(57)【要約】本発明は、励起状態エネルギーの二つのクエンチャーを含む核酸プローブ及びその使用方法を提供する。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブ；
５’−Ｙ１−Ｌ１−ＬＱ１−Ｌ２−Ｙ２−３’
ここで、Ｙ１は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含み；
Ｙ２は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含み；
Ｙ１及びＹ２の一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合しているフルオロフォアを有し、Ｙ１及びＹ２のもう一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合している第二のクエンチャーを有し；
Ｌ１及びＬ２は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルからそれぞれ独立して選択され；及び、
ＬＱ１は下記の化１であり；
【化１】
2018512167.tif 000072
第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化２から選択される構造を有し；
【化２】
2018512167.tif 000073
及び
2018512167.tif 000074
ここで、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃはそれぞれ独立して置換または非置換アリールから選択され；及び、
Ｌ３は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【請求項２】
Ｙ１のヌクレオチド配列は；
前記フルオロフォアまたは前記第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している５’リン酸塩を有する第一のヌクレオチドＮ１、及び
Ｌ１に共有結合している３’リン酸塩を有する第二のヌクレオチドＮ２を含み；及び、
Ｙ２のヌクレオチド配列は；
Ｌ２に共有結合している５’リン酸塩を有する第三のヌクレオチドＮ３、及び
前記第二のクエンチャーまたは前記フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している３’リン酸塩を有する第四のヌクレオチドＮ４を含み、
ここで、前記第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩が前記フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、前記第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は前記第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び、前記第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩が前記第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、前記第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は前記フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している、
請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
さらに、前記第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩を前記フルオロフォアまたは第二のクエンチャーに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
さらに、前記第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩を前記第二のクエンチャーまたはフルオロフォアに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２または３に記載の核酸プローブ。
【請求項５】
前記第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩は前記フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており；及び、
前記第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は前記第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項６】
Ｙ１は、８、９、１０または１１ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の核酸プローブ。
【請求項７】
Ｑ１は、下記の化３から選択される構造を有する； 
【化３】
2018512167.tif 000075
2018512167.tif 000076
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択される；
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８】
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル及びニトロから選択される、請求項7に記載の核酸プローブ。
【請求項９】
Ｑ１は、下記の化４から選択される構造を有する；
【化４】
2018512167.tif 000077
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５及びＲａ６はＨであり；
Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５、及びＲｂ６の少なくとも一つはそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５及びＲｂ６の残りはＨであり；及び、
Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の少なくとも一つはそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の残りはＨである、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸プローブ
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドから成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドから成る、請求項１０に記載の核酸プローブ。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドを有する請求項１２に記載の核酸プローブ。
【請求項１４】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換Ｃ１−Ｃ７アルキルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項１５】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；及び、Ｌ１及びＬ２は同一である、請求項１４に記載の核酸プローブ。
【請求項１６】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれエチルである、請求項１５に記載の核酸プローブ。
【請求項１７】
第二のクエンチャーが下記の化５の構造を有する； 
【化５】
2018512167.tif 000078
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択され；及び、
Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項１８】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；Ｒｅ５はＨである；Ｒｆ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり；及び、Ｒｆ４はＨである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【請求項１９】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシであり；Ｒｅ５は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり；Ｒｆ２はニトロであり；及び、Ｒｆ４は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである、請求項１７に記載の核酸プローブ。
【請求項２０】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシであり；Ｒｅ５は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｆ２はＨであり；及び、Ｒｆ４はニトロである、請求項１７に記載の核酸プローブ。
【請求項２１】
第二のクエンチャーが下記の構造を有する、
【化６】
2018512167.tif 000079
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項２２】
第二のクエンチャーは、ＢＢＱ−６５０（登録商標）、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）クエンチャー、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎｌ、またはＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎ２から由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項２３】
フルオロフォアは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレン−スルホネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホンサン（ＥＤＡＮＳ）、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５，５（Ｃｙ５，５）、３−（１−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−クサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピローリジニル］オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（または２）スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内塩（ＴＲまたはテキサスレッド）、ＢＯＤＩＰＹ染料、ベンゾオキサアゾール、スチビンまたはピレンであるから由来する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項２４】
フルオロフォアは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）から由来する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項２５】
フルオロフォアが下記の構造を有する；
【化７】
2018512167.tif 000080
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項２６】
Ｙ１のヌクレオチド配列は；
前記フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している５’リン酸塩を有する第一のヌクレオチドＮ１、及び
Ｌ１に共有結合している３’リン酸塩を有する第二のヌクレオチドＮ２を含み；及び、
Ｙ２のヌクレオチド配列は、Ｌ２に共有結合している５’リン酸塩を有する第三のヌクレオチドＮ３、及び前記第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している３’リン酸塩を有する第四のヌクレオチドＮ４を含み；
Ｌ１は非置換Ｃ２アルキルｄであり；
Ｌ２は非置換Ｃ２アルキルであり；
Ｑ１は下記の構造を有し：
【化８】
2018512167.tif 000081
前記第二のクエンチャーは、下記の構造を有する；
【化９】
2018512167.tif 000082
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択され；及び、
フルオロフォアはフルオレセイン部分から成る、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項２７】
第二のクエンチャーは、下記の構造を有する： 
【化１０】
2018512167.tif 000083
請求項２６に記載の各プローブ。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドから成る、請求項２６または２７に記載の核酸プローブ。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドから成る、請求項２８に記載の核酸プローブ。
【請求項３０】
Ｙ１が、８〜１１ヌクレオチド配列である、請求項２６に記載の核酸プローブ。
【請求項３１】
Ｙ２が、６〜２４ヌクレオチド配列である、請求項２６に記載の核酸プローブ。
【請求項３２】
フルオロフォアが下記の構造を有する： 
【化１１】
2018512167.tif 000084
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項３３】
フルオロフォアが下記のの構造を有する、請求項３２に記載の核酸プローブ：
【化１２】
2018512167.tif 000085
【請求項３４】
Ｙ１が８〜１１ヌクレオチド配列であり；
Ｙ２は６〜２４ヌクレオチド配列であり；
第二のクエンチャーは下記の構造を有し：
【化１３】
2018512167.tif 000086
及び、フルオロフォアは下記の構造を有する、請求項２６に記載の核酸プローブ：
【化１４】
2018512167.tif 000087
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは、構造３’−Ｙ３−Ｙ４−５’を有する第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに適しており；ここで、
Ｙ３は、第五のヌクレオチドＮ５を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；及び、
Ｙ４は、ヌクレオチドＮ５に直接付く第六のヌクレオチドＮ６を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすると、Ｎ２及びＮ５の塩基対及び、Ｎ３及びＮ６の塩基対は二本鎖を形成し、その日本鎖のＴｍは第二のオリゴヌクレオチド及び、構造５’−Ｙ１−Ｙ２−３’を有する第三のオリゴヌクレオチド間に形成される二本鎖のＴｍより高い、請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは、構造３’−Ｙ３−Ｙ４−５’を有する第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに適しており；ここで、
Ｙ３は、第五のヌクレオチドＮ５を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；及び、
Ｙ４は、ヌクレオチドＮ５に直接付く第六のヌクレオチドＮ６を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすると、Ｎ２及びＮ５の塩基対及び、Ｎ３及びＮ６の塩基対は二本鎖を形成し、その日本鎖のＴｍは第二のオリゴヌクレオチド及び、構造５’−Ｙ１−Ｙ２−３’を有する第三のオリゴヌクレオチド間に形成される二本鎖のＴｍより低い、請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項３７】
サンプルを請求項３５または３６に記載の核酸プローブと接触させ、ここで、第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方への供与体−受容体エネルギー伝達によってフルオロフォアの蛍光を低減し；及び、
サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を示す蛍光の増大を検出する：
ことからなる、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項３８】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達によって低減する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は基底状態消光によって低減する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって低減する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
蛍光の増大は、第一のオリゴヌクレオチドからのフルオロフォアの開裂から生じる、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズせず、その結果、フルオロフォアの蛍光が低減する時、第一のオリゴヌクレオチドはランダムコイル構造を形成する、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
第一のオリゴヌクレオチドが自己相補性配列を有し、クエンチャー及びフルオロフォアは第一のオリゴヌクレオチドに付着し、その結果、核酸ポリマーが分子間塩基対合を受ける時フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光する、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
方法は、ＰＣＲ生成物合成の結果、蛍光が増大するＰＣＲ反応で使用される、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
サンプルを請求項１〜３４のいずれか一項に記載の核酸プローブと接触させ、
ここで、オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに適しており、及び、第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方への供与体−受容体エネルギー伝達によってフルオロフォアの蛍光を低減し；及び、
サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を示す蛍光の増大を検出する、ことからなる、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項４６】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達によって低減する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は基底状態消光によって低減する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって低減する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
蛍光の増大は、第一のオリゴヌクレオチドからのフルオロフォアの開裂から生じる、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしない時、その結果、フルオロフォアの蛍光が低減する時、第一のオリゴヌクレオチドはランダムコイル構造を形成する、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
第一のオリゴヌクレオチドが自己相補性配列を有し、クエンチャー及びフルオロフォアは第一のオリゴヌクレオチドに付着し、その結果、核酸ポリマーが分子間塩基対合を受ける時フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光する、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
方法は、ＰＣＲ生成物合成の結果、蛍光が増大するＰＣＲ反応で使用される、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含み、少なくとも二つの残余は環外ジアゾ結合を介して共有結合している第一のクエンチャー；及び
第一のクエンチャーがオリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端へ向かう８、９、１０または１１ヌクレオチドであるヌクレオチドに付着する第二のクエンチャー；に付着するオリゴヌクレオチドを含み、及び、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーが、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択されたメンバーを介してオリゴヌクレオチドに付着する核酸プローブ。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドは、さらに結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択されたメンバーを介して、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着するフルオロフォアを含む、請求項５３に記載の核酸プローブ。
【請求項５５】
少なくとも三つの残余のそれぞれが置換または非置換フェニルである、請求項５３または５４に記載の核酸プローブ。
【請求項５６】
少なくとも三つの残余の少なくとも二つは、少なくとも一つのＣ１−Ｃ６非置換アルキル部分で置換されたフェニルである、請求項５５に記載の核酸プローブ。
【請求項５７】
前記第一のクエンチャーが、下記の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【化１５】
2018512167.tif 000088
ここで、Ｌ３は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択されたメンバーである、請求項５６に記載の核酸プローブ。
【請求項５８】
前記第二のクエンチャーは、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含み、少なくとも二つの残余は環外ジアゾ結合を介して共有結合している、請求項５３、５４及び５７のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項５９】
前記第二のクエンチャーは、オリゴヌクレオチドの３’−末端に付着している、請求項５８に記載の核酸プローブ。
【請求項６０】
前記第二のクエンチャーが、下記の構造を有する： 
【化１６】
2018512167.tif 000089
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ、及びニトロから選択される；及び、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６１】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒｅ５はＨであり；Ｒｆ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒｆ４はＨである、請求項６０に記載の核酸プローブ。
【請求項６２】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルコキシであり；Ｒｅ５はＣ１−Ｃ４アルキルである；Ｒｆ２はニトロである；Ｒｆ４はＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項６０に記載の核酸プローブ。
【請求項６３】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルコキシであり；Ｒｅ５はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒｆ２はＨであり；Ｒｆ４はニトロである、請求項６０に記載の核酸プローブ。
【請求項６４】
第二のクエンチャーが、下記の構造を有する； 
【化１７】
2018512167.tif 000090
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６５】
前記フルオロフォアが、下記の構造を有する； 
【化１８】
2018512167.tif 000091
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６６】
前記フルオロフォアが、下記の構造を有する、請求項６５に記載の核酸プローブ。
【化１９】
2018512167.tif 000092
【請求項６７】
核酸標的配列を検出する方法であって、該方法は下記を含む：
（ａ）標的配列を一本鎖標的結合配列を含む検出核酸に接触させ、但し、検出核酸は請求項１〜３６及び５４〜６６のいずれか一項に記載の核酸プローブであり、検出核酸は、フルオロフォアが励起している時フルオロフォア及び、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方間の供与体−受容体エネルギー伝達を可能にする構造であり；
（ｂ）標的結合配列を標的配列にハイブリダイズし、それによって、検出核酸の構造を変更し、蛍光パラメータの変化を生じさせる；及び
（ｃ）蛍光パラメータの変化を検出し、それによって、核酸標的配列を検出する、方法。
【請求項６８】
第一の核酸及び第二の核酸がハイブリダイズしているかどうかを確認する方法であって、ここで、第一の核酸は請求項１〜３６及び５３〜６６のいずれか一項に記載の核酸プローブであり、その方法は下記を含む：
（ａ）第一の核酸を第二の核酸に接触させる；及び
（ｂ）第一の核酸、第二の核酸及びその組み合わせから選択されたメンバーの蛍光特性の変更を検出し、それによって、ハイブリダイゼーションが起きたかどうかを確認する、方法。
【請求項６９】
核酸増幅反応のモニタリング方法であって、その方法は下記を含む：
（ａ）検出核酸を含む増幅反応混合物を調製する、但し、検出核酸は請求項１〜３６及び５４〜６６のいずれか一つに記載の核酸プローブである；
（ｂ）増幅反応混合物を増幅状態にさせる；
（ｃ）検出核酸からの蛍光信号用の反応混合物をモニタリングして、分析結果を得る；及び
（ｄ）分析結果を利用して、核酸増幅反応をモニタリングする、方法。
【請求項７０】
標的配列の増幅を検出する方法であって、その方法は下記を含む：
（ａ）標的配列を含むサンプル核酸を標的配列の側にあるＰＣＲプライマーとハイブリダイズする；
（ｂ）ハイブリダイズしたプライマーをポリメラーゼで伸長し、ＰＣＲ生成物を生成し、ＰＣＲ生成物の二本鎖を分離して、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にアクセス可能にする；
（ｃ）ＰＣＲ生成物中で、検出核酸を標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、但し、検出核酸は請求項１〜３６及び５４〜６６のいずれか一項に記載の核酸プローブである；その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、検出核酸は、フルオロフォアが励起した時フルオロフォア及び、第一のクエンチャー及び第二クエンチャーの一方または両方の間の供与体−受容体エネルギー伝達を可能にする構造にある；それによって、検出核酸の構造が変更され、蛍光パラメータの変化を引き起こす；及び
（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年４月１５日出願の米国仮特許出願第６２／１４７６９５号の３５ＵＳＣ第一１９条ｅ項に基づく利益を主張するものであり、この出願は、全ての目的のためにその全体が参照として本文書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、標識核酸プローブ及び、これらのプローブまたはプローブの断片の検出方法の分野に関する。本発明の典型的な種は、二つまたはそれ以上の蛍光部分によって放出されたエネルギーを消光することが可能な一つまたは複数の消光部分によって標識化された核酸オリゴマーであり、その消光部分はまた核酸オリゴマーと結合する。一般的に、少なくとも一つの消光部分及び蛍光部分の一つは、オリゴマーがフルオロフォアからクエンチャーへの検出可能なエネルギー伝達が生じるのに十分な近傍の位置で結合している。
【背景技術】
【０００３】
ｑＰＣＲマーケットで優勢なプローブ型は、５’ヌクレアーゼアッセイで使用される線形加水分解プローブである。伝統的に、それらは、一般的に核酸オリゴマーの末端、例えば、５’蛍光レポーター及び３’クエンチャー、例えば、ダーククエンチャーに位置する二つの色素によって標識づけられる。３’修飾は、ハイブリダイゼーションへのプローブからのポリメラーゼ伸長を阻害し、プローブがその標的配列にハイブリダイズする前にフルオロフォアからの信号を消光する二重の目的で役立つことが可能である。
【０００４】
クエンチャー及びフルオロフォアは、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｏｒｅｓｔｅｒ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ））及び／または静的消光によって相互作用することがあり、互いに接触して、非蛍光である基底状態錯体を形成するという仮説が立てられる（非特許文献１及び２）。この相互作用は、プローブが溶液中に遊離している時、シグナルを抑制する。オリゴハイブリダイゼーション下で、形成された二本鎖はかなり堅牢であり、したがって、より可撓性が大きな一本鎖オリゴに比較すると有効長さが増大する。したがって、プローブを標的配列に結合させることは、オリゴ及び放出された蛍光信号の反対側末端に位置する色素間の相互作用を邪魔するのに十分である（非特許文献３）。
【０００５】
ハイブリダイゼーションでの信号放出は、フルオロフォア及びクエンチャー間でオリゴを加水分解することによって恒久的にすることが可能である。実際、Ｔａｑポリメラーゼがプライマーから伸長し、その進路でプローブに衝突する時開裂が実現される（図１）。ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性は、プローブが結合安定性を失い、鎖から置換されるまで、プローブのその５’末端から一つまた複数の塩基を開裂する。この加水分解は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの信号化メカニズムの基本である。
【０００６】
図１は、５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））アッセイを図示したものである。つまり、変性後、プローブ及びプライマーは解離鎖にアニールする。伸長中、ポリメラーゼはプライマーから伸長し、プローブに衝突し、及び鎖から置換されたヌクレオチド断片を加水分解する。プローブの開裂は、フルオロフォア及びクエンチャーを分離し、信号放出を恒久的にする。
【０００７】
プローブの性能は、一般的な意味で、信号対ノイズ比（ＳＮ比）、すなわち、増幅の前の初期蛍光によって増幅に続く最終蛍光を割ることによって定量化することが可能である。初期蛍光は、消光効率を示し、したがって、このバックグラウンド信号を二倍にすることは、ＳＮ比を２の倍数で約分する。消光効率は、ある程度オリゴ長に左右される（非特許文献４）。一本鎖オリゴは、ランダムコイルのように挙動すると考えられ、したがって、有効間隔は多数の配座の平均であるが、しかしながら、原理は変わらず、配列長が増大すると、消光効率が減少し、その結果として、プローブの基本蛍光性が上昇し、ＳＮ比の値は貧弱である。このため、プローブの設計は、最終的な用途で十分な消光効率を達成するために、通常、３０塩基またはそれ以下に制限される。
【０００８】
オリゴ核酸長は、消光効率だけではなく、それらの結合安定性を考慮して、選択される。共通の設計ガイドラインは、プライマーのＴＭより上昇した、７０℃のＴＭを有するプローブ配列を選択することである。プローブは、通常、塩基組成によって、及びハイブリダイゼーションを促進する特殊な修飾の不在下で、そのＴＭを達成するためには２０塩基より長くなければならない。このように、配列設計は、結合安定性及び消光効率間の注意深い妥協であるが、その２０〜３０塩基窓は多数の困難な標的には不適切である。例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定は、ミスマッチ識別のために必要な強化された特異性を実現するために２０塩基より短いプローブを要求する。そのような低いＴＭでプローブは、それらの結合安定性を増大させる化学構成成分‐Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）（非特許文献５）または、とりわけ、ＢＨＱｐｌｕｓプローブで使用されるプロピニルなしでは、非機能的であるであろう。これらの化学的修飾は、より低い制限を緩和するのに役立ち、長さで２０塩基以下のコンパクトな配列設計を可能にする。
【０００９】
多くの標的遺伝子は特にＡＴリッチであり、適切なＴＭを得るために、より長い配列を要求する。配列長さの上限は、むしろ３’端末でよりも、蛍光レポーターに近接する内部の位置にクエンチャーを配置することによって、緩和される。事実、初期のＴａｑＭａｎプローブ設計のいくつかは、このために、それらの消光効率を改善するために、内部配置でクエンチャーを有していた（非特許文献６）しかしながら、プローブがプライマーのように挙動し、伸長を開始するのを防ぐためには、現在空席の３’位置は、なお末端リン酸塩または脂肪族炭素スペーサーのような遮断薬で修飾されなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍａｒｒａｓ、Ｓ．Ａ．Ｅ．、Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．、及びＴｙａｇｉ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０：ｅ１２２（２００２）
【非特許文献２】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３５：１７−２９  （２００６）
【非特許文献３】Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｋ．Ｍ．、及びＰａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｌ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：２８５−２９２  （１９９５）
【非特許文献４】Ｃａｒｄｕｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８７９０−８７９４  （１９８８）
【非特許文献５】Ｋｕｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：６５５−６６１  （２０００）
【非特許文献６】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１（１６）：３７６１−３７６６  （２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
内部クエンチャーを有するプローブは、３０塩基より長い配列での消光効率を向上させる。内部クエンチャーは、伝統的にチミジン塩基から外れて配置され、それによって、糖リン酸塩主鎖を保存し、恐らくは塩基対合のいかなる分裂も最小にする。しかしながら、あるアッセイでは、この戦略は増幅に対する信号放出の大きさを減少させるであろう。この抑制の理由は完全に明らかではないが、結果はＳＮ比の分子を効率的に減らし、プローブ性能を落とす。図２Ａ〜Ｃは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ１）が三つの異なるプローブ長を横切って内部Ｔ残留に配置された時の代表的な結果を示している。
【００１２】
図２Ａ〜Ｃでは、末端標識プローブで信号化された増幅トレースが鎖線として示されている。内部Ｔ‐ＢＨＱ１プローブで信号化された増幅トレースは実線で示されている。消光効率の向上は、より長いプローブ配列で最も明らかであり、一方、２１塩基プローブでは、末端標識プローブに比較すると信号放出の大きさが減衰している。
【００１３】
オリゴ合成の間クエンチャーを包含するために使用される反応性前駆体はＴ−連鎖ホスホラミダイトを含むので、Ｔ−ＢＨＱ１のデザリングをオフにすると、チミジンはプローブ設計を、５’末端に対してＴを有するそれらの配列に制限する。この塩基依存性は、選択したアッセイからの減衰した信号放出、特に短いプローブ配列でのそれらと同様に、重大な制限である。下記によって、ｑＰＣＲアッセイの設計は、より容易になされ、及び、それらの信号増幅はより堅固になるであろう：
１．信号放出の大きさ及び消光効率を両方とも向上させる。
２．クエンチャーの位置を制限するいかなる塩基依存性も排除する。
３．同様な性能向上を示す短い配列及び長い配列の両方の設計を可能にする標識配向かう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、これらの三つのことを満たし、同様に他の利点を有する核酸プローブを提供する。
【００１５】
本発明は、二つの励起状態エネルギーのクエンチャーを含む核酸プローブ及び、それらの使用方法を提供する。
【００１６】
本発明のその他の目的、利点及び特徴は、下記の図面を参照して行う以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））アッセイを図示したものである。
【図２Ａ】図２Ａはプローブ長が２１塩基での末端標識プローブ（鎖線）及び内部Ｔ‐ＢＨＱ１標識プローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂはプローブ長が２９塩基での末端標識プローブ（鎖線）及び内部Ｔ‐ＢＨＱ１標識プローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図２Ｃ】図２Ｃはプローブ長が３５塩基での末端標識プローブ（鎖線）及び内部Ｔ‐ＢＨＱ１標識プローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図３】図３は本発明の例示的なダブルクエンチャープローブの構造を図示したものである。
【図４Ａ】図４Ａはプローブ長が２１塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図４Ｂ】図２４はプローブ長が２９塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図４Ｃ】図４Ｃはプローブ長が３５塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図５Ａ】図５Ａはプローブ長が２１塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の原増幅トレースを図示したものである。
【図５Ｂ】図５Ａはプローブ長が２１塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の正規化増幅トレースを図示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃはプローブ長が２９塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の原増幅トレースを図示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｄはプローブ長が２９塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の正規化増幅トレースを図示したものである。
【図５Ｅ】図５Ｅはプローブ長が３５塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の原増幅トレースを図示したものである。
【図５Ｆ】図５Ｆはプローブ長が３５塩基での末端標識プローブ（鎖線）及びダブルクエンチャープローブ（実線）の正規化増幅トレースを図示したものである。
【図６Ａ】図６Ａは末端標識プローブ（鎖線）及びＩ‐ＴＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは末端標識プローブ（鎖線）及びＩ‐ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）の増幅トレースを図示したものである。
【図７Ａ】図７Ａは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ−ＴＤＡＢ＋３‐ＢＨＱ１プローブの増幅トレースを図示したものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ＋Ａｎｉｌｉｎｅ＋３‐ＢＨＱ１プローブ（斜線）の増幅トレースを図示したものである。
【図８Ａ】図８Ａは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ‐ｄＲＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（斜線）の増幅トレースを図示したものである。
【図８Ｂ】図８Ｂは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ‐ｇＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（斜線）の増幅トレースを図示したものである。
【図９Ａ】図９Ａは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ‐ＢＨＱ（）＋３‐Ｓｐ３プローブ（斜線）の増幅トレースを図示したものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及びＩ‐ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ（）プローブ（斜線）の増幅トレースを図示したものである。
【図１０】図１０は末端標識プローブ（鎖線）及び様々なＩ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブの増幅トレースを図示したものである。
【図１１Ａ】図１１Ａはプローブ長が２１塩基での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂはプローブ長が２９塩基での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃはプローブ長が３５塩基での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄはプローブ長が２０塩基、１００００ＴＵ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｅ】図１１Ｅはプローブ長が２０塩基、１０００４ＴＤ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｆ】図１１Ｆはプローブ長が２０塩基、１０００７ＴＵ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｇ】図１１Ｇはプローブ長が２５塩基、１０００９ＴＤ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｈ】図１１Ｈはプローブ長が２５塩基、１０００９ＴＤ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｉ】図１１Ｉはプローブ長が２５塩基、１０１６２ＴＤ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｊ】図１１Ｊはプローブ長が３０塩基、１０００２ＴＤ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｋ】図１１Ｋはプローブ長が３０塩基、１０００６ＴＵ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【図１１Ｌ】図１１Ｌはプローブ長が３０塩基、１００１４ＴＵ配列での末端標識プローブ（鎖線）、Ｉ‐ＢＨＱ（）＋３‐ＢＨＱ１プローブ（実線）及び相補体のないプローブ（斜線）の融解曲線を図示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
略語
“ＢＨＱ”は本文書において、一般に一つまたは複数のジアゾ結合を含むダーククエンチャー及び特に“ブラックホールクエンチャー（登録商標）”を意味する。例示的なＢＨＱは、米国特許第７０１９１２９号明細書に記載されている。“ＦＥＴ”は本文書において、“蛍光エネルギー伝達”を意味する。“ＦＲＥＴ”は本文書において、“蛍光共鳴エネルギー伝達”を意味する。これらの用語は本文書において放射及び非放射エネルギー伝達過程の両方を言及するために使用されている。例えば、フォトンが発光する過程及び長期電子転移を伴う過程はこれらの用語に含まれる。本明細書を通して、これらの現象の両方は一般用語“受容体‐供与体エネルギー伝達” に含まれる。“ＳＮＰ”は“単一ヌクレオチド多型”を意味する。
【００１９】
定義
本発明をより詳細に説明する前に、本文書において記載した特定の実施態様は変更可能なものであり、本発明はそのような実施態様に限定されるものではないことが理解されなければならない。また、本文書において使用した用語は、特定の実施態様を記載する目的であり、用語は限定するためのものではないことが理解されなければならない。本発明の範囲は添付請求項によってのみ限定されるであろう。他に定義されない限り、本文書で使用された全ての専門的及び科学的単語は本発明が属する技術分野において普通の技能を持つ人に一般的に理解されるのと同様の意味を有する。値の範囲が提示されたとき、文脈が明らかに他に定めない限り、その範囲の上限及び下限の間で、下限の単位の１０分の１までの各媒介値及び、他の記載の、または記載の範囲内の媒介値は本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限はより小さい範囲に含まれ、また、記載の範囲内でいずれかの特に排除された限度を受け、本発明に包含される。記載の範囲が一つまたは両方の限度を含むとき、限界を含んで、それらのどちらかまたは両方を越える範囲もまた本発明に含まれる。本文書では、いくつかの範囲を、用語「約」を前に付けて、数値で示している。用語「約」は、ここでは、その用語が先行する数に近い、または近似のその数と同様に、それが先行する正確な数の文字のサポートを提供する。数が特に示した数に近いか、近似かどうかを決定するのに、
近い、または近似の示されていない数は、それが提示されて文脈で、特に指摘された数とほぼ同等物を提供する。本明細書に引用された全ての公報、特許または特許出願は、あたかもそれぞれ独立した出版物、特許または特許出願が特に及び独立して、参照として組み込まれているように、本文書において、同じ範囲で参照として組み込まれている。さらに、引用された全ての公報、特許または特許出願は、それぞれ本文書に参照として組み込まれており、関連する出版物が引用された主題を開示及び記述する。任意の公報の引用は出願日に先行するその開示のためであり、本文書に記載された発明が先行発明のおかげでそのような公報に先行する資格が与えられないと解釈されるべきではない。また、提供された公報の日付は実際の公開日と異なることがあり、別個に確認する必要があることがある。
【００２０】
請求項は、いかなる任意の要素も排除して書かれていることに注目すべきである。そのように、この記述は、クレーム要素の記述に関して「単に」、「ただ〜だけ」などのそのような排他的用語、または「ネガティブな」限定の使用は先行詞として役立つ。この開示を読む当技術分野の熟練者には明らかであるように、本文書に記載及び表示された個々の実施形態は、それぞれ、本発明の精神の範囲から出ることなく、容易に任意の他の複数の実施形態の特徴から分離または組み合わされる個別の要素または特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順番で、または、論理的に可能な他の順番で実行される。本文書において記載されたものに類似のまたは等価な、任意の方法及び材料を本発明の実行またはテストに使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料をここに記載する。
【００２１】
下記の定義は、本文書で下記に説明された本発明の各実施形態に広く適用可能である。他に定義されない限り、本文書で使用された全ての専門的及び化学的単語は、概して本発明が属する技術分野において普通の技能を持つ人に一般的に理解されるのと同様の意味を有する。概して、本文書及び、細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学の実験過程、及び後述のハイブリダイゼーションで使用されている術語は、よく知られており、そして一般的に技術分野で使用されている述語である。標準技術は核酸及びタンパク合成に使用される。分子生物学的技術及び手法は、一般的に従来技術及び様々な一般的な参照文献における従来の方法によって実施される（本文書に参照として組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ ら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、 ２ｄ ｅｄ. （１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ.Ｙ.を概して参照せよ）。本文書及び、分析化学及び有機合成の研究過程で使用されている術語は、よく知られており、そして一般的に技術分野で使用された術語である。標準技術、または修飾技術は化学合成及び化学分析に使用される。
【００２２】
用語“アルキル”は、それ自身または他の置換基の一部として、他に記載されない限り、完全飽和、モノまたはポリ不飽和、及び、モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−原子化ラジカルを含みうり、指定された炭素原子の番号を有する（例えばＣ１−Ｃ１０は１から１０の炭素を意味する）直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれらの結合を意味する。完全飽和炭化水素ラジカルの例は、限定ではないが、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ―ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、そして同様の物の同族体及び異性体の基を含む。不飽和アルキル基は一つまたは多くの二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例は、限定ではないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２、４−ペンタジエニル、３−（１、４ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、及びより高い同族体及び異性体を含む。用語“アルキル”は、他に記載されない限り “ヘテロアルキル”のような下記の更なる詳細で定義されるアルキル誘導体をまた任意的に含む。炭化水素基に限定されたアルキル基は“ホモアルキル”と称される。用語“アルキル”は、本文書においては、アルキル、アルケニル、及びアルキニル部分を意味し、それらはそれぞれ、価数条件を満たすため、適切なモノ−、ジ−、またはポリ原子価種である。アルキル基は任意的に一つまたは多くのグループにより置換され、本文書で“アルキル基置換”と呼ばれる。
【００２３】
用語“アルキレン”は、それ自身または他の置換基の一部として、限定ではないが、例示された−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−などのアルキル部分由来の２価のラジカルを意味し、及びさらに“ヘテロアルキレン”として後述される基を含む。通常は、アルキル（またはアルキレン）基は、本発明で申請された１０または少ない炭素原子を有する基を含む、１から２４の炭素原子を有している。アルキレンとヘテロアルキレンリンカー基にとって、リンカー基の配向性はリンカー基の化学式が書かれた方向により暗示されていないということは任意的である。例えば、化学式―Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び、任意的に−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−を示す。 “低級アルキル”または “低級アルキレン”は短い鎖アルキル基またはアルキレン基であり、概して８、７、６、５、またはより少ない炭素分子を有する。 
【００２４】
用語“アルコキシ”“アルキルアミノ”及び“アルキルチオ”（またはチオアルコキシ）は従来の意味で使用されており、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子により分子の残りに付着したアルキル基を意味する。
【００２５】
用語“ヘテロアルキル”は、それ自体で、または他の用語と連結して、他のように説明されない限り、安定した直鎖、または分岐鎖、または一定数の炭素原子及びＢ、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、及びＳから構成される基で、ヘテロアトムが任意に酸化され、窒素原子は任意に結晶化する基から選択された少なくとも一つのヘテロアトムである基により構成する環状アルキルラジカルを意味する。（一つまたは複数の）ヘテロアトムはヘテロアルキル基の内部位置または鎖の末端、例えばアルキル基が分子の残りに付いた位置に位置する。限定ではないが、“ヘテロアルキル”基の例として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、 及びＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３を含む。２つまたは多くのヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３ 及び −ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、連続となる。同様に、“ヘテロアルキレン”という用語は、それ自体で、または他の置換基の一部として、限定ではないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＮ−ＣＨ２−ＣＨ２− 及びＣＨ２−ＳＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２‐に例示されるように、置換したまたは置換されていない２価のヘテロアルキルラジカルを言及する。ヘテロアルキレン基にとって、ヘテロ原子はまた、鎖末端のどちらかまたは両方を占有しうる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。
【００２６】
用語“シクロアルキル”及び“ヘテロシクロアルキル”は、それ自体または他の用語と連結して、他のように説明されない限り、それぞれ“アルキル”及び“ヘテロアルキル”の環状版を意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルにとって、ヘテロ原子は複素環が分子の残りに付着する位置を占有し得る。シクロアルキルの例は、限定ではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル、及びその同様の物を含む。ヘテロシクロアルキルの例は、限定ではないが、１-（１,２,５,６−テトラハイドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、 ３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロティエン−２−イル、テトラヒドロティエン−３−イル、１−ピペラジニル、１−２−ピペラジニル等を含む。
【００２７】
用語“ハロ”または“ハロゲン”は、それ自体または他の置換基の一部として、他に記載されない限り、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素原子を意味する。さらに、“ハロアルキル”というような用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、“ハロ”（Ｃ１−Ｃ４）アルキル“はトリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル及び同類のものを、限定するのではないが、含むことを意味する。
【００２８】
“アリール”という用語は、他に記載されない限り、ポリ不飽和の、芳香族の、単環または複環になりうる置換基（好ましくは１から３環、１及びそれ以上は選択的にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルである）で、互いに融合しているまたは共有結合しているものを意味する。“ヘテロアリール”という用語は、窒素及び硫黄原子は選択的に酸化され、そして窒素原子は選択的に結晶化されている、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択された１から４のヘテロ原子を含むアリール基（及び環）を意味する。ヘテロアリール基は分子の残りにヘテロ原子を通じて付着し得る。アリール及びヘテロアリール基の限定ではない例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニルー４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イサオキサゾリル、５−イサオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４―ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンジミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルを含む。上記アリール及びヘテロアリール環システムの各置換基は後述する“アリール基置換基”のグループから選択される。
【００２９】
簡潔に、他の用語と連結して使用された時は（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、用語“アリール”はホモアリール及びヘテロアリール環の両方を上記に定義されたように随意に含む。したがって、用語“アリールアルキル”は随意にアリール基が、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換されたアルキル基（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル、等）を含むアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）に付いたラジカルを含む。
【００３０】
アルキル及びヘテロアルキルラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）の置換基は、一般的に“アルキル基置換基”と呼ばれ、そしてこれらは、０から、（２ｍ’＋１）（但し、ｍ’はこれらラジカルにおける炭素原子の総数である）の範囲の数である−ＯＲ’、＝Ｏ、  ＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、  −Ｓ（Ｏ）Ｒ’、  −Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及びＮＯ２に、限定されるのではないが、選択された一つまたは複数の種類の基である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”及びＲ””は好適にはそれぞれ独立して水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１−３ハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシ及びチオアルコキシ基、及びアリールアルキル基を言及する。本発明の化合物が一つまたは複数のＲ基を含む時、例えば、各Ｒ基は独立的に各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””基として一つまたは複数のこれら基が存在する時選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に付いている時、これらは５−、６−、または７−員環を形成するため窒素原子と連結し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定するのではないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことを意味する。置換についての上記言及から、本技術分野における１技能は、用語“アルキル”は炭素原子が水素よりもハロアルキル（例えば−ＣＦ３及びＣＨ２ＣＦ３）及びアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、 −Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、 −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３、等）のような他の基と結合する基を含むということを理解する。例示的なアルキル基置換基は本文書で“反応性官能基”及び“結合片”と言及されている基を含む。様々な実施形態で、アルキル基置換基はリンを含む部分、例えばリン酸ジエステル及び本文書で記述されているようなリン酸ジエステル修飾である。
【００３１】
アルキルラジカルとして記述された置換基に類似して、アリール及びヘテロアリール基の置換基は一般的には“アリール基置換基”と呼ばれる。例示的な置換基はアルキル基置換基及びその他、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ＝ＮＲ’、  ＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、  -ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、 −Ｓ（Ｏ）２ＮＲ‘Ｒ“、 −ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ 及び −ＮＯ２、 ‐Ｒ’、 −Ｎ３、 −ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで、０から芳香族環システムのオープン原子価の総数までの範囲の数である、リストから選択される；Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”及びＲ””は好適にはそれぞれ独立して水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール及び置換または非置換ヘテロアリールを意味する。本発明の化合物が一つまたは複数のＲ基を含む時、各Ｒ基は独立的に各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”及びＲ””基として一つまたは複数のこれら基が存在する時選択される。
【００３２】
アリール及びヘテロアリール環に隣接した原子の置換基の二つは随意に化学式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ‘）ｑ−Ｕ−で、Ｔ及びＵは独立して−ＮＲ−、  −Ｏ−、  −ＣＲＲ’−、または単結合、及びｑは０から３の整数である置換基で置換される。またまたは、アリール及びヘテロアリール環に隣接した原子の置換基の二つは随意に化学式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−で、Ａ及びＢは独立して−ＣＲＲ’−、  −Ｏ−、  −ＮＲ−、  −Ｓ−、  −Ｓ（Ｏ）−、  −Ｓ（Ｏ）２−、  −Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合で、ｒは１から４の整数である置換基で置換される。新しい環の単結合の一つは随意に二重結合で置換されて形成される。またまたは、アリール及びヘテロアリール環に隣接した原子の置換基の二つは随意に化学式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ’”）ｄ−、ｓ及びｄは独立して０から３までの整数で、Ｘは−Ｏ−、 ‐ＮＲ’−、 −Ｓ−、 −Ｓ（Ｏ）−、 −Ｓ（Ｏ）２−、 または−ＳＮ（Ｏ）２ＮＲ‘‐である置換基で置換される。置換基Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”及びＲ””は好適にはそれぞれ独立して水素または置換または非置換（Ｃ１−Ｃ１６）アルキルから選択される。例示的なアリール基置換基は本文書で“反応性官能基”及び“結合片”と言及されている基を含む。
【００３３】
本文書で使用されているように、用語“ヘテロ”原子は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、及びシリコン（Ｓｉ）を含む。
【００３４】
記号“Ｒ”はＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、及び置換または非置換ヘテロシクリル基から選択された置換基を表す一般的な略記である。Ｒはまたアルキル基置換基及びアリール基置換基を意味し得る。
【００３５】
用語“塩”は本文書で記述された化合物に見られる特有の置換基に依存した、比較的非毒性塩及び塩基から合成された化合物の塩を含む。本発明の合成物が比較的酸性の官能基を含む時、塩基添加塩は合成物の中性型と十分な量の目的とする塩基か、整理されたまたは適した不活性溶媒を接触させることで得られる。塩基添加塩の例はナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、及びマグネシウム塩、及び類似した塩を含む。本発明の合成物が比較的基本的官能基を含む時、酸添加塩は合成物の中性型と十分な量の目的とする塩、整理されたまたは適した不活性溶媒のどちらかを接触させることで得られる。酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、ブチル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的非毒性有機酸からの誘導体の塩同様に酸添加塩は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫黄、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、及びリン酸等ような無機酸からの誘導体を含む。またアルギン酸等のようなアミノ酸の塩、及び、グルクロン酸及びガラクツロン酸等のような有機酸の塩（例えば、Ｂｅｒｇｅ ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ６６： １−１９ （１９７７）を参照せよ）も含む。本発明のある特定の化合物は化合物が塩基か酸添加塩へ変換させる塩基性及び酸性官能基の両方を含む。塩の水和物もまた含まれる。
【００３６】
本文書で使用されているように、“核酸”はヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡか、ＲＮＡか、一重らせん、二重らせん、またはより高度に集合した合成モチーフのどれか、及びそれら化学的修飾のいずれかを意味する。修飾は追加電荷、極性、水素結合、静電相互作用、及び核酸リガンド塩基及び核酸リガンド全体への流動挙動性を組み込んだ化学基を提供する修飾を、限定するのではなく含む。このような修飾は、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、リン酸ジエステル基修飾（例えばホスホロチオエート、メチルホスホン酸）、糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５―ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換；骨格修飾、メチル化（例えば５‘及び／または３’）、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等のような異常塩基対合結合限定するのではなく含む。核酸は非天然塩基をまた含む。“ヌクレオモノマー”はヌクレオシド、ヌクレオチド、及びこれら修飾になる一重核酸ユニットを意味する。
【００３７】
“核酸塩基”は本文書で使用されているように、既知のプリン及びピリミジンの複素環及び本発明のピリミジンだけではなく、複素環類似体及び互変異性体を含有するその部分を含む。プリンはアデニン、グアニンとキサンチン、そして例示的なプリン類似体は、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン及び７−デアザキセンチンを含む。ピリミジンはウラシル、シトシン、及び5-メチルシトシン、５−メチルウラシル、及び４，４ -エタノシトシンなどの類似体を含む。この用語はまた、非天然塩基を包含する。代表的な非天然塩基は５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシ、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボオキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボオキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボオキシメチルアミノメチルウラシル、ジハイロドウラシル、ベータ- D - ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、 ２、２−ヂメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５- メトキシウラシル２ - メチルチオ− Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル- ５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プロイウドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酸メチル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−５−チオウラシル、３−（３−アミノ−２−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、ニトロインドール、及び２，６−ジアミノプリンを含む。
【００３８】
様々な実施形態で、本発明の化合物は５−位でのピリミジン誘導体を含む。誘導体は、１−アルケニル−、１−アルキニル−、ヘテロ芳香族―及び１−アルキニル−ヘテロ芳香族修飾である。“１ーアルケニル”はオレフィン−非置換（二重結合含有）非環式基を意味する。“１−アルキニル”はアセチレン−非置換（三重結合含有）非環式基を意味する。
【００３９】
本文書で使用されているように、“ヌクレオシド”は、塩基は糖または糖類似体に共有結合しており、随意にリン酸、ホスホルアミダイトまたはホスフィンを含む核酸のサブセットを意味する。用語ヌクレオシドがリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意のヌクレオシドが含まれる。糖の炭素の立体化学は、Ｄ−リボースのもの以外になりうる。ヌクレオシドはまた、例えば一つまたは複数の水酸基がハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基に置換される、またはエーテル、アミン、チオール、等として官能化される糖部分の修飾を含む種をも含む。ペントース部分はヘキソースまたは、シクロペンタン環、６員モルホリノリング等のような代わりの構造で置換できる。ヌクレオシドはまた、本文書で定義されるように、遊離カルボキシ基及び／または遊離アミノ基及び／またはそれ自体の保護形態を有するアミノ酸及び／またはアミノ酸類似体に結合した塩基を含むことを意図している。ヌクレオシドはまた随意に、一つまたは複数の塩基修飾、例えばフッ化炭素、アルケニルまたはアルキニル基による修飾を含む。ホスホジエステルまたはホスホジエステル修飾を含むヌクレオシドは、本文書ではヌクレオチドと称される。
【００４０】
“糖修飾”は本文書で使用されるように、２’−デオキシリボースというより任意のペンとースまたはヘキソース部分を意味する。修飾された砂糖はＤ−リボース、２’−Ｏ−アルキル、２’−アミノ、２’−ハロ官能性ペントース、ヘキソース等を含む。例示的な糖修飾は一つまたは複数の水酸基が、ハロゲン、ヘテロ原子、アルキル基に置換される、またはエーテル、エステル等で官能化される糖を含む。ペントース部分はヘキソースまたはシクロペンタン環、６員モルホリノリング等のような代わりの構造で置換できる。ヌクレオシドはまた、本文書で定義されるように、遊離カルボキシ基及び／または遊離アミノ基及び／またはそれ自体の保護形態を有するアミノ酸及び／またはアミノ酸類似体に結合した塩基を含むことを意図している。Ｄ−リボースのもの以外の立体化学を有する糖もまた含まれる。
【００４１】
“ホスホジエステル基修飾”は隣接したヌクレオモノマーを共有結合させる任意の天然ホスホジエステル基の類似物を意味する。代用リンケージは例えばホスホロチオエート及びメチルホスホン酸塩、及び例えばアセタール及びアミドのような非リン含有リンケージホスホジエステル類似物を含む。
【００４２】
核酸修飾はまた、クエンチャー（例えばＢＨＱ）、フルオロフォア、挿入剤、副溝結合子、フルオロカーボン、安定化基または他の部分による標識化のような３’、５’及び結合修飾を含む。様々な実施形態で、修飾または標識はリンカー基を通じてオリゴマーに共有結合している。
【００４３】
オリゴマーは本文書で互いにホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル部分で共有結合した二つ以上のヌクレオモノマーと定義されている。 このように、オリゴマーはわずか二つのヌクレオモノマー（ダイマー）を有し、そして本質的にヌクレオモノマーの上限を有さない。オリゴマーは結合に有能となりうり、そして、それ故、類似した一重らせんまたは二重らせん（または高度な集合）核酸配列と対を形成できる。オリゴマーはまた本文書に記載される長いオリゴマーのシントンとしても有用である。オリゴマーはまた、脱塩基部位と疑似ヌクレオシドを含みうる。様々な実施形態で、本発明のオリゴマーは、官能化される。オリゴマーを官能基化する部分については後述される。記述される特定の実施形態では用語“オリゴマー”はオリゴマーの核酸配列、プローブを提供する修飾された核酸配列、または本発明の固体担体を提供する修飾した核酸配列を意味して、同じように使用される。
【００４４】
“ペプチド”は、モノマーがアミノ酸で互いにアミド結合を通じて結合しているオリゴマーを意味し、代わりにポリペプチドと呼ばれる。アミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のどちらかが使用されうる。さらに、非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンもまた含まれる。一般的に遭遇する遺伝子コードされていないアミノ酸もまた本発明において使用される。本発明で使用されるアミノ酸の全てはＤ−またはＬ−異性体のどちらかである。Ｌ−異性体は概して望ましい。さらに、他のペプチド模倣薬もまた本発明において有益である。一般評論のため、Ｓｐａｔｏｌａ、  Ａ．  Ｆ．、  ｉｎ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ、 ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．  ２６７ （１９８３）を参照せよ。
【００４５】
“固体担体”は、分子、化合物、細胞及び他の存在物の結合のための表面またはそれら種がついた表面を有する固体材料である。固体担体の表面は、平滑及び他のように設定されたようになりうる。固体担体は多孔質または非多孔質になりうる。固体担体は、表面を含み、ガラス、シリコン、ナイロン、ポリマー、プラスチック、セラミック、または金属を含みうるチップまたはアレイになりうる。固体担体は、また、ナイロン、ニトロセルロース、または高分子膜を含む膜、またはガラス、セラミックス、金属、または例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはポリアロマー製の９６ウェルプレートを構成することができる、プラスチックなどを含むプレートまたはディッシュとなりうる。固体担体はまた、任意の形状であり、球形またはほぼ球形であることが望ましく、好適には１ミリメートル以下の直径または最大幅を有し、より好適には０．１〜１００ミクロンのビーズや粒子となりうる。このような粒子やビーズは、任意の適した材料、例えば、ガラスやセラミックス、及び／または例えば、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体のような、一つまたは複数の高分子、またはデキストラン、及び／または金属、特に鉄などの常磁性金属で構成される。
【００４６】
固相合成のための担体は、当該技術分野で知られており、しかし、高架橋ポリスチレン（ＭｃＣｏｌｌｕｍら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ. ３２：ＩＶ０６９−４０７２ （１９９１））、ポリスチレン／ＰＥＧ共重合体（Ｇａｏら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ. ３２： （５）４７７−５４８０ （１９９１）、シリカゲル（Ｃｈｏｗら、 Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ９： （２）８０７−２８１７ （１９８１））、ポリアミド結合シリカゲル、（Ｇａｉｔら、 Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １０： ６２４３−６２５４ （１９８２））、セルロース （Ｃｒｅａら、 Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ８： （２）３３１−２３４８ （１９８０））、及び多孔性ガラス粉体 （ＣＰＧ）（Ｋｏｓｔｅｒら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ. ２４： ７４７−７５０ （１９８３）に限定されない。例示的な固体担体はＣＰＧビーズである。ＣＰＧビーズは多種の方法でのヌクレオモノマー及びオリゴマーの接着により誘導体化される。例えば、ＣＰＧビーズはオリゴヌクレオチドアナログモノマーまたはダイマーの添付用アミノプロピルリンカーハンドルを追加するため、３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理することができ（Ｋｏｓｔｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ. ２４： ７４７−７５０ （１９８３）、または、好適には、長鎖アルキルアミン基、最適には末端ヌクレオシドを含むものは、ＣＰＧに接着することができる（Ａｄａｍｓら.、 Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １０５： ６６１−６６３ （１９８３））。オリゴヌクレオチド合成またはペプチド合成のための担体は、例えばｄＴ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、商業的に得られる。
【００４７】
“挿入剤”は部分挿入及び隣接した核酸塩基間での積み重ねが可能な平面芳香族及びヘテロ芳香族部分を意味する。これらの部分は小さい分子またはよりたんぱく質のような大きい存在物の一部である。挿入剤の非限定的例はアントラセン、アントラサイクリン、アントラシクリノン、メチレンブルー、インドール、アントラキノン、キノリン、イソキノリン、ジハイドロキノン、テトラサイクリン、ソラレン、クマリン、エチジウムハロゲン化物、エチジウムホモダイマー、ホモ二量体オキサゾール黄色（ＹＯＹＯ）、チアゾールオレンジ（ＴＯＴＯ）、ダイネマイシン、1、10 - フェナントロリン銅、カルケアマイシン、ポルフィリン、ジスタマイシン、ネトロプシン、及びビオロゲンを含む。
【００４８】
“副溝結合子”は概しておよそ１５０からおよそ２０００ダルトンまでの分子量を有する部分を言及する。本部分は、およそ１０３Ｍ−１より大きい結合次数で、二重らせん（またはより高い級の集合）ＤＮＡ，ＲＮＡ及びそれらの合成物の副溝への非挿入方法で結合する。副溝結合合成物は幅広く異なる化学構造を有し、いずれにせよ、例示的な副溝結合子は三日月型の３次元構造を有する。例はネトロプシン、ジスタマイシン、レキシトロプシン、ミスラマイシン、クロモマイシンＡ３、オリボマイシン、アントラマイシン、シブロマイシンのような特定の天然発生合成物をさらに関連する抗生物質及び合成誘導体同様に含む。特定のビス第４アンモニウム複素環合成物、ペンタミジン、スチル場微塵、べレニル、ＣＣ−１０６５及び関連ピロロインドール及びインドールポリペプチド、ヘキスト３３２５８、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）のようなジアリラミジンは、天然派生及び合成アミノ酸を含む多数のオリゴペプチド同様、副溝結合子化合物である。例示的な副溝結合子は米国特許第６０８４１０２号に記述されている。結合のこのタイプは紫外光（ｕ．ｖ．）及び核磁気共鳴分光法（ｎｍｒ）及びゲル電気泳動のような、良好な確立された分光測定方法、により検出されうる。副溝結合子分子の結合によるｕ．ｖ．スペクトルの遷移、及び“核オーバーハウザー”（ＮＯＳＥＹ）効果を使用したｎｍｒ分光法は、一般的によく知られており、本目的に有用な技術である。ゲル電気泳動は二重らせんＤＮＡ可動性が変化するこのような結合のため、副溝結合子の二重らせんＤＮＡ及びそれら片に対する結合を検出する。
【００４９】
副溝結合子は通常は２０程度の鎖、１５程度の原子、１０程度または５程度の原子を含有するリンカーを通じてオリゴマーまたは固体担体に付いている。
【００５０】
挿入部分及び作用因子は副溝結合子の“三日月形”または類似形状に対して挿入作用因子は平坦な芳香剤（多環式だと望ましい）分子であるということに基づいて容易に副溝結合子から区別される。実験的差異はまた核オーバーハウザー効果ｎｍｒ分光法でより作られる。
【００５１】
用語“リンカー”及び“Ｌ”は、本文書で使用されているように、一重共有結合（“０”級）及び、例えば、作用因子、クエンチャー、ヌクレオモノマー及び本発明のオリゴマーの安定化のための固体担体の結合、またはクエンチャーの結合または本発明のアミダイトの塩基への部分固定のような、本発明の化合物の要素を互いに共有結合したＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＰから構成される基から選択された１−３０非水素原子を組み込んだ一連の安定共有結合を言及する。例示的なリンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０非水素原子を含む。他に特定されない限り、“結合”“結合した”“連鎖”“接合”“接合した”及びに接着に関する類似した用語はリンカーを使用した技術及びリンカーを組み込んだ種を言及する。例示的なリンカーは本文書で定義されたように結合片を含む。さらに、リンカーはオリゴマー及び新生オリゴマー（オリゴマー合成過程における）の本発明の固体担体への接着に役立つ。それゆえ、本発明はリンカーを介して固体担体（例えば本発明の固体担体）に接着した本発明のオリゴマーもまた提供する。本発明の固体担体及びオリゴマーは固体担体の二つの化合物とオリゴマー（例えばオリゴマーと固体担体の間、フルオロフォアとオリゴマーの間、クエンチャーとオリゴマーの間、フルオロフォアとクエンチャーの間、等）の間の開裂可能なリンカーを随意に含む。様々な実施形態で、固体担体をオリゴマーに接合するリンカーは開裂可能なリンカーである。
【００５２】
“開裂可能なリンカー”は、反応や条件の結果によって破壊される一つまたは複数の切断基を有するリンカーである。例示的な開裂可能なリンカーは、その上にそれが合成された固体担体から本発明の合成オリゴマーの目的にかなった分離を可能にするために提供し、化学式ＩのＬ２に位置する。用語“解離性基”は、複合体の残りの部分に解放部分結合リンカーを切断することによりＴｈｅａ固体担体または本発明のオリゴマーのコンポーネントの解放を可能にする部分を意味する。オリゴマーと本発明の固体担体の用意及び使用の両方において使用される例示的な切断メカニズムは、酵素的またはその他の化学的に仲介される。
【００５３】
酵素切断グループに加えて、酵素以外の作用因子の作用によって切断されている一つまたは複数のサイトを含むことは、本発明の範囲内である。例示的な非酵素開裂剤は、以下に酸、塩基、光（例えば、ニトロベンジル誘導体、フェナシル基、オルト - ハイドロキソ桂皮酸エステル、ベンゾインエステル）、及び熱を、限定ではなく、含む。多くの解離性基は、当技術分野で知られている。例として、Ｊｕｎｇ ら, Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ, ７６１： １５２−１６２ （１９８３）; Ｊｏｓｈｉ ら, Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６５： １４５１８−１４５２５ （１９９０）； Ｚａｒｌｉｎｇ ら, Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., １２４： ９１３−９２０ （１９８０）； Ｂｏｕｉｚａｒ ら, Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １５５： １４１−１４７ （１９８６）； Ｐａｒｋ ら, Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６１： ２０５−２１０ （１９８６）； Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ら, Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., １４３： （１）８５９−１８６７ （１９８９）を参照せよ。さらに、広範囲の開裂可能、二官能性（ホモーまたはヘテロー二官能性の両方）スペーサーは市販されている。
【００５４】
例示的な解離性基は、例えば、例えば水酸化ナトリウム、アンモニアまたは他のアミンのような試薬によって切断される。様々な実施形態で開裂可能なリンカーが室温またはマイクロ波条件下で容易に切断される。一実施形態では、開裂可能なリンカーは、Ｌ２で、アミン、例えばアンモニアまたは有機溶媒中で実質的に無水アミンであるもの、で処理することにより切断される。
【００５５】
“結合片”は、二つ以上の要素（例えば、官能性要素、固体担体またはリンカー）を連結する部分である。この用語は、それぞれが相手の反応に相補的な反応性官能基を有する、相補的反応パートナーの反応により形成されている共有結合を意味する。本発明の固体担体中の結合片及びオリゴマーは、独立して選択されている。例示的な結合片は、Ｙｘ はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、または ０で、 oは１から５０までの整数である、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ 及び ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、及び  ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ，  ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、  ＣＨ２ＣＨ２ＳＮ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳ または （ＣＨ２）ｏＹｘ−ＰＥＧを、限定するのではなく含む。これら例示的結合片それぞれにおいて、ＮＨは、Ｒｔは置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルである、ＮＲｔ.となりうる。結合片はまた、ホスホジエステルまたはホスホジエステル修飾となりうる。様々な実施形態において、結合片は、リンカーと蛍光、リンカーとクエンチャー、リンカーと安定化部分またはリンカーと固体担体の間にある。本発明のオリゴマー及び固体担体の実施形態において、各結合片は異なる結合片である。
【００５６】
用語“フルオロフォア”は本文書で使用されているように本質的に蛍光性または生物学的合成物または金属イオン、または酵素による代謝に結合して蛍光の変化すなわち蛍光性を示す部分を意味する。フルオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、スペクトル特性または物理的特性を変化させるために代替される。多数のフルオロフォアは本技術分野での熟練者に知られており、限定ではなく、後者はフルオレセイン、ローダミン、ローザミンとロードールを含む、クマリン、アクリジン、フラン、ダンシル、シアニン、ピレン、ナフタレン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンザゾール、ホウ化ポリアザインダセン、オキサジン及びキサンテンを含む。本発明で使用されるこれら及び他フルオロフォアはＨａｕｇｌａｎｄ、 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳに記述されている。さらに有益なフルオロフォアは共通所有された米国特許公開出願第二００５／０２１４８３３号 及び第二００５／０１７０３６３号及び本文書の以下に記述される。
【００５７】
本文書で使用されるように、“クエンチャー”は、少なくとも部分的に蛍光体から放出される光を減衰できる本発明の任意の蛍光修飾部分を意味する。この減衰は、本文書で“消光”と称される。したがって、様々な実施形態では、消光基の存在下での蛍光の励起は、完全に存在さえしない、予想以上に低い発光信号に繋がる。消光は通常励起フルオロフォアと消光基との間のエネルギー伝達を介して行われる。
【００５８】
蛍光分子またはクエンチャーは、このような置換基が存在しない場合“親”合成物に関連する望ましい性質、例えば水への溶解度、細胞透過性及び分光吸収及び発光を増進する置換基を含む。したがって、本発明で使用される蛍光分子及びクエンチャーは、改善した置換基は存在しない場合“親”合成物に関連する、望ましい性質を増進する置換基を含む。
【００５９】
“機能要素”は共同所有された米国特許公開出願第二００７／００５９７５２号で記述されたように、クエンチャー、蛍光分子及び安定化部分（挿入剤、副溝結合部分、安定化部分（例えばアルキニル部分及びフルオロアルキル部分）で修飾された塩基、及び立体配座安定化部分を、限定ではなく含む）から選択された構造を有する本発明の合成物の一部を指す一般的用語である。
【００６０】
表現“ポリヌクレオチドの増幅”は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）及びＱ−ベータレプリカーゼの使用に基づいた増幅方法を限定ではなく含む。これらの方法は良く知られており、広く当技術分野で実践されている。例えば、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号及び、 Ｉｎｎｉｓ ら、１９９０ （ＰＣＲ）; 及び Ｗｕ ら、１９８９ａ （ＬＣＲ）を参照せよ。ＰＣＲを実施する試薬及びハードウェアは市販されている。特定の遺伝子領域から配列の増幅に有用なプライマーは、標的領域及びその隣接領域の配列と好適には相補的であり、特異的にハイブリダイズする。増幅から生成した核酸配列は直接配列決定される。代わりに、増幅された（複数の）配列は配列解析する前に複製することができる。酵素的増幅ゲノムセグメントの直接のクローニングと配列解析方法はＳｃｈａｒｆ（１９８６）によって記述されている。本発明は、増幅過程で使用するオリゴマーのプライマーを提供する。さらに、このようなプライマーの合成に使用する固体担体が提供されている。プライマーに加えて、本発明は、増幅の生成物を検出し、及び／または特徴付け、定量化するプローブ、及びそのようなプローブを使用する方法を提供する：また、これらのオリゴマーのプローブを合成するために使用する固体担体も提供される。
【００６１】
用語“塩基のスタッキング摂動”は、例えば、塩基対ミスマッチ、その認識サイト、または任意の他のオリゴヌクレオチド化合物を形成する構成要素に対するタンパク質結合のような塩基のスタッキングにおける摂動を引き起こす任意の事象を意味する。本発明の多種のプローブはそのような塩基スタッキング摂動の検出、特徴づけ及び／または定量化が可能である。さらに、本発明はそのような塩基スタッキング摂動の検出、特徴づけ及び／または定量化が可能であるプローブの合成に役立つ固体担体を提供する。
【００６２】
用語“ハイブリダイズする”は完全に塩基対合した、またはしていない、互いに結合した二つの核酸らせん構造を意味する；一般にこの用語は固体担体かそれとも溶媒に結合した本発明のオリゴマーを含む結合を意味する、
【００６３】
用語“変性”は核酸二本鎖（またはより高度な集合体）のらせんが水素結合によりもはや塩基対合しておらず、一重らせん分子に分離される過程を意味する。変性の方法は本技術分野での熟練者にはよく知られており、熱変性及びアルカリ変性を含む。本用語は一般には標的核酸からの本発明のプローブの解離を意味する。
【００６４】
用語“ミスマッチ”は、１００％相補的ではない、ハイブリダイズされた核酸二本鎖（または高度集合体）内部の核酸塩基を意味する。ミスマッチはワトソンークリック塩基対ではない、核酸の相補的らせんに位置する２塩基の塩基間の間違った任意の対合を含む。総相同性の欠如は、削除、挿入、反転、置換、またはフレームシフト変異が原因である可能性がある。様々な実施形態では、本発明のオリゴマーは、好適にはその標的における対応するミスマッチの検出及び／または特徴づけ及び／または定量化を可能にする、標的核酸に関連したミスマッチを、含む。特定の実施形態では、ミスマッチは、単一ヌクレオチドの不一致である。
【００６５】
本文書で使用されているように、用語“多型性”は遺伝子の配列変異を意味し、“突然変異”は表現型に関連付けられている、または関連すると信じられている遺伝子の配列変異を意味する。用語“遺伝子”は官能性生成タンパク質制御領域をコードする遺伝子の断片を意味する。対象同定のため本発明に従って使用される多型性マーカーは、遺伝子のコードまたは非コード領域において位置し、本発明の多様なプローブはこれらマーカーを含む核酸領域にハイブリダイズように設計されている。用語“対象”は本文書で使用されているように遺伝子試験の目的のため標的核酸が得られる試料を提供する対象を意味する。本発明のオリゴマーは多型性及び突然変異の検出及び／または特徴づけ及び／または定量化に役立つ。さらに、本発明の固体担体は多型性及び突然変異の検出及び／または特徴づけ及び／または定量化に使用するオリゴマーの合成に役立つ。
【００６６】
用語“プローブ”は本文書で使用されているように固体担体またはアミダイトを用いて用意された核酸オリゴマーを意味する。様々な実施形態で、プローブは結合パートナーとの相互作用について検出可能な応答を産生する。プローブは少なくとも一つの検出可能部分、または結合パートナーとのその相互作用への応答でのいくつかのプローブの状態の変化について検出可能なエネルギー伝達対を形成する一対の部分を含む。本発明はプローブの合成に役立つプローブ及びアミダイト及び固体担体を提供する。例示的な本発明のプローブは 多型の検出に役立つ。多種の実施形態で、多型は一本鎖核酸多型（ＳＮＰ）である。
【００６７】
用語“検出可能な応答”は、本文書で使用されるように、観察によってまたは機器によって直接的または間接的に検出可能な信号、及び、試料中のプローブの標的結合相手の存在の機能の存在、または、好適には大きさで、それら中での変化または発生を意味する。一般的には、応答可能な応答は、波長分布パターンまたは吸光強度または蛍光における変化、または光散乱、蛍光量子収率、蛍光寿命、蛍光極性、励起または発光波長における偏移、または上記パラメータの組み合わせにおける変化をもたらすフルオロフォアからの光学的応答である。与えられたスペクトル特性における検出可能な変化は概して、増加または現象である。いずれにせよ、蛍光強度の増進及び／または発光または励起蛍光波長の偏移をもたらすスペクトル変化もまた有用である。イオン結合の蛍光における変化は通常フルオロフォアの励起または基底状態のどちらかで生じる挿入剤における立体配座の及び電子の変化に由来するか、イオン結合サイトの電子濃度の変化に由来するか、結合した標的金属イオンによる蛍光の消光に由来するか、またはこれらまたは他の効果の任意の連携に由来する。代わりに、検出可能な応答はフルオロフォアが本質的に蛍光で金属イオンまたは生物学的化合物への結合で信号の変化を産生しない信号の発生である。本発明は検出可能な応答を提供するプローブ及びこのようなプローブの合成に使用する固体担体を提供する。
【００６８】
用語“担体分子”は、本文書で使用されるように、本発明の化合物が付着するいずれかの分子を意味する。代表的な担体は、タンパク質（例えば、酵素、抗体）、糖タンパク質、ペプチド、サッカリド（例えば、モノ−、オリゴ−及びポリサッカリド）、ホルモン、レセプター、抗原、基質、代謝産物、遷移状態アナログ、共同因子、阻害剤、薬品、染料、栄養物、成長因子等を限定なく含む。“担体分子”は、また、従来の定義では“分子”に含まれるとはみなされないこともありうる種、例えば、固体サポート（例えば、合成サポート、クロマトグラフィーサポート、膜）、ウイルス及び微生物を意味する。
【００６９】
結合に垂直に表示した記号
2018512167.tif 000002
は、表示部分が分子の残りに付いている地点を示している。
【００７０】
本文書に記載した化合物は一つまたは複数の非対称中心または平面を有することがある。非対称置換原子を含む本発明の化合物は随意的に活性体またはラセミ体で分離される可能性がある。ラセミ体（ラセミ化合物）の分解によって、非対称合成によって、または随意的に活性な出発原料からの合成によってのように、随意的に活性体を調製する方法は当技術で周知である。ラセミ化合物の分解は、例えば、分割剤の存在下での結晶化によって、または例えばキラルＨＰＬＣカラムを使用するクロマトグラフィーによって、遂行されうる。多数のオレフィン幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合及び同様の物がまた本文書に記載した化合物中に存在することが可能であり、全てのそのような安定異性体は本発明で検討される。本発明の化合物のシス及びトランス幾何異性体が記載され、異性体混合物として、または分離された異性体として分離されうる。特定の立体化学または異性体が特に示されていない限り、構造の全てのキラル（鏡像異性及びジアステレオマー）、及びラセミ体が意図されている。
【００７１】
本文書で使用されるラセミ、アンビスカレミック、スカレミックまたは鏡像異性的に純粋な化合物のグラフ表現は、Ｍａｅｈｒ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．、６２：１１４−１２０（１９８５）から採用した。実線及び斜線のくさびはキラル要素の絶対的な形状を表示するために使用され、波線はそれが表示する結合が何を生成しうるかのいずれかの立体化学的含意の否定であり、実線及び斜線の太線は図示された相対的な形状を示すが、絶対的な立体化学を全く暗示しない幾何学的記述子であり、くさび型の輪郭及び点線または斜線は絶対的な構造が不定の鏡像異性的に純粋な化合物を示す。
【００７２】
用語「荷電基」は、負電荷または正電荷を負う基を意味する。負電荷または正電荷は１、２、３またはそれ以上から選択された整数である、または、分数である電荷数を有する可能性がある。例示的な荷電基は、例えば、−ＯＰＯ３２−、−ＯＰＯ２’、Ｐ＋Ｐｈ３、−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”Ｒ”’、−Ｓ＋Ｒ及びＣ（Ｏ）Ｏを含む。
【００７３】
本文書に記載した化合物は一つまたは複数の荷電基を有する可能性がある。例えば、
化合物は両性であることもあるが、概して中性である。他の実施形態は、ｐＨ及び他の因子によって、一つまたは複数の荷電基を有することがある。これらの実施形態では、化合物は適した対イオンに組み合わせられることがある。塩を調製する、または、対イオンを交換する方法は当技術分野の熟練者には周知である。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸体を化学量論量の適切な塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫ
水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩または同様のもの）と反応させることによって、またはこれらの化合物の遊離塩基体を化学量論量の適切な酸と反応させることによって調製しうる。そのような反応は、通常、水中または有機溶剤中、または二つの混合物中で実施される。対イオンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィーのようなイオン交換技術によって交換されうる。対イオンまたは塩が特に指示されていない限り、全ての両性イオン、塩及び対イオンが対象とされる。ある実施形態では、塩または対イオンは、対象者への投与用に、薬学上許容されうる。薬学上許容可能な塩については、後述する。
【００７４】
またまたは、本発明の化合物は、酸の不安定な部分の開裂の結果生じる、一つまたは複数の荷電基を含む化合物を形成する可能性がある。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本文書で使用される用語の定義はＩＵＰＡＣに準じる。
【００７６】
ダブルクエンチャープローブ
一形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含み、そこに付いた第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーを有し、第一のクエンチャーはオリゴヌクレオチドの内部位置についている核酸プローブを提供する。第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーは、本文書で定義されたようなものである。
【００７７】
いくつかの実施形態で、オリゴヌクレオチドはさらにフルオロフォアを含む。フルオロフォアは、本文書で定義されたようなものである。
【００７８】
いくつかの実施形態で、本発明は、下記の構造を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブを提供する；
５’−Ｙ１−Ｌ１−ＬＱ１−Ｌ２−Ｙ２−３’
Ｙ１は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含み、Ｙ２は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含む。Ｙ１及びＹ２の一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合しているフルオロフォアを有し、Ｙ１及びＹ２のもう一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合している第二のクエンチャーを有する。Ｌ１及びＬ２は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルからそれぞれ独立して選択される。ＬＱ１は下記の化1である；
【００７９】
【化１】
2018512167.tif 000003
【００８０】
ここで、Ｑ１は第一のクエンチャーである。第一のクエンチャー、第二のクエンチャー及びフルオロフォアは、本文書で定義されたようなものである。
【００８１】
Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬＱ１のいずれも本出願によって包含され、特に本発明によって提供される。
【００８２】
いくつかの実施形態で、Ｙ１のヌクレオチド配列は、フルオロフォアまたは第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している５’リン酸塩を有する第一のヌクレオチドＮ１及びＬ１に共有結合している３’リン酸塩を有する第二のヌクレオチドＮ２を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態で、Ｙ２のヌクレオチド配列は、Ｌ２に共有結合している５’リン酸塩を有する第三のヌクレオチドＮ３及び第二のクエンチャーまたはフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している３’リン酸塩を有する第四のヌクレオチドＮ４を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩が第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩はフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している。
【００８５】
いくつかの実施形態で、核酸プローブは、さらに、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩をフルオロフォアまたは第二のクエンチャーに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態で、核酸プローブは、さらに、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩を第二のクエンチャーまたはフルオロフォアに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態で、オリゴヌクレオチドは１５から４５までの（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態で、オリゴヌクレオチドは２０から３０までの（すなわち、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態で、オリゴヌクレオチドは１５から４５までの（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５）ヌクレオチド（合計）を有する。いくつかの実施形態で、オリゴヌクレオチドは２０から３０までの（すなわち、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）ヌクレオチド（合計）を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩はフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している。
【００８８】
いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ１は８から１１までの（すなわち、８、９、１０または１１）ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ１は９ヌクレオチド配列である。
【００８９】
いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ１は８から１１までのヌクレオチド配列であり、Ｙ２は６から２４までの（すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチド配列である。
【００９０】
いくつかの実施形態で、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩は第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩はフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している。
【００９１】
いくつかの実施形態で、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ２は８から１１までの（すなわち、８、９、１０または１１）ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態で、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ２は９ヌクレオチド配列である。
【００９２】
いくつかの実施形態で、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、Ｙ２は８から１１までの（ヌクレオチド配列であり、及びＹ１は６から２４までの（すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチド配列である。
【００９３】
いくつかの実施形態で、Ｌ１は非置換アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１は非置換Ｃ１〜Ｃ７（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６またはＣ７）アルキルである。Ｌ１は非置換アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１は非置換Ｃ１〜Ｃ３（すなわち、Ｃ１、Ｃ２またはＣ３）アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１はメチルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１はｎ−プロピルである。
【００９４】
いくつかの実施形態で、Ｌ２は非置換アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ２は非置換Ｃ１〜Ｃ７（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６またはＣ７）アルキルである。Ｌ２は非置換アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１は非置換Ｃ１〜Ｃ３（すなわち、Ｃ１、Ｃ２またはＣ３）アルキルである。いくつかの実施形態で、Ｌ２はメチルである。いくつかの実施形態で、Ｌ２はエチルである。いくつかの実施形態で、Ｌ２はｎ−プロピルである。
【００９５】
いくつかの実施形態で、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ同一である。いくつかの実施形態で、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ異なる。いくつかの実施形態で、Ｌ１及びＬ２はそれぞれメチルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１及びＬ２はそれぞれエチルである。いくつかの実施形態で、Ｌ１及びＬ２はそれぞれｎ−プロピルである。
【００９６】
いくつかの実施形態で、核酸プローブは以下の構造を有するオリゴヌクレオチドである：
５’−Ｙ１−Ｌ１−ＬＱ１−Ｌ２−Ｙ２−３’
Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬＱ１は本文書で定義されたようなものである。
【００９７】
クエンチャー
第一（内部）クエンチャー
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含む構造を有し、その残余の少なくとも二つは環外ジアゾ結合を介して共有結合している。
【００９８】
いくつかの実施形態で、少なくとも三つの残余のそれぞれは置換または非置換フェニルである。
【００９９】
いくつかの実施形態で、少なくとも三つの残余の少なくとも二つは少なくとも一つの非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル部分で置換されたフェニルである。
【０１００】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、Ｌ３を介してオリゴヌクレオチドに付いている。Ｌ３は、本文書で定義されたようなものである。
【０１０１】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端に向かって８、９、１０または１１ヌクレオチドである、ヌクレオチドに付いている。
【０１０２】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端に向かって、第８及び第９、または第９及び第一０、または第一０及び第一１、または第一１及び第一２ヌクレオチドの間に付いている。いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端に向かって、第９及び第一０または１１ヌクレオチドの間に付いている。
【０１０３】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの３’末端から５’末端に向かって８、９、１０または１１ヌクレオチドである、ヌクレオチドに付いている。いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの３’末端から５’末端に向かって、第８及び第９、または第９及び第一０、または第一０及び第一１、または第一１及び第一２ヌクレオチドの間に付いている。いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端に向かって、第９及び第一０または１１ヌクレオチドの間に付いている。
【０１０４】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化２から選択される構造を有する：
【０１０５】
【化２】
2018512167.tif 000004
【０１０６】
ここで、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃはそれぞれ独立して置換または非置換アリールから選択される。Ｌ３は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０１０７】
いくつかの実施形態で、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃはそれぞれ独立して置換または非置換フェニルから選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態で、Ｌ３は、結合である。
【０１０９】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化３から選択された構造を有する；
【０１１０】
【化３】
2018512167.tif 000005
2018512167.tif 000006
【０１１１】
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択される。Ｌ３は、本文書で定義されたようなものである。
【０１１２】
いくつかの実施形態で、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、非置換アルキル及びニトロから選択される。
【０１１３】
いくつかの実施形態で、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキル及びニトロから選択される。
【０１１４】
いくつかの実施形態で、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル及びニトロから選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態で、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７（存在するならば）またはＲａ８（存在するならば）は、Ｈである。
【０１１６】
いくつかの実施形態で、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４（存在するならば）、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７（存在するならば）及びＲｂ８（存在するならば）は、それぞれ独立してＨ、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキル及びニトロから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４（存在するならば）、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７（存在するならば）及びＲｂ８（存在するならば）は、それぞれ独立してＨ及び非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキルから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｂ４はニトロである。
【０１１７】
いくつかの実施形態で、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７（存在するならば）及びＲｃ８（存在するならば）は、それぞれ独立してＨ、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキル及びニトロから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７（存在するならば）及びＲｃ８（存在するならば）は、それぞれ独立してＨ及び非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキルから選択される。
【０１１８】
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７、Ｒｃ８及びＬ３の組み合わせはいずれも本出願に包含され、本発明によって特に提供される。
【０１１９】
いくつかの実施形態で、Ｑ１は、下記の化４の構造を有する；
【０１２０】
【化４】
2018512167.tif 000007
【０１２１】
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５及びＲａ６はＨであり；及び、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６及びＬ３は、本文書で定義されたようなものである。
【０１２２】
いくつかの実施形態で、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５、Ｒｂ６の少なくとも一つ（すなわち、１、２、３または全部）はそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５及びＲｂ６の残りはＨである。
【０１２３】
いくつかの実施形態で、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の少なくとも一つ（すなわち、１、２、３、４または全部）はそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の残りはＨである。
【０１２４】
いくつかの実施形態で、Ｑ１は、下記の化４の構造を有する；
【０１２５】
【化５】
2018512167.tif 000008
【０１２６】
ここで、Ｒｂ２、Ｒｃ２、Ｒｃ４及びＬ３は、本文書で定義されたようなものである。
【０１２７】
いくつかの実施形態で、Ｒｃ４はＨである。いくつかの実施形態で、Ｒｂ２及びＲｃ２はそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、及びＲｃ４はＨである。
【０１２８】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化６から選択される構造を有する：
【０１２９】
【化６】
2018512167.tif 000009
及び
2018512167.tif 000010
【０１３０】
ここで、Ｌ３は、本文書で定義されたようなものである。
【０１３１】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化７の構造を有する：
【０１３２】
【化７】
2018512167.tif 000011
【０１３３】
第二のクエンチャー
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャー（Ｑ２）は、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含む構造を有し、その残余の少なくとも二つは環外ジアゾ結合を介して共有結合している。
【０１３４】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャー（Ｑ２）は、Ｌ４を介してオリゴヌクレオチドに付いている。Ｌ４は、本文書で定義されたようなものである。
【０１３５】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化２から選択される構造を有する：
【０１３６】
【化８】
2018512167.tif 000012
【０１３７】
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択される；及び、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態で、Ｒｅ２及びＲｅ５は、それぞれ独立してＨ、非置換アルキル及び非置換アルコキシから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｅ２及びＲｅ５は、それぞれ独立してＨ、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキル、及び非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルコキシから選択される。
【０１３９】
いくつかの実施形態で、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、非置換アルキル及びニトロから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキル及びニトロから選択される。いくつかの実施形態で、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、メチル及びニトロから選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態で、Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；Ｒｅ５はＨである；Ｒｆ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；及び、Ｒｆ４はＨである
【０１４１】
いくつかの実施形態で、Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５はＨである；Ｒｆ２はニトロである；及び、Ｒｆ４は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。
【０１４２】
いくつかの実施形態で、Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｆ２はニトロである；及び、Ｒｆ４はニトロである。
【０１４３】
いくつかの実施形態で、Ｌ４は置換または非置換ジアルキルアミンである。
【０１４４】
いくつかの実施形態で、Ｌ４は下記の化９の構造を有する：
【０１４５】
【化９】
2018512167.tif 000013
【０１４６】
ここで、ＬＮは、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される；及び、ＲＮは、Ｈ、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０１４７】
いくつかの実施形態で、上記の化学式に図示した窒素原子での付着点は、第二のクエンチャーのフェニル部分への付着点である。いくつかの実施形態で、ＬＮは、置換またアルキルである。いくつかの実施形態で、ＬＮは、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキルである。いくつかの実施形態で、ＬＮは、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）ヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態で、ＬＮはエチルである。いくつかの実施形態で、ＬＮは２−ヒドロキシエチルである。
【０１４８】
いくつかの実施形態で、ＲＮは置換または非置換アルキルである。いくつかの実施形態で、ＲＮは、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）アルキルである。いくつかの実施形態で、ＲＮは、非置換Ｃ１〜Ｃ４（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）ヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態で、ＲＮはエチルである。いくつかの実施形態で、ＲＮは２−ヒドロキシエチルである。
【０１４９】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１０の構造を有する：
【０１５０】
【化１０】
2018512167.tif 000014
【０１５１】
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２、Ｒｆ４、ＬＮ及びＲＮは、本文書で定義されたようなものである。
【０１５２】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１１の構造を有する：
【０１５３】
【化１１】
2018512167.tif 000015
【０１５４】
ここで、Ｌ４は、本文書で定義されたようなものである。
【０１５５】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１２の構造を有する：
【０１５６】
【化１２】
2018512167.tif 000016
【０１５７】
第二のクエンチャーはクエンチャー試薬から、例えば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに付いたリンカーに対する相補的反応性を有する反応性官能基を使用して、反応性官能基のクエンチャー試薬への反応を介して、由来することが可能である。
【０１５８】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、米国特許第７０１９１２９号明細書に記載されているように、ＢＨＱ（ブラックホールクエンチャー（登録商標）；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である（から由来する）。いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１３の構造を有するＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２またはＢＨＱ−３誘導体である：
【０１５９】
【化１３】
2018512167.tif 000017
または、
2018512167.tif 000018
【０１６０】
ここで、Ｌ４は本文書で定義されたようなものである。
【０１６１】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、２０１４年５月９日出願の米国仮特許出願第７０１９１２９号明細書、表題「コスミッククエンチャー（Ｃｏｓｍｉｃ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」に記載されたクエンチャーである（から由来する）。いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１４の構造を有する：
【０１６２】
【化１４】
2018512167.tif 000019
【０１６３】
ここで、Ｌ４は、本文書で定義されたようなものである。
【０１６４】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、ブラックベリークエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｂｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ＢＢＱ−６５０（登録商標）；Ｂｅｒｒｙ  ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．；米国特許第７８９７９９８６号明細書に記載）である（から由来する）。いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、下記の化１５の構造を有する：
【０１６５】
【化１５】
2018512167.tif 000020
【０１６６】
ここで、Ｌ４は、本文書で定義されたようなものである。
【０１６７】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーの構造は、第一のクエンチャーについて本文書で図示した構造のいずれかである。
【０１６８】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）クエンチャー、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎｌ、またはＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎ２である（から由来する）。
【０１６９】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に付着する。いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、オリゴヌクレオチドの３’末端に付着する。
【０１７０】
いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、第四ヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩または第一ヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩に付着する。いくつかの実施形態で、第二のクエンチャーは、第四ヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩に付着する。
【０１７１】
本発明の化合物の１優位点は、広範囲のエネルギー供与体分子がクエンチャー官能核酸プローブ及びオリゴヌクレオチドとの結合に使用できる点である。広大なフルオロフォアの配列は等技術分野で知られている。例として、Ｃａｒｄｕｌｌｏ ら、 Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ８７９０−８７９４ （１９８８）； Ｄｅｘｔｅｒ, Ｄ.Ｌ., Ｊ. ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２１： ８３６− ８５０ （１９５３）； Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ら、 Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５： １３３−１４１ （１９９２）； Ｓｅｌｖｉｎ, Ｐ., Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６： ３００−３３４ （１９９５）； Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ, ｉ. Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ４０： ８３− １１４ （１９７１）；  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：  ８１９−８４６ （１９７８）; Ｗａｎｇ ら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１： ６４９３−６４９６ （１９９０）； Ｗａｎｇ ら., Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６７：  １１９７−１２０３（１９９５）を参照せよ。
【０１７２】
本発明のクエンチャーとの結合に使用できる例示的な供与体の、限定ではない表は、表１に提供されている。
【０１７３】
表１
供与体−受容体エネルギー伝達対として選択されうる
供与体または受容体として適した部位
４−アセトアミド−４’−イソチアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジン及び誘導体
アクリジン
イソシアネートアクリジン
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホン酸
Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）−マレイミド
アントラニルアミド
ＢＯＤＩＰＹ
ブリリアントイエロー
クマリン及び誘導体
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）
７−アミノ−トリフルオロメチルクルマリン（クマラン１５１）
シアニン染料
シアノシン
４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５”ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミン五酢酸
４，４’−ジイソシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシン及び誘導体
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシン及び誘導体
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセイン及び誘導体
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２’,７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレサミン
ＩＲＩ４４
ＩＲＩ４４６
マラカイトグリーンイソチオシアネート
４−メチルウンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザニリン
フェノールレッド
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレン及び誘導体
ピレン
酪酸ピレン
スクシンイミジル−酪酸ピレン
量子ドット
リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）
ローダミン及び誘導体
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リッサミンローダミンＢスルホニルクロライドローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（テキサスレッド）
Ｎ，Ｎ．Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
金属キレート、例えば、ランタニドキレート（例えば、ユーロピウムテルビウムキレート）、ルテニウムキレート
【０１７４】
特定のプローブのための適切な供与体―受容体対を選択するための後述する参考文献で例示されるように、文献で得られる大量の実用的なガイダンスが存在する：Pｅｓｃｅ ら., Ｅｄｓ., ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９７１）； Ｗｈｉｔｅ ら., ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ： ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９７０）;等。文献はまた、蛍光及び発色分子の包括的なリスト及び関連するレポーター−クエンチャー対の光学的特性を提供する参考文献を含む（例として、Ｂｅｒｌｍａｎ, ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ, ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）; Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ, ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９７６）; Ｂｉｓｈｏｐ, Ｅｄ., ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ, Ｏｘｆｏｒｄ, １９７２）; Ｈａｕｇｌａｎｄ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  １９９２） Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４９）; 等を参照せよ）。さらに、核酸に添付できる共通反応基を介した共有結合のための誘導体レポーター及び消光分子のために、後述する参考文献で例示されるように、文献には広大なガイダンスが存在する： Ｈａｕｇｌａｎｄ （ｓｕｐｒａ）; Ｕｌｌｍａｎ ら., 米国特許第３，９９６，３４５号明細書; Ｋｈａｎｎａ ら、 米国特許第４，３５１，７６０号明細書。それゆえ、特定の実用化のためのエネルギー伝達対を選択するため、及びこれら対の部分をプローブ分子、例えば、核酸、ペプチド、または他の高分子等に結合するための当技術分野の技能の能力の範囲内である。
【０１７５】
概して、クエンチャーの吸光帯は大幅に供与体の蛍光発光帯と重複することが望ましい。供与体（フルオロフォア）が供与体−受容体エネルギー伝達を使用したプローブの要素である場合は、供与体部位が励起された場合には供与体及び受容体部位が供与体−受容体エネルギー伝達を示すように、本発明の供与体蛍光部位及びクエンチャー（受容体）は好適に選択される。フルオロフォア−クエンチャー対を選択する際に検討されるべき一要因は、供与体−受容体間のエネルギー伝達である。好適には、供与体−受容体間のFRETの効率は少なくとも１０％、好適には少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも８０％である。 ＦＲＥＴの効率は簡単にここに記載された方法及び当技術分野で知られている方法の両方を使用して実験的にテストすることができる。
【０１７６】
供与体−受容体対間のエネルギー伝達効率はまた、密接に会合したり、二量体化するための供与体及び受容体基の能力を変更することによって調整することができる。供与体及び受容体部位が知られている、または密接に会合するように決定づけられている場合、会合における増加または減少は、供与体と受容体の間の、リンカー部分、またはプローブ自体の長さを調整することによって促進することができる。会合する供与体−受容体対の能力は、疎水性またはイオン性相互作用、またはプローブ構築の立体反発を調整することによって増加または減少することができる。このように、供与体−受容体対の会合に関与する分子間相互作用は向上または減衰させられる。従って、例えば、供与体−受容体対の会合は、例えば、全体的な負の電荷を有する供与体及び全体的な正の電荷を有する受容体を利用して、増加させることができる。
【０１７７】
プローブに直接接着するフルオロフォアに加えて、フルオロフォアはまた、間接的な方法で付着させることができる。本実施形態において、リガンド分子（例えば、ビオチン）は一般的にプローブ種に共有結合する。そしてリガンドは、蛍光性化合物のように、または非蛍光性化合物の変換によって蛍光性化合物を生成する酵素のように、本質的に検出可能な、または共有の信号システムに共有結合した、他の分子（例えば、ストレプトアビジン分子）に結合する。標識として関心のある有用な酵素は、例えば、として関心のある酵素、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼとグリコシダーゼ、加水分解酵素、ペプチダーゼまたはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼ等である。蛍光化合物は、上述のように、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。使用できる多様な標識及び信号生成システムの概説としては米国特許第４３９１９０４号を参照せよ。
【０１７８】
本発明のクエンチャーとの結合に使用される供与体は、例えば、フルオレセイン、シアニン染料及びローダミン染料を含むキサンテン染料を含む。これらの化合物の多くは好適な形態は、結合サイトまたは拡散への付着の結合官能基として使用できるフェニル部分の置換基と広範囲に市販されている。優先される蛍光化合物のもう一つのグループは、アルファまたはベータ位置にアミノ基を有する、ナフチルアミンである。そのようなナフチルアミノ化合物の中に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチルー５−スルホン酸、1 - アニリノ- 8 -ナフタレンスルホン酸及び、２-ｐ-トルイジニル-６-ナフタレンスルホネートである。他の供与体は、3 - フェニル- 7 - イソシアネートクマリン、９―イソチオシアネートアクリジン及びアクリジンオレンジのような、アクリジン、；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。
【０１７９】
プローブが核酸プローブである例示的な実施形態では、レポーター分子はフルオレセイン色素（例えば、ＦＡＭ）である。フルオレセイン部分は、望ましくは拡散の３’―または５’―末端に付着し、さらに内部サイトはまたアクセス可能であり、選択された目的のための有用性を有している。ＦＡＭ誘導体がどちらの末端に付着しようと、ＢＨＱは一般的にその対掌体、または拡散鎖の内部位置に付着する。ＦＡＭ供与体は、好ましくは６−ＦＡＭアミダイトを使用して導入される。別の供与基はまた、好ましくは、供与体のアミダイト誘導体を使用して導入される。また、反応性官能基（例えば、イソチオシアネート、活性エステル等）を含む供与基は、核酸（例えば、ヘキシルアミン）に付着した範囲またはリンカーアーム上の反応性官能基との反応を介して、導入できる。
【０１８０】
さらに別の望ましい実施形態では、供与体部分は、誘導体の合成担体を用いて核酸の３’−末端に接続可能である。例えばＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミンカルボキシル酸）はこのフルオロフォアの類似物 （Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ.）で誘導体化された固体担体を使用して核酸の3'-末端に接続する。
【０１８１】
核酸の小分子の結合に関した文献の充実した本文の視点から、核酸への供与体／受容体の接族の他の多くの方法は、当技術分野の技術者に明らかになるであろう。例えばホスホルアミダイト部分と誘導体色素の方法での固相合成の終了時にローダミントフルオレセイン色素は好都合に核酸の５’−ヒドロキシルに接続する（例としてＷｏｏら、米国特許第５、２３１、１９１号；及び Ｈｏｂｂｓ, Ｊｒ., 米国特許第４、９９７、９２８を参照せよ）。
【０１８２】
具体的には、後述する参考文献で例示されるように、核酸の５’−または３’−末端に基を接続する、多くのリンカー部分及び方法が存在する：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ, Ｏｘｆｏｒｄ, １９９１）； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, １５： ５３０５−５３２１ （１９８７） （核酸の３‘−チオール基）; Ｓｈａｒｍａ ら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, １９： ３０１９ （１９９１） （３’−スルフヒドリル基）; Ｇｉｕｓｔｉ ら、 ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, ２： ２２３−２２７ （１９９３） 及び Ｆｕｎｇら、 米国特許第４７５７１４１号 （Ｐ.ｅ. Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, ＣＡ.で市販されているアミノリンク ＴＭ ＩＩを介した ５‘−ホスホアミノ基） Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４７３９００４号（３−アミノアルキルホスホリル基）; Ａｇｒａｗａｌ らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ, ３１： １５４３−１５４６ （１９９０） （ホスホラミデート結合を介した接続）; Ｓｐｒｏａｔ ら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, １５： ４８３７ （１９８７） （５−メルカプト基） Ｎｅｌｓｏｎ ら, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, １７： ７１８７−７１９４ （１９８９） （３’−アミノ基）、等。
【０１８３】
蛍光標識を検出する方法は当技術分野の技術者に広く知られている。それ故、例えば、蛍光標識は適切な光の波長でフルオロフォアを励起し、結果生じる蛍光を検出することによって検出できる。蛍光は写真フィルムのような方法、電荷結合素子（ＣＣＤｓ）などの電子検出器や光電子倍増管等の使用によって、視覚的に検出できる。同様に、酵素標識は酵素に適切な基質を提供し、結果生じる反応生成物を検出することによって、検出される。
【０１８４】
フルオロフォアは、非タンパク有機フルオロフォアまたは蛍光タンパク質でありうる。例示的な非タンパク有機フルオロフォア族は、クサンテン誘導体（（、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン及びテキサスレッド等）、シアニン誘導体（シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン及びメロシアニン等）、サッカリン誘導体及び環置換サッカリン（Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ及びＳｑｕａｒｅ染料を含む）ナフタレン誘導体（ダンシル及びプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体（ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール等）、アントラセン誘導体（ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７及ぼＣｙＴＲＡＤ  Ｏｒａｎｇｅを含むアントラキノン等）、ピレン誘導体（カスケードブルー等）、オキサジン誘導体（ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット及びオキサジン１７０等）、アクリジン誘導体（プロファヴィン、アクリジンオレンジ及びアクリジンイエロー等）、アクリルメチン誘導体（オーラミン、クリスタルバイオレット及びマラカイトグリーン等）及びテトラピロール誘導体（ホルフィン、フタロシアニン及びビリルビン等）である。
【０１８５】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレン−スルホネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホンサン（ＥＤＡＮＳ）、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５，５（Ｃｙ５，５）、３−（１−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−クサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピローリジニル］オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（または２）スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内塩（ＴＲまたはテキサスレッド）、ＢＯＤＩＰＹ染料、ベンゾオキサアゾール、スチビンまたはピレンである（から由来する）。
【０１８６】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）から由来する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアはフルオレセイン部分を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、Ｌ５を介してオリゴヌクレオチドに付着する。Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０１８８】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化１６の構造を有する：
【０１８９】
【化１６】
2018512167.tif 000021
【０１９０】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０１９１】
いくつかの実施形態で、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０１９２】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化１７の構造を有する：
【０１９３】
【化１７】
2018512167.tif 000022
【０１９４】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、６−カルボキシ−テトラクロロフルオレセインから由来する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）部分を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、Ｌ５を介してオリゴヌクレオチドに付着する。Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０１９６】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化１８の構造を有する：
【０１９７】
【化１８】
2018512167.tif 000023
【０１９８】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０１９９】
いくつかの実施形態で、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０２００】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化１９の構造を有する：
【０２０１】
【化１９】
2018512167.tif 000024
【０２０２】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、米国特許第７，３４４，７０１号明細書に記載のキサンテン染料である（から由来する）。
【０２０３】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０（ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅｓａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）部分を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、Ｌ５を介してオリゴヌクレオチドに付着する。Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０２０５】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２０の構造を有する：
【０２０６】
【化２０】
2018512167.tif 000025
【０２０７】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０２０８】
いくつかの実施形態で、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０２０９】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化１９の構造を有する：
【０２１０】
【化２１】
2018512167.tif 000026
【０２１１】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅｓａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である（から由来する）。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅｓａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）部分を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、Ｌ５を介してオリゴヌクレオチドに付着する。Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０２１３】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２２の構造を有する：
【０２１４】
【化２２】
2018512167.tif 000027
【０２１５】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０２１６】
いくつかの実施形態で、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０２１７】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２３の構造を有する：
【０２１８】
【化２３】
2018512167.tif 000028
【０２１９】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）から由来する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、Ｌ５を介してオリゴヌクレオチドに付着する。Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０２２１】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２４  の構造を有する：
【０２２２】
【化２４】
2018512167.tif 000029
【０２２３】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０２２４】
いくつかの実施形態で、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル及び置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０２２５】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２５の構造を有する：
【０２２６】
【化２５】
2018512167.tif 000030
【０２２７】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２６から選択された構造を有する：
【０２２８】
【化２６】
2018512167.tif 000031
【０２２９】
Ｌ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０２３０】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、下記の化２７から選択された構造を有する：
【０２３１】
【化２７】
2018512167.tif 000032
【０２３２】
いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に付着する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、第一のヌクレオチドＮ1の５’リン酸塩または第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩に付着する。いくつかの実施形態で、フルオロフォアは、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩に付着する。
【０２３３】
例示的なクエンチャー／フルオロフォアの組み合わせ
いくつかの実施形態で、本文書で定義されたような第一のクエンチャー（Ｑ１）、第二のクエンチャー及びフルオロフォアは、本出願書によって包含され、及び、特に本発明によって提供される。
【０２３４】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化２８の構造を有する：
【０２３５】
【化２８】
2018512167.tif 000033
【０２３６】
第二のクエンチャー（Ｑ２）は、下記の化２９の構造を有する：
【０２３７】
【化２９】
2018512167.tif 000034
【０２３８】
及び、フルオロフォアは、下記の化３０から選択される構造を有する：
【０２３９】
【化３０】
2018512167.tif 000035
【０２４０】
Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、本文書で定義されたようなものである。
【０２４１】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化３１の構造を有する：
【０２４２】
【化３１】
2018512167.tif 000036
【０２４３】
第二のクエンチャー（Ｑ２）は、下記の化３２の構造を有する：
【０２４４】
【化３２】
2018512167.tif 000037
【０２４５】
及び、フルオロフォアは、下記の化３３から選択される構造を有する：
【０２４６】
【化３３】
2018512167.tif 000038
【０２４７】
いくつかの実施形態で、第一のクエンチャー（Ｑ１）は、下記の化３４の構造を有する：
【０２４８】
【化３４】
2018512167.tif 000039
【０２４９】
第二のクエンチャー（Ｑ２）は、下記の化３５の構造を有する：
【０２５０】
【化３５】
2018512167.tif 000040
【０２５１】
及び、フルオロフォアは、下記の化３６の構造を有する：
【０２５２】
【化３６】
2018512167.tif 000041
【０２５３】
オリゴマー
また、核酸オリゴマー、例えば、プローブが提供される。例示的なオリゴマーは、それぞれが随意的にリンカーを介してそこに共有結合している二つのクエンチャー（すなわち、第一及び第二のクエンチャー）を含む。例示的なオリゴマーは、それぞれが随意的にリンカーを介してそこに共有結合している二つのクエンチャー（すなわち、第一及び第二のクエンチャー）及びフルオロフォアを含む。
【０２５４】
例示的なオリゴマーはオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド（２' -デオキシ−Ｄ−リボースまたはそれで修飾された形状を含む）すなわちＤＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（Ｄ−リボースまたはそれで修飾された形状を含む）すなわちＲＮＡ、及び任意の他のポリヌクレオチドの型プリンまたはピリミジン核酸塩基、または修飾されたプリンまたはピリミジン核酸塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドを含む。オリゴマーは本文書で使用されるように、また以前に記述されているように（Ｎｉｅｌｓｅｎら., Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：（１）４９７−１５００）、アミド結合を介して隣接したヌクレオモノマーが結合した化合物を含む。フラノース環及び／またはホスホジエステル結合のような、通常オリゴマーで発見される構成要素は任意の適した機能的に同様の要素で置換されうる。“オリゴマー”はこのように、足場は配列依存様式で標的とする核酸への結合を促すような、塩基の足場及び支持体としての機能を果たす任意の構造を含むことを意味している。
【０２５５】
ヌクレオモノマーを本発明のオリゴマーに結合する例示的な群は（i）ホスホジエステル及びホスホジエステル修飾対（ホスホロチオエート、メチルホスホネートなど）、（ii）非リン等量式（ホルムアセタール、リボアセタール、カルバメートなど）を含む置換結合、（ｉｉｉ）アラビノース、またはリボースまたはデオキシリボースの代わりのヘキソースのようなモルホリノ基、炭素環式残基または他のフラ糖、（ｉｖ）アミド結合を介して結合したヌクレオモノマーまたは任意の適した置換結合で結合した非環式ヌクレオモノマー、を含む
【０２５６】
本発明のオリゴマーは修飾された従来型のヌクレオモノマーを使用して形成され、現在は市販されている、基本的固相（または溶液相）オリゴマー合成技術を使用して合成される。概して、保護基及び核酸塩基及び、ヌクレオモノマーまたはオリゴマーに結合可能な結合基を有する、ヌクレオモノマーまたはオリゴマーシントンの合成；ヌクレオモノマーまたはオリゴマーシントンの受容体ヌクレオモノマーまたは受容体オリゴマーへの結合；保護基の除去；及び目的とするオリゴマーが合成されるまでに必要な本サイクルの繰り返し；のステップを含む方法によってオリゴマーは合成されうる
【０２５７】
本発明のオリゴマーは、４０、５０または１００ヌクレオモノマー以上のものを含む任意の長さになりうる。様々な実施形態において、オリゴマーは２−１００ヌクレオモノマーを含む。ヌクレオモノマーの１０から４０以上または同等の長さは治療または診断応用に有益である。２、３、４、または５ヌクレオモノマーを含む短いオリゴマーは特に本発明に含まれ、例えばシントンのように有益である。
【０２５８】
オリゴマーはポリメラーゼまたは逆転写酵素のプライマーとして機能を果たし得る残りを含むという条件で、無作為化した配列を有し、２０より少ない、１５より少ない、または１０より少ないヌクレオモノマーを含むオリゴマーは、プライマーとして、例えば無作為な配列プライマーを使用するクローニングや増幅プロトコルにおいて有益である。
【０２５９】
オリゴマーは従来のホスホジエステル連鎖を含み得り、またホスホラミデート連鎖のようなホスホジエステル修飾を含みうる。これら置換連鎖は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｓ）−Ｏ− （“ホスホロチオエート”）、 −Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ− （“ホスホロジチオエート”）、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）− （ｎｒｏ２）−Ｘ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ｒｏ）−Ｏ−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｏ）−Ｏ− （“チオノアルキルホスホネート）、 −Ｐ（Ｏ）（ＯＲｐ）−Ｘ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−、または −Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＲｐ２）−Ｘ−、 でＲｏはＨ（または塩）、またはアルキル（Ｃ１−Ｃ１２）で、Ｒｐ はアルキル（Ｃ１−Ｃ９）であり、連鎖はヌクレオモノマーの炭素に結合した-Ｏ-またはＳ-を介して、隣接したヌクレオモノマーに結合している、化学式の部分をもつ実施形態を、限定ではなく、含む。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーで使用される置換連鎖はホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート及びチオノメチルホスホネート結合を含む。ホスホロチオエート及びメチルホスホネート結合は生理学的環境にあるオリゴマーに追加された安定性を与える。同じオリゴマーのこのような連鎖の全てが同定される必要はないが、一般に本発明の望ましいオリゴマーは一様にホスホロチオネート連鎖または一様にメチルホスホネート連鎖を含む。
【０２６０】
オリゴマーまたはそのセグメントは従来本発明の固体担体及び／またはホスホラミデートを使用して合成され、処理されうる。当技術分野で知られ、本文書で記述されている合成方法は、当技術分野で知られる他の核酸塩基同様、本発明の化合物を含むオリゴマーの合成に、適切に保護されたヌクレオモノマーを用いることで使用できる。オリゴマーの合成の方法は、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．，ら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ   Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. （１９８６） １４：５３９９−５４６７； Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ. （１９８８） １６：４８３１−４８３９；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （１９８７） ６：２８７−２９１；  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ, Ｂ., Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ   Ｌｅｔｔ. （１９８６） ２７：５５７５−５５７８； Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ, Ｍ. Ｈ. ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ   Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９８９）, Ｊ. ＳＮ. Ｃｏｈｅｎ, ｅｄｉｔｏｒ, ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ, Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ, ｐ７−２４； Ｒｅｅｓｅ, Ｃ. Ｂ. ら, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ   Ｌｅｔｔ. （１９８５） ２６：２２４５−２２４８で見られる。メチルホスホネートがホスホンアミダイト化学を介して結合したオリゴマーはまた記述されている（Ａｇｒａｗａｌ, Ｓ. ら., Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ   Ｌｅｔｔ. （１９８７） ２８：３５３９−３５４２； Ｋｌｅｍ, Ｒ.Ｅ., ら, 国際出願第ＷＯ ９２／０７８６４号）。
【０２６１】
本文書で開示されているように、本発明はオリゴマーの“結合”を提供する。例えば、オリゴマーは安定化部分、フルオロフォア、クエンチャー、挿入剤、または特にＤＮＡ二重らせんの副溝と相互作用する物質（副溝結合子“ＭＧＢ”）のような、多様な官能性化合物と共有結合できる。他に選ばれた結合部分は、放射能、蛍光、酵素、または切断リンカー等を使用して細胞結合を容易にする部分の標識となりうる。適した放射能標識は32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ及び14Ｃを含む；そして適した蛍光標識は、フルオレセイン、レゾルフィン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（分子プローブ）及びテキサスレッドを含む；適した酵素はアルカリホスファターゼ、及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。追加フルオロフォアは本文書に記載されており、概して当該技術分野で理解されている。他の共有結合部分はビオチン、抗体、または抗体片、及びたんぱく質、例えばトランスフェリン及びＨＩＶ感染Ｔａｔたんぱく質を含む。
【０２６２】
本文書で記述されて、そして当技術分野で認識されているように、オリゴマーは任意の好都合な結合で誘導体化される。例えば、副溝結合子、フルオロフォア、クエンチャー、及びアクリジン及びソラーレンのような挿入剤は、例えばオリゴマーの５’―位末端、ＲＮＡの２’−位、または、ピリミジンの５−位に組み込まれたＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨまたはＳＨのような、任意の有効な-ＯＨ または −ＳＨを介して、本発明のオリゴマーに結合しうる。例えば、５位に −ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、 −ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ または −ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを含む誘導体化された化学式は、本発明に役立つ。ポリリシンまたはリシンを含む結合は記述されたように合成されうり、オリゴマーの標的核酸配列への結合親和性をさらに高めうる（Ｌｅｍａｉｔｒｅ, Ｍ. ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （１９８７） ８４：６４８−６５２； Ｌｅｍａｉｔｒｅ, Ｍ. ら.、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８７） ６：３１１−３１５）。
【０２６３】
広範囲の置換は結合または代替結合を介したバインドを含み接合されうる。オリゴマーのホスホジエステル結合−ＯＨ部分は、他のヌクレオモノマーへと追加結合を準備するため、標準保護基、または結合基により保護されたリン酸基で置換でき、または結合置換基にバインドしうる。５’‐末端ＯＨはリン酸化されうる；３’‐末端の ２’−ＯＨ または ＯＨ置換基もまたリン酸化されうる。水酸基は、標準的な保護基を誘導体化することができる。
【０２６４】
本発明のオリゴマーは、開裂可能リンカーを用いて細胞結合を促進する部分に共有結合的に誘導体化されうる。このような結合に使用されたリンカーはオリゴマー輸送作用因子複合体が細胞に侵入した後に現象したジスルフィド結合を含みうる。このタイプのジスルフィド含有リンカーは制御可能な半減期を有する。このようなリンカーはジスルフィド結合の酸化還元ポテンシャルのため、細胞内環境と比べて細胞外環境下では安定である。
【０２６５】
反応性官能基
本発明の化合物の成分（例えば、リンカー、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、担体分子、及び固体担体）は、第一及び第二反応性官能基の反応によって形成される結合部位を介して結合している。反応性官能基は、相補的に反応性であり、それらは反応した結果、化合物の二つの成分の間に共有結合を形成する。例えば、化学式（Ｉ）または（ＩＩ）による化合物（但し、ＲＸまたはＲＳが反応性官能基である）は、相補的に反応性の反応官能基と、もう一つに成分（リンカー、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、担体分子、及び固体担体等）に反応して、その結果生じた結合部位を介して、成分を共有結合させる。相補的に反応性の反応官能基は他の成分（リンカー、ヌクレオシド等）の任意の位置、例えば、アルキルまたはヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリール核上の置換基にも位置しうる。様々な実施形態で、反応基がアルキル（またはヘテロアルキル）、または置換アルキル（またはヘテロアルキル）鎖に付着する時、反応基は好適には鎖の末端位置に位置する。
【０２６６】
本発明を実施する上で有用な反応性基と反応のクラスは、一般に生体分子架橋化学の分野でよく知られているものである。本発明のオリゴマーの反応性前駆体と共に得ることができる、現在支持されている反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、求核置換（例えば、アシル化物、活性エステルとアミンとアルコールの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、そして炭素 - 炭素及び炭素 - ヘテロ原子多重結合への添加（例えば、ミハエル反応、ディールスアルダー付加）を、限定ではなく、含む。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ, ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ, 3ｒｄ Ｅｄ., Ｊｏｈｎ   Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９８５； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ, ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, １９９６； 及びＦｅｅｎｅｙ ら, ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ； Aｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ, ｖｏｌ. １９８, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, Ｄ.Ｃ., １９８２に記述されている。
【０２６７】
例として、本発明での使用する反応性官能基としては、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアン酸塩、イソシアネート、チオシアン酸塩、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、硫化物、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン、尿素、擬性尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物を、限定ではなく含む。反応性官能基はまた、生体架橋物生成に使用されるもの例えばＮ −ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを含む。これら官能基それぞれの生成の方法は、当技術分野でよく知られており、その特定の目的への応用及び改良は当技術分野の一技能能力内である（例として、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ, eｄｓ．  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, １９８９を参照せよ）。
【０２６８】
有用な反応性官能基変換は、例として
（ａ）活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ −ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、チオエステル、p -ニトロフェニルエステル）、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルを、限定ではなく、を含む、多様な誘導体に容易に変換されるカルボキシ基
（ｂ）エステル、エーテル、ハロゲン化物、アルデヒドなどに変換できるヒドロキシル基、
（ｃ）それによってハロゲン原子の部位で、新しいグループの共有結合をもたらす、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で後に置換することができるハロアルキル基
（ｄ）例えば、マレイミド基のようにDiels - Alder反応に参加できるジエノフィル基
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾンセミカルバゾンまたはオキシムのようなカルボニル誘導体の形成を介して、または可能な、グリニャール付加またはアルキルリチウム付加のようなメカニズムを介して、後続の誘導体化が可能なアルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するアミンとの次の反応のためのスルホニルハライド基
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換できるまたはアシル化合物と反応できる、チオール基
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化、できるアミンまたはスルフヒドリル基
（ｉ）例えば環化、アシル化、ミハエル付加等を経ることができるアルケン
（ｊ）例えば、アミン、ヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド
（ｋ）核酸合成に有用なホスホルアミダイト及びその他の標準的な官能基
を含む。
【０２６９】
官能性反応基は、本発明のオリゴマーの組立てに必要な反応に関与しないように、または干渉するように、選択できる。また、反応性官能基は保護基の存在によって反応に関与することから保護できる。当技術分野の技術者は選択された反応条件の設定と干渉しないように、特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基の例として、例として、Ｇｒｅｅｎｅ ら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ, Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ」 ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９９１を参照せよ。
【０２７０】
共有結合基
本発明のオリゴマーの一部に含まれているのは、オリゴマー及び標的配列との間に少なくとも一つの共有結合をもたらすことができる反応性官能基の部分である。複数の共有結合もまた、そのような部分の多重度を提供することによって形成されうる。共有結合は、標的鎖の塩基残基であることが望ましいが、また、糖やリン酸を含む、標的の他の部分で生成されうる。架橋剤に影響する部分の反応性が二本鎖の標的の性質を決定する。優先される架橋部分はアシル化とアルキル化剤、そして、特に、鎖の標的位置との反応を可能にするため、特異性付与部分鎖に相対的に配置するもの含む。
【０２７１】
架橋部分は、オリゴマーの配列の類似ピリミジンまたはプリン残基として都合よく配置することができる。配置は、５’−または／及び３’端、配列の内部位置、または上記の組み合わせになりうる。高い柔軟性を可能にするために末端の配置が優先される。類似部分は、また、ペプチド骨格に付着することができる。 
【０２７２】
本発明に有用なアルキル化の例示はＮ４,Ｎ４−エタノシトシン及び Ｎ６,Ｎ６−エタノアデニンを含む。
【０２７３】
塩基はプリンまたはピリミジンである必要はないことは明らかである；確かに反応性官能基が付着する部分は全く核酸塩基である必要はなく、糖、リンカー、クエンチャー、安定化部分、フルオロフォア、または本発明のオリゴマーのこれらの成分の組み合わせであることがある。反応性官能基を付着する方法は、配置が正しい限り、いずれでもよい。
【０２７４】
合成
本発明の化合物（固体担体、モノマー（例えばホスホルアミダイト）、及び本発明のオリゴマー及びこれらの断片は、一般的に従来合成されてきた。例えば、米国特許第７，０１９，１２９号明細書、及び米国特許第７，８７９，９８６号明細書を参照せよ。当技術分野で知られており、本文書で記述されている合成方法は、適切に保護されたヌクレオモノマーを使用して、当技術分野で知られている他の核酸塩基同様、本発明の化合物を含むオリゴマーの合成に使用されうる。オリゴマーの合成の方法は、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．ら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. （１９８６） １４：５３９９−５４６７； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. （１９８８）１６：４８３１−４８３９； Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （１９８７） ６：２８７−２９１；  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，  Ｂ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８６） ２７：５５７５−５５７８； Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ, Ｍ. Ｈ. ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｅｎe Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９８９）, Ｊ. ＳＮ. Ｃｏｈｅｎ, ｅｄｉｔｏｒ, ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ, ｐ７−２４； Ｒｅｅｓｅ, Ｃ. Ｂ.ら, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８５） ２８：２２４５−２２４８で見られる。メチルホスホンアミダイト化学を介したメチルホスホネート結合オリゴマーの合成はまた、記述されてきた（Ａｇｒａｗａｌ, ＳＮ. らTｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８７） ２８：３５３９−３５４２； Ｋｌｅｍ, Ｒ. ｅ., ら.,国際出願第ＷＯ９２/０７８６４号）。
【０２７５】
例示的実施形態において、ヌクレオモノマーは標準的な合成条件と試薬を使用してオリゴマーまたは好都合なその断片に直接組み込まれている。この方法によって作られた例示的結合は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、炭酸塩、モルホリノカルバミン酸塩及びスルホン酸塩を含む。
【０２７６】
多様な実施の態では、合成は、適切な前駆体から始まる短いシントン（ダイマー、トリマー等）の合成を含む。このアプローチは、Ｎ -メチルヒドロキシルアミン、ジメチルヒドラゾ、スルファミン酸塩、カルバメート、スルホン酸塩、アミドスルホン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール及び炭酸塩を含む結合の合成に適しています。
【０２７７】
本発明のオリゴマーはアミダイト、トリエステルまたは水素ホスホン酸結合方法や条件を含む任意の適切な化学により合成することができる。オリゴマーは優先的にＤＭＴ,ＭＭＴ,ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ＰＡＣＯ（フェノキシアセチル）、ＴＢＤＭＳ（t -ブチルジフェニルシリル）またはＴＭＳ（トリメチルシリル）のようなシリルエーテルで５’位で優先的に保護された適切な開始シントンから合成され、３’位で活性化されオリゴマーは、エステル、Ｈ−ホスホネート、β- シアノエチルホスホルアミダイト、ＴＢＤＭＳまたはＴＭＳまたはｔ−ブチジフェニルのようなシリルエーテルである。また、阻害された５−ヨード−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−２’−Ｏ−アルキルウリジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン、５−トリフルオロメタンフルホン酸−２’―デオキシウリジン、５−ブロモ―２’−Ｏ−アルキルウリジン、または阻害及び保護された５−ヨード−２’−でオキシシチジン、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン、５−トリフルオロメタンフルホン酸−２’−デオキシシチジン、５−ヨード−２’−Ｏ−アルキルシチジン５−ブロモ―２’−Ｏ−アルキルシチジンのような適切なウリジンまたはシチジン前駆体は、その後適切なシントンと長いオリゴマーを得るために誘導体化されるダイマー、トリマー、テトラマー、五量体以上シントンなどの短いオリゴマーに好都合に組み込まれうる。
【０２７８】
約4以上のヌクレオモノマー残基を含有するオリゴマーの例示的合成は、アミダイト、Ｈ −ホスホネートまたはトリ化学の使用に適したカップリング基を運ぶモノマー、ダイマー、またはトリマーなどのシントンを使用して行われる。シントンは、ホスホジエステル（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チオノメチルホスホネート、ホスホルアミダート等）よりも、ホスホジエステル又はリン含有結合を介したオリゴマーの要素を結合するために使用することができる。
【０２７９】
他の非リン含有置換結合の合成は、当技術分野で知られているように適切な前駆体を使用して行うことができます
【０２８０】
目的とする核酸が合成されると、それは任意の存在する保護基を除去するため（例えば、６０度、５ｈ、濃アンモニア）、当技術分野で知られている方法によって、合成され、扱われる固体担体から優先的に開裂される。塩基−官能性基が核酸に付着している実施形態において（ＴＡＭＲＡ）、脱保護は優先的に、穏やかな条件（例えば、ブチルアミン：水１：３、８時間、７０℃）が使用される。これらの条件下での脱保護は、を速な脱保護アミダイトの使用によって促進される。（例えば、ｄＣ−アセチル、ｄＧ−ｄｍｆ）
【０２８１】
固体担体からの開裂及び脱保護に続いて、核酸はクロマトグラフィー、抽出、ゲル精製を含む当技術分野において知られている任意の方法で精製される。優先される実施形態では、核酸はＨＰＬＣを用いて精製される。濃度と単離された核酸の純度は、分光光度計で２６０ ｎｍでの光学密度を測定することによって優先的に決定される。
【０２８２】
本発明のアッセイとオリゴマープローブ
様々な実施形態において、本発明は一つ以上の分析形式に使用されるオリゴマーを提供する。選択された実施形態において、オリゴマーは標的と会合または解離したための検出可能な信号の生成に関与する。本発明のオリゴマープローブは任意の特定の分析形式での使用に限定されない。従って、以下の記述は本発明のオリゴマーが使用される例示的分析形式の説明を意図しており、オリゴマーが使用される分析形式を限定することを意図していない。
【０２８３】
アッセイ
以下の記述は、一般的に本文書に記載される分析に関連する。本議論は、特定の優先的実施形態を参照することにより、本発明を説明することを意図しており、本発明の化合物が使用されるプローブと分析の種類の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の化合物を利用した他の分析形式は、当技術分野の技術者に明らかになるであろう。
【０２８４】
一般的に、例えば、未知の量の核酸のような、標的分子の濃度を決定するためには、それは最初に、プローブの一定量が公知の量の範囲におよぶ核酸標準と接触している参照データを取得することが望ましい。各参照混合物からの蛍光発光強度は、未知の濃度が、公知の標準の強度と比較されたグラフまたは標準曲線を得るために使用されている。例えば、a）ターゲット核酸内の配列にハイブリダイズする；及びb）標識のサイトである５'及び３‘末端にフルオロフォア及びクエンチャー修飾を有する；ｃ）非結合配座で消火され、次に標的核酸の結合に関する信号を放出するプローブは、そのような基準データを取得しするために使用されうる。そのようなプローブは、標的核酸濃度が増大するにつれて信号が増大する、特有の蛍光発光を提供する。そして、標的の未知の量を有するサンプルは、プローブと接触し、混合物からの発光強度が決定される。蛍光発光の強度は、その後試験混合物中の標的の濃度を取得するための参照基準と比較される。
【０２８５】
多重分析
他の実施形態において、本発明の固体担体及びオリゴマーは、混合物中の一つ以上の種を検出するための多重分析で使用されるプローブ及び一つ以上のプローブの成分として利用されている。
【０２８６】
本発明の固体担体またはオリゴマーに基づくプローブは、特に多重型の解析及び分析を実行するのに有用である。例示的な多重分析では、二つ以上の異なる種（または一つまたは複数種の領域）が、各プローブが異なるフルオロフォアで標識された、二つ以上のプローブを使用して検出される。供与体−受容体エネルギー伝達に依存して多重分析で使用される優先的種は、少なくとも二つの条件を満たす：フルオロフォア種は明るく、スペクトルが良好に分割される：そして、フルオロフォア種とクエンチャー間のエネルギー転送が効率的である。
【０２８７】
本発明の固体担体とオリゴマーは、一つ以上の蛍光レポーターが一つまたは複数のクエンチャー構造と提携している多重分析の設計を可能にする。本発明の固体担体またはオリゴマーを使用した多数の異なる多重分析は、当技術分野の技術者に明らかになるであろう。一例示的分析では、少なくとも二つの別個の蛍光レポーターがそれらの各オリゴマーで同種のクエンチャー構造と対になり、それによって、ＦＲＥＴまたは接触消光を介して信号を変調する。また、少なくとも二つの別個の蛍光レポーターが、蛍光特性がより良好に “マッチする” 別個のクエンチャー構造と提携するアッセイが実行されうる。フルオロフォアはクエンチャーや異なる分子に対するのと同様同分子に結合しうる。さらに、クエンチャー及びフルオロフォアと同様に、フルオロフォア及びクエンチャーを共有結合するオリゴ配列のように、特定のアッセイ系で使用するキャリア分子は、同一または異なることがある。
【０２８８】
上記の混合物に加えて、本発明はまた、検出または特定の分子種を検出するための定性的な方法を提供する。方法は、（a）本発明の固体担体またはオリゴマーを含む混合物と種を接触させる；及び（b）得られた混合物の一つまたは複数の要素の蛍光特性の変化を検出し、それにより分子種の存在を検出することを含む。
【０２８９】
供与体−受容体エネルギー転送を使用した、二つ以上のプローブの同時使用は、当該技術分野で知られている。例えば、異なるシーケンスの特異性を有する核酸プローブを使用した多重分析は記載されている。蛍光プローブは、特定の変異に対し個々がホモ野生型、ホモ接合性変異体またはヘテロ接合であるかどうかを判断するために使用されている。例えば、野生型配列を認識する一消光フルオレセイン分子指標及び変異対立遺伝子を認識する別のローダミン消光分子指標を使用することで、β−ケモカイン受容体の遺伝子型個体が可能である（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ ら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−１２２９  （１９９８））。フルオレセイン信号のみの存在は、個体は野生型であることを意味し、ローダミン信号の存在は、個体はホモ接合体変異だということ意味するのみである。ローダミンとフルオレセイン信号両方の存在は、ヘテロ接合体に特徴的である。Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ４９−５３ （１９９８）） は遺伝子差別のための４つの異なる標識された分子指標の同時利用を記述しており、Ｌｅｅら、 Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７： ３４２−３４９ （１９９９） は６ＰＣＲ生成物の七色均一な検出を記述している。
【０２９０】
本発明のクエンチャーは、任意の種、例えば、全細胞、ウイルス、タンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体）、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞内の粒子、生物（例えば、サルモネラ）、核酸（その例えば、ＤＮＡ、RNA、及び類似体）、多糖類、リポ多糖、脂質、脂肪酸、非生体高分子と低分子（例えば、毒素、薬剤、殺虫剤、代謝、ホルモン、アルカロイド、ステロイド）を含む、を検出及び/または実質的にすべての種を定量化するため多重分析で使用されうる。
【０２９１】
本発明の固体担体及びオリゴマーは有用な核酸プローブであり、例えば５’―ヌクレアーゼ分析、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を、液相または固相（例えば、配列）分析の標的の直接検出同様含む多様なＤＮＡ増幅／定量化方略における検出作用因子の要素として使用できる。また、固体担体及びオリゴマーは、例えば、分子指標から選択された形式、スコーピオンプローブ（登録商標）、サンライズプローブ（登録商標）、立体アシストプローブ、発光プローブ、インベーダー検出プローブ及び及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含む、実質的に任意の形式のプローブで使用されることができる。例として、Cardullo,R.ら，Proc. Natl. Acad．Sci.USA，85：8790-8794（1988；  Dexter, D.L., J. Chem. Physics, 21：836−850 （1953）； Hochstrasser, R.ら, Biophysical  Chemistry，45：133−141（1992）；Selvin, P., Methods in Enzymology, 246:300-334 （1995）; Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40:83-114 （1971）; Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 （1978）; Wang, G.ら, Tetrahedron Letters, 31:6493-6496 （1990）; Wang, Y.ら、 Anal. Chem., 67:1197-1203 （1995）; Debouck, C., ら, nature geneticsの補足, 21:48-50 （1999）; Rehman, F.N.ら, Nucleic Acids Research, 27:649-655 （1999）; Cooper, J.P.ら., Biochemistry, 29:9261-9268 （1990）; Gibson, E.M.ら, Genome Methods, 6:995-1001 （1996）; Hochstrasser, R.A.ら, Biophysical Chemistry, 45:133-141 （1992）; Holland, P.M.ら., Proc Natl. Acad. Sci USA, 88:7276-7289 （1991）; Lee, L.G.ら., Nucleic Acids Rsch., 21:3761-3766 （1993）; Livak, K.J.ら., ＰＣＲ Methods and Applications, Cold Spring Harbor Press （1995）; Vamosi, G.ら., Biophysical Journal, 71:972-994 （1996）; Wittwer, C.T.ら., Biotechniques, 22:176-181 （1997）; Wittwer, C.T.,ら Biotechniques, 22:130-38 （1997）; Giesendorf, B.A.J.ら., Clinical Chemistry, 44:482-486 （1998）; Kostrikis, L.G.ら., Science, 279:1228-1229 （1998）; Matsuo, T., Biochemica et Biophysica Acta, 1379:178-184 （1998）; Piatek, A.S.ら., Nature Biotechnology, 16:359-363 （1998）; Schofield, P., ら., Appl. Environ. Microbiology, 63:1143-1147 （1997）; Tyagi S.,ら., Nature Biotechnology, 16:49-53 （1998）; Tyagi, S.ら, Nature Biotechnology, 14:303-308 （1996）; Nazarenko, I.A.ら., Nucleic Acids Research, 25:2516-2521 （1997）; Uehara, H.ら., Biotechniques, 26:552-558 （1999）; D. Whitcombeら., Nature Biotechnology, 17:804-807 （1999）; Lyamichev, V.ら., Nature Biotechnology, 17:292 （1999）; Daubendiekら., Nature Biotechnology, 15:273-277 （1997）; Lizardi, P.M. ら., Nature Genetics, 19:225-232 （1998）; Walker, G. ら., Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 （1992）; Walker, G.T.ら., Clinical Chemistry, 42:9-13 （1996）; 及び Compton, J., Nature, 350:91-92 （1991）.を参照せよ。
【０２９２】
したがって、本発明は、核酸の標的配列を検出するための方法を提供している。方法は：（a）標的配列を検出する核酸（例えば、本発明のオリゴマー）と接触する（b）：標的配列に標的結合配列をハイブリダイズして、検出核酸の立体構造を変更し、蛍光パラメータの変化を引き起こす；及び（c）蛍光パラメータの変化を検出し、核酸標的配列を検出する：を含む。
【０２９３】
本文書で記載される方法で、他に記述のない限り、優先される検出核酸は一本鎖標的結合配列を含む。結合配列は、：ｉ）フルオロフォア、及びii）第一のクエンチャー、及びiii）第二のクエンチャーに結合している。結合配列は、任意に、さらにそこに安定化部分を結合させる。さらに、相補的な配列へのハイブリダイゼーションより前に、検出核酸は蛍光体が励起される時フルオロフォアとクエンチャー間で供与体−受容のエネルギー転送を可能にする構造であることが望ましい。さらに、本セクションで説明する各方法において、蛍光の変化は、標的配列の存在の表れとして検出される。蛍光の変化は好適にはリアルタイムで検出される。
【０２９４】
現在優先される核酸プローブは、プローブが機能を果たすため核酸が二次構造をとる必要はない。この方法では、そして他に記述のない限り、本セクションで記述される他の方法では、検出する核酸は実質的に任意の分子内で関連している二次構造を担うが、この構造は好ましくは、ヘアピン、ステムループ構造、シュードノット、三重らせん及び立体支援構造から選択された部分である。さらに、分子内塩基対の二次構造は、好ましくは、標的結合配列の一部を含む。
【０２９５】
別の態様において、本発明は標的配列の増幅を検出するための方法を提供する。方法はＰＣＲのような増幅反応の使用を含む。例示的な増幅反応は、一つまたは複数の下記のステップを含む：
（ａ）興味深い標的配列を含むサンプル核酸と標的配列の側にあるＰＣＲプライマーとハイブリダイズする；
（ｂ）ポリメラーゼを用いてハイブリダイズしたプライマーを伸長してＰＣＲ生成物を生成し、ＰＣＲ生成物の二本鎖を分離して、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にアクセス可能にする；
（ｃ）ＰＣＲ生成物中の標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に検出核酸をハイブリダイズし、そこで、検出核酸は下記を含む：
ｉ）ＰＣＲ生成物中の標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一部分に相補性であり、ＰＣＲプライマー間の領域にハイブリダイズする一本鎖標的結合配列；
ｉｉ）フルオロフォア；及び
ｉｉｉ）第一のクエンチャー及び第二のクエンチャー；
但し、そこで、標的配列へのそのハイブリダイゼーションの前に、検出核酸は、フルオロフォアが励起した時フルオロフォア及びクエンチャー間の供与体−受容体エネルギー伝達を可能にする配座にあり；
それによって、検出核酸の配座を変更し（例えば、消光効率に寄与する任意の二次構造またはランダムコイル配座を線形化する）、（信号強度のような）蛍光パラメータに変化を生じさせる；及び
（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出する。
随意的に、ポリメラーゼがプライマー伸長中にハイブリダイズされた核酸に遭遇し、ポリメラーゼの二次ヌクレアーゼ活性を介してのように、フルオロフォア及びクエンチャーをつなぐオリゴマーを加水分解する時、蛍光パラメータの変化は恒久的になり得る。
【０２９６】
さらに別の態様において、本発明は、第一の核酸と第二の核酸がハイブリダイズするかどうかを確認する方法を提供する。この方法では、本発明に従って第一の核酸は、オリゴマー（溶液中または固体担体に接続されている）である。方法は：（ａ）第一の核酸を第二の核酸に接触させる；（ｂ）第一の核酸、第二の核酸及びそれらの組み合わせから選ばれた部分の蛍光特性の変化を検出し、それによってかハイブリダイゼーションが発生したかどうかを確認する、を含む。
【０２９７】
様々な実施形態において、本発明は、核酸標的配列の多型を検出するプローブ及び使用方法を提供している。多型は、集団における二つ以上の遺伝的に決定された代替シーケンスまたは対立遺伝子の発生を意味する。多型マーカーまたはサイトは、分岐が発生した遺伝子座である。優先されるマーカーは、少なくとも二つの対立遺伝子を有し、それぞれ選択された集団の1％を超える頻度、そしてより好ましくは10％以上または20％で発生する。多遺伝子座は、一つの塩基対より小さい可能性がある。多型マーカーは制限断片長多型、多数の縦列反復（ＶＮＴＲ‘ｓ）、可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、そしてＡｌｕなどの挿入要素を含む。第一に識別された対立遺伝子形は、参照の形式で任意に指定されており、他の対立遺伝子形は代替または変異体の対立遺伝子形として指定されている。選択された集団の中で最も頻繁に発生する対立遺伝子形式は、しばしば野生型と呼ばれる。二倍体生物は対立遺伝子フォームにホモ接合体またはヘテロ接合体の可能性がある。ニ対立遺伝子多型は２つの形を有する。三対立遺伝子多型は3つの形を有する。
【０２９８】
例示的な実施形態では、本発明のプローブは、一ヌクレオチド多型を検出するために利用されている。単一ヌクレオチド多型は、対立遺伝子配列間の変動のサイトである、単一ヌクレオチドで占領された多型サイトで発生する。サイトは通常、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１００分の１または１０００分の１の部分が異なるシーケンス）が先行し、続く。単一ヌクレオチド多型は、通常多型部位サイトで別のヌクレオチドと一つのヌクレオチドの置換に従って発生する。遷移は、一プリンの他のプリンによる、一ピリミジンの他のピリミジンによる代替である。プリンまたは別のピリミジンずつピリミジンの代替品です。塩基転換は、プリンのピリミジンによる代替、またはその逆である。単一ヌクレオチド多型は、また、ヌクレオチドの欠失または参照対立遺伝子へのヌクレオチド相対物の相対的な挿入から生じる可能性がある。
【０２９９】
二つのクエンチャーとフルオロフォアの両方を持つ本発明のオリゴマーは使用されうる、または、代わりに、エネルギー伝達対（例えばクエンチャーまたはフルオロフォア）の単一部分に一つ以上の核酸が単独に標識されうる。クエンチャーで単独標識された核酸がプローブであるとき、第一及び第二核酸間の相互作用はクエンチャーと核酸間の相互作用、または、より好ましくは、第二の核酸に付着したフルオロフォアの蛍光のクエンチャーの消光を観察することによって検出できる。
【０３００】
いくつかの実施形態で、クエンチャー及びフルオロフォア間に基底状態錯体が形成される。例示的な実施形態で、クエンチャー及びフルオロフォアの両方は同一の核酸オリゴマーに結合する。
【０３０１】
核酸増幅、多型、及び検出と定量化を調べるために設計されたプローブでの一般的な実用性に加えて、現在の固体担体及びオリゴマーは、現在知られている、または後に発見される、実質的に任意の核酸プローブ形式に使用することができる。例えば、本発明の固体担体及びオリゴマーは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｌｄ ら.,  Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. ６： ９８６−９９４ （１９９６）, Ｈｏｌｌａｎｄ ら, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８８： ７２７６−７２８０ （１９９１）, Ｌｅｅ ら, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２１： ３７６１−３７６６ （１９９３））の、分子指標（ＴＹＡＧＩ 羅, Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８ （１９９６）, Ｊａｙａｓｅｎａ ら,１９９９年１１月２３日に公開された米国特許第５９８９８２３号、）、スコーピオンプローブ（Ｗｈｉｔｃｏｍｂ ら., Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ８０４−８０７ （１９９９））, サンライズプローブ （Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ら., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５： ２５１６−２５２１ （１９９７））, 立体構造支援プローブ （Ｃｏｏｋ, Ｒ., １９９９年６月９日に出願された、同時係属及び同一出願人による米国特許出願２００７／００５９７５２）、ペプチド核酸 （ＰＮＡ）に基づいた点灯プローブ（Ｋｕｂｉｓｔａ ら., 国際特許出願第９７/４５５３９号、１９９７年１２月）、二重鎖特異的ＤＮＡ色素s （Ｈｉｇｕｃｈｉ ら., Ｂｉｏ/Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ４１３−４１７ （１９９２）, Ｗｉｔｔｗｅｒ ら., ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２： １３０−１３８ （１９９７））等のようなプローブのモチーフに組み込むことができる。本発明のクエンチャーが使用されうるこれら及び他のプローブモチーフはＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ ＤＮＡ ＰＲＯＢＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｉｎｃ. １９９２に批評されている。
【０３０２】
本発明のプローブで使用するためのオリゴマーは、任意の適切なサイズを取りうり、また、好ましくは約２〜約１００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約８０ヌクレオチド、より好ましくはさらに、約２０から約４０ヌクレオチドの範囲内である。二重標識（フルオロフォア−クエンチャー）プローブでは、供与体の部分は、クエンチャーから少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドで分離される。様々な実施形態では供与体部分も好ましくはプローブの３’ −または５’−末端ヌクレオチドに付着している。クエンチャー部分はまた、好ましくはプローブの３’−または５’−末端ヌクレオチドに付着している。さらに好ましくは、供与体及び受容体部分は、内部位置が有用である一方で、それぞれ、プローブの３’−及び５’−または５’−及び３’−末端ヌクレオチドに付着している。
【０３０３】
本発明の核酸プローブの正確な配列及び長さは結合する標的ポリヌクレオチドに部分的に依存する。結合位置及び長さは特定の実施形態のため適切なアニーリング及び溶融特性を達成するために変化させることができる。そのようなデザインの選択肢を作るための誘導は多くの技術認識参考文献で見られる。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、核酸プローブの３‘末端ヌクレオチドが阻害されるまたは核酸ポリメラーゼにより拡張不可能な状態にされる。このような阻害は、直接またはリンカー部分による、核酸プローブの末端の３’−位置への供与体または受容体の添付によって好都合に行われる。
【０３０５】
核酸は、そのＤＮＡやＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体またはそれらの改変版を含むことができる。プローブと標的核酸の両方は、一本鎖、二本鎖、三本鎖として存在することができる、さらに、核酸は、放射性標識、副溝結合子、挿入作用因子、アセチレン化不飽和炭化水素、フルオアルキル基、供与体及び／または受容体基等のような他の基と塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。
【０３０６】
本発明のオリゴマーは、離散的な配列であるプライマーとして、またはランダム配列を有したプライマーとして有用である。ランダム配列プライマーの長さは一般に約６または７ヌクレオモノマー である。このようなプライマーは、様々な核酸増幅プロトコル法（ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応など）やクローニングのプロトコルで使用することができる。本発明の５’ −置換は一般的にプライマーとして機能するオリゴマーの能力を阻害することはない。３’末端残基、オリゴマーＲＮａｓｅ Ｈを無力化し、またはヌクレアーゼを安定にする他の修飾以外のサイトで２‘ −修飾を有する本発明のオリゴマーは有利に、細胞抽出物またはヌクレアーゼを含む他の溶液中のＲＮＡまたはＤＮＡ配列プローブまたはプライマーとして使用されうる。したがって、オリゴマーは、標的核酸を含むサンプルとオリゴマーを混合し、続いて標的核酸とオリゴマーのハイブリダイゼーションし、ＰＣＲ、LCRまたは他の適当な方法により、標的核酸を増幅することによって、サンプル中の核酸を増幅するためのプロトコルで使用することができる。
【０３０７】
ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、または1,2 - ジアミノシクロヘキサン酢酸の類似体などのキレート剤、誘導体化されたオリゴマーは記載されたような多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断分析で使用することができる（米国特許第４，７７２，５４８号、４，７０７，４４０号及び４，７０７，３５２号）。また、本発明のオリゴマーは５‐ （３ - ヨードアセトアミドプロパ - １ -イル）‐２’ - デオキシウリジン、５- （３ ‐ （４ −ブロモブチルアミド）プロパ-１ ‐ｙｌ）−２’−デオキシウリジンのような架橋剤で誘導体化することができ、記載された様々な分析方法やキットで使用できる（国際公開第ＷＯ９０/１４３５３号）。
【０３０８】
上記の用途に加えて、遺伝子発現を抑制するオリゴマーの能力は任意の適当な方法によって対象の細胞または組み換えシステムの発現レベルを測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏの系において検証することができる（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ, Ｍ., ら., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. （１９９１） １９：５３−５９）。
【０３０９】
本発明のオリゴマーと標的核酸分子間のハイブリダイゼーションを支持する条件は、当技術分野の技術者によって経験的に決定することができ、最適な培養温度、塩濃度、長さ、及びオリゴヌクレオチド類似物プローブの塩基組成、及びオリゴマー及びサンプルの核酸分子の濃度を含みうる。ハイブリダイゼーションは、少なくとも１ミリモラーのマグネシウムの存在下で、６．０以上のpHで、行われることが望ましい。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションより前にサンプル中の核酸分子を一本鎖にするようサンプルを処理することが必要または望ましい。このような処理の例は、塩基による処理（中和が続くことが望ましい）、高温でのインキュベーション、またはヌクレアーゼによる処理を限定ではなく、含む。
【０３１０】
加えて、核酸ハイブリダイゼーションの塩依存性は、主にハイブリダイズオリゴヌクレオチド類似物の骨格の電荷密度によって決定されるため、本発明のオリゴマー中に標準外のヌクレオチド類似物を組み込むことは、ハイブリダイゼーションの塩依存性を高めるまたは低下させることができる。この変更は、いくつかの態様で、例えば、塩条件を変化することによってハイブリダイゼーションの厳密さを増加すること、または塩濃度を減少させるによってハイブリッド核酸を除去することができることが望ましい、本発明の方法に役立つように使用することができる。さらに本発明の他の態様では、非常に低塩中で本発明のオリゴヌクレオチド類似物の核酸に対する高い親和性結合を有することが望ましい。この場合、本発明のオリゴヌクレオチド類似物中に非電荷骨格部分を有するヌクレオチドモノマーを配置することは有利である。
【０３１１】
標的核酸分子に結合する本発明のオリゴマーの高い特異度は、実行者が少なくとも一つ以上のオリゴマーの一部と完全に相補的な配列の伸縮を含む核酸配列と実質的に相補的な配列内に少数の非相補的塩基を含む配列の伸縮を含む標的核酸分子の間の区別を支持することができるハイブリダイゼーション条件を選択することを可能にする。例えば、ハイブリダイゼーションや洗浄の温度は、本発明のオリゴマーと配列の伸縮に沿って完全に相補的な標的核酸分子安定なハイブリッドを可能にするが、本発明のオリゴマーと、相補的配列の伸縮に沿った１または二つの核酸塩基ミスマッチを含む、完全に相補的ではない核酸分子間のハイブリッドの分離を促進するように選択することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度の選択は、少なくとも部分的に、塩濃度、オリゴマーと標的核酸分子の濃度、標的核酸分子に対するオリゴマーの相対的な割合、ハイブリダイズされるオリゴマーの長さ、オリゴマー及び標的核酸分子の塩基組成、オリゴヌクレオチド類似分子のモノマー組成、などの他の条件に、依存性となりうる。加えて、完全に相補的な分子のハイブリッドの安定に有利に働き、オリゴマーと一つまたは複数の塩基が一致していない標的核酸分子間の安定なハイブリッドを冷遇する条件を選択する場合、追加の条件は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド類似体の長さ、オリゴマー及び標的核酸の分子間相補性配列の伸縮の長さ、相補性の配列の伸縮内の非相補的塩基数、ミスマッチ塩基の同一性、ミスマッチ塩基の近傍の塩基の同一性、そして相補性のストレッチに沿った任意のミスマッチ塩基の相対的な位置を限定ではなく含んで、考慮に入れることができ、望ましい場合、変更される。核酸ハイブリダイゼーションの技術分野の技術者は、本発明のオリゴマーを標的核酸分子へのハイブリダイゼーションに使用するにあたり、特定のアプリケーションに依存した、ハイブリダイゼーション及び洗浄の有利な条件を決定できるようになるだろう。“有利な条件”は、一つ以上のミスマッチを含むものを含む、少なくとも一部、実質的に相補的である、オリゴマー及び標的核酸分子間の安定なハイブリッドを優遇するものとなりうる。
【０３１２】
“有利な条件”は、一つ以上のミスマッチを含むものを含む、少なくとも一部、完全に相補的であるオリゴマー及び標的核酸分子間の安定なハイブリッドを優遇し、完全に相補的ではない分子間のハイブリッドを冷遇するまたは不安定化するものとなりうる。
【０３１３】
本文書で開示されているような方法を使用することにより、異なる配列の標的核酸分子にハイブリダイズした本発明のオリゴマーの融点は決定でき、与えられたアプリケーションに有利な条件の決定に使用できる。有利なハイブリダイゼーション条件を、例えば、標的核酸分子を固体担体に付着したオリゴマーにハイブリダイズし、ハイブリダイズした複合体を検出することによって実験的に決定することもまた可能である。
【０３１４】
固体担体または本発明のオリゴマープローブに結合した標的核酸分子は好都合かつ効率的に調査集団の非結合核酸分子から、オリゴマープローブの固体担体への直接または間接的な付着によって分離することができる。固体担体はオリゴマープローブに結合していない核酸分子を除去するために高い厳密性で洗浄されうる。いずれにせよ、固体担体へのオリゴマープローブの付着は本発明の必要条件ではない。例えば、幾つかのアプリケーションにおいて、結合または非結合核酸分子はマトリックスを介した遠心分離または相分離、または幾つかは随意にオリゴマープローブに組み込まれた化学基により促進される他の分離形式（例えば、沈殿差）により分離することができる（例として、Ｎｉｅらに２０００年５月９日に公開された米国特許第６０６０２４２号を参照せよ）。
【０３１５】
核酸捕捉プローブ
一実施形態では、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーを含む固定化された核酸は、捕捉プローブとして使用される。固定化された核酸は、任意でさらに安定化部分を含む。核酸プローブは、例えば、プローブの３’ ‐または５’ ‐末端ヌクレオチドの固体担体への付着により、固体担体に直接付着することができる。しかしながら、さらに好ましくは、プローブは、リンカー（上記）によって固体担体に取り付けられている。リンカーは、固体担体からプローブを遠ざけるのに役立つ。リンカーは、最も好ましくは約５から約３０原子の長さ、より好ましくは約１０から約５０原子の長さである。
【０３１６】
様々な実施形態において、固体担体はまた、オリゴマー（プローブ）を準備する合成担体として使用される。固体担体と核酸の第１の３’−ユニット間のリンカーの長さ及び化学的安定性は効率的な合成及び担体結合核酸のハイブリダイゼーションに重要な役割を果たす。リンカーアームは、自動合成中に高収率（＞９７％）が得られるように十分に長いことが望ましい。リンカーの必要な長さは、使用される特定の固体担体に依存する。例えば、６原子のリンカーは、高架橋ポリスチレンが固体担体として使用される場合、核酸の自動合成中に＞９７％の収率を得るのに一般的に十分である。リンカーアームは、ＣＰＧが固体担体として使用される場合、自動合成中に高収率（＞９７％）を得るために少なくとも２０原子であることが望ましい。
【０３１７】
固体担体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般に、プローブが固体担体から少なくとも３０原子、より好ましくは少なくとも５０原子分離されている必要がある。この分離を達成するために、リンカーは、通常、リンカーと３’−末端の間に位置するスペーサーを含む。核酸合成のために、リンカーアームは、通常、固体担体から核酸を解放するための基本的な試薬で切断できるエステル結合によって、３’末端の３’−ＯＨに付着している
【０３１８】
固体担体に核酸プローブを付着するのに使用される多様なリンカーは当技術分野で知られている。リンカーは、固体担体に付着しているプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションを大幅に阻害しない任意の化合物で形成される。リンカーは、例えば、自動合成によってリンカーに容易に追加されるホモポリマー核酸で形成される。また、官能ポリエチレングリコールなどのポリマーは、リンカーとして使用できる。そのようなポリマーは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを大幅に阻害しないため、現在、ホモポリマー核酸よりも優先されている。ポリエチレングリコールは、市販されており、有機及び水性媒体に溶解し、官能化が容易であり、そして核酸合成及び合成後の条件下で完全に安定であるため、特に望ましい。
【０３１９】
固体担体、リンカー及びプローブ間の結合片は、高温での基本条件下で、合成及び塩基保護基の除去の間、切断されないことが望ましい。これらの結合は、一方、多様な条件下で切断可能である基から選択されうる。現在優先される結合の例は、カルバメート、エステル、アミド結合を含む。
【０３２０】
サンプル中の核酸の検出
本発明の固体担体及びオリゴマーは、核酸の検出に使用することが可能である。このような検出方法は、サンプルの提供、核酸分子オリゴマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下での試薬と少なくとも１個の本発明のオリゴヌクレオシド類似物との接触、そして一つまたは複数の本発明のオリゴマーにハイブリダイズしたサンプルの一つまたは複数の核酸分子の検出を含む。
【０３２１】
サンプルは、任意の源から得られる、有機体あるいは同じまたは別の種からの有機体のグループからのサンプルのような生物学的サンプルでありうる。生物学的サンプルでは、体液、例えば血液サンプル、血清サンプル、リンパサンプル、骨髄サンプル、腹水、胸水、骨盤洗浄液、眼液、尿、精液、唾液、または唾液などのサンプルでありうる。生物学的サンプルはまた、鼻、喉、皮膚や生殖器スワブから抽出され、または糞便材料抽出物である。生物学的サンプルには、臓器や組織、腫瘍などのサンプルすることができる。生物学的サンプルはまた、細胞株と原核生物と真核細胞の両方の初代培養の両方を含む、培養細胞のサンプルである。
【０３２２】
サンプルは、水の集合体から、または土壌から、あるいは食品、飲料、または水源から、工業用ソース、職場領域、公共エリア、またはリビングエリアのような環境から得られる。例えば土壌や食品サンプルから抽出された液体のように、サンプルは、抽出物でありうる。サンプルは、洗浄や浸漬、またはツールなどの物品、衣料品、工芸品、またはその他の材料のような物品から、標本の懸濁で作られた溶液でありうる。
【０３２３】
サンプルは未処理あるいは処理されたサンプルでありうる；処理は、サンプルの分析を容易にするため、サンプルの成分の純度、濃度、または近接性を増加する手順を含みうる。非限定的な例としては、処理は、サンプルの体積を減少する、サンプルの成分を除去あるいは分離する、サンプルまたはサンプルの１個または複数の成分を可溶化する、またはサンプルの成分を分裂、修飾、露光、リリース、あるいは分離する手順を含みうる。そのような手順の非限定的な例は遠心分離、沈殿、ろ過、均質化、細胞溶解、抗体の結合、細胞分離等である。例えば、本発明のいくつかの優先的実施形態では、サンプルは赤血球除去によって、濃縮によって、１個以上のウィルス（例えば、白血球細胞や病原性細胞）の種類の選択によって、あるいは細胞溶解等によって、少なくとも部分的に処理された血液サンプルである。
【０３２４】
例示的サンプルは少なくとも部分的に生成された核酸分子の溶液を含む。核酸分子は、単一のソースまたは複数のソースから得られ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含むことができる。例えば、核酸分子の溶液は、例えば、細胞溶解、濃縮、抽出、沈殿、核酸抽出（例えばポリA RNAの抽出やＡｌｕの要素を含むＤＮＡ配列の抽出のような）、あるいは１個または複数の酵素処理の任意の手順に従ったサンプルとなりうる。サンプルはまた、合成核酸分子を含む溶液となりうる。
【０３２５】
本発明のオリゴマーまたは固体担体は、本文書で開示される任意のオリゴマー化学式、あるいは、本文書に開示されるモノマー、ダイマー、または非核酸成分（例えば、リンカー、フルオロフォア、クエンチャー、安定化部分）を含む任意のオリゴマーとなりうる。本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド類似物は、任意の長さ及び任意の塩基組成となりうり、そして１個または複数の核酸部分、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、ステロイド、その他の生化学的及び化学的部分を含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチド類似物は、溶液中または固体担体に結合して提供されうる。本発明のいくつかの優先的実施形態では、オリゴマーは、標準外ヌクレオチド類似物を含む。
【０３２６】
結合された核酸の検出方法は、よく当技術分野で知られており、そして個体数の検出の核酸分子に付着したあるいは組み込まれた、またはハイブリダイズした標的核酸分子あるいはハイブリダイズされた標的核酸分子複合体に結合するあるいは組み込まれる、検出可能な標識の使用を含みうる。核酸分子の検出可能な標識は、当技術分野でよく知られており、フルオロフォア（本文書で前述されたものを含む）、放射性同位元素、質量変化化学基、信号生成分子によって検出することができるビオチンなどの特異的結合部分等のような蛍光分子を含む。例えば、信号オリゴマーを使用したサンドイッチハイブリダイゼーションが検出に使用される、または検出がオリゴマー/標的核酸分子複合体を認識する抗体のような特異的結合部分を使用して検出が実行される場合、検出可能なラベルはまた、本発明のオリゴマーに組み込まれ、付着しうる。固体担体は検出可能の標識の存在を決定し、それによって本発明のように標的核酸分子の固体担体上に固定化されたオリゴマーへの結合決定するため、スキャンされる、フィルムに露光される、視覚的に検査される、等。
【０３２７】
キット
本発明の一態様は、上述のように、本発明のオリゴマーを使用した分析及び本発明の固体担体を使用した合成の実践を促進するキットの構築である。本発明のキットは、通常本発明の固体担体及びオリゴマーを含み、結合の生成に有用な化学反応種として示される、あるいはオリゴマーが特異的結合対の部分である完全なオリゴマーとして示される。キットには、必要に応じ、さらに、通常、水溶液として存在する、１個以上の緩衝剤から構成されています。本発明のキットは、さらに、追加検出試薬、もたらされる標識物質を浄化するための浄化媒体、発光基準、酵素、酵素阻害剤、有機溶剤、または本発明の分析を実施するための取扱説明書を含む。キットのその他の形式は、当技術分野の技術者に明らかになり、本発明の範囲内にある。
【０３２８】
要約の方法で、例示的実施形態の中で、本発明は提供する；
【０３２９】
下記の構造を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブ；
５’−Ｙ１−Ｌ１−ＬＱ１−Ｌ２−Ｙ２−３’
ここで、Ｙ１は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含み、Ｙ２は二つまたはそれ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含む。Ｙ１及びＹ２の一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合しているフルオロフォアを有し、Ｙ１及びＹ２のもう一つはそのヌクレオチド配列に（直接またはリンカーを介して）共有結合している第二のクエンチャーを有する。Ｌ１及びＬ２は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルからそれぞれ独立して選択される。ＬＱ１は下記の化1である；
【０３３０】
【化３７】
2018512167.tif 000042
【０３３１】
Ｑ１は、下記の化３８から選択される構造を有する第一のクエンチャーである；
【０３３２】
【化３８】
2018512167.tif 000043
及び
2018512167.tif 000044
【０３３３】
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃはそれぞれ独立して置換または非置換アリールから選択される。Ｌ３は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０３３４】
前述の段落による核酸プローブでは、Ｙ１のヌクレオチド配列は、フルオロフォアまたは第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している５’リン酸塩を有する第一のヌクレオチドＮ１；及びＬ１に共有結合している３’リン酸塩を有する第二のヌクレオチドＮ２を含み；及び、Ｙ２のヌクレオチド配列は、Ｌ２に共有結合している５’リン酸塩を有する第三のヌクレオチドＮ３；及び第二のクエンチャーまたはフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している３’リン酸塩を有する第四のヌクレオチドＮ４を含む；そこで、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩がフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩が第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している時、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩はフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している。
【０３３５】
さらに、第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩をフルオロフォアまたは第二のクエンチャーに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３３６】
さらに、第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩を第二のクエンチャーまたはフルオロフォアに接続するリンカーに付いた一つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３３７】
第一のヌクレオチドＮ１の５’リン酸塩はフルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合しており、及び第四のヌクレオチドＮ４の３’リン酸塩は第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３３８】
Ｙ１は、８、９、１０または１１ヌクレオチド配列である、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３３９】
Ｑ１は、下記の化３８から選択される構造を有する第一のクエンチャーである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ；
【０３４０】
【化３９】
2018512167.tif 000045
2018512167.tif 000046
【０３４１】
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択される。
【０３４２】
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｒａ７、Ｒａ８、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ４、Ｒｂ５、Ｒｂ６、Ｒｂ７、Ｒｂ８、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５、Ｒｃ６、Ｒｃ７及びＲｃ８は、それぞれ独立してＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル及びニトロから選択される、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３４３】
Ｑ１は、下記の化３８から選択される構造を有する前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ；
【０３４４】
【化４０】
2018512167.tif 000047
【０３４５】
ここで、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ５及びＲａ６はＨであり；Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５、及びＲｂ６の少なくとも一つはそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり；Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｂ５及びＲｂ６の残りはＨであり；及び、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の少なくとも一つはそれぞれ独立してメチルまたはエチルまたはｎ−プロピルまたはイソプロピルまたはｎ−ブチルまたはイソブチルまたはｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｃ２、Ｒｃ３、Ｒｃ４、Ｒｃ５及びＲｃ６の残りはＨである。
【０３４６】
オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドから成る、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３４７】
オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドから成る、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３４８】
オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドを有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３４９】
オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドを有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５０】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換Ｃ１−Ｃ７アルキルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５１】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；及び、Ｌ１及びＬ２は同一である、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５２】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれエチルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５３】
第二のクエンチャーが下記の化４１の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５４】
【化４１】
2018512167.tif 000048
【０３５５】
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ及びニトロから選択される；及び、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０３５６】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；Ｒｅ５はＨである；Ｒｆ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；及び、Ｒｆ４はＨである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５７】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである；Ｒｆ２はニトロである；及び、Ｒｆ４は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５８】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルコキシである；Ｒｆ２はＨである；及び、Ｒｆ４はニトロである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３５９】
第二のクエンチャーが下記の化４２の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３６０】
【化４２】
2018512167.tif 000049
【０３６１】
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０３６２】
第二のクエンチャーは、ＢＢＱ−６５０（登録商標）、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）クエンチャー、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎｌ、またはＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ−ｎ２から由来する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３６３】
フルオロフォアは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレン−スルホネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホンサン（ＥＤＡＮＳ）、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５，５（Ｃｙ５，５）、３−（１−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−クサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピローリジニル］オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（または２）スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内塩（ＴＲまたはテキサスレッド）、ＢＯＤＩＰＹ染料、ベンゾオキサアゾール、スチビンまたはピレンであるから由来する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３６４】
フルオロフォアは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）から由来する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３６５】
フルオロフォアが下記の化４３の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ；
【０３６６】
【化４３】
2018512167.tif 000050
【０３６７】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０３６８】
Ｙ１のヌクレオチド配列は、フルオロフォアに（直接またはリンカーを介して）共有結合している５’リン酸塩を有する第一のヌクレオチドＮ１、及びＬ１に共有結合している３’リン酸塩を有する第二のヌクレオチドＮ２を含み；及び、Ｙ２のヌクレオチド配列は、Ｌ２に共有結合している５’リン酸塩を有する第三のヌクレオチドＮ３、及び第二のクエンチャーに（直接またはリンカーを介して）共有結合している３’リン酸塩を有する第四のヌクレオチドＮ４を含み、Ｌ１は非置換Ｃ２アルキルｄであり；Ｌ２は非置換Ｃ２アルキルであり；Ｑ１は下記の化４４の構造を有し、
【０３６９】
【化４４】
2018512167.tif 000051
【０３７０】
第二のクエンチャーは、下記の化４５の構造を有する；
【０３７１】
【化４５】
2018512167.tif 000052
【０３７２】
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択され；及び、フルオロフォアはフルオレセイン部分から成る、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３７３】
第二のクエンチャーは、下記の化４５の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０３７４】
【化４６】
2018512167.tif 000053
【０３７５】
オリゴヌクレオチドが、１５〜４５ヌクレオチドから成る、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３７６】
オリゴヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドから成る、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３７７】
Ｙ１が８〜１１ヌクレオチド配列である、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３７８】
Ｙ２が、６〜２４ヌクレオチド配列である、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３７９】
フルオロフォアが下記の化４６の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０３８０】
【化４７】
2018512167.tif 000054
【０３８１】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０３８２】
フルオロフォアが下記の化４７の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０３８３】
【化４８】
2018512167.tif 000055
【０３８４】
Ｙ１が８〜１１ヌクレオチド配列であり、Ｙ２は６〜２４ヌクレオチド配列であり、第二のクエンチャーは下記の化４８の構造を有し：
【０３８５】
【化４９】
2018512167.tif 000056
【０３８６】
及び、フルオロフォアは下記の化４９の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０３８７】
【化５０】
2018512167.tif 000057
【０３８８】
オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは、構造３’−Ｙ３−Ｙ４−５’を有する第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに適しており；但し、Ｙ３は、第五のヌクレオチドＮ５を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；及び、Ｙ４は、ヌクレオチドＮ５に直接付く第六のヌクレオチドＮ６を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすると、Ｎ２及びＮ５の塩基対及び、Ｎ３及びＮ６の塩基対は二本鎖を形成し、その日本鎖のＴｍは第二のオリゴヌクレオチド及び、構造５’−Ｙ１−Ｙ２−３’を有する第三のオリゴヌクレオチド間に形成される二本鎖のＴｍより高い、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３８９】
オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは、構造３’−Ｙ３−Ｙ４−５’を有する第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることに適しており；但し、Ｙ３は、第五のヌクレオチドＮ５を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；Ｙ４は、ヌクレオチドＮ５に直接付く第六のヌクレオチドＮ６を含む、四つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなり；第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすると、Ｎ２及びＮ５の塩基対及び、Ｎ３及びＮ６の塩基対は二本鎖を形成し、その日本鎖のＴｍは第二のオリゴヌクレオチド及び、構造５’−Ｙ１−Ｙ２−３’を有する第三のオリゴヌクレオチド間に形成される二本鎖のＴｍより低い、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０３９０】
サンプルを前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブと接触させ、そこで、第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方への供与体−受容体エネルギー伝達によってフルオロフォアの蛍光を低減し；及び、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を示す蛍光の増大を検出する：ことからなる、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドを検出する方法。
【０３９１】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９２】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は基底状態消光によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９３】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９４】
蛍光の増大は、第一のオリゴヌクレオチドからのフルオロフォアの開裂から生じる、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９５】
第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズせず、その結果、フルオロフォアの蛍光が低減する時、第一のオリゴヌクレオチドはランダムコイル構造を形成する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９６】
第一のオリゴヌクレオチドが自己相補性配列を有し、クエンチャー及びフルオロフォアは第一のオリゴヌクレオチドに付着し、その結果、核酸ポリマーが分子間塩基対合を受ける時フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光する前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９７】
方法は、ＰＣＲ生成物合成の結果、蛍光が増大するＰＣＲ反応で使用される、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０３９８】
サンプルを前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブと接触させ、そこで、オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドは第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに適しており、及び、第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方への供与体−受容体エネルギー伝達によってフルオロフォアの蛍光を低減し；及び、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を示す蛍光の増大を検出する：ことからなる、サンプル中の第二のオリゴヌクレオチドを検出する方法。
【０３９９】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４００】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は基底状態消光によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０１】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない時、蛍光は蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって低減する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０２】
蛍光の増大は、第一のオリゴヌクレオチドからのフルオロフォアの開裂から生じる、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０３】
第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしない時、その結果、フルオロフォアの蛍光が低減する時、第一のオリゴヌクレオチドはランダムコイル構造を形成する、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０４】
第一のオリゴヌクレオチドが自己相補性配列を有し、クエンチャー及びフルオロフォアは第一のオリゴヌクレオチドに付着し、その結果、核酸ポリマーが分子間塩基対合を受ける時フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光する前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０５】
方法は、ＰＣＲ生成物合成の結果、蛍光が増大するＰＣＲ反応で使用される、前段落のいずれか一つに記載の方法。
【０４０６】
置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含み、少なくとも二つの残余は環外ジアゾ結合を介して共有結合している第一のクエンチャー；及び第一のクエンチャーがオリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端へ向かう８、９、１０または１１ヌクレオチドであるヌクレオチドに付着する第二のクエンチャー；に付着するオリゴヌクレオチドを含み、及び、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーが、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択されたメンバーを介してオリゴヌクレオチドに付着する核酸プローブ。
【０４０７】
オリゴヌクレオチドは、さらに結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択されたメンバーを介して、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着するフルオロフォアを含む、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４０８】
少なくとも三つの残余のそれぞれが置換または非置換フェニルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４０９】
少なくとも三つの残余の少なくとも二つは、少なくとも一つのＣ１−Ｃ６非置換アルキル部分で置換されたフェニルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４１０】
第一のクエンチャーが、下記の化５０の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０４１１】
【化５１】
2018512167.tif 000058
【０４１２】
ここで、Ｌ３は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択されたメンバーである。
【０４１３】
第二のクエンチャーは、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、及びその組み合わせから選択された少なくとも三つの残余を含み、少なくとも二つの残余は環外ジアゾ結合を介して共有結合している、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４１４】
第二のクエンチャーは、オリゴヌクレオチドの３’−末端に付着している、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４１５】
第二のクエンチャーが、下記の化５１の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０４１６】
【化５２】
2018512167.tif 000059
【０４１７】
ここで、Ｒｅ２、Ｒｅ５、Ｒｆ２及びＲｆ４は、それぞれ独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ、及びニトロから選択される；及び、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０４１８】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルである；Ｒｅ５はＨである；Ｒｆ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルである；Ｒｆ４はＨである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４１９】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５はＣ１−Ｃ４アルキルである；Ｒｆ２はニトロである；Ｒｆ４はＣ１−Ｃ４アルキルである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４２０】
Ｒｅ２は非置換Ｃ１−Ｃ４アルコキシである；Ｒｅ５はＣ１−Ｃ４アルキルである；Ｒｆ２はＨである；Ｒｆ４はニトロである、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ。
【０４２１】
第二のクエンチャーが、下記の化５２の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０４２２】
【化５３】
2018512167.tif 000060
【０４２３】
ここで、Ｌ４は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０４２４】
フルオロフォアが、下記の化５３の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０４２５】
【化５４】
2018512167.tif 000061
【０４２６】
ここで、Ｌ５は、結合、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。
【０４２７】
フルオロフォアが、下記の化５４の構造を有する、前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブ：
【０４２８】
【化５５】
2018512167.tif 000062
【０４２９】
核酸標的配列を検出する方法であって、下記を含む：
（ａ）標的配列を一本鎖標的結合配列を含む検出核酸に接触させ、但し、検出核酸は前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブであり、検出核酸は、フルオロフォアが励起している時フルオロフォア及び、第一のクエンチャー及び第二のクエンチャーの一方または両方間の供与体−受容体エネルギー伝達を可能にする構造であり；（ｂ）標的結合配列を標的配列にハイブリダイズし、それによって、検出核酸の構造を変更し、蛍光パラメータの変化を生じさせる；及び（ｃ）蛍光パラメータの変化を検出し、それによって、核酸標的配列を検出する。
【０４３０】
第一の核酸及び第二の核酸がハイブリダイズしているかどうかを確認する方法であって、但し、第一の核酸は前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブであり、その方法は下記を含む：
（ａ）第一の核酸を第二の核酸に接触させる；及び（ｂ）第一の核酸、第二の核酸及びその組み合わせから選択されたメンバーの蛍光特性の変更を検出し、それによって、ハイブリダイゼーションが起きたかどうかを確認する。
【０４３１】
核酸増幅反応のモニタリング方法であって、その方法は下記を含む：
（ａ）検出核酸を含む増幅反応混合物を調製する、但し、検出核酸は前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブである；（ｂ）増幅反応混合物を増幅状態にさせる；（ｃ）検出核酸からの蛍光信号用の反応混合物をモニタリングして、分析結果を得る；及び（ｄ）分析結果を利用して、核酸増幅反応をモニタリングする。
【０４３２】
標的配列の増幅を検出する方法であって、その方法は下記を含む：（ａ）標的配列を含むサンプル核酸を標的配列の側にあるＰＣＲプライマーとハイブリダイズする；（ｂ）ハイブリダイズしたプライマーをポリメラーゼで伸長し、ＰＣＲ生成物を生成し、ＰＣＲ生成物の二本鎖を分離して、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にアクセス可能にする；（ｃ）ＰＣＲ生成物中で、検出核酸を標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、但し、検出核酸は前段落のいずれか一つに記載の核酸プローブである；その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、検出核酸は、フルオロフォアが励起した時フルオロフォア及び、第一のクエンチャー及び第二クエンチャーの一方または両方の間の供与体−受容体エネルギー伝達を可能にする構造にある；それによって、検出核酸の構造が変更され、蛍光パラメータの変化を引き起こす；及び（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出する。
【０４３３】
本発明の物質及び方法は、以下に記載する実施例によって、さらに表示される。これらの実施例は説明のために提示されたもので、本発明の請求の範囲を限定するものではない。
【０４３４】
実施例
構造
内部消光プローブは、３’ブロッカーを要求し続け、したがって、消光効率を改善する顕著な方法は、末端クエンチャーのその遮断機能を維持ながら、内部位置に補足のクエンチャー包含することである。ＦＡＭ−標識プローブは、内部ＢＨＱ０部分とともに、最適に機能することが分かったが、この染料対合は最小のスペクトルの重なりを有するので、それは驚異的である。内部ＢＨＱ０は、糖リン酸主鎖を分断する連鎖化学を使用して、隣接する残余間に配置されることによって、塩基組成に関係なく包含される。包含に使用されるホスホロアミダイト前駆体は、カタログナンバーＢＮＳ−５０５０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）であり、下記の化５５の構造を有する：
【０４３５】
【化５６】
2018512167.tif 000063
【０４３６】
合成中のオリゴに反応性前駆体を包含することは、内部ＢＨＱ０の修飾になる：
【０４３７】
【化５７】
2018512167.tif 000064
【０４３８】
内部ＢＨＱ０は、３’末端で追加のＢＨＱ１部分によって補足される。このダブルクエンチャーＦＡＭ標識プローブの完全な構造は、図３に示されている。
【０４３９】
ダブルクエンチャープローブ内の染色配向は  線形配列５’−［ＦＡＭ］−オリゴ配列１−［１−ＢＨＱ０］−オリゴ配列２−［ＢＨＱ１］−３’として表示されうる。
【０４４０】
内部ＢＨＱ０を残余９及び１０間に配置することは、最適であることが分かった。５’末端に近づくか、またはさらに離れるにせよ、その結果、信号放出が減少した。信号増幅は、配列位置だけでなく、またクエンチャーの種類にも依存する。ＤＡＢＳＹＬのような他のクエンチャーは、良好に作用せず、また、ＢＨＱ０／ＢＨＱ１染色配向の切り替えもしない。ＢＨＱ０発色団及びオリゴ間の結合の微妙な変化さえ、信号放出を中断するのに十分である。経験的テストは、非常に敏感な修飾システム及び全く予想しない相乗効果を明らかにした。これらの依存性は全て、後続の実験部分に示されている。
【０４４１】
機能
ＢＨＱ０及びＢＨＱ１の組み合わせは、オリゴ長とは無関係に、良好な消光効率及び信号放出の両方を生じさせる。図４Ａ〜Ｃに示したように、Ｔ‐ＢＨＱ１修飾で前もってテストした同一の三つのプローブ配列（図２Ａ〜Ｃを参照）は、ダブルクエンチャープローブとしての性能を著しく改善した。
【０４４２】
図４Ａ〜Ｃ。  末端標識プローブで信号化された増幅痕跡を斜線として図示した。ダブルクエンチャープローブで信号化された増幅痕跡を実線として図示した。三つとも全部改善された信号放出を示すが、消光効率の改善は、より長いプローブ配列で最も明らかである。比較されるプローブ配列を下記に示す：
２１−塩基プローブ（末端標識）：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［ＢＨＱ１］−３’
２１−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧ［Ｉ‐ＢＨＱ０］ＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［３−ＢＨＱ１］−３’
２９−塩基プローブ（末端標識）：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＧＧＡＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
２９−塩基プローブ（１−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＡＣＣＡＣＴＴ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＧＧＡＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（末端標識）：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
【０４４３】
改善された消光効率はＦＲＥＴの距離依存性によって予測されうるが、改善された信号は容易には説明されない。一つの可能性としては、増幅をより良好に信号化するためには、内部クエンチャーは現実には蛍光レポーターとのスペクトルの重なりが貧弱でなければならない。４９５ｎｍの最大吸光度で、ＢＨＱ０の吸収スペクトルは、その最大放射が５２０でのＦＡＭから少し移動する。まだ推論ではあるが、内部クエンチャーは、最適な性能特性のため、レポーターより短い波長で、あるいは、３’−末端上のクエンチャー（ＢＨＱ１）より短い波長で最大ラムダを有することが可能である。
【０４４４】
また、二つのクエンチャーが互いに物理的に結合して、どちらかのクエンチャーが個々に作用するよりも、より効果的にＦＡＭと相互作用する錯体を生成することが可能である。真実ならば、これは、３’‐ＢＨＱ１が５’−蛍光レポーターにより近い近傍に移動された構造化プローブ配座であり、したがって、配座補助プローブと考えられる。
【０４４５】
改善された信号放出は、ＢＨＱ０及びＴａｑポリメラーゼ間の好ましい相互作用から発生することがある。従来の末端標識プローブは、ハイブリダイゼーションについての信号を即座に放出するが、ダブルクエンチャープローブにおいては、この信号化機構は実際に全く小さいことが示された。ハイブリダイゼーションについてでさえ、ＦＲＥＴ消光は、蛍光レポーター及び内部クエンチャーの近接によってかなり重要なままである。ポリメラーゼによるヌクレアーゼ消化についてのみ、フルオロフォアはクエンチャー標識化オリゴから開裂して、蛍光信号を放射する。これらの種類の酵素依存性は、予測が極めて難しい。それらは、タンパク質との微妙な静電気及び疎水性相互作用を伴うことがあり、Ｘ線結晶学なしでモデル化することが困難である。
【０４４６】
様々な仮説が改善された信号増幅を説明できるが、二本鎖の安定化は、現在その一つではない。ＢＨＱは結合強さを改善せず、むしろ、従来の末端標識プローブに比較して、プローブのＴＭを１℃低下させることが指摘された。この不安定化は、糖リン酸主鎖を分断させる内部修飾から発生している可能性があり、標的配列の結合の種類の増加を導く。これらの仮説及びそれらの特徴付けは、実験部分でより詳細に説明される。
【０４４７】
多数の候補は、選別の効率のため、標的配列の単一の希釈点から増幅することによって試験された。検出限界近傍での感度損失がないことを確実にするため、ダブルクエンチャープローブは７点希釈シリーズを通して試験され、それらの増幅は器具の正規化アルゴリズムによる分析に基づいて提示された。
【０４４８】
図５Ａ〜Ｆ。末端標識プローブで信号化された増幅痕跡を斜線で示した。ダブルクエンチャープローブで信号化された増幅痕跡は実線で示した。
【０４４９】
実験
ダブルクエンチャープローブの改善された性能は、発色団構造、オリゴへの連鎖、互いに対する配向、及び配列内での配置に依存する極めて特殊な修飾システムを介して達成されうる。Ｔ−連鎖ＢＨＱ１を使用して修飾したプローブで観察されるように、これらの精密な特性からの偏向は、わずかでも、信号放出の大きさに関して性能低下を生じさせる。
【０４５０】
このＩ−ＴＢＨＱ１修飾の化学構造を下記の化５７に示す：
【０４５１】
【化５８】
2018512167.tif 000065
【０４５２】
そのプローブは、内部位置に単一クエンチャーを含んでいたが、３’末端でＳｐａｃｅｒ−Ｃ３修飾によってブロックされた：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣ［Ｉ−ＴＢＨＱ１］ＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［３−Ｓｐ３］−３’
【０４５３】
図２Ａ〜Ｃに示したように、結果として妥協された全体性能では、消光効率は改善されたが、信号放出は抑制された。次に、３’’−Ｓｐａｃｅｒ−Ｃ３を第二のＢＨＱ１に置換し、同様に、内部ＴＢＨＱ１を糖リン酸主鎖を分断する脱塩基処方で置換したプローブを試験した。
【０４５４】
【化５９】
2018512167.tif 000066
【０４５５】
図６Ａ、Ｂ。末端標識プローブで信号化された増幅痕跡を斜線で示した。ダブルＢＨＱ１プローブで信号化された増幅痕跡は実線で示した。図６ＡのＴ連鎖処方または図６Ｂの脱塩基処方のどちらかで、どちらも二元性ＢＨＱ１クエンチャーの形態では信号レスポンスが低下し、全体性能も妥協された。比較したプローブ配列は下記の通りである：
２１−塩基プローブ（末端標識）：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［ＢＨＱ１］−３’
２１−塩基プローブ（１−ＴＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣ［１‐ＴＢＨＱ１］ＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［３−ＢＨＱ１］−３’
２１−塩基プローブ（１−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）：
５’−［ＦＡＭ］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧ［１‐ＢＨＱ１］ＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ−［３−ＢＨＱ１］−３’
【０４５６】
１−ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ１の脱塩基処方を、それ以外はＩ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１の配置のダブルクエンチャープローブと同じシステムで試験したが、その性能は大きく低下した。簡略化のため、一つの代表的なアッセイからの結果だけを示したが、これらの二つの配置は実際に１０未満の異なる構成のパネルで比較し、その結果はここに示したものと同様である。いくつかのプローブ配列はＩ−ＢＨＱ１から大きく低減した信号レスポンスを示したが、Ｉ−ＢＨＱ０ではより頻繁に改善された7。
【０４５７】
他の二元性クエンチャー構成の性能は、異なる修飾と全く同様に良好なものはない。内部Ｔ−Ｄａｂｓｙｌ（Ｉ−ＴＤＡＢ）を有する３５塩基プローブは、第一のアリール部分（Ｉ−Ａｎｉｌｉｎｅ）だけを含むＢＨＱ０の短縮型と同様に、それぞれ、常に３‐ＢＨＱ１と組み合わせて合成された。
【０４５８】
図７Ａ、Ｂ。斜線は、末端標識プローブで信号化された増幅を示した。比較のため、ダブルクエンチャープローブＩ−ＢＨＱ０＋３−ＢＨＱ１で信号化された増幅痕跡は実線で示した。中抜き線は、図７ＡではＩ−ＴＤＡＢ＋３‐ＢＨＱ１であり、図７ＢではＩ−Ａｎｉｌｉｎｅ＋３‐ＢＨＱ１である。Ｉ−  Ａｎｉｌｉｎｅは従来の末端標識プローブと等価な信号レスポンスを有するが、消光効率は劣り、それはＡｎｉｌｉｎｅ部分がクエンチャーとして機能しないことを示している。プローブ構成は両方ともＩ−ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ１と比較すると、全体性能が劣る。下記のプローブ配列を比較した：
３５−塩基プローブ（末端標識化）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＴＤＡＢ＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［Ｉ−Ａｎｉｌｉｎｅ］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
【０４５９】
内部ＢＨＱ０のオリゴへの連鎖の変更さえ、この特殊なダブルクエンチャープローブの構成の性能を妨げるであろう。デオキシリボース部分（Ｉ−ｄＢＨＱ０）に結合される３５塩基プローブ及び糖リン酸主鎖を分断するグリコール連鎖（Ｉ−ｇＢＨＱ０）を介して付着するＢＨＱ０を有するもう一つの塩基プローブを合成した。これらの二つの修飾の反応性前駆体の構造を下記の化５９に示した。
【０４６０】
【化６０】
2018512167.tif 000067
【０４６１】
図８Ａ、Ｂ。斜線で示した増幅痕跡は、末端標識プローブで信号化された。比較のため、ダブルクエンチャープローブＩ−ＢＨＱ０＋３−ＢＨＱ１は実線で示した。中抜き線は、図８ＡではＩ−ｄＲＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１プローブであり、図８ＢではＩ−ｇＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１である。これらの修飾は同一の発色団構造を保持しているが、例示的なＩ−ＢＨＱ０と比較すると、それらの連鎖化学だけは異なり、またどちらも劣った信号レスポンスを有する。下記のプローブ配列を比較した：
３５−塩基プローブ（末端標識化）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ｄＲＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［Ｉ−ｄＲＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ｇＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［Ｉ−ｇＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
【０４６２】
そのような機能依存性は、内部ＢＨＱ０だけに限定されるわけではなく、３’末端に位置するＢＨＱ１も同様である。プローブの配置全体に対するこの末端クエンチャーの重要性を示すために、ＢＨＱ１の代わりにＳｐａｃｅｒ  Ｃ３を有するプローブを、内部ＢＨＱ０を保持したまま、試験した。また、二つのクエンチャーの逆配向、したがって、ＢＨＱ１は内部位置に配置され、内部ＢＨＱ０を保持したままでも、試験した。
【０４６３】
図９Ａ、Ｂ。斜線は、末端標識プローブで信号化された増幅を示した。比較のため、実線はダブルクエンチャープローブＩ−ＢＨＱ０＋３−ＢＨＱ１である。中抜き線は、図９ＡではＩ−ＢＨＱ０＋３‐Ｓｐ３であり、図９ＢではＩ−ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ０である。プローブ構成は両方ともＩ−ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ１と比較すると、信号レスポンスが劣り、クエンチャーの互いの配向と同様に組み合わせ内でのＢＨＱ１の役割の重要性を強調する。下記のプローブ配列を比較した：
３５−塩基プローブ（末端標識化）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐Ｓｐ３）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−Ｓｐ３］−３’
３５−塩基プローブ（Ｉ−ＢＨＱ１＋３‐ＢＨＱ０）
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧ［Ｉ−ＢＨＱ１］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ０］−３’
【０４６４】
クエンチャー配向の切り替えは、官能性に重大な作用を及ぼすが、配列位置はそれより敏感でさえある。内部ＢＨＱ０の位置を５’蛍光レポーターにより近づけたり、それからより離したりして、試験した結果を示した：
【０４６５】
図１０。クエンチャーを５’レポーターにより近く配置することによって基準蛍光が低下するが、特に従来の末端標識プローブ（斜線）と比較すると、９／１０構成の消光効率のわずかな改善だけが示される。しかしながら、内部ＢＨＱ０を残余９及び１０間のその例示的な位置からどちらかに移動させる時、信号放出は妥協され、したがって、他の構成は全部劣った性能を有する。下記のプローブ配列で比較した：
３５−塩基プローブ（末端標識化）：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
６／７Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＡＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
７／８Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡ［Ｉ−ＢＨＱ１］ＧＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
８／９Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧ［Ｉ−ＢＨＱ０］ＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［３−ＢＨＱ１］−３’
９／１０Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１：
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴ［１−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１］ＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
１１／１２Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１と
５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧ［１−ＢＨＱ０］ＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡ−［ＢＨＱ１］−３’
【０４６６】
改善された消光効率は、ＦＲＥＴの距離依存性によって容易に説明可能であるが、様々なプローブ構成にわたる信号差は全く予期していない。作用のメカニズムを究明する試みでは、ハイブリダイゼーションの熱力学は、各プローブをその補足配列と組み合わせて、次に温度勾配にわたってゆっくりと別々に溶融させることによって特徴付けられる。この溶融曲線は遷移温度、またはＴＭを記録し、プローブの結合安定性を明らかにする。増幅のアニール温度の下の低すぎるＴＭで結合するプローブは、弱い信号レスポンスを提供する。逆に、任意の結合安定性の増大は反対作用を有するべきである。常にＩ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１構成を従来の末端標識プローブと比較して、このように１２の異なるプローブ設計を試験した。その二つの間の唯一の差は、内部クエンチャーであり、したがって、この比較は、１−ＢＨＱ０自体からの結合安定性への任意の貢献を明らかにする。
【０４６７】
溶融曲線（図１１Ａ−Ｌ）は、従来のプローブと比較して、Ｉ−ＢＨＱ０＋３‐ＢＨＱ１のダブルクエンチャープローブからの平均で−１．０℃のわずかな不安定化を明らかにする。結果は試験した各プローブ配列でいくらかは変動し、選択した配列はダブルクエンチャー構成でより高いＴＭを記録するが、全体でＢＨＱ０によって貢献される意義にある安定化は存在しない。そのように、ハイブリダイゼーションの熱力学は、このダブルクエンチャープローブ型の信号化メカニズムにおいて要因でないようである。
【０４６８】
斜線及び実線をそれらの中抜き線と比較することによって測定したように、６０℃でのハイブリダイズされた、または、ハイブリダイズされていない配座間の信号の変化がより興味深い。これらの中抜き線は同一範囲にわたって、その補足の不在下での各プローブを示し、より高い温度では、全ての鎖が別々に溶融するので、斜線及び実線に重なるだろう。溶融曲線だけから、従来のプローブが最高の性能であると結論されるかもしれない：それは、ダブルクエンチャープローブ構成よりも、ハイブリダイゼーションについてより大きな信号放出を示す。しかし、このハイブリダイゼーションアッセイとは対照的に、ＰＣＲ増幅は異なる結果を生じさせる：ダブルクエンチャープローブは従来のプローブと等価の、または、より大きい信号放出を示す。６０℃での溶融曲線データは、ダブルクエンチャープローブがその補足に対するハイブリダイゼーションについてでさえ、有効に消光されたままで、他の全部より良好に消光されることを明らかにするが、最短の従来のプローブはハイブリダイズされないままなので、ＰＣＲの結果は驚異的である。この全てが、ＰＣＲアッセイにおいて、優勢な信号化メカニズムはハイブリダイゼーションより、むしろ加水分解であることを示唆している。プローブ加水分解は、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を介して実行され、したがって、ダブルクエンチャープローブはこの酵素との相互作用を介して可能性を得ると思われるだろう。ポリメラーゼと組み合わされた、この修飾系の相乗効果は予測または設計が極めて困難であろう。それは、何十もの異なる構成をｑＰＣＲの文脈でそれらの官能性について評価する意義のある実証試験によってのみ達成されるであろう。
【０４６９】
【表１】
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【０４７０】
【表２】
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【０４７１】
【表３】
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【０４７２】
【表４】
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【０４７３】
本文書に記載した実施例及び実施形態は、例示目的であり、それを踏まえて、様々な修正または変更が当技術分野の熟練者には示唆され、それは本出願の精神及び範囲内に含まれ、添付請求項の範囲内とみなされることが明らかであろう。本文書に記載した全ての出版物、特許及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照として本文書に組み込まれている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【国際調査報告】
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