(57)【要約】  本明細書において、Ｍｃｌ−１に結合する安定化ペプチドが提供される。また、これらのポリペプチドを含有する組成物、およびポリペプチドのうちの１つを対象に投与することを含む、癌の治療におけるこのようなペプチドを使用する方法が提供される。
2018511594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Ｆ１Ｇ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２Ｆ２Ｇ２Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３Ｅ３Ｆ３Ｇ３Ａ４Ｂ４Ｃ４Ｄ４Ｅ４Ｆ４Ｇ４Ａ５（配列番号１）
を含む内部架橋ポリペプチドを含む化合物であって、
ここで、Ｆ１は、Ｒもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｇ１は、Ｐもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ａ２は、Ｅもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｂ２は、Ｉまたは保存的置換である；Ｃ２は、Ｗまたは保存的置換である；Ｄ２は、Ｍもしくは保存的置換であり、Ｌもしくは保存的置換であり、Ｆもしくは保存的置換でありまたはノルロイシンである；Ｅ２は、Ｔまたは保存的置換であり、Ａまたは保存的置換であり、Ｖまたは保存的置換であり、Ａｉｂまたは保存的置換である；Ｆ２は、Ｑまたは保存的置換であり、Ｒまたは保存的置換である；Ｇ２は、Ｇ、Ｈ、Ｅ、Ｓ、またはＧ、Ｈ、ＥおよびＳのうちの１つの保存的置換である；Ａ３は、Ｌまたは保存的置換であり、Ｉまたは保存的置換である；Ｂ３は、Ｒまたは保存的置換であり、Ｄまたは保存的置換であり、Ｑまたは保存的置換であり、Ａｉｂまたは保存的置換であり、Ｍｅ−Ｌｅｕまたは保存的置換である；Ｃ３は、Ｒまたは保存的置換である；Ｄ３は、Ｌまたは保存的置換であり、Ｉまたは保存的置換である；Ｅ３は、Ｇまたは保存的置換である；Ｆ３は、Ｄまたは保存的置換である；Ｇ３は、Ｅまたは保存的置換である；Ａ４は、Ｉまたは保存的置換であり、Ｖまたは保存的置換である；Ｂ４は、Ｎまたは保存的置換である；Ｃ４は、Ａまたは保存的置換である；Ｄ４は、Ｙまたは保存的置換である；Ｅ４は、Ｙまたは保存的置換である；Ｆ４は、Ａまたは保存的置換である；Ｇ４は、Ｒもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ａ５は、Ｒもしくは保存的置換であり、または欠損している；ならびに
２つ、３つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルによって置き換えられている；３つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルおよび／もしくは内部ステッチによって置き換えられている；４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている；または少なくとも４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている化合物。
【請求項２】
３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋によって置き換えられている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記内部架橋がアルキレン基またはアルケニレン基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記アルキレンまたはアルケニレンが、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記架橋が、Ｅ２およびＢ３；Ｃ３およびＧ３；Ｆ２およびＣ３；またはＢ２およびＢ３のアルファ炭素間にある、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
配列ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号２）を有するポリペプチドを含む化合物であって、前記アミノ酸のうち、いずれも別のアミノ酸によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）のアミノ酸が別のアミノ酸によって置き換えられ、２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋によって置き換えられている化合物。
【請求項７】
配列ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（Ｍ１；配列番号６）を有するポリペプチドを含む化合物であって、前記アミノ酸のうち、いずれも別のアミノ酸によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が別のアミノ酸によって置き換えられ、２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋によって置き換えられている化合物。
【請求項８】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは配列ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（Ｂ１；配列番号２３）を含み、前記配列を有するポリペプチドを含む化合物であって、前記アミノ酸のうち、いずれも別のアミノ酸によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が別のアミノ酸によって置き換えられ、２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋によって置き換えられている化合物。
【請求項９】
ＲＰＥＩＷＭＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号３）；
ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡ（配列番号４）；
ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＲ（配列番号５）；
ＥＩＷＭＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号２０）；
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡ（配列番号２１）；
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＲ（配列番号２２）；
ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号６）；
ＩＷＢＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号７）；
ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号８）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号９）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１０）；
ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１１）；
ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号１２）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３）；
ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）；
ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１５）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１６）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１７）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）；
ＩＷＢＸＲＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１９）；
ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２３）；
ＩＷＦＡＱＥＩＤＸＩＧＤＸＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２４）；
ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号２５）；
ＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２６）；
ＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２７）；
ＥＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２８）；
ＩＷＦＡＸＥＩＤＸＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２９）；および
ＸＷＦＡＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）
から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記架橋がＣ８アルキレンまたはＣ１１アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ａ３がＬであり、Ｄ３がＬであり、Ｅ３がＧであり、Ｆ３がＤであり、およびＡ４がＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａ３がＬであり、Ｄ３がイソロイシンであり、Ｅ３がＧであり、Ｆ３がＤであり、およびＡ４がＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ａ３がイソロイシンであり、Ｄ３がＬであり、Ｅ３がＧであり、Ｆ３がＤであり、およびＡ４がＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ａ３がイソロイシンであり、Ｄ３がイソロイシンであり、Ｅ３がＧであり、Ｆ３がＤであり、およびＡ４がＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号７）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号８）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号９）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１０）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２０】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１１）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号１２）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２３】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２４】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１５）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２５】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１６）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１７）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２７】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＸＲＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１９）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項２８】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２３）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９記載の化合物。
【請求項２９】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＡＱＥＩＤＸＩＧＤＸＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２４）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３０】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号２５）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２６）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２７）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３３】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＥＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２８）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３４】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＡＸＥＩＤＸＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２９）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３５】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＸＷＦＡＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項３６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号３１）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３７】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＥＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号３２）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３８】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＲＰＥＩＷＬＴＱＳＬＱＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号３３）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３９】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＲＰＥＩＷＬＴＱＨＬＱＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号３４）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４０】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＲＰＥＩＷＩＴＱＥＬＲＲＩＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号４４）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４１】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号４５）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＸＢＴＱＸＩＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４６）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＸＴＱＧＸＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４７）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４４】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＸＬＲＲＸＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４８）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４５】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＸＲＲＬＸＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４９）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＬＸＲＬＧＸＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号５０）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４７】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＸＤＥＩＸＡＹＹＡＲＲ（配列番号５１）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４８】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＸＩＮＡＸＹＡＲＲ（配列番号５２）を含み、Ｘが内部架橋を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４９】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＲＰＥＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号５３）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５０】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号５４）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５１】
３０個以下のアミノ酸からなり、配列番号３５〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５３】
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１３４，９０４号の利益を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、増強された効力および特異性でＭｃｌ−１に結合する、構造的に安定化された治療用ペプチド、ならびに癌の治療においてこのようなペプチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｍｃｌ−１は、癌において最も頻繁に増幅される遺伝子の１つであり、化学療法剤に対する耐性において重要な因子である。Ｍｃｌ−１は、Ｂｃｌ−２と相同性を有し、いわゆるＢＨ３ドメインを含有する抗アポトーシスタンパク質ファミリーのメンバーである。Ｍｃｌ−１および上記ファミリーの他のメンバー（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｆｌ−１およびＢｃｌ−ｂ）は、ＢａｋおよびＢａｘのホモオリゴマー化に干渉することによってアポトーシスをブロックする。抗アポトーシスタンパク質は、ＢａｘおよびＢａｋに直接結合する、または関連するアポトーシス促進活性化タンパク質（Ｂｉｍ、ＢｉｄおよびＰｕｍａ）に結合し、ＢａｘおよびＢａｋの活性化を妨げる。増感因子と呼ばれる、ＢＨ３ドメインを有する他のタンパク質は、抗アポトーシス標的に競合的に結合し、それにより活性化されたＢａｘ／Ｂａｋまたはそれらの直接的な活性化タンパク質を押しのけることによって抗アポトーシス機能に拮抗する。
【０００４】
Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２などの、抗アポトーシスタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーの他のメンバーと比較してＭｃｌ−１に選択的に結合する薬剤は、様々な癌の治療に有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ヒトＭｃｌ−１に結合する、構造的に安定化されたペプチドを提供する。安定化されたペプチドは、Ｍｃｌ−１のヒトホモログと考えられるいくつかのタンパク質、例えば、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２の１つまたは複数と結合するよりも高い親和性でヒトＭｃｌ−１に結合する点において、Ｍｃｌ−１への結合について相対的に選択的である。
【０００６】
いくつかの態様において、本開示は、アミノ酸配列：Ｆ１Ｇ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２Ｆ２Ｇ２Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３Ｅ３Ｆ３Ｇ３Ａ４Ｂ４Ｃ４Ｄ４Ｅ４Ｆ４Ｇ４Ａ５（配列番号１）を含む内部架橋ポリペプチドを提供し、ここで、Ｆ１は、Ｒもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｇ１は、Ｐもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ａ２は、Ｅもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｂ２は、Ｉまたは保存的置換である；Ｃ２は、Ｗまたは保存的置換である；Ｄ２は、Ｍもしくは保存的置換であり、Ｌもしくは保存的置換であり、Ｆもしくは保存的置換でありまたはノルロイシンである；Ｅ２は、Ｔまたは保存的置換であり、Ａまたは保存的置換であり、Ｖまたは保存的置換であり、Ａｉｂまたは保存的置換である；Ｆ２は、Ｑまたは保存的置換であり、Ｒまたは保存的置換である；Ｇ２は、Ｇ、Ｈ、Ｅ、Ｓ、またはＧ、Ｈ、ＥおよびＳのうちの１つの保存的置換である；Ａ３は、Ｌまたは保存的置換であり、Ｉまたは保存的置換である；Ｂ３は、Ｒまたは保存的置換であり、Ｄまたは保存的置換であり、Ｑまたは保存的置換であり、Ａｉｂまたは保存的置換であり、Ｍｅ−Ｌｅｕまたは保存的置換である；Ｃ３は、Ｒまたは保存的置換である；Ｄ３は、Ｌまたは保存的置換であり、Ｉまたは保存的置換である；Ｅ３は、Ｇまたは保存的置換である；Ｆ３は、Ｄまたは保存的置換である；Ｇ３は、Ｅまたは保存的置換である；Ａ４は、Ｉまたは保存的置換であり、Ｖまたは保存的置換である；Ｂ４は、Ｎまたは保存的置換である；Ｃ４は、Ａまたは保存的置換である；Ｄ４は、Ｙまたは保存的置換である；Ｅ４は、Ｙまたは保存的置換である；Ｆ４は、Ａまたは保存的置換である；Ｇ４は、Ｒもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ａ５は、Ｒもしくは保存的であり、または欠損している；ここで、２つ、３つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルによって置き換えられている；３つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルおよび／もしくは内部ステッチによって置き換えられている；４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている；または少なくとも４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている。
【０００７】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｆ１Ｇ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２Ｆ２Ｇ２Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３Ｅ３Ｆ３Ｇ３Ａ４Ｂ４Ｃ４Ｄ４Ｅ４Ｆ４Ｇ４Ａ５（配列番号１）を含み、ここで、Ｆ１は、Ｒであり、または欠損している；Ｇ１は、Ｐであり、または欠損している；Ａ２は、Ｅもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｂ２は、Ｉである；Ｃ２は、Ｗである；Ｄ２は、Ｍ、Ｌ、Ｆまたはノルロイシンである；Ｅ２は、Ｔ、Ａ、ＶまたはＡｉｂである；Ｆ２は、ＱまたはＲである；Ｇ２は、Ｇ、Ｈ、ＥまたはＳである；Ａ３は、ＬまたはＩである；Ｂ３は、Ｒ、Ｄ、Ｑ、ＡｉｂまたはＭｅ−Ｌｅｕである；Ｃ３は、Ｒである；Ｄ３は、ＬまたはＩである；Ｅ３は、Ｇである；Ｆ３は、Ｄである；Ｇ３は、Ｅである；Ａ４は、ＩまたはＶである；Ｂ４は、Ｎである；Ｃ４は、Ａである；Ｄ４は、Ｙである；Ｅ４は、Ｙである；Ｆ４は、Ａである；Ｇ４は、Ｒであり、または欠損している；Ａ５は、Ｒであり、または欠損している；ここで、２つ、３つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルによって置き換えられている；３つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルおよび／もしくは内部ステッチによって置き換えられている；４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている；または少なくとも４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている。いくつかの場合において、Ｅ２およびＢ３は、炭化水素ステープルで置き換えられていてよい。
【０００８】
いくつかの場合において、架橋されたポリペプチドは、内部に、アミノ酸配列Ｆ１Ｇ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２Ｆ２Ｇ２Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３Ｅ３Ｆ３Ｇ３Ａ４Ｂ４Ｃ４Ｄ４Ｅ４Ｆ４Ｇ４Ａ５（配列番号１）を含み、ここでＦ１は、Ｒであり、または欠損している；Ｇ１は、Ｐであり、または欠損している；Ａ２は、Ｅもしくは保存的置換であり、または欠損している；Ｂ２は、Ｉである；Ｃ２は、Ｗであり；Ｄ２は、Ｍ、Ｌ、Ｆまたはノルロイシンである；Ｅ２は、Ｔである；Ｆ２は、ＱまたはＲである；Ｇ２は、Ｇ、Ｈ、ＥまたはＳである；Ａ３は、Ｌである；Ｂ３は、Ｒ、Ｄ、Ｑ、ＡｉｂまたはＭｅ−Ｌｅｕである；Ｃ３は、Ｒである；Ｄ３は、ＬまたはＩである；Ｅ３は、Ｇである；Ｆ３は、Ｄである；Ｇ３は、Ｅである；Ａ４は、ＩまたはＶである；Ｂ４は、Ｎである；Ｃ４は、Ａである；Ｄ４は、Ｙである；Ｅ４は、Ｙである；Ｆ４は、Ａである；Ｇ４は、Ｒであり、または欠損している；Ａ５は、Ｒであり、または欠損している。ここで、２つ、３つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルによって置き換えられている；３つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープルおよび／もしくは内部ステッチによって置き換えられている；４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている；または少なくとも４つのアミノ酸の側鎖は、内部ステープル、内部ステッチ、もしくは内部ステープルおよびステッチの組み合わせによって置き換えられている。いくつかの場合において、Ｅ２およびＢ３は、炭化水素ステープルによって置き換えられていてよい。
【０００９】
例えば、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋、例えば、炭化水素ステープルで置き換えられていてよい。例えば、Ｅ２およびＢ３の側鎖は、炭化水素ステープル（位置Ｄ）によって置き換えられていてよく、Ｃ３およびＧ３の側鎖は、炭化水素ステープル（Ａ位置）によって置き換えられていてよく、Ｆ２およびＣ３の側鎖は、炭化水素ステープル（Ｇ位置）によって置き換えられていてよく、またはＢ２およびＢ３の側鎖は炭化水素ステープル（Ｈ位置）によって置き換えられていてよく。
【００１０】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは、配列ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号２）を含み、ここで、上記アミノ酸のうち、いずれも、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられ、および２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋によって置き換えられている。さらに、１つまたは２つまたは３つのさらなるアミノ酸を、配列番号２のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の一方またはそれらの両方から（独立して）除去し、あるいはそれに付加し得る。例えば、ＲＰＥ、ＲＥまたはＥを、アミノ末端から除去することができ、およびＲを、カルボキシ末端に追加することができ、またはＲをアミノ末端に付加することができ、その結果、配列はＲＲで終結する。アミノ酸の対は、配列番号２の架橋（以下の配列：
ＲＰＥＩＷＭＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号３）
ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡ（配列番号４）
ＲＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＲ（配列番号５）
中のＸで示される）によって置き換えられ得る。
【００１１】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは、配列ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）を含み、ここで、Ｘは、内部架橋を表し、上記アミノ酸のうち、いずれも、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられている。さらに、１つまたは２つまたは３つのさらなるアミノ酸を、配列番号１８のカルボキシ末端の一方または両方に（独立して）付加することができる。例えば、Ｒを、カルボキシ末端に付加し得、配列はＲＲで終結する。いくつかの場合において、配列番号１８のＬは置換されておらず、配列ＧＤは置換されておらず、および第２のＩは置換されていない。
【００１２】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは、配列ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（Ｍ１；配列番号６）を含み、ここで、上記アミノ酸のうち、いずれも、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられ、および２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋によって置き換えられている。さらに、１つまたは２つまたは３つのさらなるアミノ酸を、配列番号６のアミノ末端またはカルボキシ末端に追加することができる。例えば、ＲＰＥ、ＲＥまたはＥを、アミノ末端に追加することができ、およびＲまたはＲＲを、カルボキシ末端に追加することができる。架橋によって置き換えられ得るアミノ酸の好ましい対は、以下の配列
ＥＩＷＭＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号２０）
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡ（配列番号２１）
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＲ（配列番号２２）
中のＸで示される。
【００１３】
いくつかの場合において、内部架橋ポリペプチドは、配列ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（Ｂ１；配列番号２３）を含み、ここで、上記アミノ酸のうち、いずれも、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられておらず、または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つ）が、例えば、保存的アミノ酸置換によって置き換えられ、および２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋によって置き換えられている。さらに、１つまたは２つまたは３つのさらなるアミノ酸を、配列番号１〜３２のいずれかのアミノ末端またはカルボキシ末端に追加することができる。例えば、ＲＰＥ、ＲＥまたはＥを、アミノ末端に追加することができ、およびＲまたはＲＲを、カルボキシ末端に追加することができる。配列番号１〜３２の架橋によって置き換えられているべきアミノ酸の好ましい対は、以下の配列：
ＥＩＷＭＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号２０）
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡ（配列番号２１）
ＰＥＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＲ（配列番号２２）
中のＸによって示される。
【００１４】
いくつかの場合において、内部架橋ペプチドは、配列番号１〜３２のいずれかの配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％または１００％）同一である。いくつかの場合において、内部架橋ペプチドは、配列番号１〜５４のいずれかの配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％または１００％）同一である。架橋によって置き換えられているアミノ酸側鎖は、同一性パーセントの計算において同一でないと考えられる。
【００１５】
いくつかの場合において、本開示の内部架橋ポリペプチドは、以下のペプチド（配列番号６〜１９）：
ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号６）；
ＩＷＢＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号７）（ペプチド７）；
ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号８）（ペプチド１０）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号９）（ペプチド３）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１０）（ペプチド１１）；
ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１１）（ペプチド１２）；
ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号１２）（ペプチド１３）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３）（ペプチド１４）；
ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）（ペプチド１５）；
ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１５）（ペプチド１６）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１６）（ペプチド１７）；
ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１７）（ペプチド１８）；
ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）（ペプチド１９）；および
ＩＷＢＸＲＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１９）（ペプチド２０）；
の１つを含み、
ここで、３つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋（Ｘで示される；Ｂはノルロイシンである）によって置き換えられている。さらに、これらのペプチドのいずれかにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つのアミノ酸は、例えば、保存的に置換されていてよい。いくつかの場合において、配列番号８は、ＱＧに続くＬにおいて置換されていない。いくつかの場合において、配列番号８は、ＱＧに続くＬにおいて置換されておらず、およびＷＢに続くＴにおいて置換されていない。いくつかの場合において、配列番号８は、ＷＢに続くＴにおいて置換されていない。
【００１６】
いくつかの場合において、本開示の内部架橋ポリペプチドは、以下のペプチド（配列番号２３〜３０）：
ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２３）；
ＩＷＦＡＱＥＩＤＸＩＧＤＸＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２４）；
ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号２５）；
ＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２６）；
ＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２７）；
ＥＩＷＦＸＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号２８）；
ＩＷＦＡＸＥＩＤＸＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２９）；および
ＸＷＦＡＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）；
のうちの１つを含み、
ここで、３つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖は、内部架橋（Ｘで示される）によって置き換えられている。さらに、これらのペプチドのいずれかにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つのアミノ酸は、例えば、保存的に置換されていてよい。
【００１７】
本明細書に記載される全てのポリペプチドのいくつかの実施形態において、ＲＲジペプチドを、ステープル留めされたペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に追加され得る。本明細書に記載される全てのポリペプチドのいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＲＲがカルボキシ末端配列であるように必要に応じて修飾される。
【００１８】
本明細書に記載される全てのポリペプチドのいくつかの実施形態において、架橋は、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基である。３つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋によって置き換えられている場合、架橋は、好ましくは、４番目と５番目の炭素間に単一の二重結合を有するＣ８アルケニル基である。
【００１９】
いくつかの場合において、３つのアミノ酸のアルファ炭素を連結する一対の内部架橋が存在し得る（中央のアミノ酸は２つのアミノ酸のそれぞれに架橋される）。いくつかの実施形態において、本開示の内部架橋ポリペプチドは、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の側鎖を置き換える内部ステープルを含む。いくつかの実施形態において、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも２つの内部ステープル（４つのアミノ酸の側鎖を置き換える。すなわち、各々のステープルは３つのアミノ酸によって隔てられた２つのアミノ酸の間にある）を含む。いくつかの実施形態において、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも１つの内部ステープルと内部ステッチの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、内部ステッチは、第１のアミノ酸および第２および第３のアミノ酸の側鎖を置き換え、それによって第１のアミノ酸（第２および第３のアミノ酸間にある）を、内部架橋を介して第２および第３のアミノ酸に架橋し、ここで、第１および第２のアミノ酸は、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられ、第１および第３のアミノ酸は、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられ、第２および第３のアミノ酸は異なるアミノ酸である。いくつかの実施形態において、３つのアミノ酸の側鎖を置き換える内部ステッチは、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた１対のアミノ酸を架橋する。いくつかの実施形態において、本開示の内部架橋ポリペプチドの４つのアミノ酸の側鎖は、２つの異なる内部ステープルによって置き換えられている。いくつかの実施形態において、２つの異なる内部ステープルのうちの第１のものは、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた、第１の対のアミノ酸を架橋し、少なくとも２つの異なる内部ステープルのうちの第２のものは、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた、第２の対のアミノ酸を架橋する。いくつかの実施形態において、本開示の内部架橋ポリペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸の側鎖を置き換える内部ステープル、内部ステッチ、または内部ステープルと内部ステッチの組み合わせ、例えば、少なくとも１つのステープルおよび少なくとも１つのステッチを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのステープルは、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられた１対のアミノ酸を架橋し、少なくとも１つのステッチは、第１のアミノ酸を第２のアミノ酸および第３のアミノ酸に架橋し、ここで、第１および第２のアミノ酸は、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられ、第１および第３のアミノ酸は、２つ、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられ、第２および第３のアミノ酸は、異なるアミノ酸である。
【００２０】
いくつかの態様において、本開示は、本開示の１つまたは複数の内部架橋ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、このような医薬組成物は、癌を治療しおよび／または癌に関連する１つまたは複数の症状を軽減するための１つまたは複数の医薬も含むことができる。
【００２１】
いくつかの態様において、本開示は、対象における癌、本明細書において言及されている癌のタイプのいずれかを治療する方法を提供する。これらの方法は、癌に罹患している対象を選択し；本明細書に記載される有効量の安定化されたペプチドを対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、治療前に対象におけるＭｃｌ−１レベルを評価することを含む。例えば、本明細書に開示されるペプチドは、癌または腫瘍、例えば、肺、乳房、上皮、大腸、直腸、精巣、胆嚢、胆管、胆道、前立腺、結腸、胃、食道、膵臓、肝臓、子宮、卵巣または脳の癌または腫瘍の１つまたは複数に罹患している対象を治療するために使用することができる。
【００２２】
いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、Ａ３がＬであり、Ｄ３がＬであり、Ｅ３がＧであり、Ｆ３がＤであり、Ａ４がＩである、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、ペプチドのアミノ酸配列は、ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）を含む。いくつかの場合において、Ａ３はＬであり、Ｄ３はイソロイシンであり、Ｅ３はＧであり、Ｆ３はＤであり、Ａ４はＩである。いくつかの場合において、Ａ３はイソロイシンであり、Ｄ３はＬであり、Ｅ３はＧであり、Ｆ３はＤであり、Ａ４はＩである。いくつかの場合において、Ａ３はイソロイシンであり、Ｄ３はイソロイシンであり、Ｅ３はＧであり、Ｆ３はＤであり、Ａ４はＩである。
【００２３】
いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＥＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＲＰＥＩＷＬＴＱＳＬＱＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＲＰＥＩＷＬＴＱＨＬＱＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＲＰＥＩＷＩＴＱＥＬＲＲＩＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＸＢＴＱＸＩＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４６）（ペプチド１）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＸＴＱＧＸＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４７）（ペプチド２）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号９）（ペプチド３）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＸＬＲＲＸＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４８）（ペプチド４）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＸＲＲＬＸＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号４９）（ペプチド５）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＬＸＲＬＧＸＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号５０）（ペプチド６）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号７）（ペプチド７）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＸＤＥＩＸＡＹＹＡＲＲ（配列番号５１）（ペプチド８）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＸＩＮＡＸＹＡＲＲ（配列番号５２）（ペプチド９）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号８）（ペプチド１０）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。
【００２５】
いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＲＰＥＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＥＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、ＩＷＢＸＲＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘは内部架橋を表す。
【００２６】
本明細書に記載される全てのポリペプチドのいくつかの実施形態において、ペプチドは、３０個以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載される全てのポリペプチドのいくつかの実施形態において、ペプチドは、２４個以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、ペプチドは３０個以下のアミノ酸からなり、配列番号３５〜４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００２７】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当該技術分野において公知である他の適切な方法および材料もまた使用することができる。材料、方法および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】結合研究の結果を示す図である。
【図２】ペプチドの結合のモデリングを示す図である。図２ａは、Ｍｃｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３；およびＢｆｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３のモデリングを示す。図２ｂは、Ｂｆｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３；およびＭｃｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３のモデリングを示す。図２ｃは、Ｍｃｌ−１  Ｂｉｍ  ＢＨ３；およびＢｃｌ−ｘＬ：Ｂｉｍ  ＢＨ３のモデリングを示す。図２ｄは、Ｂｃｌ−ｘＬ：Ｂｉｍ  ＢＨ３のモデリングを示す。
【図３】ＢＨプロファイリング研究の結果を示す図である。
【図４】種々の内部架橋ペプチドのアルファ−ヘリシティを評価する研究の結果を示す図である。Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．４に溶解させたステープル留めされたペプチド３（配列番号９）、７（配列番号７）および１０（配列番号８）、ならびにアミノ酸配列ＩＷＭＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号５４）のステープル留めされていないペプチドのヘリシティを示す円偏光二色性分析。
【図５】内部架橋ペプチドによる非特異的細胞溶解を評価する研究の結果を示す図である。乳酸脱水素酵素放出アッセイ（ＬＤＨ）は、膜破壊ペプチド３（配列番号９）および７（配列番号７）を同定した。ＭＥＦ細胞で試験した。ペプチド７、１０、３および１１〜２０は、それぞれ配列番号７、８、９および１０〜１９である。
【図６】種々の内部架橋ペプチドの長さの分布、正味電荷および電荷分布の分布を示す図である。左から右の列：ステープル留めされたペプチドのアミノ酸配列、蛍光標識された２３ｍｅｒのＢｉｍ−ＢＨ３を用いた競合ＦＰアッセイによって測定されたＭｃｌ−１結合活性、正味電荷、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出、および細胞取り込みを反映するフルオレセイン化されたペプチドの細胞に組み込まれた強度。ペプチド３、１１〜２０は、それぞれ配列番号９〜１９である。
【図７】ＢＨ３プロファイリング研究の結果を示す図である。ＢＨ３プロファイリングによって測定された、ステープル留めされたＢＨ３ペプチドにより誘導されたミトコンドリア脱分極のＥＣ５０値（ペプチド濃度（ｎＭ）の対数として与えられる）。この表は、生存のために抗アポトーシスタンパク質に対し異なる依存性を有する、試験された細胞株を列挙する。ペプチド１１〜２０は、それぞれ配列番号１０〜１９である。
【図８】種々の内部架橋ペプチドの細胞透過性を評価する研究の結果を示す図である。ＭＢ２リードペプチドに基づくステープル留めされたペプチドが示される。左から右の列：名称、ステープル留めされたペプチドのアミノ酸配列、フルオレセイン化されたペプチドの細胞に組み込まれた強度（細胞取り込みを反映している）、蛍光標識された２３ｍｅｒのＢｉｍ−ＢＨ３を用いた競合ＦＰアッセイによって測定したＭｃｌ−１結合活性。ＭＢ２（配列番号２３）；Ｂ１  ＳＡＨＢａ（配列番号２４）；Ｂ１  ＳＡＨＢｆ（配列番号２５）；Ｂ１  ＤＡＨＢｄ（配列番号２６）；Ｂ２  ＳＡＨＢｄ（配列番号２７）；Ｂ３  ＳＡＨＢｄ（配列番号２８）；Ｂ１  ＳＡＨＢｇ（配列番号２９）；Ｂ１  ＳＡＨＢｈ（配列番号３０）。
【図９】ＢＨ３プロファイリング研究の結果を示す図である。ＢＨ３プロファイリングによって測定された、ステープル留めされたＢＨ３ペプチドにより誘導されたミトコンドリア脱分極のＥＣ５０値（ペプチド濃度（ｎＭ）の対数として与えられる）。図８に配列を示す。
【図１０】細胞生存率アッセイの結果を示す図である。図１０Ａは、Ｍｃｌ−１依存性Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞における細胞生存率アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、ＢｃｌＸＬ依存性ＭＤＡ−ＭＢ２３１における細胞生存率アッセイの結果を示す。ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲは配列番号１４であり、ＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲは配列番号１８である。
【図１１】ステープル留めされたＭＳ１ペプチドのアミノ酸配列を列挙している表、および蛍光標識された２３ｍｅｒのＢｉｍ−ＢＨ３を用いた競合ＦＰアッセイによって測定されたＢｃｌ−２ファミリータンパク質結合活性を示す図である。ペプチド１〜１０は、それぞれ配列番号４６、４７、９、４８、４９、５０、７、５１、５２および８である。
【図１２】細胞生存率アッセイの結果を示す図である。ステープル留めされたペプチド（ペプチド１５（Ｍ６ｒ）（配列番号１４）およびペプチド１９（Ｍ１０ｒ）（配列番号１８））をＭｃｌ−１標的とすることによる感作は、細胞死受容体シグナル伝達を介して細胞死をもたらす。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＯＰＭ２細胞は、ステープル留めされたペプチドに単独で、および低用量の死受容体リガンドであるＴＲＡＩＬおよびＦａｓリガンドと組み合わせて曝露された。２４時間でのＣＴＧアッセイによって測定した細胞生存率は、血清補充培地（１０％ＦＢＳ）において用量反応性アポトーシスを示した。
【図１３】Ｍｃｌ−１免疫沈降およびＢａｋウエスタン分析の結果を示す図である。最も強力なステープル留めされたペプチド３（Ｍ１ｒ）（配列番号９）でのＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞溶解物の処理により、ＢａｋとＭｃｌ−１との間の相互作用が破壊された。抗Ｍｃｌ−１抗体は、Ｍｃｌ−１（約４０ｋＤ）を免疫沈降させた。同じブロットをＢａｋ（約２８ｋＤ）抗体を用いてプローブした。
【図１４】ジギトニンによる細胞浸透後のＢＨ３プロファイリングの結果を示す図である。左：様々のステープル留めされたペプチドによる処理に応答したＭｃｌ−１  ２６４０細胞のミトコンドリア膜の脱分極。Ｍ３ｒ（配列番号１１）、Ｍ５ｒ（配列番号１３）、Ｍ６ｒ（配列番号１４）、Ｍ８ｒ（配列番号１６）およびＭ１０ｒ（配列番号１８）についてのＥＣ５０値は、１５８、２５１、５０、６３０、および３９ｎＭである。右：様々なステープル留めされたペプチドによる処理に応答したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のミトコンドリア膜の脱分極。
【図１５】Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ計算モデリングによって得られた、Ｍｃｌ−１に結合したＭ１ａ（配列番号７）、Ｍ１ｄ（配列番号８）およびＭ１ｒ（配列番号９）のモデリングを示す図である。モデリングに用いられたＭｃｌ−１：ＢＨ３ペプチド結晶構造は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ：３ＭＫ８）から得られた。
【図１６】トリス緩衝液ｐＨ７．４に溶解したステープル留めされたペプチドの円偏光二色性分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって連結された、少なくとも２つの修飾アミノ酸を含む構造的に安定化されたＭｃｌ−１結合ペプチドを提供し、ここで、少なくとも２つのアミノ酸は、３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられる。安定化されたペプチドは、ステープル留めされたおよび／またはステッチされたペプチドを含む。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書においてペプチドの構成要素である。用語「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基の両方、ならびに側鎖を含有する分子を意味する。本明細書に開示されるペプチドに包含されるのに適したアミノ酸には、限定されないが、ペプチドに見出される２０個の天然に存在するアルファ−アミノ酸（例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＶａｌ（Ｖ））のＤ異性体およびＬ異性体などの天然のアルファ−アミノ酸、非天然のアルファ−アミノ酸（限定されないが、α，α−二置換された、Ｎ−アルキル化アミノ酸を含む）、天然のベータ−アミノ酸（例えば、ベータ−アラニン）、および非天然のベータ−アミノ酸が含まれる。本発明のペプチドの構築に使用されるアミノ酸は、有機合成によって調製することができ、または他の経路、例えば、天然源の分解もしくは天然源からの単離などによって得ることができる。
【００３２】
多数の公知の非天然アミノ酸が存在し、そのうちのいずれかが本発明のペプチドに含まれ得る。非天然アミノ酸のいくつかの例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ−アミノ酪酸、ベータ−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−１−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト−、メタ−および／またはパラ−置換されたフェニルアラニン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換されている）、二置換されたフェニルアラニン、置換されたチロシン（例えば、さらに−Ｑ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換されている）、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は、誘導体化されて、いくつか例を挙げるとヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、およびグリコシル化されたアミノ酸残基を含むことができる。
【００３３】
有用なアミノ酸には、以下が含まれる。
【００３４】
【化１】
2018511594.tif 000003
【００３５】
いくつかの場合において、ペプチドは天然のアミノ酸だけを含むが、当該技術分野において公知である非天然のアミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に取り込まれ得る化合物）および／またはアミノ酸類似体が代わりに使用されてもよい。また、ペプチドまたはポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸が、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学物質の付加によって修飾され得る。
【００３６】
したがって、本明細書に記載されるポリペプチドを含む化合物は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学物質の付加によって修飾されるポリペプチドを含むことができる。
【００３７】
いくつかの場合において、ペプチドは、配列番号１〜３２のいずれかの少なくとも７個（例えば、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個）の連続アミノ酸を含み（ｉｎｃｌｕｄｅ）（例えば、を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、から本質的になる、またはからなる）得る。
【００３８】
いくつかの場合において、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられている置換を含むことができる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３９】
アミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムを用いて達成される。配列比較は、ギャップのないアライメントを使用し、デフォルトパラメーター（Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス、１１のギャップ存在コスト、残基あたり１のギャップコスト、および０．８５のラムダ比）を用いて行う。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に報告されている。
【００４０】
上記のように、本明細書におけるペプチドは、内部（分子内）架橋（またはステープル）を一緒に形成する少なくとも２つの修飾アミノ酸を含み、ここで、少なくとも２つの修飾アミノ酸は、（Ａ）３つのアミノ酸（すなわち、ｉ、ｉ＋４）または（Ｂ）６つのアミノ酸（すなわち、ｉ、ｉ＋７）によって隔てられている。ｉとｉ＋４との間の架橋の場合において、架橋は、Ｃ８アルケン（例えば、４番目と５番目の炭素間に１つの二重結合を有する）、アルキレンまたはアルケニレンであり得る。ｉとｉ＋７との間の架橋の場合、架橋は、Ｃ１１、Ｃ１２もしくはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであり得る。架橋がアルケニレンである場合、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。ｉとｉ＋４との間の架橋の場合、架橋は、Ｃ８アルキルまたはアルケンであり得る。ｉとｉ＋７との間の架橋の場合、架橋は、Ｃ１１、Ｃ１２もしくはＣ１３アルキルまたはアルケン（例えば、単一の二重結合を有するＣ１１アルケン）であり得る。架橋がアルケンである場合、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。
【００４１】
「ペプチドステープル留め」は、合成方法から造られた用語であり、ここで、ポリペプチド鎖に存在する２つのオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を用いて共有結合的に接続されて（例えば、一緒に「ステープル留めされて」）、架橋された環を形成する（Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001; Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994）。本明細書で使用するとき、用語「ペプチドステープル留め」は、単独で「ステープル留めされた」ポリペプチドを提供するために、このような反応を促進させるために任意の数の反応条件および／または触媒を用いて、ポリペプチド鎖中に存在し得る２つの（例えば、少なくとも１対の）二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有と三重結合含有側鎖の接続を含む。用語「多重にステープル留めされた」ポリペプチドとは、１を超える個々のステープルを含有するそれらのポリペプチドを指し、様々な間隔および組成の２つ、３つ、またはそれ以上の独立したステープルを含み得る。さらに、用語「ペプチドステッチング」とは、本明細書で使用するとき、「ステッチされた」（例えば、タンデムまたは多重にステープル留めされた）ポリペプチドを提供するための単一のポリペプチド鎖における複数およびタンデムの「ステープル留め」事象を指し、２つのステープルにおいて、例えば、共通の残基に連結される。ペプチドステッチングは、ともに参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８１２１７６７号および国際公開第２０１０／０６８６８４号に開示されている。いくつかの場合において、ステープルは、本明細書で使用するとき、（例えば、ステッチングの段落の説明において以下に述べるように）不飽和結合を保持することができ、または減少させることができる。
【００４２】
多数のペプチドステープルは、全ての炭化水素架橋を有するが、他のタイプの架橋またはステープルを使用することができる。例えば、トリアゾール含有（例えば、１，４トリアゾールまたは１，５トリアゾール）架橋を使用することができる（Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137; 国際公開第２０１０／０６０１１２号）。
【００４３】
全炭化水素架橋を用いたペプチドのステープル留めは、特に生理学的に関連した条件下で、その本来の立体構造および／または二次構造を維持するのを助けることが示されている（Schafmiester et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892, 2000; Walensky et al., Science, 305:1466-1470, 2004）。
【００４４】
アルファ−ヘリックス二次構造を有する傾向の全炭化水素架橋による本明細書におけるポリペプチドのステープル留めは、ポリペプチドをその天然のアルファ−ヘリックス立体構造に制約することができる。制約された二次構造は、例えば、タンパク質分解性の切断に対するペプチドの耐性を増加させることができ、ペプチドの熱安定性を増加させることができ、ペプチドの疎水性を増加させることができ、（例えば、飲作用などのエネルギー依存性輸送機構を介して）標的細胞膜にペプチドをより良好に浸透させることができ、および／または対応する未架橋の（例えば、「ステッチ留めされていない」または「ステープル留めされていない」）ペプチドと比較して、ペプチドの生物学的活性の改善をもたらすことができる。
【００４５】
本明細書における安定化されたペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸が３つの（すなわちｉ、ｉ＋４）または６つの（すなわちｉ、ｉ＋７）アミノ酸によって隔てられた、少なくとも２つの、内部架橋またはステープル留めされたアミノ酸を含む。少なくとも２つのアミノ酸が、内部架橋（例えば、ステープル）を支持するためには必要であるが、内部架橋されたアミノ酸の追加の対は、例えば、追加の内部架橋（例えば、ステープル）を支持するために、ペプチドに含めることができる。例えば、ペプチドは、１つ、２つまたは３つのステープルを含み得る。
【００４６】
代替的にまたは追加的に、ペプチドは、３つの内部架橋またはステッチされたアミノ酸を含むことができ、例えば、共通の起源から生じる２つのステープルを生じさせることができる。ペプチドステッチは、少なくとも３つの内部架橋アミノ酸を含み、ここで、３つのアミノ酸の中間は、２つの隣接する（直接隣接しない）修飾アミノ酸の各々と（アルファ炭素間で）内部架橋を形成する。コアアミノ酸のアルファ炭素は、飽和または不飽和であり得る、ペプチドの他のアミノ酸のアルファ炭素への内部架橋である側鎖を有する。コアアミノ酸に架橋されたアミノ酸は、コアアミノ酸からいずれかの方向に３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられ得る。コアのいずれかの側にある（例えば、コアアミノ酸とコアに架橋されたアミノ酸との間）のアミノ酸の数は、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。
【００４７】
上記のように、内部テザーまたは架橋は、１つのヘリックスターン（すなわち、約３．４アミノ酸（すなわち、ｉ、ｉ＋４）または２つのヘリックスターン（すなわち、約７アミノ酸、ｉ＋７）の長さを超えて伸長することができる。したがって、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７に位置するアミノ酸は、化学修飾および架橋の候補である。このようにして、例えば、ペプチドが、配列．．．Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９．．．を有する場合、Ｘａａ１とＸａａ５との間、またはＸａａ１とＸａａ８との間の架橋は、Ｘａａ２とＸａａ６との間、またはＸａａ２とＸａａ９との間の架橋であるように有用である。
【００４８】
本発明は、式（Ｉ）
【００４９】
【化２】
2018511594.tif 000004
の修飾ポリペプチドまたはその医薬として許容される塩を特徴とし、
式中、
各Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレンもしくはアルキニレン（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３アルキレン）または［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；それぞれが０〜６個のＲ５で置換され；
Ｒ４およびＲ４’は、独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンである）であり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位元素であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、または
【００５０】
【化３】
2018511594.tif 000005
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコールであり；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは、２、３、４または６であり；
ｘは、２〜１０の整数（例えば、３または６）であり；
ｗおよびｙは、独立して０〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；および
各Ｘａａは、独立してアミノ酸（例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれか１つ、または任意の天然に存在する天然に存在しないアミノ酸）であり；
ここで、上記ポリペプチドは、配列番号１〜３２の少なくとも１５個の連続したアミノ酸もしくはその改変体、または（ａ）配列番号１〜３２の１５個の連続した１５個の連続した（例えば、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個または３５個）のアミノ酸内で、２つ、３つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対（例えば、１または２対）のアミノ酸の側鎖は、式Ｉにおいて記述されるようにアミノ酸対のアルファ炭素を連結する連結基Ｒ３によって置き換えられている；ならびに（ｂ）アミノ酸対の第１のアルファ炭素は、式Ｉにおいて記述されるＲ１で置換され、アミノ酸対の第２のアルファ炭素は、式Ｉにおいて記述されるＲ２で置換されていることを除き本明細書に記載されている別のポリペプチド配列を含む。
【００５１】
別の態様において、本発明は、式（ＩＩ）
【００５２】
【化４】
2018511594.tif 000006
の修飾ポリペプチドまたはその医薬として許容される塩を特徴とし、
式中、
各Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレンもしくはアルキニレン（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３アルキレン）または［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；それぞれが０〜６個のＲ５で置換され；
Ｒ４およびＲ４’は、独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンである）であり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位元素であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、または
【００５３】
【化５】
2018511594.tif 000007
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコール、ジアミンであり；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは、２、３、４、５または６であり；
ｘは、２〜１０の整数（例えば、３または６）であり；
ｗおよびｙは、独立して０〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；および
各Ｘａａは、独立してアミノ酸（例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つ、または任意の天然に存在する天然に存在しないアミノ酸）であり；
Ｒ７は、ＰＥＧ、ｔａｔタンパク質、親和性標識、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、例えば、チオカルバメートまたはカルバメート連結を介して結合した蛍光プローブ（例えば、フルオレセインまたはローダミン）であり；
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ８ａ、ＮＲ８ａＲ８ｂであり；
ここで、上記ポリペプチドは、配列番号１〜３２の少なくとも１５個の連続したアミノ酸（例えば、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個または３５個）、または（ａ）配列番号１〜３２の１５個の連続したアミノ酸内で、２つ、４つもしくは６つのアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖は、式Ｉにおいて記述されるようにアミノ酸対のアルファ炭素を連結する連結基Ｒ３によって置き換えられている；ならびに（ｂ）アミノ酸対の第１のアルファ炭素は、式ＩＩにおいて記述されるＲ１で置換され、アミノ酸対の第２のアルファ炭素は、式ＩＩにおいて記述されるＲ２で置換されていることを除き本明細書に記載されている別のポリペプチド配列を含む：
【００５４】
式Ｉまたは式ＩＩの場合、以下の実施形態は、開示されたものの１つである。ｘ＝２（すなわち、ｉ＋３連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ７アルキレン、アルケニレンであり得る。アルケニレンである場合、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。ｘ＝６（すなわち、ｉ＋４連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであり得る。アルケニレンである場合、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。ｘ＝３（すなわち、ｉ＋４連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ８アルキレン、アルケニレンであり得る。アルケニレンである場合、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。
【００５５】
特定の場合において、２つのアルファ、アルファ二置換された立体中心（アルファ炭素）はともにＲ立体配置もしくはＳ立体配置（例えばｉ、ｉ＋４架橋）であり、または一方の立体中心はＲであり、他方はＳ（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）である。したがって、式Ｉは、
【００５６】
【化６】
2018511594.tif 000008
として記述され、Ｃ’およびＣ’’二置換された立体中心はともにＲ立体配置であってもよく、または、例えば、ｘが３である場合、両方がＳ立体配置であってもよい。ｘが６である場合、Ｃ’二置換立体中心はＲ立体配置にあり、Ｃ’’二置換立体中心はＳ立体配置である、またはＣ’二置換立体中心はＳ立体配置であり、Ｃ’’二置換立体中心はＲ立体配置である。Ｒ３二重結合は、ＥまたはＺの立体化学配置であってもよい。同様の立体構造は、直ぐ上に記述した式中のＣ’およびＣ’’に対応する式ＩＩ中の炭素についても可能である。
【００５７】
いくつかの場合において、Ｒ３は［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４’］ｎであり；Ｒ４およびＲ４’は、独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンである（例えば、それぞれは、独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンである）。
【００５８】
いくつかの場合において、ポリペプチドは、架橋によって置き換えられているアミノ酸側鎖に加えて、配列番号１〜３２のいずれかにおける１個、２個、３個、４個または５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個のアミノ酸変化（例えば、保存的アミノ酸変化）を有するアミノ酸配列を含む。
【００５９】
テザーは、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分（例えば、Ｃ６、Ｃ８もしくはＣ１１アルキル、またはＣ６、Ｃ８もしくはＣ１１アルケニル、またはＣ５、Ｃ８もしくはＣ１１アルキニル）を含むことができる。テザーされたアミノ酸は、アルファ二置換されていてもよい（例えば、Ｃ１−Ｃ３またはメチル）。［Ｘａａ］ｙおよび［Ｘａａ］ｗは、独立して、配列番号１〜３２の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、または３５個の連続アミノ酸を含み、［Ｘａａ］ｘは、配列番号１〜３２の酸の２つ、３つまたは６つの連続したアミノ酸を含むことができるペプチドである。
【００６０】
ペプチドは、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、したがって、存在する任意のオレフィンの、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物ならびに幾何異性体（例えば、Ｚまたはシス、およびＥまたはトランス）として生じることができる。例えば、本明細書に開示されるペプチドは、例えば、シス−およびトランス−異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含む、特定の幾何または立体異性体に存在することができる。エナンチオマーは、対応するエナンチオマーを含まなくてもよく（例えば、実質的に含まなくてもよく）、および／または光学的に富化されてもよい。「光学的に富化された」とは、本明細書で使用するとき、化合物が、かなり大きな割合の１つのエナンチオマーで構成されていることを意味する。特定の実施形態において、実質的に含まないとは、組成物が少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーを含有することを意味する。他の実施形態において、化合物は、少なくとも約９５重量％、９８重量％、または９９重量％の好ましいエナンチオマーから構成されている。好ましいエナンチオマーは、限定されないが、例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびキラル塩の形成および結晶化を含む当該技術分野において公知の技術を用いてラセミ混合物から単離され得、または不斉合成によって調製され得る（例えば、Jacques, et al, Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, EX. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw- Hill, NY, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (EX. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972を参照されたい。）これらの化合物の全てのこのような異性体形態は、本発明に明示的に含まれる。
【００６１】
また、ペプチドは、複数の互変異性形態で表され得、このような場合において、本発明は、本明細書に記載される化合物の全ての互変異性形態（例えば、複数の部位でのアルキル化が位置異性体を生じさせ得ることができる平衡（例えば、ケト−エノール）状態にある異性体）、位置異性体、および本明細書に開示される化合物の酸化生成物（本発明は、このような反応生成物の全てを明示的に含む）を明示的に含む。このような化合物の全てのこのような異性体形態は、全ての結晶形態であるように含まれる。
【００６２】
記号：
【００６３】
【化７】
2018511594.tif 000009
は、分子構造の一部として使用される場合、単一の結合またはトランスもしくはシス二重結合を意味する。
【００６４】
用語「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のいずれかの基を意味する。用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖であり得る炭化水素鎖を意味する。例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、その基がその中に１〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを示す。いずれもの数字の指定がない場合、「アルキル」は、その中に１〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。用語「アルキレン」とは、二価のアルキル（すなわち、−Ｒ−）を意味する。
【００６５】
用語「アルケニル」とは、ＺまたはＥのいずれかの幾何学的配置に１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖であり得る炭化水素鎖を意味する。アルケニル部分は、示された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がその中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを示す。用語「低級アルケニル」とは、Ｃ２−Ｃ８アルケニル鎖を意味する。いずれもの数値の指定がない場合、「アルケニル」は、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００６６】
用語「アルキニル」とは、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖であり得る炭化水素鎖を意味する。アルキニル部分は、示された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がその中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを示す。用語「低級アルキニル」とは、Ｃ２−Ｃ８アルキニル鎖を意味する。いずれもの数字の指定がない場合、「アルキニル」は、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００６７】
用語「アリール」とは、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香族環系を意味し、ここで、各環の０個、１個、２個、３個、４個または５個の原子が置換基で置換されてもよい。アリール基の例には、フェニル、ナフチルなどが含まれる。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」とは、アリールで置換されたアルキルを意味する。用語「アリールアルコキシ」とは、アリールで置換されたアルコキシを意味する。
【００６８】
用語「シクロアルキル」は、本明細書で使用するとき、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、より好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和および部分不飽和の環状炭化水素基を含み、ここで、シクロアルキル基は、場合によりさらに置換されてもよい。好ましいシクロアルキル基には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタジエニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニルおよびシクロオクチニルが含まれる。
【００６９】
用語「ヘテロアリール」とは、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を意味し、上記ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合は、炭素原子と、それぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３個、１〜６個、または１〜９個のヘテロ原子）、ここで、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子は置換基で置換されてもよい。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリダジル、ピリミジル、チオフェニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルなどが含まれる。用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」とは、ヘテロアリールで置換されたアルキルを意味する。用語「ヘテロアリールアルコキシ」とは、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを意味する。
【００７０】
用語「ヘテロシクリル」とは、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を意味し、上記ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合は、炭素原子と、それぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３個、１〜６個、または１〜９個のヘテロ原子）、ここで、各環の０個、１個、２個、または３個の原子は置換基で置換されてもよい。ヘテロシクリル基の例には、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどが含まれる。
【００７１】
用語「置換基」とは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール基上で、その基の任意の原子で「置換されている」基を意味する。適切な置換基には、限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、アジドおよびシアノ基が含まれる。
【００７２】
いくつかの場合において、本明細書に記載される炭化水素テザー（すなわち、架橋）をさらに操作することができる。１つの場合において、（例えば、ルテニウム触媒の閉環メタセシス（ＲＣＭ）を用いて合成された）炭化水素アルケニルテザーの二重結合を酸化して（例えば、エポキシ化またはジヒドロキシル化による）、以下の化合物の１つを得ることができる。
【００７３】
【化８】
2018511594.tif 000010
【００７４】
エポキシド部分または遊離ヒドロキシル部分の１つのいずれかをさらに官能化することができる。例えば、エポキシドは、例えば、タグ（例えば、放射性同位元素または蛍光タグ）を結合させるために使用され得るさらなる、追加の機能性を提供する求核試薬を用いて処理することができる。このタグは、体内の所望の位置に化合物を指向させ、または体内の化合物の位置を追跡するのに役立ち得る。あるいは、追加の治療剤を官能化テザー（例えば、ラパマイシン、ビンブラスチン、タキソールなどの抗癌剤）に化学的に結合させることができる。あるいは、このような誘導体化は、ポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端の合成操作によって、またはアミノ酸側鎖を介して達成され得る。他の薬剤、官能化されたテザー、例えば、細胞へのポリペプチドの進入を促進する薬剤に結合させることができる。
【００７５】
炭化水素テザーが記載されているが、他のテザーもまた想定される。例えば、テザーは、エーテル、チオエーテル、エステル、アミンまたはアミド部分の１つまたは複数を含むことができる。いくつかの場合において、天然に存在するアミノ酸側鎖は、テザーに組み込むことができる。例えば、テザーは、セリンのヒドロキシル、システインのチオール、リジンの第一級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミンのアミドなどの官能基とカップリングすることができる。したがって、天然に存在しない２つのアミノ酸をカップリングすることによって作成されるテザーを使用するというよりはむしろ、天然に存在するアミノ酸を用いてテザーを作製することが可能である。また、単一の天然に存在しないアミノ酸を天然に存在するアミノ酸と一緒に使用することが可能である。
【００７６】
テザーの長さは変更可能であることがさらに想定される。例えば、二次アルファ−ヘリックス構造に比較的高い程度の制約を与えることが望まれる場合、より短い長さのテザーを使用することができ、一方、いくつかの場合において、二次アルファ−ヘリックス構造に対してより少ない制約を提供することが望まれ、したがって、より長いテザーが望ましい場合がある。
【００７７】
さらに、アミノ酸ｉ〜ｉ＋３、ｉ〜ｉ＋４、およびｉ〜ｉ＋７にまたがるテザーの例は、主にアルファヘリックスの単一面上にあるテザーを提供するために記載されているが、テザーは、多数のアミノ酸の任意の組み合わせにまたがるように合成することができる。
【００７８】
いくつかの場合において、アルファ二置換アミノ酸は、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するためにポリペプチドに使用される。しかしながら、アルファ二置換アミノ酸は必要ではなく、モノ−アルファ置換基（例えば、テザーされたアミノ酸）を使用する場合もまた想定される。
【００７９】
ステープル留めされたポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを含むことができる。ポリマーまたは他の薬剤がステープル留めされたポリペプチドに連結される場合、組成物が実質的に均質であることが望ましい場合がある。
【００８０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加は、ポリペプチドの薬物動態学的特性および薬力学的特性を改善することができる。例えば、ＰＥＧ化は、腎クリアランスを減少させることができ、より安定な血漿濃度をもたらすことができる。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、式：
ＸＯ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｙ
としてポリペプチドに連結されるものとして表すことができ、式中、ｎは、２〜１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルであり；Ｙは、ポリペプチドのアミン基（限定されないが、リジンのイプシロンアミンまたはＮ末端が挙げられる）に対するアミド、カルバメートまたは尿素連結である。Ｙはまた、チオール基（限定されないが、システインのチオール基が挙げられる）に対するマレイミド連結であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接または間接的に連結させるための他の方法は、当業者に公知である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよくまたは分岐状でもあってもよい。様々な官能化された誘導体を含む様々な形態のＰＥＧが市販されている。
【００８１】
骨格に分解可能な連結を有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けるエステル連結を用いて調製することができる。分解性ＰＥＧ連結を有するコンジュゲートは、国際公開第９９／３４８３３号；国際公開第９９／１４２５９号、および米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。
【００８２】
特定の実施形態において、巨大分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間リンカーを介して本明細書に記載される薬剤に結合される。特定の実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸から構成され、ここで、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者によく理解されるように、グリコシル化されてもよい。他の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。他の実施形態において、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸から構成される。非ペプチドリンカーもまた可能である。例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝２〜２０）などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの任意の立体障害のない基によってさらに置換されてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号は、二官能性ＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカー末端のそれぞれにペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用について記載する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ステープル留めされたペプチドはまた、例えば、細胞取り込みをさらに促進するまたはインビボでの安定性を高めるように修飾することができる。例えば、ペプチド模倣大員環のアシル化またはＰＥＧ化は、細胞取り込みを促進し、バイオアベイラビリティを増加させ、血液循環を増加させ、薬物動態を変化させ、免疫原性を低下させおよび／または必要とされる投与頻度を減少させる。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるペプチドを含む化合物は、例えば、細胞取り込みをさらに促進するまたはインビボでの安定性を高めるように修飾されたペプチドを含むことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるステープル留めされたペプチドは、細胞膜に（例えば、ステープル留めされていないペプチドと比較して）浸透する能力が高められている。
【００８５】
本明細書に記載される化合物を合成する方法は、当該技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用することができる。種々のステップは、所望の化合物を得るために、代替の順序または順番で実施することができることが理解される。本明細書に記載される化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基方法（保護および脱保護）は、当該技術分野において公知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれ以降の版に記載されているものなどが挙げられる。
【００８６】
本発明のペプチドは、化学合成方法によって作製することができ、これは当業者に周知である。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１上で、側鎖を保護したアミノ酸を用いるｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかによって保護されたα−ＮＨ２による固相合成の自動化されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を用いて合成することができる。
【００８７】
本明細書に記載されるペプチドの作製の１つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子を有する酸不安定結合を介して、架橋ポリスチレンレジンに結合される。このレジンは、合成のために使用される溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を洗い流すことを比較的簡便におよび迅速にさせる。Ｎ末端は、Ｆｍｏｃ基で保護され、これは酸中では安定であるが、塩基によって除去可能である。任意の側鎖官能基は、塩基に安定であり、酸に不安定な基で保護される。
【００８８】
より長いペプチドは、天然の化学的ライゲーションを用いて個々の合成ペプチドをコンジュゲートすることによって作製することができた。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。このような技術は、詳細なプロトコルを備えた周知の標準マニュアルに提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードする核酸配列を得、好ましくはその遺伝子が発現されるべき生物に最適なコドンを有するようにする。次に、合成遺伝子は、典型的にはペプチドをコードし、および必要に応じて、任意の調節要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。次に、ペプチドは、選択された発現系および宿主に適した、適切な条件下で発現される。このペプチドは、標準的な方法によって精製され、特徴付けられる。
【００８９】
ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループットの多重チャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して、ハイスループットのコンビナトリアル方式で作製され得る。
【００９０】
ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、レトロ−インベルソ結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元されたアミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランス−オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）、式中、ＲはＨまたはＣＨ３である；フルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）、式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）によって置き換えられ得る。
【００９１】
ポリペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によってさらに修飾することができる。上記のように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１−Ｃ２０の直鎖状または分岐状のアルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組み合わせにコンジュゲートすることができる。
【００９２】
したがって、本明細書に記載されるポリペプチドを含む化合物は、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって修飾されるポリペプチドを含むことができる。上記のように、ポリペプチドを含む化合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１−Ｃ２０の直鎖状または分岐状のアルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組み合わせにコンジュゲートされ得るペプチドを含むことができる。
【００９３】
様々な長さのオレフィン性側鎖を含むα，α−二置換された非天然アミノ酸は、公知の方法（Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991; Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000; およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008; Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011）によって合成され得る。ｉ＋７に連結されたｉのステープルが使用されるペプチド（安定化されたヘリックスの２回転）について、１つのＳ５アミノ酸と１つのＲ８が使用され、または１つのＳ８アミノ酸と１つのＲ５アミノ酸が使用される。開始のキラル補助基がＲ−アルキル−立体異性体を与えることを除いて、Ｒ８は、同じ経路を使用して合成される。また、８−ヨードオクテンは、５−ヨードペンテンの代わりに使用される。阻害剤は、ＭＢＨＡレジン上の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて固体支持体上で合成される（例えば、国際公開第２０１０／１４８３３５号を参照されたい）。
【００９４】
Ｆｍｏｃ保護されたα−アミノ酸（オレフィン性アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ５−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ８−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｒ５−ＯＨ以外）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィン性アミノ酸の合成は、当該分技術野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。
【００９５】
いくつかの場合において、ペプチドは、検出可能な標識を含むことができる。本明細書で使用するとき、「標識」とは、標識が結合しているペプチドの検出を可能にする、少なくとも１つの要素、同位体、または官能基が部分に組み込まれるようにするその部分を意味する。標識は、直接的に（すなわち、結合を介して）結合することができ、またはリンカー（例えば、リンカーを作製することができる、環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のアルキレン；環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のアルケニレン；環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のアルキニレン；環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のヘテロアルキレン；環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のヘテロアルケニレン；環状もしくは非環状の、分岐もしくは非分岐の、置換もしくは非置換のヘテロアルキニレン；置換もしくは非置換のアリーレン；置換もしくは非置換のヘテロアリーレン；または置換もしくは非置換のアシレン、あるいは任意のそれらの組み合わせ）によって結合することができる。標識は、検出される本発明のポリペプチドの生物学的活性または特徴を妨害しない任意の位置でペプチドに結合させることができる。
【００９６】
標識は、以下を含むことができる：放射性同位体または重同位体であり得る同位体部分を含む標識、例えば、限定されないが、
２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅ；酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合される、抗体または抗原であってもよい、免疫学的部分または免疫反応性部分を含む標識；着色、発光、リン光であり、または蛍光部分（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣなど）を含む標識；１つまたは複数の光親和性部分を有する標識；１つまたは複数の公知の結合パートナー（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）を有するリガンド部分を有する標識。
【００９７】
いくつかの場合において、標識は、生体系における分子間相互作用の直接解明のための１つまたは複数の光親和性部分を含むことができる。ジアゾ化合物、アジド、またはジアジリンのニトレンまたはカルベンへの光変換に大部分が依存する様々な公知のフォトフォアを用いることができる（例えば、Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Amsterdamを参照されたい。その全内容は、本明細書に参照により組み込まれる）。本発明の特定の実施形態において、使用される光親和性標識は、限定されないが、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸を含む１つまたは複数のハロゲン部分で置換されたｏ−、ｍ−およびｐ−アジドベンゾイルである。
【００９８】
標識はまた、造影剤であってもよく、または造影剤として役立ち得る。例示的な造影剤には、限定されないが、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ支援断層撮影法（ＣＡＴ）、単一光子放射断層撮影法、Ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において使用されるもの；抗嘔吐薬；コントラスト剤が含まれる。例示的な診断剤には、限定されないが、蛍光部分、発光部分、磁性部分；ガドリニウムキレート剤（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡおよびＨＰ−ＤＯ３Ａを有するガドリニウムキレート剤）、鉄キレート剤、マグネシウムキレート剤、マンガンキレート剤、銅キレート剤、クロムキレート剤、ＣＡＴおよびＸ線画像化に有用なヨウ素ベースの材料、ならびに放射性核種が含まれる。適切な放射性核種には、限定されないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、および１８Ｆが含まれる。
【００９９】
蛍光部分および発光部分には、限定されないが、「色素」、「標識」または「指示薬」と一般的に称される種々の異なる有機小分子または無機小分子が含まれる。例としては、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、Ａｌｅｘａ色素、シアニン色素などが挙げられる。蛍光部分および発光部分は、様々な天然に存在するタンパク質およびそれらの誘導体、例えば、遺伝子操作された改変体を含んでもよい。例えば、蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強されたＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン色およびサファイア色蛍光タンパク質、サンゴ蛍光タンパク質などが含まれる。発光タンパク質には、ルシフェラーゼ、エクオリンおよびその誘導体が含まれる。数多くの蛍光性および発光性の色素およびタンパク質は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号；Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; およびHandbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9th edition, 2002を参照されたい）。
【０１００】
また、本明細書に開示されるペプチドを得る（例えば、合成する）、ステープル留めする、および精製するのに適した方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008); Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011; Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004); Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に発行された米国特許第７，７２３，４６８号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ステープル留めされていないペプチド汚染物質を実質的に含まないまたは単離される。ペプチドを精製する方法には、例えば、固相支持体上でペプチドを合成することが含まれる。環化後、固相支持体を単離し、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物などの溶媒の溶液中に懸濁させることができる。ＤＭＳＯ／ジクロロメタン、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含み得る。特定の実施形態において、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液が使用される。この溶液を１、６、１２または２４時間インキュベートしてもよく、その後、レジンを、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで洗浄してもよい。一実施形態において、レジンをＮＭＰで洗浄する。溶液中に不活性ガスを振り混ぜてバブリングを行ってもよい。
【０１０２】
医薬組成物
本明細書に開示される、安定化されたペプチドの１つまたは複数（例えば、配列番号１〜３２の１つまたは複数）は、医薬組成物としてまたは医薬組成物中で使用するために製剤化され得る。このような組成物は、任意の経路、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された任意の経路を介して、対象に投与するために製剤化または適合させることができる。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ規格マニュアル、バージョン番号００４（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍで入手可能である）に記載されている。例えば、組成物は、吸入（例えば、経口および／または鼻吸入（例えば、ネブライザーまたはスプレーによる））、注射（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、および／または皮下）による投与；および／または経口投与、経粘膜投与、および／または局所投与（例えば、局所（例えば、鼻）スプレーおよび／または溶液）のために製剤化または適合させることができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、有効量の１つまたは複数の安定化されたペプチドを含むことができる。用語「有効量」および「治療するのに有効な」とは、本明細書で使用するとき、意図された効果または生理学的転帰（例えば、癌の治療）を引き起こすために投与の状況内で有効である一定期間（例えば、急性または慢性投与および周期的または連続投与）に利用される、本明細書に記載される１つまたは複数の化合物または医薬組成物の量または濃度を意味する。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数のペプチドおよび任意の医薬として許容される担体および／またはビヒクルを含むことができる。いくつかの場合において、医薬は、疾患または疾患の症状の調節を達成するのに有効な量で１つまたは複数の追加の治療剤をさらに含むことができる。
【０１０４】
用語「医薬として許容される担体またはアジュバント」とは、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与した場合に無毒である担体またはアジュバントを意味する。
【０１０５】
本発明の医薬組成物に使用され得る医薬として許容される担体、アジュバントおよびビヒクルには、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬剤形で使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎｓまたは他の同様のポリマー送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。シクロデキストリン、例えば、α−、β−およびγ−シクロデキストリンはまた、本明細書に記載される式の化合物の送達を増強するために有利に使用され得る。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、任意の従来の無毒性の医薬として許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含むことができる。いくつかの場合において、製剤のｐＨは、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を高めるために、医薬として許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて調整されてもよい。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内の注射または輸液技術を含む。
【０１０７】
医薬組成物は、吸入および／もしくは経鼻投与のための溶液または粉末の形態であり得る。このような組成物は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０など）および懸濁化剤を用いて、当該技術分野で公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用することができる、許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無菌性の固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の医薬として許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化されたバージョンであるように、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび／または懸濁液などの医薬として許容される剤形の製剤に一般的に使用される、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは類似した分散剤を含み得る。ＴｗｅｅｎまたはＳｐａｎなどの他の一般的に使用される界面活性剤、および／または医薬として許容される固体、液体または他の剤形の製造において一般的に使用される他の類似した乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤はまた、製剤の目的で使用することができる。
【０１０８】
医薬組成物は、限定されないが、カプセル、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散液および溶液を含む、任意の経口的に許容される剤形で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムはまた、典型的には添加される。カプセル形態の経口投与のために、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁液および／またはエマルジョンが経口投与される場合、有効成分は、油相に懸濁または溶解され、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わされ得る。必要に応じて、特定の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加することができる。
【０１０９】
代替的にまたは追加的に、医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野において公知である他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本開示は、以下の方法において本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物（以下で「Ｘ」と示される）のいずれか１つまたは複数を使用する方法を提供する。
【０１１１】
本明細書に開示される１つまたは複数の疾患または状態（例えば、癌、以下の実施例において「Ｙ」と称される）の治療における医薬として使用するための物質Ｘ。Ｙの治療のための医薬を製造するための物質Ｘの使用；Ｙの治療に使用するための物質Ｘ。
【０１１２】
いくつかの場合において、本明細書に開示される１つまたは複数のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートされた組成物は、一価または多価であってもよい。例えば、コンジュゲートされた組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた、本明細書に開示される１つのペプチドを含み得る。あるいは、コンジュゲートされた組成物は、担体にコンジュゲートされた、本明細書に開示される２つ以上のペプチドを含み得る。
【０１１３】
本明細書で使用さするとき、２つの実体が互いに「コンジュゲートされている」場合、これらは、直接的または間接的な共有結合的または非共有結合的な相互作用により連結される。特定の実施形態において、結合は共有結合である。他の実施形態において、結合は非共有結合である。非共有結合的な相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが含まれる。間接的な共有結合的な相互作用は、２つの実体が、場合によりリンカー基を介して共有結合的に接続されている場合である。
【０１１４】
担体タンパク質は、対象において免疫原性を増加または増強する任意のタンパク質を含み得る。例示的な担体タンパク質は、当該技術分野において報告されている（例えば、Fattom et al., Infect. Immun., 58:2309-2312, 1990; Devi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7175-7179, 1991; Li et al., Infect. Immun. 57:3823-3827, 1989; Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561,1991; Szu et al., J. Exp. Med. 166:1510-1524, 1987; およびSzu et al., Infect. Immun. 62:4440-4444, 1994を参照されたい）。ポリマー担体は、１つまたは複数の第１級および／または第２級アミノ基、アジド基またはカルボキシル基を含む天然または合成の材料であり得る。担体は、水溶性であってもよい。
【０１１５】
治療方法
本開示は、癌の予防および／または治療のための本明細書におけるペプチドを使用する方法を含む。用語「治療する」または「治療すること」とは、本明細書で使用するとき、対象が罹患している疾患または状態を部分的にまたは完全に軽減し、阻害し、改善しおよび／または緩和することを意味する。
【０１１６】
一般的に、本方法は、対象を選択し、本明細書における有効量の（例えば、治療的有効量の）１つまたは複数のペプチドを、例えば、医薬組成物中においてまたは医薬組成物として対象に投与し、場合により、癌の予防または治療に必要とされる投与を反復することを含む。
【０１１７】
任意の特定の患者のための具体的な投薬量および治療レジメンは、様々な因子に依存し、例えば、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患、状態または症状に対する患者の性質、および治療する医師の判断が挙げられる。
実施例
【実施例１】
【０１１８】
Ｍｃｌ−１特異的ペプチドの同定および特徴付け
Ｂｉｍ−ＢＨ３ドメイン改変体の酵母表面ディスプレイライブラリーをスクリーニングしている最中に、３つのＭｃｌ−１特異的ペプチドを発見した。２つのクローン（Ｂ３およびＡ１２）由来のＢＨ３配列は、可溶性ペプチドとしてさらなる研究のために選択した。Ｂ３およびＡ１２の配列ならびにＮ末端フルオレセインを有する２３個のアミノ酸の合成ペプチドを作製し、ＫＳＢｃｌ−２および５つのヒトＢｃｌ−２ファミリータンパク質への結合について溶液中で試験した（図１；全ての配列については表１を参照されたい）。これらの実験は、同定されたペプチドが、Ｂｃｌ−２、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗおよび程度は下がるがＢｃｌ−ｘＬに比べ、優先してＫＳＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１に結合することを示した。
【０１１９】
【表１】
2018511594.tif 000011
【０１２０】
本発明者らが同定したペプチドはＭｃｌ−１に強く結合し、他のヒトＢｃｌ−２ファミリーメンバーよりもＭｃｌ−１に対して優れた特異性を示したため、それらをＭｃｌ−１結合剤としてさらに開発することを選択した。
【０１２１】
本発明者らは、合理的な突然変異誘発を用いたスクリーニングにおいて同定されたペプチドのＭｃｌ−１結合選択性を改善しようと試みた。野生型Ｂｉｍは、２ｅ位にアラニンを有し（ペプチド位置標識については表１を参照されたい）、Ｂｉｍ  ＢＨ３点突然変異体のＳＰＯＴ−アレイ試験は、Ｂ３、Ａ１２およびＧ９に見出される２ｅのグリシン（スクリーニングにおいても同定されたＢ３の点突然変異）が、受容体の全てに許容されるまたはそれらへの結合を増加させることを示している。２ｅのスレオニンは、Ｍｃｌ−１への強力な結合を維持しながら、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｗへの結合を減少させ得る突然変異としてＳＰＯＴアレイを用いて同定した。Ｂ３、Ａ１２、およびＧ９に対応するペプチドの特異性は、２ｅ位のグリシンをスレオニンに置き換えることによって大きく改善され、Ｇ２ｅＴ突然変異を有するＡ１２、Ｂ３、およびＧ９の配列にそれぞれ対応するＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３改変体（Ｍｃｌ−１特異的である）を生成した。Ｎ末端フルオレセインで標識されたＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３は、蛍光異方性アッセイにおいて、５つのヒトＢｃｌ−２受容体への結合について試験された。図１に示されるように、３つのペプチドは全て、Ｍｃｌ−１にＫｄ≦２ｎＭで結合した。ＭＳ１は、Ｋｄ＞１μＭで他の４つの受容体に結合した。ＭＳ２は、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、およびＢｆｌ−１に対するマイクロモルの親和性で結合し、１００ナノモル範囲でＢｃｌ−ｗに結合した。ＭＳ３はまた、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２に対してマイクロモルの親和性を示し、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１に対して数百ナノモルの親和性を示した。対照的に、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、またはＢｆｌ−１の２５００ｎＭまでの結合が文献に報告されていない、マウスＮｏｘａ由来のＮｏｘａＡ  ＢＨ３ペプチドは、３つの設計されたペプチドよりも弱くＭｃｌ−１に結合し、Ｋｄは４６ｎＭであった（図１）。ＮｏｘａＡは、最もＭｃｌ−１−選択的な天然のＢＨ３であり、ＮｏｘａＡ  ＢＨ３ペプチドは、Ｍｃｌ−１に依存するアポトーシス耐性を検出するために、ＢＨ３プロファイリングアッセイにおいて日常的に使用される。ＮｏｘａＡと比較して、３つの設計されたペプチドであるＭＳ１、ＭＳ２およびＭＳ３は、Ｍｃｌ−１に対して高い親和性を有し、また、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｆｌ−１に結合しない高い特異性を示す。結合についてＮ末端フルオレセイン色素の影響を評価するために、本発明者らは、標識されていないペプチドのサブセット、ＭＳ１、ＭＳ２、Ｂｉｍ、およびＮｏｘａＡを、蛍光標識されたＢｉｍ改変体と競合させて試験した。ＭＳ１、ＭＳ２、およびＮｏｘａＡへのＭｃｌ−１結合のＫｉ値は、標識されたペプチドを用いて測定されたＫｄ値よりも低かった。Ｍｃｌ−１に結合するＭＳ１のＫｉは、適合に応じて８〜２４ｎＭであった。競合実験は、ＭＳ１が、次に緊密な結合ファミリーメンバーであるＢｃｌ−ｗと比べて、Ｍｃｌ−１に対して約４０〜１９０倍特異的であることを示した。競合実験はまた、ＭＳ１およびＭＳ２が、ＮｏｘａＡよりもＭｃｌ−１に対するかなり強い結合剤であるこ���を確認した；Ｍｃｌ−１へのＮｏｘａＡ結合は非常に弱く、したがって、競合アッセイを用いて定量することは困難であった。ＢｉｍのＢＨ３領域に対応するペプチドは、全ての受容体に非常に強く結合する。ＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３に対する結合特異性の決定要因をよりよく理解するために、本発明者らは、Ｂｉｍとは異なるこれらのペプチドの残基を同定し、Ｍｃｌ−１以外の受容体との相互作用を不安定化しようと試みた。２ｅＴ突然変異は、高度にＭｃｌ−１特異的なペプチドを生成するために不可欠であった。Ｂｉｍにおけるこの単一の点突然変異（Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴを与える、表１）は、Ｂｃｌ−ｘＬ結合において６倍の減少をもたらし、野生型Ｂｉｍバックグラウンドを有するペプチドのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１結合において２０倍超の減少をもたらす（図１）。同様に、ライブラリーペプチドＡ１２およびＢ３に２ｅＴを導入すると、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−ｘＬへの結合が約１００倍減少し、Ｂｃｌ−ｗ結合親和性が、より中程度である約１０倍減少した。したがって、２ｅ位のスレオニンは、いくつかの異なるペプチドの状況において、Ｍｃｌ−１以外の全てのヒトＢｃｌ−２受容体に対して高度に不安定化していることは明らかである。２ｅ位は、天然のＢＨ３配列の小さなもの（アラニン、グリシン、セリン）として保存されている。Ｍｃｌ−１は、Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴを含む２ｅ位により大きな残基を有するＢＨ３ペプチドに結合し、２ｅ位にロイシンを有するＭｃｌ−１  ＢＨ３領域に対応するペプチドに結合することができる。他のＢｃｌ−２パラログが２ｅ位にスレオニンを収容することができないという可能な理由を調べるために、本発明者らは、ＢｉｍのＢＨ３領域に結合したＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｆｌ−１およびＭｃｌ−１（それぞれ３ＦＤＬ、２ＶＭ６および２ＰＱＫ）の構造を比較した。図２ａに示されるように、Ｂｆｌ−１のヘリックス４は、Ｍｃｌ−１のヘリックス４よりも２ｅ位付近でペプチドに対してより近い。静的Ｍｃｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３およびＢｆｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３構造上の２ｅでの好ましいスレオニンロータマーの単純なモデリングは、スレオニンがＢｆｌ−１のＭｃｌ−１構造に容易に収容されることを示している（図２ｂ）。Ｂｃｌ−ｘＬ：Ｂｉｍ  ＢＨ３構造において、ＢＨ３ペプチドは、溝内にわずかに異なって配置され、Ｍｃｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３構造よりも溝内にさらに配向されたＡｌａ２ｅをもたらす（図２ｃ）。Ｂｃｌ−ｘＬヘリックス４の再配列は、恐らくはスレオニンを収容する必要があり、このような再構成は、Ｂｃｌ−ｘＬのＧｌｕ１２９およびＡｒｇ１３２（ヘリックス４上）とＢｉｍのＡｒｇ３ｂとの間のＢｃｌ−ｘＬ：Ｂｉｍ  ＢＨ３構造において形成する、３残基の塩架橋ネットワークの破壊をもたらす場合、不利になる場合がある（図２ｄ）。このネットワークは、Ｂｃｌ−ｘＬ残基１２９の等価物が、この複合体のペプチド位置３ｂからさらに離れるため、Ｍｃｌ−１：Ｂｉｍ  ＢＨ３またはＭｃｌ−１：Ｍｃｌ−１  ＢＨ３（２ｅ位がロイシンである）のような構造で形成することはできない。塩橋形成に関与するＢｃｌ−ｘＬの荷電残基はまた、Ｂｃｌ−２において保存されており、これは、同様の機構が、そのタンパク質について２ｅ位のスレオニンまたはより大きな残基を消失させるように作用し得ることを示唆している。ＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３は全て、２ｇで異なる置換を有し、これは野生型Ｂｉｍのグルタミン酸塩であり、典型的には他の公知のＢＨ３領域の中程度から大きな残基である。本発明者らの最も選択的なペプチドであるＭＳ１は、この位置にグリシンを有し、Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴの２ｇ位のグルタミン酸からグリシンに突然変異させることにより、全ての受容体への結合が減少した。Ｍｃｌ−１に対する親和性の変化は定量化できなかったが、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌｗ、およびＢｃｌ−ｘＬに対する親和性は、Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴと比較してさらに２〜８倍減少した。したがって、２ｇのグリシンは、Ｍｃｌ−１標的への結合を弱める代償を払うが、オフターゲット受容体とのネガティブ設計の不快な相互作用のいくつかを提供する（図１）。ペプチドＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３の３つの突然変異は、公知のＢＨ３モチーフ（２ｄ、３ｄおよび４ａ位）において通常は疎水性として保存される位置に生じる。Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴの状況で試験した場合、Ｉ２ｄＭ（ＭＳ１に見られる）は、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｆｌ−１への結合においておよそ４倍の減少をもたらした（図１）。特に、Ｂｉｍ＿Ａ２ｅＴ＿Ｅ２ｇＧおよびＢｉｍ＿Ａ２ｅＴ＿Ｉ２ｄＭに対するＢｃｌ−ｗ結合の有意な減少は、ＭＳ１が、２ｇおよび２ｄで異なる突然変異を有するＭＳ２およびＭＳ３よりもＭｃｌ−１対Ｂｃｌ−ｗに対してより選択的である理由を説明することができる。突然変異Ｉ３ｄＬは、Ｂｆｌ−１へのＢｉｍ＿Ａ２ｅＴの結合を４倍減少させたが、一方、この突然変異は、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−ｗに対してわずかに結合を増加させた（図１）。Ｆ４ａＩ突然変異は、Ｂｆｌ−１およびＢｃｌ−ｗへのＢｉｍ＿Ａ２ｅＴ結合をわずかに増加させたが、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２に対してそれぞれ６倍および３倍結合を減少させた（図１）。４ａ位は、十分に裏付けされた、Ｍｃｌ−１結合に対する特異性の源である。突然変異誘発研究およびペプチドライブラリースクリーニングは、Ｂｃｌ−ｘＬが、４ａ付近の囲い込まれた疎水性ポケットを充填するようにフェニルアラニンまたはチロシンを含むペプチドに優先的に結合するが、一方、Ｍｃｌ−１は、この位置で広範囲の置換を許容することを実証している。
【０１２２】
全細胞ＢＨ３プロファイリングアッセイを使用して、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、またはＢｆｌ−１に対し異なる依存性を有するいくつかの細胞株における、本発明者らのＭｃｌ−１結合ペプチドの特異性を試験した。このアッセイにおいて、透過性細胞を漸増量のＢＨ３ペプチドで処理し、ミトコンドリア外膜透過性化（ＭＯＭＰ）を、色素ＪＣ−１を用いて監視した（下記参照）。この研究からのペプチドを伴うＢＨ３プロファイリング実験についてのＥＣ５０値を図３に示す。Ｍｃｌ−１／Ｍｙｃ２６４０は、マウスＭｃｌ−１およびＭｙｃを過剰発現する操作されたマウス白血病細胞株であり、Ｂｃｌ−２／Ｍｙｃ２９２４は、ヒトＢｃｌ−２を過剰発現する、同様に操作された細胞株である。ウェスタンブロットおよびＢＨ３プロファイリングにより、これらの細胞は、それぞれＭｃｌ−１およびＢｃｌ−２依存性を示す。ＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３は、Ｍｃｌ−１／Ｍｙｃ２６４０において強力なミトコンドリア脱分極応答を誘発し、ＥＣ５０値は、それぞれ７０ｎＭ、７００ｎＭ、および８６０ｎＭであった。これらのペプチドは、このアッセイにおいてＮｏｘａＡよりもはるかに強力であった（ＥＣ５０＝２０μＭ）。ヒトおよびマウスのＭｃｌ−１は、Ｂｃｌ２ドメインにおいて９０％超、およびＢＨ３結合溝において９４％同一である。Ｍｃｌ−１に依存するヒト多発性骨髄腫細胞株（ＮｏｘａＡおよびＢａｄに対する応答によって示される）は、ＮｏｘａＡについて１００μＭ超のＥＣ５０値と比較して、ＭＳ１について２．５〜３．３μＭのＥＣ５０値を与えた。したがって、複数のＭｃｌ−１依存性細胞株は、ＮｏｘａＡに対するよりもＭＳ１に対してはるかに感受性であった。ＭＳ１およびＭＳ２は、ＢＨ３プロファイリングにおいて高度に選択的であった。Ｂｃｌ−２依存性株において、ＥＣ５０値は、ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３、およびＮｏｘａＡについて１００μＭ超であった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Ｂｃｌ−ｘＬ依存性プロファイルを有することが示されているヒト乳癌細胞株である。ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３、およびＮｏｘａＡについてのＥＣ５０値は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について１００μＭ超であった。ＭＳ１およびＭＳ２は、Ｂｆｌ−１依存性ＢＨ３プロファイルを示すことが以前に示されている、高いＢｆｌ−１  ｍＲＮＡ発現を有するリンパ腫株であるＰｆｅｉｆｆｅｒにおいて１００μＭ超のＥＣ５０値を示した。ＭＳ３は、ＭＳ１またはＭＳ２よりもＰｆｅｉｆｆｅｒにおいてより強い応答を示したが、ＭＳ３はまた、蛍光異方性によってより強力なＢｆｌ−１結合を示した（図１）。最後に、蛍光異方性によってＭｃｌ−１に適度な特異性を示したＢｉｍ＿Ａ２ｅＴ＿Ｅ２ｇＧ（図１）は、Ｍｃｌ−１／Ｍｙｃ２６４０において強い脱分極応答を示し、Ｂｃｌ−２／Ｍｙｃ２９２４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＰｆｅｉｆｆｅｒにおいて、ＢｉｍおよびＭＳ１の中間の脱分極応答を示した。したがって、インビトロでの結合特異性は、Ｂｃｌ−ｗ依存性細胞株がまだ同定も構築もされていないため、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、およびＢｆｌ−１に対する現在同定された依存性の全てを示す細胞株にてＢＨ３プロファイリングアッセイ���おいて再現される。ここで試験された工学的に作製されたペプチドは、活性化因子ＢＨ３ペプチドであるＢｉｍ  ＢＨ３由来であった。それにもかかわらず、これらのペプチドは、Ｍｃｌ−１に依存しない細胞株において強力な脱分極を引き起こさなかった。これは、それらが、これらのアッセイにおいて活性化因子というよりは増感因子として作用することを示している。Ｂａｘ／Ｂａｋ欠損細胞株であるＳｕ−ＤＨＬ１０において、ペプチドがミトコンドリアを脱分極させなかったため、脱分極活性はＢｃｌ−２経路に特異的であった。
【０１２３】
細胞によるＢＨ３プロファイリングアッセイ
アッセイプレートは、０．００５％ｗ／ｖジギトニン、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２μＭのＪＣ−１、および２０ｍｇ／ｍＬオリゴマイシンを含有するＤＴＥＢ（トレハロース実験緩衝液：１３５ｍＭトレハロース、５０ｍＭのＫＣｌ、２０μＭのＥＤＴＡ、２０μＭのＥＧＴＡ、０．１％ＢＳＡ、５ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５、から誘導されたもの）の１０倍希釈物を用いて各ペプチドを２００μＭから０．２ｎＭまでの連続希釈により作製した。黒色の未処理３８４ウェルプレートの各ウェルに１５μＬのペプチド希釈物を添加することにより、各ペプチドに対し３連のウェルを各細胞株について作製した。ペプチドを含有しないまたは２０μＭのＦＣＣＰ（カルボニルシアン化物−４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、酸化的リン酸化の化学的脱共役剤）を含有する対照ウェルをそれぞれゼロおよび完全脱分極のために含めた。同一のストックから複数のプレートを作製し、後に使用するために−８０℃で凍結した。凍結させたプレートを使用前に室温に戻し、細胞を１．３４×１０６細胞／ｍＬの密度でＤＴＥＢに懸濁し、１５μＬの細胞懸濁液を希釈系列の各ウェルに添加して、ウェルを０．１ｎＭから１００μＭペプチドの範囲とし、２００００細胞／ウェルとした。ＪＣ−１凝集体の蛍光は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２で５分間隔で３時間、５４５ｎｍで励起し、５９０ｎｍで測定した。各シグナル対時間曲線下の面積を計算し、未処置およびＦＣＣＰ値に対して標準化して、脱分極パーセントを生成した。曲線は、ｌｏｇ［ペプチド］対パーセント脱分極としてプロットされ、シグモイド用量−応答曲線をＧｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭ  ６を用いてフィッティングさせた。上側ベースラインがない曲線について、ＥＣ５０の上限は、１００％脱分極で固定された上側ベースラインを有する曲線をフィッティングさせることによって推定された。これは、完全な上側ベースラインを有するほとんどの曲線によって到達される上限であるためであった。
【実施例２】
【０１２４】
安定化されたペプチドは選択性を保持する
内部架橋を用いて、ＭＳ１に関連し、配列：ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号６）を有するペプチド（Ｍ１）の、以下のようないくつかの安定化された改変体を作製した：
Ｍ１  ＳＡＨＢａ：ＩＷＢＴＱＧＬＲＸＬＧＤＸＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号７）
Ｍ１  ＳＡＨＢｄ：ＩＷＢＸＱＧＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号９）
Ｍ１  ＳＡＨＢｆ：ＩＷＢＴＱＧＬＲＲＬＧＤＥＩＸＡＹＹＸＲＲ（配列番号８）
【０１２５】
図４に示すように、ペプチド３（配列番号９）（Ｍ１  ＳＡＨＢｄ）は、最も高いアルファ−ヘリックス含量を示した。表２に示すように、このペプチドはまた、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＢｃｌｗおよびＢｆｌ１よりもＭｃｌ−１に対して最大の選択性を有するようであった。
【０１２６】
【表２】
2018511594.tif 000012
【０１２７】
さらなる研究は、ペプチド３（配列番号９）（Ｍ１  ＳＡＨＢｄ）、およびペプチド３（配列番号９）（Ｍ１  ＳＡＨＢｄ）の特定の配列改変体の非特異的な細胞溶解活性を調べた。この分析の結果を図５に示す。
【０１２８】
さらなる研究は、Ｍ１  ＳＡＨＢｄおよび長さ改変体を含むいくつかの配列改変体の細胞取り込みを調べた。種々の安定化されたペプチド（Ｍ２  ＳＡＨＢｄ−Ｍ１１  ＳＡＨＢｄ）（配列番号１０〜１９）は、全てがＭ１  ＳＡＨＢｄ中に存在する同じ内部架橋を保持し、正味の電荷が変化した。図６に示すように、特定の変更は、細胞取り込みを改善するが、Ｍｃｌ−１に対する親和性を減少させた。
【０１２９】
次に、全細胞ＢＨ３プロファイリングアッセイ（上記）を使用して、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｃｌ−ｘＬ、またはＢｆｌ−１に対し異なる依存性を有するいくつかの細胞株における、本発明者のＭｃｌ−１結合ペプチドの特異性を試験した。このアッセイにおいて、透過性細胞を漸増量の安定化されたペプチドで処理し、ミトコンドリア外膜透過性化（ＭＯＭＰ）を、色素ＪＣ−１を用いて監視した。分析の結果は、選択ペプチドが、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＮＯＸＡ、ＭＳ１およびＨＲＫのＢＨ３ドメインよりもＢｃｌ−２に特異的であることを示す図７に示される。
【実施例３】
【０１３０】
Ｍｃｌ−１特異性を有する追加の安定化されたペプチド
追加のペプチドである、配列ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２３）を有するＢ１は、３つの異なる安定化されたペプチドであるＢ１  ＳＡＨＢａ、Ｂ１  ＳＡＨＢｆおよびＢ１  ＳＡＨＢｄを作製するために、位置Ａ、位置Ｆまたは位置Ｄに内部架橋を挿入することによって安定化した。細胞の取り込みは、各安定化されたペプチドおよび天然のＢ１ペプチドについて評価した。さらに、Ｂ１とは長さが異なる、Ｂ１の２つの改変体：ＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（Ｂ２；配列番号３１）およびＥＩＷＦＡＱＥＩＤＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲ（Ｂ３；配列番号３２）を作製した。
【０１３１】
位置Ｄにそれぞれ内部架橋を有する、Ｂ２およびＢ３の安定化された改変体の細胞取り込みを評価した。この研究の結果は、図８に示され、この場合、細胞平均強度のより高い値は、細胞透過性が高いことを示し、Ｘは、側鎖が炭化水素内部架橋によって置き換えられたアミノ酸を示す。
【０１３２】
上記のペプチドＢ１の改変体はまた、位置Ｇ（ＩＷＦＡＸＥＩＤＸＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ；Ｂ１  ＳＡＨＢｇ；配列番号２９）または位置Ｈ（ＸＷＦＡＱＥＩＸＲＩＧＤＥＶＮＡＹＹＡＲＲ；Ｂ１  ＳＡＨＢｈ；配列番号３０）のいずれかに内部架橋を有するＢ１の２つの追加の改変体、ならびにＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＮＯＸＡ、ＭＳ１およびＨＲＫのＢＨ３ドメインに対応するペプチドと一緒に、結合特異性について、全細胞ＢＨ３プロファイリングアッセイ（上記）を用いて分析した。分析の結果を図９に示す。
【実施例４】
【０１３３】
Ｍｃｌ−１特異性を有するペプチドの細胞死滅能の定量化
Ｍｃｌ−１特異性を有するペプチドの機能を細胞において定量した；本発明者らは、Ｍｃｌ−１阻害に依存する細胞死滅についてペプチドをアッセイした（図１０）。細胞生存率における工学的に作製された、ステープル留めされたペプチドの効果は、生存のためにＢｃｌ−ｘＬまたはＭｃｌ−１に依存するように操作された細胞株を用いて評価した。これは、癌細胞が、多くの場合、複数のＢｃｌ−２ファミリーメンバーによって重複して保護されているために行った。この実験において、本発明者らの目的は、Ｂｃｌ−ｘＬまたは他の抗アポトーシスファミリーメンバー（それらについては選択的阻害剤がすでに存在する）に対して効果が低いＭｃｌ−１選択的阻害剤を工学的に作製することであった。本発明者らは、Ｈ９２９細胞（図１０Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（図１０Ｂ）を使用し、それらの生存は、それぞれＭｃｌ−１またはＢｃｌ−ｘＬの過剰発現に依存する。Ｍｃｌ−１を発現する細胞（Ｈ９２９）をＭｃｌ−１選択的阻害剤（ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）およびＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８））で処理すると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルミネッセンスによって評価される、用量依存的な細胞死滅をもたらした。これらのペプチドは、Ｈ９２９細胞において４〜７μＭという低いＩＣ５０値で細胞の急速な死滅を誘導したが、一方、これらのペプチドは、ＭＤＡ−ＭＢ２３においては不活性のままであった。Ｂｃｌ−２選択的阻害剤であるＡＢＴ−７３７を対照として使用した。この化合物は、Ｈ９２９において活性ではないが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１の細胞生存率において明らかな用量依存的減少を引き起こした。
【０１３４】
細胞生存率は、ＢｃｌｘＬ依存性ＭＤＡ−ＭＢ２３１（図１０Ｂ）およびＭｃｌ−１依存性Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞（図１０Ａ）において、濃度増加させたＡＢＴ７３７、ＩＷＢＸＱＳＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１４）およびＩＷＢＸＱＥＬＸＲＬＧＤＥＩＮＡＲＹＡＲ（配列番号１８）の存在下における２４時間でのＣＴＧアッセイによって測定された。データは、少なくとも二重で実施された実験についての平均値およびｓ．ｄ．である。ビヒクルはＤＭＳＯである。
【０１３５】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定すること意図したものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修飾は、以下の請求項の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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