(57)【要約】  この発明により、多能性細胞を作製することに関する組成物及び方法を提供する。特に、この発明は、基底状態の多能性をもつ多能性細胞を作製することに関する、改良した培養プラットフォームを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非多能性細胞を初期化する方法であって、
ａ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、前記非多能性細胞に導入すること、又は、
ｂ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドとを、前記非多能性細胞に接触させることを含む、方法。
【請求項２】
ａ）（ｉ）及びａ）（ｉｉ）の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入し、各ベクター内の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１つ又は複数のポリヌクレオチドを前記非多能性細胞に導入することは、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１つ又は複数のポリヌクレオチドを前記非多能性細胞に導入することは、
（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することと、
（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（１）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することとを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含むベクターのうちの少なくとも１つによって導入する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとによって導入する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記１つ又は複数のベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットをもつベクター系又はｍＲＮＡによって導入する、請求項３記載の方法。
【請求項８】
ベクターのうちの少なくとも１つは、センダイウイルスによって導入する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの自己切断（self-cleaving）ポリペプチドにより連結されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記非多能性細胞を多能性細胞に初期化する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記非多能性細胞は体細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
非多能性細胞を初期化することは、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数の使用を除外する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
多能性細胞を産生する方法であって、
ａ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞に導入することと、又は、
ｂ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドとを、非多能性細胞に接触させることと、
それによって前記非多能性細胞を多能性細胞に初期化することとを含む、方法。
【請求項１４】
ａ）（ｉ）及びａ）（ｉｉ）の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入し、各ベクター内の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
１つ又は複数のポリヌクレオチドを前記非多能性細胞に導入することは、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
１つ又は複数のポリヌクレオチドを前記非多能性細胞に導入することは、
（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することと、
（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（１）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを導入することとを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性細胞を産生することは、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数の使用を除外する、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含むベクターのうちの少なくとも１つによって導入する、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとによって導入する、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ又は複数のベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットをもつベクター系又はｍＲＮＡによって導入する、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
ベクターのうちの少なくとも１つは、センダイウイルスによって導入する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
非多能性細胞を多能性細胞に初期化することに関する組成物であって、非多能性細胞の集団を含むものであり、前記非多能性細胞は、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドとを含む、組成物。
【請求項２３】
前記非多能性細胞は、ＯＣＴ４、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１及びＮＡＮＯＧからなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、またＣＤＨ１、ＺＩＣ３、ＨＥＳＲＧ、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１及びＤＮＭＴ３Ｂからなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項２４】
前記非多能性細胞が、（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、ならびに／又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものであって、前記ポリヌクレオチドは外因性である、請求項１６記載の組成物。
【請求項２５】
前記非多能性細胞が、（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、ならびに／又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものであって、前記非多能性細胞は、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数を含まない、請求項１６記載の組成物。
【請求項２６】
前記非多能性細胞が、
（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、ならびに／又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、をさらに含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２７】
多能性細胞を産生することに関するキットであって、
ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターがＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むものである、前記１つ又は複数のベクター、又は、
ｂ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドを含む、キット。
【請求項２８】
１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターを含む、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターと、
（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（１）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである前記１つ又は複数のベクターとを含む、請求項２７記載のキット。
【請求項３０】
ベクターが、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、請求項２７記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとを含む、請求項２７記載のキット。
【請求項３２】
ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって運ばれる、請求項２７記載のキット。
【請求項３３】
前記ベクターは、センダイウイルスによって運ばれる、請求項２７記載のキット。
【請求項３４】
初期化組成物であって、
（ａ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドとをコードする、１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｂ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１と、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１とからなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドを含む、初期化組成物。
【請求項３５】
（ａ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＲＲＢ及びＵＴＦ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｂ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＲＲＢ及びＵＴＦ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをさらに含む、請求項３４記載の初期化組成物。
【請求項３６】
前記初期化組成物が、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含む少なくとも１つのベクターを含む、請求項３４記載の初期化組成物。
【請求項３７】
前記初期化組成物が、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとを含む、請求項３６記載の初期化組成物。
【請求項３８】
ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって運ばれる、請求項３６記載の初期化組成物。
【請求項３９】
ベクターは、センダイウイルスによって運ばれる、請求項３６記載の初期化組成物。
【請求項４０】
非多能性細胞を初期化する方法であって、
（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入することと、
（ｂ）ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入することと、
それによって多能性細胞を取得することとを含む、方法。
【請求項４１】
（ａ）及び（ｂ）の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入し、各ベクター内の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードする、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
１つ又は複数のベクターが、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含む少なくとも１つのコンストラクトを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとを介して導入する、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
ベクターのうちの１つ又は複数は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって導入する、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
ベクターのうちの１つ又は複数は、センダイウイルスによって導入する、請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
センダイウイルスを用いて非多能性細胞を初期化する方法であって、
（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入することと、
（ｂ）ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入することと、
それによって多能性細胞を取得することとを含む、方法。
【請求項４７】
（ａ）及び（ｂ）の前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入し、前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードする、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ベクターのうちの１つ又は複数が、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数、を含むコンストラクトを含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとを介して導入するものであって、
前記ベクターは、センダイウイルスによって運ばれる、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
センダイウイルスを用いて非多能性細胞を初期化する方法であって、
（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードするポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入することと、
（ｂ）
（ｉ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、又は、
（ｉｉｉ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、を含むコンストラクトのうちの１つを前記非多能生細胞に導入することと、
それによって多能性細胞を取得することとを含む、方法。
【請求項５１】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、
（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つとを介して導入するものであって、
前記ベクターは、センダイウイルスによって運ばれる、請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１５年１０月１６日出願の米国仮出願第６２／２４２，８４２号の優先権を主張し、その開示はその全体を参照することによりここに組み入れられたものとする。
【０００２】
この発明は概して、多能性細胞を作製することに関する組成物及び方法に関する。特に、この発明は、基底状態の多能性をもつ多能性細胞を作製することに関する、改良した培養プラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００３】
今日の多能性幹細胞を用いる、疾患や毒性のスクリーニングへの取り組みならびに将来の自家／均質細胞の多能性幹細胞療法には、頑健で再現性のある、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の細胞株産生方法及び細胞株増殖方法が必要であろう。ｈｉＰＳＣは、ゲノムを組み込んだレトロウイルス及びレンチウイルスによる発現系により導入された多能性因子の異所発現によって産生される。可能な限り多くの組み込み事象を省くという取り組みには、いくつかの初期化因子（reprogramming factor）の代わりに小分子阻害剤を用いることを含むものであった。しかしながら、非組み込み法では、非効率かつ多大な労力を要することが証明されている、又は体細胞の初期化において有効でないものであり、更なる初期化因子を必要としていた（Lee et al., 2013）。
【０００４】
多能性幹細胞の培養に関するいくつかの課題は、産業的及び臨床的用途での使用に好適な細胞の誘導を可能にすることに未だ取り組まれていない。最も多く一般に利用されている従来の培養系では、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣは、フィーダー細胞上で維持する一方で、広範囲の細胞死及びゲノム異常を回避するために凝集塊として継代する（Thomson et al., 1998）。フィーダーフリー（ＦＦ）環境でｈｉＰＳＣを単一細胞培養できないということは、産業的規模でのスクリーニング又は細胞療法の用途の可能性を深刻に制限するものである（Skottman et al., 2007; Valamehr et al., 2011）。さらに、ｈｉＰＳＣの改良における最近の取り組みでは、導入遺伝子フリーではない、レンチウイルスにより誘導のｈｉＰＳＣが注目されているが、係る取り組みのうち治療関連のものを制限している。
【０００５】
別の課題は、培養液中でのヒト多能性幹細胞の自然分化に関する性状である、ゲノム修飾の不足に未だ良好に取り組まれていない（Pera and Trounson, 2004; Sathananthan and Trounson, 2005; Valamehr et al., 2011）。
【０００６】
ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣにおける研究について記述されてきているが、多能性遺伝子の連続的な異所発現は、ゲノム修飾したヒト多能性幹細胞を生じる基底状態を維持することが必要であったが（Hanna et al., 2010a）、それは産業グレード及び臨床グレードの多能性細胞に好適でない。
【０００７】
また、初期化は、長期の潜伏期を伴う非効率で確率的なプロセスであることが知られている。発現のタイミング及びレベルが、またさらに重要なものでは初期化因子の化学量論が、初期化の完了を決定する。化学量論は、反応工程における物質間の量的関係を測るものであるため、所与の反応で必要な物質の量を決定するために用いられ、また産生される産物の量を決定するために用いることもある。化学量論により、反応を完了させる物質の最適量又は最適比である、ある物質の化学量論量又は物質の化学量論比の両方が考慮される。
【０００８】
初期化因子の化学量論は、初期化の初期段階だけでなく後期段階においても重要であり、中間細胞状態の樹立及び成熟に重要である。初期化因子の様々な化学量論が、初期化効率に影響しており、異なる品質でｉＰＳＣを産生することも可能である。例えば初期化因子の化学量論は、ｉＰＳＣの多能性のレベル、自己複製、均質性、及び自然分化を含む、生物学的特性に影響する。
【０００９】
したがって、将来の多能性幹細胞療法の開発及び商業化における現在までの実質的な課題は、生産性が高く、効率的な、導入遺伝子フリー又はフットプリントフリーの、高品質なヒト多能性細胞産物の産生に関する組成物及び方法が欠如していることであることが判明した。
【発明の概要】
【００１０】
この発明は概して、非多能性細胞の初期化に関する改良した方法及び組成物を提供する。概括的な上記方法は、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、上記非多能性細胞に導入することを含む。あるいは、概括的な方法は、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドとを、上記非多能性細胞に接触させることを含む。一部の実施形態では、非多能性細胞は体細胞である。一部の実施形態では、非多能性細胞は成体幹細胞を含む。一部の実施形態では、非多能性細胞を多能性細胞に初期化する。他の実施形態では、非多能性細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ（induced pluripotent stem cell））に初期化する。さらに他の実施形態では、ｉＰＳＣは初期化された成体幹細胞を含む。
【００１１】
上記方法の一実施形態では、上記の１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入する。一部の実施形態では、各ベクター内の上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一の又は異なるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットをもつベクター系、又はｍＲＮＡによって導入する。特定の実施形態では、上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入する。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、エピソーマルベクター（episomal vector）によって導入する。様々な他の実施形態では、上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入する。
【００１２】
上記方法の一部の実施形態では、上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一のコンストラクト又はベクターに含まれる。一部の他の実施形態では、上記１つ又は複数のポリヌクレオチドは、異なるベクターに含まれる。一実施形態においては、２つ以上のポリヌクレオチドがポリシストロニックベクターに含まれるものであって、開示される初期化因子をコードする一対又は複数対の隣接したポリヌクレオチドが、自己切断（self-cleavage）ペプチド又はＩＲＥＳによって連結されていることを伴う。さらに別の実施形態では、ポリシストロニックベクターが、それぞれＯＣＴ４ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、選択マーカーと連結している。
【００１３】
別の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４を含む１つのベクターを、非多能性細胞に導入することを含む。さらに別の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４を含む第１のベクターと、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４を含む第２のベクターとを、非多能性細胞に導入することを含む。方法の一部の実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターのうちの少なくとも一方が、ポリシストロニックである。方法の他の一部の実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターの両方が、ポリシストロニックである。さらに他の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４を含む第１のベクターと、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４を含む第２のベクターとを、非多能性細胞に導入することを含む上記方法が、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４を含む第３のベクター又はそれより多くのベクターを、非多能性細胞に導入することをさらに含む。さらにまた一部の他の実施形態では、ポリヌクレオチドをコードするＯＣＴ４を含むベクターのうちの１つ又は複数を非多能性細胞に導入することを含む方法は、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。一部の実施形態では、非多能性細胞に導入する初期化因子は、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４を含まない。一部の実施形態では、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４は、非多能性細胞に導入する初期化因子から除外される。一部の実施形態では、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが存在する状態では、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４はなくてもよい。さらに一部の他の実施形態では、ポリヌクレオチドをコードする２つ以上のＯＣＴ４を含む第１のベクターを導入することを含む上記方法は、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターを導入することをさらに含む。さらに一部の他の実施形態では、上記方法は、ポリヌクレオチドをコードする１つ又は複数のＯＣＴ４を含む１つ又は複数のベクターを、非多能性細胞に導入することを含み、またＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを導入することをさらに含む。
【００１４】
概括的方法の一実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することを含む上記方法は、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００１５】
或る実施形態では、上記概括的な方法に従って非多能性細胞を初期化することは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１及びＥＳＲＲＢからなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、非多能性細胞を初期化することは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１及び／もしくはＥＳＲＲＢをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞に導入することを含む。
【００１６】
或る実施形態では、上記概括的な方法に従って非多能性細胞を初期化することは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、非多能性細胞を初期化することは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１及び／もしくはＵＴＦ１をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞に導入することを含む。
【００１７】
このように、本願の概括的な方法によれば、一部の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入することは、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを、導入することを含む。一部の特定の実施形態では、非多能性細胞に導入する初期化因子は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数を含まない。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターを非多能性細胞に導入することを含む、非多能性細胞を初期化する方法は、１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数の更なるポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することをさらに含む。一部の他の特定の実施形態では、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及び／又はＫＬＦ４は、非多能性細胞に導入する初期化因子から除外される。さらに他の特定の実施形態では、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが存在する状態では、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及び／又はＫＬＦ４はなくてもよい。
【００１８】
一部の他の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入することは、（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを導入することと、（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを導入することとを含む。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターを非多能性細胞に導入することを含む、非多能性細胞を初期化する方法は、１つ又は複数の更なる初期化因子を、非多能性細胞に導入することをさらに含む。一部の特定の実施形態では、初期化因子を非多能性細胞に導入する方法は、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及び／又はＫＬＦ４を含まない。一部の他の特定の実施形態では、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及び／又はＫＬＦ４は、非多能性細胞に導入する初期化因子から除外される。さらに他の特定の実施形態では、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが存在する状態では、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及び／又はＫＬＦ４はなくてもよい。一部の他の実施形態では、前記概括的な方法で用いる１つ又は複数のポリヌクレオチドは、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含むベクターのうちの少なくとも１つによって導入される。一実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つのベクターとによって導入される。
【００１９】
本出願の別の態様は、多能性細胞を産生する方法であって、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞に導入することを含む該方法に向けられる。代替的な実施形態においては、多能性細胞を産生する方法は、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドとを、非多能性細胞に接触させることと、それによって非多能性細胞を多能性細胞に初期化することとを含む。或る実施形態では、細胞内で内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることによって、上記非多能性細胞を多能性状態に初期化する。他の実施形態では、非多能性細胞を人工多能性幹細胞に初期化する。さらに他の実施形態では、１つ又は複数のｉＰＳＣは初期化された成体幹細胞を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、多能性細胞を産生する方法は、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターに含まれる、１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターを非多能性細胞に導入することを含む、多能性細胞を産生する方法は、１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数の更なるポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することをさらに含む。
【００２１】
一部の他の実施形態では、多能性細胞を産生する方法は、（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを導入することと、（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを導入することとを含む。一部の実施形態では、多能性細胞を産生する方法は、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数の使用を除外する。一部の実施形態では、前記方法における１つ又は複数のポリヌクレオチドは、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含むベクターのうちの少なくとも１つによって導入される。一部の他の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、以下のベクター：（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つのベクターとによって導入される。上記方法の一部の実施形態では、１つ又は複数のベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットをもつベクター系、又はｍＲＮＡによって導入する。特定の一実施形態では、ベクターは、センダイウイルスによって導入する。
【００２２】
本発明の別の態様は、非多能性細胞を多能性細胞に初期化することに関する混合物を提供する。一実施形態では、混合物は１つ又は複数の非多能性細胞を含むものであって、該非多能性細胞が、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドとを含む。一実施形態では、混合物は１つ又は複数の非多能性細胞を含むものであって、該非多能性細胞が、（ｉ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターがＯＣＴ４、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１及び／もしくはＮＡＮＯＧをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、該１つ又は複数のベクターを含み、また非多能性細胞が、（ｉｉ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターがＣＤＨ１、ＺＩＣ３、ＨＥＳＲＧ、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１及び／もしくはＤＮＭＴ３Ｂをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、該１つ又は複数のベクターをさらに含む。
【００２３】
初期化に関する混合物のさらに別の実施形態では、非多能性細胞は、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含む該１つ又は複数のベクターを含む。初期化に関する混合物の一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターを含む非多能性細胞は、１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数の更なるポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２４】
初期化に関する混合物のさらに別の実施形態では、非多能性細胞は、（ａ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである該１つ又は複数のベクターを含み、また非多能性細胞は、（ｂ）１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである該１つ又は複数のベクターをさらに含む。
【００２５】
特定の一実施形態では、この発明は、１つ又は複数の核酸であって、各核酸が（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉ）ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｖ）ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｖ）ＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｖｉ）ＨＥＳＲＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｖｉｉ）ＣＤＨ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｖｉｉｉ）ＴＤＧＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｘ）ＤＰＰＡ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｘ）ＤＮＭＴ３ＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｘｉ）ＺＩＣ３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び（ｘｉｉ）Ｌ１ＴＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１つを含む、該１つ又は複数の核酸を提供する。
【００２６】
一実施形態では、核酸は、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００２７】
別の実施形態では、核酸は、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００２８】
別の実施形態では、核酸は、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００２９】
別の実施形態では、核酸は、ＣＤＨ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＺＩＣ３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及びＨＥＳＲＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００３０】
別の実施形態では、核酸は、Ｌ１ＴＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＤＰＰＡ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及びＴＤＧＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００３１】
別の実施形態では、核酸は、ＤＮＭＴ３ＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様は、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞（multipotent cell）、寡能性細胞（oligopotent cell）、単能性細胞（unipotent cell）又は最終分化細胞（terminally differentiated cell）である。一実施形態では、細胞は、非多能性細胞である。別の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、前駆細胞である。一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、前記細胞は、外因性のＳＯＸ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのうちの１つ又は複数を含まない。
【００３３】
本願の一態様は、多能性細胞を産生することに関するキットを提供し、該キットは、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含むものである上記１つ又は複数のベクターを含む。代替的な実施形態では、キットは、（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドとを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書に開示するキットは、１つ又は複数のベクターであって、各ベクターが（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｖｉ）ポリヌクレオチドをコードする、ＣＤＨ１ｇ、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの少なくとも１つ、又は、（ｖｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである上記１つ又は複数のベクターを含む。一部の実施形態では、上記１つ又は複数のベクターを含むキットは、１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数の更なるポリヌクレオチドをさらに含む。
【００３５】
さらに一部の他の実施形態では、キットは、（ａ）（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも２つのＯＣＴ４、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ、（ｉｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＣＡＴ１及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＵＴＦ１、又は、（ｖ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＯＣＴ４、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＥＳＲＲＢ及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＮＡＮＯＧ、を含むものである１つ又は複数のベクターと、（ｂ）（ｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＣＤＨ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＺＩＣ３及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＨＥＳＲＧ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＬ１ＴＤ１、ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＰＰＡ４及びポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＴＤＧＦ１、又は、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのＤＮＭＴ３Ｂ、を含むものである１つ又は複数のベクターとを含む。一部の実施形態では、キットのベクターは、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、前記キットが、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、以下のベクター：（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのうちの少なくとも１つのベクターとを含む。一部の実施形態では、キットのベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって運ばれる。一部の実施形態では、キットのベクターは、センダイウイルスによって運ばれる。
【００３６】
この発明の別の態様は、初期化組成物を提供するものであって、該初期化組成物は、（ａ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドと、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のペプチドとをコードするものである１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、（ｂ）（ｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１と、（ｉｉ）ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１とからなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記初期化組成物の１つ又は複数のポリヌクレオチドが、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含む少なくとも１つのベクターに含まれる。一部の他の実施形態では、初期化組成物は、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのうちの少なくとも１つとを含む。一部の実施形態では、初期化組成物内のベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって運ばれる。一部の実施形態では、初期化組成物内のベクターは、センダイウイルスによって運ばれる。
【００３７】
この発明の更なる態様は、非多能性細胞を初期化する方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することと、（ｂ）ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することと、それによって多能性細胞を取得することとを含む。一部の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入されるものであり、該１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードし得る。一部の実施形態では、上記方法のベクターが、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、を含む少なくとも１つのコンストラクトを含む。一部の他の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、以下のベクター：（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つのベクターとを介して導入する。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、プラスミド、ミニサークル、又はｍＲＮＡによって導入する。一部の特定の実施形態では、ベクターは、センダイウイルスによって導入する。
【００３８】
この発明の別の態様は、センダイウイルスを用いて非多能性細胞を初期化する方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することと、（ｂ）ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することと、それによって多能性細胞を取得することとを含む。一部の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクターによって導入し、該１つ又は複数のポリヌクレオチドは、同一又は異なるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ベクターが、（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数、を含むものであるコンストラクトを含む。一部の他の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、以下のベクター：（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つのベクターとを介して導入する。
【００３９】
この発明のさらに別の態様は、センダイウイルスを用いて非多能性細胞を初期化する方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｏｃｔ４と、任意にＫｌｆ、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＥＳＲＲＢのうちの１つ又は複数とをコードするポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入することと、（ｂ）（ｉ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１のうちの一方又は両方をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１のうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧのうちの１つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、を含むコンストラクトのうちの１つを非多能性細胞に導入することと、それによって多能性細胞を取得することとを含む。一部の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、以下のベクター：（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ及びＯｃｔ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｂ）ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（ｃ）Ｌ１ＴＤ１、ＤＰＰＡ４及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに（ｄ）ＣＤＨ１、ＺＩＣ３及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、のうちの少なくとも１つのベクターとを介して導入する。
【００４０】
様々な特定の実施形態で、この発明は、非多能性細胞を初期化することによって１つ又は複数の多能性幹細胞を取得することを含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供する。さらに特定の実施形態では、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することは、１つ又は複数の非多能性細胞をＷｎｔ経路アゴニストに接触させることを含むものであって、任意にＷｎｔ経路アゴニストはＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＴＧＦβＲ阻害剤であり、またＲＯＣＫ阻害剤であってもよい。上記した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培地中で、１つ又は複数の多能性幹細胞を培養することと、それによって基底状態のｉＰＳＣを産生することとをさらに含む。関連の特定の実施形態では、細胞培地はＷｎｔ経路アゴニストを含むものであって、任意にＷｎｔ経路アゴニストはＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤である。さらなる或る実施形態では、１つ又は複数の多能性細胞を、フィーダーフリー環境で培養する。さらなる実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの集団を含む。特定の実施形態では、ｉＰＳＣの集団は、均質なｉＰＳＣの集団である。
【００４１】
本明細書に提供する方法及び組成物の特定の実施形態では、多能性細胞の集団のうち少なくとも９５％が、ＳＳＥＡ４−ＦＩＴＣ及びＴＲＡ１−８１又はＴＲＡ１−６０を発現する。さらなる実施形態では、細胞培地中で多能性細胞を培養することにより、培養細胞の自然分化が低減する。
【００４２】
一実施形態では、培養細胞内の１つもしくは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養した多能性細胞内の１つ又は複数の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低減するものであって、該分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ、ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（ブラキウリ）及びＺＩＣ３からなる群から選択する。別の実施形態では、１つ又は複数の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２及びＴＵＪ１からなる群から選択する。
【００４３】
或る実施形態では、細胞培地中で多能性細胞を培養することが、基底状態の多能性を維持又は誘導する。特定の実施形態では、少なくとも５継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の基底状態の多能性を維持する。或る特定の実施形態では、少なくとも１０継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の基底状態の多能性を維持する。さらに特定の実施形態では、少なくとも５０継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の基底状態の多能性を維持する。さらなる特定の実施形態では、少なくとも１００継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の基底状態の多能性を維持する。
【００４４】
様々な実施形態で、上述の方法は、継代中に、１つ又は複数の多能性細胞を解離（dissociating）させることをさらに含む。或る実施形態では、継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の生存能を維持する。
【００４５】
或る特定の実施形態では、この出願で提供する方法によって取得した１つ又は複数の多能性細胞は、正常な核型を含む。
【００４６】
さらに或る実施形態では、少なくとも１０継代の間、１つ又は複数の多能性細胞のゲノム安定性を維持する。或る関連の実施形態では、少なくとも５０継代の間、１つ又は複数の多能性細胞のゲノム安定性を維持する。或る他の実施形態では、少なくとも１００継代の間、１つ又は複数の多能性細胞のゲノム安定性を維持する。
【００４７】
様々な実施形態で、本発明は、（ａ）フィーダー細胞の存在下で培養された１つ又は複数の多能性細胞を単離することと、（ｂ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意にＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤である該Ｗｎｔ経路アゴニストを含む化学的に既知組成の細胞培地中で上記１つ又は複数の多能性細胞を培養することであって、該培地はＴＧＦβＲ阻害剤を含まないこととを含む、フィーダーフリー培養に多能性細胞を順応させる方法を、一部意図している。
【００４８】
様々な特定の実施形態で、本発明は、（ａ）１つ又は複数の多能性細胞を酵素処理して、単一細胞の多能性細胞を継代することと、（ｂ）フィーダーフリー環境で単一細胞の多能性細胞を培養することと、（ｃ）Ｗｎｔ経路アゴニストを含むものであって、任意に限定するものではなくＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤である該Ｗｎｔ経路アゴニストを含む化学的に既知組成の細胞培地中で上記単一細胞の多能性細胞を培養することとを含む、単一細胞として酵素的に継代される多能性細胞を培養する方法を、一部意図している。一部の実施形態では、上記培地は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない。
【００４９】
様々な或る実施形態で、本発明は、（ａ）フィーダーフリー環境で１つ又は複数の多能性細胞を培養することと、（ｂ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意にＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤である該Ｗｎｔ経路アゴニストを含む化学的に既知組成の細胞培地中で上記１つ又は複数の多能性細胞を培養することであって、該培地はＴＧＦβＲ阻害剤を含まないこととを含むものである、１つ又は複数の多能性細胞の自然分化を低減する方法を、一部意図する。
【００５０】
種々のさらなる実施形態で、本発明は、（ａ）１つ又は複数の非多能性細胞を取得することと、（ｂ）上記１つ又は複数の非多能性細胞を、多能性状態に初期化することと、（ｃ）ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培地中で多能性細胞を培養することと、それによって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生することとを含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を、一部意図する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図１は向上した初期化とｈｉＰＳＣ維持とのための多段階培養プラットフォームの結果を示す。（Ａ）レンチウイルスで産生したｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４中で均質な未分化細胞集団を維持し、一方ＳＭＣ４で培養したレンチウイルスで産生したｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６で、自然分化が確認された。形態（上方図）と、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１に関するフローサイトメトリー（下方図）とで示すように、ＦＴｉ０９６は、３継代の間ＦＭＭに移行させた場合、自然分化は最小化した。（Ｂ）ウイルスエレメントＷＰＲＥの導入遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、レンチウイルス感染後４日目（感染後４日目（Day 4 P.I.））の、親繊維芽細胞株のＷＰＲＥ発現に対する相対値とした。非感染の繊維芽細胞株（繊維芽細胞）とヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９とを、陰性対照として用いた。各セットの値は、棒グラフの上に示している。（Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子フリーのレンチウイルス誘導ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１集団における種々の培地組成物の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（−ＴＧＦβＲｉ）を除去したもの、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬに増加させたもの、１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを加えたもの。（Ｄ）繊維芽細胞株を、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、種々の培地（従来法による培地はＣｏｎｖ．とする）に分割して、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１である２つの陽性集団に選別した。選別ゲートを青色で協調している。各セットを、さらに１０日間それぞれの培地で培養したが、ＳＭＣ４セットに関してはＦＭＭとＳＭＣ４とに分割した点が異なる。２７日目に、培養をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１である２つの陽性集団に再度選別し、選別事象の正規化した密度で播種し、さらに９日間、それぞれの培地で維持した。従来法による培養セットのゲーティングは、正規化した細胞数に達するように拡大した。３６日目、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現に関して、各培養を染色した。セット毎に、代表的な免疫細胞学的な画像を右図に示している。（Ｅ）（Ｄ）で述べたように染色した３６日目のコロニー計数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭへのものと、ＦＲＭとに関してはトリプリケート（３回測定）を示し、ＦＭＭ及びｈＥＳＣに関してはデュプリケート（２回測定）を示している。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【００５２】
【図２Ａ】図２は、エピソームにより初期化した個々のｈｉＰＳＣを、クローン増殖用の９６ウェルプレートに効率よく選択及び播種することを示している。（Ａ）エピソームでの誘導、多段階培養プラットフォーム、フローサイトメトリー選別及びクローン増殖を示した経時的な概略図。（Ｂ）トランスフェクション後の図示した日数での、ＦＦ培養でＦＲＭ中に維持されてＦＭＭに移行される（Ａで概説）、エピソームで誘導した初期化のフローサイトメトリープロファイル。親系統（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１−８１＋／ＣＤ３０＋の集団）毎に用いた選別ゲーティング戦略を、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する、９６ウェルプレートのうちのウェルの割合（パーセント）を表した下方のヒストグラム図に対応するそれぞれの色で示している。複数のクローン又は分化したクローンを含有するウェルは、数値化しなかった。実線は、全誘導のうちの平均百分率を表し、破線は、標準偏差を表す。（Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下での従来法による培地中で維持した、トランスフェクション後１９日目の、初期化のために誘導されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。この誘導された集団は、（Ｂ）のＦＴＣ００７の同一集団から得たが、その後は異なる培養で処理した。（Ｄ）９６ウェルプレート中の選別コロニーの種々の多能性マーカーの免疫細胞学的分析。各図右下の図は、ＤＡＰＩ染色を示す。（Ｅ）ウェル当たり３細胞で、９６ウェルプレートに直接選別（ＦＡＣＳ）したＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０のウェル毎のＮＡＮＯＧ発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ。発現の範囲は、凡例に記載するように、Ｈ１ヒトＥＳＣと比較して０倍から４倍の間であり、ＧＡＰＤＨに対して正規化されている。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【００５３】
【図３Ａ】図３は、エピソームにより初期化したｈｉＰＳＣクローンが、それらの未分化状態を維持しており、導入遺伝子配列を含んでいないことを示している。（Ａ）単一細胞継代の２４時間後の、ｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表図。（Ｃ）種々のｈｉＰＳＣクローン由来のエピソーマルＤＮＡに関するＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７−ｃ１  ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７−ｃ２１  ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６−ｃ２５  ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６−ｃ３６  ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７−ｃ１１  ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７−ｃ１４  ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７−ｃ１７  ｐ６（陽性対照として用いるエピソーマルコンストラクトを維持する株）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトにより産生されたｈｉＰＳＣ（相互汚染に対する対照として機能する）；レーン１０、陽性対照として用いるエピソーマルベクター。全てのセットに対して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを入れ、ＰＣＲサイクルを３５とした。（Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１−８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光法で検出した多能性マーカー。（Ｅ）種々の親株よりの選択されたｈｉＰＳＣクローンに関するフローサイトメトリープロファイル。上段のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１の細胞表面発現である。下段のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧの細胞内発現である。（Ｆ）内在性多能性遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して正規化され、ＨＵＥＳ９  ｈＥＳＣに対する相対値とした。ＫＬＦ４の発現量では、２つのデータポイントがＨＵＥＳ９より１５倍大きいため、グラフの上に記載した。エラーバーは、デュプリケート（２回測定）の標準偏差を表す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【図３Ｆ】同上。
【００５４】
【図４Ａ】図４は、単一細胞かつＦＦでの連続培養中、ゲノム安定性と多能性とが維持されることを示している。（Ａ）ＦＦかつ単一細胞の培養で維持した、種々のｈｉＰＳＣクローンからのＧ分染法による２０〜４０の分裂中期細胞における細胞遺伝学的分析。（Ｂ）ＦＦかつ単一細胞の培養で長期継代（２５〜３０継代）したｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（Ｃ）３〜４日目のＦＴＣ０１７−ｃ１１の定方向分化。（Ｄ）３細胞系統（trilineage）への分化を示す、ｈｉＰＳＣクローンの胚様体の形成及び分化。免疫細胞学的分析を分化の２８日後に行った：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７−ｃ２１及びＦＴＣ０１６−ｃ２５由来の、テラトーマの組織学的切片。黒色矢印が内胚葉を、白色矢印が外胚葉を、灰色矢印が中胚葉を指す。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【００５５】
【図５Ａ】図５は、最少数の初期化因子でのｈｉＰＳＣクローンの誘導を示す。（Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、種々の形式でｐＣＥＰ４にクローニングした。表に、ベクター系及び略語を表している。（Ｂ）誘導の１３日後の、種々の遺伝子組み合わせによって誘導した初期化の反応速度についてのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１のフローサイトメトリープロファイル。初期化因子の化学量論の効果は、ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ（０．１％：１．０３％）を用いて初期化効率を比較すること；２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（１．０３％：３．５３％）；２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（０．５８％：３．５３％）；ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔを比較すること（０．６％：１．０３％）；ＯＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（０．０６％：０．５８％）によって示した。（Ｃ）ウェル当たり３細胞及び９細胞で、９６ウェルプレートのウェル中に存在するＴＲＡ１−８１陽性ｈｉＰＳＣクローンを表す効率ヒストグラム。（Ｄ）種々のｈｉＰＳＣクローン由来のエピソーマルＤＮＡに関するＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ−ｃ７  ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ−ｃ１０  ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ−ｃ５  ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ−ｃ９  ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ−ｃ７  ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ−ｃ９  ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトにより産生したｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として用いたエピソーマルベクター。全てのセットに対して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを入れ、ＰＣＲサイクルを３５とした。（Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ由来のクローン９の形態。（Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１−８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光法で検出した多能性マーカー。画像は倍率１０×で撮影した。（Ｇ）選択された遺伝子セット由来のｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上段のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１の細胞表面発現である。下段のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧの細胞内発現である。（Ｈ）誘導の概ね７２〜９６時間後での選択されたｈｉＰＳＣクローンの定方向分化。（Ｉ）ＦＦかつ単一細胞の培養で維持した、種々のｈｉＰＳＣクローンからのＧ分染法による分裂中期細胞の細胞遺伝学的分析。（Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ−ｃ１０由来の、テラトーマ組織学的切片。左図は内胚葉、中央図は中胚葉、右図は外胚葉である。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図５Ｇ】同上。
【図５Ｈ】同上。
【図５Ｉ】同上。
【図５Ｊ】同上。
【００５６】
【図６Ａ】図６は、ＦＭＭ中での最小限因子のエピソームで誘導したｈｉＰＳＣについての相対的な遺伝子発現プロファイルを示している。ヒートマップは、従来法により維持したｈｉＰＳＣ株、従来法により維持したＨ１  ｈＥＳＣ、及び、ＦＭＭ中で維持した種々の遺伝子の組み合わせを用いて誘導したエピソーマルｈｉＰＳＣ株についての、多能性（Ａ）遺伝子及び分化（Ｂ）遺伝子の相対遺伝子発現量（ＲＱ）を示す、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ｄｙｎａｍｉｃ  ａｒｒａｙより得た結果である。株ごとの相対遺伝子発現量を、各マス内に記載し、凡例（下方右）にまとめた３つの発現量に基づいて、色分けした。全てのセットがデュプリケート（２回測定）で実行され、２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１）の平均発現量に対して正規化され、１×の値を表す６つの対照である従来法による株（ＭＥＦ上のＯＳＫ  ｈｉＰＳＣ及びＨ１  ｈＥＳＣ）の中央発現量を基準とした。
【図６Ｂ】同上。
【００５７】
【図７Ａ】図７は、ＦＭＭで維持したｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の発現を低減し、かつ、基底状態を表すことを示している。（Ａ）合計で３３９プローブセットが、従来法による培養とＦＭＭ培養とで、２．５倍上がって又は２．５倍下がって変動的に発現した。ユークリッド距離測定に基づいた完全連結法を用いた、３３９プローブセットについての階層クラスタリング。（Ｂ）従来法による培養（ＦＭＭ培養と比較）で２．５倍以上上方制御された、２１３プローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセスエンリッチメント解析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（Ｃ）基底又は準安定の多能性状態のものを表す遺伝子一覧。一覧は、文書に記載した基準に由来する。（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づいた完全連結法を用いた、（Ｃ）の遺伝子に対応する２３１プローブセットについての階層クラスタリング。（Ｅ）（Ｃ）の遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左図は、基底状態の３９プローブセットを表し、右図は、準安定状態の１８８プローブセットを表す。従来法による培養の平均強度レベルをＸ軸にプロットし、一方ＦＭＭ／ＳＭＣ４の平均強度をＹ軸にプロットし、実線は等発現量を示している。（Ｆ）アフィメトリクス社（Affymetrix）のプローブセットを用いた、従来法による培地培養で誘導及び培養したｈｉＰＳＣクローンと、ＳＭＣ４培養に順応させた対応するものとでの、Ｘ染色体が位置する遺伝子の発現量の比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットを強調している。（Ｇ）ＦＭＭ中で維持したｈｉＰＳＣクローン、又は、５継代の間従来法による培養に順応させたｈｉＰＳＣクローンにおけるＨＥＫ２７ｍｅ３の代表図。左図の破線矢印は、代表的なＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色陰性の核を指し、一方右図の実線矢印はＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色陽性の核を指す。各図の左下に、核陽性染色の百分率を示している。ＦＭＭ培養細胞の方が、核が大きい。縮尺バーは、５０μｍである。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図７Ｅ】同上。
【図７Ｆ】同上。
【図７Ｇ】同上。
【００５８】
【図８Ａ】図８は、ＦＲＭ及びＦＭＭでのエピソーム誘導初期化を示す。（Ａ）初期化用プールの１０日目のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１のフロープロファイル。（Ｂ）初期化中に確認された典型的なコロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションの１３日後に撮影した。（Ｃ）最初の１４日間をＦＲＭで維持した、エピソームで初期化した繊維芽細胞を、分割して、ＦＲＭ中で維持するか又はＦＭＭに切り替えるようにした。トランスフェクションの２１日後に、初期化培養をその後、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０に関して選別し、分析前にさらに１０日間、ＦＲＭ又はＦＭＭ中に維持した。（Ｄ）代表的なＦＲＭ又はＦＭＭでの培養の形態及びフロープロファイル。白色矢印は、未分化集団及び分化集団の混合物からなる、培養内の未分化細胞の範囲を指している。黒色矢印は、大部分が未分化である集団の鮮明な輪郭を指している。下方図は、代表的なフロープロファイルである。ＦＳＣとは前方・側方散乱（Forward Side Scatter）である。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【００５９】
【図９Ａ】図９は、種々の親株の初期化を示す。（Ａ）この試験に用いた開始細胞株の要約表。各株に関連する具体的な情報に加えて、エピソームでのトランスフェクション後の選別時点での、陽性であるＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０集団の割合（パーセント）を記載した。（Ｂ）ＣＤ３４を富化させた臍帯血細胞の選別及び培養を示す図。事前にバンクで維持されていた臍帯血０．５ｍｌ量を用いて、６５，０００個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋Ｌｉｎ−細胞を抽出し、それをエピソームによるトランスフェクション前の６日間、懸濁液中で培養した。
【図９Ｂ】同上。
【００６０】
【図１０Ａ】図１０は、初期化及び維持プロセス中のｈｉＰＳＣのキャラクタリゼーションを示している。（Ａ）単一細胞の９６ウェルプレート選別の３日後の典型的なコロニーの形態。縮尺バーは、４００μｍを表している。（Ｂ）種々の開始細胞よりの、選別の７〜９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。縮尺バーは、１０００μｍを表している。（Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現に関する免疫細胞学的分析。（Ｄ）マトリゲル又はビトロネクチンのいずれかで被覆した培養プレート上で、初期化を誘導され、維持された、ＦＴＣ００７の１６日目のフロープロファイル分析。（Ｅ）明視野画像。（Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧに関する免疫細胞学的分析。（Ｇ）連続的にマトリゲル上で又は５継代の間ビトロネクチン上で、ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６−ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１に関するフローサイトメトリー分析。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【図１０Ｆ】同上。
【図１０Ｇ】同上。
【００６１】
【図１１Ａ】図１１は、ＦＭＭ培養プラットフォームによる最小限の遺伝子の初期化の実施例を示す。（Ａ）ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソーマルコンストラクトでのトランスフェクションの２〜５日後に、ハイグロマイシンで処理した細胞の形態。（Ｂ）初期化用プールは、より長い期間維持し、トランスフェクションの１６日後にプロファイリングした。（Ｃ）マトリゲル上又はビトロネクチン上いずれかで維持した培養の外観。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【００６２】
【図１２Ａ】図１２は、多数の条件で培養したｈｉＰＳＣの特性を示している。（Ａ）多能性が明らかで、ゲノムの完全性を保持する、レンチウイルスで誘導かつＳＭＣ４で維持したＦＴｉ１１１。（Ｂ）ＦＴｉ１１１  ｐ４３の解凍戦略の図示。記載したように、１つのバイアルを、４つの培養環境に解凍する。生存培養物を、それぞれの培養で継代したが、フィーダー細胞上にチアゾビビン（thiazovivin）を添加した従来法による培養については、フィーダー細胞存在下でチアゾビビンなしの従来法による培養に移行し、凝集塊として継代したこと点が異なる。（Ｃ）解凍後、種々の培養において回復した細胞の形態。フィーダー細胞存在下でチアゾビビンなしの従来法による培養では、生存細胞が確認されなかった。（Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きいコロニー形態は、従来法による培養と関係していた。縮尺バーは、１０００μｍである。（Ｅ）各培養セットの内在性多能性遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、Ｈ１  ｈＥＳＣに対する相対値とした。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１２Ｅ】同上。
【００６３】
【図１３Ａ】図１３は、種々の条件で培養したｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す。（Ａ）全ての遺伝子発現試験において記載している各株の誘導及び維持について記載した表。（Ｂ）合計で３００プローブセットが、従来法による培養条件と小分子の培養条件とで（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）、２．５倍上がって又は２．５倍下がって変動的に発現した。ユークリッド距離測定に基づいた完全連結法を用いた、３００プローブセットについての階層クラスタリング。（Ｃ）従来法による培養で２．５倍以上上方制御された（小分子培養との比較で）、１３３プローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセスエンリッチメント解析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（Ｄ）小分子培養で２．５倍以上上方制御された（従来法による培養との比較で）、１６７プローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセスエンリッチメント解析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（Ｅ）ＦＭＭ培養で２．５倍以上上方制御された（従来法による培養との比較で）、１２６プローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセスエンリッチメント解析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１３Ｅ】同上。
【００６４】
【図１４Ａ】図１４は、初期化に用いるレンチウイルスコンストラクト（Ａ〜Ｂ）及びエピソーマルコンストラクト（Ｃ〜Ｆ）の例を示したクローニングマップを示す。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーターと、ＣＲＥによる導入遺伝子の切り出しのためのＬＯＸＰ部位とを含む。エピソーマルコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１４Ｄ】同上。
【図１４Ｅ】同上。
【図１４Ｆ】同上。
【００６５】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、８〜１５日目における種々の初期化因子の組み合わせに関する、代表的なフロー分析を示す。ヒト繊維芽細胞は、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１を含む、レンチウイルス介在初期化因子の種々の組み合わせにより導入された。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【００６６】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｄは、２１〜２７日目における種々の初期化因子の組み合わせに関する、代表的なフロー分析及びｉＰＳＣ形態特性を示す。データは、固有の初期化の組み合わせを用いてＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋ｈｉＰＳＣを誘導することが可能である、ということを示している。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【００６７】
【図１７Ａ】図１７Ａ及びＢは、フロー分析（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋及びＣＤ３０＋集団）とｉＰＳＣ形態特性とで示すように、レンチウイルスでの初期化効率が大きく向上したことを示している。ヒト繊維芽細胞は、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ及びＮＡＮＯＧにより初期化した。細胞は、ＦＲＭを用いて初期化し、ＦＭＭ中で維持した。
【図１７Ｂ】同上。
【００６８】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜Ｄは、９６ウェル選別後の７〜９継代後に樹立された４つのｉＰＳＣクローンの、代表的なフロー分析及び相画像を示している。クローンは、ＦＲＭで、レンチウイルス初期化因子（ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ及びＮＡＮＯＧ）により産生され、ＦＭＭ中で維持した。高度にＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を発現した集団が、多能性を示している。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【００６９】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｂは、レンチウイルス初期化因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより初期化したヒト繊維芽細胞内での、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現に関する代表的なフロー分析を示している。クローンは、ＦＲＭを用いて初期化し、ＦＭＭ中で維持した。ＯＣＴ４＋／ＮＡＮＯＧ＋を高度に発現する集団が、多能性を示している。
【図１９Ｂ】同上。
【００７０】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｃは、レンチウイルス初期化因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより初期化したヒト繊維芽細胞由来の、ｈｉＰＳＣクローンの核型分析を示している。クローンは、ＦＲＭを用いて初期化し、ＦＭＭ中で維持した。クローンは、正常な、男性核型を示した。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【００７１】
【図２１】図２１は、初期化因子の組み合わせＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２／ラージＴと比較した、初期化因子の組み合わせＯＣＴ４／ＥＳＲＲＢ／ＮＡＮＯＧ／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１の９６ウェルプレート選別における効率を示している。
【００７２】
【図２２Ａ】図２２Ａ及びＢは、（Ａ）４、６及び１１日目にＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ−Ｐ２Ａ−ＥＳＲＲＢ−Ｔ２Ａ−ＬＩＮ２８／ＥＣＡＴ１−Ｔ２Ａ−ＵＴＦ１により、また（Ｂ）７日目に２ウェル、１０日目に１ウェルに対して、ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＥＳＲＲＢ／ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＮＡＮＯＧ／ＥＣＡＴ１−Ｔ２Ａ−ＵＴＦ１により初期化した細胞の、９６ウェルのうちの増殖中のコロニーの画像を示している。
【図２２Ｂ】同上。
【００７３】
【図２３Ａ】図２３は、（Ａ）異所ＯＣＴ４発現を伴う細胞の選択に関する、初期化因子の化学量論の効果と、遺伝子マーカーの使用とを実証するフロー分析の結果の要約と、（Ｂ）ＯＣＴ４選択なしに、エピソーマルＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＮＡＮＯＧ−Ｔ２Ａ−ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原により初期化したヒト繊維芽細胞に関するフロー分析と、（Ｃ）エピソーマルＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＮＡＮＯＧ−Ｔ２Ａ−ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原／ＯＣＴ２−Ｐ２Ａ−ＯＣＴ４−プロマイシンにより初期化したヒト繊維芽細胞のフロー分析とを示している。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【００７４】
【図２４】図２４は、ＣＲＥによる切り出し後の、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋／ＣＤ３０＋の９６ウェルプレートに選別されたクローンの画像を示している。コロニーは、ヒト繊維芽細胞由来のｉＰＳＣクローンから選別し、レンチウイルス因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより初期化し、その後導入遺伝子を切り出した。選別したコロニーは、ｉＰＳＣの表現型を示す。
【００７５】
【図２５】図２５は、早くも７日目に、センダイウイルスベクターＮＡＮＯＧ−Ｐ２Ａ−ＥＳＲＲＢ−Ｔ２Ａ−ＯＣＴ４（ＮＥＯ）及びＣＤＨ１−Ｐ２Ａ−ＺＩＣ３−Ｔ２Ａ−ＨＥＳＲＧ（ＣＺＨ）の組み合わせが、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１８１陽性である細胞集団を効率的に産生した、ということを示している。
【００７６】
【図２６】図２６は、ｉＰＳＣマーカーＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋の発現に関する、トランスフェクションの７日後のフローサイトメトリー分析を示しており、（Ａ）ではＯｃｔ４、Ｋｌｆ及びＳｏｘ２のみを含有し、（Ｂ）ではＥｃＵを添加し、（Ｃ）ではＬＤＴ１を添加し、（Ｄ）ではＣＺＨを添加した、これら各初期化因子を含有するセンダイウイルスベクターを用いた、繊維芽細胞のｉＰＳＣへの初期化を示している。
【００７７】
【図２７】図２７は、ＯＫＳと、ＯＯ、ＥｃＵ、ＮＥＯ、ＣＺＨ及びＬＤＴ１を含む更なる因子のうちの１つとの組み合わせによる繊維芽細胞の初期化における、ｉＰＳＣマーカーＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋の発現に関する、トランスフェクションの２０日後のフローサイトメトリー分析を示している。
【００７８】
【図２８】図２８は、０日目と７日目において各因子の組み合わせの２重の形質導入により初期化した、２５日目の細胞で検出されたｉＰＳＣマーカーＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
Ａ．概略
多能性細胞の産生及び維持に関する既存の方法は、自然分化を含まず高分解能（high-resolution）／高クローン性の単一細胞継代及び大規模増殖に従う、フットプリントフリーである多能性細胞の均質培養を未だ実現できていない。基底状態の多能性細胞は、これら課題を解決する品質及び特性を与えることができる。しかしながら、今日まで、フィーダーフリー条件下での基底状態の多能性細胞を、高い生産性で産生する、信頼性があり頑健である方法は、存在してない。すなわち、この技術分野における既存の方法は、産業グレード又は臨床グレードの多能性細胞の産生に好適ではあり得なかった。本明細書で意図する発明では、基底状態の多能性の特性における又は該特性を伴う、安定な多能性細胞の頑健な産生の必要性に対処し、産業的使用及び臨床的使用に好適である安定な多能性細胞の作製における課題を解決する。
【００８０】
概して、この発明は、改良した多能性細胞作製に関する組成物及び方法に関し、特に、自然分化を低減した、基底状態の多能性細胞を含む。より詳細には、この発明は、段階特異的な方法で、細胞間シグナル伝達経路の小分子調節因子を利用するため、培養方法及び多能性細胞の誘導方法が、もはや変異性及び／又は下流での使用に関してゲーティング作用の原因とならない程度まで多能性細胞を誘導及び維持させることができる、多段階培養プラットフォームに関する。さらに、本明細書で意図する培養プラットフォームは、ゲノム安定性が改良され、未分化状態が改良され、自然分化が低減され、培養均質性が改良され、単一細胞の多能性細胞の培養、解離及び継代における生存性が改良され、ならびに、導入遺伝子フリー又はフットプリントフリーである、細胞を基底状態の多能性に初期化する方法が改良された、フィーダーフリー条件下での多能性細胞の誘導及び維持を可能にする。このため、本明細書で意図する組成物及び方法により、産業的及び臨床的使用に適した多能性細胞及び／又は基底状態の多能性細胞を作製することができる。
【００８１】
今日まで、フットプリントフリーで誘導される、ヒト細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の初期化を促進し、単一細胞かつＦＦでの培養を支持する能力を示す小分子駆動のプラットフォームはなかった（Nichols and Smith, 2012）。本明細書で意図する培養プラットフォームは、部分的に、段階特異的な手法で特定の組み合わせの小分子阻害剤を添加することを提供し、多能性幹細胞の、素早く頑健な初期化及び安定した長期間の培養を可能にする。様々な実施形態で、基底状態の多能性を含む、改良した未分化多能性状態を誘導又は維持する培養プラットフォームを提供する。本明細書で意図するプラットフォームは、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）における基底状態の多能性を産生及び維持する、頑健な培養系も提供する。一実施形態では、該培養プラットフォームが、導入遺伝子フリー又はフットプリントフリーの初期化方法を可能にする。特定の実施形態では、本明細書で意図するプラットフォームは、導入遺伝子フリーのｈｉＰＳＣの多段階での誘導及び維持における重要な課題を解決するような、改良したｉＰＳＣの作製方法を示す。
【００８２】
本発明の実施では、特別に異なることを説明しない限りは、この技術分野の範囲内の、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコル、細胞培養及び遺伝子導入の生物学の従来の方法を採用するものとし、その多くは説明の目的のために以下に記載している。かかる技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)を参照のこと。
【００８３】
本明細書で引用した全ての公報、特許及び特許出願は、その全体を参照することによってここに組み入れられるものとする。
Ｂ．定義
【００８４】
別に規定していない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同様の意味を有する。本発明のために、以下の用語を以下で規定する。
【００８５】
冠詞“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、本明細書では、冠詞の文法上の対象のうちの１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために用いる。例としては、“要素（ある要素）”は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００８６】
択一（例えば、「又は（or）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方又は任意のそれらの組み合わせのうちのいずれかを意味するということを理解されたい。
【００８７】
用語「及び／又は」は、選択肢のうちの１つ又は両方のいずれかを意味するということを理解されたい。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「約」又は「概ね」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さと比べて１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％程度異なる、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さをいう。一実施形態では、用語「約」又は「概ね」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの前後±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％又は±１％である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの範囲をいう。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に」又は「本質的に」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さと比べて約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さをいう。一実施形態では、用語「本質的に同一」又は「実質的に同一」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さとほぼ同一である、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重量又は長さの範囲をいう。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「〜を実質的に含まない（実質的にフリーである）」又は「〜を本質的に含まない（本質的にフリーである）」は区別なく使用し、例えば細胞集団又は培地である組成物の記載に用いる場合、特定の物質を含まない組成物、例えば特定の物質を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、又は従来の手段の測定で検出不可能であるような組成物をいう。同様の意味を、用語「〜の欠如」に適用することができ、それは特定の物質又は組成物の成分の欠如をいう。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「明らかな」は、１つもしくは複数の標準的な方法によって難なく検出することができる、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲や事象をいう。用語「明らかでない」及びその均等物は、標準的な方法によって難なく検出することができない又は検出不可能な、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲や事象をいう。一実施形態では、ある事象の発生が５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又はそれ未満の割合であれば、それは明らかでない事象である。
【００９２】
本明細書を通して、別の解釈が必要な文脈でない限り、「備える（含む）」及び「備えた（含んだ）」という文言は、記載されているステップ又は要素又はステップもしくは要素の群を包含するが、その他のステップ又は要素又はステップもしくは要素の群を除外しないことを示唆していると理解されるであろう。特定の実施形態では、用語「含む」、「有する」、 「含有する」及び「備える」は同義的に用いる。
【００９３】
「〜からなる」とは、「〜からなる」という句の前に記載したもの全てを含み、それに限定されることを意味する。そのため、「〜からなる」という句は、列記した要素が必要又は必須であり、他の要素は存在し得ないということを示唆する。
【００９４】
「本質的に〜からなる」とは、この句に前に列記した要素と、該列記した要素への開示において特定されている動作又は作用に対して介入又は寄与しないような他の要素に限定される要素とであるあらゆる要素を含むことを意味する。すなわち、「本質的に〜からなる」という句は、列記した要素を必要又は必須とするが、その他の要素は随意であって、列記した要素の動作又は作用にそれらが影響するか否かに応じて、存在してもよく又は存在しなくてもよい。
【００９５】
本明細書全体にわたって「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連の実施形態」、「或る実施形態」、「付加的な実施形態」もしくは「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせを参照することは、その実施形態に関連して記載した特定の特徴、構造又は特性を、本発明の少なくとも１つの実施形態に含むことを意味する。そのため、この明細書全体にわたって様々な箇所で上述の句が登場するが、必ずしも、全てが同一の実施形態を指すものではない。また、特定の特徴、構造又は特性は、１つ又は複数の実施形態で、任意の好適な方法において組み合わせることができる。
【００９６】
用語「生体外（ex vivo）」は、概して、好ましくは天然条件との違いを最小限にした有機体外の人工的な環境における生体組織内又は生体組織上で成される実験又は測定などである、有機体外で実行する活動をいう。特定の実施形態では、「生体外」手順は、有機体から取得し、通常無菌状態下で実験室の装置内において、典型的には数時間又は最大で約２４時間であるが、状況に応じて最大４８時間又は７２時間、培養した生体細胞又は組織を必要とする。或る実施形態では、かかる組織又は細胞は、回収して凍結させ、その後生体外処理のために解凍させることができる。生体細胞又は組織を用いる、数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「管内（in vitro）」とみなされるが、或る実施形態では、この用語を生体外と区別なく用いることがある。
【００９７】
用語「生体内（in vivo）」は、概して、有機体内で行われる活動をいう。
【００９８】
本明細書で用いる場合、用語「初期化（reprogramming）」又は「脱分化（dedifferentiation）」又は「細胞能力（cell potency）の増加」又は「発生能（developmental potency）の増加」は、細胞の能力を増加させる方法又は細胞を低分化状態に脱分化させる方法をいう。例えば、増加した細胞能力を有する細胞は、非初期化状態にある同一細胞と比較して、発生上の可塑性がより高い（すなわち、より多くの細胞型に分化可能）。すなわち、非初期化状態にある同一細胞よりも低分化状態である細胞が、初期化細胞である。
【００９９】
本明細書で用いる場合、用語「能（能力）」は、細胞に利用可能である発生上の選択肢（すなわち、発生能）の全てをあわせたものをいう。当業者は、細胞能力が、最も可塑性が高い細胞である、最も高い発生能を有する全能性幹細胞から、最も可塑性が低い細胞である、最も低い発生能を有する最終分化細胞の範囲に及ぶ連続するものであるということを認識しているであろう。一連の細胞能力は、全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、寡能性細胞、単能性細胞及び最終分化細胞を含むが、これに限定されない。 
【０１００】
本明細書で用いる場合、用語「多能性」は、肉体又は細胞体の全ての系統（すなわち、胚そのもの）を形成する細胞の能力をいう。例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell）は、３胚葉である、外胚葉、中胚葉及び内胚葉のそれぞれから、細胞を形成することができる多能性幹細胞の型である。
【０１０１】
多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することによって判断することができる。多能性特性には、限定するものではないが、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無限自己複製の可能性、（ｉｉｉ）限定するものではないがＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４；ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１−６０／８１；ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含む、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３体細胞系（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の全てに分化する能力、（ｖ）３体細胞系からなるテラトーマ形成、及び（ｖｉ）３体細胞系からの細胞からなる胚様体の形成が含まれる。
【０１０２】
２種類の多能性である、後期の胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似である、「初回刺激を受けた」状態の多能性又は「準安定」状態の多能性、及び、初期／着床前の胚盤胞の内細胞塊に類似である、「ナイーブ」状態の多能性又は「基底」状態の多能性について先に述べた。該多能性の状態はいずれも、上記に記載した特性を呈するが、ナイーブ又は基底状態では、（ｉ）雌性細胞内のＸ染色体の事前の不活性化（preinactivation）又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存性の向上、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な低下、（ｉｖ）発生上の調節性遺伝子プロモーター上でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制型クロマチン標識の局在の低下、及び（ｖ）初回刺激を受けた状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現が低減すること、をさらに呈する。外因性多能性細胞を体細胞に誘導し、発現し、その後サイレンシングされるか又は得られた多能性細胞から除去されるという、細胞の初期化の標準的な方法論は、概して、初回刺激を受けた状態の多能性の特性を有するものと見られている。標準的な多能性細胞培養条件下では、かかる細胞は、基底状態の特性が観察されるものである外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、初回刺激を受けた状態のままである。
【０１０３】
本明細書で用いる場合、用語「多能性幹細胞形態」は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴をいう。正常な胚性幹細胞形態は、高いＮＣ比（nucleus-to-cytoplasm ratio）、核小体の顕著な存在、及び典型的な細胞間隙をもつ、球状の小さい形状によって特性決定される。
【０１０４】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子発現特性」、「遺伝子発現パネル」、「遺伝子パネル」又は「遺伝子特性」は、細胞又は細胞集団を他の細胞又は細胞集団と区別するように機能する、複数の遺伝子の発現又は発現レベルをいう。例えば、自然分化を防止するためにある培地中で維持する多能性細胞の集団は、同一の培地中に維持されていない同一起源の多能性細胞の対照集団と比較して、低減した分化遺伝子発現を含む遺伝子発現プロファイルを示し得る。
【０１０５】
本明細書で用いる場合、用語「分化マーカー遺伝子」又は「分化遺伝子」は、それが発現することにより、例えば多能性細胞などである細胞内で細胞分化が生じていることを暗示する遺伝子をいう。分化マーカー遺伝子は、以下の遺伝子を含むが、これに限定されない：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ、ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（ブラキウリ）及びＺＩＣ３。
【０１０６】
本明細書で用いる場合、用語「分化マーカー遺伝子プロファイル」又は「分化遺伝子プロファイル」、「分化遺伝子発現プロファイル」、「分化遺伝子発現特性」、「分化遺伝子発現パネル」、「分化遺伝子パネル」又は「分化遺伝子特性」は、複数の分化マーカー遺伝子の発現又は発現のレベルをいう。
【０１０７】
特定の実施形態では、自然分化の低減をみせる多能性細胞の集団は、分化マーカー遺伝子の発現又は分化マーカー遺伝子プロファイルにおける低減によって特性決定され得る。例えば、多能性細胞又は多能性細胞の集団における低減した自然分化は、所与のセットの培養条件が、１つ又は複数の分化マーカー遺伝子の発現が、同一の培養条件を欠いている対照の多能性細胞又は多能性細胞の集団の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の低減を引き起こしているということを暗示し得る。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、「遺伝子発現」は、例えば多能性細胞、又は多能性細胞を含む細胞集団である、生体サンプル中の遺伝子の相対的な発現レベル及び／又は発現パターンをいう。特定の実施形態では、多能性細胞はｉＰＳＣである。
【０１０９】
この発明の細胞を特徴付ける遺伝子の発現の検出に関してこの技術分野で利用可能な方法はいずれも、本明細書に包含されるものとする。本明細書で用いる場合、用語「発現を検出すること」は、遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の量又は存在を確認することを意味する。遺伝子の発現を検出する方法、すなわち、遺伝子発現プロファイリングには、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列に基づく方法、免疫組織化学による方法、及びプロテオミクスに基づく方法が含まれる。該方法は概して、関心の遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。一部の実施形態では、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weis et al., TIG 8:263-64, 1992）であるＰＣＲに基づく方法と、例えばマイクロアレイ（Schena et al., Science 270:467-70, 1995）であるアレイに基づく方法とを用いる。
【０１１０】
「接着（adhere）」は、容器に付着した細胞、例えば、適切な培地が存在する無菌のプラスチック（又は被覆プラスチック）細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着した細胞をいう。ある種の細胞は、細胞培養容器に接着していなければ、培養液中で維持されない又は成長しない。ある種の細胞（「非接着細胞」）は、接着することなしに、培養液中で維持される、及び／又は増殖する。
【０１１１】
「培養」又は「細胞培養」は、管内環境での、細胞の維持、成長及び／又は分化をいう。「細胞培地（培養培地）」、「培地（培養培地）」（いくつかの場合では単に「培地」）、「サプリメント」及び「培地サプリメント」は、細胞培養を育成する栄養成分をいう。
【０１１２】
「育成（培養）する（cultivate）」は、組織外又は体外にある細胞、例えば無菌のプラスチック（又は被覆プラスチック）細胞培養ディッシュ又はフラスコ中にある細胞を、維持すること、繁殖させること（増殖させること）及び／又は分化させることをいう。「育成（培養）」には、栄養、ホルモン及び／又は、細胞を繁殖ならびに／もしくは維持するのに役立つ他の因子の源として、培地が利用され得る。
【０１１３】
本明細書で用いる場合、「解離させた」細胞は、他の細胞又はある面（例えば、培養皿表面）から、実質的に離した又は精製した細胞をいう。例えば、機械的方法又は酵素的方法によって、動物又は組織から細胞を解離させることができる。あるいは、例えばクラスターの、単一細胞の、又は単一細胞とクラスターとの混合物の懸濁液に、酵素的又は機械的に解離させるなどによって、管内で凝集している細胞を、互いに解離させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、培養皿又は他の面から接着細胞を解離させる。そのため、解離により、細胞外基質（ＥＣＭ（extracellular matrix））及び培養基質（例えば、培地表面）との細胞相互作用を破壊すること又は細胞間におけるＥＣＭを破壊することに関与する場合がある。
【０１１４】
本明細書で用いる場合、用語「富化」及び「富化された」は、例えば細胞の組成物である組成物中の特定の成分の量を増加させることをいい、また「富化された」は、例えば細胞集団などである細胞組成物の説明に用いる場合には、細胞集団が、富化する前の細胞集団中のかかる成分の割合と比較して、特定の成分の量が相対的に増加することをいう。例えば、細胞集団などの組成物は、標的細胞型（すなわち、特定の特性を有する細胞）に関して富化されて、それによって標的細胞型の割合すなわちパーセントが、富化する前の細胞集団に存在する標的細胞の割合と比較して増加し得る。細胞集団は、この技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、ある標的細胞型を富化させることができる。一部の実施形態では、本明細書の実施例に記載する選別又は選択プロセスで、細胞集団を富化させる。特定の実施形態では、ある標的細胞集団に関して富化する方法は、該標的細胞集団に関して細胞集団を少なくとも約２０％に富化させるが、これは富化させた細胞集団が、該集団の富化前の集団中よりも、相対的に約２０％多い標的細胞型を含むことを意味する。一実施形態では、ある標的細胞集団に関して富化する方法により、標的細胞集団に関して、細胞集団を、相対的に少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％、もしくは少なくとも約９９．５％に富化させ、又は特定の実施形態では約９９．９％に富化させる。
【０１１５】
或る実施形態では、細胞集団は、多能性細胞の量又は多能性特性を示す細胞の量に関して富化される。この発明の特定の実施形態では、初期化しようとする細胞集団を、例えば、限定するものではないが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ３０又はＣＤ５０を含む多能性マーカーの発現である、多能性の特性を有する標的細胞に関して富化させる。
【０１１６】
特定の実施形態では、例えば初期化しようとする細胞集団である細胞集団は、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６又はＣＤ７を含み得る、分化した細胞系統又は非多能性細胞に対して特異的な表面マーカーを用いて、非多能性細胞が枯渇される。したがって、得られる細胞集団は、多能性細胞に関して富化させた細胞集団とみなすことができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、富化させた細胞はそれぞれ、異なる遺伝子又はタンパク質の発現プロファイル、例えばＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ３０及びＣＤ５０などである少なくとも２つの多能性マーカーの細胞表面発現を含む。一部の実施形態では、富化させた細胞は、２つ以上の多能性マーカーを含む。特定の実施形態では、富化させた細胞は、ＴＲＡ−１８１又はＴＲＡ−１６０のいずれかとの組み合わせにおいてＳＳＥＡ４を発現する。さらに特定の実施形態では、富化させた細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１及びＣＤ３０を発現する。一実施形態では、細胞集団は、例えば多能性細胞などである富化させた細胞を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％含む。
【０１１８】
このため、一部の実施形態では、細胞集団を多能性細胞に関して富化させる方法には、例えばＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ３０及びＣＤ５０である多能性マーカーの細胞表面発現に基づいて細胞集団を選別することと、該マーカーを発現する細胞のフラクションを回収して、多能性細胞に関して富化された細胞集団を取得することとを含む。他の実施形態では、細胞集団は、例えばＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６及びＣＤ７などの、分化する細胞又は分化した細胞のマーカーの細胞表面発現に基づいて細胞集団を選別することと、かかる細胞の細胞集団を枯渇させて、多能性細胞に関して富化された細胞集団を取得することとによって、多能性細胞に関して富化される。特定の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１３の発現に基づいて選別し、細胞集団からＣＤ１３＋細胞を除去して、多能性細胞に関して富化させた細胞集団を取得する。
【０１１９】
本明細書で用いる場合、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」は、ある細胞型であって、第２の型の細胞と共に培養されて、第２の型の細胞が成長可能である環境を提供するものである、上記ある細胞型の細胞を、第２の細胞型を支持するための増殖因子及び栄養素を提供するフィーダー細胞として説明するために用いる用語である。フィーダー細胞は、任意に、それらが支持している細胞とは異なる種よりのものである。例えば、幹細胞を含む或る型のヒト細胞は、初代培養のマウス胚性線維芽細胞及び不死化マウス胚性線維芽細胞によって支持されることがある。該フィーダー細胞は、他の細胞と共培養しようとする場合、例えばマイトマイシンＣである有糸分裂阻害剤により作用させる又は処理されて、それらが支持している細胞が大きく成長することを防止することによって、典型的に不活性化することができる。上述したものを限定することなく、具体的なフィーダー細胞の型の１つは、例えばヒト皮膚繊維芽細胞であるヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞の型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ（mouse embryonic fibroblast））であり得る。
【０１２０】
本明細書で用いる場合、「フィーダーフリー（ＦＦ）」環境は、フィーダー細胞を本質的に含まない及び／又はフィーダー細胞の育成によって予め条件付けしていない、細胞培養又は培地などの環境をいう。「予め条件付けした」培地は、例えば少なくとも１日である期間の間、培地内でフィーダー細胞を育成した後、採取した培地をいう。予め条件付けした培地は、培地内で育成したフィーダー細胞によって分泌された増殖因子及びサイトカインを含む多数の介在物質を含有する。
【０１２１】
ゲノム安定性は、細胞が、ＤＮＡを忠実に複製して、ＤＮＡ複製プロセスの完全性を維持する能力をいう。本明細書で用いる場合、用語「ゲノム安定細胞」及び「ゲノム安定性を有する細胞」は、正常なヒト体細胞と、突然変異及び染色体異常の頻度が実質的に同様であるような、突然変異及び染色体異常（例えば転座、異数性、コピー数の変化及び重複である）の頻度を示す細胞をいう。
【０１２２】
「原料」は、細胞培地中に用いて細胞の増殖及び／又は分化を維持及び／又は促進することができる、化学又は生物のいずれかを起源とする任意の化合物又は他の材料をいう。用語「成分」、「栄養素」及び「原料」は区別なく使用し得る。細胞培地に用いる従来の原料は、アミノ酸、塩類、金属、糖類、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等を含み得るが、これに限定されない。生体外での細胞の育成を促進及び／又は維持する他の原料は、所望の効果の必要に応じて、当業者によって選択することができる。
【０１２３】
「単離する」又は「単離すること」は、その天然の環境から、ある組成物又は材料を分離して回収することをいい、例えば、組織又は肉体から個々の細胞又は細胞培養液を分離することなどである。一態様では、ある細胞の集団又は組成物には、天然で該細胞と関連していた可能性がある細胞及び材料が、実質的に含まれていない。「単離した」又は「精製した」又は「実質的に純粋である」は、標的細胞集団に対して、ある細胞集団が少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％であることをいい、特定の実施形態では、全ての細胞集団をなす標的細胞に対して、少なくとも約９５％で純粋とする。細胞の集団又は組成物の純度は、この技術分野で周知である適切な方法によって評価することが可能である。例えば、実質的に純粋である多能性細胞の集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％である細胞の集団をいい、特定の実施形態では、少なくとも約９５％とし、そして或る実施形態では、全細胞集団をなす多能性細胞に対して、約９８％で純粋とする。用語「本質的に純粋」は、本明細書において「実質的に純粋」と区別なく使用される。
【０１２４】
「継代」又は「継代すること」は、細胞が所望の範囲まで増殖したときに、細胞を細分して、複数の細胞培養表面又は細胞培養容器に播く動作をいう。一部の実施形態では、「継代」又は「継代すること」は、 細胞を細分すること、希釈すること及び播くことである。細胞を、初代培養の表面又は容器から、表面又は容器の引き続きのセットに継代する場合、引き続きの培養を、本明細書では「二次培養」又は「１継代目」等と称し得る。新しい培養容器に細分して播くというそれぞれの動作を、１継代とみなす。
【０１２５】
「播くこと」は、細胞培養容器に細胞を接着させて広げるように、ある細胞又は細胞を、培養容器に置くことをいう。
【０１２６】
「多能性因子」は、単独で又は他の因子と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる因子をいう。多能性因子には、限定するものではなく、細胞の発生能を増加させることが可能であるポリヌクレオチド、ポリペプチド及び小分子が含まれる。例示的な多能性因子には、例えば、逆転写制御因子及び小分子の初期化因子が含まれる。
【０１２７】
「増殖する（Proliferate）」は、１つの細胞が本質的に同一の２つの細胞又は１つの細胞集団に分裂して数を増やす特性（例えば、再生すること）をいう。
【０１２８】
「繁殖」は、組織外又は体外にある細胞、例えばプラスチック（又は被覆したプラスチック）細胞培養ディッシュ又はフラスコなどである無菌容器中にある細胞を、増殖させること（例えば、細胞増殖を経て再生すること）をいう。
【０１２９】
「初代培養」は、単離した細胞を培地を伴った最初の培養容器に播種するものである、細胞、組織及び／又は培養をいう。該細胞、組織及び／又は培養は、持続させることができる、及び／又は増殖することができるが、細胞、組織及び／又は培養が最初の容器中に残っている限りは、該細胞、組織及び／又は培養を初代培養と称する。
【０１３０】
用語「小分子の初期化因子」又は「小分子の初期化化合物」は、本明細書では区別なく使用されるが、単独で又は他の多能性因子と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることが可能である小分子をいう。「小分子」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満又は約０．５ｋＤ未満である分子量を有する因子をいう。小分子には、核酸、ペプチド模倣薬、ペプトイド、炭水化物、脂質又は他の有機分子もしくは無機分子が含まれるが、これに限定されない。真菌、バクテリアもしくは藻類のエキスなどである化学的及び／又は生物的混合物のライブラリが、この技術分野で公知であり、或る実施形態では小分子の供給源として用いることが可能である。特定の実施形態では、本明細書で使用する小分子の初期化因子は、１０，０００ダルトン未満の分子量、例えば８０００ダルトン未満、６０００ダルトン未満、４０００ダルトン未満、２０００未満ダルトンであり、例えば５０〜１５００ダルトン、５００〜１５００ダルトン、２００〜２０００ダルトン、５００〜５０００ダルトンである分子量を有する。
【０１３１】
感染効率（ＭＯＩ（Multiplicity of infection））は、感染において、細胞１個当たりに加えたウイルス粒子（virion）の数をいう。細胞１００万個に対して、１００万のウイルス粒子を加えれば、ＭＯＩは１である。１０００万のウイルス粒子を加えたのであれば、ＭＯＩは１０である。１００，０００のウイルス粒子を加えたのであれば、ＭＯＩは０．１である。
Ｃ．細胞
【０１３２】
特定の実施形態では、本明細書で意図する組成物及び方法を用いて、１つ又は複数の細胞を培養し、解離させ、継代することができる。一実施形態では、本明細書で意図する組成物及び方法を用いて、単一細胞を培養し、解離させ、継代した。別の実施形態では、本明細書で意図する組成物及び方法を用いて、細胞集団又は複数の細胞を培養し、解離させ、継代した。
【０１３３】
特定の実施形態での使用に好適である開始細胞集団は、任意の好適である供給源より本質的に得られるものであり得、かつ、細胞型又は多能性の状態に関して、不均質又は均質であり得る。好適である細胞には、胎児細胞及び成体細胞が含まれる。さらに、好適である細胞は、例えば齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ又は霊長類を起源とする哺乳類であり得る。一実施形態では、該細胞は、ヒト細胞である。
【０１３４】
該細胞は、体細胞の、非多能性細胞、不完全に又は部分的に多能性の幹細胞、多分化能細胞、寡能性細胞、単能性細胞、最終分化細胞、又は、上述したものの任意の組み合わせを含む、混合した細胞集団であり得る。特定の実施形態での使用に好適である多能性細胞は、天然に発生する幹細胞、胚性幹細胞又はｉＰＳＣを含むが、これに限定されない。「混合した」細胞集団は、発生能の度合いが異なる細胞の集団である。例えば、混合した細胞集団は、該混合した集団が、多能性細胞、部分的な多能性細胞、及び例えば完全分化細胞などの非多能性細胞を含むものであるように、初期化しようとする細胞を含んでもよい。
【０１３５】
一実施形態では、開始細胞集団は、成人又は新生児の幹細胞／前駆細胞より選択する。特定の実施形態では、幹細胞／前駆細胞の開始集団は、中胚葉の幹細胞／前駆細胞、内胚葉の幹細胞／前駆細胞及び外胚葉の幹細胞／前駆細胞からなる群より選択する。
【０１３６】
例示的な中胚葉の幹細胞／前駆細胞としては、中胚葉幹細胞／前駆細胞、内皮幹細胞／前駆細胞、骨髄幹細胞／前駆細胞、臍帯幹細胞／前駆細胞、脂肪組織由来の幹細胞／前駆細胞、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ）、間葉幹細胞／前駆細胞、筋幹細胞／前駆細胞、腎臓幹細胞／前駆細胞、骨芽幹細胞／前駆細胞、軟骨幹細胞／前駆細胞等を含むが、これに限定されない。
【０１３７】
例示的な外胚葉の幹細胞／前駆細胞としては、神経幹細胞／前駆細胞、網膜幹細胞／前駆細胞、皮膚幹細胞／前駆細胞等を含むが、これに限定されない。
【０１３８】
例示的な内胚葉の幹細胞／前駆細胞としては、肝臓幹細胞／前駆細胞、膵臓幹細胞／前駆細胞、上皮幹細胞／前駆細胞等を含むが、これに限定されない。
【０１３９】
或る実施形態では、開始細胞集団は、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、 皮膚細胞、卵胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞等からなる群より選択した不均質又は均質な細胞集団であり得る。
Ｄ．自然分化を低減させ、基底状態の多能性を誘導する培養プラットフォーム
【０１４０】
細胞バンク、疾患モデリング、及び細胞療法への用途により、高品質である多能性細胞の作製への需要が高まってきている。例えば、大規模での産生を可能としたシステムにおいて、生産性が高く、フットプリントフリーであるｉＰＳＣを誘導すること及びそれらを増殖することは、技術的に確立されていないままである。特定の実施形態では、段階特異的な培地組成物中で小分子の経路阻害剤を用いて、多能性細胞の急速で、平行する産生、選択及び増殖を可能にした、培養プラットフォームを意図している。本明細書で意図する該プラットフォームは、完全フィーダーフリー環境下で、最小限の初期化因子を用いて効率的で早い初期化を支持し、均質かつゲノム安定性である多能性集団を維持しながら、単一細胞培養及び多能性細胞の増殖を可能にする。さらに、本明細書で意図する培養プラットフォームは、遺伝的背景に関係なく、導入遺伝子による発現に依存せずに、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む多能性細胞を、低減した自然分化状態及び通常の基底状態の多能性となるように培養することを提供する。
【０１４１】
本明細書で意図する培養プラットフォームは、部分的に、培養中の自然分化を低減した、産業グレード又は臨床グレードの多能性細胞の産生に有用である。一実施形態では、非多能性細胞を、多能性細胞になるように誘導し、多能性を維持するように培養する。別の実施形態では、非多能性細胞を、多能性細胞になるように誘導し、培養中、低減した自然分化を達成及び／又は維持するように培養する。別の実施形態では、非多能性細胞を、多能性細胞になるように誘導し、基底状態の多能性を達成及び／又は維持するように培養する。
【０１４２】
様々な実施形態で、本明細書で意図する培養プラットフォームは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００継代又はそれ以上の継代であり、この間にある任意の継代数を含む継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の基底状態の多能性、正常な核型及びゲノム安定性を維持する。
【０１４３】
他の実施形態では、本明細書で意図する培養プラットフォームは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００継代又はそれ以上の継代であり、この間にある任意の継代数を含む継代の間、１つ又は複数の多能性細胞の低減した自然分化を維持する。
【０１４４】
一実施形態では、培養プラットフォームは、細胞培地とＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤とを含む、細胞培地を含む。様々な実施形態で、本明細書で意図する細胞培地は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤を含む、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない。任意の特定の理論と結びつけて考えることなしに、上記阻害剤は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤が初期化効率を高めるが、これら阻害剤は、多能性細胞集団の長期間の維持、品質及び均質性を妨害するものである、すなわち、ＴＧＦβ経路のシグナル伝達の阻害が、細胞の初期化効率を向上させたが、管内培養系での多能性細胞集団の引き続きの維持のために、特にフィーダー細胞フリーかつ単一細胞を用いた系での酵素的な継代であって、自然分化を低減させた均質な多能性集団が好ましく、より詳細には、導入遺伝子発現を欠如させたものである該酵素的な継代のために、この阻害の解除が必要である、ということを驚くべきことに発明者は発見した。本明細書で用いる場合、用語「長期間」は、継代数で計るものであって、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０継代又はそれ以上の継代をしばしば意味するが、これに限定されない。定義したように、「継代」は、細胞が所望の範囲まで増殖したときに、複数の細胞培養表面又は細胞培養容器に、細胞を細分して播く動作をいう。さらに、本明細書に開示するように、ＧＳＫ−３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤及び任意にＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５を含まない培地において準安定の多能性細胞を培養して、多能性細胞を移行させることで、低減した自然分化を達成し及び／又は基底状態の多能性を達成する。本明細書で意図する培地プラットフォームはまた、フィーダーフリー環境において効率的な初期化と長期間の多能性細胞の培養を可能にする。また、「ＡＬＫ５阻害剤」が、非特異性のキナーゼ阻害剤を包含することを意図していないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えばＳＢ−４３１５４２（例えば、Inman, et al., J Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002)を参照）であるＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害するものである阻害剤を包含するということを理解されたい。
【０１４５】
好ましい実施形態では、培養プラットフォームは、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び任意にＬＩＦ及び／又はｂＦＧＦを含む細胞培地を含むが、限定するものではなくＴＧＦβＲ又はＡＬＫ５阻害剤を含むＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含まない。
【０１４６】
さらなる実施形態では、細胞培地は、サイトカイン及び／又は増殖因子を実質的に含まず、またフィーダーフリー環境であってもよい。他の実施形態では、細胞培地は、例えば血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカイン等のサプリメントを含有する。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、培養プラットフォームは、フィーダーフリー培養を含む。
【０１４８】
本明細書で意図する培養プラットフォームはまた、低減した自然分化を有し、及び／又は基底状態の多能性を達成した、産業グレード又は臨床グレードの多能性細胞の均質集団を作製することなどの様々な効果ももたらす。本明細書で用いる場合、用語「均質（homogenous）」は、集団において各細胞が他の細胞と同一又は実質的に同一であるような細胞の集団をいう。一実施形態では、集団におけるある細胞は他の細胞と、本明細書で意図するような例えばＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１−８１である同一の多能性マーカーのうちの１つ又は複数を各細胞が発現するものであれば、同一である。一実施形態では、細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上が、集団における他の細胞と同一であるか又は実質的に同一であれば、該集団は均質である。
１．ＴＧＦΒ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
【０１４９】
ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）に対する抗体、ドミナントネガティブであるＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）の変異形、及びＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）の発現を抑制するアンチセンス核酸を含むことが可能である。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤には、ＳＢ４３１５４２（例えば、Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)を参照）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても知られるＡ−８３−０１（例えば、Tojo, et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005)を参照。例えば、Ｔｏｉｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より市販されている。）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、Dalton, et al.の国際公開第２００８／０９４５９7号を参照。参照により本明細書に組み入れられるものとする。）、ＢＭＰ４（先のＤａｌｔｏｎを参照）、ＧＷ７８８３８８（−｛４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)を参照）、ＳＭ１６（例えば、Suzuki, et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)を参照）、IＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)を参照）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)を参照）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えば、DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)を参照）及びピリミジン誘導体（例えば、Stiefl, et al.の国際公開第２００８／００６５８３号で列記されたものを参照。参照により本明細書に組み入れられるものとする。）を含むが、これに限定されない。また、「ＡＬＫ５阻害剤」は非特異性のキナーゼ阻害剤を包含することを意図していないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えばＳＢ−４３１５４２（例えば、Inman, et al., J Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002)を参照）であるＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害するものである阻害剤を包含するということを理解されたい。この発明の範囲を限定することを意図するものではないが、ＡＬＫ５阻害剤が、間葉上皮変換／転換（ＭＥＴ（mesenchymal to epithelial conversion/transition））プロセスに影響すると考えられている。上皮間葉転換（ＥＭＴ（epithelial to mesenchymal transition））に関しては、ＴＧＦβ／アクチビン経路がドライバー（driver）である。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することにより、ＭＥＴ（すなわち、初期化）プロセスを促進することが可能である。
【０１５０】
本明細書におけるＡＬＫ５阻害効果を示すデータに鑑みて、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害が、ＡＬＫ５阻害と同様の効果を有することとなると考えられる。そのため、本明細書の各段落で記載するように、ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、又はＡＬＫ５阻害剤の代わりに、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流又は下流の）を用いることが可能である。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害剤には、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３のリン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストを含むが、これに限定されない。また、以下に記載する分類は、単に構造化目的であり、当業者には、化合物が経路内の１つ又は複数の点に影響を及ぼすことが可能であるため、化合物は、規定したカテゴリーの複数のカテゴリーで機能することができる、ということがわかるであろう。
【０１５１】
ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、ドミナントネガティブであるＴＧＦβ受容体の変異形、及びＴＧＦβ受容体を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を含むことが可能である。ＴＧＦβ受容体阻害剤の特定の例としては、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（ＳＢ−５０５１２４）；ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ（ＣＡＴ−１５２）；ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤ１１；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；グリーベック（Gleevec）；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（モリン（Morin））；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；及びＴＧＦβ受容体を標的とするアンチセンスをトランスフェクトした腫瘍細胞が挙げられるが、これに限定されない。（例えば、Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007)、Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005)、及びChang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)を参照。）
【０１５２】
ＳＭＡＤ２／３のリン酸化の阻害剤には、ＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３に対する抗体、ドミナントネガティブであるＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３の変異形、及びＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３を標的とするアンチセンス核酸を含むことが可能である。阻害剤の特定の例としては、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ−４３１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７−０１；及び３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（モリン）が挙げられる。（例えば、Wrzesinski（上述）、Kaminska（上述）、Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007)、及びKataoka, et al., EP1992360を参照。参照により本明細書に組み入れられるものとする。）
【０１５３】
ＳＭＡＤ２／３とｓｍａｄ４との相互作用の阻害剤には、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３及び／又はｓｍａｄ４に対する抗体、ドミナントネガティブであるＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３及び／又はｓｍａｄ４の変異形、ならびにＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３及び／又はｓｍａｄ４を標的とするアンチセンス核酸を含むことが可能である。ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤の特定の例としては、Ｔｒｘ−ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ−ｘＦｏｘＨ１ｂ及びＴｒｘ−Ｌｅｆ１が挙げられるが、これに限定されない。（例えば、Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005)及びZhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006)を参照。）
【０１５４】
ＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストには、ＳＭＡＤ６又はＳＭＡＤ７に対する抗体、ドミナントネガティブであるＳＭＡＤ６又はＳＭＡＤ７の変異形、及びＳＭＡＤ６又はＳＭＡＤ７を標的とするアンチセンス核酸を含むことが可能であるが、これに限定されない。阻害剤の特定の例としては、ｓｍａｄ７−ａｓ  ＰＴＯ−オリゴヌクレオチド（ｓｍａｄ７に対するアンチセンスＰＴＯ−オリゴヌクレオチド）が挙げられるが、これに限定されない。（例えば、Miyazono, et al.の米国特許第６５３４４７６号及びSteinbrecher, et al.の米国特許出願公開第２００５１１９２０３号を参照。いずれも参照により本明細書に組み入れられるものとする。）
２．ＷＮＴ経路アゴニスト
【０１５５】
本明細書で用いる場合、用語「Ｗｎｔシグナル促進剤（signal-promoting agent）」、「Ｗｎｔ経路活性化剤」又は「Ｗｎｔ経路アゴニスト」は、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを指し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５もしくはＷｎｔ１６のうちの１つ又は複数のアゴニストを含むが、これに限定されない。Ｗｎｔ経路アゴニストは、以下のポリペプチドもしくはその断片のうちの１つ又は複数をさらに含むが、これに限定されない：Ｄｋｋポリペプチド、ｃｒｅｓｃｅｎｔポリペプチド、ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド、ａｘｉｎポリペプチド、Ｆｒｚｂポリペプチド、Ｔ-細胞因子ポリペプチド又はドミナントネガティブであるｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄポリペプチド。
【０１５６】
Ｗｎｔ経路アゴニストの非限定的な例としては、以下のうちの１つ又は複数をさらに含む：Ｗｎｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、活性化Ｗｎｔ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化Ｗｎｔ受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｗｎｔ／β−カテニンのシグナル伝達を促進する小分子の有機分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現又は活性を阻害する小分子の有機分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するリボザイム、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔアンタゴニストの活性を拘束し阻害する抗体、β−カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β−カテニンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌｅｆ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｌｅｆ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０１５７】
Ｗｎｔ経路アゴニストは、例えば、ドミナントネガティブであるＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ドミナントネガティブであるＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βの発現又は活性を拘束し阻害する小分子の有機分子、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βの発現及び／又は活性を拘束し阻害するＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βの発現を拘束し阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＳＫ−３、 ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βの発現及び／又は活性を拘束し阻害する抗体、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α又はＧＳＫ３βの発現を拘束し阻害するリボザイム、ならびにＧＳＫ−３阻害剤に作用が類似するβ−カテニン標的遺伝子を活性化する、ＧＳＫ−３と独立である任意の試薬などである、ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む。
３．ＧＳＫ−３β阻害剤
【０１５８】
ＧＳＫ−３β阻害剤の特定の例としては、本明細書で意図する組成物における使用に好適であるＷｎｔ経路アゴニストがあり、またポリヌクレオチド、ポリペプチド及び小分子を含み得るが、これに限定されない。本明細書で意図するＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３β発現及び／又はＧＳＫ−３β活性を低減させることができる。本明細書で意図するＧＳＫ−３β阻害剤の例示としては、抗ＧＳＫ−３β抗体、ドミナントネガティブであるＧＳＫ−３βの変異形、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びＧＳＫ−３βを標的とするアンチセンス核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５９】
他の例示的なＧＳＫ−３β阻害剤としては、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＣＴ  ９９０２１、ＣＴ  ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ−Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ  ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン、ピリドカルバゾール−シクロペンアジエニルルテニウム錯体（Pyridocarbazole- cyclopenadienylruthenium complex）、ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン（thiadiazolidine）−３，５−ジオン、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン、ＡＲ−ＡＯ  １４４−１８、３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；ＴＷＳｌ１９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３  Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２又はそのミリストイル化体；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；ＧＦ１０９２０３Ｘ；ＲＯ３１８２２０；ＴＤＺＤ−８；ＴＩＢＰＯ；及びＯＴＤＺＴが挙げられるが、これに限定されない。
【０１６０】
特に例示的な実施形態においては、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ又はケンパウロンである。
【０１６１】
好ましい実施形態においては、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
４．ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
【０１６２】
本明細書で意図する組成物に用いて好適であるＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び小分子を含むが、これに限定されない。本明細書で意図するＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫもしくはＥＲＫの発現及び／又はＭＥＫもしくはＥＲＫの活性を低減させることができる。本明細書で意図するＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の例示としては、抗ＭＥＫ抗体又は抗ＥＲＫ抗体、ドミナントネガティブであるＭＥＫ又はＥＲＫの変異形、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＭＥＫ又はＥＲＫを標的とするアンチセンス核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６３】
他の例示的なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ−１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ（Vandetanib）、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫｌ  １２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥＡｌ  １９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４及びＰＴＫ７８７が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６４】
ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のさらなる例示としては、国際特許出願公開第ＷＯ９９／０１４２６号、第ＷＯ０２／０６２１３号、第ＷＯ０３／０７７９１４号、第ＷＯ０５／０５１３０１号及び第ＷＯ２００７／０４４０８４号に開示されている化合物が挙げられる。
【０１６５】
ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のさらなる例示としては、以下の化合物が挙げられる：６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazol-e）−５−カルボン酸（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−アミド；６−（ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−（テトラヒドロ−ピラン−２−イルム（ylm）−エチル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazole）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、１−［６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾ−ル（benzoimida-zol）−５−イル］−２−ヒドロキシ−エタノン、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazol-e）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル−エトキシ）−アミド、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−（テトラヒドロフラン−２−イルム−エチル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazole）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、６−（４−ブロモ−２−フルオロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazol-e）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、６−（２，４−ジクロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazole）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、以下ＭＥＫ阻害剤１と称する６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール（benzoimidazol-e）−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド；以下ＭＥＫ阻害剤２と称する２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，５−ジメチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド；及び４−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，５−ジメチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリダジン−３−カルボキサミド又は薬剤的に許容されるその塩。
【０１６６】
好ましい実施形態においては、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９である。
５．ＲＯＣＫ阻害剤
【０１６７】
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、Ｒｈｏキナーゼ（その３つのアイソフォームが存在する：ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈｏＣ）の下流エフェクターとなるセリン／スレオニンキナーゼである。本明細書で意図する組成物に用いて好適なＲＯＣＫ阻害剤には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び小分子を含むが、これに限定されない。本明細書で意図するＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ発現及び／又はＲＯＣＫ活性を低減させることができる。本明細書で意図するＲＯＣＫ阻害剤の例示としては、抗ＲＯＣＫ抗体、ドミナントネガティブであるＲＯＣＫの変異形、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＯＣＫを標的とするアンチセンス核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６８】
本明細書で意図する例示的なＲＯＣＫ阻害剤には、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２−８６、Ｙ２７６３２、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール及び（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド、ならびに参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする米国特許第８，０４４，２０１号に開示されるＲＯＣＫ阻害剤を含むが、これに限定されない。
【０１６９】
一実施形態においては、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２又はピリンテグリン（pyrintegrin）である。
【０１７０】
好ましい実施形態においては、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。
【０１７１】
本明細書で意図する組成物及び細胞培養中の小分子の量は、特定の分子、使用する組み合せ、培地で培養しようとする細胞の型、及び特定の用途を含む、特定の培養条件に応じて、変更することが可能であり、また最適化してよい。一実施形態では、小分子は、多能性を誘導し、初期化効率を向上させ、細胞能力を増加もしくは維持し、又は基底状態の多能性を誘導もしくは維持するのに十分である濃度で、組成物中に存在する。
【０１７２】
特定の実施形態では、この発明の細胞培地における小分子の好ましい濃度及び組み合わせを、Ｆａｔｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地（ＦＭＭ（Fate Maintenance Medium））として表１に示している。この培地の成分は、表１に示す最適濃度周辺の最適範囲内の量で、培地中に存在し得る。Ｆａｔｅ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ培地（ＦＲＭ（Fate Reprogramming Medium））は、細胞の初期化を含む、本明細書で意図する培養プラットフォームに有用であるが、基底状態の多能性細胞の樹立及び長期間の維持には好適でない。
【０１７３】
【表１】
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６．サイトカイン及び増殖因子
【０１７４】
特定の実施形態では、この発明の細胞培地は、サイトカイン及び／又は増殖因子を実質的に含まない。或る実施形態では、細胞培地は、血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカイン等の１つ又は複数のサプリメントを含有するが、これに限定されない。
【０１７５】
例示的な一実施形態では、培地は、ＥＣＭタンパク質、ラミニン１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞−シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、細胞内塩素イオンチャネル１、膜貫通受容体ＰＴＫ７、インスリン様増殖因子又はインヒビンベータＡのうちの１つ又は複数を含み得るが、ＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達経路の誘導因子又はアクチビンＡは含まない。他の実施形態では、培地は、ＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達経路の誘導因子を含み得る。
【０１７６】
別の例示的な実施形態では、培地は、以下のサイトカイン又は増殖因子のうちの１つ又は複数を含む：表皮増殖因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えばＩＬ−１からＩＬ−１８など）、種々のコロニー刺激因子（例えば顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、種々のインターフェロン（例えばＩＦＮ−γなど）、ならびに例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）などの幹細胞で効果を有する他のサイトカイン。これらサイトカインは、例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）より購入でき、天然又は遺伝子組換え個体の何れであってもよい。特定の実施形態では、増殖因子及びサイトカインは、本明細書で意図する濃度で加えられ得る。或る実施形態では、増殖因子及びサイトカインは、経験的に決定されるか又は確立されているサイトカイン技術により導かれるものである濃度で加えられてよい。
７．培養基質
【０１７７】
任意の好適な容器又は細胞培養容器を、基本培地及び／又は細胞培養サプリメントでの細胞培養用支持として用い得る。一部の実施形態では、該支持上に被覆した基質は不要である。しかしながら、一部の他の実施形態では、培養容器の表面を接着促進基質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、ゼラチン等）で被覆することで、細胞の接着を促進し、特定の実施形態では、本明細書に開示する細胞培地及びサプリメントの効果を高めることができる。細胞を培養し継代するのに好適な基質は、この技術分野で公知であり、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、例えばマトリゲル（Matrigel（商標））である天然に生じる細胞株産生マトリックスの混合物、及び例えばポリアミン単分子層及びカルボキシ末端単分子層である合成又は人工の面を含むが、これに限定されない。
【０１７８】
一実施形態では、本明細書で意図する培養プラットフォームは、マトリゲル（Matrigel（商標））又はビトロネクチンを含む基質を含む。
８．フィーダーフリー環境
【０１７９】
既存の多能性細胞培養方法は、フィーダー細胞上に、又はフィーダー細胞で予め条件付けしたウシ胎児血清を含有する培地に大いに頼っているものであるが、こうした環境は、臨床及び治療用の細胞を産生するのに好適でないものであり得る。例えば、このような異物感染した環境で育成した細胞は、動物の成分への曝露により、免疫拒絶や未知の病原体が治療患者に伝染するという深刻なリスクが存在する可能性があり、また動物のレトロウイルスが再活性化する可能性があるということから、概して、ヒトの細胞移植には適していないと考えられる。本明細書で意図するフィーダーフリー環境のように、動物成分フリーの培地を用いた培養系は、臨床グレードの細胞株、特にｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの細胞株の作製を容易にするものである。
【０１８０】
特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、ヒトフィーダー細胞を本質的に含まないものであり、またマウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、角化細胞及び胚性幹細胞を含むがこれに限定されないフィーダー細胞により予め条件付けしないものである。フィーダーフリー細胞培地は、多能性細胞の培養、細胞の初期化、多能性細胞の単一細胞培養、解離及び継代、多能性細胞の細胞選別、基底状態の多能性細胞の産生、ならびに基底状態の多能性の維持に用いて好適である。特定の実施形態では、フィーダーフリー環境を用いて、多能性を誘導し、初期化効率を向上し、及び／又は、細胞の能力を増加もしくは維持する。或る実施形態では、フィーダーフリー環境は、ｂＦＧＦを含むサイトカイン及び成長因子を実質的に含まない。
９．解離
【０１８１】
本明細書で意図する培養プラットフォームが提供する効果のひとつは、単一細胞である基底状態の多能性細胞の培養、継代及び解離における生存能及び生存性の向上である。例えば単一細胞懸濁液に解離させるなどである単一細胞への細胞の解離は、酵素的手段又は機械的手段によって達成可能である。細胞を単一細胞へ解離させることができるこの技術分野で公知の任意の酵素試薬を、この発明の方法で用いてよい。一実施形態では、この解離用試薬は、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ−Ｓｅｌｅｃｔ、コラーゲナーゼＩＶ及びディスパーゼから選択する。
【０１８２】
本明細書で意図する方法に従って細胞を解離する際に、単独で又は酵素試薬と組み合わせて、ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ又はＡｃｃｕＭａｘなどのキレート剤を使用してもよい。この解離用試薬は、カルシウムフリー及びマグネシウムフリーのＰＢＳに溶解させて、単一細胞への解離を促進させてもよい。
【０１８３】
解離中及び解離後の細胞生存性を高めるために、一部の実施形態では、生存促進物質を添加するが、これは例えば、１つ又は複数である、成長因子、細胞死及びアポトーシスをもたらす細胞経路の阻害剤、又は条件培地である。一実施形態では、生存促進物質は、チアゾビビンを含むがこれに限定されないＲＯＣＫ阻害剤である。
【０１８４】
細胞培養及び培地の回収における技術は、Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148, 1997；K. Kitano, Biotechnology 17:73, 1991；Curr. Opin. Biotechnol. 2:375, 1991；Birch et al., Bioprocess Technol. 19:251, 1990；“Teratocarcinomas and embryonic stem cells:  A practical approach” (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987)；“Guide to Techniques in Mouse Development” (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993)；“Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro” (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993)；“Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy” (P. D. Rathjen et al., al., 1993)に概説されている。
【０１８５】
幹細胞の分化については、Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997及びPedersen, Reprod. Fertil. Dev. 10:31,1998で検討されている。
１０．富化及び枯渇の戦略
【０１８６】
特定の実施形態では、例えばｉＰＳＣである多能性細胞の細胞集団の富化に関する戦略を提供する。一実施形態では、富化は、比較的短い時間でクローンｉＰＳＣコロニーを誘導し、それによってｉＰＳＣ産生効率が向上する方法を提供する。富化は、初期化するために誘導された細胞集団を選別して、多能性のマーカーを発現する細胞を特定して取得することと、それによって多能性細胞に関して富化された細胞集団を取得することとを含み得る。富化のさらなる方法論としては、分化のマーカーを発現する細胞又は非多能性細胞を枯渇させて、富化させた多能性細胞集団を取得することを含む。一部の実施形態では、初期化後に培養される細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日又はそれ以上の日数の間であるが、１０日、１１、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、４０日又はこの間にある任意の日数より短い間、誘導される。いくつかの実施形態では、初期化後に培養される細胞は、約４〜３０日、約４〜２４日、約６〜２２日、又は約８〜約１２日の間、誘導される。
【０１８７】
一実施形態では、細胞集団を多能性細胞に関して富化することには、集団内の細胞を解離することと、細胞を再懸濁させることとによって、単一細胞懸濁液を作製することを含む。解離した細胞は、細胞の維持又は細胞選別の実行に好適である任意の溶液又は培地中に再懸濁させることができる。特定の実施形態では、単一細胞懸濁液はＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｏｃｋ阻害剤を含有し、ＴＦＧβ阻害剤を含有しない。或る実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１、及び／又はＲｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
【０１８８】
特定の実施形態では、多能性細胞の正の選択をするように細胞集団を選別する、及び／又は、該集団について非初期化細胞もしくは非多能性細胞を枯渇させることによって、多能性細胞に関して富化させた細胞集団を取得する。一実施形態では、単一細胞懸濁液を調製し、その後単一細胞を、例えば適当な抗体を用いて多能性マーカーに染色するなどによって、選別のための調製をする。細胞は、例えば電磁ビーズ又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）選別によるなどの、任意の好適な細胞選別方法により選別することができる。
【０１８９】
細胞は、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１−６０／８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ５０の発現を含むがこれに限定されない、１つ又は複数の多能性マーカーに基づいて、選別することができる。様々な実施形態で、細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも４つの多能性マーカーに基づいて選別される。或る実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別され、或る特定の実施形態では、ＴＲＡ１−８１及び／又はＴＲＡ１−６０と組み合わせたＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別される。或る実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１もしくはＴＲＡ１−６０及び／又はＣＤ３０の発現に基づいて選別される。一実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１及びＣＤ３０に基づいて選別される。別の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０及びＣＤ３０に基づいて選別される。或る実施形態では、細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６及びＣＤ７を含むがこれに限定されない、細胞分化の１つ又は複数の表面マーカーを用いて、はじめに非初期化細胞を枯渇させ、その後、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１及び／又はＣＤ３０などの多能性マーカーに関して富化させる。
【０１９０】
多能性細胞に関して富化させた集団は、例えば従来法によるｈＥＳＣ培地又はこの発明の細胞培地などの細胞培養系に播くことができる。細胞培養系はフィーダー細胞を添加してもよく、又はフィーダーフリー環境であってもよい。一部の実施形態では、多能性マーカーを発現する選別された細胞を、フィーダー細胞を添加した培養系に播種し、後にフィーダーフリー環境に移行させる。一実施形態では、細胞培地はフィーダーフリー環境であり、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｏｃｋ阻害剤を含み、ＴＧＦβ阻害剤を含まない。特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、及び／又はＲｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。この発明の他の特定の実施形態では、細胞培養系は、マトリゲル（Matrigel（商標））で被覆した組織プレートを含むフィーダーフリー環境である。一実施形態では、細胞培養系は、表１に記載したＦＭＭ培地を含む。
【０１９１】
富化させた細胞集団は、本明細書に記載の細胞培養系で培養して、基底状態のｉＰＳＣコロニーを取得することができるが、典型的には、選別後約３日〜約２５日、選別後約５〜２０日、選別後５〜１５日、選別後５〜１２日、選別後約５〜９日又は選別後約５〜７日で出現する。ｉＰＳＣコロニーは、クローン増殖のために採取又は選別することが可能である。本明細書で意図する富化戦略を用いて、細胞集団を、多能性細胞に関して少なくとも約３倍、５倍又は１０倍又はそれ以上富化させる。
【０１９２】
一部の実施形態では、初期化しようとする細胞集団又は多能性細胞集団は、分化細胞を枯渇させる。一実施形態では、初期化させるために誘導した多能性細胞又は細胞の集団は、分化細胞のうちの１つ又は複数の細胞表面マーカーを有する細胞を枯渇させることが可能である。例示的な分化細胞の細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６及びＣＤ７が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、分化細胞の細胞表面マーカーとして、ＣＤ１３を用いる。
【０１９３】
他の実施形態では、細胞集団を所望の系統に分化するように誘導し、多能性細胞を枯渇させて、分化している又は分化した細胞についての富化させた集団を取得する。一部の実施形態では、分化した細胞の集団には、例えば特定の系統に分化するように誘導したＥＳＣ又はｉＰＳＣなどの細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、例えば多能性マーカーに基づいた電磁ビーズ又はＦＡＣにより集団内の細胞を選別することなどである上記に記載した陰性細胞選別技術（「パニング」）を用いて、多能性細胞を枯渇させることができる。一部の実施形態では、分化した細胞を含む細胞集団を、多能性マーカーを用いてＦＡＣにより選別し、多能性マーカーを発現する細胞を枯渇させたフラクションを取得する。他の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６及びＣＤ７を含むがこれに限定されない細胞系統別マーカー（lineage-specific marker）などの分化マーカーに基づいてＦＡＣにより選別し、多能性マーカーを枯渇させたフラクションを取得する。この発明の一部の特定の実施形態では、分化細胞の細胞表面マーカーとして、ＣＤ１３を用いる。
Ｅ．細胞初期化培養プラットフォーム
【０１９４】
細胞内で多能性を誘導する又は能力を増加させるために（Takahashi, K., and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)；Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007)；Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)；Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009)；Kim et al., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009)；Yamanaka et al., 2009；Saha, K., Jaenisch, R., Cell Stem Cell 5, 584-595 (2009)）、また初期化効率を向上させるために（Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528 (2008a)；Shi et al., Cell Stem Cell 3, 568-574 (2008b)；Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008a)；Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 1269-1275 (2008b)；Silva et al., Plos Bio 6, e253. doi: 10.1371/journal. pbio. 0060253 (2008)；Lyssiotis et al., PNAS 106, 8912-8917 (2009)；Ichida et al., Cell Stem Cell 5, 491-503 (2009)；Maherali, N., Hochedlinger, K., Curr Biol 19, 1718-1723 (2009b)；Esteban et al., Cell Stem Cell 6, 71-79 (2010)；Feng et al., Cell Stem Cell 4, 301-312 (2009)）、様々な戦略が遂行されている。しかしながら、既存の方法は、産業グレード又は臨床グレードの多能性細胞の作製に関して、すなわち、均質な多能性であり、有意な自然分化がなく、ならびに、既知組成であって異物を含まないフィーダー細胞培養系での単一細胞の酵素的継代を用いて細胞集団を培養及び増殖する能力を備えた、クローン導入遺伝子フリーの多能性細胞集団の作製に関して、高生産性である解決法を未だ実現していない。
【０１９５】
本明細書で意図する培養プラットフォームは、高グレードの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の産生に、一部有用である。一実施形態では、非多能性細胞を多能性に初期化し、培養して、多能性を維持する。別の実施形態では、ｉＰＳＣを、基底状態の多能性に培養する。
【０１９６】
様々な実施形態で、該培養プラットフォームが、導入遺伝子フリー及び／又はフットプリントフリーの初期化方法を可能にする。本明細書で意図する培養プラットフォームは、ｈｉＰＳＣ産生に必要な時間と労力を有意に低減させる、高効率なエピソームでの初期化を提供する。任意の特定の理論と結びつけて考えることなしに、小分子である特定の経路の阻害剤（ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＴＧＦβ及びＲＯＣＫ）により、初期化プロセスの初期の分化のきっかけを阻害すること及び間葉上皮変換／転換（ＭＥＴ）を促進することの両方によって、ＦＦかつ単一細胞である培養系において、エピソーマルベクターを用いて、ｈｉＰＳＣ産生効率を有意に向上させることを意図している。
【０１９７】
一実施形態では、培養プラットフォームは、細胞内の内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることを含む、１つ又は複数の非多能性細胞を多能性状態に初期化することを含む。細胞内での内在性ＯＣＴ４の発現は、１つ又は複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は、ＯＣＴ４発現の小分子誘導因子を導入することによって増加させることができる。一実施形態では、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチド又はＯＣＴ４ポリペプチドを細胞内に導入すれば、細胞内の内在性ＯＣＴ４発現を誘導するのに十分である。
【０１９８】
一実施形態では、培養プラットフォームは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、１つ又は複数の非多能性細胞に導入することを含む、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することを含む。別の実施形態では、培養プラットフォームは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドを、１つ又は複数の非多能性細胞に導入することを含む、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することを含む。
【０１９９】
一実施形態では、培養プラットフォームは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、１つ又は複数の非多能性細胞に導入することを含む、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することを含む。別の実施形態では、培養プラットフォームは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択した１つ又は複数のポリペプチドを、１つ又は複数の非多能性細胞に導入することを含む、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することを含む。一部の実施形態では、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ又は複数の非多能性細胞は、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む。一部の他の実施形態では、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ又は複数の非多能性細胞は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１及びＥＳＲＲＢからなる群から選択した初期化因子のうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む。
【０２００】
本明細書で用いる場合、特定の実施形態では、用語「導入すること」は、細胞をポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子に接触させることを含むプロセスをいう。導入ステップはまた、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの細胞への微量注入、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞に送達するリポソームの使用、又は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞透過性成分と融合して細胞に導入させることを含んでもよい。
【０２０１】
特定の実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した初期化因子のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入して、該細胞を初期化させることができる。細胞に導入される各初期化因子をコードする複数のポリヌクレオチドは、本明細書で意図するような、基底状態の多能性を達成するのに好適な任意の組み合わせにおいて、同一であっても又は異なるものであってもよい。
【０２０２】
一実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧからなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子のそれぞれをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入する。
【０２０３】
一実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧのそれぞれをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入する。
【０２０４】
一実施形態では、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２のそれぞれをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入する。
【０２０５】
一実施形態では、ＯＣＴ４をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入する。
【０２０６】
一実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧのそれぞれをコードする２つのポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入し、任意に、ＳＶ４０ＬＴを非多能性細胞に導入してもよい。
【０２０７】
別の実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧのそれぞれをコードする３つのポリヌクレオチドと、ＵＴＦ１をコードする１つのポリヌクレオチドとを、非多能性細胞に導入する。
【０２０８】
様々な例示的な実施形態で、非多能性細胞を初期化することを含む培養プラットフォームは、ＯＣＴ４をコードする１つ〜５つのポリヌクレオチドと、任意に、ＳＯＸ２をコードする１つ〜３つのポリヌクレオチド及び／又はＮＡＮＯＧをコードする１つ〜２つのポリヌクレオチドとを導入することを含む。多数のポリヌクレオチドを、同一の又は独立のコンストラクト又はベクター内において任意の組み合せで、細胞に導入してもよい。非限定的な一例では、ＯＣＴ４をコードする１つ〜４つのポリヌクレオチド、ＳＯＸ２をコードする１つ又は２つのポリヌクレオチド及びＮＡＮＯＧをコードする１つのポリヌクレオチドを、非多能性細胞に導入する。非限定的な別の例では、非多能性細胞を多能性状態に初期化することは、ＯＣＴ４をコードする２つのポリヌクレオチドを含む第１のベクター、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチド及びＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクター、ならびにＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドとＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドとＮＡＮＯＧをコードするポリヌクレオチドとを含む第３のベクターを、非多能性細胞に導入することを含む。非限定的なさらなる例では、１つ又は複数の非多能性細胞を初期化することは、ＯＣＴ４をコードする２つのポリヌクレオチドを含む第１のベクター、及びＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドとＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドとＮＡＮＯＧをコードするポリヌクレオチドとを含む第２のベクターを、非多能性細胞に導入することを含む。さらにまた非限定的な例では、ＯＣＴ４をコードする２つのポリヌクレオチドを含む第１のベクター、及びＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドとＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドとを含む第２のベクターを、非多能性細胞に導入して多能性細胞を産生する。
【０２０９】
一実施形態では、１つ又は複数のコンストラクト（又はベクター）を、非多能性細胞に導入するものであって、該コンストラクトは、（ｉ）ＯＣＴ４をコードする２つのポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＥＣＡＴ１をコードするポリヌクレオチド及びＵＴＦ１をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）ＮＡＮＯＧをコードするポリヌクレオチド、ＥＳＲＲＢをコードするポリヌクレオチド及びＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＣＤＨ１をコードするポリヌクレオチド、ＺＩＣ３をコードするポリヌクレオチド及びＨＥＳＲＧをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）ポリペプチドをコードするＬ１ＴＤ１をコードするポリヌクレオチド、ＤＰＰＡ４をコードするポリヌクレオチド及びＴＤＧＦ１をコードするポリヌクレオチド；又は（ｖｉ）ＤＮＭＴ３Ｂコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、非多能性細胞に導入する初期化因子は、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４を含まない。一部の実施形態では、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４は、非多能性細胞に導入する初期化因子から除外される。一部の実施形態では、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが存在する状態では、ＳＯＸ２及び／又はＫＬＦ４はなくてもよい。
【０２１０】
一実施形態では、本明細書で意図するポリペプチドをコードする、任意の数及び組み合わせの初期化因子を含む１つのコンストラクト（又はベクター）は、非多能性細胞に導入されて、該細胞を多能性状態に初期化するのに十分である。
【０２１１】
一実施形態では、本明細書で意図するポリペプチドをコードする、任意の数及び組み合わせの初期化因子をそれぞれが含む１つ又は複数のコンストラクト（又はベクター）は、非多能性細胞に導入されて、該細胞を多能性状態に初期化するのに十分である。
【０２１２】
好ましい実施形態では、非体細胞を初期化するための本明細書で意図する１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを用いて、１つ又は複数のポリヌクレオチドを該細胞に導入するものであり、該細胞を初期化するのに十分である。
【０２１３】
最も好ましい実施形態では、非体細胞を初期化するための本明細書で意図する１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ又は複数のエピソーマルベクターを用いて、１つ又は複数のポリヌクレオチドを細胞に導入するものであり、該細胞を初期化するのに十分である。低減した自然分化及び／又は基底状態を示す多能性細胞は、本明細書で意図しているエピソーマルベクターにより作製され得、その後ベクターがなくなるまで培養され、初期化因子をコードする外因性核酸を含まない、低減した自然分化及び／又は基底状態を示す多能性細胞を取得する。
【０２１４】
また、コンストラクト又はベクターが、少なくとも２つの初期化因子をコードするポリヌクレオチドを含むか又は１つの初期化因子をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む場合に、コンストラクト／ベクターが、ＩＲＥＳ配列か、又は各ポリペプチド間に自己切断ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドかを含む、ということを意図している。
【０２１５】
一部の態様では、非多能性細胞の初期化効率は、１つ又は複数の初期化因子のポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入した後で、該初期化因子のポリヌクレオチドの異所発現に関して選択することによって増加させる。かかる選択は、例えば、初期化因子のポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数を選択マーカーに連結することと、初期化因子のポリヌクレオチド及び選択マーカーを非多能性細胞に導入することと、選択マーカーを発現するそれら細胞を選択することとによって実行し得るものであって、該選択により、マーカーとその関連の初期化因子のポリヌクレオチドとを発現しない細胞と比較して高い初期化効率を有する細胞が特定される。当業者は、非多能性細胞による導入された初期化ポリヌクレオチドの発現を特定する任意の選択マーカーを使用することができる、ということがわかるであろう。かかる選択マーカーの非限定的な一例としては、例えばピューロマイシン耐性などの抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。選択マーカーは、以下の初期化因子のポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数に連結され得る：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１。一部の実施形態では、初期化因子のポリヌクレオチドの特定の組み合わせが、ポリシストロニックベクター（又はコンストラクト）として導入されるが、該初期化因子のポリヌクレオチドには選択マーカーが連結している。ベクター内に含まれるポリヌクレオチドは、本明細書に開示する２つ以上の初期化因子をコードし得る。非限定的な一実施形態においては、ポリシストロニックベクターが、ＯＣＴ４をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、例えばピューロマイシン耐性をコードする遺伝子などの選択マーカーと連結している。
【０２１６】
一部の態様では、ポリヌクレオチドをコードする１つ又は複数の初期化因子を含む、１つ又は複数のポリシストロニックベクターに加えて、１つ又は複数の初期化因子及び選択マーカーをコードするポリシストロニックベクターを非多能性細胞に導入するものであって、選択マーカーを発現する細胞を選択することにより、選択マーカーを発現しない細胞よりも高い初期化効率を有する細胞の集団を産生する。非限定的な一例では、ＯＣＴ４をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックベクターに加えて、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入して、該ポリヌクレオチドをピューロマイシン耐性遺伝子と連結する。選択マーカーを発現する非多能性細胞の引き続きの選択により、選択マーカーを発現しない非多能性細胞と比較して初期化効率が高い非多能性細胞が特定される。選択される細胞は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％又は少なくとも４０％の初期化効率を有し得る。
【０２１７】
特に好ましい実施形態の初期化ステップにおいては、しばしば小分子を含む。任意の特定の理論と結びつけて考えることなしに、小分子である種々の分化経路の阻害剤を含むことにより、初期化の効率と反応速度とを増加させる、ということを意図している。したがって、特定の実施形態では、非多能性細胞を初期化することは、本明細書で意図する細胞に１つ又は複数の初期化因子を導入することと、該細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤に接触させることとを含む。
【０２１８】
初期化効率の向上は、（１）初期化及び多能性細胞の産生に必要な時間の低減（例えば、小分子なしの類似又は同一のプロセスと比較して多能性細胞の産生にかかる時間が少なくとも１日短縮されることによる）、又は、あるいは、もしくはこれと組み合わせて、（２）特定のプロセスによって産生される多能性細胞数の増加（例えば、小分子なしの類似又は同一のプロセスと比較して、所与の期間中に初期化される細胞数が少なくとも１０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％等増加すること）によって、測ることが可能である。一部の実施形態では、２倍〜２０倍の初期化効率の向上が観察される。一部の実施形態では、初期化効率が２０倍以上向上している。一部の実施形態では、小分子初期化試薬なしでの方法よりも、１００倍以上の効率の向上が観察される（例えば、産生した多能性細胞数が１００倍以上増加する）。
【０２１９】
一実施形態では、本明細書で意図する培養プラットフォームは、１つ又は複数の初期化因子を本明細書で意図するような細胞に導入することによって非多能性細胞を初期化することと、該細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤ならびにＴＧＦβＲ阻害剤及び／もしくはＲＯＣＫ阻害剤を含む１つ又は複数の小分子阻害剤に接触させることとを含む。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書で意図する培養プラットフォームは、１つ又は複数の初期化因子を本明細書で意図するような細胞に導入することによって非多能性細胞を初期化することと、該細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤に接触させることとを含む。
【０２２１】
別の実施形態では、本明細書で意図する培養プラットフォームは、１つ又は複数の初期化因子を本明細書で意図するような細胞に導入することによって非多能性細胞を初期化することと、該細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤に接触させることとを含むものであって、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。
【０２２２】
フィーダー細胞フリーかつ酵素的継代の培養系での、自然分化を低減させたもしくは有意に自然分化しない長期間の多能性細胞培養を可能にするために、又は、基底状態の多能性を誘導及び／もしくは維持するために、一実施形態では、ｉＰＳＣは、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及び任意にＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む細胞培地での引き続きの培養を必要とするものであって、該細胞培地は、本明細書で意図するようなＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤を含むＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない又は欠いているものである。任意の特定の理論と結びつけて考えることなしに、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を伴った多能性細胞の長期間の培養は、培養された導入遺伝子フリーのｉＰＳＣの自然分化と、終局的には基底状態の多能性の欠如とをもたらす。
【０２２３】
様々な実施形態で、２ステップの培養プラットフォームを用いて、体細胞を安定的に初期化し、培養において自然分化を低減させること、基底状態の多能性を含むことを達成する。或る実施形態では、この技術分野で開示されている任意の好適な方法によって非多能性細胞を初期化し、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で該細胞を培養することで培養における低減した自然分化を達成するように培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。一部の実施形態では、初期化した体細胞は、基底状態の多能性細胞を提供するように培養される。
【０２２４】
特定の実施形態では、この技術分野で開示されている方法によって非多能性細胞を初期化し、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で該細胞を培養することで安定的な基底状態の多能性に培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。
【０２２５】
一部の実施形態では、非多能性細胞は、１つ又は複数の初期化因子を導入することと、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することとによって初期化され、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で該細胞を培養することによって、自然分化が低減した細胞を提供するように培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。
【０２２６】
一部の実施形態では、非多能性細胞は、１つ又は複数の初期化因子を導入することと、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することとによって初期化され、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で該細胞を培養することによって、安定的な基底状態の多能性に培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。
【０２２７】
好ましい実施形態では、非多能性細胞は、１つ又は複数の初期化因子を導入することと、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することとによって初期化され、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で、該細胞を培養することによって、安定的な基底状態の多能性に培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まず、また初期化導入遺伝子の発現の有意な残留はないものである。
【０２２８】
一実施形態では、非多能性細胞は、本明細書の他の箇所に開示するようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子を導入することと、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することとによって初期化され、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で培養されるものであって、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。
【０２２９】
好ましい実施形態では、非多能性細胞は、本明細書の他の箇所に開示するようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子を導入することと、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することとによって初期化され、次いで、この初期化した体細胞は、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で培養されるものであって、該Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンであり、該培地はＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないものである。
【０２３０】
様々な実施形態で、本明細書で意図する培養プラットフォームを用いる、自然分化が低減された多能性細胞及び／又は基底状態の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製方法を提供する。
【０２３１】
特定の実施形態では、１つ又は複数の非多能性もしくは一部多能性の幹細胞を含む出発物質を用いることと、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない培地中で、１つ又は複数の多能性もしくは一部多能性の幹細胞を培養することとによって、自然分化が低減された多能性細胞及び／又は基底状態の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する。出発物質は、取得したものか又は作製したものかのいずれかであってよい。例えば、非多能性又は一部多能性の幹細胞は、市販の供給元又は他の供給源から提供されたものであってよく、又はデノボで取得したものであってよいものであり、また非多能性細胞は、組織又は有機体から単離したものであってもよく、また一部多能性細胞は、初期化体細胞又は成体幹細胞によって産生されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の培地及びプラットフォームを用いて、多能性胚性幹細胞又は体細胞核移植によって取得した多能性細胞を、基底状態の多能性を達成するように誘導してもよい。
【０２３２】
特定の実施形態では、１つ又は複数のｉＰＳＣの集団は、初期化された体細胞又は初期化された成体幹細胞を含み得る。特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、該方法を実行するか又は該方法により産生したｉＰＳＣを取得するかのいずれかによる任意の公知の方法によって、産生されてよい。
【０２３３】
ｉＰＳＣを産生する例示的な方法には、非多能性細胞内で内在性ＯＣＴ４の発現を増加させること、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１からなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを、１つ又は複数の非多能性細胞に導入すること、又は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧからなる群から選択した１つ又は複数の初期化因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入することを含むが、これに限定されない。ｉＰＳＣを産生する方法は、非多能性細胞又は一部多能性細胞をＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＴＧＦβＲ阻害剤と、任意にＲＯＣＫ阻害剤とに接触させて、１つ又は複数のｉＰＳＣを産生することをさらに含み得る。
【０２３４】
或る実施形態では、細胞培地は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む。
【０２３５】
好ましい実施形態では、細胞培地は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含むものであって、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。
【０２３６】
特定の実施形態では、例えばｉＰＳＣである１つ又は複数の多能性細胞を細胞培地中で培養することにより、基底状態の多能性、生存能、正常な核型、ゲノム安定性及び低減した自然分化率を維持又は誘導するものであって、これは少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも５０継代、少なくとも１００継代、又はそれ以上の継代であり、この間にある任意の継代数を含む継代の間、維持することが可能である。
Ｆ．多能性細胞の特性決定
【０２３７】
本明細書で意図する培養プラットフォームを用いて作製した多能性細胞は、例えば基底状態の多能性細胞又は自然分化を低減させた多能性細胞を含む、多能性細胞産物を選択すること又は実証することをさらに含み得る。この多能性細胞は、本明細書で意図する組成物及び方法による初期化とそれに次ぐ培養との後で、又は、多能性細胞が初期化されなかった場合には本明細書で意図する培養方法に多能性細胞を移行した後で、選択及び／又は実証することができる。細胞の多能性は、多能性と関連している関連の検出可能な形態学上、分子上及び／又は生物上の変化に基づいて、特徴付けられ得る及び／又は選択され得る。
【０２３８】
細胞の能力の評価の際に、独立して又は組み合わせてモニタリングされ得る細胞多能性の具体的な特性は、遺伝子発現、メチル化、ならびに例えばｉ）球状である多能性幹細胞形態、ｉｉ）ＳＳＥＡ３／４（ヒト多能性幹細胞）；ＴＲＡ１−６０／８１；ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ５０及び先述したものの組み合わせを含む多能性幹細胞マーカーの発現、ｉｉｉ）多能性幹細胞のテラトーマ形成、ｉｖ）胚様体の形成及び管内での３細胞系統への分化、及びｖ）不活性Ｘ染色体の再活性化などの、生体内及び管内における特性を含むが、これに限定されない。或る実施形態では、上記特性のうちのいずれかのサブセットを、細胞能力のモニタリングに用いる。一実施形態では、多能性細胞は、球状のコロニー形態、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１及びＯＣＴ４の発現、ならびに胚様体及びテラトーマの形成能を有することによって特性決定される。
【０２３９】
別の実施形態では、管内培養において自然分化を低減させた多能性細胞は、以下に記載する分化マーカー遺伝子のうちの１つ又は複数の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤存在下で培養した多能性細胞と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低減されていることを含む遺伝子発現特性によって特定することができる：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ、ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（ブラキウリ）及びＺＩＣ３。
【０２４０】
一実施形態では、自然分化を低減させた多能性細胞は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２及びＴＵＪ１を含むがこれに限定されない１つ又は複数の分化マーカー遺伝子の低減された発現によって特性決定される。特定の実施形態では、自然分化を低減させた多能性細胞は、１つ又は複数の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＴＵＪ１）の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤存在下で培養した多能性細胞と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低減されていることを含む遺伝子発現特性によって特定することができる。別の特定の実施形態では、自然分化を低減させた多能性細胞は、１つ又は複数の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＴＵＪ１）の発現が、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低減されていることを含む遺伝子発現特性によって特定することができる。
【０２４１】
特定の実施形態では、基底状態の多能性細胞が、Ｘｉｓｔ発現と例えばＦｏｘａ２、Ｓｏｘ１７及びブラキウリである初期の分化細胞マーカーの発現とを有意に抑制した一方で、従来法により培養した多能性細胞では、Ｘｉｓｔ発現及び有意な初期の分化マーカーの発現の抑制はごく控えめである。
【０２４２】
特定の実施形態では、基底状態の多能性細胞は、例えば少なくとも１、３、５、７、１０、１５、２０又はそれ以上などの継代である、複数の細胞継代の間、基底状態の多能性特性を保持する。
Ｇ．ポリヌクレオチド
【０２４３】
様々な例示的な実施形態で、本発明は、本明細書で意図するポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び融合ポリペプチド、及びそれを含む組成物を一部意図している。様々な他の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の初期化因子のそれぞれをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドにより、非多能性細胞を初期化することを一部意図している。本明細書に記載する培養プラットフォームとともに用いる初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＬＲＨ１、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１を含むが、これに限定されない。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で述べる初期化因子の配列を含む。
【０２４４】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子」は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エキソン等を含むポリヌクレオチド配列をいうことがある。特定の実施形態では、用語「遺伝子」は、ポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするゲノム配列と同一であるか否かにかかわらず、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をいう。
【０２４５】
本明細書で用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に起こる状態で該ポリヌクレオチドに隣接している配列から精製されたポリヌクレオチドをいい、例えばＤＮＡフラグメントであって、該フラグメントと通常隣接している配列から取り出されたＤＮＡフラグメントである。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、又は、天然に存在するものでなく人工で作製した他のポリヌクレオチドをいう。
【０２４６】
特定の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、例えばベクターであるより大きなポリヌクレオチド内に好適な順序で配置され得る。好ましい実施形態において、該ベクターはエピソーマルベクターである。
【０２４７】
本明細書で意図するポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示しているか又はこの技術分野で公知であるような、例えば発現調節配列、プロモーター及び／又はエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、更なる制限酵素部位、複数のクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル及び自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープ標識などの、他のＤＮＡ配列と組み合わせてよいため、ポリヌクレオチドの全長は、顕著に変化することがある。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチドフラグメントを採用することができるが、好ましい全長としては、予定の組換えＤＮＡプロトコルでの調製及び使用に容易であるということに限定するということを意図している。
【０２４８】
この技術分野において公知で利用可能である、確立されている様々な技術のうちのいずれかを用いて、ポリヌクレオチドを調製、操作及び／又は発現することが可能である。所望のポリペプチドを発現するために、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、適当なベクターに挿入することが可能である。ベクターの例としては、プラスミド、自己複製配列及び転移因子がある。さらなる例示的なベクターには、限定することなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、 例えばラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ及び動物ウイルスを含む。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定することなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含む。発現ベクターの例としては、哺乳動物細胞における発現にはｐＣｌｎｅｏベクター（プロメガ社（Promega））、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス介在の遺伝子導入及び発現には、ｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（インビトロジェン社（Invitrogen））がある。特定の実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドのコード配列を、哺乳動物細胞内でのポリペプチド発現用のかかる発現ベクターに結合させることが可能である。
【０２４９】
特定の実施形態では、該ベクターは、エピソーマルベクター又は染色体外で維持されるベクターである。本明細書で用いる場合、用語「エピソーマル（エピソームによる）」は、宿主の染色体ＤＮＡへの組み込みなしに、また分裂宿主細胞から徐々に失われることなしに、複製することができるベクターをいい、これはまた、当該ベクターを染色体外に又はエピソームにより複製することも意味している。該ベクターは、リンパ増殖性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス又は酵母からのＤＮＡ複製開始点又は“ｏｒｉ（複製起点）”を、特にリンパ増殖性ヘルペスウイルス又はＥＢＶのｏｒｉＰに相当するガンマヘルペスウイルスの複製起源をコードする配列を包含するように、設計される。特定の態様では、リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ（Herpes virus saimiri））又はマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）はまた、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。典型的に、宿主細胞は、複製を活性化させるウイルス複製転写活性化タンパク質を含む。
【０２５０】
発現ベクター内に存在する「発現調節配列」、「調節要素（control element）」又は「調節配列」は、それらベクターの非翻訳領域（複製開始点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン−ダルガノ配列又はコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’の非翻訳領域）であり、それは宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行するものである。かかる要素は、それらの長さ及び特異性において異なり得る。使用するベクター系及び宿主に応じて、遍在性プロモーター及び誘導プロモーターを含む、任意の数の好適な転写要素及び翻訳要素を用いてよい。
【０２５１】
用語「操作可能に連結される」は、記載の構成要素同士が、該構成要素が予定通りに機能することを許容される関係にあるような、並置（juxtaposition）をいう。一実施形態では、この用語は、発現調節配列（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）と第２のポリヌクレオチド配列との間の機能的な連結をいうものであって、発現調節配列は、第２の配列に対応する核酸の転写に向けられる。
【０２５２】
この発明の特定の実施形態における使用に好適である例示的な遍在性発現調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクチニアウイルスよりのＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、延長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、７０ｋＤａ熱ショックタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、９０ｋＤａ熱ショックタンパク質ベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、７０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／チキンβ−アクチン（ＣＡＧ（chicken β−actin））プロモーター、及びβ−アクチンプロモーターを含むが、これに限定されない。
【０２５３】
例示的な誘導プロモーター／系には、例えばグルココルチコイド又はエストロゲン受容体（対応するホルモンで処理することによって誘導可能）をコードする遺伝子のためのプロモーターなどであるステロイド誘発プロモーター、メタロチオニンプロモーター（種々の重金属により処理することによって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「遺伝子スイッチ（GeneSwitch）」のミフェプリストン調節可能な系（Sirin et al., 2003, Gene, 323:67）、ｃｕｍａｔｅ誘導遺伝子スイッチ（国際公報第２００２／０８８３４６号）、テトラサイクリン依存調節系等を含むが、これに限定されない。
【０２５４】
部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼを用いて、条件的な発現も達成することが可能である。この発明の或る実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的なリコンビナーゼが介在する組換えのために、少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位を含む。本明細書で用いる場合、用語「リコンビナーゼ」又は「部位特異的なリコンビナーゼ」は、１つ又は複数の組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の）をもたらす組換え反応において必要となる切り出しの（excisive）タンパク質もしくは組み込みのタンパク質、酵素、補因子又は関連タンパク質を含み、それは野生型タンパク質であり得るか（Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照）、又は、突然変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列又はそのフラグメントを含有する融合タンパク質）、フラグメント及びその変異形であり得る。本発明の特定の実施形態に用いて好適である、例示的なリコンビナーゼには、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｂｘｂ１、Ｔｎ３レソルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１及びＰａｒＡを含むが、これに限定されない。
【０２５５】
特定の実施形態では、本明細書で意図するポリヌクレオチドは、１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ又は複数のＩＲＥＳ配列又は自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離させることが可能である。本明細書で用いる場合、「内部リボソーム進入部位」すなわち“ＩＲＥＳ”は、例えばＡＴＧなどである、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドンへの直接の内部リボソーム進入を促進し、それによって遺伝子のキャップ非依存的翻訳につながる要素をいう。例えば、Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 及びJackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000を参照のこと。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例としては、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものが挙げられる。この技術分野で公知である“ＩＲＥＳ”のさらなる例としては、ピコルナウイルスから取得可能であるＩＲＥＳ（Jackson et al., 1990）が挙げられるが、これに限定されない。
Ｈ．ポリペプチド
【０２５６】
本発明は、ポリペプチド、融合ポリペプチド及びポリペプチドを発現するベクターを含む組成物を、一部意図している。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で述べるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、特別に異なることを説明しない限りは、区別なく使用し、従来の、すなわちアミノ酸の配列という意味に従っている。一実施形態では、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他の変異形を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え技術及び／又は合成技術のいずれかを用いて調製することが可能である。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えばポリペプチドは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質のフラグメント又は融合タンパク質を含み得、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等である、ポリペプチドの翻訳後修飾のみならず、天然由来及び非天然由来のもの両方であるこの技術分野で公知である他の修飾を含み得る。
【０２５７】
本明細書で用いる場合、「単離したペプチド」又は「単離したポリペプチド」等は、管内で、細胞環境から及び細胞の他の成分との関連からペプチドもしくはポリペプチド分子を単離及び／又は精製することをいうものであり、すなわち、有意に生体内物質と関連していないものである。
【０２５８】
一実施形態では、２つ以上のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で述べるようにＩＲＥＳ配列によって分離させることが可能である。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドは、本明細書に記載した隣接するポリペプチド間のポリペプチド切断シグナルを含む、融合タンパク質として発現可能である。例示的なポリペプチド切断シグナルには、例えばプロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、レアカット制限酵素部位認識部位（rare restriction enzyme recognition site）、自己切断リボザイム認識部位）などのポリペプチド切断認識部位、及び、自己切断ウイルス性オリゴペプチド（deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26を参照）を含む。
【０２５９】
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断ペプチドは、当業者にとって公知である（例えば、Ryan et al, 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722；Scymczak et al (2004) Nature Biotech. 5, 589-594を参照）。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus）プロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（byovirus）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２-コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、線虫媒介球状ウイルス２４Ｋプロテアーゼ、 ＲＴＳＶ（ライスツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップイエローフレックウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、Ｘａ因子及びエンテロキナーゼの切断部位を含むが、これに限定されない。その切断厳密性（cleavage stringency）が高いことに起因して、一実施形態では、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位が好ましいものであり、例えばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）であり、ここでＸは任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断が、Ｑ及びＧ間又はＱ及びＳ間で生じる）。
【０２６０】
或る実施形態では、自己切断ポリペプチド部位が、２Ａ又は２Ａ様の部位の配列又はドメインを含む（Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041）。特定の実施形態では、ウイルス性２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド又はカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０２６１】
一実施形態では、ウイルス性２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ（equine rhinitis A virus））２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１（porcine teschovirus-1））２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択する。
表２：例示的な２Ａ部位は以下の配列を含む：
【０２６２】
【表２】
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【０２６３】
好ましい実施形態においては、１つ又は複数の初期化因子ポリペプチドをコードするベクターは、各初期化因子の間に同一又は異なるプロテアーゼ切断部位を１つ又は複数含む。
【０２６４】
本明細書で引用した全ての公報、特許出願及び発行された特許は、あたかも個々の公報、特許出願又は交付された特許が、参照することによって組み入れられることをそれぞれ明確かつ独立に示したかのように、参照することによって本明細書に組み入れられるものとする。
【０２６５】
上述した発明について、例示として、また明確な理解を目的とする例としていくつか詳細を記載したが、当業者には、この発明の教示に照らして、添付の請求項の趣旨又は範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更及び変形をなすことができる、 ということが容易にわかるであろう。単に例示として、限定するものではなく、以下の実施例を提供する。当業者は、変更又は変形したとしても本質的に同様の結果を得られるものである、種々の重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０２６６】
本明細書に開示する実施例は、段階特異的な培地組成物中で小分子の経路阻害剤を用いた、ｈｉＰＳＣの急速な、平行産生、選択及び増殖のためのプラットフォームを記載している。このプラットフォームは、完全なフィーダーフリー環境下における最小限の初期化因子により、効率を支持し、かつ、エピソームでの初期化を促進した。得られたｈｉＰＳＣは、均質かつゲノム安定性である多能性集団を維持しながら、導入遺伝子を含まず、単一細胞として容易に培養され、増殖された。この実施例で意図する培地組成物中で産生又は維持したｈｉＰＳＣは、基底状態の多能性に関連した特徴を呈し、かつ、均質な産業グレード又は臨床グレードのｈｉＰＳＣ作製する、頑健で高生産性な系を象徴するものである。
実施例１−ＩＰＳＣを長期間維持及び増殖する培地プラットフォームの特定
概説
【０２６７】
ＳＭＣ４添加培養においてレンチウイルスで誘導されるｈｉＰＳＣ株の大多数が、均質な未分化細胞集団を維持するが、株のサブセット内の導入遺伝子による初期化因子をサイレンシングすることにより、長期にわたる培養で様々な段階の自然分化をみせた（図１Ａ及びＢ）。したがって、導入遺伝子発現の残留にかかわらず、連続のＦＦ培養かつ単一細胞の酵素継代中に多能性を維持するための条件を明らかにするために、様々な細胞培養成分を評価した。ｈｉＰＳＣ産生への効率的で頑健なアプローチとして、初期化と維持プロセスの様々な段階において固有の経路を標的とする多段階培養系を明らかにした。
結果
【０２６８】
ｈｉＰＳＣ株の自然分化における有意な因子として、導入遺伝子発現をサイレンシングした状態で、長期間の維持中のＴＧＦβ経路の阻害を明らかにした（図１Ｃ）。自然分化を経たことを確認したｉＰＳＣ細胞株のうちの１つを、新規の培地形態であるＦａｔｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地（ＦＭＭ）（表１）中で培養するように移行させた。自然分化を取り除き、均質なＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞集団を、２〜３継代以内で樹立した（図１Ａ）。
【０２６９】
従来法による培養（ＭＥＦフィーダー細胞上のｈＥＳＣ培地）中、ＦＦ培養のＳＭＣ４添加培地中、又はＦＦ培養の新規に調製したＦＭＭ中で、ＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２（ＯＫＳ）レンチウイルスでの初期化も比較した（図１Ｄ）。レンチウイルスでの初期化の誘導後１７日目に、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞を、ＦＡＣで選択し、比較のためにＳＭＣ４又はＦＭＭ中に再度播いた（図１Ｄ）。ＳＭＣ４が初期化反応速度を向上させ、有意に、誘導の１７日後のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞が、ＦＭＭによる初期化よりも多く得られた（２．７２％に対して、ＦＭＭでは０．７６％及び従来法による培養では０．１０％。図１Ｄ）。
【０２７０】
最初の選別後、それぞれの各条件で細胞を１０日間維持し、第２のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性のフローサイトメトリー選択が続いた（図１Ｄ）。培養液をさらに９日間（感染後、合計３６日）維持し、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの共発現に基づいて未分化コロニーをスコア化した（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＳＭＣ４での最初の初期化に次いで、ＦＭＭへの移行を組み合わせることで、ＳＭＣ４での連続的な維持と比較して、終局的により多くのＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陽性コロニーが得られ、かつ、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陰性コロニー数が有意に低減した（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＦＭＭだけで維持する培養では、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陽性コロニーが検出されたが、該コロニーの数及びサイズは、段階特異的な培地によるアプローチに劣ることがわかった。
【０２７１】
これら結果は、初期化と維持プロセスとの様々な段階において固有の経路を標的とする新規の多段階培養系により、高品質のｈｉＰＳＣの効率的な作製がもたらされる、ということを示している。
実施例２−単一細胞の継代及びＦＦフォーマットでの導入遺伝子フリーのｈｉＰＳＣ作製に関するプラットフォーム
概説
【０２７２】
エピソーマルベクター系を用いた非組み込みの初期化方法の効率の効率は、特にＦＦ環境下で、極めて低い（＜０．００１％）（Narsinh et al., 2011; O'Doherty et al., 2013）。ＳＭＣ４及び初期化を向上させることを示す培地添加物を含有するＦａｔｅ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ培地（ＦＲＭ）と、ＦＭＭとである２つの培地を含む多段階培養系で、エピソームでの誘導を試験した（図２Ａ及び表１）。
結果
【０２７３】
ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＫＬＦ４／ＬＩＮ２８／ＭＹＣ／ＳＶ４０ＬＴ（ＯＳＮＫＬＭＴ）の遺伝子の組み合せからなるエピソームでの発現系を用いて、様々な繊維芽細胞をトランスフェクトした。エピソームでの発現の誘導後２４時間で、初期化培養をＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高める。最初の１週間以内かつ１０日までに、初期のコロニー形成が観察され、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞の大きい集団が検出された（＞１％）（図８Ａ及び８Ｂ）。１４日目、ＦＲＭで支持していた初期化培養を、ＦＲＭ又はＦＭＭ培地のいずれかに分割した。２１日目、ＦＡＣＳを用いて、培養内のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞を明らかにした（図８Ｃ）。ＦＲＭで維持した培養は、分化細胞及び未分化細胞の両方を含んでいたが、ＦＭＭ培養に含まれていたのは、大部分が未分化細胞であった（図８Ｄ）。
【０２７４】
このアプローチの生産性及び頑健性について、異なる年齢、性別及び人種のドナーからの最少量の臍帯血から増殖させた繊維芽細胞及びＣＤ３４＋細胞で試験した（図９Ａ及び９Ｂ）。体細胞の初期化は、図２Ａに概説するように、エピソーマル遺伝子の組み合わせセットＯＳＮＫＬＭＴにより誘導し、１６日から２１日の間に、個々のｈｉＰＳＣに９６ウェルプレートフローサイトメトリー選別をした（図２Ｂ）。試験した株の大多数に関して、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞の大きい集団が観察された。従来法による培地かつフィーダー細胞を用いた平行した初期化実験と比較して、ＦＲＭ及びＦＭＭ培地系では、ｈｉＰＳＣクローン数の有意な増大をもたらした（ＦＴＣ００７繊維芽細胞株では、ＦＲＭ／ＦＭＭ中で８．５５％に対して、従来法による培養液中で０．０２％。図２Ｂ及び２Ｃ）。体細胞系毎に、９６ウェルプレート当たり平均２２個のクローンｈｉＰＳＣが確認され（図２Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ）、ＳＭＣ４培地でのレンチウイルスによる初期化に対して不応となることが予め観察されている繊維芽細胞ＦＴＣ００８を含んでいた。次いでコロニーは、ＮＡＮＯＧに関して、細胞内及び表面のマーカー発現及びダイレクトｑＲＴＰＣＲを分析することによって、真のｈｉＰＳＣクローンとして確認された（図２Ｄ、２Ｅ及び１０Ｃ）。９６ウェル選別及び選択プロセスを用いた初期化効率もまた、増加した（図２Ｅ）。同様の初期化効率は、既知組成の表面被覆ビトロネクチンでも観察された（図１０Ｄ）。
【０２７５】
これらデータにより、エピソームでの初期化に適用され、かつ、高生産性な方式で平行して実行しようとする多段階の初期化実験が可能である場合に、最小の労力で、ｉＰＳＣ最終産物の品質の妥協がない、上記プラットフォームが頑健かつ再現性をもったことがわかった。
実施例３−ＦＭＭ中での導入遺伝子フリーのｈｉＰＳＣ株の長期間継代及び増殖
概説
【０２７６】
ＦＲＭ及びＦＭＭの多段階培地プラットフォームを用いたｈｉＰＳＣの長期間継代及び増殖について、実施例２のｈｉＰＳＣクローンを用いて実験し、ＦＦ培養で単一細胞として増殖させた(図３Ａ及び３Ｂ）。
結果
【０２７７】
実施例２に従って初期化したｈｉＰＳＣ株は、４〜７継代でエピソーマルＤＮＡを失うため、多能性は、導入遺伝子ベースの初期化因子とは独立である（図３Ｃ）。このｈｉＰＳＣ株は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ陽性である均質な未分化細胞の集団を維持した。さらに、これら株は、多能性培養液中で通常用いられる任意の精製戦略（図３Ｄ及び３Ｅ）が欠如した状態で、多能性特性を維持した（図３Ｆ）。同様の均質なｈｉＰＳＣ培養の増殖は、ルーチンな単一細胞の継代培養中に、マトリゲルを既知組成の表面被覆ビトロネクチンで置換した場合に観察された（図１０Ｅ〜１０Ｇ）。
【０２７８】
ＦＦ環境で単一細胞として培養したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株において、ゲノム異常性がしばしば検出された（Laurent et al., 2011; Taapken et al., 2011）。ＦＭＭ培養では、分析された全てのｈｉＰＳＣ株の核型分析でゲノム安定性を示した（図４Ａ）。さらに、単一細胞かつＦＦで培養したｈｉＰＳＣクローンは、延長期間（２５〜３０継代）の間、ＦＭＭ中で維持され、培養液の精製又は選択を必要とすることなく、それらの未分化プロファイル及びゲノム安定性を維持し続けた（図４Ｂ）。
【０２７９】
ＦＭＭ中で維持したエピソームで誘導したｈｉＰＳＣクローンはまた、容易に、全ての３体細胞系、胚様体を経由した管内分化、及びテラトーマ形成による生体内分化を生じた（図４Ｃ〜Ｅ）。
【０２８０】
これらデータは、ＦＲＭ及びＦＭＭの多段階培地プラットフォームが、多能性かつゲノム安定性である細胞の均質な集団を維持しながら、ＦＦかつ単一細胞の酵素継代形態において、導入遺伝子フリーのｈｉＰＳＣクローンを容易に産生及び増殖させることができる、ということを実証した。
実施例４−最小限の遺伝子によるエピソーマル初期化を可能とする多段階培地プラットフォーム
概説
【０２８１】
例えばＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＬＩＮ２８である癌遺伝子に対する低減した依存性をもつ、又は、初期化プロセスでＰ５３をノックダウンする必要性をもつ、フットプリントフリーの効率的な発現系は、多能性幹細胞療法に関して高い価値をもつこととなる（Lee et al., 2013; Okita et al., 2011; Yu et al., 2009）。多段階培地プラットフォームが、ＯＳＮＫＬＭＴの初期化因子を用いて、導入遺伝子フリーのｈｉＰＳＣ細胞の産生及び増殖に関して極めて効率的で頑健であるプラットフォームを実証したという理由から、プラットフォームの頑健性を、初期化因子に関する要件に対して測定した。
結果
【０２８２】
遺伝子発現の組み合わせ及び用量を変更しようとする試みにおいて、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２（ＯＮＳ）、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２（ＯＳ）又はＯＣＴ４／ＯＣＴ４（２ｘＯ）を含ませて、最小限の遺伝子セットを含有するいくつかのエピソーマル発現カセットを構築した（図５Ａ）。繊維芽細胞の細胞株を、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＳＶ４０ＬＴの組み合わせと共にトランスフェクトし、ＦＲＭ／ＦＭＭプラットフォームを用いて培養した。ＳＶ４０ＬＴのみ、初期化の１３日目の時点で、真のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞を何も産生しなかったが、トランスフェクション後の細胞生存能は向上した（図５Ｂ及び１１Ａ）。初期化プロセスの初期におけるＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性集団の発生が実証しているように、種々の初期化因子の組み合わせにより、効率的な初期化がもたらされた（１３日目までに、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴで＞０．５％、及びＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴで＞３．５％。図５Ｂ）。初期化因子の化学量論の効果は、ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ（０．１％：１．０３％）を用いた初期化の効率を比較すること；２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（１．０３％：３．５３％）；２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（０．５８％：３．５３％）；ＯＮＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔを比較すること（０．６％：１．０３％）；及びＯＳ＋Ｔ対２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔを比較すること（０．０６％：０．５８％）によって示されたが、これは一貫して、初期化に対して２ｘＯを加えることの価値を示していた。初期化因子の化学量論の効果は、ベクター及び／もしくはベクターの組み合わせ内でＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドの数、ＯＣＴ４を含む複数のベクターの組み合わせ、ならびに／又は、ＯＣＴ４とトランスフェクションのための同一のベクターもしくは全てのベクターに含まれる他の初期化因子との間の比から、明らかである。更なる日数の間初期化された培養は、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性集団を有意に増加させた（１６日目までに、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴで＞４．０％。図１１Ｂ）。驚くべきことに、観察した初期化細胞の百分率は、癌遺伝子ＫＬＦ４及びＭＹＣを含有するレンチウイルスで誘導した系及びエピソームで誘導した系に匹敵した（図２Ｂ、５Ｂ及び１１Ｂ）。
【０２８３】
いくつかの初期化因子の組み合わせを先に進めて、フローサイトメトリー選別及び個々のｈｉＰＳＣクローン選択の前に、ＦＭＭ培地に移行した。ＯＳＮＫＬＭＴのエピソームでの初期化と同様に、クローンｈｉＰＳＣ株は、最小限の遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＳＶ４０ＬＴ（２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ）を含有する組み合わせのみならず他の組み合わせから容易に誘導された（図５Ｃ）。５〜７継代で導入遺伝子及びエピソーマルベクターのマーカーを失ったｈｉＰＳＣクローンを、更なる分析のために先に進めた（図５Ｄ）。選択したクローンは、ＦＦ環境中で単一細胞として連続的に継代させて、ゲノム的に安定である均質な未分化細胞の集団を維持し、効率的に３体細胞系に分化する能力を示した（図５Ｅ〜Ｊ）。
【０２８４】
まとめると、これらデータによれば、ｈｉＰＳＣは、ＦＲＭ／ＦＭＭ、フローサイトメトリーベースの初期化プラットフォームにおいて、最小限の初期化遺伝子の一時的発現（transient expression）によって容易に産生するということを示している。
実施例５−基底状態の多能性を支持するＦＭＭプラットフォーム
概説
【０２８５】
ＦＭＭプラットフォームをさらに評価するために、既存の方法で初期化した体細胞の遺伝子発現特性を、本明細書で意図するＦＭＭプラットフォームにより初期化した体細胞の遺伝子発現特性と比較した。小分子間での遺伝子発現の差異と、従来法で維持したｈｉＰＳＣ培養（Hanna et al., 2010b; Saha and Jaenisch, 2009）とを評価した。
結果
【０２８６】
１セットの実験において、介在する小分子と従来法による培養との間にある遺伝子発現パターンを評価した。レンチウイルス誘導ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ１１１が、小分子培養液中で産生及び維持されて、多能性となることを示した。該クローンは、ｉ）フィーダー細胞をもつ従来法による培地と、ｉｉ）フィーダー細胞をもつ又はＦＦ表面上の、小分子阻害剤含有培地とを含む、種々の培養環境中で直接解凍した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。従来法による培養のｈｉＰＳＣクローンは、チアゾビビン、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で回復のみさせ、次いで回復した細胞を、凝集塊培養に切り替えた（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。培養条件の各セットで、固有のコロニー形態（図１２Ｄ）及び多能性マーカーに対する遺伝子発現の特徴的パターン（図１２Ｅ）が実証された。従来法によりフィーダー細胞上で維持した培養では、小分子中で維持したその対応する培養のものよりも、従来法による培養で維持されたｈＥＳＣ対照Ｈ１及びＨＵＥＳ９に、よりよく類似していた（図１２Ｅ）。これらデータにより、介在する小分子と従来法による培養との間において、特徴的な遺伝子発現パターンが存在しているということがわかった。
【０２８７】
レンチウイルスでの誘導かつ従来法によるＥＳＣ／フィーダー培養を用いて誘導したｈｉＰＳＣと、エピソームで誘導した株との間において、またＦＲＭ／ＦＭＭプラットフォーム中で維持した初期化因子の異なる組み合わせにより誘導したエピソーマル株間において、遺伝子発現における差異についても評価した。高含量ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、多能性と分化とに関連する遺伝子発現を定量化した。調査した多能性遺伝子の大多数が、ＦＭＭ培養中又はフィーダー細胞を含有する従来法による培養中で維持したｈｉＰＳＣ間において比較可能な発現パターンを呈した（図６Ａ）。しかしながら、分化に関連する遺伝子の評価において、細胞株間における差異が観察された（図６Ｂ）。ＦＭＭで維持したｈｉＰＳＣは、従来法による培地中かつフィーダー細胞上で維持したｈｉＰＳＣ及びＨ１  ｈＥＳＣの両方と比較した場合に、３体細胞系に関連する大多数の遺伝子についてのより低い発現を呈した。エピソーマル遺伝子セットＯＳＮＫＬＭＴにより誘導した株のサブセットが、外胚葉系統、ＯＴＸ２及びＴＵＪ１の発現をみせるようであった一方で、この発現は、Ｌｉｎ２８、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣの使用なしにエピソームで誘導されたｈｉＰＳＣにおいては、ごくわずかであった（図６Ｂ）。驚くべきことに、試験した全ての分化遺伝子の発現は、最小限のエピソーマル遺伝子セット由来の全てのｈｉＰＳＣにおいて完全に抑制され、かつＦＭＭ中で維持された（図６Ｂ）。それと共に、これらデータは、ＦＲＭ／ＦＭＭプラットフォームが、エピソームベースの初期化因子がほとんどない状態で、頑健に細胞を初期化することが可能であり、基底状態の多能性状態にあるｈｉＰＳＣを維持することが可能であるということを示唆した。
【０２８８】
次の方法から誘導したｈｉＰＳＣに関して、全般的な遺伝子発現パターンを確認した：ｉ）ＦＭＭで維持した、エピソームでの誘導、ｉｉ）ＦＭＭで維持したが３継代の間は従来法による培地に切り替えた、エピソームでの誘導、ｉｉｉ）ＳＭＣ４で維持した、レンチウイルスでの誘導、及びｉｖ）従来法による培養で維持した、レンチウイルスでの誘導（図１３Ａ、１３Ｂ）。遺伝子発現プロファイルを評価する前に、全ての株について、多能性、ゲノム安定性、及び３体細胞系全てへの分化能があることを確認した。小分子培養と従来法による培養との間における変動的に発現した遺伝子のクラスター分析により、ｈｉＰＳＣ株が、元の導出方法及び培養によってではなく、現在の培養条件に基づいて、グループ化されたということが明らかになった（図１３Ｂ）。２．５倍である発現差を呈する３００遺伝子についての遺伝子オントロジー分類により、従来法による培養群では、主カテゴリーとしての分化及び成長が大きく富化され、一方、小分子の培養群で上方制御された遺伝子の大部分が、細胞増殖及び性分化の調節と関連している（図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ということが特定された。
【０２８９】
遺伝子発現分析を繰り返し、ＦＭＭ培養系、従来法による培養系、又は移行培養系を直接比較した（ＦＭＭ、Ｃｏｎｖ．、ＦＭＭ→Ｃｏｎｖ．、Ｃｏｎｖ．→ＦＭＭ。図１３Ａ）。クラスター分析により、産生方法又は以前の培養系にかかわらず、現在の培養系に基づいて分けられた２つの群が生じた（図７Ａ）。例えば、ｈｉＰＳＣクローンＦＴＣ０１６−ｃ２８は、従来法による培養に移行する前は、ＦＲＭ／ＦＭＭプラットフォーム下で産生及び維持した。このクローンは、ＦＭＭ中で維持したその親株によってではなく、従来法による培養だけで維持された培養でグループ化され、比較可能な結果が、従来法による培養で産生し、かつ、ＦＭＭに移行されるまで従来法によるセット内にグループ化されて、そこでＦＭＭクラスター内にグループ化されていたものである、例えばＯＫＳレンチウイルス誘導ｈｉＰＳＣクローンなどの株で確認された（図７Ａ）。遺伝子オントロジーにより、従来法による培養は、分化及び成長と関連する遺伝子を富化しようとするものと分類された（すなわち、ｐ値＝２．２Ｅ−１０、ｐａｔｔｅｒｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ（パターン特定プロセス）；図７Ｂ及び１３Ｅ）。まとめると、これらデータにより、分化傾向に関連する遺伝子がＦＭＭ培養で有意に低減するため、ｈｉＰＳＣは、ＦＭＭ培養プラットフォームに順応させて自然分化能を低減させることが可能である、ということがわかった。
【０２９０】
基底状態及び準安定状態のヒト多能性幹細胞を表すために、遺伝子一覧をまとめた（De Los Angeles et al., 2012；Han et al., 2011；Hanna et al., 2010a；Hirata et al., 2012；Nichols and Smith, 2012；Valamehr et al., 2012；Zhou et al., 2010）（図７Ｃ）。これら遺伝子一覧に基づく遺伝子クラスタリングを、ＦＭＭ又は従来法による培養におけるｈｉＰＳＣ株に対して実行した（図７Ｄ）。全ての遺伝子発現の比較と同様に、着目した遺伝子のクラスタリングにより、相互交換可能でありそうなプロファイルを伴う現在の培養条件に基づいて、細胞株が分離されることがわかった。例えば、ＦＭＭから従来法による培養に移行させたｈｉＰＳＣクローンＦＴＣ０１６−ｃ２８は、ＦＭＭ中で維持したその親ｈｉＰＳＣ株ではなく、Ｈ１  ｈＥＳＣでグループ化された（図７Ｄ）。同様に、従来法による培養で維持した繊維芽細胞株由来のレンチウイルスｈｉＰＳＣクローンは、従来法による培養のＨＵＥＳ９  ｈＥＳＣ及び他のｈｉＰＳＣクローンでグループ化されたが、ＦＭＭに切り替える場合には、他のＦＭＭ培養株のみならず臍帯血由来のエピソーマルｈｉＰＳＣでグループ化された（図７Ｄ）。２つのクラスター内での、基底状態及び準基底状態を表す遺伝子の分布は、プローブセット毎に、小分子（ＳＭＣ４／ＦＭＭ）対従来法による培養で、平均強度をプロットすることによって決定した（図７Ｅ）。驚くべきことに、基底状態に関連する遺伝子の大部分が、小分子培養クラスターにおいて発現の向上をみせ、従来法による培養クラスターにおいて、準安定状態に関する遺伝子の発現の増加が検出された（図７Ｅ）。
【０２９１】
従来法による培養で培養及び維持したｈｉＰＳＣのＸ染色体不活性化状態を、小分子培養に順応させて１０継代の間維持したその対応するものと比較した（図７Ｆ）。小分子培養中で維持したｈｉＰＳＣは、従来法による培養と比較して、Ｘ染色体遺伝子発現の増加をみせたが、これはサイレンシングしたＸ染色体の再活性化を示唆している（図７Ｆ）。注目すべき例外は、小分子培養への切り替えの際に下方制御された、Ｘ染色体不活性特異転写（ＸＩＳＴ（X-inactive specific transcript））であった（図７Ｆ）。Ｘ染色体の活性化のさらなる証拠が、従来法による培地に順応させたそれらの対応するものの培養に対する、ＦＭＭで培養したｈｉＰＳＣにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の分染によってもたらされた（図７Ｇ）。ＦＭＭにおけるｈｉＰＳＣの大部分はＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色を欠いていたが、一方、従来法による培養におけるｈｉＰＳＣの大部分は、縮小した核サイズの外観を伴うＨ３Ｋ２７ｍｅ３の核焦点を呈したものであり、これはＸ染色体不活性化を示唆していた（従来法による培養で、＞９０％のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色であったのと比較して、ＦＭＭでは、＜１０％のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色であった。図７Ｇ）。
実施例６−小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持
【０２９２】
誘導されたｈｉＰＳＣ（ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２、ＯＣＴ４／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１又はＯＣＴ４／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１／ＥＳＲＲＢ／ＮＡＮＯＧを含む初期化因子の種々の組み合わせにより誘導される繊維芽細胞又は血液細胞）は、培養密度が７５〜９０％に達したら、単一細胞としてルーチンに継代した。単一細胞の解離のために、ｈｉＰＳＣをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）で一度洗浄し、３７℃で３〜５分間、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社（Millipore））で処理し、次いで単一細胞の解離を確実にするためにピペッティングした。その後単一細胞の懸濁液を、従来法による培地と同量で混合し、２２５ｇで４分間遠心分離し、Ｆａｔｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地（ＦＭＭ）中で再懸濁させ、ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（ｈＥＳＣ最適化）マトリゲル（コーニング（Corning）社）で被覆した表面上に播いた。マトリゲルは、製造元の指示通りに表面を被覆するように調製及び使用した。継代は典型的には１：３〜１：６であり、組織培養プレートは、３７℃で１〜４時間の間マトリゲルで予め被覆し、２〜３日毎にＦＭＭを与えた。細胞培養は、３７℃かつ５％ＣＯ２で設定した炭酸ガス培養器内で維持した。従来法による培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、２０％ノックアウト血清代替品（Knock-Out Serum Replacement）（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies））、１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、１×可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ）（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）及び１００μＭのβ−メルカプトエタノールからなる。ＦＭＭは、５μＭのチアゾビビン（自家合成したもの）、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ライフテクノロジーズ社）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈＬＩＦ（ミリポア社）を添加した、従来法による培地からなる。ＦＭＭで増殖した培養のフロー分析及び形態を、図１８Ａ〜Ｄ及び図１９Ａ〜Ｂに示している。ＦＭＭで増殖した細胞もまた、図２０Ａ〜Ｄに示すように、多段階継代にわたって正常核型を示した。
実施例７−小分子培養における最小限の遺伝子による初期化
【０２９３】
初期化を開始するために、初期化因子の異所発現を、ＮＩＬを用いたレンチウイルスでの形質導入、従来のレンチウイルス組み込み、又はエピソーマルベクターによるエレクトロポレーションによって誘導した。図１４Ａ〜Ｂに示すように、レンチウイルスによる発現系は、組み込まれた導入遺伝子に対してＣＲＥによる切り出しが許容されるように、ＥＦ１αプロモーター、特異遺伝子の組み合わせ（表３）及び３’末端におけるＬＯＸＰ部位を含むいくつかの特徴からなるものであった。ＣＲＥによる切り出しにより、誘導されたｈｉＰＳＣのゲノムはもはや導入遺伝子を含まず、本質的にフットプリントフリーとなった。図１４Ｃ〜Ｆに示すように、エピソーマルコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター及び固有の初期化因子を含む、固有の特徴を有した。トランスフェクションにより、エピソーマルコンストラクトは、核内に存在し、ゲノムに組み込まれたものではない一次的に介在する（trans-mediated）方式で挙動した。
【０２９４】
レンチウイルスによる感染のため、製造元の指示通りに、マトリゲル（コーニング社）で被覆した６ウェルプレートのウェルあたり７ｘ１０４〜１ｘ１０５細胞で、開始ヒト繊維芽細胞を播種した。２９３Ｔ細胞からの新しいレンチウイルスの上清を、１：２希釈（レンチウイルス上清部：繊維芽細胞培地部）で、開始細胞に加えた。ＮＩＬウイルス上清は、１×濃度で希釈せずに用いた。事前に凍結していたウイルスを用いる場合は、希釈せずに、１×濃度で用いた。ウイルス上清の種々の因子を、６ウェル当たり合計２ｍＬの培地を最大として組み合わせた（表３）。これに５μｇ／ｍＬのポリブレン（ミリポア社）及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ＭｅｄｉＴｅｃｈ社）を添加して、次いでスピンインフェクション法を行った。６ウェルプレートをパラフィルムで封止し、３２℃、６００ｇで９０分間遠心分離した。その後プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２の培養器に１２〜１６時間移行した。レンチウイルスによるインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地は、Ｆａｔｅ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ媒地（ＦＲＭ）部と繊維芽細胞培地部とを含有した５０／５０培地に切り替えた。培地は、感染後４〜６日の間に、完全にＦＲＭに切り替えた。ＦＲＭは、５μＭのチアゾビビン（自家合成したもの）、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、２μＭのＳＢ４３１５４２（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ライフテクノロジーズ社）、１０ｎｇ／ｍＬのｈＬＩＦ（ミリポア社）、１×Ｎ２サプリメント（ライフテクノロジーズ社）及び１×Ｂ２７サプリメント（ライフテクノロジーズ社）を添加した、従来法による培地（上記に記載した）からなる。ウェルがコンフルエントになったら、予めマトリゲルで被覆した１０ｃｍディッシュ上に、細胞を継代した。継代は、マトリゲル被覆表面（上記に記載した）に対するＡｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社）での解離からなるものとした。１４〜１８日の間、又は、ｉＰＳＣコロニーが存在するようになったら、培地をＦＲＭからＦＭＭに切り替えた。単一細胞に解離した細胞を、ＦＭＭを伴うマトリゲル被覆プレート上に増殖させ、フローサイトメトリー選別まで維持した。ｈｉＰＳＣ表現型の発現の結果を、表３、図１５Ａ〜Ｃ（８〜１５日目）、図１６Ａ〜Ｄ及び図１７Ａ〜Ｂ（４週目のＯｃｔ４／Ｅｃａｔ１／ＵＴＦ１／Ｅｓｒｒｂ／Ｎａｎｏｇ）に示している。図２４は、ＣＲＥによる切り出し後の、ｉＰＳＣ表現型を示す、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋／ＣＤ３０＋の９６ウェルプレートに選別されたクローンの画像を示している。これらコロニーは、起源をヒト繊維芽細胞由来とするｉＰＳＣクローンから選別され、レンチウイルス因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより初期化され、その後導入遺伝子を切り出した。当業者は、本明細書に記載の方法、組成物及び産物が、例示の実施形態を表すものであり、この発明の範囲を限定するものではないということを容易に理解するであろう。当業者にとっては、この発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な代替及び変形が本明細書に開示された本開示を成し得るという���とが容易に明らかであるだろう。
表３：初期化因子の組み合わせ及び多能生表現型の発現
【０２９５】
【表３】
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【０２９６】
エピソーマルベクターの初期化のため、図１３に示すプラスミドを用いた繊維芽細胞又は臍帯血細胞のトランスフェクションを、ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（NEON Transfection System）（ライフテクノロジーズ社）を用いて行った。製品マニュアルに記載されているように、適当なバッファー中で、設定値１６５０ｖ／１０ｍｓ／３パルスを用いて、初期化因子を含有する概ね合計３μｇのエピソーマルプラスミドを、ＥＢＮＡ（ｍＲＮＡの形で又はクローニングプラスミドｐＣＤＮＡ中のカセットとしてのいずれかで）と共に、５×１０５の繊維芽細胞又は２．５×１０５の臍帯血細胞に同時にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、抗生物質なしに、４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））を添加した、繊維芽細胞培地又は臍帯血培地のいずれか（細胞型による）を含有する、マトリゲルで被覆した６ウェルプレートのうちのあるウェル上に直接播種した。臍帯血培地は、ＳＦＭＩＩ＋ＣＣ１１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）からなる。トランスフェクション後２４時間で、ＦＲＭを同量で培養液に添加した。繊維芽細胞培養のため、トランスフェクション後４８時間で、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（コーニング社）を、培養に添加した。トランスフェクションの５日目に培地をＦＲＭに完全に切り替え、７日後にハイグロマイシンを除去した。トランスフェクションの１４日後に、全ての初期化培地をＦＭＭに切り替えた。臍帯血培養のため、トランスフェクションの２４時間後に、ＦＲＭを同量で添加し、トランスフェクション後１４日目まで数日毎に継続的に添加したが、この培養は吸引されて、ＦＭＭで完全に置換された。いずれの場合においても、トランスフェクションのおよそ５〜７日後に、球状の接着細胞クラスターが確認された。ＦＭＭでは、全ての初期化培養を維持し、マトリゲル被覆表面（上記に記載した）上のＡｃｃｕｔａｓｅを用いて、単一細胞で継代した。単一細胞に解離した細胞を、ＦＭＭを伴うマトリゲル被覆プレート上に増殖させ、フローサイトメトリー選別まで維持した。
実施例８−初期化因子及びそれらの化学量論の影響
【０２９７】
ヒト繊維芽細胞は、いくつかの初期化因子を含有するレンチウイルスによりスピン感染させた。全てのサンプルを、抗生物質選択因子を含有せずにレンチウイルスプラスミドを用いて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＶ４０ＬＴで感染させた。細胞は、種々の初期化因子のみならずピューロマイシン選択カセットを含有する、１つのレンチウイルスプラスミドで同時に感染した。これら因子は、ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＳＯＸ２、ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＮＡＮＯＧ−Ｔ２Ａ−ＳＯＸ２又はＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＯＣＴ４のいずれかを含んだ。感染の２日後に、５０／５０培地中の５００ｎｇ／ｍＬのピューロマイシン（ライフテクノロジーズ社）を、各ウェルに加えた。５日目であって、ピューロマイシン選択から３日後に、培地を、ピューロマイシンを含まないＦＲＭに変更した。１４日目、培地をＦＭＭに切り替えた。２４〜２７日目の間に、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋集団に関してフロー分析を行った。コンストラクト内にＯＣＴ４をコードする複数のポリヌクレオチドを使用すること、又は同一ベクター内で繰り返されるＯＣＴ４ポリヌクレオチドを使用することを含む、ＯＣＴ４発現を増加させることによって、初期化効率が有意に向上したことが観察された（図２３Ａ）。
実施例９−実験手順
【０２９８】
従来法による培養系でのｈｉＰＳＣの維持
【０２９９】
従来法により培養されるｈｉＰＳＣは、マイトマイシンＣ処理したＭＥＦ（ミリポア社）のフィーダー細胞上に維持し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、２０％ｖ／ｖノックアウト血清代替品（ライフテクノロジーズ社）、１％ｖ／ｖ可欠アミノ酸（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、１００μＭのβ−メルカプトエタノール（ライフテクノロジーズ社）及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ライフテクノロジーズ社）を含有する従来法による培地（本明細書中で従来法による培地と称する）により培養した。コンフルエントになったら、従来法により培養されたｈｉＰＳＣを、１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼＩＶ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、３７℃で７分間、酵素的に解離させ、次いで機械的な解離で小片にして（凝集塊継代と称する）、回収し、従来法による培地を毎日加えると共に５〜７日毎に新しく播種されるフィーダー細胞上に、１：３〜１：４で希釈継代した。過剰な自然分化の場合には、コロニーを人手により採取して、インスリン用シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて小片に切断し、新しく播種したフィーダー細胞に移行する。細胞培養は、３７℃かつ５％ＣＯ２で設定した炭酸ガス培養器内で維持した。
【０３００】
体細胞の初期化
【０３０１】
初期化を開始するために、初期化因子の異所発現を、レンチウイルスでの形質導入又はエピソーマルベクタートランスフェクションによって誘導した。レンチウイルスでのトランスフェクションは、先の記載に従った（Valamehr et al., 2012）。簡潔にいえば、開始細胞は、マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）被覆表面上の６ウェルプレートのウェル当たり１×１０５細胞で播いた。明記しない限り、全てのマトリゲル被覆は、マトリゲル溶液（２５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁させた１分注のマトリゲル）を組織培養表面に加えることと、３７℃で２〜４時間のインキュベーションを許容することとからなる。２９３Ｔ細胞が産生する、導入遺伝子ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現するレンチウイルスからの上清を、１：２希釈（レンチウイルス上清部：繊維芽細胞培地部）で開始細胞に加え、４μｇ／ｍＬのポリブレン（ミリポア社）を添加し、１２〜１６時間の間、３７℃かつ５％ＣＯ２に移行させた。繊維芽細胞培地は以下の通りである：ＤＭＥＭ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社）、１×グルタマックス（glutamax）（ライフテクノロジーズ社）、１×可欠アミノ酸（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）。レンチウイルスと共にインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、繊維芽細胞培地を与えた。トランスフェクションの４８時間後、培地は、ＦＲＭ（又はＳＭＣ４）部及び繊維芽細胞培地部を含有する５０／５０培地に切り替えた。通常、感染後４〜６日で、培養をより大きい容器に継代したら、培地をＦＲＭ（又はＳＭＣ４）に完全に切り替えた。継代は、マトリゲル被覆表面（以下に記載した）上へのＡｃｃｕｔａｓｅによる解離からなる。培養は、次の処理までＦＲＭ（ＳＭＣ４）中で維持した。
【０３０２】
エピソーマルベクターでの初期化のため、遺伝子セットＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＫＬＦ４／ＬＩＮ２８／ＭＹＣ／ＳＶ４０ＬＴ（Ａ１４７０３、ライフテクノロジーズ社）を用いた繊維芽細胞又は臍帯血細胞のトランスフェクションを、ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ社）を用いて行った。製品マニュアルに記載されているように、適当なバッファー中で、設定値１６５０ｖ／１０ｍｓ／３パルスを用いて、概ね４μｇのベクターセットを５×１０５の繊維芽細胞又は２．５×１０５の臍帯血細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤバイオサイエンス社）を添加した、繊維芽細胞培地又は臍帯血培地のいずれか（細胞型による）を含有し、かつ、マトリゲルで被覆した、１０ｃｍディッシュ（繊維芽細胞）又は６ウェルプレート（臍帯血）のうちのあるウェルに直接播いた。臍帯血培地は、以下の通りである：ＳＦＭＩＩ＋ＣＣ１１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。トランスフェクションの２４時間後に、ＦＲＭを同量で培養に加えた。繊維芽細胞培養のため、トランスフェクションの４８時間後に、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）を、培養に加えた。培地は、トランスフェクション後５日目にＦＲＭに完全に切り替え、７日目にハイグロマイシンを除去した。トランスフェクションの１４日後に、全ての初期化培地を、ＦＭＭに切り替えた。臍帯血培養のため、トランスフェクションの２４時間後に、ＦＲＭを同量で加え、トランスフェクション後１４日目まで数日毎に継続的に加えたが、この培養は吸引されて、ＦＭＭで完全に置換された。いずれの場合においても、トランスフェクション後およそ５〜７日目に、球状の接着細胞クラスターが確認された。ＦＭＭでは、全ての初期化培養を維持して、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一細胞で継代した。単一細胞に解離した細胞を、ＦＭＭを伴うマトリゲル被覆プレート上に増殖させ、フローサイトメトリー選別まで維持した。ビトロネクチン（ライフテクノロジーズ社）で表面被覆した試験では、全ての態様を同様に保持したが、ビトロネクチンをマトリゲルの代替とした点が異なる。低減させた因子のエピソームでの初期化のため、ｐＣＥＰ４（ライフテクノロジーズ社）ベクターの骨格は、ＥＦ１αプロモーターの調節下で、ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＯＣＴ４、ＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＳＯＸ２又はＯＣＴ４−Ｐ２Ａ−ＮＡＮＯＧ−Ｔ２Ａ−ＳＯＸ２を含有するように構成した。低減させた因子のエピソーマルベクターでのトランスフェクションのため、いくつかの変形を除いて、上記に記載した同一のプロトコルに従った。ＥＢＮＡを、ＥＢＮＡ  ｍＲＮＡ（２０μｇ）又はベクターカセット（２μｇ）（Howden et al., 2006）のいずれかとして同時にトランスフェクトした。ハイグロマイシン選択は１０日間維持し、１６日目はＦＭＭを導入した。
【０３０３】
レンチウイルスの産生
【０３０４】
２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）を、抗生物質なしに繊維芽細胞培地中で維持し、密度を８０％に達しないようにした。繊維芽細胞培地は、ＤＭＥＭ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ライフテクノロジーズ社）、１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）及び１×ＮＥＡＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）からなるものとした。細胞は、ＰＢＳで一度洗浄し、次いで０．０５％トリプシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）で３７℃で４分間インキュベートすることにより継代した。剥離した細胞を、繊維芽細胞培地中に再懸濁させて、２２５ｇで４分間遠心分離し、所望のプレート上に播種した。組み込みレンチウイルスを産生するために、２９３Ｔを、１日目に、ウイルス調製（viral prep）毎に１０ｃｍディッシュ当たり３．５ｘ１０６細胞で継代した。２日目に、トランスフェクションの１時間前に、培地を１０ｍＬの新しい繊維芽細胞培地に変更した。ＤＮＡを、ＣａｌＰｈｏｓキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために以下のものを配合した：関心の遺伝子を含有する５μｇのレンチウイルスクローニングプラスミド、３．２μｇのパッケージングプラスミドｐＰＡＸ、６３０ｎｇのパッケージングプラスミドｐＭＤＧ、８７μＬのカルシウム溶液、及び最大７００μＬの水。１ｍＬ血清用ピペットを用いて気泡を生じさせながら、７００μＬのＨＢＳ溶液を加えた。これを室温で１５分間インキュベートし、その後２９３Ｔの１０ｃｍプレートに液滴で加えた。３日目に、ウイルス上清を除去して廃棄し、１５ｍＬの新しい繊維芽細胞培地を該プレートに加えた。４日目に、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス上清を回収して、４℃で保存した。１５ｍＬの繊維芽細胞培地をプレートに加えた。５日目に、トランスフェクションの７２時間後に、ウイルス上清を回収して、４日目の上清に加えた。このウイルスプールを、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＧｏＳｔｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて力価を確認した。ウイルスは、感染に用いるか、又は、−８０℃で一定分量ずつ凍結させた。非組み込みレンチウイルス（ＮＩＬ（Non-Integrating Lentivirus））（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を産生するために、プロトコルは、ウイルス調製毎にＴ７５フラスコを用いて、製造元の指示に従った。トランスフェクションの４８時間後、７２時間後及び９６時間後に、上記に記載したように、ウイルス上清を回収し、貯蔵し、濾過し、力価試験した。ＮＩＬウイルスは、感染に用いるか、又は、−８０℃で一定分量ずつ凍結させた。
【０３０５】
小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持
【０３０６】
誘導したｈｉＰＳＣは、培養密度が７５〜９０％に達したら、単一細胞としてルーチンに継代した。なお、過度の密集は分化をもたらし得る。単一細胞への解離のために、ｈｉＰＳＣをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）で一度洗浄し、３７℃で３〜５分間Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、次いで単一細胞への解離を確実にするためにピペッティングした。その後単一細胞の懸濁液を、従来法による培地と同量で混合し、２２５ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭ中で再懸濁させ、マトリゲル被覆した表面上に播いた。継代は、典型的に１：４〜１：８とし、予め３７℃で２〜４時間マトリゲル被覆した組織培養プレートに移行し、隔日でＦＭＭを与えた。細胞培養液は、３７℃かつ５％ＣＯ２で設定した炭酸ガス培養器内に維持した。ＦＭＭ及びＦＲＭの培地組成を、表１に記載している。ＳＭＣ４培養については、先に述べている（Valamehr et al., 2012）。簡潔にいえば、小分子である０．４ｍＭのＰＤ０３２５９０１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、１ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、５ｍＭのチアゾビビン及び２ｍＭのＳＢ４３１５４２（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を、従来法による培地に加え、プロトコルに従って継代する。
【０３０７】
フローサイトメトリー分析及び選別
【０３０８】
解離した単一細胞（上記に記載）の初期化プールを、ハンクス平衡塩類溶液（Hanks' Balanced Salt Solution）（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）、４％ウシ胎児血清（インビトロジェン社）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）を含有する、冷却した染色バッファー中に再懸濁する。ＳＳＥＡ４−ＦＩＴＣ、ＴＲＡ１−８１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７及びＣＤ３０−ＰＥ（ＢＤバイオサイエンス社）を含む複合化一次抗体（Conjugated primary antibody）を、細胞溶液に加え、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体を、１００万細胞当たり、１００μＬの染色バッファー中７〜１０μＬで用いた。溶液は、染色バッファーで一度洗浄し、２２５ｇで４分間遠心分離し、１０μＭのチアゾビビンを含有する染色バッファー中に再懸濁させ、フローサイトメトリー選別のために氷上で維持した。フローサイトメトリー選別は、上記に記載したゲーティング戦略を用いて、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で実行した。選別した細胞は、ウェル当たり３及び９イベントの濃度で、１００μＭノズルを用いて、９６ウェルプレートに直接排出した。ウェル当たり３細胞のソーティングは、我々の好ましい濃度であったが、これは選別したイベントが、選別後に各ウェル中で確認される実際の細胞数に必ずしも対応するものではなかったということ、我々にとって、ウェル当たり３細胞というのが、個々のコロニーを含有する好ましいウェル数をもたらしたことを申し添えたい。各ウェルは、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）を添加した２００μＬのＦＭＭで事前に満たし、事前に５×マトリゲルで一晩被覆した。５×マトリゲルの事前被覆は、１分注のマトリゲルを、５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に加え、その後適切な再懸濁液が得られるように４℃で一晩インキュベートして、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに加えて、次いで３７℃で一晩インキュベートすることを含む。５×マトリゲルは、各ウェルへの培地の添加直前に吸引する。選別が完了したら、インキュベーション前に９６ウェルプレートを２２５ｇで１〜２分間遠心分離した。該プレートは、７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから取り出し、１００μＬのＦＭＭで置換した。選別の１０日後に、追加的に１００μＬのＦＭＭを、再度ウェルに与えた。早くも２日目にコロニー形成が検出され、大部分のコロニーは、選別後７〜１０日の間に増殖した。１継代目において、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３７℃で概ね１０分間、３０μＬのＡｃｃｕｔａｓｅで解離させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ処理の延長の必要性は、延長した期間に培養内の何も変わらなかったコロニーの密度に表れる。細胞の解離を確認した後で、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、コロニーを崩壊させるように数回ピペッティングした。解離したコロニーを、５×マトリゲルで事前被覆した９６ウェルプレートの別のウェルに移行し、その後、インキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離した。この１：１継代を行い、初期のコロニーを広く展開させる。引き続きの継代は、３〜５分間のＡｃｃｕｔａｓｅ処理���、ＦＭＭ中に１×マトリゲルで事前被覆されたより大きいウェルに１：４で展開させることとを伴ってルーチンになされる。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（ミリポア社）で実行し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて分析した。
【０３０９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとフリューダイム分析
【０３１０】
全ＲＮＡを、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ライフテクノロジーズ社）を用いて単離した。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（バイオ・ラッド社（Bio-Rad））を用いて、単離した全ＲＮＡ１００ｎｇから逆転写した。その後ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（ライフテクノロジーズ社）及び０．２×濃度のｐｏｏｌｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイを用いた、２２個の特異的標的遺伝子と２個の参照調節遺伝子の前増幅に用いた。製造元のプロトコルに記載されている標準サイクル条件（standard cycling condition）での１４サイクルの増幅により、ｃＤＮＡからＳＴＡ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（特異的標的の増幅））を実行した。前増幅したｃＤＮＡ反応物（ｎ＝４８）は、１：５（滅菌水中）希釈し、リアルタイム定量ＰＣＲ反応物のテンプレートとして用いた。デュプリケート（２回測定）でロードしたＴａｑＭａｎアッセイと共に、ＮａｎｏＦｌｅｘ  ＩＦＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＭＸ（フリューダイム社）を用いて、４８．４８Ｄｙｎａｍｉｃアレイ（フリューダイム社）をロードし、またＢｉｏＭａｒｋ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（フリューダイム社）を用いて、リアルタイム反応を実行した。結果は、ＢｉｏＭａｒｋ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（フリューダイム社）を用いて分析した。３２を超えるＣｔ値（サイクル閾値（cycle threshold））をもつサンプルは、計算から除外した。平均Ｃｔ値は、上記アッセイの２回測定より計算し、デルタ−デルタＣｔ値（ΔΔＣｔ値）は、６つの対照であるＭＥＦ細胞株（ＭＥＦ上のＯＳＫ  ｈｉＰＳＣ及びＨ１  ＥＳＣ）の中央値に対する、２つの参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１）の平均値を用いて計算した。相対遺伝子発現（ＲＱ（Relative gene expression））の結果は、ヒートマップ形式でＥｘｃｅｌ（マイクロソフト社）で表示される。
表４：ＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎプローブ
【０３１１】
【表４−１】
2018534922.tif 000005
【０３１２】
【表４−２】
2018534922.tif 000006
＊ＲｅｆＳｅｑは、各遺伝子のＮＣＢＩ参照配列の識別子である。
【０３１３】
導入遺伝子の存在試験
【０３１４】
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ＭｉｎｉキットとプロテイナーゼＫ消化（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））とにより単離した。１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（キアゲン社）を用いて、導入遺伝子特異的プライマーセット（以下の表５）（Yu et al., 2007）により増幅した。ＰＣＲ反応は、３５サイクルで、以下の通り行った：９４℃で３０秒間（変性）、６０〜６４℃で３０秒間（アニーリング）、及び７２℃で１分間（伸長）。繊維芽細胞よりのゲノムＤＮＡ及びレンチウイルス法により産生したｈｉＰＳＣを、陰性対照として用いた。エピソーマルコンストラクトのＤＮＡを、陽性対照として用いた。
表５：導入遺伝子特異的プライマーセット
【０３１５】
【表５】
2018534922.tif 000007
【０３１６】
免疫細胞化学分析
【０３１７】
細胞は、４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（アルファ・エイサー社（Alfa Aesar））で固定し、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（フィッシャーサイエンティフィック社（Fisher Scientific））含有ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中で０．１５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich））を用いて、２５℃で１時間透過処理した。透過処理後、細胞を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴＢ）（フィッシャーサイエンティフィック社）中１％ｖ／ｖのＢＳＡ（インビトロジェン社）で、２５℃で３０分間ブロックした。ＰＢＳＴＢを穏やかに除去した後、細胞を、４℃で一晩、ＰＢＳＴＢ中で一次抗体と共にインキュベートした。この試験で用いた一次抗体には、ＯＣＴ４（サンタクルーズ社（Santa Cruz））、ＮＡＮＯＧ（サンタクルーズ社）、ＴＲＡ１６０（ミリポア社）、ＴＲＡ１−８１（ミリポア社）、ＳＳＥＡ４（ミリポア社）、β−ＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems））、α−平滑筋アクチン（シグマ社（Sigma））、ＦｏｘＡ２（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、Ｓｏｘ１７（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ネスチン（アブカム社（Abcam））及びアルファ−１−フェトプロテイン（ダコ社（Dako））を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳＴＢ中１：２５０希釈の二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又は５５５；インビトロジェン社）で染色した。細胞は、ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、ヘキスト染料（Hoechst dye）（インビトロジェン社）で染色した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色分析のため、ｈｉＰＳＣをカバーガラス上で７２〜９６時間増殖させて、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ＥＭＳ）で２５℃で１５分間固定した。細胞透過を、２５℃で１時間、ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で実行し、その後細胞を、２５℃で３０分間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）でインキュベートした。ブロッキング後、カバーガラスを、４℃で一晩、ブロッキング溶液中１：１６００希釈の抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７)抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０７−４４９、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）でインキュベートした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ライフテクノロジーズ社、Ａ２１４２９）とした。核は、ＤＡＰＩで対比染色し、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（カールツァイス社（Carl Zeiss））で観察した。画像は、ＡｘｉｏＶＳ４０バージョン４．８．１．０（カールツァイスイメージングソリューション社（Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh））により撮影した。
【０３１８】
実施例７に従って初期化した細胞を、４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（アルファ・エイサー社）で固定し、ＰＢＳ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社）で洗浄し、ＰＢＳ中０．１５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチ社）を用いて、２５℃で１時間透過処理した。透過処理後、細胞を、ＰＢＳ（ＰＢＳＢ）中１％ｖ／ｖのＢＳＡ（シグマ社）で、２５℃で３０分間ブロックした。ＰＢＳＢを穏やかに除去した後、細胞を、４℃で一晩、ＰＢＳＢ中で一次抗体と共にインキュベートした。この試験に用いた一次抗体には、ＯＣＴ４（サンタクルーズ社）及びＴＲＡ１８１（ミリポア社）を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳＢ中１：２５０希釈の二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又は５５５；ライフテクノロジーズ社）で染色した。細胞は、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ヘキスト染料（インビトロジェン社）で染色した。染色した核を、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（カールツァイス社）で観察した。画像は、ＡｘｉｏＶＳ４０バージョン４．８．１．０（カールツァイスイメージングソリューション社）により撮影した。
【０３１９】
分化分析（ＥＢと定方向分化）
【０３２０】
ｈｉＰＳＣは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）、２０％のウシ胎児血清（インビトロジェン社）、１％の可欠アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）及び１００μＭのβ−メルカプトエタノールを含有する分化培地中のＥＢとして分化された。簡略的にいえば、ＥＢ形成のために、ｈｉＰＳＣをＦＭＭ中に播種し、翌日従来のものに切り替えて、この細胞を刺激した。従来法による培地中で３〜４日後、培養をＡｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社）で単一細胞に解離し、１０μＭのＹ２７６３２を含む分化用培地中に、最終濃度１００，０００細胞／ｍＬで再懸濁させた。なお、ＥＢ形成に関しては、チアゾビビンの代わりに、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を用いた。細胞は、Ｖ字形底部の９６ウェル非組織培養プレート（Ｎｕｎｃ社）中に１００μＬ／ウェルで播種し、９５０ｇで５分間遠心分離した。翌日、密集した「球状凝集塊」を、分化用培地中、概ね３０〜４０ＥＢ／ウェルで、Ｐ１０００を用いて、超低接着性６ウェルプレート（コーニング社）に移行した。７日後、ＥＢを１：１でマトリゲル被覆６ウェルプレートに移行し、３日毎に分化用培地を与えた。培養３週間後、細胞を固定し、染色した。定方向単層分化のため、ｈｉＰＳＣをＦＭＭ中のマトリゲル被覆ウェル上に播種し、翌日、５０％及び９０％コンフルエントにさせた。いずれの密度においても、分化が誘導された。神経誘導のため、ＦＭＭ培地を、１０μＭのＳＢ４３１５４２及び１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（いずれもＳＭＡＤ阻害剤、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を添加したｈＥＳＣ用培地で置換した。２日後、分化用培地を、両ＳＭＡＤ阻害剤に加えて３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社)を添加した。２日後に細胞を固定し、ネスチン（アブカム社）で染色した。中胚葉分化のため、培地を、１×Ｂ２７培地添加物（ライフテクノロジーズ社）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加したＲＰＭＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）で置換した。培地は隔日で交換し、細胞を４日目に固定し、αＳＭＡ（シグマ社）に染色した。内胚葉分化は、Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて実行した。ｈｉＰＳＣを、内胚葉分化用培地で３日間インキュベートし、固定し、ＳＯＸ１７（Ｒ＆Ｄシステムズ社）に染色した。
【０３２１】
遺伝子発現分析
【０３２２】
製造元が推奨するプロトコルを用いて、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ライフテクノロジーズ社）により、ＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計（サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific））を用いて、全ＲＮＡを定量化した。簡略的にいえば、ビオチン化ａＲＮＡを、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ａＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）／アンビオン社（Ambion）、テキサス州オースティン）の標準プロトコルにより、オプションであるＳｅｃｏｎｄ  Ｒｏｕｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎを利用して、全ＲＮＡ約１００ｎｇから調製し、その後ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社／アンビオン社、テキサス州オースティン）により、標準プロトコルを用いて、ビオチン標識のａＲＮＡに転写した。ビオチン標識のａＲＮＡは、アフィメトリクス社の推奨に従って、精製及び断片化した。２０μｇの断片化ａＲＮＡを用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３−ｐｌｕｓ−２．０チップ（アフィメトリクス社、カリフォルニア州サンタクララ）に対し、４５℃で１６時間ハイブリダイズした。このアレイを、アフィメトリクス社Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０内で洗浄及び染色し、アフィメトリクス社ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇを用いてスキャンした。発現のローデータファイルは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓで利用可能である（ＧＳＥ５０８６８）。このイメージデータを、アフィメトリクス社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアにより、デフォルトの分析設定値で分析した。アレイは、ログスケールのｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ、アフィメトリクス社）により正規化し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４．５（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ社、カリフォルニア州パロアルト）で可視化した。変動的発現プローブの生物学的経路エンリッチメント解析を、ＤＡＶＩＤ（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）バージョン６．７を用いて、遺伝子オントロジー（ＧＯ）データベースに対比して実行した（ＧＯ生物学的プロセス（GO Biological Process）に対する特異的エンリッチメントと＜０．０１のｐ値）。ユークリッド距離測定（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４．５）による完全連結クラスタリング法を用いて、階層クラスタリングを実行し、Ｌｏｇ２の発現量に基づいてサンプル間で遺伝子発現プロファイルを比較した。クラスタリング用のプローブセットは、発現量が全体的に変動的であるか（２．５倍上がっている（＞２．５倍）、２．５倍下がっている（＜２．５倍））又は基定状態もしくは準安定状態を規定する標的遺伝子一覧に存在するかのいずれかによって選択した。Ｘ染色体遺伝子発現の比較のため、ＲＭＡで正規化したアフィメトリック社遺伝子チップの強度は、２＾［ＲＭＡのｌｏｇ２の強度値］を得ることで線形発現値に変換される。線形発現比は、初回刺激を受けた発現セッ��によって除算したナイーブ発現セットとして算出される。Ｘ染色体に対してマップした全てのプローブセットに関する発現比を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ４．５で可視化し、２倍上がっている又は２倍下がっているエンリッチメント比であるプローブセットを強調させた。
【０３２３】
核型分析
【０３２４】
２０〜４０個のＧ分染法による分裂中期細胞の細胞遺伝学的分析は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ウィスコンシン州マディソン）により行われた。
【０３２５】
テラトーマ形成
【０３２６】
単一細胞に解離したｈｉＰＳＣを、２００μＬ溶液（１００μＬのＦＭＭ及び１００μＬのマトリゲル）当たり５０万細胞と３００万細胞の濃度で、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ欠損マウスに皮下注入した。５〜６週後（３００万細胞注入）と、７〜８週後（５０万細胞注入）とに、テラトーマをＰＢＳに採取し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後、処理の間、７０％エタノール中で、室温で維持した。切断と、ヘマトキシリン及びエオシンによる染色とのため、サンプルを、ＵＣＳＤのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに出した。切断片は、ニコンＤＳ−Ｆｉ１カメラを備えたニコンＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００顕微鏡を用いて検討、解釈及び撮影した。
【０３２７】
統計的分析
【０３２８】
標準偏差に関する統計的評価のために、スチューデントｔ検定を用いた。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．２（ライフテクノロジーズ社）を用いて、ｑＲＴＰＣＲデータに関するＲＱ最小値及び最大値（エラーバー）を決定した。
【０３２９】
概して、以下の請求項においては、用いた文言は、明細書中及び請求項中に開示した特定の実施形態に、請求項が限定されるものと解釈されるべきではなく、かかる請求項に与えられる均等物の全範囲に加えて、可能性のある実施形態の全てを含むものと解釈されるべきである。したがって、各請求項は、この開示によって限定されない。
実施例１０−初期化因子として用いるために特定した遺伝子
【０３３０】
上記に記載したアフィメトリックス分析によって初期化因子として用いるために、いくつかの遺伝子を特定した。全部で７個の遺伝子において、初期化中に上方制御され、分化中に下方制御されることを観察した（表６）。表６において、「多能性」は、その親繊維芽細胞株と比較した場合の、ｉＰＳＣ内で増加した遺伝子発現の比（fold change）を示し、一方「分化」は、ｉＰＳＣが分化して多能性を失った場合に、減少した遺伝子発現の比を示している。分化は、自然分化開始後３日目及び８日目に遺伝子発現の平均をとることによって計算し、多能性ｉＰＳＣ遺伝子発現と比較した。値が大きいほど、分化にかかる遺伝子発現において大きい損失を示す。
表６−初期化因子として用いるために特定した遺伝子
【０３３１】
【表６】
2018534922.tif 000008
【０３３２】
ＨＥＳＲＧ（ｈＥＳ細胞関連遺伝子タンパク質；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｑ１Ｗ２０９）は、胎児の卵巣内及び未分化ＥＳ細胞内で発現することが知られており、ＥＳ細胞の分化中に下方制御される。カルシウム依存性細胞接着タンパク質をコードするＣＤＨ１（カドヘリン−１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｐ１２８３０）は、上皮細胞の細胞間接着性、移動性（mobility）及び増殖を制御する機序に関与している。ＴＤＧＦ１（奇形癌由来増殖因子１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｐ１３３８５）は、その後中胚葉を生じさせる原外胚葉細胞の決定に関与すると考えられている。ＤＰＰＡ４（発生多能性関連タンパク質４（Developmental pluripotency-associated protein 4）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｑ７Ｌ１９０）は、標的遺伝子の後成的な状態の維持と、胚細胞が原始外胚葉系統へ分化するのを阻止することとに関与するようである。ＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｑ９ＵＢＣ３）は、ゲノム全体でのデノボメチル化に必要であり、発生期間中のＤＮＡメチル化パターンの樹立に不可欠である。ＺＩＣ３（ジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ  ３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｏ６０４８１）は、転写活性化因子として機能することが知られており、最初期の段階において、軸方向の正中線の発生と左右（ＬＲ）非対称性形成機構との両方に必要である。Ｌ１ＴＤ１（Ｌｉｎｅ−１型トランスポザーゼドメイン含有タンパク質１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｑ５Ｔ７Ｎ２）は、ヒト胚性幹細胞の自己複製及び分化に関連し得る。上記した遺伝子のいずれもが、体細胞の初期化に関する潜在的な転写因子として、この技術分野で開示されてこなかった。
【０３３３】
表６で特定した初期化遺伝子の組み合わせを含有する例示的なコンストラクトを、表７に示している。
表７：ｉＰＳＣ初期化に関する化学量論的因子を含有するコンストラクト
【０３３４】
【表７】
2018534922.tif 000009
【０３３５】
表７から選択した１つ又は複数の発現コンストラクトから得られる遺伝子組み合わせからなる、エピソーム、レンチウイルス及びセンダイウイルスによる発現系のそれぞれについて、種々の繊維芽細胞をトランスフェクトすることにより、初期化効率の試験をする。初期化因子の種々の組み合わせは、表７のコンストラクトのうちの、コンストラクト１と３、１と４、１と５、１と６、１と４と５、１と４と５と６、１と４と６、１と５と６、１と２と４、１と３と４、２と５と６、１と２と３と５と６、及び任意の他の組み合わせを選択することで取得する。設計したコンストラクトは、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチド数、ＯＣＴ４を含む複数のベクターの組み合わせ、及び／又は、ＯＣＴ４及び他の初期化因子間の比を考慮に入れており、初期化効率向上に適切な又は最適である初期化因子の化学量論を達成する。種々のコンストラクトの組み合わせは、開示したように、高効率な初期化の達成ではＳＯＸ２及びＫｌｆ４の使用を除外しており、ＳＯＸ２及びＫｌｆ４は不必要であること、又はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＲＲＢ、ＵＴＦ１、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３及びＬ１ＴＤ１のうちの１つ又は複数を含むコンストラクトと、包含される他の因子と比較して、コンストラクト内により高い割合で含むＯＣＴ４との例示的な組み合わせで置換可能であることを示している。
【０３３６】
エピソーマル発現系の場合、１つ又は複数のコンストラクトのエピソーマル発現の誘導後２４時間で、初期化培養をＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高める。初期のコロニー形成が１週間以内に確認され、１４日目までに、フローサイトメトリーを用いてＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞集団が観察されている。１４日目、ＦＲＭで支持している初期化培養を、ＦＭＭ培地に移行する。２１日目、ＦＡＣＳを用いて、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性クローンを、９６ウェルプレートに選別する。細胞を、ＦＭＭで増殖及び維持する。ｈｉＰＳＣクローン数は、ＮＡＮＯＧに関する、組織内及び表面のマーカー発現とダイレクトｑＲＴＰＣＲとの分析によって確認する。表７に示すようなエピソーマルコンストラクトの特定の組み合わせによる、９６ウェル選別及び選択プロセスを用いた初期化の効率もまた評価される。
【０３３７】
このエピソームでのアプローチのみならずセンダイウイルスでのアプローチ（以下を参照）の生産性及び頑健性について、異なる年齢、性別及び人種のドナーからの最少量の臍帯血から増殖させた繊維芽細胞及びＣＤ３４＋細胞で、さらに試験する。ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性である細胞集団の存在が、試験した全ての株で観察されている。ｈｉＰＳＣクローン数は、ＮＡＮＯＧに関する、組織内及び表面のマーカー発現とダイレクトｑＲＴＰＣＲとの分析によって確認した。表７に示すようなエピソーマルコンストラクトの特定の組み合わせによる、９６ウェル選別及び選択プロセスを用いた初期化の効率もまた評価される。
【０３３８】
レンチウイルス発現系の場合、１つ又は複数のコンストラクトのレンチウイルス発現の誘導後２４時間で、初期化培養をＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高める。初期のコロニー形成が１週間以内に確認され、１４日目までに、フローサイトメトリーを用いてＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞集団が観察されている。１４日目、ＦＲＭで支持している初期化培養を、ＦＭＭ培地に移行する。２０〜３０日目の間に、ＦＡＣＳを用いて、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性クローンを、９６ウェルプレートに選別する。あるいは２０〜２４目の間に、細胞を、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞に関してディッシュにバルク状に選別（bulk sorted）する。コンフルエントになったら、通常１０〜１４日目の間に、細胞を、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞に関してＦＡＣＳを用いて９６ウェルに選別する。細胞を、ＦＭＭで増殖及び維持する。ｈｉＰＳＣクローン数は、ＮＡＮＯＧに関する、組織内及び表面のマーカー発現とダイレクトｑＲＴＰＣＲとの分析によって確認する。表７に示すようなレンチウイルスコンストラクトの特定の組み合わせによる、９６ウェル選別及び選択プロセスを用いた初期化の効率もまた評価される。このレンチウイルスでのアプローチの生産性及び頑健性について、最少量の臍帯血から増殖させた繊維芽細胞及びＣＤ３４＋細胞で、さらに試験する。
【０３３９】
センダイウイルス発現系の場合、１つ又は複数のコンストラクトを用いたセンダイウイルスの誘導の２４時間後、初期化培養をＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高める。初期のコロニー形成が１週間以内に確認され、１４日目までに、フローサイトメトリーを用いてＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞集団が観察されている。１４日目、ＦＲＭで支持している初期化培養を、ＦＭＭ培地に移行する。２０〜３０日目の間に、ＦＡＣＳを用いて、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性クローンを、９６ウェルプレートに選別する。あるいは２０〜２４目の間に、細胞を、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞に関してディッシュにバルク状に選別（bulk sorted）する。コンフルエントになったら、通常１０〜１４日目の間に、細胞を、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１／ＣＤ３０陽性細胞に関してＦＡＣＳを用いて９６ウェルに選別する。細胞を、ＦＭＭで増殖及び維持する。ｈｉＰＳＣクローン数は、ＮＡＮＯＧに関する、組織内及び表面のマーカー発現とダイレクトｑＲＴＰＣＲとの分析によって確認する。表７に示すようなセンダイウイルスコンストラクトの特定の組み合わせによる、９６ウェル選別及び選択プロセスを用いた初期化の効率もまた評価される。このセンダイウイルスでのアプローチの生産性及び頑健性について、最少量の臍帯血から増殖させた繊維芽細胞及びＣＤ３４＋細胞で、さらに試験する。
実施例１１−センダイウイルスベクターを介した、化学量論的因子を用いた初期化
【０３４０】
初期化因子を発現するセンダイウイルスを用いて、繊維芽細胞からｉＰＳＣを産生した。表７に示すように、コンストラクト１〜５をセンダイウイルスベクター（株式会社ＩＤファーマ、日本国つくば市）に組み込んだ。繊維芽細胞を、各ウイルスベクターと種々のベクターの組み合わせとで形質導入し、先に記載した条件下（表８）で初期化を開始した。
【０３４１】
【表８】
2018534922.tif 000010
【０３４２】
初期化培養は、ＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高めた。感染後７日目に、ｉＰＳＣマーカーＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１８１の発現に関して、細胞を分析した。センダイウイルスベクターＮＡＮＯＧ−Ｐ２Ａ−ＥＳＲＲＢ−Ｔ２Ａ−ＯＣＴ４（ＮＥＯ）と、ＣＤＨ１−Ｐ２Ａ−ＺＩＣ３−Ｔ２Ａ−ＨＥＳＲＧ（ＣＺＨ）との組み合わせにより、早くも７日目に約１％の割合で、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１８１陽性である細胞集団が効率的に産生され、Ｓｏｘ及びＫｌｆなしに良好かつ効率的なｉＰＳＣ初期化を示した（図２５）。さらに、Ｍｙｃ＋ＮＥＯ＋ＯＯ＋ＥｃＵもまた、Ｓｏｘ及びＫｌｆなしに良好かつ効率的なｉＰＳＣ初期化を呈した（データは示さず）。
【０３４３】
また、初期化因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ及びＳｏｘ２を含有するセンダイウイルスは、７日目に０．２５％という比較的低効率で繊維芽細胞をｉＰＳＣに初期化することを観察した（図２６Ａ）。しかしながら、センダイベクターＯＫＳを表７に列記した初期化因子に添加することによって、感染後７日目であっても、初期化効率が有意に増加した。トランスフェクションの７日後に、ｉＰＳＣマーカーＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋の発現に関して、繊維芽細胞をフローサイトメトリーで分析した。図２６Ｂ〜Ｄに示すように、ＯＫＳをＥｃＵ、ＬＤＴ１及びＣＺＨに添加した場合に、早くも７日目にｉＰＳＣ初期化率がそれぞれ４２．９％、６７％及び７４．３％となる。ｉＰＳＣマーカーの誘導は、繊維芽細胞マーカーＣＤ１３の下方制御によって達成された（データは示さず）。トランスフェクション後２０日までに、図２７に示すように、ＣＺＨの初期化における従来の因子との相乗効果が安定的に維持されて、改善もされた。ＥｃＵ（２．０１％）及びＬＤＴ１（４５．８％）の相乗効果は、ＯＫＳのみ（０．２１％）を用いた初期化と比較して、変化しないままであったが、その効果は、７日目からのデータと比較した場合では低減していた。理論で限定することなしに、かかる低減は、各因子の組み合わせを運ぶウイルスの安定性が比較的低いことに関連しているようである。また以下に示すように、いくつかのウイルスベクターで見られる安定性の問題は、多重のウイルス形質導入することによって少なくとも一部解決することが可能である。
【０３４４】
体細胞の初期化に関して、（１）Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２と、（２）Ｏｃｔ４及びＫｌｆと、ならびに（３）単独でのＯｃｔ４と共に用いる場合の、ＥｃＵ、ＬＤＴ１及びＣＺＨのうちの１つ又は複数についての効果の向上についても評価した。１つ又は複数のコンストラクトを用いたセンダイウイルスの誘導の２４時間後、初期化培養をＦＲＭに移行し、初期化反応速度を高める。コロニー形成が１週間以内に観察される場合、フローサイトメトリーを用いて、７日目及び／又は１４日目にＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１−８１陽性細胞集団を検出する。Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｏｃｔ４及びＫｌｆ、ならびに単独でのＯｃｔ４がそれぞれ、様々な効率で初期化を達成する、ということは先に示した。ＥｃＵ、ＬＤＴ１及びＣＺＨの効果の大きな向上を考えれば、それらのいずれかをＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｏｃｔ４及びＫｌｆ、又はＯｃｔ４に加えることにより、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆを用いたときに見られたものと同様の良好かつ効率的な初期化を導くこととなる、ということを予想することは理にかなっている。
【０３４５】
初期化因子を含有するウイルスを安定化させ、それによって初期化効率をさらに向上させるための戦略として、多重の形質導入を試験した。はじめに、０日目に形質導入された繊維芽細胞を、６日目に２つのサンプルに分割し、その一方を、０日目に用いたのと同じＭＯＩ（感染効率）を用いて、７日目に再び形質導入した。２５日目までに検出されたｉＰＳＣマーカーは、試験した種々の初期化因子の組み合わせの中で、ＯＯ＋ＥｃＵ＋ＮＥＯ＋ＣＺＨ＋ＬＤＴ１での２重の形質導入により、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１８１陽性である細胞集団が１０．３％（図２８）に達するように、通常見られる量である約０．１〜０．５％と比較して最も高い効率を有するということを示している。さらに、表９中の種々の因子組み合わせを用いて、単一又は多重の形質導入での初期化を最適化するように、ベクター毎に異なるＭＯＩで形質導入を変化させた。
【０３４６】
【表９】
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【０３４７】
このように、ＥＣＡＴ１、ＥＳＲＲＢ、ＵＴＦ１、ＬＤＴ１、ＣＤＨ１、ＺＩＣ３、ＤＰＰＡ４、ＴＤＧＦ１及びＨＥＳＲＧは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣを含む１つ又は複数の従来の初期化因子を用いる場合に、効率的かつ効果的に初期化を向上させることが可能である初期化因子として確認された。
【０３４８】
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物及び産物が、例示の実施形態を表すものであり、この発明の範囲を限定するものではないということを容易に理解するであろう。当業者にとっては、この発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な代替及び変形が本明細書に開示された本開示を成し得るということが容易に明らかであるだろう。
【０３４９】
明細書に記載した特許及び公報の全てが、本開示が属する技術分野の当業者のレベルを示唆している。特許及び公報の全ては、個々の公報が参照することによって組み入れられるように、あたかもそれぞれ明確かつ独立に示したかのように、同程度に参照することによって本明細書に組み入れられるものである。
【０３５０】
本明細書に例示的に記載した本開示は、本明細書に明文で開示されていない、任意のある要素又は要素、ある限定又は限定が欠如している状態で、適宜実施してもよい。すなわち、例えば本明細書の各例において、用語「含む」、「本質的に〜からなる」及び「からなる」のいずれか１つは、他の２つのうちのいずれかと置換することができる。使用した用語及び表現は、説明の点で用いたものであって限定するためではなく、またかかる用語及び表現の使用において、図示又は記載した特徴又はその一部分についてのあらゆる均等物の除外を意図しているものではないが、請求する本開示の範囲内で様々な変形が可能であるものと考える。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び選択自由な特徴によって明確に開示したが、本明細書で開示した概念の変形及び変化物が、当業者によって主張されてもよいこと、またかかる変形及び変化物は、添付の請求項によって規定されるこの発明の範囲内として考えられるものであることとを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
2018534922.tif 000109
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018534922.tif 000114
2018534922.tif 000115
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