(57)【要約】本発明は、それを必要とする対象に、治療有効量のクロモリンおよび任意選択でイブプロフェンを投与することによって、アルツハイマー病を処置する方法を対象とする。クロモリンは、クロモリンナトリウムの形態であってよく、吸入によって投与され得る。クロモリンは、経口的に、吸入器を介して、静脈内に、腹腔内にまたは経皮的に送達され得る。クロモリンは、約１４〜１３３ｎｇ／ｍｌの血漿中クロモリン濃度を達成するために投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のクロモリンを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記クロモリンが、クロモリンナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イブプロフェンを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロモリンが、１７．１ｍｇまで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
イブプロフェンが、１０ｍｇの量で投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記クロモリンが、経口的に、吸入器を介して、静脈内に、腹腔内にまたは経皮的に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量のクロモリンが、１週間の処置後、Ａβを約１０％から約５０％減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クロモリンが、約１４〜１３３ｎｇ／ｍｌの血漿中クロモリン濃度を達成するために投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記クロモリンが、約４６ｎｇ／ｍｌの血漿中クロモリン濃度を達成するために投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記血漿中クロモリン濃度が、約６〜６０分で達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記血漿中クロモリン濃度が、約２２分以内に達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記クロモリンが、約０．３から約０４ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘクロモリン濃度を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クロモリンが、約０．２４ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘクロモリン濃度を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イブプロフェンが、約２．３から５．２ｇ／ｎｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘを達成する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記イブプロフェンが、約３．９４ｇ／ｎｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘを達成する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記イブプロフェンＣｍａｘが、約２〜４時間以内に達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記イブプロフェンＣｍａｘが、約２．５５時間以内に達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記イブプロフェンが、約２５から約１９７０ｎｇ／ｍｌの血漿中平均Ｃｍａｘイブプロフェン濃度を達成する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記イブプロフェンが、約１０９１ｎｇ／ｍｌの血漿中平均Ｃｍａｘイブプロフェン濃度を達成する、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月１９日に出願された米国出願番号第６２／２５７，６１６号の利益を主張しており、この米国出願は本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、８から２０年の平均経過を伴う、不可逆性進行性脳疾患である。疾患は、認知および機能障害をもたらし、これは、記憶、思考力、見当識、人格、およびその最も重症な形態では、日常生活の最も基本的なタスクを続行する能力に影響を与え得る。ＡＤは、米国において死因の第６位である。アルツハイマー病および認知症は、加齢による遺伝子突然変異または脳傷害のプロセスに関連する複雑な神経変性機序によって生じる疾患の一部である。
【０００３】
推定５４０万人のアメリカ人がＡＤを有する。６５歳を超える８人に１人ならびに８５歳およびそれよりも高齢の人物のほぼ半数がＡＤを有すると推定されている。しかしながら、ＡＤは過小診断されるため、罹患した人物の半数よりも多くがアルツハイマー病患者として識別されず、疾患を処置されていない。
【０００４】
２０３０年までに、６５歳およびそれよりも高齢の米国人口の区分は、「ベビーブーマー」世代の加齢の結果として倍増し、アルツハイマー病を患う人々の数の倍増をもたらすと予期されている。
【０００５】
国際アルツハイマー病協会の２０１５年世界アルツハイマー病レポートによれば、世界中で推定３６００万人が認知症を呈する。この数は、２０年ごとに倍増し、２０３０年までに６６００万人、２０５０年までに１億１５００万人になると予期されている。アルツハイマー型認知症は、認知症の大部分を占め、すべての認知症の５０％から７５％であると推定されている。
【０００６】
世界的に認知症はひどく過小診断されている。研究は、高所得国において、認知症の症例のわずか２０％から５０％が正確に識別され、主治医によって文書記録されていることを示す。低から中所得国において、この数字ははるかに低い。インドにおける１つの研究は、認知症を持つ対象の９０％が識別されないままであると示唆した。世界の人口が高齢化するにつれて、早期診断および処置は、ＡＤと共生している人々の生活を改善するための重大な懸案事項となり得る。
【０００７】
パーキンソン病（特発性もしくは原発性パーキンソニズム、運動低下剛性症候群（hypokinetic  rigid  syndrome）（ＨＲＳ）または振戦麻痺としても公知であるＰＤ）は、主として運動系に影響を与える中枢神経系の変性障害である。パーキンソン病の運動症状は、中脳の領域である黒質におけるドーパミン産生細胞の死滅によって生じる。
【０００８】
ルー・ゲーリック病およびシャルコー病としても公知である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ニューロンの死滅を伴う特異的な障害である。ＡＬＳは、筋硬直、筋収縮、および筋消耗により次第に悪化する虚弱によって特徴付けられる。これは、発話、嚥下、および最終的には呼吸困難をもたらす。
【０００９】
レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、びまん性レビー小体病、皮質性レビー小体病およびレビー型老年性認知症を含む多様な他の名称でも公知であるレビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、パーキンソン病と密接に関連する認知症の一種である。これは、死後脳組織学で検出可能な、ニューロンにおけるレビー小体、アルファ−シヌクレインおよびユビキチンタンパク質の塊の存在によって解剖学的に特徴付けられる。
【００１０】
多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）および血管性認知機能障害（ＶＣＩ）としても公知である血管性認知症は、脳への血液供給における問題、典型的には一連の軽度の脳卒中によって引き起こされて、段階的な認知機能低下につながる認知症である。血管性認知症は、高齢者におけるアルツハイマー病（ＡＤ）に次ぐ認知症の２番目に多い形態である。当該用語は、脳血管疾患と脳構造の変化（脳卒中、病変）をもたらすリスク因子との複雑な相互作用、および結果として生じる認知の変化からなる症候群を指す。
【００１１】
アルツハイマー病の前臨床段階は、しばしば軽度認知機能障害（ＭＣＩ）と称されてきたが、この用語が異なる診断段階に対応するか、またはＡＤの第１のステップを識別するものであるかについては議論がある。Petersen  R.C.、「The  Current  Status  of  Mild  Cognitive  Impairment-What  Do  We  Tell  Our  Patients?」、Nat.  Clin.  Pract.  Neurol.、（２００７年）３巻（２号）：６０〜１頁を参照されたい。
【００１２】
軽度認知機能障害は、個体の年齢および教育に基づいて予期されるものを超越しているが、個体の日常活動を妨げるに十分なほど有意ではない認知機能障害の発症および進化を伴う、脳機能症候群である。Petersenら、「Mild  cognitive  impairment:  clinical  characterization  and  outcome」、Arch.  Neurol.、（１９９９年）５６巻（３号）：３０３〜８頁を参照されたい。ＭＣＩは、多くの場合、正常な加齢と認知症との間の遷移段階であることが分かっている。ＭＣＩは、多様な症状を提示し得るが、記憶喪失が主症状である場合、「健忘性ＭＣＩ」（ａＭＣＩ）と称され、しばしば、ＡＤの前駆段階として見られる。Grundmanら、「Mild  cognitive  impairment  can  be  distinguished  from  Alzheimer  disease  and  normal  aging  for  clinical  trials」、Arch.  Neurol.（２００４年）６１巻（１号）：５９〜６６頁。研究は、これらの個体が、１年当たりおよそ１０％から１５％の速度でおそらくアルツハイマー病に進行する傾向があることを示唆している（同文献）。
【００１３】
ａＭＣＩ患者はＡＤについての神経病理学的基準を満たさないことがあるが、アルツハイマー病を進化させる遷移段階にある場合があることを示唆する証拠があり、この仮定された遷移段階の患者は、新皮質におけるびまん性アミロイドおよび内側側頭葉における頻繁な神経原線維タングルを実証した。Petersenら、「Neuropathologic  features  of  amnestic  mild  cognitive  impairment」、Arch.  Neurol.（２００６年）６３巻（５号）：６６５〜７２頁を参照されたい。
【００１４】
加えて、個体が記憶以外のドメインにおいて機能障害を有する場合、状態は非健忘性単一または複数ドメインＭＣＩとして分類され、これらの個体は、他の認知症（例えば、レビー小体型認知症）に変換する可能性がより高いと考えられる。Tabertら、「Neuropsychological  prediction  of  conversion  to  Alzheimer  disease  in  patients  with  mild  cognitive  impairment」、Arch  Gen  Psychiatry.（２００６年）６３巻（８号）：９１６〜２４頁。しかしながら、ＭＣＩの一部の事例は、時間をかけても単純に安定なままであることもあり、または寛解することさえある。症候群の原因それ自体は不明なままであり、したがって、予防および処置をする。
【００１５】
ＡＤの初期の症状は、多くの場合、誤って加齢またはストレスのせいにされる。Waldemar  G.、「Recommendations  for  the  Diagnosis  and  Management  of  Alzheimer's  Disease  and  Other  Disorders  Associated  with  Dementia:  EFNS  Guideline」、Eur  J  Neurol.（２００７年）１４巻（１号）：ｅ１〜２６頁。ＡＤリスクに対する遺伝的素因を持つが明らかな症状のない多くの対象も、疾患プロセスの初期に識別され得る。一部の場合、詳細な神経心理学的検査は、ある人物がＡＤの診断の臨床基準を満足する最大８年前に、軽度の認知困難を明らかにすることができる。Backmanら、「Multiple  Cognitive  Deficits  During  the  Transition  to  Alzheimer's  Disease」、J.  of  Internal  Medicine、（２００４年）２５６巻（３号）：１９５〜２０４頁。これらの初期症状は、最も複雑な日常生活活動に影響を与え得る。Nygard  L.、「Instrumental  Activities  of  Daily  Living:  A  Stepping-stone  Towards  Alzheimer's  Disease  Diagnosis  in  Subjects  with  Mild  Cognitive  Impairment?」、Acta  Neurol  Scand.（２００３年）付録（１７９号）：４２〜６頁。最も顕著な欠損は記憶喪失であり、これは、最近学んだ事実を思い出すことの困難および新たな情報を獲得できないこととして現れる（Backman、２００４年；Arnaizら、「Neuropsychological  features  of  mild  cognitive  impairment  and  preclinical  Alzheimer's  disease」、Acta  Neurol  Scand付録（２００３年）１７９巻：３４〜４１頁）。
【００１６】
注意力、計画立案、順応性および抽象的思考の実行機能、または意味記憶（意味および概念関係の記憶）における機能障害を伴うわずかな問題も、ＡＤの初期段階の兆候であり得る（Backman、２００４年）。無関心はこの段階において観測され得、疾患の経過を通して最も持続する精神神経症状のままである。Landesら、「Apathy  in  Alzheimer's  Disease」、J  Am  Geriatr  Soc.（２００１年）４９巻（１２号）：１７００〜７頁。抑うつ症状、興奮性、および微妙な記憶困難に対する意識の低減も、一般に出現する。Murray  E.D.ら（２０１２年）、Depression  and  Psychosis  in  Neurological  Practice、In  Bradley  W.G.ら、Bradley's  neurology  in  clinical  practice、（第６版）、Philadelphia、PA:  Elsevier/Saunders。
【００１７】
ＡＤを持つ人々において、学習および記憶の機能障害増大は、最終的には確定診断につながる。彼らのごく一部において、言語、実行機能、知覚（失認）、または運動の実行（失行）に関する困難は、記憶の問題よりも顕著である。Forstlら、「Clinical  Features  of  Alzheimer's  Disease」、European  Archives  of  Psychiatry  and  Clinical  Neuroscience.（１９９９年）２４９巻（６号）：２８８〜２９０頁。ＡＤは、すべての記憶容量に等しく影響を与えるわけではない。人物の人生（エピソード記憶）、学習した事実（意味記憶）、および潜在記憶（フォークを使用して食べる等、物事の行い方についての身体の記憶）のより古い記憶は、新たな事実または記憶よりも低い程度まで影響を受ける。Carlesimoら、「Memory  Deficits  in  Alzheimer's  Patients:  A  Comprehensive  Review」、Neuropsychol  Rev.（１９９２年）３巻（２号）：１１９〜６９頁およびJelicicら、「Implicit  Memory  Performance  of  Patients  with  Alzheimer's  Disease:  A  Brief  Review」、International  Psychogeriatrics.（１９９５年）７巻（３号）：３８５〜３９２頁。
【００１８】
言語の問題は、語彙の縮小および言葉の流暢性の減少によって主として特徴付けられ、これは、口語および文語の一般的な貧困化につながる。Forstl、１９９９年、およびTalerら、「Language  Performance  in  Alzheimer's  Disease  and  Mild  Cognitive  Impairment:  a  comparative  review」、J  Clin  Exp  Neuropsychol.（２００８年）３０巻（５号）：５０１〜５６頁。この段階において、アルツハイマー病を持つ人物は、通常、基本的な考えを十分に伝えることができる。Forstl、１９９９年；Taler、２００８年；およびFrank  E.M.、「Effect  of  Alzheimer's  Disease  on  Communication  Function」、J  S  C  Med  Assoc.（１９９４年）９０巻（９号）：４１７〜２３頁。書くこと、描画または身支度等の微細運動タスクを実施すること、ある特定の運動協調性および計画立案の困難（失行）が存在し得るが、それらは一般的に気付かれない。Forstl、１９９９年。疾患が進行するにつれて、ＡＤを持つ人々は、多くの場合、多くのタスクを独立して実施し続けることができるが、ほとんどの認知要求活動で援助または監督を必要とすることがある。同文献。
【００１９】
進行性劣化は、最終的には自立を妨害し、対象は、日常生活のほとんどの一般的な活動を実施することができない。同文献。発語困難は、語彙を思い出せないことによって明白となり、これは、頻繁な誤った語の代用（錯語症）につながる。読み書きの技能も、進行的に失われる。同文献、Frank、１９９４年。複雑な運動シーケンスは、時間が経つにつれておよびＡＤが進行するにつれて協調的でなくなっていくため、転倒のリスクが増大する。Forstl、１９９９年。この相の間に、記憶の問題は悪化し、人物は近親者を認識できないことがある。同文献。以前は無傷であった長期記憶が損なわれ始める。同文献。
【００２０】
行動および神経精神の変化がより広く行きわたるようになる。一般的な徴候は、徘徊、興奮性および感情易変性であり、号泣、計画されたものではない攻撃の爆発、または介護への抵抗につながる。同文献。日没現象も現れ得る。Volicerら、「Sundowning  and  Circadian  Rhythms  in  Alzheimer's  Disease」、Am  J  Psychiatry、２００１年［検索２００８−０８−２７］１５８巻（５号）：７０４〜１１頁。ＡＤを持つ人々のおよそ３０％は、幻影誤識別（illusionary  misidentifications）および他の妄想の症状を発生する。Forstl、１９９９年。対象は、自分の疾患プロセスおよび制限の洞察も失う（病態失認）。同文献。尿失禁が発生し得る。同文献。これらの症状は、親族および世話人に対してストレスを生み出し、これは、その人物を在宅ケアから他の長期ケア施設に移動させることによって低減させることができる。同文献；Goldら、「When  Home  Caregiving  Ends:  A  Longitudinal  Study  of  Outcomes  for  Caregivers  of  Relatives  with  Dementia」、J  Am  Geriatr  Soc.（１９９５年）４３巻（１号）：１０〜６頁。
【００２１】
ＡＤの最終段階の間、人物は、介護者に完全に依存する。Forstl、１９９９年。言語は、単純な語句またはさらには単一の語まで低減し、最終的には、完全な発語喪失につながる。同文献；Frank、１９９４年。口話能力の喪失にもかかわらず、人々は、多くの場合、感情のシグナルを理解し、返すことができる。Forstl、１９９９年。攻撃性は依然として存在し得るが、極端な無関心および消耗のほうがはるかに一般的な結果である。同文献。ＡＤを持つ人々は、究極的には、最も簡単なタスクさえ援助なしには実施することができなくなるであろう。同文献。筋肉量および可動性は、寝たきりになり、自力で食べる能力を失うところまで劣化する。同文献。ＡＤは末期疾病であり、死因は、典型的には、疾患自体ではなく、褥瘡の感染または肺炎等の外部要因である。同文献。
【００２２】
ＡＤの処置は、病因の複数のトリガーに対処することを必要とし得る。ＡＤ患者の脳内には、２つの主要な神経病理：ａ）アミロイド斑としても公知である、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドで主に構成される細胞外タンパク質斑；およびｂ）タウタングルとしても公知である、ニューロンの内側に見られるタウタンパク質で構成される原線維の細胞内タングルがあると考えられる。Ａβの神経毒性オリゴマー凝集体の出現および広がりは、神経損傷につながるキートリガーとして広く認められており、次いで、これは、細胞内タウタングルの蓄積に、および最後に、ＡＤ病因における神経細胞死につながる。
【００２３】
Ａβペプチド（長さ３７から４３アミノ酸）は、天然アミロイド前駆体タンパク質またはＡＰＰの順次開裂によって形成される。Karranら、「The  amyloid  cascade  hypothesis  for  Alzheimer's  disease:  an  appraisal  for  the  development  of  therapeutics」、Nature  Reviews（２０１１年）１０巻：６９８〜７１２頁。長さ４０または４２アミノ酸である異常なＡβペプチドアイソフォーム（Ａβ−４０／４２）は、原線維に成長して脳内にアミロイド斑として蓄積するオリゴマーの凝集体にミスフォールドする。ＡＤ病因にとってさらに重要なことには、Ａβオリゴマーの代替的な運命は、それらがシナプス伝達を阻止するニューロンのシナプスに捕捉されることであり、これが、最終的には、神経変性および死滅をもたらす。Haassら、「Soluble  protein  oligomers  in  neurodegeneration:  lessons  from  the  Alzheimer's  amyloid  β-peptide」、Nature  Reviews  Mol.  Cell  Biol.（２００７年）８巻：１０１〜１１２頁；Hashimotoら、「Apolipoprotein  E,  especially  Apolipoprotein  E4,  Increases  the  Oligomerization  of  amyloid  beta  Peptide」、J.  Neurosci.（２０１２年）３２巻：１５１８１〜１５１９２頁。
【００２４】
Ａβオリゴマー媒介性神経中毒のカスケードは、別のＡＤトリガー、すなわち脳内における慢性局所炎症応答によって深刻化する。Krsticら、「Deciphering  the  mechanism  underlying  late-onset  Alzheimer  disease」、Nature  Reviews  Neurology、（２０１２年）：１〜１０頁。ＡＤは、アミロイド斑に関連する豊富なミクログリア細胞の存在によって特徴付けられる、慢性神経炎症性成分を有する。Henekaら、「Acute  treatment  with  the  PPARγ  agonist  pioglitazone  and  ibuprofen  reduces  glial  inflammation  and  A  1-42  levels  in  APPV717I  transgenic  mice」、Brain（２００５年）１２８巻：１４４２〜１４５３頁；Imbimboら、「Are  NSAIDs  useful  to  treat  Alzheimer's  disease  or  mild  cognitive  impairment」、Front.  Aging  Neurosci（２０１０年）２（論文１９）：１〜１４頁。これらのシクロオキシゲナーゼ（cycloxygenase）（ＣＯＸ１／ＣＯＸ２）発現ミクログリアは、アミロイドオリゴマーを貪食し、活性化して、炎症促進性サイトカインを分泌する。Hoozemansら、「Soothing  the  Inflamed  Brain:  Effect  of  Non-Steroidal  Anti-Inflammatory  Drugs  on  Alzheimer's  Disease  Pathology」、CNS  &  Neurological  Disorders  -  Drug  Targets（２０１１年）１０巻：５７〜６７頁；Griffin  T.S.、「What  causes  Alzheimer's?」、The  Scientist（２０１１年）２５巻：３６〜４０頁；Krstic、２０１２年。この神経炎症応答は、血液脳関門を通して局所血管漏出を促進する（Zlokovic  B、「Neurovascular  pathways  to  neurodegeneration  in  Alzheimer's  disease  and  other  disorders」、Nature  Reviews  Neurosci.（２０１１年）１２巻：７２３〜７３８頁）以外に、ガンマ−セクレターゼ活性の変調を介して異常なＡβペプチド４０／４２のさらなる生成を駆動することに関与し（Yanら、「Anti-Inflammatory  Drug  Therapy  Alters  β-Amyloid  Processing  and  Deposition  in  an  Animal  Model  of  Alzheimer's  Disease」、J.  Neurosci.（２００３年）２３巻：７５０４〜７５０９頁；Karran、２０１１年）、成人の脳における海馬の神経新生にとって有害であるとされてきた。Gaspariniら、「Non-steroidal  anti-inflammatory  drugs  (NSAIDs)  in  Alzheimer's  disease:  old  and  new  mechanisms  of  action」、J.  Neurochem（２００４年）９１巻：５２１〜５３６頁。故に、神経炎症は、アミロイドオリゴマー媒介性神経中毒と組み合わさって、ＡＤを持つ対象において、脳全体に広がる進行性神経不全および神経細胞死をもたらすサイクルを生み出す。
【００２５】
研究者らは、ＡＤの進行を遅らせるかまたは停止させ、脳機能を保存するための将来の処置（疾患修飾処置）が、疾患の初期段階の間に投与される場合に最も有効になると考えている。将来、バイオマーカーイメージングは、どの個体がこれらの初期段階にあり、利用可能になったら疾患修飾処置を受けるべきであるかを識別するのに必須となるであろう。イメージング技術は、処置の効果をモニターし、作用の経過を調整するためにも重大となるであろう。
【００２６】
上記で述べた通り、Ａβ老人斑の蓄積は、過剰リン酸化されたタウタンパク質を含有する神経原線維タングルとともに、ＡＤの神経病理学的特徴とみなされる。近年では、集中的な研究は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中におけるＡβおよびリン酸化タウの相対レベルが、ＡＤ神経病理の存在を予測するためのバイオマーカーとして有効に使用され得ることを示した。Blennow  K.、「Biomarkers  in  Alzheimer's  disease  drug  development」、Nat  Med.（２０１０年）１６巻：１２１８〜２２頁。より具体的には、研究は、ＡＤ患者および後にＡＤに変換するＭＣＩ患者において、健康な対照患者と比較した場合に、ＡβのＣＳＦレベルが有意に減少し、一方、リン酸化タウのＣＳＦレベルが有意に増大することを示した。Andreasenら、「Sensitivity,  specificity,  and  stability  of  CSF-tau  in  AD  in  a  community-based  patient  sample」、Neurology.（１９９９年）５３巻：１４８８〜９４頁；Buchhaveら、「Cerebrospinal  fluid  levels  of  β-amyloid  1-42,  but  not  of  tau,  are  fully  changed  already  5  to  10  years  before  the  onset  of  Alzheimer  dementia」、Arch  Gen  Psychiatry.（２０１２年）６９巻：９８〜１０６頁；Lanariら、「Cerebrospinal  fluid  biomarkers  and  prediction  of  conversion  in  patients  with  mild  cognitive  impairment:  4-year  follow-up  in  a  routine  clinical  setting」、Scientific  World  Journal.（２００９年）９巻：９６１〜６頁；Monge-Argilesら、「Biomarkers  of  Alzheimer's  disease  in  the  cerebrospinal  fluid  of  Spanish  patients  with  mild  cognitive  impairment」、Neurochem  Res.（２０１１年）３６巻：９８６〜９３頁；およびSunderlandら、「Decreased  beta-amyloid1-42  and  increased  tau  levels  in  cerebrospinal  fluid  of  patients  with  Alzheimer  disease」、JAMA.（２００３年）２８９巻：２０９４〜１０３頁。
重要なことに、これらのバイオマーカーの相対的変化は、アルツハイマー型認知症の徴候の数年前に見られる。Buchhave、２０１２年。実際に、１３７人のＭＣＩ患者の研究で、Buchhaveらは、ベースラインにおいて病理学的バイオマーカーレベルを表示したＭＣＩ患者の９０％が９から１０年以内にＡＤを発生したこと、およびＡβのＣＳＦレベルがＡＤ認知症への変換の少なくとも５から１０年前に完全に減少したことを実証した。同文献。２０３人の患者（ＡＤを持つ１３１人および７２人の対照）の分析において、Sunderlandらは、ＣＳＦ  Ａβについては４４４ｐｇ／ｍＬおよびＣＳＦタウについては１９５ｐｇ／ｍＬの閾値が、ＡＤ患者を対照から識別するために、それぞれ９２％および８９％の感度および特異度を与えたことを示唆した。Sunderland、２００３年。同様に、Andreasenらは、ＣＳＦタウについては３０２ｐｇ／ｍＬのカットオフが、ＡＤ患者を対照患者から識別するために、それぞれ９３％および８６％の感度および特異度をもたらしたことを見出した。Andreasen、１９９９年。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Petersen  R.C.、「The  Current  Status  of  Mild  Cognitive  Impairment-What  Do  We  Tell  Our  Patients?」、Nat.  Clin.  Pract.  Neurol.、（２００７年）３巻（２号）：６０〜１頁
【非特許文献２】Petersenら、「Mild  cognitive  impairment:  clinical  characterization  and  outcome」、Arch.  Neurol.、（１９９９年）５６巻（３号）：３０３〜８頁
【非特許文献３】Grundmanら、「Mild  cognitive  impairment  can  be  distinguished  from  Alzheimer  disease  and  normal  aging  for  clinical  trials」、Arch.  Neurol.（２００４年）６１巻（１号）：５９〜６６頁
【非特許文献４】Petersenら、「Neuropathologic  features  of  amnestic  mild  cognitive  impairment」、Arch.  Neurol.（２００６年）６３巻（５号）：６６５〜７２頁
【非特許文献５】Tabertら、「Neuropsychological  prediction  of  conversion  to  Alzheimer  disease  in  patients  with  mild  cognitive  impairment」、Arch  Gen  Psychiatry.（２００６年）６３巻（８号）：９１６〜２４頁
【非特許文献６】Waldemar  G.、「Recommendations  for  the  Diagnosis  and  Management  of  Alzheimer's  Disease  and  Other  Disorders  Associated  with  Dementia:  EFNS  Guideline」、Eur  J  Neurol.（２００７年）１４巻（１号）：ｅ１〜２６頁。
【非特許文献７】Backmanら、「Multiple  Cognitive  Deficits  During  the  Transition  to  Alzheimer's  Disease」、J.  of  Internal  Medicine、（２００４年）２５６巻（３号）：１９５〜２０４頁。
【非特許文献８】Nygard  L.、「Instrumental  Activities  of  Daily  Living:  A  Stepping-stone  Towards  Alzheimer's  Disease  Diagnosis  in  Subjects  with  Mild  Cognitive  Impairment?」、Acta  Neurol  Scand.（２００３年）付録（１７９号）：４２〜６頁
【非特許文献９】Arnaizら、「Neuropsychological  features  of  mild  cognitive  impairment  and  preclinical  Alzheimer's  disease」、Acta  Neurol  Scand付録（２００３年）１７９巻：３４〜４１頁
【非特許文献１０】Landesら、「Apathy  in  Alzheimer's  Disease」、J  Am  Geriatr  Soc.（２００１年）４９巻（１２号）：１７００〜７頁
【非特許文献１１】Murray  E.D.ら（２０１２年）、Depression  and  Psychosis  in  Neurological  Practice、In  Bradley  W.G.ら、Bradley's  neurology  in  clinical  practice、（第６版）、Philadelphia、PA:  Elsevier/Saunders
【非特許文献１２】Forstlら、「Clinical  Features  of  Alzheimer's  Disease」、European  Archives  of  Psychiatry  and  Clinical  Neuroscience.（１９９９年）２４９巻（６号）：２８８〜２９０頁
【非特許文献１３】Carlesimoら、「Memory  Deficits  in  Alzheimer's  Patients:  A  Comprehensive  Review」、Neuropsychol  Rev.（１９９２年）３巻（２号）：１１９〜６９頁
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【非特許文献２６】；Griffin  T.S.、「What  causes  Alzheimer's?」、The  Scientist（２０１１年）２５巻：３６〜４０頁
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【非特許文献２８】Yanら、「Anti-Inflammatory  Drug  Therapy  Alters  β-Amyloid  Processing  and  Deposition  in  an  Animal  Model  of  Alzheimer's  Disease」、J.  Neurosci.（２００３年）２３巻：７５０４〜７５０９頁
【非特許文献２９】Gaspariniら、「Non-steroidal  anti-inflammatory  drugs  (NSAIDs)  in  Alzheimer's  disease:  old  and  new  mechanisms  of  action」、J.  Neurochem（２００４年）９１巻：５２１〜５３６頁
【非特許文献３０】Blennow  K.、「Biomarkers  in  Alzheimer's  disease  drug  development」、Nat  Med.（２０１０年）１６巻：１２１８〜２２頁
【非特許文献３１】Andreasenら、「Sensitivity,  specificity,  and  stability  of  CSF-tau  in  AD  in  a  community-based  patient  sample」、Neurology.（１９９９年）５３巻：１４８８〜９４頁
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【非特許文献３３】Lanariら、「Cerebrospinal  fluid  biomarkers  and  prediction  of  conversion  in  patients  with  mild  cognitive  impairment:  4-year  follow-up  in  a  routine  clinical  setting」、Scientific  World  Journal.（２００９年）９巻：９６１〜６頁
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【非特許文献３５】Sunderlandら、「Decreased  beta-amyloid1-42  and  increased  tau  levels  in  cerebrospinal  fluid  of  patients  with  Alzheimer  disease」、JAMA.（２００３年）２８９巻：２０９４〜１０３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明の要旨
本発明は、アルツハイマー病を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のクロモリンを投与するステップを含む、方法を包含する。一実施形態は、クロモリンが、クロモリンナトリウムである場合を包含する。方法は、イブプロフェンを投与するステップをさらに含んでよい。別の実施形態は、クロモリンが、１７．１ｍｇまで投与される場合を含む。さらに別の実施形態は、イブプロフェンが、１０ｍｇの量で投与される場合を包含する。一実施形態は、クロモリンが、経口的に、吸入器を介して、静脈内に、腹腔内にまたは経皮的に送達される場合を含む。別の実施形態は、治療有効量のクロモリンが、１週間の処置後、Ａβを約１０から５０％減少させる場合を含む。
【００２９】
本発明は、クロモリンが、約１４〜１３３ｎｇ／ｍｌの血漿中クロモリン濃度を達成するために投与される、方法を包含する。ある実施形態は、クロモリンが、約４６ｎｇ／ｍｌの血漿中クロモリン濃度を達成するために投与される場合を含む。別の実施形態は、血漿中クロモリン濃度が、約６〜６０分で達成される場合を含む。さらに別の実施形態は、血漿中クロモリン濃度が、約２２分以内に達成される場合を含む。
【００３０】
本発明は、クロモリンが、約０．３から約０．４ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘクロモリン濃度を達成する、方法も包含する。ある実施形態は、クロモリンが、約０．２４ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘクロモリン濃度を達成する場合を含む。別の実施形態は、イブプロフェンが、約２．３から５．２ｇ／ｎｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘを達成する、方法を含む。さらに別の実施形態は、イブプロフェンが、約３．９４ｇ／ｎｌのＣＳＦ中平均Ｃｍａｘを達成する、方法を含む。ある実施形態は、イブプロフェンＣｍａｘが、約２〜４時間以内に達成される、方法を含む。別の実施形態は、イブプロフェンＣｍａｘが、約２．５５時間以内に達成される、方法を含む。さらに別の実施形態は、イブプロフェンが、約２５から約１９７０ｎｇ／ｍｌの血漿中平均Ｃｍａｘイブプロフェン濃度を達成する、方法を含む。別の実施形態は、イブプロフェンが、約１０９１ｎｇ／ｍｌの血漿中平均Ｃｍａｘイブプロフェン濃度を達成する、方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、クロモリンナトリウムおよびフィセチン（fesitin）についての化学構造を例証する。
【図１Ｂ−１】図１Ｂは、Ａβ４０およびＡβ４２線維化に対するクロモリンナトリウムの効果を３７℃で１時間のインキュベーションで試験し、漸増濃度のクロモリンナトリウム（５、５０、５０００ｎＭ）が、ナノモル濃度でＡβ原線維形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて阻害したことを例証する。
【図１Ｂ−２】図１Ｂは、Ａβ４０およびＡβ４２線維化に対するクロモリンナトリウムの効果を３７℃で１時間のインキュベーションで試験し、漸増濃度のクロモリンナトリウム（５、５０、５０００ｎＭ）が、ナノモル濃度でＡβ原線維形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて阻害したことを例証する。
【図１Ｃ−Ｅ】図１Ｃは、ＴＥＭを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβ重合のクロモリンナトリウム阻害を例証し、Ａβ４２原線維の形成は、５００ｎＭのクロモリンナトリウムとのインキュベーション後に阻害された。図１Ｄは、発光シグナルを用量依存的様式で有意に減少させた、ルシフェラーゼコンジュゲートＡβ４２のＮ−またはＣ−末端両方を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞のクロモリンナトリウムによる処理を例証する。図１Ｅは、既存のオリゴマーを既に含有し、発光シグナルに影響を及ぼすことができなかった馴化培地に対するクロモリンナトリウムの効果を例証する。
【００３２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａは、ＡＤトランスジェニックマウスの、２．１ｍｇ／ｋｇまたは３．１５ｍｇ／ｋｇのクロモリンナトリウムへの７日間にわたる急性曝露が、ＴＢＳ可溶性Ａβｘ−４０およびＡβｘ−４２両方の含有量を５０％よりも多く有意に低下させた後のＡβ凝集を例証する（それぞれ、２．１ｍｇ／ｋｇ用量：Ａβｘ−４０については３９．５％、Ａβｘ−４２については４０．９％；３．１５ｍｇ／ｋｇ用量；Ａβｘ−４０については３７．１％、Ａβｘ−４２については４６．２％）。図２Ｂは、８２Ｅ１／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されたＡβオリゴマーの濃度を、オリゴマー凝集体のレベルの変化が検出できなかったことに注目して例証する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、クロモリンナトリウムがモノマーＡβの量を減少させたことを示した、６Ｅ１０および８２Ｅ１検出抗体を使用する４ｋＤａ  Ａβバンドの定量化を例証する。
【００３３】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、２％トリトン中で順次に抽出されたＡβ洗剤耐性種の濃度を例証する。図３Ｂは、２％ＳＤＳ中で順次に抽出されたＡβ洗剤耐性種の濃度を例証する（図３Ｂ）。
【００３４】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａは、Ａβペプチドの最も不溶性の画分（ギ酸抽出物）に対する、およびアミロイド沈着物の密度に対するクロモリンナトリウムの影響を例証する。図４Ｂは、クロモリンナトリウムが、ＴＢＳ、トリトンおよびＳＤＳ抽出物中のＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の可溶性プールのみに影響を及ぼし、各生化学的画分（ＴＢＳ、トリトン、ＳＤＳおよびギ酸）内におけるＡβペプチドの分布を全体的に改変しなかったことを例証する。図４Ｃおよび４Ｄは、抗Ａβ抗体を用いて免疫組織化学的に評価し、アミロイドペプチドの細胞外沈着凝集体の量が、１週間のクロモリンナトリウム処理後、影響を受けないままであったことを確認した、アミロイド負荷の定量化およびアミロイド沈着物の密度を例証する。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ａは、Ａβペプチドの最も不溶性の画分（ギ酸抽出物）に対する、およびアミロイド沈着物の密度に対するクロモリンナトリウムの影響を例証する。図４Ｂは、クロモリンナトリウムが、ＴＢＳ、トリトンおよびＳＤＳ抽出物中のＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の可溶性プールのみに影響を及ぼし、各生化学的画分（ＴＢＳ、トリトン、ＳＤＳおよびギ酸）内におけるＡβペプチドの分布を全体的に改変しなかったことを例証する。図４Ｃおよび４Ｄは、抗Ａβ抗体を用いて免疫組織化学的に評価し、アミロイドペプチドの細胞外沈着凝集体の量が、１週間のクロモリンナトリウム処理後、影響を受けないままであったことを確認した、アミロイド負荷の定量化およびアミロイド沈着物の密度を例証する。
【００３５】
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａは、クロモリンナトリウムの投与がＩＳＦ  Ａβｘ−４０レベルを３０％減少させたことを例証する（ＰＢＳ：３８７ｐＭ、クロモリン２８３ｐＭ）。図５Ｂは、ＩＳＦ  Ａβｘ−４２およびＡβオリゴマーの両方が試験において同様に実施されたことを例証する。
【００３６】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、クロモリンナトリウムを注射したマウスにおいて、ＩＳＦ  Ａβレベルが、ＰＢＳ処理マウスよりも有意に早く、化合物Ｅの投与わずか２時間後に減少し始めたことを例証する。図６Ｂは、クロモリンナトリウム処理マウスにおけるＩＳＦ  Ａβの半減期が、対照よりも約５０％短かったことを例証する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の詳細な説明
本発明は、それを必要とする対象への低用量のクロモリンの投与によってアルツハイマー病（ＡＤ）を処置する方法であって、低用量のクロモリンが、Ａβモノマーの、高次のオリゴマーおよび原線維への凝集を阻害する方法を包含する。方法は、ＡＤを処置するためにクロモリンと同時にまたは順次にいずれかでイブプロフェンの投与をさらに含んでよい。本発明はまた、クロモリンを、それを必要とする対象に、少なくとも１週間の処置後にＡβの可溶性レベルを約１０％から約５０％減少させるのに十分な量で投与することによって、ＡＤを処置する方法も含む。理論によって限定されるものではないが、ＡＤを処置する方法は、Ａβ生成に影響を与えることなく、Ａβモノマーの、高次のオリゴマーおよび原線維へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝集を阻害することに基づくと考えられる。ミスフォールドされたＡβモノマーは、高次のオリゴマーに凝集して、最終的には、細胞外空間に沈着して原線維アミロイド老人斑を形成する原線維を形成し得る。モノマーよりもＡβオリゴマーが、ニューロンに対して神経毒性であり、ＬＴＰを阻害し、ニューロンのストレス、異常なタウのリン酸化、シナプス崩壊および記憶機能障害につながることが示されている。したがって、Ａβレベルを減少させ、オリゴマー形成を防止し、または可溶性オリゴマーを脱凝集させることができる治療剤が、処置目的であり得る。
【００３８】
低用量経口抗炎症薬は、初期ＡＤを持つ人物において神経炎症応答を阻害することが理論化されている。Ａβオリゴマー媒介性神経中毒のカスケードは、別のＡＤトリガー：脳内における慢性局所炎症応答によって深刻化する。Krstic、２０１２年。ＡＤは、アミロイド斑に関連する豊富なミクログリア細胞の存在によって特徴付けられる、慢性神経炎症性成分を有する。Heneka、２００５年およびImbimbo、２０１０年。これらのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ１／ＣＯＸ２）発現ミクログリアは、アミロイドオリゴマーを貪食し、次いで、活性化して、炎症促進性サイトカインを分泌する。Hoozemans、２０１１年；Griffin、２０１１年；およびKrstic、２０１２年。この神経炎症応答は、血液脳関門を通して局所血管漏出を促進する（Zlokovic、２０１１年）以外に、ガンマ−セクレターゼ活性の変調を介して異常なＡβペプチド４０／４２のさらなる生成を駆動すること（Yan、２００３年；Karran、２０１１年）、および成人の脳における海馬の神経新生を阻害すること（Gasparini、２００４年）に関与するとされてきた。故に、神経炎症は、アミロイドオリゴマー媒介性神経中毒と組み合わさって、ＡＤを持つ対象において、脳全体に広がる進行性神経不全および神経細胞死をもたらすサイクルを生み出す。
【００３９】
複数の疫学研究からの説得力のある証拠は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の長期投薬が、疾患発症の遅延、症候性重症度の低減および認知機能低下の減速を含む年配者におけるＡＤリスクを劇的に低減させることを明らかにした。Veldら、「Nonsteroidal  Antiinflammatory  Drugs  and  the  Risk  of  Alzheimer's  Disease」、N.  Engl.  J.  Med（２００１年）３４５巻：１５１５〜１５２１頁；Etminanら、「Effect  of  non-steroidal  anti-inflammatory  drugs  on  risk  of  Alzheimer's  disease:  systematic  review  and  meta-analysis  of  observational  studies」、Brit.  Med.  Journal（２００３年）３２７巻：１〜５頁；Imbimbo、２０１０年）。以下の３つの機序が、ＡＤ進行に寄与するプロセスを、ＮＳＡＩＤがどのように阻害するか説明するために提案されている：
【００４０】
ａ）ＣＯＸ活性を阻害し、それにより、脳内におけるミクログリア活性化およびサイトカイン生成を低減または防止することによる（Mackenzieら、「Nonsteroidal  anti-inflammatory  drug  use  and  Alzheimer-type  pathology  in  aging」、Neurology（１９９８年）５０巻：９８６〜９９０頁；Alafuzoffら、「Lower  counts  of  Astroglia  and  Activated  Microglia  in  Patients  with  Alzheimer's  Disease  with  Regular  Use  of  Non-Steroidal  Anti-inflammatory  Drugs」、J.  Alz.  Dis.（２０００年）２巻、３７〜４６頁；Yan、２００３年；Gasparini、２００４年；Imbimbo、２０１０年）；
【００４１】
ｂ）アミロイド沈着を低減させることによる（Weggenら、「A  subset  of  NSAIDs  lower  amyloidogenic  αβ42  independently  of  cyclooxygenase  activity」、Nature（２００１年）４１４巻：２１２〜２１６頁；Yan、２００３年；Imbimbo、２０１０年）；
【００４２】
ｃ）シナプスにおけるＣＯＸ媒介性プロスタグランジンＥ２応答をブロックすることによる。Kotilinekら、「Cyclooxygenase-2  inhibition  improves  amyloid-β-mediated  suppression  of  memory  and  synaptic  plasticity」、Brain（２００８年）１３１巻：６５１〜６６４頁。
【００４３】
神経炎症応答を抑えることは、いくつかの機序によりＡＤ進行に影響を及ぼし
得る。イブプロフェンは、ヒト血液脳関門を横断し（Bannwarth  B.、「Stereoselective  disposition  of  ibuprofen  enantiomers  in  human  cerebrospinal  fluid」、Br.  J.  Clin.  Pharmacol.（１９９５年）４０巻：２６６〜２６９頁；Parepallyら、「Brain  Uptake  of  Nonsteroidal  Anti-Inflammatory  Drugs:  Ibuprofen,  Flurbiprofen,  and  Indomethacin」、Pharm.  Research（２００６年）２３巻：８７３〜８８１頁）、炎症促進性サイトカインの生成を抑え（Gasparini、２００４年）、これは、ＡＤ進行を防止するためのその効用に寄与するはずである。しかしながら、ＡＤの処置のための臨床試験において単独療法としてロフェコキシブおよびナプロキセン等のＮＳＡＩＤが投与されている場合、結果は、イブプロフェンを含むＮＳＡＩＤを摂取している個体においてＡＤリスクの低減を示す複数の疫学研究（Veld、２００１年；Etminan、２００３年）にもかかわらず、結論に達しなかったか、または臨床試験において唯一の療法として投与された場合にＡＤ進行のより高いリスクを示したかのいずれかであった（Thalら、「A  Randomized,  Double-Blind,  Study  of  Rofecoxib  in  Patients  with  Mild  Cognitive  Impairment」、Neuropsychopharmacology（２００５年）３０巻：１２０４〜１２１５頁；Imbimbo、２０１０年）。ＡＤにおける単独療法のためのロフェコキシブおよびナプロキセン等のＮＳＡＩＤの選択（Gasparini、２００４年）を取り巻く批評の他、ＡＤＡＰＴロフェコキシブ／ナプロキセン処置試験が、軽度から中等度のＡＤを呈している対象で行われた。Aisenら、「Effects  of  Rofecoxib  or  Naproxen  vs.  Placebo  on  Alzheimer  Disease  Progression」、JAMA（２００３年）２８９巻：２８１９〜２８２６頁；Breitnerら、「Extended  results  of  the  Alzheimer's  disease  anti-inflammatory  prevention  trial」、Alz.  Dementia（２０１１年）４０２〜４１１頁。疫学データを前提として、ＮＳＡＩＤ投与は疾患の非常に初期の段階においてのみ有益であり得ると仮定されてきた。Imbimbo、２０１０年；Breitner、２０１１年。故に、この研究は、初期ＡＤの臨床的証拠を持つ標的患者に特異的に設計された。
【００４４】
ＮＳＡＩＤ疫学研究において、ＡＤのリスク低減は、イブプロフェンおよびインドメタシン等のＡβ−４２ペプチドレベルを推定上低下させたＮＳＡＩＤに限られたことに注目することも重要である（Gasparini、２００４年；Imbimbo、２０１０年）。低ＮＳＡＩＤ用量の長期投薬は、より高用量と等しく有効であることも注目に値する。Breitner  J.、「Alzheimer's  disease:  the  changing  view」、Annals  Neurol.（２００１年）４９巻：４１８〜４１９頁；Broeら、「Anti-inflammatory  drugs  protect  against  Alzheimer's  disease  at  low  doses」、Arch  Neurol.（２０００年）５７巻：１５８６〜１５９１頁。
【００４５】
炎症応答は、アミロイド生成およびオリゴマー低濃度と相関しているとされてきた。したがって、本発明のイブプロフェン用量は、全身毒性に与える影響を最小限にとどめながら、少なくともその量で処置するように算出される。
【００４６】
イブプロフェンは、疼痛のために承認されており、上述した通り、炎症を処置するために使用される。中程度から強度の疼痛および炎症では、医師は、最大８００ｍｇ用量を１日に４回（３２００ｍｇ）処方する（subscribe）。この用量は、最大２週間にわたって与えられ得る。この処置のための総処置用量は、３２００ｍｇ／日×１４日＝４４，８００ｍｇであり、これは２１７ｍＭに等しい。この毎日投薬の連続使用は、重度の副作用をともなう。処方箋なしの市販の用量は、２００ｍｇである。１日当たり複数回用量を使用する人もいれば、毎日１回使用する人もいる。
【００４７】
１日１回用量の年間消費量は、合計で１年当たり７３，０００ｍｇとなる。アミロイド斑に変換する推定１日βアミロイド（ａｂｅｔａ）について「不可視の」神経炎症応答を処置するために提案されている用量（２２〜２７ｎｇ／日）（参考）は、１０ｍｇ／日を投与することによって達成することができ、これは３６５０ｍｇ／年に等しい。この年間用量は、疼痛については、２週間の最大用量の１３分の１または店頭処方箋なしの市販の年間用量の２０分の１である。提案されている用量の利点は、薬物の慢性使用の排除である。
【００４８】
ＡＬＺＴ−ＯＰ１ｂ（イブプロフェン）についての用量根拠および算出は、次の通りである：
【００４９】
（ＲＳ）−２−（４−（２−メチルプロピル）フェニル）プロパン酸）ＭＷ＝２０６Ｄａ（２０６ｇ／ｍｏｌ）
【００５０】
血漿への経口吸収は、９８％である。タンパク質結合イブプロフェンからの脳取り込み＝全体の５％であり、血漿中の遊離イブプロフェン濃度＝総血漿イブプロフェンの０．５％である。したがって、５．５％の血漿中用量は、１〜４％までの範囲で血漿から脳取り込みされる。例えば：１０ｍｇイブプロフェン×９８％＝経口錠剤からの吸収後、血漿中９．８ｍｇイブプロフェンであり、９．８ｍｇ×脳取り込みに利用可能な５．５％＝０．５４ｍｇであり、したがって、取り込みの範囲は、血漿中１〜４％用量＝５．４ｅｅ−４ｇ×１％脳取り込み＝５．４ｅｅ−６ｇ／２０６ｇ／ｍｏｌ＝２．６ｅｅ−８ｍｏｌ／１．５Ｌ脳体積＝脳１Ｌ当たり１７．５ｎＭイブプロフェンである。４％についての算出は、次の通りであった：２１．６ｅｅ−３ｇ×４％脳取り込み＝２１．６ｅｅ−６ｇ／２０６ｇ／ｍｏｌ＝１．０５ｅｅ−７ｍｏｌ／１．５Ｌ脳体積＝脳１Ｌ当たり７０ｎＭ（または１％を４倍）。したがって、１０ｍｇイブプロフェン錠剤は、脳内において１７．５〜７０ｎＭ濃度をもたらすと推定された。この濃度は、Ａβの毎日の生成によってトリガーされる潜在的な炎症応答を処置するために、概算として相互関連された。
【００５１】
ＩＮＤおよび第Ｉ相研究中の２４人のヒト対象における血漿およびＣＳＦレベルの評価、続いて、健康な志願者（５５〜７９歳）への１０ｍｇまたは２０ｍｇの経口投与を行った。
【００５２】
血漿中のイブプロフェンの予備的ＰＫプロファイルは、多くの場合、時間差のある、不規則な吸収パターンによって特徴付けられた。ヒトの薬物動態データは、１０ｍｇの経口投与のための血漿中イブプロフェン濃度が、９５．４±８５．９分（範囲１２分から６時間）でＣｍａｘ１０９１±４７４．６ｎｇ／ｍｌ（範囲：２５．５〜１９７０．０ｎｇ／ｍｌ）をもたらしたことを示す。見かけの血漿中ｔ１／２は１．９３±０．３２時間（範囲１．５から２．５時間）であり、血漿からの適度なクリアランスを示していた。
【００５３】
最大４時間の観測された時間間隔の間におけるＣＳＦ中イブプロフェンの平均Ｃｍａｘは、１０ｍｇ用量の経口投与後、２．５５±０．９６１時間（範囲２．０から４．０時間）で３．９４±１．２９２ｎｇ／ｍｌ（範囲２．３から５．２ｎｇ／ｍｌ）であった。脳内におけるこのレベルのイブプロフェン（１９．２±６．３ｎＭ）は、Ａβの毎日の生成によって引き起こされる潜在的な炎症応答を処置するのに十分であると推定された。
【００５４】
したがって、１０ｍｇイブプロフェン錠剤は、脳内濃度（８３６ｎｇ）または２２〜２７ｎｇを処置するために必要とされる用量よりも４倍大きい濃度をもたらすと推定される。このナノモルイブプロフェン脳内濃度は、Ａβの毎日の生成によって引き起こされる潜在的な炎症応答を処置すると推定される。一部の実施形態では、この薬物用量は、１つの特異的処置としてまたは標準的な疾患処置へのアジュバントとして、１つまたは複数の抗アミロイド薬との混合物として組み合わせられる。
【００５５】
要約すると、ＮＳＡＩＤは、いくつかの機序を介して、神経炎症応答を抑え、ＡＤ進行に影響を及ぼすことが予測される。Ａβオリゴマー化を阻害する薬物と一緒に投与される場合。
【００５６】
クロモリン用量例を決定するために、本発明者らは次の通りに算出した。クロモグリク酸ナトリウム：５，５’−（２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ）ビス（４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボン酸）ＭＷ＝５１２Ｄａ（５１２ｇ／ｍｏｌ）。クロモリンについての用量根拠および算出は、次の通りであった。（１）乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）結果は、１７．１ｍｇのＡＰＩ当たり４〜５ｍｇのクロモリン（全身取り込みに必要とされる３μｍ未満のサイズの粒子を持つインパクター画分（impactor  fractions）で）が、全身取り込みのために下気道に送達されることを示す。４〜５ｅｅ−３ｇ／５１２ｇ／ｍｏｌ＝７．８〜９．８マイクロモルのクロモリン血漿中レベル。クロモリンが０．２〜１％であった場合、血漿からの脳内取り込み＝１６〜９８ナノモル÷１．５Ｌの脳＝脳内において１１〜６６ｎＭクロモリン／Ｌ（１日当たり）である。したがって、ＡＺＨＡＬＥＲデバイスで吸入した１７．１ｍｇのクロモリンは、脳内において１１〜６６ｎＭ濃度をもたらすと推定された。
【００５７】
ヒトの薬物動態データは、血漿中クロモリン濃度が、１７．１ｍｇ用量のクロモリンの吸入時に、２２．８±１６．６分（範囲：６〜６０分）で４６．７±３３．０ｎｇ／ｍｌ（範囲：１４〜１３３ｎｇ／ｍｌ）の最大に到達したことを示す。血漿からのクロモリンクリアランスは急速であり、１．７５±０．９時間（範囲：０．６〜３．７時間）の半減期であった。１７．１ｍｇのクロモリン吸入後のＣＳＦ中平均Ｃｍａｘクロモリン濃度は、３．７２±０．７０４時間で０．２４±０．０７７ｎｇ／ｍｌ（範囲：０．２〜０．４ｎｇ／ｍｌ）であり、０．４７±０．１５ｎｍｏｌ／Ｌに対応していた。脳内におけるこのレベルのクロモリン（０．４７ｎｍｏｌ／Ｌ×１．５Ｌ＝０．７０ｎｍｏｌ）は、推定１日２２〜２７ｎｇ（２７ｎｇ／５１２ＭＷ＝０．０６ｎｍｏｌ）のアミロイド斑および関連する炎症応答に用量設定するに十分であると推定された。
【００５８】
また、３４．２ｍｇ用量吸入は、０．３６±０．１７ｎｇ／ｍｌ（範囲：０．１６〜０．６１ｎｇ／ｍｌ）の範囲内であり、０．７１ｎＭのクロモリン濃度に対応していた。８時間にわたる同様の休薬（ｗａｓｈｏｕｔ）プロファイルで４時間が最大であると仮定すると、ＣＳＦへの外挿は１．４１ｎＭの濃度に倍増する。この濃度は、１日当たり脳内において生成される推定２２〜２７ｎｇｒ（２７ｎｇｒ／５１２ＭＷ＝０．０６ｎＭ）の斑に用量設定するための量よりも１桁より大きい量（２３倍）に変わる。この１７．１ｍｇの提案されている長期日用量は、薬物の潜在的な長期毒性使用に影響を与えることなく、重合を遅延または中止させる（holt）に十分である。
【００５９】
一部の実施形態では、別個の処置として、またはアルツハイマー病等の他の神経変性標的疾患との組合せとして（別個に送達されるまたは混合物として）疾患進行を滴定するための、指定された用量または算出された用量のクロモリンおよび他の抗Ａβ剤が提案される。
【００６０】
組合せ処置パラダイムは、神経変性およびニューロン死につながる複数のトリガーを軽減するように提案される。ＡＤ進行が非常に初期の段階で止められれば、海馬における保存または改善されたニューロンの可塑性および神経新生により、認知パフォーマンスにおけるこの低下は逆転され得る（Kohmanら、「Neurogenesis,  inflammation  and  behavior」、Brain,  Behavior,  and  Immunity（２０１３年）２７巻：２２〜３２頁）。組合せ処置パラダイムは、認知を改善し、転帰を最適化するための標準処置へのアジュバント添加として機能するように提案される。
【００６１】
ＡＤ進行の緩和は、進行性ＡＤを持つ患者の長期ケアにおいて高額な医療コストを下げることに加えて、患者のクオリティオブライフを潜在的に改善し得る。
【００６２】
治験薬ＡＬＺＴ−ＯＰ１ｂ（イブプロフェン）は、ＮＳＡＩＤとして炎症を処置するための非選択的ＣＯＸ阻害剤である。このクラスの他のメンバーは、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ケトロラック、ナプロキセン、ピロキシカムおよびスリンダクを含む。これらの薬物は、軽度から中等度の疼痛、発熱および炎症の管理に一般に使用され、アスピリンには及ばないが抗血小板効果も有する。
【００６３】
ＣＯＸ酵素は、ある特定の脂肪酸をプロスタグランジンに変換する。薬物のラベルに従って摂取されたイブプロフェンは、疾病および傷害に応答して我々の身体が放出する物質であるプロスタグランジンの生成をブロックすることによって働く。プロスタグランジンは、疼痛および腫脹（炎症）を引き起こし、脳内で放出されて発熱も引き起こす。ＣＯＸ酵素から出発する反応の「鎖」の末端におけるプロスタグランジンは、疼痛、発熱および血管拡張に対する感受性の増大（血流量増大または炎症）を引き起こす。したがって、この反応の鎖の出発を阻害することにより、イブプロフェンは、疼痛、発熱および炎症を低減させる。イブプロフェンは、両方のＣＯＸ酵素の活性をブロックすることから、非選択的ＣＯＸ阻害剤ＮＳＡＩＤと考えられる。
【００６４】
上述した通り、神経炎症応答を抑えることは、いくつかの機序によりＡＤ進行に影響を及ぼし得る。イブプロフェンは、ヒト血液脳関門を横断し（Bannwarth、１９９５年；Parepally、２００６年）、炎症促進性サイトカインの生成を抑え（Gasparini、２００４年）、これは、ＡＤ進行を防止するためのその効用に寄与するはずである。しかしながら、ＡＤの処置のための臨床試験において単独療法としてロフェコキシブおよびナプロキセン等のＮＳＡＩＤが投与されている場合、結果は、イブプロフェンを含むＮＳＡＩＤを摂取している個体においてＡＤリスクの低減を示す複数の疫学研究（Veld、２００１年；Etminan、２００３年）にもかかわらず、結論に達しなかったか、またはＡＤ進行のより高いリスクを示したかのいずれかであった（Thal、２００５年；Imbimbo、２０１０年）。ＡＤにおける単独療法のためのロフェコキシブおよびナプロキセン等のＮＳＡＩＤの選択（Gasparini、２００４年）を取り巻く批評の他、ＡＤＡＰＴロフェコキシブ／ナプロキセン処置試験が、軽度から中等度のＡＤを呈している対象で行われた（Aisen、２００３年；Breitner、２０１１年）。疫学データを前提として、ＮＳＡＩＤ投与は疾患の非常に初期においてのみ有益であり得ると仮定されてきた（Imbimbo、２０１０年；Breitner、２０１１年）。故に、初期ＡＤの臨床的証拠を提示している患者が、この臨床試験における研究のために選択された。
【００６５】
ＮＳＡＩＤ疫学研究において、ＡＤのリスク減少は、イブプロフェンおよびインドメタシン等のＡβ−４２ペプチドレベルを推定上低下させたＮＳＡＩＤに限られたこと（Gasparini、２００４年；Imbimbo、２０１０年）、ならびに低ＮＳＡＩＤ用量の長期投薬は、より高用量と等しく有効であったこと（Broe、２０００年；Breitner、２００１年）に注目することが重要である。それ故、このＡＺＴｈｅｒａｐｉｅｓ  ＡＬＺＴ−ＯＰ１試験における１つのコホートで、１０ｍｇのイブプロフェンが経口錠剤（ＡＬＺＴ−ＯＰ１ｂ）として投与される。この用量は、店頭用の承認用量よりも有意に低い。クロモリン吸入処置（ＡＬＺＴ−ＯＰ１ａ）と組み合わせて、本発明者らは、低レベルの神経炎症応答をイブプロフェンで抑えることが、ＡＤ進行による認知機能低下を予防することに有意に寄与するであろうという仮説を試験する。
【００６６】
イブプロフェン（ＡＬＺＴ−ＯＰ１ｂ）は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のクラスに属する。この研究のために、１０ｍｇイブプロフェン錠剤を、ＡＤにおいて見られる神経炎症応答効果を予防および／または遅らせるためにＡＬＺＴ−ＯＰ１ａと同時に毎日（経口的に）摂取する。この薬物は、ＦＤＡ承認であり、長年にわたって処方箋なしで市販され（ＯＴＣ）入手可能であったが、この研究には、入手可能なＯＴＣよりも小さい用量で使用する。
【００６７】
イブプロフェン錠剤の活性成分、ＵＳＰは、（±）−２−（ｐ−イソブチルフェニル）プロピオン酸であり、それをプロピオン酸誘導体のクラスの有機化合物にしている。イブプロフェンは、７４〜７７℃の融点を持つ安定な白色結晶性粉末であり、水に非常に溶けにくく（１ｍｇ／ｍＬ未満）、エタノールおよびアセトン等の有機溶媒に易溶性である。そのｐＫａは、４．４〜５．２である。
【表２】
2018534336.tif 000002
【００６８】
投与経路、投薬量、レジメンおよび処置期間
【００６９】
イブプロフェンは、毎日１回、水とともに口によって（経口的に）、処置の持続期間にわたって摂取され得る。
【００７０】
錠剤は、ＮＳＡＩＤの慢性投薬に関連する胃腸潰瘍および胃出血等の考えられる望ましくない副作用を回避するために、消化器系において薬物が吸収される場所を制御するように腸溶性コーティングされていてよい。腸溶性コーティング錠は、胃における強酸性環境（およそｐＨ３）をバイパスし、小腸に見られる、より塩基性の環境（およそｐＨ７〜９）に溶解することが意図されている。この実施形態のためのイブプロフェンの日用量は、疼痛、発熱および炎症のために処方される日用量の８０〜１００分の１である。
【００７１】
クロモリンの記述
【００７２】
治験薬ＡＬＺＴ−ＯＰ１ａ（クロモリン）は、１９７０年代から、喘息の処置のための使用をＦＤＡによって承認されている合成クロモン誘導体である。喘息処置では、クロモリン粉末を、乾燥粉末吸入器、スピンヘラーデバイスを介する肺への吸入のために微粒化した。液体鼻腔内および眼科用製剤も、鼻炎および結膜炎の処置のために開発されてきた。
【００７３】
クロモリンの作用機序は、肥満細胞安定剤、すなわち、肥満細胞からのヒスタミンの放出を防止するとともに活性化リンパ球からのサイトカイン放出を抑制するためのものとして特徴付けられる（Netzerら、「The  actual  role  of  sodium  cromoglycate  in  the  treatment  of  asthma  -  a  critical  review」、Sleep  Breath（２０１２年）１６巻：１０２７〜１０３２頁；Kellerら、「Have  inadequate  delivery  systems  hampered  the  clinical  success  of  inhaled  disodium  cromoglycate?」、Time  for  reconsideration.（２０１１年）８巻：１〜１７頁）。これは、急性発作のための処置としてではなく、アレルギー性および運動誘発性喘息のための予防薬として、毎日４回投与された。
【００７４】
本発明者らの研究は、免疫応答を抑制するためのその役割とともに、ＡＤ進行を潜在的に中止させるまたは遅らせるためにこの承認薬を使用するという別目的での再利用を可能にする、クロモリンの新たな作用機序を示した。これらの研究は、クロモリンがＡβペプチドと結合し、そのオリゴマーおよび高次の凝集体への重合を阻害することを示した。Ａβ重合の阻害は、ニューロンのアミロイド媒介性中毒を止め、これらの異常なＡβオリゴマーの、それらの蓄積よりもむしろ脳外の通過を修復する。さらに、本発明者らは、クロモリンが、動物モデルにおいて血液脳関門を通り抜け、そのため、クロモリン吸入後の血漿バイオアベイラビリティが、Ａβオリゴマー化および蓄積を妨げるに十分な脳内濃度に変わることを示した。
【００７５】
ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス（脳内でアミロイド負荷を発生する）を使用するＡβ動物モデルでの本発明者らの研究は、ＡＬＺＴ−ＯＰ１ａ処置についての有益性の統計学的に有意な証拠を提供した。トランスジェニック動物への偽（ｍｏｃｋ）処置ではないクロモリンの投与は、年齢を適合させた健康な非トランスジェニック動物で見られた、モーリスの水迷路試験における記憶容量低下を防止した。２つの他の公知のアミロイド結合剤の同様の投与は、このアルツハイマートランスジェニック動物モデルにおいていかなる有益性も提供することができなかった。これらの結果は、ＡＬＺＴ−ＯＰ１ａ処置が、ＡＤのトランスジェニック動物モデルにおいて、脳アミロイド負荷によって引き起こされる学習および記憶の低下を遅延したことを示している。
【００７６】
クロモリンナトリウムは、５，５’−［（２−ヒドロキシトリメチレン）ジオキシ］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボキシレート］の二ナトリウム塩であり、水溶性、無臭、白色、水和結晶性粉末である。
【００７７】
【表１】
2018534336.tif 000003
【００７８】
a  １カプセル当たりのクロモリンナトリウム、ＵＳＰの重量は、無水ベースで１７．１ｍｇ（通常ベースでは１カプセル当たり１８．６ｍｇ）である。
【００７９】
b  ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルは、乾燥粉末吸入器を通して薬物製品を計量および送達するようにのみ機能し、投与中には取り込まれない。
【００８０】
用量におけるクロモリンの量は、数ある中でも、疾患の状態、健康、年齢、性別、体重等の対象の多様な状態に依存し得る。製剤が吸入のために製剤化される場合、典型的には、単回用量におけるクロモリンの量は、約５から約２０ｍｇ、好ましくは約１０から１９ｍｇであり、より好ましくは、量は、約１５から１８ｍｇである。一特定の実施形態では、クロモリンの量は、約１７．１ｍｇである。
【００８１】
例えば、製剤は、乾燥粉末吸入器デバイスでの使用のために調製されたクロモリン粉末ブレンドを含有し得る。各単位は、１７．１ｍｇのクロモリンおよび薬学的に許容される添加剤を含む。製剤は、喘息の処置のために現在投与されている毎日４回の承認用量レベルのクロモリン用量（１日当たり合計８０ｍｇのクロモリン）の５０％未満である毎日２回（３４．２ｍｇ）投与され得る。
【００８２】
毎日投与では、典型的には、クロモリンの量は、約５ｍｇから約４５ｍｇであり得、好ましくは、日用量の量は、約２０ｍｇから約３８ｍｇであり得、より好ましくは、量は、約３０ｇｍから約３６ｍｇであり得る。例えば、３４．２ｍｇの日用量のクロモリン（１７．１ｍｇのクロモリン、乾燥粉末吸入器を使用して毎日２回、朝夕に吸入される）は、脳卒中後の神経の炎症を阻害し、肥満細胞遊走／脱顆粒、グリア活性化およびニューロンの喪失を限定し、認知機能低下を潜在的に減速させる。
【００８３】
イブプロフェンとともに投与される場合、典型的には、クロモリンは約１７．１ｍｇの量で投与され、イブプロフェンは２０ｍｇで投与される（連続して摂取される２回の経口的に投与される１０ｍｇ用量等）。あるいは、クロモリンは３４．２ｍｇで投与され（１７．１ｍｇの２回の連続吸入用量の投与等）、イブプロフェンは２０ｍｇである。
【００８４】
製造されたカプセルは、水分、光、および薬物安定性に負の影響を及ぼし得る他の環境要因への曝露を防止するために、ブリスター化および包装される。すべての製品包装およびラベル付けは、ｃＧＭＰ、ＧＣＰ、地域、連邦および国固有の規制および要件に従う。
【００８５】
本発明のある特定の特色について本明細書において例証し記述してきたが、多くの修正、置換、変更および等価物に当業者は今や想到する。したがって、添付の請求項は、すべてのそのような修正および変更を本発明の真の趣旨内にあるとして網羅することが意図されていることを理解されたい。
【実施例】
【００８６】
クロモリンナトリウムＵ．Ｓ．Ｐ．グレードをＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．（Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）から購入し、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。１００ｍＭのストック溶液をｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に使用し、１０．２ｍＭをｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、クロモリンナトリウムストック溶液を、細胞培養培地中、１０ｎＭ、１０μＭまたは１ｍＭの最終濃度で直接希釈し、一方、１．０２ｍＭの化合物の溶液をダルベッコ（Bulbecco's）リン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で調製した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで腹腔内注射した（３つの異なる用量で：１．０５ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、または３．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミロイド線維化アッセイは、ＤＭＳＯにおよびメタノールにそれぞれ溶解した合成Ａβペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、Ｂｏｇａｒｔ  ＧＡ）およびチオフラビン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ流出およびミクログリア取り込みアッセイのために、合成Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドをＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．から購入した。１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）への１ｍｇ／ｍｌの濃度での再懸濁後、ペプチドを乾燥させ、２％（ｖ／ｖ）Ｍｅ２Ｓｏ（Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有するＰＢＳに再可溶化し、０．２ｍｍのフィルターに通して濾過した。Ａβ４０およびＡβ４２のストック溶液を、５０ｎＭで細胞培養物に付与した。
【００８７】
（実施例１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａβ線維化オリゴマー化および解離アッセイ
【００８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ線維化アッセイは、ＤＭＳＯに２５０μＭの濃度で溶解し、１分間にわたって音波処理した、Ａβ４０およびＡβ４２を使用して実施した。Ａβ４０およびＡβ４２を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）中、人工ＣＳＦ溶液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、および２５ｍＭグルコース、ｐＨ７．３）で、２００μｌのアッセイ体積中５μＭに希釈した。１０μＭチオフラビン−Ｔおよび漸増濃度のクロモリンナトリウム（５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭ）の添加後、０．５ｍｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を添加することによって、線維化プロセスを開始した。ＤＭＳＯを対照として使用した。Ｍ３マイクロプレートリーダーを使用して、それぞれ４５０ｎｍおよび４８０ｎｍの励起および発光波長における蛍光強度を測定することによって、線維化の進行を、室温で１０分毎に６０分間にわたって追跡した。Ｍ３プレートリーダーによって提供されるソフトウェアによって時間０における蛍光読み取りを使用して、結果をバックグラウンドに対して正規化した。
【００８９】
Ａβ集塊およびオリゴマー解離アッセイは、Ａβスプリットルシフェラーゼ相補性アッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施した。Ａβオリゴマーの形成に対するクロモリンナトリウムの効果を評価するために、Ａβ４２にコンジュゲートされたＧａｕｓｓｉａｎルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のＮ−およびＣ−末端断片を安定的に過剰発現するように設計されたＨＥＫ２９３細胞株を、クロモリンナトリウムを加えずに、または１０ｎＭ、１０μＭもしくは１ｍＭで加えて、３７℃で１２時間にわたってインキュベートした。これらの細胞から馴化培地を収集し、１０ｎＭのセレンテラジンを添加し、ワラック１４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。オリゴマー解離アッセイは、ＰＢＳまたはクロモリンナトリウム（１０ｎＭ、１０μＭまたは１ｍＭ）を、Ａβ４２と融合したＧｌｕｃを半分ずつ過剰発現しているナイーブＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地とともに、３７℃で１２時間にわたってインキュベートすることによって実施した。ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９０】
透過電子顕微鏡法によるＡβ４２原線維形成の分析
【００９１】
クロモリンの抗原線維発生特性は、ＴＥＭ分析を実施することによって確認した。簡潔に述べると、合成Ａβ４２を、５ｎＭまたは５００ｎＭのいずれかの濃度のクロモリンナトリウムを添加してまたは添加せずに、ＰＢＳに３７℃で４８時間にわたって０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。４８時間にわたるインキュベーションの後、１５μｌのＡβ４２原線維溶液を、炭素コーティングＥＭグリッドに室温で２０分間にわたって吸着させた。滅菌ＰＢＳおよびｄｄＨ２Ｏ中で３回洗浄後、グリッドを乾燥させ、その後、２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル水で２回８分間にわたって陰性染色した。次いで、各グリッドを、脱気したｄｄＨ２Ｏ中で簡単に洗浄し、風乾させ、１５０，０００×の倍率のＴＥＭによってイメージングした。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏミクログリア取り込みアッセイ
【００９３】
Ａβ取り込みのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を実施した。簡潔に述べると、ヒトミクログリア細胞（ＨＭＧ  ０３０、Ｃｌｏｎｅｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を胎児の脳組織試料から単離し、５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを補充した培養培地（５０：５０のＤＭＥＭ：Ｆ−１２）に懸濁した。単離されたミクログリア細胞をガラス底ウェルプレート中に平板培養し、５％ＣＯ２を供給して３７℃で２日間にわたってインキュベートした後、Ａβおよびクロモリンナトリウムで処理した。培地交換の後、ミクログリア細胞を、５０ｎＭ  Ａβ４２とともに、クロモリンナトリウムを１０ｎＭ、１０μＭもしくは１ｍＭで加えてまたは加えずに、３７℃で１６時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、培地を収集し、２部位Ａβ  ＥＬＩＳＡを使用してＡβ４０およびＡβ４２のレベルを測定し、ミクログリア細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、数をカウントした。
【００９４】
動物およびクロモリンナトリウム処理
【００９５】
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９（ＡＰＰ／ＰＳＩ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙから購入した。これらのマウスは、いずれもプリオンプロモーターの制御下で、ヒト突然変異体Ｋ５９４Ｎ／Ｍ５９５Ｌおよびエクソン９が失欠したプレセニリン１遺伝子を発現する。このＡＤマウスモデルは、アミロイド沈着が６カ月齢から始まる重度の表現型を提示する。本研究において、７．５カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１雄に、１．０５ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇまたは３．１５ｍｇ／ｋｇ体重の増加用量のクロモリンナトリウムまたはＰＢＳを、１週間にわたって毎日腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。間質液（ＩＳＦ）試料採取のために、９カ月齢の雄ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、最高用量のクロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ体重）またはＰＢＳを、ＩＳＦ試料採取の直前に７日間にわたって毎日ｉ．ｐ．注射した。ＩＳＦ収集の最後の注射の１日後、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた。次いで、心臓穿刺を介して血漿を収集した。経心臓ＰＢＳ灌流後、脳を解剖し、１つの脳半球を免疫組織化学のために４％パラホルムアルデヒド中で固定し、一方、対側の半球を生化学的アッセイのために液体窒素中で急速凍結した。
【００９６】
生化学的試料調製
【００９７】
脳組織試料を、１０体積のＴＢＳＩ（プロテアーゼ阻害剤を加えたトリス緩衝化生理食塩水）中、機械的バウンサーホモジナイザーにより２５ストロークで均質化し、２６０，０００ｇ、４℃で３０分間にわたって遠心分離した。ＴＢＳ可溶性上清を収集し、次いで、２％トリトン−１００／ＴＢＳＩ、２％ＳＤＳ／ＴＢＳＩおよび７０％ギ酸中で連続的に均質化した。
【００９８】
サンドイッチＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット法
【００９９】
Ａβ４０およびＡβ４２の濃度は、市販のキット、Ａβ４０についてはＢＮＴ７７／ＢＡ２７、またはＡβｘ−４２についてはＢＮＴ７７／ＢＣ０５をそれぞれ使用して決定した。グアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）処理では、試料を、０．５Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌとともに３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。オリゴマーＡβ種を、８２ＥＩ／８２ＷＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用して定量化し、ここでは、捕捉および検出抗体はいずれも同一である。免疫ブロット法のために、ＴＢＳ可溶性画分を１０〜２０％Ｎｏｖｅｘトリス−グリシンゲル上で電気泳動した。ニトロセルロース膜上に転写後、ブロットを、５％無脂肪スキムミルク／ＴＢＳＴ（０．１％ツイーン２０を加えたトリス緩衝化生理食塩水）緩衝液中で１時間にわたってブロックした。次いで、膜を、抗Ａβ抗体６Ｅ１０および８２ＥＩにより４℃で終夜プローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体マウストゥルーブロットとの室温で１時間にわたるインキュベーション後、ＥＣＬキットを使用して免疫反応性タンパク質を発生させ、ハイパーフィルムＥＣＬ上で検出した。イメージＪソフトウェアを使用するデンシトメトリーによって、Ａβシグナル強度を測定した。
【０１００】
免疫化学
【０１０１】
連続パラフィン切片を４μｍで切断し、アミロイド斑に対するウサギ抗ヒトアミロイド（Ｎ）抗体、続いて、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体で免疫染色し、ＡＢＣエリートおよびＤＡＢキットを使用して発色させた。ＣＣＤカメラモデルＤＰ７０を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１落射蛍光正立顕微鏡を使用して、イメージを撮影した。アミロイド負荷および斑密度の定量分析は、光学的閾値の適用後、ＢＩＯＱＵＡＮＴソフトウェアを使用して行った。このソフトウェアは、ＣＣＤカメラを備えた正立Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡のモーター駆動ステージと協調している。照明ムラを回避するためのバックグラウンド補正後、免疫染色したアミロイド斑を１０倍対物レンズ下で閾値化した。ミクログリアにおけるＡβの共局在化分析のために、４μｍのパラフィン切片を、Ａβについてはマウス抗Ａβ抗体６Ｅ１０およびミクログリアについてはウサギ抗Ｉｂａ１、続いて、アレクサ４８８またはＣｙ３コンジュゲート二次抗体で免疫染色した。ＰＢＳとクロモリンナトリウムで処理した動物との間のすべての写真を撮影するために、同じピンホール設定およびゲインを使用して、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡でイメージを獲得した。アミロイド沈着物と共局在化しているＩｂａ１のパーセンテージは、イメージ分析後にＦｉｊｉソフトウェアを使用して決定した。全く同じ閾値を４８８およびＣｙ３チャネルの両方に適用し、各斑に対応するＲＯＩを選択した。このＲＯＩのＣｙ３チャネルへの適用（Ｉｂａ１染色）後、ＲＯＩ内の粒子の分析を実施し、各アミロイド沈着物と重複しているＩｂａ１染色の％を測定した。
【０１０２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ微小透析
【０１０３】
ＩＳＦ  Ａβ試料採取のためにｉｎ  ｖｉｖｏ微小透析を実施した。簡潔に述べると、マウスの両方の海馬（ＡＰ  −３．１ｍｍ、Ｌ  ＋／−２．８ｍｍ、ＤＶ  −１．１ｍｍ）に、イソフルラン（Ｏ２中１．５％）での麻酔下、２つのガイドカニューレを定位的に移植した。３日間の回復時間後、クロモリンナトリウムのｉ．ｐ．注射を始めた。ＩＳＦ試料採取は、クロモリンナトリウムまたは対照としてのＰＢＳへの曝露１週間後に行った。ＩＳＦ試料採取には、１０００ｋＤａの分子プローブを使用した。使用前に、プローブを人工脳脊髄液（ａＣＳＦ：単位ｍＭ：１２２ＮａＣｌ、１．３ＣａＣｌ２、１．２ＭｇＣｌ２、３．０ＫＨ２ＰＯ４、２５．０ＮａＨＣＯ３）で洗浄した。次いで、プローブの出口および入口を、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）チューブを使用して、それぞれ蠕動ポンプおよびマイクロシリンジポンプに接続した。プローブを、ガイドカニューレを通してマウスの海馬に挿入した。移植後、ａＣＳＦを１０μｌ／分の流速で１時間にわたって灌流し、その後、ＩＳＦ試料採取した。総ＡβまたはオリゴマーＡβの測定のためのＩＳＦ試料は、それぞれ０．５μｌ／分または０．１μｌ／分の流速で収集し、Ａβ測定まで−８０℃で貯蔵した。ｉｎ  ｖｉｖｏ微小透析試料採取の間、マウスは起きており、プローブアセンブリに加圧することなく無制限の動きを可能にするように設計された微小透析ケージ内を自由に移動していた。
【０１０４】
逆微小透析を使用する化合物Ｅ処理
【０１０５】
対側海馬をこの実験に使用した。４時間にわたるベースライン試料採取後、ａＣＳＦに希釈した１００ｍＭのγ−セクレターゼ阻害剤化合物Ｅを、海馬中に灌流して、プローブ周囲の組織におけるＡβ生成を急速に阻害した。ＩＳＦ内のＡβレベルを、追加で５時間にわたって測定した。片対数プロットをＡβレベルから作製し、ＩＳＦ  Ａβの半減期を外挿した。
【０１０６】
統計分析
【０１０７】
統計分析は、グラフパッド５プリズムソフトウェアを使用して実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、各実験を独立して少なくとも３回実施し、正規性を検証した。３つまたはそれよりも多い群間での平均の比較を、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、ボンフェローニのポストホック検定を使用して分析した。ｉｎ  ｖｉｖｏデータをマウス当たりで平均し、ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定、続いて、ダンの多重比較検定を使用して分析した。アミロイド斑の定量化については、ノンパラメトリックのマン・ホイットニー検定を使用してデータを分析した。０．０５未満のＰ値は有意であるとみなした。
【０１０８】
結果
【０１０９】
クロモリンナトリウムは、Ａβ重合をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するが、既存のオリゴマーには影響を及ぼさない。Ａβ４０およびＡβ４２線維化に対するクロモリンナトリウムの効果を、チオフラビンＴアッセイにより試験した。漸増濃度のクロモリンナトリウム（５、５０、５０００ｎＭ）とともに３７℃での１時間にわたるインキュベーションは、Ａβ原線維形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏにてナノモル濃度で阻害した（図１Ｂ）。ＴＥＭを使用して、Ａβ４２原線維の形成は５００ｎＭのクロモリンナトリウムとのインキュベーション後に阻害され（図１Ｃ）、一方、より低い濃度（５０ｎＭ）で効果は検出されなかった。オリゴマー形成を特異的にモニターするためのスプリットルシフェラーゼ相補方法を使用して、ルシフェラーゼコンジュゲートＡβ４２のＮ−またはＣ−末端両方を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞の、クロモリンナトリウムによる処理は、発光シグナルを用量依存的様式で有意に減少させた（図１Ｄ）。しかしながら、この効果は、１０μＭを上回るクロモリンナトリウムの濃度でしか検出できなかった。チオフラビン−Ｔアッセイとのこの相違は、本発明者らのスプリットルシフェラーゼ相補方法が細胞環境で実施されたという事実に起因し得る。加えて、このオリゴマー化アッセイは、Ａβ４０ペプチドよりもアミロイド形成性であり、より速く凝集するＡβ４２ペプチドの存在に基づくものであった。対照的に、既存のオリゴマーを既に含有する馴化培地へのクロモリンナトリウムの添加は、発光シグナルに影響を及ぼすことができなかった（図１Ｅ）。これらのデータは、クロモリンナトリウムが、高次のオリゴマーまたは原線維へのＡβ重合を効率的に防止したが、既存の凝集体を解離することはできないことを示している。
【０１１０】
ＡＰＰ／ＰＳＩマウスにおけるクロモリンナトリウムへの１週間の曝露は、可溶性Ａβの含有量をｉｎ  ｖｉｖｏで有意に低下させたが、アミロイド沈着にも高度に原線維性のＡβ種にも影響を与えない。クロモリンナトリウムは、Ａβ凝集プロセスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで妨げ、したがって、抗アミロイド形成性化合物として分類され得る。ＡＤトランスジェニックマウスの、２．１ｍｇ／ｋｇまたは３．１５ｍｇ／ｋｇのクロモリンナトリウムへの７日間にわたる急性曝露は、ＴＢＳ可溶性Ａβｘ−４０およびＡβｘ−４２両方の含有量を、５０％よりも多く有意に低下させた（それぞれ、２．１ｍｇ／ｋｇ用量：Ａβｘ−４０については３９．５％、Ａβｘ−４２については４０．９％；３．１５ｍｇ／ｋｇ用量：Ａβｘ−４０については３７．１％、Ａβｘ−４２については４６．２％）（図２Ａ）。
【０１１１】
ＴＢＳ可溶性画分を、０．５Ｍグアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）とともに３７℃で３０分間にわたってインキュベートして、オリゴマー、またはＡβと他のタンパク質との間に形成された他の複合体を解離した。インキュベーション後のＡβのレベルは、概して、ネイティブ条件、とりわけより凝集しやすいＡβｘ−４２と比べて増大した。クロモリンナトリウムによる処理は、ＴＢＳ可溶性Ａβの総レベルを用量依存的様式で低下させた（それぞれ、２．１ｍｇ／ｋｇ用量：Ａβｘ−４０については５０．７％、Ａβｘ−４２については６３．３％；３．１５ｍｇ／ｋｇ用量：Ａβｘ−４０については４４．６％、Ａβｘ−４２については７６．１％）（図２Ａ）。
【０１１２】
クロモリンナトリウムは、高次のアミロイド種の含有量を有意に改変しなかった。この結果をさらに調査するために、同じ捕捉および検出抗体を使用する８２Ｅ１／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ａβオリゴマーの濃度も特異的に測定した。ここでも、オリゴマー凝集体のレベルの変化は検出できなかった（図２Ｂ）。ＴＢＳ可溶性抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにも供した。６Ｅ１０および８２Ｅ１検出抗体を使用する４ｋＤａ  Ａβバンドの定量化は、クロモリンナトリウムがモノマーＡβの量を減少させたことを示し（図２Ｃ）、初期のＥＬＩＳＡデータを確認した。Ａβの総レベルと比較して低い可溶性Ａβオリゴマーの割合により、ウェスタンブロッティングによってそれらの特異的凝集体を検出しなかった。
【０１１３】
２％トリトン（図３Ａ）および２％ＳＤＳ（図３Ｂ）緩衝液中で順次に抽出されたＡβ洗剤耐性種の濃度は、最高用量のクロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）による処理が、ＰＢＳ対照と比較してＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の量を有意に減少させたことを示した。クロモリンナトリウムは、考慮されるすべての画分について、Ａβｘ−４２よりもＡβｘ−４０を減少させるのに大きな影響を有するように見えた。
【０１１４】
Ａβペプチドの最も不溶性の画分（ギ酸抽出物）に対する、およびアミロイド沈着物の密度に対するクロモリンナトリウムの影響を研究した。不溶性Ａβレベルは、急性クロモリンナトリウム投与によって影響を受けなかった（図４Ａ）。不溶性Ａβペプチドのレベルが最も可溶性の画分と比較してはるかに高かったため、かつクロモリンナトリウムが、ＴＢＳ、トリトンおよびＳＤＳ抽出物中のＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の可溶性プールのみに影響を及ぼしたため、各生化学的画分内におけるＡβペプチドの分布を全体的に改変しなかった（ＴＢＳ、トリトン、ＳＤＳおよびギ酸、図４Ｂ）。アミロイド負荷の追加の定量化およびアミロイド沈着物の密度は、抗Ａβ抗体を用いて免疫組織化学的に評価し、アミロイドペプチドの細胞外沈着凝集体の量が、１週間のクロモリンナトリウム処理後、影響を受けないままであったことを確認した（図４Ｃおよび４Ｄ）。データは、クロモリンナトリウムが、ＡＤトランスジェニックマウスに短時間にわたって投与された場合、アミロイドのほとんどの原線維形態に主として影響を与えなかったことを示した。
【０１１５】
まとめると、これらの結果は、クロモリンナトリウムの急性ｉ．ｐ．投与が、ＴＢＳ、トリトンおよびＳＤＳ可溶性モノマーＡβの量をｉｎ  ｖｉｖｏで急速に減少させることを示し、これは、脳内のアミロイドの最も交換可能なプールを構成する。
【０１１６】
クロモリンナトリウムは、ＡＰＰ／ＰＳＩマウスの間質液中におけるＡβ４０の濃度を減少させた。クロモリンナトリウムへの急性曝露は、可溶性モノマーアミロイドペプチドの量を主として減少させた。ＡＰＰ／ＰＳＩマウスに、最高用量のＰＢＳまたはクロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ体重）を、１週間にわたって毎日ｉ．ｐ．注射した。クロモリンナトリウムの急性投与は、ＩＳＦ  Ａβｘ−４０レベルを３０％劇的に減少させた（ＰＢＳ：３８７ｐＭ、クロモリン２８３ｐＭ）。ＩＳＦ  Ａβｘ−４２およびＡβオリゴマーはいずれも同様に挙動した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１１７】
クロモリンナトリウムは、ＩＳＦ内のＡβの半減期を低減させ、プロセスは、血液脳関門を通るＡβの脱出よりもミクログリア取り込みに関連するものであった。ＩＳＦにおけるＡβの半減期は、γ−セクレターゼ阻害剤化合物Ｅを用いる逆微小透析を使用して推定した。マウスを、最高用量（３．１５ｍｇ／ｋｇ体重）で処理した。クロモリンナトリウムを注射したマウスにおいて、ＩＳＦ  Ａβレベルは、ＰＢＳ処理マウスよりも有意に速く、化合物Ｅの投与後わずか２時間で減少し始めた（図６Ａ）。計算すると、クロモリンナトリウム処理マウスにおけるＩＳＦ  Ａβの半減期は、対照よりも約５０％短く（図６Ｂ）、この化合物による処理後、ＩＳＦ  Ａβがより急速に除去されたことを示していた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【国際調査報告】
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