(57)【要約】  CD30に特異的に結合し、かつCD30を免疫学的に認識するキメラ抗原受容体 (CAR)が開示される。該CARに関連する、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物がまた開示される。哺乳動物における状態を治療又は予防する方法であって、該状態が、がんである方法がまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD30に対する抗原特異性を有するキメラ抗原受容体 (CAR)であって、以下：
(a)ヒト重鎖相補性決定領域 (CDR)1、ヒト重鎖CDR2、ヒト重鎖CDR3、ヒト軽鎖CDR1、ヒト軽鎖CDR2及びヒト軽鎖CDR3を含む抗CD30抗原結合ドメイン；
(b)ヒトヒンジドメイン；
(c)ヒト膜貫通ドメイン；並びに
(d)(i)ヒト細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン及び(ii)ヒトT細胞共刺激ドメインの一方又は両方、
を含む、CAR。
【請求項２】
抗原結合ドメインが、配列番号1〜6の各々のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のCAR。
【請求項３】
抗原結合ドメインが、配列番号7及び8の両方のアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のCAR。
【請求項４】
ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインが、ヒトCD8αのヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項５】
ヒトCD8αのヒンジドメイン及び膜貫通ドメインが、配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のCAR。
【請求項６】
細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、ヒトCD28、ヒト4-1BB及びヒトCD3ζのうちの1以上の、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項７】
ヒトCD28の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが配列番号12のアミノ酸配列を含み、ヒト4-1BBの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが配列番号14のアミノ酸配列を含み、及びヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のCAR。
【請求項８】
配列番号17又は18のアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項９】
ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、(i)ヒトCD28のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、並びに(ii)ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１０】
ヒトCD28のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号13のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のCAR。
【請求項１１】
ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項9又は10に記載のCAR。
【請求項１２】
配列番号16のアミノ酸配列を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のCARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１４】
請求項13に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項15に記載の、少なくとも2の宿主細胞を含む、宿主細胞集団。
【請求項１７】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のCAR、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の組換え発現ベクター、請求項15に記載の宿主細胞又は請求項16に記載の宿主細胞集団、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳動物における状態の治療又は予防における使用のための、請求項1〜12のいずれか1項に記載のCAR、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の組換え発現ベクター、請求項15に記載の宿主細胞、請求項16に記載の宿主細胞集団又は請求項17に記載の医薬組成物であって、該状態が、がんである、CAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団又は医薬組成物。
【請求項１９】
請求項18に記載の、使用のためのCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団又は医薬組成物であって、該がんがリンパ腫である、CAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団又は医薬組成物。
【請求項２０】
請求項18又は19に記載の、使用のための宿主細胞又は宿主細胞集団であって、該宿主細胞又は宿主細胞集団が哺乳動物に対して自己である、宿主細胞又は宿主細胞集団。
【請求項２１】
請求項18又は19に記載の、使用のための宿主細胞又は宿主細胞集団であって、該宿主細胞又は宿主細胞集団が哺乳動物に対して同種異系である、宿主細胞又は宿主細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2015年10月15日に出願された米国仮特許出願番号第62/241,896号（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）についての利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による取り込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に取り込まれる：2016年8月22日付けの「726313_ST25.txt」という名前の27,962バイトのASCII（テキスト）ファイル1件。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、公衆衛生に関する問題である。例えば、化学療法等の治療における進歩にも関わらず、リンパ腫を含む多くのがんについての予後は悪い場合がある。従って、がん、特にリンパ腫に対する追加的な治療の満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明の一実施形態は、CD30に対する抗原特異性を有するキメラ抗原受容体 (CAR)であって、以下：(a)ヒト重鎖相補性決定領域 (CDR)1、ヒト重鎖CDR2、ヒト重鎖CDR3、ヒト軽鎖CDR1、ヒト軽鎖CDR2及びヒト軽鎖CDR3を含む抗CD30抗原結合ドメイン；(b)ヒトヒンジドメイン；(c)ヒト膜貫通ドメイン；並びに(d)(i)ヒト細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン及び(ii)ヒトT細胞共刺激ドメインの一方又は両方、を含む、CARを提供する。
【０００５】
本発明の更なる実施形態は、本発明のCARに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物を提供する。
【０００６】
本発明の追加的な実施形態は、哺乳動物における状態を治療又は予防する方法であって、該状態が、がんである、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図面の幾つかの視点における簡単な説明
【図１】図1A及び1Bは、CD30+HHリンパ腫細胞株 (陽性対照)又は表示された健常な組織において、qPCRによって測定した、βアクチンのcDNA、105コピー当たりの、CD30のcDNAのコピー数を示すグラフである。
【図２】図2A〜2Cは、5F11-28Z (A)、5F11-CD828Z (B)及び5F11-CD8BBZ (C)のCARの構造をそれぞれ説明する概略図である。
【図３】図3は、5F11-28Zを発現するCFSE標識T細胞を、CD30-bv173細胞と共に培養した場合(CD30+、黒塗りのヒストグラム)又は陰性対照NGFR-bv173細胞と共に培養した場合(CD30陰性、白抜きのヒストグラム)の、蛍光色素CFSEの希釈の程度を示すヒストグラムである。
【図４】図4Aは、培養の様々な時点（日）での第一のドナー由来の生きた細胞の総数を示すグラフであって、T細胞は、非形質導入 (白四角)であったか、又は5F11-28Z (丸)、AC10-28Z (▲)若しくはXmAb2513-28Z (白三角)を形質導入された。図4Bは、培養の様々な時点（日）での第二のドナー由来の生きた細胞の総数を示すグラフであって、T細胞は、非形質導入 (菱形)であったか、又は5F11-28Z (丸)、AC10-28Z (▲)若しくはXmAb2513-28Z (白三角)を形質導入された。
【図５】図5A及び5Bは、培養の様々な時点（日）での第一（A）及び第二（B）のドナー由来の生きた細胞の総数を示すグラフであって、T細胞は、非形質導入 (白四角)であったか、又は5F11-28Z (▼)、5F11-CD8BBZ (▲)若しくは5F11-CD8-28Z (丸)を形質導入された。
【図６】図6は、5F11-28Z CARを形質導入したT細胞(エフェクター)(丸)と、HHリンパ腫細胞 (標的)を、様々なエフェクター：標的の割合で共培養した後に、測定したHH特異的な細胞傷害性のパーセントを示すグラフである。データは、CD30陰性の標的細胞CCRF-CEMの細胞傷害性のパーセントに対する、HH細胞の細胞傷害性のパーセントとして提示する。SP6-CD828Z CARを発現するT細胞(四角)を、陰性対照 (エフェクター)として用いた。
【図７】図7Aは、5F11-28Z (白丸)、5F11-CD828Z (黒丸)若しくはSP6-CD828Z (四角)のいずれかを形質導入したT細胞（800万）の静脈内注入で処理したマウス、又は処理していないマウス(白三角)の、T細胞注入後の様々な時点（日）での腫瘍サイズ (面積)(mm2)を示すグラフである。示される結果は、2回の実験結果を組み合わせた結果である。結果は、平均の標準誤差を伴った腫瘍サイズとして報告される。図7Bは、5F11-28Z (白丸)、5F11-CD828Z (黒丸)若しくはSP6-CD828Z (四角)のいずれかを形質導入したT細胞（800万）の静脈内注入で処理した、又は処理していない (白三角)、腫瘍を有するマウスの、T細胞注入後の様々な時点（日）での生存パーセントを示すグラフである。
【図８】図8Aは、0.67×106 (四角)、2×106 (三角)又は6×106 (丸)の、5F11-CD28Zを形質導入したT細胞の単回注入で処理したマウス、又は処理していないマウス(黒丸)内の、T細胞注入後の様々な時点（日）での腫瘍体積 (mm2)を示すグラフである。図8Bは、0.67×106 (四角)、2×106 (三角)又は6×106 (丸)の、5F11-CD28Zを形質導入したT細胞の単回注入で処理した、又は処理していない(黒丸)、腫瘍を有するマウスの、T細胞注入後の様々な時点（日）での生存パーセントを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、CD30に対する抗原特異性を有するCARであって、以下：(a)ヒト重鎖相補性決定領域 (CDR)1、ヒト重鎖CDR2、ヒト重鎖CDR3、ヒト軽鎖CDR1、ヒト軽鎖CDR2及びヒト軽鎖CDR3を含む、抗CD30抗原結合ドメイン；(b)ヒトヒンジドメイン；(c)ヒト膜貫通 (TM)ドメイン；並びに(d)(i)ヒト細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン及び(ii)ヒトT細胞共刺激ドメインの一方又は両方、を含む、CARを提供する。
【０００９】
CARは、T細胞シグナル伝達ドメインに連結した、抗体の抗原結合ドメイン(例、一本鎖可変フラグメント (scFv))を含有する、人工的に構築したハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。CARの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、MHC非拘束性の様式で、選択された標的にT細胞特異性及び反応性を向けなおす能力が挙げられる。MHC非拘束性の抗原認識によって、CARを発現する細胞に、抗原プロセッシングとは独立した抗原を認識する能力が与えられ、それゆえ腫瘍回避の主要な機構をバイパスする。更に、T細胞内で発現する場合、CARは、好都合なことに内在的なT細胞受容体 (TCR)α及びβ鎖と二量体化しない。
【００１０】
本発明のCARは、多くの利点を提供し得る。例えば、本発明のCARの構成要素の全て又は殆んど全ては、ヒト配列であり得る。従って、本発明のCARのヒト患者への投与は、非ヒト配列、例、マウス配列を含有するCARと比べて、ヒト患者内のCARに対する望ましくない免疫応答を引き起こす可能性がより低いものであり得る。
【００１１】
本発明のCARは、ヒトCD30(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー8 (TNFRSF8)としてもまた知られる)に対する抗原特異性を有する。CD30は、リンパ腫を含む多様なヒトがん細胞が発現又は過剰発現する。CD30を発現又は過剰発現するがんの例としては、それらに限定されないが、B細胞リンパ腫 (例えば、例、びまん性大B細胞リンパ腫 (DLBCL)、原発性縦隔B細胞リンパ腫 (PMBL)、ホジキンリンパ腫 (HL)、非ホジキンリンパ腫、縦隔グレーゾーンリンパ腫及び結節性硬化症HL等)並びにT細胞リンパ腫 (例えば、例、未分化大細胞リンパ腫 (ALCL)、非特定型末梢T細胞リンパ腫 (PTCL-NOS)及び血管免疫芽球T細胞リンパ腫 (AITL))が挙げられる。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、CD30に対する抗原特異的応答を誘発することによって、本発明のCARは、以下：CD30を発現するがん細胞を標的にし破壊すること、がん細胞を低減又は排除すること、腫瘍部位（複数可）に対して免疫細胞の浸潤を促進すること、及び抗がん応答を促進／拡張すること、の1以上を提供すると考えられる。
【００１２】
語句「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答を誘発する」は、本明細書で用いられる場合、抗原に対するCARの結合が免疫応答を誘発するよう、該CARが抗原 (CD30)に対して特異的に結合し、及び免疫学的に認識し得ることを意味する。
【００１３】
本発明の一実施形態は、5F11ヒト抗体 (「5F11」)の抗原結合ドメインを含むCARを提供する。5F11の抗原結合ドメインは、CD30に対して特異的に結合する。5F11抗体は、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第7,387,776号に記載される。
【００１４】
抗原結合ドメインは、5F11抗体の任意の抗原結合部分を含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、Fabフラグメント (Fab)、F(ab')2フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、一本鎖可変領域フラグメント (scFv)又はジスルフィド安定化可変領域フラグメント (dsFv)であり得る。好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインはscFvである。scFvは、抗体軽鎖のVドメインに合成ペプチドを介して連結された抗体重鎖の可変(V)ドメインを含む、トランケートFabフラグメントであり、通常の組換えDNA工学技術を用いて生成し得る。しかしながら、本発明のCARにおいて使用される抗CD30抗原結合ドメインは、これらの例示的な型の抗体フラグメントに限定されない。
【００１５】
抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み得る。本発明の一実施形態においては、重鎖可変領域は相補性決定領域 (CDR)1、CDR2及びCDR3を含む。好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインはヒト重鎖CDR1、ヒト重鎖CDR2及びヒト重鎖CDR3を含む。これに関して、抗原結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる1以上の重鎖CDR1；配列番号2のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる重鎖CDR2；及び配列番号3のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる重鎖CDR3を含み得る。好ましくは、重鎖は、配列番号1〜3のアミノ酸配列の全てを含む。
【００１６】
本発明の一実施形態においては、軽鎖可変領域は軽鎖CDR1、軽鎖CDR2及び軽鎖CDR3を含み得る。好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインは、ヒト軽鎖CDR1、ヒト軽鎖CDR2及びヒト軽鎖CDR3を含む。これに関して、抗原結合ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる1以上の軽鎖CDR1；配列番号5のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる軽鎖CDR2；及び配列番号6のアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる軽鎖CDR3を含み得る。好ましくは、軽鎖は配列番号4〜6の全てのアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインは配列番号1〜6のアミノ酸配列の全てを含む。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、抗原結合ドメインは重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインはヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を含む。抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、配列番号7のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、配列番号8のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。従って、本発明の一実施形態においては、抗原結合ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、抗原結合ドメインは、配列番号7及び8の両方のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態においては、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はリンカーによって連結され得る。リンカーは任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、リンカーは配列番号10を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。本発明の一実施形態においては、抗原結合ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含むscFvを含む。
【００１９】
本発明の一実施形態においては、抗原結合ドメインはリーダー配列を含む。リーダー配列は、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のアミノ末端に位置し得る。好ましくは、リーダー配列は軽鎖可変領域のアミノ末端に位置する。リーダー配列は、任意の好適なリーダー配列を含み得る。例えば、抗原結合ドメインは配列番号9を含む、それからなる又は本質的にそれからなるリーダー配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、リーダー配列が細胞の表面のCARの発現を促進し得る一方で、発現したCARにおけるリーダー配列の存在は、該CARが機能するために不必要であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞表面上のCARの発現に際して、リーダー配列の全部又は一部がCARから切除され得る。従って、本発明の一実施形態においては、CARはリーダー配列を欠く。
【００２０】
本発明の一実施形態においては、CARはヒンジドメイン及び膜貫通 (TM)ドメインを含む。好ましくは、ヒンジドメインはヒトヒンジドメインであり、TMドメインはヒトTMドメインである。ヒンジドメイン及びTMドメインは、ヒトCD8αのヒンジドメイン及びTMドメインを含み得る。これに関して、ヒトCD8αのヒンジドメイン及びTMドメインは、配列番号11のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。
【００２１】
本発明の一実施形態においては、CARは細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインはヒト細胞内T細胞シグナル伝達ドメインである。細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、ヒトCD28、ヒト4-1BB及びヒトCD3ζのうちの1以上の、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含み得る。CD28は、T細胞の共刺激において重要なT細胞マーカーである。ヒトCD28の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。4-1BBはまたCD137として参照され、T細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、そのことは、Tリンパ球の分化を促進し、及び長期間の生存を促進する。ヒト4-1BBの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。CD3ζはシグナルを生成するようTCRと会合し、免疫受容体チロシン活性化モチーフ (ITAM)を含有する。ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号15のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、CARは(i)ヒトCD8αのヒンジドメイン及びTMドメイン；(ii)ヒトCD28の細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン；並びに(iii)ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、を含む。これに関して、CARは配列番号11〜12及び15の全てのアミノ酸配列を含み得る。配列番号11〜12及び15の全てのアミノ酸配列を含むCARは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたように、抗原結合ドメインを更に含み得る。これに関して、CARは、(i)配列番号1〜6、11〜12及び15；(ii)配列番号7〜8、11〜12及び15；又は(iii)配列番号23、11〜12及び15のアミノ酸配列を含み得る。
【００２３】
本発明の一実施形態においては、CARは、(i)ヒトCD8αのヒンジドメイン及びTMドメイン；(ii)ヒト4-1BBの細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン；並びに(iii)ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。これに関して、CARは、配列番号11及び14〜15の全てのアミノ酸配列を含み得る。配列番号11及び14〜15の全てのアミノ酸配列を含むCARは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたように、抗原結合ドメインを更に含み得る。これに関して、CARは、(i)配列番号1〜6、11及び14〜15；(ii)配列番号7〜8、11及び14〜15；又は(iii)配列番号23、11及び14〜15のアミノ酸配列を含み得る。
【００２４】
本発明の一実施形態においては、CARは、(i)ヒトCD28のヒンジドメイン、TMドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、並びに(ii)ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。ヒトCD28のヒンジドメイン、TMドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。ヒトCD3ζの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号15のアミノ酸配列を含み得、それからなり得又は本質的にそれからなり得る。これに関して、CARは配列番号13及び15の両方のアミノ酸配列を含み得る。配列番号13及び15の両方のアミノ酸配列を含むCARは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたように、抗原結合ドメインを更に含み得る。これに関して、CARは、(i)配列番号1〜6、13及び15；(ii)配列番号7〜8、13及び15；又は(iii)配列番号23、13及び15のアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
本発明の一実施形態は、配列番号16〜18のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCARを提供する。配列番号16〜18のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCARの構成要素は、表1に記載される。
【００２６】
【表１】
2018531014.tif 000002
【００２７】
本発明の範囲には、本明細書に記載された本発明のCARの機能的変異体が含まれる。用語「機能的変異体」は、本明細書で用いられる場合、親CARと実質的又は有意に配列同一性又は類似性を有するCARを指し、その機能的変異体は、それが変異体であるところのCARの生物学的活性を保持する。例えば、機能的変異体は、親CARと類似する程度、同じ程度又はより高い程度に標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されたCAR(親CAR)の変異体を包含する。親CARに準拠して、例えば機能的変異体は、親CARに対してアミノ酸配列において、少なくとも約30％、約50％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％以上同一であり得る。
【００２８】
例えば、機能的変異体は、少なくとも1の保存的アミノ酸置換を有する親CARのアミノ酸配列を含み得る。代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも1の非保存的アミノ酸置換を有する親CARのアミノ酸配列を含み得る。このケースにおいては、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性と干渉しないか、又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が親CARと比べて増強するよう、機能的変異体の生物学的活性を促進し得る。
【００２９】
本発明のCARのアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、ある物理的及び／又は化学的性質を有する1つのアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負電荷の極性アミノ酸を別の酸性／負電荷の極性アミノ酸（例、Asp又はGlu）に置換、非極性側鎖を有するアミノ酸を別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等）に置換、塩基性／正電荷の極性アミノ酸を別の塩基性／正電荷の極性アミノ酸（例、Lys、His、Arg等）に置換、極性側鎖を有する電荷を持たないアミノ酸を別の極性側鎖を有する電荷を持たないアミノ酸（例、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等）に置換、β分枝側鎖を有するアミノ酸を別のβ分枝側鎖を有するアミノ酸(例、Ile、Thr及びVal)に置換、芳香族側鎖を有するアミノ酸を別の芳香族側鎖を有するアミノ酸(例、His、Phe、Trp及びTyr)に置換等であり得る。
【００３０】
CARは、他の構成要素、例、他のアミノ酸がCARの生物学的活性を実質的に変更しないよう、特定のアミノ酸配列又は本明細書に記載された配列から本質的になり得る。
【００３１】
本発明の実施形態のCARは任意の長さのものであり得、すなわち、CARが生物学的活性、例、抗原に特異的に結合する、又は哺乳動物における状態を治療若しくは予防する能力等を保持する限り、任意のアミノ酸数を含み得る。例えば、CARは約50〜約5000アミノ酸長であり、例えば50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000以上のアミノ酸長であり得る。
【００３２】
本発明の実施形態のCARは、1以上の天然で生じたアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばアミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ-n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリシン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα-tert-ブチルグリシンが挙げられる。
【００３３】
本発明の実施形態のCARは、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、環化（例えばジスルフィド架橋を介した）、又は酸付加塩へ変換及び／又は任意で二量体化若しくは重合化し得る。
【００３４】
本発明の実施形態のCARは、当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。CARは、ポリペプチド又はタンパク質を作製する任意の好適な方法によって作製し得る。ポリペプチド及びタンパク質を、de novo合成する好適な方法は、当該技術分野において公知である。また、CARは、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (4thed.), Cold Spring Harbor Press (2012)に記載されるように標準的な組換え法により、本明細書に記載の核酸を用いて、組換えにより作製することができる。代替的に、本明細書に記載されたCARは、例えば、例、Synpep (Dublin, CA)及びMultiple Peptide Systems (Sandiego, CA)等の企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のCARは合成及び／又は組換え体であり得る。
【００３５】
本発明の一実施形態によって、本明細書に記載されたCARのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、更に提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されたリーダー配列、リンカー、抗原結合ドメイン、TMドメイン及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメインの任意の1以上をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、核酸は、表2に記載のヌクレオチド配列のいずれか1つを含む。
【００３６】
【表２】
2018531014.tif 000003
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般的にDNA又はRNAのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、天然の材料から合成又は取得（例、単離及び／又は精製）し得、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得、並びに天然の結合、非天然の結合又は未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見いだされるホスホジエステルの代わりに、例えば、ホスホロアミダイト結合若しくはホスホロチオエート結合等の改変されたヌクレオチド間結合を含有し得る。幾つかの実施形態においては、核酸は挿入、欠失、逆位及び／又は置換を何ら含まない。しかしながら、幾つかの例においては、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが好適であり得る。
【００３８】
本発明の一実施形態の核酸は、組換え体であり得る。本明細書で用いられる場合、用語「組換え体」は、(i)生細胞の外側で、天然又は合成の核酸セグメントを、生細胞中で複製できる核酸分子に連結することによって構築される分子、又は(ii)上記(i)に記載されるものの複製によって生じる分子、を指す。本明細書の目的のためには、複製はin vitro複製又はin vivo複製であり得る。
【００３９】
核酸は、他の構成要素、例、他のヌクレオチドが、コードされるCARの生物学的活性を実質的に変更しないよう、特定のヌクレオチド配列又は本明細書に記載された配列から本質的になり得る。
【００４０】
組換え体の核酸は、天然で生じない配列を有するか、又はそうでなければ2つの分離した配列のセグメントの人工的な組合せにより作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、しばしば化学合成によって達成され、又は、より一般的には、単離した核酸のセグメントの人工的な操作、例えば、例、Greenら、上記に記載されたもの等の遺伝子工学技術によって達成される。核酸は、当該技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Greenら、上記を参照。例えば、核酸は、天然で生じたヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加するよう、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された、様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、5-フルオロウラシル（fluorouracil）、5-ブロモウラシル（5-bromouracil）、5-クロロウラシル（5-chlorouracil）、5-ヨードウラシル（5-iodouracil）、ヒポキサンチン（hypoxanthine）、キサンチン（xanthine）、4-アセチルシトシン（4-acetylcytosine）、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル（5-(carboxyhydroxymethyl)uracil）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine）、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル（5-carboxymethylaminomethyluracil）、ジヒドロウラシル（dihydrouracil）、β-D-ガラクトシルキューオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン（inosine）、N６-イソペンテニルアデニン（N６-isopentenyladenine）、1-メチルグアニン（1-methylguanine）、1-メチルイノシン（1-methylinosine）、2,2-ジメチルグアニン（2,2-dimethylguanine）、2-メチルアデニン（2-methyladenine）、2-メチルグアニン（2-methylguanine）、3-メチルシトシン（3-methylcytosine）、5-メチルシトシン（5-methylcytosine）、N６-置換アデニン（N６-substituted adenine）、7-メチルグアニン（7-methylguanine）、5-メチルアミノメチルウラシル（5-methylaminomethyluracil）、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル（5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil）、β-D-マンノシルキューオシン（beta-D-mannosylqueosine）、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル（5'-methoxycarboxymethyluracil）、5-メトキシウラシル（5-methoxyuracil）、2-メチルチオ-N６-イソペンテニルアデニン（2-methylthio-N6-isopentenyladenine）、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)（uracil-5-oxyacetic acid (v)）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル（pseudouracil）、キューオシン（queosine）、2-チオシトシン（2-thiocytosine）、5-メチル-2-チオウラシル（5-methyl-2-thiouracil）、2-チオウラシル（2-thiouracil）、4-チオウラシル（4-thiouracil）、5-メチルウラシル（5-methyluracil）、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル（3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil）及び2,6-ジアミノプリン（2,6-diaminopurine）が挙げられるが、それらに限定されない。代替的に、本発明の核酸の１以上は、例えば、例、Macromolecular Resources (Fort Collin、CO)及びSynthegen (Houston, TX)等の企業から購入できる。
【００４１】
核酸は、本明細書に記載されたCARのいずれかをコードする、単離又は精製された任意のヌクレオチド配列を含み得る。代替的に、ヌクレオチド配列は、いずれかの配列に退縮する（degenerate）又は退縮配列の組合せである、ヌクレオチド配列を含み得る。
【００４２】
本発明の一実施形態はまた、本明細書に記載されたいずれかの核酸のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載されたいずれかの核酸のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸を提供する。
【００４３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシーな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に濃い量で、標的配列（本明細書に記載された核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件には、ヌクレオチド配列と一致するいくつかの小さな領域（例えば、3〜10塩基）を偶然有するランダム配列から正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は散在する僅かなミスマッチを含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別しうる条件が含まれる。そのような相補性の小領域は、14〜17塩基又はそれ以上の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションによりそれらが容易に区別され得る。比較的、高ストリンジェンシーの条件には、例えば、約50〜70℃の温度で、約0.02〜0.1MのNaCl又はそれと同等なものによって提供されるような、低塩条件及び／又は高温条件が含まれる。そのような高ストリンジェンシーな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあれば、殆んど許容せず、本明細書に記載された本発明のCARのいずれかの発現を検出するのに特に適している。ホルムアミド添加量を増加することにより、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に理解されている。
【００４４】
本発明の一実施形態においては、核酸は、CARをコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を含む。如何なる特定の理論又は機構に拘束されることもないが、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、mRNA転写産物の翻訳効率を上昇させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、ネイティブのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用できるtRNAによって翻訳され得る別のコドンに置換することを含み得、それゆえ翻訳効率が上昇する。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳に干渉するであろうmRNAの二次構造を減少させ得、それゆえ翻訳効率が上昇する。これに関して、CARをコードする核酸は、配列番号20〜22のいずれか1つの、コドンを最適化したヌクレオチド配列を含み得る。
【００４５】
本発明はまた、本明細書に記載された、いずれかの核酸のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約70％以上、例、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％又は約99％同一である、ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００４６】
一実施形態においては、本発明の核酸は、組換え発現ベクターに取り込まれ得る。これに関して、本発明の一実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のためには、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトがmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるために十分な条件下でベクターを細胞と接触させるとき、宿主細胞による、mRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは全体として天然で生じるものではない。しかしながら、ベクターの部分は天然に生じ得る。本発明の組換え発現ベクターは、一本鎖又は二本鎖であり得、天然の材料から部分的に合成又は取得され得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る、DNA及びRNAを含むが、それらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。該組換え発現ベクターは、天然で生じたヌクレオチド間結合、天然で生じないヌクレオチド間結合、又はその両方の型の結合を含み得る。好ましくは、非天然で生じた若しくは改変されたヌクレオチド、又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨害しない。
【００４７】
一実施形態においては、本発明の組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために用い得る。好適なベクターとしては、例えばプラスミド及びウイルス等の増殖及び増幅（expansion）のため若しくは発現のため、又はその両方のために設計されたものが挙げられる。該ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences, Glen Burine, MD）、pBluescriptシリーズ（Stratagene, LaJolla, CA）、pETシリーズ（Novagen, Madison, WI）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）及びpEXシリーズ（Clonetech, Palo Alto, CA）からなる群から選択され得る。バクテリオファージベクター、例えば、λGT10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4及びλNM1149等もまた使用され得る。植物発現ベクターの例としては、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及びpBIN19（Clonetech）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、pEUK-C1、pMAM及びpMAMneo（Clonetech）が挙げられる。組換え発現ベクターはウイルスベクター、例、レトロウイルスベクターであり得る。本発明の一実施形態においては、ベクターはガンマ・レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はトランスポゾンである。
【００４８】
一実施形態においては、本発明の組換え発現ベクターは、例えばGreenら、上記に記載された標準的な組換えDNA技術を用いて調製され得る。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞において機能的である複製システムを含有するように調製され得る。複製システムは、例、ColE1、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルス等に由来するものであり得る。
【００４９】
組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがDNAベースであるか、又はRNAベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の型（例、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な、例えば転写の、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の調節配列を含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを促進するために制限酵素認識部位を含み得る。
【００５０】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性等を含む。本発明の発現ベクターのための好適なマーカー遺伝子としては、例えばネオマイシン／G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００５１】
組換え発現ベクターは、本発明のCARをコードするヌクレオチド配列、又は本発明のCARをコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、ネイティブ又は非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例、強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも当業者の通常の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
【００５２】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現若しくは安定した発現のいずれかのために、又はその両方のために、設計され得る。また、組換え発現ベクターは構成的発現又は誘導的発現のために作製され得る。
【００５３】
更に、組換え発現ベクターは自殺遺伝子を含むよう作製され得る。本明細書において用いられる場合、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に、試薬、例、薬剤、に対する感受性を付与し、細胞がその試薬と接触若しくはそれに対して曝露される場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（cytosine daminase）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【００５４】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例、植物、動物、菌類若しくは藻類であり得、又は原核細胞、例、バクテリア又は原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞であり得、すなわち生物、例、ヒトから直接単離し得る。宿主細胞は、付着細胞又は懸濁細胞、すなわち懸濁液中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は当該技術分野で公知であり、例、DH5α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は原核細胞、例、DH5α細胞である。CARを産生する目的のために、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型であり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発生段階であり得る一方、宿主細胞は末梢血リンパ球（PBL）又は末梢血単核細胞（PBMC）であっても良い。宿主細胞はB細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞又はT細胞であっても良い。
【００５５】
本明細書の目的のために、T細胞は、例えば培養T細胞、例、初代T細胞、又は培養T細胞株由来のT細胞、例、Jurkat, SupT1等、又は哺乳動物から得られたT細胞等の任意のT細胞であり得る。哺乳動物から得られた場合、T細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺若しくは他の組織又は体液を含むが、これらに限定されない多数の供給源から得ることができる。T細胞はまた濃縮又は精製し得る。T細胞はヒトT細胞であっても良い。T細胞はヒトから単離したT細胞であっても良い。T細胞は、CD4＋／CD8＋二重陽性T細胞、CD4＋ヘルパーT細胞、例、Th1及びTh2細胞、CD8＋T細胞（例、細胞傷害性T細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶T細胞、ナイーブT細胞等を含むが、これらに限定されない、任意の型のT細胞であり得、任意の発生段階のT細胞であり得る。T細胞は、CD8＋T細胞又はCD4＋T細胞であっても良い。
【００５６】
また本発明の一実施形態によって、本明細書に記載された少なくとも2の宿主細胞を含む細胞集団が提供される。細胞集団は、少なくとも1の他の細胞、例、組換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例えば、T細胞）、又はT細胞以外の細胞、例、B細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加え、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均一な集団であり得る。代替的に、細胞集団は、集団が組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例、本質的にそれからなる）、実質的に均質な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むよう、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載された組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００５７】
本発明の一実施形態においては、集団内の細胞数を急速に増幅させ得る。CARを発現する細胞数の増幅は、例えば米国特許第8,034,334号；米国特許第8,383,099号；米国特許出願公開番号第2012/0244133号；Dudleyら、J. Imm nother., 26:332-42 (2003)；及びRiddellら、J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載のように、当該技術分野において公知である多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、細胞数の増幅は、T細胞をOKT3抗体、IL-2及びフィーダーPBMC（例、放射線照射した同種異形PBMC）と共に培養することによって実施される。
【００５８】
CAR、機能的変異体、核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞 (それらの集団を含む)は、単離及び／又は精製され得、それらの全ては以後、「本発明の抗CD30材料」と総称的に言及される。本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」又は「単離された」は、完全な精製又は単離を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図される。それゆえ、例えば、精製された（単離された）宿主細胞の調整物は、宿主細胞が、体内の自然な環境における細胞よりも高純度なものである。そのような宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって生成し得る。幾つかの実施形態においては、宿主細胞の調整物は、宿主細胞が調製物の総細胞含有量の少なくとも約50％、例えば、少なくとも約70％に相当するよう、精製される。例えば、純度は、少なくとも約50％であり得、約60％、約70％若しくは約80％超であり得、又は約100％であり得る。
【００５９】
本発明の抗CD30材料は、例えば医薬組成物等の組成物に製剤化し得る。これに関して、本発明の一実施形態は、本明細書に記載された本発明の抗CD30材料のいずれか、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の抗CD30材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、1超の本発明の抗CD30材料、例、CAR及び核酸を含み得る。代替的に、医薬組成物は、例えば、例、アスパラギナーゼ（asparaginase）、ブスルファン（busulfan）、カルボプラチン（carboplatin）、シスプラチン（cisplatin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、フルオロウラシル（fluorouracil）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、メトトレキセート（methotrexate）、パクリタキセル（paclitaxel）、リツキシマブ（rituximab）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）等の化学療法剤等の、他の医薬的な活性剤又は薬剤との組合せで、本発明のCAR材料を含み得る。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、本発明の宿主細胞又はその集団を含む。
【００６０】
好ましくは、担体は医薬的に許容される担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の特定の本発明のCAR材料のために慣用的に使用されるもののいずれかであり得る。投与できる組成物を調製する方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press (2012)においてより詳細に記載されている。医薬的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００６１】
担体の選択は、特定の本発明のCAR材料によって、及び本発明のCAR材料を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物の多様な好適な製剤がある。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内又は腹腔内投与のための製剤のいずれかを含み得る。1超の経路が、本発明のCAR材料を投与するために使用され得、ある場合には、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答を提供し得る。
【００６２】
好ましくは、本発明のCAR材料は、注射（例、静脈内）によって投与される。本発明のCAR材料が本発明のCARを発現する宿主細胞（又はその集団）である場合、注射用細胞のための医薬的に許容される担体は、例えば、例、通常の生理食塩水（水中、約0.90％w/vのNaCl、水中約300 mOsm/LのNaCl、又は水1L当たり約9.0gのNaCl）、NORMOSOL R電解質溶液（Abbott, Chicago, IL）、PLASMA-LYTE A（Baxter, Deerfield, IL）、水中約5％のデキストロース又はリンゲル乳酸塩等の任意の等張な担体を含んでもよい。一実施形態においては、医薬的に許容される担体に、ヒト血清アルブミン（albumen）が補充される。
【００６３】
「有効量」又は「治療のための有効量」は、個人におけるがんを予防又は治療するために十分である用量を指す。治療又は予防における使用のための有効量は、例えば、患者の治療されている状態のステージや重篤度、年齢、体重、一般的健康状態、及び処方医の判断に依存する。用量のサイズはまた、選択された抗CD30材料、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定の抗CD30材料の投与に伴っておこり得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度、並びに望まれる生理学的効果によって決定される。当業者は、様々な状態(例、がん)は、投与の各々の又は様々なラウンドにおいて恐らく本発明の抗CD30材料（複数可）を用いた、複数の投与を含む、延長された治療を必要し得ることを理解する。
【００６４】
本発明のCAR材料の用量はまた、特定の本発明のCAR材料の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、例えば年齢、体重、一般的健康状態、食事、性別、投与される本発明のCAR材料、投与経路及び治療されている状態の重篤度等の様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療する本発明のCAR材料の投薬量を決定する。本発明のCAR材料が細胞集団である一実施形態においては、1回の注入当たりに投与される細胞数は、例、約1×106〜約1×1012細胞以上で変化し得る。
【００６５】
本発明の目的のために、投与される本発明の抗CD30材料の量又は用量は、妥当な時間枠で、対象又は動物内で治療又は予防応答をもたらすために十分でなければならない。例えば、本発明の抗CD30材料の用量は、CD30に結合するのに十分でなければならず、又は投与時から約2時間以上、例、約12〜約24時間以上の期間内に状態を治療若しくは予防するのに十分でなければならない。ある実施形態においては、期間は更に長くなる可能性がある。用量は、特定の本発明の抗CD30材料の有効性及び哺乳動物（例、ヒト）の状態、並びに治療される哺乳動物（例、ヒト）の体重によって決定される。
【００６６】
本発明の目的のために、例えば、T細胞の異なる用量がそれぞれ与えられた哺乳動物のセット中で、そのようなT細胞を哺乳動物に所与の用量で投与した際に、標的細胞が溶解される程度、及び／又は本発明のCARを発現するT細胞によって分泌されるIFN-γの程度を比較することを含むアッセイ法を、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために使用し得る。ある用量の投与の際に標的細胞が溶解される及び／又はIFN-γが分泌される程度は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイされ得る。
【００６７】
本発明の抗CD30材料（複数可）が1以上の追加の治療剤と共に投与される場合、1以上の追加の治療剤は、哺乳動物に対して共投与され得る。「共投与」は、本発明の抗CD30材料（複数可）が1以上の追加の治療剤の作用を促進し得、又はその逆であり得るよう、1以上の追加の治療剤及び本発明のCAR材料（複数可）を十分に近い時間内に投与することを意味する。これに関して、本発明の抗CD30材料（複数可）が最初に投与され得、1以上の追加の治療剤が2番目に投与され得、又はその逆であり得る。代替的に、本発明の抗CD30材料（複数可）及び1以上の追加の治療剤は、同時に投与され得る。CARを発現する細胞の機能を促進し得る追加の治療剤は、例えば、1以上のサイトカイン又は1以上の抗体 (例、PD-1機能を阻害する抗体)を含み得る。抗CD30材料（複数可）と共投与され得る例示的な治療剤は、IL-2である。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、IL-2は本発明の抗CD30材料（複数可）の治療効果を促進し得ると考えられる。
【００６８】
本発明の抗CD30材料及び医薬組成物は、哺乳動物における状態を治療又は予防する方法において使用され得ることが意図される。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、本発明の抗CD30 CARは、細胞によって発現される場合、抗CD30 CARが、抗CD30 CARが特異的であるCD30を発現する細胞に対して免疫応答を媒介できるよう、生物学的活性、例、CD30を認識する能力を有する。これに関して、本発明の一実施形態は、哺乳動物における状態を治療又は予防する方法であって、哺乳動物における状態を治療又は予防するための有効量で、本発明のCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び／又は医薬組成物のいずれかを哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。該状態は、CD30の発現又は過剰発現によって特徴づけられる任意の状態であり得る。好ましい実施形態においては、該状態は、がんである。
【００６９】
本発明の一実施形態は、本発明の抗CD30材料（複数可）を投与することに先立って、哺乳動物をリンパ枯渇させることを更に含む。リンパ枯渇の例としては、骨髄非破壊的（nonmyeloablative）リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的（myeloablative）リンパ球枯渇化学療法、全身放射線治療等が挙げられるが、それらに限定されない場合がある。
【００７０】
宿主細胞又は細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は哺乳動物に対して同種異系又は自己である細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物に対して自己である。
【００７１】
本明細書で言及する哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、例えばマウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及び例えばウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物はネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ科）を含むネコ目由来であっても良い。哺乳動物はウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目由来であっても良い。哺乳動物は霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人目（ヒト及び類人猿）であっても良い。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７２】
本発明の方法に関して、がんは任意のがんであり得る。好ましくは、がんはリンパ腫である。特に好ましい実施形態においては、がんはB細胞リンパ腫 (例えば、例、びまん性大B細胞リンパ腫 (DLBCL)、原発性縦隔B細胞リンパ腫 (PMBL)、ホジキンリンパ腫 (HL)、非ホジキンリンパ腫、縦隔グレーゾーンリンパ腫及び結節性硬化症HL等)、又はT細胞リンパ腫 (例えば、例、未分化大細胞リンパ腫 (ALCL)、非特定型末梢T細胞リンパ腫(PTCL-NOS)、血管免疫芽球T細胞リンパ腫 (AITL)及び他のT細胞リンパ腫等)である。好ましくは、がんは、CD30の発現又は過剰発現によって特徴付けられる。
【００７３】
本明細書において用いられる場合、用語「治療」及び「予防」並びにそれらから派生する用語は、必ずしも100％又は完全な治療若しくは予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、治療又は予防の様々な程度がある。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における、任意の量又は任意のレベル（any amount of any level）の状態の治療又は予防を提供し得る。更には、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されている、状態、例、がんの１以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、状態、例、がん又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。代替的に又は追加的に、「予防」は、状態、例、がん又はその症状若しくは状態の再発を遅延させることを包含し得る。
【００７４】
本発明の一実施形態においては、本発明のCARをコードする核酸は、本明細書に記載されたベクターのいずれかに導入される。次いで、ベクターは、任意の好適な技術、例えば、例、遺伝子編集、トランスフェクション、形質転換又は形質導入等によって、本明細書に記載された宿主細胞のいずれか(例、NK細胞又はT細胞)に導入し得る。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において公知であり、例えば、リン酸カルシウムDNA 共沈殿；DEAEデキストラン；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子衝突；及びリン酸ストロンチウムDNA共沈殿が挙げられる。ファージ又はウイルスベクターは、好適なパッケージング細胞中で感染性粒子を増幅後、宿主細胞に導入され得、それらの多くは市販されている。
【００７５】
本発明のCARをコードするベクターが導入されている、1以上の単離された宿主細胞 (例、NK細胞又はT細胞)は、本発明の抗CD30 CARを発現するための条件下、ex vivoで培養され得、次いでCD30を発現するがんによって侵された哺乳動物 (好ましくはヒト)に直接導入され得る。そのような細胞移入法は、「養子細胞移入 (ACT)」として、当該技術分野において参照される。
【００７６】
哺乳動物に対して宿主細胞 (例、T細胞又はNK細胞)が投与される場合、細胞は哺乳動物に対して同種異系又は自己であり得る。「自己」の投与方法においては、細胞が哺乳動物から回収され、保存（及び任意で改変）され、同じ哺乳動物に対して戻される。「同種異系」の投与方法においては、哺乳動物は、遺伝的に類似するが、同一でないドナー由来の細胞が接種される。好ましくは、細胞は哺乳動物に対して自己である。本発明の一実施形態においては、哺乳動物に投与される細胞は遺伝子編集されている。
【００７７】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物における状態の治療又は予防に使用するための、本発明のCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は医薬組成物のいずれかを提供し、該状態はがんである。がんは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された、がんのいずれかであり得る。
【００７８】
以下の実施例において、本発明を更に説明するが、言うまでもなく、決してその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７９】
以下の材料及び方法は、実施例1〜11において記載される実験において使用した。
【００８０】
細胞株及び初代細胞
これらの実験において使用するCD30+標的細胞は、CD30+リンパ腫細胞株SU-DHL-1 (リンパ腫、アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC))、HH (T細胞リンパ腫、ATCC)及びHDLM-2 (ホジキンリンパ腫、DSMZ)であった。別のCD30+標的 (CD30-bv173)を提供するために、ガンマレトロウイルスベクターMSGV (Hughesら、Human Gene Ther., 16(4): 457-472 (2005))を用いて、bv173と呼ばれる白血病細胞株（Adrian Wiestner、NHLBIの厚意で譲受）にCD30遺伝子を形質導入した。以下のCD30陰性細胞株：白血病細胞株ngfr-bv173 (MSGVγレトロウイルスベクターを用いて低アフィニティー神経成長因子遺伝子を形質導入したbv173)、T細胞白血病細胞株CCRF-CEM (ATCC)、Saos-2 (骨肉腫細胞株、ATCC)；A549 (肺がん細胞株、ATCC)；MDA-MB231 (乳がん細胞株、ATCC)、293GP (ヒト胚性腎細胞株、Steven Rosenberg、国立がん研究所 (NCI)の厚意で譲受)、TC71 (ユーイング肉腫細胞株、S.A. Rosenberg、NCIの厚意で譲受)、COLO205 (結腸がん細胞株、NCI腫瘍リポジトリ（repository）)、U251 (膠芽細胞腫細胞株、NCI腫瘍リポジトリ)及びPanc10.05 (膵臓がん細胞株、ATCC)を用いた。患者由来の原発性ヒトCD34+造血幹細胞をまた、標的として使用した。NCI IRBが承認した臨床試験に登録された患者由来の組織試料又は末梢血単核細胞(PBMC)を、T細胞培養を開始するために用いた。
【００８１】
CD30転写産物コピーを定量するためのリアルタイムqPCR
ヒトの通常の定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)アレイ (Origene, Rockville, MD)に含まれる48のヒト組織由来のcDNA試料におけるCD30 cDNAコピーを、CD30特異的プライマー及びプローブセット(Invitrogen, Waltham, MA)を用いたqPCRを実行することによって定量した。陽性対照として、CD30+リンパ腫細胞株HHのcDNA中のCD30 cDNAコピーを定量した。RNeasyミニキット(Qiagen, Venlo, Netherlands)を用いて、形質細胞腫細胞からRNAを抽出し、標準的な方法を用いてcDNAを合成した。CD30の完全長cDNAをコードするプラスミド (Origene)の希釈を増幅することによって、CD30 qPCRのための標準曲線を作成した。qPCRは、反応あたり10〜109コピーのCD30のコピー数を正確に検出した。Taqmanβアクチンプライマー及びプローブキット (Applied Biosystems, Grand Island, NY)を用いて、同じ組織におけるβアクチンcDNAコピー数をまた定量した。βアクチンプラスミドの連続希釈を増幅することによって、βアクチン標準曲線を作成した。全てのqPCR反応をRoche LightCycler480装置で行った。データは、100,000アクチンcDNAコピー当たりのCD30 cDNAコピーとして表した。
【００８２】
抗CD30キメラ抗原受容体 (CAR)の構築
4つの抗ヒトCD30抗体の配列を特許から得た。完全なヒト5F11及び17G1抗体 (米国特許第7,387,776号)、AC10マウス抗体 (米国特許出願公開番号第2005/0123536号)及びヒト化XmAb2513抗体 (米国特許出願公開番号第2012/0014943号)に由来する特異的な抗体配列を用いた。ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなHuMabマウスをワクチン接種することによって、5F11及び17G1抗体を得た。マウスはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであり、それゆえマウスは完全なヒト抗体を生成する。ヒトCD3を有するマウスをワクチン接種することによってcAC10マウス抗体を獲得し、XmAb2513はcAC10のヒト化型である。これらの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、以下のパターン：軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域、を有する一本鎖可変フラグメント (scFv)を設計するために用いた。リンカーは以下のアミノ酸配列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG (配列番号10)を有していた (Kochenderferら、J. Immunother., 32(7): 689-702 (2009))。
【００８３】
設計した最初の抗CD30 CAR DNAを、5F11-CD8BBZ (配列番号18)と命名した。このCARの配列は、5'末端から3'末端のこのパターン：CD8αリーダー配列 (配列番号9)、5F11 scFv (配列番号23)、ヒトCD8α分子のヒンジ及びTM領域 (配列番号11)、4-1BB (CD137)分子の細胞質部分 (配列番号14)、並びにCD3ζ分子の細胞質部分 (配列番号15)の通りであった。2つの型の5F11-CD8BBZを合成した。1つの型は、N末端RFVSSアミノ酸配列 (配列番号19)を含有する4-1BB配列を含み；他方の型はRFVSS配列 (配列番号19)を欠いていた。設計した次のCARは、scFvが17G1抗体由来の可変領域を有することを除き、5F11-CD8BBZと同一であった。CD28を含有するCARのシリーズを次に設計した。5F11-CD8BBZの4-1BB部分をCD28分子の細胞質ドメイン(配列番号12)で置換することによって、5F11-CD828Z (配列番号17)を設計した。5F11-28Z (配列番号16)を次に設計した。このCARは、5'から3'末端の以下のパターン：CD8αリーダー配列 (配列番号9)、5F11 scFv (配列番号23)、ヒトCD28分子のヒンジ及びTM及び細胞質領域 (配列番号13)、並びにCD3ζ分子の細胞質部分 (配列番号15)を有していた。5F11-28Zの5F11 scFvを、AC10又はXmAb2513 scFvでそれぞれ置換することによって、AC10-28Z及びXmAb2513-28Zを構築した。
【００８４】
2,4,6-トリニトロフェニルハプテンを認識するSP6 scFvを含有する陰性対照CARをまた構築した (Eshharら、PNAS, 90(2): 720-724 (1993))。このCARは、SP6-CD828Zとして参照する。SP6 CARは以前に報告され、CD8αヒンジ及びTM領域、CD28の細胞質部分、並びにCD3ζ分子のシグナル伝達ドメインを含有した(Carpenterら、Clin. Cancer Res., 19(8): 2048-2060 (2013))。SP6-CD828Z CARは、マウス又はヒトタンパク質を認識せず、陰性対照として使用した。
【００８５】
全てのCAR配列をコードするDNAのコドンを最適化し（co）、適切な制限酵素認識部位を含めて、Invitrogen (GeneArt)によって合成した。CAR配列を、pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPREと命名した、レンチウイルスベクタープラスミド(Yangら、J. Immunother., 33(6): 648-658 (2010))にライゲーションした。標準的な制限酵素及びライゲーション法を用いることによって、このベクターのcoDMF5部分をCAR配列で置換した。
【００８６】
レンチウイルス上清の産生
以前に公表されたプロトコール(Yangら、J. Immunother., 33(6): 648-658 (2010))を僅かに改変した版に従って、各CARをコードするレンチウイルスを含有する上清を産生した。上清を産生するために以下のプラスミド：pMD2.G (水疱性口内炎ウイルスエンベロープをコードする)、pMDLg/pRRE (gag及びpolをコードする)、pRSV-Rev (Revをコードする)、並びに適切なCARをコードするプラスミドを用いて、以前に詳述した(Yangら、J. Immunother., 33(6): 648-658 (2010))ように、293T-17細胞 (ATCC)をトランスフェクトした。トランスフェクション後、トランスフェクトした293T-17細胞を約40時間培養した。次いで、培養上清を回収し、遠心分離し、細胞残屑を除去した。次いで、Merk Millipore Ltd. (Billerica, MA)由来のAmicon Ultra-15限外濾過装置を用いて上清を限外濾過した。
【００８７】
T細胞形質導入
T細胞を以前に記載された様式(Kochenderferら、J. Immunother., 32(7): 689-702 (2009))と同様の様式で培養した。簡易には、5％ヒトAB血清 (Valley Biomedical, Winchester, VA)及び300国際単位(IU)／mLのインターロイキン-2 (IL-2、Chiron (Emeryville, CA))を含有するAIM V培地 (Invitrogen)中で、抗CD3モノクローナル抗体OKT3 (Ortho, Rochester, NY)を用いて、PBMCを刺激した。培養開始後22〜26時間で、活性化したPBMCを計数し、遠心分離した。細胞を遠心分離後、培養培地をペレット化した細胞から回収し、保存した。培養を開始した同じ培地に、細胞を再懸濁し(1×106細胞／mlで)、硫酸プロタミンと共にレンチウイルスベクターを培地に添加した。1ウェル当たり4×106T細胞を含む、6ウェル組織培養プレート (Corning, Corning, NY)中で、細胞を培養した。次いで、細胞を37℃で約48時間培養した。次いで、細胞を遠心分離し、デカンテーションし、5％ヒトAB血清及び300 IU／mLのIL-2を含む新鮮な培養用AIM V培地中で、0.5×106／mLで再懸濁した。2〜3日毎に、細胞濃度を0.5×106T細胞／mlに調整した。
【００８８】
プロテインL染色による形質導入したT細胞上のCARの検出
細胞を洗浄し、蛍光活性化細胞選別(FACs)バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)及び0.1％アジ化ナトリウム及び0.4％ウシ血清アルブミン (BSA))中で、懸濁した。細胞表面CAR scFvを検出するために、ビオチン標識プロテインL (GenScript, Piscataway, NJ)を添加した。細胞を4℃で30分間インキュベーションし、2回洗浄した。細胞をFACsバッファー中で懸濁し、通常のマウスIgG (Invitrogen)を用いてブロックした。次いで、細胞をフィコエリトリン(PE)標識ストレプトアビジン (BD Pharmingen, San Jose, CA)、抗CD4 (eBioscience, San Diego, CA)、抗CD8 (eBioscience)、抗CD30 (BD Pharmingen)及び抗CD3 (eBioscience)を用いて染色した。LSR IIフローサイトメーター (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を用いて、フローサイトメトリーによる収集を行い、FlowJoソフトウェア (Treestar, Inc. Ashland, OR)を用いて分析を行った。CARを発現する (CAR+)T細胞のパーセンテージは、プロテインL染色した、CARを形質導入した培養物中のT細胞のパーセンテージから、各実験においてプロテインL染色した同じドナーに由来する、同じように培養した非形質導入T細胞のパーセンテージを引いたものとして計算した。BD Biosciences由来の抗CD30抗体を用いて標準的な方法によって、T細胞をCD30について染色した。
【００８９】
インターフェロンγELISA
5％ヒト血清を含むAIM-V培地を含む、96ウェル丸底プレートの重複ウェル中で、CD30＋又はCD30陰性の標的細胞と、CARを形質導入したT細胞とを組合せた。プレートを37℃で18〜20時間インキュベーションした。インキュベーション後、標準的な方法(Pierce, Waltham, MA)を用いて、IFNγについてのELISAを行った。
【００９０】
CD107aアッセイ
試験した各T細胞培養について、2本のチューブを調製した。1本のチューブは、CD30＋標的細胞を含有し、他方のチューブはCD30陰性標的細胞を含有した。両方のチューブは、CARを形質導入したT細胞、5％ヒトAB血清、力価測定した濃度の抗CD107a抗体 (eBioscience, clone eBioH4A3)及び1μLのGolgiStopタンパク質輸送阻害剤(monesin, BD Biosciences)を含む1mlのAIM-V培地を含有した。全てのチューブを、37℃で4時間インキュベーションし、次いで、CD3、CD4及びCD8について染色した。
【００９１】
増殖アッセイ
培養を、24ウェルプレート中で設定した。培養に含まれる標的細胞は、0.5×106の放射線照射したCD30+細胞又は0.5×106の放射線照射したCD30陰性細胞のいずれかであった。培養はまた、抗CD30 CARを発現する培養由来の0.75×106 T細胞を含んでいた。以前に記載された(Manneringら、J. Immunol. Methods, 283(1-2): 173-183 (2003))ように、T細胞をカルボキシフルオレセイン・ジアセテート・スクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）(CFSE, Invitrogen)で標識した。培養で用いた培地は、5％ヒトAB血清を含むAIM Vであった。培地にIL-2は添加しなかった。開始後4日で、死細胞を除外するためにトリパンブルーを用いて、各培養中の生細胞を計数し、「プロテインL染色による形質導入したT細胞上のCARの検出」に記載されたように、フローサイトメトリーを行った。
【００９２】
細胞傷害性アッセイ
以前に記載された(Kochenderferら、J. Immunother., 32(7): 689-702 (2009))ように、細胞傷害性アッセイを行った。陰性対照CCRF-CEM細胞の生存に対する、CD30+HHリンパ腫細胞の生存を比較することによって、細胞傷害性を測定した。同じチューブ中で、これらの細胞型の両方と、CARを形質導入したT細胞とを組合せた。CCRF-CEM陰性対照細胞を蛍光色素5-(及び-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン（5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine）(CMTMR)(Invitrogen)で標識し、CD30+HHリンパ腫標的細胞をCFSEで標識した。標的細胞に対して複数のT細胞の比で、滅菌した5ml試験チューブ (BD)中に、二重で、T細胞及び標的細胞の培養を設定した。チューブ中に含有した標的細胞は、50,000 CCRF-CEM陰性対照細胞に加えて、50,000 CD30+HH細胞であった。培養を、37℃で4時間インキュベーションした。インキュベーション後すぐに、7AAD (7-アミノ-アクチノマイシンD)(BD)を添加し、フローサイトメトリーによる収集を行った。各T細胞及び標的細胞の培養について、生きたHH細胞のパーセントを、生きたCCRF-CEM陰性対照細胞のパーセントで割ることによって、CD30+HH標的細胞の生存パーセントを決定した。各T細胞及び標的細胞の培養中のHH標的細胞の生存パーセントを、エフェクターT細胞を含まず、HH標的細胞及びCCRF-CEM細胞のみを含有するチューブ中の生きたCCRF-CEM陰性対照細胞パーセントに対する生きたHH標的細胞のパーセントの比で割ることによって、HH標的細胞の補正した生存パーセントを計算した。この補正は、開始細胞数におけるばらつき、及び標的細胞の自然死を考慮に入れるために必要であった。細胞傷害性を以下のように計算した：CD30+HH標的細胞の細胞傷害性パーセント＝100−CD30+HH標的細胞の補正した生存パーセント。
【００９３】
実施例1
本実施例は、健常なヒト組織中にCD30 RNAが存在しないか、又は非常に低いレベルで発現することを実証する。
【００９４】
48の健常なヒト組織のRNAから調製したcDNA試料のパネルで、qPCRによって、CD30発現の分析を行った (図1A及び1B)。結果は、健常なヒト組織中に、CD30が存在しない、又は非常に低いレベルで発現することを示した。これらのqPCR結果は、他の研究者が行った広範囲の先行する免疫組織化学研究(Schwartingら、Blood, 74(5): 1678-1689 (1989)；Itoら、American J. Pathol., 145(2): 276-280 (1994)；Faliniら、Blood, 85(1): 1-14 (1995))と整合していた。特に、qPCRによって検出された低レベルのCD30 RNA 発現を有した僅かな器官は、他の研究者が行った実験においては、免疫組織化学によるCD30は陰性であった (Schwartingら、Blood, 74(5): 1678-1689 (1989)；Itoら、American J. Pathol., 145(2): 276-280 (1994)；Faliniら、Blood, 85(1): 1-14 (1995))。この先行する免疫組織化学研究は、妊娠子宮の脱落膜細胞(Itoら、American J. Pathol., 145(2): 276-280 (1994))を除き、主要なヒト器官の細胞上で、CD30が発現しないことを示した。
【００９５】
実施例2
本実施例は、初代ヒトCD34+細胞（CDD34+ cells）及び初代ヒト末梢血単核細胞の細胞株表面上で、CD30発現が存在する又は存在しないことを実証する。
【００９６】
他の研究者は、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、幾つかのB細胞リンパ腫及び幾つかの型のT細胞リンパ腫を含む、幾つかの異なる型のリンパ腫表面上で、CD30を検出している (Steinら、Blood, 66(4): 848-858 (1985)；Schwartingら、Blood, 74(5): 1678-1689 (1989)；Faliniら、Blood, 85(1): 1-14 (1995))。フローサイトメトリーによって、一連の細胞株の表面上でCD30発現をアッセイした。幾つかの細胞株、例えばHHリンパ腫細胞株等が、高レベルのCD30を発現することを見出した。幾つかの他の細胞株、例えばCOLO205細胞株等が、CD30を発現しなかった。ngfr-bv173細胞株は、CD30を発現しなかった。CD30-bv173細胞株 (CD30を発現するよう形質導入された)は、CD30を発現した。初代ヒトCD34+細胞（CDD34+ cells）及び初代ヒト末梢血単核細胞上でのCD30発現をまた評価した；CD34+細胞及びPBMCのいずれも、CD30を発現しなかった。
【００９７】
実施例3
本実施例は、各CARが5F11、AC10及びXmAb2513抗体に由来する1のscFvを取り込んでいる、CARのT細胞表面発現を実証する。
【００９８】
4つの異なる抗CD30一本鎖可変フラグメント (scFv)の各々の1を取り込んだCARを生成した。これらのscFvは、4つの異なるモノクローナル抗体、17G1、5F11、AC10及びXmAb2513に由来した。17G1由来のscFvを取り込んだCARは、T細胞上で高いレベルで発現せず、広範囲に研究しなかった。5F11、AC10及びXmAb2513抗体の各々の1に由来するscFvを取り込んだCARを、in vitroで広範囲に研究した。異なるscFvを評価するために、CD28 共刺激分子由来のヒンジ、TM及び細胞質領域、並びにC末端にCD3ζT細胞活性化分子を有するCAR設計を用いた。
【００９９】
第一に、5F11、AC10及びXmAb2513抗体の各々の1に由来するscFvを取り込んだCARのT細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって比較した。ヒトT細胞を、0日目に抗CD3抗体OKT3を用いて刺激した。5F11-28Z、AC10-28Z又はXmAb2513-28Zのいずれかをコードするレンチウイルスを用いて、T細胞を1日目に形質導入した。対照として、幾つかのT細胞を非形質導入のままにした。T細胞をIL-2含有培地中で増殖させた。7日目に、細胞をプロテインL、CD3、CD4、CD8及びCD30で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。3つのCAR全てがT細胞上に高レベルで発現し、3つの異なるCARの表面発現のレベルは殆んど同一であった。CD8及びCARを発現する細胞のパーセンテージを表Aに示す。生きたCD3+リンパ球に、プロットをゲートした。異なる2患者由来の細胞を用いて同様の結果を得た。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
実施例4
本実施例は、5F11-28Z CARを発現するT細胞が、AC10-28Z CAR又はXmAb2513 CARのいずれかを発現するT細胞よりも、機能的に優れていることを実証する。
【０１０２】
活性化T細胞はCD30を発現し(Horieら、Seminars in immunology, 10(6): 457-470 (1998))、それゆえCD30+T細胞の排除が抗CD30-CARを発現するT細胞の培養中で起こり得るので、CD30を発現した総T細胞のパーセンテージを評価した。実施例3においては、CAR発現を評価するために同じT細胞培養を用いてCD30を発現した総T細胞のパーセンテージを評価した。
【０１０３】
AC10-28Zを形質導入したT細胞、XmAb2513-28Zを形質導入したT細胞及び非形質導入T細胞の培養と比べて、5F11-28Zを形質導入したT細胞の培養において、CD30+T細胞がかなり低減したことを見出した。CD8及びCD30を発現する細胞のパーセンテージを表Bに示す。生きたCD3+リンパ球に、プロットをゲートした。表Bは、非形質導入T細胞、又はAC10-28Z若しくはXmAb-28Zをコードする遺伝子を用いて形質導入したT細胞と比べて、5F11-28Z遺伝子を用いて形質導入したT細胞の中で、CD30を発現する細胞のパーセンテージが、かなり低かったことを示す。6実験において、同様の結果が得られた。これらの結果は、5F11-28Zを形質導入したT細胞が、培養からCD30+T細胞を排除することにおいて、AC10-28Zを形質導入したT細胞又はXmAb2513-28Zを形質導入したT細胞よりも効果的であることを示唆していた。
【０１０４】
【表４】
2018531014.tif 000005
【０１０５】
実施例2の実験及び表Aにおいて評価した、同じ培養に由来する細胞を、脱顆粒について評価した。T細胞をCD30+標的細胞SUDHL-1と共に、4時間培養した。CD107a分子は、T細胞脱顆粒のマーカーである。脱顆粒を検出するために、CD107aに対する抗体を培養中に含めた。細胞はまた、CD3及びCD8について染色した。生きたCD3+リンパ球に、プロットをゲートした。
【０１０６】
表Cは、CD8及びCD107aを発現する細胞のパーセンテージを示す。表Cに示すように、AC10-28Z又はXmAb2513-28Zのいずれかを形質導入した細胞に比べて、5F11-28Zを形質導入したT細胞によって、より強いCD30特異的脱顆粒が実証された。異なる2人のドナー由来の細胞を用いて、同様の結果を得た。
【０１０７】
【表５】
2018531014.tif 000006
【０１０８】
標的細胞との共培養でのCD30特異的インターフェロンγ(IFNγ)放出を、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)で測定した。AC10-28Z又はXmAb2513-28Zのいずれかを形質導入した細胞と比べて、5F11-28Zを形質導入したT細胞は、より強くCD30特異的IFNγを放出することを実証した (表D-1)。表D-1のSUDHL-1、HH及びCD30-bv173は、CD30+細胞株である。表D-1のNGFR-bv173及びCCRF-CEMはCD30陰性細胞株である。表D-1の値は、培養期間の終わりにおける、放出IFNγ（pg／mL）である。プロテインLを用いて、CARを形質導入したT細胞及び非形質導入T細胞を染色し、各CARを形質導入したT細胞集団の％プロテインL染色から、非形質導入T細胞の％プロテインL染色を減算することによって、各CARを発現するT細胞のパーセンテージ(表D-2)を決定した。
【０１０９】
これらの結果から、5F11-28Zを発現するT細胞が、AC10-28Z又はXmAb2513のいずれかを発現するT細胞よりも機能的に優れていることを確認した。
【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
実施例5
本実施例は、5F11-28Z及び5F11-CD828Z CARのCD30特異的機能について実証する。
【０１１３】
5F11 scFvを含有するT細胞の機能的優位性のために、このCARを用いて更なる実験を行った。5F11 scFvを含有する3つのCARを設計した (図2A-2C)。IFNγELISAアッセイにおいて、5F11-28Z及び5F11-CD828ZのCD30特異的機能を確認した (表E-1)。CARを発現するT細胞を、表E-1の標的細胞と共に終夜培養し、次いでIFNγELISAを行った。表E-1のSUDHL-1及びHDLM-2は、CD30+細胞株である。表E-1のNGFR-bv173、CCRF-CEM及び293GPは、CD30陰性細胞株である。表E-1の値は、培養期間の終わりにおける、放出IFNγ（pg／mL）である。プロテインLを用いて、CARを形質導入したT細胞及び非形質導入T細胞を染色し、各CARを形質導入したT細胞集団の％プロテインL染色から、非形質導入T細胞の％プロテインL染色を減算することによって、各CARを発現するT細胞のパーセンテージ (表E-2)を決定した。
【０１１４】
【表８】
2018531014.tif 000009
【０１１５】
【表９】
2018531014.tif 000010
【０１１６】
実施例6
【０１１７】
本実施例は、5F11-CD8BBZ CARと比べ、CD30特異的な優れた活性を提供する、5F11-28Z CAR及び5F11-CD828Z CARについて実証する。
【０１１８】
T細胞に、異なる3つのCAR（5F11-28Z、5F11-CD828Z又は5F11-CD8BBZ）の1つを形質導入した。CARを形質導入したT細胞を、CD30+標的細胞CD30-bv173又はCD30陰性細胞株ngfr-bv173のいずれかと共に、4時間培養した。脱顆粒を検出するために、CD107aに対する抗体を培養中に加えた。細胞はまた、CD3及びCD8について染色した。生きたCD3+リンパ球に、プロットをゲートした。
【０１１９】
4-1BBを含有するCAR （5F11-CD8BBZ）と比べて、CD28を含有するCAR （5F11-28Z及び5F11-CD828Z）はCD30+標的細胞に対する脱顆粒の程度がより大きかった；加えて、5F11-CD8BBZと比べて、CD28を含有するCARはCD30陰性の標的に対する脱顆粒のバックグラウンドがより小さかった（表F-1及びF-2）。表F-1は、CD30+標的細胞CD30-bv173との共培養で、CD8及びCD107aを発現する細胞のパーセンテージを示す。表F-2は、CD30陰性細胞株ngfr-bv173との共培養で、CD8及びCD107aを発現する細胞のパーセンテージを示す。同様の結果が、2つの異なるドナーにおいてみられた。本実験で使用したT細胞の細胞表面でのCARの発現は：5F11-28Z、95.8%；5F11-CD828Z、96.0%；5F11-CD8BBZ、93.2%、であった。
【０１２０】
【表１０】
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【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
同様に、抗原特異的IFNγ産生を評価した場合、5F11-28Z CARを発現するT細胞は、CD30+標的細胞と共に培養したときに、最も多くのIFNγを産生した。4-1BB部分を含有するCARを発現するT細胞と比べた場合、5F11-28Z又は5F11-CD828Zのいずれかを発現するT細胞は、CD30陰性標的に対してより低いバックグラウンドでのIFNγ産生を示した (表G)。表GのHHはCD30+リンパ腫細胞株である。表GのA549、TC71、Sol8、Panc10.05及びMDA231は、CD30陰性細胞株である。初代CD34+造血幹細胞をまた含めた (表G)。表Gの5F11-28Z T細胞の95.8％が、フローサイトメトリーによって測定されたようにCARを発現した。
【０１２３】
【表１２】
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【０１２４】
CD28を含有するCARのCD30特異的活性が、4-1BBを含有するCARのCD30特異的活性よりも優れていたので、5F11-28Z及び5F11-CD828Zが更なる開発のために最も有望なCARであると結論付けた。5F11-CD828Z又は5F11-CD8BBZを発現するT細胞と比べて、5F11-28Z CARを発現するT細胞は、全ての実験を分析した場合に、最も強いCD30+標的細胞の認識を示した (表D-1、D-2、E-1、E-2及びG)。
【０１２５】
実施例7
本実施例は、5F11-28Z CARを発現するT細胞が、in vitroでCD30特異的様式で増殖することについて実証する。
【０１２６】
5F11-28Zを発現するT細胞を、細胞が増殖するにつれて希釈される蛍光色素CFSEを用いて標識した。図3に示されるように、5F11-28Zを形質導入したT細胞を陰性対照NGFR-bv173細胞と共に培養した場合 (CD30陰性、白抜きのヒストグラム)よりも、5F11-28Z T細胞をCD30-bv173細胞と共に培養した場合 (CD30+、黒塗りのヒストグラム)に、より大幅にCFSEを希釈した。従って、5F11-28Z CARを発現するT細胞は、in vitroでCD30特異的な様式で増殖した (図3)。生きたCD3+、CARを発現するリンパ球に、プロットをゲートした。異なる4つの実験において、同様の結果を得た。
【０１２７】
実施例8
本実施例は、臨床的な養子細胞移入用の十分な細胞を産生するために、培養中で抗CD30-CARを形質導入したT細胞数を十分に増幅する（expand）ことについて実証する。
【０１２８】
CD30を発現する活性化T細胞、及び抗CD30 CARを発現するT細胞を含有するT細胞培養は、非形質導入T細胞の培養と比べて、CD30+T細胞が減少していた。抗CD30-CARを形質導入したT細胞培養の培養における、この減少したCD30+T細胞数は、CARを発現するT細胞によって恐らくCD30+T細胞が排除されたことが原因であった。抗CD30-CARを形質導入したT細胞が増殖でき、CAR T細胞療法の臨床試験において通常投与される108〜109T細胞を生成するために十分生存できたか否かを決定しようとした。
【０１２９】
0日目にOKT3刺激を用いてT細胞培養を開始した。T細胞を非形質導入のままとし、又は5F11-28Z、AC10-28Z若しくはXmAb2513-28zを培養の1日目に形質導入して、in vitroでIL-2含有培地中で増殖させた。トリパンブルーを用いて、総生細胞を光学顕微鏡によって計数した。CARの3つ全てについて、各CARを形質導入したT細胞の90％超が、プロテインL染色によって検出されたようにT細胞表面上にCARを発現した。異なる2人のドナーに由来する細胞での結果を、それぞれ図4A及び4Bに示す。AC10-28Z及びXmAb2513-28Z CAR T細胞培養を、培養9日目に意図的に停止し、5F11-28Zを形質導入した及び非形質導入の培養を11日目に意図的に停止した。
【０１３０】
別の実験においては、0日目にOKT3刺激を用いてT細胞培養を開始した。T細胞を非形質導入のままとし、又は5F11-CD8-28Z、5F11-CD8-BBZ若しくは5F11-28ZをT細胞に形質導入して、in vitroでIL-2含有培地中で増殖させた。トリパンブルーを用いて、総生細胞を光学顕微鏡によって計数した。CARの3つ全てについて、各CARを形質導入したT細胞の90％超が、プロテインL染色によって検出されたように、T細胞表面上にCARを発現した。異なる2人のドナーに由来する結果を、それぞれ図5A及び5Bに示す。
【０１３１】
反復実験においては、臨床的な養子細胞移入用に十分な細胞を産生するために、培養中で抗CD30-CARを形質導入したT細胞数が十分に増幅することが示された (図4A〜4B及び5A〜5B)。
【０１３２】
実施例9
本実施例は、5F11-28Zを形質導入したT細胞が、in vitroでCD30+HHリンパ腫細胞を殺すことができることについて実証する。
【０１３３】
5F11-28Zを発現するT細胞がCD30+HHリンパ腫細胞株細胞を特異的に殺すことができることを示す、in vitroのフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイを行った。アッセイは、4時間のインキュベーション時間であった。図6に示されるように、5F11-28Zを形質導入したT細胞がin vitroでCD30+HHリンパ腫細胞を殺すことができることが証明された。
【０１３４】
実施例10
本実施例は、5F11-28Z及び5F11-CD828Zを発現するT細胞がin vitroで腫瘍を根絶する能力について実証する。本実施例はまた、5F11-28Z及び5F11-CD828Zを発現するT細胞で処理した、腫瘍を有するマウスが長期間、腫瘍を再発することなく生存することについて実証する。
【０１３５】
5F11-28Z及び5F11-CD828Zを発現するT細胞が、in vivoで腫瘍を根絶する能力を評価した。免疫不全nod scid共通γ鎖欠損 (NSG)マウス内で、CD30+HHリンパ腫細胞の皮下腫瘍を樹立した。4日後、5F11-28Z若しくは5F11-CD828Z又はSP6-CD828Zのいずれかを形質導入した、同じドナーに由来する8×106T細胞を、単回静脈内注入することでマウスを処理した。マウスの第4群を未処理のままとした。SP6-CD828Zは、ヒト又はマウスタンパク質を認識しないCARである。陰性対照として、SP6-CD828Zを用いた。9匹のマウスを含有した未処理群を除いて、各群10匹のマウスを含有した。各実験で、異なる健常なドナー由来のT細胞を用いた。
【０１３６】
結果を図7A及び7Bに示す。5F11-28Z又は5F11-CD828Zを発現するT細胞の接種マウスにおいて、腫瘍は完全に根絶された；それに対し、SP6-CD828Zを形質導入したT細胞の接種マウス及び未処理マウスにおいては、進行性の腫瘍増殖が起こった (図7A)。同様に、5F11-28Z又は5F11-CD828Zを形質導入したT細胞の接種マウスは全て、長期間腫瘍を再発することなく生存した；それに対し、未処理マウス及びSP6-CD828Zを形質導入したT細胞の接種マウスは全て、進行性の腫瘍で死亡した (図7B)。生存率はKaplan-Meier法によって算出した。
【０１３７】
実施例11
本実施例は、可溶性CD30が存在するにもかかわらず、抗CD30 CARが腫瘍を根絶することにおいて効果的であることを実証する。
【０１３８】
CD30+リンパ腫を有する数名の患者においては、CD30+悪性細胞によってCD30が脱落する (Viscoら、European J. Haematol., 77(5): 387-394 (2006)；Pizzoloら、British J. Haematol., 75(2): 282-284 (1990))。それゆえ、標的細胞を認識するための抗CD30 CARの能力に対する可溶性CD30の影響を評価した。非形質導入又は5F11-28Z CARを発現するよう形質導入されたT細胞を、表Hに表示された標的細胞と共に終夜培養し、次いで標準的なIFNγELISAを行った。表HのHH細胞は、CD30+細胞株である。表H中のμg／mLが続けられる数字(表Hの最も左の列)は、T細胞及び標的細胞を共に培養した全ての時間での、培地に添加したヒトCD30タンパク質の濃度を指す。表H中のU251及びColo-205はCD30陰性細胞株である。表Hの最も右の2列における数字は、培養期間の終わりにおける、放出IFNγ（pg／mL）である。表H中の5F11-28Z T細胞の94.8％が、フローサイトメトリーによって測定されたように、CARを発現した。
【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
表Hは、標的細胞及び5F11-28Zを発現するT細胞を含有する培養に、高濃度の可溶性CD30タンパク質を添加することは、CD30+標的細胞を認識する、CAR T細胞の能力を妨害しなかったことを示す。血清中及びリンパ腫集団内のCD30タンパク質濃度の以前の見積もりによって、表Hの培養に添加するためのCD30タンパク質濃度の選択を導いた(Nagataら、PNAS, 102(22): 7946-7951 (2005))。可溶性CD30の存在にも関わらず、抗CD30 CARが腫瘍を根絶することにおいて有効であり得るという更なる証拠が、実施例10のマウス実験によって提供される。HH腫瘍を有する4匹のマウスの血清におけるELISAによって、約11 ng／mLに対応する77単位／mLの平均濃度で、CD30が検出された。HH細胞によってCD30が脱落するにも関わらず、HH腫瘍は図7Aに示されるようにマウス中で根絶された。
【０１４１】
実施例12
本実施例は、5F11-CD28Zを形質導入した細胞の用量滴定について実証する。
【０１４２】
固形集団を形成するような様式で、免疫不全NSGマウスに、4×106 HH細胞を移植した。次いで、マウスを6×106の非形質導入T細胞の単回注入、又は5F11-CD28Zを形質導入した0.67×106、2×106又は6×106のT細胞の単回注入で処理した。5F11-CD28Zを発現するT細胞は、2×106又は6×106抗CD30 CAR T細胞の注入を受けたマウス内の腫瘍を排除することができた；しかしながら、非形質導入T細胞又は0.67×106 抗CD30 CAR T細胞の注入は、腫瘍を排除することができなかった。5F11-CD28Zを発現するT細胞の接種マウスは、CAR T細胞媒介性傷害性の兆候を何ら示さなかった。マウスは、被毛の乱れ（ruffled fur）又は低下した活性を示さず、実験の終わりに屠殺した場合、又は大きい腫瘍が発達後に屠殺した場合にのみ死亡した。
【０１４３】
本明細書において引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に、具体的に、参照によって取り込まれることが示されているのと同程度に、かつ全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１４４】
本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（すなわち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値は個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「例えば〜など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１４５】
本発明を実施するための発明者が知るベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予測し、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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