(57)【要約】本発明は、２１３Ｂｉまたは２２５Ａｃなどの、アルファ放出放射性核種の、癌細胞または腫瘍などの、標的細胞または標的組織への事前標的指向型送達を目的とする方法及び組成物に関する。好ましい実施形態では、事前標的指向化方法は、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する少なくとも１つの結合部位、及びハプテンに対する少なくとも１つの結合部位を含む二重特異性抗体の投与と、ｂ）アルファ放出放射線核種で標識されたハプテン複合化標的指向化可能型構築物の投与と、を含む。より好ましくは、二重特異性抗体は、放射性核種と共に、標的細胞へと迅速に内部移行する。最も好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）複合体として調製される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ粒子放出放射性核種の、腫瘍への送達方法であって、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する１つの結合部位、及びハプテンに対する１つの結合部位を有する二重特異性抗体の、腫瘍を有する対象への投与と、
ｂ）アルファ粒子放出放射性核種で標識されたハプテン含有標的指向化可能型構築物の、前記対象への投与と、
を含む、前記送達方法。
【請求項２】
前記二重特異性抗体が、腫瘍細胞へと内部移行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象がヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二重特異性抗体が、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を含む複合体であって、前記第１の融合タンパク質が、ヒトタンパク質キナーゼＡの制御サブユニットであるＲＩ、ＲＩ、ＲＩＩ、またはＲＩＩに由来する二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に結合した第１の抗体または抗原結合抗体断片を含み、前記第２の融合タンパク質が、ヒトＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に由来するアンカードメイン（ＡＤ）部分に結合した第２の抗体または抗原結合抗体断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二重特異性抗体が、ＴＦ１２である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記放射性核種が、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、及びＴｈ−２２７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記放射性核種が、Ｂｉ−２１３またはＡｃ−２２５である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的指向化可能型構築物が、ＩＭＰ２８８、ＩＭＰ４０２、ＩＭＰ４５３、ＩＭＰ４５７、及びＩＭＰ４９８からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二重特異性抗体が、ｈＲＳ７、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＲ１、ｈＰＡＭ４、ｈＡ２０、ｈＡ１９、ｈＩＭＭＵ３１、ｈＭｕ−９、ｈＬ２４３、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＭＮ−３、ＲＦＢ４、リツキシマブ、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｘｕｍａｂ）、ランブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ、トレメリムマブ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、Ｊ５９１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、Ｄ２／Ｂ、Ｇ２５０、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ、トシツモマブ、及びトラスツズマブからなる群から選択される抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハプテンが、ＨＳＧまたはＩｎ−ＤＴＰＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体が、ｈ６７９及びｈ７３４からなる群から選択される抗ハプテン抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
毒素、薬物、放射性核種、免疫調節物質、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、光反応性の治療物質、抗血管新生物質、及びアポトーシス促進物質からなる群から選択される治療物質の、前記対象への投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬物が、５−フルオロウラシル、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、プロ−２Ｐ−ＤＯＸ、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水溶性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンカアルカロイドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療物質が、ＳＮ−３８またはプロ−２Ｐ−ＤＯＸである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記毒素が、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスの菌体外毒素、及びシュードモナスの菌体内毒素からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射性核種が、１０３ｍＲｈ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、１０９Ｐｄ、１０９Ｐｔ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１９Ｓｂ、１１Ｃ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５Ｉ、１２５ｍＴｅ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３Ｎ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５２Ｄｙ、１５３Ｓｍ、１５Ｏ、１６１Ｈｏ、１６１Ｔｂ、１６５Ｔｍ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９ｍＯｓ、１８９Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、１９７Ｐｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１５Ｐｏ、２１７Ａｔ、２１９Ｒｎ、２２１Ｆｒ、２２３Ｒａ、２２４Ａｃ、２２５Ａｃ、２２５Ｆｍ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｂｒ、７５Ｓｅ、７６Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、９９Ｍｏ、９９ｍＴｃ、及び２２７Ｔｈからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫調節物質が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、及びトロンボポエチンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記サイトカインが、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、ＮＧＦ−β、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−λ、マクロファージ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット（ｋｉｔ）リガンド、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びリンホトキシンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５ａ、補体因子Ｃ５、ＰＬＡＧＬ２、ならびに癌遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＡＡが、Ｔｒｏｐ−２、ＣＤ２２、またはＣＤ７４である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫の低悪性度形態、Ｂ細胞リンパ腫の高悪性度形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、食道、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、及び前立腺の癌腫からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍の増殖阻害または生存阻害をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
癌の治療方法であって、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する１つの結合部位、及びハプテンに対する１つの結合部位を有する二重特異性抗体の、癌を有する対象への投与と、
ｂ）アルファ粒子放出放射性核種で標識されたハプテン含有標的指向化可能型構築物の、前記対象への投与と、
を含む、前記治療方法。
【請求項２４】
前記二重特異性抗体が、腫瘍細胞へと内部移行する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、ヒト対象である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記二重特異性抗体が、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を含む複合体であって、前記第１の融合タンパク質が、ヒトタンパク質キナーゼＡの制御サブユニットであるＲＩ、ＲＩ、ＲＩＩ、またはＲＩＩに由来する二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に結合した第１の抗体または抗原結合抗体断片を含み、前記第２の融合タンパク質が、ヒトＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に由来するアンカードメイン（ＡＤ）部分に結合した第２の抗体または抗原結合抗体断片を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記二重特異性抗体が、ＴＦ１２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記放射性核種が、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、及びＴｈ−２２７からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記放射性核種が、Ｂｉ−２１３またはＡｃ−２２５である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的指向化可能型構築物が、ＩＭＰ２８８、ＩＭＰ４０２、ＩＭＰ４５３、ＩＭＰ４５７、及びＩＭＰ４９８からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記二重特異性抗体が、ｈＲＳ７、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＲ１、ｈＰＡＭ４、ｈＡ２０、ｈＡ１９、ｈＩＭＭＵ３１、ｈＭｕ−９、ｈＬ２４３、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＭＮ−３、ＲＦＢ４、リツキシマブ、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｘｕｍａｂ）、ランブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ、トレメリムマブ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、Ｊ５９１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、Ｄ２／Ｂ、Ｇ２５０、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ、トシツモマブ、及びトラスツズマブからなる群から選択される抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハプテンが、ＨＳＧまたはＩｎ−ＤＴＰＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記二重特異性抗体が、ｈ６７９及びｈ７３４からなる群から選択される抗ハプテン抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
毒素、薬物、放射性核種、免疫調節物質、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、光反応性の治療物質、抗血管新生物質、及びアポトーシス促進物質からなる群から選択される治療物質の、前記対象への投与をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬物が、５−フルオロウラシル、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、プロ−２Ｐ−ＤＯＸ、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水溶性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンカアルカロイドからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療物質が、ＳＮ−３８またはプロ−２Ｐ−ＤＯＸである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記毒素が、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスの菌体外毒素、及びシュードモナスの菌体内毒素からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記放射性核種が、１０３ｍＲｈ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、１０９Ｐｄ、１０９Ｐｔ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１９Ｓｂ、１１Ｃ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５Ｉ、１２５ｍＴｅ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３Ｎ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５２Ｄｙ、１５３Ｓｍ、１５Ｏ、１６１Ｈｏ、１６１Ｔｂ、１６５Ｔｍ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９ｍＯｓ、１８９Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、１９７Ｐｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１５Ｐｏ、２１７Ａｔ、２１９Ｒｎ、２２１Ｆｒ、２２３Ｒａ、２２４Ａｃ、２２５Ａｃ、２２５Ｆｍ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｂｒ、７５Ｓｅ、７６Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、９９Ｍｏ、９９ｍＴｃ、及び２２７Ｔｈからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫調節物質が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、及びトロンボポエチンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記サイトカインが、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、ＮＧＦ−β、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−λ、マクロファージ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット（ｋｉｔ）リガンド、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びリンホトキシンからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５ａ、補体因子Ｃ５、ＰＬＡＧＬ２、ならびに癌遺伝子産物からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＡＡが、Ｔｒｏｐ−２、ＣＤ２２、またはＣＤ７４である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫の低悪性度形態、Ｂ細胞リンパ腫の高悪性度形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、食道、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、及び前立腺の癌腫からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１月９日出願の米国仮特許出願第６２／１０１，６０１号、及び２０１５年６月２９日出願の第６２／１８５，９７８号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で利益を主張し、これらの文献の内容はそれぞれ、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列リスト
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列リストを含み、これによって、その全体が、参照によって組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＭＭ３５３ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔの名称で２０１５年１０月２２日に作成され、そのサイズは、２７，８３２バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、癌などの疾患を標的とする能力が改善した治療複合体に関する。好ましくは、送達システムは、二重特異性抗体が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの、腫瘍関連抗原に対する１つまたは複数の結合部位と、ヒスチジン−スクシニル−グリシン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ）（ＨＳＧ）などの、標的指向化可能型構築物のハプテンに対する１つまたは複数の結合部位と、を有する事前標的指向化方法を含む。標的指向化可能型構築物は、２１３Ｂｉ治療物質を含んでよい。最も好ましくは、二重特異性抗体は、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）複合体として調製される。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体は、癌及び他の疾患細胞に対する、毒性物質の標的指向型送達に使用されてきた。しかしながら、抗体と毒性物質との免疫複合体は、癌または自己免疫疾患の治療においてある程度の成功は収めたものの、感染性疾患などの、他の疾患における用途はほとんどなかった。粒子放出放射性核種、または細菌もしくは植物の毒素もまた、特に癌治療を目的として、抗体に複合化され（Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，２００６，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５６：２２６−２４３）、ある特定の感染性疾患の前臨床治療を目的とした放射性免疫複合体（Ｄａｄａｃｈｏｖａ  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，２００６，Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ５０：１９３−２０４）は存在したものの、毒性物質が最も一般的な化学療法薬である。当該分野では、薬物、毒素、放射性核種、及び他の治療物質を対象とする、より有効な標的指向型送達方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、２１３Ｂｉなどの、治療物質の標的指向型送達を目的とする、改善された方法及び組成物を提供することによって、当該技術分野において必要とされるものが満たされていない状況を解決する。好ましい実施形態では、方法及び組成物は、新規の二重特異性抗体構築物を用いた事前標的指向化を含み、当該二重特異性抗体構築物は、ＣＥＡなどの、腫瘍関連抗原に対する少なくとも１つの結合部位と、ＨＳＧまたはＩｎ−ＤＴＰＡなどの、標的指向化可能型構築物のハプテンに対する少なくとも１つの結合部位と、を含む。標的指向化可能型構築物は、治療物質または診断物質の担体として働く。
【０００６】
より好ましくは、二重特異性抗体構築物は、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）手法（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号を参照のこと。それぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）によって調製される。ＤＮＬ手法は、タンパク質キナーゼＡに由来する二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ部分）と、多くの既知のＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ部分）と、の間で、特異的な結合相互作用が生じることを利用するものである。ＤＤＤ部分は、自発的に二量体を形成した後、ＡＤ部分に結合する。ＡＤ部分及びＤＤＤ部分に対して、抗体またはその断片などの、適切なエフェクター部分を結合することによって、ＤＮＬ手法では、任意の所望の標的指向型送達複合体を共有結合で特異的に形成することが可能である。エフェクター部分が、タンパク質またはペプチドである場合、ＡＤ部分及びＤＤＤ部分を組み込んで、エフェクター部分に複合化した融合タンパク質としてよい。
【０００７】
使用される抗体または抗原結合断片は、キメラ、ヒト化したもの、またはヒトのものであってよい。親マウス抗体よりも、キメラ抗体を使用することが好ましく、これは、キメラ抗体が、ヒト抗体の定常領域配列を有しており、それ故に、マウス抗体ほど強力なヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しないためである。ＨＡＭＡ反応誘導の可能性をさらに減らすためには、ヒト化抗体を使用することが、よりいっそう好ましい。以下に議論されるように、マウスのフレームワーク領域及び定常領域の配列を、ヒト抗体のフレームワーク領域及び定常領域の対応配列で置換することによる、マウス抗体のヒト化手法は、当該技術分野においてよく知られており、多数のマウス抗癌抗体に適用されてきた。抗体のヒト化では、ヒトフレームワークの１つまたは複数のアミノ酸残基を、親マウスのフレームワーク領域配列に由来する対応残基で置換することもあり得る。以下にも議論されるように、ヒト抗体の産生手法もよく知られている。
【０００８】
さまざまな実施形態が、ＣＥＡ発現性の癌を治療するための、主題の方法及び組成物の使用に関し得、当該癌には、限定はされないが、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または胃癌が含まれる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、治療は、１つまたは複数の他の治療物質との組み合わせ療法によって増進し得る。使用される既知の治療物質には、毒素、免疫調節物質（サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、及び腫瘍壊死因子など）、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉなど）、光反応性の治療物質、抗血管新生物質、ならびにアポトーシス促進物質が含まれる。治療物質は、同一もしくは異なる抗体または他の標的指向型分子と複合化することによって送達してよく、あるいは非複合化形態で投与してよい。他の治療物質は、二重特異性抗体及び標的指向化可能型構築物の前、それらと同時、またはそれらの後に投与してよい。
【００１０】
好ましい実施形態では、治療物質は、薬物または毒素などの、細胞傷害性の物質である。また、好ましくは、薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、２−ピロリノドキソルビシン（２−ＰＤｏｘ）、プロ−２−ＰＤｏｘ、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制物質、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシン及びそのアナログ、代謝拮抗物質、アルキル化物質、有糸分裂阻害物質、抗血管新生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進物質、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１１】
別の好ましい実施形態では、治療物質は、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスの菌体外毒素及びシュードモナスの菌体内毒素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される毒素であるか、またはサイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫調節物質である。
【００１２】
他の好ましい実施形態では、治療物質は、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、及び２２７Ｔｈからなる群から選択される放射性核種である。オージェ放出粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、及びＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは、１００ｋｅＶ未満、及び最も好ましくは、７０ｋｅＶ未満である。アルファ粒子の生成を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種には、限定はされないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、及びＴｈ−２２７が含まれる。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは、３，０００〜８，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは、４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される可能性がある追加の放射性同位体には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ、及び同様のものが含まれる。他の実施形態では、治療物質は、色素原及び色素からなる群から選択される光反応性の治療物質である。
【００１３】
あるいは、治療物質は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼからなる群から選択される酵素である。そのような酵素は、例えば、相対的に非毒性である形態で投与され、標的部位で、その酵素によって細胞傷害性の物質へと変換されるプロドラッグと組み合わせて使用してよい。他の代替手段では、薬物は、対象の内在性酵素によって、毒性が低い形態へと変換され得るが、治療酵素によって、細胞傷害性の形態へと再度変換され得る。
【００１４】
したがって、開示の方法及び組成物は、細胞傷害性物質の送達に標的指向型部分が役立つ疾患及び状態の治療を目的として適用してよい。そのような疾患または状態は、癌の免疫療法などにおいて、標的指向型部分が非複合化状態またはそのままの状態で使用されると、与える効果が不十分である標的分子または標的細胞が存在することによって特徴づけられ得る。（疾患治療における使用を目的とする、抗体と、同位体、薬物、及び毒素との免疫複合体の調製方法については、例えば、米国特許第４，６９９，７８４号、第４，８２４，６５９号、第５，５２５，３３８号、第５，６７７，４２７号、第５，６９７，９０２号、第５，７１６，５９５号、第６，０７１，４９０号、第６，１８７，２８４号、第６，３０６，３９３号、第６，５４８，２７５号、第６，６５３，１０４号、第６，９６２，７０２号、第７，０３３，５７２号、第７，１４７，８５６号、第７，２５９，２４０号、ならびに米国特許出願公開第２００５０１７５５８２号（放棄済）、第２００５０１３６００１号、第２００４０１６６１１５号（放棄済）、第２００４００４３０３０号（放棄済）、第２００３００６８３２２号（放棄済）、及び第２００３００２６７６４号（放棄済）を参照のこと。それぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００１５】
本発明がそのように限定されるものではないが、カンプトテシン（ＣＰＴ）ならびにそのアナログ及び誘導体は、好ましい化学療法的な部分である。本発明の範囲に入る他の化学療法的な部分は、タキサン（例えば、バッカチンＩＩＩ、タキソール）、カリチアマイシン、エポチロン、アントラサイクリン薬物（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、及び２−ピロリノドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．によって出版されたＰｒｉｅｂｅ  Ｗ（ｅｄ．），ＡＣＳ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｓｅｒｉｅｓ  ５７４，１９９５（３３２ｐｐ）、及びＮａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２４６４−２４６９，１９９６を参照のこと）、ゲルダナマイシンによって例示されるベンゾキノイド（ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｉｄ）アンサマイシン（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ２３：４４２−４４７，１９７０、Ｎｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  １７：３６１−３７３，１９９９）、ならびに同様のものである。
【００１６】
癌の治療を含む、ある特定の実施形態では、免疫複合体は、手術、放射線療法、化学療法、そのままの抗体を用いる免疫療法、放射免疫療法、免疫調節物質、ワクチン、及び同様のものと組み合わせて使用してよい。同様の組み合わせは、自己免疫疾患などの、標的指向型部分の対象として適した他の疾患の治療に好ましい。例えば、カンプトテシン複合体または放射性免疫複合体は、ＴＮＦ阻害剤、Ｂ細胞抗体、インターフェロン、インターロイキン、放射線感作物質、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、血管炎などの自己免疫疾患、ならびにＩ型糖尿病（若年性糖尿病）の治療を目的とする他の治療物質、と組み合わせることができる。こうした組み合わせ療法は、そのような組み合わせにおいて投与されることになる、それぞれの治療用量の低減が可能であり得、したがって、ある特定の副作用が低減し、必要な治療過程が低減する可能性を有している。ウイルス性疾患では、免疫複合体は、他の治療薬物、免疫調節物質、そのままの抗体、またはワクチン（例えば、肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、もしくはパピローマウイルスに対する抗体、またはこうしたウイルスの免疫原に基づくワクチン）と組み合わせることができる。こうした病原体または他のウイルス性病原体に対する抗体及び抗原に基づくワクチンは、当該技術分野において知られており、場合によっては、既に市販されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＩＭＰ４５３の合成を示す。
【図２】ペプチドとの複合化に向けた、ＳＮ−３８の活性化を示す。
【図３】ＳＮ−３８向けのデンドロン担体を示す。
【図４】デンドロンに対する結合に向けたアジド−ＳＮ−３８の合成を示す。
【図５】ヌードマウスにおける、皮下ＬＳ１７４Ｔ異種移植片の増殖曲線を示す。５ｎｍｏｌのＴＦ２二重特異性抗体をマウスに注入した後、０．２８ｎｍｏｌの２１３Ｂｉ−ＩＭＰ２８８またはＰＢＳを単回注入した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
別段の指定がない限り、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味する。
【００１９】
本明細書では、「ａｂｏｕｔ（約）」は、±１０％を意味する。例えば、「約１００」であれば、９０〜１１０の任意の数を含むことになる。
【００２０】
本明細書では、抗体は、全長（すなわち、天然起源もしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成されるもの）の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体断片のような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち特異的な結合性を有する）部分を指す。
【００２１】
抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、及び同様のものなどの、抗体の一部である。構造とは無関係に、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同一の抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽可変領域及び重可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）などの、抗体の可変領域からなる単離された断片も含む。
【００２２】
キメラ抗体は、好ましくは、げっ歯類抗体である、１つの種に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であるが、抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。獣医学用途向けには、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌなどの、他の種のものに由来してよい。
【００２３】
ヒト化抗体は、例えば、げっ歯類抗体といった、１つの種に由来する抗体に由来するＣＤＲが、げっ歯類抗体の重可変鎖及び軽可変鎖から、ヒトの重可変ドメイン及び軽可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域の配列）へと転換されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。ある特定の実施形態では、親（げっ歯類）抗体に由来するフレームワーク領域の少数のアミノ酸残基を、ヒト抗体のフレームワーク領域の配列へと置換してよい。
【００２４】
ヒト抗体は、例えば、抗原性の負荷に応答して、特異的ヒト抗体を産生するように「操作」された遺伝子導入マウスから得た抗体である。この手法では、マウスの重鎖及び軽鎖の内在性の遺伝子座を標的として破壊した胚性幹細胞株に由来する系統のマウスへと、ヒトの重鎖及び軽鎖の遺伝子座の要素が導入される。遺伝子導入マウスは、特定抗原に特異的なヒト抗体を合成することができると共に、このマウスは、ヒト抗体分泌性のハイブリドーマの産生に使用することができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって説明されている。完全なヒト抗体は、遺伝子または染色体を導入する方法、ならびにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、こうした手法はすべて、当該技術分野において知られている。例えば、非免疫化ドナーに由来する、免疫グロブリンの可変ドメインの遺伝子レパートリーに由来するヒト抗体及びその断片の、インビトロでの産生については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照のこと。この手法では、抗体可変ドメインの遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要コートタンパク質の遺伝子または非主要コートタンパク質の遺伝子のいずれかのフレーム内にクローン化され、ファージ粒子の表面に機能性抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子は、ファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体を機能的な性質に基づいて選択することは、そうした性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。このように、ファージは、Ｂ細胞の性質のいくつかを模倣するものである。ファージディスプレイは、さまざまな形式で実施することができる。概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生成してもよい。米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照のこと。これらの文献の実施例のセクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２５】
治療物質は、抗体部分と別々、同時、またはその後に投与される化合物、分子、または原子であるか、あるいは抗体部分、すなわち、抗体もしくは抗体断片、または細断片と複合化しており、疾患の治療において有用である。治療物質の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アポトーシス促進物質、抗血管新生物質、ホウ素化合物、光反応性の物質または色素、及び放射性同位体が含まれる。使用される治療物質については、以下に、より詳細に記載される。
【００２６】
免疫複合体は、少なくとも１つの治療物質及び／または診断物質と複合化した抗体、抗体断片、または融合タンパク質である。
【００２７】
ＣＰＴは、カンプトテシンの略語であり、本出願では、ＣＰＴは、カンプトテシン自体、またはカンプトテシンのアナログもしくは誘導体に相当する。カンプトテシンの構造、及びそのアナログのいくつかが以下に示され、記載の番号付け、及びＡ〜Ｅの文字で示される環を有する。
【００２８】
【化１】
2018502859.tif 000003
【００２９】
好ましい実施形態では、化学療法的な部分は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、２−ピロリノ−ドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）、ＣＰＴ、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８、トポテカン、ラルトテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、及びエポチロンからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、化学療法的な部分は、ＳＮ−３８である。
【００３０】
標的指向化可能型構築物
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の診断物質及び／または治療物質で標識された部分は、ペプチドまたは他の標的指向化可能型構築物を含んでよい。標識されたペプチド（またはタンパク質）は、標的とする細胞、組織、病原性生物、または他の標的に対して直接結合するように選択してよい。他の実施形態では、標識されたペプチドは、例えば、標的指向化可能型構築物のペプチドに対する１つまたは複数の結合部位と、疾患または状態と関連する標的抗原に対する１つまたは複数の結合部位と、を有する二重特異性抗体を使用して、間接的に結合するように選択してよい。例えば、対象に対して、抗体が最初に投与される事前標的指向化手法において、二重特異性抗体を使用してよい。二重特異性抗体が標的抗原に結合し、未結合の抗体が循環から排除されるように、十分な時間をとってよい。その後、標識されたペプチドなどの、標的指向化可能型構築物を、その対象に投与し、二重特異性抗体に結合させて、疾患細胞または疾患組織に局在化するようにしてよい。
【００３１】
そのような標的指向化可能型構築物は、さまざまな構造であってよく、標的指向化可能型構築物に対して高い親和性で結合する抗体または断片が利用可能であるかということだけでなく、事前標的指向化方法の中で、二重特異性抗体または多特異性抗体と共に使用されるときに、インビボでのクリアランスが迅速であるかということも対象として選択される。疎水性物質は、強力な免疫応答の誘発に最良である一方で、親水性物質は、インビボでのクリアランスの迅速化に好ましい。したがって、疎水性及び親水性の特徴バランスが確立される。このことの一部は、親水性のキレート物質を使用して、有機部分の多くに固有の疎水性を相殺することによって達成してよい。また、標的指向化可能型構築物のサブユニットには、反対の溶液性質を有しているもの選択してよく、例えば、ペプチドを選択する場合、それは、アミノ酸を含むものであって、そのいくつかは疎水性であり、そのいくつかは親水性である。ペプチドの他には、糖質を使用してもよい。
【００３２】
アミノ酸を最低２残基、好ましくは、２〜１０残基有するペプチドを使用してよく、キレート物質などの他の部分とカップリングしてもよい。リンカーは、低分子量複合体であるべきであり、好ましくは、その分子量は、５０，０００ダルトン未満、有利には、約２０，０００ダルトン未満、約１０，０００ダルトン未満、または約５，０００ダルトン未満である。より通常であれば、標的指向化可能型構築物のペプチドは、４残基以上を有することになる。当該ペプチドは、ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列識別番号８１）というペプチドなどであり、ＤＯＴＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン１，４，７，１０−四酢酸であり、ＨＳＧは、ヒスタミンスクシニルグリシル基（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ  ｇｌｙｃｙｌ  ｇｒｏｕｐ）である。あるいは、ＤＯＴＡは、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル）−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）、ＤＴＰＡ、または他の既知のキレート部分によって置換してよい。
【００３３】
標的指向化可能型構築物は、インビボでのペプチドの安定性を増加させるために、骨格構造において、例えば、Ｄ−アミノ酸といった、非天然アミノ酸を含んでもよい。代替の実施形態では、非天然アミノ酸またはペプトイドから構築されたものなどの、他の骨格構造を使用してよい。
【００３４】
標的指向化可能型構築物として使用されるペプチドは、固相支持体、ならびに直交性の脱保護及びカップリングを繰り返す標準的な手法を使用した自動化ペプチド合成機で便利に合成される。キレート部分または他の物質との複合化のために後に使用されることになる、ペプチドにおける遊離アミノ基は、Ｂｏｃ基などの標準的な保護基で有利に遮断され、一方、Ｎ末端残基は、血清中安定性を増加させるためにアセチル化してよい。そのような保護基は、当業者によく知られている。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。二重特異性抗体システム内での後の使用に向けてペプチドが調製された段階で、ペプチドは樹脂から有利に切断されて、対応するＣ末端アミドが生成する。Ｃ末端アミドの生成は、インビボでカルボキシペプチダーゼの活性を阻害するためである。ペプチド合成の例示の方法は、後述の実施例において開示される。
【００３５】
二重特異性抗体を用いる事前標的指向化が使用される場合、抗体は、標的組織が産生する抗原、または標的組織と関連する抗原に対する第１の結合部位と、標的指向化可能型構築物のハプテンに対する第２の結合部位と、を含むことになる。ハプテンの例には、限定はされないが、ＨＳＧ及びＩｎ−ＤＴＰＡが含まれる。ＨＳＧハプテンを対象として産生された抗体は知られており（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体へと容易に組み込むことができる（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号、第７，１３８，１０３号、及び第７，３００，６４４号を参照のこと。これらの文献は、実施例セクションに関して、参照によって、本明細書に組み込まれる）。しかしながら、Ｉｎ−ＤＴＰＡ及び７３４抗体などの、他のハプテン及びそれに結合する抗体が、当該技術分野において知られており、使用してよい（例えば、米国特許第７，５３４，４３１号であり、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
代替の実施形態では、二重特異性抗体を用いる事前標的指向化において使用される、抗体とハプテンとの結合相互作用に代わるものとして、クリックケミストリー反応の特異性を使用してよい。後に議論されるように、例えば、アジド部分には、シクロオクチン部分の反応特異性を、またはニトロン部分には、アルキン部分の反応特異性を、インビボでの環化付加反応において使用してよい。抗体または他の標的指向型分子は、置換されたシクロオクチン部分、アジド部分、またはニトロン部分を組み込むことによって活性化される。標的指向化可能型構築物は、１つまたは複数の診断物質または治療物質と、相補的反応性部分とで標識される。すなわち、標的指向型分子が、シクロオクチンを含む場合、標的指向化可能型構築物は、アジドを含むことになり、標的指向型分子が、ニトロンを含む場合、標的指向化可能型構築物は、アルキンを含むことになる等である。活性化された標的指向型分子は、対象に投与され、事前標的指向化プロトコール向けに開示されるように、標的とする細胞、組織、または病原体に局在化するようになる。その後、反応性の標識された標的指向化可能型構築物が投与される。標的指向化可能型構築物のシクロオクチン、ニトロン、またはアジドは、内在性の生体分子とは非反応性であり、標的指向型分子の相補部分と高度に反応性であるため、特異的な結合相互作用の結果、組織に局在化した標的指向型分子に対して、標的指向化可能型構築物が高度に特異的に結合する。
【００３７】
後述の実施例において開示される、標的指向化可能型構築物の大半がペプチドであるものの、他の型の分子を標的指向化可能型構築物として使用してよいことを、当業者なら理解するであろう。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの重合体分子は、診断物質または治療物質を結合するための官能基で容易に誘導化し得る。置換されたシクロオクチン、ニトロン、またはアジドなどの、適切な反応基を結合した後、標識された重合体を、診断物質または治療物質の送達に利用してよい。そのような担体分子の多くの例は、当該技術分野において知られており、それらを利用してよく、例には、限定はされないが、重合体、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、及びミセルが含まれる。
【００３８】
抗体
標的抗原
使用される標的指向型抗体は、さまざまな細胞表面抗原または疾患関連抗原に特異的または選択的であり得る。使用される標的抗原の例には、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５ａ、補体因子Ｃ５、ＰＬＡＧＬ２、ならびに癌遺伝子産物が含まれ得る。特に好ましい標的抗原は、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）である。
【００３９】
腫瘍の標的指向化などの、ある特定の実施形態では、使用される抗体は、腫瘍関連抗原を標的とするものであってよい。こうした抗原マーカーは、腫瘍が産生する物質であり得るか、または腫瘍部位、腫瘍細胞表面、もしくは腫瘍細胞内に蓄積する物質であり得る。そのような腫瘍関連マーカーには、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，“Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，ｉｎ  Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｄ．，“Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，ｐａｇｅ  ３４７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，１９７９）、ならびに米国特許第４，１５０，１４９号、第４，３６１，５４４号、及び第４，４４４，７４４号において開示されるものが含まれ、これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に関する報告には、Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：９９２−９７）、Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：２２９−４８）、Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５３６−４４）、及びＲｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２：５５−６３）が含まれ、示されているＴＡＡに関して、それぞれが参照によって、本明細書に組み込まれる。
【００４０】
腫瘍関連マーカーは、前出のＨｅｒｂｅｒｍａｎによって、多くのカテゴリーに分類されており、当該カテゴリーには、癌胎児性抗原、胎盤抗原、発癌性ウイルスまたは腫瘍ウイルスに関連する抗原、組織関連抗原、臓器関連抗原、異所性ホルモン、及び正常抗原またはその変異体が含まれる。場合によっては、腫瘍関連マーカーのサブユニットを使用することが、腫瘍特異性の高い抗体の産生に有利であり、当該サブユニットは、例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のベータ−サブユニットまたは胎児性抗原（ＣＥＡ）のガンマ領域であり、米国特許第４，３６１，６４４号及び第４，４４４，７４４号に開示されるように、非腫瘍物質に対する交差反応性が大幅に軽減された抗体の産生を刺激するものである。
【００４１】
別の関心マーカーは、膜貫通型活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ＣＡＭＬ−ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２５２−２５６（２０００）を参照のこと。簡潔に記載すると、ＴＡＣＩは、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、リンパ腫）を対象とするマーカーである。ＴＡＣＩ及びＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）には、腫瘍壊死因子のホモログである増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）が結合する。ＡＰＲＩＬは、初代Ｂ細胞及び初代Ｔ細胞のインビトロでの増殖を刺激すると共に、Ｂ細胞をインビボで蓄積させることで脾臓重量を増加させる。ＡＰＲＩＬは、受容体への結合でＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と競合もする。可溶性のＢＣＭＡ及びＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に阻止し、ＡＰＲＩＬが刺激する、初代Ｂ細胞の増殖を遮断する。ＢＣＭＡ−Ｆｃは、マウスにおいて、キーホールリンペットヘモシアニン及びＰｎｅｕｍｏｖａｘに対する抗体の産生も抑制する。このことは、ＢＣＭＡ及び／またはＴＡＣＩを介したＡＰＲＩＬ及び／またはＴＡＬＬ−Ｉのシグナル伝達が、液性免疫の生成に必要であるということを示している。したがって、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−Ｉと、ＢＣＭＡ−ＴＡＣＩとは、Ｂ細胞機能及びＴ細胞機能の刺激に関与する、２つのリガンド−２つの受容体という経路を形成している。
【００４２】
疾患が、リンパ腫、白血病、または自己免疫疾患を伴う場合、標的とする抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物（例えば、ｃ−ｍｅｔまたはＰＬＡＧＬ２）、ＣＤ６６ａ−ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択してよい。
【００４３】
抗体の産生方法
ＭＡｂは、さまざまなよく確立された手法によって、ハイブリドーマの培養物から単離及び精製することができる。そのような単離手法には、プロテイン−Ａまたはプロテイン−ＧのＳｅｐｈａｒｏｓｅを用いる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３を参照のこと。Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も併せて参照のこと。免疫原に対して抗体を最初に産生させた後、抗体は、配列決定してから組換え手法によって調製することができる。マウスの抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、当業者によく知られており、以下に議論されるとおりである。
【００４４】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、マウス抗体の可変領域によって置換された組換えタンパク質である。キメラ抗体では、対象に投与されるときの免疫原性が減少し、安定性が増加している。マウス免疫グロブリンの可変ドメインのクローン化を目的とする一般的な手法は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６：３８３３（１９８９）において開示されている。キメラ抗体の構築手法は、当業者によく知られている。例として、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４）では、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるマウスＬＬ２のＶκドメイン及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列と、それぞれ、ヒトのκ定常領域ドメイン及びＩｇＧ１定常領域ドメインと、を組み合わせることによってＬＬ２キメラが産生された。
【００４５】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂの産生手法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、及びＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）を参照のこと）。キメラまたはマウスのモノクローナル抗体は、マウスの免疫グロブリンの重可変鎖及び軽可変鎖からマウスのＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインへと転換することによってヒト化してよい。キメラモノクローナル抗体におけるマウスのフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトのＦＲ配列で置換される。マウスのＣＤＲをヒトのＦＲへと単純に転換すると、結果として、抗体の親和性が減少するか、または失われることさえ多いため、マウス抗体の元の親和性を回復させるためには、さらなる改変が必要になる可能性がある。これは、ＦＲ領域における１つまたは複数のヒト残基を、それに対応するマウス残基で置換して、そのエピトープに対する良好な結合性を有する抗体を得ることによって達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと。置換に好ましい残基には、ＣＤＲ残基側鎖の１、２、もしくは３オングストローム以内に位置するＦＲ残基、ＣＤＲ配列に隣接して位置するＦＲ残基、またはＣＤＲ残基との相互作用が予測されるＦＲ残基が含まれる。
【００４６】
ヒト抗体
完全なヒト抗体の産生方法は、コンビナトリアル手法、またはヒトの免疫グロブリン遺伝子座を用いて形質転換した遺伝子導入動物のいずれを使用したものも当該技術分野において知られている（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８、Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６、Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：５４４−５０）。完全なヒト抗体は、遺伝子または染色体を導入する方法、ならびにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、こうした手法はすべて、当該技術分野において知られている。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照のこと。そのような完全なヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して副作用がさらに少なく、本質的な内在性ヒト抗体としてインビボで機能すると予測される。
【００４７】
１つの代替手段では、ヒト抗体の生成のために、ファージディスプレイ手法を使用してよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。ヒト抗体は、健常なヒト、または癌などの特定の疾患状態を示すヒトから生成してよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。疾患を有する個体からヒト抗体を構築する利点は、循環している抗体のレパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体へと偏った状態にあり得ることである。
【００４８】
この方法論の１つの非限定例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によって、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーが構築された。概して、全ＲＮＡは、循環している血液リンパ球から得られたものであった（前出の参考文献）。組換えＦａｂは、μ鎖、γ鎖、及びκ鎖の抗体レパートリーからクローン化され、ファージディスプレイライブラリーへと挿入された（前出の参考文献）。重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用することで、ＲＮＡはｃＤＮＡへと変換され、ＦａｂのｃＤＮＡライブラリーの調製に使用された（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１  ｔｏ  ９．２２）に従って実施された。最終的なＦａｂ断片は、制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージのゲノムに挿入することで、ファージディスプレイライブラリーが調製された。そのようなライブラリーは、当該技術分野において知られるように、標準的なファージディスプレイ法によって選別してよい。ファージディスプレイは、さまざまな形式において実施することができ、その概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。
【００４９】
ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生成してもよい。米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照のこと。これらの文献は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。こうした手法は例示であり、ヒトの抗体または抗体断片の調製及び選別には、任意の既知の方法を利用してよいと当業者なら認識するであろう。
【００５０】
別の代替手段では、標準的な免疫化プロトコールを使用して、本質的に任意の免疫原性標的に対する抗体を生成するために、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作された遺伝子導入動物を使用してよい。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって開示されている。そのようなシステムの非限定例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３であり、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び同様の動物では、マウス抗体の遺伝子は不活化され、機能性のヒト抗体遺伝子によって置換されているが、一方で、マウスの免疫系の残りの部分はそのままで残っている。
【００５１】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び制御配列に加えて、可変領域配列の大部分を含む、ヒトのＩｇＨ及びＩｇカッパの遺伝子座部分を含めた、生殖系列配置のＹＡＣ（酵母人工染色体）を用いて形質転換された。抗体産生Ｂ細胞の生成に、ヒト可変領域のレパートリーを使用してよく、抗体産生Ｂ細胞は、既知の手法によって処理してハイブリドーマにしてよい。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生することとなり、ヒト抗体は、上で議論した標準的な手法によって回収及び／または産生してよい。さまざまな系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が利用可能であり、それらはそれぞれ、異なるクラスの抗体の産生能力を有する。遺伝子導入によって産生したヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態学的な性質を保持しながら、治療的な可能性を有していることが示された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。請求される組成物及び方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作された任意の遺伝子導入動物を利用してよいと、当業者なら認識するであろう。
【００５２】
既知の抗体
使用される標的指向型分子には、当該技術分野において知られ、腫瘍関連抗原への結合特異性を有する任意の抗体または断片を組み込んでよいと、当業者なら認識するであろう。請求される方法及び組成物の範囲内で、癌の治療を目的として使用してよい特定の抗体には、限定はされないが、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−１）（ＥＧＰ−１、ＴＲＯＰ−２としても知られる））、ＫＣ４（抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても知られる）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗アルファ−フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＰＡＭ４（アカクリバツズマブ（ａｋａ  ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、抗ＭＵＣ５ＡＣ）、及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が含まれる。
【００５３】
そのような抗体は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号、第５，８７４，５４０号、第６，１０７，０９０号、第６，１８３，７４４号、第６，３０６，３９３号、第６，６５３，１０４号、第６，７３０．３００号、第６，８９９，８６４号、第６，９２６，８９３号、第６，９６２，７０２号、第７，０７４，４０３号、第７，２３０，０８４号、第７，２３８，７８５号、第７，２３８，７８６号、第７，２５６，００４号、第７，２８２，５６７号、第７，３００，６５５号、第７，３１２，３１８号、第７，５８５，４９１号、第７，６１２，１８０号、第７，６４２，２３９号、及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号、第２００６０１９３８６５号、第２００６０２１０４７５号、第２００７００８７００１号であり、それぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
使用される特定の既知抗体には、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲ１（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、Ｄ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ならびにＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）（２０１４年２月１４日出願の米国特許出願第１４／１８０，６４６号）が含まれ、記載の特許または出願の内容がそれぞれ、図及び実施例セクションに関して、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
ＣＤ６６抗原は、同様の構造を有した５つの異なる糖タンパク質からなり、当該５つの糖タンパク質は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされるＣＤ６６ａ−ｅであり、それぞれ、ＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１、及びＣＥＡである。こうしたＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は、顆粒球、消化管の正常上皮細胞、及びさまざまな組織の腫瘍細胞に主に発現する。癌を対象とするための適した標的としては、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１−７）などの癌精巣抗原、ならびに骨髄性白血病（Ｋｏｚｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２−７）に加えて、Ｂ細胞疾患にも生じるＣＤ７９ｂ、及び非ホジキンリンパ腫（Ｐｏｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６−６２３）のＣＤ７９ｂもまた含まれる。前述の抗原の多くは、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」という表題で、２００２年１１月１５日出願の米国仮出願第６０／４２６，３７９号において開示されている。癌幹細胞は、より治療抵抗性の悪性細胞前駆体集団とみなされるものであり（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５−４０）、ある特定の癌型において標的とすることができる抗原を有している。当該抗原は、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５−７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５−９１）、及び膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０−５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８−６３）、膵癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０−７）、及び頭頸部扁平上皮癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３−８）におけるＣＤ４４などである。乳癌治療向けの別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１−９）によって説明されるＬＩＶ−１抗原である。
【００５６】
多発性骨髄腫の治療については、例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１−１２）：３４５−３４６、Ｔａｓｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８−９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．）、ＣＳ１（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９−３７、ならびにＣＤ４０（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８−５９０６）といったものを対象として、適した標的指向型抗体について説明されている。
【００５７】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、自然免疫及び適応免疫ならびにアポトーシスの重要な制御因子である。ＣＤ７４は、ＭＩＦを対象とする内在性の受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦ媒介性の細胞内経路に対するアンタゴニストである抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、及び慢性リンパ性白血病などの幅広い範囲の疾患状態の治療に使用し得るものである（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４、Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介性疾患の治療を目的として治療的に使用される抗ＣＤ７４抗体の例である。
【００５８】
チェックポイント阻害剤である抗体は、癌治療において主に使用されてきた。免疫チェックポイントは、自己寛容の維持、及び末梢組織の損傷を最小化するための免疫系応答の度合いの調節を担う、免疫系における阻害経路を指す。しかしながら、腫瘍細胞もまた、腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を減少させるために、免疫系チェックポイントを活性化することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られる）、及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）に対する抗体は、チェックポイント阻害剤の例であり、疾患原因の細胞、組織、または病原体に対する免疫応答の有効性を増進する１つまたは複数の物質と組み合わせて使用してよい。抗ＰＤ１抗体の例には、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５，ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８，ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）、及びピディリズマブ（ＣＴ−０１１，ＣＵＲＥＴＥＣＨ  ＬＴＤ．）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７，ＲＭＰ１−１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５，Ｊ１１６，ＭＩＨ４）から市販されている。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例には、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体もまた、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から市販されている。抗ＣＴＬＡ４抗体の例には、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ，１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、及びＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは、転移性メラノーマの治療を対象として、ＦＤＡの承認を最近受けた（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。さらに最近では、ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３を含む、他のチェックポイント抑制性受容体が同定された（Ｓｔａｇｇ，２０１３，Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ５：１６９−８１）。ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３に対する抗体を使用してもよい。
【００５９】
例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１４といった、マトリックスメタロプロテイナーゼに対する抗体もまた、抗癌治療において使用される。（例えば、Ａｇａｒｗａｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７：２７４６−５７、Ｆｒｅｉｊｅ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２００３；５３２：９１−１０７、Ｃｏｔｉｃｃｈｉａ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；１２３：２９５−３００、Ｂｏｉｉｒｅ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００５；１２０：３０３−１３、Ｂｅｌｏｔｔｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：５２２４−９、Ｂａｒｂｏｌｉｎａ  ＭＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７；２８２：４９２４−３１、Ｋａｉｍａｌ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；７３：２４５７−６７、Ｄｅｎｚｅｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２；９３：３４１−５３を参照のこと）。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、迅速に内部移行した後、再発現し、処理され、細胞表面での提示が生じる抗体が使用されることで、循環している複合体の、細胞による連続的な取り込み及び付着が可能となる。最も好ましい抗体／抗原の対の例は、ＬＬ１であり、ＬＬ１は、抗ＣＤ７４ＭＡｂである（インバリアント鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号、第７，３１２，３１８号を参照のこと。それぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、ある特定のＴ細胞リンパ腫、メラノーマ、結腸癌、肺癌、及び腎癌、膠芽腫、ならびにある特定の他の癌に高度に発現する（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６−３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用についての概説は、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｓｅｐ  １５；１３（１８  Ｐｔ  ２）：５５５６ｓ−５５６３ｓに含まれており、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
二重特異性抗体が使用される場合、第２のＭＡｂは、当該技術分野において知られる任意の抗ハプテン抗体から選択してよく、限定はされないが、ｈ６７９（米国特許第７，４２９，３８１号）ならびに７３４（米国特許第７，４２９，３８１号、第７，５６３，４３９号、第７，６６６，４１５号、及び第７，５３４，４３１号）が含まれる。これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６２】
使用される抗体は、さまざまな既知の供給源から商業的に入手してよい。例えば、抗体を分泌するさまざまなハイブリドーマ株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から利用可能である。限定はされないが、腫瘍関連抗原を含む、さまざまな疾患標的に対する多くの抗体が、ＡＴＣＣに寄託され、及び／またはそれらの可変領域配列が公開されており、請求される方法及び組成物における使用を目的として利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号、第７，２８２，５６７号、第７，１５１，１６４号、第７，０７４，４０３号、第７，０６０，８０２号、第７，０５６，５０９号、第７，０４９，０６０号、第７，０４５，１３２号、第７，０４１，８０３号、第７，０４１，８０２号、第７，０４１，２９３号、第７，０３８，０１８号、第７，０３７，４９８号、第７，０１２，１３３号、第７，００１，５９８号、第６，９９８，４６８号、第６，９９４，９７６号、第６，９９４，８５２号、第６，９８９，２４１号、第６，９７４，８６３号、第６，９６５，０１８号、第６，９６４，８５４号、第６，９６２，９８１号、第６，９６２，８１３号、第６，９５６，１０７号、第６，９５１，９２４号、第６，９４９，２４４号、第６，９４６，１２９号、第６，９４３，０２０号、第６，９３９，５４７号、第６，９２１，６４５号、第６，９２１，６４５号、第６，９２１，５３３号、第６，９１９，４３３号、第６，９１９，０７８号、第６，９１６，４７５号、第６，９０５，６８１号、第６，８９９，８７９号、第６，８９３，６２５号、第６，８８７，４６８号、第６，８８７，４６６号、第６，８８４，５９４号、第６，８８１，４０５号、第６，８７８，８１２号、第６，８７５，５８０号、第６，８７２，５６８号、第６，８６７，００６号、第６，８６４，０６２号、第６，８６１，５１１号、第６，８６１，２２７号、第６，８６１，２２６号、第６，８３８，２８２号、第６，８３５，５４９号、第６，８３５，３７０号、第６，８２４，７８０号、第６，８２４，７７８号、第６，８１２，２０６号、第６，７９３，９２４号、第６，７８３，７５８号、第６，７７０，４５０号、第６，７６７，７１１号、第６，７６４，６８８号、第６，７６４，６８１号、第６，７６４，６７９号、第６，７４３，８９８号、第６，７３３，９８１号、第６，７３０，３０７号、第６，７２０，１５号、第６，７１６，９６６号、第６，７０９，６５３号、第６，６９３，１７６号、第６，６９２，９０８号、第６，６８９，６０７号、第６，６８９，３６２号、第６，６８９，３５５号、第６，６８２，７３７号、第６，６８２，７３６号、第６，６８２，７３４号、第６，６７３，３４４号、第６，６５３，１０４号、第６，６５２，８５２号、第６，６３５，４８２号、第６，６３０，１４４号、第６，６１０，８３３号、第６，６１０，２９４号、第６，６０５，４４１号、第６，６０５，２７９号、第６，５９６，８５２号、第６，５９２，８６８号、第６，５７６，７４５号、第６，５７２，８５６号、第６，５６６，０７６号、第６，５６２，６１８号、第６，５４５，１３０号、第６，５４４，７４９号、第６，５３４，０５８号、第６，５２８，６２５号、第６，５２８，２６９号、第６，５２１，２２７号、第６，５１８，４０４号、第６，５１１，６６５号、第６，４９１，９１５号、第６，４８８，９３０号、第６，４８２，５９８号、第６，４８２，４０８号、第６，４７９，２４７号、第６，４６８，５３１号、第６，４６８，５２９号、第６，４６５，１７３号、第６，４６１，８２３号、第６，４５８，３５６号、第６，４５５，０４４号、第６，４５５，０４０号、第６，４５１，３１０号、第６，４４４，２０６号、第６，４４１，１４３号、第６，４３２，４０４号、第６，４３２，４０２号、第６，４１９，９２８号、第６，４１３，７２６号、第６，４０６，６９４号、第６，４０３，７７０号、第６，４０３，０９１号、第６，３９５，２７６号、第６，３９５，２７４号、第６，３８７，３５０号、第６，３８３，７５９号、第６，３８３，４８４号、第６，３７６，６５４号、第６，３７２，２１５号、第６，３５９，１２６号、第６，３５５，４８１号、第６，３５５，４４４号、第６，３５５，２４５号、第６，３５５，２４４号、第６，３４６，２４６号、第６，３４４，１９８号、第６，３４０，５７１号、第６，３４０，４５９号、第６，３３１，１７５号、第６，３０６，３９３号、第６，２５４，８６８号、第６，１８７，２８７号、第６，１８３，７４４号、第６，１２９，９１４号、第６，１２０，７６７号、第６，０９６，２８９号、第６，０７７，４９９号、第５，９２２，３０２号、第５，８７４，５４０号、第５，８１４，４４０号、第５，７９８，２２９号、第５，７８９，５５４号、第５，７７６，４５６号、第５，７３６，１１９号、第５，７１６，５９５号、第５，６７７，１３６号、第５，５８７，４５９号、第５，４４３，９５３号、第５，５２５，３３８号を参照のこと。こうしたものは例示にすぎず、さまざまな他の抗体及びそれらのハイブリドーマが、当該技術分野において知られている。選択した関心疾患関連標的に対する抗体を対象として、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースを単に検索するだけで、ほとんどあらゆる疾患関連抗原に対して、抗体配列または抗体を分泌するハイブリドーマを取得し得ることを、当業者なら認識するであろう。クローン化された抗体の抗原結合ドメインは、当該技術分野においてよく知られる標準的な手法を使用して、増幅、切り出し、発現ベクターへの連結、適応宿主細胞への遺伝子導入を実施し、タンパク質産生に向けて使用してよい。
【００６３】
抗体断片
特定エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法を使用して生成することができる。抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、及び同様のものなどの、抗体の抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子をペプシンで消化することによって産生することができ、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の同定を迅速化及び容易化するために、Ｆａｂ’の発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）。抗体断片は、全長抗体をタンパク分解性の加水分解に供すか、または断片をコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉもしくは別の宿主で発現することによって調製することができる。こうした方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号及び第４，３３１，６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献によって説明されており、こうした特許は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０．−２．１０．４も併せて参照のこと。
【００６４】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。ＶＬドメイン及びＶＨドメインは会合することで、標的結合部位を形成する。こうした２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によって、共有結合でさらに連結される。ｓｃＦｖ分子の調製方法及び適したペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，“Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ．”ＦＡＳＥＢ  Ｖｏｌ  ９：７３−８０（１９９５）、及びＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，”ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ  ９：１３２−１３７（１９９１）において説明されており、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
既知のＶＨ、Ｖカッパ、及びＶ８０の遺伝子ファミリーのすべてに対応するＰＣＲプライマーを使用して、非免疫化ヒトドナーからＶ遺伝子を単離することによって、大きなレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーを構築することができる。例えば、Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４（１９９６）を参照のこと。増幅の後、Ｖカッパ及びＶラムダのプールを組み合わせることで、１つのプールが形成される。こうした断片は、ファージミドベクターと連結される。その後、ｓｃＦＶのリンカーが、ＶＬ断片の上流に配置されるようにファージミドと連結される。ＶＨ断片と、リンカー−ＶＬ断片と、が増幅され、ＪＨ領域で会合する。得られたＶＨ−リンカー−ＶＬ断片は、ファージミドベクターと連結される。ファージミドライブラリーは、選択した抗原に対する結合性で選別することができる。
【００６６】
当該技術分野では、例えば、単一ドメインの抗体断片といった、他の抗体断片が知られており、請求される構築物において使用してよい。単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、標準的な免疫化手法によって、例えば、ラクダ、アルパカ、またはラマから得てよい（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ  ２６：２３０−２３５，２００１、Ｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：１６１−７５，２００３、Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２４：１３−２５，２００７を参照のこと）。ＶＨＨは、強力な抗原結合能力を有し得、通常のＶＨ−ＶＬの対では接近し難い新規のエピトープと相互作用することができる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。アルパカの血清に含まれるＩｇＧの約５０％は、ラクダ重鎖のみのＩｇＧ抗体（Ｃａｂ）である（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。アルパカは、既知の抗原で免疫化してよく、標的抗原に結合して中和するＶＨＨを単離することができる（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。アルパカのＶＨＨをコードする配列の事実上すべてを増幅するＰＣＲプライマーが同定されており、アルパカＶＨＨのファージディスプレイライブラリーの構築に使用してよい。このファージディスプレイライブラリーは、当該技術分野においてよく知られる標準的なバイオパニング手法による抗体断片の単離に使用することができる（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。こうしたもの及び他の既知の抗原結合抗体断片を、請求される方法及び組成物において利用してよい。
【００６７】
抗体のクローン化及び産生のための一般的な手法
キメラ抗体またはヒト化抗体の産生などの、さまざまな手法は、抗体のクローン化及び構築の手順を伴い得るものである。関心抗体の抗原結合性のＶκ（可変軽鎖）配列及びＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、及びｃＤＮＡライブラリー選別などの、さまざまな分子クローン化手順によって取得してよい。マウスＭＡｂを発現する細胞に由来するＭＡｂのＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローン化し、配列決定することができる。その確実性を確認するためには、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））によって説明されるように、クローン化されたＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子を、細胞培養において、キメラＡｂとして発現することができる。Ｖ遺伝子の配列に基づいて、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））によって説明されるように、ヒト化ＭＡｂを設計し、構築することができる。
【００６８】
ｃＤＮＡは、マウスＭＡｂを産生する任意の既知のハイブリドーマ株または遺伝子導入細胞株から、一般的な分子クローン化手法によって調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ（１９８９））。ＭＡｂ向けのＶκ配列は、プライマーであるＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））によって説明される延長プライマーセットを使用して増幅してよい。ＶＨ配列は、プライマー対であるＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））によって説明される、マウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを使用して増幅することができる。ヒト化Ｖ遺伝子は、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））によって説明されるように、長いオリゴヌクレオチド鋳型の合成と、ＰＣＲ増幅とを組み合わせることによって構築することができる。
【００６９】
Ｖκ向けのＰＣＲ産物は、ステージングベクター（ｓｔａｇｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）へとサブクローン化することができる。ステージングベクターは、ｐＢＲ３２７に基づくステージングベクターであるＶＫｐＢＲなどであり、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、及び簡便な制限部位を含む。ＶＨ向けのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳなどの同様のステージングベクターへとサブクローン化することができる。プロモーター及びシグナルペプチドの配列と共に、Ｖκ配列及びＶＨ配列を含む発現カセットはそれぞれ、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切り出し、ｐＫｈ及びｐＧ１ｇなどの、適切な発現ベクターと連結することができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、適切な細胞へと同時導入し、キメラＭＡｂ、ヒト化ＭＡｂ、またはヒトＭＡｂの産生を対象として、上清液を監視することができる。あるいは、Ｖκ及びＶＨの発現カセットを切り出し、ｐｄＨＬ２などの、単一の発現ベクターへとサブクローン化することができ、このことは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）に加えて、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）においても示される）によって説明されるとおりである。
【００７０】
代替の実施形態では、発現ベクターは、無血清培地における遺伝子導入、増殖、及び発現に事前適応した宿主細胞へと遺伝子導入してよい。使用してよい細胞株の例には、Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株、Ｓｐ／ＥＳＦ細胞株、及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株が含まれる（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号、第７，５３７，９３０号、及び第７，６０８，４２５号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。こうした例示の細胞株は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株に基づいており、変異体Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子が遺伝子導入され、メトトレキサートに曝露して導入遺伝子配列を増幅するものであり、事前適応することで、タンパク質発現に向けの無血清細胞株となっている。
【００７１】
二重特異性抗体及び多特異性抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の治療物質送達を目的とする手法及び組成物は、標的指向型部分としての二重特異性抗体または多特異性抗体と共に使用してよい。二重特異性抗体または多特異性抗体の産生方法は多く知られている。これは、例えば、米国特許第７，４０５，３２０号に開示されるとおりであり、当該文献の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体は、クアドローマ法によって産生することができ、クアドローマ法は、それぞれが１つの異なる抗原部位を認識する１つのモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を含むものである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００７２】
二重特異性抗体の別の産生方法は、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に繋留するヘテロ二機能性の架橋剤を使用するものである（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１４：６２８−６３１、Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体は、２つの親モノクローナル抗体のそれぞれを還元して、それぞれを半分の分子とした後、それらを混合して、再び酸化させてハイブリッド構造を得ることによって、産生することもできる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替手段は、適切なリンカーを使用して、２つまたは３つの個別に精製したＦａｂ’断片を化学的に架橋結合することを含むものである（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号を参照のこと）。
【００７３】
他の方法は、レトロウイルス由来のシャトルベクターを介して、別々の選択可能マーカーを、それぞれの親ハイブリドーマへと遺伝子導入とした後、それら親ハイブリドーマを融合することによる、ハイブリッドハイブリドーマの生成効率改善（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）を含むか、または異なる抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を含む発現プラスミドの、１つのハイブリドーマ細胞株への遺伝子導入を含むものである。
【００７４】
結合活性を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成するために、同族のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、適切な組成及び長さのペプチドリンカー（通常、１２残基を超えるアミノ酸からなる）で連結することができる。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４，９４６，７７８号、及び米国特許第５，１３２，４０５号において開示されており、これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。ペプチドリンカーのアミノ酸長を１２残基未満に減らすと、同一鎖のＶＨドメインとＶＬドメインとの対形成が妨げられ、ＶＨドメイン及びＶＬドメインには、他の鎖の相補性ドメインとの対形成圧力がかかり、結果的に、機能性の多量体が形成される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインを３〜１２残基のアミノ酸のリンカーで連結したポリペプチド鎖は、二量体を主に形成する（ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）と呼ばれる）。アミノ酸残基数が０〜２のリンカーを用いると、三量体（トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）と呼ばれる）、及び四量体（テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）と呼ばれる）に偏るが、オリゴマー形成の正確なパターンは、リンカーの長さに加えて、組成ならびにＶドメインの配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に依存するように思われる。
【００７５】
多特異性抗体または二重特異性抗体の産生を目的とするこうした方法は、収率の低さ、精製の必要性、安定性の低さ、または手法にかかる労力の大きさに関して、さまざまな困難を伴う。さらに最近では、「ドック・アンド・ロック」（ＤＮＬ）として知られる手法を利用することで、事実上、任意の所望の抗体、抗体断片、及び他のエフェクター分子の組み合わせが産生された（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及びＵＳＳＮ１１／９２５，４０８を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。手法は、相補性のタンパク質結合ドメインを利用するものであり、こうしたドメインは、アンカードメイン（ＡＤ）、ならびに二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）と称され、お互いが結合することで、二量体、三量体、四量体、五量体（ｑｕｉｎｔａｍｅｒ）、及び六量体の範囲の複合体構造の構築が可能である。こうしたものは、高収率で安定な複合体を形成し、広範な精製を必要としない。ＤＮＬ手法によって、単一特異性、二重特異性、及び多特異性の抗体の構築が可能となる。ここに請求される方法の実施の際は、二重特異性抗体または多特異性抗体の調製を目的として、当該技術分野において知られる任意の既知の手法を利用してよい。
【００７６】
さまざまな実施形態では、本明細書に開示の複合体は、複合材料である多特異性抗体の一部であり得る。そのような抗体は、異なる特異性を有する２つ以上の異なる抗原結合部位を含み得る。多特異性複合材料は、同一抗原の異なるエピトープに結合し得るか、あるいは２つの異なる抗原に結合し得る。
【００７７】
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）
好ましい実施形態では、二重特異性抗体もしくは多特異性抗体または他の構築物は、ドック・アンド・ロック技術を使用して産生してよい（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号を参照のこと。それぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の制御（Ｒ）サブユニットと、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）と、の間に生じる特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を活用するものである（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４。Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡは、二次メッセンジャーであるｃＡＭＰがＲサブユニットに結合することによって引き起こされる、最も研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的な役割を担っており、１９６８年にウサギの骨格筋から初めてに単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。このホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性化形態に維持された２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは、２つの型のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）と共に見つかっており、型はそれぞれ、αアイソフォーム及びβアイソフォームを有している（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離され、二量体形成ドメインは、アミノ末端の最初の４４残基からなることが示された（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。ｃＡＭＰがＲサブユニットに結合することで、広域性のセリン／スレオニンキナーゼ活性の発現に向けて、活性触媒サブユニットの遊離が生じる。ＰＫＡは、ＡＫＡＰとドッキングしていることで、区画に分かれて存在しており、その区画化を通して、活性触媒サブユニットが、選択される基質へと指向化されている（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【００７８】
最初のＡＫＡＰである微小管結合タンパク質２が１９８４年に特徴づけられて以降（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む、さまざまな細胞内部位に局在化する５０を超えるＡＫＡＰが、さまざまな構造と共に同定され、それらの種は、酵母からヒトに及ぶものであった（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡを対象とする、ＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性へリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間でかなり異なっており、ＲＩＩ二量体の結合親和性は、２〜９０ｎＭの範囲であることが報告された（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体のＲサブユニットに対してのみ結合するということになる。ヒトＲＩＩαに対しては、ＡＤは、アミノ末端の２３残基によって形成された疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体形成ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは共に、同一のＮ末端４４残基アミノ酸配列内に位置しており（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、本明細書では、ＤＤＤと呼ばれる。
【００７９】
我々は、任意の２つの実体をドッキングして非共有結合性複合体とするための優れたリンカー分子対として、ヒトＲＩＩαのＤＤＤと、ＡＫＡＰのＡＤと、を利用するプラットフォーム技術を開発した。当該任意の２つの実体は、これ以後、Ａ及びＢと称される。当該非共有結合性複合体は、ジスルフィド結合の形成が促進する戦略的位置において、ＤＤＤ及びＡＤの両方にシステイン残基を導入することで、さらにロックして安定な繋留構造とすることができる。「ドック・アンド・ロック」手法の一般的な方法論は、次のとおりである。実体Ａは、Ａの前駆体にＤＤＤ配列を連結することによって構築され、その結果として、第１成分がもたらされる。当該第１成分は、これ以後、ａと称される。ＤＤＤ配列が存在すれば、自発的な二量体形成が起きるであろうから、したがって、Ａは、ａ２からなるということになる。実体Ｂは、Ｂの前駆体にＡＤ配列を連結することによって構築され、その結果として、第２成分がもたらされる。当該第２成分は、これ以後、ｂと称される。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフによって、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位が創出されることになり、したがって、ａ２とｂとの迅速会合が促進されることで、ａ２ｂからなる、２成分の三量体複合体が形成される。この結合事象は、ジスルフィド架橋を介して２つの実体を共有結合的に固定する反応が続けて生じることで不可逆なものとなる。この反応は、有効局所濃度の原理に基づいて、非常に効率的に生じるのものであり、これは、ＤＤＤ及びＡＤの両方に配置された反応性チオール基が、初期の結合相互作用によって近接化して（Ｃｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的に連結されることになるためである。リンカー、アダプターモジュール、及び前駆体をさまざまな組み合わせで使用することで、限定はされないが、二量体、三量体、四量体、五量体、及び六量体のＤＮＬ構築物を含む、異なる化学量論のさまざまなＤＮＬ構築物を産生し、使用してよい（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号を参照のこと）。
【００８０】
２つの前駆体の官能基を避ける形で、ＤＤＤ及びＡＤを結合することによって、そのような部位特異的連結において、２つの前駆体の元の活性が保存されることも予測される。この手法は、事実上、モジュラーであり、幅広い範囲の活性を有するペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、及び他のエフェクター部分を含む、幅広い範囲の物質の、部位特異的及び共有結合的な連結に適用できる可能性を有する。後述の実施例に記載される、ＡＤとＤＤＤとが複合化したエフェクターを構築する融合タンパク質法を利用することで、事実上、任意のタンパク質またはペプチドをＤＮＬ構築物へと組み込み得る。しかしながら、手法は、限定ではなく、他の複合化方法を利用してよい。
【００８１】
融合タンパク質の調製については、さまざまな方法が知られており、関心融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を得るための核酸合成、ハイブリダイゼーション、及び／または増幅が含まれる。そのような二本鎖核酸は、標準的な分子生物学の手法によって、融合タンパク質産生用の発現ベクターへと挿入してよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９を参照のこと）。そのような好ましい実施形態では、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分は、エフェクターであるタンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれに結合してもよい。しかしながら、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分の、エフェクター部分への結合部位は、エフェクター部分及びその生理活性に関与するエフェクター部分の一部（複数可）の化学的性質に応じて変わり得ると、当業者なら認識するであろう。さまざまなエフェクター部分の部位特異的な結合は、二価架橋結合試薬の使用及び／または他の化学的複合化手法などの、当該技術分野において知られる手法を使用して実施してよい。
【００８２】
他の代替の実施形態では、エフェクター部分に複合化したＡＤペプチドもしくはＤＤＤペプチドの産生のため、またはＡＤ部分及びＤＤＤ部分をお互いに共有結合で結合して、ＤＮＬ複合体を安定化する不可逆的な共有結合を生成するためでさえ、クリックケミストリー反応を使用してよい。
【００８３】
事前標的指向化
事前標的指向化手法において、二重特異性抗体または多特異性抗体を利用してよい。事前標的指向化は、多段プロセスであって、直接的な標的指向型抗体では、血液からのクリアランスが遅いことを解決するために元々は開発され、このクリアランスの遅さは、骨髄などの正常組織に対する望ましくない毒性に寄与するものである。事前標的指向化では、放射性核種または他の治療物質は、血液から数分以内に除去される小さな送達分子（標的指向化可能型構築物）に対して結合される。事前標的指向型の二重特異性抗または多特異性抗体は、標的抗原に対する結合部位に加えて、標的指向化可能型構築物に対する結合部位も有している。当該抗体は、最初に投与され、未結合の抗体が循環から除去された後に、標的指向化可能型構築物が投与される。
【００８４】
事前標的指向化方法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７、Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８、Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８、Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１、米国特許第５，２５６，３９５号、Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１、米国特許第６，０７７，４９９号、第７，０１１，８１２号、第７，３００，６４４号、第７，０７４，４０５号、第６，９６２，７０２号、第７，３８７，７７２号、第７，０５２，８７２号、第７，１３８，１０３号、第６，０９０，３８１号、第６，４７２，５１１号、第６，９６２，７０２号、及び第６，９６２，７０２号において開示されており、それぞれが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８５】
対象における疾患または障害の治療または診断の事前標的指向化方法を、（１）二重特異性の抗体または抗体断片の、対象への投与と、（２）任意選択で実施する、除去性組成物の、対象への投与、及びその組成物による、循環からの抗体除去の可能化と、（３）１つまたは複数のキレートした治療物質もしくは診断物質、または化学的に結合した治療物質もしくは診断物質を含む標的指向化可能型構築物の、対象への投与と、によって提供してよい。
【００８６】
免疫複合体
好ましい実施形態では、免疫複合体を形成するために、治療物質または診断物質を、抗体または抗体断片に共有結合で結合してよい。担体部分は、例えば、還元されたＳＨ基及び／または糖質側鎖に結合してよい。担体部分は、還元された抗体成分のヒンジ領域に、ジスルフィド結合形成を介して結合することができる。あるいは、そのような物質は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシニル（ＳＰＤＰ）などの、ヘテロ二機能性の架橋剤を使用して結合することができる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。そのような複合化向けの一般的な手法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７  ２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと。あるいは、担体部分は、抗体のＦｃ領域における糖質部分を介して複合化することができる。
【００８７】
抗体の糖質部分を介した、抗体への官能基の複合化方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２（１９８８）、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０）、及びＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号を参照のこと。これらの文献の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。一般的な方法は、酸化された糖質部分を有する抗体と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有する担体重合体と、の反応を含むものである。この反応の結果、最初にシッフ塩基（イミン）結合が形成され、これを還元して二級アミンとすることによって安定化して、最終的な複合体を形成することができる。
【００８８】
免疫複合体の抗体成分が抗体断片であるならば、Ｆｃ領域は存在しなくてよい。しかしながら、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域へと、糖質部分を導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）、米国特許第５，４４３，９５３号、及び第６，２５４，８６８号を参照のこと。これらの文献の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。操作された糖質部分は、治療物質または診断物質の結合に使用される。
【００８９】
標的指向型分子に対する担体部分の結合を目的する代替方法は、クリックケミストリー反応を使用するものである。クリックケミストリーの手法は、小さなサブユニットをモジュラー様式で共に連結することによって、複雑な物質を迅速に生成するための方法であると元々は考えられていた（例えば、Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４０：３００４−３１、Ｅｖａｎｓ，２００７，Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ６０：３８４−９５を参照のこと）。クリックケミストリー反応には、銅によって触媒されるヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）１，３−双極子環化付加反応（Ｔｏｒｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７−６４）などの、さまざまな形態が当該技術分野において知られおり、「クリック反応」と称されることが多い。他の代替手段には、ディールス・アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）などの環化付加反応、求核置換反応（特に、エポキシ化合物及びアジリジン化合物のような小さく歪んだ環に対するもの）、尿素化合物のカルボニル化学の形成、ならびにチオール・エン反応における、アルキンなどの、炭素−炭素二重結合が関与する反応が含まれる。
【００９０】
アジドとアルキンとのヒュスゲン環化付加反応は、還元物質の存在下で銅触媒を使用することで、第１の分子に結合した末端アルキン基の反応を触媒するものである。アジド部分を含む第２の分子の存在下では、アジドは、活性化されたアルキンと反応することで、１，４−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する。銅によって触媒されるこの反応は、室温で起こり、十分に特異的であるため、反応生成物の精製は必要でないことが多い。（Ｒｏｓｔｏｖｓｔｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６、Ｔｏｒｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７）。アジド官能基及びアルキン官能基は、水溶性媒体において、生体分子に対してほぼ不活性であることから、反応は、溶液で混合されたときに可能となる。形成されるトリアゾールは、化学的に安定であり、酵素的な切断を受けないことから、クリックケミストリーの生成物は、生体システムにおいて高度に安定である。銅触媒は、生細胞に対して毒性を有するが、銅に基づくクリックケミストリー反応は、インビトロでの免疫複合体形成には使用してよい。
【００９１】
生体分子を共有結合で修飾することを目的とした、銅を使用しないクリック反応が提唱されている（例えば、Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７を参照のこと）。銅触媒を使用しない反応では、銅触媒の代わりに環の歪みを使用することで、［３＋２］アジド−アルキン環化付加反応が促進される（前出の参考文献）。例えば、シクロオクチンは、内部にアルキン結合を含む８炭素の環構造を有している。閉環構造であるが故に、アセチレンによって結合角が大幅に歪められており、このアセチレンは、アジド基との反応性が高いことからトリアゾールが形成される。したがって、シクロオクチン誘導体を、銅を使用しないクリック反応を目的として使用してよい（前出の参考文献）。
【００９２】
銅を使用しない別の型のクリック反応が、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３０６５−６８）によって報告されており、歪みによって促進するアルキン−ニトロン環化付加を含むものである。元のシクロオクチン反応は速度が遅いということに対処するために、三重結合に隣接して電子求引基が結合している（前出の参考文献）。そのような置換シクロオクチンの例には、ジフルオロ化シクロオクチン、４−ジベンゾシクロオクチノール、及びアザシクロオクチンが含まれる（前出の参考文献）。銅を使用しない代替反応では、歪みによって促進するアルキン−ニトロン環化付加を含めることで、Ｎ−アルキル化イソキサゾリンが得られた（前出の参考文献）。反応は、例外的に速い反応速度論を有していることが報告され、ペプチド及びタンパク質の部位特異的な修飾を目的として、ワンポットの３段階プロトコールで使用された（前出の参考文献）。ニトロンは、適切なアルデヒドと、Ｎ−メチルヒドロキシルアミンとの縮合によって調製され、環化付加反応は、アセトニトリルと水との混合物中で実施された（前出の参考文献）。インビトロで抗体に対して担体部分を結合するために、こうしたもの、及び他の既知のクリックケミストリー反応を使用してよい。
【００９３】
Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７）によって、過アセチル化されたＮ−アジドアセチルマンノサミンの存在下で、ＣＨＯ細胞において組換え糖タンパク質を発現した結果、対応するＮ−アジドアセチルシアル酸が、糖タンパク質の糖質へと生物的に組み込まれることが示された。アジドで誘導化された糖タンパク質は、ビオチン化シクロオクチンと特異的に反応して、ビオチン化糖タンパク質を形成する一方で、アジド部分を含まない対照糖タンパク質は、未標識のままであった（前出の参考文献）。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：６６４−６６７）は、同様の手法を使用することで、過アセチル化されたＮ−アジドアセチルガラクトサミンと共にインキュベートしたゼブラフィッシュ胚において、細胞表面糖鎖を代謝的に標識した。アジドで誘導化された糖鎖は、ジフルオロ化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）試薬と反応することで、インビボでの糖鎖の視覚化が可能となる。
【００９４】
ディールス・アルダー反応もまた、インビボでの分子の標識化に使用されてきた。Ｒｏｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３３７５−７８）によって、トランス−シクロオクチン（ＴＣＯ）反応性部分を有し、腫瘍に局在化した抗ＴＡＧ７２（ＣＣ４９）抗体と、１１１Ｉｎ標識されたテトラジンＤＯＴＡ誘導体と、のインビボでの収率は、５２％であったと報告された。ＴＣＯで標識されたＣＣ４９抗体は、結腸癌異種移植片を有するマウスに投与され、その１日後に、１１１Ｉｎ標識されたテトラジンプローブが注入された（前出の参考文献）。放射標識されたプローブと、腫瘍に局在化した抗体とが反応した結果、放射活性が腫瘍に明確に局在化し、腫瘍：筋肉の比が１３：１となった。このことは、放射標識されたプローブを注入してから３時間後に、生きたマウスに対してＳＰＥＣＴイメージングを実施することによって示された（前出の参考文献）。この結果によって、ＴＣＯと、テトラジン標識された分子とのインビボでの化学反応が確認された。
【００９５】
標識化用部分の生物学的な組み込みを使用した、抗体の標識化手法は、米国特許第６，９５３，６７５号においてさらに開示されている（当該文献の実施例セクションが、参照によって組み込まれる）。そのような「景観化された（ｌａｎｄｓｃａｐｅｄ）」抗体は、グリコシル化部位に反応性のケトン基を有するように調製された。方法は、ＣＨ１ドメインまたはＶκドメインに１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位を有する抗体をコードする発現ベクターを細胞に遺伝子導入し、糖類または糖類前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において発現させることを含むものであった。ケトン誘導化された糖類または前駆体は、Ｎ−レブリノイルマンノサミン及びＮ−レブリノイルフコースを含むものであった。その後、景観化された抗体が、ヒドラジド基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミノ基、またはチオセミカルバジド基などの、ケトン反応性部分を含む物質と反応することで、標識された標的指向型分子が形成された。景観化された抗体に結合する物質の例には、ＤＴＰＡのようなキレート物質、ドキソルビシン−デキストランなどの大きな薬物分子、及びアシル−ヒドラジド含有ペプチドが含まれる。景観化手法は、ケトン部分を含む抗体の産生に限定されるものではなく、代わりに、ニトロン、アジド、またはシクロオクチンなどの、クリックケミストリーの反応基を、抗体または他の生体分子に導入するために使用してよい。
【００９６】
クリックケミストリー反応を改変したものは、インビトロまたはインビボでの使用に適している。化学的な複合化または生物学的な組み込みのいずれかによって、反応性の標的指向型分子を形成してよい。抗体または抗体断片などの標的指向型分子は、アジド部分、置換されたシクロオクチン基もしくはアルキン基、またはニトロン部分で活性化してよい。標的指向型分子が、アジド基またはニトロン基を含む場合、対応する標的指向化可能型構築物は、置換されたシクロオクチン基またはアルキン基を含むことになり、逆も同様である。そのような活性化された分子は、上で議論したとおり、生きた細胞における代謝組み込みによって調製してよい。あるいは、そのような部分を、生体分子へと化学的に複合化する方法は、当該技術分野においてよく知られており、任意のそのような既知の方法を利用してよい。
【００９７】
治療物質及び診断物質
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の標的指向型分子または標的指向化可能型構築物は、１つまたは複数の治療物質及び／または診断物質に結合してよい。治療物質は、好ましくは、放射性核種、免疫調節物質、抗血管新生物質、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、アポトーシス促進物質、干渉ＲＮＡ、光反応性の治療物質、化学療法的な物質または毒素であり得る細胞傷害性の物質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。使用される薬物は、抗有糸分裂物質、抗キナーゼ物質、アルキル化物質、代謝拮抗物質、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される医薬的性質を有し得る。
【００９８】
使用される薬物の例には、限定はされないが、５−フルオロウラシル、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水溶性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンカアルカロイドが含まれる。
【００９９】
使用される毒素には、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、例えば、オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）といったリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスの菌体外毒素、及びシュードモナスの菌体内毒素が含まれ得る。
【０１００】
使用される免疫調節物質は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及びそれらの組み合わせから選択してよい。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−γなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と命名されたものなどの幹細胞増殖因子である。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α及び腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子−Ｉ及びインスリン様増殖因子−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−γなどのインターフェロン、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、キット（ｋｉｔ）リガンドまたはＦｌＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、ならびにＬＴが含まれる。
【０１０１】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ、及びＩＰ−１０が含まれる。
【０１０２】
疾患組織の治療に有用な放射性同位体には、限定はされないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、及び２１１Ｐｂが含まれる。治療放射性核種は、好ましくは、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有し、好ましくは、オージェ放射体については、６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体については、１００〜２，５００ｋｅＶの範囲、及びアルファ放射体については、４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲を有する。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは、１００〜４，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは、５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、及びＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは、１００ｋｅＶ未満、及び最も好ましくは、７０ｋｅＶ未満である。アルファ粒子の生成を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種には、限定はされないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、及びＦｍ−２５５が含まれる。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは、３，０００〜８，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは、４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される可能性がある追加の放射性同位体には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ、及び同様のものが含まれる。
【０１０３】
治療物質は、光反応性の物質または色素を含んでよい。蛍光色素などの蛍光組成物、及び他の色素原、または可視光感受性であるポルフィリンなどの色素は、病巣に対して適した光をあてることによって、病巣の検出及び治療に使用されてきた。治療では、これは、光放射、光線療法、または光線力学的療法と呼ばれてきた。Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６），２２：４３０を参照のこと。さらに、モノクローナル抗体は、光線療法の達成を目的として、光活性化した色素とカップリングされた。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３），１３０：１４７３、同著者，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５），４５：４３８０、Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６），８３：８７４４、同著者，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７），４６：８３、Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８９），２８８：４７１、Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．（１９８９），９：４２２、Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６７：２５２９を参照のこと。
【０１０４】
副腎皮質ステロイドホルモンは、他の化学療法物質の有効性を増やすことができ、結果的に、組み合わせ療法において頻繁に使用される。プレドニゾン及びデキサメタゾンは、副腎皮質ステロイドホルモンの例である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、アンジオスタチン、バキュロスタチン（ｂａｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、マスピン、抗胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）ペプチド及び抗胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）抗体、抗血管増殖因子抗体（抗ＶＥＧＦ及び抗ＰｌＧＦなど）、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体及び抗Ｆｌｔ−１ペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート（ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、アンジオポエチン−２、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンジオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子、またはミノサイクリンなどの、抗血管新生物質を使用してよい。
【０１０６】
治療物質は、ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含んでよい。標的組織への送達を目的として、標的指向化可能型構築物に対して、任意のｓｉＲＮＡ種または干渉ＲＮＡ種を結合してよいと、当業者なら認識するであろう。さまざまな標的に対するｓｉＲＮＡ種が、当該技術分野において多く知られており、任意のそのような既知のｓｉＲＮＡを、請求される方法及び組成物において利用してよい。
【０１０７】
使用される可能性がある既知のｓｉＲＮＡ種には、ＩＫＫ−ガンマ（米国特許第７，０２２，８２８号）、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１、及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（米国特許第７，１４８，３４２号）、Ｂｃｌ２及びＥＧＦＲ（米国特許７，５４１，４５３号）、ＣＤＣ２０（米国特許第７，５５０，５７２号）、トランスデューシン（ベータ）様３（米国特許第７，５７６，１９６号）、ＫＲＡＳ（米国特許第７，５７６，１９７号）、炭酸脱水酵素ＩＩ（米国特許第７，５７９，４５７号）、補体第３成分（米国特許第７，５８２，７４６号）、インターロイキン１受容体関連キナーゼ４（ＩＲＡＫ４）（米国特許第７，５９２，４４３号）、サバイビン（米国特許第７，６０８，７０７０号）、スーパーオキシドジスムターゼ１（米国特許第７，６３２，９３８号）、ＭＥＴ癌原遺伝子（米国特許第７，６３２，９３９号）、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（米国特許第７，６３５，７７１号）、ＩＧＦ−１Ｒ（米国特許第７，６３８，６２１号）、ＩＣＡＭ１（米国特許第７，６４２，３４９号）、補体Ｂ因子（米国特許第７，６９６，３４４号）、ｐ５３（７，７８１，５７５）、ならびにアポリポタンパク質Ｂ（７，７９５，４２１）、に対して特異的ものが含まれ、それぞれの参照特許の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡ種は、既知の商業供給源からさらに利用可能であり、供給源は、数ある中でも、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）などである。ｓｉＲＮＡ種が公的に利用可能な他の供給源には、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＣｅｎｔｒｅのｓｉＲＮＡｄｂデータベース、ＭＩＴ／ＩＣＢＰ  ｓｉＲＮＡデータベース、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｓｈＲＮＡライブラリー、及びＮＣＢＩのＰｒｏｂｅデータベースが含まれる。例えば、ＮＣＢＩのＰｒｏｂｅデータベースには、３０，８５２のｓｉＲＮＡ種が存在する。任意の関心遺伝子について、ｓｉＲＮＡ種は既に設計されているか、または公的に利用可能なソフトウェアツールを使用して容易に設計し得ると、当業者なら認識するであろう。主題のＤＮＬ複合体を使用して、任意のそのようなｓｉＲＮＡ種を送達してよい。
【０１０９】
当該技術分野において知られるｓｉＲＮＡ種の例が、表１に示される。ｓｉＲＮＡは、二本鎖分子として送達されるが、表１では、単純化するために、センス鎖配列のみが示されている。
【０１１０】
【表１】
2018502859.tif 000004
【０１１１】
当該技術分野において知られるｓｉＲＮＡ種の全体数のうちの極少数が抽出されて表１に示されており、請求される方法及び組成物においては、任意のそのような既知のｓｉＲＮＡを利用してよいことを、当業者なら認識するであろう。
【０１１２】
診断物質は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤、及び光反応性物質からなる群から選択される。そのような診断物質は、よく知られており、任意のそのような既知の診断物質を使用してよい。診断物質の非限定例には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のガンマ−放射体、ベータ−放射体、もしくはポジトロン−放射体などの放射性核種が含まれ得る。
【０１１３】
使用される常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、またはエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ得る。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、またはビスマス（ＩＩＩ）が含まれ得る。
【０１１４】
超音波造影剤には、ガス充填リポソームなどのリポソームが含まれ得る。放射線不透過性の診断物質は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物から選択してよい。さまざまな蛍光標識が当該技術分野において知られており、限定はされないが、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、及びフルオレサミンが含まれる。使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルが含まれ得る。
【０１１５】
治療的な治療
別の態様では、本発明は、対象の治療方法に関し、当該方法は、治療上有効な量の、本明細書に記載の治療複合体の、対象への投与を含む。本明細書に記載の治療複合体を用いて治療され得る疾患には、限定はされないが、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ性白血病であり、例えば、ＬＬ２抗体を使用。米国特許第６，１８３，７４４号を参照のこと）、内胚葉由来消化器系上皮の腺癌、乳癌及び非小細胞肺癌などの癌、ならびに他の癌腫、肉腫、グリア系腫瘍、骨髄性白血病等が含まれる。具体的には、例えば、悪性固形腫瘍または造血器新生物によって産生またはそれと関連する癌胎児性抗原といった抗原に対する抗体が有利に使用される。当該悪性固形腫瘍または造血器新生物は、例えば、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、精巣、脳、またはリンパの腫瘍、肉腫、またはメラノーマである。そのような治療学は、疾患の状態及び複合体の忍容性に応じて、１回または繰り返して実施することができ、他の治療様式との最適な組み合わせで使用することもできる。当該他の治療様式は、手術、外部放射線、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子療法、及び同様のものなどである。組み合わせはそれぞれ、癌の型、段階、患者の状態、及び優先治療、ならびに管理医師が考慮する他の因子に適応させることになる。
【０１１６】
本明細書では、「対象」という用語は、任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）を指し、限定はされないが、ヒトを含む哺乳類を含む。用語は、特定の年齢または雌雄に限定されないことが意図される。したがって、用語は、雄性または雌性を問わず、成体及び新生児である対象、ならびに胎児を包含する。
【０１１７】
好ましい実施形態では、Ｍｕ−９抗体を含む治療複合体を、米国特許第６，９６２，７０２号、及び第７，３８７，７７２号に開示のように、結腸直腸癌、ならびに膵癌及び卵巣癌を治療するために使用することができる。これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、ＰＡＭ４抗体を含む治療複合体は、米国特許第７，２３８，７８６号、及び第７，２８２，５６７号に開示されるように、膵癌を治療するために使用することができる。これらの文献はそれぞれ、実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、ＲＳ７抗体（上皮糖タンパク質−１［ＥＧＰ−１］抗原に対する結合性を有する）を含む治療複合体を、米国特許第７，２３８，７８５号に開示のように、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮、及び前立腺の癌腫などの、癌腫を治療するために使用することができる。当該文献の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
別の好ましい実施形態では、抗ＡＦＰ抗体を含む治療複合体を、米国特許第７，３００，６５５号に開示のように、ヒト化、キメラ、及びヒトの抗体形態を使用して、肝細胞癌、胚細胞性腫瘍、及び他のＡＦＰ産生腫瘍を治療するために使用することができる。当該文献の実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、抗テネイシン抗体を含む治療複合体を、造血器及び固形の腫瘍を治療するために使用することができ、テネイシンに対する抗体を含む複合体は、固形腫瘍、好ましくは、膠芽腫のような脳癌を治療するために使用することができる。
【０１２１】
好ましい実施形態では、ヒト疾患の治療において使用される抗体は、ヒト型またはヒト化された型（ＣＤＲが導入されたもの）の抗体であるが、マウス型及びキメラ型の抗体を使用することができる。免疫応答を最小化するためには、送達物質としてのＩｇＧ分子を同一種とすることが最も好ましい。このことは、反復治療が考慮されるときに、特に重要である。ヒトについては、ＩｇＧ抗体がヒトのものであるか、またはヒト化されていると、患者が抗ＩｇＧ免疫応答を起こす可能性は低い。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞に存在する内部移行性の抗原に結合した後、迅速に内部移行する。このことは、結合している化学療法薬物もまた、細胞に迅速に内部移行することを意味する。しかしながら、内部移行速度が遅い抗体もまた、選択的な治療を達成するために使用することができる。
【０１２２】
好ましい実施形態では、標的細胞への、より有効な取り込みは、多価の多特異性抗体または多価の単一特異性抗体を使用して達成することができる。そのような二価の二重特異性の抗体の例は、米国特許第７，３８７，７７２号、第７，３００，６５５号、第７，２３８，７８５号、及び第７，２８２，５６７号において見られ、これらの文献のそれぞれの実施例セクションが、参照によって本明細書に組み込まれる。こうした多価または多特異性の抗体は、癌の標的指向化において特に好ましく、そうした癌は、複数の抗原標的を発現し、同一抗原標的の発現エピトープが複数でありさえするが、こうした標的抗原は、免疫療法を目的とする、抗体による標的指向化及び十分な結合を回避することが多い。これは、細胞または病原体の単一抗原標的の発現または利用性が不十分なためである。複数の抗原またはエピトープを標的とすることによって、上述の抗体は、標的に対する高い結合性及び停留時間を示し、したがって、本発明が対象とする薬物の飽和度を高めることが可能である。
【０１２３】
投与方法
１つもしくは複数の医薬的に適した賦形剤、１つもしくは複数の追加成分、またはこうしたものの何らかの組み合わせを含む組成物を得るために、診断物質または治療物質で標識された対象分子を製剤化してよい。こうしたことは、それによって、活性成分（すなわち、標識された分子）と、１つまたは複数の医薬的に適した賦形剤と、が混合物において統合される、医薬的に有用な投与量を調製する既知の方法によって達成することができる。無菌のリン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に適した賦形剤の１つ例である。他の適した賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにそれらの改定版を参照のこと。
【０１２４】
本明細書に記載の組成物の好ましい投与経路は、非経口的な注入である。注入は、静脈内、動脈内、リンパ内、くも膜下腔内、または腔内へのものであってよい（すなわち、非経口的）。非経口投与では、組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤と関連して、溶液、懸濁液、または乳濁液などの、単位投与量の注入が可能な形態において製剤化されることになる。そのような賦形剤は、本質的に非毒性であり、非治療的である。そのような賦形剤の例は、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、及びハンクス液である。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水溶性賦形剤を使用してもよい。好ましい賦形剤は、５％のブドウ糖を含む生理食塩水である。賦形剤は、緩衝剤及び保存剤を含む、等張性及び化学的安定性を増進する物質などの、微量の添加物を含んでよい。経口投与を含む、他の投与方法も企図される。
【０１２５】
標識された分子を含む製剤化組成物は、例えば、ボーラス投与または持続点滴を介して、静脈投与に使用することができる。注入用組成物は、例えば、添加された保存剤と共に、アンプルまたは複数用量容器といった、単位投与量形態で存在し得る。組成物は、油性または水溶性の媒体において、懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤、及び／または分散剤などの、製剤用薬剤を含み得る。あるいは、組成物は、例えば、発熱物質を含まない無菌水といった、適した媒体との使用前構成を目的とする粉末形態であり得る。
【０１２６】
組成物は、溶液で投与してよい。溶液のｐＨ範囲は、ｐＨ５〜９．５、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５であるべきである。その製剤は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ、またはクエン酸塩、及び同様のものなどの適した医薬的に許容可能な緩衝剤を含む溶液におけるものであるべきである。緩衝剤の濃度範囲は、１〜１００ｍＭであるべきである。製剤化溶液は、５０〜１５０ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩も含んでよい。マンニトール、トレハロース、ソルビトール、グリセロール、アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミン、またはプロタミンの塩などの、有効量の安定化剤も含んでよい。組成物は、哺乳類の皮下へ、静脈内へ、筋肉内へ、または他の非経口経路によって、投与してよい。さらに、投与は、持続点滴、または単一もしくは複数のボーラスによって投与してよい。
【０１２７】
例えば、事前標的指向化手法において、二重特異性抗体が投与される場合、ヒトを対象として投与される抗体の投与量は、患者の年齢、体重、伸長、性別、全身の医学的状態、及び既往歴などの因子に応じて変わることになる。典型的には、単回静脈注入として、約１ｍｇ〜２００ｍｇの投与量範囲内で、二重特異性がレシピエントに投与されることが望ましいが、状況に応じて、低投与量または高投与量で投与してもよい。体表面積の平方メートル当たり約１０ｍｇ〜、または典型的な成人については、１７〜１８ｍｇの投与量範囲内で抗体がレシピエントに投与されることが、典型的には望ましいが、状況に応じて、低投与量または高投与量で投与してもよい。ヒト対象に投与され得る二重特異性抗体の投与量の例は、１〜２００ｍｇであり、より好ましくは、１〜７０ｍｇ、最も好ましくは、１〜２０ｍｇであるが、高用量または低用量を使用してよい。治療的な二重特異性抗体の投与量を増やしてよく、投与量は、１〜２００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１００〜１０００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、２００〜７５０ｍｇ、またはこれらの間に存在する任意の範囲などである。
【０１２８】
一般に、投与される標識された分子（複数可）の投与量は、患者の年齢、体重、伸長、性別、全身の医学的状態、及び既往歴などの因子に応じて変わることになる。好ましくは、標識された分子は、飽和用量で患者に投与される。放射標識された分子の投与については、投与量は、ミリキュリーで測定してよい。
【０１２９】
好ましい実施形態では、標識されたペプチド、タンパク質、及び／または抗体は、癌治療に使用される。癌の例には、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれる。そのような癌の、より具体的な例には、後述のものに加えて、扁平上皮癌（例えば、上皮性の扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎（ｋｉｄｎｅｙ）癌または腎（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が含まれる。「癌」という用語は、原発性で悪性の細胞または腫瘍（例えば、その細胞が、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外には、患者の身体部位へ遊走していないもの）、及び続発性で悪性の細胞または腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる二次部位への、悪性細胞または腫瘍細胞の遊走である転移から生じたもの）を含む。
【０１３０】
癌または悪性腫瘍の他の例には、限定はされないが、小児急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、視床下部及び視経路の小児神経膠腫、小児リンパ性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、松果体及びテント上原始神経外胚葉の小児腫瘍、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部肉腫、視経路及び視床下部の小児神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵島細胞癌（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞性腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内メラノーマ、膵島細胞癌（Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵島膵癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇及び口腔の癌、肝癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮性頸部癌、原発性転移性扁平上皮性頸部癌、転移性扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、副鼻腔及び鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在的腫瘍、膵癌、異常蛋白血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉及び松果体の腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行性の腎盂及び尿管の癌、絨毛��腫瘍、尿管及び腎盂の細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視経路及び視床下部の神経膠腫、外陰癌、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに任意の他の過剰増殖疾患が含まれ、それらに加えて、上記の臓器系に局在する新生物が含まれる。
【０１３１】
本明細書に記載及び請求される方法及び組成物は、悪性または前悪性の状態の検出または治療に使用してよい。そのような使用は、新生物または癌へと先行して進行することで知られるか、またはそれが疑われる状態であり、具体的には、過形成、化生、または最も具体的には、異形成からなる非新生物性の細胞増殖が生じた状態に適用される（そのような異常な増殖状態の概説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照のこと）。
【０１３２】
異形成は、癌の前兆であることが多く、主に上皮において見られる。異形成は、最も無秩序な形態の非新生物性の細胞増殖であり、個々の細胞の統一性、及び構築上の細胞配向性の消失を伴う。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する場所に、特徴的に生じる。検出することができる異形成疾患には、限定はされないが、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頚部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、半肢性骨端異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性骨異形成、開花性骨性異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗低下性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ奇形、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が含まれる。
【０１３３】
検出及び／または治療することができる、追加の新生物発生前疾患には、限定はされないが、良性の増殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性の状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、及び食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、ならびに日光角化症が含まれる。
【０１３４】
追加の過剰増殖性の疾患、障害、及び／または状態には、限定はされないが、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性のもの、前骨髄球性のもの、骨髄単球性のもの、単球性のもの、及び赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍などの、悪性腫瘍及び関連疾患の進行、及び／または転移が含まれ、固形腫瘍には、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫が含まれる。
【０１３５】
キット
さまざま実施形態が、患者における疾患組織の治療に適した成分を含むキットに関し得る。例示のキットは、本明細書に記載の少なくとも１つの複合体化した抗体または他の標的指向型部分を含んでよい。投与を目的とする成分を含む組成物が、経口送達などの、消化管経由の送達を目的として製剤化されないのであれば、何らかの他の経路を介してキットの成分を送達する能力を有する器具を含んでよい。非経口送達などの用途を目的とする器具の１つの型は、対象の身体へと組成物を注入するために使用されるシリンジである。吸入器具を使用してよい。
【０１３６】
キットの成分は、一緒に包装するか、または２つ以上の容器へと分別してよい。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に適した組成物の無菌凍結乾燥製剤を含むバイアルであってよい。キットは、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１つまたは複数の緩衝剤も含んでよい。使用してよい他の容器には、限定はされないが、パウチ、トレー、箱、管、または同様のものが含まれる。キットの成分は、包装し、容器内で無菌に維持してよい。含むことができる別の成分は、キットを使用する個人に対する、その使用のための説明書である。
【実施例】
【０１３７】
本発明のさまざまな実施形態が、下記の実施例によって例示されるが、その範囲が限定されることはない。
【０１３８】
実施例１．ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）構築物の調製
ＤＤＤ融合タンパク質及びＡＤ融合タンパク質
ＤＮＬ手法は、事実上、任意の抗体、抗体断片、または他のエフェクター部分を含む、二量体、三量体、四量体、六量体等を調製するために使用することができる。ある特定の好ましい実施形態については、抗体及び抗体断片は、二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列またはアンカードメイン（ＡＤ）配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生してよい。しかしながら、化学的な架橋結合、クリックケミストリー反応等などの、他の複合化方法が存在することを、当業者なら認識するであろう。
【０１３９】
手法は、限定されるものではなく、使用される任意のタンパク質またはペプチドを、ＤＮＬ構築物への組み込みを目的として、ＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質として産生してよい。化学的な架橋結合が利用される場合、ＡＤ複合体及びＤＤＤ複合体は、当該技術分野において知られる任意の架橋結合手法を使用してＡＤ配列またはＤＤＤ配列へと架橋結合し得る任意の分子を含んでよい。ある特定の例示の実施形態では、以下にさらに詳細に記載されるように、デンドリマー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、他の重合体部分をＤＮＬ構築物へと組み込んでよい。
【０１４０】
異なる型のＤＮＬ構築物については、異なるＡＤ配列またはＤＤＤ配列を利用してよい。例示のＤＤＤ配列及びＡＤ配列を以下に示す。
ＤＤＤ１：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列識別番号３３）
ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列識別番号３４）
ＡＤ１：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列識別番号３５）
ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列識別番号３６）
【０１４１】
ＤＤＤ１及びＤＤＤ２は、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩＩα形態のＤＤＤ配列を含むことを、当業者なら認識するであろう。しかしながら、代替の実施形態では、ＤＤＤ部分及びＡＤ部分は、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列、及び対応するＡＫＡＰ配列に基づくものであってよく、以下に、ＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ、及びＡＤ３において例示されるとおりである。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列識別番号３７）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列識別番号３８）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列識別番号３９）
【０１４２】
発現ベクター
プラスミドベクターであるｐｄＨＬ２は、多くの抗体及び抗体に基づく構築物を産生するために使用されてきた。Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９），１２５：１９１−２０２、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７），８０：２６６０−６を参照のこと。このバイシストロン性の哺乳類発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の合成を方向づけるものである。こうしたベクターの配列は、異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築物の多くで大部分が同一であり、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の配列のみに差異が存在する。当業者に知られる分子生物学のツールを使用することで、こうしたＩｇＧ発現ベクターを、Ｆａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤの発現ベクターへと変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成するためには、重鎖のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインをコードする配列と、ヒンジの最初の４残基、１４残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、及びヒトＲＩＩαの最初の４４残基（ＤＤＤ１と称される）をコードする配列と、が交換される。Ｆａｄ−ＡＤ発現ベクターを生成するためには、ＩｇＧのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを対象とする配列と、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、及びＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基の合成ＡＤ（ＡＤ１と称される）をコードする配列と、が交換される。当該合成ＡＤは、バイオインフォマティクス及びペプチドアレイ技術を使用して生成され、非常に高い親和性（０．４ｎＭ）でＲＩＩαの二量体に結合することが示されたものである。Ａｌｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３），１００：４４４５−５０を参照のこと。
【０１４３】
以下に記載されるように、ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターから、Ｆａｂ−ＤＤＤ１発現ベクターまたはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれへの変換も容易にするために、シャトルベクターを２つ設計した。
【０１４４】
ＣＨ１の調製
ＣＨ１ドメインは、ｐｄＨＬ２プラスミドベクターを鋳型として使用して、ＰＣＲによって増幅した。左ＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）末端、及びｃＩＩ制限エンドヌクレーゼ部位からなるものを使用し、これは、５’側のＣＨ１コード配列である。右プライマーは、ヒンジの最初の４残基（ＰＫＳＣ（配列識別番号８２））に、グリシン４残基及びセリン１残基が続き、ＢａｍＨＩ制限部位を含む２つのコドン（ＧＳ）を最後に有するものをコードする配列からなるものを使用した。４１０ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ＰＧＥＭＴ（登録商標）ＰＣＲクローン化ベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標），Ｉｎｃ．）へとクローン化し、Ｔ７（５’）配向の挿入断片を対象として、クローンを選別した。
【０１４５】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む２つのコドンを最初に有する１１残基のリンカーペプチドの後にＤＤＤ１が続くアミノ酸配列をコードするように、二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。停止コドン及びＥａｇＩ制限部位が、３’末端に付加されている。コードされるペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列識別番号４０）
【０１４６】
ＲＩＩＡ１−４４トップ及びＲＩＩＡ１−４４ボトムと命名した２つのオリゴヌクレオチドは、それらの３’末端で３０塩基対が重なり合うものであり、これらを合成及び結合することで、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列の中央１５４塩基対を含めた。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応に供した。プライマー伸長の後、ＰＣＲによって二本鎖を増幅した。増幅産物を、ＰＧＥＭＴ（登録商標）へとクローン化し、Ｔ７（５’）配向の挿入断片を対象として選別した。
【０１４７】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む２つのコドンを最初に有する１１残基のリンカーペプチドの後にＡＤ１が続くアミノ酸配列をコードするように、二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。停止コドン及びＥａｇＩ制限部位が、３’末端に付加されている。コードされるペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列識別番号４１）
【０１４８】
上記ペプチド配列をコードする、２つの相補的に重なり合うオリゴヌクレオチドを、ＡＫＡＰ−ＩＳトップ、及びＡＫＡＰ−ＩＳボトムと命名し、これらを合成及びアニールした。ＰＣＲによって二本鎖を増幅した。増幅産物を、ＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクターへとクローン化し、Ｔ７（５’）配向の挿入断片を対象として選別した。
【０１４９】
ＤＤＤ１とＣＨ１との連結
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの制限酵素を用いて、ＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出した後、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）における同一部位に連結することで、シャトルベクターであるＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。
【０１５０】
ＡＤ１とＣＨ１との連結
ＡＤ１配列を含む１１０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて、ＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出した後、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）における同一部位に連結することで、シャトルベクターであるＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。
【０１５１】
ｐｄＨＬ２に基づくベクターへの、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローン化
このモジュラー設計を用いることで、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のいずれも、ｐｄＨＬ２ベクターにおける任意のＩｇＧ構築物へと組み込むことができる。ｐｄＨＬ２から、ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩの制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、この除去部を、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片で置換することによって、重鎖定常ドメイン全体が、上記構築物の１つで置換される。
【０１５２】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２ｈの構築
６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、アミノ酸１４残基からなる柔軟なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介して、ＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にカップリングしたＡＤ１を有するｈ６７９  Ｆａｂの産生を目的とする発現ベクターである。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いて、ＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＡＤ１断片を含むＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片で置換することによって、ｈ６７９の可変ドメインを含む、ｐｄＨＬ２に基づくベクターを、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２へと変換した。
【０１５３】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、融合タンパク質であるＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のコピーを２つ含む安定な二量体の産生を目的とする発現ベクターであり、当該融合タンパク質では、ＤＤＤ１は、柔軟なペプチドスペーサーを介して、ＣＨ１のカルボキシル末端で、ｈＭＮ−１４  Ｆａｂに連結される。プラスミドベクターであるｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２は、ｈＭＮ−１４  ＩｇＧを産生するために使用されてきたものである。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩの制限エンドエンドヌクレーゼを用いて消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを除去し、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１断片を挿入することによって、ｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２をＣ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２へと変換した。
【０１５４】
同一手法は、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲ１、ｈＲＳ７、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＡ１９、ｈＡ２０、及び他の多くのものなどの、さまざまな既知の抗体のＦａｂの発現を目的とするプラスミドを産生するために利用されてきた。概して、抗体の可変領域をコードする配列は、ｐｄＨＬ２発現ベクターに存在しており、発現ベクターは、上記のように、ＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質の産生に向けて変換した。任意のそのような抗体のＦａｂ断片を含むＡＤ融合タンパク質と、ＤＤＤ融合タンパク質とを、１つのＡＤ融合タンパク質当たり、２つのＤＤＤ融合タンパク質というおよその比で組み合わせ得ることで、第１の抗体の２つのＦａｂ断片と、第２の抗体の１つのＦａｂ断片と、を含む三量体のＤＮＬ構築物が産生する。
【０１５５】
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、融合タンパク質であるＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のコピーを２つ含む安定な二量体の産生を目的とする発現ベクターであり、当該融合タンパク質では、ＤＤＤ１は、柔軟なペプチドスペーサーを介して、ＶＨのアミノ末端で、ｈＭＮ−１４  Ｆａｂに連結される。発現ベクターは、下記のように操作した。ＤＤＤ１ドメインは、ＰＣＲによって増幅した。
【０１５６】
ＰＣＲの結果として、ＮｃｏＩ制限部位と、ＢａｍＨＩ制限部位を含むリンカーの一部をコードする配列と、をそれぞれ、５’末端及び３’末端に付加した。１７０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧｅｍＴベクターへとクローン化し、Ｔ７（５’）配向の挿入断片を対象として、クローンを選別した。ＮｃｏＩ及びＳａｌＩの制限酵素を用いて、１９４ｂｐの挿入断片をｐＧｅｍＴベクターから切り出し、それら同一酵素を用いてＳＶ３シャトルベクターを消化して調製したものへとクローン化することで、中間ベクターであるＤＤＤ１−ＳＶ３を生成した。
【０１５７】
ｈＭＮ−１４  Ｆｄ配列をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲの結果として、ＢａｍＨＩ制限部位と、リンカーの一部をコードする配列と、を増幅産物の５’末端に付加した。停止コドン及びＥａｇＩ制限部位を、３’末端に付加した。１０４３ｂｐの増幅産物をｐＧｅｍＴへとクローン化した。ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩの制限酵素を用いて、ｐＧｅｍＴからｈＭＮ−１４−Ｆｄ挿入断片を切り出した後、それら同一酵素を用いてＤＤＤ１−ＳＶ３ベクターを消化して調製したものと連結することで、構築物であるＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４Ｆｄ−ＳＶ３を生成した。
【０１５８】
ＸｈｏＩ及びＥａｇＩの制限酵素を用いて、Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４  Ｆｄ配列を切り出し、１．２８ｋｂの挿入断片を、それら同一酵素を用いてＣ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２を消化することによって調製したベクター断片と連結した。最終的な発現ベクターを、Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐＤＨＬ２とした。Ｎ結合型のＦａｂ断片は、Ｃ結合型Ｆａｂ断片と比較して、同様のＤＮＬ複合体形成及び抗原結合特性を示した（未掲載）。
【０１５９】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生を目的とする発現ベクターであり、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４は、アミノ酸１４残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介して、ｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル末端に付加したＤＤＤ２の二量体形成及びドッキングドメインの配列を有する。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合性相互作用によって一緒に保持されたｈＭＮ−１４  Ｆａｂの２つの同一コピーからなる。
【０１６０】
発現ベクターは、下記のように操作した。２つの重なり合う相補性のオリゴヌクレオチドを合成的に調製し、リンカーペプチドの一部と、ＤＤＤ２の１〜１３残基とをコードする配列を含めた。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化することで、５’末端及び３’末端に突出部を調製した。これらの突出部はそれぞれ、制限エンドヌクレーゼであるＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したＤＮＡとの連結に適合する。
【０１６１】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを用いてシャトルベクターであるＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を消化して調製したものと連結することで、シャトルベクターであるＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）から５０７ｂｐの断片を切り出し、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＩｇＧ発現ベクターであるｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２を消化して調製したものと連結した。最終的な発現構築物は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と命名した。同様の手法が、多くの異なるヒト化抗体のＦａｂ断片のＤＤＤ２融合タンパク質を生成するために利用されてきた。
【０１６２】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２は、ＡとしてのＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４に対する、Ｂとしての対として設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２の産生を目的とする発現ベクターであり、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２は、アミノ酸１４残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加したＡＤ２のアンカードメイン配列を有する。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列の前にシステイン残基を１つ、及びアンカードメイン配列の後にもシステイン残基をもう１つ有する。
【０１６３】
発現ベクターは、下記のように操作した。２つの重なり合う相補性のオリゴヌクレオチド（ＡＤ２トップ及びＡＤ２ボトム）を合成的に調製し、ＡＤ２と、リンカー配列の一部と、をコードする配列を含めた。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化することで、５’末端及び３’末端に突出部を調製した。これらの突出部はそれぞれ、制限エンドヌクレーゼであるＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化したＤＮＡとの連結に適合する。
【０１６４】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩを用いてシャトルベクターであるＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を消化して調製したものと連結することで、シャトルベクターであるＣＨ１−ＡＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩの制限酵素を用いて、ＣＨ１及びＡＤ２をコードする配列を含む４２９塩基対の断片をシャトルベクターから切り出し、それら同一酵素を用いてｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターを消化して調製したものと連結した。最終的な発現ベクターは、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
【０１６５】
実施例２．ＤＮＬ構築物であるＴＦ１の生成
ＴＦ１と称されるＤＮＬ構築物の大スケールでの調製を、下記のように実施した。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（プロテインＬで精製）と、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（ＩＭＰ−２９１で精製）と、を１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいて、ほぼ化学量論的な濃度で最初に混合した。ＴＣＥＰの添加前は、ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて、ａ２ｂの形成を示す証拠は全く示されなかった（未掲載）。代わりに、ａ４（７．９７分、２００ｋＤａ）、ａ２（８．９１分、１００ｋＤａ）、及びＢ（１０．０１分、５０ｋＤａ）に相当するピークが存在した。５ｍＭのＴＣＥＰを添加した結果、ａ２ｂ複合体の形成が迅速に生じ、このことは、１５０ｋＤａのタンパク質に一致する新しいピークが、８．４３分に出現したことによって示された（未掲載）。ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２に帰属されるピーク（９．７２分）が依然として明らかに存在しており、それに加えて、ａ２またはａ４のいずれに対応する明らかなピークも観測されなかったことから、この実験では、Ｂが過剰に存在していると思われた。１時間還元した後、ＰＢＳを数回取り換えながら一晩透析することによって、ＴＣＥＰを除去した。得られた溶液を１０％のＤＭＳＯ溶液とし、室温で一晩保持した。
【０１６６】
ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析すると、ａ２ｂに相当するピークの保持時間は、僅かに０．１分減少して８．３１分となっており、ピークが鋭くなったように思われた（未掲載）。このことは、我々のこれまでの知見に基づくと、結合親和性が増加したことを示している。ＩＭＰ−２９１の親和性クロマトグラフィーによって、複合体をさらに精製することで、カッパ鎖の混入物を除去した。予測したとおり、過剰に存在するｈ６７９−ＡＤ２が同時精製されたため、分取ＳＥ−ＨＰＬＣによって後に除去した（未掲載）。
【０１６７】
ＴＦ１は、高度に安定な複合体である。ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）のセンサーチップに対する、ＴＦ１の結合性を試験すると、観測された応答は、試料注入の終了時点で、明らかに減少することはなかった。対照的に、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及びｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の両方を等モル混合物として含む溶液を、同様の条件下で試験すると、応答単位の増加が観測され、これに付随して、試料注入の間及びその直後に、検出可能な低下が生じた。このことは、初期に形成されたａ２ｂ構造が不安定であったことを示している。さらに、ＷＩ２を続けて注入すると、ＴＦ１の応答単位が実質的に増加した一方で、Ｃ−ＤＤＤ１／ＡＤ１混合物では、増加は生じないことが明らかとなった。
【０１６８】
センサーチップに固定化されたＴＦ１に対してＷＩ２が結合した結果として応答単位がさらに増加したことは、２つの結合部位が完全に機能性であり、それぞれにＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットが寄与していることに相当するものであった。このことは、ＴＦ１が、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合する能力を有していたことによって確認された（未掲載）。ｈ６７９−ＡＤ２及びＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ１４を含む混合物を、ＴＦ１と全く同様に還元し、酸化したものをＢＩＡｃｏｒｅによって分析すると、ＷＩ２が追加で結合することはほとんどなく（未掲載）、このことは、ＴＦ１などの、ジスルフィド結合で安定化したａ２ｂ複合体が、ＤＤＤ２と、ＡＤ２との相互作用を介してのみ形成可能であることを示している。
【０１６９】
プロセスの時間及び効率を下げるために、プロセスに対して改良を２つ実施した。第１に、遊離のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２が残存せず、軽鎖に加えて、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２に未繋留のいかなるａ４／ａ２構造も、ＩＭＰ−２９１親和性クロマトグラフィーによって除去されることになるように、ａ４／ａ２構造の混合物として存在するＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の使用モルを僅かに過剰として、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させた。第２に、還元後にＴＣＥＰを除去する手段として、透析またはダイアフィルトレーションの代わりに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いた。これにより、プロセスの時間が短くなるだけでなく、潜在的なウイルス除去段階も加わることになる。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と、６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２とを混合し、５ｍＭのＴＣＥＰを用いて室温で１時間還元した。溶液を０．７５Ｍの硫酸アンモニウム溶液とした後、ブチルＦＦ  ＨＩＣカラムへと負荷した。カラムを０．７５Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄することでＴＣＥＰを除去した。還元したタンパク質は、ＰＢＳでＨＩＣカラムから溶出し、１０％のＤＭＳＯ溶液とした。室温で一晩インキュベートした後、ＩＭＰ−２９１親和性クロマトグラフィーによって、高度に精製されたＴＦ１を単離した（未掲載）。ゲル濾過などの、追加の精製段階は必要ではなかった。
【０１７０】
実施例３．ＤＮＬ構築物であるＴＦ２の生成
ＴＦ２と命名した三量体のＤＮＬ構築物は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２との反応によって得た。ＴＦ２のパイロットバッチは、下記のように、９０％を超える収率で生成した。プロテインＬで精製したＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）と、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）とを１．４：１のモル比で混合した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにおける総タンパク質濃度は、１．５ｍｇ／ｍｌとした。続いて、ＴＣＥＰによる還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯによる酸化、及びＩＭＰ２９１の親和性クロマトグラフィーを含む段階を実施した。ＴＣＥＰの添加前は、ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて、ａ２ｂの形成を示す証拠は全く示されなかった。５ｍＭのＴＣＥＰを添加した結果、二成分構造と予測される１５７ｋＤａのタンパク質に一致するａ２ｂ複合体が迅速に形成された。ＩＭＰ２９１の親和性クロマトグラフィーによって、ＴＦ２は、ほぼ均一となるまで精製された（データ未掲載）。ＩＭＰ２９１は、６７９Ｆａｂが結合するＨＳＧハプテンを含む合成ペプチドである（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７１２２ｓ−２９ｓ）。ＩＭＰ２９１に結合しなかった画分を、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析したところ、生成物からは、ａ４、ａ２、及び遊離のカッパ鎖が除去されていることが示された（未掲載）。
【０１７１】
ＴＦ２の機能性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイによって決定した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合性のａ２ｂ複合体の対照試料として使用）、またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（未還元のａ２成分及びｂ成分の対照試料として使用）を希釈して１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）とし、ＨＳＧを固定化したセンサーチップ上を通過させた。ＴＦ２の応答は、２つの対照試料のものと比較して約２倍であり、このことは、対照試料においては、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分のみが、センサーチップに結合して残存したことを示している。ｈＭＮ−１４に対する抗イディオタイプ抗体であるＷＩ２  ＩｇＧを続けて注入すると、シグナル応答が追加で生じ、これによって、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと堅固に結合するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４成分を有しているのはＴＦ２のみであったことが示された。センサーチップに固定化されたＴＦ２に対して、ＷＩ２が結合することで応答単位がさらに増加したことは、２つの結合部位が完全に機能性であり、それぞれにＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットが寄与していることに相当するものであった。このことは、ＴＦ２が、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合する能力を有していたことによって確認された（未掲載）
【０１７２】
実施例４．二重特異性抗体であるＴＦ１０の産生
同様のプロトコールを使用することで、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４のコピーを２つ、及びＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９のコピーを１つ含む三量体のＤＮＬ構築物であるＴＦ１０を生成した。ＴＦ１０における、癌を標的とする抗体成分は、ｈＰＡＭ４に由来し、ｈＰＡＭ４は、放射標識されたＭＡｂとして詳細に研究されたヒト化抗膵癌ムチンＭＡｂである（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：７３８０−７３８７，２００７）。ハプテン結合成分は、ｈ６７９に由来し、ｈ６７９は、ヒト化抗ヒスタミニル−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）ＭＡｂである。ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２  ｘ  ｈ６７９）抗体は、上記のとおり、（抗ＣＥＡ）２ｘ抗ＨＳＧの二重特異性Ａｂ（ｂｓＡｂ）であるＴＦ２の産生を対象に開示した方法を使用して産生した。ＴＦ１０構築物は、ヒト化ＰＡＭ４Ｆａｂを２つ、及びヒト化６７９Ｆａｂを１つ有する。
【０１７３】
２つの融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤ及びｈ６７９−ＡＤ２）は、安定的に遺伝子導入された骨髄腫細胞において独立に発現した。組織培養上清液を統合し、ｈＰＡＭ４−ＤＤＤがモルで２倍過剰となるようにした。１ｍＭの還元型グルタチオンを使用して、穏和な還元条件下で、反応混合物を室温で２４時間インキュベートした。還元した後、２ｍＭの酸化型グルタチオンを使用して、緩和に酸化することによってＤＮＬ反応を完了した。ＴＦ１０は、ＩＭＰ２９１の親和性ゲル（ａｆｆｉｇｅｌ）樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーによって単離した。この樹脂は、ｈ６７９Ｆａｂに対する高い結合特異性を有する樹脂である
【０１７４】
上に開示したＤＮＬ手法は、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分に結合し得る抗体、免疫複合体、または他のエフェクター部分の任意の組み合わせを含む複合体を産生するために使用してよいことを、当業者なら認識するであろう。
【０１７５】
実施例４．ＤＮＬ（商標）構築物であるＴＦ１０及びＴＦ１２の産生
ＴＦ２構築物の生成に使用したものと同様のプロトコールを使用することで、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４のコピーを２つ、及びＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９のコピーを１つ含む、三量体のＤＮＬ（商標）構築物であるＴＦ１０を生成した。ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２  ｘ  ｈ６７９）抗体は、上記のとおり、（抗ＣＥＡ）２ｘ抗ＨＳＧの二重特異性Ａｂ（ｂｓＡｂ）であるＴＦ２の産生を対象に開示した方法を使用して生成した。ＴＦ１０構築物は、ヒト化ＰＡＭ４Ｆａｂを２つ、及びヒト化６７９Ｆａｂを１つ有する。
【０１７６】
２つの融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤ２及びｈ６７９−ＡＤ２）は、安定的に遺伝子導入された骨髄腫細胞において独立に発現した。組織培養上清液を統合し、ｈＰＡＭ４−ＤＤＤ２がモルで２倍過剰となるようにした。１ｍＭの還元型グルタチオンを使用して、穏和な還元条件下で、反応混合物を室温で２４時間インキュベートした。還元した後、２ｍＭの酸化型グルタチオンを使用して、緩和に酸化することによってＤＮＬ（商標）反応を完了した。ＴＦ１０は、ＨＳＧが複合化した親和性ゲル（ａｆｆｉｇｅｌ）樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーによって単離した。この樹脂は、ｈ６７９Ｆａｂに対する高い結合特異性を有する樹脂である。
【０１７７】
同一手法を利用することで、抗ＥＧＰ−１（抗ＴＲＯＰ２）ｈＲＳ７Ｆａｂ−ＤＤＤ２のコピーを２つ、及び抗ＨＳＧ６７９Ｆａｂ−ＡＤ２のコピーを１つ含むＤＮＬ（商標）構築物であるＴＦ１２を産生した。ＴＦ１２構築物は、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ２）及びＨＳＧに対する結合活性を保持していた。
【０１７８】
実施例５．複数の抗体に由来する、ＡＤが連結したＦａｂ融合タンパク質及びＩｇＧ融合タンパク質、ならびにＤＤＤが連結したＦａｂ融合タンパク質及びＩｇＧ融合タンパク質の産生
先行実施例に記載の手法を使用して、表２に示されるＩｇＧ融合タンパク質及びＦａｂ融合タンパク質を構築し、ＤＮＬ構築物へと組み込んだ。融合タンパク質は、親抗体の抗原結合特性を保持しており、ＤＮＬ構築物は、組み込まれた抗体または抗体断片の抗原結合活性を示した。
【０１７９】
実施例６．ＤＮＬ向けの配列変異体
ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮＬ構築物へと組み込まれるＡＤ配列及びＤＤＤ配列は、上で議論したように、ＡＤ１、ＡＤ２、ＡＤ３、ＤＤＤ１、ＤＤＤ２、ＤＤＤ３、またはＤＤＤ３Ｃのアミノ酸配列を含む。しかしながら、代替の実施形態では、ＤＮＬ複合体の構築において、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分の配列変異体を利用してよい。例えば、ヒトＰＫＡのＤＤＤ配列の変異体は４つのみ存在しており、ＰＫＡのＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ、及びＲＩＩβのＤＤＤ部分がそれらに相当する。ＲＩＩαのＤＤＤ配列は、上に開示するＤＤＤ１及びＤＤＤ２の基礎である。ヒトＰＫＡの４つのＤＤＤ配列を以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの残基１〜４４、ＲＩＩβの残基１〜４４、ＲＩαの残基１２〜６１、及びＲＩβの残基１３〜６６に相当する。（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡのＲＩＩαのＤＤＤ部分から僅かに改変されていることに留意されたい）。
ＰＫＡ  ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列識別番号４２）
【０１８０】
【表２】
2018502859.tif 000005
【０１８１】
ＰＫＡ  ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列識別番号４３）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列識別番号４４）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列識別番号４５）
【０１８２】
ＡＤドメイン及びＤＤＤドメインの構造機能相関は、これまでに研究の対象となってきた。（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６、Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１８３】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）は、ＡＤとＤＤＤとの結合相互作用を結晶構造から調べ、ヒトＤＤＤ配列は、二量体形成またはＡＫＡＰ結合性のいずれにおいても重要な保存アミノ酸残基を多く含むと結論づけた。当該保存アミノ酸残は、以下の配列識別番号３３において括弧で括って示される。（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の図１を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＤＤＤ配列の配列変異体の設計においては、括弧で括った残基のいずれの変更も避けることが望ましいであろうと考えられる一方で、二量体形成及びＡＫＡＰ結合性に対して重要性が低い残基については、保存アミノ酸の置換が実施される可能性があることを、当業者なら認識するであろう。
ＳＨ［Ｉ］Ｑ［Ｉ］ＰＰＧ［Ｌ］ＴＥ［ＬＬ］ＱＧ［Ｙ］Ｔ［Ｖ］Ｅ［ＶＬ］ＲＱＱＰＰＤ［ＬＶ］Ｅ［Ｆ］Ａ［Ｖ］Ｅ［ＹＦ］ＴＲ［Ｌ］ＲＥＡＲＡ（配列識別番号３３）
【０１８４】
Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、さまざまなＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列を、バイオインフォマティクスを用いた解析を実施することで、ＲＩＩに選択的である、ＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれるＡＤ配列（配列識別番号３５）を設計し、ＤＤＤに対するその結合定数は０．４ｎＭであった。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰの結合性に対するペプチドアンタゴニストとして設計された。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列における残基で、置換するとＤＤＤに対する結合性が減少する傾向がある残基は、配列識別番号３５において括弧で括って示される。ＡＤ配列の配列変異体の設計においては、括弧で括った残基のいずれの変更も避けることが望ましいであろうと考えられる一方で、ＤＤＤ結合性に対して重要性が低い残基については、保存アミノ酸の置換が実施される可能性があることを、当業者なら認識するであろう。
ＡＫＡＰ−ＩＳの配列
ＱＩＥＹＬ［Ａ］ＫＱ［ＩＶ］ＤＮ［ＡＩ］ＱＱＡ（配列識別番号３５）
【０１８５】
Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶学及びペプチド選別を利用することで、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列識別番号４６）を開発し、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対するその選択性が、ＲＩアイソフォームと比較して、５桁高いことを示した。括弧で括った残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比較して、アミノ酸置換が生じている位置を示し、こうした置換によって、ＲＩＩαのＤＤＤ部分に対する結合性が上昇した。この配列では、Ｎ末端のＱ残基は、残基番号４と付番され、Ｃ末端のＡ残基の残基番号は、２０である。置換することでＲＩＩαに対する親和性に影響する可能性を有する残基は、残基８、残基１１、残基１５、残基１６、残基１８、残基１９、及び残基２０であった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ある特定の代替の実施形態では、ＤＮＬ構築物を調製するために、ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分の配列の代わりに、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳの配列を用いてよいことが企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列の代わりにしてよい可能性を有する他の代替配列は、配列識別番号４７〜４９において示される。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比較して置換されている部分は、括弧で括られている。配列識別番号４６において示されるＡＤ２配列と同様に、ＡＤ部分は、Ｎ末端残基としてシステイン及びグリシン、ならびにＣ末端残基としてグリシン及びシステインを追加で含んでもよいと想定される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹ［Ｖ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｙ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列識別番号４６）
代替のＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹ［Ｋ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列識別番号４７）
ＱＩＥＹ［Ｈ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列識別番号４８）
ＱＩＥＹ［Ｖ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列識別番号４９）
【０１８６】
Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．の図２において、さまざまなＡＫＡＰタンパク質に由来するＤＤＤ結合配列がさらに開示されており、以下に示されるものである。
ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ−ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列識別番号５０）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列識別番号５１）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列識別番号５２）
ＲＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列識別番号５３）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列識別番号５４）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列識別番号５５）
二重特異性ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列識別番号５６）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列識別番号５７）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列識別番号５８）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列識別番号５９）
【０１８７】
Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）もまた、ＰＫＡに対するＡＫＡＰの結合と競合するペプチドを開発し、当該ペプチドは、配列識別番号６０〜６２において示される。こうしたペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列識別番号６０）、ＲＩＡＤ（配列識別番号６１）、及びＰＶ−３８（配列識別番号６２）と命名された。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対して高い親和性を示し、一方で、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８は、ＲＩに対して高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列識別番号６０）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列識別番号６１）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列識別番号６２）
【０１８８】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）もまた、ＰＫＡに対するＡＫＡＰの結合と競合する他のペプチドを開発し、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対するその結合常数は、最低で０．４ｎＭまで低下した。さまざまなＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列が、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の表１に提供されており、以下の表３に再掲載される。ＡＫＡＰＩＳは、合成のＲＩＩサブユニット結合ペプチドに相当する。他のペプチドはすべて、示されるＡＫＡＰのＲＩＩ結合ドメインに由来する。
【０１８９】
【表３】
2018502859.tif 000006
【０１９０】
異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存されている残基は、ＡＫＡＰ  ＩＳの配列（配列識別番号３５）を参照し、括弧で括って以下に示される。残基は、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって観測されたものと同一であり、Ｃ末端にアラニン残基が追加されている。（Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）の図４を参照のこと。参照によって本明細書に組み込まれる）。ＲＩＩのＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ、及びＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐのものであった。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬ［Ａ］ＫＱ［ＩＶ］ＤＮ［ＡＩ］ＱＱ［Ａ］（配列識別番号３５）
【０１９１】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）は、ヒトから非ヒトのタンパク質に由来する異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分間で、最も高度に保存されている思われるＤＤＤ配列の残基を同定した。そうした残基は、配列識別番号３３において示される、ヒトＰＫＡのＲＩＩαのＤＤＤ配列を参照し、括弧で括って以下に示される。特に保存されている残基は、二重括弧で括ってさらに示される。残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）によって、ＡＫＡＰタンパク質に対する結合性に重要であると示唆されるものと重複するが、同一ではない。ＤＤＤの配列変異体の設計においては、最も保存されている残基（二重括弧内）の変更を避けることが最も望ましく、保存残基（括弧内）の変更も避けることが好ましいであろうと考えられる一方で、括弧または二重括弧のいずれでも括られていない残基については、保存的なアミノ酸置換を考えてよいことを、当業者なら認識するであろう。
Ｓ［ＨＩ］Ｑ［［ＩＰ］］Ｐ［［ＧＬ］］Ｔ［Ｅ］［［ＬＬ］］［Ｑ］［［Ｇ］］［Ｙ］［［Ｔ］］Ｖ［［ＥＶＬＲ］］Ｑ［［ＱＰ］］Ｐ［［ＤＬ］］［ＶＥ］［［ＦＡ］］ＶＥ［［ＹＦ］］ＴＲ［［Ｌ］］Ｒ［Ｅ］Ａ［［Ｒ］］Ａ（配列識別番号３３）
【０１９２】
得られるＤＮＬ構築物の治療的及び／または薬物動態学的な性質を増進するために、ＤＮＬ構築物の抗体部分またはリンカー部分において、こうしたもの及び他のアミノ酸置換を利用してよいと、当業者なら認識するであろう。
【０１９３】
実施例７．抗体とデンドリマーとのＤＮＬ複合体
我々は、Ｅ１−Ｇ５／２と命名した新規の免疫複合体を合成し、特徴づけた。当該免疫複合体には、ＤＮＬの方法によって調製することで、ｈＲＳ７に由来するＦａｂの安定二量体に対して部位特異的に連結された第５世代（Ｇ５）のＰＡＭＡＭデンドリマーのハーフ（Ｇ５／２）を含めた。ｈＲＳ７は、さまざまな固形癌に発現するＴｒｏ−２抗原に結合すると、迅速に内部移行するヒト化抗体である。
【０１９４】
方法
ＡＤ２−Ｇ５／２及びｈＲＳ７−Ｆａｂ−ＤＤＤ２は、穏和な酸化還元状態で自己会合する２つのモジュールであり、これら２つの自己会合モジュールを結合することによってＥ１−Ｇ５／２を調製した後、プロテインＬカラムで精製した。ＡＤ２−Ｇ５／２を調製するために、我々は、ＡＤ２ペプチドをマレイミド基で誘導化して、シスタミンコアを有するＧ５のＰＡＭＡＭを還元して生成した単一チオールと反応させ、逆相ＨＰＬＣを使用することで、ＡＤ２−Ｇ５／２を単離した。我々は、ｈＲＳ７−Ｆａｂ−ＤＤＤ２を、上記の実施例に記載のように、骨髄腫細胞において融合タンパク質として産生させた。
【０１９５】
Ｅ１−Ｇ５／２の分子サイズ、純度、及び組成は、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウエスタンブロット法によって分析した。Ｅ１−Ｇ５／２の生物学的な機能は、ｈＲＳ７に対する抗イディオタイプ抗体への結合性、ゲル遅延度アッセイ、及びＤＮａｓｅ保護アッセイによって評価した。
【０１９６】
結果
Ｅ１−Ｇ５／２は、サイズ排除ＨＰＬＣによって、いくつかの微量ピークが隣接する主要ピーク（９０％超）からなることが示された。Ｅ１−Ｇ５／２の３つの構成物（Ｆｄ−ＤＤＤ２、軽鎖、及びＡＤ２−Ｇ５／２）は、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、ウエスタンブロット法によって確認した。抗イディオタイプ結合分析によって、Ｅ１−Ｇ５／２が、抗体とデンドリマーとの異なるサイズの複合体の集団を含み、それらはすべて、抗イディオタイプ抗体の認識能力を有していたことが明らかとなり、したがって、このことは、購入したＧ５デンドリマーのサイズが、構造的にばらついていたことを示唆している。
【０１９７】
結論
ＤＮＬ手法は、抗体を用いた標的指向化が可能な、デンドリマーに基づくナノ粒子を構築するために使用することができる。そのような物質では、インビトロ及びインビボでの用途を目的とする、薬物、プラスミド、またはｓｉＲＮＡの担体としての性質が改善されていた。
【０１９８】
実施例８．ＤＮＬデンドリマー向けの、マレイミドとＡＤ２との複合体
【０１９９】
【化２】
2018502859.tif 000007
【０２００】
ＰＥＧ部分まで含めたペプチドＩＭＰ４９８は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＰＳ３ペプチド合成機を用いて、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂で実施するＦｍｏｃ法によって合成した（０．１ｍｍｏｌスケール）。ジイソプロピルエチルアミン及びＤＭＦと共に、β−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルと、樹脂とを４時間混合することによって、マレイミドを手作業で添加した。１５ｍＭのＴＦＡ、０．５ｍＬのＨ２Ｏ、０．５ｍＬのトリイソプロピルシラン、及び０．５ｍＬのチオアニソールを用いて室温で３時間処理することで、ペプチドを樹脂から切断した。ＴＦＡを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ緩衝液を使用して、逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドを精製することで、凍結乾燥後の精製産物として約９０ｍｇを得た。
【０２０１】
還元型Ｇ５デンドリマー（Ｇ５／２）の合成
２．０３ｇ、７．０３ｘ１０−６ｍｏｌ相当のＧ−５デンドリマー（ＭｅＯＨ中１０％、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．１４２６のＴＣＥＰ．ＨＣｌを含む１：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（約４ｍＬ）で還元し、室温で一晩撹拌した。Ｃ−１８カラムを用いて、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ緩衝液で溶出する逆相ＨＰＬＣによって、反応混合物を精製することで、凍結乾燥後の所望生成物として０．０６３３ｇを得た。
【０２０２】
Ｇ５／２デンドリマーとＡＤ２との複合体の合成
０．０４６９ｇ（３．３５ｘ１０−６ｍｏｌ）のＧ５／２デンドリマーを、０．０１２４ｇのＩＭＰ４９８（４．４ｘ１０−６ｍｏｌ）と混合し、１：１のＭｅＯＨ／１ＭのＮａＨＣＯ３に溶解してから、室温で１９時間混合した後、０．０７５１ｇのジチオスレイトール及び０．０４４１ｇのＴＣＥＰ．ＨＣｌで処理した。溶液を室温で一晩混合し、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ緩衝液を使用して、Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムで精製することで、ＡＤ２とデンドリマーとが複合化して含まれる材料を０．００３３ｇ得た。ＡＤ２とデンドリマーとの複合化は、ゲル電気泳動及びウエスタンブロット法によって判断した。
【０２０３】
実施例９．二重特異性抗体による事前標的指向化を介した、細胞傷害性薬物向けの送達システム
上で議論したように、全身性の毒性が減少した治療物質の標的指向型送達の改善を目的として、二重特異性抗体及び標的指向化可能型構築物を用いて、事前標的指向化方法が使用されてきた。事前標的指向化では、対象に対して、二重特異性抗体（ｂｓＭＡｂ）を最初に投与して、標的細胞または標的組織に局在化させる。任意選択で、循環からのｂｓＭＡｂのクリアランスを早めるために、除去性物質を投与してよい。ｂｓＭＡｂが循環から除去された後、標的組織に局在化したｂｓＭａｂに結合する標的指向化可能型構築物が投与される。標的指向化可能型構築物は、１つまたは複数の治療物質及び／または診断物質に複合化されている。標的指向化可能型構築物は、循環から非常に迅速に除去され、典型的には、未変化のまま、主に尿で排出されるため、細胞傷害性の治療物質が循環に存在する時間はほとんどなく、非標的組織に取り込まれないことから、全身性の毒性は低減される。
【０２０４】
本実施例で目的としたことは、治療的な事前標的指向化において使用するための、新規の試薬を開発することである。こうしたものは、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡＣＡＭ５）二重特異性抗体を使用して、ヒト結腸直腸癌を対象とする動物モデルにおいて試験した。事前標的指向化試験において、例として使用した細胞傷害性薬物は、ＳＮ−３８である。
【０２０５】
以下に詳細に記載されるコアペプチド標的指向化可能型構築物（ＩＭＰ４５７）を開発した。この標的指向化可能型構築物は、ＳＮ−３８が結合するように改変されており、コアペプチド当たり、最大４つのＳＮ−３８部分を結合することができる。重合体分子当たり、８〜１６個のＳＮ−３８部分を結合することできるデンドロン重合体も調製した。標的指向化可能型構築物は、癌などの疾患組織の組み合わせ療法を目的とする治療放射性核種及び化学療法物質の両方に結合する能力を有する。
【０２０６】
例として使用した二重特異性抗体は、上の実施例に記載のＴＦ２  ＤＮＬ構築物である。ＴＦ２は、ＣＥＡＣＡＭ５に結合するｈＭＮ−１４Ｆａｂ部分を２つ、及びＨＳＧに結合するｈ６７９Ｆａｂ部分を１つ含む。腫瘍表面で、２つのＴＦ２  ｂｓＭＡｂが架橋結合するように、標的指向化可能型構築物には、ペプチド当たり２つのＨＳＧハプテンを含めた。２つの二重特異性抗体が架橋することで、事前標的指向型ペプチドの、腫瘍表面での保持が増進する（Ｂａｒｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １４：１５３−６６）。
【０２０７】
好ましくは、ペプチド−免疫複合体は、薬物の徐放が可能となるように設計され、例えば、最大１日は安定であるが、その後は時間依存的な様式で放出される薬物結合を有する。これは、事前標的指向化の動態学に適合するものであり、腫瘍におけるペプチドの蓄積は、１時間以内に最大に達し、その後の数時間をかけて９０％超が、尿で排出されることによって、血流から除去される。長期間身体に保持され、肝臓及び他の臓器において代謝が生じるようになる、薬物と抗体との直接的な複合体とは異なり、事前標的指向化では、注入された製品のほとんどが、そのまま排出されることで、全身性の副作用が最小化する。しかしながら、腫瘍に局在化した薬物とペプチドとの複合体は、腫瘍内で徐々に放出される。
【０２０８】
標的指向化可能型構築物ペプチドの合成
ペプチドは、ペプチド合成の間に、ペプチド側鎖の選択的な修飾と、ペプチドの伸長とが可能となるように、Ａｌｏｃ保護基及びＦｍｏｃ保護基を組み合わせて使用して、固相ペプチド合成によって合成した。ＩＭＰ４０２を最初に合成し、図１に従って、ＩＭＰ４５３の調製に使用した。ＩＭＰ４０２は、デンドロン薬物担体との複合化にも適している。
【０２０９】
ＩＭＰ４０２は、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂で下記のように合成した。樹脂に対して、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを結合した。リジン側鎖のＦｍｏｃを除去し、Ｎ−トリチル−ヒスタミニル−スクシニル−グリシル基（トリチル−ＨＳＧ−ＯＨ）を結合した。リジンからＡｌｏｃ基を除去し、ペプチドに対してＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを付加した。ペプチドに対して、さらにＡｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを付加し、そのリジン側鎖に対してトリチル−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。リジンからＡｌｏｃ基を除去し、標準的なペプチドカップリン方法を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、及びＴｒｉ−ｔ−ブチル−ＤＯＴＡ−ＯＨをペプチドに付加した。ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣによって精製した。
【０２１０】
ペプチド免疫複合体の合成
ペプチドカップリングに必要となるＳＮ−３８前駆体の合成は、図２に示される。ＳＮ−３８の１０位を、最初にＢｏｃ基で保護した後、２０位をクロロギ酸ｐ−ニトロフェニルで修飾することで、１０−Ｂｏｃ−２０−ｐ−ニトロフェニルカーボネートＳＮ−３８前駆体を生成した。その後、活性化ＳＮ−３８をペプチドと混合することで、Ｂｏｃ−ＳＮ−３８の保護複合体を生成し、これをＨＰＬＣによって精製した。その後、Ｂｏｃ基を穏和な条件下で除去することで、所望の生成物を、複合化プロセス全体で、全収率２０％で得た。得られたＳＮ−３８複合化ペプチドであるＩＭＰ４５３は、ＤＯＴＡ部分を１つ、ＳＮ３８部分を１つ、及びＨＳＧ部分を２つ含む。
【０２１１】
１１１Ｉｎで標識されたＩＭＰ４５３を用いた最初の試験によって、ＬＳ１７４ヒト結腸癌細胞株に対する優れた腫瘍標的指向性が示された（２８％ＩＤ／ｇ）（表４）。ペプチドの大部分が、尿中排出によって除去された（表４）。３時間時点で、腎臓への取り込みは上昇し（２１％ＩＤ／ｇ）、ビス−ＤＴＰＡペプチドで観測されたものと比較して高かったが（未掲載）、初期の腎臓への取り込みは、その５０％が２４時間で除去された。二重特異性抗体を投与していないマウスにペプチドを注入すると、腎臓への取り込みは、９．９７％ＩＤ／ｇにすぎなかった（表５）。事前標的指向化されたマウスの腎臓における取り込みの上昇は、おそらく、血液または腎臓に二重特異性抗体が存在したことによるものである。ペプチドを改変して、ＤＯＴＡキレート部分の代わりにＤＴＰＡを含めることで、腎臓への取り込みを、ＩＭＰ２２５及びＩＭＰ２７４のように、ビス−ＤＴＰＡペプチドで見られたものと同一の範囲まで低減し得る。ＴＦ２が存在しない場合、標識されたペプチドが腫瘍に取り込まれることはほとんどなかった（表５）。
【０２１２】
【表４】
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【０２１３】
【表５】
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【０２１４】
ＤＴＰＡが複合化したペプチド
ＩＭＰ４５３のアナログは、上記のように合成され、ＤＯＴＡ基がＤＴＰＡ基によって置換される。ペプチドは、１１１Ｉｎで標識され、ペプチドの腫瘍標的指向性及びクリアランスは、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスにおいて調べられる。ペプチドは、ＤＯＴＡで標識されたペプチドと同様の標的指向性をインビボで示すが、３時間時点での腎臓への取り込みは低い。ペプチド毒性は、賦形剤を添加し、ｐＨ５〜６の酢酸緩衝液において製剤化され、治療的な使用に向けて凍結乾燥される。
【０２１５】
デンドロン複合体
デンドロン担体分子の利点は、それが非対称的であり、異なって置換することを目的とする、複数の表面基と、１つの接着性（ｆｏｃａｌ）官能基とを有することである。ビス−ＨＳＧペプチドを、定義された接着性部位に結合することで、部位特異的な配置となる。図３では、ＰＡＭＡＭデンドロンが例示されるが、最大で１６個の表面基を用いて、他のデンドロンを使用してよい。簡潔に記載すると、これには、上で議論したように、アジドとエンとのクリック環化付加を介して複数のＳＮ−３８分子を導入するために、アセチレン基で複数部を誘導化することが必要である。
【０２１６】
接着性官能基は、「ＢＯＣ」の脱保護、及びマレイミドへの誘導化によって変換され、事前標的指向化を目的とするシステイン含有ビスＨＳＧペプチドに複合化される。同一ペプチドは、インビボでの標的指向性の決定を目的として、Ｉｎ−１１１放射標識での標識化を可能とするＤＯＴＡ分子も含む。費用効果が高いのであれば、アミノ基または何らかの他の基のいずれかを表面に有するデンドロンが購入される。あるいは、片側が保護された１，６−ジアミノヘキサンを出発物質として、メタクリル酸エステルの反応と、エチレンジアミンに基づくエステル化分解と、を反復手順で実施することによって、特定のデンドロンが社内で調製される。ＢＯＣで保護されたアミノ基は、最終的に、ビス−ＨＳＧペプチドを部位選択的に結合することになる接着性官能基として働く。
【０２１７】
アジド−ＳＮ−３８の調製
クリックケミストリーによる、標的指向化可能型構築物へのＳＮ−３８の付加などの、クリックケミストリー反応については、標的指向化可能型構築物のシクロオクチン部分またはアルキン部分との反応のために、アジド−ＳＮ−３８部分を調製してよい。調製例は、図４に示される。３．４３ｇのＳＮ−３８を使用し、１回の大スケールでの反応に加えて、小スケールでの反応を数多く実施した結果、ＳＮ−３８シリルエーテル（中間体１）が、７４％を超える収率で再現性よく調製された。０．２４〜２．０ｇの範囲の量で、架橋剤を限定試薬として使用して、カーボネート（中間体３）を５回調製した結果、精製カーボネートを０．３３〜２．６３ｇ（７７〜９０％）得た。この段階で、シリル基の脱保護を実施し、単純な水溶性の後処理によって材料を精製することで、フッ化物試薬が確実に除去された。アジド−ＳＮ−３８は、図４に示される中間体４であり、デンドリマーのアセチレン基への環化付加に使用される。
【０２１８】
クリック環化付加は、それが公開（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：６９１６−６９２６）されて以来、トリフェニルホスフィンと臭化銅とを０．１対０．２の当量で使用する、ジクロロメタンにおける均一反応を用いることによって単純化され、その結果として、生成物の質及び収率が改善した。古い方法を用いると、収率は、５８〜８２％であったが、一方で、新しい方法を用いると、収率は、８６％となった。我々は、この新しいプロセスは、均一反応条件であるということを考慮すると、スケールアップが容易に可能であるものと考える。合成手順の最終反応は、ジクロロ酢酸などの、穏和な酸を使用した、「ＭＭＴ」基の除去であり、高収率で進行する。クリック環化付加は、ＤＭＳＯを共溶媒として使用し、硫酸銅及びアスコルビン酸塩を含める水溶性の反応条件においても検討されることになる。
【０２１９】
実施例１０．担腫瘍マウスにおけるＴＦ２を用いた事前標的指向化
皮下にヒト結腸直腸腺癌の異種移植片（ＬＳ１７４Ｔ）を有する雌性胸腺欠損ヌードマウスにおいて、ＴＦ２を用いて事前標的指向化試験を実施した。細胞が増殖して、マウス当たり１ｘ１０７個の細胞を５５匹のマウスの皮下へ注入するために十分となるまで、組織培養において細胞を増殖させた。１週間後、腫瘍を測定し、時点ごとにマウスを割り付けて、５匹のマウス群とした。この試験の開始時点で、腫瘍の平均サイズは、０．１０５±０．０６８ｃｍ３であった。２０匹のマウスに対して、８０μｇの１２５Ｉ−ＴＦ２（５００ｐモル、２μＣｉ）を注入し、１６時間後に、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（４０μＣｉ、９２ｎｇ、５０ｐモル）を投与した。ペプチド注入後の０．５時間、１時間、４時間、及び２４時間の時点でマウスを屠殺し、剖検した。さらに、２４時間時点群の３匹のマウスについては、注入の１時間後、４時間後、及び２４時間後にγ−カメラで撮像した。対照として、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５のみを投与（事前標的指向化なし）した３匹の追加マウスを、注入の１時間後、４時間後、及び２４時間後に撮像した後、２４時間の撮像セッションを終えてから剖検した。腫瘍ならびにさまざまな組織を取り出し、γ−計測器内に置いて、それぞれの時点の組織におけるＩＤ／ｇの％を決定した。
【０２２０】
１２５Ｉ−ＴＦ２と、１２５Ｉ−ＴＦ２で事前標的指向化した９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５と、について、ＩＤ／ｇの％値を決定した（未掲載）。ＴＦ２のレベルは、ペプチド注入の最初の４時間（またはＴＦ２投与後の２０時間）にわたって相対的に未変化のままであり、ペプチド注入後の０．５時間時点（ＴＦ２投与後の１６．５時間時点）の６．７±１．６％ＩＤ／ｇから、４時間時点（ＴＦ２注入後の２０時間時間）の６．５±１．５％ＩＤ／ｇまでの範囲であった。ＴＦ２を用いて事前標的指向化したＩＭＰ−２４５の腫瘍への取り込み値（ＩＤ／ｇの％）は、ペプチド注入後、０．５時間、１時間、４時間、及び２４時間の時点で、２２±３％、３０±１４％、２５±４％、及び１６±３％であった。
【０２２１】
正常組織に関して、ＴＦ２を用いて事前標的指向化したマウスにおいて、肝臓、肺、及び血液に存在するペプチドをそれぞれの時点で調べたところ、これまでに開発された他の事前標的指向型物質で得られた結果と比較して顕著に少なかった（Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；１１（１９  Ｓｕｐｐｌ）：７１２２ｓ−７１２９ｓ）。こうしたデータは、続いて投与されるペプチドに結合する可能性を有する、いかなる残留断片も後に残すことなく、正常臓器を通過して、ＴＦ２が効率的に除去されることを示している（未掲載）。
【０２２２】
正常組織におけるレベルが低いことに加えて、腫瘍への取り込みが高いことで、優れた腫瘍：非腫瘍（Ｔ／ＮＴ）比が得られた（未掲載）。したがって、このことは、ＴＦ２が、ＣＥＡ産生腫瘍に対して、ジ−ＨＳＧに基づくエフェクターを局在化させるための、適した事前標的指向型物質であることを立証している。
【０２２３】
実施例１１．ＣＥＡ発現性結腸癌の異種移植片を有するマウスにおける、２１３Ｂｉを用いた事前標的指向型放射免疫療法
抗ＣＥＡｘ抗ＨＳＧの二重特異性抗体であるＴＦ２と、１７７Ｌｕで標識されたジ−ＨＳＧ−ＤＯＴＡペプチドであるＩＭＰ２８８と、を用いた事前標的指向型放射免疫療法（ＰＲＩＴ）は、ＣＥＡ発現性結腸癌の異種移植片の腫瘍増殖を遅延し得るものである。ＰＲＩＴの治療効力は、アルファ放出放射性核種を使用することによって改善し得る。この試験の目的は、ＰＲＩＴに対する、２１３Ｂｉの可能性評価とした。
【０２２４】
ＩＭＰ２８８を２１３Ｂｉで標識し、インビトロでの結合特性（ＩＣ５０、Ｋｄ、内部移行）を、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ２８８のものと比較した。ＴＦ２二重特異性抗体を用いて事前標的指向化したＬＳ１７４Ｔ異種移植片を皮下に有するマウスにおいて、２１３Ｂｉ−ＩＭＰ２８８の腫瘍標的指向性を試験した。最終的に、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍の増殖に対する２１３Ｂｉ−ＩＭＰ２８８（２．５〜１４ＭＢｑ）の効果を評価した。
【０２２５】
ＩＭＰ２８８は、２１３Ｂｉで安定的に標識され、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ２８８と同様の結合特性を示した（Ｋｄ＝０．８ｎＭ）。２１３Ｂｉ−ＩＭＰ２８８の腫瘍標的指向性は、注入後１５分で早くも観測され（９．３±２．０％ＩＤ／ｇ）、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ２８８のものと同等であった。事前標的指向化されたＬＳ１７４Ｔ腫瘍の腫瘍増殖は、２１３Ｂｉ−ＩＭＰ２８８の単回注入によって顕著に阻害された（図５）。この試験によって、結腸癌の異種移植片などの、ＣＥＡ発現性腫瘍に対する、２１３Ｂｉを用いたＰＲＩＴの実現可能性が示された。
【０２２６】
先行記載から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対してさまざまな変更及び改変を実施し、過度の実験を伴うことなく、それをさまざまな用途及び条件に適応させることができる。本明細書に引用される特許、特許出願、及び出版物はすべて、参照によって組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月8日(2017.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する対象に投与することにより、アルファ粒子放出放射性核種を、腫瘍へ送達するためのキットであって、
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する１つの結合部位、及びハプテンに対する１つの結合部位を有する二重特異性抗体と、
ｂ）アルファ粒子放出放射性核種で標識されたハプテン含有標的指向化可能型構築物と、
を含む、前記キット。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記二重特異性抗体が、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を含む複合体であって、前記第１の融合タンパク質が、ヒトタンパク質キナーゼＡの制御サブユニットであるＲＩ、ＲＩ、ＲＩＩ、またはＲＩＩに由来する二量体形成及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に結合した第１の抗体または抗原結合抗体断片を含み、前記第２の融合タンパク質が、ヒトＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に由来するアンカードメイン（ＡＤ）部分に結合した第２の抗体または抗原結合抗体断片を含む、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
前記二重特異性抗体が、ＴＦ１２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記放射性核種が、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、及びＴｈ−２２７からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
前記標的指向化可能型構築物が、ＩＭＰ２８８、ＩＭＰ４０２、ＩＭＰ４５３、ＩＭＰ４５７、及びＩＭＰ４９８からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記二重特異性抗体が、ｈＲＳ７、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＲ１、ｈＰＡＭ４、ｈＡ２０、ｈＡ１９、ｈＩＭＭＵ３１、ｈＭｕ−９、ｈＬ２４３、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＭＮ−３、ＲＦＢ４、リツキシマブ、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｘｕｍａｂ）、ランブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ、トレメリムマブ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、Ｊ５９１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、Ｄ２／Ｂ、Ｇ２５０、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ、トシツモマブ、及びトラスツズマブからなる群から選択される抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１または２に記載のキット。
【請求項８】
前記ハプテンが、ＨＳＧまたはＩｎ−ＤＴＰＡであり、前記二重特異性抗体が、ｈ６７９及びｈ７３４からなる群から選択される抗ハプテン抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１または２に記載のキット。
【請求項９】
毒素、薬物、放射性核種、免疫調節物質、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、光反応性の治療物質、抗血管新生物質、及びアポトーシス促進物質からなる群から選択される治療物質をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記治療物質が、５−フルオロウラシル、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、プロ−２Ｐ−ＤＯＸ、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、ＮＧＦ−β、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−λ、マクロファージ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４���ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット（ｋｉｔ）リガンド、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びリンホトキシンからなる群から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫の低悪性度形態、Ｂ細胞リンパ腫の高悪性度形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、食道癌、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、及び前立腺の癌腫からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【国際調査報告】
2018502859.tif 000015