(57)【要約】本明細書は、目的のタンパク質の産生のために使用することができる改良された真核細胞の培養培地を含む組成物を記載する。タウリンを無血清培地または化学的に規定された培地に添加して、目的のタンパク質の産生を増大させることができる。本培地組成物を使用して高レベルでタンパク質を組換え発現する方法を含む。タウリンを含む種々の供給ストラテジーにより、産生されるタンパク質の力価が増大する。さらに、タウリンを添加しても培養成績や得られる抗体の品質に悪影響を及ぼさない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
改良された組換えタンパク質を産生するための組換え真核細胞を培養する方法であって、（ａ）細胞を増殖期の間に規定された細胞培養培地中で増殖または維持する工程、（ｂ）前記基本の細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程であって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および（ｃ）タウリンの添加によって前記目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも１回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも２回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも３回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも４回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも５回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の持続時間の間に毎日行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記規定された細胞培養培地中の培養物に、増殖期の間に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ）、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、抗体フラグメント、およびＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程；（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程；（ｃ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；および（ｄ）前記細胞中で前記目的のタンパク質を産生させる工程であって、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記目的のタンパク質の力価が、前記培地へのタウリンの添加によって増大した、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｃ）の細胞が、前記目的のタンパク質を高収量で産生することが可能である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、０．１ｍＭ未満のＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して少なくとも３％より高いタンパク質収量が可能である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、０．１ｍＭ未満のＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して少なくとも８％より高いタンパク質収量が可能である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
タウリン補足培養培地中で目的のタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程；
（ｃ）細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；
（ｄ）前記細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを補足する工程；
（ｅ）前記細胞培養物を工程（ｄ）のタウリン補足条件下で少なくとも６日間維持する工程であって、非タウリン補足培養で培養した細胞と比較して前記細胞中で目的のタンパク質をより高い力価で発現させ、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程；および
（ｆ）前記目的のタンパク質を回収する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記目的のタンパク質の力価が、タウリン補足によって増大した、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記回収したタンパク質のタンパク質力価が、比較対照培養の前記力価より少なくとも８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、または少なくとも２０％より高く、前記比較対照培養培地が、工程（ｄ）のタウリン補足条件に供されなかった、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
目的の組換えタンパク質を高収量で産生する方法であって、少なくとも約０．１ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、前記細胞株が、組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法。
【請求項３２】
前記目的の組換えタンパク質の収量が、Ｌ−タウリンを含まない細胞培養培地中で培養した細胞株と比較して、前記細胞培養培地中にタウリンを含めることによって増大した、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ、または少なくとも２．５ｇ／Ｌ増加させることができる、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも３％増加させることができる、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、アンモニア蓄積を少なくとも８％減少させることができる、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは複数のユースポイント添加物を前記細胞培養培地に添加する工程をさらに含む、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む抗体の高収量組換え産生のためのＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４３】
オルニチンをさらに含む、請求項４２に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４４】
プトレシンをさらに含む、請求項４３に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４５】
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４６】
前記培地が無血清である、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４７】
前記培地が加水分解物を含まない、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４８】
前記培地が化学的に規定されている、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４９】
前記培地を０日目の産生バッチ培養物に提供する、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５０】
フィードを、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、および／または１０日目の産生バッチ培養物に提供する、請求項４２〜４９のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５１】
前記産生バッチ培養物に提供した培地およびフィードが、産生期の間に約５ｍＭ〜約１０ｍＭの総Ｌ−タウリンを含む、請求項５０に記載のＣＨＯ細胞培養フィード。
【請求項５２】
１つまたは複数の脂肪酸をさらに含む、請求項４２〜５１のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５３】
前記１つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される、請求項５２に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５４】
ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２からなる群から選択されるビタミンおよび補因子をさらに含む、請求項４２〜５３のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５５】
ヌクレオシドの混合物をさらに含む、請求項４２〜５４のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５６】
前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンの１つまたは複数を含む、請求項５５に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５７】
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンをさらに含む、請求項４２〜５６のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５８】
１つまたは複数の二価カチオンをさらに含む、請求項４２〜５７のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項５９】
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、またはその両方である、請求項５８に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項６０】
Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む、請求項５９に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項６１】
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを含む、ＣＨＯ細胞培養におけるタンパク質産生のための流加培養培地および／またはフィード。
【請求項６２】
オルニチンをさらに含む、請求項６１に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【請求項６３】
プトレシンを含む、請求項６２に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【請求項６４】
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【請求項６５】
目的の組換えタンパク質の産生のために真核細胞を培養する方法であって、（ａ）請求項４２〜６４のいずれか１項に記載の細胞培養培地を提供する工程、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を増殖または維持する工程であって、細胞培養物を形成し、、前記細胞が目的のタンパク質を発現する工程を含む、方法。
【請求項６６】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記目的のタンパク質が、前記細胞によって前記培地に分泌される、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞培養が、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較して少なくとも３％アンモニア蓄積を減少させることが可能である、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞培養が、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較して少なくとも８％アンモニア蓄積を減少させることが可能である、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明は、細胞培養のためおよび組換えタンパク質産生のための培地および方法に関する。本発明は、具体的には、タンパク質生物治療薬を産生するための組換え真核細胞の培養のためのタウリン補足培地およびその培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
しばしばβ−アミノ酸と呼ばれる有機酸タウリンは、ほとんどの組織内に高濃度で見出され、アミノ酸システインの誘導体である（Ｈｕｘｔａｂｌｅ，ＲＪ．，１９９２，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，７２：１０１−１６３）。
【０００３】
【化１】
2018521664.tif 000003
タウリンの構造
【０００４】
タウリンは、ヒトおよび他の哺乳動物種の多数の組織（例えば、脳、網膜、心筋、骨格筋および平滑筋、血小板、および好中球）中に存在する。タウリンは、浸透圧調節、膜安定化、および抗炎症を補助することが認められており、また、電子輸送鎖活性の増強によってミトコンドリアタンパク質合成を制御してスーパーオキシド生成に対して保護する（Ｊｏｎｇら，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ２５；Ｊｏｎｇら，２０１２，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４２：２２２３−２２３２ｓｗ）。初代神経細胞培養では、タウリンは、そのグルタミン酸塩誘導性毒性の抑制効果に起因して、細胞保護剤として特徴付けられている。胚培養用の種々のタウリン含有培地が開発されている。
【０００５】
アミノ酸フィードを含む細胞培養技術は、培養細胞からの組換えタンパク質産生において長く利用されている。アミノ酸は、生合成前駆体、エネルギー源、およびオスモライトなどであり、産生培養においてアミノ酸を使用することは継続的な細胞成長および生産性と強く相関する。
【０００６】
しかし、生産性および高収量のタンパク質発現に寄与する生理学的事象は無数にあり、代謝活動および輸送機構が競合するので供給ストラテジーのデザインが困難である。アミノ酸補足のタイプおよび添加のタイミングも培養によって産生されるタンパク質の品質に影響を及ぼし得る（Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，ら，２００６，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：６１−６７）。副生成物の蓄積は、しばしば、産生細胞培養において問題となり、この蓄積は細胞培養において栄養素が不均衡になることの結果と考えられ、最終的には細胞成長を阻害する（Ｆａｎ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５  Ｍａｒ；１１２（３）：５２１−３５）。ヒポタウリンまたはそのアナログもしくは前駆体は、細胞培養において組換え産生されたポリペプチドを含む組成物の色の強さを低下させるという望ましい結果を達成することが示唆されている（ＷＯ２０１４１４５０９８Ａ１号、２０１４年９月１８日公開）。未成熟網膜色素上皮細胞の成熟網膜色素上皮細胞への成熟を促進するタウリンを含む細胞培養培地も記載されている（ＷＯ２０１３１８４８０９Ａ１号、２０１３年１２月１２日公開）。しかし、タウリン補足培地において組換えタンパク質の生産性が至適化されることは当該分野で認識されていない。アンモニアなどの潜在的に有毒な細胞代謝副生成物の産生を最小にしながら組換え産生タンパク質の生産性を増大させる細胞培養プロセスが非常に望ましい。生産性が一貫して増大すると、商業規模で生物治療製剤を有意により多く供給することができる。
したがって、哺乳動物細胞を培養するための培地および培養方法が当該分野で必要であり、ここで、培地は、健康且つ頑強な細胞の成長および維持、ならびに高力価の生物医薬品薬物物質の生産が可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１４５０９８号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１８４８０９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，ら，２００６，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：６１−６７
【非特許文献２】Ｆａｎ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５  Ｍａｒ；１１２（３）：５２１−３５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本発明者らは、細胞培養培地中にタウリンを含めると細胞特異的生産性が増大し、且つそれらの細胞によるアンモニア副生成物の産生が低下するという驚くべき発見をした。タウリンを含む種々の供給ストラテジーにより、産生されるタンパク質の力価が増大する。さらに、タウリンを添加しても培養成績や得られる抗体の品質に悪影響を及ぼさない。
本発明は、高収量で治療タンパク質を産生する方法であって、タウリンを含む培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、前述の細胞株が治療タンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明は、無血清であり、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地に関する。本発明は、無血清であり、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのタウリン、約０．２〜約１ｍＭのタウリン、約０．３〜約１ｍＭのタウリン、約０．４〜約１ｍＭタウリン、または約０．５〜約１ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地に関する。本発明は、無血清であり、約１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地に関する。本発明は、無血清であり、約１ｍＭ〜約５ｍＭのタウリン、約１ｍＭ〜約６ｍＭのタウリン、約１ｍＭ〜約７ｍＭのタウリン、約１ｍＭ〜約８ｍＭのタウリン、または約１ｍＭ〜約９ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地に関する。
【００１１】
一部の実施形態では、培地は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される追加のアミノ酸をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、培地は１６ｇ／Ｌ以下の加水分解物を含む。いくつかの実施形態では、培地はいかなる加水分解物も含まない。
【００１３】
１つの実施形態では、培地は、化学的に規定された（カスタム処方など）基本培地または市販の基本培地など）を含む。１つの実施形態では、完全培地は、化学的に規定され、血清や加水分解物を含まない。
【００１４】
いくつかの実施形態では、基本培地およびフィードを含む全てのプロセスは、総量が少なくとも１１５ｍＭのアミノ酸またはアミノ酸塩の混合物を含む。一実施形態では、アミノ酸の混合物は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を表１から選択される量で含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、培地は、１つまたは複数の脂肪酸を含む。１つの特定の実施形態では、培地は、脂肪酸（または脂肪酸誘導体）とαトコフェロールとの混合物を含む。脂肪酸または脂肪酸誘導体は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、培地は、ヌクレオシドの混合物を含む。１つの実施形態では、培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、培地は、塩の混合物を含む。塩には、２価のカチオン（カルシウムおよびマグネシウムなど）が含まれる。１つの実施形態では、培地は、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含む。他の塩には、リン酸塩が含まれ得る。
【００１８】
１つの実施形態では、培地は、（１）０．１±０．０１５ｍＭ、１±０．０１５ｍＭ、３±０．０５ｍＭ、５±０．１０ｍＭ、７±０．１５ｍＭ、または１０±０．２ｍＭのタウリンを含み、（２）１６ｇ／Ｌ以下の加水分解物を含み、（３）無血清であり、（４）任意選択的にアミノ酸の混合物をさらに含み、（５）脂肪酸の混合物を含み、（６）ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンが含まれる）の混合物を含み、（７）カルシウム塩、マグネシウム塩、およびリン酸塩を含む。
【００１９】
本発明は、目的のタンパク質を高収量で産生する方法であって、少なくとも約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、細胞株がタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法を提供する。他の実施形態では、培地は、前述の本発明の態様のいずれかを具体化している。
【００２０】
別の態様では、本発明は、改良された組換えタンパク質を産生するための真核細胞を培養する方法であって、（ａ）細胞を増殖期の間に特定細胞培養培地中で増殖または維持する工程、（ｂ）基本細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程であって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および（ｃ）タウリンの添加によって目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、タウリンの補足を、産生期の間に少なくとも１回、産生期の間に２回、３回、４回、もしくは５回、または産生期の持続時間に毎日行う。他の実施形態では、本方法は、増殖期の間に、培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法により、タウリン補足を欠くか、０．１ｍＭ未満のタウリンを補足し、そうでなければ同一の条件下の真核細胞と比較して、組換えタンパク質産生が改善される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、細胞培養培地（前述の態様に記載の培地の任意の実施形態など）中での細胞の培養方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、（１）少なくとも０．１ｍＭ±０．０１５ｍＭの濃度のタウリンを含み、（２）１６ｇ／Ｌ以下の加水分解物を含むか、加水分解物を含まず、（３）無血清であり、（４）任意選択的に、表１から選択されるアミノ酸の混合物からなる群から選択されるアミノ酸を含む培地中で細胞を増殖または維持する工程を使用する。
【００２２】
１つの実施形態では、任意選択的なアミノ酸補足物の混合物は、以下の表１中のアミノ酸からなる群から選択される：
【表１】
2018521664.tif 000004
【００２３】
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細菌細胞である。１つの実施形態では、細胞は、組換えタンパク質産生で有用な哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞または誘導ＣＨＯ−Ｋ１など）である。いくつかの実施形態では、細胞は、目的のタンパク質（生物治療タンパク質など）を発現する。生物治療タンパク質は、抗原結合タンパク質であってよく、この抗原結合タンパク質はＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、Ｆｃ−融合タンパク質（ＳｃＦｖ分子など）またはｔｒａｐ分子である。ｔｒａｐ分子には、ＶＥＧＦｔｒａｐおよびＩＬ−１Ｔｒａｐタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗体（ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、二重特異性抗体、または抗体フラグメントなど）である。
【００２４】
種々の形態の無血清培地にタウリンを含めることによってタンパク質産生に正の影響が及ぼされることを考慮すると、本方法に従って培養した細胞は、平均タンパク質力価が増大する。１つの実施形態では、タウリンを補足しなかった培地のタンパク質力価と比較した場合、本方法のタウリン補足培地で成長させた細胞は、比較対照培養（すなわち、タウリンを補足していない培養）のタンパク質力価より少なくとも８％高いタンパク質力価を有するタンパク質を産生する。一実施形態では、タウリン補足培養で成長させた細胞は、タウリンを補足しなかった培地のタンパク質力価と比較した場合、比較対照培養の力価より、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、または少なくとも２９％高いタンパク質力価をもたらす。
【００２５】
同様に、無血清培地中にタウリンのみを含めることによって、培養細胞は、タウリンを含めない培養細胞よりもアンモニア副生成物を減少させることが可能である。１つのタウリン補足培地の無血清且つ加水分解物のない実施形態では、細胞培養により、補足をしない（すなわち、０．１ｍＭ未満のタウリン補足またはタウリン補足なし）類似の細胞培養培地における類似の細胞培養よりも少なくとも４％低く、３２％まで低くアンモニア副生成物レベル（ｍＭ  ＮＨ３）を低下させることが可能である。
【００２６】
別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数のユースポイント（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｕｓｅ）添加物を細胞培養培地に添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、ユースポイント添加物は、ＮａＨＣＯ３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＮｉＳＯ４、Ｎａ４ＥＤＴＡ、およびクエン酸ナトリウムのうちの任意の１つまたは複数である。１つの実施形態では、本方法は、以下の各ユースポイント化学物質を細胞培養培地に添加する工程を使用する：ＮａＨＣＯ３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＮｉＳＯ４、Ｎａ４ＥＤＴＡ、およびクエン酸ナトリウム。いくつかの実施形態では、ユースポイント添加物を、培養開始時に培地に含めることができる。
【００２７】
１つの特定の実施形態では、態様は、（１）濃度が少なくとも０．１ｍＭのタウリンから本質的になり；（２）１６ｇ／Ｌ以下の加水分解物を含み、（３）無血清であり、（４）任意選択的に、総量が少なくとも約２０ｍＭ、または少なくとも約２５ｍＭ、または少なくとも約３０ｍＭ、または少なくとも約４０ｍＭ、または少なくとも約５０ｍＭ、または少なくとも約６０ｍＭ、または少なくとも約７０ｍＭのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、無血清培地中で細胞を培養する方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、（１）目的のタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入する工程；（２）目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程；（３）任意の前述の態様に記載の無血清細胞培養培地の１つの実施形態において、または本明細書中に記載の方法の任意の実施形態に従って、選択された細胞を培養する工程；および（４）細胞中で目的のタンパク質を発現させる工程であって、目的のタンパク質が培地中に分泌される工程を使用することによって目的のタンパク質を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質の産生で使用される細胞は、生物治療薬を産生することが可能な哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、２９３細胞、およびＢＨＫ細胞など）またはその任意の誘導体である。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞など）である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、Ｆｃドメインを有するタンパク質である。いくつかの場合、２種の目的のタンパク質が重複していてもよい（例えば、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質、抗体、およびＳｃＦｖタンパク質の場合など）。したがって、いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗体（ヒト抗体またはヒト化抗体、抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２など）、二重特異性抗体、ｔｒａｐ分子（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐまたはＩＬ−１−Ｔｒａｐなど）、ＳｃＦｖ分子、または可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質など）である。
【００３０】
１つの実施形態では、目的のタンパク質を、０．１ｍＭ未満のタウリンを含むか、タウリンを補足していない無血清細胞培養培地中で類似する細胞によって産生される平均１４、１５、１６、または１７日目の力価より少なくとも８％高い平均１４、１５、１６、または１７日目の力価で産生することが可能である。１つの実施形態では、目的のタンパク質を、０．１ｍＭ未満のタウリンを含むか、タウリンを補足していない無血清細胞培養培地中で類似する細胞によって産生される平均６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７日目の力価より少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、または少なくとも２９％高い平均６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７日目の力価で産生することが可能である。
【００３１】
別の実施形態では、目的のタンパク質を、（１）目的のタンパク質（抗体または他の抗原結合タンパク質など）をコードする核酸配列をＣＨＯ細胞に導入すること；（２）目的のタンパク質を安定に発現する細胞を選択すること；（３）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む無血清細胞培養培地中で選択した細胞を培養することによって産生する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、Ａｂ３産生細胞培養において各産生培養日に回収したサンプル由来のタンパク質力価（収量）を示し、タウリン補足（黒塗りの四角が実線で繋げられている）を非タウリン補足（ｘが点線で繋げられている）と比較している。タンパク質収量に対するタウリン補足培養の利点は、産生培養の６日目という早期に認められる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（詳細な説明）
本発明が記載される特定の方法および実験条件に限定されないことは理解されるべきである。なぜならこのような方法および条件は変動し得るからである。同様に、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。なぜなら本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義されるからである。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」は、文脈が格別そうでないことを規定しなければ、複数形への言及を含む。従って、例えば、「方法（ａ  method）」への言及は、本明細書で記載される、および／もしくは本開示を読んで当業者に明らかになるタイプの、１またはそれより多くの方法および／または工程を含む。
【００３５】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似もしくは均等な任意の方法および材料が本発明の実施において使用され得るものの、特定の方法および材料がここでは記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００３６】
本出願人は、細胞培養培地へのタウリンの添加によって、非常に少量のタウリンを含むかタウリンを含まない細胞培養培地と比較して細胞培養における組換え細胞によるタンパク質産生が改善されるという驚くべき発見をした。
【００３７】
本細胞培養物および方法を記載する前に、本発明が記載の特定の方法および実験条件に制限されず、したがって、方法および条件は変動し得ると理解すべきである。本明細書中で使用した用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことも理解すべきである。
【００３８】
本明細書中で使用した項目の見出しは整理することのみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈すべきではない。別段の指示がない限り、本明細書中に記載の方法および技術を、一般に、当該分野で公知の従来の方法に従い、且つ種々の一般的な文献および本明細書を通して引用および考察しているより具体的な文献に記載のように行う。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．  （２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．    （１９９０）、およびＪｕｌｉｏ  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．  （１９９８）、ａｎｄ  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）を参照のこと。本開示を通して言及された全ての刊行物は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【００３９】
（定義）
「タウリン」は、２−アミノエタンスルホン酸（ＩＵＰＡＣ命名法；ＣＡＳレジストリ番号１０７−３５−７）としても公知である。「タウリン」および「Ｌ−タウリン」を、同一の有機化合物を言及するために互換的に使用する。タウリンはアミノ基を含む有機酸であるが、アミノ酸というのはアミノ基およびカルボキシル基の両方を含むので、当業者に伝統的に公知なように、タウリンは「アミノ酸」と見なされない。システインの誘導体であるヒポタウリンが酸化によってタウリンに変換されるときにタウリンが生合成される。
【００４０】
用語「補足（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」、「補足する（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）」、および「〜を補足した」などは、細胞の成長および／または分化を維持および／または促進するか、培養物または細胞の特質を総じて拡大または強化するか、欠損を補うために細胞培養培地中で使用することができる成分、構成成分、分子などを添加することをいう。この目的を達成するために、タウリン補足には、特定濃度のタウリン溶液の培養培地への添加が含まれる。
【００４１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「およびタンパク質」を、本明細書を通して互換的に使用し、これらの用語は、ペプチド結合によって相互連結した２つまたはそれを超えるアミノ酸残基を含む分子をいう。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質はまた、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ−リボシル化などの修飾を含んでもよい。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、科学的または商業的に有益であり得る（タンパク質系薬物が含まれる）。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質には、特に、抗体およびキメラタンパク質もしくは融合タンパク質が含まれる。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、細胞培養方法を使用して組換え動物細胞株によって産生される。
【００４２】
用語「異種ポリヌクレオチド配列」は、本明細書中で使用する場合、生物医薬品薬物物質として産生されるキメラタンパク質（ｔｒａｐ分子など）、抗体、または抗体の一部（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）などの目的のタンパク質をコードする核酸ポリマーをいう。異種ポリヌクレオチド配列を、遺伝子工学技術によって製造し（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、無イントロン配列（ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）など）、細胞に導入することができ、細胞内でこの配列はエピソームとして存在することができるか、細胞ゲノムに組み込むことができる。異種ポリヌクレオチド配列は、産生細胞ゲノム内の異所に導入される天然に存在する配列であり得る。異種ポリペプチド配列は、別の生物由来の天然に存在する配列（ヒトオルソログをコードする配列など）であり得る。
【００４３】
「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である４本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１個のドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されたより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成されている。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方をいう。用語「抗体」には、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体分子（抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離した抗体など）が含まれる。抗体という用語には、二重特異性抗体も含まれ、二重特異性抗体には、１つを超える異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体は、一般に、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（本出願に参考として組み込まれる）に記載されている。
【００４４】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントをいう。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１各ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離ＣＤＲ、および（ｖｉｉ）Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）からなり、これらのフラグメントが合成リンカーによって連結されて単一のタンパク質鎖を形成し、この単一のタンパク質鎖においてＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成しているｓｃＦｖが含まれる。単鎖抗体の他の形態（ダイアボディなど）も用語「抗体」に含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００４５】
さらには、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体の一部の１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性の会合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。かかる免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）および二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。抗体の一部（ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）を、従来技術（全抗体のパパイン消化またはペプシン消化など）を使用して全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の一部、および免疫接着分子を、当該分野で一般的に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照のこと）。
【００４６】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むように企図されている。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入された変異）。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において、マウス等、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むようには企図されていない。
【００４７】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段によって調製、発現、作出もしくは単離された抗体等、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されたあらゆるヒト抗体を含むよう企図されている。係る組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、係る組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックである動物が使用される場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に付され、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これに関係するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しなくてよい配列となる。
【００４８】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つまたはそれを超えるタンパク質の一部または全部を含み、これらのタンパク質のうちの１つが免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、これらのタンパク質は自然界では一緒には見出されない。抗体誘導ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した一定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら，”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１  −  １０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、いくつかの実施形態において免疫グロブリンのヒンジ領域ならびにその後に続くＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ部分にカップリングした１つまたは複数の受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ−融合タンパク質は、１つまたは複数のリガンドに結合する２つまたはそれを超える個別の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ−融合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１  ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ−１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト；米国特許第６，９２７，００４を参照のこと）またはＶＥＧＦ  ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号および同第７，２７９，１５９号を参照のこと）などのｔｒａｐである。
【００４９】
（細胞培養）
用語「細胞培養培地」および「培養培地」は、典型的には、細胞の成長を増強するために必要な栄養素（炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、およびヒスチジン）、および非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、およびチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなど）を提供する哺乳動物細胞の成長のために使用される栄養液をいう。細胞培養培地は、抽出物（例えば、血清もしくはペプトン（水解物））を含み得、これらは、細胞増殖を支える原材料を供給する。培地は、動物由来抽出物の代わりに、酵母由来抽出物もしくはダイズ抽出物を含み得る。化学的に規定される培地とは、化学成分の全てが既知である（すなわち、既知の化学構造を有する）細胞培養培地をいう。化学的に規定される培地は、動物由来成分（例えば、血清由来もしくは動物由来のペプトン）を完全に含まない。一実施形態では、培地は、化学的に規定される培地である。
【００５０】
本溶液はまた、最小の比率を超えて成長および／または生存を増強する構成成分（ホルモンおよび成長因子が含まれる）を含み得る。本溶液を、好ましくは、ｐＨおよび塩濃度が細胞の生存および増殖に最適になるように調合する。
【００５１】
「細胞株」は、細胞の連続継代または継代培養によって特定の系列から誘導された細胞をいう。用語「細胞」を、「細胞集団」と互換的に使用する。
【００５２】
用語「細胞」とは、組換え核酸配列を発現するために適切な任意の細胞を含む。細胞は、真核生物の細胞（例えば、非ヒト動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、トリ細胞、昆虫細胞、酵母細胞もしくは細胞融合物（例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマ））を含む。ある種の実施形態において、上記細胞は、ヒト、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿（ａｐｅ）、ハムスター、ラットもしくはマウスの細胞である。他の実施形態において、上記細胞は、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ  ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ  ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞、リンパ球、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ細胞（Ｂリンパ球）、Ａ４３１細胞（表皮）、ＣＶ−１細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態において、上記細胞は、１種またはそれより多くのウイルス遺伝子を含む（例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞））。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ  Ｋ１細胞である。
【００５３】
本発明の１つの態様は、産生培養においてタンパク質の産生および回収前に細胞集団を拡大させる種培養に関する。タウリンを、本明細書中に記載の発明に従って、種培養配合物中の基本培地に添加することができる。
【００５４】
本発明の別の態様は、タンパク質を産生および回収する産生培養に関する。産生期に先立って、典型的には増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）または種培養としても公知）が存在し、この増殖期に、細胞培養のための全ての構成成分を培養過程の開始時に培養容器に供給し、次いで、細胞集団を生産規模になるまで拡大させる。従って、培養容器に、開始させる細胞株に応じて初期細胞増殖期に適切な播種密度で細胞を接種する。いくつかの態様では、その後の産生期における細胞の生産性をさらに改善または増強するために、本明細書中に記載の発明に従って、種培養配合物中の基礎培養培地にタウリンを添加することができる。
【００５５】
本発明の１つの態様は、特に、産生培養培地および／またはシードトレイン培養物にタウリンを添加することによって、組換え真核細胞による１つまたは複数の目的の組換えタンパク質の産生を改善し、かつ細胞生存を維持しながら組換え真核細胞の成長を増強するように細胞培養条件を改変する産生培養に関する。産生培養容器またはバイオリアクター中で、基礎培養培地および細胞を、種培養または増殖期の後に培養容器に供給する。特定の実施形態では、細胞上清または細胞ライセートを産生培養後に回収する。他の実施形態では、目的のポリペプチドまたはタンパク質を、当該分で周知の技術を使用して培養培地または細胞ライセート（いずれにせよ目的のタンパク質の位置に依存し得る）から回収する。
【００５６】
培養容器としては、ウェルプレート、Ｔフラスコ、振盪フラスコ、撹拌容器、スピナーフラスコ、中空繊維、エアリフトバイオリアクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切な細胞培養容器は、バイオリアクターである。バイオリアクターとは、環境条件を扱うもしくは制御するように製造もしくは操作される任意の培養容器をいう。このような培養容器は、当該分野で周知である。
【００５７】
バイオリアクタープロセスおよびシステムは、ガス交換を最適化し、十分な酸素を供給して細胞増殖および生産性を持続させ、ＣＯ２を除去するために開発されてきた。ガス交換の効率を維持することは、細胞培養およびタンパク質生産の成功裡のスケールアップを確実にするために重要な基準である。適切なシステムは、当業者に周知である。
【００５８】
ポリペプチド生産期において、「流加細胞培養」もしくは「流加培養」とは、動物細胞および培養培地が、その培養容器に最初に供給され、さらなる培養栄養素が、連続してもしくは不連続増分で、培養の間に培養物にゆっくりと供給される（培養終了前に定期的な細胞および／もしくは生成物採取があってもなくてもよい）バッチ培養をいう。流加培養は、定期的に全培養物（これは、細胞および培地を含み得る）が取り出され、新鮮な培地で置換される「半連続流加培養」を含む。流加培養は、細胞培養のための全成分（動物細胞および全ての培養栄養素を含む）が、バッチ培養における培養プロセスの開始時に培養容器に供給されることから、単純な「バッチ培養」とは区別される。流加培養は、上清が上記プロセスの間に培養容器から取り出されない限りにおいて灌流培養とはさらに区別され得るのに対して、灌流培養において、上記細胞は、例えば、濾過によって培養物中に引きとめられ、その培養培地は、連続してもしくは断続して導入され、培養容器から除去される。しかし、流加細胞培養の間に試験目的でサンプルが取り出されることが企図される。上記流加プロセスは、最大作業体積および／もしくはタンパク質生産が達成されることが決定されるまで継続する。
【００５９】
語句「連続細胞培養」とは、本明細書で使用される場合、細胞を継続して、通常は、特定の増殖期の中で増殖させるために使用される技術に関する。例えば、細胞の一定の供給が必要とされるか、または特定の目的のポリペプチドもしくはタンパク質の生産が必要とされる場合、上記細胞培養は、特定の増殖期での維持を必要とし得る。従って、その条件は、継続してモニターされなければならず、その特定の期に上記細胞を維持するためにそれに応じて調節されなければならない。
（培地）
本発明は、無血清で約０．１ｍＭ〜１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地を提供する。「無血清」は、動物血清（ウシ胎児血清など）を含まない細胞培養培地に適用する。無血清培地は、１６ｇ／Ｌ以下の加水分解物（ダイズ加水分解物など）を含み得る。本発明はまた、血清を含まないだけではなく加水分解物も含まない化学的に規定された培地を提供する。「加水分解物を含まない」は、動物または植物のタンパク質加水分解物（例えば、ペプトンおよびトリプトンなど）などの外因性のタンパク質加水分解物を含まない細胞培養培地に適用する。「基本培地」は、（シードトレイン中および／または細胞培養物産生の０日目に存在する）初期培地であり、細胞を増殖させ、必要な全ての栄養素（アミノ酸の基本混合物が含まれる）を含む。基本培地用の種々のレシピ（すなわち、配合物）を、商業的に利用可能なロットで製造または購入することができる。同様に、「基本フィード培地」は、産生培養の間に一般的に消費され、且つ供給ストラテジー（いわゆる「流加」培養用）で利用される補足栄養素の混合物を含む。多様な基本フィード培地が市販されている。「フィード」には、プロトコール（ケモスタットなどの連続フィード培養系（Ｃ．Ａｌｔａｍｉｒａｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２００１  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１７（６）：１０３２−４１を参照のこと）が含まれる）または流加プロセス（Ｙ．Ｍ．Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０１０  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２６（５）：１４００−１０）などに従った計画的添加または一定間隔での培地への添加が含まれる。例えば、培養物に、１日１回、１日おきに１回、３日毎に１回供給することができるか、モニタリングしている特定の培地構成成分の濃度が所望の範囲から外れた場合に供給することができる。
【００６０】
ロット間の変動を縮小し、下流処理工程を強化しながら細胞培養培地から血清を排除し、加水分解物を減少させるか排除すると、不運なことに、細胞の成長、生存率、およびタンパク質発現が減少する。したがって、化学的に規定された無血清且つ加水分解物がないか、または加水分解物を含まない培地は、細胞成長およびタンパク質産生を改善するためのさらなる成分が必要である。
【００６１】
したがって、本発明の細胞培養培地は、生細胞培養に必要な全ての栄養素を含む基本培地を含む。本明細書中に記載の発明に従って、タウリンを、種培養配合物中の基本培地に添加することができる。さらに、タウリンを、産生培養配合物中の基本培地に添加し、次いで、これに、培養されるべき細胞の要件または所望の細胞培養パラメータに応じて、ポリアミンなどのさらなる成分または増加した濃度のアミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、および微量元素などの構成成分を周期的に（いわゆる「流加」培養など）供給してもしなくてもよい。
【００６２】
本発明において、タウリン補足細胞培養培地は、タンパク質産生培養を通じてアミノ酸が枯渇し得るか（さらなるアミノ酸補足を行わない場合）、タウリン補足細胞培養培地は、「非枯渇」であり得る（枯渇アミノ酸（下記）を補足する場合）。本発明者らは、産生期にタウリンを補足した培養物によって前述の種々の培養条件下での組換えタンパク質産生が改善されることを観察した。
【００６３】
本発明は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍＭの濃度（ミリモル／リットルで示す）のタウリンを含むタウリン補足培地を提供する。
【００６４】
一実施形態では、培地は、追加的に、１００μＭ±１５μＭオルニチン、または３００μＭ±４５μＭのオルニチン、または６００μＭ±９０μＭオルニチン、またはさらには９００μＭ±１３５μＭのオルニチンを含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ±１ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ、または少なくとも約，１０ｍｇ／Ｌ±２ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ、１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ、または少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ±７．５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ、または少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ±１５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ、または少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ±２２．５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。
【００６５】
プトレシンを、任意選択的に、補足培地に添加することができる。プトレシンは、いくつかの細胞培養培地配合物中の構成成分として、非常に低い濃度で含まれている；例えば、ＷＯ２００５／０２８６２６号（０．０２〜０．０８ｍｇ／Ｌプトレシンと記載）；米国特許第５，４２６，６９９号（０．０８ｍｇ／Ｌ）；米国特許第ＲＥ３０，９８５号（０．１６ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，８１１，２９９号（０．２７ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，１２２，４６９号（０．５６３５ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，０６３，１５７号（１ｍｇ／Ｌ）；ＷＯ２００８／１５４０１４号（約１００μＭ〜約１０００μＭ）；米国特許出願公開第２００７／０２１２７７０号（０．５〜３０ｍｇ／Ｌポリアミン；２ｍｇ／Ｌプトレシン；２ｍｇ／Ｌプトレシン＋２ｍｇ／Ｌオルニチン；２ｍｇ／Ｌプトレシン＋１０ｍｇ／Ｌオルニチン）を参照のこと。
【００６６】
いくつかの実施形態では、培地に、オルニチンとプトレシンとの組み合わせをさらに補足し、ここで、プトレシン濃度は少なくとも約１５０〜７２０μＭであり得る。いくつかの実施形態では、培地に約１７０〜２３０μＭのプトレシンをさらに補足する。１つの実施形態では、培地は、９０μＭ±１５μＭ以上のオルニチンに加えて、２００μＭ±３０μＭのプトレシンを含む。１つの実施形態では、培地は、１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌ以下のオルニチンに加えて、３０ｍｇ／Ｌ±４．５ｍｇ／Ｌ以下のプトレシン・２ＨＣｌを含む。別の実施形態では、培地は、１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌ以上のオルニチン・ＨＣｌに加えて、３０ｍｇ／Ｌ±４．５ｍｇ／Ｌ以上のプトレシン・２ＨＣｌを含む（２０１４年９月１８日公開の国際公開番号ＷＯ２０１４／１４４１９８Ａ１号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと）。
【００６７】
さらに他の実施形態では、オルニチンは、０．０９±０．０１４ｍＭ〜０．９±０．１４ｍＭの範囲の濃度（０．０９±０．０１４ｍＭ、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭ、または０．９±０．１４ｍＭオルニチンなど）で培地中に存在する。いくつかの実施形態では、培地はまた、少なくとも０．２０±０．０３ｍＭのプトレシンを含む。いくつかの実施形態では、さらなるプトレシン濃度は、０．２０±０．０３ｍＭ〜０．７１４±０．１１ｍＭの範囲（０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６、または０．７１４±０．１１ｍＭプトレシンなど）である。
【００６８】
種々の他の補足物を培養培地に添加することができ、さらに適切な条件を決定するためのその添加は、当業者の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、非枯渇とするか、補足栄養素を必要とする場合、培地に、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物を補足する。
【００６９】
１つの実施形態では、培地に、約１７０μＭ〜１７５μＭのヌクレオシドをさらに補足する。１つの実施形態では、培地は、累積濃度が少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１０５μＭのプリン誘導体を含む。１つの実施形態では、培地は、約１００μＭ〜１１０μＭのプリン誘導体を含む。プリン誘導体には、ヒポキサンチンならびにヌクレオシドであるアデノシンおよびグアノシンが含まれる。１つの実施形態では、培地は、累積濃度が少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、または少なくとも６５μＭのピリミジン誘導体を含む。１つの実施形態では、培地は、約６５μＭ〜７５μＭのピリミジン誘導体を含む。ピリミジン誘導体には、ヌクレオシドであるチミジン、ウリジン、およびシチジンが含まれる。１つの特定の実施形態では、培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンを含む。
【００７０】
上記の任意の添加物の含有に加えて、１つの実施形態では、培地に、マイクロモル量の脂肪酸（または脂肪酸誘導体）およびトコフェロールをさらに補足する。一実施形態では、脂肪酸は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸のうちのいずれか１つまたは複数を含む。１つの実施形態では、培地は、トコフェロール、リノール酸、およびチオクト酸を含む。
【００７１】
１つの実施形態では、培地に、ビタミンの混合物（他の栄養素および必須栄養素を含む）を累積濃度が少なくとも約７００μＭまたは少なくとも約２ｍＭでさらに補足することもできる。１つの実施形態では、ビタミンの混合物は、１つまたは複数のＤ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、Ｄ−パントテン酸（ｈｅｍｉＣａ）、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２などを含む。１つの実施形態では、ビタミンの混合物は、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、Ｄ−パントテン酸（ｈｅｍｉＣａ）、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２の全てを含む。
【００７２】
本発明の培地の種々の実施形態には、上記実施形態の任意の組み合わせ（表示の量のタウリン、さらに、とりわけ（ａ）アミノ酸；（ｂ）任意選択的に、ヌクレオシド；（ｃ）二価カチオンの塩；（ｄ）脂肪酸およびトコフェロール；および（ｅ）ビタミンを含む化学的に規定された加水分解物を含まない無血清培地が含まれる）が含まれる。いくつかの実施形態では、少量の全加水分解物をタウリン補足培地に添加することができる。
【００７３】
出願人は、本発明の実施の際に、種々の基本培地の任意の１つまたは複数またはその組み合わせにタウリンを使用することができることを想定している。基本培地は、当該分野で一般的に知られており、とりわけ、イーグルＭＥＭＥ（最小必須培地）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９５５，１１２（３１６８）：５０１−５０４）、ハムＦ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９６５，５３：２８８−２９３）、Ｆ−１２  Ｋ培地、ダルベッコ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９５２  Ａｕｇｕｓｔ；３８（８）：７４７−７５２）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２  １：１、トローウェルＴ８、Ａ２培地（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｌ．，１９６１，１０：３８９−４０１）、ウェイマウス培地（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９４５，３９（２）：１８８−１９９）、ウィリアムズＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９７１，６９：１０５  ｅｔ  ｓｅｑ．）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ａｍｅｒ．  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９６７，１９９：５１９−５２４）、ＭＣＤＢ  １０４／１１０培地（Ｂｅｔｔｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８１，７８（９）：５５８８−５５９２）、Ｖｅｎｔｒｅｘ  ＨＬ−１培地、アルブミン−グロブリン培地（Ｏｒｒら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９７３，２５（１）：４９−５４）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、リーボビッツＬ−１５培地、および無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）など）、プロタミン−亜鉛−インスリン培地（Ｗｅｉｓｓら，１９７４，米国特許第４，０７２，５６５号）、ビオチン−葉酸培地（Ｃａｒｔａｙａ，１９７８，米国再発行特許第３０，９８５号）、トランスフェリン−脂肪酸培地（Ｂａｋｅｒ，１９８２，米国特許第４，５６０，６５５号）、トランスフェリン−ＥＧＦ培地（Ｈａｓｅｇａｗａ，１９８２，米国特許第４，６１５，９７７号；Ｃｈｅｓｓｅｂｅｕｆ，１９８４，米国特許第４，７８６，５９９号）、および他の培地の順列（Ｉｎｌｏｗ，米国特許第６，０４８，７２８号；Ｄｒａｐｅａｕ，米国特許第７，２９４，４８４号；Ｍａｔｈｅｒ，米国特許第５，１２２，４６９号；Ｆｕｒｕｋａｗａ，米国特許第５，９７６，８３３号；Ｃｈｅｎ，米国特許第６，１８０，４０１号；Ｃｈｅｎ，米国特許第５，８５６，１７９号；Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，米国特許第５，７０５，３６４号；Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，米国特許第７，６６６，４１６号；Ｒｙｌｌ，米国特許第６，５２８，２８６号；Ｓｉｎｇｈ，米国特許第６，９２４，１２４号；およびＬｕａｎ，米国特許第７，４２９，４９１号などを参照のこと）が含まれる。
【００７４】
特定の実施形態では、培地は化学的に規定されており、タウリンに加えて以下を含む：本明細書中に定義のアミノ酸混合物、ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ；ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＫＣｌ；ＭｇＳＯ４；ＮａＣｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４または他のリン酸塩；ピルビン酸塩；Ｄ−ビオチン；塩化コリン；葉酸；ミオ−イノシトール；ナイアシンアミド；塩酸ピリドキシン；Ｄ−パントテン酸；リボフラビン；塩酸チアミン；ビタミンＢ１２；ρ−アミノ安息香酸；エタノールアミンＨＣｌ；ポロクサマー１８８；ＤＬ−ａ−トコフェロールホスファート；リノール酸；Ｎａ２ＳｅＯ３；チオクト酸；およびグルコース；ならびに、任意選択的に、アデノシン；グアノシン；シチジン；ウリジン；チミジン；およびヒポキサンチン２Ｎａ。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明の培地の開始容量オスモル濃度は、２００〜５００、２５０〜４００、２７５〜３５０、または約３００ｍＯｓｍである。本発明の培地中での細胞の成長中、特に、流加プロトコールにしたがった任意の供給後の培養物の容量オスモル濃度は、約３５０、４００、４５０、５００、または約５５０ｍＯｓｍまで増加し得る。
【００７６】
特定培地の容量オスモル濃度が約３００未満であるいくつかの実施形態では、特定の過剰量の１つまたは複数の塩の添加によって、容量オスモル濃度は約３００になる。１つの実施形態では、容量オスモル濃度を、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マグネシウム塩、カルシウム塩、アミノ酸塩、脂肪酸の塩、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、塩であるキレート剤、糖（例えば、ガラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、フコースなど）、およびその組み合わせから選択される１つまたは複数のオスモライトの添加によって所望のレベルまで増加させる。１つの実施形態では、オスモライトを、特定培地中に既に存在する構成成分中のオスモライト濃度を超える濃度で添加する（例えば、特定された糖構成成分の濃度を超える濃度で糖を添加する）。
【００７７】
上記の培地のあらゆる実施形態をタウリン補足培地といい、少なくとも約０．１ｍＭのタウリンを含む任意の他の無血清培地も同様にタウリン補足培地という。逆に、タウリンを含まない培地（すなわち、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む培地）を、以後、非タウリン補足培地または非タウリン補足という。
【００７８】
（流加培養）
細胞培養の供給ストラテジーは、多細胞生物外または組織外の細胞の最適な成長および増殖を確実にすることを目的とする。哺乳動物細胞に適切な培養条件は、当該分野で公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと。哺乳動物細胞を、懸濁液中または固体基質に付着させながら培養することができる。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、回転瓶、振盪フラスコ、または撹拌槽型バイオリアクター（マイクロキャリアを使用するか使用しない）、およびバッチ、流加、連続、半連続、または灌流の各モードでの操作が哺乳動物細胞培養に利用可能である。細胞培養培地または濃縮フィード培地を、培養中に培養物に連続的にまたは間隔を置いて添加することができる。例えば、培養物に、１日１回、１日おきに１回、３日毎に１回供給することができるか、モニタリングしている特定の培地構成成分の濃度が所望の範囲から外れた場合に供給することができる。
【００７９】
タウリンを含めることに加えて、１つの実施形態では、培地に、累積（合計）濃度が少なくとも２０ｍＭのアミノ酸をさらに補足することができる。１つの実施形態では、開始細胞培養培地中に含まれる初期アミノ酸濃度は、かかる累積（合計）補足アミノ酸濃度に含まれない。細胞培養培地の１つの実施形態、すなわち、細胞を培養する方法または目的のタンパク質を産生するための方法において、培地に、約２０ｍＭ超、約２５ｍＭ超、約３０ｍＭ超、約４０ｍＭ超  約５０ｍＭ超、または約６０ｍＭ超、約７０ｍＭ超、約１００ｍＭ超、約２００ｍＭ超、約３００ｍＭ超、約４００ｍＭ超、または約５００ｍＭ超の量で補足することができる。本明細書中の表１も参照のこと。１つの実施形態では、培地へのアミノ酸の添加量は、約３０ｍＭ±１０ｍＭまたはそれを超える。
【００８０】
当業者は、細胞成長を補助するか、細胞ストレスを最小にするか、産生期中に「非枯渇培地」を提供するために、補足物供給レジメンを最適にすることができる。
【００８１】
「非枯渇培地」には、栄養素、特に、目的の組換えタンパク質の産生に必要なアミノ酸を有すると判断されている細胞培養培地が含まれる。アミノ酸フィードは、典型的には、細胞培養における組換えタンパク質産生のための構成要素として必要なアミノ酸を補足する。しかし、培養細胞によって産生される特定のタンパク質の要件に応じて、アミノ酸によっては他のアミノ酸より早く枯渇し得る。非枯渇培地では、必要なアミノ酸が消費された場合にこのアミノ酸が補充されるように供給レジメが特定されている。したがって、枯渇およびその後の至適消費率（ｐｇ／細胞−日）を、以下の工程によって決定することができる：細胞培養培地中で目的のタンパク質を発現する真核細胞を培養すること；各時点での培養培地中の各アミノ酸濃度を測定して枯渇レベルを確立すること；アミノ酸濃度が枯渇レベルを下回る枯渇時点を識別すること；各アミノ酸の消費率を計算すること；および枯渇時点の直前の時点での消費率として至適消費率を決定すること。次いで、培養培地を枯渇させないために、細胞培養物に、適切な濃度の特定のアミノ酸を補足して決定したかかる至適消費率を維持する。
【００８２】
本発明が、非枯渇培養物と同様に、枯渇培養物におけるタンパク質力価を改善するタウリン補足細胞培養培地を提供すると理解される。
【００８３】
本発明は、上記のタウリン補足培地中で目的のタンパク質を発現する細胞株を含む細胞培養物を提供する。タンパク質生物治療薬を産生するために日常的に使用される細胞株の例には、とりわけ、初代細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、およびニワトリ胚細胞が含まれる。１つの実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ細胞株または大規模タンパク質産生のために最適化されたいくつかの特定のＣＨＯ細胞バリアントのうちの１つまたは複数（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１）である。
【００８４】
１つの実施形態では、タウリン補足細胞培養物は、ユースポイント成分として培地に添加することができるか、培地配合物中に含めることができるインスリンを含む。１つの実施形態では、細胞株は、生物治療タンパク質を産生することが可能な細胞を含む。
【００８５】
１つの実施形態では、流加プロセスに従って細胞培養の間に間隔を置いて培地に補足する。流加培養は当該分野で一般的に知られており、タンパク質産生を最適にするために使用されている（Ｙ．Ｍ．Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０１０  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２６（５）：１４００−１０を参照のこと）。
【００８６】
典型的には、培地を交換しない細胞増殖期または種培養（すなわち、第１の細胞培養）を行った後、ポリペプチド産生期として公知の別個の第２の培養を行う。流加プロセスを、典型的には、産生期の間に使用する。
【００８７】
本発明は、産生細胞培養の開始時（０日目）に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地を提供する。あるいは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む細胞培養培地を、産生細胞培養の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、および／または１０日目に補足することができる。複数の日に産生培養物に添加される細胞培養培地には、総量が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む。約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの総タウリンを含む細胞培養培地を、任意の順序で添加することができる。
【００８８】
タウリンを、シードトレイン拡大期に基礎培地に補足することもできる。
【００８９】
上記のビタミン、アミノ酸、および他の栄養素などのさらなる栄養素を含めるために、産生培養の期間中毎日または２〜３日毎の頻度で間隔を置いて補足物を供給することができる。２週間またはそれを超える産生培養の持続期間を通して、少なくとも２回、または少なくとも８回補足物を供給する（栄養素を含む補足培地を添加する）ことができる。別の実施形態では、培養の持続期間中毎日補足物を供給することができる。別の培養供給スケジュールも想定される。
【００９０】
非枯渇培地を提供するためにさらなるアミノ酸補足も行うことができ、ここで、枯渇アミノ酸は、当該分野で公知であり、且つ本明細書中に記載の方法に従って決定される。このレジメを使用する場合、さらなるアミノ酸を、決定されたアミノ酸枯渇に応じて、産生培養持続期間中に一定の間隔、好ましくは、毎日、または２〜３日毎の頻度で補足または添加する。１つの実施形態では、非枯渇細胞培養培地を維持するためのさらなるアミノ酸の混合物を、２週間またはそれを超える培養中の１日目前後、２日目前後、３日目前後、４日目前後、５日目前後、６日目前後、７日目前後、８日目前後、９日目前後、１０日目前後、１１日目前後、１２日目前後、１３日目前後、および１４日目前後に培養物に添加する。別の培養供給スケジュールも想定される。
【００９１】
動物細胞（ＣＨＯ細胞など）を、小規模培養（約２５ｍＬの培地を有する１２５ｍｌの容器、約５０〜１００ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの容器、約１００〜２００ｍＬの培地を有する５００ｍＬの容器など）で培養することができる。あるいは、培養は、大規模（例えば、約３００〜１０００ｍＬの培地を有する１０００ｍＬの容器、約５００ｍＬ〜３０００ｍＬの培地を有する３０００ｍＬの容器、約２０００ｍＬ〜８０００ｍＬの培地を有する８０００ｍＬの容器、および約４０００ｍＬ〜１５０００ｍＬの培地を有する１５０００ｍＬの容器など）であり得る。生産用培養物は、１０，０００Ｌまたはそれを超える培地を含むことができる。タンパク質治療薬の臨床製造用などの大規模細胞培養物は、典型的には、数日間、または数週間維持され、その間に細胞が所望のタンパク質を産生する。この間に、培養物に、培養中に消費された構成成分（栄養素およびアミノ酸など）を含む濃縮フィード培地を補足することができる。濃縮フィード培地は、任意の細胞培養培地配合物に基づき得る。かかる濃縮フィード培地は、細胞培養培地のほとんどの構成成分を、その通常の有用量の、例えば、約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、またはさらに約１０００倍含むことができる。濃縮フィード培地を、しばしば、流加培養プロセスで使用する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、タウリンを含む細胞培養物に、細胞成長またはタンパク質産生中に「ユースポイント添加物」（添加物、ユースポイント成分、またはユースポイント化学物質としても公知）をさらに補足する。ユースポイント添加物には、成長因子または他のタンパク質、緩衝液、エネルギー源、塩、アミノ酸、金属、およびキレート剤のうちの任意の１つまたは複数が含まれる。他のタンパク質には、トランスフェリンおよびアルブミンが含まれる。成長因子（サイトカインおよびケモカインが含まれる）は当該分野で一般的に知られており、細胞成長、または、いくつかの場合、細胞分化を刺激することが公知である。成長因子は、通常、タンパク質（例えば、インスリン）、小ペプチド、またはステロイドホルモン（エストロゲン、ＤＨＥＡ、およびテストステロンなど）である。いくつかの場合、成長因子は、細胞増殖またはタンパク質産生を促進する非天然化学物質（例えば、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）およびメトトレキサートなど）であり得る。タンパク質およびペプチドの成長因子の非限定的な例には、アンギオポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎児ソマトトロピン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＦＢＳ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−７などが含まれる。１つの実施形態では、細胞培養培地に、ユースポイント添加成長因子であるインスリンを補足する。１つの実施形態では、添加後の培地中のインスリン濃度（すなわち、細胞培養培地中のインスリン量）は、約０．１μＭ〜１０μＭである。
【００９３】
緩衝液は、当該分野で一般に知られている。本発明は、任意の特定の緩衝液に制限されず、任意の当業者は、特定のタンパク質を産生する特定の細胞株との使用に適切な緩衝液または緩衝系を選択することができる。１つの実施形態では、ユースポイント添加緩衝液はＮａＨＣＯ３である。別の実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳである。他の実施形態では、ユースポイント添加緩衝液は、ＮａＨＣＯ３およびＨＥＰＥＳの両方を含む。
【００９４】
細胞培養におけるユースポイント添加物として用いるためのエネルギー源も当該分野で周知である。制限されないが、１つの実施形態では、ユースポイント添加エネルギー源はグルコースである。特定の細胞株および産生されるタンパク質の特定且つ具体的な要件を考慮すると、１つの実施形態では、グルコースを、約１〜２０ｍＭの濃度まで培地に添加することができる。いくつかの場合、グルコースを、２０ｇ／Ｌまたはそれを超える高レベルで添加することができる。
【００９５】
キレート剤も同様に、細胞培養およびタンパク質産生の分野で周知である。ＥＤＴＡテトラナトリウム二水和物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）およびクエン酸塩は、当該分野で使用される２つの一般的なキレート剤であるが、他のキレート剤を本発明の実施において使用することができる。１つの実施形態では、ユースポイント添加キレート剤はＥＤＴＡテトラナトリウム二水和物である。１つの実施形態では、ユースポイント添加キレート剤は、クエン酸塩（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７など）である。
【００９６】
１つの実施形態では、細胞培養培地に、エネルギー源として１つまたは複数のユースポイント添加アミノ酸（例えば、グルタミンなど）をさらに補足することができる。１つの実施形態では、細胞培養培地に、ユースポイント添加グルタミンを約１ｍＭ〜１３ｍＭの最終濃度で補足する。
【００９７】
他のユースポイント添加物には、１つまたは複数の種々の金属塩（鉄、ニッケル、亜鉛、および銅の塩など）が含まれる。１つの実施形態では、細胞培養培地に、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化第二鉄、および硫酸ニッケルのうちの任意の１つまたは複数を補足する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、タウリン補足培地中の細胞から得られるタンパク質力価は、非タウリン補足で培養した細胞由来のタンパク質力価（収量）より少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％高い、少なくとも２３％高い、少なくとも２４％高い、少なくとも２５％高い、少なくとも２６％高い、少なくとも２７％高い、少なくとも２８％高いまたは少なくとも２９％高い。いくつかの実施形態では、タウリン補足培地中の細胞から得られるタンパク質力価は、非タウリン補足培地で培養した類似の細胞または同一の細胞由来のタンパク質力価（収量）より少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、または少なくとも５％高い。
【００９９】
いくつかの実施形態では、細胞培養中のアンモニア蓄積は、非タウリン補足培地における細胞培養と比較して、タウリン補足培地において４％より大きく、５％より大きく、６％より大きく、７％より大きく、８％より大きく、９％より大きく、１０％より大きく、１５％、または２０％より大きく低下する。
【０１００】
（タンパク質産生）
タウリン補足培地およびタウリン補足培地での細胞の培養方法に加えて、本発明は、タウリン補足培地で培養した細胞におけるタンパク質（治療に有効な抗体または他の生物医薬品薬物物質など）の改良された産生方法を提供する。本発明は、治療タンパク質を高収量で産生する方法であって、タウリンを含む培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、細胞株が、治療タンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法を提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、タウリンを含む培地（タウリン補足培地）で培養した哺乳動物細胞によるタンパク質の力価（収量）は、非タウリン補足培地で培養した同一の哺乳動物細胞によるタンパク質の力価より少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ高い。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、タウリン補足培地で培養した細胞由来の、培養培地のリットルあたりのタンパク質産物のグラムで表すことができるタンパク質収量または力価は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも、３．５ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも５．５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６．５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも７．５ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、少なくとも８．５ｇ／Ｌ、少なくとも９ｇ／Ｌ、少なくとも９．５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｇ／Ｌである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、タウリン補足培地中の細胞から得られるタンパク質力価は、非タウリン補足培地で培養した類似の細胞または同一の細胞由来のタンパク質力価（収量）より少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％高い、少なくとも２４％高い、少なくとも２５％高い、少なくとも２６％高い、少なくとも２７％高い、少なくとも２８％高いまたは少なくとも２９％高い。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、タンパク質産物（目的のタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ２抗体．一実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載の抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド−１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ）−２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載の抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ）様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載の抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載の抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載の抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載の抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載の抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン−９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公開第２０１４／００４４７３０Ａ１号に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長分化因子−８抗体（例えば、抗ミオスタチン抗体としても公知であり、米国特許第８，８７１，２０９号または同第９，２６０，５１５号に記載の抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５Ａ１号または同第２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載の抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは同第８，９４５，５５９号に記載の抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号、または同第９，１７３，８８０号に記載の抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８Ａ１号または同第２０１４／０２７１６４２Ａ１号に記載の抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５３Ａ１号に記載の抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号および同第２０１５０２６６９６６Ａ１号ならびに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載の抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号および同第２０１５０２６６９６６Ａ１号ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載の抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群−４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載の抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載）、抗中東���吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載の抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および同第９，３５３，１７６号に記載の抗ＮＧＦ抗体）、および抗アクチビンＡ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号および同第２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ（ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、デュピルマブ、トレボグルマブ（ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、およびリヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）からなる群から選択される。本開示を通して言及した全ての刊行物は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、Ｆｃ部分および別のドメインを含む組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ−融合タンパク質）である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ−融合タンパク質は、Ｆｃ部分にカップリングした受容体の細胞外ドメインを１つまたは複数含む受容体Ｆｃ−融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ＩｇＧのヒンジ領域の後にＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ−融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２つまたはそれを超える個別の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ−融合タンパク質は、ＴＲＡＰタンパク質（例えば、ＩＬ−１  ｔｒａｐ（例えば、リロナセプト（ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域含む）；米国特許第６，９２７，００４号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと）またはＶＥＧＦ  ｔｒａｐ（例えば、アフリベルセプトまたはｚｉｖ−アフリベルセプト（ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む）；米国特許第７，０８７，４１１号および同第７，２７９，１５９号を参照のこと）など）である。他の実施形態では、Ｆｃ−融合タンパク質は、ＳｃＦｖ−Ｆｃ−融合タンパク質であり、このタンパク質は、１つまたは複数の抗原結合ドメイン（Ｆｃ部分にカップリングした抗体の重鎖可変フラグメントおよび軽鎖可変フラグメントなど）のうちの１つまたは複数を含む。
【０１０７】
本発明は、タンパク質産生用細胞のいかなる特定の型にも制限されない。タンパク質産生に適切な細胞型の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、トリ細胞、細菌細胞、および酵母細胞が含まれる。細胞は、幹細胞、組換え遺伝子発現用ベクターで形質転換された組換え細胞、またはウイルス産物産生用のウイルスでトランスフェクトされた細胞であり得る。細胞は、目的のタンパク質をコードする組換え異種ポリヌクレオチド構築物を含み得る。この構築物は、エピソームであり得るか、細胞のゲノムに物理的に組み込まれた要素であり得る。細胞はまた、目的のタンパク質が異種ポリペプチド構築物にコードされることなく目的のタンパク質を産生することができる。換言すれば、細胞は、目的のタンパク質を天然にコードすることができる（抗体を産生するＢ細胞など）。細胞はまた、初代細胞（ニワトリ胚細胞など）または初代細胞株であり得る。有用な細胞の例には、ＢＳＣ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ニワトリ胚細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、およびＣＨＯ細胞が含まれる。種々の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ細胞誘導体（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＵＸ  Ｂ−１１、ＣＨＯ  ＤＧ−４４、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ、ＧＳ−ＣＨＯ、Ｓ−ＣＨＯ、またはＣＨＯｌｅｃ変異株など）である。
【０１０８】
１つの実施形態では、ＣＨＯ細胞である細胞は、タンパク質を異所性に発現する。１つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖領域（ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、またはＣＨ３領域など）を含む。１つの実施形態では、タンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。１つの実施形態では、タンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む。１つの実施形態では、タンパク質は、ヒンジ領域ならびにＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む。１つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態では、タンパク質は、抗体（ヒト抗体、げっ歯類抗体、またはキメラヒト／げっ歯類抗体（例えば、ヒト／マウス、ヒト／ラット、またはヒトハムスター）など）である。
【０１０９】
産生期を、振盪フラスコまたはウェイブバッグ（ｗａｖｅ  ｂａｇ）から１リットルのバイオリアクターおよび大規模産業用バイオリアクターまでの任意の規模の培養で実施することができる。同様に、シードトレイン拡大期を、振盪フラスコまたはウェイブバッグから１リットルまたはそれを超える規模のバイオリアクターまでの任意の規模の培養で行うことができる。大規模プロセスを、約１００リットルから２０，０００リットルまたはそれを超える体積で行うことができる。幾つかの手段（温度変化または化学的誘導など）のうちの１つまたは複数を用いてタンパク質産生を制御することができる。増殖期は、産生期より高温で生じ得る。例えば、増殖期は約３５℃〜３８℃の第１の温度で生じることができ、産生期は、約２９℃〜３７℃、任意選択的に、約３０℃〜３６℃または約３０℃〜３４℃の第２の温度で生じ得る。さらに、タンパク質産生の化学誘導物質（カフェイン、酪酸塩、タモキシフェン、エストロゲン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、およびヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）など）を、温度変化と同時、前、または後に添加することができる。誘導物質を温度変化の後に添加する場合、誘導物質を温度変化の１時間後から５日後に添加することができる（温度変化の１〜２日後など）。産生細胞培養を、ケモスタットなどの連続供給培養系（Ｃ．Ａｌｔａｍｉｒａｎｏら，２００１前出を参照のこと）としてか、流加プロセス（Ｈｕａｎｇ、２０１０前出）に従って実施することができる。
【０１１０】
本発明は、細胞培養プロセスを介したタンパク質産生の改良に有用である。本発明で使用される細胞株を、商業的または科学的に興味深いポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。細胞株の遺伝子操作は、組換えポリヌクレオチド分子を用いた細胞のトランスフェクション、形質転換、もしくは、導入、または宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるための別の変化（例えば、相同組換えおよび遺伝子活性化または組換え細胞の非組換え細胞との融合による）を含む。目的のポリペプチドを発現するように細胞または細胞株を遺伝子操作するための方法およびベクターは、当業者に周知である；例えば、種々の技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８および年４回のアップデート）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に例示されている。培養における成長に適切な広範な種々の細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）および販売者から利用可能である。産業で一般的に使用される細胞株の例には、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶｌ（Ｃｏｓが含まれる）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳｌ）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。ＣＨＯ細胞は、複雑な組換えタンパク質（サイトカイン、凝固因子、および抗体など）の産生のために広く使用されている（Ｂｒａｓｅｌら（１９９６），Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら（１９９１），Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄら（１９９０），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）、ＤＸＢｌ１、およびＤＧ−４４は、有効なＤＨＦＲ選択性を示し、且つ増幅可能な遺伝子発現系によってこれらの細胞中で高レベルの組換えタンパク質発現が可能であるので、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．（１９９０），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５３７−５６６）。さらに、これらの細胞は接着培養物または懸濁培養物として操作が容易であり、比較的良好な遺伝子安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞によって組換え発現されたタンパク質は広く特徴付けられており、規制当局によって臨床的製造および商業的製造での使用が承認されている。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、米国特許出願公開第２０１０／０３０４４３６Ａ１号、同第２００９／０１６２９０１Ａ１号、および同第２００９／０１��７４１６Ａ１号、ならびに米国特許第７，４５５，９８８Ｂ２号、同第７，４３５，５５３Ｂ２号、および同第７，１０５，３４８Ｂ２号に記載の細胞株である。
【０１１１】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態の範囲に制限されず、これらの実施形態は、本発明の各々の態様または実施形態の例示であることを意図する。機能的に等価な方法および構成成分は、本発明の範囲内である。本明細書中に記載の発明に加えて、前述の説明および添付の図面から本発明の種々の修正形態が当業者に自明である。かかる修正形態は、本発明の範囲内である。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１：タウリン補足による抗体価の改善）
実施例１Ａ−ハイスループット振盪フラスコ培養：２５０ｍＬ振盪フラスコに、ＣＨＯ−Ｋ１由来のモノクローナル抗体（Ａｂ１）産生細胞株の種培養物を接種した。接種した細胞を３５．５℃で１７日間成長させ、必要に応じてグルコースおよび他の補足栄養素を供給した。細胞を、化学的に規定された（加水分解物を含まず、かつ無血清）基本培地中で成長させた。
【０１１３】
各培養フラスコは、補足なし（フラスコ１ａ）、または０日目に１ｍＭタウリンを補足した（フラスコ１ｂ）。
【表２】
2018521664.tif 000005
＊力価増加（％）についてのベースラインコントロール；フラスコ１ｂを補足ない培地における力価（フラスコ１ａ）と比較した。
＾補足なし培養物と補足培養物との間の最終力価の相違が統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
力価値を１７日目に回収したタンパク質から計算し、この力価は、ベースラインと比較して統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。タウリン補足培養物は、補足なし培養物に対し最終タンパク質力価が全体で８％増加する。
【０１１５】
実施例１Ｂ−ベンチトップ規模のバイオリアクター：類似する例であるが、大規模産生において、２Ｌバイオリアクターに、ＣＨＯ−Ｋ１由来のモノクローナル抗体（Ａｂ２、Ａｂ３、またはＡｂ４）産生細胞株の種培養物を接種した。接種した培養物を、温度３５．５℃、ＤＯ設定点４０．４％、および空気注入２２ｃｃｍで１４日間成長させた。Ａｂ２およびＡｂ３プロセスのｐＨ設定値は７．０±０．１５であり、Ａｂ４プロセスのｐＨ設定値は７．１３±０．２７であった。必要に応じて、グルコース、消泡剤、および基礎フィードをバイオリアクターに供給した。培養物を、補足なし培地（バイオリアクター２ａ、３ａ、４ａ）で成長させるか、約１ｍＭタウリン補足培地（Ａｂ２およびＡｂ３）または約３ｍＭタウリン補足培地（Ａｂ４）（産生０日目に添加（それぞれ、バイオリアクター２ｂ、３ｂ、および４ｂ））中で成長させた。
【０１１６】
抗体収量（力価）は、Ａｂ２産生細胞については６．４ｇ／Ｌであったが、タウリンを用いて成長させた細胞は８ｇ／Ｌタンパク質を産生した。タウリン補足せずに成長させた細胞と比較した２４％の力価の増加は統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。得られたＡｂ３産生培養物およびＡｂ４産生培養物の最終力価も、タウリン非補足培養物と比較して、１４日後に有意に高い（ｐ＜０．０５）（それぞれ、１１％および２０％）。表３を参照のこと。
【表３】
2018521664.tif 000006
＊補足なし培地は、力価増加％についてのベースラインコントロールであり、ここで、バイオリアクター２ｂ、３ｂ、または４ｂの力価増加％を補足なし培地（それぞれ、バイオリアクター２ａ、３ａ、または４ａ）における力価と比較する。
＾補足培養物と補足なし培養物との間の最終力価の相違は統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１１７】
Ａｂ３産生細胞培養物についてのタンパク質力価に関する経時変化をプロットし、タウリン補足によるタンパク質力価の有意な改善が、６日目より各培養日で認められた。
【表４】
2018521664.tif 000007
＊同日に回収した補足なし培地と比較した近似増加（％）
＾タウリン補足を用いた力価の増加は、補足なし培地と比較して統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１１８】
力価の有意な改善は、産生培養物において６日目という早期に認められた（タウリンを補足しない同一の培養物と比較して１２％増加）。図１も参照のこと。この経時変化における最大の相違は９日目に認められ（３ａと比較してバイオリアクター３ｂにおいて２９％の有意な（ｐ＜０．０５）増加）、培養最終日（１４日目）に１１％の有意な（ｐ＜０．０５）力価の増加が認められた。
【０１１９】
タウリン補足のタンパク質産生における利点が、異なる規模（実施例１Ａおよび１Ｂ）および異なる細胞株（実施例１Ｂ）にわたって観察される。
【０１２０】
（実施例２：ハイスループット振盪フラスコ培養でのタウリン濃度変動における生産性の一貫性）
産生０日目の培養物へのタウリンの添加量を変化させることによって、タンパク質力価の一貫性を試験した。２５０ｍＬ振盪フラスコに、ＣＨＯ−Ｋ１由来のモノクローナル抗体（Ａｂ１）産生細胞株の種培養物を接種した。接種した細胞を３５．５℃で１４日間成長させ、必要に応じてグルコースおよび他の補足栄養素を供給した。細胞を、化学的に規定された（加水分解物なし、かつ無血清）基本培地中で成長させた。
【０１２１】
各培養物は、タウリンを含まないか（補足なし）、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、または１０ｍＭの濃度でタウリンを含んでいた。
【表５】
2018521664.tif 000008
＊補足なし培地は力価増加％についてのベースラインコントロールである。
＃補足なしコントロールと比較した最終力価の相違は統計学的に有意である（ｐ＜０．１）。
＾補足なしコントロールと比較した最終力価の相違は統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）．
【０１２２】
タウリンを少なくとも０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で補足した場合、タウリンの補足量を変動させても一貫して高力価であることを示す。タウリン補足条件についての最終力価は、補足なし条件と統計学的に異なっていた。０．１ｍＭタウリンではｐ＜０．１であり、０．３ｍＭ〜１０ｍＭタウリンではｐ＜０．０５であった。
【０１２３】
（実施例３：ハイスループット振盪フラスコ培養におけるタウリン供給変動スケジュールの試験）
実施例３Ａ：シードトレイン拡大期の間のタウリン添加：
【０１２４】
拡大シードトレイン期の培養物へのタウリン添加の利点を、ハイスループット振盪フラスコモデルで評価した。フラスコ６ａ（表６）では、Ａｂ１産生ＣＨＯ細胞を、１ｍＭタウリンを補足した化学的に規定された（加水分解物なし、かつ無血清）基本培地中で解凍した。基礎培地のタウリン濃度を、拡大期を通して１ｍＭに維持した。産生の間、培養基礎培地に、０日目に１ｍＭ  タウリンを補足した。グルコースおよび栄養基礎フィードを、１７日間の産生の間に必要に応じて供給した。
【０１２５】
フラスコ６ｂ細胞は、シードトレイン拡大期を通して、タウリンを含まない（補足なし）の化学的に規定された（加水分解物なし、かつ無血清）基礎培地中で成長した。産生０日目に、培養基礎培地に、１ｍＭタウリンを補足した。１７日の産生の間に、グルコースおよび栄養基礎フィードを必要に応じて供給した。
【表６】
2018521664.tif 000009
最終力価（１７日目）の相違は、統計学的に有意ではない（ｐ＞０．１）。
【０１２６】
両条件（産生期のみ、またはシードトレインと産生期との組み合わせにおけるタウリン補足）についての最終（１７日目）力価値は類似している。得られた力価は統計学的に有意ではない（ｐ＞０．１）。シードトレイン拡大期におけるタウリン添加の利点は、産生期におけるタウリン補足に類似している。
【０１２７】
実施例３Ｂ：産生期の間のタウリン供給変動スケジュール：標準的なタウリン供給の変動スケジュールがタウリン補足培養物のタンパク質力価に任意の影響を及ぼしたかどうかを決定するために、Ａｂ１産生ＣＨＯ細胞を成長させる類似の振盪フラスコ培養においてさらなる実験を行った。細胞を、供給スケジュールが前述と同一であり、グルコース／栄養基礎フィードを必要に応じて添加する実施例２に類似の変動培養条件に供した。
【０１２８】
Ａｂ１産生培養物に、総量５ｍＭのタウリンを補足した。タウリン供給変動スケジュールにおいて類似の生産性（７．１ｇ／Ｌ、６．８ｇ／Ｌ、および７．０ｇ／Ｌ）が観察される。本実験で比較した力価値は統計学的に異なっていない（ｐ＞０．１）（表７を参照のこと）。
【表７】
2018521664.tif 000010
１４日の力価値間の相違は統計学的に有意でない（ｐ＞０．１）。
【０１２９】
タウリン供給スケジュールは、いかなる負の影響も及ぼさず、タウリン補足が産物収量に有利であるという結果も変化させない。したがって、タウリン補足を、０日目に１回加えるか、その後の産生期に加えるか、産生期に複数の間隔を置いて加えることができる。
【０１３０】
（実施例４：高処理ハイスループット振盪フラスコ培養におけるアンモニア副生成物の測定）
アンモニア副生成物を、Ａｂ１産生ＣＨＯ細胞のタウリン補足培養物について実施例２に類似の様式で行った１４日後の培養物で測定した。細胞を、グルコース／栄養基本フィードを必要に応じて添加する上記に類似の変動培養条件に供した。
【表８】
2018521664.tif 000011
＊アンモニア減少％についてのベースラインコントロール；タウリン補足条件を補足なし培地中のアンモニアと比較した。
＾アンモニア濃度の減少は統計学的に有意である（ｐ＜０．１）。
【０１３１】
Ａｂ１産生細胞では、培地中へのタウリン補足は健康で持続可能な培養を補助し、アンモニア副生成物が３２％減少していた。タウリン補足由来のアンモニア濃度の減少は統計学的に有意である（ｐ＜０．１）。
【０１３２】
本発明は、他の特定の実施形態で具体化することができる。
【図１】
2018521664.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月6日(2018.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改良された組換えタンパク質を産生するための組換え真核細胞を培養する方法であって、（ａ）細胞を増殖期の間に規定された細胞培養培地中で増殖または維持する工程、（ｂ）前記基本の細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程であって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および（ｃ）タウリンの添加によって前記目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に約１〜約５回行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の持続時間の間に毎日行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記規定された細胞培養培地中の培養物に、増殖期の間に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ）、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、抗体フラグメント、およびＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程；
（ｃ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；および
（ｄ）前記細胞中で前記目的のタンパク質を産生させる工程であって、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記工程（ｃ）の細胞が、前記目的のタンパク質を高収量で産生することが可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、０．１ｍＭ未満のＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して約３％〜約８％またはそれより大きくより高いタンパク質収量が可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
タウリン補足培養培地中で目的のタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程；
（ｃ）細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；
（ｄ）前記細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを補足する工程；
（ｅ）前記細胞培養物を工程（ｄ）のタウリン補足条件下で少なくとも６日間維持する工程であって、非タウリン補足培養で培養した細胞と比較して前記細胞中で目的のタンパク質をより高い力価で発現させ、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程；および
（ｆ）前記目的のタンパク質を回収する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
前記回収したタンパク質のタンパク質力価が、比較対照培養の前記力価より少なくとも８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、または少なくとも２０％より高く、前記比較対照培養培地が、工程（ｄ）のタウリン補足条件に供されなかった、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
目的の組換えタンパク質を高収量で産生する方法であって、少なくとも約０．１ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、前記細胞株が、組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法。
【請求項２５】
前記目的の組換えタンパク質の収量が、Ｌ−タウリンを含まない細胞培養培地中で培養した細胞株と比較して、前記細胞培養培地中にタウリンを含めることによって増大した、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ、または少なくとも２．５ｇ／Ｌ増加させることができる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を約３％〜約８％またはそれより大きく増加させることができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む抗体の高収量組換え産生のためのＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３２】
オルニチンをさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３３】
プトレシンをさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３４】
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３５】
前記培地が、無血清であるか、加水分解物を含まないか、または化学的に規定されているかのいずれかである、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３６】
フィードを、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、および／または１０日目の産生バッチ培養物に提供する、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３７】
前記産生バッチ培養物に提供した培地およびフィードが、産生期の間に約５ｍＭ〜約１０ｍＭの総Ｌ−タウリンを含む、請求項３６に記載のＣＨＯ細胞培養フィード。
【請求項３８】
１つまたは複数の脂肪酸をさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される、請求項３８に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４０】
ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２からなる群から選択されるビタミンおよび補因子をさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４１】
ヌクレオシドの混合物をさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地であって、前記ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンからなる群から選択される、ＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４２】
１つまたは複数の二価カチオンをさらに含む、請求項３１に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４３】
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、またはその両方である、請求項４２に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
【請求項４４】
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを含む、ＣＨＯ細胞培養におけるタンパク質産生のための流加培養培地および／またはフィード。
【請求項４５】
オルニチンをさらに含む、請求項４４に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【請求項４６】
プトレシンを含む、請求項４４に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【請求項４７】
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の流加培養培地および／またはフィード。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
別の実施形態では、目的のタンパク質を、（１）目的のタンパク質（抗体または他の抗原結合タンパク質など）をコードする核酸配列をＣＨＯ細胞に導入すること；（２）目的のタンパク質を安定に発現する細胞を選択すること；（３）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのタウリンを含む無血清細胞培養培地中で選択した細胞を培養することによって産生する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
改良された組換えタンパク質を産生するための組換え真核細胞を培養する方法であって、（ａ）細胞を増殖期の間に規定された細胞培養培地中で増殖または維持する工程、（ｂ）前記基本の細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程であって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および（ｃ）タウリンの添加によって前記目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法。
（項目２）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも１回行う、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも２回行う、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも３回行う、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも４回行う、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の間に少なくとも５回行う、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記（ｂ）のタウリン補足を産生期の持続時間の間に毎日行う、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記規定された細胞培養培地中の培養物に、増殖期の間に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを補足する工程をさらに含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ）、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、抗体フラグメント、およびＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程；（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程；（ｃ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；および（ｄ）前記細胞中で前記目的のタンパク質を産生させる工程であって、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程を含む、方法。
（項目１８）
前記目的のタンパク質の力価が、前記培地へのタウリンの添加によって増大した、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記工程（ｃ）の細胞が、前記目的のタンパク質を高収量で産生することが可能である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が、０．１ｍＭ未満のＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して少なくとも３％より高いタンパク質収量が可能である、項目１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、０．１ｍＭ未満のＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して少なくとも８％より高いタンパク質収量が可能である、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、項目１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、項目１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
タウリン補足培養培地中で目的のタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程；
（ｃ）細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；
（ｄ）前記細胞培養培地に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを補足する工程；
（ｅ）前記細胞培養物を工程（ｄ）のタウリン補足条件下で少なくとも６日間維持する工程であって、非タウリン補足培養で培養した細胞と比較して前記細胞中で目的のタンパク質をより高い力価で発現させ、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程；および
（ｆ）前記目的のタンパク質を回収する工程
を含む、方法。
（項目２９）
前記目的のタンパク質の力価が、タウリン補足によって増大した、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記回収したタンパク質のタンパク質力価が、比較対照培養の前記力価より少なくとも８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、または少なくとも２０％より高く、前記比較対照培養培地が、工程（ｄ）のタウリン補足条件に供されなかった、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
目的の組換えタンパク質を高収量で産生する方法であって、少なくとも約０．１ｍＭのＬ−タウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、前記細胞株が、組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法。
（項目３２）
前記目的の組換えタンパク質の収量が、Ｌ−タウリンを含まない細胞培養培地中で培養した細胞株と比較して、前記細胞培養培地中にタウリンを含めることによって増大した、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、項目３１〜３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ、または少なくとも２．５ｇ／Ｌ増加させることができる、項目３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも３％増加させることができる、項目３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記産生方法により、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産生方法と比較して、アンモニア蓄積を少なくとも８％減少させることができる、項目３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
１つまたは複数のユースポイント添加物を前記細胞培養培地に添加する工程をさらに含む、項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのＬ−タウリンを含む抗体の高収量組換え産生のためのＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４３）
オルニチンをさらに含む、項目４２に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４４）
プトレシンをさらに含む、項目４３に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４５）
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、項目４２〜４４のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４６）
前記培地が無血清である、項目４２〜４５のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４７）
前記培地が加水分解物を含まない、項目４２〜４６のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４８）
前記培地が化学的に規定されている、項目４２〜４７のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目４９）
前記培地を０日目の産生バッチ培養物に提供する、項目４２〜４８のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５０）
フィードを、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、および／または１０日目の産生バッチ培養物に提供する、項目４２〜４９のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５１）
前記産生バッチ培養物に提供した培地およびフィードが、産生期の間に約５ｍＭ〜約１０ｍＭの総Ｌ−タウリンを含む、項目５０に記載のＣＨＯ細胞培養フィード。
（項目５２）
１つまたは複数の脂肪酸をさらに含む、項目４２〜５１のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５３）
前記１つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される、項目５２に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５４）
ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２からなる群から選択されるビタミンおよび補因子をさらに含む、項目４２〜５３のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５５）
ヌクレオシドの混合物をさらに含む、項目４２〜５４のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５６）
前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンの１つまたは複数を含む、項目５５に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５７）
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンをさらに含む、項目４２〜５６のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５８）
１つまたは複数の二価カチオンをさらに含む、項目４２〜５７のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目５９）
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、またはその両方である、項目５８に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目６０）
Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む、項目５９に記載のＣＨＯ細胞培養培地。
（項目６１）
約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの量でタウリンを含む、ＣＨＯ細胞培養におけるタンパク質産生のための流加培養培地および／またはフィード。
（項目６２）
オルニチンをさらに含む、項目６１に記載の流加培養培地および／またはフィード。
（項目６３）
プトレシンを含む、項目６２に記載の流加培養培地および／またはフィード。
（項目６４）
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、項目６１〜６３のいずれか１項に記載の流加培養培地および／またはフィード。
（項目６５）
目的の組換えタンパク質の産生のために真核細胞を培養する方法であって、（ａ）項目４２〜６４のいずれか１項に記載の細胞培養培地を提供する工程、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を増殖または維持する工程であって、細胞培養物を形成し、、前記細胞が目的のタンパク質を発現する工程を含む、方法。
（項目６６）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記目的のタンパク質が、前記細胞によって前記培地に分泌される、項目６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記目的のタンパク質が、Ｆｃ−融合タンパク質、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記目的のタンパク質が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群から選択される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択される、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記細胞培養が、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較して少なくとも３％アンモニア蓄積を減少させることが可能である、項目６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記細胞培養が、０．１ｍＭ未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較して少なくとも８％アンモニア蓄積を減少させることが可能である、項目６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2018521664.tif 000013
2018521664.tif 000014
2018521664.tif 000015