(57)【要約】  サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、以下の順序で以下の工程：ａ）第１の検出タグを用いて第１の分析物にタグ付けするために、第１の分析物に第１の検出抗体をコンジュゲートする工程；ｂ）第１の分析物を捕捉しかつサンプルから第１の分析物を完全に枯渇させるために、第１の分析物に第１の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；ｃ）第２の検出タグを用いて第２の分析物にタグ付けするために、枯渇させたサンプル中の第２の分析物に第２の検出抗体をコンジュゲートする工程；ｄ）サンプルから第２の分析物を捕捉するために、第２の分析物に第２の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；ｅ）第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体の部位それぞれにおいて第１の検出タグおよび第２の検出タグの存在または不在を検出し、それにより、サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出する工程を含むサブトラクティブイムノアッセイを含んでなる。
2018533021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、以下の順序で以下の工程：
ａ）第１の検出タグを用いて第１の分析物にタグ付けするために、第１の分析物に第１の検出抗体をコンジュゲートする工程；
ｂ）第１の分析物を捕捉し、かつサンプルから第１の分析物を完全に枯渇させるために、第１の分析物に第１の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；
ｃ）第２の検出タグを用いて第２の分析物にタグ付けするために、前記枯渇させたサンプル中の第２の分析物に第２の検出抗体をコンジュゲートする工程；
ｄ）前記サンプルから第２の分析物を捕捉するために、第２の分析物に第２の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；
ｅ）前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体の部位それぞれにおいて前記第１の検出タグおよび前記第２の検出タグの存在または不在を検出し、それにより、前記サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出する工程
を含むイムノアッセイを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記第１の検出抗体および前記第２の検出抗体が、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第１の検出抗体および第２の検出抗体であり、かつ、前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体が、基体上の所定の部位に固定された固定化された第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の捕捉抗体の濃度が前記第１の検出抗体の濃度以上であり、好ましくは、１：１〜５：１の間、より好ましくは、１．５：１〜３：１の間の比にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド（３）、第１のコンジュゲーションパッド（１０）、少なくとも１本の第１のテストライン（１１）および任意選択により少なくとも１本の第１のコントロールライン（１２）を有するニトロセルロースメンブレン（４）、第２のコンジュゲーションパッド（２０）、少なくとも１本の第２のテストライン（２１）および任意選択により少なくとも１本の第２のコントロールライン（２２）を有するニトロセルロースメンブレン（４’）、ならびに吸収パッド（５）を含んでなるラテラルフローアッセイストリップ（１）を用いたラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイであり；
その第１のコンジュゲーションパッド（１０）が、前記第１の検出抗体を含有し、その第１のテストライン（１１）が、前記第１の捕捉抗体によって形成され、その第２のコンジュゲーションパッド（２０）が、前記第２の検出抗体を含有し、かつ、その第２のテストライン（２１）が、前記第２の捕捉抗体によって形成され、その任意選択の少なくとも１本の第１のコントロールライン（１２）が、前記第１の検出抗体に特異的に結合する第１の対照抗体を含有し、その任意選択の少なくとも１本の第２のコントロールライン（２２）が、前記第２の検出抗体に特異的に結合する第２の対照抗体を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の分析物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であり、かつ、前記第２の分析物が、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の検出抗体および前記第１の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）の異なるエピトープに特異的であり；かつ、前記第２の検出抗体および前記第２の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）の異なるエピトープに特異的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、生物試料、環境試料または食品試料から採取される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイを実施する前に、前記サンプルが、ＩｇＧ抗体コーティングされた磁性ビーズを用いて、黄色ブドウ球菌を単離濃縮することによって前処理され、前記ＩｇＧ抗体が、そのＦａｂ領域で磁性ビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと特異的に相互作用するように、そのＦｃ領域は使われていない状態である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１の分析物および第２の分析物を検出するために、請求項１〜８のいずれか一項に記載のイムノアッセイを実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップであって、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド（３）、第１のコンジュゲーションパッド（１０）、少なくとも１本の第１のテストライン（１１）および任意選択により少なくとも１本の第１のコントロールライン（１２）を有するニトロセルロースメンブレン（４）、第２のコンジュゲーションパッド（２０）、少なくとも１本の第２のテストライン（２１）および任意選択により少なくとも１本の第２のコントロールライン（２２）を有するニトロセルロースメンブレン（４’）、ならびに吸収パッド（５）を含んでなり；
前記第１のコンジュゲーションパッド（１０）が、第１の検出タグを用いて前記第１の分析物にタグ付けするために、前記第１の分析物に対する第１の検出抗体を含有し；
前記第１のテストライン（１１）が、前記第１の分析物を捕捉しかつ前記サンプルからその第１の分析物を完全に枯渇させるために、前記第１の分析物に対する第１の捕捉抗体によって形成され；
前記第２のコンジュゲーションパッド（２０）が、第２の検出タグを用いて前記第２の分析物にタグ付けするために、該枯渇させた前記サンプル中の前記第２の分析物に対する第２の検出抗体を含有し；
前記第２のテストライン（２１）が、前記サンプルから前記第２の分析物を捕捉するために、前記第２の分析物に対する第２の捕捉抗体によって形成され；
前記任意選択の少なくとも１本の第１のコントロールライン（１２）が、前記第１の検出抗体に特異的に結合する第１の対照抗体を含有し；
前記任意選択の少なくとも１本の第２のコントロールライン（２２）が、前記第２の検出抗体に特異的に結合する第２の対照抗体を含有する、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
【請求項１０】
前記第１の検出抗体および前記第２の検出抗体が、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第１の検出抗体および第２の検出抗体であり、前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体が、前記第１のテストラインおよび前記第２のテストライン（１１、２１）の部位に固定された固定化された第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体であり、かつ、前記任意選択の第１のコントロールラインおよび第２のコントロールライン（１２、２２）の抗体が、前記第１のコントロールラインおよび前記第２のコントロールライン（１２、２２）の部位に固定されている、請求項９に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
【請求項１１】
前記第１の分析物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であり、かつ、前記第２の分析物が、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）である、請求項９または１０に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
【請求項１２】
前記第１の検出抗体および前記第１の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）の異なるエピトープに特異的であり；かつ、前記第２の検出抗体および前記第２の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）の異なるエピトープに特異的である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
【請求項１３】
第１のコンジュゲーションパッド（１０）および第１のテストライン（１１）の少なくとも１つのさらなるセットが、第１のコンジュゲーションゾーン（１０）および第１のテストライン（１１）の第１のセットに続く、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
【請求項１４】
サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するためのキットであって、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップを含んでなる、キット。
【請求項１５】
以下：
スワブからサンプルを溶出するための薬剤を含んでなる、患者からサンプルを採取するためのスワブ；
サンプル中の黄色ブドウ球菌の不在または存在を検出するためのＥｂｆイムノクロマトグラフィーディップスティック；
黄色ブドウ球菌を単離濃縮するためのＩｇＧ抗体コーティングされた磁性ビーズであって、前記ＩｇＧ抗体は、そのＦａｂ領域で磁性ビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと特異的に相互作用するように、そのＦｃ領域は使われていない状態であり；洗浄工程および磁性ビーズからの黄色ブドウ球菌の溶出のための薬剤を含んでなる、磁性ビーズ；および
黄色ブドウ球菌の固定化および透過処理のための薬剤
の少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、イムノアッセイを含んでなる方法に関する。本発明はさらに、前記イムノアッセイを実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップおよび前記方法を用いて第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するためのキットを指す。
【背景技術】
【０００２】
術後の創傷感染を含む多くの院内感染は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus (S.aureus))による鼻咽頭定着に起因する。鼻腔内定着率は非常に高く、患者３人に１人は陽性である（参考文献１、参考文献２、参考文献３）。術後の感染および定着は、黄色ブドウ球菌の術前検出および抗生物質治療により、予防することができる。抗生物質耐性について鼻腔内サンプルを分析するための現在のスクリーニング法は、結果を出すのに比較的長い時間を要する。多くの場合、医師はその結果なしに治療の決定を下さなければならず、効果のない広域抗生物質の使用、または抗生物質の過剰使用、および除菌失敗のリスクが高くなる。従って、鼻腔内サンプル中の黄色ブドウ球菌をスクリーニングするための迅速な検査は、外科手術の設定において緊急に必要とされる（参考文献４、参考文献５、参考文献６）。
【０００３】
これまでのところ、黄色ブドウ球菌の検出のための複数のアッセイが利用可能である。これらの検査は、主に、抗体またはＰＣＲに基づいている。また、アプタマーのような特殊な試薬を用いて新しい技術も開発されている。これらの検査により、黄色ブドウ球菌の同定、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)（ＭＲＳＡ）、またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus)（ＭＳＳＡ）のさらなる同定が可能になる、すなわち、これらの検査は、均一ＭＲＳＡ集団から、またはＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合集団からＭＲＳＡを検出するように、また、均一ＭＳＳＡ集団からＭＳＳＡを検出するようにも設計される。
【０００４】
しかしながら、ＭＲＳＡとＭＳＳＡとの間の唯一の明確な区別は、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）およびＭＲＳＡに見出されるそのコード遺伝子ｍｅｃ  Ａの存在であり、他の総ての成分は両方に共通している。ＭＳＳＡには固有の抗原／エピトープは存在しない。従って、ＭＲＳＡに結合しない、ＭＳＳＡに特有の抗体は存在しない。第１の分析物（例えば、ＭＲＳＡ）に対してのみ固有の抗原／エピトープを有するが第２の分析物（例えば、ＭＳＳＡ）に対してはないというこの問題は、他の細菌についても存在する。例は、単一株の抗生物質感受性細菌および抗生物質耐性細菌の潜在的に混在する集団からの、他の抗生物質耐性細菌、例えば、テトラサイクリン耐性または関連性の高いカルバペネマーゼ（例えば、ＮＤＭ、ＫＰＣ−２）および基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）の検出、例えば、尿路病原性大腸菌(Escherichia coli (E,coli))のＩＩＩ型分泌装置（ＴＴＳＳ）または腎盂腎炎関連線毛（ｐ線毛）を介した、単一株の病原性細菌および非病原性細菌の潜在的に混在する集団からのグラム陰性細菌性病原体の検出であり得る。
【０００５】
黄色ブドウ球菌プロテインＡ遺伝子(ｓｐａ)タイピングおよびヌクレオチドに基づく多型の相違は、ＭＲＳＡとＭＳＳＡとの間に存在するが、これらは必ずしも排他的ではなく、ｓｐａ遺伝子の広範な多様性のためにそれらをＭＲＳＡおよびＭＳＳＡのルーチン分析への使用するのは困難である。
【０００６】
従って、ＭＲＳＡ株およびＭＳＳＡ株の混合集団中のＭＲＳＡおよびＭＳＳＡを同時に同定するためのポイントオブケア(point of care)検査は存在しない。現在のところ、これは、異なるタグ、例えば、ＰＢＰ２ａおよびＰＢＰ２についての２つの異なる蛍光色素タグを用いて混合集団を抗体またはアプタマーに基づき染色し、続いて、顕微鏡下で目視検査を行って、両方のタグを有する細胞、すなわち、ＭＲＳＡと、単一のタグを有する細胞、すなわち、ＭＳＳＡとを区別することによってのみ可能である。
【０００７】
ＭＲＳＡのストリップに基づくイムノクロマトグラフィー検出（ラテラルフローイムノクロマトグラフィーとも呼ばれる）は、例えば、ＥＰ１９７０７０６から知られており、遊離ＰＢＰ２ａタンパク質（抽出後）の検出（参考文献１４）または全細胞での検出（参考文献７）のいずれかによる。ＵＳ８６７９８１２には、細胞から抗原を抽出することによってＰＢＰ２およびＰＢＰ２ａ抗原を含む複数の抗原またはタンパク質を評価するための２−Ｄ抗体アレイが記載されている。しかしながら、これらの検出アッセイの総ては、黄色ブドウ球菌混合集団におけるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの同時検出を可能にしない。
【０００８】
特定のコード遺伝子のＰＣＲなどの他の方法、またはＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方を検出する生化学的検査が知られている。しかしながら、高性能の実験室設備が必要なため、これらの検査は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断としての役割を果たさない。また、結果を出すのに数時間から数日かかる。
【０００９】
また、ＭＲＳＡをＰＢＰ２およびＰＢＰ２ａコード遺伝子に対して二重陽性としておよびＭＳＳＡをＰＢＰ２コード遺伝子に対して単一陽性として検出することが知られている蛍光色素タグ付け核酸ハイブリダイゼーション方法もある（参考文献８）。この検査では、暗室内で蛍光顕微鏡およびデジタルカメラが必要であり、この点でも、ケアの現場（ポイントオブケア）に適用されない。
【００１０】
これらの既知の方法の大部分はまた、アッセイ実施前に患者サンプルからの黄色ブドウ球菌の培養を必要とする。これには多くの時間が必要であり、一晩かかることが多い。
【００１１】
全体として、ポイントオブケア診断に好適な−鼻腔内定着において一般的に報告されている−黄色ブドウ球菌の混合集団におけるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方の迅速同定の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、サンプル中の２つの分析物（例えば、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）の迅速かつ同時の検出のためのイムノアッセイを提供することであり、また、第１の分析物の存在下で第２の分析物を容易に区別することができないように、それらのうちの１つ（例えば、ＭＲＳＡ）に対してのみに固有の抗原／エピトープが存在する場合にも同様である。
【００１３】
本発明の別の目的は、生物試料、環境試料または食品試料から直接採取されたサンプルからの黄色ブドウ球菌の迅速な単離濃縮のための方法を提供することである。
【００１４】
これらの目的の少なくとも１つは、請求項１に記載の方法、請求項８に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイストリップおよび請求項１２に記載のキットによって達成される。従って、サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するための方法は、以下の順序で以下の工程：（ａ）第１の検出タグを用いて第１の分析物にタグ付けするために、第１の分析物に第１の検出抗体をコンジュゲートする工程；（ｂ）第１の分析物を捕捉しかつサンプルから第１の分析物を完全に枯渇させるために、第１の分析物に第１の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；（ｃ）第２の検出タグを用いて第２の分析物にタグ付けするために、枯渇させたサンプル中の第２の分析物に第２の検出抗体をコンジュゲートする工程；（ｄ）前記サンプルから第２の分析物を捕捉するために、第２の分析物に第２の捕捉抗体をコンジュゲートする工程；（ｅ）前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体の部位それぞれにおいて前記第１の検出タグおよび前記第２の検出タグの存在または不在を検出し、それにより、前記サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出する工程を含むイムノアッセイを含んでなる。前記第１の検出抗体および前記第１の捕捉抗体は、前記第１の分析物の異なるエピトープに特異的であり、かつ、前記第２の検出抗体および前記第２の捕捉抗体は、前記第２の分析物の異なるエピトープに特異的である。前記第１の検出抗体および前記第２の検出抗体は、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第１の検出抗体および第２の検出抗体であり得、かつ、前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体は、基体上の所定の部位に固定された固定化された第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体であり得る。
【００１５】
言い換えれば、サブトラクティブイムノアッセイとも呼ばれる、本発明のイムノアッセイは、以下のように作業する：第１の工程では、サンプルを、第１の分析物の第１の検出エピトープに特異的な、遊離した第１の検出抗体と接触させ、その第１の検出抗体は、第１の検出タグ（例えば、ＡｕＮｐ）で標識されている。第１の分析物がサンプル中に存在する場合、それは、第１の検出抗体とコンジュゲートし、それにより、第１の検出タグでマーキングされる。第２の工程では、固定化された第１の捕捉抗体を使用して、第１の分析物の第１の捕捉エピトープとコンジュゲートし、その第１の捕捉エピトープは、第１の検出エピトープとは異なる。それにより、サンプル中に存在する場合に、第１の検出抗体とコンジュゲートした第１の分析物は、第１の捕捉抗体の部位に固定され、サンプルから完全に枯渇させることができる。第１の分析物とコンジュゲートした第１の検出タグの存在または不在は、続いて、第１の分析物の存在または不在を決定するために、第１の捕捉抗体の固定化部位で検出することができる。第３の工程では、第１の分析物を枯渇させたサンプルを、第２の分析物の第２の検出エピトープに特異的な、遊離した第２の検出抗体と接触させ、その第２の検出抗体は、第２の検出タグ（例えば、ＡｕＮｐ）で標識されている。第２の分析物がサンプル中に存在する場合、それは、第２の検出抗体とコンジュゲートし、それにより、第２の検出タグでマーキングされる。第４の工程では、固定された第２の捕捉抗体を使用して、第２の分析物の第２の捕捉エピトープとコンジュゲートし、その第２の捕捉エピトープは、第２の検出エピトープとは異なる。それにより、サンプル中に存在する場合に、第２の検出抗体とコンジュゲートした第２の分析物は、第２の捕捉抗体の部位に固定される。第２の分析物とコンジュゲートした第２の検出タグの存在または不在は、続いて、第２の分析物の存在または不在を決定するために、第２の捕捉抗体の固定化部位で検出することができる。
【００１６】
このサブトラクティブイムノアッセイは、例えば、ポイントオブケア方式でのＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの検出に好適である。これは迅速で簡単であり、肉眼による検出が可能であり得る。
【００１７】
このサブトラクティブイムノアッセイは、混合集団内の「追加の」抗原／エピトープを有する細胞の亜集団および「追加の」分子を有さない同一細胞の亜集団（すなわち、後者の細胞亜集団は総ての抗原／エピトープを前者と共有するが、「追加の」抗原／エピトープのみ欠いている）を同定するのに好適である。例は以下である：タンパク質サンプル中の翻訳後タンパク質修飾変異体（例えば、グリコシル化、リン酸化、Ｓ−ニトロシル化、Ｎ−アセチル化、メチル化、脂質化、タンパク質分解）の検出；単一株の抗生物質感受性細菌および抗生物質耐性細菌の潜在的に混在する集団からの、他の抗生物質耐性細菌、例えば、テトラサイクリン耐性または関連性の高いカルバペネマーゼ（例えば、ＮＤＭ、ＫＰＣ−２）および基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）の検出；例えば、尿路病原性大腸菌のＩＩＩ型分泌装置（ＴＴＳＳ）または腎盂腎炎関連線毛（ｐ線毛）を介した、単一株の病原性細菌および非病原性細菌の潜在的に混在する集団からのグラム陰性細菌性病原体の検出。
【００１８】
一般的に、第１の捕捉抗体の量は、サンプルから第１の分析物を十分に枯渇させるように調節される。その量は、第１の分析物および／または第２の分析物の性質に依存する。いくつかの実施態様では、前記第１の捕捉抗体の濃度は、前記第１の検出抗体の濃度以上であり得、好ましくは、１：１〜５：１の間、より好ましくは、１．５：１〜３：１の間の比にあり得る。検出抗体よりもわずかに多い捕捉抗体を使用することにより、検出抗体でタグ付けされた第１の分析物総てが第１の捕捉抗体によりサンプルから枯渇されることが保証される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施態様では、前記サブトラクティブイムノアッセイは、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド、第１のコンジュゲーションパッド、少なくとも１本の第１のテストラインおよび任意選択により少なくとも１本の第１のコントロールラインを有するニトロセルロースメンブレン、第２のコンジュゲーションパッド、少なくとも１本の第２のテストラインおよび任意選択により少なくとも１本の第２のコントロールラインを有するニトロセルロースメンブレン、ならびに吸収パッドを含んでなるラテラルフローアッセイストリップを用いたラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイであり得；その第１のコンジュゲーションパッドは、前記第１の検出抗体を含有し、その第１のテストラインは、前記第１の捕捉抗体によって形成され、その第２のコンジュゲーションパッドは、前記第２の検出抗体を含有し、かつ、その第２のテストラインは、前記第２の捕捉抗体によって形成され得る。その任意選択の少なくとも１本の第１のコントロールラインは、前記第１の検出抗体に特異的に結合する第１の対照抗体を含有する。その任意選択の少なくとも１本の第２のコントロールラインは、前記第２の検出抗体に特異的に結合する第２の対照抗体を含有する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施態様では、前記アッセイストリップは、２本以上の第１のテストラインを順次に含んでなり得、サンプルが前記第２のコンジュゲーションパッドに移動する前に、第１の分析物総てがサンプルから除去／枯渇されることが保証される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施態様では、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの少なくとも１つのさらなるセットは、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの第１のセットに続き得る。第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインのさらなるセットにより、第１のコンジュゲーションゾーンにおける第１の分析物を伴う第１の検出抗体の起こり得る望まれない飽和からのこれまで検出されなかった遊離した第１の分析物が検出される場合がある。第１の分析物を伴う第１の検出抗体の飽和が起こらずかつ第１のセットの第１のテストライン内で総ての第１の分析物が枯渇される（第１の捕捉抗体の飽和なし）場合、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインのさらなるセットの第１のテストラインは陰性である。さらなるセットの第１のテストラインが陽性である場合、第１の検出抗体または第１の捕捉抗体のいずれかは第１の分析物で飽和しており、このアッセイを、希釈された患者サンプルで繰り返す必要がある。第１のコントロールラインは、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの少なくとも１つのさらなるセットに続き得る。
【００２２】
本発明のいくつかの実施態様では、前記第１の分析物はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であり、かつ、前記第２の分析物は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施態様では、前記第１の検出抗体および前記第１の捕捉抗体は、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）の異なるエピトープに特異的であり；かつ、前記第２の検出抗体および前記第２の捕捉抗体は、ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）の異なるエピトープに特異的である。
【００２４】
ＰＢＰ２ａによるＭＲＳＡ検出は容易であるが、黄色ブドウ球菌の混合集団では、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方がＰＢＰ２（およびＭＳＳＡについて公開されている総てのマーカー）を含むため、ＭＳＳＡ検出は不可能である。本明細書に記載のサブトラクティブイムノアッセイの原理は、ＭＲＳＡ検出後、ＭＲＳＡに関連する総てのＰＢＰ２をこのイムノアッセイの最初のパートで枯渇させ、ＭＳＳＡのみに関連するＰＢＰ２の連続的検出を可能にすることである。両方の工程は、単一のイムノクロマトグラフィーアッセイストリップを用いて実施される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施態様では、前記サンプルは、生物試料、環境試料または食品試料から採取される。この採取は、鼻腔スワブ、例えば、Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ製のＥＳｗａｂを用いて実施され得る。
【００２６】
本発明のいくつかの実施態様では、鼻腔スワブからの溶出液を、Ｅｂｆイムノクロマトグラフィーディップスティックを用いて黄色ブドウ球菌の存在について試験することができる。Ｅｂｆの病原性／侵襲性黄色ブドウ球菌における高度に保存された性質および構成的発現は、病原体の検出に好適なマーカーとなる。細胞外培地へのその分泌は、細菌のいかなる処理も行わず、細菌のいかなる損失もなく、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）ラテラルフロー検出に容易に受け入れられることとなる。
【００２７】
ポイントオブケア方式で混合集団中のＭＲＳＡおよびＭＳＳＡを同時に検出するための方法の実施態様では、Ｅｂｆイムノクロマトグラフィーディップスティックを、患者から採取した鼻腔スワブ溶出液に挿入し得、一度テストゾーン内で赤色が発色したら、黄色ブドウ球菌の存在が陽性であることを示すことが読み取られる。次に、ハンドヘルド比色測定装置を用いて細菌濃度を測定し得る。一度黄色ブドウ球菌が検出されると、それは、プロテインＬ結合超常磁性ビーズ上に捕捉され、ＰＢＰ２ａ／ＰＢＰイムノクロマトグラフィーストリップ上でＭＲＳＡおよびＭＳＳＡについて試験され得る。ＭＲＳＡは、最初に検出され、前記ストリップのＰＢＰ２ａテスト／捕捉ライン内でサンプル液から枯渇される。実際には、テストラインでは、コンジュゲートパッド中の検出抗体を初期に可溶化し、その検出試薬をテストラインに運んだ分析物粒子の数だけが読み取られる。テストラインでは、サンプルパッドに吸収された分析物粒子の数は検出されない。従って、コンジュゲートパッド中の検出抗体が飽和しない範囲でサンプルをアッセイすることは非常に重要である。これらの条件下では、テストライン通過後、前方へ進むサンプルは、ＭＲＳＡ細胞を含有しないが、ＭＳＳＡ細胞のみ含有する。タグ付き抗ＰＢＰ２検出抗体（例えば、ＡｕＮｐタグ付き）を含有する第２のコンジュゲーションパッドは、ＭＳＳＡ細胞を受けるように前記ストリップ上に配置され、任意のＭＳＳＡ−抗ＰＢＰ２−ＡｕＮｐ複合体は、ＰＢＰ２テストラインで赤色のライン（ＡｕＮｐタグ使用の場合）として検出され、さらに比色分析によって定量される。
【００２８】
前記検出方法の感度を高めるために、本発明のいくつかの実施態様では、鼻腔スワブまたは任意の他のサンプルからの溶出液を、磁性または常磁性ビーズを用いることによる黄色ブドウ球菌の単離濃縮工程に供し得る。この工程は実際のサブトラクティブイムノアッセイの前に実施される。従って、磁性または常磁性ビーズをＩｇＧ抗体でコーティングし得、このＩｇＧ抗体は、そのＦａｂ領域でそのビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと特異的に相互作用するように、そのＦｃ領域は使われていない状態である。
【００２９】
単離は、ＩｇＧ抗体に対するプロテインＡの天然親和性に基づく濃縮工程である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌表面上に発現され、非常に高い親和性を有する、封入された黄色ブドウ球菌の場合でさえ、ＩｇＧ分子のＦｃ領域によって接近可能でありかつ結合される。結合速度は非常に速い（参考文献１０）。好ましくは、前記ＩｇＧはヒトＩｇＧであり、この理由は、それがプロテインＡによる最も強い結合を示すためである。所与のサンプル、例えば、鼻腔スワブ溶出液では、いずれの黄色ブドウ球菌も前記ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に捕捉される。
【００３０】
プレブロックされたプロテインＬ結合磁性または常磁性ビーズを使用し得、この場合、プロテインＬはこれらのビーズに化学的に架橋されている。ＩｇＧ抗体は、そのＦａｂ領域およびプロテインＬを介して磁性ビーズにコンジュゲートし得る。このＩｇＧ抗体は、続いて、その後工程での浸出を回避するためにこのビーズ上のプロテインＬに架橋される。
【００３１】
所与のサンプル中の黄色ブドウ球菌を単離濃縮するための方法は、処理されたサンプルのさらなる使用とは独立した別個の発明であり得ることは理解される。サンプル、例えば、生物試料、環境試料または食品試料から採取されたサンプル中の黄色ブドウ球菌を単離濃縮するための方法は、ＩｇＧ抗体コーティングされたビーズ、好ましくは、磁性ビーズを使用し、前記ＩｇＧ抗体は、そのＦａｂ領域でそのビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと特異的に相互作用するように、そのＦｃ領域は使われていない状態である。
【００３２】
黄色ブドウ球菌特異的マーカーＰＢＰ２およびＭＲＳＡ特異的マーカーＰＢＰ２ａの検出のために、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）ペーパーストリップを使用し得る。報告されている研究では、ＩＣＡは、１ｎｇのＰＢＰ２ａを肉眼で検出することができた（参考文献１４）。別の研究では、黄色ブドウ球菌の全細胞が肉眼で５００〜５０００ＣＦＵ／ｍｌ検出された（参考文献１７）。
【００３３】
ＩｇＧ結合磁性または常磁性ビーズを用いて黄色ブドウ球菌を単離濃縮するための方法は、濃縮前の臨床サンプルに対して＜５００ＣＦＵ／ｍｌまで次のイムノアッセイの感度を増大させ得る。
【００３４】
実施態様のいくつかでは、比色計、好ましくは、ハンドヘルド比色計をＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの定量分析のために使用し得る。
【００３５】
本発明はさらに、第１の分析物および第２の分析物を検出するために、前記サブトラクティブイムノアッセイを実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイストリップであって、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド、第１のコンジュゲーションパッド、少なくとも１本の第１のテストラインおよび任意選択により少なくとも１本の第１のコントロールラインを有するニトロセルロースメンブレン、第２のコンジュゲーションパッド、少なくとも１本の第２のテストラインおよび任意選択により少なくとも１本の第２のコントロールラインを有するニトロセルロースメンブレン、ならびに吸収パッドを含んでなるストリップに関する。前記第１のコンジュゲーションパッドは、第１の検出タグを用いて前記第１の分析物にタグ付けするために、前記第１の分析物に対する第１の検出抗体を含有する。前記第１のテストラインは、前記第１の分析物を捕捉しかつ前記サンプルからその第１の分析物を完全に枯渇させるために、前記第１の分析物に対する第１の捕捉抗体によって形成される。前記第２のコンジュゲーションパッドは、第２の検出タグを用いて前記第２の分析物にタグ付けするために、枯渇させた前記サンプル中の前記第２の分析物に対する第２の検出抗体を含有する。前記第２のテストラインは、前記サンプルから前記第２の分析物を捕捉するために、前記第２の分析物に対する第２の捕捉抗体によって形成される。前記任意選択の少なくとも１本の第１のコントロールラインは、前記第１の検出抗体に特異的に結合する第１の対照抗体を含有する。前記任意選択の少なくとも１本の第２のコントロールラインは、前記第２の検出抗体に特異的に結合する第２の対照抗体を含有する。
【００３６】
本発明のいくつかの実施態様では、前記第１の検出抗体および前記第２の検出抗体は、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第１の検出抗体および第２の検出抗体であり、前記第１の捕捉抗体および前記第２の捕捉抗体は、前記第１のテストラインおよび前記第２のテストラインの部位に固定された固定化された第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体であり、かつ、前記任意選択の第１のコントロールラインおよび第２のコントロールラインの抗体は、前記第１のコントロールラインおよび前記第２のコントロールラインの部位に固定されている。
【００３７】
本発明のいくつかの実施態様では、前記アッセイストリップは、２本以上の第１のテストラインを順次に含んでなり得、サンプルが前記第２のコンジュゲーションパッドに移動する前に、第１の分析物総てがサンプルから除去／枯渇されることが保証される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施態様では、前記アッセイストリップは、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの第１のセットに続いて、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの少なくとも１つのさらなるセットを含んでなり得る。第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインのさらなるセットにより、第１のコンジュゲーションゾーンにおける第１の分析物を伴う第１の検出抗体の起こり得る望まれない飽和からのこれまで検出されなかった遊離した第１の分析物が検出される場合がある。第１の分析物を伴う第１の検出抗体の飽和が起こらずかつ第１のセットの第１のテストライン内で総ての第１の分析物が枯渇される（第１の捕捉抗体の飽和なし）場合、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインのさらなるセットの第１のテストラインは陰性である。さらなるセットの第１のテストラインが陽性である場合、第１の検出抗体または第１の捕捉抗体のいずれかは第１の分析物で飽和しており、このアッセイを、希釈された患者サンプルで繰り返す必要がある。第１のコントロールラインは、第１のコンジュゲーションゾーンおよび第１のテストラインの少なくとも１つのさらなるセットに続き得る。
【００３９】
本発明の実施態様のいくつかでは、前記第１の分析物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であり、前記第２の分析物は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）である。
【００４０】
立体障害を防ぐために、前記第１の検出抗体および前記第１の捕捉抗体は、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）の異なるエピトープに特異的であり得；かつ、前記第２の検出抗体および前記第２の捕捉抗体は、ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）の異なるエピトープに特異的であり得る。
【００４１】
本発明はさらに、上記のように、サンプル中の第１の分析物および第２の分析物の存在または不在を検出するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップを含んでなるキットに関する。このキットは、以下の少なくとも１つをさらに含んでなり得る：（ｉ）スワブからサンプルを溶出するための薬剤を含む、患者からサンプルを採取するためのスワブ；（ｉｉ）サンプル中の黄色ブドウ球菌の不在または存在を検出するためのＥｂｆイムノクロマトグラフィーディップスティック；（ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌を単離濃縮するためのＩｇＧ抗体コーティングされた磁性ビーズであって、前記ＩｇＧ抗体は、そのＦａｂ領域で磁性ビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと特異的に相互作用するように、そのＦｃ領域は使われていない状態であり；洗浄工程および磁性ビーズからの黄色ブドウ球菌の溶出のための薬剤を含む、磁性ビーズ；および（ｉｖ）黄色ブドウ球菌の透過処理のための薬剤。
【００４２】
本発明の上記実施態様に記載のサブトラクティブイムノアッセイおよびキットは、以下の理由により、ケアの現場（ポイントオブケア）で使用することができる：
−これは、携帯型比色計を保存する機器を必要としない簡単なイムノクロマトグラフィーアッセイ形式である。唯一の操作は、サンプル中の黄色ブドウ球菌の磁性ビーズに基づく濃縮ならびに任意選択の固定化および／または透過処理であり、これらの操作は、磁性または常磁性ビーズ、外部磁石、ピペット、数種のバッファー、固定剤および透過処理剤を必要とする。これらのパーツは総て、上記のイムノアッセイを実施するためにキットに含まれ得る。
−携帯型比色計による定量が可能である。
−イムノクロマトグラフィーアッセイを用いたサンプリングは、５０マイクロリットルの液体しか必要とせず、黄色ブドウ球菌数（ＣＦＵ−コロニー形成単位）が非常に少ない可能性があるサンプルの不必要な希釈を防ぐ少量でのサンプル処理が可能である。磁性または常磁性ビーズを用いた細菌の濃縮は、前記アッセイの感度を増大させる可能性が高い。提案されたアッセイは、感度５００ＣＦＵ／ｍｌ、実際には、２５ＣＦＵ／ストリップ（ストリップに適用された５０マイクロリットル中）でのイムノクロマトグラフィーアッセイ形式に基づいている。従って、前記濃縮工程は、＜５００ＣＦＵ／ｍｌまで前記アッセイの感度を増大させることができる。
−全アッセイ期間は１時間を越えない。最終的な検出および定量までのスワブを得るアッセイ時間形態は、３５分〜５４分の間であり、洗浄および処理に６分であると推定される。サンプル溶出１〜２分、Ｅｂｆ（黄色ブドウ球菌−ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方）の検出５分、黄色ブドウ球菌の固定化２０分、生物の透過処理１分、黄色ブドウ球菌の捕捉１〜２分、捕捉磁石からの黄色ブドウ球菌の溶出４分、ＰＢＰ２ａ（ＭＲＳＡ）およびＰＢＰ２（ＭＳＳＡ）の検出５〜２０分。合計時間＝３４分〜５４分。処理／ＰＢＳ洗浄は６分を超えてはならない。
−記載されたアッセイは、黄色ブドウ球菌の肉眼による検出を可能にする。
−混合集団におけるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの同時同定が可能である。
【００４３】
図面に示されている実施態様を参照して、本発明をより詳細に以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイストリップの概略図を示す；
【図２】図２は、図１のアッセイストリップの可能性のある読み出しを示す。
【発明の具体的説明】
【００４５】
以下では、黄色ブドウ球菌の同定ならびに耐性株および感受性株の両方の混合物を含有する鼻腔スワブからのＭＲＳＡ株およびＭＳＳＡ株の両方の同定を可能にするイムノアッセイプロセスを記載する。以下に記載するサブトラクティブイムノアッセイは、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡとは異なる他の分析物に対しても使用することができ、３つ以上の別個の分析物にアップスケールすることもできることは理解される。このサブトラクティブイムノアッセイは、２つの分析物のうちの１つに対してのみ固有の抗原／エピトープが存在し、これは、第２の分析物には存在せず、他の抗原／エピトープが総て同一である場合に特に有用である。
【００４６】
本明細書に記載のイムノアッセイでは、４つのマーカーを使用する：（ｉ）サンプル（例えば、スワブ溶出液）中の黄色ブドウ球菌の初期検出のための細胞外因子である細胞外結合因子（Ｅｂｆ）；（ｉｉ）サンプルから黄色ブドウ球菌を単離濃縮するために使用される一方、黄色ブドウ球菌同定のための特異的マーカーとしてのプロテインＡ、（ｉｉｉ）ＭＲＳＡの検出に特異的なペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）および（ｉｖ）ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡに特異的な、ＭＳＳＡを検出するために使用されるペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）。これら２つのマーカーは実際のサブトラクティブイムノアッセイで使用される。
【００４７】
細胞外結合因子（Ｅｂｆ）
Ｅｂｆ（細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質）は、細胞外マトリックス中のフィブリノーゲンとの結合を通じてアドヘシンとして作用する。これはまた、莢膜産生が開始されていない感染の初期段階において黄色ブドウ球菌によって開始される補体活性化を中和する働きをし得る補体タンパク質Ｃ３と結合する（参考文献９）。Ｅｂｆは、病原性／侵襲性黄色ブドウ球菌におけるその高度に保存された性質および構成的発現のため、および細胞外培地へのその分泌が、細菌のいかなる処理も行わずに、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）ラテラルフロー検出に容易に受け入れられることとなるため、黄色ブドウ球菌の指標として選択される。
【００４８】
プロテインＡ
プロテインＡの免疫グロブリン結合特性を利用することによりＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの検出／定量の感度を最適化するために、前記イムノアッセイは黄色ブドウ球菌の濃縮から始める。プロテインＡは、細胞表面上に発現される高度に保存された黄色ブドウ球菌特異的マーカーである。ＩｇＧ  ＦｃドメインとのプロテインＡの結合は、２０秒以内の非常に迅速な結合速度を示す（参考文献１０）。従って、細菌の捕捉もまた、黄色ブドウ球菌プロテインＡを検出するために間接的に役立つ。
【００４９】
ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）
ＰＢＰ２ａおよびそのコード遺伝子ｍｅｃ  Ａは、ＭＲＳＡにのみ存在し、これらの生物のメチシリン耐性機構の中心である。ＰＢＰ２とは異なるＰＢＰ２ａは、β−ラクタムに対して低い親和性を有する。ＰＢＰ２のトランスグリコシラーゼ活性と併せて、ＰＢＰ２ａ  トランスペプチダーゼ活性は、ＭＲＳＡ細胞におけるβラクタムの存在下でのペプチドグリカン合成を可能にする（参考文献１１；参考文献１２；参考文献１３）。ＰＢＰ２ａは、ＭＲＳＡに特有であり、従って、試験サンプルからのＭＲＳＡ細胞の検出および選択的枯渇のために選択される。文献において用いられている、ＰＢＰ２ａ検出用に市販されている多くのイムノアッセイがある。多数のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がＰＢＰ２ａに対して利用可能である。
【００５０】
ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）
ＰＢＰ２は、主要細胞壁成分であるペプチドグリカンの合成に関与する重要な酵素であり、総ての黄色ブドウ球菌細胞中に存在する。この酵素は、トランスペプチダーゼとしてのみ作用するＰＢＰ２ａとは異なり、トランスグリコラーゼ活性およびβ−ラクタム感受性トランスペプチダーゼ活性の両方を示す。記載のアッセイは、ＰＢＰ２を介してＭＳＳＡ細胞の存在を評価する前に試験サンプルから総てのＭＲＳＡ細胞を除去するように設計されている（サブトラクティブイムノアッセイ）。
【００５１】
マーカーを選択する際の条件は、選択されたマーカーが、鼻咽頭の粘膜に定着する黄色ブドウ球菌、または定着した粘膜上またはその中に常に測定可能な濃度で存在しなければならないことである。Ｅｂｆ、プロテインＡ、およびＰＢＰ２は総ての黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）において常に存在し、従って、測定可能であるが、一方、ＰＢＰ２ａはＭＲＳＡ株において常に存在し、測定することができる。これらのタンパク質は総て、既刊文献において研究されている（参考文献９；参考文献１０；参考文献１４；参考文献１５；参考文献１６）。
【００５２】
サンプリングプロセス
Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．のＥＳｗａｂは、好気性生物および嫌気性生物を含む臨床試料の採取および輸送用に認可されたスワブ（ＣＬＳＩ  Ｍ４０−Ａ性能基準；微生物の輸送システムの品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））である。このスワブは、冷蔵庫（４〜８℃）および室温（２０〜２５℃）の両方で最大４８時間、好気性生物および嫌気性生物の生存力を維持する。ＥＳｗａｂは、患者のサンプルを採取するために使用され、サンプルは、スワブから１ｍｌ  ＰＢＳ中に１〜２分間自動溶出される（Ｅｓｗａｂに必要なボルテックスは不要）（参考文献１８）。スワブ溶出液は、ピペットで新しいチューブに移すことができる。他のスワブシステムも使用し得る。しかしながら、上述のＥＳｗａｂは、他のスワブと比較して、研究された微生物についてほぼ１ｌｏｇ（ベース１０）高いカウントを与えた（参考文献２６）。
【実施例】
【００５３】
以下のセクションでは、Ｅｂｆの検出、プロテインＡを介した黄色ブドウ球菌の捕捉、ＰＢＰ２ａおよびＰＢＰ２の検出（サブトラクティブイムノアッセイ）、ＩＣＡストリップの構築および機構、携帯型比色測定装置をこの順番に詳述する。アッセイ感度（１００ＣＦＵ／サンプル）およびアッセイ特異性に関するアッセイ性能についての実験を記載する。
【００５４】
黄色ブドウ球菌の検出、固定化、濃縮および透過処理
Ｅｂｆイムノクロマトグラフィーディップスティックを、スワブ溶出液に挿入し、一度テストゾーン内で赤色が発色したら、黄色ブドウ球菌の存在を示すことが読み取られる。Ｅｂｆについての陽性結果に続いて、溶出液中の細菌を、ＰＢＳ中の等容量の２．７％パラホルムアルデヒドおよび０．００５％グルタルアルデヒドで２０分間（黄色ブドウ球菌の平均倍加時間）固定する（参考文献１６；参考文献１９；参考文献２０）。液量をＰＢＳで３０倍に増やし、固定液を０．０４５％ホルムアルデヒド、０．０００８％グルタアルデヒド（gluteraldehyde）の終濃度に希釈する。０．４％ホルムアルデヒドが架橋するためには３７℃で４分必要であるため、これらの濃度では、固定化は起こらない可能性がある（参考文献２１）。
【００５５】
固定液は、プロテインＬがＩｇＧに結合し、次の工程でのＩｇＧの固定化を防止することを可能にするのに十分に希釈しなければならない。続いて、ビーズを剥がして、固定された抗体から黄色ブドウ球菌を遊離させる。固定された抗体は、効率的に剥がされ得ないため、プロテインＬ（ビーズ上）および抗体の固定を防止することが重要である。
【００５６】
プロテインＬは、マウス免疫グロブリンκＩ軽鎖にのみ結合し、そのＦｃドメインは使われていない状態である。ＩｇＧはプロテインＬ−ビーズに結合することができる。ＩｇＧは、一度プロテインＬに結合すると、その後のストリッピングにおいてそれが黄色ブドウ球菌と共溶出することを防止するために化学的に架橋される。ＩｇＧ１でコーティングされ、プレブロックされたプロテインＬ結合超常磁性ビーズをスワブ溶出液に添加する。ＩｇＧのＦｃドメインは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡと相互作用するように、使われていない。これらのビーズの添加により、黄色ブドウ球菌の細胞表面に発現されるプロテインＡと結合しているビーズ上に使われていない状態のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを生じる。プロテインＡとＩｇＧのＦｃドメインとの非常に迅速な結合速度（２０秒以内（参考文献１０））から、黄色ブドウ球菌はポイントオブケア方式で効率的に単離濃縮することができる。１〜２分の結合後に、黄色ブドウ球菌をさらに処理し得る。
【００５７】
洗浄および流体変化が行われている間は、強力な外部磁石を用いてビーズを沈降させ、拘束し得る。上清液は、洗浄または流体変化の間に、ピペットにより注意深く除去される。ビーズ上の黄色ブドウ球菌は、ＰＢＳで２回洗浄し、ＧＴＥバッファー（グルコース５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ  １０ｍＭ）中終濃度１０〜３０ｎｇ／ｍｌのリゾスタフィン（Ｓｉｇｍａ）で１分間透過処理する。透過処理は、膜貫通タンパク質ＰＢＰ２およびＰＢＰ２ａへの抗体アクセスおよび結合を可能にする（参考文献１６；参考文献２２）。ビーズはＰＢＳで２回洗浄する。
【００５８】
捕捉ビーズからの黄色ブドウ球菌の遊離
免疫検出の感度を高めるために、磁気捕捉によりスワブ溶出液から黄色ブドウ球菌を濃縮する。黄色ブドウ球菌は、２つの理由から、プロテインＬ−ビーズから遊離されるべきである：（ｉ）プロテインＬは、ヒト免疫グロブリンκ鎖に結合し、これがマウス免疫グロブリンのκ鎖Ｉに結合する。利用可能な抗体試薬（ＰＢＰ２およびＰＢＰ２ａに対する抗体）が、κＩＩＩもしくはＩＶ、またはプロテインＬに結合しないλ型軽鎖−ＩｇＧ類でない限り、プロテインＬの存在は、ＩＣＡ中に抗体に無差別に結合するために、イムノアッセイの機能を完全に損なわせる；（ｉｉ）記載したアッセイ形式の主要な診断目標である混合集団においてビーズに結合する黄色ブドウ球菌のＭＲＳＡ細胞とＭＳＳＡ細胞とはＩＣＡによってもはや区別されない。
【００５９】
黄色ブドウ球菌を担持するビーズは、抗体ストリッピングバッファー（５０ｍＭグリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）中で２回洗浄し（２分／洗浄）（参考文献２３；参考文献２４）、１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で中和し得る。これらのバッファーは、固定されたプロテインＡから抗体を解離させるために日常的に使用され、細胞表面から抗体を効果的に解離させるために使用されている。ストリッピングが不完全である場合、濃度がより高い０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファーを使用し得る。
【００６０】
ＰＢＰ２ａおよびＰＢＰ２を介したＭＲＳＡおよびＭＳＳＡのイムノクロマトグラフィー検出
本明細書に記載のＩＣＡアッセイに使用することができる抗体を以下に列挙する。これらの抗体は市販されておりかつ／または文献で使用されている。
−抗Ｅｂｆ抗体：抗Ｅｂｆマウスまたはヒトポリクローナル精製ＩｇＧ（参考文献２５）。
−抗ＰＢＰ２ａ抗体：捕捉ｍａｂ  ＩｇＭ（クローン  １Ｇ１２）および検出ｍａｂ  ＩｇＧ（クローン  １０Ｇ２）（参考文献１４）；捕捉ｍａｂ  クローン番号Ｍ８１２１５２１および検出ｍａｂ  クローン番号Ｍ８１２１５２２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）；捕捉ｍａｂ  クローン番号Ｍ８１２１５２３および検出ｍａｂ  クローン番号Ｍ８１２１５２２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ製抗ＰＢＰ２ａマウスモノクローナル抗体  カタログ番号ＭＢＳ５３０９６９、ＭＢＳ５３０２２１およびＭＢＳ５３１９１５（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ製）；
−抗ＰＢＰ２抗体：抗ＰＢＰ２ウサギポリクローナル（参考文献１６）。
【００６１】
ＩＣＡ作動原理（サブトラクティブイムノクロマトグラフィーアッセイ）
２つのコンジュゲートパッド１０、２０を有するペーパーベースのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ１は、全黄色ブドウ球菌細胞におけるＰＢＰ２ａと、その後のＰＢＰ２との連続検出のために提供される。ストリップ構築物を図１に示している。
【００６２】
ＰＢＰ２ａ／ＰＢＰ２検出用のイムノクロマトグラフィーストリップ（ＰＢＰ２ａ／ＰＢＰ２ストリップ）は、サンプルの流れ（図１の矢印）方向に、以下に列挙する８つのパーツまたは領域／ゾーンを含んでなる：
１．）サンプルアプリケーションゾーン３（サンプルアプリケーションパッド）。このゾーンは、サンプル液（スワブ溶出液または黄色ブドウ球菌濃縮後の溶出液）に浸漬され、この場所からサンプル液はストリップに沿って最後のゾーン（吸収パッド）まで移動する。
２．）第１のコンジュゲーションゾーン１０（第１のコンジュゲートパッド）。このゾーンは、遊離した第１の検出抗体を含有する。第１の検出抗体は、検出下の第１の分析物（本明細書ではＰＢＰ２ａ）に特異的であり、シグナル発生系（第１の検出タグ）とコンジュゲートされる。第１の検出タグは、シグナルのための金ナノ粒子（ＡｕＮｐ）であり得、それは高感度であり、そのシグナルは第１の分析物の存在下で発色した赤色の形態で肉眼で見えるためである。サンプルは、アプリケーションゾーン（サンプルアプリケーションパッド）から第１のコンジュゲーションゾーン（第１のコンジュゲートパッド）まで流れ、そこで、第１の検出抗体（例えば、ＡｕＮｐ標識抗体）は第１の分析物に結合する。
３．）第１のテストライン１１（第１の捕捉／テストゾーン）。このゾーンは、第１の分析物（例えば、ＰＢＰ２ａ）に特異的であるが、第１のコンジュゲートパッドの第１の検出抗体とは異なるエピトープを認識する、固定化された第１の捕捉抗体を含有する。第１のコンジュゲートパッドにおいて形成される複合体、第１の分析物−第１の検出抗体は、第１の分析物を介して固定化された第１の捕捉抗体と結合し、第1の捕捉ゾーンにおいて複合体を濃縮する。第１のテストラインにおけるＡｕＮｐの集束は、肉眼で見える明瞭な赤色として現れ、その強度は第１の分析物濃度に比例して増加する。ＰＢＰ２ａを含有するＭＲＳＡ細胞は、第１の捕捉ゾーンにおいて捕捉および検出され、サンプルから完全に枯渇される。
４．）第１のコントロールライン１２（第１のコントロールゾーン）。余分な第１の検出抗体（例えば、ＡｕＮｐタグ付き）と、サンプルからの非結合物質とは、第１のコントロールゾーンに移動する。このゾーンは、第１の検出抗体（ＡｕＮｐコンジュゲート）に特異的に結合する第１の対照抗体を含有する。第１のコントロールゾーンは、余分な遊離した第１の検出抗体を吸収するとともに、ストリップ装置が適切に機能しているという確認の役割を果たす。第１のコントロールライン上の赤色は、装置が作動していることを示す。
５．）第２のコンジュゲーションゾーン２０（第２のコンジュゲートパッド）。その時点で第１の検出抗体（抗ＰＢＰ２ａ−ＡｕＮｐ抗体）および第１の分析物（ＭＲＳＡ細胞）を含まない、細菌細胞を含む非結合物質は、第２のコンジュゲートパッドまで流れる。第２のコンジュゲートパッドは、第２の分析物（例えば、ＰＢＰ２）に特異的な、遊離した第２の検出抗体（例えば、ＡｕＮｐとコンジュゲートされた抗ＰＢＰ２抗体）を含有する。
６．）第２のテストライン２１（第２の捕捉／テストゾーン）。このゾーンは、第２の分析物（例えば、ＰＢＰ２）に特異的であるが、第２のコンジュゲートパッドの第２の検出抗体とは異なるエピトープ(a different epitope form)を認識する、固定された第２の捕捉抗体を含有する。第２のコンジュゲートパッドにおいて形成される複合体、第２の分析物−第２の検出抗体は、第２の分析物を介して固定された第２の捕捉抗体と結合し、第２の捕捉ゾーンにおいて複合体を濃縮する。第２のテストラインにおけるＡｕＮｐの集束は、肉眼で見える明瞭な赤色として現れ、その強度は第２の分析物濃度に比例して増加する。従って、ＰＢＰ２を含有するＭＳＳＡ細胞は、ここで捕捉および検出される。
７．）第２のコントロールライン２２（第２のコントロールゾーン）。余分な第２の検出抗体（例えば、ＡｕＮｐタグ付き）と、サンプルからの非結合物質とは、第２のコントロールゾーンに移動する。このゾーンは、第２の検出抗体（ＡｕＮｐコンジュゲート）に特異的に結合する第２の対照抗体を含有する。第２のコントロールゾーンは、余分な遊離した第２の検出抗体を吸収し、ストリップ装置が適切に機能しているという確認の役割を果たす。第２のコントロールライン上の赤色は、装置が作動していることを示す。
８．）吸収ゾーン５（吸収パッド）。最後に、吸収パッドは、未反応／非結合物質を含有する不必要なサンプル液を吸収する。
【００６３】
サブトラクティブイムノクロマトグラフィーのためのイムノクロマトグラフィーストリップの構築
以下では、イムノクロマトグラフィーストリップの構築のための可能性がある方法を記載する。
【００６４】
ストリップについてのゾーンの配置は、プラスチック支持体２上に印刷し得る。サンプルアプリケーションパッド３、コンジュゲーションパッド１０、コンジュゲーションパッド２０、ニトロセルロースメンブレン４、ニトロセルロースメンブレン４’、および正しいサイズに切断された吸収パッド５は、プラスチック支持体に接着される。ＩＣＡストリップの構築物は、コンジュゲーションパッド２０によって一緒に保持された２つのニトロセルロースストリップ４、４’を含んでなる。ニトロセルロース４の第１のストリップは、その近位端（アプリケーションパッド３に近い方が末端となる）にコンジュゲーションパッド１０を有する。ニトロセルロース４’の第２のストリップは、その遠位端（アプリケーションパッド３から遠い方の末端）に吸収パッド５を有する。
【００６５】
予備構築物をＵＶ／８時間により滅菌する。第１のテストライン１１および第２のテストライン２１ならびに第１のコントロールゾーン１２および第２のコントロールゾーン２２は、第１の捕捉抗体および第２の捕捉抗体ならびに第１の対照抗体および第２の対照抗体をニトロセルロースメンブレン４、４’上のそれぞれのゾーンに、ＢｉｏＤｏｔｔｅｒ  Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（ＢｉｏＤｏｔ  Ｉｎｃ、アーバイン、ＣＡ）でスポッティングすることにより作製し、３７℃で３０分間インキュベートする。ニトロセルロースメンブレンを０．５％カゼイン溶液で２０分間ブロックし、洗浄する（参考文献１４）。ブロッキング工程は、ストリップを使用しているときに無関係なサンプル成分からの非特異的結合を防止する。１８マイクロリットルのブロックした第１および第２のＡｕＮｐ−検出抗体コンジュゲートをそれぞれ、第１のコンジュゲーションパッド１０および第２のコンジュゲーションパッド２０に適用し、３７℃で２時間乾燥させる。コンジュゲーションパッドは、ガラス繊維（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはセルロースから作製することができる。風乾後、第１のコンジュゲートパッドをニトロセルロースメンブレンの近位端に配置する。第１のコンジュゲーションパッドは、サンプルアプリケーションパッド３およびニトロセルロースパッド４の両方にわずかに（およそ０．２ｃｍ）重なるように配置する。第２のコンジュゲーションパッド２０は、ニトロセルロースパッド４、４’に両側で（およそ０．２ｃｍ）重なる。次いで、完成したストリップをバッファー  ０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）で飽和させ、乾燥させ、デシケーター内で４℃で保存する。
【００６６】
２０ｎｍ〜４０ｎｍのＡｕＮｐ（金ナノ粒子）を使用して、第１の検出抗体および第２の検出抗体をタグ付けする。また、捕捉された分析物の視覚化用の他のタグも使用し得る。
【００６７】
所望のサイズのＡｕＮｐは、還元／安定剤の容量を制御する水溶液中での金還元のためのＴｕｒｋｅｖｉｃｈ（１９８５）の方法によって得られる。ＡｕＮｐと抗体とのコンジュゲーションは、ＡｕＮｐのシュテルン層を克服してそれらと抗体との結合を可能にするために、抗体の等電点で実施する。金コロイド懸濁液と、終濃度３０μｇ／ｍｌの抗ＰＢＰ２ａ  ｍａｂとを混合し、参照により２０分間インキュベートする（参考文献１４）。その後、１．０％カゼインナトリウムをブロッキング剤として添加する。非結合ＩｇＧを１４，０００×ｇで１５分間除去した後、ペレットを、０．１％カゼインナトリウム（および１０％トレハロース二水和物、ｐＨ８．２を使用）を含有する０．５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに再懸濁し（参考文献１４）、コンジュゲーションパッドに適用する。
【００６８】
第１のコンジュゲーションパッド１０については、マウス抗ＰＢＰ２ａ  ｍａｂ（第１の検出抗体）を使用する。第１のテストライン１１については、結合中の立体障害を防ぐために第１の検出抗体によって認識されるエピトープとは全く異なるエピトープに対するマウス抗ＰＢＰ２ａ  ｍａｂ（第１の捕捉抗体）を使用する。第１のコントロールライン１２については、第１の検出抗体（通常は、抗マウスＩｇＧ）の特異的アイソタイプを認識する抗マウス抗体を使用する。また、他の供給源（非ネズミ）の抗体も検出抗体として使用し得る。
【００６９】
第２のコンジュゲーションパッド２０については、マウス抗ＰＢＰ２  ｍａｂ（第２の検出抗体）を使用する。第２のテストライン２１については、結合中の立体障害を防ぐために第２の検出抗体によって認識されるエピトープとは全く異なるエピトープに対するマウス抗ＰＢＰ２  ｍａｂ（第２の捕捉抗体）を使用する。第２のコントロールライン２２については、第２の検出抗体（通常は、抗マウスＩｇＧ）の特異的アイソタイプを認識する抗マウス抗体を使用する。
【００７０】
モノクローナル抗体が第１の分析物および第２の分析物の検出および捕捉に使用される場合、このアッセイの特異性は高くなるであろう。アッセイ結合の第１の特異性は第１の検出抗体に起因する；従って、１種のモノクローナルのみが利用可能である場合（利用可能な他のものはポリクローナルである）、それは第１の分析物に対して高度に特異的であり、交差反応する可能性は低いため、それは第１の検出抗体に使用すべきである。
【００７１】
ストリップアッセイプロセスおよび読み出し
テストゾーン（単数または複数）について（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡまたは両方が存在するかどうかに依存）およびＰＢＰ２検出のコントロールゾーン（サンプル通過する最後のコントロールライン）について発色するまで、イムノクロマトグラフィーストリップを５０μｌの細胞懸濁液に浸漬する（免疫磁気捕捉および遊離後）。赤色テストラインの強度は、細菌濃度の増加と正の相関がある。
【００７２】
異なるテストラインは以下となる：
−ＭＲＳＡのみの存在下では、ＰＢＰ２ａについて赤色となり（陽性）、ＰＢＰ２について赤色とならず（陰性）；
−ＭＳＳＡのみの存在下では、ＰＢＰ２ａについて赤色とならない（陰性）が、ＰＢＰ２について赤色となり（陽性）；または
−ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方の存在下では、ＰＢＰ２ａについて赤色となり（陽性）、ＰＢＰ２について赤色となる（陽性）。
【００７３】
サンプルは黄色ブドウ球菌の存在についてこれまでに試験している（Ｅｂｆアッセイ；プロテインＡを介した濃縮）ため、両方のテストラインが陰性であるという結果は生じない。
【００７４】
それに従って、図２に示すように、いくつかのサンプルの読み出しが存在する：（ｉ）第１のテストゾーン（１１）および／または第２のテストゾーン（２１）ならびにそれぞれの第１のコントロールゾーン（１２）および／または第２のコントロールゾーン（２２）における赤色のライン（図２の黒色）は、アッセイが機能することを示し、分析物が検出される（図２：ストリップ１〜３）。図２の最初の３つの読み出しはそれぞれ、サンプルがＭＲＳＡおよびＭＳＳＡについて陽性である（ストリップ１）、ＭＳＳＡについてのみ陽性である（ストリップ２）、ＭＲＳＡについてのみ陽性である（ストリップ３）場合の例を示す。（ｉｉ）両方のコントロールゾーンにおける赤色のラインは、アッセイが機能することを示しているにすぎず、分析物は検出されず、サンプルがＭＳＳＡおよびＭＲＳＡについて陰性であることを意味する（ストリップ４）。しかしながら、黄色ブドウ球菌について陰性のサンプルは事前に除外されているため、これは通常起こらない。（ｉｉｉ）コントロールゾーンの一方のみでの赤色のラインは、アッセイが適切に機能していないことを意味する（ストリップ５および６）。（ｉｖ）それぞれのコントロールゾーンに赤色のラインがなくテストゾーンのみでの赤色のラインは、第１の分析物または第２の分析物の濃度が非常に高いために第１の検出抗体または第２の検出抗体のいずれかが飽和しているかまたはアッセイが適切に機能していないことを示唆する。（このオプションは図２には示されていない）。飽和の場合、サンプルを希釈し、アッセイを再度行い得る。第１の検出抗体が飽和している場合、ＭＲＳＡの不完全な枯渇が起こり、第２のテストゾーンのＭＳＳＡシグナルは、実際には、ＭＲＳＡに起因する可能性がある。典型的には、サンプル中の黄色ブドウ球菌の濃度に対する抗体の濃度は、抗体の飽和を起こさない範囲で選択される。（ｉｖ）赤色のラインが全くない場合、アッセイが適切に機能していないことを意味する（ストリップ７）。
【００７５】
比色定量
赤色テストラインの強度は、細菌濃度の増加と正の相関がある。ＭＲＳＡ／ＭＳＳＡの濃度を定量する１つの可能性は、Ａｕナノ粒子の色強度を読み取るＣＣＤカメラデバイスのない携帯型比色計である（参考文献１７）。この計器は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、フォトダイオード、対数集積チップ、電源、ＬＭ３２４クァッドオペアンプ、およびコンデンサーで構成される。ＬＥＤは光源である。フォトダイオードは、ＥＰＩＧＡＰ−ＥＰＤ−４７０−５／０．５の４００ｎｍ〜５５０ｎｍに特定である。対数集積チップＬＯＧ１０２ＡＩＤは、反射光の対数尺度を取る。リーダーは、ＬＥＤにより濃度バーを５段階で表示する。リーダーは、テストラインおよびコントロールラインで色反射によって誘導される電圧変化を捕捉する。コントロールラインとテストラインとの間での電圧の相対的差異を測定して、読み取りのばらつきを最小限に抑え、計器の適切な機能を保証する。
【符号の説明】
【００７６】
１    アッセイストリップ
２    支持体
３    サンプルアプリケーションパッド
４    ニトロセルロースメンブレン
４’  ニトロセルロースメンブレン
５    吸収パッド
１０  第１のコンジュゲーションパッド
１１  第１のテストライン（ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる）
１２  第１のコントロールライン（ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる）
２０  第２のコンジュゲーションパッド
２１  第２のテストライン（ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる）
２２  第２のコントロールライン（ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる）
【００７７】
参考文献
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2018533021.tif 000004
2018533021.tif 000005
2018533021.tif 000006
【図１】
2018533021.tif 000007
【図２】
2018533021.tif 000008
【国際調査報告】
2018533021.tif 000009
2018533021.tif 000010
2018533021.tif 000011