(57)【要約】  本明細書には、高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌を治療する方法であって、治療有効量のｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＥＺＨ２）阻害剤を投与することを含む方法が提供される。このほか、ＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とを用いる併用療法が提供される。【選択図】図１
2018522045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＥＺＨ２）阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
治療前に、前記癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含むと判定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療前に前記対象の癌の生検を実施し、前記癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含むかどうかを判定する段階を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
癌を有する対象を治療する方法であって、前記癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することと、前記対象の癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含む場合、前記対象に治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項５】
ＥＺＨ２阻害剤が患者の癌を治療する効果を評価する方法であって、前記患者から試料を採取することと、前記癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することとを含み、１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高い場合、前記ＥＺＨ２阻害剤が効果を示す可能性があるとする、方法。
【請求項６】
癌を有する対象を治療する方法であって、前記癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することと、前記対象の癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高くない場合、前記対象にＥＺＨ２阻害剤の投与以外の治療有効量の癌治療法を実施し、前記対象の癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高い場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することとを含む、方法。
【請求項７】
治療有効量の免疫調節剤を投与することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＺＨ２阻害剤を前記免疫調節剤と同時に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫調節剤が、免疫チェックポイント遮断阻害剤、細胞ベースの治療法、ワクチン戦略、免疫応答の代謝阻害を防ぐ薬剤およびサイトカイン系治療薬から選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫調節剤が免疫チェックポイント遮断阻害剤である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫調節剤が、抗ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ９３６５５９、アテゾリズマブ、アベルマブ、抗ＣＤ４７、ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１、ランブロリズマブ、ＡＭＰ−２２４およびＭＥＤＩ−４７３６から選択される免疫チェックポイント遮断阻害剤である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫調節剤が、抗ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ９３６５５９、アテゾリズマブ、抗ＣＤ４７、ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１、ランブロリズマブ、ＡＭＰ−２２４およびＭＥＤＩ−４７３６から選択される免疫チェックポイント遮断阻害剤である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫調節剤がαＰＤ−１抗体である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、高頻度の制御性Ｔ細胞、高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージまたは高頻度の制御性Ｔ細胞と高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージの両方を特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、前記癌から採取した組織試料の腫瘍内のＴｒｅｇの中央カットオフ値が顕微鏡の高倍率視野当たり１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６もしくは６．５であることによって定義される高頻度の制御性Ｔ細胞、前記癌から採取した組織試料の腫瘍内のＭ２腫瘍関連マクロファージの中央カットオフ値が顕微鏡の高倍率視野当たり１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６もしくは６．５であることによって定義される高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージまたは前記癌から採取した組織試料の腫瘍内のＴｒｅｇの中央カットオフ値が顕微鏡の高倍率視野当たり１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６もしくは６．５であり、前記癌から採取した組織試料の腫瘍内のＭ２腫瘍関連マクロファージの中央カットオフ値が顕微鏡の高倍率視野当たり約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６もしくは６．５であることによって定義される高頻度の制御性Ｔ細胞と高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージの両方を特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、Ｔ細胞リンパ腫、ブドウ膜黒色腫、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、黒色腫および神経膠腫から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺扁平上皮癌、多形神経膠芽腫およびびまん性巨細胞腫から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌がホジキンリンパ腫である、請求項１〜１５および請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することと、前記ＥＺＨ２阻害剤の投与後にＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こったか、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制が起こったか、もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こったか、または以上のものの組合せが起こったかどうかを判定することと、Ｔｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少、腫瘍関連マクロファージの抑制もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大またはその組合せがみられた場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤の投与を継続することを含む、方法。
【請求項２０】
癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することと、前記ＥＺＨ２阻害剤の投与後にＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こったか、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制が起こったか、もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こったか、または以上のものの組合せが起こったかどうかを判定することと、Ｔｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こらなかった場合、腫瘍関連マクロファージの抑制が起こらなかった場合およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こらなかった場合、前記対象にＥＺＨ２阻害剤の投与以外の治療有効量の癌治療法を実施することと、Ｔｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大またはその組合せがみられた場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤の投与を継続することとを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、ＥＰＺ−６４３８、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ００５６８７、ＥＰＺ０１１９８９、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、ＧＳＫ３４３、ＵＮＣ１９９９、ＥＰＺ−６４３８から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、
【化１】
2018522045.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
式
【化２】
2018522045.tif 000008
を有する有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、包装された組成物であって、高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌に罹患している対象を治療するための指示書とともに包装された組成物。
【請求項２４】
有効量の免疫調節剤をさらに含む、請求項２３に記載の包装された組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本願は、２０１５年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２００，２４４号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｚｅｓｔｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＥＺＨ２）の小分子阻害剤は、様々な種類の癌の治療を目指し多数のものが臨床開発の段階にある。抗癌療法としての新たなＥＺＨ２阻害剤の開発に向けていくつか進歩がみられるものの、これらの阻害剤が特に効果的な患者集団は未だ明らかにされていない。本明細書には、ＥＺＨ２阻害剤による治療に特に適した患者集団が開示される。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]現時点で、ＥＺＨ２の阻害によって制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖が抑えられ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）が増加し、好ましいＣＤ８／Ｔｒｅｇ比がもたらされ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）が増加し、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が減少することがわかっている。これらの発見に基づけば、高頻度のＴｒｅｇまたは高頻度のＭ２関連マクロファージを特徴とする癌を有する対象または癌に対する免疫応答が必要な対象は、ＥＺＨ２阻害剤を用いる効果的な抗癌治療が実施可能な患者集団となる。
【０００４】
[0004]例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＥＺＨ２阻害剤で処置するとヒト制御性Ｔ細胞の抑制能が低下することがわかった（図４を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＥＺＨ２阻害によって制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖が抑えられ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）が増加し、好ましいＣＤ８／Ｔｒｅｇ比がもたらされ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）が増加し、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が減少することがわかった。例えば、図６〜８を参照されたい。さらに、ＣＴ２６癌細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏではＥＺＨ２阻害に対して非感受性であることがわかった（図９）が、マウスをＥＺＨ２阻害剤で処置したところ（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでは）、ＣＴ２６癌細胞の増殖が抑えられた。例えば、図１０および図１４を参照されたい。
【０００５】
[0005]Ｔｒｅｇは腫瘍内に多数存在するほか、抗癌免疫応答の抑制、さらには免疫を介さない機序によって癌促進に極めて重要な役割を担っていることから、癌進行の主な構成要素の１つとなっている。例えば、Ｆａｒａｓｈｉ−ｂｏｎａｂら，ＭＯＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４，１（４）：０００２４を参照されたい。特に、腫瘍中のＴｒｅｇレベルの増大が検出され、疾患転帰の不良の原因となっている場合、腫瘍微小環境でのＴｒｅｇ誘導因子の調節およびＴｒｅｇの枯渇または妨害が、抗癌免疫を誘導し免疫療法の効果を改善するのに有効な方法であることが明らかにされている。例えば、Ｎｉｚａｒら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００９）１００，１６９７−１７０３を参照されたい。腫瘍中のＴｒｅｇを枯渇させるという単一の操作でも、効果的な癌単独療法となるだけでなく、他の癌治療法と十分に併用可能な方法となることが明らかにされている。例えば、Ｓｍｙｔｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）９２，４７３−４７４を参照されたい。
【０００６】
[0006]本明細書でＥＺＨ２阻害剤が制御性Ｔ細胞の増殖を効果的に抑えることが明らかにされている（Ｔｒｅｇ、例えば図６を参照されたい）ことから、また、Ｔｒｅｇ抑制と抗癌免疫療法との間に関係があることがわかっていることを考慮に入れ、一態様では、Ｔｒｅｇの頻度が高い癌を有する対象を治療する方法であって、対象に有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。このような方法は、治療有効量の免疫調節剤である第二の薬剤を投与することをさらに含む。
【０００７】
[0007]細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞またはキラーＴ細胞としても知られる）は、癌細胞、感染細胞または別の方法で損傷もしくは感染した細胞を死滅させるＴリンパ球である。例えば、Ｍａｈｅｒら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００４）９１，８１７−８２１を参照されたい。このデータに基づき、また、本明細書でＥＺＨ２阻害剤が細胞傷害性Ｔ細胞を増加させることが明らかにされている（図６を参照されたい）ことから、別の態様では、癌を有する対象の細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を増大させる方法であって、対象に有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。このような方法は、治療有効量の免疫調節剤である第二の薬剤を投与することをさらに含む。
【０００８】
[0008]ＮＫ細胞は、例えば直接腫瘍細胞の死を誘導することによって、腫瘍免疫監視に何らかの役割を果たすことが知られている。例えば、Ｚａｍａｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；１７８：４０１１−４０１６を参照されたい。ＮＫＴ細胞はＮＫ細胞と同じ特性を有し、セミインバリアントなＴ細胞受容体とＮＫ細胞マーカーを同時に発現することができる。例えば、Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（３）：２３１−７を参照されたい。癌治療におけるＮＫ細胞とＮＫＴ細胞との関係に基づき、また、本明細書でＥＺＨ２阻害剤がＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を増加させることが明らかにされている（例えば、図７を参照されたい）ことから、別の態様では、癌を有する対象のＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞またはその両方の頻度を増大させる方法であって、対象に有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。このような方法は、治療有効量の免疫調節剤を投与することをさらに含み得る。
【０００９】
[0009]腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、２種類の主要な表現型であるＭ１とＭ２に分類される。Ｍ１  ＴＡＭは癌進行を抑制し、Ｍ２  ＴＡＭは腫瘍成長を促進する。例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４，７：１９およびＨｅｕｓｉｎｋｖｅｌｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１，９：２１６を参照されたい。このデータに基づき、また、本明細書でＥＺＨ２阻害剤がＭ２腫瘍関連マクロファージを減少させることが明らかにされている（例えば、図８を参照されたい）ことから、別の態様では、高頻度のＭ２  ＴＡＭを特徴とする癌を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。このような方法は、治療有効量の免疫調節剤である第二の薬剤を投与することをさらに含む。
【００１０】
[0010]本明細書にはこのほか、ＥＺＨ２阻害剤と、免疫調節剤である第二の薬剤とを含む、医薬組成物が提供される。この併用により、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を抑え、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）を増加させ、好ましいＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をもたらし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を増加させ、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を減少させるのに相乗効果が得られることがわかっている。例えば、図１１〜１３を参照されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏでも投与による相乗効果がみられ、この併用が癌細胞を減少させることがわかった。例えば、図１０および図１４を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0011]ヒトＴｒｅｇ分化時にアップレギュレートされるＰＲＣ２コア成分を示す図である。
【図２】[0012]ＥＺＨ２がＴｒｅｇ細胞の抑制された遺伝子座に結合し、阻害によってＨ３Ｋ２７トリメチル化がなくなることを示す図である。
【図３】[0013]図３Ａは、ＥＺＨ２阻害がＦＯＸＰ３発現に何ら影響を及ぼさなかったことを示す図であり、図３Ｂは、処置ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが低下したことを示す図であり、図３Ｃは、特定のサイトカインの発現レベルが用量依存性に増大したことを示す図である。
【図４】[0014]Ｔｒｅｇ細胞の抑制能にはＥＺＨ２の触媒活性が必要であることを示す図である。
【図５】[0015]ヒトｉＴｒｅｇのＥＺＨ２ノックダウンによって抑制機能が低下することを示す図である。
【図６】[0016]ＥＺＨ２阻害剤で処置すると、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖が抑えられ、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖が増大することを示す図である。
【図７】[0017]ＺＨ２阻害剤で処置すると、ＮＫ細胞が増加することを示す図である。
【図８】[0018]ＥＺＨ２阻害剤で処置すると、抑制性Ｍ２  ＴＡＭが減少することを示す図である。
【図９】[0019]シスプラチンおよびＥＺＨ２阻害剤で処置したときのＣＴ２６細胞の感受性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を示す図である。
【図１０】[0020]ＥＺＨ２阻害剤で処置したときおよびＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とで処置したときのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＴ２６腫瘍体積の減少を示す図である。
【図１１】[0021]ＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とで処置すると、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖が抑えられ、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖が増大することを示す図である。
【図１２】[0022]ＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とで処置すると、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が増加することを示す図である。
【図１３】[0023]ＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とで処置すると、抑制性Ｍ２  ＴＡＭが減少することを示す図である。
【図１４】[0024]図１４Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＴ２６癌細胞がＥＺＨ２阻害に対して感受性を示さないことを示しているのに対し、図１４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＥＺＨ２阻害剤で処置したときおよびＥＺＨ２阻害剤と免疫調節剤である第二の薬剤とで処置したとき、ＣＴ２６腫瘍体積が減少することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
[0025]本明細書に記載されるマーカーのうちの１つまたは複数のものによって、ＥＺＨ２阻害剤の投与が免疫応答を誘発することがわかった。この発見に基づき、本開示は、一態様では、ＥＺＨ２阻害剤を用いて特定の癌対象集団を治療する方法に関するものである。この癌対象集団は、１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高いことを特徴とする癌を有するものである。
【００１３】
[0026]一態様では、本開示は、高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
[0027]一態様では、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤で治療する前に、癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含むと判定されている。このような判定は日常的な診断方法によって下すことができる。その方法としては、特に限定されないが、生検、内視鏡検査法、画像診断法（Ｘ線、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩおよび超音波）および血液検査が挙げられる。一態様では、治療前に対象の癌の生検を実施し、癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含むかどうかを判定する段階を、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤で治療する前に実施する。
【００１５】
[0028]別の態様では、癌を有する対象を治療する方法であって、癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することと、対象の癌が高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を含む場合、対象に治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することとを含む方法が本明細書に提供される。
【００１６】
[0029]別の態様では、ＥＺＨ２阻害剤が患者の癌を治療する効果を評価する方法であって、患者から試料を採取することと、癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することとを含み、高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高い場合、ＥＺＨ２阻害剤が効果を示す可能性があるとする方法が本明細書に提供される。
【００１７】
[0030]別の態様では、癌を有する対象を治療する方法であって、癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度を判定することと、対象の癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高くない場合、対象にＥＺＨ２阻害剤の投与以外の治療有効量の癌治療法を実施し、対象の癌の１つまたは複数の抑制性免疫細胞の頻度が高い場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することとを含む方法が本明細書に提供される。
【００１８】
[0031]別の態様では、本明細書に記載される方法は、治療有効量の免疫調節剤を投与することをさらに含む。特に明示されない限り、本明細書に記載される投与は、本明細書に記載される免疫調節剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に記載のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含むことが理解されよう。したがって、治療目的に同時投与が必要であるわけではない。しかし、一態様では、ＥＺＨ２阻害剤を免疫調節剤と同時に投与する。
【００１９】
[0032]本明細書で定義される「免疫調節剤」は、患者の免疫系によって患者の癌の進行速度を低下させる、癌を阻止もしくは軽減する、または癌の拡散を抑えることができるよう患者の癌の免疫応答を誘導または増強することに関与する薬剤を指す。このような薬剤としては、例えば、免疫チェックポイント遮断阻害剤、細胞ベースの治療薬、ワクチン戦略、免疫応答の代謝阻害を防ぐ薬剤およびサイトカイン系治療薬が挙げられる。一態様では、本発明の方法の免疫調節剤は免疫チェックポイント遮断阻害剤である。一態様では、本明細書に記載される免疫調節剤は、抗ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ９３６５５９，アテゾリズマブ、抗ＣＤ４７、ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１、ランブロリズマブ、ＡＭＰ−２２４およびＭＥＤＩ−４７３６から選択される免疫チェックポイント遮断阻害剤である。一態様では、本明細書に記載される免疫調節剤は、抗ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ９３６５５９、アテゾリズマブ、抗ＣＤ４７、ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１、アベルマブ、ランブロリズマブ、ＡＭＰ−２２４およびＭＥＤＩ−４７３６から選択される免疫チェックポイント遮断阻害剤である。別の代替態様では、本明細書に記載される免疫調節剤はαＰＤ−１抗体である。
【００２０】
[0033]本明細書で定義される「抑制性免疫細胞」は、患者の癌に対する防御に関与する他の免疫細胞の活性または増殖を抑制することができるリンパ系列の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー細胞）および骨髄系列の細胞（例えば、単球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、巨核球および顆粒球（好酸球、好中球、好塩基球））を指す。一態様では、本明細書に記載される方法で言及される１つまたは複数の抑制性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞およびＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）ならびにその組合せから選択される。別の態様では、本明細書に記載される方法で言及される１つまたは複数の抑制性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞もしくはＭ２腫瘍関連マクロファージまたはその組合せである。
【００２１】
[0034]本明細書にはこのほか、癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与すること；ＥＺＨ２阻害剤の投与後にＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こったか、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制が起こったか、もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こったか、または以上のものの組合せが起こったかどうかを判定すること；およびＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少、腫瘍関連マクロファージの抑制もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大またはその組合せがみられた場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤の投与を継続することを含む、方法が提供される。そうでない場合、対象をＥＺＨ２とは異なる抗癌療法で治療する。
【００２２】
[0035]さらに、対象の癌を治療する方法であって、癌の試料を採取することと、高頻度の１つもしくは複数の高頻度の制御性Ｔ細胞または高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージがみられるかどうかを判定することと、対象をＥＺＨ２阻害剤で治療することとを含む、方法が提供される。対象に高頻度の１つまたは複数の高頻度の制御性Ｔ細胞も高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージもみられない場合、対象をＥＺＨ２阻害剤以外の抗癌療法で治療し得る。
【００２３】
[0036]したがって、癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与すること；ＥＺＨ２阻害剤の投与後にＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こったか、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制が起こったか、もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こったか、または以上のものの組合せが起こったかどうかを判定すること；Ｔｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少が起こらなかった場合、腫瘍関連マクロファージの抑制が起こらなかった場合およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大が起こらなかった場合、対象にＥＺＨ２阻害剤の投与以外の治療有効量の癌治療法を実施すること；ならびにＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの抑制もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の頻度の増大またはその組合せがみられた場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤の投与を継続することを含む、方法が提供される。
【００２４】
[0037]本明細書で使用される「高頻度」は、癌から採取した組織試料の腫瘍内のＴｒｅｇまたはＭ２腫瘍関連マクロファージの中央カットオフ値が、顕微鏡の高倍率（倍率４００倍）視野当たり１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６または６．５であることを意味する。一態様では、癌から採取した組織試料の腫瘍内のＴｒｅｇまたはＭ２腫瘍関連マクロファージの中央カットオフ値は、顕微鏡の高倍率（倍率４００倍）視野当たり１．５、２、２．５または３である。別の態様では、癌から採取した組織試料の腫瘍内のＴｒｅｇまたはＭ２腫瘍関連マクロファージの中央カットオフ値は、顕微鏡の高倍率（倍率４００倍）視野当たり２である。顕微鏡の高倍率（倍率４００倍）視野当たりの腫瘍内のＴｒｅｇまたはＭ２腫瘍関連マクロファージを判定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｇａｏら（２００７），Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  ２５（１８）：２５８６−２５９３にみることができる。
【００２５】
[0038]上記のものに加えて、高頻度のＭ２腫瘍関連マクロファージは、腫瘍試料当たり合計約２０，０００個の細胞に対する密度が２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個または６０個のＭ２マクロファージを意味する。別の態様では、腫瘍試料当たり合計約２０，０００個の細胞に対する密度が２０個、２５個または３０個のＭ２マクロファージを意味する。腫瘍試料中の総細胞数当たりのＭ２マクロファージの密度を求める方法は当該技術分野で公知であり、例えば、パラフィン包埋癌標本の１５μｍの免疫染色切片にレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）をベースとするフローサイトメトリーを実施することが挙げられる。例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４個、７：１９を参照されたい。
【００２６】
[0039]本明細書で定義される細胞傷害性免疫細胞のうちの１つまたは複数のものの「頻度の増大」は、本明細書で、例えばナチュラルキラー細胞の頻度の増大などで使用される場合、治療後の患者の細胞傷害性免疫細胞のうちの１つまたは複数のものの活性、増殖または発生が治療前に比べて増大することを意味する。
【００２７】
[0040]本明細書で定義される抑制性免疫細胞のうちの１つまたは複数のものの「減少」は、本明細書で、例えばＴｒｅｇを介するＴ細胞増殖抑制の減少などで使用される場合、治療後の抑制性免疫細胞の活性、増殖または発生が治療前に比べて減少することを意味する。
【００２８】
[0041]本明細書で定義される抑制性免疫細胞の１つまたは複数のものの「抑制」、例えばＴ細胞増殖の抑制などは、本明細書で使用される場合、本明細書で定義される抑制性免疫細胞のうちの１つまたは複数のものの活性、増殖または発生を低下させることを意味する。
【００２９】
[0042]本明細書に記載されるＥＺＨ２阻害剤としては、例えば、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性を阻害することが可能な小分子または生物製剤が挙げられる。阻害はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはその組合せで測定することができる。一態様では、本明細書に記載される方法のＥＺＨ２阻害剤は、ＥＰＺ−６４３８、ＥＰＺ００５６８７、ＥＰＺ０１１９８９、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、ＧＳＫ３４３、ＵＮＣ１９９９のほかにも、国際公開第２０１３／０７５０８３号、同第２０１３／０７５０８４号、同第２０１３／０７８３２０号、同第２０１３／１２０１０４号、同第２０１４／１２４４１８号、同第２０１４／１５１１４２号および同第２０１５／０２３９１５号に記載されているものから選択される。一代替態様では、本明細書に記載される方法のＥＺＨ２阻害剤は、
【００３０】
【化１】
2018522045.tif 000003
【００３１】
またはその薬学的に許容される塩から選択される。別の代替態様では、本明細書に記載される方法のＥＺＨ２阻害剤は、
【００３２】
【化２】
2018522045.tif 000004
【００３３】
またはその薬学的に許容される塩である。別の代替態様では、本明細書に記載される方法のＥＺＨ２阻害剤は、
【００３４】
【化３】
2018522045.tif 000005
【００３５】
またはその薬学的に許容される塩である。
[0043]本明細書にはこのほか、必要とする対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載されるＥＺＨ２阻害剤および治療有効量の本明細書で定義される免疫調節剤である第二の薬剤を投与することを含む方法が提供される。
【００３６】
[0044]ＥＺＨ２阻害剤および本明細書で定義される免疫調節剤の量は、一緒に相乗効果を誘発して、生体試料中または患者の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を抑え、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）を増加させ、好ましいＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をもたらし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）を増加させ、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を減少させ、ＥＺＨ２を阻害し、かつ／または本明細書に記載される１つもしくは複数の癌を治療する量である。
【００３７】
[0045]このほか、ＥＺＨ２阻害剤と本明細書に記載される免疫調節剤とを含む、医薬組成物が含まれる。
[0046]本明細書で使用される「治療」、「治療する」および「治療すること」という用語は、本明細書に記載される癌またはその１つもしくは複数の症状の進行を逆転させること、緩和することまたは阻害することを指す。例示的な癌の種類としては、例えば、副腎癌、腺房細胞癌、聴神経腫、末端黒子型黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性赤血球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、腺扁平上皮癌、脂肪組織新生物、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞巣状横紋筋肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、未分化大細胞リンパ腫、甲状腺未分化癌、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、星状細胞腫、非定型奇形ラブドイド腫瘍、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、芽細胞腫、骨癌、ブレンナー腫瘍、ブラウン腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、脳腫瘍、癌腫、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫、癌肉腫、軟骨腫瘍、セメント質腫、骨髄性肉腫、軟骨腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、腎明細胞肉腫、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、デゴス病、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫、胎児期発育不全性神経上皮腫瘍、未分化胚細胞腫、胎児性癌、内分泌腺新生物、内胚葉洞腫瘍、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、封入奇形胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞甲状腺癌、神経節腫、消化管癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛癌、巨細胞線維芽腫、骨巨細胞腫、膠腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グルカゴノーマ、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、胆嚢癌、胃癌、有毛細胞性白血病、血管芽細胞腫、頭頸部癌、血管周皮腫、血液系悪性腫瘍、肝芽腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、浸潤性小葉癌、腸癌、腎臓癌、喉頭癌、悪性黒子、致死性正中癌、白血病、ライディッヒ細胞腫、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、麦芽リンパ腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫、悪性トリトン腫瘍、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、肥満細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、乳腺髄様癌、甲状腺髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性尿路上皮癌、ミュラー管混合腫瘍、粘液性腫瘍、多発性骨髄腫、筋組織新生物、菌状息肉症、粘液性脂肪肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻咽腔癌、神経鞘腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、眼癌、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、好酸性顆粒細胞腺腫、視神経鞘髄膜腫、視神経腫瘍、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、パンコースト腫瘍、乳頭様甲状腺癌、傍神経節腫、松果体芽腫、松果体細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、多胎芽腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、膵臓癌、咽頭癌、腹膜偽粘液���、腎細胞癌、腎髄様癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター転換、直腸癌、肉腫、神経鞘腫症、精上皮腫、セルトリ細胞腫、性索性腺間質腫瘍、印環細胞癌、皮膚癌、小円形青色細胞腫瘍、小細胞癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチノーマ、煤煙性疣贅、脊椎腫瘍、脾辺縁帯リンパ腫、扁平上皮癌、滑膜肉腫、セザリー病、小腸癌、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、莢膜細胞腫、甲状腺癌、移行細胞癌、咽喉癌、尿膜管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌、ブドウ膜黒色腫、子宮癌、疣状癌、視覚経路神経膠腫、外陰癌、腟癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００３８】
[0047]一態様では、本明細書に記載される方法または組合せによって治療される癌は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、Ｔ細胞リンパ腫、ブドウ膜黒色腫、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、黒色腫および神経膠腫から選択される。別の態様では、癌は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）およびＴ細胞系急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）から選択される。別の態様では、癌は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺扁平上皮癌、多形神経膠芽腫およびびまん性巨細胞腫から選択される。別の態様では、治療される癌は非ホジキンリンパ腫である。
【００３９】
[0048]このほか、本明細書に記載される１つまたは複数の癌、例えば高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌などを治療する薬剤の製造への本明細書に記載されるＥＺＨ２阻害剤の使用が含まれる。このほか、本明細書に記載される１つまたは複数の癌、例えば高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌などを治療する薬剤の製造において、任意選択で薬学的に許容される担体とともに、ＥＺＨ２阻害剤と本明細書に記載される免疫調節剤とを含む、医薬組成物が含まれる。このほか、癌、例えば高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌などを有する対象の治療に使用するＥＺＨ２阻害剤が含まれる。さらに、任意選択で薬学的に許容される担体とともに、ＥＺＨ２阻害剤と本明細書に記載される免疫調節剤とを含み、本明細書に記載される１つまたは複数の癌、例えば高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌などの治療に使用する、医薬組成物が含まれる。
【００４０】
[0049]さらに、有効量の本明細書に記載されるＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、包装された組成物であって、高頻度の１つまたは複数の抑制性免疫細胞を特徴とする癌に罹患している対象を治療するための指示書とともに包装された組成物が提供される。一態様では、包装された組成物は、有効量の本明細書に記載される免疫調節剤をさらに含む。
【００４１】
[0050]「薬学的に許容される担体、補助剤または賦形剤」という用語は、一緒に製剤化する化合物の薬理活性に悪影響を及ぼさず、ヒトに使用しても安全な無毒性の担体、補助剤または賦形剤を指す。本開示の組成物に使用し得る薬学的に許容される担体、補助剤または賦形剤としては、特に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸塩など、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース一水和物、ラウリル硫酸ナトリウムおよびクロスカルメロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、ロウ、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００４２】
[0051]本明細書の組成物および投与方法は、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸内投与、経鼻投与、頬側投与、経膣投与または埋め込みリザーバーを介する投与であり得る。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技術を包含する。
【００４３】
[0052]他の投与形態については、国際公開第２０１３／０７５０８３号、同第２０１３／０７５０８４号、同第２０１３／０７８３２０号、同第２０１３／１２０１０４号、同第２０１４／１２４４１８号、同第２０１４／１５１１４２号および同第２０１５／０２３９１５号に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００４４】
[0053]ここまで、これの実施形態をいくつか記載してきたが、本発明者らの基本的な実施例を改変して、本開示の化合物および方法を用いる他の実施形態とし得ることは明らかである。したがって、本開示の範囲は、これまでに例として示した特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲により定められるべきであることが理解されよう。
【００４５】
[0054]本願全体を通じて引用される全参考文献（参考論文、発行済み特許、特許出願公開および同時係属特許出願を含む）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれることをここに明記する。特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、当業者に一般に知られている意味を有する。
【００４６】
[0055]阻害剤１は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｗ．Ｄ．ら（２０１４），ＥＥＺＨ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ３Ｋ２７  Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，１４６３−１４７５に記載されている方法に従って調製した。
【００４７】
[0056]阻害剤４は、国際公開第２０１３／１２０１０４号に記載されている方法に従って調製した。
[0057]材料および方法
[0058]Ｔｒｅｇ分化およびＲＮＡ−ｓｅｑ。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ社（コルマール、ペンシルベニア州）からＬｅｕｋｏｐａｋ試料を入手し、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）密度勾配遠心分離により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＭｉｌｔｅｎｙｉナイーブヒトＴ細胞単離キット（１３０−０９４−１３１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ＰＢＭＣからナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を９８％超の純度になるまで単離した。単離細胞をｉＴｒｅｇ極性化条件下、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（１１１３２Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＧＦβおよび１０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（それぞれ１００−Ｂおよび２０２−ＩＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて１０６細胞／ｍＬで培養した。活性化から６時間後、２４時間後、３日後および４日後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキットを用いてｉＴｒｅｇ培養物からＲＮＡを単離し、フロリダ州のＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社にてシーケンシングを実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑで得たリードを、ＴｏｐＨａｔ  ｖ１．４．１をパラメータ、ｐ２−−ｌｉｂｒａｒｙ−ｔｙｐｅｆｒ−ｕｎｓｔｒａｎｄｅｄで用いてｈｇ１９バージョンのヒトゲノムにマッピングした。ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｂｏｗｔｉｅ＿ｉｎｄｅｘｅｓ／からｈｇ１９  ｂｏｗｔｉｅゲノムインデックスをダウンロードした。２つ組のリードペアを除去した後、さらに処理した。ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ−７３／ｇｔｆ／ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３７．７３．ｇｔｆ．ｇｚから入手した参照トランスクリプトーム、Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３７．７３．ｃｈｒ．ｇｔｆに対して、パラメータ−−ｎｏ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ−ｌｅｎｇｔｈ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎおよび−−ｌｉｂｒａｒｙ−ｔｙｐｅ  ｆｒ−ｕｎｓｔｒａｎｄｅｄを用いてＣｕｆｆｌｉｎｋｓを実行した。発現が推定できなかった試行をＮＡとし、残りの解析については無視した。
【００４８】
[0059]ＣｈＩＰ。ナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をｉＴｒｅｇ極性化条件（上記の通り）下、５μＭの阻害剤１またはＤＭＳＯで４日間処置した。１％ホルムアルデヒドを含む細胞培地で細胞４×１０７個を１０分間架橋した。最終濃度１２５ｍＭのグリシンを１０分間用いてホルムアルデヒド−架橋を停止させた。細胞をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤を添加したＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを液体窒素で急速冷凍し、次の準備が整うまで−８０℃で保管した。氷上で冷溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、プロテアーゼ阻害剤）１ｍｌを加えて細胞ペレットを解凍し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、３．５分、計１５分（サイクル：１０秒オン、３０秒オフ）に設定したマイクロチッププローブ超音波処理器（Ｂｒａｎｓｏｎ社）を用いて、試料を氷上で超音波処理した。試料を清澄化し、上清を収集した。可溶化液に追加のＣｈＩＰ希釈緩衝液（１．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１６７ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えてＳＤＳ濃度を０．１％まで低下させた後、抗体を加えた。免疫沈降には、細胞２×１０７個のクロマチンに抗ＥＺＨ２抗体（０７−６８９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）４μｇを加え、４℃で一晩インキュベートした。ヒストン修飾ＣｈＩＰには、細胞１０×１０６個のクロマチンに、ショウジョウバエＳ２細胞１．２５×１０５個のクロマチンを超音波処理したものおよび正規化対照に用いる抗Ｈ２Ａｖ抗体（３９７１５、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社）２μｌとともに抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体（９７３３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）４μｇを加え、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質Ｇ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１試料当たり５０μｌ加えることにより抗体−クロマチン複合体を捕捉した。ビーズ−クロマチン混合物を回転させながら４℃で１時間インキュベートした。抗体−タンパク質−ＤＮＡが結合したビーズをＲＩＰＡ洗浄緩衝液（０．１％ＳＤＳ、０．１％ＤＯＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回、ＲＩＰＡ５００洗浄緩衝液（０．１％ＳＤＳ、０．１％ＤＯＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回、ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（０．５％ＤＯＣ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３回、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。溶離緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて６５℃で１時間、断続的に攪拌しながらＤＮＡ−タンパク質複合体をビーズから溶離した。溶離したクロマチンに６５℃で４時間、架橋反転を実施した。架橋が外れたＤＮＡを３７℃で３０分間、０．２５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡで処理し、次いで５５℃で１時間、プロテイナーゼＫ消化（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を実施した。ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）によってＤＮＡを精製し、緩衝液ＥＢ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）で溶離した。
【００４９】
[0060]免疫沈降し精製したＤＮＡにＯｖａｔｉｏｎ  Ｕｌｔｒａｌｏｗ  ＤＲ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ社）を製造業者の指示通りに用いて、各試料について固有にバーコード化したライブラリーを作製した。各ライブラリーの調製にはＤＮＡを１０ｎｇ用いた。各ライブラリーの調製にはＰＣＲ増幅を１７サイクル実施した。キットにより提供された異なるバーコードを用いて、３つの試料を同時に増幅した。ライブラリー調製の最後のビーズ精製段階の後、ＤＮＡを２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で泳動させ、２００〜３５０ｂｐのＤＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムにより精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ社）でＤＮＡの品質を評価し、次いで、ＭＩＴ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のＢｉｏＭｉｃｒｏ  ＣｅｎｔｅｒにあるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑでシーケンシングを実施した。
【００５０】
[0061]Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイ。Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイ（ＨＴＨ１７ＭＡＧ−１４Ｋ−１２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を製造業者のプロトコル通りに用いて、第４日の細胞上清のサイトカインを定量化した。
【００５１】
[0062]Ｔｒｅｇ抑制アッセイ。ヒトｉＴｒｅｇをＤＭＳＯまたは５μＭの阻害剤１の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間分化させた（上記の通り）。４日目に細胞をＤｙｎａｂｅａｄによる刺激から取り出し、洗浄し、カウントした。製造業者のプロトコルを用いてＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；Ｃ３４５５４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でナイーブＴ細胞を標識した。ナイーブＴ細胞とｉＴｒｅｇの共培養を１：２、１：４および１：８の比でセットした。Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）をビーズと細胞の比が１：８になるよう加えた。
【００５２】
[0063]ＥＺＨ２のレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン。ナイーブヒトＴ細胞を上記の通りにｉＴｒｅｇ誘導条件下で培養し、活性化から約１６時間後、ＥＺＨ２に特異的なｓｈＲＮＡを保有するレンチウイルス（１タンパク質当たり３つの独立したヘアピンをｐＬＫＯ．１ベースのレンチウイルスベクターにクローン化した；下の表）を感染させた。８μｇ／ｍＬのｓｅｑｕａｂｒｅｎｅ（Ｓ２６６７−１ＶＬ、Ｓｉｇｍａ社）の存在下でＴ細胞にレンチウイルス上清を加え、次いで、３０℃、２１００ｒｐｍで９０分間、スピン感染を実施した。２４時間後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンの添加によって形質導入細胞を選別し、ＧＦＰ蛍光を測定することにより感染率をモニターした。第７日のｉＴｒｅｇ培養物を用いて抑制アッセイをセットし、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（６５−０８４２−９０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でナイーブＴ細胞を標識した。
【００５３】
【表１】
2018522045.tif 000006
【００５４】
[0064]腫瘍移植および投薬。ＣＴ２６マウス結腸癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大培養し、６〜８週齢の雌ＢＡＢＬ／Ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社）の皮下側腹部領域にマウス１匹当たり１×１０５個の細胞を５０％マトリゲルで接種した。腫瘍が触知可能（２００ｍｍ３）になってからマウスを無作為化し、同日に投与を開始した。阻害剤１を２００ｍｇ／ｋｇで１日２回皮下投与し、ＰＤ−１抗体（クローン：ＲＭＰ１−１４、ＢＥ０１４６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）を２００μｇ／マウスで３〜４日毎に腹腔内投与した。２〜３日毎に腫瘍を測定し体重を記録した。
【００５５】
[0065]腫瘍浸潤細胞の単離および分析。腫瘍を小片に細切し、３７℃で３０分間、３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡおよび１００μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩで消化した後、ＦＢＳを加えた。４０μＭフィルターを用いて消化済みの腫瘍塊をろ過し、遠心沈降させ、ＰＢＳで洗浄した。免疫細胞を可視化し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメトリー分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でＦＡＣＳにより定量化した。
【００５６】
[0066]マウス抗体。ＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｆｃブロック；１４−０１６１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ４５  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０（４８−０４５１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ３ｅ  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（４５−００３１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ４  ＡＰＣ（１７−００４１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ８ａ  ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎｅ７（２５−００８１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（１１−０４５１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ１１ｂ  ＰＥ（１２−０１１２−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｆ４／８０  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（４５−４８０１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｌｙ−６Ｃ  ＡＰＣ（１７−５９３２−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ１６０  ＰＥ（１２−１６０１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎｅ７（２５−３３５１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＮＫ１．１  ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（４７−５９４１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＩＦＮγ  ＡＰＣ（１７−７３１１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＴＮＦα  ＰＥ（１２−７３２１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ３ε  ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（４７−００３１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ１９  ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（４７−０１９３−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｋｉ−６７  ＦＩＴＣ（１１−５６９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ４  ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（４７−００４１−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＭＨＣ−ＩＩ（Ｍ／１１４．１５．２）−ＡｍＣｙａｍ／Ｖ５００（５６２３６６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＤ８α  ＡｍＣｙａｎ／Ｖ５００（５６０７７８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＤ２０６  ＦＩＴＣ（ＭＲＤ５Ｄ３）（ＭＣＡ２２３５ＦＡ、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、Ｌｙ−６Ｇ  ＰＥ／Ｃｙ７（１２７６１７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）。
【００５７】
[0067]ヒトＴｒｅｇ分化時にＰＲＣ２コア成分がアップレギュレートされ、その触媒成分であるＥＺＨ２は上記細胞に不可欠なクロマチン構造モジュレーターである。
[0068]Ｔｒｅｇ生物学におけるＥＺＨ２の役割を明らかにするため、Ｔｒｅｇ分化時にＥＺＨ２がＰＲＣ２コア成分であるＥＥＤおよびＳＵＺ１２とともに発現するかどうかを検討することから始めた。そのような目的で、６時間後、２４時間後、３日後および４日後、ナイーブヒトＴ細胞およびＴｒｅｇ系経路に沿って分化するＴ細胞（ＴＧＦ−β１およびＩＬ−２の存在下でＴ細胞受容体を介して活性化されるナイーブＴ細胞）のＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を実施した。ナイーブＴ細胞では、ＥＺＨ２、ＥＥＤおよびＳＵＺ１２の発現レベルはいずれも検出されない。しかし、Ｔｒｅｇに分化する際には、わずか６時間後にＰＲＣ２成分が３種類とも誘導され、検討した分化の残りの期間にわたって高発現を維持する（４日後；図１）。以上の観察結果は、ＰＲＣ２がヒトＴｒｅｇ分化に何らかの役割を果たすという考えと一致する。ＰＲＣ２の触媒成分であるＥＺＨ２がヒストンＨ３のリジン２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を駆動することから、強力で選択的なＥＺＨ２小分子阻害剤である阻害剤１を用いて、実際にＥＺＨ２がヒトＴｒｅｇ細胞に発現するのみならず、生化学的に活性であるかどうかを検討した。実際、クロマチン免疫沈降の後にディープシーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）を実施すると、ＥＺＨ２が上記の細胞の特定の抑制された遺伝子座に結合し、その阻害によってＨ３Ｋ２７トリメチル化がなくなることがわかる（図２）。
【００５８】
[0069]ＥＺＨ２はＦＯＸＰ３発現には必要ない。
[0070]転写因子ＦＯＸＰ３はＴｒｅｇ細胞に不可欠な調節因子であることが知られており、このため、その発現にＥＺＨ２が何らかの役割を果たすかどうかを理解することが重要である。そのような目的で、ナイーブヒトＴ細胞を漸増濃度の阻害剤１の存在下でＴｒｅｇに分化させ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により培養物を分析した。阻害剤１で処置した培養物とＤＭＳＯ対照で処置した培養物との間でＦＯＸＰ３＋細胞の頻度の差は検出されなかったことから、ＥＺＨ２阻害はＦＯＸＰ３発現に何ら影響を及ぼすことはなかった（図３Ａ）。同じ細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３は確実に減少していることから、上のようにＦＯＸＰ３発現に対して影響を及ぼさないのは、同化合物に生化学的活性がないことに起因するというわけではない（図３Ｂ）。さらに、培地にコードタンパク質のＩＦＮγ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１０が分泌されたことからわかるように、特定の遺伝子の発現に用量依存性の増大が観察された（図３Ｃ）。以上の観察結果を考え合わせると、ＥＺＨ２は、ＦＯＸＰ３発現に不可欠であるというわけではないが、ヒトＴｒｅｇ細胞の機能に重要な役割を果たしている可能性があることが示唆される。
【００５９】
[0071]ＥＺＨ２はヒトＴｒｅｇ細胞の活性に機能上必要なものである。
[0072]Ｔｒｅｇ細胞の基本的な生物学的機能の１つに、Ｔ細胞を含めた他の免疫細胞の増殖の抑制がある。このような機能は、いわゆる抑制アッセイを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討することが可能であり、このアッセイでは、Ｔｒｅｇ細胞をナイーブＴ細胞（「反応細胞」、Ｔｒｅｓｐ）と共培養し、ＦＡＣＳ色素であるＣＳＦＥまたはＰａｃ−Ｂｌｕｅの漸進的な希釈によってナイーブＴ細胞の増殖を追跡することができる。ＥＺＨ２阻害によって何らかの機能的結果が生じるかどうかを明らかにするため、阻害剤１またはＤＭＳＯ対照の存在下で分化させたＴｒｅｇ細胞を用いて抑制アッセイを実施した。予想された通り、Ｔｒｅｓｐ細胞に対するＤＭＳＯ処置Ｔｒｅｇ細胞の比が増大すると、Ｔｒｅｓｐ増殖の抑制が増大した。一方、阻害剤１の存在下で分化させたＴｒｅｇ細胞には、その抑制能の低下がみられ（図４）、Ｔｒｅｇ細胞の完全な生物活性にはＥＺＨ２の触媒活性が必要であることが明らかになった。重要なのは、阻害剤１がＴｒｅｓｐ単独の増殖には何ら影響を及ぼさなかったことである（図４）。直交アッセイを用いて、阻害剤１のオフターゲット効果の可能性を排除し、Ｔｒｅｇ活性にはＥＺＨ２が機能上必要であることを裏付けるため、Ｔｒｅｇ細胞分化条件下、ヒトＴ細胞に３つの独立したＥＺＨ２  ｓｈＲＮＡヘアピンをレンチウイルスで形質導入することにより、ＥＺＨ２発現を減少させた。ＥＺＨ２を標的とし対照は標的としない（ＮＴＣ）ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞では、ＥＺＨ２  ｍＲＮＡのレベルおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３全体のレベルの有意な低下がみられ、ＦＯＸＰ３タンパク質発現に対する影響は最小限に抑えられた（図５）。抑制アッセイでは、３種類いずれのヘアピンでもＴｒｅｇ細胞の抑制能の低下がみられた（図５）。以上のデータを考え合わせると、ＥＺＨ２はヒトＴｒｅｇ細胞の抑制能に機能上必要なものであり、この機能はＥＺＨ２の触媒活性に依存することがわかる。
【００６０】
[0073]ＥＺＨ２阻害によってＣＴ２６同種移植腫瘍モデルの腫瘍成長が阻害される。
[0074]最初に、ＣＴ２６癌細胞の処置がＥＺＨ２阻害に感受性を示すかどうかを評価した。免疫療法プロトコルを試験するモデルとして、また宿主免疫応答に関する試験にＣＴ２６癌細胞を用いるプロトコルは公知である。Ｔｒｅｇ、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＭ２マクロファージの調節に関しては好ましい結果が得られた（図６〜８）ものの、ＣＴ２６細胞が阻害剤１の投与に対して実質的に感受性を示さなかった（図９）のは当惑させるものであった。それでも、Ｔｒｅｇ細胞の抑制能にはＥＺＨ２が機能上必要であるという本発明者らの発見に基づき、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでは免疫による攻撃を逃れるために抑制経路が腫瘍細胞によって利用されることがわかっていることから、阻害剤１をｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験で検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに同系ＣＴ２６癌細胞（ＥＺＨ２阻害、阻害剤１に対して非感受性）を接種し、腫瘍が触知可能になってから、マウスを４つの処置群、すなわち、溶媒対照；抗ＰＤ１抗体（ＰＤ−１）；阻害剤１；組合せＰＤ１＋阻害剤１に無作為に割り付けた。２１日の処置期間の後、ＰＤ１処置群はわずかな有効性が認められるにとどまった。一方、阻害剤１で処置した場合、有意な有効性が認められた。組合せ群にも有効性が認められ、他のいずれのグループと比較しても有効性が高い傾向が見られた（図１０）。
【００６１】
[0075]ＥＺＨ２阻害によってｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍免疫応答が変化する。
[0076]図１１に図示する観察された有効性は、腫瘍にみられる免疫浸潤の変化を伴うものであった。試験終了時（第２２日）、マウスから腫瘍を単離し、消化し、ＦＡＣＳによる免疫細胞集団の定量化ができるよう免疫マーカーで染色した。阻害剤１＋αＰＤ１群には、ＰＤ１群のみと比較して増殖Ｔｒｅｇの割合の有意な減少および増殖ＣＤ８  Ｔ細胞の有意な増加がみられた（＊ｐ≦０．０５、スチューデントのＴ検定）。αＰＤ１群で有効性が低いことが観察されたのと同じく、特に組合せ群と比較して、このグループのみ増殖Ｔｒｅｇ細胞の増加とともに増殖細胞傷害性ＣＤ８細胞の減少がみられた（図１１）。この効果は、ＥＺＨ２阻害剤で処置したグループをＥＺＨ２阻害剤で処置しなかったグループと対照して一緒に分析しても明らかであった（図６）。
【００６２】
[0077]マウスおよびヒトでは、ＣＤ８  Ｔ細胞が抗腫瘍効果の主要なエフェクターであることがわかっている。本発明者らはほかにも、われわれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で予測されたもの以外の免疫細胞の変化を検討し、予想外の観察結果をいくつか得た。最初に、抗腫瘍活性の主要な駆動細胞でもあるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫＴ細胞は、阻害剤１処置個体では増加したが、αＰＤ１群では減少した（図１２）。この効果は、ＥＺＨ２阻害剤で処置したグループをＥＺＨ２阻害剤で処置しなかったグループと対照して一緒に分析しても明らかであった（図７）。次に、免疫抑制性であることが知られているＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、阻害剤１処置個体では減少したが、αＰＤ１処置個体では増加した（図１３）。この効果は、ＥＺＨ２阻害剤で処置したグループをＥＺＨ２阻害剤で処置しなかったグループと対照して一緒に分析した場合にも認められた（図８）。阻害剤１＋αＰＤ１で処置した場合の腫瘍体積の減少を図１０に示す。ほぼ同じ結果が阻害剤４でもみられた。漸増濃度の阻害剤４の存在下でＣＴ２６マウス結腸癌細胞の増殖を評価した。阻害剤４。図１４Ａからわかるように、阻害剤４は、阻害剤４の不在下で増殖させたＣＴ２６細胞と比較して有意な生存能の低下を引き起こすことはなかった。しかし、ＣＴ２６細胞を接種した免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスを用い、単一薬剤として、または抗マウスＰＤ１抗体と組み合わせて阻害剤４の効果を評価したところ、抗ＰＤ１と組み合わせた阻害剤４では、一部の個体に腫瘍成長の完全な抑制がみられた（図１４Ｂ）。抗ＰＤ１の不在下では、阻害剤４により腫瘍成長が溶媒処置対照個体と比較して中程度に遅くなった。
【００６３】
[0078]以上の新規のデータを考え合わせると、ＥＺＨ２阻害は単一薬剤として、また抗ＰＤ１抗体などのチェックポイント阻害剤と組み合わせて、癌免疫療法で実施可能な方法であることがわかる。
【００６４】
[0079]ここまで本発明の実施形態をいくつか記載してきたが、本発明者らの基本的な実施例を改変して、本発明の化合物および方法を用いる他の実施形態とし得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、これまでに例として示した特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲により定められるべきであることが理解されよう。
【図１】
2018522045.tif 000009
【図２】
2018522045.tif 000010
【図３】
2018522045.tif 000011
【図４】
2018522045.tif 000012
【図５】
2018522045.tif 000013
【図６】
2018522045.tif 000014
【図７】
2018522045.tif 000015
【図８】
2018522045.tif 000016
【図９】
2018522045.tif 000017
【図１０】
2018522045.tif 000018
【図１１】
2018522045.tif 000019
【図１２】
2018522045.tif 000020
【図１３】
2018522045.tif 000021
【図１４】
2018522045.tif 000022
【国際調査報告】
2018522045.tif 000023
2018522045.tif 000024
2018522045.tif 000025
2018522045.tif 000026