(57)【要約】網膜色素上皮細胞を産生する方法が開示される。網膜色素上皮細胞を含む細胞集団およびその使用も開示される。2018521678.tif 000019
2018521678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜色素上皮（RPE）細胞を産生する方法であって、
（a）分化誘導剤を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養して分化細胞を得る工程；
（b）TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養物中で該分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を含む混合細胞集団を産生する工程；
（c）該培養物から該混合細胞集団を取り出す工程であって、該混合細胞集団の細胞の10％超が非色素細胞である、工程；およびその後、
（d）該混合細胞集団を接着性表面上で培養して、増殖したRPE細胞集団を産生する工程；および
（e）該増殖したRPE細胞集団を収集し、それによってRPE細胞を産生する工程
を含む、方法。
【請求項２】
工程（c）が酵素的に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程（c）において前記培養物中の全細胞の50％超が取り出される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
工程（a）の前にヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記増殖したRPE細胞集団の細胞の70％超がCRALBP+PMEL17+である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
接着性表面が、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIおよびコラーゲンIVからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
接着性表面上での細胞集団の培養が少なくとも3週間行われる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
接着性表面上での細胞集団の培養が8代を超える継代にわたって行われる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記増殖したRPE細胞集団が30回を超える細胞倍加を受けている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程（e）の後、RPE細胞を凍結保存する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
凍結保存が、90％ヒト血清／10％ DMSO、CryoStor 2％、CryoStor 5％およびCryoStor 10％ならびにStem Cell Bankerからなる群から選択される培地中で行われる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
分化誘導剤がニコチンアミドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
工程（a）の培地がアクチビンAを欠いている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
TGFβスーパーファミリーのメンバーが、TGFβ1、TGFβ3およびアクチビンAからなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
工程（b）の培地がニコチンアミドおよびアクチビンAを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
工程（b）の後かつ工程（c）の前に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠く培地中でRPE細胞を培養する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
工程（a）が非接着条件下で行われる、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
工程（a）が、最初は非接着条件下で行われ、その後、接着条件下で行われる、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
非接着条件が非接着性培養プレートを含む、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
非接着条件が非接着性基材を含む、請求項18または19記載の方法。
【請求項２２】
工程（a）が、
（i）培養されるヒト多能性幹細胞集団を、ニコチンアミドを含む培地中、アクチビンAの非存在下、非接着条件下で培養して、分化細胞を含む細胞のクラスターを産生する工程；およびその後、
（ii）（i）の該分化細胞を、ニコチンアミドを含む培地中、アクチビンAの非存在下、接着条件下で培養する工程
を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
工程（ii）の前に前記細胞のクラスターを解離して、細胞の凝集塊または細胞の単一細胞懸濁液を生成する工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
工程（a）が少なくとも5日間行われる、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
工程（b）が少なくとも1週間行われる、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
。
【請求項２６】
培養の少なくとも一部が、大気酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
培養が、大気酸素レベルが約10％よりも高い条件下で行われる、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ヒト多能性幹細胞をフィーダー細胞上で増殖させる、請求項4記載の方法。
【請求項２９】
フィーダー細胞がヒト帯線維芽細胞を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
接着性表面上での細胞集団の培養が少なくとも3継代にわたって行われる、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
網膜疾患または神経変性疾患もしくは障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（a）請求項1〜30のいずれか一項記載の方法にしたがってRPE細胞を産生する工程；および
（b）収集後、治療有効量の該RPE細胞を該対象の眼の中に移植し、それによって該疾患を処置する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
分化したRPE細胞の移植が眼の網膜下腔で行われる、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
RPE細胞が、懸濁液の状態で、またはマトリックスもしくは基材上に固定化された細胞の単層として、移植される、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
網膜疾患または障害が、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性症、加齢黄斑変性症（AMD）、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、脈絡膜欠如、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか1つによって生じた損傷に起因するRPE損傷および網膜損傷の少なくとも1つから選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
請求項1〜30のいずれか一項記載の方法にしたがって産生されたRPE細胞集団。
【請求項３６】
網膜疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項35記載のRPE細胞を該対象に投与し、それによって該網膜疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害を処置する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、そのいくつかの態様において、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を調製する方法に関する。
【０００２】
本発明は、そのいくつかの態様において、網膜色素上皮細胞に関し、より具体的には、ただし非排他的に、治療剤としてのそのような細胞の評価に関する。本発明はまた、胚性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
網膜色素上皮（RPE）とは、神経網膜と脈絡毛細管板との間に位置する色素細胞の単層である。RPE細胞は、網膜およびその光受容体の維持および機能において決定的な役割を演じる。そのような役割は、血液網膜関門の形成、迷光の吸収、神経網膜への栄養素の供給、視色素の再生ならびに落屑した光受容体外節の取り込みおよび再循環を含む。
【０００４】
網膜組織はいくつかの理由で変性し得る。理由としては、通常は非遺伝性である、動脈または静脈の閉塞、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症がある。遺伝性疾患としては、網膜組織変性も伴う、網膜色素変性症、網膜分離症、格子状変性、ベスト病、シュタルガルト病がある。一般的な網膜変性状態が加齢黄斑変性（AMD）である。これらの状態は進行性の網膜変性を特徴とする。
【０００５】
RPE細胞は、上述の網膜疾患において変性するRPEの細胞補充療法（cell replacement therapy）のために潜在的に使用され得る。また、網膜変性疾患の処置のための遺伝子導入のための媒体としても使用され得る。加えて、これらの細胞は、他の細胞（たとえば光受容体）と組み合わせて、または小分子と組み合わせて、使用されることもできる。これらの細胞はまた、網膜変性疾患のインビトロモデルとして、小分子の治療効果のハイスループットスクリーニングのためのツールとして、また、網膜変性疾患のための新薬の発見および試験のために、役立ち得る。RPE細胞はまた、RPEの発達、成熟、特性、性質、代謝、免疫原性、機能および他の細胞型との相互作用の基礎研究にも使用することもできる。
【０００６】
ヒトの胎児RPEおよび成人RPEが、同種異系間移植の代替ドナー源として使用されてきた。しかし、十分な組織供給を得る際の現実的な問題および中絶された胎児からの組織の使用に関する倫理的懸念が、これらのドナー源の広範な使用を制限している。成人および胎児RPE移植片の供給におけるこれらの制限を考慮して、代替ドナー源の可能性が研究されてきた。ヒト多能性幹細胞は、移植のためのRPE細胞の供給源として有意な利点を提供する。それらの多能性発生能は、真正な機能性RPE細胞への分化を可能にし得、無限の自己複製の可能性を与えられるならば、RPE細胞の無限のドナー源として役立ち得る。事実、ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（iPSC）が、RPE機能不全によって生じた網膜変性のRoyal College of Surgeons（RCS）ラットモデルへの網膜下移植ののち、インビトロでRPE細胞へと分化し、網膜変性を軽減し、視覚機能を保持し得ることが実証された。したがって、多能性幹細胞は、RPE細胞産生のための無限の供給源となり得る。
【０００７】
多能性幹細胞からRPE細胞を誘導するための現行のプロトコルは労力および時間を要するものであり、限られた数の色素細胞しか産生しない。臨床状況において使用するのに十分な量でRPE細胞を産生するためには、新たな方法が必要である。
【０００８】
背景技術には、WO2013/114360（特許文献1）、WO2008/129554（特許文献2）およびWO2013/184809（特許文献3）が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2013/114360
【特許文献２】WO2008/129554
【特許文献３】WO2013/184809
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの態様の局面にしたがって、網膜色素上皮（RPE）細胞を産生する方法であって、
（a）分化誘導剤を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養して分化細胞を得る工程；
（b）TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養物中で分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を含む混合細胞集団を産生する工程；
（c）培養物から混合細胞集団を取り出す工程であって、混合細胞集団の細胞の10％超が非色素細胞である、工程；およびその後、
（d）混合細胞集団を接着性表面上で培養して、増殖したRPE細胞集団を産生する工程；および
（e）増殖したRPE細胞集団を収集し、それによってRPE細胞を産生する工程
を含む、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの態様の局面にしたがって、本明細書に記載される方法にしたがって産生されたRPE細胞集団が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの態様の局面にしたがって、網膜疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の本明細書に記載されるRPE細胞を対象に投与し、それによって網膜疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害を処置する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの態様の局面にしたがって、網膜疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（a）本明細書に記載される方法にしたがってRPE細胞を産生する工程；および
（b）収集後、治療有効量のRPE細胞を対象の眼の中に移植し、それによって疾患を処置する工程
を含む、方法が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（c）は酵素的に行われる。
【００１５】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（c）において培養物中の全細胞の50％超が取り出される。
【００１６】
本発明のいくつかの態様にしたがって、方法はさらに、工程（a）の前にヒト多能性幹細胞を増殖させる工程を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの態様にしたがって、増殖したRPE細胞集団の細胞の70％超がCRALBP+PMEL17+である。
【００１８】
本発明のいくつかの態様にしたがって、接着性表面は、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンIおよびコラーゲンIVからなる群から選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの態様にしたがって、接着性表面上での細胞集団の培養は少なくとも3週間行われる。
【００２０】
本発明のいくつかの態様にしたがって、接着性表面上での細胞集団の培養は少なくとも8継代にわたって行われる。
【００２１】
本発明のいくつかの態様にしたがって、方法はさらに、工程（e）の後、RPE細胞を凍結保存する工程を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの態様にしたがって、凍結保存は、90％ヒト血清／10％ DMSO、CryoStor 2％、CryoStor 5％およびCryoStor 10％ならびにStem Cell Bankerからなる群から選択される培地中で行われる。
【００２３】
本発明のいくつかの態様にしたがって、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの態様にしたがって、分化誘導剤はニコチンアミドを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（a）の培地はアクチビンAを欠いている。
【００２６】
本発明のいくつかの態様にしたがって、TGFβスーパーファミリーのメンバーは、TGFβ1、TGFβ3およびアクチビンAからなる群から選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（b）の培地はニコチンアミドおよびアクチビンAを含む。
【００２８】
本発明のいくつかの態様にしたがって、増殖したRPE細胞集団は30回を超える細胞倍加を受けている。
【００２９】
本発明のいくつかの態様にしたがって、方法はさらに、工程（b）の後かつ工程（c）の前に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠く培地中でRPE細胞を培養する工程を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（a）は非接着条件下で行われる。
【００３１】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（a）は、最初は非接着条件下で行われ、その後、接着条件下で行われる。
【００３２】
本発明のいくつかの態様にしたがって、非接着条件は非接着性培養プレートを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの態様にしたがって、非接着条件は非接着性基材を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（a）は、
（i）培養されるヒト多能性幹細胞の集団を、ニコチンアミドを含む培地中、アクチビンAの非存在下、非接着条件下で培養して、分化細胞を含む細胞クラスターを産生する工程；およびその後、
（ii）（i）の分化細胞を、ニコチンアミドを含む培地中、アクチビンAの非存在下、接着条件下で培養する工程
を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの態様にしたがって、方法はさらに、工程（ii）の前に細胞クラスターを解離して、細胞の凝集塊または細胞の単一細胞懸濁液を生成する工程を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（a）は少なくとも5日間行われる。
【００３７】
本発明のいくつかの態様にしたがって、工程（b）は少なくとも1週間行われる。
【００３８】
本発明のいくつかの態様にしたがって、培養の少なくとも一部は、大気酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる。
【００３９】
本発明のいくつかの態様にしたがって、培養は、大気酸素レベルが約10％よりも高い条件下で行われる。
【００４０】
本発明のいくつかの態様にしたがって、ヒト多能性幹細胞はフィーダー細胞上で増殖させる。
【００４１】
本発明のいくつかの態様にしたがって、フィーダー細胞はヒト帯線維芽細胞を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの態様にしたがって、接着性表面上での細胞集団の培養が少なくとも3継代にわたって行われる。
【００４３】
本発明のいくつかの態様にしたがって、分化したRPE細胞の移植は眼の網膜下腔で行われる。
【００４４】
本発明のいくつかの態様にしたがって、RPE細胞は、懸濁液の状態で、またはマトリックスもしくは基材上に固定化された細胞の単層として、移植される。
【００４５】
本発明のいくつかの態様にしたがって、網膜疾患または障害は、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性症、加齢黄斑変性症（AMD）、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、脈絡膜欠如、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか1つによって生じた損傷に起因するRPE損傷および網膜損傷の少なくとも1つから選択される。
【００４６】
別段定義されない限り、本明細書の中で使用されるすべての専門用語および／または科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等である方法および材料を本発明の態様の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、本発明明細書が、定義を含め、優先する。加えて、材料、方法および例は例示でしかなく、必ずしも限定的であることを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
本発明のいくつかの態様が、添付の図面および画像を参照しながら例としてのみ本明細書に記載される。図面を詳細に参照するとき、示される詳細は例であり、本発明の態様の例示的説明のためのものであることが強調される。これに関し、図面と合わせて理解される詳細な説明は、本発明の態様が実施され得る方法を当業者に明らかにする。
【００４８】
【図１Ａ】実施例1の場合のRPE製造工程および工程内管理ポイント（黄色の星印、工程内管理（In Process Control）すなわちIPC 1〜11）の概要である。NUTSPlus、bFGFおよびTGFβを含有するNutristem培地；NUTSMinus、bFGFおよびTGFβなしのNutristem培地；NIC、ニコチンアミド；SB、球状体（spheroid body）。
【図１Ｂ】実施例2の場合のRPE製造工程および工程内管理ポイント（黄色の星印、工程内管理すなわちIPC 1〜11）の概要である。NUTSPlus、bFGFおよびTGFβを含有するNutristem培地；NUTSMinus、bFGFおよびTGFβなしのNutristem培地；NIC、ニコチンアミド；SB、球状体。
【図２】製造工程1中に沿ったCRALBP+PMEL17+細胞のレベルを示す。IPCポイント5〜9の密度プロットならびにポジティブコントロールRPE細胞およびネガティブコントロールhESCの代表的な密度プロット。各プロット中の右上および右下四分割区内の数値は、それぞれ、単一生細胞ゲーティング集団からの％CRALBP+PMEL17+およびCRALBP+PMEL17-細胞を示す。分析は、FCS Express 4ソフトウェアを使用して実施した。
【図３】製剤中のCRALBP+PMEL17+細胞のレベルを示す。IPCポイント11の密度プロット（製剤、すなわち凍結保存後のP2におけるRPE）ならびにポジティブコントロールRPEおよびネガティブコントロールhESCの代表的な密度プロット。各プロット中の右上四分割区内の数値は、単一生細胞ゲーティング集団からの％CRALBP+PMEL17+を示す。分析は、FCS Express 4ソフトウェアを使用して実施した。
【図４】製造工程に沿ったRPE細胞の形態を示す。
【図５】図5A〜Cは、様々なマトリックス上で増殖させ、10％ DMSOを含有する90％ヒト血清（HS）中（コントロール：青い棒）またはCryoStor 5％中（CS；赤い棒）で凍結保存した、機械的（Mech）に単離された細胞および酵素的（Enz）に回収された細胞の解凍後生存率および活性を示す。Gel、ニコチンアミド（Nic）を含むまたは含まないrhゼラチン；Col I、コラーゲンI；Col IV、コラーゲンIV；Lm521、ラミニン521。
【図６】図6A〜Dは、ニコチンアミドを含むrhゼラチン上で増殖させ、様々な凍結保存培地、すなわち10％ DMSOを含有する90％ヒト血清（HS）、CryoStor 5％（CS5）、Biological Industries Solution 1〜3（BI1〜3）、Prime XV（PXV）、Stem Cell Banker（SCB）中で凍結保存した、機械的に単離された細胞の解凍後生存率、全生細胞数／バイアルおよび活性を示す。コントロールとして、ニコチンアミドなしのrhゼラチンで増殖させ、SCB（SCB Gel）中で凍結保存した細胞に関して、解凍後生存率、全生細胞数／バイアルおよび活性を計測した。
【図７】図7A〜Bは、増殖段階終了時の累積細胞収量。機械的単離（A）および酵素的回収（B）後の累積細胞収量。
【図８】MITFおよびZo-1抗体ならびにベストロフィン-1およびZo-1抗体を使用した、工程2からの製剤RPE細胞の共染色を示す。
【図９】製造工程2に沿った％CRALBP+PMEL17+細胞を示す。IPCポイント5〜9の密度プロットならびにポジティブコントロールRPEおよびネガティブコントロールhESCの代表的な密度プロットが提示されている。数値は、単一生細胞ゲーティング集団からの％CRALBP+PMEL17+二重陽性細胞を示す。分析は、FCS Express 4ソフトウェアを使用して実施した。
【図１０】製造工程2に沿った％Oct4+Tra-1-60+細胞を示す。IPCポイント1、8および11の密度プロットならびにポジティブコントロールRPEおよびネガティブコントロールhESCの代表的な密度プロットが提示されている。数値は、単一生細胞ゲーティング集団からの％Oct4+TRA-1-60+二重陽性細胞を示す。
【図１１】製造工程2に沿った％Pax6+細胞を示す。IPCポイント8および11の密度プロットならびにポジティブコントロールRPEおよびネガティブコントロールhESCの代表的な密度プロットが提示されている。数値は、単一生細胞ゲーティング集団からの％Pax6+陽性細胞を示す。
【図１２】RPE増殖段階中の様々な継代において全細胞の酵素的回収または多角形／色素細胞の機械的単離を使用した製造工程2に沿った細胞中のグルコースおよび乳酸成長プロファイルを比較するグラフを提示する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
発明の特定の態様の詳細な説明
本発明は、そのいくつかの態様において、多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を調製する方法に関する。
【００５０】
本発明の少なくとも1つの態様を詳細に説明する前に、本発明はその適用が必ずしも以下の説明に記載される詳細または実施例によって例示される詳細に限定されないということが理解されるべきである。本発明は、他の態様が可能である、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００５１】
ヒト胚性幹細胞がRPE細胞産生のための細胞供給源として提案されている。hESCから自発的分化および分化誘導によって網膜色素上皮（RPE）細胞を得るために、2つの一般的手法が使用されている。自発的分化において、平らなコロニーまたは胚様体（EB）中のhESCは、色素RPE細胞を含有する細胞集団へと自発的に分化することを許される。分化誘導法は、RPE細胞へのhESCの分化を駆動するためにいくつかの因子を使用する。たとえば、内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,956,866号を参照すること。
【００５２】
その中で記載されているプロトコルの重要な限界は、工業的な大量生産を制限する、その低スケール性である。米国特許第8,956,866号に記載されているRPE分化の最終工程は、非色素細胞から多角形／色素RPE細胞を機械的に単離することに基づく。この手法は、労力および時間を要するものである。
【００５３】
本発明者らは今、多角形／色素細胞の機械的単離を実施することなく、精製されたRPE細胞集団を得ることができると提案する。
【００５４】
機械的および酵素的に回収された細胞の増殖後に実施されたCRALBP+PMEL17+RPE純度試験は、2回の増殖サイクルののち、酵素的に回収された細胞は機械的に単離された細胞と同じくらい高純度であり、コラーゲンIに播種された場合で純度95.20％（機械的に単離された場合の97.99％と比較）、コラーゲンIVに播種された場合で純度95.02％（機械的に単離された場合の96.68％と比較）、ラミニン521に播種された場合で純度94.91％（機械的に単離された場合の96.41％と比較）であることを実証した。3回の増殖サイクルの後でも類似の結果が見られた。これらの結果は、典型的な多角形の上皮単層形態を実証する形態試験によって、また、PEDF分泌、バリア機能ならびにVEGFおよびPEDFの極性分泌を実証する機能試験によって裏付けられた。これらの発見の一貫性を示すために、第二の生産実験を実施した（図9）。
【００５５】
したがって、本発明の第一の局面にしたがって、網膜色素上皮（RPE）細胞を産生する方法であって、
（a）分化誘導剤を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養して分化細胞を得る工程；
（b）TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養物中で分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を含む混合細胞集団を産生する工程；
（c）培養物から混合細胞集団を取り出す工程であって、混合細胞集団の細胞の10％超が非色素細胞である、工程；およびその後、
（d）混合細胞集団を接着性表面上で培養して、増殖したRPE細胞集団を産生する工程；および
（e）増殖したRPE細胞集団を収集し、それによってRPE細胞を産生する工程
を含む、方法が提供される。
【００５６】
文脈が許すとき互換可能に使用され得る「網膜色素上皮細胞」、「RPE細胞」、「RPE」とは、網膜の色素上皮細胞層を形成する天然のRPE細胞の細胞型に機能的に類似する（たとえば、眼の中に移植されると、天然のRPE細胞の機能的活性に類似する機能的活性を示す）細胞型の細胞をいう。
【００５７】
1つの態様にしたがって、RPE細胞は、成熟RPE細胞の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのマーカーを発現する。そのようなマーカーは、CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、ベストロフィンおよびチロシナーゼを含むが、これらに限定されない。任意で、RPE細胞はまた、RPE前駆細胞のマーカー、たとえばMITFを発現し得る。別の態様において、RPE細胞はPAX-6を発現する。別の態様において、RPE細胞は、Rx、OTX2またはSIX3を含むが、これらに限定されない、網膜前駆細胞の少なくとも1つのマーカーを発現する。任意で、RPE細胞はSIX6および／またはLHX2のいずれかを発現する。
【００５８】
本明細書の中で使用される語句「成熟RPE細胞のマーカー」とは、非RPE細胞または未熟なRPE細胞と比べて成熟RPE細胞中で増加する（たとえば少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍）抗原（たとえばタンパク質）をいう。
【００５９】
本明細書の中で使用される語句「RPE前駆細胞のマーカー」とは、非RPE細胞と比べてRPE前駆細胞中で増加する（たとえば少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍）抗原（たとえばタンパク質）をいう。
【００６０】
別の態様にしたがって、RPE細胞は、網膜の色素上皮細胞層を形成する天然のRPE細胞の形態に類似する形態、すなわち色素を有し、特徴的な多角形を有する形態を有する。
【００６１】
さらに別の態様にしたがって、RPE細胞は、黄斑変性症のような疾患を処置することができる。
【００６２】
さらに別の態様にしたがって、RPE細胞は、本明細書中で先に挙げた要件の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたはすべてを満たす。
【００６３】
本明細書の中で使用される語句「幹細胞」とは、培養中、特定の特別な機能を有する他の細胞型（たとえば完全に分化した細胞）へと分化するよう誘発されるまで長期間、未分化状態にとどまることができる細胞（たとえば多能性幹細胞または多分化能幹細胞）をいう。好ましくは、語句「幹細胞」は、胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、成人幹細胞、間葉系幹細胞および造血幹細胞を包含する。
【００６４】
特定の態様にしたがって、RPE細胞は多能性幹細胞（たとえばESCまたはiPSC）から産生される。
【００６５】
人工多能性幹細胞（iPSC）は、体細胞から、体細胞の遺伝子操作によって、たとえば体細胞、たとえば線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞への転写因子、たとえばOct-3/4、Sox2、c-MycおよびKLF4のレトロウイルス導入によって産生することができる［Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb 14.（電子版が書籍よりも先）；IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451:141-146；K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-872］。他の胚様幹細胞は、レシピエント細胞が有糸分裂を阻止されるならば、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合または接合子中への核移植によって産生することができる。加えて、iPSCは、非統合法を使用して、たとえば小分子またはRNAを使用して産生することができる。
【００６６】
語句「胚性幹細胞」とは、3つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉、中胚葉）すべての細胞へと分化することもできるし、または未分化状態にとどまることもできる胚細胞をいう。語句「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成する胚組織から得られる細胞（たとえば胚盤胞）、胚の着床前に形成する胚組織から得られる細胞（すなわち着床前胚盤胞）、着床後／原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞（EBC）（WO2006/040763を参照）および妊娠中のいずれかの時点、好ましくは妊娠10週よりも前に胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（EG）細胞を含み得る。本発明のいくつかの態様の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を使用して得ることができる。たとえば、ヒト胚性幹細胞はヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は一般に、ヒトのインビボ着床前胚または体外受精（IVF）胚から得られる。または、単一細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡張することもできる。ヒトES細胞の単離の場合、胚盤胞から透明帯を取り出したのち、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかなピペット操作によって無傷の内部細胞塊（ICM）から取り出す手法によってICMを単離する。次いで、ICMを、その増殖を可能にする適切な培地を含む組織培養フラスコ中にプレーティングする。9〜15日後、ICM誘導増殖物を機械的解離または酵素的分解のいずれかによって凝集塊へと解離し、次いで、細胞を新しい組織培養培地上に再びプレーティングする。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個々に選択し、凝集塊へと機械的に解離し、再びプレーティングする。次いで、得られるES細胞を規定どおり4〜7日ごとに分割する。ヒトES細胞の調製方法に関するさらなる詳細に関しては、Reubinoff et al. Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559；Thomson et al., ［米国特許第5,843,780号；Science 282: 1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995］；Bongso et al., ［Hum Reprod 4: 706, 1989］；およびGardner et al., ［Fertil. Steril. 69: 84, 1998］を参照すること。
【００６７】
本発明のいくつかの態様にしたがって市販の幹細胞を使用することもできることが理解されよう。ヒトES細胞は、NIHヒト胚性幹細胞レジストリ［www.grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm］または他のhESCレジストリから購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077（H7）、WA09（H9）、WA13（H13）、WA14（H14）、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNhem19、BJNhem20、SA001、SA001である。
【００６８】
特定の態様にしたがって、胚性幹細胞株はHAD-C102またはESIである。
【００６９】
加えて、ES細胞は、マウス（Mills and Bradley, 2001）、ゴールデンハムスター［Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7］、ラット［Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92］、ウサギ［Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8；Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33］、いくつかの家畜種［Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60；Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8；Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67］および非ヒト霊長類種（アカゲザルおよびマーモセット）［Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8；Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9］を含む他の種からも得ることができる。
【００７０】
拡張胚盤胞細胞（EBC）は、受精後少なくとも9日の、原腸形成よりも前の段階の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、透明帯を消化して［たとえば酸性タイロード液（Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）によって］、内部細胞塊を露出させる。次いで、標準的な胚性幹細胞培養法を使用して、胚盤胞を胚全体として受精後少なくとも9日間かつ14日以内で（すなわち原腸形成イベントよりも前に）インビトロ培養する。
【００７１】
ES細胞を調製するための別の方法がChung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008に記載されている。この方法は、インビトロ受精工程中に胚から単一細胞を取り出す工程を含む。胚はこの工程中に破壊されない。
【００７２】
EG細胞は、妊娠約8〜11週（ヒトの場合）の胎児から得られる始原生殖細胞から当業者に公知の実験室技術を使用して調製される。生殖隆起を分離し、小さな塊へと切り分け、その後、その塊を機械的解離によって細胞へと分ける。次いで、EG細胞を、適切な培地を含む組織培養フラスコ中で増殖させる。細胞は、一般には7〜30日後または1〜4回の継代後にEG細胞と合致する細胞形態が認められるまで、培地を毎日交換しながら培養する。ヒトEG細胞を調製する方法に関するさらなる詳細に関しては、Shamblott et al., ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998］および米国特許第6,090,622号を参照すること。
【００７３】
ES細胞を調製するさらに別の方法は、単為生殖による方法である。この工程においても、胚は破壊されない。
【００７４】
現在実施されているES培養法は主に、幹細胞増殖に必要な因子を分泌すると同時にそれらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用に基づく。培養は一般に、固体表面、たとえばゼラチンまたはビメンチンでコートされた表面上で行われる。例示的なフィーダー層は、ヒト胚線維芽細胞、成人ファロピウス管上皮細胞、初代マウス胚線維芽細胞（PMEF）、マウス胚線維芽細胞（MEF）、マウス胎児線維芽細胞（MFF）、ヒト胚線維芽細胞（HEF）、ヒト胚性幹細胞の分化から得られるヒト線維芽細胞、ヒト胎児筋細胞（HFM）、ヒト胎児皮膚細胞（HFS）、ヒト成人皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞（HFF）、ヒト臍帯線維芽細胞、臍帯または胎盤から得られるヒト細胞、ならびにヒト骨髄間質細胞（hMSC）を含む。ESCを未分化状態に維持するための増殖因子を培地に加えてもよい。そのような増殖因子はbFGFおよび／またはTGFβを含む。別の態様において、hESCをナイーブな未分化状態に維持するための薬剤を培地に加えてもよい。たとえば、Kalkan et al., 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540を参照すること。
【００７５】
ヒト臍帯フィーダー層
ヒト臍帯線維芽細胞は、ヒト血清（たとえば20％）およびグルタミンで補足されたダルベッコ変法イーグル培地（たとえばDMEM、SH30081.01、Hyclone）中で増殖させ得る。好ましくは、ヒト臍帯細胞は放射線を照射される。これは、当技術分野において公知の方法を使用して行われ得る（たとえば、Gamma cell, 220 Exel, MDS Nordion 3,500ラド）。ひとたび十分な細胞が得られたならば、それらを凍結（たとえば凍結保存）し得る。ESCの増殖の場合、一般に、ヒト臍帯線維芽細胞を、約20％のヒト血清（およびグルタミン）で補足されたDMEM（たとえばSH30081.01、Hyclone）中25〜40,000個/cm2の濃度で、任意でゼラチン（たとえば組換えヒトゼラチン（RhG100-001、Fibrogen）などの接着性基材でコートされた固体表面（たとえばT75またはT175フラスコ）に播種する。hESCは一般に、1〜4日後、支持培地（たとえば、ヒト血清アルブミンを含むNutristem）中のフィーダー細胞上にプレーティングされる。ESCの分化を防ぐためのさらなる因子、たとえばbFGFおよびTGF-βが培地に添加されてもよい。ひとたび十分な量のhESCが得られたならば、細胞を機械的に分断し得る（たとえば、無菌チップまたは使い捨て無菌幹細胞ツールを使用することにより；14602 Swemed）。または、酵素的処理（たとえばコラゲナーゼAまたはTrypLE Select）によって細胞を取り出してもよい。必要な量のhESCに達するまでこの工程を何回か繰り返してもよい。特定の態様にしたがって、1回目の増殖ののち、TrypLE Selectを使用してhESCを取り出し、2回目の増殖ののち、コラゲナーゼAを使用してhESCを取り出す。
【００７６】
フィーダー細胞層としてのヒト胚線維芽細胞または成人ファロピウス管上皮細胞
ヒトES細胞は、ヒト胚線維芽細胞または成人ファロピウス管上皮細胞を使用して増殖させ、維持することができる。これらのヒトフィーダー細胞上で増殖すると、ヒトES細胞は、正常な核型を示し、アルカリホスファターゼ活性を提示し、Oct-4および他の胚細胞表面マーカー、たとえばSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60およびGCTM-2を発現し、インビボで奇形腫を形成し、すべての主要な形態的多能特性を保持する［Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. (2002). Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20: 933-6］。
【００７７】
包皮フィーダー層
ヒトES細胞は、米国特許出願第10/368,045号に開示されているように、ヒト包皮フィーダー層上で培養することができる。包皮由来のフィーダー細胞層は、ヒトES細胞を培養するのに適した完全なアニマルフリー環境からなる。加えて、包皮細胞は、その誘導以降、50代もの継代にわたって培養状態に維持することができ、比較的一定の環境をES細胞に提供する。これらの条件下、ヒトES細胞は、代替プロトコル（たとえばMEF）で増殖させた細胞から機能的に区別できないということがわかった。分化後、ES細胞は、3つの胚性胚葉すべてと関連する遺伝子をインビトロで発現し、3つの胚葉すべてから生じる組織からなる奇形腫をインビボで形成した。
【００７８】
フィーダー細胞フリーの系もまた、ES細胞の培養に使用されている。そのような系は、フィーダー細胞層の代わりとして、血清代替品、サイトカインおよび増殖因子（IL6および可溶性IL6受容体キメラを含む）で補足されたマトリックスを利用する。幹細胞は、培地、たとえばLonza L7系、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8の存在下、細胞外マトリックス（たとえばMatrigel（登録商標）またはラミニン）のような固体表面上で増殖させることができる。フィーダー細胞と幹細胞との同時増殖を必要とし、混合細胞集団を生じさせ得るフィーダーベースの培養とは異なり、フィーダーフリー系で増殖させた幹細胞は表面から容易に分離する。
【００７９】
分化工程の前に、ESCをフィーダー上で増殖させてもよい。本発明によって考慮される例示的なフィーダー層ベースの培養は本明細書中で先に記載されている。増殖は一般に、少なくとも2日間、3日間、4日間、5日間、6日間または7日間、行われる。増殖は、少なくとも1継代、少なくとも2継代、少なくとも3継代、少なくとも4継代、少なくとも5継代、少なくとも6継代、少なくとも7継代、少なくとも8継代、少なくとも9継代または少なくとも10継代にわたって行われる。
【００８０】
増殖後、多能性幹細胞（たとえばESC）は、分化誘導剤を使用する分化誘導に供される。
【００８１】
1つの例示的な分化プロトコルにおいて、胚性幹細胞は、第一の分化誘導剤を使用してRPE細胞系へと分化させたのち、トランスフォーミング増殖因子-β（TGFβ）スーパーファミリーのメンバー（たとえばTGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3サブタイプ、ならびにアクチビン（たとえばアクチビンA、アクチビンBおよびアクチビンAB）、結節性抗ミュラー管ホルモン（AMH）、いくつかの骨形成タンパク質（BMP）、たとえばBMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6およびBMP7ならびに増殖・分化因子（GDF）を含む相同性リガンド）を使用してRPE細胞へとさらに分化させる。特定の態様にしたがって、トランスフォーミング増殖因子-β（TGFβ）スーパーファミリーのメンバーはアクチビンA、たとえば20〜200ng/ml、たとえば100〜180ng/mlのアクチビンAである。
【００８２】
特定の態様にしたがって、第一の分化誘導剤はニコチンアミド（NA）、たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mMのニコチンアミド（NA）である。
【００８３】
別の態様にしたがって、第一の分化誘導剤は3-アミノベンズアミドである。
【００８４】
「ナイアシンアミド」とも知られるNAは、β細胞機能を保存し、改善すると考えられるビタミンB3（ナイアシン）のアミド誘導体形態である。NAは化学式C6H6N2Oを有する。NAは、成長、および食品のエネルギーへの変換にとって不可欠であり、関節炎の処置ならびに糖尿病の処置および予防に使用されている。
2018521678.tif 000003
【００８５】
特定の態様にしたがって、ニコチンアミドは、ニコチンアミド誘導体またはニコチンアミド模倣体である。本明細書の中で使用される用語「ニコチンアミド（NA）の誘導体」とは、天然NAの化学的に修飾された誘導体である化合物をいう。1つの態様において、化学的修飾は、アミド部分の窒素または酸素原子を介する基本的なNA構造のピリジン環の置換（環の炭素または窒素員を介する）であり得る。置換されると、1つまたは複数の水素原子が置換基によって置換される、および／または置換基がN原子に結合して四価の正電荷窒素を形成し得る。したがって、本発明のニコチンアミドは置換または非置換ニコチンアミドを含む。別の態様において、化学的修飾は、たとえばNAのチオベンズアミド類似体を形成するための、1つの基の欠失または置換であり得、そのすべては有機化学の当業者によって理解されるとおりである。本発明に関連する誘導体はまた、NAのヌクレオシド誘導体（たとえばニコチンアミドアデニン）を含む。多様なNA誘導体が、いくつかはPDE4酵素の阻害活性と関連して（WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A）、またはVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤として（WO01/55114）、記載されている。たとえば、4-アリール−ニコチンアミド誘導体を調製する方法（WO05/014549）。他の例示的なニコチンアミド誘導体がWO01/55114およびEP2128244に開示されている。
【００８６】
ニコチンアミド模倣体は、多能性細胞からのRPE細胞の分化および成熟におけるニコチンアミドの効果を再現するニコチンアミドの修飾形態およびニコチンアミドの化学的類似体を含む。例示的なニコチンアミド模倣体は、安息香酸、3-アミノ安息香酸および6-アミノニコチンアミドを含む。ニコチンアミド模倣体として作用し得る化合物の別のクラスがポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）の阻害剤である。例示的なPARP阻害剤は、3-アミノベンズアミド、イニパリブ（BSI 201）、オラパリブ（AZD-2281）、ルカパリブ（AG014699、PF-01367338）、ベリパリブ（ABT-888）、CEP 9722、MK 4827およびBMN-673を含む。
【００８７】
さらなる考慮される分化誘導剤は、たとえば、ノギン、Wntのアンタゴニスト（Dkk1またはIWR1e）、nodalアンタゴニスト（Lefty-A）、レチノイン酸、タウリン、GSK3b阻害剤（CHIR99021）およびnotch阻害剤（DAPT）を含む。
【００８８】
特定の態様にしたがって、分化は以下のように行われる：
（a）第一の分化誘導剤（たとえばニコチンアミド）を含む培地中での、ESCの培養；および
（b）TGFβスーパーファミリーのメンバー（たとえばアクチビンA）および第一の分化誘導剤（たとえばニコチンアミド）を含む培地中での、工程（a）から得られた細胞の培養。
【００８９】
好ましくは、工程（a）は、TGFβスーパーファミリーのメンバー（たとえばアクチビンA）の非存在下で行われる。
【００９０】
1つの態様において、工程（a）における培地は、TGFβスーパーファミリーのメンバーを完全に欠いている。別の態様において、培地中のTGFβスーパーファミリーのメンバーのレベルは、20ng/ml未満、10ng/ml未満、1ng/ml未満またはさらには0.1ng/ml未満である。
【００９１】
上記プロトコルは、工程（b）で得られた細胞を、第一の分化誘導剤（たとえばニコチンアミド）を含むがTGFβスーパーファミリーのメンバー（たとえばアクチビンA）を欠く培地中で培養することによって続けてもよい。この工程を本明細書の中で工程（b*）と呼ぶ。
【００９２】
以下、さらなる態様によって上記プロトコルをさらに詳細に説明する。
【００９３】
工程（a）：十分な量のESCが得られたならば、分化工程を開始する。ESCは一般に、細胞培養物から取り出し（たとえばコラゲナーゼA、ディスパーゼ、TrypLE select、EDTAを使用することにより）、ニコチンアミドの存在下（かつアクチビンAの非存在下）で、非接着性基材（たとえば細胞培養プレート、たとえばHydrocellまたはアガロースコートされた培養皿もしくは細菌検査用ペトリ皿）上にプレーティングする。ニコチンアミドの例示的な濃度は、0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mMである。ひとたび細胞が非接着性基材（たとえば細胞培養プレート）上にプレーティングされると、細胞培養物は、細胞懸濁液、好ましくは懸濁培養物の浮遊クラスター、すなわちヒト胚性幹細胞（hESC）に由来する細胞の凝集物と呼ばれ得る。細胞クラスターは任意の基材（たとえば培養プレート、担体）に付着しない。浮遊性幹細胞の供給源は、参照により全体として本明細書に組み入れられるWO06/070370号にすでに記載されていた。この段階は、最低1日、より好ましくは2日間、3日間、1週間またはさらには14日間、行われ得る。好ましくは、細胞は、たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mMのニコチンアミドとともに（かつアクチビンAの非存在下で）3週を超えては懸濁培養されない。1つの態様において、細胞は、たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mMのニコチンアミドとともに（かつアクチビンAの非存在下で）6〜8日間、懸濁培養される。
【００９４】
1つの態様にしたがって、細胞が非接着性基材、たとえば細胞培養プレート上で培養されるとき、大気酸素条件は20％である。しかし、大気酸素含有率が約20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％未満またはさらには約5％未満になるように（たとえば1％〜20％、1％〜10％または0〜5％）大気酸素条件を操作することもまた、考慮される。
【００９５】
特定の態様にしたがって、細胞は、非接着性基材上で、最初は通常大気酸素条件下、次いで通常未満に下げた大気酸素条件下で培養される。
【００９６】
非接着性細胞培養プレートの例は、Nunc製のもの（たとえばHydrocell Cat No. 174912）などを含む。
【００９７】
一般に、クラスターは、少なくとも50〜500,000個、50〜100,000個、50〜50,000個、50〜10,000個、50〜5000個、50〜1000個の細胞を含む。1つの態様にしたがって、クラスター中の細胞は、層には編成されず、不規則な形状を形成する。1つの態様において、クラスターは多能性胚性幹細胞を欠いている。別の態様において、クラスターは少量の多能性胚性幹細胞（たとえば、タンパク質レベルでOCT4およびTRA-1-60を共発現する5％以下または3％以下（たとえば0.01〜2.7％）の細胞）を含む。一般に、クラスターは、ニコチンアミドの影響下で部分的に分化している細胞を含む。そのような細胞は主として神経および網膜前駆体マーカー、たとえばPAX6、Rax、Six3および／またはCHX10を発現する。
【００９８】
クラスターは、当技術分野において公知の酵素的または非酵素的（たとえば機械的）方法を使用して解離され得る。1つの態様にしたがって、細胞は、もはやクラスター状態ではない、たとえば細胞2〜100,000個、2〜50,000個、2〜10,000個、2〜5000個、2〜1000個、2〜500個、2〜100個、2〜50個の凝集物または凝集塊になるように解離される。特定の態様にしたがって、細胞は単一細胞懸濁液の状態にある。
【００９９】
その後、細胞（たとえば解離された細胞）は、接着性基材上にプレーティングされ、たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mMのニコチンアミドの存在下で（かつアクチビンAの非存在下で）培養される。この段階は、最低1日、より好ましくは2日間、3日間、1週間またはさらには14日間、行われ得る。好ましくは、細胞は、ニコチンアミドの存在下で（かつアクチビンの非存在下で）3週を超えては培養されない。例示的な態様において、この段階は6〜7日間行われる。
【０１００】
1つの態様にしたがって、細胞が接着性基材、たとえばラミニン上で培養されるとき、大気酸素条件は20％である。大気酸素条件は、含有率が約20％、15％、10％未満になるように、より好ましくは約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満になるように、より好ましくは約5％になるように（たとえば1％〜20％、1％〜10％または0〜5％）操作されてもよい。
【０１０１】
特定の態様にしたがって、細胞は、接着性基材上で、最初は通常大気酸素条件下、次いで通常未満に下げた大気酸素条件下で培養される。
【０１０２】
接着性基材の例は、フィブロネクチン、ラミニン、ポリD-リジン、コラーゲンおよびゼラチンを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
工程（b）：第一の分化誘導段階（工程a；すなわち、ニコチンアミド（たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mM）の存在下での培養）ののち、部分的に分化した細胞を接着性基材上でさらなる分化段階に供する、すなわち、アクチビンA（たとえば0.01〜1000ng/ml、0.1〜200ng/ml、1〜200ng/ml、たとえば140ng/ml、150ng/ml、160ng/mlまたは180ng/ml）の存在下で培養する。したがって、アクチビンAは、0.1pM〜10nM、10pM〜10nM、0.1nM〜10nM、1nM〜10nM、たとえば5.4nMの最終モル濃度で添加され得る。
【０１０４】
この段階でニコチンアミドを添加してもよい（たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mM）。この段階は、1日〜10週間、3日間〜10週間、1週間〜10週間、1週間〜8週間、1週間〜4週間、たとえば少なくとも1日、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、行われ得る。
【０１０５】
特定の態様にしたがって、この段階は約2週間行われる。この分化段階は、本明細書中で先に詳述したように、低大気酸素条件または通常大気酸素条件で行われ得る。
【０１０６】
工程（b*）：第二の分化誘導段階（すなわち、ニコチンアミドおよびアクチビンAの存在下で、接着性基材上での培養；工程（b））ののち、さらに分化した細胞を、任意で、接着性基材上での後続の分化段階に供する、すなわち、ニコチンアミド（たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mM）の存在下で、かつアクチビンAの非存在下で、培養する。この段階は、少なくとも1日、2日間、5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間またはさらには4週間、行われ得る。好ましくは、この段階は約1週間行われる。この分化段階はまた、本明細書中で先に詳述したように、低大気酸素条件または通常大気酸素条件で実施され得る。
【０１０７】
ESCが分化するところの基本培地は、インビトロでの細胞増殖を支持するための当技術分野において公知の任意の細胞培養培地、一般には、培養物中の細胞を生存可能な状態に維持するために必要な塩、糖、アミノ酸および任意の他の栄養素を含む、規定の基礎液を含む培地である。特定の態様にしたがって、基本培地はならし培地ではない。本発明にしたがって利用され得る市販の基本培地の非限定的な例は、Nutristem（ESC分化の場合はbFGFおよびTGFβを含まず、ESC増殖の場合はbFGFおよびTGFβを含む）、Neurobasal（商標）、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、Cellgro（商標）幹細胞増殖培地またはX-Vivo（商標）を含む。基本培地は、細胞培養を扱う技術分野において公知の多様な薬剤で補足されもよい。以下は、本開示にしたがって使用される、培養物に含まれ得る様々な補足物質の非限定的な参照である：
−血清または血清代替品を含有する培地、たとえば非限定的に、ノックアウト血清代替品（knock out serum replacement）（KOSR）、Nutridoma-CS、TCH（商標）、N2、N2誘導体もしくはB27、または組み合わせ；
−細胞外マトリックス（ECM）成分、たとえば非限定的に、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびゼラチン。この場合、ECMは、TGFβスーパーファミリーの増殖因子の1つまたは複数のメンバーを担持するために使用され得る；
−抗菌剤、たとえば非限定的に、ペニシリンおよびストレプトマイシン；ならびに
−非必須アミノ酸（NEAA）、培養中のSCの生存を促進する際に役割を演じることが知られているニューロトロフィン、たとえば非限定的にBDNF、NT3、NT4。
【０１０８】
好ましい態様にしたがって、ESCを分化させるために使用される培地はNutristem培地（Biological Industries, 06-5102-01-1A）である。
【０１０９】
特定の態様にしたがって、ESCの分化および増殖はゼノフリー条件下で行われる。
【０１１０】
1つの態様にしたがって、増殖／成長培地は、異種由来の不純物を欠いている、すなわち、動物由来成分、たとえば血清、動物由来増殖因子およびアルブミンを欠いている。したがって、この態様にしたがって、培養は異種由来の不純物の非存在下で実施される。
【０１１１】
ゼノフリー条件下でESCを培養するための他の方法が、内容全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第20130196369号に提供されている。
【０１１２】
RPE細胞を含む調製物は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Good Manufacturing Practice）（GMP）（たとえば、調製物はGMP準拠調製物である）および／または現行の優良組織規則（Good Tissue Practice）（GTP）（たとえば、調製物はGTP準拠調製物であり得る）にしたがって調製され得る。
【０１１３】
分化工程中、胚性幹細胞の分化状態をモニターし得る。細胞分化は、分化を示すことが知られている細胞特異的マーカーまたは組織特異的マーカーの検査に基づいて判定することができる。
【０１１４】
組織／細胞特異的マーカーは、当技術分野において周知の免疫学的技術［Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7］を使用して検出することができる。例は、膜結合マーカーまたは細胞内マーカーの場合のフローサイトメトリー、細胞外マーカーおよび細胞内マーカーの場合の免疫組織化学的技術、ならびに分泌分子マーカーの場合の酵素イムノアッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書中で先に記載された分化段階ののち、色素細胞および非色素細胞の両方を含む混合細胞集団が得られる。
【０１１６】
本発明のこの局面にしたがって、混合細胞集団の細胞はプレートから取り出される。
【０１１７】
1つの態様において、これは酵素的に行われる（たとえばトリプシン（TrypLE Select）を使用）。本発明のこの局面にしたがって、培養物から取り出される（およびその後、増幅される）細胞の少なくとも10％、20％、30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％が非色素細胞である。
【０１１８】
別の態様において、これは機械的に、たとえばセルスクレーパを使用して行われる。
【０１１９】
さらに別の態様において、これは化学的に行われる（たとえばEDTA）。
【０１２０】
また、酵素的処理と化学的処理との組み合わせ、たとえばEDTAと酵素的処理との組み合わせが考慮される。
【０１２１】
さらには、培養物から取り出される（およびその後、増幅される）細胞の少なくとも10％、20％またはさらには30％が色素細胞である。
【０１２２】
本発明のこの局面にしたがって、培養物中の全細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％が取り出される（およびその後、増幅される）。
【０１２３】
混合細胞集団の増殖は、細胞外マトリックス、たとえばゼラチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン（たとえばラミニン521）、フィブロネクチンおよびポリD-リジン上で行われ得る。増殖のために、細胞は、無血清KOM、血清含有培地（たとえば、20％ヒト血清を含むDMEM）またはNutristem培地（06-5102-01-1A, Biological Industries）中で培養され得る。これらの培養条件下、適当な条件下で継代されたのち、色素細胞：非色素細胞の比が増して、精製されたRPE細胞集団が得られるようになる。そのような細胞は、RPE細胞に特徴的な多角形形態および色素形成を示す。
【０１２４】
1つの態様において、増殖は、ニコチンアミド（たとえば0.01〜100mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、5〜50mM、5〜20mM、たとえば10mM）の存在下かつアクチビンAの非存在下で行われる。
【０１２５】
混合細胞集団は、懸濁液（マイクロキャリヤを含む、または含まない）中または単層中で増殖させ得る。単層培養または懸濁培養における混合細胞集団の増殖は、当業者に周知の方法により、バイオリアクタまたはマルチ／ハイパースタック中での大規模増殖へと変形されてもよい。
【０１２６】
1つの態様にしたがって、増殖段階は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間またはさらには10週間、行われる。好ましくは、増殖段階は、1週間〜10週間、より好ましくは2週間〜10週間、より好ましくは3週間〜10週間、より好ましくは4週間〜10週間または4週間〜8週間、行われる。
【０１２７】
さらに別の態様にしたがって、混合細胞集団は、増殖段階中に少なくとも1回、増殖段階中に少なくとも2回、増殖段階中に少なくとも3回、増殖段階中に少なくとも4回、増殖段階中に少なくとも5回または増殖段階中に少なくとも6回、継代される。
【０１２８】
本発明者らは、細胞が酵素的に回収されるとき、増殖を、8代を超える継代、9代を超える継代、さらには10代を超える継代（たとえば11〜15継代）にわたって継続させることが可能であることを示した。合計細胞倍加回数を、30よりも多く、たとえば31、32、33、34またはそれより多くまで増やすことができる。
【０１２９】
本明細書に記載される方法にしたがって産生されるRPE細胞集団は、いくつかの異なるパラメータにしたがって特性決定され得る。
【０１３０】
したがって、たとえば、得られるRPE細胞は、多角形であり、色素を有し得る。
【０１３１】
増殖したRPE細胞集団の収集は、当技術分野において公知の方法を使用して（たとえば、トリプシンのような酵素を使用して、またはEDTAなどを使用して化学的に）行われ得る。
【０１３２】
収集ののち、増殖したRPE細胞集団は、任意で、当技術分野において公知の方法を使用して凍結保存されてもよい。凍結保存に適した培地の例は、90％ヒト血清／10％ DMSO、CryoStor 10％、5％および2％、Stem Cell BankerならびにPrime XV（登録商標）FreezISを含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
本明細書に開示される細胞集団は未分化ヒト胚性幹細胞を欠いていることが理解されよう。1つの態様にしたがって、たとえばFACSによって計測して250,000個に対して1個未満の細胞がOct4+TRA-1-60+細胞である。細胞はまた、PCRによって計測して、下方制御（5,000倍超）されたGDF3またはTDGFの発現を有する。たとえば図10を参照すること。
【０１３４】
本発明のこの局面のRPE細胞は胚性幹細胞マーカーを発現しない。前記1つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、OCT-4、NANOG、Rex-1、アルカリホスファターゼ、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60および／またはTRA-1-81を含み得る。
【０１３５】
RPE調製物は、非RPE細胞に対して実質的に精製されてもよく、少なくとも約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のRPE細胞を含む。RPE細胞調製物は、非RPE細胞を本質的に含まなくてもよいし、またはRPE細胞のみからなってもよい。たとえば、実質的に精製されたRPE細胞調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％または1％未満の非RPE細胞型を含み得る。たとえば、RPE細胞調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％または0.0001％未満の非RPE細胞を含み得る。
【０１３６】
RPE細胞調製物は、非RPE細胞および他の成熟レベルのRPE細胞の両方に関して実質的に純粋であり得る。調製物は、非RPE細胞に関して実質的に精製され、成熟RPE細胞に関して濃縮され得る。たとえば、成熟RPE細胞に関して濃縮されたRPE細胞調製物においては、RPE細胞の少なくとも約30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％または100％が成熟RPE細胞である。調製物は、非RPE細胞に関して実質的に精製され、成熟RPE細胞ではなく分化RPE細胞に関して濃縮されてもよい。たとえば、RPE細胞の少なくとも約30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％が、成熟RPE細胞ではなく分化RPE細胞であってもよい。
【０１３７】
本明細書に記載される調製物は、HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、パルボウイルスB19、エプスタイン・バルウイルスまたはヘルペスウイルス1および2、SV40、HHV5、6、7、8、CMV、ポリオーマウイルス、HPV、エンテロウイルスの存在を含むが、これらに限定されない、細菌、ウイルスまたは真菌の混入または感染を実質的に有しない状態であり得る。本明細書に記載される調製物は、マイコプラズマ混入または感染を実質的に有しない状態であり得る。
【０１３８】
本明細書に開示される細胞集団を特性決定する別の方法は、マーカー発現による方法である。したがって、たとえば、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、90％、95％または100％がベストロフィン1を発現する。1つの態様にしたがって、細胞の80〜100％がベストロフィン1を発現する。
【０１３９】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が小眼球症関連転写因子（MITF）を発現する。たとえば、細胞の80〜100％がMITFを発現する。
【０１４０】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が小眼球症関連転写因子（MITF）およびベストロフィン1の両方を発現する。たとえば、細胞の80〜100％がMITFとベストロフィン1とを共発現する。
【０１４１】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が小眼球症関連転写因子（MITF）およびZO-1の両方を発現する。たとえば、細胞の80〜100％がMITFとZO-1とを共発現する。
【０１４２】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％がZO-1およびベストロフィン1の両方を発現する。たとえば、細胞の80〜100％がZO-1とベストロフィン1とを共発現する。
【０１４３】
別の態様にしたがって、免疫染色またはFACSによって計測して、細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％がペアードボックス遺伝子6（PAX-6）を発現する。たとえば図11を参照すること。
【０１４４】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（CRALBP）を発現する。たとえば、細胞の85〜100％がCRALBPを発現する。
【０１４５】
別の態様にしたがって、免疫染色によって計測して、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が網膜色素上皮特異的タンパク質65kDa（RPE65）を発現する。たとえば、細胞の80〜100％がRPE65を発現する。
【０１４６】
RPE細胞は一般に、終末分化を示すマーカー、たとえばベストロフィン1、CRALBPおよび／またはRPE65を共発現する。
【０１４７】
増殖段階ののち、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99またはさらには100％がCRALBP+PMEL17+であるRPE細胞を含む細胞集団が得られる。
【０１４８】
RPE細胞の誘導が非常に有益であることは当業者によって十分に理解されるであろう。RPE細胞は、それらの生存、再生および機能を促進するための新薬の開発のためのインビトロモデルとして使用され得る。RPE細胞は、RPE細胞に対して毒性または再生作用を有する化合物のハイスループットスクリーニングに役立ち得る。RPE細胞は、光受容体細胞の発生、分化、維持、生存および機能にとって重要である機構、新たな遺伝子、可溶性因子または膜結合因子を明らかにするために使用され得る。
【０１４９】
RPE細胞はまた、網膜変性および他の変性性疾患における機能不全RPE細胞または変性RPE細胞の移植、補充および支持のためのRPE細胞の無限の供給源としても役立ち得る。さらに、遺伝子改変されたRPE細胞は、移植後に眼および網膜中で遺伝子を担持し、発現させるためのベクターとしても役立ち得る。
【０１５０】
RPE細胞が治療剤として働き得る眼の状態は、概して網膜機能不全、網膜傷害および／または網膜色素上皮の損失と関連する網膜疾患または障害を含むが、これらに限定されない。本発明にしたがって処置され得る状態の非限定的なリストは、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性症、加齢黄斑変性症（AMD）、乾性AMD、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、脈絡膜欠如、パターンジストロフィーおよびRPEの他のジストロフィー、シュタルガルト病、光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか1つによって生じた損傷に起因するRPE損傷および網膜損傷を含む。
【０１５１】
本発明のこの局面の細胞を使用して処置することができる例示的な変性障害は、パーキンソン病、ALS、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病およびてんかんを含むが、これらに限定されない、神経変性障害を含む。
【０１５２】
処置され得る対象は、霊長類（ヒトを含む）、イヌ、ネコ、有蹄類（たとえばウマ、ウシ、ブタ（swine）(たとえば、ブタ（pig）））、トリおよび他の対象を含む。商業的に重要なヒトおよび非ヒト動物（たとえば家畜）が特に関心対象である。処置され得る例示的な哺乳動物は、イヌ；ネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；げっ歯類など、および霊長類、特にヒトを含む。非ヒト動物モデル、特に哺乳動物、たとえば霊長類、ネズミ、ウサギなどを実験的調査のために使用してもよい。
【０１５３】
本明細書中に記載されるように産生されたRPE細胞は、対象の眼または他の部位内（たとえば脳内）の様々な標的部位に移植され得る。1つの態様にしたがって、RPE細胞の移植は、RPEの通常の解剖学的位置（光受容体外節と脈絡膜との間の）である、眼の網膜下腔への移植である。加えて、細胞の移動能力および／またはポジティブな傍分泌効果に依存して、硝子体腔、網膜内層または外層、網膜周辺部および脈絡膜内を含むさらなる眼の区画への移植を考慮することができる。
【０１５４】
対象に投与し得る生細胞の数は一般に注射1回あたり50,000〜5×106個である。
【０１５５】
細胞は一般に、担体（たとえば等張溶液および／または食塩水）、たとえばBSS plus（商標）中に製剤化される。他の考えられる溶液は、Cryostor 5またはCryostor 2のような凍結保存溶液を含む。担体は、任意で、RPEの生着、組み込み、生存、効力などを支援するさらなる因子を含んでもよい。
【０１５６】
移植は、当技術分野において公知の様々な技術によって実施され得る。RPE移植を実施する方法は、たとえば、米国特許第5,962,027号、第6,045,791号および第5,941,250号ならびにEye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997; 235(3): 149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb. 24, 2000; 268(3): 842-6；Opthalmic Surg February 1991; 22(2): 102-8に記載されている。角膜移植を実施する方法は、たとえば、米国特許第5,755,785号およびEye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12；Curr Opin Opthalmol August 1992; 3 (4): 473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998; 29 (4): 305-8；Ophthalmology April 2000; 107 (4): 719-24；およびJpn J Ophthalmol November-December 1999; 43(6): 502-8に記載されている。主に傍分泌効果が利用される場合、細胞はまた、半透過性の容器に封入された状態で眼に送達され、維持され得、これもまた、宿主免疫系への細胞の曝露を減らす（Neurotech USA CNTF delivery system；PNAS March 7, 2006 vol. 103(10) 3896-3901）。
【０１５７】
投与工程は、それを必要とする眼へのRPE細胞の眼内投与を含み得る。眼内投与は、網膜下腔へのRPE細胞の注射を含み得る。
【０１５８】
1つの態様にしたがって、移植は、扁平部硝子体切除術ののち、小さな網膜開口部を介して、または直接注入によって、細胞を網膜下腔の中に送達することによって実施される。
【０１５９】
RPE細胞は様々な形態で移植され得る。たとえば、RPE細胞は、単一細胞懸濁液の形態で、マトリックスとともに、またはマトリックスもしくは膜、細胞外マトリックスもしくは基材、たとえば細胞分解性ポリマーもしくはそれらの組み合わせに付着した状態で、標的部位に導入され得る。RPE細胞はまた、他の網膜細胞、たとえば光受容体といっしょに移植（共移植）されてもよい。
【０１６０】
処置の有効性は、視覚および眼の機能および構造の様々な尺度によって、とりわけ、最高矯正視力（BCVA）、暗順応および明順応状態でのペリメトリーもしくはマイクロペリメトリーにより計測される網膜感光度、全視野、多焦点、焦点またはパターン網膜電図（ERG）、コントラスト感度、読取り速度、色覚、臨床生体顕微鏡検査、眼底撮影、光干渉断層撮影（OCT）、眼底自発蛍光（FAF）、赤外およびマルチカラーイメージング、フルオレセインまたはICG血管造影、適応光学ならびに視覚機能および眼構造を評価するために使用されるさらなる手段によって評価され得る。
【０１６１】
対象は、RPE細胞の投与の前またはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、プレド・フォルテ（Predforte）のようなコルチコステロイドを投与されてもよい。
【０１６２】
別の態様にしたがって、対象は、RPE細胞の投与の前またはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、プレド・フォルテのようなコルチコステロイドを投与されない。
【０１６３】
処置の前、それと同時および／またはその後に、免疫抑制薬が対象に投与されてもよい。
【０１６４】
免疫抑制薬は以下のクラスに属し得る：
糖質コルチコイド、細胞増殖抑制剤（たとえばアルキル化剤または代謝拮抗物質）、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、イムノフィリンに作用する薬剤（たとえばシクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムス）。さらなる薬物は、インターフェロン、オピオイド、TNF結合タンパク質、ミコフェノレートおよび小さな生物学的薬剤を含む。
【０１６５】
免疫抑制薬の例は、間葉系幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ALG）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BAS1 L1X1MAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンA）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB（登録商標）（抗CD20抗体）、シロリムス、タクロリムス、タクロリムスおよび／またはミコフェノール酸モフェチルを含む。
【０１６６】
処置の前、それと同時および／またはその後に、抗生物質が対象に投与されてもよい。抗生物質の例は、オフロックス、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トブレックス、ビガモックスまたは眼科用に認可された任意の他の局所抗生物質製剤を含む。
【０１６７】
本明細書の中で使用される用語「約」とは、±10％をいう。
【０１６８】
用語「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、「含む（include）」、「含む（including）」、「有する（having）」およびそれらの活用形は、「〜を含むが、〜に限定されない」を意味する。
【０１６９】
用語「〜からなる」は、「〜を含み、〜に限定される」を意味する。
【０１７０】
用語「〜から本質的になる」とは、組成物、方法または構造が、さらなる成分、工程および／または部品を含んでもよいが、ただし、そのさらなる成分、工程および／または部品が、請求項に係る組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変化させないことを意味する。
【０１７１】
本明細書の中で使用される単数形冠詞「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに別段指示しない限り、複数の指示対象を含む。たとえば、用語「化合物」または「少なくとも1つの化合物」は、それらの混合物を含め、複数の化合物を含み得る。
【０１７２】
本明細書の中で数値範囲が示される場合、それは、示された範囲内の任意の言及された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第一の示された数値と第二の示された数値との「間の範囲」および第一の示された数値「から」第二の示された数値「までの範囲」は、本明細書の中では互換可能に使用され、かつ第一および第二の示された数値ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０１７３】
本明細書の中で使用される用語「方法」とは、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の当業者には公知である、またはそのような当業者によって容易に開発されるようなやり方、手段、技術および手法を含むが、それらに限定されない、所与の仕事を達成するためのやり方、手段、技術および手法をいう。
【０１７４】
本明細書の中で使用される用語「処置」とは、状態の進行を無効化する、実質的に阻害する、遅らせる、または好転させること、状態の臨床的または外観的症候を実質的に改善すること、または状態の臨床的または外観的症候の出現を実質的に予防することを含む。
【０１７５】
理解しやすくするために別々の態様に関して説明される本発明の特定の特徴は、1つの態様として組み合わされた状態で提供されてもよいことが理解されよう。逆に、簡潔に説明するために1つの態様に関して説明される本発明の様々な態様は、別々に提供されてもよいし、または任意の適当な部分的組み合わせとして提供されてもよいし、または適宜、本発明の任意の他の記載される態様として提供されてもよい。様々な態様に関して説明される特定の特徴は、これらの要素なしでは動作不能でない限り、これらの態様の不可欠な特徴と考慮されてはならない。
【０１７６】
本明細書中で先に詳細に説明され、以下、特許請求の範囲で定義されるような本発明の様々な態様および局面は、以下の実施例において実験的裏付けを見いだす。
【実施例】
【０１７７】
次に、上記詳細な説明とともに本発明のいくつかの態様を非限定的に例示する以下の実施例を参照する。
【０１７８】
概して、本明細書の中で使用される名称および本発明において利用される実験室手法は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えDNA技術を含む。そのような技術は文献において徹底的に説明されている。たとえば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号および第5,272,057号に記載された方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照すること；利用可能なイムノアッセイは特許および科学技術文献に広く記載されており、たとえば、米国特許第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号および第5,281,521号；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization―A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照すること；これらすべてが参照により全文が記載されているごとくに本明細書に組み入れられる。他にも一般的な参考文献が本文献のあらゆるところで提供されている。それらにおける手法は当技術分野において周知であると考えられ、読み手の都合のために提供される。それらに含まれるすべての情報が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
実施例1
この実施例は、以下に記すように産生されるRPE細胞の非機械的選択の効果を分析する。
【０１８０】
材料および方法
RPE細胞の産生：組換えヒトビトロネクチン（rhVTN）上に播種された放射線照射されたゼノフリーGMPグレードCRD008 hUCF上で、ゼノフリーGMPグレードHAD-C 102 hESCをコロニーとして増殖させた。hESC増殖は、増殖因子である塩基性FGFおよびTGFβ（Biological Industries 05-100-1A）に加えてヒト血清アルブミンを含有するNutristem培地の存在下で実施した。次いで、増殖したhESCを懸濁培養に移して、通常O2条件下、分化を誘導的に開始させた。球状体（SB）が形成し、それを、神経運命およびその後RPE細胞運命へと向ける継続的分化誘導条件下で、接着性細胞培養物としてプレーティングした（図1）。分化段階終了時、以下の2つの技術を使用して細胞を収集し、増殖させた：（1）非色素区域を手作業で切除し、除去し、残った色素細胞区域を酵素的に回収した、ならびに（2）細胞（色素および非色素）を酵素的に回収した。次いで、細胞を、rhゼラチンで覆われた細胞培養プレート上に播種し、製造指示書にしたがって、ニコチンアミドの存在下および非存在下でまたはラミニン521、コラーゲンIもしくはコラーゲンIV上で、3継代にわたって増殖させた。継代2代目（P2）で細胞を収集し、現行のSOPにしたがって90％ヒト血清および10％ DMSOで構成された凍結保存培地（cryo-medium）中および様々な無血清ゼノフリーGMPグレード凍結保存培地（CryoStor CS5およびCS10、BioLife Solutions；Stem Cell Banker AMSBIO；Prime-XV FreeIS DMSO Free、Irvine Scientific；BI1 BI2およびBI3、Biological Industries）中で凍結保存した。
【０１８１】
結果
製造工程に沿ったCRALBP/PMEL17 RPE純度：rhVTN上に播種されたCRD008 hUCF上で増殖させたHAD-C 102 hESCをRPEへと分化させた。分化段階終了時、ラミニン511上で増殖した細胞を2つの方法で収集した：（1）機械的に、非色素／非多角形区域を機械的に排除したのち、色素／多角形区域をTrypLE Selectによって酵素的に回収する方法、および（2）酵素的に、多角形／色素細胞および非多角形／非色素細胞を含有するすべての培養物をTrypLEで処理し、すべての細胞を回収する方法。次いで、細胞を、増殖のために、ニコチンアミドを含むrhゼラチンおよびニコチンアミドを含まないrhゼラチン（コントロール）上ならびに他のマトリックス（ラミニン521、コラーゲンIおよびコラーゲンIV）上に播種した。分化段階終了時、酵素的および機械的単離（工程内管理すなわちIPC 5〜7）後のP0（IPC 8）および凍結保存後のP2（IPC 11）で、RPE純度計測のためのCRALBP+PMEL17+細胞の評価を実施した。図2および表1に見てとれるように、分化段階終了時のCRALBP+PMEL17+RPE純度のレベルは、すべての細胞の酵素的回収の後（IPCポイント5）では12．2％であり、多角形／色素細胞の機械的単離の後（IPCポイント7）では26．91％であった。機械的に単離された非多角形／非色素細胞の区域（IPCポイント6）は、予想どおり、CRALBP+PMEL17+二重陽性細胞を2.58％しか含有しなかった。様々なマトリックス上での1回の増殖サイクルののち（P0、IPCポイント8；製造工程終了の2段階前）、CRALBP+PMEL17+二重陽性細胞のレベルは、すべての細胞を酵素的に回収したときには28.86％〜66.07％の範囲であり、多角形／色素細胞を機械的に単離したときには64.33％〜83.02％の範囲であった。2回の増幅サイクルののち、P1（IPCポイント9）で、機械的に処理された細胞から生じた培養物中と、酵素的に処理された細胞から生じた培養物中とで、特に、細胞をコラーゲンI上に播種したとき（酵素的に回収された細胞中では95.20％、機械的に回収された細胞中では97.99％）、細胞をコラーゲンIV上に播種したとき（酵素的に回収された細胞中では95.02％、機械的に回収された細胞中では96.68％）、および細胞をラミニン521上に播種したとき（酵素的に回収された細胞中では94.91％、機械的に回収された細胞中では96.41％）、CRALBP+PMEL17+RPE純度のレベルに大きな差はなかった。特に、分化工程終了時に細胞をCryoStor 5％中で凍結保存したとき、P2（製剤、IPCポイント11）でも類似の結果が見られた（詳細に関しては、図2および3ならびに表1を参照）。
【０１８２】
（表１）製造工程に沿ったCRALBP+PMEL17+細胞のレベル
2018521678.tif 000004
DS、原薬；DP、製剤；IPC、工程内管理；NA、該当なし；ND、実施せず；P、継代。
【０１８３】
製造工程に沿ったPEDF分泌および効力計測：製造工程の増殖段階に沿った様々なIPCポイントで、RPE細胞から分泌されることが公知の色素上皮由来因子（PEDF）を細胞培養培地中で計測した。表2に見てとれるように、P0終了時（IPCポイント8）におけるPEDF分泌は、様々なマトリックス上で増殖させた、機械的に単離された多角形／色素細胞から生じる細胞培養物中で、1,846〜2,698ng/mL/日の範囲であった。様々なマトリックス上で増殖させた、酵素的に回収された細胞から生じる細胞培養物中で、範囲は212〜1,113ng PEDF/mL/日であった。P1終了時（IPCポイント9；2回の増殖サイクル後）、分泌されたPEDFのレベルは、様々なマトリックス上で増殖させた、機械的に単離された色素細胞から生じる細胞培養物中で、7,779〜13,067ng/mL/日の範囲であった。様々なマトリックス上で増殖させた、酵素的に回収された細胞から生じる細胞培養物中で、範囲は4,251〜9,347ng PEDF/mL/日であった。
【０１８４】
凍結保存前のP2終了時（原薬、IPCポイント10）、PEDF分泌は2つの処理群（すなわち、機械的に単離された多角形／色素細胞から生じる細胞培養物および酵素的に回収された細胞から生じる細胞培養物）において類似していた。
【０１８５】
（表２）製造工程に沿ったPEDF分泌
2018521678.tif 000005
DS、原薬；DP、製剤；IPC、工程内管理；NA、該当なし；ND、実施せず；P、継代；TBD、未定。
【０１８６】
RPE細胞間の密な接合が、血液網膜関門の形成ならびにPEDFおよびVEGFの極性分泌を可能にする。PEDFは頂端膜側に分泌され、そこで、血管新生抑制および神経向性増殖因子として働く。VEGFは主に基底膜側に分泌され、そこで、脈絡膜内皮に対して血管新生促進性増殖因子として働く。トランスウェルシステムにおいて、P0終了時（IPCポイント8）に、製造工程終了時において機械的に単離または酵素的に回収され、ラミニン521上で増殖させた細胞におけるRPE極性化（バリア機能ならびにPEDFおよびVEGF極性分泌）を計測した。表3に見てとれるように、バリア機能／経上皮電気抵抗（TEER）ならびにPEDFおよびVEGFの極性分泌が実証された。
【０１８７】
（表３）製造工程に沿った極性化の結果
2018521678.tif 000006
【０１８８】
製造工程に沿った形態評価：製造工程に沿った様々なポイントで細胞を形態に関して分析した（図4）。分化段階終了時、細胞培養ウェルの機械的または酵素的処理の前に（IPCポイント5）、各ウェル中の多角形／色素細胞の相対区域を評価した。区域の45％±9％（平均±SD、n＝6ウェルプレートのうちの3ウェル）が色素／多角形細胞で覆われていた（図4の代表図を参照）。先に指摘したように、色素／多角形細胞の区域は、細胞培養ウェルのいくつかからは非色素／非多角形区域／細胞の手作業での切除ののちネガティブに選択し、その他の細胞培養ウェルからは酵素的に回収した。機械的および酵素的に回収された細胞を様々なマトリックス［ニコチンアミドを含むrhゼラチンおよび含まないrhゼラチン（コントロール）、ラミニン521、コラーゲンIならびにコラーゲンIV］上で増殖させ、P0終了時（IPCポイント8）、P1終了時（IPCポイント9）およびP2終了時（IPCポイント10）で、形態に関して分析した。P0増殖段階終了時の形態は密集した培養物を示し、機械的に選択された色素／多角形細胞から生じ、様々なマトリックス上で増殖させた細胞培養物中に典型的な多角形上皮単層形態が見られた。酵素的に回収された細胞から生じた細胞培養物中、大部分の区域はこの典型的な形態を示したが、一方で、他の区域は、異なる形態の細胞を含んでいた。P1およびP2終了時、機械的および酵素的に処理された細胞から生じる培養物は、類似の、密集した多角形の上皮単層の一貫した形態を示した（図4）。
【０１８９】
凍結保存後の生存率および活性：製造工程終了時、様々なマトリックス［ニコチンアミドを含むrhゼラチンおよび含まないrhゼラチン（コントロール）、コラーゲンI、コラーゲンIVならびにラミニン521］上で3継代にわたって増殖させた、機械的および酵素的処理から回収された細胞を収集し、表4に記載された様々なゼノフリー／アニマルフリーGMPグレート凍結保存培地中、1.5×106および10×106個/ml/バイアルで凍結保存した。
【０１９０】
（表４Ａ）製造工程終了時の細胞の凍結保存
2018521678.tif 000007
【０１９１】
解凍後（IPCポイント11）の生存率および解凍細胞の播種後1日での活性を細胞カウント（Trypan Blue色素排除アッセイまたはChemometec NC-200セルカウンタを使用）およびTox8（Sigma R-6892）によって評価した。簡潔にいうと、解凍後の製剤細胞を、96ウェルプレートに、三つ組で、ウェルあたり20％ヒト血清を含有する0.2mL DMEMの最終量中、生細胞0.2×106個／ウェルの密度で播種し、37℃および5％C02で24時間インキュベートした。インキュベーション期間終了時、培養物をTox8（Sigma R-6892）によってメーカーの指示にしたがって評価し、次いで細胞をPBSで洗浄し、TrypLE Select処理ののち、NC-200セルカウンタを使用して計数した。次いで、付着した生細胞の平均数を1ウェルあたり播種された全細胞数で割り、それに100を掛けることによって％活性を計算した。
【０１９２】
解凍後生存率は、様々なマトリックス［ニコチンアミドを含むrhゼラチンおよび含まないrhゼラチン（コントロール）、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン521］上で増殖させ、10％ DMSOを含有する90％ヒト血清（コントロール；図5A、青い棒）中またはCryoStor 5％（CS；図5A、赤い棒）中で凍結保存された、機械的に単離された細胞および酵素的に回収された細胞に関して類似していたが、ニコチンアミドを含むrhゼラチン上で増殖させた細胞の解凍後生存率がわずかに良好であった。解凍後生存率は処理群の間で類似していたが、活性は、細胞をCryoStor 5％中で凍結保存したとき（図5Bおよび5C、赤い棒）のほうが、10％ DMSOを含有する90％ヒト血清中で凍結保存したとき（図5Bおよび5C、青い棒）よりも有意に良好であった。
【０１９３】
ニコチンアミドを含むrhゼラチン上で増殖させ、様々な凍結培地（10％ DMSOを含有する90％ヒト血清、CryoStor 5％、Biological Industries Solution 1〜3、Prime XVおよびStem Cell Banker）中で凍結保存された、機械的に単離された細胞の解凍後細胞生存率および活性の評価は、CryoStor 5％がその他の凍結保存培地に対して有意な利点を有し、解凍後生存率および24時間培養後活性がそれぞれ92％および70.7％である（それぞれ図6Aおよび6C）ことを示した。ニコチンアミドを含むrhゼラチン上で増殖させ、SCB中で凍結保存された、機械的に単離された細胞の生存率および活性はそれぞれ83％および67％であった。
【０１９４】
製造終了時の細胞収量：分化段階終了時、機械的に単離された細胞および酵素的に回収された細胞をカウントし、1ウェルあたり類似の数の生細胞を様々なマトリックス［ニコチンアミドを含むrhゼラチンおよび含まないrhゼラチン（コントロール）、コラーゲンI、コラーゲンIVならびにラミニン521］上に3回の増殖サイクルにわたって播種した。各継代終了時、各ステップで収集されたすべての細胞が播種されたと仮定して、1ウェルあたりの細胞数および累積細胞数を計測した。図7Aに示すように、細胞を機械的に単離したとき、ニコチンアミドを含むrhゼラチン上で細胞を増殖させたときに最高の収量が達成された。細胞を酵素的に単離したとき、ラミニン521上で細胞を増殖させたときに最高の収量が達成された（図7B）。
【０１９５】
実施例2
この実施例は、実施例1におけるように反復製造工程で産生されたRPE細胞の非機械的選択の効果を分析する。
【０１９６】
材料および方法
RPE細胞の産生：組換えヒトゼラチン上に播種された放射線照射されたゼノフリーGMPグレードCRD008 hUCF上で、ゼノフリーGMPグレードHAD-C 102 hESCをコロニーとして増殖させた。hESC増殖は、増殖因子である塩基性FGFおよびTGFβ（Biological Industries 05-100-1A）に加えてヒト血清アルブミンを含有するNutristem培地の存在下で実施した。次いで、増殖したhESCを懸濁培養に移して、低O2条件（5％）下、分化を誘導的に開始させた。球状体（SB）が形成し、次いでそれを、神経運命およびその後RPE細胞運命へと向ける継続的分化誘導条件下で、接着性細胞培養物としてプレーティングした（図1B）。分化段階終了時、以下の2つの技術を使用して細胞を収集し、増殖させた：（1）非色素区域を手作業で切除し、除去し、残った色素細胞区域を酵素的に回収した、ならびに（2）すべての細胞（色素および非色素）を酵素的に回収した。次いで、細胞を、rhゼラチンで覆われた細胞培養プレート上に播種し、製造指示書にしたがって、3継代にわたって増殖させた。継代2代目（P2）で細胞を収集し、90％ヒト血清および10％ DMSOで構成された凍結保存培地中および様々な無血清ゼノフリーGMPグレード凍結保存培地（5％ DMSOを含むCryoStor（CS5）および2％ DMSOを含むCryoStor（CS2）、BioLife Solutions）中で凍結保存した。
【０１９７】
いくつかの実験においては、増殖段階を11継代まで延長した。
【０１９８】
CRALBPおよびPMEL17を共発現する細胞％のFACS評価：製造工程に沿った様々な工程内管理ポイントで細胞をCRALBPおよびPMEL17の共発現に関して評価した。細胞を、Fixable Viability Stain FVS450（BD、Cat # 562247）で染色し、80％メタノールで固定し、一次マウス抗CRALBP（Clone B2、Abcam Cat # ab15051）またはそのアイソタイプコントロール（マウスIgG2a；Abcam Cat # ab170191）およびウサギモノクロナール抗ヒトPMEL17（クローンEPR4864、Abcam Cat # ab137062）またはそのアイソタイプコントロール（ウサギIgGモノクロナール；Abcam Cat # ab 172730）で共免疫染色し、次いで、二次抗体ヤギ抗マウス（Dako Cat # F0479）およびヤギ抗ウサギ（Jackson Cat # 111-606-144）それぞれで共免疫染色した。Naviosフローサイトメータ（Beckman Coulter）を使用してFACSデータの取得を実施し、FCS Express 4ソフトウェアを使用して分析を実施した。
【０１９９】
PAX6を発現する細胞％のFACS評価: 製造工程に沿った様々な工程内管理ポイントで細胞をPAX6の発現に関して評価した。細胞を、Fixable Viability Stain FVS450（BD、Cat # 562247）で染色し、固定バッファ（BD Cat # 554655）を使用して固定し、Perm buffer III（BD、Cat #558050）を使用して透過化し、マウス抗ヒトPAX6（BD、Cat # 562249）で免疫染色した。Naviosフローサイトメータ（Beckman Coulter）を使用してFACSデータの取得を実施し、FCS Express 4ソフトウェアを使用して分析を実施した。
【０２００】
Oct4およびTRA-1-60を共発現する細胞％のFACS評価：製造工程に沿った様々な工程内管理ポイントで細胞をOct4およびTRA-1-60の共発現に関して評価した。細胞を、Fixable Viability Stain FVS450（BD、Cat # 562247）で染色し、固定し、Fix/Perm転写因子バッファセット（BD、Cat #562574）を使用して透過化し、マウス抗ヒトOct3/4（BD、Cat # 562252）およびマウス抗ヒトTRA-1-60（BD、Cat # 560193）で免疫染色した。Naviosフローサイトメータ（Beckman Coulter）を使用してFACSデータの取得を実施し、FCS Express 4ソフトウェアを使用して分析を実施した。アッセイ検出限界は0.004％であり、定量限界は0.001％である。
【０２０１】
ベストロフィン1、MITFおよびZO-1の免疫染色：OpRegen製剤細胞を解凍し、24〜30日間培養し、次いで固定し（4％PFA）、透過化した（5％正常ロバ血清を含有するPBS中0.2％ Triton X-100を使用）。細胞を、マウス抗ヒトベストロフィン1（Novus Biologicals、Cat # NB300-164）およびウサギ抗ヒトZO-1（Invitrogen、Cat # 61-7300）ならびにマウス抗ヒトMITF（Thermo Fisher Scientific/Neomarkers、Cat # MS772-P1）およびウサギ抗ヒトZO-1で共免疫染色した。細胞を洗浄し、二次抗体ロバ抗ウサギIgG（Jackson、Cat # 711-546-152）およびロバ抗マウスIgG（Jackson、Cat # 715-606-151）で免疫染色した。細胞を洗浄し、Vectashield DAPI（Vector Laboratories、Cat # H-1200）および蛍光封入剤（DAKO、Cat # S3023）を使用して封入した。全細胞数の計測のために対比核染色としてDAPIを加えた。各免疫染色細胞培養ウェルの中心から10×ソフトウェア誘導共焦点画像（FluoViewソフトウェアによって制御されるOlympus IX82）を撮り、各画像からの最小500のDAPI陽性細胞をベストロフィン1およびMITFの発現に関して分析した。ベストロフィン1およびMITF陽性細胞％を計算した。
【０２０２】
分泌タンパク質のレベルのELISA計測
製造工程に沿った様々な工程内管理ポイントで細胞培養培地を回収した。以下の表4Bに記すELISAキットを使用して、メーカーの指示にしたがって、分泌されたタンパク質のレベルの評価を実施した。
【０２０３】
（表４Ｂ）
2018521678.tif 000008
【０２０４】
グルコース消費および乳酸産生の評価：製造工程に沿った様々な工程内管理ポイントで細胞培養培地を回収した。Accutrend Plus（Cobas）メーターを、グルコースのために予備校正されたストリップ（Cobas、Cat #11447475）および乳酸のために予備校正されたストリップ（Cobas、Cat #03012654）とともに使用して、グルコースおよび乳酸のレベルを計測した。
【０２０５】
バリア機能ならびにPEDFおよびVEGF極性分泌の評価：OpRegen製剤を解凍し、ニコチンアミドの存在下、14日間培養した。次いで、細胞をさらに4週間、トランススウェル（Costar 3460、0.4μm）に移し、その間、経上皮電気抵抗（TEER；バリア機能）を計測し、PEDFおよびVEGF分泌の評価のために週1回のベースで上下のトランスウェルチャンバから培地を回収した。頂端膜側PEDF分泌と基底膜側PEDF分泌との比および基底膜側VEGF分泌と頂端膜側VEGF分泌との比を報告する。
【０２０６】
結果
上記のように産生された製剤細胞のバッチリリースを表5に提示する。
【０２０７】
（表５）
2018521678.tif 000009
* TEERが＞100Ωであるとき、PEDFおよびVEGF極性分泌が予想される；BLOD：検出限界未満（すなわち0.004％未満）
【０２０８】
機械的単離を受けた細胞は、増殖中、酵素的に回収された細胞と比べて類似のグルコースおよび乳酸プロファイルを示した。図12を参照すること。
【０２０９】
MITFおよびベストロフィン1染色：製剤細胞におけるMITFおよびベストロフィン1の発現を分析した。図8から見てとれるように、機械的単離なしで産生されたRPE細胞は、同一の分化工程を使用するが機械的単離によって産生されたRPE細胞と同じ程度に、MITFおよびベストロフィン1を発現した。結果を以下の表6に定量する。
【０２１０】
（表６）
2018521678.tif 000010
【０２１１】
製造工程に沿ったCRALBP/PMEL17 RPE純度：分化段階終了時、すべての細胞の酵素的回収および多角形／色素細胞の機械的単離ののち（工程内管理すなわちIPC 5〜7）、凍結保存後のP0（IPC 8）およびP2（製剤、IPC 11）で、RPE純度計測のためにCRALBP+PMEL17+細胞の評価を実施した。
【０２１２】
結果を図9に示し、以下の表7にまとめる。
【０２１３】
（表７）
2018521678.tif 000011
【０２１４】
製造工程に沿った未分化hESCの計測：RPE細胞中に残存する未分化hESC（Oct4+TRA-1-60+）の程度を分析するために、FACS分析を実施した。
【０２１５】
結果を表8にまとめ、図10に提示する。
【０２１６】
（表８）
2018521678.tif 000012
BLOD：検出限界未満（すなわち0.004％未満）
【０２１７】
製造工程に沿った因子分泌：製造工程に沿ってPEDF、TIMP-2、sgp130およびsTNF-R1分泌を計測した。結果を以下の表9に示す。
【０２１８】
（表９）
2018521678.tif 000013
【０２１９】
製造工程に沿ってVEGF、アンギオゲニン、TIMP-1およびMIF分泌を計測した。結果を以下の表10に示す。
【０２２０】
（表１０）
2018521678.tif 000014
2018521678.tif 000015
【０２２１】
製造工程に沿ってVEGF、アンギオゲニン、TIMP-1およびMIF分泌を計測した。結果を以下の表11に示す。
【０２２２】
（表１１）
2018521678.tif 000016
【０２２３】
製造工程に沿ったPax6+細胞の計測：Pax6+細胞の割合を分析するためにFACS分析を実施した。
【０２２４】
結果を表12にまとめ、図11に提示する。
【０２２５】
（表１２）
2018521678.tif 000017
【０２２６】
製造終了時の細胞収量：分化段階終了時、機械的に単離された細胞および酵素的に回収された細胞をカウントし、1ウェルあたり類似の数の生細胞をrhゼラチン上に増殖サイクルまで播種した。各継代終了時、各ステップで収集されたすべての細胞が播種されたと仮定して、細胞数および累積細胞数を計測した。表13に示すように、酵素的に単離された細胞は、より高い収量およびより多い合計細胞倍加回数を示した。
【０２２７】
（表１３）
2018521678.tif 000018
* 細胞をさらに増殖させることはできなかった。
【０２２８】
これらのデータは、すべての細胞が酵素的に回収されるならば、増殖段階を延長することができることを実証する。
【０２２９】
本発明は、その具体的な態様に関連して説明されたが、多くの代替、修飾および変形が当業者に自明であることは明らかである。したがって、特許請求の範囲の精神および広い範囲に入るようなすべての代替、修飾および変形を包含することが意図される。
【０２３０】
本明細書中で挙げられたすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により具体的かつ個別に本明細書に組み入れられることが示される場合と同じ程度に、参照により全体として本明細書に組み入れられる。加えて、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されてはならない。セクションの見出しは、それらが使用される程度に、必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2018521678.tif 000020
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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