(57)【要約】  本発明は、デルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ、家禽のワクモ）から誘導される特異的抗原を用いて、前記による感染若しくは蔓延の傾向があるか又は感受性を有する鳥類の種で免疫応答を引き起こすことができるという発見に基づく。惹起された免疫応答は防御性であり、鳥類宿主におけるD.ガリナエの感染/蔓延を予防するか又はその除去若しくは根絶を促進できる。さらにまた、D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する顕著な健康上の問題が存在する場合、本発明を用いて鳥類宿主でD.ガリナエ感染/蔓延集団を減少させることができるだけでなく、D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する多数の二次的疾患及び/又は症状に間接的に対処する手段としてもまた本発明を用いることができる。【選択図】図１
2018512152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の種で免疫応答の惹起に使用する、1つ以上のデルマニスス・ガリナエ（Dermanyssus gallinae）（D.ガリナエ）抗原であって、前記1つ以上のD.ガリナエ抗原が、
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体
から成る群から選択される、前記抗原。
【請求項２】
免疫応答が防御性応答である、請求項1に記載の使用のための、請求項1に記載の1つ以上のD.ガリナエ抗原。
【請求項３】
鳥類の種が、家畜化又は狩猟鳥種、ニワトリ、キジ、ライチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びアヒル種から成る群から選択される、請求項1に記載の使用のための、請求項1に記載の1つ以上のD.ガリナエ抗原。
【請求項４】
鳥類の種がガルス・ガルス・ドメスチクス（Gallus gallus domesticus）である、請求項1に記載の使用のための、請求項1に記載の1つ以上のD.ガリナエ抗原。
【請求項５】
鳥類の種で免疫応答の惹起に使用する、下記から成る群から選択される1つ以上のデルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）抗原を含む、組成物、免疫原性組成物又はワクチン：
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体。
【請求項６】
動物で免疫応答の惹起に使用する、デルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）のセルピン（Deg-SRP-1）又はその免疫原性フラグメントを含む、組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項７】
デルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）の（i）セルピン（Deg-SRP-1）若しくはその免疫原性フラグメント；（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）若しくはその免疫原性フラグメント；（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）若しくはその免疫原性フラグメント；及び
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）若しくはその免疫原性フラグメントを含む、鳥類の種で免疫応答の惹起に使用する、組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項８】
組成物、免疫原性組成物又はワクチンがさらに、（i）アジュバント、（ii）別のポリペプチド、及び（iii）希釈剤及び/又は賦形剤から成る群から選択される1つ以上の追加の成分を含む、請求項5、6又は7に記載の使用のための、請求項5、6又は7に記載の組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項９】
（i）セルピン（Deg-SRP-1）が、少なくとも部分的に配列番号:1によってコードされるか、及び/又は配列番号:2を含み；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）が、少なくとも部分的に配列番号:3によってコードされるか、及び/又は配列番号:4を含み；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）が、少なくとも部分的に配列番号:5によってコードされるか、及び/又は配列番号:6を含み；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）が、少なくとも部分的に配列番号:7によってコードされるか、及び/又は配列番号:8を含み；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）が、少なくとも部分的に配列番号:9によってコードされるか、及び/又は配列番号:10を含み；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2が、少なくとも部分的に配列番号:11/12によってコードされるか、及び/又は配列番号:13/14を含み；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）が、少なくとも部分的に配列番号:15によってコードされるか、及び/又は配列番号:16を含み；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）が、少なくとも部分的に配列番号:17によってコードされるか、及び/又は配列番号:18を含み；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）が、少なくとも部分的に配列番号:19によってコードされるか、及び/又は配列番号:20を含み；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）が、少なくとも部分的に配列番号:21によってコードされるか、及び/又は配列番号:22を含む、請求項1から8のいずれかに記載の使用のための抗原、組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項１０】
組成物、免疫原性組成物又はワクチンが、鳥類の種でD.ガリナエの感染/蔓延の定着を防ぐために予防的に投与することが意図される、請求項1から9のいずれかに記載の使用のための、請求項1から9のいずれかに記載の組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項１１】
1つ以上のD.ガリナエ抗原又は前記と結合できる抗体の存在についてサンプルをプローブする方法であって、前記方法が、
サンプルと
（a）下記（i）−（xi）から成る群から選択される1つ以上のD.ガリナエ抗原：
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体、又は
（b）上記（a）（i）−（a）（xi）のD.ガリナエ抗原の1つ以上と結合することができる1つ以上の抗体
とを接触させる工程を含み、
前記サンプル及び抗体/抗原を一切の抗体及び/又は抗原間の結合を許容する条件下で接触させる、前記方法。
【請求項１２】
サンプルを固定された1つの抗体/複数の抗体及び/又は複数の抗原と接触させる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
1つ以上のD.ガリナエ抗原又は前記と結合することができる1つの抗体の存在が、抗体抗原複合物の検出によって確認される、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
下記から成る群から選択される配列をコードする単離又は組換え核酸：
（a）配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19又は21のいずれか1つ；
（b）（a）のいずれかの配列と少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%相同又は同一である配列；及び
（c）免疫原性抗原をコードする（a）のいずれかの配列のフラグメントと少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%相同又は同一である配列。
【請求項１５】
鳥類で免疫応答の惹起に使用する、請求項14に記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１６】
鳥類の種で免疫応答を惹起する方法であって、前記方法が、下記（i）−（xi）から成る群から選択される1つ以上のデルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）抗原を前記鳥類の種に投与する工程を含む、前記方法：
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体。
【請求項１７】
組成物、免疫原性組成物又はワクチンが多価ワクチン内に含まれる、請求項1から10のいずれか1項に記載の使用のための、請求項1から10のいずれか1項に記載の組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項１８】
多価ワクチンが他の鳥類の疾患に対する抗原及び/又は表1に列挙するワクチンを含む、請求項17に記載の使用のための、請求項17に記載の組成物、免疫原性組成物又はワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生生物に対して宿主の免疫応答を引き起こすことができる抗原に関する。特に、本発明は、鳥類宿主の寄生生物感染例の防御及び/又は減少に使用されるワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
産卵鶏飼育場の家禽のワクモ（デルマニスス・ガリナエ・ドギア（Dermanyssus gallinae De Geer））の蔓延は、EUの家禽産業に概算で年間130,000,000ユーロの損害をもたらし（約0.43ユーロ/鶏）、生産設備におけるこの害虫の蔓延は動物の安寧に重要な意味を有する[1,2]。家禽のワクモの蔓延は、貧血、苛立ち及び情動不安の増加、羽つつき及びカニバリズムの発生増加の結果として産卵鶏にとって主要な健康福祉問題である[1]。家禽のダニはまた多数の重要な疾患の中間宿主として関係を有する[3]。ダニ集団の制御は、採卵産業にとって目下のところ主要な問題であり、ほとんどの殺ダニ剤はダニ集団の限定的であるか又は長続きしない減少しかもたらさない。さらにまた、以前に有効であった殺ダニ剤に対する耐性の出現とともに、従来の有効な殺ダニ剤（例えば有機リン系フェニトロチオン）の撤去はダニ制御に関するこれらの問題を悪化させている[例えば4を参照されたい]。UK家禽ユニットの2004年調査では、応答した農場の87.5%がD.ガリナエの蔓延を報告した[5]。加えて、通常ケージを“改善”（enriched）ケージ（巣作りエリア、止まり木及びリッター/スクラッチパッドを含む）に交換することを要請するEU法令は、当該寄生生物により多くの退避地をケージ内に提供することによってダニ問題を悪化させているかもしれない。また別の制御戦略として、ワクチン接種は、長期有効性、化学残留物/環境汚染からの解放、及び耐性リスクの減少を含む利点を提供する。吸血性外部寄生生物に対するワクチンは、有効で持続性のある制御をもたらし得ることが今や認識されている[6,7]。前記には、防御性Bm86免疫原を用いて開発された効果的な市販チックワクチンが含まれる[6]。重要なことに、他の研究グループが発表した研究[10,11]と併せて我々の以前の研究[8,9]は、家禽のワクモに対する（自然のままの抗原及び組換え抗原を用いる）ワクチン接種は実現及び提出可能な目標であるということをはっきりと定着させた。本明細書に記載する研究は、免疫した鳥で防御を誘発することが明らかにされたダニ抽出物に存在しかつ免疫原性を有するダニ分子のスクリーニングを介して、家禽のワクモに対するワクチン候補物質を発見するために免疫学、プロテオミクス及びゲノミクスを結合させたアプローチの使用を初めて明らかにする。
【０００３】
これまでのところ、D.ガリナエについては、候補抗原は、ダニの自然のままのタンパク質抽出物の分画し前記をワクチンとして用いる“実際的”アプローチ[9]、又は他の外部寄生生物種の防御抗原に関する仮定的オルソロジーに基づいて適切なD.ガリナエ抗原を選別する“合理的タイプ”のアプローチ[8]により同定された。“合理的”アプローチによる潜在的なワクチン候補物質の同定は、外部寄生生物分野では数年にわたって支持されてきたが、実際に有用であるためには以下の2つの警告にしたがう：i）どの分子が外部寄生生物の生存に真に必須であるかを理解し；さらにii）これらの分子が宿主の免疫系にアクセスできることを明示する必要がある[6]。第三のアプローチ、交差防御を解明するために他の外部寄生生物種の防御抗原の利用もまた行われてきた[10]。しかしながら、雌鶏を検証済みの防御性チック抗原（Bm86）を用いて免疫したとき、高い抗体力価が達成されたがD.ガリナエに対する有効な防御は観察されなかった[10]。このことは、相対的にほとんど研究が為されていないD.ガリナエに他の外部寄生生物から単純にワクチン標的を推定することのリスクを示している。
しかしながら、この分野における多くの研究にもかかわらず、D.ガリナエに対する適切なワクチンは未だに同定されていない。さらにまた、特異的な又は単一の抗原候補物質を含む、費用効率が高く激しい防御免疫を提供するワクチンは存在しない。
本発明は従来技術に付随するこれら問題の除去を探求する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、デルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ、家禽のワクモ）から誘導される特異的抗原を用いて、前記による感染若しくは蔓延の傾向があるか又は感受性を有する鳥類の種で免疫応答を引き起こすことができるという発見に基づく。さらにまた、本発明者らは、惹起された免疫応答は防御性であり、鳥類宿主におけるD.ガリナエの感染/蔓延を予防するか又はその除去若しくは根絶を促進できることを見出した。さらにまた、D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する顕著な健康上の問題が存在する場合、本発明を用いて鳥類宿主でD.ガリナエ感染/蔓延集団を減少させることができるだけでなく、D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する多数の二次的疾患及び/又は症状に間接的に対処する手段としてもまた本発明を用いることができる。
本明細書を通して、“comprising（含む）”という用語は、本発明の実施例が表示の要点を含み（“comprise”）、したがって他の要点もまた包含し得ることを指すために用いられることは留意されるべきである。しかしながら、本発明の関係では、“comprising（含む）”という用語は、本発明が該当する特色物から“本質的に成る（consist essentially of）”か、又は該当する特色物から“成る（consist of）”実施例もまた包含され得る。
【０００５】
本発明は、（i）−（xi）として下記に列挙したD.ガリナエ抗原の1つ以上に関する：
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体。
【０００６】
例示的なDeg-SRP-1抗原は、少なくとも部分的に下記の配列（配列番号:1）によってコードされる。
Deg-SRP-1：配列番号:1
ATGGCCGACCAAGACTTAAAGGTGGCTTCGCCCAACGAGAAACCGGGCGGAAAGTATGCCCTTGGGATGAGCTTTCTACAAAAGTTGTGCCGGGATCCGGGGGAGAACTTTGCTTTCTCACCGCTCAGCCTTGGGATCGCGTTCTCGATGCTAGTGGCCGGAGTCAAAGGTGACACGAAGAAGCAACTTCTCGATCTGCTTGGCTTTGCTAACGAGGCAGATCTTCACGCAATGTACGCCGAGCTCATGAAAGACAAGGAACTGCCCATTAAAATTGCTAATAAATACGTGGTCCAGAACAAACTCAAAATTCAGAAGAATTTTGAAACGCTCGCTAAGGAAAAATACCAGTCAGAGGTTGAGTCGGTCGACTTCGTTAAGGATGGTCGAAAACTCGAGGCTTCGGTCAATGCGTGGGTGGCATCAAAAACAAACGACATGATAAAACAGCTTATCCAGCCTGGAACTTTTACAGCGGACACCATTCTTGTGTTACTTAACGCAGTCTACTTTAAAGGTACGTGGGTGAACGAGTTCGATCCTGTTCCGTATGAGATGGACTTCAAATTACGAAACGGCTCTACTGTAAAGAAGAACTTCATGACTCAAAAGTCATCCGACTTTAAATACTTAGAAACGGACAAACTTAAAATGGTTAAGATTCCGTACAAGGAGGCAGGATGCTACATGGTTGTCGCTCTTCCTAAGGATGATGGTAAACACATTGATGAAGTTCTGGTAACGATGACTGCCGCCGAGATGCACTCCGCTGTGGAGAAGCTAAACGCAACACGTAGCCCGCAGGTGCTGTTGACGATGCCGAAGTTCAAGATTGATTACAAATATGGCAACCTCGTCGAACACATGAAGGCTCTAAGTGTGACCAAGATTTTCGCAGGGGGCGACTTTGGCGACCTCTTTGAGGAGATGGGCGATGCCGTGGAAGTCTCCTCCGTGGTTCATAAAACTGTAGTTGAAGTGGATGAAAAAGGCACCAAAGCAGCGGCTGCTACTGCTATGGTGGTGTCGCTTCGTTGTTCAAGAGGAGCCGTGGAAGAACCTATTCAGCTGATTCTAAATCGAGCTTTTTTCTTTTCCATTTATATTGGCGAACATCATATTTCCGCCTTCAAGGGATTGTGTTTCAGTCCTTAAC
【０００７】
例示的なDeg-SRP-1抗原は下記のアミノ酸配列（配列番号:2）を含むことができる。
Deg-SRP-1：配列番号:2
MADQDLKVASPNEKPGGKYALGMSFLQKLCRDPGENFAFSPLSLGIAFSMLVAGVKGDTKKQLLDLLGFANEADLHAMYAELMKDKELPIKIANKYVVQNKLKIQKNFETLAKEKYQSEVESVDFVKDGRKLEASVNAWVASKTNDMIKQLIQPGTFTADTILVLLNAVYFKGTWVNEFDPVPYEMDFKLRNGSTVKKNFMTQKSSDFKYLETDKLKMVKIPYKEAGCYMVVALPKDDGKHIDEVLVTMTAAEMHSAVEKLNATRSPQVLLTMPKFKIDYKYGNLVEHMKALSVTKIFAGGDFGDLFEEMGDAVEVSSVVHKTVVEVDEKGTKAAAATAMVVSLRCSRGAVEEPIQLILNRAFFFSIYIGEHHISAFKGLCFSP
【０００８】
例示的なDeg-HGP-1抗原は、少なくとも部分的に下記の配列（配列番号:3）によってコードされる。
Deg-HGP-1（シグナルペプチドは除く）：配列番号:3
CATACGCAGAAGCCCGGCATGGCCTTcCGTTCGAATGTGCGAGTaCAGCGCATTGTCGACAACACCTACGGCCTGAAGATCGAAGATTTTGAAGTGGCGACGGCCAAcGaACGCGAAACCGACTGGAGCGAGACGGaAAAGATGGCCTTCgtCAAAAACGAACGCCtgaGTTCCATGGTCGAAAGGCCGTTTTTGGTTCACCTTGAGCGTACTGAAAACCTTTCTACCTATGAGTTCAAGTCGCTCGAGACGCACAGCGATGATCCGGTGTGGTCgaCGAACATCAAGAAGGGCCTTGTGTCGCTGATCACGCTGCACGTGCCGTTCGACAACGaCGAACAGATCTACTCGAGCGTCGAGCCGACCGtttATGGCAAGTGCAACGTCCACTGGCACAGGCAGAGcAAGCCGCACTGGACGCGGCCCGACTCGaAGGTGTTGaACATCAGCCGAGCCATAGATCACGAAAACTGCGAGACCGTTGCGAACAGGGTCTACGGATCGGTTATgGGcACCCCtTGTATGGATGGCAGCTGTCAGCGACAtcACACGTACCCGGTGTCGACGAGTTCACaAGCAAAGTACTCGCtTGTGGCCGCATCTGGGGACACCAATAATTGGATTCTGGAAACCGCCCGAGACAACTcCGTCTTCACGCACGCGcCCCATACCGAAAATGGCAATGTGCTTAAACTTAAGACAGCGCAACgGaTGCGTCTTAtTGACACCGTGGACGCGACTGAGAAGCTCGAGATCGTCGGCGAAACGCAAGTTGATGATCAGCTTATGATGCACTTCACaAAGAgGTGGAGGCTTGAGCGATCCGTCGACCTCGACAAgGcCGATGACtTTGTcCTCGACTGGGACATCAgGGGCTGCAGCAACgGGACCATCGcCCTGCTACAGAAGCTTCGAAGTCTTCGCAATGCCGACGAcaaTCAGCTGGGCATGTTCGACaACaACGTCGCCGAGACGTTCAGCGCCGCTATcGAGATGATGTACTTGCTTGATCGCGAACaACtTGCGGTAGTCTATGACCGTATCGTCAAGGCgGCTcCCGAGGCgGAGCTCGAGCAGGCACAGCGGCtTTTTGtCGAGGTGGCCTCGGCTGCAGGCAGTACAACCGCCATGAAGTTCGTCATGGACAAGTTCCAGGCTGGTGATATCAGTGTGCGTTTCATGCGGCCCTTCCtTTCgGGCATAACCCGAGGCTTGTTTGATCGCACCTCTGGAGCCCTGGAGATATTCGAGAACTTCTGCACGTCGGACCAAATGAAGGCCCTTcCAGAGGAGCGCCGACAATGTCTGCTTGCCTACACGGCGTTAGTGTACGACACGTACCGACTGGAACACTTCAATGTTCaAAAGCATGAGCGTAAGGACACGCgGGAGACGATCtTTaAAAGGATTGTCCCAGAGTACAGTGTGGCAGcCGAGGAAGGCCGCGAAGCTTTCAAGACGTACATGCTCATCGCGGGCAACTTGAAGACGGCGAGCTCTGTCGAGTTCCTTGCCCGGGCCGTTCTCGACGAGAAACTCGACCGCCTCACGGCCATGGATGCGATGCGAACGCTCATCATGACAGCCGACAACTCAGAGGTCGCAAGGAAGGCCGCTCTCACAGTGTATGCAGATAGCTCCAAGCCAGCTGAGCTTCGAATGCTCGCGGCTATTGTCATCATGAGGTCAAACCCGCCATTAAGCGTCTTCTAtTCAATGGCCGATCGGCTGTTGCATGAGAAGAGCGACCAGGTTCGGTCGTATGTGGTGTCTATGtTCAAAGAGCTCAGTCAAACCACACACCCCTTCTTCAGACACTTAGCCAACAAGGCACATTATGTCGCCCCGAAGCTTGAAGCCCGTCTCCCGTCCGAGTGGAAGAGAAAGGATTATCtcACTTCGCACACGAAGCTCGCCTCCGGATAccATCCCAAGTATGACCACGGTGGGCACAGCATTATCTCGATGATCATGTCGGATTCGTACGTGCCTCGTGActTGTACGTGAACTTCGGCGATTTCTTTGCGGGctTCTTCTTTGATAACTTCGGCAtGTCTATCAGTCAGCAGGGAATGGAGCGCCTcATCGACCAtTTCAACaAcCCCCGCACATTCGGTAACAAgTTTgGcCGCAATCTATGGAACATGGCTGGCAGACGTCGGCAGACGCGTGAcGCGGCCTCAGTCGAGCACGCTATGGACGAGATCGACTCGACGCTGAACATCCACACGAAGAAGTACGACCCGATGCGACTCGACATGACGTTCAGCGCCTTCGGCGAGAACATCCACACGGTCAGCCTGAACGaAAGCTTCTTCCTGCCACTGCTGTcGCCCGACTACAAACCAGGCACGCTCTTGAACaAAAtctTGTCCACaGAGAGAGACATGCACTCATTCAAGAACCTCCGCGACATGACTTTCATGATTCCAACGGCGATTGGTATGCCTGCCTGGTTCGATGTGCAACTGccCACAGTGCTCTCGTGTCGCCGaAAGGAGTCTTCGTTCGATTTTGGCAACGAAGGTGcCCTGAAACTAAAGCTCGACCAGCGCATTGTCATGGACGCGCAGCTCGAGGAGTCTCTTAGATTTGGCGTGCCTGGACTCCAAGTGTCCCTCGGCGTCGGCTTCAAGAGGCGTCTCGCGTTGAACCTGCCAATCAAATTGGATGTCGATGCgaACGTGGCAACGGGCAAGGTTGTTATGAACCAGGACTTTGTTCTTCCGCGCGACATCATGCGCTACAAGTTTGAACCATACACgaTTGAAGACAACTTCAAGGAGCCCGAGAAGACAACGTACTTGGctcTCTTCAAGGACGAGGAATTAGTAGAGTTCAAAAGTCAGccgcTTAAGGACCTCCTCGGAATCGACTTTTTCCTGGAAGGAAAACAGCTGcCCAAATCAGTACTCTcgtGGGACTTTAGCCAATGGCTTAAATCTGATaTTCGCCAAAAACTGTACTACGCGATTGTCAACCCCAAGTGGCGTCCGCGCAGTCTAAGCCTAAGTGCGGcCCCAGCCAAAGAACATCCCACAACAGGCCGTGTCCTGACATTTAAGCACAAAATGACCCCAcCTGAAGCAACCGAGCGGCCgGGATCGCGtTTCGAGGAAtTCGAGAAAGATCTGCCgGAGTCGTTTGTGCATGTCATCCAGGTCAGTAACGAGCTGACGAGCAGCAAGAAGCGACGCGCCGATCTAGAGGTTCGCTATTCGTACACACCAAATCGCGTCGAGCACTGGATTCAGCTGTTTTACGACCGGACCCCGCTTTCGAGCCAGGACACAGATCATACGAAGCtgtgCATGGTTGCCAAGGTCAAGCAGACAACGACCGACTGGGAGAAGCTCACCAAAGAGCAAGTAATGCACGTCAACGACGGACAGCGAATGGaCGTCCTGATGAACCTGCAGTACGGCAAgaGCTGCAAGACTGGCGATGAGCCTGATGCAAGTTcGTTGCaGATGCTTGCTCgtGCCACATACGAGCACAGCGATGAGCAAAAGCGGTGGCTCAGTGAGCTGACAACTGGCGAAACGAGGAGCAGAGTGCACGGCCTCGAAAATCCTTACATGAAGTTCTACACCAAGTGCATCAAGTACCTCGAGAAGGGCCTCTTGATGCCGTTCGCGTGCCACAAGTTCATCGTTCACACGAGTCAGCTGAACAACATGACGCTCGACGtcGAGGTGAACGATCGgGCACACGTGCTGACGAATCCGTGCATGTCGACCCTCCGCGCCTACCTCGCGGCTCAGTACGACGCGAACCTGCGAATGTTcGCTCCaCAGCGCAACGTGTCGAGGCCCGGCCATTGGCATATGAACTCGGTCGTGCgGGAgCCGTGTATCAACCAGCGTCTCGCAGACATCGCCATAGTCgGACCCTACCACAGCTCGTTCTGGGAGAGCGTGCCAGTTTCGTGGGGCGCTCACTGGGCGCCTAGGACCGCCACCCACCTCGGCTCGACCAACATGCAGAGCTACTCGCGCAAGTGGTTCCACCGTTACTGCGACATTCAGTTGAACTCAGTGGCCACGTTCGATAACGTCGTATACGAGCTACCGGAAACCAACTGCTGGAAGGTTCTAGCCAAAGACTGTTCAGAGATGAAGGTGTTTACGCTACTTGGCAGAGCGAACGCCGACAAGAAGAAGGAGATCAGGCTGCTCGTCGACAAGTACGAAGTTCACCTCAAAAACGTTGACGGCAAAATTGTTCTCACGCTGAACGGTGCCGAAGAAGTGCTGGCCGAACGTCAGCCCAAGCTTGTCAAGAA
CGAGAACGGCTTCGTGACGCTCGTCATCCTCAACAAGGGACACGGCCTTATGCAAATTGATGCGCCGATCTACGGCATCTATATGCTCGCCATGGACTCGGCGGCCTTCATcCAGGTGGCGCCCTACTATCgTgGCAAACTGTGCGGCCTTTGCGGCAACTTCAATCTGGACCGTCAGCACGAGTTCCACACGACCGACGGCTGTCACCACAGAACGCCCTGGTCATTCGCCAGGAATTTCGTGATTCCCAGCGATCAGTGCGCGCCCGTGCCCGAGGCCACTGATGCCGGCCAACCATACTGCAGACAAGCTTAG
【０００９】
例示的なDeg-HGP-1抗原は下記のアミノ酸配列（配列番号:4）を含むことができる。
Deg-HGP-1（シグナルペプチドは除く）：配列番号:4
HTQKPGMAFRSNVRVQRIVDNTYGLKIEDFEVATANERETDWSETEKMAFVKNERLSSMVERPFLVHLERTENLSTYEFKSLETHSDDPVWSTNIKKGLVSLITLHVPFDNDEQIYSSVEPTVYGKCNVHWHRQSKPHWTRPDSKVLNISRAIDHENCETVANRVYGSVMGTPCMDGSCQRHHTYPVSTSSQAKYSLVAASGDTNNWILETARDNSVFTHAPHTENGNVLKLKTAQRMRLIDTVDATEKLEIVGETQVDDQLMMHFTKRWRLERSVDLDKADDFVLDWDIRGCSNGTIALLQKLRSLRNADDNQLGMFDNNVAETFSAAIEMMYLLDREQLAVVYDRIVKAAPEAELEQAQRLFVEVASAAGSTTAMKFVMDKFQAGDISVRFMRPFLSGITRGLFDRTSGALEIFENFCTSDQMKALPEERRQCLLAYTALVYDTYRLEHFNVQKHERKDTRETIFKRIVPEYSVAAEEGREAFKTYMLIAGNLKTASSVEFLARAVLDEKLDRLTAMDAMRTLIMTADNSEVARKAALTVYADSSKPAELRMLAAIVIMRSNPPLSVFYSMADRLLHEKSDQVRSYVVSMFKELSQTTHPFFRHLANKAHYVAPKLEARLPSEWKRKDYLTSHTKLASGYHPKYDHGGHSIISMIMSDSYVPRDLYVNFGDFFAGFFFDNFGMSISQQGMERLIDHFNNPRTFGNKFGRNLWNMAGRRRQTRDAASVEHAMDEIDSTLNIHTKKYDPMRLDMTFSAFGENIHTVSLNESFFLPLLSPDYKPGTLLNKILSTERDMHSFKNLRDMTFMIPTAIGMPAWFDVQLPTVLSCRRKESSFDFGNEGALKLKLDQRIVMDAQLEESLRFGVPGLQVSLGVGFKRRLALNLPIKLDVDANVATGKVVMNQDFVLPRDIMRYKFEPYTIEDNFKEPEKTTYLALFKDEELVEFKSQPLKDLLGIDFFLEGKQLPKSVLSWDFSQWLKSDIRQKLYYAIVNPKWRPRSLSLSAAPAKEHPTTGRVLTFKHKMTPPEATERPGSRFEEFEKDLPESFVHVIQVSNELTSSKKRRADLEVRYSYTPNRVEHWIQLFYDRTPLSSQDTDHTKLCMVAKVKQTTTDWEKLTKEQVMHVNDGQRMDVLMNLQYGKSCKTGDEPDASSLQMLARATYEHSDEQKRWLSELTTGETRSRVHGLENPYMKFYTKCIKYLEKGLLMPFACHKFIVHTSQLNNMTLDVEVNDRAHVLTNPCMSTLRAYLAAQYDANLRMFAPQRNVSRPGHWHMNSVVREPCINQRLADIAIVGPYHSSFWESVPVSWGAHWAPRTATHLGSTNMQSYSRKWFHRYCDIQLNSVATFDNVVYELPETNCWKVLAKDCSEMKVFTLLGRANADKKKEIRLLVDKYEVHLKNVDGKIVLTLNGAEEVLAERQPKLVKNENGFVTLVILNKGHGLMQIDAPIYGIYMLAMDSAAFIQVAPYYRGKLCGLCGNFNLDRQHEFHTTDGCHHRTPWSFARNFVIPSDQCAPVPEATDAGQPYCRQA
【００１０】
例示的なDeg-VIT-1抗原は、少なくとも部分的に下記の配列（配列番号:5）によってコードされる。
Deg-VIT-1（シグナルペプチドは除く）：配列番号:5
AGCGCCGAAGTGTTCCACTTTGTGGGTCAACATGGCCAGGGTTCAACCGTTTACGGTGTCCGTGGCGCAGTGACTGTCGGCGCTCACCAGCTGACAGCTGAGAAGACTGCCCTCGAGTACAATGGCACGTTGGCCGTTGAGCAGATCCGTGAGGGCGAGTTTCTCACTAAATTCACTCACTTCACCGTTGGCAAGTACAACAAGCTCCAGAGGAGCGTCCAAGATGAGACTTTTGATGACCTCACGCCCGAAGAACAGCGCGTGGTCAAGACGCTCCGTGAGCCGGCTGTTTATGAACCTCATATGCAGAGACCCGTCAGGTTCTTTGTGAAGGAGGGCCAGATTGTGCGCATGGAGGCTGAAAAGGAGCACCCGCAGTGGTCCCTTAACATCTTCCGTAGCGTGCTCACCCTTTTCCAGAGCCAAGTTAGCAAACCCGCTACACTTGCTGTGCCCCATGTCGAGTACAAATATGAGGATGGCATCACTGGCAACTGCAAGGTCCAATACGAGGTCTTCTCTCTGCCCGAGGACGTGACCGTACAGGGCGTGTTCAACCTGACTAAGACCAAGAACTACAAGGACTGTCTCGGCCGCCCTGTCTACCTTCATCTTAAGGATACTCAGCGTGGCTGCGCTGGAGTATGCGACAACCACCGCCCCGAGAACTTCCTTGCCGGATATGAAGAGGAAATCACCGACTACGAGCTGAAGCCCACACCTGGCTGCCCGGTCAACCAGCAACGCAAGGATACCCTCGTAACTGTCCAAACTGTTACTAAGTACAATGTCTCCAACGGTTACCTCGATGAAGTTCGTTCGGAGCATACTGACATCTACCGTCTCTATGGTGGAAAGCTCCACGTTTTCACTACTCTTCAGCTGCGTCTTTATGGCGTTGCTGGCCCTAAAATCGAAGAGCCAAAGACCGTCGAAATTTACAAGACACTTCAACTGCGTCTCCCGCACGAGGAAGATGAGCTTGACATTCCCGTCTATGCTCTTCTGAGGGAACACACTACGCAGCAGCAATACGGTCAGCACTTCCAAAAGTACTTTGAGGCTGTTGTTCAGGAGCTTCTTCAACTTAAGGATACCCAGAAGCAGGGCCAACCCGAAAAGCAACACTACCACTCTACCGCCTATCTTGTCGAGCTGGTGCAAGCTGTCTCCTCTATGACTGAGAAGGAGCTTAAGAGTATCATACCGACCATTGTTCACCAAGCTCAGCCTAAGCAGCTCACTGAGGAGGAGCACGTCCGCCGCCAGCTCTGGGTTGAACTCTTGGGTAAAGCCGGTTCTAAGTCTGCTGTCAAGATCATTGTTGAGCTCGTCAAGGGCAAGCTTCTTACCCCCACCGAAATTCGTCGTGTTCTTCAGGATGTTGCCGCCTTCCAGTCCTATCCTGACACTGAAATGGTTGAGCAAATTCTTGCTCTTTGTGTTAAGGAGCAGGGTCTTACCGCCACCGGTAAAGCTACAGCTTGTGTCGCTGCCGGTAAGGTTCTTTCCAAAGCCTGCAACTCAAAGGTTTACCAGTTGGCTCAGAAGCACGAGCAACACAAGAAGACAATCAACGGCAAGTACCAATCTATTGTTCAGATGCAAGAACAGAAGTACACCCCCGAGACCGAACCTGAGGCTGAGGAGTACCGTGTGACTTTTGGCCACTTGCCTGTAGACCCTAAATTGGTCTGTACACCTGAAAAGCTCCAGAAATACGTTtCTGACCTTtCGCACGCTCTtCACCAaGCtACCGACTTCAAGCATGTCGTGGCCTacaTCAaTGGTTTGGCTCATGTTCAGAAGCCCGAGGTTCTTCCTGAGCTGCTGGGTTACGTAAACGGCACTGCTTCCAACTTGGTACATATCCATGAGCAAGGTGAGGATATCAAGGAGGCCGTTGAGTTTGCGCGACACGTCGCTATTGTATCCCTCCAACATGTTGCCGTCAAGTACCCGAAAGAGGTTAACCCGATTGTACGCGTTGTCTTCGAAAATACAACTGAGAAGGTTCAGACCCGTATTTTGGCCTTCGACGTCTGGATGGACACTCAGCCCGCCCAGTGGGAGGTCGAGAAAGTAATGCAAATTGCCAATAAGGATTCCTCGCTTGAGTTGACGCACTACGTCTACACTGCTCTCAAGACCGCCATGAAGGCTGAGGAGCCTTGCTACCAATTGCTGGCTCAACGTGTCCGCGCCGCCTGGACCCAGCTCCGTCCCTTCGACCTTGGCTCCGAATTCTCTCACCTCCGCTCCAAATTCTACTATGACACTGTTGAGAACTACGGTATTCGCGGAGTTTGGAAAGTGATTGCCTCCAACACCACCATTCTGCCCTTCTATACCGAAGCTAAGGTTAACCAGGTCCGCGGCCCTTACAAGACGACTCTTTTCGGCGCTAAGTTGCTCGTGAAGGGTGGTGACAAGGTTTTGGAAGAGCTGGTTGGTAAGGATGGTCTCCTTGAGCGCATTGCTTACGCCCTTGTCGGTCAGATCAAGACGGGACCGCGCCAACAGAACACTGAGCAGCTCCTTAAGGATATCGCCCAGGGTATGGGTCTGAAACGCGAGAAGGACGAAACCCCCAAGGCTGTGCTCTTCTGGAAGCTTTTCTCTGGAGACGCTGTTATCCCTCTGGACTCCCACTACATCAATGAACTGAAGCAAGAGCTGCTTCAGACCGTAACGAAATTCGGCAAAGATGGAGTTACTGGCCACATCGTCCGGGTGCTTGTGCCCACCAAGGCTTTCCACGTCGAGCCCTCTACCATCGGTCTTCCGATTGTCCACTCGACGATCCACCCTGTCGTTCTCTCTGTTCGCTACGAAAACATCAAGATTCACTACGGTAACCAGGAAAGTCGTGTGGCCCCTAAGACGTTGGAGATCTCTGGTACTGTTCAACCTACCATTCTCTCCTTCCGCCAATCTCGTGTCTTTGTTTCTGACAAAGTAGGCCAGAAAAACCCCACCGTAAAGACCACTGATATCAAGGAGTTCAACGTGCGCCTCGCCTTCCGTGTAGTCTATGAGCACACTCCCAAGCGGTTCCGTGTTCACGTAAAACCAGTCTTTGACCGCGTGTTCCACTCCGGCCACTGCACTGAGCTTAAACTCGAGTCCGCCGTTCTCCTTAAAGAGGAACTCGCTGCTAAGACTGTTGAGTATGATAAGTGTATCAAGTCTCTTTATCAACCCATCCGCCGTAACCACCAGATTGCCGGTGAATGGTCTGGAATGATGCTTCGCCTTACCGGCGAGTCTCACCAGCCTTGGTCTGGCCTTCCCATGTTTGCCCCAAGCGTTGTAAGCAGCGAAGGCATTCTCGGCGCCATTATTAACCGTCTTTCTAACAAGGGTATGAAGCACCACACTGTTTCACTCTACCTTGAGACCAACAACCAACAACCGATTACCGAATGGGTCGCCACTATTGACGTCGACTCTAACGTCGAGCGTCTCGCCAAGGTGCCTCTTAGCCAGCAGATTACGAAAGTTCAGAAACTCAAGGTGCAGTACGCAAACCGTGCTCAGCCTCTTTACCCCGAACTGGAGCCGCTTGTTCGCAAGGTTGAAAGCCTTCTTGAGAAATTCGAAACCCTCGATGAAACTACCGTAGAGAAACTGATGCTGGTAAAGATTGAAGGTCTTTATCAAGGTCAACCTAAAAGTACTCTTAAAATCGCAATGAAGAAAATCTATAACCTtGAGAAGACTgAGCAGCAATACGCtCTaGCCGCtATGCaTCAGGAATCTCACAAGGGTCTTGAACTCTCTACCAACGTCTCTTACCCCAAGATCGGATCCCCATTCCGCTACGACCCTACCTTCTACGCTGAGGATGAGCGCATGAACGGCACCCTCATCGTCAAGCTCCAGAGCCCACAGGAGCAGgTCTTCCACGTCAAGTTTCAgGCTACGAAGTCCGAGGAACAGCTCAAGGAGACCGAGTATGAGTGGTTTGAAGTTCGTTGTCTCGCGGAGCAAAAGGCTGGTAAAATCATGACCGACGCGTGCAGGAAGGCCGTTCTCAAGGACAACTCCCTGGACCAATTGAAAATCGCCGTCACGGTTCCCCGAAATGTTCACCCCAAGATCCAAACGCTTGCCTACAAAACACTTGACCTAATGAAGTACATGTGGTACCCGAAGATGCAGACTGAAGTTGCTGGTCTCAAGCAACGCGAAGTGCTGCAGGCCCTTCAGCACACCGAACGGGAAGTACGCATCTCCGTTAACGCTACTCGTGAATCTCTCTGGCATCTTCTATATGATGTCCGCGTCGAGATGCCATTCGAGAACGTTACTTTCTCCAAGGTTAACATTCCTGGTGTTCGTCCCGCACACATGCAGCTCACAACAAAAGAGCAGCTTGAACATGTGTATTACCGTGGCCAAAAAGATAACGTCTGTGTTCTTGGCGACAAGTCTGTACGCACGTACGACAACGTCACCTTCGGCCTTGATGTTAAGACTGGCTGCGAATACGTGCTCACCCGTGATACAAGCTCGGGTACCCCCGACTTCACTGTCACCTTCCAGGTTGTTAAGCCTGACACCTTCGCCAAGAAGATTCGGGTCCAGCTTGAGAACACTCTGGTAGAGTTGGAGCCCTTCACTACCACCGATCGCTACATCACTGTTGTGGTGAACGGCACCCAGTACCAAATCACCTTCGAGAAGCCTGTGGTATTTGAGTACGCTGCCGGTAAGCGTGTGTTCCTTAACGTGGTAGACACTTCCAACGTTCACCACGCTCCCGTCATCACCCTCTACACTGAACCGAAGGAGGTCCGCGTCTTCTTCGATGGCCACTCAGCCAAGGTCTTTGTTGTCAACAAGTACAAGGGTAACACAAAGGGCGTATGCGGCAACAACGACAACGAGCAGGCCCACGAGTTTATTGGGCCCAACGGAAAGGAGTACCAACATGCCAATGAGTTTATCGCTTCCTATGGCATCGGACAGGCTTGCAAGGTGCCCGCCGAGAACACGCGCGAGAAGCTCATGGAGACCTTGAAGAAAGAGGTCGAACAGATCCGCCGCCAGGAGCTAATCAAGAAGGAAAAGCTTCGCAAAGAGATGCAAGAACTCGAACGTGCGCGCAACCCGCAGTGGATGGAGCAGCAGGAAGAACAGTTCTGGGGCGAGCCACTAAGCACAGTCAGCAACGAGGAGTGGACTACAGACTCCGTTGAGGAACAACAGCTGCAGCGCCAGGTACTAAAGACGGCCATGTCTATCGAGAATGGCCACATTTGTTTCTCCGCTAGACCGATTGCCACCTGCAAGCAAGGTTACaAGAACCACGGCGTTCTCCGCACCGAGCGTGTCGAATCGATTTGCCTCGAAAAGAACGAGGAGGCCGCGATTCAAGCT
【００１１】
例示的なDeg-VIT-1抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:6）を含むことができる。
Deg-VIT-1（シグナルペプチドは除く）：配列番号:6
SAEVFHFVGQHGQGSTVYGVRGAVTVGAHQLTAEKTALEYNGTLAVEQIREGEFLTKFTHFTVGKYNKLQRSVQDETFDDLTPEEQRVVKTLREPAVYEPHMQRPVRFFVKEGQIVRMEAEKEHPQWSLNIFRSVLTLFQSQVSKPATLAVPHVEYKYEDGITGNCKVQYEVFSLPEDVTVQGVFNLTKTKNYKDCLGRPVYLHLKDTQRGCAGVCDNHRPENFLAGYEEEITDYELKPTPGCPVNQQRKDTLVTVQTVTKYNVSNGYLDEVRSEHTDIYRLYGGKLHVFTTLQLRLYGVAGPKIEEPKTVEIYKTLQLRLPHEEDELDIPVYALLREHTTQQQYGQHFQKYFEAVVQELLQLKDTQKQGQPEKQHYHSTAYLVELVQAVSSMTEKELKSIIPTIVHQAQPKQLTEEEHVRRQLWVELLGKAGSKSAVKIIVELVKGKLLTPTEIRRVLQDVAAFQSYPDTEMVEQILALCVKEQGLTATGKATACVAAGKVLSKACNSKVYQLAQKHEQHKKTINGKYQSIVQMQEQKYTPETEPEAEEYRVTFGHLPVDPKLVCTPEKLQKYVSDLSHALHQATDFKHVVAYINGLAHVQKPEVLPELLGYVNGTASNLVHIHEQGEDIKEAVEFARHVAIVSLQHVAVKYPKEVNPIVRVVFENTTEKVQTRILAFDVWMDTQPAQWEVEKVMQIANKDSSLELTHYVYTALKTAMKAEEPCYQLLAQRVRAAWTQLRPFDLGSEFSHLRSKFYYDTVENYGIRGVWKVIASNTTILPFYTEAKVNQVRGPYKTTLFGAKLLVKGGDKVLEELVGKDGLLERIAYALVGQIKTGPRQQNTEQLLKDIAQGMGLKREKDETPKAVLFWKLFSGDAVIPLDSHYINELKQELLQTVTKFGKDGVTGHIVRVLVPTKAFHVEPSTIGLPIVHSTIHPVVLSVRYENIKIHYGNQESRVAPKTLEISGTVQPTILSFRQSRVFVSDKVGQKNPTVKTTDIKEFNVRLAFRVVYEHTPKRFRVHVKPVFDRVFHSGHCTELKLESAVLLKEELAAKTVEYDKCIKSLYQPIRRNHQIAGEWSGMMLRLTGESHQPWSGLPMFAPSVVSSEGILGAIINRLSNKGMKHHTVSLYLETNNQQPITEWVATIDVDSNVERLAKVPLSQQITKVQKLKVQYANRAQPLYPELEPLVRKVESLLEKFETLDETTVEKLMLVKIEGLYQGQPKSTLKIAMKKIYNLEKTEQQYALAAMHQESHKGLELSTNVSYPKIGSPFRYDPTFYAEDERMNGTLIVKLQSPQEQVFHVKFQATKSEEQLKETEYEWFEVRCLAEQKAGKIMTDACRKAVLKDNSLDQLKIAVTVPRNVHPKIQTLAYKTLDLMKYMWYPKMQTEVAGLKQREVLQALQHTEREVRISVNATRESLWHLLYDVRVEMPFENVTFSKVNIPGVRPAHMQLTTKEQLEHVYYRGQKDNVCVLGDKSVRTYDNVTFGLDVKTGCEYVLTRDTSSGTPDFTVTFQVVKPDTFAKKIRVQLENTLVELEPFTTTDRYITVVVNGTQYQITFEKPVVFEYAAGKRVFLNVVDTSNVHHAPVITLYTEPKEVRVFFDGHSAKVFVVNKYKGNTKGVCGNNDNEQAHEFIGPNGKEYQHANEFIASYGIGQACKVPAENTREKLMETLKKEVEQIRRQELIKKEKLRKEMQELERARNPQWMEQQEEQFWGEPLSTVSNEEWTTDSVEEQQLQRQVLKTAMSIENGHICFSARPIATCKQGYKNHGVLRTERVESICLEKNEEAAIQA
【００１２】
例示的なDeg-PUF-1抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:7）によってコードされる
Deg-PUF-1（完全長配列）：配列番号:7
ATGCTcTtCAAGCTTCTTCTCGTCGTCGGCCTGACGGCGGCCATCGCCTCGGCCGGCCGCGGCTCGGATCAACGAGATCAGCGAGGTGGCCGCGACCATTCCCACGACAGCCACCATGGCTCGACCGAGGgcGGCCgCCGGGATCGTGAGACGACGGATCCGCTTTTCGCCAAGTTCATGGAGACAACGAAAAAGTGTGTCAACGACCTCCTCCCACAGTCCGGCCTGGAGCAGAGGGATCAACAGGCGTTGCTGGAAATGATCAAGCCGATGCACGTGCTCCAGAGGGAACACAGCACTGATCAGTCCGGTCGACAACATGCTCAGCACACGTTTACACCTCCGTATAAGTGCTCCCCTCAGGGAGAGCTCCTGACGATCTCACCAGCCGAAGTGTACGTTACGAGCATGGGCAAGCACCTAGACGCAACCGATAAGGTGTCACAACGAGCGAAAGCGCAGAAGGTATTCAGAGACGCCCTGCCGTGCATGGAGGAGATTTTCAAAAATCAGCCGTCACCTAATCAAAAAAGCCTGAGCGGTCAGCCCGGAGGACCACgAAGGACACACCACAGCACTTCGACAGAACGCCCACGTACACCCTAA
例示的なDeg-PUF-1抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:8）を含むことができる。
Deg-PUF-1（完全長配列）：配列番号:8
MLFKLLLVVGLTAAIASAGRGSDQRDQRGGRDHSHDSHHGSTEGGRRDRETTDPLFAKFMETTKKCVNDLLPQSGLEQRDQQALLEMIKPMHVLQREHSTDQSGRQHAQHTFTPPYKCSPQGELLTISPAEVYVTSMGKHLDATDKVSQRAKAQKVFRDALPCMEEIFKNQPSPNQKSLSGQPGGPRRTHHSTSTERPRT
例示的なDeg-ASP-1抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:9）によってコードされる。
Deg-ASP-1：配列番号:9
ATGGCGACGCGCGTCGTCCTCGTACTGTGGGCGGCGTCATGTGCCGCCCAAGCCGGCCTCATGAGGGTACCCCTGCTCAAGATGGAGACCATTCGGTCGCAAATGATGTCGAAAAATACACCGCGTCAATTGTTGCACTCACAGTCAGCAGGCGTCAATGGAGTCAAAGGAAGCGTTGAGCCTATCAACAACTATATGGATGCACAATACTACGGCCCGATCTCAATCGGCAGCCCGCCACAGCCATTCCAGGTCGTTTTCGATACTGGCTCATCGGATCTTTGGGTGCCCTCTTCCAAATGTCCACTTACCAATATTGCATGCCTGCTGCATAACAAGTACCATTCGGACAAATCGTCGACATACGTCAAAAACGGAACTGAATTCAAAATTCAGTACGGCTCGGGCGCGGTGAGCGGCGTCCTGTCGGCGGACACGGTTGATCTGAATGGTATGCGCGTCACCAACCAGACGTTTGCCGAGATCATGCGCGAATCGGGCCTCGGCTTTATAGCTGGAAAGTTCGACGGCATCCTCGGTATGGGCTATCCGACGATCGCCAGGGGTGGCCTACCGGTCTTCGACCAGATGGTGGCGCAGAACGTCATCGACCAGGCCGTCTTTACCTTCTTCCTcACCCGCGACCCCAACCACCCCACAGGCAGCGAGCTCGTTTTAGGAGGCATCGACCCGAAGCACCACAAGGGAGAAATTACCTACACCCCGGTCACCCGCAAAGGCTACTGGCAGTTCGGCGTTGACAAGATTGCAGTGAGTGGACATTCAGATGAGTTGTGTAAGGGCGGCTGCCAAGCTATCGCCGATACGGGCACGTCGCTTATCGCCGGCCCCACAAAGGAGGTCACGAAGCTGAACGAGCTCATCGGCGCCGCGCCATTCATCGGCGGCGAGTACATTGTTAACTGCAAAAATCTGCCCAACATGCCCAATATCGAGTTCACGATTTCAAACAGGACGTTCGTTCTCACTCCAGACGAATACATCCTCAAGATGAGCCAGGGCAGCATGCCGGTGTGCCTATCAGGTTTCATCGGCCTTGATGTCCCGCGTGATCCCGTCTGGATCCTGGGCGACGTCTTCATCGGCCGATACTTTACGGtTTTCGACCGCCAAAATGATCAAGTTGGCTTCGCCGACGCAGCCTAG
【００１３】
例示的なDeg-ASP-1抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:10）を含むことができる。
Deg-ASP-1：配列番号:10
MATRVVLVLWAASCAAQAGLMRVPLLKMETIRSQMMSKNTPRQLLHSQSAGVNGVKGSVEPINNYMDAQYYGPISIGSPPQPFQVVFDTGSSDLWVPSSKCPLTNIACLLHNKYHSDKSSTYVKNGTEFKIQYGSGAVSGVLSADTVDLNGMRVTNQTFAEIMRESGLGFIAGKFDGILGMGYPTIARGGLPVFDQMVAQNVIDQAVFTFFLTRDPNHPTGSELVLGGIDPKHHKGEITYTPVTRKGYWQFGVDKIAVSGHSDELCKGGCQAIADTGTSLIAGPTKEVTKLNELIGAAPFIGGEYIVNCKNLPNMPNIEFTISNRTFVLTPDEYILKMSQGSMPVCLSGFIGLDVPRDPVWILGDVFIGRYFTVFDRQNDQVGFADAA
例示的な変種1 Deg-PUF-2抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:11）によってコードされる。
Deg-PUF-2-変種1：配列番号:11
ATGTTGTCCATCCGTGTCGCACTCGTGGCCCTTTGCGCCTCGGTGGCCATCGCCGCTCCGTCTGGCGGCATTTGCCCAACTGGCGGCGACTGCCCAAAATGTGGTGTGCCGGTACAGGACCTCGAGGAGGTCCTTCGTGATGCCAAGTCTGCTTTTATTGTTGCCACTGGTATCGAGCAAGACGGCAAATCCTGGATGTCTCCTCGCCGTTGGCAGGATATTCTTGGAGCAGAGGGTAACAATTACGCCGTGCAGAAGTATCCCGTGGACGAGCGCCAATGGGAAGTAAAGGATGGCAAGTGCAGGCAGTACTTTGTTAAGCCTGTTTATGAGATCACCCCAGGCCAAACTCCTCGCGTCATCCACAAGCCAACTGTCGCAGGGATCCATATCAATGAGGATTGCCGATGCCCTGAGCTGATCCGCGGACATGGTTATGCTGTTATCGTCTTCAAGGACCATAAAATCAACCACCTCGATGAGCTTGCTCGGGCCGCTCTTGATGAGCACGTTGTCGTCGTGCCGCTCCCTCATGGCCAGTGGACCATCCCTTCGTCGACTGAAAATGACAGCATGAGCGACGTTGTTGAGACGAAACTCCCCTCTGCGTTTCTGAATGACGACGTCAAGGAGGAGTGTCCTGAGGCTACCACGTGCCCCGCCTGCGAAGTTGTTCATAGTTCGGAACAATTGCAGGGCATTTGCCAATTCCAGCAGGCTCTTCTCGTAAAGCGCACGATGGATCATCGTACGCCCGCCGAGGAGGTCGCTCCCTGGAGCATGCCCACACTAAGCGTCTACATGGCCAAGGCTGATGAGAACGACTACCATCTTCGGCTCGAAATAACTCCTCGCGAGCAAGGCTCATGCGTGCGGGGTGTGCTCCGCATCCTTGATGCCTTCACCAGTGAGTTCGAAGGCCGACGCAATCAGAAGTTCCAACTGGGTAAAGATTGCGAGTGTGAGTACCTTCGCAATAACACCGGCTTCGCTATCCTTCAGTCCGAAGAAAAGATCAGCAAGAACGGTGTGCTCTCCCAAAAGGAAAAAATCCTTGTGCTTCCTGAAGGTCAGTATTTGCTTCCGCAGTGCCAGCCAGAGCAAGCTGAAGAGCGTTCAGTAGATGAAAACGAGAAGGCCGTCGAATGTGGCGAGCCCGACGAAACCTGTCCCGTGTGCGACATGATTACCCCCGAGGTGCAGGAGGCAATCGAGGCCGAGGATACCTATCTGCTTAAGATGCAAACGAACACTCACCTCAAGTCGTCTGAAGAACACGAGAACGCCAAGTGCGGCGCTGCTCGTCTCATTTCCGTCTTCAAGGGTAACAAGGAGAACGTCAAACCCGAGCTTTCTTTCACCCTTCCCGAGAAGTGTCACTGCAATGCCATGTCTGCCAATGGTCGGCAATTCTACGCTGTGATCAAGAAGGACGCCGTGGATAATGACAACCTCGACAAACTGGTTCTCAATGATCAAGTCTATATCATTGGCTATAACTACCGTTCCCATGGTCTCATTCAGAGGTGGCTGAATCAAGGAGAAAAGGAGCAGCTTGAAGAGGCCGCTGATGAGCGTGTTGACTACGACGGATACTTGTCGTACGCTCCCCCGATGTACGCGCCTCCGCCCCCTCATCCGCTGTACGCGCCTCCGCC
【００１４】
例示的な変種1 Deg-PUF-2抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:12）を含むことができる。
Deg-PUF-2-変種1：配列番号:12
MLSIRVALVALCASVAIAAPSGGICPTGGDCPKCGVPVQDLEEVLRDAKSAFIVATGIEQDGKSWMSPRRWQDILGAEGNNYAVQKYPVDERQWEVKDGKCRQYFVKPVYEITPGQTPRVIHKPTVAGIHINEDCRCPELIRGHGYAVIVFKDHKINHLDELARAALDEHVVVVPLPHGQWTIPSSTENDSMSDVVETKLPSAFLNDDVKEECPEATTCPACEVVHSSEQLQGICQFQQALLVKRTMDHRTPAEEVAPWSMPTLSVYMAKADENDYHLRLEITPREQGSCVRGVLRILDAFTSEFEGRRNQKFQLGKDCECEYLRNNTGFAILQSEEKISKNGVLSQKEKILVLPEGQYLLPQCQPEQAEERSVDENEKAVECGEPDETCPVCDMITPEVQEAIEAEDTYLLKMQTNTHLKSSEEHENAKCGAARLISVFKGNKENVKPELSFTLPEKCHCNAMSANGRQFYAVIKKDAVDNDNLDKLVLNDQVYIIGYNYRSHGLIQRWLNQGEKEQLEEAADERVDYDGYLSYAPPMYAPPPPHPLYAPP
例示的な変種2 Deg-PUF-2抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:13）によってコードされる。
Deg-PUF-2-変種2：配列番号:13
ATGTTGTCCATCCGTGTCGCACTCGTGGCCCTTTGCGCCTCGGTGGCCATCGCCGCTCCGTCTGGCGGCATTTGCCCAACTGGCGGCGACTGCCCAAAATGTGGTGTGCCGGTACAGGACCTCGAGGAGGTCCTTCGTGATGCCAAGTCTGCTTTTATTGTTGCCACTGGTATTGAGCAAGACGGCAAATCCTGGATGTCTCCTCGCCGTTGGCAGGATATTCTTGGAGCAGAGGGTAACAATTACGCCGTGCAGAAGTATCCCGTGGACGAGCGCCAATGGGAAGTAAAGGATGGCAAGTGCAGGCAGTACTTTGTTAAGCCTGTTTATGAGATCACCCCAGGCCAAACTCCTCACGTCATCCACAAGCCAACTGTCGCAGGTGTCCATATCAATGAGGATTGCCGATGCCCTGAGCTGATCCGCGGACATGGTTATGCTGTTATCATCTTCAAGGACCATAAAATCAACCACCTCGATGAGCTTGCTCGGGCCGCTCTTGATGAGCACGTTGTGGTCGTGCCGCTCCCTCATGGCCAGTGGACCATCCCTTCGTCGACTGAAAATGACAGCATGCGCGACGTAACTGAGACGAAACTCCCCTCTGCGTTCCTGAACGACGACGTCAAGGAGGAGTGTCCTGAGGCTACCACGTGCCCCGCCTGCGAAGTTGTTCATAGTTCGAAACAATTGCAGGGCATTTGCCAATTCCAGCAGGCTCTTCTCGTAAAGCGCACGATGGATCATCGTACGCCCGCCGAGGAGGTCGCTCCCTGGAGCATGCCCACACTAAGCGTCTACATGGCCAAGGCTGACGAGAACGACTACCAGCTTCGGCTCGAAATAACTCCTCGCGAGCAAGGCTCATGCGTGCGGGGTGTGTTCCGCATCCTTGAAGCCTTCACCAATGACTTTGAAGGCCGACGAAATCAGAAGTTCCAACTGGGTAAAGATTGCGAGTGTGAGTACCTTCGCAATCACACCGGCTTCGCTATCCTTCAGTCCGAAGACAAGGTCACCAAGAACGGTGTACTCTCCGAAAAGGAAAAAATCCTTATGCTTCCTGAAGGTCAGTATTTGCTTCCGCAGTGCCAGCCAGAGCAAGCTGAAGAGCGTTCAGTAGAGGAAAATGCGCAGGTCGTCGAATGTGGCGAGCCCGACGAAACCTGTCCCGTCTGCGACATGCTTACCACTGAGGTGCAGGAAGCGATCGAGGCCGAGGATACCTATCTGCTTAAGATGCAAACGAAGACTCACCTCAAGTCGTCCGAAGAACACGATAATGCCAAGTGCGGCGCTGCTCGTCTCATTTCCGTCTTTAAGGGCAACAAAGAAAACGTCAAACCCGAGCTTTCTTTCACCCTTCCCGAGAAGTGTCACTGCAATGCCATGTCTGCCAATGGTCGCCAATTTTACGCTGTGATCAAGAAGGATGCCGTGGATAATGACAAGCTCGATAAACTTGTTCTGAATGAGCAAGTCTATATCATCGGCTATAACTACCGTTCCCATGGCCTCATCCAGAGGTGGCTAAATCAGGGAGAAAAGGAGCAGCTTGACGAGCCCGCCGATGAACGTGCCGACTACGATGGGTACATGTCGTACGCTCCTAAAGCGTACGCAGCCCCTCCGGCATACGCTCCCATGCCTGCTTATGGCGCCCCCGTATACGCGCCTCCGCCTGCGTACTCGCCGCCTCCGCCGGCATACGCACCCCCGCCACCGGCATACGCACCCCCGCCACCTCCGCCTG
【００１５】
例示的な変種2 Deg-PUF-2抗原は下記配列（配列番号:14）を含むことができる。
Deg-PUF-2-変種2：配列番号:14
MLSIRVALVALCASVAIAAPSGGICPTGGDCPKCGVPVQDLEEVLRDAKSAFIVATGIEQDGKSWMSPRRWQDILGAEGNNYAVQKYPVDERQWEVKDGKCRQYFVKPVYEITPGQTPHVIHKPTVAGVHINEDCRCPELIRGHGYAVIIFKDHKINHLDELARAALDEHVVVVPLPHGQWTIPSSTENDSMRDVTETKLPSAFLNDDVKEECPEATTCPACEVVHSSKQLQGICQFQQALLVKRTMDHRTPAEEVAPWSMPTLSVYMAKADENDYQLRLEITPREQGSCVRGVFRILEAFTNDFEGRRNQKFQLGKDCECEYLRNHTGFAILQSEDKVTKNGVLSEKEKILMLPEGQYLLPQCQPEQAEERSVEENAQVVECGEPDETCPVCDMLTTEVQEAIEAEDTYLLKMQTKTHLKSSEEHDNAKCGAARLISVFKGNKENVKPELSFTLPEKCHCNAMSANGRQFYAVIKKDAVDNDKLDKLVLNEQVYIIGYNYRSHGLIQRWLNQGEKEQLDEPADERADYDGYMSYAPKAYAAPPAYAPMPAYGAPVYAPPPAYSPPPPAYAPPPPAYAPPPPPP
例示的なDeg-SRP-2抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:15）によってコードされる。
Deg-SRP-2：配列番号:15
CTCTCGATGGCCTTCGAGGGTTCTCGCGGATCGACGAGAAATGAAATGCTCGAAGCGCTGaAACTTAAAGCGCTTGAACCGGAGGCGATCTGGCGGGCCTACTCTGCTCTAACGTCACGCAAGCATGAAAACAACACTAAACCCGGCGACTATTTCTCAGATGTGCAGTTTATCATGAGGCTTGCGAATCGTATGTACCTCAGCAAGGGCTATCCGATCGATCCGTCGTACGTCGACCAATTGAAGACCACATACCATGCCGATGCCGTCAATGTCGACTTCGCCGCCGAAGGCCCTGCCGTCCAAAAGCAAATCAACGAATTCGTTCGCGAACGAACTAACAATCTCATTCCACAGATTCTTCCTAGCCCGCTTGCTGCGAGCACGGTACTCGCGCTCGTCAACTCTGTATACTTTAAGGGCGATTGGACAGAAGCCATGACCGAGAAGAATCAGGTGATGCTCTTTAACAAGGATTCGAAAGTCCATCAGCAAGAGTACTCCAATTGGCTCAACACGGAAGACAATATGCCGTATCTGGAATCGGCAGCACTGCGCGCAAAACTCATTCGCATACCATATAAGTCGAGCAAATATTCGGCAAGCATGCTTATCATTGTACCTGAAGACCTTCTCYGTGACGGCAACCAGTGGCTTCACGACGTCAAGTGGACGGACATACAACAGGAACTCAGCAAAATGCGGATGACAAGAGTGAACCTGACAATGCCTCGTTTTGAGGTCGGTGCTCGTCTTCAACTAGAAAATACGTTGCCTTCAATGGGAATGCCCTTTGCCTTTGACACGGCGACATCGGATCTGTTTGGAATGGTGACTGACAAAGGCCAACGCCTTAGCATTGATCAGGTTATACACCAGACAAAGATGACCGTCACGAAATACGGCACAGAAGCTGCTGCGGCTACAGTTCTCACGGTGATGCTAACTTTGTATCAGATACCAACCGAACCCATCACTATGGTCGTTGATCGCGCGTTTTACTTCGCAATCCTTTATGGCACGTATGATGCAGCCGACGTAATGCCGCTTTTCAACGGAGTCATTTATAAAAAGTAGT
【００１６】
例示的なDeg-SRP-2抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:16）を含むことができる。
Deg-SRP-2：配列番号:16
LSMAFEGSRGSTRNEMLEALKLKALEPEAIWRAYSALTSRKHENNTKPGDYFSDVQFIMRLANRMYLSKGYPIDPSYVDQLKTTYHADAVNVDFAAEGPAVQKQINEFVRERTNNLIPQILPSPLAASTVLALVNSVYFKGDWTEAMTEKNQVMLFNKDSKVHQQEYSNWLNTEDNMPYLESAALRAKLIRIPYKSSKYSASMLIIVPEDLLXDGNQWLHDVKWTDIQQELSKMRMTRVNLTMPRFEVGARLQLENTLPSMGMPFAFDTATSDLFGMVTDKGQRLSIDQVIHQTKMTVTKYGTEAAAATVLTVMLTLYQIPTEPITMVVDRAFYFAILYGTYDAADVMPLFNGVIYKK
例示的なDeg-CPR-1抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:17）によってコードされる。
Deg-CPR-1：配列番号:17
ATGTTGATCCGCTGCGTTGTCACGGCTCTTGCAGCCGTGACGGTTGTCTCAGGAGTTTCGGTGCCCCGAGGTGCGCCAGAGTTCCCGCCGTCCTACACTGCGTCGGGCTACATCCTCCTGCCGTACTGTGAGCTGCGAGAGCCGTTCACCGCCTACTACGATGGTGAATCGGACCGATCGCGTATTGACTATTACGACGGCGAGATGAAGACATTCGTCGGAAAATCAGGCACGTTCAAGGTTGTCTGGTCGCCCAATGAGAAGACACATATACCGGAGCTGAACTGCTACGAGGCCGGACCGGCTAAAAGCCAGAGCATTTTGCCGGACCTCACCAACTTCACCTTCGTTCGGGTCGAGCCGTGCGAAACCGATTCGACGCACATTGTCAAGCCCCTGCTCCGAGGTGCTGACAAATGCTATCGCTATGAGAAGAAAGTGGATAACTTCGGACGCGTCTCCAAGTACACGTTCTGGGCCTCACAGGACGACGATAACACCCCAATTCCGGTACGCTACGTCATGATGGGTTACGACTCACTCTTGGGATCGCACTTCGACAAGTATGAGGTCGTGTACACCGACTACACACCCGGACCCGTCGAAGATGACCTCTTCCAAGTCAAGACTGTTATTGACAAGGAATGCACTTCGTTCCCGTCGCCGCCGGGCGTGTCCACTACCCACCTGTTCAACCCGATGGCGGAGTTCATTGACGAGAAGGATTCGCACGTGCACGAACACTTCGAGCACTTCAAATCGACACACGGCAAGGCATACGGCCACCAGGCCGAGGAGATCATCCGCAAGGACAATTTCCGCCACAACCAACGCTTCGTCAATTCGATGAACCGCCGCAACCTTTCGTACGCGCTGAAGCTCAACCACCGCGCCGACTGGAGCCAGGACGAGTTCAGGCTGCTCCGGGGCCGTCTACAGTTCACCAGCCAGAAGTCGATGGCCAGGGAGTTCCCCAAGGAACAGTACTCGGATCGCGTCGAGCCGGACTACGTCGACTGGCGACTCGAGGGAGCCGTCACGCCGGTCAAGGACCAGGCTGTGTGCGGGTCGTGCTGGAGCTTTGGCACGGTCGGCCACATCGAAGGCGCCTACTTCCGCAAGTTCGGCGAGCTGGTCCGTTTCTCCGAGCAGCAGCTCGTAGACTGTTCGTGGAATGCCGGCAACGATGCCTGCGACGGTGGTCTGGACTTTATCGCCTACCACTACATCCAGAAGTACGGACTGGCCAGCAACGACCAATACGGACCCTACCGCGGCATTGACGGCAAATGCAAGGACCTGGAGATTTCCAACAAGCCCATTAGCACGCTGAAAGGCTACCGAAACGTGACCACTGTGGAAGACCTCCGCAAGGCGCTCGCGTTTGTCGGCCCCATATCGGTGTCGATCGATGCATCAAGGCCGTCGCTCAGCTTCTATTCGCATGGAGTCTACAGCGATCCGGACTGCAGTTCGACGGAACTCGACCACTCCGTGCTCGCTGTTGGCTACGGCACGCTGCACGGTGAGCCGTACTGGCTCATCAAGAACTCGTGGTCCACGTACTGGGGCAACGACGGATACATTCTCATCTCGCAGAAGAACAACATGTGGGCGTTGCCTCGCAGGCAACCTACGTCGAGCTGTAGATAG
【００１７】
例示的なpepC1A-13094抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:18）を含むことができる。
Deg-CPR-1：配列番号:18
MLIRCVVTALAAVTVVSGVSVPRGAPEFPPSYTASGYILLPYCELREPFTAYYDGESDRSRIDYYDGEMKTFVGKSGTFKVVWSPNEKTHIPELNCYEAGPAKSQSILPDLTNFTFVRVEPCETDSTHIVKPLLRGADKCYRYEKKVDNFGRVSKYTFWASQDDDNTPIPVRYVMMGYDSLLGSHFDKYEVVYTDYTPGPVEDDLFQVKTVIDKECTSFPSPPGVSTTHLFNPMAEFIDEKDSHVHEHFEHFKSTHGKAYGHQAEEIIRKDNFRHNQRFVNSMNRRNLSYALKLNHRADWSQDEFRLLRGRLQFTSQKSMAREFPKEQYSDRVEPDYVDWRLEGAVTPVKDQAVCGSCWSFGTVGHIEGAYFRKFGELVRFSEQQLVDCSWNAGNDACDGGLDFIAYHYIQKYGLASNDQYGPYRGIDGKCKDLEISNKPISTLKGYRNVTTVEDLRKALAFVGPISVSIDASRPSLSFYSHGVYSDPDCSSTELDHSVLAVGYGTLHGEPYWLIKNSWSTYWGNDGYILISQKNNMWALPRRQPTSSCR
例示的なDeg-GPD-1抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:19）によってコードされる。
Deg-GPD-1：配列番号:19
ATGTCGGCCGCCCTACAGATTAAGAAGGTTCTCATCAGCGACTCGTGTGATGCCCGCTGCGCGGAAATCCTGCGCGAGGCCGGCTGTGATGTCACTGTGAAGACAGACTTCACCAAAGAACAGCTGGTGGAAGCGATCAAGGACTTCGATGCGCTTGTCGTGCGGAGCGCGACCAAAGTCACTGCGGATGTGATCAACGCCGCCACTAACCTCAAGGTGATTGGGCGTGCAGGAACGGGCGTGGACAACATCGACTGCGATGTAGCGACAGCTCGCGGCGTGCTCGTGATTAACGCGCCTGGTGGCAACACGCTTGCTGCCGCCGAGATGACCTGCGCCATGATCATCTCGCTGTCGCGTGACGTCGCCGCCGCGTGCGCCTCACTAAAAGCTGGCCGCTGGGACCGCAAGACGTTCATGGGCACCGAGCTAAACGGCAAGACTCTAGGCATCGTCGGACTTGGCCGGATCGGCCGCGAGGTCGCCATCCGCATGCAGGCCTTCGGCATGACGACGATTGGCTACGATCCGATTATTCCGGCCGAGCAGGCGGCGAAGTTTAACGTGAAGGCGATGAGCCTCGATGAGTTGTGGCCGCAGTGCGACTACATCACCGTGCACACGCCGCTTCTGCCCGAGACAAAGAACCTCATCAGCGCCGGCACGCTCGCTCGCTGCAAGAAGGGCGTCAAGGTGGTCAACTGTGCCCGGGGCGGCATCGTCAACGAGAACGACCTGCTCGCGGCGCTCGAGTCGGGACAGGCGTCGGGGGCCGGTTTTGACGTGTTCGAAGACGAACCGCCCAAGAACACGGCGTTCATCGCTCACCCGAAGGTCATCTGCACACCACATTTGGGCGCCAACACGAAGGAGGCCCAGTCAAAGGTGGCTATCGAGATCGCCGAGCAGTTTGTCGCTCTGAAAAAGGGCGAACGCGCTTGGGGTGCCGTCAACAAGCCCAAGCCAGCTAACTAA
例示的なDeg-GPD-1抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:20）を含むことができる。
Deg-GPD-1：配列番号:20
MSAALQIKKVLISDSCDARCAEILREAGCDVTVKTDFTKEQLVEAIKDFDALVVRSATKVTADVINAATNLKVIGRAGTGVDNIDCDVATARGVLVINAPGGNTLAAAEMTCAMIISLSRDVAAACASLKAGRWDRKTFMGTELNGKTLGIVGLGRIGREVAIRMQAFGMTTIGYDPIIPAEQAAKFNVKAMSLDELWPQCDYITVHTPLLPETKNLISAGTLARCKKGVKVVNCARGGIVNENDLLAALESGQASGAGFDVFEDEPPKNTAFIAHPKVICTPHLGANTKEAQSKVAIEIAEQFVALKKGERAWGAVNKPKPAN
【００１８】
例示的なDeg-PUF-3抗原は、少なくとも部分的に下記配列（配列番号:21）によってコードされる。
Deg-PUF-3：配列番号:21
ATGCGAGGCgTCTTAGTGATAGCCGCACTCGGCCTCCTGGCCGAAGTCGGCCTCGGAAGTCCATTCTCGAATTCGGAATGCTCCGAGCAGYGMATTCARTACATCCTCACCGATGCCTTGGGACCGAAGATGCTTCGATTATACAAGGAGCTGCTTAAACCTGACACAGGTTACACGAGTCCAGTCGACGTAAACGGCCAAACCTACGAGGTGTCAATGCCCAAAAAGAACCTCATCCAGAACGCTATCCGCAAAGGCGTGAAGGAAAGCATCATCGAAGGAATGCTGGACGACGCTGCTATTGTGCCCACTGGTACTGCATCGCGTACTTCGCCGACATCATTCAGGCCAAACCAGCAGACGATCGAAAGGCCACACGTTCTGGAGCCGGTACGCGAGCGCCGCCCTTCATCGCAGAGTCACTACAAAATCTACACGACGAGAAATGGTGACATCAACATTGACATCAAAGGTCAGACTCTTCGAGTGCCAGACGATCTCACACGACTGCCGCACATTGTCGACGATCCCGATACAGTTGTCGACATCGTTCGCCATCTGAAGGAACTGGGCGTTCCTGTGAGTCGTGACGGTAATCGAATCACGATCGGCAGCACCACCTCGCCGCAGGGCCTGACGCTTCGTGTGTCGATAAAGAAGATCGACGACAAGCCCAGCAGTGTAACAATTAAGGCCAACGATGATGAGTACACACTGCCTGGCGACGAGAACCGACTGAACCGGTACATCACCCGCGAGCCCGAGGTAGCCTATCACATTCTGCGAATTCTGTCGCGACACGGCGTGCCGGTCGAGTACGACGACCAGACGAAGACTATCAAGGCGAAGCTGACCCCGGAGGACGACTACATCGGGTCGAGRACGAGCGTTCCAAGCCACAGCAGCAATCCCAGCCATGCTGGCAGCACCAGCACGAGTTTGGTGACGCCTAGCGCCTCGTCGCCGAGGATTATCCGTGTTGGCACCACGTCCTACTATCTGCCCGAGGACTGGGACCGCCTCAAGAGAGATCTGCAAGATGGCCGCATCTCCGCTACGAGCGTACTCGACATTCTCGATTCGCAGCATATCGCCGCACCYCGTGATATAATCTCTGTTATCCGTACCCGAATCAGCACKTCAGTTGAAAAGGTGAGRGTAATGCGTTACGGCGATGAAGTMACCGTCGAGCTGGGCTCGCAGAGCTTTAAACTTCCGAAAGACGATCGCGAGTTGGAGAAGGCGCTTCGCGAGAACGAGTTCCCTATCGAGCTTATCCGCGACTCTCTGCTTCGAATCGGCGTCGATACGCGTCGTGTCGGCTCGTCGCTGCGCGTGATTCTGCCTGGTGGAGAGGCGTATCTGTCCGGGCTACCAACAACTCGGCAGTACCGCTACGACATCGTTTCCAAACCGGGAGGCGTCCAAATTACTGCTGGCTCCGAGACGTATAATCTTCCTGCGGAAAAAACCATCCTTGAGCGCGCAATCGCCGAGAAGAAGGTCTTGCCGCGAACCCTCGTCGATGCGTTTAACGACGTTGGCATCCCATCCGAAATGGACATCACCAAGCAAGAAATGACAGTCGACCTTACGTCGGGACTTCTYAGAATCCCCGTGCCGCTAAACATTCAGCAGACAAAAGTGGGTACACGACTGAGACTCAATATGCGCGGACCCGAAGGCAACAAGGTCTATACGCTGACGATTGGCGAATCAGGCAACGACAAGGTTGAGCTTCCCGCCGATGTCCATATCGTCAACAACTACATCCGTTCCGGAAAGGTCGACTCCAATCTCCTTATGCAGCTGCTCGGCCGAATGGGTGTTTCGCACTACTTTGATTYTGCCAAGGACGTTCACGTCGTTACCCTGAATGGGCGGCCCTACGACATTCAGAAATCACACGTCTCGGAACGAGGCAGCTACCCACACAGCAGTCACCAGCAGGCGCGAGTCTTTTGA
例示的なDeg-PUF-3抗原は下記アミノ酸配列（配列番号:22）を含むことができる。
Deg-PUF-3：配列番号:22
MRGVLVIAALGLLAEVGLGSPFSNSECSEQXIQYILTDALGPKMLRLYKELLKPDTGYTSPVDVNGQTYEVSMPKKNLIQNAIRKGVKESIIEGMLDDAAIVPTGTASRTSPTSFRPNQQTIERPHVLEPVRERRPSSQSHYKIYTTRNGDINIDIKGQTLRVPDDLTRLPHIVDDPDTVVDIVRHLKELGVPVSRDGNRITIGSTTSPQGLTLRVSIKKIDDKPSSVTIKANDDEYTLPGDENRLNRYITREPEVAYHILRILSRHGVPVEYDDQTKTIKAKLTPEDDYIGSRTSVPSHSSNPSHAGSTSTSLVTPSASSPRIIRVGTTSYYLPEDWDRLKRDLQDGRISATSVLDILDSQHIAAPRDIISVIRTRISTSVEKVRVMRYGDEVTVELGSQSFKLPKDDRELEKALRENEFPIELIRDSLLRIGVDTRRVGSSLRVILPGGEAYLSGLPTTRQYRYDIVSKPGGVQITAGSETYNLPAEKTILERAIAEKKVLPRTLVDAFNDVGIPSEMDITKQEMTVDLTSGLLRIPVPLNIQQTKVGTRLRLNMRGPEGNKVYTLTIGESGNDKVELPADVHIVNNYIRSGKVDSNLLMQLLGRMGVSHYFDXAKDVHVVTLNGRPYDIQKSHVSERGSYPHSSHQQARVF
【００１９】
したがって、本発明は、上記の配列番号:1−22によって提供される配列の任意の1つによって少なくとも部分的にコードされるか、又は前記任意の1つを含む1つ以上のD.ガリナエ抗原に関するか、及び/又は当該1つ以上のD.ガリナエ抗原を利用する。したがって、本明細書で用いられる“抗原”又は“D.ガリナエ抗原”という表現はいずれも、上記（i）−（x）として列挙される全抗原又は自然のままの抗原、配列番号:1−22のいずれかを含む又はいずれかによってコードされる抗原及び/又はそれらのいずれかの免疫原性/抗原性フラグメント、変種、組換え型及び/又は誘導体を包含する。
免疫原性/抗原性フラグメントは、動物（特に鳥類種）に投与されたときに、免疫応答を誘引することができる任意のD.ガリナエ抗原フラグメント（例えば本明細書に記載するD.ガリナエ抗原のいずれかのフラグメント）であり得る。“免疫応答”は、抗体（例えばIgY、IgA、IgM及び/又はIgG又は任意の他の該当するアイソタイプ）応答及び/又はサイトカインを誘引する任意の応答又は細胞媒介免疫応答と考えることができる。例えば、本発明によって提供される多様なD.ガリナエ抗原フラグメントは、当該フラグメントが誘導される完全な抗原によって誘引される免疫応答と実質的に同一又は類似の免疫応答を誘引することができよう。ある実施態様では、本発明によって提供される抗原フラグメントは、鳥類種で防御性免疫応答を提供することができる。
本発明のD.ガリナエ抗原は1つ以上のエピトープを規定し、したがって“抗原”という用語はまた、1つ以上のD.ガリナエ抗原エピトープを含むタンパク質又はペプチドを包含できることは、当業者には理解されるであろう。
【００２０】
さらにまた、“抗原”という用語は、本明細書に記載する抗原のいずれかの組換え型を包含する。“抗原”という用語はまた、本発明のD.ガリナエ抗原のいずれかの組換え調製免疫原性フラグメントを含む。本発明の抗原の組換え型及び前記を入手する方法は後で記載される。
他の実施態様では、“抗原”又は“抗原フラグメント”という用語は、本明細書に記載する抗原のいずれかの変種又は誘導体を包含することができる（そのような抗原は“変種”抗原又は“誘導”抗原と称される）。繰り返せば、これらの用語は、本発明のD.ガリナエ抗原のいずれかの変種/誘導体、又は配列番号:1−22のいずれかを含む又はいずれかによってコードされる変種/誘導体を含むことは理解されるべきである。いずれの変種又は誘導抗原も、対応する完全な又は自然のままの抗原によって同じ宿主で誘引される免疫応答と類似又は実質的に同一の免疫応答を誘引するという点で免疫原性/抗原性であり得ることは当業者には理解されよう（そのような変種/誘導体は“免疫原性変種/誘導体”と称することができる）。免疫原性変種/誘導体は、参照配列（例えば本発明のD.ガリナエ抗原の配列又はD.ガリナエ抗原をコードする配列）に対して1つ以上のヌクレオ塩基及び/又はアミノ酸残基の置換、倒置、付加及び/又は欠失を含むタンパク質/ペプチド配列又は核酸若しくはアミノ酸配列を含むか、又はそれらによってコードされ得る。
“置換”という用語は、1つ以上の保存的置換を包含できることは当業者には理解されるであろう。“保存的置換”という用語は、タンパク質又はペプチドの1つ以上のアミノ酸を類似の特性を有する代替アミノ酸で入替える作業を包含することを意図することは当業者には理解されるであろう（前記代替アミノ酸は、自然のままの（又は野生型の）タンパク質の物理化学的特性及び/又は構造又は機能を実質的に変更しない）。
【００２１】
本発明の関係では、変種/誘導体抗原は、参照配列（例えば野生型配列（上記（i）−（x）として提供される特異的D.ガリナエ抗原のいずれかの又はいずれかによってコードされる配列を含む）又は配列番号:1−22のいずれか（又はそのフラグメント）を含む又はいずれかによってコードされる抗原）と比較したとき、1つ以上のアミノ酸/ヌクレオチドの置換、付加、欠失及び/又は倒置を有することが認められる変異配列を含むか、又は変異配列によってコードされ得る。
誘導体とみなすことができる抗原はさらに、本明細書に記載するフラグメント又は変種の1つ以上の特色物を、当該抗原の構造又はそのアミノ酸残基に対する1つ以上の改変と組み合わせて含むことができる。
当業界では周知のように、遺伝暗号の縮退は、一次アミノ酸配列を変更することなくコドン内の1つ以上の塩基の置換を可能にする。したがって、遺伝子縮退を利用して、本明細書に記載するD.ガリナエ抗原のいずれかのペプチド又はタンパク質配列をコードする変種配列を得ることができる。
（上記に記載の）免疫原性であることに加えて、有用なフラグメント、変種、変異体及び/又は誘導体は、該当する完全な野生型又は自然のままのD.ガリナエ抗原の（又は前記をコードする）完全なアミノ酸又は核酸配列（n）の約5から約10残基（アミノ酸及び/又は核酸）の任意のものを約n−1残基に含むことができる。本発明によって提供されるフラグメント、変種及び/又は誘導体は、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、3000、4000又は5000残基を含むことができ、その上限（n−1）は、完全な抗原をコードする核酸のサイズ（n）又は当該抗原の一次配列を含むアミノ酸残基の数（n）に左右される。
加えて、或いはまた別に、本発明によって提供される抗原フラグメント、変種及び/又は誘導体は、本明細書に開示する多様な参照（例示的）抗原の配列（コード配列又は一次アミノ酸配列）と少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同であるか又は同一である配列を含むか、又は前記によって少なくとも部分的にコードされる。
【００２２】
2つ以上の（アミノ酸又は核酸）配列間の“相同性”の程度（又はパーセンテージ）は、2つ以上の配列をアラインメントし、同一である又は同一ではないがリダンダントヌクレオチド置換（リダンダントヌクレオチド置換は個々のコドンによってコードされるアミノ酸に影響を与えない）又保存的アミノ酸置換によって相違するアラインメント残基の数を決定することによって決定できる、
2つ以上の（アミノ酸又は核酸）配列間の“同一性”の程度（又はパーセンテージ）はまた、配列をアラインメントしてアラインメント配列間の正確な残基マッチ数を確認し、この数を比較した総残基数で割ることによって決定できる。得られた数字に100を掛ければ配列間のパーセンテージ同一性が得られよう。
したがって、本発明は以下に関する：
（a）上記の（i）−（x）から成る群から選択されるD.ガリナエ抗原の1つ以上；
（b）配列番号:1−22として提供される配列の1つ以上を含むか又は前記によって少なくとも部分的にコードされる抗原；
（c）上記（a）又は（b）によって提供されるいずれかの抗原の免疫原性フラグメント、変種又は誘導体；及び/又は
（d）上記（a）−（c）によって提供される抗原のいずれかの組換え型。
本発明はさらに、動物（とくに鳥類種）で免疫応答を惹起するために使用される、（a）−（d）によって定義される抗原のいずれか1つに関することができる。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載するD.ガリナエ抗原の1つ以上を含む（利用する）医薬、方法及び組成物を提供する。本明細書で用いられる、“組成物”という用語は、任意の形態の免疫原性又はワクチン組成物を包含する。免疫原性組成物は、鳥類種に投与したとき免疫応答を誘引する本発明の抗原の1つ以上を含む任意の組成物であり得ることは当業者には理解されるであろう。同様に、本発明のワクチン又はワクチン組成物は、鳥類種に投与したとき免疫応答（防御性免疫応答を含むことができる）を誘引する本発明のD.ガリナエ抗原の1つ以上を含むことができる。誘発される免疫応答が、液性（又は抗体媒介）及び/又は細胞媒介成分を含み得ることは当業者には理解されるであろう。誘発される免疫応答は防御性免疫応答を含むことができ、当業者には、防御性免疫が、動物の感染/蔓延を解決する能力及び/又は感染/蔓延に随伴する徴候の緩和に役立つ能力に寄与し得ることは理解されるであろう。本発明の関係では、本明細書に記載する抗原の利用を介して惹起される免疫応答を“防御性”免疫応答と称することができる。“防御性”免疫応答という用語は以下の免疫応答のいずれも包含することができる：（i）宿主の病原体量の減少を促進又は達成する；（ii）感染/蔓延の影響又は徴候の1つ以上を緩和する；及び/又は（iii）更なる（その後の/二次性）感染の発生を予防、軽減又は制限する。
したがって、防御性免疫応答は、特定の病原体による感染/蔓延、及び/又は特定の疾患若しくは症状の進行を動物で予防することができる。本発明の関係では、防御性免疫応答は、動物でD.ガリナエによる感染/蔓延を予防し、D.ガリナエ感染/蔓延の範囲を制限することができ、及び/又は動物でD.ガリナエ感染/蔓延に随伴する疾患若しくは症状及び/又は前記に随伴する1つ以上の徴候の進行を予防することができる。D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する、例えば家禽（ニワトリを含む）の徴候には、痛み及び刺激（特に胸部及び脚領域）並びに産卵の低下がある。他の徴候には、膿疱、かさぶた及び過剰な色素沈着の形成又は進行及び羽毛の消失が含まれ得る。鳥類の重度な感染/蔓延は貧血をもたらし得る。
したがって、本発明が“組成物”の提供に関するかぎり、これら組成物は免疫原性組成物及び/又はワクチン組成物を含むと理解することができる。さらにまた、“免疫応答”の惹起と言えば、液性及び/又は細胞媒介免疫応答だけでなく、“防御性免疫応答”の任意の形態もまた包含すると理解されるべきである。
【００２４】
本発明の特徴は、鳥類種の免疫応答の惹起で使用される、1つ以上のデルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）抗原を提供し、ここで、当該1つ以上のD.ガリナエ抗原は以下から成る群から選択される：
（i）セルピン（Deg-SRP-1）；
（ii）ヘムリポ糖タンパク質（Deg-HGP-1）；
（iii）ビテロゲニン（Deg-VIT-1）；
（iv）未知機能1のタンパク質（Deg-PUF-1）；
（v）アスパルチルプロテイナーゼ/カテスピンD（Deg-ASP-1）；
（vi）未知機能2のタンパク質（Deg-PUF-2）：変種1及び/又は2；
（vii）セルピン（Deg-SRP-2）；
（viii）ペプチダーゼC1Aシステインプロテイナーゼ（Deg-CPR-1）；
（ix）ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（Deg-GPD-1）；
（x）未知機能3のタンパク質（Deg-PUF-3）；及び
（xi）（i）から（x）のいずれか1つの免疫原性フラグメント、変種又は誘導体。
ある実施態様では、本発明の第一の特徴の使用抗原は組成物の形態で提供される。組成物は1つ以上の賦形剤又は希釈剤を含むことができる。組成物は免疫原性組成物又はワクチン組成物であり得る。組成物はさらにアジュバントを含むことができる。
さらに別の特徴では、本発明は、鳥類種で免疫応答を惹起する医薬の製造で、上記（i）から（xi）のように列挙されるデルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）抗原の1つ以上の使用を提供する。
さらにまた別の特徴で、本発明は鳥類種で免疫応答を惹起する方法を提供し、前記方法は、上記（i）から（ix）のように列挙されるデルマニスス・ガリナエ（D.ガリナエ）抗原の1つ以上を投与する工程を含む。
【００２５】
本明細書で用いられる“鳥類”、“鳥類種”又は“鳥類宿主”という用語は、例えば家禽又は飼い鳥として包括的に知られているものを含む。他の実施態様では、これらの用語は範囲を広げて、家畜化又は狩猟鳥種、例えばニワトリ、キジ、ライチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びアヒル種を含む。ある実施態様では、“鳥類”、“鳥類種”又は“鳥類宿主”という用語は、市場で重要な又は農場飼育される鳥種に範囲が拡大される。
有利には、本発明で提供する使用、医薬及び方法のための抗原及び組成物を利用して、免疫応答（例えば防御性免疫応答）をニワトリ（ガルス・ガルス・ドメスチクス）で惹起することができる。このようにして、本発明は、ニワトリでD.ガリナエ感染/蔓延の発生を予防、軽減及び/又は処置するために利用できる使用、医薬及び方法のための抗原及び組成物を提供する。
D.ガリナエは吸血性鳥類外部寄生生物であり、吸血時に宿主の免疫グロブリンに暴露される。理論に拘束されないが、本発明者らは、1つ以上のD.ガリナエ抗原を鳥類に投与することによって、1つ以上のD.ガリナエ抗原に特異的な（選択的な）抗体が鳥類の血液中で生成されると仮説を立てる。このようにして、吸血時に、D.ガリナエ寄生生物は、当該寄生生物に有害な影響を与え、消耗させ、撲滅、殺滅及び/又は不活化する抗D.ガリナエ抗原抗体に暴露される。繰り返せば、理論に拘束されないが、抗体によって媒介されるD.ガリナエ寄生生物の消耗、撲滅、殺滅及び/又は不活化は、抗体媒介細胞傷害性プロセス及び/又は補体経路を巻き込み得る。
【００２６】
本明細者で一般的に“抗体”及び“特異的”又は“選択的”抗体というとき、これらの用語は、本明細書に記載する抗原と結合する抗体（及びその活動性又はエピトープ結合フラグメント）、及び/又はある程度の選択性、特異性及び/又は親和性を示す抗体（及びその活動性又はエピトープ結合フラグメント）を包含することは理解されるべきである。
さらに、“抗体”という用語はまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に関係し得ることは理解されるべきである。このタイプの抗体については後で考察する。
ある実施態様では、本発明は、鳥類種で免疫応答を惹起する、本明細書に記載の1つ以上のD.ガリナエ抗原を含むワクチン又はワクチン組成物に関する。ワクチンを予防的に用いて、鳥類宿主のD.ガリナエ感染/蔓延の確立を防ぐか又は確立したD.ガリナエ感染/蔓延を軽減、緩和又は根絶することができる。さらにまた、D.ガリナエ感染/蔓延に随伴する二次合併症、疾患又は症状の徴候を間接的に緩和し、軽減し又は根絶するための手段として、本明細書に記載のD.ガリナエ抗原のいずれかを含むワクチン又はワクチン組成物を用いることができる。“間接的に”という用語は、本発明によって提供されるワクチンはD.ガリナエ感染/蔓延に随伴する二次合併症には直接の影響を与えないかもしれないが、本明細書に記載のワクチンによって影響を受けるD.ガリナエ感染/蔓延集団の減少によってD.ガリナエ感染/蔓延に随伴する二次合併症例の減少に同様に影響を与え得るということを読み手に理解させることになることを当業者は理解するであろう。これらの二次合併症は、例えば細菌性病原体（例えばサルモネラ（Salmonella）、カンピロバクター（Campylobacter）又は大腸菌（E. coli）、マイコバクテリア種（例えばM.ガリセプチクム（M. gallisepticum））を含む）又はウイルス（トリインフルエンザを含む）と密接に関係することがある。これらの病原体はしばしば鳥類宿主に影響を及ぼすダニの体表又は体内で運ばれるか[3]、或いはこれらの病原体は、ダニに取り囲まれる鳥類宿主又はヒトの健康的に不利な影響の結果であるか又はダニが生成するアレルゲンの結果であり得る。
【００２７】
理論に拘束されないが、本発明の抗原、組成物、免疫原性組成物、ワクチン又はワクチン組成物を投与された鳥類種は防御性抗D.ガリナエ抗原抗体を生成することができ、前記抗体は、D.ガリナエを消耗させるか、撲滅、殺滅及び/又は不活化するために機能することができる。本明細書に記載する1つ以上の抗原は、例えば、交尾、受精、胚形成、卵黄形成、胚発生のための栄養物の隔離、胚発生、性特異的生殖及び発生プロセス、性の分化及び成熟、体細胞及び胚細胞の性分化プロセス、卵子形成、精子形成、卵細胞成熟及び/又は排卵に直接又は間接的に必要とされ得る。したがって、さらにまたいずれの特定の理論に拘束されないが、本発明者らは、本発明によって利用される特異的なD.ガリナエ抗原に応じて、鳥類宿主で惹起される防御性抗体の少なくともいくつかは抗繁殖作用（寄生生物の卵生産及び/又は幼生発生を制限する）を有することができると仮説を立てる。
本発明によって提供される多様な組成物は、本明細書に記載する抗原の1つ以上及び医薬賦形剤、担体又は希釈剤を含む無菌的医薬組成物として処方できる。これらの組成物は、経口、局所（皮膚及び舌下を含む）、非経口（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）、経皮及び/又は粘膜投与のために処方できる。
本明細書に記載する組成物は分離された投薬ユニットを含むことができ、製薬業界で周知の任意の方法によって調製できる。方法は、典型的には、本明細書に記載するD.ガリナエ抗原の1つ以上を液体担体又は微細分割した固体担体又はその両方と一緒に結合させる工程を含む。
【００２８】
担体が固体の経口投与に適した組成物は、もっとも好ましくはユニット用量処方物、例えばボーラス、カプセル又は錠剤として提供され、前記は各々予め決定された量の本発明の1つ以上のD.ガリナエ抗原を含む。錠剤は、場合によって1つ以上の付属成分とともに圧縮又は鋳型成形によって作製できる。圧縮錠剤は、自由流動形（例えば粉末又は顆粒）の活性化合物（例えば1つ以上のD.ガリナエ抗原）を場合によって結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、滑沢化剤、表面活性剤又は分散剤と混合して適切な機械で圧縮することによって調製できる。鋳型成形錠剤は、活性化合物を不活性な液体希釈剤とともに鋳型成形することによって作製できる。錠剤は場合によって被覆でき、被覆しないならば場合によって刻み目を入れることができる。カプセルは、活性化合物を単独で又は1つ以上の付属成分と混合してカプセル殻に充填し、続いて通常の態様で密封することによって調製できる。カシェ剤はカプセルと同様であり、活性化合物は任意の付属成分とともにライスペーパーに密閉される。活性化合物はまた分散顆粒として処方でき、前記は、投与前に例えば水に懸濁するか又は食物に振りかけることができる。顆粒は例えばサシェに詰めることができる。担体が液体の経口に適した処方物は、水性又は非水性液の溶液若しくは懸濁物として、又は水中油液のエマルジョンとして調製できる。
経口投与に適した組成物には制御放出投薬形（例えば錠剤）が含まれ、前記では、活性化合物（例えば1つ以上のD.ガリナエ抗原）は適切な放出制御マトリックス中に処方されるか、又は適切な放出制御フィルムで被覆される。そのような組成物は予防的使用のために特に便利であり得る。
非経口投与のために処方される組成物には、水性又は油性ベヒクル中の活性化合物（例えば1つ以上のD.ガリナエ抗原）の無菌的溶液又は懸濁物が含まれる。
【００２９】
注射可能組成物（例えばワクチンを含む）は、ボーラス注射又は持続輸液のために適合させることができる。そのような調製物は、便利なようにユニット用量又はマルチ用量容器で提供され、前記は処方物の導入後に使用が必要とされるまで密閉される。また別には、活性化合物（例えば1つ以上のD.ガリナエ抗原）は散剤形でもよく、前記は適切なベヒクル（例えば無菌的で発熱物質を含まない水又はPBS）で使用前に構成される。
本発明のD.ガリナエ抗原の1つ以上を含む組成物は長期作用性デポー調製物として処方でき、前記は筋肉内注射又は移植（例えば皮下又は筋肉内移植）によって投与できる。デポー調製物は、例えば適切なポリマー若しくは疎水性物質又はイオン交換樹脂を含むことができる。それらはまた、鳥類の免疫応答の親和性及び/又は長寿命性を強化することが知られている調製物又はアジュバント（例えば水中油の単一エマルジョン又は二重エマルジョン）を含むことができる。そのような長期作用性組成物は予防的使用のために特に便利である。
粘膜投与のために適切な（又は処方される）組成物には、エアロゾル分散用粒子を含む組成物又は飲水に分散される組成物が含まれる。分散されたときに、そのような組成物は、例えば鼻腔内での保持を可能にするために、望ましくは10から200ミクロンの範囲の粒子直径を有するべきである。これは、適切な粒子サイズの散剤の使用又は適切なバルブの選択によって適宜達成することができる。他の適切な組成物には、20から500ミクロンの範囲の粒子直径を有する粗い散剤（鼻の近くに保持した容器から鼻道を通る迅速な吸入による投与用）及び点鼻薬（水性又は油性溶液若しくは懸濁物中に活性化合物を0.2から5% w/v含む）が含まれる。
【００３０】
上述した担体成分に加えて、本明細書に記載する多様な組成物は、適切な1つ以上の追加の（医薬的に許容できる）担体成分、例えば希釈剤、緩衝剤、香料、結合剤、表面活性剤、膨張剤、滑沢剤、保存料（抗酸化剤を含む）など、及び目標のレシピエントの血液と処方物を等張にするために加えられる物質を含み得ることは理解されよう。医薬的に許容できる担体は当業者には周知であり、0.1M及び好ましくは0.05Mリン酸緩衝液又は0.8%食塩水が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記の他に、医薬的に許容できる担体は水性又は非水性溶液、懸濁物及びエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、鉱物油及び注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性担体には、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョン又は懸濁物（食塩水及び緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ベヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発性油が含まれる。保存料又は他の添加物（例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなど）もまた加えることができる。
局所処方物に適切な組成物は例えばゲル、クリーム又は軟膏として提供できる。
外部寄生生物の感染/蔓延を処置又は予防するとき、局所（皮膚又は皮下）免疫応答の発生は特に有益であることは当業者には理解されるであろう。
獣医が使用する組成物は便利には散剤又は液体濃縮形であり得る。標準的な獣医処方慣行にしたがえば、便利な水溶性賦形剤（例えばラクトース又はシュクロース）を散剤中に取り込み、それらの物理的特性を改善することができる。したがって、本発明の特に適切な散剤は、50から100% w/w、好ましくは60から80% w/wの活性成分（例えば1つ以上のD.ガリナエ抗原）、及び0から50% w/w、好ましくは20から40% w/wの通常的な獣医用賦形剤を含む。これらの散剤を、例えば鳥類の飼料に（おそらく中間プレミックスの方法により）添加するか、又は動物の飲水で希釈することができる。
【００３１】
本発明の液体濃縮物は適切には1つ以上のD.ガリナエ抗原を含み、場合によってさらに別に、許容可能な獣医使用の水混和性溶媒（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールフォーマル又は30% v/vまでのエタノールと混合したそのような溶媒）を含むことができる。液体濃縮物は動物の飲水に投与することができる。
一般的には、本発明によって提供される1つ以上のD.ガリナエ抗原の適切な用量は、約10から約100μg/鳥の範囲であり得る。さらにまた、本明細書に記載する1つ以上の抗原は、約1から約10週間の期間にわたって約2から約5回投与できる。ある実施態様では、各鳥は、本明細書に記載する1つ以上の抗原の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は100μgを投与され得る。さらにまた、各鳥は、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10週間の期間にわたって2、3、4又は5回抗原を投与され得る。各鳥は、各投与機会に同じ又は異なる用量のD.ガリナエ抗原を投与され得ることは理解されよう。
本発明の多様な組成物、免疫原性組成物、及びワクチンは、本明細書に記載する1つ以上の抗原を含み得ることは留意されるべきである。例えば、多様な組成物は、本明細書に記載する2つ以上の抗原を含むことができる。免疫プロトコルは、1つ以上の異なる組成物の使用（投与）を含むことができ、前記組成物は、動物（例えば鳥類対象動物）が本発明の1つ以上の抗原を既に投与されてあることをともに担保する。投与される予定の抗原は単独で又は一緒に投与することができる。2つ以上の抗原が投与される場合、前記抗原は別々に、及び異なる時に、一緒に又は同時に投与することができる。
【００３２】
経皮投与は、含侵遮蔽物、包帯、バンデージなどの使用によって、又は経皮デリバリー装置の何らかの形態を用いることによって達成できる。
本発明によって提供される多様な抗原は、D.ガリナエ抗原から直接誘導された調製物として提供され得る。例えば、本発明で使用される抗原は、ドナー動物及び/又は鳥類の環境又は生息場所から採集した全寄生生物又は断片化寄生生物から入手できる。ドナー動物は、自然に感染/蔓延した動物又は意図的に（実験的に）D.ガリナエを感染させた動物であり得る。ある実施態様では、抗原を誘導し得るD.ガリナエは、多数の異なる鳥類ドナー対象動物から入手できる（これらの鳥類対象動物は同じ又は異なる環境及び/又は生息場所に生息する）。鳥類種が農場飼育されている場合、D.ガリナエは、農場内の1つ以上の箇所（農場内の例えばある特定の囲い、鶏舎、ケージ又は小屋）から入手し得るか、及び/又は前記箇所内の1羽以上の感染又は蔓延した鳥類宿主から入手し得る。
D.ガリナエが感染/蔓延した（又は前記が感染/蔓延するリスクがある）鳥類対象動物の特定集団での使用が意図されるワクチン又は組成物は、（i）本発明の組成物を投与される特定集団の環境、生息場所又は現場から収集又は採集した1つ以上のD.ガリナエ、及び/又は（ii）本発明の組成物を投与される特定集団とつながりがある又は密接に関係する環境、生息場所又は現場から収集又は採集した1つ以上のD.ガリナエから誘導される1つ以上のD.ガリナエ抗原を含み得ることは理解されるべきである。例示すれば、農場が入り組んだ箇所（おそらく個別の地理的領域にわたって広がっている）を含む場合、本発明は、当該入り組んだ箇所の1つ以上から入手又は採集されるD.ガリナエ抗原を利用することができ、これらの抗原を用いて、当該入り組んだ箇所の各々で農場飼育される鳥類対象動物で使用される組成物及び/又はワクチンを提供できよう。
【００３３】
当業者は、上記2つのパラグラフに記載したタイプの組成物及び/又はワクチンを“自家組成物”又は“自家ワクチン”と称することができる。したがって、本発明は、鳥類種の免疫応答の惹起で使用される、本明細書に記載するD.ガリナエ抗原の1つ以上を含む自家組成物及びワクチンを提供する。
使用される任意のD.ガリナエ抗原を入手するために、採集又は収集したD.ガリナエを均質化プロトコルに付して、D.ガリナエ成分の均質化懸濁物を生成することができる。得られた均質化D.ガリナエ懸濁物を続いて1つ以上のサイズ/密度分離技術（例えば遠心分離）に付して、本発明の1つ以上の抗原を含む分画から望ましくないD.ガリナエデブリを除去することができる。続いて抗原含有分画を滅菌手順に付して、それらを本発明の使用に適切にすることができる。このようにして調製した抗原含有分画をさらに処理して、より希少のより高度に精製された（又はより清浄な）/濃縮された抗原又は特異的若しくは精選抗原を含む分画を生成できる（最終目標は、本明細書に記載する抗原又はその任意のフラグメントに一致する抗原を除く全てを含まない1つ以上の分画を生成することである）。例示すれば、使用される抗原分画の調製及び/又は1つ以上の特異的抗原の抽出のために、例えば陰イオン交換、ゲルろ過、及び/又は親和性クロマトグラフィーのような技術を用いることができる。例えば、本発明の抗原の1つ以上を投与した鳥類対象動物から抽出した抗体を適切な土台に固定し、当該抗体とそれらの標的抗原との間で結合が許容される条件下で、本発明の抗原の1つ以上を含む溶液と接触させることができる。例えば、当該溶液は種々の抗原のプールを含むことができる。このようにして、1つ以上の特異的な抗原を抗原混合集団から抽出又は濃縮することができる。
【００３４】
本発明の抗原を用いて卵黄（IgY）免疫応答を惹起することができる。卵黄IgYは適切な土台に固定し得る。
本発明で使用されるD.ガリナエ抗原は、1つ以上の冷凍保存/冷凍保護剤の添加によって低温又は凍結保存用に調製することができる。
ある実施態様では、本発明で提供する、使用、医薬及び方法のための抗原及び組成物は1つ以上のD.ガリナエ抗原を含み、前記抗原は、
（a）配列番号:1−22、
（b）（a）のいずれか1つと少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%相同であるか又は同一の配列、及び
（c）（a）、（b）又は（c）のいずれか1つの免疫原性フラグメントと少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%相同であるか又は同一の配列から成る群から選択される配列を含むか又は前記配列によってコードされる。
記述するように、D.ガリナエ抗原アミノ酸配列（配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22）の提供に加えて、本発明はさらに前記をコードするたような核酸配列（配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21）及び/又はそのフラグメント（好ましくは免疫原性ペプチドをコードするフラグメント）に関する。当該核酸配列を改変して、天然に存在する残基の1つ以上を一致する又は等価の合成若しくは化学的若しくは酵素的改変ヌクレオチドで入れ替えることができる。本明細書に開示する核酸配列を更なる改変に付して核酸コードの縮退を可能にすることができる。すなわち、いずれの野生型配列も改変して、その一次アミノ酸配列に一切影響を与えることなく1つ以上のコドン配列を改変することができる。
【００３５】
配列番号:1−22によって提供される配列（特に核酸配列）のいずれかの全部又は部分と実質的に相補性である核酸配列は本発明の範囲内である。そのような相補性配列はプライマー又はプローブとして有用であり得る。当該相補性配列は、本明細書に開示する任意の配列の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50又は50以上（例えば100まで、200又は200以上）の切れ目なく続く（continuous）又は連続する（contiguous）塩基を表す配列と相補性であり得る。
“実質的に相補性”という用語は、上記の配列番号:1−22のいずれか又はそのフラグメント（特に免疫原性フラグメント）と一切の核酸配列相補性に関してある程度の同一性/相同性を示す核酸分子を包含することは理解されるべきである。配列番号:1−22のいずれか（又はその免疫原性フラグメント）と配列相補性に関してあるレベルの同一性又は相同性を有する核酸配列は、完全長相補性配列又は該当するその部分と少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性又は相同性を示すことができる。
本発明はさらに、本明細書に記載するタンパク質/核酸配列のいずれかの天然又は人工生成変種若しくはアナローグに関することができる。そのような変種は、例えば参照配列（例えば、配列番号:1−22に開示されたものを含む本明細書に開示する配列）に対して1つ以上のアミノ酸/核酸の欠失、付加、置換及び/又は挿入を示すことができる。ある種の実施態様では、置換は保存的置換であり得る。保存的置換は、あるタンパク質又はペプチド配列の1つ以上のアミノ酸の同様な特性を有する代替アミノ酸による入替えを必要とし、保存的置換は自然のままの（又は野生型）タンパク質の物理化学的特性及び/又は構造又は機能を実質的に変更しない。
【００３６】
本発明によって提供される核酸分子は、核酸構築物又はベクター、例えばクローニング又は発現カセット/ベクターの形態をとることができ、前記には例えばEP1370284に記載された使用のためのファージベクターが含まれる。“核酸構築物”又は“ベクター”という用語はさらにDNAワクチンとしての使用が意図される構築物を包含することができる。
本発明によって提供されるベクターは、例えば細菌、真菌、動物（原生動物、鳥類種及び哺乳動物を含む）及び/又は昆虫細胞でD.ガリナエ抗原をコードする核酸配列の発現を指令することができる。
したがって、本発明は、本発明のD.ガリナエ抗原をコードする核酸配列、又は以下から成る群から選択される配列を有するか若しくは前記配列によってコードされる核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する：
（a）配列番号:1−22、
（b）（a）のいずれか1つと少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%相同であるか又は同一の配列、及び
（c）（a）又は（b）のいずれか1つの免疫原性フラグメントと少なくとも30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%相同であるか又は同一の配列。
本発明のこの特徴で使用される適切な発現ベクターはさらに、原核細胞又は真核細胞（例えば原生動物、鳥類、哺乳動物、真菌、細菌、植物及び/又は昆虫細胞）で発現を指令することができる、1つ以上のプロモーター配列を含むことができる。
【００３７】
本発明によって提供されるベクターは、環状又は直鎖状、単鎖又は二本鎖でもよく、DNA、RNA又はその組み合わせ若しくは改変物を含むことができる。さらにまた、本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はウイルスベクター（例えばレトロウイルス又はバクテリオファージベクター）であり得る。本発明によって提供されるベクターは、さらに選別又はマーカーエレメント、例えば抗生物質耐性遺伝子及び/又は場合によって検出可能タグを含むことができる。多数の適切なベクターが公知であり、更なる情報は以下の文献から入手できる：Pouwels et al. Cloning Vectors: a Laboratory Manual（1985及び補遺), Elsevier, N.Y.；及びRodriquez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass（1988）（前記文献はともに参照により本明細書に含まれる）。
したがって、該当するD.ガリナエ抗原を採集又は収集したD.ガリナエから直接的に抽出又は精製する技術に加えて、本発明で利用される抗原は組み換え技術を用いて入手できる。ある実施態様では、該当するD.ガリナエ抗原（例えば本明細書に記載の抗原のいずれか）をコードする1つ以上の核酸配列を含む発現ベクターを用いて、1つ以上の組換えD.ガリナエ抗原を生成することができる。
したがって、さらに別の特徴では、本発明は、本明細書に記載するベクターをトランスフェクトした又は前記で形質転換した宿主細胞を提供する。真核細胞又は原核細胞（例えば原生動物、鳥類、植物、昆虫、哺乳動物、真菌及び/又は細菌細胞）に本明細書に記載の1つ以上のベクターをトランスフェクトすることができる。異種又は外来核酸配列（例えば発現ベクター）を細胞に導入するために用いられる技術は当業者には周知であり、これら技術には、例えば熱ショック処理、形質転換/トランスフェクションを誘発する1つ以上の化学物質（例えばリン酸カルシウム）の使用、ウイルス担体、マイクロインジェクション及び/又は例えばエレクトロポレーションのような技術の使用が含まれる。形質転換/トランスフェクション技術に関する更なる情報は以下の文献で見出すことができる：Current Protocols in Molecular Biology, Ausuble, F.M., et al., John Wiley & Sons, N.Y.（1989）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３８】
上記の観点から、本発明は、配列番号:1−22（又はその免疫原性フラグメント）の配列を含む又は前記配列によってコードされるD.ガリナエ抗原を生成して鳥類の免疫応答の惹起で使用されるプロセスを提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明の核酸配列で宿主細胞を形質転換するか、又は本発明の核酸構築物を宿主細胞にトランスフェクトする工程；（b）当該核酸の発現（より適切に言えば前記によってコードされるタンパク質の発現）が生じる条件下で（a）で入手した細胞を培養する工程；及び（c）発現された組換えタンパク質又はペプチドを当該細胞培養及び/又は培養上清から単離する工程。
上記の方法にしたがって生成される組換えタンパク質/ペプチドは、ワクチン又はワクチン組成物で用いる前に部分的に宿主細胞から精製することができる。ポリペプチドが宿主細胞から分泌される場合には、細胞を培地から遠心分離によって分離することができる。そのような状況では、上清（分泌ポリペプチドを含む）を直接ワクチンとして又はワクチン組成物で用いることができる。また別に、ポリペプチドをこの上清から例えば親和性クロマトグラフィーを用いて部分的に精製してもよい。
本明細書に記載するD.ガリナエ抗原のいずれも別の成分（例えば別のポリペプチド及び/又はアジュバント、希釈剤又は賦形剤）と混合することができる。
例えば、本発明によって提供される組成物、免疫原性組成物、及び/又はワクチン/ワクチン組成物は、他の鳥類疾患/感染又は蔓延を制御するために用いられる、例えばウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原又は他の寄生生物抗原を含むことができる。
例えば、当該ワクチン又はワクチン組成物は、他の鳥類（例えばニワトリ）疾患に対する抗原を含む多価ワクチンに取り込まれることができる。これらのワクチンは、例えば下記の表1に列挙されるワクチン及び標的生物を含むことができる。
【００３９】
表1：例示鳥類ワクチン
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【００４０】
本発明で使用されるアジュバント又は本明細書に記載する組成物に添加されるアジュバントは、例えばアルミニウム塩（ミョウバン）、油エマルジョン、サポニン、免疫刺激複合物（ISCOM）、リポソーム、ミクロ粒子、非イオン性ブロック共重合体、誘導多糖類、サイトカイン、及び/又は細菌誘導物質形を含むことができる。
さらにまた別の特徴では、本発明は、本明細書に記載するワクチン又は組成物、及び/又は本明細書に記載する1つ以上のD.ガリナエ抗原を含むワクチン又は組成物で処置された、ワクチン接種された、又は免疫された鳥類集団、例えばニワトリの農場飼育集団を提供する。
本発明に記載するワクチンは、1つ以上のD.ガリナエ抗原が動物の接種に用いられるサブユニット型ワクチンの形態をとり得ることは当業者には理解されるであろう。加えて或いはまた別に、ワクチンは、本発明によって提供される1つ以上の抗原又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子を含み、ワクチン接種される動物の細胞によって発現させることができる（DNAワクチンとして知られている）。このようにして、ワクチン接種宿主（例えばワクチン接種ニワトリ）で、D.ガリナエ抗原の構成的発現が構成的防御性免疫応答を誘引することができる。
動物の免疫応答の惹起で使用されるD.ガリナエ抗原の提供に加えて、本発明はまた、記載のD.ガリナエ抗原のいずれかと結合する（或いは親和性又は特異性を有する）ポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体（又はその抗原結合フラグメント）を提供することができる。タンパク質/ペプチド配列に特異的なポリクローナル/モノクローナル抗体の生成及び単離は当業界では日常的であり、更なる情報は例えば以下の文献で見出すことができる：“Basic methods in Antibody production and characterisation” Howard & Bethell, 2000（Taylor & Francis Ltd.）。そのような抗体を診断手順で用いて、例えば鳥類種のD.ガリナエ感染/蔓延とともに受動免疫も検出又は診断することができる。“抗体”という用語は卵黄抗体（IgY）を含む。
【００４１】
本発明はさらに、鳥類宿主におけるD.ガリナエ感染/蔓延及び随伴する疾患の予防又は制御で使用されるワクチンを提供する。ワクチンはポリペプチドワクチン又はポリヌクレオチドワクチンであり得る。
本発明はさらに、D.ガリナエ感染/蔓延及び随伴する疾患（例えば二次感染など）に対して鳥類を免疫する方法を提供し、前記方法は、本発明のワクチンを鳥類に投与する工程を含む。
本発明はさらに、D.ガリナエの感染、蔓延及び/又はサンプル汚染を診断又は検出する方法を提供する。当該方法は、本発明の1つ以上のD.ガリナエ抗原、及び/又は本発明の抗原のいずれかに対して特異性及び/又は親和性を有する抗体を利用することができる。使用される抗体及び/又は抗原は、土台に（おそらく何らかの形態の結合部分（例えば抗体）を介して）固定することができる。
適切な土台には、ニトロセルロース、ガラス及び/又はプラスチックを含むもの、例えばマイクロタイタープレートなどが含まれ得る。使用される抗体及び/又は抗原を多数の別々のスポットを含むアレーとして固定できる。任意の与えられたスポットは、それぞれ別個に単一タイプの抗体/抗原又は単一の抗原特異性/親和性を有する複数の抗体を含むことができる。加えて或いはまた別に、任意の与えられたスポットは、種々のタイプの抗体若しくは抗原又は種々の抗原に対して特異性/親和性を有する複数の抗体を含むことができる。
診断又は検出方法は、サンプルを本発明の（場合によって固定されてある）抗原又は抗体と接触させる工程を含むことができる。サンプル及び本発明の（場合によって固定されてある）抗原又は抗体を、サンプル中の一切の抗体及び/又は抗原と本発明の（場合によって固定されてある）抗体及び/又は抗原との結合を許容する条件下で接触させることができる。
したがって、本発明の検出及び/又は診断方法を用いて、1つのD.ガリナエ抗原及び/又は複数のD.ガリナエ抗原と反応する（又は特異性及び/又は親和性を有する）抗体の存在についてサンプルをプローブすることができる。サンプルの供給源及び性質に応じて、サンプル中の1つのD.ガリナエ抗原及び/又は複数のD.ガリナエ抗原と反応する（又は特異性及び/又は親和性を有する）抗体の存在が確認されれば、D.ガリナエの感染、蔓延及び/又は汚染の指標となり得る。
【００４２】
1つのD.ガリナエ抗原及び/又は複数のD.ガリナエ抗原と反応する（又は特異性及び/又は親和性を有する）抗体の存在は、抗体/抗原複合体の検出によって確認できる。例えば、当該方法がサンプル中の抗D.ガリナエ抗体の存在を検出するために利用される場合、サンプル中の一切の抗体と当該サンプルが接触されてある抗原との結合を許容する適切な条件下で、当該サンプルを本発明の（場合によって固定されている）抗原のいずれかと接触させることができる。未結合物質を除去するために場合によって洗浄した後、例えば、当該サンプル中に存在する抗体に対して親和性を有する標識された（例えば蛍光又は化学発光により標識された）二次抗体（又は他の結合部分）を使用して抗体/抗原複合体を検出することができる。類似の方法を実施して、サンプル中のD.ガリナエ抗原の存在を検出することができる。このタイプの方法では、抗原は本明細書に記載する抗原のいずれでもよく、抗原に対して特異性及び/又は親和性を有する（場合によって固定された）抗体とサンプルを接触させることができる。洗浄して未結合物質を除去した後、抗原/抗体複合体の検出は、当該複合体又はその成分（例えば当該抗原成分）と結合する標識（例えば蛍光又は化学発光標識）二次抗体（又は他の結合部分）を使用することによって達成できる。サンプルは、生物学的サンプル、例えば血液サンプル（例えば鳥類/ニワトリの血液、全血、血漿又は血清）、卵黄、糞便、尿、汗、組織、皮膚、剥離物、分泌物などを含むことができる。サンプルは環境又は野外サンプル、例えば巣作り材料、わら、土壌、草、飼料、飲水などのサンプルを含むことができる。
本発明はさらにキットを提供し、前記キットは、場合によってD.ガリナエの感染、蔓延及び/又は汚染を検出及び/又は診断する方法で使用され、本明細書に記載する1つ以上の抗原及び/又は本発明の抗原のいずれかに対して特異性及び/又は親和性を有する抗体を含む。キットで使用される抗原及び/又は抗体は適切な土台に固定できる。キットはさらに、使用のための指示、反応のための容器、並びに検出及び/又は診断方法で使用される希釈剤、緩衝液及び/又は洗浄溶液を提供できる。
下記の図面を参照しながら本発明をこれから詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】デルマニスス・ガリナエに所定の血液飼料をデリバーするために用いられるin vitro吸血装置  当該装置はWrightら（2009）[9]が記載した装置の改造である。具体的な改造には以下が含まれる。ニワトリ皮膚吸血膜を事前に引き延ばしたパラフィルム“M”（Bemis(商標) Flexible packaging）で置き換え、仔羊去勢用ゴムリング（NetTex）をパステットバルブ周囲に配置して密封を作り出し血液飼料の漏れを防ぐ。
【図２】イオン交換クロマトグラフィー後のデルマニスス・ガリナエ可溶性タンパク質プール（IEX-プール）のそれぞれ異なる免疫反応プロフィール  2μgのIEX-プール1から5及び2μgの可溶性ダニタンパク質（SMP、プール6）を12%のBis-Tris Novexゲル（Invitrogen）で分離し、ニトロセルロースに移し、SMPに対して作製した80μg/mLのIgY（左ブロット）又はナイーブな雌鶏から得た80μg/mLのIgY（右ブロット）を用いてプローブした。結合IgYはウサギ抗IgY-ペルオキシダーゼ（Sigma）で検出し、SIGMA FASTTM 3,3’-ジアミノベンジジン基質（Sigma）で可視化した。
【図３】ワクチン接種雌鶏の血液摂取後のデルマニスス・ガリナエの生存  IEX-プール（グループ（Gp）1−5）、可溶性ダニ抽出物（グループ6）又はアジュバント単独（グループ7）でワクチン免疫した雌鶏のヘパリン添加全血でダニを飼育した。生存分析はフレイルティ関数を用いコックス比例ハザードモデルにより実施した。吸血後24、48、72及び96時間後の生存ダニの平均比率が、対応する95%信頼区間（斜線部）とともにプロットされている。
【図４】IEXグループ1タンパク質の2-Dゲル分析及びそれらの対応する免疫反応スポットのプロフィール  IEXグループ1タンパク質を7−11のpI範囲でレプリケートゲルにより分離した。1つのゲルをSimplyBlueTM SafeStain（Life Technologies）（パネルC）で染色し、2つのレプリケートゲルで免疫ブロットを実施し、グループ1でワクチン免疫した雌鶏の100μg/mLの卵黄IgY（パネルA）又はコントロール（グループ7）雌鶏の100μg/mLの卵黄IgY（パネルB）でスクリーニングした。結合IgYはウサギ抗IgY-ペルオキシダーゼIgGで検出し、化学発光基質で可視化した。LC-ESI-MS/MSの後、切り出して同定されるスポットは丸で囲み番号を付されている。
【図５】IEXグループ4タンパク質の免疫親和性濃縮  IEXグループ4タンパク質に対して作製した精製卵黄IgYをHiTrap NHS-活性化カラムに架橋し、IEXグループ4タンパク質を免疫親和性クロマトグラフィーによって選択的に濃縮した。親和性精製前のグループ4タンパク質（パネルA、レーン1及び3）及び溶出した親和性濃縮材料（パネルB、レーン2及び4）を12% Bis-Tris Novexゲル（Invitrogen）で分離し、ニトロセルロースに移した。免疫ブロットのレーン1及び2（パネルA）をグループ7（アジュバント単独コントロール）の雌鶏のプール血清（1：200希釈）でプローブし、レーン3及び4をグループ4の雌鶏のワクチン免疫後のプール血清（1：200希釈）でプローブした。結合IgYはウサギ抗IgY-ペルオキシダーゼ（Sigma）で検出し、SIGMA FASTTM 3,3’-ジアミノベンジジン基質（Sigma）で可視化した。溶出免疫親和性濃縮材料をさらに濃縮し、電気泳動により分離し、SimplyBlueTM SafeStainで染色した（パネルB、レーン5）。レーン5に現れる染色された濃縮タンパク質プロフィールを24の等しいサイズの水平薄片に切断し、抽出タンパク質をLC-ESI-MS/MSに付した。
【図６】免疫雌鶏の血液で飼育したダニの生存に対する組換えデルマニスス・ガリナエタンパク質による雌鶏の免疫の効果  組換えワクモ抗原で免疫した雌鶏の血液で飼育されたダニの生存分析のグラフによる要約を示す（ダニの生存は吸血後の時間に対してプロットされている）。95%信頼区間は斜線領域によって表されている。この図の略語として、Deg-SRP-1は“Serp-02564”、Deg-HGP-1は“HemeLGP-13207”、Deg-VIT-1は“Vit-12013”、Deg-PUF-1は“UK-11549”、Deg-ASP-1は“Asp-00293”、Deg-PUF-2は“UK-13089”、Deg-SRP-2は“Serp-01514”、Deg-CPR-1は“PepC1A-13094”、Deg-GPD-1は“PGDH-00877”、及びDeg-PUF-3は“UK-00186”である。
【００４４】
材料と方法
ダニ吸血アッセイ及びタンパク質抽出に使用されるD.ガリナエダニの収集及び条件付け
スコットランドの産業的卵生産ユニットから、発育期及び性別が入り混じったD.ガリナエダニを75cm2の通気口付き組織培養フラスコ（Corning）に収集した。ダニを廃棄材から離れさせてから、液体窒素で瞬間凍結し必要になるまで-80℃で保存した。収集から24時間以内に瞬間凍結したダニは“吸血ダニ”集団を構成する。なぜならば、これらのダニの大半は吸血から時間が経過していないからである。“飢餓ダニ”は、室温（RT）で7日間の初期インキュベーション、続いて4℃で14日間の保存によって条件付けされた。飢餓ダニは、吸血アッセイで用いるか、又は液体窒素で瞬間凍結して必要になるまで-80℃で保存された。
【００４５】
可溶性ダニタンパク質（SMP）の抽出
可溶性ダニタンパク質（SMP）は瞬間凍結ダニから以下のように調製された：1gの凍結ダニを10mLの氷冷リン酸緩衝液（PBS）に懸濁し、氷上で2ｘ30秒パルス（S25N-8G分散エレメント付きUltra Turrex(商標) T 25 D-S2、IKA）で均質化した。不溶性物質及びデブリを遠心分離（25,000ｘg、4℃、20分）によって除去した。可溶性物質をデカントし、2度目の遠心分離でこのSMPをさらに清澄にした。このSMPを直ちに液体窒素で瞬間凍結して-80℃で保存した。SMPの濃度はビシンコニン酸（BCA）アッセイ（Peirce）を製造業者のプロトコルにしたがって用いて概算した。
【００４６】
イオン交換クロマトグラフィー（IEX）によるSMPの分画
イオン交換クロマトグラフィー（IEX）の前に、20mgのSMPをPD-10脱塩カラム（GE healthcare）で脱塩した。IEXは、AKTA高速液体タンパク質クロマトグラフィー（FPLC）系（Amersham Biosciences）と一緒にした1mLのHiTRAP Q HP陰イオンカラム（GE healthcare）を用いて室温で実施し、20 mMトリス-HCL（pH7.4）中の0から0.5M NaCl濃度の直線勾配とその後のイソクラチック工程（20mMトリス-HCL、1M NaCl（pH7.4））で溶出を行った。溶出タンパク質を1mLの分画で収集し、直ちに液体窒素で瞬間凍結し-80℃で保存した。IEX-SMP分画の免疫ブロットを、アジュバント中の全SMP又はアジュバント/PBS単独（コントロールグループ）で免疫し（下記に記載）、その免疫原性プロフィールにしたがって5つの別個のプール（グループ1−5）にプールした雌鶏のIgYでプローブした。IEX-SMPプール及び未分画SMPの各々をUltracel(商標)-10K Amicon(商標)Ultra-15遠心分離フィルターユニット（Merck Millipore Ltd）で濃縮し、0.22μM Millex-GV 13 mm PVDFユニット（Merck Millipore Ltd）でろ過滅菌し、雌鶏を免疫する前に濃度を決定した（BCAキット、Pierce）。
【００４７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）及び免疫ブロットのデベロップ
一次元ゲル電気泳動（1D-PAGE）のために、所定濃度のダニタンパク質をNuPAGE(商標)MES SDS泳動緩衝液（GE healthcare）中の12% Bis-Tris Novexゲルで分離した。タンパク質は、銀染色（SilverQuest, Invitrogen）によりin situで可視化するか、又は免疫ブロッティングのためにXcell IIブロットモジュール（GE healthcare）で製造業者の指示にしたがってニトロセルロース膜に移した。免疫ブロットのデベロップのために、電気的にブロットされたタンパク質を保持する膜をPBST（PBS、0.05%（v/v）トウィーン20（Sigma））中の5%（w/v）粉乳中でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、固定タンパク質を、PBS中の80−100μg/mL卵黄由来IgY（卵黄-IgY）で、又はPBSで1：50から1：200に希釈した血清でプローブした。IgY及び血清は、[9]の記載のように、Quil Aアジュバント中のSMP又はアジュバント/PBS単独で免疫した雌鶏に由来した。ブロットを洗浄し、結合IgYを、ウサギ抗IgY-ペルオキシダーゼ結合物（PBS（Sigma）で1：20,000に希釈）中でのインキュベーションによって検出した。ブロットをPBST中で5回洗浄した後、比色基質：SIGMA FASTTM 3,3’-ジアミノベンジジン（Sigma）又はSuperSignal West Pico化学発光基質（Thermo Scientific）中でデベロップさせた。ブロットはImageQuant LAS4000発光画像分析装置（GE healthcare）を用いて捕捉した。
【００４８】
IEX-SMP分画による雌鶏の免疫及び殺ダニ効果の評価
14羽のISA-ウォーレンス雌鶏（24週齢）を以下のように7つのグループにランダムに振り分け（5つのIEX-プール（グループ1−5）、全SMP（グループ6）、及びQuilAアジュバント単独（コントロール、グループ7））、隔週の間隔で3回適切な免疫原で免疫した。各々200μLのワクチン用量を処方し、前記は200μgの適切なタンパク質及び200μgのQuilAアジュバント（Brenntag Bioserve）（グループ1から6）、又は200μgのQuilA単独（グループ7）を含んでいた。ワクチンを交互の胸部筋肉に筋肉内投与した。卵黄-IgYの供給源としてワクチン接種前及びこの実験を通して卵を収集した。IgYは、IgY精製キットを用い製造業者（Pierce）の指示にしたがって卵黄から精製した。それぞれのワクチン接種前並びに最終ワクチン接種から3、5及び6週間後に、翼の上腕静脈から全血をヘパリン添加（最終濃度36USP/mL血液）チューブに採取した。ダニ生存におけるワクチン接種雌鶏の血液摂取の影響を査定するために、各グループで2羽のトリのヘパリン添加血液をプールし、以前に記載されたin vitro吸血装置[9]の改造型（図1）を用いて、条件付けしたD.ガリナエに投与した。各グループのために10の吸血チャンバーをセットアップし、相対湿度75%、39℃、24時間間隔でダニに吸血させた。吸血ダニを吸血チャンバーから取り出して96ウェルのマイクロタイタープレートに単離し、直ちに、さらに吸血から48、72及び96時間後に生存率についてダニを点数化した。吸血アッセイは最終免疫から3、5及び6週間後に実施した。
【００４９】
二次元（2-D）ゲル電気泳動及び免疫反応スポットの同定
IEX-濃縮由来のグループ1及び4のタンパク質を二次元（2-D）電気泳動により分離し、構成的免疫反応タンパク質をプロテオミクス分析と結合させたウェスタンブロット分析を用いて同定した。当該2-D手順で用いた全てのキット、材料及び装置は製造業者（GE healthcare）から入手し、さらに特段の記載がなければ、全ての手順は当該製造業者のハンドブック（GE healthcare, 2004）に掲載された詳細な方法論にしたがった。
グループ1及び4のタンパク質の100μgアリコットから不純物を除去した後、前記を以下に再懸濁し（7M尿素、2%（w/v）CHAPS、2Mチオウレア、0.3%（w/v）DTT、0.002%（w/v）ブロモフェノールブルー、2%（v/v）IPG緩衝液（プール1についてはIPG緩衝液7−11；プール4については3−10））、適切なImmobiline DryStrips上で16時間、室温で再水和し、以下のように等電点電気泳動に付した：300Vで30分、30分かけて1000Vに上昇、続いて90分かけて5000Vに上昇、続いて5000Vで25分間。フォーカシングしたタンパク質を以下の溶液で15分間変性させ（75mMトリス-HCl（pH8.8）、6M尿素、30%（v/v）グリセロール、2%（w/v）SDS、0.002%（w/v）ブロモフェノールブルー（10mg/ml DTTを補充））、続いて25mg/mLのヨードアセトアミドを含む平衡化緩衝液で15分間インキュベートし、続いて、Multiphor II電気泳動系でExcel SDS二次元均質ゲル12.5%（25cmｘ11cm）を用い二次元で分離した。
二次元ゲルの1つのレプリケートを切断し、SimplyBlueTM SafeStain（Invitrogen）でタンパク質を染色した。残りの2つのレプリケートゲルをHybond-Cニトロセルロース膜にエレクトロブロットし、以下の100μg（グループ1又は4タンパク質に対して雌鶏で作製したPBS中の卵黄-IgY（陽性）又はアジュバント単独のコントロールグループ7由来の卵黄-IgY（コントロール））を用いて免疫スクリーニングを上記のように実施した。同時局在化染色し、さらに免疫標識したタンパク質スポットをSimplyBlueTM染色したゲルから切り出し、タンパク質をLC-ESI-MS/MSに付してペプチドデータを作製した。前記データをNCBInrデータベース（09-Jan-2015）及びカスタムD.ガリナエトランスクリプトームデータベース（Bartley et al., 2015（準備中））で検索し、ストリンジェントな同定基準（[13]に記載）を用いて該当するタンパク質をコードするDNA配列を同定した。
【００５０】
SMPの免疫親和性濃縮
IEXグループ4タンパク質の濃縮を可能にするために、1mLのHiTrap NHS-活性化HPカラム（GE healthcare）に、IEXグループ4タンパク質で免疫した雌鶏の卵黄-IgYを架橋した（IEXグループ4タンパク質は、還元、変性条件下と対照的に自然のままの条件下でIgYと結合した）。略記すれば、製造業者のスピン手順にしたがって、カップリング緩衝液（0.2M NaHCO3、0.5M NaCl（pH8.3））で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）を用いて精製卵黄-IgYの緩衝液交換を実施した。HiTrap NHS-活性化HPカラムを6mLの氷冷HCL（1mM）でプライムし、カップリング緩衝液中の卵黄-IgY（3.75mg）を3時間、4℃でカラムを再循環させた。卵黄-IgYをセファロースマトリックスに架橋し、さらに2mLの緩衝液A（0.5Mエタノールアミン、0.5M NaCl（pH8.3））及び2mLの緩衝液B（0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaCl（pH4））による連続洗浄の3ラウンドとその後の12mLのPBSによる平衡化によってカラムを脱活性化した。IEXグループ4タンパク質（1.4mg）を4℃で16時間カラムに再循環させた。未結合物質を10mLのPBSでカラムから洗浄し、結合タンパク質は4mLの溶出緩衝液（0.1Mグリシン、6M尿素（pH2.5））で溶出させた。濃縮された免疫反応成分をカラムから溶出させ、SDS-PAGEゲルで分離した（NuPAGE(商標)MES SDS泳動緩衝液中の4−12% Bis-Tris Novexゲル（GE healthcare））。前記ゲルを続いて24片の2.5mm切片に分割し、以前に記載されたように[12]、各切片をLC-ESI-MS/MSに付した。カスタムD.ガリナエのトランスクリプトームデータベース（Bartley et al., 2015(準備中)）及びNCBInrデータベース（09-Jan-2015）のマスコット検索を用いて、各ゲル切片内の成分を同定した。
【００５１】
組換えタンパク質の作製及びワクチン潜在能力の査定
上記のように2-D免疫ブロッティング又は免疫親和性精製によりIEXグループ1及び4から識別した10タンパク質を、ワクチン候補として更なる分析のために選択した(表3)。これらタンパク質の各々をコードする転写物のオープンリーディングフレーム（ORF）のコード配列（CDS）は、それらの該当するコンティグのバイオインフォマティクス分析から推測するか、又はDeg-SRP-2の事例ではcDNA末端の迅速増幅（RACE）によって誘導された。“Deg-PUF-2”と名付けられたタンパク質は、2つの変種コンティグ配列を有した。これらDeg-PUF-2変種の両方のCDSを合成し（MWGオペロン）、一方、残りの全てのワクチン候補のCDSは、以前の記載[14]のように全RNAからRT-PCRによって増幅した。Deg-PFU-2の両変種1及び2並びにDeg-CPR-1のCDSを発現ベクターpET22b（Novagen）でサブクローニングし、他の全てのワクチン候補のCDSはpET SUMOでサブクローニングした（予想されるシグナルペプチドコード配列は適切な場合には省略した）。当該プラスミドの各々で大腸菌BL21コンピテント細胞を形質転換した後、各タンパク質の組換え型を生成し、以前の記載のように親和性精製した[8,14]。それらのサイズ（したがって発現の困難性）のために、Deg-HGP-1は2つの半分部分として発現させ、さらにDeg-VIT-1のN-末端側の半分のみを発現させて免疫原として用いた。組換えタンパク質の各々のワクチン潜在能力は以下のように査定した：産卵期の雌鶏の筋肉内（胸部）に3回2週間間隔で表3に記載のタンパク質の各々の50μgをアジュバントとして200μgのQuilAとともに注射した。アジュバント単独コントロールグループもまた加えた。血清抗体レベルのモニター及びin vitro吸血アッセイのために、各ワクチン接種前及び3回目のワクチン接種後の2週間から始めて1週間間隔で各雌鶏の翼の上腕静脈から血液を採取した。上記及び図1に示した改造in vitro吸血装置を用いて、免疫した雌鶏の血液をダニに与え（血液は3回目の免疫から2、3及び4週間後に採取）、死亡率を5日間にわたって24時間間隔で測定した。吸血アッセイはトリプリケートで実施した。対応するアジュバント単独コントロールグループと比較して、平均死亡率の増加が得られた。
【００５２】
統計分析
ダニの死亡率データを2つの異なる統計的アプローチを用いて分析した。生存分析（説明変数として処置グループを取り入れる）を、フレイルティ関数を用いるコックス比例ハザードモデルに基づいて実施した。96時間後に生存していたダニを中途打ち切りデータとして処理した。フレイルティ関数は、変量効果として各実験内の複製物、及びガウス分布を想定して制限付き最尤法を用いて得られる変量効果の概算を組み入れた。第二のアプローチでは、各処置グループの24、48及び96時間におけるダニの累積死亡率を別々の一般化線形混合モデル（GLMM）で分析し、これらの時点におけるグループ間の平均死亡率の相違を調べた。当該モデルは、母数効果として処置グループをさらに変量効果として各実験内のレプリケートを含んでいた。データの過分散は、個々のレベルの変量効果を含むことによって斟酌された。一般化線形混合モデルは、二項分布及びロジットリンク関数を用いて当てはめられた。
【００５３】
結果
SMPのイオン交換クロマトグラフィー（IEX）によるSMPの分画
IEXは、SMPに含まれる複雑なタンパク質混合物を、未結合タンパク質を含む“フロースルー”（FT）分画（グループ1プール）、及び最小限のタンパク質オーバーラップと免疫反応性プロフィールを有する4つのグループ（グループ2−5）にプールできる連続的に溶出する分画に分離することができた（図2）。最低限の免疫反応性が、IEX-分画又はSMPを非免疫雌鶏のIgYとインキュベートしたときに検出されたが、ただし分子量が約25及び65KDaの2つのタンパク質（前記はIgY軽鎖及び重鎖に一致する）は除かれる。IEX-分画及びSMPに存在するIgYは、ダニの腸に存在する血液飼料に由来し、前記が抗IgY-ペルオキシダーゼ結合物によって検出される。
【００５４】
IEX-SMP分画による雌鶏の免疫及び殺ダニ効果の評価
5つのIEX-プール（グループ1−5）、全SMP（グループ6）及びQuilAアジュバント単独（コントロール、グループ7）を用いて、雌鶏を免疫し、免疫した雌鶏の血液をダニに与えた。当該血液飼料を摂取したダニを、吸血24時間後及びその後毎日死亡率について点数化した。全ての免疫グループ（グループ2を除く）でダニの平均死亡率は、コントロールグループより低かった（p＜0.001）（表2、図3）。グループ1及び4のダニは、実験中いずれの時点でも最高の死亡率リスクを有し、コントロールグループよりも死亡の確率は3.06から3.72倍であった（p＜0.001）。同様に、吸血96時間後の各処置グループのダニの累積死亡率のGLMM分析もまた、グループ1及びグループ4を最高の死亡率（それぞれ0.37及び0.40）を有すると認定した（p＜0.05）。吸血24、48及び72時間後のより早い時点では、グループ1及び4のみが、コントロールグループと比較して一貫しかつ実質的に有意な死亡率の増加を示した。両分析は、IEX-プール1及び4によるワクチン免疫はダニ生存で最強の効果を有することを示唆し、したがってIEX-プール1及び4を、これらのIEX-プールの免疫反応性でありかつ潜在的な防御性タンパク質成分を識別する綿密な分析のために選択した。
【００５５】
2-Dゲル電気泳動及び免疫親和性精製を用いるワクチン候補の認定
免疫ブロッティングと合体させた2-Dゲル電気泳動は、IEX-グループ1プール（図4）及びグループ4プール（データは示されていない）の高解像分離及び免疫反応性スポットの明瞭な存在を示した。しかしながら、2-Dゲルプラットフォームにおけるタンパク質の解像は、還元条件下におけるタンパク質の効率的な変性に左右される（還元は立体的エピトープの消失をもたらし得る）。したがって、2-D PAGE分析から得られるデータを補完するために、第二の非変性免疫親和性濃縮アプローチを利用してタンパク質を識別した（図5）。免疫ブロッティング及び免疫親和性精製から得られたグループ1及び4の全ての免疫反応性タンパク質の実体を表5（グループ1タンパク質）及び表6（グループ4タンパク質）に要約する。それぞれ合計14及び16のスポットをグループ1及びグループ4から2-D PAGE免疫ブロッティングによって識別した。
グループ4タンパク質（グループ1ではなく）の免疫親和性濃縮は成功した（図5）。非濃縮物質（図5A、レーン3）と親和性濃縮物質（図5A、レーン4）との免疫ブロットの比較から、免疫親和性濃縮工程に続いていくつかのタンパク質の特異的濃縮が存在することは明瞭である。濃縮タンパク質の大半は55KDaを超える分子量を有し、免疫ブロットにおけるこれらのバンドのいくつかの強度によって強い免疫反応性及び/又は豊富さが示唆される。
【００５６】
組換えタンパク質の作製及びワクチン潜在能力の査定
その免疫反応性及び仮説的機能によってIEX-グループ1及びグループ4タンパク質で認定された10の選別候補抗原（表3）について組換えタンパク質を作製した。これらの組換え抗原は首尾よく大腸菌で発現され、ニッケル親和性クロマトグラフィーを用いて親和性精製され、さらに雌鶏の免疫前に再折畳みすることができた。免疫雌鶏の血液でダニをin vitroで飼育し、吸血期間後4日間にわたって適用したコックス比例ハザードモデルを用いて、吸血アッセイから得られた全データを分析した（表4、図6）。更なる分析で、一般化線形混合モデル（GLMM）を吸血後24及び120時間の死亡率データに適用した（表4）。Deg-SRP-1、Deg-PUF-1、Deg-HGP-1及びDeg-VIT-1による免疫はダニ死亡率で最大の増加をもたらすことを示す強力な統計的証拠が、両試験を用いたときに存在した（p＜0.05）。
【００５７】
結論
1）未精製の可溶性D.ガリナエ抽出物のイオン交換クロマトグラフィーによる細分画は、in vitroで試験したとき、有意なワクチン潜在能力を有する半精製タンパク質プールの認定をもたらした。
2）これらのタンパク質の2-D分離の免疫親和性分析及び免疫ブロッティングはプロテオーム分析と一体となって、もっとも強力な免疫反応性タンパク質の実体を明らかにした。
3）これらタンパク質の4つ、セルピン、ビテロゲニン、ヘムリポ糖タンパク質及び未知機能のタンパク質の組換え型は、これらのタンパク質で免疫した雌鶏の血液をダニに与えたときにin vitro吸血分析で有意なレベルのダニ死亡率を提示した。
【００５８】
表2：免疫雌鶏及びコントロール雌鶏の血液摂取後のダニ死亡率における影響
2018512152.tif 000007
aコントロールグループ7と比較した実験期間中のワクチン接種グループ（1−6）におけるダニ死滅リスク比。
LCI及びUCI：下方及び上方95%信頼区間
【００５９】
表3：ワクチン抗原候補として選択された10タンパク質の要旨
選択は、免疫ブロッティング及び免疫親和性タンパク質濃縮の2-D電気泳動を用いプロテオーム識別に基づく。7抗原が他の種の既知タンパク質との相同性に基づいて推定される機能を有し、3抗原は未知機能を有する。
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【００６０】
表4：個々の抗原でワクチン接種された雌鶏の血液を与えられたダニの生存分析
ダニの生存の有意な低下をもたらす処置はピンクで強調されている。
2018512152.tif 000009
【００６１】
表5：IEXグループ、2-Dゲル免疫反応スポットのプロテオーム分析
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【００６２】
表6：IEXグループ4、2-Dゲル免疫反応スポットのプロテオーム分析及び免疫親和性濃縮グループ4タンパク質
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【００６３】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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