(57)【要約】  本発明は、組織損傷の分野に関する。より具体的には、本発明は、組織損傷の治療に有用な医薬組成物を提供する。特定の実施態様において医薬組成物は、（ａ）幹細胞動員物質と（ｂ）免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドとを含む。本発明の医薬組成物は、様々な経路及び投与処方により投与することができる。
2018521132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１種の幹細胞動員物質；（ｂ）少なくとも１種の免疫抑制剤；及び（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
医薬組成物が、皮下注射又は筋肉内注射用に製剤化される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
少なくとも１種の幹細胞動員物質がＣＸＣＲ４アンタゴニストを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストが、ＡＭＤ３１００、ＴＧ−００５４、又はＡＭＤ３４６５を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＡＭＤ３１００を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１種の免疫抑制剤がＦＫ結合タンパク質リガンドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１種の免疫抑制剤がタクロリムスを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
タクロリムスが、免疫抑制のための正常な用量の約１／１０で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１種の免疫抑制剤がタクロリムスを含み、少なくとも１種の幹細胞動員物質がＡＭＤ３１００を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
タクロリムスとＡＭＤ３１００とが約１／１０〜約１／１００の比率で存在する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
（ａ）タクロリムス；（ｂ）ＡＭＤ３１００；及び（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物であって、タクロリムスとＡＭＤ３１００とが約１／１０〜約１／１００の比率で存在する医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が皮下注射用に製剤化される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）タクロリムス；（ｂ）ＡＭＤ３１００；及び（ｃ）医薬的に許容し得る担体からなる医薬組成物であって、タクロリムスとＡＭＤ３１００とが約１／１０〜約１／１００の比率で存在し、医薬組成物が皮下注射用に製剤化される医薬組成物。
【請求項１４】
（ａ）タクロリムス；及び（ｂ）ＡＭＤ３１００から本質的になる医薬組成物であって、タクロリムスとＡＭＤ３１００とが約１／１０〜約１／１００の比率で存在し、医薬組成物が筋肉内注射用に製剤化される医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、及び（ｂ）ＦＫ結合タンパク質リガンドを含む医薬組成物。
【請求項１６】
ＦＫ結合タンパク質リガンドが、タクロリムス又はその類似体、メリダマイシン又はＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ）を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストが、ＡＭＤ３１００、ＴＧ−００５４、又はＡＭＤ３４６５を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
医薬組成物が、タクロリムスとＡＭＤ３１００の実質的に同時の投与のために製剤化される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、患者の組織損傷を治療する方法。
【請求項２０】
組織損傷が、火傷、創傷、臓器移植、脊髄損傷、及び自己免疫疾患若しくは炎症性疾患のうちの１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫性又は炎症性疾患がＩＢＤである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＢＤが大腸炎又はクローン病として現れる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
創傷が糖尿病性潰瘍である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、皮下、経口的、筋肉内、静脈内、又は腹腔内投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が１日おきに投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、組織損傷が発生したか又は観察された日と同じ日に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
対象の組織損傷を治療する方法であって、対象に請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を、組織損傷が発生したか又は観察された日に１回以上投与する工程、組織損傷が発生したか又は観察された日の約１ヵ月後に１回以上投与する工程、組織損傷が発生したか又は観察された日の約２ヵ月後に１回以上投与する工程、及び組織損傷が発生したか又は観察された日の約３ヵ月後に１回以上投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
医薬組成物が、経口的、筋肉内、静脈内、又は腹腔内投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組織損傷が、臓器移植、火傷、創傷、自己免疫性又は炎症性疾患の診断、及び自己免疫性又は炎症性疾患のエピソードの発生からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
自己免疫性又は炎症性疾患がＩＢＤである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＢＤが、大腸炎又はクローン病として現れる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
創傷が糖尿病性潰瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法であって、
（ａ）組織損傷が発生したか又は観察された日に、及び再度、組織損傷が発生したか又は観察された日の約２、４、６、及び８日後に；
（ｂ）組織損傷が発生したか又は観察された日のほぼ１ヵ月目に、及び、組織損傷が発生したか又は観察された日の１カ月目のほぼ２、４、６、及び８日後に；
（ｃ）組織損傷が発生したか又は観察された日のほぼ２ヵ月目に、及び、組織損傷が発生したか又は観察された日の２カ月目のほぼ２、４、６、及び８日後に；ならびに
（ｄ）組織損傷が発生したか又は観察された日のほぼ３ヵ月目に、及び、組織損傷が発生したか又は観察された日の３カ月目のほぼ２、４、６、及び８日後に、１回以上投与される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織損傷の分野に関する。より具体的には、本発明は、組織損傷の治療に有用な医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞療法は、臓器移植、種々の組織損傷（火傷、手術、褥瘡、皮膚潰瘍などを含む創傷）、神経損傷及び／又は変性（脊髄損傷を含む）を含む多数の症状の治療、又はＩＢＤ若しくは他の炎症性疾患若しくは自己免疫性疾患、又はＩＢＤ若しくは他の炎症性若しくは自己免疫性疾患のエピソードの発症の診断に有用であり得る。しかしながら、このような治療法は通常、対象からの内因性幹細胞の単離、体外でのそれらの幹細胞の培養と調製、及び対象への再移植を必要とする。これらのプロセスはコストがかかり、時間がかかり、必ずしも信頼できるものではない。
【０００３】
以前の研究により、幹細胞動員物質（stem cell mobilizer）と免疫抑制剤とを、異なる時間に投与するか、又は同時であるが異なる部位に別々に投与すると、幹細胞を動員できることが示されている（例えば、Okabayashi T, et al. Mobilization of host stem cells enables long-term liver transplant acceptance in a strongly rejecting rat strain combination. Am J Transplant 2011; 11: 2046?2056、及び Lin Q, Wesson RN, Maeda H, et al. Pharmacological mobilization of endogenous stem cells significantly promotes skin regeneration after full-thickness excision: The synergistic activity of AMD3100 and Tacrolimus. J Invest Dermatol 2014; 134(9): 2458-2468を参照）。これらの方法での幹細胞の動員は、幹細胞動員物質と免疫抑制剤のいずれかを単独で投与した場合よりも良好であったが、それぞれの薬剤の複数回の複数の部位への注射が必要であり、対象に対する不快感及びリスクが増大し、ならびに治療法に対する効果が低下している。
【０００４】
従って、内因性幹細胞が組織損傷の部位に蓄積し、幹細胞を除去したり再移植したりする必要無しで治癒を補助し、リスク及び不快感がより少なくて、対象により効率的に投与することができるように、骨髄中の貯蔵部位から内因性幹細胞を動員するのに有用な医薬製剤に対する大きなニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
一実施態様において、本発明は医薬組成物を提供する。特定の実施態様において上記医薬組成物は、（ａ）幹細胞動員物質；（ｂ）免疫抑制剤；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含む。別の実施態様において上記組成物は、（ａ）少なくとも１種の幹細胞動員物質；（ｂ）少なくとも１種の免疫抑制剤；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含む。ある実施態様において上記医薬組成物は、対象の単一の部位に実質的に同時に投与できるように、例えば、単一の製剤で調製される。
【０００６】
別の実施態様において、幹細胞動員物質はＣＸＣＲ４アンタゴニストを含む。例えば、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＭＤ３１００、ＴＧ−００５４、又はＡＭＤ３４６５を含み得る。別の実施態様において、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００を含む。別の実施態様において、免疫抑制剤は、ＦＫ結合タンパク質リガンド、例えば、タクロリムス（Tacrolimus）（ＦＫ−５０６）又はその類似体を含む。タクロリムス類似体の例には、アスコマイシン（ascomycin）、５０６ＢＤ、及びＬ−６８５，８１８が含まれる。具体的な実施態様において免疫抑制剤は、免疫抑制性物質、例えば、タクロリムスを含み、少なくとも１種の幹細胞動員物質はＡＭＤ３１００を含む。特定の実施態様において、タクロリムスとＡＭＤ３１００は、約１／１０〜約１／１００の比率で存在する。
【０００７】
本発明はまた、（ａ）タクロリムス；（ｂ）ＡＭＤ３１００；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を、含む医薬組成物を提供し、ここで、タクロリムスとＡＭＤ３１００は、約１／１０〜約１／１００の比率で存在する。特定の実施態様において医薬組成物は、皮下注射用に製剤化される。別の実施態様において医薬組成物は、本質的に（ａ）タクロリムスと（ｂ）ＡＭＤ３１００とからなり、ここでタクロリムスとＡＭＤ３１００は、約１／１０〜約１／１００の比率で存在する。
【０００８】
本発明はさらに、（ａ）ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、及び（ｂ）ＦＫ結合タンパク質リガンドを含む医薬組成物を提供する。ＦＫ結合タンパク質リガンドは、例えば、タクロリムス若しくはその類似体、メリダマイシン（meridamycin）、又はＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ）を含むことができる。別の実施態様においてＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＭＤ３１００、ＴＧ−００５４、又はＡＭＤ３４６５を含む。
【０００９】
別の実施態様において医薬組成物は、（ａ）幹細胞動員物質；（ｂ）免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンド；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含む。医薬組成物は、（ａ）幹細胞動員物質；（ｂ）タクロリムス；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含むことができる。別の実施態様において医薬組成物は、（ａ）ＡＭＤ３１００、ＴＧ−００５４、又はＡＭＤ３４６５の１つ；（ｂ）免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンド；及び場合により（ｃ）医薬的に許容し得る担体を含むことができる。ある実施態様において医薬組成物は、対象の単一の部位に実質的に同時に投与できるように製剤化される。
【００１０】
本発明はまた、１種以上の幹細胞動員物質と、１種以上の免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドを含む医薬パック又はキットを特徴とする。
【００１１】
本発明の医薬組成物及び医薬パック又はキットは、幹細胞動員物質及び免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドのより高次の組み合わせを特徴とし、例えば、１、２、又はそれ以上の幹細胞動員物質（ＡＭＤ３１００、Ｇ−ＣＳＦなど）を、１、２、又はそれ以上の免疫抑制剤（例えば、ＦＫ５０６、ラパマイシン、シクロスポリンＡ）又はＦＫＢＰリガンド（例えば、メリダマイシン）と組み合わせることができる。
【００１２】
別の実施態様において本発明は、本発明の治療的に有効な医薬組成物を投与する工程を含む、患者の組織損傷を治療するための方法を提供する。特定の実施態様においてこの投与工程は、医薬組成物を構成する幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドの、対象の単一の部位への、例えば単一の製剤としての、実質的に同時の投与を含む。本発明の医薬組成物及び方法で治療することができる組織損傷は、創傷、炎症性又は自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、例えば、脊髄からの末梢神経の損傷又は変性（急性損傷及び遅延性２次性変性を含む）、又は糖尿病性神経障害、及び臓器移植を含む。創傷には、皮膚の創傷、例えば、裂傷、火傷、褥瘡、及び慢性創傷（圧迫潰瘍若しくは糖尿病性足潰瘍など）、又は糖尿病に関連する他の創傷が含まれ得る。
【００１３】
本発明はさらに、組織損傷を患う対象のための３回投与処方、すなわち本発明の医薬組成物の医薬的有効量を対象に、組織損傷の約１カ月後と約２カ月後と約３カ月後の合計３回投与することを含む、対象の組織損傷を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、投与は皮下又は筋肉内である。３回投与処方の１つの実施態様において投与工程は、医薬組成物を構成する幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドの、対象の単一の部位への、例えば、単一の製剤としての、実質的に同時の投与を含む。別の実施態様において組織損傷は、臓器移植、火傷、創傷、神経損傷及び／又は変性（脊髄損傷を含む）、ＩＢＤ又は他の自己免疫性若しくは炎症性疾患の診断、及びＩＢＤ又は他の自己免疫性若しくは炎症性疾患のエピソードの発症から成る群から選択される。
【００１４】
本発明はさらに、組織損傷を患う対象の投与処方を含み、すなわち本発明の医薬組成物の医薬的有効量を対象に、１日おきに所定の期間又は組織損傷が治癒されるまで又は組織損傷がもはや観察されなくなるまで、投与することを含む、対象の組織損傷を治療する方法を含む。いくつかの実施態様において、投与は皮下又は筋肉内である。別の実施態様において投与工程は、医薬組成物を構成する幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドの、対象の単一の部位への、例えば、単一の製剤としての、実質的に同時の投与を含む。別の実施態様において組織損傷は、臓器移植、火傷、創傷、神経損傷及び／又は変性（脊髄損傷を含む）、ＩＢＤ又は他の自己免疫性若しくは炎症性疾患の診断、及びＩＢＤ又は他の自己免疫性若しくは炎症性疾患のエピソードの発症から成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＡＭＤ３１００／タクロリムス（ＦＫ５０６）ＡＦ併用製剤による幹細胞動員活性を示すグラフである。
【図２】図２は、火傷のマウスモデルにおけるＡＦ併用剤治療を示す一連の写真である。
【図３】図３は、火傷のマウスモデルにおいてＡＦ併用剤治療が創傷治癒を加速したことを示すグラフである。
【図４】図４Ａは、火傷の５カ月後にＡＦ併用剤治療が瘢痕形成を改善したことを示す一連の写真であり、図４Ｂはグラフである。
【図５】図５は、生理食塩水、ＡＭＤ３１００単独、タクロリムス単独、及びＡＭＤ３１００とタクロリムスの別個の注射と比較した、ＡＦ併用剤による幹細胞動員活性を示すグラフであり、群当たりｎ＝３である。
【図６Ａ】図６Ａは、糖尿病ラットにおける創傷の生成を示す図であり、代表的な創傷の写真は０日目と９日目である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、糖尿病ラットにおける生理食塩水又はＡＦ併用剤治療の３時間後の、末梢血液試料中のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の測定を示す図及びグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、生理食塩水又はＡＦ併用剤のいずれかによる治療後の、糖尿病ラットにおける創傷治癒を示す写真のパネルである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、生理食塩水及びＡＦ併用剤治療した糖尿病ラットの写真のパネルであり、生理食塩水又はＡＦ併用剤治療した糖尿病ラットの創傷部位における、ＣＤ１３３＋内皮前駆細胞（「ＣＤ１３３」）、ＣＤ３４＋幹細胞（「ＣＤ３４」）、毛細血管及び毛包新生（「内皮」）、及び瘢痕（「３カ月目の瘢痕」）の数を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、高齢マウスにおける切開創（４ｃｍ）の作製を示す一連の写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、高齢マウスにおける治癒創傷の引張強度の測定を示す図及び写真である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、生理食塩水、幹細胞動員物質（「ＡＭＤ」）、免疫抑制剤（「ＦＫ５０６」）、及びＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療した高齢マウスにおける、治癒創傷の破断時張力（ニュートン）及び破断時仕事量（ミリジュール）を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、生理食塩水、幹細胞動員物質（「ＡＭＤ」）、免疫抑制剤（「ＦＫ」）、及びＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療した高齢マウスの創傷部位における、ＳＤＦ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、及びＫｉ６７の発現を示すゲル電気泳動の一連の写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、生理食塩水、幹細胞動員物質（「ＡＭＤ」）、免疫抑制剤（「ＦＫ」）、及びＡＦ併用剤（「ＡＦ Ｃｏｍｂｏ」）で治療した高齢マウス創傷形成の７日後の、創傷部位における上皮増殖（Ｋｉ６７＋）を示す一連の写真である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、生理食塩水、幹細胞動員物質（「ＡＭＤ３１００」）、免疫抑制剤（「ＦＫ５０６」）、及びＡＦ併用剤（「ＡＦ Ｃｏｍｂｏ」）で治療し、ヘマトキシリンとエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）で染色した高齢マウスにおける瘢痕形成を示す一連の写真である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＤＳＳ投与後１０日目にＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療したものと比較して、生理食塩水で治療した、ＤＳＳ誘発ＩＢＳを有するマウスで観察された血便と軟便を示す一連の写真である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＤＳＳ投与後１０日目にＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療したものと比較して、生理食塩水で治療した、ＤＳＳ誘発ＩＢＳを有するマウスで観察された、より短い大腸（colon）及び拡大した盲腸を示す写真とグラフである（グラフ中、＊ｐ＜０．０５；ｎ＝４）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＤＳＳ投与後１０日目にＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療したものと比較して、生理食塩水（「対照」）で治療した、ＤＳＳ誘発ＩＢＳを有するマウスで観察された、固有層／粘膜における陰窩の消失、破壊、又は短縮、及び炎症細胞の見かけの浸潤を示す、大腸のヘマトキシリンとエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）で染色された組織切片を示す一組の写真である。
【図１０】図１０は、生理食塩水又はＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療した、ＤＳＳ誘発ＩＢＳを有するマウスの疾患活動度指数（ＤＡＩ）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、生理食塩水又はＡＦ併用剤（「ＡＦ」）で治療した、ＤＳＳ誘発ＩＢＳを有するマウスからの大腸粘膜における、ＣＤ１３３＋幹細胞とＫｉ６７＋増殖細胞の免疫蛍光二重染色を示す一組の写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＡＦ併用剤による治療後の０日目（左側パネル）と２８日目（右側パネル）に自発性大腸炎を発症していた代表的なマウス（「ＩＬ−１０−／−マウス」）の、粘膜炎症と直腸脱を示す一組の写真である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、生理食塩水（「対照」）又はＡＦ併用剤（「ＡＦ」）のいずれかで治療した自発性大腸炎を発症していたマウス（「ＩＬ−１０−／−」）の、大便を有する大腸の一部を示す一組の写真である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、野生型マウスの、又は生理食塩水（「生理食塩水対照」）又はＡＦ併用剤（”ＡＦ”）のいずれかで治療した自発性大腸炎を発症していたマウス（「ＩＬ−１０−／−」）の大腸の、ヘマトキシリンとエオシン（「Ｈ＆Ｅ」で）染色した組織切片を示す一組の写真である。下のパネルは、上側のパネルの挿入図を示す。
【図１３】図１３は、ラットにおける中等度の打撲性脊髄損傷の４週間後の行動評価を表すグラフである。損傷後１日目又は５日目に、ＡＦ併用剤による治療を開始した。左及び右の四肢の運動のＢＢＢスコアを、損傷後３０日間評価した。値は左右両肢の平均±ＳＥＭを表し、生理食塩水対照群に対する統計的有意性（ｐ＜０．０５）は星印で示される。
【図１４】図１４は、中等度の打撲性脊髄損傷を受け、ＡＦ併用剤（パネルＡ；「ＡＦ治療」）又は生理食塩水（パネルＢ；「生理食塩水対照」）で治療したラットの脊髄の、ヘマトキシリンとエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色を示す一組の写真、及び生理食塩水対照ラット（「生理食塩水」）又はＡＦ併用剤（「ＡＦ Ｃｏｍｂｏ」）で治療したラットの損傷部位の空洞の大きさ（ｍｍ２）を表すグラフ（パネルＣ）である。グラフ中で、これらの値は、Tukey事後検定を受けた群間の面積測定を表し、生理食塩水対照群に対する統計的有意性（ｐ＜０．０５）は星印で示される。
【図１５】図１５は、皮膚同種移植を受けたブタの外科的切除創における、０日目から１２週間目までの皮膚再生を示す一組の写真である。左下のパネルは、１２週目の新生皮膚の毛包の再生を示し、矢印は、示された領域（右側パネル）の組織染色（ヘマトキシリンとエオシン）を示す。
【図１６】図１６は、ＡＦ併用剤（「ＡＦ Ｃｏｍｂｏ」）又はＡＭＤ３１００とタクロリムス（Ａ＋Ｆ）の別々の注射で治療した損傷ラットにおける改善された創傷閉鎖速度を、完全な創傷閉鎖までの損傷後の日数で経時的な元の創傷面積パーセントの関数として、示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法及び構成要素等に限定されるものではなく、これらは変化し得ることを理解されたい。また本明細書で使用される用語は、特定の実施態様のみを説明するために使用され、本発明の範囲の限定を意図するものではないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形が含まれることに留意されたい。すなわち、例えば、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質への言及であり、当業者に公知の等価物などを含む。本明細書に記載されているものと類似の又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、具体的な方法、装置、及び材料が記載される。
【００１７】
全ての雑誌記事、書籍、マニュアル、公開特許出願、及び発行された特許を含む本明細書に引用された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語及び語句の意味が提供される。定義は本質的に限定することを意味するものではなく、本発明の特定の態様をより明確に理解するのに役立つものである。
【００１８】
「薬剤」又は「有効成分」は、薬学的効果を生じることができる医薬組成物として又はその中で使用される任意の物質を指しに、例えば、小さな合成化合物又は天然由来の有機化合物、核酸、ポリペプチド、抗体、断片、アイソフォーム、変異体、又はそのような目的のために独立して使用することができる他の物質を指す（全て、本発明に従う）。
【００１９】
「アンタゴニスト」は、例えば、タンパク質、細胞、又は生理学的システムの少なくとも１つの生物活性を抑制又は阻害する薬剤を指す。アンタゴニストは、タンパク質又は細胞受容体と別の分子、例えば、標的ペプチド又は酵素基質との相互作用を阻害又は低下させる化合物であり得る。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、又は拮抗される生物活性に関連して発現されるタンパク質の量を低下させる化合物であり得る。
【００２０】
「造血（Hematopoiesis）」は、血球の発生及び恒常性の高度に統合されたプロセスを指す。造血は、胎児期には卵黄嚢、次に肝臓、ならびに最終的には骨髄で起きる。正常な成人では、これは骨髄及びリンパ組織で起きる。全ての血球は多能性幹細胞から発生する。多能性細胞は、３つ、２つ、又は１つの造血分化経路に約束された幹細胞に分化する。
【００２１】
用語「免疫抑制性物質」は「免疫抑制剤」と互換的に使用され、免疫系の活性を阻害する、遅くする、又は逆転させる物質を指す。免疫抑制性物質は、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含む）に直接的に（例えば、免疫細胞に作用することにより）又は間接的に（他の免疫仲介細胞に作用することにより）応答する機能を抑制することにより作用する。
【００２２】
用語「幹細胞」及び「造血幹細胞」は、本明細書では互換的に使用される。幹細胞は、２つの重要な特徴により他の細胞型と区別することができる。第１に幹細胞は、時に長時間休止した後、細胞分裂を通じて自己再生することができる非特殊化細胞である。第２に幹細胞は、特定の生理学的条件又は実験条件下で、特別な機能を有する組織特異的又は器官特異的細胞になるように誘導することができる。腸や骨髄のようないくつかの臓器では、幹細胞は、機能しなくなった組織や損傷した組織を修復し取り替えるために定期的に分裂する。しかしながら、膵臓や心臓などの他の臓器では、幹細胞は特殊な条件下でのみ分裂して分化する。本明細書で使用される用語「幹細胞」は、赤血球、白血球、及び血小板を含む全ての血液細胞に分化することができる多能性又は多分化能性幹細胞を指すことができる。例えば、本発明で用いられる「造血幹細胞」又は「幹細胞」は、骨髄中のみならず、臍帯血由来の細胞にも含まれる。
【００２３】
「内因性幹細胞」という用語は、治療されている同じ個体に由来する幹細胞を意味する。本明細書で使用される「内因性幹細胞」は、対象から取り出し再移植され得るか、又は治療過程を通して対象内に残存することができる。「自己由来幹細胞」という用語は、治療されている対象に固有の幹細胞を意味し、一般に幹細胞が治療過程中に対象内に留まることを示す。本明細書に記載の方法に従って幹細胞動員物質を対象に投与する場合、内因性／自己由来幹細胞が動員されることが理解される。
【００２４】
幹細胞に関して使用される「幹細胞動員物質」、「造血幹細胞又は前駆細胞の動員物質」、又は「動員する」は、任意の化合物、例えば、小型有機分子、合成又は天然由来の化合物、ポリペプチド又はタンパク質、例えば、増殖因子若しくはコロニー刺激因子又はその活性断片若しくは模倣物、核酸、炭水化物、抗体、又は骨髄から末梢血への幹細胞の移動を増強するように作用する任意の他の物質を指す。幹細胞動員物質は、末梢血中の造血幹細胞又は造血前駆細胞／前駆細胞の数を増加させることができ、従って本方法に従って対象、の治療に使用するための幹細胞のよりアクセス可能な供給源を可能にし、ここで対象には、例えば、臓器移植レシピエント（recipient）、火傷被害者、ＩＢＤのような自己免疫性又は炎症性疾患を有する者、神経損傷及び／又は神経変性（脊髄損傷を含む）を有する者、又は糖尿病に関連する創傷を含む創傷治癒を促進する必要がある者が含まれる。いくつかの実施態様において幹細胞動員物質は、ＣＤ３４＋及び／又はＣＤ１３３＋幹細胞を動員する任意の物質を指す。別の実施態様において幹細胞動員物質は、ＣＸＣＲ４発現細胞のＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）仲介性化学誘引を破壊する。
【００２５】
用語「患者」、「対象」、又は「宿主」は本明細書では互換的に使用され、本方法により治療される任意の個々のヒト又は動物、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、又はげっ歯類を指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的又は生理学的効果を得ることをいう。薬理学的及び／又は生理学的効果は、例えば、疾患又は障害又はその症状に関連する特定の結果を完全に又は部分的に遅延又は防止することにより、予防的であり得るか、又は、例えば、疾患又は障害／又は症状又はその有害な作用を改善するか又はその部分的又は完全な治癒となることにより治療的であってもよい。
【００２７】
本発明は、少なくとも１種の幹細胞動員物質と、少なくとも１種の免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドを含む、医薬組成物を提供する。適切な幹細胞動員物質は当技術分野において公知であり、小有機分子、ポリペプチド、核酸、及び炭水化物を含む。
【００２８】
適切なポリペプチド幹細胞動員物質は、サイトカイン、コロニー刺激因子、プロテアーゼ、又はケモカインを含むことができる。いくつかの実施態様において、サイトカイン幹細胞動員物質は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−７  ＩＬ−７）、及びインターロイキン１２（ＩＬ１２）を含む。
【００２９】
適切なコロニー刺激因子幹細胞動員物質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、ＦＬＴ−３リガンド、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３０】
適切なプロテアーゼ幹細胞動員物質は、メタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ２又はＭＭＰ９）、セリンプロテアーゼ（例えば、カテプシンＧ又はエラスターゼ）、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシンＫ）、及びジペプチジルペプチダーゼ−１（ＤＤＰ−１又はＣＤ２６）を含み得る。
【００３１】
適切なケモカイン幹細胞動員物質は、ＣＸＣＬ１２、ＩＬ−８、Ｍｉｐ−ｉａ、及びＧｒｏ３を含み得る。
【００３２】
適切な核酸幹細胞動員物質は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子又はアンチセンス分子を含み得る。
【００３３】
適切な炭水化物幹細胞動員物質は、硫酸化糖質、例えばフコイダン又は硫酸化デキストランを含み得る。フコイダンは、１：１．２３：０．３６のモル比のＬ−フコース、硫酸塩、及び酢酸塩からなる炭水化物であり、太平洋褐色海藻ヒバマタ（Fucus evanescens）から単離することができる。Bilan et al., 337(8) Carbohydrate Research 719-30 (2002)を参照されたい。硫酸化デキストランは、様々な硫酸化パターンを有する一連の多糖を指し、Pomin et al., 15(12) Glycobiology 1376-1385 (2005); Melo et al., 279(2) J. Biol. Chem. 20824-20835 (2004); 及び Farias et al., 275(38) J. Biol. Chem. 29299-29307 (2000) を参照されたい（これらの全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３４】
他の適切な幹細胞動員物質には、ＡＭＤ３１００；間質細胞由来因子（ＳＤＦ−１）；ＳＤＦ−１類似体（例えば、Chemokine Therapeutics Corp.から入手可能なＣＴＣＥ−０２１４）；抗ＳＤＦ−１抗体；シクロホスファミド；幹細胞因子（ＳＣＦ）；フィルグラスチム；アンセスチム；骨髄性前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４１０９号に開示されており、その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる；及び最晩期抗原（ＶＬＡ−４）アンタゴニスト、例えば、ナタリズマブ（Natalizumab）などのα−４インテグリンアンタゴニスト、又は抗ホスホインテグリンｃｔ４（Ｓｅｒ９８８）、クローン６．３３（Upstate Cell Signaling Solutions）、又はペプチド（例えば、フェニルアセチル−ｌｅｕ−ａｓｐ−ｐｈｅ−Ｄ−プロリンアミド、例えば、Cytel Corp., San Diego, CAから入手可能）が挙げられる。
【００３５】
特定の実施態様において、幹細胞動員物質はＣＸＣＲ４アンタゴニストを含む。いくつかの実施態様において、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＴＧ−００５４（ブリキサフォア（Burixafor）；ホスホン酸、ｐ−（２−（４−アミノ−６−アミノ−２−（（トランス−４−（（（３−（シクロヘキシルアミノ）プロピル）アミノ）メチル）−シクロヘキシル）メチル）アミノ）−４−ピリミジニル）−１−ピペラジニル）エチル）−）（TaiGen Biotechnology Co., Ltd. (Taipei, Taiwan)）である。別の実施態様において、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＭＤ３４６５（Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１−［４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデク−１−イルメチル）フェニル］メタンアミン）である。さらに別の実施態様において、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００である。ＡＭＤ３１００はまた、（１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］ビス−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンとしても知られており、例えば、米国特許第６，８３５，７３１号及び第６，８２５，３５１号（これらの開示の全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のプロトタイプの非ペプチドアンタゴニストである対称ビシクラム（bicyclam）である。「ＡＭＤ３１００」という用語は、本明細書ではプレリキサフォア（Plerixafor）、ｒＩＮＮ、ＪＭ３１００、及び商品名Mozobil（登録商標）と互換的に使用される。本発明はまた、本医薬組成物におけるＡＭＤ３１００の模倣物の使用を企図する。例えば、ＣＸＣＲ４受容体の主要リガンド結合ポケットを裏打ちしているＴＭ−ＩＩＩ、−ＩＶ、−Ｖ、−ＶＩ、及び−ＶＩＩに位置する１６位での突然変異置換は、本発明の医薬組成物の。ＣＸＣＲ４受容体は、ＡＭＤ３１００の主要な相互作用点として3つのアミノ酸残基を同定した；すなわちＡｓｐ171（ＡｓｐＩＶ：２０）、Ａｓｐ262（ＡｓｐＶＩ：２３）、及びＧｌｕ288（ＧｌｕＶＩＩ：０６）。分子モデル化は、ＡＭＤ３１００の１つのシクラム（cyclam）環がＴＭ−ＩＶ中のＡｓｐ171と相互作用し、他方の環が、ＴＭ−ＶＩ及び−ＶＩＩ由来のそれぞれＡｓｐ262とＧｌｕ288のカルボン酸基の間に挟まれていることを示唆する。ある研究では、位置ＶＩＩ：０６へのＧｌｕのみの導入と位置ＶＩＩ：０２への中和性Ｌｙｓ残基の除去により、ＣＸＣＲ４中のその親和性の１０倍以内へのＡＭＤ３１００の親和性の１０００倍の増加をもたらすことが見出された。例えば、ＣＸＣＲ４受容体を効率的かつ選択的にブロックするように設計された、改善された経口バイオアベイラビリティーを有するペプチド又は非ペプチドアンタゴニストなどの、他の任意の適切なＡＭＤ３１００模倣物を使用することができる。
【００３６】
別の実施態様において幹細胞動員物質は、ＢＫＴ１４０（Biokin Therapeutics, Ltd. (Rehovot, Israel)）である。４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３としても知られているＢＫＴ１４０は、ＡＭＤ３１００で得られる値と比較して高親和性（約１ｎｍｏｌ／＋のＩＣ50）でＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に結合し、これを阻害する。さらにＢＫＴ１４０は、ＣＸＣＬ１２により刺激される細胞遊走を、プレリキサフォア（Plerixafor）に対する５１±１７ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値と比較して０．５〜２．５ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ50値内で妨害し、高い動員能力を示唆する。例えば、Peled et al., 20 Clin Cancer Res. 469-79 (2013) を参照されたい（その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
上記のように、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の免疫抑制剤を少なくとも１種の幹細胞動員物質とともに含むことができる。
【００３８】
任意の適切な免疫抑制剤、例えば、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン（ＣｓＡ）及びその類縁体、ＩＳＡ（ＴＸ）２４７、及びタクロリムス）；アザチオプリン（ＡＺ）；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）；ミゾリビン（ＭＺ）；レフルノミド（ＬＥＦ）；プレドニゾロン及びメチルプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド（副腎皮質ホルモン、コルチコステロイド、又はコルチコイドとしても知られている）；シロリムス（ラパマイシンとしても知られている）；エベロリムス；ＦＫ７７８；ＴＡＦＡ−９３；デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）；２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］−１，３−プロパンジオール塩酸塩（ＦＴＹ７２０）をを、本医薬組成物に使用することができる。
【００３９】
他の適切な免疫抑制剤には、シクロホスファミド；１５−デオキシスペルグアリン（グスペリムス（Gusperimus））；インターフェロン；スルファサラジン；ミモリビン；ミソプロストール；抗ＩＬ−２受容体抗体；サリドマイド；抗腫瘍壊死因子抗体；抗ＣＤ２抗体；抗ＣＤ１４７抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ８抗体、及び抗胸腺細胞グロブリン抗体；ORTHOCLONE（登録商標）（ＯＫＴ３としても知られている、Ortho Biotech, Raritan, NJから）；SANDIMMUNE（登録商標）ORAL（シクロスポリン）、Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJから入手可能；タクロリムスとしても知られているPROGRAF（登録商標）、例えば、Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, ILから入手可能）；ミコフェノール酸としても知られているCELLCEPT（登録商標）、Roche Pharmaceuticals, Nutley、NJから入手できる；及び、シロリムスとしても知られているRAPAMUNE（登録商標）（Pfizer, Inc., Collegeville, Pa. から入手可能）が挙げられる。いくつかの実施態様において免疫抑制剤は、ラパマイシン、タクロリムス、ミコフェノール酸、アザチオプリン、又はシクロホスファミドである。さらに別の適切な免疫抑制剤には、インターロイキン−２アルファ鎖遮断薬（例えば、バシリキシマブ及びダクリズマブ）；イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤（例えば、ミコフェノール酸モフェチル）；又はジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤（例えば、メトトレキセート）がある。
【００４０】
特定の実施態様において、免疫抑制剤はタクロリムスである。タクロリムス（ＦＫ−５０６又はフジマイシン（Fujimycin）としても知られている）は、同種異系臓器移植後に患者の免疫系の活性を低下させ、臓器拒絶反応のリスクを低下させるために、主に使用される免疫抑制剤である。これは、Ｔ細胞によるインターロイキン２（ＩＬ−２）産生を低下させる。タクロリムスはまた、重度のアトピー性皮膚炎（湿疹）、骨髄移植後の重度の難治性ブドウ膜炎、及び皮膚症状の白斑の治療のための局所調製物においても使用される。タクロリムスは、ストレプトミセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）細菌を含む日本の土壌試料の発酵ブロスから１９８４年に発見された２３員のマクロライドラクトンである。この薬剤は、１日２回（静脈内）投与用の商品名Prograf（登録商標）；１日１回投与（経口）を可能にする徐放性製剤である商品名Advagraf（登録商標）；及び局所製剤である商品名Protopic（登録商標）で販売されている。
【００４１】
本発明の医薬組成物はまた、少なくとも１種のＦＫ結合タンパク質リガンドを少なくとも１種の幹細胞動員物質とともに含むことができる。例には、ＦＫ−５０６（タクロリムス）及びその誘導体／類似体（５０６ＢＤとＬ０６８５，８１８を含む）；ラパマイシン及びその誘導体／類似体（Ｗａｙ−１２４４６６、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、及びＡＰ２３５７３を含む）；アスコマイシン及びその誘導体／類似体（ピメクロリムスを含む）が含まれる。例えば、Liu et al., 23(11) EXPERT OPIN. THER. PATENTS 1435-49 (2013)を参照されたい（その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、免疫抑制剤タクロリムス／ＦＫ−５０６はＦＫ結合タンパク質リガンドであるが、特定の実施態様においてＦＫ結合タンパク質リガンドは、非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドを含むことができる。非免疫抑制性リガンドの例には、メリダマイシン、アンタスコマイシン、及びＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ）が含まれる。
【００４２】
従って本発明は、有効量の少なくとも１種の幹細胞動員物質と少なくとも１種の免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドを含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明はさらに、幹細胞動員物質及び免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合タンパク質リガンドの両方の特徴を有する単一の活性物質を含む医薬組成物をさらに企図する。例えば、タクロリムスは、幹細胞動員物質及び免疫抑制剤の両方として使用することができる。
【００４３】
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」は交換可能に使用され、対象の所望の治療を提供する本発明の医薬組成物の量をいう。当業者により理解されるように、所定の疾患、障害、又は症状を治療するための本医薬組成物の治療有効量は、対象ごとに異なり、対象の年齢、全身状態、治療される症状の重篤度、投与される特定の化合物及び／又は組成物などの因子に依存するであろう。任意の個々の対象に適した本医薬組成物の適切な治療有効量は、本明細書で提供される情報から当業者が容易に決定することができる。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、対象、例えば、ヒトへの投与に適した生物学的に適合性のある形態である。本医薬組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。「医薬的に許容し得る」という用語は、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの政府規制機関により承認されたか、又は米国薬局方又はその他の一般に認められている薬局方に記載されているか、又は一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）ように、ヒト又は動物での使用に適していることを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される用語「賦形剤」は、それを用いて幹細胞動員物質及び／又は免疫抑制剤が投与される担体又はビヒクル（任意の適切な希釈剤、補助剤などを含む）を指す。適切な医薬的に許容し得る賦形剤は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む水及び油のような滅菌液体であってもよい。水は、医薬組成物が経口投与される場合、医薬的に許容される賦形剤であり得る。医薬組成物が、例えば、皮下、筋肉内、又は血管内（例えば、静脈内）に注射される場合、滅菌水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、乳酸加リンゲル液などは、医薬的に許容し得る賦形剤であり得る。
【００４６】
他の適切な医薬的に許容し得る賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スリムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。医薬組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などのような、ヒト対象などの対象への投与に適した任意の形態をとることができる。本発明の医薬組成物は、例えば、トリグリセリドなどの伝統的な医薬賦形剤を用いて坐剤として製剤化することもできる。本発明の経口医薬製剤は、医薬賦形剤として標準的な担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。具体的な実施態様において、本発明の医薬組成物は、有効量の幹細胞動員物質及び／又は免疫抑制剤を、適当な量の医薬的に許容し得る賦形剤と一緒に含んで、例えば、皮下、筋肉内、又は血管内（例えば、静脈内）投与による、患者への正しい投与の形態を提供することができる。本医薬製剤に使用するのに適した固体及び液体の医薬的に許容し得る賦形剤の特性についての議論は、例えば、Rowe et al., eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th Edition, London: Pharmaceutical Press, 2012（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている賦形剤を参照されたい。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な投与経路、例えば、経口、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、体腔内、骨内、骨盤内、心内膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、頬内、舌下、鼻腔内、イオン導入手段又は経皮手段により投与することができる。特定の実施態様において、本医薬組成物の投与経路は、経口投与、又は注射、例えば、皮下、筋肉内、又は血管内（例えば、静脈内又は動脈内）注射である。特定の実施態様において、本医薬組成物の投与経路は、皮下注射による。
【００４９】
いくつかの実施態様において、幹細胞動員物質と免疫抑制剤とを含む本発明の医薬組成物は単独で使用することができ、例えば、幹細胞動員物質と免疫抑制剤を含むが、他の有効成分を含まないか、又は潜在的な毒性を最小限に抑えながら最適な有効性を得るために、例えば、日常的な試験により定義されるような、所望の治療を達成するために当該技術分野において知られている適切な用量の少なくとも１種の他の有効成分を一緒に含む製剤として使用することができる。
【００５０】
本発明の医薬組成物を使用する適切な治療有効量及び投与処方は、患者の種、年齢、体重、性別、及び全般的な医学的状態；治療される症状及びその重篤度又は侵食度；投与経路；患者の腎機能及び肝機能；及び使用される具体的な医薬組成物を含む様々な要因に従って、通常の熟練した臨床医が選択することができる。
【００５１】
特定の実施態様において、本発明の免疫抑制剤を含む医薬組成物は、低用量で投与することができる。本発明の文脈における免疫抑制剤の「低用量」又は「低投与量」という語句（幹細胞動員物質と組み合わせて）は、免疫抑制に典型的に使用されるよりも低い免疫抑制剤の特定の量の使用を指し、例えば、ヒトで免疫抑制に典型的に使用される量よりも低い。ある実施態様において、低投与量は、拒絶を防止すると推定されるヒト臓器移植レシピエントの免疫抑制のための典型的な使用量よりも低い特定量の使用を指す。
【００５２】
特定の実施態様において、免疫抑制剤、例えば、タクロリムスの低用量は、ヒトの免疫抑制に使用される通常の用量の約１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１３、１／１４未満、又は約１／１５未満である。特定の実施態様において、免疫抑制剤、例えば、タクロリムスの低用量は、ヒトにおける免疫抑制に使用される量の約１／１０未満である。
【００５３】
別の実施態様において、免疫抑制剤、例えば、タクロリムスの低用量は、ヒトにおける免疫抑制に使用される量の約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、又はそれ未満、又は約１／９又はそれ未満である。さらなる実施態様において、免疫抑制剤、例えば、タクロリムスの低用量は、免疫抑制を生じるヒトの特定の状況に使用される典型的な量の、約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．０８、又は０．０７倍、又はそれ未満である。
【００５４】
特定の実施態様において、ヒトにおける免疫抑制剤（例えば、タクロリムス）の低用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ〜約０．３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇなどである。ある実施態様において、ヒトにおけるタクロリムスの低用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０７４ｍｇ／ｋｇである。
【００５５】
ヒトにおける免疫抑制のためのタクロリムスの通常用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜０．３ｍｇ／ｋｇ／日（経口）、及び約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日（ＩＶ）である。特定の実施態様においてヒトにおけるタクロリムスの低用量は、通常用量の約１／１０であり；例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／日（経口）及び約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜０．００５ｍｇ／ｋｇ／日（ＩＶ）である。
【００５６】
別の実施態様においてヒトにおけるタクロリムスの低用量は、経口投与では約０．１ｍｇ／ｋｇ／日未満の任意の量を含む。低用量は、約０．０９５、０．０９、０．０８５、０．０８、０．０７５、０．０７、０．０６５、０．０６、０．０５５、０．０５、０．０４５、０．０４、０．０３５、０．０３、０．０２９、０．０２８、０．０２７、０．０２６、０．０２５、０．０２４、０．０２３、０．０２２、０．０２１、０．０２０、０．０１９、０．０１８、０．０１７、０．０１６、０．０５、０．０１４、０．０１３、０．０１２、０．０１１、０．０１０、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、又は０．００１ｍｇ／ｋｇ／日未満の任意の量を含み得る。
【００５７】
静脈内投与の場合、ヒトにおけるタクロリムスの低用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日未満の任意の量を含む。低用量は、約０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、又は０．００１ｍｇ／ｋｇ／日未満の任意の量を含み得る。
【００５８】
さらなる実施態様においてヒトにおけるタクロリムスの低用量は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌの血中濃度範囲をもたらす。濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．０９ｎｇ／ｍｌ、０．０８ｎｇ／ｍｌ、０．０７ｎｇ／ｍｌ、０．０６ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ、０．０４ｎｇ／ｍｌ、０．０３ｎｇ／ｍｌ、０．０２ｎｇ／ｍｌ、又は０．０１ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。別の実施態様において、ヒトへの投与後の血中タクロリムス濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ未満である。濃度は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、又は０．０５ｎｇ／ｍｌから約１、２、３、４、又は５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約０．１〜４ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。
【００５９】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物中の幹細胞動員物質はＡＭＤ３１００である。このような実施態様において医薬組成物は、ＡＭＤ３１００の典型的なヒト用量、例えば、約０．１２〜０．２４ｍｇ／ｋｇを含むことができる。いくつかの実施態様において、６０ｋｇの体重を有する患者の場合、ＡＤＭ３１００の用量は、皮下注射により約０．２４ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、単一の部位で対象に実質的に同時に投与するように製剤化することができる。本明細書で使用される「実質的に同時の投与」は、本発明の医薬組成物を構成する幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合リガンドが、対象に同時に又はほぼ同時に送達されることを意味する。例えば、幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合リガンドは、単一の製剤として対象の単一の部位に送達され得るか、又は別個の製剤として、例えば、対象の同じ単一の部位への連続投与による送達により、例えば、連続皮下注射又は筋肉内注射により送達することができ、ここで、別個の製剤は実質的に同時に対象の体内の実質的に同じ空間を占める。幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合リガンドが、単一の製剤で送達されるか、又は別々の製剤で連続して送達されるとき、本発明の医薬組成物が最終的に吸収され、全身に、例えば、経口的又は経直腸的に分散される投与経路は、「実質的に同時の投与」と考えられる。
【００６１】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合リガンドは、実質的に同時投与により対象に投与される場合、幹細胞動員物質と免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫ結合リガンド投与が別々の時間に（対象の同じ部位にあるか否かにかかわらず）、又は実質的に同時であるが対象の異なる部位に投与する場合と比較して、幹細胞の動員を相乗的に刺激する方法で、対象の体内に吸収される。この未知で驚くべき相乗効果は、例えば、下記の図５及び実施例１に示されており、これは、ＡＭＤ３１００及びタクロリムスＡＦの単一の製剤が、単独で投与されたＡＭＤ３１００、単独で投与されたタクロリムス、又は別々に投与されたＡＭＤ３１００とタクロリムスより、幹細胞を動員するのに、統計的に有意により有効であったことを示す。この相乗効果は、例えば、以下の実施例９及び図１６にさらに示されており、これは、ＡＭＤ３１００とタクロリムスとの組み合わせを含む医薬組成物で治療された対象が、ＡＭＤ３１００及びタクロリムスを別々に（「Ａ＋Ｆ」）投与された対象と比較して予想外に、速い創傷治癒時間を達成することを示す。ＡＭＤ３１００とタクロリムスとの相乗的な組み合わせは、より早い治癒時間をもたらすことに加えて、例えば、タクロリムスの投与量が有意に少ない（Ａ＋Ｆ治療では、２倍のタクロリムスが使用された）という点でＡ＋Ｆ治療よりも有利であり、これは、例えば、免疫抑制の望ましくない副作用をさらに回避し、ＡＭＤ３１００とタクロリムス併用療法を受けた被験者には、より少ない総注射回数を与えた。
【００６２】
本発明の医薬組成物が、幹細胞動員物質ＡＭＤ３１００及び低用量免疫抑制剤タクロリムス（ＦＫ−５０６）を組み合わせの形態で含む場合、この組み合わせは、本明細書では「ＡＦ」又は「ＡＦ併用剤」と呼ばれることがある。
【００６３】
上記のように、ＡＭＤ３１００（プレリキサフォア又はモゾビル）はＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、元々抗ＨＩＶ薬として開発されたが、骨髄微小環境（niche）からＣＤ３４及び他の幹細胞を強力に動員する可能性のあることが分かった。ＡＭＤ３１００は、ＦＤＡにより２００８年に、多発性骨髄腫癌患者での使用について、骨髄破壊的化学療法の前の幹細胞のバンキング（banking）のために、最初に承認された。現在ＡＭＤ３１００は、しばしばニューポジェン（neupogen）（Ｇ−ＣＳＦ）とともに、骨髄破壊的化学療法前のバンキングのために、多発性骨髄腫癌患者の造血幹細胞を動員するために使用されている。これらの動員された幹細胞は、次に癌治療後に患者に移植して戻される。こうして薬物ＡＭＤ３１００は、安全で効果的であることが十分に確立されている。
【００６４】
上記したように、ＦＫ５０６（タクロリムス又はプログラフ）は、１９８７年に土壌細菌ストレプトミセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）の一種から発見された。ＦＫ５０６は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２（ＦＫ５０６結合タンパク質）に結合して新しい複合体を生成することにより、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を低下させる。このＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６複合体はカルシニューリンと相互作用しこれを阻害して、Ｔリンパ球シグナル伝達とＩＬ−２転写の両方を阻害する。ＦＫ５０６は、１９９４年にＦＤＡにより肝臓移植への使用について初めて承認され、その使用は腎臓、心臓、小腸、膵臓、肺、気管、皮膚、角膜、骨髄、及び四肢の移植を含むように拡大されている。
【００６５】
従って「ＡＦ併用剤」とも呼ばれる本明細書に記載の「ＡＦ」医薬組成物は、損傷部位における幹細胞の動員、補充（recruitment）、及び保持において、ＡＭＤ３１００及び低用量タクロリムスの強力な相乗的活性を提供する。上述したように及び図５と図１６及び実施例２と９に示すように、驚くべきことに、幹細胞動員物質（ＡＭＤ３１００など）及び免疫抑制剤（タクロリムスなど）又はＦＫタンパク質結合リガンドの別個の投与、又は幹細胞動員物質と免疫抑制剤又はＦＫタンパク質結合リガンドの異なる部位での同時投与と比較して、ＡＦ併用剤は、組織損傷を治療する上で相乗効果を示す。
【００６６】
特定の実施態様において、ＡＦ併用剤におけるタクロリムスとＡＭＤ３１００との比率は、約１／１０から１／１００である。別の実施態様において、ＡＦ併用剤は２つの有効成分のみを含み、ここで、第１の有効成分がＡＭＤ３１００で第２の有効成分がタクロリムスであり、組成物は１０〜４０ｍｇのＡＭＤ３１００と０．１〜４ｍｇのタクロリムスを含む。これら及び他のＡＦ併用剤において、タクロリムスはＡＭＤ３１００の効力を向上させる。従ってＡＦ併用剤を含む本医薬組成物は、（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と（ｂ）幹細胞動員物質例えば、ＣＸＣＲアンタゴニスト）の比で説明することができる。特定の実施態様において、この比率は、約１／１、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１３、１／１４、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、１／２１、１／２２、１／２３、１／２４、１／２５、１／２６、１／２７、１／２８、１／２９、１／３０、１／３１、１／３２、１／３３、１／３４、１／３５、１／３６、１／３７、１／３８、１／３９、１／４０、１／４１、１／４２、１／４３、１／４４、１／４５、１／４６、１／４７、１／４８、１／４９、１／５０、１／５１、１／５２、１／５３、１／５４、１／５５、１／５６、１／５７、１／５８、１／５９、１／６０、１／６１、１／６２、１／６３、１／６４、１／６５、１／６６、１／６７、１／６８、１／６９、１／７０、１／７１、１／７２、１／７３、１／７４、１／７５、１／７６、１／７７、１／７８、１／７９、１／８０、１／８１、１／８２、１／８３、１／８４、１／８５、１／８６、１／８７、１／８８、１／８９、１／９０、１／９１、１／９２、１／９３、１／９４、１／９５、１／９６、１／９７、１／９８、１／９９、１／１００、又はそれ以上である。
【００６７】
いくつかの実施態様において本発明の医薬組成物は、（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と（ｂ）幹細胞動員物質を、約１／１０〜１／１００、１／１０〜１／９９、１／１０〜１／９８、１／１０〜１／９７、１／１０〜１／９６、１／１０〜１／９５、１／１０〜１／９４、１／１０〜１／９３、１／１０〜１／９２、１／１０〜１／９１、１／１０〜１／９０、１／１０〜１／８９、１／１０〜１／８８、１／１０〜１／８７、１／１０〜１／８６、１／１０〜１／８５、１／１０〜１／８４、１／１０〜１／８３、１／１０〜１／８２、１／１０〜１／８１、１／１０〜１／８０、１／１０〜１／７９、１／１０〜１／７８、１／１０〜１／７７、１／１０〜１／７６、１／１０〜１／７５、１／１０〜１／７４、１／１０〜１／７３、１／１０〜１／７２、１／１０〜１／７１、１／１０〜１／７０、１／１０〜１／６９、１／１０〜１／６８、１／１０〜１／６７、１／１０〜１／６６、１／１０〜１／６５、１／１０〜１／６４、１／１０〜１／６３、１／１０〜１／６２、１／１０〜１／６１、１／１０〜１／６０、１／１０〜１／５９、１／１０〜１／５８、１／１０〜１／５７、１／１０〜１／５６、１／１０〜１／５５、１／１０〜１／５４、１／１０〜１／５３、１／１０〜１／５２、１／１０〜１／５１、１／１０〜１／５０、１／１０〜１／４９、１／１０〜１／４８、１／１０〜１／４７、１／１０〜１／４６、１／１０〜１／４５、１／１０〜１／４４、１／１０〜１／４３、１／１０〜１／４２、１／１０〜１／４１、１／１０〜１／４０、１／１０〜１／３９、１／１０〜１／３８、１／１０〜１／３７、１／１０〜１／３６、１／１０〜１／３５、１／１０〜１／３４、１／１０〜１／３３、１／１０〜１／３２、１／１０〜１／３１、１／１０〜１／３０、１／１０〜１／２９、１／１０〜１／２８、１／１０〜１／２７、１／１０〜１／２６、１／１０〜１／２５、１／１０〜１／２４、１／１０〜１／２３、１／１０〜１／２２、１／１０〜１／２１、１／１０〜１／２０、１／１０〜１／１９、１／１０〜１／１８、１／１０〜１／１７、１／１０〜１／１６、１／１０〜１／１５、１／１０〜１／１４、１／１０〜１／１３、１／１０〜１／１２、又は１／１０〜１／１１の比率範囲で含むことができる。
【００６８】
別の実施態様において本医薬組成物は、（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と（ｂ）幹細胞動員物質を、約１／１５〜１／１００、１／１５〜１／９９、１／１５〜１／９８、１／１５〜１／９７、１／１５〜１／９６、１／１５〜１／９５、１／１５〜１／９４、１／１５〜１／９３、１／１５〜１／９２、１／１５〜１／９１、１／１５〜１／９０、１／１５〜１／８９、１／１５〜１／８８、１／１５〜１／８７、１／１５〜１／８６、１／１５〜１／８５、１／１５〜１／８４、１／１５〜１／８３、１／１５〜１／８２、１／１５〜１／８１、１／１５〜１／８０、１／１５〜１／７９、１／１５〜１／７８、１／１５〜１／７７、１／１５〜１／７６、１／１５〜１／７５、１／１５〜１／７４、１／１５〜１／７３、１／１５〜１／７２、１／１５〜１／７１、１／１５〜１／７０、１／１５〜１／６９、１／１５〜１／６８、１／１５〜１／６７、１／１５〜１／６６、１／１５〜１／６５、１／１５〜１／６４、１／１５〜１／６３、１／１５〜１／６２、１／１５〜１／６１、１／１５〜１／６０、１／１５〜１／５９、１／１５〜１／５８、１／１５〜１／５７、１／１５〜１／５６、１／１５〜１／５５、１／１５〜１／５４、１／１５〜１／５３、１／１５〜１／５２、１／１５〜１／５１、１／１５〜１／５０、１／１５〜１／４９、１／１５〜１／４８、１／１５〜１／４７、１／１５〜１／４６、１／１５〜１／４５、１／１５〜１／４４、１／１５〜１／４３、１／１５〜１／４２、１／１５〜１／４１、１／１５〜１／４０、１／１５〜１／３９、１／１５〜１／３８、１／１５〜１／３７、１／１５〜１／３６、１／１５〜１／３５、１／１５〜１／３４、１／１５〜１／３３、１／１５〜１／３２、１／１５〜１／３１、１／１５〜１／３０、１／１５〜１／２９、１／１５〜１／２８、１／１５〜１／２７、１／１５〜１／２６、１／１５〜１／２５、１／１５〜１／２４、１／１５〜１／２３、１／１５〜１／２２、１／１５〜１／２１、１／１５〜１／２０、１／１５〜１／１９、１／１５〜１／１８、１／１５〜１／１７、又は１／１５〜１／１６の比率範囲で含むことができる。
【００６９】
いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物内の（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と（ｂ）幹細胞動員物質の比率範囲は、約１／２０〜１／１００、１／２０〜１／９９、１／２０〜１／９８、１／２０〜１／９７、１／２０〜１／９６、１／２０〜１／９５、１／２０〜１／９４、１／２０〜１／９３、１／２０〜１／９２、１／２０〜１／９１、１／２０〜１／９０、１／２０〜１／８９、１／２０〜１／８８、１／２０〜１／８７、１／２０〜１／８６、１／２０〜１／８５、１／２０〜１／８４、１／２０〜１／８３、１／２０〜１／８２、１／２０〜１／８１、１／２０〜１／８０、１／２０〜１／７９、１／２０〜１／７８、１／２０〜１／７７、１／２０〜１／７６、１／２０〜１／７５、１／２０〜１／７４、１／２０〜１／７３、１／２０〜１／７２、１／２０〜１／７１、１／２０〜１／７０、１／２０〜１／６９、１／２０〜１／６８、１／２０〜１／６７、１／２０〜１／６６、１／２０〜１／６５、１／２０〜１／６４、１／２０〜１／６３、１／２０〜１／６２、１／２０〜１／６１、１／２０〜１／６０、１／２０〜１／５９、１／２０〜１／５８、１／２０〜１／５７、１／２０〜１／５６、１／２０〜１／５５、１／２０〜１／５４、１／２０〜１／５３、１／２０〜１／５２、１／２０〜１／５１、１／２０〜１／５０、１／２０〜１／４９、１／２０〜１／４８、１／２０〜１／４７、１／２０〜１／４６、１／２０〜１／４５、１／２０〜１／４４、１／２０〜１／４３、１／２０〜１／４２、１／２０〜１／４１、１／２０〜１／４０、１／２０〜１／３９、１／２０〜１／３８、１／２０〜１／３７、１／２０〜１／３６、１／２０〜１／３５、１／２０〜１／３４、１／２０〜１／３３、１／２０〜１／３２、１／２０〜１／３１、１／２０〜１／３０、１／２０〜１／２９、１／２０〜１／２８、１／２０〜１／２７、１／２０〜１／２６、１／２０〜１／２５、１／２０〜１／２４、１／２０〜１／２３、１／２０〜１／２２、又は１／２０〜１／２１を含むことができる。
【００７０】
別の実施態様において、本発明の医薬組成物内の（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と（ｂ）幹細胞動員物質の比率範囲は、約１／３０〜１／１００、１／３０〜１／９９、１／３０〜１／９８、１／３０〜１／９７、１／３０〜１／９６、１／３０〜１／９５、１／３０〜１／９４、１／３０〜１／９３、１／３０〜１／９２、１／３０〜１／９１、１／３０〜１／９０、１／３０〜１／８９、１／３０〜１／８８、１／３０〜１／８７、１／３０〜１／８６、１／３０〜１／８５、１／３０〜１／８４、１／３０〜１／８３、１／３０〜１／８２、１／３０〜１／８１、１／３０〜１／８０、１／３０〜１／７９、１／３０〜１／７８、１／３０〜１／７７、１／３０〜１／７６、１／３０〜１／７５、１／３０〜１／７４、１／３０〜１／７３、１／３０〜１／７２、１／３０〜１／７１、１／３０〜１／７０、１／３０〜１／６９、１／３０〜１／６８、１／３０〜１／６７、１／３０〜１／６６、１／３０〜１／６５、１／３０〜１／６４、１／３０〜１／６３、１／３０〜１／６２、１／３０〜１／６１、１／３０〜１／６０、１／３０〜１／５９、１／３０〜１／５８、１／３０〜１／５７、１／３０〜１／５６、１／３０〜１／５５、１／３０〜１／５４、１／３０〜１／５３、１／３０〜１／５２、１／３０〜１／５１、１／３０〜１／５０、１／３０〜１／４９、１／３０〜１／４８、１／３０〜１／４７、１／３０〜１／４６、１／３０〜１／４５、１／３０〜１／４４、１／３０〜１／４３、１／３０〜１／４２、１／３０〜１／４１、１／３０〜１／４０、１／３０〜１／３９、１／３０〜１／３８、１／３０〜１／３７、１／３０〜１／３６、１／３０〜１／３５、１／３０〜１／３４、１／３０〜１／３３、１／３０〜１／３２、又は１／３０〜１／３１を含むことができる。
【００７１】
さらなる実施態様において本発明の医薬組成物は、（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）とｂ）幹細胞動員物質を、約１／４０〜１／１００、１／４０〜１／９９、１／４０〜１／９８、１／４０〜１／９７、１／４０〜１／９６、１／４０〜１／９５、１／４０〜１／９４、１／４０〜１／９３、１／４０〜１／９２、１／４０〜１／９１、１／４０〜１／９０、１／４０〜１／８９、１／４０〜１／８８、１／４０〜１／８７、１／４０〜１／８６、１／４０〜１／８５、１／４０〜１／８４、１／４０〜１／８３、１／４０〜１／８２、１／４０〜１／８１、１／４０〜１／８０、１／４０〜１／７９、１／４０〜１／７８、１／４０〜１／７７、１／４０〜１／７６、１／４０〜１／７５、１／４０〜１／７４、１／４０〜１／７３、１／４０〜１／７２、１／４０〜１／７１、１／４０〜１／７０、１／４０〜１／６９、１／４０〜１／６８、１／４０〜１／６７、１／４０〜１／６６、１／４０〜１／６５、１／４０〜１／６４、１／４０〜１／６３、１／４０〜１／６２、１／４０〜１／６１、１／４０〜１／６０、１／４０〜１／５９、１／４０〜１／５８、１／４０〜１／５７、１／４０〜１／５６、１／４０〜１／５５、１／４０〜１／５４、１／４０〜１／５３、１／４０〜１／５２、１／４０〜１／５１、１／４０〜１／５０、１／４０〜１／４９、１／４０〜１／４８、１／４０〜１／４７、１／４０〜１／４６、１／４０〜１／４５、１／４０〜１／４４、１／４０〜１／４３、１／４０〜１／４２、又は１／４０〜１／４１の比率範囲で含むことができる。
【００７２】
別の実施態様において本発明の医薬組成物は、（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）と幹細胞動員物質を、約１／５０〜１／１００、１／５０〜１／９９、１／５０〜１／９８、１／５０〜１／９７、１／５０〜１／９６、１／５０〜１／９５、１／５０〜１／９４、１／５０〜１／９３、１／５０〜１／９２、１／５０〜１／９１、１／５０〜１／９０、１／５０〜１／８９、１／５０〜１／８８、１／５０〜１／８７、１／５０〜１／８６、１／５０〜１／８５、１／５０〜１／８４、１／５０〜１／８３、１／５０〜１／８２、１／５０〜１／８１、１／５０〜１／８０、１／５０〜１／７９、１／５０〜１／７８、１／５０〜１／７７、１／５０〜１／７６、１／５０〜１／７５、１／５０〜１／７４、１／５０〜１／７３、１／５０〜１／７２、１／５０〜１／７１、１／５０〜１／７０、１／５０〜１／６９、１／５０〜１／６８、１／５０〜１／６７、１／５０〜１／６６、１／５０〜１／６５、１／５０〜１／６４、１／５０〜１／６３、１／５０〜１／６２、１／５０〜１／６１、１／５０〜１／６０、１／５０〜１／５９、１／５０〜１／５８、１／５０〜１／５７、１／５０〜１／５６、１／５０〜１／５５、１／５０〜１／５４、１／５０〜１／５３、１／５０〜１／５２、１／５０〜１／５１、１／６０〜１／１００、１／６０〜１／９９、１／６０〜１／９８、１／６０〜１／９７、１／６０〜１／９６、１／６０〜１／９５、１／６０〜１／９４、１／６０〜１／９３、１／６０〜１／９２、１／６０〜１／９１、１／６０〜１／９０、１／６０〜１／８９、１／６０〜１／８８、１／６０〜１／８７、１／６０〜１／８６、１／６０〜１／８５、１／６０〜１／８４、１／６０〜１／８３、１／６０〜１／８２、１／６０〜１／８１、１／６０〜１／８０、１／６０〜１／７９、１／６０〜１／７８、１／６０〜１／７７、１／６０〜１／７６、１／６０〜１／７５、１／６０〜１／７４、１／６０〜１／７３、１／６０〜１／７２、１／６０〜１／７１、１／６０〜１／７０、１／６０〜１／６９、１／６０〜１／６８、１／６０〜１／６７、１／６０〜１／６６、１／６０〜１／６５、１／６０〜１／６４、１／６０〜１／６３、１／６０〜１／６２、１／６０〜１／６１の比率範囲で含むことができる。
【００７３】
別の実施態様において、本発明の医薬組成物内の（ａ）免疫抑制剤又はＦＫＢＰリガンド（免疫抑制剤又は非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドを含む）とｂ）幹細胞動員物質の比率範囲は、約１／７０〜１／１００、１／７０〜１／９９、１／７０〜１／９８、１／７０〜１／９７、１／７０〜１／９６、１／７０〜１／９５、１／７０〜１／９４、１／７０〜１／９３、１／７０〜１／９２、１／７０〜１／９１、１／７０〜１／９０、１／７０〜１／８９、１／７０〜１／８８、１／７０〜１／８７、１／７０〜１／８６、１／７０〜１／８５、１／７０〜１／８４、１／７０〜１／８３、１／７０〜１／８２、１／７０〜１／８１、１／７０〜１／８０、１／７０〜１／７９、１／７０〜１／７８、１／７０〜１／７７、１／７０〜１／７６、１／７０〜１／７５、１／７０〜１／７４、１／７０〜１／７３、１／７０〜１／７２、１／７０〜１／７１、１／８０〜１／１００、１／８０〜１／９９、１／８０〜１／９８、１／８０〜１／９７、１／８０〜１／９６、１／８０〜１／９５、１／８０〜１／９４、１／８０〜１／９３、１／８０〜１／９２、１／８０〜１／９１、１／８０〜１／９０、１／８０〜１／８９、１／８０〜１／８８、１／８０〜１／８７、１／８０〜１／８６、１／８０〜１／８５、１／８０〜１／８４、１／８０〜１／８３、１／８０〜１／８２、１／８０〜１／８１、１／９０〜１／１００、１／９０〜１／９９、１／９０〜１／９８、１／９０〜１／９７、１／９０〜１／９６、１／９０〜１／９５、１／９０〜１／９４、１／９０〜１／９３、１／９０〜１／９２、又は１／９０〜１／９１を含むことができる。
【００７４】
特定の実施態様において本発明の医薬組成物は、（ａ）非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドと（ｂ）幹細胞動員物質（例えば、ＣＸＣＲアンタゴニスト）を含む。このような実施態様において、非免疫抑制性ＦＫＢＰリガンドと幹細胞動員物質の比率は、約１／１０〜１／１００であり得る。さらなる実施態様においてこの比率は、約１／１０より大きく、約１／１、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、又は１／９であり得る。別の実施態様においてこの比率は、約１／１００未満であり、特に限定されるものではないが、約１／１５０、１／２００、１／２５０、１／３００、１／３５０、１／４００、１／４５０、及び１／５００、又はそれ以上（上記の範囲を含む）を含む。
【００７５】
特定の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、数週間のコースにわたって少なくとも週に１回投与され得る。ある実施態様において本医薬組成物は、少なくとも週に１回、数週間から数カ月にわたって投与される。別の実施態様において本医薬組成物は、週に１回、４〜８週間にわたって投与される。さらに別の実施態様において本医薬組成物は、週に１回、４週間にわたって投与される。
【００７６】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本医薬組成物は、少なくとも１日に１回で約２日間、少なくとも１日に１回で約３日間、少なくとも１日に１回で約４日間、少なくとも１日に１回で約５日間、少なくとも１日に１回で約６日間、少なくとも１日に１回で約７日間、少なくとも１日に１回で約８日間、少なくとも１日に１回で約９日間、少なくとも１日に１回で約１０日間、少なくとも１日に１回で約１１日間、少なくとも１日に１回で約１２日間、少なくとも１日に１回で約１３日間、少なくとも１日に１回で約１４日間、少なくとも１日に１回で約１５日間、少なくとも１日に１回で約１６日間、少なくとも１日に１回で約１７日間、少なくとも１日に１回で約１８日間、少なくとも１日に１回で約１９日間、少なくとも１日に１回で約２０日間、少なくとも１日に１回で約２１日間、少なくとも１日に１回で約２２日間、少なくとも１日に１回で約２３日間、少なくとも１日に１回で約２４日間、少なくとも１日に１回で約２５日間、少なくとも１日に１回で約２６日間、少なくとも１日に１回で約２７日間、少なくとも１日に１回で約２８日間、少なくとも１日に１回で約２９日間、少なくとも１日に１回で約３０日間、又は少なくとも１日に１回で約３１日間、投与することができる。
【００７７】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、１日おきに約２日間、１日おきに約３日間、１日おきに約４日間、１日おきに約５日間、１日おきに約６日間、１日おきに約７日間、１日おきに約８日間、１日おきに約９日間、１日おきに約１０日間、１日おきに約１１日間、１日おきに約１２日間、１日おきに約１３日間、１日おきに約１４日間、１日おきに約１５日間、１日おきに約１６日間、１日おきに約１７日間、１日おきに約１８日間、１日おきに約１９日間、１日おきに約２０日間、１日おきに約２１日間、１日おきに約２２日間、１日おきに約２３日間、１日おきに約２４日間、１日おきに約２５日間、１日おきに約２６日間、１日おきに約２７日間、１日おきに約２８日間、１日おきに約２９日間、１日おきに約３０日間、又は１日おきに約３１日間以上、投与することができる。
【００７８】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、毎日約１回、２日毎に約１回（本明細書では１日おきに１回とも記載される）、３日毎に約１回、４日毎に約１回、５日毎に約１回、６日毎に約１回、７日毎に約１回、８日毎に約１回、９日毎に約約１回、１０日毎に約１回、１１日毎に約１回、１２日毎に約１回、１３日毎に約１回、１４日毎に約１回、１５日毎に約１回、１６日毎に約１回、１７日毎に約１回、１８日毎に約１回、１９日毎に約１回、２０日毎に約１回、２１日毎に約１回、２２日毎に約１回、２３日毎に約１回、２４日毎に約１回、２５日毎に約１回、２６日毎に約１回、２７日毎に約１回、２８日毎に約１回、２９日毎に約１回、３０日毎に約１回、又は３１日毎に約１回、投与することができる。特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、１日おきに投与することができる。
【００７９】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、毎週約１回、２週間毎に約１回、３週間毎に約１回、４週間毎に約１回、５週間毎に約１回、６週間、７週間毎に約１回、８週間毎に約１回、９週間毎に約１回、１０週間毎に約１回、１１週間毎に約１回、１２週間毎に約１回、１３週間毎に約１回、１４週間毎に約１回、１５週間毎に約１回、１６週間毎に約１回、１７週間毎に約１回、１８週間毎に約１回、１９週間毎に約１回、又は約２０週間毎に約１回、投与することができる。
【００８０】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、１ヵ月毎に約１回、２ヵ月毎に約１回、３ヵ月毎に約１回、４ヵ月毎に約１回、５ヵ月毎に約１回、６ヵ月、７ヵ月毎に約１回、８ヵ月毎に約１回、９ヵ月毎に約１回、１０ヵ月毎に約１回、１１ヵ月毎に約１回、１２ヵ月毎に約１回、投与することができる。
【００８１】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、少なくとも週に１回で約２週間、少なくとも週に１回で約３週間、少なくとも週に１回で約４週間、少なくとも週に１回で約５週間、少なくとも週に１回で約６週間、少なくとも週に１回で約７週間、少なくとも週に１回で約８週間、少なくとも週に１回で約９週間、少なくとも週に１回約１０週間、少なくとも週に１回で約１１週間、少なくとも週に１回で約１２週間、少なくとも週に１回で約１３週間、少なくとも週に１回で約１４週間、少なくとも週に１回で約１５週間、少なくとも週に１回で約１６週間、少なくとも週に１回で約１７週間、少なくとも週に１回で約１８週間、少なくとも週に１回で約１９週間、又は少なくとも週に１回で約２０週間、投与することができる。
【００８２】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、少なくとも週に１回で約１カ月間、少なくとも週に１回で約２カ月間、少なくとも週に１回で約３カ月間、少なくとも週に１回で約４カ月間、少なくとも週に１回で約５カ月間、少なくとも週に１回で約６カ月間、少なくとも週に１回で約７カ月間、少なくとも週に１回で約８カ月間、少なくとも週に１回で約９カ月間、少なくとも週に１回で約１０カ月間、少なくとも週に１回で約１１カ月間、少なくとも週に１回で約１２カ月間、投与することができる。
【００８３】
特定の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、組織損傷を患っている対象に医薬組成物を、組織損傷が発生したか又は観察されたとき、組織損傷が発生又は観察された約１カ月後、約２カ月後、及び約３カ月後に１回以上の投与で、合計４回投与することを含む投与処方又は治療方法で投与することができる。任意の投与経路を使用することができる。投与処方又は治療法のいくつかの実施態様において、使用される投与経路は皮下又は筋肉内である。投与処方又は治療方法の別の実施態様において、投与経路は皮下である。特定の実施態様において、組織損傷が発生したか又は観察されたあたりのときに１回以上投与することができ、組織損傷が発生した後約１カ月後、約２カ月後、及び約３カ月後に１回投与、２回投与、３回投与、４回投与、５回投与、６回投与、７回投与、８回投与、９回投与、又は１０回投与することができる。１回以上の投与は、組織損傷が発生したか又は観察された時に、１日以上にわたって行われ、組織損傷の約１カ月後、約２カ月後、及び約３カ月後に、例えば、毎日又は１日おきに１回投与することができる。１回以上の投与は、組織損傷が発生したか又は観察された時から、及び組織損傷の約１カ月後、約２カ月後、及び約３カ月後に、均等な間隔で又は均等ではない間隔で行うことができる。１つの実施態様において、組織損傷が発生したか又は観察されたほぼその日（０日目）に、及び組織損傷が発生したか又は観察された日の約２、４、６、及び８日後に、再度１回又はそれ以上の投与が行われる；組織損傷が発生したか又は観察された日の約１カ月日に、及び組織の損傷が発生又は観察され日の１カ月目の約２、４、６、及び８日後に；再度、組織損傷が発生したか又は観察された日の２カ月目に、及び組織の損傷が発生又は観察され日の２カ月目の約２、４、６、及び８日後に；及び、組織損傷が発生したか又は観察された日の３カ月目に、及び組織の損傷が発生又は観察された日の３カ月目の約２、４、６、及び８日後に、１回又はそれ以上の投与を行うことができる。
【００８４】
別の実施態様において、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物は、組織損傷を患っている対象に医薬組成物を一日おきに投与することを含む投与処方又は治療方法で投与することができる。任意の適切な投与経路、例えば、皮下又は筋肉内投与を使用することができる。特定の実施態様において、投与経路は皮下である。本医薬組成物の１日おきの投与は、組織損傷が治療されるまで、及び／又は所定の期間、例えば、約１週間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、２９日間、３０日間、５週間、又は６週間の期間にわたって行うことができる。
【００８５】
本発明の治療方法では、ＡＦ併用剤の１回目の投与を含む本医薬組成物の１回目の投与を誘発する組織損傷は、特定の治療が必要であることを知らせるか又は示す任意の組織損傷であり得る。例えば、組織損傷は、臓器移植（肝臓、心臓、肺、腎臓、又は角膜移植、又は皮膚移植を含む）、火傷、創傷、神経損傷及び／又は変性（脊髄損傷を含む）の発生、又はＩＢＤ若しくは他の自己免疫性若しくは炎症性疾患の診断、又はＩＢＤ若しくは他の自己免疫性若しくは炎症性疾患のエピソードの発症でもよい。例えば、１回目の投与は、組織損傷の発生直後であってもよいし、又は現実的で医学的に妥当なその少し後、例えば、組織損傷が発生したか又は観察された日と同じ日に、組織損傷の発生後、例えば、約１分、５分、３０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１２時間、又は１８時間以内に行うことができる。いくつかの実施態様において、１回目の投与は、組織損傷の発生から、例えば、約１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日遅らせることができる。
【００８６】
裂傷、切り傷、擦り傷、刺し傷、又はこれらの組み合わせを含むあらゆる種類の火傷又は創傷は、本発明の医薬組成物及び方法（ＡＦ併用剤を含む）で治療することができる。本発明の医薬組成物及び方法により治療することができる創傷は、物理的手段（例えば、自己又は他人による事故、外科的介入など）などの任意の原因により発生させることができるか、又は疾患、障害、又は症状（例えば、糖尿病又は不動状態）の後遺症として発生させることができる。本発明の医薬組成物及び方法により治療することができる熱傷は、例えば、皮膚又は他の組織を極端な熱又は寒さにさらすなどの任意の原因により、発生させ得る。
【００８７】
大規模な全層熱傷及び軟部組織損傷は、自己皮膚、創傷感染、重篤な代謝ストレス、及び他の関連する損傷の限界のために、軍及び民間の両方の損傷において重大な外科的及び医学的課題を与え続ける。ヒト死亡者ドナーの皮膚同種移植片は、重度の熱傷傷害後の皮膚カバーの適切かつよく使用される一時的な選択肢を提供する。しかしながら、火傷の免疫抑制効果が低下し、一般に火傷後の瘢痕が生じると、移植片拒絶が一般的である。肥厚性瘢痕化も極めて一般的であり、火傷に関連する最も高い罹患率の原因である。本発明者は、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物及び方法が、自己由来幹細胞の集団を動員し、皮膚同種移植片の宿主再増殖を誘導し得ることを見出した。このキメラ皮膚への変換は、免疫抑制を必要とせずに、長期の移植片の受容（「テイク（take）」）を可能にする（例えば、後述の実施例２参照）。
【００８８】
ある実施態様において本発明は、ＡＦ併用剤などの本発明の医薬組成物を１日おきに、例えば、火傷又は創傷が発生した日から開始して所定の期間、又は火傷若しくは創傷が実質的に治癒するまで投与することを含む、被験者の全層熱傷又は軟部組織損傷を治療する方法を提供する。
【００８９】
糖尿病は世界中で約２億人の人が患っており、糖尿病患者の多くが創傷治癒能力を低下している可能性がある。糖尿病患者のうち１５％が足潰瘍などの創傷を発症し、このような足潰瘍を有する人の１２〜２４％が切断を必要とする可能性がある。糖尿病性足潰瘍又は他の創傷をより迅速に治癒することは、糖尿病被験者の下肢切断、罹患率、及び死亡率をもたらす可能性がある合併症を制限することができる。しかしながら、糖尿病性足潰瘍及び糖尿病患者が罹患した他の創傷は、一般的に治癒が困難である。本発明者は、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物及び方法が、足潰瘍などの糖尿病性創傷の治癒を促進できることを発見した（例えば、後述の実施例３参照）。
【００９０】
ある実施態様において、本発明は、糖尿病患者の創傷、例えば、糖尿病性潰瘍（糖尿病性足潰瘍を含む）を治療する方法であって、ＡＦ併用剤などの本発明の医薬組成物を１日おきに、例えば、創傷が発生したか又は潰瘍が観察された日から初めて所定の期間、又は創傷が実質的に治癒するまで、投与することを含む方法を提供する。
【００９１】
潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸壁の破壊に伴う構造的損傷をもたらす慢性の再発性疾患である。これらの症状は、炎症細胞の粘膜下蓄積だけでなく、上皮層への重度の損傷によっても特徴付けられる。ＩＢＤが粘膜炎症の自発的発症により開始及び維持されるという考えに基づいて、現在の治療アプローチは、顕性炎症を抑制することを主目的とし、薬理学的物質（コルチコステロイド及び免疫調節物質）、生物製剤（抗ＴＮＦ−アルファ）、及び炎症を起こした腸の部分を除去するための手術、の使用を含む。しかしながら、これらの治療様式には、部分的には患者の非遵守と再発に起因する限界がある。さらにＩＢＤ患者の約１／３は特定の治療に応答せず、ＩＢＤの治癒法がない。現在、開発中のほとんどのＩＢＤ療法は抗体ベースの生物製剤であり、これらは全て、抗薬物抗体又はＡＤＡと呼ばれることもある生物製剤に対する抗体の生成により、治療応答の消失の可能性がある。
【００９２】
最近の臨床研究では、ＩＢＤ患者の長期寛解の最も重要な予後因子として「粘膜治癒」に注目しており、ＩＢＤの治療を改善するためには上皮再生の達成が決定的に必要であることが示唆されている細胞ベースの治療法を用いた再生医療アプローチは、現在ＩＢＤの治癒的治療のための最も有望な選択肢の１つと考えられている。幹細胞は自己複製し、分化した子孫細胞を生成する能力が非常に高いため、再生医療における多くの用途の注目の的である。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、その免疫調節性及び再生特性及び強力なインビトロ増殖能のために、細胞療法にとって魅力的である。従って、自己及び同種異系の脂肪又は骨髄由来のＭＳＣ供給源は、ＩＢＤ治療のための初期臨床試験に使用されている。ＩＢＤの治療として幹細胞に基づく治療法を採用している最近の臨床試験の有望な結果にもかかわらず、細胞を採取し、拡大し、移植するのに必要な複雑で時間がかかり高価なプロセスは、多数の患者を治療することを困難にしている。本発明者は、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物及び方法が、自己由来の幹細胞を腸内の炎症部位及び／又は損傷部位に動員することにより、ＩＢＤ（大腸炎及びクローン病を含む）などの自己免疫性又は炎症性疾患を治療することができることを見出した（例えば、以下の実施例５参照）。
【００９３】
１つの実施態様において本発明は、対象（大腸炎又はクローン病を含む）の、例えば、ＩＢＤ（大腸炎及びクローン病を含む）などの自己免疫疾患又は障害を治療する方法を提供し、この方法は、ＡＦ併用剤などの本発明の医薬組成物を１日おきに、例えば、自己免疫疾患又は障害が診断されたか、又は自己免疫疾患若しくは障害に関連する症状又はエピソードが観察された日から開始して、自己免疫疾患又は障害が治療されるか、又は自己免疫疾患若しくは障害に関連する症状若しくはエピソードが３週間のような所定の時間治療されるまで、投与することを含む。
【００９４】
米国における脊髄損傷（ＳＣＩ）の発生率は１年に１万人以上で、１００万人あたり７２０人に達し、毎年永続的な障害に耐えている。ＳＣＩは、傷害部位の損傷組織の壊死性コアの急速な発達、続いて長期の遅延した２次変性を特徴とする運動機能及び／又は感覚機能の障害を含む。この２次変性は数週間又は数カ月にわたって続き、乏突起神経膠腫を含む常在細胞の慢性進行性破壊、及びニューロパシーのさらなる脱髄を伴う。今日まで、ＳＣＩの神経学的転帰にプラスの作用を示した証明された治療様式は存在しない。
【００９５】
過去１０年間の幹細胞生物学の進歩により、幹細胞はニューロン及びグリアの良好な供給源を提供し、また宿主組織に対する神経保護作用を発揮し、組織工学及び再生医療の新たな分野を開いていることが示されている。ＳＣＩの治療法として幹細胞を用いた最近の動物試験や臨床試験の有望な結果にもかかわらず、回復は完全ではなく、脊髄の修復促進は依然として不十分である。さらに、内因性細胞を採取し、拡大し、移植するのに必要な複雑で時間がかかる高価なプロセスは、多くの患者を効果的に治療することを困難にしている。ＡＦ併用剤は、その抗炎症性及び再生特性のために、ＳＣＩの治療に魅力的である。本発明者は、ＡＦ併用剤を含む本発明の医薬組成物及び方法が、自己由来幹細胞を損傷部位に動員することによりＳＣＩを治療することができることを発見した（例えば、以下の実施例６参照）。
【００９６】
ある実施態様において本発明は、対象における脊髄神経の急性損傷及び２次分解を含むＳＣＩを治療する方法を提供し、この方法は、ＡＦ併用剤などの本発明の医薬組成物を、例えば、ＳＣＩが発生した日に開始して、ＳＣＩ又はＳＣＩに関連する症状が治療されるまで、又はＳＣＩの発生後２９日又は３０日間などの所定の期間、１日おきに投与することを含む。いくつかの実施態様において、ＡＦ併用剤などの本発明の医薬組成物の投与は、ＳＣＩの発生後ある期間、例えば、ＳＣＩの発生の１日又は５日間遅延させることができる。
【００９７】
組織損傷を治療するために本発明の治療方法を実施している者は、周知の技術又は知識を用いて、本医薬組成物の投与が組織損傷を治療しているか否かを容易に判定することができる。例えば、創傷や火傷の治癒は、定期的な監視により目視で観察することができる。ＩＢＤなどの自己免疫疾患又は障害の治療は、対象の患部の炎症の程度の変化を、関連する症状の軽減を、及び／又は血液若しくは組織中のバイオマーカー（例えば、炎症性サイトカイン又は自己抗体）のレベルの変化を監視することにより決定することができる。ＳＣＩの治療は、体の患部に感覚が戻る時間について対象を監視することによって、又は運動機能の変化を観察することによって決定され得る。
【００９８】
さらに詳述しなくても、当業者は、先の説明を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。以下の実施例は例示的なものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、本明細書に記載され特許請求されている化合物、組成物、物品、装置、及び／又は方法がどのようになされ評価されたかの完全な開示及び記載を、当業者に提供するために提示されており、純粋に例示的なものであることを意図しており、ならびに本発明者が発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確保するための努力がなされているが、ここではいくつかの誤差及び偏差を説明する。特に別の指定がなければ、部は重量部であり、温度は摂氏度又は周囲温度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、及び他の反応範囲、及び記載されたプロセスから得られる生成物純度及び収率を最適化するために使用し得る条件などの反応条件の、多くの変形及び組み合わせがある。
【０１００】
実施例１及び２の材料と方法：
ＡＦ併用剤注射剤
試薬：ＡＭＤ３１００及びタクロリムス（粉末）をSigma-Aldrich (St. Louis, MO）から入手した。
タクロリムス製剤：タクロリムス粉末の疎水性及び水溶液（例えば、生理食塩水）中のその溶解度が低いため、タクロリムス粉末を１００％エタノール（全容量の８％）、ヒマシ油（総容量の２％）、及び注射用滅菌生理食塩水（全容量の９０％）の混合液中に溶解した。タクロリムスは、Ｃ44Ｈ69ＮＯ12・Ｈ2Ｏの実験式と８２２．０３の式量を有する。
ＡＭＤ３１００製剤：２４ｍｇのＡＭＤ３１００を５．９ｍｇの塩化ナトリウムを含む滅菌水に溶解し、必要に応じて塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０〜７．５に調整した。ＡＭＤ３１００の分子量は５０２．７９ｇ／ｍｏｌである。
ＡＦ併用剤：約１：１０から１：１００のタクロリムス対ＡＭＤ３１００の重量比に従って、可溶化されたタクロリムスをＡＭＤ３１００溶液に加えた。例えば、０．２ｍｇ／０．２ｍｌのＦＫ５０６を２０ｍｇ／０．８ｍｌのＡＭＤ３１００に添加して、２０ｍｇのＡＭＤ３１００と０．２ｍｇのＦＫ５０６を含む１ｍｌの組成物を作製した。体重６０ｋｇの患者では、ＡＭＤ３１００の投与量は約０．２４ｍｇ／ｋｇ／日であり、従って１４．４ｍｇのＡＭＤ３１００と０．１４４ｍｇのタクロリムスを含む組成物０．７２ｍｌが患者に投与される（０．００２４ｍｇ／ｋｇ）。
【０１０１】
実施例１−ＡＦ併用剤による幹細胞動員活性のアッセイ。
造血性コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイは、細胞試料の造血前駆細胞含有量を定量及び評価する方法として、ヒト及び動物モデルにおける研究及び臨床応用に広範に使用されている。幹細胞動員活性は、動員された末梢血試料中のＣＦＣアッセイを用いて測定することができる。ＣＦＣは分裂し、光学顕微鏡で検出可能なより成熟した細胞のコロニーに分化することができる。これは、薬剤により動員された多能性幹細胞系統の定量化を可能にする。
【０１０２】
Ｃ５７／Ｂ６マウスを４つの治療群に分けた：１）生理食塩水で治療した対照群；２）ＡＭＤ３１００群（１．０ｍｇ／ｋｇ）；（３）低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で治療したタクロリムス群；（４）ＡＦ併用剤群（ＡＭＤ３１００とタクロリムスを含む）。薬物治療の３時間後に動物を殺処分し、末梢血を採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。生存ＰＢＭＣを計測し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むMethocult GFメチルセルロース培地（StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada；カタログ番号：０３４４４）と混合して、１×１０5の生存ＰＢＭＣ／１．５ｍｌ培地の最終密度を得た。Methocult細胞混合物を超低細胞付着表面（Ultra Low Cell Adherence Surface）６ウェルプレート（Corning, Lowell, MA）に分注し、培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９５％で１４日間インキュベートした。倒立顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY）をＸ４で用いて、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計測した。１ミリリットル当たりの生存細胞数をウェルあたりの蒔いた細胞数で除し、計測されたＣＦＵ／ウェルの数を掛けて、ＣＦＵの数を求めた。
【０１０３】
図１は、ＡＭＤ３１００又はタクロリムス単独で治療したマウスにおいて、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数が顕著に増加したことを示す。驚くべきことに、マウスをＡＦ併用剤で治療した場合に、ＣＦＣの数はさらに高かった。これらの結果は、内因性幹細胞の動員におけるＡＦ併用剤中の成分の強力な相乗的活性を示す。ＡＦ併用剤は、幹細胞の動員において、単独で投与されたＡＭＤ３１００、単独で投与されたタクロリムス、又はＡ＋Ｆ２重薬物治療（すなわち、別個に投与された幹細胞動員物質ＡＭＤ３１００と免疫抑制剤タクロリムス）より有効であったことを示す図５も参照されたい。
【０１０４】
実施例２−マウスにおけるＡＦ併用剤による火傷創治癒の改善
幹細胞療法は、火傷創治癒の質を改善し、瘢痕の形成を低下させ、皮膚を再建することができる。高価で時間がかかる、熱傷を治療するための内因性幹細胞の調製の必要性を避けるために、この試験は、ＡＦ併用剤により内因性骨髄幹細胞が薬理学的に動員されて火傷を治療することができることを示す。
【０１０５】
Ｃ５７／Ｂ６マウスの背部皮膚に全層性熱傷（直径１２ｍｍ）を作製した（図２）。火傷したマウスを以下のようにランダムに４つの実験群に分割し、創傷直後から完全な治癒まで、生理食塩水又は薬物の皮下注射を行った：（１）生理食塩水で治療した対照群；（２）１日おきに治療されたＡＭＤ３１００群（１．０ｍｇ／ｋｇ）；（３）低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で毎日治療されたＦＫ５０６群；（４）１日おきに治療されたＡＦ併用剤群。全ての創傷評価は二重盲検であった。
【０１０６】
ＡＦ併用剤によりもたらされた内因性幹細胞動員は、全身創傷の完全治癒の時間を２５％減少させることができ（１９±２日対２６±３日、ｎ＝１０／群、ｐ＜０．００１）（図３）、これは巨視的及び組織学的に評価された瘢痕形成の減少を伴った（図４）。これらの結果は、ＡＦ併用剤が創傷７日後に火傷部位に、より多くの数の系統陰性ＣＤ１３３＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＣＸＣＲ４＋幹細胞及びＭ２マクロファージを動員したことを示している。ＡＦ併用剤治療はまた、肉芽組織における間質細胞由来因子（ＳＤＦ）−１及び血管新生サイトカイン（ＶＥＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＨＧＦ）の発現を増加させた。Ｒｏｓａ２６ＧＦＰレポーター対立遺伝子を含むＣＤ１３３＋／Ｃ−Ｌマウスを用いた系統追跡研究は、二重治療した火傷創に修復プロセスの改善へのＣＤ１３３＋細胞の寄与をさらに証明した。
【０１０７】
結論として、ＡＦ併用剤による内因性幹細胞の動員、補充、及び保持は、火傷創のより良好で迅速な治癒をもたらす。これらの知見は、火傷創治癒に対する著しく有利な治療的アプローチを提供する。
【０１０８】
実施例３〜７の材料と方法：
ＦＫ５０６粉末（Sigma）とＡＭＤ３１００粉末（Sigma）（いずれも、溶液の調製に使用する前は、−２０℃で保存した）から、ＡＦ併用薬物組成物（ＡＭＤ３１００＋ＦＫ５０６）を調製した。最終的に調製した溶液（組成物Ｉと組成物ＩＩ；下記参照）を、使用するまで４℃で保存した。
組成物Ｉ（ラット及びマウスなどのげっ歯類に使用）：
ＦＫ５０６
ストック溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）＝１２０ｍｇのＦＫ粉末＋５ｍｌの９５％ＥｔＯＨ＋５ｍｌのクレマフォア（Cremaphor）
ＦＫ溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）＝１ｍｌのＦＫストック溶液＋１９ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
ＡＭＤ３１００
ストック溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）＝１２０ｍｇのＡＭＤ３１００粉末＋１０ｍｌのＨ２Ｏ（２．５〜３ｍｇの塩化ナトリウムを含み、必要に応じて塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてでｐＨ６．０〜７．５に調整）
ＡＭＤ３１００溶液（１．２ｍｇ／ｍｌ）＝１ｍｌのＡＭＤ３１００溶液＋９ｍｌのＰＢＳ
ＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００  １ｍｇ／ｍｌ；ＦＫ５０６  ０．１ｍｇ／ｍｌ）＝１０ｍｌのＡＭＤ３１００溶液＋２ｍｌのＦＫ５０６溶液＝１２ｍｇのＡＭＤ３１００＋１．２ｍｇのＦＫ５０６／１２ｍｌ＝１ｍｇのＡＭＤ３１００＋０．１ｍｇのＦＫ５０６／ｍｌ。ＡＭＤ３１００／ＦＫ５０６比＝１０／１。
ストック溶液：室温（１．０ｍｌバイアルにアリコートした）
ラット及びマウスへの投与：１ｍｌ／ｋｇ
ラットへの投与（１ｍｌ／ｋｇ）：与えた容量（ｍｌ）＝体重（ｇ）×１ｍｌ／１０００ｇ。例えば、２５０ｇのラットに０．２５ｍｌの皮下注射を行う。
組成物ＩＩ（ブタなどの大型動物に使用）：
ＦＫ５０６
ストック溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）＝１２０ｍｇのＦＫ粉末＋５ｍｌの９５％ＥｔＯＨ＋５ｍｌのクレマフォア
ＦＫ溶液（６ｍｇ／ｍｌ）＝１０ｍｌのＦＫストック溶液＋１０ｍｌのＰＢＳ
ＡＭＤ３１００
ストック溶液（２２ｍｇ／ｍｌ）＝２２００ｍｇのＡＭＤ３１００粉末＋１００ｍｌのＨ２Ｏ
ＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００  １ｍｇ／ｍｌ；ＦＫ５０６  ０．２１ｍｇ／ｍｌ）＝９０ｍｌのＡＭＤ３１００ストック溶液＋１０ｍｌのＦＫ５０６溶液＝１９８０ｍｇのＡＭＤ３１００＋６０ｍｇのＦＫ５０６／１００ｍｌ。ＡＭＤ３１００／ＦＫ５０６比＝３３／１。
【０１０９】
ストック溶液：室温（５ｍｌバイアルにアリコートした）
ブタへの投与：０．０５ｍｌ／ｋｇ：与えた容量（ｍｌ）＝体重（ｋｇ）×０．０５ｍｌ／１ｋｇ。例えば、５０ｋｇのブタに２．５ｍｌの皮下注射を行う。
【０１１０】
実施例３−ラットにおけるＡＦ併用剤による糖尿病性創傷治癒の改善
糖尿病性潰瘍を治療するための本医薬組成物及び方法の有用性を証明するために、糖尿病のラットモデルを用いて以下の試験を行った。
【０１１１】
血糖値≧３５０ｍｇ／ｄｌのストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病ＳＤラットを４週間、試験に使用した。滅菌使い捨て生検パンチ（直径５ｍｍ）を用いて、ラットの背部皮膚に全層創傷を作製した（図６Ａ）。創傷したラットをランダムに２つの実験群（ｎ＝６）に分割し、創傷直後と、完全な治癒まで１日おきに、生理食塩水又はＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００／ＦＫ５０６比＝１０／１、ＡＭＤ３１００＝１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を行った。全ての創傷評価は二重盲検であった。
【０１１２】
ＡＦ併用剤により誘導された幹細胞動員活性を、実施例１で上述したように、ＡＦ併用剤治療の３時間後の末梢血液試料のＣＦＣアッセイを用いて測定した。末梢血中のＣＦＣの数は、ＡＦ併用剤で治療した糖尿病ラットで１０倍増加し（図６Ｂ）、これは、骨髄幹細胞が糖尿病ラットにおけるＡＦ Ｃｏｍｂｏ療法により動員され得ることを示す。生理食塩水で治療した糖尿病ラットにおいて、手術後２２日目に創傷の完全な閉鎖に達し、これは、この確立されたモデルにおける既知の治癒動態と一致する。治癒時間は、ＡＦ併用剤で治療した糖尿病ラットで１６日に、すなわち３０％減少した（図６Ｃ）。治癒には、瘢痕の縮小と毛包の再生が伴った。ＡＦ併用剤治療はまた、創傷部位におけるＣＤ３４＋幹細胞及びＣＤ１３３＋内皮前駆細胞の数を増加させ、毛細血管及び毛包新生を増強した（図６Ｄ）。
【０１１３】
要約すると、ＡＦ併用剤治療による自己由来幹細胞の創傷部位での動員、補充、及び保持は糖尿病性創傷のより良好で迅速な治癒をもたらし、高価で時間がかかる内因性幹細胞の単離、調製、及び使用を回避する。
【０１１４】
実施例４−ＡＦ併用剤治療は、高齢マウスモデルにおける創傷引張強度を増加させ瘢痕形成を減少させる
高齢者の創傷治癒障害は大きな臨床的問題である。高齢のマウスモデルにおける創傷の治療により、高齢のヒトにおける創傷治癒を増強するための本発明の組成物と方法の有用性を示すために、以下の試験を行った。後述するようにＡＦ併用剤は、高齢マウスの創傷治癒の質を改善し、創傷引張強度を上昇させた。
【０１１５】
高齢Ｃ５７ＢＬ６マウスに切開創（４ｃｍ）を施し（図７Ａ）、以下のようにランダムに４つの実験群に分け、生理食塩水又は薬剤を創傷から２週間皮下注射した：（１）生理食塩水で治療した対照群；（２）１日おきに治療されたＡＭＤ３１００群（１．０ｍｇ／ｋｇ）；（３）毎日治療したＦＫ５０６群（０．１ｍｇ／ｋｇ）；（４）ＡＭＤ３１００とＦＫ５０６のＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００／ＦＫ５０６比＝１０／１）で１日おきに治療した群。全ての創傷評価は二重盲検であった。
【０１１６】
高齢のマウスでは、手術後２１日の治癒創傷の引張強度は若年マウスよりも有意に低かった（データは示していない）。ＡＦ併用剤で治療したより高齢のマウスは、引張強度（３．８２±０．３６Ｎ対２．０６±０．２３Ｎ、ｐ＝０．０００５０３）と破断時仕事量（ｐ＝０．０２１１５４）の有意な上昇を示し、治癒創傷の強度がより若いマウスで観察されるものまで回復した（図７Ｃ）。またＡＦ併用剤による高齢マウスの治療は、創傷の７日後に創傷部位におけるＳＤＦ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、及びＫｉ６７の発現を上昇させ（図８Ａ）、上皮増殖（Ｋｉ６７＋）を増強し（図８Ｂ）、瘢痕形成を減少させた（図８Ｃ）。従ってＡＦ併用剤による治療は、ＡＦ併用剤治療による創傷部位における内因性幹細胞の動員、補充、及び保持をもたらし、高齢のマウスの切開創傷モデルにおいて治癒創傷の引張強度と瘢痕の最小化の回復を示した。
【０１１７】
実施例５−ＡＦ併用剤療法はヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスモデルにおいて大腸炎症を低下させ上皮再生を改善した
ＩＢＤを治療する際の本組成物及び方法の有用性は、ヒトＩＢＤのマウスモデルにおいて証明された。
【０１１８】
ＡＦ併用剤の投与は、ＤＳＳ誘発急性ネズミ大腸炎モデルにおいて組織像と疾患活動度指数の顕著な改善をもたらした
ＤＳＳ−大腸炎の誘発のために３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（７日間）を使用した。マウスをランダムに２つの実験群に分け、１日目から９日目まで、生理食塩水又はＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００  １ｍｇ／ｋｇと低用量ＦＫ５０６  ０．１ｍｇ／ｋｇ、１日おき）の皮下注射を行った。１０日目に、ＡＦ併用剤治療マウスと比較して生理食塩水治療したマウスにおいて、血便と軟便（図９Ａ）及びより短い大腸と拡大した盲腸（図９Ｂ）が観察された。組織学的分析は、生理食塩水で治療したマウスの固有層／粘膜において陰窩の消失、破壊、又は短縮、及び炎症細胞の見かけの浸潤を示した（図９Ｃ）。対照的に、ＡＦ併用剤で治療したＤＳＳマウスでは、顕著な腸上皮表面損傷又は表面上皮細胞の消失は観察されなかった。生理食塩水で治療したマウス（対照）の疾患活動度指数（ＤＡＩ）は徐々に増加し、ＤＳＳ除去の１日後の８日目にピークに達した（図１０）。しかしながら、ＡＦ併用剤で治療したマウスでは、ＤＡＩは７日目まで増加しなかった。対照マウスと比較してＡＦ併用剤治療マウスでは、ＤＡＩはほとんど５０％低かった（図１０）。ＣＤ１３３+幹細胞及びＫｉ６７+増殖細胞を、生理食塩水対照及びＡＦ治療マウスからの大腸の粘膜において、二重免疫蛍光染色法により測定した。７日間のＤＳＳ治療により、大腸陰窩に損傷が生じ（図９Ｃ）、陰窩の下部のＣＤ１３３+幹細胞及びＫｉ６７+増殖細胞の数が減少した（図１１、左パネル；明るい染色）。しかしながら、ＣＤ１３３+幹細胞とＫｉ６７+増殖細胞及び陰窩組織像は、ＡＦ併用剤治療したマウスで大きく回復した（図１１、右パネル；明るい染色、及び図９Ｃ）。
【０１１９】
Ｂ．ＡＦ併用剤療法は、ＩＢＤのＩＬ−１０−ＫＯマウスモデルにおいて大腸炎症を低下させた
使用した動物施設の条件下で、Ｃ５７ＢＬ／６  ＩＬ−１０ＫＯマウスは３〜４カ月齢の間に自発性大腸炎（ＩＢＤ）を発症した。ＩＢＤを有する動物を、ＡＦ併用剤（ｎ＝７）又は生理食塩水（対照）で１日おきに３週間治療し、治療の１週間後に殺処分した。生理食塩水で治療したマウスの大腸の肉眼的及び組織学的検査は、中程度から重度の大腸炎及び陰窩の分岐を伴う上皮過形成を示した（図１２Ａと１２Ｂ）。ＡＦ併用剤で治療したマウスは、野生型対照と同様に、最小の炎症を示した（図１２Ｃ）。
【０１２０】
実施例６−ラットにおけるＡＦ併用剤治療による脊髄損傷（ＳＣＩ）後の回復の改善
ＳＣＩの治療のための本発明の組成物及び方法の有用性を、以下のように証明した。ＳＣＩの臨床的に関連した打撲ラットモデルは、軽度の損傷を模倣するために１２．５ｍｍの高さからの荷重落下を用いて作製した。損傷を受けたラットをランダムに３群に分け、１日目から２９日目まで又は５日目から２９日目まで、生理食塩水、ＡＦ併用剤を皮下注射した（皮下注射、１日おき）。Basso, Beattie and Bresnahan 運動機能評価スケール（ＢＢＢスコア）の平均を使用して、関節の動き、後肢の動き、足踏み、四肢の協調、胴体の位置、足の配置、及び尾の位置を評価した。ラット群のＢＢＢスコア間の統計的差を分析して、ＳＣＩからの回復を評価した。このデータは、ＡＦ併用剤が、ＳＣＩの１日後と５日後に治療を受けた打撲ラットのＢＢＢスケールを有意に改善し得ることを示した（図１３）。１２．５ｍｍの打撲損傷に予想されるように、空洞の形成が治療群（図１４Ａ）と対照群（図１４Ｂ）で見られた。しかしながら、ＡＦ併用剤で治療した脊髄中の空洞は、対照群の空洞よりも形成が不充分であった。すなわち対照は、より顕著な空洞を示し、これは中央管に沿って中心点からさらに伸びていた。群間の面積測定値は、対照群（図１４Ｃ）と比較してＡＦ併用剤治療群は空洞サイズの約３倍の有意な減少を示したが、これは、ＡＦ併用剤による治療が、このレベルの打撲損傷について通常予測される神経変性の進行を制限することを示している。これらの結果は、ＡＦ併用剤による自己由来幹細胞の薬理学的動員が、脊髄修復／再生を促進し、脊髄損傷における機能回復を促進することを示す。
【０１２１】
実施例７−ブタにおけるＡＦ併用剤治療と皮膚同種移植片によるインサイチュ皮膚再生の誘発
大きな全層創傷及び軟部組織損傷を治療するための本発明の医薬組成物及び方法の有用性を、以下の試験により証明された。分割厚さの皮膚同種移植片を移植した全層切除創を、マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital, Boston, MA）の移植生物学研究センター（Transplantation Biology Research Center）から得たミニブタで行った。移植ブタを、皮膚移植直後及び１日おきに６週間、ＡＦ併用剤で治療した。図１５に示すように、皮膚同種移植片は移植後４週間以内に徐々に拒絶され、創傷床は新たに生成された組織で満たされた。新たに生成された組織は、赤紫色の上皮のような薄い膜で覆われていた。半透明で薄い赤紫色の皮膚は、７週間後にピンクがかった赤色に変化し、移植後１２週間で毛髪を伴う正常な皮膚になった。これらの結果は、ＡＦ併用剤治療によりインサイチュ皮膚再生が誘発され、自己由来幹細胞を同種移植部位に動員し採し、皮膚同種移植片が組織の幹細胞再生の足場として機能することを示す。
【０１２２】
実施例８−ＡＦ併用剤で治療したブタの長期腎臓移植生存
臓器移植拒絶反応を予防し臓器移植レシピエントにおける長期生存を促進するための本発明の医薬組成物及び方法の有用性を、マサチューセッツ総合病院群のミニブタの完全な主要組織適合性遺伝子座（ブタ白血球抗原［ブタ白血球抗原［ＳＬＡ］）ミスマッチにわたって実施された腎臓移植の以下の試験により証明した。
【０１２３】
動物
ＳＬＡで同定されたドナーブタ及びレシピエントブタ（体重５０〜８０ｋｇ）は、マサチューセッツ総合病院（Boston, MA）の移植生物学研究センターから入手した。これらのブタの免疫原性の特徴は既に記載されている（３０）。２ハプロタイプの完全ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩミスマッチドナー及びレシピエントを腎臓移植に使用した。全てのレシピエントは、臓器移植前に顕著なインビトロ抗ドナー細胞傷害アッセイ応答（＞２０％の特異的溶解）を示した。この試験については、治験審査委員会（動物実験委員会（Animal Care and Use Committee））の承認が得られた。全ての動物飼育及び治療は、国立医学研究会（National Society of Medical Research ）により企画された「実験動物管理の原則」（“Principles of Laboratory Animal Care”）、及び米国研究会議の米国実験動物資源協会 (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council）が準備した「実験動物のケア及び使用のためのガイド」（“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”）に従っており、全米アカデミー出版局（National Academies Press）により公表され、２０１１年に改訂された。
【０１２４】
腎臓移植
腎臓移植に使用された外科的操作は、Kirkman RL, et al. Transplantation in miniature swine. VI. Factors influencing survival of renal allografts. Transplantation 1979; 28: 18-23に記載されており、その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、ドナー腎臓をフラッシュし、冷生理食塩水で３〜６時間維持した後、再灌流した。レシピエントに両側腎切除術を行った。大動脈及び下大静脈を、腎動脈及び静脈の終末側動脈及び静脈吻合に用いた。腎臓移植は、膀胱尿細管吻合により行った。Silastic中心静脈留置カテーテルを、外科的に外頸静脈又は内頸静脈に配置した。カテーテルは、インビトロアッセイ及び腎機能と全血タクロリムスレベルのモニタリングのための頻繁な血液サンプリングを容易にした。
【０１２５】
拒絶モニタリング
腎機能は、連続した血清クレアチニンレベルにより監視された。血清クレアチニン及び血中尿素窒素レベルは、Johns HopkinsのPhenotyping Laboratory of the Department of Comparative Medicineで分析された。生検は、開放型又は経皮的超音波誘導法によるコア針生検を用いて移植レシピエントに対して実施した。腎臓同種移植片拒絶は、血清クレアチニンの１０ｍｇ／ｄＬ超までの持続的上昇又は無尿症（ブタ血清クレアチニンについての正常な検査値は１〜３ｍｇ／ｄＬ）と定義された。同種移植拒絶反応は、全ての症例において組織学的に確認された。
【０１２６】
組織病理学的検査
腎臓同種移植片について、コア針生検又はウェッジ生検を行った。急性拒絶反応のスコア化は、バンフ分類（Solez K, et al. Banff 07 classification of renal allograft pathology: Updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8: 753-760を参照）（その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に基づくものであった。マッソントリクローム染色は、標準的なプロトコールに従って行った。
【０１２７】
ＳＬＡ同定及びＳＬＡミスマッチの近交系ミニブタに、Sachs DH, et al. Transplantation in miniature swine. I. Fixation of the major histocompatibility complex. Transplantation 1976; 22: 559-567（その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、両側腎摘出及び移植を行った（図１Ｂ）。免疫抑制無しでは、これらの動物は２週間以内に急性腎不全により死亡し、移植片は急性細胞拒絶（ＡＣＲ）の組織学的特徴を示す、例えば、Kirkman RL, et al. Transplantation in miniature swine. VI. Factors influencing survival of renal allografts. Transplantation 1979; 28: 18-23（前述）を参照されたい。５つの実験治療群を以下のように定義し、各群に、移植後０、２、４、６、及び８日目に皮下注射を行った：（１）生理食塩水（ｎ＝１）；（２）低用量（０．０３ｍｇ／ｋｇ）タクロリムス単独（ｎ＝３）；（３）ＡＭＤ３１００  １ｍｇ／ｋｇ単独（ｎ＝３）；（４）ＡＦ併用剤治療（ＡＭＤ３１００  １ｍｇ／ｋｇ及びタクロリムス０．０３ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１）；（５）群４のようなＡＦ併用剤治療であるが、移植後１、２、及び３カ月目に８日間のコースの反復を伴う。
【０１２８】
結果を表１に示す。治療を受けなかった動物（生理食塩水対照）は、急性拒絶反応を示し、血清クレアチニンが１９．４ｍｇ／ｄＬに達した時の術後（ＰＯＤ）１０日目に安楽死させた。低用量のタクロリムスを投与された第２群の２匹（ｎ＝３）は、生存期間の延長は認められたが、血清クレアチニンの著しい上昇を示し、ＰＯＤ  ２７日目及び２８日目に腎不全（３日間の無尿症）で死亡した。１ヵ月後にタクロリムスを反復投与された１匹（２１３４３）は、ＰＯＤ  ４０日目に血清クレアチニン値が１２．３から８．３ｍｇ／ｄＬに低下したが、ＰＯＤ  ５６日目には９．８ｍｇ／ｄＬにリバウンドして無尿症になった。ＡＭＤ３１００のみを投与された第３群の動物（ｎ＝３）は、幹細胞動員を示したが、生存期間の延長は無く、ＰＯＤ  ９、１０、及び１６日目に血清クレアチニン上昇と無尿症で死亡した。対照的に、手術前後にＡＦ併用剤治療を受けた第４群の動物は、ＰＯＤ  ２４０日目まで生存したが、クレアチニンが上昇（１３．１ｍｇ／ｄＬ）し無尿症が発生した後に安楽死させた。移植外植片の組織像は、重度の線維症を示したが、炎症はほとんど無いか／軽度であった。ＡＦ併用剤治療群の残りのミニブタは、１、２、及び３カ月目にＡＦ併用剤ほ再投与を受け（第５群）、１．５又は２年目の皮膚同種移植拒絶反応後に１回の追加の８日間コース治療を受け、これらの３匹の動物は、それ以後いかなるタイプの医学的治療も受けておらず、移植後３年間、正常な血清クレアチニンレベル（１．８、２．１、２．７ｍｇ／ｄＬ）（正常なブタクレアチニン値は１．０〜３．０ｍｇ／ｄＬ）で生き続けた。特にブタ２１０８４は、移植後３０日目に移植片機能の傷害の発現（クレアチニン  ２２ｍｇ／ｄＬ）に伴う尿路感染症を示した。抗生物質とＡＦ併用剤の再投与により腎機能は改善し、血清クレアチニンは、術後６０日目に３．１ｍｇ／ｄＬ、１００日目に２．５ｍｇ／ｄＬ、１年後に２．１ｍｇ／ｄＬ、３年後で１．８ｍｇ／ｄＬに低下した。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
全ての実験群の生存率の比較を表１に要約する。低用量ＦＫ５０６治療は生存期間を延長したが、後期拒絶反応に対しては効果がなかった。１匹の動物は３０日目にＦＫ５０６の再投与を受けたが、ＰＯＤ  ５６日目で死亡した。動物１９４３８は１回の二重薬物治療を受けて血清クレアチニンレベルが１ヵ月目に３．１ｍｇ／ｄＬに低下したが、後期慢性拒絶反応を示し、２４０日間生存した。組織像は、炎症、細管萎縮、及び重篤な線維症を示した。対照的に、１カ月目、２カ月目、及び３カ月目に反復投与された動物は、腎機能が正常で長期間生存し、後期／慢性拒絶反応に対するＡＦ併用薬物療法の有効性を示した。
【０１３１】
実施例９−ＡＦ併用剤療法対ＡＭＤ３１００とタクロリムスの別個の投与による創傷治癒の改善
ＡＦ併用剤の予想外の相乗効果は、以下のようにさらに証明された。８〜１２週齢の雄ルイスラットをイソフルランで麻酔した。背部の皮膚を剃毛し、ベタジンと７０％エタノールで洗浄した。４つの切除創を、正中線の両側の１ｃｍ、肋骨縁と腸骨稜の中間点の上下１ｃｍに配置し、ペンでマークした。滅菌使い捨て生検パンチ（直径５ｍｍ、Miltex）をマークの中心に縦に整列させ、同時に圧力及びねじりを加えて、皮膚及び皮筋層を打ち抜いた。同じ操作を繰り返し、各動物に４つの創傷を生じさせた。動物が意識を取り戻した後、１匹ずつ収容した。
【０１３２】
動物を以下のように２つの実験群で別々に異なる時間に試験し、比較のためにデータをプールした。１）ＡＦ Ｃｏｍｂｏ群（ｎ＝６）は、創傷形成（０日）から創傷閉鎖を完了するまで、ＡＭＤ３００  １ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇタクロリムスのＡＦ併用剤（ＡＭＤ３１００対タクロリムスの比＝１０／１．２）を用いて１日おきにを治療した。２）Ａ＋Ｆ群（ｎ＝６）は、創傷形成（０日）から創傷閉鎖を完了するまで、ＡＭＤ３１００（１ｍｇ／ｋｇ、隔日）とタクロリムス（０．１ｍｇ／ｋｇ、毎日）を与えた。両方の群からのデータを、損傷後の時間に対する元の創傷面積のパーセントとして一緒にグラフ化して、図１７に示す用量応答を決定した．Ａ＋Ｆ群のデータは、もともとLin et al. J Invest Dermatol. 2014 Sep; 134(9): 2458-2468（その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に報告された。
【０１３３】
創傷面積の割合を得るために、各群からの動物の各創傷部位を、示した時間間隔でデジタル写真撮影し、Adobe Photoshop（バージョン７．０；Adobe system）を用いて写真上で創傷面積を決定した。経時的な創傷面積の変化は、最初の創傷面積のパーセントとして表した。全ての創傷評価は二重盲検であった。
【０１３４】
創傷は、Ａ＋Ｆ群の動物で手術後１４日目に完全閉鎖に達した。ＡＦ Ｃｏｍｂｏ群の６匹の動物は、Ａ＋Ｆ群の動物と比較して有意により速い治癒を示し、ＡＦ Ｃｏｍｂｏ群の傷は１３日目に完全閉鎖に達した。このようにＡＦ Ｃｏｍｂｏ群は予想外に速い創傷治癒時間を示し、Ａ＋Ｆ群の動物と比較して、投与されたタクロリムスは５０％少なかった（ＡＦ Ｃｏｍｂｏ群の１日おきの０．１ｍｇ／ｋｇに対して、Ａ＋Ｆ群の毎日の０．１ｍｇ／ｋｇ）。従って相乗的ＡＦ併用剤は、例えば、より早い治癒時間を提供すること、有意に少ない用量のタクロリムスを投与すること（これは、免疫抑制の望ましくない副作用をさらに避けることができる）、及び対象に合計の注射回数が少ない点で、Ａ＋Ｆ組合せに対して有利である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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