(57)【要約】  本開示は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（ＡＳＯ）にコンジュゲートされた、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を含む単離化合物、そのような化合物の組成物、及び本開示の化合物または組成物の１つによる、がんならびに自己免疫疾患を治療する方法（免疫応答の刺激を伴って、または伴わずに）、免疫刺激の方法、ＣＥＢＰＡを活性化する方法、及びＳＴＡＴ転写因子の活性を低減する方法に関する。
2018519831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）の低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、または（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列にコンジュゲートされた、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を含む、単離化合物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が、抗ＳＴＡＴ１オリゴヌクレオチド配列、抗ＳＴＡＴ２オリゴヌクレオチド配列、抗ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド配列、抗ＳＴＡＴ４オリゴヌクレオチド配列、抗ＳＴＡＴ５Ａオリゴヌクレオチド配列、抗ＳＴＡＴ５Ｂオリゴヌクレオチド配列、または抗ＳＴＡＴ６オリゴヌクレオチド配列である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
さらに、前記ホスホロチオエート化ＯＤＮ配列と、前記低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）または前記ＡＳＯとの間にリンカーを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記リンカーが、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記リンカーが、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
前記リンカーが、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
前記リンカーが、非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
前記リンカーが、置換された２から４０員環のヘテロアルキレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯが、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’フルオロ、２’−デオキシ、ユニバーサル塩基、５−Ｃ−メチル、反転デオキシ脱塩基性残基の組み込み、及びロックド核酸から成る群から選択される化学的修飾を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記修飾が、前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯの、各々の末端核酸塩基に位置する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記修飾が、前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯの、各々の末端核酸塩基に位置しない、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記修飾が、血清由来のヌクレアーゼから保護する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
薬学的に許容される賦形剤、及び請求項１に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
第２治療薬をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第２治療薬が、抗腫瘍または抗がん剤、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤、抗感染性剤、増殖阻害剤、免疫原性薬剤、免疫調節剤、及びケモカインから成る群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗がん剤が、細胞死促進薬である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記第２治療薬が、アクチノマイシンＤ／ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン（ペグ化リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、アレムツズマブ、ＢＣＧ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、インターフェロン、イピリムマブ、ラパチニブ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＥＡ）、メルタンシン（ＤＭ１）、リツキシマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、及びトラスツズマブ、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
がんの治療が必要な対象において、がんを治療する方法であって、前記対象に、請求項１の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記がんが、前立腺がん、乳がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、黒色腫、脳腫瘍、大腸がん、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象における前記がんが、同時に免疫応答を刺激しながら治療される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が、（ｉ）配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つにコンジュゲートされた、ＣＥＢＰＡ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または（ｉｉ）配列番号７〜１８及び９８〜１０１の、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つにコンジュゲートされた、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象における前記がんが、同時に免疫応答を刺激することなく治療される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、配列番号２９〜３０のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つとコンジュゲートされた、ＣＥＢＰＡ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯの１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
自己免疫疾患の治療が必要な対象において、自己免疫疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項１に記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患及び／または障害が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象における前記自己免疫疾患が、同時に免疫応答を刺激することなく治療される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、配列番号２９〜３０のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つにコンジュゲートされた、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物または前記組成物が、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、前記対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療が、前記化合物または組成物の用量に依存している、請求項２８の１つに記載の方法。
【請求項３０】
約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの前記化合物が、前記対象に投与される、請求項２８の１つに記載の方法。
【請求項３１】
免疫応答を刺激することが必要な対象において、免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、（ｉ）ＣＥＢＰ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または（ｉｉ）配列番号の３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓにコンジュゲートされた、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、または（ｉ）ＣＥＢＰ、ｐ２１、またはｐ５３のｓａＲＮＡ、もしくは（ｉｉ）配列番号の３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓにコンジュゲートされた、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
前記刺激が、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞または骨髄細胞の成熟、分化、もしくは増殖を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記刺激が、ＴＨ１型免疫応答の増加を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫応答の刺激が、前記対象の臓器へ、樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を補充する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫応答の刺激が、前記対象における抗原提示細胞の集団を拡大する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫応答の刺激が、前記対象におけるがん細胞の増殖を抑制する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物または前記組成物が、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、前記対象に投与される、請求項３１の１つに記載の方法。
【請求項３８】
細胞において、Ｃ／ＥＢＰαの発現を増進する方法であって、前記細胞を、ＣＥＢＰのｓａＲＮＡとコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、またはＣＥＢＰのｓａＲＮＡとコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記細胞を、請求項１に記載の化合物の有効量と接触させることを含む、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項４０】
細胞を、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓに連結された、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、または配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓに連結された、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量と接触させることを含む、細胞においてＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させる方法。
【請求項４１】
前記細胞が、がん細胞である、請求項３８の１つに記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、急性骨髄性リンパ（ＡＭＬ）細胞、または前立腺がん細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＭＬ細胞が、骨髄からのものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、インビトロで培養された細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、宿主におけるインサイチュである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、エクスビボで培養された組織における細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触ステップが、ウイルス性の形質導入を含まない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触ステップが、ウイルス性の形質導入を含まず、及び前記細胞が、前記化合物または前記医薬組成物と接触する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、約１〜１００ナノモル濃度の前記化合物と接触する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月２日に出願された、米国仮特許出願第６２／１８７，８７８号、及び２０１５年１２月７日に出願された、米国仮特許出願第６２／２６４，０２６号の利益を主張し、その全体及び全ての目的に対し、その各々の内容を、本明細書に援用する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された、「配列リスト」、表、またはコンピュータープログラムリスト別表の参照
２０１６年６月１４日に作成され、７３，４６９バイト、ＩＢＭ−ＰＣ機械フォーマット、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムにおいて、ファイル４８４４０−５７０００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ＴＸＴに記載された配列リストを、参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
急性骨髄性白血病は、未熟骨髄前駆細胞の蓄積により特徴付けられる。白血病誘発は、骨髄系統の分化、自己複製及び／または増殖を制御する、がん遺伝子、腫瘍抑制因子または転写因子の異常調節をもたらす。転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）は、顆粒球及びマクロファージの分化を促進し、ならびに造血幹細胞の自己複製を、負に調節する。緊急の顆粒球形成時及び白血病誘発時には、Ｃ／ＥＢＰαは、Ｃ／ＥＢＰβ及びＳＴＡＴ３転写因子の転写活性によって、置換される。Ｃ／ＥＢＰαの変異または下方調節は、ＡＭＬの患者に頻繁に観察される。低分子活性化ＲＮＡｓ（ｓａＲＮＡｓ）は、遺伝子発現を誘発することができる。ｓａＲＮＡ及びその他のオリゴヌクレオチド治療剤の臨床応用における要因は、標的送達に困難であり、さらに核酸への免疫システムに固有の感受性により、さらに複雑化する。ＳＴＡＴ３は、がん細胞及び非悪性腫瘍関連細胞の両方で作用する。しかしながら、ＳＴＡＴ３などの転写因子を標的化することは、それらの酵素活性の欠如によって複雑であり、及び非薬理学的なアプローチを必要とする。ＳＴＡＴ３を抑制するためのアンチセンス技術は、利用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞選択性を欠いているため、効果を限定してきた。本開示は、安定であり、及び播種性がんに対する全身投与に適している、ｓａＲＮＡがコンジュゲートした、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを用いて、がん、例えば、ＡＭＬを治療するための化合物、組成物、及び方法に関する。本開示はまた、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、がん、例えば前立腺がん及び膠芽細胞腫を治療するための化合物、組成物、ならびに方法に関する。
【発明の概要】
【０００４】
１つの態様において、現開示は、とりわけ、標的遺伝子の発現を調節するための、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）含む、単離化合物を提供する。１つの態様において、本開示は、目的とする遺伝子の、アンチセンス核酸配列または低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）にコンジュゲートした、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む、単離化合物を包含する。実施形態において、当該ＯＤＮは、１５〜３０塩基長、一本鎖、部分的にまたは完全にホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチドである。
【０００５】
実施形態において、本開示の化合物は、遺伝子発現を増進させるための低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、または遺伝子発現を抑制するためのアンチセンス配列を含む。
【０００６】
１つの態様において、本開示は、本開示の化合物を含む、化合物または組成物を用いて、対象における免疫応答を刺激することを伴いまたは伴わず、その化合物を含む、化合物または組成物を用いて、対象におけるがんを治療する方法を包含する。1つの態様において、本開示は、本開示のホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした、Ｃ／ＥＢＰαのｓａＲＮＡを含有する化合物を含む、化合物または組成物を用いて、細胞においてＣ／ＥＢＰα発現を増進させる方法を包含する。１つの態様において、本開示は、本開示のホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした、ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ６の、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含有する化合物を含む、化合物または組成物を用いて、転写因子であるシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ６）の発現を抑制する方法を包含する。
【０００７】
1つの態様において、本開示は、細胞を、当該化合物を含む、化合物または組成物の有効量に接触させることにより、その細胞の増殖を阻害する方法を包含する。
【０００８】
当該低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）を、活性化することができる。この方法には、骨髄腫、急性骨髄性白血病、前立腺がん、乳がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、黒色腫、脳腫瘍、大腸がん、白血病、またはリンパ腫を治療すること含む。当該組成物は、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、その対象に投与されてよい。
【０００９】
本開示のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明ならびに請求項から明らかになるであろう。
【００１０】
特にその意でないことが明示されない限り、本明細書で参照される、すべての出版物、参照、特許及び／または特許出願は、すべての目的に対し、その内容全体が、参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、化学的に安定化された、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計を示す。二本鎖及び一本鎖のＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの配列を示す。下線は、そのコンジュゲート骨格における、ホスホロチオエート化部位である。その２’ＯＭｅ変性ヌクレオチドを、四角い囲み内に示し、及びイタリック体で記載し、そのＣ３リンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の５ユニットを含むリンカー位置を示し、ＡＳは、アンチセンス鎖、ＳＳは、センス鎖である。図１Ａは、配列番号１０３及び配列番号２の二本鎖を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、配列番号１０４及び配列番号１０５の二本鎖を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、配列番号１０３を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図１Ｄ】図１Ｄは、配列番号１０４を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図１Ｅ】図１Ｅは、配列番号１０６及び配列番号１０７の二本鎖を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図１Ｆ】図１Ｆは、配列番号１０８及び配列番号１０９の二本鎖を含む、コンジュゲート配列を描写する。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定された、ｍＲＮＡ発現レベルの棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定された、ｍＲＮＡ発現レベルの棒グラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃ及び２Ｄは、タンパク質発現レベルのウェスタンブロット画像である。野生型（ＷＴ）またはＴＬＲ９欠損（ＴＬＲ９ＫＯ）マウスから単離された、新鮮な骨髄細胞を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートの処理過程でインキュベートするか、またはリポフェクトアミン２０００を用いた、５０ｎＭの非コンジュゲートｓａＲＮＡでトランスフェクションした。Ｃ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを、それぞれｑＰＣＲ（図２Ａ〜２Ｂ）及びウエスタンブロッティング（図２Ｃ〜２Ｄ）を用いて測定した。
【図２Ｄ】図２Ｃ及び２Ｄは、タンパク質発現レベルのウェスタンブロット画像である。野生型（ＷＴ）またはＴＬＲ９欠損（ＴＬＲ９ＫＯ）マウスから単離された、新鮮な骨髄細胞を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートの処理過程でインキュベートするか、またはリポフェクトアミン２０００を用いた、５０ｎＭの非コンジュゲートｓａＲＮＡでトランスフェクションした。Ｃ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを、それぞれｑＰＣＲ（図２Ａ〜２Ｂ）及びウエスタンブロッティング（図２Ｃ〜２Ｄ）を用いて測定した。
【図３】ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡが誘発する、標的のヒトがん細胞におけるＣ／ＥＢＰαの転写活性を表す、棒グラフを示す。Ｃ／ＥＢＰα特異的プロモーター・ルシフェラーゼ構造を発現する、ヒトＤＵ１４５前立腺がん細胞を、そこに示すように、５００ｎＭの種々のＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下でインキュベートするか、またはリポフェクトアミン２０００を用いた、５０ｎＭの非コンジュゲートｓａＲＮＡでトランスフェクトした。ホタルルシフェラーゼに一致する配列を持つ、ＣｐＧ−ＦＬＵＣ−ＲＮＡコンジュゲートを、陰性対照として使用した。７２時間以降の細胞を溶解し、及びＣｉｇｎａｌ  Ｃ／ＥＢＰレポーターアッセイキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、レベルを解析した。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、ヒト及びマウス細胞において、そのＣ／ＥＢＰαのｍＲＮＡでの、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡの、ＴＬＲ９依存効果及びタンパク質レベルを表すためのアッセイにおける、ヒトＤＵ１４５前立腺がん細胞、及びＭＯＬＭ１３白血病細胞の、各々の棒グラフを示す。ヒトＤＵ１４５前立腺がん細胞（図４Ａ）、及びＭＯＬＭ１３白血病細胞（図４Ｂ）を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートの処理過程でインキュベートするか、またはリポフェクトアミン２０００を用いた、５０ｎＭの非コンジュゲートｓａＲＮＡでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼに一致する配列を持つ、ＣｐＧ−ＦＬＵＣ−ＲＮＡコンジュゲートを、陰性対照とて使用した。７２時間以降の細胞を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた、ＣＥＢＰＡ  ｍＲＮＡレベルの解析のために、単離ＲＮＡに溶解した。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、ヒト及びマウス細胞において、そのＣ／ＥＢＰαのｍＲＮＡでの、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡの、ＴＬＲ９依存効果及びタンパク質レベルを表すためのアッセイにおける、ヒトＤＵ１４５前立腺がん細胞、及びＭＯＬＭ１３白血病細胞の、各々の棒グラフを示す。ヒトＤＵ１４５前立腺がん細胞（図４Ａ）、及びＭＯＬＭ１３白血病細胞（図４Ｂ）を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートの処理過程でインキュベートするか、またはリポフェクトアミン２０００を用いた、５０ｎＭの非コンジュゲートｓａＲＮＡでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼに一致する配列を持つ、ＣｐＧ−ＦＬＵＣ−ＲＮＡコンジュゲートを、陰性対照とて使用した。７２時間以降の細胞を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた、ＣＥＢＰＡ  ｍＲＮＡレベルの解析のために、単離ＲＮＡに溶解した。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、５００ｎＭのＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡコンジュゲートでインキュベートされたか、または４８時間インビトロで、ＣＥＢＰ・ｓａＲＮＡ単独でトランスフェクトされた、ヒトＭＶ４−１１ＡＭＬ細胞のフローサイトメトリーのスペクトルである。ＨＬＡＤＲ及び刺激分子のＣＤ８６ならびにＣＤ４０の発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。データは、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡが、インビボで免疫刺激効果を有することを示す（ＣＤ８６（図５Ａ）、ＣＤ４０（図５Ｂ）、及びＨＬＡＤＲ（図５Ｃ））。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、５００ｎＭのＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡコンジュゲートでインキュベートされたか、または４８時間インビトロで、ＣＥＢＰ・ｓａＲＮＡ単独でトランスフェクトされた、ヒトＭＶ４−１１ＡＭＬ細胞のフローサイトメトリーのスペクトルである。ＨＬＡＤＲ及び刺激分子のＣＤ８６ならびにＣＤ４０の発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。データは、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡが、インビボで免疫刺激効果を有することを示す（ＣＤ８６（図５Ａ）、ＣＤ４０（図５Ｂ）、及びＨＬＡＤＲ（図５Ｃ））。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、５００ｎＭのＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡコンジュゲートでインキュベートされたか、または４８時間インビトロで、ＣＥＢＰ・ｓａＲＮＡ単独でトランスフェクトされた、ヒトＭＶ４−１１ＡＭＬ細胞のフローサイトメトリーのスペクトルである。ＨＬＡＤＲ及び刺激分子のＣＤ８６ならびにＣＤ４０の発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。データは、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡが、インビボで免疫刺激効果を有することを示す（ＣＤ８６（図５Ａ）、ＣＤ４０（図５Ｂ）、及びＨＬＡＤＲ（図５Ｃ））。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、マウスにおける同系の白血病細胞に対する、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡの用量依存効果の、折れ線グラフ及びフローサイトメトリーデータを示す。Ｃｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ白血病が樹立された後（＞１％、血液中のＡＭＬ細胞の１〜５％の範囲で）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ      ｓａＲＮＡの様々な用量を、１日おきに２回注入し、及び最終処置後の１日で安楽死させた。図６Ａは、治療前後にフローサイトメトリーを用いて評価した、末梢血中のＡＭＬ細胞の割合の、折れ線グラフを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡが、用量依存性の方法で、骨髄及び脾臓において、ＡＭＬ細胞の割合を減少させることを表す、フローサイトメトリーのスペクトルを示す。種々の臓器における、ＧＦＰ＋ｃキット＋ＡＭＬ細胞のフローサイトメトリー解析の代表的な結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、骨髄のＡＭＬ細胞において、標的遺伝子発現を誘発するＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの、静脈内注入の、フローサイトメトリー及びヒストグラムデータを示す。樹立されたＣｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ白血病を持つマウスに、１ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡを使用して、１日おきに３回注入し、及び最終処置後の１日で安楽死させた。図７Ａ  は、フローサイトメトリーの代表的な結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、リアルタイムｑＰＣＲを用いて、骨髄から濃縮したｃキット＋ＡＭＬ細胞で測定した、ＣＥＢＰＡ  ｍＲＮＡレベルの棒グラフを示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、骨髄のＡＭＬ細胞における、標的遺伝子発現を誘発するＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの、静脈内注入の、折れ線グラフ及びフローサイトメトリーデータを示す。樹立されたＣｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ白血病を持つマウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡを使用して、１日おきに４回注入し、及び最終処置後の１日（２０日目）で安楽死させた。図８Ａは、治療前、治療中、及び治療後のフローサイトメトリーを用いて評価した、末梢血中のＡＭＬ細胞の割合の、折れ線グラフを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実験終了時の末梢血、骨髄、及び脾臓における、ＡＭＬ細胞の割合のフローサイトメトリー解析を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートの、代表的な配列設計及びＰＡＧＥゲルデータを示す。図９Ａに、一本鎖のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ設計の一例を示す。ホスホロチオエート化ヌクレオチドには下線を引く。炭素リンカーの（ＣＨ２）３ユニットは青色、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２のギャップマー配列における、２’ＯＭｅ変性ヌクレオチドは赤色である。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２（図９Ｂ）及びＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ４（図９Ｃ）コンジュゲートを、５０％ヒト血清中で、３７℃で最大５日間インキュベートした。次いで、そのサンプルを、７．５Ｍの尿素／２０％ＰＡＧＥゲル上で溶解し、及び臭化エチジウムを用いて染色した。その代表的なゲル画像を示す。Ｍは、ＤＮＡマーカーの位置を表す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートの、代表的な配列設計及びＰＡＧＥゲルデータを示す。図９Ａに、一本鎖のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ設計の一例を示す。ホスホロチオエート化ヌクレオチドには下線を引く。炭素リンカーの（ＣＨ２）３ユニットは青色、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２のギャップマー配列における、２’ＯＭｅ変性ヌクレオチドは赤色である。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２（図９Ｂ）及びＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ４（図９Ｃ）コンジュゲートを、５０％ヒト血清中で、３７℃で最大５日間インキュベートした。次いで、そのサンプルを、７．５Ｍの尿素／２０％ＰＡＧＥゲル上で溶解し、及び臭化エチジウムを用いて染色した。その代表的なゲル画像を示す。Ｍは、ＤＮＡマーカーの位置を表す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートの、代表的な配列設計及びＰＡＧＥゲルデータを示す。図９Ａに、一本鎖のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ設計の一例を示す。ホスホロチオエート化ヌクレオチドには下線を引く。炭素リンカーの（ＣＨ２）３ユニットは青色、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２のギャップマー配列における、２’ＯＭｅ変性ヌクレオチドは赤色である。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ２（図９Ｂ）及びＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ４（図９Ｃ）コンジュゲートを、５０％ヒト血清中で、３７℃で最大５日間インキュベートした。次いで、そのサンプルを、７．５Ｍの尿素／２０％ＰＡＧＥゲル上で溶解し、及び臭化エチジウムを用いて染色した。その代表的なゲル画像を示す。Ｍは、ＤＮＡマーカーの位置を表す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ヒトのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞による、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３のフローサイトメトリーデータを示す。ヒト前立腺がん細胞（図１０Ａ）及び脾細胞（図１０Ｂ）を、いかなるトランスフェクション試薬をも含まずに、指示濃度の蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３と共に、１時間インキュベートした。がん細胞、樹状細胞（ＤＣｓ、ＣＤ１１ｃ）、マクロファージ（ＭＡＣ、Ｆ４／８０＋Ｇｒｌ−）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）、及びＴ細胞（ＣＤ３＋）による、当該オリゴヌクレオチドの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３は、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞によって、急速に内在化した。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ヒトのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞による、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３のフローサイトメトリーデータを示す。ヒト前立腺がん細胞（図１０Ａ）及び脾細胞（図１０Ｂ）を、いかなるトランスフェクション試薬をも含まずに、指示濃度の蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３と共に、１時間インキュベートした。がん細胞、樹状細胞（ＤＣｓ、ＣＤ１１ｃ）、マクロファージ（ＭＡＣ、Ｆ４／８０＋Ｇｒｌ−）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）、及びＴ細胞（ＣＤ３＋）による、当該オリゴヌクレオチドの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３は、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞によって、急速に内在化した。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞による、  ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３のフローサイトメトリーデータを示す。マウスの前立腺がん細胞（図１１Ａ）及び脾細胞（図１１Ｂ）を、いかなるトランスフェクション試薬をも含まずに、指示濃度の蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、１時間インキュベートした。がん細胞、樹状細胞（ＤＣｓ、ＣＤ１１ｃ）、マクロファージ（ＭＡＣ、Ｆ４／８０＋Ｇｒｌ−）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）、及びＴ細胞（ＣＤ３＋）による、オリゴヌクレオチドの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３は、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞によって、急速に内在化した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞による、  ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３のフローサイトメトリーデータを示す。マウスの前立腺がん細胞（図１１Ａ）及び脾細胞（図１１Ｂ）を、いかなるトランスフェクション試薬をも含まずに、指示濃度の蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、１時間インキュベートした。がん細胞、樹状細胞（ＤＣｓ、ＣＤ１１ｃ）、マクロファージ（ＭＡＣ、Ｆ４／８０＋Ｇｒｌ−）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）、及びＴ細胞（ＣＤ３＋）による、オリゴヌクレオチドの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３は、マウスのインビトロの免疫細胞及び前立腺がん細胞によって、急速に内在化した。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、インビトロの前立腺がん細胞による取り込み後の、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３の細胞内局在を表す、共焦点顕微鏡画像を示す。ＤＵ−１４５前立腺がん細胞を、（１５分（図１２Ａ）、１時間（図１２Ｂ）、２時間（図１２Ｃ）、及び４時間（図１２Ｄ））に示すように。５００ｎＭの蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、異なる時間でインキュベートした。ＤＲＡＱ５（登録商標）による核染色後に、共焦点顕微鏡を用いて、そのコンジュゲートの細胞内局在を評価した。２つの独立した実験の1つからの、代表的な画像を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、インビトロの前立腺がん細胞による取り込み後の、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３の細胞内局在を表す、共焦点顕微鏡画像を示す。ＤＵ−１４５前立腺がん細胞を、（１５分（図１２Ａ）、１時間（図１２Ｂ）、２時間（図１２Ｃ）、及び４時間（図１２Ｄ））に示すように。５００ｎＭの蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、異なる時間でインキュベートした。ＤＲＡＱ５（登録商標）による核染色後に、共焦点顕微鏡を用いて、そのコンジュゲートの細胞内局在を評価した。２つの独立した実験の1つからの、代表的な画像を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、インビトロの前立腺がん細胞による取り込み後の、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３の細胞内局在を表す、共焦点顕微鏡画像を示す。ＤＵ−１４５前立腺がん細胞を、（１５分（図１２Ａ）、１時間（図１２Ｂ）、２時間（図１２Ｃ）、及び４時間（図１２Ｄ））に示すように。５００ｎＭの蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、異なる時間でインキュベートした。ＤＲＡＱ５（登録商標）による核染色後に、共焦点顕微鏡を用いて、そのコンジュゲートの細胞内局在を評価した。２つの独立した実験の1つからの、代表的な画像を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、インビトロの前立腺がん細胞による取り込み後の、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３の細胞内局在を表す、共焦点顕微鏡画像を示す。ＤＵ−１４５前立腺がん細胞を、（１５分（図１２Ａ）、１時間（図１２Ｂ）、２時間（図１２Ｃ）、及び４時間（図１２Ｄ））に示すように。５００ｎＭの蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に、異なる時間でインキュベートした。ＤＲＡＱ５（登録商標）による核染色後に、共焦点顕微鏡を用いて、そのコンジュゲートの細胞内局在を評価した。２つの独立した実験の1つからの、代表的な画像を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３が、アンドロゲン依存性ＤＵ−１４５（図１３Ａ）及びＬＮＣａｐ−Ｓ１７（図１３Ｂ）前立腺がん細胞において、強力なＳＴＡＴ３のノックダウンを誘発したことを示す、棒グラフ及び発現データである。ＤＵ−１４５（図１３Ａ）及びＬＮＣａｐ−Ｓ１７（図１３Ｂ）前立腺がん細胞を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ／ＧｐＣ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯｓ、非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯｓ、または非標的化ＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮと共に、インビトロで２４時間インキュベートした。ＳＴＡＴ３・ｍＲＮＡの発現を、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ、ｑＰＣＲ）を用いて測定した。３連試験における、２つの独立した実験の１つからの結果を、平均±ＳＤで示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３が、アンドロゲン依存性ＤＵ−１４５（図１３Ａ）及びＬＮＣａｐ−Ｓ１７（図１３Ｂ）前立腺がん細胞において、強力なＳＴＡＴ３のノックダウンを誘発したことを示す、棒グラフ及び発現データである。ＤＵ−１４５（図１３Ａ）及びＬＮＣａｐ−Ｓ１７（図１３Ｂ）前立腺がん細胞を、５００ｎＭの種々のＣｐＧ／ＧｐＣ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯｓ、非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯｓ、または非標的化ＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮと共に、インビトロで２４時間インキュベートした。ＳＴＡＴ３・ｍＲＮＡの発現を、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ、ｑＰＣＲ）を用いて測定した。３連試験における、２つの独立した実験の１つからの結果を、平均±ＳＤで示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、前立腺がん細胞における、非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯと比較した、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの用量依存効果を示す。ＤＵ１４５細胞を、ｑＰＣＲアッセイを用いて、ＳＴＡＴ３  ｍＲＮＡ  のレベルを分析する前に、異なる濃度のＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（左パネル）またはＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（右パネル）を用いて処置した。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独よりも、より迅速にＳＴＡＴ３ノックダウンを誘発したことを示す。示すように、細胞を、５００ｎＭのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ、非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯ  、または陰性対照としてのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＳＳＯで、２４または４８時間処置した。ＳＴＡＴ３の活性化及びタンパク質レベルを、ウエスタンブロッティングを用いて評価した。βアクチンを、負荷対照として使用した。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯコンジュゲートが、インビトロの前立腺がん細胞におけるアポトーシスの誘発において、ＳＴＡＴ３ＡＳＯの単独よりもより有効であったことを示す、フローサイトメトリーデータである。細胞（ＤＵ−１４５（図１４Ａ）、及びＬＮＣａＰ・Ｓ１７（図１４Ｂ））を、５００ｎＭの、当該ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲート、当該ＳＴＡＴ３ＡＳＯ単独、または対照の非標的化コンジュゲートである、ＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮ（ＣｐＧ−ｓｃｂＯＤＮ）と共に、２４時間インキュベートした。アポトーシス細胞の割合を、７ＡＡＤ及びアネキシンＶでの染色後に、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯコンジュゲートが、インビトロの前立腺がん細胞におけるアポトーシスの誘発において、ＳＴＡＴ３ＡＳＯの単独よりもより有効であったことを示す、フローサイトメトリーデータである。細胞（ＤＵ−１４５（図１４Ａ）、及びＬＮＣａＰ・Ｓ１７（図１４Ｂ））を、５００ｎＭの、当該ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲート、当該ＳＴＡＴ３ＡＳＯ単独、または対照の非標的化コンジュゲートである、ＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮ（ＣｐＧ−ｓｃｂＯＤＮ）と共に、２４時間インキュベートした。アポトーシス細胞の割合を、７ＡＡＤ及びアネキシンＶでの染色後に、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｃは、全身に注入された、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯＣｙ３  のインビボ生体内分布の、フローサイトメトリーデータを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｙ３標識化のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３を静脈内注入し、及び３時間後に、安楽死させた。代表的な等高線図（図１５Ａには骨髄が描かれており、及び図１５Ｂにはリンパ節が描かれている）は、骨髄及び末梢リンパ節からの、単一細胞の懸濁液におけるフローサイトメトリーを用いて表した、ＣＤ１１ｂ＋  骨髄性細胞、またはＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣｓ）による、オリゴヌクレオチドの内在化を示す（ｎ＝４）。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｃは、全身に注入された、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯＣｙ３  のインビボ生体内分布の、フローサイトメトリーデータを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｙ３標識化のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３を静脈内注入し、及び３時間後に、安楽死させた。代表的な等高線図（図１５Ａには骨髄が描かれており、及び図１５Ｂにはリンパ節が描かれている）は、骨髄及び末梢リンパ節からの、単一細胞の懸濁液におけるフローサイトメトリーを用いて表した、ＣＤ１１ｂ＋  骨髄性細胞、またはＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣｓ）による、オリゴヌクレオチドの内在化を示す（ｎ＝４）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、２．５ｍｇ／ｋｇのＣｙ３標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯＣｙ３  を使用して静脈内注入を行い、及びその３時間後に安楽死させた、樹立されたＲＭ９前立腺腫瘍を持つ  、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを示す。そこに示すように、樹状細胞（ＤＣｓ）（ＣＤ１１ｃ＋）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、または  ＮＫ細胞（ＣＤ４９ｂ＋）によるオリゴヌクレオチドの内在化を、様々な臓器からの単一細胞の懸濁液上での、フローサイトメトリーを用いて評価した。平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートが、ＳＴＡＴ３を効果的に標的化し、及びＴＬＲ＋Ｂ細胞リンパ腫の生存率を低下させたことを示す、フローサイトメトリーデータ及び棒グラフである。図１６Ａは、いかなるトランスフェクション試薬をも含まずに、５００ｎＭの蛍光標識化ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯＣｙ３と共に１時間インキュベートされた、非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞の、フローサイトメトリーデータを示す。そのオリゴヌクレオチドの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）を用いて測定した、ＳＴＡＴ３  ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞を、５００ｎＭの、指示されたオリゴヌクレオチドと共に、２４時間インキュベートした。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、５００ｎＭのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯで、３日間、毎日処置した  、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞の結果を示す棒グラフである。その生存率を、ＸＴＴ（第二世代のテトラゾリウム染料、（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド））アッセイを用いて測定した。３連試験における２つの独立した実験の１つからの結果を、平均±ＳＥＭで示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯによる、小膠細胞及びグリオーマ細胞の特異的な取り込み、ならびにＳＴＡＴ３阻害を示す、フローサイトメトリーデータ及び棒グラフである。マウスＴＬＲ９＋ＢＶ２及びＫ−ｌｕｃ細胞（図１７Ａ）、ならびにヒトの初代グリオーマ幹様細胞（図１７Ｂ）が、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯを、迅速に内在化し、及びインビトロのその非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯ  を、より少ない度合いで内在化した（２５０ｎＭ／１時間）。細胞を、２５０ｎＭの  ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯＡｌｅｘａ４８８、または非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯＡｌｅｘａ４８８と共に、示された時間でインキュベートし、及びＡｌｅｘａ４８８陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して測定した。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯによる、小膠細胞及びグリオーマ細胞の特異的な取り込み、ならびにＳＴＡＴ３阻害を示す、フローサイトメトリーデータ及び棒グラフである。マウスＴＬＲ９＋ＢＶ２及びＫ−ｌｕｃ細胞（図１７Ａ）、ならびにヒトの初代グリオーマ幹様細胞（図１７Ｂ）が、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯを、迅速に内在化し、及びインビトロのその非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯ  を、より少ない度合いで内在化した（２５０ｎＭ／１時間）。細胞を、２５０ｎＭの  ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯＡｌｅｘａ４８８、または非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯＡｌｅｘａ４８８と共に、示された時間でインキュベートし、及びＡｌｅｘａ４８８陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して測定した。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、ｍＲＮＡにおけるＳＴＡ３の強力及び迅速なノックダウン、及び初代ヒトグリオーマ幹様細胞におけるタンパク質レベルを誘発することを示す。ＳＴＡＴ３  ｍＲＮＡレベルに対する、リアルタイムｑＰＣＲの代表的な結果を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｃは、多様な送達経路を用いた投与後の、グリオーマ担持マウスにおける、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３阻害剤の生体内分布を示す、棒グラフ及びフローサイトメトリーデータである。図１８Ａは、蛍光標識化ＣＳＩｓが、ＴＬＲ９＋ＧＬ２６１グリオーマ及び骨髄細胞  （ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０ＬＯ小膠細胞、及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＭＤＳＣｓ）によるが、その非悪性脳実質によってではない、細胞の選択的なオリゴヌクレオチドの取り込みを表す、生体内分布の研究を示す。樹立された同所性腫瘍を持つマウスを、示された蛍光標識化試薬及び投与経路（単一注入、または６時間毎の３回のＩＶ注入）を用いて、注入の３時間後に安楽死させた。腫瘍及び脳組織からの単一細胞の懸濁液を、フローサイトメトリーを用いて、蛍光細胞の割合に対して解析し、平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＩＶ注入の動物から単離された、種々の試験細胞集団における、ゲーティング戦略及び蛍光シグナルのレベルを表す、代表的なドットプロットを示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、イン・ビボのＧＬ２６１  腫瘍において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの頭蓋内／ＩＴ注入が、ＳＴＡＴ３ノックダウンを誘発したことを示す。マウスに、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ）の単一用量を注入した。ＧＡＰＤＨ発現への正規化を伴った、リアルタイムｑＰＣＲを用いた、遺伝子発現解析の２１時間後に、腫瘍を採取した。平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４）。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｅは、当該ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの局所投与が、その遠位での腫瘍の増殖を抑え、及びＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント調節を阻害することを示す。図１９Ａは、ＣｐＧＳＴＡＴ３ＡＳＯのインビボでのコンジュゲートによる抗腫瘍効果が、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ単独よりも、より顕著であることを示す。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、２ｘ１０５個のマウス前立腺がんＲＭ９細胞を用いて、２箇所に皮下注入した。腫瘍が十分に樹立された後（矢印によって示すように）、腫瘍の１つに、５ｍｇ／ｋｇのそこに示されたコンジュゲートのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ単独、ＣｐＧＳＴＡＴ３ＳＳＯまたはＰＢＳを、１日おきに、腫瘍内（ＩＴ）注入をして処置した。腫瘍の増殖を、示された時間ポイントで測定した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＳＴＡＴ３ＡＳＯではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、遠位の未処理部位で、ＳＴＡＴ３発現を阻害することを示す。ＳＴＡＴ３・ｍＲＮＡ  のレベルを、別々に処置されたマウスから採取した、全ＲＭ９腫瘍において、ｑＰＣＲを用いて評価した。
【図１９Ｃ】図１９Ｃ〜１９Ｄは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、腫瘍浸潤性骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）において、ＳＴＡＴ３活性化（図１９Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイントの発現（図１９Ｄ）を低下させることを示す。ｐＳＴＡＴ３（右パネル）及びＰＤ−Ｌ１表面発現（左パネル）のレベルを、示されているように、処置後のＲＭ９腫瘍から単離されたＭＤＳＣｓ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）において、フローサイトメトリーによって評価した。代表的なヒストグラムのオーバーレイを示し、及びマウス各グループの結果をまとめた棒グラフを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｃ〜１９Ｄは、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、腫瘍浸潤性骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）において、ＳＴＡＴ３活性化（図１９Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイントの発現（図１９Ｄ）を低下させることを示す。ｐＳＴＡＴ３（右パネル）及びＰＤ−Ｌ１表面発現（左パネル）のレベルを、示されているように、処置後のＲＭ９腫瘍から単離されたＭＤＳＣｓ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）において、フローサイトメトリーによって評価した。代表的なヒストグラムのオーバーレイを示し、及びマウス各グループの結果をまとめた棒グラフを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、ＳＴＡＴ３ＡＳＯではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯが、遠位の未処理部位で、ＳＴＡＴ３の発現を阻害することを示す。ＳＴＡＴ３・ｍＲＮＡ  のレベルを、別々に処置されたマウスから採取した、全ＲＭ９腫瘍において、ｑＰＣＲを用いて評価した。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｂは、当該ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの静脈内投与が、ＲＭ９前立腺がんの実験的骨転移モデルの完全退縮をもたらすことを示す、画像（図２０Ａ）及びフローサイトメトリーデータ（図２０Ｂ）である。ＲＭ９前立腺がん細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６  マウスの脛骨内に注入した。樹立された腫瘍を持つ動物を、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯコンジュゲート、ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ単独、またはＣｐＧ−スクランブル化ＡＳＯを、最大１５日まで、毎日の点滴注入を用いて処置した。腫瘍組織量及びマウスの病態を、ＡｍｉＸ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ）画像処理システム上での生物発光画像（ＢＬＩ）、またはボディー・コンディション・スコア（ＢＣＳ）の各々を使用して、モニターした（図２０Ａ）。グラフは、実験終了時、またはそのマウスが安楽されられた時点（ＢＣＳ＜２）での、フローサイトメトリーを用いて評価した、その骨髄におけるＲＭ９ｍｃｈｅｒｒｙ＋細胞の割合（図２０Ｂ）を、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｂは、当該ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの静脈内投与が、ＲＭ９前立腺がんの実験的骨転移モデルの完全退縮をもたらすことを示す、画像（図２０Ａ）及びフローサイトメトリーデータ（図２０Ｂ）である。ＲＭ９前立腺がん細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６  マウスの脛骨内に注入した。樹立された腫瘍を持つ動物を、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯコンジュゲート、ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ単独、またはＣｐＧ−スクランブル化ＡＳＯを、最大１５日まで、毎日の点滴注入を用いて処置した。腫瘍組織量及びマウスの病態を、ＡｍｉＸ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ）画像処理システム上での生物発光画像（ＢＬＩ）、またはボディー・コンディション・スコア（ＢＣＳ）の各々を使用して、モニターした（図２０Ａ）。グラフは、実験終了時、またはそのマウスが安楽されられた時点（ＢＣＳ＜２）での、フローサイトメトリーを用いて評価した、その骨髄におけるＲＭ９ｍｃｈｅｒｒｙ＋細胞の割合（図２０Ｂ）を、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示す。
【図２１】ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ阻害剤の二又作用が、ヒトのがん免疫治療の治療効果を増大できることを示している。ＴＬＲ９は、腫瘍関連の骨髄細胞（マクロファージ、小膠細胞、及びＧ−ＭＤＳＣｓ）のみならず、特定のがん細胞（腫瘍増殖細胞）によっても発現している。治療で誘発されたがん細胞死（例えば、ＣＡＲ・Ｔ細胞治療または放射線療法後）は、腫瘍微小環境において、間接的にＳＴＡＴ３を活性化し、ＴＬＲ９リガンドの放出をもたらす。ＴＬＲ９／ＳＴＡＴ３のシグナル伝達は、マクロファージ／小膠細胞の分化を阻害し、一方で血管新生を刺激し、及び免疫応答を抑制する。さらに、腫瘍増殖細胞におけるＳＴＡＴ３の活性化は、がんの自己複製及び治療への耐性を支えている。ＣＳＩｓは、ＴＬＲ９＋細胞コンパートメントの両方において、ＳＴＡＴ３の標的化を可能にし、それにより、全体として治療効果の向上を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において提供されるのは、とりわけ、部分及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とする、単離された化合物である。この単離化合物には、低分子活性化ＲＮＡｓ（ｓａＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）にコンジュゲートされた、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）核酸配列を含む。このｓａＲＮＡ及び／またはＡＳＯは、２’ＯＭｅ、ロック核酸で修飾されてよい。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示の化合物の組成物、及びその開示された化合物または組成物を用いた、治療が必要な対象における疾患の治療法である。
【００１３】
定義
本主題を理解する目的、及び付帯の請求項の構築のために、以下の定義が含まれる。本明細書で使用される略語は、化学及び生物学に分野において使用される、従来の意味を有する。
【００１４】
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、当業者によって通常理解されることと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照のこと。本明細書に記載されているものと同様のまたはそれに準ずる、任意の方法、装置及び材料が、本開示の実践において使用され得る。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されており、及び本開示の範囲を制限するものではない。
【００１５】
本明細書において使用される、「低分子活性化ＲＮＡｓ（ｓａＲＮＡｓ）」は、その平易な及び通常の意味に従って用いられ、及び遺伝子発現を活性化または誘発することができるＲＮＡを指す。遺伝子特異的ｓａＲＮＡｓは、標的遺伝子のプロモーターにおける配列を標的化し、及びその遺伝子の発現を誘発する。実施形態において、このｓａＲＮＡオリゴマーは、１５〜３０塩基の二本鎖オリゴマーであってよい。当該ｓａＲＮＡオリゴマーは、一本鎖のオーバーハングを伴って、部分的に二本鎖であってよい（例えば、図１Ａ〜１Ｆを参照）。この二本鎖は、ガイド鎖（アンチセンス、ＡＳ）及びパッセンジャー鎖（センス鎖、ＳＳ）を含む。実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、標的遺伝子の転写開始部位と比べて、ヌクレオチドが−７５〜＋２５の間の部分を標的としてよい。実施形態において、当該オリゴマーは、２’化学修飾を有していてよい。実施形態において、当該オリゴマーは、血清の安定性を高める化学修飾、例えば、ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃメチルヌクレオチド、反転デオキシ塩基性残基の組み込み、またはロック核酸を有していてよい。
【００１６】
本明細書において使用される、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、その平易な及び通常の意味に従って用いられ、及びその遺伝子産物の発現を低減するために、遺伝子の転写産物を標的とする、オリゴヌクレオチド指す。実施形態において、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗遺伝子Ｘアンチセンスオリゴヌクレオチド配列である。たとえば、ＳＴＡＴのＡＳＯは、「抗ＳＴＡＴアンチセンスオリゴヌクレオチド配列」を指すことができる。抗ＳＴＡＴ１オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）活性化因子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、ヒトにおいては、そのＳＴＡＴ１遺伝子によってコードされるが、翻訳レベルを低減または阻害する、オリゴヌクレオチドである。これは、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーの一員である。抗ＳＴＡＴ２オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子２（ＳＴＡＴ２）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。抗ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。抗ＳＴＡＴ４オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子４（ＳＴＡＴ４）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。抗ＳＴＡＴ５Ａオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子５Ａ（ＳＴＡＴ５Ａ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。抗ＳＴＡＴ５Ｂオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子５Ｂ（ＳＴＡＴ５Ｂ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。抗ＳＴＡＴ６オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳レベルを、低減または阻害するオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
実施形態において、当該オリゴマーは、２’化学修飾を有していてよい。実施形態において、当該オリゴマーは、血清の安定性を高める化学修飾、例えば、ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃメチルヌクレオチド、反転デオキシ塩基性残基の組み込み、またはロック核酸（ＬＮＡ）を有していてよい。
【００１８】
本明細書において使用される用語「ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）」とは、核酸配列、例えば、「ＣｐＧ核酸配列」、「ＧｐＣ核酸配列」、または「ＰＳ（ホスホロチオエート化）核酸配列」を指し、それらのヌクレオチド間連結のいくつかまたは全てが、ホスホロチオエート連結を構成する。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、１５〜３０塩基長の一本鎖であり、及び／または部分的にもしくは完全にホスホロチオエート化されている。部分的ホスホロチオエート化ＯＤＮは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８のヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結を構成している、ＯＤＮである。配列内で、ホスホロチオエート化は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはすべてのヌクレオチドで、ひと続きになり得る。実施例において、いくつかのオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されていない。
【００１９】
本明細書において使用される用語「ＣｐＧ核酸配列」とは、ホスホジエステルのヌクレオチド間連結またはホスホジエステル誘導体のヌクレオチド間連結を介した、３’Ｇヌクレオチドに結合する５’Ｃヌクレオチドにおける、ＣｐＧモチーフを含む核酸を指す。実施形態において、ＣｐＧモチーフは、ホスホジエステルのヌクレオチド間連結を含む。実施形態において、ＣｐＧモチーフは、ホスホジエステル誘導体のヌクレオチド間連結を含む。実施形態において、ＣｐＧモチーフは、ホスホロチオエート連結を含む。
【００２０】
本明細書において使用される用語「ＧｐＣ核酸配列」とは、ホスホジエステルのヌクレオチド間連結またはホスホジエステル誘導体のヌクレオチド間連結を介した、３’Ｃヌクレオチドに結合する５’Ｇヌクレオチドにおける、ＧｐＣモチーフを含む核酸を指す。実施形態において、ＧｐＣモチーフは、ホスホジエステルのヌクレオチド間連結を含む。実施形態において、ＧｐＣモチーフは、ホスホジエステル誘導体のヌクレオチド間連結を含む。実施形態において、ＧｐＣモチーフは、ホスホロチオエート連結を含む。
【００２１】
本明細書において使用される用語「完全なホスホロチオエート化ＯＤＮ」とは、すべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮまたはＧｐＣ−ＯＤＮ）を指す。
【００２２】
本明細書において使用される用語「クラスＡのＣｐＧ・ＯＤＮ」もしくは「ＡクラスのＣｐＧ・ＯＤＮ」、または「Ｄ型のＣｐＧ・ＯＤＮ」もしくは「クラスＡのＣｐＧ・ＤＮＡ配列」とは、生物学的及び化学的に、その共通の意味に従って用いられ、及びその５’、３’、またはその両末端に、１つ以上のポリＧ配列、ＣｐＧモチーフを含む内部パリンドローム配列、１つ以上のホスホジエステル誘導体が結合するデオキシヌクレオチドを有する、オリゴデオキシヌクレオチドを含む、ＣｐＧモチーフを指す。実施形態において、クラスＡ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、その５’、３’、またはその両末端のポリＧ配列、ＣｐＧモチーフを含む内部パリンドローム配列、及び１つ以上のホスホジエステル誘導体が結合する、デオキシヌクレオチドを含む。実施形態において、当該ホスホジエステル誘導体は、ホスホロチオエートである。クラスＡ・ＣｐＧ・ＯＤＮの例示には、ＯＤＮ・Ｄ１９、ＯＤＮ・１５８５、ＯＤＮ・２２１６、及び  ＯＤＮ・２３３６を含む。
【００２３】
本明細書において使用される用語「クラスＢのＣｐＧ・ＯＤＮ」もしくは「ＢクラスのＣｐＧ・ＯＤＮ」、または「Ｋ型のＣｐＧ・ＯＤＮ」もしくは「クラスＢのＣｐＧ・ＤＮＡ配列」とは、生物学的及び化学的に、その共通の意味に従って用いられ、及びＣｐＧモチーフを含む６ｍｅｒモチーフの１つ以上を含むオリゴデオキシヌクレオチド、ホスホジエステル誘導体が結合する全てのデオキシヌクレオチドを含む、ＣｐＧモチーフを指す。実施形態において、クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフ、及ホスホジエステル誘導体が結合する全てのデオキシヌクレオチドを含む、６ｍｅｒモチーフの１つ以上のコピーを含む。実施形態において、当該ホスホジエステル誘導体は、ホスホロチオエートである。実施形態において、クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフを含む、1つの６ｍｅｒモチーフを含む。実施形態において、クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフを含む６ｍｅｒモチーフの、２つのコピーを含む。実施形態において、クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフを含む６ｍｅｒモチーフの、３つのコピーを含む。実施形態において、クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフを含む６ｍｅｒモチーフの、４つのコピーを含む。クラスＢ・ＣｐＧ・ＯＤＮの例示には、ＯＤＮ・１６６８、ＯＤＮ・１８２６、ＯＤＮ・２００６、及び  ＯＤＮ・２００７を含む。
【００２４】
本明細書において使用される用語「クラスＣのＣｐＧ・ＯＤＮ」もしくは「ＣクラスのＣｐＧ・ＯＤＮ」、または「Ｃ型のＣｐＧ・ＤＮＡ配列」とは、生物学的及び化学的に、その共通の意味に従って用いられ、及びＣｐＧモチーフを含むパリンドローム配列、及びホスホジエステル誘導体（ホスホロチオエート）が結合する全てのデオキシヌクレオチドを含む、オリゴデオキシヌクレオチドを指す。クラスＣ・ＣｐＧ・ＯＤＮの例示には、ＯＤＮ・２３９５、及び  ＯＤＮＭ・３６２を含む。
【００２５】
本明細書で使用される略語は、化学及び生物学の分野内で使用される、それらの従来の意味を有する。本明細書で説明される化学構造及び式は、化学分野で公知の、化学原子価の標準規則に従って構築される。
【００２６】
置換基が、左から右に書かれた従来の化学式で指定される場合、それらは同様に右から左へその構造を書いて得られる、化学的に同一の置換基を包含し、例えば、−ＣＨ２Ｏ−  は、−ＯＣＨ２−と等価である。
【００２７】
単独のまたは他の置換基の一部としての、用語「アルキル」とは、特に断りのない限り、直鎖状（すなわち、分岐していない）もしくは分岐状の非環状炭素鎖（もしくは炭素）、またはそれらの組み合わせを意味し、完全な飽和、モノもしくはポリの非飽和であってよく、及び設計された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する）、二価及び多価ラジカルを含むことができる。飽和炭化水素ラジカルの例示には、非限定的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、（シクロヘキシル）メチルなどの基、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体及び異性体を含む。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例示には、非限定的に、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、及びより高次の同族体ならびに異性体を含む。アルコキシは、酸素リンカー（−Ｏ−）を介して、その分子の残りの部分に接合されたアルキルである。
【００２８】
単独のまたは他の置換基の一部としての、用語「アルキレン」とは、特に断りのない限り、例として、非限定的に、―ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−  などの、アルキルから誘導される、二価のラジカルを意味する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４の炭素原子を有する。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、一般に、８またはそれ以下の炭素原子を有する、短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。単独のまたは他の置換基の一部としての、用語「アルケニレン」とは、特に断りのない限り、アルケンから誘導される、二価のラジカルを意味する。
【００２９】
単独のまたは他の用語との組み合わせとしての、用語「ヘテロアルキル」とは、特に断りのない限り、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、及びＳからなる群から選ばれる、少なくとも１つの炭素原子及び少なくとも１つのヘテロ原子を含む、安定な非環状の直鎖もしくは分枝鎖、またはそれらの組合せを意味し、ここでその窒素及び硫黄原子が、任意で酸化されていてよく、及びその窒素ヘテロ原子が、任意で四級化されていてよい。このヘテロ原子（複数可）のＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、及びＳｉは、そのヘテロアルキルの任意の内部位置、またはそのアルキル基が、その分子の残りの部分に接合した位置に、配置されていてよい。例示には、非限定的に、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び−ＣＮを含む。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、最大２つまたは３つまでのヘテロ原子が連続していてよい。
【００３０】
同様に、単独でまたは他の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」とは、特に断りのない限り、非限定的に、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示される、ヘテロアルキルから誘導された、二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロはまた、その鎖のどちらか片方または両末端を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンとヘテロアルキレンとの連結基の場合は、その連結基の方向は、その連結基の式が書かれている方向であることを意味してはいない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−  は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−、及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。上記のように、本明細書において使用されるヘテロアルキル基は、ヘテロ原子を介して、その分子の残りの部分に接合している、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、及び／または−ＳＯ２Ｒ’などの基を包含する。「ヘテロアルキル」が列挙されるところでは、−ＮＲ’Ｒ’’などの、特定のヘテロアルキル基の列挙が続き、用語のヘテロアルキ及び−ＮＲ’Ｒ’’が、冗長または相互排他的ではないことが理解されよう。むしろ、その特定のヘテロアルキル基は、明瞭さを加えるために唱えられる。したがって、用語「ヘテロアルキル」は、−ＮＲ’Ｒ’’などの、特定のヘテロアルキル基を除外していると、本明細書では解釈されてはならない。
【００３１】
単独でまたはその他の用語との組み合わせとしての、用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」とは、特に断りのない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の、環状非芳香型を意味し、ここでその環または複素環を構成する炭素は、非水素原子との結合に参加しているすべての炭素原子価であるので、必ずしも、水素に結合されている必要はない。さらに、ヘテロシクロアルキルに対して、ヘテロ原子は、そのヘテロ環が接合している、その分子の残りの部分に、その位置を占めることができる。シクロアルキルの例示には、非限定的に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを含む。ヘテロシクロアルキルの例示には、非限定的に、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどを含む。単独でまたは他の置換基の一部としての、「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」とは、それぞれシクロアルキル及びヘテロシクロアルキルから誘導される、二価のラジカルを意味する。
【００３２】
単独で、または他の置換基の一部としての、「ハロ」または「ハロゲン」とは、特に断りのない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及び多価ハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」には、非限定的に、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを包含する。
【００３３】
用語「アシル」とは、特に断りのない限り、Ｒが、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである、−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味する。
【００３４】
用語「アリール」とは、特に断りのない限り、多価不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味し、共に縮合している（すなわち、縮合環アリール）または共有結合している（例えば、ビフェニル）、単環または複素環（好ましくは  １から３環）であり得る。縮合環アリールとは、縮合環の少なくとも１つが、アリール環である、共に縮合した複素環を指す。用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの、少なくとも1つのヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、ここでその窒素及び硫黄原子が、任意で酸化され、及びその窒素原子（複数可）が、任意で四級化されている。このように、用語「ヘテロアリール」には、縮合環ヘテロ基  （すなわち、縮合環の少なくとも１つが、ヘテロ芳香環である、共に縮合した複素環）を含む。５，６−縮合環ヘテロアリレンは、共に縮合した２つの環を指し、ここで１つの環が、５員環であり、及びその他の環が、６員環であり、ならびにここで少なくとも１つの環が、ヘテロアリール環である。同様に、６，６−縮合環ヘテロアリレンは、共に縮合した２つの環を指し、ここで１つの環が、６員環であり、及びその他の環が、６員環であり、ならびにここで少なくとも１つの環が、ヘテロアリール環である。及び６，５−縮合環ヘテロアリレンは、共に縮合した２つの環を指し、ここで１つの環が、６員環であり、及びその他の環が、５員環であり、ならびにここで少なくとも１つの環が、ヘテロアリール環である。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して、その分子の残りの部分に接合され得る。アリールならびにヘテロアリール基の非限定的な例示には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び  ６−キノリルを含む。上述のアリール及びヘテロアリール環系の各々についての置換基は、後述の許容される置換基群から選択される。単独でまたは他の置換基の一部としての、「アリレン」及び「ヘテロアリレン」とは、それぞれアリール及びヘテロアリールから誘導される、二価のラジカルを意味する。ヘテロアリール基の非限定的な例示には、ピリジニル、ピリミジニル、チオフェニル、チエニル、フラニル、インドリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、チアナフタニル、ピロロピリジニル、インダゾリル、キノリニル、キノキサリニル、ピリドピラジニル、キナゾリノニル、ベンゾイソオキサゾニル、イミダゾピリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチオフェニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ピロリル、��ラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリルチエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、プリニル、ベンズイミダゾリル、イソキノリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾロピリミジル、ピロロピリミジル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはキノリルを含む。上記例示は、置換または非置換であってよく、及び上記の各テロアリールの例示の二価ラジカルは、非限定的に、ヘテロアリレンの例示である。
【００３５】
縮合環ヘテロシクロアルキル−アリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキルは、シクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルは、他のヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル−アリール、縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリール、縮合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキル、もしくは縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルは、それぞれ独立して、非置換であるか、または本明細書に記載の置換基の１つ以上と置換されていてよい。
【００３６】
本明細書において使用される用語「オキソ」とは、炭素原子に二重結合した酸素を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される用語「アルキルスルホニル」とは、−Ｓ（Ｏ２）−Ｒ’  を有する部分を意味し、ここでＲ’は、上記で定義した置換または非置換のアルキル基である。Ｒ’は、炭素  （例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキルスルホニル」）  の、特定の数を有してよい。
【００３８】
上記の各用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、及び「ヘテロアリール」)  は、指示されたラジカルの、置換及び非置換の両形態を含む。ラジカルの各種類に対する好ましい置換基を、以下に提供する。
【００３９】
当該アルキル及びヘテロアルキルのラジカルに対する置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル）は、非限定的に、ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲の数における、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、  −ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’Ｃ＝（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＮ、−ＮＯ２から選ばれる多様な基の１つであり得て、ここでｍ’は、そのようなラジカルにおける炭素原子の総数である。Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は、それぞれ好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール  （例えば、１〜３ハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシ、もしくは  チオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、１つ以上のＲ基を含む場合、例えば、それら基の１つ以上が存在する場合の、各Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基であるように、そのＲ基の各々が、独立して選択される。Ｒ’及びＲ’’が、同じ窒素原子に接合している場合、それらは、窒素原子と組み合わされて、４、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、非限定的に、１−ピロリジニル及び  ４−モルホリニルを含む。置換基の上記考察から、当業者は、用語「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）、及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を包含していることを、理解されよう。
【００４０】
アルキルラジカルについて記述される置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基についての置換基は、多様であり、及び例えば  、その芳香族環上の、ゼロから未結合の原子価の総数までの範囲の数における、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、  −ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’Ｃ＝（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され、ならびにここでＲ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’が、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールから選ばれる。本発明の化合物が、１つ以上のＲ基を含む場合、例えば、それら基の１つ以上が存在する場合の、各Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基であるように、そのＲ基の各々が、独立して選択される。
【００４１】
２つ以上の置換基は、任意でアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を形成するために、結合されてよい。このような、いわゆる環形成置換基は典型的に、必ずしもそうある必要はないが、環状の基部構造に接合されたものである。１つ実施態様において、この環形成置換基は、その基部構造に隣接するように接合される。例えば、環状基部構造の隣接する環員に接合された、２つの環形成置換基は、縮合環構造を作る。他の態様において、当該環形成置換基は、その基部構造の単一の環員に結合される。例えば、環状基部構造の単一環員に結合された、２つの環形成置換基は、スピロ環構造を作る。そのうえ他の実施形態において、当該環形成置換基は、その基部構造の隣接しない環員に接合される。
【００４２】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、任意で、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の環を形成してよく、ここでＴ及びＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、または単結合であり、及びｑは  、０から３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、任意で、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置換されてよく、ここでＡ及びＢは、独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、または単結合であり、及びｒは、１から４の整数である。このように形成された新しい環の単結合の一つは、任意で、二重結合で置換されてよい。あるいは、アリールまたはヘテロ環の隣接する原子上の２つの置換基は、任意で、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ’−（Ｃ’’Ｒ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基  で置き換えられて良く、ここでｓは、０から３の整数であり、及びＸ’は、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。当該置換基  Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ’’’は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、及び置換もしくは非置換のヘテロアリールから選ばれる。
【００４３】
本明細書において使用される用語「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」とは、酸素  （Ｏ）、窒素  （Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、及びケイ素（Ｓｉ）を含むものである。
【００４４】
本明細書において使用される「置換基」とは、（Ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、−ＮＨＳＯ２ＣＨ３、−Ｎ３、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び（Ｂ）（ｉ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、−ＮＨＳＯ２ＣＨ３、−Ｎ３、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに（ｉｉ）（ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、−ＮＨＳＯ２ＣＨ３、−Ｎ３、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び（ｂ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、−ＮＨＳＯ２ＣＨ３、−Ｎ３、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、の部分から選択される基を意味する。
【００４５】
本明細書において使用される「サイズ限定置換基」または「サイズ限定置換基群」とは、「置換基群」対して前述された、全ての置換基から選択される基を意味し、ここで、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２から２０員環のヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、及び各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリールである。
【００４６】
本明細書において使用される「低級置換基」または「低級置換基群」とは、「置換基群」対して前述された、全ての置換基から選択される基を意味し、ここで、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２から８員環のヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３から７員環のヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、及び各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５から９員環のヘテロアリールである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本明細書の化合物において記載される各置換基は、少なくとも1つの置換基群で、置換される。より具体的には、いくつかの実施形態において、本明細書の化合物において記載される、各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリレン、及び／または置換ヘテロアリレンは、少なくとも１つの置換基群で、置換される。その他の実施形態において、これらの群の少なくとも１つまたは全部が、少なくとも１つのサイズ限定置換基群で、置換される。その他の実施形態において、これらの群の少なくとも１つまたは全部が、少なくとも１つの低級置換基群で、置換される。
【００４８】
本明細書の化合物のその他の実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキルであってよく、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２から２０員環のヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、及び／または各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリールである。本明細書の化合物のその他の実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の２から２０員環のヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のアリレンは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレンであり、及び／または各置換もしくは非置換のヘテロアリレンは、置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８のアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２から８員環のヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ７のシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３から７員環のヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、及び／または各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５から９員環のヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８のアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の２から８員環のヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ７のシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３から７員環のヘテロシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレンであり、及び／または各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５から９員環のヘテロアリレンである。いくつかの実施形態において、当該化合物は、後述の実施例で説明される化学種である。
【００５０】
本明細書において、２つの部分を指す場合の用語「コンジュゲートした」とは、２つの部分が結合していることを意味し、ここで２つの部分を繋ぐ結合または複数の結合が、共有または非共有性であってよい。実施形態において、その２つの部分は、互いに（例えば、直接にまたは共有結合した媒介物を介して）、共有結合している。実施形態において、当該２つの部分は、非共有結合  （例えば、イオン結合（複数可）、ヴァンデルワール力の結合（複数可）／相互作用、水素結合（複数可）、極性結合（複数可）、またはそれらの組み合わせもしくは混合物）である。
【００５１】
さらに、その合成方法が、本明細書に記載されるように、種々の保護基を利用していることは、当業者には理解されよう。本明細書において使用される用語「保護された反応基」とは、一時的に遮断された特定の機能部分（例えば、酸素、硫黄、窒素及び炭素）を指し、そのため反応が、多官能性化合物における別の反応部位で、選択的に行われ得る。保護基は、当業者に公知の方法を用いた化合物の合成時の適切な段階で、導入及び除去されてよい。当該保護基は、文献で記述されているような、標準的な有機合成の方法に従って適用される（例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（２００７）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ‘ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）、  及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）を参照のこと。その各々は、保護基に関した参照によって援用される）。特定の例示的な保護基が、本明細書に詳細に記述されるが、しかしながら、本発明は、これらの保護基に限定されるものではないことは、理解されよう。むしろ、多様な追加の保護基が、当業者に公知の方法に従って利用されてよい。
【００５２】
例示的なアルコール保護基には、非限定的に、メチルエーテル、置換メチルエーテル  （例えば、ＭＯＭ（メトキシメチルエーテル）、ＭＴＭ（メチルチオメチルエーテル）、ＢＯＭ（ベンジロキシメチルエーテル）、ＰＭＢＭ（ｐ−メトキシベンジロキシメチルエーテル）、任意置換のエチルエーテル、任意置換のベンジルエーテル、シリルエーテル（例えば、ＴＭＳ（トリメチルシリルエーテル）、ＴＥＳ（トリエチルシリルエーテル）、ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシリルエーテル）、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル）、トリベンジルシリルエーテル、ＴＢＤＰＳ（ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル）、エステル（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸  （Ｂｚ）、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩）炭酸塩、環状アセタール及びケタールを含む。実施形態において、ヒドロキシ基は、エーテル（−ＯＲ＊）またはエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ＊）として保護されてよく、ここでＲ＊  が、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば、１〜３のハロゲンで置換されたアリール）、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。例示的な保護されたヒドロキシル基には、ｔ−ブチルエーテル、ベンジル、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）、またはトリチル（トリフェニルメチル）エーテル、トリメチルシリルもしくはｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、またはアセチルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、または−ＯＡｃ）などで保護されたヒドロキシルを含む。
【００５３】
例示的なアミノ保護基には、非限定的に、カルバメート（カルバミン酸メチル、カルバミン酸エチル、置換カルバミン酸エチル（例えば、Ｔｒｏｃ）、ｔ−ブチルカルバミン酸塩（Ｂｏｃ）、及びカルバミン酸ベンジル（Ｃｂｚ））、アミド、環状イミド誘導体、Ｎ−アルキル及びＮ−アリールアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体などを含む。例えば、保護されたアミノ基には、アミド（−ＮＲ＊Ｃ（＝Ｏ）Ｒ＊）またはカルバミン酸塩（  −ＮＲ＊Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ＊）などで保護された、窒素基を含み、ここで各Ｒ＊は、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、もしくは非置換のシクロアルキル、もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば、１〜３のハロゲンで置換されたアリール）、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。実施形態において、保護されたアミノ基としては、例えば、メチルアミド（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３）、カルバミン酸ベンジル（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）、ｔ−ブチルカルバミン酸塩（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３）として、９−フルオレニルメトキシアミド（−ＮＨＦｍｏｃ）、６−ニトロベラトリロキシアミド（−ＮＨＮｖｏｃ）として、２−トリメチルシリルエトキシアミド（−ＮＨＴｅｏｃ）として、２，２，２−トリクロロエトキシアミド（−ＮＨＴｒｏｃ）として、アリルオキシアミド（−ＮＨＡｌｌｏｃ）として、２−（フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−ＮＨＰｓｅｃ）として、または、適切な場合における（例えば、環状アミン）ニトロラジカルとして、である。
【００５４】
例示的なスルフヒドリル保護基には、非限定的に、チオエーテル（−ＳＲ＊）を含み、ここでＲ＊が、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば、１〜３のハロゲンで置換されたアリール）、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。実施形態において、保護されたスルフヒドリル基は、例えば、置換もしくは非置換のベンジルチオエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルチオエーテル、４−メチルチオエーテル、トリチルチオエーテル、２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＭＳＥ）チオエーテル、２−シアノエチルチオエーテル、９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）チオエーテル、またはアセトアミドメチルエーテル（−ＳＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３）である。
【００５５】
実施形態において、クリックケミストリー反応基は、アジド基、アルケン基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、スルフヒドリル基、ジビニルスルホン誘導体、またはマレイミド誘導体であり、または含む。したがって、実施形態において、当該リンカーは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ケミストリーによるコンジュゲートに適した、保護されたアミノ基または  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ジビニルベンゼンスルホンとコンジュゲートすることができるスルフヒドリル基、１−アルキル−３−メチルアクリロイル（アクリロイル）塩化物またはアクリロイル誘導体とコンジュゲートすることができる、保護されたスルフヒドリル基、マレイミド誘導体とコンジュゲートすることができる、保護されたスルフヒドリル基を含む、反応基（例えばクリックケミストリーの反応基）または保護された反応基で置換される。
【００５６】
「標識」または「検出可能部分」は、分光、光化学、生化学、免疫、化学、磁気共鳴画像処理、またはその他の物理的な手段によって、検出可能な組成物である。例えば、有用な検出可能部分には、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるものなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、微小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）ナノ粒子、ＵＳＰＩＯナノ粒子凝集体、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子、ＳＰＩＯナノ粒子凝集体、単結晶質ＳＰＩＯ、単結晶質ＳＰＩＯ凝集体、単結晶質酸化鉄ナノ粒子、単結晶質酸化鉄、その他のナノ粒子造影剤、ガドリニウムキレート（Ｇｄ−ｃｈｅｌａｔｅ）分子を含む、リポソームまたはその他の送達ベヒクル、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種（例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、フッ素−１８、ルビジウム−８２）、フルオロデオキシグルコース（例えば、フッ素−１８標識化の）、任意のガンマ線放出放射性核種、陽電子放出核種、放射性標識化グルコース、放射性標識化水、放射性標識化アンモニア、生体コロイド、微小気泡（例えば、アルブミン、ガラクトース、脂質、及び/またはポリマーを含む微小気泡の殻を含み、空気、重質気体（複数種可）、パーフルオロカーボン、窒素、オクタフルオロプロパン、パーフレキサン脂質マイクロスフィア、パーフルトレンなどを含む微小気泡の殻）、ヨード造影剤（例えば、イオヘキソール、イオジヘキソール、イオバーソール、イオパミドール、イオキシラン、イオプロミド、ジアトリゾ酸、メトリゾ酸、イオキサグル酸）、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、またはハプテン及びタンパク質もしくは、例えば、標的ペプチドとの特異的な反応性を有するペプチドまたは抗体に、放射性標識を組み込むことにより、検出可能な他の実体を含む。検出可能部分にはまた、ナノ粒子、粒子、凝集体に封入され、追加組成物で被覆され、標的物質（例えば、本明細書に記載の化合物）に結合するように誘導される、上記組成物のいずれも含む。オリゴヌクレオチドまたはタンパク質を当該標識にコンジュゲートさせるための、本技術分野で公知の任意の方法が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載される方法を用いて、取り入れられてよい。
【００５７】
本明細書において使用される用語「細胞」とはまた、そのような細胞に由来する、個別の細胞、細胞株、または培養物を指す。「培養物」とは、同一または異なる種類の単離細胞を含む、組成物を指す。
【００５８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連する用語「同一の」または「同一性」パーセントとは、同じであるか、または後述のデフォルトパラメーターを有する、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを利用して、または手動アライメント及び目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照）によって測定されて、同じである（すなわち、比較ウィンドウまたは指定部分にわたる最大一致に対して、比較し及びアライメントする場合、特定の部分において、約６０％が同一性、好ましくは６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高い同一性）、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセントを有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は次いで、「実質的に同一である」と言われる。  この定義はまた、試験配列の相補体を指し、またはそれに適用されてよい。この定義にはまた、欠失及び／または追加を有する配列、ならびに置換基を有するそれらを含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約１０のアミノ酸または２０ヌクレオチド長である部分、より好ましくは、１０〜５０のアミノ酸または２０〜５０ヌクレオチド長である部分に対して存在する。本明細書において使用される、パーセント（％）アミノ酸配列同一性は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて、配列をアライメントし及びギャップを導入した後に、基準配列中のアミノ酸と同一である、候補配列中のアミノ酸の割合として定義される。配列同一性パーセントを決定する目的に対応したアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、本技術分野内の様々な方法で達成され得る。アライメントを測定するための適切なパラメータは、比較される配列の全長にわたって、最大のアライメントを達成するために必要となるアルゴリズムを含む、公知の方法によって決定され得る。
【００５９】
配列比較の場合、通常1つの配列は、比較される試験配列に対して、基準配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び基準配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、及び配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータが使用され得て、または代替パラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、その基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００６０】
「患者」、「対象」、「治療を必要とする患者」、及び「治療を必要とする対象」は、本明細書においては同義的に使用され、ならびに当該方法及び本明細書で提供される組成物を用いた投与により治療が可能となる、疾患もしくは病態に苦しむ、またはその傾向にある有機体を指す。非限定的な例示には、ヒト、その他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及びその他の哺乳類以外の動物を含む。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。インビトロまた培養のインビトロで得られた、生物学的実体の組織、細胞及びその子孫もまた、熟考される。
【００６１】
本明細書において使用される用語「投与」とは、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、病巣内、腔内、鼻腔内または皮下投与、もしくは例えば、ミニ浸透ポンプなどの、対象への低速放出装置の移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜的（例えば、頬、舌下、口蓋、歯肉、鼻、腟、直腸、または経皮）な経路を含む、任意の経路による。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内を含む。送達のその他の様式には、非限定的に、リポソーム製剤、静脈内輸液、経皮パッチなどの使用を含む。
【００６２】
用語「治療する」、「治療すること」または「治療」、及び本明細書において使用されるその他の文法的に同等なものには、疾患、病態または病候を軽減すること、抑えること、改善すること、または予防すること、追加の病候を防ぐこと、病候の根本的な代謝原因を改善または防止すること、疾患または病態を阻害すること、例えば、疾患または病態の発達を阻止すること、疾患または病態を緩和すること、疾患または病態からの回帰を起こすこと、疾患または病態によって引き起こされる状態を緩和すること、もしくは疾患または病態の病候を止めることを含み、予防を含むものである。当該用語はさらに、治療上の利点及び／または予防上の利点を達成することを含む。治療上の利点によって、治療される基礎疾患の根絶または改善がなされる。また、治療上の利点は、基礎疾患に関連する、１つ以上の生理学的な病態の根絶または改善によって達成され、その結果、その患者が、依然として基礎疾患を持つ病人であるかもしれないが、その患者に改善が観察される。
【００６３】
用語「防止する」、「防止すること」または「防止」、及び本明細書において使用されるその他の文法的に同等なものには、疾患またはその疾患の病候を、発達、発生から避け、妨害しまたは回避すること、同様に病候の発生を減少させることを含む。当該防止は、完全に（すなわち、検出できない病態）または部分的であってよく、そのため、より少ない病候が、あたかも治療を介在させていないように、観察される。当該用語はさらに、予防的利益を含む。防止される疾患または病態に対して、当該組成物が、特定の疾患を発症する危険性のある患者に、または、この疾患の診断が行われなかったとしても、疾患の生理的病態の１つ以上を報告する患者に投与されてよい。
【００６４】
用語「阻害すること」とは、本開示の化合物または組成物が存在しない状態と比較して、影響（疾患状態、または遺伝子／タンパク質／ｍＲＮＡの発現レベル）を低減することを意味する。
【００６５】
本明細書において使用される「試験化合物」とは、特定化された生物学的標的または経路の活性、非活性、もしくはその他の調節機能を同定するための、スクリーニング段階で用いられる実験化合物を指す。
【００６６】
「対照」または「対照実験」とは、その明白な普通の意味に従って用いられ、及びその実験の対象または試薬が、その実験の手順、試薬、または変数を省略する場合除いて、並列実験として扱われるような実験を指す。いくつかの例示において、この対照は、実験の効果を評価する場合の、比較基準として用いられる。いくつかの実施形態において、対照とは、本明細書（実施形態及び実施例を含む）に記載される化合物が存在しない場合の、タンパク質の活性の測定である。
【００６７】
「疾患」または「病態」とは、本明細書において提供される化合物または方法で治療される可能性がある、患者もしくは対象の、存在状態もしくは健康状態を指す。いくつかの事例において、「疾患」または「病態」  は、「がん」  を指す。
【００６８】
本明細書において使用される用語「がん」とは、白血病、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍を含む、哺乳動物において見出されるがん、新生物、悪性または良性の腫瘍のすべての型を指す。例示的ながんには、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、腎臓がん及び膵臓がんを含む。追加の例示には、白血病（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄白血病（ＣＭＬ））、脳のがん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、非上皮性悪性腫瘍、及び前立腺がん、子宮頸がん、胃がん、頭頸部がん、子宮がん、中皮腫、転移性骨がん、髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵島細胞腺腫、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん状態の皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿管がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、内分泌及び外分泌膵臓の新生物を含む。
【００６９】
「接触すること」は、その明白な普通の意味に従って使用され、及び少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子または細胞を含む化合物）が、反応、相互作用、または物理的に接触するのに十分に近位になることを可能にするプロセスを指す。しかしながら、得られる反応生成物は、その添加試薬の反応から直接に、またはその反応混合物中で作成され得る１種以上の添加試薬からの中間体から作成され得ることを理解される必要がある。いくつかの実施形態において、接触することには、本明細書に記載の化合物が、タンパク質または酵素と相互作用をすることを可能にすることを含む。
【００７０】
本明細書において使用される用語「表現型」及び「表現型の」とは、疾患の病候、生化学的性質、または生理学的性質の発病もしくは進行などの有機体の観察可能な特徴を指す。
【００７１】
細胞内のＤＮＡ分子の発現レベルは、その細胞内に存在する、対応するｍＲＮＡの量、またはその細胞によって作成されるＤＮＡによってコードされる、タンパク質の量のいずれかに基づいて決定されてよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．７−１８．８８）。ポリペプチドを参照として使用する場合、発現には、非限定的に、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、ポリペプチドの作成に関与する任意のステップを含む。発現は、タンパク質を検出するための従来の技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学的など）を用いて、検出され得る。
【００７２】
用語「遺伝子」とは、タンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。これには、コード領域（リーダー及びトレーラー）の前後の部分、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。このリーダー、トレーラー、ならびにイントロンには、遺伝子の転写及び翻訳時に必要な、調節因子を含む。さらに、「タンパク質遺伝子産物」とは、特定の遺伝子から発現されたタンパク質である。
【００７３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指しての用語「〜の量」とは、成分または因子が検出された場合の量を指す。この量は、対照に対して測定され得て、例えば、その対照との関連において、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの増加したレベルは、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの濃縮を表す。したがって、実施形態において、増加量は、宿主（例えば、マウス）へ、本明細書に記載のＨＳＰＣｓを移植する際の、より高いレベルまたは効率を示す。当該用語は、濃縮の定量的な測定だけでなく、対照に対する相対的な増減の定性的測定をも指す。
【００７４】
本明細書の記載及び請求項を通して、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、及びその単語のその他の形態の、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ(含む)」ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」などは、非限定的に包含していることを意味し、及び例えば、その他の成分を除外する意図はない。
【００７５】
「Ａｎａｌｏｇ（類似体）」、「ａｎａｌｏｇｕｅ（類似体）」、または「誘導体」  は、化学と生物学の中で用いられる、その明白な普通の意味に従って使用され、及び他の物質（すなわち、いわゆる「参照」物質）と構造的に似ているが、しかし組成において、例えば、異なる因子の原子による１つの原子の置換において、または特定の官能基の存在において、もしくは他の官能基による１つの官能基の置換において、またはその参照物質のキラル中心の絶対立体において異なる、化学物質を指す。いくつかの実施形態において、誘導体は、薬学的に許容される物質、例えば、リン酸またリン酸塩とのコンジュゲート体であってよい。
【００７６】
本明細書において使用される用語「塩」とは、本明細書において使用される物質の酸性または塩基性の塩を指す。許容される塩の非限定的な実例は、ミネラル酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸など）の塩、有機酸（酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸）の塩、及び４級アンモニウム（ヨウ化メチル、ヨウ化エチルなど）の塩である。
【００７７】
用語「薬学的に許容される塩」とは、本明細書に記載される化合物に含まれる特定の置換基に応じて、比較的毒性のない酸または塩基で調製された、活性化合物の塩を含むものである。本開示の化合物が、比較的酸性の機能性を含む場合、塩基性付加塩は、そのような化合物の中性形態を、希釈されていない状態でまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基に接触させることにより、得ることができる。薬学的に許容される塩基性付加塩の例示には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、もしくは類似の塩を含む。本開示の化合物が、
比較的塩基性の機能を含む場合、酸性付加塩は、そのような化合物の中性形態を、希釈されていない状態でまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることにより、得ることができる。薬学的に許容される酸性付加塩の例示には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、１水素炭酸、リン酸、１水素リン酸、２水素リン酸、硫酸、１水素硫酸、水素、または亜リン酸などの、無機酸から誘導されるもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの、相対的に毒性のない有機酸から誘導される塩を含む。また、アルギニン酸などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩が含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：１−１９（１９７７）を参照）。本開示のある特定の化合物は、その化合物を、塩基性または酸性付加塩のいずれかへの変換を可能にする、塩基性及び酸性の両機能を含む。当業者に公知の、その他の薬学的に許容されるキャリアが、本開示に適している。塩は、相応する塩基を含まない形態である、水性またはその他のプロトン溶媒において、より可溶性になる傾向がある。その他のケースにおいて、当該調製は、使用前に、緩衝液と組み合わされた、ｐＨが４．５から５．５の範囲の、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、２％〜７％のマンニトール中での、凍結乾燥粉末であってよい。
【００７８】
したがって、本開示の化合物は、薬学的に許容される酸と共に、塩として存在してよい。本開示には、そのような塩を含む。そのような塩の例示には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例えば、（＋）酒石酸塩、（−）酒石酸塩、またはラセミ混合物を含む、それらの混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸などのアミノ酸との塩を含む。これらの塩は、当業者に公知の方法によって、調製されてよい。
【００７９】
「補助剤」（ラテン語の、ａｄｉｕｖａｒｅに由来し、援助するの意）は、他の物質への影響を修正する、薬理学的及び／または免疫学的物質である。
【００８０】
「希釈剤」（充填剤、賦形剤またはシンナーとも呼ばれる）  は、希釈用の物質である。特定の流体は、容易にポンプで送り込むには粘性がありすぎ、または１つの特定点からその他へ流すには濃すぎる。この状態で、そのような流体を移送することは、経済的に実現可能ではなく、この点が、問題となり得る。この制約された移動を緩和するために、希釈剤が添加される。これにより、流体の粘度が下がり、その結果、ポンピング移送／輸送コストも減少する。
【００８１】
用語「投与」または「投与すること」とは、治療を必要とする個人へ、現実施形態の物質または現実施形態の物質を含む医薬組成物を提供する行為を指す。
【００８２】
「共投与する」とは、本明細書に記載の組成物が、追加療法の投与と同時に、その直前に、またはその直後に投与されることを意味する。本開示の化合物または組成物は、その患者に、単独で投与され得て、または共投与され得る。共投与は、化合物単独でのまたは併用（１つ以上の化合物または物質）での、同時もしくは逐次投与を含むものである。当該調製はまた、必要に応じて、その他の活性物質と組み合わせることができる（例えば、代謝の低下を減らすために）。
【００８３】
本明細書において使用される用語「逐次投与」とは、２つの物質（例えば、本明細書に記載の化合物または組成物）の投与が、同日に別々で発生し、または同日に発生しない（例えば、連続した日に発生する）ことを含む。
【００８４】
本明細書において使用される用語「同時投与」には、少なくとも一部において重複期間を含む。例えば、２つの薬剤（例えば、活性を有する、本明細書に記載の薬剤または薬剤のクラスのいずれか）  が同時に投与される場合、それらの投与が、特定の所望の時間内に発生する。当該薬剤の投与は、同日に開始し、及び終了してよい。１つの薬剤の投与はまた、両方の薬剤が同じ日に少なくとも１回服用される限りの日（複数可）ごとに、２番目の薬剤の投与に先行することができる。同様に、１つの薬剤の投与は、両方の薬剤が同じ日に少なくとも１回服用される限り、２番目の薬剤の投与の後へ、延長することができる。生理活性剤／物質は、同時投与を含むために、毎日、同時に服用される必要はない。
【００８５】
本明細書において使用される「間欠投与」は、一定期間  （「第１投与期間」とみなすことができる）、その後、その薬剤が服用されていないか、またはより低い維持用量で服用される期間（これ「オフ期間」とみなすことができる）、その後、その薬剤が、再び投与される期間（「第２投与期間」とみなすことができる）が続く、薬剤の投与を含む。一般的に、投与の第２段階中は、その薬剤の投与量レベルは、第１投与期間中に投与されたものと一致するが、しかし医学的な必要性に応じて、増加または減少させることができる。
【００８６】
本明細書において使用される用語「投与すること」とは、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内もしくは皮下投与、またはミニ浸透ポンプなどの、対象への低速放出装置の移植を意味する。投与は、非経口及び粘膜（例えば、頬、舌下、口蓋、歯肉、鼻、腟、直腸、または経皮）を含む、任意の経路による。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内を含む。送達の他の様式には、非限定的に、リポソーム製剤、静脈内点滴、経皮パッチなどの使用を含む。
【００８７】
本明細書に開示された組成物は、アプリケータスティック、溶液、懸濁液、乳化液、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料、粉末、及びエアロゾルとして配合され、局所経路によって、経皮的に投与される。経口製剤には、患者による摂取に適した、錠剤、丸薬、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、トローチ剤、オブラート、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などを含む。固形製剤には、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、オブラート、坐剤、及び分散性顆粒を含む。液形態の製剤には、溶液、懸濁液及び乳化液、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液を含む。本開示の組成物はさらに、徐放性及び／または快適性を提供するための成分を含んでいてよい。このような成分としては、高分子量、アニオン性のムコミメティックポリマー、ゲル化多糖類及び微細に分割された薬用キャリア基材を含む。これらの成分は、米国特許第４，９１１，９２０号、第５，４０３，８４１号、第５，２１２，１６２号、及び第４，８６１，７６０号に、詳細に考察されている。これらの特許の全内容は、すべての目的対して、それら全体を参照として、本明細書に援用される。本明細書に開示された組成物はまた、体内で徐放するための微小球として送達され得る。例えば、微小球は、皮下に徐々に放出される、薬物含有微小球の皮内注入を介して、（Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｎｉａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．７：６２３−６４５，１９９５を参照）、生分解性及び注入用ゲル製剤として（例えば、Ｇａｏ  Ｐｈａｎｎ．Ｒｅｓ．１２：８５７−８６３，１９９５を参照）、または経口投与のための微小球として（例えば、Ｅｙｌｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：６６９−６７４，１９９７を参照）、投与され得る。
【００８８】
本明細書において使用される「有効量」または「治療に有効な量」とは、臨床結果を含む有益な結果などの、所望の生体効果に影響を与えるのに十分な量である。このように、「有効量」は、適用される状況に依存する。有効量は、疾患の状態、年齢、性別、及び治療されている個人の体重など、当該技術分野で公知の要因に応じて変動してよい。複数の分割用量は、毎日投与されて良く、またはその用量は、治療状況の緊急性に応じて指示されるように、それに比例して減少されてよい。さらに、この開示の組成物／配合物は、治療量を達成するために、必要に応じて頻繁に投与され得る。
【００８９】
医薬組成物は、当該治療薬（例えば、実施形態または実施例を含む、本明細書に記載の物質）が、治療上有効な量で、すなわち、その意図した目的を達成するために有効な量で含有された、組成物を含んでよい。特定の適用に対する実際の有効量は、とりわけ、治療されている病態に依存するであろう。疾患の治療に対応した方法で投与される場合、そのような組成物は、所望の結果を達成するために、例えば、標的分子の活性を調節する、及び／または疾患の病態の進行を抑える、排除する、または遅らせるために有効な、治療薬の量を含む。
【００９０】
哺乳動物に投与される投与量及び頻度（単一または複数回の用量）は、例えば、その哺乳類が他の疾患に苦しんでいるかどうか、その投与経路、その受益者の体格、年齢、性別、健康、体重、体の質量指数、及び食事、治療される疾患の病候の性質及び範囲、同時治療の種類、治療される疾患からの合併症、またはその他の健康上の問題などの、多様な要因に応じて変動できる。その他の治療計画及び薬剤が、この開示の方法及び薬剤の組み合わせで使用され得る。確立された投与量（例えば、頻度及び持続期間）の調節及び操作は、当業者の能力で十分に対処される。
【００９１】
本明細書に記載の任意の治療薬について、治療に有効な量は、最初に、細胞培養アッセイから決定され得る。目的濃度は、本明細書に記載の、または当該技術分野で公知の方法を用いて測定される、本明細書に記載の方法に到達できる治療薬（複数可）の濃度である。
【００９２】
当該技術分野でよく知られているように、ヒトに使用する、治療の有効量はまた、動物モデルから決定され得る。例えば、ヒトの用量は、動物に有効であることが見出された濃度に到達するように、配合され得る。ヒトの投与量は、前述のように、薬効をモニターし、投与量を上方または下方に調整することによって、調節され得る。前述の方法及びその他の方法に基づいて、ヒトにおいて最大効果を達成するための用量の調節は、当業者の能力で、十分に対処される。
【００９３】
投与量は、その患者の要求及び取り入れられた治療薬に応じて変動してよい。患者に投与される用量は、時間をかけて、その患者に有益な治療反応をもたらすのに、適切でなければならない。その用量の規模はまた、任意の副作用の存在、性質、及び程度によって決定される。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、開業医の技能内で対処される。一般的に、治療は、その薬剤の最小用量未満である、より少ない投与量で開始される。その後、その投与量は、その状況下での最適な効果に達するまで、少量ずつ増量される。投与量及び間隔は、治療されている特定の臨床徴候に対応して、効果的な投与薬剤のレベルを提供するために、個別に調節され得る。これによって、個々の疾患状態の重症度に見合った、治療計画が提供される。
【００９４】
成分の重量パーセントは、特に逆に明記されない限り、その成分が含まれる配合物または組成物の総重量に基づく。
【００９５】
本明細書に使用される「賦形剤」には、開示される物質に含まれるかまたは併用されてよい、任意のその他の物質を含み、その賦形剤は、治療的または生物学的な活性物質／薬剤ではない。このようにして、賦形剤は、薬学的または生物学的に許容され、もしくは関連するべきである（例えば、賦形剤は、一般に個人に非毒性でなければならない）。「賦形剤」は、１つのそのような物質を含み、及びまた多数の賦形物を含むものである。本開示の目的に対して、用語「賦形剤」及び「キャリア」は、本開示のいくつかの実施形態において互換的に用いられ、当該用語は、「安全及び効果的な医薬組成物の実践に使用される成分」であると、本明細書において定義される。
【００９６】
用語「約」とは、配合物の調製において、及び疾患または障害の治療において、その薬効を変化させない、薬剤の濃度または量における任意の最小の変化を指す。本開示の薬剤（例えば、治療用／活性物質）の濃度範囲に関連して、用語「約」とは、有効量または範囲であると記載された、量または範囲の任意の変動を指す。
【００９７】
範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／または「約」他の特定の値までとして、本明細書では表現され得る。そのように範囲が表現される場合、他の態様は、１つの特定の値から、及び／またはその他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表現される場合には、「約」の前提を使用することにより、その特定の値が、他の態様を形成することが理解されよう。その範囲の互いの終点が、その他の終点と関係して、及びその他の終点とは無関係に、その両方において重要であることが、さらに理解されよう。また、本明細書では、開示される多数の値があり、及び各値は、その値自身に加えて、その特定の値を「約」として開示されることが、また理解されよう。この出願全体を通して、データが、多数の異なる形式で提供され、及びこのデータポイントが、終点及び開始点を、ならびにそのデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことが、また理解されよう。たとえば、仮に特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０及び１５に対して、それを上回って大きい、それ以上、それ未満、それ以下、ならびにそれらに等しいことが、１０から１５の間同様に開示されると考える、ことが理解されよう。２つの特定の単位間の各単位も開示されることが、また理解されよう。たとえば、仮に１０及び１５が開示される場合、次いで１１、１２、１３、及び１４もまた、開示される。
【００９８】
化合物
１つの態様において、本開示は、目的遺伝子のアンチセンス核酸配列または低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）へコンジュゲートされた、ホスホロチオエート化デオキシヌクレオチドを含む、単離化合物を包含する。実施形態において、当該ホスホロチオエート化ＯＤＮは、１５から３０の  塩基長、一本鎖、部分的または完全なホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチドである。実施形態において、その単離化合物は、式ＰＯＤＮ−Ｌ−ＡＮＡ（Ｉ）、またはＰＯＤＮ−Ｌ−ｓａＲＮＡ（ＩＩ）を有する。式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、ＰＯＤＮはホスホロチオエート化ＯＤＮであり、及びＬは、共有結合リンカーなどのリンカーである。式（Ｉ）において、ＡＮＡは、アンチセンス核酸配列である。式（ＩＩ）において、ｓａＲＮＡは、低分子活性化ＲＮＡである。
【００９９】
実施形態において、当該単離化合物には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）へコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の内の１つの、連続する１５核酸塩基に、約８０％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、本開示は、ｓａＲＮＡへコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の内の１つの、連続する１５核酸塩基に、約８０％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、単離化合物を提供する。実施形態において、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の内の１つの、連続する１５核酸塩基に、約８０％〜１００％の配列同一性を有する当該核酸配列は、ｓａＲＮＡまたはＡＳＯへコンジュゲートされた、１５から３０の塩基長、一本鎖、部分的または完全なホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを含む。実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ６）アンチセンスオリゴヌクレオチドである。実施形態において、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドである。実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、ＣＥＢＰ／α、ｐ２１、またはｐ５３のｓａＲＮＡである。
【０１００】
実施形態において、本開示の当該単離化合物には、ｓａＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）へコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の内の１つの、連続する１５核酸塩基に、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の内の１つの、連続する１５核酸塩基に、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜１００％の配列同一性を有する当該核酸配列は、ｓａＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）へコンジュゲートされた、１５から３０の  塩基長、一本鎖、部分的または完全なホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを含む。
【０１０１】
本開示は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはＡＳＯへコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む、単離化合物を提供する。実施形態において、本開示は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）を活性化することができる、短い活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）へコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む。
【０１０２】
実施形態において、本開示は、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１、ならびにｓａＲＮＡまたはＡＳＯの配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）間のリンカーを伴って、そのｓａＲＮＡまたはそのＡＳＯへコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１の配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を提供する。このリンカーは、共有結合リンカーであってよい。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のアルキレン、もしくはヘテロアルキレンリンカーであり、またはそれを含む。実施形態において、ｓａＲＮＡコンジュゲートされた当該核酸は、１つ以上の置換もしくは非置換のヘテロアルキレンリンカーを含む。リンカーは、配列におけるその合成中に、追加されてよい。実施形態において、ヘテロアルキレンリンカーは、介在リン酸結合を伴って、互いに結合される。
【０１０３】
実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、または置換もしくは非置換のシクロヘテロアルキレンである。本明細書において使用される「シクロヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキレン鎖内に、１つ以上の２価の環状部分を有する、ヘテロアルキレンである。この環状部分は、置換もしくは非置換のシクロアルキン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンであってよい。実施形態において、当該環状部分は、置換もしくは非置換のリボース（例えば、ヌクレオシド）である。実施形態において、当該環状部分は、リンカーの分岐点として機能し、それによって、分岐リンカーを形成する。この環状部分の分岐点は、本明細書において提供されるコンジュゲートへ、追加の機能部分、例えば検出可能部分、薬物部分、または生体分子などへ結合するために利用されてよい。以下により詳細に説明するように、この追加の機能部分は、当該技術分野で公知のクリックケミストリー技術を用いて、結合されてよい。
【０１０４】
実施形態において、当該リンカー（例えば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）におけるＬ）は、以下の式を有する部分であり、またはそれを含む。
−（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４−［（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４］ｚ−（ＣＨ２）ｎ−
【０１０５】
上記の式において、符号ｎは、１から５までの整数  （例えば、３）であり、及び符号ｚは、０から５０までの整数（例えば、０から２５、０から１０、または０から５）である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から５、または１から５である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から４、または１から４である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から３、または１から３である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、３である。
【０１０６】
実施形態において、当該リンカー（例えば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）におけるＬ）は、以下の式を有する部分であり、またはそれを含む。
−（ＣＨ２）ｎ１−ＰＯ４−［（ＣＨ２）ｎ２−ＰＯ４］ｚ−（ＣＨ２）ｎ３−
【０１０７】
上記の式において、符号ｎ１、ｎ２及びｎ３は、独立して、１から５までの整数  （例えば、３）であり、及び符号ｚは、０から５０までの整数（例えば、０から２５、０から１０、または０から５）である。実施形態において、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、３であり、及びｚは、０から５、または１から５である。実施形態において、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、３であり、及びｚは、０から４、または１から４である。実施形態において、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、３であり、及びｚは、０から３、または１から３である。実施形態において、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、３であり、及びｚは、３である。
【０１０８】
例えば、当該リンカーは、以下の構造を有し、ここでそのリンカーは、片末端にあるグアニンの３’リン酸、及びその他の末端にあるチミジンの５’リン酸と結合している。
【化１】
2018519831.tif 000003
当業者は、上記構造におけるグアニン及びチミジンは、任意の核酸モノマー／核酸塩基で置換され得ることは、直ちに理解されよう。
【０１０９】
実施形態において、当該リンカーは、リン酸部分にコンジュゲートされた、３つの炭素（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）を有する、ヘテロアルキレンを含む。このヘテロアルキレン部分は、変動され得る（例えば、このリンカーは、２、４、５、６、７、または８つの炭素を有する、ヘテロアルキレンを含むことがでる）。
【０１１０】
実施形態において、上記のグアノシンは、当該ＯＤＮ核酸配列に結合されており、及びチミジンは、当該低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはＡＳＯに結合されている。
【０１１１】
実施形態において、当該リンカー（例えば、リンカーが  、ヘテロアルキレンンカーであってよい）は、反応基（例えば、クリックケミストリー反応基）または保護反応基で置換されてよい。この反応基は、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯ化合物を、検出可能な部分または生体分子（例えば、標的化部分）などの、本明細書で記載の追加の機能部分へコンジュゲートするために使用されてよい。
【０１１２】
このように、当該ヘテロアルキレンリンカーには、さらなる修飾、コンジュゲート、または追加部分への結合を含んでよい。
【０１１３】
当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯ化合物を、追加の機能部分へコンジュゲートするために使用される反応基は、生体コンジュゲート反応ケミストリーにおいて有用な、任意の適用可能な反応基であってよい。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと。
【０１１４】
実施形態において、当該反応基は、クリックケミストリーの反応基である。クリックケミストリーは、高速で、使いやすく、精製が簡単で、汎用性があり、部位に特異的であり、及び高い生成収率を与える、反応の一群を指す。実施形態において、４つの異なるクリック反応が可能である。（１）環化付加−これらは、一義的には１，３−双極性環化付加を指すが、しかしまた、ヘテロ・ディールス・アルダー環化付加を含む。（２）求核的開環−これらは、アジリジン、エポキシド、環状硫酸塩、アジリジニウムイオン、エピスルホニウムイオンなどの、歪んだヘテロ環の求電子的開環を指す。（３）非アルドール型のカルボニルケミストリー−例示には、尿素、チオ尿素、ヒドラゾン、オキシムエーテル、アミド、芳香族ヘテロ環を含む。（４）炭素−炭素の多重結合の付加−例示には、エポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシ化、スルフェニルハロゲン化物付加、ノトロシルハロゲン化物付加、及び特定のマイケル付加を含む。実施形態において、使用されるクリック反応は、１，２，３−トリアゾールを形成するための、アジドまたは末端アルキンの、ＣｕＩ触媒作用による、ヒュスゲン１，３−双極性環化付加（ＨＤＣ）であってよい。実施形態において、このクリック反応は、銅を含まない反応であってよい。
【０１１５】
実施形態において、当該クリックケミストリーの反応基は、アジド基、アルケン基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、スルフヒドリル基、ジビニルスルホン誘導体、もしくはマレイミド誘導体であり、またはそれらを含む。したがって、実施形態において、当該リンカーは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ケミストリーによるコンジュゲートに適した、保護アミノ基または  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ジビニルスルホンでコンジュゲートされ得るスルフヒドリル基、１−アルキル−３−メチルアクリロイル（アクリロイル）塩化物またはアクリロイル誘導体とコンジュゲートされ得る、保護スルフヒドリル基、マレイミド誘導体とコンジュゲートされ得る、保護スルフヒドリル基を含む、反応基  （例えば、クリックケミストリーの反応基）または保護反応基で置換される。
【０１１６】
以下に示すのは、シクロヘテロアルキレン分岐のリンカーの構造例である。
【化２】
2018519831.tif 000004
【０１１７】
上に示すように、シクロヘテロアルキレン分岐のリンカーは、片末端にあるグアニンの３’リン酸、及びその他の末端にあるチミジンの５’リン酸と結合している。このシクロヘテロアルキレン分岐リンカーの部分は、分岐点であり、及び５−置換チミジンである。このチミジンは、追加の機能部分に結合するための反応基としての役割を果たすことができ、ＮＨＳ部分含む反応基で、５位にて置換される。
【０１１８】
反応性官能基及び保護反応性官能基を含む、部分の分岐点としての役割を果たすために使用できる化合物の追加事例を、以下に提供する。
Ｆｍｏｃアミノ修飾因子Ｃ６ｄＴ
【化３】
2018519831.tif 000005
Ｓ−Ｂｚ−チオール修飾因子Ｃ６−ｄＴ
【化４】
2018519831.tif 000006
ＤＢＣＯ−ｄＴ
【化５】
2018519831.tif 000007
ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル
【化６】
2018519831.tif 000008
【０１１９】
実施形態において、当該リンカーの分岐点は、非環状であってよい。反応性官能基及び保護反応性官能基を含むリンカー内で、非環状部分の分岐点としての役割を果たす化合物の一例を、以下に提供する。
【化７】
2018519831.tif 000009
【０１２０】
上に説明したように、当該反応基は、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯ化合物は、検出可能な部分、治療用部分（例えば、薬剤部分）、標的化部分、または生体分子などの、追加の機能部分へコンジュゲートするために、使用されてよい。追加の機能部分には、蛍光標識、標的化合物（骨標的ビスフォスフォネート）、薬剤、または抗体を含む。実施形態において、追加部分は、化学反応性部分、検出可能部分、治療用部分（例えば、抗がん剤または抗ウイルス剤）、核酸配列、ＤＮＡ配列、または核酸類似体である。実施形態において、当該検出可能な部分は、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、ガンマ線放出放射性核種、陽電子放出核種、生体コロイド、微小気泡、ヨード造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である。実施形態において、追加部分は、治療用部分（例えば、抗がん剤または抗ウイルス剤）である。
【０１２１】
実施形態において、当該追加機能部分は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。実施形態において、当該追加部分は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキル、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリール、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリールである。実施形態において、当該追加部分は、置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキル、置換された２から４０員環のヘテロアルキル、置換されたＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、置換された３から８員環のヘテロシクロアルキル、置換されたＣ６〜Ｃ１０のアリール、または置換された５から１０員環のヘテロアリールである。実施形態において、当該追加機能部分は、Ｒ１置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキル、Ｒ１置換された２から４０員環のヘテロアルキル、Ｒ１置換されたＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｒ１置換された３から８員環のヘテロシクロアルキル、Ｒ１置換されたＣ６〜Ｃ１０のアリール、またはＲ１置換された５から１０員環のヘテロアリールである。実施形態において、当該追加機能部分は、Ｒ１置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換のＣ１〜Ｃ４０アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１〜Ｃ４０アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換のＣ３〜Ｃ２１アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換のＣ３〜Ｃ１８アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換のＣ３〜Ｃ１５アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ６〜Ｃ２１アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ２１アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ１８アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ１５アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１２〜Ｃ１５アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１２アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１３アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１４アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換直鎖状のＣ１５アルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、Ｒ１置換の２から４０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、−（非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換直鎖状の２から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された５から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された１０から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された１５から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２０から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された３０から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から３５員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から３０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から２５員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から２０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から１０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から５０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、−（置換された２から６０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該追加機能部分は、置換された２から４０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、置換された１０から５０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、置換された２０から４０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、置換された２５から４０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該追加機能部分は、置換された３０から４０員環のヘテロアルキルである。
【０１２２】
実施形態において、追加機能部分におけるＲ１は、検出可能部分または治療用部分である。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、検出可能部分である。実施形態において、当該検出可能部分は、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、ガンマ線放出放射性核種、陽電子放出核種、生体コロイド、微小気泡、ヨード造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、治療用部分（例えば、抗がん剤または抗ウイルス剤）である。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、Ｈである。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、オキソである。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、酸素である。実施形態において、追加機能部分  におけるＲ１は、硫黄である。実施形態において、追加機能部分におけるＲ１は、＝Ｓである。
【０１２３】
実施形態において、当該追加連結する置換基には、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のへテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のへテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンを含む。当該追加連結する置換基には、その反応基または追加部分に接合した、ＰＥＧ部分を含んでよい。
【０１２４】
実施形態において、当該リンカーには、非置換のＣ３アルキレン（例えば、リン酸ジエステルリンカー基によって分離される、上述のもの）を含む。実施形態において、当該リンカーは、非置換のＣ１５アルキレンであってよい。実施形態において、当該リンカーは、非置換のＣ６からＣ１６アルキレンを含む。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンであってよい。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンであってよい。実施形態において、当該リンカーは、非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または非置換の５から１０員環のヘテロアリレンであってよい。実施形態において、当該リンカーは、置換された２から４０員環のヘテロアルキレンであってよい。
【０１２５】
リンカーは、結合、核酸配列、２つの核酸配列、ＤＮＡ配列、２つのＤＮＡ配列、核酸類似体配列、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換の  ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の  ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンであってよい。
【０１２６】
実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン（例えば、リン酸ジエステルリンカー基で結合した、置換もしくは非置換のアルキレン基）、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンであるか、またはそれらを含む。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、置換もしくは非置換の２から２０員環のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである。実施形態において、当該リンカーは、非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、非置換の２から２０員環のヘテロアルキレン、非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである。実施形態において、当該リンカーは、非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレンである。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレンである。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキレンである。実施形態において、当該リンカーは、置換された２から４０員環のヘテロアルキレンである。実施形態において、当該リンカーは、アルキルリン酸塩（例えば、リン酸プロピル）を含む。実施形態において、当該リンカーは、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、アルキルリン酸塩（例えば、リン酸プロピル）から構成される。実施形態において、当該リンカーは、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、１〜５アルキルリン酸塩（例えば、リン酸プロピル）から構成される。実施形態において、当該リンカーは、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、１〜４アルキルリン酸塩（例えば、リン酸プロピル）から構成される。実施形態において、当該リンカーは、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、４アルキルリン酸塩（例えば、リン酸プロピル）から構成される。当業者は、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、アルキルリン酸塩から構成されるリンカーは、アルキレン基よりも、１つ多くのリン酸塩を持つことを認識されよう（例えば、両末端でリン酸塩よって、その化合物の残りの部分に結合された、４アルキルリン酸塩から構成されるリンカーは、リン酸基とアルキル基とを交互に持つ、５つのリン酸塩及び４つのアルキル基を有するであろう）。
【０１２７】
実施形態において、ｓａＲＮＡは、２’Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’フルオロ、２’−デオキシ、ユニバーサル塩基、５−Ｃ−メチル、反転デオキシ脱塩基性残基の組み込み、もしくはロック核酸、またはそれらの任意の組合せ（複数可）などの、修飾を含んでよい。実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、そのｓａＲＮＡの末端核酸に位置する、修飾を有してよい。実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、そのｓａＲＮＡの末端核酸に位置する、修飾を有していなくてよい。実施形態において、当該ｓａＲＮＡの修飾は、その化合物を、血清由来ヌクレアーゼから保護する。
【０１２８】
実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、５’ＧＡＣＣＡＧＵＧＡＣＡＡＵＧＡＣＣＧＣＵＵ３’［配列番号１］のガイド鎖（アンチセンスもしくはＡＳ）配列、または配列番号１に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び３’ＵＵＣＵＧＧＵＣＡＣＵＧＵＵＡＣＵＧＧＣＧ５’［配列番号２］のパッセンジャー鎖  （センス鎖もしくはＳＳ）配列、または配列番号２に９０％〜９９％の相同性を有する配列を含む。配列番号１、もしくは配列番号１に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び配列番号２、もしくは配列番号２に９０％〜９９％の相同性を有する配列は、ＣＥＢＰプロモーターの活性化に対して、共にｓａＲＮＡを形成する。実施形態において、本開示のｓａＲＮＡは、５’ＵＡＣＵＵＧＧＡＧＡＡＵＧＡＧＵＵＧＧ３’［配列番号３］のガイド鎖（ＡＳ）配列、または配列番号３に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び３’ＡＵＧＡＡＣＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＡＣＣ５’［配列番号４］のパッセンジャー鎖（ＳＳ）配列  、または配列番号４に９０％〜９９％の相同性を有する配列を含む。配列番号３、もしくは配列番号３に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び配列番号４、もしくは配列番号４に９０％〜９９％の相同性を有する配列は、ｐ２１プロモーターの活性化に対して、共にｓａＲＮＡを形成する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、当該ｓａＲＮＡは、５’ＵＵＡＧＧＡＡＧＧＣＵＵＵＣＣＧＵＡＡ３’［配列番号５］のガイド鎖（ＡＳ）配列、または配列番号５に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び３’ＡＡＵＣＣＵＵＣＣＧＡＡＡＧＧＣＡＵＵ５’［配列番号６］のパッセンジャー鎖（ＳＳ）配列、もしくは配列番号６に９０％〜９９％の相同性を有する配列を含む。配列番号５、または配列番号５に９０％〜９９％の相同性を有する配列、及び配列番号６、もしくは配列番号６に９０％〜９９％の相同性を有する配列は、ｐ５３プロモーターの活性化に対して、共にｓａＲＮＡを形成する。
【０１３０】
実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、末端部分を有する。末端部分は、化学反応性部分、検出可能部分、治療用部分（例えば、抗がん剤もしくは抗ウイルス剤）、核酸配列、ＤＮＡ配列、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
【０１３１】
実施形態において、末端部分は、化学反応性部分、検出可能部分、治療用部分（例えば、抗がん剤もしくは抗ウイルス剤）、核酸配列、ＤＮＡ配列、核酸類似体、Ｒ１置換もしくは非置換のアルキル、Ｒ１置換もしくは非置換のヘテロアルキル、Ｒ１置換もしくは非置換のシクロアルキル、Ｒ１置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１置換もしくは非置換のアリール、または  Ｒ１置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
【０１３２】
実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、検出可能部分である、末端部分を含む。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、例えば、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、ガンマ線放出放射性核種、陽電子放出核種、生体コロイド、微小気泡、ヨード造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分などの、末端検出可能部分を含む。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、治療用部分（例えば、抗がん剤または抗ウイルス剤）である、末端部分を含む。
【０１３３】
実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである、末端部分を含む。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキル、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリール、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリールである、末端部分を含む。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキル、置換された２から４０員環のヘテロアルキル、置換されたＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、置換された３から８員環のヘテロシクロアルキル、置換されたＣ６〜Ｃ１０のアリール、または置換された５から１０員環のヘテロアリールである、末端部分を含む。実施形態において、当該末端部分は、Ｒ１置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキル、Ｒ１置換された２から４０員環のヘテロアルキル、Ｒ１置換されたＣ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｒ１置換された３から８員環のヘテロシクロアルキル、Ｒ１置換されたＣ６〜Ｃ１０のアリール、またはＲ１置換された５から１０員環のヘテロアリールである。実施形態において、当該末端部分は、Ｒ１置換されたＣ１〜Ｃ４０のアルキルである。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換のＣ３〜Ｃ２１のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換のＣ３〜Ｃ１８のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ３〜Ｃ１５のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ６〜Ｃ２１のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ２１のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ１８のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ９〜Ｃ１５のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１２〜Ｃ１５のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１２のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１３のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１４のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、―（非置換直鎖状のＣ１５のアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、Ｒ１置換された２から４０員環のヘテロアルキルである。実施形態において、当該末端部分は、−（非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換直鎖状の２から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された５から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された５から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された１５から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２０から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された３０から４０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から３５員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から３０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から２５員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から２０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から１０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から５０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。実施形態において、当該末端部分は、−（置換された２から６０員環のヘテロアルキレン）−Ｒ１である。
【０１３４】
実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換された２０から４０員環のヘテロアルキルである、末端部分を含む。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換された１０から５０員環のヘテロアルキルである、末端部分を含む。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換された２０から４０員環のヘテロアルキルである、末端部分を含む。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換された２５から４０員環のヘテロアルキルである、末端部分を含む。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、置換された３０から４０員環のヘテロアルキルである、末端部分を含む。
【０１３５】
実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートは、Ｒ１が、検出可能な部分または治療用部分である、Ｒ１基を有する末端部分を含む。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、検出可能部分である。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートにおけるＲ１は、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、ガンマ線放出放射性核種、陽電子放出核種、生体コロイド、微小気泡、ヨード造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である、検出可能部分である。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、治療用部分（例えば、抗がん剤または抗ウイルス剤）である。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、Ｈである。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、オキソである。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、酸素である。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、硫黄である。実施形態において、当該ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）−ｓａＲＮＡ／ＡＳＯコンジュゲートの末端部分におけるＲ１は、＝Ｓである。
【０１３６】
実施形態において、当該化合物のＯＤＮ核酸配列は、非メチル化のＣｐＧまたはＧｐＣモチーフを含む。実施形態において、このＣｐＧ核酸配列は、クラスＡのＣｐＧ核酸配列、クラスＢのＣｐＧ核酸配列、またはクラスＣのＣｐＧ核酸配列を含む。実施形態において、このＧｐＣ核酸配列は、クラスＡのＧｐＣ核酸配列、クラスＢのＧｐＣ核酸配列、またはクラスＣのＧｐＣ核酸配列を含む。
【０１３７】
実施形態において、当該化合物は、Ｃ及びＧ（ＣｐＧまたはＧｐＣ）が、ホスホジエルテルのヌクレオチド間連結によって結合したヌクレオチドである、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む。実施形態において、当該化合物は、Ｃ及びＧが、ホスホジエルテル誘導体のヌクレオチド間連結によって結合したヌクレオチドである、ＣｐＧまたはＧｐＣを含む。
【０１３８】
実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）結合のＤＮＡ置換基は、クラスＡのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、ＴＬＲ結合のＤＮＡ置換基は、クラスＢのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、ＴＬＲ結合のＤＮＡ置換基は、クラスＣのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、ＴＬＲ結合のＤＮＡ置換基（例えば、ＴＬＲ９結合のＤＮＡ置換基）は、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ塩基及びホスホジエルテル連結、及び／またはホスホジエルテル誘導体連結（例えば、ホスホロチオエート連結（複数可））を伴った、デオキシリボ核酸から構成される。
【０１３９】
【表１】
2018519831.tif 000010
2018519831.tif 000011
2018519831.tif 000012
【０１４０】
実施形態において、本開示の化合物は、本開示に記載されるように、リンカーによって結合された、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、またはｐ５３  ｓａＲＮＡ（配列番号５〜６）を有する、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の、１つの組み合わせを含む。実施形態において、本開示の化合物は、本開示に記載されるように、リンカーによって結合された、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３の１つを有する、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の、１つの組み合わせを含む。当該化合物の組み合わせの例示は、表２〜４に記載される。
【０１４１】
実施形態において、当該化合物は、エンドソームＴＬＲを結合する。実施形態において、当該化合物は選択的に、その他のＴＬＲにエンドソームＴＬＲを結合する。実施形態において、当該化合物は特異的に、エンドソームＴＬＲを結合する。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ３を結合する。実施形態において、当該化合物は優先的に、その他のＴＬＲにエンドソームＴＬＲ３を結合する。実施形態において、当該化合物は特異的に、ＴＬＲ３を結合する。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ７を結合する。実施形態において、当該化合物は優先的に、その他のＴＬＲにＴＬＲ７を結合する。実施形態において、当該化合物は特異的に、ＴＬＲ７を結合する。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ８を結合する。実施形態において、当該化合物は優先的に、その他のＴＬＲにＴＬＲ８を結合する。実施形態において、当該化合物は特異的に、ＴＬＲ８を結合する。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ９を結合する。実施形態において、当該化合物は優先的に、その他のＴＬＲにＴＬＲ９を結合する。実施形態において、当該化合物は特異的に、ＴＬＲ９を結合する。実施形態において、当該化合物は、ＣｐＧを含み、ここでＣ及びＧは、ホスホジエステルのヌクレオチド間連鎖、またはホスホジエステル誘導体のヌクレオチド間連鎖によって結合された、ヌクレオチドである。
【０１４２】
実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、クラスＡのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、クラスＢのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、クラスＣのＣｐＧオリゴ  デオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮＤ１９、またはＯＤＮ２３３６である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、またはＯＤＮ２００７である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、ＯＤＮ２３９５またはＯＤＮＭ３６２  である。実施形態において、当該ＴＬＲ結合ＤＮＡ置換基は、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮＤ１９、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２００７、ＯＤＮ２３９５、またはＯＤＮＭ３６２の誘導体である。実施形態において、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮＤ１９、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２００７、ＯＤＮ２３９５、またはＯＤＮＭ３６２の誘導体は、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のヌクレオチド置換基（例えば、異なるヌクレオチド間で置換された、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）を含む。実施形態において、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮＤ１９、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２００７、ＯＤＮ２３９５、またはＯＤＮ  Ｍ３６２の誘導体は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のヌクレオチド間連結の置換（例えば、ホスホジエステル誘導体で置換されたホスホジエステル、またはホスホジエステルで置換されたホスホジエステル誘導体）を含む。実施形態において、ＯＤＮ・１５８５、ＯＤＮ・２２１６、ＯＤＮ・Ｄ１９、ＯＤＮ・２３３６、ＯＤＮ・１６６８、ＯＤＮ・１８２６、ＯＤＮ・２００６、ＯＤＮ・２００７、ＯＤＮ・２３９５、またはＯＤＮ・Ｍ３６２の誘導体は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００）のヌクレオチドの欠失を含む。実施形態において、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ  Ｄ１９、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２００７、ＯＤＮ２３９５、またはＯＤＮＭ３６２の誘導体は、１つ以上（例えば、１、２、３、４���５、６、７、８、９、または１０）のヌクレオチド付加を含む。
【０１４３】
実施形態において、当該化合物は、ホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、または  Ｏ−メチルホスホノアミダイト連結）を含む。実施形態において、当該化合物は、多数のホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、Ｏ−メチルホスホノアミダイト連結、またはそれらの組み合せ）を含む。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ９結合ＤＮＡ置換基における、ホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ−メチルホスホノアミダイト連結）を含む。実施形態において、当該化合物は、ＴＬＲ結合性核酸（エンドソームＴＬＲ−、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−、ＴＬＲ８−、またはＴＬＲ９結合性核酸）置換基における、ホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ−メチルホスホノアミダイト連結）を含む。
【０１４４】
実施形態において、当該ＣｐＧ核酸配列におけるホスホジエステル誘導体連鎖は、ホスホロアミダート連結、ホスホロジアミダート連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホノカルボン酸連結、ホスホノカルボン酸塩連結、ホスホノ酢酸連結、ホスホノギ酸連結、ホスホン酸メチル連結、ホスホン酸ホウ素連結、またはＯ−メチルホスホノアミダイト連結であってよい。
【０１４５】
実施形態において、当該化合物中の核酸ヌクレオチド間連結の１つ以上が、ホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ−メチルホスホノアミダイト連結）である（例えば、当該化合物中の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全てのヌクレオチド間連結が、ホスホジエステル誘導体連結（例えば、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、Ｏ−メチルホスホノアミダイト連結、またはそれらの組み合わせ）である）。
【０１４６】
実施形態において、本開示は、ＣｐＧを、ＣＥＢＰＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結する化合物を含む。実施形態において、当該ＯＮＤ−ｓａＲＮＡは、その細胞質（及びその細胞核内に）に存在する。実施形態において、ＯＤＮ−アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの核送達は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチド上のＲＮａｓｅＨ介在作用の結果として、遺伝子発現に影響を与える。
【０１４７】
実施形態において、本開示は、ＯＮＤを、ＳＴＡＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結する化合物を含む。例えば、本開示は、表２、３、及び／または４に記載される、ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３−ＡＳＯ（アンチセンス）の化合物を含む。
【０１４８】
組成物
１つの態様において、本開示は、薬学的に許容される賦形剤、及び本明細書に開示される化合物を含む、医薬組成物を提供する。実施形態において、この組成物は、第２治療薬を含む。実施形態において、この第２治療薬は、抗がん剤である。実施形態において、当該第２治療薬は、同一単位の投与量の一部、または個別単位の投与量の一部であってよい。当該第２治療薬は、表１〜４に記載される化合物、またはそれらの誘導体の１つではない。
【０１４９】
実施形態において、本開示は、１つ以上の追加の抗がん治療、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、または抗ＳＴＡＴ薬と、本開示の化合物との組み合わせを含む。抗がん治療の追加の例示には、非限定的に、手術、放射線療法（放射線治療）、生物療法、免疫療法、化学療法（例えば、テモゾロミド）、またはそれら治療法の組み合わせを含む。さらに、細胞毒性物質、抗血管新生及び抗増殖剤は、本開示の化合物を含む組成物と組み合わせて使用され得る。
【０１５０】
当該方法及び使用法のいずれかの特定の態様において、本開示は、がんと診断された対象に、本開示の化合物及び化学療法薬の、治療に効果的な量を投与することにより、がんを治療することを含む。多様な化学療法薬は、本開示の治療法及び使用法を組み合わせて、用いられてよい。実施形態において、化学療法薬は、  テモゾロミドであってよい。実施形態において、当該化学療法薬は、放射線治療と併用して、投与されてよい。
【０１５１】
１つの例示において、この併用治療は、別々の配合物または単一の医薬配合物を用いた同時投与、及び両方（または全ての）活性薬が、同時にそれらの生物学的活性を発揮する場合、期間があってよいが、いずれかの順序での連続投与を含む投与を関与させてよい。このような化学療法薬の調製及び投与スケジュールは、製造者の指示に従って用いられ、または当業者によって経験的に決定されてよい。化学療法薬の調製及び投与スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）に記載されている。当該化学療法薬は、本開示の化合物または組成物の投与の前後に、またはそれと同時に与えてられてよい。
【０１５２】
当該方法及び使用法のいずれかの、いくつかのその他の態様において、本開示の化合物と腫瘍療法との組み合わせに有用な、その他の治療薬には、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＳＴＡＴまたはＴＮＦなどの、腫瘍の増殖に関与するその他因子の拮抗薬を含む。時には、その対象に１つ以上のサイトカインを、さらに投与することが有益な場合がある。実施形態において、本開示の化合物または組成物は、増殖阻害剤と共に投与される。例えば、この増殖阻害剤がまず投与され、続いて本開示の化合物または組成物が投与されてよい。しかしながら、本開示の化合物または組成物の同時投与または最初の投与も、可能であり得る。この増殖阻害剤に適した投与量は、現在用いられているものであり、及びこの増殖阻害剤と、本開示の化合物との併用作用（相乗作用）により減らされてよい。
【０１５３】
本明細書における当該配合物はまた、治療されている特定の病候、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性剤で治療されている病候に対して、必要に応じて１つ以上の活性化合物が含まれていてよい。例えば、その１つの配合物中の、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ上の異なるエピトープまたは同一のエピトープを結合する抗体）、ＶＥＧＦＲ、またはＥｒｂＢ２に結合している薬剤を、さらに提供することが望ましい場合がある。あるいは、またはさらに、当該組成物は、化学療法薬、または細胞毒性薬を含んでいてよい。そのような分子は、意図された目的に対しての有効量で組み合わされて、好ましい存在となる場合がある。
【０１５４】
当該方法及び使用法のいずれかの、特定の態様において、がん療法と本開示の化合物または組成物との組み合わせに対して有用な、その他の治療薬には、その他の抗血管新生剤を含む。多くの抗血管新生剤が特定され、及びＣａｒｍｅｌｉｅｔならびにＪａｉｎ（２０００）によって記載された物を含んで、当該技術分野においては公知である。実施形態において、本開示の化合物または組成物は、その他のＣＥＢＰＡ拮抗薬、中和抗ＣＥＢＰＡ抗体、ＣＥＢＰＡの低分子量阻害剤、及びそれらの任意の組み合わせとの併用で使用される。
【０１５５】
実施形態において、本開示は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）にコンジュゲートした、ＣｐＧ核酸配列を含む組成物、及びＳＴＡＴ結合ＤＮＡ置換基にコンジュゲートした、ＴＬＲ結合性核酸置換基を含む化合物を包含する。実施形態において、このＳＴＡＴは、ヒトのＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、またはＳＴＡＴ６である。実施形態において、ＳＴＡＴ３結合ＤＮＡ置換基にコンジュゲートした、ＴＬＲ９結合性核酸置換基である。実施形態において、このＴＬＲ９結合性核酸置換基は、ＣｐＧモチーフを含む。実施形態において、当該ＴＬＲ９結合性核酸置換基は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。実施形態において、当該ＴＬＲ９結合性核酸置換基は、Ｇ−４重体を形成することができる、ＤＮＡ配列を含む。実施形態において、当該ＴＬＲ９結合性核酸置換基は、クラスＡのＣｐＧ  ＤＮＡ配列、クラスＢのＣｐＧ  ＤＮＡ配列、またはクラスＣのＣｐＧ  ＤＮＡ配列を含む。実施形態において、当該ＴＬＲ９結合性核酸置換基は、リンカーによって、第二ＳＴＡＴ３結合ＤＮＡ配列に共有結合した第一ＳＴＡＴ３結合ＤＮＡ配列を含む。及び
【０１５６】
実施形態において、本開示は、ＣｐＧを、ＣＥＢＰＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドへ連結する組成物を含む。実施形態において、当該ＯＤＮ−ｓａＲＮＡは、その細胞質（及びその細胞核内に）に存在する。実施形態において、ＯＤＮ−アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの核送達は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチド上における、ＲＮａｓｅＨ介在作用の結果として遺伝子発現に影響を与える。
【０１５７】
実施形態において、本開示は、ＯＤＮを、ＳＴＡＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結する、組成物を含む。例えば、３つのＯＤＮ−ＳＴＡＴ３−ＡＳＯ（アンチセンス）コンジュゲート（ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＳＴＡＴ３−ＡＳＯコンジュゲート）が、表２に記載される。
【０１５８】
【表２】
2018519831.tif 000013
【０１５９】
表２に「ｘ」で表されるリンカーは、−（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４−［（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４］ｚ−（ＣＨ２）ｎであり、その符号ｎは、１から５（例えば、３）の整数であり、及び符号ｚは、０から５０（例えば、０から２５、０から１０、または０から５）の整数である。実施形態において、ｎは３であり、及びｚは０から５、または１から５である。実施形態において、ｎは３であり、及びｚは０から４、または１から４である。実施形態において、ｎは３であり、及びｚは０から３、または１から３である。実施形態において、ｎは３であり、及びｚは３である。２’ＯＭｅ（２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、２’−Ｏメチルで置換された、２’位におけるヒドロキシル）、ＰＳは、ホスホロチオエート化である。硫黄で置換された１つの非架橋酸素、ＰＳ＋３は、その修飾された配列における、３つのリン酸塩を表し、硫黄で置換された１つの非架橋酸素を有し、ＰＳ＋５は、その修飾された配列における５つのリン酸塩を表し、硫黄で置換された１つの非架橋酸素を有する。
【０１６０】
例えば、以下に示すように、実施形態において、当該ＣｐＧ配列中の核酸は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含んでいてよい。
【化８】
2018519831.tif 000014
【０１６１】
ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する、当該ＣｐＧ核酸配列の一部を上に示す。
【０１６２】
このリンカーは、以下の構造を有していてよく、当該リンカーは、一方の末端にあるグアニンの３’リン酸と、他方の末端のチミジンの５’リン酸とを結合し、及びそのアンチセンス部の核酸塩基は、２’ＯＭｅで修飾されていてよい。
【化９】
2018519831.tif 000015
【０１６３】
上記式は、（ＣＨ２）３リンカーで、その３’−ＯＨ末端に連結された当該ＣｐＧ核酸の一部を表し、アンチセンスＲＮＡの５’リン酸へ連結する。
【０１６４】
当該リンカーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリレンである。実施形態において、リンカーは、当該ＴＬＲ９結合ＤＮＡ置換基と、当該ＳＴＡＴ３結合ＤＮＡ置換基とをつなぐ。実施形態において、当該リンカーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリレンである。
【０１６５】
実施形態において、本開示は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）及び表３に記載された化合物にコンジュゲートされた、ＣｐＧ核酸配列を含む組成物を包含する。
【０１６６】
【表３】
2018519831.tif 000016
2018519831.tif 000017
【０１６７】
【表４】
2018519831.tif 000018
2018519831.tif 000019
2018519831.tif 000020
2018519831.tif 000021
【０１６８】
表３及び表４に「ｘ」で表されるリンカーは、−（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４−［（ＣＨ２）ｎ−ＰＯ４］ｚ−（ＣＨ２）ｎであり、その符号ｎは、１から５（例えば、３）の整数であり、及び符号ｚは、０から５０（例えば、０から２５、０から１０、または０から５）の整数である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から５、または１から５である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から４、または１から４である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、０から３、または１から３である。実施形態において、ｎは、３であり、及びｚは、３である。リンカー「ｘ」は、その連鎖に複数回（例えば、１、２、３、４、５、または６回であっても）存在してよく、ここでｎ及びｚは、各リンカー  「ｘ」の存在に対して、独立している。
【０１６９】
本開示は、本開示の化合物の有効用量を有する組成物を包含する。この有効用量は、その薬剤の約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間であってよい。
【０１７０】
がんを治療し、細胞内での  Ｃ／ＥＢＰＡ発現を高め、細胞増殖を阻害し、及び／またはＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させるための本開示の化合物の有効用量は、その化合物の約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．０１ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．１ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約１．０ｍｇ／ｋｇから約５．０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約５．０ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約１０ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約１５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約２０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約２５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約３０ｍｇ／ｋｇから約３５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約３５ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約４０ｍｇ／ｋｇから約４５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約４５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約５０ｍｇ／ｋｇから約５５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約５５ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約６０ｍｇ／ｋｇから約６５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約６５ｍｇ／ｋｇから約７０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約７０ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約７５ｍｇ／ｋｇから約８０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約８０ｍｇ／ｋｇから約８５ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約８５ｍｇ／ｋｇから約９０ｍｇ／ｋｇの間、その化合物の約９０ｍｇ／ｋｇから約９５ｍｇ／ｋｇの間、またはその化合物の約９５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間であってよい。
【０１７１】
いくつかの態様において、本開示は、その化合物が、その組成物の約  ０．１％から約２０％ｗ／ｖの間であり得る、本開示の化合物の有効用量を有する、組成物を包含する。
【０１７２】
例えば、本明細書に開示の化合物の有効用量は、その組成物の約０．００１％〜約０．０１％の間、約０．０１％〜約０．１％の間、約０．１％〜約１．０％の間、約１．０％〜約２．０％の間、約２．０％〜約３．０％の間、約３．０％〜約４．０％の間、約４．０％〜約５．０％の間、約５．０％〜約６．０％の間、約６．０％〜約７．０％の間、約７．０％〜約８．０％の間、約８．０％〜約９．０％の間、約９．０％〜約１０％の間、約１０％〜約１１％の間、約１１％〜約１２％の間、約１２％〜約１３％の間、約１３％〜約１４％の間、約１４％〜約１５％の間、約１５％〜約１６％の間、約１６％〜約１７％の間、約１７％〜約１８％の間、約１８％〜約１９％の間、または約１９％〜約２０％ｗ／ｖの間であってよい。
【０１７３】
遺伝子発現の増強または抑制の方法、及び／またはその使用法
遺伝子発現の増強及び免疫応答の刺激
１つの態様において、本開示は、本開示の化合物及び／または組成物を伴って、発現遺伝子の発現を増強し、及び免疫応答を刺激する方法を含む。実施形態において、遺伝子発現を増強し、及び免疫応答を刺激することは、ＣｐＧ配列を有するホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）とコンジュゲートしたｓａＲＮＡを用いて達成される。実施形態において、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列、例えば、配列番号７〜１８の１つとコンジュゲートされたＣ／ＥＢＰＡ、ｐ２１、及びｐ５３の各々のｓａＲＮＡを用いて、Ｃ／ＥＢＰＡ、ｐ２１、及びｐ５３の発現が増強され、及び免疫応答が刺激される。
【０１７４】
遺伝子発現の増強及び免疫応答の刺激
１つの態様において、本開示は、免疫応答を刺激することなく、本開示の化合物及び／または組成物を用いて、発現遺伝子の発現を増強する方法を包含する。実施形態において、免疫応答を刺激することのない、遺伝子発現の増強は、本開示のＧｐＣまたはＰＳ配列を有する、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列とコンジュゲートされたｓａＲＮＡを用いて達成される。実施形態において、Ｃ／ＥＢＰＡ、ｐ２１、及びｐ５３の発現が、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列、例えば、配列番号２９〜３０の１つとコンジュゲートされた、Ｃ／ＥＢＰＡ、ｐ２１、及びｐ５３の各々のｓａＲＮＡを用いて、免疫応答を刺激することなく増強される。
【０１７５】
遺伝子発現の抑制、及び免疫応答の刺激
1つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発しながら、化合物及び／または組成を用いて、遺伝子を抑制する方法を包含する。実施形態において、本開示は、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つと連結された配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つの化合物を用いて、遺伝子、例えば、ＳＴＡＴを抑制する方法を提供する。例えば、ＳＴＡＴ遺伝子（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５の１つ）を抑制する方法は、配列番号４３〜６０の化合物を用いて達成される。これらの化合物は、１時間以内のインキュベーションで、哺乳類（例えば、ヒト）の免疫細胞、前立腺がん細胞などの標的のＴＬＲ９＋細胞による迅速な内在化を可能にする。当該化合物の取り込みは、低濃度（例えば、５０ｎＭ）で検出され得る。これらの配列は、ヌクレアーゼ耐性であり、全身投与、及び脾臓または骨髄などの遠位臓器において、ＴＬＲ９＋  細胞の標的化を可能にする（図１５Ａ〜１５Ｂ）。当該化合物の静脈内（ＩＶ）注入では、その骨髄において、骨髄細胞のかなりの部分及びその末梢リンパ節において、ＤＣｓを含む骨髄細胞の相当な割合へ当該化合物が送達され得る（図１５Ａ〜１５Ｂ）。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、悪性細胞及び／または腫瘍関連免疫細胞、例えば、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）において免疫応答を刺激しつつ、抑制される。ＭＤＳＣｓは、前立腺がんの進行及び乏しい患者生存に重要な役割を果たす、未熟及び潜在的な免疫抑制性骨髄細胞の異種集団である。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、同時に免疫応答を刺激しつつ、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）において抑制される。
【０１７６】
免疫応答を刺激することのない、遺伝子発現の抑制
１つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発することなく、化合物及び／または組成物を用いて、遺伝子発現を抑制する方法を包含する。実施形態において、本開示は、化合物、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つと連結された、例えば、配列番号２９〜３０のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つを用いて、遺伝子、例えば、ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５の１つ）を抑制する方法を提供する。例えば、ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５の抑制は、免疫原性効果を刺激することなく、配列番号６１〜９５の化合物を用いて達成される。配列番号７８〜９５の化合物は、配列番号６１〜７７の化合物に比べてより高い安定性を有する。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、免疫応答を刺激することなく、悪性細胞及び／または腫瘍関連免疫細胞、例えば、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）において抑制される。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、免疫応答を刺激することなく、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）において抑制される。
【０１７７】
遺伝子発現を抑制し、及びアポトーシをス誘発する方法
１つの態様において、本開示は、アポトーシスを誘発しながら、本開示の化合物及び／または組成を用いて、遺伝子発現を抑制する方法を包含する。実施形態において、本開示は、化合物、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つと連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つを用いて、遺伝子、例えば、ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５）を抑制する方法を提供する。例えば、ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５を抑制する方法は、標的細胞のアポトーシスを誘発しながら、例えば、配列番号４３〜６０の化合物を用いて達成される。
【０１７８】
アポトーシスを誘発することなく遺伝子発現を抑制する方法
１つの態様において、本開示は、アポトーシスを誘発することなく、化合物及び／または組成物を用いて遺伝子発現を抑制する方法を包含する。実施形態において、本開示は、アポトーシスを誘発することなく、化合物、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つと連結された、例えば、配列番号２９〜３０のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つを用いて、遺伝子、例えば、ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５）を抑制する方法を提供する。例えば、ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５を抑制する方法は、標的細胞のアポトーシスを誘発することなく、例えば、配列番号６１〜９５の化合物を用いて達成される。
【０１７９】
がんの治療法
１つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発しながら、本開示の化合物及び／または組成物を用いてがん及び／または腫瘍を治療する方法を包含する。１つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発せずに本開示の化合物及び／または組成物を用いてがん及び／または腫瘍を治療する方法を包含する。
【０１８０】
実施形態において、当該がんは、造血細胞がんであってよい。実施形態において、当該がんは、造血細胞がんではない。実施形態において、当該がんは、骨髄腫または急性骨髄性白血病である。実施形態において、当該がんは、前立腺がん（例えば、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ））、乳がん、乳がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、黒色腫、脳腫瘍、大腸がん、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。
【０１８１】
実施形態において、当該化合物または組成物は、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、対象に投与される。実施形態において、当該治療は、当該化合物または組成物の用量依存性である。実施形態において、当該化合物の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇが、対象に投与される。この範囲内のすべての桁数及び様々な範囲もまた、暗示される。
【０１８２】
がんの治療及び免疫応答の誘発
実施形態において、本開示は、治療が必要な対象において、がんを治療する方法を提供し、その方法は、本明細書に開示される化合物を含む、化合物またはその医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。本開示は、治療が必要な対象において、がんを治療し及び免疫応答を刺激する方法を提供し、その方法は、例えば、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、ｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）の１つ、または例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つの化合物を含む、化合物または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【０１８３】
実施形態において、当該がんの治療方法には、本開示に記載のように、リンカーで結合された、例えば、配列番号７〜１８、２９〜３０及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つと、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、またはｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）の１つとの組み合わせの化合物の、化合物または組成物を治療が必要な対象へ投与することを含む。実施形態において、当該がんの治療方法には、本開示に記載のように、リンカーで結合された、例えば、配列番号７〜１８、２９〜３０及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つと、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つとの組み合わせの化合物の、化合物または組成物を治療が必要な対象へ投与することを含む。
【０１８４】
実施形態において、当該免疫応答の刺激には、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞または骨髄細胞の成熟、分化、もしくは増殖を含む。実施形態において、当該免疫応答の刺激には、ＴＨ１型免疫応答の増加を含む。実施形態において、当該免疫応答の刺激には、その対象の臓器へ、樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を補充してよい。実施形態において、当該免疫応答の刺激は、対象における抗原提示細胞の集団を拡大する。実施形態において、当該免疫応答の刺激は、対象におけるがん細胞の増殖を抑制する。実施形態において、当該化合物または組成物は、免疫応答を刺激するために、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により対象に投与される。
【０１８５】
本開示は、細胞内でのＣ／ＥＢＰα、ｐ２１、及び／またはｐ５３の発現を増強し、及び同時に免疫原性効果を誘発する方法を提供し、その方法は、当該細胞を、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、及びｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）の各々の１つに連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つの化合物の、化合物または医薬組成物の有効量と接触させることを含む。本開示は、細胞を、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、及びｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）のそれぞれの１つに連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つの化合物の、化合物または医薬組成物の有効量と接触させることを含む、その細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本開示は、当該細胞を、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つの化合物の、化合物または医薬組成物の有効量と接触させることを含む、ＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させる方法を提供する。
【０１８６】
実施形態において、当該細胞は、がん細胞である。実施形態において、当該細胞は、急性骨髄性リンパ（ＡＭＬ）細胞、または前立腺がん細胞である。実施形態において、このＡＭＬ細胞は、その骨髄からのものである。実施形態において、当該細胞は、インビトロで培養された細胞であり、当該細胞は、宿主におけるインサイチュであり、当該細胞は、エクスビボで培養された組織である。実施形態において、この接触ステップは、ウイルス性形質導入を含まない。実施形態において、当該接触ステップは、ウイルス性形質導入を含まず、及び当該細胞を、本開示の化合物、または本開示の化合物を含む医薬組成物と接触させる。実施形態において、当該細胞は、当該化合物の約１ナノモルから約１００ナノモルと接触する。この範囲内のすべての桁数及び様々な範囲もまた、暗示される。
【０１８７】
ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの静脈内注入は、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質の発現を誘発し、及び血液ならびに様々な臓器における白血病細胞の割合を、用量に依存した減少に導いた。ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの２．５ｍｇ／ｋｇ及びそれ以上の繰り返し注入は、完全なＡＭＬの根絶をもたらした。この戦略の抗腫瘍効果は、ＴＬＲ９のトリガー及びＣ／ＥＢＰαの上方調節が組み合わされた免疫刺激作用によって、さらに高められたように思われる。Ｃｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ１白血病モデルにおいて、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの点滴注入は、様々な臓器への、樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ  細胞の補充をもたらした。したがって、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡの戦略は、ＡＭＬ及び潜在的な前立腺がんの治療に対して、新規及び細胞選択的な戦略を提供することができる。骨髄細胞の分化におけるＣ／ＥＢＰαの公知の役割を伴って、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡは、がん細胞の増殖を抑制しながら、がん患者における抗原提示細胞の集団を拡大することを可能にするであろう。
【０１８８】
当該コンジュゲートのホスホロチオエート化及び一本鎖ＣｐＧ  ＯＤＮ部分は、標的細胞によって内在化のトリガーとなる。ＣｐＧＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡのエンドソームでの取り込みは、スカベンジャー受容体を介して媒介され、及びＴＬＲ９との相互作用へと導く。ＴＬＲ９の活性化は、免疫刺激シグナル（シグナル１）を生成し、一方また、細胞質への当該コンジュゲートの放出を可能にする。ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡは最終的に、遺伝子発現過程と相互作用する核に到達し、及びそれによって、その標的遺伝子の発現へと導く。このＣ／ＥＢＰαタンパク質は、細胞分化の転写活性因子として作用する（シグナル２）。免疫刺激及び分化シグナルの両組み合わせは、その抗原提示を高め、及び強力な抗腫瘍免疫応答をもたらす。
【０１８９】
ＳＴＡＴ３活性は、多くの場合、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びＮＦ−κＢシグナル伝達から下流で、ストレス及び炎症に応答して放出されたサイトカインによって引き起こされる。このＴＬＲ９／ＮＦ−κＢ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達軸は、前立腺がん細胞の自己複製、腫瘍形成能及び治療耐性における役割を持つ。炎症及び腫瘍形成のシグナル伝達に対応した固有の集合点として、ＳＴＡＴ３は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）などの、悪性細胞及び腫瘍関連免疫細胞の両方で活性化される。このＭＤＳＣｓは、前立腺がんの進行と乏しい患者生存において重要な役割を果たす、未熟及び強力な免疫抑制性骨髄細胞の異種集団である。ＴＬＲ９＋  顆粒球ＭＤＳＣｓ（Ｇ−ＭＤＳＣｓ、Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ１４−ＣＤ１５ＨＩＣＤ３３ＬＯ）は、転移性／去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）に局在化した、その疾患の進行中に、前立腺がん患者の血液中に蓄積された、高度に活性化されたＳＴＡＴ３を伴う細胞の集団である。実施形態において、この戦略は、例えば、骨髄性免疫細胞及び  Ｂリンパ球などの腫瘍微小環境におけるＴＬＲ９＋細胞において、標的となる遺伝子を抑制するためである。実施形態において、前立腺がん及び膠芽細胞腫などの固形腫瘍における、ＴＬＲ９陽性の血液悪性腫瘍及びがん幹様細胞が治療される。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、免疫応答を刺激することなく、悪性細胞及び／または腫瘍関連免疫細胞、例えば、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）において抑制される。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、同時に免疫応答を刺激しながら、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）において抑制され、それによってＣＲＰＣが治療される。
【０１９０】
免疫応答を刺激することのない、がんの治療
本開示は、治療が必要な対象において、免疫応答を刺激することなく、がんを治療する方法を提供し、その方法は、例えば、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、ｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）の１つ、または例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物を含む、化合物または医薬組成物の有効量をその対象に投与することを含む。
【０１９１】
実施形態において、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ａＲＮＡ  （配列番号３〜４）、ｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）の１つ、または例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物を含む当該化合物または医薬組成物は、がんを治療するために免疫応答を刺激することなく、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、その対象へ投与される。
【０１９２】
本開示は、同時に免疫原性効果を誘発すること無く、細胞においてＣ／ＥＢＰα、ｐ２１、及び／またはｐ５３の発現を増強する方法を提供し、その方法は、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１  ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、及びｐ５３  ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）のそれぞれの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物の、化合物または医薬組成物の有効量を、その細胞に接触させることを含む。本開示は、同時に免疫応答を誘発すること無く、制御不能の細胞成長及び／または増殖を阻害する方法を提供し、ＣＥＢＰＡ・ｓａＲＮＡ（配列番号１〜２）、ｐ２１・ｓａＲＮＡ（配列番号３〜４）、及びｐ５３・ｓａＲＮＡ（  配列番号５〜６）のそれぞれの１つ、または例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ・ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物の、化合物または医薬組成物の有効量を、その細胞に接触させることを含む。本開示は、同時に免疫応答を誘発すること無く、細胞におけるＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させる方法を提供し、例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの、化合物または医薬組成物の有効量を、その細胞に接触させることを含む。実施形態において、本開示は、免疫応答を誘発することなく、例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物で、細胞、例えば、ＳＴＡＳＴにおける、制御されない細胞成長及び／または増殖を阻害し、及び／またはＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させ、がんを治療する方法を提供する。例えば、当該方法には、免疫応答を誘発しない、例えば、配列番号６１〜９５の化合物を投与することを含む。実施形態において、ＳＴＡＴ発現は、免疫応答を刺激することなく、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）において抑制され、それによってＣＲＰＣが治療される。
【０１９３】
腫瘍の微小環境内でのシグナル伝達クロストークの遮断
実施形態において、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のコンジュゲート、種々の化学的に修飾された、及びヌクレアーゼ耐性のＳＴＡＴ  ＡＳＯ配列、例えば、ＣｐＧ／ＧｐＣ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯを有する、合成ＴＬＲ９リガンドが生成される（例えば、配列番号４３〜９５）（表１、２、及び４、ならびに図９Ａ）。実施形態において、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のコンジュゲート、種々の化学的に修飾された、及びヌクレアーゼ耐性のＳＴＡＴ  ＡＳＯ配列、例えば、ＣｐＧ／ＧｐＣ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯを有する、合成ＴＬＲ９リガンド（例えば、配列番号４３〜９５）が、ＴＬＲ９＋細胞に投与される。実施形態において、ＣｐＧ／ＧｐＣオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のコンジュゲート、種々の化学的に修飾された、及びヌクレアーゼ耐性のＳＴＡＴ  ＡＳＯ配列、例えば、ＣｐＧ／ＧｐＣ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯを有する、合成ＴＬＲ９リガンド（例えば、配列番号４３〜９５）が、対象に投与される。実施形態において、このＣｐＧ  ＯＤＮの、ＳＴＡＴ  ＡＳＯ、例えば、ＣｐＧ／ＧｐＣ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯへの連結が、標的ＴＬＲ９＋細胞による迅速な内在化を可能にする。実施形態において、このＣｐＧ  ＯＤＮの、ＳＴＡＴ  ＡＳＯ、例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯへの連結が、１時間以内のインキュベーション（例えば、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、５０分、５５分、または６０分）で、標的ＴＬＲ９＋細胞による迅速な内在化を可能にする。ＴＬＲ９＋細胞には、ヒト及びマウス免疫細胞、ならびに前立腺がん細胞を含む（図１０Ａ〜１０Ｂ、及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。実施形態において、ヒト及びマウス骨髄性免疫細胞による、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ  ＡＳＯ、例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（配列番号４３〜６０）の取り込みは、５０ｎＭまたはそれ以下の濃度（例えば、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、または５０ｎＭ）で、検出可能である（図１０Ａ〜１０Ｂ、及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ  ＡＳＯ、例えば、ＣｐＧ／ＧｐＣ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（配列番号４３〜９５）の細胞内への取り込みは、共焦点顕微鏡を用いて検証される。実施形態において、当該コンジュゲートは、培養培地にそれを添加後の１５分以内（例えば、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１２分、または１５分）に、標的細胞の細胞質において、検出可能である（図１２Ａ〜１２Ｂ）。これらのコンジュゲートの効率的な取り込みは、２４時間以内のインキュベーションを伴った、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞におけるＳＴＡＴ３ノックダウンの効能向上に対応しており、しばしば、それぞれＡＳＯ単独の効果を超えていた（図１３Ａ〜１３Ｂ）。実施形態において、ＡＳＯのＴＬＲ９を活性化しないＧｐＣ／ＯＤＮへのコンジュゲート  （ＧｐＣ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ、例えば、配列番号６１〜７７）はまた、ＳＴＡＴ３発現を強力に阻害する（図１３Ａ〜１３Ｂ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０）は、非��ンジュゲートのＳＴＡＴ３ＡＳＯと比較して、ｍＲＮＡ（図１３Ｃ）及びタンパク質（図１３Ｄ）の両方におけるＳＴＡＴ３のノックダウンの、より迅速な誘発を示す。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴＡＳＯ、例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の内在化及び標的のノックダウンは、グリオーマ及び小膠細胞細胞において、同様に有効である（図１７Ａ〜１７Ｃ）。実施形態において、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独、または対照としてのＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ  ＡＳＯコンジュゲート、例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０）は、細胞において細胞死を誘発する（図１４Ａ〜１４Ｂ）。実施形態において、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独、または対照としてのＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲート（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、培養の２４時間以内（例えば、３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、５時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間）に、細胞において細胞死を誘発する。実施形態において、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独、または対照としてのＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲート（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、オリゴヌクレオチドの存在下で、培養の２４時間以内に、細胞において細胞死を誘発する。実施形態において、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独、または対照としてのＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯコンジュゲート（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、１〜１０００ｎＭ（例えば、５００ｎＭ）濃度でのオリゴヌクレオチドの存在下で、培養の２４時間以内に、細胞において細胞死を誘発する。実施形態において、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独、または対照としてのＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲート（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドの存在下で、培養の２４時間以内に、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞において細胞死を誘発する。
【０１９４】
実施形態において、改善されたヌクレアーゼ耐性のＣｐＧ  ＡＳＯｓ（例えば、配列番号６１〜９５）は、全身投与、及びＴＬＲ９＋細胞の標的化を可能にする（図１５Ａ〜１５Ｃ、及び図１８Ａ〜１８Ｃ）。実施形態において、改善されたヌクレアーゼ耐性のＣｐＧ  ＡＳＯｓ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、全身投与、及び遠位臓器（例えば、脾臓または骨髄）において、ＴＬＲ９＋細胞の標的化を可能にする。実施形態において、蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の１回の静脈内（ＩＶ）注入は、骨髄性細胞の大部分に、コンジュゲートを送達するのに適している（図１５Ａ〜１５Ｃ）。実施形態において、蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の１回の静脈内（ＩＶ）注入は、骨髄において、骨髄性細胞の５０％またはそれ以上（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）に送達するのに適している。実施形態において、蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の１回の静脈内（ＩＶ）注入は、樹状細胞を含む末梢リンパ節において、骨髄性細胞のかなりの部分（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上）に送達するのに適している。実施形態において、蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の静脈内（ＩＶ）注入の繰り返し投与は、脳限局性のグリオーマ瘍において、骨髄性細胞のかなりの割合（例えば、ＭＤＳＣｓの２０％、２５％、または３０％）への浸透を可能にする。実施形態において、蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の１回の局所静脈内（ＩＶ）注入の投与は、その腫瘍微小環境へのほぼ完全な浸透（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．５）を可能にする。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の投与は、ＴＬＲ９＋の悪性腫瘍に対して有効に活用される。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、標的遺伝子ノックダウン及び細胞毒性を増強する（図１６Ａ〜１６Ｃ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、遠位の未処理箇所において、腫瘍サイズを低減する（図１９Ａ）。実施形態において、遠位におけるＳＴＡＴ３発現の低減は、注入部位からのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の放出による、全身性の効果と相関している（図１９Ｂ及び図１９Ｅ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）を使用した治療は、ＳＴＡＴ３及びＰＤ−Ｌ１の免疫チェックポイント分子の発現を低減する（図１９Ｃ〜１９Ｄ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）を使用した治療は、遠位の腫瘍部位での骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓにおいて、ＳＴＡＴ３及びＰＤ−��１の免疫チェックポイント分子の発現を低減する。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）は、全身に投与される（図２０Ａ〜２０Ｂ）。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）の投与経路は、ＩＰ（腹腔内）、ＰＯ（経口）、またはＩＶ（静脈内）であってよい。実施形態において、当該投与経路は、経皮、皮下、筋肉内、髄腔内、眼内、鼻腔内、経粘膜、唇の下、送気、腸内、坐剤、動脈内、関節内、脳内、頭蓋内、硝子体内、または脛骨内である。実施形態において、対象は、０．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）を、毎日、静脈内注入されて治療される。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）による治療は、腫瘍の完全退縮を誘発する。実施形態において、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ（例えば、配列番号４３〜６０、７８〜８６）による治療は、限局性腫瘍（例えば、骨、脾臓、膀胱、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、結腸、リンパ節、肺、脳、腎臓、肝臓、胃、大腸、小腸、食道、脊椎、頭、首、皮膚、または心臓）の完全退縮を誘発する。実施形態において、ヌクレアーゼ耐性のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ阻害物質は、播種性ＴＬＲ９＋細胞において、及び寛容原性の腫瘍関連細胞において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の同時標的化を可能にする（図２１）。実施形態において、ヌクレアーゼ耐性のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ阻害物質は、播種性ＴＬＲ９＋細胞において、及び寛容原性の腫瘍関連細胞（例えば、マクロファージ、小膠細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＭＤＳＣｓ）において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の同時標的化を可能にする。実施形態において、当該腫瘍微小環境内での、シグナルク伝達クロストークの遮断は、がんの治療に有効である。
【０１９５】
自己免疫疾患及び／または障害の治療方法
１つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発することなく、本開示の化合物及び／または組成物を用いて、自己免疫疾患及び／または障害を治療する方法を包含する。実施形態において、当該方法は、免疫原性効果を誘発することなく、本開示の化合物及び／または組成物を用いた、骨髄性細胞における遺伝子の抑制を包含する。実施形態において、この骨髄性細胞は、腫瘍の微小環境内にあり、自己免疫疾患及び／または障害、もしくはがん（例えば、前立腺がん）に関与している。
【０１９６】
実施形態において、当該方法は、免疫原性効果を誘発することことのない本開示の化合物及び／または組成物を用いた、自己免疫疾患及び／または障害（例えば、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））の治療を包含する。実施形態において、当該方法は、免疫原性効果を誘発することのない、本開示の化合物及び／または組成物を用いた骨髄細胞における遺伝子の抑制を包含する。
【０１９７】
本開示は、治療が必要な対象において、免疫応答を刺激することなく、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））を治療する方法を提供し、その方法は、例えば、配列番号３１〜４２、及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物を含む、化合物または医薬組成物の有効量を、その対象に投与することを包含する。
【０１９８】
本開示は、細胞を、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物または医薬組成物の有効量に接触させることを含んで、同時に免疫応答を誘発することなく、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））を治療する方法を提供する。実施形態において、本開示は、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つ  に連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物を用いて、免疫応答を誘発することなく、細胞、例えば、ＳＴＡＴ１〜ＳＴＡＴ５において、制御不能な細胞成長及び／または増殖を阻害し、及び／またはＳＴＡＴ転写因子の活性を低減して、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））を治療する方法を提供する。例えば、その方法には、免疫応答を誘発しない、例えば、配列番号６１〜９５の化合物を投与することを包含する。
【０１９９】
実施形態において、本開示は、細胞を、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物または医薬組成物の有効量に接触させることを含んで、同時に免疫応答を誘発することなく、クローン病を治療する方法を提供する。実施形態において、本開示は、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つ  に連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物または医薬組成物で、免疫応答を誘発することなく、クローン病を治療する方法を提供する。例えば、その方法には、免疫応答を誘発しない、例えば、配列番号６１〜９５の化合物を投与することを包含する。
【０２００】
対まひの治療法
１つの態様において、本開示は、免疫原性効果を誘発するかまたはせずに、本開示の化合物及び／または組成物を投与することにより、治療が必要な対象において、対まひを治療する方法を提供する。実施形態において、当該方法は、免疫原性効果を誘発するかまたはせずに、本開示の化合物及び／または組成物で、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）において、遺伝子を抑制することを包含する。
【０２０１】
本開示は、治療が必要な対象において、免疫応答を刺激することなく、対まひを治療する方法を提供し、その方法は、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の、ＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つに連結された、例えば、配列番号２９〜３０の１つの化合物を含む化合物または医薬組成物の有効量を、その対象に投与することを包含する。
【０２０２】
本開示は、例えば、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３の１つに連結された、例えば、配列番号７〜１８及び９８〜１０１の１つのホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の化合物または医薬組成物の有効量を用いて、同時に免疫応答を誘発しながら、対まひを治療する方法を提供する。
【０２０３】
リンカーの合成及び修飾法
実施形態において、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ、センス鎖）及びＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ、アンチセンス鎖）は、４ステップを含むサイクルを用いて、合成されてよい。ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ）及びＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ）の完全な合成、脱保護、精製及び脱塩の後、本開示のＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ／ＡＳ）の化合物を作成するために、その２成分は、アニールされてよい。
【０２０４】
当該合成の開始点は、ポリスチレンベースの固相担体に、その３’酸素を介して連結された、保護されたヌクレオシドであってよい。この合成には、ヌクレオシドのホスホロアミダイトケミストリーを用いることができる。この合成サイクルには、（１）５’ヒドロキシル基の脱保護（脱トリチル化）、（２）ヌクレオチドホスホロアミダイトの、５’ヒドロキシル基ヘのカップリング、（３）未反応５’ヒドロキシル基のキャッピング、（４）酸化＊の４ステップが含まれてよい。＊ステップ（４）は、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの合成に対応した、硫化ステップで置き換えることができる。
【０２０５】
これらの４ステップは、全てのヌクレオチド成分が添加されるまで、上記の順番で繰り返すことができる。
【０２０６】
この合成経路は、以下のスキーム１に示され得る。
【化１０】
2018519831.tif 000022
スキーム１。
【０２０７】
この合成プロセスのさらに詳細は、本開示の実施例２に記載される。
【０２０８】
実施形態において、当該ヘテロアルキレンリンカーは、その合成が完了した後、及びそのオリゴヌクレオチドが、なおその担体に接合している間に、さらなる修飾、コンジュゲート、または追加部分の接合を可能にする。
【０２０９】
実施形態において、本開示は、置換されたヘテロアルキレンリンカーを有するｓａＲＮＡにコンジュゲートした、ＣｐＧ核酸配列を含み、その合成及びそのオリゴヌクレオチドが、担体に接合している間に、さらなる修飾、コンジュゲート、または接合を可能にすることができる。
【０２１０】
実施形態において、当該置換されたヘテロアルキレンリンカーは、置換基へ修飾、コンジュゲート、または接合される。修飾には、元の置換基の異なる置換基への転換を含んでよい。例えば、ブロモアルカン置換基は、アジドアルカンへ転換されてよい。コンジュゲートは、２つの大きな部分の結合をもたらすことができる。例えば、ＮＨＳ誘導体は、ＰＥＧ−ＮＨ２とコンジュゲートされ得る。ペプチドもまた、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得て、または抗体は、オリゴヌクレオチドへコンジュゲートされてよい。接合は、小分子の大きな分子への結合をもたらし得る。例えば、ビオチンのＮＨＳエステルは、オリゴのアミノ誘導体に接合されてよい。
【０２１１】
実施形態において、本開示は、複数の異なるリンカー、複数の同一のリンカー、または以下の群から選択されるリンカーの置換を有するｓａＲＮＡにコンジュゲートした、ＣｐＧ核酸配列を含む。
ＮＨＳエステルならびにジビニルスルホンと、その類似体との反応により、機能化のためにさらに使用できる、Ｆｍｏｃアミノ変性Ｃ６・ｄＴ（アミノ基の導入）。
【化１１】
2018519831.tif 000023
ジビニルスルホンとアクリル類似体との反応により、機能化のためにさらに使用できる、Ｓ−Ｂｚ−チオール変性Ｃ６−ｄＴ（スルフヒドリル基の導入）。
【化１２】
2018519831.tif 000024
ＮＨＳエステルならびにジビニルスルホンと、その類似体との反応により、機能化のためにさらに使用できる、アミノ変性セリノールホスホロアミダイト（アミノ基の導入）。
【化１３】
2018519831.tif 000025
アジド反応物との機能化のためにさらに使用できる、ＤＢＣＯ−ｄＴ（アルキン、銅を含まないクリックケミストリーの導入）。
【化１４】
2018519831.tif 000026
ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（アミノ基との反応による、アルキン、銅を含まないクリックケミストリーの導入）。
【化１５】
2018519831.tif 000027
【実施例】
【０２１２】
実施例１：材料及び方法
ＣｐＧ−ＣＥＢＰα−ｓａＲＮＡの取り込み。１Ｘ１０５個の細胞を、指示されたｓａＲＮＡ（５００μＭ、最終濃度）と共に、５００μｌの培地でインキュベートした。３時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣｓを、抗ＣＤ１４抗体及び抗ＣＤ１９抗体で染色し、異なる細胞種による取り込みを評価した。Ｃｙ３の取り込みレベルを、フローサイトメトリーで解析した。
【０２１３】
ＤＵ１４５におけるＣｐＧ−ｓａＲＮＡ（−Ｃｙ３）の局在化。１Ｘ１０５  個のＤＵ１４５細胞を、２４ウェルプレートのカバースリップ上に移植した。細胞が、約６０％に密集した時点で、Ｃｙ３−標識化ＣｐＧ−ｓａＲＮＡコンジュゲートを、最終濃度が５００μＭで、その培養物に添加した。トランスフェクションの２時間または２４時間後に、細胞を、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭのＣａＣｌ２  を含むＰＢＳで穏やかに洗浄し、ならびに室温で２０分間、０．２５ｍｌの２％パラホルムアルデヒドで固定した。次に細胞を、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭのＣａＣｌ２  を含むＰＢＳで一度洗浄し、ならびに室温で１０分間、０．１％のトリトンＸ−１００で透過処理した。次いで細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５００ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて染色し、及び１０μｌのＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  に封入した。ＣｐＧ−ｓａＲＮＡの局在化を、共焦点顕微鏡により評価した。
【０２１４】
定量リアルタイムＰＣＲｓによる、ＣＥＢＰａ誘発の評価。１Ｘ１０５  個の細胞を、２４ウェルプレートの５００μｌの培地に移植し、及び特に指定のない限り２４時間毎に、５００μＭの最終濃度で、指定されたＲＮＡオリゴを用いてトランスフェクションした。非ＣｐＧコンジュゲートオリゴのトランスフェクションに対して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の５０ｎＭのｓａＲＮＡを、室温で２０分間、リポフェクトアミン２０００（１対１００希釈）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１６６８−０２７）と共にインキュベートし、及び１００μｌの脂質−ｓａＲＮＡ複合体を添加した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞からの全ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を、逆転写に使用した。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を、Ｔａｑｍａｎの定量リアルタイムＰＣＲに使用し、及び結果を、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）で定量化した。ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡ発現レベルを、ＴＢＰ発現に正規化した。ヒトＣＥＢＰＡに使用されたプライマー配列は、（フォワードプライマー）５’−ｇａｃａｔｃａｇｃｇｃｃｔａｃａｔｃｇ−３’、（リバースプライマー）５’−ｇｇｃｔｇｔｇｃｔｇｇａａｃａｇｇｔ−３’であった。
【０２１５】
ＣＥＢＰレポーターアッセイ。ＣＥＢＰレポーターアッセイを、製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  ＣＣＳ−００１Ｌ）に従って実施した。簡単に説明すると、ウェル当たり４Ｘ１０４個のＤＵ１４５細胞を、２．５％のＦＣＳだけを補充したＲＰＭＩの１５０μｌ容量で、９６ウェルプレートに播種した。０．６μｌのリポフェクトアミン２０００、１μｌのルシフェラーゼ、または対照のプラスミド、及び非ＣｐＧコンジュゲート化ｓａＲＮＡ（最終濃度５０μＭ）を、５０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。ルシフェラーゼ、または対照のプラスミドを、一度だけトランスフェクションした。５０μｌのＲＰＭＩ培地のＣｐＧコンジュゲートｓａＲＮＡを、最終濃度５００μＭで、２４時間毎に、ウェルに直接追加した。３日後、細胞を穏やかにＰＢＳで洗浄し、及び５０μｌのパッシブ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４Ａ）を、各ウェルに直接追加した。次に、その溶解物を、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９１０）を伴った、ウミシイタケ／ホタルのデュアルルシフェラーゼアッセイに対して、ホワイトの９６ウェルのＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）へトランスフェクションした。次に、そのプレートを、ホタルルシフェラーゼに対して、及び次いでウミシイタケルシフェラーゼに対して測定した。値を、未処理サンプルの活性に対して正規化した。この実験は、３通りで実施した。
【０２１６】
ＭＶ４；１１  成熟化。１Ｘ１０５個のＭＶ４−１１細胞を、リポフェクトアミン２０００だけを用いて、一度トランスフェクションしたＳＳ／ＡＳを除いて、２４時間毎に、指示されたｓａｒＮＡ（終濃度が５００μＭ）でトランスフェクションした。９６時間後に、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、及び生存性マーカーとしての、ｈＣＤ８６（ＦＩＴＣ）、ｈＣＤ４０（ＰＥ）、ＨＬＡＤＲ（ＡＰＣ）及び  ７−ＡＡＤに特異的な抗体で染色した。発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定した。
【０２１７】
Ｃｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ誘発マウス白血病モデルの発達。Ｃｂｆｂ１／５６Ｍ／Ｍｘ−Ｃｒｅ１マウスを、１０世代を超えて、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し、同系ＡＭＬモデルを生み出した。コア結合因子β−平滑筋ミオシン重鎖の、ポリイノシン−ポリシチジル酸誘発（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の発現の２週間後に、トロンボポエチン受容体及びＧＦＰ遺伝子をコードする、レトロウイルスＭＩＧ−Ｍｐｌベクターで形質導入し、移植可能なＣｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ１マウスのＡＭＬを作り出した。
【０２１８】
インビボ実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から受け入れた。動物の処置／手順を、確立されている制度上の指導、及びＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＯＨ）から、承認されたプロトコルに従って実施した。リン酸緩衝生理食塩水中の、１Ｘ１０６個のＣｂｆｂ／ＭＹＨ１１／Ｍｐｌ１のＡＭＬ細胞を、後眼窩注入を介して注入した。
【０２１９】
用量試験に対して、血液中のＡＭＬ細胞レベルが  １％を超えた場合、骨髄に存在するＡＭＬ細胞の１０％〜２０％に相当するが、ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡまたはＣｐＧ−ＦＬＵＣ−ＲＮＡの多様な用量の、１、２．５、または５ｍｇ／ｋｇを、後眼窩注入を介して投与し、及び１日おきに、その尾から、血液を抜き出して、注入以降に循環しているｃ−キット＋／ＧＦＰ＋をモニターした（グループ当たり３〜４匹のマウス）。そのマウスを、３回目の処置後の１日で安楽死させ、及び脾臓と骨髄における、ｃ−キット＋／ＧＦＰ＋の％を、フローサイトメトリーにより解析した。
【０２２０】
ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡの抗腫瘍効果を試験するために、ＰＢＬ中のＧＦＰ＋ＡＭＬの％が、１〜５％に達した時点で、ＰＢＳ（２００μｌ）、ＣｐＧ−ＦＬＵＣ  ＲＮＡ（２００μｌ中に５ｍｇ／ｋｇ）、またはＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（２００μｌ中に５ｍｇ／ｋｇ）を、後眼窩注入により、１日おきに５回、注入した（６〜８匹のマウス／群）。処置の過程で、ＰＢＬを、尾からの出血により取得し、及び１日おきに、ＡＭＬ組織量を、フローサイトメトリーで解析した（ＧＦＰ及び７ＡＡＤ）。このマウスを、５回目の処置後の１日で安楽死させ、及び脾臓ならびに骨髄を、その後の分析のために採取した。
【０２２１】
ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの設計及び合成。当該ＣｐＧ−ＡＳＯｓを、従来記載されているように（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００９）、ＣｐＧ（Ｄ１９）−ＯＤＮをＳｔａｔ３またはスクランブル化ＡＳＯｓへ連結することにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成コア（ＣＯＨ）中で、合成した。
【０２２２】
細胞。健康的なＰＢＭＣｓを、ＣｏＨのＤｏｎｏｒ  Ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒからの、ＩＲＢ＃１３３７８で管理下の匿名ドナーから誘導した。サンプルの取得は、ヘルシンキ宣言に従って、ＣｏＨ機関レビュー委員会によって承認された。ヒトＰＣ３及びＤＵ−１４５の前立腺がん細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
【０２２３】
フローサイトメトリー。がん細胞株及び免疫細胞の細胞外染色に対して、単一細胞の懸濁液を、非特異的な結合をブロックするために、ＦｃγＩＩＩ／ＩＩＲ特異的抗体でインキュベートし、及び次いで、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３０３ａ、Ｆ４／８０、ＧＲ１、Ｂ２２０及びＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する、蛍光色素標識化の抗体の異なる組合せを用いて、染色した。アポトーシス細胞死を、アネキシンＶアッセイにより決定した。蛍光色素データを、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で収集し、及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【０２２４】
生体内分布。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を、ｔｈｅ  ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３Ｃｙ３を静脈内に注入し、及び３時間後に安楽死させた。そのリンパ節及び骨髄を採取した。単一の細胞懸濁液を、機械的な組織分散及び記載されている（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ２００５）ようなコラゲナーゼ  Ｄ／ＤＮａｓｅＩ処理によって調製し、及びＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃ及びＦ４／８０抗体を使用して染色した。異なる集団による取り込みを、フローサイトメトリーにより評価した。
【０２２５】
定量リアルライムＰＣＲ。全ＲＮＡを、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）システムＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、培養またはインビボで増殖した腫瘍細胞から抽出し、及び次いで、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ｃＤＮＡｓに転写した。遺伝子発現を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ、Ｒｏｃｈｅ）、及びＳＴＡＴ３（フォワード５’−ＣＴＧＣＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＣ−３’、及びリバース５’−ＣＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＣ−３’）に対して、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）を用いて設計されたプライマーの特定ペア、ならびにＲｏｃｈｅのリファレンス遺伝子アッセイを用いたＴＢＰを利用して、解析した。配列に特異的な増幅を、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム  (Ｂｉｏ−Ｒａｄ)  で、解析した。そのデータを、ＴＢＰレベルに対し正規化し、及びその相対遺伝子発現レベルを、２−△△Ｃｔ法を用いて、算出した。
【０２２６】
共焦点顕微鏡。ＤＵ−１４５細胞を、異なる時点に対して標識化された、５００ｎＭの  ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ  Ｃｙ３を使用して処置した。細胞を、２０分間、２％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中で透過処理し、及びその核酸を、５分間、ＤＲＡＱ５（登録商標）を使用して染色した。スライドを、封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）  に封入した。共焦点画像処理を、ｃＬＳＭ５１０−Ｍｅｔａ倒立型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）  の、水浸対物レンズＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ４０Ｘ／１．２を使用して、実施した。画像取得に対して、ＬＳＭソフトウェアｖ．４．２  ＳＰ１を、及び取得後解析に対して、ＬＳＭ画像ブラウザｖ．４，２，０１２１（Ｚｅｉｓｓ）を使用した。
【０２２７】
統計解析。対応のないｔ検定を利用し、両側Ｐ値を計算し、  ２つの処置群間の差異の統計的有意性を推定した。一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡに加えて、Ｂｏｎｆｅｅｒｒｏｎｉのポスト試験を適用し、複数のグループ間、または腫瘍成長の動力学実験での、それぞれの違いを評価した。統計的に有意なＰ値を、＊  ＊  ＊は、ｐ＜０．００１、＊  ＊は、ｐ＜０．０１、及び＊は、ｐ＜０．０５のように数字で示した。データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて解析した。
【０２２８】
実施例２：当該ＣｐＧ−ｓａＲＮＡ合成の製造プロセス
ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ、センス鎖）及び  ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ、アンチセンス鎖）を、以下のセクションで説明するように、４ステップから成るサイクルを用いて合成した。ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ）及びＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ）の完全な合成、脱保護、精製及び脱塩後に、その２つの化合物をアニールし、薬剤製品ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ／ＡＳ）を作成した。
【０２２９】
この合成の開始点は、ポリスチレンベースの固相担体に、その３’酸素を介して連結された、保護されたヌクレオシドであった。この合成には、ヌクレオシドのホスホロアミダイトケミストリーを用いた。当該合成サイクルは、（１）５’ヒドロキシル基の脱保護（脱トリチル化）、（２）ヌクレオチドホスホロアミダイトの、５’ヒドロキシル基ヘのカップリング、（３）未反応５’ヒドロキシル基のキャッピング、（４）酸化＊の４ステップから成る。＊ステップ（４）は、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの合成のために、硫化ステップで置き換えることができる。
【０２３０】
これらの４ステップを、全てのヌクレオチド成分が添加されるまで、上記の順番で繰り返した。
【０２３１】
この合成経路を、本開示のスキーム１に示す（前述を参照）。
【０２３２】
製造の第一段階（脱保護及びＨＰＬＣ精製まで）を、ＧＥ、８００  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ  ０８８５５−１３２７からの、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００及びＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒを使用して、実施した。
【０２３３】
脱トリチル化
当該合成サイクルの第１ステップにおいて、その担体結合モノマーの酸不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を、トルエン中のジクロロ酸（ＤＣＡ）の５％溶液で除去した。得られたＤＭＴカチオン発色を定量し、当該合成サイクルのカップリング効率を決定した。オレンジ色は、開裂したＤＭＴカルボカチオンによって生成され、４９５ｎｍで、可視部分で吸収された。この吸光度の強度を、カップリング効率を決定するために利用した。ほとんどの市販のＤＮＡシンセサイザーは、各サイクルに対応した脱トリチル化の収率を測定し、及び記録するハードウェアを持ち、そのため合成の効率が、リアルタイムで監視できるようになっている。そのＤＮＡ塩基は、酸に不安定なので、脱トリチル化のステップは、完全な脱トリチル化を保証する必要があるときのみ必要である。
【０２３４】
ＣｐＧ−ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＳＳ）の合成を、第１の３’末端ヌクレオシド、すでに固相担体に結合している２’−Ｏ−メチルウリジンで開始した。この合成に用いた固相担体は、Ｐｒｉｍｅ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓからのＬＣＡＡ−ＣＰＧ担体であった。第１のヌクレオシドを、３つの炭素リンカー及びコハク酸結合を介して、担体に接合した。０．７５ミリモルスケールでの合成には、９２ｍＬのサイズのカラムに収めた、１９．００ｇの担体が必要であった。この反応からの生成物は、１３ｇの質量増加をするはずであった。
【０２３５】
ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ）の合成に用いられる固相担体は、Ｐｒｉｍｅ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓからのＬＣＡＡ−ＣＰＧであった。０．７５ミリモルスケールのＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡ（ＡＳ）の合成には、４６ｍＬのサイズのカラムに収められた、９．５ｇの担体が必要であった。この反応からの生成物は、１１ｇの質量増加をする。  
【０２３６】
カップリング
脱トリチル化後に、次に保護されたホスホロアミダイトを、その反応カラムに送達した。エチルチオテトラゾールを使用し、そのホスホロアミダイトを活性化した。２つの試薬を、その反応カラムへ送達する直前に混合した。エチルチオテトラゾール、弱酸、プロトン化したそのホスホロアミダイトの第三窒素基、及びそのジイソプロピルアミン・部分が、良好な離脱基となった。
【０２３７】
このカップリング機構は、取り込まれた活性化モノマーの３’−Ｏ−リン上の、遊離した５’−ヒドロキシル基による求核攻撃であった。この理由から、カラム内の全く水酸基のない環境を維持することが、重要であった。これを保証するために、一般溶剤として乾燥アセトニトリルを用い、及び全ての試薬ならびに溶媒を、無水状態に維持した。これらの条件下で、カップリングの効率は非常に高く、それにより長いオリゴヌクレオチドの合成が可能になった。
【０２３８】
カップリング条件
ホスホロアミダイトを、無水アセトニトリル、ＡＣＮ（０．１７５Ｍ）、活性化因子のエチルチオテトラゾール、ＥＴＴ（無水ＡＣＮ中に、０．６ＭＭ）に溶解した。２．５当量（ｅｑ）のデオキシホスホロアミダイト、２．５当量のプロパンジオールリンカーのホスホロアミダイト、及び３．０当量のリボホスホロアミダイトを使用した。ＤＮＡ及びプロパンジオールに対するリサイクル時間は、３．５分、ＲＮＡに対しては、１２．５０分、及びリボグアノシンに対しては、１２．００分であった。  活性化因子対ホスホロアミダイトのｖ／ｖ比は、３対２である。カップリングを、室温（２２〜２４℃）で実施した。
【０２３９】
キャッピング
これらの効率測定にもかかわらず、この担体に結合されたヌクレオシドの、５’ヒドロキシル基の僅かな割合が、取り込まれた活性化モノマーにカップリングしなかった。生成物の削除を最小にするために、それらを不活性状態にして、及び精製プロセスを簡素化した。通常、ピリジン及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはＡＣＮに溶解した、無水酢酸及び１−メチルイミダゾールは、延長されない５’−ヒドロキシルを「キャップ」する、アシル化剤を生成するように作用する。この５’−アセチルエステルは、すべての後続のサイクルで非反応性としてキャップされ、及び最終的なアンモニア脱保護ステップ中に除去された。キャッピングに続く、追加のＡＣＮ洗浄で、合成収率が増加した。
【０２４０】
キャッピング条件
ＣＡＰ  Ａは、無水ＡＣＮ中の、２０％１−メチル−イミダゾール溶液であり、ＣＡＰ  Ｂは、使用前に、ＣＡＰ  Ｂ１とＣＡＰ  Ｂ２の等容量を混合して作成したものであり、ここでＣＡＰ  Ｂ１は、無水ＡＣＮ中の、４０％無水酢酸溶液、及びＣＡＰ  Ｂ２は、無水ＡＣＮ中の６０％２，６−ルチジン溶液であった。
【０２４１】
酸化
カップリング及びキャッピングの後、そのヌクレオチド間連結は、不安定な三価の亜リン酸トリエステルであって、及びリン酸トリエステルへの酸化が必要である。このステップは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成のためには硫化ステップで置き換えることができる。
【０２４２】
酸化条件
酸化を、ピリジン対水が９対１の水溶液中の、０．０５Ｍのヨウ素溶液で実施した。酸化硫化を、無水ピリジン中の、０．３Ｍのキサンタン水素化物溶液で実施した。
【０２４３】
最終脱トリチル化
最終脱トリチル化を、トルエン中５％ＤＣＡ溶液で洗浄することにより、シンセサイザー上で実施する。
【０２４４】
担体の除去及び脱保護
特定の配列が構築された後、オリゴヌクレオチドは、その担体から除去（開裂）され、及び最終的には、使用前に脱保護される必要がある。合成後に、樹脂を、ＡＣＮ中の２０％ジエチルアミン（ＤＥＡ）溶液で処理し、そのシアノエチル基のβ除去によりリンを脱保護した。５５℃で６０分の、６００ｍＬのメチルアミン−アンモニウム水酸化物混合液（ＡＭＡ）での処理を行い、その担体から当該オリゴヌクレオチドを開裂し、及びその環外アミノ基の保護基を除去した。得られた混合物を、急速に氷中で冷却し、ろ過し、及びそのポリマー残基を、２００ｍＬのエタノール対水が１対１の水溶液で、２回洗浄した。得られた溶液を合わせて、容量フラスコに入れ、及び代表サンプルを採取し、２５８ｎｍの吸光度の測定により、その収率を推定した。その後、その溶液を、減圧下で速やかに、乾燥するまで蒸発させ、秤量した。
【０２４５】
ＡＭＡを用いた、この開裂及び脱保護の後、得られた粗混合物は、リボース残基上で依然としてその２’−ＴＢＤＭＳ保護が行われている、完全長のオリゴヌクレオチド、遊離の５’−ヒドロキシル末端を有する切断された失敗配列、及び脱保護の副産物（ベンズアミド、イソブチルアミド、アクリロニトリル、及びアセトアミド）を含んでいた。このＴＢＤＭＳ保護基を、塩基性フッ化物イオンによる、最終脱保護ステップで除去した。脱保護は、６０℃で１．５時間の、７００ｍＬのトリエチルアミントリヒドロフッ化物／トリエチルアミン／ＤＭＳＯが、１０対２対１の混合物での処理によって、実施した。その反応を次いで、周囲温度まで冷却し、３Ｌのアセトンと混合し、常温で一晩放置し、及び遠心分離した。その上澄み液を分離し、上清の代表サンプルを採取し（５Ｘ２０μＬ）、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、再溶解し、及び２５８ｎｍで、その吸光度を測定した。当該上清に、かなりの量の生成物が存在している場合は、さらに１，０００ｍＬのアセトンを添加し、及びその混合物を、さらに２時間、室温で保管した。最終の遠心分離後、その上清を廃棄し、及びペレットを、真空の常温下で、乾燥するまで保管した。
【０２４６】
ＲＮＡ合成
ＲＮＡの化学合成は、リボースの２’−ヒドロキシルでの付加的な保護基の必要性を除いて、ＤＮＡに使用される合成と同一であった。この位置は、通常、その合成中は安定している、ｔｅｒｔ−ブチルジメチル・シリル基で保護される。それらは、塩基性フッ化物イオンによって、最後の脱保護のステップで取り除かれた。その糖及び塩基の両方の残りの位置は、ＤＮＡと同じ方法で保護された。ＤＮＡ合成のプロトコルにおける複数の変数−そのカップリング時間、モノマーの受渡し速度、洗浄ステップの頻度−を調節することによって、最大９９％までの段階的カップリングの効率が得られた。  
【０２４７】
アニーリング
核酸の相補鎖をアニールするために、多数の方法を利用することができる。各ケースにおいて、その目標は、任意の二次構造を排除して、その相補鎖を変性し、及び次いで、その鎖をハイブリダイズ可能にすることである。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの効率に影響を与える、２つの要因は、塩濃度及び温度の低下速度である。アニーリングは、その温度が、変性後にゆっくり低下する場合に、特に、そのオリゴヌクレオチドが、高いＧＣ含有量を有するか、またはヘアピン構造を形成する場合に、最も効率的に起きる。核酸の相補鎖のアニーリングは、次の4つのステップを含んでいた。
１．濃縮した相補的なオリゴヌクレオチドを、１対１のモル比で、１，０００ｍＬのナシ型丸底フラスコ中で混合した。
２．オリゴヌクレオチドの混合物を、水で最終濃度に希釈した。
３．水浴を使用して、オリゴヌクレオチドをアニールした。
１，０００ｍＬの丸底フラスコ中のオリゴヌクレオチドを、８５℃の水浴中で、３．０分間、インキュベートした。
そのフラスコを、３７℃の水浴に移し、３０分間インキュベートした。
４．適切なトレイに注いだ。トレイを凍結乾燥器内に安置した。そのトレイを凍結し、及び凍結乾燥を続けた。
【０２４８】
プロセス制御
使用前に試薬の同一性を検証し、その合成の開始前に合成パラメータを検証した。カップリング効率を、非ブロック化ステップ後に得られた廃液の、ＤＭＴカチオンアッセイによってモニターした。そのＤＭＴ基は、そのオリゴヌクレオチドの５’末端でのヒドロキシル保護基であった。このＤＭＴアッセイは、自動化されたＤＮＡシンセサイザーの性能に、即時フィードバックをするのに有用であった。このＤＭＴカチオンを、その合成サイクルにおける、各々の脱トリチル化ステップで遊離させ、及びＵＶ吸光度測定により定量化した。当該合成のその他のパラメータとして、圧力、導電性、温度、試薬の流れ、担体と試薬の接触時間などもまた、リアルタイムで監視した。モニタリングの結果を、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  １００のＵｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって作成及び保存された、合成評価ファイルに取り込んだ。
【０２４９】
実施例３：転移性前立腺がんの免疫療法における、腫瘍形成及び免疫抑制シグナル伝達の阻害剤としての、標的型ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ
ＳＴＡＴ３を標的とする、がん免疫療法
ＳＴＡＴ３転写因子は、多面的ながん遺伝子であり、及びヒトのがんにおいて一般的に活性化される、免疫抑制のマスター調節因子である。広範な証拠が、進行性前立腺がんなどの腫瘍は、正常細胞とは異なり、その生存、血管新生、及び転位のために、ＳＴＡＴ３に高度に依存していることを、示唆している（ＭＯｒａ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．ＣＡＮＣＥＲ  Ｒｅｓ  ６２，６６５９−６６（２００２）、  Ｄｈｉｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ５１，２４１−６（２００２）、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０，３０３−９（２００４）、及びＨｅｄｖａｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １６，４８７−９７（２００９））。前立腺がんにおいて、ＳＴＡＴ３の活性化は、腫瘍の進行を、ホルモン難治性／去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）表現型、及び乏しい患者生存に向ける結果となる。ＳＴＡＴ３の活性は、多くの場合、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及び  ＮＦ-κＢシグナル伝達の下流で、ストレス及び炎症に応答して放出されるサイトカインによって引き起こされる。
【０２５０】
ＴＬＲ９／ＮＦ−κＢ／ＳＴＡＴ３のシグナル伝達軸は、前立腺がん細胞の自己複製、腫瘍形成能及び治療耐性において、役割を果たしている。炎症性及び腫瘍形成シグナル伝達に固有の、集合点としてのＳＴＡＴ３は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）などの、悪性細胞及び腫瘍関連免疫細胞の両方で活性化される。このＭＤＳＣｓは、前立腺がんの進行及び乏しい患者生存に、極めて重要な役割を果たす、未熟で、及び強力な免疫抑制性骨髄細胞の異種集団である。
【０２５１】
ＴＬＲ９＋  顆粒球ＭＤＳＣｓの集団（Ｇ−ＭＤＳＣｓ、Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ１４−ＣＤ１５ＨＩＣＤ３３ＬＯ）は、転移性／去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）への局在化からの疾患の進行中に、前立腺がん患者の血液中に蓄積する、非常に活性化されたＳＴＡＴ３を有する。Ｔ細胞増殖における、これらＧ−ＭＤＳＣｓの阻害効果は、ＳＴＡＴ３媒介のアルギナーゼ−１（ＡＲＧ−１）の発現に依存し、それによってＴ細胞の増殖及び活性を強力に阻害する。
【０２５２】
免疫及び前立腺がん細胞における、ＣｐＧ  ＯＤＮコンジュゲートの迅速な内在化
種々の化学的修飾及びヌクレアーゼ耐性のＳＴＡＴ３  ＡＳＯ配列を有する、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のコンジュゲート、合成のＴＬＲ９リガンドを生成した（表１〜４、及び図９Ａ〜９Ｃ）。このＣｐＧ  ＯＤＮのＳＴＡＴ３  ＡＳＯへの連結によって、ヒト及びマウスの免疫細胞などの標的ＴＬＲ９＋細胞、ならびにインキュベーションの１時間以内の前立腺がん細胞により、迅速な内在化が可能になった（それぞれ、図１０Ａ〜１０Ｂ（ヒト）、及び図１１Ａ〜１１Ｂ（マウス））。骨髄性免疫細胞によるＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの取り込みは、最低５０ｎＭ濃度でも、検出可能であった（図１０Ａ〜１０Ｂ、及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【０２５３】
ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの効率的な取り込み
ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの細胞内取り込みを、共焦点顕微鏡により検証した。図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、当該コンジュゲートは、培養培地にそれを添加した後の１５分以内に、標的細胞の細胞質において、検出可能であった。これらのコンジュゲートの効率的な取り込みは、しばしば、それぞれのＡＳＯ単独の効果を超えて、インキュベーションの２４時間以内のＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞における、ＳＴＡＴ３ノックダウンの改善された有効性に対応していた（図１３Ａ〜１３Ｄ）。ＴＬＲ９（ＧｐＣ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ）を活性化しない、ＡＳＯのＧｐＣ  ＯＤＮへのコンジュゲートはまた、ＳＴＡＴ３の発現を強く阻害した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。重要なのことに、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独または対照のＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮのいずれでもなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートだけが、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドの存在下で、培養の２４時間以内のＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞において、細胞死を誘発することが可能であった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
【０２５４】
遠位臓器における、ＴＬＲ９＋細胞の全身投与及び標的化を可能にした、ＣｐＧ−ＡＳＯのヌクレアーゼ耐性
改善されたＣｐＧ−ＡＳＯｓのヌクレアーゼ耐性は、脾臓または骨髄などの遠位臓器における、ＴＬＲ９＋細胞の全身投与及び標的化を可能にした（図１５Ａ〜１５Ｂ）。蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの１回の静脈内（ＩＶ）注入は、その骨髄において、骨髄細胞のかなりの部分に、及び末梢リンパ節において、ＤＣｓを含む、骨髄細胞の大部分に、当該コンジュゲートを送達した（図１５Ａ〜１５Ｂ）。ヒトＢ細胞のリンパ腫細胞における実験は、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ戦略が、標的遺伝子のノックダウン及び細胞毒性を高めて、その他のＴＬＲ９＋悪性腫瘍に対して利用できることを示唆した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。全体として、これらの結果は、新規のヌクレアーゼ耐性のＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ阻害剤は、播種性ＴＬＲ９＋前立腺がん細胞及びＭＤＳＣｓなどの、寛容原性の腫瘍関連免疫細胞における、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の同時標的化を可能にすることを示している。このような２つの戦略は、インビボで有効にする必要があり、  腫瘍の微小環境内のシグナル伝達のクロストークの遮断に焦点を当てた、標的化がん治療への、パラダイムシフト的な免疫療法アプローチを提供する。
【０２５５】
実施例４：ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの設計及び合成
当該ＣｐＧ−ＡＳＯｓを、前述のように、ＣｐＧ（Ｄ１９）−ＯＤＮを、Ｓｔａｔ３またはスクランブルＳＯｓに連結させることにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成コア（ＣＯＨ）中において、合成した（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００９）。
【０２５６】
健康なＰＢＭＣｓを、ＣｏＨのＤｏｎｏｒ  Ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒからの、ＩＲＢ＃１３３７８で管理下での匿名ドナーから誘導した。サンプルの取得は、ヘルシンキ宣言に従って、当該機関のレビュー委員会によって承認された。ヒトＰＣ３及びＤＵ−１４５前立腺がん細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、一方ＩＬ−６を安定的に発現するＬｎＣａＰ・Ｓ１７を、Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＦＬ  から入手した。マウスのＭｙｃ−ＣａＰ細胞、ＲＭ１及びＲＭ９を、それぞれ元のソースから入手した。ヒトのＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ３前立腺がん細胞を、元のＡＴＣＣから誘導し、及び認証された。ヒトのＯＣＩ−Ｌｙ３、ＲＬ、Ｊｅｃｋｏ１及びＲＥＣ１Ｂ細胞・非ホジキンリンパ腫細胞を、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅから入手した。
【０２５７】
フローサイトメトリー
がん細胞株及び免疫細胞の細胞外染色に対して、単一細胞の懸濁液を、ＦｃγＩＩＩ／ＩＩＲ特異的抗体と共にインキュベートし、非特異的結合を遮断し、及び次いで、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３０３ａ、Ｆ４／８０、ＧＲ１、Ｂ２２０及びＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して、蛍光標識化抗体の異なる組合せで染色した。アポトーシス細胞死を、アネキシンＶアッセイによって決定した。蛍光色素データを、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で収集し、及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【０２５８】
全細胞の溶解物を、先に報告３１したように調製し、及びチロシンリン酸化ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、総ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）  及びβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ）に特異的な抗体を用いて分析した。
【０２５９】
インビボ実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を、ｔｈｅ  ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。動物の処置／手順を、確立された制度上の指導、及びＩＡＣＵＣから承認されたプロトコルに従って実施した。マウスに、２Ｘ１０５個のＲＭ９細胞を、２部位に皮下注入した。その腫瘍の成長を、カリパスを用いて評価した。樹立された腫瘍を持つマウスを、様々なＣｐＧ−コンジュゲート（５ｍｇ／ｋｇ）で、毎日腫瘍内注入を用いて処置し、及び最後の処置の翌日に安楽死させた。実験用転移性マウスモデルに対して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ中の２Ｘ１０５個のＲＭ９  ｍｃｈｅｒｒｙ／ルシフェラーゼ細胞を、脛骨内に注入した。樹立された腫瘍を持つマウスに、ＣｐＧ−コンジュゲート（５ｍｇ／ｋｇ）を、毎日、静脈内注入し、及び当該機関のガイドラインに従ったボディスコアに基づいて、または最後の処置の翌日に安楽死させた。腫瘍組織量を、生物発光画像処理（ＢＬＩ）を用いてモニターし、及びＡｍｉＸ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ）画像処理システムを用いて測定した。
【０２６０】
生体内分布
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を、ｔｈｅ  ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。動物の処置／手順を、確立された制度上の指導、及びＩＡＣＵＣから承認されたプロトコルに従って実施した。樹立された腫瘍を持つか、または持たないＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３Ｃｙ３  を静脈内注入し、及び３時間後に安楽死させた。その腫瘍、リンパ節骨髄、脾臓、及び脳を採取した。単一細胞の懸濁液を、記述されているように（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ２００５）、機械的な組織破壊及びコラゲナーゼ  Ｄ／ＤＮａｓｅＩの処理によって調製し、及びＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｃ、及びＦ４／８０抗体を用いて染色した。異なった集団による取り込みを、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２６１】
定量リアルライムＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）システムＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、培養またはインビボで増殖した腫瘍細胞から抽出し、及び次いで、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ｃＤＮＡｓに転写した。遺伝子発現を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ、Ｒｏｃｈｅ）、及びＳＴＡＴ３（フォワード５’−ＣＴＧＣＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＣ−３’［配列番号９６］、及びリバース５’−ＣＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＣ−３’［配列番号９７］）に対して、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）を用いて設計されたプライマーの特定ペア、ならびにＲｏｃｈｅのリファレンス遺伝子アッセイを用いたＴＢＰを利用して、解析した。配列に特異的な増幅を、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム  (Ｂｉｏ−Ｒａｄ)  で、解析した。そのデータを、ＴＢＰレベルに正規化し、及びその相対遺伝子発現レベルを、２−△△Ｃｔ法を用いて、算出した。
【０２６２】
共焦点顕微鏡
ＤＵ−１４５細胞を、異なる時点に対して標識化された、５００ｎＭのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ  Ｃｙ３を使用して処置した。細胞を、２０分間、２％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中で透過処理し、及びその核を、５分間、ＤＲＡＱ５（商標登録）を使用して染色した。スライドを、封入体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に封入した。共焦点画像処理を、ｃＬＳＭ５１０−Ｍｅｔａ倒立型共焦点顕微鏡  （Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）  の、水浸対物レンズＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ４０Ｘ／１．２を使用して、実施した。画像取得に対して、ＬＳＭソフトウェアｖ．４．２ＳＰ１を、及び取得後解析に対して、ＬＳＭ画像ブラウザｖ．４，２，０，１２１（Ｚｅｉｓｓ）を使用した。
【０２６３】
対応のないｔ検定を利用し、両側Ｐ値を計算し、  ２つの処置群間の差異の統計的有意性を推定した。一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡに加えて、Ｂｏｎｆｅｅｒｒｏｎｉのポスト試験を適用し、複数のグループ間、または腫瘍成長の動力学実験で、それぞれの違いを評価した。統計的に有意なＰ値を、＊  ＊  ＊は、ｐ＜０．００１、＊  ＊は、ｐ＜０．０１、及び＊は、ｐ＜０．０５のように数字で示した。データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて解析した。
【０２６４】
種々の化学的修飾及びヌクレアーゼ耐性のＳＴＡＴ３  ＡＳＯ配列を有する、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のコンジュゲート、合成ＴＬＲ９リガンドを生成した（表１、２、及び４、及び図９Ａ）。このＣｐＧ  ＯＤＮのＳＴＡＴ３  ＡＳＯへの連結によって、ヒト及びマウスの免疫細胞などの標的ＴＬＲ９＋細胞、ならびにインキュベーションの１時間以内の前立腺がん細胞により、迅速な内在化が可能になった（図１０Ａ〜１０Ｂ、及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。ヒト及びマウスの骨髄性免疫細胞による、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯの取り込みは、最低５０ｎＭ濃度でも、検出可能であった（図１０Ａ〜１０Ｂ、及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯの細胞内取り込みを、共焦点顕微鏡により検証した。図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、当該コンジュゲートは、培養培地にそれを添加した後の１５分以内に、標的細胞の細胞質において、検出可能であった。これらのコンジュゲートの効率的な取り込みは、しばしば、それぞれのＡＳＯ単独の効果を超えて、インキュベーションの２４時間以内のＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞における、ＳＴＡＴ３ノックダウンの改善された有効性に対応していた（図１３Ａ〜１３Ｂ）。ＴＬＲ９（ＧｐＣ−ＳＴＡＴ３・ＡＳＯ）を活性化しない、ＡＳＯのＧｐＣ  ＯＤＮへのコンジュゲートはまた、ＳＴＡＴ３の発現を強く阻害した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。このＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯは、非コンジュゲートＳＴＡＴ３ＡＳＯと比較して、ｍＲＮＡ（図１３Ｃ）及びタンパク質（図１３Ｄ）レベルの両方において、ＳＴＡＴ３ノックダウンのより迅速な誘発を示した。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの内在化、及び標的ノックダウンはまた、グリオーマ及び小膠細胞細胞においても同様に有効であることが検証された（図１７Ａ〜１７Ｃ）。重要なのことに、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ単独または対照のＣｐＧ−スクランブル化ＯＤＮのいずれでもなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯコンジュゲートだけが、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドの存在下で、培養の２４時間以内のＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ−Ｓ１７細胞において、細胞死を誘発することが可能であった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
【０２６５】
改善されたＣｐＧ−ＡＳＯｓのヌクレアーゼ耐性は、脾臓または骨髄などの遠位臓器における、ＴＬＲ９＋細胞の全身投与及び標的化を可能にした（図１５Ａ〜１５Ｃ及び図１８Ａ〜１８Ｃ）。蛍光標識化されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの１回の静脈内（ＩＶ）注入は、その骨髄において、骨髄性細胞のかなりの部分、及び末梢リンパ節において、ＤＣｓを含む骨髄細胞の大部分に、当該コンジュゲートを送達するのに十分であった（図１５Ａ〜１５Ｃ）。繰り返しのＩＶ注入は、脳限局性グリオーマにおいて、骨髄細胞のかなりの割合（例えば、ＭＤＳＣｓの３０％）への、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの浸透を可能にし、一方でその腫瘍の微小環境へのほぼ完全な浸透は、このオリゴヌクレオチドの、１回の局所注入後に達成された（図１８Ａ〜１８Ｃ）。ヒトＢ細胞のリンパ腫細胞の実験では、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ戦略が、その他のＴＬＲ９＋悪性腫瘍に対して利用でき、標的遺伝子ノックダウンと細胞毒性を増進することを、示唆している（図１６Ａ〜１６Ｃ）。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ  のインビボ効果を試験するために、我々は、悪性の同系前立腺がん、Ｒａｓ−／Ｍｙｃが引き起こした、及びホルモンに依存しないＲＭ９腫瘍のモデルを選択した。最初の実験において、マウスの２箇所の皮下に、ＲＭ９腫瘍を移植し、及び１部位の腫瘍を、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ、ＳＴＡＴ３ＡＳＯまたは対照のオリゴヌクレオチドの腫瘍内注入用いて、処置した（図１９Ａ〜１９Ｄ）。ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ及びＳＴＡＴ３ＡＳＯの両方が、初期に治療部位の腫瘍の増殖を阻害し、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯだけがまた、遠位の未処理箇所において、腫瘍サイズを減少させた（図１９Ａ）。これらの効果は、その注入部位からのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ放出の全身性効果を示すかのように、その遠位におけるＳＴＡＴ３発現の低下と相関していた（図１９Ｂ及び図１９Ｅ）。さらに、ＳＴＡＴ３ＡＳＯではなく、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯを使用した処置は、その遠位腫瘍部位における、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）での、ＳＴＡＴ３及びＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント分子の発現を減少させた（図１９Ｃ〜１９Ｄ）。全身的に投与されたＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの抗腫瘍効果を検証するために、骨転移前立腺腫瘍の実験的モデルを、脛骨内に移植した（図２０Ａ〜２０Ｂ）。腫瘍が樹立された後、マウスを、５ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯ、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ、対照のＣｐＧ−ｓｃｒＯＤＮ、またはＰＢＳのみの、毎日の静脈内注入を使用して処置した。図２０Ａ〜２０Ｂに示すように、ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３ＡＳＯの処置だけが、ＳＴＡＴ３ＡＳＯ及び対照のＣｐＧ−ｓｃｒＯＤＮの限定的な効果と比較して、骨限局性ＲＭ９腫瘍の完全退縮を誘発した。このように、新規のヌクレアーゼ耐性ＣｐＧ−ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ阻害剤は、播種性ＴＬＲ９＋前立腺がん細胞、及びマクロファージ／小膠細胞／ＭＤＳＣｓなどの、寛容原性の腫瘍関連免疫細胞における、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の同時標的化を可能にする（図２１）。当該結果は、腫瘍の微小環境内の、シグナル伝達のクロストークの遮断に焦点を当てた、標的化がん療法に対する免疫療法アプローチが、がんの治療に効果的であり��ることを示す。
【０２６６】
本開示の番号付き実施形態は、次の通りである。
１．低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列にコンジュゲートされた、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を含む、単離化合物。
【０２６７】
２．前記低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）が、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）のｓａＲＮＡである、前記化合物。
【０２６８】
３．前記ＡＳＯが、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）のＡＳＯである、前記化合物。
【０２６９】
４．前記アンチセンス配列が、抗ＳＴＡＴ１、抗ＳＴＡＴ２、抗ＳＴＡＴ３、抗ＳＴＡＴ４、抗ＳＴＡＴ５Ａ、抗ＳＴＡＴ５Ｂ、または抗ＳＴＡＴ６オリゴヌクレオチド配列である、前記化合物。
【０２７０】
５．さらに前記ＯＤＮ配列、及び前記低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、または前記ＡＳＯとの間のリンカーを含む、前記化合物。
【０２７１】
６．前記リンカーが、置換もしくは非置換のアルキン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキンを含む、前記化合物。
【０２７２】
７．前記置換アルキンまたは置換ヘテロアルキンが、アジド基、保護アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基、及び保護スルフヒドリル基である、前記化合物。
【０２７３】
８．保護スルフヒドリル基を有する、前記置換アルキンまたは置換ヘテロアルキンが、ジビニルスルホン、アクリロイル、及びマレイミドから成る基から選択される部分にコンジュゲートされている、前記化合物。
【０２７４】
９．前記アクリロイル誘導体が、塩化アクリロイルである、前記化合物。
【０２７５】
１０．前記リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはビスフォスフォネート部分にコンジュゲートされた、置換されたアルキレン基またはヘテロアルキレン基の繰り返し単位を含む、前記化合物。
【０２７６】
１１．前記リンカーが、３個の炭素を有する、非置換のヘテロアルキレンを含む、前記化合物。
【０２７７】
１２．前記リンカーが、６から１２個の炭素を有する、非置換のヘテロアルキレンを含む、前記化合物。
【０２７８】
１３．前記リンカーが、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のアリレン、または置換もしくは非置換のヘテロアリレンである、前記化合物。
【０２７９】
１４．前記リンカーが、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、置換もしくは非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、置換もしくは非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または置換もしくは非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである、前記化合物。
【０２８０】
１５．前記リンカーが、非置換のＣ１〜Ｃ４０のアルキレン、非置換の２から４０員環のヘテロアルキレン、非置換のＣ３〜Ｃ８のシクロアルキレン、非置換の３から８員環のヘテロシクロアルキレン、非置換のＣ６〜Ｃ１０のアリレン、または非置換の５から１０員環のヘテロアリレンである、前記化合物。
【０２８１】
１６．前記リンカーが、置換された２から４０員環のヘテロアルキレンである、前記化合物。
【０２８２】
１７．前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯが、化学的に修飾されている、前記化合物。
【０２８３】
１８．前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯが、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’フルオロ、２’−デオキシ、ユニバーサル塩基、５−Ｃ−メチル、反転デオキシ脱塩基性残基の組み込み、及びロックド核酸をから成る群から選択される化学的修飾を含む、前記化合物。
【０２８４】
１９．前記修飾が、前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯの、各々の末端核酸塩基に位置する、前記化合物。
【０２８５】
２０．前記修飾が、前記ｓａＲＮＡまたは前記ＡＳＯの、各々の末端核酸塩基に位置しない、前記化合物。
【０２８６】
２１．前記修飾が、血清由来のヌクレアーゼから保護する、前記化合物。
【０２８７】
２２．前記ＯＤＮ配列が、ホスホジエルテル誘導体連結を含む、前記化合物。
【０２８８】
２３．ＯＤＮ核酸配列における、ホスホジエルテル誘導体連結が、ホスホロアミダート連結、ホスホロジアミダート連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホノカルボン酸連結、ホスホノカルボン酸塩連結、ホスホノ酢酸連結、ホスホノギ酸連結、ホスホン酸メチル連結、ホスホン酸ホウ素連結、またはＯ−メチルホスホノアミダイト連結から成る群から選ばれる、前記化合物。
【０２８９】
２４．前記ホスホジエルテル誘導体連結が、ホスホロチオエート連結である、前記化合物。
【０２９０】
２５．薬学的に許容される賦形剤、及び条項の１つに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【０２９１】
２６．第２治療薬をさらに含む、前記医薬組成物。
【０２９２】
２７．前記第２治療薬が、抗腫瘍または抗がん剤、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤、抗感染性剤、増殖阻害剤、免疫原性薬剤、免疫調節剤、及びケモカインから成る群から選ばれる、前記医薬組成物。
【０２９３】
２８．前記抗がん剤が、細胞死促進薬である、前記医薬組成物。
【０２９４】
２９．前記第２治療薬が、アクチノマイシンＤ／ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン（ペグ化リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、アレムツズマブ、ＢＣＧ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、インターフェロン、イピリムマブ、ラパチニブ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＥＡ）、メルタンシン（ＤＭ１）、リツキシマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、及びトラスツズマブ、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選ばれる、前記医薬組成物。
【０２９５】
３０．治療が必要な対象において、がんを治療する方法であって、前記対象に、条項１〜２４の１項に記載の化合物、または条項の１つに記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【０２９６】
３１．前記がんが、前立腺がん、乳がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、黒色腫、脳腫瘍、大腸がん、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、前記がんの治療法。
【０２９７】
３２．前記対象における前記がんが、同時に免疫応答を刺激しながら治療される、前記がんの治療法。
【０２９８】
３３．前記化合物が、（ｉ）配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つにコンジュゲートされた、ＣＥＢＰＡ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または（ｉｉ）配列番号７〜１８及び９８〜１０１の配列の、ホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）にコンジュゲートされた、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯを含む、前記がんの治療法。
【０２９９】
３４．前記対象における前記がんが、同時に免疫応答を刺激することなく治療される、前記がんの治療法。
【０３００】
３５．前記化合物が、配列番号２９〜３０の１つとコンジュゲートされた、ＣＥＢＰＡ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯの１つを含む、前記がんの治療法。
【０３０１】
３６．治療が必要な対象において、自己免疫疾患を治療する方法であって、前記対象に、条項１〜２４の１つに記載の化合物、または条項の１つに記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【０３０２】
３７．前記自己免疫疾患及び／または障害が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、また全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、前記自己免疫疾患の治療法。
【０３０３】
３８．前記対象における前記自己免疫疾患が、同時に免疫応答を刺激することなく治療される、前記自己免疫疾患の治療法。
【０３０４】
３９．前記化合物が、配列番号２９〜３０の１つにコンジュゲートされた、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＳＴＡＴ  ＡＳＯｓの１つを含む、前記自己免疫疾患の治療法。
【０３０５】
４０．前記化合物または前記組成物が、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、前記対象に投与される、前記自己免疫疾患の治療法。
【０３０６】
４１．前記治療が、前記化合物または組成物の用量に依存している、前記がんまたは自己免疫疾患の治療法。
【０３０７】
４２．約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの前記化合物が、前記対象に投与される、前記がんまたは自己免疫疾患の治療法。
【０３０８】
４３．治療が必要な対象において、免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、（ｉ）ＣＥＢＰ、ｐ２１、もしくはｐ５３のｓａＲＮＡ、または（ｉｉ）配列番号の３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓにコンジュゲートされた、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、または（ｉ）ＣＥＢＰ、ｐ２１、またはｐ５３のｓａＲＮＡ、もしくは（ｉｉ）配列番号の３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓにコンジュゲートされた、配列番号７〜１８及び９８〜１０１のスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量を投与することを含む、前記方法。
【０３０９】
４４．前記刺激が、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞または骨髄細胞の成熟、分化、もしくは増殖を含む、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１０】
４５．前記刺激が、ＴＨ１型免疫応答の増加を含む、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１１】
４６．前記免疫応答の刺激が、前記対象の臓器へ、樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を補充する、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１２】
４７．前記免疫応答の刺激が、前記対象における抗原提示細胞の集団を拡大する、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１３】
４８．前記免疫応答の刺激が、前記対象におけるがん細胞の増殖を抑制する、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１４】
４９．前記化合物または前記組成物が、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、経口、または局所投与により、前記対象に投与される、前記免疫応答の刺激方法。
【０３１５】
５０．細胞において、Ｃ／ＥＢＰαの発現を増進する方法であって、前記細胞を、ＣＥＢＰＡ  ｓａＲＮＡとコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、またはＣＥＢＰのｓａＲＮＡとコンジュゲートされた、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量と接触させることを含む、前記方法。
【０３１６】
５１．前記細胞を、条項の１つに記載の化合物、または条項の１つに記載の医薬組成物の有効量と接触させることを含む、細胞増殖を阻害する方法。
【０３１７】
５２．前記細胞を、配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓに連結された、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物、または配列番号３１〜４２及び１１０〜１１３のＡＳＯｓに連結された、配列番号７〜１８、２９〜３０、及び９８〜１０１のホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）配列の１つを含む化合物を含有する医薬組成物の、有効量と接触させることを含む、細胞においてＳＴＡＴ転写因子の活性を低下させる方法。
【０３１８】
５３．前記細胞が、がん細胞である、前記条項の１つに記載の方法。
【０３１９】
５４．前記細胞が、急性骨髄性リンパ（ＡＭＬ）細胞、または前立腺がん細胞である、前記方法。
【０３２０】
５５．前記ＡＭＬ細胞が、その骨髄からのものである、前記方法。
【０３２１】
５６．前記細胞が、インビトロで培養された細胞である、前記方法。
【０３２２】
５７．前記細胞が、宿主におけるインサイチュである、前記方法。
【０３２３】
５８．前記細胞が、エクスビボで培養された細胞である、前記方法。
【０３２４】
５９．前記接触ステップが、ウイルス性の形質導入を含まない、前記方法。
【０３２５】
６０．前記接触ステップが、ウイルス性の形質導入を含まず、及び前記細胞が、前記化合物または前記医薬組成物と接触する、前記方法。
【０３２６】
６１．細胞が、約１〜１００ナノモル濃度の前記化合物と接触する、前記方法。
【０３２７】
その他の実施形態
本開示を、その詳細な説明と併せて記載してきたが、その一方で、前述の説明は、本開示の範囲を示し、及び限定を意図するものではなく、付帯の請求項の範囲によって定められるものであることは理解されよう。その他の態様、利点、及び修正は、以下の請求項の範囲内である。
【図１Ａ】
2018519831.tif 000028
【図１Ｂ】
2018519831.tif 000029
【図１Ｃ】
2018519831.tif 000030
【図１Ｄ】
2018519831.tif 000031
【図１Ｅ】
2018519831.tif 000032
【図１Ｆ】
2018519831.tif 000033
【図２Ａ】
2018519831.tif 000034
【図２Ｂ】
2018519831.tif 000035
【図２Ｃ】
2018519831.tif 000036
【図２Ｄ】
2018519831.tif 000037
【図３】
2018519831.tif 000038
【図４Ａ】
2018519831.tif 000039
【図４Ｂ】
2018519831.tif 000040
【図５Ａ】
2018519831.tif 000041
【図５Ｂ】
2018519831.tif 000042
【図５Ｃ】
2018519831.tif 000043
【図６Ａ】
2018519831.tif 000044
【図６Ｂ】
2018519831.tif 000045
【図７Ａ】
2018519831.tif 000046
【図７Ｂ】
2018519831.tif 000047
【図８Ａ】
2018519831.tif 000048
【図８Ｂ】
2018519831.tif 000049
【図９Ａ】
2018519831.tif 000050
【図９Ｂ】
2018519831.tif 000051
【図９Ｃ】
2018519831.tif 000052
【図１０Ａ】
2018519831.tif 000053
【図１０Ｂ】
2018519831.tif 000054
【図１１Ａ】
2018519831.tif 000055
【図１１Ｂ】
2018519831.tif 000056
【図１２Ａ】
2018519831.tif 000057
【図１２Ｂ】
2018519831.tif 000058
【図１２Ｃ】
2018519831.tif 000059
【図１２Ｄ】
2018519831.tif 000060
【図１３Ａ】
2018519831.tif 000061
【図１３Ｂ】
2018519831.tif 000062
【図１３Ｃ】
2018519831.tif 000063
【図１３Ｄ】
2018519831.tif 000064
【図１４Ａ】
2018519831.tif 000065
【図１４Ｂ】
2018519831.tif 000066
【図１５Ａ】
2018519831.tif 000067
【図１５Ｂ】
2018519831.tif 000068
【図１５Ｃ】
2018519831.tif 000069
【図１６Ａ】
2018519831.tif 000070
【図１６Ｂ】
2018519831.tif 000071
【図１６Ｃ】
2018519831.tif 000072
【図１７Ａ】
2018519831.tif 000073
【図１７Ｂ】
2018519831.tif 000074
【図１７Ｃ】
2018519831.tif 000075
【図１８Ａ】
2018519831.tif 000076
【図１８Ｂ】
2018519831.tif 000077
【図１８Ｃ】
2018519831.tif 000078
【図１９Ａ】
2018519831.tif 000079
【図１９Ｂ】
2018519831.tif 000080
【図１９Ｃ】
2018519831.tif 000081
【図１９Ｄ】
2018519831.tif 000082
【図１９Ｅ】
2018519831.tif 000083
【図２０Ａ】
2018519831.tif 000084
【図２０Ｂ】
2018519831.tif 000085
【図２１】
2018519831.tif 000086
【配列表】
2018519831000001.app
【国際調査報告】
2018519831.tif 000087
2018519831.tif 000088
2018519831.tif 000089
2018519831.tif 000090