(57)【要約】  本発明は、病理学的過リン酸化（ＰＨＦ）タウにおけるリン酸化セリン３９６残基（ｐＳ３９６）に特異的に結合するモノクローナル抗体の新規な種類、ならびにアルツハイマー病およびタウオパチーの治療にこれらの分子およびそれらのタウ結合フラグメントを使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２】
無傷の抗体からなる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）；Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメントなどのＦａｂ様フラグメント；および単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域などのドメイン抗体からなる群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項５】
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、タウ（配列番号３３）におけるリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項７】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号８の重鎖または配列番号７の軽鎖を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号８の重鎖および配列番号３４の軽鎖を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１０】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１６の重鎖および／または配列番号１５の軽鎖を含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号２４の重鎖および／または配列番号２３の軽鎖を含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１５】
配列番号３２の重鎖および／または配列番号３１の軽鎖を含む、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記重鎖が、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、および配列番号３５からなる群から選択され、前記軽鎖が、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、および配列番号３６からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１７】
（ａ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
（ｄ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１８】
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１９】
２つの残基がチロシン残基から除去されたリン酸化セリンを含む過リン酸化タウのアミノ酸モチーフに対して選択的なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２０】
前記アミノ酸モチーフが、配列：
−Ｙ−Ｘ−Ｓ（リン酸化）−Ｐ−
を有し、ここで、Ｙがチロシンであり、Ｘが天然アミノ酸であり、Ｐがプロリンであり、Ｓ（リン酸化）が、リン酸化ヒドロキシル側鎖を有するセリンである、請求項１９に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２１】
Ｆｃ領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２２】
物質の生体内半減期を増加させるための部分をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２３】
ｉ）抗体は、非リン酸化タウに実質的に結合しない；ｉｉ）抗体は、３９６がリン酸化されないとき、４０４においてリン酸化されるタウに実質的に結合しない；ｉｉｉ）抗体は、３９６においてリン酸化されるタウに結合する；およびｉｖ）抗体は、３９６および４０４が両方ともリン酸化されるとき、タウに結合するという試験基準にしたがって、リン酸化残基３９６を含むヒトタウへの免疫特異的結合を示す、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２４】
２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）内の少なくとも１８連続アミノ酸残基、例えば少なくとも２０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導される、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２５】
２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）を含む１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば２０〜３０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導される、請求項２４に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２６】
月齢をマッチさせた健常対照よりＡＤ罹患患者に由来するリン酸化タウ（ｐタウ）に対する特異性を有するモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、リン酸化−および多量体特異的Ｓｅｔｕｐ  １  ＥＬＩＳＡを用いて、ＡＤおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ（ｐタウ）（配列番号３３）を検出するためのＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したＡＤ疾患材料に対する特異性の５０倍超、例えば１００倍超の増加の、月齢をマッチさせた健常対照に由来するタウよりＡＤ罹患患者に由来するリン酸化タウ（ｐタウ）に対する特異性の差を有するようになっている、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２７】
ＡＤ罹患タウに対する特異性を有するモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、リン酸化−および多量体特異的Ｓｅｔｕｐ  １  ＥＬＩＳＡを用いて、ＡＤおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ（ｐタウ）（配列番号３３）を検出するためのＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したＡＤ疾患材料に対する特異性の５０倍超、例えば１００倍超の増加の、月齢をマッチさせた健常対照よりＡＤに対する特異性の差を有するようになっている、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２８】
ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーする二リン酸化ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）に対して誘導される、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２９】
ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株において生産または製造された、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３０】
ＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ−２１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＨＫＢ−１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ−７ヒト細胞株において生産される、請求項２９に記載の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体が、ｉ）リン酸化エピトープＳ３９６に対して免疫特異的であり、かつｉｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウを特異的に認識するクローンを単離するために、ヒト病理学的および非病理学的タウでハイブリドーマをスクリーニングすることによって単離されたハイブリドーマによって発現され、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３２】
前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３３】
前記検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識である、請求項３２に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記調製物が、タウに結合することが可能でないかまたは前記調製物の抗タウ機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まず、前記機能性が、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないようにまたはそれがＳ３９６に優先的に結合するように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）実施例に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
【請求項３５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記抗体または前記そのエピトープ結合フラグメントが、天然抗タウ抗体の構造と比べて、そのアミノ酸配列の構造変化を有し、前記構造変化により、前記抗体または前記フラグメントが、前記天然抗タウ抗体によって示される機能性と比べて変化した機能性を示し、前記機能性が、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないようにまたはそれがＳ３９６に優先的に結合するように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするか、またはその構成鎖をコードする核酸。
【請求項３８】
治療に使用するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
タウオパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択されるタウオパチーを治療するのに使用するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物または医薬組成物、または請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
タウオパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記薬剤が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状を治療するためのものである、請求項４１に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または調製物または医薬組成物、または組成物。
【請求項４３】
被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３６に記載の医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項４４】
前記治療が、長期である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記長期治療が、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上にわたる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体がヒトである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
治療に使用するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体、またはそのフラグメント、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３６に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項４８】
被験体の脳における前記タウの存在または量を検出または測定するのに使用するための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または前記抗体またはフラグメントを含む調製物または医薬組成物。
【請求項４９】
前記検出または測定が、前記タウに結合された前記抗タウ抗体のインビボイメージングを含む、請求項４８に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
【請求項５０】
前記検出または測定が、前記タウに結合された、前記抗タウ抗体または前記そのフラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項４８または４９に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
【請求項５１】
過リン酸化タウを含むもつれから過リン酸化タウを除去する方法であって、過リン酸化タウを抗体と接触させる工程と含み、前記もつれから９０％の過リン酸化タウが取り除かれるように、前記抗体が、リン酸化残基３９６を有するタウに対して選択的であり、または請求項１〜３１のいずれか一項に記載されるとおりである方法。
【請求項５２】
患者におけるアルツハイマー病の進行を遅らせる方法であって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のリン酸化残基３９６を有するタウに対して選択的な抗体を投与することによって、前記患者における病理学的タウタンパク質の蓄積を減少させるかまたは軽減する工程を含む方法。
【請求項５３】
残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに対して免疫特異的な高特異性、高親和性抗体を生成するための方法によって生成される抗体であって、前記方法が、
（Ａ）２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）を含む、１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば２０〜３０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と；
（Ｂ）前記哺乳動物の前記免疫化を２回以上繰り返す工程と；
（Ｃ）残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と；
（Ｄ）前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的過リン酸化（ＰＨＦ）タウにおけるリン酸化セリン３９６残基（ｐＳ３９６）に特異的に結合するモノクローナル抗体の新規な種類、ならびにアルツハイマー病およびタウオパチーの治療にこれらの分子およびそれらのタウ結合フラグメントを使用する方法に関する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、米国特許法施行規則（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１条に従う１つまたは複数の配列表（以下参照）を含み、これは、コンピュータ可読媒体（ファイル名：０９９５．ｔｘｔ、２０１６年６月２３日に作成され、４０ｋＢのサイズを有する）で開示され、このファイルは、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）および認知症などの加齢性神経変性疾患は、現在、最大の社会的課題の１つである。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、高齢者の介護のコストが、今後増加し続け、診断される認知症事例の数が２０５０年までに３倍になるであろうと推定している（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ−Ｓｔａｔｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔ（２０１２）ＤＥＭＥＮＴＩＡ：Ａ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｐｒｉｏｒｉｔｙ，ＷＨＯ）。ＡＤの最初の治療は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびＮＭＤＡ調節剤などの神経伝達物質調節剤であった。これらの治療は、世紀の変わり目に利用可能になり、依然として、認知症およびＡＤに関連する記憶障害の症状緩和のための基礎を成すものである。しかしながら、これらの薬剤は、ＡＤの根本原因である、アミロイド−β（Ａβ）ペプチドおよびタウタンパク質凝集体の蓄積ならびにそれに関連する、ニューロンシナプス、最終的にはニューロンの喪失を標的にしていない。
【０００４】
高齢者の長期的なコミュニティ規模の研究（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＡＤＮＩ  ｏｎｌｉｎｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｎｉ−ｉｎｆｏ．ｏｒｇ／；Ｂｒｅｔｅｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １１  Ｓｕｐｐｌ  １，２３−２８；Ｌａｕｎｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １１  Ｓｕｐｐｌ  １，２−１３）は、大規模なゲノムワイド関連解析（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５，１４５２−１４５８）とともに、ＡＤが認知症の多様な混合であり、進行したＡＤ患者の最大で１０パーセントに、アミロイド病変がないことを示した（Ｃｒａｒｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２８，７５５−７６６）。さらに、ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋによる重要な病理学的研究（Ｂｒａａｋ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒａａｋ，Ｅ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ  １６５，３−１２）は、解剖前の神経原線維変化病変の程度と認識状態との間の明らかな相関関係を実証した。これらの観察は、幾人かの研究者（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３６２−３８１）および最近の長期的なバイオマーカー研究によって裏付けられており、このバイオマーカー研究は、タウおよびリン酸化タウの脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルが、疾患の初期および後期を通して増加することを示す（Ｊａｃｋ，Ｃ．Ｒ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．１２，２０７−２１６）。
【０００５】
上に示されるように、微小管関連タンパク質タウ、およびその過リン酸化形態は、ＡＤの主な特徴の１つである細胞内神経原線維変化の主な構成要素である。さらに、タウの特定の遺伝的変異体が、家族性の前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に関連している。ＡＤにおけるタウ病変の出現は、内嗅皮質から出発し、その後、海馬および皮質領域が続く明確な空間的パターンで起こる（Ｂｒａａｋ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒａａｋ，Ｅ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ  １６５，３−１２）。また、タウ病変の特定の段階が、認知能力と深く関係している（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３６２−３８１；Ｂｒａａｋ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４９  Ｓｕｐｐｌ  ３，１４−２２）。総合すると、このエビデンスは、ＡＤについてのタウに基づく仮説の基礎となる。それは、タウの細胞内蓄積が、微小管変性および脊柱崩壊をもたらすことを含む。結果として、ニューロン間の伝達の機能不全および細胞死が続く。最近、タウ自体が、１つの細胞から次の細胞へと神経変性を伝達し得る内因性病原性（ｅｎｄｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）種となり得ることも示された（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，９０９−９１３）。
【０００６】
Ｉ．内因性病原体としてのタウ
Ｃｌａｖａｇｕｅｒａおよび同僚は、タウ自体が内因性病原体（ｅｎｄｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）として働き得ることを実証した（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，９０９−９１３）。低スピン（ｌｏｗ  ｓｐｉｎ）脳抽出物を、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスから単離し（Ａｌｌｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２，９３４０−９３５１）、希釈し、幼若ＡＬＺ１７マウスの海馬および皮質領域に注入した。ＡＬＺ１７マウスは、遅い病変（ｌａｔｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）のみを発現するタウトランスジェニックマウス株である（Ｐｒｏｂｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．９９，４６９−４８１）。注入されたＡＬＺ１７マウスは、固体線維状病変を直ぐに発現し、Ｐ３０１Ｓマウスに由来する免疫枯渇された脳抽出物または野生型マウスに由来する抽出物の投与は、タウ病変を誘発しなかった。可溶性（Ｓ１）およびサルコシル不溶性タウ（Ｐ３）中の脳抽出物の分別（Ｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ．Ｄｉｓ．３３，２４９−２６３）およびＡＬＺ１７マウスへのこれらの注入は、Ｐ３画分が、病変の誘発に最も有効であることを実証した。それは、細胞内の過リン酸化線維状タウの大部分を含有する。病変の大部分は、Ｐ３０１Ｓ抽出物を野生型マウスの脳内に注入した場合にも誘発され得るが、ＮＦＴは形成されなかった。その後の研究において、Ｃｌａｖａｇｕｅｒａらは、他のタウオパチー（嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ））の死後脳組織から抽出されたヒトタウも、ＡＬＺ１７モデルにおいてタウ病変を誘発し得ることを示した（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，９５３５−９５４０）。これらのデータの提示以来、いくつかの他のタウシーディングおよび拡散モデルが報告されている（Ａｈｍｅｄ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７，６６７−６８３；Ｗａｌｋｅｒ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ．７０，３０４−３１０）。これらの研究からの主な結論は、細胞内封入体中の病原性タウが細胞から細胞周辺腔中へと分泌される機構を示す。次に、病理学的タウ材料は、順行および逆行方向の両方で、小胞の鞘に沿って輸送され、その後、バルクエンドサイトーシスによって、隣接する細胞によって取り込まれる。この機構は、ヒトの疾患において観察される病変の拡散が、明確な解剖学的パターンにしたがう理由を説明する。興味深いことに、病理学的タウの末梢投与は、ＡＬＺ１７マウスにおけるタウ病変の形成を加速させ得る（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７，２９９−３０１）。この拡散機構は、他のタンパク質症における疾患伝播を説明し得る（Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３３，３１７−３２５；Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ���ｏｌ．Ｍｅｄ．８，４１１−４１３）。
【０００７】
ＩＩ．タウ種
タウタンパク質が、内因性病原体として働き得るという発見は、潜在的な介入治療において標的にされ得る「病原性種」への探求を引き起こした。
【０００８】
微小管関連タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）は、ヒトゲノムの１７番染色体に位置し、成人ヒト脳においてタウタンパク質の６つのアイソフォームを発現する。これらのアイソフォームは、ＭＡＰＴ遺伝子内の１６のエクソンのうちのエクソン２、３および１０の選択的スプライシングから生じる。エクソン２および３は、２９のアミノ酸反復を発現し、エクソン１０は、さらなる微小管結合領域を発現する。結果として、タウアイソフォームは、０、１または２つのＮ末端反復および３または４つのＣ末端微小管結合領域（３Ｒまたは４Ｒタウ）を含有する。一般的に、タウの６つのアイソフォームが発現される。最長（２Ｎ４Ｒ）および最短（０Ｎ３Ｒ）アイソフォームは、それぞれ４４１および３５２アミノ酸からなる（Ｋｏｌａｒｏｖａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１２，７３１５２６）。タウのＮ末端突出領域（２Ｎ４Ｒ）は、４４のアミノ酸のグリシンに富むテイルからなり、残基４５〜１０２は、２つの強酸性領域を包含する（Ｎ１、Ｎ２ドメイン）。２つのプロリンに富む領域は、残基１５１〜２４３（Ｐ１、Ｐ２ドメイン）において見られる。タンパク質の残りの部分は、４つの微小管結合領域（Ｒ１〜Ｒ４）、続いて、短いＣ末端領域によって構成される。
【０００９】
タウは、非常に可溶性でかつ高リン酸化に不安定なタンパク質である。タウの最長アイソフォーム中のアミノ酸残基のうちの約２０パーセントまたは８５個が、潜在的な（Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）リン酸化部位である。これらのほぼ半分が、実験的に観察され（Ｈａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１５，１１２−１１９；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１７０４７−１７０５４）、微小管結合領域の末端残基の周りに集まる。タウは、細胞周期中に動的にリン酸化および脱リン酸化される。タウは、減数分裂を起こさせるために微小管から解離しなければならない。有糸分裂後細胞（分化したニューロン）におけるその主な役割は、最適な軸索輸送を可能にするよう、微小管安定剤として働くことである。タウは、そのほぼ脱リン酸化された形態でのみ微小管と結合することができ、したがって、リン酸化は、ニューロン内の直接の微小管結合／解離スイッチとして働く。正常な条件下で、細胞質タウは、平均して２つのリン酸化部位を含有する。対らせん状線維状材料において、少なくとも７〜８つの部位が、リン酸化されている（Ｈａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１５，１１２−１１９；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１７０４７−１７０５４）。過リン酸化、対らせん状線維状タウは、アルツハイマー病の主な特徴であり（Ｋｏｓｉｋ  ｅｔ．ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ，８６，４０４４−４０４８）、過リン酸化タウの明確な移動度シフトが、ヒトＡＤ脳材料の免疫細胞化学分析において観察される。
【００１０】
Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ分光法のような従来の構造法を用いてタウタンパク質を研究することは、その準安定性を反映して難しかった。このような研究は、主に、非リン酸化タンパク質のドメインフラグメントにおいて行われた。ＮＭＲ分光法を用いた、完全長タウ（２Ｎ４Ｒ）に関するこれまでの構造研究のみが、タンパク質が、安定した二次構造のごくわずかな伸長を含むことを明らかにしている（Ｍｕｋｒａｓｃｈ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ．Ｂｉｏｌ．７，ｅ３４）。この分析は、ペプチド骨格の二次構造が、βシート構造を取る傾向が高いことを示す。骨格の最初の２００残基は、微小管結合領域を包含するＣ末端よりかなり秩序化されている。溶液中のタンパク質内の多くの特定の長距離相互作用の存在は、それが非常に秩序化されたモルテングロビュール状態で存在することを示す（Ｏｈｇｕｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｗａｄａ，Ａ．（１９８３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１６４，２１−２４）。
【００１１】
特にカスパーゼおよびカルパイン（Ａｓｐ１３、Ｇｌｕ３９１およびＡｓｐ４２１）によって生成されるタウのプロテアーゼ産物は、もつれ材料（ｔａｎｇｌｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）中で同定された（Ｇａｍｂｌｉｎ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１００３２−１００３７）。特に、Ａｓｐ４２１における切断が、自由Ａｓｐ４２１末端に結合するタウＣ３抗体を用いて詳細に研究された。この切断は、アポトーシスの誘発に関連するＡＤ発症の初期事象として仮定された（ｄｅＣａｌｉｇｎｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，１２０１−１２０４）。Ａｓｐ１３におけるＮ末端切断およびＧｌｕ３９１におけるＣ末端切断は、発症の後期事象とみなされる（ｄｅＣａｌｉｇｎｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，１２０１−１２０４；Ｄｅｌｏｂｅｌ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７２，１２３−１３１）。最近、さらなるＮ末端フラグメント（残基１〜２２４）が、ＡＤおよびＰＳＰ患者に由来するＣＳＦにおいて同定され、疾患および特に病原の初期マーカーであることが仮定された（米国特許出願第１４／０９２５３９号明細書；Ｂｒｉｇｈｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｅｉｎｇ，１−１７）。同様のカルパイン切断フラグメントが、他のグループによって報告された（Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｉｇｉｏ，Ｅ．Ｈ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１７，６７６−６８５；Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．６，ｅ２３８６５）。
【００１２】
過リン酸化およびタウの分画のほか、翻訳後アセチル化（Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２，２５２；Ｍｉｎ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｅｕｒｏｎ  ６７，９５３−９６６）およびＯ−ＧｌｃＮＡｃ化（Ｚｈｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）が、ＡＤに関連するもつれ病変の形成における病変規定過程であることが提示された。
【００１３】
ＩＩＩ．タウ免疫療法
免疫療法は、従来、受動および能動ワクチン手法に分けられる。能動ワクチン手法では、病原因子が患者に注入され、自然免疫系が免疫応答を引き起こす。これは、投与された抗原に対する高親和性抗体を生成するＢ細胞の成熟を誘発する。受動ワクチン手法では、自然免疫系の誘発は、抗原に対して特異的な抗体を注入することによって回避される。次に、固有のクリアランス系が、抗体結合リガンドを除去する。
【００１４】
ＡＣ免疫は、タウのリン酸化セリン４０９に対するマウスモノクローナル抗体を追跡する。抗体を、ヒトＡＤおよび対照脳組織に対してプロファイリングし、もつれ病変を認識するそれらの能力に基づいて選択した。２つの抗体のヒト化形態、ｈＡＣＩ−３６−２Ｂ６−Ａｂ１およびｈＡＣＩ−３６−３Ａ８−Ａｂ１は両方とも、アミノ酸４０１〜４１８内のタウエピトープに結合する（国際公開第２０１３／１５１７６２号パンフレット）。
【００１５】
Ｒｏｇｅｒ  Ｎｉｔｓｃｈのグループは、変性タウオパチーの兆候を有さない高齢の健常個体からタウ自己抗体を単離した。タウ特異的抗体を発見するために、いくつかの抗体を、完全長組み換えヒトタウ（２Ｎ４Ｒ）を用いて単離した。次に、これらを、疾患および健常個体に由来するタウ単離物を区別するそれらの能力についてスクリーニングした。３つの主要な抗体、４Ｅ４、４Ａ３および２４Ｂ２が、特許文献に記載されている（国際公開第２０１２０４９５７０号パンフレット；米国特許出願公開第２０１２０８７８６１号明細書）。それらのエピトープマッピングは、全てが、位置Ｖ３３９〜Ｋ３６９の、微小管結合領域内およびそのＣ末端のアミノ酸を認識することを示す。これらの抗体は、リン酸化特異性を示さない。
【００１６】
Ｃ２Ｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、主に、神経変性疾患の早期発見のための診断手段の開発に重点を置いている。完全長ヒトおよびマウスタウタンパク質に対する抗体を生成した。ヒトタウおよびマウスタウをそれぞれ認識する、８つおよび５つの抗体を同定した（Ｙａｎａｍａｎｄｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｕｒｏｎ  ８０，４０２−４１４）。異なる結合反応速度を有する３つの抗体を、インビボの評価のために選択した。すなわち、タウ残基３０６〜３２０、７〜１３および２５〜３０をそれぞれ認識する、ＨＪ９．３、ＨＪ９．４およびＨＪ８．５であり、最後のものは、ヒトタウに特異的である。また、抗体を、タウの細胞間伝播の巧妙な機構的レポーターアッセイにおいて病変の転移を防ぐそれらの能力に基づいて選択した（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｎ  ８２，１２７１−１２８８；Ｋｆｏｕｒｙ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，１９４４０−１９４５１）。Ｐ３０１Ｓトランスジェニックマウスにおける長期の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入試験におけるそれらの評価は、処理されたマウスの免疫組織化学的分析におけるＡＴ８染色によって測定した際の過リン酸化タウタンパク質のレベルを減少させるそれらの能力を実証した。
【００１７】
Ｐｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓの抗体は、ＡＤおよび対照脳材料における病理学的タウと正常なタウとを区別し得る診断手段として元々は開発された（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，５８２７−５８３１）。ＰＨＦ１およびＭＣ１抗体の治療的有用性の評価を、Ｐ３０１ＳおよびＪＰＮＬ３において実証した（Ｐ３０１Ｌ）（Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１８，６５８−６６７；Ｃｈａｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，３４４５７−３４４６７；Ｄ’Ａｂｒａｍｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．８，ｅ６２４０２  ｍｉｃｅ）。ＰＨＦ１が、線状リン酸化タウエピトープ（ｐＳ３９６、ｐＳ４０４）を認識する一方、ＭＣ１は、線状配列の２つの明確な部分を必要とする構造的タウエピトープ、残基４６〜２０２内のエピトープおよび残基３１２〜３４２間のＣ末端エピトープを認識する立体配座依存性抗体である（Ｊｉｃｈａ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４８，１２８−１３２）。長期の１２〜１３週間の免疫化試験におけるこれらの２つの抗体の注入は、他の脳領域の中でも特に脊髄および脳幹病変のかなりの減少をもたらし、これは、これらのマウスにおいて観察される運動障害の軽減に置き換えられる（Ｄ’Ａｂｒａｍｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．８，ｅ６２４０２）。
【００１８】
ｉＰｅｒｉａｎ／Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂは、誘導多能性幹細胞に基づく神経培養において活動亢進を促進した、タウのＮ末端フラグメント（ｅｔａｕ：残基１〜２２４）から構成される仮定された病理学的タウ種に対するタウ抗体を開発した。抗体のポートフォリオが開発されたが、特性決定は、残基９〜１８内のＮ末端エピトープを認識する抗体ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２に重点を置いていた。したがって、これらの抗体は、疾患の初期兆候であり得る、段階的なＡＤおよびＰＳＰ患者に由来するＣＳＦにおける高いタウレベルを検出する。ＪＰＮＬ３（Ｐ３０１Ｌ）マウスにおける抗体のインビボ注入は、進行性運動障害の部分的な回復をもたらした（米国特許出願第１４／０９２５３９号明細書）。
【００１９】
Ｅｉｎａｒ  Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎは、タウに基づく免疫療法の有効性を実証する最初のプログラムであった。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ補助剤と一緒にタウペプチド３７９〜４０８［ｐＳ３９６、ｐＳ４０４］からなる能動ワクチンを用いて、ＪＰＮＬ３（Ｐ３０１Ｌ）マウスを免疫した。この研究において、タウ病変の著しい減少が、対照動物と比較したときに、ワクチンで処理されたマウスにおいて観察された。タウオパチー関連運動表現型の軽減が、同様に検出された。その有効性が、突然変異体タウによって駆動されない異なるマウスモデル（ｈｔａｕ／ＰＳ１）において確認された（Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＡＩＣ  ２０１１（７，ｉｓｓｕｅ  ４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｅｄｎ）ｐ．ｓ４８０−ｓ４３１；Ｃｏｎｇｄｏｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，３５４５２−３５４６５；Ｇｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，３３０８１−３３０９５）。
【００２０】
Ｐｒｏｔｈｅｎａは、Ｋ３６９Ｉ（Ｋ３）トランスジェニックタウマウスおよびＰ３０１Ｌマウスモデルにおいて３つのタウ抗体を評価した。様々な特性を有する抗体を、インビボの評価のために選択した。異なるアイソタイプ（ＩｇＧ１／ｋおよびＩｇＧ２ａ／ｋ）を有する２つのｐＳ４０４抗体または総（ｐａｎ）抗タウ抗体（ＩｇＧ１／ｋ）を、長期のパラダイムで注入した。Ｋ３６９Ｉマウスを、３週齢から開始して２１週間にわたって週に１回の注入で処理し、Ｐ３０１Ｌマウスを、４月齢から開始して７ヶ月間にわたって週に１回の注入で処理した。タウ陽性の神経原線維封入体の減少が、ＩｇＧ２ａ／ｋ  ｐＳ４０４抗体を用いたＫ３マウスにおいて観察された。ｐＳ４０４抗体の両方が、ｐＳ４２２陽性タウのレベルを減少させることができた一方、ｐａｎ−抗タウ抗体で処理されたマウスにおいて減少は観察されなかった。これらの研究は、１）タウクリアランスは、アイソタイプ依存性であり得ること、および；２）総−抗タウ抗体が過リン酸化タウを減少させることができなかったため、疾患に関連するタウ種を標的にすることが重要であり得ることを示唆している（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２５０４４号明細書）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の発明者らは、リン酸化タウセリン残基３９６（ｐＳ３９６）に特異的な抗体を意外にも発見し；これは、先行技術と対照的に、主に、３９６および４０４残基の両方においてリン酸化されるか、４０４残基のみまたはタウにおける他の残基においてリン酸化されるタウタンパク質を認識する抗体である。
【００２２】
本発明者らは、ヒト病理学的タウに対する著しい特異性および選択性をさらに有する抗体を開発した。病原性タウタンパク質に対して非常に選択的かつ特異的な抗体が必要とされている。本発明の抗体は、国際公開第２０１３／０５０５６７号パンフレットの抗体（国際公開第２０１３／０５０５６７号パンフレットの図１を参照）と比較して、非病理学的タウよりヒト病理学的タウに対するはるかに高度な特異性および選択性を示す。特異的結合を有することが報告された、国際公開第２０１２／０４５８８２号パンフレットの抗体は、タウアミノ酸３９３〜４０１、３９６〜４０１、３９４〜４００および３９３〜４００の６〜９つの残基アミノ酸配列から誘導された。病原性過リン酸化タウに対して誘導された、本発明の抗体からのこの構築物は、本明細書に記載されるより長いアミノ酸配列を含む。
【００２３】
実施例に示されるように、５つの公開されたタウ抗体：ｈＡＣＩ−２Ｂ６（国際公開第２０１３１５１７６２号パンフレットに記載されている）；ＩＰＮ００２（国際公開第２０１４０２８７７７号パンフレットに記載されている）；ＨＪ８．５（国際公開第２０１４００８４０４号パンフレットに記載されている）；抗タウｐＳ４２２モノクローナル抗体２．１０．３（米国特許第８６０９０９７号明細書に記載されている）；ＰＨＦ１３（マウス、ラットおよびヒト由来のＳｅｒ  ３９６においてリン酸化され、Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ（ＰＬＯＳＯＮＥ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２５６１４  Ｍａｙ  １，２０１５およびＯｔｖｏｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６，８１１４−８１２４）によって説明されるタウの検出に推奨される市販の抗体（例えばＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）；および４Ｅ４抗体（米国特許第８９４０２７２号明細書においてＶ３３９、Ｅ３４２、Ｄ３８７、Ｅ３９１およびＫ３９５に結合することが記載されている）との比較は、本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントが、比較用抗体のいずれよりも、ヒト病理学的タウに対するより高度な特異性および選択性を示すことを示した。
【００２４】
さらに、本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントは、病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別し、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）病変に関連するタウに結合する能力などの多くの有利な特徴を示す。電気生理学的研究において、本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントはさらに、減少した二発刺激促通および自発的な微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を改善することができた。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、ヒト（２Ｎ４Ｒアイソフォーム）タウ（配列番号３３）のリン酸化残基セリン３９６に、ならびにこのような特異的な単離および回収を可能にする新規な方法を用いて産生されたこのような抗体に特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントに関する。抗体は、それらがリン酸化４０４残基に実質的に結合しないように、リン酸化残基３９６および４０４を区別することができるそれらの能力によってさらに特徴付けられる。
【００２６】
特定の理論によって制約されるものではないが、本発明者らによるエビデンスは、３９６ではなく残基４０４においてリン酸化されるタウタンパク質の存在下における、残基３９６においてリン酸化されるヒトタウタンパク質に対する本発明の抗体の区別および選択性が、病理学的および治療学的観点から顕著であることを実証している。本発明の抗体は、非病理学的であるが、リン酸化されたタウの存在下で、病理学的タウに対して選択的である。本発明の抗体は、正常なタウの存在下で、病理学的タウのタウもつれ（ｔａｕ  ｔａｎｇｌｅ）を除去することができる。特定の理論によって制約されるものではないが、タウ位置３９６においてリン酸化されたタウタンパク質を含むタウのもつれを除去することは、タウもつれへの病理学的タウのシーディングを防ぐものと考えられる。したがって、本発明の一態様は、分子がタウ位置４０４においてリン酸化されたタウタンパク質の存在下にある場合でも、３９６−リン酸化タウに選択的に結合することが可能な抗体に関する。本発明の関連する態様は、分子が非病原性タウの存在下にある場合でも、３９６−リン酸化タウに選択的に結合することが可能な抗体に関する。さらに定義される、本発明は、病理学的タウに対して選択的な抗体に関し、前記病理学的タウは、タウのヒト２Ｎ４Ｒアイソフォームを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて（ウエスタンブロット分析によって）６４ｋＤａバンドとして現われる過リン酸化タウである。
【００２７】
本発明の一態様は、以下の試験基準を満たす抗タウ抗体に関する：ｉ）抗体は、非リン酸化タウに結合しない；ｉｉ）抗体は、４０４においてリン酸化されるタウにも、および３９６においてリン酸化されるタウにも結合しない；ｉｉｉ）抗体は、３９６においてリン酸化されるタウに結合する；ｉｖ）抗体は、３９６および４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する。本発明者らは、試験基準ｉｉｉ）およびｉｖ）下の結合が、同じ程度であることを発見し、位置４０４におけるリン酸化が、結合過程を阻害も促進もしないことを主張する。本発明者らは、試験基準ｉｉ）に反して、３９６においてリン酸化されず、４０４においてリン酸化されるタウタンパク質への結合が、試験モデルにおいて、もつれを除去せず、または病理学的タウも除去しないことをさらに発見した。
【００２８】
本発明の一態様は、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇ｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４および７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％以下だけ減少させる抗タウ抗体に関する。本発明のさらなる態様は、過リン酸化タウ６４および７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％以下だけ減少させる抗タウ抗体；または、本明細書に記載されるようにヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、リン酸化Ｓ３９６過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、アルツハイマー病などのタウオパチーに罹患した患者を治療する方法であって、もつれを除去するか、または前記もつれの進行を軽減する工程を含む方法に関し、前記もつれは、過リン酸化タウを含み、前記方法は、もつれが除去され、過リン酸化タウのその含有量が減少され、またはもつれ形成の進行が軽減されるように、過リン酸化タウを本発明の抗体と接触させる工程を含む。
【００３０】
別に定義される、本発明は、アルツハイマー病などのタウオパチーに罹患した患者を治療する方法に関し、前記方法は、もつれから過リン酸化タウが取り除かれるように、リン酸化残基３９６を有するタウに対して選択的な抗体ともつれを接触させる工程を含む。
【００３１】
より詳細には、本発明は、以下を含む群から選択される４つのモノクローナル抗体のうちのいずれか１つに関する：
抗体Ｃ５．２
ここで、抗体Ｃ５．２は、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含み；
抗体Ｃ８．３
ここで、抗体Ｃ８．３は、
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含み；
抗体Ｃ１０−２
ここで、抗体Ｃ１０−２は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含み；
および
抗体Ｄ１．２
ここで、抗体Ｄ１．２は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む。
【００３２】
中に定常領域を含む、例示的な抗体Ｃ５．２の完全軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３および配列番号２４に示される（実施例において使用されるように）。
【００３３】
中に定常領域を含む、例示的な抗体Ｃ８．３の完全軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３１および配列番号３２に示される（実施例において使用されるように）。
【００３４】
中に定常領域を含む、興味深い抗体Ｃ１０−２の完全軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に示される（実施例において使用されるように）。ヒト化Ｃ１０−２抗体の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号３５に示される。ヒト化Ｃ１０−２抗体の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号３６に示される。本発明の一態様は、配列番号３５または配列番号３６、または両方を含む本発明の抗体に関する。
【００３５】
中に定常領域を含む、例示的な抗体Ｄ１．２の完全軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７および配列番号８に示される（実施例において使用されるように）。
【００３６】
代替的な実施形態において、抗体Ｄ１．２は、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ここで、位置３におけるアミノ酸はバリンである（一方、配列番号７の例示的な軽鎖において、このアミノ酸はメチオニンである）。この軽鎖は、上述されるように重鎖と組み合わされてもよく、すなわち、配列番号４、５および６のＣＤＲを有する。例えば、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖と一緒に、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る（抗体「Ｄ１．２＊」）。
【００３７】
本発明の一態様は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体に関する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含むか、またはさらに含む抗体に関する。
【００３９】
本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントは、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ＴＢＩ（軽度、急性または慢性の外傷性脳損傷）、および慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）などのタウオパチーを治療するのに使用され得る。
【００４０】
本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントはさらに、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病の治療に使用することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】病理学的材料への結合ドットブロット  図１（パネルＡ〜Ｂ）は、病理学的タウの検出（実施例３）を評価するために１μｇ／ｍｌのＤ１．２またはＣ１０−２を用いて調べられた、ＡＤ患者（ＡＤ）および高齢の健常個体（ｃｏｎ）の脳に由来するかまたは３２週齢のｒＴｇ４５１０および非トランスジェニック（ｗｔ）同腹仔に由来する５００ｎｇのＳ１およびＰ３画分を示すドットブロット分析の結果を示す（Ｓ１およびＰ３画分の生成は、実施例３に開示されている）。ドットブロットは、Ｄ１．２（パネルＡ）またはＣ１０−２（パネルＢ）が、トランスジェニックマウス（Ｔｇ４５１０）において発現される際に、ＡＤ患者またはヒト（Ｐ３０１Ｌ）タウに由来する疾患材料において特異的に反応することを示す。
【図２】Ｄ１．２およびＣ１０−２抗体のウエスタンブロット分析  図２（パネルＡ〜Ｂ）は、１μｇ／ｍｌのＤ１．２（パネルＡ）またはＣ１０−２（パネルＢ）を用いて調べられた、３２週齢のｒＴｇ４５１０および非トランスジェニック（ｗｔ）同腹仔の脳に由来する２μｇのＳ１およびＰ３画分またはＡＤ患者（ＡＤ）および高齢の健常個体（ｃｏｎ）の脳に由来する２０μｇのＳ１およびＰ３画分を示すウエスタンブロット分析の結果を示す。０．０１ｍｇの組織に由来するＳ１およびＰ３画分を、（組織重量に基づいて）１：５０の比率で充填した。ウエスタンブロットにおいて、正常なＰ３０１Ｌ突然変異体ヒト４Ｒ０Ｎタウが、５５ｋＤａにおいて示される一方、過リン酸化Ｐ３０１Ｌ突然変異体ヒト４Ｒ０Ｎタウ種は、６４および７０ｋＤａにおいて示される。ＡＤに由来するＰ３画分では、過リン酸化タウが、５４、６４、６９および７４ｋＤａにおいて示される（実施例３）。図は、抗体が、過リン酸化された、移動度シフトされたタウタンパク質に特異的に結合することを示す。
【図３】ＭＳＤにおける病理学的Ｐ３材料への結合  図３（パネルＡ〜Ｄ）は、ヒトＡＤおよび非罹患対照脳から単離されるタウに対するＤ１．２（パネルＡ）、Ｃ５−２（パネルＢ）、Ｃ１０−２（パネルＣ）およびＣ８−３（パネルＤ）のＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡ結合の結果を示す（実施例４）。図１に示されるのと同様に、ＥＬＩＳＡプレートにおける疾患（ＡＤ）および健常対照脳から単離されるタウの固体化は、本発明の抗体が、病理学的タウ種に特異的に結合することを実証するのに使用され得る。増加する濃度の抗体は、飽和結合をもたらす。多くの結合抗体が、二次抗マウス抗体を用いて検出される。
【図４】ペプチド親和性およびｐＳ３９６選択性（ペプチド結合）  図４（パネルＡ〜Ｄ）は、位置Ｓ３９６およびＳ４０４におけるリン酸化の全ての組合せを用いた、タウ（３８６−４０９）ペプチドに対するＣ１０−２（パネルＡ）およびＤ１．２（パネルＢ）の特異的結合の分析の結果を示す（実施例５）。ヒト病理学的材料に対する特異的親和性は、評価するのが難しく、この理由から、本発明者らは、特異的リン酸化および非リン酸化ペプチドを用いて正確なエピトープ親和性を決定するために特異的ペプチド結合を使用する。特異的な用量反応曲線が、残基Ｓｅｒ３９６およびＳｅｒ４０４においてリン酸化される、ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）への抗体Ｃ１０−２（パネルＣ）およびＤ１．２（パネルＤ）の結合について示される。非リン酸化ペプチド（ＮＰ）および一リン酸化ペプチド（ｐＳ３９６およびｐＳ４０４）との競合結合が行われた。さらに、リン酸化セリン２６２に対応する対照ペプチドが含まれていた。競合結合は、全ての結合がリン酸化３９６セリン残基を介して得られることを実証する。さらに、データは、残基４０４におけるリン酸化が、リン酸化セリン３９６における抗体の結合を妨げないことを実証する。
【図５】病変特異的抗体の組織学的特性評価  図５、パネルＡは、Ｃ１０−２（左列）およびＤ１．２（右列）抗体が、Ｔｇ４５１０（上行）細胞体および神経網においてｐ−タウ種に結合することを示す。免疫反応性は、非−Ｔｇ脳切片（下行）において検出されない。図５、パネルＢは、Ｃ１０−２（左列）およびＤ１．２（右列）抗体が、ＡＤドナー（ＡＤ）（上行）における細胞体および神経絨毛糸（ｎｅｕｒｏｐｉｌ  ｔｈｒｅａｄ）においてｐ−タウ種に結合することを示す。対照ドナー脳には、免疫反応性がない（下行）（実施例６）。
【図６】Ｃ１０−２および対照抗体についての病理学的および非病理学的Ｐ３への結合  図６（パネルＡ〜Ｅ）は、先行技術の抗体２−１０−３（パネルＡ）、ＨＡＣＩ−２Ｂ６（パネルＢ）、ＩＰＮ  ００２（パネルＤ）、およびＨＪ８．５（パネルＥ）と比較した、病理学的材料を認識する際の本発明の抗体Ｃ１０−２（パネルＣ）の優位性を実証する結果を示す。図は、Ｐ３０１Ｌ突然変異体ヒトタウを発現する１０月齢のＴｇ４５１０マウスに由来するタウへの結合とともに、健常（対照として）および疾患（ＡＤ）ヒト脳に由来するタウへのＣ１０−２の特異的結合を示す。増加する濃度の抗体が、ＥＬＩＳＡプレート上に固定されるＰ３タウ材料に加えられる。病理学的タウに対する選択性の比率が、活性種による完全飽和で決定される。先行技術の抗体のそれぞれに対する選択性倍数（ｆｏｌｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）が、図に示される（実施例７）。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞およびインビトロにおけるシーディングの防止  図７（パネルＡ〜Ｃ）は、Ｃｉｓｂｉｏアッセイによるタウ凝集の定量化を示す。播種されたｐｃＤＮＡ  ＨＥＫ２９３細胞は、シグナルを示さず、これは、入力シーディング材料の検出がなかったことを確認する。Ｗｔ（野生型）シーディング材料（ＷＷ）は、シーディングを示さなかったが、対照的に、ｒＴｇ４５１０ホモジネート（ＣＣ）は、非播種と比較して、効率的に播種された。このシーディング効果は、ＨＥＬによる処理によって影響されなかったが、タウ抗体による処理によって部分的に改善された（Ｃ１０−２＞Ｄ１．２＞ｈＡＣＩ３６−２Ｂ６−Ａｂ１）。グラフ（パネルＡ〜Ｃ）は、３つの独立した組の試料を示し、相対タウ凝集としてプロットされる（総タンパク質に対して正規化されたバックグラウンドに対するシグナル倍数（ｆｏｌｄ  ｓｉｇｎａｌ））（実施例８）。
【図８】電気生理学的障害の改善  図８は、Ｔｇ４５１０マウスおよび対照としてのｔＴａマウスにおけるＣ１０−２によるＣＡ１亜慢性処理における誘発電場電位を示す、ＣＡ１誘発電場電位（Ｃ１０−２、パネルＡ；Ｄ１．２、パネルＢ）における二発刺激促（パネルＢおよびＤ）および基底シナプス伝達（パネルＡおよびＣ）障害の抗体による改善を示す。動物を、２週間にわたって１５ｍｇ／ｋｇの用量の抗体で週に２回処理した（実施例９を参照）。パネルＡ（Ｃ１０−２について）およびパネルＣ（Ｄ１．２について）において、電場電位（ｆＥＰＳＰ）の傾きが、刺激強度に対してプロットされる。パネルＡおよびＣは、４．５〜５．５月齢のｒＴｇ４５１０（下側の２つの曲線）およびｔＴＡ（上側の２つの曲線）対照マウスにおける海馬のＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性のインビボの電気生理学的評価において、ｉ）基底シナプス伝達が、ｔＴＡマウスと比較してｒＴｇ４５１０において有意に低下され、ｉｉ）二発刺激促通が、ｔＴＡマウスと比較してｒＴｇ４５１０において有意に減少されることを示す。  シナプス前機構に依存するものと考えられる短期シナプス可塑性である二発刺激促通を、ｒＴｇ４５１０およびｔＴＡマウスにおいてさらに測定した（Ｃ１０−２についてはパネルＢおよびＤ１．２についてはパネルＤ）。簡潔に述べると、２５〜１０００ｍｓで変化する刺激間時間間隔（ＩＳＩ）を有する一対の刺激を、シャファー側枝に加え、第２のｆＥＰＳＰの傾きを、第１のｆＥＰＳＰの傾きと比較した。促通が全てのＩＳＩで観察され、５０および７５ｍｓのＩＳＩで最大の促通を有していた。興味深いことに、有意に低いＰＰＦが、ｔＴＡマウス（第１の２つのバー）と比較したとき、ｒＴｇ４５１０マウス（第２の２つのバー）において観察された。
【図９】図１〜８に概略が示されるスクリーニングの概要  抗体を、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーする二リン酸化ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）に対して誘導した。ハイブリドーマを、ドットブロットおよび免疫化されたヒト病理学的および非病理学的タウを用いたＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ（実施例４）を用いてスクリーニングして、リン酸化エピトープＳ３９６および／またはＳ４０４のいずれかに対して高度に特異的なクローンを単離すると同時に、ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウを特異的に認識した。ドットブロットおよびウエスタンブロットにおいて病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力が、ハイブリドーマの選択に使用される。１６のクローンを選択し、そのうちの４つのクローン（Ｄ１．２、Ｃ１０−２、Ｃ５．２およびＣ８．３）が、ヒト病理学的材料に結合する目立った能力を示す。特異的な免疫化およびスクリーニングプロトコルの使用が、高リン酸化セリン−３９６（ｐＳ３９６）特異的抗体を産生する。
【図１０】残基ｐＳｅｒ３９６が、ｍＡｂ  Ｃ５．２の抗原結合部位の中心に結合される  １．９Åの解像度における、リン酸化ペプチド３８６〜４１０との複合体中のｍＡｂ  Ｃ５．２の結晶構造。この構造において、残基３９２〜３９８の電子密度が分解される。残基｛ｐ｝Ｓｅｒ３９６が、ｍＡｂ  Ｃ５．２の抗原結合部位の中心に結合される。抗タウｍＡｂのこの構造試験において、エピトープは、重鎖（右下）および軽鎖（左下）にわたって結合される。
【図１１】ホスホセリンタウ（２９２〜２９８）ペプチドとの抗体Ｃ５．２の相互作用  図１１は、抗体Ｃ５．２と、ホスホセリンタウ（２９２〜２９８）ペプチドとの相互作用を示す。Ｉｌｅ（３９２）−ＶＡＬ（３９３）−Ｔｙｒ（３９４）−Ｌｙｓ（３９５）−Ｐ−Ｓｅｒ（３９６）−Ｐｒｏ（３９７）−Ｖａｌ（３９８）の構造が示される。主な相互作用は、タウペプチドのＬ３：Ｈ３、Ｌ３：Ｆ８＊、Ｈ１：Ｈ１３、Ｈ２：Ｙ１、Ｈ２：Ｙ３およびＹ（３９４）によって形成される疎水性ポケットを必要とする。溶媒和｛ｐ｝Ｓ（３９６）およびＬ３：Ｔ４、Ｈ１：Ｒ１０、Ｈ１：Ｔ１１、Ｈ３：Ｒ１、Ｈ３：Ｔ３の間で形成される広範囲の水素結合ネットワークがある。用いられる命名法では、最初の文字（例えば、Ｌ３：Ｈ３の「Ｌ」）は、含まれるＣＤＲ残基が、軽鎖ＣＤＲであるかまたは重鎖ＣＤＲであるかを示し、最初の数字は、このような鎖のどのＣＤＲが含まれるかを示し（例えば、「Ｌ３」は、軽鎖のＣＤＲ３を示す）、残りの語（例えば、Ｌ３：Ｈ３の「Ｈ３」）は、含まれるアミノ酸の名称および位置を示し（例えば、「Ｈ３」は、ＣＤＲの第３の残基位置におけるヒスチジンを示し）；したがって、「Ｌ３：Ｈ３」は、軽鎖ＣＤＲ３の第３の位置におけるヒスチジン残基を示す。Ｙ（３９４）側鎖および骨格の間に強い水素結合および電荷／極性相互作用があり、｛ｐ｝Ｓ３９６のホスホネートが、ペプチド骨格の変化を形成する。（＊）Ｌ３：Ｆ８は、ＣＤＲ  Ｌ３のフレームワーク残基に隣接するＣ末端である。  Ｃ５．２のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ  Ｌ１：ＱＡＳＱＤＴＳＩＮＬＮ（配列番号１７）ＣＤＲ  Ｌ２：ＧＡＳＮＬＥＤ（配列番号１８）ＣＤＲ  Ｌ３：ＬＱＨＴＹＬＰ（配列番号１９）ＣＤＲ  Ｈ１：ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＲＴＩＨ（配列番号２０）ＣＤＲ  Ｈ２：ＹＩＹＰＧＤＤＳＴＫＹＮＤＮＦＫＧ（配列番号２１）ＣＤＲ  Ｈ３：ＲＧＴＭＤＹ（配列番号２２）である。
【図１２】シーディングアッセイ（ＨＥＫ２９３）のためのタウの欠失  図１２（パネルＡ〜Ｂ）は、マウスＣ１０−２（ｍＣ１０−２）およびヒト化Ｃ１０−２（ｈＣ１０−２）を用いたｒＴｇ４５１０脳ホモジネートの免疫枯渇を示す。欠失されたホモジネートのウエスタンブロットを、Ｅ１（総タウ；パネルＡ；下側））およびＣ１０−２（ｐＳ３９６タウ；パネルＡ；上側）で検出し、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２は両方とも、過リン酸化タウを効率的に欠失させた（Ｅ１ブロットにおける上側バンドおよびＣ１０−２ブロットにおける全てのバンド）。また、欠失されたホモジネートを、Ｃｉｓｂｉｏアッセイを用いて、凝集タウの欠失について分析した。パネルＢは、試料における凝集タウの変化を示す。ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２を用いた欠失試験は、タウ凝集体をそれぞれ９９および９９．５％除去した（パネルＢ）。
【図１３】欠失された材料を用いたシーディングアッセイ（ＨＥＫ２９３）  パネルＡ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞内にＰ３０１Ｌ−ｈタウを播種するのに使用される欠失されたホモジネートを示す。対照動物（ＷＷ）に由来するホモジネートが播種しなかった一方、ｒＴｇ４５１０ホモジネート（ＣＣ）は、総細胞溶解物におけるＣｉｓｂｉｏ凝集アッセイによってまたは１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（不溶性過リン酸化Ｄ１．２およびタウ（パネルＡ、上側および下側）の定量化）中のＨＥＫ２９３細胞の分画によって測定した際、効率的に播種された。ＨＥＬおよびｈＨＥＬ抗体による欠失は、シーディングに影響を与えなかった一方、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２による欠失は、タウ凝集を８８％および９６％（パネルＣ）および不溶性タウを９７％および１００％（パネルＢ）それぞれ防いだ。
【図１４】免疫枯渇ｒＴｇ４５１０材料（インビボのシーディング試験に使用される）  パネルＡ〜Ｃは、免疫枯渇ｒＴｇ４５１０脳抽出物のウエスタンブロット（パネルＡ；上側、下側）分析を示す。Ｃ１０−２およびＤ１．２は、ヒト過リン酸化６４ｋＤａバンドを９０％だけ特異的に減少させ、５５ｋＤａタウ、タウ５に対する効果を与えず、市販の総タウ抗体は、対照的に、正常５５ｋＤａタウを７４％だけ減少させ、ヒト６４ｋＤａタウに対する効果を与えない（パネルＢ〜Ｃ）。
【図１５】免疫枯渇ＡＤ材料（インビボのシーディング試験に使用される）  図１５（パネルＡ〜Ｃ）は、免疫枯渇されたアルツハイマー病の脳抽出物のウエスタンブロット（パネルＡ）分析を示す。Ｃ１０−２およびＤ１．２を用いた免疫枯渇は、総タウレベルを１０％超減少させず、過リン酸化タウを特異的に低下させた（９０％の減少）（パネルＢ〜Ｃ）。
【図１６】（パネルＡ）：免疫枯渇ｒＴｇ４５１０材料が播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬タウ病変  図１６（パネルＡ）は、ｒＴｇ４５１０またはＡＤ脳ホモジネートが播種されたｒＴｇ４５１０脳におけるタウ病変の定量化を示す。シーディングの前に、過リン酸化タウは、Ｃ１０−２またはＤ１．２を用いてホモジネート中で９０〜９５％だけ減少されたが、正常タウは減少されなかった。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。（パネルＢ）免疫枯渇ＡＤ材料が播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬もつれ病変  図１６（パネルＢ）は、ｒＴｇ４５１０（Ａ）またはＡＤ（Ｂ）脳ホモジネートが播種されたｒＴｇ４５１０脳におけるタウ病変の定量化を示す。シーディングの前に、過リン酸化タウは、Ｃ１０−２またはＤ１．２を用いてホモジネート中で９０〜９５％だけ減少されたが、正常タウは減少されなかった。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。
【図１７】Ｄ１．２で処理された播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬もつれ病変  図１７は、播種されたｒＴｇ４５１０マウスの海馬におけるもつれを有するニューロンの定量化を示す。病変は、時間とともに増加する（Ｉｇ  Ｇ、１ヶ月；ＩｇＧ  ２ヶ月；ＩｇＧ  ３ヶ月）。しかしながら、マウスをＤ１．２で処理すると、病変は、シーディングの１、２および３ヵ月後に有意に減少される（Ｄ１．２  １ヶ月；Ｄ１．２  ２ヶ月；Ｄ１．２  ３ヶ月）。
【図１８】シーディングアッセイ（ＨＥＫ２９３）のためのタウの欠失  パネルＡは、マウスＣ１０−２（ｍＣ１０−２）およびヒト化Ｃ１０−２（ｈＣ１０−２）を用いたｒＴｇ４５１０脳ホモジネートの免疫枯渇を示す。欠失されたホモジネートのウエスタンブロットを、Ｅ１（総タウ）およびＣ１０−２（ｐＳ３９６タウ）で検出し、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２は両方とも、過リン酸化タウを効率的に欠失させた（Ｅ１ブロットにおける上側バンドおよびＣ１０−２ブロットにおける全てのバンド）。欠失されたホモジネートを、Ｃｉｓｂｉｏアッセイを用いて、凝集タウの欠失について分析した。パネルＢは、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２による欠失が、タウ凝集体をそれぞれ９９および９９．５％除去したことを示す。
【図１９】欠失された材料を用いたシーディングアッセイ（ＨＥＫ２９３）  パネルＡは、タウ分画（不溶性画分に対するウエスタンを示す。パネルＢは、ウエスタンブロット定量化を示す。パネルＣは、細胞溶解物中の凝集タウを示す。欠失されたホモジネートを用いて、ＨＥＫ２９３細胞内にＰ３０１Ｌ−ｈタウを播種した。対照動物（ＷＷ）に由来するホモジネートが播種しなかった一方、ｒＴｇ４５１０ホモジネート（ＣＣ）は、総細胞溶解物におけるＣｉｓｂｉｏ凝集アッセイによってまたは１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中のＨＥＫ２９３細胞の分画（不溶性過リン酸化Ｄ１．２＋タウの定量化）によって測定した際、効率的に播種された。ＨＥＬおよびｈＨＥＬ抗体による欠失は、シーディングに影響を与えなかった一方、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２（パネルＣ）による欠失は、タウ凝集を８８％および９６％および不溶性タウを９７％および１００％それぞれ防いだ（パネルＢ）。
【図２０】正常なタウより過リン酸化タウに対するＣ１０−２およびＤ１．２の免疫選択性。  インビボのシーディング試験に使用される免疫枯渇ｒＴｇ４５１０材料：パネルＡは、免疫枯渇ｒＴｇ４５１０脳抽出物のウエスタンブロット分析を示す。パネルＢは、Ｃ１０−２およびＤ１．２が、有意な量のｐ３９６を含まないタウ５５ｋＤａバンドより、セリン３９６においてリン酸化される過リン酸化６４ｋＤａバンドを特異的に減少させることを示す。対照的に、市販の総タウ抗体であるタウ５は、正常な５５ｋＤａタウを減少させ、６４ｋＤａタウへの結合において非効率である。
【図２１】正常なタウより過リン酸化タウに対するＣ１０−２およびＤ１．２の免疫選択性。  免疫枯渇ＡＤ材料（インビボのシーディング試験に使用される：パネルＡは、免疫枯渇されたアルツハイマー病の脳抽出物のウエスタンブロット分析を示す。ｍＣ１０−２およびＤ１．２を用いた免疫枯渇は、総タウレベルを１０％超減少させず（パネルＢ）、過リン酸化タウを特異的に低下させる（９０％の減少）（パネルＣ）。
【図２２】ｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬タウ病変  パネルＡは、免疫枯渇ｒＴｇ４５１０材料が播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬タウ病変を示す。パネルＢは、免疫枯渇ＡＤ材料が播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬もつれ病変を示す。ｒＴｇ４５１０（Ａ）またはＡＤ（Ｂ）脳ホモジネートが播種されたｒＴｇ４５１０脳におけるタウ病変の定量化。シーディングの前に、過リン酸化タウは、抗体Ｃ１０−２またはＤ１．２を用いてホモジネート中で９０〜９５％だけ減少されたが、正常なタウは減少されなかった。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。
【図２３】Ｄ１．２で処理された播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける海馬もつれ病変  播種されたｒＴｇ４５１０マウスの海馬におけるもつれを有するニューロンの定量化。図は、病変が、時間とともに増加し、マウスをＤ１．２で処理することによって、病変が、シーディングの２および３ヵ月後に有意に低下されることを示す。
【図２４】免疫枯渇ヒトＡＤ抽出物のウエスタンブロット分析  図は、Ｃ１０−２のヒト化形態（ｈＣ１０−２）、ならびにｍＣ１０−２は、残りの総タウが、２．１０．３、Ｃ１０−２（ｈＣ１０−２）、ならびにｍＣ１０−２と劇的に異なっていないが（左側のパネル）、免疫枯渇方法によってアルツハイマー病の脳抽出物中に存在するより多くの過リン酸化タウタンパク質を除去する点で、２．１０．３（Ｐ−Ｓ４２２）抗体と異なることを示す。これは、定量化によって図２５において確認される。
【図２５】免疫枯渇後の凝集タウの定量化  ｈＣ１０−２およびｍＣ１０−２抗体は、免疫枯渇方法によってアルツハイマー病の脳抽出物中に存在するより多くの凝集タウタンパク質を除去するその能力が、２．１０．３抗体と異なる。
【図２６】免疫枯渇後に残っている総タウ  異なる量のヒト化Ｃ１０−２（▲）および２．１０．３抗体（◆）を用いてアルツハイマー病の抽出物を免疫枯渇させた後のウエスタンブロットシグナルの定量化。図２６において、タウ５を用いた総タウシグナルの定量化（全てのタウアイソフォームが、分析に含まれていた）が示される。両方の抗体は、アルツハイマー病の脳標本からタウのわずかな部分を除去する。Ｐ−Ｓ４２２タウに対する特異性を有することが示された２．１０．３は、総タウ量の最大で２４％を除去する一方、Ｃ１０−２は、総タウの最大で１５％を除去する（図２６を参照）。
【図２７】過リン酸化タウの免疫枯渇後に残っている総タウ  図２７は、セリン４２２においてリン酸化される過リン酸化タウの定量化を示す（全てのバンドおよび高分子量塗抹（ｓｍｅａｒ）が分析に含まれていた）。２．１０．３（▲）およびＣ１０−２（◆）は両方とも、セリン４２２においてリン酸化されるタウの９０％超を除去する。しかしながら、５０％のタウを除去するのに必要な抗体の量は異なる：抗体２．１０．３では、０．４２μｇの抗体が必要とされる一方、Ｃ１０−２では、０．２７μｇが同じ効果のために必要とされる。
【図２８】過リン酸化タウの免疫枯渇後に残っている総タウ  セリン３９６においてリン酸化される過リン酸化タウの定量化（全てのバンドおよび高分子量塗抹が分析に含まれていた）。Ｃ１０−２（◆）は、セリン３９６においてリン酸化されるタウを効率的に除去する（最大の効果：８８％および効果の半分には、０．３０μｇの抗体を用いて達する）。２．１０．３（▲）は、セリン３９６においてリン酸化されるタウのよりわずかな部分を除去する（最大の効果：６０％およびその効果の半分には、０．６３μｇの抗体を用いたときに達する）。これは、セリン４２２においてリン酸化される全てのタウが、セリン３９６においてもリン酸化されるが、位置４２２におけるリン酸化セリンが存在しない場合、セリン３９６においてリン酸化される過リン酸化タウの部分がないことを示す。
【図２９】過リン酸化タウの免疫枯渇後に残っている総タウ  セリン１９９／２０２においてリン酸化される過リン酸化タウの定量化（全てのバンドおよび高分子量塗抹が分析に含まれていた）。Ｃ１０−２（◆）によって除去されるタウの大部分はまた、セリン１９９／２０２においてリン酸化され、これは、そのリン酸化を有するタウの６９％が、免疫枯渇によって影響されるためである（０．３４μｇの抗体を用いたときの効果の５０％）。２．１０．３（▲）免疫枯渇は、Ｐ−Ｓ１９９／２０２タウに関するＳ字形用量反応を示さないが、シグナルの低下が、増加する量の抗体で見られる（最大量の抗体（５μｇ）を用いたときの最大５２％の減少。このデータは、リン酸化セリン３９６を標的にするＣ１０−２抗体が、４２２位置におけるリン酸化セリンを標的にする２．１０．３抗体より大きいプールの過リン酸化タウに結合することを示す。
【図３０】ｍＣ１０−２被覆プレートにおけるタウ抗原捕捉のｍＤ１．２およびｍＣ１０−２阻害  流体相ＥＬＩＳＡにおいて、ｒＴｇ４５１０  Ｐ３標本および可変量のＣ１０−２またはＤ１．２抗体の混合物を、Ｃ１０−２被覆プレート上に加える。溶液中のＰ３タウへの抗体結合が多くなるほど、より少ない利用可能なタウエピトープが、プレートに結合することができる。プレートへのタウ結合の量は、スルホタグ化ヒトタウ抗体によって決定される。Ｃ１０−２（▲）およびＤ１．２（□）は、溶液中のタウへの異なる結合を有し、ここで、Ｃ１０−２は、プレートへの全ての結合を競合し得る（ＩＣ５０  ２０ｎＭ）。他方、Ｄ１．２は、溶液中のタウへの非常に低いレベルの結合を示す。
【図３１】ｍＣ１０−２被覆プレートにおけるタウ抗原捕捉のＰＨＦ１３およびｍＣ１０−２阻害  流体相ＥＬＩＳＡにおいて、ＡＤ  Ｐ３標本および可変量のＣ１０−２およびＰＨＦ１３抗体の混合物を、Ｃ１０−２被覆プレート上に加えた。溶液中のＰ３タウへの抗体結合が多くなるほど、より少ない利用可能なタウエピトープが、プレートに結合することができる。プレートへのタウ結合の量は、スルホタグ化ヒトタウ抗体によって決定される。Ｃ１０−２およびＰＨＦ１３は、溶液中のタウへの異なる結合を有し、ここで、Ｃ１０−２は、プレートへの全ての結合を競合し得る（ＩＣ５０＝３ｎＭ）一方、ＰＨＦ１３は競合しなかった。
【図３２】ｍＣ１０−２およびＰＦＨ−１３は両方とも、Ｐタウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）に用量依存的に結合する  図３２は、ｍＣ１０−２およびＰＨＦ−１３が、１００ｎｇ／ｍｌのｐ−タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４で被覆されたＭＳＤプレートにおいて同等によく結合することを示す。増加する濃度の抗体（ｘ軸で示される）を、２時間にわたってウェル中でインキュベートした後、洗浄およびスルホタグ化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた結合抗体の検出を行った。これは、後の実施例に使用される調製されたＰＨＦ−１３が活性であることを示す。
【図３３】ＡＤ−Ｐ３とのｍＤ１．２およびｍＣ１０−２結合の比較  図３３は、ｍＤ１．２およびｍＣ１０−２が、１μｇ／ｍｌのＡＤ−Ｐ３で被覆されたＭＳＤプレートにおいて同等によく結合することを示す。増加する濃度の抗体（ｘ軸で示される）を、室温で１時間にわたって１０ｕＭのｐ−タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）ペプチドの存在下および非存在下でインキュベートし、続いて、２時間にわたってウェル中でインキュベートした後、スルホタグ化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた結合抗体の検出の前に行った。ＩＣ５０値は、ＡＤ−Ｐ３およびＡＤ−Ｓ１（ｐ）の捕捉について３２０ｎＭおよび１１ｎＭであった。対照的に、ｍＤ１．２は、５８９および５０３ｎＭのＩＣ５０値で、タウ抗原捕捉の著しく弱い阻害を示し、これは、可溶性抗原へのはるかに低親和性の結合を示唆している。  アッセイを２工程で行った。Ａ：１μｇ／ｍｌのＡＤ−Ｐ３および２０ｎｇ／ｍｌのＡＤ  ｓ１（ｐ）をそれぞれ、増加する濃度のｍＤ１．２およびｍＣ１０−２とともにインキュベートし、室温で１時間インキュベートして、抗体−抗原結合（占有（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ））の増加を可能にした。Ｂ：試料を、２時間にわたってＡＤ−Ｐ３（１μｇ／ｍｌ）で被覆されたＭＳＤプレート上でインキュベートした後、洗浄およびスルホタグ化抗総タウＧ抗体を用いた捕捉されたタウ抗原の検出を行った。
【図３４】ｍＣ１０−２は、固体ファージディスプレイＡＤ−Ｐ３抗原に効率的に結合するが、ＰＨＦ−１３は結合しない  ＰＨＦ−１３ではなく、ｍＣ１０−２の高い特異的結合：図３４は、ｍＣ１０−２が、ＡＤ−Ｐ３抗原で被覆されたＭＳＤプレート（１μｇ／ｍｌ）に効率的に結合することを示す。比較すると、ＰＨＦ−１３の低い結合活性は、生理学的ｐ−タウ抗原に対するより低い親和性を示す。さらに、ＰＨＦ−１３は、ｍＣ１０−２と比較して著しく高度な非特異的結合を実証した（表６を参照）。増加する濃度の抗体（ｘ軸で示される）を、２時間インキュベートした後、スルホタグ化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた結合抗体の検出の前に行った。結合シグナルを非特異的結合活性について補正した（１０ｕＭのｐ−タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）ペプチドの存在下で測定されるシグナルとして定義される。ＩＣ５０値は、ＡＤ−Ｐ３のｍＣ１０−２捕捉について３ｎＭであった。対照的に、ＰＨＦ−１３は、実質的に阻害を示さなかった。  アッセイを２工程で行った。Ａ：１μｇ／ｍｌのＡＤ−Ｐ３を、増加する濃度のｍＣ１０−２およびＰＨＦ−１３とともにインキュベートし、室温で１時間インキュベートして、抗体−抗原結合（占有）の増加を可能にした。Ｂ：試料を、２時間にわたってＡＤ−Ｐ３（１μｇ／ｍｌ）で被覆されたＭＳＤプレート上でインキュベートした後、洗浄およびスルホタグ化抗総タウ抗体を用いた捕捉されたタウ抗原の検出を行った。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
参照により援用される配列
配列番号１：Ｄ１．２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２：Ｄ１．２軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３：Ｄ１．２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号４：Ｄ１．２重鎖ＣＤＲ１
配列番号５：Ｄ１．２重鎖ＣＤＲ２
配列番号６：Ｄ１．２重鎖ＣＤＲ３
配列番号７：Ｄ１．２軽鎖
配列番号８：Ｄ１．２重鎖
配列番号９：Ｃ１０−２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１０：Ｃ１０−２軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１１：Ｃ１０−２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号１２：Ｃ１０−２重鎖ＣＤＲ１
配列番号１３：Ｃ１０−２重鎖ＣＤＲ２
配列番号１４：Ｃ１０−２重鎖ＣＤＲ３
配列番号１５：Ｃ１０−２軽鎖
配列番号１６：Ｃ１０−２重鎖
配列番号１７：Ｃ５．２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１８：Ｃ５．２軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１９：Ｃ５．２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２０：Ｃ５．２重鎖ＣＤＲ１
配列番号２１：Ｃ５．２重鎖ＣＤＲ２
配列番号２２：Ｃ５．２重鎖ＣＤＲ３
配列番号２３：Ｃ５．２軽鎖
配列番号２４：Ｃ５．２重鎖
配列番号２５：Ｃ８．３軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２６：Ｃ８．３軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２７：Ｃ８．３軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２８：Ｃ８．３重鎖ＣＤＲ１
配列番号２９：Ｃ８．３重鎖ＣＤＲ２
配列番号３０：Ｃ８．３重鎖ＣＤＲ３
配列番号３１：Ｃ８．３軽鎖
配列番号３２：Ｃ８．３重鎖
配列番号３３：ヒトタウ
配列番号３４：Ｄ１．２＊軽鎖
配列番号３５：ヒト化Ｃ１０−２重鎖
配列番号３６：ヒト化Ｃ１０−２軽鎖
配列番号３７：タウ残基３８６〜４０８（ｐＳ３９６、ｐＳ４０４）
【００４３】
本明細書において使用される際、「タウ」という用語は、「タウタンパク質」と同義であり、タウタンパク質アイソフォーム（例えば、Ｐ１０６３６、１−９としてＵｎｉＰｒｏｔにおいて同定される）のいずれかを指す。本明細書において使用されるタウのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるようにアイソフォーム２（配列番号３３）に対して示され、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である：
【化１】
2018531580.tif 000002
【００４４】
本発明は、タウ、特に、ヒトタウに特異的に結合することが可能であり、一実施形態において、ヒトタウのリン酸化Ｓ３９６残基（ｐＳ３９６）に特異的に結合する能力を示す抗体およびそのエピトープ結合フラグメントに関する。本発明の抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、例えば抗体制限または非飽和条件下で、ヒトタウにおけるリン酸化４０４（ｐＳ４０４）残基に特異的に結合することができないかまたは実質的にできないことによってさらに特徴付けられる。さらに、ｐＳ４０４におけるリン酸化は、ｐＳ３９６への特異的結合を妨げない。本明細書において使用される際、「ｐＳ」および「｛ｐ｝Ｓ」という表記は、アミノ酸残基ホスホセリンを示す。本明細書において使用される際、抗体は、別のエピトープと比べて、このような結合が、このような他のエピトープで観察される結合の２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、より好ましくは、１％未満である場合、エピトープに結合することが「実質的に」できない。
【００４５】
本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、分子（「抗原」）のエピトープに特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、または本発明のある実施形態によれば、免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然抗体は、典型的に、通常、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成される四量体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および、３つの領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される重鎖定常領域から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプ）を含む任意のアイソタイプのものであり得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。重鎖および軽鎖可変領域が、典型的に、抗原認識に関与する一方、重鎖および軽鎖定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存される配列の領域が散在する「相補性決定領域」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。特に関連があるのは、自然界に存在し得るものと異なる物理的環境中で存在するように「単離され」ているか、またはアミノ酸配列中の天然抗体と異なるように修飾された抗体およびそれらのエピトープ結合フラグメントである。
【００４６】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープおよび線状エピトープは、後者ではなく、前者への結合が、変性溶媒の存在下で常に失われる点で区別される。エピトープは、特異的エピトープ結合ペプチドによって有効に遮断されるアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は、特異的エピトープ結合ペプチドのフットプリント内にある）などの、結合に直接関与するアミノ酸残基および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。
【００４７】
本明細書において使用される際、「抗体のエピトープ結合フラグメント」という用語は、エピトープに特異的に結合することが可能な抗体のフラグメント、部分、領域（ｒｅｇｉｏｎ）または領域（ｄｏｍａｉｎ）（それがどのように産生されるかにかかわらず（例えば、切断により、組み換えにより、合成的になど））を意味する。エピトープ結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の１、２、３、４、５または６つ全てを含有してもよく、このようなエピトープに特異的に結合することが可能であるが、このような抗体のものと異なるこのようなエピトープに対して特異性、親和性または選択性を示し得る。しかしながら、好ましくは、エピトープ結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の６つ全てを含有するであろう。抗体のエピトープ結合フラグメントは、単一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であるか、もしくはそれを含んでもよく、またはアミノ末端およびカルボキシル末端（例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントなど）をそれぞれ有する２つ以上のポリペプチド鎖の一部であるか、もしくはそれを含んでもよい。エピトープ結合能力を示す抗体のフラグメントは、例えば、無傷の抗体のプロテアーゼ切断によって得られる。より好ましくは、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によって天然にコードされるが、またはこのような遺伝子配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、それらのコードｃＤＮＡ）が、ＶＬおよびＶＨ領域が結合して一価エピトープ結合分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：５８７９−５８８３を参照）としてそれらが作製されるのを可能にするフレキシブルリンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。あるいは、単一のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ領域が一緒に結合するのを可能にするには短すぎるフレキシブルリンカー（例えば、約９個未満の残基）を用いることによって、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または同様の分子（２つのこのようなポリペプチド鎖が一緒に結合して、二価エピトープ結合分子を形成する）を形成することができる（二重特異性抗体の説明については、例えばＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４−８（１９９３）を参照）。本発明の範囲内に包含されるエピトープ結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価フラグメント、または国際公開第２００７０５９７８２号パンフレットに記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から本質的になるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨ領域から本質的になるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨ領域から本質的になり��ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ；２ｉ（ｌｌ）：４８４−９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）またはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ；５＿（ｌ）：ｌ  ｌｌ−２４）および（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖抗体または単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）を参照）としてそれらが作製されるのを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体フラグメントは、本明細書においてさらに説明される。抗体という用語は、特に規定されない限り、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供される、抗原（エピトープ結合フラグメント）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントも含むことも理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。本明細書において使用される際、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を指す。このような抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ；所望のエピトープに結合することが可能な好適なフラグメントは、無傷の抗体と同じように有用性について容易にスクリーニングされ得る。
【００４８】
「二重特異性抗体」という用語は、それぞれ独立した標的を標的にする２つの独立したエピトープ結合フラグメントを含有する抗体を指す。これらの標的は、異なるタンパク質上に存在するエピトープ、または同じ標的上に存在する異なるエピトープであり得る。二重特異性抗体分子は、親単一特異性二価抗体分子のＨＣの定常領域における補償的アミノ酸改変を用いて作製され得る。得られるヘテロ二量体抗体は、２つの異なる親単一特異性抗体から与えられる１つのＦａｂを含有する。Ｆｃ領域におけるアミノ酸改変は、時間を経ても安定した二重特異性を有するヘテロ二量体抗体の向上した安定性をもたらす（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２８５，１９６３７−１（２０１０）、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ３：６  ５４６−５５７（２０１１）、Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ  ４２０，２０４−２１９（２０１２）、Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２５：１０  ５７１−５８０（２０１２）、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１０：１１３，５１４５−５１５０（２０１３）、Ｓｐｒｅｔｅｒ  Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ５：５  ６４６−６５４（２０１３））。二重特異性抗体は、ＳｃＦｖ融合を用いて生成される分子も含み得る。次に、２つの単一特異性ｓｃｆｖは、独立して、単一の二重特異性分子を生成するために安定したヘテロ二量体を形成することが可能なＦｃ領域に結合される（Ｍａｂｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＤＳ  ２３：３  １１５−１２７（２０１０）。二重特異性分子は、二重の結合能を有する。例えば、ＣＮＳ疾患を治療するために血液脳関門を横切って治療用抗体を送達するために、治療標的および経細胞輸送表面受容体の両方を標的にする。
【００４９】
「抗体Ｄ１．２」という用語は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を有する抗体軽鎖可変領域；
ならびに
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
【００５０】
一実施形態において、抗体Ｄ１．２またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号８の重鎖および／または配列番号７の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【００５１】
関連する実施形態において、抗体Ｄ１．２＊またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号８の重鎖および／または配列番号３４の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【００５２】
「抗体Ｃ１０−２」という用語は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を有する抗体軽鎖可変領域；
ならびに
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
【００５３】
一実施形態において、抗体Ｃ１０−２またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号１６の重鎖および／または配列番号１５の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【００５４】
さらなる実施形態において、ヒト化抗体Ｃ１０−２またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号３５の重鎖、配列番号３６の軽鎖、または両方を含むかまたはそれからなり得る。本発明の一実施形態は、配列番号３５の重鎖、配列番号３６の軽鎖を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。
【００５５】
「抗体Ｃ５．２」という用語は、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を有する抗体軽鎖可変領域；
ならびに
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
【００５６】
一実施形態において、抗体Ｃ５．２またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号２４の重鎖および／または配列番号２３の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【００５７】
「抗体Ｃ８．３」という用語は、
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を有する抗体軽鎖可変領域；
ならびに
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをフラグメントを示すことが意図される。
【００５８】
一実施形態において、抗体Ｃ８．３またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号３２の重鎖および／または配列番号３１の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【００５９】
「抗タウ抗体」は、タウまたはタウフラグメントに特異的に結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである。
【００６０】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を指す。従来のモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、２つ以上のＦａｂ領域から構成され得、それによって、２つ以上の標的に対する特異性を高める。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、任意の特定の産生方法（例えば、組み換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）によって限定されることは意図されていない。
【００６１】
本発明の抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、特に治療目的に用いられる場合、好ましくは、「ヒト化」される。「ヒト化」という用語は、一般に組み換え技術を用いて調製される、非ヒト種に由来する免疫グロブリンから得られるエピトープ結合部位、およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた残りの免疫グロブリン構造を有する分子を指す。エピトープ結合部位は、ヒト定常領域に融合された完全な非ヒト抗体可変領域、またはヒト可変領域の適切なヒトフレームワーク領域に移植されたこのような可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。このようなヒト化分子のフレームワーク残基は、野生型（例えば、完全ヒト）であってもよく、またはそれらは、配列がヒト化のための基盤として機能したヒト抗体に見られない１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように修飾され得る。ヒト化は、分子の定常領域がヒト個体における免疫原として働く可能性を低下させるかまたはなくすが、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）“Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：４２２０−４２２４）。別の手法は、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変領域を改変して、それらをヒト型にできる限り近くなるように再形成することにも焦点を当てている。重鎖および軽鎖の両方の可変領域が、該当する抗原に対する応答が異なり、結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、これらの相補性決定領域（ＣＤＲ）には、所与の種において比較的保存され、かつＣＤＲの足場を提供すると考えられる４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接することが知られている。非ヒト抗体が、特定の抗原に対して調製される場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変されるヒト抗体中に存在するＦＲに移植することによって、「再形成」または「ヒト化」され得る。様々な抗体に対するこの手法の適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｙ  ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｏｎ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ���ｎ  Ｏｆ  Ｒｅｓｈａｐｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＣＤ４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−ｐ１８５ｈｅｒ２  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４２８５−４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＣＤ３３  Ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４によって報告されている。ある実施形態において、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体に由来する全ての６つのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）を保存する。他の実施形態において、ヒト化抗体は、元の抗体に対して改変された１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有し、これらは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。抗原をヒト化する能力は周知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，８５９，２０５号明細書；同第６，４０７，２１３号明細書；同第６，８８１，５５７号明細書を参照）。
【００６２】
「抗体「ＸＸ」という用語は、そのそれぞれの配列番号によって定義される軽鎖、軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域ＣＤＲ１〜３、およびそのそれぞれの配列番号によって定義される重鎖、重鎖可変領域、または重鎖可変領域ＣＤＲ１〜３を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメント（例えば抗体「Ｃ１０−２」）を示すことが意図される。特定の実施形態において、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、それらの配列番号によって定義され含まれるそれらの全重鎖可変領域およびそれらの配列番号によって定義されるそれらの軽鎖可変領域によって定義され含まれる。
【００６３】
本明細書において特に規定されない限り、抗体のＦｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．米国保健福祉省の国立衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵ  ｉｎｄｅｘとも呼ばれるＥＵ番号付与体系にしたがって行われる。
【００６４】
本明細書において使用される際、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、別のエピトープと比べてそのエピトープと、より高頻度で、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性または結合活性で反応または会合する場合、別の分子（すなわち、エピトープ）の領域に「特異的に」結合するといわれる。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的に結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもまたは結合しなくてもよいことも理解される。本明細書において使用される際、所定の抗原への抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的に、抗原をリガンドとしておよび抗体を検体として用いてＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器において例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した際の約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下のＫＤに対応する親和性での結合を指し、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性より少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低くなる量は、抗体のＫＤに依存するため、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が非常に特異的である）場合、抗原に対する親和性が、非特異的抗原に対する親和性より低くなる量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【００６５】
本明細書において使用される際の「ｋｄ」（秒−１または１／秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【００６６】
本明細書において使用される際の「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１または１／Ｍ秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【００６７】
本明細書において使用される際の「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、ｋｄをｋａで除算することによって得られる。
【００６８】
本明細書において使用される際の「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで除算することによって得られる。
【００６９】
一実施形態において、本発明は、以下の特性：
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基（ｐＳ４０４）に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力；または本明細書に記載されるように、ヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、Ｓ３９６リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力
の１つまたは複数を示す抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態は、残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに対して免疫特異的な高特異性、高親和性抗体を生成するための方法によって生成される抗体であって、前記方法が、
（Ａ）２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）を含む、１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば２０〜３０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と；
（Ｂ）前記哺乳動物の前記免疫化を２回以上繰り返す工程と；
（Ｃ）残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と；
（Ｄ）前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体に関する。
【００７１】
本明細書において使用される際、タウ分子に結合することが「実質的にできないこと」は、対照抗体によって仲介される検出可能な結合と比べて、機能性の２０％超の相違、４０％超の相違、６０％超の相違、８０％超の相違、１００％超の相違、１５０％超の相違、２倍超の相違、４倍超の相違、５倍超の相違、または１０倍超の相違を示す。
【００７２】
「選択的」および「免疫選択的」という用語は、２つのエピトープに対する抗タウ抗体の結合能力に言及する場合、飽和条件下で観察される結合が、少なくとも８０％の相違、少なくとも９５％の相違、最も好ましくは、１００％の相違（すなわち、１つのエピトープへの検出可能な結合なし）を示すことが意図される。「選択的」および「免疫選択的」という用語は、タウ抗体に言及する場合、抗体が、ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合し、病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別することができることを意味することがさらに意図される。
【００７３】
ＴＢＳ−抽出可能（Ｓ１）、高塩／サルコシル−抽出可能（Ｓ３）、およびサルコシル−不溶性（Ｐ３）画分という用語は、本明細書に記載されるタウ生化学的分画によって得られる画分である。
【００７４】
いくつかの抗体において、ＣＤＲのごく一部、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる、結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するのに必要とされる。関連するエピトープに接触せず、ＳＤＲ中にないＣＤＲ残基が、過去の研究に基づいて（例えばＣＤＲ  Ｈ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、必要とされないことが多い）、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループの外側にあるＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）、分子モデリングによっておよび／または実験により、またはＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）“ＳＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  Ｔｏ  Ｍｉｎｉｍｉｚｅ  Ｉｔｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ”，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３−８７２に記載されるように特定され得る。１つまたは複数のドナーＣＤＲ残基が存在しないかまたは全ドナーＣＤＲが省略される位置におけるこのようなヒト化抗体において、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において（Ｋａｂａｔ番号付けによって）対応する位置を占めるアミノ酸であり得る。含まれるＣＤＲ中のドナーアミノ酸に対する受容体のこのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として、潜在的な免疫原性を低下させるのに潜在的に有利である。しかしながら、置換は、親和性の変化も引き起こすことがあり、親和性の著しい低下は回避されるのが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も、実験により選択され得る。
【００７５】
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸改変が、機能的結合の喪失をもたらし得るということ（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．ｅｔｃ．（１９８２）“Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９（６）：１９７９−１９８３）は、別の機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定するための手段を提供する。このような変異体ＣＤＲを得るための１つの好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが突然変異を起こされて（例えばランダム突然変異によって、または部位特異的方法（例えば、突然変異遺伝子座をコードするプライマーによるポリメラーゼ連鎖媒介性増幅）によって）、置換アミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列中の関連する残基の同一性を、置換される（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の同一性と比較することによって、その置換についてのＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアが特定され得る。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できるアラインメントについて配列のデータベースを分析することによって作成されるアミノ酸置換のマトリックスを提供する（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．（２００４）“Ｗｈｅｒｅ  Ｄｉｄ  Ｔｈｅ  ＢＬＯＳＵＭ６２  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｏｍｅ  Ｆｒｏｍ？”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（８）：１０３５−１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）“Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１０９１５−１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，５５５−５６５。現在、最先端のＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高くなるほど、置換がより保存的になり、ひいては置換が機能に影響を与えない可能性が高くなる）。得られるＣＤＲを含むエピトープ結合フラグメントが、タウに結合できない場合、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、不十分に保存的であると見なされ、より高い置換スコアを有する新たな置換候補が選択され、生成される。したがって、例えば、元の残基がグルタミン酸塩（Ｅ）であり、非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０であり、より保存的な変化（アスパラギン酸塩、アスパラギン、グルタミン、または��ジンなどへの）が好ましい。
【００７６】
【表１】
2018531580.tif 000003
【００７７】
したがって、本発明は、改良されたＣＤＲを同定するためのランダム突然変異の使用を想定している。本発明の文脈において、保存的置換は、表２、３または４の１つまたは複数に反映されているアミノ酸の種類の範囲内の置換によって定義され得る。
【００７８】
【表２】
2018531580.tif 000004
【００７９】
【表３】
2018531580.tif 000005
【００８０】
【表４】
2018531580.tif 000006
【００８１】
より保存的な置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００８２】
アミノ酸のさらなる基は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を用いて配合され得る。
【００８３】
ファージディスプレイ技術が、ＣＤＲ親和性を増加させる（または低下させる）のに代わりに使用され得る。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、突然変異または「ＣＤＲウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）」を用い、再選択（ｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、標的抗原またはその抗原性のエピトープ結合フラグメントを使用して、初期抗体または親抗体と比較した際に、抗原に対するより高い（またはより低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を同定する（例えばＧｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３を参照）。単一のヌクレオチドではなくコドン全体の突然変異誘発は、アミノ酸突然変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異体クローンのプールからなるライブラリーが構築され得、変異体クローンのそれぞれが、単一のＣＤＲ中の単一のアミノ酸改変により異なり、各ＣＤＲ残基に対して各可能なアミノ酸置換を提示する変異体を含む。抗原に対する増加した（または低下した）結合親和性を有する突然変異体は、固定化突然変異体を標識抗原と接触させることによってスクリーニングされ得る。当該技術分野において公知の任意のスクリーニング方法が、抗原に対する増加したまたは低下した親和性を有する突然変異体抗体を同定するのに使用され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５：６０３７；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１９９４を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングが、使用可能であり得る（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１を参照）。
【００８４】
このような親和性成熟を達成するための方法は、例えば：Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）“Ａｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｔｏｒｔｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，ＭＢｉｏ．２（１）ｐｉｉ：ｅ００３４５−１０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００３４５−１０；Ｋｕａｎ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｍａｔｕｒｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０．１００２／ｉｊｃ．２５６４５；Ｈａｃｋｅｌ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  ＣＤＲ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｂｉａｓｅｓ  Ｅｎｒｉｃｈ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１（１）：８４−９６；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１”，ＭＡｂｓ  １（５）：４６２−４７４；Ｇｕｓｔｃｈｉｎａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＣＤＲ−Ｈ２  Ｌｏｏｐ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆａｂ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎａｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｏｆ  Ｇｐ４１  Ｙｉｅｌｄｓ  Ａ  Ｓｅｔ  Ｏｆ  Ｆａｂｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｎｄ  Ｂｒｅａｄｔｈ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９３（１）：１１２−１１９；最後に、Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ＲＡＧＥ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  Ｂｏｔｈ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８８（３）：５４１−５５８；Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３５３−３７６；Ｓｔｅｉｄｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ���Ｍ−ＣＳＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＤＲ−Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１）：１３５−１４４；およびＢａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５（２６）：９０２９−９０３４に記載されている。
【００８５】
したがって、包含される抗体またはそれらのエピトープ結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって；例えば置換される４つのアミノ酸残基、３つのアミノ酸残基、２つのアミノ酸残基または１つのアミノ酸残基によって、親抗体、Ｄ１．２、Ｃ１０−２、Ｃ５．２またはＣ８．３のＣＤＲの配列と異なり得る。本発明の一実施形態によれば、ＣＤＲ領域中のアミノ酸が、上記の３つの表において定義されるように、保存的置換で置換され得ることがさらに想定される。例えば、酸性残基Ａｓｐは、抗体の結合特性に実質的に影響を与えずにＧｌｕで置換され得る。
【００８６】
「正常なタウ」という用語は、タンパク質のモル当たり２〜３モルのホスフェートを含有する正常な脳タウを指す。
【００８７】
「過リン酸化タウ」という用語は、ウエスタンブロットにおけるポリ−アニオン種に誘発される移動度シフトと一致するタウのポリリン酸化種またはリン酸化された５つ、６つまたは７つ超のセリン、トレオニンまたはチロシン部位を有するタウ種を指す。
【００８８】
「リン酸化残基３９６を有するタウ」という用語は、残基３９６がリン酸化され、残基４０４が、リン酸化されるかまたはリン酸化されない過リン酸化タウに関連する。
【００８９】
「トランスジェニック非ヒト動物」という用語は、１つまたは複数のヒト重鎖および／または軽鎖導入遺伝子または導入染色体（ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（動物の天然ゲノムＤＮＡへと統合されるかまたは非統合のいずれか）を含み、完全ヒト化抗体を発現することが可能なゲノムを有する非ヒト動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、マウスが、タウ抗原および／またはタウを発現する細胞で免疫されるときにヒト化抗タウ抗体を産生するように、ヒト化軽鎖導入遺伝子およびヒト化重鎖導入遺伝子またはヒト化重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト化重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えばＨｕＭＡｂマウス（ＨＣｏ７またはＨＣｏｌ２マウスなど）の場合と同様に、マウスの染色体ＤＮＡへと統合され得、またはヒト化重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されるように、導入染色体ＫＭマウスの場合と同様に、染色体過剰に（ｅｘｔｒａ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ）維持され得る。このようなトランスジェニックおよび導入染色体マウス（本明細書においてまとめて「トランスジェニックマウス」と呼ばれる）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組み換えおよびアイソタイプスイッチングを行うことによって、所与の抗原（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥなど）に対するヒト化モノクローナル抗体の複数のアイソタイプを産生することが可能である。
【００９０】
トランスジェニック、非ヒト動物も、特定の抗体をコードする遺伝子を誘導することによって、例えば動物の乳汁中で発現される遺伝子間を作動可能に連結することによって、特定の抗原に対する抗体の産生に使用され得る。
【００９１】
本明細書において使用される際の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患または障害の進行または重症度を改善し、遅らせ、軽減し、または抑制すること、またはこのような疾患または障害の１つまたは複数の症状または副作用を改善し、遅らせ、軽減し、または抑制することを意味する。本発明の趣旨では、「治療」または「治療すること」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法をさらに意味し、ここで、「有益なまたは所望の臨床結果」としては、限定はされないが、部分的であるかまたは全体的であるか、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、障害または疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化していない）疾患または障害状態、疾患または障害状態の進行の遅延または緩徐化、疾患または障害状態の改善または緩和、および疾患または障害の寛解が挙げられる。
【００９２】
「有効量」は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに適用される場合、意図される生物学的効果または所望の治療結果（限定はされないが臨床結果を含む）を達成するのに、必要な投与量および期間にわたる、十分な量を指す。「治療的に有効な量」という語句は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに適用される場合、障害もしくは疾患の状態の進行、または障害もしくは疾患の症状の進行を改善し、緩和し、安定させ、抑制し、遅らせ、軽減し、または遅延させるのに十分な、抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントの量を表すことが意図される。一実施形態において、本発明の方法は、他の化合物と組み合わせた、抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントの投与を提供する。このような場合、「有効量」は、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な組合せの量である。
【００９３】
本発明の抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの治療的に有効な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが個体における所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はまた、抗体または抗体部分の何らかの毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回る量である。
【００９４】
上に示されるように、本発明は、特に、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、およびこのような分子（ひいてはそのこのようなエピトープ結合フラグメント）を産生するための完全に新規な方法に関する。この方法は、図９に概略が示される。モノクローナル抗体を単離する新規な方法のこの能力は、ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基セリン３９６（｛ｐ｝Ｓ３９６）に特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体を単離するその使用によって本明細書において例示される。これらの抗体は、タウが残基３９６においてもリン酸化されない限り、リン酸化セリン４０４でタウタンパク質に結合しないように、リン酸化残基セリン３９６およびセリン４０４（ｐＳ４０４）を区別するそれらの能力によってさらに特徴付けられる。
【００９５】
本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントは、｛ｐ｝Ｓ３９６特異的抗体（図９）の選択に好ましい新規な方法（図９）の使用によって生成および単離された。さらに、この非常に厳密な抗体クローン選択手順を適用することによって、Ｓ３９６に対して高度に特異的であるだけでなく、リン酸化｛ｐ｝Ｓ３９６エピトープに対しても高度に選択的である抗体が得られた。これらの抗体は、アルツハイマー病の脳に由来するタウを独自に認識する。本発明者らは、図９に概略が示されるスクリーニング手順が、機能的および治療的有用性を有する抗体の同定を確実にすることも実証する。
【００９６】
抗体を、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４０８をカバーする二リン酸化ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）に対して誘導した（実施例１）。マウスをリン酸化ペプチドで免疫した。十分な抗体価が得られたら、マウスを殺処分し、ハイブリドーマを生成した（実施例２）。ハイブリドーマを、ドットブロット（実施例３）および免疫化されたヒト病理学的および非病理学的タウを用いたＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ（実施例４）を用いてスクリーニングした。ドットブロットおよびウエスタンブロットにおいて病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力を、ハイブリドーマの選択に使用した。１６のクローンを選択し、そのうちの４つのハイブリドーマクローンを回収し、それにより、ヒト病理学的タウ材料に結合する目立った能力を示す抗体を産生した。
【００９７】
また、病理学的および非病理学的タウへの特異的結合を、罹患および非罹患ヒトＡＤ脳に由来するタウの単離およびＭＳＤ  ＥＬＩＳＡプレートにおけるこの材料の固定化によって決定した（実施例４）。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）内の少なくとも１８、例えば少なくとも２０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導されるモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。本発明のこの態様において、モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、典型的に、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）を含む１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば２０〜３０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導される。
【００９９】
本発明のさらなる態様は、月齢を健常にマッチさせた対照よりＡＤ罹患患者に由来するリン酸化タウ（ｐタウ）に対する特異性を有する本発明のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、本明細書に記載されるように、リン酸化−および多量体特異的Ｓｅｔｕｐ  １  ＥＬＩＳＡを用いて、ＡＤおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ（ｐタウ）を検出するためのＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したＡＤ疾患材料に対する特異性の５０倍超、例えば１００倍超の増加の、月齢をマッチさせた健常対照に由来するタウよりＡＤ罹患患者に由来するリン酸化タウ（ｐタウ）に対する特異性の差を有するようになっているモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。
【０１００】
本発明の関連する態様は、ＡＤ罹患タウに対する特異性を有する本発明のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、リン酸化−および多量体特異的Ｓｅｔｕｐ  １  ＥＬＩＳＡを用いて、ＡＤおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ（ｐタウ）を検出するためのＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したＡＤ疾患材料に対する特異性の５０倍超、例えば１００倍超の増加の、月齢を健常にマッチさせた対照よりＡＤに対する特異性の差を有するようになっているモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。
【０１０１】
Ｓｅｔｕｐ  １  ＥＬＩＳＡ方法は、工程Ａ）Ｃ１０−２被覆プレートを用いたＡＤ脳に由来する病理学的ヒトタウ抗原の捕捉；Ｂ）増加する濃度のｐＳ３９６特異的抗体ともにタウ抗原のインキュベーション；およびＣ）ＭＳＤからのスルホタグ化抗ヒト（総）タウ抗体を用いたタウ抗原捕捉および抗体に仲介される阻害の検出を含む。
【０１０２】
本発明は、残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに対して免疫特異的な高特異性、高親和性抗体を生成するための方法によって生成される抗体であって、前記方法が、
（Ａ）２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーするＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）を含む、１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば２０〜３０連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と；
（Ｂ）前記哺乳動物の前記免疫化を２回以上繰り返す工程と；
（Ｃ）残基リン酸化Ｓ３９６を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と；
（Ｄ）前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体にさらに関する。
【０１０３】
さらに詳細には、工程Ａは、Ｃ１０−２抗体、典型的に、コーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ（捕捉抗体）によるＭＳＤプレート（典型的に、４Ｃで一晩）コーティング、ブロッキング（典型的に、室温で１時間）および典型的に、３回の洗浄を含む。工程Ｂは、ＡＤ（３人の患者からプールされる）に由来するＰ３溶解物（典型的に、１：１０００＝２〜４μｇ／ｍｌの総タンパク質）および／またはＳ１（ｐ）（典型的に、１：３００＝２０〜４０ｎｇ／ｍｌの総タンパク質）の試料を、段階的な濃度のｐＳ３９６ペプチドエピトープ特異的抗体と混合し、（典型的に、室温で１時間）インキュベートすることを含む。続いて、反応物を、工程Ａにおいて準備されたプレート上で２時間インキュベートする。工程Ｃは、スルホタグ化ヒトタウを用いてＣ１０−２で捕捉されたタウを検出することを含む。製造業者の指示にしたがって、ＭＳＤからのタウ抗体（典型的に、１：５０）。プレートを、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００において分析する。ＡＤ  Ｐ３およびＡＤ  Ｓ１（ｐ）を、同様の設備において試験する。
【０１０４】
さらなる実施形態は、ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株において生産または製造された、ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１０５】
ＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ−２１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＨＫＢ−１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ−７ヒト細胞株において生産される、ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１０６】
Ｄ１．２およびＣ１０−２の特異的親和性および結合特性が、位置３９６または４０４（配列番号２９〜３２）においてリン酸化されるかまたはリン酸化されないタウ３８６〜４１０（２Ｒ４Ｎ）ペプチドを用いて特性評価された。本出願において概略が示される特異的な免疫化およびスクリーニングプロトコル（図９）を用いると、図４に示されるように高リン酸化セリン−３９６（ｐＳ３９６）特異的抗体が産生される。
【０１０７】
抗体が病理学的タウに対して特異的であることを実証するために、Ｄ１．２およびＣ１０−２抗体はまた、免疫組織化学的分析によって特性評価された（実施例６）。抗体は、アルツハイマー病の脳およびヒト（Ｐ３０１Ｌ）突然変異体タウを発現するＴｇ４５１０タウトランスジェニックマウスに由来する切片における神経原線維変化への高度に特異的な結合を示す（図５）。ヒト対照脳および非トランスジェニックマウス脳に由来する組織への結合は観察されず、これは、抗体が、ヒトタウ、特に、アルツハイマー病病変に関連するタウに特異的に結合することを実証している。
【０１０８】
疾患病変に関連するタウを認識するこれらの抗体の独自の能力は、実施例７において実証される。本発明者らは、実施例３に記載されているアッセイにおいて病理学的タウ対非病理学的タウの結合を比較している。比較は、５つの公開されたタウ抗体：ｈＡＣＩ−２Ｂ６、ＩＰＮ００２、ＨＪ８．５、２．１０．３、および４Ｅ４に対して行われる。図６は、健常および罹患した脳に由来するタウに対する対照抗体のそれぞれの結合、および１０月齢のＴｇ４５１０タウトランスジェニックマウスから単離されたＰ３０１Ｌヒト突然変異体タウへの結合を示す。これは、単離された抗体が、ヒト病理学的タウに対する非常に高度な特異性および選択性を示すことを実証している。この選択性は、表５に示されるように比較用抗体のいずれよりも優れている。
【０１０９】
【表５】
2018531580.tif 000007
【０１１０】
飽和結合において、抗体Ｄ１．２およびＣ１０−２は、ヒトＡＤ脳から単離されたＰ３タウに対する１００倍超の選択性を示す。
【０１１１】
選択された抗体が、機能的および治療的有用性を有することを実証するために、抗体を、インビトロおよび細胞内のタウ凝集アッセイにおいて試験した（実施例８）。これらのアッセイは、抗体が、タウの病理学的凝集過程を妨げることができることを実証する機能アッセイである。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトタウ−Ｐ３０１Ｌ−ＦＬＡＧ（４Ｒ０Ｎ）で一過性にトランスフェクトする。続いて、細胞を、ヒトＡＤ脳またはトランスジェニックＴｇ４５１０脳に由来するタウ抽出物に曝露する。病理学的タウへのこの曝露は、細胞へのタウの取り込みおよび細胞内凝集を促進する。抗体Ｄ１．２およびＣ１０−２を用いたタウ標本の免疫枯渇、およびこれらの抗体による細胞の直接の処理は両方とも、タウ凝集体の形成を劇的に減少させることができる（図７）。
【０１１２】
抗体Ｄ１．２およびＣ１０−２の治療的有用性も、ヒトタウ／ＰＳ１マウスにおいて評価された（実施例９）。このマウスモデルは、高齢期（１２〜１８月齢）にのみＡＤ病変を生じるさらなるＡＤ疾患関連動物モデルである。しかしながら、マウスは、固体もつれ病変の発生前にタウ過リン酸化を示す。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの用量を週に２回、１３週間にわたって長期的に注入した。抗体で処理されたマウスは、図９に示されるようにリン酸化タウの劇的な減少を示し、これは、抗体Ｄ１．２およびＣ１０−２による長期治療が、もつれ病変、ひいてはその後のインビボの神経変性を減少させることを示す。
【０１１３】
本発明の抗体は、免疫枯渇方法によってｒＴｇ４５１０マウス脳抽出物から過リン酸化タウを特異的に除去する。さらに、本発明の抗体は、ホモジネートから正常なタウを除去しない一方、市販のタウ５抗体は正常なタウを除去する。残基４０４または残基４０４および３９６の両方においてリン酸化されるタウタンパク質に結合する市販の抗体と対照的に、本発明の抗体は、セリン３９６においてリン酸化される過リン酸化タウを９５％だけ特異的に除去する。実験（実施例１２）は、本発明の抗体が、脳ホモジネート中の総タウのごくわずかな部分（８％）のみを除去するにもかかわらず、抗体は、過リン酸化タウを（９０％だけ）特異的に除去することを実証する。したがって、本発明の一態様は、病原性過リン酸化タウに免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。さらに、過リン酸化タウを、本発明の抗体を用いて除去した実験において、シーディング活性がなくされた。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。シーディングの減少は、もつれ形成の発生およびアルツハイマー病を含むタウオパチーの進行を軽減することが提示されている。したがって、本発明のさらなる態様は、ＡＤまたはＡＤの症状の進行の軽減に使用するための本発明の抗体に関する。
【０１１４】
より詳細には、上に詳述されるように、本発明は、以下を含む群から選択される４つのモノクローナル抗体のうちのいずれか１つに関する：
抗体Ｄ１．２
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３。
【０１１５】
抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号８の重鎖可変領域および／または配列番号７の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。
【０１１６】
関連する実施形態において、抗体Ｄ１．２またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号８の重鎖および／または配列番号３４の軽鎖を含むかまたはそれからなり得る。
【０１１７】
抗体Ｃ１０−２
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３。
【０１１８】
抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号１５の重鎖可変領域および／または配列番号１６の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。
【０１１９】
ヒト化Ｃ１０−２抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５に示される。ヒト化Ｃ１０−２抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３６に示される。
【０１２０】
全体として、実施例は、Ｃ１０−２を含む本発明の抗体が、ＡＤ−Ｐ３抗原で被覆されたＭＳＤプレートに効率的に結合することを示す。比較すると、ＰＨＦ−１３などの市販の抗体は、低い結合活性を有する。さらに、ＰＨＦ−１３は、本発明の抗体と比較してかなり高度な非特異的結合を示した（表６Ａ〜表６Ｄを参照）。表６は、Ｃ１０−２被覆プレートにおけるＰタウ抗原捕捉のｍＣ１０−２流体相阻害が有効である一方（ＩＣ５０＝１０〜２０ｎＭ）、ｍＤ１．２は有効でない（ＩＣ５０＝５００〜１０００ｎＭ）ことを示す。ｍＣ１０−２被覆プレートにおけるｐ−タウ抗原捕捉のｍＣ１０−２流体相阻害が、ＩＣ５０＝１０〜２０ｎＭ）を有して有効である一方、ＰＨＦ−１３は有効でない（ＩＣ５０＝５００〜１０００ｎＭ）。
【０１２１】
本発明の一態様は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体に関する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様は、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む抗体に関する。
【０１２３】
本発明のさらなる態様は、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３ならびに
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
のうちの１つ、２つまたは３つを含む抗体に関する。
【０１２４】
抗体Ｃ５．２
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３。
【０１２５】
抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号２３の重鎖可変領域および／または配列番号２４の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。
【０１２６】
図１０の結晶構造から分かるように、エピトープは、Ｃ５．２の重鎖および軽鎖にわたって結合される。したがって、関連する実施形態において、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；または
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；または
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；および
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；または
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；または
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む。
【０１２７】
抗体Ｃ８．３
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３。
【０１２８】
抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号３１の重鎖可変領域および／または配列番号３２の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。
【０１２９】
抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０１３０】
上述される抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、一実施形態によれば、（４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有する、このような軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の変異体をさらに含み得る。
【０１３１】
図１１から分かるように、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３およびＬＣ  ＣＤＲ３は、少なくとも一実施形態において、タウの３９２〜３９８領域への結合のために重要である。本発明の一実施形態において、本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントは、
ａ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および
ｃ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
ｄ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
【０１３２】
本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントは、
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含み得る。
【０１３３】
本発明の一態様において、本発明は、タウペプチドのＹ３９４とともに、Ｌ３：Ｈ３、Ｌ３：Ｆ８＊、Ｈ１：Ｈ１３、Ｈ２：Ｙ１、Ｈ２：Ｙ３によって形成される疎水性ポケットを形成する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。一実施形態において、本発明は、溶媒和｛ｐ｝Ｓ３９６およびＬ３：Ｔ４、Ｈ１：Ｒ１０、Ｈ１：Ｔ１１、Ｈ３：Ｒ１、Ｈ３：Ｔ３間の水素結合ネットワークの形成について本明細書にさらに記載される抗体と競合する抗体に関し；（＊）Ｌ３：Ｆ８は、ＣＤＲ  Ｌ３のフレームワーク残基に隣接するＣ末端である（図１１を参照）。
【０１３４】
Ｘ線結晶構造から分かるように、本発明の抗体は、２つのレベルの選択性で結合する。第１のレベルの選択性は、過リン酸化病理学的タウに対する選択性であり、第２のレベルの選択性は、リン酸化セリン残基に対する選択性であり、ここで、前記リン酸化セリンのホスフェートが、２つの残基が前記リン酸化セリンから除去されたチロシン残基の側鎖に水素結合される。したがって、本発明の興味深い態様は、２つの残基がチロシン残基から除去されたリン酸化セリンを含む過リン酸化タウのアミノ酸モチーフに対して選択的な抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。典型的に、アミノ酸モチーフは、配列：
Ｙ−Ｘ−Ｓ（リン酸化）−Ｐ−
を有し、ここで、Ｙがチロシンであり、Ｘが天然アミノ酸であり、Ｐがプロリンであり、Ｓ（リン酸化）が、リン酸化ヒドロキシル側鎖を有するセリンである。
【０１３５】
同様に、本発明の興味深い態様は、リン酸化タウ、好ましくは、過リン酸化タウに結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関し、ここで、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、アミノ酸残基モチーフＩＡに対して選択的であり、ここで、Ｒが、天然アミノ酸の側鎖である。
【化２】
2018531580.tif 000008
【０１３６】
特定の理論によって制約されるものではないが、アミノ酸モチーフＩＡが病理学的タウによって取られる立体配座にあるとき、本発明の抗体が、前記モチーフに対して選択的であると考えられる。したがって、アミノ酸モチーフＩＡは、典型的に、本発明の抗体によって選択的に認識される配列である。したがって、本発明の興味深い態様は、リン酸化タウ、好ましくは、過リン酸化タウに結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関し、ここで、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、アミノ酸残基モチーフＩＢに対して選択的であり、ここで、Ｒが、天然アミノ酸の側鎖である。
【０１３７】
本発明のこの態様の典型的な実施形態において、本発明は、リン酸化タウ、好ましくは、過リン酸化タウに結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関し、ここで、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、アミノ酸残基モチーフＩＢに対して選択的であり、ここで、Ｒが、限定はされないがＩＣまたはＩＤなどの天然アミノ酸の側鎖である。
【化３】
2018531580.tif 000009
【０１３８】
本発明は、患者におけるタウもつれ形成を減少させる方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを投与する工程を含む方法も提供する。
【０１３９】
本発明の一態様は、本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを用いてタウオパチーを治療する方法に関する。典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。特に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状から選択され得る。
【０１４０】
したがって、本発明のさらなる態様は、タウオパチーの治療に使用するための、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。特に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状から選択され得る。
【０１４１】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、補助剤および／または安定剤と一緒に組成物中の、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントは、タウオパチーの治療のための療法に使用され得る。典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（急性または慢性外傷性脳損傷）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。特に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状から選択され得る。
【０１４２】
本発明によって想定される治療は、長期であってもよく、患者は、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上治療され得る。
【０１４３】
本発明の抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されているハイブリドーマ方法によって産生されるモノクローナル抗体であってもよく、または組み換えＤＮＡもしくは他の方法によって産生されるモノクローナル抗体であってもよく、またはより好ましくは、本明細書に開示される新規な方法によって産生され得る（図９）。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、任意の好適な源から得られる。したがって、例えば、モノクローナル抗体は、例えば、表面において抗原を発現する細胞、または該当する抗原をコードする核酸の形態で、該当する抗原で免疫されたマウスから得られるマウス脾臓Ｂリンパ球細胞から調製されるハイブリドーマから得られる。モノクローナル抗体はまた、免疫されたヒトまたは非ヒト哺乳動物（ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、霊長類など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得られる。
【０１４４】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。タウに対するヒト化モノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックまたは導入染色体マウスを用いて生成され得る。このようなトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂ（ヒト化モノクローナル抗体）マウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書においてまとめて「トランスジェニックマウス」と呼ばれる。
【０１４５】
ＨｕＭＡｂマウスは、内因性μおよびＫ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と一緒に、再配列されていないヒト重鎖可変および定常（μおよびＹ）ならびに軽鎖可変および定常（κ）鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６−８５９（１９９４））。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＩｇＫの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が、クラススイッチおよび体細胞突然変異を起こして、高親和性ヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、上記参照；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３，４９−１０１（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４  ５３６−５４６（１９９５）に概説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，６２８７−６２９５（１９９２）、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，６４７−６５６（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９１２−２９２０（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，５７９−５９１（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットも参照されたい。
【０１４６】
ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８１１−８２０（１９９３）に記載されているように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例１に記載されているように）、およびＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように）を有する。さらに、ＨＣｏ７マウスは、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（米国特許第５，７７０，４２９号明細書に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１２マウスは、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例２に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１７マウスは、ＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載されているように）を有し、ＨＣｏ２０マウスは、ＨＣｏ２０ヒト重鎖導入遺伝子を有する。得られるマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の破壊のためにバックグラウンドのホモ接合体においてヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。
【０１４７】
ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８１１−８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているように、染色体１４フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入染色体も保有する。ＨＣｏ１２−Ｂａｌｂ／ｃ、ＨＣｏ１７−Ｂａｌｂ／ｃおよびＨＣｏ２０−Ｂａｌｂ／ｃマウスは、国際公開第０９／０９７００６号パンフレットに記載されているように、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０を、ＫＣｏ５［Ｊ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）に交差させることによって生成され得る。
【０１４８】
ｒＴｇ４５１０マウスは、突然変異体タウ導入遺伝子発現に対する時間的および空間的制御を提供する公知のタウオパチーモデルである。ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８１１−８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているように、染色体１４エピトープ結合フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入染色体も保有する。
【０１４９】
これらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、周知の技術にしたがって、ヒト化モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するのに使用され得る。本発明のヒト化モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または他の種に由来する本発明の抗体はまた、該当する免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックな別の非ヒト哺乳動物または植物の生成、および回収可能な形態での抗体の産生によって遺伝子導入的に生成され得る。哺乳動物におけるトランスジェニック産生に関連して、抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中で産生され、それから回収され得る。例えば米国特許第５，８２７，６９０号明細書、米国特許第５，７５６，６８７号明細書、米国特許第５，７５０，１７２号明細書および米国特許第５，７４１，９５７号明細書を参照されたい。
【０１５０】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型的に、ＡＤＣＣ誘導などの所望のエフェクター機能によって導かれる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、κまたはλのいずれかが使用され得る。必要に応じて、本発明の抗タウ抗体のクラスは、公知の方法によってスイッチされ得る。例えば、元はＩｇＭであった本発明の抗体は、本発明のＩｇＧ抗体にクラススイッチされ得る。さらに、クラススイッチ技術は、あるＩｇＧサブクラスを別のＩｇＧサブクラスに、例えばＩｇＧｌからＩｇＧ２に変換するのに使用され得る。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチによって変更され得る。一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えばＩｇＧ１、κである。抗体は、そのアミノ酸配列が、他のアイソタイプと比べてそのアイソタイプに最も相同性が高い場合、特定のアイソタイプのものであるといわれる。
【０１５１】
一実施形態において、本発明の抗体は、完全長抗体、好ましくは、ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ１、κ抗体である。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗体エピトープ結合フラグメントまたは一本鎖抗体である。
【０１５２】
抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、例えば従来の技術を用いたエピトープ結合断片化によって得られ、エピトープ結合フラグメントは、全抗体について本明細書に記載されるのと同じように有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２エピトープ結合フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られるＦ（ａｂ’）２エピトープ結合フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Ｆａｂ’エピトープ結合フラグメントを生成し得る。Ｆａｂエピトープ結合フラグメントはＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得られ；Ｆａｂ’エピトープ結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体のペプシン消化により得られる。Ｆ（ａｂ’）エピトープ結合フラグメントはまた、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により、以下に記載されるＦａｂ’を結合することによって生成され得る。Ｆａｂ’エピトープ結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体エピトープ結合フラグメントである。Ｆａｂ’−エピトープ結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２エピトープ結合フラグメントを、ジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって得られる。抗体エピトープ結合フラグメントはまた、組み換え細胞におけるこのようなエピトープ結合フラグメントをコードする核酸の発現によって生成され得る（例えばＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４、１２３−３８（１９９５）を参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２エピトープ結合フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、このような切断された抗体エピトープ結合フラグメント分子を生成するために、Ｈ鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、続いて翻訳停止コドンを含み得る。
【０１５３】
一実施形態において、抗タウ抗体は、一価抗体、好ましくは、ヒンジ領域の欠失を有する国際公開第２００７０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている一価抗体である。したがって、一実施形態において、抗体は、一価抗体であり、前記抗タウ抗体は、ｉ）前記一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗タウ抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列およびＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列およびＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結され、ＩｇＧ１サブタイプの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物もしくはヒトに投与されるとき、ＣＬ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともにジスルフィド結合または共有結合を形成することが可能なアミノ酸をＣＬ領域が含まないように修飾されている工程と；ｉｉ）前記一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列およびヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒンジ領域に対応する領域および、Ｉｇサブタイプによって必要とされるように、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物ヒトに投与されるとき、ヒトＩｇのＣＨ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともに、ジスルフィド結合または共有結合または安定した非共有重鎖間結合の形成に関与するアミノ酸残基を含まないように修飾されており、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列および前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結される工程と；ｉｉｉ）前記一価抗体を生成するために細胞発現系を提供する工程と；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞内で（ｉ）および（ｉｉ）の核酸構築物を共発現することによって、前記一価抗体を生成する工程とを含む方法によって構築される。
【０１５４】
同様に、一実施形態において、本発明の抗タウ抗体は、
（ｉ）本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域のエピトープ結合部分、および
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域またはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むその領域
を含む一価抗体であり、ここで、ＣＨ領域またはその領域は、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがＩｇＧ４サブタイプでない場合、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、同一のＣＨ領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のＣＨ領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
【０１５５】
さらなる実施形態において、本発明の一価抗体の重鎖は、ヒンジ領域全体が欠失しているように修飾されている。
【０１５６】
別のさらなる実施形態において、前記一価抗体の配列は、それがＮ結合型グリコシル化のための受容体部位を含まないように修飾されている。
【０１５７】
本発明は、抗タウ結合領域（例えば、抗タウモノクローナル抗体のタウ結合領域）が、２つ以上のエピトープを標的にする二価または多価二重特異性骨格の一部である「二重特異性抗体」も含む（例えば、第２のエピトープは、二重特異性抗体が、血液脳関門などの生物学的障壁を越える改良されたトランスサイトーシスを示し得るように、活性な輸送受容体のエピトープを含み得る）。したがって、別のさらなる実施形態において、抗タウ抗体の一価Ｆａｂは、異なるタンパク質を標的にするさらなるＦａｂまたはｓｃｆｖに結合されて、二重特異性抗体を生成し得る。二重特異性抗体は、二重機能、例えば抗タウ結合領域によって与えられる治療機能、および血液脳関門などの生物学的障壁を越える輸送を促進するために受容体分子に結合し得る輸送機能を有し得る。
【０１５８】
本発明の抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントは、一本鎖抗体も含む。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖Ｆｖ領域が結合されたペプチドである。一実施形態において、本発明は、本発明の抗タウ抗体のＦｖにおける重鎖および軽鎖が、ペプチド一本鎖において（典型的に、約１０、１２、１５つまたはそれ以上のアミノ酸残基の）フレキシブルペプチドリンカーと結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供する。このような抗体を産生する方法が、例えば米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，５５２−５５４（１９９０）に記載されている。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり、または３つ以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。
【０１５９】
本明細書に記載される抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、任意の好適な数の修飾アミノ酸の包含によって修飾され得るおよび／またはこのような共役置換基との結合によって修飾され得る。これに関連する適合性は、一般に、非誘導体化親抗タウ抗体に関連するタウ選択性および／または抗タウ特異性を少なくとも実質的に保持する能力によって決定される。１つまたは複数の修飾アミノ酸の包含は、例えば、ポリペプチド血清半減期を増加させ、ポリペプチド抗原性を低下させ、またはポリペプチド貯蔵安定性を増加させるのに有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組み換え産生の際に翻訳と同時に（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）もしくは翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾されるか（例えば、哺乳類細胞における発現の際のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ結合型グリコシル化）または合成手段によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸の修飾の当業者の指針となるのに十分な言及は、文献全体を通して十分にある。例のプロトコルが、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎ  ＣＤ−Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに見られる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、または有機誘導化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択され得る。
【０１６０】
本発明の抗体およびそのエピトープ結合フラグメントはまた、例えばそれらの血中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾され得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに結合するための方法が、例えば米国特許第４，７６６，１０６号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，４９５，２８５号明細書および米国特許第４，６０９，５４６号明細書に示されている。さらなる例示的なポリマーとしては、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約１，０００〜約４０，０００、例えば約２，０００〜約２０，０００、例えば、約３，０００〜１２，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ）が挙げられる。
【０１６１】
本発明の抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、診断法においてまたは画像診断用リガンドとしてさらに使用され得る。
【０１６２】
一実施形態において、１つまたは複数の放射性標識アミノ酸を含む本発明の抗体およびそのエピトープ結合フラグメントが提供される。放射性標識抗タウ抗体は、診断および治療目的の両方に使用され得る（放射性標識分子への結合は、別の考えられる特徴である）。このような標識の非限定的な例としては、限定はされないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ、６０Ｃｏ）、銅（６４Ｃｕ）、ジスプロシウム（１６５Ｄｙ）、エルビウム（１６９Ｅｒ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、金（１９８Ａｕ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、水素（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１５Ｉｎ）、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、イリジウム（１９２Ｉｒ）、鉄（５９Ｆｅ）、クリプトン（８１ｍＫｒ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、窒素（１３Ｎ、１５Ｎ）、酸素（１５Ｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、カリウム（４２Ｋ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルビジウム（８１Ｒｂ、８２Ｒｂ）、ルテニウム（８２Ｒｕ、９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ナトリウム（２４Ｎａ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ、８９Ｓｒ、９２Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）およびジルコニウム（８９Ｚｒ）が挙げられる。ジルコニウム（８９Ｚｒ）が特に興味深い。放射性標識アミノ酸および関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））ならびに米国特許第４，６８１，５８１号明細書、米国特許第４，７３５，２１０号明細書、米国特許第５，１０１，８２７号明細書、米国特許第５，１０２，９９０号明細書（米国再発行特許第３５，５００号明細書）、米国特許第５，６４８，４７１号明細書および米国特許第５，６９７，９０２号明細書を参照。例えば、放射性同位体が、クロラミンＴ法によって結合され得る（Ｌｉｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ  Ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｔａｎｎｙｌ）Ｂｅｎｚｏａｔｅ  Ａｓ  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ”，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５（７）：６５９−６６５；Ｋｕｒｔｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｔｏ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｉｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６（９）：１２５５−１２６１；Ｒｅａ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（３  Ｓｕｐｐｌ）：８５７ｓ−８６１ｓ）。
【０１６３】
本発明は、蛍光標識（希土類キレート（例えば、ユウロピウムキレート）など）、フルオレセイン型標識（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン）、ローダミン型標識（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）またはダンシルクロリド）、ＶＩＶＯＴＡＧ  ６８０  ＸＬ  ＦＬＵＯＲＯＣＨＲＯＭＥ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、フィコエリトリン；ウンベリフェロン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ；シアニン；フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはそれらの類似体（これらは全て、光学的検出に好適である）を用いて検出可能に標識される抗タウ抗体およびそのエピトープ結合フラグメントも提供する。化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分子を、限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ得る。
【０１６４】
化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分子を、限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ得る。常磁性標識も用いられ得、好ましくは、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を用いて検出される。このような常磁性標識としては、限定はされないが、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、カルシウム（Ｃａ）、セリウム（Ｃｅ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ホルミウム（Ｈｏ）、イリジウム（Ｉｒ）、リチウム（Ｌｉ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、酸素（Ｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ナトリウム（Ｎａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、スズ（Ｓｎ）、チタン（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）、およびジルコニウム（Ｚｉ）、特に、Ｃｏ＋２、ＣＲ＋２、Ｃｒ＋３、Ｃｕ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、Ｇａ＋３、Ｍｎ＋３、Ｎｉ＋２、Ｔｉ＋３、Ｖ＋３、およびＶ＋４の常磁性イオン、様々なポジトロン放出型断層撮影法を用いたポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含有する化合物が挙げられる。
【０１６５】
したがって、一実施形態において、本発明の抗タウ抗体またはそのタウ結合フラグメントは、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識で標識され得る。フラグメントの標識抗体は、被験体の脳における前記タウの存在または量を検出または測定するのに使用され得る。この方法は、前記タウに結合された抗タウ抗体またはタウ結合フラグメントのインビボイメージングの検出または測定を含んでもよく、前記タウに結合された前記抗タウ抗体またはタウ結合フラグメントのエクスビボイメージングを含み得る。
【０１６６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体またはそのタウ結合フラグメントの１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの組み換え産生に使用され得る。
【０１６７】
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合成核酸ベクター（好適な組の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の好適なＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。このようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態において、抗タウ抗体コード核酸は、例えば、線形発現要素（ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、Ｓｙｋｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １２，３５５−５９（１９９７）に記載されているように）、圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）核酸ベクター（例えば米国特許第６，０７７，８３５号明細書および／または国際公開第００／７００８７号パンフレットに記載されているように）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ  １９／１８、またはｐＵＣ  １１８／１１９、「ミッジ（ｍｉｄｇｅ）」最小サイズ核酸ベクターなどのプラスミドベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  ３，７９３−８００（２００１）に記載されているように）を含む裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクターにおいて、またはＣａＰＯ４沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物（例えば、国際公開第００／４６１４７号パンフレット、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３，９５５１−５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １４，７２５（１９７８）、およびＣｏｒａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２，６０３（１９８１）に記載されているように）として含まれる。このような核酸ベクターおよびその使用法は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第５，５８９，４６６号明細書および米国特許第５，９７３，９７２号明細書を参照）。
【０１６８】
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における本発明の抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの発現に好適である。このようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５５０３−５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）など）などの発現ベクターが挙げられる。
【０１６９】
発現ベクターは、さらにまたは代わりに、酵母系における発現に好適なベクターであり得る。酵母系における発現に好適な任意のベクターが用いられてもよい。好適なベクターとしては、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモータを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３，５１６−５４４（１９８７）、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２４，３２９−３５８（２０１２）、Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０（５），１１０８−１１１８（２０１２）、Ｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４２（２），１０５−１２４（２００７）、Ｂｏｅｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（３），５１３−５２３（２００７）、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，３５９−３６６（２００２）、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，３４９−３５７（２００２）に概説されている）。
【０１７０】
本発明の発現ベクターにおいて、抗タウ抗体コード核酸は、任意の好適なプロモータ、エンハンサー、および他の発現促進要素を含むかまたはそれらと結合され得る。このような要素の例としては、強力な発現プロモータ（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモータ／エンハンサーならびにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、およびＨＩＶ  ＬＴＲプロモータ）、有効なポリ（Ａ）終止配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質抵抗性遺伝子、および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸は、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成的プロモータとは対照的に誘導性プロモータも含み得る（当業者は、このような用語が、実際に、特定の条件下における遺伝子発現の程度の記述語であることを認識するであろう）。
【０１７１】
さらに他の態様において、本発明は、本明細書に定義される本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントまたは本明細書に定義される本発明の二重特異性分子を産生するトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）などの、組み換え真核生物または原核生物宿主細胞に関する。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、および哺乳類細胞（ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞など）が挙げられる。例えば、一実施形態において、本発明は、本発明の抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの発現のための配列コードを含む細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの発現のための配列コードを含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素などの、融合されていない核酸を含む細胞を提供する。
【０１７２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗タウ抗体を産生するための方法であって、ａ）本明細書において上述されるように本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養する工程と、ｂ）培地から本発明の抗体を精製する工程とを含む方法に関する。
【０１７３】
一実施形態において、本発明は、調製物であって、このような用語が本明細書において使用される際、本明細書に定義される抗タウ抗体を含み、タウに結合することが可能でないかまたは調製物の抗タウ機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まない調製物に関する。したがって、このような調製物は、自然発生する血清、またはこのような血清の精製誘導体を包含せず、抗タウ抗体と、調製物の抗タウ抗体の機能性を変更しない別の抗体との混合物を含み、ここで、このような機能性は、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力または本明細書に記載されるように、ヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、Ｓ３９６リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力
である。
【０１７４】
本発明は、特に、天然抗タウ抗体の構造と比べてそのアミノ酸配列の構造変化を（そのＣＤＲ、可変領域、フレームワーク残基および／または定常領域のいずれかに）有するこのような抗タウ抗体の調製物であって、前記構造変化により、抗タウ抗体が、前記天然抗タウ抗体によって示される機能性と比べて著しく変化した機能性（すなわち、機能性の２０％超の相違、４０％超の相違、６０％超の相違、８０％超の相違、１００％超の相違、１５０％超の相違、２倍超の相違、４倍超の相違、５倍超の相違、または１０倍超の相違）を示し；ここで、このような機能性は、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力；または本明細書に記載されるように、ヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、Ｓ３９６リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力
であり、特に、このような変化した機能性は、構造変化の結果であり、したがってそれと切り離すことができない。
【０１７５】
自然発生する抗体を「実質的に含まない」という用語は、このような調製物におけるこのような自然発生する抗体の、または調製物のタウ結合特性を実質的に変更しないこのような調製物におけるある濃度のこのような自然発生する抗体の包含の完全な非存在を指す。抗体は、それが自然発生する対応物を有さないか、またはそれを自然に伴う成分から分離もしくは精製されている場合、「単離」されているといわれる。
【０１７６】
「自然発生する抗体」という用語は、それがこのような調製物に関する場合、生きたヒトまたは他の動物内で、それらの免疫系の機能の自然な結果として誘発される抗体（自然発生する自己抗体を含む）を指す。
【０１７７】
したがって、本発明の調製物は、抗タウ抗体およびタウによって保有されないエピトープに結合することが可能な意図的に加えられるさらなる抗体を含有するこのような調製物を除外せず、実際は明確にそれを包含する。このような調製物は、特に、調製物が、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を治療する際に向上した有効性を示すその実施形態を含む。さらに、本発明は、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状の治療に使用することが意図された、抗タウ抗体抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを含有する調製物に関する。さらに、本発明の調製物は、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性の治療に使用され得る、抗タウ抗体抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを含有する。
【０１７８】
さらに他の態様において、本発明は、
（ｉ）本明細書に定義されるタウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、または調製物であって、このような用語が本明細書において定義される際、このような抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物、および
（ｉｉ）薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
【０１７９】
医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２０１３に開示されているものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤とともに製剤化され得る。
【０１８０】
薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤は、本発明の選択された化合物および選択された投与方法に好適であるべきである。医薬組成物の担体および他の成分のための適合性は、本発明の選択された化合物または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する大きな悪影響がないことに基づいて決定される（例えば、エピトープ結合に対するそれほど大きくない影響（１０％以下の相対的阻害、５％以下の相対的阻害など））。
【０１８１】
本発明の医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性洗浄剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物に含めるのに好適な他の材料も含み得る。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、または非毒性の、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス機能化（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）セファロース、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などの、大型のゆっくりと代謝される高分子も含み得る。
【０１８２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、またはそのアミド、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排せつ速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康および過去の病歴、ならびに医療分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に応じて決まる。
【０１８３】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または経鼻手段を含む、任意の好適な経路および方法によって投与され得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。本明細書において使用される際の「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【０１８４】
インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与するさらなる好適な経路が、当該技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
【０１８５】
一実施形態において、その医薬組成物は、静脈内または皮下注射または注入によって投与される。
【０１８６】
薬学的に許容できる担体としては、本発明の化合物と生理学的に適合性の、あらゆる好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１８７】
本発明の医薬組成物に用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、およびゴマ油などの植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガムおよび注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）、および／または様々な緩衝液が挙げられる。他の担体が、医薬品分野において周知である。
【０１８８】
薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。
【０１８９】
適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の場合、所要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤、例えば（１）水溶性酸化防止剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性酸化防止剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）；および（３）金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）も含み得る。
【０１９１】
本発明の医薬組成物は、組成物中に糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、グリセロールなど）または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の保存可能期間または有効性を向上させ得る、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤または緩衝液などの、選択された投与経路に適切な１つまたは複数の補助剤も含有し得る。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの速放性から化合物を保護する担体とともに調製され得る。このような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など）を単独でまたはワックスまたは当該技術分野において周知の他の材料とともに含み得る。このような製剤の調製のための方法は、一般に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１９３】
一実施形態において、本発明の化合物は、インビボでの適切な分配を確実にするように製剤化され得る。非経口投与用の薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。補助的な活性化合物も、組成物に組み込まれ得る。
【０１９４】
注射用の医薬組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で、滅菌性かつ安定性でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤濃度に好適な他の規則構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）を含有する、水性または非水性溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合、所要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール（グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収が、抗体の吸収を遅らせる物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、例えば上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および例えば上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１９５】
滅菌注射用溶液は、上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１９６】
治療の上記の方法および本明細書に記載される使用における投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割量が、時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治療状況の要件によって示されるように比例的に減少または増加されてもよい。非経口組成物は、投与のしやすさおよび投与の均一性のために単位剤形で製剤化され得る。本明細書において使用される際の単位剤形は、治療される被験体のための統一された投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、所要の医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特性および得られる具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体における敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【０１９７】
本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの有効投与量および投与計画は、治療される疾患または病態に応じて決まり、当業者によって決定され得る。いずれの日も所定の投与量が投与され、投与量は、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。したがって、例示的な投与量としては、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ／体重、例えば約０．１５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ／体重が挙げられる。
【０１９８】
当該技術分野において通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師は、医薬組成物に用いられる本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるより少ないレベルから開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加し得る。一般に、本発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、一般に、上述される要因に応じて決まる。投与は、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与であり得る。必要に応じて、医薬組成物の有効１日用量は、任意選択的に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で、別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の分割用量として投与され得る。本発明の化合物は、単独で投与されることが可能であるが、上述されるように医薬組成物として化合物を投与するのが好ましい。
【０１９９】
本発明の標識抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、疾患または障害を検出、診断、または監視するために、診断目的で使用され得る。本発明は、限定はされないが、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、神経変性または認知疾患または障害の検出または診断を提供し、（ａ）タウに特異的に結合する１つまたは複数の抗体を用いて、被験体の細胞または組織試料内のピログルタミル化Ａβフラグメントの存在を測定する工程と；（ｂ）抗原のレベルを、制御レベル、例えば正常な組織試料におけるレベルと比較し、それによって、抗原の制御レベルと比較した、抗原の測定レベルの増加が、疾患または障害を示すか、または疾患または障害の重症度を示す工程を含む。
【０２００】
本発明の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、当該技術分野において周知の免疫組織化学法を用いて、生物学的試料内のタウまたはタウのフラグメントを測定するのに使用され得る。タンパク質を検出するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）およびメソスケールディスカバリープラットフォーム（ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）ベースのアッセイ（ＭＳＤ）などの免疫測定法が挙げられる。好適な抗体標識が、このようなキットおよび方法に使用され得、当該技術分野において公知の標識としては、酵素標識（アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼなど）；放射性同位体標識（ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）など）；および発光標識（ルミノールおよびルシフェラーゼなど）；および蛍光標識（フルオレセインおよびローダミンなど）が挙げられる。
【０２０１】
標識抗タウ抗体またはそれらのタウ結合フラグメントの存在は、診断目的で、インビボで検出され得る。一実施形態において、診断は、ａ）有効量のこのような標識分子を被験体に投与する工程；ｂ）投与後、所定の時間間隔にわたって待機して、標識分子を、Ａβ堆積の部位（もしあれば）で濃縮させ、非結合標識分子が、バックグラウンドレベルになるまで除去されるのを可能にする工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出が、被験体が疾患または障害に罹患していることを示すか、または疾患または障害の重症度を示すように、被験体中の標識分子を検出する工程を含む。このような実施形態によれば、分子は、当業者に公知の特定のイメージングシステムを用いた検出に好適なイメージング部分で標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識抗体の量を、特定のイメージングシステムのために予め決定された標準値と比較することを含む、当該技術分野において公知の様々な方法によって決定され得る。本発明の診断法に使用され得る方法およびシステムとしては、限定はされないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査法が挙げられる。
【０２０２】
さらなる態様において、本発明は、治療に使用するための、本明細書に定義されるモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
【０２０３】
さらなる態様において、本発明は、タウオパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、本明細書に定義されるモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
【０２０４】
さらなる態様において、本発明は、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を治療するのに使用するための、本明細書に定義されるモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
【０２０５】
さらなる態様において、本発明は、タウオパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用するための、本明細書に定義されるモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
【０２０６】
好ましくは、薬剤は、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、最も好ましくは、アルツハイマー病（ＡＤ）を治療するためのものである。薬剤はまた、好ましくは、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状の治療のためのものである。
【０２０７】
さらなる態様において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、本明細書に定義される薬剤モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【０２０８】
好ましい実施形態において、治療は、長期であり、好ましくは、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上にわたる。
【０２０９】
さらなる態様において、本発明は、治療に使用するための、本明細書に定義される抗体、またはそのフラグメントを含むキットを提供する。
【０２１０】
実施形態
１．配列番号３３のリン酸化残基３９６などの、ヒトタウのリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１１】
２．無傷の抗体からなる、実施形態１に記載の抗体。
【０２１２】
３．Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）；Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）；ミニボディ（Ｆｖ）２−ＣＨ３領域、およびドメイン抗体（例えば単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域）からなる群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、実施形態１または２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１３】
４．抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、いずれかの先行する実施形態に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１４】
５．ヒトまたはヒト化抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１５】
６．抗体またはエピトープ結合フラグメントが、以下の特性
（ａ）ヒト病理学的タウに対する選択性および特異性；
（ｂ）０．５〜１０ｎＭ、例えば１〜５ｎＭまたは１〜２ｎＭの、ｐ−タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）（配列番号３３）に対する結合親和性（ＫＤ）
の１つまたは複数を示す、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１６】
７．前記抗体が、タウ（配列番号３３）におけるリン酸化４０４残基に実質的に結合しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１７】
８．（ａ）配列番号１のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２１８】
９．配列番号８の重鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列および／または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有する配列番号７の軽鎖可変領域を含む、実施形態８に記載のモノクローナル抗体。
【０２１９】
１０．（ａ）配列番号９のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２０】
１１．配列番号１６の重鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列およびまたは配列番号１５の軽鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載のモノクローナル抗体。
【０２２１】
１２．エピトープ結合フラグメントが、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含むモノクローナル抗体。
【０２２２】
１３．配列番号２４の重鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列およびまたは配列番号２３の軽鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載のモノクローナル抗体。
【０２２３】
１４．（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２４】
１５．配列番号３２の重鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列およびまたは配列番号３１の軽鎖可変領域または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載のモノクローナル抗体。
【０２２５】
１６．前記抗体またはそのフラグメントが、ヒトタウへの結合について、実施形態８〜１５に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと競合する、実施形態１〜７の１つに記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２６】
１７．Ｆｃ領域を含む、いずれかの先行する実施形態に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２７】
１８．生体内半減期を増加させるための部分をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２８】
１９．生体内半減期を増加させるための部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランからなる群から選択される、実施形態１８に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２２９】
２０．抗体が、検出可能な部分をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３０】
２１．検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識を含む群から選択される、実施形態２０に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３１】
２２．検出可能な部分が、放射性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態２０または２１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３２】
２３．放射性同位体が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ，８９Ｚｒ、１２３Ｉおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される、実施形態２２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３３】
２４．検出可能な部分が、常磁性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態２１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３４】
２５．常磁性同位体が、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅからなる群から選択される、実施形態２４に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３５】
２６．検出可能な部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学または超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である、実施形態２０〜２５のいずれかに記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３６】
２７．検出可能な部分が、結合部分を介して、間接的に抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに結合される、実施形態２０〜２６のいずれかに記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３７】
２８．結合部分が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択される、実施形態２７に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３８】
２９．重鎖が、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、および配列番号３５からなる群から選択され、軽鎖が、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、および配列番号３６からなる群から選択される、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２３９】
３０．（ａ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
（ｄ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２４０】
３１．（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；および
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２４１】
３２．実施形態１〜３１のいずれかに記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【０２４２】
３３．前記分子がｃＤＮＡ分子である、実施形態３２に記載の核酸分子。
【０２４３】
３４．実施形態３２または３３に記載の核酸分子を含むベクター。
【０２４４】
３５．実施形態３２〜３４のいずれかに記載の核酸分子を含む組み換え宿主細胞。
【０２４５】
３６．実施形態１〜３１のいずれかに記載の抗体またはエピトープ結合フラグメントを産生するための方法であって、コードされた抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの発現を可能にする条件下で、実施形態３５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【０２４６】
３７．先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記調製物が、タウに結合することが可能でないかまたは前記調製物の抗タウ機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まず、前記機能性が、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％％超減少させない能力；または本明細書に記載されるように、ヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、Ｓ３９６リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
【０２４７】
３８．先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記抗体または前記そのエピトープ結合フラグメントが、天然抗タウ抗体の構造と比べて、そのアミノ酸配列の構造変化を有し、前記構造変化により、前記抗体または前記フラグメントが、前記天然抗タウ抗体によって示される機能性と比べて変化した機能性を示し、前記機能性が、
（ｉ）非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉ）Ｓ４０４においてリン酸化され、Ｓ３９６においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと；
（ｉｉｉ）Ｓ３９６においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｉｖ）Ｓ３９６およびＳ４０４の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力；
（ｖ）それがリン酸化４０４残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基Ｓ３９６およびＳ４０４を選択的に区別する能力；
（ｖｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力；
（ｖｉｉ）病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力；および／または
（ｖｉｉｉ）本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたｒＴｇ４５１０抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ６４ｋＤａおよび７０ｋＤａバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、５５ｋＤａタウバンドを１０％超減少させない能力；または本明細書に記載されるように、ヒトＡＤ死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、Ｓ３９６リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも９０％だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを１０％超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
【０２４８】
３９．実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、または実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物；および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【０２４９】
４０．医療に使用するための、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物。
【０２５０】
４１．タウオパチーを治療するのに使用するための、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物。
【０２５１】
４２．タウオパチーが、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状からなる群から選択される、実施形態４１に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、調製物、または医薬組成物。
【０２５２】
４３．タウオパチーを治療するための薬剤の製造における、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物の使用。
【０２５３】
４４．タウオパチーが、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状からなる群から選択される、実施形態４３に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、調製物、または医薬組成物の使用。
【０２５４】
４５．被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーを治療する方法であって、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
【０２５５】
４６．治療が長期である、実施形態４５に記載の方法。
【０２５６】
４７．長期治療が、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上にわたる、実施形態４６に記載の方法。
【０２５７】
４８．被験体がヒトである、実施形態４５〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
４９．医療に使用するための、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物を含むキット。
【０２５９】
５０．被験体の脳における前記タウの存在または量を検出または測定するのに使用するための、実施形態１〜３１のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、実施形態３７〜３８のいずれかに記載の調製物、または実施形態３９に記載の医薬組成物。
【０２６０】
５１．前記検出または測定が、前記タウに結合された前記抗タウ抗体のインビボイメージングを含む、実施形態５０に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、調製物または医薬組成物。
【０２６１】
５２．前記検出または測定が、前記タウに結合された、前記抗タウ抗体または前記そのフラグメントのエクスビボイメージングを含む、実施形態５０に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、調製物または医薬組成物。
【０２６２】
５３．残基４０４においてリン酸化されるが、残基３９６においてリン酸化されないヒトタウの存在下で、ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２６３】
５４．ｉ）抗体は、非リン酸化タウに実質的に結合しない；ｉｉ）抗体は、３９６がリン酸化されないとき、４０４においてリン酸化されるタウに実質的に結合しない；ｉｉｉ）抗体は、３９６においてリン酸化されるタウに結合する；およびｉｖ）抗体は、３９６および４０４が両方ともリン酸化されるとき、タウに結合する
という試験基準にしたがって、リン酸化残基３９６を含むヒトタウへの免疫特異的結合を示す、モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２６４】
５５．ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な、２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーする二リン酸化ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）に対して誘導されるモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２６５】
５６．ハイブリドーマが、ｉ）リン酸化エピトープＳ３９６のいずれかに対して免疫特異的であり、かつｉｉ）ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウを特異的に認識するクローンを単離するために、ヒト病理学的および非病理学的タウでスクリーニングされ、前記抗体が、病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別することができる、実施形態５５に記載のモノクローナル抗体。
【０２６６】
５７．過リン酸化タウを含むもつれから過リン酸化タウを除去する方法であって、過リン酸化タウを抗体と接触させる工程を含み、もつれから９０％の過リン酸化タウが取り除かれるように、前記抗体が、リン酸化残基３９６を有するタウに対して選択的である方法。
【０２６７】
５８．患者におけるアルツハイマー病の進行を遅らせる方法であって、前記患者における病理学的タウタンパク質の蓄積を減少させるかまたは軽減する工程を含み、リン酸化３９６残基を有するタウタンパク質を除去する抗体を投与する工程を含む方法。
【０２６８】
５９．患者におけるアルツハイマー病の進行を遅らせる方法であって、病理学的タウタンパク質の基となるタウタンパク質を除去する工程を含み、リン酸化残基３９６を有するタウタンパク質が除去される方法。
【０２６９】
６０．アルツハイマー病の患者を治療する方法であって、過リン酸化タウを、リン酸化残基３９６を有するタウに対して選択的な抗体と接触させることによって、過リン酸化タウおよび正常なタウを含むもつれから過リン酸化タウを除去する工程を含む方法。
【０２７０】
６１．実施形態１〜３１、４０〜４２または５０〜５６のいずれか１つに記載の抗体の使用を含む、実施形態５７〜５９のいずれかに記載の方法。
【０２７１】
６２．ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な単離されたモノクローナル抗体、またはその単離されたエピトープ結合フラグメント。
【０２７２】
６３．ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能な組み換えヒトまたは組み換えヒト化モノクローナル抗体、またはその単離されたエピトープ結合フラグメント。
【０２７３】
６４．２Ｎ４Ｒタウの残基３８６〜４１０をカバーする二リン酸化ペプチド：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ｛ｐ｝ＳＰＶＶＳＧＤＴ｛ｐ｝ＳＰＲＨＬ（配列番号３７）に対して誘導される組み換えモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントであって、ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能である、組み換えモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
【０２７４】
６５．単離されたモノクローナル抗体、またはその単離されたエピトープ結合フラグメントを含む医薬組成物であって、前記単離されたモノクローナル抗体、またはその単離されたエピトープ結合フラグメントが、上の実施形態のいずれか１つに記載されるとおりである医薬組成物。
【０２７５】
６６．ヒトタウ（配列番号３３）のリン酸化残基３９６に免疫特異的に結合することが可能なキメラモノクローナル抗体またはその単離されたエピトープ結合フラグメント。
【０２７６】
６７．ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株において生産または製造された、実施形態１〜３１および５１〜５６のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２７７】
６８．ＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ−２１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＨＫＢ−１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ−７ヒト細胞株において生産される、実施形態６７に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【実施例】
【０２７８】
実施例１：リン酸化ペプチド３９６／４０４によるマウスの免疫化
Ｃ５６／ＢＬ６およびＦＶＢマウスを、ＴｉｔｅｒＭａｘ補助剤中で製剤化された１０μｇのＰ３０コンジュゲートリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）（配列番号３７）で免疫した。
【０２７９】
マウス（Ｃ５６／ＢＬ６およびＦＶＢ株、雌および雄。２〜３月齢のマウスを、ペプチドエピトープＰ３０コンジュゲートリン酸化タウ３８６〜４０８で免疫した。
【０２８０】
免疫原性Ｐ３０コンジュゲートリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）ペプチドを、ＴｉｔｅｒＭａｘ／供給業者のプロトコルにしたがって、ＴｉｔｅｒＭａｘ（１：１ｖｏｌ：ｖｏｌで混合される４００μｇ／ｍｌのペプチド）中で製剤化し、マウスに、２０μｇのペプチド（１００μｌ）の抗原を皮下注入した。対照マウスに、補助剤のみを注入した。全てのペプチド免疫化マウスを、１ヶ月間隔で、０．５μｇのペプチド／Ｔｉｔｅｒｍａｘ（上述されるように製剤化され、注入される１０μｇ／ｍｌのペプチド）で追加免疫した。最後に、マウスを、脾細胞とＳＰ−２細胞との融合の３日前にＴｉｔｅｒｍａｘなしのＰ３０コンジュゲートリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で追加免疫した。１μｇ／ｍｌのリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で被覆されたＥＬＩＳＡプレートへの陽性結合を示し、ＡＤおよびＴＧ４５１０脳溶解物（実施例３において後述される）に由来するＳ１およびＰ３抗原に対する優先的結合活性を示した後、ハイブリドーマを、再クローニングサイクルのために選択した。ドットブロットおよび脳溶解物で被覆されたＥＬＩＳＡまたはＭＳＤプレートを用いて、このような結合を、対照に由来する脳溶解物へのこのような抗体の結合活性と比較した。
【０２８１】
実施例２：ハイブリドーマ生成
マウスを、脾細胞とＳＰ−２細胞との融合の３日前にＴｉｔｅｒｍａｘなしのＰ３０コンジュゲートリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で追加免疫した。１μｇ／ｍｌのリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で被覆されたＥＬＩＳＡプレートへの陽性結合、およびドットブロットおよび脳溶解物で被覆されたＥＬＩＳＡまたはＭＳＤプレートを用いて、対照に由来する脳溶解物と比較した、ＡＤおよびＴＧ４５１０脳溶解物に由来するＳ１およびＰ３抗原に対する優先的結合活性の後、ハイブリドーマを、再クローニングサイクルのために選択した。
【０２８２】
実施例３  特定の抗体のウエスタンブロットおよびドットブロット分析
タウ生化学的分画
ヒトタウ突然変異Ｐ３０１Ｌを過剰発現するヒトまたはｒＴｇ４５１０マウスに由来する脳組織を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する１０体積のトリス−緩衝生理食塩水中で以下のように均質化した：５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；２７４ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＫＣｌ；１％のプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）；１％のホスファターゼ阻害剤混液ＩおよびＩＩ（Ｓｉｇｍａ）；および１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ）。ホモジネートを、４℃で２０分間にわたって２７，０００×ｇで遠心分離して、上清（Ｓ１）およびペレット画分を得た。ペレットを、５体積の高塩／スクロース緩衝液（０．８ＭのＮａＣｌ、１０％のスクロース、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、［ｐＨ７．４］、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）中で再度均質化し、上記のように遠心分離した。上清を収集し、３７℃で１時間にわたってサルコシル（１％の最終濃度；Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした後、４℃で１時間にわたって１５０，０００×ｇで遠心分離して、Ｐ３画分と呼ばれるサルコシル不溶性ペレットを得た。Ｐ３ペレットを、脳ホモジネートに使用された元の体積の半分に等しい体積になるまで、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁させた。
【０２８３】
ウエスタンおよびドットブロット
分画された組織抽出物Ｓ１およびＰ３を、０．１ＭのＤＴＴを含有するＳＤＳ−試料緩衝液に溶解させた。熱処理された試料（９５℃で１０分間）を、４〜１２％のビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に移した。ドットブロット試料を、試料にわたって公知の濃度で、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上に直接滴下した。ウエスタンおよびドットブロット膜の両方を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％）ｐＨ７．４中の５％の脱脂粉乳中でブロックした後、１μｇ／ｍｌのＤ１．２またはＣ１０−２中で、４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：５０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともにインキュベートした。結合抗体を、強化化学発光システム（ＥＣＬ  ＰＬＵＳ  ｋｉｔ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。定量化およびウエスタンおよびドットブロット免疫反応性の視覚分析を、コンピュータに接続されたＬＡＳ−４０００  ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）およびＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｖ３．１ソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて行った。タンパク質充填量を、元の画分の体積によって調整し、これは元の組織の湿重量に換算され得る。結果が図１および図２に示される。
【０２８４】
実施例４  固定化ヒト病理学的材料を用いた３９６／４０４抗体のスクリーニングおよび選択
ハイブリドーマ上清を、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９を用いて、１μｇ／ｍｌのペプチドリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で被覆されたｎｕｎｃプレートにおける抗体結合についてスクリーニングした。
【０２８５】
続いて、陽性上清を、それぞれＡＤおよび健常対照（ＨＣ）に由来する脳（Ｐ３ペレット、実施例３を参照）溶解物抗原で被覆されたＥＬＩＳＡまたはＭＳＤプレートにおける結合のために、ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡおよび０．１のＮＰ４０中で１：５０〜１：８００に希釈した。脳溶解物抗原を、ＥＬＩＳＡまたはＭＳＤプレートのインキュベーション／コーティングの前に、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９中で１５００倍に希釈した。続いて、ウェルを、室温で２時間にわたってブロックし（ＰＢＳ、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１％のＮＰ−４０）、抗体結合活性を、供給業者のプロトコルにしたがって、ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）およびスルホタグ（ＭＳＤ、ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃）コンジュゲート抗マウスＩｇＧを用いて検出した。０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈された抗体（Ｄ１−２、Ｃ５−２、Ｃ８−３およびＣ１０−２）の選択が、用量反応によって特性評価され、ＡＤ−Ｐ３抗原で被覆されたプレートに対するサブナノモルないしナノモルの結合活性が、特異的および対照ペプチドの選択に対する結合活性についてさらに特性評価されたことを示した。結果が図３に示される。
【０２８６】
実施例５：ペプチド特異性および結合親和性
病理学的タウへの結合について陽性の抗体を、様々なリン酸化ペプチド（ｐ）エピトープに対する見かけの親和性（ＩＣ５０）および選択性／特異性についてさらに特性評価した。ＭＳＤプレートを、上述されるように、１００ｎｇ／ｍｌのリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で被覆した。リン酸化タウに対する抗体を、用量反応アッセイにおいて分析して、適切な分析シグナルレベル（最大機器シグナルの０．５〜２％に対応するＭＳＤにおける典型的な５，０００〜２０，０００ＲＵまたはＥＬＩＳＡにおける４５０ｎｍで１．０〜１．５のＯＤシグナルを提供する抗体濃度を特定した。抗体の選択を、２時間／室温で、段階的な濃度（０〜１０００ｎＭ）のリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／４０４）とともにインキュベートした。続いて、反応物を、上述されるように、１００ｎｇ／ｍｌのペプチドリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）で被覆されたペプチド被覆ＭＳＤプレートに適用し、結合活性を測定した。阻害アッセイからのＩＣ５０値は、１０〜１００ｎＭの見かけの親和性（ＫＤ）に対応する。
【０２８７】
特異性およびリン酸化選択性：適切な濃度のモノクローナル抗体を、１００ｎＭの二リン酸化された（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）、リン酸化されていないかまたは一リン酸化された（ｐＳ３９６またはｐＳ４０４）リン酸化タウ３８６〜４０８とともにインキュベートし、結合活性について分析した（阻害アッセイ）。対照リン酸化タウペプチド（リン酸化タウ２６０〜２７０（ｐＳ２６２）またはリン酸化タウ２４０〜２７０（ｐＳ２６２）および組み換え非リン酸化タウタンパク質を、比較のために分析した。全てのＡＤ−Ｐ３抗原陽性抗体は、リン酸化ペプチドタウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４）および一リン酸化ペプチドリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ３９６）に対する強い優先性を示し、一リン酸化ペプチドリン酸化タウ３８６〜４０８（ｐＳ４０４）および非リン酸化ペプチドタウ３８６〜４０８に対する結合活性を示さなかった。対照リン酸化ペプチドタウ２４０〜２７０およびリン酸化タウ。結果が図４および図３２に示される。
【０２８８】
実施例６：免疫組織化学による抗体の組織学的特性評価
マウス脳組織を、８月齢のｒＴｇ４５１０マウス（ＣａｍＫＩＩプロモータ下でヒトＰ３０１Ｌ−タウを過剰発現する）および非トランスジェニック同腹仔（ｎｏｎ−Ｔｇ）から収集し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィンに埋め込まれる、前頭葉のヒト脳試料は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）から入手した。末期アルツハイマー病と診断されたドナーに由来する組織を、月齢をマッチさせた非認知症対照ドナーと比較した。厚さ４ｕｍの切片を、脱パラフィンし、１０分間にわたって１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６中で切片をマイクロ波処理することによって抗原賦活化を行った。内因性ペルオキシダーゼを、１％の水素ペルオキシダーゼ、続いて、ＰＢＳ／１％のＢＳＡ／０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ−ＢＴ）中の５％の正常ブタ血清でブロックした。切片を、様々な濃度で、ＰＢＳ−ＢＴ中で希釈されたＤ１．２およびＣ１０−２抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。切片を、ＰＢＳ、０．２５％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄してから、１時間にわたって１：５００で、ビオチン化二次ブタ抗マウス抗体（Ｅ０４６４；ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした。さらなる洗浄の後、ストレプトアビジン−ビオチン複合体キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を適用し、免疫反応性を、ジアミノベンジジンで視覚化した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。結果が図５に示される。
【０２８９】
実施例７：病理学的タウに対する抗体の選択性
ＭＳＤプレートを、ＡＤ脳（１：１５００に希釈された）またはＴＧ４５１０脳（１：３０００に希釈された）に由来する可溶化Ｐ３抗原で被覆した。結果が図６に示される。
【０２９０】
検出を、上の実施例４に記載されるように行う。
【０２９１】
実施例８：ＨＥＫ細胞シーディングアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を、平板培養の２４時間後に、６ウェルプレートにおいてヒトタウ−Ｐ３０１Ｌ−ＦＬＡＧで一過性にトランスフェクトし、続いて、２４時間後に、２４時間にわたって脳ホモジネートとともにインキュベートした後、細胞を分割および再度平板培養し、さらに２４時間後に収集した。細胞を溶解させ、１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、Ｐｈｏｓ−ｓｔｏｐおよび完全なホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）緩衝液が補充されたＰＢＳ中で超音波処理し、３０分間にわたって１００，０００×ｇで超遠心分離した。ペレットを、ＳＤＳ中で再懸濁させ、超音波処理し、３０分間にわたって１００，０００×ｇで超遠心分離した。上清を、ウエスタンブロット法によって分析した。ヒトタウ−Ｐ３０１Ｌを発現する細胞は、ｒＴｇ４５１０タウトランスジェニックマウスに由来する総脳ホモジネートをシーディングすると、不溶性（ＳＤＳ画分、Ｅ１／ＦＬＡＧ検出）、過リン酸化（Ｄ１．２｝ｐＳ３９６検出）タウを示した。マウスに由来する対照脳ホモジネートで処理された細胞は、凝集過リン酸化ヒトタウが存在しないことを示した。さらに、ＨＥＫ２９３細胞の総細胞溶解物を、Ｃｉｓｂｉｏ製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。このアッセイは、ＦＲＥＴにおいてドナー（Ｔｂ３＋コンジュゲート）およびアクセプタ（ｄ２コンジュゲート）抗体の両方に同じ抗体を用いた時間分解蛍光に基づくものである。１０μｌの試料を、１０μｌの抗体混合物と混合し、２０時間インキュベートした。プレートをＰｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーで読み取って、時間分解蛍光（励起光のスイッチング後に測定／積分される（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ＦＲＥＴシグナル）を評価した。アッセイは、ヒト剖検材料、ｒＴｇ４５１０マウスにおいて、および高い特異性および感度を有する播種されたＨＥＫ細胞において凝集タウを測定する。結果が図７に示され、シーディング効果が、ＨＥＬによる処理によって影響されなかったが、タウ抗体による処理によって部分的に改善されたことを示す（Ｃ１０−２＞Ｄ１．２＞ｈＡＣＩ３６−２Ｂ６−Ａｂ１）。
【０２９２】
実施例９：Ｄ１．２およびＣ１０−２に対するインビボの機能的（電気生理学（ｅｌｐｈｙｓ））反応の回復
４．５〜５．５月齢のｒＴｇ４５１０およびｔＴＡ対照マウスにおける海馬のＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性のインビボの電気生理学的評価は、ｉ）基底シナプス伝達が、ｔＴＡマウスと比較してｒＴｇ４５１０において有意に低下され、ｉｉ）二発刺激促通が、ｔＴＡマウスと比較してｒＴｇ４５１０において有意に減少されることを示した。
【０２９３】
全ての実験を、実験動物の世話および使用についてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）、および動物実験を規制するＤａｎｉｓｈ  ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎにしたがって行った。
【０２９４】
５〜５．５月齢のｒＴｇ４５１０およびｔＴＡ雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ）を、記録の時点で、この試験に使用した。マウスを、制御された温度（２２±１．５℃）および湿度条件（５５〜６５％）で群居させ、１２：１２時間の明／暗サイクル（０６：００ｈで照明をオンにする）で飼育した。食物および水は自由に摂取可能であった。
【０２９５】
動物に、ウレタン（１．２ｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で麻酔をかけた。次に、マウスを定位フレームに取り付け、マウスの体温を加熱パッドによって３７．５℃に調整し、頭蓋骨を露出させた。白金線を、基準として働くように前頭骨に設置し、ＰａｘｉｎｏｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，２００１）の図解にしたがって以下の配置で、海馬中への記録および刺激電極の挿入のためにさらなる孔を空けた：記録、ブレグマの１．５〜１．７ｍｍ後方、正中線の１．０〜１．２ｍｍ側方、脳の表面の１．４〜１．７ｍｍ下；刺激、ブレグマの１．８〜２．０ｍｍ後方、正中線の１．５〜１．７ｍｍ側方、脳の表面の１．３〜１．７ｍｍ下。動物を、記録の全期間を通して定位フレームに置いたままにし、それらの麻酔のレベルを定期的に調べた。
【０２９６】
電場電位（ｆＥＰＳＰ）を、３０秒ごとのシャファー側枝の電気刺激によってＣＡ１において誘発し、記録電極の深さを、マイナスのｆＥＰＳＰが単極方形パルスに応答して記録されるまで調整した。誘発されたｆＥＰＳＰの傾きを、ｆＥＰＳＰの最大振幅の３０〜７０％で典型的に測定した。
【０２９７】
最適なｆＥＰＳＰが誘発されたら、基底シナプス伝達を、刺激強度と誘発されたｆＥＰＳＰの傾きとの間の関係（入出力関係）によって評価した。様々な強度の刺激は、０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、および５００μＡであり、これを低い方から順に連続して加え、各強度で２〜３回繰り返す。基底シナプス伝達は、ｔＴＡマウスと比較してｒＴｇ４５１０マウスにおいて著しく低下したことが分かった。
【０２９８】
シナプス前機構に依存するものと考えられる短期シナプス可塑性である二発刺激促通を、ｒＴｇ４５１０およびｔＴＡマウスにおいてさらに測定した。簡潔に述べると、２５〜１０００ｍｓで変化する刺激間時間間隔（ＩＳＩ）を有する一対の刺激を、シャファー側枝に加え、第２のｆＥＰＳＰの傾きを、第１のｆＥＰＳＰの傾きと比較した。促通が全てのＩＳＩで観察され、５０および７５ｍｓのＩＳＩで最大の促通を有していた。興味深いことに、有意に低いＰＰＦが、ｔＴＡマウスと比較したとき、ｒＴｇ４５１０マウスにおいて観察された。
【０２９９】
ｒＴｇ４５１０マウスにおける基底シナプス伝達および二発刺激促通の特定された低下を、抗体有効性を試験するための読み出しとしてさらに使用した。
【０３００】
腹腔内（ｉ．ｐ．）に２週間にわたって週に２回の、４つの用量の抗体の投与の２〜４日後に、全ての実験において記録を行った。基底シナプス伝達および二発刺激促通を、可能であれば、各動物の両方の海馬において記録し、個別の実験としてさらに使用した。結果が図８に示され、ＣＡ１誘発電場電位において二発刺激促通および基底シナプス伝達障害の抗体による改善を示す。
【０３０１】
実施例１０：ｒＴｇ４５１０脳抽出物に由来するタウの免疫枯渇
６０μｇのマウスおよびヒト化Ｃ１０−２抗体を、３００μｌのＭａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁液（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｔ  ｎｏ  １０００７Ｄ）に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、６０μｌのｒＴｇ４５１０脳抽出物と混合し、室温で１０分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２による欠失は、タウ凝集体をそれぞれ９９および９９．５％除去した。結果が図１２に示される。
【０３０２】
実施例１１：免疫枯渇された抽出物を用いたＨＥＫ細胞シーディングアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレートにおいてヒトタウ−Ｐ３０１Ｌ−ＦＬＡＧで一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、ヒト化またはマウスＣ１０−２を用いて免疫枯渇させた脳ホモジネートとともにインキュベートした。２４時間後、細胞を再度平板培養し、さらに２４時間後に収集した。細胞を溶解させ、１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）が補充されたＴＢＳ中で超音波処理し、３０分間にわたって１００，０００×ｇで超遠心分離した。ペレットを、１％のＳＤＳ中で再懸濁させ、超音波処理し、３０分間にわたって１００，０００×ｇで超遠心分離した。上清を、ウエスタンブロット法によって分析した。ヒトタウ−Ｐ３０１Ｌを発現する細胞は、ｒＴｇ４５１０タウトランスジェニックマウスに由来する総脳ホモジネートをシーディングすると、不溶性（ＳＤＳ画分、Ｅ１／ＦＬＡＧ検出）、過リン酸化タウ（より高い分子量で動作する、Ｄ１．２／ｐＳ３９６タウ）を示した。ｔＴＡマウスに由来する対照脳ホモジネートで処理された細胞は、凝集過リン酸化ヒトタウが存在しないことを示した。さらに、ＨＥＫ２９３細胞の総細胞溶解物を、Ｃｉｓｂｉｏ製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。ＨＥＬおよびｈＨＥＬ抗体による欠失が、シーディングに影響を与えなかった一方、ｍＣ１０−２およびｈＣ１０−２による欠失はそれぞれ、タウ凝集を８８および９６％および不溶性タウを９７および１００％防いだ。結果が図１３に示される。
【０３０３】
実施例１１：ｒＴｇ４５１０脳抽出物に由来するタウの免疫枯渇
１００μｇのマウスＣ１０−２、Ｄ１．２およびタウ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を、５００μｌのＭａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁液（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｔ  ｎｏ  １０００７Ｄ）に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、１００μｌのｒＴｇ４５１０脳抽出物と混合し、室温で１０分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。Ｃ１０−２およびＤ１．２は、ホモジネートに由来する正常なタウを除去しないが、市販のタウ５抗体は除去する。対照的に、本発明の２つの抗体は、セリン３９６においてリン酸化されるタウである過リン酸化タウ（６４ｋＤａ）を９５％だけ特異的に除去する。結果が図１４に示される。
【０３０４】
実施例１２：アルツハイマー病の脳抽出物に由来するタウの免疫枯渇
１００μｇのマウスＣ１０−２およびＤ１抗体を、５００μｌのＭａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁液（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｔ  ｎｏ  １０００７Ｄ）に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、１００μｌのアルツハイマー病の脳抽出物と混合し、室温で１０分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。Ｄ１．２およびＣ１０−２は、脳ホモジネート中の総タウのごくわずかな部分（８％）のみを除去する。しかしながら、抗体は、ＡＤ患者に特有の過リン酸化タウ（９０％）を特異的に除去する。結果が図１５に示される。
【０３０５】
実施例１３：免疫枯渇された抽出物を用いたｒＴｇ４５１０マウスにおけるシーディング
ＣａｍＫ２陽性ニューロン（ｒＴｇ４５１０）中、ｔｅｔ−ｏｆｆ応答因子下でヒト突然変異タウ（Ｐ３０１Ｌ  ０Ｎ４Ｒ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。このモデルは、通常、３月齢でタウ病変を発生し始めるが、妊娠中および子が生まれてから最初の３週間にわたって母親にドキシサイクリンを供給することによって、病変は、より遅い段階で発生する（６月齢後に開始する）。試験に使用される、ドキシサイクリンで前処理されたマウスは、注入の時点で２．５月齢であった。マウスに、吸入剤の吸入によって麻酔をかけ、定位フレームに固定した。頭蓋骨を露出させ、ブレグマおよびラムダが水平になるまで調整した。ブレグマの２ｍｍ側方（右）および２．４ｍｍ後方で、頭蓋骨に孔を空けた。１０μｌのシリンジのベベルチップ（ＳＧＥ）を用いて、シーディング材料を、上記の配置で、脳表面の１．４ｍｍ前面に注入した。２μｌの、実施例１１および１２に記載される免疫枯渇された抽出物を、その部位（１μｌ／分）にゆっくりと注入し、シリンジを５分間そのままにして置いてから、それを取り出した。創傷を縫うことによって閉じ、目を覚ますまでマウスを加熱した。マウスを３ヶ月間飼育してから殺処分し、かん流を４％のＰＦＡで固定した。
【０３０６】
免疫組織化学：固定された脳を、ＮＳＡにおいて３５μｍの冠状断面へと切断し、６つ置きの切片を、タウもつれ（ガリアス銀染色）および過リン酸化タウ（ＡＴ８）について染色した。陽性染色されたニューロン（細胞体）を、全ての脳の海馬の同側および反対側で計数した。海馬の全てのサブ領域が含まれていた。脳当たり８つの切片を計数した。結果は、８つの切片からの陽性ニューロンの合計を反映する。バックグラウンドシグナルを、２匹の非注入マウスにおいて決定した。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。結果が図１６に示される。ｒＴｇ４５１０（Ａ）またはＡＤ（Ｂ）脳ホモジネートが播種されたｒＴｇ４５１０脳におけるタウ病変の定量化。シーディングの前に、過リン酸化タウは、Ｃ１０−２またはＤ１．２を用いてホモジネート中で９０〜９５％だけ減少されたが、正常なタウは減少されなかった。ホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、ホモジネートは、タウ病変のシーディングをもはや誘発しない。
【０３０７】
ｒＴｇ４５１０またはアルツハイマー病の脳に由来するホモジネートは、内因性タウ病変が発生されなかった段階で、ｒＴｇ４５１０マウスにおいてタウ病変を播種し得る。実施例１１および１２に記載されているように、Ｄ１．２またはＣ１０−２を用いてホモジネートから過リン酸化タウを除去することによって、シーディング活性はなくされる。
【０３０８】
実施例１４：播種されたｒＴｇ４５１０マウスにおける抗体処理
ドキシサイクリンで処理されたｒＴｇ４５１０マウス（実施例１３に記載される）を、２月齢から開始して、１５ｍｇ／ｋｇ／週で、マウスＤ１．２または対照抗体で長期的に処理した。２．５ヶ月の時点で、ｒＴｇ４５１０脳抽出物を、海馬（実施例１３に記載される）に注入した。マウスを、脳注入の１、２および３ヵ月後に殺処分し、免疫組織化学および以下の分析を、実施例１３に記載されるように行った。Ｄ１．２処理は、シーディングが開始された２および３ヵ月後に、タウ病変を有意に減少させた。結果が図１７に示される。
【０３０９】
播種されたｒＴｇ４５１０マウスの海馬におけるもつれを有するニューロンの定量化。病変は、時間とともに増加し、マウスをＤ１．２で処理することによって、病変は、シーディングの２および３ヵ月後に有意に減少される。播種されたｒＴｇ４５１０マウスの海馬におけるもつれを有するニューロンの定量化。病変は、時間とともに増加し、マウスをＤ１．２で処理することによって、病変は、シーディングの２および３ヵ月後に有意に減少される。
【０３１０】
ｒＴｇ４５１０またはアルツハイマー病の脳に由来するホモジネートは、内因性タウ病変が発生されなかった段階で、ｒＴｇ４５１０マウスにおけるタウ病変を播種し得る。マウスをＤ１．２で全身的に処理することによって、タウ病変の発生が、有意に減少され得る。
【０３１１】
実施例１５：ヒト化タウ抗体を用いたアルツハイマー病の脳抽出物に由来するタウの免疫枯渇
１００μｇのマウスおよびヒト化Ｃ１０−２ならびに先行技術の抗体２．１０．３およびＨＪ８．５抗体（ソース）を、５００μｌのＭａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁液（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｔ  ｎｏ  １０００７Ｄ）に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、１００μｌのアルツハイマー病の脳抽出物と混合し、室温で１０分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物を、ウエスタンブロットおよびＣｉｓＢｉｏアッセイによって分析した。マウスおよびヒト化Ｃ１０−２は、ｈＨｅｌ対照抗体と比較して、ｐＳ３９６リン酸化タウの９３および９７％を効率的に除去したが、総タウの２２および１７％のみを除去した。２．１０．３抗体は、セリン３９６リン酸化タウの９１％および総タウの１０％を除去した。２．１０．３は、Ｃ１０−２抗体（中央の６４ｋＤａバンド）と比較して、過リン酸化バンドの１つを除去する効率が低いようである。ＨＪ８．５抗体は、タウの大部分、総タウの８９％およびｐＳ３９６タウの８８％を除去することによって、Ｃ１０−２および２．１０．３抗体の両方と、完全に異なるプロファイルを有する。結果が図２３〜２４に示される。
【０３１２】
実施例１６：ヒト化タウ抗体を用いたアルツハイマー病の脳抽出物に由来する凝集タウの免疫枯渇
また、実施例１３に記載されている免疫枯渇されたＡＤ抽出物を、実施例１０に記載されているタウ凝集アッセイを用いて分析した。Ｃ１０−２およびＨＪ８．５抗体は、ＡＤ材料に由来する凝集タウを、２．１０．３抗体より効率的に除去している。全てｈＨｅｌ抗体と比較して、効率性の順に：ＨＪ８．５（９９％）、ｈＣ１０−２（９８％）、ｍＣ１０−２（９６％）および２．１０．３（９０％）。結果が図２５に示される。
【０３１３】
実施例１７：タウの免疫枯渇
２５μｇの抗体（ヒト化Ｃ１０−２または２．１０．３）を、１２５μｌのＭａｇｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁液（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｎｏｖｅｘ，Ｃａｔ  ｎｏ  １０００７Ｄ）に固定した。十分な洗浄の後、被覆されたビーズを、可変量の非被覆洗浄ビーズと混合した。５μｇの抗体に対応する１００％のＡｂ被覆ビーズから開始して、１００％の非被覆ビーズに到るまで。ビーズの総量は、全ての試料において同じであった。ビーズを、２０μｌのＡＤ抽出物と混合し、室温で１０分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物を分割し、急速凍結させ、使用するまで−８０Ｃに保持した。
【０３１４】
ウエスタンブロットを用いた欠失の分析
試料を、１×ＬＤＳローディングバッファーおよび１００ｍＭのＤＴＴ中で沸騰させた。３μｌの抽出物に相当する体積を、４〜１２％のビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  Ｎｏｖｅｘ）上に充填した。電気泳動の後、タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  ＰＶＤＦ膜（０．４５μｍ、ＩＰＦＬ１０１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットした。膜を、ＳＥＡブロッキング緩衝液（Ｐｒｏｄ＃３７５２７、Ｔｈｅｒｍｏ）でブロックした。タウおよびＰ−タウレベルを、タウ５（Ａｂｃａｍ  ａｂ８０５７９、１：２０００）マウスＣ１０−２（１μｇ／ｍｌ）、Ｐ−Ｓ１９９／２０２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４４７６８  Ｇ、１：１０００）、Ｐ−Ｓ４２２（Ａｂｃａｍ  ａｂ７９４１５、１：７５０）、ヒトＩＰＮ（１μｇ／ｍｌ）を用いて試料中で評価した。Ｇａｐｄｈおよびアクチンを、充填対照として使用した（Ａｂｃａｍ  ａｂ９４８４、１：２０００、Ｓｉｇｍａ  Ａ５４４１、１：２００００）。二次蛍光体コンジュゲートＩｇＧ抗体を使用し（ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ヒト、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ヤギ抗ウサギ、ＩＲＤｙｅ  ６８０ヤギ抗マウス、ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、シグナルを、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘおよびＩｍａｇｅ  ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量化した。個々のバンドならびにレーン全体におけるシグナルの定量化を行い、これから、Ｓ字形用量反応曲線をプロットし、可能であれば、最大効果およびＥＣ５０値を推定した。
【０３１５】
結果
両方の抗体は、アルツハイマー病の脳標本からタウのわずかな部分を除去する。Ｐ−Ｓ４２２タウに対する特異性を有することが示された２．１０．３は、総タウ量の最大で２４％を除去する一方、Ｃ１０−２は、総タウの最大で１５％を除去する（図２６を参照）。
【０３１６】
２．１０．３およびＣ１０−２は両方とも、セリン４２２においてリン酸化されるタウの９０％超を除去するが、５０％のＰ−Ｓ４２２タウを除去するのに必要な抗体の量は異なり、２．１０．３では、０．４２μｇの抗体が必要とされ、Ｃ１０−２では、０．２７μｇが同じ効果のために必要とされる（図２７を参照）。
【０３１７】
Ｃ１０−２は、セリン３９６においてリン酸化されるタウを効率的に除去する（最大の効果：８８％および効果の半分には、０．３０μｇの抗体を用いて達する）。２．１０．３は、セリン３９６においてリン酸化されるタウのよりわずかな部分を除去する（最大の効果：６０％およびその効果の半分には、０．６３μｇの抗体を用いて達する）（図２８を参照）。これは、セリン４２２においてリン酸化される全てのタウが、セリン３９６においてもリン酸化されるが、位置４２２におけるリン酸化セリンが存在しない場合、セリン３９６においてリン酸化される過リン酸化タウの部分がないことを示す。
【０３１８】
Ｃ１０−２によって除去されるタウの大部分はまた、セリン１９９／２０２においてリン酸化され、これは、そのリン酸化を有するタウの６９％が、免疫枯渇によって影響されるためである（０．３４μｇの抗体を用いたときの効果の５０％）（図２９を参照）。２．１０．３免疫枯渇は、Ｐ−Ｓ１９９／２０２タウに関するＳ字形用量反応を示さないが、シグナルの低下が、増加する量の抗体で見られる（最大量の抗体（５μｇ）を用いたときの最大５２％の減少（図２９を参照）。
【０３１９】
このデータは、リン酸化セリン３９６を標的にするＣ１０−２抗体が、４２２位置におけるリン酸化セリンを標的にする２．１０．３抗体より大きいプールの過リン酸化タウに結合することを示す。
【０３２０】
実施例１８：ＡＤ脳溶解物における病理学的タウ抗原のｍＣ１０−２特異的な捕捉の抗体に仲介される阻害
材料および方法
材料
コーティング緩衝液：炭酸塩緩衝液ｐＨ８．５、１５０ｍＭのＮａＣＬ。ブロッキング緩衝液：３％のＢＳＡ（画分Ｖ）、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中０．１％のＮＰ４０。洗浄緩衝液：０．１％のＢＳＡ（画分Ｖ）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中０．１％のＮＰ４０。スルホタグヤギ総ヒト化タウ抗体（ＭＳＤ  Ｄ２２１ＬＡ−１、５０μｇ／ｍｌ）。
【０３２１】
方法は、増加する濃度のｐＳ３９６特異的抗体によるタウ抗原のインキュベーション（工程Ｂ）の後、Ｃ１０−２被覆プレートを用いてＡＤ脳に由来する病理学的ヒトタウ抗原の捕捉（工程Ａ）を測定することを目的としている。タウ抗原の捕捉および抗体に仲介される阻害を、ＭＳＤからのスルホタグ化抗ヒト（総）タウ抗体を用いて検出した。
【０３２２】
Ａ：ＭＳＤプレートを、コーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌのｍＣ１０−２（捕捉抗体）で被覆し（４Ｃで一晩）、続いて、室温で１時間ブロックし）、３回洗浄した（図３０）。
【０３２３】
Ｂ：ＡＤ（３人の患者からプールされる）に由来する試料Ｐ３溶解物（１：１０００＝２〜４μｇ／ｍｌの総タンパク質）および／またはＳ１（ｐ）（１：３００＝２０〜４０ｎｇ／ｍｌの総タンパク質）を、段階的な濃度のｐＳ３９６ペプチドエピトープ特異的抗体と混合し、室温で１時間インキュベートした。続いて、反応物を、工程Ａにおいて準備されたプレート上で２時間インキュベートした（図３１）。
【０３２４】
Ｃ：Ｃ１０−２で捕捉されるタウを、スルホタグ化ヒトタウを用いて検出した。製造業者の指示にしたがって、ＭＳＤからのタウ抗体（１：５０）。プレートを、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ  ６００において分析した。ＡＤ  Ｐ３およびＡＤ  Ｓ１（ｐ）を、同様の設備において試験した（図３３／３４）。
【０３２５】
【表６】
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【０３２６】
【表７】
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【０３２７】
【表８】
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【０３２８】
【表９】
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【０３２９】
表６Ａ〜６Ｄ：タウ抗原捕捉阻害
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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