(57)【要約】  グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ１）ポリペプチド分子を含むタンパク質調製物が開示され、そのＧＯＴ１は、ヒト血清中に存在するものと配列が同一である。その調製物のＧＯＴ１ポリペプチド分子の１００％が、ＧＯＴ１ポリペプチドの１位にアラニンを有する。そのＧＯＴポリペプチド分子は、その調製物中のタンパク質の少なくとも９５％を構成する。その製造方法および使用も開示される。【選択図】図3
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）ポリペプチド分子を含むタンパク質調製物であって、前記ＧＯＴ１ポリペプチド分子の１００％が、前記ＧＯＴ１ポリペプチドの１位にアラニンを有し、前記ＧＯＴ１ポリペプチド分子は、前記調製物中のタンパク質の少なくとも９５％を構成する、タンパク質調製物。
【請求項２】
前記タンパク質が、前記調製物中の分子の少なくとも９８％を構成する、請求項１に記載のタンパク質調製物。
【請求項３】
活性な作用物質として請求項１または２に記載のタンパク質調製物、および薬学的に許容され得る担体を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＧＯＴ１が、配列番号２と少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む、請求項１または３に記載の調製物または薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＧＯＴ１が、配列番号２に示されているアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載の調製物または薬学的組成物。
【請求項６】
目的のポリペプチドおよび低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）を含む融合タンパク質であって、前記目的のポリペプチドのＮ末端は、前記ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、前記融合タンパク質は、異種親和性タグを欠く、融合タンパク質。
【請求項７】
グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）および低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）を含むＧＯＴ１融合タンパク質であって、前記ＧＯＴ１のＮ末端は、前記ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、前記融合タンパク質は、親和性タグを欠く、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＧＯＴ１が、１位にアラニンを含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記親和性タグが、ポリヒスチジンタグである、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＧＯＴ１のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％相同である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＳＵＭＯのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９０％相同である、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１と少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１に示されているアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＳＵＭＯが、酵母ＳＵＭＯである、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記酵母ＳＵＭＯが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍｉｆ  ｔｗｏ  ３のサプレッサー（Ｓｍｔ３）である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項６〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３と少なくとも９０％相同な核酸配列を含む、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６または１７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項１９】
過剰なグルタメートに関連する疾患または状態の処置を必要とする被験体において過剰なグルタメートに関連する疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製物または薬学的組成物を前記被験体に投与することによって前記疾患または状態を処置する工程を含む、方法。
【請求項２０】
過剰なグルタメートに関連する疾患または状態の処置において使用するための、請求項１に記載のタンパク質調製物。
【請求項２１】
過剰なグルタメートに関連する疾患または状態の処置において使用するための、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記疾患または状態が、脳の疾患または状態である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法、調製物または組成物。
【請求項２３】
前記脳の疾患が、中枢神経系の癌である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法、調製物または組成物。
【請求項２４】
前記癌が、神経膠芽腫である、請求項２３に記載の方法、調製物または組成物。
【請求項２５】
前記脳の状態が、脳虚血である、請求項２２に記載の方法、調製物または組成物。
【請求項２６】
前記疾患が、神経変性疾患である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法、調製物または組成物。
【請求項２７】
ポリペプチドを精製する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドおよびＳＵＭＯを含む融合タンパク質を宿主細胞において発現させる工程であって、前記ポリペプチドのＮ末端は、前記ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、前記融合タンパク質は、異種親和性タグを欠く、工程；
（ｂ）前記融合タンパク質から前記ＳＵＭＯを除去する工程；および
（ｃ）前記宿主細胞から前記ポリペプチドを単離することによって、前記ポリペプチドを精製する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）が、工程（ｃ）の前に実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、ＧＯＴ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記除去する工程が、ＳＵＭＯプロテアーゼを用いて実施される、請求項２７または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記単離する工程が、熱沈殿、塩誘導沈殿、混合モードクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される手法を用いて実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離する工程が、熱沈殿、塩誘導沈殿、混合モードクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記単離する工程が、
（ａ）熱処理によって前記ＧＯＴ１を精製する工程；
（ｂ）塩誘導沈殿によって前記ＧＯＴ１を精製する工程；
（ｃ）混合モードクロマトグラフィーによって前記ＧＯＴ１を精製する工程；
（ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記ＧＯＴ１を精製する工程；および
（ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって前記ＧＯＴ１を精製する工程
によって実施され、ここで、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われ、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に行われ、工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われ、工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記塩誘導沈殿が、硫酸アンモニウムによって誘導される沈殿を含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、いくつかの実施形態において、精製されたグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）調製物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）は、グルタメートをアルファ−ケトグルタレートに変換することによってグルタメートの血中濃度を制御する血清酵素である。動物モデルでは、組換えグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ｒＧＯＴ）の全身投与によって、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷および神経膠腫脳腫瘍をはじめとした脳内に過剰なグルタメートを放出すると知られているいくつかの適応症の発症後に、脳に蓄積する過剰量の興奮毒性のグルタメートのスカベンジングが可能になると示されている。
【０００３】
脳内の過剰なグルタメートは、神経障害の主な原因の１つである。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）型の脳腫瘍の浸潤性の性質および急速な成長は、不治であると考えられている。この疾患に関連する急速な成長および神経障害の理由の１つは、脳に蓄積して腫瘍に隣接する正常な脳細胞を死滅させる興奮毒性のグルタメート分子をＧＢＭ細胞が分泌し続けることである。その結果、急速な腫瘍の拡大に必要とされる頭蓋内の空間ができる。
【０００４】
ＧＢＭマウスモデルにおいてｒＧＯＴ１と標準的な治療薬テモゾロミド（ＴＭＺ）とを同時投与すると、ＴＭＺ処置のみを受けた群と比べて腫瘍の成長が有意に遅延し、寿命が４５〜７６日延長した（Ｒｕｂａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ（２０１２）３０（６）：２２２６−２２３５）。
【０００５】
虚血性脳卒中ラットモデルにおけるｒＧＯＴ１の投与によって引き起こされる血中グルタメートレベルの低下は、脳に蓄積した過剰量の興奮毒性の（ｅｘｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）グルタメート分子が血液脳関門を通って血流に急速に（１５分以内に）流出させることが以前に示されている（Ｆ．Ｃａｍｐｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂｏｌ．２０１１，３１，１３８７；Ｍ．Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓ．２０１４，５，ｅ９９２）。
【０００６】
さらなる背景技術としては、Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１２，１１：９２；Ｍａｒｂｌｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００６  Ｊａｎ；１５（１）：１８２−１８９；および米国特許出願第２０１０００２１９８７号明細書が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第２０１０００２１９８７号明細書(非特許文献)  (非特許文献１)Ｒｕｂａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ（２０１２）３０（６）：２２２６−２２３５    (非特許文献２)Ｆ．Ｃａｍｐｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂｏｌ．２０１１，３１，１３８７    (非特許文献３)Ｍ．Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓ．２０１４，５，ｅ９９２    (非特許文献４)Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１２，１１：９２    (非特許文献５)Ｍａｒｂｌｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００６  Ｊａｎ；１５（１）：１８２−１８９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）ポリペプチド分子を含むタンパク質調製物が提供され、ここで、そのＧＯＴ１ポリペプチド分子の１００％が、ＧＯＴ１ポリペプチドの１位にアラニンを有し、そのＧＯＴ１ポリペプチド分子は、その調製物中のタンパク質の少なくとも９５％を構成する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、活性な作用物質として、本明細書中に記載されるタンパク質調製物、および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、目的のポリペプチドおよび低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）を含む融合タンパク質が提供され、ここで、目的のポリペプチドのＮ末端は、ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、その融合タンパク質は、異種親和性タグを欠く。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）および低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）を含むＧＯＴ１融合タンパク質が提供され、ここで、ＧＯＴ１のＮ末端は、ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、その融合タンパク質は、親和性タグを欠く。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本明細書中に記載される融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本明細書中に記載される単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、過剰なグルタメートに関連する疾患または状態の処置を必要とする被験体において過剰なグルタメートに関連する疾患または状態を処置する方法が提供され、その方法は、治療有効量の本明細書中に記載される調製物または薬学的をその被験体に投与することによって、その疾患または状態を処置する工程を含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ポリペプチドを精製する方法が提供され、その方法は、
（ａ）ポリペプチドおよびＳＵＭＯを含む融合タンパク質を宿主細胞において発現させる工程であって、そのポリペプチドのＮ末端は、ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、その融合タンパク質は、異種親和性タグを欠く、工程；
（ｂ）その融合タンパク質からＳＵＭＯを除去する工程；および
（ｃ）宿主細胞からポリペプチドを単離することによって、ポリペプチドを精製する工程
を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によると、上記タンパク質は、調製物中の分子の少なくとも９８％を構成する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＧＯＴ１は、配列番号２と少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＧＯＴ１は、配列番号２に示されているアミノ酸配列からなる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＧＯＴ１は、１位にアラニンを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によると、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＧＯＴ１のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％相同である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＳＵＭＯのアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも９０％相同である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によると、融合タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によると、アミノ酸配列は、配列番号１に示されているとおりである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＳＵＭＯは、酵母ＳＵＭＯである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によると、酵母ＳＵＭＯは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍｉｆ  ｔｗｏ  ３のサプレッサー（Ｓｍｔ３）である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によると、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９０％相同な核酸配列を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によると、疾患または状態は、脳の疾患または状態である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によると、脳の疾患は、中枢神経系の癌である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によると、癌は、神経膠芽腫である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によると、脳の状態は、脳虚血である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によると、疾患は、神経変性（ｎｅｕｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によると、工程（ｂ）は、工程（ｃ）の前に実施される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリペプチドは、ＧＯＴ１である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によると、除去する工程は、ＳＵＭＯプロテアーゼを用いて実施される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によると、単離する工程は、熱沈殿、塩誘導沈殿、混合モードクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される手法を用いて実施される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によると、単離する工程は、熱沈殿、塩誘導沈殿、混合モードクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によると、単離する工程は、
（ａ）熱処理によってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｂ）塩誘導沈殿によってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｃ）混合モードクロマトグラフィーによってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィーによってＧＯＴ１を精製する工程；および
（ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィーによってＧＯＴ１を精製する工程
によって実施され、ここで、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われ、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に行われ、工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われ、工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。
【００３９】
熱沈殿、塩誘導沈殿は、硫酸アンモニウムによって誘導される沈殿を含む。
【００４０】
熱沈殿、宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群より選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によると、宿主細胞は、細菌細胞である。
【００４２】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および／または科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単なる例証的なものであって、必ずしも限定的であると意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
図面のいくつかの図の簡単な説明
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面および像を参照しながら、ほんの一例として本明細書中に記載される。ここから図面を詳細に具体的に参照していくが、その詳細は、一例としておよび本発明の実施形態を例証的に考察する目的で示されることが強調される。この点において、図面とともに行われる説明によって、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
図面において：
【図１】ＳＵＭＯ−ＧＯＴ生合成プロセスの完全なスキームを示している。
【図２】生合成中の発酵槽内のｐＨ、ｐＯ２、撹拌機、温度、気流および培養物の光学濃度のモニタリング。
【図３】既知組成の培地において得られた高濃度のバイオマスの典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを表している。
【図４】精製スキームのフローチャートである。
【図５】ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌの典型的なクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図６】ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの典型的なクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図７】Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの典型的なクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ滴定の写真である。ライン３−２，５μｇ；ライン５−５，０μｇ；ライン７−１０，０μｇ；ライン９−２０μｇ。
【図９】最終的なＧＯＴ１溶液の典型的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図１０】最終的なＧＯＴ１溶液の典型的なＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図１１】コントロールおよびＧＯＴ１サンプルのペプチドマッピングのクロマトグラムを重ねたもの。
【図１２】等電点電気泳動によって不純物を図示しているクマシー染色ゲルの写真である。１−広範囲ｐＩマーカー；２−標準液Ａ；３−標準液Ｂ；４−バッチ１；５−バッチ２；６−バッチ３；７−バッチ４；８−バッチ５；９−広範囲ｐＩマーカー。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の特定の実施形態の説明
本発明は、そのいくつかの実施形態において、精製されたグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）調製物およびそれを生成する方法に関する。
【００４５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記載に示されるまたは実施例によって例証される詳細に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施もしくは実行することが可能である。
【００４６】
血中グルタメートのスカベンジングは、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）および虚血性脳損傷をはじめとした様々な障害において放出される細胞外グルタメートの興奮毒性作用を減少させるための魅力的な防御ストラテジーである。
【００４７】
現在までに、組換えタンパク質の簡便で直接的な親和性精製のために典型的に使用されているヒスチジン−６タグを含む組換えヒトｒＧＯＴがＥ．ｃｏｌｉ系において調製された。Ｈｉｓタグを含む組換えタンパク質は、免疫学的意義に起因してヒトでは使用できないので、Ｎ末端の位置にアラニン部分を有するヒト酵素と同一のｒＧＯＴ１調製物を生成する必要があった（ＪＭ，Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９０，２７０：６５１−７）。
【００４８】
組換え細菌発現系は、Ｎ末端のメチオニンを含む組換えポリペプチドを生成する。このアミノ酸は、次の５つのＮ末端アミノ酸の配列に応じて、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ２）によって切断され得る。しかしながら、ＭＡＰ２細菌酵素を用いてｒＧＯＴ１からＮ末端のメチオニンが切断されるとき、Ｎ末端のメチオニンだけでなく、メチオニン切断後に露出されるようになるその次の３つのアミノ酸（アラニン−プロリン−プロリン）も、この酵素によって切断されることが見出された。したがって、いくつかのメンバーがＮ末端のアラニンを含み、他のメンバーは２番目または３番目のＮ末端アミノ酸で切断された、不均一なタンパク質集団が生成された。そのような不均一なタンパク質調製物は、ヒトの治療には適していない。
【００４９】
この問題を克服するために、本発明者らは、ＳＵＭＯ実体をコードする遺伝子（Ｓｍｔ３、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ起源）とＧＯＴ１遺伝子を継ぎ目なく融合することによってキメラタンパク質を作製した。細菌系における発現、その融合タンパク質からのＳＵＭＯ実体の切断およびｒＧＯＴ１の生化学的精製の後、本発明者らは、図１１および１２ならびに本明細書中の下記の表６に示されるような９５％超の純度の生物学的に活性なｒＧＯＴ１調製物を得た。
【００５０】
したがって、本発明の第１の態様によると、ポリペプチドを精製する方法が提供され、その方法は、
（ａ）ポリペプチドおよびＳＵＭＯを含む融合タンパク質を宿主細胞において発現させる工程であって、ここで、そのポリペプチドのＮ末端は、ＳＵＭＯのＣ末端に翻訳段階で融合され、その融合タンパク質は、異種親和性タグを欠く、工程；
（ｂ）その融合タンパク質からＳＵＭＯを除去する工程；および
（ｃ）宿主細胞からそのポリペプチドを単離することによって、ポリペプチドを精製する工程
を含む。
【００５１】
用語「融合タンパク質」とは、１つを超える親タンパク質または親ポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むタンパク質のことを指す。本発明のこの態様の融合タンパク質は、目的の１つのタンパク質のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、ＳＵＭＯのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで（かつリンカーなしで）付加された融合遺伝子から発現される。次いで、その融合遺伝子は、本明細書中の下記にさらに記載されるように、組換え宿主細胞によって単一のタンパク質として発現され得る。
【００５２】
本発明のこの態様によると、融合タンパク質は、本明細書中の下記でさらに詳述されるような異種親和性精製タグを欠く。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＳＵＭＯ」とは、低分子ユビキチン様修飾因子（またはＳＵＭＯ）タンパク質ファミリーのメンバーであるポリペプチドのことを指す。ＳＵＭＯタンパク質は、典型的には低分子であり；ほとんどが、およそ１００アミノ酸長であり、１２ｋＤａの質量である。正確な長さおよび質量は、ＳＵＭＯファミリーメンバー間で異なり、そのタンパク質がどの生物に由来するかに依存する。ＳＵＭＯは、酵母ＳＵＭＯ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍｉｆ  ｔｗｏ  ３のサプレッサー（Ｓｍｔ３））、ヒトＳＵＭＯ−１、ヒトＳＵＭＯ−２、ヒトＳＵＭＯ−３、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａのＳＵＭＯ−１〜ＳＵＭＯ−８のうちのいずれか１つ、トマトＳＵＭＯ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＳＵＭＯ−１〜ＳＵＭＯ−３のうちのいずれか１つ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＳｍｔ３、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのＳＭＯ−１、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＰｍｔ３、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＳＵＭＯ、カビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのＳＵＭＯであり得る。
【００５４】
特定の実施形態によると、ＳＵＭＯタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）であり、ＮＣＢＩの標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｐ］ソフトウェアを用いて測定されるとき、配列番号５に示されているアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、少なくとも９１％相同、少なくとも９２％相同、少なくとも９３％相同、少なくとも９４％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９６％相同、少なくとも９７％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、さらにより好ましくは１００％相同である。
【００５５】
本発明のこの態様の融合タンパク質の第２のポリペプチド（または目的のポリペプチド）は、例えば、治療薬、ワクチン、診断薬、バイオ燃料の製造のためおよび他の多くの目的の用途のために、研究および産業の環境において使用される任意のポリペプチドであってよい。
【００５６】
ポリペプチドは、細胞内ポリペプチド（例えば、サイトゾルタンパク質）、膜貫通ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、完全長のポリペプチドまたはそのフラグメントであり得る。１つの実施形態によると、ポリペプチドは、１０アミノ酸、２０アミノ酸、５０アミノ酸または１００アミノ酸未満である。
【００５７】
特定の実施形態によると、ポリペプチドは、ヒトポリペプチドであり、ＮＣＢＩの標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｐ］ソフトウェアを用いて測定されるとき、野生型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％相同、より好ましくは  ９６％相同、９７％相同  ９８％相同、９９％相同、さらにより好ましくは１００％相同なアミノ酸配列を有する。
【００５８】
主題の組成物および方法を用いることによって作製され得る例示的な治療的タンパク質としては、ある特定の天然のおよび組換えのヒトホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、卵胞刺激ホルモンおよび絨毛性ゴナドトロピン）、造血性タンパク質（例えば、エリトロポイエチン、Ｃ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１１）、血栓性および止血性タンパク質（例えば、組織プラスミノゲンアクチベーターおよび活性化タンパク質Ｃ）、免疫学的タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、リンフォカイン）、抗体ならびに他の酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ）が挙げられるがこれらに限定されない。主題の組成物および方法によって作製され得る例示的なワクチンとしては、様々なインフルエンザウイルス（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型、ならびに各型の様々な血清型、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ型肝炎）、ライム病およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。異種性に生成されるタンパク質診断薬の例としては、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＨＩＶ抗原およびＣ型肝炎抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
特定のポリペプチドまたはタンパク質の例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ベータ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）、インターフェロンガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＩＧＦ−ベータ）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化されると制御され、正常Ｔ細胞から発現されおそらく分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ））、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１−アルファおよびＭＩＰ−１−ベータ）、Ｌｅｉｓｈｍｎａｎｉａ伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＮＦアルファタイプＩＩレセプター、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリンならびに可溶性糖タンパク質、例えば、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０糖タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。他の例としては、セクレチン、ネシリチド（ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ））およびＧＹＰ−Ｉが挙げられる。
【００６０】
他の例示的なポリペプチドは、米国特許出願第２０１２０３２９０９号明細書（その内容は参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【００６１】
ある特定の実施形態において、異種性に生成されるタンパク質は、酵素またはその生物学的に活性なフラグメントである。好適な酵素としては、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、異種性に生成されるタンパク質は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）クラス１の酵素、例えば、ＥＣ１．１〜１．２１のいずれかまたは１．９７の酵素である。その酵素は、ＥＣクラス２、３、４、５または６の酵素でもあり得る。例えば、その酵素は、ＥＣ２．１〜２．９、ＥＣ３．１〜３．１３、ＥＣ４．１〜４．６、ＥＣ４．９９、ＥＣ５．１〜５．１１、ＥＣ５．９９またはＥＣ６．１〜６．６のいずれかから選択され得る。
【００６２】
特定の実施形態によると、ポリペプチドは、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼタイプ１（ＧＯＴ１；ＮＭ＿００２０７９．２；Ｐ１７１７４）である。この酵素は、ＥＣ  Ｎｏ．２．６．１．１を有するピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）依存性の細胞質酵素である。ＧＯＴ１は、アミノ酸代謝ならびに尿素回路およびトリカルボン酸回路において役割を果たす。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性は、発生中の肝臓グルコース合成および脂肪細胞のグリセロール新生（ｇｌｙｃｅｒｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与する。ＧＯＴ１は、血清グルタメートレベルの重要な制御因子でもある。高レベルのグルタメート（約４０マイクロモル濃度）が血液循環中に存在するのとは対照的に、正常な脳は、非常に低レベルの細胞外グルタメート（約１マイクロモル濃度）を有する。少量の脳グルタメートは、脊椎動物の中枢神経系の神経伝達物質として重要な役割を果たす。
【００６３】
本発明のこの態様の融合タンパク質のＧＯＴ１は、血清ＧＯＴ１のアミノ酸配列を有する（すなわち、そのＮ末端（そのタンパク質配列の１位）にアラニンを含む）。
【００６４】
好ましくは、ＧＯＴ１は、ＮＣＢＩの標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｐ］ソフトウェアを用いて測定されるとき、配列番号２に示されているアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、少なくとも９１％相同、少なくとも９２％相同、少なくとも９３％相同、少なくとも９４％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９６％相同、少なくとも９７％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、さらにより好ましくは１００％相同なアミノ酸配列を含む（ここで、そのタンパク質の１番目のアミノ酸は、アラニンであってメチオニンではない）。
【００６５】
特定の実施形態によると、ＧＯＴ１は、配列番号２に示されている配列からなる。
【００６６】
好ましくは、ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１融合タンパク質は、ＮＣＢＩの標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｐ］ソフトウェアを用いて測定されるとき、配列番号１に示されているアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、少なくとも９１％相同、少なくとも９２％相同、少なくとも９３％相同、少なくとも９４％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９６％相同、少なくとも９７％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、さらにより好ましくは１００％相同なアミノ酸配列を含む。
【００６７】
別の実施形態によると、ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１融合タンパク質は、配列番号１に示されているアミノ酸配列からなる。
【００６８】
組換え技術を用いてＳＵＭＯ融合タンパク質（例えば、ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１融合タンパク質）を生成するために、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが使用され得る。例示的な核酸配列は、配列番号３に示されている。
【００６９】
用語「核酸配列」とは、天然に存在する塩基、糖および共有結合性のヌクレオシド間結合（例えば、骨格）から構成されるデオキシリボ核酸配列、ならびにそれぞれの天然に存在する部分と同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドのことを指す。そのような改変は、組換え発現が可能であるという条件で本発明によって可能にされる。
【００７０】
本発明のこの態様に係る融合タンパク質の核酸配列は、相補的なポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムのポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）であり得る。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、句「相補的なポリヌクレオチド配列」とは、逆転写酵素または他の任意のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたメッセンジャーＲＮＡの逆転写に由来する配列のことを指す。そのような配列は、その後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてインビボまたはインビトロにおいて増幅され得る。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、句「ゲノムのポリヌクレオチド配列」とは、染色体に由来する（染色体から単離された）配列のことを指すので、これは、染色体の連続した一部である。
【００７３】
本明細書中で使用されるとき、句「複合ポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも部分的に相補的な配列であって、少なくとも部分的にゲノムである配列のことを指す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために必要ないくつかのエキソン配列ならびにそれらの間に挿入されたいくつかのイントロン配列を含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含む任意の起源のものであってよく、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列は、シス作用性発現調節エレメントをさらに含み得る。
【００７４】
ＳＵＭＯをコードするポリヌクレオチド配列と目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列との連結は、ＰＣＲ、ライゲーション酵素および制限酵素の使用をはじめとした標準的な分子生物学的手法を用いて実施され得る。Ｎ末端にＳＵＭＯおよびＣ末端に目的のポリペプチドを有する融合タンパク質が生成されるように、ＳＵＭＯの５’末端が、目的のタンパク質をコードする遺伝子の３’末端にライゲートされることが認識される。
【００７５】
融合タンパク質をコードする作製されたポリヌクレオチドは、典型的には、異種親和性タグをコードするいかなる配列も含まない。
【００７６】
句「異種親和性タグ」は、本明細書中で使用されるとき、融合タンパク質または目的のポリペプチドを親和性精製するために使用され得るＳＵＭＯまたは目的のポリペプチド（すなわち、野生型配列）に天然には含まれないアミノ酸配列のことを指す。
【００７７】
したがって、例えば、本発明のこの態様の単離されたポリヌクレオチドは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、Ｓ−タグ、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡタグ、ＦＬＡＧＴＭエピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープおよびｃ−ｍｙｃエピトープをコードする核酸配列を欠く。
【００７８】
組換え手法を用いて本発明の融合タンパク質を生成するために、それをコードするポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド配列がシス制御配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下になるように核酸発現ベクターにライゲートされる。
【００７９】
種々の原核細胞または真核細胞が、本発明のポリペプチドを発現するための宿主発現系として使用され得る。これらとしては、微生物、例えば、本ポリペプチドをコードする配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌；本ポリペプチドをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；本ポリペプチドをコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または本ポリペプチドをコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、例えば、Ｔｉプラスミドで形質転換された植物細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
融合タンパク質を発現させるために使用され得る例示的な細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質欠損株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１またはＲｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ−２、最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１である。
【００８１】
融合タンパク質を発現させるために使用され得る例示的な酵母細胞は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００８２】
本発明のこの実施形態とともに使用するのに適した構成的プロモーターとしては、ほとんどの環境条件下およびほとんどのタイプの細胞において機能的である（すなわち、転写を指示することができる）配列、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。
【００８３】
本発明のこの実施形態とともに使用するのに適した誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８−４０５）またはｌａｃオペレーターが挙げられる。後者の場合、遺伝子発現は、２０〜３０℃（例えば、２５℃）の温度においてイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ〜１ｍＭの濃度で使用して誘導される。
【００８４】
本発明のこの実施形態に係る発現ベクターは、このベクターを原核生物、真核生物または好ましくはその両方（例えば、シャトルベクター）における複製および組み込みにとって好適であるようにするさらなる配列を含み得る。典型的なクローニングベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｓ））ならびに転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【００８５】
真核生物プロモーターは、典型的には、２つのタイプの認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に配置されたＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成の開始を指示するのに関わると考えられている。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される割合を決定する。
【００８６】
エンハンサーエレメントは、連結された同種または異種のプロモーターからの転写を最大１，０００倍刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流または上流に配置されたとき、活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントが、幅広い宿主範囲を有し、種々の組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に適している。本発明に適した他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するもの、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶ）由来の末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｐｅａｔ）が挙げられる。参照により本明細書中に援用されるＥｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８３を参照のこと。
【００８７】
本発明の発現ベクターから発現されるポリペプチドの翻訳効率を高めるために、ポリアデニル化配列も発現ベクターに付加され得る。正確かつ効率的なポリアデニル化のために２つの異なる配列エレメント、すなわちポリアデニル化部位の下流に配置されたＧＵまたはＵリッチ配列および１１〜３０ヌクレオチド上流に配置された６ヌクレオチドＡＡＵＡＡＡの高度に保存された配列が必要とされる。本発明に適した終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。
【００８８】
すでに記載したエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを高めることまたは組換えＤＮＡを有する細胞の識別を容易にすることを意図した他の特殊なエレメントを含み得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外の複製を促進するＤＮＡ配列を含む。プラスミド上に保有されるまたは宿主細胞のゲノムとともに保有される遺伝子によって適切な因子が提供される限り、これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、エピソームとして複製される。
【００８９】
ベクターは、真核生物のレプリコンを含んでもよいし、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、そのベクターは、適切な選択マーカーを用いて真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は不可能である。その代わり、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
【００９０】
本発明に適した細菌発現ベクターの例としては、ｐＥＴ２１ｂ＋、ｐＢＲ３２２またはｐＥＴ２８＋が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９１】
哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）ならびにそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターも、本発明によって使用され得る。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしては、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターとしては、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞における発現に有効であると示された他のプロモーターの指揮下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。
【００９３】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を用いることができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に広く記載されており、それらの方法としては、例えば、安定的なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。さらに、ポジティブ−ネガティブ選択法について米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照のこと。
【００９４】
形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドを発現させる有効な条件下で培養される。有効な培養条件としては、タンパク質の生成を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるがこれらに限定されない。有効な培地とは、本発明の組換えポリペプチドを産生するように細胞が培養される任意の培地のことを指す。そのような培地としては、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分、例えば、ビタミンを有する水溶液が挙げられる。
【００９５】
本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートにおいて培養され得る。培養は、組換え細胞にとって適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行われ得る。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【００９６】
生成のために使用されるベクターおよび宿主系に応じて、結果として生じる本発明のポリペプチドは、組換え細胞内に残ってもよいし、発酵培地に分泌されてもよいし、２枚の細胞膜の間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔）に分泌されてもよいし、細胞膜またはウイルス膜の外表面上に保持されてもよい。
【００９７】
所定の時間にわたる培養の後に、組換え融合タンパク質の回収が実施される。
【００９８】
融合タンパク質が、細胞内で発現される場合、融合タンパク質を放出するために、好ましくは細胞膜が破壊される。
【００９９】
細胞の破壊は、均質化をはじめとした当該分野で公知の方法を用いて実施され得る。
【０１００】
融合タンパク質は、ＳＵＭＯプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．６８）を加えることによって、脱ＳＵＭＯ化される。
【０１０１】
脱ＳＵＭＯ化は、精製手順の任意の段階において実施してよい。特定の実施形態によると、この手順は、本明細書中の下記にさらに記載されるように、熱変性の後、かつ塩析および／または交換クロマトグラフィーの前に実施される。
【０１０２】
ＳＵＭＯプロテアーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＬＰ１（Ｕｂｌ特異的プロテアーゼ１）、Ｕｌｐ２、ヒトＳＥＮＰ１、ヒトＳＥＮＰ２、ヒトＳＥＮＰ３、ヒトＳＥＮＰ５、ヒトＳＥＮＰ６、ヒトＳＥＮＰ７、マウスＳＥＮＰ１、マウスＳＥＮＰ２、マウスＳＥＮＰ３、マウスＳＥＮＰ５、マウスＳＥＮＰ６、マウスＳＥＮＰ７、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａのＵｌｐ１ａ〜Ｕｌｐ１ｄのうちのいずれか１つ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａのＵｌｐ２ａ〜Ｕｌｐ２ｈのうちのいずれか１つ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａのＥＳＤ４、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのＵｌｐ−１、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのＵｌｐ−２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＵＬＰ１、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＵｌｐ１、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＵＬＰ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのＵｌｐ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＸＳＥＮＰ１ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＸＳＥＮＰ１ｂ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのＸｏｐＤ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＵｌｐ１、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵｌｐ、それらの等価物、それらのホモログ、それらの触媒ドメインまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０３】
融合タンパク質は、熱変性、塩誘導沈殿、混合モードクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の方法を用いて精製され得る。
【０１０４】
熱変性：
高温ではタンパク質ごとに異なる安定性を有するので、標的タンパク質が、混入タンパク質よりも高い熱安定性を有する場合、数分から数時間までの様々な時間にわたる高温でのインキュベーションによって、望まれないタンパク質が沈殿することが多く、それらのタンパク質は、遠心分離によって除去することができる。高温での標的タンパク質の安定性は、場合によっては、基質またはその折り畳みを増強する他の特定のリガンドの存在によって高められ得る。アルファ−ケトグルタレート（例えば、１０ｍＭ）およびピリドキサール５−リン酸（例えば、２０μＭ）の存在下におけるＧＯＴ１は、７０℃において熱安定性である。したがって、温度を約７０℃に上昇させることによって、変性した混入タンパク質が沈殿し得る。
【０１０５】
塩誘導沈殿：
タンパク質の溶解度は、その溶液のイオン強度、ゆえに塩濃度に従って変動する。２つの異なる影響が認められる：低い塩濃度では、タンパク質の溶解度は、塩濃度の上昇（すなわちイオン強度の上昇）とともに上昇する（塩溶と呼ばれる作用）。塩濃度（イオン強度）がさらに上昇すると、タンパク質の溶解度は、下がり始める。十分に高いイオン強度では、タンパク質は、その溶液からほぼ完全に沈殿する（塩析）。タンパク質は、高イオン強度ではその溶解度が著しく異なるので、塩析（または塩誘導沈殿）が、所与のタンパク質の精製を助ける非常に有用な手順である。通常使用される塩は、非常に水溶性であることから硫酸アンモニウムであり、これは、ホフマイスター系列において高い２種のイオンを形成し、酵素活性に対して有害作用を及ぼさない。それは、通常、飽和水溶液として使用され、その飽和水溶液は、必要とされる濃度に希釈され、その濃度は、飽和溶液（１００％溶液）に対するパーセント濃度として表現される。
【０１０６】
クロマトグラフィー樹脂：
用語「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」は、本明細書中で交換可能に使用され、混合物中に存在する他の分子から目的の被検体（例えば、目的のポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質）を分離する任意の種類の固相のことを指す。通常、目的の被検体は、その混合物の個々の分子が、移動相の影響下においてまたは結合および溶出プロセスにおいて固定固相を通って移動する速度の差の結果として、他の分子から分離される。非限定的な例としては、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂および混合モード樹脂が挙げられる。使用される樹脂の体積、カラムの長さおよび直径、ならびに動的容量および流速は、いくつかのパラメータ、例えば、処理される流体の体積、本発明のプロセスに供される流体中のタンパク質の濃度などに依存する。各工程に対するこれらのパラメータの決定は、十分に当業者の平均的な技術の範囲内である。
【０１０７】
混合モードクロマトグラフィー：
混合モードクロマトグラフィーは、混合モードのクロマトグラフィーリガンドを利用するクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態において、そのようなリガンドは、結合されるべき物質と相互作用する少なくとも２つの異なるが協同的な部位を提供することができるリガンドのことを指す。これらの部位の１つは、リガンドと目的の物質との間に引力型の電荷間相互作用を付与する。他方の部位は、典型的には、電子受容体−供与体相互作用ならびに／または疎水性および／もしくは親水性相互作用を付与する。電子供与体−受容体相互作用には、水素結合、π−π、陽イオン−π、電荷移動、双極子間、誘起双極子などのような相互作用が含まれる。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、混合モードクロマトグラフィー媒体は、有機担体または無機担体（時折、ベースマトリックスと示される）に直接またはスペーサーを介して結合された混合モードリガンドを含む。その担体は、粒子、例えば、本質的に球状の粒子、モノリス、フィルター、膜、面、キャピラリーなどの形態であり得る。ある特定の実施形態において、その担体は、天然のポリマー、例えば、架橋された炭水化物材料、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギナン、ジェラン、アルギネートなどから調製される。高い吸着能を得るために、その担体は、多孔性であることができ、そしてリガンドが、外面ならびに孔の表面に結合される。そのような天然のポリマー担体は、標準的な方法、例えば、逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４）に従って調製され得る。あるいは、その担体は、合成ポリマー、例えば、架橋された合成ポリマー、例えば、スチレンまたはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどから調製され得る。そのような合成ポリマーは、標準的な方法に従って生成され得る。例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照のこと。多孔性の天然または合成ポリマー担体は、商業的供給源、例えば、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからも入手可能である。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、混合モード樹脂は、陰イオン交換および疎水性相互作用が可能な官能基を含む。そのような樹脂の例としては、ブチル−セファロース、オクチル−セファロース、フェニル−セファロース（例えば、７〜９のｐＨ範囲）、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（例えば、４．０〜８．０のｐＨ範囲）、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（すべてＰａｌｌ  Ｃｏｒｐが製造）、Ｃａｐｔｏ  ＡｄｈｅｒｅまたはＣａｐｔｏ  ＭＭＣが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
陽イオン交換クロマトグラフィー：
分離を行う際、種々の手法のいずれか、例えば、バッチ精製法またはクロマトグラフ法を用いることによって、タンパク質混合物を陽イオン交換材と接触させることができる。当該タンパク質のｐＩより低いｐＨを有する緩衝液中に存在するとき全体的に正電荷を有するタンパク質は、負に帯電した官能基を含む陽イオン交換材に良く結合する。溶出は、通常、イオン交換マトリックスの帯電した部位について溶質と競合するように緩衝液のイオン強度（すなわち、伝導率）を高めることによって達成される。ｐＨを変更することおよびそれによって溶質の電荷を変化させることが、溶質を溶出させる別の方法である。伝導率またはｐＨの変更は、漸進的（勾配溶出）であってもよいし、段階的（段階溶出）であってもよい。クロマトグラフィーのための陽イオン担体を形成するために、マトリックスに陽イオン性置換基を付着させてもよい。陽イオン交換置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｎｔｓ）の非限定的な例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げられる。
【０１１１】
好ましくは、ＣＥＸ樹脂は、ＣＭ官能基を含む。
【０１１２】
セルロースイオン交換樹脂、例えば、ＤＥ２３ＴＭ、ＤＥ３２ＴＭ、ＤＥ５２ＴＭ、ＣＭ−２３ＴＭ、ＣＭ−３２ＴＭおよびＣＭ−５２ＴＭは、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋから入手可能である。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）に基づく、それによって架橋されたイオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ならびにＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗはすべて、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから入手可能である。さらに、ＤＥＡＥとＣＭの両方によって誘導体化されたエチレングリコール−メタクリレート共重合体、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭＣＭ−６５０ＳまたはＭが、Ｔｏｓｏｈ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから入手可能である。
【０１１３】
さらに、ＤＥＡＥとＣＭの両方によって誘導体化されたエチレングリコール−メタクリレート共重合体、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭＣＭ−６５０ＳまたはＭが、Ｔｏｓｏｈ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから入手可能であるか、またはＮｕｖｉａ  ＳおよびＵ  ＯＳｐｈｅｒｅＴＭＳは、ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能であるか、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡから入手可能である。
【０１１４】
陰イオン交換クロマトグラフィー：
様々な陰イオン交換クロマトグラフィー担体を使用することができ、それは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｍｉｎｉ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｐ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ、ＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどからなる群より選択され得る。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおいて（例えば、４．０〜９．０のｐＨ範囲において）行われる。
【０１１５】
特定の実施形態によると、タンパク質がＧＯＴ１であるとき、精製する工程は、以下の手法を開示される順序で用いて実施される：
（ａ）熱処理（例えば、１０分間の６５〜７０℃）によってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｂ）塩誘導沈殿（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）によってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｃ）混合モードクロマトグラフィー（例えば、４．０〜８．０のｐＨ範囲でのＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）によってＧＯＴ１を精製する工程；
（ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、４．０〜７．０のｐＨ範囲でのＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）によってＧＯＴ１を精製する工程；および
（ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、４．０〜９．０のｐＨ範囲でのＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）によってＧＯＴ１を精製する工程。
【０１１６】
本明細書中に記載される方法を用いて、本発明者らは、タンパク質の１位にアラニンを有する（メチオニンを有しない）高度に精製されたＧＯＴ１のタンパク質調製物を生成した。
【０１１７】
したがって、本発明の別の態様によると、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）ポリペプチド分子を含むタンパク質調製物が提供され、ここで、そのＧＯＴ１ポリペプチド分子の１００％が、ＧＯＴ１ポリペプチドの１位にアラニンを有し、ＧＯＴ１ポリペプチド分子は、その調製物中のタンパク質の少なくとも９５％を構成する。
【０１１８】
本明細書中で使用されるとき、句「タンパク質調製物」とは、少なくとも１つのタンパク質の液体混合物、例えば、細胞溶解産物、元の細胞に存在するすべてではないタンパク質を含む部分的な細胞溶解産物、またはいくつかの細胞溶解産物の組み合わせのことを指す。用語「タンパク質調製物」には、溶解されて精製されたタンパク質も含まれる。典型的には、タンパク質調製物は、他の細胞成分、例えば、脂質、脂肪、核酸などを欠く。
【０１１９】
ＧＯＴ１ポリペプチドは、可溶化された状態でタンパク質調製物中に存在する。
【０１２０】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９０％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２１】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９１％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２２】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９２％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２３】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９３％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２４】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９４％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２５】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９５％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２６】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９６％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２７】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９７％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２８】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９８％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１２９】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の少なくとも９９％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１３０】
１つの実施形態によると、調製物中のタンパク質の１００％が、ＧＯＴ１ポリペプチド分子である。
【０１３１】
タンパク質調製物中のＧＯＴ１ポリペプチドは、Ｎ末端（そのタンパク質の１位）にアラニンを有する。
【０１３２】
本発明のこの態様によると、当該タンパク質の１位にアラニンを有するＧＯＴ１タンパク質の調製物中のパーセントは、メチオニンがメチオニンアミノペプチダーゼを用いて切断される細菌細胞において発現された組換えＧＯＴ１タンパク質の調製物と比べて高い。
【０１３３】
したがって、本発明のこの態様の調製物中のＧＯＴ１タンパク質のパーセントは、メチオニンがメチオニンアミノペプチダーゼを用いて切断される細菌細胞において発現された組換えＧＯＴ１タンパク質の調製物と比べて、１％高い、２％高い、３％高い、４％高い、５％高い、またはそれ以上高いことがある。
【０１３４】
本発明のこの態様によると、ＧＯＴ１分子の少なくとも９９．９％が、１位にアラニンを含み、ＧＯＴ１分子の少なくとも９９．９９％が、１位にアラニンを含み、ＧＯＴ１分子の少なくとも９９．９９９％が、１位にアラニンを含み、好ましくは、ＧＯＴ１分子の少なくとも９９．９９９９％または１００％が、１位にアラニンを含む。
【０１３５】
本明細書中に記載される組換えＧＯＴ１ポリペプチドは、過剰なグルタメートに関連する疾患または状態を処置するために使用され得る。
【０１３６】
過剰なグルタメートに関連する疾患の例としては、無酸素脳症、脳卒中、周産期脳障害、外傷性脳損傷、細菌性髄膜炎、くも膜下出血、癲癇、急性肝不全、緑内障、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ、痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、痙攣性の状態、開心術、動脈瘤手術、冠状動脈バイパス移植術およびアルツハイマー病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３７】
特定の実施形態によると、疾患は、中枢神経系の癌である。
【０１３８】
本明細書中で使用されるとき、句「中枢神経系の癌」とは、典型的には、隣接する健康な神経細胞に対してグルタメートが興奮毒性を発揮することを可能にするのに十分なレベルのグルタメートを放出する脳腫瘍（原発性または続発性）のことを指す。したがって、中枢神経系の癌には、グリア細胞、神経細胞、シュワン細胞、松果体細胞（ｐｉｎｅａｌｃｙｔｅ）、髄膜腫（ｍｅｎｎｉｎｇｉｏｍａ）およびメラノーマの原発腫瘍、ならびに脳に転移する肉腫、リンパ腫および複数の全身性悪性腫瘍が含まれる。
【０１３９】
特定の例としては、星状細胞腫および神経膠芽腫ならびにまたそれらの関連する神経腫瘍および神経膠腫瘍、神経膠腫（例えば、グレード１および２を含む）、乏突起膠腫、神経細胞腫、異形成神経上皮腫瘍（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒ）、原始神経外胚葉性腫瘍ならびに神経節性神経腫が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４０】
ＧＯＴ−１で処置され得るさらなる状態としては、外傷性脳損傷および振盪症、反復性片頭痛、脳性麻痺、蘇生および仮死、反復性癲癇発作、筋萎縮性（Ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ）側索硬化症（ＡＬＳ）、細菌性髄膜炎ならびにパーキンソン病が挙げられる。
【０１４１】
ＧＯＴ１ポリペプチドは、それ自体として、または薬学的組成物の一部として、提供され得る。本明細書中で使用されるとき、「薬学的組成物」とは、他の成分、例えば、生理的に好適な担体および賦形剤、浸透剤などを伴う、上記の本明細書中に記載される１つ以上の活性成分の調製物のことを指す。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１４２】
本明細書中において、用語「活性成分」とは、生物学的効果について説明できる調製物（例えば、ＧＯＴ１）のことを指す。本明細書中以後、句「生理的に許容され得る担体」および「薬学的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され、生物に対して有意な刺激作用を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤のことを指す。アジュバントは、これらの句に含められる。薬学的に許容され得る担体に含められる成分の１つは、例えば、有機媒質と水性媒質の両方に広範囲の溶解度を有する生体適合性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｍｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９））であり得る。
【０１４３】
本明細書中において、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に加えられる不活性な物質のことを指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４４】
薬物の製剤化および投与のための手法は、参照により本明細書中に援用される“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版に見られる。
【０１４５】
本発明の薬学的組成物の好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸、または非経口的送達（筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに鞘内、直接的な脳室内（心室内）、静脈内、腹腔内、鼻腔内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｕｓ）および眼内注射を含む）が挙げられ得る。
【０１４６】
特定の実施形態によると、経路は、全身性であり、投与は、血中（血漿中）グルタメートレベルを低下させるような、かつ脳内グルタメートレベルに対する血中グルタメートレベルを上昇させるような投与である。
【０１４７】
投与様式は、患者の状態にも依存し得る。例えば、発作の場合、骨内投与または静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）投与が好ましいことがある。
【０１４８】
本発明の薬学的組成物は、当該分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠マスキング、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスを用いて、製造され得る。
【０１４９】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性成分の処理を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理的に許容され得る担体を用いる従来の様式で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１５０】
注射の場合、本発明の活性成分は、水溶液、好ましくは、生理的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液または生理的食塩緩衝液中に製剤化され得る。経粘膜的投与の場合、透過すべき関門にとって適切な浸透剤を製剤において使用する。そのような浸透剤は、当該分野で広く知られている。
【０１５１】
経口投与の場合、本化合物は、活性な化合物を当該分野で周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような担体は、患者による経口摂取の場合、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口的に使用するための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用し、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、所望であれば好適な補助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって、作製することができる。好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム；および／または生理的に許容され得るポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望であれば、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを加えてもよい。
【０１５２】
糖衣錠コアは、好適なコーティングを伴って提供される。このために、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮された糖液が使用され得る。識別のためまたは活性な化合物の用量の種々の組み合わせを特徴づけるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１５３】
経口的に使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンから作製された押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールから作製された密閉軟カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および必要に応じて安定剤と混合された活性成分を含み得る。軟カプセルでは、活性成分は、好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与用のすべての製剤が、選択された投与経路に適した投与量で存在するべきである。
【０１５４】
頬側投与の場合、本組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤または舐剤の形態をとり得る。
【０１５５】
経鼻吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための活性成分は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、バルブに定量を送達させることによって決定され得る。当該化合物と好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含む、ディスペンサーにおいて使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【０１５６】
本明細書中に記載される調製物は、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与のために製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回用量の容器に入った状態で、必要に応じて保存剤が加えられて、提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）、例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含み得る。
【０１５７】
非経口投与用の薬学的組成物としては、水溶性の形態の活性な調製物の水溶液が挙げられる。さらに、活性成分の懸濁液が、適切な油性または水性の注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。必要に応じて、懸濁液は、好適な安定剤、または活性成分の溶解度を高めて高度に濃縮された溶液の調製を可能にする作用物質も含み得る。
【０１５８】
あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質非含有水溶液で構成するための、粉末の形態であり得る。
【０１５９】
本発明の薬学的組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物としても製剤化され得る。
【０１６０】
本発明の文脈において使用するために適した薬学的組成物には、意図された目的を達成するのに有効な量で活性成分を含む組成物が含まれる。より詳細には、治療有効量とは、疾患の症状を予防する、緩和するもしくは回復させるまたは処置されている被験体の生存時間を延長するのに有効な活性成分の量のことを意味する。
【０１６１】
治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６２】
本発明の処置方法によって使用されるいずれの薬学的組成物の場合も、治療有効量または用量は、最初にインビトロアッセイから推定され得る。例えば、ある用量が、動物モデルにおいて製剤化され得、係る情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１６３】
本明細書中に記載される活性成分の毒性および治療効果は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータが、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投与量を製剤化する際に使用され得る。投与量は、使用される剤形および用いられる投与経路に応じて変動し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態に鑑みて個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１６４】
神経系の癌の動物モデルは、容易に使用可能である。
【０１６５】
したがって、異種移植モデルが、前臨床治療の用量反応の特徴の評価および治療反応に対する腫瘍部位の影響の評価によく適している。Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００７  Ａｐｒｉｌ；１０６（４）：６５２−９は、星状細胞腫の形成をもたらす、ＧＦＡＰプロモーター（発現をアストロサイトに限定する）からｖ−ｓｒｃを発現する導入遺伝子の生殖細胞系列挿入を作製した。Ｖ−ｓｒｃは、ヒト神経膠腫においても活性化されるいくつかのシグナル伝達経路を活性化する。これらのＧＦＡＰ／ｖ−ｓｒｃ神経膠腫は、主に低悪性度または未分化であるが、場合によっては、神経膠芽腫の組織学的特徴を獲得する。
【０１６６】
Ｇｕｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１６７（３）：８５９−６７は、ＧＦＡＰプロモーターから発癌性Ｈ−Ｒａｓを過剰発現するトランスジェニックマウスを開発した。これらのマウスの種々の樹立系統が、様々なレベルの発癌性Ｒａｓを発現する。Ｈ−Ｒａｓを最も多く産生するものは、神経膠芽腫の特徴のすべてを有する星状細胞腫を発症する。中程度にＨ−Ｒａｓを発現するものは、生殖細胞系列伝達に進み、３月齢までに高有病率で低悪性度の未分化星状細胞腫を発症する。Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０００  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；２６（１）：１０９−１３は、Ｎｆ−１とｐ５３が共に欠失したアストロサイトの特徴を有する神経膠腫を形成した。Ｎｆ−１は、Ｒａｓ活性をダウンレギュレートするＲａｓＧＡＰタンパク質であり、ゆえに、Ｎｆ−１の喪失によって、Ｒａｓ活性は上昇する。マウスの中のすべての細胞においてＮｆ−１だけが変異しても、アストログリオーシスは生じるが、神経膠腫は形成しない。しかしながら、ｐ５３の変異が組み合わさると、マウスは、ヒトにおける神経膠芽腫の特徴を有するアストロサイトの腫瘍を発症する。Ｕｈｒｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１０（１１）：１２５７−６０は、レトロウイルスベクターによる体細胞へのＰＤＧＦ−Ｂの遺伝子導入を用いて、星状芽細胞腫を作製した。これらの実験において、複製可能なＭＭＬＶベクター系は、様々なＣＮＳ腫瘍形態の形成をもたらす。これらの実験において見られる最も頻度の高い組織像は、神経膠芽腫の特徴を有する高悪性度の神経膠腫である。組織特異的ＡＬＶベースのＲＣＡＳレトロウイルスベクターによる体細胞遺伝子導入も、マウスにおいて神経膠芽腫の形成を示す。これらの腫瘍は、活性化ＲａｓおよびＡｋｔをコードする遺伝子を、ＣＮＳ前駆体を発現するネスチンに組み合わせて遺伝子導入した後に生じる。この系において、ＲａｓもＡｋｔも単独では、これらの神経膠芽腫の形成にとって十分でない。ヒトＷＨＯグレードＩＩＩ星状細胞腫の特徴を有するトランスジェニックマウスモデルが、ｐＲｂならびに関連タンパク質ｐ１０７およびｐ１３０のアストロサイト特異的不活性化によって開発された（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これは、ＧＦＡＰプロモーターによって駆動される１コピーのＴ１２１遺伝子の発現によって達成された。Ｔ１２１は、ｐＲｂタンパク質を顕著に不活性化するがｐ５３の機能を干渉しない、ＳＶ４０  Ｔ抗原の１２１アミノ酸のＮ末端フラグメントである。１００パーセントのＴｇＧ（Ｚ）Ｔ１２１マウスが、約６月齢において高悪性度の星状細胞腫を発症する。ヒトの疾患に似た組織学的特徴としては、ニューロンおよび脈管構造への接着が挙げられる。
【０１６７】
処置されるべき状態の重症度および反応性に応じて、投与は、単回または複数回の投与であり得、一連の処置は、数日間から数週間、あるいは治癒するまでまたは疾患状態もしくは症状が低減するまで続く。
【０１６８】
投与される薬学的組成物の量は、当然のことながら、処置される被験体、苦痛の重症度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１６９】
また、適合性の薬学的担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物が調製され得、適切な容器に入れられ得、示される状態の処置についてラベルされ得る。
【０１７０】
本発明の組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含み得る、パックまたはディスペンサーデバイスに入った状態で、例えば、ＦＤＡによって承認されたキットとして、提供され得る。そのパックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔、例えば、ブリスター包装、または患者による個人の１日の注射のための予め充填された用量を含む自動注射器（ＰＥＮ）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与の指示書が添付されている場合がある。パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を規制している行政機関によって規定された形態で容器に貼付された通知にも適応している場合があり、その通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当該機関による承認を反映している。そのような通知は、例えば、処方薬に対して米国食品医薬品局が承認したラベルまたは承認された製品の挿入物であり得る。
【０１７１】
本作用物質は、悪性腫瘍の位置、細胞型およびグレードに基づいて選択される、脳腫瘍に対する他の処置様式とともに（補助療法として）提供され得ることが認識される。従来の治療としては、手術、放射線治療および化学療法が挙げられる。テモゾロミドは、血液脳関門を効率的に通過することができ、治療において使用されている化学療法薬である。高悪性度の再発神経膠芽腫の場合、最近の研究は、ベバシズマブなどの血管新生阻害薬を従来の化学療法と併用して活用したところ、有望な結果を得た。他の薬剤としては、テモダール、ニトロソ尿素、カルムスチンおよびシスプラチン、ならびに抗体ベースの薬物、例えば、セツキシマブが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
本発明の作用物質と同時投与され得る他の抗癌薬としては、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（Ａｃｏｄａｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；アクロニン（Ａｃｒｏｎｉｎｅ）；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（Ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド；塩酸ビサントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ジメシル酸ビスナフィド（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン（Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン（Ｃａｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキセート（Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（Ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール；ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン（Ｆｌｕｏｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸���リノテカン；酢酸ランレオチド（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ロメトレキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）ナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル（Ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（Ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）；メツレデパ；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペプロマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン（Ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；プリカマイシン；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン（Ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニムスチン（Ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール（Ｓａｆｉｎｇｏｌ）；塩酸サフィンゴール（Ｓａｆｉｎｇｏｌ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；セムスチン；シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルホス酸ナトリウム（Ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン（Ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン（Ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；タキソール；テコガランナトリウム（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ  Ｓｏｄｉｕｍ）；テガフール；塩酸テロキサントロン（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン（Ｔｉａｚｏｆｕｉｒｉｎ）；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；リン酸トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；塩酸ツブロゾール（Ｔｕｂｕｌｏｚ��ｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ウラシルマスタード；ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンロイロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ボロゾール（Ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられるがこれらに限定されない。さらなる抗悪性腫瘍剤としては、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のＣｈａｐｔｅｒ  ５２  Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  ＣａｌａｂｒｅｓｉおよびＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）およびそれに対する緒言１２０２〜１２６３に開示されているものが挙げられる。
【０１７３】
本明細書中で使用されるとき、用語「約」とは、±１０％のことを指す。
【０１７４】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する」およびそれらの複合物は、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する。
【０１７５】
用語「〜からなる」は、「〜を含み、それらに限定される」を意味する。
【０１７６】
用語「本質的に〜からなる」とは、さらなる成分、工程および／または部分が、特許請求される組成物、方法または構造の基本的な新規の特徴を実質的に変化させない場合に限り、その組成物、方法または構造が、そのさらなる成分、工程および／または部分を含むことがあることを意味する。
【０１７７】
本願全体にわたって、本発明の様々な実施形態は、範囲の形態で提示されることがある。範囲の形態での記載は、単に便宜のためおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内に存在し得る部分的な範囲ならびに個々の数値のすべてを明確に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的な範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を明確に開示しているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅を問わず適用される。
【０１７８】
本明細書中で使用されるとき、用語「方法」とは、所与のタスクを達成するための様式、手段、手法および手順のことを指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の分野の当業者に公知であるかまたは公知の様式、手段、手法および手順からそのような当業者によって容易に開発される様式、手段、手法および手順が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７９】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置する」には、ある状態の進行を抑止するか、実質的に阻害するか、遅延させるかもしくは逆転させること、ある状態の臨床的もしくは審美的な症状を実質的に回復させること、またはある状態の臨床的もしくは審美的な症状の出現を実質的に予防することが含まれる。
【０１８０】
本発明の態様に従って処置され得る被験体には、哺乳動物の被験体、例えば、ヒト被験体が含まれる。
【０１８１】
明確にするために別個の実施形態の文脈に記載されている本発明のある特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈に記載されている本発明の様々な特徴が、別々にもしくは任意の好適な部分的な組み合わせで、または本発明の記載された他の任意の実施形態において好適であるように、提供され得る。様々な実施形態の文脈に記載されているある特定の特徴は、その実施形態がそれらのエレメントなしで無効にならない限り、それらの実施形態の本質的な特徴であるとみなされるべきでない。
【０１８２】
本明細書の上記に示されるおよび下記の特許請求の範囲の項において特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験に基づく裏付けを見出す。
実施例
【０１８３】
ここから以下の実施例について言及する。以下の実施例は、上記の説明とともに、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で説明する。
【０１８４】
通常、本明細書中で使用される命名法および本発明において用いられる研究室の手順には、分子的手法、生化学的手法、微生物学的手法および組換えＤＮＡ法が含まれる。そのような手法は、文献において十分説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示されているような方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと。利用可能なイムノアッセイは、特許文献および科学文献に広く記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１���５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。これらのすべてが、本明細書中に完全に示されたかのように参照により援用される。他の一般的な参考文献がこの文書全体にわたって提供される。それらの中の手順は、当該分野で周知であると考えられ、読み手に対する便宜のために提供される。それらの中に含まれるすべての情報が、参照により本明細書中に援用される。
【０１８５】
一般的な材料および方法
還元条件および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度：ｒＧＯＴ１の純度の測定は、還元条件および非還元条件下における界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下でのプレキャストポリアクリルアミドゲルにおける垂直電気泳動によって行った。還元タンパク質および非還元タンパク質のサンプルを、ポリアクリルアミドゲルプレートにおいて分子サイズに従って分離した。
【０１８６】
ｒＧＯＴ１  ＤＳサンプルの電気泳動的分離のために、ＮｕＰＡＧＥＴＭ４〜１２％ビス−Ｔｒｉｓゲルを、還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ用の泳動緩衝液としてのＭＥＳ緩衝液および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のＭＯＰＳ緩衝液とともに使用した。サンプルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＬＤＳ  ＮｕＰＡＧＥＴＭサンプル緩衝液（４×）で希釈した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを０．５Ｍ  ＤＴＴによって還元した。元のサンプルおよび調製したローディングサンプルを静かに振盪し、続いて加熱した。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、異なるゲルにおいて互いとは別々に行った。
【０１８７】
電気泳動後、ゲルをＰａｇｅＢｌｕｅＴＭ染色試薬で染色し、バンドの移動度を測定した。
【０１８８】
タンパク質純度の測定のために、定量的画像解析用のＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアによって、各バンドの強度をすべてのバンドについて評価した。
【０１８９】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集物：ｒＧＯＴ１二量体型を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、構成要素の分子の異なる形状に基づいて、より高分子量の関連不純物およびモノマーから分離した。
【０１９０】
試験溶液のサンプルを、移動相である０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液の均一濃度流および２１４ｎｍでの検出を用いることによって、１０，０００〜５００，０００Ｄａの分子量間隔でグロブリンを分画するのに適した５μｍのサイズの親水化処理された（ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｉｓｅｄ）シリカゲル粒子で満たされた、長さ３００ｍｍかつ内径７．８ｍｍのステンレス鋼カラムにおいてクロマトグラフィー分析した。
【０１９１】
試験溶液中の凝集した形態のｒＧＯＴ１を測定する場合、二量体ピークより短い保持時間を有するすべてのピークの合計面積のパーセントを、すべてのピークの積分面積に対して評価した。
【０１９２】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度および関連タンパク質：疎水性特性が異なるｒＧＯＴ１関連タンパク質、すなわち、酸化／還元型および脱アミド化型のｒＧＯＴ１ならびに他の関連する未知の種に対するｒＧＯＴ１の純度を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定した。０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液の勾配および２１５ｎｍにおける検出を用いて、ポアサイズが３０ｎｍであるブチルシリカゲル（粒径５μｍ）が充填されたカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）において、試験溶液および標準液のサンプルをクロマトグラフィー分析した。試験溶液中のｒＧＯＴ１の純度および関連物質の量の測定のために、各成分のピーク面積のパーセントを、すべてのピークの積分面積に対して評価した。
【０１９３】
等電点電気泳動による不純物：等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、タンパク質をその等電点に従って分離する電気泳動の方法である。両性の電解質（両性電解質）の混合物を含むポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルのスラブゲルにおいて分離を行った。両性電解質は、電場に供されると、ゲル内を移動して、ｐＨ勾配を作り出す。いくつかの場合において、ゲルを調製する際にゲルネットワークの特定の領域に弱酸および弱塩基を組み込むことによって調製された、固定化されたｐＨ勾配を含むゲルを使用した。適用されたタンパク質が、その等電点（ｐＩ）と同じｐＨを有するゲル画分に達すると、その電荷が中和され、移動が止まる。
【０１９４】
サンプルを、定電力において少なくとも１．２５時間、標準的なｐＩマーカーの焦点が鮮明に合うまで、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＰｒｅｃａｓｔゲルにおいて泳動した。そのプレートをクマシーブリリアントブルー色素で染色した。
【０１９５】
ＵＶによるタンパク質含有量：製剤化された材料の光学濃度を２８０ｎｍにおいて測定するＵＶ分光測定法を用いて、タンパク質濃度を測定した。特定の吸光係数（１．４６１ｍｌｍｇ−１ｃｍ−１）をタンパク質濃度の計算のために使用した。
【０１９６】
ＬａｂｅｌｇｕａｒｄＴＭマイクロリッターセルを測定のために使用した。これは、タンパク質濃度測定のための革新的な光学経路である。このセルは、未希釈サンプルの０．７μｌから１０μｌまでの範囲のマイクロリットル未満のサンプル体積を用いたときに最適な測定結果が得られるようにデザインされている。
【０１９７】
Ｋａｒｍｅｎ法による酵素活性：ｒＧＯＴ１の酵素活性は、Ｋａｒｍｅｎ法（Ｋａｒｍｅｎ  Ａ，Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｆ，Ｌａ  Ｄｕｅ  ＪＳ．Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９５５；３４：１２６−３１．）の原理に基づき、このＫａｒｍｅｎ法は、指示反応としてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤ）を用いる共役酵素反応を組み込んでおり、ＮＡＤＨが２５℃においてＮＡＤ＋に酸化されるときの３４０ｎｍにおける吸光度の変化を連続的にモニターする。反応物のｐＨは、８．３である。
【０１９８】
酵素活性の１単位は、２５℃において１分あたり１μｍｏｌのオキサロ酢酸を生成した酵素の量として定義される。
【０１９９】
ペプチドマッピング：ｒＧＯＴ１サンプルを、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃによる消化のために調製した。タンパク質をアンフォールドするために、それを変性させ、ジスルフィド結合を切断し、次いで、アルキル化して、タンパク質のリフォールディングを回避した。消化の後、ポアサイズが１００Åであるオクタデシルシリカゲル（粒径５μｍ）が充填されたカラムにおいて、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液および０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル／水溶液からなる移動相による勾配溶出を用いるクロマトグラフィー分離を行った。ＵＶ検出を同時の２つの波長：２１５ｎｍおよび２８０ｎｍに設定した。
【０２００】
ペプチドピークの保持時間、ピークの数、ならびに全体的な溶出パターンの視覚的評価を行った。次に、サンプル中のペプチドと対照基準との数値的比較を、すべてのピークの積分面積に対する成分のピーク面積のパーセンテージとして、ならびにすべての積分ピーク高の合計に対する各ピーク高のパーセンテージとして評価した。
【０２０１】
フェニルヒドラジン法によるＰＬＰ：ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）は、ビタミンＢ６の活性型であり、コエンザイムとしてＧＯＴ１に存在する。ＰＬＰの測定方法は、ピリドキサールまたはピリドキサール５’−リン酸をフェニルヒドラジンで処理したときの鮮黄色ヒドラジンの形成に基づく（Ｗａｄａ  Ｈ  ａｎｄ  Ｓｎｅｌｌ  Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６１；２３６（７），２０８９−９５）。形成されたヒドラジンは、４１０ｎｍのＵＶ光を吸収する。ｒＧＯＴ１サンプル中のＰＬＰの量を測定するためには、０〜２５μＭのＰＬＰの範囲の検量線を得なければならない。したがって、ｒＧＯＴ１を検量線の吸光度の直線の範囲に希釈し、計算した。
【０２０２】
ＥＳＩ−ＭＳによる分子量：ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ２５カラムを用いてｒＧＯＴ１タンパク質サンプルを１０ｍＭ酢酸溶液で脱塩することによって、サンプルを調製した。ＭＳ解析のために、脱塩したサンプルを、４０％アセトニトリル、０．２５％ギ酸溶液中に製剤化することによって、５倍希釈した。
【０２０３】
Ａｐｏｌｌｏ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＥＳＩ）イオン源を備えたＭｉｃｒｏＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ質量分析計をこの解析のために使用した。物質の分子量を、デコンボリュートした質量スペクトルから算出した。タンパク質のＮ末端の均一性を、すべてのピーク強度に対する特定の成分のピーク強度のパーセンテージとして評価した。
【０２０４】
エドマン分解法によるタンパク質のＮ末端アミノ酸の決定：アミノ酸が１つずつ除去され、そのフェニルチオヒダントイン誘導体として特定されるような、フェニルイソチオシアネートとＮ末端残基の遊離アミノ基との反応に基づくペプチドの周期的分解。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸を、２７０ｎｍにおける検出のために逆相Ｃ−１８カラムに移す。１９種のＰＴＨ−アミノ酸の標準的な混合物（図５）も、その分離用カラムに注入した（通常、配列決定ランの第１のサイクルとして）。このクロマトグラムは、各エドマン分解サイクルのクロマトグラムとの比較のために、アミノ酸の標準的な保持時間を提供する。コンピュータデータ解析システムを用いてＨＰＬＣクロマトグラムを収集した。特定の残基番号に存在するアミノ酸を決定するために、目的の残基からのクロマトグラムを、それを他のものの上に重ね合わせることによって、前の残基からのクロマトグラムと比較した。これによって、特定の残基に対するアミノ酸を決定した。
【０２０５】
生合成：Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクターにおいて、空気および必要とされる溶存酸素飽和レベルを維持するための純酸素混合物を供給しながら生合成を行った。その生合成は、微量要素／炭素源の溶液を連続的に適応的に供給しながら、制御された温度およびｐＨにおいて行った。培養は、高密度処理を保証するのに十分な混合を提供しながら既知組成の培地中で行った。
【実施例１】
【０２０６】
ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１の発現（ＥＸＰＲＰＥＳＳＩＯＮ）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８／ＧＯＴ１（Δｈｉｓ）由来の構築物をＧＯＴ１遺伝子増幅のための主要な鋳型として使用した。開始メチオニンをコードする最初のＡＴＧコドンを除く完全な遺伝子（配列番号４）が増幅されるようにプライマーをデザインした。プライマー配列は、以下のとおりであった：順方向ＳＵＭＯ２：５’−ＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧ−３’配列番号６  逆方向ＳＵＭＯ２：３’−ＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧＡＴ−５’配列番号７。
【０２０７】
以下の条件下でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上記遺伝子を増幅した：９５℃５分；次いで、９５℃１分、５６℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル反復。最後に７２℃で１０分間保持。増幅された配列は、１２９３ｂｐ長（ＳＵＭＯ実体への融合のための制限エンドヌクレアーゼ標的を含むＧＯＴ１遺伝子をコードする）であり、アガロース電気泳動ゲルにおいてかなりの量で可視化された。次いで、そのＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ−ＳＵＭＯプラスミドにライゲートし、方向およびサイズについて陽性のクローンを、２回目のＰＣＲの鋳型として使用するために選択した。２回目のＰＣＲを、プライマー配列：ＳＵＭＯ−ＦＯＲ−ＮＣＯＩ：ＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡ−配列番号８およびＲＥＶ−ＧＯＴ１：ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＡ−配列番号９（５’→３’方向）を用いて行った。以下の条件下でＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２回目のＰＣＲを行った：９５℃５分；次いで、９５℃１分、５８℃８０秒、７２℃１分を３０サイクル反復。最後に７２℃で１０分間保持。得られたＰＣＲ産物は、１５４９ｂｐ長であり、ｐＥＴ２８プラスミドにクローニングするためのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を含んでいた。２回目のＰＣＲによって、ＳＵＭＯ実体がＧＯＴ１配列ならびに特定の制限酵素認識部位に付加された。
【０２０８】
そのようなＰＣＲ産物は、ｐＥＴ−ＳＵＭＯプラスミドに存在する親和性タグ（Ｈｉｓ、ＭＹＫＤなど）を全く含まず、ＧＯＴ１組換え配列に継ぎ目なく融合されたＳＵＭＯ実体を厳密にコードする。この産物を、適切に消化されたｐＥＴ２８ｂ＋プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、最初のクローン選択のために一過性のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。配列決定と制限エンドヌクレアーゼ消化の両方によって確認された正しい構造を有するクローンを、発現株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎから購入）に形質転換した。最終体積の１０％のグリセロールを含むリサーチセルバンクを、確認されたクローンから調製し、さらなるプロセス開発のために使用した。
【０２０９】
以下の組成（ｇ／Ｌ）を有する培地中でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８／ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１（△ｈｉｓ）株を培養した：
ａ）フラスコ内での接種材料の調製（培養）用（ｇ／Ｌ）：リン酸水素二ナトリウム（１７．０）、リン酸二水素カリウム（１．８２）、硫酸アンモニウム（３．０）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５）、Ｄ（＋）−グルコース一水和物（１５．０）および微量要素原液（０．１６ｍＬ）；
ｂ）発酵用（ｇ／Ｌ）：第二リン酸アンモニウム（４．０）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５）、リン酸二水素カリウム（１３．３）、クエン酸一水和物（１．６）、Ｄ（＋）−グルコース一水和物（３０．０）および微量要素原液ｅ）（０．２５ｍＬ）；
ｃ）供給液Ａ（ｇ／Ｌ）：Ｄ（＋）−グルコース一水和物（７００．０）、硫酸マグネシウム七水和物（２０．７）および微量要素原液ｅ）（２．２ｍＬ／Ｌ）；
ｄ）供給液Ｂ（ｇ／Ｌ）：第二リン酸アンモニウム（３６０．０）およびリン酸二水素カリウム（３０６．７）；および
ｅ）微量要素（微量元素）原液（ｇ／Ｌ）：塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（３０．０）、塩化カルシウム二水和物（４．０５）、硫酸亜鉛（ＩＩ）七水和物（６．７５）、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物（１．５）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（３．０）、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（１．１４）、モリブデン酸ナトリウム二水和物（０．３）およびホウ酸（０．６９）。
【０２１０】
図１は、ＳＵＭＯ−ＧＯＴ生合成プロセスの完全なスキームを示している。
【０２１１】
接種材料の調製：フラスコ内の５００ｍＬの滅菌された培養用培地［ａ）］を含むエルレンマイヤーフラスコに、０．２０ｍＬの保存培養物ＷＣＢ（ワーキングセルバンク）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８／ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１（Δｈｉｓ）を接種した。その後、そのフラスコを、３００ｒｐｍの撹拌速度、３０℃の温度で１８時間、回転振盪機においてインキュベートした。インキュベーション後の光学濃度は、４．５０ｏ．ｕ．（光学単位）［λ＝５９５ｎｍ］以上でなければならない。
【０２１２】
発酵：リサーチセルバンク由来の組換え生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１／ΔＨｉｓ／ｐＥＴ２８／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、０．５Ｌの増殖培地を含む１Ｌエルレンマイヤーフラスコ内で１７〜１９時間生育する。そのフラスコを、３０±２℃および３００±５０ｒｐｍの振盪速度で振盪機恒温器においてインキュベートした。その後、接種材料の光学濃度を６００ｎｍの波長で測定し、発酵槽（使用体積１２Ｌ（総体積１５Ｌ）のＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽）内でおよそ０．５Ａ．Ｕ．の細胞密度を得るために播種体積を再計算した。培養純度のためのサンプルを採取し、栄養培地上にプレーティングすることによって試験した。
【０２１３】
７．７Ｌの発酵培地を調製し、１５Ｌ発酵槽とともにオートクレーブした。発酵の前に、７００ｍＬのグルコースおよびホスフェート溶液を調製し、別々にオートクレーブし、発酵槽に無菌的に移した。生合成の前に、ｐＨ維持のための塩基溶液および泡制御のための消泡液も別々に調製し、発酵槽システムに接続した。生合成の前に、リン酸供給液およびグルコース供給液を調製し、オートクレーブした。生合成中にＳＵＭＯ−ＧＯＴ１細胞を誘導するためのＩＰＴＧ溶液を調製し、使用の直前に、滅菌された０．２μｍフィルターを用いて滅菌した。計算された体積の接種材料を播種する前に、ｐＨ、温度、撹拌および溶存酸素の制御を確立した。
【０２１４】
発酵パラメータの設定値は、以下であった：ジャケット付き発酵槽における制御された水流によって保証される３７℃（誘導時点まで）および２５℃（誘導時点後）の温度；アンモニア溶液で調整される６．８のｐＨ；空気および酸素ガス流で維持される２０％Ｏ２濃度。細胞の光学濃度が６５〜８５Ａ．Ｕ．に達するまで培養物を３７℃で生育し、その時点において、滅菌されたＩＰＴＧ溶液を加えた。誘導後、培養物を新しい温度で３．５時間生育した。グルコースの濃度（供給時点の１７．０ｇ／Ｌ濃度で維持される）を、細胞密度が２０Ａ．Ｕ．に達した後は３０分ごと、および細胞密度が６０〜７０Ａ．Ｕ．に達した後は１５分ごとに測定した。増殖培地中のグルコース濃度の測定値に従って炭素供給を行った。リン酸供給液の４つのアリコートを発酵中に加えた。第１のものは、細胞密度が６０〜７０Ａ．Ｕに達したとき加え、残りは、時間に従って、つまり誘導の１時間後、１．５時間後および２時間後に加えた。発酵後、バイオマスを回収し、遠心分離を行った。発酵の直後に、サンプルを栄養培地にプレーティングすることによって、培養物の純度の試験を行った。
【０２１５】
発酵槽からのバイオマスを遠心分離用ボトルに移し、１２２２７×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。次いで、そのバイオマスを遠心機用ボウル（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｂｏｗｌｓ）から取り出し、さらなる貯蔵のためにプラスチックバッグに移した。そのバッグを−３３℃の冷蔵庫に置いた。
【０２１６】
サンプルを凍結貯蔵の１２時間後より後に採取し、タンパク質の総濃度について試験し（Ｌｏｗｒｙ法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、ＳＵＭＯ−ＧＯＴ１の量についてゲルスキャンした（図３）。
【実施例２】
【０２１７】
主な精製プロセスの説明
バイオマスの凍結片（１５７０〜１８３０ｇ）をバッグから取り出した。緩衝液Ｗ−Ａ０２が入った容器内で３ｍＬ／グラムの細胞ペーストで４〜８℃の温度において細胞を再構成した。高圧ホモジナイザーを９００ｂａｒの圧力で３サイクル使用して、細胞を破壊した。懸濁液を遠心分離し、沈殿物を廃棄し、タンパク質溶液を次の工程に使用した。懸濁液をウォーターバス内で撹拌しながら加熱し、温度が５０℃に達したら、アルファ−ケトグルタレートおよびピリドキサール５−リン酸水和物を、１０ｍＭ（アルファ−ケトグルタレート）および２０μＭ（ピリドキサール５−リン酸）の最終濃度まで加えた。温度を６５〜７０℃に上昇させ、溶液を１０±１分間インキュベートした。２〜１０℃に冷却した後、変性した材料を遠心分離によって除去した。上清をデカントして回収した。加熱処理後のタンパク質溶液に１ｍＭのＤＴＴを加えた。１００，０００ＵのＳＵＭＯプロテアーゼを加え、切断のために温度を４〜１０℃で１０〜２４時間維持した。脱ＳＵＭＯ化の後、そのタンパク質溶液に固体硫酸アンモニウムを３００ｇ／Ｌの濃度まで加えた。この溶液を室温において２０分間撹拌し、遠心分離した。ペレットを廃棄し、撹拌し続けながら、上清の流体にさらなる量の硫酸アンモニウム（１３０ｇ／Ｌ）を加えた。４〜１０℃で２０分間貯蔵した後、最終的なペレットを遠心分離によって回収し、２０ｍｌ／ｇのペレットになるようにＰＢＳ緩衝液に溶解した。
【実施例３】
【０２１８】
精製プロセスの説明
３つのクロマトグラフィー工程を用いて、ｒＧＯＴ１中間体材料を精製した：ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌ樹脂（ベッド高１５．３〜１５．８ｃｍ）の媒体を使用する混合モード相互作用、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ベッド高９．４〜９．９ｃｍ）およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ベッド高９．２〜１０．２ｃｍ）を使用するイオン交換クロマトグラフィー。
【０２１９】
混合モード−ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌ：ペレットを溶解した後、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌクロマトグラフィーを行った。タンパク質溶液のｐＨを７．３０〜７．５０に調整し、充填し、次いで、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．９５〜４．０５）で容器に直接溶出した。８０ｍＡＵ（上）〜４５ｍＡＵ（下）の光学濃度を有する画分を回収した（図５）。
【０２２０】
陽イオン交換クロマトグラフィーＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：混合モードクロマトグラフィーの後に溶出したタンパク質を充填し、次いで、ｐＨを上げながら（Ｗ−Ｅ０２）清潔な容器に溶出した。８０ｍＡＵ（上）から３５ｍＡＵ（下）までのタンパク質画分を回収し、ｐＨを５．９０〜６．１０に調整し、伝導率を２．０〜２．２ｍＳ／ｃｍに調整した（図６）。
【０２２１】
陰イオンクロマトグラフィーＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：伝導率が＜２ｍＳ／ｃｍになるまでタンパク質画分を希釈し、ｐＨをｐＨ６．００に調整し、カラムに充填した。フロースルー中の３５ｍＡＵ（上）から３０ｍＡＵ（下；図７）までのタンパク質画分を回収した。
【実施例４】
【０２２２】
製剤化
陰イオン交換クロマトグラフィーからのタンパク質溶液を、３０ｋＤａ膜を用いて１５〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０への緩衝液交換のために１００膜分離体積を使用した。最終的なタンパク質濃度は、１０±２ｍｇ／ｍｌであった。膜透過圧は、０．３〜０．６であった。純度は、＞９９％であると見出され、製剤化されたＧＯＴを、還元条件と非還元条件の両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図９）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（図１０）によって解析した。ＲＰ−ＨＰＬＣ解析の結果を本明細書の下記の表１に要約する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０２２３】
本発明をその特定の実施形態とともに説明してきたが、多くの代替物、改変およびバリエーションが当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の請求項の精神およびその広範な範囲に入るそのような代替物、改変およびバリエーションのすべてが包含されると意図されている。
【０２２４】
本明細書中で言及された刊行物、特許および特許出願のすべてが、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確にかつ個々に参照により本明細書中に援用されると示されたのと同一程度に、それらの全体が本明細書に参照により援用される。さらに、本願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明に対する従来技術として利用可能であると自認するものとして解釈されるものではない。セクションの見出しが使用される限りにおいて、それらは、必ずしも限定と解釈されるべきでない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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