(57)【要約】  本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子、並びにその製造方法及び使用に関する。特に、本発明は、制御放出のためのポリマー担体、例えば(ナノ)粒子、マイクロスフェア、及び他のタイプのポリマーデバイスへの多量の薬物の共有結合による捕捉をもたらす。ポリマー担体又はデバイスは、リガンドを付着させて、特定の組織への標的指向性及び/又は(非)侵襲的モニタリングを実現することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に共有結合によって捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物捕捉粒子を形成する工程と;
(iva)ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(ivb)ポリマー鎖の少なくとも一部がアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾール結合を形成するようにする工程と
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも10wt%の量で存在する薬物を含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの前記粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に共有結合によって捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、充填容量が少なくとも10%である薬物捕捉粒子を形成する工程とを含み、場合によって粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせる更なる工程を含む方法。
【請求項３】
薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物捕捉粒子を形成する工程と;
(va)ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(vb)ポリマー鎖の少なくとも一部がアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾール結合を形成するようにする工程と
を含む方法。
【請求項４】
薬物を含む粒子を製造する方法であって、薬物が前記粒子中に少なくとも10%の量で存在し、前記方法が、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、前記薬物が前記粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に共有結合によって捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、充填容量が少なくとも10%である薬物捕捉粒子を形成する工程とを含み、粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせる更なる工程を含む方法。
【請求項５】
リガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を、ポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)粒子を、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付す工程と;
(iiia)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(iiib)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾール結合を形成するようにする工程と
を含む方法。
【請求項６】
ポリマー鎖がジ又はトリブロックコポリマーである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ブロックコポリマーの一部が感熱性(コ)ポリマーを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
感熱性ポリマーが、N-ヒドロキシアルキル-(メタ)アクリルアミド又はN-(メタ)アクリロイルアミノ酸の疎水的に改質されたエステルをベースとする(コ)ポリマーから選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
感熱性ポリマー鎖が、N-イソプロピルアクリルアミド及び/又はアルキル-2-オキサザリンから誘導されたモノマーを更に含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマー鎖又はブロックコポリマーが、官能基、例えば、HPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)又はHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)の(オリゴ)乳酸エステルを含む、N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクタートの(コ)ポリマーを含有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリマーの少なくとも一部がアジド基又はアルキン基を含む、請求項2、4〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ブロックポリマーが親水性(コ)ポリマーをPEGとして含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
アジド基又はアルキン基がPEGに結合している、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは感熱性ポリマーをベースとする、ミセル、ヒドロゲル、マイクロ粒子及び/又はコーティング形成ポリマーを使用する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
薬物が、分解性リンカーを介してポリマーマトリクスに結合している、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
粒子の薬物充填容量が少なくとも15%である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
リガンドが、治療用リガンド、標的指向性リガンド及び/又はイメージングリガンドである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか一項の方法のいずれかによって得ることができる粒子。
【請求項１９】
医薬品としての使用のための、請求項18に記載の粒子。
【請求項２０】
セラグノスティクスとしての使用のための表面に結合したイメージングリガンドを含む、請求項19に記載の使用のための粒子。
【請求項２１】
請求項18に記載の粒子の使用であって、前記粒子が、診断用として表面に結合したイメージングリガンドを含む、使用。
【請求項２２】
前記診断がコンパニオン診断である、請求項21に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子、とりわけ、活性のある生物学的又は治療的化合物又は組成物の制御放出のためのナノ粒子に関し、具体的には、能動的標的指向性が治療すべき系の特定部分に活性原材料を送達することを可能にする表面改質を伴うナノ粒子に関する。加えて、本発明は、ナノ粒子を選択的に微調整(最適化又は調節)して生物学的又は治療的結果を向上させ、時には最大化する方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、生物学的又は治療的結果の向上及び最大化を目的とした、ナノ粒子送達系の選択的最適化、又はナノ粒子送達系の特性の選択的な調節を伴う。
【背景技術】
【０００３】
本発明のナノ粒子は、感熱性ブロックコポリマーをベースとするものである。特に、部分的にメタクリル化されたオリゴラクタート単位を有するPEG-b-ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクタート)をベースとするコポリマーが好適であるが、感熱性ブロックを構成するのに他の(メタ)アクリルアミドエステル、例えば、HPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)及びHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)のエステル、場合によって(オリゴ)乳酸エステル、及びN-(メタ)アクリロイルアミノ酸エステルも使用可能である。他に好適な感熱性ブロックコポリマーは、誘導体化及び非誘導体化メタクリラート基によって修飾されていてもよい官能基を含有するモノマーから誘導されたもの、例えばHPMAm-ラクタートポリマーである。即ち、この修飾は、リンカー部分の組込みを包含する。
【０００４】
使用できる他のタイプの官能性感熱性(コ)ポリマーは、疎水的に修飾されたポリ(N-ヒドロキシアルキル)(メタ)アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)と反応性官能基(例えば、酸性アクリルアミド及び他の部分、例えばN-アクリロイルスクシンイミド)を含有するモノマーとのコポリマー組成物、又はポリ(アルキル)2-オキサザリンの同様のコポリマー等である。
【０００５】
更なる好適な感熱性基は、NIPAAm及び/又はアルキル-2-オキサキソリンをベースとするものとすることができ、これらのモノマーは、反応性官能基を含有するモノマー、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基又はスクシンイミド基を含有する(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリラートと反応してもよい。
【０００６】
適切な感熱性ポリマーは、US-B-7,425,581及びEP-A-1 776 400、更にWO2010/033022及びWO2013/002636に記載されている。WO2012/039602の薬物-ポリマーマトリクス粒子は、このようなポリマーを使用していることが記載されている。更には、WO2012/039602には、これらの公知のポリマーマトリクス粒子に使用し得る生分解性リンカー分子が記載されている。
【０００７】
医薬リード最適化プログラムでは、治療すべき疾病又は症状に応じて最終製品及びその適用範囲を微調整するために、多数のパラメータを選択的に最適化する必要があり、また、最適化することができる。
【０００８】
重要な側面は、ナノ粒子のサイズである。本発明に関し、このサイズは、場合によって特定の架橋部分の使用と組み合わせてナノ粒子を形成するポリマー鎖の長さによって主として決まる。
【０００９】
実際には、疾病又は症状を治療する必要があるとき、治療すべき系のどの部分を標的とする必要があるか、又は標的とすることができるか、例えばどの受容体が過剰発現され、どれが標的にできるかを当業者は理解しているか、決める必要がある。
【００１０】
全身的な標的(例えば受容体)の選択の後、対応するリガンド又は他の標的指向性デバイス若しくは追跡デバイス(例えば、特定の標的への結合に選択的な抗体若しくはナノボディ、ペプチド又は別の小分子)を選択すべきであり、本発明のナノ粒子の外表面に結合させる必要がある。一部の実施形態において、2種以上のリガンド又は他の標的指向性デバイス若しくは追跡デバイスがナノ粒子の外表面に存在することが好適である。
【００１１】
リガンドの選択の後、リガンドをナノ粒子に結合させるための結合方法を選択する必要がある。考慮すべき重要なことは、リガンドが安定してコンジュゲート状態を保つべきなのか、時間がたてば潜在的に切断されるべきなのか、という点である。
【００１２】
リガンド及びコンジュゲーション化学反応が決定されたら、リガンド結合の程度が異なるナノ粒子の範囲を定義すべきである。というのは、早期前臨床試験に基づきナノ粒子上のリガンドの数を最適化する必要があるためである。即ち、薬物動態プロファイル(以下、「PKプロファイル」)を結合の有効性に対して決定する必要がある。標的指向性化合物をナノ粒子表面に安定的にコンジュゲートさせるための選択肢は、治療用化合物又は色素、放射性薬剤等をコンジュゲートして(非)侵襲的イメージングを可能にし、それによりナノ粒子の薬物動態学的及び生体内分布プロファイルを理解し、更にはサイズ、分解プロファイル等の医薬的特徴が可変のナノ粒子の潜在的に異なるプロファイルを理解するためにも使用できる。
【００１３】
ビヒクル、即ちナノ粒子系が定義されると、標的に送達すべき活性原材料を選択することができる。多くの場合、有効な治療のため、最も強力な活性原材料、例えば薬物を選択しようとする。しかし、ビヒクルに2種以上の活性原材料を充填することも可能である。
【００１４】
症状、並びに活性原材料及びその結果としての投薬計画に関して行った選択に応じ、更には活性原材料を放出すべき場所に応じ、ナノ粒子及び薬物結合化学物質の分解性を決定し、制御し、調節しなければならない。これは、充填ナノ粒子系からの所望の放出プロファイルに繋げなければならず、急速放出と持続放出及び長期放出とでは異なり得る。
【００１５】
例えば、ナノ粒子の施用頻度に基づき、ナノ粒子の分解性プロファイルを選択する必要がある。推測できることであるが、例えば、がんの長期治療では、放出薬物分子へのかなり急速な暴露(したがって急速な分解)が望まれるが、他の用途では、緩慢な分解が望まれることもある。活性原材料の利用可能性に応じ、ナノ粒子系の分解も調節する必要がある。
【００１６】
先行技術では、多くのナノ粒子系で、1つの特性の調節が即座に別の特性への悪影響に繋がる。本発明の目的は、選択的なパラメータの柔軟な調整が最終的な系の特性の最適化をもたらす系に到達することである。
【００１７】
また、本発明者らが驚いたことには、本発明が関連する技術の基礎を形成するナノ粒子系は、特別に作られた系を創出する自由を提供する。即ち、上に示すポリマーに基づくナノ粒子系は、中に捕捉された活性化合物の有効性及び耐容性が向上した送達系をもたらす。これは、治療すべき系又は系の一部における動態の改善、組織レベル、細胞レベル又は分子レベルであるかどうかにかかわらず治療を必要とする部位における能動的標的指向性、長期にわたる循環、及び活性原材料の調節可能で適時の放出により、達成される。それにより、可変の医薬的特徴を有するナノ粒子を非侵襲的に(標識の表面へのコンジュゲーションを介して)追跡する機会が生物学的プロファイルの迅速な理解を可能とし、それによって最良の選択肢の選択が容易になる。
【００１８】
本発明の系における要件調節工程を、以下に詳述する。
【００１９】
ところで、WO2014/142653は、標的細胞におけるナノ粒子の取り込みがサイズ及び組成に大きく依存し、そのためサイズ及び組成の十分な制御が必要であると思われると記載している。しかし、多くのナノ粒子、及び先行技術の製造方法では、サイズ及び/又は組成を制御することは不可能である。実際、先行技術の粒子の大部分は広い粒径分布を示し、そのため、それらの粒子に基づく粒子は不均一なものとなるか、更なる精製が必要となる。更には、制御放出の目的のためには、バッチ間の再現性を確保するために薬物の封入及び/又はリガンドの結合に対する厳密な制御が必要である。先行技術におけるナノ粒子の大部分は、このような厳密な制御を可能にせず、したがって持続的な治療反応を生み出すのに適していない。
【００２０】
WO2010/138193は、細胞、例えば薬物提示細胞内の作用部位を標的とすることができ、pH感受式に合成ナノ担体から解離する免疫調節剤を含む合成ナノ担体の組成物に関する。WO2010/138193の合成ナノ担体は、抗原提示細胞(APC)に優先的に取り込まれる。APCに取り込まれると、合成ナノ担体は、細胞外の中性のpHとは対照的にpHがより酸性となるエンドソーム/リソソーム区画へとエンドサイトーシスされると推測される。これらの条件下では、免疫調節剤は、合成ナノ担体からのpH感受性解離を呈し、合成ナノ担体から放出される。次いで、免疫調節剤は、エンドソーム/リソソームと関係する受容体と自由に相互作用し、所望の免疫反応を刺激する。しかし、WO2010/138193は、免疫調節剤が存在する場合のポリマーの架橋を開示していない。免疫調節剤がナノ粒子に共有結合によって捕捉されている系は開示されていない。WO2010/138193では、粒子は、まず免疫調節剤をポリマーにコンジュゲートさせ、次いで免疫調節剤-ポリマー複合体のナノ粒子を作製することにより製造される。したがって、WO2010/138193の系は、それぞれの異なる免疫調節剤毎にコンジュゲーションのための異なる経路を必要とする。
【００２１】
US2009/011993は、抗原提示細胞を標的とする活性剤、例えばワクチン、免疫調節剤、及び/又は薬物を送達する粒子に関する。US2009/011993は、ポリマー骨格にケタール基を含む新しいタイプの疎水性ポリマーを開示し、ケタール基は、両酸素原子がポリマー骨格内に位置するように配置されている。US2009/011993は、ポリマーを免疫調節剤に架橋するための外部架橋剤の使用を開示しており、免疫調節剤の存在下でのポリマーの架橋工程を開示していない。
【００２２】
Rijckenら(Biomaterials 2007;28(36):5581〜5593頁)は、(100%)mPEG5000及びN-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド)-オリゴラクタートをベースとするコア架橋高分子ミセルを記載し、それらの特性を研究している。これらのミセルは共有結合によって捕捉された薬物を含有せず、リガンドをそれらの表面にコンジュゲートさせる可能性もない。
【００２３】
EP1776400は、分解性感熱性高分子ミセルを記載する。ミセルは、非共有結合によって捕捉された薬物、例えばパクリタキセルを含有する。ミセル表面上の標的指向性リガンド又はイメージングリガンドの共有結合は、記載されていない。
【００２４】
Talelliら(Biomaterials 2010;31(30):7797〜7804頁)は、ドキソルビシンを捕捉した架橋高分子ミセルを記載する。ミセルは表面に標的指向性リガンド又はイメージングリガンドを含有せず、ポリマーは、クリックケミストリーによってそのようなリガンドへの結合を可能にするアジド又はアルキン基を含有していない。
【００２５】
先行技術の大部分の系は、ワクチン系又は治療系のいずれかであり、粒子及びコンジュゲーションが、異なる活性剤、例えば免疫調節剤又は薬物毎に最適化を必要とする。そのため、他の活性原材料を含む新しい粒子毎に広範な研究が必要であり、異なる活性原材料の間で相違を生じている。最適な製剤は場合によって、必要とされる反応のタイプ及び意図する投与経路に依存する。様々な製剤の態様、例えば粒子径、標的指向性リガンド等は、場合によって選択した投与経路に基づき調整される。先行技術に記載されたナノ粒子は、ある特定の薬物/活性原材料及びある特定の投与経路には適しているかもしれないが、多くの場合、別の薬物及び/又は他の投与経路には不適当である。したがって、異なる治療経路に対し、異なるナノ粒子をその都度開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】US-B-7,425,581
【特許文献２】EP-A-1 776 400
【特許文献３】WO2010/033022
【特許文献４】WO2013/002636
【特許文献５】WO2012/039602
【特許文献６】WO2014/142653
【特許文献７】WO2010/138193
【特許文献８】US2009/011993
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Rijckenら、Biomaterials 2007;28(36):5581〜5593頁
【非特許文献２】Talelliら、Biomaterials 2010;31(30):7797〜7804頁
【非特許文献３】Neradovicら、Macomolecules 34 (2001)、7589〜7591頁
【非特許文献４】Kimら、Polym. Adv. Technol.、10(1999)、647〜654頁
【非特許文献５】Leeら、Macromol. Biosci. 6(2006)846〜854頁
【非特許文献６】Huら、Macromol. Biosci. 9(2009)、456〜463頁
【非特許文献７】Kimら、J. Control. Rel. 138(2009)197〜204頁
【非特許文献８】Bonthaら、J. Control. Rel. 114(2006)163〜174頁
【非特許文献９】Leeら、Angew. Chem 121(2009)5413〜4516頁
【非特許文献１０】Nishiyamaら、Cancer Res. 63(2003)、8977〜8983頁
【非特許文献１１】Miyataら、J. Control. Rel. 109(2005)15〜23頁
【非特許文献１２】Censiら、J. Control Rel 140(2009)230〜236頁
【非特許文献１３】C.J. Rijcken、C.J. Snel、R.M. Schiffelers、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: Synthesis, characterisation and in vivo studies、Biomaterials、28(2007) 5581〜5593頁
【非特許文献１４】D. Neradovic、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Thermoresponsive polymeric micelles with controlled instability based on hydrolytically sensitive N-Isopropylacrylamide copolymers、Macromolecules、34(2001)7589〜7591頁
【非特許文献１５】M. Talelli、M. Iman、A.K. Varkouhi、C.J.F. Rijcken、R.M. Schiffelers、T. Etrych、K. Ulbrich、C.F. van Nostrum、T. Lammers、G. Storm、W.E. Hennink、Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin、Biomaterials、31(2010)7797〜7804頁
【非特許文献１６】Q. Hu、C.J. Rijcken、R. Bansal、W.E. Hennink、G. Storm、J. Prakash、Complete regression of breast tumour with a single dose of docetaxel-entrapped core-cross-linked polymeric micelles、Biomaterials、53(2015)370〜378頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、異なる目的のために容易に調整可能な粒子を提供することである。更に、本発明の別の目的は、粒径分布の狭い粒子を提供することである。本発明の更に別の目的は、異なる薬物、活性化合物及び/又はリガンド、例えば、親水性化合物及び疎水性化合物の両方を、広いサイズ範囲にわたり収容できる粒子を提供することである。更には、本発明の別の目的は、例えば、生理学的条件下で、又は標的部位において選択的に薬物又は活性化合物の放出を制御可能な粒子を提供することである。本発明の別の目的は、捕捉された薬物若しくは活性化合物及び/又はリガンドのそれぞれが独自の放出プロファイルを有する粒子を提供することである。本発明の更に別の目的は、粒子、例えば粒子の表面に共有結合したリガンドを含む粒子を提供することである。リガンドは、本発明の粒子を対象の細胞又は部位、例えばAPC又は腫瘍細胞へと導くことができる。これに代えて、又はこれに加えて、リガンドは、(非)侵襲的イメージングに使用してもよい。これに代えて、又はこれに加えて、リガンドは、治療用化合物、例えばペプチドであってもよい。本発明の更に別の目的は、粒子の内部に捕捉された薬物に対して安全及び/又は非破壊的な粒子の製造方法を提供することである。更に、本発明の目的は、薬物の放出のために粒子の分解を制御することである。
【００２９】
本発明は、上記の目的の1つ又は複数を達成する粒子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
第1の態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子であって、
(i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iva)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(ivb)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【００３１】
したがって、こうした方法の最終結果は、全ての成分(即ち、薬物、リガンド及びポリマー鎖)が互いに共有結合しているため、好ましくは真に単一の巨大分子である粒子である。
【００３２】
ポリマー又はリガンドは、当業者に公知の方法により、アジド基によって誘導体化されていてもよい。原理上は、アルキン部分とのアジド基のこの反応は、加熱の使用及び例えば銅触媒の使用による(金属)触媒の使用を含む、あらゆる公知の方法を使用して達成できる。
【００３３】
本発明のこの方法においては、「薬物」について言及する。しかし、この用語は、限定的な意味で解釈すべきではない。これは、治療すべき系に対して、又は治療すべき系において意図した効果を有するあらゆる種類の活性原材料を包含する。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、リガンドを含む粒子であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を、ポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)粒子を、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付す工程と;
(iiia)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(iiib)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾール結合を形成するようにする工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【００３５】
本発明者らにとって、アジド基又はアルキン基のナノ粒子表面又はリガンドへの導入、及びそれに続くクリックケミストリーによるアジド基とアルキン基との反応がナノ粒子のサイズに本質的に影響を与えなかった、即ち、ナノ粒子の表面が全く変化しないか、最小限にしか変化しないことは、全く予想外であった。更に、アジド基又はアルキン基のリガンドとの結合への変換率は非常に高いことが判明し、ここで、一般には既に適切な標的指向化の可能性を示しているリガンドの数は限定されている。したがって、本発明は、ナノ粒子表面におけるコンジュゲーションの程度の完全な制御を可能とする。リガンドのポリマーへのコンジュゲーションは、NMRによってモニターすることができる。アジドとアルキンとの反応はトリアゾール基を形成し、15N NMRによって示すことができる。加えて、粒子の薬物放出プロファイルも変化せず、バースト放出の増加も認められなかった。したがって、これは、本発明の粒子の場合、粒子の1つの特定の特性を他の特性に影響を与えることなく改変又は最適化することが可能であることを示している。更なる利点は、アジド-アルキン反応が触媒及び高温を用いることなく容易に実施できることである。粒子の表面に共有結合できるリガンドの例は、治療用リガンド、標的指向性リガンド及び/又はイメージングリガンドである。
【００３６】
別の態様において、本発明は、少なくとも10wt%の量で存在する薬物を含む粒子であって、
(i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)前記混合物を、ポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、充填容量が少なくとも10%である薬物充填粒子を形成する工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【００３７】
別の予想外の結果によると、本発明により調製されたナノ粒子に捕捉される薬物の量は、予想より遙かに多いことが見出された。捕捉された薬物の量は、捕捉された薬物の重量を粒子の重量で除し、%で表した充填容量(LC)で表すことができる。本発明の粒子の充填容量は、驚くほど高い。充填容量は少なくとも10%であり、又は、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%にさえなり得ることが見出された。
【００３８】
本発明の粒子の薬物捕捉効率は、驚くべきことに、高いことも見出された。薬物捕捉効率は、実際に捕捉された薬物の重量を粒子に供給された薬物の重量で除し、%で表したものである。本発明の粒子の場合、薬物捕捉効率は、少なくとも30%になり、又は、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%にさえなり、少なくとも80%にさえなり、更には90wt.%超にさえもなり得る。驚くべきことに、この高い充填容量及び薬物捕捉容量は、小さな粒子にも見られる。例えば、20〜200nmのような小さな粒子でさえ依然として高い充填容量及び/又は薬物捕捉効率を示し、25〜100nmのような小さな粒子でさえ依然として高い充填容量及び/又は薬物捕捉効率を示し、或いは、30〜75nmのような小さな粒子でさえ依然として高い充填容量及び/又は薬物捕捉効率を示し、更に35〜65nmのような小さな粒子でさえ依然として高い充填容量及び/又は薬物捕捉効率を示し得る。
【００３９】
また、充填容量が少なくとも10%の粒子が、充填容量が10%未満の粒子と比べて有意に大きくないことも判明した。加えて、薬物充填容量が高い粒子でも薬物放出プロファイルは有意に変化しなかった。
【００４０】
ポリマーマトリクスは、形成されるポリマー網目である。したがって、薬物は、ポリマーマトリクス中に、即ち、架橋によって形成されるポリマー網目中に捕捉される。薬物は、ポリマー鎖に架橋し、したがって、ポリマーマトリクスの共有結合部分も形成する。
【００４１】
好適な実施形態において、充填容量が少なくとも10%の薬物捕捉粒子の形成後、薬物充填粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせてもよい。場合によって、リガンドは、アジド-アルキン付加環化を介して粒子にコンジュゲートする。アジド基はポリマー上に存在してもよく、アルキン基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。加えて、アルキン基はポリマー上に存在してもよく、アジド基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアルキン基を含み、リガンドがアジド基を含む。好適な実施形態において、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。
【００４２】
更なる態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iva)ポリマーがアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(ivb)ポリマーがアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【００４３】
更なる態様において、本発明は、リガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を、ポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)粒子を、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付す工程と;
(iiia)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(iiib)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾール結合を形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【００４４】
更なる態様において、本発明は、少なくとも10wt%の量で存在する薬物を含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、充填容量が少なくとも10%である薬物充填粒子を形成する工程と
を含む方法を提供する。
【００４５】
好適な実施形態において、充填容量が少なくとも10%の薬物充填粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせる。場合によって、リガンドは、アジド-アルキン付加環化を介して粒子にコンジュゲートする。アジド基はポリマー上に存在してもよく、アルキン基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。加えて、アルキン基はポリマー上に存在してもよく、アジド基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアルキン基を含み、リガンドがアジド基を含む。好適な実施形態において、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。
【００４６】
本発明の更なる態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくともその一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(va)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(vb)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【００４７】
本発明の更なる態様において、本発明は、薬物を含む粒子を製造する方法であって、薬物が前記粒子中に少なくとも10wt%の量で存在し、前記方法が、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、充填容量が少なくとも10%であるの薬物充填粒子を形成する工程と
を含む方法を提供する。
【００４８】
架橋後、生成した粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせてもよい。好適な実施形態において、充填容量が少なくとも10%の薬物充填粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせる。場合によって、リガンドは、アジド-アルキン付加環化を介して粒子にコンジュゲートする。アジド基はポリマー上に存在してもよく、アルキン基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。加えて、アルキン基はポリマー上に存在してもよく、アジド基はリガンド上に存在してもよい。即ち、ポリマー鎖の少なくとも一部がアルキン基を含み、リガンドがアジド基を含む。好適な実施形態において、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。
【００４９】
本発明の更なる態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(va)ポリマー鎖がアジド基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させる、又は
(vb)ポリマー鎖がアルキン基を含む場合、前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて
アジド基がアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【００５０】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、アジドとアルキンとの反応は、触媒無しで遂行される。本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、アジドとアルキンとの反応は、室温で遂行される。本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、アジドとアルキンとの反応は、触媒無しで室温で遂行される。
【００５１】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、1500個のうち1個のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化され、場合によって1500個のうち2個、場合によって1500個のうち5個、場合によって1500個のうち7個、場合によって1500個のうち10個、場合によって1500個のうち15個、場合によって1500個のうち20個、場合によって1500個のうち25個、場合によって1500個のうち30個、場合によって1500個のうち35個、場合によって1500個のうち40個、場合によって1500個のうち45個、場合によって1500個のうち50個、場合によって1500個のうち55個、場合によって1500個のうち60個、場合によって1500個のうち65個、場合によって1500個のうち70個、場合によって1500個のうち75個、場合によって1500個のうち100個、場合によって1500個のうち150個、場合によって1500個のうち200個、場合によって1500個のうち250個、場合によって1500個のうち300個、場合によって1500個のうち400個、場合によって1500個のうち500個、場合によって1500個のうち600個、場合によって1500個のうち750個、場合によって1500個のうち900個、場合によって1500個のうち1000個、場合によって1500個のうち1200個、場合によって1500個のうち1300個、場合によって1500個のうち1400個のポリマー鎖が、アジド基により誘導体化される。
【００５２】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化される。
【００５３】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のリガンドがアジド基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のリガンドがアジド基によって誘導体化される。
【００５４】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、1500個のうち1個のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化され、場合によって1500個のうち2個、場合によって1500個のうち5個、場合によって1500個のうち7個、場合によって1500個のうち10個、場合によって1500個のうち15個、場合によって1500個のうち20個、場合によって1500個のうち25個、場合によって1500個のうち30個、場合によって1500個のうち35個、場合によって1500個のうち40個、場合によって1500個のうち45個、場合によって1500個のうち50個、場合によって1500個のうち55個、場合によって1500個のうち60個、場合によって1500個のうち65個、場合によって1500個のうち70個、場合によって1500個のうち75個、場合によって1500個のうち100個、場合によって1500個のうち150個、場合によって1500個のうち200個、場合によって1500個のうち250個、場合によって1500個のうち300個、場合によって1500個のうち400個、場合によって1500個のうち500個、場合によって1500個のうち600個、場合によって1500個のうち750個、場合によって1500個のうち900個、場合によって1500個のうち1000個、場合によって1500個のうち1200個、場合によって1500個のうち1300個、場合によって1500個のうち1400個のポリマー鎖が、アルキン基により誘導体化される。
【００５５】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化される。
【００５６】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のリガンドがアルキン基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のリガンドがアルキン基によって誘導体化される。
【００５７】
適切には、ポリマー鎖は、架橋工程において反応せず、形成され架橋された粒子の表面にリガンドを連結させるのに使用し得る反応性部分を含む。或いは、架橋後、更に反応して架橋粒子の表面にリガンドをコンジュゲートさせ得る追加の連結基を生成された架橋粒子の表面に結合させる。また、ポリマー鎖上の反応性部分を架橋工程中にブロックし、ポリマー網目が形成されてから非ブロック化してもよい。次いで、これらの非ブロック化された反応性部分をリガンド及び/又は薬物及び/又はアジュバントと反応させ、これらが架橋粒子の表面に結合するようにしてもよい。加えて、薬物は、架橋粒子のポリマー鎖にコンジュゲートできる反応性部分を含んでもよい。
【００５８】
本発明の方法は、放射性標識又は他のタイプの標識を粒子に導入するために使用することもできる。すると、粒子は、診断又は粒子の治療活性のモニタリングに使用するのにも適したものとなる。
【００５９】
別の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための本発明による粒子に関し、好ましくは、前記粒子は薬物捕捉粒子であり、及び/又はその表面にコンジュゲートした治療用リガンドを含む。
【００６０】
本発明の更に別の態様は、本発明の粒子を使用した治療方法に関し、好ましくは、前記粒子は薬物捕捉粒子であり、及び/又はその表面にコンジュゲートした治療用リガンドを含む。
【００６１】
別の態様において、本発明は、本発明による粒子の使用に関し、前記粒子は、診断、例えばコンパニオン診断用として表面に結合したイメージング標識を含む。
【００６２】
本発明の態様及び/又は実施形態において、ポリマーは、場合によってポリマー鎖1つ当たり少なくとも1つの反応性部分を含み、それらのポリマー鎖の少なくとも一部は、ポリマー鎖1つ当たり少なくとも1つのアジド基又は少なくとも1つのアルキンを含む。また、本発明の態様及び/又は実施形態において、薬物は、少なくとも1つの反応性部分を含む。また、本発明の態様及び/又は実施形態において、リガンドは、少なくとも1つのアルキン基又は1つのアジド基を含む。好適な実施形態において、ポリマー鎖の少なくとも一部がアジド基を含み、リガンドがアルキン基を含む。
【００６３】
有利には、薬物は、架橋工程中にポリマーマトリクスに共有結合によって捕捉される。有利には、薬物は反応性部分を含み、ポリマー鎖も薬物の反応性部分と反応できる反応性部分を含み、薬物とポリマー鎖との共有結合を可能にする。架橋工程中に、ポリマーは薬物と共に網目を形成し、それにより薬物が捕捉されたポリマー-薬物マトリクスが形成される。粒子の形成後、少なくとも1つのアルキン基又は少なくとも1つのアジドを含むリガンドが、アジド基がアルキン基と反応して安定したトリアゾール結合を形成する条件下で薬物が捕捉された粒子と反応する。アジドとアルキンの反応は非常に穏やかであり、薬物又は薬物-ポリマー結合に影響しない、即ち、早期薬物放出及び/又はナノ粒子分解をほとんど又は全く誘発しない。
【００６４】
本発明のナノ粒子は、水性媒体中で自己集合してミセル構造となるコポリマーをベースとする。本発明によれば、ナノ粒子は、様々な粒径を用いて調製することができる。これは第1に、ナノ粒子を構築するブロックコポリマーの分子量を変えることにより達成され、第2に架橋剤のタイプと密度も影響を与える。これを、PEG-b-ポリ[N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド-ラクタート](mPEG-b-p(HPMAmLacn)ブロックコポリマーについて例示するが、上記のタイプの他のタイプのブロックコポリマーにも一般化できる。
【００６５】
したがって、これらのナノ粒子のサイズは、様々なポリマー長を有するブロックコポリマーを使用することにより調整でき、そのブロックコポリマーは、部分的に誘導体化されていてもよい。典型的には、本発明の方法及び粒子に使用されるポリマー鎖は、典型的には分子量が10,000〜30,000であるが、それよりも分子量が小さい又は大きいポリマー鎖も使用できる。
【００６６】
場合によって、使用されるブロックコポリマーは、PEG(例えばモノメトキシポリ(エチレングリコール);mPEG)のブロックのような固定された親水性のブロックと、可変の感熱性ブロックとを有し、PEGは例えば、Mnが約5000g/molのPEGであるが、それよりもMn値が高いものも低いものも同様に作用する。上述のように、本発明は、ナノ粒子形成ポリマー鎖の一部がアジド基又はアルキン基を含むという事実を利用する。アジド又はアルキン基は、好ましくは本発明の方法及び粒子に使用されるポリマー鎖の中のPEGに結合している。こうしたアジド基又はアルキン基は、それぞれアジド-PEG-OH分子又はアルキン-PEG-OH分子から出発し、これを開始剤中でmPEG-OHに代えて変換することにより導入してもよい。本発明において、場合によって1と30wt.%の間、より場合によって2と15wt.%の間、最も場合によって3と10wt.%の間、場合によって4と8wt.%の間、例えば最大で5wt.%のブロックコポリマー鎖がアジド基又はアルキン基を含有する。
【００６７】
モノメトキシポリ(エチレングリコール)の固定された親水性ブロックとHPMAmLac1及びHPMAmLac2のランダムコポリマーで構成される可変の感熱性ブロックを含有するこれらのブロックコポリマーは、開始剤(先に言及したアジド-PEG開始剤に加えて)として(mPEG5000)2-ABCPAを使用したフリーラジカル重合により合成される。これは、Rijckenら、Biomaterials 28(2007)5581〜5593頁及びNeradovicら、Macomolecules 34(2001)、7589〜7591頁に記載されている。モノマー/開始剤の供給モル比を20と300との間で変化させて分子量が異なる一組のブロックコポリマーを得た。ラクタート側鎖の末端水酸基を異なる架橋部分、例えばメタクリル酸若しくは2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルスルフィニル)酢酸-ピバロイル、又は他の架橋部分で誘導体化することにより、ナノ粒子のサイズを微調整することができる。
【００６８】
一般に、粒子は直径によって分類される。粗粒子は、10,000と2,500ナノメートルの間の範囲をカバーする。微粒子、例えばマイクロ粒子は、2,500と100ナノメートルの間の大きさである。超微粒子、例えばナノ粒子は、1と100ナノメートルの間の大きさである。本発明の場合、ナノ粒子は、0.1と1000ナノメートルの間、場合によって1と500ナノメートルの間、より場合によって5と250ナノメートルの間、より場合によって10と200ナノメートルの間、より場合によって30と150ナノメートルの間のサイズ範囲であってもよい。サイズは、標的細胞に取り込まれる能力に影響し得る。一般に、20〜200nmのサイズ範囲のウイルスサイズの粒子は、通常はエンドサイトーシスによって取り込まれて細胞性免疫反応を生じるが、500nmと5ミクロンの間のサイズの粒子は、主として食作用及び/又はマクロピノサイトーシスによって取り込まれて体液性免疫反応を促進する傾向が強い。特定の細胞には通常、取り込むことができる粒子の上限及び下限サイズがある。或いは、特定の細胞が本発明の粒子を取り込まないことを望む場合、当業者は、これらの細胞の範囲外のサイズを選択することができる。本発明の粒子は、特定の細胞を標的とすることを可能にする、所望のサイズに調整することができる。加えて、本発明の方法によって製造された粒子は、粒子の大部分が所望の粒径を有するように狭い分布を有し、したがって所望の細胞を標的とすることができる。
【００６９】
好適な実施形態において、本発明の粒子は、粒径分布が非常に狭く、これは、粒子の大部分が同じサイズを有することを意味する。場合によって、粒子は、多分散指数(DPI)が0.5未満、より場合によって0.4未満、更により場合によって0.3未満、より場合によって0.2未満、最も場合によって0.1未満であり、又は0.05未満でさえある。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】L2によるブロックコポリマーmPEG5000-b-pHPMAmLacnの誘導体化である(p及びmはそれぞれ、誘導体化されていないブロックコポリマー中に存在するHPMAmLac1単位及びHPMAmLac2単位の数であり;r及びsはそれぞれ、誘導体化されたブロックコポリマー中に存在する、誘導体化されていない単位及びL2誘導体化HPMAmLacn(n=1又は2)単位の数である)。
【図２】様々なDTX誘導体の合成スキームである。
【図３】薬物供給量約4mg/mlでの充填容量及び薬物捕捉効率である。
【図４】充填容量が異なる粒子の薬物放出である。
【図５】生理学的条件下(pH7.4、37℃)でのDTX捕捉CCL-PMからのDTXのin vitro放出である。データは、平均±SD(n=3)として表されている。
【図６】生理学的条件下(pH7.4、37℃)でのエンプティなCCL-PMの分解特性である。(A)はZ平均粒径、(B)は多分散指数、(C)は誘導計数率である。データは、平均±SD(n=3)として表されている。
【図７】アルキン誘導体化リガンドとアジド誘導体化ナノ粒子の付加環化からのトリアゾールの形成を示すスケジュールである。
【図８】RGD CriPecエンプティにおけるトリアゾール結合の形成を示すNMRスペクトルである。
【図９】RGDを有しない場合(左上)と1%RGDを有する場合(左下)のドキソルビシンを捕捉した35nmナノ粒子、及びRGDを有しない場合(右上)と1%RGDを有する場合(右下)のドキソルビシンを捕捉した65nmナノ粒子の総ドキソルビシン及び放出されたドキソルビシンの薬物動態学的プロファイルである。
【図１０】測定された放出されたドキソルビシンと総ドキソルビシンを組み合わせたものであり、サイズが異なる場合、及び粒子がRGD(1%)とコンジュゲートしているか否かで差がないことを示している。
【図１１Ａ】デスフェラール-BCNとN3-CriPecナノ粒子との反応である。
【図１１Ｂ】N3 CriPecナノ粒子とデスフェラール-BCNとの反応のNMRオーバーレイスペクトルである。
【図１２】BCN-DY751とN3-CriPecナノ粒子との反応である。
【図１３】4T1乳がん細胞を注入したヌードマウスにおける、CriPec(登録商標)ナノ粒子の原発腫瘍及び転移への集積である。
【図１４】Aは、生理学的な条件下(pH7.4)での、RGD標的指向性リガンドを含む場合と含まない場合のナノ粒子からのAHA1放出であり、Bは、弱酸性条件下(pH5.5)及び生理学的条件下(pH7.4)での、RGD標的指向性リガンドを含む場合と含まない場合のナノ粒子からのAHA1放出である。
【図１５】Aは、BCN-PEG4-NHSのSIINFEKLの末端NH2へのコンジュゲーションであり、Bは、SIINFEKL-BCNの5%N3 CriPecエンプティへのコンジュゲーションである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明は、薬物を含む粒子を提供する。粒子は、粒子内部に薬物を共有結合によって捕捉してもよい。加えて、本発明は、粒子の外表面上のリガンド又は薬物を提供してもよい。本発明の制御放出粒子は、1つの粒子内に数種の異なる薬物を同時に収容することで、異なる薬物が同じ部位で放出されるようにしてもよい。本発明の粒子は、充填容量が高いため、2種以上の異なる薬物を粒子中に捕捉できる。粒子の充填容量が高いので、活性の低い薬物の使用も可能である。例えば架橋粒子の外表面に特定のリガンドをコンジュゲートさせることにより、制御放出粒子に特定の標的部位への標的指向性を持たせることも可能である。加えて、薬物の放出プロファイルを必要に応じて調節することができる。本発明の粒子は、異なる分子及び薬物毎に異なるリンカーを使用することで、薬物毎に所望の放出を実現してもよい。それぞれが独自の放出プロファイルを有する異なる分子を用いて1つの系を生成してもよい。本発明の系は、(治療)効果の最適化のための真の調節可能な系を提供する。
【００７２】
本発明は更に、表面に共有結合した1つ又は複数のリガンドを含む粒子、及びそうした粒子を調製する方法を提供する。表面に結合させることができるリガンドの例としては、標的指向性リガンド、治療用リガンド、イメージングリガンド、又はそれらの組合せが挙げられる。そうした粒子は、捕捉した薬物を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００７３】
イメージングリガンドを含む粒子は、in vitro又はin vivoの両方で(非)侵襲的イメージングに特に有用である。こうした粒子は、粒子がイメージングのために化合物、系、細胞又は組織の特定の部分を標的とするように、有利には標的指向性リガンドを更に含む。イメージング標識を含む粒子が、イメージングのために、及び/又は診断用として好ましくは使用される。例えば、こうした粒子を、コンパニオン診断用として使用することができる。「コンパニオン診断」という用語は、本明細書において使用した場合、例えば、特定の患者に対する治療法の決定の指針とするために、治療用化合物、例えば本発明による薬物捕捉粒子のコンパニオンとして使用される診断用粒子を指す。コンパニオン診断は、例えば、粒子の分布を判定し、その結果として特定の患者に対するその適用可能性及び必要投薬量を判定するために、例えば、薬物捕捉粒子を用いた療法に先だって患者に施される。同じナノ粒子(例えば、サイズ及びポリマー鎖が同じ)が治療用粒子に関して診断用粒子に使用される場合、診断用粒子は、療法に先立ち治療用ナノ粒子の薬物動態及び生体内分布プロファイルを理解する手掛かりを得るのに特に適している。これはまた、サイズ、分解プロファイル等、可変の薬学的特性を持つナノ粒子の様々なプロファイルの差異の評価を可能とし、療法に先立ち最も適切な治療用粒子の選択を可能とする。共有結合によって捕捉された薬物と、表面に結合したイメージングリガンド又は表面に結合した治療用リガンド及びイメージングリガンドの両方を含む本発明による粒子は、例えば、イメージングと療法の組合せに、即ち、セラグノスティクスとして使用される。
【００７４】
本発明の粒子は、以下に対する完全な制御により、特注の最適化された薬物捕捉粒子にとって本質的に必要とされる要素を最良の形で含んでいるため、柔軟性がある。
【００７５】
・1つ又は複数の特定の分子、例えばリガンドの共有結合によるコンジュゲーションを可能にする粒子の外表面における反応性部分の範囲の可能性。
【００７６】
・粒子の特定の効果の明確な評価を可能とし、先行技術に開示されているようなより不均一なナノ粒子分散物に存在するわずかな割合の非常に大きい粒子又は非常に小さい粒子による望ましくない障害副作用を防止する、粒径分布が非常に狭い特定のサイズの粒子を提供する粒子の製造方法。先行技術から、目的毎に粒子の最適化が必要であるように思われる。本発明の系は、その均質性、安定性、及び純度のために、真に粒子を最適化できるという利点を提供する。粒子は、遙かに大きい粒子若しくは小さい粒子、又は遊離薬物若しくはリガンドのような不純物を含まずに製造することができる。薬物が共有結合によって捕捉されるため、粒子は遊離薬物から容易に精製できる。薬物がポリマーマトリクスに共有結合されているので、粒子は、保存中長時間安定している。こうして、観察される効果は意図した粒子に由来するものであって、不純物に由来するものではないことが確認される。加えて、リガンドの粒子へのコンジュゲーションは非常に穏やかであり、そのため、粒子中に捕捉された薬物に有意な影響を及ぼさない。更には、リガンドの表面へのコンジュゲーションは非常に効率的であり、安定した結合を生成し、結果として、精製及び調合のような処理の際にリガンドはほとんど、或いは本質的に全く除去されることはない。重要なことには、コンジュゲートした正確な量をモニターすることができ、こうして、観察される効果は、意図したリガンド標的化粒子に由来するものであって、遊離リガンド等の不純物に由来するものではないことが確認される。また、リガンドのコンジュゲーションはナノ粒子のサイズに最小限の影響しか及ぼさない。そのため、追加の最適化を必要とせずにリガンドの異なる粒子の使用が可能である。
【００７７】
・本発明の粒子製造方法は、形成された粒子の表面上のリガンドだけでなく、ポリマーマトリクス内部に存在する2種以上の異なる薬物の幾つかの異なる組合せを有する粒子を製造するための柔軟性を提供する。架橋及び/又は表面改質の後、薬物を含む粒子は、精製が容易な真に単一の巨大分子となる。この高純度は、治療作用に関する基本的な作用機序を詳細に評価するために不可欠であるだけでなく、薬物の安全性及び医薬的特性評価に関する大きな進歩を表すものでもある。
【００７８】
・本発明は、一定範囲の親水性及び疎水性いずれかの、広いサイズ範囲にわたる化合物の捕捉を可能とする。本発明の粒子は、親水性又は疎水性の活性剤に限定されない。ポリマーマトリクスへの薬物の架橋は、疎水性及び親水性アジュバント、並びに薬物をポリマーマトリクス内に捕捉することを可能にする。
【００７９】
・本発明は、様々なクラスの多種多様な薬物、例えば、巨大分子、タンパク質、ペプチド、ホルモン、小分子、例えば合成化学物質、若しくはmRNA、siRNA、shRNA及びDNA分子等の核酸分子、アプタマー、又はそれらの任意の組合せの共有結合による捕捉を可能とする。
【００８０】
・薬物は、タンパク質又はペプチドであってもよく、生理学的な条件に暴露したときの凝集又は沈殿のような物理的な変化だけでなく、化学的及び酵素的分解を受けやすいものであってもよい。本発明の粒子は、タンパク質の捕捉を提供することで、体内への導入後に(酵素)分解からそれらを保護してもよい。粒子は、非常に高密度であり、それによって粒子のコアへの酵素の浸透を阻害し、それによりタンパク様薬物を効果的に保護するものであってもよい。
【００８１】
・本発明の粒子は、稠密で無損傷なものであってもよく、そのため、マクロファージ取り込みを制限し、更なる治療標的化が可能である。本発明の粒子は、腫瘍及び炎症組織における高度な蓄積だけでなく、長期血中滞留が認められている。
【００８２】
・本発明の粒子は、架橋により最初は安定しているが、経時的には生分解性でもある。安定性は、バースト放出を防止し、薬物を血液循環により長く保持することで、より長期間にわたり正しい標的細胞を活性化する可能性を高める。時間と共に、捕捉された化合物、例えば薬物が放出される。加えて、本発明の粒子は、分解して小さな断片となる。
【００８３】
・本発明の粒子は、所望の薬物放出動態に調節してもよい。所望の分解速度を得るために架橋のタイプ及び架橋密度を調節してもよい。以下の実験が示すことであるが、架橋のタイプ及び架橋密度が、薬物放出の動態を決定する。こうして、粒子は、短期から長期まで、所望の薬物放出動態を求めて調節される。例えば、粒子の分解は、リンカーのタイプ及び架橋密度に応じ、生理学的な条件下で約30日を要してもよく、200日、更には約400日を要してもよい。
【００８４】
・本発明の粒子においては薬物リンカーのタイプを調節することが可能であり、したがって、(より)長期にわたり持続する薬物暴露を伴う粒子を製造できる。
【００８５】
・薬物を異なるリンカーとコンジュゲートさせることが可能である。その結果、様々な薬物の放出プロファイルが可能となる。薬物は、異なる反応基を有していてもよいが、系は、異なるリンカーを許容し、そのため、これらの異なるリンカーを異なる反応基を薬物に結合させるために使用することで、より多くの異なる薬物の使用が可能となる。これが、誘導体形成及び/又は精製に対して更なる制御及びリンカー特異性を提供し、柔軟性を向上できる。異なるリンカーは、1つの粒子からの薬物放出速度を異なるものとすることが可能であり、例えば、異なる薬物又は1種類の薬物でも、急速放出と緩徐放出の両方の使用を可能とする。
【００８６】
・本発明の方法は、非常に柔軟である。共有結合によるコンジュゲーションによって薬物を捕捉し、場合によって、更に表面にリガンドが共有結合した粒子の合成を提供する。
【００８７】
・本発明の方法は、薬物が共有結合によって捕捉されているために本発明の粒子中で安定しているだけでなく、リガンドも表面に安定してコンジュゲートしているので、非共有結合によって捕捉された薬物又はリガンドを除去するための精製が容易である。本発明の粒子は、一度に1つのパラメータの明確な評価を可能とする高いバッチ間再現性を有して高度に制御可能であり、広範に適用可能でもある。これにより、製造の最適化だけでなく、治療用途の最適化も容易である。
【００８８】
特に、一実施形態において、本発明は、ポリマー担体又は高分子デバイス、例えばミセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ヒドロゲル、及び他のタイプのワクチン接種用ポリマー担体又はデバイスに、場合によって共有結合によって捕捉又は結合させた薬物をもたらす。薬物は、粒子内に共有結合によって捕捉され、及び/又は高分子デバイス又は担体に結合している。
【００８９】
本発明の一実施形態及び/又はその複数の実施形態において、粒子は制御放出系であり、緩徐放出、持続放出、拍動放出、及び遅延放出を含むあらゆる種類の制御放出を包含することができる。
【００９０】
本発明に関し、当然のことであるが、粒子は、ナノ粒子及び/又はマイクロ粒子であってもよい。
【００９１】
ナノ粒子は、疾病に対する治療的使用のための有望な候補であると考えられる。本発明の粒子は、疎水性化合物及び親水性化合物の両方を含む、広範な種類の薬物を含有してもよい。適切な粒子は、WO2010/033022に記載されている。
【００９２】
本発明の粒子及び/又はその実施形態において、薬物はまず、水性環境において非共有結合によってポリマー相、とりわけ、ポリマーが豊富な相に捕捉され、続いて3Dポリマー網目に共有結合によってコンジュゲートされる。
【００９３】
薬物捕捉粒子を調製する方法の工程(ii)において、粒子の形成時、薬物及び/又は複数の薬物が、物理的に、又は非共有結合によって捕捉される。或いは、代替的な方法では、薬物が形成された粒子と混合される工程(iii)において、薬物が物理的に、又は非共有結合によって捕捉される。架橋工程では、薬物及び/又は複数の薬物が共有結合によって捕捉され、薬物が粒子の内部に共有結合によって捕捉された粒子となる。なお、先行技術は、薬剤の存在無しに最初に架橋工程を実施する系を開示していることに留意されたい。本出願の発明においては、薬物は架橋工程時に存在し、それによって、薬物はポリマーマトリクスに共有結合する。また、薬物を粒子の表面に結合する場合、薬物は、粒子のポリマーマトリクスに共有結合する。
【００９４】
本発明及び/又はその実施形態の粒子は、まず薬物をポリマーと混合し、続いてポリマーを架橋してポリマーマトリクスを形成することで調製される。架橋は、それぞれ重合可能な部分を用いて誘導体化されたポリマー及び薬物を用い、フリーラジカル開始剤の存在下で行ってもよいが、例えば他のタイプの共有結合コンジュゲーションリンカーも使用可能である。
【００９５】
薬物を共有結合によって捕捉及び/又はコンジュゲートさせた粒子は、先に説明したように、幾つかの利点を有し得る。結果として得られる粒子は、治療的、治癒的、又は予防的特性を有し得る。本発明及び/又はその実施形態の粒子は、薬物を必要とされる場所に供給するための調節可能な系を提供することができる。加えて、粒子は、所望の場所及び/又は特定の細胞型を標的とするために、リガンドを付着させてもよい。治療用リガンドのコンジュゲーションによる粒子中への薬物の捕捉は、これらの化合物を例えば経口又は皮下投与による治療に適するものとすることができる。
【００９６】
工程(i)において、ポリマー鎖は、場合によって互いに相互作用(下記参照)し、水相中でポリマー副相を形成する。即ち、相対的にポリマー鎖が豊富な相と相対的にポリマー鎖が乏しい相が創出される。好適な実施形態において、薬物はポリマー鎖が豊富な相に存在する。ポリマー鎖が豊富な副相における薬物のサブ位置は、薬物とポリマー鎖との間の物理的な相互作用に基づいて生じる。
【００９７】
工程(i)において、薬物は、ポリマー鎖と共有結合コンジュゲートを形成しない。架橋工程(ii)又は(iii)においてのみ、薬物とポリマー鎖が共に3D網目を形成する。
【００９８】
薬物は、高分子担体又はデバイスを形成しているポリマーの架橋と同時に、場合によってリンカー分子を介してポリマー担体に共有結合する。工程(ii)又は(iii)で形成される架橋された薬物-ポリマーコンジュゲートは、非架橋ポリマー粒子よりも高い熱力学的安定性を呈する。加えて、捕捉された薬物分子は、高分子担体への共有結合のために、急速放出が防止される。
【００９９】
本発明の粒子は、粒子形成の前に薬物を単一のポリマー鎖に直接カップリングすること必要とせず、そのため、使用するポリマーの初期特性、例えば感熱特性及び/又は薬物充填粒子形成の容易さを十分に保持する。固定タイプのポリマー、例えば感熱性生分解性ブロックコポリマーの使用は、薬物捕捉デバイスの組成の迅速で容易な変化/最適化を可能にする、広範囲に適用可能なプラットホーム技術を提供する。
【０１００】
本発明の粒子は、架橋後に高分子担体を形成可能なポリマー鎖と非共有結合によって相互作用可能な全ての薬物に適用可能である。水相中で、ポリマー鎖(架橋工程前の)は、場合によって特定の構造、又は少なくともポリマー鎖が豊富な領域に集まり、薬物は、これらの集合体内に局在する。あらゆるタイプの物理的相互作用が可能である(以下参照)。
【０１０１】
唯一の更なる要件は、薬物が、高分子粒子の基礎を形成するポリマー鎖の部分と反応できる部分を含有する(又は、反応性の置換基で修飾可能である)ことである。場合によって、薬物は、アルキン基又はアジド基を含まない。
【０１０２】
好適な実施形態において、薬物は、リンカー分子、場合によって分解性リンカーを備えている。したがって、本発明の好適な薬物捕捉粒子では、薬物は、分解性リンカーを介してポリマーマトリクスに結合している。
【０１０３】
粒子コアのような担体のコアにおける薬物の共有結合による捕捉により、薬物は、最初は遊離せず、「バースト放出」されない。薬物は、体内における架橋担体の長期滞留及び/又は血液循環の恩恵を受け、それにより注入部位及び/又は血流中でデポとして作用し、同時に、標的組織、例えば腫瘍、リンパ節、又は炎症組織における高薬物濃度に繋がる可能性がある。加えて、本発明の粒子は、凍結乾燥させることで、長期製品安定性を得ることができる。例えば、薬物充填粒子を含む本発明による粒子は、形態を失わせることなく凍結乾燥させてから懸濁させることが容易であり、乾燥粉末として長期保存可能期間が得られる。これは、とりわけ、冷蔵を必要としない、及び/又は乾燥粉末である粒子が好適な発展途上国において、有利である。
【０１０４】
結果として得られる薬物充填高分子デバイスは、薬物の早期放出(バースト放出)を示さないが、例えば、非経口投与時に、注入部位及び/又は血液循環において長期滞留を示す。本発明の一実施形態及び/又はその複数の実施形態において、薬物は、場合によってそれぞれ独自の特定の放出速度を有する捕捉された化合物の経時的持続放出を可能とする適切なリンカーを含む。これは、(大幅に)増強されたがん細胞に対する標的指向性、及びがん組織への集積をもたらすことで、治療作用を増大させることに繋がり得る。
【０１０５】
本発明の一実施形態及び/又はその複数の実施形態において、薬物は、リンカー、場合によって分解性リンカー又は場合によって生分解性リンカーを介してポリマーマトリクスに捕捉される。こうした系は、薬物の脈動放出又は定量放出を可能とする。以下に説明し詳細に述べるように、担体からの薬物の制御放出は、生理学的な条件下での薬物と高分子担体との間の場合によって分解性であるリンカー若しくは連結基の切断によって、又は局所的環境要因若しくは外部刺激によって達成される。加えて、捕捉は、捕捉がなければ遊離薬物、又は非共有結合によって捕捉された薬物を静脈内投与した直後に存在し得る、毒性のある高薬物ピークレベルに血液が暴露されることを防止する。更に重要なことに、通常の組織への系の移動を防止することにより、急性毒性効果を減少させることができる。反対に、薬物は、架橋ミセルのコアのような形成される架橋されたポリマー担体の三次元網目に閉じ込められることで環境から完全に保護され、それにより、早期の分解及び/又はクリアランスが防止される。これらの独特な態様は、薬物を正しい場所と時間に、予想される有効用量で送達する。
【０１０６】
或いは、本発明の一実施形態及び/又はその複数の実施形態において、粒子表面上のリガンドは、粒子の外表面に存在することで標的とされる細胞が利用可能であるため、放出される必要はない。
【０１０７】
本発明の粒子を製造する段階的方法は、2つの必須の連続工程を含む。
【０１０８】
第1の工程において、水性環境で架橋性ポリマーと薬物を混合する。これは、場合によって水又は水混和性溶媒、例えばエタノールのような低級アルコール、テトラヒドロフラン、又はジメチルスルホキシドであってもよい適切な溶媒中の薬物を、場合によって水性のポリマー溶液又は分散液に添加することにより達成される。存在するポリマーと薬物は、ポリマーと薬物が密に接触するように選択され、好適な実施形態においては、薬物はポリマー鎖と接触する。換言すれば、第1の工程において、ポリマー鎖と薬物との物理的な非共有結合による相互作用が、高分子デバイスの特定の領域における化合物の選択的局在をもたらす。
【０１０９】
第1の工程の結果として、薬物を形成している分子が溶液中のポリマー鎖の中及び間に非共有結合によって捕捉される。本明細書及び添付の請求項において、「非共有結合による相互作用」という概念は、共有結合ではない何らかの相互作用、即ち、結合が電子対の共有を伴わない原子又は結合間の何らかの結合を意味する。非共有結合による相互作用の例は、疎水性、芳香族性、水素結合性、静電気性、立体錯体性、及び金属イオン性相互作用である。
【０１１０】
本発明の粒子の製造方法の架橋工程では、第1の工程に続き、非共有結合によって捕捉された薬物が、新しく形成される/形成されたポリマー網目に共有結合される。即ち、反応が行われ、ポリマー鎖が架橋される。これは、分子間及び分子内の両方で起こる可能性があるが、分子間の架橋が明らかに好適であり、分子間の架橋に有利な工程はいずれも、本発明が請求する方法の好適な実施形態である。架橋工程と同時に、薬物の反応性部分もポリマー鎖に共架橋し、ポリマーと薬物の絡み合う網目が形成される。適切には、ポリマーは2つ以上の反応基を含み、2種以上の薬物と反応し得る。場合によって、ポリマーは、互いに反応できる異なる反応基を含むことで、ポリマーと薬物の3D網目を形成する。2種以上の異なる反応基を含むポリマーを使用してもよい。加えて、異なる反応基が、異なるポリマー上存在してもよい。場合によって、反応基はアジド基ではない。場合によって、反応基はアルキン基ではない。
【０１１１】
この工程は、開始剤及び/又は触媒を必要とすることがあるが、物理的な環境もまた架橋及びコンジュゲートを形成する反応を引き起こし得る。開始剤及び/又は触媒が必要な場合、これらはポリマー溶液に薬物と共に添加してもよいが、それよりも早い段階又は遅い段階で反応系に添加することもできる。
【０１１２】
薬物の組み込みの程度、即ち捕捉効率が95〜100%と高いことがあるため、形成された3D網目には多量の薬物が組み込まれる場合がある。
【０１１３】
本発明の粒子の充填容量は、少なくとも10%、11%、12%、13%若しくは14%になり、又は、少なくとも15%、16%、17%、18%若しくは19%にさえなり、又は、少なくとも20%、21%、22%、23%若しくは24%にさえなり、又は、少なくとも25%、26%、27%、28%若しくは29%にさえなり、少なくとも30%、少なくとも32%、少なくとも35%、少なくとも37%にさえなり、又は、少なくとも40%にさえなり得る。好ましくは、本発明の粒子の充填容量は、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも12%、より好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも17%、より好ましくは少なくとも18%、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも21%である。
【０１１４】
充填容量は、捕捉された薬物の重量を粒子又はポリマーの重量で除し、%で表したものである。粒子の調製時に工程(i)又は工程(ii)においてポリマー供給量又はポリマー濃度に対して薬物供給量又は薬物濃度を上昇させると、充填容量が上昇する。典型的な薬物濃度又は薬物供給量は、0.1mg/ml〜50mg/mlの範囲であってもよい。場合によって、薬物供給量又は薬物濃度は、0.5mg/ml〜40mg/ml、場合によって1mg/ml〜30mg/ml、場合によって1.5mg/ml〜25mg/ml、場合によって2mg/ml〜20mg/ml、場合によって2.5mg/ml〜15mg/ml、場合によって3mg/ml〜12mg/ml、場合によって3.5mg/ml〜10mg/ml、場合によって4mg/ml〜8mg/ml、場合によって4.5〜7mg/ml、場合によって5〜6mg/mlの範囲である。
【０１１５】
薬物:ポリマー重量比は、場合によって0.01〜10、場合によって0.05〜8、場合によって0.1〜6、場合によって0.15〜5、場合によって0.2〜4、場合によって0.25〜3、場合によって0.3〜2.5、場合によって0.35〜2、場合によって0.4〜1.5、場合によって0.45〜1、場合によって0.5〜0.75の範囲である。
【０１１６】
本発明の粒子の薬物捕捉効率は、驚くべきことに、高いことも見出された。薬物捕捉効率は、捕捉された薬物の重量を粒子に供給された薬物の重量で除し、%で表したものである。本発明の粒子の場合、薬物捕捉効率は、少なくとも30%になり、又は、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%にさえなり、少なくとも80%にさえなり得る。
【０１１７】
本発明の粒子の充填容量は、粒径分布に影響しないことが発見された。したがって、充填容量が10%、11%、12%、13%若しくは14%であり、又は、少なくとも15%、16%、17%、18%若しくは19%でさえあり、又は、少なくとも20%、21%、22%、23%若しくは24%でさえあり、又は、少なくとも25%、26%、27%、28%若しくは29%でさえあり、少なくとも30%、少なくとも32%、少なくとも35%、少なくとも37%若しくは少なくとも40%でさえある粒子は、0.5未満、場合によって0.4未満であり、場合によって0.3未満でさえあり、場合によって0.2未満であり、場合によって0.1未満、又は、場合によって0.05未満の狭い多分散指数(DPI)を有することができる。
【０１１８】
したがって、充填容量が10%、11%、12%、13%若しくは14%であり、又は、少なくとも15%、16%、17%、18%若しくは19%でさえあり、又は、少なくとも20%、21%、22%、23%若しくは24%でさえあり、又は、少なくとも25%、26%、27%、28%若しくは29%でさえあり、少なくとも30%、少なくとも32%、少なくとも35%、少なくとも37%若しくは少なくとも40%でさえある粒子は、サイズが0.1と1000ナノメートルの間、場合によって1と500ナノメートルの間、場合によって5と250ナノメートルの間、場合によって10と200ナノメートルの間、及び場合によって30と150ナノメートルの間の範囲であってもよい。
【０１１９】
本発明及び/又はその実施形態の好適な方法によると、両親媒性のポリマーを完全に溶媒に溶解させてもよい。
【０１２０】
薬物は、溶媒中に存在してもよく、前記ポリマーの溶解後、更には自己集合して結合していない粒子になる際に添加してもよく、薬物は、ポリマー又はミセル溶液に広く分散する。
【０１２１】
次いで、この系を、ポリマーの一部がポリマーの他の部分とは異なる挙動を示し、クラスタ化が起こる状況に繋がる特定の状況(例えば、温度、pH、溶媒)の変化に曝してもよく、
薬物の物理的性質のため、これらの薬物は、新たに形成されたクラスタ化した高分子溶液中の特定の領域に局在し、
この局在化の後、架橋が起こって薬物を好適な領域に固定する。
【０１２２】
場合によって、感熱性ブロックコポリマーが使用される。例えば、薬物を、非架橋の感熱性ブロックコポリマーも存在する水性の環境において、その下限臨界溶液温度(LCST)よりも低い温度、又はその臨界ミセル形成温度(CMT)よりも低い温度で混合する。このLCSTよりも低い温度では、系は溶液の状態であり、このCMTより低い温度では、ミセル形成は起こらない。しかし、こうした系を加熱することで、粒子又は粒子が形成され、それによりその疎水性のコアに薬物が捕捉される。或いは、工程(i)において薬物を含まないエンプティな粒子が形成される。続いて薬物溶液がエンプティな粒子に添加される。次に、コアの中に絡み合うミセル網目を形成する架橋反応も、LCST又はCMTよりも高い温度で行う。この架橋反応は、ポリマー溶液の加熱前、又は非架橋粒子又は粒子の形成後に開始剤及び/又は触媒を添加することによって促進することができる。最初にナノ粒子を形成し、次いで架橋前に薬物を添加する方法が、ペプチドに非常に適したものとなり得る。
【０１２３】
本発明及び/又はその実施形態の方法の別の実施形態において、ポリマーは、粒子を製造するために過酷な条件を必要としない。適切には、粒子の形成には、薬物に害を及ぼし得る有機溶媒及び/又は他の化学物質若しくは溶媒を使用しない。本発明において使用し得る適切なポリマー鎖は、例えば、感熱性ブロックコポリマーである。特に、部分的にメタクリル化されたオリゴラクタート単位を有するPEG-b-ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクタート)をベースとするコポリマーが好適である。様々な他の(メタ)アクリルアミドエステル、例えば、HPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)又はHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)のエステル、場合によって(オリゴ)乳酸エステル、及びN-(メタ)アクリロイルアミノ酸エステルを使用して感熱性ブロックを構成することができる。好適な感熱性ブロックコポリマーは、メタクリラート基によって修飾されていてもよい官能基を含有するモノマーから誘導され、例えばHPMAm-ラクタートポリマーである。
【０１２４】
使用し得る他のタイプの官能性感熱性(コ)ポリマーは、疎水的に修飾されたポリ(N-ヒドロキシアルキル)(メタ)アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)と反応性官能基(例えば、酸性アクリルアミド及び他の部分、例えばN-アクリロイルオキシスクシンイミド)を含有するモノマーとのコポリマー組成物、又はポリ(アルキル)2-オキサザリンの同様のコポリマー等である。
【０１２５】
更なる好適な感熱性基は、NIPAAm及び/又はアルキル-2-オキサキソリンをベースとするものであってもよく、これらのモノマーは、反応性官能基を含有するモノマー、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基又はスクシンイミド基を含有する(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリラートと反応してもよい。
【０１２６】
適切な感熱性ポリマーは、US-B-7,425,581及びEP-A-1 776 400に記載されている。
【０１２７】
ただし、必ずしも感熱性ではなく、架橋性反応基を含有するか、架橋性反応基で修飾されていてもよい他のタイプの両親媒性ブロックコポリマー又はイオン性粒子も使用し得る。このような場合、最先端の方法、例えば直接溶解、透析、塩析及び溶媒蒸発を使用して粒子及び/又は粒子を形成することができる。
【０１２８】
水中でポリマーに富む相に適合し(例えば、疎水性の相互作用又はイオン相互作用のために)、反応性部分を含有するか反応性部分を結合させるために使用できる部分を含有するこれらの他のタイプのポリマーは、例えば、PEG-PLA-メタクリラート(例えば、Kimら、Polym. Adv. Technol.、10(1999)、647〜654頁に詳細に記載されているもの)、メタクリル化PLA-PEG-PLA(例えば、LeeらによるMacromol. Biosci. 6(2006)846〜854頁に記載されているもの)、メタクリル化PEG-ポリカプロラクトン(例えば、HuらによりMacromol. Biosci. 9(2009)、456〜463頁に記載されているもの)、更にポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、及び/又はポリカプロラクトンをベースとする他の反応性部分を含有する(ブロックコ)ポリマーである。
【０１２９】
加えて、イオン相互作用のために粒子を形成できるポリマー、例えば、ポリ(エチレンオキシド)-b-ポリメタクリル酸コポリマーと二価の金属カチオンのブロックイオノマー複合体(例えば、KimらによりJ. Control. Rel. 138(2009)197〜204頁に記載されているもの、及びBonthaらによりJ. Control. Rel. 114(2006)163〜174頁に記載されているもの)、ポリ(エチレングリコール)とポリ(アミノ酸)のブロックコポリマーをベースとするポリイオン錯体(例えば、Leeら、Angew. Chem 121(2009)5413〜4516頁; Nishiyamaら、Cancer Res. 63(2003)、8977〜8983頁、又はMiyataら、J. Control. Rel. 109(2005)15〜23頁に教示されているもの)を使用してもよい。
【０１３０】
一般に、適切な溶媒系において異なる副相を創出できるポリマーは全て、そうした副相において選択的に局在化できる薬物と共に使用可能である。
【０１３１】
ポリマー鎖と薬物は、反応性部分を含有するか、それらが反応性部分を含有するように修飾されていてもよい。使用するポリマーは、架橋し薬物の反応基と反応できる十分に多数の反応性置換基を含有する必要がある。適切な結果は、ポリマーのモノマー単位の例えば10〜15%、15〜20%、20〜25%、25〜30%、30〜35%、35〜40%、40〜45%、又は45〜50%が反応性の置換基を有するときに得られる。ただし、最大100%のモノマー単位が反応性置換基で誘導体化されていてもよい。例えばモノマー単位の50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%が反応性の置換基で誘導体化されていてもよい。また、モノマー単位の1〜10%、2〜8%、3〜7%、4〜6%、及び2〜5%が反応性置換基で誘導体化されていてもよい。
【０１３２】
また、薬物は、薬物-ポリマーマトリクスが形成されるように、場合によってポリマーに対して架橋できる反応性の置換基を有する。本発明の好適な実施形態及び/又はその複数の実施形態において、薬物は、架橋できる少なくとも1つの反応性部分又は置換基を有する。場合によって、2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ又は5つの反応性部分が薬物上に存在する。場合によって、薬物は、アルキン基を含まない。当然のことであるが、大きい分子は小さい分子よりも多数の反応性部分を有することができ、そのため、反応性部分の量は、薬物のサイズに大きく依存する。薬物は、大きな生体分子であってもよく、したがって、5個を超える、又は10個さえ超える、又は15個さえ超える、又は20個さえ超える、又は25個さえ超える反応性部分を含有してもよい。本発明の文脈において、反応性部分、反応性置換基、及び反応基は、交換可能に使用され、いずれも架橋及び別の分子への結合のような作用が可能な基を意味する。場合によって、反応基又は反応性部分は、アジド基ではない。場合によって、反応基又は反応性部分は、アルキン基ではない。
【０１３３】
薬物の放出速度は、異なるタイプのリンカーを使用して反応性部分を薬物にコンジュゲートさせることにより、容易に制御できる。周知の分解性リンカー分子の適切なタイプとしては、エステル、炭酸塩、イミン、カルバミン酸塩、コハク酸塩若しくはオルト(オキシム)エステル、ケタール、アセタール、ヒドラゾン、及び酵素分解性リンカー(例えば、ペプチド)、又はこれらの組合せが挙げられるが、これに限定されない。加えて、あらゆるタイプの周知の刺激応答性リンカー、例えば光/温度/超音波応答性リンカー及び他のリンカーも使用できる。薬物を修飾する場合、放出時に、薬物のみが放出され、その完全な活性を確保するため、他の活性を有する誘導体は放出されないように、コンジュゲーションのタイプが考慮される。生分解性結合を使用することにより、元の薬物は、特定の制御放出プロファイルに従って放出され、その後、その活性、とりわけ、その免疫原性効果又は刺激的効果を発揮する。
【０１３４】
本発明の粒子は、捕捉された、又は他の方法で組み込まれた制御放出用の薬物を含む、ミセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ヒドロゲル、及び他のタイプのポリマー担体又はデバイス、例えば捕捉された薬物を含むコーティングを有するデバイスのようなポリマー担体である。
【０１３５】
前記のように、架橋工程は、本発明の方法に必須である。本発明による適切な架橋は、エステル結合、ヒドラジン結合、アミド結合、シッフ塩基結合、イミン結合、アセタール結合、及びそれらの潜在的な対応する誘導体を含む類似の生分解性結合からなる群から選択される結合をもたらす架橋である。本発明による適切な架橋は、アルコール、酸、カルボキシル、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン等から選択される反応性部分との架橋である。また、光重合が適切である(Censiら、J. Control Rel 140(2009)230〜236頁)。反応性部分は、ポリマー鎖中に存在してもよく、及び/又は薬物中に存在してもよく、及び/又は結合分子上に存在してもよい。場合によって、リンカー又はポリマーは、複数の結合を形成するように、2つ以上の反応性部分を含む。
【０１３６】
場合によって、架橋は、生分解性結合を生じる。
【０１３７】
薬物が分解性リンカーを介して捕捉される場合、治療的活性を有する化合物の定量放出が確保される。以下に説明し詳述するように、担体からの薬物の制御放出は、生理学的な条件下での活性原材料、例えば薬物と高分子担体の間の場合によって分解性であるリンカー若しくは連結基の切断によって、又は局所的環境要因若しくは外部刺激によって達成される。分解性リンカーの適切な例は、WO2012/039602に見出すことができ、これは、参照することにより組み込まれる。
【０１３８】
そうしたリンカーは、以下の式で例示することができる:
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
-  式中、n及びmは、0〜20、場合によって1〜10の整数であり、場合によって、nは、1〜5、更に場合によって1〜3の整数であり;mは、1〜7、更に場合によって1〜5の整数であり;
-  R1及びR2は、互いに独立して孤立電子対、酸素部分、例えば=O、窒素部分、例えば=N-Rxから選択され、ここで、Rxは、均一又は不均一な原子群であり、場合によって、独立して直鎖又は分岐C1〜C6アルキル、直鎖又は分岐C1〜C6アルケニルであり、そのアルキル又はアルケニル基は、1つ又は複数のハロゲン基、水酸基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基で場合によって置換されていてもよく;或いは、芳香族基であり、場合によって、アルキル及びアルケニル基について記載した置換基のうちの1つ又は複数により場合によって置換されていてもよいフェニル基であり;或いは、ハロゲン基、水酸基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は1つ又は2つのC1〜C3アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基、又はシアノ基であり;
-  Aは、結合部分であり;
-  Qは、直接結合、C=O、C=NH又はC=NRp基であり、ここで、RpはC1〜C3アルキルである。この式中、HO-Q基はHR9N-Q基で置き換えることができ、ここで、R9は、水素原子又はC1〜C3アルキル基のいずれかとすることができる。
【０１３９】
以下の好適なリンカー式において、HO-Q基はカルボン酸基であり、コンジュゲーション部分Aは、重合性メタクリラートであり、これらの部分は以下の実施例においても例示される。
【０１４０】
【化１】
2018534320.tif 000002
【０１４１】
当然のことであるが、上記例は限定されず、例えば、メタクリラート基は、本明細書に記載されているような任意の重合性基で置換されていてもよい。適切なコンジュゲーション基は、式-PL-RvC=CRuRwの重合性部分であり、ここで、-PL-は、連結基、例えば-O-、-NH-、置換された-N-であり、置換基はC1〜C3アルキル、-O-C(O)-、-O-(C(O))r-C6H26-であり、ここで、rは、0又は1であり、bは、1〜6の整数であり;Ru、Rv及びRwは、独立して水素原子又はC1〜C3基を表す。
【０１４２】
場合によって、ポリマーの末端は、それぞれアルキン基又はアジド基を含むリガンドと相互作用し得るアジド基又はアルキン基を含む。ポリマーの末端にあるアジド基又はアルキン基のみが、追加の官能性を採用してもポリマーの物理的化学的特性が変化しないことを保証する。驚くべきことに、アジド基又はアルキン基は粒子形成及び架橋反応を受けることがあり、リガンド上のアルキン基又はアジド基への結合を形成するこれらの工程後も活性状態を維持することが発見された。適切には、アジド基又はアルキン基は、それぞれアジド-PEG-OH分子又はアルキン-PEG-OH分子から出発し、これを開始剤中でmPEG-OHに代えて変換することにより導入してもよい。次いで、アジド-PEG開始剤又はアルキン-PEG開始剤を使用し、それぞれアジド基又はアルキン基でポリマー鎖を誘導体化する。本発明において、場合によって1と30wt.%の間、より場合によって2と15wt.%の間、最も場合によって3と10wt.%の間、例えば最大で6wt.%のコポリマー鎖がアジド基を含有してもよい。
【０１４３】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、ポリマー鎖は、ポリマー鎖1つ当たり少なくとも1つのアジド基、場合によってポリマー鎖1つ当たり1つのアジド基を、場合によって末端位置に含む。
【０１４４】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、ポリマー鎖は、ポリマー鎖1つ当たり少なくとも1つのアルキン基、場合によってポリマー鎖1つ当たり1つのアルキン基を、場合によって末端位置に含む。
【０１４５】
したがって、本発明は、ポリマーがアジド基によって官能化又は誘導体化され、リガンドがアルキン基によって官能化又は誘導体化される方法及び生成物に関する。
【０１４６】
したがって、本発明は、ポリマーがアルキン基によって官能化又は誘導体化され、リガンドがアジド基によって官能化又は誘導体化される方法及び生成物に関する。
【０１４７】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、1500個のうち1個のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化され、場合によって1500個のうち2個、場合によって1500個のうち5個、場合によって1500個のうち7個、場合によって1500個のうち10個、場合によって1500個のうち15個、場合によって1500個のうち20個、場合によって1500個のうち25個、場合によって1500個のうち30個、場合によって1500個のうち35個、場合によって1500個のうち40個、場合によって1500個のうち45個、場合によって1500個のうち50個、場合によって1500個のうち55個、場合によって1500個のうち60個、場合によって1500個のうち65個、場合によって1500個のうち70個、場合によって1500個のうち75個、場合によって1500個のうち100個、場合によって1500個のうち150個、場合によって1500個のうち200個、場合によって1500個のうち250個、場合によって1500個のうち300個、場合によって1500個のうち400個、場合によって1500個のうち500個、場合によって1500個のうち600個、場合によって1500個のうち750個、場合によって1500個のうち900個、場合によって1500個のうち1000個、場合によって1500個のうち1200個、場合によって1500個のうち1300個、場合によって1500個のうち1400個のポリマー鎖が、アジド基により誘導体化される。当然ながら、ここに記載するようなアジド基とポリマー鎖の量は比であり、方法及び/又は粒子を1500個のポリマー鎖によって限定するものと解釈すべきではない。
【０１４８】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のポリマー鎖がアジド基によって誘導体化される。
【０１４９】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のリガンドがアジド基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のリガンドがアジド基によって誘導体化される。
【０１５０】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、1500個のうち1個のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化され、場合によって1500個のうち2個、場合によって1500個のうち5個、場合によって1500個のうち7個、場合によって1500個のうち10個、場合によって1500個のうち15個、場合によって1500個のうち20個、場合によって1500個のうち25個、場合によって1500個のうち30個、場合によって1500個のうち35個、場合によって1500個のうち40個、場合によって1500個のうち45個、場合によって1500個のうち50個、場合によって1500個のうち55個、場合によって1500個のうち60個、場合によって1500個のうち65個、場合によって1500個のうち70個、場合によって1500個のうち75個、場合によって1500個のうち100個、場合によって1500個のうち150個、場合によって1500個のうち200個、場合によって1500個のうち250個、場合によって1500個のうち300個、場合によって1500個のうち400個、場合によって1500個のうち500個、場合によって1500個のうち600個、場合によって1500個のうち750個、場合によって1500個のうち900個、場合によって1500個のうち1000個、場合によって1500個のうち1200個、場合によって1500個のうち1300個、場合によって1500個のうち1400個のポリマー鎖が、アルキン基により誘導体化される。
【０１５１】
当然ながら、ここに記載するようなアルキン基とポリマー鎖の量は比であり、方法及び/又は粒子を1500個のポリマー鎖によって限定するものと解釈すべきではない。
【０１５２】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のポリマー鎖がアルキン基によって誘導体化される。
【０１５３】
本発明のいずれかの態様及び/又はその実施形態において、約0.01%〜約100%のリガンドがアルキン基によって誘導体化され、場合によって約0.1%〜約90%、場合によって約0.5%〜約80%、場合によって約1%〜約70%、場合によって約2%〜約60%、場合によって約3%〜約50%、場合によって約4%〜約40%、場合によって約5%〜約30%、場合によって約6%〜約25%、場合によって約7%〜約20%、場合によって約8%〜約15%、場合によって約9%〜約13%、場合によって約10%〜約12%のリガンドがアルキン基によって誘導体化される。表面が更に改質されていない粒子の場合、ポリマーは、非/反応性部分、例えばメトキシを末端に有していてもよい。適切なポリマーはm-PEG-b-HPMAmLacXであり、それにより、Xは、(Y誘導体化)化合物と相互作用して安定コンジュゲーション又は生分解性結合を生じることができる任意の反応性部分とすることができる。後者は、化合物の使用のタイプに依存する。即ち、その生物学的な活性が安定した結合によって制限される場合には、経時的放出を確保し、最大の生物学的効果を可能とするために生分解性の結合を必要とし、一方で、リガンドが内在化している場合には、粒子全体の完全な細胞内取り込みを確保するために安定した結合を必要とする。
【０１５４】
場合によって、Xポリマーのパーセンテージは、0と100%の間、場合によって0〜50%、場合によって0〜20%の範囲であってもよく、表面にコンジュゲートし得る反応性部分の%に対する良好な制御手段である。場合によって、Xはアジド又はアルキンである。
【０１５５】
こうして、粒子は、薬物を捕捉するだけでなく、治療作用に必要な薬物を含む粒子が標的細胞を実際に標的とするように、表面にリガンドを含むこともできる。場合によって、粒子表面上のリガンドは、リンカー、場合によって分解性リンカーと共に利用される。適切には、リンカーは、アルキン基又はアジド基を含む。
【０１５６】
場合によって、リガンドは、粒子表面にコンジュゲートする。リガンドは、薬物が特定の細胞又は組織、例えばがん細胞を適切に標的とするようにできる。治療すべき系の特定の部分を標的とすることができる任意のタイプの化合物を、リガンドとして使用することができる。こうしたリガンドは、ここでは標的指向性リガンドとも称する。適切なリガンドは、抗体、ナノボディ、抗体断片、成長因子、及びトランスフェリン等のタンパク質、RGD、環状RGD、オクトレオチド、APペプチド、及びtLyp-1ペプチド等のペプチド、A10及びAS1411等のアプタマー、ヒアルロン酸等の多糖類、葉酸等の生体小分子、ガラクトース、ビスホスフォネート、ビオチン、並びに合成化学物質等の小分子であってもよい。加えて、適切なリガンドは、マンノース/マンナン、各免疫グロブリンクラスのFc受容体のためのリガンド、CD11c/CD18及びDEC205受容体標的、DC-SIGN受容体標的からなる群から選択されてもよい。当業者は、所望の標的細胞に対する適切な標的指向性化合物/リガンドを熟知しており、所望の標的指向性化合物を選択することができる。本発明の文脈において、標的指向性リガンド、標的指向性、標的指向性化合物、標的指向性基又はリガンドは交換可能に使用され、いずれも特定の細胞又は特定の組織を標的とすることができる化合物を意味する。好適な標的指向性リガンドは、抗体、ナノボディ、抗体断片及び成長因子を含むペプチド及びタンパク質である。
【０１５７】
或いは、リガンドは、(非)侵襲的イメージングを可能とする造影剤であってもよく、造影剤を含んでもよい。「イメージングリガンド」という用語は、本明細書において使用した場合、例えば、in vitro、in vivo又はex vivoにて、化合物、系、細胞若しくは組織中に存在する、又はそれらに結合している場合に、本発明の粒子の検出を可能とする部分を指す。こうしたリガンドは、好ましくは検出可能な信号を生成することができる。in vivo及び/又はin vitroにて化合物、系、細胞又は組織を画像化するために使用でき、本発明の粒子に結合できる何らかのリガンド(又はそれらの組合せ)が適切である。使用できる造影剤の例としては、酵素、蛍光化合物、放射性同位体、化学発光化合物、及び生物発光化合物が挙げられる。適切なイメージングリガンドは、蛍光又は近赤外(NIR)色素、例えば近赤外オリゴ色素であってもよい。本発明の粒子に結合させることができる造影剤の非制限的例は、Abz(アントラニリル、2-アミノベンゾイル)、N-Me-Abz(N-メチル-アントラニリル、N-メチル-2-アミノベンゾイル)、FITC(フルオレセインイソチオシアナート)、5-FAM(5-カルボキシフルオレセイン)、6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、APC(アロフィコシアニン)、TAMRA(カルボキシテトラメチルローダミン)、Mca(7-メトキシクマリニル-4-アセチル)、AMCA又はAmc(酢酸アミノメチルクマリン)、ダンシル(5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホニル)、EDANS(5-[(2-アミノエチル)アミノ]ナフタレン-1-スルホン酸)、Atto(例えば、Atto465、Atto488、Atto495、Atto550、Atto647)、Cy3(1-(5-カルボキシペンチル)-3,3-ジメチル-2-((1E,3E)-3-(1,3,3-トリメチルインドリン-2-イリデン)プロパ-1-エン-1-イル)-3H-インドール-1-イウムクロリド)、トリスルホン化Cy5を含むCy5(1-(5-カルボキシペンチル)-3,3-ジメチル-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-トリメチルインドリン-2-イリデン)ペンタ-1,3-ジエニル)-3H-インドリウムクロリド)、及びCy7(1-(5-カルボキシペンチル)-2-[7-(1-エチル-5-スルホ-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-イリデン)ヘプタ-1,3,5-トリエン-1-イル]-3H-インドリウム-5-スルホン酸塩)を含むシアニン(Cy)色素、Alexa Fluor(例えば、Alexa Fluor 647、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa594、Alexa633、Alexa647)、Bodipy(例えば、Bodipy(登録商標)FL)、Dylight(例えば、DyLight 488、DyLight 550)、Trp(トリプトファン)、Lucifer Yellow(エチレンジアミン又は6-アミノ-2-(2-アミノ-エチル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[デ]イソキノリン-5,8-ジスルホン酸)、例えばDy750、Dy751、Dy700、Dy703、Dy732、Dy734、Dy749、Dy776、Dy777等の近赤外オリゴ色素、並びにこれらのいずれかの誘導体である。或いは、リガンドは、(放射性)カチオン性金属に複合してSPECT又はPETスキャンによる非侵襲的イメージングを可能とするキレート剤(例えば、DOTA、DTPA、デスフェラール等)であってもよい。
【０１５８】
或いは、リガンドは、治療用リガンドであってもよく、治療用リガンドを含んでもよい。本明細書において使用する場合、「治療用リガンド」という用語は、療法、例えば、治療目的又はワクチン接種目的に使用可能な薬剤を指す。粒子表面に結合可能な治療用リガンドの例は、本発明の粒子に捕捉させることができる薬物と同じである。捕捉させる薬物と表面上のリガンドはいずれも、ポリマーマトリクスに共有結合している。例としては、巨大分子、タンパク質、ペプチド、ホルモン、小分子、例えば、合成化学物質、若しくは核酸分子(例えばmRNA、siRNA、shRNA及びDNA分子)、アプタマー、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。治療用リガンドは、例えば、治療又はワクチン接種の用途に使用することができる。例えば、本明細書の実施例では、ワクチン接種を目的としてペプチドSIINFEKLを粒子表面にコンジュゲートさせる。治療用リガンドとしての薬物の粒子表面への結合は、核酸、ペプチド又はタンパク質の場合に特に好適であり、薬物は場合によって、治療用リガンドとして粒子表面にコンジュゲートする。特に好適な実施形態において、治療用リガンドは、ペプチド又はタンパク質である。当業者は、療法のタイプ、標的細胞及び/又は投与経路に基づき適切な治療用リガンドを選択することができる。
【０１５９】
更なる態様において、リガンドは、2種以上の異なるタイプのリガンドの組合せであってもよい。例えば、標的指向性部分と造影剤を組み合わせて単一の粒子で標的指向性とイメージングの両方を達成することができる。別の例として、標的指向性部分と治療薬を組み合わせて、標的指向性と治療又はワクチン接種両方を達成することができる。したがって、好ましくは、リガンドは、治療用リガンド、標的指向性リガンド、イメージングリガンド、及びそれらの組合せからなる群から選択される。更に、単一のナノ粒子の表面に2種以上のリガンドを結合させることも可能である。例えば、2種以上の異なる標的指向性リガンド、2種以上のイメージングリガンド、2種以上の治療用リガンド、又は1種又は複数種の標的指向性リガンドと、1種又は複数種の治療用リガンドと、1種又は複数種のイメージングリガンドの組合せを粒子表面に結合させることができる。
【０１６０】
場合によって、リガンドはアルキン基を含み、アルキン基で誘導体化されていてもよい。
【０１６１】
場合によって、リガンドはアジド基を含み、アジド基で誘導体化されていてもよい。
【０１６２】
場合によって、2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ又は5つのアルキン基がリガンド上に存在する。最も場合によって、リガンドは、1つのアルキン基を含む。
【０１６３】
場合によって、2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ又は5つのアジド基がリガンド上に存在する。最も場合によって、リガンドは、1つのアジド基を含む。
【０１６４】
リガンドの性質、及びポリマーの性質によっては、当業者は、ポリマー又はリガンドがアルキン基又はアジド基のどちらにより良好に適合するか判定してもよい。
【０１６５】
アジド-アルキン付加環化は、アジドと末端又は内部アルキンとの1,3-双極性付加環化であり、1,2,3-トリアゾールを生じる。付加環化反応によっては、熱又は触媒を必要とするものがある。場合によって、アジドとアルキンとの反応は、銅(I)、ルテニウム又は銀のような金属触媒で触媒される。適切には、銅(I)触媒は、臭化第一銅又はヨウ化第一銅のような任意の銅(I)源であってもよい。場合によって、銅(I)触媒は、in situでCu(I)を発生させるための銅(II)(例えば、硫酸銅(II))と還元剤(例えば、アスコルビン酸ナトリウム)の混合物である。Cu(I)は水性溶媒中では不安定なため、安定化リガンドが反応結果の向上に効果的である。Cp*RuCl(PPh3)2、Cp*Ru(COD)、及びCp*[RuCl4]は、一般に使用されるルテニウム触媒であり、Cp*は、シクロペンタジエニル(Cp)又はエンタメチルシクロペンタジエニルであってもよい。反応は、種々の溶媒、並びに水と、アルコール、DMSO、DMF、tBuOH及びアセトンを含む様々な(部分的に)混和性の有機溶媒との混合物中で行うことができる。Cu(I)に対するニトリルの強力な配位能力のために、溶媒としてアセトニトリルを回避することが最善である。
【０１６６】
場合によって、アジドとアルキンとの反応は、触媒無しで遂行される。場合によって、アジドとアルキンとの反応は、室温で遂行される。場合によって、アジドとアルキンとの反応は、触媒無しで室温で遂行される。
【０１６７】
したがって、本発明は、ナノ粒子であって、アジドで誘導体化されたポリマーとアルキンで誘導体化されたリガンドを用いて製造される粒子に関する。
【０１６８】
一態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iv)粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iv)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させて、
ポリマーのアジド基がリガンドのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【０１６９】
別の態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iv)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させて、
ポリマーのアジド基がリガンドのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【０１７０】
本発明の別の態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を供給する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアジド基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(v)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアルキン基を含むリガンドと反応させて、
ポリマーのアジド基がリガンドのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【０１７１】
したがって、本発明は、ナノ粒子であって、アルキン基で誘導体化されたポリマーとアジド基で誘導体化されたリガンドを用いて製造される粒子に関する。
【０１７２】
一態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iv)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
リガンドのアジド基がポリマーのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法によって得ることができる粒子を提供する。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
i)反応性部分を含む薬物を、ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液と混合する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付して、薬物が粒子のコアに封入される工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(iv)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
リガンドのアジド基がポリマーのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【０１７４】
本発明の別の態様において、本発明は、薬物及びリガンドを含む粒子を製造する方法であって、
(i)ポリマー鎖を含む水性溶液又は分散液を用意する工程であって、前記ポリマー鎖の少なくとも一部が、少なくとも1つのアルキン基を含み、ポリマー鎖が、更に、薬物の反応性部分と反応できる少なくとも1つの反応性部分を含み、ポリマー鎖が、更に、分子内又は分子間で架橋できる、工程と;
(ii)この混合物をポリマーが自己集合して粒子となる条件に付す工程と;
(iii)工程(ii)からの粒子を、薬物を含む溶液と混合して、薬物が粒子に封入されるようにする工程と;
(iv)工程(iii)からの粒子混合物を、ポリマーマトリクスの形成と同時に薬物が前記ポリマーマトリクス中に、即ち形成されるポリマー網目中に捕捉されるような条件下で、ポリマーマトリクスを形成する架橋反応に付して、薬物充填粒子を形成する工程と;
(v)前記薬物捕捉粒子を、少なくとも1つのアジド基を含むリガンドと反応させて、
リガンドのアジド基がポリマーのアルキン基と反応してトリアゾールを形成するようにする工程と
を含む方法を提供する。
【０１７５】
当然のことであるが、異なる薬物の混合物を本発明による粒子に捕捉させてもよい。場合によって、薬物は、上記のポリマーのポリマー鎖と物理的非共有結合によって相互作用する傾向にあるような性質を有することが必要である。好適な実施形態において、本発明は、場合によって感熱性のポリマーを使用した疎水性化合物の封入にとりわけ有用である。
【０１７６】
本発明及び/又はその実施形態の粒子において、薬物は、任意の薬物であってもよい。本発明の粒子に封入できる薬物の例は、巨大分子、タンパク質、ペプチド、ホルモン、小分子、例えば、合成化学物質、若しくは核酸分子(例えばmRNA、siRNA、shRNA及びDNA分子)、アプタマー、又はこれらの任意の組合せである。特に、薬物が核酸又はペプチドである場合、薬物は、場合によって粒子表面に治療用リガンドとしてコンジュゲートする。当業者は、療法のタイプ、標的細胞及び/又は投与経路に基づき適切な薬物を選択することができる。
【０１７７】
本発明の好適な実施形態及び/又はその複数の実施形態において、粒子は、2種以上の薬物を含んでもよい。同じ疾病を標的とする2種以上の薬物を使用してもよく、及び/又は異なる病因物質を標的とする薬物を使用してもよい。
【０１７８】
更には、本発明及び/又はその実施形態の粒子は、医薬品として使用するためのものである。好適な実施形態において、本発明及び/又はその実施形態の粒子は、疾病に対抗して使用するためのものである。本発明は更に、本発明の粒子を対象者に使用及び/又は投与する治療方法に関する。
【０１７９】
場合によって、疾病は、がん、感染症、眼科疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、マイコプラズマ感染症、寄生虫感染症、炎症、皮膚疾患、心疾患、中枢神経系の疾患、自己免疫疾患、増殖性疾患、関節炎、精神疾患、乾癬、糖尿病、代謝障害、肺病、呼吸器疾患、肺疾患、COPD、筋骨格系の疾患、気腫、浮腫、ホルモン疾患からなる群から選択される。より具体的には、本発明及び/又はその実施形態の粒子は、脊髄損傷、心臓発作、局所貧血、関節炎、真菌感染症、術後疼痛、疼痛、非小細胞肺がん(又はがん小細胞肺、膀胱、非ホジキンリンパ腫、消化管一般、結腸直腸、頭頸部、乳、固形一般)、急性リンパ性及び急性骨髄性白血病、乳がん、脳腫瘍、白血病一般、肝臓がん、膵臓がん、大腸がん、子宮頸がん、リンパ腫一般、卵巣がん、扁平上皮細胞がん、肺がん一般、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、小細胞肺がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、食道がん、副腎がん、メラノーマ、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病、皮膚一般、膀胱、頭頸部、非小細胞肺、食道、卵巣、メラノーマ、平滑筋肉腫、胆管、乳、前立腺、全身性エリテマトーデス、中皮腫、及び/又は肉腫一般からなる群から選択される疾患を含むが、それに限定されない疾患の治療に適している。
【０１８０】
更には、本発明及び/又はその実施形態の粒子は、眼疾患、感染症、炎症性疾患、がん、心疾患、中枢神経系疾患、自己免疫疾患、及び/又は他の疾患、例えば尿崩症、多尿症、多渇症、手術後疼痛及び/又は脊髄損傷からなる群から選択される疾病を含むが、それに限定されない疾病の治療に適している。
【０１８１】
感染症は、グラム陰性菌感染症、皮膚の感染症、及び/又は真菌感染症を含む細菌感染症を含む群から選択されてもよい。
【０１８２】
炎症性疾患は、関節リウマチ、I型糖尿病、II型糖尿病、虫垂炎、滑液包炎、結腸炎、膀胱炎、皮膚炎、髄膜炎、静脈炎、鼻炎、腱炎、へんとう炎、及び/又は血管炎を含む群から選択されてもよい。
【０１８３】
がんは、ホルモン感受性前立腺がん、ホルモン感受性乳がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、消化管がん一般、大腸がん、頭頸部がん、乳がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、乳がん、脳腫瘍、白血病、肝臓がん、精巣がん、小細胞肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、扁平上皮細胞がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、食道がん、副腎がん、メラノーマ、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病皮膚がん、平滑筋肉腫、前立腺がん、全身性エリテマトーデス、中皮腫、及び/又は肉腫を含む群から選択されてもよい。
【０１８４】
眼疾患は、黄斑変性、急性術後眼内炎、黄斑浮腫、及び/又は白内障を含む群から選択されてもよい。
【０１８５】
心疾患は、血管収縮、冠動脈心疾患、虚血性心疾患、冠動脈疾患、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、不整脈、炎症性心疾患、心内膜炎、炎症性の心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、脳卒中及び脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧症、及び/又はアテローム性動脈硬化症を含む群から選択されてもよい。
【０１８６】
中枢神経系疾患は、脳炎、急性灰白髄炎、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫及び炎症性疾患、例えば多発性硬化症又は急性播種性脳脊髄炎、並びに遺伝性疾患、例えばクラッベ病、ハンチントン病、及び/又は副腎白質ジストロフィーを含む群から選択されてもよい。
【０１８７】
自己免疫疾患は、急性播種性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗シンセターゼ症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じんましん、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病/バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ベルガー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分2欠乏症、接触性皮膚炎、頭部動脈炎、クレスト症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、1型糖尿病、びまん型全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬剤誘発性ループス、円板状エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維化性肺胞炎(又は特発性肺線維症)、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名妊娠性類天疱瘡、汗腺膿瘍、ヒューズ・ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(自己免疫血小板減少性紫斑病参照)、IgA腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状IgA病(LAD)、ルー・ゲーリッグ病(別名筋萎縮性側索硬化症)、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群(ギラン・バレー症候群参照)、混合性結合組織疾患、限局性強皮症、ムッハ・ハーベルマン病、別名急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー[46][47]、視神経脊髄炎(別名デビック病)、ニューロミオトニア、眼部瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、PANDAS(ストレプトコッカス関連小児自己免疫性神経精神疾患)、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、パリー・ロムベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性��皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維化症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、統合失調症、APSの別の形態であるシュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病(若年性関節リウマチ参照)、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病(PANDAS参照)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス(エリテマトーデス参照)、高安動脈炎、側頭動脈炎(別名「巨細胞性動脈炎」)、血小板減少症、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性結腸炎(2種類の特発性炎症性腸疾患「IBD」のうちの1種)、混合性結合組織疾患とは異なる未分化結合織疾患、未分化脊椎関節症、じんましん様血管炎、血管炎、白斑、及び/又はウェゲナー肉芽腫症を含む群から選択されてもよい。
【０１８８】
他の疾患は、尿崩症、多尿症、及び/又は多渇症、掻痒、術後疼痛及び/又は対まひを含む脊髄損傷を含む群から選択されてもよい。
【０１８９】
本発明及び/又はその実施形態の粒子は、幾つかの投与経路に適切に使用し得る。適切な経路は、非経口、静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)、筋肉内、リンパ管内、腹腔内、口腔及び舌下を含む経口、粘膜送達、例えば鼻腔内及び経肺、真皮内、例えば局所、皮膚貼付、経皮である。
【０１９０】
明瞭化及び簡潔な説明を目的として、特徴は、同一又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、当然ながら、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組合せを有する実施形態を含み得る。
【０１９１】
当業者は理解することであるが、粒子の実施形態、特徴及び/又は特性は、本発明の方法及び/又は使用の実施形態、特徴及び/又は特性でもある。当業者は更に理解することであるが、方法又は使用の実施形態、特徴及び/又は特性は、本発明の粒子の実施形態、特徴及び/又は特性である。
【０１９２】
実験データ:
材料及び方法
ドセタキセル(DTX)は、Phyton Biotech GmbH社(Ahrensburg、Germany)から得た。N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、4-メトキシフェノール、無水メタクリル酸、酢酸アンモニウム、ギ酸、向山試薬(2-クロロ-1-メチル-ピリジニウムヨージド)、オキソン、過硫酸カリウム(KPS)、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、及びトリフルオロ酢酸(TFA)は、Sigma Aldrich社(Zwijndrecht、Netherlands)から得た。アセトニトリル(ACN)、ジクロロメタン(DCM)、ジエチルエーテル(DEE)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、及びテトラヒドロフラン(THF)は、Biosolve社(Valkenswaard、Netherlands)から購入した。無水エタノール及びトリエチルアミン(TEA)は、Merck社(Darmstadt、Germany)から購入した。
L1は、2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルチオ)酢酸
L2は、2-(2-(メタクリロイルオキシ)-エチルスルフィニル)酢酸
L3は、2-(2-(メタクリル-オイロキシ)エチルスルホニル)酢酸である。
【０１９３】
ブロックコポリマーの合成
モノメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG、Mn=5000g/mol)の固定された親水性ブロック、及びN-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミドモノラクタート(HPMAmLac1)とN-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミドジラクタート(HPMAmLac2)のランダムコポリマーで構成される可変の感熱性ブロックを含有するブロックコポリマーを、(mPEG5000)2-ABCPAを開始剤として使用したフリーラジカル重合によって合成した(C.J. Rijcken、C.J. Snel、R.M. Schiffelers、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: Synthesis, characterisation and in vivo studies、Biomaterials、28(2007)5581〜5593頁;D. Neradovic、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Thermoresponsive polymeric micelles with controlled instability based on hydrolytically sensitive N-Isopropylacrylamide copolymers、Macromolecules、34(2001)7589〜7591頁)。別に規定しない限り、コモノマー供給比HPMAmLac1/Lac2は53/47(mol/mol)で一定に保った。「標準ブロックコポリマー」のモノマー/開始剤の供給モル比は150であり、分子量が異なる代替的なブロックコポリマー一組を得るために20と300の間で変化させた。これを達成するため、モノマーの総供給量(0.7g)を一定に保つ一方で、開始剤の供給量を適切に調整した。端的に言えば、HPMAmLac1、HPMAmLac2、及び開始剤を気密ガラスバイアル中でACNに溶解させた(1mL当たりのモノマープラス開始剤の総量450mg)。反応混合物を少なくとも10分間窒素でフラッシングし、70℃に加熱し、次いで、20〜24時間撹拌した。次に、結果として得られたブロックコポリマーを、混合物を過剰量のDEE(ポリマー1グラム当たり18mL)に滴加することにより沈殿させた。沈殿物をろ過し、真空炉で一晩乾燥させた。ブロックコポリマーは、オフホワイト色の固体として得られ、プロトン核磁気共鳴(NMR)を使用して特性評価した(M. Talelli、M. Iman、A.K. Varkouhi、C.J.F. Rijcken、R.M. Schiffelers、T. Etrych、K. Ulbrich、C.F. van Nostrum、T. Lammers、G. Storm、W.E. Hennink、Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin、Biomaterials、31(2010)7797〜7804頁)。
【０１９４】
メタクリル酸によるブロックコポリマーの誘導体化
合成されたブロックコポリマー(供給モル比HPMAmLac1/Lac2=53/47)のラクタート側鎖の末端水酸基の一部(5〜15mol%)をメタクリル酸で誘導体化し(C.J. Rijcken、C.J. Snel、R.M. Schiffelers、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: Synthesis, characterisation and in vivo studies、Biomaterials、28(2007)5581〜5593頁)、臨界ミセル温度(CMT)が5と15℃の間のメタクリル酸誘導体化ブロックコポリマー(「MA-ブロックコポリマー」と呼ぶ)(収率85〜95%)を得た。NMR GPC及びUV可視分光法を用いてMA-ブロックコポリマーの特性評価をした。
【０１９５】
L2によるブロックコポリマーの誘導体化
合成されたブロックコポリマー(供給モル比HPMAmLac1/Lac2=30/70又は53/47)のラクタート側鎖の末端水酸基の一部(5〜25mol%)をL2で誘導体化して、L2-誘導体化ブロックコポリマー(「L2-ブロックコポリマー」と呼ぶ)を得た(図1)。ミセル形成に使用したこれらのL2-ブロックコポリマーについて、コモノマー組成をHPMAmLac1/Lac2=30/70(mol/mol)に調整して誘導体化前に比較的低いCMTを可能とした。
【０１９６】
L2のカルボキシル基を最初に活性化し、混合無水物2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルスルフィニル)酢酸-ピバロイル(L2-Pv)を形成した。端的に言えば、L2(0.46mmol、1当量)をDCM(2.0ml)に溶解させた。次に、TEA(0.46mmol、1当量)を添加し、反応混合物を0℃に冷却した。その後、塩化ピバロイル(0.46mmol、1当量)を添加し、混合物を0℃で1時間撹拌してL2-Pvを得、これを更なる精製又は分析を行うことなく次の工程に使用した。ラクタート側基のx mol%(x=5〜25)をL2で誘導体化するため、ブロックコポリマー(1.50g)をTHF(15ml)に溶解させた。次に、DMAP(0.03g)、L2-Pv(ブロックコポリマーのラクタート側基からの末端水酸基と比較してx%当量)とTEA(L2-Pvと比較して1当量)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。その後、反応混合物をDEE(27mL)に滴加してL2-ブロックコポリマーを沈殿させた。沈殿、ろ過及び乾燥工程をもう一度繰り返し、オフホワイト色の固体を得た(収率70〜80%)。以下に記載するように、NMR GPC及びUV可視分光法を用いてL2-ブロックコポリマーの特性評価をした。NMRで判定したL2で誘導体化されたヒドロキシル末端基のパーセンテージを、MAブロックコポリマーについて利用したものと同様のアプローチを用いて計算した。
【０１９７】
GPC及びUV-VIS分光法による(誘導体化された)ブロックコポリマーの特性評価
合成した(誘導体化した)ブロックポリマーの分子量及びその分布とその分布を、PFG5μm Linear Sカラム(Polymer Standards Service社、Germany)を使用した以外は、以前に報告された方法(C.J. Rijcken、C.J. Snel、R.M. Schiffelers、C.F. van Nostrum、W.E. Hennink、Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: Synthesis, characterisation and in vivo studies、Biomaterials、28(2007)5581〜5593頁)を本質的に用いたGPCにより判定した。
【０１９８】
水溶液中で合成した(誘導体化した)ブロックコポリマーのCMTをUV-2450分光光度計(島津製作所社、Japan)で記録した。測定の前に、ブロックコポリマーを、2mg/mLの濃度の酢酸アンモニウム緩衝液(150mM、pH5.0)に4℃で一晩溶解させた。波長とスリット幅は、それぞれ650nm及び2nmであった。ランピング加熱速度は1℃/分であり、散乱強度の記録間隔は0.2℃であった。吸光度-温度曲線の基線への外挿によって得られたX軸上での立ち上がりを、ブロックコポリマーのCMTとみなした。
【０１９９】
DTX誘導体の合成及び分析
DTXL1の合成
L1をDTXのC-2'位の水酸基にコンジュゲートさせてDTXL1を得た(図2)。端的に言えば、L1(24.75mmol)をDCM(1000mL)に溶解させ、750rpmで撹拌した。次に、DMAP(59.41mmol)、DTX(24.75mmol)及び向山試薬(29.70mmol)を添加し、混合物を予熱した油浴に入れ、40℃で1時間撹拌して黄色の溶液を得た。次に、混合物を室温に冷却し、水(450mL)を添加して2相系を得た。水層をDCM(300mL)で抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮して黄色の油状物を得た。結果として得られた油状物をカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/エチル酢酸塩(4/1〜1/1))で精製し、DTXL1を白色固体(71%収率)として95%を超える純度で得た。
【０２００】
DTXL2の合成
上記と同じ合成及び精製方法を用い、L2をDTXのC-2'位のヒドロキシル基にコンジュゲートさせてDTXL2(収率59%)を95%を超える純度で得た(図2)。
【０２０１】
DTXL3の合成
DTXL1のリンカーセグメント中の硫黄原子を酸化してDTXL3を得た(図2)。端的に言えば、DTXL1(17.10mmol)をACN/水(60%/40%(v/v))混合物(213mL)に溶解させ、室温で30分間撹拌して均質な溶液を得た。その後、オキソン(22.23mmol)を添加し、結果として得られた混合物を室温で2日間撹拌した。次に、水(170mL)を添加して層を分離させた。有機層を集め、水層を酢酸エチル(200mL)で2度抽出した。合わせた有機層を水(100mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。得られた固形物をカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル(3/1〜1/3))で精製し、白色固体(収率80%)を95%を超える純度で得た。
【０２０２】
DTX(L2)2の合成
2つのL2リンカーをDTXのC-2'及びC-7位のヒドロキシル基にそれぞれコンジュゲートさせ、DTX(L2)2を得た(図2)。端的に言えば、DTX(2.5mmol)、L2(5.0mmol)、向山試薬(6.20mmol)、及びDMAP(12.4mmol)をDCM(83mL)に溶解させ、40℃で1時間撹拌した。次に、反応混合物を塩水と水で洗浄し、有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。油状残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル/n-ヘキサン(9/1))を用いて精製し、DTX(L2)2を非晶質の白色固体(収率23%)として90%を超える純度で得た。
【０２０３】
DTX誘導体の分析
Gemini 300MHz分光計(Varian Associates Inc. NMR Instruments社、Palo Alto、CA)を用いてDTX誘導体のプロトンNMRスペクトルを記録した。DTX誘導体の1H NMRスペクトルは、DMSO-d6溶媒中で得た。
【０２０４】
陽イオンモードの島津製作所社液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)QP8000でのエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)を用いてDTX誘導体の分子量を判定した。Gemini(登録商標)3μmC18カラム(150×3mm)(Phenomenex社)を使用し、100%溶離剤A(95%H2O/5%ACN/0.1%トリフルオロ酢酸)から100%B(5%H2O/95%ACN/0.1%トリフルオロ酢酸)までの勾配で1時間、流速1mL/min、UV-検出253nmにて行った。
【０２０５】
DTX誘導体の純度を、UV-検出器(TUV、Waters社)を備えた超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)(Waters社、USA)で判定した。流速0.7mL/分及びUV-検出227nmでの20分の定組成運転(移動相:H2O中0.1%ギ酸)のために、Acquity HSS T3 1.8μmカラム(50×2.1mm)(Waters社)を使用した。ACN/水(70%/30%(v/v))混合物に溶解させたDTX誘導体標準を使用して校正曲線(0.5と100μg/mLの間は直線)を準備した。
【０２０６】
粒径分布
コア架橋された高分子ミセル(CCL-PM)の粒径を、Malvern ALV/CGS-3測角器を用いた動的光散乱(DLS)により測定した。25℃の水の粘度と屈折率を全ての測定に使用した。DLSの結果は、z-平均粒径(Zave)及び多分散指数(PDI)として与えられる。
【０２０７】
UPLCによるDTXLx-CCL-PMの分析
DTXLx-CCL-PM中の放出されたDTXの含量、及びDTXの総量(即ち、放出された量と捕捉された量)を、UPLCにより判定した。放出されたDTXの含量を判定するため、ミセル分散液をACN/水(70%/30%(v/v))混合物の混合物で10倍に希釈し、次に、結果として得られた混合物の7μLをUV-検出器(TUV、Waters社)を備えたUPLCに注入した。流速0.8mL/分及びUV-検出227nmでの6分の定組成運転(移動相:50%H2O/50%ACN/0.1%ギ酸)のために、Acquity HSS T3 1.8μmカラム(50×2.1mm)(Waters社)を使用した。ACN/水(70%/30%(v/v))混合物に溶解させたDTX及びDTX誘導体標準を使用して校正曲線(0.5と100μg/mLの間は直線)を準備した。
【０２０８】
Q. Hu、C.J. Rijcken、R. Bansal、W.E. Hennink、G. Storm、J. Prakash、Complete regression of breast tumour with a single dose of docetaxel-entrapped core-cross-linked polymeric micelles、Biomaterials、53(2015)370〜378頁に記載されているように、安息香酸(DTXの最終分解生成物)の含量を定量することにより、DTXLx-CCL-PM中の総DTX含量を間接的に測定した。
【０２０９】
薬物捕捉効率(EE)は、UPLCデータを使用して以下のように計算した:
【０２１０】
【数１】
2018534320.tif 000003
【０２１１】
DTXLx-CCL-PMからのin vitro薬物放出
DTXLx-CCL-PMからのDTXのin vitro放出をリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中37℃で測定した。端的に言えば、DTX-CCL-PMを、ポリソルベート80を1%(v/v)含有するリン酸緩衝液(100mM、pH7.4、15mMのNaCl補充)で20倍に希釈した(放出されたDTXを可溶化するため)。混合物を37℃でインキュベートし、異なる時点にサンプルを集め、UPLCを用いて放出されたDTX及び7-epi-DTX(DTXの既知のエピマー)の含量について分析した。放出されたDTX及び7-epi-DTXの濃度を、7μLの混合物をUPLC系に注入することで判定した。Acquity HSS T3 1.8μmカラム(50×2.1mm)(Waters社)を使用し、100%溶離剤A(70%H2O/30%ACN/0.1%ギ酸)から100%B(10%H2O/90%ACN/0.1%ギ酸)までの勾配で11分、流速0.7mL/分、UV-検出227nmにて行った。放出されたDTX及び7-epi-DTXの濃度を判定するため、ACN/水(70%/30%(v/v))混合物の混合物に溶解させたDTX標準を使用して校正曲線(0.5と100μg/mLの間は直線)を準備した。実際のDTXのパーセンテージを計算するため、DTX及び7-epi-DTX(これらが一緒になってクロマトグラムにおける全ピーク面積の90%以上を構成する)のみを考慮し、DTXの加水分解不安定性に起因して生理学的な条件下で経時的に生成されるDTXの他の分解生成物は考慮しなかった。
【０２１２】
【数２】
2018534320.tif 000004
【０２１３】
CCL-PMのin vitro分解プロファイル
メタクリル酸(ラクタート側鎖のヒドロキシル末端基の5又は10mol%)又はL2(ラクタート側鎖のヒドロキシル末端基の5又は10mol%)で誘導体化されたブロックコポリマーをベースとするエンプティなCCL-PMの分解動態をin vitroで調査した。端的に言えば、エンプティなCCL-PM分散液をリン酸緩衝液(100mM、pH7.4、15mMのNaCl補充)又はホウ酸緩衝液(100mM、pH9.4)で5倍に希釈し、それぞれ37℃及び60℃でインキュベートした。これらインキュベートした分散液のZave及びPDIを、DLSを用いてモニターした。加えて、1秒当たりのキロ数(kcps)で表す誘導計数率(DCR)もDLS測定中に記録した。DLS測定は、DCRが100kcps以下に低下したときに終了させた。
【０２１４】
結果:
高い薬物充填容量
Table 1(表1)は、ポリマー供給量と薬物の供給量の関数としてのポリマー粒子の充填容量(LC)を示す。粒子のサイズ(Zave)及び多分散性(DPI)は、影響を受けないことがわかる。20%を超える充填容量が得られる。図3は、薬物供給量約4mg/mlでの高い充填容量と薬物捕捉効率を示す。
【０２１５】
【表１】
2018534320.tif 000005
【０２１６】
図4は、より薬物充填容量の高い粒子を使用した場合でも、薬物の放出が有意に変化しないことを示す。
【０２１７】
薬物捕捉量(充填容量)が高ければ、捕捉効率が倍増することも見出された。加えて、本発明者らは、小さな粒子も大充填容量を有し、薬物を多量に捕捉することを予想外に見出した。
【０２１８】
Table 2(表2)は、リンカーのタイプが粒子のサイズを変化させないことを示しており、粒子のサイズが同じであっても異なる放出プロファイルが得られることを示唆する。
【０２１９】
CriPecドセタキセル:ドセタキセルの誘導体化に使用されるリンカーのタイプのみが異なり、他の全ての特性は同等である。
【０２２０】
【表２】
2018534320.tif 000006
【０２２１】
【表３】
2018534320.tif 000007
【０２２２】
Table 3(表3)及び図5は、異なるリンカーを使用しても薬物放出動態が大きく変化しないことを示している。
【０２２３】
環状RGDfk-BCNのN3-ナノ粒子へのコンジュゲーション
図7は、環状RGDfk-BCNのN3-CriPecナノ粒子へのコンジュゲーションを示す。
【０２２４】
BCN-cRGDfKの合成
環状RGDfKペプチドを調製し、固体支持体ペプチド合成を用いて環化した。切断後、粗ペプチドをHPLCで精製した。精製したcRGDfK(環状Arg-Gly-Aspペプチド)をBCN-p-ニトロフェニルカルボナートと反応させ、続いてHPLC精製することにより、ビシクロノニン-RGDfk(BCN-RGDfK)を調製した。
【０２２５】
5%N3 CriPecナノ粒子の合成
95w%のプレーンCriPecブロックコポリマー(mPEG-b-HPMAmDPn)と5w%のアジドブロックコポリマー(N3-PEG-b-HPMAmDPn)で構成される5%N3 CriPecエンプティナノ粒子(NP)を合成する。このアジドブロックコポリマーは、mPEG5000と比較してアジド-PEG5000を出発材料として使用したことを除き、上記と同様に合成される。ナノ粒子の合成は、特にQ. Hu、C.J. Rijcken、R. Bansal、W.E. Hennink、G. Storm、J. Prakash、Complete regression of breast tumour with a single dose of docetaxel-entrapped core-cross-linked polymeric micelles、Biomaterials、53(2015)370〜378頁に記載されているように進む。
【０２２６】
得られた5%N3 CriPec NPを、接線流ろ過(TFF)によって精製し、コンジュゲーションのために濃縮(必要な場合)する。
【０２２７】
RGD CriPec NPの合成
N3 CriPec NPを水性緩衝液中、表示した量のBCN-cRGDfKと一晩室温で反応させる。BCN-cRGDfKの減少をUPLCによって経時的にモニターし、15N NMRによりコンジュゲーションを追跡する。NMRスペクトルを図8に示す。遊離アジド分子が存在しないこと、及び典型的なトリアゾールピークが存在することにより、RGDとCriPecエンプティとの共有結合によるコンジュゲーションが実際に生成されたことが実証された。次に、RGD CriPec NPをTFFにより精製して、非コンジュゲートBCN-cRGDfK(存在する場合)及び他の不純物を除去する。
【０２２８】
当量は、アジドに対するアルキン含有リガンドの量である。
【０２２９】
【表４】
2018534320.tif 000008
【０２３０】
Table 4(表4)は、リガンドのコンジュゲーションが高効率であることを示す。
【０２３１】
Table 5(表5)及びTable 6(表6)は、表面コンジュゲーションが粒径に影響しないことを示す。
【０２３２】
【表５】
2018534320.tif 000009
【０２３３】
【表６】
2018534320.tif 000010
【０２３４】
Table 6(表6)は、ポリマーにコンジュゲートした、したがってナノ粒子に捕捉されたローダミンを含むCriPecナノ粒子(NP)を示す。標的指向性リガンドのコンジュゲーションの際に粒子は変化しないことがわかる。
【０２３５】
Table 7(表7)は、リガンドの表面へのコンジュゲーションが、捕捉された薬物に影響しないことを示す。バースト放出(BR)は起こらず、即ち、コンジュゲーション後に遊離ドキソルビシンは測定不能である。
【０２３６】
【表７】
2018534320.tif 000011
【０２３７】
Table 7(表7)は、標的指向性リガンドを含有する粒子が、充填容量、バースト放出、サイズ及び多分散性に関して特性が変化しないことを示す。これは、投与法の更なる最適化が必要ないことを意味する。
【０２３８】
粒子分解
リンカーのタイプと密度が、粒子の分解性を決定する。リンカーに応じて数週間又は数カ月以内に完全な崩壊を得ることができ、したがって、ナノ粒子を所望通りに設計することができる。
【０２３９】
【表８】
2018534320.tif 000012
【０２４０】
Table 8(表8)及び図6は、リンカーのタイプ及び密度に応じたナノ粒子の完全分解プロファイルを示す。
【０２４１】
薬物動態データナノ粒子
8〜12週齢の雌NCr nu/nuマウスに、RGD有り及び無しのドキソルビシン捕捉ナノ粒子を注入した。粒子は、35又は65nmであった:
グループ1=180mMのHEPES中CriPecドキソルビシン35nm、pH7.4
グループ2=180mMのHEPES中CriPecドキソルビシン65nm、pH7.4
グループ3=180mMのHEPES中RGD CriPecドキソルビシン35nm、pH7.4
グループ4=180mMのHEPES中RGD CriPecドキソルビシン65nm、pH7.4
12mg/kgの用量で単回静脈内注射。血液サンプリング:注入後5分、1時間、2時間、8時間、24時間及び48時間(Table 9(表9))。確認済みの方法を用いたドキソルビシンの総量及び放出量の測定。
【０２４２】
【表９】
2018534320.tif 000013
【０２４３】
図9及び図10は、35nmと65nmの非コンジュゲート又は1%RGDコンジュゲートナノ粒子の比較を示す。ドキソルビシンの総量及び放出量はいずれも同様の薬物動態学的プロファイルを示しており、小径(35nm)及び大径(65nm)の標的指向化及び非標的指向化ナノ粒子のクリアランスがこのマウスモデルでは類似していることを示唆する。
【０２４４】
デスフェラールCriPecエンプティの合成
DMSOを含む20mMの酢酸アンモニウム緩衝液(pH5)中、N3 CriPecナノ粒子(上記のように調製)と5当量のデスフェラール-BCNを一晩コンジュゲートさせ、表面にデスフェラールが結合したCriPecナノ粒子を調製した(図11A参照)。緩衝液を0.2mM EDTAを含む100nM酢酸ナトリウム-d3で置き換え、N3 CriPecナノ粒子とデスフェラール-BCNとの反応を15N NMR(HMBC 15N-1H)により追跡した。NMRスペクトルを図11Bに示す。遊離アジド分子が存在しないこと、及び典型的なトリアゾールピークが存在することにより、デスフェラールとCriPecエンプティとの共有結合によるコンジュゲーションが実際に生成されたことが実証された。デスフェラールCriPecエンプティのDLS分析は、サイズ及びPDIがそれぞれ48nm及び0.21であること、即ち、デスフェラールコンジュゲーション時に粒径が変化しないことを示している。
【０２４５】
Dy751 CriPecナノ粒子の合成
DMSOを含む酢酸アンモニウム緩衝液(pH5)中、1:1のBCN-DY751を5%N3 CriPecエンプティ(上記のように調製)に一晩コンジュゲートさせて、表面に近赤外(NIR)色素Dy751(Dyomics社)が結合したCriPecナノ粒子を調製した(図12参照)。反応を、UPLCにより非コンジュゲートBCN-DY751のレベルを追跡することで追跡した。非官能基化(即ち、アジド基を持たない)ナノ粒子を対照として使用した。コンジュゲーション後、DY751 CriPecエンプティを接線流ろ過により精製し、特性評価をした。その特徴を以下Table 10(表10)に列挙する。
【０２４６】
【表１０】
2018534320.tif 000014
【０２４７】
これらDy751ミセルの生体内分布を腫瘍を持つマウスにおいてモニターした。0日目に、200,000個のIRFP(赤外蛍光タンパク質;励起波長680nm)で標識した4T1乳がん細胞をヌードマウスに同所注入した。CTスキャンにより転移が確認された後、42日目にNIRで標識したナノ粒子をin vivo/ex vivo蛍光発光分子トモグラフィー;FMTのためにこの動物にi.v.注入した。注入15分、4時間、24時間及び72時間後にCT/FMTにより動物をモニターした。
【０２４８】
この技術により、自発的転移性コロニー形成の検出が可能であり、更には、原発腫瘍及び転移において増加するCriPec(登録商標)ナノ粒子集積を経時的に非侵襲的にモニターできる(図13)。
【０２４９】
RGD CriPec AHA1ナノ粒子の合成
表面上のペプチドRGDで標的指向化され、ds siRNA AHA1を共有結合によって捕捉したCriPecナノ粒子を調製した。AHA1の生物学的標的は、Hsp90シャペロンAha1である。加水分解性リンカー(生理学的な条件下で酸応答性又は切断性)がds siRNA AHA1に結合しており、そのため、反応性部分は5'-アミノである。
【０２５０】
95%L2-誘導体化mPEG-b-p(HPMAmDP1DP2)ポリマーとL2-誘導体化5%N3-PEG-b-p(HPMAmDP1DP2)ポリマーとの混合物にAHA1L7を滴加して酸応答性リンカー(AHA1L7)を含有するds siRNA AHA1を共有結合によって捕捉したナノ粒子を調製し、5%N3 CriPec AHA1ナノ粒子を得た。
【０２５１】
これにより、TEMED及びKPSの存在下でのsiRNAリンカーとポリマーの両方の反応性(メタクリラート)部分の架橋(上記と同様、かつQ. Hu、C.J. Rijcken、R. Bansal、W.E. Hennink、G. Storm、J. Prakash、Complete regression of breast tumour with a single dose of docetaxel-entrapped core-cross-linked polymeric micelles、Biomaterials、53(2015)370〜378頁に記載されているように)とその後の表面へのRGDコンジュゲーションの結果として、siRNA-リンカーはCriPecナノ粒子の高分子マトリクス内に共有結合によって捕捉される。
【０２５２】
RGD CriPecナノ粒子について先に記載したように、BCN-cRGDfKを5%N3 CriPec AHA1ナノ粒子にコンジュゲートさせることにより、RGDをナノ粒子に結合させた。
【０２５３】
薬物(AHA1)の放出を、DTXLx-CCL-PMについて先に記載したように判定した。
【０２５４】
図14Aは、ナノ粒子の表面における標的指向性リガンドRGDペプチドの存在が放出動態に影響しないことを示す。
【０２５５】
図14Bは、弱酸性条件(pH5.5)下では、pH7.4と比較して、酸応答性リンカー(L7)を含有する共有結合によって捕捉されたds siRNA AHA1を含むナノ粒子からAHA1の選択的な放出が起こることを示す。この図は、これらの条件下では、標的指向性リガンド(RGD)の存在が放出プロファイルに影響しないことを更に示す。
【０２５６】
SIINFEKL CriPecエンプティの合成
オボアルブミンペプチドSIINFEKL(OVA残基257〜264)が表面に結合した、薬物を何も捕捉していないCriPecナノ粒子(即ち、CriPecエンプティ)をワクチン接種剤としての施用のために調製した。まず、SIINFEKLの末端NH2へのBCN-PEG4-NHSのコンジュゲーションにより、SIINFEKLをBCN化合物で誘導体化した(図15A)。
【０２５７】
その後、pH5の緩衝液中でSIINFEKL-BCNを5%N3 CriPecエンプティにコンジュゲートさせ、UPLCにより未反応SIINFEKL-BCNのレベルを判定することでコンジュゲーション変換をモニターした(図15B)。非官能化(アジドを含まないCriPecエンプティ)の陰性対照を、実際のコンジュゲーションと潜在的物理的吸着とを区別するために並行して実施した。デスフェラール及びRGDについて上記したのと同様に、コンジュゲーションを15N NMRによりモニターし、全アジド部分の完全変換を実証した。
【０２５８】
その後、先に本明細書に記載したようにSIINFEKL CriPecエンプティの特性を明らかにし、以下、結果をTable 11(表11)に示す。
【０２５９】
【表１１】
2018534320.tif 000015
【図１】
2018534320.tif 000016
【図２】
2018534320.tif 000017
【図３】
2018534320.tif 000018
【図４】
2018534320.tif 000019
【図５】
2018534320.tif 000020
【図６】
2018534320.tif 000021
【図７】
2018534320.tif 000022
【図８】
2018534320.tif 000023
【図９】
2018534320.tif 000024
【図１０】
2018534320.tif 000025
【図１１Ａ】
2018534320.tif 000026
【図１１Ｂ】
2018534320.tif 000027
【図１２】
2018534320.tif 000028
【図１３】
2018534320.tif 000029
【図１４】
2018534320.tif 000030
【図１５】
2018534320.tif 000031
【国際調査報告】
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2018534320.tif 000033
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