(57)【要約】共通抗体軽鎖を含むことを特徴とする、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体が提供される。このような二特異性抗体は、多発性骨髄腫のような形質細胞障害の処置における医薬として使用することができる。この二特異性抗体は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む共通抗体軽鎖、ならびにＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含むＣＤ３結合部分の重鎖を含むことを特徴とし得る。
2018502062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む共通抗体軽鎖、ならびにＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含むＣＤ３結合部分の重鎖を含むことを特徴とする二特異性抗体。
【請求項２】
共通可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号２９の共通軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、
ａ）配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２４のＣＤＲ３Ｈ
ｂ）配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２５のＣＤＲ３Ｈ
ｃ）配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２６のＣＤＲ３Ｈ
ｄ）配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号３７のＣＤＲ３Ｈ
からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
【請求項５】
ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、
ａ）配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２４のＣＤＲ３Ｈ
ｂ）配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２５のＣＤＲ３Ｈ
ｃ）配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２６のＣＤＲ３Ｈ
ｄ）配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号３７のＣＤＲ３Ｈ
からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなることを特徴とし、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂおよび前記ＣＤ３−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記第１のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により一方のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結された１個のＣＤ３−Ｆａｂおよび１個のＢＣＭＡ  Ｆａｂと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結されたＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂからなることを特徴とし、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して第２のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二特異性抗体の調製のための方法であって、
ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体の前記軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターにより宿主細胞を形質転換するステップと、
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、前記宿主細胞を培養するステップと、
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
多発性骨髄腫などの形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体または請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する新規の二特異性抗体、それらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＢＣＭＡ；ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟標的は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである［Ｌａａｂｉら、１９９２年、Ｍａｄｒｙら、１９９８年］。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟、成長、および生存に関与する、非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド：ＢＣＭＡに対する高アフィニティーリガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘導性リガンド）と、ＢＣＭＡに対する低アフィニティーリガンドであるＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４）とに対する受容体である。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦとは、構造的類似性および重複を示すが、顕著に異なる受容体結合特異性も示す。また、負の調節因子ＴＡＣＩも、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩへの協調した結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化させ、生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現およびアポトーシス促進性因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）の下方調節を増大させ、こうして、アポトーシスを阻害し、生存を促進する。この作用の組合せは、Ｂ細胞の分化、増殖、生存、および抗体産生を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁において総説されている）。
【０００３】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）と標識されるＣＤ３の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体からなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されている。最先端技術において記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁）である。ＳＰ３４は、霊長動物ＣＤ３およびヒトＣＤ３のいずれとも反応する。ＳＰ３４は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤについてのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用された；Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年））である。ＷＯ２０１４０５６７８３は、同じＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬを有する本出願の抗ＣＤ３ε抗体について言及する。
【０００４】
最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。
【０００５】
誤対合副生成物の問題を回避する手法であって、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」として公知である手法は、接触界面を修飾するように、突然変異を、ＣＨ３ドメインへと導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目的とする。１つの鎖上では、かさ高いアミノ酸を、短い側鎖を伴うアミノ酸で置きかえ、「ホール」を創出した。逆に、大型の側鎖を伴うアミノ酸を、他のＣＨ３ドメインへと導入して、「ノブ」を創出した。これらの２つの重鎖（および両方の重鎖に対して適切でなければならない、本発明に従って使用するための２つの上記共通の軽鎖）を共発現させることにより、ホモ二量体の形成（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）と対比して高収率の、ヘテロ二量体の形成（「ノブ−ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ファージディスプレイ手法と、ヘテロ二量体を安定化させるジスルフィド架橋の導入とを使用して、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面をリモデリングすることにより、ヘテロ二量体の百分率を、さらに増大させうる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁）。ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術のための新たな手法については、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１において記載されている。このフォーマットは、非常に魅力的であると考えられるが、現在のところ、臨床に向けた進展について記載するデータは、入手可能でない。この戦略の１つの重大な制約は、誤対合および不活性分子の形成を防止するのに、２つの親抗体の軽鎖が、同一でなければならないことである。こうして、この技法は、本発明に従って使用するためにこれらの抗体の重鎖および／または上記共通の軽鎖を最適化しなければならないので、第１および第２の標的に対する２つの抗体から出発して、２つの標的に対する組換え二特異性抗体を容易に開発するのには適切でない。Ｘｉｅ，Ｚ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁は、ｓｃＦｖを、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、ＦＣパートに使用する、二特異性抗体のフォーマットに言及している。ＷＯ２０１２１１６９２７およびＷＯ２０１０１４５７９２は、ＣＨ１とＣＬドメインとを交換することについて言及している。ＷＯ２００９０８０２５４は、二特異性抗体を作製するためのＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物について言及している。ＷＯ２００６０９３７９４は、ヘテロ二量体のタンパク質結合性組成物に関する。ＷＯ１９９９３７７９１は、多目的の抗体誘導体について記載している。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁は、可変領域ドメイン交換の、ＩｇＧの機能的特性に対する影響に言及している。
【０００６】
ＷＯ２０１３０２３６２は、ヘテロ二量体化されたポリペプチドに関する。ＷＯ２０１３１２７３３は、ヘテロ二量体のＦｃ領域を含むポリペプチドに関する。ＷＯ２０１２１３１５５５は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＥＰ２６４７７０７は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁は、ドメインのクロスオーバーを伴う、二特異性の二価ＩｇＧ抗体に関する。
【０００７】
ＢＣＭＡに対する抗体については、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁、ＷＯ２００１２４８１１、ＷＯ２００１２４８１２、ＷＯ２０１０１０４９４９およびＷＯ２０１２１６３８０５において記載されている。ＢＣＭＡに対する抗体、ならびにリンパ腫および多発性骨髄腫の処置のためのそれらの使用については、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６およびＷＯ２０１０１０４９４９において言及されている。ＷＯ２０１３１５４７６０は、ＢＣＭＡ認識部分と、Ｔ細胞活性化部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０００８】
Ｒｙａｎ，ＭＣら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ.、６巻（２００７年）、３００９〜３０１８頁は、形質細胞悪性腫瘍のための、ＢＣＭＡのターゲティングに関する。リガンド遮断活性を伴う抗体ＳＧ１は、ネイキッド抗体として、または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系に対する細胞傷害作用を促進しうる。阻害性ＢＣＭＡ抗体であるＳＧ１は、核因子κＢの、ＡＰＲＩＬ依存的な活性化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、用量依存的に遮断する。ＳＧ１の細胞傷害作用は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強するＦｃ突然変異を伴うおよびこれを伴わないキメラ化の後で、ネイキッド抗体として評価された。Ｒｙａｎはまた、ＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡへの結合を有意には阻害しない抗体であるＳＧ２についても言及している。しかし、ＳＧ２は、ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞系に対する薬物コンジュゲートの細胞傷害性活性として測定されるＳＧ１よりも２０倍高いＩＣ５０値を示した。Ｒｙａｎは、ＢＣＭＡ抗体が、ＡＰＲＩＬ依存的なＮＦ−κＢの活性化の阻害、ナチュラルキラー細胞媒介型ＡＤＣＣ活性による腫瘍細胞溶解の促進、およびＡＤＣによる細胞傷害作用の誘導を含む、複数の機構を介して、骨髄腫細胞系に作用しうると結論付けている。
【０００９】
ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体は、ＷＯ２００７１１７６００、ＷＯ２００９１３２０５８、ＷＯ２０１２０６６０５８、ＷＯ２０１２１４３４９８およびＷＯ２０１３０７２４１５に言及されている。ＷＯ２０１４１２２１４３およびＷＯ２０１４１２２１４４は、本発明にも開示されている特定のＣＤＲおよび可変ドメインを含む、ＢＣＭＡに対する抗体ならびにＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体について記載する。配列番号２の可変軽鎖ＶＬ、およびＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌを含むＶＬは、抗ＣＤ３抗体の軽鎖として本明細書に言及されている。
【００１０】
Klein  Ch.ら、mAbs、４巻：６号、６５３〜６６３頁；２０１２年は、共通軽鎖と組み合わせた、ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨ）技術について言及する。Merchant  AM.ら、Nature  Biotech、１６巻、６７７〜６８１頁（１９９８年）は、同一軽鎖およびリモデリングされた重鎖を有する二特異性抗体に関する。Weidle  UHらは、１本の軽鎖を共有するが別々の特異性をなお有する２個の結合剤を組み合わせた、「共通軽鎖」原理の使用によるＬ鎖誤対合の回避に関する。ＷＯ２００７１４７９０１、ＷＯ２０１３１８４７６１およびＷＯ２０１４１２４３２６はまた、共通軽鎖技術に関する。ＷＯ２０１４１４０２４８は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに結合する二特異性抗体について言及する。ｈｕＢＣＭＡに対する二特異性抗体のＫｄ値は、ナノモル未満の（subnanomolar）範囲内であった。この二特異性抗体は、腫瘍異種移植モデルにおける治療有効性を示した。ＷＯ２０１３／０７２４０６は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに結合する二特異性抗体について言及する。ｈｕＢＣＭＡに対する二特異性抗体のＫｄ値は、ナノモル未満の範囲内であった。この抗体は、ヒトＢＡＦＦ受容体およびＴＡＣＩと交差反応せず、エフェクターＴ細胞をＢＣＭＡ発現標的へとリダイレクトさせることにより、細胞傷害活性を示した。この二特異性抗体は、腫瘍異種移植モデルにおける治療有効性を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０００／０４１４７４号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０５６７８３号
【特許文献３】国際公開第２００９／０８０２５１号
【特許文献４】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献５】国際公開第１９９６／０２７０１１号
【特許文献６】欧州特許出願公開第１８７０４５９号明細書
【特許文献７】国際公開第２０１２／１１６９２７号
【特許文献８】国際公開第２０１０／１４５７９２号
【特許文献９】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献１０】国際公開第２００６／０９３７９４号
【特許文献１１】国際公開第１９９９／３７７９１号
【特許文献１２】国際公開第２０１３／０２３６２号
【特許文献１３】国際公開第２０１３／１２７３３号
【特許文献１４】国際公開第２０１２／１３１５５５号
【特許文献１５】欧州特許出願公開第２６４７７０７号明細書
【特許文献１６】国際公開第２００９／０８０２５３号
【特許文献１７】国際公開第２００１／２４８１１号
【特許文献１８】国際公開第２００１／２４８１２号
【特許文献１９】国際公開第２０１０／１０４９４９号
【特許文献２０】国際公開第２０１２／１６３８０５号
【特許文献２１】国際公開第２００２／０６６５１６号
【特許文献２２】国際公開第２０１３／１５４７６０号
【特許文献２３】国際公開第２００７／１１７６００号
【特許文献２４】国際公開第２００９／１３２０５８号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献２６】国際公開第２０１２／１４３４９８号
【特許文献２７】国際公開第２０１３／０７２４１５号
【特許文献２８】国際公開第２０１４／１２２１４３号
【特許文献２９】国際公開第２０１４／１２２１４４号
【特許文献３０】国際公開第２００７／１４７９０１号
【特許文献３１】国際公開第２０１３／１８４７６１号
【特許文献３２】国際公開第２０１４／１２４３２６号
【特許文献３３】国際公開第２０１３／０７２４０６号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁
【非特許文献２】Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁
【非特許文献３】Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年）
【非特許文献４】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁
【非特許文献５】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁
【非特許文献６】Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁
【非特許文献７】Ｘｉｅ，Ｚ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁
【非特許文献８】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁
【非特許文献９】Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁
【非特許文献１０】Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁
【非特許文献１１】Ｒｙａｎ，ＭＣら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ.、６巻（２００７年）、３００９〜３０１８頁
【非特許文献１２】Ｋｌｅｉｎ  Ｃｈ．ら、ｍＡｂｓ、４巻：６号、６５３〜６６３頁；２０１２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、軽鎖誤対合を伴わずに高収率で産生され、容易に精製され、ＢＣＭＡに対する高アフィニティーおよびＢＣＭＡ陽性細胞の殺滅を示すことができる、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明者らは、ＷＯ２０１４１２２１４３およびＷＯ２０１４１２２１４４に記載されているヒトＢＣＭＡおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体において使用される抗ＣＤ３抗体（ＣＨ２５２７）の軽鎖を、このような二特異性抗体における共通軽鎖として使用することができることを認識した。
【００１５】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む共通抗体軽鎖、ならびにＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含むＣＤ３結合部分の重鎖を含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。好ましくは、本発明は、前記共通抗体軽鎖内に、共通可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む、本発明に従う抗体に関する。好ましくは、本発明は、配列番号２９の共通軽鎖を含む、本発明に従う抗体に関する。
【００１６】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む抗体軽鎖であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む抗体軽鎖に関する。
【００１７】
好ましくは、本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための、可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む抗体軽鎖であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む抗体軽鎖に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための、配列番号２９の抗体軽鎖であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む抗体軽鎖に関する。
【００１９】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む抗体軽鎖の使用であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む使用に関する。好ましくは、使用される抗体軽鎖は、可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含むことを特徴とする。好ましくは、使用される抗体軽鎖は、軽鎖として配列番号２９の軽鎖を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含み、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む抗体軽鎖が、共通軽鎖である二特異性抗体に関する。
【００２１】
好ましくは、本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含み、可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む抗体軽鎖が、共通軽鎖である二特異性抗体に関する。
【００２２】
好ましくは、本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含み、配列番号２９の抗体軽鎖が、共通軽鎖であることを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００２３】
好ましくは、ＣＤ３結合部分の重鎖は、可変重鎖ドメインＶＨとして配列番号１のＶＨを含む。
【００２４】
本発明に従う共通軽鎖の定常軽鎖ＣＬは、カッパまたはラムダ型、好ましくは、カッパ型のものである。
【００２５】
好ましくは、ＢＣＭＡ結合部分の重鎖は、ＣＤＲとして、
ａ）配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２４のＣＤＲ３Ｈ（セットｐＳＣＨＬＩ３３３）
ｂ）配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２５のＣＤＲ３Ｈ（セットｐＳＣＨＬＩ３７２）
ｃ）配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２６のＣＤＲ３Ｈ（セットｐＳＣＨＬＩ３７３）
ｄ）配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号３７のＣＤＲ３Ｈ（セット８３Ａ１０）
からなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【００２６】
好ましくは、ＢＣＭＡ結合部分の重鎖は、可変重鎖ドメインＶＨとして配列番号１５、１６、１７または３４のＶＨ（８３Ａ１０）を含む。
【００２７】
好ましくは、アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおいて濃度５００ｎＭまたはそれより低いヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下、２５ｎＭの抗体濃度で測定される、前記二特異性抗体のヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーは、２００ｎＭまたはそれより低い。
【００２８】
好ましくは、リダイレクトＴ細胞殺滅ＬＤＨ放出アッセイにおいて１０：１のＥ：Ｔ比のヒトＰＢＣＭおよびＨ９２９細胞の存在下、１００ｎＭおよびそれより低い濃度で２４時間使用される場合、前記二特異性抗体のＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０６８）を殺滅する効力（ＥＣ５０）は、２ｎＭまたはそれより低いと測定される。
【００２９】
好ましくは、アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおける５００ｎＭまたはそれより低い濃度のヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下、２５ｎＭの抗体濃度において、軽鎖が配列番号２９のものであるヒトＩｇＧ１型の抗体において測定される、前記ＢＣＭＡ結合部分のヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーは、２００ｎＭまたはそれより低い。
【００３０】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１個のＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の１個のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ（単数または複数）」とも称する）と、Ｆｃ部分とからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂは、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されており、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂは、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ａ）。
【００３１】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなり、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂおよび前記ＣＤ３−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記第１のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｂ）。
【００３２】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなり、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により一方のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｃ）。
【００３３】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結された１個のＣＤ３−Ｆａｂおよび１個のＢＣＭＡ  Ｆａｂと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結されたＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｄ）。
【００３４】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｅ）。
【００３５】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂからなることを特徴とし、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して第２のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｆ）。
【００３６】
好ましくは、本発明に従う前記二特異性抗体は、１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｇ）。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、１個のＣＤ３−Ｆａｂと、１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂは、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂは、そのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結されている。ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂは、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ＢＣＭＡ−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＢＣＭＡ−Ｆａｂを含む二特異性抗体であって、両方のＢＣＭＡ−ＦａｂおよびＣＤ３−Ｆａｂが、本発明に従う使用のための前記共通軽鎖を含む二特異性抗体が特に好まれる（図１Ｂ）。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、重鎖ＣＤＲとして、抗体ｐＳＣＨＬＩ３３３のＣＤＲＨ、またはＶＨとして、ｐＳＣＨＬＩ３３３のＶＨを含むことが特に好まれる。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、重鎖ＣＤＲとして、抗体ｐＳＣＨＬＩ３７２のＣＤＲＨ、またはＶＨとして、ｐＳＣＨＬＩ３７２のＶＨを含むことがさらに好まれる。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、重鎖ＣＤＲとして、抗体ｐＳＣＨＬＩ３７３のＣＤＲＨ、またはＶＨとして、ｐＳＣＨＬＩ３７３のＶＨを含むことがさらに好まれる。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、重鎖ＣＤＲとして、抗体８３Ａ１０のＣＤＲ、ＶＨとして、８３Ａ１０のＶＨを含むことがさらに好まれる。
【００３８】
Ｆａｂ断片は、最先端技術に従う適切なリンカーの使用によって化学的に一体に連結されている。好ましくは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカー（配列番号３８）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３９）が使用される（Desplancq  DKら、Protein  Eng.１９９４年８月；７巻（８号）：１０２７〜３３頁およびMack  M.ら、PNAS、１９９５年７月１８日、９２巻、１５号、７０２１〜７０２５頁）。２個のＦａｂ断片の間の連結は、重鎖の間で行われる。したがって、第１のＦａｂ断片のＣＨ１のＣ末端は、第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端に連結される。Ｆａｂ断片およびＦｃ部分の間の連結は、ＣＨ１およびＣＨ２の間の連結として本発明に従って行われる。
【００３９】
ＢＣＭＡに特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片は、同じ抗体に由来することが好ましく、ＣＤＲ配列、可変ドメイン配列ＶＨおよびＶＬ、ならびに定常ドメイン配列ＣＨ１およびＣＬが同一であることが好ましい。ＢＣＭＡに特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片のアミノ酸配列は、同一であることが好ましい。ＢＣＭＡ抗体は、抗体ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２またはｐＳＣＨＬＩ３７３のＣＤＲ配列を含む抗体、抗体ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２またはｐＳＣＨＬＩ３７３のＶＨ配列を含む抗体、または抗体ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３または８３Ａ１０のＶＨおよびＣＨ１配列を含む抗体であることが好ましい。
【００４０】
好ましくは、二特異性抗体は、Ｆａｂ断片およびＦｃ部分として、抗ＣＤ３抗体の１個以下のＦａｂ断片、抗ＢＣＭＡ抗体の２個以下のＦａｂ断片および１個以下のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＦｃ部分を含む。好ましくは、抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片のＮ末端またはＦｃ部分のヒンジ領域のいずれかに連結される。好ましくは、連結は、ＢＣＭＡ−ＦａｂのＣＨ１およびＣＤ３−ＦａｂのＶＨの間で行われる。
【００４１】
本発明に従うこのような好まれる抗体は、次のポリペプチドの重鎖および軽鎖セットを含むことを特徴とする抗体である：
ａ）配列番号１５のＶＨおよび配列番号２のＶＬ（セットｐＳＣＨＬＩ３３３）
ｂ）配列番号１６のＶＨおよび配列番号２のＶＬ（セットｐＳＣＨＬＩ３７２）
ｃ）配列番号１７のＶＨおよび配列番号２のＶＬ（セットｐＳＣＨＬＩ３７３）
ｄ）配列番号３４のＶＨおよび配列番号２のＶＬ（セット８３Ａ１０）
【００４２】
好ましくは、本発明に従う抗体はさらに、カニクイザルＢＣＭＡにも特異的に結合することを特徴とする。
【００４３】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号３、４および５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号６、７、および８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７−ＶＬ７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号１および２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７−ＶＬ７）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００４４】
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、重鎖ＣＤＲである配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含み、軽鎖ＣＤＲである配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ｐＳＣＨＬＩ３３３）。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、重鎖ＣＤＲである配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２５のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ｐＳＣＨＬＩ３７２）。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、重鎖ＣＤＲである配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２６のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ｐＳＣＨＬＩ３７３）。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、重鎖ＣＤＲである配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈ、配列番号３７のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌ、配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）。
【００４５】
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、配列番号１５のＶＨを含むことを特徴とする。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、配列番号１６のＶＨを含むことを特徴とする。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、配列番号１７のＶＨを含むことを特徴とする。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、好ましくは抗体部分、好ましくはＦａｂ断片は、配列番号３４のＶＨを含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明は、好ましくは、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、次のポリペプチドからなる群から選択される重鎖および軽鎖セットを含むことを特徴とする二特異性抗体に関する：
ｉ）配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９（セット１）、
ｉｉ）配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１（セット２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号２９、配列番号３２および配列番号３３（セット３）。
【００４７】
【表１】
2018502062.tif 000003
【００４８】
【表２】
2018502062.tif 000004
【００４９】
【表３】
2018502062.tif 000005
【００５０】
次の（２＋１）Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ  ＣＬＣを作製するために、上の表２に言及されているそれぞれの「構成ブロック（building  block）」／配列番号が必要とされた：
pSCHLI333-TCB:  27、28、29×3
pSCHLI372-TCB:  29×3、30、31
pSCHLI373-TCB:  29×3、32、33
【００５１】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに対する高アフィニティーおよび低い凝集を示す。
【００５２】
本発明はさらに、それぞれの重鎖および軽鎖セットをコードする核酸セットにも関する。
【００５３】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ２３９Ｇ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【００５４】
本発明に従う抗体は、１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、週２回または週１回、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与され、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは５μｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与される、多発性骨髄腫異種移植モデル（例えば、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＲＰＭＩ８２２６細胞またはＵ２６６Ｂ１細胞またはＬ−３６３細胞による異種移植）において、７０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは１００％に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
【００５５】
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、２４時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましく、半減期は、異種移植モデルにおける、週２回または１回の投与で有効である用量について測定されることが好ましい。
【００５６】
腫瘍細胞上の標的およびＣＤ３に結合し、分子フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有する二特異性抗体は、消失半減期が、１〜４時間と非常に短い。（ｓｃＦｖ）２二特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体ブリナツモマブを用いた臨床試験では、この化合物は、患者が携行するポンプを介して、数週間および数カ月間にわたり投与しなければならなかった（Ｔｏｐｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻（１８号）：２４９３〜８頁）。週２回または週１回のｉｖまたはｓｃ投与と比較して、ポンプを介して投与される処置は、患者にとってはるかに不都合であり、また、はるかに危険でもある（例えば、ポンプの不具合、カテーテルに関する問題）。
【００５７】
本発明に従う抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、５００ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、３５０ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値、好ましくは１００ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００５８】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、１ｎＭ未満、好ましくは、０．５ｎＭ、好ましくは、０．１ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００５９】
二特異性抗体の安定性は、実際的な条件および臨床適用の影響を受ける可能性がある。近年における抗体操作の改善にも拘らず、一部の組換えタンパク質および分子フォーマット（例えば、ｓｃＦＶ断片）は、ストレス条件下で、他の組換えタンパク質および分子フォーマットより容易に変性し、凝集物を形成する傾向がある（ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００１年、３０５巻、９８９〜１０１０頁）。本発明に従う抗体は、標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とすることが好ましい。
【００６０】
本発明に従う二特異性抗体は、ヒトＴ細胞の存在下において、多発性骨髄腫患者の原発性骨髄腫細胞の、リダイレクトされた殺滅を誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、変更は、
ａ）二特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）二特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とすることが好ましい。
【００６１】
本発明に従う抗体は、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、両方のＣＨ３ドメインが、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、両方の重鎖の定常重鎖ドメインＣＨ３のうちの１つが、定常重鎖ドメインＣＨ１で置きかえられており、他の定常重鎖ドメインＣＨ３が、定常軽鎖ドメインＣＬで置きかえられていることを特徴とすることが好ましい。
【００６２】
本発明に従う抗体は、カニクイザルＢＣＭＡにもまた特異的に結合することをさらに特徴とすることが好ましい。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態は、好ましくは本発明に従う構成ブロックの、本発明に従う抗体のアミノ酸配列をコードする、１つまたは複数の核酸である。
【００６４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う核酸を含む発現ベクターであって、宿主細胞内で前記核酸を発現させることが可能なベクターである。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、本発明に従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法である。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
【００６７】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体を含む診断用組成物である。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、治療を必要とする患者を処置するための方法であって、患者へ、治療有効量の、本発明に従う二特異性抗体を投与するステップにより特徴付けられる方法である。
【００７０】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫のような形質細胞障害、またはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害の処置のための本発明に従う抗体である。多発性骨髄腫とは、骨髄コンパートメント内の、異常な形質細胞の、単クローン性の拡大および蓄積により特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。多発性骨髄腫また、同じＩｇＧ遺伝子再配列および体細胞超変異を伴う、循環クローン性Ｂ細胞も伴う。多発性骨髄腫は、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）と呼ばれる、無症状性の前悪性状態であって、骨髄形質細胞の低レベルおよび単クローン性タンパク質により特徴付けられる状態から起こる。多発性骨髄腫細胞は、低速度で増殖する。多発性骨髄腫は、複数の構造的染色体変化（例えば、不均衡型転座）の進行性の発生から生じる。多発性骨髄腫は、悪性形質細胞と、骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）との交互的な相互作用を伴う。活動性の多発性骨髄腫の臨床徴候は、単クローン性の抗体スパイク、形質細胞の過密な骨髄、溶解性骨病変、および破骨細胞の過剰刺激から生じる骨破壊（ＤｉｍｏｐｕｌｏｓおよびＴｅｒｐｏｓ、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１０年、２１巻、増刊７号：ｖｉｉ１４３〜１５０頁）を含む。形質細胞を伴う別のＢ細胞障害、すなわち、ＢＣＭＡを発現する別のＢ細胞障害は、ループスとしてもまた公知の、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＳＬＥとは、体内の任意のパートに影響を及ぼす可能性があり、免疫系が身体自身の細胞および組織を攻撃することにより表され、その結果として、慢性炎症および組織損傷がもたらされる、全身性の自己免疫疾患である。ＳＬＥは、抗体−免疫複合体が、さらなる免疫応答を誘起し、これを引き起こす、ＩＩＩ型過敏反応である（ＩｎａｋｉおよびＬｅｅ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２０１０年；６巻：３２６〜３３７頁）。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、全身性エリテマトーデスの処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ−Ｃ】図１。指定されているＦｃ部分ありまたはなしのＦａｂ断片（ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的）だけを含む、二特異性二価および三価抗体：（Ａ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｂ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｃ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｄ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｅ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｆ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｇ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ。好ましくは、ＬＣ誤対合を回避し、副生物を低減するために、Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡのＬＣは同一である（共通ＬＣ）。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡは、可撓性のリンカーにより互いに連結されている。
【図１Ｄ−Ｇ】図１。指定されているＦｃ部分ありまたはなしのＦａｂ断片（ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的）だけを含む、二特異性二価および三価抗体：（Ａ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｂ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｃ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｄ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｅ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｆ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｇ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ。好ましくは、ＬＣ誤対合を回避し、副生物を低減するために、Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡのＬＣは同一である（共通ＬＣ）。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡは、可撓性のリンカーにより互いに連結されている。
【図２】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される、ＴＡＣＩ受容体へのＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の結合の欠如。曲線１は、参照チャネルにおけるシグナルに対応し、曲線２は、結合が起こるチャネル（結合チャネル）に対応し、曲線２−１は、減算されたシグナル（結合チャネル−参照チャネル）であり、これが、結合事象によるシグナルであることを意味する。ＳＰＲ結合アッセイは、ｐＳＣＨＬＩ３７２  ＩｇＧが、ヒトＴＡＣＩ受容体に結合しなかったことを明らかに実証した（実施例４を参照）。
【図３Ａ−Ｂ】図３。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣの産生および精製。（Ａ）ｐＳＣＨＬＩ３３３−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｂ）ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｃ）ｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣに適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップ後の最終タンパク質調製物のＣＥ−ＳＤＳグラフ（非還元（上）および還元（下））。全３種の分子は、図１Ｂに記載されているような分子フォーマットのものである（実施例６を参照）。
【図３Ｃ】図３。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣの産生および精製。（Ａ）ｐＳＣＨＬＩ３３３−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｂ）ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｃ）ｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣに適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップ後の最終タンパク質調製物のＣＥ−ＳＤＳグラフ（非還元（上）および還元（下））。全３種の分子は、図１Ｂに記載されているような分子フォーマットのものである（実施例６を参照）。
【図４】フローサイトメトリーによる、ＢＣＭＡｈｉ陽性Ｈ９２９細胞におけるＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の蛍光強度中央値を、抗体濃度（０．１２〜５００ｎＭ）の関数としてプロットした；（Ａ）Ｈ９２９細胞（Ａ）およびＭＫＮ４５細胞（Ｂ）におけるｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ。ＤＰ４７−ＴＣＢは、１００ｎＭを下回る濃度でＢＣＭＡに結合しなかった陰性対照ＴＣＢである（実施例７を参照）。
【図５】フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合するＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ）の蛍光強度中央値を、抗体濃度の関数としてプロットする。１００ｎＭを下回る濃度における、ＢＣＭＡ陰性かつＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞への非結合（実施例８を参照）。
【図６】フローサイトメトリーによって検出される、Ｈ９２９細胞の存在下でＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体によって媒介されるＴ細胞活性化。４８時間のインキュベーション後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９および後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベル。ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下、濃度依存的かつ特異的な様式でＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を誘導した。使用したＥ：Ｔ比は、１０のＰＢＭＣ：１のＨ９２９細胞であった；ＣＤ６９およびＣＤ２５上方調節の測定前に、細胞を４８時間インキュベートした。陰性対照ＴＣＢであるＤＰ４７−ＴＣＢは、Ｔ細胞活性化を誘導しなかった。２つの独立した実験の代表的な結果（実施例９を参照）。
【図７Ａ】図７。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体は、比色ＬＤＨ放出アッセイによって検出される、ＢＣＭＡｈｉ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクト殺滅を誘導する。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ａ、Ｂ）およびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ａ）は、ＬＤＨ放出によって測定される、ＢＣＭＡｈｉ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の濃度依存的殺滅を誘導した。ＢＣＭＡに結合しないがＣＤ３のみに結合する陰性対照ＴＣＢであるＤＰ４７−ＴＣＢは、Ｈ９２９細胞殺滅を誘導しなかった。使用したＥ：Ｔ比は、１０のＰＢＭＣ：１のＨ９２９細胞であった；ＬＤＨ放出の測定前に、細胞を２４時間インキュベートした。３つの独立した実験の代表的な結果（実施例１０を参照）。
【図７Ｂ】図７。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体は、比色ＬＤＨ放出アッセイによって検出される、ＢＣＭＡｈｉ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクト殺滅を誘導する。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ａ、Ｂ）およびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ａ）は、ＬＤＨ放出によって測定される、ＢＣＭＡｈｉ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の濃度依存的殺滅を誘導した。ＢＣＭＡに結合しないがＣＤ３のみに結合する陰性対照ＴＣＢであるＤＰ４７−ＴＣＢは、Ｈ９２９細胞殺滅を誘導しなかった。使用したＥ：Ｔ比は、１０のＰＢＭＣ：１のＨ９２９細胞であった；ＬＤＨ放出の測定前に、細胞を２４時間インキュベートした。３つの独立した実験の代表的な結果（実施例１０を参照）。
【図８】ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体は、比色ＬＤＨ放出アッセイによって検出される、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ陽性Ｕ２６６骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクト殺滅を誘導する。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣは、ＬＤＨ放出によって測定される、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ陽性Ｕ２６６骨髄腫細胞の濃度依存的殺滅を誘導した。ＢＣＭＡに結合しないがＣＤ３のみに結合する陰性対照ＴＣＢであるＤＰ４７−ＴＣＢは、Ｈ９２９細胞殺滅を誘導しなかった。使用したＥ：Ｔ比は、１０のＰＢＭＣ：１のＵ２６６細胞であった；ＬＤＨ放出の測定前に、細胞を２４時間インキュベートした。２つの独立した実験の代表的な結果（実施例１１を参照）。
【図９】フローサイトメトリーによって測定される、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導される、自家骨髄浸潤Ｔ細胞（患者の全骨髄吸引物）の存在下における多発性骨髄腫患者骨髄骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞溶解。アネキシン−Ｖ陰性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。患者骨髄腫形質細胞の濃度依存的かつ特異的な溶解が観察された一方、検査した最高濃度のＴＣＢ抗体における対照ＴＣＢによる悪性骨髄形質細胞の溶解は観察されなかった。生存（アネキシン−Ｖ陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的低減によって反映される通り、ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣは、患者骨髄骨髄腫形質細胞の殺滅を誘導する。患者００１における代表的実験（実施例１２を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される「標的」という用語は、ＢＣＭＡまたはＣＤ３のいずれかを意味する。「第１の標的および第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３、および第２の標的としてのＢＣＭＡを意味するか、または、第１の標的としてのＢＣＭＡ、および第２の標的としてのＣＤ３を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という用語は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである、ＢＣＭＡとしてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟標的（ＴＮＦＲＳＦ１７であるＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３））に関する。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従い、アミノ酸１〜５４（または５〜５１）からなる。本明細書で使用される「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体に関する。
【００７４】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号３、４および５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号１（ＶＨ）および配列番号２（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。本明細書で使用される「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に関する。
【００７５】
「ＣＤ３またはＢＣＭＡに特異的に結合すること」とは、抗体が、ＣＤ３またはＢＣＭＡのターゲティングにおいて、治療剤として有用であるように、ＣＤ３またはＢＣＭＡ（標的）に、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体が、無関係なＣＤ３以外またはＢＣＭＡ以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される通り、抗体の、ＣＤ３またはＢＣＭＡへの結合の、約１０分の１、好ましくは、１００分の１未満である。ＣＤ３またはＢＣＭＡに結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍであることが好ましい。抗ＣＤ３および／または抗ＢＣＭＡ抗体は、異なる種に由来するＣＤ３および／またはＢＣＭＡの間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３および／またはＢＣＭＡのエピトープに結合することが好ましい。「ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの規定を指す。ＢＣＭＡ（またはＢＣＭＡおよびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的についてのＯＤ値は、特殊なアッセイの検出限界のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、０．３ｎｇ／ｍＬ超、またはＢＣＭＡをプレートに結合させていないか、もしくはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満である。
【００７６】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３結合部分」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片に含まれる、ＶＨおよびＣＨ１からなる抗体重鎖ならびにＶＬおよびＣＬからなる抗体軽鎖の組合せに関する。本発明に従う二特異性抗体において、軽鎖として前記共通軽鎖を含むＣＤ３結合部分である「ＣＤ３結合部分」が、好ましくは１回組み込まれている。
【００７７】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ結合部分」という用語は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＦａｂ断片に含まれる、ＶＨおよびＣＨ１からなる抗体重鎖ならびにＶＬおよびＣＬからなる抗体軽鎖の組合せに関する。本発明に従う二特異性抗体において、軽鎖として前記共通軽鎖を含むＢＣＭＡ結合部分である「ＢＣＭＡ結合部分」が、好ましくは１回または２回組み込まれている。
【００７８】
本発明に従う抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、５００ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、３５０ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値、好ましくは１００ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００７９】
本発明に従う抗体は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＴＩＢ−１９６（商標））細胞に結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００８０】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞に結合するその能力により特徴付けられる。
【００８１】
本発明に従う抗体は、ＨＥＫ細胞上で一過性に発現させたカニクイザルＢＣＭＡに結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞の存在下において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導するその能力により特徴付けられる。
【００８３】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、１ｎＭ未満、好ましくは、０．５ｎＭ、好ましくは、０．１ｎＭおよびこれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００８４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対（本明細書では、このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対を、ＬＣ／ＨＣと略記する）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、任意選択で重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラス：ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
【００８５】
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＶＬ−ＣＬと略記される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチドである。
【００８６】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のためのいくつかの手法であって、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１において十分に記載されている手法が存在する。このような手法のいずれにおいても、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインの両方を、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはや、それ自身とホモ二量体化することができず、操作された相補的な他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように（第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、ヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメインまたは２つの第２のＣＨ３ドメインの間でホモ二量体が形成されないように）相補的な形で操作することが典型的である。本発明の好ましい一実施形態では（本発明に従う抗体が、重鎖内にＣＨ３ドメインを含む場合には）、本発明に従う前記多特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（１９９６年）、６１７〜６２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；ＷＯ９８／０５０４３１において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術により変更することができる。この方法では、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させるように、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変更する。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々を「ノブ」としうる一方で、他は「ホール」となる。
【００８７】
こうして、本発明の一実施形態では、本発明に従う前記抗体は（各重鎖内にＣＨ３ドメインを含み）、ａ）抗体の第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインおよびｂ）抗体の第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、本発明に従う抗体の形成を促進するように変更されていることもさらに特徴とし、前記変更は、
ｉ）本発明に従う抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｉｉ）本発明に従う抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
【００８８】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることが好ましい。
【００８９】
本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されうるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されている。
【００９０】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のための他の技法も、本発明の代替法として想定されており、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／１５７９５３、ＷＯ２０１３／０９６２９１において記載されている。
【００９１】
一実施形態では、本発明に従う抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体であり、ＷＯ２０１０／１２９３０４において記載されているヘテロ二量体化法を、代替的に使用することができる。
【００９２】
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体（変異体または突然変異体の抗体）を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【００９３】
本明細書で使用される「二特異性抗体」および「本発明に従う抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の２つの対（ＨＣ／ＬＣ）のうちの一方が、ＢＣＭＡに特異的に結合しており、他の一方が、ＣＤ３に、または好ましくは、ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合している抗体を指す。本出願中で使用される「〜価の」という用語は、抗体分子内の、明記された数の結合性部位の存在を示す。本発明に従う二価抗体は、一方が、ＣＤ３のための、他方が、ＢＣＭＡのための、２つの結合性部位を有する。それ自体、「三価」という用語は、本発明に従う抗体内の３つの結合性部位であって、２つの結合性部位が、ＢＣＭＡのためであり、１つの結合性部位が、ＣＤ３のためである、結合性部位の存在を示す。
【００９４】
ギリシャ文字：α、δ、ε、γ、およびμで示される、５種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ  ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ（２００２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列の）と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し（Ｗｏｏｆ  Ｊ、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻（２００４年）、８９〜９９頁）、重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。
【００９５】
本明細書で使用される「共通軽鎖」は、本発明に従う二特異性抗体において使用される唯一の軽鎖である。哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる、２種類の軽鎖が存在する。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメインＣＬと、１つの可変ドメインＶＬとを有する。軽鎖のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖であることが好ましく、定常ドメインＣＬは、カッパ（κ）軽鎖（定常ドメインＣＫ）に由来することが好ましい。本発明に従う抗体の重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、ヒトドメインであることが好ましい。
【００９６】
本発明に従う「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従う二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）、好ましくは、同じアロタイプ（例えば、白色人種）のＦｃパートを有する。
【００９７】
本明細書で使用される「抗体のＦａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のＦａｂ断片は、２つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のＦａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１、およびＶＨ）および軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ではない。
【００９８】
「抗体のＦｃパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、好ましくは、ヒト由来のＦｃパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のＦｃパートは、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化、およびＦｃ受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１２７巻（１９８１年）、２５５５〜２５６０頁；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．、およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻（１９７９年）、９０７〜９１７頁；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻（１９８０年）、３３８〜３４４頁；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７巻（２０００年）、９９５〜１００４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻（２０００年）、４１７８〜４１８４頁；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（２００１年）、１２１６１〜１２１６８頁；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６巻（１９９５年）、３１９〜３２４頁；ならびにＥＰ０３０７４３４により記載されている。このような結合性部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け（下記を参照されたい））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体が通例、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。Ｆｃパートは、ヒトＦｃパートであることが好ましい。Ｆｃパートは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートであることが好ましい。本発明に従う抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、好ましくは、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換、ならびに置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことが好ましい。
【００９９】
本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体であって、位置Ｐｒｏ３２９におけるアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されるＦｃ変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従う抗体内の野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９を、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ８７およびＴｉｐ１１０との間で形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、２６７〜２７３頁（２０００年７月２０日））を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ変異体内の、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ（ロイシン２３４が、アラニンにより置換されていることを示す）およびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ変異体については、ＷＯ２０１２１３０８３１において、詳細に記載されている。
【０１００】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えＤＮＡ技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号、および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【０１０１】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（１９８８年）、３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻（１９８５年）、２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
【０１０２】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５巻（２００１年）、３６８〜３７４頁）。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１９９３年）、２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（１９９３年）、２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９３年）、３３〜４０頁を参照されたい）。ヒト抗
体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２７巻（１９９２年）、３８１〜３８８頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２２巻（１９９１年）、５８１〜５９７頁）で作製することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Coleら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１９９１年）、８６〜９５頁）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃパートの変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への突然変異、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、定常領域において修飾される抗体も含む。
【０１０３】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
【０１０４】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性領域」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「ＦＲ」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のＣＤＲ３は、標的への結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）による標準的な規定に従い、決定する。
【０１０６】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
【０１０７】
本発明に従う二特異性抗体を調製するためには、各軽鎖および重鎖をコードする、別々のベクターまたは、別の適切な量のベクターを使用することができる。このようなベクターは、宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【０１０８】
本明細書で使用される「核酸または核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【０１０９】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような呼称は、子孫細胞を含む。こうして、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、およびこれに由来する培養物であって、継代数に関わらない培養物を含む。また、全ての子孫細胞は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する、変異体の子孫細胞も含まれる。顕著に異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【０１１０】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、ベクター／核酸の、宿主細胞への移入のプロセスを指す。透過しにくい細胞壁バリアを伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｈ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻（１９７８年）、５４６頁以降により記載されている、リン酸カルシウム沈殿法により実行する。しかし、また、核注射によるまたはプロトプラスト融合によるなど、ＤＮＡを細胞へと導入するための他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁の構築を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ  ＳＮら、ＰＮＡＳ、１９７２年、６９巻（８号）：２１１０〜２１１４頁により記載されている通り、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【０１１１】
最先端技術では、形質転換を使用する、抗体の組換え産生が周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、１７巻（１９９９年）、１８３〜２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、８巻（１９９６年）、２７１〜２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．、ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、１６巻（２０００年）、１５１〜１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．ら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４８巻（１９９８年）、８７０〜８８０頁による総説論文；ならびにＵＳ６３３１４１５およびＵＳ４８１６５６７において記載されている。
【０１１２】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をｍＲＮＡへと転写するプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物ともまた称する）を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内の発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１１３】
「ベクター」とは、核酸分子、特に、自己複製型核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する核酸分子である。用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの、細胞への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載される機能のうちの１つを超える機能を提供するベクターも含まれる。
【０１１４】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチドへと転写および翻訳されるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。
【０１１５】
本発明に従う二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞（上清または溶解の後における細胞）から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。
【０１１６】
ＮＳ０細胞内の発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２巻（２０００年）、１０９〜１２３頁；およびＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ.、７３巻（２００１年）、２６１〜２７０頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３０巻（２００２年）、Ｅ９頁により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻（１９８９年）、３８３３〜３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（１９９２年）、４２８５〜４２８９頁；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４巻（１９９７年）、７７〜８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１９９９年）、７１〜８３頁；ならびにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９４巻（１９９６年）、１９１〜１９９頁により記載されている。
【０１１７】
原核細胞に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを活用することが公知である。
【０１１８】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか；またはリボソーム結合性部位は、翻訳を容易とするように位置づけられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。
【０１１９】
一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続であり、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で連続であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１２０】
二特異性抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、従来の手順を使用して、たやすく単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として用いることができる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターへと挿入することができ、次いで、宿主細胞内で組換えモノクローナル抗体の合成を得るように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞であって、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトする。
【０１２１】
Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）結合剤は、細胞の殺滅（例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０；Dreierら、Int  J  Cancer、２００２年）において、非常に高度な、濃度／腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有するが、Ｔ細胞二特異性結合剤（ＴＣＢ）は、従来の単一特異性抗体よりはるかに低用量で施されている。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の処置のための、５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか、０．０３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）、または非ホジキンリンパ腫の処置のための、６０μｇ／ｍ２／日の連続静脈内投与で施され、これらの投与時における血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍｌの範囲である（Klingerら、Blood、２０１２年、Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年、Goebelerら、Ann  Oncol、２０１１年）。低用量のＴＣＢで、患者において高度な有効性を発揮しうるため、本発明に従う抗体では、皮下投与が可能であり、臨床状況において好ましいことが想定される（０．２５〜２．５ｍｇ／ｍ２／週の用量範囲が好ましい）。これらの低濃度／用量／受容体占有度であってもなお、ＴＣＢは、無視できない有害事象を引き起こしうる（Klingerら、Blood、２０１２年）。したがって、腫瘍細胞占有度／カバレッジを制御することが極めて重要である。本発明に従う抗体の別の利点は、Ｆｃ部分の組入れに基づき、これは、Ｆｃ部分を伴わないＴＣＢ（例えば、ブリナツモマブ）であって、患者が携行するポンプで、静脈内において連続的に施すことを要請するＴＣＢと比較して、消失半減期を、最大約１２日間またはさらにそれ超まで延長し、週１回または２回の投与の機会をもたらす。
【０１２２】
ＣＤ１９×ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）抗体ブリナツモマブについては、再発性／不応性の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を伴う患者において、最大８０％の奏効率が示されている。ＡＬＬと同様、多発性骨髄腫および他の形質細胞疾患にも、依然として高い医療的必要が存在する。今日利用可能な全ての処置にも拘らず、初回の診断の５年後に、多発性骨髄腫患者のうちの約６０％が、既に死亡している。多発性骨髄腫を伴う患者のための有効な処置が、依然として必要とされている。
【０１２３】
本発明に従う抗体は、例えば、ブリナツモマブおよび公表されているＢＣＭＡ×ＣＤ３  ＴＣＢ抗体に対して、固有の特徴および利点：
・長い消失半減期（数時間ではなく、数日間）
・簡便な週２回または１回の投与（患者が数週間／数カ月間携行するポンプによる投与ではない）
・ＢＣＭＡ×ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の高度の安定性および低度の凝集をもたらす、分子フォーマットおよび構造
・本発明に従う共通の軽鎖、および好ましくは適正な重鎖対合を改善するＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術、例えば、補体系および／またはＦｃＲを保有するエフェクター細胞との相互作用に由来する潜在的な副作用を回避する、ＦｃのＣＨ３内のＰｒｏ３２９およびＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を使用することによって高品質の製造を可能とし、精製を容易とする、分子構造の最適化
を有する。
【０１２４】
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する：
実施形態１．ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む共通抗体軽鎖、ならびにＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含むＣＤ３結合部分の重鎖を含むことを特徴とする二特異性抗体。
【０１２５】
実施形態２．共通可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む、実施形態１に記載の抗体。
【０１２６】
実施形態３．配列番号２９の共通軽鎖を含む、実施形態１または２に記載の抗体。
【０１２７】
実施形態４．ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含み、可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む抗体軽鎖が、共通軽鎖であることを特徴とする、実施形態１から３のいずれか１つに従う抗体。
【０１２８】
実施形態５．ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含み、配列番号２９の抗体軽鎖が、共通軽鎖であることを特徴とする、実施形態１から４のいずれか１つに従う抗体。
【０１２９】
実施形態６．ＣＤ３結合部分の可変重鎖ドメインＶＨとして配列番号１のＶＨを含むことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか１つに従う抗体。
【０１３０】
実施形態７．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、
ａ）配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２４のＣＤＲ３Ｈ
ｂ）配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２５のＣＤＲ３Ｈ
ｃ）配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２６のＣＤＲ３Ｈ
ｄ）配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号３７のＣＤＲ３Ｈ
からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
【０１３１】
実施形態８．ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、
ａ）配列番号１８のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２４のＣＤＲ３Ｈ(セットｐＳＣＨＬＩ３３３）
ｂ）配列番号１９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２５のＣＤＲ３Ｈ（セットｐＳＣＨＬＩ３７２）
ｃ）配列番号２０のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号２６のＣＤＲ３Ｈ（セットｐＳＣＨＬＩ３７３）
ｄ）配列番号３５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号３６のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号３７のＣＤＲ３Ｈ（セット８３Ａ１０）
からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【０１３２】
実施形態９．ＢＣＭＡ結合部分の可変重鎖ドメインＶＨとして配列番号１５、１６、１７または３４のＶＨ（８３Ａ１０）を含むことを特徴とする、実施形態１から８のいずれか１つに従う抗体。
【０１３３】
実施形態１０．アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおける５００ｎＭまたはそれより低い濃度のヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下、２５ｎＭの抗体濃度で測定される、前記二特異性抗体のヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーが、２００ｎＭまたはそれより低いことを特徴とする、実施形態１から９のいずれか１つに従う抗体。
【０１３４】
実施形態１１．リダイレクトＴ細胞殺滅ＬＤＨ放出アッセイにおいて、１０：１のＥ：Ｔ比のヒトＰＢＣＭおよびＨ９２９細胞の存在下、１００ｎＭまたはそれより低い濃度で２４時間使用される場合、前記二特異性抗体のＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０６８）を殺滅する効力（ＥＣ５０）が、２ｎＭまたはそれより低いと測定されることを特徴とする、実施形態１から１０のいずれか１つに従う抗体。
【０１３５】
実施形態１２．アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおける５００ｎＭまたはそれより低い濃度のヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下、２５ｎＭの抗体濃度において、軽鎖が配列番号２９のものであるヒトＩｇＧ１型の抗体において測定される、前記ＢＣＭＡ結合部分のヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーが、２００ｎＭまたはそれより低いことを特徴とする、実施形態１から１１のいずれか１つに従う抗体。
【０１３６】
実施形態１３．ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１個のＦａｂ断片と、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の１個のＦａｂ断片と、Ｆｃ部分とからなることを特徴とし、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む、実施形態１から１２のいずれか１つに従う二特異性抗体（図１Ａ）。
【０１３７】
実施形態１４．２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなることを特徴とし、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂおよび前記ＣＤ３−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記第１のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｂ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１３８】
実施形態１５．２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃ部分とからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により一方のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｃ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１３９】
実施形態１６．それらのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結された１個のＣＤ３−Ｆａｂおよび１個のＢＣＭＡ  Ｆａｂと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結されたＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｄ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１４０】
実施形態１７．１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｅ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１４１】
実施形態１８．２個のＢＣＭＡ−Ｆａｂからなることを特徴とし、第１のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して第２のＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、そのＣ末端を介して前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｆ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１４２】
実施形態１９．１個のＢＣＭＡ−Ｆａｂと、１個のＣＤ３  Ｆａｂとからなることを特徴とし、前記ＢＣＭＡ  Ｆａｂが、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端に連結され、前記ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、前記共通軽鎖を含む（図１Ｇ）、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【０１４３】
実施形態２０．一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、変更が、
ａ）二特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）二特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態１から１９のいずれか１つに従う抗体。
【０１４４】
実施形態２１．実施形態１から２０のいずれか１つに従う二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
【０１４５】
実施形態２２．実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
【０１４６】
実施形態２３．実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１４７】
実施形態２４．医薬としての使用のための、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２３に従う医薬組成物。
【０１４８】
実施形態２５．多発性骨髄腫のような形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２３の医薬組成物。
【０１４９】
実施形態２６．多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２８の医薬組成物。
【０１５０】
実施形態２７．多発性骨髄腫のような形質細胞障害、またはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害の処置のための、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２８の医薬組成物。
【０１５１】
実施形態２８．ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体。
【０１５２】
実施形態２９．実施形態１に従う二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための抗体軽鎖であって、前記二特異性抗体が、実施形態１から２０に従う抗体である抗体軽鎖。
【０１５３】
実施形態３０．ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む抗体軽鎖の使用であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む使用。
【０１５４】
実施形態３１．軽鎖が、可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含むことを特徴とする、実施形態３０に従う使用。
【０１５５】
実施形態３２．軽鎖が、軽鎖として配列番号２９の軽鎖を含むことを特徴とする、実施形態３０または３１に従う使用。
【０１５６】
実施形態３３．ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための、ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ１Ｌ、配列番号７のＣＤＲ２Ｌおよび配列番号８のＣＤＲ３Ｌを含む抗体軽鎖であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む抗体軽鎖。
【０１５７】
実施形態３４．可変軽鎖ドメインＶＬとして配列番号２のＶＬを含む、実施形態３３に従う抗体軽鎖。
【０１５８】
実施形態３５．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体における共通軽鎖としての使用のための、可変軽鎖として配列番号２９を含む抗体軽鎖であって、ＣＤ３結合部分の重鎖が、ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４のＣＤＲ２Ｈおよび配列番号５のＣＤＲ３Ｈを含む、実施形態３３または３４に従う抗体軽鎖。
【０１５９】
実施形態３６．実施形態１から２０のいずれか１つに従う抗体における共通軽（loght）鎖としての使用のための、実施形態３３から３５のいずれか１つに従う抗体軽鎖。
【０１６０】
以下の例、配列表、および図は、本発明の理解の一助とするために提示するものであり、本発明の真の範囲は、付属の特許請求の範囲で記される。本発明の精神から逸脱することなく、記される手順に改変を施しうることが理解される。
【０１６１】
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年において記載されている、標準的方法を使用して、ＤＮＡを取り扱った。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１年）に従い番号付けされ、言及された。
【０１６２】
遺伝子の合成
ａ）所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Ｋｐｎｌ／ＳａｄまたはＡｓｃｌ／Ｐａｃｌを介して、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターへとクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で提供されている仕様に従い、注文した。
【０１６３】
ｂ）要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するＰＣＲにより作出するか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングした。プラスミドＤＮＡは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製した。プラスミド濃度は、ＵＶ分光法により決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインした。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列によりデザインした。
【０１６４】
ＤＮＡの配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定した。
【０１６５】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理
Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージバーション９．２を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用した。
【０１６６】
発現ベクター
ａ）抗ＢＣＭＡ抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動する。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
【０１６７】
ｂ）ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体ベクターの作出のため、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、２種の別個の抗原決定基ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合することができる少なくとも２個の抗原結合部分からなる。抗原結合部分は、それぞれ可変および定常領域を含む重鎖および軽鎖で構成されたＦａｂ断片である。ＬＣ誤対合を回避するために、Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＢＣＭＡの軽鎖は、同一である。二特異性分子設計は、ＣＤ３に関して一価であり、ＢＣＭＡに関して二価であり、この場合、一方のＦａｂ断片が、内側のＦａｂのＮ末端に融合されている（２＋１）。分子が長い半減期を有することができるように、二特異性分子は、Ｆｃ部分を含有した。構築物の略図を図１に提示する；構築物の好まれる配列を配列番号２９〜３１に示す。哺乳動物発現ベクターによる懸濁液中で生育するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の、ポリマーに基づく共トランスフェクションにより、分子を産生した。２＋１  Ｆａｂ−ＩｇＧ構築物の調製のため、１：１：２：１比（重鎖：改変重鎖：軽鎖：改変軽鎖＝１：１：２：１；標準抗体の比：重鎖：軽鎖＝１：１）で、対応する発現ベクターを細胞にトランスフェクトした。
【０１６８】
細胞培養技法
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．、およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
【０１６９】
ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系）内の一過性発現
二特異性抗体は、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性でポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（二特異性抗体産生の比：重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖＝１：１：２：１；標準抗体の比：重鎖：軽鎖＝１：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのＰＥＩ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡＰＥＩ混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。
【０１７０】
タンパク質の決定
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算した。
【０１７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示書に従い使用する。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を伴う）、またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用する。
【０１７２】
タンパク質精製
アフィニティーステップおよびサイズ除外クロマトグラフィーである１回の仕上げ（polishing）ステップにより、抗体を精製した。
【０１７３】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
【０１７４】
サイズ除外クロマトグラフィーによる精製
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
純度および単量体含量の測定
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定した。
【０１７５】
ＰＢＭＣからの初代ヒト汎Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。略述すると、血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）にわたり、注意深く層化させた。４５０×ｇ、室温で３０分間遠心分離の後（ブレーキをオフに切り替える）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、チューブを、ＰＢＳで、５０ｍｌの総容量まで満たした。混合物を、４００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した（ブレーキをオンに切り替える）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ（登録商標））、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、１０％のＦＣＳ、および１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。
【０１７６】
ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０９１−１５６）を使用して実施した。略述すると、細胞ペレットを、細胞１０００万個当たり４０μｌの低温緩衝液（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中で希釈し、細胞１０００万個当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に、４℃で１０分間インキュベートした。細胞１０００万個当たり３０μｌの低温緩衝液および２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートした。現行容量の１０〜２０倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、３００×ｇで１０分間遠心分離ステップにかけた。最大１億個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。標識されていないヒト汎Ｔ細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０４２−４０１）を使用して実施した。結果として得られるＴ細胞集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ（登録商標））、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、ＡＩＭ−Ｖ培地中で保存した（２４時間より長くない）。
【０１７７】
ＰＢＭＣからの初代ヒトナイーブＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（型番１３０−０９３−２４４）製のＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離ステップは省略した（初代ヒト汎Ｔ細胞の単離についての記載もまた参照されたい）。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
抗ＢＣＭＡ抗体の作出
（実施例１．１）
抗原およびツール試薬の作製
（実施例１．１．１）
可溶性の組換えヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン
ファージディスプレイ選択のための抗原として使用される、ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡの細胞外ドメインを、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞内で、Ｎ末端単量体のＦｃ融合体として一過性に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を保有するＦｃ部分のＣ末端に配置されたａｖｉタグ認識配列における、ＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、部位特異的にビオチニル化させた。ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡの細胞外ドメインは、それぞれ、メチオニン４〜アスパラギン５３、メチオニン４〜アスパラギン５２、およびアラニン２〜トレオニン４９を含んだ。これらを、Ｎ末端において、ヒトＩｇＧ１のヒンジへと融合させ、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術による、非融合ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分（ホール鎖）とのヘテロ二量体化を可能とした。
【０１７９】
ＢＣＭＡの細胞外ドメインを回収するために、以下のプライマー：
ＢａｍＨ１部位（太字、下線を付す）を組み込む、ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ−３（配列番号９）、および
リバースプライマー：５−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣ−３（配列番号１０）；
プライマー：５−ＡＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＡＣ−３（配列番号１１）、および
リバースプライマー：５−ＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧ−３（配列番号１２）；
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字、下線を付す）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ−３（配列番号１３）、ならびに
リバースプライマー：５−ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＧＴＡＧＣ−３（配列番号１４）
を使用した。
【０１８０】
遺伝子合成を使用して、ＢＣＭＡの細胞外ドメインを得ることもできる。
【０１８１】
（実施例１．２）
ツールとしてのＢＣＭＡ発現細胞
（実施例１．２．１）
それらの表面上でＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞系
ＢＣＭＡの発現を、フローサイトメトリーにより、４つのヒト骨髄腫細胞系（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６Ｂ１およびＬ−３６３）上で評価した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（（Ｈ９２９）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））を、１０〜２０％の熱不活化ＦＣＳを伴い、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５０μＭのメルカプトエタノールを含有する場合もある、８０〜９０％のＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞（（ＲＰＭＩ）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を、９０％のＲＰＭＩ  １６４０、および１０％の熱不活化ＦＣＳを含有する培地中で培養した。Ｕ２６６Ｂ１（（Ｕ２６６）ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、および１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および１５％の熱不活化ＦＣＳを含有するように改変されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ｌ−３６３細胞系（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ４９）を、８５％のＲＰＭＩ  １６４０、および１５％の熱不活化ＦＣＳ中で培養した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、９６ウェル丸底プレートの細胞５０，０００個／ウェルで再懸濁させ、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、型番ａｂ５４８３４、マウスＩｇＧ１）と共に、４℃で３０分間インキュベートした（内部化を防止するように）。マウスＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として使用した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４１２１）。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウス二次抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩデバイス上で解析した。Ｈ９２９骨髄腫細胞系、Ｕ２６６Ｂ１、ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞系、およびＬ−３６３骨髄腫細胞系の表面膜上のＢＣＭＡ受容体数の相対定量化は、ＱＩＦＩＫＩＴ解析（Ｄａｋｏ、型番Ｋ００７８、製造元の指示書に従う）により評価した。Ｈ９２９細胞は、ヒトＢＣＭＡを、他の骨髄腫細胞系の最大３．８〜２７倍高い最高密度で発現させた。Ｈ９２９は、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現骨髄腫細胞であるＵ２６６ならびにＢＣＭＡｌｏ発現骨髄腫細胞であるＲＰＭＩ−８２２６およびＬ３６３と比較して、ＢＣＭＡｈｉ発現骨髄腫細胞系であると考えられる。表３は、ヒト多発性骨髄腫細胞系の細胞表面上の相対ＢＣＭＡ受容体数についてまとめる。
【０１８２】
【表３−２】
2018502062.tif 000006
【０１８３】
（実施例１．３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えライブラリーからＢＣＭＡ結合剤を得る
（実施例１．３．１）
共通軽鎖Ｆａｂライブラリーの構築
ヒト化抗ＣＤ３抗体軽鎖（配列番号２９）に基づいて構築されたＦａｂフォーマットの抗体ライブラリーを作出した。重鎖にのみ多様性を導入した。６種の異なる重鎖フレームワークを使用した：ＶＨ１−４６、ＶＨ１−６９、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２３、ＶＨ４−５９およびＶＨ５−１。ＣＤＲ１、２および３をランダム化し、各重鎖ライブラリーをランダム化されていない軽鎖と組み合わせた。Nissimら、EMBO  J.１９９４年２月１日；１３巻（３号）：６９２〜８頁およびSilacciら、Proteomics.２００５年６月；５巻（９号）：２３４０〜５０頁によって記載されている通りにライブラリーを作出した。
【０１８４】
（実施例１．３．２）
抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンの選択
１種の定常ＶＬおよび６種の異なるヒトＶＨ配列からなる合成Ｆａｂライブラリーからのファージディスプレイによって抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂを確立した。
【表４】
2018502062.tif 000007
【０１８５】
選択ラウンド（バイオパニング）は、以下のパターンに従い溶液中で実施した：１）抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇するための、１０ｕｇ／ｍｌの無関係なヒトＩｇＧでコーティングされたイムノチューブ内、ライブラリープール１つ当たり約１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング；２）Ｆｃ結合剤をさらに枯渇させるための、総容量２ｍｌ中、１００ｎＭの無関係な非ビオチニル化Ｆｃ  ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物の存在下における、非Ｆｃ結合性ファージミド粒子の、１００ｎＭのビオチニル化ＢＣＭＡとの０．５時間のインキュベーション；３）パニング反応物を、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンあらかじめコーティングされたマイクロタイタープレート上の１６のウェルへと分配し、移すことによる、シェーカー上２０分間にわたる、ビオチニル化ＢＣＭＡおよび特異的結合性ファージの捕捉；４）プレート洗浄機を使用する、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により１０〜３０回、およびＰＢＳにより１０〜３０回のそれぞれのウェルの洗浄；５）２３０ｎＭのマウスＡＰＲＩＬを添加することによって、天然リガンドの結合性部位を認識するＦａｂクローンを変位させ、こうして、ＡＰＲＩＬと競合しないファージ抗体について選択する、任意選択の競合的洗浄ステップ；６）１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）、ウェル１つ当たり１２５ｕｌの添加による、５〜１０分間のファージ粒子の溶出と、１Ｍのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、等容量の添加による中和；７）対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞への、溶出させたファージ粒子の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の感染、シェーカー上、３０℃で一晩にわたるインキュベーション、および、その後における、次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子の、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０１８６】
選択は、一定の抗原濃度である１００ｎＭを使用して、３〜５ラウンドにわたり実行した。ヒトＢＣＭＡだけを抗原として使用する選択方策とは別に、交差反応性抗体について選択するために、カニクイザルＢＣＭＡまたはマウスＢＣＭＡもまた、ヒトＢＣＭＡと交互に使用する、さらなる選択方策も実行した。なおさらに、ストレプトアビジンプレートベースの捕捉に対する代替法として、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ５．４×１０７個の、パニング反応物への添加に続き、上で記載した条件下で、それぞれの磁石を使用する洗浄ステップによって、抗原：ファージ複合体の捕捉も実施した。
【０１８７】
特異的結合剤は、ＢｉｏＲａｄ製のＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用する、Ｆａｂを含有する細菌培養物上清の、表面プラズモン共鳴によるスクリーニングにより同定した。略述すると、対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に、溶出させたファージ粒子を感染させた後、単一のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をプレーティングし、１ｍｌの発現培養物の、９６ディープウェルプレートへの接種のために取り集めた。Ｆａｂは、８．０００〜１０．０００ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ポリクローナル抗体で誘導体化されたＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）ＧＬＭチップ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、型番１０９−００５−００６）上で、上清から、垂直方向に捕捉した。その後、ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡ、ならびに無関係なＦｃ  ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物を、解析物として水平方向に注入した。ＢＣＭＡへの有意な結合応答を呈示し、抗原のＦｃ部分に結合しなかったクローンを、０．５リットルの培養物容量中で細菌により発現させ、アフィニティー精製し、ＢｉｏＲａｄ製のＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）ＸＰＲ３６バイオセンサー上で、ワンショット反応速度プロトコールを使用する、ＳＰＲ解析により反応速度的に特徴付けた。
【０１８８】
（実施例２）
ＢＣＭＡ結合アッセイ：表面プラズモン共鳴
抗ＢＣＭＡ抗体の、組換えＢＣＭＡへの結合についての、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による評価は、以下の通りに行った。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００上、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）をランニングバッファーとして実施した。抗ＢＣＭＡ抗体と、組換えＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）（ヒト、カニクイザル、およびマウス）との相互作用のアビディティーを決定した。指示書（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、ビオチニル化組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）、ビオチニル化組換えカニクイザルＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）、およびビオチニル化組換えマウスＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ＳＡチップ上に、直接カップリングさせた。固定化レベルは、８０〜１２０ＲＵの範囲であった。抗ＢＣＭＡ抗体は、フローセルを介して、４倍の濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）、３０μＬ／分の流量で、１２０秒間にわたり流過させた。解離は、１８０秒間モニタリングした。バルク屈折率の差違は、基準フローセル上で得られる応答を控除することにより補正した。ここで、抗ＢＣＭＡ抗体を、標準的なアミンカップリングキットにおいて記載されている通りに、あらかじめ活性化させ、脱活性化させた、空の表面上に流動させた。見かけの反応速度定数は、比較を目的とする、相互作用の二価性にも拘らず、数値積分により、１：１のラングミュア結合についての速度式を当てはめる、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ１．０、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出した。
【０１８９】
【表５】
2018502062.tif 000008
【０１９０】
【表６】
2018502062.tif 000009
【０１９１】
【表７】
2018502062.tif 000010
【０１９２】
抗ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体および組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の間の相互作用のアフィニティーも決定した。標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｐＨ５．０でＣＭ５チップにおいて抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を直接カップリングした。固定化レベルは、約６５００ＲＵであった。抗ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体を９０秒間２５ｎＭで捕捉した。組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、４倍濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）で流速３０μＬ／分によりフローセルに１２０または１８０秒間にわたって通過させた。解離を１２０または４００秒間モニターした。参照フローセルにおいて得られる応答を減算することにより、バルク屈折率の差異を補正した。参照では、抗ヒトＦａｂ抗体が固定化された表面上に組換えＢＣＭＡを流動させたが、その表面には、抗ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体ではなくＨＢＳ−ＥＰが注射されている。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェア（ｖ１．０、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して速度定数を得て、数値積分により１：１ラングミュア結合に対して速度式を当てはめた（表８）。
【０１９３】
【表８】
2018502062.tif 000011
【０１９４】
（実施例３）
共通軽鎖を有する二価抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の作出
共通軽鎖の使用をいずれのＢＣＭＡ抗体にも適用することができるという仮説を検証するために、ＷＯ／２０１４／１２２１４３に以前に記載された二価ＢＣＭＡ抗体８３Ａ１０のネイティブ軽鎖を、配列番号２９の共通軽鎖に置換することにより、８３Ａ１０−ＣＬＣ二価ＢＣＭＡ抗体を作出した。材料および一般方法セクションに記載されている二価ＩｇＧ抗体の作出のための一般技法を使用して、２個の８３Ａ１０の重鎖および２個の共通軽鎖を含む抗ＢＣＭＡ抗体を産生した。実施例２に記載されている方法と同様の方法により、ヒトＢＣＭＡに対する８３Ａ１０−ＣＬＣ  ＩｇＧ抗体のアフィニティーをＳＰＲにより測定した。表９は、８３Ａ１０−ＣＬＣ  ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体への組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の結合について描写する。
【０１９５】
【表９】
2018502062.tif 000012
【０１９６】
（実施例４）
抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＴＡＣＩ−ＲおよびｈｕＢＡＦＦ−Ｒに対する特異性についての試験
ＴＮＦ−ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーのメンバーとして、ＴＡＣＩ受容体およびＢＡＦＦ受容体は、細胞外ドメイン内の相同性を、それぞれ、２２％、および１８．５％として、ＢＣＭＡ受容体と類縁である。したがって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合実験を実施して、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の特異性について検討した。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）をランニングバッファーとして実施した。標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｆｃを融合させた、ｈｕＢＣＭＡ、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ、およびｈｕＴＡＣＩ−Ｒを、ｐＨ５．０で、高固定化レベル（約５０００ＲＵ）により、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップの異なるフローチャネル上に、化学的に固定化する。まず、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ  ｐＳＣＨＬＩ３７２ならびに陽性対照としての抗ｈｕＴＡＣＩ−Ｒ  ＩｇＧまたは抗ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ  ＩｇＧの高濃縮溶液（３μＭ、ＨＢＳ−ＥＰ中に溶解させた）を注入（会合時間：８０秒間、解離時間：６００秒間、流量：３０μｌ／分）して、結合が生じるのかどうかを点検した。抗ｈｕＴＡＣＩ−Ｒ  ＩｇＧの、ｈｕＴＡＣＩ−Ｒへの正の結合イベントのほか、抗ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ  ＩｇＧの、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒへの正の結合イベント、および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＢＣＭＡへの正の結合イベントは、全ての受容体が、固定化の後でもやはり認識されることを指し示した。抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒおよび／またはｈｕＴＡＣＩ−Ｒへの、大きな反応速度定数による結合については、固定化レベルを小さくした（３００ＲＵ）場合の反応速度パラメータについての注意深い検討を、新しいＣＭ５センサーチップ上で実施した。濃度を３０００〜９３．７５ｎＭ（ＨＢＳ−ＥＰ中に２倍希釈した）とする抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体希釈液を、注入（会合時間：８０秒間、解離時間：３００秒間、流量：３０μｌ／分）し、試料を、二連で調べた。また、可能な場合、すなわち、解離が高速で完了してしまわない場合は、再生も実施した。抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体と、ｈｕＢＡＦＦ−ＲまたはｈｕＴＡＣＩ−Ｒとの相互作用についての反応速度による査定は、物質移動についての項（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）を含む、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィッティングにより実施した。定常状態解析も行った。図２に描写されている通り、曲線１は、参照チャネルにおけるシグナルに対応し、曲線２は、結合が起こるチャネル（結合チャネル）に対応し、曲線２−１は、減算されたシグナル（結合チャネル−参照チャネル）であり、これが、結合事象によるシグナルであることを意味する。図２に示す通り、ＳＰＲ結合アッセイは、ｐＳＣＨＬＩ３７２  ＩｇＧが、ヒトＴＡＣＩ受容体に結合しなかったことを明らかに実証した。結合の陽性対照として、ＴＡＣＩ受容体にわずかに結合するが、非常に速いオンレート（on-）およびオフレート（off-rate）であることが公知の別のＢＣＭＡ  ＩｇＧを使用した（データ図示せず）。
【０１９７】
（実施例５）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
（実施例５．１）
抗ＣＤ３抗体
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号３、４および５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む、可変ドメインＶＨと、配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む、可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号１（ＶＨ）および配列番号２（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。上で記載した抗ＣＤ３抗体を使用して、以下の実施例で使用されるＴ細胞二特異性抗体を作出した。
【０１９８】
（実施例６）
ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ  Ｆｃ含有（２＋１）抗体の産生および精製
二特異性抗体の産生のため、懸濁液中で培養された、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるそれぞれの哺乳動物発現ベクターの一過性のポリマーに基づく共トランスフェクションによって二特異性抗体を発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）培地において１５０万個の生細胞／ｍＬで播種した。最終産生容量１ｍＬにつき２００万個の生細胞を遠心分離した（５分間、２１０×ｇ）。上清を吸引し、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に細胞を再懸濁した。１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地において１μｇのＤＮＡ（二特異性抗体産生の比：重鎖：改変重鎖：軽鎖：改変軽鎖＝１：１：２：１；標準抗体の比：重鎖：軽鎖＝１：１）を混合することにより、最終産生容量１ｍＬにつきＤＮＡを調製した。０．２７μＬのＰＥＩ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の添加後に、混合物を１５秒間ボルテックスし、室温に１０分間放置した。１０分後に、再懸濁した細胞およびＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をまとめ、続いて適切な容器に移し、これを振とうデバイス（３７℃、５％ＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、最終産生容量１ｍＬにつき、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．２５ｍＭバルプロ酸および１２．５％Ｐｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を添加した。２４時間後に、最終産生容量１ｍＬにつき７０μＬのフィード溶液を添加した。７日後に、または細胞生存率が７０％に等しいまたはこれよりも低くなったときに、遠心分離および滅菌濾過により上清から細胞を分離した。アフィニティーステップおよび１回の仕上げステップサイズ除外クロマトグラフィーにより、抗体を精製した。
【０１９９】
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
【０２００】
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
【０２０１】
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算した。
【０２０２】
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定した。
【０２０３】
図３は、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップ後の最終タンパク質調製物のＣＥ−ＳＤＳグラフ（非還元（上）および還元（下））を描写する：（Ａ）ｐＳＣＨＬＩ３３３−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｂ）ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ、（Ｃ）ｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ。ｐＳＣＨＬＩ３３３−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体に適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣによる精製ステップは、純度８９．２％および１００％の単量体含量（Ａ）、ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体に関しては純度８８．５％および１００％の単量体含量（Ｂ）、ならびにｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体に関しては純度９１．８％および１００％の単量体含量（Ｃ）をもたらした。表１０は、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣによる精製ステップ後の、ｐＳＣＨＬＩ３３３−ＴＣＢ  ＣＬＣ、ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の特性を要約する。全ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体において、＞８８％純度および１００％単量体含量に一貫して達した。全体的な結果により、産生／精製特徴における利点は、ＴＣＢ抗体への共通軽鎖（ＣＬＣ）の使用により達成することができたこと、および開発可能特性が非常に良好な、既に高品質のタンパク質調製物を達成するのに要請される精製ステップは、２つ（すなわち、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣ）のみであったことが明らかに実証される。
【０２０４】
【表１０】
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【０２０５】
（実施例７）
ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系へのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーにより、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９細胞におけるヒトＢＣＭＡへの結合に関して、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）を解析した。陰性対照としてＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現しないヒト胃腺癌細胞系）を使用した。簡潔に説明すると、培養細胞を採取し、計数し、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を評価した。次に、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において１ｍｌ当たり２×１０６個の細胞となるよう生細胞を調整する。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１００μｌのこの細胞懸濁液をさらにアリコート分割し、３０μｌのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体または対応するＴＣＢ対照と共に３０分間４℃でインキュベートした。０．１２〜５００ｎＭの間の最終濃度範囲内で、全ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（およびＴＣＢ対照）を滴定および解析した。次に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共にさらに３０分間４℃でインキュベートした。次に、細胞を染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル当たり１００ｕｌのＢＤ固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）を使用して解析した。図４に描写されている通り、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の平均蛍光強度を、抗体濃度の関数としてプロットした；（Ａ）Ｈ９２９細胞におけるｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ；（Ｂ）ＭＫＮ４５細胞におけるｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）抗体は、１００ｎＭを下回る濃度でＢＣＭＡ陰性およびＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞に結合しなかった。適用できる場合、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＥＣ５０を計算し、Ｈ９２９細胞への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合の最大結合の５０％に達するために必要とされる抗体濃度を表示するＥＣ５０値を表１１に要約する。
【０２０６】
【表１１】
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【０２０７】
（実施例８）
ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞系へのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーにより、ヒト白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２）において発現されたヒトＣＤ３へのそれらの結合特性に関するＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）も解析した。１０％の熱失活ＦＣＳを補充したＲＰＭＩにおいて、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を培養した。簡潔に説明すると、培養細胞を採取し、計数し、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）を使用して細胞生存率を評価した。次に、０．１％のＢＳＡを含有するＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において１ｍｌ当たり２×１０６個の細胞となるように生細胞を調整した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１００μｌのこの細胞懸濁液をさらにアリコート分割した。３０μｌのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体または対応するＴＣＢ対照を細胞含有ウェルに添加して、０．１２ｎＭ〜５００ｎＭの最終濃度を得た。同じ容積モル濃度のＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体および対照ＩｇＧを使用した。３０分間４℃のインキュベーション後に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェルのＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、続いてウェル当たり１００ｕｌのＢＤ固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して細胞を４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）を使用して解析した。Ｔ細胞へのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合を評価し、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞においてゲーティングして蛍光強度中央値を決定し、ヒストグラムまたはドットプロットにおいてプロットした。図５は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（Ａ）またはＭＫＮ４５細胞（Ｂ）に結合するＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）の蛍光強度中央値を示し、抗体濃度の関数としてプロットする。ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体のＥＣ５０値および最大結合は到達されなかった。アイソタイプ対照抗体は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合せず、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３３３、ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）抗体は、１００ｎＭを下回る濃度でＢＣＭＡ陰性およびＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞に結合しなかった。
【０２０８】
（実施例９）
ＣＤ３陽性Ｔ細胞およびＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系へのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の結合によるヒトＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー）
ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在または非存在下で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を評価することにより、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞活性化を誘導するそれらの能力に関してＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）を解析した。簡潔に説明すると、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞を細胞解離緩衝液により採取し、計数し、生存率をチェックした。改変ＲＰＭＩ−１６４０培地において１ｍｌ当たり０．３×１０６個の（生）細胞となるように細胞を調整し、ウェル当たり１００μｌのこの細胞懸濁液をピペットで吸って丸底９６ウェルプレートに入れた（示されている通り）。５０μｌの（希釈された）ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体を細胞含有ウェルに添加して、０．０１２ｐＭ〜１００ｎＭの最終濃度を得た。健康なドナーの採取したての血液からヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を単離し、改変ＲＰＭＩ−１６４０培地において１ｍｌ当たり６×１０６個の（生）細胞となるように調整した。アッセイプレートのウェル当たり５０μｌのこの細胞懸濁液を添加して、骨髄腫腫瘍細胞に対するＰＢＭＣの最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得た。ヒトＢＣＭＡを発現する標的細胞の存在下で、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体が、特異的にＴ細胞を活性化することができたか解析するために、３〜１０ｎＭのそれぞれのＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体分子と共にＰＢＭＣを含有するが、標的細胞を含有しないウェルを含めた。３７℃、５％ＣＯ２の４８時間インキュベーション後に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１５０μｌ／ウェルの０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。供給元の示唆に従い、ＣＤ４（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ型番５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧｌ；クローンＬ７８；ＢＤ型番３４０５６０）およびＣＤ２５（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ型番５５５４３４）の表面染色を４℃で３０分間行った。１５０μｌ／ウェルの０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ型番５５４６５５）を使用して１５分間４℃で固定した。遠心分離後に、２００μｌ／ウェルの０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳに試料を再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ装置（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（登録商標））を使用して解析した。図６は、４８時間のインキュベーション後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９および後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルを描写する（２つの独立した実験の代表的な結果）。ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣおよびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体は、濃度依存的かつ特異的な様式で、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下、ＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を誘導した。ヒトＰＢＭＣをＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体で処置した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は観察されず、Ｔ細胞におけるＣＤ３への結合にもかかわらず、ＴＣＢ抗体がＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しない場合、Ｔ細胞活性化が起こらないことを示唆する。
【０２０９】
（実施例１０）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導されるＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞のリダイレクトＴ細胞細胞傷害性（比色ＬＤＨ放出アッセイ）
細胞におけるＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合による構築物の架橋により、ＢＣＭＡ高発現ＭＭ細胞においてＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在力に関しても、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）を解析した。簡潔に説明すると、ヒトＢＣＭＡ発現Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液により採取し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩにおいて洗浄および再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たりおよそ３０，０００個の細胞を蒔き、所望の最終濃度のために構築物のそれぞれの希釈物を添加した（３連で）；０．１２ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度。適切な比較のために、全ＴＣＢ構築物および対照を、同じ容積モル濃度となるように調整した。ヒト総Ｔ細胞（エフェクター）をウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比５：１を得た。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した場合、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を使用した。陰性対照群は、エフェクターまたは標的細胞のみによって表された。ヒト汎Ｔ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。正規化のため、細胞死を誘導する最終濃度の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と標的細胞とのインキュベーションにより、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を決定した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと共インキュベートした、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体全くなしの標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２の２０〜２４時間または４８時間インキュベーション後に、続いて、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造元の説明書に従い、アポトーシス性／壊死性ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線においてＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標））を使用してＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。図７に示す通り、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体であるｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ａ、Ｂ）およびｐＳＣＨＬＩ３７３−ＴＣＢ  ＣＬＣ（Ｂ）は、ＬＤＨ放出によって測定される、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の濃度依存的殺滅を誘導した。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しないＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体は、１００ｎＭの検査した最高濃度であってもＬＤＨ放出を誘導しなかったため、Ｈ９２９細胞の殺滅は特異的であった。表１２は、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体によって誘導されるＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞のリダイレクトＴ細胞殺滅のＥＣ５０値を要約する。
【０２１０】
【表１２】
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【０２１１】
（実施例１１）
ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体によって誘導されるＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫細胞のリダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
細胞におけるＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合による構築物の架橋により、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現ＭＭ細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力に関して、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体（ｐＳＣＨＬＩ３７２、ｐＳＣＨＬＩ３７３）を解析した。簡潔に説明すると、ヒトＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液により採取し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩにおいて洗浄および再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにおけるウェル当たりおよそ３０，０００個の細胞を蒔き、所望の最終濃度のために構築物のそれぞれの希釈物を添加した（３連で）；０．１２ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度。適切な比較のために、全ＴＣＢ構築物および対照を、同じ容積モル濃度となるように調整した。ウェルにヒト総Ｔ細胞（エフェクター）を添加して、最終Ｅ：Ｔ比５：１を得た。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した場合、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を使用した。陰性対照群は、エフェクターまたは標的細胞のみによって表された。ヒトＴ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。正規化のため、細胞死を誘導する最終濃度の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と標的細胞とのインキュベーションにより、ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を決定した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと共インキュベートした、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体全くなしの標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２の２０〜２４時間インキュベーション後に、続いて、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造元の説明書に従い、アポトーシス性／壊死性ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線においてＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体の濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標））を使用してＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。表１３は、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ  ＣＬＣ抗体によって誘導されるＢＣＭＡ陽性Ｕ２６６細胞のリダイレクトＴ細胞殺滅のＥＣ５０値を要約する。
【０２１２】
【表１３】
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【０２１３】
（実施例１２）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導される自家骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における骨髄患者骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞細胞傷害性（マルチパラメータフローサイトメトリー）
多発性骨髄腫に対するＴＣＢ抗体候補の前臨床査定時において、最も有意義であり、極めて重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けのうちの１つは、ＴＣＢ分子が、患者のＴ細胞を活性化し、患者の骨髄由来の初代骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞殺滅を誘導することができるか否かである。骨髄骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞殺滅を誘導する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の効果を評価するために、多発性骨髄腫患者から全骨髄吸引物をＥＤＴＡコーティングされたチューブ内に収集し、細胞培養アッセイのために直ちに使用した。フローサイトメトリーにより、全骨髄試料中に存在する腫瘍細胞に対するエフェクター細胞の比（Ｅ：Ｔ比）を決定および測定した。簡潔に説明すると、２００μｌの骨髄試料を９６ディープウェルプレートに移した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体および対照抗体希釈物を滅菌培地において調製し、０．０１ｐＭ〜３０ｎＭの範囲の最終濃度のために１０μｌの調製物をそれぞれのウェルに添加した。穏やかな振とうにより骨髄−抗体懸濁液を混合し、続いてパラフィンフィルムで密封して、３７℃、５％ＣＯ２で２４〜７２時間インキュベートする。インキュベーション期間後に、ＣＤ１３８／ＣＤ３８／ＣＤ５またはＣＤ２またはＣＤ３／ＣＤ５６／ＣＤ４５／アネキシン−Ｖ／ＢＣＭＡを含む抗体パネルに基づいて調製した２０μｌの対応するＦＡＣＳ抗体溶液を、９６−Ｕ字底プレートに添加した。蛍光色素標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入し、自家製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を使用した。次に、試料を暗所で室温にて１５分間インキュベートし、マルチカラーフローサイトメーターを使用して取得および解析を行った。骨髄腫細胞集団ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋／ｍｉｄにおいてゲーティングされたアネキシン−Ｖ陰性発現を評価することにより、生きた骨髄腫細胞を決定した。次に、骨髄腫の生きた細胞の百分率を決定した。所定のＴＣＢ濃度におけるアネキシン−Ｖ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数を測定し、ＴＣＢなしのアネキシン−Ｖ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数からこれを減算し、ＴＣＢなしのアネキシン−Ｖ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数で割ることにより、特異的濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導される患者骨髄骨髄腫形質細胞の溶解の百分率も決定した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の特異性を検証するために、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞など、他の骨髄細胞型におけるアネキシン−Ｖ発現も測定した。図９に示す通り、生存（アネキシン−Ｖ陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的低減によって反映される通り、ｐＳＣＨＬＩ３７２−ＴＣＢ  ＣＬＣは、患者骨髄骨髄腫形質細胞の殺滅を誘導する。２４時間目および７２時間目の両方で、低いｎＭ濃度範囲による骨髄腫細胞のリダイレクト溶解が観察された。悪性形質細胞の溶解は、ＣＤ３のみに結合するがＢＣＭＡには結合しない対照ＴＣＢにより観察されず、検査した最高濃度のＴＣＢ抗体において骨髄腫形質細胞の細胞死を誘導しなかったため、患者骨髄腫形質細胞の濃度依存的か��特異的な溶解が見られた。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｇ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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