(57)【要約】本発明は、遺伝子改変NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウスを提供し、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、変異iRhom2タンパク質は、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上の突然変異のため、野生型iRhom2タンパク質とは異なり、マウスは、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と外因性腫瘍の増殖増加とを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスであって、前記マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、前記マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする、遺伝子改変NSGマウス。
【請求項２】
更に、異種腫瘍細胞を含む、請求項1記載の遺伝子改変NSGマウス。
【請求項３】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の腫瘍から得られる、請求項2記載の遺伝子改変NSGマウス。
【請求項４】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の乳房腫瘍から得られた腫瘍細胞である、請求項2又は3記載の遺伝子改変NSGマウス。
【請求項５】
前記マウスがNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスである、請求項1乃至4の何れかに記載の遺伝子改変NSGマウス。
【請求項６】
異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製するための方法であって、
遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、
異種腫瘍細胞を提供することと、
前記遺伝子改変NSGマウスに前記異種腫瘍細胞を投与することにより、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製することと、を含む方法。
【請求項７】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の腫瘍から得られる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の乳房腫瘍から得られた腫瘍細胞である、請求項6又は7記載の方法。
【請求項９】
前記マウスがNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスである、請求項5乃至8の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
被験物質の抗腫瘍活性を同定するための方法であって、
遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、
異種腫瘍細胞を提供することと、
前記遺伝子改変NSGマウスに前記異種腫瘍細胞を投与して、異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスを作製することと、
異種腫瘍細胞を含む前記遺伝子改変NSGマウスに被験物質を投与することと、
前記異種腫瘍細胞を含む前記遺伝子改変NSGマウスへの前記被験物質投与後の前記異種腫瘍細胞の前記被験物質に対する応答をアッセイすることと、
前記異種腫瘍細胞に対する前記被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することと、を含み、前記異種腫瘍細胞に対する前記被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして前記被験物質を同定する、方法
【請求項１１】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の腫瘍から得られる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記異種腫瘍細胞がヒト被験体の乳房腫瘍から得られた腫瘍細胞である、請求項10又は11記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスがNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスである、請求項10乃至12の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記被験物質が抗体である、請求項10乃至13の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記被験物質が抗癌剤である、請求項10乃至14の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を共に本願明細書の一部とする2015年10月30日出願の米国仮特許出願第62/248,417号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
特定の態様によれば、本発明は、遺伝子改変NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスを提供し、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、変異iRhom2タンパク質は、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上の突然変異のため、野生型iRhom2タンパク質とは異なり、マウスは、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と外因性腫瘍の増殖増加とを特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
近年、癌の診断及び治療が著しく進歩している一方、癌は、依然として一般的で広く見られる。米国国立がん研究所のSurveillance Epidemiology and End Results(SEER)データベースは、2010年から2012年の米国での発生率及び死亡率データに基づいて、米国の男性の2人に1人、女性の3人に1人が何らかの癌を発症するリスクがあると考えられることを示している。同データベースは、米国の男性の4人に1人、女性の5人に1人が何らかの癌のため死亡するリスクがあると考えられることを示している。
【０００４】
癌の診断及び治療の進歩は、生存の機会を向上させるために必要となる。しかしながら、癌及び新薬の研究及び評価に使用される殆どの癌モデルは、インビトロの細胞株からなり、このようなインビトロモデルの分析は、インビボの生理学的プロセスの複雑さを考えると、価値が限定される。現在のインビボ癌モデルは、特に、分析が可能な限り早いことが望ましい場合、インビボで増殖させた異種移植片腫瘍における患者由来腫瘍細胞の分析等、用途が限定されることが多い。
【０００５】
したがって、インビボ癌モデル、及びインビボ癌モデルを用いた抗腫瘍組成物及び治療を特定するための方法に対する必要性は、引き続き存在している。
【発明の概要】
【０００６】
遺伝子改変NSGマウスが、本発明の態様により提供され、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、遺伝子改変NSGマウスは、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする。
【０００７】
遺伝子改変NSGマウスが、本発明の態様により提供され、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、遺伝子改変NSGマウスは、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とし、遺伝子改変NSGマウスは、異種腫瘍細胞を含む。
【０００８】
本発明の態様により、遺伝子改変NSGマウスが提供され、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、遺伝子改変NSGマウスは、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とし、遺伝子改変NSGマウスは、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含む。
【０００９】
遺伝子改変NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスが、本発明の態様により提供される。遺伝子改変NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスが、異種腫瘍細胞を含む本発明の態様により提供される。遺伝子改変NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスが、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含む本発明の態様により提供される。
【００１０】
態様によれば、本発明は、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製するための方法を提供し、方法は、遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、異種腫瘍細胞を提供することと、遺伝子改変NSGマウスに異種腫瘍細胞を投与することにより、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製することとを含む。
【００１１】
態様によれば、本発明は、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製するための方法を提供し、方法は、遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を提供することと、遺伝子改変NSGマウスに異種腫瘍細胞を投与することにより、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製することと、を含む。
【００１２】
態様によれば、本発明は、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製するための方法を提供し、方法は、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とするNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを提供することと、異種腫瘍細胞を提供することと、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに異種腫瘍細胞を投与することにより、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製することと、を含む。
【００１３】
態様によれば、本発明は、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製するための方法を提供し、方法は、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とするNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを提供することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を提供することと、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに異種腫瘍細胞を投与することにより、異種腫瘍細胞の評価用のマウスモデル系を作製することと、を含む。
【００１４】
態様によれば、本発明は、抗腫瘍組成物を同定するための方法を提供し、方法は、遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択される1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、異種腫瘍細胞を提供することと、遺伝子改変NSGマウスに異種腫瘍細胞を投与して、異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスを作製することと、異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスに被験物質を投与することと、異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスへの被験物質投与後の異種腫瘍細胞の被験物質に対する応答をアッセイすることと、異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することと、を含み、異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する。
【００１５】
態様によれば、本発明は、抗腫瘍組成物を同定するための方法を提供し、方法は、遺伝子改変NSGマウスであって、ゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とする遺伝子改変NSGマウスを提供することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を提供することと、遺伝子改変NSGマウスにヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を投与して、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスを作製することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を有する遺伝子改変NSGマウスに被験物質を投与することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含む遺伝子改変NSGマウスへの被験物質投与後の、マウスにおけるヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞の被験物質に対する応答をアッセイすることと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することと、を含み、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する。
【００１６】
態様によれば、本発明は、抗腫瘍組成物を同定するための方法を提供し、方法は、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とするNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを提供することと、異種腫瘍細胞を提供することと、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに異種腫瘍細胞を投与して、異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを作製することと、異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに被験物質を投与することと、異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスへの被験物質投与後の異種腫瘍細胞の被験物質に対する応答をアッセイすることと、異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することと、を含み、異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する。
【００１７】
態様によれば、本発明は、抗腫瘍組成物を同定するための方法を提供し、方法は、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを特徴とするNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを提供することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を提供することと、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスにヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を投与して、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを作製することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに被験物質を投与することと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞を含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスへの被験物質投与後の、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞の被験物質に対する応答をアッセイすることと、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することと、を含み、ヒト被験体の腫瘍から得られた異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、N末端領域(アミノ酸1乃至373)及びC末端領域(アミノ酸374乃至827)を示すと共に、アミノ酸159の相対位置を示す、マウスiRhom2(配列番号1)の概略図である。
【図２Ａ】図2Aは、アミノ酸159(上、矢印)におけるiRhom2をコードするマウス野生型(WT)Rhbdf2遺伝子の領域のDNA配列決定の結果を、アミノ酸159(下、矢印)におけるp.P159L変異iRhom2をコードするマウスp.P159L変異Rhbdf2遺伝子の領域のDNA配列決定の結果と比較して示す、DNA配列決定装置のグラフィック出力である。
【図２Ｂ】図2Bは、ATT(野生型)からACT(影付きC)に変異したアミノ酸156コドンにおいてp.I156T変異iRhom2をコードするマウスp.I156T変異Rhbdf2遺伝子の領域のDNA配列決定の結果を示すDNA配列決定装置のグラフィック出力である。
【図２Ｃ】図2Cは、GAT(野生型)からAAT(矢印)に変異したアミノ酸158コドンにおいてp.D158N変異iRhom2をコードするマウスp.D158N変異Rhbdf2遺伝子の領域のDNA配列決定の結果を示すDNA配列決定装置のグラフィック出力である。
【図３】図3は、Rhbdf2 p.P159L変異(NSG-Bald)を保有し、無毛表現型を特徴とする6週齢のマウス(左)及び野生型Rhbdf2対立遺伝子を保有する正常な白毛同腹対照マウス(右)の画像である。
【図４】図4は、Rhbdf2 p.P159L変異(NSG-Bald)を保有し、N末端領域にp.P159L変異を有するiRhom2を発現するNSGマウスにおける異種腫瘍増殖の増加を示すグラフである。
【図５Ａ】図5Aは、NSGマウスにおける血管マーカCD31についてのMDA-MB 231ヒト乳癌細胞由来腫瘍の免疫染色の結果を示す画像セットである。
【図５Ｂ】図5Bは、N末端領域に変異を有するiRhom2を発現するマウスにおける血管マーカCD31についてのMDA-MB 231ヒト乳癌細胞由来腫瘍の免疫染色の結果を示す画像セットである。
【図６】図6は、マウスiRhom1及びiRhom2アミノ酸配列の比較である。
【図７】図7は、Rhbdf1遺伝子欠損マウスについてヘテロ接合性のマウス(Rhbdf1+/-)は、正常なサイズ(右)であり、Rhbdf1遺伝子欠損に対してホモ接合のマウス(Rhbdf1-/-)は小さいサイズ(左)であることを示す画像である。
【図８】図8は、Rhbdf1遺伝子欠損マウスについてヘテロ接合性のマウス(Rhbdf1+/-)が正常な生存率(上の線)を示し、Rhbdf1遺伝子欠損についてホモ接合性のマウス(Rhbdf1-/-)が3乃至4週までに死亡すること(下の線)を示すグラフである。
【図９】図9は、約3乃至4週齢で死に至る重度の心臓線維症(「○」で示す)を有するRhbdf1-/-ホモ接合性マウスから単離された心臓のヘマトキシリン及びエオシン染色切片の3枚の画像セットで、スケールバーは1mmである。
【図１０】図10は、心臓線維症を示さないRhbdf1-/+ヘテロ接合性マウスから単離された心臓のヘマトキシリン及びエオシン染色切片の画像で、スケールバーは1mmである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ロンボイドタンパク質は、殆ど全ての種に存在する。ロンボイドプロテアーゼは、細胞制御に重要な切断事象を司る膜内セリンプロテアーゼである。これらの膜内プロテアーゼの活性部位は、細胞膜の脂質二重層に埋め込まれ、膜貫通ドメイン内の他の膜貫通タンパク質を切断する。
【００２０】
不活性ロンボイド(iRhoms)は、以前はタンパク質分解的に不活性であると考えられていた高度に保存された膜内タンパク質である。野生型iRhomsは、サイトゾルN末端ドメイン、保存されたシステインリッチな不活性ロンボイド相同ドメイン(IRHD)、及びペプチダーゼドメイン内の活性部位セリン残基を欠く休眠タンパク質分解部位を特徴とする。
【００２１】
iRhomsは、様々な種の多様な機能に関与し、これには、キイロショウジョウバエにおける上皮増殖因子受容体(EGFR)シグナル伝達の調節、ヒト扁平上皮癌細胞の生存、哺乳類細胞株の小胞体膜からのミスフォールドタンパク質のクリアランス、初代マウスケラチノサイトにおける移動の誘導、マウスにおける可溶性TNFαの分泌、及びマウス胚線維芽細胞における刺激されたADAM17媒介性メタロプロテアーゼ分断の基質選択性の調節が含まれる。EGF様リガンドは、iRhomファミリーメンバの基質として作用し得る。
【００２２】
iRhom機能の他の態様は、引き続き解明されている。iRhom2ノックアウトマウスは、McIlwain et al., Science, 2012, 335(6065):229-232に記載の通り、「生存可能且つ繁殖可能であり、明らかな欠陥を示さず、正常な寿命を有し、正常な免疫細胞分布を示す」ことが分かっている。
【００２３】
驚くべきことに、本明細書に記載の本発明の態様によれば、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異は、無毛表現型と、異種腫瘍の増殖増加とをNSGマウスにもたらすことが分かった。NSGマウスは、様々なタイプの異種移植の研究に有用であるが、極度に遅い異種腫瘍増殖を特徴とし、異種腫瘍を覆う皮膚の毛のために異種腫瘍の画像化が困難となる場合があるため、これらの表現型は、ヒト及び他の哺乳類における抗腫瘍薬及び治療の開発に寄与する。
【００２４】
したがって、遺伝子改変免疫不全マウスが、本発明により提供され、免疫不全マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、遺伝子改変免疫不全マウスは、変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、変異iRhom2タンパク質は、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異により、野生型iRhom2タンパク質とは異なり、遺伝子改変免疫不全マウスは、無毛表現型及び異種腫瘍細胞の増殖増加を特徴とする。
【００２５】
本発明の遺伝子改変免疫不全マウス、方法、及び組成物は、限定では無いが、異種腫瘍細胞増殖のモデル、移植異種腫瘍の薬物及び/又は治療処置に対する応答のアッセイのインビボでの方法、自然免疫系に影響を与える薬剤の試験、iRhom2に関連するシグナル伝達及び活性に影響を与える薬剤の試験等、様々な有用性を有する。
【００２６】
本明細書に用いた科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。こうした用語は、以下を例として含む様々な標準的参考文献の文中で定義及び使用されている:J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001、F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002、B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002、D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004、Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004、A. Nagy, M. Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer (Eds) 2002, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695919、及びK. Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002;185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808。
【００２７】
単数の用語である「a」、「an」、及び「the」は、限定的ではなく、特に明記されていない限り、或いは文脈から明らかとなる場合を除き、複数の指示物を含むものとする。
【００２８】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを含む任意の形態である2個以上のヌクレオチドを有するRNA又はDNA分子を示す。「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸の一本鎖形態におけるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内のヌクレオチドの順序を示すために用いられる。
【００２９】
「二重鎖(duplex)」及び「二本鎖(double-stranded)」という用語は、相補的なヌクレオチド配列の結合相互作用を特徴とする核酸を示すために用いられる。二重鎖は、「センス」鎖及び「アンチセンス」鎖を含む。このような二重鎖には、RNA/RNA、DNA/DNA、又はRNA/DNA型の二重鎖が含まれる。
【００３０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において、2乃至1000個の連結されたヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を表すために用いられ、「ポリヌクレオチド」という用語は、1000個を超えるヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を表すために用いられる。
【００３１】
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオチド配列に対して、個々のヌクレオチド又はヌクレオチドの種類を示す名詞として用いられる。
【００３２】
本明細書で用いられる「遺伝子操作マウス」という用語は、分子生物学的手法、即ち、組換えDNA技術により、個々のマウスゲノム又はマウス株ゲノムに導入された1つ以上のDNA修飾を含むマウスを示す。「遺伝子操作マウス」という用語は、個々のマウスゲノムに導入された1つ以上のDNA修飾を含むマウスの子孫であって、同様に1つ以上のDNA修飾を含むものを包含する。
【００３３】
「野生型」という用語は、未変異のマウス、タンパク質、又は核酸を示す。
【００３４】
マウス野生型Rhbdf2遺伝子は、サイトゾルN末端領域(アミノ酸1乃至347)、保存相同性ドメイン、及び休眠ペプチダーゼドメインを含む不活性ロンボイドプロテアーゼiRhom2をコードする。
【００３５】
野生型マウスiRhom2タンパク質は、野生型Rhbdf2遺伝子配列である配列番号2によりコードされる、本明細書に配列番号1として示すアミノ酸配列を有する。
【００３６】
野生型マウスiRhom1タンパク質は、本明細書に配列番号3として示すアミノ酸配列を有する。
【００３７】
「発現(expression)」、「発現する(expressing)」、「発現する(experss)」、及び文法上の同意語は、対応するmRNAを産生する遺伝子の転写、及び/又は対応するタンパク質を産生するmRNAの翻訳を示す。変異Rhbdf2遺伝子に関して、「発現する(experss)」、「発現(expression)」、「発現する(expressing)」、及び「発現する(expersses)」という用語は、対応するmRNAを産生する変異Rhbdf2遺伝子の転写、及び/又は対応する変異iRhom2タンパク質を産生するmRNAの翻訳を示す。
【００３８】
本発明の特定の態様では、突然変異を免疫不全マウスのRhbdf2遺伝子に導入し、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異のため野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質の発現を特徴とすると共に、野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景の免疫不全マウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍増殖の増加とを更に特徴とする、遺伝子操作免疫不全マウスを生成する。
【００３９】
本明細書で用いられる「無毛表現型(hairless phenotype)」という用語は、N末端領域に1つ以上の突然変異を有するiRhom2タンパク質を発現し、野生型iRhom2を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して95%以下の毛を有する遺伝子操作免疫不全マウスを示す。特定の態様によれば、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異を有するiRhom2タンパク質を発現する遺伝子操作NSGマウスは、野生型iRhom2を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、95%以下の毛を有する。
【００４０】
本明細書で用いる「異種腫瘍増殖の増加」とは、N末端領域に1つ以上の突然変異を有するiRhom2タンパク質を発現する遺伝子操作免疫不全マウスの特徴を示し、遺伝子操作免疫不全マウスにおける異種腫瘍は、対応する野生型iRhom2を発現する同じ遺伝的背景のマウスにおける異種腫瘍と比較して、より迅速に体積が増加する。特定の態様によれば、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異を有するiRhom2タンパク質を発現する遺伝子操作NSGマウスは、野生型iRhom2を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、異種腫瘍増殖の増加を特徴とする。
【００４１】
「免疫不全マウス」という用語は、T細胞及びB細胞等の機能性免疫細胞の欠如、DNA修復の欠陥、リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再構成における欠陥、 並びにIgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、及びIgA等の免疫機能分子の欠如のうち、1つ以上を特徴とするマウスを示す。免疫不全マウスは、Rag1及びRag2等、免疫機能に関与する遺伝子における1つ以上の欠損により特徴付けることができる(Oettinger, M.A et al., Science, 248:1517-1523, 1990、及びSchatz, D. G. et al., Cell, 59:1035-1048, 1989)。免疫不全マウスは、マウスに異常な免疫機能をもたらす上記又は他の欠陥の何れかを有し得る。
【００４２】
特に有用な免疫不全マウス株は、一般にNOD scidガンマ(NSG)マウスと呼ばれるNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (Shultz LD et al, 2005, J. Immunol, 174:6477-89に詳述)、一般にNRGマウスと呼ばれるNOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ (Shultz LD et al, 2008, Clin Exp Immunol 154(2):270-84)、及び一般にNOGマウスと呼ばれるNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (Ito, M. et al., Blood 100, 3175-3182 (2002)に詳述)である。
【００４３】
「NOD scidガンマ」及び「NSG」という用語は、本明細書において、周知の免疫不全マウス株NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJを示すために相互に交換可能に用いられる。NSGマウスは、NOD/ShiLtJバックグラウンド、重症複合免疫不全(scid)突然変異、及びインターロイキン2受容体ガンマ鎖の完全ノックアウトからの複数の免疫欠損を併せ持つ。その結果、NSGマウスは、成熟T、B、及びNK細胞が欠如しており、サイトカインシグナル伝達が欠損している。NSGマウスは、IL2R-γ(ガンマc)発現の欠如と、検出可能な血清免疫グロブリンの不在と、溶血性補体の不在と、成熟Tリンパ球の不在と、成熟ナチュラルキラー細胞の不在とを特徴とする。
【００４４】
「重症複合免疫不全(severe combined immune deficiency, SCID)」という用語は、T細胞の不在及びB細胞機能の欠如により特徴付けられる状態を示す。
【００４５】
SCIDの一般的な形態には、IL2RG遺伝子におけるガンマ鎖遺伝子変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(-)により特徴付けられるX連鎖SCIDと、Jak3遺伝子変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(-)、ADA遺伝子変異及びリンパ球表現型T(-)B(-)NK(-)、IL-7Rアルファ鎖変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、CD3デルタ又はイプシロン変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、RAG1/RAG2変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、アルテミス遺伝子変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、CD45遺伝子変異及びリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)により特徴付けられる常染色体劣性SCIDと、が含まれる。
【００４６】
本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスは、一般にscid変異と呼ばれる重症複合免疫不全変異(Prkdcscid)を有する。scid変異は、周知であり、Bosma, et al., Immunogenetics 29:54-56, 1989に記載の通り、マウス染色体16上に位置している。scid変異についてホモ接合性のマウスは、機能的T細胞及びB細胞の欠如、リンパ球減少症、低グロブリン血症、及び正常な造血微小環境により特徴付けられる。scid変異は、例えば、PCR又はフローサイトメトリ等の周知の方法を用いて、scid変異に対するマーカを検出することにより、検出することができる。
【００４７】
本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスは、IL2受容体ガンマ鎖欠損を有する。「IL2受容体ガンマ鎖欠損(IL2 receptor gamma chain deficiency)」という用語は、IL2受容体ガンマ鎖の減少を示す。IL2受容体ガンマ鎖の減少は、遺伝子欠失又は突然変異に起因する場合がある。IL2受容体ガンマ鎖の減少は、例えば、周知の方法を用いて、IL2受容体ガンマ鎖遺伝子の欠失又は変異を検出すること、及び/又はIL2受容体ガンマ鎖の発現の減少を検出することにより、検出することができる。
【００４８】
重症複合免疫不全症、又は重症複合免疫不全症と共にIL2受容体ガンマ鎖欠損を有する遺伝子改変免疫不全マウスが、本発明の態様により提供され、そのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含む。
【００４９】
scid変異、又はscid変異と共にIL2受容体ガンマ鎖欠損を有する遺伝子改変免疫不全マウスが、本発明の態様により提供され、そのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含みことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異のため野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００５０】
scid変異、又はscid変異と共にIL2受容体ガンマ鎖欠損を有する遺伝子改変免疫不全マウスが、本発明の態様により提供され、そのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含みことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異のため野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００５１】
遺伝子改変NSGマウスが、本発明の態様により提供され、そのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含みことから、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異のため、野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００５２】
Rhbdf2遺伝子の「突然変異」とは、Rhbdf2遺伝子の突然変異を有するマウスが、N末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現し、無毛表現型及び異種腫瘍細胞の増殖増加を特徴とするようになる、遺伝子の遺伝子改変を示す。
【００５３】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、遺伝子改変免疫不全マウスは、配列番号1のアミノ酸1から373までのN末端領域の少なくとも一部のインフレーム欠失のため、野生型iRhom2タンパク質と異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、遺伝子改変免疫不全マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。変異iRhom2のアミノ酸374乃至827は、配列番号1の野生型iRhom2タンパク質と同一であるか、又は実質的に類似する。
【００５４】
本発明の態様によれば、遺伝子改変NSGマウスは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、遺伝子改変NSGマウスは、配列番号1のアミノ酸1から373までのN末端領域の少なくとも一部のインフレーム欠失のため、野生型iRhom2タンパク質と異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、遺伝子改変NSGマウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。変異iRhom2のアミノ酸374乃至827は、配列番号1の野生型iRhom2タンパク質と同一であるか、又は実質的に類似している。
【００５５】
配列番号1の野生型iRhom2タンパク質のアミノ酸374乃至827に関して、「実質的に類似」という用語は、野生型iRhom2のアミノ酸374乃至827の機能を保持しつつ、70%、75%、80%、81% 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を示す。
【００５６】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、マウスは、アミノ酸イソロイシン156、アスパラギン酸158、及びプロリン159でのN末端領域における1つ、2つ、又は3つの突然変異のため、配列番号1の野生型iRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、変異iRhom2のアミノ酸374乃至827は、配列番号1の野生型iRhom2タンパク質と同一であるか、又は実質的に類似し、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００５７】
iRhom2のイソロイシン156、アスパラギン酸158、及びプロリン159から選択される1つ、2つ又は3つのアミノ酸は、マウスRhbdf2遺伝子の遺伝子改変により、他の任意のアミノ酸に変異させるか、又は欠失させて、変異Rhbdf2遺伝子を有する遺伝子改変免疫不全マウスを作製することが可能であり、マウスは、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異を有する変異iRhom2タンパク質を発現し、変異iRhom2のアミノ酸374乃至827は、配列番号1の野生型iRhom2タンパク質と同一であるか、又は実質的に類似し、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００５８】
本発明の態様によれば、iRhom2をコードするRhbdf2遺伝子配列のコドン156は、ATT(野生型)からACT又は当該コドンの他の置換又は欠失へ変異させ、オープンリーディングフレームは、無傷の状態とする。
【００５９】
本発明の態様によれば、iRhom2をコードするRhbdf2遺伝子配列のコドン158は、GATからAAT若しくはAAC又は当該コドンの他の置換又は欠失へ変異させ、オープンリーディングフレームは、無傷の状態とする。
【００６０】
本発明の態様によれば、iRhom2をコードするRhbdf2遺伝子配列のコドン159は、CCAからCTA又は当該コドンの他の置換又は欠失へ変異させ、オープンリーディングフレームは、無傷の状態とする。
【００６１】
遺伝コードの縮重の性質のため、2つ以上の核酸配列が特定のiRhom2ポリペプチドをコードし、このような核酸配列は、所望のiRhom2を産生すると理解される。
【００６２】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、プロリン159での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJ(NSG-BALDP159L)マウスであり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６３】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、プロリン159での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159X/SzJ(NSG-BALDP159X)マウスであり、Xは、任意のアミノ酸であり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６４】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、イソロイシン156での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156T/SzJ(NSG-BALDI156T)マウスであり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６５】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、イソロイシン156での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156X/SzJ(NSG-BALDP156X)マウスであり、Xは、任意のアミノ酸であり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６６】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、アスパラギン酸158での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158N/SzJ(NSG-BALDD158N)マウスであり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６７】
変異Rhbdf2遺伝子を含むゲノムを有する、本発明の態様により提供される遺伝子改変NSGマウスは、アスパラギン酸158での変異Rhbdf2遺伝子を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158X/SzJ(NSG-BALDP158X)マウスであり、Xは、任意のアミノ酸であり、マウスは、無毛表現型と異種腫瘍細胞の増殖増加とを特徴とする。
【００６８】
本発明の遺伝子改変マウス及びその使用の態様は、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lから選択される1つ以上のマウスiRhom2変異を特に参照して説明しているが、iRhom2のN末端領域における1つ以上の異なる又は追加の突然変異が考えられ、本開示及び特許請求の範囲の趣旨及び広義の範囲内に含まれるこのような代替物、変形物、及び変更物を全て包含することが意図される。
【００６９】
様々な方法の何れかを用いて、Rhbdf2遺伝子を変異させ、Rhbdf2遺伝子の突然変異を含むゲノムを有する遺伝子改変免疫不全マウスを作製することができる。Rhbdf2遺伝子は、限定では無いが、ゲノム編集、化学的突然変異誘発、照射、相同組換え、及びアンチセンスRNAのトランスジェニック発現等、遺伝子工学の標準的方法により、遺伝子改変免疫不全マウスのゲノムにおいて変異させる。
【００７０】
変異遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子改変動物を生成する方法には、限定では無いが以下に記載のものが含まれる:J. P. Sundberg and T. Ichiki, Eds., Genetically Engineered Mice Handbook, CRC Press; 2006、M. H. Hofker and J. van Deursen, Eds., Transgenic Mouse Methods and Protocols, Humana Press, 2002、A. L. Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919、Kursad Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002;185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 978047015180、Meyer et al. PNAS USA, vol. 107 (34), 15022-15026。
【００７１】
遺伝子改変方法
【００７２】
相同性に基づく組換え遺伝子改変戦略が用いられ、これには、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用いたヌクレアーゼ媒介プロセス、転写活性化様(Transcription Activator-Like, TAL)、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)-Cas、又はDrosophila組換え関連タンパク質(DRAP)アプローチ等がある。簡単に言えば、このプロセスは、標的TALEN又はZFN又はCRISPR又はDRAPをコードするRNA分子及び少なくとも1つのオリゴヌクレオチドをES又はiPS細胞に導入し、その後、修正した遺伝子を有するES細胞又はiPS細胞を選択することを含む。
【００７３】
遺伝子の突然変異は、受精卵母細胞(接合子)又は胚において直接達成し得る。このために、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ媒介プロセス、TALEN、CRISPR-Cas、又はDRAPを応用することができる。好適なアプローチは、TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPである。簡単に言えば、方法は、受精卵母細胞又は胚又は細胞に、標的TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPをコードする少なくとも1つの核酸分子、及び少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを導入することを含む。この方法は、更に、受精した卵母細胞、胚、又は細胞をインキュベートし、TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPを発現させることを含み、TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPにより標的染色体配列に導入された二本鎖切断は、相同性指向性DNA修復プロセスにより修復される。TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPをコードする核酸は、発現ベクタとしてDNA、又はRNAにすることができる。TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPをコードする核酸の代わりに、TALEN、ZFN、CRISPR-Cas、又はDRAPタンパク質を受精卵母細胞又は胚又は細胞に送達してもよい。DRAP手法は、US6534643、US6858716、及びUS6830910並びにWatt et al, 2006に記載されている。
【００７４】
本明細書で用いられる「標的部位」及び「標的配列」という用語は、編集の対象となる染色体配列の一部を定める核酸配列で、結合のための十分な条件が存在する場合に、ヌクレアーゼが認識及び結合するように操作されるものを示す。
【００７５】
ヌクレアーゼ
【００７６】
標的部位に特異的に結合するように操作された、TALEN、ZFN、及びI-SceI等のホーミングエンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを用いて、様々な異なる種でゲノム改変を行うことに成功している。
【００７７】
TAL(転写活性化様)エフェクタ
【００７８】
キサントモナス属の植物病原菌は、重要な栽培植物において多くの病気を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、25種類以上のエフェクタタンパク質を植物細胞に注入する保存III型分泌(T3S)系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写アクチベータを模倣して植物の転写を操作する転写活性化様(TAL)エフェクタ、又はTALE(転写活性化様エフェクタ(transcription activator-like effector))があり、Kay et al 2007, Science, 318:648-651を参照されたい。これらのタンパク質は、DNA結合ドメイン及び転写活性化ドメインを含む。最も特徴が明確なTALエフェクタの1つは、斑点細菌病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)由来のAvrBs3である(Bonas et al 1989, Mol Gen Genet 218: 127-136及びW02010079430参照)。TALエフェクタは、タンデム反復の集中ドメインを含み、各反復は、これらのタンパク質のDNA結合特異性にとって重要な約34個のアミノ酸を含む。加えて、これらは、核局在化配列及び酸性転写活性化ドメインを含んでおり、概説については、Schornack et al 2006, J Plant PhysioI163(3): 256-272、Scholze and Boch 2011, Curr Opin Microbiol, 14:47-53を参照されたい。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、brg11及びhpx17と命名されたキサントモナスのAvrBs3ファミリーと相同な2つの遺伝子が、R.solanacearum biovar 1株GMI 1000及びbiovar 4株RS1000において見つかっており、Heuer et al. 2007, Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに98.9%同一だが、hpxl7の反復ドメインにおける1,575bpの欠失により異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのAvrBs3ファミリータンパク質と40%未満の配列同一性を有する。
【００７９】
これらのTALエフェクタの特異性は、タンデムリピート内に見られる配列に依存する。反復配列は、約102bpを含み、反復は、一般に互いに91乃至100%相同である(Bonas et al, 1989, Mol Gen Genet 218: 127-136)。反復の多型は、通常、位置12及び13にあり、位置12及び13の高頻度可変性の2残基と、TALエフェクタの標的配列内の隣接ヌクレオチドの同一性との間には、1対1の対応があると思われ、Moscou and Bogdanove 2009, Science 326: 1501、及びBoch et al 2009, Science 326:1509-1512を参照されたい。2個の高頻度可変性残基は、反復可変二残基(repeat variable diresidues, RVD)として知られ、一方のRVDは、DNA配列の1個のヌクレオチドを認識し、各TALエフェクタのDNA結合ドメインが高精度で大きな認識部位を標的とすることが可能な状態を確保する(15乃至30nt)。実験的に、これらのTALエフェクタのDNA認識のためのコードは、位置12及び13のHD配列がシトシン(C)への結合につながるように決定されており、NGは、T、NI乃至A、C、G、又はTに結合し、NNは、A又はGに結合し、IGは、Tに結合する。これらのDNA結合反復を、反復の新しい組合せ及び数を有するタンパク質へと組み立て、新しい配列と相互作用し、植物細胞中のレポータ遺伝子の発現を活性化することが可能な人工的転写因子が作成されている(Boch et al 2009, Science 326:1509-1512)。これらのDNA結合ドメインは、全ての細胞型における標的ゲノム編集又は標的遺伝子制御の分野において一般的適用性を有することが現在では明らかとなっている(Gaj et al, 2013)。更に、操作されたTALエフェクタは、哺乳類細胞の天然のキサントモナスTALエフェクト又はタンパク質では自然には見られないヌクレアーゼ等の外因性機能タンパク質エフェクタドメインと関連して機能することが明らかとなっている。TALヌクレアーゼ(TALN又はTALEN)は、TALをヌクレアーゼ、例えば、N末端又はC末端のFokIヌクレアーゼドメインと組み合わせることで構築することが可能であり、Kim et al. 1996, PNAS 93:1156-1160、Christian et al 2010, Genetics 186:757-761、Li et al, 2011; and Miller et al, 2011を参照されたい。NHEJによる欠失を引き起こすTALENの機能性は、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、ツメガエル、メダカ、ラット、及びヒト細胞において明らかとなっている(Ansai et al, 2013、 Carlson et al, 2012、Hockemeyer et al, 2011、 Lei et al, 2012、Moore et al, 2012、Stroud et al, 2013、Sung et al, 2013、Wefers et al, 2013)。
【００８０】
TALENについて、その製造方法は、米国特許US8420782、US8450471、US8450107、US8440432、US8440431、及び米国特許出願US20130137161、US20130137174に更に記載されている。
【００８１】
他の有用なエンドヌクレアーゼは、例えば、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、Bg/I、及びAlwIを含み得る。一部のエンドヌクレアーゼ(例えば、FokI)が二量体としてのみ機能するという事実は、TALエフェクタの標的特異性を高めるために利用することができる。例えば、一部の例では、各FokI単量体は、異なるDNA標的配列を認識するTALエフェクタ配列に融合することが可能であり、2つの認識部位が近接している場合のみ、不活性単量体が一緒になり、機能的酵素を形成する。ヌクレアーゼの活性化にDNA結合が必要であることから、高度に部位特異的な制限酵素を形成することができる。
【００８２】
一部の実施形態において、TALENは、核局在化シグナル又は配列(nuclear localization signal or sequence, NLS)を更に含み得る。NLSは、TALENヌクレアーゼタンパク質を核内で標的化し、染色体内の標的配列に二本鎖切断を導入することを容易にするアミノ酸配列である。
【００８３】
核局在化シグナルは、当該技術分野において公知であり、例えば、Makkerh et al. 1996, Curr Biol. 6:1025-1027を参照されたい。NLSは、SV40 Large T抗原由来の配列PKKKRKV(配列番号5)(Kalderon 1984, Cell 39: 499-509)、ヌクレオプラスミン由来のRPAATKKAGQAKKK(配列番号6)(Dingwallet al., 1988, J Cell Biol. 107, 841-9)を含む。他の例は、McLane and Corbett 2009, IUBMB Life 61, 697-70、Dopie et al. 2012, PNAS 109, E544-E552に記載されている。
【００８４】
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから取得し得る。切断ドメインを誘導し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、限定では無く、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。例えば、2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.、及びBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。DNAを切断する他の酵素が知られており、例えば、SIヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNase I、小球菌ヌクレアーゼ、酵母HOエンドヌクレアーゼがある。Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい。これらの酵素の1つ以上、又はその機能的フラグメントは、切断ドメインの供給源として使用し得る。
【００８５】
ジンクフィンガー媒介ゲノム編集
【００８６】
遺伝子編集、特に欠失を形成するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の使用は、十分に確立されている。例えば、Carbery et al, 2010、Cui et al, 2011、Hauschild et al, 2011、Orlando et al, 2010、及びPorteus & Carroll, 2005を参照されたい。ZFNは、非相同末端結合(NHEJ)媒介性欠失を導入することによるノックアウトの生成、又は相同性指向性修復プロセスを介した標的挿入のために使用し得る。
【００８７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介プロセスの構成要素には、DNA結合ドメイン及び切断ドメインを有するジンクフィンガーヌクレアーゼが含まれる。これについては、例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141、Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340、Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660、Segal et al. (2001) Curr Opin. Biotechnol. 12:632-637、及びChoo et al. (2000) Curr Opin. Struct. Biol. 10:411-416、並びに米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に記載されている。標的配列に対してジンクフィンガー結合ドメインを設計及び選択する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Biochemistry 2002,41,7074-7081、米国特許第6,607,882号、6,534,261号、及び第6,453,242号を参照されたい。一部の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、更に、核局在化シグナル又は配列(NLS)を含み得る。NLSは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内で標的化し、染色体内の標的配列に二本鎖切断を導入することを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当該技術分野で公知である。例えば、Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027を参照されたい。切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから取得し得る。切断ドメインを誘導し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、限定では無く、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。例えば、2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.、及びBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。DNAを切断する追加の酵素が知られている(例えば、SIヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNase I、小球菌ヌクレアーゼ、酵母HOエンドヌクレアーゼ)。Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい。これらの酵素の1つ以上(又はその機能的フラグメント)は、切断ドメインの供給源として使用し得る。切断ドメインは、上述したように、切断活性の二量体化を必要とする酵素又はその一部に由来し得る。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含むため、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要となる場合がある。或いは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが両方の単量体を含み、活性酵素二量体を形成し得る。制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は多くの種に存在し、DNAに(認識部位において)配列特異的に結合し、結合部位又はその付近でDNAを切断することができる。特定の制限酵素(例えば、IIS型)は、認識部位から除去された部位でDNAを切断し、分離可能な結合及び切断ドメインを有する。例えば、IIS型酵素FokIは、一方の鎖の認識部位から9ヌクレオチド、他方の認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号、第5,436,150号、及び第5,487,994号、Li et al. (1992) PNAS 89:4275-4279、Li et al. (1993) PNAS 90:2764-2768、Kim et al. (1994) PNAS 91:883-887、Kim et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも1つのIIS型制限酵素からの切断ドメインと、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含んでよく、これらは操作されていてもいなくてもよい。IIS型制限酵素の例は、例えば、出典を明記することによりその開示内容全体を共に本願明細書の一部とする国際公開WO07/014,275に記載されている。他の制限酵素は、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを含み、これらもまた、本開示により企図される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420を参照されたい。切断ドメインが結合ドメインから分離可能なIIS型制限酵素の例は、FokIである。この特定の酵素は二量体として活性を有する(Bitinaite et al. 1998, PNAS 95: 10,570-10,575)。結果として、本開示の目的のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて用いられるFokI酵素の一部は、切断単量体と考えられる。したがって、FokI切断ドメインを用いた標的二本鎖切断のために、FokI切断単量体をそれぞれ含む2つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、活性酵素二量体を再構成し得る。或いは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び2つのFokI切断単量体を含む単一のポリペプチド分子を用いてもよい。特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、出典を明記することによりその開示内容全体を共に本願明細書の一部とする米国特許公開第20050064474号、第20060188987号、及び第20080131962号に記載のように、ホモ二量体化を最小化又は防止する1つ以上の操作された切断単量体を含み得る。非限定的な例として、FokIの位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、及び538のアミノ酸残基は、全てFokI切断ハーフドメインの二量化に影響を与えるための標的となる。偏性ヘテロ二量体を形成するFokIの操作された開裂単量体の例には、第1の切断単量体がFokIのアミノ酸残基位置490及び538に変異を含み、第2の切断単量体がアミノ酸残基位置486及び499に変異を含む対が含まれる。したがって、一実施形態において、アミノ酸位置490のFokI変異により、Glu(E)がLys(K)に置換され、アミノ酸残基538の変異により、Ile(I)がLys(K)に置換され、アミノ酸残基486の変異により、Gln(Q)がGlu(E)に置換され、位置499の変異により、Ile(I)がLys(K)に置換される。具体的には、FokIの操作された切断単量体は、1つの切断単量体において位置490をEからK、538をIからKへ変異させて、「E490K:I538K」と称する操作された切断単量体を作製することと、他の切断単量体において位置486をQからE、499をIからLへ変異させて「Q486E:I499L」と称する操作された切断単量体を作製することとにより、調製し得る。上記操作された切断単量体は、異常切断が最小化又は排除された偏性ヘテロ二量体突然変異体である。操作された切断単量体は、適切な方法、例えば、米国特許公開第20050064474号に記載のような野生型切断単量体(FokI)の部位特異的突然変異誘発により調製し得る。
【００８８】
上述したジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的組込み部位に二本鎖切断を導入するように操作し得る。二本鎖切断は、標的組込み部位であってもよく、又は組込み部位から1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、又は1000個のヌクレオチドまで離間し得る。一部の実施形態において、二本鎖切断は、組込み部位から1、2、3、4、5、10、15、又は20個のヌクレオチドまで離間し得る。他の実施形態において、二本鎖切断は、組み込み部位から10、15、20、25、30、35、40、45、又は50個のヌクレオチドまで離間し得る。更に他の実施形態において、二本鎖切断は、組み込み部位から50、100、又は1000個のヌクレオチドまで離間し得る。
【００８９】
CRISPR-Cas系
【００９０】
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)は、配列決定された細菌の略40%及び配列決定された古細菌の90%のゲノムに見られ、外来DNA要素に対する耐性を付与する複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座であり、Horvath, 2010, Science 327: 167-170、Barrangou et al, 2007、及びMakarova et al, 2011を参照されたい。CRISPRリピートは、24乃至48塩基対の大きさの範囲である。通常は、何らかの二回転対称(dyad symmetry)を示し、ヘアピン等の二次構造の形成を示唆するが、真の回文構造は有していない。CRISPRリピートは、同様の長さのスペーサにより分離されている。
【００９１】
CRISPR関連(cas)遺伝子は、CRISPRリピート・スペーサ列に関連する場合が多い。40種類以上のCasタンパク質ファミリーが記載されている(Haft et al. 2005, PLoS Comput Biol. 1 (6): e60)。cas遺伝子及び反復構造の特定の組み合わせは、8つのCRISPRサブタイプを定義するために使用されており、その一部は、repeat-associated mysterious protein(RAMP)をコードする他の遺伝子モジュールと関連している。
【００９２】
様々な生物に多様なCRISPR系があり、最も単純なものの1つは、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来のII型CRISPR系であり、Cas9タンパク質をコードする単一の遺伝子、及び2つのRNA、即ち、成熟CRISPR RNA(crRNA)及び部分相補的なトランス作用RNA(tracrRNA)のみが、外来DNAのRNA誘導サイレンシングに必要十分となる(Gasiunas et al, 2012、Jinek et al, 2012)。crRNAの成熟には、tracrRNA及びRNase IIIが必要となる(Deltcheva et al, 2011)。しかしながら、この必要条件は、tracrRNA-crRNA複合体を模倣する設計ヘアピンを含む、操作されたスモールガイドRNA(sgRNA)を使用することにより回避することができる(Jinek et al., 2012)。sgRNAと標的DNAとの間の塩基対形成は、Cas9のエンドヌクレアーゼ活性による二本鎖切断(DSB)を引き起こす。結合特異性は、sgRNA-DNA塩基対形成と、DNA相補領域に並置された短いDNAモチーフ(プロトスペーサ隣接モチーフ[PAM]配列:NGG)との両方により決定される(Marraffini & Sontheimer, 2010)。例えば、CRISPR系は、2つの分子、Cas9タンパク質、及びsgRNAの最小セットを必要とするため、宿主非依存性遺伝子標的化プラットフォームとして使用することができる。最近では、Cas9/CRISPRを、部位選択的RNA誘導ゲノム編集に利用できることが実証されている(Carroll, 2012、Chang et al, 2013、Cho et al, 2013、Cong et al, 2013、Hwang et al, 2013、Jiang et al, 2013、Mali et al, 2013、Qi et al, 2013、Shen et al, 2013、Wang et al, 2013)。Wang et al. 2013は、オリゴヌクレオチドと組み合わせる場合、CRISPR/Cas9系による標的挿入が可能であることを示している。
【００９３】
1つ以上のヌクレアーゼ及び/又はTAL等の1つ以上の他のペプチド又はタンパク質をコードする核酸は、原核細胞又は真核細胞への形質転換及びコードされたペプチド及び/又はタンパク質(群)の発現のために、発現ベクタにクローニングすることができる。本明細書での使用において、「発現ベクタ」は、適切な宿主細胞、例えば、発現系に導入された場合、ポリペプチドへの転写及び翻訳が可能なポリヌクレオチドとして定義される。インビボ「発現系」は、所望の発現産物が生じるように機能することが可能な発現ベクタを含む適切な宿主細胞である。発現ベクタは、コードされたタンパク質を、インビトロ発現系内等、インビトロで産生するためにも使用し得る。
【００９４】
発現ベクタは、原核生物ベクタ、例えば、プラスミド、又はシャトルベクタ、昆虫ベクタ、又は真核生物ベクタにすることができる。
【００９５】
ヌクレアーゼ発現構築物は、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第20030232410号、第20050208489号、第20050026157号、第20050064474号、第20060188987号、第20060063231号、第20080182332号、第2009011188号、及び国際公開WO07/014,275に記載されている。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーター又は誘導プロモーターの制御下にし得る。他の適切な細菌及び真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)、Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biologyに記載されている。タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス種、及びサルモネラ属において利用することができる(Palva et al. (1983) Gene 22:229-235)。
【００９６】
プロモーターに加えて、発現ベクタは、一般に、原核細胞又は真核細胞の何れかである宿主細胞における核酸の発現に必要な全ての追加エレメント、例えば、シグナル配列、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列を含む、転写ユニット又は発現カセットを含む。したがって、一般的な発現カセットは、例えば、ヌクレアーゼをコードする核酸配列に適切に作用可能に連結されたプロモーターと、例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結に必要なシグナルとを含む。カセットの他の要素は、例えば、エンハンサー、異種スプライシングシグナル、及び/又は核局在化シグナル(NLS)を含み得る。
【００９７】
適切なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当該技術分野において公知である。細菌細胞での発現では、適切なプロモーターには、限定では無いが、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP、及びtrcが含まれる。真核細胞での発現では、適切なプロモーターには、限定では無いが、サイトメガロウイルス最初期プロモーター(cytomegalovirus immediate early promoter)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復に存在するプロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、及び当該技術分野で公知の様々な組織特異的プロモーターが含まれる。
【００９８】
一部の実施形態において、例えば、酵母細胞での発現では、適切なプロモーターには、構成的プロモーターとして、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーター等と、調節可能なプロモーターとして、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PH05プロモーター、CUP1プロモーター、GAL7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、及び例えばピキア属で使用するためのAOX1等が含まれる。適切なベクタ及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００９９】
原核生物宿主細胞で使用するのに適切なプロモーターには、限定では無いが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーターと、trpプロモーターと、lacオペロンプロモーターと、ハイブリッドプロモーター、例えばlac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーターと、trcプロモーターと、tacプロモーター等と、araBADプロモーターと、インビボで調節されるプロモーターとしてssaGプロモーター又は関連するプロモーター等(例えば、米国特許公開第20040131637号参照)と、pagCプロモーター(Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93、Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83参照)と、nirBプロモーター(Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805- 2813参照)及びその他(例えば、Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255、及びChatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892参照)と、シグマ70プロモーター、例えばコンセンサスシグマ70プロモーター(例えば、GenBank受入番号AX798980、AX798961、及びAX798183を参照)と、固定相プロモーター、例えばdpsプロモーター、spvプロモーター等と、病原性アイランドSPI-2に由来するプロモーター(例えば、WO96/17951参照)と、actAプロモーター(例えば、Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1087-1096参照)と、rps Mプロモーター(例えば、Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367参照)と、Tet(テトラサイクリン)プロモーター(例えば、Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) in Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162参照)と、SP6プロモーター(例えば、Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035参照)と等が含まれる。大腸菌等の原核生物での使用に適した強力なプロモーターには、限定では無いが、Trc、Tac、T5、T7、及びpλが含まれる。細菌宿主細胞で使用するオペレータの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレータ(LacIリプレッサタンパク質は、ラクトースとの接触時にコンフォメーションを変化させることにより、LacIリプレッサタンパク質がオペレータに結合するのを防ぐ)、トリプトファンプロモーターオペレータ(トリプトファンと複合体化した際に、TrpRリプレッサタンパク質は、オペレータに結合するコンフォメーションを有し、トリプトファンの非存在下では、TrpRリプレッサタンパク質は、オペレータに結合しないコンフォメーションを有する)、及びtacプロモーターオペレータが含まれ、例えば、deBoer et al. (1983) PNAS 80:21-25を参照されたい。
【０１００】
このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞用の真核生物発現系は、当業者に周知であり、同様に市販されている。
【０１０１】
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順の何れかを使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法(例えばソノポレーション)、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクタ、エピソーム及び組込の両方のウイルスベクタ、及びクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又は他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入する他の周知の方法が含まれる(例えば、Sambrook et al., 前掲参照)。使用する特定の遺伝子操作手法が、選択したタンパク質を発現可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を上手く導入することができればよい。
【０１０２】
例えばCas9及びdCas9遺伝子は、Jinek et al., 2012に記載のように、ベクタpMJ806及びpMJ841からクローン化される。遺伝子をPCR増幅し、Tc誘導性プロモーターPLtetO-1(Lutz and Bujard, 1997, Nucleic Acids Res. 25:1203-10)、クロラムフェニコール選択マーカ、及びp15A複製起点を含むベクタに挿入する。sgRNA鋳型を、アノテーションされた転写開始部位、アンピシリン選択マーカ、及びColE1複製起点を有する最小合成プロモーター(J23119)を含むベクタにクローニングする。インバースPCRを用いて、新たな20bpの相補領域を有するsgRNAカセットを生成する。発現系は、例えば、Cong et al, 2013、及びJinek et al, 2012に記載されている。
【０１０３】
ドナーオリゴヌクレオチドは、本発明の態様によるTAL、ZFN、CRISPR、及びDRAPを含む遺伝子編集系と組み合わせて使用される。
【０１０４】
突然変異を生成するためにRhbdf2遺伝子の染色体配列を編集する方法は、Rhbdf2遺伝子の突然変異を導入する配列を含む少なくとも1つのドナーオリゴヌクレオチドを受精卵母細胞、胚、又は細胞に導入することを含む。ドナーオリゴヌクレオチドは、少なくとも3つの成分、即ち、Rhbdf2変異の配列をコードする配列、上流配列、及び下流配列を含む。タンパク質をコードする配列は、上流及び下流配列に隣接し、上流及び下流配列は、染色体における組込み部位の何れかの側との配列類似性を共に有する。
【０１０５】
一般に、ドナーオリゴヌクレオチドは、DNAとなる。ドナーオリゴヌクレオチドは、DNAプラスミド、DNAの線状断片、PCRフラグメント、裸の核酸、一本鎖核酸、合成オリゴヌクレオチド、又はリポソーム又はポロクサマ等の送達ビヒクルと複合体化した核酸にし得る。好適な実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。
【０１０６】
マウスRhbdf2遺伝子を突然変異させるのに有用な特定のオリゴヌクレオチドが、本発明により提供される。
【０１０７】
野生型Rhbdf2遺伝子配列(配列番号2)に点突然変異p.P159Lを導入するためのドナーオリゴヌクレオチドは、次の通りである:CGTGCAAGATGCCCAAGGTGGGCCCCCTGGAGGTGATGGGCAGCAAGCGGCTCTCCCAGGGTCTGGGCAACATTGTTCACCCACATCTCTTGCAGATTGTGGATCTACTGGCTCGGGGTAGGGCCTTCCGCCATCCAGATGAGGTGGACCGGCCTCACGCTGCCCACCCACCTCTGACTCCAGGGGTCCTGTCTCTCAC (配列番号4)。
【０１０８】
配列番号4のドナーオリゴヌクレオチドの変異体を用いて、野生型Rhbdf2遺伝子配列内の点突然変異p.P159Lを導入し得る。例えば、ドナーオリゴヌクレオチド変異体は、野生型Rhbdf2遺伝子配列内に点突然変異p.P159Lを導入して、P159Lに加えてN末端に突然変異を有する変異iRhom2を生成するために使用される。
【０１０９】
本発明の態様によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を配列番号4の何れかに対して有し、変異体は、配列番号4をコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする。
【０１１０】
点突然変異p.P159L(配列番号4)を導入するためのドナーオリゴヌクレオチドは、点変異p.I156T及びp.D158Nを導入するように作用可能であることも分かった。更に、配列番号4のドナーオリゴヌクレオチドは、免疫不全マウスのゲノムに複数の点突然変異、特にp.P159L、p.I156T、及びp.D158Nのうち2つ以上の組み合わせ、又はこれら3つの突然変異の全てを導入するように作用可能であることが分かった。
【０１１１】
ドナーヌクレオチド変異体は、本明細書に開示したものと同一ではないが、遺伝コードの縮重のため、野生型又は変異iRhom2の所望の部分をコードするものを含む。
【０１１２】
基準タンパク質を推定相同体と比較する際には、アミノ酸配列内の対応位置にあるアミノ酸の同一性に加えて、アミノ酸類似性を考慮し得る。「アミノ酸類似性」は、基準タンパク質内の対応するアミノ酸位置と比較した、推定相同体におけるアミノ酸同一性及び保存的アミノ酸置換を示す。
【０１１３】
保存的アミノ酸置換を基準タンパク質に形成し、変異体を作製することができる。
【０１１４】
保存的アミノ酸置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸に対する、1つのアミノ酸の当技術分野で認識されている置換である。例えば、各アミノ酸は、以下の特性の1つ以上を有するものとして記述し得る:電気陽性、電気陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、及び親水性。保存的置換とは、特定の構造的又は機能的特徴を有する1つのアミノ酸が、同じ特性を有する別のアミノ酸に対して置換されることである。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれ、塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リジン、アルギニンが含まれ、脂肪族アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン、及びバリンが含まれ、芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、グリシン、チロシン、及びトリプトファンが含まれ、極性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、及びチロシンが含まれ、疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、及びトリプトファンが含まれ、保存的置換には、各群内のアミノ酸間の置換が含まれる。アミノ酸は、相対サイズに関して記述してもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、トレオニン、セリン、バリンは、全て一般に小さいと見做される。
【０１１５】
変異体は、合成アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、及び/又は非標準アミノ酸を含むことが可能であり、これには一例として、限定では無く、αアミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、3-ホスホセリン、ホモセリン、5-ヒドロキシトリプトファン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、及びオルニチンが含まれる。
【０１１６】
核酸に関して、遺伝暗号の縮重の性質のため、複数の核酸配列が特定のタンパク質をコードすることが可能であり、このような代替核酸を本発明の組成物及び方法において使用し得ることは、当業者に理解されよう。
【０１１７】
同一性パーセントは、基準アミノ酸又は核酸配列及び推定相同アミノ酸又は核酸配列を含む、アミノ酸配列又は核酸配列の比較により決定される。2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、最適に比較する目的で配列をアラインメントする(例えば、第1のアミノ酸又は核酸配列の配列にギャップを導入して、第2のアミノ酸又は核酸配列と適切にアラインメントすることができる)。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置を、第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドが占める場合、分子はその位置において同一となる。2配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数となる(即ち、同一性%=同一の重複位置数/位置の総数×100%)。比較される2配列は、一般に同じ長さ又はほぼ同じ長さである。
【０１１８】
2配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することもできる。同一性パーセントの決定に使用されるアルゴリズムには、一例として、S. Karlin and S. Altshul, PNAS, 90:5873-5877, 1993、T. Smith and M. Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482-489, 1981、S. Needleman and C. Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970、W. Pearson and D. Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988のアルゴリズム、及び、限定では無いがGAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA等のコンピュータ実装に組み込まれた他のアルゴリズムと、例えば、Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)に組み込まれ、国立バイオテクノロジー情報センターで公開されているBLASTが含まれる。
【０１１９】
2配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的な例には、Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268のアルゴリズムで、Karlin and Altschul, 1993, PNAS. 90:5873-5877のように修正されたものがある。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメータを、例えばscore=100、word length=12に設定して行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムパラメータを、例えばscore50、word length=3に設定して行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得る。比較の目的でギャップのあるアライメントを得るには、Gapped BLASTを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように利用する。又は、PSI BLASTを用いて、分子間の遠縁の関係を検出する反復検索を行う。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI Blastプログラムを利用する際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメータを用いる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの他の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する際には、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を用いる。
【０１２０】
2配列間の同一性パーセントは、ギャップの許容の有無に拘わらず、上述したものと同様の手法を用いて決定される。同一性パーセントの計算では、一般に完全一致のみが計数される。
【０１２１】
1つ以上の核酸又はアミノ酸突然変異を、それぞれ所定の核酸又はタンパク質の機能的特性を変更することなく導入できることを、当業者は認識するであろう。
【０１２２】
Rhbdf2遺伝子の突然変異を含むゲノムを有する遺伝子改変免疫不全マウスの生成は、着床前胚又は胚性幹(ES)細胞若しくは誘導多能性幹(iPS)細胞等の幹細胞への遺伝子ターゲティングベクタの導入により達成することができる。
【０１２３】
「遺伝子ターゲティングベクタ」という用語は、標的遺伝子への挿入又は標的遺伝子の置換等により、特定の染色体座を組み換えて変異させるのに有効な二本鎖組換えDNA分子を示す。
【０１２４】
標的遺伝子変異のために、遺伝子ターゲティングベクタは、組換えDNA手法を用いて作製され、幹細胞内在性Rhbdf2遺伝子に相同な5’及び3’配列を含む。遺伝子ターゲティングベクタは、随意で、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン、又はピューロマイシン等の選択マーカを更に含むことが好ましい。当業者は、遺伝子ターゲティングベクタに含めるための配列を選択し、日常の実験の範囲で用いることができる。遺伝子ターゲティングベクタは、周知の方法論を用いて組換え的又は合成的に生成することができる。
【０１２５】
遺伝子ターゲティングベクタを着床前胚にDNA注入する方法では、非ヒト着床前胚への注入前に遺伝子ターゲティングベクタを線状化する。好ましくは、遺伝子ターゲティングベクタは、受精卵母細胞に注入する。受精卵母細胞は、交配翌日(0.5dpc)に過排卵した雌から採取し、発現構築物を注入する。注入後の卵母細胞は、一晩培養するか、又は交尾後0.5日の偽妊娠の雌の卵管に直接移植する。過排卵、卵母細胞の採取、遺伝子ターゲティングベクタの注入、及び胚移植のための方法は、当技術分野において公知であり、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919に記載されている。子孫は、PCR、サザンブロット、又は配列決定等のDNA分析により、Rhbdf2遺伝子変異の存在について試験することができる。Rhbdf2遺伝子の突然変異を有するマウスは、ELISA又はウェスタンブロット分析及び/又はRT-PCR等のmRNA発現を使用すること等により、iRhomタンパク質発現について試験することができる。
【０１２６】
あるいは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、及びリポフェクション等の周知の方法を用いて、遺伝子ターゲティングベクタを幹細胞(ES細胞又はiPS細胞)にトランスフェクトし得る。
【０１２７】
マウスES細胞を、特定の株に対して最適化された培地で増殖させる。通常、ES培地は、15%ウシ胎仔血清(FBS)又は合成若しくは半合成等価物、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、50U/mlペニシリン及びストレプトマイシン、0.1mM 2-メルカプトエタノール、及びダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の1000U/ml LIF(一部の細胞系に対しては、分化の化学抑制剤を追加)を含む。詳細な説明は、当該技術分野において公知である(Tremml et al., 2008, Current Protocols in Stem Cell Biology, Chapter 1:Unit 1C.4)。ES細胞分化の抑制剤の説明については、Buehr, M.,et al., 2003. Genesis of embryonic stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 358, 1397-1402を参照されたい。
【０１２８】
細胞は、PCR、サザンブロット、又は配列決定等のDNA分析により、Rhbdf2遺伝子変異についてスクリーニングする。Rhbdf2遺伝子の突然変異を生じる正しい相同組換え事象を有する細胞は、ELISA又はウェスタンブロット分析を用いること等によりiRhomタンパク質発現について、及び/又はRT-PCR等によりmRNA発現について、試験することができる。必要に応じて、幹細胞をCreリコンビナーゼで処理することにより、選択マーカを除去することができる。Creリコンビナーゼ処理後、変異iRhom2をコードする核酸の存在について、細胞を分析する。
【０１２９】
Rhbdf2遺伝子を突然変異させる正しいゲノム事象を有する選択された幹細胞を、着床前胚に注入することができる。マイクロインジェクションのために、トリプシン及びEDTAの混合物を用いて、ES又はiPS細胞を、単細胞とした後、ES培地に再懸濁する。細かく引き延ばしたガラス針(内径20乃至25マイクロメータ)を用いて、単細胞群を選択し、マイクロマニピュレータを装備した倒立顕微鏡を用いて、胚の透明帯を介して胚盤腔(胞胚腔)に導入する。胚盤胞注入の代わりに、幹細胞を初期段階の胚(例えば、2細胞、4細胞、8細胞、桑実胚前、又は桑実胚)に注入することができる。注入は、透明帯を穿孔するレーザ又はピエゾパルスを用いて支援し得る。胚盤胞又は8細胞期胚当たり、約9乃至10個の選択された幹細胞(ES又はiPS細胞)、4細胞期胚当たり6乃至9個の幹細胞、及び2細胞期胚当たり約6個の幹細胞が注入される。幹細胞導入後、胚は、37℃、窒素中5%CO2、5%O2で数時間回復させるか、又は一晩培養後、偽妊娠のレシピエントである雌に移植する。更に幹細胞注入の代わりとして、幹細胞は、桑実胚期の胚と凝集させることができる。これらの方法は全て確立されており、幹細胞キメラを作製するために用いることができる。更に詳細な説明については、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Nagy et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919, 1990, Development 110, 815-821、US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、及びKraus et al., 2010, Genesis 48, 394-399を参照されたい
【０１３０】
偽妊娠胚レシピエントは、当該技術分野において公知の方法を用いて準備される。簡単に言うと、6乃至8週齢の繁殖可能な雌マウスを、精管切除した又は不妊の雄と交配させて、外科的に導入した胚の支持につながるホルモン状態を誘導する。交尾後2.5日目(2.5dpc)に、胚盤胞を含む15個までの幹細胞を、子宮-卵管接合部に極めて近い子宮角に導入する。初期段階の胚及び桑実胚については、このような胚をインビトロで培養して胚盤胞とするか、又は胚段階に応じて0.5dpc又は1.5dpcの偽妊娠雌の卵管に移植する。移植胚からのキメラ仔は、移植時の胚齢に応じて、導入後16乃至20日で生まれる。キメラの雄を、繁殖用に選択する。子孫は、毛の減少、即ち、無毛表現型の出現、及び/又はPCR、サザンブロット、又は配列決定等の核酸分析により、ES細胞ゲノムの伝達について分析することができる。更に、変異iRhomの発現を、変異iRhomをコードするmRNAを検出することで、あるいは、タンパク質分析、例えばイムノアッセイ、又は機能アッセイ等により、変異タンパク質の発現を検出することで分析して、Rhbdf2遺伝子変異を確認することができる。Rhbdf2遺伝子変異を有する子孫を交雑させ、Rhbdf2遺伝子変異についてホモ接合性である非ヒト動物を作製する。トランスジェニックマウスを免疫不全マウスに交配させ、Rhbdf2遺伝子変異を有するコンジェニック免疫不全株を作製する。
【０１３１】
遺伝子改変された非ヒト動物を評価して、マウスが変異Rhbdf2遺伝子を発現するようにRhbdf2遺伝子が変異しているかを決定する方法は周知であり、核酸アッセイ、分光アッセイ、イムノアッセイ、及び機能アッセイ等の標準的手法が含まれる。
【０１３２】
1つ以上の標準を用いて、試料中のiRhomの定量を可能にすることができる。
【０１３３】
推定変異Rhbdf2遺伝子を有するマウスにおける変異iRhom2の機能を評価するためにアッセイを行うことができる。推定Rhbdf2遺伝子変異を有するマウスにおける推定変異iRhom2の機能を評価するアッセイには、マウスの毛の評価が含まれる。
【０１３４】
随意で、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスは、選抜育種により作製される。第1の所望の遺伝子型を有するマウスの第1の親株は、第2の所望の遺伝子型を有するマウスの第2の親株と交配させ、第1及び第2の所望の遺伝子型を有する遺伝子改変マウスである子孫を作製し得る。例えば、免疫不全である第1のマウスを、Rhbdf2遺伝子変異を有する第2のマウスと交配させ、免疫不全でRhbdf2遺伝子変異を有する子孫を作製し、Rhbdf2遺伝子変異によりコードされる変異iRhom2を発現させ、1つ以上のRhbdf2遺伝子変異を含む遺伝子改変免疫不全マウスにおいて、1つ以上のRhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを発生させ得る。
【０１３５】
他の例では、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウス、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac(NOG)又はNOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ(NRG)マウスは、Rhbdf2遺伝子変異を有するマウスと交配させ、免疫不全でRhbdf2遺伝子変異を有する子孫を作製し、Rhbdf2遺伝子変異によりコードされる変異iRhomを発現させ、突然変異を保有する免疫不全の子孫の無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを発生させ得る。
【０１３６】
本発明の態様は、実質的にその細胞の全てにおいてRhbdf2遺伝子変異を含む遺伝子改変免疫不全マウスと、全てではなく、その一部の細胞においてRhbdf2遺伝子変異を含む遺伝子改変免疫不全マウスとを提供する。
【０１３７】
本発明の態様によれば、変異Rhbdf2遺伝子を有することから対応する変異iRhomを発現するようになり、無毛表現型と、マウスに投与された異種腫瘍細胞からの異種腫瘍の増殖増加とを発生させ、増殖性疾患の腫瘍モデルを提供する本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに、異種腫瘍細胞を投与する。本発明の態様によれば、変異Rhbdf2遺伝子を有することから対応する変異iRhom2を発現するようになり、無毛表現型と、マウスに投与された異種腫瘍細胞からの異種腫瘍の増殖増加とを発生させる本発明の遺伝子改変NSG、NOG又はNRGマウスに、異種腫瘍細胞を投与する。
【０１３８】
本発明の態様によれば、異種腫瘍細胞を、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156X/SzJ、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158X/SzJ、又はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159X/SzJマウスに投与し、マウスは、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有する。
【０１３９】
本発明の態様によれば、異種腫瘍細胞を、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156T/SzJ、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158N/SzJ、又はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスに投与し、マウスは、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有する。
【０１４０】
本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される異種腫瘍細胞は、様々な腫瘍細胞の何れかにすることが可能であり、限定では無いが、腫瘍細胞株の細胞及び原発腫瘍細胞を含む。異種腫瘍細胞は、様々な生物、好ましくは、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、及びヒツジを含む哺乳動物の何れかに由来し得る。
【０１４１】
本発明の特定の態様によれば、異種腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。本発明の特定の態様によれば、ヒト腫瘍細胞は、限定では無いが、血液試料、組織試料、又はヒト腫瘍の生検により得られた試料等、ヒトから得られた試料中に存在する。
【０１４２】
ヒトから得られた腫瘍細胞は、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに直接投与することが可能であり、又はマウスへの投与前にインビトロで培養し得る。
【０１４３】
本明細書での使用において、「腫瘍」という用語は、限定では無いが、前新生物性過剰増殖、上皮内癌、新生物、転移、並びに固形及び非固形腫瘍を含む、未制御の増殖を特徴とする細胞を示す。腫瘍の例には、限定では無く、次の癌により生じるものである:リンパ腫、白血病、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、三種陰性乳癌、中枢又は末梢神経癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃腸癌、神経膠芽腫、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、鼻腔癌、口腔咽頭癌、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌、及び外陰癌。
【０１４４】
腫瘍細胞は、限定では無いが、皮下注射、腹腔内注射、又は尾静脈への注射等、様々な経路により投与することができる。
【０１４５】
異種腫瘍細胞の移植は、限定では無いが、腫瘍形成の徴候に関するマウスの目視検査等、様々な方法の何れかにより評価することができる。
【０１４６】
投与される腫瘍細胞の数は、限定的されないと考えられる。単一の腫瘍細胞は、本明細書に記載の遺伝子改変免疫不全動物において検出可能な腫瘍に拡大することができる。投与される腫瘍細胞の数は、一般に、1000乃至1×106個の腫瘍細胞の範囲だが、より多い又は少ない数でも投与し得る。
【０１４７】
本発明のRhbdf2遺伝子の変異を有する遺伝子改変免疫不全マウスで、N末端領域に変異のある対応するiRhom2を発現する免疫不全マウスにおける異種腫瘍の増殖増加は、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景の免疫不全マウスと比較して観察することができる。この増加は、任意の検出可能な増加、例えば、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景の免疫不全マウスと同期間で比較して1%以上、例えば、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景の免疫不全マウスと同期間で比較して10%以上の腫瘍体積の増加、例えば、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景の免疫不全マウスと同期間で比較して20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%以上の腫瘍体積の増加にすることができる。
【０１４８】
様々な方法の何れかを用いて、異種腫瘍の増殖を測定することが可能であり、限定では無いが、生存マウスにおける測定、生存マウスから切除した腫瘍の測定、若しくは原位置での腫瘍の測定、又は死亡したマウスからの切除が含まれる。測定値は、キャリパ等の測定機器、超音波検査、コンピュータ断層撮影、陽電子放射断層撮影、蛍光イメージング、生物発光イメージング、磁気共鳴イメージング等の1つ以上の画像化手法を使用する測定、及び上記または他の腫瘍測定方法の任意の2つ以上の組み合わせを用いて取得することができる。異種腫瘍細胞を有するマウスから得られた試料中の腫瘍細胞の数は、特に非固形腫瘍について、腫瘍増殖を測定するために使用することができる。例えば、血液試料中の非固形腫瘍細胞の数を評価して、マウスにおける非固形腫瘍の増殖の測定値を得ることができる。
【０１４９】
本発明の態様による組成物の抗腫瘍活性を同定するための方法は、変異Rhbdf2遺伝子を有することから対応する変異iRhomを発現するようになり、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有する遺伝子改変免疫不全マウスを提供することと、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて固形又は非固形腫瘍を形成する異種腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与することと、試験化合物を遺伝子改変免疫不全マウスに投与することと、試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることを含み、腫瘍及び/又は腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして被験物質を同定する。
【０１５０】
本発明の態様による組成物の抗腫瘍活性を同定するための方法は、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから対応する変異iRhomを発現するようになり、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有する遺伝子改変NSG、NOG、又はNRGマウスを提供することと、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて腫瘍を形成する異種腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与することと、試験化合物を遺伝子改変免疫不全マウスに投与することと、試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることを含み、腫瘍及び/又は腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして被験物質を同定する。
【０１５１】
本発明の態様による組成物の抗腫瘍活性を同定するための方法は、Rhbdf2遺伝子に変異を含むことからN末端領域に変異を有する対応する変異iRhomを発現するようになり、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有する遺伝子改変NSGマウスを提供することと、遺伝子改変NSGマウスにおいて腫瘍を形成する異種腫瘍細胞を遺伝子改変NSGマウスに投与することと、試験化合物を遺伝子改変NSGマウスに投与することと、試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることを含み、腫瘍及び/又は腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして被験物質を同定する。
【０１５２】
本発明の態様による組成物の抗腫瘍活性を同定するための方法は、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156X/SzJ、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158X/SzJ、又はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159X/SzJマウスを提供することと、マウスにおいて腫瘍を形成する異種腫瘍細胞をマウスに投与することと、試験化合物をマウスに投与することと、試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることを含み、腫瘍及び/又は腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして被験物質を同定する。
【０１５３】
本発明の態様による組成物の抗腫瘍活性を同定するための方法は、Rhbdf2遺伝子変異の無い同じ背景のマウスと比較して、無毛表現型と異種腫瘍の増殖増加とを有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfI156T/SzJ、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfD158N/SzJ、又はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJマウスを提供することと、マウスにおいて腫瘍を形成する異種腫瘍細胞をマウスに投与することと、試験化合物をマウスに投与することと、試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることを含み、腫瘍及び/又は腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、抗腫瘍活性を有するものとして被験物質を同定する。
【０１５４】
試験化合物に対する異種腫瘍及び/又は腫瘍細胞の応答をアッセイすることは、本発明の方法の態様による異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較することを含み、異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する。標準は、当該技術分野において周知であり、使用される標準は、任意の適切な標準にすることができる。一例において、標準は、抗腫瘍効果を有することが公知の化合物である。他の例において、比較可能な異種腫瘍を処置しないことで、被験物質の効果と比較するための、未処置の腫瘍増殖の基準レベルの指標が提供される。標準は、個々の比較可能なマウス又は比較可能なマウスの集団において以前に決定された、予期される腫瘍増殖の基準レベルであり、呼び出して、アッセイ結果と比較するために、印刷又は電子媒体に保存されたものにし得る。
【０１５５】
アッセイの結果は、パラメトリック又はノンパラメトリック検定、分散分析、共分散分析、多変量解析のロジスティック回帰、フィッシャーの正確確率検定、カイ2乗検定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニ検定、ウィルコクソンの符号順位検定、マクネマ検定、フリードマン検定、及びペイジのL傾向検定により例示される、被験物質が腫瘍に対して阻害効果を有するかを決定する様々な方法の何れかによる統計分析を用いて分析することができる。上記及び他の統計的検定は、当該技術分野において周知であり、Hicks, CM, Research Methods for Clinical Therapists: Applied Project Design and Analysis, Churchill Livingstone (publisher); 5th Ed., 2009、及びFreund, RJ et al., Statistical Methods, Academic Press; 3rd Ed., 2010において詳述されている。
【０１５６】
本明細書で使用する「阻害効果」という用語は、腫瘍増殖、腫瘍細胞代謝、及び腫瘍細胞分裂のうち1つ以上を阻害する被験物質の効果を示す。
【０１５７】
本発明の方法において用いられる被験物質は、任意の化学物質にすることが可能であり、例として、合成若しくは天然化合物又は合成若しくは天然化合物の組み合わせ、有機又は無機小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質、又はこれらの何れかの組み合わせを含む。
【０１５８】
本発明の態様によれば、被験物質は、抗癌剤である。
【０１５９】
抗癌剤は、例えば、Brunton et al. (eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Macmillan Publishing Co., 2011に記載されている。
【０１６０】
抗癌剤には、例として以下が含まれる:アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン、ビスナフィドジメシラート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ブレキナール、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カペシタビン、カラセミド、カルベチマ、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシラート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシラート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、インターロイキンII(IL-2、組換えインターロイキンII又はrIL2を含む)、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-n1、インターフェロンアルファ-n3、インターフェロンベータ-Ia、インターフェロンガンマ-Ib、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レトロゾール、ロイプロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マスオプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ネララビン、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルムナプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマ、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、タモキシフェン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレチド、ベムラフェニブ、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシネナート、ビンロイロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾレドロネート、及びゾルビシン。
【０１６１】
本発明の態様によれば、抗癌剤は、抗癌抗体である。使用される抗癌抗体は、少なくとも1種類の腫瘍、特にヒト腫瘍を阻害するのに有効な任意の抗体にすることができる。抗癌抗体には、限定では無く、以下が含まれる:3F8、8H9、アバゴボマブ、アフツズマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツマブラブタンシン、アポリズマブ、 アルシツモマブ、アスクリンバクマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ブロンチクズマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブボガトックス、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コルツキシマブラブタンシン、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、デニンツズマブマホドチン、デパツキシズマブマホドチン、デュルバルマブ、ドゥシギツマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エノブリツズマブ、エンフォルツマブベドチン、エナバツズマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、IMAB362、イマルマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブラブタンシン、インデュサツマブベドチン、イネビリズマブ、イノツズマブオゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、ファスツズマブベドチン、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミルベツキシマブソラブタンシン、ミツモマブ、モガムリズマブ、キセツモマブパスドトクス、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オレゴボマブ、オポルツズマブモナトクス、オトレルツズマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピディリズマブ、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サシツズマブゴビテカン、サマリズマブ、セリバンツマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、ソフィツズマブベドチン、タカツズマブテトラキセタン、タレクスツマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、テツロマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ウブリツキシマブ、ウトミルマブ、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バルリルマブ、ベセンク��ブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、及びザツキシマブ。
【０１６２】
発明の組成物及び方法の実施形態を、以下の実施例に例示する。これらの実施例は説明の目的で提供され、発明の組成物及び方法の範囲に対する限定とは見做されない。
【実施例】
【０１６３】
実施例1
【０１６４】
Rhbdf2遺伝子内の点変異p.P159Lを有するNSG-BALDP159Lマウスを、CRISPR/Cas9手法を用いて作製した。NSG胚におけるRhbdf2遺伝子座は、Cas9 mRNA、切断ガイドRNA(sgRNA)、及び一本鎖オリゴヌクレオチドDNA(ssDNA:
【化１】
2018531606.tif 000002
)の前核マイクロインジェクションにより標的化し、配列番号1のアミノ酸159のプロリンをロイシンに変異させた。下線のコドンCTAは、ゲノムに導入されている変異コドンである。マウスiRhom2(配列番号1)の模式図を図1に示す。
【０１６５】
マウスを生成するために使用したsgRNA(17mer):G CAG ATT GTG GAT CCA C(配列番号7)
【０１６６】
CRISPR/Cas9プロトコル
1. PCR装置、遠心分離機をオンにする-蓋を閉じ、温度を4℃に設定。
2. 作業エリアをRNase-Zapする。
3. -80℃から氷へ移動(前方底部シェルフ右のラベル付きボックス内)。
a. sgRNA
b. Cas9 mRNA
4. ガイド及びCas9mRNAを20,000×gで15乃至30分間4℃で回転。
5. 各試料の上部から取り出し、sgRNA及びCas9の希釈物を作製。
a. 4μL Tris/EDTA(TE)+4μLガイド
i. よく混合した後、Biospekを2μL(プログラム=RNA 1mm)。
ii. sgRNAを最終濃度300ng/μL、Cas9mRNAを最終濃度500ng/μLにするために残りの6μLに加えるべきIDTEの量を計算する。
iii. TEを加えて希釈後、よく混合する(ボルテックス、クイックスピン)。
6. PCRチューブでの結合:
a. 16.25μLのTE
b. 3.00μLのCas9mRNA
c. 1.25μLのsgRNA
d. 混合及びクイックスピンして、PCR装置内に配置し、「再生(renature)」プログラムを実行(RNAフォルダ下)
7. プラスミドを濃度125ng/μLに希釈。
a. 2μL TE+5μLプラスミド
i. よく混合した後、2μLをBiospekする(プログラム=DNA_1mm)。
ii. これを最終濃度125ng/μLにするために残りの4μLに加えるべきTEの量を計算する。
iii. IDTEを添加後、よく混合する(ボルテックス、クイックスピン)。
8. RNASinを10倍希釈する(9μL IDTEに1μL)。
9. 再生完了後、試料を氷上に移動する。冷却後、試料をボルテックスして混合及びクイックスピンする。
10. 最後に、希釈したプラスミド(2μL)及びRNASin(1.25μL)を添加する。体積は、これにより25μLになる。混合及びクイックスピンした後、20μLを新しいチューブに移す。マウス接合体へのマイクロインジェクションのために、最初にDNA/RNA材料を前核、その後、針の引き抜き時に細胞質に注入する。
【０１６７】
合計16匹の仔が生まれ、驚くべきことに、16匹のうち8匹が、部分的(95%以上)乃至完全(100%)な脱毛を示した。仔の尾細胞から取得したDNAを、PCRを用いて増幅し、クリーンアップし、配列決定して、どの仔がp.P159L変異を有するかを特定及び確認した。
【０１６８】
以下の配列決定プライマを使用して、点変異を同定する。
フォワード:ACACACACATGTACCGCCAT(配列番号8)
リバース:TTCTGGCCTTTAGGGTGTGC(配列番号9)
【０１６９】
PCRサイクル条件を表Iに示す:
【表１】
2018531606.tif 000003
【０１７０】
PCR産物の磁気ビーズクリーンアッププロトコル
*標準:15μLのPCR+3μLの6×色素→8μLをゲルに流し、残りの10μLを精製。
1. よく混合したビーズ18μLを添加する(比=PCR産物1μL当たり1.8μLビーズ)。
2. よく混合した後、クイックスピンする(可能な限り短くし、液体を落とすのみとし、ビーズのペレット/塊を発生させない)。
3. 室温で少なくとも5分間、静置する。
4. 磁石の上に置いて、少なくとも2分間、静置する。
5. 100μLの70%エタノールを各試料に加え洗浄する。ペーパータオル上へ反転する。少なくとも2回以上、又はローディング色素の痕跡が全く無くなるまで、繰り返す。
6. 少量のエタノールが底部に残る。最後の洗浄後、フィルタ付きゲルローディングピペットチップを用いて、ビーズをそのまま残しつつ、これを可能な限り取り除く。
7. 磁石上に置いたまま、通常約10分間、エタノールを試料から蒸発させる。
8. 磁石から移動させ、エタノールが完全に蒸発していることを確認した後、40μLの水を加える。十分に混合した後、クイックスピンする(ここでも可能な限り短く)。
9. 試料を磁石の上に戻し、少なくとも2分間、静置する。
10. ビーズとの接触を避けるためにゲルローディングピペットを用いて、25μL(試料にビーズが付いてくることなく行える場合はそれ以上)を新しいチューブに移動する。
11. 精製試料が配列決定に使用可能となる(精製済み試料5μL+5μMシーケンシングプライマー1μL)。必要に応じて、試料をゲルに流してクリーンアップの成功を確認することができる。
【０１７１】
配列決定の結果により、図2に示すように、野生型マウスは、p.P159L変異についてヘテロ接合性の変異マウスが区別される。p.P159L変異を有するファウンダーマウスを、NSGマウスとバッククロス(N1)し、生殖系列伝達による変異マウスの発生を確認した。Rhbdf2P159L対立遺伝子についてヘテロ接合性の結果的に生じた子孫(N1F1)をインタークロスし、ホモ接合性Rhbdf2P159Lマウスを作製した。Rhbdf2P159L対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、無毛表現型を特徴とする。Rhbdf2D158N対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、無毛表現型を特徴とする。Rhbdf2I156T対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、無毛表現型を特徴とする。Rhbdf2I156T、Rhbdf2D158N、及びRhbdf2P159L対立遺伝子の何れか2つ以上についてホモ接合性のマウスは、無毛表現型を特徴とする。
【０１７２】
毛の消失は、NSG-Baldマウスにおいて明確に視認でき、6日齢までに生じる。図3は、Rhbdf2 p.P159L変異(NSG-Bald)を保有し、無毛表現型を特徴とする6週齢のマウス(左)及び野生型Rhbdf2対立遺伝子を保有する正常な白毛同腹対照マウス(右)を示す。
【０１７３】
同様の手順を用いて、配列番号1のイソロイシン156での突然変異、配列番号1のアスパラギン酸158での突然変異、及び交互の(alternate)オリゴヌクレオチドを用いた156、158、及び159での2つ又は3つの突然変異の組合せを含む変異iRhom2を有する他の遺伝子操作NSGマウスを作製して、マウスのゲノムが変異Rhbdf2遺伝子を含む遺伝子改変NSGマウスを作製し、マウスは、変異iRhom2タンパク質を発現し、表IIに示すように無毛表現型により特徴付けられる。
【表２】
2018531606.tif 000004
【０１７４】
NSG-BALDマウスにおける異種腫瘍細胞移植
【０１７５】
SKOV3ヒト卵巣癌細胞をATCC(HTB-77)から取得し、RPMI培地で培養する。6乃至8週齢のNSG-BALD及びNSGの雌マウス(n=10)に、200マイクロリットルのPBSに懸濁した0.5×106個の細胞を腹腔内注射する。体重及び腫瘍増殖を50日間モニタし、研究期間の終わりに剖検を行い、腫瘍試料を10%NBF中で固定し、パラフィン包埋してH&E染色を行う。
【０１７６】
統計分析
【０１７７】
カプラン・マイヤ生存曲線は、GraphPad Prismを用いて作成する。P値0.05未満を有意とする。
【０１７８】
実施例2
【０１７９】
動物
【０１８０】
6乃至8週齢のNSG-BALDP159L(n=5)及びNSGの雌マウス(n=4)を用いて腫瘍増殖を調べた。マウスは、ジャクソン研究所において特異的病原体不在(SPF)条件下で繁殖及び維持した。食物及び酸性化水は、自由に与えた。
【０１８１】
異種腫瘍細胞の調製及び投与
【０１８２】
MDA-MB 231ヒト乳癌細胞をRPMI培地で培養し、37℃で増殖させた。200μLのPBSに懸濁したMDA-MB231ヒト乳癌細胞(3×106)をNSG-BALDP159L及びNSGマウスに皮下注射した。
【０１８３】
腫瘍サイズ
【０１８４】
皮下異種移植腫瘍の直径は、外側キャリパを用いて毎日測定した。外側キャリパにより腫瘍体積を決定するために、外側キャリパを用いて最大縦径(長さ)及び最大横径(幅)を決定した。次に、腫瘍体積を以下のように計算した:1/2(長さ×幅2)=腫瘍体積。研究の最後に、腫瘍を採取し、組織学的分析を行った。
【０１８５】
腫瘍の増殖
【０１８６】
腫瘍の増殖は、次の式を用いて計算した:[特定の日の腫瘍体積/7日目に記録された腫瘍体積]×100=腫瘍体積の増加パーセント。
【０１８７】
統計
【０１８８】
データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表され、スチューデントのt検定を用いて、NSGとNSG-BALDP159Lマウスとの間の増殖の差を計算した。p値0.05未満を有意とした。腫瘍の増殖の有意差は、早くも18日目に観察された。
【０１８９】
結果
【０１９０】
図4は、NSGマウス(下の線)及びNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlRhbdfP159L/SzJ(NSG-BALDP159L)(上の線)動物に移植されたヒト乳房腫瘍細胞株MDA-MB231の増殖を示すプロットである。NSG-BALDP159L(上の線)マウスにおけるMDA-MB 231ヒト乳癌細胞腫瘍の増殖は、対照NSGマウスと比較して有意に速く、腫瘍体積における略2倍の増加がNSG-BALDP159L対NSGマウスで観察された。
【０１９１】
NSG(図5A)及びNSG-BALDP159L(図5B)マウスにおける血管マーカCD31のMDA-MB 231ヒト乳癌細胞由来腫瘍の免疫染色。NSG-BALDP159Lマウスから得られた異種腫瘍において、NSGマウスからの異種腫瘍と比較して強いCD31免疫組織化学染色が観察され、NSG-BALDP159Lマウスでの異種腫瘍における血管新生の増加を示している。理論的考察に限定されるものではないが、異種腫瘍における血管新生の増加は、p.I156T、p.D158N、及びp.P159Lからなる群から選択された1つ以上の突然変異を有し、iRhom2タンパク質を発現する本発明の態様による遺伝子操作免疫不全マウスにおける腫瘍の増殖増加を裏付けるものとなり得る。
【０１９２】
実施例3
【０１９３】
マウスiRhom1及びマウスiRhom2は、配列番号1及び3のアライメントである図6に示すように、関連性の高いタンパク質である。マウスiRhom1及びマウスiRhom2の高度な構造的同一性から、iRhom1における修飾の機能的効果がiRhom2の修飾で観察されるものと類似しているかを調べる研究を行った。
【０１９４】
Rhbdf1ノックアウトC57BL/6マウスを生成して、iRhom1欠損マウスを作製したところ、iRhom1欠損が体重減少につながることが分かった。図7は、正常な大きさ(右)のRhbdf1遺伝子欠損についてヘテロ接合性のマウス(Rhbdf1+/-)を、体重減少のため小さい(左)Rhbdf1遺伝子欠損についてホモ接合性のマウス(Rhbdf1-/-)と比較した大きさの差を示している。
【０１９５】
Rhbdf1ノックアウトC57BL/6マウスは、図8にグラフで示すように、3乃至4週齢までに死亡する。Rhbdf1遺伝子欠損についてヘテロ接合性のマウス(Rhbdf1+/-)は、正常な生存パーセントを示し(図8のグラフの上の線)、生存及び繁殖可能となる一方、Rhbdf1遺伝子欠損についてホモ接合性のマウス(Rhbdf1-/-)は3乃至4週齢までに死亡する(図8のグラフの下の線)。
【０１９６】
Rhbdf1ノックアウトC57BL/6マウスは、重度の心臓線維症(cardiac fibrosis)を特徴とする。Rhbdf1ノックアウトC57BL/6マウスの心臓を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色したものは、図9に「○」を付した重度の心臓線維症を示し、これらの動物は約3乃至4週齢で死に至る。対照的に、Rhbdf1-/+ヘテロ接合性マウスは、図10に示したRhbdf1-/+ヘテロ接合性マウスから単離した心臓のヘマトキシリン及びエオシン染色切片の画像に例示されるように、心臓線維症を示さない。
【０１９７】
更に、Rhbdf1ノックアウトマウスは、生後間もなく死亡するため、これらのマウスで腫瘍を増殖させることは不可能である。更に、Rhbdf1ノックアウトC57BL/6マウスは、無毛表現型を示さず、完全な被毛を有する。このように、驚くべきことに、マウスiRhom1及びマウスiRhom2の高度な関連性にも拘わらず、これらのタンパク質の変化に伴う表現型は異なる。
【０１９８】
項目
【０１９９】
項目1.遺伝子改変免疫不全マウスであって、マウスのゲノムは、変異Rhbdf2遺伝子を含むことから、遺伝子改変免疫不全マウスは、N末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになり、マウスは、無毛表現型を特徴とする。
項目2.マウスが重度の複合免疫不全を有する、項目1記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目3.マウスがIL2受容体ガンマ鎖欠損を有する、項目1記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目4.マウスがscid変異を含む、項目1乃至3の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目5.マウスがscid変異についてホモ接合性である、項目1乃至4の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目6.遺伝子改変免疫不全マウスが変異Rhbdf2遺伝子を含むことからN末端領域における1つ以上の突然変異のため野生型マウスiRhom2タンパク質とは異なる変異iRhom2タンパク質を発現するようになると共に、無毛表現型を特徴とする、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウスである、項目1に記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目7.更に、異種腫瘍細胞を含む、項目1乃至6の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目8.更に、ヒト腫瘍細胞を含む、項目1乃至7の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目9.N末端領域における1つ以上の突然変異がアミノ酸156、158、159、又はそれらの2つ以上の置換からなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異である、項目1乃至8の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目10.N末端領域の1つ以上の突然変異がアミノ酸156、158、159、又はそれらの2つ以上の欠失からなる群から選択されるiRhom2のN末端領域における1つ以上の突然変異である、項目1乃至9の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目11.N末端領域における1つ以上の突然変異がiRhom2のN末端領域の全部又は一部の欠失である、項目1乃至10の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目12.マウスがRhbdf2遺伝子の突然変異又は欠失についてホモ接合性である、項目1乃至11の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目13.変異iRhom2のアミノ酸374乃至827が野生型iRhom2タンパク質と同一又は実質的に類似する、項目1乃至12の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目14.Rhbdf2遺伝子のN末端領域に突然変異又は欠失を有し、対応する変異iRhom2を発現し、対応する野生型iRhom2タンパク質を発現する同じ遺伝的背景のマウスと比較して、外因性腫瘍の増殖増加を特徴とする、項目1乃至12の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
項目15.異種腫瘍細胞の応答に対するマウスモデル系を作製するための方法であって、先行項目の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウスを提供することと、遺伝子改変免疫不全マウスに異種腫瘍細胞を投与することと、を含む方法。
項目16.抗腫瘍組成物を同定するための方法であって、先行項目の何れかに記載の遺伝子改変免疫不全マウスを提供することと、遺伝子改変免疫不全マウスに異種腫瘍細胞を投与することと、マウスに被験物質を投与することと、異種腫瘍細胞の応答をアッセイすることと、異種腫瘍細胞に対する被験物質の効果を決定するために応答を標準と比較すること、を含み、異種腫瘍細胞に対する被験物質の阻害効果により、被験物質を抗腫瘍組成物として同定する、方法。
【０２００】
配列
【０２０１】
マウスiRhom2タンパク質配列:配列番号1
【化２】
2018531606.tif 000005
【０２０２】
マウスRhbdf2遺伝子配列:(太字は、エクソンを示し、下線は、アミノ酸156、158、及び159のコドンを示す)配列番号2
【化３−１】
2018531606.tif 000006
【化３−２】
2018531606.tif 000007
【化３−３】
2018531606.tif 000008
【化３−４】
2018531606.tif 000009
【化３−５】
2018531606.tif 000010
【化３−６】
2018531606.tif 000011
【化３−７】
2018531606.tif 000012
【化３−８】
2018531606.tif 000013
【化３−９】
2018531606.tif 000014
【化３−１０】
2018531606.tif 000015
【０２０３】
マウスiRhom1タンパク質配列全長配列番号3
【化４】
2018531606.tif 000016
【０２０４】
明確にするために別個の実施形態の文脈において説明した、本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供し得ると理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態との関連において説明した、本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切な部分的組み合わせとして提供し得る。
【０２０５】
本明細書にて言及した任意の特許又は公表文献は、各公表文献について明確且つ個別に出典を明記することにより本願明細書の一部とすることを示したものとして、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【０２０６】
本明細書に記載の組成物及び方法は、好適な実施形態を例示的に現時点で表すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。それらの変更及び他の用途は、当業者に想到されるであろう。こうした変更及び他の用途は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を逸脱することなく実施することができる。
【符号の説明】
【０２０７】
[図1]
N-terminus: N末端
C-terminus: C末端
[図2B]
Base 377 of 694: 694のうち塩基377
[図4]
Percent increase in tumor volume: 腫瘍体積の増加パーセント
Time (days): 時間(日)
[図6]
SEQ ID NO: 配列番号
[図8]
Percent survival: 生存パーセント
Days: 日数
【図１】
2018531606.tif 000017
【図２Ａ】
2018531606.tif 000018
【図２Ｂ】
2018531606.tif 000019
【図２Ｃ】
2018531606.tif 000020
【図３】
2018531606.tif 000021
【図４】
2018531606.tif 000022
【図５Ａ】
2018531606.tif 000023
【図５Ｂ】
2018531606.tif 000024
【図６】
2018531606.tif 000025
【図７】
2018531606.tif 000026
【図８】
2018531606.tif 000027
【図９】
2018531606.tif 000028
【図１０】
2018531606.tif 000029
【配列表】
2018531606000001.app
【国際調査報告】
2018531606.tif 000030
2018531606.tif 000031
2018531606.tif 000032
2018531606.tif 000033