(57)【要約】  被験体における敗血症又は内毒素血症を治療する方法であって、その被験体に、或る量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニスト又は或る量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニスト又はＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビター又はＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターを投与することを含む、方法。
【請求項５】
前記量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターが投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターが投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が既に敗血症に罹っており、かつ前記方法は、該被験体における敗血症を治療するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体における敗血症の発症を低下又は抑制するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体が既に内毒素血症に罹っており、かつ前記方法は、該被験体における内毒素血症を治療するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストである、請求項１若しくは２又は７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストである、請求項１、３又は７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｃｘ４３ヘミチャネルの細胞外ドメインの配列を有するペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、配列ＥＮＶＣＹＤ（配列番号１）又はＮＶＣＹＤＫ（配列番号２）を有するペプチドを含む、請求項１若しくは２又は７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７である保護性ペプチドアンタゴニストと重複している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７である保護性ペプチドアンタゴニストと重複していない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
カルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムが投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
カルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムは、植物性物質を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムは、それぞれ合成により製造されたカルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、抗Ｐａｎｘ１モノクローナル抗体である、請求項１若しくは２又は７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、抗Ｃｘ４３モノクローナル抗体である、請求項１、３又は７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
被験体における虚血−再潅流障害を治療する方法又は被験体における虚血−再潅流障害の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、被験体における虚血−再潅流障害の治療に十分な量の、又は被験体における虚血−再潅流障害の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｃｘ４３ヘミチャネルの細胞外ドメインの配列を有するペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、配列ＥＮＶＣＹＤ（配列番号１）又はＮＶＣＹＤＫ（配列番号２）を有するペプチドを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７である保護性ペプチドアンタゴニストと重複している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７である保護性ペプチドアンタゴニストと重複していない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記虚血−再潅流障害は、肝虚血−再潅流障害である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年８月６日付けで出願された米国仮出願第６２／２０１，７５９号の利益を主張するものであり、その内容は引用により本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
本出願全体にわたり、様々な特許及びその他の刊行物が、括弧内の番号によって参照される。参考資料の全引用は、本明細書の最後に記載されている。本明細書で参照されるこれらの参考文献並びに全ての特許文献、特許出願公報及び書籍の開示は、引用することによりその全体が本出願の一部をなし、こうして本発明の属する技術分野がより十分に記載される。
【０００３】
細菌感染及び敗血症は、米国だけでも年間２２５０００人を超える犠牲者の命を奪う、集中治療室における最も頻度の高い死因である。敗血症の病因は、十分に理解されずにいるが、微生物感染への応答において自然免疫細胞（ＩＭＣ）によって伝播される調節不能な全身性炎症を原因とし（１、２）、炎症誘発性メディエーター（例えば、ＨＭＧＢ１、ＣＩＲＰ及びＮＯ）によって維持される調節不全の炎症応答に一部起因する。致死的全身性炎症（ＬＳＩ）の後期メディエーターとしてのＨＭＧＢ１の影響力の大きい発見（非特許文献１）は、ＨＭＧＢ１分泌の薬理学的調節の根底をなす複雑なメカニズムの調査を促した。
【０００４】
本発明は、ヘミチャネル活性を介したＨＭＧＢ１分泌の調節を含む敗血症の薬理学的治療の改善への要望に取り組むものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wang et al., Science, 285: 248-51, 1999
【発明の概要】
【０００６】
被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニスト又はＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法が提供される。
【０００７】
また、被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビター又はＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターを投与することを含む、方法が提供される。
【０００８】
また、被験体における虚血−再潅流障害を治療する方法又は被験体における虚血−再潅流障害の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、被験体における虚血−再潅流障害の治療に十分な量の、又は被験体における虚血−再潅流障害の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法が提供される。
【０００９】
本発明の更なる目的は、以下の記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】主要な甘草成分及び誘導体の化学構造。主要な甘草成分であるグリチルリチン酸（glycyrrhizic acid）（ＧＺＡ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルクロニダーゼ（glucuronidase）によってグリチルレチン酸（glycyrrhetinic acid）（ＧＴＡ又はエノキソロン）へと加水分解され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＧＴＡを、「カルベノキソロン」（ＣＢＸ）と呼ばれるコハク酸エステルへとエステル化することができる。
【図２】ＣＢＸは、ＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌及びＮＯ産生を効果的に抑制した。初代腹腔マクロファージを、粗製ＬＰＳでＣＢＸの不存在下又は存在下にて１６時間かけて刺激し、ＨＭＧＢ１、ＮＯ及びＴＮＦの細胞外レベルを、ウェスタンブロッティング、グリース反応及びＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定した。ＡＵ（任意単位）、＊（「＋ＬＰＳ単独」に対してＰ＜０．０５）。
【図３】ＣＢＸ及びｏＡＴＰ（Ｐ２Ｘ７Ｒアンタゴニスト）は、粗製ＬＰＳに誘導されるＰＫＲリン酸化を抑えた。初代腹腔マクロファージを、粗製ＬＰＳでＣＢＸ（図３Ａ）又はｏＡＴＰ（図３Ｂ）の不存在下又は存在下にて１６時間かけて刺激し、全ＰＫＲ及びリン酸化ＰＫＲ（「Ｐ−ＰＫＲ」）の細胞レベルを、ハウスキーピングタンパク質のβ−アクチンに関するウェスタンブロッティング分析によって測定した。＊（「−ＬＰＳ−ＣＢＸ又はｏＡＴＰ」に対してＰ＜０．０５）、＃（「＋ＬＰＳ単独」に対してＰ＜０．０５）。
【図４】ＣＢＸの遅延投与は、マウスを致死的敗血症から回復させた。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを致死的敗血症に罹患させ（ＣＬＰによる誘導）、そして生理食塩水又はＣＢＸを、示された用量でＣＬＰ後＋２４時間の時点、＋４８時間の時点及び＋７２時間の時点で腹腔内投与した。動物生存率を観測し、カプランマイヤー法を使用して、群間の差を比較した。矢印は、薬剤投与の時点を示している。＊（生理食塩水対照群に対してＰ＜０．０５）。
【図５】ＬＰＳ及びＳＡＡは、マウスマクロファージ及びヒト単球においてＰａｎｘ１発現を誘導する。初代マウス腹腔マクロファージ（図５Ａ）及びヒト末梢血単核細胞（ＨｕＰＢＭＣ、図５Ｂ）を、粗製ＬＰＳ又はＳＡＡで６時間かけて刺激し、細胞Ｐａｎｘ１レベルを、免疫細胞化学（図５Ａ）及びウェスタンブロッティング分析（図５Ｂ）によって評価した。
【図６】Ｃｘ４３特異的ペプチドアンタゴニスト及びＰａｎｘ１特異的ペプチドアンタゴニストは、敗血症の致死率に様々な影響を及ぼす。図６Ａ）Ｂａｌｂ／ＣマウスをＣＬＰに誘導される敗血症に罹患させ、そのマウスに生理食塩水又はＣｘ４３特異的ミメティックペプチド若しくはＰａｎｘ１特異的ミメティックペプチド（Ｇａｐ２６又は１０Ｐａｎｘ；１２０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＬＰ後＋６時間の時点、＋１８時間の時点及び＋３６時間の時点で腹腔内投与した。動物生存率を２週間にわたり観測し、カプランマイヤー法を使用して、群間の差を比較した。２つの独立した実験のまとめは同様の結果をもって示された。＊（生理食塩水群に対してＰ＜０．０５）。図６Ｂ）３種のミメティックペプチドアンタゴニスト：Ｇａｐ１９、Ｇａｐ２６及びＧａｐ２７の相対的局在を示すためのＣｘ４３の膜トポロジー。
【図７】小さなＣｘ４３ペプチドアンタゴニストの合成。コネキシン４３（Ｃｘ４３）の細胞外ループ１（ＥＬ１）に相当するペプチドを合成した（下方の図に示される１０種のペプチド）。これらのペプチドを、感染惹起性又は損傷惹起性の炎症性疾患の動物モデルにおいて、マクロファージのヘミチャネル活性の阻害におけるそれらの活性及び保護効力についてスクリーニングした（Ｐ１は、配列番号３であり、Ｐ２は、配列番号４であり、Ｐ３は、配列番号５であり、Ｐ４は、配列番号６であり、Ｐ５は、配列番号１であり、Ｐ６は、配列番号２であり、Ｐ７は、配列番号７であり、Ｐ８は、配列番号８であり、Ｐ９は、配列番号９であり、かつＰ１０は、配列番号１０である）。上方の図に示されるＣｘ４３配列は、配列番号１１である。Ｃｘ４３細胞外ループ１は、配列番号１２である。Ｇａｐ２６として知られる配列を有するＣｘ４３細胞外ループ１の部分（配列番号１３）は、配列番号１２の残基２２から残基３４までの範囲である。
【図８】Ｐ５ペプチド（配列番号１）は、細菌性エンドトキシンに誘導される色素取り込みを有意に阻害した。ルシファーイエロー色素の取り込みを使用することで、コネキシン４３開口型ヘミチャネル活性を測定した。簡潔には、ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＬＰＳでＣＢＸ又はその他のＣｘ４３ペプチドアンタゴニスト（ＧＡＰ２６（配列番号１３）又はＰ５）の不存在下又は存在下にて１６時間かけて刺激した。引き続き、細胞培養物を、ルシファーイエロー（ＬＹ、１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に１５分間にわたりインキュベートし、１×ＰＢＳによる３回の激しい洗浄後に２％パラホルムアルデヒドで固定した。拡散された蛍光シグナルを有する細胞の数を、蛍光顕微鏡下で計数した。点状（punctate）の蛍光シグナルを有する細胞は除外した。それというのも、点状のシグナルは、ＬＹ色素の食作用（Ｃｘ４３ヘミチャネルを通じた受動拡散ではなく）により生ずると見られるからである。
【図９】Ｐ５ペプチドは、致死的敗血症を有意に抑えた。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（雄、２０ｇ〜２５ｇ、７週齢〜１０週齢）をＣＬＰにより致死的敗血症に罹患させ、そして対照の生理食塩水（０．２ｍｌ／マウス）又は示されたペプチド（１０．０ｍｇ／ｋｇ）でＣＬＰ後＋０．５時間の時点、＋２４時間の時点で腹腔内投与した。動物生存率を２週間までの間にわたり評価し、カプランマイヤー法を使用して、群間の死亡率の差を比較した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。ここで留意すべきは、ペプチド番号２、番号３、番号４、番号８、番号９及び番号１０は、致死的敗血症に対する保護をもたらさなかったことである。しかしながら、Ｐ５（配列番号１）は、動物の生存を劇的にかつ有意に高めた。より低い程度で、Ｐ６（配列番号２）も、致死的敗血症の動物モデルにおいて保護効果を示した（データは示さず）。
【図１０】Ｃｘ４３ペプチドアンタゴニストの静脈内投与は、肝虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）障害に対する保護をもたらした。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（２０ｇ〜２５ｇ）を、肝動脈及び門脈を６０分間にわたり一時的にクランプする（それは一般的に肝臓の７０％に虚血を起こす）ことによって肝虚血／再潅流に陥らせた。再潅流の開始時に、０．２ｍｌの生理食塩水、Ｐ５（ＥＮＶＣＹＤ；体重１ｋｇ当たり１０．０ｍｇ）又はＰ５Ａ（ＥＮＶＳＹＤ（配列番号１４）；体重１ｋｇ当たり１０．０ｍｇ）を、内頚静脈を介して注入した。虚血発症から２４時間の時点で、動物を安楽死させて、血液を採取し、肝臓障害マーカー、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルを市販のキットを用いて測定した。ここで留意すべきは、Ｐ５ペプチドは、Ｉ／Ｒ障害に対して有意に保護を増進したことである。＊（シャム対照に対してＰ＜０．０５）；＃（生理食塩水群（「Ｉ／Ｒ」）に対してＰ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニスト又はＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法が提供される。
【００１２】
一実施形態においては、上記量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストが投与される。
【００１３】
一実施形態においては、上記量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストが投与される。
【００１４】
また、被験体における敗血症若しくは内毒素血症を治療する方法又は被験体における敗血症の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、敗血症若しくは内毒素血症の治療に十分な量の、又は敗血症の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビター又はＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターを投与することを含む、方法が提供される。
【００１５】
一実施形態においては、上記量のＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターが投与される。一実施形態においては、上記量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターが投与される。
【００１６】
上記方法の被験体は、既に敗血症に罹っていてよく、該方法は、被験体における敗血症を治療するものである。
【００１７】
一実施形態においては、上記方法は、被験体における敗血症の発症を低下又は抑制するものである。
【００１８】
上記方法の被験体は、既に内毒素血症に罹っていてよく、該方法は、被験体における内毒素血症を治療するものである。
【００１９】
また、被験体における虚血−再潅流障害を治療する方法又は被験体における虚血−再潅流障害の発症を低下若しくは抑制する方法であって、その被験体に、被験体における虚血−再潅流障害の治療に十分な量の又は被験体における虚血−再潅流障害の発症の低下若しくは抑制に十分な量のＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、方法が提供される。一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストである。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｃｘ４３ヘミチャネルの細胞外ドメインの配列を有するペプチドである。一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、配列ＥＮＶＣＹＤ（配列番号１）又はＮＶＣＹＤＫ（配列番号２）を有するペプチドを含む。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７又はＧａｐ１９である保護性ペプチドアンタゴニストと重複している。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７又はＧａｐ１９である保護性ペプチドアンタゴニストと重複していない。一実施形態においては、虚血−再潅流障害は、肝虚血−再潅流障害である。
【００２０】
上記方法の一実施形態においては、アンタゴニストであるカルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムが投与される。一実施形態においては、カルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムは、植物性物質を含まない。一実施形態においては、カルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムは、それぞれ合成により製造されたカルベノキソロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸又はグリチルリチン酸モノアンモニウムである。
【００２１】
上記方法の一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストである。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｃｘ４３ヘミチャネルの細胞外ドメインの配列を有するペプチドである。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７である保護性ペプチドアンタゴニストと重複している。一実施形態においては、ペプチドアンタゴニストは、Ｇａｐ２６又はＧａｐ２７又はＧａｐ１９である保護性ペプチドアンタゴニストと重複していない。
【００２２】
上記方法の一実施形態においては、Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストであってよい。該方法の一実施形態においては、Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、抗Ｐａｎｘ１モノクローナル抗体である。該方法の一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、抗Ｃｘ４３モノクローナル抗体である。
【００２３】
上記方法の一実施形態においては、Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、１５００Ｄａ以下の小さな有機分子である。該方法の一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、１５００Ｄａ以下の小さな有機分子である。
【００２４】
上記方法の一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質のアンタゴニストは、ギャップ結合アンタゴニストではない。
【００２５】
一実施形態においては、Ｐａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターは、抗Ｐａｎｘ１のｓｉＲＮＡである。一実施形態においては、Ｃｘ４３ヘミチャネルタンパク質発現のインヒビターは、抗Ｃｘ４３のｓｉＲＮＡである。
【００２６】
本発明のアンタゴニストは、両方の種類のヘミチャネルを標的とし得るか、又は一方の種類のヘミチャネルをもう一方を上回って標的とし得る。例えば、小さな分子であるプロベネシドは、Ｐａｎｘ１に関する、より特異的な（Ｃｘ４３よりも）インヒビターであることが示唆されているが（９９）、その一方で、Ｃｘ４３の細胞内ループ（ＩＬ１）に相当するもう１つのミメティックペプチドのＧａｐ１９（図６Ｂ）は、Ｃｘ４３ギャップ結合コミュニケーション又はＰａｎｘ１チャネル活性に影響を及ぼすことなく、Ｃｘ４３ヘミチャネル活性（ＡＴＰ放出又は色素取り込みによって現れる）を特異的に阻害する（１００）。これらのそれぞれは、本発明によって包含される。
【００２７】
一般に、作用物質（例えば、治療剤、組成物及び／又は製剤）の「有効な」量は、規定の効果を達成し、所望の生物学的応答を惹起するのに有効な量である。幾つかの実施形態においては、或る物質の治療的有効量は、疾患、疾病及び／又は病態に罹っている又は罹りやすい被験体に投与される場合に、上記疾患、疾病及び／又は病態の１つ以上の症状の治療、診断、予防及び／又はその発症の遅延のために十分な量である。当業者に明らかであるように、或る物質の有効量は、所望の生物学的終点、送達されるべき物質、その化合物の薬物動態、標的細胞又は標的組織、治療される疾患、投与方式及び患者等のような要因に応じて変動し得る。例えば、疾患、疾病及び／又は病態の治療のための組成物及び／又は製剤の有効量は、上記疾患、疾病及び／又は病態の１つ以上の症状又は特徴を緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防する、その発症を遅延する、その重症度を低下させる、及び／又はその発生率を低下させる量である。通例、有効量は、一連の個々の用量全体を通じて投与されることを当業者であれば理解するであろう。幾つかの実施形態においては、医薬的な内容で使用される場合の用語「有効量」（例えば、医薬的有効量）は、或る作用物質が、所望の治療効果を達成するのに十分な量で存在することを意味する。
【００２８】
本発明の方法によって包含される投与経路には、限定されるものではないが、以下の、耳内投与、頬部投与、結膜投与、皮膚投与、皮下投与、子宮頚部投与、洞内投与、気管内投与、腸内投与、硬膜外投与、血液透析による投与、間質内投与、腹腔内投与、羊膜内投与、動脈内投与、関節内投与、胆管内投与、気管支内投与、卵巣被膜内（intrabursal）投与、心臓内投与、軟骨内投与、仙骨内投与、空洞内投与、腔内投与、大脳内投与、槽内投与、角膜内投与、冠動脈内投与、皮内投与、椎間板内投与、管内（intraductal）投与、表皮内投与、食道内投与、胃内投与、膣内投与、歯肉内投与、回腸内投与、管腔内投与、病巣内投与、リンパ内投与、髄内投与、髄膜内投与、筋内投与、眼内投与、卵巣内投与、心外膜内投与、腹腔内投与、胸膜腔内投与、前立腺内投与、肺内投与、副鼻腔内（intrasinal）投与、脊髄内投与、滑膜内投与、腱内投与、精巣内投与、鞘内投与、胸腔内投与、尿細管内（intratubular）投与、腫瘍内投与、鼓膜内投与、子宮内投与、血管内投与、静脈内投与、心室内投与、膀胱内投与、硝子体内投与、喉頭内投与、鼻内投与、経鼻胃投与、眼投与、経口投与、口腔咽頭投与、非経口投与、経皮（percutaneous）投与、関節周囲投与、硬膜外投与、直腸投与、吸入投与、眼球後投与、くも膜下投与、結膜下投与、舌下投与、粘膜下投与、局所投与、経皮（transdermal）投与、経粘膜投与、経胎盤投与、経気管投与、尿管投与、尿道（urethral）投与及び膣投与の個々の経路及びその任意の部分集合のそれぞれが含まれる。
【００２９】
上記方法の一実施形態においては、被験体はヒトである。
【００３０】
一実施形態においては、Ｃｘ４３は、以下の配列（配列番号１５）を有するヒトＣｘ４３である。
ＭＧＤＷＳＡＬＧＫＬＬＤＫＶＱＡＹＳＴＡＧＧＫＶＷＬＳＶＬＦＩＦＲＩＬＬＬＧＴＡＶＥＳＡＷＧＤＥＱＳＡＦＲＣＮＴＱＱＰＧＣＥＮＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲＦＷＶＬＱＩＩＦＶＳＶＰＴＬＬＹＬＡＨＶＦＹＶＭＲＫＥＥＫＬＮＫＫＥＥＥＬＫＶＡＱＴＤＧＶＮＶＤＭＨＬＫＱＩＥＩＫＫＦＫＹＧＩＥＥＨＧＫＶＫＭＲＧＧＬＬＲＴＹＩＩＳＩＬＦＫＳＩＦＥＶＡＦＬＬＩＱＷＹＩＹＧＦＳＬＳＡＶＹＴＣＫＲＤＰＣＰＨＱＶＤＣＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩＦＭＬＶＶＳＬＶＳＬＡＬＮＩＩＥＬＦＹＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤＰＹＨＡＴＳＧＡＬＳＰＡＫＤＣＧＳＱＫＹＡＹＦＮＧＣＳＳＰＴＡＰＬＳＰＭＳＰＰＧＹＫＬＶＴＧＤＲＮＮＳＳＣＲＮＹＮＫＱＡＳＥＱＮＷＡＮＹＳＡＥＱＮＲＭＧＱＡＧＳＴＩＳＮＳＨＡＱＰＦＤＦＰＤＤＮＱＮＳＫＫＬＡＡＧＨＥＬＱＰＬＡＩＶＤＱＲＰＳＳＲＡＳＳＲＡＳＳＲＰＲＰＤＤＬＥＩ。
【００３１】
一実施形態においては、Ｐａｎｘ１は、以下の配列（配列番号１６）を有するヒトＰａｎｘ１である。
ＭＡＩＡＱＬＡＴＥＹＶＦＳＤＦＬＬＫＥＰＴＥＰＫＦＫＧＬＲＬＥＬＡＶＤＫＭＶＴＣＩＡＶＧＬＰＬＬＬＩＳＬＡＦＡＱＥＩＳＩＧＴＱＩＳＣＦＳＰＳＳＦＳＷＲＱＡＡＦＶＤＳＹＣＷＡＡＶＱＱＫＮＳＬＱＳＥＳＧＮＬＰＬＷＬＨＫＦＦＰＹＩＬＬＬＦＡＩＬＬＹＬＰＰＬＦＷＲＦＡＡＡＰＨＩＣＳＤＬＫＦＩＭＥＥＬＤＫＶＹＮＲＡＩＫＡＡＫＳＡＲＤＬＤＭＲＤＧＡＣＳＶＰＧＶＴＥＮＬＧＱＳＬＷＥＶＳＥＳＨＦＫＹＰＩＶＥＱＹＬＫＴＫＫＮＳＮＮＬＩＩＫＹＩＳＣＲＬＬＴＬＩＩＩＬＬＡＣＩＹＬＧＹＹＦＳＬＳＳＬＳＤＥＦＶＣＳＩＫＳＧＩＬＲＮＤＳＴＶＰＤＱＦＱＣＫＬＩＡＶＧＩＦＱＬＬＳＶＩＮＬＶＶＹＶＬＬＡＰＶＶＶＹＴＬＦＶＰＦＲＱＫＴＤＶＬＫＶＹＥＩＬＰＴＦＤＶＬＨＦＫＳＥＧＹＮＤＬＳＬＹＮＬＦＬＥＥＮＩＳＥＶＫＳＹＫＣＬＫＶＬＥＮＩＫＳＳＧＱＧＩＤＰＭＬＬＬＴＮＬＧＭＩＫＭＤＶＶＤＧＫＴＰＭＳＡＥＭＲＥＥＱＧＮＱＴＡＥＬＱＧＭＮＩＤＳＥＴＫＡＮＮＧＥＫＮＡＲＱＲＬＬＤＳＳＣ。
【００３２】
一実施形態においては、Ｇａｐ２６は、配列：ＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲ（配列番号１７）を有する。
【００３３】
一実施形態においては、Ｇａｐ２７は、配列：ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ（配列番号１８）を有する。
【００３４】
一実施形態においては、Ｇａｐ１９は、配列：ＫＱＩＥＩＫＫＦＫ（配列番号１９）を有する。
【００３５】
本明細書中に記載される様々な要素の全ての組合せは、本明細書中に別段の指示がない限り又は文脈によってはっきりと否定されない限り本発明の範囲内である。
【００３６】
本発明は、続く実験の詳細からより理解されるであろう。しかしながら、当業者は、論じられる具体的な方法及び結果が、添付の特許請求の範囲により完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを容易く認識するであろう。
【００３７】
実験結果
序論
近年、超純度リポ多糖（ＬＰＳ）（１０μｇ／ｍｌ）はマクロファージを刺激し、こうして初期サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）が産生されるが、初期のＬＰＳプライミングが二次刺激（例えば、ＡＴＰ）を伴わなければ、ＨＭＧＢ１分泌を完全に引き起こさないことが実証された（４３、４４）。同様に、ＡＴＰ自身は、ＰＫＲリン酸化（４４）及びインフラマソーム活性化（４６〜４８）を促進し得るとしても、事前のＬＰＳ曝露がなければＨＭＧＢ１分泌を誘導することはできない（４３）。それに対して、一般的に用いられる（そしてまた恐らくより臨床的に意義のある）粗製ＬＰＳ（１％未満の細菌性タンパク質及び例えばＣｐＧ−ＤＮＡ等の核酸を含む）による長期刺激によって、劇的なＰＫＲリン酸化（４９）及びＨＭＧＢ１分泌（２１）が引き起こされた。
【００３８】
マクロファージ／単球は、コネキシン（Ｃｘ）又はパネキシン（Ｐａｎｘ）から構成される膜ヘミチャネルを通じてＡＴＰを放出する。アミノ酸配列のホモロジーの欠如にもかかわらず、Ｃｘ４３及びＰａｎｘ１は、４つの膜貫通型ドメイン、１つの細胞内ループ（加えて、Ｎ末端及びＣ末端）並びに２つの細胞外ループを有することにより、同様の膜トポロジーを示す。両者ともオリゴマー化して６量体型ハーフチャネル（又は「ヘミチャネル」）を形成し得るが、Ｃｘ４３ヘミチャネルだけが隣接細胞上のヘミチャネルとドッキングして、心臓、脈管系及び脳における細胞間コミュニケーションを促進するギャップ結合チャネル（ＧＪＣ）を形成することができる。それにもかかわらず、Ｃｘ４３ヘミチャネル及びＰａｎｘ１ヘミチャネルの両方は、活性化された生得免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ及び好中球）からのＡＴＰ放出の時間モード（temporal mode）をもたらすことがある（５１、５２）。例えば、Ｐａｎｘ１は、薬理的阻害（１００μＭを上回る甘草成分誘導体ＣＢＸによる）又は遺伝子ノックアウトにより、ＡＴＰ遊離を均一に抑えるため、ＡＴＰ遊離がアポトーシス細胞からのＡＴＰ放出の一因となることが実証された（５３、５４）。プリン作動性Ｐ２Ｘ７受容体（Ｐ２Ｘ７Ｒ）の活性化を通じて、ＡＴＰはインフラマソーム活性化の一因となることが示唆された（５０）。Ｐ２Ｘ７Ｒの活性化は、小さいカチオン（Ｃａ２＋）について透過性のＡＴＰ開口型Ｐ２Ｘ７Ｒチャネルの即座（ミリ秒以内）の開口をもたらし、それに引き続き、より大きいＰａｎｘ１ヘミチャネルのゆるやかな動員及び開口（何秒ないし何分にわたる）が起こり、９００Ｄａまでのより大きなアニオン性分子（例えば、ＡＴＰ）の通過が可能となる（５５〜５７）。このＰａｎｘ１に介在されるフィードフォワード型のＡＴＰ放出は、ＬＰＳに刺激されるインフラマソーム活性化（５８）に引き続いて、インフラマソーム依存性サイトカイン放出（４６〜４８、５９、６０）の一因となる。
【００３９】
甘草（ラディックス・グリチリザエ（Radix glycyrrhizae）又はリコリス）は、伝統的に消化性潰瘍、肝損傷及び肝炎の治療に使用されてきたが、その保護メカニズムは、分からないままである。本明細書に開示されるデータは、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、つまり主要な甘草成分であるグリチルリチン（グリチルリチン酸、ＧＺＡ）の誘導体が、ＬＰＳに誘導されるＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＲ）リン酸化及びＨＭＧＢ１分泌を用量依存的に阻止し、遅れて投与されたとしても、致死的敗血症（盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）によって誘導される）からマウスを回復させることを示している。
【実施例】
【００４０】
多数の薬草成分を、ＬＰＳに誘導されるＰＫＲ活性化及びＨＭＧＢ１分泌の阻害における活性についてスクリーニングした。甘草（ラディックス・グリチリザエ）は、伝統的に、消化性潰瘍、肝炎及び肺気管支炎を含む様々な炎症性疾患の治療において何世紀にもわたって使用されてきた。その抗炎症特性は、肝炎（６１）、肝虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）（６２、６３）、トキシンに誘導される肝損傷（６４、６５）、内毒素血症（６６、６７）及び大腸炎（６８）の動物モデルにおいて有益であることが分かっている主要な成分のグリチルリチン（グリチルリチン酸（ＧＺＡ）、図１）によるものである。ＧＺＡ中のグルクロン酸をコハク酸に置き換えると、新たな化合物、つまりカルベノキソロン（ＣＢＸ、図１）といった、今までは食道潰瘍形成及びその他の炎症疾患を伴う患者のために処方されていた薬剤（６９）が得られる。
【００４１】
その発端以来、ＣＢＸは、Ｃｘ４３ギャップ結合（ＥＣ５０＝５０μＭ〜１００μＭ）及びＰａｎｘ１ヘミチャネル（ＥＣ５０＝１μＭ〜４μＭ）を含む様々な生物学的活性を用量依存的に阻害することが実証されてきた（７０、７１）。例えば、これまでに、ＣＢＸ（１０μＭ）は、低酸素症（７２）、せん断応力（shear stress）（７３）及び低酸素分圧（７４）に対する応答におけるＰａｎｘ１ヘミチャネルに介在されるＡＴＰ放出を効果的に阻害することが実証された。さらに、ＣＢＸは、ＬＰＳに誘導される色素取り込み（５５、７５）を阻害し、ＬＰＳに誘導される急性肺損傷（７６）及び脳虚血障害（７７）に対する保護をもたらすことができる。本明細書においては、ＣＢＸは、マクロファージ培養物においてエンドトキシンに誘導される一酸化窒素産生及びＨＭＧＢ１分泌を顕著に阻害することが開示されており（図２）、それにより甘草の抗炎症特性が確かめられる。しかしながら、ＣＢＸが、ＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌を、Ｃｘ４３ギャップ結合を損なうことによって阻害するということはありそうもない。それというのも、マクロファージは、自身とギャップ結合を形成しないし、その他の細胞型におけるギャップ結合を遮断するために使用されるＣＢＸの濃度（例えば、５０μＭ〜１００μＭ）は、マクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌の阻止のために使用される濃度（例えば、５μＭ〜１０μＭ）よりもかなり高いからである（４９）。しかしながら、ＣＢＸがＣｘ４３ヘミチャネルに介在されるＡＴＰ放出を抑える場合に、それにより引き続いてＰＫＲ活性化及びＨＭＧＢ１分泌に影響が及ぼされることは知られていない。この可能性を試験するために、アニオン性色素であるルシファーイエロー（ＬＹ、ＭＷ＝４４４Ｄａ）の細胞取り込みを測定することによって、ＣＢＸが膜ヘミチャネル活性に影響を及ぼすかどうかが確認された。静止マクロファージにおいて、約２％の細胞は、ＬＹインキュベーション後に拡散性の蛍光シグナルを示したが、長期のＬＰＳ刺激によって、ＬＹ陽性細胞の数が約１６％にまで高められ、それは、ＬＰＳがマクロファージのヘミチャネル活性を増大させることを示唆している（４９）。しかしながら、ＣＢＸは、ＬＹ陽性細胞の数を６％〜８％にまで有意に減少させ、それは、ＣＢＸが、マクロファージのヘミチャネル活性の遮断によりＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌を効果的に阻害することを示唆している。
【００４２】
重要なＡＴＰ受容体の１つであるＰ２Ｘ７Ｒは、ＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌において重要である可能性がある。それというのも、特異的Ｐ２Ｘ７ＲアンタゴニストであるｏＡＴＰは、同様に、ＬＰＳに誘導されるＬＹ取り込み及びＨＭＧＢ１分泌を阻害するためである（データは示さず）。ＬＰＳ／ＡＴＰに誘導されるインフラマソーム活性化におけるＰ２Ｘ７Ｒ及びＰＫＲの役割に照らして（４４、５８）、ＣＢＸアンタゴニスト及びＰ２Ｘ７Ｒアンタゴニスト（例えば、ｏＡＴＰ）が、初代マクロファージ培養物において、ＬＰＳに誘導されるＰＫＲ活性化に効果を奏するかどうかが試験された。注目すべきことには、粗製ＬＰＳ（微量の細菌性タンパク質及び核酸を含む）による長期刺激は、全ＰＫＲタンパク質レベルの２倍超の増大をもたらしたが、より大きな（８倍超の）リン酸化されたＰＫＲレベルの上昇をもたらした（図３Ａ、図３Ｂ）。さらに、このＬＰＳに誘導されるＰＫＲ発現及びリン酸化の増大は、ＣＢＸ（図３Ａ）及びｏＡＴＰ（図３Ｂ）の両者によって有意に抑えられ、ＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌におけるヘミチャネル及びＰＫＲ活性化についての重要な役割を示唆した。
【００４３】
致死的敗血症におけるＨＭＧＢ１の病因的役割（３２）を考慮して、ＣＢＸの治療能力を、ＣＬＰによって誘導される多菌性敗血症の臨床的に関連する動物モデルを使用して調査した。ＣＢＸの初回用量は、ＣＬＰの２４時間後の、マウスに嗜眠、下痢及び立毛を含む明らかな敗血症の徴候が現れた時点で投与した。敗血症の発症から２４時間後に始めるＣＢＸの繰り返しの投与（引き続き、ＣＬＰ後４８時間及び７２時間の時点での追加の投薬）により、用量依存的な有意な保護（図４）がもたらされ、このことは、ＣＢＸの敗血症の治療における治療薬としての裏付けを示している。ここで得られたデータ（示されていない）は、ＣＢＸがＨＭＧＢ１のＡボックスに、最も良く知られるＨＭＧＢ１インヒビターであるＧＺＡの親和性よりも２０倍超高い親和性で結合することを示している（１１１）。
【００４４】
ＣＢＸの薬理学的ターゲット、例えばＰａｎｘ１及びＣｘ４３がまた、ＡＴＰ流出、ＰＫＲ活性化及びＨＭＧＢ１分泌によってＬＳＩにおいて病因的役割を果たし得るかどうかは、今まで知られていなかった。粗製ＬＰＳ又はその他のＨＭＧＢ１分泌刺激（例えば、ＳＡＡ又はＣＩＲＰ）による長期刺激が、Ｐａｎｘ１ヘミチャネル及び／又はＣｘ４３ヘミチャネルの発現を上方制御し、それによりＡＴＰ流出、ＰＫＲリン酸化、そして引き続いてのＨＭＧＢ１分泌が促進されることで、ＬＳＩの病因の原因となり得るかどうかが調査された。外因性ＰＡＭＰ（ＬＰＳ）及び内因性炎症誘発性メディエーター（ＳＡＡ又はＣＩＲＰ）は、Ｐａｎｘ１ヘミチャネル及び／又はＣｘ４３ヘミチャネルの発現並びにＰＫＲリン酸化を刺激することによって、ＨＭＧＢ１分泌を調節するという仮説が提唱された。ＡＴＰ流出におけるＣｘ４３及びＰａｎｘ１の重要な役割と共に、超純度ＬＰＳに誘導されるＨＭＧＢ１分泌のためのＡＴＰの必要性に照らせば、粗製ＬＰＳ及びその他の重要なＨＭＧＢ１分泌刺激（例えば、ＣＩＲＰ及びＳＡＡ）が、ヘミチャネル発現及びＰＫＲ／ＳＴＡＴ１リン酸化を一様に調節し得るかどうかを確認することが望ましかった。
【００４５】
初代マウスマクロファージ及びヒト単球を使用して、様々な炎症性刺激によるＨＭＧＢ１分泌の調節の根底をなすメカニズムを調査した。初代腹腔マクロファージを、以前に記載されたように（２３、７８）、２ｍｌのチオグリコレートブロス（４％、Difco社（ミシガン州デトロイト））の腹腔内注射から２日後〜３日後にＢａｌｂ／Ｃマウス（雄、７週齢〜８週齢、２０グラム〜２５グラム）から単離した。ヒト末梢血単核細胞（ＨｕＰＢＭＣ）を、以前に記載されたように（２３、７８、７９）、ニューヨーク（ロングアイランド）の血液バンク（ニューヨーク州メルヴィル）から購入したヒト血液から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、Pharmacia社（ニュージャージー州ピスカタウェイ））中での密度勾配遠心分離によって単離した。８０％〜９０％のコンフルエンスになったら、マクロファージ／単球の培養物を、様々な刺激、つまり超純度及び粗製のＬＰＳ、ＣＩＲＰ１４、ＳＡＡ（PeproTech社、カタログ番号３００−１３）により、種々の濃度で、様々な期間（０時間、６時間、１２時間及び１８時間）にわたって刺激するものとする。マクロファージ／単球の培養物におけるＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質又はＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質の発現レベルは、以前に記載されたように（２１、２３、８０）、ウェスタンブロッティング又は免疫細胞化学技術によって測定される。
【００４６】
ヘミチャネルタンパク質の発現は、免疫細胞と非免疫細胞とで、異なる調節がされる可能性がある。例えば、ＬＰＳは、肝臓及び心臓（８１）においてＣｘ４３発現を下方制御するが、腎臓、肺（８２）及びＩＭＣ（８３、８４）においてＣｘ４３発現を上方制御する。したがって、粗製ＬＰＳ、ＳＡＡ又はＣＩＲＰでの長期刺激は、同様に、単球／マクロファージの培養物においてＣｘ４３ヘミチャネルタンパク質及びＰａｎｘ１ヘミチャネルタンパク質を上方制御すると考えられる。確かに、ＬＰＳ及びＳＡＡの両者とも、マウスマクロファージ（図５Ａ）及びヒト単球（図５Ｂ）の両方でＰａｎｘ１の細胞レベルを効果的に高めることが判明した。アポトーシス細胞におけるＰａｎｘ１のカスパーゼ３による酵素分解がＰａｎｘ１ヘミチャネルの活性化及び開口のために必要であるという見解（５３）と一致して、Ｐａｎｘ１の上方制御が、Ｐａｎｘ１の分解生成物を表すと思われるより小さい分子量（１０ｋＤａ）のバンド（図５Ｂ）の出現を伴うことが判明した。
【００４７】
ＬＳＩの病原におけるヘミチャネルの役割：ここで得られたデータにより、ＬＰＳ及びＳＡＡが、初代マウスマクロファージ及びヒト単球におけるＰａｎｘ１及びＣｘ４３の発現を上方制御することが示された。このことは、ＣＤ１１ｃを発現する白血球におけるＣｘ４３の推奨されているコンディショナルノックアウトが、マウスをより致死的内毒素血症に罹りやすくするという最近の研究（１０５）を考慮して興味深いものであり、このことは、肺胞マクロファージ−上皮ギャップ結合コミュニケーション（ＧＪＣ）におけるＣｘ４３に有益な役割があるという見解を裏打ちするものである。これらのヘミチャネルタンパク質のＡＴＰ依存性ＰＫＲ活性化及びＨＭＧＢ１分泌の可能性のある役割に照らして、これらのヘミチャネル活性の変化（ミメティックペプチドアンタゴニスト、中和抗体又は薬草由来インヒビター、例えばＧＺＡを使用することによる）又はタンパク質レベルの変化（遺伝子ノックアウトによる）が、内毒素血症及びＣＬＰに誘導される敗血症における動物の生存に影響を及ぼすかどうかを確認した。
【００４８】
通例、敗血症は、以前に記載されたように（２１、７８、９４、９５）、動物において、既知の量のボーラスのエンドトキシンを腹腔内投与することによって（内毒素血症）、又は盲腸の穿孔を介する腹膜炎の手術による誘導（盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）として知られる技術）によって模擬される。ヘミチャネルタンパク質のＬＳＩにおける可能性のある役割を理解するために、雄のＢａｌｂ／Ｃマウス（７週齢〜８週齢、２０ｇ〜２５ｇ）を、致死的内毒素血症又は敗血症に罹患させ、そして広範囲のヘミチャネルインヒビター（例えば、ミメティックペプチドアンタゴニスト及び薬草成分のＧＺＡ）を、様々な用量で、かつ内毒素血症又は敗血症の発症後の時点（０．５時間後、１２時間後及び２４時間後）に腹腔内注射する。ＬＳＩの転帰に対するそれらの効果は、抗ヘミチャネル処置された群とビヒクル処置された対照との間の長期（２週間）生存率を比較することによって評価される。
【００４９】
ヘミチャネル活性を調節するために、様々なミメティック「ギャップ」ペプチドを、Ｃｘ４３及びＰａｎｘ１の細胞外ループを擬態するように設計した。例えば、Ｇａｐ２６及びＧａｐ２７は、第一及び第二の細胞外ループ（ＥＬ１及びＥＬ２、図６Ｂ）にあるアミノ酸の短い区間を擬態し、それらは、Ｃｘ４３の細胞外ループと相互作用する（９６）ことで、Ｃｘ４３ヘミチャネル活性又はＣｘ４３ギャップ結合形成が阻害されると予想される。同様に、Ｐａｎｘ１特異的ミメティック阻害ペプチドである１０Ｐａｎｘは、Ｐ２Ｘ７Ｒに誘導されるＰａｎｘ１ヘミチャネル活性化を選択的に抑えることが実証された（９７、９８）。Ｐａｎｘ１特異的ミメティックペプチドである１０Ｐａｎｘは、１２０ｍｇ／ｋｇの用量で繰り返し投与される場合に、ＣＬＰに誘導される動物の致死率を再現的に悪化させることが判明した（図６Ａ）。それとは際立って対照的に、Ｃｘ４３特異的ミメティックペプチドの繰り返しの投与（Ｇａｐ２６を、ＣＬＰ後＋６時間の時点及び＋１８時間の時点及び３６時間の時点で；１２０ｍｇ／ｋｇ）により、致死的敗血症に対する再現的かつ有意な保護が増進された（図６Ａ）。
【００５０】
Ｃｘ４３のＬＳＩにおける病因的役割を更に確認するために、Ｃｘ４３の細胞外ループを標的とするモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製し、Ｃｘ４３特異的ＭＡｂが、同様に動物を致死的敗血症から保護するかどうかを試験した。この研究所により、Ｇａｐ２６反応性抗体を産生する多数のハイブリドーマが作製され、それらの抗体は、ＬＹ色素取り込み又はＡＴＰ放出アッセイを使用してヘミチャネル活性の阻害におけるそれらの抗体の活性についてスクリーニングされるものとする（４９）。
【００５１】
コネキシン４３（Ｃｘ４３）の細胞外ループ１（ＥＬ１）に相当するペプチドを合成した（図７の下方に示される１０種のペプチド）。これらのペプチドを、感染惹起性又は損傷惹起性の炎症性疾患の動物モデルにおいて、マクロファージのヘミチャネル活性の阻害におけるそれらの活性及び保護効力についてスクリーニングした。
【００５２】
Ｐ５ペプチド（配列番号１）は、細菌性エンドトキシンに誘導される色素取り込みを有意に阻害した。ルシファーイエロー色素の取り込みを使用することで、コネキシン４３開口型ヘミチャネル活性を測定した。簡潔には、ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＬＰＳでＣＢＸ又はその他のＣｘ４３ペプチドアンタゴニスト（ＧＡＰ２６（配列番号１３）又はＰ５）の不存在下又は存在下にて１６時間かけて刺激した。引き続き、細胞培養物を、ルシファーイエロー（ＬＹ、１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に１５分間にわたりインキュベートし、１×ＰＢＳによる３回の激しい洗浄後に２％パラホルムアルデヒドで固定した。拡散された蛍光シグナルを有する細胞の数を、蛍光顕微鏡下で計数した。点状の蛍光シグナルを有する細胞は除外した。それというのも、点状のシグナルは、ＬＹ色素の食作用（Ｃｘ４３ヘミチャネルを通じた受動拡散ではなく）により生ずると見られるからである。Ｐ５ペプチドはまた、致死的敗血症を有意に抑えた。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（雄、２０ｇ〜１５ｇ、７週齢〜１０週齢）をＣＬＰにより致死的敗血症に罹患させ、そして対照の生理食塩水（０．２ｍｌ／マウス）又は示されたペプチド（１０．０ｍｇ／ｋｇ）でＣＬＰ後＋０．５時間の時点、＋２４時間の時点で腹腔内投与した。動物生存率を２週間までの間にわたり評価し、カプランマイヤー法を使用して、群間の死亡率の差を比較した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。ここで留意すべきは、ペプチド番号２、番号３、番号４、番号８、番号９及び番号１０は、致死的敗血症に対する保護をもたらさなかったことである。しかしながら、Ｐ５（配列番号１）は、動物の生存を劇的にかつ有意に高めた。より低い程度で、Ｐ６（配列番号２）も、致死的敗血症の動物モデルにおいて保護効果を示した（データは示さず）。
【００５３】
Ｃｘ４３ペプチドアンタゴニストの静脈内投与は、肝虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）障害に対する保護をもたらした。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（２０ｇ〜２５ｇ）を、肝動脈及び門脈を６０分間にわたり一時的にクランプする（それは一般的に肝臓の７０％に虚血を起こす）ことによって肝虚血／再潅流に陥らせた。再潅流の開始時に、０．２ｍｌの生理食塩水、Ｐ５（ＥＮＶＣＹＤ、体重１ｋｇ当たり１０．０ｍｇ）又はＰ５Ａ（ＥＮＶＳＹＤ（配列番号１４）、１０．０ｍｇ／ｋｇ）を、内頚静脈を介して注入した。虚血発症から２４時間の時点で、動物を安楽死させて、血液を採取し、肝臓障害マーカー、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルを市販のキットを用いて測定した。ここで留意すべきは、Ｐ５ペプチドは、Ｉ／Ｒ障害に対する有意な保護を増進したことである。＊（シャム対照に対してＰ＜０．０５）；＃（生理食塩水群（「Ｉ／Ｒ」）に対してＰ＜０．０５）。
【００５４】
参考文献
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【図１】
2018522056.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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