(57)【要約】本発明は低酸素下培養間葉幹細胞（ＭＳＣ）の、筋骨格障害、特に骨関節炎の処置のための移植用細胞の製造における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素下培養間葉幹細胞（ＭＳＣ）の、筋骨格障害処置のための移植用細胞の製造における使用、ここで低酸素下培養ＭＳＣは酸素濃度１０％未満の低酸素状態で培養することによって得られる。
【請求項２】
筋骨格障害が、捻挫、靱帯、腱、筋肉および軟骨の捻れおよび裂傷、腱炎、腱鞘炎、線維筋痛症、骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、滑液包炎、急性および慢性背部痛、骨粗鬆症、手根管症候群、ドゥケルヴァン病、ばね指、テニス肘、回旋筋腱板、神経節嚢胞、骨形成不全症、ディシェンヌ症候群（Duschennes）、ハーラー症候群ならびにハンター症候群からなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
筋骨格障害が骨関節炎である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
ＭＳＣが自己または非自己ＭＳＣである、請求項１記載の使用。
【請求項５】
低酸素下培養ＭＳＣが、酸素濃度０％から７％の範囲の低酸素状態下でＭＳＣを培養することによって得られる、請求項１記載の使用。
【請求項６】
低酸素下培養ＭＳＣが、酸素濃度１％から７％の範囲の低酸素状態下で自己または非自己ＭＳＣを培養することによって得られる、請求項１記載の使用。
【請求項７】
低酸素下培養ＭＳＣが、酸素濃度１％から３％の範囲の低酸素状態下で自己または非自己ＭＳＣを培養することによって得られる、請求項１記載の使用。
【請求項８】
ＭＳＣが非自己ＭＳＣである、請求項４記載の使用。
【請求項９】
低酸素下培養ＭＳＣが、酸素濃度およそ１％下でＭＳＣを培養することによって得られる、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
低酸素下培養ＭＳＣが以下の工程の方法によって得られる、請求項１、５、６、７および９のいずれかに記載の使用：
（ａ）ＭＳＣを含む培地中に、哺乳類細胞の懸濁液を調製する；
（ｂ）培養皿で、低酸素状態下で哺乳類細胞懸濁液を培養する；
（ｃ）培地を変更し、上記の低酸素状態下で細胞を最低でも１代継代培養する；
（ｄ）（ｃ）の工程で得られるＭＳＣを回収する。
【請求項１１】
ＭＳＣがおよそ９日またはそれ以上の間、低酸素状態下で培養される、請求項１または１０記載の使用。
【請求項１２】
移植用細胞が、直接移植、静脈内注射、筋肉内注射、骨内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射または関節内注射により投与される、請求項１記載の使用。
【請求項１３】
移植用細胞が関節内注射により投与される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
移植用細胞が直接移植により投与される、請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
移植用細胞がさらに注射用の溶媒を含む、請求項１記載の使用。
【請求項１６】
注射用の溶媒が、生体高分子、天然高分子による生体模倣複合体および合成高分子からなる群から選択される、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
天然高分子による生体模倣複合体が、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アルギン酸またはキトサンである、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
合成高分子が、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）や高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）などのポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリアクリル酸、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、多硫化物または酸素、硫黄および窒素からなる群から選択された元素を含むポリカーボネイトである、請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
注射用の溶媒が、コラーゲン、フィブリン糊またはヒアルロン酸である、請求項１５記載の使用。
【請求項２０】
注射用の溶媒がヒアルロン酸である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
ＭＳＣが骨髄ＭＳＣである、請求項１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は基本的に、低酸素下培養間葉幹細胞の、筋骨格障害処置のための移植用細胞の製造における新規な使用に関する。特に、筋骨格疾患は骨関節炎である。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
骨関節炎（ＯＡ）は多くの国でますます好発している関節疾患である。ＯＡはいくつかの抗炎症薬、鎮痛剤または潤滑補助剤で処置できることが一般的に知られている。あるいはＯＡは、損傷の修復や再構築のための、穿孔を含む外科手術、微細破壊および骨軟骨柱移植術によっても処置できるが、これらは症状を一時的に改善するだけで、根治や変性した組織の再生をもたらすわけではない。
【０００３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）をＯＡの処置のために使用することが報告された。ＨＡの関節内注射はＯＡの処置に使用されたが、膝のＯＡの進行防止や軟骨の保護におけるＨＡの効果は未だ議論の余地がある。いくつかの研究では、ＯＡの処置において、ＨＡの治療効果は認められず、ＨＡは潤滑効果のみを提供することが示された(Lo et al., Intra-articular hyaluronic acid in treatment of knee osteoarthritis: a meta-analysis. JAMA 2003; 290:3115-21)。ＨＡは関節内への注入後、関節面に局在化することが報告されたため、ＨＡ内に送られた前駆細胞や幹細胞は関節面へと運ばれると考えられた。
【０００４】
近年、細胞の移植や人工軟骨を含む細胞療法は、関節軟骨の欠陥の修復を助けるために発展してきた。単層培養条件下で培養された自己の軟骨細胞の移植によって、膝の軟骨の欠陥がうまく処置できたことが報告された(Brittberg et al., Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 1994; 331:889-95)。
【０００５】
最近の報告では、自己複製が可能で、様々な間葉組織に分化する間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、臨床応用のための有望な手段として現れたことも示唆された。例えば、骨形成不全症のための細胞療法や軟骨および骨の組織工学である(Wei et al., Mesenchymal stem cells in regenerative medicine for musculoskeletal disorders: bench, bedside, and industry. Cell Transplant. 2014; 23:505-12)。健常なドナーからの同種異系ＭＳＣは筋骨格障害の患者を処置する「普遍的なドナー細胞」として役立つかもしれない。しかしながら、ＭＳＣは本質的に免疫特権があるわけではなく、同種異系のＭＳＣは免疫適格性でＭＨＣ不適合の移植患者に拒絶された(Eliopoulos et al., Allogeneic marrow stromal cells are immune rejected by MHC class I- and class II-mismatched recipient mice. Blood, 2005; 106:4057-65)。低酸素ＭＳＣと呼ばれる低酸素状態下で培養されたＭＳＣ、特に長期間の低酸素培養ＭＳＣでは、正常酸素ＭＳＣと呼ばれる正常酸素状態下で増殖させたＭＳＣと比較して、細胞の老化が低下し、増殖速度と分化能が増加した(Tsai et al., Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST. Blood, 2011; 117:459-69)。低酸素ＭＳＣは移植後に離れた部位への移動や生着が増加した。低酸素ＭＳＣはまた、正常酸素ＭＳＣよりも多くの血管新生のサイトカインと増殖因子を分泌し(Hung et al., Angiogenic effects of human multipotent stromal cell conditioned medium activated the PI3K-Akt pathway in hypoxic endothelial cells to inhibit apoptosis, increase survival, and stimulate angiogenesis. Stem Cells, 2007; 25:2363-70)、低酸素ＭＳＣ由来の培養上清は、齧歯動物の突然の不整脈による死を防ぎ、創傷治癒や骨折治癒を刺激するために用いられてきた。最近、低酸素ＭＳＣは、宿主の免疫拒絶に耐えることで、同種異系の宿主組織内で生存および生着し、虚血性の肢を回復する能力が増加したと報告された(Huang et al., Hypoxic mesenchymal stem cells engraft and ameliorate limb ischaemia in allogeneic recipients. Cardiovasc. Res. 2014; 101:266-76)。低酸素ＭＳＣはまた、同種異系の移植患者における骨の修復や腱の治癒にも用いられた(Huang et al., Mesenchymal stem cells from a hypoxic culture improve and engraft Achilles tendon repair. Am. J. Sports Med. 2013; 41:1117-25)。しかしながら、低酸素ＭＳＣのその他の効果は予期されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の要約
本発明は、低酸素下培養間葉幹細胞（ＭＳＣ）が筋骨格障害、特に骨関節炎の処置に有効であるという予期しない発見に基づく。
【０００７】
従って、本発明は筋骨格障害、特に骨関節炎の処置のための移植用細胞の製造における、ＭＳＣの新規な使用を提供する。
【０００８】
別の側面として、本発明はＭＳＣで作製された移植用細胞の治療上有効な量を、処置が必要な対象へ投与することを含む、筋骨格障害の処置方法を提供する。
【０００９】
本発明において、筋骨格障害は、捻挫、靱帯、腱、筋肉および軟骨の捻れおよび裂傷、腱炎、腱鞘炎、線維筋痛症、骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、滑液包炎、急性および慢性背部痛、骨粗鬆症、手根管症候群、ドゥケルヴァン病、ばね指、テニス肘、回旋筋腱板、神経節嚢胞、骨形成不全症、ディシェンヌ症候群(Duschennes)、ハーラー症候群、ハンター症候群ならびにこれらの合併症からなる群から選択される。特に本発明の例としての筋骨格障害は、骨関節炎である。
【００１０】
本発明の一つの特徴的な態様において、ＭＳＣは、１０％未満の低酸素濃度状態下で自己または非自己のＭＳＣを培養することによって得られうる、低酸素下培養ＭＳＣである。
【００１１】
本発明の一つの実施態様において、低酸素下培養ＭＳＣは、酸素濃度０％から７％の範囲の低酸素濃度状態下、好ましくは酸素濃度１％から３％、最も好ましくは酸素濃度およそ１％で、自己または非自己のＭＳＣを培養することによって得られる。
【００１２】
本発明の一以上の態様において、低酸素下培養ＭＳＣを含む構成物は、直接移植、静脈内注射、筋肉内注射、骨内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射または関節内注射により投与される。一つの特徴的な態様において、低酸素下培養ＭＳＣを含む構成物は、関節内注射または直接移植により、投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面の簡単な説明
先述の要約、並びに後述の発明の詳細な説明は、添付された図面により、さらによく理解されるだろう。図面は下記を示す：
【００１４】
【図１】図１にウサギのＯＡを処置するための低酸素下培養ＭＳＣの実験計画を示す。括弧内の数字はＡＣＬＴおよび分析を受けたウサギの数を示す。（ＣＴＲ：対照群；Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリンおよびエオシン；Ｓ．Ｏ：サフラニンＯ；Ｐ．Ｂ：プルシアンブルー)
【００１５】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは低酸素下培養骨髄細胞の分化能を示す。図２Ａは誘導の２１日後のオイルレッドＯ染色を示す顕微鏡写真であり、脂肪細胞分化の結果を示す；横棒＝５０μｍ。図２Ｂは誘導の２１日後のアリザリンレッドＳ染色を示す顕微鏡写真であり、骨分化の結果を示す；横棒＝１００μｍ。図２Ｃは誘導の２１日後のペレットのアルシアンブルー染色を示す顕微鏡写真であり、軟骨分化の結果を示す；横棒＝１ｍｍ。
【００１６】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは大腿骨および脛骨の全体の外観を示す。図３Ａは処理の６および１２週間後における大腿顆の全体像を示す。図３Ａのアスタリスクは骨棘の形成を示す。図３Ｂは脛骨プラトーの関節面における墨汁染色の結果を示す（鳥瞰図）。
【００１７】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは大腿顆のＨＥおよびサフラニンＯ染色の結果を示す。図４Ａは処理の６および１２週間後の、異なる群における大腿顆のヘマトキシリンを示す顕微鏡写真である。図４Ｂは処理の６および１２週間後の異なる群における大腿顆のエオシンおよびサフラニンＯ染色を示す顕微鏡写真である。図４ＣはサフラニンＯ染色の定量分析の結果である。データは平均値±標準偏差である。＊Ｐ＜０．０５。
【００１８】
【図５】図５は組織学的な度合いのマンキンスコアを示す。ここでマンキンスコアは処理後６および１２週間後の関節の、異なる部分のスコアである。データは平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００１９】
【図６】図６Ａ〜６ＢはＩＩ型コラーゲンの免疫組織化学的染色を示す。図６Ａは染色されたＩＩ型コラーゲンを含む大腿顆の顕微鏡像を示す（拡大率，ｘ１００）。図６ＢはＩＩ型コラーゲンの定量解析を示す。データは平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００２０】
【図７】図７Ａ〜７ＢはＸ型コラーゲンの免疫組織化学的染色を示す。図７Ａは染色されたＸ型コラーゲンを含む大腿顆の顕微鏡像を示す（拡大率，ｘ１００）（上部ボックス，ｘ４００）。図７ＢはＸ型コラーゲンの定量解析を示す。データは平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００２１】
【図８】図８Ａ〜８Ｄは低酸素下で事前調整され、注射されたＭＳＣのプルシアンブルー染色の結果を示す。図８Ａは間葉幹細胞へのＳＰＩＯナノ粒子のエンドサイトーシスの効率を示す。図８Ｂ、８Ｃ、８ＤはプルシアンブルーおよびサフラニンＯ染色によって、それぞれ大腿顆（拡大率，ｘ１００）、脛骨プラトー（拡大率，ｘ１００）、半月板（拡大率，ｘ５０）の、軟骨に注射されたＭＳＣの生着を示す顕微鏡写真である。図８Ｂおよび８Ｃの下部ボックスは２００ｘの写真であり、図８Ｄの下部ボックスは１００ｘの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
別段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明の当業者が通常理解するものと同じ意味である。
【００２３】
本明細書において、単数形（a, anおよびthe）は、文中で明らかな他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば「試料(a sample)」という言及は、それについて当業者に知られている、多数の当該試料およびそれらと同等なものを含む。
【００２４】
本明細書において、用語「筋骨格障害」はヒトの骨、関節、靱帯、筋肉、腱、神経、腱、軟骨ならびに肢、首および背中を支える構造体の障害や痛みを指す。そしてこれは、痛みを生じ、通常の活動を損なう変性疾患および炎症状態である。具体的な筋骨格障害の例として、骨、関節、靱帯、筋肉、神経、腱、軟骨ならびに肢、首および背中を支える構造体に関する全ての疾患を含む。筋骨格障害は、捻挫、靱帯、腱、筋肉および軟骨の捻れおよび裂傷、腱炎、腱鞘炎、線維筋痛症、骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、滑液包炎、急性および慢性背部痛、骨粗鬆症、手根管症候群、ドゥケルヴァン病、ばね指、テニス肘、回旋筋腱板、神経節嚢胞、骨形成不全症、ディシェンヌ症候群(Duschennes)、ハーラー症候群、ハンター症候群ならびにこれらの合併症からなる群から選択される。
【００２５】
本明細書において、用語「間葉幹細胞」または「ＭＳＣ」は、例えば骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などを含む、多様な細胞型に分化できる、多能性幹細胞を指す。間葉幹細胞またはＭＳＣは、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、乳児の乳歯における角膜実質および歯髄、臍帯組織または臍帯血などを含むがこれらに限らず、どの組織源からでも抽出され得る。本発明の一態様において、ＭＳＣは骨髄ＭＳＣである。
【００２６】
本明細書で使用される用語「低酸素」は、１０％未満の酸素濃度のように、通常の大気の酸素濃度（例えば、２０％〜２５％）よりも低い酸素濃度状態を指す。
【００２７】
用語「治療上有効な量」または「有効な量」とは、望ましい効果、すなわち予防や処置を達成するために計算された所定量を指す。本発明は筋骨格障害、特に骨関節炎の処置のための移植用細胞の製造におけるＭＳＣの使用を提供する。一方で本発明はまた、ＭＳＣで作製された移植用細胞の治療上有効な量を、処置が必要な対象へ投与することを含む、骨関節炎の処置法を提供する。
【００２８】
本発明において、ＭＳＣは低酸素下培養ＭＳＣであり、自己または非自己ＭＳＣであり得る。低酸素下培養ＭＳＣは、１０％未満の低酸素濃度状態下で自己または非自己のＭＳＣを培養することによって得られる。本発明の一態様において、ＭＳＣは、酸素濃度０％から７％の範囲の低酸素濃度状態下、好ましくは酸素濃度１％から３％、最も好ましくは酸素濃度およそ１％で培養される。本発明の特徴的な態様として、ＭＳＣは１％酸素濃度下で培養された自己ＭＳＣである。
【００２９】
本発明において、移植用細胞は低酸素下培養ＭＳＣで作製されている。本発明の一態様において、低酸素下培養ＭＳＣは、以下の工程の方法によって得られる：
（ａ）ＭＳＣを含む培地中に、哺乳類細胞の懸濁液を調製する；
（ｂ）培養皿で、０％から７％Ｏ２による低酸素状態下、好ましくは１％〜７％Ｏ２、より好ましくは１％〜３％Ｏ２、最も好ましくはおよそ１％Ｏ２で、哺乳類細胞の懸濁液を培養する；
（ｃ）培地を変更し、上記の低酸素状態下で細胞を最低でも１代、好ましくは２代継代培養する；
（ｄ）（ｃ）の工程で得られるＭＳＣを回収する。
【００３０】
一つの態様として、ＭＳＣはおよそ９日間またはそれ以上、低酸素状態下で培養される。
【００３１】
例えば、移植用細胞は直接移植、静脈内注射、筋肉内注射、骨内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射または関節内注射により投与され得る。
【００３２】
本発明において、移植用細胞は低酸素下培養ＭＳＣから作製されるが、これらはさらに、欠陥部にＭＳＣを運ぶのに適した、注射用の溶媒を含み得る。そしてこの溶媒は、生体高分子、天然高分子による生体模倣複合体および合成高分子からなる群から選択される。天然高分子による生体模倣複合体は、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アルギン酸、キトサンなどでもよい。合成高分子は、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）や高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）などのポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリアクリル酸、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、多硫化物および酸素、硫黄および窒素からなる群から選ばれた元素を含むポリカーボネイトなどでもよい。本発明の一以上の態様において、注射用の溶媒はコラーゲン、フィブリン糊またはヒアルロン酸である。一つの特徴的な態様において、注射用の溶媒はヒアルロン酸である。
【００３３】
複数の実施例から、骨関節炎は、低酸素下培養ＭＳＣから作製された移植用細胞によって、処置できることが示され、そしてこれは他の筋骨格障害へ拡張できるはずである。従って本発明はまた、間葉幹細胞（ＭＳＣ）から作製された移植用細胞の治療上有効な量を、処置が必要な対象へ投与することを含む、筋骨格障害の手法を提供する。筋骨格障害は、捻挫、靱帯、腱、筋肉および軟骨の捻れおよび裂傷、腱炎、腱鞘炎、線維筋痛症、骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、滑液包炎、急性および慢性背部痛、骨粗鬆症、手根管症候群、ドゥケルヴァン病、ばね指、テニス肘、回旋筋腱板、神経節嚢胞、骨形成不全症、ディシェンヌ症候群(Duschennes)、ハーラー症候群、ハンター症候群ならびにこれらの合併症からなる群から選択される。
【００３４】
本発明はさらに、制限ではなく説明の目的で提供される、下記の例示によって説明される。
【実施例】
【００３５】
実施例
【００３６】
１．ウサギの骨髄間葉幹細胞の単離
【００３７】
本プロトコルは台北栄民総医院(Taipei Veterans General Hospital)（台北、台湾）が制定する動物福祉ガイドライン(the institutional animal welfare guidelines)によって承認された。骨格が成熟したニュージーランドホワイト種のウサギ２匹の大腿骨を取り出し、軟部組織を無菌的に剥離した。骨幹に１８ゲージの針を挿入して、基本培地（α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD）を流し、骨髄を押し出した。単核細胞を密度勾配遠心分離法によって骨髄から単離し、完全培地（ＣＣＭ：１６．６％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが添加されたα−ＭＥＭ）に懸濁し、プラスチックの皿に播種した。初期培養の２４時間後、非接着細胞を培養液の交換および培地の洗浄によって除去した。培地は基本的に６から８日後に６５％から７０％のコンフルエンスに達し、細胞（継代数０）が次の継代培養のために回収される９日目に、サブコンフルエンスに達した。継代数１から始める細胞を、１００ｃｅｌｌ／ｃｍ２でＣＣＭ中に播種し、増殖した。培地は一週間に二回交換した。低酸素下培養のため、９４％Ｎ２、５％ＣＯ２、１％Ｏ２で構成された混合気体下で、細胞を培養した。低酸素混合気体の維持のため、ＣＯ２およびＯ２の２つの気体感知器を備えた恒温器を用いた；純粋なＮ２が入ったタンクからのＮ２ガスの運搬によってこのＯ２量は達成され、維持された。酸素量が望ましい水準を超えて上昇した際は常に、過剰なＯ２を置換するために、系の中にＮ２ガスが自動的に注入された。
【００３８】
２．インビトロでのＭＳＣの骨形成および脂肪形成
【００３９】
ＭＳＣを以下の培養環境のうちの一つで処理した：（ｉ）１０％ ＦＢＳ、５０ｇ／ｍＬ アスコルビン酸−２−リン酸（ナカライ、京都、日本）、１０−８Ｍ デキサメタゾン(Sigma、St、Louis、MO)および１０ｍＭ β−グリセロリン酸(Sigma)を添加したα−ＭＥＭの、骨分化培地；（ｉｉ）１０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸−２−リン酸、１０−７Ｍ デキサメタゾン(Sigma)、５０μｇ／ｍＬ インドメタシン(Sigma)、０．４５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma)および１０μｇ／ｍＬ インスリン(Sigma)を添加したα−ＭＥＭの、脂肪細胞分化培地。培養液は３日毎に交換した。分化の形態的な特徴が現れた後、これらの細胞は組織化学分析および免疫蛍光分析に用いられた。
【００４０】
３．インビトロでのＭＳＣの軟骨形成
【００４１】
セミコンフルエンス時に、５×１０５個のＭＳＣをトリプシン処理し、５００ｇで１０分遠心沈殿された。１２〜２４時間のインキュベーションにより、細胞はほぼ球状の凝集を形成した。ＦＢＳを含む培養液は、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ(BD Biosciences、Bedford、Mass)、６．２５μｇ／ｍｌ インスリン、６．２５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ 亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５．３５ｍｇ／ｍｌ リノール酸、１０-７Ｍ デキサメタゾン(Sigma)、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸−２−リン酸（ナカライ、京都、日本）および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β１を添加した、無血清、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地からなる軟骨分化培地に変更した。培養液は２から３日間隔で交換し、ペレットは２１日目に回収した。
【００４２】
４．超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）を用いた細胞標識
【００４３】
ＳＰＩＯはShiehに記述されているように調製した(Shieh et al., Aqueous dispersions of magnetite nanoparticles with NH3+ surfaces for magnetic manipulations of biomolecules and MRI contrast agents. Biomaterials 2005; 26:7183-91)。簡潔に述べると、０．１Ｍ Ｆｅ（ＩＩＩ）(Sigma)溶液および０．２Ｍ Ｆｅ（ＩＩ）(Sigma)水溶液をそれぞれＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２を溶かすことによって調製した。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の生成のため、４ｍＬのＦｅ（ＩＩＩ）溶液および１ｍＬのＦｅ（ＩＩ）溶液を室温で混合した。次に５Ｍ ＮａＯＨを滴化し、混合溶液のｐＨを１１に調製した。磁石による収集の後、沈殿を５０ｍＬの脱イオン水で洗浄した。その後、３ｇの有機酸を加え、粒子表面を完全に被覆した。遠心分離による余分な付着物の除去後、沈殿を脱イオン水で再分散した。標識を行う前に、ＳＰＩＯナノ粒子のエンドサイトーシスを促進するため、室温で１時間、培地に０．７５μｇ／ｍＬ ポリ−Ｌ−リジン(Sigma)を入れて混ぜ、５０μｇ／ｍＬのＳＰＩＯを被覆した。ＭＳＣを４ｘ１０４個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、２４時間増殖させた。ＭＳＣをＳＰＩＯ含有培地で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで徹底的に洗浄した。
【００４４】
５．骨関節炎のモデル：ＡＣＬＴ（前十字靱帯切断）
【００４５】
生後１２ヶ月で約３．０ｋｇ（２．８〜３．５ｋｇの範囲）のニュージーランドウサギの膝関節を次の四つの群に分けた（図１参照）：（１）ＯＡ（ＭＳＣやＨＡ処理なしのＯＡ誘導）（ｎ＝１０）、（２）反対側の対照（シャム手術）；（３）ＨＡを伴うＯＡ（ＯＡ誘導後、ＨＡ処理）および（４）反対側のＨＡプラスＭＳＣを伴うＯＡ（ＯＡ誘導後、ＨＡプラスＭＳＣ処理）（ｎ＝１８）。膝関節のＯＡはヨシオカに記述されているように誘導した(Yoshioka et al. Characterization of a model of osteoarthritis in the rabbit knee. Osteoarthritis.Cartilage. 1996; 4:87-98)。簡潔に述べると、内側の関節の切開を行った。膝を完全屈曲させ、膝蓋骨を側方に脱臼させ、ＡＣＬ（前十字靱帯）を切除した。創傷を塞ぎ、局所的な抗菌性軟骨剤によって覆った。全てのウサギは手術後かごに戻され、自由に移動できるようにした。１２ヶ月後、ＡＣＬの切除によって、ＯＡ群（左膝）、ＨＡを伴うＯＡ群（左膝）、ＨＡプラスＭＳＣを伴うＯＡ群（右膝）にＯＡが誘導された。ＡＣＬＴから８週間後、ＨＡ群のＯＡの膝関節に０．４ｍｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）の高分子量ヒアルロン酸（ＨＡ）(Hya-Joint、SciVision Biotech、Taipei)を注射し、一方ＨＡプラスＭＳＣ群のＯＡの膝関節には、１０６個のＳＰＩＯ標識された生きたＭＳＣ（継代数１）を含む０．４ｍｌのＨＡを注射した。ＨＡまたはＨＡプラスＭＳＣ処理後、各群のウサギの半分を６週間後に２０分のＣＯ２吸入によって殺し、半分は１２週間後に殺した。
【００４６】
６．巨視的な調査
【００４７】
大腿骨遠位部と脛骨近位部の表面を露出し、巨視的に調べた。２ｍｌの墨汁を注射器で脛骨プラトー上に注射した。２分後、表面を生理食塩水で洗浄した。脛骨プラトーの染色パターンを巨視的に調べた。
【００４８】
７．組織学的解析
【００４９】
低酸素下で事前調整された細胞の分化能の評価のため、培地から培養液を除去し、細胞をＰＢＳで二回洗浄した。細胞を３．７％パラホルムアルデヒド内で１０分間室温で固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。骨形成培養によって処理された細胞は、骨分化を明らかにするため、アルカリホスファターゼ活性によって染色した。脂肪生成および軟骨形成の培養環境で処理された細胞は、脂肪分化および軟骨分化を示すため、それぞれオイルレッドＯおよびアルシアンブルーで染色した。
【００５０】
ウサギを殺した後、膝を回収し、関節軟骨の付いた大腿顆を収集し、組織学的な標本調製の前に、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した(Tonar Biotech; Taipei)。その後、試料を１０％ギ酸(Sigma)／ＰＢＳ(Gibco/BRL、Grand Island、NY)で脱灰した。脱灰された大腿関節の試料をパラフィンで包埋し、矢状面に４μｍの検鏡試片を調製した。パラフィン包埋された切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した。グルコサミノグルカンはサフラニンＯファストグリーン（０．７５％ヘマトキシリンで対比染色された１％サフラニンＯとその後の１％ファストグリーン; Sigma）で染色し、各脛骨近位部の関節軟骨内における全ておよび赤色で染色された領域をImage-Pro Plus software, version 5.0で測定した。各群における赤色で染色された領域と全ての領域との比（赤色：全体）を計算した。
【００５１】
ＳＰＩＯ標識されたＭＳＣまたはＭＳＣ処理を受けたウサギの膝関節内の鉄粒子の局在を特定するため、プルシアンブルー染色を行った。インビトロでの細胞染色では、ＳＰＩＯ標識された細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄し、４％グルタルアルデヒドで固定し、その後再度洗浄し、２％フェロシアン化カリウムを含む６％塩酸で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞の鉄含量を調べた。生体内細胞トラッキングでは、パラフィン包埋された切片を脱パラフィンし、蒸留水で水和した。その後、切片を等量の１２％塩酸および４％フェロシアン化カリウム(Sigma)に３０分間浸した。切片を蒸留水で３回洗浄後、５分間Nuclear Fast Redで対比染色し、蒸留水で二回すすいだ。
【００５２】
８．免疫組織化学的分析
【００５３】
局在化したＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンを免疫染色した。大腿関節の切片を再水和し、３％過酸化水素(Sigma)で組織内の内在性ペルオキシダーゼをブロックした。ＩＩ型コラーゲンを２．５％ヒアルロニダーゼ(Sigma)および１ｍｇ／ｍＬのプロナーゼを加えたＰＢＳ（ｐＨ７．４；Sigma）内で３７℃、１時間の混合によって賦活化し、一方Ｘ型コラーゲンを０．１ユニット／ｍＬのコンドロイチナーゼＡＢＣによる３７℃、１時間の処理で賦活化し、次に１ｍｇ／ｍＬのペプシン(Sigma)を含むトリス塩酸（ｐＨ３．０、MDBio、Taipei、Taiwan）で３７°Ｃ、１５分処理した。その後切片を１０分間のUltra V block(Thermo Scientific、Fremont、CA)でブロックし、ＩＩ型コラーゲンに対する一次抗体（マウス・モノクローナル抗体）(1:200; CP18; Calbiochem, La Jolla, CA)およびＸ型コラーゲンに対する一次抗体（ラット・ポリクローナル抗体）(1:200; ab58632; Abcam, Cambridge, MA)で３７℃、４時間インキュベートした。ＩＩ型コラーゲンにはビオチン標識された抗マウスのヤギ・イムノグロブリン(Dako, Carpinteria, CA)およびＸ型コラーゲンにはビオチン標識された抗ウサギのヤギ・イムノグロブリン(Biocare Medical, Walnut Creek, CA)、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したストレプトアビジン(Biocare Medical)を用いて、二次抗体を３０分インキュベートした。０．０１％過酸化水素を含む３，３−ジアミノベンジジンを用いた染色は茶色になった。最終的に、切片をヘマトキシリン(Sigma)で対比染色し、顕微鏡で観察した。各大腿骨の関節軟骨内の領域において染色された、全てのＩＩ型およびＸ型コラーゲンを、Image-Pro Plus software, version 5.0を用いて測定した。各動物における染色された領域と全領域との比（染色：全体）を計算した。
【００５４】
９．修正マンキンスコア
【００５５】
膝の関節軟骨の変性の度合いを評価し、修正マンキンスコアを用いて記録した。修正マンキンスコアには４つの変数が含まれる：１つ目、表面（０＝通常、１＝不規則的、２＝細繊維化または液胞、３＝疱疹または腐食）；２つ目、低細胞性（０＝通常、１＝軟骨細胞の少量の減少、２＝軟骨細胞の大きな減少、３＝細胞なし）；３つ目，クローン化（０＝通常、１＝たまに双子、３＝双子または三つ子、３＝多重に入れ子状態の細胞）、そして４つ目、好アルシアン性(alcianophilia)（０＝通常，１＝色の小さな低下、２＝色の大きな低下、３＝色なし）。この評価系では、スコアが高ければ高いほど、ＯＡの度合いが高い。３人の研究者によって、全体の組織学的評価を行った。この分析を行う際、研究者は群の割り当てに目隠しをされていた。
【００５６】
統計解析
【００５７】
全てのデータは平均値と標準偏差（ｓ．ｄ．）で表される。対照群、ＯＡ群、ＨＡを伴うＯＡ群、ＨＡプラスＭＳＣを伴うＯＡ群の中での、病理組織学的な段階の統計学的な比較を、ウィルコクソン検定のようなノンパラメトリック検定を用いて、行った。ｐ値が＜０．０５の場合にその差を有意と見なした。上記の検定はStatistical Package for Social Sciences(version 11.0; SPSS Inc., Chicago, IL)によって行われた。
【００５８】
ＩＩ．結果
【００５９】
１．ウサギの骨髄、低酸素下処理細胞の分化能
【００６０】
低酸素下で事前調整された細胞が、多分化能の能力を持っているかどうかを調べるため、異なる分化培地でこの細胞を培養した。これらのウサギ骨髄細胞は、オイルレッドＯ染色された脂質小胞の細胞内蓄積によって立証された脂肪形成系（図２Ａ）、アリザリンレッドＳによって検定された骨形成系（図２Ｂ）、そしてアルシアンブルー染色によって立証された軟骨形成系（図２Ｃ）、に分化する能力を持っていることが代表的な顕微鏡写真によって示された。
【００６１】
２．ウサギＭＳＣの注射後の大腿骨および脛骨における全体の外観
【００６２】
ＭＳＣの注射後、関節面は、軟骨の剥離、骨棘の形成（アスタリスク）および軟骨下骨の露出を含む、骨関節炎の徴候の減少を示した（図３Ａ）。関節軟骨表面の不規則さを検出するために用いられてきた墨汁染色は、細胞の注射なしの群における脛骨顆上のより多くの亀裂を示し、これらの亀裂は主に関節の内側に局在化した（図３Ｂ）。これらの所見は処理の６週間後および１２週間後の両方で観察された。
【００６３】
３．大腿顆のＨＥおよびサフラニンＯ染色
【００６４】
ウサギの対照研究における、ＯＡの関節および反対側の対照の関節から得られたＨＥ染色された関節軟骨、並びに、ウサギの実験研究における、ＨＡ処理されたＯＡの関節およびＨＡプラスＭＳＣ処理されたＯＡの関節から得られたＨＥ染色された関節軟骨の、代表的な顕微鏡写真を図４Ａに示す。ＡＣＬＴを受けたウサギの膝関節は、表面の不規則性、細繊維化または中裂、細胞型の変化およびtidemarkの完全性の損失を示したが、一方シャム手術を受けた動物の膝関節は、これらのＯＡの描像を欠いた（図４Ａ）。ＭＳＣを注射した群の関節面は、ＯＡおよびＯＡ＋ＨＡ群と比較して、より少ない軟骨の損失および表面の不規則性を示した。これらの所見は関節の内側および外側の区画で共に明白であった（図４Ａ）。
【００６５】
ウサギの対照研究における、ＯＡの関節および反対側の対照実験の関節から得られたサフラニンＯ染色された関節軟骨、並びに、ウサギの実験研究における、ＨＡ処理されたＯＡの関節およびＨＡプラスＭＳＣ処理されたＯＡの関節から得られたサフラニンＯ染色された関節軟骨の、代表的な顕微鏡写真を図４Ｂに示す。サフラニンＯ染色された領域と全ての領域との比（赤色：全体）を測定し、各群の間で比較した（図４Ｃ）。ＡＣＬＴを受けたウサギの膝関節はサフラニンＯ染色の低下を示したが、一方シャム手術を受けた動物の膝関節はこれらのＯＡの描像を欠いた（図４Ａ）。軟骨のサフラニンＯ染色によって、ＯＡおよびＯＡ＋ＨＡの動物でのプロテオグリカンの有意な損失が示された（図４Ｂ）。修正マンキンスコアは、ＯＡおよびＯＡ＋ＨＡの動物と比較して、細胞処理後の有意な改善を示した。ＭＳＣ群は対照の動物と同等のスコアを示した。これらの改善は関節の異なる区画および処理後６週間後と１２週間後で共に一貫性があった（図５）。
【００６６】
４．ＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンの免疫組織化学的染色
【００６７】
四つの群から得られた、免疫組織化学的染色された関節軟骨の代表的な顕微鏡写真を、図６Ａに示す。ＭＳＣ処理後６および１２週目の両方において、ＯＡ群またはＨＡを伴うＯＡ群における免疫局在化したＩＩ型コラーゲンの密度が、ＭＳＣ処理された関節のそれに比べて有意に小さかったことを、相対的な密度を定量化することによる免疫組織化学的分析は示した（図６Ｂ）。
【００６８】
６および１２週目の両方において、免疫局在化したＸ型コラーゲン（茶色に染色）は、ＯＡ群またはＨＡを伴うＯＡ群の関節軟骨細胞内から、支配的に発見された（図７Ａ）。さらに６および１２週目の両方において、免疫局在化したＸ型コラーゲンは、ＨＡのみで処理されたＯＡ群と比較して、ＨＡプラスＭＳＣで処理されたＯＡ群の軟骨内では、あまり明白ではなかった（図７Ａ）。免疫局在化したＸ型コラーゲンの減少において、ＨＡのみと比較して、ＨＡプラスＭＳＣの有意な効果を、これらのデータは立証する。ＭＳＣ処理群と比較して、ＯＡおよびＯＡ＋ＨＡ群におけるＸ型コラーゲンのための未熟軟骨細胞染色の有意な増加もまた認められた（図７Ｂ）。共に、これらのデータはＸ型コラーゲンの生成に対する、ＭＳＣによる抑制効果を示唆した。
【００６９】
５．低酸素下で事前調整され、注射されたＭＳＣのプルシアンブルー染色
【００７０】
インビトロでの細胞培養におけるプルシアンブルー染色によって、間葉幹細胞内へのＳＰＩＯナノ粒子の高効率でのエンドサイトーシスが示された（図８Ａ）。動物内では、膝関節の至る所で、少量の散らばったＳＰＩＯ標識された細胞が同定された。これらの注射されたＭＳＣはプルシアンブルー染色によって同定され、大腿骨（図８Ｂ）、脛骨（図８Ｃ）および半月板（図８Ｄ）の軟骨内に局在化していた。これらの所見は、注射の１２週間後、ＳＰＩＯ標識された細胞が軟骨の表面に移動し、関節の異なる部位へ散らばることを示唆した。
【００７１】
上記の例によって、低酸素下培養ＭＳＣを含む構成物の投与を通して、関節面から軟骨の剥離、骨棘の形成、軟骨下骨の露出が減少したことが証明された。対象の軟骨内のプロテオグリカンの減少もまた改善された。さらに、低酸素下培養ＭＳＣを含む構成物の投与を通して、対象の軟骨内のＩＩ型コラーゲンの生成が増加し、対象の軟骨内のＸ型コラーゲンの生成が抑制された。
【００７２】
本発明の関連する分野の通常の知識を有する者は、本明細書の記述に基づいて、さらなる説明を必要とせずに、本発明を最も広い範囲で利用できると信じられる。従って、提供された明細書および請求項は、本発明の範囲を何らかの点で制限するのではなく、説明のためのものとして理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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