(57)【要約】  本発明はMIC-1融合タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、ペプチドリンカーを介して結合している、融合タンパク質のC末端におけるMIC-1タンパク質又はそのアナログ及び融合タンパク質のN末端におけるヒトA1AT(A1AT)の機能的バリアントとを含む、融合タンパク質を含む化合物に関する。本発明の化合物はMIC-1活性を有する。本発明はまた、このような化合物及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物、並びに、当該化合物の医学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の融合タンパク質を含む化合物:
A-B-C (I)、
(式中、AはヒトA1AT又はその機能的バリアントである;Bはペプチドリンカーであって、前記ペプチドリンカーは10〜100アミノ酸長である;及び、CはMIC-1タンパク質又はそのアナログである;並びに、ここで、A1ATのC末端又はその機能的バリアントはペプチドリンカーのN末端に融合し、ペプチドリンカーのC末端はMIC-1タンパク質又はそのアナログのN末端に融合している)。
【請求項２】
前記ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]n (ここで、XはAsp又はGluであり;YはAlaであり;mは2から4であり;nは少なくとも5である)を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
前記XがGluである、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
前記mが2〜3であり、前記nが5〜12である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記nが7〜12である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記ペプチドリンカー中に1〜4つのPro残基を含む、請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記リンカー長の約20〜30％を占める前記リンカーの中央部に1〜4つのPro残基を含む、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
前記リンカー中に2つのPro残基を含む、請求項6又は7に記載の化合物。
【請求項９】
前記リンカー中に1つのPro残基を含む、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
前記Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に対して少なくとも85％の同一性を示すMIC-1アナログである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物。  
【請求項１１】
前記Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)に対して少なくとも85％の配列同一性を示すヒトA1ATの機能的バリアントである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドリンカーが25〜100アミノ酸長である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の化合物、又は医薬として許容可能なそれらの塩、アミド、若しくはエステル及び一つ又は複数の医薬として許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。 
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
肥満などの摂食障害の、例えば食物摂取の低減、体重減少、食欲抑制及び満腹感の誘発による、予防並びに/又は治療において使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はα-1-アンチトリプシン(A1AT)融合タンパク質及びその医薬的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
「SEQUENCE LISTING」と題する配列表は、2015年12月21日に作成されたものであり、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
マクロファージ抑制性サイトカイン(MIC-1)は、GDF-15及び胎盤骨形成タンパク質としても知られており、細胞の成長と分化に関わるペプチドホルモンファミリーである、TGF-βファミリーの遠い一員である。MIC-1は、分子量24.5ｋDaのシステインリッチなホモダイマーとして循環している。MIC-1は当初、マクロファージにおいて、IL-1b、TNF-alpha、 IL-2及びTGF-bを含む刺激によって上方制御されることが報告された。MIC-1は、リポ多糖誘導性TNF-alpha産生を低減させることができることも示され、これらのデータに基づいて、MIC-1は抗炎症性サイトカインであることが提案された。最近の研究では、進行癌のヒト患者の体重が減少する理由を調査し、体重減少がMIC-1の循環レベルと相関することを示した。これらの結果は、MIC-1が体重を制御していることを示している。この仮説は、前立腺癌細胞を異種移植されたマウスにおいて検証され、そのデータは、MIC-1レベルの上昇が、体重低下及び食物摂取量の減少に関連しており、この効果は、MIC-1に対する抗体の投与によって逆転したことを示した。組み換えMIC-1をマウスに投与すると、視床下部神経ペプチドY及びプロオピオメラノコルチンが制御されるため、MIC-1は中枢機構によって食物摂取を制御していると提案された。さらには、MIC-1を過剰発現するトランスジェニックマウスは、通常の低脂肪食及び高脂肪食の両方で体重増加及び体脂肪の増加が低減している。また、MIC-1を過剰発現するトランスジェニックマウスは、低脂肪食又は高脂肪食を与えられた両方の場合で、それぞれ、同等の食餌の野生型動物と比較して耐糖能が上昇した。
【０００４】
天然のMIC-1は半減期が短く、このこと天然のMIC-1による治療には有効性を維持するため毎日の投与が必要となることを意味する。
【０００５】
US2012/0094356は、ヒトα-1-アンチトリプシン又はそのバリアントを、医薬的に重要なタンパク質及びペプチドに対する融合に使用することに関する。
【０００６】
WO2005/099746は、MIC-1調節剤の投与により、食欲及び/又は体重を調節する方法に関する。
【０００７】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US2012/0094356
【特許文献２】WO2005/099746
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、介在ペプチドリンカーによってMIC-1に融合するN末端融合パートナーを含む、生物学的に活性な組み換え融合タンパク質の開発に関する。開示された融合タンパク質は、改良された生産容易性、タンパク質の安定性、血漿半減期及び融合タンパク質の生物学的活性の保持等の一連の有利な特徴を併せ持つ。
【００１０】
一つの態様において、本発明は、ペプチドリンカーを介して連結している、融合タンパク質のC末端におけるMIC-1タンパク質又はそのアナログ及び融合タンパク質のN末端におけるヒトα-アンチトリプシン(A1AT)の機能的バリアントを含む融合タンパク質を含む化合物を提供する。ペプチドリンカーは10〜100アミノ酸長を有する。一つの態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列[X-Ym]n(XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2〜4であり、nは少なくとも5である)を含む。
【００１１】
一つの態様において、本発明は、ペプチドリンカーを介して連結している、C末端におけるMIC-1タンパク質又はそのアナログ及び融合タンパク質のN末端におけるヒトA1ATの機能的バリアントを含む融合タンパク質を含む化合物をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】
一つの態様において、本発明は、本発明の化合物又はその医薬として許容可能な塩、アミド若しくはエステル、及び一つ若しくは複数の医薬として許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
一つの態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物を提供する。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、肥満などの摂食障害の治療 (食物摂取量の低減、体重減少、食欲の抑制及び満腹感の誘発などによる)において使用するための本発明の化合物を提供する。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、肥満の治療において使用するための本発明の化合物を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本発明の化合物はMIC-1アゴニストである。一つの態様において、本発明の化合物は食物摂取を抑制する。一つの態様において、本発明の化合物は、体重を減少させる。
【００１７】
一つの態様において、本発明の化合物は、天然のMIC-1の半減期よりも長い半減期を有する。 
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明はMIC-1融合タンパク質を含む化合物に関する。一つの態様において、本発明はMIC-1融合タンパク質に関する。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、ペプチドリンカーを介して連結している、融合タンパク質のC末端におけるMIC-1又はそのアナログ及び融合タンパク質のN末端におけるヒトA1AT又はその機能的バリアントを含む、融合タンパク質を含む化合物を提供する。ペプチドリンカーは10〜100アミノ酸長を有する。一つの態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列[X-Ym]n(XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2〜4であり、nは少なくとも5である)を含む。
【００２０】
本発明の融合タンパク質戦略は、可溶性の安定な血漿タンパク質ヒトα-1-アンチトリプシン(A1AT)と天然のMIC-1とを組み合わせる。ヒトA1ATは、MIC-1の発現収率の向上及び安定性を付与するため、融合パートナーとしての使用に有益となる高い可溶性及び安定性などの特有の性質を有している。融合パートナーとしてのヒトA1ATはまた、顕著なサイズ増加により、MIC-1の血漿半減期を増大させ得る。本発明は、血漿半減期が増大したMIC-1融合タンパク質を含む化合物を提供する。
【００２１】
以下では、ギリシャ文字は、その記号又は対応する表記名で表されてもよい。例えば:α =アルファ; β =ベータ; ε =イプシロン; γ = ガンマ; ω = オメガ;等である。また、ギリシャ文字μは、「u」で表されてもよく、例えば、μl=ul又はμM=uMであってよい。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
MIC-1タンパク質及びアナログ
本明細書において使用される用語「MIC-1」は、GDF-15及び骨形成タンパク質(PLAB)としても知られる、マクロファージ阻害サイトカイン1(MIC-1)を意味する。野生型ヒトMIC-1タンパク質の全長の配列は、UNIPROTデータベースからアクセッション番号Q99988で利用可能である。308アミノ酸の前駆体タンパク質はシグナルペプチド (アミノ酸1〜29)、プロペプチド(アミノ酸30〜196)及び成熟タンパク質(アミノ酸197〜308)を含む。112アミノ酸の成熟MIC-1タンパク質は、配列番号1(SEQ ID NO:1)として本明細書に含まれる。成熟MIC-1は、4つの鎖内ジスルフィド結合及び1つの鎖間ジスルフィド結合を形成して、共有結合した24.5kDaのホモダイマーを生成する、9つのシステイン残基を含む。成熟タンパク質(配列番号1)における、His6Aspに相当する自然突然変異を記載している。
【００２３】
従って、野生型のヒトMIC-1の特定の例は、配列番号1のMIC-1のタンパク質、アミノ酸改変His6Aspを有する配列番号1並びに前にプロペプチド及び/又は上で参照したシグナルペプチドを有する、任意のこれらの配列である。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「MIC-1タンパク質」は、配列番号1のヒトMIC-1タンパク質又はそのアナログを意味する。配列番号1の配列を有するタンパク質は、また、「天然の」MIC-1又は「野生型」MIC-1と命名されてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「MIC-1アナログ」又は「MIC-1タンパク質のアナログ」は、成熟MIC-1タンパク質(配列番号1)のバリアントであるタンパク質又は化合物を意味する。一つの態様において、MIC-1アナログは成熟MIC-1タンパク質(配列番号1)の機能的バリアントである。本発明の一つの態様において、MIC-1アナログは、天然のMIC-1(配列番号1)に対して少なくとも85％、90％又は95％の配列同一性を示す。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、MIC-1アナログは、ヒトの天然のMIC-1(配列番号1)と比較して、17個未満のアミノ酸改変(置換、欠失、付加(挿入を含む)及びこれらの任意の組合せ)を含む。2つのアナログ間の配列同一性を決定するための方法の例として、2つのペプチドHis6Asp MIC-1及び天然MIC-1を配列比較する。天然のMIC-1に対するHis6Asp MIC-1アナログの配列同一性は、配列比較された同一の残基数から異なる残基数を減じ、天然のMIC-1の残基の総数で除算することによって得られる。従って、前記の例において、配列同一性は(112-1)/112である。
【００２７】
本出願全体において使用される用語「アミノ酸改変」は、天然のMIC-1(配列番号1)と比較した、アミノ酸への改変を意味する。この改変は、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸への置換、又はペプチドのアミノ酸に共有結合する置換基への置換の結果であり得る。
【００２８】
置換
一つの態様において、アミノ酸は、保存的置換により置換されてよい。本明細書において使用される、用語「保存的置換」は、一つ又は複数のアミノ酸が、類似の生物物理学的特性を有する別の残基によって置き換わることを意味する。例としては、類似の特性を有するアミノ酸残基(例えば、小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び芳香族アミノ酸を含む)の置換が挙げられる。
【００２９】
一つの態様において、MIC-1アナログは、一つ又は複数の非天然及び/又は非アミノ酸、例えば、疑似アミノ酸のMIC-1配列への置換を含んでよい。
【００３０】
欠失及び短縮
一つの態様において、本発明のMIC-1アナログは、ヒトMIC-1アミノ酸配列からの一つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を、単独で、又は、一つ若しくは複数の挿入若しくは置換と組合せて有してよい。
【００３１】
挿入
一つの態様において、本発明のMIC-1アナログは、ヒトMIC-1アミノ酸配列への一つ若しくは複数のアミノ酸残基の挿入を、単独で、又は一つ若しくは複数の欠失及び/若しくは置換と組み合わせて有してよい。
【００３２】
一つの態様において、本発明のMIC-1アナログは、一つ若しくは複数の非天然アミノ酸及び/又は非アミノ酸のMIC-1配列への挿入を含んでよい。
【００３３】
MIC-1アナログは、i)変化しているアミノ酸残基に対応する成熟MIC-1タンパク質中のアミノ酸残基数(すなわち、天然のMIC-1における対応する位置)、及び、ii)実際の変化を参照して記載されてよい。換言すれば、MIC-1アナログは、天然のMIC-1（配列番号1）と比較して多くのアミノ酸残基が変化したMIC-1タンパク質である。これらの変化は、独立して、一つ又は複数のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を表してよい。
【００３４】
以下は、適切なアナログ命名法の非限定的な例である。His6Asp MIC-1は、天然に存在する6位のヒスチジンがアスパラギン酸で置換されている、天然のヒトMIC-1を表す。
【００３５】
上記の例から明らかなように、アミノ酸残基は、その完全名、それらの1文字コード及び/又は3文字コードによって同定することができる。これら3つの方法は完全に同等である。
【００３６】
用語「タンパク質」は、例えば、MIC-1タンパク質の文脈において使用される場合は、アミド(又はペプチド)結合によって内部結合された一連のアミノ酸を含む化合物を意味する。
【００３７】
アミノ酸はアミノ基及びカルボン酸基並びに場合により、しばしば側鎖として表される一つ又は複数の追加的な基を含む分子である。
【００３８】
用語「アミノ酸」は、コードされた(又はタンパク新生の若しくは天然の)アミノ酸(20の標準アミノ酸の中の)、及び、コードされていない(又は非タンパク新生若しくは非天然の)アミノ酸を含む。コードされたアミノ酸は、自然にタンパク質内に組み込まれるものである。標準アミノ酸は遺伝的コードによってコードされるものである。非コードアミノ酸は、タンパク質中に見出されず、又標準的な細胞機構によって産生されない(例えば、それらは翻訳後修飾を受けている可能性がある)。以下では、光学異性体が記載されていないMIC-1タンパク質のすべてのアミノ酸は、特に特定しない限りは、L-アミノ酸を意味するものと理解されるべきである。
【００３９】
α-1-アンチトリプシン
本発明はα-1-アンチトリプシン(A1AT)のMIC-1に対する融合パートナーとしての使用に関する。A1ATは、分子サイズ394アミノ酸で高度に規則正しい球状構造を有するプロテイナーゼインヒビターである。A1ATは3つのN-結合型グリコシル化部位のために異なるグリコフォームを示し、このことが天然に発生する異種性をタンパク質に付与する。A1ATの多型バリアントのいくつかが見いだされ、そのうちのいくつかは生物学的活性に影響しないが、その他のものはヒトの疾患につながるA1AT機能不全であった。正常な非病原性バリアントの例は、Val213Alaである。疾患を引き起こすバリアントの例はGlu342Lysである。A1ATの主な機能は、肺における好中球プロテアーゼ酵素 (例えば炎症の存在下で好中球によって産生される好中球エラスターゼ) の作用のバランスを保つことである。A1ATは、重症肺気腫のための補充療法に使用されている。従って、A1AT単独での治療は、十分に実証されており、融合タンパク質の野生型A1AT部分による毒物学的事象は限定的であり得る。 本発明の一部として、A1ATはMIC-1の融合パートナーとして評価され、A1ATとMIC-1との間のリンカー領域における構造/生物物理学的変異が探究される。
【００４０】
ヒト血清アルブミン(HSA)又はFcドメイン(ヒトIgGの定常ドメイン)等の融合パートナーは、治療用タンパク質のN-又はC-末端に融合されたとき、血漿半減期を延長することが出来ることが十分に立証されている。HAS又はFc等の、血漿半減期を延長するためのよく知られた融合パートナーは最大3週間の非常に長い半減期を有するのに対し、A1ATの血漿半減期は約6日間である。A1ATは、エンドソームからのリサイクルを可能にするFc新生児受容体に結合せず、従って、融合パートナーとして使用された場合、MIC-1により短い血漿半減期を付与する可能性が最も高い。
【００４１】
治療用タンパク質に大きな融合パートナーを添加すると、下流のプロセシングで取り扱いが困難となる不安定な融合タンパクをもたらす場合があるため、問題となり得る。従って、重要なパラメータは、発現の容易性、融合タンパク質の安定性、生物学的活性の維持及び一般的な生産コストである。目的の治療用タンパク質を含む、組み換えA1ATタンパク質は、例えば、A1ATをコードする遺伝子又はその断片が、治療用タンパク質をコードするDNAへの連結されるような遺伝子操作によって得られてよい。適切な発現宿主に、その後、適切なプラスミドをコードする融合ヌクレオチド配列が形質転換又は形質移入(トランスフェクション)され、融合タンパク質が発現する。融合パートナーとしてのヒトA1ATは、腎クリアランスを阻害し、循環中で分子がより長く存在することを可能にする顕著なサイズ増加により、治療用タンパク質の血漿半減期を増大させると考えられている。野生型A1AT(短縮型及び/又はアミノ酸置換機能的バリアント)と同様の血漿半減期延長効果を有する、A1ATの機能的バリアントを設計することが出来る。A1ATの新しいバリアントの設計は、それらが有益な方法で融合タンパク質の性質を変化させることが出来るため、有利であり得る。天然のA1ATは多くのグリコフォームを含む。発現宿主において、組み換えにより均一な融合タンパク質産物を生成する点で、分子中のグリコシル化部位の数を減らすことは有利であり得る。
【００４２】
A1ATはまた、232位に遊離のCysを含むが、これは凝集問題を引き起こし、分子の生物物理学的安定性に影響し、アミノ酸置換によって除去することが出来る。
【００４３】
A1ATは生物学的に活性なプロテアーゼインヒビターであり、主な機能は、肺における好中球プロテアーゼ酵素 (例えば炎症の存在下で好中球によって産生される好中球エラスターゼ) の作用のバランスを保つことである。生物学的活性が融合タンパク質に有益であり得るが、A1ATの生物学的効果がMIC-1融合タンパク質の所望の薬理学的性質を妨げる場合、この活性を除去することが望ましくなることもある。このことは、生産可能性、安定性及び延長効果に関する利点を保持しつつ、A1ATのポリマー形成の可能性を阻害する方法で、A1ATにおける反応部位ループの突然変異誘発により行うことが出来る。組み換え体産生のためのチャレンジを引き起こす可能性があるアミノ酸残基、非限定的な例では酸化を受けやすいメチオニン残基及び単一のCys232を置換することが望ましい。
【００４４】
野生型成熟ヒトA1AT配列は、配列番号2(SEQ ID NO:2)として本明細書に含まれており、当該配列は、Uniprotデータベースに登録番号：P01009で注釈が付けられている。本発明は、生物学的に活性なMIC-1タンパク質も若しくはそのバリアント及び生物学的に活性な及び/もしくは治療的に活性のあるヒトA1ATの断片若しくはバリアントを含む、又はそれらから成るヒトA1AT融合タンパク質を提供する。一つの態様において、本発明は、天然の成熟MIC-1及び天然の成熟ヒトA1ATを含む、又はそれらから成るA1AT融合タンパク質を提供する。
【００４５】
本明細書において「機能的バリアント」は、元のタンパク質を同じ機能を実質的に保持している、あるタンパク質の化学的バリアントを意味する。
【００４６】
融合タンパク質
本明細書において「融合タンパク質」は、少なくとも2種の遺伝子の核酸配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質を意味する。一つの態様において、本発明の融合タンパク質は、対象となる薬学的活性を有する天然のMIC-1と融合した、融合パートナーとしてヒトA1ATを含む。融合タンパク質はしばしば、組み換え体の発現及び治療用タンパク質の安定性向上、並びに、そのようなタンパク質の細胞培養中からの回収及び精製の改善のために使用される。融合タンパク質は、リンカー配列などの人工配列を含んでよい。
【００４７】
本明細書において「融合パートナー」は融合タンパク質の一部であるタンパク質、すなわち、融合タンパク質に包含される少なくとも2種のタンパク質の一つ、を意味する。
【００４８】
本発明の一つの態様において、融合パートナーは、分子量約12kDaのMIC-1(配列番号1)のN末端又はその機能的バリアントに、異なる長さ、電荷及び/若しくは構造的モチーフのアミノ酸配列から成るインタードメインリンカー領域を介して作動可能に連結された、分子量約52kDa (配列番号2)のA1AT又はその機能的バリアントを含む。
【００４９】
本明細書において「融合タグ」は、融合タンパク質の一部、すなわち、融合タンパク質に含まれる少なくとも2種のタンパク質のうちの一つのタンパク質配列、を意味し、融合タンパク質の発現、安定化又は精製を改善する配列、例えば、6Xヒスチジンタグ(His6等)、若しくは可溶化ドメイン(Dsbc (Thiol:disulfide interchange protein)、マルトース結合タンパク質MBP(Maltose Binding Protein)、若しくはチオレドキシンTrx(Thioredoxin)を含む。
【００５０】
本発明の一つの態様において、約60kDaのサイズを有するNH2-A1AT-リンカー-MIC-1-COOHのモノマーは、二つのMIC-1分子の間の鎖間ジスルフィド架橋を介して天然分子としてホモ二量体を形成し、分子量約120kDaの活性なA1AT-MIC-1融合タンパク質を形成する(図1に模式図として示す)。
【００５１】
ペプチドリンカー
本明細書において使用される、用語「ペプチドリンカー」は、典型的には、融合タンパク質の機能、フォールディング又は発現を促進するために使用されるアミノ酸配列を意味する。融合タンパク質の形態にある二つのタンパク質は、相互の機能的活性が相互作用していてもよく、相互作用はしばしば、二つのタンパク質配列の間にリンカーを挿入することによって、除去又は低減され得ることは、当該技術分野において公知である。
【００５２】
融合タンパク質中に含まれるMIC-1タンパク質のMIC-1タンパク質推定受容体への暴露、血漿半減期又は融合タンパク質全体の安定性は、融合タンパク質のリンカー配列/構造の違いによって影響され得る。
【００５３】
本発明によるリンカーは、リンカーの長さの変化（リンカー中のアミノ酸の数の変化）を含む、異なる予測された生物物理学的又は構造的性質、並びに、予測されたαへリックス構造などの二次構造、リジッドな構造若しくはフレキシブル構造、ランダムコイル構造若しくは電荷又はそれらの組合せ、例えば、フレキシブルなリンカーのN末端部分又はαへリックス構造を組み合わせたリジッドなリンカーのN末端部分若しくはリジッドなリンカーを有するように設計された。本発明は、リンカーの中央部又はリンカーのN末端のいずれかに位置する1〜4個の隣接するPro残基を含むリンカーの組合せを含み、これは、プロリンの強固な立体構造のために、プロリン残基に隣接する領域の二次構造に影響する。A1ATの構造は、C末端がタンパク質のコア骨格に近接していることを示している。リンカー長は、生物学的活性を有するMIC-1ドメインに結合した融合パートナーによって提供される立体障害の可能性を変えることによって、A1ATとMIC-1ドメインの間の潜在的な相互作用に影響し得る。立体障害は、融合タンパク質モノマーの二つのドメインの正確なフォールディング、ダイマーの形成又はMIC-1部分と推定受容体との相互作用に影響し得る。
【００５４】
機能特性
生物学的活性-インビトロ薬理
一つの態様において、本発明の化合物はインビボにおいて強力であり、これは適切な動物モデル及び臨床試験において、当業界で公知の通りに決定されてよい。 
【００５５】
非肥満Sprague Dawleyラットは、適切な動物モデルの一例であり、食物摂取の変化はこのようなラットにおいて、インビボ、例えば実施例2に記載の通りに決定されてよい。
【００５６】
一つの態様において、本発明の化合物は非肥満Sprague Dawleyラットにおいて、インビボで食物摂取を抑制する。
【００５７】
一例として、本発明の特定の実施形態において、7日間にわたって記録した24時間食物摂取量の最も有意(p<0.10)な減少である最大有効性は、少なくとも10％又は少なくとも15％でなければならない。
【００５８】
一例として、本発明の特定の実施形態において、24時間の食物摂取量の有意(p<0.10)な減少の総計である累積有効性は、ビヒクルと比較して、少なくとも10％又は少なくとも30％でなければならない。
【００５９】
生物物理学的特性
一つの態様において、本発明の化合物は、優れた生物物理学的特性を有する。これらの特性は、物理学的安定性及び/又は可溶性を含むがこれらに限られない。これら及び他の生物物理学的安定性は、タンパク質化学の分野で公知の標準的な方法を用いて測定されてよい。特定の実施形態において、これらの特性は、天然MIC-1(配列番号1)と比較して改善される。天然MIC-1と比較した、融合タンパク質の生物物理学的安定性の向上は、少なくとも部分的には融合パートナーの安定化効果に起因し得る。
【００６０】
産生方法
本発明のもののような融合タンパク質は、当業者に公知の組み換えタンパク質技術によって産生されてよい。一般的には、対象となるタンパク質又はその機能的バリアントをコードする核酸配列は、所望の融合タンパク質をコードするよう改変される。この改変は、融合タンパク質として発現された二つ以上のタンパク質をコードする核酸配列のインフレーム融合を含む。このような融合タンパク質は、リンカーペプチドを有する又は有さず、融合タグ、例えばヒスチジンタグ(His6等)又は可溶化ドメイン(Dsbc、MBP若しくはTrx)に融合された融合タンパク質である。その後、改変された配列は、発現ベクターに挿入され、次いで発現宿主細胞に形質転換又は形質移入(トランスフェクション)される。
【００６１】
融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトは、適切には、ゲノムDNA、cDNA又は合成起源であってよい。アミノ酸配列の変更は、周知の技術により遺伝コードを改変することによって達成される。
【００６２】
融合タンパク質をコードするDNA配列は通常、組み換えDNA手法に好都合に供されてよい任意のベクターであってよい組み換えベクターに挿入され、当該ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外に独立して存在し、その複製は染色体の複製とは独立している、すなわち、プラスミドであってよい。また、ベクターは、宿主に組み込まれた際に宿主細胞のゲノムに統合され、それが総合された染色体と共に複製されたものであってもよい。
【００６３】
ベクターは、好ましくは、融合タンパク質をコードするDNA配列が作動可能にDNAの翻訳に必要となる更なるセグメントに連結している、発現ベクターである。用語「作動可能に連結された」とは、セグメントが意図する目的(例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、ポリペプチドをコードするDNA配列を通過して、転写終結で終端するまで進行する)に沿うよう機能するように配列されることを意味する。
【００６４】
従って、融合タンパク質の発現において使用するための発現ベクターは、クローン遺伝子又はcDNAの転写を開始又は促進することが出来るプロモーターを含む。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
【００６５】
さらに、融合タンパク質の発現のための発現ベクターはまた、宿主細胞により認識されて転写を終了させる配列である、転写終結配列を含む。転写終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に結合している。選択された宿主細胞内で機能する任意の転写終結配列が、本発明において使用されてよい。
【００６６】
融合タンパク質の発現は、宿主細胞のサイトゾルにおける細胞内発現を目的とし得、又は、増殖培地への細胞外発現のための分泌経路に導かれ得る。
【００６７】
細胞内発現は、デフォルト経路であり、プロモーターを含むDNA配列、次に融合タンパク質をコードするDNA配列、その次に転写終結配列を有する発現ベクターを必要とする。
【００６８】
融合タンパク質を宿主細胞の分泌経路に導くために、融合タンパク質のN末端伸長部分として分泌シグナル配列(シグナルペプチド又はプレ配列としても知られる)が必要である。シグナルペプチドをコードするDNA配列は、 正しいリーディングフレームで融合タンパク質をコードするDNA配列の5’末端に連結される。シグナルペプチドは、通常、当該タンパク質に関連するものであってもよく、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来であってもよい。
【００６９】
融合タンパク質、プロモーター、転写終結配列及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれコードするDNA配列を連結し、それらを複製に必要な情報を有する適切なベクターに挿入するために使用される手法は、当業者に周知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989参照)。
【００７０】
融合タンパク質をコードするDNA配列が導入される宿主細胞は、細胞内又は細胞外のいずれかで融合タンパク質を発現することが出来る任意の細胞であってよい。融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするDNA配列を含み、融合タンパク質を発現させることが出来る宿主細胞を、適切な栄養培地において、融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養することにより、産生され得る。融合タンパク質の発現に適する宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、及びヒト胚性腎臓(human embryonic kidney (HEK))細胞株、ベビーハムスター腎臓(Baby Hamster Kidney (BHK))細胞株、又はチャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary (CHO))細胞株である。翻訳後修飾が必要な場合は、適切な宿主細胞は、酵母、カビ、昆虫及び哺乳類細胞などの高等真核細胞を含む。
【００７１】
宿主内で融合タンパク質が発現された後は、従来技術を用いて、回収され、必要な純度に精製されてよい。このような従来の回収及び精製技術の非限定的な例は、遠心分離、可溶化、濾過、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)、ゲル濾過、及び凍結乾燥である。
【００７２】
組み換え体の発現と融合タンパク質の精製の例は、例えば、CordingleyらによるJ. Virol. 1989, 63, 第5037-5045頁、BirchらによるProtein Expr Purif., 1995, 6, 第609-618頁及び WO2008/043847に見ることができる。
【００７３】
微生物発現と融合タンパク質の精製の例は、例えば、ChichらによるAnal. Biochem, 1995, 224, 第245-249頁及びXinらによるProtein Expr. Purif. 2002, 24, 第530-538頁に見ることができる。
【００７４】
本発明の多数の化合物の調製方法の具体例は、実施例に含まれる。
【００７５】
投与形態
用語「治療」は、関連する疾患、障害又は状態の予防及び最小化の両方を含むことを意味する(すなわち、「治療」は、明示されるか文脈上明らかに矛盾していない限り、本発明の化合物又は本発明の組成物の予防的及び治療的投与の両方に関する)。
【００７６】
投与経路は、本発明の化合物を、体内の所望の又は適切な場所に効率的に移送する、例えば非経口的(皮下、筋肉内又は静脈内等)な、任意の経路であってよい。あるいは、本発明の化合物は、経口、経肺、直腸内、経皮、口腔内、舌下又は経鼻投与され得る。
【００７７】
本発明の化合物の投与量、本発明の化合物の投与頻度の決定及び任意で薬学的に活性な他の剤と一緒に投与される本発明の化合物の選択は、肥満及び関連疾患の治療に精通している医師と相談して決定される。
【００７８】
医薬組成物
本発明の化合物又は医薬として許容可能なその塩、アミド若しくはエステル及び医薬として許容可能な賦形剤は、当業者に公知の通りに調製されてよい。
【００７９】
用語「賦形剤」は、広範には、活性な治療成分以外の任意の成分を意味する。賦形剤は、無活性物質(inert substance)、不活性物質(inactive substance)及び/又は医薬活性ではない物質であってよい。
【００８０】
賦形剤は様々な目的(例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助として、並びに/又は、投与を改善する及び/若しくは活性物質の吸収を改善する)を果たしてよい。
【００８１】
薬学的に活性な成分と様々な賦形剤の製剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (例えば第19版(1995)及びそれ以降の版)に記載されており、当業者に公知である。
【００８２】
用語「物理学的安定性」は、ポリペプチドが、熱-機械的ストレスに暴露された結果、並びに/又は、不安定な界面及び表面(疎水性表面など)と相互作用した結果、生物学的に不活性及び/又は不溶性の凝集体を形成する傾向を意味する。水性ポリペプチド製剤の物理学的安定性は、様々な温度で様々な時間、機械的/物理学的ストレス(例えば撹拌)に暴露した後、目視による調査及び/又は濁度測定によって評価されてよい。あるいは、物理学的安定性は、例えばチオフラビンT又は「疎水性パッチ」プローブ等の、ポリペプチドの配座状態の分光剤又はプローブを用いて評価されてよい。
【００８３】
用語「化学的安定性」は、インタクトなポリペプチドと比較して、生物学的効果が減少した及び/若しくは免疫学的効果が増大した化学的分解産物の形成をもたらず、ポリペプチド構造における化学的(特に共有結合の)変化を意味する。化学的安定性は、様々な環境条件に暴露された後、様々な時点での化学的分解物の量を、例えば、SEC-HPLC及び/又はRP/HPLCで測定することによって評価され得る。
【００８４】
組合せ治療
本発明の化合物での治療はまた、一つ又は複数の薬理学的に活性な物質、例えば、抗肥満剤、食欲調節剤、並びに、肥満に起因する若しくは肥満に関連する合併症及び障害を治療及び又は予防する剤から選択されるものと組み合わされてもよい。
【００８５】
医薬の適応症
一つの態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物に関する。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明の化合物は以下の医学的治療に使用されてよい：
(i)肥満などの摂食障害の、例えば食物摂取の低下、体重減少、食欲抑制、満腹感の誘発による予防及び/又は治療。
(ii)高血糖及び/又は耐糖性異常の予防及び/又は治療。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】A1AT-MIC-1二量体融合タンパク質の模式図。A、B及びCは、それぞれA1ATドメイン、リンカー領域及びMIC-1の相対的位置を示す。-SS-は、2つのA1AT-MIC-1モノマーを一緒に連結して機能的二量体融合タンパク質を形成する鎖間ジスルフィド架橋を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
本発明はさらに以下の非限定的な発明の実施形態によって記載される:
1. 式(I)の融合タンパク質を含む化合物:
A-B-C (I)、
(式中、AはヒトA1AT又はその機能的バリアントである;Bはペプチドリンカーであって、前記ペプチドリンカーは10〜100アミノ酸長である;及び、CはMIC-1タンパク質又はそのアナログである;並びに、ここで、A1ATのC末端又はその機能的バリアントはペプチドリンカーのN末端に融合し、ペプチドリンカーのC末端はMIC-1タンパク質又はそのアナログのN末端に融合している)。
【００８９】
2. ペプチドリンカーが25〜100、25〜50又は30〜50アミノ酸長である、実施形態1に記載の化合物。
【００９０】
3. ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]n (ここで、XはAsp又はGluであり;YはAlaであり;mは2から4であり;nは少なくとも5である)を含む、実施形態1又は2に記載の化合物。
【００９１】
4. 化合物が、MIC-1タンパク質又はそのアナログの間の鎖間ジスルフィド架橋によって形成される、式(I):
A-B-C (I)
の二つの融合タンパク質のホモダイマーである、実施形態1〜3のいずれか一つに記載の化合物。
【００９２】
5. XがAspである、実施形態1〜4のいずれか一つに記載の化合物。
【００９３】
6. XがGluである、実施形態1〜5のいずれか一つに記載の化合物。
【００９４】
7. mが2〜3であり、nが5〜12である、実施形態3〜6のいずれか一つに記載の化合物。
【００９５】
8. nが10である、実施形態3〜7のいずれか一つに記載の化合物。
【００９６】
9. nが12である、実施形態3〜7のいずれか一つに記載の化合物。
【００９７】
10. リンカー中にPro残基を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。  
【００９８】
11. リンカー中に1〜4つのPro残基を含む、実施形態1〜10のいずれか一つに記載の化合物。
【００９９】
12. リンカー中に4つのPro残基を含む、実施形態11に記載の化合物。
【０１００】
13. リンカー中に3つのPro残基を含む、実施形態11に記載の化合物。
【０１０１】
14. リンカー中に2つのPro残基を含む、実施形態11に記載の化合物。
【０１０２】
15. リンカー中に1つのPro残基を含む、実施形態11に記載の化合物。
【０１０３】
16. Pro残基がリンカーのN末端に位置する、実施形態10〜15のいずれか一つに記載の化合物。
【０１０４】
17. Pro残基がリンカーの末端に位置しない、実施形態10〜15のいずれか一つに記載の化合物。
【０１０５】
18. リンカー長の約20〜30％を占めるリンカーの中央部に1〜4つのPro残基を含む、実施形態10〜15のいずれか一つに記載の化合物。
【０１０６】
19. リンカー長の約20〜30％を占めるリンカーの中央部に2つのPro残基を含む、実施形態18に記載の化合物。
【０１０７】
20. リンカー長の約20〜30％を占めるリンカーの中央部に1つのPro残基を含む、実施形態18に記載の化合物。
【０１０８】
21. リンカー長の約10〜20％を占めるリンカーの中央部に1〜4つのPro残基を含む、実施形態10〜15のいずれか一つに記載の化合物。
【０１０９】
22. リンカー長の約10〜20％を占めるリンカーの中央部に2つのPro残基を含む、実施形態21に記載の化合物。
【０１１０】
23. リンカー長の約10〜20％を占めるリンカーの中央部に1つのPro残基を含む、実施形態21に記載の化合物。
【０１１１】
24. リンカー長の約5〜10％を占めるリンカーの中央部に1〜4つのPro残基を含む、実施形態10〜15のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１２】
25. リンカー長の約5〜10％を占めるリンカーの中央部に2つのPro残基を含む、実施形態24に記載の化合物。
【０１１３】
26. リンカー長の約5〜10％を占めるリンカーの中央部に1つのPro残基を含む、実施形態24に記載の化合物。
【０１１４】
27. ペプチドリンカーが、EAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE (配列番号8(SEQ ID NO:8))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１５】
28. ペプチドリンカーが、GGSSEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE (配列番号9(SEQ ID NO:9))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１６】
29. ペプチドリンカーが、PPPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE (配列番号10(SEQ ID NO:10))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１７】
30. ペプチドリンカーが、PPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE (配列番号13(SEQ ID NO:13))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１８】
31. ペプチドリンカーが、PPEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEAAEE (配列番号14(SEQ ID NO:14))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１１９】
32. ペプチドリンカーが、EAAEAAEAAEAAEAAEAAEPEAAEAAEAAEAAEAAEAAE (配列番号15(SEQ ID NO:15))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２０】
33. ペプチドリンカーが、EAAEAAEAAEAAEAAEAAEPPEAAEAAEAAEAAEAAEAAE (配列番号16(SEQ ID NO:16)) を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２１】
34. ペプチドリンカーが、EAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEE (配列番号17(SEQ ID NO:17))を含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２２】
35. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に対して少なくとも85％の同一性を示すMIC-1アナログである、実施形態1〜34のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２３】
36. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に対して少なくとも90％の同一性を示すMIC-1アナログである、実施形態1〜35のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２４】
37. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に対して少なくとも95％の同一性を示すMIC-1アナログである、実施形態1〜36のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２５】
38. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)と比較して最大17個のアミノ酸改変を有するMIC-1アナログである、実施形態1〜37のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２６】
39. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)と比較して最大11個のアミノ酸改変を有するMIC-1アナログである、実施形態1〜38のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２７】
40. Cが、天然のMIC-1(配列番号1)と比較して最大5個のアミノ酸改変を有するMIC-1アナログである、実施形態1〜39のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２８】
41. Cが、Asn3がGluで置換されたMIC-1アナログ(配列番号19)である、実施形態1〜40のいずれか一つに記載の化合物。
【０１２９】
42. Cが、成熟ヒトMIC-1(配列番号1)である、実施形態1〜40のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３０】
43. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)に対して少なくとも85％の配列同一性を示すヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜42のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３１】
44. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)に対して少なくとも90％の配列同一性を示すヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜43のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３２】
45. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)に対して少なくとも95％の配列同一性を示すヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜44のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３３】
46. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)の232位に対応する位置においてシステイン以外の別のアミノ酸を含むヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜45のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３４】
47. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)の232位に対応する位置においてアラニン又はセリンを含むヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜45のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３５】
48. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)の232位に対応する位置においてアラニンを含むヒトA1ATの機能的バリアントである、実施形態1〜45のいずれか一つに記載の化合物。  
【０１３６】
49. Aが、野生型ヒトA1AT(配列番号2)である、実施形態1〜45のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３７】
50. 融合パートナーを更に含む、実施形態1〜49のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３８】
51. N末端融合パートナーを更に含む、実施形態1〜50のいずれか一つに記載の化合物。
【０１３９】
52. MIC-1アゴニストである、実施形態1〜51のいずれか一つに記載の化合物。
【０１４０】
53. 食物摂取量を低減させることができる、実施形態1〜52のいずれか一つに記載の化合物。
【０１４１】
54. 非肥満Sprague Dawleyラットでの単回用量試験において決定された、食物摂取量をインビボで低減させるのに有効である、実施形態1〜53のいずれか一つに記載の化合物。
【０１４２】
55. Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号15のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４３】
56. Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号16のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４４】
57. Aが配列番号20のヒトA1ATであり、Bが配列番号15のペプチドリンカーであり、Cが配列番号19の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４５】
58. Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号17のペプチドリンカーであり、及びCが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４６】
59. 式(I)のHisタグ融合タンパク質から成り、当該Hisタグが配列番号3のHisタグであり、Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号15のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４７】
60. 式(I)のHisタグ融合タンパク質をから成り、当該Hisタグが配列番号3のHisタグであり、Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号16のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４８】
61. 式(I)のHisタグ融合タンパク質を構成し、当該Hisタグが配列番号3のHisタグであり、Aが配列番号20のヒトA1ATであり、Bが配列番号15のペプチドリンカーであり、Cが配列番号19の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１４９】
62. 式(I)のHisタグ融合タンパク質を構成し、当該Hisタグが配列番号3のHisタグであり、Aが配列番号2のヒトA1ATであり、Bが配列番号17のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
【０１５０】
63. 実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物、又は医薬として許容可能なそれらの塩、アミド、若しくはエステル及び一つ又は複数の医薬として許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。 
【０１５１】
64. 医薬として使用するための、実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５２】
65. 肥満などの摂食障害の、例えば食物摂取の低減、体重減少、食欲抑制及び満腹感の誘発による、予防並びに/又は治療において使用するための、実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５３】
66. 肥満の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５４】
67. 肥満などの摂食障害の、例えば食物摂取の低減、体重減少、食欲抑制及び満腹感の誘発による治療のための医薬の製造における、実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物の使用。
【０１５５】
68. 肥満の治療のための医薬の製造における、実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物の使用。
【０１５６】
69. 薬学的に活性な量の実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物の投与による、例えば食物摂取の低減、体重減少、食欲抑制及び満腹感の誘発による、肥満などの摂食障害の治療又は予防方法。
【０１５７】
70. 薬学的に活性な量の実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物の投与による肥満の治療又は予防方法。
【０１５８】
71. 実施形態1〜62のいずれか一つに記載の化合物をコードするポリヌクレオチド分子。
【実施例】
【０１５９】
この実施例の項目は、略語のリストから始まり、本発明の化合物の調製、精製及び特性評価の一般的方法を含むセクションが続く。次に、これらの融合タンパク質の活性及び性質に関連する実施例(見出しが薬理学的方法であるセクション)が続く。当該実施例は本発明を理解するのに役立つ。
【０１６０】
略語リスト
「メインピーク」は、ミリ当量単位で最も高いUV強度を有し、融合タンパク質を含む、精製クロマトグラムにおけるピークである。
HPLCは、高速液体クロマトグラフィーである。
SDS-PAGEは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
IMACは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーである。
SECは、サイズ排除クロマトグラフィーである。
MSは、マススペクトロメトリーである。
【０１６１】
材料と方法
要するに、融合タンパク質の一般的な設計は、N末端のヒトA1AT、リンカー領域及びC末端の野生型MIC-1の、3つの部分を含む。哺乳動物細胞中での発現に適したプラスミド骨格pTT5が本発明において使用され、これは以前にも記載されている(Shiら, Biochemistry 2005, 44, 第15705-15714頁)。融合タンパク質をコードする配列に加えて、すべてのプラスミドは、融合タンパク質のN末端部分をコードする領域のすぐ上流にある、組み換え融合タンパク質の増殖培地中への分泌を可能にするCD33分泌シグナル配列をコードしていた。タンパク質精製を容易にするため、すべてのコンストラクトは6×Hisタグ(His6)を融合タンパク質のN末端において含んだ。前記融合パートナーで広範囲の様々なアミノ酸リンカーを試験し、それらがタンパク質の総収量にエ移調するかどうかを調べた。
【０１６２】
融合タンパク質は、技術水準の組換えタンパク質技術方法によって調製した。融合タンパク質をコードするプラスミドは、関連配列の遺伝子合成に基づくストラテジーとpTT5哺乳動物発現ベクター(Genescript Inc)へのサブクローニングを用いることで得られ、その発現収率を、発現宿主系としてヒト腎臓胚細胞(HEK)(Expi293F、Invitrogen)を用いて、まず小規模で評価した。発現した融合タンパク質は、振盪フラスコでスケールアップし、HisTrap Excelカラムによる捕捉及び続くSuperdex 200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)から構成される二段階自動クロマトグラフィーを用いて精製した。画分を、メインピークの前に溶出する生成物関連不純物による汚染を避けるようにプールした。
【０１６３】
方法を以下に詳述する。
【０１６４】
精製の一般的方法
融合コンストラクトの小規模スクリーニング及び発現
各コンストラクトの発現レベルは、Expi293(発現培地) (Life Technologies(商標) #A1435101)中で増殖させた、2ml懸濁培地中のヒト腎臓胚細胞(HEK)(Expi293F(商標)、Life Technologies(商標)#A14527)へのプラスミドの一過性トランスフェクションによって決定した。Expi293細胞は、使い捨ての24ウェルのマルチウェルブロック(Axygen, #P-DW-10ml-24-C-S)中で、37℃、8％CO2、湿度80％で培養した。振盪速度は、Infors Multitron Cellインキュベーターで50mm軌道投下、200rpmであった。各トランスフェクションについては、100 ulのトランスフェクション培地(Opti-MEM(登録商標) I (1x) + GlutaMAX(商標)-I 血清低減培地, Life technologies(商標) #51985-026)中2μg DNA及びトランスフェクション培地中5.4μlのExpiFectamine(商標)293試薬(ExpiFectamine(商標) 293 Transfection Kit, Life technologies(商標) #A14525)を、製造者の指示書に従って使用した。トランスフェクション後16〜20時間で、培養物に、10μlのエンハンサー1及び100μlのエンハンサー2（ExpiFectamine（商標）293 Transfection Kit、Life technologies（商標）＃A14525）を加えた。トランスフェクション後4〜6日で、細胞培養物を4000g、10分間の遠心分離によって回収し、清澄化された培養培地を、タンパク質発現のさらなる分析に使用した。
【０１６５】
各融合タンパク質の生産容易性は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)工程を用いた小規模精製スクリーニングによって評価した。精製したタンパク質溶液は、サンプルを還元することなくSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲル(Novex(登録商標) NuPAGE(登録商標) 4-12% Bis-Tris midiタンパク質ゲル, 26ウェル, Life Technologies(商標) #WG1403BOX)で泳動し、得られたタンパク質バンドをクマシー染色(InstantBlue(商標), Expedeon #ISBL1L)で可視化した。結果は、有効性のインビボ評価のために十分なタンパク質を提供するために、各コンストラクトに必要な細胞培養量を決定するために用いられた。
【０１６６】
A1AT-MIC-1融合タンパク質のスケールアップ発現
MIC-1融合タンパク質をコードするプラスミドでOneShot(登録商標) Top10F´化学的コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(OneShot(登録商標) Top10F´, Life Technologies(商標) #C303003, 又は XL1-Blueコンピテントセル, Agilent technologies, #200249)を形質転換し、Amp/Carb選択寒天プレート培地でコロニーを成長させ、形質転換体をTerrific Broth (TB)培養液に植菌するために使用した。一晩培養した後、大腸菌(E.coli)細胞のペレットを大規模プラスミド調製(EndoFree(登録商標)  Plasmid Mega Kit, Qiagen(登録商標) #12381)に使用した。
【０１６７】
一過性発現は、OptiMEM(登録商標)トランスフェクション培地(50 ml/L細胞培養物)中のプラスミドDNA(1mg/L細胞培養物)を、OptiMEM(登録商標)トランスフェクション培地(50 ml/L細胞培地)中のExpiFectamine(商標)293試薬(2.7 ml/lL細胞培養物)に添加し、10〜20分間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを細胞培養物(Expi293F細胞 3×106細胞/ml)に添加することによって実施した。トランスフェクション後16〜20時間で、培養物に、エンハンサー1(5ml/L細胞培養物)及びエンハンサー2(50ml/L細胞培養物)を加えた。Expi293細胞を1L使い捨て振盪フラスコ(Corning #CLS431147)で、37℃、8％CO2、及び湿度80％で培養した。振盪速度は、Infors Multitron Cellインキュベーターで50mm軌道投下、110rpmであった。
【０１６８】
トランスフェクション後約90〜120時間で、培養物を4000g、10分間の遠心分離によって回収した。清澄化された培地は、精製前に0.22μmフィルターを通して濾過滅菌した。
【０１６９】
精製
遠心分離及び0.22μmフィルターを通して濾過した後、清澄化された上清を、上清1リットルあたり200mLのHis-結合緩衝液（300mMリン酸ナトリウム（NaP）、1.8M NaCl、60mMイミダゾール、pH7.5）を添加し、IMAC精製のための条件を整えた。
【０１７０】
AKTAクロマトグラフィーシステムを使用して、条件を整えた上清を、バッファーA(50mM NaP、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH7.5）で平衡化した5ml HisTrap Excelカラム(GE-Healthcare、スウェーデン)に低流速(1ml/分)でアプライし、その後、低親和性結合不純物をウォッシュバッファー(50mM NaP、300mM NaCl、30mMイミダゾール、pH7.5)で溶出した。結合した融合タンパク質を100％バッファーB(50mM NaP、300mM NaCl、300〜500mMイミダゾール、pH7.5)で段階的に溶出させ、メインピークをUnicorn(商標)ソフトウェアのピーク検出オプションを用いて収集し、さらに、調製用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、HiLoad Superdex 200 16/600 PGカラム(GE-Healthcare、スウェーデン)上で、1xPBS pH7.4（Ampliqon）中で自動的に精製した。1.8mlの画分を回収し、プレキャスト4〜12％NuPAGE(登録商標)ゲル(Life technologie(商標)を用いた非還元SDS-PAGEによって分析した。要するに、サンプルを4×LDS（ドデシル硫酸リチウム）サンプル緩衝液と混合した。混合物を、SDS-PAGEゲルに載せる前に、95℃で5分間加熱した。Novex SeeBlue(登録商標) plus2 pre-stained Protein standard (Life technologies(商標))を、サイズ評価のために画分のそばで一緒にSDS-PAGE泳動した。タンパク質を、製造者の指示書に従い、InstantBlueTM染色(Expedeon, Cambridgeshire, 英国)を用いて可視化した。
【０１７１】
検出及び性質評価の一般的方法
MS分析
ペプチド質量マッピングは、正しいリンカー配列を検証するために実施し、当業者に公知の方法を用いて行った。要するに、精製タンパク質を「In solution tryptic digest and guanidation kit」(Pierce製品番号89895)で採用された方法を用いて酵素消化に供した。使用した酵素は、トリプシン及びAspNであった。ペプチド質量は、Maxis Impact(商標) ESI-Q-OTOF質量分析計(Bruker Daltonics)と組み合わせたThermo-Dionex Ultimate3000TM HPLC (Thermo Fisher Scientific)で、温度45℃、流速0.2ml/分でReversed phased column(逆相カラム)(Waters BEH300 C8 1.7μm 1.0x100)を用い、ペプチドの分離のために設計された、0〜90％アセトニトリル/TFAグラジエントと溶媒(バッファーA:0.1％TFA/99.9％水及びバッファーB:0.1％TFA/99.9％アセトニトリル)を用いて、得られた。融合タンパク質における正しいリンカー配列の同定及び検証を可能にするペプチドマスマッピングは、実験的に決定されたペプチド質量を抽出するData analysis software (Bruker Daltonics)、及び、実験的な質量と予想される融合タンパク質配列に由来する計算質量とを一致させるためのBiotoolsソフトウェア（Biotools）とを、製造者の指示に従って用いることによって行った。一般的には、可変修飾は「酸化(M)」及び「カルバミドメチル(C)」に設定し、質量耐性は20ppmに設定し、MS / MS耐性は50mmuに設定した。
【０１７２】
標準的なHPLCと組み合わせた化学発光窒素検出 (CLND)を、タンパク質濃度の決定に用いた。
【０１７３】
実施例1:本発明の化合物の発現及び精製
表1に示す融合タンパク質バリアントをコードする様々なプラスミドは、A1ATとMIC-1の間のリンカー配列が異なるよう設計した。プラスミドは、周知の組み換えDNA技術の方法(GenScript Incから得られる)によって作成した。リンカー配列は表2に示す。
【０１７４】
代表的な例として、化合物5の大規模生産は、材料及び方法のセクションに記載されているように、Expi293F細胞における一過性発現によって実施した。簡潔には、500μgのプラスミドDNAを25mlのOpti-MEM（登録商標）トランスフェクション培地に添加し、1.35mlのExpiFectamine（商標）293試薬を25mlのOpti-MEM（登録商標）トランスフェクション培地に添加した。二つの溶液を、トランスフェクションミックスを形成するよう組み合わせた。20分間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスを、細胞濃度3×106細胞/mlのexpi293F細胞培養物500mlに添加した。トランスフェクション後18時間で、2.5mlのエンハンサー1及び25mlのエンハンサー2を培地に加えた。トランスフェクション後5日で、培養物を4000g、10分間の遠心分離によって回収した。清澄化された培地は、精製前にトランスフェクション後約90〜120時間で、培養物を4000g、10分間の遠心分離によって回収した。清澄化された培地は、精製前に0.22μmフィルターを通して濾過滅菌した。
【０１７５】
A1AT分子がMIC-1タンパク質のN末端に可変リンカーによって融合するインビボ効果を調べるために、発現させた分子を、材料のセクションに記載した方法を用いて精製した。化合物5を、サイズ排除を組み合わせた自動固定化金属クロマトグラフィーを使用して成功裏に精製した。SECカラムの全量中の2つのピークを分画し分析した。第1のピークをカラムの空隙で溶出し、非還元SDS-PAGEで溶出したタンパク質が凝集状態であることを確認した。メインピークは凝集ピークと部分的に重複していた。従って、メインピーク全体を表すすべての画分がプールに含まれているわけではない。プールした画分の非還元SDS-PAGEにより、約120kDaのタンパク質として移動した単一のバンドが生じた。
【０１７６】
表1.本発明の化合物のリスト。表中の化合物は、N末端に野生型A1AT(配列番号2)又はCys232Ala A1AT (配列番号20)、アミノ酸配列で示される介在リンカー配列、及び、C末端に野生型MIC-1配列(配列番号1)又は野生型MIC-1のAsn3Gluアナログ(配列番号19)を有する。IMAC精製を容易にするため、すべてのコンストラクトにN末端のHis6タグ(配列番号3)を組み込んだ。比較のために化合物1〜4を含めた。
【表１】
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【０１７７】
表2. ペプチドリンカーと対応する配列番号(SEQ ID NO)及びアミノ酸配列のリスト
【表２】
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【０１７８】
表3. MIC-1バリアントと対応する配列番号(SEQ ID NO)のリスト
【表３】
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【０１７９】
表4.α-1-アンチトリプシン(A1AT) バリアントと対応する配列番号(SEQ ID NO)のリスト
【表４】
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【０１８０】
薬理学的方法
実施例2:痩せ型Sprague Dawleyラットにおける食物摂取量に対する本発明の融合タンパク質の効果
本実施例の目的は、インビボで化合物の有効性を試験することである。本発明の化合物のインビボ有効性は、9〜11週齢の非肥満Sprague Dawleyラットにおいて測定した。体重1kgあたり4nmolの単回用量を動物に注射した。化合物を、生理的等張リン酸緩衝食塩水(PBS)溶液(137mM NaCL; 2.7mM KCl; 10mM Na2HPO4; 1.8mM KH2PO4)中で、皮下投与（1ml/kg）した。食物摂取量の変化は、自動食物モニタリングシステム (HM2  BioDAQ 又はラット用Feedwin systems Ellegaard A/S)で測定した。HM2システムに入る前に、当該システムで監視するために、ラットの背部頸部領域にチップを挿入した。HM2システムにおいては1ケージあたり3匹のラットを入れた。BioDAQシステムにおいては、1ケージあたり2匹のラットを仕切りで分離して入れた。各化合物をn=5個体で試験した。実験前に、動物を少なくとも7日間馴化させた。収集したデータ(表5参照)を、毎日の12時間の暗期の開始から次の暗期までの1日の食物摂取量（24時間の食物摂取量）として表す。投与した化合物に応じた1日の食物摂取量の変化は、治療群の1日の平均食物摂取量からビヒクル/PBS群の1日の平均食物摂取量を差し引くことによって計算した。変化は、スチューデントのt検定（両側検定）を用いてp <0.1であれば有意であるとみなした。結果は、所与の日のビヒクル(％)と比較した食物摂取量における「最大減少」として表す;データはまた、調査期間中の食物摂取量の有意(p<0.1)な減少(％)の合計として、食物摂取量の「累積減少」も表している;データはまた、食物摂取量が有意(p<0.1)に減少した日数である「効果の持続」も表している。
【０１８１】
化合物1〜3は、最大有効性についても累積食物摂取量についても、何ら有意なPD効果を示さなかった(表1、表5)。これらの3つのリンカーはGly及びSer残基に基づいているので、データは、30アミノ酸以上までの異なる長さの典型的な可動性リンカーが、A1AT-MIC-1の機能的に活性なバリアントをもたらさないことを示す。加えて、Pro残基及びThr残基を含む化合物4及び9もまた、何ら有意な食物摂取量の低減を示さなかった(表1及び表5)。対照的に、化合物5は、投薬後24時間から2日間持続して食物摂取を有意に減少させ、最大有効性は18％であり、累積食物摂取は35％であった。化合物5、6及び7は、痩せ型SDラットにおいて、4 nmol/kgの単回投薬後24時間後の食物摂取を、それぞれ18%、19%及び 15%抑制した(表1及び表5)。7つのGlu-Ala-Ala-Ala反復を含む化合物16もまた、食物摂取を有意に減少させた。これらのデータを総合すると、Glu及びAla残基を反復するバリアントを含むこれら4つのリンカーは、生物学的に活性なA1ATとMIC-1との融合タンパク質を生じ、有意に食物摂取量を減少させ、化合物16の場合は、3日間の長期持続効果を有した。化合物5のリンカーのGlu残基がGln残基で置換されるか(化合物17)、Glu/Ala反復の数が10から6に減少すると(化合物8)、食物摂取量における有意な効果は観察されなくなった。これらのデータは全体として、本発明のA1AT-MIC-1融合タンパク質は、食物摂取量の減少において生物学的に有効となるためには、Glu及びAla反復をベースとするアミノ酸構造と、リンカーの最小長の両方を有しなければならないことを示している(表1及び表5)。
【０１８２】
Glu/Ala反復を含むリンカーのN末端にPro残基を含む化合物10及び11は、食物摂取量を21％(最大有効性)減少させ、Glu/Ala反復を含むリンカーの中央部に1つ又は2つのPro残基を含む化合物12及び13は、食物摂取量をそれぞれ28％及び23％(最大有効性)減少させた。データは、Glu/Ala反復を含むリンカーと組み合わせる場合に、リンカー中で隣接するPro残基の数又は位置の変化は、食物摂取量における最大有効性、累積有効性及び効果の持続に影響し得ることを示している。一方で、N末端において、可動性のGly/SerリッチなリンカーとPro残基とを組み合わせた場合、食物摂取量に対する有意な効果は何ら観察されなかった(化合物7と比較した化合物7により例示される)。
【０１８３】
化合物14及び15の結果は、本発明の強力なリンカーは、MIC-1及びA1ATの機能的バリアントと組み合わせた場合てもなお、MIC-1におけるAsn3の置換(化合物14、表3)によって及びA1AT中のCys232の置換（化合物15、表4）に例示される通り、食物摂取量に有意な影響をもたらし得ることを示す。
【０１８４】
表5.痩せ型SDラットにおける1日の摂食量に対する、単回用量(4 nmol/kg)のA1AT-MIC-1アナログの効果。データは、1) 7日間にわたって記録した24時間食物摂取量の最大の有意な（p <0.10）減少である最大有効性、2) ビヒクルと比較して、24時間食物摂取量が有意に（p <0.10）減少の合計である累積有効性、及び、3) ビヒクルと比較して、食物摂取量が有意に（p <0.10）減少した日数である効果の持続、の3つの方法で示した。比較のために化合物1〜4を含めた。 
【表５】
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【０１８５】
本明細書においては本発明の特定の特徴を図示し記載したが、当業者にとっての、多くの改変、置換、変更、及び均等物がここで生じるだろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に含まれるすべてのそのような改変及び変更を包含するように意図されていることを理解されたい。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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