(57)【要約】本発明は、ブラキウリなどの異種遺伝子の発現を増強するために使用することが可能である、１つまたはそれ以上のプロモーター及び／または発現カセットに関する。特に、１つまたはそれ以上のプロモーター及び／または発現カセットは、ポックスウイルスなどのウィルスベクターの一部として異種遺伝子の発現を増強する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターと、
ｂ．前記プロモーターに作動可能に連結されるコード配列と
を含み、前記コード配列の発現が前記プロモーターによって制御される、コード配列の発現のための発現カセット。
【請求項２】
前記プロモーターが、配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記プロモーターが、配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つに対してハイブリッド化が可能である核酸配列から選択される、請求項１〜２に記載の発現カセット。
【請求項４】
ポックスウイルスのゲノムにおいて自然に存在する発現カセットではない、請求項１〜３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーターが、配列識別番号：４及び配列識別番号：５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１〜４に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記プロモーターが、配列識別番号：４及び配列識別番号：５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１〜４に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記プロモーターが、配列識別番号：９またはその部分配列である、請求項１〜４に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記部分配列が、配列識別番号：４及び５から選択される、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記コード配列が、少なくとも１つの（ａ）治療タンパク質またはペプチド、抗原、抗原性エピトープ、アンチセンスＲＮＡ、腫瘍随伴抗原もしくはエピトープ、あるいはリボザイムに対してコード化する、請求項１〜８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記コード配列が、少なくとも１つの腫瘍随伴抗原（ＴＡＡ）に対してコード化する、請求項１〜８の発現カセット。
【請求項１１】
前記コード配列が、少なくとも１つの、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ抗原またはその組合せから選択されるＴＡＡに対してコード化する、請求項１〜１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記コード配列が、ブラキウリ抗原に対してコード化する、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記ブラキウリ抗原が、ブラキウリＬ２５４Ｖである、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記コード配列が、配列識別番号：１１及び配列識別番号：１３からなる群から選択されるブラキウリ抗原をコード化する核酸配列を含んでなる、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記コード配列が、配列識別番号：１２、配列識別番号：１４及び配列識別番号：１５からなる群から選択される、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記コード配列が、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリ抗原に対してコード化する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記コード配列が、配列識別番号：１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２及び４３からなる群から選択されるブラキウリ抗原に対してコード化する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記コード配列が、配列識別番号：２６〜２７、３０〜３１、３８〜３９、４２及び４３からなる群から選択されるブラキウリ抗原に対してコード化する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記コード配列が、配列識別番号：２４〜２５、２８〜２９、３６〜３７、４０及び４１からなる群から選択される核酸に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記コード配列が、配列識別番号：２５もしくは２９またはその部分配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記コード配列が、配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む、請求項１〜１１に記載の発現カセット。
【請求項２２】
配列識別番号：７２〜７６からなる群から選択される核酸を含む、発現カセット。
【請求項２３】
配列識別番号：７２、配列識別番号：７３及び配列識別番号：７４からなる群から選択される核酸を含む、発現カセット。
【請求項２４】
配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列または配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つの誘導配列を含むか、またはそれからなる、コード配列の発現を増強するためのプロモーターであって、前記誘導が、１つまたはそれ以上の置換、欠失及び／または挿入を有し、かつ前記誘導配列が、ポックスウイルスプロモーターとして活性であり、及び／またはポックスウイルス感染細胞において活性である、プロモーター。
【請求項２５】
配列識別番号：１〜１０及び７７またはその部分配列からなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれからなる、コード配列の発現を増強するためのプロモーター。
【請求項２６】
配列識別番号：９またはその部分配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる、コード配列の発現を増強するためのプロモーター。
【請求項２７】
前記部分配列が、配列識別番号：３〜８からなる群から選択される、請求項２６に記載のプロモーター。
【請求項２８】
配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１またはその部分配列からなる群から選択されるブラキウリ抗原に対してコード化する核酸に対して少なくとも７０％の同一性を有する、合成核酸。
【請求項２９】
１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９またはその部分配列からなる群から選択される、合成核酸。
【請求項３０】
１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１またはその部分配列からなる群から選択される、合成タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜２３に記載の発現カセット、請求項２４〜２７に記載のプロモーター、請求項２８〜２９に記載の核酸及び／または請求項３０に記載のタンパク質を含む、ベクター。
【請求項３２】
プラスミドである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
組換型ウイルスである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３４】
前記組換型ウイルスがポックスウイルスである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記アビポックスウイルスが鷄痘ウイルスである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記発現カセットが、前記ポックスウイルスゲノムの欠失部位に挿入される、請求項３１〜３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記発現カセットが、前記ポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項３１〜３５に記載のベクター。
【請求項３９】
オルソポックスウイルスである、請求項３３〜３４に記載のベクター。
【請求項４０】
前記オルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、改質Ａｎｋａｒａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＢＮから選択される、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸、ｄ）請求項３０のタンパク質またはｅ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターを含む、ワクチン、薬剤または医薬組成物。
【請求項４２】
ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸、ｄ）請求項３０のタンパク質またはｅ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４３】
ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸またはｄ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターを、標的細胞に導入することを含む、標的細胞中にコード配列を導入する方法。
【請求項４４】
ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸またはｄ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターによる宿主細胞の感染を含む、ペプチド、タンパク質またはウイルスを製造する方法。
【請求項４５】
ａ．ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸を含む、発現ベクターまたはウイルスを提供すること；及び
ｂ．前記発現ベクターまたはウイルスに、前記発現カセット、前記プロモーターまたは前記核酸の発現に寄与する条件を受けさせること
を含む、核酸を発現する方法。
【請求項４６】
薬剤、好ましくは、ワクチンの調製における、ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸、ｄ）請求項３０のタンパク質またはｅ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項４７】
核酸を発現するための、ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸、ｄ）請求項３０のタンパク質またはｅ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項４８】
薬剤、好ましくは、ワクチンとして使用するための、ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸、ｄ）請求項３０のタンパク質またはｅ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４９】
コード配列を標的細胞中に導入する方法において使用するための、ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の発現カセット、ｂ）請求項２４〜２７のプロモーター、ｃ）請求項２８〜２９の核酸またはｄ）請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポックスウイルス、特に、鶏痘ウイルス及びカナリーポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）などのアビポックスウイルスにおけるタンパク質発現の１つまたはそれ以上の新規プロモーターに関する。本発明は、さらに、上記プロモーターを含むポリヌクレオチド、特に、上記プロモーター及び発現される核酸を含むポリヌクレオチド；上記を含むベクター；上記構成を含む宿主細胞；及び上記のいずれかを含む組成物に関する。さらに本発明は、１つまたはそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される１つまたはそれ以上の新規ポリペプチドに関する。より特には、１つまたはそれ以上の新規ポリペプチドは、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｕｒｙ）タンパク質と関連する。
【背景技術】
【０００２】
組換型ポックスウイルスは、感染性生物、より最近では、腫瘍に対するワクチンとして使用されている。Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５（８）：１０３１−１０３４。これらのポックスウイルス群の２つ、アビポックスウイルス及びオルソポックスウイルスは、腫瘍闘病において効果があることが示され、かつ可能性のあるがん治療に関連する。同上。
【０００３】
１つの代表的なアビポックスウイルスの種、鶏痘は、鶏痘ウイルスは哺乳動物の細胞に入り、そしてタンパク質を発現するが、自己複製が不成功となるため、ヒト投与のための安全な媒体であることが示された。Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００５  Ｆｅｂ；４（１）：６３−７６。さらに、発現のための媒体としての鶏痘ウイルスの使用は、がん、マラリア、結核、ＡＩＤＳ及びエボラに対するワクチンの多数の臨床試験において評価されている。同上。
【０００４】
鶏痘などの組換型ポックスウイルスは、ｐ９７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３及びＥＴＡなどのいくつかの感染性疾患及び腫瘍随伴遺伝子を含めて、広範囲の挿入遺伝子を発現するために使用されている（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。最近調査されている１つの代表的な腫瘍抗原は、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）（「Ｔ」としても知られる）である。
【０００５】
ブラキウリは、マウスにおいて、劣性致死でもある優性短尾突然変異体として識別され；同種接合Ｔ／Ｔ胎児は、後部中胚葉形成不全のために妊娠中期に死亡する（Ｃｈｅｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，７０：４２９−４５９，１９３５）。マウスブラキウリ遺伝子は、ヒトなどの他の種における相同体と同様にクローン化された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３４３：６１７−６２２，１９９０）。マウスブラキウリのヒト相同体の発現は、妊娠１４〜１５週におけるヒト流産胎児の脊索残遺物、髄核において、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：２２６−２３３，１９９６）。
【０００６】
ブラキウリは、一般に、中胚葉細胞分化の認識のために価値のある標識であることが証明されている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１０：２８０−２８６，１９９４）。例えば、胎児自身における発現は別として、ブラキウリは、生体外において、中胚葉細胞系列に沿って分化する特定のマウスＥＣ及びＥＳ細胞系の分化の間に活性化されると報告されている（例えば、Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２３：６９１−６９４，１９９６を参照のこと）。ヒトにおいては、ブラキウリは、奇形がん腫（Ｇｏｋｈｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １１：１５７−６２，２０００）、脊索腫（Ｖｕｊｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２：１５７−６５，２００６）及び血管芽腫（Ｇｌａｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：４１６７−４１７２，２００６）において発現されることが示されている。
【０００７】
より最近では、ブラキウリを発現するポックスウイルスが、腫瘍に対する活性免疫療法薬として有効である可能性があることが記載されている（ＷＯ  ２０１４／０４３５３５を参照のこと）。
【０００８】
活性免疫療法薬及びワクチンを含め、感染症及びがん治療を改善するための、明らかに実質的に未だ対処されていない医学的要求が存在する。上記に基づき、当該技術において、活性免疫療法薬において使用される、ブラキウリなどの抗原の発現を改善するための要求が存在する。本発明は、この要求を満たすものである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ポックスウイルスの一部として組み込まれたコード配列及び抗原の発現の増強を随伴する、１つまたはそれ以上のプロモーター、核酸、発現カセット、組換型ペプチド及び組換型ポックスウイルスを提供する。
【００１０】
本発明の一態様において、
ａ．配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターと、
ｂ．プロモーターに作動可能に連結されるコード配列と
を含み、コード配列の発現がプロモーターによって制御される、発現カセットが提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様において、発現カセットは、その中のコード配列の増強された発現のために、ウイルスまたはプラスミドなどのベクターの一部として組み込まれることが可能である。好ましくは、発現カセットは、限定されないが、オルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスなどのポックスウイルスの一部である。より好ましくはは、発現カセットは、鶏痘ウイルスなどのアビポックスウイルスである。なおさらなる態様において、発現カセットは、ポックスウイルスのゲノムにおいて自然に存在する発現カセットではない。
【００１２】
さらなる態様において、ａ）配列識別番号：１〜１０からなる群から選択される核酸配列、ｂ）配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つの部分配列、またはｃ）配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つの誘導配列を含むか、またはそれからなる、１つまたはそれ以上のプロモーターであって、上記誘導が、１つまたはそれ以上の置換、欠失及び／または挿入を有し、かつ上記誘導配列が、ポックスウイルスプロモーターとして活性であり、及び／またはポックスウイルス感染細胞において活性である、プロモーターが提供される。
【００１３】
なおさらなる態様において、本発明は、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の新規ブラキウリタンパク質をコード化する１つまたはそれ以上の核酸配列を含む。なおさらなる態様において、本発明は、配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の新規核酸配列を含む。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は、
ａ．配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターと、
ｂ．プロモーターに作動可能に連結されるコード配列と
を含み、コード配列が、ｉ）配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される、ブラキウリタンパク質をコード化する核酸、またはｉｉ）配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸、のいずれかを含み、コード配列の発現がプロモーターによって制御される、発現カセットを含む。
【００１５】
本発明のさらなる目的及び利点は、以下の記載において一部、明らかにされるであろう。そして一部は、記載から明白であるか、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の目的及び利点は、特に添付の請求項で指摘された要素及び組合せを使用することによって理解され、かつ達成されるであろう。
【００１６】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、模範、かつ説明のみであって、そして請求として本発明を限定するものではないことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】非組換型ウイルスＦＰＶ−ＷＴ、または組換型ウイルスＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４ＡもしくはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａによって感染されたヒト樹状細胞（ＤＣ）中のブラキウリタンパク質の発現を示す。実施例１に詳述されるように、ウサギモノクロナル抗ブラキウリ抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を実行した。
【図２】非組換型ウイルスＭＶＡ−ＷＴもしくはＦＰＶ−ＷＴ、または組換型ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２４９Ｂ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２８１Ａクローン３２、ＦＰＶ−ｍＢＮ２８１Ａクローン３５、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５４ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３５５Ａによって感染されたヒト樹状細胞（ＤＣ）中のブラキウリタンパク質の発現を示す。実施例２に詳述されるように、ウサギモノクロナル抗ブラキウリ抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を実行した。
【図３】実施例２に詳述されるように、非組換型ウイルスＭＶＡ−ＷＴもしくはＦＰＶ−ＷＴ、または組換型ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２４９Ｂ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２８１Ａクローン３２、ＦＰＶ−ｍＢＮ２８１Ａクローン３５、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５４ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３５５Ａによって感染されたヒト樹状細胞（ＤＣ）のウエスタンブロット分析からのＧＡＰＤＨに対するブラキウリタンパク質の相対的発現を示す。
【図４】実施例３に記載されるように、それぞれのタンパク質に特異的な蛍光標識抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価される、組換型ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２４９Ｂ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａによって感染されたＣＭＭＴ細胞（アカゲザル乳房腫瘍細胞系）中のブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現を示す。
【図５】実施例３に記載されるように、フローサイトメトリーによって評価される、組換型ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰＶ−ｍＢＮ２４９Ｂ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａによって感染されたＣＭＭＴ細胞（アカゲザル乳房腫瘍細胞系）中のブラキウリタンパク質の発現レベルの中央値を示す。
【図６】実施例４に記載されるように、フローサイトメトリーによって評価される、組換型ウイルスＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ｂによって感染されたＣＭＭＴ細胞（アカゲザル乳房腫瘍細胞系）中のブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、配列識別番号：１〜１０及び７７に提示されるプロモーター配列が、腫瘍抗原ブラキウリの発現を増強するという驚くべき決定に基づく。図１〜６に示され、かつ本明細書中により詳細に記載されるように、本発明のプロモーターを使用する場合、ブラキウリ抗原の発現が増強される。プロモーター及びブラキウリ抗原が、組換型ポックスウイルスの一部として使用される場合、発現はさらに増強される。
【００１９】
少なくとも１つの態様において、本開示の種々の実施形態は、ＰｒＳ及びワクシニアウイルス４０ｋ（ＶＶ−４０Ｋ）などの周知のワクシニアプロモーターを使用する、ブラキウリタンパク質の不十分な発現レベルの結果として生じた。ブラキウリ発現レベルを増強する試みにおいて、本発明者らは、種々のワクシニアプロモーター及び随伴タンパク質（例えば、ＶＶ−４０ｋ、Ｉ３など）及びＦＰＶにおけるいずれかの可能な相同体も分析した。発明者らは、いくつかのＦＰＶ相同体配列が、以前に発見されたことを理解した。例えば、Ｚａｎｔｉｎｇｅ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；７７（Ｐｔ  ４）：６０３−１４  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  ＦＰＶ  ０８８  ａｔ  ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０３９０５１．１，Ａｆｏｎｓｏ，Ｃ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８），３８１５−３８３１（２０００）を参照のこと。
【００２０】
ブラキウリ発現を増強する最初の試みにおいて、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３９０５１．１における遺伝子ＦＰＶ０８８の可能なプロモーター領域が、発明者らによってブラキウリと共に構成され、試験されたが、望ましくないプロモーター結果が得られた（例えば、ｍＢＮ３４４Ａにおける図１及び２を参照のこと）。発明者らは、遺伝子ＦＰＶ０８８のＯＲＦからのヌクレオチドの付加によって、次のプロモーターを作成したが、同様に望ましくない結果が得られた（例えば、ｍＢＮ３５４Ａにおける図１及び２を参照のこと）。本発明者らは、遺伝子ＦＰＶ０８８のＯＲＦからのヌクレオチドのさらなる付加によって、さらなる構成を作成した。これは、本明細書に記載され、かつ例示されるように、腫瘍抗原ブラキウリの発現を増強する。
【００２１】
したがって、種々の実施形態において、本発明は、限定されないが、プラスミド、組換型ウイルスなどの発現ベクターにおけるコード配列及び／または核酸の発現を増強するための、１つまたはそれ以上の核酸配列、核酸配列を含む１つまたはそれ以上のプロモーター、核酸を含む１つまたはそれ以上の発現カセット、１つまたはそれ以上のペプチド及び／またはペプチド配列に関する。さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の核酸配列、プロモーター、発現カセット及び／またはペプチド及び／またはペプチド配列を含む、１つまたはそれ以上の組換型ポックスウイルスに関する。
【００２２】
さらに、本発明の種々の実施形態において、ブラキウリポリペプチドをコード化する１つまたはそれ以上の核酸配列が提供される。一実施形態において、ブラキウリポリペプチドをコード化する１つまたはそれ以上の核酸は、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される。本発明によるブラキウリポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される。
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、文脈上明白に他が示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形も含む。したがって、例えば、「エピトープ」への言及は、１つまたはそれ以上のエピトープを含み、かつ「方法」への言及は、本明細書に記載の方法に対して変更または置き換え可能である、当業者に既知の同等のステップ及び方法への言及を含む。
【００２４】
他が明記される場合を除き、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、シリーズの全ての要素を示すものとして理解される。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態への多くの同等物を認識するか、または通常以上の実験を使用しないことを確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明によって含まれるように意図される。
【００２５】
本明細書及びそれに続く請求項全体で、文脈上が別のことを必要としない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という用語、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、明記された整数またはステップ、あるいは整数またはステップの群を含むが、いずれかの他の整数またはステップ、あるいは整数またはステップの群を排除しないことを暗示するものとして理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語で、あるいは時には、使用される場合、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語で代用することができる。上記用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）、ｈａｖｉｎｇ（有する））のいずれも、あまり好ましくはないが、本発明の態様または実施形態に関して本明細書中で使用される場合はいつでも、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」という用語で代用することができる。本明細書で使用される場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」は、請求要素において明記されないいずれの要素、ステップまたは成分も排除する。本明細書で使用される場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」は、請求の基本的かつ新規特徴に本質的に影響を与えない材料またはステップを排除しない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素の間の結合語「及び／または」は、個々及び組合せの選択肢の両方を含むことが理解される。例えば、２つの要素が「及び／または」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２要素を含まない第１の要素の適用性を意味する。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素の適用性を意味する。第３の選択肢は、第１及び第２の要素の適用性を意味する。これらの選択肢のいずれか１つが、意味の範囲内に含まれると理解され、したがって、本明細書で使用される用語「及び／または」の必要条件を満たす。選択肢の２つ以上の同時の適用性も、意味の範囲内に含まれると理解され、したがって、用語「及び／または」の必要条件を満たす。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、例えば、促進される遺伝子のコード領域からのＲＮＡの合成に関与するタンパク質転写因子及びポリメラーゼによって認識され、かつ結合される、特定のＤＮＡ配列要素を含有する、発現される核酸の配列の上流に位置する核酸（通常、ＤＮＡ）の調節領域を意味する。プロモーターは、典型的に、問題の遺伝子に隣接しているため、プロモーターにおける位置は、特定の遺伝子に対してＤＮＡの転写が開始する転写の開始部位に対して指定される（すなわち、上流の位置は、−１から数えられる負の数であり、例えば、−１００は、１００塩基対上流の位置である）。したがって、プロモーター配列は、位置−１までヌクレオチドを含み得る。しかしながら、＋１の位置からのヌクレオチドは、プロモーターの一部ではなく、すなわち、この点に関して、翻訳開始コドン（ＡＴＧまたはＡＵＧ）はプロモーターの一部ではないことは留意されなければならない。したがって、配列識別番号：１〜１０及び７７は、本発明のプロモーターを含むポリヌクレオチドである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、コード配列、核酸、タンパク質及び／または抗原の発現レベルに関して使用される場合、「ｅｎｈａｎｃｉｎｇ（増強する）」または「ｅｎｈａｎｃｅｄ（増強した）」という用語は、ＰｒＳまたはＶＶ−４０ｋなどの当該技術において既知の１種またはそれ以上のプロモーターを随伴する場合及び／またはその一部としてのコード配列、核酸、タンパク質及び／または抗原の発現レベルに対しての、１種またはそれ以上のプロモーター、発現カセット、核酸、タンパク質及びベクターを随伴する場合及び／またはその一部としてのコード配列、核酸、タンパク質及び／または抗原の発現における増加を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、配列識別番号：１〜１０及び７７に提示されるヌクレオチド配列と「本質的に同じ発現特徴」を有するヌクレオチド配列は、産生された組換型タンパク質の量によって測定された場合、配列識別番号：１〜１０及び７７のプロモーター活性の少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％を示すであろう。問題のプロモーター配列が、配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれかと「本質的に同じ発現特徴」を有するか否かは、本出願の実施例１〜４に明らかにされた方法を使用して、当業者によって容易に決定され得る。本発明によるプロモーターは、好ましくは、ポックスウイルスプロモーター、好ましくは、アビポックスウイルスプロモーターとして活性であるか、またはポックスウイルス感染細胞、好ましくは、アビポックスウイルス感染細胞においてプロモーターとして活性である。アビポックスウイルスは、好ましくは、鷄痘ウイルスである。「痘疹ウイルスプロモーターとして活性」とは、プロモーターが、上記ウイルスによる細胞の感染後に、痘疹ウイルスと作動可能に連結する遺伝子の発現を導くことが可能であることを意味する。細胞は、好ましくは、ポックスウイルスの後期及び／または初期及び／または初期／後期発現を可能にする細胞である。「ポックスウイルス感染細胞において活性なプロモーター」は、プロモーターがポックスウイルスゲノムの一部ではなく、例えば、プラスミドまたは線形ポリヌクレオチドあるいは非ポックスウイルスゲノムの一部である状況も含む。そのような状況において、プロモーターを含む細胞がポックスウイルスゲノムを含む場合、例えば、細胞がポックスウイルスに感染している場合、本発明によるプロモーターは活性である。これらの状況下、ウィルスＲＮＡポリメラーゼは、本発明によるプロモーターを識別し、そしてプロモーターに関連する遺伝子／コード配列の発現が活性化する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「配列識別番号：１〜１０及び７７に提示される核酸から誘導される」という用語は、配列識別番号：１〜１０及び７７のヌクレオチド配列が、明示されるヌクレオチド改質、例えば、少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換及び／または反転をもたらすための基礎として考慮されることを意味する。「誘導」という用語は、既知の方法、例えば、エラープローンＰＣＲによって、配列識別番号：１〜１０及び７７に対応する物理的配列を実際に改質することの可能性を含む。「誘導」という用語は、インシリコで配列識別番号：１〜１０及び７７の配列に改質を行うこと、次いで、そのようにして決定された配列を物理的核酸として合成することの可能性を追加的に含む。例えば、「誘導」という用語は、例えば、配列識別番号：１〜１０及び７７の出発配列を改質することにおけるハイブリッド形成安定性及びいずれかの二次核酸構造の可能性に関しての核酸配列の分析のために、いずれかの周知のコンピュータプログラムを使用することの可能性を含む。好ましくは、配列識別番号：１〜１０及び７７の核酸に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のヌクレオチドが付加されて、欠失されて、置換されて、及び／または反転された。さらに、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、挿入または欠失は、発現される核酸の開始コドンに生じるべきではない。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ（発現した）」、「ｅｘｐｒｅｓｓ（発現する）」、「ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（発現）」などの用語は、対象となる配列の転写のみ、ならびに翻訳及び転写の両方を意味する。したがって、ＤＮＡの形態で存在する核酸の発現に関して、この発現に起因する産物は、（発現される配列の転写のみから得られる）ＲＮＡまたは（発現される配列の転写及び翻訳の両方から得られる）ポリペプチド配列であり得る。したがって、「発現」という用語は、ＲＮＡとポリペプチド産物の両方が上記発現から得られて、そして同一共有環境において一緒に残存することの可能性も含む。例えば、ｍＲＮＡがポリペプチド産物へのその翻訳の後に存在し続ける場合、これは事実である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、典型的に、クローン化及び／または転換のために使用されるベクターまたは組換型ウイルスの一部として定義される。発現カセットは、典型的に、ａ）１つまたはそれ以上のコード配列（例えば、タンパク質及び／または抗原をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、遺伝子、核酸）、ならびにｂ）１つまたはそれ以上のコード配列の発現を制御する配列を含む。さらに、発現カセットは、通常、真核生物においてポリアデニル化部位を含有する３’未翻訳領域を含み得る。
【００３３】
「組換型」という用語は、自然界に生じないか、または自然界に見出されない配列の別のポリヌクレオチドに結合した半合成または合成由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
【００３４】
本発明の一態様は、配列識別番号：１〜１０及び７７との少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、かつ配列識別番号：１〜１０及び７７と本質的に同じ発現特徴を有す核酸を有するプロモーターを含む。
【００３５】
本明細書に記載される核酸配列に関する「パーセント（％）配列相同性または同一性」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列し、ギャップを導入した後、参照配列（すなわち、それが誘導される核酸配列）におけるヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドの百分率として定義される。ヌクレオチド配列同一性または相同性のパーセントを決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータ・ソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成可能である。当業者は、比較される配列の全長上での最大整列を達成するために必要ないずれのアルゴリズムも含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００３６】
例えば、核酸配列のための適切な整列は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、かつＧｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３によって標準化されたスコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの代表的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用新案で、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明に関連する同一性パーセントを確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、かつＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）によって流通された、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権を取られたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このセットのパッケージから、スコアリングテーブル（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップエクステンションペナルティー及び６のギャップ）に対してデフォルトパラメータを使用して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用することができる。生じたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出するための他の適切なプログラムは、一般に、当該技術において既知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、次のデフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを使用可能である：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；エクスペクト＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見ることができる：ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／。
【００３７】
プロモーター及び核酸配列
一実施形態において、本開示は、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３８】
別の実施形態において、本開示は、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸との少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列と本質的に同じ発現特徴を有する核酸配列を含む。さらなる実施形態において、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、かつ配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列と本質的に同じ発現特徴を有する核酸配列が提供される。
【００３９】
なおさらなる実施形態において、配列識別番号：１〜１０及び７７のヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換及び／または反転を含む、配列識別番号：１〜１０及び７７に提示される核酸から誘導されるヌクレオチド配列を有し、かつ配列識別番号：１〜１０及び７７の核酸と本質的に同じ発現特徴を有する核酸が提供される。
【００４０】
なおさらなる実施形態において、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列に対してハイブリッド化が可能であるヌクレオチド配列を有し、かつ配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列と本質的に同じ発現特徴を有する核酸が提供される。
【００４１】
本発明の一態様において、
ａ）配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列またはその部分配列；
ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換及び／または反転を含む、（ａ）に提示される核酸から誘導されるヌクレオチド配列を有し、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特徴を有する核酸；
ｃ）（ａ）の核酸との少なくとも７０％の同一性を有し、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特徴を有する核酸配列；ならびに
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列に対してハイブリッド化が可能であり、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特徴を有する核酸、
ｅ）核酸配列が２４５までのヌクレオチドを含む、配列識別番号：３、４、５、６、７、８または９を含む核酸配列
からなる群から選択される、コード及び／または遺伝子配列の発現を増強するためのプロモーターが提供される。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列に対してハイブリッド化が可能であり、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特徴を有する核酸に関する。「ハイブリッド化が可能」という用語は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸のいずれの部分も、別のＤＮＡ配列へのハイブリッド化が可能であり、（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特徴を有するいずれのＤＮＡ配列の検出及び単離が可能となる条件でのハイブリッド化を意味する。ハイブリッド化は厳密な条件下で実行され；条件が厳密であるほど、部分的に補足的な配列が分離する可能性が高く、すなわち、より高い厳密性がハイブリッド化の可能性を低下させる。実際に、「厳密な条件」という用語は、高温（例えば、６５℃）及び／または低塩濃度（例えば、０．１×ＳＳＣ）によるハイブリッド化条件を意味する。温度の増加及び／または塩濃度の減少によって、厳密性は低下する。厳密な条件下で、配列間に少なくとも７０％、または好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の同一性がある場合のみ、ハイブリッド化が生じるであろう。ハイブリッド化は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５ｔｈ  ｅｄ．Ｃａｎａｄａに提示されるように実行可能である。
【００４３】
好ましくは、本発明のプロモーター及び／または核酸は、２４５または２４２ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さを有する。また、本発明のプロモーター及び／または核酸は、２３２または２１５ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さを有する。より好ましくは、本発明のプロモーターは、２１２，２００ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さ、または１９５ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さ、または１８３ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さ、または１７０もしくは１６７ヌクレオチドまでであり、かつそれを含む長さを有する。一実施形態において、上記で提示される（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の核酸は、約５０〜２５０ヌクレオチド、約６０〜２２０ヌクレオチド、約７０〜２００ヌクレオチド、約８０〜１９０ヌクレオチド、または約９０〜１８０ヌクレオチドを含む。
【００４４】
あるいは、配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つにおいて定義される配列の部分配列であり得る、これらのプロモーターの誘導体を使用することは、本発明の範囲内である。「配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つによる配列の部分配列」という用語は、プロモーターとして、特に、ＦＰＶなどのオルソポックスウイルスにおける、またはＦＰＶなどのオルソポックスウイルス感染細胞においてプロモーターとしてなお活性である、配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つのより短いフラグメントを指す。
【００４５】
様々な実施形態において、配列識別番号：９の代表的な部分配列は、配列識別番号：２〜８から選択される。一態様において、配列識別番号：４または５は、配列識別番号：９の好ましい部分配列である。別の態様において、配列識別番号：８の部分配列としては、配列識別番号：２〜７が含まれ、配列識別番号：７の部分配列としては、配列識別番号：２〜６が含まれ、配列識別番号：６の部分配列としては、配列識別番号：２〜５が含まれ、配列識別番号：５の部分配列としては、配列識別番号：２−４が含まれ、配列識別番号：６の部分配列としては、配列識別番号：２〜５が含まれ、配列識別番号：５の部分配列としては、配列識別番号：２〜４が含まれ、配列識別番号：４の部分配列としては、配列識別番号：２〜３が含まれ、かつ配列識別番号：３の部分配列としては、配列識別番号：２が含まれる。
【００４６】
配列識別番号：１〜１０及び７７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその部分配列を含むか、またはそれからなるプロモーターの誘導体は、配列識別番号：１〜１０及び７７の配列のいずれか１つに対して、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失及び／または挿入を有する配列であることも可能である。本発明による誘導体は、プロモーターとして、特に、オルソポックスウイルス及び／またはアビポックスウイルスウイルス感染細胞におけるオルソポックスウイルス及び／またはアビポックスウイルスプロモーターとして、より好ましくは、アビポックスウイルス感染細胞におけるアビポックスウイルスプロモーターとして、なお活性である。本発明による誘導体において、欠失、置換及び挿入が、１つの配列において組み合わされていてもよい。
【００４７】
好ましくは、誘導体は、本明細書に記載の配列識別番号：１〜１０及び７７の配列のいずれか１つまたはその部分配列と比較した場合、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも６０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する。
【００４８】
ブラキウリタンパク質
本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載の種々のプロモーターの合成の結果として、発明者らは、１つまたはそれ以上の組換型ブラキウリタンパク質を生成したことを決定した。特に、１つまたはそれ以上の組換型ブラキウリタンパク質は、１つまたはそれ以上の本発明のプロモーターとブラキウリタンパク質との組合せの結果として生じる融合タンパク質である。１つまたはそれ以上の組換型ブラキウリタンパク質は、ワクチン、医薬または他の治療組成物の一部として有用となる可能性があることが予想される。
【００４９】
したがって、種々の態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の合成及び新規組換型ブラキウリタンパク質、及び／または組換型ブラキウリタンパク質をコード化する合成及び新規核酸を含む。
【００５０】
一実施形態において、ブラキウリタンパク質をコード化する核酸に対して少なくとも７０％の同一性を有し、上記ブラキウリタンパク質が、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の核酸配列が提供される。追加的な実施形態において、ブラキウリタンパク質をコード化する核酸に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、上記ブラキウリタンパク質が、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の核酸が提供される。
【００５１】
本発明の種々の他の実施形態において、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択される、１つまたはそれ以上のブラキウリタンパク質が提供される。さらなる実施形態において、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるペプチドとの少なくとも７０％の同一性を有する、１つまたはそれ以上のブラキウリタンパク質が提供される。なおさらなる実施形態において配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１、からなる群から選択されるペプチドとの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するペプチドが提供される。
【００５２】
別の実施形態において、ブラキウリタンパク質をコード化する１つまたはそれ以上の核酸配列であって、配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸配列が提供される。
【００５３】
他の実施形態において、配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸との少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸配列と本質的に同じ発現特徴を有する、１つまたはそれ以上の核酸配列が提供される。さらなる実施形態において、配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、かつ配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸配列と本質的に同じ発現特徴を有する、核酸配列が提供される。
【００５４】
好ましい実施形態において、配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の核酸配列が提供される。
【００５５】
発現カセット
さらなる実施形態によると、本発明は、本発明による１つまたはそれ以上のプロモーター及び／またはブラキウリ組換型タンパク質及び／または核酸を含む発現カセットに関する。
【００５６】
一実施形態において、配列識別番号：１〜１０からなる群から選択される核酸との少なくとも７０％の同一性を有するプロモーターと、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリペプチドをコード化する核酸とを含む発現カセットが提供される。別の実施形態において、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択されるプロモーターと、配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択されるブラキウリペプチドをコード化する核酸とを含む発現カセットが提供される。
【００５７】
好ましい実施形態において、配列識別番号：７２〜７６からなる群から選択される核酸配列との少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列を含む発現カセットが提供される。さらなる実施形態において、配列識別番号：７２〜７６からなる群から選択される核酸との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する核酸配列を含む発現カセットが提供される。
【００５８】
より好ましい実施形態において、配列識別番号：７２を含む発現カセットが提供される。
【００５９】
より好ましい実施形態において、配列識別番号：７３を含む発現カセットが提供される。
【００６０】
より好ましい実施形態において、配列識別番号：７４を含む発現カセットが提供される。
【００６１】
組換型ポックスウイルス
さらなる実施形態によれば、本発明による核酸、プロモーター、組換型タンパク質及び／または発現カセットは、ベクターの一部であり得る。「ベクター」という用語は、当業者に既知のいずれのベクターも意味する。ベクターは、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクターまたはｐＵＣ系のベクターであることができる。より好ましくは、ベクターは組換型ウイルスである。本発明に関して、「ウイルス」または「組換型ウイルス」という用語は、ウィルスゲノムを含む感染性ウイルスを意味する。この場合、本発明の核酸、プロモーター、組換型タンパク質及び／または発現カセットは、それぞれの組換型ウイルスのウィルスゲノムの一部である。組換型ウィルスゲノムはパッケージ化され、そして得られた組換型ウイルスは、細胞及び細胞系の感染のため、特に、ヒトを含む生体動物の感染のために使用することができる。本発明によって使用され得る典型的な組換型ウイルスは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）に基づくベクターである。ポックスウイルスベクターが最も好ましい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明による核酸、プロモーター、ポリペプチド及び発現カセットは、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターとして活性であるか、またはポックスウイルス感染細胞においてプロモーターとしてで活性である。ポックスウイルスは、好ましくは、アビポックスウイルスまたはオルソポックスウイルスである。より好ましくは、ポックスウイルスは、アビポックスウイルスである。
【００６３】
「アビポックスウイルス」という用語は、鶏痘ウイルス、カナリーポックスウイルス（Ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）、アンコポックスウイルス（Ｕｎｃｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ミナポックスウイルス（Ｍｙｎａｈｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ピジョンポックスウイルス（Ｐｉｇｅｏｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、プシタシンポックスウイルス（Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｐｏｘｖｉｒｕｓ）、クワイルポックスウイルス（Ｑｕａｉｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ピーコックポックスウイルス（Ｐｅａｃｏｃｋｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ペンギンポックスウイルス（Ｐｅｎｇｕｉｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スパローポックスウイルス（Ｓｐａｒｒｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スターリングポックスウイルス（Ｓｔａｒｌｉｎｇｐｏｘｖｉｒｕｓ）及びターキーポックスウイルス（Ｔｕｒｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）などのいずれのアビポックスウイルスも意味する。好ましいアビポックスウイルスは、カナリーポックスウイルス及び鶏痘ウイルスである。
【００６４】
カナリーポックスウイルスの例は、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株である。ＡＬＶＡＣと呼ばれるプラーク精製カナリーポックス株（米国特許第５，７６６，５９８号明細書）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受入料番号ＶＲ−２５４７で、ブダペスト条約の条件下でデポジットされた。別のカナリーポックス株は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手可能な、ＬＦ２  ＣＥＰ  ５２４  ２４  １０  ７５として指定される市販のカナリーポックスワクチン株である。
【００６５】
鷄痘ウイルスの例は、株ＦＰ−１、ＦＰ−５、ＴＲＯＶＡＣ（米国特許第５，７６６，５９８号明細書）及びＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（米国特許第７，４１０，６４４号明細書）である。ＦＰ−１は、１日齢ニワトリでワクチンとして使用されるように改質されたＤｕｖｅｔｔｅ株である。この株は、Ｏ  ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８０として指定される市販の鶏痘ウイルスワクチン株であって、そしてＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ＦＰ−５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ．１６５，ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．３０３２１から入手可能なニワトリ胚由来の市販の鶏痘ウイルスワクチン株である。
【００６６】
特定の実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸配列を含む。種々の追加的な実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：７２〜７６から選択される核酸配列を含む発現カセットを含む。より好ましい実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：７２、７３及び７４から選択される核酸配列を含む発現カセットを含む。
【００６７】
他の実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリ抗原をコード化する核酸を含む。さらなる実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリペプチドを含む。さらなる実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸を含む。最も好ましい実施形態において、組換型ＦＰＶは、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリペプチド及び／または配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸を含む。
【００６８】
本開示の種々の他の実施形態において、組換型ポックスウイルスは、限定されないが、ワクシニアウイルス、改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＢＮなどのオルソポックスウイルスである。
【００６９】
ワクシニアウイルス株の例は、Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｄａｉｒｅｎ、Ｇａｍ、ＭＲＩＶＰ、Ｐｅｒ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＴＢＫ、Ｔｏｍ、Ｂｅｒｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、ＢＩＥＭ、Ｂ−１５、Ｌｉｓｔｅｒ、ＥＭ−６３、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｉｋｅｄａ及びＷＲである。好ましいワクシニアウイルス（ＶＶ）株は、Ｗｙｅｔｈ（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許第７，４１０，６４４号明細書）である。別の好ましいＶＶ株は、ＭＶＡ（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．［１９９４］，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０）である。別の好ましいＶＶ株は、ＭＶＡ−ＢＮである。
【００７０】
本発明の実施において有用であり、かつブダペスト条約の必要条件に従ってデポジットされたＭＶＡウィルス株の例は、１９９４年１月２７日にデポジッション番号ＥＣＡＣＣ  ９４０１２７０７で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍにデポジットされた株、ＭＶＡ  ５７２及び２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ  ００１２０７０７でデポジットされたＭＶＡ  ５７５である。番号Ｖ０００８３００８でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で２０００年８月３０日にデポジットされたＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体は、追加的な代表的株である。
【００７１】
ＭＶＡ−ＢＮは、そのより高い安全性（複製可能性が低い）のため好ましいが、全てのＭＶＡは本発明に適切である。本発明の実施形態によれば、ＭＶＡ株は、ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に記載されている。
【００７２】
一実施形態において、本発明は、がん治療のための組換型オルソポックスウイルス、好ましくは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、Ｗｙｅｔｈ株、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮを含む。組換型オルソポックスウイルスは、オルソポックスウイルス中への異種配列の挿入によって生成される。
【００７３】
特定の実施形態において、ＭＶＡは、番号Ｖ０００８３００８でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）において２０００年８月３０日にデポジットされたＭＶＡ−ＢＮであり、かつ参照によって本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開ＷＯ２００２０４２４８０号（米国特許第６，７６１，８９３号明細書及び米国特許第６，９１３，７５２号明細書も参照）に記載されている。
【００７４】
特定の実施形態において、組換型ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体である。そのような「誘導体」は、デポジットされた株（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．Ｖ０００８３００８）と本質的に同じ複製特徴を示すが、そのゲノムの１つまたはそれ以上の部分における差異を示すウイルスを含む。デポジットされたウイルスと同じ「複製特徴」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞及び細胞系においてデポジットされた株と同様の増幅比で複製するウイルス、ＨｅＬａ、ＨａＣａｔ及び１４３Ｂ；ならびに生体内で、例えば、ＡＧＲ１２９遺伝子導入マウスモデルにおいて決定されるものと同様の複製特徴を示すウイルスである。
【００７５】
特定の実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：１〜１０及び７７からなる群から選択される核酸を含む。種々の追加的な実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：７２〜７６から選択される核酸配列を含む発現カセットを含む。より好ましい実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：７２、７３及び７４から選択される核酸配列を含む発現カセットを含む。
【００７６】
他の実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：１１、１３、１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリ抗原をコード化する核酸を含む。さらなる実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：１２、１４〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸を含む。より好ましい実施形態において、組換型オルソポックスウイルスは、配列識別番号：１８〜１９、２２〜２３、２６〜２７、３０〜３１、３４〜３５、３８〜３９、４２〜４３、４６〜４７、５０〜５１、５４〜５５、５８〜５９、６２〜６３、６６〜６７、７０及び７１からなる群から選択されるブラキウリペプチド及び／または配列識別番号：１６〜１７、２０〜２１、２４〜２５、２８〜２９、３２〜３３、３６〜３７、４０〜４１、４４〜４５、４８〜４９、５２〜５３、５６〜５７、６０〜６１、６４〜６５、６８及び６９からなる群から選択される核酸を含む。
【００７７】
本発明による発現カセットまたはプロモーターをウイルスゲノム中に、特に、ポックスウイルスのゲノム中に、最も好ましくは、オルソポックスウイルス及び／またはＦＰＶのゲノム中に挿入することができる方法は、当業者に既知である。例えば、本発明による発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体は、相同組換えによってポックスウイルスのゲノム中に挿入され得る。これを目標として、本発明による発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体が挿入されたポックスウイルスゲノムの領域に対して相同的であるヌクレオチドストレッチによって両側を挾まれた、本発明による発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体を含む核酸を、ＣＥＦまたはＢＨＫ細胞などの許容細胞系中に形質移入する。細胞は、ポックスウイルスによって感染され、そして感染細胞において、核酸及びウィルスゲノムの間で相同組換えが生じる。あるいは、最初に、ポックスウイルスで細胞を感染させ、次いで、感染細胞中に核酸を形質移入することも可能である。再び、細胞中で組換えが生じる。次いで、組換型ポックスウイルスは、従来技術で既知の方法によって選択される。組換型ポックスウイルスの構成は、この特定の方法に限定されない。その代わり、当業者に既知のいずれの適切な方法も、この目的のために使用されてよい。
【００７８】
本発明による発現カセットまたはプロモーターは、ウイルスまたはウィルスベクターのいずれかの適切な部分中に、特に、ウイルスゲノム中に導入されてよい。オルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスの場合、挿入は、ウィルスゲノムの非本質的部分中に、またはウィルスゲノムの遺伝子間領域中にされてよい。「遺伝子間領域」という用語は、好ましくは、コード配列を含まない２つの隣接遺伝子間に位置するウィルスゲノムのそれらの部分を意味する。ウイルスがオルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスである場合、挿入は、ウィルスゲノムの欠失部位にされてもよい。「欠失部位」という用語は、自然発生オルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルスのゲノムに対して欠失したウィルスゲノムのそれらの部分を意味する。しかしながら、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）などの少なくとも１つの細胞培養系において増幅及び増殖が可能である組換型を入手することが可能である限り、発現カセットがウイルスゲノム中のいずれにも挿入され得ることは本発明の範囲内であるため、挿入部位は、オルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスゲノムのこれらの好ましい挿入部位に制限されない。
【００７９】
本発明によるプロモーターは、すでにベクターの一部である遺伝子、例えば、オルソポックスウイルス及び／またはアビポックスウイルスのゲノムを発現するために使用されてもよい。そのような遺伝子は、ウィルスゲノムの天然由来部分であり得るか、またはすでにベクター中に挿入された外来遺伝子であり得る。これらの場合、本発明によるプロモーターは、ベクター中で遺伝子の上流に挿入され、その発現はプロモーターによって制御される。
【００８０】
ワクチン及び／または組成物
さらなる実施形態によると、本発明は、ワクチンまたは医薬剤としての本発明によるベクターに関する。より一般的に、本発明は、本発明による発現カセット、ＤＮＡまたはベクターを含むワクチンまたは医薬組成物に関する。ワクチンまたは医薬組成物を動物またはヒト体内に投与することができる方法は、当業者に既知である。ＤＮＡ及び組換型プラスミドベクターの場合、ＤＮＡ及びベクターは、注射によって単純に投与することができる。ワクチンまたは組成物が、オルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルス、特に、組換型ＭＶＡまたは組換型ＦＰＶなどの組換型ウイルスである場合、それは、当業者の知識に従って、例えば、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内または皮下投与によって、動物またはヒト体内に投与されてもよい。投与されたウイルスの量についてのさらなる詳細が以下に示される。
【００８１】
医薬組成物またはワクチンは、一般に、本発明によるプロモーター、発現カセットまたはベクターに加えて、１種またはそれ以上の薬学的に許容可能及び／または認可された担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤及び／または安定剤を含み得る。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、浸潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることが可能である。適切な担体は、典型的に、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などの大型の、代謝の遅い分子である。
【００８２】
医薬組成物またはワクチンの調製のために、本発明によるＤＮＡ、発現カセットまたはベクター、特に、組換型ＭＶＡまたは組換型ＦＰＶなどの組換型オルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルスは、生理学的に許容可能な形態に変換される。ＭＶＡ及びＦＰＶに関して、これは、種痘のために使用されるポックスウイルスワクチンの調製の経験に基づいて実行可能である（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されるとおり）。例えば、精製されたウイルスを、約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４で配合された５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの滴定量を用いて、−８０℃で貯蔵した。ワクチンショットの調製のために、例えば、本発明による組換型ウイルスの１０１〜１０９粒子を、アンプル中、好ましくはガラスアンプル中で、２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でフリーズドライさせる。代わりに、ワクチンショットは、配合物中のウイルスの段階的フリーズドライによって製造することができる。この配合物は、生体内投与に適切である、マンニトール、デキストラン、糖質、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンなどの追加的な添加剤、酸化防止剤または不活性ガスなどの他の添加剤、安定剤または組換型タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含有することができる。フリーズドライのために適切な配合物を含有する典型的なウイルスは、１０ｍＭ  トリス緩衝液、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌのデキストラン（ＭＷ３６０００〜４００００）、４５ｇ／ｌのスクロース、０．１０８ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物ｐＨ７．４を含む。次いで、ガラスアンプルを密封し、そして数カ月間、４℃から室温で貯蔵することができる。しかしながら、必要性がない限り、アンプルは好ましくは−２０℃未満の温度で貯蔵される。
【００８３】
ワクチン接種または治療のために、凍結乾燥物またはフリーズドライ生成物を０．１〜０．５ｍｌの水溶液、好ましくは、水、生理食塩水またはトリス緩衝液中に溶解して、全身的または局所的のいずれかで、すなわち、非経口的、筋肉内または他のいずれかの熟練の開業医に既知の投与経路によって投与することができる。投与モード、用量及び投与の数は周知の様式で同業者によって最適化されることができる。
【００８４】
１つまたはそれ以上の実施形態において、本発明は、さらに、本発明による核酸、プロモーター、組換型タンパク質及び／または発現カセットを標的細胞中に導入することを含む、治療の目的のためにヒト細胞などの標的細胞にコード配列を導入する方法に関する。代表的なヒト標的細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージ及び線維芽細胞、腫瘍細胞などの他の非ＡＰＣを含むことができる。
【００８５】
本発明は、さらに、本発明による組換型ウイルスによる宿主細胞の感染、それに続く、適切な条件下での感染宿主細胞の培養、さらに、上記宿主細胞によって産生されたペプチド及び／またはタンパク質及び／またはウイルスの単離及び／または濃縮を含む、ペプチド、タンパク質及び／またはウイルスを産生するための方法に関する。本発明によるウイルスを産生、すなわち、増幅することが意図される場合、細胞は、ウイルスが複製可能である細胞である必要がある。ポックスウイルス、特にＭＶＡに関して、適切な細胞はＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）またはＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞である。鶏痘ウイルスなどのアビポックスウイルスに関して、適切な細胞はＣＥＦまたはＣＥＤ（ニワトリ胚真皮）細胞を含む。本発明による組換型ウイルスによってコード化されたペプチド／タンパク質を産生することが意図される場合、細胞は、組換型ウイルスベクターによって感染可能であり、かつウイルスコード化タンパク質／ペプチドの発現を可能にするいずれの細胞であってもよい。
【００８６】
本発明は、さらに、本発明による発現カセット、核酸、プロモーター、組換型タンパク質及び／または発現カセットＤＮＡによる形質移入、それに続く、ポックスウイルスによる細胞の感染を含む、ペプチド、タンパク質及び／またはウイルスの産生方法に関する。感染宿主細胞は、適切な条件下で培養される。さらなるステップは、上記宿主細胞によって産生されたペプチド及び／またはタンパク質及び／またはウイルスの単離及び／または濃縮を含む。ポックスウイルスによって細胞を感染するステップは、細胞の形質移入のステップの前または後に実行されてよい。
【００８７】
本発明は、さらに、本発明による核酸、プロモーター、組換型タンパク質及び／または発現カセットを含む細胞に関する。特に、本発明は、本発明による組換型ウイルスによって感染した細胞に関する。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、本発明をさらに例証する。提供された実施例が、技術の適用性を限定するものとして決して解釈されないことを当業者は理解するであろう。
【００８９】
実施例１：組換型鶏痘ウイルスで感染させたヒトＤＣにおけるブラキウリの発現
ブラキウリタンパク質の発現を識別するために、２．５の感染多重度（ＭＯＩ）において、ヒト樹状細胞（ＤＣ）を陽性対照ウイルスである、ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭを含む組換型ＭＶＡで感染させた。ヒトＤＣを、本開示によるブラキウリ発現カセット及びＴＲＩＣＯＭを含む陰性対照非組換型鶏痘（ＦＰＶ−ＷＴ）または組換型鷄痘ウイルス株でも感染させた。（表１でより詳細に記載される）ＦＰＶ−ＷＴ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ及びＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａを含む、それぞれのＦＰＶ株を使用して、２０のＭＯＩでＤＣを感染させた。ＦＰＶブラキウリ発現は、ウサギモノクロナル反ブラキウリ抗体で実行されたウエスタンブロット分析によって検出された。ハウスキーピングタンパク質グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）も、負荷対照としてウエスタンブロット分析によって検出された。
【表１】
2018521651.tif 000002
【００９０】
結果を図１に示す。ブラキウリの発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ及びＦＰＶｍＢＮ３４５組換型ＦＰＶで検出されたが、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ組換型ＦＰＶを使用した場合、検出されなかった。ブラキウリ発現は、ＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭでも検出された。同様の試料負荷は、ＧＡＰＤＨ発現によっても実証された。
【００９１】
実施例２：組換型鶏痘ウイルスで感染させたヒトＤＣにおけるブラキウリの発現
ブラキウリタンパク質の発現−レベルを、異なるプロモーターを用いてブラキウリを発現する追加の組換型ＦＰＶ株の間でも比較した。ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭを含む陽性対照組換型ＭＶＡ及び陰性対照非組換型株ＭＶＡ−ＷＴによって、５のＭＯＩで感染させた。ヒトＤＣを、本開示によるブラキウリ発現カセット及びＴＲＩＣＯＭを含む組換型ＦＰＶ（例えば、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５４Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５５Ａ、表１を参照のこと）によっても感染させた。ヒトＤＣを、ワクシニアウイルス（ＶＶ）−４０ｋプロモーターまたはＰｒＳプロモーターのいずれかを有するブラキウリ発現カセットを含む組換型鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）によって、さらに感染させた。非組換型ＦＰＶ−ＷＴ株は、陰性対照として使用した。全てのＦＰＶは、４０のＭＯＩで使用された。ブラキウリ発現は、ウサギモノクロナル抗ブラキウリ抗体によって実行されたウエスタンブロット分析によって検出された。ＧＡＰＤＨも、負荷対照として検出された。
【００９２】
結果を図２に示す。ブラキウリの発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ及びＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ組換型ＦＰＶで検出されたが、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４４Ａ及びＦＰＶ−ｍＢＮ３５４Ａ組換型ＦＰＶを使用した場合、検出されなかった。より特に、ブラキウリを促進するＶＶ−４０ｋまたはＰｒＳプロモーターを有する組換型ＦＰＶ（すなわち、ＦＶＰ−ｍＢＮ２８１Ａ、ＦＶＰ−ｍＢＮ２４９Ｂ）に関して、ブラキウリの発現はより低レベルで検出された。陰性対照（非感染ＤＣ、ＭＶＡ−ＷＴまたはＦＰＶ−ＷＴ）では、ブラキウリ発現は検出されなかった。同様の試料負荷は、ＧＡＰＤＨ発現によっても実証された。
【００９３】
実施例２に示されるウエスタンブロットからのブラキウリ発現レベルは、細胞間で同等のレベルで発現されることが予想されるハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現に対して標準化された。ブラキウリ及びＧＡＰＤＨバンドのそれぞれの強度を測定し、そして同一試料内でのブラキウリ及びＧＡＰＤＨバンド間の比率を算出した。
【００９４】
結果を図３に示す。ＦＰＶ構成の間で、ＧＡＰＤＨと比較してブラキウリの最も高い発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５５Ａで感染させたＤＣにおいて検出された。中程度の相対的ブラキウリ発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａで感染させたＤＣにおいて検出された。最も低い相対的ブラキウリ発現は、ブラキウリを促進するＶＶ−４０ｋまたはＰｒＳプロモーターを有する組換型ＦＰＶ（すなわち、ＦＶＰ−ｍＢＮ２８１Ａ、ＦＶＰ−ｍＢＮ２４９Ｂ）から検出された。ブラキウリの最も高い相対的発現は、陽性対照ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭによる感染から観察され；陰性対照試料においては、ブラキウリ発現は検出されなかった。したがって、組換型ＦＰＶ菌株の間で、ブラキウリのより優れた発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３５５、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５またはＦＰＶ−ｍＢＮ３４４プロモーターからのブラキウリ発現を促進させるベクターによって誘導された。
【００９５】
実施例３：組換型鶏痘ウイルスで感染させたＣＭＭＴ細胞中のブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭの発現
ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現は、それぞれのタンパク質に対して特異的である蛍光標識抗体を使用するフローサイトメトリーによっても評価された。ＣＭＭＴ細胞（アカゲザル乳房腫瘍細胞系）を、ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭを含む陽性対照組換型ＭＶＡで、または本開示によるブラキウリ発現カセット及びＴＲＩＣＯＭを含む組換型ＦＰＶ（例えば、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３Ａ、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ）で、またはブラキウリを促進するＰｒＳプロモーターを有する組換型ＦＰＶ（ＦＶＰ−ｍＢＮ２４９Ｂ）で感染させた。細胞を１未満のＭＯＩで感染させ、非感染及び感染細胞の混合物を分析した。非感染ＣＭＭＴ細胞は、陰性対照として使用された。
【００９６】
ＦＡＣＳ試料は、ＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａで入手され、そしてＢＤ  ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）またはＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析された。
【００９７】
結果を図４に示す。ブラキウリ及び３種のＴＲＩＣＯＭタンパク質（ＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８）に関して検出されたシグナルの棒グラフをプロットし、そして陽性シグナルが検出されたところでゲートを描写した（黒線）。ＦＰＶ構成の間で、（ｘ軸に沿ってシグナルにおいて最も大きいシフトによって示される）ブラキウリの最も高い発現は、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａで感染させたＣＭＭＴ細胞で検出された。最も低いブラキウリ発現は、ブラキウリを促進するＰｒＳプロモーターを有する組換型ＦＰＶ（すなわち、ＦＶＰ−ｍＢＮ２８１Ａ、ＦＶＰ−ｍＢＮ２４９Ｂ）から検出された。ＴＲＩＣＯＭタンパク質の同様の発現レベルは、ＦＰＶ構成の間で検出された。ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現は、陽性対照ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭによる感染からも観察された。
【００９８】
感染細胞のブラキウリの発現レベルを定量化するために、蛍光強度（ＭＦＩ）中央値を、図４でゲートされたブラキウリ−陽性細胞に関して算出した。
【００９９】
結果を図５に示す。ＦＰＶ構成の間で、最も高いブラキウリＭＦＩは、ＦＰＶ−ｍＢＮ３４３ＡまたはＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａで感染させたＣＭＭＴ細胞で検出された。最も低いブラキウリＭＦＩは、ブラキウリを促進するＰｒＳプロモーターを有する組換型ＦＰＶ（ＦＶＰ−ｍＢＮ２４９Ｂ）から検出された。全ての試験された構成の最も高いブラキウリＭＦＩは、陽性対照ウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭで感染させた細胞であった。したがって、感染ＣＭＭＴ細胞におけるブラキウリの発現レベル中央値は、ＰｒＳプロモーターよりもＦＰＶ−ｍＢＮ３４５またはＦＰＶ−ｍＢＮ３４４プロモーターからのブラキウリ発現を促進させるベクターの方が高かった。
【０１００】
実施例４：ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ｂからのブラキウリの発現
最初に組換型ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ａ株を生成するために使用される薬剤選択カセットは、臨床開発に適切な組換型ベクターを生成するために除去された。これは、薬剤選択なしにニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上でウイルスを継代培養し、個々のクローンをプラーク精製して、そしてＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって選択カセットが不足するクローンを識別することによって達成された。これによって、Ｉ３＋１５ａａプロモーター及びＴＲＩＣＯＭによって促進されたブラキウリ発現カセットを含むが、薬剤選択カセットを含まないＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ｂの産生が得られた。
【０１０１】
ＦＰＶ−ｍＢＮ３４５Ｂからのブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現は、細胞の部分集合を感染させるために０．６２５のＭＯＩで、または全ての細胞を感染させるために４０のＭＯＩで、ＦＰＶ−ＢＮ３４５Ｂによってそれらを感染することによって、ＣＭＭＴ細胞において確認された。
【０１０２】
結果を図６に示す。ブラキウリ及び３種のＴＲＩＣＯＭタンパク質（ＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８）に関して検出されたシグナルの棒グラフをプロットした。赤線は、０．６２５のＭＯＩで感染させた試料に関するものであり、青線は、４０のＭＯＩで感染させた試料に関する。未感染細胞は陰性対照として使用された（黒線）。０．６２５のＭＯＩにおいて、ブラキウリ及び３種のＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現は、非感染細胞からより高いピークの右側にシフトしたピークとして検出された。４０のＭＯＩにおいて、ブラキウリ及びＴＲＩＣＯＭの発現は、全ての細胞において、非感染細胞の右側にシフトしたピークとして検出された。
【０１０３】
本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の明細及び実施の考察から、当業者に明白であろう。明細書及び実施例は代表としてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は、請求項によって示される。
【図１】
2018521651.tif 000003
【図２】
2018521651.tif 000004
【図３】
2018521651.tif 000005
【図４】
2018521651.tif 000006
【図５】
2018521651.tif 000007
【図６】
2018521651.tif 000008
【配列表】
2018521651000001.app
【国際調査報告】
2018521651.tif 000009
2018521651.tif 000010
2018521651.tif 000011
2018521651.tif 000012