(57)【要約】  マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の微生物叢分泌タンパク質ＭＰＴ６３から改変ペプチドＡＴ−０１を合成した。このペプチド（約３０アミノ酸）は、ＭＰＴ６３（１３１アミノ酸）の免疫原性領域の一部を含む。このペプチドは、抗がん性がよく特徴付けられている腫瘍抑制タンパク質であるＳＭＡＲ１（足場マトリックス付着領域結合タンパク質１）を安定化させることが判明している。ＡＴ−０１をさらに改変して、６つの新しい独立したペプチドを作製した。これらのペプチドの中で、ＡＴ−０１  ＣおよびＡＴ−０１  Ｄは、他のペプチドよりも有効であることが判明した。ＡＴ−０１  Ｄはまた、抗転移活性を支持するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の細胞移動を減弱させる。コロニー形成アッセイからの細胞成長の阻害も、この抗がん活性を支持した。このペプチドは、安全で効果的ながん療法としての大きな潜在的価値を示す、高用量では細胞に毒性を引き起こさない。
2018512446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列およびこの変異体／誘導体からなる、抗がん活性が増加した抗がん剤としての改変ペプチドならびにこれらの医薬組成物。
【請求項２】
ＡＴ０１Ａ、ＡＴ０１Ｂ、ＡＴ０１Ｃ、ＡＴ０１Ｄ、ＡＴ０１ＥおよびＡＴ０１Ｆと命名されたペプチドを含み、それぞれ配列番号２、３、４、５、６および７を有する、請求項１に記載のペプチド変異体。
【請求項３】
配列番号４を有するＡＴ０１Ｃである、請求項１または２に記載のペプチド変異体。
【請求項４】
配列番号５を有するＡＴ０１Ｄである、請求項１から３のいずれかに記載のペプチド変異体。
【請求項５】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分泌タンパク質ＭＰＴ６３から合成される、請求項１から４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から４に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項１から４に記載のペプチドおよび医薬として許容される担体および／またはアジュバントをさらに含み、前記ペプチドが０．１から２５０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る医薬組成物。
【請求項８】
標的化送達および／または診断適用を担う他の連結薬剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項９】
サイクリンＤ１を抑制することによる細胞周期停止を介して腫瘍をさらに抑制する、足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）の安定化に有用である、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
がんに罹患している対象を診断、予防および治療する方法であって、ペプチドＡＴ０１もしくはこの変異体を１．０から１０ｍｇの範囲で、場合により他の連結体と共に投与すること、またはこれらの医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、微生物叢細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分泌タンパク質ＭＰＴ６３から合成された新規ペプチドに関する。特に、本発明は、抗腫瘍抗がん活性を有するペプチドを提供する。より詳細には、本発明のペプチドは、足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）を安定化させ、腫瘍をさらに抑制する。約３０個のアミノ酸を含むペプチドＡＴ０１をさらに改変して、増強された抗がん活性を有する抗がん剤候補を開発する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、発展途上国および先進国にとって同様に世界的な公衆衛生上の主要な脅威として浮上している。米国がん協会は、２０１５年に診断された新規のがん患者数は約１６６万人、米国のみでは５８９，４３０人のがん死亡を予測している。がんの進行は、制御されない細胞成長および変異細胞の増殖によって特徴付けられ、急速に増殖するがんは未治療のまま放置すると患者の死を招き得る。今日まで、がん介入は、主に放射線療法、免疫療法および化学療法アプローチに依存してきた。概して、市場で入手可能なこれらのがん療法は、費用がかかり、および／または重篤な副作用を引き起こす。さらに、これらの療法は、がんの耐性の発生をもたらし得るか、または継続された療法に耐性となるがんの最終的な再発の原因となり得る。従って、患者にとって、より安全で費用効果の高い代替治療アプローチが緊急に必要とされており、Ａｍｒｉｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの改変ペプチドがこの主要で満たされていない医学的必要性のための１つの解決策を提供する可能性がある。
【０００３】
正常細胞のがん細胞への形質転換に関与する細胞内および細胞外機序を理解するための分子生物学的、生化学的および細胞生物学的研究には非常に力を入れているにもかかわらず、世界は、がんに対する真に持続可能で費用効果が高く、安全で効果的な治療を依然として待っている。多くのがん治療薬の主な制限は、薬理学的に関連する化合物、ペプチジル模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびタンパク質を細胞に送達する問題である（Ｅｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９９７）。ペプチドベースの薬物は、細胞膜の透過性の低さおよび選択性の形で制限を有する。これらの問題は、輸送体または特異的受容体に依存せずに生体膜を効率的に通過し、さまざまな生物学的カーゴの細胞内送達を媒介できるタンパク質転移ドメイン（ＰＴＤ）をペプチドに付けることによって回避される。
【０００４】
新生物の進行には複数の遺伝子変異が必要であり、ｐ５３の不活性化は全てのヒトのがんの約６０％に共通して関与している（Ｌｅｖｉｎ，１９９７；Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎ，２００２）。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、ＤＮＡ損傷およびがん遺伝子の活性化を含む広範囲の細胞ストレスに応答して活性化され、安定化される短命の潜伏性転写因子である。ｐ５３は、分化、老化および血管新生を含む腫瘍成長を阻害し得る、幾つかの過程の調節に関与する（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｒｅｎ，２００３）。しかし、ｐ５３の中心的機能は、部分的には、ｐ５３応答性標的遺伝子の発現を活性化してこれらの応答を媒介することによって、被ストレス細胞における細胞周期停止および／またはアポトーシスの両方を誘導する能力であると思われる。細胞ストレスによるｐ５３活性化の正確な機序は非常に興味深いものであり、共有結合性修飾によって、ｐ５３タンパク質のレベルおよびｐ５３の比活性の両方の増加に関与すると思われ、このＮ−末端およびＣ−末端ドメインにおいて高度に保存された残基は、リン酸化、ユビキチン化またはアセチル化による潜在的な翻訳後修飾の標的である（Ｇｉａｃｃｉａ  ａｎｄ  Ｋａｓｔａｎ，１９９８；Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎ  ２００３）。
【０００５】
本研究は、インビトロおよびインビボの両方で腫瘍抑制タンパク質ＳＭＡＲ１を安定化することによってｐ５３を上方制御する１以上のペプチドを開発することを目的とした。ＳＭＡＲ１は、腫瘍の成長および進行を妨げる強力な腫瘍抑制因子であることが報告されている６８ＫＤａのタンパク質であり、細胞内でマスター調節因子の役割を果たす。ＳＭＡＲ１は、がん細胞の成長を調節することによって腫瘍成長を妨げるｐ５３のセリン−１５と相互作用し、安定化させる。ＳＭＡＲ１はサイクリンＤ１遺伝子を抑制することが知られており、Ｇ１期に細胞を停止させることによって細胞進行を妨げる。Ｇ１期からＳ期への移行に必要とされるサイクリンＤ１遺伝子は、がんに際して異常に活発である。サイクリンＤ１はさらに、乳がんにおいても過剰発現されることが見出されている。このタンパク質は、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂと相互作用することが示されており、この遺伝子の発現はＲｂによって正に調節される。細胞周期の進行を変化させるこの遺伝子の突然変異、増幅および過剰発現は、さまざまな腫瘍において頻繁に観察され、腫瘍形成に寄与すると思われる。これは腫瘍形成の調節におけるＳＭＡＲ１の計り知れない重要性を強調している。高悪性度の乳がんでは、ＳＭＡＲ１は乳がんの段階に比例して下方制御されることが報告されている。この研究により、ＳＭＡＲ１が、がんの発症につれて分解または完全に失われ、異常ながん細胞の成長を制御するためには回復の必要性があることが示されている。本発明者らの研究は、ＡＴ−０１が実際にＳＭＡＲ１に結合し、ＳＭＡＲ１の分解を防ぎ、続いて、異常な細胞成長および進行を阻止するために必要なＳＭＡＲ１の発現レベルを維持するというＡＴ−０１の有効性を初めて実証した。特に、ペプチドＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄの介入は、ＳＭＡＲ１の発現を細胞内で維持可能にするために必要とされる有効性が増強され、ＳＭＡＲ１ががん遺伝子を下方制御するマスター細胞レギュレーターとしての役割を果たす、即ちＳＭＡＲ１の伝統的な抗がん活性を継続できることを実証している。従って、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄペプチドは、特にＳＭＡＲ１のような腫瘍抑制タンパク質を安定化することによって、がんにおける腫瘍学的ペプチド治療薬として有用な薬剤として機能し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Egleton,  RD.,  and  Davis,  TP.  1997.  Bioavailability  and  Transport  of  Peptides  and  Peptide  Drugs  into  the  Brain.  Peptides  18,  1431-1439.
【非特許文献２】Levine,  AJ.  1997.  p53,  the  Cellular  Gatekeeper  for  Growth  and  Division.  Cell  88,  323-331.
【非特許文献３】Michael,  D.,  and  Oren,  M.  2002.  The  p53  and  Mdm2  families  in  cancer.  Curr.  Opin.  Genet.  Dev.  12,  53-59.
【非特許文献４】Vogelstein,  B.,  Lane,  D.,  and  Levine,  AJ.  2000.  Surfing  the  p53  network.  Nature  408,  307-310.
【非特許文献５】Oren,  M.  2003.  Decision  making  by  p53:  life,  death  and  cancer.  Cell  Death.  Differ.  10,  431-442.
【非特許文献６】Giaccia,  and  Kastan.  1998.  The  complexity  of  p53  modulation:emerging  patterns  from  divergent  signals.  2973-2983.
【非特許文献７】Michael,  D.  and  M.  Oren.  2003.  The  p53-Mdm2  module  and  the  ubiquitin  system.  Semin.  Cancer  Biol.  13:49-58.
【発明の概要】
【０００７】
（ｉ）主要な目的は、先行技術の限界を排除／最小化する抗がん剤として作用可能なさらなる新規ペプチドを提供することである。
【０００８】
（ｉｉ）第２の目的は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分泌タンパク質ＭＰＴ６３から合成されたペプチドを提供することである。
【０００９】
（ｉｉｉ）第３の目的は、がん遺伝子をさらに抑制し、ｐ５３を再活性化する、足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）として知られているマスター細胞レギュレータータンパク質を安定化するペプチドを提供することである。さらに、このペプチドは、抗がん活性を発揮するＳＭＡＲ１の発現レベルを細胞おいて維持する。
【００１０】
（ｉｖ）第４の目的は、抗がん活性が増強された約３０個のアミノ酸を含む改変ペプチドＡＴ−０１またはこの誘導体による、安全で扱いやすい療法を提供することである。
【００１１】
（ｖ）第５の目的は、治療薬候補として有用な改変ペプチドＡＴ−０１もしくはこの誘導体を提供すること、またはがんを阻止するペプチジル薬物を開発することである。
【００１２】
（ｖｉ）第６の目的は、がんの早期検出のための造影剤または診断剤の候補として有用な改変ＡＴ−０１またはこの誘導体を開発することである。
【００１３】
（ｖｉｉ）第７の目的は、ＡＴ−０１、改変ＡＴ−０１ペプチドまたはこの誘導体を含む組成物、医薬組成物ならびにこれらの用途を提供することである。
【００１４】
（ｖｉｉｉ）第８の目的は、がんに罹患している対象の診断、予防または治療方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ペプチド誘導体（ＡＴ−０１ＡからＡＴ−０１Ｆ）の構造を示す。
【図２】ＡＴ−０１、ＡＴ−０１ＡからＡＴ−０１ＦによるＨＣＴ１１６細胞のインビトロ処理ならびにＳＭＡＲ１の安定化におけるＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄの有効性の向上を示す。さまざまながん細胞株にわたって示された、ＳＭＡＲ１の安定化におけるペプチド誘導体ＡＴ−０１Ｄの有効性の向上を示す。
【図３】全長タンパク質結合ドメイン（ＰＢＤ）またはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のいずれかのＳＭＡＲ１タンパク質とＡＴ−０１および誘導ペプチドとの間の物理的相互作用を実証する等温滴定熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）（ＩＴＣ）実験である。
【図４】コンピュータ視覚化ソフトウェアによって予測される、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１ＤペプチドのＳＭＡＲ１との結合部位候補を示す。
【図５】コロニー形成アッセイを利用した、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄペプチドの存在下で予測されるヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞移動の軽減を示す。
【図６】それぞれ、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６結腸がん細胞の処理期間中に腫瘍体積が１／２から２／３減少したことを実証する、インビボ前臨床試験期間中のＡＴ−０１Ｃの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従って、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列およびこの変異体／誘導体からなる抗がん活性が増加した抗がん剤としての改変ペプチドならびにこれらの医薬組成物を提供する。
【００１７】
実施形態の１つによれば、ＡＴ０１に由来するＡＴ０１Ａ、ＡＴ０１Ｂ、ＡＴ０１Ｃ、ＡＴ０１Ｄ、ＡＴ０１ＥおよびＡＴ０１Ｆと命名されたペプチドを含む変異体は、それぞれ配列番号２、３、４、５、６および７を有する。
【００１８】
第２の実施形態によれば、ＡＴ０１Ｃと命名されたペプチドを含む変異体は配列番号４を有する。
【００１９】
第３の実施形態によれば、ＡＴ０１Ｄと命名されたペプチドを含む変異体は配列番号５を有する。
【００２０】
第４の実施形態によれば、抗がん剤であるこのペプチドは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分泌タンパク質ＭＰＴ６３から合成され得る。
【００２１】
第５の実施形態によれば、本発明は、ＡＴ０１またはこの変異体ｄを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
第６の実施形態によれば、本発明は、医薬として許容される担体および／またはアジュバントをさらに含み、ペプチドが０．１から２５０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る医薬組成物を提供する。
【００２３】
第７の実施形態によれば、本発明は、標的化送達および／または診断適用を担う他の連結薬剤をさらに含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
第８の実施形態によれば、本発明は、サイクリンＤ１を抑制することによる細胞周期停止を介して腫瘍をさらに抑制する、足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）の安定化に有用であり得る医薬組成物を提供する。
【００２５】
第９の実施形態によれば、本発明は、ペプチドＡＴ０１もしくはこの変異体を、場合により他の連結体と共に投与することによって、またはこれらの医薬組成物を投与することによって、がんに罹患している対象を診断、予防および治療する方法を提供する。
【００２６】
詳細な説明：
宿主系への侵入を可能にし、感染を支援するさまざまな分泌タンパク質がＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって分泌される。Ｇｏｕｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  は、バイオインフォマティクスアプローチを用いてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の３，９２４種の分泌タンパク質を同定した。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の分泌タンパク質ＭＰＴ−６３は、抗がん活性を示す。ＭＰＴ−６３は、免疫原性活性とは別に、未知の機能を有する１７ＫＤａのタンパク質である。しかし、この１．５オングストロームの結晶構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに詳しく記載されている。
【００２７】
ＡＴ０１と命名された３０アミノ酸ペプチドは、抗がん特性を示すＭＰＴ−６３から合成される。このペプチドを、両側からさらに改変し、この抗がん活性に必要な正確な配列を正確に指摘した。従って、親の３０アミノ酸ペプチド、即ちＡＴ−０１から６つのペプチドを生成した。これらのペプチドを、ＡＴ−０１（３０アミノ酸）、ＡＴ−０１Ａ（２５アミノ酸）、ＡＴ−０１Ｂ（２５アミノ酸）、ＡＴ−０１Ｃ（２０アミノ酸）、ＡＴ−０１Ｄ（２０アミノ酸）、ＡＴ−０１Ｅ（１５アミノ酸）およびＡＴ−０１Ｆ（１０アミノ酸）と命名した。それぞれ、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６を有するＤＭ０１、ＤＭ０２、ＤＭ０３、ＤＭ０４、ＤＭ０５、ＤＭ０６、ＤＭ０７、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２と名付けられた追加のペプチドを、表１に示すように、ＡＴ−０１におけるアミノ酸の選択的置換または付加によって設計した。
【００２８】
【表１】
2018512446.tif 000003
【００２９】
がん進行経路におけるこれらのペプチドの役割を理解し、確認するために、足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）の誘導を試験した。ＳＭＡＲ１は、マスター細胞レギュレーターとして認識され、この発現が、乳がんを含む多くのがんにおいて悪性度が高いほど劇的に減少する核マトリックス関連タンパク質の１つであると認識されている。ＳＭＡＲ１遺伝子は、ヒト染色体１６ｑ２４．３遺伝子座に位置し、幾つかのタイプのがんにおいてヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失が報告されている（Ｍａｌｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＳＭＡＲ１は、インビボでの腫瘍進行の遅延および細胞周期の調節に関与するｐ５３相互作用タンパク質であることも報告されている。ＳＭＡＲ１がｐ５３と物理的に相互作用し、共局在することが実証されている（Ｊａｌｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらのペプチドはＳＭＡＲ１のポケット内に強く結合し、このユビキチン化を回避する。ＳＭＡＲ１安定化のためのこの３０アミノ酸ペプチドの最小で最良の機能的領域を同定するために、ＡＴ０１の両側から５アミノ酸を欠失させることにより、さらなるペプチドを設計した。このようにして、２５アミノ酸（ＡＴ−０１ＡおよびＡＴ−０１Ｂ）の２つのペプチド、２０アミノ酸の１つのペプチド（ＡＴ−０１Ｃ）、１５アミノ酸の２つのペプチド（ＡＴ−０１ＤおよびＡＴ−０１Ｅ）および１０アミノ酸の１つのペプチド（ＡＴ−０１Ｆ）を調製し、ＳＭＡＲ１誘導アッセイについてスクリーニングした。ＳＭＡＲ１の優れた誘導を示す最小のペプチドは、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄであった。本発明者らは、これらのペプチドの多くがＳＭＡＲ１の誘導を示すと考えている。
【００３０】
ＭＰＴ６３分泌タンパク質は本質的に有害で感染性であるが、これにもかかわらず、特に遺伝子改変に関して重要な生物学的役割を果たす。この文脈において、本発明者らは、これらのペプチドの抗がん特性を初めて提供する実験に基づいた証拠を初めて開発し、これらのペプチドが、がん遺伝子を下方制御し、順に、腫瘍の縮小を引き起こすＳＭＡＲ１タンパク質の分解を防止することによって、腫瘍抑制タンパク質ＳＭＡＲ１を実際に安定化することを実証した。
【００３１】
これらのペプチドは、単独で、または他の化合物と組み合わせて使用することができる。一例として、これらは、標的化薬物送達系において薬物に連結することができる。さらに別の例として、これらは、診断または研究用途のためのプローブに連結することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは、メサトレキセート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、アウロチオマレート（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入および局所注射）、ベータ−２−アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリケート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、イブプロフェンなどのＮＳＡＩＤｓ、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン系薬物、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの前炎症性サイトカインによるシグナル伝達を妨げる薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびこれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５  ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（レナルセプト）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、およびｓＩＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、ヒドロキシクロロキンサルフェート、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、メチルプレドニゾロンアセテート、金ナトリウムチオマレート、アスピリン、トリアムシノロンアセトニド、プロポキシフェンナプシレート／ａｐａｐ、フォレート、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、オキシコドンＨＣｌ、ヒドロコドンビタータレート／ａｐａｐ、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え体、トラマドールＨＣｌ、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロネートナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、アミトリプチンＨＣｌ、スルファジアジン、オキシコドンＨＣｌ／アセトアミノフェン、オロパタジンＨＣｌ、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１  ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８ＢＰ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ−７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１およびメソプラムなどの薬剤と組み合わせて投与することもできる。
【００３３】
本発明のペプチドが同時投与または併用可能ながんの治療剤の非限定的な例としては以下が挙げられる：ブデソニド；表皮成長因子；スルファサラジン；アミノサリチレート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；成長因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ならびに他のヒトサイトカインもしくは成長因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦに対する抗体またはこれらのアンタゴニスト。本発明の抗体またはこれらの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。
【００３４】
本発明は、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入による。）による非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含み得る。注射用製剤は、防腐剤を加えた単位剤形（例えば、アンプルまたは複数用量容器）で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含み得る。または、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。
【００３５】
本発明は、デポー調合剤として処方された組成物の投与をさらに含むことができる。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、組成物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中エマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
【００３６】
一般的に、組成物の成分は、単位剤形、例えば、凍結乾燥された乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性薬剤の量を示すアンプルまたは分包（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密閉容器で、別々にまたは混合して供給される。投与様式が注入である場合、組成物は、医薬品グレードの滅菌水または滅菌生理食塩水を含む注入ボトルに分注することができる。投与様式が注射によるものである場合、投与前に成分を混合可能なように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００３７】
特に、本発明はまた、本発明の予防剤または治療剤または医薬組成物の１以上が、薬剤の量を示すアンプルまたは分包のような密閉容器に包装されることも提供する。一実施形態において、本発明の予防剤または治療剤または医薬組成物の１以上は、滅菌され、凍結乾燥された乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密閉容器で供給され、対象への投与のための適切な濃縮物に（例えば、水または生理食塩水で）再構成することができる。好ましくは、本発明の予防剤または治療剤または医薬組成物の１以上は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位用量で、滅菌され、凍結乾燥された乾燥粉末として密閉容器で供給される。本発明の凍結乾燥された予防剤または治療剤または医薬組成物は、元の容器中に２℃から８℃の間で保存されなければならず、本発明の予防剤または治療剤または医薬組成物は、再構成後１週間以内、好ましくは５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与されなければならない。別の実施形態において、本発明の予防剤または治療剤または医薬組成物の１以上は、薬剤の量および濃度を示す密閉容器内で液体形態で供給される。好ましくは、液体形態の投与される組成物は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで密閉容器で供給される。液体形態は、元の容器に２℃から８℃の間で保存されなければならない。
【００３８】
本発明のペプチドは、非経口投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。好ましくは、ペプチドは、０．１から２５０ｍｇ／ｍｌを含有する注射用溶液として調製される。注射用溶液は、液体または凍結乾燥剤形のいずれかとして、フリントまたはアンバーバイアル、アンプルまたは薬剤充填済み注射器において構成することができる。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）の、Ｌ−ヒスチジン（１から５０ｍＭ、最適には５から１０ｍＭ）であり得る。他の適切な緩衝液としては、ナトリウムスクシネート、ナトリウムシトレート、ナトリウムホスフェートまたはカリウムホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。塩化ナトリウムは、溶液の毒性を改変するために、０から３００ｍＭ（液体剤形の場合、最適には１５０ｍＭ）の濃度で使用することができる。凍結保護剤は、主に０から１０％のスクロース（最適には０．５から１．０％）を凍結乾燥剤形に含めることができる。他の適切な凍結保護剤としては、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。増量剤は、主に１から１０％のマンニトール（最適には２から４％）を凍結乾燥剤形に含めることができる。安定剤は、主に１から５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には５から１０ｍＭ）を、液体および凍結乾燥剤形の両方に使用することができる。他の適切な増量剤には、グリシン、アルギニンが挙げられ、０から０．０５％のポリソルベート−８０（最適には０．００５から０．０１％）として含めることができる。さらなる界面活性剤としては、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の組成物は、さまざまな形態であり得る。これらには、例えば、溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射用または注入用溶液の形態であり、例えば、他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態において、本明細書に記載のペプチドは、静脈内に注入または注射によって投与される。別の実施形態において、ペプチドは、筋肉内または皮下に注射によって投与される。
【００４０】
治療用組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物（即ち、抗体または抗体部分）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体および必要な他の成分を上に列挙した成分から含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および噴霧乾燥であり、活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を、予め滅菌濾過したこの溶液から生じる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることにより、注射用組成物の持続的な吸収をもたらすことができる。
【００４１】
本発明のペプチドは当該分野で公知のさまざまな方法によって投与することができるが、多くの治療用途では、好ましい投与経路／投与様式は、皮下注射、静脈内注射、または注入である。当業者には理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に依存して変化するとも思われる。特定の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤のような、化合物を急速放出から保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許を取得しているか、または当業者に一般的に知られている。特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。化合物（および所望により他の成分）は、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または対象の食餌に直接組み込んでもよい。経口治療投与のためには、化合物を賦形剤に組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハーなどの形態で使用することができる。非経口投与以外の方法で本発明の化合物を投与するには、この不活性化を防止する物質で化合物をコーティングするか、または化合物と同時投与することが必要な場合がある。
【００４２】
追加の活性化合物も組成物に組み込むことができる。特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ペプチド活性が有害である障害を治療するために有用な１以上のさらなる治療剤と同時製剤化および／または同時投与される。さらに、本発明の１以上の結合タンパク質は、２以上の前述の治療剤と組み合わせて使用することができる。このような併用療法は、投与する治療剤をより少ない投薬量で有利に利用し、これによりさまざまな単剤療法に伴う毒性または合併症の可能性を回避することができる。
【実施例】
【００４３】
材料および方法
ペプチドの合成
研究に用いた全てのペプチドは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＵＳＡ）によって化学的に合成された。ペプチドは、固相化学によって合成され、９５％超に精製された。純度は、ＨＰＬＣおよび質量分析によって確認した。ペプチドを凍結乾燥形態で受け取り、緩衝液に溶解して、必要なストック溶液を得た。
【００４４】
ドッキングおよびバイオインフォマティクス
ドッキング解析は、ＳＭＡＲ１とペプチドとの正確な相互作用残基を見つけるために、Ａｕｔｏｄｏｃｋソフトウェアを使用して行った。ペプチド構造はソフトウェアにより予測され、作成されたＰＤＢファイルはその後のドッキング解析に用いた。相互作用するアミノ酸の解析をＰＤＢ  ｓｕｍを用いて行い、結合長さおよび結合残基を見出した。ペプチドの生理化学的特性を、さまざまなバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて得た。
【００４５】
細胞培養およびペプチド処理
ＳＷ６２０、ＭＣＦ７、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞をＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）において維持し、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をＬ−１５ＤＭＥＭ培地において維持した。ＮＣＩ−Ｈ５２２をＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）において培養した。全ての細胞に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００単位のペニシリンストレプトマイシン抗生物質を添加した。培養は、５％二酸化炭素ガスを供給し、相対湿度９７％に維持した３７℃のインキュベーターにおいて維持した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、他の条件を同じに保ちながら、二酸化炭素を含まないインキュベーターにおいて維持した。細胞を播種し、翌日ペプチドで４８時間処理した。２４時間後、新鮮な培地を添加し、ペプチド処理をさらに２４時間続けた。
【００４６】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、ウェスタンブロッティング技術によってＰＶＤＦ膜に移した。ブロットを、４℃において５％ＢＳＡを用いて一晩ブロッキングした。翌日ブロットを１×ＴＢＳＴで洗浄し、一次抗体をＲＴにおいて２時間添加した。その後洗浄し、ＲＴにおいて１時間二次抗体を添加した。ブロットを再度洗浄し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）にオートラジオグラフィーにより現像した。用いた抗体はＳＭＡＲ１（Ｂｅｔｈｙｌ）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）であった。
【００４７】
ＰＣＲ
ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋（３×１０＾５）細胞を３５ｍｍペトリ皿において培養し、異なる濃度のペプチドを用いて４８時間処理した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにおいて推定した。ｃＤＮＡを２μｇのｍＲＮＡから調製し、２μｌのｃＤＮＡを用いてＰＣＲをセットアップした。ＰＣＲに使用するＳＭＡＲ１プライマーはフォワードプライマーがＴＣＧＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＧであり、リバースプライマーはＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣである。ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。ＰＣＲ条件を９５℃で１分間、６２℃で１分間、および７２℃で３５サイクルに維持した。アンプリコンを１％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウム試薬で染色した。ゲルをＵＶ光トランスイルミネーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で露光し、記録した。
【００４８】
ＩＴＣによるペプチド相互作用アッセイ
ＳＭＡＲ１全長および切断型（タンパク質結合およびＤＮＡ結合ドメイン）ＳＭＡＲ１を発現させ、精製し、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイによるペプチドとの相互作用研究に使用した。全てのペプチドを全長および切断型のＳＭＡＲ１タンパク質で滴定し、続いてＩＴＣにより熱変化を測定した。ＩＴＣにより得られたデータから結合定数を計算した。特に記載しない限り、セットアップは、ＩＴＣ機器を使用して２５℃において行った。
【００４９】
創傷治癒アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳がん細胞（１×１０＾６）を６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳおよび１００単位のペニシリンストレプトマイシン抗生物質を添加したＬ１５  ＤＭＥＭ培地において２４時間維持した。細胞を、それぞれ１０μｇのＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄペプチドにより２４時間処理した。２４時間後に創傷を創成し、培地で洗浄して創傷創成中に剥離した細胞を除去した。新鮮なペプチドを加え、プレートを、３７℃の温度を維持しながら顕微鏡チャンバーに載置した。ＮＩＫＯＮ共焦点顕微鏡において５分間隔で画像を取得した。低速度撮影を１６時間に設定し、画像を編集して、細胞移動のビデオムービーを作成した。
【００５０】
コロニー形成アッセイ
２００個のＨＣＴ１１６細胞を３５ｍｍペトリ皿に播種し、２４時間培養した。新鮮な１０μｇのＡＴ−０１Ｄを、１２日目まで２日ごとに添加した。細胞を１×リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次いで３％パラ−ホルムアルデヒドを用いて１０分間固定した。細胞を洗浄し、クリスタルバイオレットで３０分間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを逆さにして風乾させた。コロニーを、倒立明視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて計測した。細胞群は、５０を超える細胞からなるコロニーであると同定された。
【００５１】
インビボ実験
ＳＣＩＤマウスに、どちらも結腸がん細胞である１００万個のＨＣＴ１１６細胞（がん腫）またはＨＴ２９細胞（腺がん）のいずれかを皮下注射した。２週間後、発達した腫瘍が見られ、ＡＴ−０１Ｃペプチドを注射する工程を開始した。ＨＣＴ１１６異種移植マウスモデルでは、２５ｍｇ／マウスｋｇ体重のＡＴ−０１Ｃペプチドを腹腔内注射した。ＨＴ２９異種移植マウスモデルの場合、５０ｍｇ／マウスｋｇ体重のＡＴ−０１Ｃペプチドを腹腔内注射した。ＡＴ−０１Ｃのストック濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。両方のマウス群に、ＡＴ−０１Ｃペプチドを２１日間毎日、腫瘍から５ｍｍだけ離して注射した。毎日の注射は、発達中の腫瘍の周囲にＡＴ−０１Ｃを注射することによって行った。注射２１日後、腫瘍を切除し、これらの重量および体積を測定した。
【００５２】
ＡＴ−０１Ｃは、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍形成を退行させた：腫瘍は、１００万個のＨＣＴ１１６細胞またはＨＴ２９細胞（異種移植モデル）のいずれかを皮下注射することによりＳＣＩＤマウスにおいて惹起された。腫瘍が発達し、目に見えるようになった後、ＡＴ−０１Ｃペプチド処理を開始した。ＨＣＴ１１６結腸がん細胞を用いて惹起された腫瘍に対して、２５ｍｇ／マウスｋｇ体重のＡＴ−０１Ｃを腹腔内注射した。５０ｍｇ／ｋｇ体重のＡＴ−０１Ｃペプチドを、ＨＴ２９細胞で惹起された腫瘍の治療として腹腔内に注射した。ＡＴ−０１Ｃは腫瘍から５ｍｍ離れた腫瘍周囲に毎日注射した。ペプチド注射の２１日後、マウスを屠殺し、腫瘍を切除した。腫瘍（ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９異種移植片の両方）の重量および体積を、ペプチドが注射されなかった対応対照と比較した。ＡＴ−０１Ｃを注射したマウス異種移植片は、腫瘍体積および腫瘍重量の減少を示した。全てのマウスは、２１日間の治療期間中生存した（図５）。
【００５３】
結論として、本発明は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分泌タンパク質（ＭＰＴ６３）に由来する新規な抗がんペプチドＡＴ０１またはこの遺伝子改変体を提供する。腫瘍抑制タンパク質ＳＭＡＲ１の発現を安定化するこれらのペプチドの機序は、ユビキチン媒介分解の防止によるものである。ＳＭＡＲ１の安定化された発現は、細胞の抗転移性または抗増殖性などの抗がん特性をこれらのペプチドに付与する。腫瘍体積およびサイズを退行させるＡＴ−０１Ｃの能力は、ＡＴ−０１Ｃががんの治療薬として使用できることを示している。従って、これらの新規ペプチドは、ＳＭＡＲ１が調節されることが判明しているがんの有望な治療薬である。
【００５４】
結果
ペプチドがＳＭＡＲ１を安定化する。
ペプチドのｐＩは６〜１０の範囲であるので、従って、このようなペプチドは、環境または培養培地条件のｐＨ変化（表１）に従って異なる挙動を示すと思われる。理論的に、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒソフトウェアを用いて各ペプチドの分子量を計算した。ペプチドの予測構造を図１に示す。さまざまな利用可能なペプチドを用いて４８時間処理したＨＣＴ１１６細胞は、ＳＭＡＲ１発現を安定化させた。幾つかのペプチドはＳＭＡＲ１を誘導できなかった（図２ａ）。本発明者らは、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の別の新規ペプチドｐ２８もまた試験し、このペプチドは、抗がん活性が非常によく実証されており、現在第Ｉ相臨床試験の対象となっている。これらのペプチドを用いたＳＭＡＲ１の応答を見るために、異なるがん起源のさまざまな細胞株を、ＳＭＡＲ１を最も安定させるＡＴ−０１Ｄで処理した。しかし、異なる濃度のこれらのペプチドを用いて試験した場合、異なる細胞系において同様の応答が示された。ペプチドは、ＭＣＦ７、ＳＷ６２０、ＮＣＨ−Ｉ５２２、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞において試験した。ＳＭＡＲ１の誘導がＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞で観察されたので、このようなペプチドがｐ５３とは独立して働くことがさらに証明された（図２ｂ〜ｆ）。ＡＴ−０１Ｄペプチドを用いたさらなるＰＣＲ分析は、ＳＭＡＲ１の転写調節を制御できなかった（図２ｇ）。従って、これらのペプチドは、タンパク質レベルでこの分解を防止することによってタンパク質を安定化させることができたと推定される。
【００５５】
ＳＭＡＲ１誘導の機序
ＳＭＡＲ１の安定性は転写レベルでは観察されないことが報告されているので、ＳＭＡＲ１タンパク質によるペプチド制御の可能性に焦点を当てた。ペプチドとＳＭＡＲ１との相互作用の何らかの可能性を確認するために、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を行った。大部分のペプチドは、ＳＭＡＲ１のタンパク質結合ドメイン（ＰＢＤ）との相互作用を示したが、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とは結合できなかった。ＡＴ−０１を除いて、全てのペプチドは、図３に示すように、多かれ少なかれＳＭＡＲ１のＰＢＤとの相互作用を示した。可能な説明の１つは、以前にＲａｍｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５）によって報告されたように、高悪性度の乳がんにおけるＳＭＡＲ１の下方制御である。タンパク質レベルでは、タンパク質の下方制御はプロテオソーム分解機序によって起こる。これらのペプチドは、ＳＭＡＲ１のユビキチン結合部位に結合して、これをブロックし、これにより分解を防止する可能性がある。
【００５６】
ＩＴＣ研究を支援するために、バイオインフォマティクスソフトウェアを用いてペプチドをＳＭＡＲ１にドッキングした（図４）。全てのペプチドのＰＤＤ構造は、ＡｎｔｉＣＰソフトウェアを用いて作製した。次いで、ペプチドをＳＭＡＲ１  ＰＤＢ構造とドッキングさせた。解析から、相互作用する残基／アミノ酸をＰＤＢ  ｓｕｍを用いて同定した。結合の長さと相互作用の性質を研究し、ペプチドとＳＭＡＲ１とのドッキングを確認し、検証した。２つの水素結合と３７６の非結合接触が見出された。ＳＭＡＲ１において、アミノ酸配列ＲＣＨＬおよびＲＱＲＬがユビキチン部位である。ＡＴ−０１ＣはＬに結合し、ＳＭＡＲ１に結合して、分解を行うためにユビキチン部分にとって非常に重要な部位をブロックする。ＩＴＣとは異なり、ＳＭＡＲ１の全長ＰＤＢ構造をドッキング目的で使用した。ＩＴＣとドッキング研究の両方で見出された相互作用結果の良好な相関関係が存在する。全てペプチドのタンパク質結合能は、表１から見られるものとほぼ同じである。従って、いずれのタンパク質への結合についても、これは同様の結合能で結合する。このような研究から、ペプチドとＳＭＡＲ１との相互作用は構造の立体障害および立体配座に依存することが見出されている。
【００５７】
ペプチドが細胞移動およびコロニー形成アッセイを遅延させた。
これらのペプチドの抗がん（抗転移）特性を確認するために、創傷治癒または細胞移動のアッセイを行った。高度に転移性のＭＤＡ−ＭＢ２３１乳がん細胞のＡＴ−０１Ｄを用いた処理は、このペプチドが、対照のＤＭＳＯ処理細胞と比較して、これらの細胞の転移または移動を減弱させ得ることを示した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、細胞移動アッセイのためにＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄで処理した。これらのペプチドは両方とも、１６時間まで記録した場合、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の移動を減弱させることが観察された（図５ａからｃ）。これらのペプチドは、細胞移動を担う遺伝子を調節すると思われる。ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄによる処理後、アネキシンＶ染色からのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による解析は、細胞死の兆候を示さなかった。従って、細胞移動の減弱は、細胞のアポトーシスによるものではなく、ＳＭＡＲ１の抗転移または細胞停止のみが原因である。
【００５８】
ＨＣＴ１１６細胞を毎日ＡＴ−０１Ｄで処理し、コロニー形成アッセイに供した。培養の１２日後、形成されたコロニーは、ＡＴ−０１Ｄ処理細胞よりもＤＭＳＯ（対照）処理細胞でより多く見出された。ＡＴ−０１Ｄペプチドは、図およびグラフから明らかなように、時間の経過と共にコロニー形成への細胞増殖の速度を遅延または低減させた（図５、ｄからｆ）。ＤＭＳＯまたはＡＴ−０１Ｄにより処理した細胞では培養１２日目までアポトーシス細胞または細胞群は観察されなかった。群内の５０個の細胞を１つのコロニーとみなした。Ｍａｌｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）は、ＳＭＡＲ１が、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３を安定化させ、サイクリンＤ１の下方制御などがん遺伝子の運命を制御することによって、細胞周期制御タンパク質を介して細胞増殖を制御することを以前に報告していた（Ｒａｍｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの２つの因子は、細胞増殖の遅延に寄与し、ペプチド処理が進むとコロニー形成単位の遅延をもたらす。がんでは、ＳＭＡＲ１は分解され、細胞周期制御の喪失は制御されない細胞増殖をもたらす。がんにおけるＳＭＡＲ１分解が、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄのような小分子化合物またはペプチドの導入によって防止可能であれば、細胞増殖を制御することができる。これは、少なくともＳＭＡＲ１が脱制御されていると同定されたがんにおいて、有望な治療薬をもたらす。
【００５９】
ＳＭＡＲ１の下方制御を担う機序および経路は依然として不明確である。腫瘍抑制タンパク質ＳＭＡＲ１の喪失は、より転移性および攻撃性のがん細胞をもたらす。以前の報告により、サイクリンＤ１のプロスタグランジンＡ２媒介性下方制御が、安定したＳＭＡＲ１の発現に起因することが示唆されている。このような化合物は、ＳＭＡＲ１の５’ＵＴＲを標的とし、ｍＲＮＡ安定性を引き起こす（Ｍａｌｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＳＭＡＲ１はまた、ｐ５３のような他の腫瘍抑制タンパク質と会合し、細胞周期停止または腫瘍進行を媒介する。ＳＭＡＲ１が存在しない場合、さまざまな転写因子および腫瘍抑制タンパク質は、がんの腫瘍形成特性の防止に対して効率的に機能しないおそれがある。
【００６０】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の分泌タンパク質ＭＰＴ６３改変ペプチドは、ＳＭＡＲ１の発現を安定化させ得ることが見出されている。実験から、親ペプチドからのペプチドの改変によりＳＭＡＲ１の安定性を変え得ることは明らかである。ＡＴ−０１は、ＩＴＣおよびドッキング研究から分かるように、ＳＭＡＲ１と相互作用することができず、ＳＭＡＲ１の誘導が非常に少ないか、またはまったくない。しかし、ＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄは、ＳＭＡＲ１の発現を有意に誘導することができ、ＩＴＣおよびドッキング研究中に肯定的な結果が得られたことを示した。ペプチド処理の際のＳＭＡＲ１の安定性の原因は明らかではないが、ペプチドがＳＭＡＲ１のユビキチン部位にドッキングしてタンパク質分解を妨げると推定される。バイオインフォマティクス解析から、ＳＭＡＲ１ユビキチン部位はＲＣＨＬにおいて相互作用ペプチドによってブロックされることが見出されている。ＳＭＡＲ１は、リガーゼが結合可能なる３つのユビキチン部位を有し、従って、分解が優先される。ペプチドの起源は同じであっても、アミノ酸の長さを改変することにより、異なる立体配座がもたらされる。ペプチドによって形成されたループは、ＳＭＡＲ１タンパク質にドッキングするように見られる。これはＳＭＡＲ１の安定性を部分的に維持し、タンパク質の分解を防止する。
【００６１】
ペプチドの抗がん特性は、ＳＭＡＲ１の安定化された発現に起因する可能性がある。細胞移動アッセイから、これらのＭ．ツベルクローシス由来ペプチドの幾つかが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１のような侵襲性がん細胞株の転移特性を遅延させる能力を示すことが確認されている。ＳＭＡＲ１は、乳がん、結腸がんなどのがんにおいて非常に活発であるＴＧＦβ経路を下方制御することによって転移を遅延させることが以前に報告されている（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＴＧＦβ経路に対するこれらのペプチドの直接的な効果は確認されていないが、ペプチドにより安定化されたＳＭＡＲ１の発現は、確実に抗転移活性の解明に役立つ。コロニー形成アッセイは、これらのペプチドが細胞増殖を低減させる能力を支持する。
【００６２】
結論として、本発明は、Ｍ．ツベルクローシスの分泌タンパク質（ＭＰＴ６３）に由来する新規な抗がんペプチドＡＴ０１またはこの遺伝子改変体、例えばＡＴ−０１ＣおよびＡＴ−０１Ｄを提供する。腫瘍抑制タンパク質ＳＭＡＲ１の発現を安定化するこれらのペプチドの機序は、ユビキチン媒介分解の防止によるものである。ＳＭＡＲ１の安定化された発現は、細胞の抗転移性または抗増殖性などの抗がん特性をこれらのペプチドに付与する。従って、これらの新規ペプチドは、マスター細胞レギュレーターＳＭＡＲ１が安定化されていることが判明しているがんの有望な治療薬である。
【００６３】
【表２】
2018512446.tif 000004
2018512446.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2018512446000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月7日(2017.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮＡＲＴＡＤ；
ＧＱＶＷＥＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡ；
ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡ；
ＧＮＶＩＲＧＳＶＡＰＡＶＳＱＦＮＧＰＬ；
ＰＱＮＡＩＲＧＡＶＴＰＡＶＳＱＦＮＶＡ；
ＰＱＮＡＩＲＷＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮＬＨ；
ＤＦＮＡＩＶＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮＧＡＬ；
ＬＫＮＰＩＲＧＳＱＴＰＡＶＳＱＦＮＨＩＧ；
ＧＡＮＡＩＲＧＳＨＤＰＡＶＳＱＦＮＧＬ；
ＧＡＮＡＩＲＣＳＶＦＰＡＶＳＱＦＮＩＧ；
ＧＹＰＶＡＧＱＶＷＥＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮＡＲＴＡＤＧＩＮＹＲ；および
ＰＱＧＥＱＳＴＧＫＩＹＦＤＶＴＧＰＳＰＴ
からなる群のメンバーであるアミノ酸残基配列を有する生物学的に活性なペプチド。
【請求項２】
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮＡＲＴＡＤ；
ＧＱＶＷＥＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮ；
ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡおよび
ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡ
からなる群のメンバーであるアミノ酸残基配列を有する、抗がん剤として適切なペプチド。
【請求項３】
アミノ酸残基配列：ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸残基配列：ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸残基配列：ＧＱＶＷＥＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸残基配列：ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡを有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドおよび医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
約０．１から約２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で前記ペプチドを含む溶液である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
さらに緩衝液を含み、約５から約７の範囲であるｐＨ値を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドの安定化量を、これを必要とする患者に投与することを含む足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）を安定化する方法。
【請求項１１】
ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＧＱＶＷＥＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡＶＳＱＦＮを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＡＴＡＴＶＮＡＩＲＧＳＶＴＰＡを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
抗がん剤としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）の安定化剤としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
がんの治療のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
がんの治療のための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
がんの治療のための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
足場マトリックス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）を安定化するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2018512446.tif 000012
2018512446.tif 000013
2018512446.tif 000014