(57)【要約】  特定の態様において、骨髄分化一次応答遺伝子88(MyD88)及び/又はトール様受容体3(TLR3)を抑制し、加齢黄斑変性(AMD)の治療に有用なRNA複合体が、本発明において提供される。特定の態様において、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物並びにそのようなRNA複合体及び医薬組成物を使用する方法が、本発明において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MyD88 mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端が平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項２】
TLR3 mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端が平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が19〜21nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖が19nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が20nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が21nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が少なくとも24nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖が24〜121nt長である、請求項6記載のRNA複合体。
【請求項９】
前記アンチセンス鎖が31nt長である、請求項1又は2記載のRNA複合体。
【請求項１０】
前記センス鎖が15nt長である、請求項1〜9のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１１】
前記センス鎖が16nt長である、請求項1〜9のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１２】
前記センス鎖が17nt長である、請求項1〜9のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8及び表10に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項1〜12のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１４】
前記センス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8及び表10に列挙されているセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項1〜13のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１５】
前記RNA複合体が細胞によるMyD88発現を抑制することができる、請求項1及び3〜14のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１６】
前記RNA複合体が細胞によるTLR3発現を抑制することができる、請求項2〜14のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１７】
前記RNA複合体が化学修飾を含む、請求項1〜16のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項１８】
前記RNA修飾が2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合又はコレステロール部分である、請求項17記載のRNA複合体。
【請求項１９】
前記RNA複合体がコレステロール部分を含む、請求項18記載のRNA複合体。
【請求項２０】
前記コレステロール部分は、前記センス鎖の3'末端に結合している、請求項19記載のRNA複合体。
【請求項２１】
前記RNA複合体が2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項17〜20のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項２２】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端に位置する、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２３】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２４】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２５】
前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２６】
2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端及び前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２７】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含み、前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項21記載のRNA複合体。
【請求項２８】
前記RNA複合体がホスホロチオエート結合を含む、請求項17〜27のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項２９】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項28記載のRNA複合体。
【請求項３０】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項28記載のRNA複合体。
【請求項３１】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項28記載のRNA複合体。
【請求項３２】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項28記載のRNA複合体。
【請求項３３】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項28〜32のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３４】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項38〜32のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３５】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項28〜32のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３６】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項28〜32のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３７】
前記RNA複合体が送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過できる、請求項28〜36のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３８】
前記RNA複合体が細胞毒性ではない、請求項1〜37のいずれか1項記載のRNA複合体。
【請求項３９】
細胞によるMyD88又はTLR3発現を抑制する方法であって、請求項1〜38のいずれか1項記載のRNA複合体と前記細胞を接触させることを含む方法。
【請求項４０】
前記細胞がヒト対象の眼に存在する、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記対象がAMDを有する、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記RNA複合体を前記対象の眼に投与することを含む、請求項40〜43のいずれか1項記載の方法。
【請求項４５】
前記RNA複合体が硝子体内注射によって投与される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
対象におけるAMDを治療する方法であって、請求項1〜38のいずれか1項記載のRNA複合体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４７】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記RNA複合体を前記対象の眼に投与することを含む、請求項46〜48のいずれか1項記載の方法。
【請求項５０】
前記RNA複合体が硝子体内注射によって投与される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
請求項1〜38のいずれか1項記載のRNA複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５２】
前記組成物が硝子体内送達である、請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物が点眼薬である、請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５４】
対象におけるAMDを治療する方法であって、請求項51〜53のいずれか1項記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項５５】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
前記医薬組成物を前記対象の眼に投与することを含む、請求項54〜56のいずれか1項記載の方法。
【請求項５８】
前記医薬組成物が硝子体内注射によって投与される、請求項57記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2015年11月16日に出願された米国仮出願第62/255,878号(その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性(AMD)は、眼の黄斑を裏打ちする網膜色素上皮の変性に起因する疾患であり、これは、失明に至る。黄斑は、眼の背面を裏打ちする光感受性組織からなる網膜にある小さな領域であり、中心視力において重大な役割を果たす。AMDは、世界中の失明の主な原因の1つである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
AMDは、「ウェット(滲出)」型及び「ドライ(乾燥)」型として生じる。ウェット型AMDは、網膜における異常な血管成長の結果である。ウェット型AMDでは、血管内皮増殖因子(VEGF)の量の増加がこの血管新生の一因となるため、治療選択としては、VEGFインヒビターの使用が挙げられる。しかしながら、VEGFインヒビターで治療された多くの患者は、治療後2〜3年以内に後期ドライ型黄斑変性の主要症状である地図状萎縮(GA)を発症する。ドライ型AMDの疾病病因は不明であり、ドライ型AMDに対して現在利用可能な医学的治療はない。したがって、ウェット型及びドライ型黄斑変性の両方を治療することができる治療法の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
MyD88及びTLR3は、ドライ型AMD及びウェット型AMDの両方の発症に重要な役割を果たす。ドライ型黄斑変性の治療に効果がないVEGF抗体とは異なり、ウェット型及びドライ型黄斑変性の両方を治療するために、MyD88又はTLR3を標的とする治療剤を使用することができる。
【０００５】
特定の態様において、骨髄分化一次応答遺伝子88(MyD88)及び/又はトール様受容体3(TLR3)を抑制し、加齢黄斑変性(AMD)(例えば、ウェット型及び/又はドライ型AMD)の治療に有用なRNA複合体を本発明において提供する。特定の態様において、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物並びにそのようなRNA複合体および医薬組成物の使用方法を提供する。
【０００６】
特定の態様においては、MyD88 mRNA配列(例えば、ヒトMyD88 mRNA配列)に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖と該アンチセンス鎖に対する配列相補性を有するセンス鎖とを含むRNA複合体を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は細胞によるMyD88発現を抑制できる。特定の実施形態においては、RNA複合体は細胞によるMyD88産生を抑制できる。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は長い非対称短鎖干渉RNA(lasiRNA)である。
【０００７】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、少なくとも19ヌクレオチド(nt)長である。幾つかのそのような実施形態においては、アンチセンス鎖は、19〜21nt長(すなわち、19、20又は21nt長)である。他のそのような実施形態においては、アンチセンス鎖は、少なくとも24nt長(例えば、24〜121nt長)、例えば、31nt長である。特定の実施形態においては、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20又は21ntのアンチセンス鎖が、MyD88 mRNA配列と相補的である。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、15〜17nt長(すなわち、15nt長、16nt長又は17nt長)である。特定の実施形態においては、少なくとも15nt、少なくとも16nt又は少なくとも17ntのセンス鎖は、アンチセンス鎖の配列と相補的である。代表的なRNA複合体としては、表1、表2、表3、表4、表5又は表6に列挙されているRNA複合体が挙げられる。
【０００８】
特定の態様において、TLR3 mRNA配列(例えば、ヒトTLR3 mRNA配列)に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖及び該アンチセンス鎖に対する配列相補性を有するセンス鎖を含むRNA複合体を本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は細胞によるTLR3発現を抑制することができる。特定の実施形態においては、RNA複合体は、細胞によるTLR3産生を抑制することができる。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、長い非対称短鎖干渉RNA(lasiRNA)である。
【０００９】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、少なくとも19ヌクレオチド(nt)長である。幾つかのそのような実施形態においては、アンチセンス鎖は、19〜21nt長(すなわち、19、20又は21nt長)である。他のそのような実施形態においては、アンチセンス鎖は、少なくとも24nt長(例えば、24〜121nt長)である。特定の実施形態においては、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20又は21ntのアンチセンス鎖は、TLR3 mRNA配列と相補的である。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、15〜17nt長(すなわち、15nt長、16nt長又は17nt長)である。特定の実施形態においては、少なくとも15nt、少なくとも16nt又は少なくとも17ntのセンス鎖は、アンチセンス鎖の配列と相補的である。代表的なRNA複合体としては、表7、表8又は表10に列挙されているRNA複合体が挙げられる。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は化学修飾を含み、この場合、該修飾は送達ビヒクルの非存在下、細胞膜の透過を促進する。幾つかの実施形態においては、修飾は、2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合及び/又はコレステロール部分である。幾つかのそのような実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドは、センス鎖の3'末端に位置する。幾つかのそのような実施形態においては、センス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内に2、3、4、5又は6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。他の実施形態では、2'-O-メチルヌクレオシドは、アンチセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかのそのような実施形態においては、アンチセンス鎖の3'末端領域は、複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内に2、3、4、5又は6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域及びアンチセンス鎖の3'末端領域の両方が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。代表的なRNA複合体としては、表3、表4、表5、表6、表8又は表10に列挙されている修飾RNA複合体が挙げられる。特定の実施形態においては、RNA複合体は、細胞毒性ではない。
【００１１】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は、ホスホロチオエート結合を含む。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%がホスホロチオエート結合である。幾つかのそのような実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖内のリボヌクレオチド間の全ての結合がホスホロチオエート結合である。同様に、幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%がホスホロチオエート結合である。幾つかのそのような実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の全ての結合がホスホロチオエート結合である。
【００１２】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は、コレステロール部分を含む。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分は、センス鎖の3'末端に結合している。
【００１３】
特定の態様においては、本発明で提供するRNA複合体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物が本発明で提供される。特定の実施形態においては、医薬組成物は、眼への投与用(例えば、点眼薬)に製剤化される。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、硝子体内送達用に製剤化される。
【００１４】
特定の態様において、細胞によるMyD88及び/又はTLR3発現を抑制する方法であって、本発明において提供するRNA複合体及び/又は医薬組成物と細胞を接触させることを含む方法を本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、細胞は、ヒト対象(例えば、ウェット型又はドライ型AMDを有するヒト対象)の眼に存在する。特定の態様において、AMD(例えば、ウェット型AMD及び/又はドライ型AMD)についてのヒト対象の治療方法であって、本発明において提供するRNA複合体及び/又は医薬組成物を対象、例えば、眼に投与することを含む方法を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体及び/又は医薬組成物は、硝子体内注射によって眼に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、MyD88を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.3nMの濃度でHeLa細胞にトランスフェクトし、24時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。3回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図２】図2は、MyD88を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.3nM、0.1nM、0.03nM及び0.01nMの濃度でHeLa細胞にトランスフェクトし、24時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。3回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図３】図3は、異なるアンチセンス鎖長(19、21又は31ヌクレオチド)を有し、MyD88を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効果を示す。asiRNAを0.1nM、0.03nM又は0.01nMの濃度でHeLa細胞にトランスフェクトし、24時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。3回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図４】図4は、MyD88を標的とする例示的なasiRNAによるMyD88タンパク質発現の抑制を示す。asiRNAを3nM又は10nMの濃度でA549又はHeLa細胞にトランスフェクトし、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。パネル(a)は、トランスフェクションの48時間後のA549細胞におけるMyD88タンパク質発現レベルを示す。パネル(b)は、トランスフェクションの48時間後のHeLa細胞におけるMyD88タンパク質発現レベルを示す。(NT=無処理、L2K=トランスフェクション対照)。
【図５】図5は、2'-O-メチル化修飾を含む例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.1nM又は0.03nMの濃度でHeLa細胞にトランスフェクトし、24時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。
【図６】図6は、種々の化学修飾が施された例示的なMyD88標的化細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA又はcp-asiMyD88)の遺伝子サイレンシング効率を示す。cp-asiRNAを1μMの濃度でHeLa細胞の存在下かつトランスフェクションビヒクルを使用せずにインキュベートし、48時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。3回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図７】図7は、例示的なcp-asiRNAによるMyD88タンパク質発現の抑制を示す。cp-asiRNAをトランスフェクションビヒクルを使用せずにHeLa細胞と接触させ、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。(NT=無処理)。
【図８】図8は、種々の化学修飾が施された例示的なcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。cp-asiRNAを1μMの濃度でHeLa細胞の存在下かつトランスフェクションビヒクルを使用せずにインキュベートし、48時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。3回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図９】図9は、例示的なcp-asiRNAによるMyD88タンパク質発現の抑制を示す。cp-asiRNAをトランスフェクションビヒクルを使用せずにHeLa細胞と接触させ、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。(NT=無処理、RiM=トランスフェクション試薬のみ、NC=陰性対照)。
【図１０】図10は、異なるアンチセンス鎖長(21又は19ヌクレオチド)を有し、2'-O-メチル化修飾を含むcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。各cp-asiRNAを1μMの濃度でHeLa細胞の存在下かつトランスフェクションビヒクルを使用せずにインキュベートし、48時間後、リアルタイムPCRを用いてMyD88 mRNA発現の度合を測定した。
【図１１】図11は、例示的なcp-asiRNAによるMyD88タンパク質発現の抑制を示す。cp-asiRNAを1uM又は3uMの濃度でHeLa細胞の存在下かつトランスフェクションビヒクルを使用せずにインキュベートし、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。(NT=無処理)。
【図１２】図12は、トール様受容体3(TLR3)を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.1nMの濃度でHaCaT細胞にトランスフェクトし、24時間後、qRT-PCRを用いてTLR3 mRNA発現の度合を測定した。2回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１３】図13は、TLR3を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.1nMの濃度でHaCaT細胞にトランスフェクトし、24時間後、qRT-PCRを用いてTLR3 mRNA発現の度合を測定した。2回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１４】図14は、TLR3を標的とする例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。asiRNAを0.3nMの濃度でHaCaT細胞にトランスフェクトし、24時間後、qRT-PCRを用いてTLR3 mRNA発現の度合を測定した。
【図１５】図15は、例示的なasiRNAによるTLR3タンパク質発現の抑制を示す。asiRNAを10nMの濃度でHaCaT細胞にトランスフェクトし、48時間後、ウエスタンブロットを用いてTLR3タンパク質発現の度合を測定した。
【図１６】図16は、例示的なcp-asiRNAにより24時間処理したHaCaT細胞の画像を示す。cp-asiRNAは、1uMでインキュベーションし、24時間後、HaCaT細胞の形態をECLIPSE 100(Nikon)によりイメージングした。
【図１７】図17は、種々の化学修飾が施された例示的なTLR3標的化細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA又はcp-asiTLR3)の遺伝子サイレンシング効率を示す。1μMの濃度のcp-asiRNAをHaCaT細胞と共にインキュベートし、48時間後、qRT-PCRを用いてTLR3 mRNA発現の度合を測定した。2回の反復実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１８】図18は、例示的なcp-asiRNAによるTLR3タンパク質発現の抑制を示す。示したcp-asiRNAをトランスフェクションビヒクルを使用せずにHaCaT細胞と接触させ、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。(NT=無処理)。
【図１９】図19は、例示的なcp-asiRNAによるTLR3 mRNA及びタンパク質発現の抑制を示す。示したcp-asiRNAをトランスフェクションビヒクルを使用せずにHaCaT細胞と接触させ、48時間後、qRT-PCR及びウエスタンブロットを用いてTLR3発現の度合を測定した。
【図２０】図20は、例示的なcp-asiRNAによるTLR3タンパク質発現の抑制を示す。示したcp-asiRNAをトランスフェクションビヒクルを使用せずにHaCaT細胞と接触させ、48時間後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。(NT=無処理)。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
総論
特定の態様において、MyD88及び/又はTLR3発現を抑制し、それによりAMD(例えば、ウェット型AMD及び/又はドライ型AMD)の治療に有用である非対称RNA複合体(例えば、asiRNA又はlasiRNA)を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、トランスフェクションビヒクルを必要とすることなく細胞を透過することができるように化学修飾される。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8又は表10に列挙されているRNA複合体である。特定の態様において、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物並びにそのようなRNA複合体及び医薬組成物を使用する方法を、本発明において提供する。
【００１７】
MyD88は、免疫応答を活性化するタンパク質の1つとしてドライ型AMD及びウェット型AMDの両方の発症において重要な役割を果たすタンパク質である。VEGFを標的とする、ドライ型黄斑変性の治療に効果がない従前のAMD療法とは異なり、MyD88を標的とする療法は、ウェット型及びドライ型AMDの両方を治療するために使用することができる。例示的なヒトMyD88 cDNA配列を以下に提供する。
ヒトMyD88 cDNA配列。
2018533956.tif 000002
2018533956.tif 000003
【００１８】
トール様受容体3(TLR3)は、先天性免疫系において1型膜貫通型シグナル伝達分子(transmembrane signaling molecule)として中心的な役割を果たす。TLR3リガンドとしては、RNAウイルスの増殖によって形成される二本鎖RNA及びポリイノシン・ポリシチジン酸(ポリI:C)dsRNAアナログが挙げられる。ドライ型AMDを患っている個体において、dsRNAの1タイプであるalu-RNAが網膜上皮細胞に蓄積する。健康な個体と比較して、ウェット型AMDを患っている人は、末梢血単核細胞におけるTLR3の発現レベルが高く、これは、TLR3がドライ型及びウェット型AMDの両方の発病機序に密接に関連することを示す。例示的なヒトMyD88 cDNA配列を以下に提供する。
ヒトTLR3 cDNA配列
2018533956.tif 000004
2018533956.tif 000005
【００１９】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体はasiRNAまたはlasiRNAである。本明細書中で用いるasiRNAなる語は、19〜21nt(ヌクレオチド)のアンチセンス鎖と13〜17ntのセンス鎖とを有する二本鎖非対称短鎖干渉RNA分子を意味する。asiRNAに関する追加的情報は、米国特許公開第2012/0238017号およびChangら, Mol. Ther. 17:725-732(2009)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に見ることができる。本明細書中で用いるlasiRNAなる語は、13〜21ntのセンス鎖と24ntを超えるアンチセンス鎖とを有する長い二本鎖非対称干渉RNA分子を意味する。lasiRNAに関する追加的情報は米国特許公開第2013/0273657号(その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に見ることができる。
【００２０】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、送達ビヒクル、例えばリポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマーを使用して細胞に送達される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、細胞におけるMyD88及び/又はTLR3の抑制を媒介するのに、そのような送達ビヒクルの使用を必要としないよう化学修飾される。そのようなRNA複合体は、本明細書において細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)又は細胞透過性lasiRNA(cp-lasiRNA)と称される。
【００２１】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここに集める。
【００２２】
本明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の対象物の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例えば、「an」要素は1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる「投与する」なる語は、医薬物質または医薬組成物を対象に与えることを意味し、医療従事者による投与および自己投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本明細書中で用いる「干渉核酸」、「抑制性核酸」は互換的に用いられる。干渉核酸は、一般に、一連の環状サブユニットを含み、それらサブユニットはそれぞれが塩基対形成部分を有し、ワトソン-クリック塩基対形成により核酸(典型的にはRNA)中の標的配列にその塩基対形成部分がハイブリダイズして標的配列内で核酸:オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするサブユニット間結合により、連結されている。干渉RNA分子には、アンチセンス分子、siRNA分子、asiRNA分子、lasiRNA分子、一本鎖siRNA分子、miRNA分子およびshRNA分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような干渉核酸は、mRNAの翻訳を遮断または阻害するように、あるいは天然プレmRNAスプライスプロセシングを阻害するように、あるいは標的化mRNAの分解を誘導するように設計してもよく、それがハイブリダイズする標的配列に対して「指向性である」または「標的化されている」と称されうる。干渉核酸には、例えば、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、2'-O-メチルオリゴヌクレオチドおよびRNA干渉物質(siRNA物質)が含まれうる。RNAi分子は、一般に、標的分子とヘテロ二重鎖を形成することによって作用し、それは選択的に分解又は「ノックダウン」され、それにより標的RNAを不活性化する。幾つかの条件下、干渉RNA分子は、転写物の翻訳を抑止することおよび/または転写物の転写を阻害することにより、標的転写物を不活性化することも可能である。干渉核酸は、より一般的には、前記のようにして標的の核酸に対して標的化されている場合、タンパク質のような生体関連標的に対して「標的化されている」と言われる。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる語は互換的に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれであれ、任意の組合せおよび任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしうる。以下のものはポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合には、重合体の構築の前または後で施されうる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合(コンジュゲート化)によって、さらに修飾されうる。本明細書に記載されている全ての核酸配列において、UヌクレオチドはTヌクレオチドと交換可能である。
【００２６】
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体」なる語は、医薬上許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材を意味する。
【００２７】
オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」と言えるのは、そのオリゴマーが、生理的条件下で、45℃より実質的に高い、または少なくとも50℃、または少なくとも60℃〜80℃またはそれを超えるTmで標的にハイブリダイズする場合である。そのようなハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。所与のイオン強度およびpHにおいて、Tmは、標的配列の50%が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。さらに、そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対してアンチセンスオリゴマーの厳密な相補性を有する場合だけでなく、「近い」または「実質的な」相補性を有する場合にも生じうる。
【００２８】
本明細書中で用いる「対象」なる語は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いる「治療的有効量」および「有効量」なる語は、いずれかの医学的治療に適用可能な合理的な利益/リスク比で対象中の細胞の少なくとも亜集団において所望の治療効果を得るのに有効な物質の量を意味する。
【００３０】
対象における疾患の「治療」または疾患を有する対象の「治療」は、疾患の少なくとも1つの症状を軽減させ、またはその悪化を防止するように、医薬的治療、例えば薬物の投与、を対象に対して施すことを意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる、障害又は状態を「予防する」治療薬とは、障害又は状態の発症前に統計サンプルに投与されると、未治療の対照サンプルと比較して治療サンプルにおける障害又は状態の発生を低減するか、あるいは発症を遅延させるか、あるいは未治療の対照サンプルと比較して障害又は状態の1つ以上の症状の重症度を低減する化合物を指す。
【００３２】
RNA複合体
特定の態様において、MyD88又はTLR3 mRNAを標的とし、細胞によるMyD88又はTLR3発現を抑制するRNA複合体を本発明において提供する。ヒトMyD88及びTLR3 mRNAの核酸配列は、本開示の最後にある配列表に提供する。
【００３３】
特定の態様において、MyD88又はTLR3 mRNA配列(例えば、ヒトMyD88又はTLR3 mRNA配列)に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖及びアンチセンス鎖と配列相補性を有するセンス鎖を含むRNA複合体を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、細胞によるMyD88又はTLR3発現を抑制することができる。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、長い非対称短鎖干渉RNA(lasiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8または表10に列挙されているRNA複合体である。本明細書に記載されているRNA複合体はRNA塩基、非RNA塩基またはRNA塩基と非RNA塩基との混合を含有しうる。例えば、本発明で提供する特定のRNA複合体は主にRNA塩基から構成されうるが、DNA塩基または非天然ヌクレオチドをも含有しうる。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも19ヌクレオチド(nt)長である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は19〜21nt長(すなわち、19、20または21ntの長さ)である。幾つかの実施形態においては、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20又は21ntのアンチセンス鎖は、MyD88又はTLR3 mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、MyD88又はTLR3 mRNA配列と完全に相補的である。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも24nt長(例えば、少なくとも25nt長、少なくとも26nt長、少なくとも27nt長、少なくとも28nt長、少なくとも29nt長、少なくとも30nt長または少なくとも31nt長)である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は124nt長以下(例えば、100nt長以下、90nt長以下、80nt長以下、70nt長以下、60nt長以下、50nt長以下または40nt長以下)である。幾つかの実施態様においては、アンチセンス鎖は31nt長である。幾つかの実施形態においては、少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30又は31ntのアンチセンス鎖は、MyD88又はTLR3 mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、MyD88又はTLR3 mRNA配列と完全に相補的である。
【００３６】
幾つかの実施形態においては、センス鎖は15〜17nt長(すなわち、15nt長、16nt長または17nt長)である。幾つかの実施形態においては、センス鎖の少なくとも15nt、少なくとも16ntまたは少なくとも17ntがアンチセンス鎖の配列に相補的である。幾つかの実施形態においては、センス鎖はアンチセンス鎖の配列に完全に相補的である。
【００３７】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端がセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、センス鎖の5'末端がアンチセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。
【００３８】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖及び/又はセンス鎖は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8又は表10に列挙されている配列から選択されるセンス鎖配列及び/又はアンチセンス鎖配列を有する。
【００３９】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は化学修飾を含み、該修飾は送達ビヒクルの非存在下、細胞膜の透過を促進する。幾つかの実施形態においては、該修飾は2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合またはコレステロール部分である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表2または表4に列挙されている修飾RNA複合体である。特定の実施形態においては、RNA複合体は細胞毒性ではない。
【００４０】
本明細書に記載されているRNA複合体は種々のオリゴヌクレオチド化学物質を用いうる。オリゴヌクレオチド化学物質の例には、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエート、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドおよびモルホリノ化学(前記のいずれかの組合せを含む)が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、PNAおよびLNA化学はより短い標的化配列を用いることが可能である。なぜなら、それらは、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドと比べて比較的高い標的結合強度を有するからである。ホスホロチオエート骨格を有する2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドを作製するために、しばしば、ホスホロチオエートと2'O-Me-修飾化学物質とが組み合わされる。例えば、PCT公開番号WO/2013/112053およびWO/2009/008725(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)を参照されたい。
【００４１】
ペプチド核酸(PNA)は、ピリミジンまたはプリン塩基が結合しているN-(2-アミノエチル)グリシン単位からなる、デオキシリボース骨格と構造的に同形の骨格を有するDNAの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するPNAは、ワトソン-クリック塩基対形成規則に従い、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識の点でDNAを模倣する。PNAの骨格はホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により形成されており、これにより、それらはアンチセンス用途に好適なものとなる(後記の構造を参照されたい)。骨格は非荷電であるため、通常より大きな熱安定性を示すPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖が生じる。PNAはヌクレアーゼまたはプロテーゼによっては認識されない。
【００４２】
天然構造に対する根本的な構造変化にかかわらず、PNAはヘリックス形態でのDNAまたはRNAへの配列特異的結合が可能である。PNAの特徴には、相補的DNAまたはRNAに対する高い結合アフィニティ、一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する抵抗性、塩濃度に無関係なDNAまたはRNAとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンDNAとの三重鎖形成が含まれる。PANAGENE.TMは、それが独占所有するBts PNAモノマー(Bts; ベンゾチアゾール-2-スルホニル基)、および独占所有するオリゴマー化法を開発している。Bts PNAモノマーを使用するPNAオリゴマー化は脱保護、カップリングおよびキャッピングの反復サイクルから構成される。PNAは、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて合成的に製造される。例えば、米国特許第6,969,766号、第7,211,668号、第7,022,851号、第7,125,994号、第7,145,006号および第7,179,896号を参照されたい。また、PNAの製造に関しては、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号を参照されたい。PNA化合物の更なる教示はNielsenら, Science, 254:1497-1500, 1991に見出されうる。前記のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００４３】
干渉核酸は「ロックド核酸」サブユニット(LNA)をも含みうる。「LNA」は、架橋核酸(BNA)と称される修飾クラスのメンバーである。BNAは、C3-エンド(ノーザン)糖パッカー(pucker)中のリボース環のコンホメーションを固定する共有結合により特徴づけられる。LNAの場合、架橋は2'-Oおよび4'-C位間のメチレンから構成される。LNAは骨格の予備構成および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増強する。
【００４４】
LNAの構造は、例えば、Wengelら, Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54:3607およびAccounts of Chem. Research (1999) 32:301; Obikaら, Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; (1998) 39:5401およびBioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230に見出されうる。本発明で提供する化合物は1以上のLNAを含むことが可能であり、幾つかの場合には、該化合物はもっぱらLNAから構成されうる。個々のLNAヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴヌクレオチド内へのそれらの組込みのための方法は、例えば、米国特許第7,572,582号、第7,569,575号、第7,084,125号、第7,060,809号、第7,053,207号、第7,034,133号、第6,794,499号および第6,670,461号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。典型的なサブユニット間リンカーはホスホジエステルおよびホスホロチオエート部分を含み、あるいは、非リン含有リンカーが使用されうる。1つの実施形態は、各LNAサブユニットがDNAサブユニットによって分離されているLNA含有化合物である。ある化合物は、交互LNAおよびDNAサブユニットから構成され、この場合、サブユニット間リンカーはホスホロチオエートである。
【００４５】
特定の実施形態においては、RNA複合体はコレステロール部分に連結されている。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の5'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の5'末端に結合している。
【００４６】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体は2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。2'-O-メチル化ヌクレオシドはリボース分子の2'-OH残基にメチル基を含む。2'-O-Me-RNAはRNAと同じ(または類似した)挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解に対して保護されている。2'-O-Me-RNAは更なる安定化のためにホスホチオアートオリゴヌクレオチド(PTO)とも組み合わされうる。2'-O-Me-RNA(ホスホジエステルまたはホスホチオアート)は当技術分野における通常の技術に従い合成されうる(例えば、参照により本明細書に組み入れるYooら, Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004を参照されたい)。
【００４７】
幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはアンチセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域とアンチセンス鎖の3'末端領域との両方が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。
【００４８】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体はホスホロチオエート結合を含む。「ホスホロチオエート」(またはS-オリゴ)は、非架橋酸素の1つが硫黄により置換されている通常のDNAのバリアントである。ヌクレオチド結合間の硫化は、5'から3'へのおよび3'から5'へのDNA POL 1エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼS1およびP1、RNアーゼ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは2つの基本的経路により、すなわち、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用により、またはテトラエチルチウラムジスルフィド(TETD)または3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド(BDTD)のいずれかで亜リン酸トリエステルを硫化する方法により得られる(例えば、Iyerら, J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990を参照されたい)。後者の方法はほとんどの有機溶媒における元素硫黄の不溶性および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。また、TETDおよびBDTD法はより高い純度のホスホロチオエートを与える。
【００４９】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００５０】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００５１】
本明細書に記載されているRNA複合体を細胞と接触させ、または生物(例えば、ヒト)に投与することが可能である。あるいは、RNA複合体をコードする構築物および/またはベクターを細胞または生物と接触させ、あるいは細胞または生物内に導入することが可能である。ある実施形態においては、ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用する。
【００５２】
本明細書に記載されているRNA複合体は、当技術分野で公知の任意の適当な方法により製造されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は化学合成またはインビトロ転写により製造される。
【００５３】
特定の態様においては、本発明で提供するRNA複合体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を本発明で提供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、眼への送達用に(例えば、点眼薬として)製剤化される。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、硝子体内送達用に製剤化される。
【００５４】
幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、AMDの治療のための第2の物質(例えば、抗VEGF治療薬、例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ペガプタニブ及び/又はアフリベルセプト)をさらに含む。特定の実施形態においては、医薬組成物はトランスフェクションビヒクルを含まない。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマー)を含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、本明細書に記載されている複数(例えば、2以上)のRNA複合体の組合せを含む。
【００５５】
これらの製剤または組成物の製造方法は、本明細書に記載されているRNA複合体を担体と、そして所望により1以上の補助成分と一緒にする工程を含む。一般に、製剤は、本明細書に記載されている物質を液体担体と均一かつ密に一緒にすることにより製造される。
【００５６】
治療方法
【００５７】
特定の態様において、細胞によるMyD88及び/又はTLR3発現を抑制する方法であって、本発明において提供するRNA複合体と細胞を接触させることを含む方法を本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、修飾RNA複合体であり、トランスフェクションビヒクルの非存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体及び/又はアプタマー)の存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、細胞は、ヒト対象の眼に存在する。幾つかの実施形態においては、対象は、AMD(例えば、ウェット型AMD又はドライ型AMD)を有する。
【００５８】
特定の態様において、AMD(例えば、ウェット型AMD又はドライ型AMD)に対するヒト対象の治療方法であって、本発明において提供するRNA複合体又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。特定の実施形態においては、RNA複合体又は医薬組成物は、対象の眼に投与される。幾つかの実施形態においては、RNA複合体又は医薬組成物は、対象によって自己投与される。
【００５９】
本方法においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、例えば、送達ビヒクルを使用しない核酸として(例えば、cp-asiRNAおよびcp-lasiRNAの場合)、送達試薬と併用して、および/または本明細書に記載されているRNA複合体を発現する配列を含む核酸として、対象に投与されうる。幾つかの実施形態においては、当技術分野で公知の任意の核酸送達方法が、本明細書に記載されている方法において用いられうる。適当な送達試薬には、例えば、Mirus Transit TKO親油性試薬; リポフェクチン; リポフェクタミン; セルフェクチン; ポリカチオン(例えば、ポリリシン)、アテロコラーゲン、ナノプレックスおよびリポソームが含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸分子用送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用はMinakuchiら, Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanaiら, Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); およびKawataら, Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。例示的な干渉核酸送達システムは米国特許第8,283,461号、第8,313,772号、第8,501,930号、第8,426,554号、第8,268,798号および第8,324,366号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)で提供されている。
【００６０】
本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体を対象に送達するためにリポソームを使用する。本明細書に記載されている方法における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成性脂質(これは、一般には、中性または負荷電リン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む)から形成されうる。脂質の選択は、一般には、所望のリポソームのサイズおよび血流内のリポソームの半減期のような要因を考慮することによって導かれる。リポソームの製造のための種々の方法が公知であり、例えば、Szokaら, (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; ならびに米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号および第5,019,369号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。
【００６１】
本方法に使用されるリポソームはまた、単核マクロファージ系(「MMS」)および細網内皮系(「RES」)によるクリアランスを回避するために修飾されうる。そのような修飾リポソームは表面上のまたはリポソーム構造内に取り込まれたオプソニン化抑制部分を有する。
【００６２】
本明細書に記載されているリポソームの製造に使用するためのオプソニン化抑制部分は、典型的には、リポソーム膜に結合した大きな親水性重合体である。本明細書中で用いるオプソニン化抑制部分がリポソーム膜に「結合」していると言えるのは、それが化学的または物理的に、例えば、膜自体の内部への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接結合により、該膜に結合している場合である。これらのオプソニン化抑制性親水性重合体は、例えば米国特許第4,920,016号(その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されているとおり、MMSおよびRESによるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表面層を形成する。
【００６３】
幾つかの実施形態においては、リポソームの修飾に適したオプソニン化抑制部分は、約500〜約40,000ダルトンまたは約2,000〜約20,000ダルトンの数平均分子量を有する水溶性重合体である。そのような重合体には、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体; 例えばメトキシPEGまたはPPG、およびPEGまたはPPGステアラート; 合成重合体、例えばポリアクリルアミドまたはポリN-ビニルピロリドン; 直鎖状、分枝状またはデンドリマー状ポリアミドアミン; ポリアクリル酸; カルボキシルまたはアミノ基が化学結合している多価アルコール、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドGM1が含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGまたはそれらの誘導体の共重合体も好適である。また、オプソニン化抑制性重合体はPEGおよびポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかのブロック共重合体でありうる。また、オプソニン化抑制重合体は、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン; アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖状または分枝状); あるいはカルボキシル化多糖またはオリゴ糖、例えば、炭酸誘導体と反応してカルボキシル基が結合したものでありうる。幾つかの実施形態においては、オプソニン化抑制部分はPEG、PPGまたはそれらの誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と称されることがある。
【００６４】
本明細書中で開示されている医薬組成物は、任意の適切な投与経路、例えば、局所的、硝子体内、経口的及び非経口的に送達されうる。特定の実施形態においては、医薬組成物は、(例えば、経口又は非経口投与により)全身送達される。他の特定の実施形態においては、医薬組成物は眼への直接投与によって局所的に送達される。
【００６５】
医薬組成物中のRNA複合体の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴うことなく個々の患者、組成物および投与方法に関して所望の治療応答を得るのに有効なRNA複合体の量が得られるように変動可能である。
【００６６】
選択される投与量レベルは、使用される個々の物質の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用される個々の化合物と併用される他の薬物、化合物および/または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態および過去の病歴ならびに医学分野でよく知られている同様の要因を含む種々の要因に依存する。
【００６７】
当技術分野における通常の技量を有する医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することが可能である。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される物質の用量を、所望の治療効果を達成する必要レベルより低いレベルで処方および/または投与し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることが可能である。
【００６８】
一般に、本明細書に記載されているRNA複合体の適当な1日量は、治療効果を得るのに有効な最低用量であるRNA複合体の量である。そのような有効量は、一般に、前記の要因に依存する。
【実施例】
【００６９】
[実施例1]
MyD88特異的非対称短鎖干渉RNAのスクリーニング
高い効率でMyD88を抑制する非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)を同定するために、44個のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングしたasiRNAの核酸配列を表1に示す。
【００７０】
【表１】
2018533956.tif 000006
2018533956.tif 000007
2018533956.tif 000008
【００７１】
表1に列挙されているasiRNAを、1×siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。該HeLa細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従い使用して、0.3nMのasiRNAをトランスフェクトした。
【００７２】
トランスフェクションの24時間後、リアルタイムPCRを用いて、トランスフェクト細胞におけるMyD88 mRNAレベルを測定した。具体的には、RNAiso Plus(TaKaRa)を使用して全RNAを抽出し、ついで高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用して500ngの抽出RNAをcDNA合成に使用した。合成されたcDNAを希釈し、ついでStepOneリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用して定量的リアルタイムPCRを行った。パワーSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を使用して、MyD88遺伝子の増幅を検出した。GAPDHを内部対照として増幅した。以下のプライマー配列を使用した。
ヒトGAPDH-フォワード  5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'
ヒトGAPDH-リバース  5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3'
ヒトMyD88-フォワード  5'-AAG TTA TTT GTT TAC AAA CAG CGA CCA-3'
ヒトMyD88-リバース  5'-GGA AGA ATG GCA AAT ATC GGC T-3'
【００７３】
44個のasiRNAのそれぞれによるMyD88抑制のレベルを図1に示す。それらのasiRNA配列のうちの3つ、すなわち、asiMyD88(26)、asiMyD88(27)及びasiMyD88(32)を、フォローアップ研究に使用するために選択した。
【００７４】
[実施例2]
MyD88標的化asiRNAを使用したMyD88 mRNA発現レベルの抑制
それらのasiRNA配列のうちの3つ、すなわち、asiMyD88(26)、asiMyD88(27)及びasiMyD88(32)を、MyD88発現を抑制するそれらの能力に関して異なる濃度で試験した。asiRNAを、1×siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。HeLa細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従い使用して、asiRNAをトランスフェクトした。
【００７５】
異なる濃度の3つのasiRNAによるMyD88抑制のレベルを図2に示す。図2に示されるとおり、低濃度のasiMyD88(26)及びasiMyD88(27)は、最高レベルのMyD88抑制を示した。asiMyD88(26)及びasiMyD88(27)を、フォローアップ研究に使用するために選択した。
【００７６】
[実施例3]
asiRNAの修飾
異なるアンチセンス鎖長を有する種々の潜在的asiMyD88構造体を合成し、MyD88発現を抑制するそれらの能力に関して試験した(表2)。
【００７７】
【表２】
2018533956.tif 000009
【００７８】
表2に列挙されているasiRNAを、1×siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。該HeLa細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従い使用して、0.3nMのasiRNAをトランスフェクトした。
【００７９】
トランスフェクションの24時間後、リアルタイムRT-PCRを用いて、トランスフェクト細胞におけるMyD88 mRNAレベルを測定した。具体的には、RNAiso Plus(TaKaRa)を使用して全RNAを抽出し、ついで高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用して500ngの抽出RNAをcDNA合成に使用した。合成されたcDNAを希釈し、ついでStepOneリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用して定量的リアルタイムPCRを行った。パワーSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を使用して、MyD88遺伝子の増幅を検出した。GAPDHを内部対照として増幅した。
【００８０】
6個のasiRNAのそれぞれによるMyD88抑制のレベルを図3に示す。asiMyD88(26)及びasiMyD88(27)の21ヌクレオチドアンチセンスが最高レベルのMyD88抑制を示した。21ヌクレオチドアンチセンスを、フォローアップ研究に使用するために選択した。
【００８１】
[実施例4]
MyD88特異的asiRNAを使用したMyD88タンパク質の抑制
MyD88タンパク質の抑制に対するasiMyD88の有効性を試験した。
【００８２】
asiRNAを、1×siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。
【００８３】
100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したA549細胞(ATCC)及びHeLa細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、5.0×104個のA549細胞又はHeLa細胞を12ウェルプレートに播いた。A549細胞及びHeLa細胞に、Lipofectamine(商標)RNAiMAX(Invitrogen)を製造業者の指示に従い使用して、10nM及び3nMのasiRNAをトランスフェクトした。24時間後、OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。
【００８４】
asiRNAトランスフェクションの48時間後、MyD88タンパク質発現のレベルをウエスタンブロットにより測定した。簡潔に説明すると、トランスフェクトA549細胞及びHeLa細胞をRIPAバッファー(GE)で細胞溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物15μg又はHeLa細胞の全タンパク質抽出物30μgを12% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗MyD88抗体(Abcam)及び抗β-アクチン抗体(Santa Cruz)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜を1×TBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜を1×TBSTで10分間洗浄し、1×ECLで1分間処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、MyD88及びβ-アクチンバンドをイメージングした。
【００８５】
ウエスタンブロットアッセイの結果を図4に示す。A549細胞及びHeLa細胞のasiMyD88トランスフェクション細胞株全てにおいて、80%以上のMyD88タンパク質抑制が確認された(図4)。
【００８６】
[実施例5]
MyD88 asiRNAの化学修飾
asiRNAに化学修飾を施した。後記のとおり、該修飾の幾つかはasiRNAのエンドサイトーシス及び安定性を改善した。4個のasiRNA(表3)をHeLa細胞におけるMyD88 mRNA抑制に関して試験した。
【００８７】
【表３】
2018533956.tif 000010
【００８８】
100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。該HeLa細胞を、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従い使用してトランスフェクトした。24時間後、HeLa細胞におけるMyD88 mRNAレベルを測定した。
【００８９】
各asiRNAによるMyD88抑制のレベルを図5に示す。修飾MyD88(27)が、最高レベルのMyD88抑制を示した。
【００９０】
[実施例6]
自己送達のためのasiRNAの化学修飾
asiRNAに化学修飾を施し、修飾asiRNAの細胞送達を他の送達ビヒクルの非存在下で試験した。後記のとおり、該修飾の幾つかはasiRNAの安定性およびエンドサイトーシスを改善した。そのような細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)は送達ビヒクルの非存在下で細胞内に送達される能力を有する。
【００９１】
20個の潜在的cp-asiRNA(表4)をHeLa細胞におけるMyD88 mRNA抑制に関してスクリーニングした。各潜在的cp-asiRNAを、送達ビヒクルを使用せず、HeLa細胞と共に1μMでインキュベートし、リアルタイムPCRによりMyD88 mRNAレベルを測定した。
【００９２】
【表４】
2018533956.tif 000011
2018533956.tif 000012
【００９３】
HeLa細胞(ATCC)は、100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したものである。
【００９４】
表4に列挙されている潜在的cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。
【００９５】
トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。
【００９６】
asiRNA処理の48時間後、MyD88 mRNA発現のレベルを測定した。
【００９７】
20個の潜在的cp-asiRNAのそれぞれによるMyD88抑制のレベルを図6に示す。試験した潜在的cp-asiRNAのうち、cp-asiRNA(26)-1及びcp-asiRNA(27)-7が最高レベルのMyD88抑制を示した。
【００９８】
[実施例7]
MyD88特異的cp-asiRNAを使用したMyD88タンパク質の抑制
MyD88タンパク質の抑制に関するcp-asiRNAの有効性を試験した。各潜在的cp-asiRNAを、送達ビヒクルを使用せず、HeLa細胞と共に1μMでインキュベートし、MyD88タンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。
【００９９】
100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。トランスフェクションの1日前に、5.0×104個のHeLa細胞を12ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。
【０１００】
asiRNA処理の48時間後、MyD88タンパク質発現のレベルをウエスタンブロットにより測定した。簡潔に説明すると、処理したHeLa細胞をRIPAバッファー(GE)で細胞溶解した。全タンパク質抽出物30μgを12% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗MyD88抗体(Abcam)及び抗γ-チューブリン(Bethyl)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜を1×TBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜を1×TBSTで10分間洗浄し、1×ECLで1分間処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、MyD88及びγ-チューブリンバンドをイメージングした。
【０１０１】
ウエスタンブロットアッセイの結果を図7に示す。cp-asiMyD88(27)-4及びcp-asiMyD88(27)-7とインキュベートした細胞株全てが、60%以上のMyD88タンパク質抑制を示した(図7)。
【０１０２】
[実施例8]
MyD88特異的cp-asiRNAを使用したMyD88タンパク質の抑制
アンチセンス鎖に異なる数のホスホロチオエート結合を有する種々の潜在的cp-asiMyD88構造体を合成し、MyD88発現を抑制するそれらの能力に関して試験した(表5)。
【０１０３】
【表５】
2018533956.tif 000013
【０１０４】
表5に列挙されている潜在的cp-asiRNAのそれぞれ(1μM)の、HeLa細胞においてMyD88 mRNAを抑制する能力を試験した。100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。表5に列挙されている潜在的cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。asiRNA処理の48時間後、MyD88 mRNA発現のレベルを測定した。
【０１０５】
図8に示されているとおり、センス鎖に3つのホスホロチオエート結合及びアンチセンス鎖に4つのホスホロチオエート結合を含むMyD88 mRNA潜在的cp-asiRNA(26)、センス鎖に3つのホスホロチオエート結合及びアンチセンス鎖に3つの2'-O-メチル化及び4つのホスホロチオエート結合を含むcp-asiRNA(27)が最高レベルのMyD88抑制を示した。
【０１０６】
[実施例9]
追加的なMyD88特異的cp-asiRNAを使用したMyD88タンパク質の抑制
MyD88タンパク質の抑制に関するcp-asiRNAの有効性を試験した。各潜在的cp-asiRNAを、送達ビヒクルを使用せず、3uMでHeLa細胞と共にインキュベートし、MyD88タンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。トランスフェクションの1日前に、5.0×104個のHeLa細胞を12ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。
【０１０７】
asiRNA処理の48時間後、MyD88タンパク質発現のレベルをウエスタンブロットにより測定した。簡潔に説明すると、処理したHeLa細胞をRIPAバッファー(GE)で細胞溶解した。全タンパク質抽出物30μgを12% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗MyD88抗体(Abcam)及び抗γ-チューブリン(Bethyl)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜を1×TBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜を1×TBSTで10分間洗浄し、1×ECLで1分間処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、MyD88及びγ-チューブリンバンドをイメージングした。
【０１０８】
ウエスタンブロットアッセイの結果を図9に示す。cp-asiMyD88とインキュベートした細胞株全てが50%以上のMyD88タンパク質抑制を示した。さらに、cp-asiMyD88(26)-10及びcp-asiMyD88(27)-2は、他のcp-asiMD88と比べて、より高い効率のMyD88抑制能を有することが示された(図9)。
【０１０９】
[実施例10]
追加的なMyD88 cp-asiRNA構造体
異なる鎖長並びに異なる数の2'-O-メチル化修飾及びホスホロチオエート結合を有する種々の潜在的cp-asiMyD88構造体を合成し、MyD88発現を抑制するそれらの能力に関して試験した(表6)。
【０１１０】
【表６】
2018533956.tif 000014
【０１１１】
1μM又は3μMの表6に列挙されている潜在的cp-asiRNAのそれぞれの、HeLa細胞においてMyD88 mRNAを抑制する能力を試験した。100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。表6に列挙されている潜在的cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。トランスフェクションの1日前に、2.0×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。asiRNA処理の48時間後、MyD88 mRNA発現のレベルを測定した。
【０１１２】
図10に示されるとおり、21ヌクレオチドアンチセンス鎖に4つの2'-O-メチル化及び6つのホスホロチオエート結合を含むMyD88 mRNA潜在的cp-asiRNA(26)、19ヌクレオチドアンチセンス鎖に4つの2'-O-メチル化及び6つのホスホロチオエート結合を含むcp-asiRNA(27)が最高レベルのMyD88抑制を示した。
【０１１３】
[実施例11]
追加的なMyD88特異的cp-asiRNAを使用したMyD88タンパク質の抑制
MyD88タンパク質の抑制に関するcp-asiRNAの有効性を試験した。各潜在的cp-asiRNAを、送達ビヒクルを使用せず、HeLa細胞と共に1μM及び3μMでインキュベートし、MyD88タンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養したHeLa細胞(ATCC)を使用した。cp-asiRNAをOPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。
【０１１４】
トランスフェクションの1日前に、5.0×104個のHeLa細胞を12ウェルプレートに播いた。処理の直前に、HeLa細胞を1×DPBS(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。asiRNA処理の48時間後、MyD88タンパク質発現のレベルをウエスタンブロットにより測定した。簡潔に説明すると、処理したHeLa細胞をRIPAバッファー(GE)で細胞溶解した。全タンパク質抽出物30μgを12% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗MyD88抗体(Abcam)及び抗γ-チューブリン(Bethyl)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜を1×TBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜を1×TBSTで10分間洗浄し、1×ECLで1分間処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、MyD88及びγ-チューブリンバンドをイメージングした。
【０１１５】
ウエスタンブロットアッセイの結果を図11に示す。3μMのcp-asiMyD88とインキュベートした細胞株全てが50%以上のMyD88タンパク質抑制を示した。さらに、cp-asiMyD88(26)-13は、他のcp-asiMD88と比べて、より高い効率のMyD88抑制能を有することが示された(図11)。
【０１１６】
[実施例12]
トール様受容体3特異的な非対称短鎖干渉RNAのスクリーニング
高効率でトール様受容体3を抑制する非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)を同定するために、100個のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングしたasiRNAの核酸配列を表7に示す。
【０１１７】
【表７】
2018533956.tif 000015
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2018533956.tif 000017
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【０１１８】
表7に列挙されているasiRNAをアニーリングバッファー(Bioneer Inc.韓国)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。UVトランスイルミネーターを使用して、適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)並びに100単位/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で培養した5×103個のHaCaT細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播いた。HaCaT細胞に、RNAiMAX(Invitrogen Inc.)を製造業者の指示に従い使用して、0.1nMのasiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、qRT-PCRを用いて、トランスフェクト細胞におけるTLR3 mRNAレベルを測定した。具体的には、TOYOBO細胞溶解試薬を使用して、全RNAを抽出し、ついでTOYOBO RT試薬(TOYOBO SuperPrep)を使用して、反応混合物の体積の1/5をcDNA合成に使用した。合成されたcDNAを希釈し、ついでTHUNDERBIRD(登録商標)Probe qPCR Mix(TOYOBO)を使用して定量的RT-PCRを行った。TLR3 TaqMan(登録商標)プローブ(Hs01551078_m1)及び18S TaqMan(登録商標)プローブ(Hs03928985_g1)を使用して、標的遺伝子の増幅を検出した。
【０１１９】
100個のasiRNAのそれぞれによるTLR3抑制の発現レベルを図12に示す。17個のasiRNA配列、すなわちasiRNA(13)、asiRNA(25)、asiRNA(26)、asiRNA(28)、asiRNA(32)、asiRNA(33)、asiRNA(37)、asiRNA(38)、asiRNA(39)、asiRNA(53)、asiRNA(58)、asiRNA(60)、asiRNA(71)、asiRNA(77)、asiRNA(78)、asiRNA(82)及びasiRNA(83)を、フォローアップ研究に使用するために選択した。
【０１２０】
[実施例13]
自己送達のためのasiRNAの化学修飾
実施例12において選択したasiRNAに化学修飾を施し、他の送達ビヒクルの非存在下で修飾asiRNAの細胞送達を試験した。後記のとおり、該修飾の幾つかはasiRNAのエンドサイトーシス及び安定性を改善した。そのような細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)は送達ビヒクルの非存在下で細胞に送達される能力を有する。上記の方法を使用して測定した、細胞によるTLR3 mRNAの発現を図13及び14に示し、TLR3タンパク質レベルを図15に示す。細胞の形態を図16に示す。
【０１２１】
潜在的cp-asiRNA(表8)をHaCaT細胞におけるトール様受容体3(TLR3)mRNA抑制に関してスクリーニングした。各潜在的cp-asiRNAを、送達ビヒクルを使用せず、ヒト皮膚角化細胞株であるHaCaT細胞と共に1μM及び3μMでインキュベートし、qRT-PCR及びウエスタンブロット研究によりTLR3発現レベルを測定した。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
100mm細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)及び100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)でHaCaT細胞(ATCC)を培養した。表8に列挙されている潜在的cp-asiRNAをOpti-MEM(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。潜在的cp-asiRNAの適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。
【０１２４】
cp-asiRNA処理の日に、5×104個の細胞を24ウェルプレートに播き、ついでOpti-MEM中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。24時間後、qRT-PCRを用いてHaCaT細胞におけるTLR3 mRNAレベルを測定した。具体的には、RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を用いて全RNAを抽出し、ついで大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して、500ngの反応混合物をcDNA合成に使用した。合成されたcDNAを希釈し、ついでパワーSYBRグリーンPCRマスターミックス(Applied Biosystems)を使用して定量的RT-PCRを行った。以下のプライマー配列を使用した。
【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
48時間のcp-asiRNAインキュベーション後、ウエスタンブロットによりTLR3タンパク質発現のレベルを測定した。簡潔に説明すると、処理したHaCaT細胞を哺乳動物タンパク質抽出バッファー(GE Healthcare)で細胞溶解した。全タンパク質抽出物10μgを8% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗TLR3抗体(Abcam)及び抗γ-チューブリン抗体(Bethyl)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜をTBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体(Santa Cruz)と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜をTBSTで10分間洗浄し、ECL基質(Thermo Scientific)で処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、標的タンパク質バンドをイメージングした。
【０１２７】
24個の潜在的cp-asiRNAのそれぞれによるTLR3抑制のレベルを図17及び18に示す。試験した潜在的cp-asiRNAから、cp-asiTLR3 39(2,4)を更なる研究のために選択した。
【０１２８】
[実施例14]
追加的なTLR3 cp-asiRNA構造体
異なる鎖長を有する他の潜在的cp-asiTLR3構造体を合成し、TLR3発現を抑制するその能力に関して試験した(表10)。
【０１２９】
【表１０】
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【０１３０】
表10に列挙されている潜在的cp-asiRNAのそれぞれの、HaCaT細胞においてTLR3発現を抑制する用量依存的な能力を試験した。10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)及び100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)でHaCaT細胞を培養した。表10に列挙されている潜在的cp-asiRNAをOpti-MEM(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。潜在的cp-asiRNAの適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。cp-asiRNA処理の日に、5×104個の細胞を24ウェルプレートに播き、ついでOpti-MEM中、潜在的cp-asiRNAの存在下で24時間培養した。その時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地に交換した。24時間後に、HaCaT細胞におけるTLR3発現レベルを測定した。
【０１３１】
図19に示されているとおり、TLR3発現の潜在的cp-asiRNAは21ヌクレオチドアンチセンス鎖からなり、潜在的cp-asiRNAは19ヌクレオチドアンチセンス鎖からなり、同様のレベルのTLR3抑制を示した。更なる実験のためにcp-asiTLR3(39)21及びcp-asiTLR3(39)19を選択した。
【０１３２】
TLR3タンパク質の産生に対する低濃度のcp-asiTLR3(39)21及びcp-asiTLR3(39)19の有効性を試験した。cp-asiRNAをOpti-MEM(Gibco)中、95℃で2分間及び37℃で1時間インキュベートした。潜在的cp-asiRNAの適切な鎖アニーリングがゲル電気泳動により確認された。10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)並びに100単位/mlペニシリン及び100ug/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)でHaCaT細胞を培養した。処理の日に、5×104個のHaCaT細胞を12ウェルプレートに播き、ついでOpti-MEM中、潜在的cp-asiRNAの存在下において培養した。
【０１３３】
24時間後、ウエスタンブロットによりHaCaTにおけるTLR3タンパク質レベルを測定した。簡潔に説明すると、処理したHaCaT細胞を哺乳動物タンパク質抽出バッファー(GE Healthcare)で細胞溶解した。全タンパク質抽出物10ugを8% SDS-PAGEゲルにローディングし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、300mAで1時間にわたり、メタノール(Merck)で既に活性化されたPVDF膜(Bio-Rad)にタンパク質を転写した。該膜を5%脱脂乳(Seoul Milk)により室温で1時間ブロッキングし、ついで抗TLR3抗体(Abcam)及び抗γ-チューブリン抗体(Bethyl)を含有する5%脱脂乳中、4℃で一晩インキュベートした。ついで該膜をTBSTで10分間、3回洗浄し、HRP結合二次抗体(Santa Cruz)と共に5%脱脂乳中、室温で1時間インキュベートした。該膜をTBSTで10分間洗浄し、ECL基質(Thermo Scientific)で処理した。ついでChemidoc装置(Bio-Rad)を使用して、標的タンパク質バンドをイメージングした。
【０１３４】
図20からわかるとおり、21ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するTLR3発現の潜在的cp-asiRNA及び19ヌクレオチドアンチセンス鎖を有する潜在的cp-asiRNAは低濃度で同様のレベルのTLR3抑制を示した。
【０１３５】
文献の援用
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許および特許出願を、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、本明細書における定義を含め本出願が優先する。
【０１３６】
均等物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または通常の実験のみを行ってそれらを確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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