにするｄｄＰＣＲを示す。ＤＭＤ患者筋芽細胞のｃＤＮＡにおけるインビトロでのエクソン４７〜５２の接合部を配列決定した（図１６を参照されたい）。図１６では、未処理細胞（対照細胞Δ４８−５０）からのバンドの配列は、エクソン４７〜５１が予想通りに結合され、処理細胞（Δ４８−５０＋Δ５１）での欠失バンドはエクソン４７〜５２の接合部を示すことを示した。そのため、ゲノムＤＮＡレベルを目的とするエクソン５１および本開示のシステムの明確な欠如が転写を介して行なわれていた。
【０１８７】
実施例２
Δ５２／ｍｄｘマウスの作成
図１７はΔ５２／ｍｄｘマウスの設計を示す。ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスをＬｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得て、ＤＭＤの関連モデル（エクソン５２が除去されており、この欠失により読み枠外シフトおよびＤＭＤ遺伝子型が生じている）を作成するために操作した。ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスはｍｄｘバックグランウド中の５番染色体上に完全長の野生型ヒトジストロフィン遺伝子を含み、その結果、マウスジストロフィンは発現されない。
【０１８８】
ＤＭＤの関連モデルを作成するために、ＳｐＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集システムおよびｇＲＮＡを使用して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２を標的としてこのエクソン５２を欠失させた。エクソン５２の上流および下流を標的とする様々なｇＲＮＡを試験し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して検証した（図１８を参照されたい）。上流ｇＲＮＡの場合、フォワードプライマー−ｃｔｃｃｇｇａａｔｇｔｃｔｃｃａｔｔｔｇ（配列番号８７）およびリバースプライマー−ＴＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴ（配列番号１０７）を使用し、親バンドサイズは４０２ｎｔであった。ＪＣＲ９４（ＡＡＣＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＣ（配列番号４１））の場合、予想される切断サイズは２４３ｎｔおよび１５９ｎｔであった。下流ｇＲＮＡの場合、フォワードプライマー−ＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴ（配列番号１０８）およびリバース−ａｔｇａｇｇｇａｇａｇａｃｔｇｇｃａｔｃ（配列番号８８）を使用し、親バンドサイズは５０９ｎｔであった。ＪＣＲ９９（ＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号４２））の場合、予想される切断サイズは３４６ｎｔおよび１６３ｎｔであった。ｇＲＮＡの対（例えばＪＣＲ９４およびＪＣＲ９９）を試験し、フォワードプライマー−ｃｔｃｃｇｇａａｔｇｔｃｔｃｃａｔｔｔｇ（配列番号８７）およびリバースプライマー−ａｔｇａｇｇｇａｇａｇａｃｔｇｇｃａｔｃ（配列番号８８）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ中のエクソン５１の欠失を検出することにより検証した（図１９を参照されたい）。親バンドサイズは７１８ｎｔであり、欠失バンドは３９２ｎｔであり、ｇＲＮＡ間の欠失は３２６ｎｔであった。ＪＣＲ９４およびＪＣＲ９９の対をゲノム編集システムで使用してΔ５２／ｍｄｘマウスを作成した。具体的には、このマウスを、ＪＣＲ９４  ｇＲＮＡ、ＪＣＲ９９  ｇＲＮＡおよびＳａＣａｓ９をマウス胚に注入することにより作成した。
【０１８９】
図２０は、ＢＡＣリコンビニアリングサービス（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅ）を含むＤＮＡマイクロインジェクションプロトコルを示す。１日目：妊馬を血清ゴナドトロピンで腹腔内処理して排卵を誘発した。３日目：妊馬をヒト絨毛性ゴナドトロピンで腹腔内処理した。第１ラウンドでは４７１個の胚を作成したが、５個の栓のみを視認した。１５０個の受精胚を使用した（１４匹の雌が過排卵した）。前核注射をＣａｓ９  ５０ｎｇ未満および各ガイド２０ｎｇで実施した。図２１は、遺伝子導入マウスを作成するためのマウス繁殖プロトコルを示す。
【０１９０】
以下の遺伝子型同定プロトコルを使用して、ファウンダーマウスの遺伝子型を同定した。ＤＮＥａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、このマウスの尾の切れ端からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。各仔の遺伝子型を同定するために、以下の通りにＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＨｉＦｉ  Ｔａｑキットを使用してｇＤＮＡを増幅させた：ｉ．ｇＤＮＡ  １００ｎｇ；ｉｉ．ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  ２．５μＬ；ｉｉｉ．ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＨｉＦｉ  Ｔａｑ  ０．１μＬ；ｉｖ．ＪＲＨ２６１（ｃｔｃｃｇｇａａｔｇｔｃｔｃｃａｔｔｔｇ（配列番号８７））（１０μＭ）１μＬ；ｖ．ＪＲＨ２６４（ａｔｇａｇｇｇａｇａｇａｃｔｇｇｃａｔｃ（配列番号８８））（１０μＭ）１μＬ；およびｖｉ．総体積２５μＬまでの水。反応を以下の通りにサーモサイクラーで実行した：ｉ．４分にわたり９５度：ｉｉ．３０秒にわたり９５度；ｉｉｉ．３０秒にわたり５２度；ｉｖ．１：００分にわたり６８度；ｖ．工程ｉｉ〜ｉｖを３５回繰り返す；および永久に４度。ＰＣＲ反応物をゲル上で分離した（図２２）。予想されるバンドサイズは、欠失が存在しなかった（即ち、エクソン５２が依然として存在した）場合には７１８ｎｔであり、エクソン５２が欠失した場合には約３９２ｎｔであった。図２２で示すように、ファウンダーマウス７、６３および７６はエクソン５２が欠失していた。
【０１９１】
増幅バンドを、ＪＲＨ２６４プライマー（図２３を参照されたい）を使用して配列決定し、標的領域の再結合末端を配列決定した。図２３は配列決定領域を示し、太字、下線付きおよび通常の文字は天然配列を示し、イタリック体の文字は挿入または欠失を示す。予想される配列（「デルタ５２」）では、太字の文字は下線付きの文字に連結されている。ファウンダーマウスでは、この領域に挿入（イタリック体の文字）および欠失（ハイフン）が存在した。
【０１９２】
雄ファウンダーマウスをｍｄｘ／ｍｄｘ雌と交配させ、キメラを繁殖させた（図２４）。ファウンダー雄７６またはファウンダー雄６３とｍｄｘ／ｍｄｘ雌とから作成した同腹仔を、図２２で使用した条件を使用してエクソン５２欠失に関してスクリーニングして遺伝子型を同定した（それぞれ図２５および図２６）。エクソン５２が欠失した場合、予想されるバンドサイズは約３９２ｎｔであった。エクソン５２が存在した場合、予想されるバンドサイズは約７１８ｎｔであった。仔５４４９７および５４４９８（ファウンダー雄６３＋ｍｄｘ／ｍｄｘ雌の繁殖対に由来）はエクソン５２が欠失しており、配列決定した（図２７）。仔５４４９７および５４４９８は３９２ｂｐの配列決定読み取りにおいて互いに９２．８６％の同一性を有し、挿入欠失は同一であった。
【０１９３】
健康なｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスおよびΔ５２／ｍｄｘマウスでのジストロフィンの発現を、蛍光免疫組織化学を使用して比較した。図２８で示すように、Δ５２／ｍｄｘマウス仔５４４９７および５４４９８はジストロフィンタンパク質を欠いた。心臓染色の場合、ラミニンプローブ曝露は１００ミリ秒であり、ジストロフィン曝露は９００ミリ秒であった。ＴＡ筋サンプルの場合、ラミニンプローブ曝露およびジストロフィンプローブ曝露は２．０秒であった。ジストロフィンタンパク質を欠いたΔ５２／ｍｄｘマウスを示す図２９も参照されたい。心臓およびＴＡ筋の両方において、Δ５２／ｍｄｘマウスではジストロフィン発現が失われた。ＴＡ筋では、わずかな自発的復帰変異体繊維（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｖｅｒｔａｎｔ  ｆｉｂｅｒ）（ランダムスプライス事象または体細胞変異）が存在したが、これはｍｄｘマウスモデルと一致した。ウエスタンブロッティングはまた、Δ５２／ｍｄｘマウスがＤＭＤ遺伝子型と一致するジストロフィンタンパク質を欠いており、健康なｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスがジストロフィンを発現することも示した。図３０を参照されたい。
【０１９４】
Δ５２／ｍｄｘマウスは、オープンフィールド試験の最初の５分後にｍｄｘマウスと同様のレベルの活動を示した。このオープンフィールド試験では、マウスに、３０分にわたりオープンフィールドアリーナ（２０×２０×３０ｃｍ）を自由に探索させた。動物の活動および位置を、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙソフトウェア（バージョン５．３、Ｏｍｎｉｔｅｃｈ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）を実行するコンピュータにインターフェースで接続された赤外線ダイオード（ｘ、ｙおよびｚ軸）を使用して自動的にモニタリングした。図３１は、自発運動および探索により示された、ｍｄｘマウスおよびｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスと比較したΔ５２／ｍｄｘマウスの全体的な活動を示す。移動距離および直立した垂直方向の活動をそれぞれ左側のパネルおよび右側パネルに示す。
【０１９５】
実施例３
エクソン５１の除去によるジストロフィンの回復
エクソン５１の除去により、Δ５２／ｍｄｘマウスにおいてベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）様の遺伝子型を作成することができ、理論的にはジストロフィン発現を回復させることができる。Δ５２／ｍｄｘマウスを使用して、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムを使用したエクソン５１の除去によるジストロフィン発現の回復を実証した。図３２は、イントロン領域中でエクソン５１の上流および下流をｇＲＮＡが標的とすることによりエクソン５１をスキップさせる、ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡを使用した修正戦略を示す。
【０１９６】
標準：ｇＲＮＡ  ＪＣＲ１７９（上流）またはＪＣＲ１８３（下流）（それぞれ配列番号３７および配列番号３８）ならびにＳａＣａｓ９を含むプラスミドをＤＭＤ患者筋芽細胞に電気穿孔した。分化細胞からタンパク質を回収し、ジストロフィン抗体によるウエスタンブロットを使用して分析した。図３３は、ゲノムＤＮＡを編集してジストロフィンタンパク質を回復させ得ることを示しており、なぜならば、３つ全ての成分（即ち、両方のｇＲＮＡおよびＳａＣａｓ９）で処理した細胞はジストロフィン発現を示したからである。
【０１９７】
次いで、このシステムをΔ５２／ｍｄｘマウスで試験した。図３４は、ｇＲＮＡおよびＳａＣａｓ９システムを使用してΔ５２／ｍｄｘマウスを処理するための実験設計を示し、この実験設計で使用する２種のウイルスベクターの概略を含む。ベクターＰＴ３６６−１７９（配列番号３９）およびＰＴ３６６−１８３（配列番号４０）ならびにウイルス粒子を製造するための当分野で既知の方法を使用して、ＡＡＶ８組換えウイルスコンストラクトを作成した。これらのウイルスベクター（ＡＡＶ８）を、２種のウイルス粒子としてインビボで同時送達した。各ウイルス粒子は、ＳａＣａｓ９とｇＲＮＡのうちの１つとを含んだ（図３を参照されたい）。Δ５２／ｍｄｘマウスをＡＡＶ８組換えウイルスコンストラクトの５Ｅ１１で処理した。ウイルスを右ＴＡ筋に筋肉内注射し、左ＴＡ筋は対側対照としての役割を果たし、この左ＴＡ筋にＰＢＳを注射した。処理後、左ＴＡ筋および右ＴＡ筋の両方を取り出し、それぞれの切片をゲノムＤＮＡ分析用に採取した。図３５に示すように、目的の領域を横切ってＰＣＲを実施し、左側のゲル上での処理右ＴＡ筋において欠失バンドが認められ、このことは、あるレベルのゲノム編集を示した。この欠失バンドを配列決定し、優性産物は、各ｇＲＮＡのＰＡＭからの予想連結３塩基対であった。図３５は、右ＴＡ筋におけるインビボでのエクソン５１欠失を示す。
【０１９８】
同様に、処理右ＴＡおよび対照左ＴＡ筋の切片を分析して、編集がＲＮＡを通じて伝えられるかどうかを決定した。ｃＤＮＡ中のエクソン５０〜５３を横切ってＰＣＲを実施した。図３６の右側のゲルに示すように、処理サンプルのうちの２つでは、エクソン５１および５２の欠如が存在する。欠失バンドを配列決定し、マウスがエクソン５２を既に欠いており且つＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムがエクソン５１を除去したと仮定すると、予想したように優性産物はエクソン５０〜５３の連結であった（底部の右側の配列クロマトグラムを参照されたい）。図３６は、右ＴＡ筋におけるインビボでのエクソン５１欠失を示す。
【０１９９】
図３７は、Δ５２／ｍｄｘマウスの対照ＰＢＳを注射した左ＴＡ筋中にジストロフィンがほとんど存在しなかったことを示す代表的な蛍光免疫組織化学的染色を示す。対照左ＴＡ上の緑色でのある程度のジストロフィン染色は、緑色に染まる場合もある復帰変異体繊維または死滅細胞に起因する可能性がある。右側の写真に示すように、処理右ＴＡ筋では緑色のジストロフィン染色が明らかに増加している。図３７は、処理ＴＡ筋におけるインビボでのジストロフィンタンパク質回復を示す。
【０２００】
３匹の試験マウスからの左右のＴＡ筋からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット分析を実施した。図３８は、処理ＴＡ筋におけるインビボでのジストロフィンタンパク質の回復を示す。対照左ＴＡ筋ではタンパク質発現が見られず、３つ全ての右ＴＡ筋は様々なレベルのジストロフィンタンパク質発現を示した。マウス１の右ＴＡからのタンパク質発現が最も強力であり、マウス２および３は、微弱であるとはいえ存在するバンドを有した。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムは、Δ５２／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィンタンパク質発現をある程度まで回復させるためにインビボで作用した。
【０２０１】
マウスの生理学的試験。処理マウス（全て雄ｈＤＭＤ−Δ５２（ｈｅｔ）／ｍｄｘ（ｈｅｍｉ）マウス）を、ＳａＣａｓ９を含むおよびｇＲＮＡを含むＡＡＶ８（ｎ＝１０）またはＡＡＶ９（ｎ＝１０）組換えウイルスコンストラクトで処理し、未処理マウス（ｈＤＭＤ−Δ５２／ｍｄｘ）（ｎ＝１０）と比較した。ＡＡＶ組換えウイルスコンストラクトを、ベクターＰＴ３６６−１７９（配列番号３９）およびＰＴ３６６−１８３（配列番号４０）を使用し且つ当分野で既知の方法を使用して作成した。処理マウスは、６〜８週齢の尾静脈に注射したウイルス２００μＬを有した。８週間後にマウスを試験した。
【０２０２】
オープンフィールドの距離試験。マウスに、３０分にわたりオープンフィールドアリーナを自由に探索させた。動物の活動および位置を、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙソフトウェアを実行するコンピュータにインターフェースで接続された赤外線ダイオードで自動的にモニタリングした。データを連続的に収集し、５分間隔である区間に入れた。図３９は、未処理の１６週齢のマウスと比較した、８週齢で処理した１６週齢のマウスでの総移動距離に関する全ての時点での平均を示す。１６週後の後ろ足で立っている姿勢の合計に関する全ての時点の平均を図４０に示す。統計は、一方向ＡＮＯＶＡ、各カラム平均と未処理平均との比較、およびＤｕｎｎｅｔｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ（平均＋／−ＳＥＭ）であった。ＡＡＶ８処理マウスおよびＡＡＶ９処理マウスは、未処理の年齢が一致するマウスと比べて統計的に有意に多い移動距離を示す（統計的に有意）。全ての処理マウスは、未処理の年齢が一致する対照と比較して、後ろ足で立っている姿勢の統計的に有意に増加した量を示す。
【０２０３】
握力。１６週の未処理マウスと処理マウスとの握力を試験した。マウスに、前足および後ろ足に対してそれぞれ３〜５回試行して握力を試験した。試行平均を図４１に示す。握力を重量グラムとして報告する。図４１に示すように、ＡＡＶ９処理マウスは、未処理の年齢が一致するマウスと比較して、前足において統計的に有意に増加した握力を示した。統計は、双方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃであった。
【０２０４】
ｃＤＮＡ  ＰＣＲ。マウスの心臓からの組織を、ＲＮＥａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して処理した。結果として得られたＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ  １μＬを、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＤＮＡポリメラーゼならびにエクソン４８でのプライマー（フォワードプライマー：ｇｔｔｔｃｃａｇａｇｃｔｔｔａｃｃｔｇａｇａａ（配列番号８９））およびエクソン５４でのプライマー（リバースプライマー：ＣＴＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧ（配列番号９０））を使用してＰＣＲ増幅させた。予想されるバンドサイズは、欠失が存在しなかった（即ち、エクソン５２が依然として存在した）場合には９９７ｎｔであり、エクソン５２が欠失した場合には約７６４ｎｔであった。図４２は、３６〜５０時間齢で顔面静脈を介してＡＡＶ９を注射したＰ２マウス（「ＪＡ１０（Ｐ２  ＡＡＶ９）」）、および尾静脈を介してＡＡＶ８の３．３−７．７Ｅ１２（「ＪＡ１１（ＴＶ  ＡＡＶ８）」）またはＡＡＶ９の４．３−７．５Ｅ１２（「ＪＡ１２（ＴＶ  ＡＡＶ９）」）を注射した成体マウスを示す。図４２に示すように、Ｐ２マウス（４８〜５４時間齢マウス）ＡＡＶ９処理マウス、ならびにＡＡＶ８成体処理マウスおよびＡＡＶ９成体処理マウスにおいて様々な程度に編集が生じ、このことを、エクソン５３に結合するプライマーｔｔｔｃｔｇｔｇａｔｔｔｔｃｔｔｔｔｇｇａｔｔｇ（配列番号１０９）を使用した欠失バンドの配列決定によりさらに確認した。図４３は、Ｊａ１０マウス１由来の欠失バンドの配列におけるエクソン５１および５２の欠失を示す代表的なクロマトグラムを示す。
【０２０５】
前述の詳細な説明および付随する実施例は、単に実例に過ぎず、本発明の範囲への制限と受け取るべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されることが理解されよう。
【０２０６】
開示された実施態様に対する様々な変更および改変は、当業者には明らかであろう。限定はされないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用の方法に関するものを含めた、こうした変更および改変を、その趣旨および範囲から逸脱せずに行うことができる。
【０２０７】
完全性の理由から、本発明の種々の態様を、次の番号付けした条項で提示する：
第１項．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【０２０８】
第２項．第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含むＤＮＡターゲティング組成物であって、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、ＤＮＡターゲティング組成物。
【０２０９】
第３項．前記第１のｇＲＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号４１であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号４２である、第２項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１０】
第４項．前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、第２項または第３項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１１】
第５項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉｉ）配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第２〜４項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１２】
第６項．クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質をさらに含む第２〜５項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１３】
第７項．前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２５）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９分子を含む、第６項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１４】
第８項．前記Ｃａｓタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子を含む、第６項または第７項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１５】
第９項．前記ＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号８３のヌクレオチド配列、配列番号８４のヌクレオチド配列、配列番号３７のヌクレオチド配列および／または配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、第２〜８項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【０２１６】
第１０項．第１項に記載のｇＲＮＡ分子または第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物を含む単離ポリヌクレオチド。
【０２１７】
第１１項．第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物または第１０項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【０２１８】
第１２項．第６〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物を含むベクター。
【０２１９】
第１３項．（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子、および（ｃ）ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子をコードするベクターであって、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、ベクター。
【０２２０】
第１４項．前記ベクターは、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成されている、第１３項に記載のベクター。
【０２２１】
第１５項．前記第１のｇＲＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号４１であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号４２である、第１３項または第１４項に記載のベクター。
【０２２２】
第１６項．前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、第１３〜１５項のいずれか一項に記載のベクター。
【０２２３】
第１７項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第１３〜１６項のいずれか一項に記載のベクター。
【０２２４】
第１８項．前記ベクターはウイルスベクターである、第１１〜１７項のいずれか一項に記載のベクター。
【０２２５】
第１９項．前記ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、第１８項に記載のベクター。
【０２２６】
第２０項．前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、第１９項に記載のベクター。
【０２２７】
第２１項．前記ベクターは、前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子および／または前記Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、第１１〜２０項のいずれか一項に記載のベクター。
【０２２８】
第２２項．前記組織特異的プロモーターは筋肉特異的プロモーターである、第２１項に記載のベクター。
【０２２９】
第２３項．第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【０２３０】
第２４項．第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティングシステム、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２３に記載の細胞と、任意選択で使用するための説明書とを含むキット。
【０２３１】
第２５項．細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティングシステム、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクターを細胞に投与することを含む方法。
【０２３２】
第２６項．対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティングシステム、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクターまたは第２３項に記載の細胞を含むゲノム編集用組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【０２３３】
第２７項．前記ゲノム編集用組成物を前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、第２６項に記載の方法。
【０２３４】
第２８項．前記変異ジストロフィン遺伝子を修正することはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、第２５〜２７項のいずれか一項に記載の方法。
【０２３５】
第２９項．変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティングシステム、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクターまたは第２３項に記載の細胞を前記対象に投与することを含む方法。
【０２３６】
第３０項．対象中での変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の改変アデノ随伴ウイルスベクターであって、第１項に記載のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９分子をコードする第２のポリヌクレオチド配列と含む改変アデノ随伴ウイルスベクター。
【０２３７】
第３１項．前記改変アデノ随伴ウイルスベクターは配列番号３９または配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む、第３０項に記載の改変アデノ随伴ウイルスベクター。
【０２３８】
第３２項．ジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１を含むセグメントの欠失用の組成物であって、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを含み、前記第１および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれがヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１を含むセグメントが欠失される、組成物。
【０２３９】
第３３項．前記セグメントは約５０個の塩基対〜約２，０００個の塩基対の長さを有する、第３２項に記載の組成物。
【０２４０】
第３４項．前記セグメントは、約１１８個の塩基対、約２３３個の塩基対、約３２６個の塩基対、約７６６個の塩基対、約８０５個の塩基対または約１６１１個の塩基対の長さを有する、第３３項に記載の組成物。
【０２４１】
第３５項．前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は同一である、第３２〜３４項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２４２】
第３６項．前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、第３５項の記載の組成物。
【０２４３】
第３７項．前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、第３６項に記載の組成物。
【０２４４】
第３８項．前記第１のＣａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は異なる、第３２〜３４項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２４５】
第３９項．前記第１のＣａｓ９分子または前記第２のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、第３８項に記載の組成物。
【０２４６】
第４０項．前記第１のＣａｓ９分子および／または前記第２のＣａｓ９分子は、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＳａＣａｓ９分子を含む、第３２〜３９項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２４７】
第４１項．前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターはウイルスベクターである、第３２〜４０項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２４８】
第４２項．前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、第４１項に記載の組成物。
【０２４９】
第４３項．前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、第４２項に記載の組成物。
【０２５０】
第４４項．前記ジストロフィン遺伝子はヒトジストロフィン遺伝子である、第３２〜４３項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５１】
第４５項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は異なるターゲティングドメインを含む、第３２〜４４項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５２】
第４６項．前記第１のｇＲＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５であり、前記第２のｇＲＮＡ分子は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９である、第３２〜４５項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５３】
第４７項．前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される、第３２〜４６項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５４】
第４８項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第３２〜４７項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５５】
第４９項．前記第１のベクターは配列番号３９に記載のヌクレオチド配列を含み、前記第２のベクターは配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含む、第３２〜４８項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５６】
第５０項．薬物での使用のための第３２〜４９項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５７】
第５１項．デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置での使用のための第３２〜５０項のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５８】
第５２項．第３２〜５１項のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
【０２５９】
第５３項．細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記細胞に、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される、方法。
【０２６０】
第５４項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第５３項に記載の方法。
【０２６１】
第５５項．前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊された読み枠、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を含む、第５３項または第５４項に記載の方法。
【０２６２】
第５６項．前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切り詰め型遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む、第５３〜５５項のいずれか一項に記載の方法。
【０２６３】
第５７項．前記変異ジストロフィン遺伝子は、前記読み枠を破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、第５３〜５５項のいずれか一項に記載の方法。
【０２６４】
第５８項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容部位の破壊もしくはスプライス供与配列の破壊によるスプライシングの改変を含む、第５３〜５７項のいずれか一項に記載の方法。
【０２６５】
第５９項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はエクソン５１の欠失を含む、第５３〜５８項のいずれか一項に記載の方法。
【０２６６】
第６０項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は相同組換え修復を含む、第５３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【０２６７】
第６１項．前記細胞にドナーＤＮＡを投与することをさらに含む第６０項に記載の方法。
【０２６８】
第６２項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、第５３〜６１項のいずれか一項に記載の方法。
【０２６９】
第６３項．前記細胞は筋芽細胞である、第５３〜６２項のいずれか一項に記載の方法。
【０２７０】
第６４項．前記細胞はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象に由来する、第５３〜６３項のいずれか一項に記載の方法。
【０２７１】
第６５項．前記細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しているヒト対象由来の筋芽細胞である、第５３〜６４項のいずれか一項に記載の方法。
【０２７２】
第６６項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第５３〜６５項のいずれか一項に記載の方法。
【０２７３】
第６７項．変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、（ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９〜２４個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される、方法。
【０２７４】
第６８項．前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される、第６７項に記載の方法。
【０２７５】
第６９項．前記対象はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している、第６８項に記載の方法。
【０２７６】
第７０項．前記第１のベクターおよび第２のベクターを前記対象の筋肉に投与する、第６７〜６９項のいずれか一項に記載の方法。
【０２７７】
第７１項．前記筋肉は骨格筋または心筋である、第７０項に記載の方法。
【０２７８】
第７２項．前記骨格筋は前脛骨筋である、第７１項に記載の方法。
【０２７９】
第７３項．前記第１のベクターおよび第２のベクターを前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、第６７〜７２項のいずれか一項に記載の方法。
【０２８０】
第７４項．エクソン５２が欠失した（Δ５２）ヒトジストロフィン遺伝子（ｈＤＭＤ）を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法であって、第１項に記載のｇＲＮＡ、第２〜９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティングシステム、第１０項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１１〜２２項のいずれか一項に記載のベクター、第３０項または第３１項に記載の改変アデノ随伴ウイルスベクターまたは第３２〜５１項のいずれか一項に記載の組成物を齧歯動物胚に投与し、それにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２が欠失される、投与すること、および前記ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２が欠失している遺伝子導入齧歯動物胚を選択することであって、前記齧歯動物胚は正常なヒトジストロフィン遺伝子を含む、選択することを含む方法。
【０２８１】
第７５項．前記齧歯動物胚はマウス胚である、第７４項に記載の方法。
【０２８２】
第７６項．前記齧歯動物胚はヘテロ接合性ｈＤＭＤまたはヘテロ接合性ｈＤＭＤ−Δ５２である、第７４項または第７５項に記載の方法。
【０２８３】
第７７項．前記齧歯動物胚に、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子を投与してヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５２を欠失させる、第７４〜７６項のいずれか一項に記載の方法。
【０２８４】
第７８項．前記齧歯動物胚に、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質を投与することをさらに含む第７４〜７７項のいずれか一項に記載の方法。
【０２８５】
第７９項．第７４〜７８項のいずれか一項に記載の方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚。
【０２８６】
第８０項．第７９項に記載の遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物。
【０２８７】
付表
ＪＣＲ１７９を有するｐＤＯ２４０（配列番号３７）（ｇＲＮＡは太字）
【化２９】
2018534950.tif 000034
【化３０】
2018534950.tif 000035
【０２８８】
ＪＣＲ１８３を有するｐＤＯ２４０（配列番号３８）（ｇＲＮＡは太字）
【化３１】
2018534950.tif 000036
【化３２】
2018534950.tif 000037
【０２８９】
ＪＣＲ１７９  ＰＴ３６６ＡＡＶ  １７９を有するＰＴ３６６（配列番号３９）−インビボでの作業に使用されるＡＡＶプラスミド（ｇＲＮＡは太字；ＳａＣａｓ９は大文字；ＮＬＳは小文字、太字および下線付き）
【化３３】
2018534950.tif 000038
【化３４】
2018534950.tif 000039
【化３５】
2018534950.tif 000040
【化３６】
2018534950.tif 000041
【化３７】
2018534950.tif 000042
【０２９０】
ＪＣＲ１８３を有するＰＴ３６６（配列番号４０）−インビボでの作業に使用される（ｇＲＮＡは太字；ＳａＣａｓ９は大文字；ＮＬＳは小文字、太字および下線付き）
【化３８】
2018534950.tif 000043
【化３９】
2018534950.tif 000044
【化４０】
2018534950.tif 000045
【化４１】
2018534950.tif 000046
【化４２】
2018534950.tif 000047
【０２９１】
ｐＤＯ２４２（インビボでの作業のために全てのＪＣＲ８９／９１プロジェクトおよびＪＣＲ１５７／１６０プロジェクトで使用されるＳａＣａｓ；ＳａＣａｓ９は大文字）（配列番号８３）
【化４３】
2018534950.tif 000048
【化４４】
2018534950.tif 000049
【化４５】
2018534950.tif 000050
【化４６】
2018534950.tif 000051
【０２９２】
ｐＪＲＨ１（全てのＪＣＲ１７９／１８３プロジェクトに使用されるＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９は大文字；ＮＬＳは小文字、太字および下線付き）（配列番号８４）
【化４７】
2018534950.tif 000052
【化４８】
2018534950.tif 000053
【化４９】
2018534950.tif 000054
【化５０】
2018534950.tif 000055
【化５１】
2018534950.tif 000056
【０２９３】
ＰＴ３６６中のＮＬＳ配列（配列番号８５）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧ
【０２９４】
ｐＤＯ２０３−ｇＲＮＡをＳｐＣａｓ９にクローニングするための一般的なバックボーン；ＪＣＲ９４およびＪＣＲ９９を太字の部位に入れて細胞中で試験し、次いでｈＤＭＤ−ｄｅｌｔａ５２／ｍｄｘマウスを作製するためにｍＲＮＡを作製した（配列番号８６）
【化５２】
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【化５３】
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【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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