(57)【要約】本開示は、抗アポトーシス性タンパク質ＢＦＬ−１のステープル化ペプチド阻害剤（例えば、システイン反応性ステープル化ペプチド）、およびＢＦＬ−１発現癌の処置において当該阻害剤を使用する方法を特徴とする。
2018534240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが配列番号２２〜３６、図１８、または配列番号４１〜１１９に記載のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
式Ｉ：
【化１】
2018534240.tif 000004
［式中、
（ａ）
（ｉ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＥＶＥＳＡＴＱＬＲ（配列番号１３７）、Ｒ9−ＡＴＱＬＲ（配列番号１３８）、Ｒ9−ＶＥＳＡＴＱＬＲ（配列番号１３９）、Ｒ9−ＥＳＡＴＱＬＲ（配列番号１４０）、およびＲ9−ＳＡＴＱＬＲ（配列番号１４１）からなる群から選択され；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＦＧＤであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＬＮＦＲ（配列番号１４２）−Ｒ10、ＬＮＦＲＱ（配列番号１４３）−Ｒ10、ＬＮＦＲＱＫ（配列番号１４４）−Ｒ10、ＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号１４５）−Ｒ10、ＬＮＦＲＱＫＬ（配列番号１７２）−Ｒ10、およびＬＮＦＲＱＫＬＬＫ−Ｒ10（配列番号１４６）からなる群から選択されるか；または
（ｉｉ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＩＡＱＥＬＲ（配列番号１４７）、Ｒ9−ＡＱＥＬＲ（配列番号１４８）、およびＲ9−ＡＱＥＬＲ（配列番号１４９）からなる群から選択され；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＩＧＤであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＦＮＡＹＹＡＲＫ（配列番号１５０）−Ｒ10またはＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１５１）−Ｒ10であるか；または
（ｉｉｉ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＬＳＥＳＬＫ（配列番号１５２）またはＲ9−ＳＥＳＬＫ（配列番号１５３）であり；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＩＧＤであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＬＤＳＮＫ（配列番号１５４）−Ｒ10またはＬＤＳＮ（配列番号１５５）−Ｒ10であるか；または
（ｉｖ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＶＧまたはＲ9−Ｇであり；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＱＬＡであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＩＧＤＤＩＮＲＲ（配列番号１５６）−Ｒ10またはＩＧＤＤＩＮＲ（配列番号１５７）−Ｒ10であるか；または
（ｖ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＰＧＧＲＬＡＥＶＣＴＶＬＬＲ（配列番号１５８）またはＲ9−ＧＧＲＬＡＥＶＣＴＶＬＬＲ（配列番号１５９）であり；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＬＧＤであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＥＬＥＱＩＲＰＳ（配列番号１６０）−Ｒ10またはＥＬＥＱＩＲ（配列番号１６１）−Ｒ10であるか；または
（ｖｉ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡ（配列番号１６２）またはＲ9−ＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡ（配列番号１６３）であり；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＶＧＤであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＢＤＲＳＩ（配列番号１６４）−Ｒ10またはＢＤＲＳＩＲ（配列番号１６５）−Ｒ10であり、ここで、Ｂは、ノルロイシンであるか；または
（ｖｉｉ）
[Ｘａａ]ｗは、Ｒ9−ＥＱＷＡＲＥＩＧＡＱＬＲ（配列番号１６６）、Ｒ9−ＱＷＡＲＥＩＧＡＱＬＲ（配列番号１６７）、Ｒ9−ＲＥＩＧＡＱＬＲ（配列番号１６８）、およびＲ9−ＥＩＧＡＱＬＲ（配列番号１６９）からなる群から選択され；
[Ｘａａ]ｘは、アミノ酸配列ＭＡＤであり、ここで、Ｍはメチオニンまたはノルロイシンであり；
[Ｘａａ]ｙは、ＬＮＡＱＹ（配列番号１７０）−Ｒ10またはＬＮＡＱＹＥ（配列番号１７１）−Ｒ10であり；
（ｂ）
Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｃ1〜Ｃ10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ3は、Ｃ8アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンであり、エポキシド、１個もしくは２個の−ＯＨ、または１個もしくは２個のアミノヒドロキシル基で置換されていてもよく；
ここで、（ａ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）において、
Ｒ9は、非天然求電子基含有アミノ酸であり；
Ｒ10は、細胞透過性増強基（例えば、荷電の分布または疎水特性を変化またはシフトさせるアミノ酸）または安定性増強基（例えば、非天然、Ｄ、またはαメチルアミノ酸点変異）であり；
具体的なアミノ酸のうち１、２、３、４または５つは別のアミノ酸によって置換されていてもよい］
で示される化合物。
【請求項３】
Ｒ9が、アクリルアミドの末端にある３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−ホモプロリン；アクリルアミドの末端にあるＬ−ホモプロリン；アクリルアミドの末端にあるイソニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−ニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＬ−ニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−プロリン；アクリルアミドの末端にあるＬ−プロリン；アクリルアミドの末端にあるtrans−４−ジメチルアミノクロトン酸；およびアクリル酸からなる群から選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3がＣ8アルキレンである、請求項２記載の化合物。
【請求項５】
当該化合物がＢＦＬ−１と結合し、好ましくは、当該化合物がＢＦＬ−１と共有結合する、請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Ｂｆｌ−１と結合する内部架橋ペプチドであって、当該ポリペプチドが下記ポリペプチド：
（ｉ）ＡＥＬＥＶＥＣＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬＮ（配列番号１２２）；
（ｉｉ）ＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１２３）；
（ｉｉｉ）ＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩ（配列番号１２４）；
（ｉｖ）ＳＳＴＭＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲＲＹ（配列番号１２５）；
（ｖ）ＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮＭＥＬ（配列番号１２６）；または
（ｖｉ）ＲＬＡＥＶＣＡＶＬＬＲＬＧＤＥＬＥＭＩＲ（配列番号１２７）
のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面の少なくとも１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸を含み、
ここで、
（ａ）２、３または６アミノ酸離れている少なくとも一対のアミノ酸の側鎖が連結基Ｒ3に置き換わっており、該連結基はこの一対のアミノ酸のα炭素を連結しており、ここで、
各Ｒ3は、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンであり、エポキシド、１個もしくは２個の−ＯＨ、または１個もしくは２個のアミノヒドロキシル基で置換されていてもよく、
連結基Ｒ3に置き換えられているそれらの側鎖を有する各対のアミノ酸のα炭素のＨは、独立して、Ｃ1〜Ｃ10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルに置き換えられていてもよく；
（ｂ）配列番号１〜７、３７〜４０、または１２０の少なくとも１個のアミノ酸は、非天然求電子基含有アミノ酸に置き換えられており；
（ｃ）配列番号１〜７、３７〜４０、または１２０の１、２、３、４または５個のアミノ酸は、他の天然または非天然アミノ酸によって置換されている、
内部架橋ペプチド。
【請求項７】
Ｒ3がＣ8アルキレンである、請求項６記載の内部架橋ペプチド。
【請求項８】
当該化合物がＢＦＬ−１と結合する、請求項６記載の内部架橋ペプチド。
【請求項９】
ＢＦＬ−１の発現を示す癌に罹患している患者を処置する方法であって、当該方法が当該患者に請求項１記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
癌がメラノーマまたは他の固形腫瘍である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
癌が白血病またはリンパ腫である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ＢＦＬ−１の発現を示す癌に罹患している患者を処置する方法であって、当該方法が当該患者に請求項６記載の内部架橋ペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
ＢＦＬ−１への依存性を示す癌に罹患している患者を処置する方法であって、当該方法が当該患者に請求項１記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
癌がメラノーマまたは他の固形腫瘍である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
癌が白血病またはリンパ腫である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
癌がＢＦＬ−１の発現を示す、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ9が、構造式：
【化２】
2018534240.tif 000005
［式中、
Ｒ4およびＲ5のうち１つは、アミン、エーテル、チオエーテル、カルボニル、アミド、炭素または水素から選択される化合物の残部と結合し、他方はＨであり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択され；
Ｒ6は、アミン、エーテル、チオエーテル、アミドおよび炭素からなる群から選択され；
Ｒ7は、窒素含有複素環、置換アニリン、およびアミンからなる群から選択され；
Ｒ8は、アクリロイル、β−メチルアクリロイル、β−アルキルアクリロイル、α−シアノアクリロイル、ビニルスルホニル、α−フルオロアセチル、α−クロロアセチル、α−ブロモアセチル、およびα−ヨードアセチルからなる群から選択され、ここで、Ｒ8は、Ｒ7のＮと結合する］
を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
求電子基が、構造式：
【化３】
2018534240.tif 000006
［式中、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択され；
Ｒ6は、アミン、エーテル、チオエーテル、アミド、カルボニル、酸素、硫黄および炭素からなる群から選択され；
Ｒ7は、窒素含有複素環、置換アニリン、アミンおよびアミノ酸からなる群から選択され；
Ｒ8は、アクリロイル、β−メチルアクリロイル、β−アルキルアクリロイル、α−シアノ アクリロイル、ビニルスルホニル、α−フルオロアセチル、α−クロロアセチル、α−ブロモアセチルおよびα−ヨードアセチルからなる群から選択され、ここで、
Ｒ6は、Ｒ7窒素複素環の炭素と結合するアミドであり；
Ｒ7は、カルボニルを介してＲ8と複素環の窒素を介して結合する］
を有する、請求項６記載の化合物。
【請求項１９】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、ＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２１）のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるアミノ酸配列であってＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１２１における少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されており、配列番号１２１の位置７のＦが、より嵩高い側鎖を有するアミノ酸と置換されている、ポリペプチド。
【請求項２０】
より嵩高い側鎖を有するアミノ酸が、チロシン、Ｐｈｅ(３−Ｉ)−ＯＨ、Ｐｈｅ(４−Ｉ)−ＯＨおよびＰｈｅ(３,４−Ｃｌ２)−ＯＨからなる群から選択される、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが、配列番号１２１における少なくとも２個のアミノ酸がオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されていることを除けば配列番号１２１のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１２１の位置７のＦがより嵩高い側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１９または２０記載のポリペプチド。
【請求項２２】
オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸がともにＳ−ペンテニルアラニンである、請求項１９〜２１いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１２１における少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する別の非天然アミノ酸によって置換されている、請求項１９〜２１いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、下記アミノ酸配列：
（ｉ）ＡＥＬＥＶＥＣＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬＮ（配列番号１２２）；
（ｉｉ）ＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１２３）；
（ｉｉｉ）ＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩ（配列番号１２４）；
（ｉｖ）ＳＳＴＭＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲＲＹ（配列番号１２５）；
（ｖ）ＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮＭＥＬ（配列番号１２６）；または
（ｖｉ）ＲＬＡＥＶＣＡＶＬＬＲＬＧＤＥＬＥＭＩＲ（配列番号１２７）
のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるアミノ酸配列を含み、
ここで、当該ポリペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合し；
ここで、各アミノ酸配列における少なくとも２個のアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されており、
ここで、当該ポリペプチド中の少なくとも１個のシステインは、存在する場合には、セリンに置き換えられることができ、ここで、当該ポリペプチド中の少なくとも１個のメチオニンは、存在する場合には、ノルロイシンに置き換えられることができ；
ここで、当該ポリペプチドは、求電子基を担持する非天然アミノ酸、または非アミノ酸ウォーヘッドを含む、
ポリペプチド。
【請求項２５】
当該ポリペプチドが、少なくとも５アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である、請求項２４記載のポリペプチド。
【請求項２６】
オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸がともにＳ−ペンテニルアラニンである、請求項２４または２５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する別の非天然アミノ酸によって置換されている、請求項２４または２５記載のポリペプチド。
【請求項２８】
求電子基を担持する非天然アミノ酸が、当該ポリペプチドのＮ末端にある、請求項２４〜２７いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２９】
非天然アミノ酸が、当該ポリペプチド骨格と連結されている求電子アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有しており、リンカーが、窒素含有複素環窒素含有複素環アミノ酸またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環またはヘテロ環である、請求項２４〜２８いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３０】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、配列番号２２−３６、図１８または配列番号４１−１１９に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項３０記載のポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１発現癌の処置方法であって、当該方法が、当該ヒト対象体に請求項３０記載のポリペプチドまたは請求項３１記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３３】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１依存癌の処置方法であって、当該方法が、当該ヒト対象体に請求項３０記載のポリペプチドまたは請求項３１記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
ヒト対象体が、さらに、化学療法、放射線療法、免疫療法もしくは他の癌処置様式、またはその組み合わせを施される、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
該が、メラノーマ、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、請求項３２〜３４いずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、ＪＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号１２８）のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列であってＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合するアミノ酸配列を含み；Ｂｆｌ−１のＣｙｓ５５との共有結合を形成し；配列番号１２８における少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されており、Ｊが、求電子基を担持する非天然アミノ酸、またはアミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドである、ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列が、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも７０％同一である、請求項３６記載のポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸配列が、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも８０％である、請求項３６記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ポリペプチドが、少なくとも５アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である、請求項３６〜３８いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４０】
オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸がともにＳ−ペンテニルアラニンである、請求項３６〜３９いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４１】
少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する別の非天然アミノ酸によって置換されている、請求項３６〜３９いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４２】
非天然アミノ酸が、当該ポリペプチド骨格と連結されている求電子アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有しており、リンカーが、窒素含有複素環窒素含有複素環アミノ酸またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環またはヘテロ環である、請求項３６〜４１いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４３】
求電子基を担持する非天然アミノ酸が、(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド；１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド,(Ｒ)−１ アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｒ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｅ)−４−(ジメチルアミノ)ブタ−２−エンアミド；およびアクリルアミドからなる群から選択される、請求項３６〜４１いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１発現癌またはＢｆｌ−１依存癌の処置方法であって、当該方法が、ヒト対象体に請求項３６〜４３いずれか１項記載のポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、ＪＥＶＥＳＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号１２９）のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列であってＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合するアミノ酸配列を含み；Ｂｆｌ−１のＣｙｓ５５との共有結合を形成し；配列番号１２９における少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されており、Ｊが、求電子基を担持する非天然アミノ酸、またはアミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドである、ポリペプチド。
【請求項４６】
アミノ酸配列が、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列のヘリックスのＢｆｌ−１相互作用面と少なくとも６０％同一である、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４７】
アミノ酸配列が、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列のヘリックスのＢｆｌ−１相互作用面と少なくとも８０％同一である、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ポリペプチドが、少なくとも５アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である、請求項４５〜４７いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４９】
オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸がともにＳ−ペンテニルアラニンである、請求項４５〜４８いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５０】
少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する別の非天然アミノ酸によって置換されている、請求項４５〜４８いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５１】
非天然アミノ酸が、当該ポリペプチド骨格と連結されている求電子アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有し、リンカーが窒素含有複素環窒素含有複素環アミノ酸またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環またはヘテロ環である、請求項４５〜５０いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５２】
求電子基を担持する非天然アミノ酸が、(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド；１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド,(Ｒ)−１ アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｒ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｅ)−４−(ジメチルアミノ)ブタ−２−エンアミド；およびアクリルアミドからなる群から選択される、請求項４５〜５０いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１発現癌またはＢｆｌ−１依存癌の処置方法であって、当該方法が、当該ヒト対象体に請求項４５〜５２いずれか１項記載のポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５４】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、ＪＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３０）のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列であってＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合するアミノ酸配列を含み；Ｂｆｌ−１のＣｙｓ５５との共有結合を形成し；配列番号１３０における少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換されており、Ｊが、求電子基を担持する非天然アミノ酸、またはアミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドである、ポリペプチド。
【請求項５５】
アミノ酸配列が、配列番号１３０に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも７０％同一である、請求項５４記載のポリペプチド。
【請求項５６】
アミノ酸配列が、配列番号１３０に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも８０％同一である、請求項５４記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ポリペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である、請求項５４〜５６いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５８】
オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸がともにＳ−ペンテニルアラニンである、請求項５４〜５７いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５９】
少なくとも２個のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する別の非天然アミノ酸によって置換されている、請求項５４〜５７いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６０】
非天然アミノ酸が、当該ポリペプチド骨格と連結されている求電子アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有しており、リンカーが、窒素含有複素環窒素含有複素環アミノ酸またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環またはヘテロ環である、請求項５４〜５９いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６１】
求電子基を担持する非天然アミノ酸が、(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド；１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド,(Ｒ)−１ アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｒ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｅ)−４−(ジメチルアミノ)ブタ−２−エンアミド；およびアクリルアミドからなる群から選択される、請求項５４〜５９いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１発現癌またはＢｆｌ−１依存癌の処置方法であって、当該方法が、当該ヒト対象体に請求項５４〜６１いずれか１項記載のポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６３】
Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、アミノ酸配列：
（ｉ）ＪＥＶＥＳＡＴＱＬＲＸＦＧＤＸＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号２４）；
（ｉｉ）ＪＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）；または
（ｉｉｉ）ＪＡＴ８ＬＲＲＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号６２）
［ここで、Ｊは、非天然の求電子基含有アミノ酸またはアミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり、Ｘは、非天然アミノ酸であり、８は、Ｒ−オクテニルアラニンである］
を含む、ポリペプチド。
【請求項６４】
ポリペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である、請求項６３記載のポリペプチド。
【請求項６５】
非天然求電子基が、当該ポリペプチド骨格と連結されている求電子アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有し、リンカーが、窒素含有複素環窒素含有複素環アミノ酸またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環またはヘテロ環である、請求項６３または６４記載のポリペプチド。
【請求項６６】
各Ｘが、同一の非天然アミノ酸である、請求項６３〜６５いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６７】
Ｘが、異なる非天然アミノ酸を示す、請求項６３〜６５いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６８】
各Ｘが、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項６３〜６５いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６９】
請求項６３〜６８いずれか１項記載のポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７０】
ヒト対象体におけるＢＦＬ−１発現癌またはＢｆｌ−１依存癌の処置方法であって、当該方法が、当該ヒト対象体に請求項６３〜６８いずれか１項記載のポリペプチドまたは請求項６９記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項７１】
癌が、メラノーマ、リンパ腫または白血病である、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
請求項３０記載のポリペプチドによる処置のためにヒト対象体を選択する方法であって、当該方法が、
（ａ）ヒト対象体から腫瘍を含む生体試料を得ること；
（ｂ）当該腫瘍試料がＢｆｌ−１を発現することを決定すること、および
（ｃ）請求項３０に記載のポリペプチドによる処置のために当該対象体を選択すること
を含む、方法。
【請求項７３】
対象体がＢｆｌ−１発現または依存癌を有するかどうかを決定する法法であって、当該方法が、
（ａ）ヒト対象体から腫瘍を含む生体試料を得ること；
（ｂ）請求項３０記載のポリペプチドが腫瘍由来のタンパク質を共有結合的に修飾することを決定すること；および
（ｃ）当該対象体がＢｆｌ−１発現または依存癌を有することを決定すること
を含む、方法。
【請求項７４】
さらに、ヒト対象体に請求項３０記載のポリペプチドを等することを含む、請求項７２または７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／２１１,６８０号の優先権を主張する（その記載内容は、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する）。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって認められた認可番号１Ｒ３５ＣＡ１９７５８３の下に政府の支援を受けて行われた。
【０００３】
技術の分野
本開示は、Ｂｆｌ−１と結合することができる構造的に安定化されたペプチドおよび癌の処置に当該ペプチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アポトーシス促進性メンバーおよび抗アポトーシス性メンバーの両方を含むＢＣＬ−２タンパク質ファミリーは、細胞運命を指示するチェックおよびバランスの複雑なネットワークを形成する。当該ファミリーは、４つまでの保存「ＢＣＬ−２ホモロジー」（ＢＨ）ドメインの存在によって構造的に定義され、これらは全て、αヘリックス部分を含む。Ｂｆｌ−１およびＭＣＬ−１などの抗アポトーシス性タンパク質は、全ＢＨドメインにおいて配列保存を呈するが、アポトーシス促進性タンパク質は、「マルチＢＨドメイン」メンバー（例えば、ＢＡＸおよびＢＡＫ）と、αヘリックスＢＨ３ドメインにおいてのみ配列類似性を呈する「ＢＨ３オンリー」メンバー（例えば、ＢＩＭおよびＮＯＸＡ）とに分けられる。当該ＢＨ３オンリーサブグループは、多様であり、異質な刺激からの死誘発性シグナル（pro-death signal）をミトコンドリアに位置するアポトーシス機構に伝達する。当該ＢＨ３オンリータンパク質の死シグナルは、抗アポトーシス性タンパク質によって中和されるか、または直接もしくは間接的にミトコンドリア・エクセキューショナー（mitochondrial executioner）、ＢＡＸおよびＢＡＫに送達される。活性化されると、ＢＡＸ／ＢＡＫは、ミトコンドリア外膜透過処理を誘導し、放出されたミトコンドリア因子が、死のプログラムを不可逆的に実行するカスパーゼを誘導することを可能にする。
【０００５】
癌細胞は、抗アポトーシス性タンパク質を過剰発現してアポトーシス促進性タンパク質を抑制し、それにより、それらの生存を確実するアポトーシス遮断を開始する。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質相互作用を妨害する薬物は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導することができる。
【０００６】
ＢＦＬ−１は、さまざまな液状腫瘍および固形腫瘍におけるミトコンドリアアポトーシス経路の抑制に関与している。例えば、過剰発現または変異してユビキチン介在性分解に抵抗した場合、Ｂｆｌ−１は、ＢＣＲ依存／高ＮＦκＢサブクラスの胚中心リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫を含む個別のリンパ腫において化学療法抵抗性を誘発する。Ｂｆｌ−１はまた、最近、臨床的に関連するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ耐性変異を有するものを含むヒトメラノーマの約３０％において病理学的生存因子であると同定された。かくして、ＢＦＬ−１活性を妨害する化合物は、メラノーマおよび他のさまざまな癌の処置に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ＮＯＸＡ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫまたはＢＯＫに関連する（例えば、これらと配列ホモロジーを共有する）構造的に安定化されたペプチド、ならびに当該安定化ペプチドを処置および／または予防剤として使用する方法を提供する。当該安定化ペプチドは、ＢＦＬ−１と結合することができ、場合によっては、ＢＦＬ−１と共有結合により結合することができ、それにより、ＢＦＬ−１活性を調節すること（例えば、妨害すること）ができる。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、ＮＯＸＡ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫまたはＢＯＫのＢＨ３ドメインの全部または一部（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸）のアミノ酸配列を含む内部架橋したポリペプチドであって、
２、３または６アミノ酸離れている２個のアミノ酸の側鎖が内部ステープルに置き換えられているか；３個のアミノ酸の側鎖が内部ステッチに置き換えられているか；４個のアミノ酸の側鎖が２つの内部ステープルに置き換えられているか、５個のアミノ酸の側鎖がステッチとステープルとの組み合わせに置き換えられているか、または６個のアミノ酸の側鎖が２つのステッチまたは３つのステープルに置き換えられており；所望により、１個のアミノ酸の側鎖またはＮ末端が、Ｂｆｌ−１におけるシステインの側鎖と共有結合反応することができる求電子基に置き換えられていてもよい、ポリペプチドを提供する。ある特定の場合には、架橋ポリペプチドのアミノ酸の側鎖、またはＮ末端もしくはＣ末端は、アミノ酸ではない求電子ウォーヘッド（warhead）に置き換えられている。かくして、当該求電子基（electrophile）は、非天然アミノ酸に関連して導入され得るだけでなく、架橋ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にとっての化学的キャップとしても導入され得る。
【０００９】
いくつかの実施態様において、内部架橋ペプチドは、配列番号１〜７または３７〜４０からなる群から選択されるポリペプチドを修飾することによって（例えば、アミノ酸置換によって）調製され得る。いくつかの実施態様において、内部ステープルは、２個のアミノ酸の側鎖と置き換わり、すなわち、各ステープルは、例えば３、４または６アミノ酸離れている、２個のアミノ酸の間にある。いくつかの実施態様において、内部ステッチは、３個のアミノ酸の側鎖と置き換わり、すなわち、該ステッチは、例えば３および６アミノ酸離れている、３個のアミノ酸の間の一対の架橋である。いくつかの実施態様において、該内部ステープルおよび／または内部ステッチは、（４個のアミノ酸の側鎖と置き換わり、すなわち、各ステープルが、例えば３アミノ酸離れている、２個のアミノ酸の間にある）少なくとも２つの内部ステープルを含む。いくつかの実施態様において、該内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも１つの内部ステープルと内部ステッチとの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、該内部ステッチは、１番目のアミノ酸の側鎖ならびに２番目および３番目のアミノ酸と置き換わり、これによって、（２番目のアミノ酸と３番目のアミノ酸の間にある）１番目のアミノ酸と２番目および３番目のアミノ酸とを内部架橋を介して架橋する（ここで、１番目のアミノ酸と２番目のアミノ酸は、２、３または６アミノ酸離れており、１番目のアミノ酸と３番目のアミノ酸は、２、３または６アミノ酸離れており、２番目のアミノ酸と３番目のアミノ酸は、別々のアミノ酸である。いくつかの実施態様において、本開示の４個のアミノ酸の側鎖は、２つの別々の内部ステープルに置き換えられている。いくつかの実施態様において、当該２つの別々の内部ステープルの１つ目は、２、３または６アミノ酸離れている１番目の対のアミノ酸と架橋し、少なくとも２つの別々の内部ステープルのうち２つ目は、２、３または６アミノ酸離れている２番目の対のアミノ酸を架橋する。いくつかの実施態様において、本開示の内部架橋ポリペプチドは、配列番号１〜７または３７〜４０からなる群；配列番号１〜７または３７〜４０からなり、アミノ末端またはカルボキシ末端修飾を有する群；ならびに配列番号１〜７または３７〜４０からなり、１、２、３、４または５つのアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸が保存的にまたは非保存的に置換されている）群から選択されるポリペプチドから調製される。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、下記アミノ酸配列：
（ｉ）ＡＥＬＥＶＥＣＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬＮ（配列番号１２２）；
（ｉｉ）ＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１２３）；
（ｉｉｉ）ＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩ（配列番号１２４）；
（ｉｖ）ＳＳＴＭＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲＲＹ（配列番号１２５）；
（ｖ）ＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮＭＥＬ（配列番号１２６）；または
（ｖｉ）ＲＬＡＥＶＣＡＶＬＬＲＬＧＤＥＬＥＭＩＲ（配列番号１２７）
のヘリックスの相互作用面（すなわち、Ｂｆｌ−１と相互作用するヘリックス）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とし、ここで、当該ポリペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合する；ここで、各アミノ酸配列における少なくとも２個のアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換され、ここで、ポリペプチド中の少なくとも１個のシステインは、存在する場合には、セリンに置き換えられてよく、また、ここで、ポリペプチド中の少なくとも１個のメチオニンは、存在する場合には、ノルロイシンに置き換えられてよく；また、ここで、当該ポリペプチドは、求電子基を有する非天然アミノ酸を含む。上記のとおり、ペプチド配列に関して上記した同一性率は、各ペプチドのヘリックスのＢｆｌ−１相互作用面に言及している。Ｂｆｌ−１と相互作用しないペプチドの領域では、非常に大きな可変性が認められる。実際、それらのアミノ酸のほぼ全て（例えば、ヘリックスの非相互作用面の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸）が置換され得る（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換またはアラニン）。ある特定の実施態様において、これらのペプチドのヘリックスの相互作用面は、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの場合、置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、下記アミノ酸配列：
（ｉ）ＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１３１）；
（ｉｉ）ＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１３２）；
（ｉｉｉ）ＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲ（配列番号１３３）；
（ｉｖ）ＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲ（配列番号１３４）；
（ｖ）ＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳ（配列番号１３５）；または
（ｖｉ）ＣＡＶＬＬＲＬＧＤＥＬＥＭ（配列番号１３６）
のヘリックスの相互作用面（すなわち、Ｂｆｌ−１と相互作用するヘリックス）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とし、ここで、当該ポリペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１と選択的に結合し；ここで、各アミノ酸配列における少なくとも２個のアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換され、ここで、ポリペプチド中の少なくとも１個のシステインは、存在する場合には、セリンに置き換えられてよく、また、ここで、ポリペプチド中の少なくとも１個のメチオニンは、存在する場合には、ノルロイシンに置き換えられてよく；また、ここで、当該ポリペプチドは、求電子基を担持する非天然アミノ酸を含む。上記のとおり、ペプチド配列に関して上記した同一性率は、各ペプチドのヘリックスのＢｆｌ−１相互作用面に言及している。Ｂｆｌ−１と相互作用しないペプチドの領域では、非常に大きな可変性が認められる。実際、それらのアミノ酸のほぼ全て（例えば、ヘリックスの非相互作用面の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸）が置換され得る（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換またはアラニン）。ある特定の実施態様において、これらのペプチドのヘリックスの相互作用面は、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの場合、置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１２】
いくつかの態様において、本開示は、Ｂｆｌ−１と結合するポリペプチドであって、配列番号２２〜３６、４１〜１１９のいずれか１つまたは図１８に記載のアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とする。いくつかの場合、本開示は、Ｂｆｌ−１と結合し、配列番号２２〜３６、４１〜１１９のいずれか１つまたは図１８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、Ｂｆｌ−１の共有結合的修飾に必須の「ウォーヘッド」を含む。当該ウォーヘッドは、Ｎ末端もしくはＣ末端に、またはポリペプチド配列内に存在し得る。いくつかの場合、ウォーヘッドは、非天然の求電子基担持アミノ酸である。ある特定の実施態様において、ウォーヘッドは、アクリルアミドの末端にある３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−ホモプロリン；アクリルアミドの末端にあるＬ−ホモプロリン；アクリルアミドの末端にあるイソニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−ニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＬ−ニペコチン酸；アクリルアミドの末端にあるＤ−プロリン；アクリルアミドの末端にあるＬ−プロリン；trans−４−ジメチルアミノクロトン酸；およびアクリル酸からなる群から選択される。他の実施態様において、ウォーヘッドは、(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド；１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、(Ｒ)−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド；(Ｓ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｒ)−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；(Ｅ)−４−(ジメチルアミノ)ブタ−２−エンアミド；およびアクリルアミドからなる群から選択される求電子基を担持する非天然アミノ酸である。他の実施態様において、ウォーヘッドは、アミノ酸ではない。例えば、求電子部分およびペプチドは、飽和窒素含有複素環（アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン）または不飽和窒素含有複素環（アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン）を介して連結される。該ペプチドと求電子基はまた、フェニル（アニリン）のような置換アミノ官能化環（例えば、Ｎ−アリールアクリルアミド）によって、または、より複雑な二環式もしくは多環式環、例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、アザインドールによって連結され得る。いくつかの実施態様において、求電子ウォーヘッドは、アクリルアミドであるか、または、より一般的には、α,β−不飽和カルボニル、例えばα−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans−４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、もしくはtrans−４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、またはいずれかの他の置換アクリルアミド、またはＮ−官能化ビニルスルホニル、α−フルオロアセチル、α−クロロアセチル、α−ブロモアセチル、およびα−ヨードアセチルまたは他の求電子部分であると定義される。当該求電子基は、非天然アミノ酸に関連して導入され得るだけでなく、架橋（例えば、ステープル化またはステッチ化）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にとっての化学的キャップとしても導入され得る。
【００１３】
他の態様において、本開示は、ＪＥＶＥＳＡＴＱＬＲＸＦＧＤＸＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号２４）；ＪＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）；またはＪＡＴ８ＬＲＲＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号６２）のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面と少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とし、ここで、Ｊは、非天然の求電子基含有アミノ酸であり（しかし、この位置（すなわち「Ｊ」）は、アミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子ウォーヘッドでもあり得ることに注意する。当該求電子基は、化学的キャップとしての役割を果たすことができる。）、Ｘは、非天然アミノ酸であり、８は、Ｒ−オクテニルアラニンである。ポリペプチド配列における２つのＸは、間隔に応じてオレフィン側鎖を有する同一または異なる非天然アミノ酸であり得る。いくつかの場合、各Ｘは、Ｓ−ペンテニルアラニンである。
【００１４】
特定の態様において、本開示は、アミノ酸配列：ＪＥＶＥＳＡＴＱＬＲＸＦＧＤＸＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号２４）；ＪＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号３０）；またはＪＡＴ８ＬＲＲＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を含むポリペプチドを特徴とし、ここで、Ｊは、非天然の求電子基含有アミノ酸であり（しかし、この位置（すなわち、「Ｊ」）は、アミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子ウォーヘッドでもあり得ることに注意する。当該求電子基は、化学的キャップとしての役割を果たすことができる。）、Ｘは、非天然アミノ酸であり、８は、Ｒ−オクテニルアラニンである。ポリペプチド配列における２つのＸは、間隔に応じてオレフィン側鎖を有する同一または異なる非天然アミノ酸であり得る。いくつかの場合、各Ｘは、Ｓ−ペンテニルアラニンである。他の実施態様において、求電子ウォーヘッドは、アミノ酸ではない。例えば、求電子部分およびペプチドは、飽和窒素含有複素環（アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン）または不飽和窒素含有複素環（アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン）を介して連結される。該ペプチドと求電子基はまた、フェニル（アニリン）のような置換アミノ官能化環（例えば、Ｎ−アリールアクリルアミド）によって、または、より複雑な二環式または多環式環、例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、アザインドールによって連結され得る。いくつかの実施態様において、求電子ウォーヘッドは、アクリルアミドであるか、またはより一般的には、α,β−不飽和カルボニル、例えばα−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans−４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、もしくはtrans−４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、またはいずれかの他の置換アクリルアミドであると定義される。当該求電子基は、非天然アミノ酸に関連して導入され得るだけでなく、架橋（例えば、ステープル化またはステッチ化）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にとっての化学的キャップとしても導入され得る。
【００１５】
いくつかの実施態様において、リンカーは、いくつかの重要な役割を果たす。リンカーは、標的システインのＳＨとα−β不飽和アミド（または類似の求電子部分）との間で共有結合反応を生じさせることができる位置、配向および幾何学的位置においてオングストロームまたはサブオングストロームの精度で求電子基を位置づけるのに役立つ。環であるリンカーは、反応に適合し得る構成を採用することができる。アミノベンゼンまたは類似のアミノ誘導体化芳香環または一連の環は、正確な配置も可能である。最後に、求電子基の反応性は、所望の反応が無差別に反応しないように正確に調整されることが必要であるので、リンカー上の置換基は、反応性に影響を及ぼし得、したがって、注意深い選択を必要とする。
【００１６】
ある特定の実施態様において、本書に記載のポリペプチドは、ステープル、ステッチ、またはステープルとステッチとの組み合わせを有する。
【００１７】
ある特定の実施態様において、本書に記載のポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸長であって、１００、７５、５０または３０アミノ酸長未満である。ある特定の実施態様において、本書に記載のポリペプチドは、８〜３０アミノ酸長である。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、本開示の１つ以上の内部架橋ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、当該医薬組成物は、１種類以上の癌処置用医薬を含むこともできる。
【００１９】
いくつかの態様において、本開示は、対象体における癌の処置方法を提供する。これらの方法は、癌に罹患している対象体を選択し、当該対象体に、本書に記載の特許請求の範囲の安定化ペプチドの有効量を投与することを含むことができる。これらの方法は、該対象体に化学療法、放射線療法、免疫療法もしくは他の癌処置様式、またはその組み合わせを施すことと協力して実施することができる。これらの処置は、安定化ウォーヘッド含有ペプチドによる処置と同時または連続して施すことができる。
【００２０】
用語「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のいずれかのラジカルをいう。用語「アルキル」とは、示された数の炭素原子を含有する直鎖であっても分岐鎖であってもよい炭化水素鎖をいう。例えば、Ｃ1〜Ｃ10は、基が１〜１０個（境界も含む）の炭素原子を有し得ることを示す。数字表示がない場合、「アルキル」は、１〜２０個（境界も含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。用語「アルキレン」とは、二価のアルキル（すなわち、−Ｒ−）をいう。
【００２１】
用語「アルケニル」とは、ＺまたはＥいずれかの幾何学的配置の炭素−炭素二重結合を１つ以上有する直鎖であっても分岐鎖あってもよい炭化水素鎖をいう。アルケニル部分は、所定の数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ2〜Ｃ10は、基が２個〜１０個（境界も含む）の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルケニル」とは、Ｃ2〜Ｃ8アルケニル鎖をいう。数字表示がない場合、「アルケニル」は、２〜２０個（境界も含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００２２】
用語「アルキニル」とは、炭素−炭素三重結合を１つ以上有する直鎖であっても分岐鎖であってもよい炭化水素鎖をいう。アルキニル部分は、示された数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ2〜Ｃ10は、基が２〜１０個（境界も含む）の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルキニル」とは、Ｃ2〜Ｃ8アルキニル鎖をいう。数字表示がない場合、「アルキニル」は、２〜２０個（境界も含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００２３】
用語「アリール」とは、各環の０個、１個、２個、３個、４個または５個の原子が置換基によって置換され得る、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香環系をいう。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」とは、アリールで置換されたアルキルをいう。用語「アリールアルコキシ」とは、アリールで置換されたアルコキシをいう。
【００２４】
本書で用いる場合、用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、より好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和または部分不飽和環状炭化水素基を包含し、ここで、該シクロアルキル基は、さらに、置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタジエニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル、およびシクロオクチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「ヘテロアリール」とは、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合には１個〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を有し（ここで、該ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択される）（例えば、単環式、二環式または三環式の場合にそれぞれ炭素原子および１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子）、各環の０個、１個、２個、３個または４個の原子が置換基によって置換され得る、芳香族５〜８員単環式環系、芳香族８〜１２員二環式環系、または芳香族１１〜１４員三環式環系をいう。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、１,２,３−トリアゾリル、１,２,４−トリアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリダジル、ピリミジル、チオフェニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリルなどが挙げられる。用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」とは、ヘテロアリールで置換されたアルキルをいう。用語「ヘテロアリールアルコキシ」とは、ヘテロアリールで置換されたアルコキシをいう。
【００２６】
用語「ヘテロシクリル」とは、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を有し（ここで、該ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択される）（例えば、単環式、二環式または三環式の場合にそれぞれ炭素原子および１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子）、各環の０個、１個、２個または３個の原子が置換基によって置換され得る、非芳香族５〜８員単環式環系、非芳香族８〜１２員二環式環系または非芳香族１１〜１４員三環式環系をいう。ヘテロシクリル基の例としては、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル（thiiryl）、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
【００２７】
用語「置換基」とは、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクリル基またはヘテロアリール基においてその基のいずれかの原子において「置換される」基をいう。好適な置換基としては、ハロ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ニトロ基、ハロアルキル基、アルキル基、アルカリール（alkaryl）基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、アミド基、カルボキシ基、アルカンスルホニル基、アルキルカルボニル基、アジド基およびシアノ基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
用語「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基の両方、および側鎖を含有する分子をいう。本書に記載のペプチドへの包含に好適なアミノ酸としては、天然αアミノ酸、例えばペプチドに見られる２０個の一般的な天然に存在するαアミノ酸（例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＶａｌ（Ｖ））のＤ異性体およびＬ異性体、非天然αアミノ酸（α,α−二置換およびＮ−アルキル化アミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない）、天然βアミノ酸（例えば、βアラニン）ならびに非天然βアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドの構成に用いられるアミノ酸は、有機合成によって製造することができるか、または他の経路、例えば天然源からの分解または単離によって得ることができる。
【００２９】
本発明のペプチドに含むことができる多くの既知の非天然アミノ酸が存在する。非天然アミノ酸のいくつかの例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、γアミノ酪酸、βシアノアラニン、ノルバリン、４−(Ｅ)−ブテニル−４(Ｒ)−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−l−メチルピロール−２−カルボン酸、２,４−ジアミノ酪酸、２,３−ジアミノプロピオン酸、２,４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−(アミノメチル)安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト置換、メタ置換および／またはパラ置換フェニルアラニン（例えば、−Ｃ(＝Ｏ)Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換されたもの）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、さらに、−Ｑ＝Ｏ)Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換されたもの）、およびスタチンである。加えて、アミノ酸は、いくつか挙げるとヒドロキシル化、ホスホリル化、スルホン化、アシル化、およびグリコシル化されているアミノ酸残基を含むように誘導体化され得る。
【００３０】
他に特記しない限り、本書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。方法および物質は、本発明において用いるために本書に記載される；当該技術分野で知られている他の好適な方法および物質を用いることもできる。物質、方法および実施例は、単に例示的であって、限定を意図するものではない。本書に記載の刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の文献はすべて、出典明示によりその全体として本書の一部を構成する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】アクリルアミド含有ステープル化ペプチドによるＢｆｌ−１の特異的標的化の一般的な概念的ストラテジーを図示している。
【図２】多くの内部架橋ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドを図示する。Ｘは、側鎖が内部架橋を形成することができるアミノ酸（例えば、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸）を示す。図中の配列は、配列番号９〜２１（上部（配列番号９）から下部（配列番号２１）まで）に示されるアミノ酸配列を有する。
【図３Ａ】種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドのＭＣＬ−１およびＢｆｌ−１への結合を評価する研究の結果を図示する。
【図３Ｂ】Ｆ３２における置換を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドを図示する。図中に示されるアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する。
【図４Ａ】Ｃ２５Ｓ置換を有する種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドおよびＣ２５Ｓ置換を有しない種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドのＢｆｌ−１への結合を評価する研究の結果を図示する。
【図４Ｂ】Ｃ２５Ｓ置換を有する種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドおよびＣ２５Ｓ置換を有しない種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドのＢｆｌ−１、ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−ＸＬへの結合を評価する研究の結果を図示する。
【図５Ａ】Ｂｆｌ−１  Ｃ５５Ｓ構築物の試験によって示されるとおり、ＮＯＸＡのＣｙｓ２５がＢｆｌ−１  Ｃｙｓ５５と排他的に相互作用することを示す結合研究の結果を図示する。
【図５Ｂ】リポソーム放出アッセイ前のＢｆｌ−１：ＮＯＸＡジスルフィド結合の形成が、ＢＡＸ活性化およびリポソーム色素放出に対するＢｆｌ−１の抗アポトーシス性効果を無効にすることを示す研究の結果を図示する。
【図６】ＮＯＸＡ、ＢＡＸ、ＢＩＭ１、ＢＩＭ２、ＢＡＫおよびＢＯＫ  ＳＡＨＢペプチドを図示する。Ｊは、標的タンパク質への共有結合のための「ウォーヘッド」の位置を示す。当該異なるペプチドのアミノ酸配列は、上部から下部へ、配列番号２２〜３６、１、および３７〜４０に記載されている。配列番号１、３８および３９における太めの残基は、「ウォーヘッド」に置き換えられ得るアミノ酸を同定する。
【図７】ステープリング技術、および形成され得る種々のステープルを図示する。
【図８Ａ】いくつかのＮＯＸＡ  ＳＡＨＢウォーヘッドペプチドが、還元条件下でＢｆｌ−１と結合することを示す研究の結果を図示する。求電子置換は、１＝３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸、２＝Ｄ−ホモプロリン、３＝Ｌ−ホモプロリン、４＝イソニペコチン酸、５＝Ｄ−ニペコチン酸、６＝Ｌ−ニペコチン酸、７＝Ｄ−プロリン、８＝Ｌ−プロリン、９＝trans−４−ジメチルアミノクロトン酸、１０＝アクリル酸である。
【図８Ｂ】結合ポケット内にあるＢｆｌ−１  Ｃｙｓ５５がＮＯＸＡ  ＳＡＨＢウォーヘッドペプチドへの結合に必要なシステイン残基のみであることを実証する、Ｂｆｌ−１  ＣｙｓからＳｅｒへの変異を用いた研究の結果を図示する。
【図８Ｃ】種々のＮＯＸＡウォーヘッドステープル化ペプチドとの共有結合コンジュゲート体を形成するＢｆｌ−１を示す研究の結果を図示する、ここで、ウォーヘッドは、配列のＮ末端であり、まず、ＮＯＸＡ  Ｌｅｕ２１と置き換わり、次に、Ｃｙｓ２５と置き換わる。リンカー５、６および１０は、ペプチドがアセチルでキャップ化されている「Ａｃ」以外は全て類似している。
【図９Ａ】選択されたＮＯＸＡウォーヘッドＳＡＨＢをＭＣＬ−１、Ｂｆｌ−１およびＢＣＬ−ＸLと接触させると、Ｂｆｌ−１のみがＳＡＨＢの存在下で分子量シフトを有することを示す研究の結果を図示する。
【図９Ｂ】Ｂｆｌ−１およびＢＣＬ−ＸLを過剰発現するエシェリキア・コリ（E.coli）ライセート（lysate）にＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢまたはＤＭＳＯを添加し、ウエスタンブロット法を実施して分子量シフトについて試験した。Ｂｆｌ−１だけが、ＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢの添加によって分子量シフトを示した。
【図９Ｃ】ＢＳＡ、Ｂｆｌ−１およびＢｔｎ−ＮＯＸＡまたはＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢを添加した細胞培養培地は、ビオチンについてウエスタンブロットされ、培地中に見られる他のタンパク質との非特異的結合を示さず、バンドは、Ｂｆｌ−１については２０ｋＤａでしか見られなかった。
【図１０Ａ】ＮＯＸＡ  Ｃ２５とＢＦＬ−１  Ｃ５５との間の並立を強調するＮＯＸＡ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１ΔＣ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＭＱＰ）の構造。図中に示されているＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAのアミノ酸配列は配列番号９に示されており；図中に示されているＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA  Ｃ２５Ｓのアミノ酸配列は配列番号１３に示されている。
【図１０Ｂ】ＢＦＬ−１ΔＣ構築物と、示された天然システインおよびシステインからセリンへの変異を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAペプチドとの間の結合相互作用の解離定数。結合実験は、技術的および生物学的にデュプリケートで行った。
【図１０Ｃ】クーマシー染色法（上部）によって検出されるとおり、ＢＦＬ−１ΔＣおよびＦＩＴＣ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA構築物の酸化条件への暴露により、天然のＮＯＸＡ  Ｃ２５およびＢＦＬ−１  Ｃ５５を保持するペプチド／タンパク質対についてのみ分子量シフトが生じた。Ｃ５５を担持するＢＦＬ−１ΔＣと野生型ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAとの間のジスルフィド結合形成は、ＦＩＴＣスキャン（下部）によって確認された。
【図１０Ｄ】酸化条件下で、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAペプチドをＭＣＬ−１ΔＮΔＣまたはＢＣＬ−ＸLΔＣなどの代替抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と一緒にインキュベートした場合、クーマシー染色法によって評価されるとおり、分子量シフトを引き起こさなかった。
【図１１】ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのＢＦＬ−１結合活性。ＢＦＬ−１ΔＣ構築物と、示された天然システインおよびシステインからセリンへの変異を担持するビオチン−ＰＥＧ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAペプチドとの間の会合および解離結合相互作用をバイオレイヤーインターフェロメトリー（biolayer interferometry）によって測定した。実験は、技術的および生物学的デュプリケートで行い、例示的な会合および解離プロファイルを示した。
【図１２Ａ】ＮＯＸＡ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１ΔＣ（左、ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＭＱＰ）およびＢＩＭ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１ΔＣ（右、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＶＭ６）複合体の構造は、求電子ウォーヘッドとの置き換えのための個別のＢＨ３残基とＣ５５との近さを示している。図中に示されているＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−ＷＨのアミノ酸配列は配列番号２４に示されている；図中に示されているＢＩＭ  ＳＡＨＢA−ＷＨのアミノ酸配列は配列番号３０に示されている。
【図１２Ｂ】ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢペプチドのＮ末端で導入される反応性アクリルアミド部分の化学構造。
【図１２Ｃ】ウォーヘッド１〜８を担持するＢＩＭおよびＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの、天然Ｃ５５だけを保持しているＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓとの反応性。
【図１２Ｄ】ＢＩＭおよびＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３ペプチドは、Ｃ５５を担持しているＢＦＬ−１ΔＣタンパク質と選択的に反応した。
【図１２Ｅ】ＢＩＭおよびＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３ペプチドは、これらの抗アポトーシス性標的におけるシステインの存在にもかかわらず、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣまたはＢＣＬ−ＸＬΔＣと反応しなかった。
【図１３Ａ】ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと組換えＨｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、ＢＣＬ−ＸLΔＣ（タグレス）およびＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣとの１：１：１：１混合物（各１μＭ）のＳＡプルダウンによって示されるとおり、ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢへのアクリルアミド部分の取り込みは、ＢＦＬ−１標的化のための競争優位性をもたらした
【図１３Ｂ】ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢと組換えＨｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ（タグレス）およびＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣとの１：１：１：１混合物（各１μＭ）のＳＡプルダウンによって示されるとおり、ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢへのアクリルアミド部分の取り込みは、ＢＦＬ−１標的化のための競争優位性をもたらした。
【図１３Ｃ】リポソーム放出アッセイで用いられた組換えＢＦＬ−１ΔＣおよびそのＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３コンジュゲート体のクーマシー染色。
【図１３Ｄ】ＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出によってモニターされたとおり、ＢＨ３オンリータンパク質ｔＢＩＤは、ＢＡＸ介在性リポソームポレーション（poration）を直接活性化した。ＢＦＬ−１ΔＣは、ｔＢＩＤ誘発ＢＡＸポレーションを完全にブロックするが、一方、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３によるＢＦＬ−１ΔＣの共有結合的会合は、ＢＦＬ−１ΔＣの機能的活性を効果的に阻害した。リポソーム実験は、トリプリケートで行われ、例示的な放出プロファイルを示した。
【図１３Ｅ】ＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出によってモニターされたとおり、ＢＨ３オンリータンパク質ｔＢＩＤは、ＢＡＸ介在性リポソームポレーションを直接活性化した。ＢＦＬ−１ΔＣは、ｔＢＩＤ誘発ＢＡＸポレーションを完全にブロックするが、一方、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３によるＢＦＬ−１ΔＣの共有結合的会合は、ＢＦＬ−１ΔＣの機能的活性を効果的に阻害した。リポソーム実験は、トリプリケートで行われ、例示的な放出プロファイルを示した。
【図１４Ａ】抗ＨＡウエスタン分析により観察されたＢＦＬ−１ΔＣの分子量のシフトから明らかなように、ビオチン化ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３ペプチドは、トランスフェクト２９３ＴライセートからのライセートにおけるＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓと架橋した。抗ビオチンブロッティングは、細胞ライセート中の他のタンパク質との交差反応をほとんどまたは全く伴わずに、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣバンドへのビオチンの選択的取り込みを確認した。
【図１４Ｂ】トランスフェクト２９３Ｔ細胞のビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３による処理、次いで、細胞溶解、ＨＡ免疫沈降法、およびビオチンウエスタン分析によって、ウォーヘッド担持ＢＩＭ  ＳＡＨＢが細胞内アクセスを獲得し、天然Ｃ５５を含有する発現ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを共有結合的に標的とする能力が示された。
【図１４Ｃ】ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３は、２９３Ｔライセート中のＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ相互作用のためのｔＢＩＤと効果的に競合し、示された免疫沈降およびウエスタン分析によって測定されたとおり、堅固な共有結合的コンジュゲーションを達成したが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAは、達成しなかった。
【図１４Ｄ】排他的非共有結合ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１相互作用に関連して、示された免疫沈降法およびウエスタン分析によって測定されたとおり、化合物、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢAは、ｔＢＩＤとの競合に同等に効果的であった。
【図１４Ｅ】ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３による細胞処理によってＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを共有結合的修飾したが、対応する構築物は、アクリルアミド系ウォーヘッドを欠いていた。ＨＡウエスタン分析によってモニターされたとおり、架橋ＢＦｌ−１ΔＣは、２時間まで観察され、レベルは、１２時間処理期間を通して時間依存様式で増加し続けた。
【図１５Ａ】２９３Ｔ細胞を、ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（２０μＭ）で２４時間処理し、次いで、洗浄し、トリプシン処理し、再洗浄し、該細胞を溶解した。相対的ステープル化ペプチド取り込みは、細胞ライセートの電気泳動法およびビオチンウエスタン分析によって評価した。
【図１５Ｂ】２９３Ｔ細胞は、モックトランスフェクトされたかまたはされず、次いで、２４時間後にビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（２０μＭ）でさらに４時間処理され、次いで、細胞ライセートの相対的ビオチンブロッティングについて上記したように処理された。
【図１６Ａ】Ａ３７５Ｐ細胞をＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（４０μＭ）で処理し、示された時点でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって生存率を測定した。データは、技術的セクスチュープリケート（sextuplicate）で行った実験についての平均±標準偏差であり、同様の結果を有する独立した細胞培養物を用いて２回反復した。
【図１６Ｂ】Ａ３７５Ｐ細胞、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（４０μＭ）の３０分間処理によるＬＤＨ放出の定量化。データは、技術的トリプリケートで行った実験についての平均±標準偏差である。
【図１６Ｃ】Ａ３７５Ｐ細胞をＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（４０μＭ）で処理し、示された時点でＣａｓｐａｓｅＧｌｏアッセイによってカスパーゼ３／７活性化を測定した。データは、技術的セクスチュープリケートで行った実験についての平均±標準偏差であり、同様の結果を有する独立した細胞培養物を用いて２回反復した。
【図１６Ｄ】示された時点で収集した細胞質およびミトコンドリア画分のチトクロムｃウエスタン分析によって検出されたとおり、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（４０μＭ）で処理されたＡ３７５Ｐ細胞におけるミトコンドリアチトクロムｃ放出。＊、両側スチューデントｔ検定によりｐ＜０.００１。
【図１７Ａ】ＳＡプルダウンおよびＢＦＬ−１ウエスタン分析（上部）によってモニターされたとおり、Ａ３７５Ｐライセートにおいて、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAと比べて増強した、ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３による天然ＢＦＬ−１の標的化。対照的に、両化合物は、ＭＣＬ−１（そのＢＨ３結合溝においてシステインを担持しておらず、したがって、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３についての競争優位性をもたらさない）の結合に同等に効果的である（下部）。
【図１７Ｂ】ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３は、免疫反応性ＢＦＬ−１と同じ分子量で遊走するミトコンドリアタンパク質をビオチン化するが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAはそうではない。
【図１７Ｃ】ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３で処理Ａ３７５Ｐ細胞のライブ共焦点顕微鏡は、天然ＢＦＬ−１の細胞内部位であるミトコンドリアでのその局在化を明らかにする。バー、１０μｍ。
【図１７Ｄ】細胞収縮、核凝縮および膜ブレブ形成によって表されるとおり、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３処理Ａ３７５Ｐ細胞は、アポトーシス誘導を受けることが観察される。上記のとり、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒの共局在化もまた明らかである。バー、１０μｍ。
【図１８】ステープル化ペプチド組成物。
【図１９】タンパク質標的システイン残基数、近位ヘリックス残基数および距離（Å）が附記されているＴｂｉｄ  ＢＨ３ペプチドと複合化したヒトＢｆｌ−１の結晶構造。当該結晶構造の下に、ＢＩＤ  ＢＨ３の典型的なステープル化ペプチド配列がある。Ｊ＝非天然の求電子基含有アミノ酸（しかし、アミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり得る）；Ｂ＝ノルロイシン、８＝Ｒ８、Ｘ＝オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）。
【図２０】タンパク質標的システイン残基数、近位ヘリックス残基数および距離（Å）が附記されているＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドと複合化したヒトＢｆｌ−１の結晶構造。当該結晶構造の下に、ＮＯＸＡ  ＢＨ３の典型的なステープル化ペプチド配列がある。Ｊ＝非天然の求電子基含有アミノ酸（しかし、アミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり得る）；８＝Ｒ８、Ｘ＝オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）。
【図２１】ＮＯＸＡ  ＢＨ３の位置Ｌ２１が同定されたＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドと複合化したヒトＢｆｌ−１の結晶構造。
【図２２】タンパク質標的システイン残基数、近位ヘリックス残基数および距離（Å）が附記されているＢＡＫ  ＢＨ３ペプチドと複合化したヒトＢｆｌ−１の結晶構造。Ｊ＝非天然の求電子基含有アミノ酸（しかし、アミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり得る）；８＝Ｒ−オクテニルアラニン。
【図２３】「ウォーヘッド」を有する典型的なＢＡＫ  ＢＨ３ステープル化ペプチド。Ｊ＝非天然の求電子基含有アミノ酸（しかし、アミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり得る）；８＝Ｒ８、Ｘ＝オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）。
【図２４】「ウォーヘッド」を有する典型的なＢＡＸ  ＢＨ３ステープル化ペプチド。Ｊ＝非天然の求電子基含有アミノ酸（しかし、アミノ酸を含まない求電子ウォーヘッドであり得る）；８＝Ｒ８、Ｘ＝オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）。
【図２５】ウォーヘッド担持ペプチドは、発現ＢＦＬ−１の細胞内架橋を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
安定化ペプチド
本開示は、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって連結されている少なくとも２個の修飾アミノ酸を含む、ＮＯＸＡ、ＢＩＭ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤまたはＢＯＫに関連する構造安定化ペプチドであって、該構造安定化ペプチドが結合する標的タンパク質（例えば、Ｂｆｌ−１）内のＣｙｓ残基と共有結合を形成することができる反応性基（ウォーヘッド）を有する、構造安定化ペプチドを提供する。本書に記載の安定化ペプチドは、ステープル化ペプチドおよびステッチ化ペプチド、ならびに複数のステッチ、複数のステープルまたはステープルとステッチの混合を含有するペプチドを包含する。
【００３４】
いくつかの場合、Ｂｆｌ−１を結合するペプチドとしては、下記配列：
ＡＥＬＥＶＥＳＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬＬ（配列番号１；ＮＯＸＡ）
ＤＭＰＲＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号２；ＢＩＭ）
ＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮＭＥＬＱＲ（配列番号３；ＢＡＸ）
ＳＳＴＭＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲＲＹＤＳＥＦＱＴＭＬＱＨＬＱ（配列番号４；ＢＡＫ）
ＰＧＧＲＬＡＥＶＳＴＶＬＬＲＬＧＤＥＬＥＱＩＲＰＳ（配列番号５；ＢＯＫ）
ＳＥＳＱＥＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩＰＰＧ（配列番号６；ＢＩＤ）
ＥＥＥＱＷＡＲＥＩＧＡＱＬＲＲＭＡＤＤＬＮＡＱＹＥＲＲＲＱＥＥＱＱ（配列番号７；ＰＵＭＡ）
ＫＫＦＥＰＫＳＧＷＭＴＦＬＥＶＴＧＫＩＣＥＭＬＳＬＬＫＱＹＣ（配列番号８；ＢＦｌ−１）
から選択される配列の少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０またはそれ以上）または少なくとも１５（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２またはそれ以上）連続するアミノ酸を包含する（例えば、それらを含むか、基本的にそれらからなるか、またはそれらからなる）ことができ、ここで、当該ペプチドは、強化または安定化されたαヘリックス二次構造を有し（例えば、当該ペプチドは少なくとも１つの内部架橋を含む）、かつ、システイン残基の側鎖と反応することができる求電子基を担持する非天然アミノ酸（例えば、反応性アクリルアミド部分を担持する非天然アミノ酸）を有する。
【００３５】
いくつかの場合、当該ペプチドは、３０個未満、２５個未満または２０個未満のアミノ酸を含む。
【００３６】
いくつかの場合、Ｂｆｌ−１と結合する安定化ペプチドは、配列番号１〜７または３７〜４０の１つに対して少なくとも５０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９.５％、または１００％）の同一性を有することができる。ある特定の実施態様において、当該ペプチドに関する上記の同一性率は、当該ペプチドのヘリックスのＢｆｌ−１相互作用面に言及する。結晶構造から、Ｂｆｌ−１相互作用残基は下記のものである：
ＮＯＸＡ：Ｌｅｕ−２１、Ｇｌｕ−２２、Ｖａｌ−２３、Ｇｌｕ−２４、Ｃｙｓ−２５、Ａｌａ−２６、Ｇｌｎ−２８、Ｌｅｕ−２９、Ａｒｇ−３０、Ｐｈｅ−３２、Ｇｌｙ−３３、Ａｓｐ−３４、Ｌｅｕ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｇｌｎ−４０；
ＢＩＭ：Ｇｌｕ−１４５、Ｉｌｅ−１４６、Ｔｒｐ−１４７、Ｉｌｅ−１４８、Ａｌａ−１４９、Ｇｌｕ−１５１、Ｌｅｕ−１５２、Ａｒｇ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｉｌｅ−１５５、Ｇｌｙ−１５６、Ａｓｐ−１５７、Ｐｈｅ−１５９、Ａｓｎ−１６０、Ｔｙｒ−１６２、Ｔｙｒ−１６３、Ａｌａ−１６４、Ａｒｇ−１６５；
ＢＩＤ：Ｉｌｅ−８２、Ｉｌｅ−８３、Ａｓｎ−８５、Ｉｌｅ−８６、Ａｌａ−８７、Ｈｉｓ−８９、Ｌｅｕ−９０、Ａｌａ−９１、Ｖａｌ−９３、Ｇｌｙ−９４、Ａｓｐ−９５、Ｍｅｔ−９７、Ａｓｐ−９８、Ｉｌｅ−１０１、Ｇｌｙ−１０４；および
ＢＡＫ：Ｇｌｙ−７２、Ｖａｌ−７４、Ｇｌｙ−７５、Ａｒｇ−７６、Ｇｌｎ−７７、Ｌｅｕ−７８、Ａｌａ−７９、Ｉｌｅ−８１、Ｇｌｙ−８２、Ａｓｐ−８３、Ｉｌｅ−８５、Ａｓｎ−８６。
【００３７】
いくつかの場合、安定化ペプチドは、当該安定化ペプチドのヘリックスの非相互作用面（すなわち、Ｂｆｌ−１と相互作用しないヘリックスの部分）に１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸置換を有することができる。本書に記載のポリペプチドの「相互作用面」は、ＢＦＬ−１タンパク質と相互作用する（例えば、特異的に相互作用するか、または特異的に結合する）αヘリックスのこれらのアミノ酸残基を含む。ある特定の場合、当該ペプチドは、ペプチドのヘリックスの相互作用面に１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のアミノ置換を有する。いくつかの場合、配列番号１〜７のいずれか１つの相互作用面にあるアミノ酸を他のアミノ酸（例えば、Ａｌａ）に置き換えるのが有用であり得る。ある特定の実施態様において、当該アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、ペプチドの相互作用面の化学的構造を変更しないアミノ酸置換である。いくつかの場合、本書に記載のペプチドは、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、もしくは１〜９個）の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１〜７のうちの１つを含むことができる。本書に記載のペプチドのヘリックスの相互作用面にないアミノ酸において大きな変化が認められる。例えば、これらのアミノ酸の全てではないがほとんど全てが（例えば、保存的アミノ酸で）置換され得る。いくつかの場合、アミノ酸の側鎖は、当該アミノ酸を下記のものに置き換えるように置換される：３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸；Ｄ−ホモプロリン；Ｌ−ホモプロリン；イソニペコチン酸；Ｄ−ニペコチン酸；Ｌ−ニペコチン酸；Ｄ−プロリン；Ｌ−プロリン；trans−４−ジメチルアミノクロトン酸；およびアクリル酸。いくつかの場合、当該ペプチド変異体は、３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸；Ｄ−ホモプロリン；Ｌ−ホモプロリン；イソニペコチン酸；Ｄ−ニペコチン酸；Ｌ−ニペコチン酸；Ｄ−プロリン；Ｌ−プロリン；trans−４−ジメチルアミノクロトン酸；およびアクリル酸から選択されるアミノ末端基を有する。ある特定の場合において、当該ウォーヘッドはアミノ酸ではない。いくつかの実施態様において、当該求電子部分とペプチドは、飽和窒素含有複素環（アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン）または不飽和窒素含有複素環（アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン）を介して連結される。当該ペプチドと求電子基はまた、フェニル（アニリン）のような置換アミノ官能化環（例えば、Ｎ−アリールアクリルアミド）によって、または、より複雑な二環式もしくは多環式環、例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、アザインドールによって連結され得る。いくつかの実施態様において、当該求電子ウォーヘッドは、アクリルアミドであるか、またはより一般的には、α,β−不飽和カルボニル、例えば、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans−４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、もしくはtrans−４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、または何れかの他の置換アクリルアミドであると定義される。いくつかの場合、当該安定化ペプチドは、１個または２個のステープル（例えば、３（または６）アミノ酸離れている２個のアミノ酸の間に１個のステープル、または３（または６）アミノ酸離れている２個のアミノ酸の間にそれぞれ２個のステープル）を有する配列番号１〜７の１つの配列を有する。加えて、この安定化ペプチド中のアミノ酸（その側鎖は、ステープルに置き換えられていない）の１、２、３、４または５個は、保存的置換によって置き換えられ得、１個のアミノ酸の側鎖は、システイン残基の側鎖と反応することができる求電子基に置き換えられる。いくつかの実施態様において、当該内部ステープルは、２個のアミノ酸の側鎖と置き換わっており、すなわち、各ステープルは、例えば３、４または６アミノ酸離れている、２個のアミノ酸の間にある。いくつかの実施態様において、当該内部ステッチは、３個のアミノ酸の側鎖と置き換わっており、すなわち、当該ステッチは、例えば３および６アミノ酸離れている、３個のアミノ酸の間の一対の架橋である。
【００３８】
いくつかの場合、「保存的アミノ酸置換」は、１個のアミノ酸残基が類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基に置き換えられる置換を含むことができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３９】
アミノ酸配列の間の同一性率を決定する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、当該配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、最適な整列のために１番目および２番目のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視され得る）。好ましい実施態様において、比較目的のために整列された参照配列の長さは、当該参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、当該分子は、その位置で同一である。２個のアミノ酸配列の間の同一性率の決定は、ＢＬＡＳＴ  ２.０プログラムを用いて行われる。配列比較は、非ギャップ整列を使用し、かつ、デフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、ギャップ存在コスト（gap existence cost）１１、残基ごとのギャップコスト（per residue gapped cost）１、およびラムダ比０.８５）を使用して行われる。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学アルゴリズムは、Altschul et al. によって記載されている（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）。
【００４０】
ｉとｉ＋３との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ７アルキレンまたはアルケニレンであり得る。ｉとｉ＋４との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ８アルキレンまたはアルケニレンであり得る。ｉとｉ＋７との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであり得る。当該架橋がアルケニレンである場合、１つ以上の二重結合が存在し得る。
【００４１】
ｉとｉ＋３との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８アルキルまたはアルケン（例えば、単一の二重結合を有するＣ６アルケン）であり得る。ｉとｉ＋４との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ８アルキルまたはアルケンであり得る。ｉとｉ＋７との間の架橋の場合、当該架橋は、Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３アルキルまたはアルケン（例えば、単一の二重結合を有するＣ１１アルケン）であり得る。当該架橋がアルケンである場合、１つ以上の二重結合が存在し得る。
【００４２】
「ペプチドステープリング」とは、架橋環を形成するために閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を用いて、ポリペプチド鎖中に存在する２つのオレフィン含有側鎖（例えば、架橋性側鎖）が共有結合される（例えば、「一緒にステープル化される」）合成方法に由来する造語である（Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001；Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994）。本書で用いる場合、用語「ペプチドステープリング」は、単独で「ステープル化」されたポリペプチドを提供するためにあらゆる反応条件および／またはこのような反応を促進する触媒を用いて、ポリペプチド鎖中に存在し得る２つ（例えば、少なくとも一対の）の二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖を結合することを包含する。用語「多重にステープル化」されたポリペプチドとは、２つ以上の個々のステープルを含有するこれらのポリペプチドをいい、種々のスペーシングおよび組成の２つ、３つまたはそれ以上の独立したステープルを含有し得る。加えて、本書で用いる場合、用語「ペプチドステッチング」とは、２つのステープルが例えば共通の残基に連結されている「ステッチ化」された（例えば、タンデムにまたは多重にステープル化された）ポリペプチドを提供するための単一のポリペプチド鎖における複数のタンデムの「ステープリング」事象をいう。ペプチドステッチングは、例えば、国際公開第２００８／１２１７６７号および国際公開第２０１０／０６８６８４号に記載されている（どちらも出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する）。いくつかの場合、本書で用いる場合、ステープルは、不飽和結合を保持することができるか、または還元され得る（例えば、下記のステッチングのパラグラフの記載に記載されるとおり）。
【００４３】
多くのペプチドステープルは全炭化水素架橋を有するが、他のタイプの架橋またはステープルを用いることができる。例えば、トリアゾール含有（例えば、１,４−トリアゾールまたは１,５−トリアゾール）架橋を用いることができる（Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137；国際公開第２０１０／０６０１１２号）。
【００４４】
全炭化水素架橋を用いるペプチドのステープリングは、特に生理学的に関連する条件下で、天然の立体構造および／または二次構造を維持するのに役立つことが示されている（Schafmiester et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892, 2000；Walensky et al., Science, 305:1466-1470, 2004）。
【００４５】
αヘリックス二次構造を有する傾向にある全炭化水素架橋による本書におけるポリペプチドのステープリングは、当該ポリペプチドをその天然αヘリックス立体構造に拘束することができる。この拘束された二次構造は、例えば、タンパク質切断に対するペプチドの抵抗性を増大させることができ、ペプチドの熱安定性を増大させることができ、ペプチドの疎水性を増大させることができ、標的細胞の膜へのペプチドのより良好な浸透を可能にすることができ、および／または、対応する非架橋（例えば、「非ステッチ化」または「非ステープル化」）ペプチドと比較してペプチドの生物活性の向上をもたらすことができる。
【００４６】
修飾（例えば、内部架橋を支持するため）のためのアミノ酸の選択は、また、ステープルスキャニングによって促進され得る。用語「ステープルスキャン」とは、ステープル化ペプチドのライブラリーの合成をいい、これにより、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；およびｉとｉ＋７の単一および複数のステープルまたはステッチの位置は、ステープル化またはステッチ化構築物について所望のまたは最適な特性および活性を同定するために全ての可能な位置をサンプリングしてペプチド配列の長さに沿って連続して配置される。ステープルスキャニング方法の例は図面に例示される。
【００４７】
好適なテザー（tether）は、本書、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８５７５、国際公開第２００９／１０８２６１号および国際公開第２０１０／１４８３３５号に記載されている。
【００４８】
本書に記載のペプチドにおける使用に適切なアミノ酸側鎖は当該技術分野において知られている。例えば、好適なアミノ酸側鎖としては、メチル（アラニンのαアミノ酸側鎖がメチルである場合）、４−ヒドロキシフェニルメチル（チロシンのαアミノ酸側鎖が４−ヒドロキシフェニルメチルである場合）およびチオメチル（システインのαアミノ酸側鎖がチオメチルである場合）などが挙げられる。「末端不飽和アミノ酸側鎖（terminally unsaturated amino acid side chain）」とは、ポリペプチド鎖における他の末端不飽和部分（terminal unsaturated moiety）との架橋反応に関与する末端不飽和部分、例えば置換もしくは非置換の二重結合（例えば、オレフィン系）または三重結合（例えば、アセチレン系）を有するアミノ酸側鎖をいう。ある特定の実施態様において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」は、末端オレフィン系アミノ酸側鎖（terminal olefinic amino acid side chain）である。ある特定の実施態様において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」は、末端アセチレン系アミノ酸側鎖（terminal acetylenic amino acid side chain）である。ある特定の実施態様において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」の末端部分は、それ以上置換されていない。
【００４９】
上記のとおり、内部テザーまたは架橋は、１ヘリカルターンの長さにわたって（すなわち、約３.４アミノ酸（すなわち、ｉ,ｉ＋３、またはｉ,ｉ＋４））または２ヘリカルターンの長さにわたって（すなわち、約７アミノ酸（すなわち、ｉ,ｉ＋７））伸びることができる。したがって、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；またはｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は、化学修飾および架橋の理想的な候補である。かくして、例えば、ペプチドが配列...Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9...（ここで、「...」は、さらなるアミノ酸の任意の存在を示す）を有する場合、Ｘａａ1とＸａａ4との間、またはＸａａ1とＸａａ5との間、またはＸａａ1とＸａａ8との間の架橋は、Ｘａａ2とＸａａ5との間、またはＸａａ2とＸａａ6との間、またはＸａａ2とＸａａ9との間などの架橋と同様に有用である。
【００５０】
ポリペプチドは、さらに配列を安定化するため、または、より長いポリペプチドストレッチの安定化を促進するために、ポリペプチド配列内に２つ以上の架橋を含むことができる。該ポリペプチドが１つの部分で容易に合成するには長すぎる場合、別々に合成した架橋ペプチドをネイティブケミカルライゲーション（native chemical ligation）と称される技術によって結合することができる（Bang, et al., J. Am. Chem. Soc. 126:1377）。別法として、大きいペプチドは、フゼオンの工業的合成におけるように、収束的手法を用いてルーチン的に合成され、これにより、完全に保護された断片は、特異的かつ連続的に反応し、最後に脱保護した後に、所望の全長生成物を形成する。
【００５１】
ペプチドは、１つ以上の不斉中心を含有することができ、かくして、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物、ならびに存在するオレフィンの幾何異性体（例えば、Ｚまたはcis、およびＥまたはtrans）として生じることができる。例えば、本書に記載のペプチドは、例えば、cis−異性体およびtrans−異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、(Ｄ)−異性体、(Ｌ)−異性体、そのラセミ混合物、ならびに他のその混合物を包含する特定の幾何異性体または立体異性体形態で存在することができる。エナンチオマーは、それらの対応するエナンチオマーを含まなくてもよく（例えば、実質的に含まなくてもよく）、および／または光学的に濃縮されていてもよい。本書で用いる場合、「光学的に濃縮されている」とは、化合物が有意に大きい割合の１つのエナンチオマーで構成されていることを意味する。ある特定の実施態様において、実質的に含まないとは、組成物が少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーを含有することを意味する。他の実施態様において、化合物は、少なくとも約９５重量％、９８重量％、または９９重量％の好ましいエナンチオマーから構成される。好ましいエナンチオマーは、例えばキラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化が挙げられるがこれらに限定されない当該技術分野において知られている技術を用いて、ラセミ混合物から単離することができるか、または、不斉合成によって製造することができる（例えば、Jacques, et al, Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel, EX. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw- Hill, NY, 1962)；Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (EX. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)を参照）。これらの化合物のかかる異性体形態は全て、本発明に明示的に包含される。
【００５２】
ペプチドは、また、複数の互変異性体形態で表すこともでき、このような場合、本発明は、本書に記載の化合物の全ての互変異性体形態（例えば、複数の部位でのアルキル化が位置異性体を生じ得る場合、平衡状態の異性体（例えば、ケト−エノール））、位置異性体、および本書に記載の化合物の酸化生成物を自明的に包含する（本発明は、このような反応生成物を全て自明的に包含する）。このような化合物のかかる異性体形態は全て、全ての結晶形態と同様に包含される。
【００５３】
いくつかの場合、本書に記載の炭化水素テザー（すなわち、架橋）は、さらにマニピュレートすることができる。一例として、炭化水素アルケニルテザーの二重結合（例えば、ルテニウム触媒化閉環メタセシス（ＲＣＭ）を用いて合成されるような）は、（例えば、エポキシド化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化によって）酸化されて下記化合物の１つを提供することができる。
【化１】
2018534240.tif 000003
【００５４】
エポキシド部分、または遊離ヒドロキシル部分の１つのいずれかは、さらに官能化され得る。例えば、エポキシドは、例えば治療剤を付着させるために使用することができる、付加官能性を提供する求核試薬で処理することができる。このような誘導体化は、別法として、ポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端の合成マニピュレーションによって、またはアミノ酸側鎖を介して達成することができる。他の薬剤、例えば細胞へのポリペプチドの進入を促進する薬剤を官能化テザーに付着させることができる
【００５５】
炭化水素テザーが記載されているが、他のテザーも想定される。例えば、テザーは、エーテル部分、チオエーテル部分、エステル部分、アミン部分またはアミド部分のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの場合、天然に存在するアミノ酸側鎖をテザーに組み込むことができる。例えば、テザーは、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リジン中の第一アミン、アスパルテートもしくはグルタメート中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドなどの官能基とカップリングすることができる。したがって、２つの天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって製造されるテザーを用いるのではなく天然に存在するアミノ酸を用いてテザーを作成することが可能である。また、単一の天然に存在しないアミノ酸を天然に存在するアミノ酸と一緒に用いることも可能である。
【００５６】
さらに、テザーの長さは変えることができることも想定される。例えば、二次αヘリックス構造に比較的高度な拘束を与えることが望ましい場合には、より短いテザーを用いることができるが、一方、二次αヘリックス構造にあまり拘束を与えないことが望ましい場合があり、したがって、より長いテザーが望ましい場合がある。
【００５７】
加えて、主にαヘリックスの単一面上にあるテザーを提供するために、アミノ酸ｉからｉ＋３に、ｉからｉ＋４に；およびｉからｉ＋７にまたがるテザーの例が記載されているが、該テザーは、多数のアミノ酸のあらゆる組み合わせにもまたがるように合成することができる。
【００５８】
いくつかの場合、α二置換アミノ酸は、ポリペプチドにおいて、αヘリックス二次構造の安定性を向上させるために使用される。しかしながら、α二置換アミノ酸は必要ではなく、モノα置換基を用いる場合（例えば、テザー化アミノ酸において）は想定されない。
【００５９】
ステープル化ポリペプチドとしては、薬物、トキシン、ポリエチレングリコールの誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを挙げることができる。ポリマーまたは他の薬剤がステープル化ポリペプチドと結合する場合、組成物が実質的に均一であることが望ましい場合がある。
【００６０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加は、ポリペプチドの薬物動態学的および薬力学的特性を向上させることができる。例えば、ＰＥＧ化は、腎クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらすことができる。ＰＥＧは、水溶性ポリマーであり、ポリペプチドと連結するように、式：
ＸＯ−−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−−ＣＨ2ＣＨ2−−Ｙ
［式中、ｎは２〜１０,０００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ1-4アルキルであり；Ｙは、ポリペプチドのアミン基（リジンのεアミン、またはＮ末端が挙げられるがこれらに限定されるものではない）への、アミドリンケージ、カルバメートリンケージまたは尿素リンケージである］
として表すことができる。Ｙは、チオール基（システインのチオール基が挙げられるが、これに限定されるものではない）へのマレイミドリンケージであってもよい。ＰＥＧをポリペプチドへ直接または間接的に連結するための他の方法は、当該技術分野の当業者に知られている。ＰＥＧは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。種々の官能性誘導体を包含する種々の形態のＰＥＧが市販されている。
【００６１】
骨格に分解性リンケージを有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けるエステルリンケージを用いて製造することができる。分解性ＰＥＧリンケージを有するコンジュゲート体は、国際公開第９９／３４８３３号、国際公開第９９／１４２５９号および米国特許第６,３４８,５５８号に記載されている。
【００６２】
ある特定の実施態様において、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間リンカーを介して本書に記載の薬剤と結合する。ある特定の実施態様において、該リンカーは、ペプチド結合によって連結される１〜２０個のアミノ酸から構成され、ここで、該アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者によって十分に理解されるように、グリコシル化され得る。他の実施態様において、この１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。他の実施態様において、リンカーは、グリシンおよびアラニンのような立体障害のない大多数のアミノ酸から構成される。非ペプチドリンカーもまた可能である。例えば、−ＮＨ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)−（ここで、ｎ＝２〜２０である）のようなアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ1〜Ｃ6）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ2、フェニルなどの立体障害のない基によって置換され得る。米国特許第５,４４６,０９０号には、二官能性ＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカー末端の各々におけるペプチドを有するコンジュゲート体の形成におけるその使用が記載されている。
【００６３】
いくつかの実施態様において、ステープル化ペプチドは、また、例えば、細胞取り込みを促進するために、またはインビボ安定性を増大させるために、修飾することできる。例えば、ペプチド模倣性大環状分子のアシル化またはＰＥＧ化は、細胞取り込みを促進し、バイオアベイラビリティを増大させ、血液循環を増加させ、薬物動態を改変し、免疫原性を低下させ、および／または必要な投与回数を減少させる。
【００６４】
いくつかの実施態様において、本書に記載のステープル化ペプチドは、（例えば、非ステープル化ペプチドと比較して）細胞膜に浸透する能力が高くなる。
【００６５】
本書に記載の化合物の合成方法は、当該技術分野において知られている。それにもかかわらず、以下に例示する方法を用いることができる。所望の化合物を得るために種々の工程を別のシーケンスまたは順序で行うことができることが理解される。本書に記載の化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基方法（保護および脱保護）は当該技術分野において知られており、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)；T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの続版に記載されるようなものが挙げられる。
【００６６】
本発明のペプチドは、当業者に周知の化学合成方法によって作成することができる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照。故に、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１にて、側鎖保護アミノ酸を用いて、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学によって保護されたα−ＮＨ2を用いる固相合成法の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を用いて合成することができる。
【００６７】
本書に記載のペプチドを作成する１つの方法は、固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）を用いることである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定性結合を介して架橋ポリスチレン樹脂と結合する。この樹脂は、比較的簡単かつ迅速に過剰の試薬および副生成物を洗浄する、合成に使用される溶媒に不溶である。Ｎ末端は、酸において安定であるが塩基によって除去可能であるＦｍｏｃ基で保護される。側鎖官能基は、塩基安定で酸不安定な基によって保護される。
【００６８】
長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを結合することによって作成され得る。別法として、この長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。かかる技術は、周知の標準マニュアルにて詳細なプロトコールとともに提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、好ましくは該遺伝子が発現されるべき生物に最適なコドンを用いて、該アミノ酸配列を逆翻訳して、該アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、必要に応じて、典型的にはペプチドおよびあらゆる調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子を作成する。該合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞内に導入する。次いで、該ペプチドを、選択した発現系および宿主にとって適切な好適な条件下で発現させる。標準的な方法によって該ペプチドの精製および特徴付けを行う。
【００６９】
該ペプチドは、ハイスループットコンビナトリアル法で、例えばAdvanced Chemtechから入手可能なハイスループット多重チャネルコンビナトリアルシンセサイザーを用いて、作成することができる。
【００７０】
ペプチド結合を、例えばペプチドの生理学的安定性を増大させるために、レトロインベルソ結合（Ｃ(Ｏ)−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ2）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ2またはＣＨ2−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ2またはＣＨ2−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ2−ＣＨ2）；チオアミド結合（Ｃ(Ｓ)−ＮＨ）；trans−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換trans−オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ(Ｏ)−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ(Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＣＨ3である）；およびフルオロ−ケトメチレン結合（Ｃ(Ｏ)−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ(Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ3である）に置き換えることができる。
【００７１】
さらに、アセチル化、アミド化、ビオチニル化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって、ポリペプチドを修飾することができる。上記したように、ペプチドを、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ1〜Ｃ20直鎖または分岐鎖アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組み合わせとコンジュゲートすることができる。
【００７２】
さまざまな長さのオレフィン系側鎖を含有するα,α−ジ置換非天然アミノ酸は、公知の方法によって合成することができる（Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991；Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000；およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008; Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011）。ペプチドについて、ｉとｉ＋７を連結するステープル（i linked to i+7 staple）を用いる場合（安定化されたヘリックスの２ターン）、ａ）１個のＳ５アミノ酸および１個のＲ８が使用されるか、またはｂ）１個のＳ８アミノ酸および１個のＲ５アミノ酸が使用される。Ｒ８は、出発キラル補助基がＲ−アルキル−立体異性体を与えることを除けば同一の経路を用いて合成される。また、５−ヨードペンテンに代えて８−ヨードオクテンを用いる。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂において固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）を用いて固体支持体上で合成される（例えば、国際公開第２０１０／１４８３３５号を参照）。
【００７３】
Ｆｍｏｃ保護α−アミノ酸（オレフィン系アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ5−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ8−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ8−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ8−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｒ5−ＯＨ以外）、２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルアミニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡは、例えば、Novabiochem（San Diego, CA）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１,２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Sigma-Aldrichから市販されている。オレフィン系アミノ酸合成は、当該技術分野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。
【００７４】
再度、本書に記載のペプチドを得る（例えば、合成する）、ステープリングする、および精製するのに好適な方法も当該技術分野において知られている（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008)；Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011；Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004)；Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願第１２／５２５,１２３号；および２０１０年５月２３日に発行された米国特許第７,７２３,４６８号（各々、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する）を参照）。
【００７５】
いくつかの実施態様において、ペプチドは、非ステープル化ペプチド夾雑物を実質的に含まないか、または単離される。ペプチドの精製方法は、例えば、固相支持体上でペプチドを合成することを含む。環化後、固相支持体を単離し、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物などの溶媒の溶液に懸濁することができる。ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、ＤＭＳＯを約３０％、４０％、５０％、または６０％含むことができる。特定の実施態様において、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液が使用される。該溶液は、１、６、１２または２４時間インキュベートすることができ、その後、該樹脂を、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで、洗浄することができる。ある実施態様において、該樹脂はＮＭＰで洗浄される。振盪し、該溶液に不活性ガスを通気することができる。
【００７６】
本発明の架橋ポリペプチドの特性は、例えば下記の方法を用いて、アッセイすることができる。
【００７７】
αヘリックス度を決定するためのアッセイ：  化合物を水溶液（例えば、ｐＨ７の５ｍＭリン酸カリウム溶液、または蒸留水、２５〜５０μＭの濃度まで）に溶解する。分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Aviv）において標準的な測定パラメータ（例えば、温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ解像度（step resolution）、０.５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；光路長、０.１ｃｍ）を用いて円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを得る。平均残基楕円率をモデルヘリックスデカペプチドについて報告されている値（Yang et al., Methods Enzymol. 130:208 (1986)）で割ることによって、各ペプチドのαヘリックス含有量を算出する。
【００７８】
融解温度（Ｔｍ）を決定するためのアッセイ：  架橋または非修飾テンプレートペプチドを蒸留水または他の緩衝液もしくは溶媒に溶解し（例えば、５０μＭの最終濃度で）、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Aviv）において標準的なパラメータ（例えば、波長２２２ｎｍ；ステップ解像度、０.５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；温度上昇率：１℃／分；光路長、０.１ｃｍ）を用いて、ある温度範囲（例えば、４〜９５℃）にわたって楕円率の変化を測定することによってＴｍを決定する。
【００７９】
インビトロプロテアーゼ耐性アッセイ：  ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、それによって、ペプチド系化合物はインビボで急速に分解しやすくなる。しかしながら、ペプチドヘリックス形成は、典型的にはアミド骨格を埋没させ、および／またはひずませ、および／または保護し、したがって、タンパク質切断を予防するかまたは実質的に遅らせることができる。本発明のペプチド模倣性大環状分子をインビトロ酵素タンパク質分解（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン）させて、対応する非架橋または別にステープル化されたポリペプチドと比べた分解速度の変化について評価することができる。例えば、該ペプチド模倣性大環状分子および対応する非架橋ポリペプチドを、トリプシンアガロースと一緒にインキュベートし、遠心分離によって様々な時点で反応をクエンチし、その後ＨＰＬＣ注入して２８０ｎｍでの紫外線吸収により残存基質を定量する。簡潔に述べると、該ペプチド模倣性大環状分子およびペプチド模倣性前駆体（５ｍｃｇ）を、トリプシンアガロース（Pierce）（Ｓ／Ｅ約１２５）と一緒に０、１０、２０、９０、および１８０分間インキュベートする。高速での卓上遠心分離によって反応をクエンチし、単離した上清中に残存している基質を２８０ｎｍでのＨＰＬＣによるピーク検出によって定量する。タンパク質分解反応は一次速度則を示し、ｌｎ［Ｓ］対時間のプロットから速度定数、ｋを決定する。
【００８０】
ペプチド模倣性大環状分子および／または対応する非架橋ポリペプチドを、各々、マウス、ラットおよび／またはヒトの新鮮な血清（例えば、１〜２ｍＬ）と一緒に、３７℃で、例えば、０、１、２、４、８および２４時間インキュベートする。大環状分子濃度が異なる試料を血清による段階希釈によって調製することができる。インタクトな化合物のレベルを決定するために、以下の手順を使用することができる：例えば、血清１００μＬを２ｍｌ遠心管に移し、その後、５０％ギ酸１０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを添加し、４±２℃で１０分間、１４,０００ＲＰＭで遠心分離することにより、試料を抽出する。次いで上清を新しい２ｍｌチューブに移し、ＴｕｒｂｏｖａｐにおいてＮ2＜１０ｐｓｉ下にて３７℃で蒸発させる。試料をアセトニトリル：水（５０：５０）１００μＬで再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。エクスビボ安定性を試験するための同等または同様の手順は知られており、血清における大環状分子の安定性を決定するために使用することができる。
【００８１】
インビボプロテアーゼ耐性アッセイ：  ペプチドステープリングの重要な利益は、インビトロプロテアーゼ耐性の、顕著に向上したインビボでの薬物動態への翻訳である。
【００８２】
インビトロ結合アッセイ：  アクセプタータンパク質に対するペプチド模倣性大環状分子およびペプチド模倣性前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を用いることができる。ＦＰＡ技術は、偏光および蛍光トレーサーを用いて分子配向および運動を測定する。偏光で励起されると、見掛けの分子量が高い分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きいタンパク質と結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、小分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、溶液中にて遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較して、より遅いそれらの回転速度に起因して、より高レベルの偏光蛍光を発光する。
【００８３】
医薬組成物
医薬組成物としての使用または医薬組成物における使用のために、本書に記載の安定化ペプチドの１種以上（例えば、配列番号２２〜３６および４１〜１１９の１種以上、または図１８におけるペプチドの１種以上）を製剤化することができる。ある特定の実施態様において、該医薬組成物は、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を除いて、配列番号２２〜３６および４１〜１１９に記載のアミノ酸配列または図１８におけるペプチドの１種以上と同一のアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列に対するこれらの変化は、これらのペプチドのＢｆｌ−１非相互作用αヘリックス面および／またはＢｆｌ−１相互作用αヘリックス面に対して行われ得る。かかる組成物は、あらゆる経路、例えば、食品医薬品局（Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）によって承認されたあらゆる経路による対象体への投与のために製剤化されるかまたは適合させることができる。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ標準マニュアル（Data Standards Manual）バージョンナンバー００４（fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmで入手可能）に記載されている。例えば、組成物は、吸入（例えば、経口および／または鼻腔吸入（例えば、ネブライザーまたはスプレーを介する））、注射（例えば、静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内、および／または皮下）による投与のために；および／または経口投与、経粘膜投与、および／または局所投与（局所（例えば、鼻）スプレー剤および／または液剤を包含する）のために、製剤化されるかまたは適合させることができる。
【００８４】
いくつかの場合、医薬組成物は、１種以上の安定化ペプチドの有効量を含むことができる。本書で用いる場合、用語「有効量」および「処置に有効な」とは、所定の効果または生理学的結果（例えば、感染症の処置）をもたらすためのその投与の状況内で有効な一定期間（急性または慢性投与および定期的または継続投与を包含する）用いられる、本書に記載の１種以上の化合物または医薬組成物の量または濃度をいう。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、１種以上のペプチドおよび薬学的に許容される担体および／またはビヒクルを含むことができる。いくつかの場合、医薬は、さらに、疾患または疾患症状の調節の達成に有効な量で１種以上のさらなる治療剤を含むことができる。
【００８６】
用語「薬学的に許容される担体または補助剤」とは、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与される場合には非毒性である、担体または補助剤をいう。
【００８７】
本発明の医薬組成物に使用することができる薬学的に許容される担体、補助剤およびビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００サクシネート、薬学的投与剤形に使用される界面活性剤、例えば、ツイーンまたは他の類似のポリマー系送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。シクロデキストリン、例えば、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンもまた、本書に記載の式によって示される化合物の送達を増強するために有利に使用することができる。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、慣用の非毒性の薬学的に許容される担体、補助剤、またはビヒクルを含有することができる。いくつかの場合、該製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸、塩基、または処方された化合物またはその送達形態の安定性を高めるための緩衝剤で調整することができる。本書で用いる場合、非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技術を包含する。
【００８９】
医薬組成物は、吸入および／または鼻投与用の溶液または粉末の形態とすることができる。かかる組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）および懸濁化剤を用いて当該技術分野で公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤はまた、例えば１,３−ブタンジオール中溶液として、非毒性の非経口上許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、マンニトール、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油（sterile, fixed oil）は、慣用的に溶媒または懸濁媒体として用いることができる。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを包含する無菌性固定油（bland fixed oil）を用いることができる。脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで、オリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容される油と同様に、注射剤の製剤に有用である。これらの油性液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、または乳剤および／または懸濁剤のような薬学的に許容される投与剤形の製剤化に一般的に使用される類似の分散剤を含有することもできる。ＴｗｅｅｎまたはＳｐａｎのような一般的に使用される他の界面活性剤、および／または、薬学的に許容される固体、液体または他の投与剤形の製造に一般的に使用される他の類似の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤も製剤化の目的で使用することができる。
【００９０】
医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、乳剤、および水性懸濁剤、分散製剤および液剤が挙げられるがこれらに限定されない経口的に許容される投与剤形で経口投与され得る。経口用の錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた典型的に添加される。カプセル形態での経口投与について、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤および／または乳剤を経口投与する場合、有効成分は、乳化剤および／または懸濁化剤と合わせて、油相に懸濁または溶解することができる。必要に応じて、ある種の甘味剤および／または矯味矯臭剤および／または着色剤を添加することができる。
【００９１】
別法として、または、加えて、医薬組成物は、鼻エアゾールまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該技術分野で知られている他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて生理食塩水で液剤として調製することができる。
【００９２】
いくつかの場合、本書に記載の１種以上のペプチドは、例えば担体タンパク質と、コンジュゲートすることができる。このようなコンジュゲート組成物は、一価または多価であり得る。例えば、コンジュゲート組成物は、本書に記載の１つのペプチドが担体タンパク質とコンジュゲートしたものを含むことができる。別法として、コンジュゲート組成物は、本書に記載の２種以上のペプチドが担体とコンジュゲートしたものを含むことができる。
【００９３】
本書で用いる場合、２つのものが互いに「コンジュゲートし」た場合、それらは、直接的または間接的な共有結合的または非共有結合的相互作用によって連結される。特定の実施態様において、該会合は共有結合的である。他の実施態様において、該会合は、非共有結合的である。非共有結合的相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが挙げられる。間接的共有結合的相互作用は、２つのものが共有結合的に連結している場合には、リンカー基を介していてもよい。
【００９４】
担体タンパク質としては、対象体における免疫原性を増大または増強させるタンパク質を挙げることができる。例示的な担体タンパク質は、当該技術分野において記載されている（例えば、Fattom et al., Infect. Immun., 58:2309-2312, 1990；Devi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7175-7179, 1991；Li et al., Infect. Immun. 57:3823-3827, 1989；Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561,1991；Szu et al., J. Exp. Med. 166:1510-1524, 1987；およびSzu et al., Infect. Immun. 62:4440-4444, 1994を参照）。ポリマー担体は、１種以上の第一および／もしくは第二アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含有する天然または合成材料であり得る。担体は水溶性であり得る。
【００９５】
処置方法
本開示は、癌の予防および／または処置のために本書に記載のペプチドのいずれかを使用する方法を包含する。本書で用いる場合、用語「処置する」または「処置すること」とは、対象体が罹患している疾患または状態を、部分的または完全に、軽減（alleviating）、阻害、寛解（ameliorating）、および／または緩和（relieving）することをいう。
【００９６】
本書に記載のペプチドは、Ｂｆｌ−１発現癌を有するヒト対象体の処置に有用であり得る。本書に記載のペプチドはまた、Ｂｆｌ−１依存癌を有するヒト対象体の処置に有用であり得る。ある特定の実施態様において、癌は、メラノーマ、白血病またはリンパ腫である。
【００９７】
一般的に、方法は、対象体を選択すること、および、例えば医薬組成物においてまたは医薬組成物として、本書におけるペプチドのうち１種以上の有効量を対象体に投与することを含み、また、癌、例えばメラノーマまたはリンパ腫の予防または処置に必要な場合には投与を繰り返すことを含んでもよく、また、経口、静脈内または局所投与することができる。対象体は、例えば該対象体がＢｆｌ−１を発現する癌を有することを決定することに基づいて、処置のために選択され得る。本開示のペプチドは、対象体の癌がＢｆｌ−１を発現するか、または対象体の癌がＢｆｌ−１に依存スルかを決定するために使用することができる。
【００９８】
特定の患者のための特定の投与量および処置計画は、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物組み合わせ（drug combination）、疾患、状態または症状の重篤度および経過、疾患、状態または症状に対する患者の素質、ならびに処置を行う医師の判断を含む種々の要因に依存する。
【００９９】
１回以上の投与、適用または投薬で、有効量を投与することができる。治療化合物の治療有効量（すなわち、有効な投与量）は、選択された治療化合物に依存する。当該組成物は、１日１回以上〜１週間に１回以上（１日おきに１回を包含する）投与することができる。当業者は、疾患または障害の重篤度、以前の処置、対象体の総体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるがこれらに限定されない特定の要因が対象体を有効に処置するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ると解する。さらにまた、本書に記載の治療化合物の治療有効量による対象体の処置は、単回の処置または一連の処置を含むことができる。例えば、有効量は、少なくとも１回で投与され得る。
【実施例】
【０１００】
実施例１：  ステープル化ＮＯＸＡペプチドの調製
ＮＯＸＡ  ＢＨ３ドメインの配列を有するペプチドにおける位置[ｉ,ｉ＋４]で非天然アミノ酸をオレフィン側鎖で置換し、次いで、ルテニウム触媒化オレフィンメタセシスを行ってＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドを得ることによって、構造的に安定化されたαヘリックスＮＯＸＡ関連ペプチドを調製した。同様にして、ＮＯＸＡ配列に欠失または置換を有する変種を作成した。多くのこのようなペプチドが図２に記載されている。当該ペプチドの蛍光誘導体は、ＭＣＬ−１およびＢｆｌ−１に対する結合親和性を評価するために蛍光偏光結合アッセイにおいて使用された。
【０１０１】
これらの研究によって、ＮＯＸＡ配列のＦ３２がより嵩高い側鎖を有するアミノ酸に変異した場合、当該結合はＭＣＬ−１よりもＢｆｌ−１に対する選択性を呈したことが明らかになった（図３Ａ）。このことは、Ｆ３２が指向されることがモデリングによって示唆されているＭＣＬ−１結合ポケットにある裂け目（cleft）はより小さいので、より嵩高い残基はＢｆｌ−１ポケットほどには許容されない、という事実に起因するかもしれない。第２群の、Ｆ３２において置換を有するＮＯＸＡ変異体を合成した。これらの変異体は、位置Ｆ３２にさまざまな嵩高い側鎖を有する。これらの変異体は、図３Ｂに記載されている。ＢＣＬ−１よりもＢＦＬ−１に対して選択性を与えるＦ３２置換としては、Ｐｈｅ(３−Ｉ)、Ｐｈｅ(４−Ｉ)およびＰｈｅ(３,４ ＣＬ2)が挙げられる。
【０１０２】
実施例２：  ジスルフィド結合形成の研究
次に、ＮＯＸＡにおけるＣｙｓ２５の影響を研究した。モデリングは、Ｂｆｌ−１およびＮＯＸＡが、当該２種類のタンパク質が結合し合う場合には近くに位置するシステイン残基を有することを示唆する。システイン残基の硫黄の間の距離は、結合タンパク質（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＭＱＰ）の予め決定されていた結晶構造によれば、３.５Åである。これとは対照的に、モデリングは、ＭＣＬ−１がそのＮＯＸＡ  ＢＨ３結合ポケットのすぐ近くにシステインを有していないことを示す。ＮＯＸＡにおけるＣｙｓ２５の標的相互作用に対する影響を調べるために、本発明者らは、Ｂｆｌ−１および種々のＢｆｌ−１システイン変異体へのＷＴ  ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよびＮＯＸＡ  Ｃ２５Ｓ  ＳＡＨＢの結合を調べた。ジスルフィド結合の形成を立証するためにインビトロコンジュゲーションアッセイを行った。タンパク質およびＮＯＸＡペプチドの全体還元（global reduction）、次いで、ＧＳＳＧのようなオキシダントの導入によって、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３ｋＤａシフトとして示されるジスルフィド結合の生成がもたらされた（図４Ａ）。ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢへＣ２５Ｓ置換を導入することによってジスルフィド結合形成の機会が無くなった場合、結合の差異は無くなり、ＮＯＸＡ  Ｃ２５Ｓ  ＳＡＨＢは、Ｂｆｌ−１−およびＭＣＬ−Ｉの両方に類似の親和性をもって結合し、これは、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ単独はＢｆｌ−１に特異性を与えず、むしろジスルフィド結合の形成がＢｆｌ−１に対してＮＯＸＡを選択的にすることができることを示している（図４Ａ）。ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１を使用する類似の実験は、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１がそれらの配列内にシステインを含有する場合でさえ、Ｂｆｌ−１だけがＮＯＸＡと共有結合を形成することを示す。これは、ＮＯＸＡ  Ｃｙｓ２５がＢｆｌ−１  Ｃｙｓ５５に対して特異的であること、およびジスルフィド結合形成が特異的であることを示す（図４Ｂ）。
【０１０３】
実施例３：  ジスルフィド結合形成の機能的影響の研究
Ｂｆｌ−１：ＮＯＸＡジスルフィド結合形成の機能的影響を、競合結合アッセイおよびリポソーム放出アッセイを用いて評価した。他のＦＩＴＣ  ＢＨ３ドメインに結合を暴露する前のＢｆｌ−１：ＮＯＸＡジスルフィド結合の前形成は、溶液結合平衡（solution binding equilibrium）に達した後でさえ、Ｂｆｌ−１結合ポケットの利用能を有意に減少させた。ＮＯＸＡ  Ｃ２５Ｓ  ＳＡＨＢまたはＢｆｌ−１  Ｃ５５Ｓ構築物の使用は、これらの阻害効果を抑制した。リポソーム放出アッセイにおいて、Ｂｆｌ−１単独は、ＢＡＸの活性化、および、それに続くリポソームにおける孔形成を阻害する。ＮＯＸＡをＢｆｌ−１と同時に添加した場合、ＢＡＸに対するＢｆｌ−１の抗アポトーシス性効果は、多少阻害された。重要なことに、リポソーム放出アッセイを行う前にＢｆｌ−１：ＮＯＸＡジスルフィド結合の形成を可能にすることは、Ｂｆｌ−１の効果をほとんど完全に抑制し、ＢＡＸ活性を陽性対照のものに戻す（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【０１０４】
実施例４：  求電子ウォーヘッドを含むようにするペプチドの修飾
Ｂｆｌ−１のＣｙｓ５５と共有結合を形成する可能性のあるさらなるＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ変異体を作成するために、本発明者らは、「ウォーヘッド」が、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢがＢｆｌ−１と結合した場合にどちらもＢｆｌ−１のＣｙｓ５５の４Å内にあると予測されるＣｙｓ２５またはＬｅｕ２１のどちらかと置き換わった多数の変異体を作成した。この種々のＮＯＸＡ  ＳＡＨＢウォーヘッド変異体は、図６に記載されている。加えて、他のＢＨ３ペプチド、ＢＩＭ１、ＢＩＭ２、ＢＡＫおよびＢＯＫのウォーヘッド変異体を設計した。これらの記載において、Ｊは、ウォーヘッドの位置を示している。
【０１０５】
図７Ａは、種々の長さの炭化水素ステープルを作成するために使用することができる変異体アミノ酸を示している。図７Ｂは、種々の長さのステープル（内部架橋）を作成するためにこの変異体アミノ酸をどのように使用することができるかを示している。
【０１０６】
Ｂｆｌ−１とのコンジュゲーションアッセイにおいて、種々のウォーヘッドＳＡＨＢを試験し、ジスルフィド結合と比較した場合、いくつかのウォーヘッドについての共有結合効率は、ウォーヘッドについて＞９０％であり、ジスルフィド結合についての約７５％と比べて非常に高かった。Ｄ−ホモプロリン、Ｌ−ホモプロリンおよびtrans−４−ジメチルアミノクロトン酸は効率が悪かった（図８Ａ）。
【０１０７】
反応性ウォーヘッドがオフターゲットシステインと実質的に反応したかどうかを評価するために、本発明者らは、イー・コリ（E. coli）ライセートまたはＢＳＡを添加した細胞培養培地の存在下で該結合を調べた。検出可能なオフターゲット結合は見出されなかった。ＮＯＸＡウォーヘッドＳＡＨＢは、Ｂｆｌ−１上のＣｙｓ５５とだけ相互作用する（図８Ｂ）。
【０１０８】
ＢＩＭおよびＢＡＸウォーヘッドＳＡＨＢもＢｆｌ−１結合効率について試験し、同じ結果が得られ、還元条件下および非還元条件下の両方でプロリンベースのウォーヘッド部分がＢｆｌ−１と効率的な共有結合を生成することができることを示した。これは、もともと、酸化条件下でのみ十分な量で存在するＢｆｌ−１とＮＯＸＡとの間で発見されたジスルフィド結合の改良である。
【０１０９】
ウォーヘッドＳＡＨＢも、システイン残基を含有するが結合ポケット内にはない他の抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーとのそれらの結合について試験した。オリジナルのＢＩＭステープル化ペプチドが無差別な（promiscuous）結合剤であり、ＮＯＸＡステープル化ペプチドがＢｆｌ−１およびＭＣＬ−１−の両方と相互作用する場合でさえ、ＮＯＸＡおよびＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢは、ＢＣＬ−ＸLまたはＭＣＬ−１の上のシステインと相互作用しなかった（図９Ａ）。これらの結果は、イー・コリ（E. coli）ライセートイムノブロット（図９Ｂ）、およびＢＳＡ（３５システイン残基）を含有する細胞培地においても見られた（図９Ｃ）。全体として、ＮＯＸＡおよびＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢは、効率がプロトタイプシステインよりもはるかに高いＢｆｌ−１特異的結合剤である。
【０１１０】
実施例１〜４において使用した方法
固相ペプチド合成法：  ペプチドおよびそれらのステープル化誘導体を合成するために、Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成法を使用した。種々のステープル長さを達成するために、α−メチル,α−アルケニルアミノ酸は、２個、３個または６個の残基に隣接して使用された。Ｒ５残基を位置ｉで取り込み、Ｓ５を位置ｉ＋３で取り込み、一方、２つのＳ５残基を位置ｉおよびｉ＋４で使用し、Ｒ８を位置ｉで使用し、Ｓ５を位置ｉ＋７で使用した［２９］。ステープリング反応のために、ジクロロエタンに溶解したＧｒｕｂｂｓ第１世代ルテニウム触媒を、依然として樹脂上にある該ペプチドに添加した。最大転換を確実にするために、ステープリングを３〜５回行った。一旦ステープル化したら、ペプチドを、トリフルオロ酢酸を使用して樹脂から切断し、次いで、ヘキサン：エーテル（１：１）混合物を使用して沈殿させ、その後、それらを風乾し、ＬＣ−ＭＳを使用して精製した。本発明者らは、精製されたペプチドの量を正確に決定するため、および正しい配列が作成されたか確認するためにアミノ酸分析を行った。
【０１１１】
蛍光偏光アッセイ：  抗アポトーシス性タンパク質に対するステープル化ペプチドの結合親和性を決定するために、溶液−状態平衡結合アッセイを使用した。タンパク質を１μｍから段階希釈し、次いで、ＦＩＴＣ標識ＳＡＨＢと合わせ、５分でマイクロプレートリーダーで偏光を測定した。次いで、本発明者らは、用量反応曲線の非線形回帰分析によって解離定数（ＫD）を算出した。
【０１１２】
Ｂｆｌ−１：ＮＯＸＡコンジュゲーションアッセイ：  非還元環境下におけるジスルフィド結合形成について試験するためにコンジュゲーションアッセイを開発した。ＤＴＴの存在下でモル比３：１のＦＩＴＣ−ステープル化ペプチド：タンパク質を合わせ、次いで、希釈し、１.２モル過剰のＧＳＳＧと一緒にインキュベートした。次に、試料に対して非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛍光についてスキャンし、次いで、クーマシーで染色した。
【０１１３】
リポソーム放出アッセイ：  蛍光色素ＡＮＴＳ（８−アミノナフタレン−１,３,６−トリスルホン酸、二ナトリウム塩）およびクエンチャーＤＰＸ（ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミド）をカプセル化した、ミトコンドリア外膜に似た脂質組成物を有する大型単層ベシクル（ＬＵＶ）を作成した。ＢＡＸのＢｆｌ−１誘導阻害の測定のために、Ｂｆｌ−１、ＢＡＸ、ｔＢｉｄアクチベーターおよびリポソームを合わせた。共有結合したＢｆｌ−１：ＮＯＸＡのＢＡＸ活性化に対する効果を試験するために、Ｂｆｌ−１およびＮＯＸＡ  ＳＡＨＢを前記のとおりプレインキュベートし、次いで、設定した濃度で使用した。それぞれ３５５ｎｍおよび５２０ｎｍの励起波長および発光波長をもって、Ｍ１０００Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダー（Tecan）を用いて１２０分間にわたって、ＤＰＸ解離（Ｆ）に起因するＡＮＴＳ放出および脱クエンチングを測定した。最大放出（Ｆ１００）を決定するために、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いたリポソーム溶解後にプレートを読み取った。ＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出率を[(Ｆ−Ｆ０)／(Ｆ１００−Ｆ０)]×１００として算出した。
【０１１４】
Ｂｆｌ−１：  ウォーヘッドＳＡＨＢコンジュゲーションアッセイ
１０μＭ  Ｂｆｌ−１をＤＴＴで還元し、次いで、モル比３：１のウォーヘッドＳＡＨＢと一緒にインキュベートした。次いで、試料をローディング染料と合わせ、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーで染色した。試験した全ての抗アポトーシスタンパク質に対して同じセットアップを用いた。
【０１１５】
イー・コリ（E. coli）ライセートＷＢ
９×Ｈｉｓタグ化Ｂｆｌ−１またはＧＳＴ−ＢＣＬ−ＸLを過剰発現させるイー・コリ（E. coli）ライセートを、ＲＴで３０分間、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、次いで、ＲＴで２時間、５０μＭビオチン化ＢＩＭウォーヘッドＳＡＨＢと合わせた。次いで、当該試料に対して４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、移動させ、α−ＢＣＬ２Ａ１（Abcam  １２５２５９）およびα−ＢＣＬ−ｘS/L（Ｓ−１８）（Santa Cruz Biotechnology）を用いてブロットした。
【０１１６】
実施例５：  ＮＯＸＡ  ＢＨ３およびＢＦＬ−１の結合界面におけるシステイン間の共有結合反応
抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質は、表面の溝においてアポトーシス促進性メンバーの決定的なαヘリックスＢＨ３ドメインを捕捉することによって細胞死を遮断する。癌細胞は、一連の抗アポトーシス性メンバーを過剰発現させることによってこの生存メカニズムを乗っ取り、化学療法的処置に抵抗する恐るべきアポトーシス遮断を開始する。抗アポトーシス性タンパク質のＢＨ３結合ポケットへの薬物送達（drugging）は、最優先の目標となっている。
【０１１７】
ＢＨ３オンリータンパク質ＮＯＸＡは、抗アポトーシス性ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１との相互作用に対して天然の二重選択性を呈し、したがって、そのＢＨ３配列は、ＢＦＬ−１阻害剤を開発するための出発点として選択された。ＮＯＸＡ  ＢＨ３と複合したヒトＢＦＬ−１ΔＣ（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＭＱＰ）の結晶構造の研究において、本発明者らは、ジスルフィド結合形成に適合する、３.９Åの距離でのＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ５５へのＮＯＸＡ  Ｃ２５の近接性を観察した（図１０Ａ）。他の抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーはそのＢＨ３結合ポケット内にシステインを含有していないので、本発明者らは、ステープル化ＢＨ３ペプチドによるＣ５５標的化が、選択的共有結合反応性を有するＢＦＬ−１阻害剤を産生する可能性があると推論した。本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、まず、結合研究のために、ステープル化ＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチド、およびそれらの天然システイン（ＮＯＸＡ：Ｃ２５、ＢＦＬ−１：Ｃ４、Ｃ１９、Ｃ５５）および一連のセリン変異体（ＮＯＸＡ：Ｃ２５Ｓ、ＢＦＬ−１：Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ、Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓ）を有する組換えＢＦＬ−１ΔＣ構築物を作成した。ＮＯＸＡ  ＢＨ３（ａａ１９−４３）の後にモデル化されたＢＣＬ−２ドメイン（ＳＡＨＢ）の安定化αヘリックスについては、本発明者らは、本発明者らの古典的な「Ａ」位置（Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004)）（Ｒ３１およびＫ３５の置換）にｉ,ｉ＋４全炭化水素ステープルを配置し、バイオレイヤー・インターフェロメトリー分析のためにＰＥＧ−ビオチンでＮ末端を誘導した。本発明者らは、ペプチド／タンパク質対が全て４６〜１６５ｎＭの範囲内の解離定数を示したことを見出した（図１０Ｂ、図１１）。かくして、セリン変異誘発は、それ自体としては、結合親和性に対して有害な影響を及ぼさないと思われ、もしあれば、ＢＦＬ−１相互作用を３.５倍まで多少増強した。
【０１１８】
次いで、本発明者らは、ＮＯＸＡ  Ｃ２５およびＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ５５の間のジスルフィド結合形成が生化学的に実行可能であったかを決定しようとした。実際に、ＤＴＴ（１０ｍＭ）還元、その後のＧＳＳＧ酸化（１２ｍＭ）の後に、本発明者らは、変性および非還元条件下でのゲル電気泳動およびクーマシー染色法によって評価されるように、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAと一緒にインキュベートした場合に野生型ＢＦＬ−１ΔＣの分子量のシフトを観察したが、そのＣ２５Ｓ変異体はそうではなかった（図１０Ｃ、上部）。本発明者らのＦＩＴＣ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAペプチドの使用は、ＦＩＴＣスキャンによって検出されるように、ＢＦＬ−１タンパク質が野生型によって標識されていたがＣ２５Ｓ変異体ペプチドによって標識されていなかったという確認を提供した（図１０Ｃ、下部）。同様に、本発明者らは、分子量シフト（クーマシー染色）および（Ｃ５５のみが存在している）ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ構築物のＦＩＴＣ標識化の両方によって示されるように、ＮＯＸＡ  Ｃ２５はＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ５５とジスルフィド結合を形成したが、Ｃ５５を欠いているＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓ構築物との付加物を形成しなかったと決定した（図１０Ｃ）。システイン特異性の尺度として、本発明者らは、どちらもシステインを含有する（ＭＣＬ−１  Ｃ２８６、ＢＣＬ−ＸＬ  Ｃ１５１）ＭＣＬ−１ΔＮΔＣおよびＢＣＬ−ＸLΔＣを用いて実験を繰り返し、酸化条件下でＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAとインキュベートした後に分子量シフトまたはＦＩＴＣ標識化を観察しなかった（図１０Ｄ）。
【０１１９】
これらのデータは、ＮＯＸＡ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１界面における併置されたシステインが選択的にジスルフィド結合を形成することを示している。
【０１２０】
実施例６：  求電子ウォーヘッドを担持するステープル化ＢＨ３ペプチドの選択的ＢＦＬ−１反応性
ジスルフィド結合形成に関与するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAおよびＢＦＬ−１ΔＣの能力は、ＢＦＬ−１のＢＨ３結合ポケットのような重要な調節表面に局在するシステインの共有結合標的化のためのステープル化ペプチドを開発する新しい機会を示唆した。タンパク質標的阻害の基礎としての細胞内ジスルフィド結合形成に依存することは、扱いやすい薬理学的ストラテジーではないため、本発明者らは、代わりに、反応性アクリルアミド部分を担持する非天然アミノ酸の挿入のための可能な部位を調べ、ＮＯＸＡ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＭＱＰ）の結晶構造に基づいて、ＮＯＸＡ  Ｌ２１がＮＯＸＡ  Ｃ２５よりもＢＦＬ−１  Ｃ５５にさらに近接している（それぞれ、３.３対３.９Å）ことを同定した（図１２Ａ、上部）。より無差別なＢＩＭ  ＢＨ３配列の場合、ＢＩＭ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＶＭ６）の結晶構造に基づいて、Ｗ１４７は、ＢＦＬ−１  Ｃ５５（３.６Å）への最適な隣接を明示する（図１２Ａ、下部）。かくして、本発明者らは、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢAを、それぞれ位置Ｌ２１およびＷ１４７で、異なるアクリルアミド種を担持する一連の非天然アミノ酸でキャップした（図１２Ｂ）。
【０１２１】
求電子「ウォーヘッド」担持ＮＯＸＡ（ａａ２１−４３）およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA（ａａ１４７−１６６）パネルの反応性を比較すると、本発明者らは、還元および変性ゲル電気泳動およびクーマシー染色法によって評価されるように、ＢＦＬ−１の、ウォーヘッド１、３、５および８を担持するＳＡＨＢのより重いコンジュゲート付加物への効率的な変換を観察した（図１２Ｃ）。本発明者らは、最も有効なウォーヘッドの１つであるＤ−ニペコチン酸（図１２Ｂの３）を担持するＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢを特異性試験に進めた。
【０１２２】
まず、本発明者らは、ＢＦＬ−１  Ｃ５５に対するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３の選択性を試験した。ＳＡＨＢA−３化合物を、全ての天然システインを担持するＢＦＬ−１構築物（ＢＦＬ−１  ＷＴ）、Ｃ５５のみを担持するＢＦＬ−１構築物（ＢＦＬ−１  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ）、Ｃ４およびＣ１９のみを担持するＢＦＬ−１構築物（ＢＦＬ−１  Ｃ５５Ｓ）、またはシステインを担持しないＢＦＬ−１構築物（ＢＦＬ−１  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓ）と一緒にインキュベートした後、本発明者らは、ＢＨ３結合ポケットのＣ５５に対するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３のシステイン選択性を明確に示すＷＴおよびＢＦＬ−１  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ構築物との排他的な反応性を観察した（図１２Ｄ）。
【０１２３】
化合物特異性のさらなる尺度として、本発明者らは、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣおよびＢＣＬ−ＸLΔＣを用いて実験を繰り返し、これらの抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質中にシステインが存在するにもかかわらず、非特異的反応性を観察しなかった（図１２Ｅ）。
【０１２４】
かくして、本発明者らは、ステープル化ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドにシステイン反応性ウォーヘッドを導入することにより、ＢＦＬ−１  ＢＨ３結合溝の効率的かつ選択的な共有結合的標的化が生じることを見出した。
【０１２５】
本発明者らは、次に、ＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢのＢＦＬ−１  Ｃ５５反応性薬剤への変換が、抗アポトーシス性タンパク質混合物に関連して非共有結合的ＳＡＨＢ相互作用および共有結合的ＳＡＨＢ相互作用のバランスにどのように影響を及ぼすかを調べた。まず、本発明者らは、ゲル電気泳動および銀染色により容易に同定され得るように、異なるＮ末端タグ（それぞれ、ＧＳＴ、タグなし、およびＨｉｓ）を有する組換えＭＣＬ−１ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−ＸLΔＣおよびＢＦＬ−１ΔＣタンパク質を生成した（図１３Ａ−Ｂ）。ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAまたはＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３（各成分について１：１：１：１）を用いた抗アポトーシス性混合物のインキュベーション後には、本発明者らは、選択的な共有結合反応に対応するＢＦＬ−１ΔＣの分子量のシフトを見るだけである（図１３Ａ、左）。ストレプトアビジン（ＳＡ）のプルダウンは、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAによるＭＣＬ−１ΔＮΔＣの顕著な非共有結合捕獲を明らかにしたが、共有結合的ＢＦＬ−１ΔＣコンジュゲーションの結果として比較的少ないＭＣＬ−１ΔＮΔＣおよび顕著に多いＢＦＬ−１ΔＣ会合を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３の相互作用傾向の顕著なシフトを示した（図１３Ａ、右）。ＢＩＭ  ＢＨ３の広範囲な抗アポトーシス性結合スペクトルと一致して、対応するＢＩＭ  ＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣおよびＢＦＬ−１ΔＣに加えてＢＣＬ−ＸLΔＣを会合したが、共有結合的コンジュゲーションの結果として、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAと比較してＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３についてのＢＦＬ−１ΔＣ標的化傾向の増加が再度観察された（図１３Ｂ）。
【０１２６】
かくして、ＢＦＬ−１ΔＣとの選択的共有結合反応の能力は、ＳＡＨＢ相互作用の競合バランスをＢＦＬ−１に向けてシフトすることができる。
【０１２７】
実施例７：  リポソーム、ライセートおよび細胞におけるＢＦＬ−１の標的遮断
ＢＦＬ−１  ＢＨ３結合ポケットの共有結合的標的化の機能的結果を決定するために、本発明者らは、直接ＢＡＸ活性化に対するＢＦＬ−１の影響をモニターするために設計されたリポソーム放出アッセイを行った。本発明者らは、ＡＮＴＳ／ＤＰＸでカプセル化された大型単層ベシクル（ＬＵＫ）を生成し、ＢＡＸ媒介膜ポレーション後にフルオロフォアのリポソーム放出をモニターした。ＢＡＸ単独はリポソームに対して影響を及ぼさなかったが、直接的アクチベーターＢＨ３オンリータンパク質ｔＢＩＤの添加は、ＢＦＬ−１ΔＣによって抑制されたプロセスである時間応答性ＢＡＸ媒介放出を引き起こした（図１３Ｃ−Ｅ）。しかしながら、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３コンジュゲートＢＦＬ−１ΔＣの添加後に（図１３Ｃ）、ＢＦＬ−１の阻害機能は失われた（図１３Ｄ−Ｅ）。これらのデータは、ＢＦＬ−１のＢＨ３結合ポケットをＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３により共有結合的に「栓をすること（plugging）」がその抗アポトーシス性機能を不可逆的に中和することを強調している。
【０１２８】
本発明者らは、次に、本発明者らの共有結合的ステープル化ペプチド阻害剤がより複雑なタンパク質混合物においてＢＦＬ−１と選択的に反応することができるかどうかを試験しようとした。Ｃ５５誘導体化を特異的に追跡するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞においてＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを一時的に発現させ、２４時間後、求電子ウォーヘッドを含有していたかまたは含有していなかったＣ末端Ｌｙｓ−ビオチン誘導体化ＳＡＨＢ構築物による架橋分析のために細胞ライセートを収穫した。抗ＨＡウエスタン分析は、Ｃ５５でＢＦＬ−１タンパク質へのＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３の両方の共有結合的組み込みと一致して、ウォーヘッド担持ＳＡＨＢについてのみ顕著な分子量シフトを明らかにした（図１４Ａ、上部）。観察された分子量シフトがＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３組み込みを反映していたことを確認するために、本発明者らはビオチンウエスタン分析を行った。本発明者らは、シフトされたＨＡ−ＢＦＬ−１バンドが実際にビオチン免疫反応性であり、重要なことに、２９３Ｔライセートからの他の電気泳動タンパク質との非特異的反応性が皆無かそれに近いものであったことを見出した（図１４Ａ、下部）。
【０１２９】
本発明者らのストラテジーを細胞試験に進めるために、本発明者らは、まず、本発明者らのビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３構築物の細胞取り込みの可能性を評価した。本発明者らは、２０μＭの化合物と一緒に２９３Ｔ細胞を２４時間インキュベートし、トリプシン処理し、当該細胞を洗浄して付着ペプチドを除去し、次いで、抗ビオチンウエスタン分析のためのライセートを生成した。本発明者らは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３を用いて細胞試験を進めた（図１５Ａ）。本発明者らはさらに、トランスフェクション条件自体がＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３の細胞取り込みに独立して影響を及ぼさなかったことを確認した（図１５Ｂ）。ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA（ａａ１４７−１６６）またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（２０μＭ、６時間）を用いて、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを一時的に過剰発現させている２９３Ｔ細胞を処理し、次いで、上記のとおり生成したライセートを抗ＨＡ免疫沈降に供した。インプットのビオチンウエスタン分析により、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３で処理された細胞の変性および還元された電気泳動ライセート中にのみ、単一の顕著なタンパク質バンドが明らかになった（図１５Ｂ、左）。免疫沈降物を抗ＨＡウエスタン分析に供したところ、ＢＦＬ−１ダブレットが明らかになり、ビオチンウエスタン分析は、上のバンドが実際にビオチン化ＨＡ−ＢＦＬ−１に相当することを確認した（図１５Ｂ、右）。
【０１３０】
ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３で細胞を処理した後に細胞内ＢＦＬ−１の特異的標識の実行可能性を実証したので、本発明者らは、次に、ＢＦＬ−１複合体を破壊するＢＩＭ  ＳＡＨＢの能力に対する共有結合的会合対非共有結合的会合の相対的な影響を調べた。この実験のために、本発明者らは、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来のライセートにｔＢＩＤを加え、当該混合物をビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３と一緒にインキュベートし、抗ＨＡ免疫沈降を行い、ＨＡ、ｔＢＩＤおよびビオチンについてブロットした。著しくは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAは、ＨＡ−ＢＦＬ−１結合に対してｔＢＩＤと競合することができなかったが、ウォーヘッド担持ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３構築物は、高分子量種への完全なタンパク質変換およびｔＢＩＤ共免疫沈降のほぼ全阻害によって例示されるように、ＨＡ−ＢＦＬ−１を共有結合的に捕捉した（図１４Ｃ）。そのＢＨ３結合ポケットにシステインを担持していないＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１を一時的に発現する２９３Ｔ細胞由来のライセートを用いて実験を繰り返した場合、両方のＢＩＭ  ＳＡＨＢAペプチドは、ｔＢＩＤ／ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１共免疫沈降の非共有結合的破壊因子として同等に効果的であった（図１４Ｄ）。かくして、ウォーヘッドを導入し、ステープル化ペプチド共有結合反応を可能にすることによって、ＢＩＭ  ＳＡＨＢAのＢＦＬ−１標的化効果を選択的に増強することができる。
【０１３１】
最後に、本発明者らは、細胞におけるＢＦＬ−１の共有結合的標的化の動力学および効率を調べるために、対応する非ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA構築物に目を向けた。ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを一時的に過剰発現するＢＩＭ  ＳＡＨＢA処理およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３処理２９３Ｔ細胞を比較すると、本発明者らは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３の暴露から２時間以内に抗ＨＡウエスタン分析によってＢＦＬ−１の個別の分子量シフトを観察し、１２時間の評価期間にわたって架橋種が漸増した（図１４Ｅ）。
【０１３２】
まとめると、これらのデータは、求電子ウォーヘッドを担持しているステープル化ペプチドの、処理されたライセートおよび細胞においてＢＦＬ−１を共有結合的に標的とする能力を強調している。
【０１３３】
実施例８：  ＢＦＬ−１発現メラノーマにおけるシステイン反応性ＢＩＭ  ＳＡＨＢAによるアポトーシスの優先的活性化
ＢＦＬ−１は、最近、症例の約３０％において観察される遺伝子増幅およびメラノーマオンコジーンであるＭＩＴＦ転写因子によって媒介されるＢＦＬ−１過剰発現のために、ヒトメラノーマの細胞系列特異的な要因（lineage-specific driver）に関係しているとされている（Haq et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110:4321-4326 (2013)）。かくして、ＢＦＬ−１発現によって駆り立てられる癌細胞における共有結合的ＢＦＬ−１標的化の機能的影響を調べるために、本発明者らは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３と、Ａ３７５Ｐメラノーマ細胞におけるＢＣＬ−２ファミリータンパク質の非共有結合的ステープル化ペプチドモジュレーターであるＢＩＭ  ＳＡＨＢA1との比較効果を試験した。本発明者らは、まず、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1およびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３が、処理したＡ３７５Ｐ細胞、および本発明者らが以前にＦＩＴＣ標識ステープル化ペプチドの比較細胞浸透をベンチマークするために使用した（Bird et al., Biophysical determinants for cellular uptake of hydrocarbon-stapled peptide helices. Nat Chem Biol in press. 2016）マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）のＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（ＩＸＭ）高含量落射蛍光顕微鏡によって定量化されたように、同等の細胞取り込みを有することを確認した（データは示さない）。ＢＩＭ  ＳＡＨＢの取り込みのメカニズムは、ミクロピノサイトーシスと一致しており、４時間目の処理したＡ３７５ＰおよびＭＥＦ細胞の落射蛍光顕微鏡パターンによって証明されている（データは示さない）。
【０１３４】
ＢＩＭ  ＳＡＨＢにＡ３７５Ｐ細胞を暴露した後、本発明者らは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1と比較して、ウォーヘッド担持ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３の経時的な細胞毒性の有意な増強を観察した（図１６Ａ）。本発明者らは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢが細胞に対する膜溶解効果を有しないことをＬＤＨ放出アッセイによって確認した（図１６Ｂ）。観察された細胞毒性は、代わりに、時間応答性カスパーゼ３／７活性化（図１６Ｃ）およびミトコンドリアチトクロムｃ放出（図１６Ｄ）によって反映されるように、ミトコンドリアアポトーシス誘導と一致した。その細胞生存率のより顕著な低下に従って、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３処理は、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1について観察されたものと比べて高いレベルのカスパーゼ３／７活性化およびチトクロムｃ放出を誘導した（図１６Ｃ−Ｄ）。Ａ３７５Ｐ細胞の増強された感受性をＢＦＬ−１の優先的なＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３会合に機械的に関連付けるために、本発明者らは、Ａ３７５Ｐライセートを対応するビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢと一緒にインキュベートした後、ＳＡプルダウンおよび抗ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１ウエスタン分析を行った。ＢＩＭ  ＳＡＨＢAおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３は、組換え抗アポトーシス性タンパク質との競合相互作用に関連して前に観察されたように、抗アポトーシス性ＭＣＬ−１との同等の結合を示したが（図１３Ｂ）、ウォーヘッド担持構築物は、再度、ＢＦＬ−１の会合の著しい増加を示した（図１７Ａ）。ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３が実際に天然ミトコンドリアＢＦＬ−１を標識することができることを確認するために、本発明者らは、Ａ３７５Ｐ細胞から精製したミトコンドリアをビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢと一緒にインキュベートし、ミトコンドリアタンパク質のＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３選択性ビオチン化を免疫反応性ＢＦＬ−１と同一の分子量で観察した（図１７Ｂ）。また、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３で処理されたＡ３７５Ｐ細胞のライブ共焦点顕微鏡画像法により、形態学的に正常なＡ３７５Ｐ細胞（図１７Ｃ）と、細胞収縮、核凝縮および膜ブレブ形成によって反映されるようなアポトーシス誘導を受けているもの（図１７Ｄ）との両方において、ＢＦＬ−１活性の生理学的部位であるミトコンドリアでのステープル化ペプチドの顕著な細胞内局在が明らかになった。
【０１３５】
重要なことに、本発明者らは、２つのさらなるＢＦＬ−１発現メラノーマ細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８）においてＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３についての細胞毒性およびカスパーゼ３／７活性化の比較増加を観察したが（データは示さない）、ＢＦＬ−１発現を欠くかまたは維持しているが、代替オンコジーンメカニズム（例えば、Ａ５４９、ＭＣＦ７、Ｈ９２９）によって駆動される非メラノーマ株におけるこの現象の証拠はない（データは示さない）。
【０１３６】
まとめると、これらのデータは、天然ＢＦＬ−１のより効果的な会合およびアポトーシス誘発のより大きな有効性によって反映されるように、ＢＦＬ−１依存癌に関連して、ウォーヘッド担持ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３のメカニズム的な利点を強調している。かくして、ＢＦＬ−１を選択的に捕捉するためにシステイン反応性標的化ストラテジーを利用することに加えて、ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３のような共有結合的ＢＦＬ−１阻害剤に対する高感受性もまた、ヒト癌におけるＢＦＬ−１依存性を同定するための診断アプローチを提供する。
【０１３７】
実施例５〜８で使用した方法
ステープル化ペプチド合成：  本発明者らが従前に報告した方法（Bird et al., Methods Enzymol., 446:369-386 (2008); Bird et al., Curr. Protoc. Chem. Biol., 3:99-117 (2011)）を用いて、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３ドメインに対応する炭化水素−ステープル化ペプチド、およびアセチル、ＦＩＴＣ−βＡｌａ、ビオチン−ＰＥＧもしくは求電子ウォーヘッドによってＮ末端誘導体化されたもの、またはＬｙｓ−ビオチンによってＣ末端誘導体化されたものを合成し、精製し、定量化した。アクリルアミド担持ペプチドは、アクリル酸またはtrans−クロトン酸を当該ペプチドＮ末端とカップリングさせることによって、または標準的なＦｍｏｃカップリング法および脱保護法を用いてまずＦｍｏｃ保護環状アミノ酸（Chem-Impex International）とカップリングさせた後にＦｍｏｃ脱保護およびアクリル酸によるアシル化を行うことによって、合成した。アクリルアミド担持ペプチドのＦＩＴＣ誘導体化は以下に詳述する。ステープル化ペプチド組成物、ならびに数値によるそれらの観察された質量および用途を図１８に示す。
【０１３８】
アクリルアミド担持ステープル化ペプチドのＦＩＴＣ誘導体化：  シスタミン二塩酸（１当量）を、ＤＩＥＡ  ２７０μＬ（３当量）を伴うＤＭＳＯ  １０ｍＬに溶解し、次いで、ＦＩＴＣ  ４００ｍｇ（２当量）を添加した。該反応をＬＣＭＳによってモニターし、一夜撹拌して反応が完了した後、水１ｍＬ中２当量のＴＣＥＰを添加した。還元生成物を、４０ｇ  Ｃ１８逆相カラムを装備したＩｓｃｏ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製システムにて水−アセトニトリル勾配液を用いて精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥させて、ＦＩＴＣ標識システアミン３８５ｍｇを得た。続いて、アクリルアミド含有ステープル化ペプチドとのコンジュゲーション反応により、予想通り、ｐＨ依存性であることが判明し、ｐＨ６およびｐＨ８では反応は生じなかったが、ｐＨ１０のホウ酸バッファー中での反応は、１ｍＭ  ＤＭＳＯペプチドストック、ＦＩＴＣ−システアミンの５ｍＭ  ＤＭＳＯストック、および０.０５Ｍホウ酸バッファーの１：１：３溶液中での一夜のインキュベーション後に完了した。次いで、ＦＩＴＣ標識ペプチド生成物であるＦＩＴＣ−Ｃｙｓｔｅ−３をＨＰＬＣによって精製した。
【０１３９】
組換えタンパク質発現および精製：  組換え抗アポトーシス性タンパク質、ＢＦＬ−１ΔＣ（ａａ１−１５３）、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（ａａ１７０−３２７）およびＢＣＬ−ＸLΔＣ（ａａ１−２１２）をｐＥＴ１９ｂ（Novagen；ＢＦＬ−１ΔＣ）またはｐＧＥＸ−４Ｔ−１（GE Healthcare；ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−ＸLΔＣ）発現ベクターにクローニングし、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させ、記載されていて（Pitter et al., Methods Enzymol., 446, 387-408 (2008)）以下に詳述するような連続アフィニティおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０１４０】
ＢＦＬ−１ΔＣ（ａａ１−１５３）をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ１９ｂ発現ベクター（Novagen）にクローニングした後、ＤＮＡの配列決定を行って構築物を確認した。ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発によって、システインからセリンへの変異を有する構築物を作成した（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Stratagene）。形質変換エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬＯＢＳＴＲ（Andersen et al., 2013）（＃ＥＣ１００１、Kerafast）をアンピシリン含有Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中にて培養し、０.５ｍＭ  イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて１６℃で一夜タンパク質発現を誘発した。細菌ペレットを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２つの完全プロテアーゼ阻害剤錠剤（Roche）に再懸濁し、次いで、顕微溶液化し（Ｍ−１１０Ｌ、Microfluidics）、４５,０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen）カラムに通した。該カラムを、５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭイミダゾールを含有する平衡化バッファー２５ｍＬで連続して洗浄し、次いで、Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣを３００ｍＭイミダゾールを含有する平衡化バッファーで溶離した。Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣを含有する画分を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して４℃で透析し、次いで、濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−７５（GE Healthcare）ゲル濾過カラムに負荷した。当該カラムを平衡化バッファー３０ｍＬで洗浄し、Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣを含有する画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動／クーマシー染色ならびに抗ＢＦＬ−１（Abcam、＃１２５２５９）および抗Ｈｉｓ（Abcam、＃１８１８４）ウエスタンブロッティングの両方によって分析した。次いで、精製タンパク質を濃縮し、液体窒素を用いて急速冷凍し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４１】
ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（ａａ１７０−３２７）およびＢＣＬ−ＸＬΔＣ（ａａ１−２１２）構築物をｐＧＥＸ−４Ｔ−１（GE Healthcare）にクローニングした後、ＤＮＡの配列決定を行って構築物を確認した。形質転換エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Sigma-Aldrich）をアンピシリン含有ＬＢ中にて培養し、０.５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘発し、３７℃で４時間増殖させた。細菌ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０.１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および完全プロテアーゼ阻害剤錠剤（Roche）に再懸濁し、次いで、顕微溶液化し、４５,０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を、０.１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで平衡化したグルタチオンセファロース（GE Healthcare）カラムに通した。当該カラムを、２５ｍＬの０.１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳおよびＰＢＳで連続して洗浄し、次いで、ＧＳＴをトロンビン（Sigma）で２５℃で一夜樹脂上切断した。ＧＳＴ不含タンパク質をＰＢＳで溶離し、濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−７５（GE Healthcare）ゲル濾過カラムに負荷した。当該カラムを平衡化バッファー３０ｍＬで洗浄し、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣまたはＢＣＬ−ＸＬΔＣを含有する画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびクーマシー染色法によって分析した。ＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ精製のために、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１０ｍＭ  ＧＳＨを用いてタンパク質をカラムから溶離し、濃縮し、上記のようにＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−７５ゲル濾過カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製タンパク質を濃縮し、液体窒素を用いて急速凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１４２】
バイオレイヤーインターフェロメトリー：  ＢＦＬ−１ΔＣとのＮＯＸＡペプチド相互作用の結合分析をＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４システム（Fortebio, Menlo Park, CA）にて３０℃で行った。スーパーストレプトアビジン（ＳＳＡ）チップを１×キネティックバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７.４、０.０１％ＢＳＡ、０.００２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で予め湿らせ、次いで、Ｎ末端ビオチン−ＰＥＧリンカーを担持するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ（１０μｇ／ｍＬ）とコンジュゲートした。２μｇ／ｍＬビオシチンと一緒にインキュベートすることによって過剰のストレプトアビジンをクエンチした。次いで、チップをキネティックバッファーで洗浄し、ＢＦＬ−１ΔＣの段階希釈液に１０分間浸漬して、会合速度を測定し、その後、キネティックバッファー中にて１５分間インキュベートして、解離速度を測定した。Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン９.０を用いて解離定数を算出した。
【０１４３】
インビトロ共有結合的コンジュゲーションアッセイ：  ＢＦＬ−１ΔＣ構築物（４０μＭ）を、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAまたはＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA  Ｃ２５Ｓ（１２０μＭ）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の１０ｍＭ  ＤＴＴ（最終体積、５μＬ）と合わせ、次いで、暗所にて室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。還元環境下でのこのインキュベーション後、当該混合物を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＧＳＳＧで５倍希釈し、暗所にて室温でさらに３０分間インキュベートした。次いで、当該試料を４×ＤＴＴ不含ローディングバッファー中にて煮沸し、１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動にかけた。当該ゲルを水ですすぎ、ＦＩＴＣスキャン（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００、GE Healthcare）に供し、次いで、クーマシー染色した。
【０１４４】
ウォーヘッド担持ＳＡＨＢのために、Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の１０ｍＭ  ＤＴＴで室温にて３０分間前処理し（最終体積、９.５μＬ）、次いで、室温でのさらなる２時間のインキュベーションのために、モル比１０：１のウォーヘッド１−８を担持するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢAペプチド（最終体積、１０μＬ）と合わせた。ゲル電気泳動法およびクーマシー染色のためのプロセシングは上記のとおり行った。
【０１４５】
ストレプトアビジンプルダウン：  組換えＨｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、ＢＣＬ−ＸLΔＣ（タグなし）およびＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（各々１μＭ）を合わせ、ＰＢＳ中３ｍＭのＤＴＴで室温にて３０分間還元し、次いで、１μＭのビオチン化ＳＡＨＢA、ＳＡＨＢA−３またはビヒクルと一緒に室温で４時間インキュベートした。次いで、当該混合物を、ＰＢＳ洗浄した大容量ＳＡアガロース（Thermo Fisher Pierce）と合わせ、回転させながら室温で２時間インキュベートした。ビーズを３０００ｒｐｍで遠心分離し、ＮＰ−４０溶解バッファー（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、１０ｍｇ／ｍＬビオチンを含有する１０％ＳＤＳ中にて沸騰させることによって、結合したタンパク質を溶離した。インプット（１０％）および溶離液を１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動にかけ、次いで、銀染色および画像処理を行った。
【０１４６】
リポソーム放出アッセイ：  以下に詳述するように、ＢＦＬ−１ΔＣ（１０μＭ）をＤＴＴ（２０ｍＭ）で４℃にて３０分間処理した後にＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３ペプチドと一緒に１.２×、０.７５×、および０.５×のペプチド：タンパク質モル比で各々４℃ｎいて１時間連続インキュベートすることによって調製したＳＡＨＢA−３／ＢＦＬ−１ΔＣコンジュゲートを用いて、リポソーム放出アッセイを行った。
【０１４７】
カプセル化されたＡＮＴＳおよびＤＰＸを有する大型単層ベシクル（ＬＵＶ）を作成し、記載されたように（Leshchiner et al., 2013;Lovell et al., 2008）精製した。３８４ウェルプレート中にて、ＢＡＸ（４００ｎＭ）、ｔＢＩＤ（４０ｎＭ）、およびＢＦＬ−１ΔＣまたはＳＡＨＢA−３／ＢＦＬ−１ΔＣコンジュゲート（１.５μＭ）の所定の組み合わせをリポソーム（５μＬ）に添加し（最終体積、３０μＬ）、放出したフルオロフォアを、それぞれ３５５ｎｍおよび５２０ｎｍの励起波長および発光波長でＭ１０００  Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダー（Tecan）を用いて１２０分間にわたって測定した。ＢＦＬ−１ΔＣ（１０μＭ）をＤＴＴ（２０ｍＭ）で４℃にて３０分間処理した後、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３ペプチドと一緒に１.２×、０.７５×、および０.５×のペプチド：タンパク質モル比で各々４℃にて１時間連続インキュベートすることによってＳＡＨＢA−３／ＢＦＬ−１ΔＣコンジュゲートを調製した。１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル電気泳動およびクーマシー染色によって、コンジュゲーション効率を確認した。次いで、タンパク質コンジュゲートを７５μＭに濃縮し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−７５（GE Healthcare）ゲル濾過カラムに負荷し、平衡化バッファー３０ｍＬで洗浄し、画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、リポソームアッセイにおいて新鮮に用いた。ＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出パーセントを[(Ｆ−Ｆ０)／(Ｆ１００−Ｆ０)]×１００として算出した（ここで、Ｆ０は、０時間目のベースライン蛍光であり、Ｆは、各時点で記録した蛍光であり、Ｆ１００は、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によるリポソーム処理に基づくＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出の最大量である）。
【０１４８】
ライセートおよび細胞におけるＢＦＬ−１標的化：  ビオチンハンドルおよび／またはアクリルアミドウォーヘッドを導入したかまたは導入しない一連のＮＯＸＡおよびＢＩＭ  ＳＡＨＢ構築物を、以下に詳述するように行った、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを含有するライセートまたはＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを発現する細胞（トランスフェクト２９３Ｔ細胞）または天然ＢＦＬ−１（Ａ３７５Ｐ）における比較ＢＦＬ−１標的化アッセイにおいて用いた。
【０１４９】
２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に維持し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Roche）を用いて、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを含有するｐＣＭＶプラスミド２μｇを用いてトランスフェクションを行った。ライセート実験のために、トランスフェクションから２４時間後に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１％ＣＨＡＰＳ溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.４、１００ｍＭ  ＤＴＴ）と一緒にインキュベートすることによって溶解した。ＢＣＡキットを製造者（Thermo Scientific）の説明書に従って用いて可溶性画分のタンパク質濃度を測定した。ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（１０μＭ）をライセート１００μｇに加え、室温で２時間インキュベートした。次いで、試料をＬＤＳバッファー中にて煮沸し、ＨＡ（Sigma-Aldrich、＃１２ＣＡ５）およびビオチン（Abcam、＃５３４９４）抗体の１：１０００希釈液を用いてウエスタン分析を行った。ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１との相互作用についてｔＢＩＤと競合するビオチン化ＳＡＨＢの能力を評価するために、上記のとおり、ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１０ベクター（Sigma）において、２９３Ｔ細胞を、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９ＳまたはＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１のいずれかを用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１％ＣＨＡＰＳバッファーに溶解し、ＢＣＡキットによるタンパク質濃度決定のために上清を回収した。ライセート試料（０.５ｍｇ）を０.２５μＭ組換えｔＢＩＤ（R&D Systems）および５μＭビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３と一緒に室温で６時間インキュベートした。次いで、当該混合物をＨＡまたはＦＬＡＧ（Sigma-Aldrich、Ｆ７４２５）免疫沈降にかけた後、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ビオチン、およびＢＩＤ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１１４２３）抗体の１：１０００希釈液を用いてウエスタン分析を行った。ビオチン化ペプチドで処理した２９３Ｔ細胞からのＨＡ免疫沈降のために、上記のとおり、細胞を、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを用いてトランスフェクトし、２４時間後、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にて２０μＭビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３と一緒に６時間インキュベートした。細胞を収穫し、上記のとおり溶解し、抗ＨＡアガロースビーズ（Pierce）と一緒に一夜インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、ＬＤＳバッファー中にて煮沸することによって溶離し、ＨＡおよびビオチン抗体を用いてウエスタン分析を行った。非ビオチン化ＳＡＨＢによる２９３Ｔ処理のために、細胞を、上記のとおり、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを用いてトランスフェクトし、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にて２０μＭ  ＢＩＭ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３と一緒にインキュベートし、上記のとおり、ＨＡおよびアクチン抗体を用いるウエスタン分析のために所定の時点でライセートを収穫した。Ａ３７５Ｐメラノーマ研究のために、細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に維持し、ライセート１ｍｇにビオチン��ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（３０μＭ）を添加した後、ＣＨＡＰＳ溶解バッファー中にて４℃で一夜インキュベートした。ビオチン捕獲を、当該混合物を大容量ＳＡアガロース（Thermo Scientific）と一緒に４℃で２時間インキュベートした後、遠心分離し、ペレット化したビーズを３×１ｍＬの溶解バッファーで洗浄することによって行った。ビーズ結合タンパク質を、１０ｍｇ／ｍＬビオチンを含有する１０％ＳＤＳ中にて１０分間煮沸することによって溶離し、次いで、電気泳動、ならびにＢＦｌ−１（Abcam、＃１２５２５９）およびＭＣＬ−１（Rockland、＃６００−４０１−３９４Ｓ）抗体を用いるウエスタン分析を行った。
【０１５０】
細胞生存率、ＬＤＨ放出、およびカスパーゼ３／７活性化アッセイ：  １０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するそれらの標準的な培養培地（Ａ３７５Ｐ：ＤＭＥＭ；ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＭＣＦ−７：ＥＭＥＭ；Ａ５４９、Ｈ９２９：ＲＰＭＩ）を用いて、癌細胞を培養した。細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし（５×１０3細胞／ウェル）、一夜インキュベートした後、所定の希釈のために、５％ＦＢＳを添加した対応する培地中にて所定の濃度のＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３で処理した。それぞれＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏおよびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７化学発光試薬（Promega）を用いて、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性化を測定し、発光をマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５、Molecular Devices）によって検出した。３０分間のペプチドインキュベーション後、１５００ｒｐｍで４℃にて５分間プレート遠心分離し、細胞培養培地１００μＬを透明プレート（Corning）に移し、ＬＤＨ試薬（Roche）１００μＬと一緒に３０分間振盪しながらインキュベートし、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍでの吸光度を測定することによってＬＤＨ放出を定量化した。
【０１５１】
ミトコンドリアチトクロムｃ放出およびビオチンかアッセイ：  ６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレート中にＡ３７５Ｐ細胞をプレーティングし（３×１０5細胞／ウェル）、上記のとおり培養した。２４時間後、所定の希釈のために５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にてＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（４０μＭ）で細胞を処理し、次いで、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、サイトゾル（上清）およびミトコンドリア（ペレット）画分を記載されるように（Dewson, 2015）単離した。簡潔には、０.０２５％ジギトニンおよびプロテアーゼ阻害剤を添加した透過処理バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ７.５、２５０ｍＭシュークロース、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）にペレット細胞を１×１０7細胞／ｍＬで再懸濁した後、氷上にて１０分間インキュベートし、１３,０００ｇで遠心分離した。得られた上清およびペレット画分をＬＤＳバッファー中にて煮沸し、チトクロムｃ抗体（BD Pharmingen ＃５５６４３３）の１：１０００希釈液を用いてウエスタン分析を行った。ビオチン化研究のために、上記のとおり、Ａ３７５Ｐミトコンドリアを単離し、透過処理バッファーに再懸濁し、次いで、ビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢAまたはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（５０μＭ）で室温にて４時間処理した。次いで、試料をＬＤＳバッファー中にて煮沸し、ＢＦＬ１（Abcam ＃１２５２５９）、ビオチン（Abcam、＃５３４９４）およびＶＤＡＣ１（Abcam ＃１４７３４）抗体の１：１０００希釈液を用いてウエスタン分析を行った。
【０１５２】
共焦点顕微鏡：  チャンバーカバーガラス中にてＡ３７５Ｐ細胞をプレーティングし（１.５×１０4細胞／ウェル）、上記のとおり培養した。２４時間後、５％ＦＢＳを含有するフェノール不含ＤＭＥＭ中にてＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢA1またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３（１μＭ）で４時間細胞を処理した。細胞を洗浄し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Thermo）、Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２で染色し、ライブ画像処理した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ倒立顕微鏡（Nikon Instruments）に設置したＹｏｋｏｇａｗａ  ＣＳＵ−Ｘ１スピニングディスクコンフォーカル（Andor Technology）を用いて、共焦点画像を回収した。Ｏｒｃａ  ＥＲ  ＣＣＤカメラ（Hamamatsu Photonics）および４８８ｎｍレーザーと一緒に１００×１.４  ＮＡ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ対物レンズを用いて、画像を獲得した。獲得パラメータ、シャッター、フィルター位置および焦点は、Ａｎｄｏｒ  ｉＱソフトウェア（Andor Technology）によって制御した。
【０１５３】
ステープル化ペプチドの細胞取り込み：  処理された細胞からの電気泳動されたライセートのビオチンウエスタン分析によってビオチン化ＳＡＨＢの細胞取り込みを評価するために、６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレートにおいて１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中にて２９３Ｔ細胞をプレーティングした（２×１０5細胞／ウェル）。２４時間後、さらなる２４時間のインキュベーションのために、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にて細胞にビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢA−３またはＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３ペプチド（２０μＭ）を添加した。次いで、細胞をトリプシン処理して表面結合ペプチドを除去し、ＰＢＳで洗浄し、上記のように１％ＣＨＡＰＳ溶解バッファーに溶解し、製造者（Thermo Scientific）の説明書に従ってＢＣＡキットによってタンパク質濃度を決定するために上清を回収した。ＬＤＳバッファー中にて細胞ライセート試料（５０μｇ）を煮沸し、抗ビオチン（Abcam、＃５３４９４）抗体の１：１０００希釈液および抗アクチン（Sigma-Aldrich、＃Ａ１９７８）抗体の１：２０００希釈液を用いてウエスタン分析を行った。ステープル化ペプチド取り込みに対するトランスフェクション条件の潜在的効果を評価するために、６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレートにおいて２９３Ｔ細胞をプレーティングし（２×１０5細胞／ウェル）、上記のように培養した。２４時間後、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Roche）を用いてモック（mock）トランスフェクションを行い、トランスフェクトされなかった対照細胞と一緒にプラスミドを用いなかった。さらなる２４時間のインキュベーションの後、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中において２０μＭビオチン化ＢＩＭ  ＳＡＨＢA−３ペプチドを細胞に加え、４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、上記のように溶解し、ライセートをビオチンおよびアクチンウエスタン分析に供した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ高含量落射蛍光顕微鏡による細胞取り込み分析のために、黒色の透明底９６ウェルプレートにおいて所定の細胞株を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％グルタミンを添加したＤＭＥＭ中、ＭＥＦのためには１.５×１０4細胞／ウェルの密度で、またはＡ３７５Ｐ細胞のためには１×１０4細胞／ウェルの密度で、一夜プレーティングした。翌日、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にてＦＩＴＣ標識ペプチドまたは等量のビヒクル（０.１％ＤＭＳＯ）で細胞を４時間処理し、次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２およびＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（ＣＭＤＲ、Invitrogen）で１０分間染色した。次いで、培地を吸引し、細胞を４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Molecular Devices）によって画像処理した。２０×倍率で１ウェルにつき５箇所の部位についてデータを回収し、各処理をトリプリケートで行い、次いで、分析し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて定量化した。細胞の境界の可視化のために、および細胞の内側のＦＩＴＣ−ペプチドを測定するためのマスクの生成のために、ＣＭＤＲ染色を用い、それによって、分析から蛍光デブリを排除した。ＣＭＤＲ画像マスクを細胞境界から徐々に抗体させるためにＭｅｔａＸｐｒｅｓｓにおけるカスタムモジュールを適用し、さらに、分析されたＦＩＴＣシグナルを内在化ペプチドに限定した。Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＴＩＦＩ）の測定値は、細胞あたり、ペプチド構築物あたり検出された絶対蛍光のレベルを表す。平均よりもはるかに大きく明るいＦＩＴＣおよびＣｙ５異常値を除外するために最大および最小閾値を利用し、ビヒクル処理した細胞が分析によって陰性となるように細胞あたりの総強度および平均強度を設定した。
【０１５４】
統計学的解析：  データセットは両側スチューデントｔ検定によって解析し、ｐ＜０.０５は統計学的に有意であるとみなした。
【０１５５】
実施例９：  ウォーヘッド担持ＮＯＸＡペプチドは発現したＢＦＬ−１の細胞内架橋を示す
２９３Ｔ細胞をＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓでトランスフェクトし、続いて、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にて２０μＭウォーヘッド担持ＢＩＭまたはＮＯＸＡ−ＳＡＨＢと一緒に２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、溶解し、次いで、ＨＡおよびアクチン抗体を用いるウエスタン分析のためにライセートを単離した。一連のウォーヘッド担持ＮＯＸＡペプチドは、発現したＢＦＬ−１の細胞内架橋を示し、試験されたパネルの最も有効な薬剤はＮＯＸＡ１５であった。
【０１５６】
他の実施態様
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであって限定するものではないことを理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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