(57)【要約】  本発明は、記憶様表現型を有するＴリンパ球を増幅するための方法に関し、該方法では、記憶様表現型の維持を容易にするために、２−ヒドロキシグルタレート（２ＨＧ）などの記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させている。これは、例えば、細胞免疫療法において有用であり得る。記憶誘導化合物は、式（Ｉ）（式中、ｐは０又は１であり、ｐが０である場合、Ｙは−ＣＨ２−又は−Ｃ＝であり、ｐが１である場合、Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈであり；Ｙが−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、又は−Ｏ−である場合、Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３  −（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基、又は、＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；Ｙが二重結合した−Ｃ＝である場合、Ｘは−Ｈであり；各ｎは、独立して、０〜１２である）を有し得る。
2018531613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔリンパ球の初期細胞集団を提供すること、
該Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及び
該Ｔリンパ球を培養すること、
を含む、
Ｔリンパ球細胞集団を増幅し、これによりＴリンパ球の増幅された細胞集団を製造する方法であって、
該記憶誘導化合物が、式（Ｉ）：
【化１】
2018531613.tif 000010
（式中、
ｐは０又は１であり、ｐが０である場合、Ｙは−ＣＨ２−又は−Ｃ＝であり、ｐが１である場合、Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈであり；
Ｙが−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、又は−Ｏ−である場合、Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３  −（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基、又は、＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；
Ｙが二重結合した−Ｃ＝である場合、Ｘは−Ｈであり；
各ｎは、独立して、０〜１２である）
を有する、方法。
【請求項２】
前記増幅された細胞集団中のＴリンパ球が記憶様Ｔリンパ球である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔリンパ球がＣＤ８＋Ｔリンパ球である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔリンパ球がＣＤ４＋Ｔリンパ球である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記記憶様Ｔリンパ球が、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＣＲ７ｈｉｇｈ、及びＣＤ４４ｈｉｇｈを含む表現型を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記記憶様Ｔリンパ球が、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈとＣＤ４４ｈｉｇｈ；又はＣＣＲ７＋とＣＤ４５ＲＯ＋を含む表現型を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記初期細胞集団中のＴリンパ球がポリクローナルである、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
Ｔリンパ球の初期細胞集団が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＴＩＬが、がん状態を有するドナー個体に由来する腫瘍サンプルから単離される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記初期細胞集団中のＴリンパ球がモノクローナルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
異種抗原受容体を発現するようにＴリンパ球を改変することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
異種抗原受容体が、腫瘍抗原に対して特異的である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｔリンパ球を活性化させることを更に含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストへの曝露によってＴリンパ球を活性化させる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＣＲアゴニストが、提示細胞の表面上のクラスＩ ＭＨＣ分子上に提示されるペプチドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＣＲアゴニストが、提示細胞の表面上のクラスＩＩ ＭＨＣ分子上に提示されるペプチドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＣＲアゴニストが、ＴＣＲに結合する抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記記憶誘導化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
2018531613.tif 000011
（式中、
ｐは１であり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
−Ｒ１は、−Ｈであり；
Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基であり；
各ｎは独立して０〜１２である）
を有する、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記記憶誘導化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018531613.tif 000012
（式中、
ｐは１であり；
−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈであり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−から選択され；
Ｘは＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；
各ｎは独立して０〜１２である）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形などのそのモノ−及びジエステル形
を有する、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記記憶誘導化合物が、式（ＩＶ）：
【化４】
2018531613.tif 000013
（式中、
ｐは０であり；
ＸはＨであり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−から選択される）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形などのそのモノ−及びジエステル形
を有する、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記記憶誘導化合物がＳ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｓ−２ＨＧ）である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記記憶誘導化合物がＲ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｒ−２ＨＧ）である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記記憶誘導化合物がスクシナートである、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記記憶誘導化合物がフマラートである、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
記憶誘導化合物を含む培地中でＴリンパ球を培養することによって、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させる、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
プロ形の記憶誘導化合物を含む培地中でＴリンパ球を培養することによって、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させる、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
プロ形の細胞透過性が、記憶誘導化合物の細胞透過性よりも高い、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記プロ形が、Ｔリンパ球中で記憶誘導化合物に変換される、請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項２９】
前記プロ形が、細胞透過性部分にコンジュゲートさせた記憶誘導化合物を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞透過性部分が、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記記憶誘導化合物が、エステル結合によって前記細胞透過性部分に連結されている、請求項２９又は請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記プロ形が、記憶誘導化合物のＣ１〜Ｃ１２アルキルエステル又はその薬学的に許容される塩である、請求項２６〜３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記プロ形が、Ｒ−２ＨＧ、Ｓ−２ＨＧのＣ１〜Ｃ１２アルキルエステル、スクシナート又はフマラートである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記プロ形が、Ｓ−２ＨＧオクチルエステル、Ｒ−２ＨＧオクチルエステル、ジメチルスクシナート、又はモノメチルフマラートである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記培養後にＴリンパ球を単離することを含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
薬学的に許容される賦形剤を用いて、Ｔリンパ球を医薬組成物へと製剤化することを含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記初期細胞集団がドナー個体から得られる、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
ｍＴＯＲシグナル伝達がＴリンパ球中で阻害されない、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
Ｔリンパ球の前記増幅された細胞集団がレシピエント個体に投与される、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
Ｔリンパ球の増幅された細胞集団が静脈内注入によって個体に投与される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
レシピエント個体が、前記投与後に記憶Ｔリンパ球により媒介される免疫応答を示す、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
ドナー個体とレシピエント個体とが同じである、請求項３９〜４１のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
ドナー個体とレシピエント個体とが異なる、請求項３９〜４１のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
前記レシピエント個体ががん状態を有する、請求項３９〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記レシピエント個体が感染を有する、請求項３９〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記レシピエント個体が自己免疫疾患を有する、請求項３９〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
ドナー個体から得られたＴリンパ球の初期細胞集団を提供すること、
該Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及び
該記憶誘導化合物の上昇した細胞内濃度を有するＴリンパ球を培養して、増幅された細胞集団を製造すること、並びに；
Ｔリンパ球の該増幅された細胞集団をレシピエント個体に投与すること
を含む、処置方法。
【請求項４８】
前記レシピエント個体が、Ｔリンパ球により媒介される免疫応答によって寛解される疾患を有する、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
Ｔリンパ球により媒介される免疫応答によって寛解される疾患の予防的処置のためのものである、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｔリンパ球が、前記疾患に関連する１つ以上の抗原に対して特異的である、請求項４８又は４９記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患が、ウイルス感染、真菌感染、若しくは細菌感染、がん状態、又は自己免疫疾患である、請求項４８〜５０のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｔリンパ球を活性化させることを含む、請求項４７〜５１のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
請求項３９〜５２のいずれか一項記載の方法で使用するための、記憶様Ｔリンパ球の細胞集団。
【請求項５４】
請求項１〜３８のいずれか一項記載の方法によって製造される、請求項５３記載の使用のための細胞集団。
【請求項５５】
請求項３９〜５２のいずれか一項記載の方法で使用するための医薬を製造するための、記憶様Ｔリンパ球の細胞集団の使用。
【請求項５６】
前記細胞集団が、請求項１〜３８のいずれか一項記載の方法によって製造される、請求項５５記載の使用。
【請求項５７】
記憶誘導化合物又はそのプロ形を含む、Ｔリンパ球の増幅のための培養培地。
【請求項５８】
インビトロ培養において記憶様Ｔリンパ球の細胞集団を製造するための、記憶誘導化合物又はそのプロ形の使用。
【請求項５９】
インビトロ培養における哺乳動物細胞において幹細胞に関連する特性及び／又は多能性を誘導するための、記憶誘導化合物又はそのプロ形の使用。
【請求項６０】
Ｔリンパ球がＣＤ８＋Ｔリンパ球である、請求項４７〜５９のいずれか一項記載の方法、細胞集団、使用、又は培養培地。
【請求項６１】
Ｔリンパ球がＣＤ４＋Ｔリンパ球である、請求項４７〜５９のいずれか一項記載の方法、細胞集団、使用、又は培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、例えば養子Ｔ細胞療法に使用するための、Ｔリンパ球をインビトロで増幅するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
天然の又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変の自己Ｔリンパ球の養子移植を用いる細胞免疫療法に基づくストラテジーは、がん及び他の状態の状況において効果的な臨床応答を送達する有望で新規な方法である。
【０００３】
現在、Ｔ細胞は、患者の末梢血又は腫瘍から単離され、操作され、インビトロで増幅された後に、再注入される。
【０００４】
養子Ｔ細胞療法を実施するには２つの主アプローチがある：患者から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離、インビトロで増幅、及び注入；又は、Ｔリンパ球を単離、特定の腫瘍抗原を認識するようにそれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をインビトロで改変、及び注入。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アプローチは、標的抗原が悪性細胞上で強く発現している場合（すなわち、Ｂ細胞白血病において発現しているＣＤ１９抗原）に、一般的に効果的である。ＴＩＬアプローチは、高い突然変異率を示すがんの種類（例えば黒色腫）において最も効果的である。なぜなら、ＴＣＲの完全な個別化されたレパートリーが、再注入されたＴ細胞において提示されるからである。
【０００５】
どちらのアプローチも、限定的な再生能及び増殖能を有する短寿命で高度に細胞溶解性のＴ細胞であるエフェクターＴリンパ球の産生に依拠する。養子Ｔ細胞療法を用いて得られる応答は、短期においては印象的であるが、長期の成功はこれまで限定的であった。前臨床試験により、応答を持続させるためには、強い記憶応答が不可欠であることが示されているが、現在まで自己記憶細胞の製造の報告はない。
【０００６】
それ故、養子Ｔ細胞療法の主な難題は、持続的な免疫応答の産生である。このような応答を産生することが困難である１つの理由は、導入された細胞が導入後に持続できないことである。この持続性の欠如が生じるのは、活性化されたＴ細胞が、インビトロでの増幅期中に、限定的な再生能及び増殖能を有する最終分化したエフェクター細胞となるためである。それ故、記憶様表現型を維持しつつ最終分化することなくインビトロでＴリンパ球を増幅する方法は、養子Ｔ細胞療法において導入された細胞の持続性を高め、持続的な免疫応答を産生する際に有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
概要
本発明は、Ｔリンパ球中の２−ヒドロキシグルタラート（２ＨＧ）などの記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇が、記憶様表現型の維持を促進するという知見に関する。
【０００８】
それ故、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇は、例えば細胞免疫療法における持続性Ｔ細胞応答の産生で使用するための、細胞集団の増幅で有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一局面は、
Ｔリンパ球の初期細胞集団を提供すること、
Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及び
Ｔリンパ球を培養すること
を含む、
Ｔリンパ球の細胞集団を増幅し、これによりＴリンパ球の増幅された細胞集団を製造する方法を提供する。
【００１０】
増幅された細胞集団における記憶様Ｔリンパ球の数及び／又は比率は、初期細胞集団に対して増加し得る。
【００１１】
本発明の別の局面は、
ドナー個体から得られたＴリンパ球の初期細胞集団を提供すること、
Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、
Ｔリンパ球を培養して、増幅された細胞集団を製造すること、及び；
Ｔリンパ球の増幅された細胞集団をレシピエント個体に投与すること
を含む、処置方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の局面は、Ｔリンパ球を増幅するための培養培地を提供し、該培養培地は、記憶誘導化合物又はプロ形（pro-form）の記憶誘導化合物を含む。
【００１３】
本発明の別の局面は、インビトロで培養したＴリンパ球において記憶様表現型を維持するための、記憶誘導化合物又はそのプロ形の使用を提供する。
【００１４】
本発明の記憶誘導化合物は、そのような化合物の有機二酸、又はモノ−若しくはジエステル形であり得る。好ましくは、記憶誘導化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
2018531613.tif 000003
（式中、
ｐは０又は１であり、ｐが０である場合、Ｙは−ＣＨ２−又は−Ｃ＝であり、ｐが１である場合、Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈから選択され；
Ｙが−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−である場合、Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基であるか、又は、Ｘは、＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；
Ｙが二重結合した−Ｃ＝である場合、Ｘは−Ｈであり；
各ｎは、独立して、０〜１２である）、
並びにそのモノ−及びジエステル形を有する。
【００１５】
好ましい記憶誘導化合物としては、２−ヒドロキシグルタラート（２ＨＧ）、スクシナート、及びフマラートが挙げられる。
【００１６】
２−ヒドロキシグルタラート（２ＨＧ）としては、Ｒ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｒ−２ＨＧ、Ｄ−２−ヒドロキシグルタラートとしても知られる）、Ｓ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｓ−２ＨＧ、Ｌ−２−ヒドロキシグルタラートとしても知られる）、又はそれらの混合物が挙げられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＶＨＬ−ＨＩＦのシグナル伝達が、２−ヒドロキシグルタラートのレベルを調節することを示す。ＶｈｌＦＩ／ＦＩ、Ｖｈｌ−／−、及びＨｉｆ１α−／−Ｖｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球メタボロームの主成分分析。各主成分の百分率変化が括弧内に示されている。
【図２Ａ】図２は、ＶＨＬ−ＨＩＦのシグナル伝達が、２−ヒドロキシグルタラートレベルを調節することを示す。図２Ａは、メタボロームスクリーンからのｐ値の減少順に順位付けされた代謝物を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＶｈｌＦＩ／ＦＩ、Ｖｈｌ−／−、及びＨｉｆ１α−／−Ｖｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧの相対レベルを示す。各々の点は、個々のマウスを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、αＣＤ３抗体及びαＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで５日間ＩＬ−２中で培養した、ＶｈｌＦＩ／ＦＩ及びＶｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；１つの遺伝子型あたりｎ＝４の個々のマウス。
【図２Ｄ】図２Ｄ及び２Ｅは、ＶＨＬの再構成を含む又は含まない、（Ｄ）ＲＣＣ４細胞及び（Ｅ）７８６−Ｏ細胞中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；ｎ＝３；ＥＶ＝空ベクター。
【図２Ｅ】図２Ｄ及び２Ｅは、ＶＨＬの再構成を含む又は含まない、（Ｄ）ＲＣＣ４細胞及び（Ｅ）７８６−Ｏ細胞中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；ｎ＝３；ＥＶ＝空ベクター。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＶＨＬの欠失を含む又は含まない、ＭＥＦ中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；ｎ＝２〜４の個々の単離物。ｐ値が、適用可能である場合には各パネルについて示されている（一対比較のための両側スチューデントｔ検定、及び多重比較のための一元配置分散分析（one-way ANOVA））。エラーバーは標準偏差を示し、Ｂ及びＣ中の各点は個々のマウスを示す。ｎｓ＝有意ではない。
【図３Ａ】図３は、２−ヒドロキシグルタラートの低酸素誘導が、ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＨＩＦ−２αではなくＨＩＦ−１αに依存することを示す。図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化した、ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す。次いで、細胞を、２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養した；１つの条件あたりｎ≧１１匹のマウス。
【図３Ｂ】図３Ｂは、細胞体積に対するノーマライズによって決定した、全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内総濃度を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、３Ａと同様に培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球に由来する全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）についての１Ｈ−ＮＭＲ分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３ａと同様に培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球由来の細胞内代謝物抽出物中のＳ−２ＨＧ及びＲ−２ＨＧについてのエナンチオ選択的分析を示す；ｎ＝２３匹のマウス。
【図３Ｅ】図３Ｅは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養した、Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ１α−／−マウスから単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内濃度を示す；１つの遺伝子型あたりｎ＝４匹のマウス。
【図３Ｆ】図３Ｆは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養した、Ｈｉｆ２αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ２α−／−マウスから単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内濃度を示す；１つの遺伝子型あたりｎ＝４匹のマウス。
【図３Ｇ】図３Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球、及び活性化後の指定された時点の活性化ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内量を示す。１つの時点についてｎ≧４匹のマウス。ｐ値が、適用可能である場合には各パネルについて示されている（一対比較のための両側スチューデントｔ検定（Ａ、Ｂ）、多重比較のための一元配置分散分析（Ｄ）、及び分類されたデータのための二元配置分散分析（two-way ANOVA）（Ｅ、Ｆ））。エラーバーは標準偏差を示し；Ａ、Ｂ、Ｄ及びＧ中の各点は個々のマウスを示す。
【図４】図４は、グルタミンが、低酸素のＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧの供給源であることを示す。図４Ａ及び４Ｂは、未標識の基質、Ｕ−１３Ｃ−グルコース又はＵ−１３Ｃ−グルタミンと共に（Ａ）１％及び（Ｂ）２１％酸素中で図３Ａと同様に活性化し培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の１３Ｃ同位体分子種のプロファイルを示す；１つの条件あたりｎ＝７匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５Ａ】図５は、ＨＩＦ−１α−ＰＤＫ１系が、低酸素のＣＤ８＋Ｔリンパ球中の全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の産生を制御することを示す。図５Ａは、図３Ａと同様に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した２１％及び１％の両方の酸素中においてαＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、活性化から４日後の、細胞内のグルタマート、スクシナート、フマラート、及びマラートの総レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；ｎ＝７匹のマウス。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ１α−／−マウスから単離し、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の細胞内グルタマートの総レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；１つの遺伝子型あたりｎ＝４匹のマウス。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｈｉｆ２αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ２α−／−マウスから単離し、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の細胞内グルタマートの総レベルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量を示す；１つの遺伝子型あたりｎ＝４匹のマウス。
【図５Ｄ】図５Ｄは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、１％の酸素及び指定された濃度のジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養した、ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＨ Ｅ１α（Ｓ２３２）及び全ＰＤＨ−Ｅ１αの細胞質画分のイムノブロットを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅ及び５Ｆは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、５mMのＤＣＡと共に２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の（Ｅ）全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内濃度又は（Ｆ）細胞内グルタマートの総レベルを示す；１群あたり４匹のマウス。ｐ値が、適用可能である場合には各パネルについて示されている（一対比較のための両側スチューデントｔ検定（３Ａ）、及び分類されたデータのための二元配置分散分析（３Ｂ〜３Ｆ））。エラーバーは標準偏差を示し、Ａ中の各点は個々のマウスを示す。ｎｓ＝有意ではない。
【図５Ｆ】図５Ｅ及び５Ｆは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、５mMのＤＣＡと共に２１％又は１％のいずれかの酸素中でＩＬ−２と共に更に４８時間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の（Ｅ）全２ＨＧ（Ｓ−２ＨＧ＋Ｒ−２ＨＧ）の細胞内濃度又は（Ｆ）細胞内グルタマートの総レベルを示す；１群あたり４匹のマウス。ｐ値が、適用可能である場合には各パネルについて示されている（一対比較のための両側スチューデントｔ検定（３Ａ）、及び分類されたデータのための二元配置分散分析（３Ｂ〜３Ｆ））。エラーバーは標準偏差を示し、Ａ中の各点は個々のマウスを示す。ｎｓ＝有意ではない。
【図６Ａ】図６は、２１％及び１％の両方の酸素中で培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球から調製した核画分及び細胞質画分のイムノブロット分析を示す。図６Ａは、１６時間の漸増濃度のＳ−２ＨＧ−オクチルエステル若しくはＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又は１０mMの遊離酸形のＳ−２ＨＧ若しくはＲ−２ＨＧに応答した、ＨＩＦ−１α、ＨＤＡＣ１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＨ Ｅ１α（Ｓ２３２）及び全ＰＤＨ−Ｅ１αについてのイムノブロット分析を示す。細胞を、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に４日間増幅し、その後、指定された濃度のＳ−２ＨＧ−オクチルエステル若しくはＲ−２ＨＧオクチルエステル、又は１０mMの遊離酸形のＳ−２ＨＧ若しくはＲ−２ＨＧを用いて１６時間処置した。矢印はＨＩＦ−１αタンパク質を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、０．５mMのＳ−２ＨＧオクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルに応答した、処置から１日後又は７日後における、ＨＤＣＡ１タンパク質、ヒストンＨ３タンパク質、ＨＩＦ−１αタンパク質、及びＨＩＦ−２αタンパク質についての核内抽出物についてのイムノブロット分析を示す。
【図７Ａ】図７は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及び／又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルがＣＤ８＋Ｔリンパ球において代謝変化を引き起こすことを示す。図７Ａは、図６ａと同様に、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて処置したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、グルコース消費を示し、図７Ｂは乳酸塩産生を示し、図７ＣはＶＥＧＦの生成量を示す。各点は１匹のドナーマウスを示す。ｎ≧１６匹のマウス。Ｐ値が各パネルについて示されている；多重比較のための一元配置分散分析（Ａ、Ｂ及びＣ）。n.s.＝有意ではない。
【図７Ｂ】図７は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及び／又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルがＣＤ８＋Ｔリンパ球において代謝変化を引き起こすことを示す。図７Ａは、図６ａと同様に、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて処置したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、グルコース消費を示し、図７Ｂは乳酸塩産生を示し、図７ＣはＶＥＧＦの生成量を示す。各点は１匹のドナーマウスを示す。ｎ≧１６匹のマウス。Ｐ値が各パネルについて示されている；多重比較のための一元配置分散分析（Ａ、Ｂ及びＣ）。n.s.＝有意ではない。
【図７Ｃ】図７は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及び／又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルがＣＤ８＋Ｔリンパ球において代謝変化を引き起こすことを示す。図７Ａは、図６ａと同様に、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて処置したＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、グルコース消費を示し、図７Ｂは乳酸塩産生を示し、図７ＣはＶＥＧＦの生成量を示す。各点は１匹のドナーマウスを示す。ｎ≧１６匹のマウス。Ｐ値が各パネルについて示されている；多重比較のための一元配置分散分析（Ａ、Ｂ及びＣ）。n.s.＝有意ではない。
【図８Ａ】図８は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−−オクチルエステルが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球における記憶関連特性の獲得を駆動することを示す。図８Ａは、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＥＧ７−ＯＶＡ細胞の特異的殺滅を示す。全脾臓細胞を、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に４日間増幅し、その後、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて２４時間処置した。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を標的細胞及び対照細胞と共に４時間インキュベートした。１つの条件あたりｎ＝３匹のマウス。
【図８Ｂ】０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル又はビヒクルを用いて２４時間処置した野生型ＣＤ８＋Ｔリンパ球の培地中の、図８ＢはＩＦＮ−γの量を示し、図８ＣはＩＬ−２タンパク質の量を示す。細胞をαＣＤ３抗体＋αＣＤ８２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に４日間増幅し、その後、指定された濃度のＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて２４時間処置した。ｎ≧１６匹のマウス。
【図８Ｃ】０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル又はビヒクルを用いて２４時間処置した野生型ＣＤ８＋Ｔリンパ球の培地中の、図８ＢはＩＦＮ−γの量を示し、図８ＣはＩＬ−２タンパク質の量を示す。細胞をαＣＤ３抗体＋αＣＤ８２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に４日間増幅し、その後、指定された濃度のＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて２４時間処置した。ｎ≧１６匹のマウス。
【図８Ｄ】図８Ｄは、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化し、そして０日目からＩＬ−２を補充することなく、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル若しくはＲ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に又はこれらなしで、７日間培養した、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の生存率を示す。１つの条件あたりｎ＝４匹のマウス。
【図８Ｅ】図８Ｅ、図８Ｆ、及び図８Ｇは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に２日間増幅したＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＩｌ２（８Ｅ）、Ｉｆｎｇ（８Ｆ）及びＥｏｍｅｓ（８Ｇ）のｍＲＮＡの発現を示す。次いで、細胞を、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに２４時間又は７日間のいずれかの期間処置した。１群あたりｎ≧４匹のマウス。
【図８Ｆ】図８Ｅ、図８Ｆ、及び図８Ｇは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に２日間増幅したＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＩｌ２（８Ｅ）、Ｉｆｎｇ（８Ｆ）及びＥｏｍｅｓ（８Ｇ）のｍＲＮＡの発現を示す。次いで、細胞を、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに２４時間又は７日間のいずれかの期間処置した。１群あたりｎ≧４匹のマウス。
【図８Ｇ】図８Ｅ、図８Ｆ、及び図８Ｇは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し、次いで、ＩＬ−２の存在下で更に２日間増幅したＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＩｌ２（８Ｅ）、Ｉｆｎｇ（８Ｆ）及びＥｏｍｅｓ（８Ｇ）のｍＲＮＡの発現を示す。次いで、細胞を、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに２４時間又は７日間のいずれかの期間処置した。１群あたりｎ≧４匹のマウス。
【図８Ｈ】図８Ｈは、様々な用量のＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて活性化し、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル若しくはＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに４日間又は７日間のいずれかの期間処置したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上のＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現を示す。１群あたりｎ＝４匹のマウス。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１。
【図８Ｉ】図８Ｉは、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルが、Ｃｃｒ７を含む他の記憶関連遺伝子の発現を誘導することを示す。
【図９Ａ】図９は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球において、活性化後の増殖を減少させることを示す。多重比較のための一元配置分散分析（Ｂ）。エラーバーは標準偏差を示し、Ｂ中の各点は個々のマウスを示す。図９Ａは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて活性化しそして０日目からＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルと共に培養した、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の３日目のＣＦＳＥ希釈アッセイを示す。データは４匹のマウスの代表である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３日目の９ＡにおけるＣＦＳＥ希釈アッセイの平均蛍光強度を示す。１条件あたりｎ＝４匹のマウス。
【図９Ｃ】図９Ｃは、αＣＤ３抗体＋αＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化し次いでＩＬ−２と共に更に４８時間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球の生細胞数の変化倍数を示す。次いで、細胞を０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて処置し、処置開始後の指定された時点で計数を実施した。１条件あたりｎ＝８匹のマウス。
【図１０Ａ】図１０は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルが、ＣＤ４４Ｈｉｇｈ及びＣＤ６２ＬＨｉｇｈＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の形成を促進することを示す。図１０Ａは、図１０Ｂの実験についてのワークフローの概略を示した図解を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて活性化し、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて４日間、６日間、及び８日間のいずれかの期間処置したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上のＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現を示す。データは、ｎ＝４匹の個々のマウスの代表である。
【図１１Ａ】図１１は、ＨＩＦ−１αが、活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＣＤ６２Ｌのインビトロダウンレギュレーションに必要であることを示す。図１１Ａは、図１１Ｂ及びＣの実験についてのワークフローの概略を示した図解を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて処置した、Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ１α−/−ＣＤ８＋Ｔリンパ球上の、処置の１日後、７日後及び１０日後におけるＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの表面発現を示す。データは１つの遺伝子型あたり３匹のマウスのうちの代表例である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて処置した、Ｈｉｆ２αｆｌ／ｆｌ及びＨｉｆ２α−/−ＣＤ８＋Ｔリンパ球上の、処置の１日後、７日後及び１０日後におけるＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの表面発現を示す。データは１つの遺伝子型あたり２匹のマウスのうちの代表例である。
【図１２Ａ】図１２は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルが用量依存的に記憶様表面マーカーを誘導すること、並びに、これは可逆的であることを示す。ｐ値が、適用可能である場合には各パネルについて示されている。多重比較のための一元配置分散分析（Ｄ、Ｅ）。エラーバーは標準偏差を示す。ｎｓ＝有意ではない。図１２Ａは、処置の４日後におけるＳ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの濃度の関数としての、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ６２Ｌの表面発現を示す。点線は、ビヒクルで処置した細胞上の４日目のＣＤ６２Ｌのレベルを示す。細胞を、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化し、ＩＬ−２の存在下で培養した；ｎ＝３匹のマウス。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、処置の７日後におけるＳ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの濃度の関数としての、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ６２Ｌの表面発現を示す。点線は、ビヒクルで処置した細胞上の７日目のＣＤ６２Ｌのレベルを示す。細胞を、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化し、ＩＬ−２の存在下で培養した；ｎ＝３匹のマウス。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１２Ｄ及び１２Ｅに提示されたデータについての実験ワークフローの概略を示した図解を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ビヒクル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて７日間処置し、その後、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルで処置した細胞からＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを洗い流したか、又はビヒクルで処置した細胞に０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを添加し、３日間毎に９日間以上かけて経過観察した、ＣＤ６２ＬＨｉｇｈＣＤ８＋Ｔリンパ球％を示す。ｎ＝４匹のマウス。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ビヒクル又は０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて７日間処置し、その後、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルで処置した細胞からＳ−２ＨＧ−オクチルエステルを洗い流したか、又はビヒクルで処置した細胞に０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルを添加し、３日間毎に９日間以上かけて経過観察した、ＣＤ６２ＬＨｉｇｈＣＤ８＋Ｔリンパ球％を示す。ｎ＝４匹のマウス。
【図１３Ａ】図１３は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いてのＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの処置が、記憶細胞の形成を誘導することを示す。図１３Ａは、図１３Ｂ、図１３Ｃ及び図１３Ｄの記憶想起実験についての実験ワークフローの概略を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂ及び図１３Ｃは、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて７日間増幅した、ＳＩＩＮＦＥＫＬにより活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の養子移植から３７日後の、ワクチン接種を受けた同腹仔のうちの一匹のＣＤ４５．２マウスの脾臓における、（Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球、又は（Ｃ）Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｂ及び図１３Ｃは、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクルを用いて７日間増幅した、ＳＩＩＮＦＥＫＬにより活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の養子移植から３７日後の、ワクチン接種を受けた同腹仔のうちの一匹のＣＤ４５．２マウスの脾臓における、（Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球、又は（Ｃ）Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄ〜Ｆは、ワクチン接種から７日後（ＣＤ８＋Ｔ細胞がマウスに導入されてから３７日後）の、（１３Ｄ）１つの脾臓あたりに回収されたＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数、及び（１３Ｅ）各脾臓における全ＣＤ８＋細胞集団の中のＣＤ４５．１＋細胞の％、又は（１３Ｆ）１つの脾臓あたりに回収されたＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の数を示す。１群あたりｎ＝６匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｄ〜Ｆは、ワクチン接種から７日後（ＣＤ８＋Ｔ細胞がマウスに導入されてから３７日後）の、（１３Ｄ）１つの脾臓あたりに回収されたＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数、及び（１３Ｅ）各脾臓における全ＣＤ８＋細胞集団の中のＣＤ４５．１＋細胞の％、又は（１３Ｆ）１つの脾臓あたりに回収されたＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の数を示す。１群あたりｎ＝６匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｄ〜Ｆは、ワクチン接種から７日後（ＣＤ８＋Ｔ細胞がマウスに導入されてから３７日後）の、（１３Ｄ）１つの脾臓あたりに回収されたＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数、及び（１３Ｅ）各脾臓における全ＣＤ８＋細胞集団の中のＣＤ４５．１＋細胞の％、又は（１３Ｆ）１つの脾臓あたりに回収されたＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の数を示す。１群あたりｎ＝６匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４Ａ】図１４は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置が、幹細胞性に必要とされる多能性に関連した遺伝子の発現を誘導することを示す。活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて１日間又は７日間処置した。Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られた誘導は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られたものより弱い。各点は個々のドナーマウスを示す。ｎ＝４匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置が、幹細胞性に必要とされる多能性に関連した遺伝子の発現を誘導することを示す。活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて１日間又は７日間処置した。Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られた誘導は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られたものより弱い。各点は個々のドナーマウスを示す。ｎ＝４匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４Ｃ】図１４は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置が、幹細胞性に必要とされる多能性に関連した遺伝子の発現を誘導することを示す。活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて１日間又は７日間処置した。Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られた誘導は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られたものより弱い。各点は個々のドナーマウスを示す。ｎ＝４匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４Ｄ】図１４は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置が、幹細胞性に必要とされる多能性に関連した遺伝子の発現を誘導することを示す。活性化したＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルのいずれかを用いて１日間又は７日間処置した。Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られた誘導は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルで見られたものより弱い。各点は個々のドナーマウスを示す。ｎ＝４匹のマウス。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１５】図１５は、１００μM〜５００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置が、記憶を形成するためのｍＴＯＲシグナル伝達を阻害しないことを示す。
【図１６】図１６は、α−ケトグルタル酸オクチルエステルを用いてのＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの処置が、記憶細胞の形成を誘導しないことを示す。
【図１７Ａ】図１７は、モノメチルフマラート又はジメチルスクシナートを用いてのＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの処置が、記憶細胞の形成を誘導し、一方、α−ケトグルタル酸オクチルエステルを用いての処置は誘導しないことを示す。図１７Ａは、図１７Ｂ及び図１７Ｃについての実験ワークフローの概略を示す。図１７Ｂは、ＩＬ−２の存在下で０．５mMのモノメチルフマラート、０．５mMのジメチルスクシナート、０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、０．５mMのα−ケトグルタル酸オクチルエステル、又はビヒクルを用いて７日間増幅した、ＳＩＩＮＦＥＫＬにより活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の養子移植から３７日後の、ワクチン接種を受けた同腹仔のうちの一匹のＣＤ４５．２マウスの脾臓における、ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔリンパ球の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１７は、モノメチルフマラート又はジメチルスクシナートもまた、ＣＤ４４Ｈｉｇｈ及びＣＤ６２ＬＨｉｇｈＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球のインビトロでの形成を誘導することを示す。図１７Ａは、図１７Ｂ及び図１７Ｃの実験についてのワークフローの概略を示した図解を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて活性化し、ＩＬ−２の存在下でＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステル、αＫＧ−オクチルエステル、モノメチルフマラート、ジメチルスクシナート、又はビヒクルのいずれかを用いて７日間処置したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上のＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現を示す。データはｎ＝３匹の個々のマウスの代表である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＣＤ６２Ｌの平均蛍光強度及び関連する統計を示す。エラーバーは標準偏差を示し、各点は個々のマウスを示す。一元配置分散分析。
【図１８】図１８は、５００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルｃｒｅを用いて７日間処置したＨｉｆ１αｆｌ／ｆｌＣＤ８＋Ｔリンパ球（ｎ＝４）及びＨｉｆ１αｆｌ／ｆｌｄｌｃｋＣＤ８＋Ｔリンパ球（ｎ＝４）上に示された表現型マーカーのフローサイトメトリーによる特徴付けを示す。各点は個々のマウスを示す。
【図１９−１】図１９Ａは、ＦＬＡＧについてのイムノブロット分析による、ＣＤ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＬ２ｈｇｄｈ−ＦＬＡＧの発現の検証を示す。矢印はＬ２ｈｇｄｈ−ＦＬＡＧタンパク質を示す。図１９Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、空ベクター又はＬ２ｈｇｄｈ−ＦＬＡＧ過剰発現ベクターを含有しているレトロウイルスを用いての形質導入後に２１％（ｎ＝７）又は１％（ｎ＝３）の酸素中で７日間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ６２Ｌの発現を示す。各々の点の対は、個々のマウスを示す。ＣＤ８＋ＧＦＰ＋生細胞に対してゲーティング。
【図１９−２】図１９Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４）から単離し、空ベクター又はＬ２ｈｇｄｈ−ＦＬＡＧ過剰発現ベクターを含有しているレトロウイルスを用いての形質導入後に２１％の酸素中で３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に又は伴わずに７日間培養したＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ１２７の発現に対するＫＬＲＧ１の発現の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。関連する統計が示され、各々の点の対は、個々のマウスを示す。ＣＤ８＋ＧＦＰ＋生細胞に対してゲーティング。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＬ２ｈｇｄｈのノックダウンのｐＰＣＲによる検証を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、２１％及び１％の酸素の両条件における、Ｌ２ｈｇｄｈに対するｓｈＲＮＡに応答したＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＳ−２ＨＧの細胞内の量を示す（ｎ＝４）。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、Ｌ２ｈｇｄｈに対するｓｈＲＮＡに応答した、ＣＤ６２Ｌの表面発現を示す（ｎ＝４）。２１％又は１％の酸素中でのｓｈスクランブル又はｓｈＬ２ｈｇｄｈに応答した、形質導入された（ＧＦＰ＋）ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ６２Ｌの表面レベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムが、右に示されている。各点は個々のマウスを示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、Ｌ２ｈｇｄｈに対するｓｈＲＮＡに応答した、ＣＤ１２７の表面発現を示す（ｎ＝４）。２１％又は１％の酸素中でのｓｈスクランブル又はｓｈＬ２ｈｇｄｈに応答した、形質導入された（ＧＦＰ＋）ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＣＤ１２７の表面レベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムが、右に示されている。各点は個々のマウスを示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、恒常的増殖実験の概略を示した図解を示す。ＣＤ４５．１．１又はＣＤ４５．１．２ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化し、３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に又は伴わずに９日間培養した。各群の細胞を１：１で混合し、ＣＦＳＥで標識し、その後、致死量以下の放射線を照射されたＣＤ４５．２．２マウスに導入した。７日後、マウスを供死し、脾臓におけるＣＤ４５．１．１及びＣＤ４５．１．２ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在をフローサイトメトリーによって計数した。養子移植前及び後の各プールについての代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。フローサイトメトリープロットはＣＤ８＋生細胞を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、致死量以下の放射線を照射されたＣＤ４５．２．２マウス（ｎ＝６）の脾臓に由来する、３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに９日間前処置した、養子共移植したＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の、養子移植から７日後における回収率を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、養子移植後から７日目の、図２１Ｂの細胞内のインビボでのＣＦＳＥレベルを示す。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、インビボで０〜９回分裂した図２１Ｂの移植した細胞の％を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ＣＤ４５．２．２マウス（ｎ＝６）の脾臓に由来する、３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに９日間前処置した、回収した養子移植したＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の、移植から３０日後における代表的なフローサイトメトリープロット及び関連する統計を示す。フローサイトメトリープロットは生細胞上にゲーティングされている。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ナイーブ細胞と比較した、移植後３０日目の、図２２Ａから回収した細胞の代表的な表現型分析を示す（ｎ＝６）。
【図２３Ａ】図２３Ａは、想起実験の概略を示した図を示す。ＣＤ４５．１．１又はＣＤ４５．１．２ ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化し、３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に又は伴わずに９日間培養した。各群の細胞を１：１で混合し、その後、ＣＤ４５．２．２マウスに導入した。３０日後、これらのレシピエントマウスに、ＳＩＩＮＦＥＫＬの積載された樹状細胞をワクチン接種して想起を誘導し、脾臓、リンパ節及び肝臓におけるＣＤ４５．１．１及びＣＤ４５．１．２ＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在を、フローサイトメトリーによって７日後に計数した。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ワクチン接種後７日目（導入後３７日目）の指定された臓器において想起されているＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ワクチン接種を受けたＣＤ４５．２．２マウス（ｎ＝６）の脾臓、リンパ節及び肝臓に由来する、３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに７日間前処置した、養子共移植したＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の、移植から３７日後における回収率を示す。
【図２４】図２４Ａは、ＥＧ７−ＯＶＡ皮下腫瘍を１２日間有し、その後、Ｔ細胞なし（ｎ＝７）又は事前にＳ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に（ｎ＝６）又は伴わずに（ｎ＝６）培養した０．７×１０６個のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を静脈内注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを示す。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の静脈内注射を受ける前に、致死量以下の放射線照射を用いてマウスのリンパを枯渇させた。エラーバーは平均の標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意ではない。図２４Ｂは、ＥＧ７−ＯＶＡ皮下腫瘍を９日間有し、その後、Ｔ細胞なし（ｎ＝６）又は事前にＳ−２ＨＧ−オクチルエステルと共に（ｎ＝６）又は伴わずに（ｎ＝６）培養した１．０×１０６個のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を静脈内注射した、リンパに満ちたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意ではない。
【図２５Ａ】図２５Ａは、活性化し、６００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの非存在下（ビヒクル対照）又は存在下で１４日間増幅した、精製ヒトＣＤ８＋上の表面マーカーＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯについての代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、活性化し、８００μMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの非存在下（ビヒクル対照）又は存在下で１４日間増幅した、精製ヒトＣＤ８＋上の表面マーカーＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯについての代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ドットプロットにおける数字はＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯの発現によって規定される対応する四分円に存在する細胞の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、例えば細胞免疫療法に使用するための、Ｔリンパ球細胞集団のインビトロ増幅に関する。記憶様Ｔリンパ球の形成を促進し、非増殖性のエフェクターＴリンパ球（例えば細胞障害性Ｔリンパ球；ＣＴＬ）への最終分化を抑制するために、増幅中に２ＨＧ、スクシナート、又はフマラートなどの記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させることが、本明細書において示される。
【００１９】
好ましくは、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇は、Ｔリンパ球中のｍＴＯＲ又はｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害しない。例えば、Ｔリンパ球中のｐ７０Ｓ６キナーゼ及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化は、記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇によって影響を受けなくてもよい。それ故、本発明の方法は、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害することなく、インビトロにおいて記憶様Ｔリンパ球の増幅を可能とする。
【００２０】
ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＣＲ７ｈｉｇｈ、ＣＤ４４ｈｉｇｈマーカーの発現に加えて、本明細書に記載のように増幅した記憶様Ｔリンパ球はまた、記憶誘導化合物の非存在下で増幅されたエフェクターＴリンパ球と比較して、増加した長期の増殖及び生存率を示し得る。
【００２１】
好ましくは、培養及び増幅中のＴリンパ球において上昇した細胞内濃度の記憶誘導化合物は、エフェクター細胞への分化及び記憶様特性の減少を防ぐ。
【００２２】
本明細書に記載の本発明の全ての局面において、Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球又はより好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球であり得る。
【００２３】
ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球は、獲得免疫系の一部である。ＣＤ８＋Ｔリンパ球の通常の機能は、がん細胞並びに細菌及びウイルスなどの細胞内病原体に感染した細胞を死滅させることである。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ヘテロ二量体受容体ＣＤ８を発現している。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識する。この認識中に、ＣＤ８ヘテロ二量体は、ＭＨＣクラスＩの保存された部分（α３領域）に結合する。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ヘルパーＴ細胞として頻繁に特徴付けられ、Ｂ細胞による抗体の産生を促進し、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答を増強及び維持し、マクロファージの活性を調節する。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４受容体を発現している。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体と抗原提示細胞との相互作用を支援し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
【００２４】
初期細胞集団は、標的抗原に対して特異的なＴリンパ球を含み得、すなわち、それらはクラスＩ ＭＨＣ分子により抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される特異的なペプチド抗原を認識しそれによって活性化可能である。
【００２５】
いくつかの実施態様では、初期細胞集団はポリクローナルであり得る。該細胞集団内の細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示された場合に同じ抗原の異なるエピトープを認識し得るか、又は、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示された場合に異なる抗原のエピトープを認識し得る。
【００２６】
他の実施態様では、初期細胞集団はモノクローナルであり得、すなわち、該細胞集団内の細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示された場合に同じ標的抗原の同じエピトープを認識し得る。
【００２７】
初期細胞集団内のＴリンパ球は、未分化細胞、部分的に分化した細胞、及び完全に分化した細胞の混合物であり得る。例えば、初期細胞集団は、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及びエフェクターＴ細胞を含み得る。
【００２８】
Ｔリンパ球の初期細胞集団は、ドナー個体から得てもよい。
【００２９】
任意の適切なドナー個体が使用され得る。いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球は、ウイルス感染、細菌感染、若しくは真菌感染又はがんなどの疾患状態を患っているドナー個体から、或いは、健康な個体、例えばこのような状態を患っている個体とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致している（供与前又は後のいずれかにおいて）健康な個体から得ることができる。
【００３０】
Ｔリンパ球の初期細胞集団は、ドナー個体の適切なサンプルから、例えば脾臓若しくはリンパ節などのリンパ組織に由来するサンプルから、又は血液サンプル若しくは腫瘍サンプルから、単離又はそれ以外の方法で得てもよい。適切な単離技術は当技術分野において周知であり、これには例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Rheinherz et al (1979) PNAS 76 4061参照）、細胞パニング（例えば、Lum et al (1982) Cell Immunol 72 122参照）、及び抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用した単離（例えば、Gaudernack et al 1986 J Immunol Methods 90 179参照）が挙げられる。簡便には、ＣＤ８＋Ｔリンパ球は抗ＣＤ８抗体を使用して単離され得、ＣＤ４＋Ｔリンパ球は抗ＣＤ４抗体を使用して単離され得る。例えば、サンプルを、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズと共にインキュベートし得、ビーズを、磁気分離を使用して単離し得る。
【００３１】
いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球の初期細胞集団は、ドナー個体由来の細胞のサンプルに含まれ得る。細胞のサンプルは、Ｔリンパ球の初期細胞集団に加えて、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージなどの他の細胞型も含む異種サンプルであり得る。
【００３２】
いくつかの好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、初期細胞集団中のＴリンパ球を活性化させることを含み得る。
【００３３】
Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度レベルが上昇する前、好ましくは上昇する直前に、Ｔリンパ球は、別々の培養工程で活性化され得る。或いは、Ｔリンパ球は、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度が上昇するのと同時に、すなわち同じ培養工程において活性化されてもよい。
【００３４】
Ｔリンパ球は、任意の簡便な技術によって活性化され得る。いくつかの好ましい実施態様では、Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストへの曝露によって活性化され得る。本明細書に記載される方法は更にＴＣＲアゴニストにＴリンパ球を曝露することを含み得る。
【００３５】
適切なＴＣＲアゴニストとしては、提示細胞の表面上のクラスＩ又はＩＩ ＭＨＣ分子上に提示されたペプチドなどの、ＴＣＲリガンドが挙げられる。
【００３６】
提示細胞としては、任意の有核細胞が挙げられ得る。ペプチド／ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ複合体は、提示細胞によって天然に発現されていてもよいし、又は、提示細胞に対して異種であり、組換え手段によって細胞内に事前に導入された異種のコード核酸を用いて発現されていてもよい。
【００３７】
いくつかの実施態様では、提示細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。ＭＨＣクラスＩＩを発現する適切なＡＰＣとしては、天然のＡＰＣ、例えばマクロファージ、単球、Ｂ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）、又は人工のＡＰＣ、例えばＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ及び場合によりＩＣＡＭ−７０を発現するように操作された線維芽細胞若しくは他の細胞が挙げられる。
【００３８】
適切な提示細胞は、ドナー個体から得られたサンプルから単離され得る。
【００３９】
いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球の初期細胞集団を含むドナー個体由来のサンプルは更に、提示細胞を含み得る。サンプル中の細胞に導入されたペプチド抗原は、サンプル中の提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ複合体に提示される。次いで、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ複合体を提示している提示細胞は、サンプル中のＴリンパ球を活性化する。
【００４０】
本明細書に記載の方法は更に；
提示細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞を、外来性ペプチド抗原にインビトロで曝露することにより、該抗原が、提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子によって提示されること、及び
該提示細胞をＴリンパ球と共にインビトロで培養することにより、Ｔリンパ球が、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子によって提示された抗原によって活性化されること
を含み得る。
【００４１】
他の実施態様では、Ｔリンパ球を、提示細胞の非存在下、活性化ペプチド抗原を含む培養培地中で培養し得、この抗原はその後、取り込まれてＴリンパ球それ自体の表面上にＭＨＣクラスＩ分子と組み合わせて提示され得る。
【００４２】
適切なＴＣＲアゴニストとしてはまた、培養培地中に存在し、単独で、又は提示細胞の表面上に提示されているＣＤ３２などの免疫グロブリンＦｃ受容体を介して提示細胞に架橋された場合のいずれかでＴＣＲを刺激する、アゴニスト作用を有する特異的結合メンバーなどの可溶性因子が挙げられる。
【００４３】
適切なアゴニスト作用を有する特異的結合メンバーとしては、抗ＴＣＲ抗体が挙げられる。
【００４４】
抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３、又はαＣＤ２８などのＴＣＲの成分に特異的に結合し得る。ＴＣＲの刺激に適した抗ＴＣＲ抗体は当技術分野において周知であり（例えばＯＫＴ３）、業者（例えばイーバイオサイエンス社、米国）から入手可能である。
【００４５】
いくつかの好ましい実施態様では、Ｔリンパ球は、抗αＣＤ３抗体及び抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化され得る。
【００４６】
記憶誘導化合物の活性化、増幅及びその濃度の上昇は、別々の培養培地中で順次実施されても、又は同じ培養培地中で同時に実施されてもよい。
【００４７】
記憶誘導化合物の細胞内濃度が上昇したＴリンパ球を任意の簡便な技術を使用して培養することにより、増幅された細胞集団を製造し得る。
【００４８】
Ｔリンパ球は、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグ又は培養皿、及び他のバイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターをはじめとする、任意の適切なシステムにおいて本明細書に記載のとおりに培養され得る。このようなシステムの使用は、当技術分野において周知である。
【００４９】
Ｔリンパ球のエクスビボでの増殖に使用するのに適した数多くの培養培地、特に完全培地、例えばＡＩＭ−Ｖ、イスコフ培地、及びＲＰＭＩ−１６４０（インビトロジェン社−ギブコ社）が入手可能である。培地に、血清、血清タンパク質、及び選択的薬剤などの他の因子を補充してもよい。例えば、いくつかの実施態様では、２mMのグルタミン、１０％のＦＢＳ、２５mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、及び５５μMのβ−メルカプトエタノールを含有しかつ場合により２０ng/mlの組換えＩＬ−２の補充された、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用し得る。培養培地に、日常的な実験によって当業者によって容易に決定され得る標準的な濃度の上記のアゴニスト因子又はアンタゴニスト因子を補充してもよい。
【００５０】
簡便には、細胞を、５％ＣＯ２を含有している加湿雰囲気中、適切な培養培地中で３７℃で培養する。
【００５１】
Ｔリンパ球及び他の哺乳動物細胞の培養のための方法及び技術は、当技術分野において周知である（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293, Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52参照）。
【００５２】
ドナー個体から得られたＴリンパ球の初期細胞集団をインビボで培養することにより、細胞が増殖して初期細胞集団を増幅する。インビトロでの培養中、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度は上昇する。
【００５３】
Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を、任意の適切な技術によって上昇させ得る。
【００５４】
記憶誘導化合物は、該化合物の二酸、又はモノ−若しくはジエステル形であってもよい。ここでの酸は、カルボン酸基−ＣＯＯＨ及びカルボキシレート形も指す。したがって、該化合物の塩形も考えられる。それ故、二酸は、２つのカルボン酸基を含有し、これらは各々、場合により酸、塩、又はエステルの形態である。
【００５５】
前記化合物は、ヒドロキシル、アミノ、チオール、又はハロの官能基などの追加の官能基を含み得る。該化合物は、アルケニル（又はアルケニレン）官能基を含み得る。該化合物は、追加のカルボン酸基を含み得る。しかしながら、カルボン酸基の数は通常２である。
【００５６】
いくつかの実施態様では、一方又は両方の酸基はα，β−不飽和酸である。いくつかの実施態様では、一方又は両方の酸基が飽和酸である。
【００５７】
カルボン酸基は、アルキレン、ヘテロアルキレン、又はアルケニレンリンカーを介して接続され得、該リンカーは場合により置換されていてもよく、例えば場合によりヒドロキシル、アミノ（−ＮＨ２）、チオール、ハロ、フェニル、及び置換フェニルの１つ以上を用いて置換されていてもよい。
【００５８】
アルキレンリンカーは直鎖又は分岐、例えば直鎖であり得、Ｃ１−２０アルキレン、例えばＣ２−２０、例えばＣ２−１０、例えばＣ２−６、例えばＣ２−４、例えばＣ２−３アルキレンであり得る。
【００５９】
ヘテロアルキレンリンカーは、アルキレンリンカー内の１つ以上の炭素、例えば１つの炭素が、ヘテロ原子基Ｏ、Ｓ、又はＮＨで置換されている、アルキレンリンカーである。ヘテロアルキレンリンカーは、Ｃ３−２０、例えばＣ３−１０、例えばＣ３−６、例えばＣ３−４、例えばＣ３であり得る。該ヘテロ原子はカルボン酸基に結合していない。
【００６０】
アルケニレンリンカーは、直鎖又は分岐、例えば直鎖であり得、Ｃ２−２０アルケニレン、例えばＣ２−２０、例えばＣ２−１０、例えばＣ２−６、例えばＣ２−４、例えばＣ２−３アルケニレンであり得る。
【００６１】
２つのカルボン酸基がアルキレンリンカーによって接続されている場合、該化合物は、飽和ジカルボン酸と称され得る。
【００６２】
２つのカルボン酸基がアルケニレンリンカーによって接続されている場合、該化合物は、不飽和ジカルボン酸と称され得る。
【００６３】
前記化合物は、飽和ジカルボン酸、例えば直鎖ジカルボン酸、又はその塩形若しくはそのエステル形であり得る。飽和ジカルボン酸は、置換されていなくても、一置換されていてもよい。
【００６４】
前記化合物は、不飽和ジカルボン酸、例えば一不飽和ジカルボン酸、又はその塩形若しくはエステル形であり得る。不飽和ジカルボン酸は、直鎖不飽和ジカルボン酸、又はその塩形若しくはエステル形であり得る。
【００６５】
前記化合物は、更なるカルボン酸官能基を含有し得るが、該化合物はたった２つのカルボン酸基を有するのが典型である。該化合物は、各々のカルボン酸の中にカルボニル基を含有し、それ故、二酸は２つのカルボニル基を有する。好ましくは、該化合物は他のカルボニル官能基を含有していない。
【００６６】
前記化合物は好ましくは、ケト官能基を含まず、より好ましくはケトエステル官能基、例えばα−ケトエステル官能基を含有しない。本発明者らは、ケトエステル化合物のαケトグルタラートが良好な活性を提供しないことを見出した。
【００６７】
典型的には、カルボン酸のエステルはアルキルエステル、例えばＣ１−１０アルキルエステル、例えばＣ１−８アルキルエステルである。この場合の実施例としては、メチルエステル及びオクチルエステルが挙げられる。アルキル基は直鎖でも分岐でもよく、例えば直鎖であり得る。
【００６８】
いくつかの実施態様では、前記化合物は、最大でも２００、最大でも１５０又は最大でも１００の分子量を有し得る。該化合物は、４〜３０個の炭素原子、例えば４〜２０個の炭素原子を有し得る。該化合物は４〜５個の酸素原子であり得る。
【００６９】
前記化合物の二酸形及びエステル形は市販されているか、又は標準的な合成方法を使用して調製され得る。
【００７０】
いくつかの実施態様では、前記化合物は、２−ヒドロキシグルタラート、フマラート及び／又はスクシナート、及びその塩形及びエステル形である。
【００７１】
いくつかの実施態様では、前記化合物はα−ケトグルタラートではなく、例えば該化合物はα−ケトグルタル酸オクチルエステルではない。
【００７２】
好ましくは、記憶誘導化合物は、式（Ｉ）：
【化２】
2018531613.tif 000004
（式中、
ｐは０又は１であり、ｐが０である場合、Ｙは−ＣＨ２−又は−Ｃ＝であり、ｐが１である場合、Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈであり；
Ｙが−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−である場合、Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３  −（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基、又は、＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；
Ｙが二重結合した−Ｃ＝である場合、Ｘは−Ｈであり；
各ｎは、独立して、０〜１２である）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形などのそのモノ−及びジエステル形を有する。
【００７３】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される記憶誘導化合物は、式（ＩＩ）：
【化３】
2018531613.tif 000005
（式中、
ｐは１であり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
−Ｒ１は、−Ｈであり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ及び−Ｏ−から選択され；
Ｘは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉから選択される単結合した基であり；
各ｎは独立して０〜１２である）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形などのそのモノ−及びジエステル形を有し得る。
【００７４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される記憶誘導化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化４】
2018531613.tif 000006
（式中、
ｐは１であり；
−Ｒ１は、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、又は−ＣＨ２ＰｈＯＣＨ２Ｐｈであり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−から選択され；
Ｘは＝Ｏ及び＝Ｓから選択される二重結合した基であり；
各ｎは独立して０〜１２である）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形などのそのモノ−及びジエステル形を有し得る。
【００７５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される記憶誘導化合物は、式（ＩＶ）：
【化５】
2018531613.tif 000007
（式中、
ｐは０であり；
ＸはＨであり；
Ｙは−ＣＨ−、ＣＨ２、−ＮＨ−、−Ｓ、及び−Ｏ−から選択される）、
並びに、そのアルキルモノ−及びジエステル形のようなそのモノ−及びジエステル形を有し得る。
【００７６】
好ましい記憶誘導化合物としては、２−ヒドロキシグルタラート（２ＨＧ）、スクシナート及びフマラートが挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施態様では、記憶誘導化合物はα−ケトグルタラートではない。
【００７８】
記憶誘導化合物は、その遊離酸及び薬学的に許容されるその塩を含み得る。
【００７９】
いくつかの好ましい実施態様では、記憶誘導化合物は、２ＨＧである。２ＨＧは、Ｓ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｓ−２ＨＧ）、Ｒ−２−ヒドロキシグルタラート（Ｒ−２ＨＧ）、又はその混合物を含み得る。混合物は、規定の比のエナンチオマーを含有し得る。例えば、混合物は、３０％のＳ−２ＨＧ及び７０％のＲ−２ＨＧを含み得る。いくつかの特に好ましい実施態様では、２ＨＧはＲ−２ＨＧである。
【００８０】
いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球を低酸素環境で培養することにより、２ＨＧの細胞内濃度を上昇させる。低酸素環境は、２１％未満の酸素、１５％未満の酸素、又は１０％未満の酸素、例えば１０％、５％、又は１％の酸素を有する任意の環境を含み得る。低酸素環境は、２ＨＧの細胞内産生を増加させる。
【００８１】
他の実施態様では、Ｔリンパ球を、記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させる培地中で培養する。
【００８２】
適切な培養培地は、記憶誘導化合物、より好ましくはそのプロ分子（pro-molecule）を含み得る。
【００８３】
培地中での培養中に、記憶誘導化合物又はそのプロ分子は細胞膜を通過し、Ｔリンパ球に進入し、これにより、記憶誘導化合物の細胞内濃度は上昇する。
【００８４】
培養培地は、１０μMから１０mM、好ましくは約０．１〜０．５mMの記憶誘導化合物又はそのプロ形を含み得る。
【００８５】
いくつかの実施態様では、記憶誘導化合物又はそのプロ形の、細胞膜を横断してＴリンパ球への透過は、電気穿孔法によって増加し得る。例えば、培養培地に由来する記憶誘導化合物又はそのプロ形は、電気穿孔法によってＴリンパ球に導入され得、これにより、記憶誘導化合物の細胞内濃度は上昇し得る。適切な電気穿孔技術は、当技術分野において周知である。
【００８６】
いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球中への細胞膜を横断しての記憶誘導化合物又はそのプロ形の透過は、細胞透過性を増加させる溶媒を用いて細胞を処置することによって増加させ得る。適切な溶媒は当技術分野において周知であり、これにはＤＭＳＯ、油、及びアルコールが挙げられる。例えば、記憶誘導化合物又はそのプロ形へのＴリンパ球の透過性は、溶媒を使用して増加させ得、これにより、記憶誘導化合物の細胞内濃度は上昇し得る。
【００８７】
いくつかの実施態様では、Ｔリンパ球中への細胞膜を横断しての記憶誘導化合物又はそのプロ形の通過は、２ＨＧ輸送体などの分子輸送体を発現するように細胞を改変することによって増加させ得る。適切な輸送体は当技術分野において周知であり、これにはカルボキシレート輸送体が挙げられる。例えば、記憶誘導化合物の細胞内濃度は、記憶誘導化合物の存在下において分子輸送体を発現するように改変された細胞を培養することによって増加させ得る。
【００８８】
いくつかの実施態様では、培養培地は、プロ形の記憶誘導化合物を含み得る。
【００８９】
プロ形の記憶誘導化合物は、Ｔリンパ球内で（例えば細胞内酵素によって）記憶誘導化合物に変換される前駆体分子である。好ましくは、プロ形の記憶誘導化合物の細胞透過性は、記憶誘導化合物の細胞透過性よりも高い、すなわち、それは、Ｔリンパ球の形質膜を横断する増大した能力を有する。
【００９０】
プロ形の記憶誘導化合物の例としては、プロ−２ＨＧ、プロ−フマラート、及びプロ−スクシナートが挙げられ得る。プロ−２ＨＧは、プロ−Ｓ−２ＨＧ、プロ−Ｒ−２ＨＧ、及び、プロ−Ｒ−２ＨＧとプロ−Ｓ−２ＨＧとの混合物を含み得る。
【００９１】
プロ形の記憶誘導化合物は、その遊離酸及び薬学的に許容されるその塩を含み得る。
【００９２】
プロ形は、１つ以上の細胞透過性部分にコンジュゲートさせた記憶誘導化合物を含み得る。例えば、プロ−Ｓ−２ＨＧは、１つ以上の細胞透過性部分にコンジュゲートさせたＳ−２ＨＧを含み得、プロ−Ｒ−２ＨＧは１つ以上の細胞透過性部分にコンジュゲートさせたＲ−２ＨＧを含み得る。
【００９３】
細胞透過性部分は、細胞膜を通した分子の透過を促進又は増加させる分子又は化学基である。
【００９４】
記憶誘導化合物にコンジュゲートさせるのに適した一連の細胞透過性部分は当技術分野において公知であり、本発明に従って採用され得る。
【００９５】
適切な細胞透過性部分としては、疎水性部分、例えば脂質、脂肪酸、ステロイド、及びかさ高い芳香族又は脂肪族化合物、例えばアルキル基（好ましくはＣ１〜Ｃ２４、好ましくはＣ１〜Ｃ１２アルキル基、例えばモノメチル基若しくはジメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、ドシル基、ウンデシル基、及びドデシル基であるがこれらに限定されない）；細胞膜受容体又は運搬体を有し得る部分、例えばステロイド、ビタミン、及び糖、天然及び非天然アミノ酸、例えばデオキシグルコサミン、オリゴヌクレオチド、例えばオリゴグアニジウム、及びペプチド、例えば輸送体ペプチド及び細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が挙げられる。
【００９６】
細胞透過性部分としては、リポフェクタミン（商標）、トランスフェクテース（Transfectace）（商標）、トランスフェクタム（Transfectam）（商標）、サイトフェクチン（Cytofectin）（商標）、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＭＥＡＰ、ＤＯＤＭＰ、ＤＯＰＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＥＤＬＰＣ、ＥＤＭＰＣ、ＤＰＨ、ＴＭＡＤＰＨ、ＣＴＡＢ、リシル−ＰＥ、ＤＣ−Ｃｈｏ、−アラニルコレステロール；ＤＣＧＳ、ＤＰＰＥＳ、ＤＣＰＥ、ＤＭＡＰ、ＤＭＰＥ、ＤＯＧＳ、ＤＯＨＭＥ、ＤＰＥＰＣ、プルロニック（商標）、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ＢＲＩＪ、プラズマローゲン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロール−３−エチルホスファチジルコリン、ジメチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジエチルアンモニウムプロパン、トリエチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リゾ脂質、糖脂質、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、コレステロールエステル、コレステロール塩、油、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−アミノカルボニルメチレン）エチレンジアミンテトラ四ヨウ化物塩；Ｎ５Ｎ’’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレンジエチレントリアミン六ヨウ化物塩；Ｎ，Ｎビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，ＮＭ−ビス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）シクロヘキシレン−１，４−ジアミン四ヨウ化物塩；１，７，７−テトラ−（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルアンモニウムメチルアミノ−カルボニルメチレン）−３−ヘキサデシルアミノカルボニル−メチレン−１，３，７−トリアザヘプタン七ヨウ化物塩；Ｎ５Ｎ５Ｎ’，Ｎ’−テトラ（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ’−（１５２−ジオレオイルグリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）ジエチレントリアミン四ヨウ化物塩；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；脂肪酸、リゾ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グルコ脂質（glucolipid）、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、コレステロール、トコフェロールヘミスクシナート、エーテルに結合した脂肪酸を有する脂質、エステルに結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、リン酸ジアセ��ル、ステアリルアミン、カルジオリピン、６〜８炭素長の脂肪酸を有するリン脂質、非対称なアシル鎖を有するリン脂質、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−ａ−Ｄ−マンノピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノエート；Ｎ−スクシニルジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール；ｌ＾−ジパルミトイル−ｓｎ−スクシニル−グリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−ホスホエタノールアミン、及びパルミトイルホモシステインが挙げられ得る。
【００９７】
ＣＰＰは、受容体に非依存的かつエネルギーに非依存的に形質膜を透過する疎水性又は塩基性ペプチドである。適切なＣＰＰとしては、膜移行配列（ＭＴＳ）、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ＣＡＲ（ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ）、オリゴアルギニン（例えばＲ８）、Xentry（商標）（ＬＣＬＲＰＶＧ）、トランスポータン、トランスポータン１０、ＭＰＧ、及びＰｅｐ−１が挙げられる。
【００９８】
細胞透過性部分は、不安定結合によってプロ形の記憶誘導化合物に連結され得、この不安定結合はＴリンパ球内で細胞内切断を受けて記憶誘導化合物を放出し得る。
【００９９】
適切な不安定結合としては、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ケトン結合、及びジスルフィド結合が挙げられる。
【０１００】
好ましくは、不安定な結合はエステル結合である。エステル結合は、Ｔリンパ球内の細胞内エステラーゼによって切断され、細胞内でプロ−２ＨＧなどのプロ形から、２ＨＧなどの記憶誘導化合物を放出し得る。
【０１０１】
いくつかの好ましい実施態様では、プロ形は、記憶誘導化合物のアルキルエステルであり、好ましくは記憶誘導化合物のモノメチル又はジメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、ドシル、ウンデシル、及びドデシルエステル、最も好ましくは記憶誘導化合物のＣ８アルキルエステル（２ＨＧオクチルエステル）であるがこれらに限定されない。
【０１０２】
適切なプロ形の記憶誘導化合物としては、ジメチルスクシナート、モノメチルフマラート、Ｒ−２ＨＧオクチルエステル、Ｓ−２ＨＧオクチルエステル、及びその混合物が挙げられる。
【０１０３】
記憶誘導化合物の細胞内レベルが上昇したＴリンパ球は、ＰＤＨ−Ｅ１αのリン酸化上昇、グルコースの取り込み増加、乳酸塩の分泌増加、ＶＥＧＦの産生増加、溶解能の低下、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌減少、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生増加、及びＩＬ−２を補充することなく培養液中で生存率上昇、のうち１つ以上を示し得る。
【０１０４】
Ｔリンパ球の細胞集団の増幅中における記憶誘導化合物の細胞内レベルの上昇は、細胞がエフェクター表現型ではなく記憶様表現型を採用することを、引き起こす。
【０１０５】
記憶様表現型は、ＣＤ６２ｈｉｇｈ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋のマーカーの１つ、２つ、３つ、又は４つ全ての発現を含み得る。例えば、記憶様表現型は、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＣＲ７ｈｉｇｈ、及びＣＤ４４ｈｉｇｈ；ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ及びＣＤ４４ｈｉｇｈ；並びに／又はＣＣＲ７＋及びＣＤ４５ＲＯ＋の発現を含み得る。
【０１０６】
記憶様表現型は更に、エフェクター表現型と比較して、長い期間にわたる宿主内で生存する能力の向上及び／又はワクチン接種時のより高い想起能を含み得る。
【０１０７】
２ＨＧなどの記憶誘導化合物は、増幅された細胞集団において記憶様細胞の数を増加させることが本明細書において示される。例えば、記憶様Ｔリンパ球である増幅された細胞集団におけるＴリンパ球の数は、
（ｉ）記憶誘導化合物の非存在下で培養した対照細胞集団、及び／又は
（ｉｉ）初期細胞集団
と比較して増加し得る。
【０１０８】
２ＨＧなどの記憶誘導化合物は、増幅された細胞集団において記憶様細胞の比率を増加させることが本明細書において示される。例えば、記憶様Ｔリンパ球である増幅された細胞集団におけるＴリンパ球の比率は、
（ｉ）記憶誘導化合物の非存在下で培養した対照細胞集団、及び／又は
（ｉｉ）初期細胞集団
と比較して増加し得る。
【０１０９】
例えば、増加した細胞内濃度の記憶誘導化合物を有するＴリンパ球を７日間培養した後、細胞集団中の細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が記憶様表現型を示し得る。比較すると、増加した細胞内濃度の記憶誘導化合物を有さない対照Ｔリンパ球を７日間培養した後、細胞集団中の細胞の３０％未満、２０％未満、又は１０％未満が記憶様表現型を示し得る。
【０１１０】
本明細書に記載のように製造された記憶様Ｔリンパ球の細胞集団は、がん免疫療法及びワクチン開発をはじめとする一連の適用における養子細胞移植に有用であり得る。
【０１１１】
上記のように、いくつかの適用のために、初期細胞集団中のＴリンパ球はポリクローナルであり得る。
【０１１２】
いくつかの好ましい実施態様では、ポリクローナルＴリンパ球の初期細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。
【０１１３】
ＴＩＬの適切な細胞集団は、がん状態を有する個体に由来する腫瘍サンプルから単離され得る。サンプルから単離されたＴＩＬの細胞集団は、個体における腫瘍によって発現している抗原に対して特異的なＴＣＲのレパートリーを含み得る。
【０１１４】
本明細書に記載されるＴＩＬの細胞集団の増幅は、腫瘍特異的なＴＣＲのレパートリーを発現する記憶様Ｔリンパ球の増幅された細胞集団を生じ得る。増幅された細胞集団を、ドナー個体に投与することにより（すなわち自己Ｔ細胞導入）、個体におけるがん状態を処置し得る。
【０１１５】
本明細書に記載のあらゆるがん状態は、ＴＩＬを使用して処置され得る。処置のために好ましいがんとしては、高い突然変異率を有するがん、例えば黒色腫、肺がん、子宮頸がん、及び消化管のがん、例えば結腸直腸がんが挙げられる。
【０１１６】
上記のように、いくつかの適用のために、初期細胞集団中のＴリンパ球はモノクローナルであり得る（すなわち抗原特異的）。
【０１１７】
初期細胞集団の単離後、Ｔリンパ球は、例えば、標的抗原、例えば腫瘍抗原に対して特異的となるように又はそれを認識するように改変され得る。
【０１１８】
Ｔリンパ球は、記憶誘導化合物の濃度が細胞内で上昇する前、最中、又は後に、好ましくは前に、操作又は改変され得る。
【０１１９】
例えば、Ｔリンパ球は、キメラ抗原受容体、Ｔ−ｂｏｄｙ受容体又は異種αβＴＣＲヘテロ二量体などの異種抗原受容体を発現するように改変され得る。異種受容体は、抗原、例えば腫瘍抗原に対して特異的であり得る。
【０１２０】
Ｔリンパ球中の発現に適した異種受容体は、選択された標的抗原に対して既知の特異性及び結合力を有し得る。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、がん細胞は、個体における正常な体細胞によっては発現されていない１つ以上の抗原（すなわち腫瘍抗原）を発現し得る。腫瘍抗原は、個体において免疫応答を惹起し得る。特に、腫瘍抗原は、１つ以上の腫瘍抗原を発現する個体において、がん細胞に対するＴ細胞により媒介される免疫応答を惹起し得る。１つ以上の腫瘍抗原が、改変されたＴリンパ球上の異種受容体に対する標的抗原として選択され得る。異種受容体を発現するように改変されたＴリンパ球を本明細書に記載のように増幅して、がん状態の処置のために個体に投与し得る。
【０１２２】
がん細胞によって発現される腫瘍抗原としては、例えば、がん生殖細胞系列遺伝子によってコードされるがん精巣（ＣＴ）抗原、例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ及びＸＡＧＥ、並びにその免疫原性断片が挙げられる（Simpson et al. Nature Rev (2005) 5, 615-625, Gure et al., Clin Cancer Res (2005) 11, 8055-8062; Velazquez et al., Cancer Immun (2007) 7, 1 1; Andrade et al., Cancer Immun (2008) 8, 2; Tinguely et al., Cancer Science (2008); Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn (2008) 198, 99 e91-97）。
【０１２３】
発現され得る他の腫瘍抗原としては、例えば、過剰発現した又は突然変異したタンパク質及び分化抗原、特にメラニン細胞分化抗原、例えばｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７及びＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプシュタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、α−胎児タンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ結合タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ及びチロシナーゼ関連タンパク質、例えばＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２が挙げられる。
【０１２４】
発現され得る他の腫瘍抗原としては、「ストレスのかかった」がん細胞によって使用されるＡＵＧ以外の翻訳開始機序によって生じるアウトオブフレームなペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられる（Malarkannan et al. Immunity 1999 Jun;10(6):681-90）。
【０１２５】
発現され得る他の腫瘍抗原は当技術分野において周知である（例えば国際公開第００／２０５８１号；Cancer Vaccines and Immunotherapy（2000）Stern, Beverley及びCarroll編、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ参照）。これらの腫瘍抗原の配列は公共データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９４／００５３０４ Ａ１号、国際公開第１９９４／０２３０３１ Ａ１号、国際公開第１９９５／０２０９７４ Ａ１号、国際公開第１９９５／０２３８７４ Ａ１号及び国際公開第１９９６／０２６２１４ Ａ１号にも見られる。
【０１２６】
Ｔリンパ球は、任意の簡便な技術を使用して異種抗原受容体を発現するように遺伝子的に改変され得る。例えば、異種核酸、例えば異種受容体をコードしている核酸構築物又はベクターを、培養培地中の細胞に導入し得る。これは、例えば非エフェクターＴ細胞が異種抗原受容体を発現することを引き起こすことによって、Ｔリンパ球の機能又は抗原特異性を改変するために有用であり得る。例えば、特定の抗原、例えば疾患関連抗原に対して特異的であるＴＣＲ又はＴＣＲサブユニットなどの異種抗原受容体をコードしている構築物、又はドミナントネガティブ型の受容体、例えばＴＧＦβ受容体ＩＩをコードしている構築物を、細胞に導入し得る。異種抗原受容体を発現するようなＴ細胞の遺伝子的改変及びその後の養子Ｔ細胞療法におけるこのような遺伝子的に改変されたＴ細胞の使用は当技術分野において周知である。様々な疾患関連抗原、特に腫瘍関連抗原、例えばＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、及びＮＹ−ＥＳＯ−１に対して特異的なＴＣＲをコードしている遺伝子は当技術分野において周知である。
【０１２７】
異種核酸を細胞に導入又は取り込む場合、当業者には周知である特定の配慮を払わなければならない。挿入しようとする核酸は、標的細胞内で転写を駆動するであろう有効な調節配列を含有している構築物又はベクター内で組み立てられるべきである。構築物ベクターを細胞内に輸送するのに適した技術は当技術分野において周知であり、これには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア又はレンチウイルスを使用した形質導入が挙げられる。例えば、固相での形質導入は、レトロネクチンによりコーティングされレトロウイルスベクターの予め積載された組織培養プレート上での培養によって選択することなく実施され得る。
【０１２８】
例えば核酸構築物の調製における核酸の操作及び形質転換、ＤＮＡの細胞内への導入、並びに遺伝子の発現のための多くの公知の技術及びプロトコールが、Protocols in Molecular Biology、第二版、Ausubel et al.編、John Wiley & Sons、1992に詳細に記載されている。
【０１２９】
場合により増幅後に、Ｔリンパ球は、上記のようなＦＡＣＳ及び抗体でコーティングされた磁気粒子をはじめとする、任意の簡便な技術を使用して、増幅された細胞集団から単離及び／又は精製され得る。例えば、標的抗原に対して特異的なＴリンパ球が、増幅された細胞集団から単離され得る。
【０１３０】
本明細書に記載されるインビトロでの培養液中での増幅及び任意選択な単離の後、Ｔリンパ球を、治療的に許容される賦形剤を用いて医薬組成物へと製剤化し得る。
【０１３１】
投与（例えば注入による）に適した医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、を含有し得る、水性及び非水性で等張で発熱物質非含有の無菌注射液；並びに、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液を含む。このような製剤に使用するのに適した等張ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸リンゲル注射液が挙げられる。適切なビヒクルは、標準的な薬剤学のテキスト、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company、イーストン、ＰＡ州、1990に見られ得る。
【０１３２】
いくつかの好ましい実施態様では、Ｔリンパ球は、個体への静脈内注入に適した医薬組成物へと製剤化され得る。
【０１３３】
本明細書において使用する「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、被験者（例えばヒト）の組織と接触させて使用するのに適し、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合った、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各々の担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能」でなければならない。
【０１３４】
本明細書に記載されるインビトロでの増幅後に、Ｔリンパ球は、レシピエント個体に投与され得る。いくつかの実施態様では、ドナー個体とレシピエント個体は同じである（すなわち、Ｔリンパ球は、その後にＴリンパ球を用いて処置される個体から得られる）。他の実施態様では、ドナー個体とレシピエント個体は異なる（すなわち、Ｔリンパ球はある個体から得られ、その後、異なる個体を処置するために使用される）。ドナー個体とレシピエントの個体は、移植片対宿主疾患及び他の望ましくない免疫作用を回避するためにＨＬＡを一致させ得る。
【０１３５】
本発明の態様は、療法、例えば養子Ｔ細胞療法における、本明細書に記載のように増幅されたＴリンパ球の細胞集団の使用に関する。
【０１３６】
個体の処置方法は；
上記のように増幅されたＴリンパ球の細胞集団をそれを必要とする個体に投与すること
を含み得る。
【０１３７】
Ｔリンパ球の細胞集団は、静脈内に、例えば個体への注入によって投与され得る。
【０１３８】
Ｔリンパ球の細胞集団は自己であり得る。すなわち、Ｔリンパ球は最初、該リンパ球が続いて投与される個体と同じ個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体は同じである）。レシピエント個体への投与用のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の適切な細胞集団は、個体から得られたＴリンパ球の初期細胞集団を提供すること、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球を培養することを含む方法によって製造され得る。
【０１３９】
Ｔリンパ球の細胞集団は同種であり得る。すなわち、Ｔリンパ球は最初、該リンパ球が続いて投与される個体とは異なる個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体は異なる）。レシピエント個体への投与用のＴリンパ球の適切な細胞集団は、ドナー個体から得られたＴリンパ球の初期細胞集団を提供すること、Ｔリンパ球中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及びＴリンパ球を培養することを含む方法によって製造され得る。
【０１４０】
投与後、レシピエント個体は、記憶Ｔリンパ球により媒介される免疫応答を示し得る。
【０１４１】
本明細書に記載されるＴリンパ球を用いての処置に適した個体は、Ｔリンパ球により媒介される免疫応答によって寛解される状態を有し得る。
【０１４２】
Ｔリンパ球は、疾患に関連する１つ以上の抗原に対して特異的であり得る。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、個体は、感染、例えばウイルス感染、細菌感染若しくは真菌感染、がん、又は自己免疫状態を有し得る。
【０１４４】
がんは、悪性がん細胞の異常な増殖によって特徴付けられ得、これには、白血病、例えばＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、及びＣＬＬ、リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫、並びに固形がん、例えば肉腫、皮膚がん、黒色腫、膀胱がん、脳のがん（brain cancer）、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、肝がん、頭頸部がん、食道がん、膵臓がん、腎臓がん、副腎がん、胃がん、精巣がん、膀胱がん及び胆管がん、甲状腺がん、胸腺がん、骨のがん、及び脳のがん（cerebral cancer）が挙げられ得る。
【０１４５】
個体内のがん細胞は、個体における正常な体細胞とは免疫学的に異なり得る（すなわち、がん性腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、がん細胞は、がん細胞によって発現された１つ以上の抗原に対して個体において全身免疫応答を誘起することができる場合がある。免疫応答を誘起する抗原は腫瘍抗原であり得るか、又は正常細胞によって共有され得る。
【０１４６】
上記のような処置に適した個体は、哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えばマウス）、イヌ科（例えばイヌ）、ネコ科（例えばネコ）、ウマ科（例えばウマ）、霊長類、サル科（例えばサル又は類人猿）、サル（例えばマーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えばゴリラ、チンパンジー、オラウータン、テナガザル）、又はヒトであり得る。
【０１４７】
いくつかの好ましい実施態様では、個体はヒトである。他の好ましい実施態様では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療効力を実証するためのモデルとして簡便に使用される哺乳動物（例えばネズミ科、霊長類、ブタ、イヌ科、又はウサギ動物）が使用され得る。
【０１４８】
いくつかの実施態様では、個体は、最初のがん処置後に微小残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【０１４９】
がんを有する個体は、当技術分野において公知である臨床基準に従ってがんの診断を行なうのに十分である少なくとも１つの同定可能な兆候、症状、又は臨床所見を呈し得る。このような臨床基準の例は、医学教科書、例えばHarrison’s Principles of Internal Medicine、第１５版、Fauci AS et al.編、McGraw-Hill, New York, 2001に見られ得る。いくつかの場合では、個体におけるがんの診断は、個体から得られた体液又は組織のサンプル中の特定の細胞型（例えばがん細胞）の同定を含み得る。
【０１５０】
処置は、いくつかの望ましい治療効果、例えば状態の進行の抑制又は遅延が達成される、ヒト又は動物における（例えば獣への適用）、任意の処置及び療法であり得、これには、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の寛解、状態の治癒若しくは緩解（部分緩解又は完全緩解）、状態の１つ以上の症状及び／若しくは兆候の予防、遅延、軽減、若しくは停止、又は処置をしない場合に予想される生存率を上回る被験者若しくは患者の生存率の延長が含まれる。
【０１５１】
予防的措置としての処置（すなわち予防）も含まれる。例えば、がんの発生又は再発が起こりやすいか又はリスクのある個体は、本明細書に記載のように処置され得る。このような処置は、個体におけるがんの発生又は再発を予防又は遅延させ得る。
【０１５２】
特に、処置は、完全ながんの緩解及び／又はがん転移の抑制を含む、がん増殖の抑制を含み得る。がんの増殖は一般的に、より発達した形態へのがん内の変化を示す多くの指標のいずれか１つを指す。したがって、がん増殖の抑制を測定するための指標としては、がん細胞の生存率の低下、腫瘍の体積又は形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像診断法を使用して決定されるような）、遅延した腫瘍の増殖、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型過敏症皮膚検査の成績の向上、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性の上昇、及び腫瘍特異的抗原レベルの減少が挙げられる。個体におけるがん性腫瘍における免疫抑制の低減は、がん増殖、特に被験者にすでに存在しているがん増殖に個体が抵抗する能力を向上させ得、及び／又は個体におけるがん増殖傾向を減少させ得る。
【０１５３】
記憶様Ｔリンパ球、又は記憶様Ｔリンパ球を含む医薬組成物を、全身的／末梢的に又は所望の作用部位に、非経口的（例えば静脈内注入、特に静脈内ボーラス注射をはじめとする注入による）を含むがこれらに限定されない任意の簡便な投与経路によって被験者に投与し得る。適切な注入技術は当技術分野において公知であり、一般的に療法に使用される（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med., 319:1676, 1988参照）。
【０１５４】
典型的には、投与される細胞の数は、典型的には３０分間の経過にわたり、体重１kgあたり約１０５〜約１０１０個、典型的には１個体あたり１０８〜１０１０個の細胞であり、処置は必要に応じて、例えば数日間から数週間の間隔で繰り返される。記憶様Ｔリンパ球、及び記憶様Ｔリンパ球を含む組成物の適切な用量は、患者毎に変更され得ることが理解されるだろう。至適用量の決定は一般的に、本発明の処置のあらゆるリスク又は有害な副作用と治療利点のレベルのバランスを取ることを含むだろう。選択された用量レベルは、具体的な細胞の活性、投与経路、投与時刻、細胞の減少率又は不活性化率、処置期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、及び過去の病歴を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存するだろう。細胞の量及び投与経路は最終的には、医師の判断によるが、一般的に用量は、実質的に有毒な又は有害な副作用を引き起こすことなく作用部位において所望の効果を達成する局所濃度を達成するようなものであろう。
【０１５５】
記憶様Ｔリンパ球を単独で投与することも可能であるが、環境によっては、記憶様Ｔリンパ球の細胞集団のインビボでの増幅を促進するために、標的抗原、標的抗原を提示するＡＰＣ、及び／又はＩＬ−２と組み合わせて該細胞を投与することが好ましくあり得る。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、記憶様Ｔリンパ球の細胞集団は、サイトカイン、例えばＩＬ−２の投与、細胞障害性化学療法、及び放射線療法などの１つ以上の他の療法と組み合わせて投与され得る。
【０１５７】
１つ以上の他の療法は、好ましくは記憶様Ｔリンパ球の投与部位とは離れた部位において、任意の簡便な手段によって投与され得る。いくつかの実施態様では、ＩＬ−２は静脈内投与され得る。
【０１５８】
記憶様Ｔリンパ球の投与は１回量で、処置の経過にわたり継続的に又は断続的に（例えば適切な間隔での分割量で）行なわれ得る。最も効果的な投与手段及び投与量を決定する方法は当業者には周知であり、療法のために使用される製剤、療法の目的、処置される標的細胞、及び処置される被験者により変更されるだろう。１回又は複数回の投与が、処置する医師によって選択された用量レベル及びパターンを用いて行なわれ得る。
【０１５９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって製造された記憶様Ｔリンパ球の増幅された細胞集団を提供する。本発明の方法によって製造された記憶様Ｔリンパ球の細胞集団は本明細書の何処かに記載されており、そして、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈであり、ＣＴＬ活性及びＩＦＮγ発現などのエフェクター機能を欠失している。
【０１６０】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される処置方法に使用するための、本明細書に記載の方法によって製造された記憶様Ｔリンパ球の増幅された細胞集団を提供する。
【０１６１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される処置方法に使用するための医薬の製造における、本明細書に記載の方法によって製造された記憶様Ｔリンパ球の増幅された細胞集団の使用を提供する。
【０１６２】
本発明の別の態様は、記憶誘導化合物又はそのプロ形を含む、Ｔリンパ球の増幅のための培養培地を提供する。
【０１６３】
例えば、培地は、スクシナート、プロ−スクシナート、フマラート、プロ−フマラート、Ｓ−２ＨＧ、Ｒ−２ＨＧ、プロ−Ｒ−２ＨＧ及び／又はプロ−Ｓ−２ＨＧを含み得る。
【０１６４】
好ましい培地は、プロ−２ＨＧ、例えば２ＨＧオクチルエステルを含み得る。
【０１６５】
培地は、グルコース、アミノ酸、例えばグルタミン、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシン、並びにβ−メルカプトエタノールなどの追加の因子の補充された、ＲＰＭＩ−１６４０などの基礎培地を含み得る。
【０１６６】
いくつかの実施態様では、培地は、化学組成が既知である培地であり得る。ＣＤＭは、明記された成分のみ、好ましくは化学構造が既知である成分のみを含有する、細胞培養用の栄養溶液である。ＣＤＭは、完全には明らかになっていない成分、例えば血清又はそれから単離されたタンパク質、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びフィーダー細胞若しくは他の細胞を欠いている。いくつかの実施態様では、ＣＤＭはヒト化されていてもよく、非ヒト動物由来の成分を欠失していてもよい。ＣＤＭ中のタンパク質は組換えヒトタンパク質であってもよい。適切なＣＤＭは、当技術分野において周知であり、以下により詳細に記載している。
【０１６７】
培地に、血清又は血清代用物が補充されていてもよい。
【０１６８】
場合により、培地に組換えＩＬ−２又は他のサイトカインが補充されていてもよい。基礎培地及び培地成分は、業者（例えばギブコ社、ロシュ社、シグマ社、Europabioproducts社、セルジェニックス社、ライフサイエンシーズ社）から入手することができる。
【０１６９】
培養培地は、脱イオン蒸留水中で製剤化され得る。培養培地は典型的には使用前に、汚染を防ぐために例えば紫外線、加熱、放射線照射、又はろ過によって滅菌されるだろう。培養培地は、貯蔵又は輸送のために凍結（−２０℃又は−８０℃で）されてもよい。培養培地は、汚染を防ぐために１つ以上の抗生物質を含有していてもよい。
【０１７０】
培養培地は、１倍製剤、又はより濃縮された製剤、例えば２倍から２５０倍濃縮された培地製剤であり得る。１倍製剤では、培地中の各成分は細胞培養に意図された濃度、例えば上記に示された濃度である。濃縮製剤では、１つ以上の成分が、細胞培養に意図されるより高い濃度で存在する。濃縮された培養培地は当技術分野において周知である。培養培地は、公知の方法、例えば塩沈降又は選択的ろ過を使用して濃縮され得る。濃縮された培地は、使用のために（好ましくは脱イオンされ蒸留された）水又は任意の適切な溶液、例えば食塩水溶液、水性緩衝液又は培養培地を用いて希釈され得る。
【０１７１】
培養培地は、密封された容器に含有され得る。密封容器は、汚染を防ぐために、培養培地の輸送又は貯蔵にとって好ましくあり得る。容器は、任意の適切な容器、例えばフラスコ、プレート、瓶、広口瓶、バイアル、又はバッグであり得る。
【０１７２】
本発明の別の態様は、記憶誘導化合物又はそのプロ形を含む、Ｔリンパ球のインビトロ増幅のためのキットを提供する。
【０１７３】
本発明の別の態様は、インビトロで培養したＴリンパ球において記憶様表現型を維持するための、記憶誘導化合物又はそのプロ形の使用を提供する。
【０１７４】
例えば、スクシナート、プロ−スクシナート、フマラート、プロ−フマラート、Ｓ−２ＨＧ、Ｒ−２ＨＧ、プロ−Ｒ−２ＨＧ、プロ−Ｓ−２ＨＧ、又はその混合物が使用され得る。
【０１７５】
本発明の他の態様は、本明細書に記載される哺乳動物細胞中の記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇が、哺乳動物細胞における幹細胞に関連する特性及び／又は多能性を誘導するという知見に関する。これは、例えば、活性化したＴリンパ球をＴ記憶幹細胞へとリプロミングするのに有用であり得る。
【０１７６】
Ｔ記憶細胞は、抗原により再刺激された時に短寿命のエフェクター細胞の持続的な供給源を提供することによって生涯続く免疫記憶を確実にする、自己再生能及び多分化能を有する抗原に曝された経験のある免疫幹細胞である。記憶Ｔ細胞は、分子サイン、転写プログラム、非対称的な分裂、及びテロメア長の維持をはじめとする多くの特色を多能性幹細胞と共有している（Fearon et al, Science 293, 248-250 (2001)）。それらはまた、単一の記憶幹細胞前駆体から多様なエフェクター細胞及び記憶免疫細胞サブセットの子孫を生じる多能性も有する（Graef et al (2014) Immunity 41. 116-126）。
【０１７７】
多くの因子の中でもとりわけ、Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇが、幹細胞の自己再生及び多能性の維持に不可欠である（Loh et al, Nature Genetics 38, 431 - 440 (2006)）。成人体細胞は、特定の遺伝子のセットの導入によって幹細胞へとリプログラミングされ得る。当初、４つの遺伝子の発現が、リプログラミングのための最小限の必要条件として同定された（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−ｍｙｃ）（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006)）。今では、多能性へのリプログラミングは、Ｏｃｔ３／４の発現のみによって達成することができることが認められている。
【０１７８】
本発明の態様は、インビトロ培養における哺乳動物細胞において幹細胞に関連する特性及び／又は多能性を誘導するための、上記のような記憶誘導化合物又はそのプロ形の使用を提供する。
【０１７９】
哺乳動物細胞において幹細胞に関連する特性及び／又は多能性を誘導する方法、又は多能性幹細胞を生成する方法は、
哺乳動物細胞の初期細胞集団を提供すること、
哺乳動物細胞中の記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させること、及び
哺乳動物細胞を培養し、これにより、幹細胞に関連する特性及び／又は多能性を有する哺乳動物細胞の増幅された細胞集団を製造すること
を含み得る。
【０１８０】
記憶誘導化合物及び記憶誘導化合物の細胞内濃度を上昇させる方法は、上で詳細に記載されている。
【０１８１】
体細胞中の記憶誘導化合物の細胞内濃度の上昇は、多能性リプログラミング因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＫｌｆ４）の発現を誘導し、これにより多能性幹細胞への細胞のリプログラミングが起こる。
【０１８２】
いくつかの好ましい実施態様では、増幅された細胞集団における多能性幹細胞の数及び／又は比率は、初期細胞集団と比較して増加し得る。
【０１８３】
幹細胞に関連する特性は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＫｌｆ４などの多能性リプログラミング因子の発現を含み得る。
【０１８４】
適切な哺乳動物細胞としては、体細胞、例えばＴリンパ球が挙げられる。
【０１８５】
この文脈において、本発明の態様は、個体から成人体細胞を入手し、細胞内２−ＨＧ濃度を上昇させることによって体細胞を多能性細胞へとリプログラミングすることを含む、幹細胞療法のための方法を提供する。リプログラミングされた細胞は個体に再注入されても、又は他の細胞型へと分化させて個体に再注入されてもよい。
【０１８６】
リプログラミング及び任意選択の分化後、前記細胞をレシピエント個体に投与し得る。いくつかの実施態様では、ドナー個体とレシピエント個体は同じである（すなわち、リプログラミング用の体細胞は、その後に多能性幹細胞又はそれから分化させた細胞を用いて処置される個体から得られる）。他の実施態様では、ドナー個体とレシピエント個体は異なる（すなわち、体細胞はある個体から得られ、多能性幹細胞は異なる個体を処置するために使用される）。ドナー個体とレシピエント個体は、移植片対宿主疾患及び他の望ましくない免疫作用を回避するためにＨＬＡを一致させ得る。
【０１８７】
本明細書に記載のように製造された多能性幹細胞の細胞集団は、療法、例えば幹細胞療法に使用され得る。個体の処置方法は；
上記のように製造された多能性幹細胞の細胞集団をそれを必要とする個体に投与することを含み得る。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、リプログラミング後、多能性幹細胞をインビトロで分化させて、分化した体細胞を製造し得る。次いで、分化した体細胞を療法に使用し得る。
【０１８９】
本発明の他の局面及び実施態様は、「含んでいる」という用語が「からなる」という用語で置き換えられた上記の局面及び実施態様、並びに、「含んでいる」という用語が「から本質的になる」という用語で置き換えられた上記の局面及び実施態様を提供する。
【０１９０】
本出願は、特記しない限り、上記の局面及び上記の実施態様のいずれかとお互いとの全ての組み合わせを開示することを理解すべきである。同様に、本出願は、特記しない限り、単独での又は他の局面のいずれかとの、好ましい特徴及び／又は任意の特徴の全ての組み合わせを開示する。
【０１９１】
上記の実施態様の改変、更なる実施態様、及びその改変は、本開示を読めば当業者には明らかとなり、したがって、これらは本発明の範囲内である。
【０１９２】
本明細書に示された全ての文書及び配列データベースエントリーは、全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１９３】
本明細書において使用する場合の「及び／又は」は、２つの明記された特徴又は成分の各々が、他方を伴って又は他方を伴わずに具体的に開示されていると捉えられるべきである。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、各々が個々に本明細書に示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）ＡとＢ、のそれぞれが具体的に開示されていると捉えられるべきである。
【０１９４】
ここで、実施例を用いて及び上で説明した図面を参照して、本発明の特定の局面及び実施態様を説明する。
【実施例】
【０１９５】
実験
１．  材料及び方法
１．１  ＣＤ８＋Ｔリンパ球の単離及び活性化
ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ポジティブセレクションによってマウス脾臓から単離した。モノクローナル抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ）抗体（ミルテニー社、１３０−０４９−４０１）にコンジュゲートしたマイクロビーズとのインキュベーションに続いて、ＭＡＣＳカラムでの磁気ビーズによる単離を行なった。特記しない限り、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、プレートに結合させたαＣＤ３（５μg/ml）及び可溶性αＣＤ２８（１μg/ml）を用いて４８時間活性化した。ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化のために、ＯＴ−Ｉマウス由来の全脾臓細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと共に４８時間培養した。全てのＣＤ８＋Ｔ細胞を、特記しない限り、２mMのグルタミン、１０％ＦＢＳ、２５mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、５５μMのβ−メルカプトエタノールを含有しかつ２０ng/mlの組換えマウスＩＬ−２（バイオレジェンド社、５７５４０４）を補充した又は補充していないＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【０１９６】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、勾配遠心分離後に健康なドナーの血液から磁気的に単離した。抗ヒトＣＤ８抗体（ミルテニー社、１３０−０９７−０５７）にコンジュゲートしたマイクロビーズとのインキュベーションに続いて、ＭＡＣＳカラムでの磁気ビーズによる単離を行なった。精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、αＣＤ３及びαＣＤ２８でコーティングしたビーズ（Dynabeads、１１１．６１Ｄ）を用いて活性化し、組換えヒトＩＬ−２（３０UI/ml、ロシュ社、１１０１１４５６００１）の存在下で増幅させた。
【０１９７】
１．２  細胞培養
４８時間活性化した後、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、様々な時間をかけて２１％又は１％のいずれかの酸素条件下において培養した。１０％ＦＢＳ及び０．８mg/mlのＧ４１８を補充した高グルコースＤＭＥＭを、ＲＣＣ４ＥＶ細胞、ＲＣＣ４ＶＨＬ細胞、７８６−ＯＥＶ細胞、７８６−ＯＶＨＬ細胞、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞及びＥＧ7−ＯＶＡ細胞のための標準的な増殖培地として使用した。ＭＥＦ細胞及びＥＬ−４細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭで培養した。低酸素実験のために、細胞を、指定された時間の間、Ruskinn Sci-tive低酸素ワークステーションに移した。Ｓ−２ＨＧオクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルはトロントリサーチケミカルス社から、ＤＣＡはシグマ社から購入した。α−ＫＧ−オクチルエステルはケイマン社から購入した。Ｓ−２ＨＧ及びＲ−２ＨＧの遊離酸は、シグマ社から購入した。
【０１９８】
１．３  細胞の計数、容積、及び生存率
細胞を、ＡＤＡＭ−ＭＣ自動細胞計数器（ナノエンテック社）で計数し、生存率をヨウ化プロピジウムの排除によって評価した。細胞体積を、Ｚ２コールターカウンター（ベックマンコールター社）を使用して決定した。
【０１９９】
１．４  フローサイトメトリー及び選別
細胞を染色し、Fortessa（ＢＤバイオサイエンス社）で取得した。以下のフルオロフォア、及びフルオロフォアにコンジュゲートした抗体を使用した：抗ＣＤ６２Ｌ抗体（バイオレジェンド社、ＭＥＬ−１４）、抗ＣＤ４４抗体（バイオレジェンド社、ＩＭ７）、抗ＣＤ８ａ抗体（バイオレジェンド社、５３−６．７）、抗ＣＤ４５．１抗体（バイオレジェンド社、Ａ２０）、抗ＣＤ４５．２抗体（バイオレジェンド社、１０４）、抗ＣＤ１２７抗体（バイオレジェンド社、Ａ７Ｒ３４）、抗ＫＬＲＧ１抗体（バイオレジェンド社、２Ｆ１／ＫＬＲＧ１）、抗ＣＤ１９抗体（バイオレジェンド社、６Ｄ５）、抗Ｂｃｌ−２抗体（バイオレジェンド社、ＢＣＬ／１０Ｃ４）、Ｅｏｍｅｓ（イーバイオサイエンス社、Ｄａｎ１１ｍａｇ）、ＰＤ−１（バイオレジェンド社、２９Ｆ．１Ａ１２）、４１ＢＢ（バイオレジェンド社、１７Ｂ５）、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体−ＰＥ（プロイミューン社、Ｆ０９３−２Ａ）、ＣＦＳＥ（ライフテクノロジーズ社）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレット（ライフテクノロジーズ社）、ＰＩ−アネキシンＶ（バイオレジェンド社、６４０９２８）、抗Ｂｃｌ−ｘｌ−ＰＥ抗体（セルシグナリングテクノロジーズ社、５４Ｈ６）。核に局在するマーカーであるＥｏｍｅｓの染色のために、Transcription Factor Staining Buffer Set（イーバイオサイエンス社）を、製造業者の説明書に従って使用した。細胞内サイトカインの染色のために、ＯＴ−Ｉ細胞を、ゴルジストップ溶液（ＢＤ）と共にＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて４時間再刺激した。１Ｈ−ＮＭＲ実験のために、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＭｏＦｌｏ（ベックマンコールター社）での抗マウスＣＤ８−ＡＦ６４７抗体（バイオレジェンド社）を用いての免疫染色によって全脾臓細胞から選別した。次いで、細胞を上記のように活性化し培養した。ヒトＴ細胞の染色のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＣＲ７抗体（イーバイオサイエンス社、１２−１９７９−４１）の存在下で３７℃で３０分間インキュベートし、その後、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（バイオレジェンド社、ＵＣＨＬ１）を用いて染色した。
【０２００】
１．５  Ｖｈｌ−／−マウス胚線維芽細胞の作製
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、胚年齢Ｅ１２．５−１４．５日令のＶｈｌＦｌ／Ｆｌ胚から単離した。次いで、ＭＥＦを、ＳＶ４０のラージＴ抗原を用いての安定なトランスフェクションによって不死化した。１５回継代した後、Ｖｈｌの急性欠失を実施するために、各遺伝子型の細胞を、ｅＧＦＰ単独、又はＣｒｅリコンビナーゼとｅＧＦＰ（Vector Biolabs社）の両方、のいずれかを発現している１００ＰＦＵ/細胞のアデノウイルスに一過性（２４時間）に感染させた。次いで、細胞集団を、ＭｏＦｌｏ（ベックマンコールター社）フローサイトメトリーでの選別によってｅＧＦＰについて濃縮した。
【０２０１】
１．６  ｑＰＣＲによる欠失効率の決定
欠失効率を定量するために、ｇＤＮＡを、DNeasy Blood & Tissueキット（キアゲン社）を使用して単離し、続いてリアルタイムＰＣＲを行なった。標的遺伝子の量を、ＡｃｔｂｇＤＮＡレベルに対してノーマライズした。
【０２０２】
１．７  Ｉｄｈ１及びＩｄｈ２の配列決定
ｇＤＮＡを、以下のＣＤ８＋Ｔリンパ球サンプルから抽出した：新たに単離されたナイーブなＨｉｆ１ａＦｌ／Ｆｌ及びＨｉｆ１ａ−／−；２１％酸素中で計４日間後の増幅しているＨｉｆ１ａＦｌ／Ｆｌ及びＨｉｆ１ａ−／−；２１％酸素中で２日間及び１％酸素中で更に２日間（合計で４日間培養）後の増殖しているＨｉｆ１ａＦｌ／Ｆｌ及びＨｉｆ１ａ−／−。産物を精製した後、ＰＣＲ及びサンガー配列決定を実施した。
【０２０３】
１．８  ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を使用して単離した。ＲＮＡ １μgを、First-Strand Synthesisキット（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡ合成のために使用した。全てのサンプルを、サイバーグリーンと共にStepOnePlusシステム（アプライドバイオシステムズ社）を使用して技術的トリプリケートで実施した。
【０２０４】
１．９  培地中のグルコース、ラクテート、ＶＥＧＦ、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γの測定
ＣＤ８＋Ｔ細胞を４日間増幅させ、次いで、Ｓ−２ＨＧオクチルエステル又はＲ−２ＨＧオクチルエステルを用いて１６時間処置した。培養培地中のグルコース及びラクテートレベルを、デイドベーリング社のディメンションＲＸＬ分析装置を用いて測定した。新鮮な培地と比較した代謝物の濃度の変化を、生細胞数に対してノーマライズした。培地中のＶＥＧＦ、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γタンパク質レベルを、メソスケールディスカバリー社の以下のキットを使用して決定した：ＶＥＧＦではＫ１５０ＢＭＣ−２、ＩＦＮ−γではＫ１５０４８Ｄ−２、及びＩＬ−２についてはＫ１５２ＱＱＤ。数値を、生細胞数に対してノーマライズした。
【０２０５】
１．１０  インビトロ細胞障害性アッセイ
ＯＴ−Ｉマウス由来の全脾臓細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて４８時間活性化し、ＩＬ−２含有培地で更に４日間増幅させた。次いで、ＯＴ−Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて又は用いずに２４時間処置し、次いで、標的細胞（ＥＧ７−ＯＶＡ、ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）及び対照細胞（ＥＬ４、ＣＦＳＥｈｉｇｈ）と共にインキュベートした。ビヒクル又はＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルで処置したＯＴ−Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に４時間共培養した後に、ＣＦＳＥ−ｈｉｇｈ細胞集団に対するＣＦＳＥ−ｌｏｗ細胞集団のシグナルにおける減少をノーマライズすることによって、特異的溶解を計算した。
【０２０６】
１．１１  メタボロミクス
メタボロミクス実験を、細胞内代謝物の決定のために、ＧＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォーム（メタボロン社）を使用して実施した。サンプルを、ブラッドフォードアッセイによって測定したタンパク質濃度を使用してノーマライズし、中央値を１に設定するように再調整した。欠落している数値は、最小値を用いて補完した。MetaboAnalyst2.0（Xia et al. 2009;  Xia et al. 2012）を用いて実施した分析は、教師なし階層的クラスタリング及び主成分分析を含んでいた。
【０２０７】
１．１２  １Ｈ−ＮＭＲデータ取得及び分析
１Ｈ核磁気共鳴（１ＨＮＭＲ）分光分析を、内部標準物質として４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸（ＤＳＳ）を用いて６００ＭＨｚのブルカーアバンスＮＭＲ分光計で溶媒を抑制して実施した。Electronic RefeREnce To access In vivo Concentration（ＥＲＥＴＩＣ）法７を使用して、各サンプル中のＤＳＳの濃度を決定した。１ＨＮＭＲスペクトルの処理は、Chenomx NMR Suite 7.6（ケノミックス社）を使用した０次及び１次オーダ位相補正の両方、続いてベースライン補正を含んでいた。化学シフトの割り当てに基づいて、Chenomx NMR Suite 7.6も使用して、２−ヒドロキシグルタラートを同定した。各サンプルのスペクトル強度を、内部標準物質に対してノーマライズした。
【０２０８】
１．１３  質量分析
細胞を計数して、生細胞数を決定した。２〜３百万個の生細胞を収集し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、氷冷８０％エタノール中で抽出した。２回の凍結解凍サイクル後に、沈降したタンパク質を、１６，０００ｇでの遠心分離によって取り出し、ブラッドフォードアッセイによるタンパク質含量の決定のために保持した。上清を蒸発乾固し、サンプルを各アッセイのための適切な緩衝液中で再構成した。２ＨＧ、グルタマート、フマラート、スクシナート、及びマラートの定量のために、内部標準物質として既知量の重水素化２ＨＧ（Ｄ３−２ＨＧ）並びに１３Ｃで標識されたグルタマート、マラート、フマラート、及びスクシナート（全てｍ＋２）を含有している０．１％ギ酸に、細胞抽出物を溶解した。安定同位体で標識した標準物質の検量曲線を、サンプルの全てのバッチを用いて作製し、絶対的な定量を可能とした。Agilent 1290システムを使用して、５０℃に保たれたHypercarbカラム（Thermo社）（１００mm×２．１mm、３μmの粒径）の積載されたSciex 6500 MSに、各サンプル１０μlを注入した。移動相Ａは０．１％ギ酸水溶液からなっていた。移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸からなっていた。０．４ml/分の流速を有する勾配プロファイルは以下のとおりであった：９５％Ａで１．０分間、７０％Ａで更に２．５分間、５％Ａで更に１．５分間。質量分析条件は、分裂なし、３５０℃のイオン源の温度を有する超高感度イオン源のイオン化、及び負の極性を含んでいた。２ＨＧ、グルタマート、スクシナート、フマラート、マラート、Ｄ３−２ＨＧ、１３Ｃ−グルタマート、１３Ｃ−スクシナート、１３Ｃ−フマラート、及び１３Ｃ−マラートについてのプリカーサーイオンは、それぞれ、１４７、１４６、１１７、１１５、１３３、１５０、１４８、１１９、１１７、及び１３５ｍ／ｚであった。２ＨＧ、グルタマート、スクシナート、フマラート、マラート、Ｄ３−２ＨＧ、１３Ｃ−グルタマート、１３Ｃ−スクシナート、１３Ｃ−フマラート、及び１３Ｃ−マラートについてのプロダクトイオンは、それぞれ、１２９、１２８、７３、７１、１１５、１３２、１３０、７４、７２、及び１１７ｍ／ｚであった。２ＨＧ、グルタマート、スクシナート、フマラート、マラート、Ｄ３−Ｓ−２ＨＧ、１３Ｃ−グルタマート、１３Ｃ−スクシナート、１３Ｃ−フマラート、及び１３Ｃ−マラートについての典型的な保持時間は、それぞれ、１．６５、０．６３、１．４９、２．９１、１．１５、１．６７、０．６７、１．４９、２．９１、及び１．１５分であった。２ＨＧのエナンチオ選択性の決定のために、細胞抽出物を、０．３％の酢酸及び０．１％の水酸化アンモニウム並びに既知量のＤ３--２ＨＧを含有しているＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ（５：９５ ｖ／ｖ）に溶かした。安定な同位体で標識された内部標準物質の検量曲線を、サンプルの全てのバッチを用いて作製し、絶対的な定量を可能とした。Agilent 1290システムを使用して、周囲温度に保たれたAstec CHIROBIOTIC Rカラム（２５mm×４．６mm、５μmの粒径）の積載されたSciex 6500 MSに、各サンプル５μlを注入した。移動相は、０．３％の酢酸及び０．１％の水酸化アンモニウムを含有しているＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ（５：９５ｖ／ｖ）からなっていた。移動相を、１．２ml/分の流速で９．６分間、均一濃度で流した。質量分析条件は上記のとおりであった。典型的な保持時間は、それぞれＳ−２ＨＧ及びＲ−Ｓ−２ＨＧについて３．７１分及び４．３３分であった。全ての１３Ｃトレーサー研究は、１０％の透析されたＦＢＳを含有している培地中で実施された。グルコース又はグルタミンを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地を、各々の基質プールが完全に標識されるが他方は標識されないように調製した。［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース又は［Ｕ−１３Ｃ５］グルタミンの最終濃度は、それぞれ１１mM及び２mMであった。培地に、２５mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び５５μMのβ−メルカプトエタノールも補充した。［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース又は［Ｕ−１３Ｃ５］グルタミンは、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリー社から購入した。定常状態の標識を、トレーサーの存在下で細胞を２４時間培養することによって達成した。モニタリングした多重反応モニタリング（ＭＲＭ）のトランジションは、水の減少（−１８ｍ／ｚ）に対応した。ｍ＋０、ｍ＋１、ｍ＋２、ｍ＋３、ｍ＋４、及びｍ＋５ ２ＨＧのために使用したＭＲＭトランジションは、それぞれ、１４７−１２９、１４８−１３０、１４９−１３１、１５０−１３２、１５１−１３３、及び１５２−１３４ｍ／ｚであった。
【０２０９】
１．１４  イムノブロッティング
核画分及び細胞質画分を、ＮＥ−ＰＥＲキット（サーモサイエンティフィック社）を用いて細胞から調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブランに転写し、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で調製した５％ミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で遮断した。次いで、メンブランを、一次抗体と共に４℃で一晩、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次抗体と共に翌日に１時間インキュベートした。以下の一次抗体を、１：１０００の希釈率で使用した：ＨＩＦ１α（ノバス社）、ＨＩＦ２α（ノバス社）、ＰＤＨ−Ｅ１α（アブカム社）、ＰＤＨ−Ｅ１αｐＳ２３２（カルバイオケム社）、ラミンＢ１（アブカム社）、ＨＤＡＣ１（アブカム社）、β−チューブリン（アブカム社）、４Ｅ−ＢＰ１（セルシグナリング社）、ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｓ６５）（セルシグナリング社）、ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔ３７／Ｔ４６）（セルシグナリング社）、Ｓ６Ｋ（セルシグナリング社）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）（セルシグナリング社）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ（Ｓ３７１）（セルシグナリング社）。
【０２１０】
１．１５  タンパク質の定量
タンパク質の定量は、製造業者の説明書に従ってＤＣ−プロテインアッセイ（バイオラッド社）を使用して実施した。５９５nmにおける吸光度を測定し、サンプルを、既知濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して作成した標準曲線に対して定量した。
【０２１１】
１．１６  インビボでの記憶想起実験
ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１＋マウス由来の全脾臓細胞を、ＩＬ−２及びビヒクル、０．５mMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル又は０．５mMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて７日間活性化した。次いで、１００万個のＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ５７／Ｂ６野生型ＣＤ４５．２＋宿主マウスに静脈内注射した。３０日後、宿主マウスに、ＳＩＩＮＦＥＫＬの積載された樹状細胞を腹腔内にワクチン接種した。７日後、脾臓を宿主マウスから収集し、ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋及びＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ五量体＋細胞の存在を、フローサイトメトリーによって決定した。細胞の絶対数をカウントビーズ（CountBright、ライフテクノロジーズ社）を使用して決定した。樹状細胞を、野生型ＣＤ５７／Ｂ６マウスから抽出された骨髄から調製した。骨髄由来細胞を、ＴＣで処理されていないペトリ皿において、２０ng/mlのｍＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）の補充された２mMのグルタミン、１０％のＦＢＳ、２５mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、５５μMのβ−メルカプトエタノールを含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。８日間培養した後、樹状細胞を、１μg/mlのＬＰＳ（シグマ社）を用いて２４時間活性化した。樹状細胞の成熟を、以下のマーカーを使用してフローサイトメトリーによって確認した：ＭＨＣクラスＩＩ−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ−ＡＦ４８８、ＣＤ１１ｃ−ＡＦ４８８、及びＣＤ８６−ＰＥ／Ｃｙ７（バイオレジェンド社）。次いで、成熟樹状細胞に、２μMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを３７℃で１時間ロードした。ペプチドをロードした後、樹状細胞を、ＰＢＳ中３mMのＥＤＴＡを用いて３７℃で５〜１０分間剥離させ、ＰＢＳで洗浄した。ワクチン接種のために、１００μlのＰＢＳ中マウス１匹あたり、１００万個のペプチドがロードされた樹状細胞を腹腔内注射した。
【０２１２】
１．１７  動物モデル
英国内務省及びケンブリッジ大学に従う特定病原体フリーの条件でマウスを繁殖及び飼育した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の以下のｌｏｘＰにフランキングする対立遺伝子の欠失は、ｄＬｃｋマウス２３：Ｈｉｆ１ａＦｌ／Ｆｌ  ３５、ＶｈｌＦｌ／Ｆｌ  ３６、及びＥｐａｓ１ＦｌＦｌ  ３７との繁殖を介して成し遂げられた。全てのマウスを、１０世代かけてＣ５７／Ｂ６バックグラウンドに戻し交配した。Ｈ−２Ｋｂの状況でオボアルブミン残基２５７〜２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を認識するマウスＴＣＲ−Ｖα２遺伝子及びＴＣＲ−Ｖβ５遺伝子についてのトランスジェニック挿入断片を含有しているＯＴ−Ｉマウス３８を、ＣＤ４５．１マウス３９と交配した。無作為化及びブラインド化を、全てのマウス実験に導入した。
【０２１３】
１．１８  統計分析
統計分析を、グラフパッドプリズム６ソフトウェアで実施した。一対比較を、適切な場合にはウェルチ補正と共に対応のないスチューデントｔ検定を使用して評価した。多重比較を、多重検定のためのボンフェローニ補正を含む、一元配置分散分析を用いて評価した。分類されたデータを、ボンフェローニ補正を含む二元配置分散分析によって評価することにより、多重比較について調整した。エラーバーは、図の説明文に示されているように標準偏差として示されている。
【０２１４】
１．１９  ｓｈＲＮＡ及び過剰発現
ｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウン実験のために、ｓｈＲＮＡを、ｐＭＫＯ．１ＧＦＰ（ｐＭＫＯ．１ＧＦＰは、William Hahnからの贈呈品であった、アドジーン社のプラスミド１０６７６番）にクローニングした。ｓｈＲＮＡにより媒介される標的遺伝子のノックダウンを、Ｌ２ｈｇｄｈｓｈＲＮＡ又はスクランブルｓｈＲＮＡを発現しているレトロウイルスを用いての形質導入によって成し遂げた。目的のｓｈＲＮＡを含有しているｐＭＫＯ．１ＧＦＰベクターを、リポフェクタミン２０００（サーモフィッシャー社）を使用してｐＣＬ−Ｅｃｏ（ｐＣＬ−Ｅｃｏは、Inder Vermaからの贈呈品であった（アドジーン社の１２３７１番））を用いてフェニックス細胞にトランスフェクトした。ウイルス上清を４８時間後に回収した。製造業者の説明書に従ってレトロネクチン（タカラバイオテック社）を使用して、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞をウイルス上清で形質導入した。実験は、図の説明文に示された時点で実施され、ＧＦＰを、選択マーカーとして使用した。Ｌ２ｈｄｇｈ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。Ｌ２ｈｄｇｈの発現のために、ベクターＳＦＧ．ｗｔＣＮｂ＿ｏｐｔ．ＩＲＥＳ．ｅＧＦＰ（Martin Puleからの贈呈品（アドジーン社のプラスミド２２４９２番）を使用して、挿入断片をマルチクローニングサイトで置換することによって、空ベクター対照を作製した。Ｃ末端のＦＬＡＧでタグ化されたＬ２ｈｄｇｈをコードしているマウスＤＮＡ配列を空ベクターにクローニングした。ｓｈＲＮＡ実験に関して、各酵素をコードするレトロウイルスを作製し、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を以前のとおりに形質導入した。細胞を、形質導入の翌日に２１％又は１％の酸素中に置き、ＧＦＰ＋細胞を７日後にフローサイトメトリーによって評価した。
【０２１５】
１．２０  インビボ存続実験
ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１＋マウス由来の全脾臓細胞を、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化した。４８時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブセレクションによって精製し、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下で７日間培養した。次いで、１００万個のＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型ＣＤ４５．２．２宿主マウスに静脈内注射した。３０日後、宿主マウスを供死して脾臓における導入された細胞の存続を評価した。細胞の絶対数を、カウントビーズ（CountBright、ライフテクノロジーズ社）を使用して決定した。
【０２１６】
１．２１  恒常的増殖
ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．１マウス及びＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウス由来の全脾臓細胞を、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化した。４８時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブセレクションによって精製し、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下で更に７日間培養した。次いで、ビヒクルで処置した細胞とＳ−２ＨＧで処置した細胞を１：１で混合し、ＣＦＳＥで標識し、その後、致死量以下の放射線で照射されたＣＤ４５．２／ＣＤ４５．２宿主に静脈内注射した。７日後、脾臓を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞の絶対数をカウントビーズ（CountBright、ライフテクノロジーズ社）を使用して決定した。
【０２１７】
１．２２  養子細胞免疫療法実験
養子細胞療法実験のために、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下、１０００nMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて活性化した。４８時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブセレクションによって精製し、ＩＬ−２及びビヒクル又は３００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステルの存在下で更に７日間培養した。ＯＴ−Ｉ細胞を、９〜１２日間樹立したＥＧ７−ＯＶＡ腫瘍を有する腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊのリンパが枯渇した又はリンパに満ちたマウスの静脈内に導入した。リンパ枯渇は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球の養子移植前の５Ｇｙの全身照射によって成し遂げられた。
【０２１８】
１．２３  ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた実験
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いての実験のために、細胞を磁気的に単離し、活性化し、３０UI/mLの組換えヒトＩＬ−２の存在下で１mLあたり１×１０６個の細胞の濃度で播種した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、６００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、８００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル、又はビヒクル（対照）の存在下で１４日間増幅した。１４日目に、ＣＤ８＋生細胞上でのＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯの表面発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０２１９】
２．  結果
本発明者らは、低い（フォンヒッペルリンドウ、ＶｈｌＦｌ／Ｆｌ）ＨＩＦシグナル伝達を有するＣＤ８＋Ｔリンパ球と、高い（Ｖｈｌ−／−）ＨＩＦシグナル伝達を有するＣＤ８＋Ｔリンパ球との間で有意に異なる代謝物を同定するための不偏メタボロミクスプロファイリング、並びに、これらの変化に対するＨＩＦ−１αの特定の寄与を制御するためのＨＩＦ−１α−ＶＨＬダブルノックアウト（Ｈｉｆ１α−／−Ｖｈｌ−／−）を使用した。教師なしクラスタリング及び主成分分析（図１）は、ＶｈｌＦｌ／Ｆｌ（ＷＴ）細胞からのＶｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球の分離を示す。Ｈｉｆ１α−／−Ｖｈｌ−／−は、このＷＴ対照と一緒にクラスター化し、このことはＨＩＦ−１αが、Ｖｈｌ欠失後の代謝変化の大半を媒介することを示す（図１）。解糖は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を維持するための不可欠な代謝経路であり１６、これらのデータは、ＶＨＬが、ＨＩＦ−１αの抑制を介してこれを負に調節し、効果は後期解糖中間体に最も顕著に現れることを示す。
【０２２０】
トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル及び関連する代謝物に関して、本発明者らは、ＶＨＬの欠損は、後期中間体を全体的に抑制するが、初期中間体は増加させることを見出す。顕著には、２ＨＧは、Ｖｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球において最も有意に強化された代謝物の１つとして位置づけられる（図２Ａ）。更に、Ｈｉｆ１α−／−Ｖｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧのレベルとＶｈｌＦｌ／ＦｌＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧのレベルは全く異ならず（図２Ｂ）、このことは、２ＨＧの増加は、ＶＨＬが除去された場合のＨＩＦ−１αの活性化に続発することを示唆する。本発明者らは、定量液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＶｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧレベルを検証した（図２Ｃ）。本発明者らはまた、２ＨＧが、ＶＨＬを安定に発現している同質遺伝子対照と比較して、ＶＨＬ-nullのＲＣＣ４細胞において上昇していることを認め（図２Ｄ）、このことは、この上昇におけるＶＨＬの役割を実証する。興味深いことに、２ＨＧはまた、ＨＩＦ−２αを専ら発現している７８６−Ｏ腎がん細胞においても上昇している（図２Ｅ）。ＶｈｌＦｌ／Ｆｌマウス（このマウスでは本発明者らは実際に、ｃｒｅ発現アデノウイルスを用いての感染によってＶｈｌを欠失させた）から単離したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）もまた、有意に上昇した２ＨＧレベルを示す（図２Ｆ）。要するに、本発明者らのデータは、ＶＨＬ−ＨＩＦ系は２ＨＧレベルを調節すること、及び、恒常的なＨＩＦ−１αのシグナル伝達はＶｈｌ-nullのＣＤ８＋Ｔリンパ球中のこの効果の基礎にあるようであることを示す。
【０２２１】
Ｒ−２ＨＧは、多くの異なるがんにおいて発がん遺伝子であるＩＤＨ１及びＩＤＨ２の突然変異によって生じる１７、１８。しかしながら、Ｓ−２ＨＧの蓄積は、低酸素に曝された表面上は野生型のＩＤＨ１／２を有する細胞９、１０、及びミトコンドリア機能不全を有する細胞１９、２０、並びに、腎細胞がん２１において起こる。２１％酸素中でエクスビボで培養した活性化した野生型ＣＤ８＋Ｔリンパ球では、２ＨＧの細胞内濃度は１９０μM±３０μMである（図３Ａ及び３Ｂ）。１％酸素中では、２ＨＧのレベルは顕著に上昇する（図３Ａ及びＣ）。顕著には、２ＨＧの平均細胞内濃度は低酸素では１．７１mM±０．２５mMである（図３Ｂ）。このような高いレベルの２ＨＧを考えると、低酸素中での初代ＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖がヒトにおいてＲ−２ＨＧの産生を引き起こすことが知られている突然変異を生じるというありそうにない可能性を排除するために、本発明者らは、Ｉｄｈ１及びＩｄｈ２の両方の保存された活性部位のアルギニン２２を配列決定した１７。野生型Ｉｄｈ１／２と一致して、正常酸素圧で活性化したＣＤ８＋初代Ｔリンパ球においてはＳ−２ＨＧが全２ＨＧプールの６０％近くを占め、これは低酸素においては９０％まで増加することを、２ＨＧのＳエナンチオマーとＲエナンチオマーの分割は示す（図３Ｄ）。
【０２２２】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の顕著なＳ−２ＨＧの上昇が低酸素で起こり、これはＶＨＬの欠損後のＨＩＦ−１αの存在に依存しているので、本発明者らは、ＨＩＦのシグナル伝達が、これらの細胞における２ＨＧの低酸素での蓄積を調節すると判断した。これを試験するために、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のＨｉｆ１α又はＨｉｆ２αの欠失のための、遠位のＬｃｋプロモーター下で発現されているｃｒｅリコンビナーゼと共に、ｌｏｘＰにフランキングしているＨｉｆ１α又はＥｐａｓ１（本明細書ではＨＩＦ−２αと称される）対立遺伝子を有するマウスを作製した。Ｈｉｆ１α及びＨｉｆ２αの両方についての欠失効率は、２１％及び１％の酸素の両方においてエクスビボで増幅したＣＤ８＋Ｔリンパ球において９８％超であり、生存率の差異は、試験された時点においては全く観察されなかった。計４日間の増幅後（最後の２日間は２１％又は１％酸素のいずれかで）、本発明者らは、２ＨＧの高い細胞内濃度は、低酸素においてＨｉｆ２α−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球では維持されるが、Ｈｉｆ１α−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球では維持されていないことを見出す（図３Ｅ及びＦ）。データを生細胞又はタンパク質含量のいずれかに対してノーマライズした場合にも同じことが当てはまる。本発明者らは次に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の正常酸素圧での活性化の時間経過にわたる２ＨＧレベルを決定することを探究した。新たに単離したナイーブなＣＤ８＋Ｔリンパ球中の２ＨＧは検出不可能であり、一方、そのレベルは、αＣＤ３抗体及びαＣＤ２８抗体を用いての活性化後に高く上昇している；これは、培養２日目までに起こり、最大の上昇は４日目までに及ぶ（図３Ｇ）。その後、２ＨＧレベルは活性化後７日目及び９日目までに減少する（図３Ｇ）；このことは、Ｔ細胞受容体トリガー後のこの代謝物の産生の経時的調節を示す。
【０２２３】
本発明者らは次に、ＨＩＦ−１αが、低酸素により誘導される２ＨＧの産生を促進する代謝経路を決定することを探究した。中心炭素の代謝に関与する酵素の発現レベルは、明りょうな解糖誘導及びＴＣＡサイクルの抑制を示す。驚くべきことに、グルタミナーゼ２（Ｇｌｓ２）もまた低酸素によって誘導される。近年の報告は、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ及びＭＤＨ１／２）、並びに、Ｓ−２ＨＧから、低酸素におけるＳ−２ＨＧの可能性ある供給源としての２−オキソグルタラート（Ｌ２ＨＧＤＨ）９、１０への変換に関与する該デヒドロゲナーゼの減少を関係づける。初代Ｈｉｆ１α−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球中の、低酸素でのこれらの酵素の発現は、ＭＤＨ１／２を介したＳ−２ＨＧの蓄積が起こりそうもないことを示唆する。更に、Ｈｉｆ１α−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球に見られるＬ２ＨＧＤＨの増加は僅かであるが、Ｓ−２ＨＧレベルの低減の原因となり得、ＨＩＦ−１αにより媒介されるＬ２ＨＧＤＨの抑制を示し得る。しかしながら、予想されたとおり、ＨＩＦ−１α依存的なピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（Ｐｄｋ１）及びＬｄｈａの増加は、低酸素において顕著であり；興味深いことに、Ｇｌｓではなくグルタミナーゼ２（Ｇｌｓ２）が同じようなＨＩＦ−１αへの依存性を示し、このことは低酸素でのＳ−２ＨＧ産生におけるグルタミンの代謝を関係付ける。実際に、Ｕ−１３Ｃ−グルコース又はＵ−１３Ｃ−グルタミントレーサーを使用して、本発明者らは、グルタミンが１％酸素中において２ＨＧの供給源であり９（図４Ａ）；ｍ＋５同位体分子種が占め、このことは、おそらく乱雑なＬＤＨＡ活性を介した９、グルタミン由来２−オキソグルタラートからＳ−２ＨＧへの直接変換１９を示す。２１％酸素中においてはグルコース及びグルタミンの両方からの２ＨＧへの同じような寄与がある（図４Ｂ）。しかしながら、絶対的なスクシナートのプールは変化せず、一方、フマラート及びマラートのプールは低酸素において減少し；興味深いことに、グルタマートのプールは増加する（図５Ａ）。これはＶｈｌ−／−ＣＤ８＋Ｔリンパ球においても明らかであり、低酸素による細胞内グルタマートの誘導は、ＨＩＦ−２α（図５Ｃ）ではなくＨＩＦ−１α（図５Ｂ）に依存する。ＰＤＫ１の活性化、その後のピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）のリン酸化は、グルタミノリシス２４、２５を駆動する還元的グルタミン代謝を調節する重要な点である。したがって、ＰＤＫ１の阻害は、低酸素により誘導されるＨＩＦ−１α依存性Ｓ−２ＨＧの蓄積を消失させるはずである。実際に、野生型初代ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のジクロロアセタート（ＤＣＡ）を用いてのＰＤＫ１の薬理学的阻害は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）のリン酸化を大きく減少させ（図５Ｄ）、低酸素におけるＳ−２ＨＧレベルを減少させる（図５Ｅ）。ＰＤＫ１活性の阻害はまた、低酸素により誘導されるグルタマートのプールの増加も妨害する（図５Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＨＩＦ−１α−ＰＤＫ１系による低酸素でのＣＤ８＋Ｔリンパ球中の中心炭素の代謝の再構築が、グルタミン由来２−オキソグルタラートを生じ、これは次いで下流酵素によってＳ−２ＨＧに���換されるという考えを奨励する。
【０２２４】
Ｓ−２ＨＧは、ＶＨＬ依存的分解のためにＨＩＦ−１αをヒドロキシル化する２−オキソグルタラート依存性プロリルヒドロキシラーゼの強力な阻害剤であると報告されている３、４。これと一致して、本発明者らは、ＨＩＦ−１αが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球において、細胞透過性Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての処置によって濃度依存的に安定化されることを見出す（図６Ａ）。同じことがＲ−２ＨＧ−オクチルエステルについても観察されるが（図６Ａ）、細胞不透過性である両分子の遊離酸形では観察されない（図６Ａ）。ＨＩＦ−２αタンパク質の量の増加も認められる（図６Ｂ）。少なくともＨＩＦ−１αについては、この量の増加は、継続的な処置の７日目でさえ見られる（図６Ｂ）。更に、ＰＤＨ−Ｅ１αのリン酸化の増加（図６Ａ）、グルコース取り込み増加（図７Ａ）、乳酸塩分泌の増加（図７Ｂ）、及びＶＥＧＦ産生の増加（図７Ｃ）が認められる。これらの多くの変化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能に関連している１１、１６；しかしながら、意外なことに、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて処置した抗原特異的ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解能は顕著に低い（図８Ａ）。これは、インターフェロン−γの分泌減少（図８Ｂ）及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生増加に関連している（図８Ｃ）。また、ＩＬ−２が補充されなくても生存能が上昇し（図８Ｄ）、これはおそらく自己分泌型生存促進経路を反映している。これらの効果は、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての一過性及び長期の処置の両方の後に転写レベルで媒介される（図８Ｅ、８Ｆ）。これらの効果は、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルでの処置よりもＳ−２ＨＧ−オクチルエステルでの処置の方がより顕著である。
【０２２５】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球の分化及び機能に関与する遺伝子の更なる転写プロファイリングは、エフェクタープログラム及び記憶プログラムの両方が改変されていることを示す（図８Ｇ）。特に、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いての急性処置（２４時間）は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の分化２６の重要なメディエーターであるＥｏｍｅｓ１５の転写レベルを抑制するが、その後、継続的な７日間の処置後にはより高い発現レベルとなり（図８Ｆ）、そして、活性化後に増殖は減少する（図９Ａ〜Ｃ）。増殖の制限は、Ｒ−２ＨＧ−オクチルエステルではより顕著ではない。要するに、これらのデータは、ＨＩＦ−１α活性の促進にも関わらず、Ｓ−２ＨＧ及びＲ−２ＨＧは、エフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球の形成を奨励するのではなく、むしろ記憶様特性を有するものの形成を奨励する２７。実際に、記憶に関連した転写物の発現は増加している（図８Ｉ）。したがって、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の分化状態を識別するために使用される２つの表面マーカーであるＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４のレベルを調べた２８。Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルによる処置は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球（図１０Ａ及び１０Ｂ）及びポリクローナルなＣＤ８＋Ｔリンパ球（図１１Ａ〜Ｃ）の両方の設定においてＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｈｉｇｈ細胞集団の形成を促進する。更に、この効果は抗原刺激のレベル（図８Ｈ）、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの用量（図１２Ａ及び１２Ｂ）に依存し、また処置を中止すれば元に戻ることが可能である（図１２Ｃ、１２Ｄ、及び１２Ｅ）。興味深いことに、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４４ｈｉｇｈエフェクター細胞を処置した場合には効果は起こらず（図１２Ｄ及び１２Ｅ）、このことは、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルによる新たに活性化されたナイーブ細胞の処置は、既に確立しているエフェクター細胞集団の分化を奨励するのではなくむしろ、記憶様サブセットの形成を促進することを実証する。更に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球をα−ケトグルタル酸オクチルエステルで処置した場合には効果は観察されなかった（図１６及び１７）。最後に、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルを用いて７日間前処置した養子移植したＣＤ４５．１ ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球（図１３Ａ）は、養子移植から３７日後に、ワクチン接種に応答して増強したインビボ想起を示す（図１３Ｂ〜Ｆ）。
【０２２６】
インビトロでの活性化後のＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションは、ＨＩＦ−１αが存在しない場合には起こらない２９；このＨＩＦ−１αの欠失は、ＣＤ６２Ｌに対するＳ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルによる処置の効果を遮蔽する（図１１Ａ、Ｂ）。ＨＩＦ−２αは、ＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションにおいて役割を全く果たしていないようであり、したがって、Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル又はＲ−２ＨＧ−オクチルエステルによる処置は、ＨＩＦ−２α null細胞において野生型対照において阻害するのと同じ程度にＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションを阻害する（図１１Ａ、Ｃ）。したがって、この効果は、ＨＩＦ経路によってではなく、他の２−オキソグルタラート依存性ジオキシゲナーゼ、例えばヒストン及びＤＮＡをそれぞれエピジェネティックに修飾する十文字Ｃ（ＪｍｊＣ）及び１１個の転座（Ｔｅｔ）タンパク質の修飾によって媒介されることができる４、３０、３１。代謝経路のリプログラミング及びラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）活性の修飾もまた、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の記憶形成の公知の変更因子であり３２、３３、４４、４５；これらの両方が２ＨＧによって影響を受ける１０、３４、３６。しかしながら、ｍＴＯＲの修飾は、本明細書に記載されるＳ−２ＨＧ及びＲ−２ＨＧによる記憶様ＣＤ８＋Ｔリンパ球の形成の誘導に関与しない（図１５）。なぜなら、ｍＴＯＲを阻害するのに必要とされる用量は、記憶形成に必要とされる用量をはるかに上回るからである。
【０２２７】
Ｓ−２ＨＧによる細胞の処置は、多能性に関連した遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４）の発現を誘導する（図１４）。更に、Ｓ−２ＨＧにより処置したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＩＦ−１αに非依存的に、より多くのＣＤ１２７（図３ｃ）、ＣＤ４４、４１ＢＢ、及びＥｏｍｅｓを発現する（図１８）。興味深いことに、Ｓ−２ＨＧにより処置した細胞はまたより少ないＰＤ−１を発現する（図１８）。
【０２２８】
細胞透過性Ｓ−２ＨＧを用いての処置の不在下において内因的に産生されたＳ−２ＨＧの役割を決定するために、Ｓ−２ＨＧを２−オキソグルタラートに選択的に酸化するデヒドロゲナーゼであるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ２ｈｇｄｈ）の過剰発現（図１９Ａ）を実施した。Ｌ２ｈｇｄｈの過剰発現は、２１％及び１％の酸素中の両方において活性化後にＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションを促進し（図１９Ｂ）、このことは、内因的に産生されたＳ−２ＨＧがＣＤ６２Ｌの発現を調節することを示す。更に、Ｌ２ｈｇｄｈの過剰発現により、ＫＬＲＧ１Ｈｉｇｈ細胞の比率が増加し、これは外因性Ｓ−２ＨＧの存在下では減少する（図１９Ｃ）。逆に、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＬ２ｈｇｄｈの成功裏なノックダウン（図２０Ａ）は、特に１％酸素中において内因性Ｓ−２ＨＧレベルを上昇させ（図２０Ｂ）、ＣＤ６２Ｌの維持を促進した（図２０Ｃ）。事実、Ｌ２ｈｇｄｈの抑制は、低酸素への曝露に応答したＣＤ６２Ｌの減少を遮断した（図２０Ｃ）。同じ効果が、低酸素条件においてＣＤ１２７の量でも見られる（図２０Ｄ）。これらのデータは、Ｌ２ｈｇｄｈ活性が、内因性Ｓ−２ＨＧレベルを制御することによって、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上の重要な表現型表面マーカーの発現を調節することを実証した。これらの表現型効果は、記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球に見られ、Ｓ−２ＨＧによるＣＤ８＋Ｔリンパ球のエクスビボでの処置が、養子細胞移植の状況で長期存続及び生存率を増強し得るという示唆を提供する４７。
【０２２９】
したがって、本発明者らは、ＣＦＳＥで標識されたビヒクル、及びＳ−２ＨＧで処置したＣＤ４５．１．１又はＣＤ４５．１．２ ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、リンパを枯渇させた宿主に同時導入し（図２１Ａ）、記憶細胞の特徴である恒常的増殖能を評価した４８、４９。不完全な混合に因り、両実験におけるＳ−２ＨＧにより処置した細胞は、同時導入する直前にビヒクルで処置した細胞と共にプールされる場合、数値的に不利であった（図２１Ａ）。このことにも関わらず、Ｓ−２ＨＧにより処置した細胞は、より大きな恒常的増殖を示し（図２１Ｂ〜Ｃ）、より多くの細胞が５回以上分裂した（図２１Ｄ）。これを考慮し、次いで、本発明者らは、Ｓ−２ＨＧにより処置した細胞がインビボで長時間存続する能力を評価した。Ｓ−２ＨＧにより前処置した、養子移植したＣＤ４５．１ ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、導入から３０日後に劇的に増強された存続を示した（図２２Ａ）。更に、それらは、ナイーブ細胞と比較して、記憶細胞によって発現されるマーカーである５０、５１、上昇したレベルのＣＤ４４、ＣＤ１２７、及びＢｃｌ−２を発現した（図２２Ｂ）。ＳＩＩＮＦＥＫＬをロードした樹状細胞を用いてのワクチン接種に応答して、Ｓ−２ＨＧにより処置したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球は優れた想起応答を開始した（図２３Ａ〜Ｃ）。これと一致して、Ｓ−２ＨＧにより前処置したＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、リンパが枯渇した（図２４Ａ）及びリンパに満ちた（図２４Ｂ）腫瘍を有するマウスの両方において、インビボで腫瘍増殖を制御する上でより熟達している。まとめると、これらのデータは、Ｓ−２ＨＧによるエクスビボでの処置は、それがインビボで導入された場合、導入されなければエフェクター分化によって減少するであろう、増殖能及び生存能が高まった状態で細胞を維持することを実証する。
【０２３０】
ヒトＴ細胞分化を改変させるＳ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの能力を決定するために、本発明者らは、インビトロで健康なドナーからヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し活性化させた。ビヒクル対照、６００μMのＳ−２ＨＧ−オクチルエステル（図２５Ａ）又は８００μMのＲ−２ＨＧ−オクチルエステル（図２５Ｂ）の存在下での増幅後、本発明者らは、フローサイトメトリーによってヒトＴ細胞記憶マーカーであるＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯの発現を調べた。Ｓ−２ＨＧ−オクチルエステル及びＲ−２ＨＧ−オクチルエステルの両方が、それぞれのビヒクル対照と比較した場合、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯの発現を誘導した。
【０２３１】
本発明者らのデータは、Ｓ−２ＨＧ及びＲ−２ＨＧの生理学的産生が、記憶様ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞集団の形成を誘導し、状況に依存的な様式で免疫の調節を可能とすることを示す。明らかに、これらの代謝物及び他の記憶誘導化合物の薬理学的投与は、Ｔ細胞応答性の治療的操作において際立った効力を有し、養子Ｔ細胞療法における活性を増強するための新規なストラテジーを提供する。
【０２３２】
参考文献
【表１】
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2018531613.tif 000009
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2018531613.tif 000018
【図２Ｅ】
2018531613.tif 000019
【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
2018531613.tif 000021
【図３Ｂ】
2018531613.tif 000022
【図３Ｃ】
2018531613.tif 000023
【図３Ｄ】
2018531613.tif 000024
【図３Ｅ】
2018531613.tif 000025
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2018531613.tif 000027
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
2018531613.tif 000052
【図１０Ｂ】
2018531613.tif 000053
【図１１Ａ】
2018531613.tif 000054
【図１１Ｂ】
2018531613.tif 000055
【図１１Ｃ】
2018531613.tif 000056
【図１２Ａ】
2018531613.tif 000057
【図１２Ｂ】
2018531613.tif 000058
【図１２Ｃ】
2018531613.tif 000059
【図１２Ｄ】
2018531613.tif 000060
【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
2018531613.tif 000087
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
2018531613.tif 000093
【図２５Ａ】
2018531613.tif 000094
【図２５Ｂ】
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【配列表】
2018531613000001.app
【国際調査報告】
2018531613.tif 000096
2018531613.tif 000097
2018531613.tif 000098