(57)【要約】本開示は、概して、細胞の遺伝子修飾のための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ゲノム改変（例えば部位特異的ヌクレアーゼ）のための安定化された試薬、及び非遺伝子コード改変修飾（例えばＤＮＡメチル化）のための安定化された試薬に関する。安定化方法は、好適な温度での試薬の貯蔵、乾燥形態への変換、及び化学修飾を含む。2018533962.tif 000004
2018533962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の安定化された遺伝子改変試薬を調製するための方法であって、
（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の溶媒中溶液を調製することと、
（ｂ）（ａ）の溶媒の８０％超を除去することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記溶媒が、水、１種以上のアルコール、または水及び１種以上のアルコールの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種が、
（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、
（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び
（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
からなる群から選択される１種以上の試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水が、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧フリーズドライ、超臨界流体乾燥、または真空遠心により除去される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒の８０％から９９．５％が、前記１種以上の遺伝子改変試薬の水溶液から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
個々の遺伝子改変試薬が、１枚のマルチウェルプレートの２つ以上のウェル内に入れられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記個々の遺伝子改変試薬の前記溶媒中溶液が、前記マルチウェルプレートのウェルに加えられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記個々の遺伝子改変試薬が多層プレートのウェル内に存在する間に、水性の前記溶媒の一部または全てが、前記個々の遺伝子改変試薬から除去される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
５０から１００個の個々の遺伝子改変試薬が、前記マルチウェルプレートの異なるウェル内に入れられる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記個々の遺伝子改変試薬が、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液が、
（ａ）１種以上の緩衝剤、
（ｂ）１種以上のプロテアーゼ阻害物質、
（ｃ）１種以上のヌクレアーゼ阻害物質、
（ｄ）１種以上の塩、
（ｅ）１種以上の炭水化物、
（ｆ）１種以上のトランスフェクション試薬、
（ｇ）１種以上のポリアミン、及び
（ｈ）１種以上の培養培地
からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記炭水化物が、スクロース、トレハロース、ラクトスクロース、またはシクロデキストリンの１つ以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水の除去前の前記水溶液のｐＨが４から約１１の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の遺伝子改変試薬を貯蔵するための方法であって、
（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の水溶液を調製することと、
（ｂ）（ａ）において調製された前記水溶液から水の９０％超を除去することと、
（ｃ）３０日間の貯蔵後に遺伝子改変機能活性の７５％超が保持される条件下に、１種以上の遺伝子改変試薬を置くことと
を含む、方法。
【請求項１５】
少なくとも３０日間の貯蔵後に、少なくとも１種または前記１種以上の遺伝子改変試薬の遺伝子改変機能活性の９０％超が保持される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１２０日間の貯蔵後に、少なくとも１種または前記１種以上の遺伝子改変試薬の遺伝子改変機能活性の９０％超が保持される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記１種以上の遺伝子改変試薬の２種以上が、同じ貯蔵容器内で貯蔵される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記貯蔵容器がマルチウェルプレートである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
個々の前記遺伝子改変試薬が、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記１種以上の遺伝子改変試薬が、−２０℃で、４℃で、または２０℃から３０℃の間で貯蔵される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
１種以上の安定化された遺伝子改変試薬を含む組成物であって、前記組成物が、１種以上の遺伝子改変試薬を含み、
前記遺伝子改変試薬の含水率が１０％（ｗ／ｗ）未満である、組成物。
【請求項２２】
前記含水率が約０．２％から約８％である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記１種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種が、
（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、
（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び
（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
からなる群から選択される１種以上の試薬である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記安定化された試薬が、
（ａ）１種以上の緩衝剤、
（ｂ）１種以上のプロテアーゼ阻害物質、
（ｃ）１種以上のヌクレアーゼ阻害物質、
（ｄ）１種以上の塩、
（ｅ）１種以上の炭水化物、
（ｆ）１種以上のトランスフェクション試薬、
（ｇ）１種以上のポリアミン、及び
（ｈ）１種以上の培養培地
からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
５０から１００個の個々の安定化された遺伝子改変試薬が、１枚のマルチウェルプレートの異なるウェル内に入れられる、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、概して、細胞の遺伝子修飾のための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ゲノム改変（例えば部位特異的ヌクレアーゼ）のための安定化された試薬、及び非遺伝子コード改変修飾（例えばＤＮＡメチル化）のための安定化された試薬に関する。安定化方法は、好適な温度での試薬の貯蔵、乾燥形態への変換、及び化学修飾を含む。
【背景技術】
【０００２】
背景
いくつかのゲノム相互作用システム、例えばデザイナー亜鉛フィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬ）、ＣＲＩＳＰＲ、及びホーミングメガヌクレアーゼが開発されている。これらのシステムに関する１つの問題は、それらが、改変のための標的部位の特定、ならびにしばしば労力及び時間を要するそれらの部位に特異的な試薬の設計の両方を必要とすることである。一態様において、本発明は、ゲノム相互作用試薬の効率的な設計、調製、及び使用を可能にする。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、部分的に、核酸分子の修飾のための組成物及び方法に関する。ゲノムを修飾するための効率的なシステム及び技術が極めて必要とされている。本発明は、この必要性に対応し、関連した利点を提供する。
【０００４】
いくつかの態様において、本発明は、１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種等）の安定化された遺伝子改変試薬を調製するための方法、及びそのような方法により調製された、安定化された遺伝子改変試薬を含む。いくつかの場合において、これらの方法は、（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の溶媒中溶液を調製することと、（ｂ）（ａ）の溶媒の８０％超を除去することとを含む。さらに、溶媒は、水性であっても、有機（例えば１種以上のアルコール）であっても、または水性の溶媒及び１種以上の有機溶媒の混合物であってもよい。溶媒は、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧フリーズドライ、超臨界流体乾燥、または真空遠心を含む任意の数の手段により除去され得る。いくつかの場合において、溶媒の８０％から９９．５％（例えば、約８０％から約９５％、約８０％から約９０％、約８５％から約９５％、約８５％から約９９％、約９０％から約９９％、約９０％から約９８％、約９０％から約９７％、約９０％から約９６％、約９３％から約９９％等）が、１種以上の遺伝子改変試薬から除去され得る。
【０００５】
いくつかの場合において、１種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種は、（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子からなる群から選択される１種以上の試薬であってもよい。
【０００６】
いくつかの場合において、個々の遺伝子改変試薬は、１枚のマルチウェルプレートの２つ以上のウェル内に入れられる。さらに、個々の遺伝子改変試薬は、溶媒中に可溶化されながらマルチウェルプレートのウェル内に加えられてもよい。また、個々の遺伝子改変試薬が多層プレートのウェル内に存在する間に、溶媒の一部または全てが個々の遺伝子改変試薬から除去されてもよい。
【０００７】
１つ以上のドナー核酸分子（例えばドナーＤＮＡ）が、遺伝子改変試薬と同時混合されてもよい。例えば、異なる挿入物が特定の染色体座に導入された細胞が調製されてもよい。したがって、本発明は、異なる核酸断片が特定の座に導入された細胞の「ライブラリ」を含む。いくつかの場合において、ドナー核酸分子の数は、約２から約１０，０００個（例えば、約５から約１０，０００個、約２０から約１０，０００個、約５０から約１０，０００個、約９０から約１０，０００個、約２００から約１０，０００個、約４００から約１０，０００個、約８００から約１０，０００個、約２，０００から約１０，０００個、約２から約１０，０００個、約１００から約１，０００個、約２００から約３，０００個、約１５０から約１，５００個等）であってもよい。
【０００８】
集合物中に存在する遺伝子改変試薬の数は大きく変動し得、約２から約１０，０００個（例えば、約５から約１０，０００個、約２０から約１０，０００個、約５０から約１０，０００個、約９０から約１０，０００個、約２００から約１０，０００個、約４００から約１０，０００個、約８００から約１０，０００個、約２，０００から約１０，０００個、約２から約１０，０００個、約１００から約１，０００個、約２００から約３，０００個、約１５０から約１，５００個等）であってもよい。そのような遺伝子改変試薬は、１枚以上のマルチウェルプレートの異なるウェル内に入れられてもよい。多くの場合において、そのような個々の遺伝子改変試薬は、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合する。
【０００９】
いくつかの場合において、遺伝子改変試薬と接触する溶媒（例えば水溶液）は、（ａ）１種以上の緩衝剤、（ｂ）１種以上のプロテアーゼ阻害物質、（ｃ）１種以上のヌクレアーゼ阻害物質、（ｄ）１種以上の塩、（ｅ）１種以上の炭水化物、（ｆ）１種以上のトランスフェクション試薬、（ｇ）１種以上のポリアミン、及び（ｈ）１種以上の培養培地からなる群から選択される１種以上の成分を含有してもよい。特定の場合において、炭水化物は、スクロース、トレハロース、ラクトスクロース、またはシクロデキストリンの１つ以上である。
【００１０】
さらに、水の除去前の溶媒（例えば水溶液）のｐＨは、４から１１（例えば、約４から約７、約４から約６．５、約４から約８、約６．５から約１１、約６．５から約１０、約７から約１１、約７から約１０等）の間であってもよい。
【００１１】
本発明は、さらに、１種以上の遺伝子改変試薬を貯蔵するための方法、及びそのような方法により調製された、貯蔵された遺伝子改変試薬を含む。いくつかの場合において、これらの方法は、（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の水溶液を調製することと、（ｂ）（ａ）において調製された水溶液から水の９０％超を除去することと、（ｃ）３０日間の貯蔵後に遺伝子改変機能活性の７５％超が保持される条件下に、１種以上の遺伝子改変試薬を置くこととを含む。特定の場合において、少なくとも３０日間（例えば、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間等）の貯蔵後に、遺伝子改変機能活性の７５％超（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％等）が保持される。
【００１２】
さらに、１種以上の遺伝子改変試薬の２種以上が、同じ貯蔵容器（例えば、マルチウェルプレート）内に貯蔵されてもよい。個々の貯蔵された遺伝子改変試薬は、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合してもよい。さらに、１種以上の遺伝子改変試薬は、−７０℃で、−２０℃で、４℃で、または２０℃から３０℃（例えば、約−７０℃から約３０℃、約−２２℃から約３０℃、約２℃から約３０℃、約−４℃から約３０℃、約−１０℃から約３０℃、約−１５℃から約３０℃、約−２２℃から約１０℃等）の間で貯蔵されてもよい。
【００１３】
本発明は、さらに、１種以上の安定化された遺伝子改変試薬を含む組成物を含む。そのような組成物は、１種以上の遺伝子改変試薬を含み、遺伝子改変試薬の含水率は、１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、約０．３％から約７％、約０．５％から約８％、約０．５％から約５％、約０．２％から約４％、約０．２％から約３％等）である。
【００１４】
さらに、本発明の組成物は、（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子からなる群から選択される１種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種を含んでもよい。上述のように、１つ以上のドナー核酸分子（例えばドナーＤＮＡ）は、遺伝子改変試薬と同時混合されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
ここで、本明細書において開示される原理、及びその利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて考慮される以下の説明が参照される。
【図１】本発明のいくつかの態様の代表的な図である。この図は、単一成分（例えば、亜鉛フィンガー及びＴＡＬシステム）、ならびに複数成分遺伝子改変システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９及びＣｐｆ１システム）の試薬の例を示す。代表的な単一成分システムのための試薬は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質であってもよい。これらの任意の１つ以上が、ゲノム改変のために細胞内に導入されてもよい。代表的な複数成分システムのための試薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質であってもよい。これらの一方または両方が、ゲノム改変のために細胞内に導入されてもよい。ＤＮＡ及びｍＲＮＡ試薬は、次いでＲＮＡ（例えばｇＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたはＴａｌヌクレアーゼ）に変換される前駆体として細胞に進入する。
【図２】本発明の一態様における使用のための例示的なプレート形式を示す図である。プレートは、６×８のウェルのアレイを含有し、各ウェルは、数字及び文字の組み合わせにより特定される。ウェルＡ，１及びＡ，６は、遺伝子改変試薬を含有せず、したがって対照ウェルである。
【図３】代表的な自然発生的ＴＡＬタンパク質のモジュール構造の概略図である。このタンパク質は、アミノ末端（Ｎ）、塩基選択性を決定付ける１２位及び１３位に超可変残基を有する楕円により示される可変数の３４アミノ酸反復を含む中央アレイ、ならびに核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び転写活性化因子（ＡＤ）ドメインを含むカルボキシル末端（Ｃ）で構成される。
【図４】Ｃａｓ９タンパク質及び標的ゲノム遺伝子座の両方に結合したガイドＲＮＡを示す、ガイドＲＮＡ分子（１０４ヌクレオチド）の概略図である。ヘアピン領域１は、ヌクレオチドＧＡＡＡにより連結された相補的ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ領域のハイブリダイゼーションにより形成される。ヘアピン領域２は、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’位における相補的領域により形成される。
【図５】ＤＮＡオリゴテンプレートを使用してガイドＲＮＡを合成するためのワークフローを示す図である。ＤＮＡテンプレートをコードするガイドＲＮＡは、アセンブリＰＣＲを使用して生成される。このアセンブリ反応の成分は、１）標的特異的ＤＮＡオリゴ（ｃｒＲＮＡ領域をコードする）、２）インビトロ転写に使用される細菌プロモーター（この場合Ｔ７プロモーター）に特異的なＤＮＡオリゴ、及び３）ｔｒａｃｒＲＮＡ領域をコードする重複ＰＣＲ生成物を含む。充填反応に続いて、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（この場合高忠実度ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用してサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）においてＰＣＲ増幅が行われ、全長ｇＲＮＡコード化テンプレートが生成される。ＰＣＲアセンブリの後、得られたＤＮＡ塩プレートは、非コードＲＮＡ合成用のインビトロ転写試薬（この場合ＭＥＧＡＳＨＯＲＴＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｔ７キット）を使用して３７℃で転写されて標的特異的ｇＲＮＡが生成される。合成後、得られたｇＲＮＡは、カラムまたは磁気ビーズに基づく方法を使用して精製される。精製されたインビトロ転写ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を用いた同時トランスフェクションまたは対象となる宿主システムもしくは細胞株におけるｍＲＮＡ送達に使用可能である。
【図６】ＣＲＩＳＰＲシステムを使用したニッキングに基づく核酸開裂戦略を示す概略図である。図の上部において、２つの線は二本鎖核酸を表す。２つのニック部位は、部位１及び部位２で示されている。これらの部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体と相互作用する核酸の領域を示す、実線または破線のボックス内に位置している。図の下部は、両方の鎖における２つの近い位置にあるニックをもたらすニッキング作用を示す。
【図７】乾燥及び凍結乾燥から再構成された後のＵ２ＯＳ−Ｃａｓ９細胞株におけるＩＶＴガイドＲＮＡの開裂効率を示す図である。ＣＰＦＳ１  Ｔ２と標示されたウェルにはガイドＲＮＡは存在しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
定義
本明細書において使用される場合、「核酸改変」という用語は、遺伝子コードの改変もしくは変更、または非コードベースの核酸修飾を指す。遺伝子コード改変は、核酸分子のヌクレオチド配列の変更を指す。非コードベース核酸改変は、ヌクレオチド配列改変が関与しない、メチル化等の核酸修飾、及び遺伝子発現の改変をもたらす修飾（例えば、ヒストンアセチル化、プロモーター活性化、プロモーター抑制等）を指す。したがって、機能的ＴＡＬ−ＶＰ１６融合タンパク質は、ＤＮＡの転写に関与する場合、非コードベース核酸改変をもたらす。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「遺伝子改変試薬」という用語は、１つ以上の核酸改変活性を有する、または１つ以上の核酸改変活性を有する複合体の成分を含有する組成物を指す。例示的な遺伝子改変試薬は、機能的亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合タンパク質、機能的ＴＡＬ−ＶＰ１６融合タンパク質、及びＣａｓ９タンパク質を標的核酸分子の特定のヌクレオチド領域に誘導することができるｇＲＮＡ分子を含有する試薬である。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「安定化された遺伝子改変試薬」という用語は、機能活性の損失を最小限としながらある期間貯蔵され得る試薬を指す。この定義に関連するパラメータは、本明細書に記載されている。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」という用語は、組み合わされると少なくともＣＲＩＳＰＲ関連活性（例えば、二本鎖ＤＮＡの標的遺伝子座特異的な二本鎖開裂）をもたらすＣＲＩＳＰＲタンパク質及び核酸の集合物を指す。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ複合体」は、互いに関連して機能活性を有する凝集体を形成するＣＲＩＳＰＲタンパク質及び核酸（例えばＲＮＡ）を指す。ＣＲＩＳＰＲ複合体の例は、標的遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡに結合した野生型Ｃａｓ９（時折Ｃｓｎ１と呼ばれる）タンパク質である。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」という用語は、核酸（例えばＲＮＡ）結合ドメイン核酸及びエフェクタードメイン（例えばＣａｓ９、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を含むタンパク質を指す。核酸結合ドメインは、所望の標的核酸（例えばガイドＲＮＡ）にハイブリダイズすることができる領域を有する第１の核酸分子と相互作用するか、または所望の標的核酸（例えばｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズすることができる領域を有する第２の核酸との相互作用を可能にする。ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわちＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、追加的なＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含んでもよい。
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、上で参照された第１の核酸分子に結合する複合体を形成するタンパク質を指す。したがって、１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質は、例えば、ガイドＲＮＡに結合してもよく、別のタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。これらは、Ｃａｓ９等の単一タンパク質と同じ機能を果たす複合体の一部として機能するため、全てＣＲＩＳＰＲタンパク質とみなされる。
【００２３】
多くの場合において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、核への輸送を可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「転写調節配列」という用語は、（１）１つ以上の構造遺伝子（例えば、２個、３個、４個、５個、７個、１０個等）のメッセンジャーＲＮＡへの転写、または（２）１つ以上の遺伝子の非翻訳ＲＮＡへの転写を調節するように機能する、核酸分子上に任意の構成または幾何構造で含有される機能的な一連のヌクレオチドを指す。転写調節配列の例は、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、抑制因子等を含む。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、転写調節配列の例であり、具体的には、非翻訳ＲＮＡをコードする開始コドンまたは核酸の近位に位置する遺伝子の５’領域として一般的に説明される核酸である。隣接核酸断片の転写は、プロモーター領域において開始される。抑制可能なプロモーターの転写速度は、抑制剤に応じて減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導剤に応じて増加する。構成的プロモーターの転写速度は、特には調節されないが、全般的な代謝状態の影響下で変動し得る。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、挿入物に有用な生物学的または生化学的特性を提供する核酸分子（例えばＤＮＡ）を指す。例は、プラスミドファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、動原体、及びインビトロもしくは宿主細胞において複製する、もしくは複製されることが可能な、または所望の核酸断片を宿主細胞内の所望の位置に移送することが可能な他の配列を含む。ベクターは、ベクターの本質的な生物学的機能を損失することなく配列が決定可能な様式で切断され得る、またその複製及びクローニングをもたらすために核酸断片がスプライスされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、２個、３個、４個、５個、７個、１０個等）を有し得る。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「核酸標的化能力」という用語は、配列特異性に基づいて核酸を認識する、及び／またはそれに関連する分子または分子の複合体の能力を指す。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「標的遺伝子座」という用語は、遺伝子改変試薬相互作用（例えば結合及び開裂）のための核酸分子内の部位を指す。遺伝子改変試薬が二本鎖核酸を開裂するように設計されている場合、標的遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される切断部位及び周囲の領域である。遺伝子改変試薬が、近接する二本鎖核酸をニッキングして二本鎖破壊を形成するように設計されている場合、破壊点を包囲する、及びそれを含む領域は、標的遺伝子座と呼ばれる。
【００２９】
概要：
本発明は、部分的に、ゲノム改変のための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、安定化された試薬、及びそのような試薬を生成及び使用するための方法に関する。安定化は、貯蔵条件（例えば、温度、湿度等）から、または貯蔵されている試薬の化学的特性（例えば、化学修飾ヌクレオチド、緩衝剤、還元剤の存在等）から得ることができる。
【００３０】
例示を目的として図１に記載される概略図を使用して、単一成分及び複数成分の２つの広義のカテゴリーの遺伝子改変試薬を調製することができる。単一成分遺伝子改変試薬は、遺伝子改変機能成分であるか、または遺伝子改変機能成分をコードする試薬を指す。したがって、単一成分システムは、典型的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含む。試薬がＤＮＡである場合、このＤＮＡは、典型的には細胞内に導入され、そこで転写されてｍＲＮＡを形成する。次いで、ｍＲＮＡは翻訳されて、遺伝子改変機能成分としてのタンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬタンパク質）を生成する。
【００３１】
複数成分システムは、遺伝子改変活性に２つ以上の成分を必要とする。この種のシステムの一例は、Ｃａｓ９ベースＣＲＩＳＰＲシステムである。このようなシステムは、遺伝子改変活性のために、タンパク質成分（例えばＣａｓ９タンパク質）及び少なくとも１つの核酸成分（例えばｇＲＮＡ）を必要とする。タンパク質成分は、タンパク質として細胞内に導入され得るか、または細胞内に導入されるｍＲＮＡもしくはＤＮＡによりコードされ得る。さらに、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、複数成分システムの１つ以上のタンパク質成分を発現する細胞内に導入されてもよい。
【００３２】
ほとんどの場合において、目標は、細胞内に、（１）１種以上の機能性遺伝子編集試薬、（２）１種以上の核酸分子コード遺伝子編集試薬、または（３）すぐに遺伝子改変複合体を形成する１種以上の遺伝子改変試薬、及び１種以上の核酸分子コード付加的遺伝子改変試薬の組み合わせのいずれかを導入することである。
【００３３】
特に、本発明は、他の核酸分子と相互作用するように設計されたタンパク質及び核酸分子の組み合わせに関する。いくつかの場合において、本発明は、タンパク質／核酸複合体に関し、核酸成分は、標的核酸分子に相補的な配列を有する。これらのシステムにおいて、複合化した核酸と標的核酸分子との間で相補的な配列は、複合体を標的核酸と関連させるために使用される。これが生じると、複合体に関連した機能活性は、標的核酸分子を修飾するために使用され得る。
【００３４】
非化学的安定化：
非化学的安定化は、遺伝子改変試薬の機能成分（例えば、ＴＡＬタンパク質、ｇＲＮＡ等）の化学修飾が関与しない安定化手段を指す。
【００３５】
非化学的安定化のいくつかの手段が、本発明の実践に使用され得る。そのような手段は、（ａ）温度、（ｂ）ｐＨ、（ｃ）イオン強度、（ｄ）他の化合物との複合体形成、（ｅ）タンパク質及び核酸を分解する酵素を阻害する作用物質の提供（例えば、ヌクレアーゼ、阻害物質、プロテアーゼ阻害物質等）、及び（ｆ）乾燥を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、遺伝子改変試薬を含有する脱水または凍結乾燥組成物を調製するための組成物及び方法に関する。ごく少量の溶媒（例えば水）を含有する試薬は、一般に、生物学的反応をほとんど生じないと推定され、したがって室温でも比較的安定であると推定される。
【００３７】
試料から水を除去するためにいくつかの方法が使用されているが（例えば、真空または部分真空条件下での遠心）、当技術分野において知られている方法に従って凍結乾燥が行われてもよい。多くの場合において、溶媒は、凍結乾燥により除去される。凍結乾燥のプロトコールの例は、（１）５分で＋２０℃から−４０℃への勾配温度減少、（２）３時間かけて−４０℃、（３）３０分で−４０℃から−１０℃への勾配温度上昇、（４）４時間かけて−１０℃、（５）１５分で−１０℃から＋１０℃への勾配温度上昇、（６）２時間かけて＋１０℃、（７）１５分で＋１０℃から＋３０℃への勾配温度増加、及び（８）４〜８時間かけて＋３０℃である。
【００３８】
多くの場合において、グリセロール及び洗剤は、ある特定のドライダウン（ｄｒｙ  ｄｏｗｎ）法のための遺伝子改変試薬中に存在しない。例えば、グリセロールは、上で参照された凍結乾燥法において存在してもよいが、好ましいものではない。
【００３９】
脱水または乾燥は、遺伝子改変試薬を安定化するために使用され得る。典型的には、遺伝子改変試薬の８０％超が水である。この水の実質的な部分の除去が、安定化をもたらし得る。例えば、凍結乾燥は、典型的には溶液の含水率を０．３％から８％の間のパーセンテージに低下させる。したがって、本発明は、遺伝子改変試薬を含み、含水率は、約０．１％から約１０％、約０．５％から約１０％、約１％から約１０％、約０．１％から約７％、約０．１％から約５％、約０．５％から約５％、約０．５％から約４％、約０．３％から約６％、約０．３％から約４％、約０．３％から約３％等である。
【００４０】
遺伝子改変試薬を乾燥させることの１つの利点は、それによって周囲温度での安定性が増加することである。したがって、一態様において、本発明は、遺伝子改変試薬を安定化するための方法、及びそのような方法により生成された組成物を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、セロビオースが、溶媒除去前の調製物中に５０ｍＭから５００ｍＭの間の濃度で安定剤として存在し得る。セロビオースの使用の利点の１つは、それが生物学的分子（例えば、核酸及びタンパク質）の凍結乾燥及び保存の両方のための効果的な安定剤であることであり、その一方、既知の技術分野の安定剤は、一般にどちらか一方の目的に使用される。また、多くの場合において、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ２等の塩が、溶媒除去の前に存在する。
【００４２】
また、タンパク質の分解を阻害するために、いくつかの手段が使用され得る。１つは、１種以上のプロテアーゼ阻害物質（例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル、ロイペプチン等）の存在である。
【００４３】
また、ＲＮＡ分子を含む核酸分子の分解を阻害するために、いくつかの手段が使用され得る。１つは、１種以上のＲＮａｓｅ阻害物質の存在である。ＳＵＰＥＲＡＳＥ  ＩＮ（商標）ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号ＡＭ２６９４）、ＲＮＡＳＥＯＵＴ（商標）（カタログ番号１０７７７−０１９）、及びＡＮＴＩ−ＲＮａｓｅ（カタログ番号ＡＭ２６９０）を含む、いくつかの市販のＲＮａｓｅ阻害物質が入手可能であり、これらは全てＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。
【００４４】
ウイルスからのカプシドタンパク質もまた、核酸分子を安定化するために使用され得る。これらのウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであってもよい。例として、ｇＲＮＡ分子を安定化したい場合は、コロナウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、及び／またはＡ型肝炎ウイルス等の一本鎖ＲＮＡウイルスからのカプシドタンパク質を使用することができる。
【００４５】
さらに、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との複合体形成により安定化されてもよい。したがって、本発明は、核酸／タンパク質複合体を含有する安定化された遺伝子改変試薬を含む。さらに、そのような複合体は、そこから溶媒が除去されていてもよい。
【００４６】
化学的／塩基安定化：
化学的安定化は、遺伝子改変試薬の機能成分（例えば、ＴＡＬタンパク質、ｇＲＮＡ等）の化学修飾が関与する安定化手段を指す。
【００４７】
本発明の実践に使用される核酸分子は、化学修飾されていてもよい。化学修飾は、いくつかの目的で使用され得る。例えば、化学修飾は、貯蔵中に核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）を安定化するために、及び／またはその細胞内半減期を増加させるために使用され得る。さらに、機能的ＲＮＡ分子（例えばｇＲＮＡ分子）に関して、ヘアピンがその構造を安定化する様式で改変されてもよい。これは、ヘアピンの形成を向上させる塩基（例えばＧ／Ｃ含量）の選択により行うことができる。
【００４８】
化学修飾は、任意の数の化学基及び位置に関する改変であってもよい。特定の化学修飾の適合性は、ＲＮＡ分子の種類、及び化学基のＲＮＡ分子内の位置により変動する。
【００４９】
化学修飾は、塩基または塩基間連結に関する修飾であってもよい。例示的な化学修飾は、ホスホロチオエート修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−プロピル修飾、２’−Ｏ−エチル修飾、２’−フルオロ修飾、及び／またはそのような修飾の組み合わせを含み得る。修飾糖もまた使用され得る。修飾糖は、Ｄ−リボース、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、及びシアノ等を含む。
【００５０】
本発明の実践に使用され得る追加の化学修飾は、Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０（２０１５）及びＲａｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２０８８３１１２（２０１５）に見出すことができる。
【００５１】
化学修飾はまた、ホスホジエステル類似体、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びＰエチオキシホスホジエステル（ｅｔｈｙｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、ならびに非リン含有連結（例えばアセタール及びアミド）を含む。
【００５２】
プソイドウリジンは、ウリジンのＣ−グリコシド異性体であり、ＲＮＡにおいて見られる１００を超える異なる修飾ヌクレオチドのうち、最も一般的である。プソイドウリジンは、プソイドウリジン化と呼ばれるプロセスにおいて転写後にＲＮＡ内の特定のウリジン残基を異性化するプソイドウリジンシンターゼと呼ばれる酵素により形成される。プソイドウリジンは、放射線からの保護を提供することが示唆されている。ＲＮＡ分子は、５’及び／または３’末端またはその近くにおける１つ以上の位置への、プソイドウリジン及び／または２’−Ｏ−メチル修飾の追加により安定化され得る。
【００５３】
化学修飾は、貯蔵寿命及び／または細胞内半減期を１．２から２０倍（例えば、約１．５から約２０倍、約２から約２０倍、約１．５から約２０倍、約１．５から約２０倍、約１．５から約２０倍、約１．５から約２０倍、約１．５から約２０倍、約１．５から約２０倍等）増加させることができる。
【００５４】
化学修飾は、１つの末端、両方の末端、及び／または核酸分子の内部に位置してもよい。多くの場合において、化学修飾は、エクソヌクレアーゼによる核酸分子の消化を阻害するように位置付けられる。いくつかの方式において、１から１０個（例えば、約１から約９個、約１から約６個、約１から約５個、約１から約４個、約１から約３個、約１から約２個等）の末端５’及び／または３’塩基が化学修飾される。より具体的な方式において、化学修飾は、ホスホロチオエート修飾もしくは２’−Ｏ−メチル修飾またはこれらの修飾の組み合わせである。
【００５５】
塩基修飾、リンカー修飾及び／または糖修飾等の、１から２０個（例えば、約１から約１５個、約２から約１５個、約３から約１５個、約３から約１０個、約３から約８個、約２から約５個等）の数の修飾において、化学修飾は存在してもよい。
【００５６】
多くのエクソヌクレアーゼは、それらがその基質への付着を維持し、解離前に複数ラウンドの触媒を行うという点で前進的である。ＲＮＡ分子の末端は、分解を防止するために存在する異なる群を有してもよい。例として、合成ＲＮＡは、典型的には５’ヒドロキシル基を有する。インビトロ転写により生成されたＲＮＡは、典型的には５’トリホスフェート基を有する。天然のＲＮＡは、典型的には５’モノホスフェート基を有する。本発明は、ｓｅ  ５’基、及び他の５’基の１つ以上を有する安定化されたＲＮＡ分子を含む。例として、５’トリホスフェート基は、ＲＮＡ  ５’ピロホスホヒドロラーゼの使用によりモノホスフェート基に変換され得る。さらに、５’モノホスフェート基は、ＲＮＡ安定性を改善するために使用され得る。
【００５７】
核酸分子を安定化するために、いくつかの追加の手段が使用されてもよい。例えば、分解を阻害するために、一連のｐｏｌｙＧが核酸分子の３’末端に追加されてもよい。特に、ｐｏｌｙＧ領域は、ｍＲＮＡの３’端に見られるｐｏｌｙＡ領域の代わりに存在して、ＲＮＡ分子上での細胞内半減期の増加をもたらしてもよい。
【００５８】
ＲＮＡ分子（例えばｇＲＮＡ分子）の安定性を改善するための別の手法は、安定化されたループまたはヘアピンとしてこれらの分子を提供することである。そのようなループの修飾の一例は、高Ｃ／Ｇ領域を含有するものである。これらの塩基間の３つの水素結合は、Ａ／Ｔ塩基を有する核酸断片から形成されたループと比較して、ループ安定性を増加させる。ＲＮＡ分子の安定性はまた、４対のＣ／Ｇ塩基で構成されるテトラループ等のループの追加により増加され得る。ループはまた、一方または両方の末端として安定化または導入され得る。ｇＲＮＡの場合、ループは、５’末端に導入され得る。したがって、本発明は、ヘアピン領域を含有する核酸分子を含み、対形成塩基の６０％から１００％の間（例えば、約６５％から約１００％、約７０％から約１００％、約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、約７５％から約９０％等）がＣ／Ｇ対である。さらに、これらのヘアピン領域は、約４から約２０個の対形成塩基（例えば、約５から約２０個の対形成塩基、約６から約２０個の対形成塩基、約７から約２０個の対形成塩基、約５から約１５個の対形成塩基、約６から約１４個の対形成塩基等）を含有し得る。
【００５９】
いくつかの場合において、天然にあるヘアピンの存在数は、核酸分子の安定性を向上させるために変更されてもよい。天然ｔｒａｃｒ分子は、３個のヘアピンを形成する。最終ヘアピンは、３’端に３〜５個の追加的塩基を有する。ｔｒａｃｒ分子、及び他のＲＮＡ分子（例えばｇＲＮＡ分子）は、これらの末端塩基のいくつかまたは全てを除去することにより安定化され得る。これは、ヌクレアーゼ開始を阻害すると考えられる。さらに、天然にあるヘアピンの切断は、溶媒曝露を変更することにより、安定化されたＲＮＡ分子をもたらし得る。
【００６０】
ＲＮＡ分子はまた、特に３’末端またはその近くでの、三重及び／または四重構造を形成する領域の導入により形成され得る。
【００６１】
Ｃａｓ９タンパク質への架橋を可能にする架橋基（例えば光活性化可能基）が、（例えば、３’末端またはその近くで）ｇＲＮＡに付加されてもよい。これは、安定なｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の形成を可能にし、ｇＲＮＡは、タンパク質による分解から保護されると考えられる。
【００６２】
例示的な遺伝子改変試薬：
遺伝子改変システムの３つの異なる例は、亜鉛フィンガーベースシステム、ＴＡＬエフェクターベースシステム、ＣＲＩＳＰＲベースシステム（例えばＣａｓ９ベースシステム及びＣＰＦ１ベースシステム）である。それぞれ、異なる原理で作用し、異なる機能性分子を使用する。これらのシステムは、（１）タンパク質ベースシステム（例えば、亜鉛フィンガー及びＴＡＬエフェクター）ならびに（２）核酸／タンパク質複合化ベースシステム（例えばＣＲＩＳＰＲ）の２つの群に細分化される。
【００６３】
Ａ．亜鉛フィンガーベースシステム
亜鉛−フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及びメガヌクレアーゼは、ゲノム工学ツールの例である。ＺＦＮは、亜鉛−フィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインからなるキメラタンパク質である。ヌクレアーゼドメインの一例は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的開裂ドメインであり（Ｋｉｍ，ＹＧ；  Ｃｈａ，Ｊ．，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ，Ｓ．Ｈｙｂｒｉｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｆｏｋ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９６  Ｆｅｂ．６；９３（３）：１１５６−６０）、典型的には５〜７塩基対のリンカー配列により分離されている。ＦｏｋＩ開裂ドメインの対は、一般に、ドメインの二量化及び反対の鎖からの非回文標的配列の開裂を可能にするために必要である。個々のＣｙｓ２Ｈｉｓ２  ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３個から６個の間の個々の亜鉛−フィンガー反復を含有し、それぞれ９個から１８個の塩基対を認識し得る。
【００６４】
ＺＮＦに関する１つの問題は、オフターゲット開裂の可能性であり、これはドナーＤＮＡのランダム統合をもたらすかまたは染色体再配置もしくはさらに細胞死をもたらす可能性があり、これはさらに高等生物における適用可能性に関する問題を提起する（Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｗｉｔｈ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  Ｗａｎｔｅｄ  ａｎｄ  Ｕｎｗａｎｔｅｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌｏｃｕｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１８  ｎｏ．４，７４３−７５３  （２０１０））。
【００６５】
Ｂ．ＴＡＬエフェクターベースシステム
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）及びラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）等の植物病原細菌の種により、植物細胞の感染後にそのＩＩＩ型分泌系を介して分泌されるＤＮＡ結合タンパク質のクラスを表す。天然ＴＡＬエフェクターは、具体的には、植物プロモーター配列に結合し、それによって遺伝子発現を調整し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化して細菌増殖を促進することが示されている（Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｐｅｒ  Ｂｓ３  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，６４５−６４８（２００７）；Ｂｏｃｈ，Ｊ．＆  Ｂｏｎａｓ，Ｕ．Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＡｖｒＢｓ３  ｆａｍｉｌｙ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．４８，４１９−４３６（２０１０）；Ｋａｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，６４８−６５１（２００７）；Ｋａｙ，Ｓ．＆  Ｂｏｎａｓ，Ｕ．Ｈｏｗ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｐｌａｎｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２，３７−４３（２００９））。天然ＴＡＬエフェクターは、一般に、中央反復ドメイン及びカルボキシル末端核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）及び転写活性化ドメイン（ＡＤ）により特徴付けられる。中央反復ドメインは、典型的には、半反復と呼ばれる一般により短いカルボキシル末端反復を除いて通常３３〜３５残基の長さである１．５から３３．５個の間の可変量のアミノ酸反復からなる。反復は、ほとんどの場合同一であるが、ある特定の超可変残基において異なる。ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識特異性は、典型的には各反復の１２位及び１３位、いわゆる反復可変２残基（ＲＶＤ）において超可変残基により媒介され、各ＲＶＤは、所与のＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチドを標的化する。したがって、ＴＡＬタンパク質中の反復の逐次的順序は、所与のＤＮＡ配列内のヌクレオチドの定義された線形順序と相関する傾向がある。いくつかの自然発生的ＴＡＬエフェクターの基礎的ＲＶＤコードが特定されており、所与のＤＮＡ配列に結合するために必要な逐次的反復順序の予測が可能となっている（Ｂｏｃｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０９−１５１２（２００９）；Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｉｐｈｅｒ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０１（２００９））。さらに、新しい反復の組み合わせで生成されたＴＡＬエフェクターは、このコードにより予測された標的配列に結合することが示されている。標的ＤＮＡ配列は、一般に、ＴＡＬタンパク質により認識される５’チミン塩基で開始することが示されている。
【００６６】
ＴＡＬのモジュール構造は、ＤＮＡ結合ドメインとエフェクター分子、例えばヌクレアーゼとの組み合わせを可能にする。特に、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、知られている新たなゲノム工学ツールの開発を可能にする。
【００６７】
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲベースシステム
遺伝子改変試薬は、ＣＲＩＳＰＲシステムをベースとしてもよい。「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、３種類のシステム、及びシステムの亜型に適用される一般的用語である。一般に、ＣＲＩＳＰＲという用語は、ＣＲＩＳＰＲシステム成分（例えばコードされたｃｒＲＮＡ）をコードする反復領域を指す。それぞれ異なる特徴を有する３種類のＣＲＩＳＰＲシステム（表１）が特定されている。
【００６８】
（表１）ＣＲＩＳＰＲシステム型の概略
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【００６９】
本発明は、数々の態様及びそれに関連した変形例を有するが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、本明細書における説明の基準点として選択されている。
【００７０】
ある特定の態様において、本発明は、安定化されたｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびにそのようなＲＮＡ分子の集合物を提供する。
【００７１】
図４は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関連した成分及び分子相互作用を示す。ここでは、Ｃａｓ９媒介ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）システムが例示される。図４には、ＤＮＡ（ハイブリダイゼーション領域１）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ハイブリダイゼーション領域２）の両方の標的にハイブリダイズするｇＲＮＡが示されている。このシステムにおいて、これらの２つのＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡの切断を可能にする様式でＣａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに持ち込むように機能する。標的ＤＮＡは、２つの部位で切断されて、二本鎖破壊を形成する。
【００７２】
図５は、本発明の例示的ワークフローを示す。図５中の概略図は、ＤＮＡ分子を生成するように設計されたオリゴヌクレオチドを示し、ガイドＲＮＡコード領域はＴ７プロモーターに動作可能に連結している。このワークフローにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、単独で、または二本鎖ＤＮＡと併せて、ＰＣＲにより、インビトロ転写に好適なプロモーターに動作可能に連結したガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を生成するために使用される。次いで、ＤＮＡ分子は、インビトロで転写されてガイドＲＮＡを生成する。次いで、ガイドＲＮＡは、例えばカラム精製またはビーズベースの方法により「清浄化」されてもよい。次いで、ガイドＲＮＡは、例として、（１）細胞内への直接導入、または（２）１つ以上のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合化した後の細胞内への導入による使用に好適である。Ｔ７プロモーターに動作可能に接続された核酸は、哺乳動物細胞がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する場合、これらの細胞内で転写され得る（Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：８４８５−８４９３（１９８９））。当然ながら、真核細胞内で機能する他のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等）もまた、ガイドＲＮＡの細胞内生成に使用され得る。例えば、Ｈ１プロモーターは、約３００塩基対の長さである。Ｔ７プロモーターの１つの利点は、その小さいサイズ（２０塩基対）である。
【００７３】
化学的に合成され、インビトロで転写されたＲＮＡを使用する１つの利点は、化学修飾された塩基がＲＮＡ分子内に導入され得ることである。
【００７４】
乾燥または凍結乾燥された遺伝子改変複合体もまた使用され得る。複合体を形成するようにされた、乾燥または凍結乾燥された遺伝子改変試薬に、いくつかの製剤が使用され得る。多くの場合において、複合体は、ＣＲＩＳＰＲシステム試薬を使用して形成され得る。
【００７５】
乾燥または凍結乾燥された遺伝子改変試薬複合体は、細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）内へのそのような複合体の導入により試験及び／または使用され得る。さらに、複合体は、１×から５×量で、マルチウェル形式で調製されてもよく、またはその中に入れられてもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ方式の場合、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、または均等物が使用され得る。Ｃａｓ９タンパク質方式の場合、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸまたは均等物が、脂質ナノ粒子ベーストランスフェクションに使用され得る。
【００７６】
例証を目的として、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの例示的条件が以下で使用される。
【００７７】
方式１：トランスフェクション試薬またはＣａｓ９なし。１から５μｇのｇＲＮＡを、マルチウェルプレートのウェルに加える。プレート及び内容物を真空乾燥し、次いで異なる温度で貯蔵する。使用前に、ｇＲＮＡを適切な濃度まで再懸濁させる。Ｃａｓ９発現安定細胞またはＣａｓ９により同時トランスフェクトされた細胞、及び好適なトランスフェクション試薬を、ウェルに加える。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００７８】
方式２：２０ｎｇのＩＶＴ生成ｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）及び１００ｎｇのＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を混合して複合体を形成し、マルチウェルプレートのウェルに加える。プレート及び内容物を真空乾燥し、次いで異なる温度で貯蔵する。トランスフェクションの前に、試料をＲＮＡｓｅ及びＤＮＡｓｅ不含水、またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）培養培地中に再懸濁させる。乾燥試料の再懸濁後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）ミックス（ウェル当たり０．６μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ及び４．４μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）を使用して調製された）を、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体に加え、次いで１５，０００〜２０，０００細胞／ウェルに適用する。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００７９】
方式３：ＩＶＴ  ｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μｌで２０ｎｇ／ウェル）及びＣａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌで１００ｎｇ／ウェル）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（０．６μｌ／ウェル）と事前に複合化し、真空乾燥する。乾燥後の事前に複合化された試料を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）中に再懸濁させ、トランスフェクションに使用する。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００８０】
方式４：ＩＶＴ生成ｇＲＮＡ（２０ｎｇ／ウェル）及びＣａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／ウェル）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（または均等物）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）（ウェル当たり４．４μｌ）と事前に複合化する。混合物を真空乾燥する。使用前に、試料をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）及び／または水中に再懸濁させ、９６ウェル形式でセルに適用する。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００８１】
方式５：ＩＶＴ生成ｇＲＮＡを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸまたはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭＥＳＳＥＮＧＥＲＭＡＸ（商標）（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）あり、またはなし）と事前に複合化する。この方式は、安定なＣａｓ９発現細胞株と共に使用され得る。使用する成分の量は、上述の方式と同じまたは同様である。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００８２】
方式６：ドナーＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ）を用いた方式１〜４。いくつかの態様において、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質、１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＴＡＬ  ｍＲＮＡ、または１種以上（例えば２種）のＴＡＬタンパク質をコードするＤＮＡが、代わりにｇＲＮＡと併せて、またはｇＲＮＡの代わりにウェルに加えられてもよい。
【００８３】
遺伝子改変活性：
本発明の試薬は、任意の数の活性を有し得る。例えば、試薬は、１つまたは複数の異種ドメイン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ等）を有する融合タンパク質を含んでもよい。融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含んでもよい。融合タンパク質成分であってもよいタンパク質ドメインの例は、これらに限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性の１つ以上を有する１つ以上のドメインを含む：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性（例えば、アセチル化活性、脱アセチル化活性、リン酸化活性、脱リン酸化活性、メチル化活性、脱メチル化活性等）、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性。
【００８４】
特に、本明細書において、部分的に、少なくとも１つの核局在化シグナルと、機能活性を有する少なくとも１つのドメイン（例えば、ヌクレアーゼ、メチラーゼ等）と、標的遺伝子座と相互作用する少なくとも１つのドメイン、または標的遺伝子座と相互作用する核酸分子と相互作用する少なくとも１つのドメインとを含む、遺伝子改変試薬が提供される。
【００８５】
遺伝子改変試薬は、転写を活性化または抑制するために使用され得る。例えば、ヌクレアーゼ活性を有さない「不活性」Ｃａｓ９（すなわちｄＣａｓ９）タンパク質が、非コード改変目的で使用されてもよい。標的遺伝子座と関連した核酸の転写を活性化するために、ｄＣａｓ９−転写活性因子融合タンパク質（例えばｄＣａｓ９−ＶＰ６４）がガイドＲＮＡと併せて使用されてもよい。同様に、標的遺伝子座と関連した核酸の転写を抑制するために、ｄＣａｓ９−抑制因子融合（例えばｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ転写抑制因子）が使用されてもよい。上で参照されたもの等の転写活性化及び抑制は、例えば、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｓ９  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４１：２１９−２２３（２０１４）において議論されている。
【００８６】
したがって、本発明は、転写の活性化及び抑制のための遺伝子改変試薬の生成及び使用のための組成物及び方法を含む。
【００８７】
図６は、標的遺伝子座を形成する２つの密接に関連する部位の選択を示す。部位のそれぞれ（部位１及び部位２）は、ニッキング活性を有する遺伝子改変試薬に結合する。この１つの目的は、核酸の「オフターゲット」切断を最小限にすることである。
【００８８】
図６において例示される２つの部位は、一般に、ニックを含有する二本鎖核酸が壊れるように互いに十分密接して位置している。この距離は、領域のＡＴ／ＣＧ含量等の因子により変動するが、ニック部位は、一般に、互いに２００塩基対以内（例えば、約１から約２００、約１０から約２００、約２５から約２００、約４０から約２００、約５０から約２００、約６０から約２００、約１から約１００、約１０から約１００、約２０から約１００、約３０から約１００、約４０から約１００、約５０から約１００、約１から約６０、約１０から約６０、約２０から約６０、約３０から約６０、約４０から約６０、約１から約３５、約５から約３５、約１０から約３５、約２０から約３５、約２５から約３５、約１から約２５、約１０から約２５、約１５から約２５、約２から約１５、約５から約１５塩基対等）である。
【００８９】
ニッキング活性は、いくかの様式で達成され得る。例えば、遺伝子改変試薬がＣａｓ９である場合、Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖核酸の異なる鎖をニッキングするＲｕｖＣ及びＨＮＨと呼ばれる２つのドメインを有する。Ｃａｓ９タンパク質は、一方または他方のドメインを不活性化するように改変されてもよい。その結果、二本鎖破壊を生じさせるためには、標的遺伝子座をニッキングするように２つのＣａｓ９タンパク質が必要である。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパルテートからアラニンの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（単一鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａを含む。
【００９０】
ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えばＣａｓ９）は、それぞれＤＮＡ標的のセンス及びアンチセンス鎖を標的化するガイド配列（例えば２つのガイド配列）と組み合わせて使用されてもよい。
【００９１】
ニッカーゼ活性を使用して核酸に二本鎖破壊を生成するための別の様式は、異種ヌクレアーゼドメインに連結したヌクレアーゼ活性を有さないＣＲＩＳＰＲタンパク質を使用することによるものである。この一例は、ＦｏｋＩドメインに連結した、ｄＣａｓ９と呼ばれるＣａｓ９の突然変異形態である。ＦｏｋＩドメインは、ヌクレアーゼ活性のために二量化を必要とする。したがって、そのような場合、２つのｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合タンパク質を、二本鎖切断の形成をもたらすヌクレアーゼ活性を生成するのに十分密接させるために、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ分子が使用される。この種の方法は、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３２：５６９−５７６（２０１４）及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３２：５７７−５８２（２０１４）に記載されている。
【００９２】
核酸の「オフターゲット」切断を最小限にするための別の様式は、二量化するまで不活性であるヌクレアーゼの使用によるものである。そのようなヌクレアーゼの一例は、ＦｏｋＩである。亜鉛フィンガータンパク質及びＴＡＬエフェクタータンパク質は、核酸分子上の異なる部位に結合してＦｏｋＩドメインを二量化させ、ヌクレアーゼ活性の再構成をもたらすように設計されている。
【００９３】
したがって、本発明は、核酸分子上の２つ以上の遺伝子座を認識する遺伝子改変試薬を含む。多くの場合において、認識部位間の距離は、図６を参照して言及されるニック部位と同じ範囲内である。
【００９４】
機能活性は、任意の数の様式で測定され得る。例えば、発現の誘導または抑制に基づく活性は、転写及び／または翻訳の増加または減少を評価することにより測定され得る。
【００９５】
機能活性がＤＮＡ（例えば細胞内ＤＮＡ）の開裂に関連する場合、核酸開裂の検出にいくつかの市販の製品が利用可能である。１つのそのような製品は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２４３７２）である。さらなるアッセイは、２０１５年１０月９日に出願された米国特許出願第１４／８７９，８７２号、名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ」において見出すことができ、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
試薬混合物及び方式：
直接的な遺伝子改変活性を有さないいくつかの化合物が試薬混合物中に含まれてもよい。１つのそのような化合物のセットは、トランスフェクション試薬である。これらは、実験プロトコールの一部として、遺伝子改変試薬に最小の添加量で含まれてもよい。
【００９７】
本発明との使用に好適なトランスフェクション薬剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質の細胞内への導入を促進するトランスフェクション薬剤を含む。例示的なトランスフェクション試薬は、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３ＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、及びＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含む。
【００９８】
遺伝子改変試薬は、遺伝子改変活性に最小の添加量が必要となるような方式で設定され得る。１つの例示的な方式において、ドナー核酸、ＺＮＦ−ＦｏｋＩ融合タンパク質の対、及びトランスフェクション試薬が、９６ウェルプレートのウェル内で凍結乾燥される。凍結乾燥された遺伝子改変試薬を有するウェル、及び遺伝子改変試薬を含有しない別のウェル（対照ウェル）に、培養培地中の細胞が加えられる。標的遺伝子座での相同的組み換えの効率は、両方の試料に対して後に測定される。
【００９９】
いくつかの場合において、遺伝子改変試薬は、ｇＲＮＡを含有し、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡと接触した細胞により発現される。細胞により取り込まれるｇＲＮＡは、次いで細胞内で発現したＣａｓ９タンパク質と関連し、遺伝子改変活性を再構成する。適切な場合には、これらの細胞は、細胞がｇＲＮＡと接触する前、それと同時、またはその後に、ドナー核酸と接触してもよい。
【０１００】
本発明は、個々の標的部位に対する特異性を有する遺伝子改変試薬の集合物をさらに含む。例えば、本発明は、特定の種類の細胞（例えばヒト細胞）内の標的部位に対する特異性を有する遺伝子改変試薬の集合物を含む。そのような細胞の集合物のメンバーは、これらの特定の種類の細胞の配列情報に基づいて生成され得る。例として、１つのそのような集合物は、特定の種類の細胞の完全ゲノム配列を使用して生成され得る。ゲノム配列データは、ヒトゲノム内の各遺伝子のコード領域に対する特異性を有する遺伝子改変試薬のライブラリを生成するために使用され得る。
【０１０１】
ｃｒＲＮＡ分子または本発明の集合物またはライブラリは、約５から約１００，０００個（例えば、約５０から約１００，０００個、約２００から約１００，０００個、約５００から約１００，０００個、約８００から約１００，０００個、約１，０００から約１００，０００個、約２，０００から約１００，０００個、約４，０００から約１００，０００個、約５，０００から約１００，０００個、約５０から約５０，０００個、約１００から約５０，０００個、約５００から約５０，０００個、約１，０００から約５０，０００個、約２，０００から約５０，０００個、約４，０００から約５０，０００個、約５０から約１０，０００個、約１００から約１０，０００個、約２００から約１０，０００個、約５００から約１０，０００個、約１，０００から約１０，０００個、約２，０００から約１０，０００個、約４，０００から約１０，０００個、約５０から約５，０００個、約１００から約５，０００個、約５００から約５，０００個、約１，０００から約５，０００個、約５０から約２，０００個、約１００から約２，０００個、約５００から約２，０００個等）等の多種多様な個々の分子を含み得る。
【０１０２】
本発明の実践に使用される遺伝子改変試薬は、いくつかの異なる方式で貯蔵され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、管（例えば、１．５ｍｌの微小遠心管）内またはプレート（例えば、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルプレート）のウェル内で貯蔵され得る。１つの例示的方式が、図２に示されている。この図において、ウェルＡ，１及びＡ，６は対照ウェルであり、遺伝子改変試薬を含有していない。他のウェルは、例えば細胞を含有する培養培地で再構成され得る乾燥処理された遺伝子改変試薬を含有する。さらに、各ウェルは、異なる標的遺伝子座に対する結合特異性を有する遺伝子改変試薬を含有し得る。
【０１０３】
ベクター成分及び細胞：
いくつかの機能的核酸成分（例えば、プロモーター、ｐｏｌｙＡシグナル、複製起点、選択可能マーカー等）が、本発明の実践に使用され得る。使用される場合、本発明の実践において使用される機能的核酸成分の選択は、用途の性質及びシステムの詳細（例えば、細胞内、細胞外、インビトロ転写、結合されたインビトロ転写／翻訳等）によって大きく変動する。
【０１０４】
プロモーターの選択は、発現生成物及び使用される細胞またはシステムの種類等のいくつかの因子に依存する。例えば、非ｍＲＮＡ分子は、ＲＮＡ  ポリメラーゼＩまたはＩＩＩプロモーターを使用して生成されることが多い。ｍＲＮＡは、一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを使用して転写される。しかしながら、例外がある。１つは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ発現システムであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）を使用してＤＮＡから転写され得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、「明確な」停止及び開始点を有さないが、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、５’及び３’末端の除去により処理される傾向がある。したがって、末端において「余分な」ＲＮＡ断片が除去される。ｍＲＮＡ（例えばｃａｓ９  ｍＲＮＡ）は、通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターにより生成される。
【０１０５】
特定のプロモーターの選択は、具体的な用途によって変動する。例えば、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターは、インビトロ転写及びインビトロ転写／翻訳システムに使用されることが多い。細胞内発現が望ましい場合、使用されるプロモーター（複数種可）は、一般に、使用される細胞内で効率的に機能するように設計される。例えば、ＣＭＶプロモーターは、哺乳動物細胞内での使用のための強力なプロモーターである。ハイブリッドＨｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ  Ｓ２プロモーターは、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）等の真核藻類において良好に機能する構成的プロモーターである。（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡからの製品マニュアル「ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」、カタログ番号Ａ２４２４４、バージョンＢ．０を参照されたい。）本発明の実践において使用され得るさらなるプロモーターは、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ｐＧＣ１、ＥＦ１α、及びＨｓｐ７０プロモーターを含む。
【０１０６】
発現ベクター内のＤＮＡ断片は、ＲＮＡ合成を誘導するために、適切な発現制御配列（複数可）（プロモーター）に動作可能に連結される。好適な真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターを含む。本発明との使用に好適な例示的プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスからのものである。さらに、プロモーターは、Ｕ６及びＨ１プロモーターからなる群から選択され得る。Ｕ６及びＨ１プロモーターは、共にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスのメンバーである。
【０１０７】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、本発明の方法により生成された核酸分子のインビボ転写に好適である。例えば、図５に記載されるような線形ＤＮＡ分子は、細胞内に導入され、例えば天然にある細胞内転写プロセスにより転写され得る。
【０１０８】
本発明の組成物及び方法におけるプロモーターはまた、発現が「オン」または「オフ」に切り替えられ得るという点で誘導性であってもよい。例えば、Ｕ６プロモーターを使用するテトラサイクリン調節可能システムが、ｓｉＲＮＡの生成を制御するために使用されてもよい。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有してもよく、または含有しなくてもよい。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。
【０１０９】
本発明との使用に好適な細胞は、多種多様な原核及び真核細胞を含む。多くの場合において、１つ以上のＣＲＩＳＰＲシステム成分は、天然では細胞と関連しない（すなわち、細胞に対して外因性である）。
【０１１０】
本発明の実践に使用され得る代表的な細胞は、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞を含む。例示的な細菌細胞は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）細胞（具体的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、最も具体的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５α、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）細胞（具体的には枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）細胞、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．）細胞、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）細胞、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．）細胞（具体的にはセラチア・マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ）細胞）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）細胞（具体的には緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞）、ならびにサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）細胞（具体的にはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及び腸チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）細胞）を含む。例示的な動物細胞は、昆虫細胞（最も具体的にはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９及びＳｆ２１細胞、ならびにトリコプルサ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）、線虫細胞（具体的にはエレガンス線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（具体的にはツメガエル細胞）、爬虫類細胞、及び哺乳動物細胞（より具体的にはＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ  ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ１０８０、ＰＣ１２、ＭＤＣＫ、Ｃ２Ｃ１２、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｋ−５６２、ＴＦ−１、Ｐ１９及びヒト胚幹細胞様クローンＨ９（Ｗｉｃｅｌｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ））を含む。例示的な酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を含む。これらの、及び他の細胞は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から市販されている。例示的な植物細胞は、大麦、小麦、米、大豆、じゃがいも、シロイヌナズナ及びタバコ（例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１）を含む。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：乾燥試薬の調製
噴霧乾燥：ガイドＲＮＡの乾燥製剤を、ガイドＲＮＡ、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、スクロース、アルブミン（重量で２０：４０：２０：２０）から調製する。１５ｍｇのｓｉＲＮＡ、１５ｍｇのアルブミン、及び１５ｍｇのスクロースを含有する水溶液（全体積７．５ｍｌ）を、３０ｍｇのＤＰＰＣを含有する１７．５ｍｌのエタノールと混合する。溶液を組み合わせる前に、磁気撹拌棒を用いてそれらを混合する。水溶液を有機溶液に加えた後、組み合わされた溶液を磁気撹拌棒により室温で約６分間混合してから、溶液を噴霧乾燥する。噴霧乾燥の条件は、Ｔｉｎｌｅｔ＝９５℃、Ｔｏｕｔｌｅｔ＝５５℃、霧化／乾燥ガス流速は６００Ｌ／時間である。
【０１１２】
実施例２：乾燥試薬の調製
ＲＮＡ貯蔵緩衝液（１ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．４）中のインビトロ転写ガイドＲＮＡストック（ウェル当たり０．５μｇから１μｇ）２０μｌを、９６ウェルプレート形式で凍結乾燥し、−２０℃に維持した。Ｕ２ＯＳ  Ｃａｓ９安定細胞内へのトランスフェクションの前に、ドライダウン法で乾燥した（ｄｒｉｅｄ  ｄｏｗｎ）ｇＲＮＡを短時間遠心分離し、２０μｌのＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅ不含水中に再懸濁させる。トランスフェクションの前に、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＲＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用してＲＮＡ濃度を測定した。トランスフェクションの１日前に、ウェル当たり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレート形式で播種した。トランスフェクションされない対照を除く各ウェルに対して、トランスフェクションの日に、２０ｎｇのｇＲＮＡを５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地に加え、続いて１．５μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを含有する５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加した。得られたトランスフェクションミックスを、室温で１０分間インキュベートし、次いで細胞に加えた。トランスフェクトされた細胞を含有するプレートを３７℃で４８時間、５％ＣＯ２インキュベータ内でインキュベートした。遺伝子座特異的インデル形成のパーセンテージを、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）により測定した。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の内蔵ソフトウェアを使用して、バンド強度を定量した。図７は、６つの異なる遺伝子に対して得られた開裂効率結果を示す。ＢＴＫ遺伝子の場合、２つの異なるゲノム遺伝子座を試験した。試験した各試料に対して、賦形剤あり、または賦形剤なしでのドライダウン法で乾燥した試料を、ＲＮＡ貯蔵緩衝液中の非凍結乾燥ＩＶＴ  ｇＲＮＡと比較した。
【０１１３】
上記の実施形態は、明確性及び理解を目的としてある程度詳細に説明されたが、当業者には、本開示を読むことで、本明細書において開示される実施形態の真の範囲から逸脱せずに、形式及び詳細に様々な変更が行われてもよいことが明らかである。例えば、上述の全ての技術、装置、システム、及び方法は、様々な組み合わせで使用され得る。
【０１１４】
本発明の例示的主題は、以下の項により示される。
項１．  １種以上の安定化された遺伝子改変試薬を調製するための方法であって、
（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の溶媒中溶液を調製することと、
（ｂ）（ａ）の溶媒の８０％超を除去することと
を含む、方法。
項２．  溶媒が、水、１種以上のアルコール、または水及び１種以上のアルコールの混合物である、項１に記載の方法。
項３．  １種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種が、
（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、
（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び
（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
からなる群から選択される１種以上の試薬である、前記項に記載の方法。
項４．  水が、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧フリーズドライ、超臨界流体乾燥、または真空遠心により除去される、項２に記載の方法。
項５．  溶媒の８０％から９９．５％が、１種以上の遺伝子改変試薬の水溶液から除去される、前記項のいずれかに記載の方法。
項６．  個々の遺伝子改変試薬が、１枚のマルチウェルプレートの２つ以上のウェル内に入れられる、前記項のいずれかに記載の方法。
項７．  個々の遺伝子改変試薬の溶媒中溶液が、マルチウェルプレートのウェルに加えられる、項６に記載の方法。
項８．  個々の遺伝子改変試薬が多層プレートのウェル内に存在する間に、水性の溶媒の一部または全てが、個々の遺伝子改変試薬から除去される、項６から７に記載の方法。
項９．  ５０から１００個の個々の遺伝子改変試薬が、マルチウェルプレートの異なるウェル内に入れられる、項６に記載の方法。
項１０．  個々の遺伝子改変試薬が、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合する、項６から９に記載の方法。
項１１．  水溶液が、
（ａ）１種以上の緩衝剤、
（ｂ）１種以上のプロテアーゼ阻害物質、
（ｃ）１種以上のヌクレアーゼ阻害物質、
（ｄ）１種以上の塩、
（ｅ）１種以上の炭水化物、
（ｆ）１種以上のトランスフェクション試薬、
（ｇ）１種以上のポリアミン、及び
（ｈ）１種以上の培養培地
からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、前記項のいずれかに記載の方法。
項１２．  炭水化物が、スクロース、トレハロース、ラクトスクロース、またはシクロデキストリンの１つ以上である、項１１に記載の方法。
項１３．  水の除去前の水溶液のｐＨが４から約１１の間である、前記項のいずれかに記載の方法。
項１４．  １種以上の遺伝子改変試薬を貯蔵するための方法であって、
（ａ）１種以上の遺伝子改変試薬の水溶液を調製することと、
（ｂ）（ａ）において調製された水溶液から水の９０％超を除去することと、
（ｃ）３０日間の貯蔵後に遺伝子改変機能活性の７５％超が保持される条件下に、１種以上の遺伝子改変試薬を置くことと
を含む、方法。
項１５．  少なくとも３０日間の貯蔵後に、少なくとも１種または１種以上の遺伝子改変試薬の遺伝子改変機能活性の９０％超が保持される、項１４に記載の方法。
項１６．  １２０日間の貯蔵後に、少なくとも１種または１種以上の遺伝子改変試薬の遺伝子改変機能活性の９０％超が保持される、項１４または１５に記載の方法。
項１７．  １種以上の遺伝子改変試薬の２種以上が、同じ貯蔵容器内で貯蔵される、項１４、１５、または１６に記載の方法。
項１８．  貯蔵容器がマルチウェルプレートである、項１７に記載の方法。
項１９．  個々の遺伝子改変試薬が、同じ生物のゲノムの異なるヌクレオチド配列に結合する、項１７に記載の方法。
項２０．  １種以上の遺伝子改変試薬が、−２０℃で、４℃で、または２０℃から３０℃の間で貯蔵される、項１４、１５、１６、１７、１８、または１９に記載の方法。
項２１．  １種以上の安定化された遺伝子改変試薬を含む組成物であって、組成物が、１種以上の遺伝子改変試薬を含み、遺伝子改変試薬の含水率が１０％（ｗ／ｗ）未満である、組成物。
項２２．  含水率が約０．２％から約８％である、項２１に記載の組成物。
項２３．  １種以上の遺伝子改変試薬の少なくとも１種が、
（ａ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｃ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質、
（ｄ）亜鉛フィンガー−ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子、
（ｅ）Ｃａｓ９タンパク質、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子、
（ｇ）ガイドＲＮＡ、及び
（ｈ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
からなる群から選択される１種以上の試薬である、項２１または２２に記載の組成物。
項２４．  安定化された試薬が、
（ａ）１種以上の緩衝剤、
（ｂ）１種以上のプロテアーゼ阻害物質、
（ｃ）１種以上のヌクレアーゼ阻害物質、
（ｄ）１種以上の塩、
（ｅ）１種以上の炭水化物、
（ｆ）１種以上のトランスフェクション試薬、
（ｇ）１種以上のポリアミン、及び
（ｈ）１種以上の培養培地
からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、項２１、２２、または２３に記載の組成物。
項２５．  ５０から１００個の個々の安定化された遺伝子改変試薬が、１枚のマルチウェルプレートの異なるウェル内に入れられる、項２１、２２、２３、または２４に記載の組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月31日(2018.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ここで、本明細書において開示される原理、及びその利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて考慮される以下の説明が参照される。
【図１】本発明のいくつかの態様の代表的な図である。この図は、単一成分（例えば、亜鉛フィンガー及びＴＡＬシステム）、ならびに複数成分遺伝子改変システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９及びＣｐｆ１システム）の試薬の例を示す。代表的な単一成分システムのための試薬は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質であってもよい。これらの任意の１つ以上が、ゲノム改変のために細胞内に導入されてもよい。代表的な複数成分システムのための試薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質であってもよい。これらの一方または両方が、ゲノム改変のために細胞内に導入されてもよい。ＤＮＡ及びｍＲＮＡ試薬は、次いでＲＮＡ（例えばｇＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたはＴａｌヌクレアーゼ）に変換される前駆体として細胞に進入する。
【図２】本発明の一態様における使用のための例示的なプレート形式を示す図である。プレートは、６×８のウェルのアレイを含有し、各ウェルは、数字及び文字の組み合わせにより特定される。ウェルＡ，１及びＡ，６は、遺伝子改変試薬を含有せず、したがって対照ウェルである。
【図３】代表的な自然発生的ＴＡＬタンパク質（配列番号：１）のモジュール構造の概略図である。このタンパク質は、アミノ末端（Ｎ）、塩基選択性を決定付ける１２位及び１３位に超可変残基を有する楕円により示される可変数の３４アミノ酸反復を含む中央アレイ、ならびに核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び転写活性化因子（ＡＤ）ドメインを含むカルボキシル末端（Ｃ）で構成される。
【図４】Ｃａｓ９タンパク質（配列番号：２）及び標的ゲノム遺伝子座（配列番号：３）の両方に結合したガイドＲＮＡを示す、ガイドＲＮＡ分子（１０４ヌクレオチド）（配列番号：４）の概略図である。ヘアピン領域１は、ヌクレオチドＧＡＡＡにより連結された相補的ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ領域のハイブリダイゼーションにより形成される。ヘアピン領域２は、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’位における相補的領域により形成される。
【図５】ＤＮＡオリゴテンプレートを使用してガイドＲＮＡ（配列番号：４）を合成するためのワークフローを示す図である。ＤＮＡテンプレートをコードするガイドＲＮＡは、アセンブリＰＣＲを使用して生成される。このアセンブリ反応の成分は、１）標的特異的ＤＮＡオリゴ（ｃｒＲＮＡ領域をコードする）、２）インビトロ転写に使用される細菌プロモーター（この場合Ｔ７プロモーター）に特異的なＤＮＡオリゴ、及び３）ｔｒａｃｒＲＮＡ領域をコードする重複ＰＣＲ生成物を含む。充填反応に続いて、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（この場合高忠実度ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用してサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）においてＰＣＲ増幅が行われ、全長ｇＲＮＡコード化テンプレートが生成される。ＰＣＲアセンブリの後、得られたＤＮＡ塩プレートは、非コードＲＮＡ合成用のインビトロ転写試薬（この場合ＭＥＧＡＳＨＯＲＴＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｔ７キット）を使用して３７℃で転写されて標的特異的ｇＲＮＡが生成される。合成後、得られたｇＲＮＡは、カラムまたは磁気ビーズに基づく方法を使用して精製される。精製されたインビトロ転写ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を用いた同時トランスフェクションまたは対象となる宿主システムもしくは細胞株におけるｍＲＮＡ送達に使用可能である。
【図６】ＣＲＩＳＰＲシステムを使用したニッキングに基づく核酸開裂戦略を示す概略図である。図の上部において、２つの線は二本鎖核酸を表す。２つのニック部位は、部位１及び部位２で示されている。これらの部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体と相互作用する核酸の領域を示す、実線または破線のボックス内に位置している。図の下部は、両方の鎖における２つの近い位置にあるニックをもたらすニッキング作用を示す。
【図７】乾燥及び凍結乾燥から再構成された後のＵ２ＯＳ−Ｃａｓ９細胞株におけるＩＶＴガイドＲＮＡの開裂効率を示す図である。ＣＰＦＳ１  Ｔ２と標示されたウェルにはガイドＲＮＡは存在しなかった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018533962000001.app
【国際調査報告】
2018533962.tif 000012
2018533962.tif 000013
2018533962.tif 000014
2018533962.tif 000015