(57)【要約】急速硬化、最適粘度、高い破裂強度、柔軟性、生体適合性、及び生分解性を特徴とする、ゼラチン、アルギネート、モンモリロナイト、及びカップリング剤を含むキット及び生体接着剤が開示される。【選択図】  図６Ｃ
2018531634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の製剤を含有する第１の容器及び第２の製剤を含有する第２の容器を含み、前記第１の製剤がゼラチン及びアルギネートを含み、及び前記第２の製剤が前記ゼラチンをカップリングするための、及び／又は前記アルギネートをカップリングするための、及び／又は前記ゼラチンを前記アルギネートにカップリングするためのカップリング剤を含み、前記第１の製剤及び前記第２の製剤の少なくとも１つがモンモリロナイトを含む、生体接着剤を形成するためのキット。
【請求項２】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記ゼラチンの濃度が、５０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記アルギネートの濃度が、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記モンモリロナイトの濃度が、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記カップリング剤の濃度が、１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中、前記ゼラチンの濃度が２００ｍｇ／ｍｌ〜４００ｍｇ／ｍｌの範囲であり、前記アルギネートの濃度が２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、前記モンモリロナイトの濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、前記カップリング剤の濃度が１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤が水を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記水の量が生体接着剤の４０％〜９５％の範囲である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の前記ゼラチンの濃度が５００ｍｇ／ｍｌ未満であり、前記生体接着剤が、前記組み合わせ時及び前記組み合わせから３０分まで１Ｐａ−ｓｅｃ〜５０Ｐａ−ｓｅｃの範囲である室温粘度を特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１の製剤及び／又は前記第２の製剤が架橋促進剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記第１の製剤及び／又は前記第２の製剤が生物活性剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記第１の製剤及び前記第２の製剤を組み合わせて得られる生体接着剤中の前記生物活性剤の濃度が、前記生体接着剤の総体積の０．１質量／体積パーセント〜１０質量／体積パーセントの範囲である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
硬化時に生体接着性マトリックスを形成するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキットであって、前記マトリックスを形成するための硬化時間が５秒〜３０分の範囲である、キット。
【請求項１４】
前記マトリックスが破裂強度を特徴とし、前記破裂強度はＳｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｓｔ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｅａｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭ  Ｆ２３９２−０４に従って、コラーゲンシートに開けられた約３．０ｍｍの均一な直径の穴の上及び周囲に前記生体接着剤約０．５ｍｌを塗布することによって提供され、かつ、厚さ約１ｍｍを有する前記マトリックスの層を破裂させるために必要とされる最大圧力で表され、、前記最大圧力が３５０ｍｍＨｇ〜６５０ｍｍＨｇの範囲である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記第１の容器から前記第１の製剤、及び前記第２の容器から前記第２の製剤を分注して、それにより生体接着剤を形成するアプリケータデバイスである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記アプリケータが、
前記第１の製剤を保持する第１のチャンバーを規定する第１のバレルと、及び前記第１のチャンバーから前記第１の製剤を押し出すための、前記チャンバーに一方の端が受け止められる第１のプランジャーとを有する第１のシリンジの形態の前記第１の容器と、
前記第２の製剤を保持する第２のチャンバーを規定する第２のバレルと、及び前記第２のチャンバーから前記第２の製剤を押し出す、前記第２のチャンバーに一方の端が受け止められる第２のプランジャーとを有する第２のシリンジの形態の前記第２の容器と、
ノズルであって、遠位端、近位端、及び前記ノズルを通って伸びるルーメンを有するノズルと、並びに、前記第１の製剤及び前記第２の製剤が前記ルーメン中で接触するように、前記ノズルの前記近位端を前記第１のチャンバー及び前記第２のチャンバーに連結するための手段と、
を含み、
これにより、前記第１のプランジャー及び前記第２のプランジャーの駆動時に前記ノズルを通って噴出され得る前記生体接着剤を形成する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
生体の接着における使用のために特定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
生体における断裂の密閉における使用のために特定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
少なくとも２つの物体の互いへの接合における使用のために特定され、前記物体の少なくとも１つが生体である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
生体接着性マトリックスを形成するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項２１】
前記生体接着性マトリックスが生体の接着用である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記生体接着性マトリックスが生体における断裂の密閉用である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記生体接着性マトリックスが少なくとも２つの物体の互いへの接合用であり、前記物体の少なくとも１つが生体である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
ゼラチン及びアルギネートを含む第１の製剤、並びに、前記ゼラチンをカップリングするための、及び／又は前記アルギネートをカップリングするための、及び／又は前記ゼラチンを前記アルギネートにカップリングするための、カップリング剤を含む第２の製剤を接触させて形成され、前記第１の製剤及び前記第２の製剤のうちの少なくとも１つがモンモリロナイトを含む、生体接着性マトリックス。
【請求項２５】
封鎖された生物活性剤をさらに含み、薬物溶出生体接着性マトリックスである、請求項２４に記載の生体接着性マトリックス。
【請求項２６】
ａ）ゼラチンと、
ｂ）アルギネートと、
ｃ）モンモリロナイトと、
ｄ）前記ゼラチンをカップリングするための、及び／又は前記アルギネートをカップリングするための、及び／又は前記ゼラチンを前記アルギネートにカップリングするための、カップリング剤と、
ｅ）水と、
を含む、生体接着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野及び背景］
本発明は、そのいくつかの実施形態において生体接着性材料に関し、より詳細には、生体接着性シーラント、製剤、及びこれを形成するためのキット、並びにその使用に関するが、これらに限定されない。
【０００２】
生体接着性マトリックス、又は略して生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）は、内科及び外科において縫合及びステープルにますます取って代わっている。この増加の理由としては、以下が挙げられる：内部の外科処置が達成され得る潜在的速さ；完全な閉鎖をもたらし、故に体液の浸出を防ぐ接合物質の能力；治療された組織を過度に変形させることなく接合を形成する可能性；抜糸を不要にする；患者の疼痛を軽減する；その使用は、鋭利な器具による施術者の損傷のリスクがない、より単純な装置を必要とする：傷跡を少なくする；及び感染の可能性を低下させる。生体接着剤はまた、空気及び身体の体液漏出を密閉する（例えば、瘻管を充填する、及び消化器処置における結腸直腸吻合の補強術として、肺からの空気漏出を密閉する、大動脈解離を修復する、並びに時として従来の縫合又はステープル法に抵抗性を示し得るバイパス術及び他の処置における血管を密閉する）のにも使用することができ、局所創傷閉鎖、大動脈解離の修復、並びに特定のデバイスの内固定及び／又は外固定にも使用することができる。
【０００３】
他の接着剤と同様に、生体接着性マトリックスは、対応する生体接着性製剤を硬化させると形成される。故に、該製剤は、例えば生体に適用され（ａｐｐｌｉｅｄ）、混合、硬化開始剤、又は他の硬化開始条件に供されると、生体接着性マトリックスを提供するように硬化する。
【０００４】
生体接着剤は、生体適合性であること、及びほとんどの場合に生分解性であることも必要とされ、急速硬化、最適接合強度、及びひとたび硬化されれば弾力性を示すことが必要とされる。さらに、生体接着性マトリックスは、対応する製剤が実行可能な稠度及び硬化／接合時間を示すように設計されるべきである。より詳細には、生体接着性製剤は、十分及び容易な塗布（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を可能にするように最適な初期粘度、たわみ性、及び粘着度を示すべきであり、使用部位から流出しないように過度に流動性でなく、むらがない適切な塗布を妨げないように過度に粘性でなく、同時に、短い硬化／ゲル化時間ですぐに凝固し、けれども、所望の部位に円滑に塗布できるように短すぎない硬化／ゲル化時間を示すべきである。さらに、生体接着性製剤／マトリックスは、体液の湿潤条件下、生きている組織に迅速に接合する能力を示すべきであり、生体接着性マトリックスは、ブリッジ、典型的には透過性の柔軟なブリッジを形成するべきであり、生体接着性製剤、マトリックス及び／又はその代謝（生分解）生成物は、身体の天然の治癒機構を妨げない一方で、局所組織毒性作用又は発癌作用を引き起こすべきではない。
【０００５】
現在利用可能な１つのタイプの接着剤は、シアノアクリレート接着剤である。Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ（登録商標）として知られる２−オクチルシアノアクリレートなどのシアノアクリレートは、組織との強い接合を作り出し、迅速な止血を可能にし、生体表面に存在する体液と接触すると重合する能力を有する。しかし、シアノアクリレート接着剤は細胞傷害性であることが見出されており、予備硬化接着性製剤の粘度は低すぎ、硬化シアノアクリレートマトリックスは堅く、非生分解性であり、正常な創傷治癒を妨げる。それ故に、非最適粘度、高い曲げ弾性率、また動物実験で癌が報告されたことにより、シアノアクリレートの使用は口腔粘膜及び命に関わる動静脈での表面塗布に限定された。
【０００６】
他の既知の生体接着性製剤は、ゼラチン及びレゾルシノールの混合物が温められ、ホルムアルデヒドの添加により数十秒以内に架橋される、ゼラチン−レゾルシノール−ホルムアルデヒドに基づく。そのような製剤から形成される生体接着剤の利点は十分な接合強度であるが、細胞傷害性がその利点に影を投げかけている。
【０００７】
組織シーラントとして使用される現在利用可能な生体接着性の別のタイプは、ウシ及び／又はヒト供給源に由来する成分を利用する。例えば、フィブリンベースの接着性製剤は、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子の溶液をトロンビン及びＣａＣｌ２の溶液と混合して典型的には調製される。２つの溶液は混合ノズルを備えた２筒式シリンジにより塗布され、反応は血液凝固における白いフィブリン血栓と類似している。市販の例としては、Ｂａｘｔｅｒ  Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）及びＥｔｈｉｃｏｎ  Ｃｒｏｓｓｅａｌ（商標）が挙げられる。フィブリンベースの生体接着性マトリックスの利点としては、止血作用、生分解性、結合組織への良好な粘着性、及び創傷治癒の促進が挙げられる。不利な点としては、低い強度（接着力及び凝集力）、低い粘度（所望の部位にのみ塗布することが難しい）、及び任意のヒト由来生成物を使用したときの感染リスクが挙げられる。米国では、汚染を防ぐためにフィブリン接着剤が患者自身の血液から調製されるが、このプロセスは時間及び費用がかかる。他の限界としては、おそらくフィブリン接着ブリッジのあまりに迅速な吸収により手術数日後に再発し得る、肺手術における空気漏出が挙げられる。
【０００８】
他の既知の生体接着剤は、アルブミン又はゼラチンに基づくタンパク質ベースの組織接着剤である。架橋の速度を向上させるためのポリアミン、特にポリ（リジン）若しくはキトサン、又はポリカルボン酸塩、特にクエン酸若しくはポリ（アクリル酸）の添加も記載された。しかし、そのような生体接着剤は、不十分な生体適合性及び強度を典型的には特徴とする。
【０００９】
Ｓｕｎｇら［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４６巻、第４号、５２０〜５３０頁、１９９９年９月１５日］は、ゼラチン、アルギネート、及びカルボジイミドに基づく製剤を含む様々な生体接着性製剤の評価を報告している。しかし、Ｓｕｎｇらにより報告された製剤は、約６００ｍｇ／ｍｌゼラチン含量以上に基づいており、実行可能な生体接着性製剤を提供しない。
【００１０】
米国特許第５，８３０，９３２号は、ポリイソブチレン、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、及びセルロースなどの吸収剤を含む、バリアディスク（ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｉｓｃ）、接着パッド、又は創傷治療パッドを作るのに適した接着性製剤を教示している。
【００１１】
本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１２１４２９号は、縫合及びステープルに取って代わり、並びに中に封鎖された生物活性剤を放出するのに使用され得るゼラチン、アルギネート、及びカップリング剤を含む生体接着性製剤を教示している。
【００１２】
医療デバイスに組み込まれる止血剤としての粘土鉱物カオリナイト（カオリンとしても知られる）の使用は、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）として商業化されている［Ｋｈｅｉｒａｂａｄｉ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．  Ｔｒａｕｍａ．、２００９、６７（３）、４５０〜４５９頁；Ｐａｈａｒｉ，Ｍ．ら、Ｃａｔｈ．  Ｌａｂ．  Ｄｉｇｅｓｔ、２０１０、１８（１）、２８〜３０頁；Ｔｒａｂａｔｔｏｎｉ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．、２０１２、１５６（１）、５３〜５４頁；及びＣａｕｓｅｙ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．、２０１２、１７７（２）、３０１〜３０５頁］。
【００１３】
ゼラチン及び粘土鉱物であるモンモリロナイトは、生分解性ナノコンポジットフィルムの形成において使用されている［Ｆｌａｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｃら、Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇ．、２０１５、１６７Ａ、６５〜７０頁；及びＪｏｒｇｅ，Ｍ．Ｆ．Ｃ．ら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、２０１５、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８０６７９１］。
【００１４】
さらなる背景技術としては、Ｐａｎｚａｖｏｌｔａ  Ｓ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４、１３１（１１）；Ｈｓｕ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ、２００７．  ４４（１）：１７〜２８頁；Ｏｔａｎｉ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９６．  １７（１４）：１３８７〜１３９１頁；Ｂａｅ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２．  １６（４）：３６１〜３７２頁；Ｍｏ，Ｘ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０００．  １１（４）：３４１〜３５１頁；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００４．  ５（４）：１２７０頁；Ｍｏ，Ｘ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ、２０１０．  ９４（１）：３２６〜３３２頁；及びＯｋｉｎｏ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ、２００２．  ５９（２）：２３３〜２４５頁が挙げられる。
【００１５】
［発明の概要］
本発明者らは、急速硬化、最適粘度、高い接合強度、柔軟性、生体適合性、及び生分解性を特徴とする生体接着性マトリックスを形成することができる生体接着性製剤を設計し、成功裏に調製及び実施した。
【００１６】
本明細書に示された生体接着性製剤は、ゼラチン、アルギネート、カップリング剤、及び粘土を含み、薬物溶出生体接着性マトリックスを形成するための生物活性剤をさらに含むことができる。
【００１７】
本明細書で示される生体接着性製剤及びマトリックスは、様々な生物学的及び医学的処置において有利に使用することができる。
【００１８】
それ故に、本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、第１の製剤を含有する第１の容器及び第２の製剤を含有する第２の容器を含み、第１の製剤がゼラチン及びアルギネートを含み、並びに第２の製剤がゼラチンをカップリングするための、及び／又はアルギネートをカップリングするための、及び／又はゼラチンをアルギネートにカップリングするためのカップリング剤を含み、第１の製剤及び第２の製剤の少なくとも１つがモンモリロナイトを含む、生体接着剤を形成するためのキットが提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中のゼラチンの濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中のアルギネートの濃度は、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中のモンモリロナイト（ＭＭＴ）の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中のカップリング剤の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中、ゼラチンの濃度は２００ｍｇ／ｍｌ〜４００ｍｇ／ｍｌの範囲であり、アルギネートの濃度は２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、モンモリロナイトの濃度は５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、カップリング剤の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤は水を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中の水の量は、該生体接着剤の４０％〜９５％の範囲である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着剤中のゼラチンの濃度は５００ｍｇ／ｍｌ未満であり、該生体接着剤は、組み合わせ時及び３０分まで１Ｐａ−ｓｅｃ〜５０Ｐａ−ｓｅｃの範囲である室温粘度を特徴とする。
【００２７】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び／又は第２の製剤は架橋促進剤をさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び／又は第２の製剤は生物活性剤をさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、第１の製剤及び第２の製剤を組み合わせて得られる生体接着剤中の生物活性剤の濃度は、生体接着剤の総体積の０．１質量／体積パーセント〜１０質量／体積パーセントの範囲である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、キットは、硬化時に生体接着性マトリックスを形成するためのものであり、マトリックスを形成するための硬化時間は５秒〜３０分の範囲である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｓｔ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｅａｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭ  Ｆ２３９２−０４に従って、コラーゲンシートに開けられた約３．０ｍｍの均一な直径の穴の上及び周囲に生体接着剤約０．５ｍｌを塗布することによって提供され、厚さ約１ｍｍを有するマトリックスの層を破裂させるために必要とされる最大圧力で表される、破裂強度を特徴とし、最大圧力は３５０ｍｍＨｇ〜６５０ｍｍＨｇの範囲である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、キットは、第１の容器から第１の製剤、及び第２の容器から第２の製剤を分注して、それにより生体接着剤を形成するアプリケータデバイスの形態である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、アプリケータデバイスは、
第１の製剤を保持する第１のチャンバーを規定する第１のバレルと、及び第１のチャンバーから第１の製剤を押し出すための、該チャンバーに一方の端が受け止められる第１のプランジャーとを有する第１のシリンジの形態の第１の容器と、
第２の製剤を保持する第２のチャンバーを規定する第２のバレルと、及び第２のチャンバーから第２の製剤を押し出す、第２のチャンバーに一方の端が受け止められる第２のプランジャーとを有する第２のシリンジの形態の第２の容器と、
ノズルであって、遠位端、近位端、及びノズルを通って伸びるルーメンを有するノズルと、並びに、第１の製剤及び第２の製剤がルーメン中で接触するように、ノズルの近位端を第１のチャンバー及び第２のチャンバーに連結するための手段と、を含み、
これにより、第１のプランジャー及び第２のプランジャーの駆動時にノズルを通って噴出され得る生体接着剤を形成する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書に示されたキットは生体の接着における使用のために特定される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に示されたキットは生体における断裂の密閉における使用のために特定される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に示されたキットは、少なくとも２つの物体の互いへの接合における使用のために特定され、物体の少なくとも１つは生体である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、生体接着性マトリックスを形成するための本明細書に示されたキットの使用が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、生体接着性マトリックスは生体の接着用である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、生体接着性マトリックスは生体における断裂の密閉用である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、生体接着性マトリックスは少なくとも２つの物体の互いへの接合用であり、物体の少なくとも１つは生体である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ゼラチン及びアルギネートを含む第１の製剤、並びに、ゼラチンをカップリングするための、及び／又はアルギネートをカップリングするための、及び／又はゼラチンをアルギネートにカップリングするための、カップリング剤を含む第２の製剤を接触させて形成され、第１の製剤及び第２の製剤のうちの少なくとも１つがモンモリロナイトをさらに含む、生体接着性マトリックスが提供される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、生体接着性マトリックスは封鎖された生物活性剤をその中にさらに含み、生体接着性マトリックスは薬物溶出生体接着性マトリックスである。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、
ａ）ゼラチン；
ｂ）アルギネート；
ｃ）モンモリロナイト；
ｄ）ゼラチンをカップリングするための、及び／又はアルギネートをカップリングするための、及び／又はゼラチンをアルギネートにカップリングするためのカップリング剤；並びに
ｅ）水
を含む、生体接着剤が提供される。
【００４４】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似した又は同等の方法及び材料が、本発明の実施形態の実施又は試験において使用され得るが、例示的な方法及び／又は材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態が、添付図を参照して例としてのみ本明細書に記載される。これより詳細に図を具体的に参照することにより、示された事項は本発明の実施形態の例としてであり、例示的な議論を目的としていることが強調される。これに関して、図と共に理解される説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａ−Ｃは、ＥＤＣ濃度が２０ｍｇ／ｍＬで一定に保たれた、破裂強度（図１Ａ）、生体接着剤の手作業による塗布（図１Ｂの濃いバー）とダブルシリンジによる塗布（図１Ｂの淡いバー）の比較も示す重ね剪断下の接合強度、及び圧縮状態での弾性率（図１Ｃ）、に対するゼラチン濃度の影響を示す比較バープロットを示す図である。
【図２】図２Ａ−Ｃは、４００ｍｇ／ｍＬゼラチン及び２０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図２Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図２Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図２Ｃ）、に対するアルギネート濃度の影響を示す比較バープロットを示す図である。
【図３】図３Ａ−Ｃは、４００：１０：２０Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図３Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図３Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図３Ｃ）、に対するＭＭＴ濃度の影響を示す比較バープロットを示す図である。
【図４】図４Ａ−Ｃは、４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図４Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図４Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図４Ｃ）、に対するカオリン濃度の影響を示す比較バープロットを示す図である。
【図５】図５Ａ−Ｂは、ＭＭＴのＸＲＤ試験の結果を示す図であり、図５Ａが、プリスティン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）ＭＭＴ（ライン１）及び非充填生体接着剤（ライン２）のＸＲＤパターンを示し、図５Ｂが、２０ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＴ（ライン３）、１０ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＴ（ライン４）、及び５ｍｇ／ｍＬ  ＭＭＴ（ライン５）を充填された本発明のいくつかの実施形態による生体接着性複合製剤の正規化  ＸＲＤパターンを示す。
【図６】図６Ａ−Ｃは、カオリン（図６Ａ）及びナトリウムモンモリロナイト（ＭＭＴ；図６Ｂ）の化学構造、並びに異なるタイプのポリマー／層状珪酸塩複合材料の略図を示しており、マイクロ複合材料がカオリン珪酸塩複合材料を特徴付けるために示唆され、挿入ナノ複合材料及び剥離ナノ複合材料がＭＭＴ珪酸塩複合材料を特徴付けるために示唆される。
【図７】図７Ａ−Ｃは、４００：１０  Ｇｅｌ−Ａｌを有する生体接着性製剤中の、ゼラチンの濃度（図７Ａ）、４００ｍｇ／ｍＬゼラチンに基づくアルギネートの濃度（図７Ｂ）、並びにＭＭＴ（図７Ｃの四角によりマークされた）及びカオリン（図７Ｃの三角によりマークされた）の濃度の影響を示す、本発明のいくつかの実施形態による例示的な生体接着性製剤の粘度を評価するために行われたレオロジー試験の結果を示す図である。
【図８】図８は、４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく例示的な生体接着性製剤において使用された、ＭＭＴの濃度（四角によりマークされた）及びカオリンの濃度（三角によりマークされた）により影響された４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ  生体接着剤のゲル化時間を示す図である。
【図９】図９Ａ−Ｂは、Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ  ４００−１０−２０ｍｇ／ｍＬを有する、本発明のいくつかの実施形態による例示的な生体接着性製剤について測定された、初期粘度（図９Ａ）及び破裂強度（図９Ｂ）に対する冷水魚ゼラチン（濃いバー）対ブタゼラチン（淡いバー）の影響を示す図である。
【図１０】図１０は、濃い／淡い矢印が、特定のパラメータの増加／減少がそれぞれ次のパラメータの増加をもたらす場合を表し、一方、破線はより適度な応答を表す、粘着及び接着強度に対する生体接着剤成分の影響を記載する質的モデルの略図である。
【００４７】
［発明の特定の実施形態の説明］
本発明は、そのいくつかの実施形態において生体接着性材料に関し、より詳細には、生体接着性シーラント、製剤、及びこれを形成するためのキット、並びにその使用に関するが、これらに限らない。
【００４８】
本発明の原理及び操作は、図面及び添付の説明を参照してよりよく理解することができる。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に記載され、又は実施例により例示された詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施若しくは実行することができる。また、本明細書に使用される表現及び語法は説明の目的のためであり、限定と見なされるべきではないことが理解されるべきである。
【００５０】
上記に示されているように、軟組織生体接着剤は組織を結び付ける物質であり、内科及び外科において広く適用され得、出血制御のために、及び広範な医学的適用に使用されるシーラントとして使用することもできる。理想の生体接着剤は、迅速な接着／密閉を可能にし、創傷治癒を可能にするのに十分な時間、創傷端の強くて近接した付着を維持するべきである。生体接着剤は、身体の天然の治癒機構を妨げるべきではなく、過度の限局性又は全身性炎症反応を引き起こすことなく分解するべきである。さらに、生体接着剤は、硬化前は粘性液体（塗布しやすい）であり、短いゲル化時間ですぐに凝固するべきである。
【００５１】
現在知られている生体接着性製剤の改善を探索するうちに、本発明者らは、ゼラチン、アルギネート、及びＥＤＣなどのカップリング剤に基づく生体接着性製剤に粘土鉱物を加えることにより、極めて効果的な生体接着性シーラントが提供されることを驚くべきことに見出した。凝固促進活性でも知られるカオリンなどの最も一般的に使用される粘土鉱物のいくつかは、生体接着剤に加えることができるが、モンモリロナイト（ＭＭＴ）は、より有利な特性を生体接着剤に与えることが驚くべきことに見出された。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「生体接着剤」は、生きている組織及び／又は別の物体に接着することができる物質を指す。生体接着剤は、したがって、生きている組織における断裂を密閉し、生きている（軟及び／又は硬）組織の２つの部分を接着し、又は生きている組織をそれ自体及び／若しくは無生物に接着するのに使用することができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、用語「生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）」は、上記に論じられているように生きている組織に接着することもでき、医学的適用において効果的及び安全に使用され得る、タンパク質及び糖質などの天然起源のポリマーを含む粘着性及び硬化性物質（糊）を記載するのに使用される。いくつかの適用において用語「生体接着剤」は、外部組織に適用される又は物体を皮膚に貼り付けるために局所的に適用される製剤を指すのに使用され、一方、生体接着剤が内部に使用されるいくつかの適用において、該用語は「シーラント」と呼ばれることが留意される。シーラントとして使用される場合、生体適合性、たわみ性、硬化性、分解性等などの全ての生体接着剤により共有される特性以外に、生体接着剤は、特定のシーラント用途に関連する破裂強度などの機械的特性を示すことが求められる。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、未硬化生体接着剤は本明細書において生体接着性製剤と呼ばれ、一方、硬化生体接着剤は本明細書において生体接着性マトリックスと呼ばれる。本明細書で使用されるとき、生体接着性製剤は、生きている組織及び／又は物体を接着する目的で、生きている組織及び／又は生きている組織に接着される物体に塗布することができる柔らかい製剤を指し、並びに生体接着性マトリックスは、生きている組織及び／又は物体を結び付ける硬化生体接着性製剤を指す。本明細書において参照される生体接着性製剤は、したがって、対応する生体接着性マトリックスの前駆体であり、生体接着性マトリックスは、生体接着性製剤が予備硬化製剤と見なされ得るように生体接着性製剤を硬化して形成される。
【００５４】
生体接着剤の成分：
本明細書に示された生体接着剤は、少なくとも２種類のポリマー（例えば、アルギネート及びゼラチン）、カップリング剤、及びＭＭＴを含有する。該生体接着性製剤は、カップリング剤の存在下で架橋反応を起こし、それにより硬化する。
【００５５】
いかなる特定の理論に縛られることなく、架橋反応は、本質的にゼラチン中の一級アミンをアルギネート中のカルボキシル基にカップリングすることによる、ゼラチン鎖とアルギネート鎖との、及び／又は１つ若しくは複数の他のゼラチン分子との架橋を伴うことが想定される。ＭＭＴは、架橋ポリマーに封入される。ゼラチンを主成分として、及びアルギネートをゼラチンと比べた少量成分として含む流体製剤を使用する場合、架橋のほとんどはゼラチンとアルギネートの間で形成することが想定される。本明細書において生体接着性マトリックスと呼ばれる、ＭＭＴを封入している実質的にゼラチン及びアルギネートである架橋ポリマーのこのネットワークは、流体生体接着性製剤の硬化半固体ゲル生成物である。それ故に、該マトリックスは、カップリング剤を用いてＭＭＴの存在下でゼラチン及びアルギネートをカップリングしてもたらされる、ＭＭＴを封入しているカップリングされたゼラチン−アルギネートマトリックスとして見なされる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、及び当技術分野で知られているように、用語「ゼラチン」は、特定の条件下でゲルを形成することができる水溶性タンパク質を記載する。ゼラチンは、コラーゲンの酸性又はアルカリ性条件及び一部分は加水分解条件での加熱溶解により典型的には得られる。タイプＡゼラチンは酸性法により得られ、正電荷をもたらす高密度のアミノ基を有する。タイプＢゼラチンはアルカリ法により得られ、負電荷をもたらす高密度のカルボキシル基を有する。コラーゲンには動物の皮膚及び骨などの種々の供給源があり、一連の物理的及び化学的特性を有する様々なゼラチン形態を提供する。典型的には、ゼラチンは、部分的に規則正しく連結された１８個のアミノ酸を含有しており、グリシン又はアラニンが残基の約３分の１〜２分の１であり、プロリン又はヒドロキシプロリンが約４分の１であり、及び残りの４分の１は酸性又は塩基性アミノ酸残基を含む。典型的には、ゼラチンを水に溶解するには、使用されるゼラチンの供給源に応じて、加熱又は撹拌し、湯を加えて少なくとも３５℃の温度に達することが必要である。適度の加熱は可溶性を高め、激しい加熱はゼラチンの凝集又は部分的な加水分解をもたらす場合がある。ゼラチンの粘度は、タイプ、濃度、時間、及び温度によって異なる。酸処理ゼラチンは、アルカリ処理ゼラチンと比較してわずかに大きな固有粘度を有する。ゼラチンは比較的安価であり、生体適合性であり、免疫学的問題がほとんどなく、生分解性である。「ブルーム」は、ゲル又はゼラチンの強度を測定するための試験である。該試験は、ゲル４ｍｍの表面を破ることなく歪めるために探針（通常は０．５インチの直径を有する）により必要とされる重さ（グラム）を判定する。結果はブルームグレード又はブルーム数で表され、典型的には３０〜３００ブルームの間である。ゼラチンのブルーム試験を行うには、６．６７％ゼラチン溶液が試験前に１０℃で１７〜１８時間保存される。
【００５７】
本発明の実施形態の文脈において、ゼラチンの代替物としては、寒天（海藻から回収された複合糖質）、カラギーナン（海藻から回収された複合糖質）、ペクチン（熟果及び野菜に生じるコロイド糖質）、コンニャク（コンニャク属の植物から抽出されるコロイド糖質）、グアーガム（グアラン。クラスタマメ属（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）のクラスタマメから抽出されるガラクトマンナンの一種）、及びゼラチンの有無にかかわらずそれらの様々な組み合わせなどの、非動物ゲル供給源を挙げることができる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、及び当技術分野で周知のように、用語「アルギネート」はアニオン性多糖類を記載する。本明細書及び当技術分野においてアルギン酸とも呼ばれるアルギネートは、β−Ｄマンヌロン酸モノマー（Ｍブロック）及びα−Ｌグルロン酸（Ｇブロック）から成るブロック共重合体であり、異なる形態のアルギネートは異なる比のＭ／Ｇを有する。用語「アルギネート」は本明細書で使用されるとき、様々なＭ／Ｇ比を包含する。Ｍ／Ｇ比は種、供給源、及び藻／植物の収穫期によって異なる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、アルギネートは０．３〜４、０．７〜３、又は１〜２にわたるＭ／Ｇ比を有する。他の実施形態において、Ｍ／Ｇ比は０．７、０．９、１、１．３、１．５、１．７、１．９、２、２．３、２．５、２．７、３、３．５、又は４である。
【００６０】
アルギネートは、水を結合することにより（自身の重量の２００〜３００倍吸水することができる）粘性ガムを形成することが知られている。
【００６１】
アルギネートは、隣接するアルギネート鎖のＧブロック間で結合し、イオン性鎖間架橋をもたらす二価カチオンとの相互作用により、穏和な条件下、水性溶液中で可逆的にゲル化する。アルギネートは一般的に、カルボキシル末端を有するアニオン性ポリマーであるため、優れた粘膜付着剤として知られ、使用されている。
【００６２】
天然起源のアルギネートは、海洋性褐藻（例えば、オオウキモ（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）、アスコフィルム・ノドスム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）、及びコンブ属）、及び土壌細菌（シュードモナス属及びアゾトバクター属）において典型的には産生される。合成的に調製されたアルギネートも企図される。
【００６３】
アルギネートは比較的安価であり、生体適合性であり、哺乳動物における免疫応答を惹起せず、生分解性である。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態の文脈において、アルギネートは、２Ｐａ−ｓｅｃ超を示す高粘度（ＨＶ）型、又は０．１〜０．３Ｐａ−ｓｅｃを示す低粘度（ＬＶ）型で使用されてもよい。以下に実施例セクションで示されているように、ＬＶ／ＨＶアルギネート型の使用は、本明細書に示された生体接着性製剤の．微調整及び最適化に別のパラメータを加える。
【００６５】
生体接着剤は、乾燥粉末又は固体粒子の懸濁液としてゼラチン／アルギネート混合物の溶液に典型的には加えられる粘土鉱物をさらに含む。粘土鉱物としては、カオリナイト（カオリン、Ａｌ２Ｓｉ２Ｏ５（ＯＨ）４）、モンモリロナイト（ＭＭＴ、（Ｎａ，Ｃａ）０．３３（Ａｌ，Ｍｇ）２Ｓｉ４Ｏ１０（ＯＨ）２・ｎＨ２Ｏ）、ハロイサイト（Ａｌ２Ｓｉ２Ｏ５（ＯＨ）４）、イライト（（Ｋ，Ｈ３Ｏ）（Ａｌ，Ｍｇ，Ｆｅ）２（Ｓｉ，Ａｌ）４Ｏ１０［（ＯＨ）２，（Ｈ２Ｏ）］）、バーミキュライト（（ＭｇＦｅ，Ａｌ）３（Ａｌ，Ｓｉ）４Ｏ１０（ＯＨ）２・４Ｈ２Ｏ）、タルク（Ｍｇ３Ｓｉ４Ｏ１０（ＯＨ）２）、セピオライト（Ｍｇ４Ｓｉ６Ｏ１５（ＯＨ）２・６Ｈ２Ｏ）、パリゴルスカイト（アタパルジャイト、（Ｍｇ，Ａｌ）２Ｓｉ４Ｏ１０（ＯＨ）・４（Ｈ２Ｏ））、及びパイロフィライト（Ａｌ２Ｓｉ４Ｏ１０（ＯＨ）２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
カオリナイト（カオリン）及びモンモリロナイト（ＭＭＴ）は両方とも、アルミナなどの別の酸化物上の層を挟み込むＳｉ２Ｏ５（別名２：５比）の珪酸四面体の平行シートの一般形態を有する層状珪酸塩（フィロ珪酸塩、又は粘土鉱物）であり、水又はヒドロキシル基を介した水素結合により結合される。カオリンは１：１粘土であり、シリカ及びアルミナ層が１：１比で交互になっていることを意味するが、ＭＭＴは２：１粘土であり、中心の八面体酸化物シートを挟み込む、２つの四面体シリカシートを有することを意味する。カオリンは湿潤時に膨張しないが、ＭＭＴは著しい湿潤膨張又は膨潤能を有することが観察されている。これらの構造の違いは、複合ゼラチン−アルギネート生体接着性シーラント製剤の性能の違いを説明することができる。
【００６７】
上記に論じられているように、カオリンは公知であり、市販の医薬品において凝固剤又は凝固促進剤として広く使用されているが、ＭＭＴはそのような目的にほとんど使用されない。以下に実施例セクションで示されているように、ＭＭＴは、例えば、カオリンと比較してより高い破裂強度を生体接着剤に与えることにより、本発明の実施形態の文脈において有利であることが見出された。それ故に、本発明の実施形態によれば、生体接着剤はＭＭＴ含む。
【００６８】
用語「カップリング剤」は本明細書で使用されるとき、２つ以上の官能基間の結合を分子内、分子間、又は両方で触媒又は形成することができる試薬を指す。カップリング剤は、ポリマーネットワークを増加させ、ポリマー鎖間の架橋を促進するために広く使用されており、それ故に、本発明のいくつかの実施形態の文脈において、カップリング剤は、ポリマー鎖間の架橋を促進することができるように、又はアミノ官能基とカルボキシル官能基の間、若しくはポリマー鎖の他の化学的に適合する官能基間の架橋を促進することができるように、又はゼラチンとアルギネートの間の架橋を促進することができるようにする。本発明のいくつかの実施形態において用語「カップリング剤」は、用語「架橋剤」に置き換えることができる。いくつかの実施形態において、ポリマーの１つはカップリング剤としての機能を果たし、架橋ポリマーとして作用する。
【００６９】
「化学的に適合する」により、２種類以上の官能基が、結合を形成するように互いに反応できることが意味される。
【００７０】
ゼラチン及びアルギネートに典型的には存在する例示的な官能基としては、アミン（大部分は一級アミン−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）、スルフヒドリル及びヒドロキシル（それぞれ−ＳＨ及び−ＯＨ）、及びカルボニル（−ＣＯＨアルデヒド及び−ＣＯ−ケトン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
一級アミンは、ゼラチン、並びに様々な天然起源の多糖類及びアミノグリコシドにおいて見出される場合、ポリペプチド鎖のＮ末端（アルファアミンと呼ばれる）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）残基の側鎖（イプシロンアミン）に生じる。生理的条件でのその正電荷のため、一級アミンは通常、タンパク質及び他の巨大分子の外側に向いている（すなわち、外表面で見出される）。故に、一級アミンは通常、コンジュゲーションに利用可能である。
【００７２】
カルボキシルは、ポリペプチド鎖のＣ末端、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）の側鎖、並びに天然起源のアミノグリコシド及びアルギネートなどの多糖類に生じる。一級アミンと同じように、カルボキシルは通常、タンパク質及び多糖類などの大きなポリマー化合物の表面にある。
【００７３】
スルフヒドリル及びヒドロキシルは、それぞれ、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）及びセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）の側鎖に生じる。ヒドロキシルは、多糖類及びアミノグリコシドに豊富である。
【００７４】
ケトン又はアルデヒドとしてのカルボニルは、合成及び／又は天然の様々な酸化プロセスにより、糖タンパク質、グリコシド、及び多糖類において形成され得る。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カップリング剤は、官能基のタイプ、及びそれらの間に形成され得る架橋結合の性質に従って選択することができる。例えば、アミンに直接カップリングするカルボキシルは、ＥＤＣなどのカルボジイミド型カップリング剤を用いて提供することができ；アミンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）、イミドエステル、ＰＦＰ−エステル、又はヒドロキシメチルホスフィンによりカルボキシル、カルボニル、及び他の反応性官能基にカップリングされてもよく；スルフヒドリルは、マレイミド、ハロアセチル（ブロモ又はヨード）、ピリジルジスルフィド、及びビニルスルホンによりカルボキシル、カルボニル、アミン、及び他の反応性官能基にカップリングされてもよく；酸化糖質におけるようなアルデヒドは、ヒドラジドを用いて他の反応性官能基にカップリングされてもよく；並びにヒドロキシルは、イソシアネートを用いてカルボキシル、カルボニル、アミン、及び他の反応性官能基にカップリングされてもよい。
【００７６】
それ故に、本発明のいくつかの実施形態において使用することができる適切なカップリング剤としては、カルボジイミド、ＮＨＳ−エステル、イミドエステル、ＰＦＰ−エステル、又はヒドロキシメチルホスフィンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
カルボジイミドは、一級アミンへのカルボキシルの直接カップリング（コンジュゲーション）を促進する完全なクロスリンカーである。故に、他の試薬と異なり、カルボジイミドはゼロ長クロスリンカーであり、カップリングされた分子間の最終架橋の一部にならない。ペプチド、タンパク質、多糖類、及びアミノグリコシドは複数のカルボキシル及びアミンを含有するため、直接的なカルボジイミド媒介カップリング／架橋は通常、ポリペプチドのランダム重合を引き起こす。
【００７８】
ＥＤＣ、すなわちＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩は、カルボキシル基とアミノ基の間の縮合を可能にしてアミド結合及び副生成物の尿素を形成する、広く使用されているカルボジイミド型カップリング剤及びクロスリンカーである。ひとたびアミン／ヒドロキシル反応物と反応すると、ＥＤＣはカップリング生成物の構造中に存在せず、それ故にその生体適合性及び生分解性は、本実施形態の文脈において問題にならない。ゼラチン分子はカルボキシル基及びアミノ基の両方を示すことから、このタイプのポリマーはＥＤＣによる分子間架橋を受けることができる。
【００７９】
ＥＤＣ及びその尿素誘導体は細胞傷害性であり、細胞成長を阻害することが知られている。生きている組織におけるアミノ基及びカルボキシル基に対するこの高い反応性、及び尿素誘導体の放出が、おそらくＥＤＣの細胞傷害性の根拠である。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態によるカルボジイミド型カップリング剤の代替物としては、グリオキサール、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ポリグルタルアルデヒド、デキストラン、クエン酸誘導体、微生物トランスグルタミナーゼ、及びゲニピンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、カップリング剤はカップリング反応中に使い尽くされ、アミン基とカルボキシル基の間のカップリング反応の副生成物として尿素誘導体を生成する。尿素誘導体の性質は、使用されるカップリング剤の性質により決定される。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、様々なカップリング剤及び架橋剤が、架橋反応をさらに促進するために、ゼラチン及びアルギネート及びカップリング剤に基づく任意の生体接着性製剤において添加剤として組み合わされ又は使用され得る。代表例では、ＮＨＳエステルがＥＤＣなどのカルボジイミド型カップリング剤に加えられる。
【００８３】
ＥＤＣの架橋反応に対するＮＨＳの添加は、加水分解を受けにくい、及び転位を防ぐＮＨＳ活性化カルボン酸基をもたらす。一方、高濃度でＮＨＳはＥＤＣと反応し、架橋反応と競合することがあり、それにより架橋のためのＥＤＣの有効量を低減し得る。それ故に、ＮＨＳなどの試薬は、本明細書において架橋促進剤と呼ばれる。
【００８４】
カップリング反応を促進する、及び本発明の文脈においては、生体接着性マトリックスを形成する上で架橋の形成を促進する様々な薬剤を加えることにより、架橋効率を向上させることが意図され、及び／又は上記に論じられているように所望の特性を示すマトリックスを形成するために必要とされるカップリング剤の量を低減することが意図される。それ故に、そのような薬剤は、本明細書において「架橋促進剤」と呼ばれる。架橋促進剤の量は、重量／体積当たりの重量／体積パーセント（ｗ／ｖ  ／  ｗ／ｖ）として、すなわちカップリング剤の量と比べて与えられ、本発明のいくつかの実施形態によれば、この量は約１％〜１００％、又は１％〜２００％重量／体積当たりの重量／体積パーセントである。
【００８５】
架橋促進剤の代表例としては、スルホ−ＮＨＳ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＨＢｔＵ、ＨＣｔＵ、ＨＡｔＵ、ＴＢｔＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＩＣペンタフルオロフェノール等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性製剤における架橋剤及び架橋促進剤の組み合わせは、接合強度が改善された生体接着性マトリックスを提供する。さらに、ＥＤＣなどの架橋剤及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの架橋促進剤の組み合わせは、生体接着剤中のＥＤＣの量の大幅な低減を可能にする。ＥＤＣ量の低減は、ＥＤＣを使用することの医療の安全性及び細胞傷害性の影響のために有益である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、架橋促進剤の量は、カップリング剤の量と比べて、１〜２００％の間の任意の値を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、１００、１５０、２００％であってもよく、又はさらに高くてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、架橋促進剤の量は、カップリング剤の量と比べて、５〜４０の任意の値を含む５、１０、１５、２０、３０、又は４０％である。
【００８８】
並行して使用される場合、ＥＤＣ及びＮＨＳは、比較的低濃度のＥＤＣが使用される場合でさえ、より強い接合生体接着性マトリックスを提供する。例示的な製剤は、１０ｍｇ／ｍｌであるＥＤＣ量及びＥＤＣ量と比べて１０％であるＮＨＳ量を含む。
【００８９】
例えば、塗布を改善し拡散を制限する粘度調節剤、浸透促進剤、及び塗布又は経過観察中の追跡を可能にする着色料又は蛍光剤などの様々な追加の及び任意選択の添加剤が、生体接着剤の予備硬化特性を修飾するために生体接着剤に加えられてもよい。生体接着剤の硬化後特性を修飾するために、以下により詳細に論じられるように、様々な添加剤、すなわち、得られたマトリックスの特性に影響を与える添加剤が生体接着剤に加えられてもよい（例えば、追加のカップリング剤／架橋剤、様々なアルギネート種に対するクロスリンカーによってゲル化剤として作用するカルシウムイオン及び他の土類金属のイオン、可塑剤、硬化剤、軟化剤、並びにマトリックスの曲げ弾性率を修飾する充填剤及び他の薬剤、並びに生体接着剤中に存在する場合、生物活性剤の放出速度、浸透、及び吸収に影響を与える添加剤など）。
【００９０】
成分の濃度：
本発明のいくつかの実施形態によれば、生体接着剤は、ゼラチン、アルギネート、ＭＭＴ、及びカップリング剤を含むが、これらの成分の各々は、第１の製剤及び第２の製剤を所定の比で組み合わせることによって生じる濃度で生体接着性製剤中に存在する。
【００９１】
生体接着性製剤が有用及び有効であるためには、そのポリマーの濃度が、主に粘度に関して、実行可能な柔らかい稠度を提供するように選択されることが本明細書において留意される。したがって、実行可能な製剤のポリマー濃度範囲の上限、特にゼラチンの濃度範囲の上限は、一定の値を超えることはできない。１つ又は複数のこれらの最大範囲値を超えることは、塗布向けに形成することができず、又は柔らかくなり得ない実行不可能な製剤をもたらす可能性がある。
【００９２】
したがって、第１及び第２の製剤のいずれか一方における様々な成分の濃度は、第１及び第２の製剤が組み合わされる体積又は重量比に従って設定される。製剤は典型的には液体として作られるため、体積に関して第１及び第２の製剤の組み合わせに言及することがより実用的であるが、第１及び第２の製剤の組み合わせは、重量に関しても言及され得ることが留意される。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、第１の製剤及び第２の製剤の組み合わせは、第１の製剤及び第２の製剤のそれぞれ１：９、２：８（１：４）、３：７、４：６、５：５（１：１）、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、又は２５：１部の体積比、又は１：９〜２５：１の間の任意の比で達成される。いくつかの実施形態において、体積比は、第１の製剤及び第２の製剤のそれぞれ１：１〜２５：１部の範囲である。いくつかの実施形態において、体積比は、第１の製剤及び第２の製剤のそれぞれ１：１〜１：１０部の範囲である。いくつかの実施形態において、体積比は、第１の製剤及び第２の製剤のそれぞれ２：１〜６：１部の範囲である。いくつかの実施形態において、体積比は、第１の製剤及び第２の製剤の４：１部の範囲である。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着性製剤中のゼラチンの濃度は、５００ｍｇ／ｍｌ以下である。本発明のいくつかの実施形態によれば、生体接着性製剤中のゼラチンの濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、生体接着性製剤中のゼラチン含量は、１００ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ〜４００ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、又は５０ｍｇ／ｍｌ〜４００ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、若しくは５０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である（上記に示された範囲の間の任意の値を含む）。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着性製剤中のアルギネートの濃度は、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、生体接着性製剤中のアルギネート含量は、１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜９０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、又は５ｍｇ／ｍｌ〜９０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、若しくは５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である（上記に示された範囲の間の任意の値を含む）。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着性製剤中のモンモリロナイトの濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、生体接着性製剤中のモンモリロナイト含量は、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜９０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である（上記に示された範囲の間の任意の値を含む）。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて得られる生体接着性製剤中のカップリング剤の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である（上記に示された範囲の間の任意の値を含む）。
【００９８】
上記に論じられているように、いくつかのカップリング剤は、細胞傷害性として又は細胞傷害性部分をもたらすとして知られているため、生体接着性製剤内では比較的低量のカップリング剤を使用することが望ましい。一方、製剤中のカップリング剤の量の低減は、製剤から形成される生体接着性マトリックスの接合強度の低下をもたらす可能性がある。本発明者らは、１０〜４０ｍｇ／ｍｌ又はさらにより低量のカップリング剤を含有する生体接着剤が、接合強度が実質的に損なわれない生体接着性マトリックスを提供するのに使用できることを実証した。
【００９９】
本明細書に示された生体接着剤のいくつかの成分の濃度が、以下の表にまとめられている。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
いくつかの例示的な生体接着性製剤が以下に示される。それぞれが、ゼラチン、アルギネート、モンモリロナイト、及びカップリング剤を、第１の製剤及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて提供される生体接着剤の総体積の体積当たりの重量パーセントとして与えられる示された濃度で含む：
例示的な生体接着性製剤Ｉ：２００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及びカルボジイミド型カップリング剤としての１０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＩＩ：３００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＩＩＩ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＩＶ：３００ｍｇ／ｍｌゼラチン、２０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤Ｖ：３００ｍｇ／ｍｌゼラチン、２０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＶＩ：３００ｍｇ／ｍｌゼラチン、２０ｍｇ／ｍｌアルギネート、５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＶＩＩ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、２０ｍｇ／ｍｌアルギネート、１０ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＶＩＩＩ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、３０ｍｇ／ｍｌアルギネート、１５ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；
例示的な生体接着性製剤ＩＸ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、４０ｍｇ／ｍｌアルギネート、２０ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；ｏｒ
例示的な生体接着性製剤Ｘ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネート、１０ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ；ｏｒ
例示的な生体接着性製剤ＸＩ：４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネート、２０ｍｇ／ｍｌモンモリロナイト、及び１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態において、カップリング剤の濃度は、製剤の性能を損なうことなく添加剤の存在により低下され得ることが本明細書において留意される。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態において、製剤は、生体接着剤の性能を改善し、より広範囲の適用における使用により適するようにするための、上記に示された任意選択の添加剤を含み得ることが本明細書において留意される。
【０１０４】
上述の例示的な製剤のいずれも、本明細書に記載された１つ又は複数の生物活性剤をさらに含むことができる。
【０１０５】
本発明の実施形態によれば、第１及び第２の製剤の溶媒は水である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の製剤を体積比１：９〜２５：１で組み合わせて提供される組み合わせ生体接着性製剤の水含量は、生体接着性製剤の４０％〜９５％の範囲である。
【０１０６】
成分濃度の他の組み合わせが企図され、そのいくつかは後に続く実施例セクションで実証されていることが本明細書において留意される。
【０１０７】
生体接着剤を形成するためのキット：
本明細書においてゼラチン、アルギネート、及びＭＭＴを含むシーラントとも呼ばれる本明細書に示された生体接着剤は、カップリング剤を接触させると硬化される。故に、生体接着剤を保管、形成、分注するための有効な手段は、カップリング剤がゼラチン及びアルギネートから分離されて保存されるキットである。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、生体接着剤を保管、形成、及び／又は塗布するためのキットが提供される。キットは、本明細書において第１の容器及び第２の容器と呼ばれる少なくとも２つの容器を含み、第１の容器は第１の製剤を含有し、第２の容器は第２の製剤を含有する。いくつかの実施形態において、第１の製剤はゼラチン及びアルギネートを含み、第２の製剤はゼラチンをカップリング及び／又はアルギネートをカップリング及び／又はゼラチンをアルギネートにカップリングするためのカップリング剤を含み、粘土鉱物モンモリロナイト（ＭＭＴ）が第１の製剤及び第２の製剤のいずれか一方に含まれる。２つの容器が密閉された状態で及び許容可能な保管条件下で保存され、並びに第１及び第２の製剤が混合されない限り、生体接着剤は硬化又は崩壊しない。
【０１０９】
上述の任意選択の添加剤、及び本明細書に記載された任意選択の生物活性剤は、第１及び／又は第２の製剤のいずれか一方に加えられてもよいことが本明細書において留意される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、キットは少なくとも２つの容器を含み、それぞれは特定の製剤に対応する成分を含有し、該成分は、２つの製剤の混合が生体接着剤をもたらすように特定の濃度まで溶媒に予め溶解されている。さらに又は或いは、キットは１つ又は複数のコンパートメントを含み、それぞれは生体接着性製剤の１つ又は複数の成分の乾燥粉末の予め測定された量を含有し、粉末（複数可）及び溶媒の混合が生体接着剤をもたらすように、個別のコンパートメントは溶媒の予め測定された量を含有する。
【０１１１】
キットは、混合及び撹拌ツール、ボウル、アプリケータ、鮮度インジケータ、不正開封防止手段、並びに利用者に説明するための印刷物をさらに含んでもよい。
【０１１２】
アプリケータデバイス：
キットは、第１及び第２の製剤の各々の測定量を制御可能に及び任意選択で同期して排出、分注、及び塗布するためのデバイス、アプリケータ、又はディスペンサーの形態にあってもよく、又はこれを含んでもよい。製剤の各々は、個々の製剤のカートリッジとして役割を果たす個々の容器から分注される。
【０１１３】
それ故に、本発明のいくつかの実施形態の別の態様によれば、本明細書に示された生体接着剤の形成、分注、及び塗布に使用する一体型二重チャンバーディスペンサー又はアプリケータデバイスが提供される。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アプリケータデバイスは、混合チューブと結合するための台が中にあるジョイント吐出口を備えたダブルバレルカートリッジアセンブリを含む。本明細書に示された生体接着性製剤の塗布に適した一体型アプリケータは、制御された安全な条件下で、個別のコンパートメントから２つのサブ製剤を効率よく分注することを必要とする２部式化学接着剤用の任意のアプリケータの設計に従ってもよい。
【０１１５】
例えば、アプリケータデバイスは、第１の製剤を保持する第１のチャンバーを規定する第１のバレル、及び第１のチャンバーから第１の製剤を押し出すための、一方の先端が該チャンバーで受け止められる第１のプランジャーを有する第１のシリンジの形態の第１の容器と、
第２の製剤を保持する第２のチャンバーを規定する第２のバレル、及び第２のチャンバーから第２の製剤を押し出す、一方の先端が第２のチャンバーで受け止められる第２のプランジャーを有する第２のシリンジの形態の第２の容器と、
ノズルであって、遠位端、近位端、及びノズルを通って伸びるルーメンを有するノズルと、並びに第１の製剤及び第２の製剤がルーメン中で接触するように、ノズルの近位端を第１のチャンバー及び第２のチャンバーに連結するための手段とを含み、
これにより、第１のプランジャー及び第２のプランジャーの駆動時にノズルを通って噴出され得る生体接着剤を形成する。
【０１１６】
本明細書に示された生体接着剤を混合、形成、分注、及び塗布するのに使用することができる追加のアプリケータデバイスは、例えば、米国特許第４，０４４，７５７号、４，９７９，９４２号、５，０８２，１４７号、６，７３２，８８７号、７，５３０，８０８号、７，６３５，３４３号、７，６９９，８０３号、８，０７４，８４３号に開示されており、これらの全てが、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
生体接着性製剤の特性：
上記に論じられているように、有効な生体接着性の設計は、例えば、実行可能性／有用性及び効率性（両方とも安全性とも翻訳される）を含むいくつかの要件を遵守すべきである。
【０１１８】
実行可能性及び安全性の検討のもと、本明細書において生体接着性製剤と呼ばれる有効な予備硬化生体接着剤は、施術者が、例えばクリニック条件下で生体接着剤を塗布及び使用できるようにする室温で粘度を示さなければならない。例えば、過度に粘性で、故に混合しにくく、広げることができない生体接着性製剤は、組織に塗布することが困難であるが、一方、十分に粘性でなく、故に過度に流動性の生体接着性製剤は流れやすく、望ましくない漏出、不十分な接着、並びに概して、有害な副作用の増大及び安全性の低下をおそらく伴うであろう。
【０１１９】
さらに実行可能性及び安全性の検討のもと、有効な生体接着剤は、有害な副作用の増大及び安全性の低下をもたらす可能性がある長期操作を避けるために、比較的短時間で生体接着剤を利用する操作を完了できるようにする、本明細書に定義された硬化時間を示すべきである。それにもかかわらず、一方で硬化時間は、正確な配置及び必要に応じて任意選択の再配置を可能にするのに十分長くあるべきである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、例えば物体が互いに近接し、比較的小さく、又は再配置ステップが必要とされなくてもよいようにたやすく最適に配置される場合、物体の瞬間又は迅速な接合が望ましいことがある。それ故に、短い硬化時間が、本発明のいくつかの実施形態において適切であり得る。そのような場合、生体接着性製剤は、比較的短期間で硬化することが望ましい。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、例えば物体がたやすく最適に配置されず、再配置ステップが必要とされ得る場合、物体の瞬間接合は望ましくないことがある。それ故に、極めて短い硬化時間は、本発明のいくつかの実施形態において実用的でない可能性がある。そのような場合、互いに接合される物体の再配置（分離及び再隣接）のための期間を生体接着性製剤が可能にすることが望ましい。
【０１２２】
生体接着剤が硬化するこの時間の範囲（ウィンドウ）は、以下にさらに論じられるように機能時間（ｗｏｒｋａｂｌｅ  ｔｉｍｅ）と呼ばれる。
【０１２３】
本明細書に示された第１及び第２の製剤を組み合わせて提供される生体接着性製剤などのマルチパート生体接着性製剤の粘度に言及する場合、本質的に、より粘性の製剤、すなわち、モンモリロナイト及び／又は任意の生物活性剤若しくは他の添加剤の有無にかかわらず、ゼラチン、アルギネート、又はゼラチン及びアルギネートの混合物を含有する製剤に関する。このより粘性の製剤は、その化学組成が維持される限り、すなわち、粘度付与ポリマー（水含量）、温度、及び分子構造が変わらないままである限り、類似した粘度を本質的に維持するであろう。或いは、粘度への言及は、第１及び第２の製剤を混合した直後に提供される、全ての成分を含む複合生体接着性製剤に関する。溶解ポリマーが高粘度に最も寄与している間に、カップリング剤を添加することは架橋によりポリマーの化学組成を変えることになり、温度及び水含量に本質的に関係なく生体接着剤の粘度を不可逆的に変える。実用的な理由から、本明細書において粘度に言及する場合、ゼラチン及びアルギネートを含有する第１の製剤に対して言及され、一方、カップリング剤を含有する第２の製剤は粘性部分と比べて粘性が低く、体積が小さいと見なされる。標準的で一般的な実践及び装置を用いた生体接着性製剤の粘度の測定は、比較的短い硬化時間のため実用的でない可能性がある。ゼラチン及びアルギネートは粘度に対する主な寄与要因であるが、全ての他の成分及び添加剤は小さな粘度修飾要因である。該製剤の粘度に直接影響する顕著な成分は、架橋剤及び架橋促進剤である。その理由は、これらの薬剤が該製剤の固体生体接着性マトリックスへの硬化（ｃｕｒｉｎｇ）（硬化（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ））に関与するためである。それ故に、該複合製剤の粘度に言及する場合、第１の製剤の粘度に言及している可能性がある。硬化剤を欠く第１の製剤の粘度は、組み合わされた第１及び第２の製剤の粘度と本質的に同じであることが確実に想定される。
【０１２４】
以下に論じられるように、生体接着性製剤は、生体接着剤の全ての成分が混ぜ合わされる時点から、生体接着剤が徐々に出来上がるには過度に粘性となる時点までの期間を指す「機能時間」を特徴とする。それ故に、本発明のいくつかの実施形態による生体接着性製剤の報告された粘度は、機能時間中の有効粘度である。
【０１２５】
動粘度は、測定方法及び他の要因に応じて様々な単位により定量化される。本実施形態の文脈において、動粘度はニュートン秒毎平方メートル（Ｎ  ｓ  ｍ−２又はＰａ−ｓｅｃ）の単位で言及され、１Ｐａ−ｓｅｃは１キログラム毎平方メートル（ｋｇ  ｍ−１  ｓ−１）に等しく、１０ポアズ（Ｐ）に等しい。例えば、２０℃の水は１ｍＰａ−ｓｅｃ（０．００１Ｐａ−ｓｅｃ）の動粘度を有すると言われ、３７℃の血液は３〜４ｍＰａ−ｓｅｃ、及び２０℃のハチミツは１０Ｐａ−ｓｅｃの粘度を特徴とする。
【０１２６】
故に、本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性製剤は：
１Ｐａ−ｓｅｃ〜５０Ｐａ−ｓｅｃの範囲である室温粘度（カップリング剤溶液を加える前のゼラチン−アルギネート溶液、又は混ぜ合わされた直後の、全ての成分を含有する最終生体接着性製剤のどちらかを指す）；及び
５秒〜３０分の範囲である生理的条件下の硬化時間
のうちの少なくとも１つを特徴とする。
【０１２７】
動粘度の基準はＰａ−ｓｅｃ単位で与えられ、その値は所定の周囲温度での特定の粘度測定値から導かれるが、動粘度は他の単位により表されてもよく、任意の生体接着性製剤又はその一部を特徴付けるのに全て使用することができる様々な方法及び手法により測定されてもよいことが本明細書において留意される。例えば、室温での動粘度の測定はより簡単であるが、５０℃などのより高い温度で製剤を混合及び調製することがより効率的及び実用的であるため、作業温度より高い温度でも生体接着性製剤の動粘度を報告及び検討することも有用であり得る。或いは、例えば、ほとんどの手術室は室温より低い標準温度に保たれるため、標準的な室温より低い温度での動粘度を報告及び検討すること、並びに製剤が塗布及び使用されることが意図される体温又は体温に近い温度での生体接着性製剤の粘度を報告及び検討することにより情報を提供し得る。
【０１２８】
それ故に、本発明のいくつかの実施形態によれば、生体接着性製剤の動粘度、又はゼラチン及びアルギネートを含有する製剤部分の動粘度は、２０℃で１Ｐａ−ｓｅｃ〜５０Ｐａ−ｓｅｃ、及び／又は３７℃で０．５Ｐａ−ｓｅｃ〜２５Ｐａ−ｓｅｃの範囲である。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生体接着性製剤の室温動粘度、又はゼラチン及びアルギネートを含有する製剤部分の動粘度は、１Ｐａ−ｓｅｃ〜５Ｐａ−ｓｅｃ、５Ｐａ−ｓｅｃ〜１０Ｐａ−ｓｅｃ、１０Ｐａ−ｓｅｃ〜１５Ｐａ−ｓｅｃ、１５Ｐａ−ｓｅｃ〜２０Ｐａ−ｓｅｃ、２０Ｐａ−ｓｅｃ〜２５Ｐａ−ｓｅｃ、２５Ｐａ−ｓｅｃ〜３０Ｐａ−ｓｅｃ、３０Ｐａ−ｓｅｃ〜３５Ｐａ−ｓｅｃ、３５Ｐａ−ｓｅｃ〜４０Ｐａ−ｓｅｃ、４０Ｐａ−ｓｅｃ〜４５Ｐａ−ｓｅｃ、又は４５Ｐａ−ｓｅｃ〜５０Ｐａ−ｓｅｃの範囲である。
【０１３０】
本明細書で使用されるとき、語句「硬化時間」は、生体接着性製剤が、本明細書に記載されるように生体接着性マトリックスを形成する期間を記載する。
【０１３１】
生体接着性製剤は、カップリング剤を片方又は両方のゼラチン及び／又はアルギネートと接触させると硬化し始めるが、このカップリング及び架橋反応は製剤の塊のバルク全体にわたって即効性ではないことが本明細書において留意される。したがって、用語「硬化時間」は、「機能時間」及び「接合時間」を含む全ての段階でのマトリックス形成のプロセス全体を包含するように定義される。「機能時間」は、製剤の全ての成分を混ぜ合わせる瞬間から、おそらく硬化プロセスが原因で製剤の粘度が高くなりすぎて製剤と機能できなくなる、すなわち、上記に論じられているように塗布、拡散、配置、及び再配置できなくなる瞬間までの時間ウィンドウである。上記に示された生体接着性製剤の粘度特性の文脈において、粘度は、架橋が広がり、製剤を過度に粘性にするまでの機能時間中に関連がある。「接合時間」は、製剤が物体に塗布される瞬間から、例えば、任意の締結／固着手段の解除（使用される場合）及び／又は処置の継続若しくは完了を可能にするように、一方から他方へ接合され邸る物体が十分な強度で接合されたと見なされる瞬間までに経過する時間として定義される。機能時間及び接合時間は、製剤、シングル又はマルチパート製剤としての使用モード、使用条件、及び物体のタイプ、及び接合面積に応じてある程度重複してもよく、それぞれ互いに継続してもよく、又は中止されてもよい。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、混ぜ合わされた全ての成分を含有する本明細書に示された生体接着性製剤の機能時間は、０秒〜３０分に及ぶ。製剤の求められ、意図された用途に応じて、長い機能時間を必要としない適用には、５秒未満、１０秒未満、又は３０秒未満に及び得る様々な機能時間を示すように製剤が設計されてもよい。より長い機能時間が求められるいくつかの実施形態において、製剤は少なくとも３０秒、少なくとも６０秒、少なくとも１２０秒、少なくとも３００秒、少なくとも６００秒、少なくとも９００秒、又は少なくとも１８００秒（３０分）の機能時間を示すように設計される。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性製剤の硬化時間は、生体接着剤の適用に応じて急速又は緩徐となるように予め定めることができる。一般に、硬化時間は５秒〜３０分の範囲である。製剤の求められ、所望される性能に応じて、急速硬化の場合、５〜２０秒、５〜３０秒、又は５〜６０秒の範囲でありうる様々な硬化時間を示すように製剤が設計されてもよい。緩徐な硬化の場合、硬化時間は３０〜６０秒、６０〜１２０秒、３０〜３００秒、６０〜６００秒、又は６０〜１８００秒（３０分）の範囲である。或いは、例えば患者の皮膚へのデバイスの局所（外部）接着など、接着プロセスが時間を制限されず、強度及び柔軟性などの他のパラメータがより重要である場合、硬化時間は上述の値より長くなり得、数秒〜３０分超の範囲であり得、３０分〜１２０分の任意の中間値を含む、例えば、４０分、５０分、６０分、及びさらに１２０分となり得る。
【０１３４】
得られた生体接着性マトリックス：
生体接着性マトリックスは、生体接着性製剤の成分のいくつかの間で起こる硬化プロセスの結果であり、それ故にマトリックスは、本明細書で論じられているように互いにカップリングされたゼラチン及びアルギネート、並びにそれらと結合（例えば、中に封入）されたモンモリロナイト、並びに任意選択で、マトリックスと結合（例えば、中に封入）されるようになった製剤の他の成分を含む。
【０１３５】
上記に論じられているように、本明細書に記載された生体接着性製剤は、対応する生体接着性マトリックスを形成するように設計され、それ故に、生体接着性マトリックスが所望の性能を示すように設計される。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載された生体接着剤は、硬化時に、本明細書に定義された生存生体の高い接合強度、生理的条件下の最適曲げ弾性率、及び最適生分解速度を特徴とするように設計される。
【０１３７】
本明細書で使用されるとき、表現「最適」は、所望の適用時の製剤及び／又は対応するマトリックスの性能に関する。この点に関して、異なる適用は、最適性能に関する異なるパラメータを必要とし得ることが留意される。最適性能は、密閉若しくは接合される物体のタイプ、接合される物体の寸法、又は密閉される面積、接触面積、条件、接着を必要とする処置の性質、並びに他の物体及び処置依存的パラメータに典型的には依存し得る。
【０１３８】
様々な生存組織及び他の生物又は無生物の接合強度は、生体接着剤の極めて望ましい特性であるが、粘膜／血漿／血液湿潤環境の生理的条件下で、生存及び非生存組織、骨、皮膚、金属、プラスチック、並びに他の天然及び合成ポリマー物質などの様々な物体を接合することは、本明細書に示された生体接着性製剤の重要な能力である。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載された生体接着剤は、硬化時に、断裂組織を密閉するのに破裂強度が十分であるように設計される。
【０１４０】
生体接着剤の破裂強度を決定する手順の例は、以下の実施例セクションで提供される。本発明のいくつかの実施形態において、生体接着剤の破裂強度は、生体接着性マトリックスで作られたプラグを破裂させるために必要とされる最大圧力に関して表され得る。プラグは３．０ｍｍの均一な直径の穴を密閉し、穴は約０．０４ｍｍ〜約０．１ｍｍの範囲である厚さのコラーゲンシートに開けられる。いくつかの実施形態において、プラグ（シール）は、約０．５ｍｌの生体接着剤を上述の穴の上及び周りに塗布してもたらされる、生体接着剤約１ｍｍ厚の層の形態にある。
【０１４１】
本発明のいくつかの実施形態において、生体接着剤の破裂強度は、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｓｔ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｅａｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭ  Ｆ２３９２−０４に従って決定することができる。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態において、生体接着剤の破裂強度は、３５０ｍｍＨｇ〜６５０ｍｍＨｇの範囲である最大圧力に関して表される。
【０１４３】
結合強度は、接合物体の試料で行われる引張試験中に作成される応力−ひずみ曲線の傾斜から実験によって決定することができ、単位面積当たりの力（ニュートン毎平方メートル（Ｎ／ｍ２）又はダイン毎平方センチメートル）の単位、すなわちパスカル（Ｐａ）、メガパスカル（ＭＰａ）、又はギガパスカル（ＧＰａ）で表される。
【０１４４】
語句「接合強度」は本明細書で使用されるとき、所与の材料の一対の接合物体に対してばらばらになる前にかけられ得る引張応力の最大量を記載する。
【０１４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性製剤からもたらされる生体接着性マトリックスは、ピーク接合時で約２，０００パスカル（２ＭＰａ）〜約６０，０００パスカル（６０ＭＰａ）の範囲である生存生体の最大接合強度を特徴とする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性マトリックスにより示される生存生体の最大接合強度は、２ＭＰａ〜１０ＭＰａ、５ＭＰａ〜２０ＭＰａ、１５ＭＰａ〜３０ＭＰａ、２０ＭＰａ〜４０ＭＰａ、３０ＭＰａ〜５０ＭＰａ、又は４０ＭＰａ〜６０ＭＰａの範囲である。
【０１４６】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着性マトリックスの別の所望の特性は、生理的条件下、環境から水を吸収して特に湿潤及び膨潤化している間に、マトリックスが接合する物体を破壊する又は該物体から脱離することなく、応力及び圧力下で撓む及び曲がる能力の程度である。
【０１４７】
意図された用途及び条件に応じて、生体接着性マトリックスは、時間と共に及び間欠又は連続運動下で、応力、変形、屈曲、伸展、圧力、及び断裂を行う（生理的条件で接着の役割を維持する）ことが予想される。本発明のいくつかの実施形態によれば、該マトリックスは、０．５ＭＰａ〜２００ＭＰａの範囲である生理的条件下の曲げ強度（弾性率）を特徴とする。或いは、本明細書に示された生体接着性マトリックスにより示される生理的条件下の曲げ弾性率は、０．５ＭＰａ〜５ＭＰａ、１ＭＰａ〜１０ＭＰａ、５ＭＰａ〜２０ＭＰａ、１０ＭＰａ〜１５ＭＰａ、１５ＭＰａ〜２０ＭＰａ、２０ＭＰａ〜３０ＭＰａ、３０ＭＰａ〜５０ＭＰａ、５０ＭＰａ〜１００ＭＰａ、７５ＭＰａ〜１５０ＭＰａ、１００ＭＰａ〜１５０ＭＰａ、又は１５５ＭＰａ〜２００ＭＰａの範囲である。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着性マトリックスは生分解性である。
【０１４９】
様々な内部又は外部医学的処置、特に内部外科処置において効果的に使用されるために、本明細書に示された生体接着性マトリックスはさらに最適生分解速度を示し、意図された用途を崩壊前に示すのに十分な時間、物体を接合できるようにする。
【０１５０】
用語「生分解性」並びにその任意の形容詞、活用形、及び格変化は本明細書で使用されるとき、検出可能な固体、半固体、ゲル、粘膜、又はさもなければ局在化形態から、任意の可溶性の、洗浄可能な、揮発性の、吸収性の及び／又は再吸収可能な分解生成物又はその代謝産物などの、非局在化形態及び／又は検出不能な形態へと化学的及び／又は物理的変換を受ける材料の特性を指す。生分解性材料は、例えば、固有の化学結合の不安定性、酵素的分解プロセス、融解、溶解、及びそれらの任意の組み合わせなどの化学的、生物学的、及び／又は物理的要因の作用のために、生理的条件でそのような変換を受ける。
【０１５１】
生体接着性マトリックス及び適用の位置の化学的及び物理的特性、並びにその意図された用途に応じて、マトリックスの生分解プロセスは、数日から数週間から数ヶ月に及ぶ可能性がある。語句「生分解速度」は、生体接着性製剤の適用から、得られた生体接着性マトリックスが生体接着性マトリックスとしてもはや存在しない時点までの期間として本明細書において定義される。「もはや存在しない」により、最初のマトリックスに起因し得る物質（複数可）が、生体接着性製剤の適用部位において実質的なレベルではもはや検出され得ないこと、又は最初の部位で正常レベルを超えて依然として検出され得るその痕跡が、もはや組織を接着させることができない、若しくはその部位に残存し得ないことが意味される。
【０１５２】
一般に、本明細書に示された硬化生体接着剤の接合強度は、生理的条件下である程度低下し始めるであろう。強度のこの低下は、化学プロセス（膨潤、溶解、及び自然化学分解）、生物学的プロセス（酵素的に駆動される反応、新たな非接着細胞及び他の組織成分の形成、並びに接着された細胞及び他の組織成分の死）、機械的プロセス（応力、ひずみ、及び断裂）等を含む要因の組み合わせによりもたらされるマトリックスの分解に起因する。単純化するために、本明細書に示された生体接着剤の接合強度を低下させる要因及びプロセスの集まりが、語句「生分解速度」の下に包含及び統合される。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生体接着剤の意図された用途は、物体が接合し、融合し、又は治癒するのに十分な期間にわたって生体を互いに付着させておくことである。期間は、生体及び行われる医学的処置に依存する。例えば、生体接着剤は、断裂の形態にある切開部を密閉し、切開部が自らを修復し、治癒できるようにするのに十分強く及び長く切開部の２つの端を隣接させる。切開部は、身体の内部部位又は表面（皮膚及び筋肉）にあってもよい。別の例において、物体の１つは皮膚のパッチであり、他の物体は無生物医療デバイスである。無生物医療デバイスの場合、生体接着剤は、目的を遂げるまで又は生体接着剤が交換されるまで、デバイスを皮膚に貼り付けておくことが意図される。
【０１５４】
生体接着剤の生分解性は、組成から始まる要因、すなわちポリマーの相対濃度及び架橋密度、生体接着剤の分子構造を変える（より多くの多様な架橋）ことができる添加剤、生分解促進剤／増強剤、並びに生分解阻害剤／抑制剤の組み合わせにより操作することができる。分解性を操作するのに使用され得る別の要因は、生体接着剤の巨視的形状及び構造、すなわち生体接着剤の表面積、周囲媒体の利用可能性、治療面積のサイズ等である。
【０１５５】
それ故に、本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に示された生体接着剤の生分解速度は、約７日〜約６ヶ月の範囲である。いくつかの場合において分解期間はより短くされてもよく、１週間〜１ヶ月（１０日〜３週間など、その間の任意の期間を含む）の範囲でもよい。他の場合において、分解期間はより長くされてもよく（例えば１〜６ヶ月）、１ヶ月〜２ヶ月、２ヶ月〜３ヶ月の範囲でもよく、又は２ヶ月〜６ヶ月の範囲でもよい。
【０１５６】
任意の生体接着剤の接合強度に関与する時間要因を決定するのに使用され得る別のパラメータは、接合強度保持の半減期、すなわち、最大接合強度が半減値、Ｔ１／２に達するまでの期間である。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ１／２は約１日〜約５ヶ月、及びそれらの間の任意の値にわたる。例えば、短い接着期間の適用に関して、Ｔ１／２は約１週間〜約２週間、又は約１０日〜約１ヶ月の範囲である。より長い接着期間に関して、Ｔ１／２は約１ヶ月〜約２ヶ月、又は約２ヶ月〜約３ヶ月、又は約３ヶ月〜約４ヶ月、又は約３ヶ月〜約５ヶ月の範囲である。
【０１５８】
最小接合時間及び最適生分解速度が論じられているが、本明細書に示された生体接着剤は生分解される前に除去される可能性があり、接合時間は機械的及び化学的手段により意図的に短縮され得ることが本明細書において留意されるべきである。
【０１５９】
薬物溶出生体接着性製剤：
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載された生体接着剤は、１つ又は複数の生物活性剤（複数可）をさらに含む。いくつかの実施形態においてそのような製剤は、硬化時に薬物溶出生体接着剤を提供するように設計される。言い換えれば、生物活性剤を含む生体接着剤は、生物活性剤が組み込まれた薬物溶出生体接着剤を形成するように硬化する。いくつかの実施形態において、そのような薬物溶出生体接着剤は、生理的媒体に接触すると生物活性剤がそこから放出されるように形成される。故に、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は、同時にリザーバー及び生物活性剤を送達する担体としての役目を果たしながら、本明細書で論じられるように様々な生体接着剤適用に使用することができる。
【０１６０】
生物活性剤を生体接着剤に組み込むことはその特性に影響を与える可能性があるが、生体接着剤は、以下に論じられるように生物活性剤（複数可）を溶出する能力を加えると、上記に示された所望の特性を有するように設計されることが本明細書において留意される。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、用語「組み込まれた」は、生物活性剤及び生体接着剤の文脈において使用されるとき、「封鎖された（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ）」、「充填された（ｌｏａｄｅｄ）」、「カプセル封入された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）」、「結合された（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」、「詰められた（ｃｈａｒｇｅｄ）」、及びこれらの用語の任意の変化形などの用語と同義に使用され、これらの全ては、生体接着剤内の以下に定義された生物活性剤の存在を記載するのに互換的に使用される。封鎖された生物活性剤は、湿潤、膨潤、溶解、化学分解、分解、生分解、酵素分解、及び生体接着剤に影響を与える他のプロセスのいずれか又はこの組み合わせの結果として、例えば、拡散、溶解、溶出、抽出、浸出によって溶出し得、又は生体接着剤から放出され得る。生物活性剤はまた、生体接着剤構造のいずれかの大幅な変化なしに、又は部分的変化により、生体接着剤から溶出することもできる。
【０１６２】
本明細書で使用されるとき、語句「生物活性剤」は、１つ又は複数の生物学的及び／又は薬学的活性を発揮する分子、化合物、複合体、付加物、及び／又は複合材料を記載する。生物活性剤は、故に、例えば、疼痛を緩和し、炎症を防ぎ、感染を予防及び／若しくは低減及び／若しくは根絶し、創傷治癒を促進し、組織再生を促進し、腫瘍／転移の根絶／抑制をもたらし、局所免疫系の抑制をもたらし、並びに／又は様々な医学的状態を予防、改善、若しくは治療するのに使用することができる。
【０１６３】
「生物活性剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」、「薬学的活性剤」、「薬学的活性材料」、「製薬」、「治療活性剤」、「生物活性剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」、「治療剤」、「薬」、「医薬品」、「薬物」、及び他の関連用語は本明細書で互換的に使用されてもよく、これらの全ては用語「生物活性剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」により包含されることが意味される。
【０１６４】
本発明の文脈における用語「生物活性剤」は、例えば、小分子及び巨大分子、細胞、組織、並びに器官などの様々な生物学的要素に印を付け、追跡し、撮像し、同定するために使用される発色剤、蛍光剤、発光剤、リン光剤；並びに局所領域における腫瘍／転移などの有害な組織を破壊するための、又は現在のステント適用などにおいて健康な組織の成長を阻害するための；又は核医学及び放射線イメージングで使用するバイオマーカーとしての、放射線療法及び追跡の両方に役立ち得る放射性材料を含む診断剤も含む。
【０１６５】
本発明に従って有用な生物活性剤は単独で又は組み合わせて使用されてもよく、すなわち、１種類を超える生物活性剤が１つの生体接着性製剤において一緒に使用されてもよく、したがって生体接着剤から同時に放出されてもよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、生物活性製剤中の濃度は、前記製剤の総体積の０．１重量体積パーセント〜１０重量体積パーセントの範囲であり、いくつかの実施形態ではさらに多い。使用される生物活性剤の性質及び生体接着剤の意図された用途に応じて、生物活性剤のより高値及びより低値の含量も企図される。
【０１６７】
生物活性剤の放出又は溶出の文脈において用語「生物活性剤」を使用する場合、放出時に生物活性剤が実質的に活性であることを意味するものである。
【０１６８】
以下に論じられるように、生物活性剤は、１つ若しくは複数の生体接着剤成分との自身の反応性によって、又はその化学的及び／若しくは物理的特性自体によって生体接着剤に影響を与えてもよい。したがって、予備硬化生体接着性製剤が本明細書で論じられた所望の特性を示せるようにしながら、及び本明細書で論じられた所望の特性を示す生体接着剤が硬化できるようにしながら、一般に、生物活性剤が意図された有効量及び放出速度で生体接着剤から溶出できるように生体接着剤に組み込まれるのに適した生物活性剤が選択されることが留意される。例えば、カップリング及び架橋反応を妨げる任意の薬剤は、本発明の範囲から排除される。例えば、カルボキシル基又は一級アミン基を示す生物活性剤は、そのような官能基に対する反応性のために選択されたカップリング剤と反応する可能性がある。そのような場合、得られたマトリックスの所望の特性を維持するために、成分のタイプ及び濃度に関していくつかの調整が生体接着性製剤に導入されてもよい。
【０１６９】
本発明のいくつかの実施形態による生物活性剤は、例えば巨大生体分子又は小さな有機分子であってもよい。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態による生物活性剤は、非タンパク質性物質、すなわち、その構造に４個以下のアミノ酸残基を有する物質である。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態による生物活性剤は非糖質物質、すなわち、その構造に４個以下の糖（アミノグリコシド包含）部分を有する物質である。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態による生物活性剤は、１つ又は複数の以下の官能基、すなわち、カルボキシル、一級アミン、ヒドロキシル、スルフヒドロキシル、及びアルデヒドを実質的に欠く。
【０１７３】
用語「巨大生体分子」は本明細書で使用されるとき、生きている生物において天然に生じる高分子バイオ化学物質、すなわちバイオポリマーを指す。アミノ酸及び核酸は、高分子巨大生体分子の最も重要な構成単位のいくつかであり、したがって巨大生体分子は、重合アミノ酸、重合核酸、重合単糖類、重合脂質及びそれらの組み合わせの１つ又は複数の鎖から典型的には成る。巨大分子は、互いに共有結合又は非共有結合され得るいくつかの巨大分子サブユニットの複合体を含んでもよい。それ故に、リボソーム、細胞小器官、及びさらにはインタクトなウイルスが巨大生体分子と見なされ得る。
【０１７４】
巨大生体分子は本明細書で使用されるとき、ダルトン（Ｄａ）より高い分子量を有し、３０００Ｄａより高くてもよく、５０００Ｄａより高くてもよく、１０ｋＤａより高くてもよく、さらには５０ＫＤａより高くてもよい。
【０１７５】
本明細書に記載された生体接着剤に有利に組み込むことができる巨大生体分子の代表例としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、オリゴヌクレオチド、及び標識オリゴヌクレオチド、核酸構築物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、多糖類、ウイルス、及びそれらの任意の組み合わせ、並びにインタクトな細胞又は他の細胞内成分及び細胞断片を含む細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本明細書で使用されるとき、語句「小有機分子」又は「小有機化合物」は、より低い出現頻度の窒素、酸素、リン、及び硫黄、並びに他の要素と一緒に、炭素及び水素から主に成る小化合物を指す。本発明の文脈において、化合物、薬剤、又は分子に関する用語「小」は、約１０００グラム毎モルより低い分子量を指す。それ故に、小有機分子は１０００Ｄａより低い、５００Ｄａより低い、３００Ｄａより低い、又は１００Ｄａより低い分子量を有する。
【０１７７】
本明細書に記載された生体接着剤に有利に組み込むことができる小有機分子の代表例としては、血管新生促進物質、サイトカイン、ケモカイン、化学誘引物質、化学忌避物質、薬物、作動薬、アミノ酸、拮抗薬、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗原、抗うつ薬、降圧剤、鎮痛剤、及び麻酔剤、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、凝固因子、骨結合剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、補助因子、脂肪酸、増殖因子、ハプテン、ホルモン、阻害剤、リガンド、単糖類、放射性同位体、放射性医薬品、ステロイド、毒素、ビタミン、ミネラル、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本実施形態の文脈における使用に適した生物活性剤の代表例としては、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、抗腫瘍剤及び化学療法剤、作動剤及び拮抗剤、アミノ酸、血管新生促進物質、食欲抑制薬、抗アレルギー性薬、抗関節炎薬、抗喘息剤、抗体、抗コリン作用薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗糖尿病剤、抗下痢薬、抗真菌薬、抗原、抗ヒスタミン薬、降圧剤、抗炎症剤、抗偏頭痛剤、抗嘔吐薬、抗新生物薬、抗酸化剤、抗パーキンソン病薬、抗増殖剤、抗原虫薬、鎮痒薬、抗精神病薬、解熱剤、アンチセンス核酸構築物、鎮痙薬、抗ウイルス剤、胆汁酸、カルシウムチャネル遮断薬、心血管製剤、細胞、中枢神経系刺激薬、化学誘引物質、ケモカイン、化学忌避物質、化学療法剤、コレステロール、補助因子、避妊薬、サイトカイン、鬱血除去薬、利尿剤、ＤＮＡ、薬物及び治療剤、酵素阻害剤、酵素、脂肪酸、糖脂質、増殖因子、成長ホルモン、止血剤及び抗出血剤、ハプテン、ホルモン阻害剤、ホルモン、睡眠薬、免疫活性剤、免疫抑制剤、阻害剤及びリガンド、標識オリゴヌクレオチド、殺菌剤、筋弛緩薬、核酸構築物、オリゴヌクレオチド、副交感神経遮断薬、ペプチド、抹消血管及び脳血管拡張薬、リン脂質、多糖類、タンパク質、神経刺激薬、放射性同位体、放射性医薬品、受容体作動薬、ＲＮＡ、単糖類、サポニン、鎮静剤、小有機分子、殺精子薬、ステロイド、交感神経模倣薬、毒素、精神安定剤、ワクチン、血管拡張剤、ウイルス成分、ウイルスベクター、ウイルス、ビタミン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
生物活性剤は、局所又は全身性応答のどちらかを達成するために選択されてもよい。生物活性剤は、皮下又は経皮（ｔｒａｎｓ−ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、筋肉内投与、及び粘膜投与を含むがこれらに限定されない、様々な局所、腸内、及び非経口タイプの投与経路に適した任意の予防剤又は治療剤であってもよい。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤にカプセル封入することができる生物活性剤の１つのクラスは、疼痛を緩和する鎮痛剤、例えばＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ−２阻害剤、オピエート、及びモルヒネ様作用薬のクラスである。
【０１８１】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に組み込むことができる生物活性剤の別のクラスは、麻酔剤のクラスである。本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に組み込むことができる生物活性剤の別のクラスは、血管新生を促進する治療剤のクラスである。非限定例としては、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ステロイド性細胞生存及び増殖剤が挙げられる。
【０１８２】
特に組織再生が望ましく、埋め込み型デバイス及び組織治癒を含む適用である特定の実施形態において、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に組み込むことができる生物活性剤の別のクラスは、サイトカイン、ケモカイン、及び関連因子である。
【０１８３】
本明細書において一般に免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｒｅｓｓａｎｔ）と呼ばれる免疫抑制薬又は薬剤の非限定例としては、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬物、及び他の免疫抑制剤が挙げられる。
【０１８４】
止血剤の非限定例としては、カオリン、スメクタイト、及びトラネキサム酸が挙げられる。
【０１８５】
カオリンは、生体接着性製剤における可溶性が限られ、したがって乾燥粉末の形態で加えられ、故に生体接着性製剤において充填剤としても少なくともある程度作用する例示的な生物活性剤であることが本明細書において留意される。この二重機能、生物活性剤及び充填剤は、本発明の実施形態により包含され、それと共に企図される任意の添加剤又は生物活性剤を特徴付け得る。
【０１８６】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、細胞増殖を妨害するのに有用な細胞傷害性因子又は細胞周期阻害剤及び他の薬剤が挙げられる。
【０１８７】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡなどの特定の生成物（組換え核酸を含む）をコードするリポザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドなどの遺伝子治療剤及びタンパク質が挙げられる。ポリヌクレオチドは、「裸の」形態で、又はポリヌクレオチドの取り込み及び発現を増強するベクター系と結合して提供されてもよい。これらとしては、ＤＮＡ圧縮剤（ヒストンなど）、非感染性ベクター（プラスミド、脂質、リポソーム、カチオン性ポリマー、及びカチオン性脂質など）、及びウイルス及びウイルス様粒子（すなわち、ウイルスのように作用するように作られた合成粒子）などのウイルスベクターが挙げられ得る。ベクターは、付加されたペプチド標的配列、アンチセンス核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、及び膜転移配列（「ＭＴＳ」）などのフェリータンパク質をコードする遺伝子配列、欠陥又は欠損内因性分子を置換するｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ、及び単純ヘルペスウイルス−１（「ＶＰ２２」）を含むＤＮＡキメラをさらに有してもよい。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、内因的又は外因的に制御され得る遺伝子送達剤が挙げられる。
【０１８９】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、二量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又はそれらの組み合わせとしての骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）のファミリー（単独又は他の分子と一緒の）が挙げられる。或いは又はさらに、ＢＭＰの上流又は下流効果を誘導することができる分子が提供されてもよい。そのような分子としては、「ヘッジホッグ」タンパク質、又はそれをコードするＤＮＡのいずれかが挙げられる。
【０１９０】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、化学療法剤が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、抗生剤が挙げられる。
【０１９１】
抗ウイルス剤としては、ヌクレオシドリン酸及び他のヌクレオシド類似体、ＡＩＣＡＲ（５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボヌクレオチド）類似体、解糖経路阻害剤、グリセリド、アニオン性ポリマー等が挙げられ得る。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターが挙げられる。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、ステロイド性抗炎症薬が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、抗酸化剤が挙げられる。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、ビタミンが挙げられる。
【０１９５】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、ホルモンが挙げられる。
【０１９６】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に有利に組み込むことができる追加の生物活性剤としては、目的とするタンパク質を送達することが所望されるならば遺伝子改変されてもよい、幹細胞を含むヒト起源（自己又は同種）の細胞、又は動物供給源由来（異種）の細胞が挙げられる。
【０１９７】
生体接着性製剤の調製及びマトリックス形成：
生物活性剤を含有する又は含有しない、本明細書に示された生体接着剤は、少なくとも硬化することができる製剤という意味で単一の調製物に成分全てを混ぜ合わせて調製される。単一の調製物はエクスビボ、インビトロ、又はインサイチュで形成されてもよく、すなわち製剤は、以下のやり方の１つにより単一の調製物を形成するように組み合わされる、別個に保存された２つ以上のサブ製剤の形態にあってもよく、又は以下に論じられるように別個に保存された乾燥粉末及び予め測定された量の溶媒（水）のセットとしてであってもよい。
【０１９８】
いくつかの実施形態において生体接着剤は、第１及び第２の製剤を接触させて形成される。いくつかの実施形態において生体接着剤の調製は、第１及び第２の製剤を混合するステップをさらに含む。
【０１９９】
インビトロは、接着される物体（複数可）に製剤を適用する前に、単一の調製物としての生体接着剤が、製剤の成分全てを混合して（例えば、バイアル中で）形成される（これらが本明細書に定義され、記載され、及び例示されているように）ことを意味する。
【０２００】
インサイチュは、単一の調製物としての生体接着剤が、第１又は第２の製剤の一方を１つの物体に、及び他方の製剤を別の物体に適用し、物体を一緒に隣接させて単一の調製物を接着部位で形成すること；又は第１若しくは第２の製剤の１つを物体に適用し、その後他の製剤を同じ物体に適用することにより形成されることを意味する。
【０２０１】
生物に適用される場合、インビトロはエクスビボに対応し、インサイチュはインビボに対応する。
【０２０２】
いずれの起こり得る事態においても、製剤は、硬化することが実質的にできない条件下で保存される。
【０２０３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書に記載された生体接着性製剤を硬化させてもたらされる生体接着性マトリックスを形成する方法が提供される。
【０２０４】
本明細書で使用されるとき、用語「硬化」は、製剤を特定の条件（例えば、加熱及び／又は混合、せん断力等）にさらすことなどの能動的手順、及び硬化時間を経過させることを含んだ受動的手順を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、方法は、硬化前に製剤の成分を混合するステップ、すなわち、本明細書に記載されたサブ製剤を混合するステップ、又は本明細書に記載された粉末（複数可）を適切な溶媒（複数可）と混合するステップをさらに含む。
【０２０６】
上記に論じられているように、混合は、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでもたらされてもよい。
【０２０７】
生体接着剤の使用：
一般に、本明細書に示された生体接着剤は、少なくとも１つが生体である物体を接着及び／又は接合することを意図された生成物の製造において使用することができる。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態による生物活性剤を含む若しくは含まない生体接着剤、及び／又はこれを含むキットは、生体の接着における使用のため特定される。いくつかの実施形態において、生体接着剤又はキットは生体における断裂の密閉における使用のため特定される。いくつかの実施形態において、生体接着剤又はキットは少なくとも２つの物体の互いへの接合における使用のため特定され、物体の少なくとも１つが生体である。
【０２０９】
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は局所的に使用され、すなわち、生体接着剤は、物体を皮膚に接着し、病変の端を接合し、皮膚移植片を固定し、又は皮膚における断裂を密閉するのに使用される。
【０２１０】
或いは、生体接着剤は、内部器官を接着し、物体を内部器官に接着するのに役立ち、内部器官の病変の端を接合し、移植片を内部器官に固定し、又は内部器官の断裂を密閉するために内部に使用される。
【０２１１】
口腔内適用に関して、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は、口腔粘膜を数秒以内に接着し、裏打ち層の必要なく完全に除去（生分解）されるまで接着したままである。本明細書に示された生体接着性マトリックスは、高い生体適合性を適用の柔軟性と組み合わせる。
【０２１２】
眼適用に関して、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は、眼粘膜に迅速に接着し、完全に除去されるまで依然として有効である。
【０２１３】
鼻腔内適用に関して、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は、鼻粘膜に直ちに接着し、完全に除去されるまで依然として有効である。本発明のいくつかの実施形態による薬物放出生体接着性マトリックスは、高い薬物負荷能力、並びに薬効を最大化する鼻滞留時間及び放出時間を提供する。
【０２１４】
膣適用に関して、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤は、数秒以内に膣粘膜を接着し、完全に除去されるまで数日間接着したままであることができる。本発明のいくつかの実施形態による薬物放出生体接着性マトリックスは、安全な有効投与及び所望の全身的効果を提供する。
【０２１５】
故に、語句「生体」は本明細書で使用されるとき、単一の生きた動物検体を含む動物又は植物の任意の生存能力のある／生きた部分を指す。生きた又は生存能力のある生体又は組織は、依然として生存能力がある又は生きた、及び生存能力又は生命維持のために生理学的環境で実質的に保存される、植物又は動物の任意の主要部分又は非主要部分と定義される。生体の非限定例としては、任意の植物又は動物、生存組織試料、皮膚組織、骨組織、結合組織、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織が挙げられる。同様に包含されるのは、皮膚、筋肉、生物の任意の身体部位の内部器官などの器官に作られた切開部端である。
【０２１６】
無生物は、蘇生、移植、増殖することができない、又はさもなければ医学的に定義された任意の生命徴候を示すことができない、合成及び／又は生物起源の物体を含む物体である。これらとしては、例えば、パッチ、骨置換部分、ペースメーカー、ポート及びベント及び本明細書に定義された生存生体への貼り付け及び固定を必要とした任意の他の医療デバイスが挙げられる。
【０２１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、無生物は、動物若しくは植物材料及び生成物から部分的若しくは完全に、又は合成物質から部分的若しくは完全に作ることができる。生体接着性製剤は、生存生体中又は生存生体上の用途に設計されるが、任意の接着剤又は糊のような生物学的又は合成無生物を接合するために効果的に使用され得ることが本明細書において留意される。
【０２１８】
用語「物体」は、同じ物体の１つ又は複数の一部又は部分を包含することを意味し、故に、本明細書に記載された製剤を用いて組織又は器官の切開部の両側を接合して切開部を閉じることは、１つの物体（組織又は器官）又は２つの物体（切開部の両側）の接合のどちらかと見なされ得ることが本明細書において留意される。
【０２１９】
いくつかの実施形態による生物活性剤を組み込む生体接着性製剤から生じる薬物溶出マトリックスは、その生体接着性能力を問わず、薬物溶出及び薬物送達能力のためだけに使用される。そのようなマトリックスは、例えば薬物デポとしての役目を果たすことができ、薬物の放出が有益である器官又は組織に接着することができる（別の物体への接合なしに）。
【０２２０】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は±１０％を指す。
【０２２１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの活用形は、「含むが限定されない」ことを意味する。
【０２２２】
用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含む及び限定される」ことを意味する。
【０２２３】
用語「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、製剤、組成、方法、マトリックス、又は構造が追加の成分、ステップ、及び／又は部分を含み得るが、追加の成分、ステップ、及び／又は部分が特許請求された製剤、組成、方法、マトリックス、又は構造の基本的及び新規の特性を実質的に変えない場合に限ることを意味する。
【０２２４】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に指示しない限り複数の言及を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。本出願全体を通じて、本発明の様々な実施形態が範囲形式に示され得る。範囲形式における記載は単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲を柔軟性なく限定すると解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能性のある部分範囲全て及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の幅を問わず適用される。
【０２２５】
数値範囲が本明細書に示されるときはいつでも、示された範囲内の任意の引用された数（分数又は整数）を含むことを意味するものである。第１の示された数及び第２の示された数の「間の範囲である」、及び第１の示された数「から」第２の示された数「まで」の「範囲である」という語句は、本明細書で互換的に使用され、第１及び第２の示された数、並びにそれらの間の分数及び整数全てを含むことを意味するものである。
【０２２６】
本明細書で使用されるとき用語「方法」は、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的、及び医学的技術分野の実践者に既知の、又は該実践者により既知のやり方、手段、手法、及び手順から容易に開発されるやり方、手段、手法、及び手順を含む、任意の課題を達成するためのやり方、手段、手法、及び手順を指すが、これらに限定されない。
【０２２７】
明確にするために個別の実施形態の文脈で記載された本発明の特定の特徴は、単一の実施形態の中で組み合わせて提供することもできることが理解される。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載された本発明の様々な特徴は、個別に、又は任意の適切な部分的組み合わせで、又は本発明の任意の他の記載された実施形態に適切なように提供することもできる。様々な実施形態の文脈で記載された特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは実施不能である場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０２２８】
上記に輪郭を示され、以下の特許請求の範囲セクションで請求された本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の例において実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【０２２９】
これより、上記の記載と一緒に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例証する以下の例に言及がなされる。
【０２３０】
実施例１
材料及び方法
材料：
本発明のいくつかの実施形態による例示的な塩基性生体接着性マトリックスを、以下の成分のいくつかを含有する例示的な生体接着性製剤から調製した：
ゼラチン    本明細書に示された例では、ブタ皮膚由来のゼラチン「タイプＡ」（９０−１１０ブルーム）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃：Ｇ６１４４から購入した。
アルギネート    本明細書に示された例では、アルギン酸ナトリウム塩（粘度約２５０  ｃｐｓ、２％（２５℃）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃：Ａ１１１２から購入した。
ＥＤＣ    Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃：Ｅ７７５０から購入した。
カオリナイト（カオリン）    公知であり広く使用されている止血剤、Ａｌ２Ｓｉ２Ｏ５（ＯＨ）４をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃：Ｋ１５１２から購入した。
モンモリロナイト、ナトリウム（Ｎａ＋−ＭＭＴ）    をＣＬＯＩＳＩＴＥ−Ｎａ＋としてＢｙｋから購入した。
一般的なアプリケータ装置は：
ダブルバレルシリンジ（Ｍｉｘｐａｃ、ＳＵＬＺＥＲ）；
ダブルシリンジ、２．５ｍｌ、４：１、ＰＰ−Ｒナチュラル１１０８６５；
リップ付きプランジャー、２．５ｍｌ、４：１、ＰＥ−ＨＤナチュラル１０７７１４；
スタティックシリンジミキサーＤＮ  ２．５×８、４：１／１０：１、青１１２３１３；
ＢｉｏＧｌｕｅ外科用接着剤、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ、ロット：１４ＭＧＷ０６２
を含んだ。
【０２３１】
方法：
本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤（シーラント）の例は、次のように調製した。４００ｍｇ／ｍｌゼラチン及び１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む製剤Ａは、６０℃に加熱しながら物質を再蒸留水（ＤＤＷ）に溶解して調製した。粘土鉱物（例えば、カオリン又はＭＭＴ）を含有する製剤では、粘土鉱物をアルギネートに溶解する前に製剤Ａに加えた。１０、１５、又は２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣを含有する製剤は、ＤＤＷを担体として用いて調製した。本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤の塗布は、全ての試験において、ダブルバレルシリンジアプリケータを用いて製剤Ａ及び製剤Ｂを組み合わせて達成した。
【０２３２】
本発明のいくつかの実施形態による様々な生体接着性（シーラント）製剤を硬化して形成した様々な生体接着性マトリックスのインビトロ破裂強度測定値を、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｓｔ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｅａｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭ  Ｆ２３９２−０４（２０１５）に従って、特注の機械的破裂テスターを用いて試験した。この試験の原理は、硬化生体接着剤により保持することができる組織漏出時点の、ｍｍＨｇ単位で表される最大破裂圧力を測定することであった。簡単には、約０．０４ｍｍ〜約０．１ｍｍの範囲である厚さを有する市販のコラーゲンケーシング（Ｆｉｂｒａｎ  Ｓ１、スペイン）からカットした洗浄コラーゲンシートを、３．０ｍｍの均一直径穴を作って穴を開け、組織基質を模倣するのに使用した。本発明のいくつかの実施形態による試験生体接着剤約０．５ｍｌをコラーゲンケーシング基質に塗布し、生体接着剤の約１ｍｍコーティングの測定厚さで穴を密閉した。試料を生体接着剤の塗布３〜６分後に試験ユニットに置き、圧力をかけた。硬化生体接着剤の不具合が生じた圧力を、デジタル圧力計（Ｋｏｂｍａｎ  ＳＤ１Ｓ６Ｂ７０）を用いて最大破裂圧力として記録した。最低１０回の繰り返しを試験生体接着剤ごとに実行した。
【０２３３】
本発明のいくつかの実施形態による様々な生体接着剤（シーラント）の膨潤比及び重量減少を、ダブルシリンジアプリケータを用いて７．０×７．０×３．５ｍｍ３シリコンモールドに未硬化試料を流し込んで試験した。硬化後、生体接着剤試料を慎重に除去し、２４時間乾燥させた。硬化生体接着性マトリックスを次いで計量し（Ｗ１）、３ｍＬ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に浸し、３７℃、１００％相対湿度で２、６、及び２４時間静的インキュベーターに入れた。次いで、ＰＢＳを除去し、キムワイプを用いて吸い取り、硬化生体接着性試料を計量し（Ｗ２）、２４時間乾燥させ、再び計量した（Ｗ３）。膨潤比及び重量減少を、以下の式に従って各時点で試料ごとに３〜４回の繰り返しに基づき計算した：
膨潤比：（Ｗ２−Ｗ３）／Ｗ３×１００％  （式１）；
重量減少：（Ｗ１−Ｗ３）／Ｗ３×１００％  （式２）。
【０２３４】
実施例２
破裂強度試験結果
本発明のいくつかの実施形態による、２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した生体接着剤（シーラント）のいくつかの実施形態の、ｍｍＨｇを単位とした破裂強度に対するゼラチン及びアルギネート濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表１に示す。
【０２３５】
【表２】
2018531634.tif 000004
【０２３６】
本発明のいくつかの実施形態による、ゼラチン及びアルギネートを含む生体接着剤のいくつかの実施形態の破裂強度（ｍｍＨｇを単位とした）に対するＥＤＣ濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表２に示す。
【０２３７】
【表３】
2018531634.tif 000005
【０２３８】
１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤（シーラント）の一例の破裂強度（ｍｍＨｇを単位とした）に対するカオリン濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表３に示す。
【０２３９】
【表４】
2018531634.tif 000006
【０２４０】
１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤の一例の破裂強度（ｍｍＨｇを単位とした）に対するモンモリロナイト（Ｎａ＋−ＭＭＴ）濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表４に示す。
【０２４１】
【表５】
2018531634.tif 000007
【０２４２】
４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含み、１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋し、粘土鉱物（カオリン又はＭＭＴ）をさらに含む、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤の一例を、生体接着剤の破裂強度に従って比較した。結果を表５に示す。
【０２４３】
【表６】
2018531634.tif 000008
【０２４４】
表１〜５に見られるように、ゼラチンの濃度の増加は、２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した場合、硬化生体接着性マトリックスのより高い破裂強度をもたらしたが、ゼラチン濃度が４００ｍｇ／ｍｌより高い場合、この影響は観察されなかった。さらに、ゼラチンの濃度の増加は、生体接着剤が過度に粘性になる前に生体接着剤に加えられ得るアルギネートの量を制限した。したがって、６００ｍｇ／ｍｌ（以上）ゼラチンを含有する製剤の粘度は、ダブルシリンジアプリケータで適切に操作するには高すぎた。
【０２４５】
表１〜５にさらに見られるように、アルギネート濃度は、ほとんどの試験生体接着剤の破裂強度に対して軽微な影響を示し、本発明のいくつかの実施形態によるゼラチン−アルギネート生体接着剤を実際に１５ｍｇ／ｍｌで架橋すると、２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで得られたものと類似した破裂強度値をもたらした。
【０２４６】
表１〜５に示された結果に起因するより興味深い観察の１つは、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤への粘土鉱物の添加に関係する。５％カオリンを４００−１０−１５生体接着剤に組み込むと、同等の粘土なし生体接着剤と比較して硬化試料の破裂強度が約３５％増加した。しかし、０．５％ＭＭＴのみをそれに加えた場合、４００−１０−１５生体接着剤の破裂強度は約４０％増加した。２％ＭＭＴを本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に組み込んだ場合、約１０５％の増加が得られた。
【０２４７】
表６は、上記に示された比較破裂強度試験をまとめている。
【０２４８】
【表７】
2018531634.tif 000009
【０２４９】
表６に見られるように、モンモリロナイトは、カオリンより高い破裂強度を生体接着性製剤に与えることにより、より知られ、より広く使用されている粘土鉱物カオリンと比較して、本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に対する優れた粘土鉱物添加剤であることが意外にも見出された。
【０２５０】
実施例３
膨潤及び重量減少試験結果
本発明のいくつかの実施形態による、１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤（シーラント）の膨潤比に対するモンモリロナイト濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表７に示す。
【０２５１】
【表８】
2018531634.tif 000010
【０２５２】
本発明のいくつかの実施形態による、１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤の重量減少に対するモンモリロナイト濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表８に示す。
【０２５３】
【表９】
2018531634.tif 000011
【０２５４】
本発明のいくつかの実施形態による、１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤の膨潤比に対するカオリン濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表９に示す。
【０２５５】
【表１０】
2018531634.tif 000012
【０２５６】
本発明のいくつかの実施形態による、１５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣで架橋した４００ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍｇ／ｍｌアルギネートを含む生体接着剤の重量減少に対するカオリン濃度の影響を、上記に記載された手順に従って試験した。結果を表１０に示す。
【０２５７】
【表１１】
2018531634.tif 000013
【０２５８】
表７〜１０に見られるように、生体接着剤中のモンモリロナイト濃度の増加はより低い膨潤比をもたらし、より有意な差がインキュベーションの６時間後に見出された。生体接着剤中の粘土鉱物モンモリロナイトの濃度は、得られたシーラントマトリックスの重量減少に対する影響が軽微であった。
【０２５９】
４００−１０−１５生体接着剤への５０ｍｇ／ｍｌカオリンの組み込みは、インキュベーションの６時間未満後に硬化生体接着性試料の溶解をもたらした。
【０２６０】
粘土鉱物を生体接着剤に組み込む影響は、得られた生体接着性マトリックスの水分取り込み（膨潤）及び重量減少に対する影響が比較的小さかったことが概ね見て取れる。
【０２６１】
表７〜１０に示されたデータに起因する興味深い観察は、作業環境に曝露されるとき膨潤及び重量減少に関してより安定な、より一貫した生体接着性マトリックス構造の完全性を与えることにより、モンモリロナイトが、カオリンと比較して本発明のいくつかの実施形態による生体接着剤に対する優れた粘土鉱物であるという意外な結果である。
【０２６２】
実施例４
硬化（ゲル化）時間
シーラントとして使用される場合、本明細書に示された生体接着剤は、生命に関わる出血状況など断裂組織をできるだけ速く密閉することがいくつかの適用において求められる。そのような適用に関して、生体接着剤は、短い硬化（ゲル化）時間を示すことが求められる。最終ゲル化前の生体接着性製剤の粘度も、特定の適用においてモニターされるべき特性である。
【０２６３】
ゲル化時間及び粘度は主成分の相対濃度と相関することから、濃度とゲル化／粘度の関係を判定するために実験を行った。
【０２６４】
表１１は、硬化（ゲル化）時間に対する生体接着剤の主成分の濃度の影響を試験した試験結果を示している。
【０２６５】
【表１２】
2018531634.tif 000014
【０２６６】
表１１に見られるように、ＭＭＴは、架橋反応に関与するアルギネート及びＥＤＣのものと類似した硬化加速効果を有するが、カオリンは同じ効果を示さない。
【０２６７】
表１２は、硬化前の生体接着性製剤の粘度（パスカル秒）に対する、カップリング剤なしの主成分の濃度の影響を試験した試験結果を示している。
【０２６８】
【表１３】
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【０２６９】
実施例５
冷水魚皮膚ゼラチン
本発明のいくつかの実施形態による別の例示的な生体接着性マトリックスを、冷水魚皮膚ゼラチンを用いて調製した。
【０２７０】
材料及び方法
材料：
冷水魚皮膚「タイプＡ」ゼラチン（Ｇ７０４１）、ブタ皮膚「タイプＡ」ゼラチン（Ｇ６１４４）、アルギン酸ナトリウム塩（Ａ１１１２）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及びカオリン（Ｋ１５１２）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、レホボト、イスラエルから購入した。ナトリウムモンモリロナイト（Ｃｌｏｉｓｉｔｅ  Ｎａ＋）はＢＹＫ（ＵＳＡ）から購入した。
【０２７１】
止血剤充填外科用生体接着剤の調製：
生体接着剤の調製は、様々な量のゼラチン及びアルギネート（Ｇｅｌ−Ａｌ）及び止血剤粉末（カオリン又はＭＭＴ）を６０℃までの加熱下で蒸留水に溶解するステップに基づく。生体接着剤の使用の直前に、架橋剤（ＥＤＣ）を止血剤を含有するＧｅｌ−Ａｌ溶液に加えた。ゼラチン及びアルギネートは、それぞれ２００〜６００及び０〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度で特徴付けした。カオリン及びＭＭＴの影響は、それぞれ５、１０、１５、２０、５０及び２．５、５、１０、１５、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で試験した。製剤はＧｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣの形態で示す。Ｇｅｌはゼラチンの濃度であり、Ａｌはアルギネートの濃度であり、ＥＤＣはカルボジイミド架橋剤の濃度である（全てｍｇ／ｍＬ）。
【０２７２】
全ての実験において生体接着剤は、ポリマー及びクロスリンカー溶液の一貫した混合を提供するスタティックミキサーを備えたダブルシリンジを４：１体積比で用いて塗布した（Ｍｉｘｐａｃ  Ｌ−Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｕｌｚｅｒ、スイス）。
【０２７３】
魚ゼラチンを含有するポリマー溶液を室温、２５±２℃に約１０分間置き、故に、塗布前に室温に達するようにした。ブタゼラチンを含有するポリマー溶液を、水槽からの除去直後、まだ温かいうちに使用した。ＥＤＣ濃度は２０ｍｇ／ｍＬであった。この濃度はポリマーにとって十分な比であり、細胞傷害性は低いことが見出された。
【０２７４】
生体接着剤の機械的特性の評価：
３種類の機械的試験を、新規生体接着剤の機械的特性の評価のための関連する基準に基づき選択した。これらの３つの方法の組み合わせは、生体接着剤機能の十分な理解を確立できるようにする。
【０２７５】
破裂強度測定値：
破裂強度は、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｓｔ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｅａｌａｎｔｓ  ＡＳＴＭ  Ｆ２３９２−０４に従って、特注の機械的破裂デバイスを用いて試験した。この試験の原理は、生体接着剤により保持することができる組織漏出時点の最大圧力を測定することである。均一の３．０ｍｍ直径穴を備えたコラーゲンケーシング（Ｓ１  Ｆｉｂｒａｎ、スペイン）を組織基質として使用した。生体接着剤約０．５ｍＬをコラーゲンケーシング基質に塗布し、約１ｍｍの測定厚さで欠損を密閉した。試料を試験ユニットに入れ、圧力をかけた。生体接着剤の不具合が生じた圧力を最大破裂圧力として記録した。最低１０回の繰り返しを製剤ごとに実行した。
【０２７６】
重ね剪断接合強度：
組織接着剤塗布において皮膚に日常的に加わるせん断力下の機械的特性を調べるために、重ね剪断下の接着接合強度を、５５００  Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）を用いてＡＳＴＭ  Ｆ２２５５−０５に従って評価した。簡単には、コラーゲンケーシングのシートを２．５ｃｍ幅のストリップにカットした。各ストリップの端の１センチメートル領域を、重ね合わせる領域として印を付け、握りやすい厚さの領域を作成するために他方の端を折り曲げた。より多くの成分の添加により異なる溶液の粘度が増加するため、生体接着剤の塗布は２つの異なる方法で実行した。
【０２７７】
ゼラチン及びＥＤＣのみを含む製剤には手作業による混合を使用した。２５μＬのポリマー溶液を２つのストリップそれぞれの印を付けた領域に広げ、１２．５μＬの架橋溶液を一方のストリップに加え、できるだけむらなく広げた。２つのストリップを接着剤の塗布直後に重ね合わせた。
【０２７８】
アルギネートを含有するより粘性の製剤には、ダブルシリンジを使用した。６０μＬ生体接着剤の近似量を一方のストリップに塗布し、第２のストリップをこの領域の上に直ちに置いた。
【０２７９】
重ね合わせ直後に１．２Ｎの力を接合領域に１５分間加え、接着剤を硬化させ、固まらせた。全手順を室温、２５±２℃で実行した。加えた負荷が検体の長軸と一致するように、試験検体を試験機械のグリップにおいた。一定のクロスヘッド速度５ｍｍ／分で不具合が生じるまで、検体に負荷をかけた。製剤ごとに１０検体を試験し、試料ごとに、不具合時の最大の力及び不具合の状態（粘着性、接着性、又はコラーゲン基質の不具合かどうか）を記録した。接着性の不具合のみを考慮に入れた。
【０２８０】
圧縮率−生体接着剤弾力性：
圧縮率を測定するために、円筒状試料（直径７．８ｍｍ、高さ３．４ｍｍ）をシリコンモールドで調製し、鋳造２４時間後に分析した。圧縮弾性率（Ｅｃ）は上記のＩｎｓｔｒｏｎマシンを用いて測定した。円筒状材料試料を速度０．２ｍｍ／分及び最大ひずみ３５％の傾斜圧縮変位に従って、負荷／非負荷３サイクルによりプレコンディショニングした。５検体を製剤ごとに試験した。圧縮率（Ｅｃ）は、ひずみの１５〜２５％の間のデータに対する線形回帰線の傾斜として計算した。
【０２８１】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）：
生体接着剤への組み込みによるＭＭＴのギャラリー距離（ｇａｌｌｅｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）の変化を測定するために、ＸＲＤデータを、化合物シリコンストリップ技術に基づく１Ｄ  ＬｙｎｘＥｙｅ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（ドイツ）Θ：ΘＸ線回折計で、ＣｕＫα線を用いて対称なＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ幾何学配置で収集した。
【０２８２】
粘度測定：
硬化前の組織における塗布及び混合の瞬間のポリマー（Ｇｅｌ−Ａｌ）生体接着剤の初期粘度は、主に水性Ｇｅｌ−Ａｌ溶液の粘度により影響される。生体接着剤の初期粘度に対する止血剤の影響を調べるために、２５℃又は３７℃の一定温度（それぞれ魚又はブタゼラチンに対して）及び１０Ｈｚの一定剪断速度で、円錐及び平板型幾何学配置（円錐角１°、直径４０ｍｍ）とフィットした制御応力レオメーター（モデルＤＨＲ３、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を用いて、ポリマー溶液の粘度測定を行なった。
【０２８３】
ゲル化／硬化時間：
架橋時間、すなわちゲル化及び硬化時間は、生体接着剤が創傷に塗布されるとき、所望の状態に達するために必要とされる時間を示す。ゲル化時間は、ポリマー溶液をクロスリンカー溶液と混合した後、磁気棒が動きを止めるために必要とされる時間として決定した。止血剤を充填した又は充填しない生体接着剤約１ｍＬを、室温で１．４ｃｍ磁気棒を用いて３００ｒｐｍで混合下、直径１．６ｃｍプレートに注いだ。
【０２８４】
統計解析：
全てのデータはＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて処理した。２つを超える群間の統計的比較を、ＸＬＳＴＡＴソフトウェアによるＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ  Ｋｒａｍｅｒ事後検定と共に）法を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意と見なした。図中のエラーバーは標準誤差を示す。
【０２８５】
結果及び考察
この試験では、魚ゼラチンに基づく並びに止血剤カオリン及びＭＭＴを充填した複合ハイドロゲル生体接着剤の機械的及び物理的特性を調べた。３種類の機械的試験、すなわちＸＲＤ、粘度、及びゲル化時間を用いて全ての成分の影響を試験した。粘着及び接着強度に対する全てのパラメータの影響を説明する質的モデルを以下に示す。
【０２８６】
生体接着剤の機械的特性：
生体接着性製剤の機械的特性は、関連する基準に基づき選択した３つの機械的測定により評価した。
【０２８７】
ゼラチン濃度の影響：
破裂圧力は、ハイドロゲル接着剤が流体漏出により壊れる前に持ちこたえることができる最大圧力として定義される。ハイドロゲルが接着剤、止血薬、又はシーラントとして使用される場合、これらは下にある組織又は体液からの著しい圧力にしばしばさらされる。
【０２８８】
図１Ａ〜Ｃは、ＥＤＣ濃度が２０ｍｇ／ｍＬで一定に保たれた、破裂強度（図１Ａ）、生体接着剤の手作業による塗布（図１Ｂの濃いバー）とダブルシリンジによる塗布（図１Ｂの淡いバー）の比較も示す重ね剪断下の接合強度、及び圧縮状態での弾性率（図１Ｃ）に対するゼラチン濃度の影響を示す比較バープロットを示している。
【０２８９】
図１Ａに見られるように、例示的な製剤は、少なくとも１６０ｍｍＨｇの圧力に耐える能力を示す。動脈血管シーラントとして設計された生体接着剤は、約２００ｍｍＨｇの収縮期血圧に持ちこたえなければならないが、角膜切開用のシーラントとして使用されるハイドロゲルに必要とされる破裂圧力限界は６７ｍｍＨｇである。２００から４００ｍｇ／ｍｌへのゼラチン濃度の増加は、破裂強度の劇的な１２０％増加をもたらす。ゼラチン濃度のさらなる増加は破裂強度をほんのわずかに改善する。一方、剪断強度のより中程度の増加（５１％）は、ゼラチン濃度が２００から４００ｍｇ／ｍｌに増加したときに達成された（図１Ｂ）。より高いゼラチン濃度では重ね剪断強度が低下し、２００及び６００ｍｇ／ｍＬゼラチンに等しい強度をもたらした。図１Ｂはまた、生体接着剤の手作業による拡散及び混合とダブルシリンジを用いた塗布の比較も示している。ダブルシリンジによる塗布により得られた重ね剪断強度は、手作業による混合後より約４５％より高い強度を示した。したがって、このシリンジを全ての試験に選択した。
【０２９０】
図１Ｃに見られるように、圧縮状態での生体接着剤の弾性率の顕著な増加は、ゼラチン濃度が３００から４００ｍｇ／ｍＬに増加したときに達成された。３００ｍｇ／ｍＬより低いゼラチン濃度で生体接着剤は、弾性ハイドロゲルを示す低い弾性率を示した。弾力性評価は通常、引張試験により実行されるが、成形検体の欠損の影響を最小化するために圧縮試験を選択した。
【０２９１】
結果は、架橋反応が約４００ｍｇ／ｍＬのゼラチン濃度で飽和状態に達すること、すなわち、ＥＤＣの反応性がゼラチン−アルギネート官能基に完全に占められていることを示している。興味深いことに、比較的低濃度のゼラチン（２００及び３００ｍｇ／ｍＬ）では、ＥＤＣ：ゼラチン比が高いという事実にもかかわらず、全ての機械的特性は比較的低く、高いクロスリンカーと官能基（アミン及びカルボキシル）の比を意味した。したがって、水性溶液の官能基の濃度は、クロスリンカーと官能基の比より大きな影響を架橋反応に対して有すると考えることができる。
【０２９２】
重ね剪断強度は、接着強度及び粘着強度を最終的に決定するいくつかの要因により影響される。反対に、生体接着剤の弾性率は、主に生体接着剤の粘着強度と相関する。生体接着剤の破裂強度も、接着及び粘着強度により影響されるが、後者はより大きな影響を有する。最大時による重ね剪断強度に対するゼラチン濃度の軽度の影響は、粘着及び接着力の総合的影響により説明することができる。破裂強度及び弾性率から観察されるように、４００ｍｇ／ｍＬまで粘着強度は有意に増加した。２００〜４００ｍｇ／ｍＬゼラチン濃度の間の粘着強度の変化は、粘度がより低いことから、より低い濃度でのはるかに優れた機械的連動により、重ね剪断強度に対する影響が破裂強度又は弾性率より低い。４００ｍｇ／ｍＬゼラチンより上の重ね剪断強度の低下は、より低い機械的連動能、及びこれらの濃度で粘着強度がむしろ適度に増加したという事実の結果として得られる。
【０２９３】
アルギネート濃度の影響：
図２Ａ〜Ｃは、４００ｍｇ／ｍＬゼラチン及び２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図２Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図２Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図２Ｃ）に対するアルギネート濃度の影響を示す比較バープロットを示している。
【０２９４】
生体接着剤の機械的特性に対するアルギネート影響の評価は、適切な濃度として見出された４００ｍｇ／ｍＬゼラチンを含むハイドロゲル溶液で行った。図２Ａからから明らかなように、アルギネート濃度は４０ｍｇ／ｍＬの最大濃度で充填された場合、破裂強度を約３０％低下させた。１０及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度でわずかな変化が観察された。アルギネート濃度が増加した場合、架橋ハイドロゲルはより低い圧縮率を示した（図２Ｃ）。故に、生体接着剤の粘着強度は、アルギネートの組み込みにより低下することが示唆され得る。
【０２９５】
２種類のポリマー間の相互作用が良好なポリマーブレンドハイドロゲルは、より高度の鎖の絡み合いをもたらすことが知られている。理論的には、より多くの絡み合いはより濃密なネットワークをもたらし、したがってより高い粘着強度を誘導する。正反対の結果に対する１つの妥当な説明は、次のようになる：接着剤マトリックスにおけるＥＤＣの相対的部分が減少し、カルボン酸基部分が増加したため、ゼラチン及びＥＤＣの一定濃度下、アルギネート濃度の増加が架橋密度を低下させた。架橋有効性は故に、アルギネート濃度の増加とともに低下した。
【０２９６】
一方で、２０ｍｇ／ｍｌアルギネートは重ね剪断強度を４０％低下させたが、より高い濃度は重ね剪断強度を改善することが見出された。４０ｍｇ／ｍｌの最高濃度の重ね剪断強度は、アルギネートなしのゼラチン溶液より４０％高いことが見出された。上述のように、重ね剪断強度は、生体接着剤の接着強度及び粘着強度の両方を反映する。破裂強度及び弾性率の変化が粘着強度の低下をもたらすと仮定すると、より高いアルギネート濃度での重ね剪断強度の増加は、接着強度の強い増加の証拠となる。これは、カルボキシル基と被着材の相互作用の改善に起因している可能性がある。一般に、生体接着剤のインビトロ評価で見出される接着強度の改善は、注意して考えるべきである。これらの方法は標準的な机上試験であるが、被着材及び精密な条件はインビボ条件を厳密にシミュレートしない。止血剤の影響の以下の評価には、４００−１０−２０ｍｇ／ｍｌ  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣの組成を選択した。
【０２９７】
止血剤濃度の影響：
止血剤ＭＭＴ及びカオリンを生体接着剤に比較的高濃度で充填し、溶液の粘度のかなりの増加をもたらした。カオリンを５０ｍｇ／ｍＬの最大濃度まで充填したのに対し、ＭＭＴは２０ｍｇ／ｍＬまで充填した。
【０２９８】
図３Ａ〜Ｃは、４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図３Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図３Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図３Ｃ）に対するＭＭＴ濃度の影響を示す比較バープロットを示している。
【０２９９】
図４Ａ〜Ｃは、４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく生体接着剤の、破裂強度（図４Ａ）、重ね剪断下の接合強度（図４Ｂ）、及び圧縮状態での弾性率（図４Ｃ）、に対する、カオリン濃度の影響を示す比較バープロットを示している。
【０３００】
図３Ａに見られるように、ＭＭＴは破裂強度に強い影響を与えることが見出された。２０ｍｇ／ｍｌのＭＭＴ濃度を使用したとき、約５３％の増加が得られた。図３Ｃに見られるように、ＭＭＴのより顕著な影響が弾性率で見出された。２０ｍｇ／ｍＬの最高濃度を使用した場合、弾性率は非充填製剤と比較して２倍に増加した。ＭＭＴを組み込んだ場合、重ね剪断強度の有意な増強はなく、重ね剪断強度は全てのＭＭＴ濃度に関して類似していた。
【０３０１】
図４Ａ〜Ｃに見られるように、類似した傾向がカオリンを充填した場合に観察された。
【０３０２】
図５Ａ〜Ｂは、ＭＭＴのＸＲＤ試験の結果を示している。図５Ａは、プリスティンＭＭＴ（ライン１）生体接着剤及び非充填生体接着剤（ライン２）のＸＲＤパターンを示し、図５Ｂは、２０ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＴ（ライン３）、１０ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＴ（ライン４）、及び５ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＴ（ライン５）を充填した本発明のいくつかの実施形態による生体接着性複合製剤の正規化ＸＲパターンを示す。
【０３０３】
図４Ａ〜Ｃ及び図５Ａ〜Ｂの比較は、より大きな改善が、カオリンより組み込みＭＭＴから生じたことを示している。カオリンは重ね剪断強度に対して影響がないのに対し、破裂強度の２５％増強が最高カオリン濃度で観察された。粘着強度のこの中程度の改善は、故に非充填生体接着剤と比較して弾性率の５０％増加で表された。
【０３０４】
機械的特性の有意の増強は、ゼラチンとＭＭＴの強い相互作用、特にゼラチンからのカルボキシレートとＭＭＴからのヒドロキシル基の水素相互作用によるものである。さらに、ゼラチンの陽性アミノ酸（ＮＨ３）とＭＭＴギャラリーの陰性部位の間に強い相互作用が存在する。一方で、この相互作用は遊離アミン基を低減し、故にカルボジイミド化学架橋効率の低下をもたらした。さらに、ポリマーマトリックス全体の安定性は、物理的架橋剤として機能するＭＭＴにより増強される。
【０３０５】
図６Ａ〜Ｃは、カオリン（図６Ａ）及びナトリウムモンモリロナイト（ＭＭＴ；図６Ｂ）の化学構造、並びに異なるタイプのポリマー／層状珪酸塩複合材料の略図を示しており、マイクロ複合材料がカオリン珪酸塩複合材料を特徴付けるために示唆され、挿入ナノ複合材料及び剥離ナノ複合材料がＭＭＴ珪酸塩複合材料を特徴付けるために示唆される。
【０３０６】
図６Ａ〜Ｃに見られるように、止血剤は両方とも類似した結晶構造を有するが、生体接着剤に止血剤を充填した場合にもたらされた複合構造は機械的特性、特に粘着強度が大きく異なる。カオリンとポリマーマトリックスの相互作用は、おそらく水素結合及び静電力から生じる。しかし、カオリンは非膨張層状珪酸塩であり、相互作用は故に最初の表面積でのみ生じた。対照的に、ＭＭＴは膨張層状珪酸塩であり、珪酸塩の表面積を大幅に増加させることができ、故に相互作用の量を大幅に増加させることができる。これらの強い相互作用は、ポリマーマトリックスにＭＭＴの安定なナノ分散をもたらし、挿入及び剥離複合材料などのナノ複合構造を生み出した。
【０３０７】
結論として、Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ生体接着性製剤は優れた機械的特性を示す。ゼラチン濃度は、生体接着剤の機械的強度と直接相関することが見出されたのに対し、アルギネートの組み込みは生体接着剤の強度、特に粘着強度をわずかに低下させることができた。止血剤は両方とも、生体接着剤の機械的強度をある程度改善した。しかし、カオリンと比較してより少量のＭＭＴが必要とされ、ＭＭＴがより有効であることを示した。さらに、生体接着剤の機械的能力の追加の増強は、止血剤の存在により出血環境における機能の改善として動物試験で明らかにされる可能性がある。
【０３０８】
構造的特徴：
プリスティンＭＭＴ及び非充填Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ生体接着剤のＸＲＤパターンを図５Ａに示す。ＭＭＴは、ブラッグの式による珪酸塩層の１．２ｎｍのｄ間隔（００１）に対応する２θ＝７．３°で単一のピークを示した。図５Ｂは、ナノ複合材料形成による変化を解明するために、プリスティンＭＭＴ、及び様々なＭＭＴ充填物を充填し非充填生体接着剤と比較した生体接着性製剤の正規化ＸＲＤパターンを示している。図５Ａ〜Ｂに見られるように、ＭＭＴ充填生体接着剤は、ＭＭＴ（００１）ピークよりより低い角度にシフトした新たな幅広いピークを含有する。このシフトは、ＭＭＴギャラリーへのポリマー鎖の閉じ込めに起因し、ナノ複合構造の形成を示している可能性がある。ＭＭＴ（００１）反射の欠如は、挿入構造より多い剥離構造を示唆している可能性がある。
【０３０９】
ポリマーマトリックスへの層状珪酸塩の組み込みは、珪酸塩とポリマーマトリックスの間で相分離した典型的なマイクロ複合材料をもたらすことができる。そのような構造は通常、カオリンなどの１：１層状珪酸塩で形成される。一方、ナノ複合構造は層の膨張により形成され得る。層間の結合がより弱いモンモリロナイトなどの２：１層状珪酸塩は、したがって、特定の条件下で膨張する能力を有する。部分的膨張は、珪酸塩層間のポリマー鎖挿入、すなわち、図６Ｃに例証された挿入構造を可能にする。より大規模な膨張は、単層への完全な層間剥離、すなわち剥離構造として表現される。
【０３１０】
粘度：
生体接着剤の粘度は使用しやすさを決定し、機械的連動機構を通じた機械的特性に影響を与える極めて重要な特性である。初期粘度、すなわち架橋反応前の粘度に対する生体接着剤の成分の影響を解明するために、レオロジー試験を行った。測定は２５℃のＧｅｌ−Ａｌ溶液で実行した。
【０３１１】
図７Ａ〜Ｃは、４００：１０  Ｇｅｌ−Ａｌを有する生体接着性製剤中のゼラチンの濃度（図７Ａ）、４００ｍｇ／ｍＬゼラチンに基づくアルギネートの濃度（図７Ｂ）、並びにＭＭＴ（図７Ｃの四角によりマークされた）及びカオリン（図７Ｃの三角によりマークされた）の濃度の影響を示す、本発明のいくつかの実施形態による例示的な生体接着性製剤の粘度を評価するために行ったレオロジー試験の結果を示している。
【０３１２】
図７Ａ〜Ｃに見られるように、粘度はゼラチン濃度と共に増加し、１００ｍｇ／ｍｌのゼラチンを追加するごとに粘度を約２．７倍増加させた。図７Ｂに示された結果は、たとえ濃度増加が１桁低い、すなわち１０ｍｇ／ｍＬであっても、アルギネートが粘度を強く増加させたことを示している。
【０３１３】
図７Ｃに見られるように、止血剤は溶液の粘度に対する異なる影響を示した。最高量のＭＭＴを充填した場合、ハイドロゲルの粘度は７倍に増加したのに対し、ＭＭＴより２．５倍高い濃度（５０ｍｇ／ｍｌ対  ２０ｍｇ／ｍＬ）で充填したにもかかわらず、カオリンの充填は粘度に対して影響がなかった。
【０３１４】
ＭＭＴ濃度の増加に伴うＧｅｌ−Ａｌ溶液の粘度の増加は、おそらくＭＭＴ層状珪酸塩の膨張性質によるものである。該性質は、ポリマーマトリックス−層状珪酸塩界面の大幅な増加をもたらし、物理的クロスリンカーとして作用し、ポリマー溶液を安定させた。カオリン及びＭＭＴはマトリックスとの同じ相互作用をもたらすが、カオリンは未拡大（ｕｎｅｘｐａｎｄｅｄ）の層状珪酸塩であり、相互作用はハイドロゲルを強化するのに重要でない。
【０３１５】
ハイドロゲルの粘度が低いとき、機械的連動能は通常良好であり、すなわち、組織中のマイクロポアにハイドロゲルが浸透しやすいことから、接着強度は増加する。高粘度生体接着剤は通常、より高い粘着強度に寄与する、より高い鎖の絡み合い及びより濃密なポリマーネットワークを示す。
【０３１６】
ゲル化時間：
最適ゲル化時間は臨床的手順に依存し、通常５〜６０秒の範囲である。
【０３１７】
図８は、４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣに基づく例示的な生体接着性製剤において使用された、ＭＭＴの濃度（四角によりマークされた）及びカオリンの濃度（三角によりマークされた）により影響された４００：１０：２０  Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ  生体接着剤のゲル化時間を示す。
【０３１８】
図８に見られるように、全ての試験製剤が所望の範囲内のゲル化時間を示した。最大ＭＭＴ濃度がゲル化時間を約３０％促進したのに対し、５０ｍｇ／ｍＬの高濃度で充填したときでさえ、カオリンはゲル化時間に対して影響がなかった。これらの結果は、図４及び図５に示された機械的強度結果並びに図７に示された粘度結果と一致しており、カオリンは、おそらくＭＭＴよりポリマーマトリックスとの相互作用が少ないために、ほとんど影響がないことを示した。さらに、ハイドロゲルの粘度及びゲル化時間は独立している。試験生体接着剤のゲル化時間は、ポリマー濃度又はクロスリンカー濃度、ｐＨ、ダブルシリンジ幾何学配置等などのいくつかの手段によりさらに調整され得ることが留意されるべきである。
【０３１９】
生体接着剤の特性に対するゼラチン供給源の影響：
図９Ａ〜Ｂは、Ｇｅｌ−Ａｌ−ＥＤＣ  ４００−１０−２０ｍｇ／ｍＬを有する、本発明のいくつかの実施形態による例示的な生体接着性製剤について測定した、初期粘度（図９Ａ）及び破裂強度（図９Ｂ）に対する冷水魚ゼラチン（濃いバー）対ブタゼラチン（淡いバー）の影響を示している。
【０３２０】
図９Ａ〜Ｂに見られるように、非充填及び止血剤充填生体接着性製剤の両方の初期粘度は、ゼラチン供給源に影響されなかった。破裂強度も同じであり、ゼラチン供給源に事実上影響されない。ブタゼラチンは、生物医学的適用に関して冷水魚ゼラチンよりはるかに一般的であるが、結果は、両方の供給源からのゼラチンに関してカルボジイミド架橋反応が等しく効果的であることを示唆している。ブタゼラチンとは対照的に冷水魚ゼラチンを使用することの付加価値は、適用前にポリマーハイドロゲルを加熱する必要性を排除することである。これはいくつかの医学的適用に有用となり得る。
【０３２１】
製剤−強度モデル：
関連する生体接着性特性による粘着及び接着強度に対する生体接着性製剤パラメータの影響を説明する質的モデルが、上記の知見に基づき示唆される。
【０３２２】
図１０は、濃い／淡い矢印が、特定のパラメータの増加／減少がそれぞれ次のパラメータの増加をもたらす場合を表し、一方、破線はより適度な応答を表す、粘着及び接着強度に対する生体接着剤成分の影響を記載する質的モデルの略図を示している。
【０３２３】
このモデルによれば、ＭＭＴの組み込みは、強化効果及び粘度の増加により生体接着剤の粘着強度に強い影響を与える。より高いアルギネート含量も、粘度及び絡み合いの増強により粘着強度に影響を与える。生体接着剤のゼラチン含量の増加は、絡み合い及び架橋密度の増強により、それぞれ粘着強度及び接着強度の両方を増強する。予想通り、架橋剤含量の増加も、より高い架橋密度のためより高い接着剤強度に寄与する。
【０３２４】
生体接着剤の機械的強度は、接着剤強度及び粘着強度の組み合わせである。生体接着剤が接着適用に使用される場合、組織に高度に接着する生体接着剤が設計されなければならない。本発明者らの提案モデルで記載されているように、低粘度ハイドロゲルの使用は、接着機構を増強し、組織のマイクロポアに浸透できるようにするのに好ましい。さらに、架橋密度は可能な限り高くする必要がある。これは、適切なポリマー、架橋剤、及び反応媒体を選択することにより達成することができる。架橋密度の増加は、ポリマー鎖間のより高量の分子間結合に、又は組織との追加の化学的相互作用として反映され得る。
【０３２５】
外科用シーラント適用のための接着強度の要件が、シーラントに加わるより低い機械的力に起因することはかなり少ない。しかし、内部強度、すなわち、ポリマーハイドロゲルの粘着強度は、シーラントプラグが引き抜かれることなく流体流動に耐えられるようにするのに極めて重要である。ハイドロゲルの粘着強度は、ポリマーの濃度及びタイプなどのポリマーマトリックス特性、並びに分子量及び分子修飾を調整して適合させることができる。これらは、粘度及び潜在的な絡み合いの変化をもたらす可能性がある。さらに、マトリックスの粘着性の増強は、ポリマーマトリックスを安定させる物理的架橋として作用する複合材料強化材により達成することができる。層状珪酸塩構造を有する止血剤は両方とも、ポリマーマトリックスを強化する。（図５、ＸＲＤで示された）ナノ複合材料レベルで配置されるＭＭＴ生体接着剤は、機械的特性を大幅に増強する。
【０３２６】
結論
ＥＤＣと架橋されたゼラチン及びアルギネートに基づく本発明のいくつかの実施形態による生体接着性製剤は、潜在的な接着剤及びシーラント適用のために設計された。止血剤カオリン及びＭＭＴの組み込みは、それぞれ、機械的及び物理的特性が増強したマイクロ複合材料及びナノ複合材料ハイドロゲルをもたらした。ナノ複合材料ＭＭＴ充填ハイドロゲルは、マイクロ複合材料カオリン充填ハイドロゲルと比較して優れた特性を示した。
【０３２７】
生体接着剤のゼラチン含量は、破裂強度、接合強度、及び圧縮率に影響を与える。２つの後者の特性は、アルギネート含量にも影響される。粘度は、主にゼラチン及びＭＭＴ含量に影響される。後者はゲル化時間にも強い影響を与える。
【０３２８】
提案モデルに基づき、ＭＭＴの組み込みは、強化効果及び粘度の増加により生体接着剤の粘着強度に強い影響を与える。より高いアルギネート含量も、粘度及び絡み合いの増強により粘着強度に影響を与える。生体接着剤のゼラチン含量の増加は、絡み合い及び架橋密度の増強により、それぞれ粘着強度及び接着強度の両方を増強する。冷水魚ゼラチンは、生体接着剤を室温（高温ではなく）での処理を可能にし、生体接着剤の特性に実質的に変化がないため、ブタゼラチンと比較して有利であることが見出された。
【０３２９】
これらの新たな複合接着剤の構造化効果と合わせて、生体接着剤の機械的及び物理的特性、特に粘着及び接着強度に対する生体接着剤の成分の影響を理解することにより、様々な適用のための関連パラメータを調節することができる。
【０３３０】
本発明は、その特定の実施形態と併せて記載されているが、多くの代替物、変更、及び変形形態が当業者には明らかであることが明白である。したがって、添付特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内にある全てのそのような代替物、変更、及び変形形態を包含することが意図される。
【０３３１】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの刊行物、特許、又は特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることを具体的及び個々に示されるのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参照の引用又は識別は、そのような参照が本発明の先行技術として利用可能であることを認めると解釈されてはならない。セクション見出しが使用される範囲において、それらは必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2018531634.tif 000016
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2018531634.tif 000028
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2018531634.tif 000032
【図７Ａ】
2018531634.tif 000033
【図７Ｂ】
2018531634.tif 000034
【図７Ｃ】
2018531634.tif 000035
【図８】
2018531634.tif 000036
【図９Ａ】
2018531634.tif 000037
【図９Ｂ】
2018531634.tif 000038
【図１０】
2018531634.tif 000039
【国際調査報告】
2018531634.tif 000040
2018531634.tif 000041