(57)【要約】  母性脳反応性抗体に対するおとり抗原を使用する自閉スペクトラム症の診断方法並びに自閉スペクトラム症の治療方法及び予防方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親に、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質を投与することを含む、方法。
【請求項２】
胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親（ｉ）又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親（ｉｉ）の血液を、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質と体外で接触させることで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルを減少させ、こうして処理された血液を、前記母親に戻して再循環させることを含む、方法。
【請求項３】
前記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含むペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質は、ＫＣＮＡＢ２に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物質は、ＥＤＩＬ３に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物質は、ＩＶＤに対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記作用物質は、ＳＵＬＴ４Ａ１に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記作用物質は、ＴＮＩＰ２に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記作用物質は、ＲＡＩ１６に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記作用物質は、ＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記作用物質は、ＫＣＮＡＢ１に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２に対する抗体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５は、ヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含むペプチドを含む融合タンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ配列を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含む血漿可溶性ペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記母親は、該母親の血液から試料を取得し、その試料中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体のレベルを定量し、こうして定量されたレベルを、それぞれの抗体の予め規定されたコントロールレベルと比較することを含む方法によって、その胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると診断されており、ここで、コントロールレベルを上回る該試料中の抗体レベルが測定されることで、前記母親は、その胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると診断される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
母親がその身ごもっている胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると特定されたことを受けて、こうして特定された母親に前記量の作用物質を投与する初期工程を更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、胎児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であり、かつ前記量の作用物質は、胎児を身ごもっている母親に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であり、妊娠中で胎児が小児として産まれる前の妊娠した母親に投与することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性を判断する方法であって、その母親の血液から取得された試料中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する抗体のレベルを定量し、各々の定量されたレベルを、それぞれの抗体について予め決められたコントロールレベルと比較することを含み、ここで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する１種以上の抗体の高められた力価は、妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性が高いことを示すものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年１０月５日付けで出願された米国仮出願第６２／２３７，１５０号（その内容は引用することにより本明細書の一部をなす）の利益を主張するものである。
【０００２】
［政府支援の表明］
本発明は、アメリカ国防総省により与えられた助成番号ＡＲ１３０１３７及びアメリカ国立衛生研究所により与えられた助成番号ＭＨ１０６１９５による政府支援によりなされたものである。アメリカ合衆国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本出願全体にわたり、様々な特許及びその他の刊行物が、括弧内の番号によって参照される。参考資料の全引用は、本明細書の末尾に挙げられている。本明細書で参照されるこれらの参考文献並びに全ての特許文献、特許出願公報及び書籍の開示内容は、引用することによりその全体が本出願の一部をなし、こうして本発明の属する技術分野がより十分に記載される。
【０００４】
自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）は、コミュニケーション及び社会的相互作用の困難さ、並びに常同行動を特徴とする神経発達症候群の１つの群である。２０１３年に、アメリカ疾病予防管理センターは、８８人のアメリカ人の子供のうち１人がＡＳＤを患っており、その診断は、過去４０年間で１０倍に増えたと見積もっている。ＡＳＤの治療法は存在しないけれども、早期検知及び介入は、それに罹患している子供の認知能力及び言語能力を大きく改善することができる。
【０００５】
本発明は、母性脳反応性抗体（maternal brain-reactive antibodies：移行脳反応性抗体）に対するおとり抗原（decoy antigens：デコイ抗原）を使用する自閉スペクトラム症の診断及び抑制的処置の必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００６】
胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親に、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質を投与することを含む、方法が提供される。
【０００７】
また、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親の血液を、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質と体外で接触させることで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルを減少させ、こうして処理された血液を、母親に戻して再循環させることを含む、方法が提供される。
【０００８】
また、妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性を判断する方法であって、その母親の血液から取得された試料中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する抗体のレベルを定量し、各々の定量されたレベルを、それぞれの抗体について予め決められたコントロールレベルと比較することを含み、ここで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する１種以上の抗体の高められた力価は、妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性が高いことを示すものである、方法が提供される。
【０００９】
本発明の更なる目的は、以下の記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】脳反応性モノクローナル抗体Ｃ６は、Ｃａｓｐｒ２に結合することを示す図である。（１Ａ）ｔＧＦＰ−Ｃａｓｐｒ２を発現するＨＥＫ  ２９３Ｔ生細胞上のＣａｓｐｒ２（真ん中のパネル）に、Ｃ６（左上のパネル）は結合するが、Ｂ１コントロール（左下のパネル）は結合しない。ｔＧＦＰのみを発現する細胞又はトランスフェクションされていない細胞には染色は見られなかった（データは示さず）。（１Ｂ）脳反応性Ｃ６の、ＣＮＴＮＡＰ２−／−マウスの海馬中のＣＡ１領域への結合の低下。
【図２】Ｃ６曝露された胎児における出生前の皮質異常を示す図である。（２Ａ）ネスチン染色は、Ｂ１曝露された雄の脳と比較したＣ６での薄い皮質板（ＣＰ）を示している。（２Ｂ）雄の胎児脳及び雌の胎児脳におけるＣＰ及びＣＰ：皮質幅（ＣＷ）比。＊＊Ｐ＜０．０００１、ｔ＝７．１５、ｔ検定。（２Ｃ）ＰＨ３陽性染色は、Ｃ６曝露において有糸核分裂細胞がより少ないことを示している。矢印は、脳室帯（ＶＺ）における神経発生領域を特定している。（２Ｄ）ＶＺ、中間帯（ＩＺ）及びサブプレート（ＳＰ）におけるＰＨ３陽性の定量。単位面積＝６２．５ｍｍ２。＊Ｐ＜０．０５、Ｚ＝２．３４、マン−ホイットニー検定。（Ｂ、Ｄ）マウスの数：Ｂ１＝５、Ｃ６＝４、各々の抗体につき２匹の同腹子。（Ｍａｌｅｓ：雄、Ｆｅｍａｌｅｓ：雌）
【図３】Ｃ６曝露された雄のマウスにおける出生後の海馬ＣＡ１異常を示す図である。（３Ａ〜３Ｅ）Ｃ６曝露されたマウスのＣＡ１錐体ニューロンは、樹状突起長さ及びスパイン密度の低下を示している。分析は、２週齢のマウス（１群あたりｎ＝３）；ニューロン：Ｂ１＝４５、Ｃ６＝４９、及び成体動物（１群あたりｎ＝４）；ニューロン：Ｂ１＝７０、Ｃ６＝８３を含む。各々の群は、２匹の同腹子由来の動物を含んでいる。（３Ａ）２週齢（左）及び成体（１６週齢〜２０週齢）（右）のＢ１曝露されたマウス及びＣ６曝露されたマウス由来の代表的なゴルジ染色されたＣＡ１錐体ニューロンのトレース図。（３Ｂ）全分枝数の累積確率。２週齢のＢ１対Ｃ６、Ｐ＜０．００３、Ｄ＝０．３５、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）検定；成体、Ｐ＜０．００１、Ｄ＝０．６４、ＫＳ検定。挿入図のボックスプロットは、全分枝数を、平均及び四分位数として示したデータで表している。（３Ｃ）ショール解析は、樹状突起長さを、細胞体からの距離の関数として示している。左：２週齢のマウス、Ｐ＜０．００５、Ｄ＝０．４４、ＫＳ。右：成体マウス、Ｐ＜０．００１、Ｄ＝０．９７、ＫＳ検定。（３Ｄ）樹状体の起点から出発して終端に向かって続けて、該起点から通過した分節数として遠心的に定義された、分枝順序の関数としての樹状突起分枝数。Ｃ６曝露されたマウス及びＢ１曝露されたマウスは、両齢時にて有意差がある：２週齢、Ｐ＜０．０１、Ｄ＝０．６、ＫＳ検定；成体、Ｐ＜０．０３、Ｄ＝０．４５、ＫＳ検定。（３Ｅ）Ｃ６曝露されたマウスのＣＡ１ニューロンにおけるシナプス樹状突起スパインの密度低下；Ｂ１＝１．１８±０．０４個のスパイン／μ；Ｃ６＝０．９２±０．０２個のスパイン／μ；＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ＝４．７８、ｔ検定。（３Ｆ）上方、標識されたＰＶ陽性介在ニューロンを示すＣＡ１野の代表的な顕微鏡写真。下方、成体Ｂ１（ｎ＝１２５１）群及びＣ６（ｎ＝９９８）群におけるＰＶ陽性ニューロンの定量、＊＊Ｐ＜０．００１、Ｚ＝４．２５、マン−ホイットニー、１群あたり４匹の動物、２匹の同腹子。
【図４】中核的なＡＳＤ症状に似た課題におけるＣ６曝露された雄の子孫の能力低下を示す図である。母性抗体曝露された雄のマウスに、成熟期（１０週齢〜１４週齢）に行動評価を行った。（４Ａ）社会的選好性課題。左側の棒グラフ（物体）、Ｃ６曝露されたマウス（ｎ＝１５）は、Ｂ１群（ｎ＝１５）のマウスと同様の時間量にわたって新奇物体を調べる；右側の棒グラフ（社会性）、Ｃ６曝露されたマウスは、見慣れないマウスの近くで有意により短時間しか費やさず、それは社会的選好性の低下を示している；＊Ｐ＜０．００５、ｔ＝３．２、ｔ検定；１群あたり４匹〜５匹の同腹子。（４Ｂ）ガラス玉覆い隠し課題。左側、２つの群における覆い隠しパターンの代表的な例。右側、Ｃ６曝露されたマウス（ｎ＝１４）は、Ｂ１群（ｎ＝１５）よりも多くのガラス玉を覆い隠しているので、高められた常同行動を示している；＊＊Ｐ＜０．０００５、ｔ＝４．２、ｔ検定；１群あたり４匹〜５匹の同腹子。（４Ｃ）時計状迷路課題。左側のグラフは、迷路の中央から終端部に位置する出口へと逃避する潜時を示している。Ｃ６曝露されたマウス（ｎ＝６）は、初期段階（出口１１）においてＢ１曝露されたマウス（ｎ＝１１）と同様の行動を取るが、第二段階において、異なる位置を学習すると（出口７）機能しなくなる。右側の柔軟性の比率（「方法」において定義される）は、Ｃ６曝露されたマウスが、見慣れた出口から新しい出口に切り替える可能性が有意により低いことを示し、それは柔軟な学習の低下を示している；＊Ｐ＜０．０２、Ｚ＝２．３６、マン−ホイットニー検定；１群あたり２匹〜３匹の同腹子。
【図５】抗ＣＡＳＰＲ２モノクローナル抗体に曝露された胎児は、薄い皮質を有することを示す図である。抗ＣＡＳＰＲ２（上方）又は非脳反応性コントロール抗体（下方）を、妊娠マウス（Ｅ１３．５）に注射し、胎児を３６時間後に採取し、処理して、核（Ｄａｐｉ）、ネスチン又はその両方（重ね合わせ）を染色した。皮質の厚さは、白いバーで示されている。
【図６】ＡＳＤの子の母親からクローニングされた脳反応性モノクローナル抗体は、ＡＳＤ様行動を引き起こすことを示す図である。抗ＣＡＳＰＲ２（栗色）又は非脳反応性コントロール抗体（黒色）を、妊娠マウス（Ｅ１３．５）に注射し、子孫を、成熟期に社会的選好性（上方の柱状図）、運動異常（真ん中のグラフ）又は不安（下方の柱状図）について分析した。雄（左側のグラフ）の子孫はＡＳＤ関連行動を示すが、雌（右側のグラフ）の子孫はＡＳＤ関連行動を示さないことが指摘される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親に、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６及びＧＤＰ  Ｄ５は、それぞれヒトのＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６及びＧＤＰ  Ｄ５である。上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含むペプチドを含む。一実施形態においては、上記ペプチドは、全てＤアミノ酸からできている。
【００１２】
また、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少の方法であって、胎児を身ごもっている母親又は妊娠中で胎児が小児として産まれる前の母親の血液を、胎児又は小児における自閉スペクトラム症の抑制又は発生減少のために有効な量の、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、内皮インテグリンリガンド（ＥＤＩＬ３）、ＩＶＤ、脳特異的スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ４Ａ１）、ＴＮＩＰ２、レチノイン酸誘導性タンパク質１６（ＲＡＩ１６）又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する作用物質と体外で接触させることで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルを減少させ、こうして処理された血液を、母親に戻して再循環させることを含む、方法が提供される。
【００１３】
体外で血液と接触させることを含む上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、担体に固定化されていてもよい。無菌条件において、血液を担体上又は担体中に流すことで、血液中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６及び／又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体のレベルを減少させることができ、その後に、その血液が母親に戻される。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルは、血液濾過によって低減される。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルは、血液吸着によって低減される。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体の血中レベルは、血漿濾過によって低減される。
【００１４】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＫＣＮＡＢ２に対する抗体に結合する。
【００１５】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＥＤＩＬ３に対する抗体に結合する。
【００１６】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＩＶＤに対する抗体に結合する。
【００１７】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＳＵＬＴ４Ａ１に対する抗体に結合する。
【００１８】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＴＮＩＰ２に対する抗体に結合する。
【００１９】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＲＡＩ１６に対する抗体に結合する。
【００２０】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体に結合する。
【００２１】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、ＫＣＮＡＢ１に対する抗体に結合する。
【００２２】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２に対する抗体に結合する。
【００２３】
上記方法の一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５は、ヒトである。
【００２４】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含むペプチドを含む融合タンパク質を含む。
【００２５】
上記方法の一実施形態においては、上記融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ配列を更に含む。上記方法の一実施形態においては、免疫グロブリンは、ＩｇＧである。上記方法の一実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。上記方法の一実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ２である。上記方法の一実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ３である。上記方法の一実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。上記方法の一実施形態においては、免疫グロブリンは、ＩｇＭである。
【００２６】
上記方法の一実施形態においては、ここで使用される融合タンパク質は、免疫グロブリンの一部と、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６若しくはＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分とから構築された融合タンパク質、又はそれと同一の配列を有するタンパク質を意味する。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５は、それぞれヒトのＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の配列を有する。一実施形態においては、免疫グロブリンの上記部分は、ＩｇＧ又はＩｇＭの一部である。一実施形態においては、その免疫グロブリンの上記部分は、ＩｇＧの一部である。上記融合タンパク質のＩｇＧ部は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はそれらの一部のいずれかであってもよい。一実施形態においては、上記部分は、Ｆｃ配列（Ｆｃ領域全体の配列）である。一実施形態においては、上記融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４のＦｃ部と同一の配列を含む。一実施形態においては、上記融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部と同一の配列を含む。
【００２７】
一実施形態においては、上記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと同じ配列を有するか、又はヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと９５％以上の配列類似性を有する。一実施形態においては、上記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインと同じ配列を有するか、又はヒトＩｇＧ２のＦｃドメインと９５％以上の配列類似性を有する。一実施形態においては、上記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメインと同じ配列を有するか、又はヒトＩｇＧ３のＦｃドメインと９５％以上の配列類似性を有する。一実施形態においては、上記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインと同じ配列を有するか、又はヒトＩｇＧ４のＦｃドメインと９５％以上の配列類似性を有する。一実施形態においては、Ｆｃドメインは、変異されていない。一実施形態においては、Ｆｃドメインは、中性のｐＨではなく酸性のｐＨでのＩｇＧのＦｃＲｎに対する親和性を高めるために、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界域で変異されている。
【００２８】
上記方法の一実施形態においては、融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ配列と同じ配列を有する免疫グロブリンＦｃ配列を含む。免疫グロブリンＦｃ配列は、当該技術分野で良く知られている。一実施形態においては、本明細書での用語「Ｆｃ配列」は、本来の配列のＦｃ領域及び多様体のＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変動し得るが、ヒトのＩｇＧ重鎖Ｆｃは、通常はＣｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで広がるものと定義される。一実施形態においては、ＦｃのＣ末端リジンは、例えば生成若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸の組換え操作によって取り除かれ得る。
【００２９】
融合タンパク質において、Ｆｃドメインの存在は、結合されたタンパク質の血漿内半減期を著しく高め、それにより治療活性が延長される。さらに、Ｆｃドメインは、融合タンパク質がＦｃ受容体と相互作用することも可能にする。一実施形態においては、上記融合タンパク質は、Ｆｃドメインに連結されたＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の部分を含む。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の部分は、Ｆｃドメインへとペプチド結合によって直接結合される。上記方法の一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の部分は、Ｆｃドメインにリンカーを介して連結されている。一実施形態においては、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の部分は、細胞外部分である。一実施形態においては、その部分は、可動性を可能にするペプチドリンカーを介して連結される。一実施形態においては、リンカーは硬直性である。一実施形態においては、リンカーは開裂可能である。本発明の範囲内の可動性リンカーの例は、限定されるものではないが、Ｇｎ、及びＧＧＧＧＳ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎ＝２、３、４又は５である。本発明の範囲内の硬直性リンカーの例は、限定されるものではないが、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＸＰ）ｎである。本発明の範囲内の開裂可能なリンカーの例としては、限定されるものではないが、ジスルフィド結合及びプロテアーゼ開裂可能なリンカーが挙げられる。好ましい一実施形態においては、上記リンカーは、ペプチドリンカーである。
【００３０】
本明細書に記載される融合タンパク質のＦｃ配列は、変異されていてもよい。好ましい実施形態は、Ｋ３２２Ａ及びＮ２９７ＤのヒトＩｇＧ１のＫａｂａｔナンバリングを含む。変異Ｋ３２２Ａ及びＮ２９７Ｄは、制限（低減）された経胎盤移行を示した。変異Ｋ３２２Ａは、Ｆｃのアミノ酸の標準的なＫａｂａｔナンバリング７５−５３．Ｋ３２２Ａ．ＨＣ１ｆを基礎としており、３２２位のリジンがアラニンに変異されている。変異Ｎ２９７Ｄは、Ｆｃのアミノ酸の標準的なＫａｂａｔナンバリング７５−５３．Ｎ２９７Ｄ．ＨＣ１ｆを基礎としており、２９７位のアスパラギンがアスパラギン酸に変異されている。それに対して、Ｐ３２９Ａ（３２９位のプロリンのアラニンへの変異）は、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合において、試験抗体、例えばＡＱＰ４  ＩｇＧと同じ経胎盤移行を示した。
【００３１】
一実施形態においては、本明細書に記載される融合タンパク質は、組換えにより製造される。一実施形態においては、融合タンパク質は、真核細胞発現系において製造される。一実施形態においては、真核細胞発現系において製造される融合タンパク質は、Ｆｃ部の残基にグリコシル化を含む。
【００３２】
一実施形態においては、融合タンパク質は、ホモ二量体である。一実施形態においては、融合タンパク質は、単量体である。一実施形態においては、融合タンパク質は、多量体である。
【００３３】
上記方法の一実施形態においては、上記作用物質は、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の細胞外部分の配列を含む血漿可溶性ペプチドを含む。
【００３４】
上記方法の一実施形態においては、母親又は胎児は、該母親の血液から試料を取得し、その試料中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５に対する抗体のレベルを定量し、こうして定量されたレベルを、それぞれの抗体の予め規定されたコントロールレベルと比較することを含む方法によって、その胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると診断されており、ここで、コントロールレベルを上回る該試料中の抗体レベルが測定されることで、母親又は胎児は、その胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると診断される。
【００３５】
一般に、作用物質（例えば、治療剤、組成物及び／又は製剤、例えば該作用物質又は該作用物質を含む組成物）の「有効な」量は、規定の効果を達成し、所望の生物学的応答を惹起するのに有効な量である。幾つかの実施形態においては、或る物質の治療的有効量は、妊娠した母親に投与される場合に、その妊娠した母親の胎児又はその妊娠した母親から産まれた小児における自閉スペクトラム症の可能性又は程度の低下のために十分な量である。当業者に明らかであるように、或る物質の有効量は、所望の生物学的終点、送達されるべき物質、その化合物の薬物動態、標的細胞又は標的組織、治療される疾患、投与方式及び患者等のような要因に応じて変動し得る。例えば、疾患、疾病及び／又は病態の治療のための組成物及び／又は製剤の有効量は、上記疾患、疾病及び／又は病態の１つ以上の症状又は特徴を緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防する、その発症を遅延する、その重症度を低下させる、及び／又はその発生率を低下させる量である。通例、有効量は、一連の個々の用量全体を通じて投与されることを当業者であれば理解するであろう。幾つかの実施形態においては、医薬的な内容で使用される場合の用語「有効量」（例えば、医薬的有効量）は、或る作用物質が、所望の治療効果を達成するのに十分な量で存在することを意味する。
【００３６】
本発明の方法によって包含される母親への投与経路には、限定されるものではないが、以下の、耳内投与、頬部投与、結膜投与、皮膚投与、皮下投与、子宮頚部投与、洞内投与、気管内投与、腸内投与、硬膜外（epidural）投与、血液透析による投与、間質内投与、腹部内投与、羊膜内投与、動脈内投与、関節内投与、胆管内投与、気管支内投与、卵巣被膜内（intrabursal）投与、心臓内投与、軟骨内投与、仙骨内投与、空洞内投与、腔内投与、大脳内投与、槽内投与、角膜内投与、冠動脈内投与、皮内投与、椎間板内投与、管内（intraductal）投与、表皮内投与、食道内投与、胃内投与、膣内投与、歯肉内投与、回腸内投与、管腔内投与、病巣内投与、リンパ内投与、髄内投与、髄膜内投与、筋内投与、眼内投与、卵巣内投与、心外膜内投与、腹腔内投与、胎盤内投与、胸膜腔内投与、前立腺内投与、肺内投与、副鼻腔内（intrasinal）投与、脊髄内投与、滑膜内投与、腱内投与、精巣内投与、鞘内投与、胸腔内投与、尿細管内（intratubular）投与、腫瘍内投与、鼓膜内投与、子宮内投与、血管内投与、静脈内投与、心室内投与、膀胱内投与、硝子体内投与、喉頭内投与、鼻内投与、経鼻胃投与、眼投与、経口投与、口腔咽頭投与、非経口投与、経皮（percutaneous）投与、関節周囲投与、硬膜外（peridural）投与、直腸投与、吸入投与、眼球後投与、くも膜下投与、結膜下投与、舌下投与、粘膜下投与、局所投与、経皮（transdermal）投与、経粘膜投与、経胎盤投与、経気管投与、尿管投与、尿道投与及び膣投与の個々の経路及びその任意の部分集合のそれぞれが含まれる。
【００３７】
上記方法の一実施形態においては、上記方法は、母親がその身ごもっている胎児において自閉スペクトラム症の危険性があると特定されたことを受けて、こうして特定された母親に上記量の作用物質を投与する初期工程を更に含む。母親がその身ごもっている胎児において自閉スペクトラム症の危険性がないと特定される一実施形態においては、その母親には上記量の作用物質は投与されない。
【００３８】
また、妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性を判断する方法であって、その母親の血液から取得された試料中のＣａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する抗体のレベルを定量し、各々の定量されたレベルを、それぞれの抗体について予め決められたコントロールレベルと比較することを含み、ここで、Ｃａｓｐｒ２、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５の１種以上に対する１種以上の抗体の高められた力価は、妊娠見込みのある母親の胎児又は小児が自閉スペクトラム症を呈する可能性が高いことを示すものである、方法が提供される。
【００３９】
本明細書で使用される場合に、予め決められたコントロールレベルは、通常は事前にコントロールとして決定又は取得された値である。コントロールの概念は、当該分野では十分に確立されており、限定されるものではないが、一例として、罹患していない被験体から（罹患した被験体に対して）実験的に決定することができ、かつ（限定されるものではないが、例として、容積、質量、年齢、部位、性別が）１つ以上の変量の効果を打ち消すのに望ましいように正規化され得る。
【００４０】
上記方法の一実施形態においては、被験体はヒトである。
【００４１】
本明細書中に記載される様々な要素の全ての組合せは、本明細書中に別段の指示がない限り又は文脈によってはっきりと否定されない限り本発明の範囲内である。
【００４２】
本発明は、続く実験の詳細からより理解されるであろう。しかしながら、当業者は、論じられる具体的な方法及び結果が、添付の特許請求の範囲により完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを容易く認識するであろう。
【００４３】
実験結果
序論
自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）は、６７件の出生のうち１件に起こり、支障を来すほどの金銭的費用及び感情的なコストをもたらす。病理生物学的メカニズムの理解の進展により、ＡＳＤ発生において母性脳反応性抗体が関係づけられている。
【００４４】
母性抗体は、胎児脳に入ることができ（７）、脳反応性抗体は、胎児脳の発達に影響を及ぼすことがあり、子孫において認知機能障害を引き起こすことがある（８）。本研究所及びその他の研究所は、ＡＳＤの子の母親が、任意抽出した妊娠可能年齢の女性又は定型発達している子の母親と比較して、脳抗原に対して反応性である循環抗体をかなり多く有していることを実証した（９、１０）。血清又は選択された脳抗原特異抗体の妊娠マウス又はサルへの静脈内投与は、子孫において神経発達欠陥及び行動欠陥を引き起こす（１１、１２）。
【００４５】
このメカニズムの理解には、モノクローナル抗体の単離及び研究、並びに特異的な脳抗原性の特定が必要とされる。ＡＭＰＡ受容体及びＮＭＤＡ受容体の膜安定性に必要とされるＫｖ１カリウムチャネルの構成要素であるコンタクチン関連タンパク質様２（Ｃａｓｐｒ２）に結合する、モノクローナル抗体（Ｃ６と呼称される）が単離された。これらの特異抗体の高められた力価が、ＡＳＤの子の血清陽性の母親に観察された。ＡＳＤへの上記抗体の寄与を裏付けるために、マウスを子宮内で母性Ｃ６に曝露した。これは、異常な皮質発達と共に、雄の子孫の海馬における抑制性ニューロンの減少及び興奮性ニューロンの樹状突起複雑性の低下、それと関連して社会的選好性、柔軟な学習の低下、及び反復行動の増加を媒介した。これらの結果は、母親の循環中のモノクローナル抗体が、ＡＳＤと関連した脳の異常を媒介し得ることを裏付けている。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ＡＳＤの子の母親の、事前に脳反応性ポリクローナル抗体を有することが分かっている血液試料から、モノクローナル抗体を作製した。これらの血液試料は罹患した子供の出生の何年も後に取得されたので、ヒト胎児脳溶解物中に存在する抗原に対して反応性であったメモリー（ＣＤ２７陽性）Ｂ細胞に着目した。これらの細胞の検出を可能にするために、ヒト胎児脳溶解物の断片をビオチン化し、Ｂ細胞と一緒にインキュベートした。胎児脳の断片に結合した、ストレプトアビジン結合によって検出された個々のＣＤ１９陽性ＣＤ２７陽性Ｂ細胞を単離した。免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子を、ＰＣＲによって増幅させ、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ  ２９３）においてＩｇＧ１−κ抗体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた（１３）。
【００４７】
免疫組織学アッセイ（９）において５μｇ／ｍｌでマウス脳に結合した幾つかの抗体を同定した。これらの抗体の抗原特異性を測定するために２つのプラットフォームを使用した：９０００種のタンパク質を含むヒト抗原アレイ（Invitrogen社）及びＡＳＤにおいて重要であることが以前に示された抗原に対する反応性のための細胞ベースのアッセイ。電位開口型Ｋｖ１カリウムチャネルの成分であるＣａｓｐｒ２（図１Ａ）の細胞外部分に結合するＣ６と呼称されるモノクローナル抗体を調査した（１４）。Ｃａｓｐｒ２は、ニューロンの細胞膜上のチャネルを安定化する膜貫通型タンパク質である（１５）。Ｃａｓｐｒ２は、細胞体、軸索、及び樹状突起スパインに存在し（１４、１６）、その脳内での発現は、胎児発達の間に始まる［（１４、１７）においてもデータは示されず］。
【００４８】
免疫組織化学分析により、Ｃ６の野生型マウスの脳切片への結合は、Ｃａｓｐｒ２をコードする遺伝子であるＣＮＴＮＡＰ２の欠失を伴うマウスの脳切片と比較して有意に増大することが明らかとなり（図１Ｂ）、そのＣａｓｐｒ２に関する特異性が確認された。重要なことには、Ｃ６が取得された女性の血清は、ＣＮＴＮＡＰ２−／−マウス脳への結合の減少を示したが、それが存在しないわけではなかった。
【００４９】
Ｃ６モノクローナル抗体の病原性を調べるために、該抗体を、抗体が胎盤を通過して、まだ胎児脳組織に入ることができ（７）、かつＣａｓｐｒ２が脳内で転写される（１４、１７）時点である妊娠のＥ１３．５日に雌のマウスに静脈内（２００μｇ）投与した。コントロールとして、胎児脳発達に影響を及ぼさないことが以前に示された（１８）ヒトモノクローナル抗体であるＢ１を使用した。Ｃ６への最初の曝露から２日後に屠殺された母親からの雄の胎児は、薄くなった皮質板を示した。この異常は、雌の胎児では観察されず、またＢ１に曝露された雄又は雌の胎児にも見られなかった（図２Ａ、図２Ｂ）。産後における雄の皮質板が雌の皮質板よりも厚いことを示す以前の報告（１９）と一致して、Ｂ１抗体に曝露された雌の胎児と比較して雄においてより厚い皮質板が観察された。Ｃ６に曝露された雄の胎児は、Ｂ１に曝露された雄の胎児と比較して、発達中の皮質において有糸核分裂細胞の減少も示した。この異常は、Ｃ６曝露された雌の胎児では観察されなかった（図２Ｃ、図２Ｄ）。
【００５０】
Ｃ６又はＢ１への子宮内での曝露を経験した雄のマウスの脳を、１６週齢〜２０週齢の時に分析した。クレシルバイオレット染色された脳切片の評価では、脳構造における主要な変化は示されなかった。より高解像度の分析により、Ｃ６曝露されたマウスの海馬ニューロンが、Ｂ１曝露されたマウスの海馬ニューロンよりも少ない樹状突起及び樹状突起スパイン、並びにより少ない樹状突起分枝を示すことが実証された（図３Ａ〜図３Ｅ）。海馬ＣＡ１ニューロンは、約４週齢までは完全に発達しておらず、その時間の前には該ニューロンは、より少ない樹状突起長さ及び分枝を有している（２０）。構造的病変の時間的経過を評価するために、２週齢のマウスにおいてＣＡ１ニューロンを調査した。Ｂ１曝露された２週齢のマウス由来のＣＡ１ニューロンは、Ｂ１曝露された８週齢のマウスと比べて未熟な樹状突起構造を示した。Ｃ６曝露された２週齢のマウスは、より少ない尖端樹状突起分枝を示し、Ｃ６曝露された成体マウスは、Ｂ１曝露された２週齢のマウスと同じ分枝数を示している（図３Ｂ〜図３Ｄ）。興味深いことに、培養されたニューロンにおけるＣａｓｐｒ２のダウンレギュレーションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状突起の減少をもたらす（２１）。
【００５１】
またＣ６又はＢ１に子宮内で曝露された雄の成体マウスのＧＡＢＡ作動性のパルブアルブミン陽性（ＰＶ陽性）ニューロンを染色した。ＰＶ陽性ニューロンの減少が、Ｃ６曝露された雄のマウスの海馬のＣＡ１領域において観察され（図３Ｆ）、それは、ＣＮＴＮＡＰ２−／−マウスが、海馬におけるＧＡＢＡ作動性のＰＶ陽性介在ニューロンの数の２０％の減少を示すという報告と一致している。
【００５２】
Ｃ６への子宮内での曝露の行動への潜在的な効果を調べるために、子宮内でＣ６又はＢ１に曝露されたマウスを、成体として、ＡＳＤの中核的な症状に着目する様々な課題において研究した（２２）。Ｃ６曝露されたマウスはどちらの性別も、病的行動、又は体重、毛並み、握力強度、身体の感触若しくは反射、自発歩行（unsupervised locomotion）における変化（Ｐ＞０．４、ｔ検定  ｎ＝１７、５匹の同腹子）、又はオープンフィールド試験で測定された不安（Ｐ＞０．８、ＡＮＯＶＡ  ｎ＝１７、５匹の同腹子）を示さなかった。
【００５３】
Ｃ６に曝露された雄のマウスは、社会的選好性試験において、別のマウスの近くで有意により短時間しか費やさないが、新奇物体の近くで、Ｂ１曝露されたマウスと同様の時間量を費やした（図４Ａ）。さらに、Ｃ６曝露されたマウスは、常同行動又は脅迫行動を調べるガラス玉覆い隠し試験において、Ｂ１曝露されたマウスよりも有意により多くのガラス玉を覆い隠した（図４Ｂ）。またそれらのマウスは、時計状迷路において新しい出口の位置の学習の点で機能しなかったが、初期課題においては通常の学習を示し、それにより柔軟な学習における欠陥が示される（図４Ｃ）。それに対して、子宮内でＣ６又はＢ１に曝露された雌の子孫のいずれも、全ての課題において同等の動作をし、こうして、雌の胎児脳に対して抗体が効果を示さないという組織学的な発達データが裏付けられた。
【００５４】
ＡＳＤの子を持つ女性の集団におけるこの特異性を有する抗体の頻度を測定するために、脳反応性血清学（９）を有することが以前に示されたＡＳＤの子の母親からの血漿を調べた。血漿試料の３７％（５３件のうち２０件）が、Ｃａｓｐｒ２をトランスフェクションさせたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の透過処理されていない細胞膜に結合したが、一方で、脳反応性抗体を欠いたＡＳＤの子の母親からの試料の１２％だけ（６３件のうち８件）だけがそのような反応性を示し、任意抽出した妊娠可能年齢の女性からの試料の１２％（５１件のうち６件）がそのような反応性を示した（Ｐ＜０．００１、カイ二乗検定）。
【００５５】
これらの結果は、ＡＳＤの子の幾らかの母親が、ｉｎ  ｖｉｖｏで胎児の脳抗原に結合する抗体を発現することを直接的に立証している。Ｃａｓｐｒ２に関する特異性を有するＣ６は、異常な胎児脳発達を媒介し、長期の行動障害をもたらす。胎児の血液−脳関門は抗体を通すので（７）、母親の血液中に存在する病原性自己抗体は、母親に検出可能な疾患が存在しない場合でさえも脳の発達に影響を及ぼすことがある。母性抗体が胎児脳発達と共に長期の認知効果に影響を及ぼすというこのパラダイムは、全身性エリテマトーデスにおいて既に報告されており（１８、２３）、その場合には、子宮内でのＮＭＤＡ受容体反応性自己抗体への曝露により、異常な胎児脳発達及び永続的な神経認知欠損がもたらされた（１８）。
【００５６】
Ｃａｓｐｒ２をコードする遺伝子であるＣＮＴＮＡＰ２の稀な多様体は、ＡＳＤと関連している（２４）。Ｃａｓｐｒ２をコードする遺伝子であるＣＮＴＮＡＰ２の変異型を有する家系は、てんかん（２５）、強迫行動（２６）及び脳における様々な性別依存性の構造的異常（２７）を示す。ＣＮＴＮＡＰ２の欠失を有するマウスは、神経細胞移動の中断、阻害的ＧＡＢＡ作動性ニューロンの損失、並びにマウスにおいてＡＳＤ様表現型を表すとみなされる行動的特徴、例えば活動過剰、常同行動、モリスの水迷路における柔軟な学習の低下、及び社会的選好性異常を示す（１７）。発達の間に、Ｃａｓｐｒ２は、脳室増殖帯において高度に発現され（１４、１７）、Ｃａｓｐｒ２を欠くマウスは、神経細胞移動障害を示す。興味深いことに、皮質厚さの変化だけでなく、ニューロン充填の低下（２８）が、ＡＳＤにおいて観察された。皮質の薄化及び増殖細胞数の低下は、一過性軸索糖タンパク質−１（ＴＡＧ１）として知られる、Ｃａｓｐｒ２と共存し（１５）かつ皮質において増殖しているニューロンの移動の役割を担う別のタンパク質によって間接的に媒介される可能性がある。
【００５７】
子宮内でＣ６に曝露された成体マウスが、海馬において樹状突起分枝の減少を示すことも分かった。そのデータは、成熟期においてこれらのマウスが、２週齢の時のＢ１コントロールマウスと同様のレベルの樹状突起複雑性を示すことを示唆している。海馬におけるＧＡＢＡ作動性ＰＶ陽性ニューロンの減少も観察された。並行して、社会的選好性及び柔軟な学習において欠陥が観察され、常同行動の増加が観察された。これらの行動は、皮質線条体回路に関与することが認識されており、海馬入力の影響を受けやすい（２９、３０）。
【００５８】
Ｃ６抗体に子宮内で曝露された雄のマウスだけが神経発達異常を示すという事実は、ＡＳＤにおける強い雄への偏り（３１）を考えると特に興味深い。本発明者らは、ＡＳＤのマウスモデルにおける性差に取り組んだその他の報告を一切認識していない。それにもかかわらず、男性は、ヒトの家系におけるＣＮＴＮＡＰ２と言語発達障害との間の連鎖関連における重要な要因であった（２４）。Ｃａｓｐｒ２特異性を有する抗体は、ＡＳＤの子の母親において頻度が高いと思われる。
【００５９】
実施例２
独自のヒト血液リソース（サイモン・シンプレックス・コレクション、自閉症遺伝学的リソース、及びファインスタイン医学研究所のＧＡＰ登録）を利用して、抗脳抗体の頻度が、コントロール群（２％、ｐ＜０．０００１）と比較してＡＳＤの子の母親の血液において有意により高い（１１％）ことを実証した。脳反応性モノクローナル抗体を同定し、単細胞をＡＳＤの子の母親からクローニングした（セルソーティングされたメモリーＢ細胞由来のＩｇＧドメインの単一細胞発現クローニング）。簡潔には、末梢血から単離されたＢ細胞を、ビオチンで事前に標識されたヒト胎児脳溶解物と一緒にインキュベートし、そしてＢ細胞−脳抗原複合体を、アビジンクロマトグラフィーを使用して単離した。血液は、ＡＳＤの子をもたらした妊娠から何年も後に取得されたので、記憶コンパートメントにおけるＢ細胞だけに重要性がおかれるものと推論された。幸いにも、そのようなメモリーＢ細胞は、ヒトにおいては何年から何十年にもわたり存続するため、何年も前に起こった妊娠の間に存在していたかもしれない自己反応性における機会を与えることができる。したがって、後続工程で蛍光マーカー及びフローサイトメトリーを使用して、個々のメモリーＢ細胞を単独のウェル中にソーティングした。Nussenzweigらによって初めて記載された技術を使用して、ＩｇＧ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、ヒト構築物中にクローニングした（３４）。次いでこれらのシーケンシングを行い、発現のためにＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクションさせた。脳に対する免疫反応性を、胎児マウス脳及び成体マウス脳に免疫組織化学を用いて検証し、関心が持たれるモノクローナル抗体を発現させ、プロテインＧクロマトグラフィーで精製した。２０種の脳反応性モノクローナル抗体のライブラリを作製した。メモリーＢ細胞の選択と一致して、これらのモノクローナル抗体のほとんどは、胚中心反応により成熟されて、メモリー細胞コンパートメントに入ったＢ細胞の特徴である可変領域の大規模な体細胞超変異を含む。推定抗原は、プールされた抗原調製物を全長ヒトタンパク質アレイでスクリーニングした後に、抗体の選択のためにイムノブロットを行うことによって同定した。
【００６０】
２０種のそのような脳反応性モノクローナル抗体のうち、８種の抗体が、神経変性疾患に関与することが知られるターゲット（ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＡＢ１、ＥＤＩＬ３、ＩＶＤ、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＴＮＩＰ２、ＲＡＩ１６又はＧＤＰ  Ｄ５）に対して反応することが測定された。これらの８種の推定抗原のうち、全てが神経変性疾患に関与するタンパク質に存在し、そして４種は、単一のタンパク質複合体であるカリウム電位開口型チャネルのサブユニットに存在する（２種のモノクローナル抗体はＫＣＮＡＢ１に結合し、２種のモノクローナル抗体はＫＣＮＡＢ２に結合する）。さらに、配列解析は、２種の抗ＫＣＮＡＢ２抗体が同一の重鎖を利用することを示している。これらの知見は、ｋｃｎａｂ２遺伝子がゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）においてＡＳＤと関連付けられたので、特に興味がそそられるものである。
【００６１】
Ｅ１３．５日目の妊娠マウスに静脈注射する場合に、１種のヒト抗ＫＣＮＡＢ２モノクローナル抗体は、雌の子孫ではなく雄の子孫において異常な皮質発達をもたらし、かつ行動異常を引き起こす。これらの研究のために、その妊娠マウスは、ＡＳＤとの関連性が関連付けられた脳構造が形成されている発達段階である１３．５日齢の胎児をはらんでいた。抗体投与の３６時間後に解析されたときに、非脳反応性コントロールＩｇＧが注射されたマウスからの胎児は、正常な組織学を示した。それに対して、抗ＫＣＮＡＢ２のＩｇＧであるＣ６が注射されたマウスの胎児は、抗体が胎児脳に入るのと一致して、異常に薄い脳皮質層を示した（図５）。この時間窓での並行したホスホヒストン３染色は、抗ＫＣＮＡＢ２抗体に曝露された胎児において有意により少ない有糸核分裂細胞を示している（示さず）。最後に成体（１０週齢〜１４週齢）として解析した場合に、非脳反応性コントロールＩｇＧが注射された妊娠マウスからの雄及び雌の両方の子孫は、様々なマウスＡＳＤ行動表現型アッセイ（例えば、不安、運動、社会性；図６）を使用して評価した場合に正常な行動を示した。際だったことに、抗ＫＣＮＡＢ２のＩｇＧが注射されたマウスの成体の子孫に対して並行して行われた行動アッセイにより、性別特異的な異常が明らかになった。雌（図６の右側）の子孫ではなく雄（図６の左側）の子孫だけが、全ての３回の標準的ＡＳＤ行動アッセイ（社会的選好性、ロータロッド及びオープンフィールド）においてＡＳＤ関連行動を示す。ＡＳＤが選択的に雄の子に罹ることを考えれば、これらのマウスにおける性別特異的な行動異常は、特に興味深い。
【００６２】
方法
調査被験体：  ＡＳＤの子を持つ母親からの血漿を、サイモン・シンプレックス・コレクション（ＳＳＣ、sfari.org/resources/simons-simplex-collection）から取得した（３５）。妊娠可能年齢の女性からのコントロール血漿を、ノース・ショア・ＬＩＪ・ヘルス・システムの臨床研究所及びファインスタイン医学研究所の登録（www.gapregistry.org）における参加者から取得した。両方のコホートは、以前（３６）に記載されたものとした。全ての個人から、適切な治験審査委員会を通じてインフォームドコンセントを得た。
【００６３】
試料採取：  血液は、事前に脳反応性抗体を有すると特定されたＳＳＣに登録された同意した母親からヘパリン化チューブ中に採取された（３６）。そのプロトコルは、ＳＳＣのみならず、ファインスタイン医学研究所の治験審査委員会によっても承認された。
【００６４】
シングルセルソーティング：  単一のヒト脳反応性メモリーＢ細胞の単離を、以前（３７）に記載された通りであるが幾つかの変更を加えて実施した。Ｂ細胞を、新鮮な単核細胞から、Ｂ  ｃｅｌｌ  ｋｉｔ（StemCell Technology社）を使用してネガティブセレクションによって精製した。次いでそれらのＢ細胞を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン標識キット（Life Technologies社）を使用してビオチンで標識されたヒト胎児脳溶解物（１ｍｌあたり３ｍｇ、Nouvus社）と一緒に室温（ＲＴ）で３０分間にわたりインキュベートした。ビオチン化された脳抗原が結合した細胞を、ビオチン選択キット（StemCell Technologies社）で単離し、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１９、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ２７及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）ストレプトアビジンで染色することで、ＣＤ１９陽性ＣＤ２７陽性脳溶解物陽性メモリーＢ細胞の分離が可能となった。コントロールとして、非脳反応性であると最初に特定された画分を、ビオチン化された脳抗原と一緒にインキュベートして、上記のように染色した。この画分においては、ＡＰＣ陽性細胞は検出されなかった。最後に、ＣＤ１９陽性ＣＤ２７陽性ＡＰＣ陽性単一細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａにおいて（３８）に記載されるようにして単離した。
【００６５】
ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲ：  個々のＩｇＨ鎖（γのみ）及びＩｇＬ鎖（k又はｌ）のｃＤＮＡ合成を、以前（３７、３８）に記載されたように実施した。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子を、ＩｇＧ１又はk定常領域を含むプラスミド（ニューヨーク州のロックフェラー大学のM.Nussenzweig氏による寄贈）中にライゲーションした。
【００６６】
抗体産生：  抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、以前（３８）に記載された通りであるが、少し変更を加えて発現させた。簡潔には、重鎖プラスミド及び軽鎖プラスミドの両方でトランスフェクションする２４時間前に、ヒト胚腎臓線維芽細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ−２９３Ｔ）の細胞を、１００ｍｍ×２０ｍｍの培養皿中に、熱不活性化仔ウシ血清（ＦＢＳ、１０％）、グルタミン（１％）及びペニシリン−ストレプトマイシン（１％、ＨｙＣｌｏｎｅ、GE Healthcare社）を補った高グルコースＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、GE Healthcare社）中に継代した。引き続き、トランスフェクションの８時間前に、その培地を、グルタミン（１％）及びペニシリン−ストレプトマイシン（１％）を補ったＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ、GE Healthcare社）に変更した。次いで細胞を、リポフェクタミン２０００（Life Technologies社）を使用して、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をコードするプラスミドＤＮＡ（５μｇ）で同時トランスフェクションさせた。培養７日後に上清を回収した。抗体を、プロテインＧ−セファロース（GE Healthcare社、Life Technologies社）において精製し、グリシンバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ３．５）で溶出させ、そしてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８）中で中和した。上清中の抗体濃度を、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（３７、３８）によって測定した。精製された抗体を、大量のＰＢＳに対して透析し、それらの完全性を、クーマシーブルーで染色された非還元でのＳＤＳゲルによって調べ、それらの濃度を、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（３７、３８）及びＮａｎｏｄｒｏｐの両方によって測定した。
【００６７】
トランスフェクションされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を使用する結合アッセイ：  血漿並びにヒトモノクローナル抗体Ｃ６及びＢ１（３９）を、以前（４０）に記載されたように生細胞ベースの免疫蛍光アッセイを使用してＣａｓｐｒ２に対する結合について分析した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、Ｔｇｆｐ−Ｃａｓｐｒ２ベクター又はＴｇｆｐベクター（Origene社）を使用してトランスフェクションさせ、そして７２時間にわたり培養した。細胞を、Ｃ６又はＢ１（ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ中１ｍｌあたり１０ｍｇ）で染色した。Ｃａｓｐｒ２でトランスフェクションさせた細胞への抗体結合を、Ａｌｅｘａ  ５９４結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Life Technologies社）によって検出した。血漿内での抗Ｃａｓｐｒ２抗体の存在について試験するために、細胞を、ＰＢＳ及びＦＣＳ（１０％）中のヤギＩｇＧ（Sigma-Aldrich社）でブロッキングし、吸着処理済み（ウサギ肝臓粉末、Sigma-Aldrich社）血漿試料（希釈１：１００及び１：２００）と一緒にインキュベートした。ＩｇＧ結合を、Ａｌｅｘａ  ５９４結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Life Technologies社）を用いて検出した。死細胞を、ＤＡＰＩ染色（Sigma-Aldrich社）で可視化し、生細胞を、Ｃａｓｐｒ２−ＩｇＧ結合について分析した。市販の細胞外エピトープに対する抗Ｃａｓｐｒ２抗体（NeroMab UC Davis社、カリフォルニア州）を、ポジティブコントロールとして取り扱った。細胞質エピトープに対する抗Ｃａｓｐｒ２抗体（Abcam社）を、ネガティブコントロールとして取り扱った。ｔＧＦＰベクターでトランスフェクションさせた細胞及びトランスフェクションされていない細胞もコントロールとして取り扱った。
【００６８】
Ｃａｓｐｒ２タンパク質発現：  胚脳及び胎盤を採取し、そして直ちに液体窒素中で凍結させ、貯蔵（−８０℃）した。脳及び胎盤を、ショ糖（０．３２Ｍ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）、並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Fisher Scientific社）を含有する氷冷均質化バッファー中で均質化し、次いで均質化された脳を１５分間にわたり遠心分離（１０００×ｇ）した。上清を回収し、２０００００×ｇで再び遠心分離した。ペレットをバッファー中で再懸濁し、２０００００×ｇで再び遠心分離した。最後に、ペレットを、溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＮＰ−４０、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁し、貯蔵（−８０℃）した。タンパク質濃度を測定するために、試料を、Ｃｏｍｐａｔ−Ａｂｌｅ（商標）タンパク質アッセイ調製試薬キット（Thermo scientific社）で処理し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo scientific社）によってアッセイした。脳及び胎盤の膜溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ（Invitrogen社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ＰＤＶＦメンブレンに転写した。メンブレンを、ブロッキングバッファー（４％のミルク、０．１％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）中にて室温で１時間にわたり染色し、引き続き、抗Ｃａｓｐｒ２モノクローナル抗体（Abcam社）（ブロッキングバッファー中１：５００）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを、抗ウサギＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０ＣＷで染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（LI-COR Biosciences社）を使用して可視化した。ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼを、抗体（Abcam社、１：１０，００００）によって検出し、ローディングコントロールとして使用した。二次抗体単独は、結合を示さなかった。
【００６９】
Ｃａｓｐｒ２のＲＮＡ発現：  トータルＲＮＡを、脳及び胎盤からＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Qiagen社）を用いて抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Bio-Rad社）を用いて逆転写させた。ｃＤＮＡを、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０マスターミックスと共にＴａｑＭａｎプローブを用いて、マウスＣＮＴＮＡＰ２及びＰｏｌｒ２Ａ（Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社）について分析した。データは、Ｐｏｌｒ２ａに対して正規化し、相対誘導は、ΔΔＣｔによって計算した。
【００７０】
妊娠母に対する抗体投与：  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢〜８週齢）を、ジャクソン研究所から入手した。動物使用は、ファインスタイン医学研究所の施設ガイドラインに従った。確定妊娠（timed pregnancy）のために、２匹の雌と１匹の雄を１４時間にわたり一緒に収容した。雄のマウスをケージから取りだした時間を、胎生（Ｅ）０．５日目と呼称した。Ｅ１３．５の時に、Ｃ６抗体（２００ｍｇ）又はＢ１コントロール抗体（２００ｍｇ）のいずれかを、確定妊娠マウスに浅麻酔のもと眼窩後方注射によって投与した（５）。胚をＥ１５．５の時に採取し、性別検査（（４１）に記載）及び胎児脳病理のために処理した。さらに臨月に至るまで妊娠させた。
【００７１】
胎児脳の免疫組織学：  Ｅ１５．５での脳を、パラホルムアルデヒド（４％）中にて４℃で一晩に続き、ショ糖溶液（３０％）中にて４℃で４８時間にわたり固定化し、次いでＯＣＴコンパウンド（Sakura社）中にてドライアイス上で凍結させ、貯蔵（−８０℃）した。矢状切片を、クライオスタット（Leica社）において切断（１２μｍ厚）し、ゼラチンコートされたスライド上にマウントし、貯蔵（−８０℃）した。染色前に、切片を室温に解凍し、ＰＢＳで２回すすぎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（０．１％）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＰＢＳ（５％）にて室温で１時間にわたりブロッキングした。抗ＰＨ３陽性抗体（１：１００、Millipore社）又は抗ネスチン抗体（１：２００、Millipore社）及びＤＡＰＩ（１ｍｌあたり１μｇ、Life Technologies社）を、４℃で一晩添加した。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した後に、抗体結合を、Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ（Life Technologies社）を使用して検出し、Ａｘｉｏ−Ｉｍａｇｅｒ（Ｚ−１、Ａｘｉｏ−Ｖｉｓｉｏｎ  ４．７、Zeiss社）で可視化した。ＰＨ３陽性細胞の定量は、（３９）に記載されるように実施した。皮質板及び皮質幅の測定値は、（３９）に記載される各々の動物の多数の切片から取得した。
【００７２】
成体の脳の免疫組織学：  脳切片は、灌流前にイソフルランでマウスを麻酔することによって調製した。血液をヘパリン化された予備灌流バッファーで置き換えた後に、マウスにパラホルムアルデヒド（４％）を灌流させた。血漿又は細胞上清からの脳反応性抗体のための免疫染色を、以前に（３６）で記載されたように、操作されていないＣ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン研究所）又はＣＮＴＮＡＰ２−／−マウス（ニューヨーク州のアルベルト・アインシュタイン医学校のBrett S.Abrahams博士からの寄贈）において実施した。
【００７３】
ゴルジ染色及び分析：  子宮内で抗体に曝露されたマウスを、２週齢又は１６週齢〜２０週齢の時に調査した。脳の調製及びゴルジ染色を、ＦＤ  Ｒａｐｉｄ  ＧｏｌｇｉＳｔａｉｎ  Ｋｉｔ（メリーランド州、エリコットシティ）によって、製造元のプロトコルに従って行った。海馬のＣＡ１領域の冠状切片（１００μｍ厚）を分析した。スパイン又は樹状突起分枝の分析に含めるために、ニューロンは、尖端樹状突起及び細胞体を含む必要があった。分枝は、隣接するニューロンから目視で区別する必要があった。スパイン解析のために、ＣＡ１錐体層のＺスタック（０．５μｍ間隔）顕微鏡写真を撮った（Ｎ．Ａ．＝１．４；Ａｘｉｏ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１、Ａｘｉｏ−Ｖｉｓｉｏｎ  ４．８、Zeiss社）。画像を、Ｚスタック情報を表示したソフトウェアプログラム（Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ、MBF社）に転送し、こうして樹状突起上のスパインを可視化し、特定し、かつ計数した。樹状突起解析のために、Ｚスタック（２．０μｍ間隔、３４５μｍ×２７３μｍのタイル、Ｎ．Ａ．＝０．７５）を収集し、ファイルを解析に送り、樹状突起分枝のトレースを定量及び解析した。
【００７４】
パルブアルブミン染色：  この分析のために、行動評価を行った１６週齢〜２０週齢のマウスが使用された。脳をミクロトームによって切片にし（４０μｍ厚）、３枚の切片おきに収集し、既述（８）のようにマウントした。７枚の切片おきに、抗パルブアルブミン抗体（Abcam社）中でＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中１：５００希釈にて４℃で一晩インキュベートし、次いで洗浄し、ビオチン化された抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Vector Laboratories社）及びアビジン−ビオチンセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体と一緒に１：１００希釈で１時間にわたりインキュベートし、引き続きＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（Vector社、ＰＫ−６１００）からの１：２００溶液及び３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、０．０５％）と共に過酸化水素（０．００３％）と一緒にインキュベートした。切片を脱水し、カバースリップを載せた。定量のために、背側海馬のＣＡ１領域の錐体細胞層を横切る整合された冠状断面から、パルブアルブミン抗体染色に対して陽性であったニューロンを計数した（Ｂｒ−１．２０μｍ〜−１．８０μｍ）（Ｎ．Ａ．＝０．４５、６００μｍ×２００μｍのタイル；Ａｘｉｏ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１；Zeiss社）。同等の分量を採取した（平均±ｓｅｍで、Ｃ６＝０．１５４±０．００５ｍｍ２、Ｂ１＝０．１４５±０．００３ｍｍ２、Ｐ＝０．１８）。
【００７５】
行動評価：  子宮内でＣ６又はＢ１に曝露されたマウスを、１０週齢〜１４週齢の時に評価した。それらのマウスを、暗所（０９：００〜２１：００）及び明所（２１：００〜９：００）の逆転スケジュールで、食餌及び水を自由摂取させて飼育した。試験１週間前に、マウスを、その概日周期の暗所期間の間に５分〜１０分のセッションで５日間にわたり取り扱った。行動的スクリーニング（４３）を実施することで、Ｃ６曝露されたマウスにおいては自律反応及び神経学的反射が正常であることを確かめた（データは示さず）。オープンフィールド試験を使用して、Ｃ６曝露されたマウスにおいて行動が正常であることを調べ、それぞれのマウスを、黒色の壁（３０ｃｍの高さ）を備えた正方形のアリーナ（一辺４０ｃｍ）の中央に置き、１０分間にわたり自由に動かした。動物の行動を、中央に置かれたビデオカメラでビデオトラッキングソフトウェア（ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ  ｖ８．５、Noldus社、米国マサチューセッツ州、アトルボロ）を使用して記録した。またアリーナの中央（１０×１０平方ｃｍ）の居在を不安の尺度として分析し、Ｃ６曝露されたマウスが、Ｂ１曝露されたマウスと同等であることが判明した（データは示さず）。ＡＳＤの中核的な症状に似た行動試験は、ガラス玉覆い隠しアッセイ、社会的選好性試験、及び時計状迷路課題であった。それらを順次実施し、試験の間に少なくとも４８時間の休止時間を設けた。ガラス玉覆い隠しアッセイ（４４）は、柔らかい床敷き（４．５ｃｍの深さ）を敷いたケージ（３８×２６ｃｍ２、１８ｃｍの高さの壁）において、２０個の黒色のガラス玉（１．２ｃｍ直径）を４個×５個の配置で置いて実施した。実験前日に、各々のマウスをケージ（ガラス玉なし）に２０分間にわたり慣れさせて、その翌日にそのマウスを、そのケージ（ガラス玉あり）に３０分間にわたり入れた。覆い隠されたガラス玉の数（床敷きによって５０％超が覆い隠されているガラス玉）を記録した。社会的選好性試験を、薄い床敷き層が床に敷かれたＹ字型迷路（各々のアームは、２７×１４ｃｍ２であり、壁の高さが２０ｃｍであり、プレキシガラス製であった）において実施した。Ｙ迷路の１本のアーム部は新奇物体（プラスチック製、約５ｃｍの直径及び５ｃｍの高さ、そのアームの終端部に配置されている）を有し、２本目のアームは、試験マウスと接触したことがないマウス（逆さにしたストレーナーカップ内に入れた）を有し、その一方で３本目のアームは空にした。新奇マウスを収容するストレーナーカップの使用により、社会的アプローチが、被験マウスによってのみ始められたことが確認された。試験１日前に、各々のマウスを、空のＹ迷路中に１０分間にわたり置いて、その翌日にそのマウスを１０分間置き、その行動を記録した（ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ  ｖ８．５）。上記物体は、各々の試験実行の間にエタノール及び水で清浄化した。上記物体及び新奇マウスの探索にかけた時間を、社会的選好性の分析のために使用した。時計状迷路課題（４３）を、時計の文字盤にある数字のようにアリーナの壁部に配置された１２個の出口を有する円形迷路において実施した。トンネルに通ずる１個の出口を除いて全ての出口を遮断した（黒色の栓）。マウスは、マウスの腹���下側を濡らして、出口を探す欲求を与えるのに十分となる２ｃｍの深さにまで水（２０℃）で満たされたアリーナからの逃避を学習した。第一段階においては、各々の動物に、１日あたり６回の試験を２日連続で、少なくとも２０分間の試験間の間隔をあけて受けさせた。第二段階においては、出口の位置を変更し、マウスに１日で６回の試験を受けさせた。それらの試験を、ソフトウェア（ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ  ８．５）で記録し、逃避までの潜時を、学習の計測のために使用した。柔軟性の比率は、以下の数式：（Ｌ２−Ｌ１）／（Ｌ２＋Ｌ１）によって計算され、式中、Ｌ１は、第一段階における最後の３回の試験の場合の潜時の逆数の平均であり、Ｌ２は、その課題の第二段階における最初の３回の試験の場合の潜時の逆数の平均であった。
【００７６】
統計解析：  正規分布した（１０より多くの標本を有する）データセットの場合は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）だけでなく、スチューデントのｔ検定を使用した。より小規模なデータセットの場合には、マン−ホイットニー検定を使用した。カテゴリーデータを解析するために、独立性に関するカイ二乗検定を使用した。正規分布していない大規模なデータセットの場合は、ノンパラメトリックなコルモゴロフ・スミルノフ検定を使用した。全ての検定は、統計ツールボックスＯｒｉｇｉｎ（バージョン９及び１１）を用いて実施され、本文中に示されている。値は、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなした。
【００７７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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