(57)【要約】  標的化部分およびヒト抗原Ｒ（ＨｕＲ）の発現を阻害するｓｉＲＮＡの両方と結合されたＤＮＡデンドリマー、このＤＮＡデンドリマーを含む医薬組成物、ならびにこのＤＮＡデンドリマーを使用する治療および利用の方法。有用なｓｉＲＮＡ配列も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化部分およびｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマーであって、ＨｕＲの発現を阻害する、ＤＮＡデンドリマー。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項３】
前記標的化部分が葉酸、トランスフェリン、抗メソテリン抗体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項４】
前記標的化部分が葉酸であり、ｓｉＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である、請求項３に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項５】
請求項１または２によるＤＮＡデンドリマーおよび少なくとも１種類の医薬品として許容可能な添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記標的化部分が葉酸であり、ｓｉＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
注射または注入用に製剤化される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨｕＲを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、および／またはＨｕＲを過剰発現する腫瘍の成長を阻害するための方法であって、当該方法が標的化部分およびＨｕＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマーを含む組成物を腫瘍細胞または腫瘍に、腫瘍細胞増殖を阻害、腫瘍成長を阻害、および／または癌を治療するのに効果的な量で投与することを含む、方法。
【請求項９】
請求項２によるＤＮＡデンドリマーが投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的化部分が葉酸、トランスフェリン、抗メソテリン抗体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡデンドリマーがインビトロで投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡデンドリマーがインビボで投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡデンドリマーが卵巣癌を有する患者に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡデンドリマーが注射または注入によって投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
標的化部分およびｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマーであって、医薬品として使用するためにＨｕＲの発現を阻害する、上記ＤＮＡデンドリマー。
【請求項１６】
ＨｕＲを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、ＨｕＲを過剰発現する腫瘍の成長を阻害する、またはＨｕＲ過剰発現性癌を治療するのに使用するための、請求項１５に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１８】
前記標的化部分が葉酸、トランスフェリン、抗メソテリン抗体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載のＤＮＡデンドリマー。
【請求項１９】
前記標的化部分が葉酸であり、ｓｉＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である、請求項１８に記載のＤＮＡデンドリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の原理および実施形態は、全般的にはヒト抗原Ｒ（ＨｕＲまたはＥＬＡＶＬ1）の発現を阻害するｓｉＲＮＡの標的化ＤＮＡデンドリマー送達、およびＨｕＲ発現の阻害に有用な組成物に関する。
【０００２】
配列リストの相互参照
２０１６年４月１１日に作成され、「ＤＳＣ００５８−００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（２  ＫＢ）として識別される配列リストが本明細書に参照によって組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
ヒト抗原Ｒ（ＨｕＲまたはＥＬＡＶＬ1としても知られている）は、腫瘍細胞生存および薬剤耐性に関与する複数の遺伝子の発現を調節する転写後調節ＲＮＡ結合タンパク質である。そしてＥＬＡＶ1遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ安定性タンパク質である。これは卵巣癌に豊富で高機能的であり、乳癌、肺癌、中皮腫、および結腸癌でも高度に発現される。
【０００４】
特定の腫瘍細胞はその表面に葉酸に対する受容体を高レベルで発現する。これによって、葉酸−薬剤共役体は葉酸受容体に結合して、エンドサイトーシスによる細胞取り込みを引き起こすため、全身投与後にこのような腫瘍に薬剤を特異的に送達することができる。とりわけ、葉酸受容体を高レベルで発現する腫瘍は、卵巣癌、中皮腫、乳癌、結腸癌、および肺癌である。
【０００５】
ＤＮＡデンドリマーは部分的に二本鎖ＤＮＡモノマーサブユニットから構成される高度に分岐した分子であり、それぞれが各鎖の中央部分に位置する配列相補性の領域を共有するが、５’および３’端では非相補性である２つの一本鎖ＤＮＡ分子を含む。モノマーの一本鎖端は４つの「アーム」を形成し、別のモノマーの相補性アーム配列とのハイブリダイゼーションのために利用できる。そのため、ＤＮＡデンドリマーは異なる相補的な一本鎖アームのハイブリダイゼーションにより層状に形成される。利用可能な未ハイブリダイゼーションアームは、標的化部分、治療用物質、または検出可能な標識のような輸送物質の結合のために使用し得る。
【０００６】
ＤＮＡデンドリマーは、様々な輸送物質分子の細胞への標的化送達のために使用されており、診断用および治療用輸送物質が含まれる。ＤＮＡデンドリマーを生体活性部分および標的化部分の組み合わせと誘導体化させることができる特性によって、全身投与後に特定の細胞型に機能的な反応性物質を送達することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の特異的な産生の結果として、対応するｍＲＮＡが選択的に不活性化されることによって、標的遺伝子の発現が効果的に抑制される過程である。とりわけ、ＤＮＡデンドリマーと結合させることができる生体分子は、ＲＮＡを分解する細胞過程によってｄｓＲＮＡ誘発遺伝子抑制を促進する、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）のようなＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの遺伝子抑制メカニズムは、標的ｍＲＮＡの分解であり、これによって翻訳されるタンパク質の量を低下させる。ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを活性化して、標的ｍＲＮＡとの相補的結合の際に配列特異的にｍＲＮＡの分解を引き起こす二本鎖ＲＮＡであり、一般的には２１〜２３ヌクレオチド長である。
【０００７】
癌治療のための改善された組成物および方法が必要とされ続けており、癌細胞に有効な治療剤の改善された標的化送達が含まれる。本発明はこれらの必要性に向けられる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の１つの態様は、癌細胞による癌関連ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡ、および癌細胞上の細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と特異的に結合する部分（標的化部分）の両方と結合され、標的化部分との結合で細胞によって内部移行されるＤＮＡデンドリマーを含む組成物に関する。特定の実施形態では、標的化部分は非癌性細胞と比べて癌細胞で過剰発現される細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と、特異的に結合することができる。
【０００９】
本組成物の第一実施形態では、ＤＮＡデンドリマーと結合されるｓｉＲＮＡは、ＨｕＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡであることができる。このようなｓｉＲＮＡの具体的な非限定例には、３’オーバーハングを有する次の二本鎖ｓｉＲＮＡが含まれる。
マウス（ｍ）ＨｕＲ  ｓｉＲＮＡ−
５’−ＧＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＧｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
３’−ｄＴｄＴＣＧＧＡＣＡＡＧＵＣＧＵＣＧＵＡＡＣＣ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
および
ヒト（ｈ）ＨｕＲ  ｓｉＲＮＡ−
５’−ＧＣＧＵＵＵＡＵＣＣＧＧＵＵＵＧＡＣＡｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
３’−ａａＣＧＣＡＡＡＵＡＧＧＣＣＡＡＡＣＵＧＵ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において、上側の鎖はセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４における小文字「ａ」は、二本鎖ｓｉＲＮＡをダイサーによって各端に対称的な２塩基の３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡに処理することができる、切断端を３’で形成する修飾を示す。これらのオーバーハングは結果として、ＲＩＳＣによるアンチセンス鎖の好ましい利用をもたらす。
【００１０】
本組成物の第二実施形態では、ＤＮＡデンドリマーに結合された標的化部分は、葉酸（卵巣癌の９０％で過剰発現される葉酸受容体を標的にする）、トランスフェリン（多くのヒト癌で過剰発現されるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的にする）、および抗メソテリン抗体または抗体フラグメント（中皮腫ならびに多くの膵臓癌および卵巣癌で過剰発現されるメソテリンを標的にする）からなる群から選択することができる。さらに具体的な例では、ＤＮＡデンドリマーと結合される標的化部分は葉酸であり得る。
【００１１】
第三の具体的な実施形態では、ＤＮＡデンドリマーは葉酸、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択されるｓｉＲＮＡと結合され得る。具体的な例では、ＤＮＡデンドリマーは葉酸、およびｓｉＲＮＡであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と結合され得る。
【００１２】
前記組成物の実施形態は、具体的に説明されたものだけでなく、特定の利用に適した他の組み合わせで組み合わすことができると理解されるものである。すなわち、特定なタイプの癌細胞における１種類または複数の選択されたｍＲＮＡの発現の阻害に適切ないずれのｓｉＲＮＡも、本組成物を非癌性細胞と比べて癌細胞で過剰発現される細胞表面タンパク質、または受容体と結合することができる任意の標的化部分を有するデンドリマーＤＮＡと結合させることができる。
【００１３】
他の実施形態では、前記組成物のいずれもＤＮＡデンドリマー、ｓｉＲＮＡ、またはこの両方の安定性を改善するために、修飾および誘導体化され得る。具体的な非限定例には、本組成物の循環時間および効率を高めるための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、蛍光色素（フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体等）、ビオチンまたはビオチン誘導体、あるいはジゴキシゲニンの結合によるＤＮＡデンドリマーおよび／またはｓｉＲＮＡの修飾を含む。ｓｉＲＮＡを安定化させる修飾の具体的な非限定例には、アンチセンス鎖の５’端での１つまたは複数のヌクレオチドの２’−メトキシ修飾（Ｏ−メチル修飾ともいう）が含まれる。
【００１４】
別の実施形態では、前記組成物のいずれもｓｉＲＮＡに加えて治療分子をさらに含み得る。追加の治療分子は、標的化部分およびｓｉＲＮＡの結合のために本明細書で説明されている結合手段のいずれかによってＤＮＡデンドリマーに非共有結合または共有結合し得る。特定の実施形態では、追加治療分子は標的化部分またはｓｉＲＮＡのいずれかによって占有されていないＤＮＡデンドリマーのアームに結合させる。追加治療分子の具体的な非限定例には、核酸治療剤、抗体治療剤、および小分子治療剤が含まれる。具体的な非限定例では、追加治療分子は化学療法剤であり得る。さらに非限定例では、化学療法剤は、ＤＮＡキャリアの二本鎖部分に挿入されるドキソルビシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、またはボレロキシンのような癌化学療法剤であることができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、前記組成物を含む医薬製剤に関する。特定の実施形態では、標的化部分および細胞癌による癌関連ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡの両方と結合されたＤＮＡデンドリマーは、１種類または複数の医薬品として許容可能な添加剤とともに製剤化され得る。これらの実施形態のいずれの修飾でも、医薬製剤は注射または注入のような非経口投与用に適応され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、ＨｕＲを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するため、および／またはＨｕＲを過剰発現する腫瘍の成長を阻害するために、前記組成物を用いる方法に関する。特定な例では、腫瘍細胞増殖および／または腫瘍の成長の阻害には、ＨｕＲ過剰発現性癌を治療するための方法が含まれる。
【００１７】
このような方法の第一実施形態では、前記実施形態および例のいずれかによる組成物は、患者における腫瘍細胞増殖を阻害、腫瘍成長を阻害、および／または癌を治療するのに効果的な量で、インビトロで癌細胞またはインビボで癌患者に投与し得る。
【００１８】
本発明の第二実施形態では、前記実施形態および例のいずれかによる組成物は、腫瘍細胞増殖を阻害、腫瘍成長を阻害、および／または癌を治療するのに効果的な量で、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、または中皮腫を有する癌患者に投与し得る。具体的な例では、前記実施形態および例のいずれかによる組成物は卵巣癌を有する患者に、患者における卵巣腫瘍細胞の増殖を阻害、卵巣腫瘍成長を阻害、および／または卵巣癌を治療するのに効果的な量で投与され得る。さらに具体的な例では、投与される本組成物は葉酸、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択されるｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマーであり得、ここで本組成物は患者における卵巣腫瘍細胞の増殖を阻害、卵巣腫瘍成長を阻害、および／または卵巣癌を治療するのに効果的な量で投与され得る。さらに具体的な例では、ＤＮＡデンドリマーに結合される標的化部分は葉酸であり得、ＤＮＡデンドリマーに結合されるｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり得る。
【００１９】
他の実施形態では、本明細書で説明される組成物および医薬製剤を用いる方法のいずれも、癌関連ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡおよび標的化部分の両方と結合されたＤＮＡデンドリマーに加えて、治療剤の投与をさらに含み得る。具体的な非限定例では、ＤＮＡデンドリマーに結合するための前記追加治療剤のいずれも、追加治療剤として別々に投与することもできる。
【００２０】
医学的処置方法に関する前記開示は、医薬品としての使用および／または癌の治療における使用のために開示される本明細書におけるＤＮＡデンドリマー組成物および医薬製剤のいずれかを含むことが意図されている。特定の実施形態では、ＨｕＲを過剰発現する癌の治療に使用するためのＤＮＡデンドリマー組成物および医薬製剤が含まれる。他の実施形態では、卵巣癌の治療に使用するためのＤＮＡデンドリマー組成物および医薬製剤が含まれる。
【００２１】
前記方法の実施形態は、具体的に説明されるものだけでなく、本発明の範囲による他の適切な組み合わせで組み合わせられ得ると理解されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】卵巣癌細胞成長におけるｓｉＨｕＲによる治療の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は次の説明で示される構成またはプロセス段階の詳細に限定されないものと理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００２４】
本明細書全体を通して、「１つの実施形態」、「特定の実施形態」、「様々な実施形態」、「１つもしくは複数の実施形態」、または「実施形態」と言った場合、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれる実施形態と関連して説明される特定の特性、構造、物質、または特徴を意味する。そのため、本明細書の全体を通して様々な箇所における「１つもしくは複数の実施形態では」、「特定の実施形態では」、「様々な実施形態では」、「１つの実施形態では」、または「実施形態では」のような語句の出現は、本発明の同一実施形態を必ずしも意味していない。さらに、特定の特性、構造、物質、または特徴は、１つまたは複数の実施形態におけるいずれかの適切な方法で組み合わされ得る。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「ＤＮＡデンドリマーと結合された」およびその同等語は、共有または非共有結合によるＤＮＡデンドリマーのアームと非デンドリマー部分の結合を意味する。結合はＤＮＡデンドリマーのアームと非デンドリマー部分の間の化学結合の形成を含み得、あるいは結合は非デンドリマー部分と結合する核酸とデンドリマーアームの相補的核酸配列のハイブリダイゼーションによって生じ得る。このようなハイブリダイゼーション結合は非デンドリマー部分の配列とデンドリマーアームの配列の間で直接的であり得、あるいはデンドリマーアームと非デンドリマー部分に結合する配列の両方とハイブリダイゼーションされる捕捉配列が、両者の間でハイブリダイゼーション「ブリッジ」を形成する間接的なハイブリダイゼーションであり得る。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「発現の阻害」およびその同等語は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量の低下を意味する。ｍＲＮＡの低下は、転写量の低下またはｍＲＮＡの転写後破壊の増加に起因し得る。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、用語「癌関連ｍＲＮＡ」およびその同等語は、正常細胞と比べて癌細胞で増加するｍＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡの増加は正常細胞と比べて癌細胞における転写率の増加、遺伝子の増幅、または長いｍＲＮＡ半減期を生じるｍＲＮＡの転写後分解の低下に起因する可能性がある。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、用語「標的化部分」およびその同等語は、細胞または組織の表面上の相補的な分子を認識して結合する分子を意味する。標的化部分の非限定例には、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質およびペプチド、受容体、ならびに受容体に対するリガンドが含まれる。標的化部分に対する特異的結合パートナーは、標的化部分が他の結合パートナーとはほとんど結合しないことを意味する。いくつかの例では、標的化部分／受容体複合体、または標的化部分／特異的結合パートナー複合体は、細胞によって内部移行され得る。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍細胞増殖の阻害」、「腫瘍成長の阻害」およびこれらの同等語は、腫瘍の細胞分裂の全体的な速度を治療によって遅らせ（腫瘍におけるすべての細胞で細胞分裂の速度が遅くなることは必ずしも意味しない）、これによって時間経過に伴う腫瘍サイズの全体的な増加が、治療しない場合の腫瘍サイズの増加と比べて低下することを意味する。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「癌の治療」およびその同等語は、癌の増殖または拡散を阻害する、癌の症状を緩和する、および／または患者から癌をほとんど消失させることを意味する。
【００３１】
癌関連ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡおよび標的化部分の両方と結合されたＤＮＡデンドリマーを含む組成物は、本発明の１つの態様である。一般的に、標的化部分は癌細胞上の細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と特異的に結合して、ｓｉＲＮＡを標的とする癌細胞に送達する。いずれの細胞表面受容体または細胞表面タンパク質もＤＮＡデンドリマー組成物の標的化部分と結合するために利用し得る。標的化部分と結合した後に内部移行される細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と結合する標的化部分の使用は、細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに効果的であり、該細胞でより効果的に相補的ｍＲＮＡを低下させることができる。癌細胞上に過剰発現される細胞表面受容体および細胞表面タンパク質と結合する標的化部分の使用は、腫瘍細胞と比べて少ない量ではあるが細胞表面受容体または細胞表面タンパク質も発現し得る正常細胞と比べて、癌細胞における相補的ｍＲＮＡの分解におけるｓｉＲＮＡ作用の特異性増加をもたらすのに効果的である。
【００３２】
標的化部分は、標的化部分の化学的性質に応じていくつかの既知の化学反応のいずれかによって、ＤＮＡデンドリマーの利用可能なアームと結合することができる。例には、ジスルフィド架橋結合の形成、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル依存性縮合、二官能基架橋反応の利用、標的化部分とＤＮＡデンドリマーのアームの直接的または間接的ハイブリダイゼーション、または電荷−電荷相互作用を介して標的化部分をＤＮＡデンドリマーに架橋させるポリカチオン性化合物の利用が含まれる。これらの結合反応はＲＮＡに関してＷＯ２０１０／０１７５４４に記載されているが、他の適切な標的化部分に適用され得る。核酸標的化部分も米国特許番号８６８５８９９号に記載された架橋化オリゴヌクレオチドを用いた切断端連結によって、ＤＮＡデンドリマーと結合され得る。標的化部分とＤＮＡデンドリマーのハイブリダイゼーションに適した選択肢には、ＷＯ０２／３３１２５に記載されているように、ＤＮＡデンドリマーのアーム端で配列と相補的である標的化部分に核酸捕捉配列を付加することが含まれる。
【００３３】
ｓｉＲＮＡは一般的には、標的化部分とは別のＤＮＡデンドリマーのアームと結合される。ｓｉＲＮＡは、ジスルフィド架橋結合の形成、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル依存性縮合、二官能基架橋反応の利用、ｓｉＲＮＡとＤＮＡデンドリマーのアームの直接的または間接的ハイブリダイゼーション、または電荷−電荷相互作用を介してｓｉＲＮＡをＤＮＡデンドリマーに架橋させるポリカチオン性化合物の利用、によってＤＮＡデンドリマーの利用可能なアームに結合させることができる。これらの結合反応はＷＯ２０１０／０１７５４４に記載されている。ｓｉＲＮＡはまた、米国特許番号８６８５８９９号に記載される架橋化オリゴヌクレオチドを用いた切断端連結によってＤＮＡデンドリマーと結合させることができる。ｓｉＲＮＡとＤＮＡデンドリマーのハイブリダイゼーションに適した選択肢には、ＷＯ０２／３３１２５に記載されているように、ＤＮＡデンドリマーのアーム端で配列と相補的であるＲＮＡに捕捉配列を付加することが含まれる。
【００３４】
対象の細胞型上の細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と結合するいずれの標的化部分もＤＮＡデンドリマーと結合され得る。ＤＮＡデンドリマー組成物の抗癌治療での使用では、癌細胞上に特異的に発現される、あるいは癌細胞上に過剰発現される細胞表面受容体または細胞表面タンパク質と結合する標的化部分を選択することが一般的に望ましい。このような標的化部分の例には、従来技術の当業者によって知られている他の適切な標的化部分のなかで、葉酸、トランスフェリン、および抗メソテリン抗体が含まれる。
【００３５】
対象の癌細胞で発現される相補的な癌関連ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションして分解させるいずれのｓｉＲＮＡも、ＤＮＡデンドリマーと結合され得る。このようなｍＲＮＡの非限定例には、卵巣癌細胞で過剰発現されるＨｕＲが含まれる。ＨｕＲ  ｍＲＮＡと結合してその分解をもたらすいずれのｓｉＲＮＡも、ＤＮＡデンドリマー組成物における使用に適している。標的化部分とともにＤＮＡデンドリマーと結合され得る有用なｓｉＲＮＡの具体的な非限定例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる。さらなる非限定例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であるｓｉＲＮＡが、標的化部分としてＤＮＡデンドリマーに結合された葉酸を有するＤＮＡデンドリマーと結合され得る。
【００３６】
前記ＤＮＡデンドリマー組成物のいずれも、標的化部分およびｓｉＲＮＡのＤＮＡデンドリマーとの結合は、化学的共役体化によるＤＮＡデンドリマーのアームへの直接的結合、ならびにＤＮＡデンドリマーのアームと連結された捕捉オリゴヌクレオチドと、標的化部分および／またはｓｉＲＮＡと結合された相補的キャリアオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションからなる群から独立して選択され得る。
【００３７】
前記ＤＮＡデンドリマー組成物のいずれかの具体的な実施形態では、標的化部分および／またはｓｉＲＮＡは、ＤＮＡデンドリマーのアームと結合された捕捉オリゴヌクレオチドを介してＤＮＡデンドリマーと結合され得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、一般的にはＤＮＡデンドリマーアームの末端と結合される。一般的には、これはＤＮＡデンドリマーのアームの末端と連結されるが、末端とハイブリダイゼーションされて任意にこれと架橋、または後述する伸長オリゴヌクレオチドの利用によってアームと結合され得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、標的化部分および／またはｓｉＲＮＡと連結される相補的キャリアオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、所定量で存在する特異的な定められた配列を提供する。キャリアオリゴヌクレオチドは各成分によって占有されるＤＮＡデンドリマーアームが所望数となる所定の濃度で、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができるため、捕捉オリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡデンドリマーと結合される標的化部分およびｓｉＲＮＡの数を制御するための手段を提供する。相補的キャリアオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、標的化部分および／またはｓｉＲＮＡはワトソンクリック塩基対を通して、ＤＮＡデンドリマーのアームと結合される。
【００３８】
前記ＤＮＡデンドリマー組成物のいずれも、医薬品として許容可能な添加剤とともに医薬製剤として製剤化し得る。このような添加剤には、溶媒、分散剤、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、保存剤（例えば、パラベン、フェノール、チメロサール、ソルビン酸、クロロブタノール）、エマルション、アルコール（例えば、エタノール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール）、および等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム）からなる群から選択される１つまたは複数の成分が含まれる。
【００３９】
ＤＮＡデンドリマー組成物を含む医薬製剤は、従来技術で知られている特定の投与経路に適応することもできる。非限定例として、医薬製剤は注射または注入用の溶液、または経口投与用の錠剤として製剤化し得る。ＤＮＡデンドリマー組成物の溶液または分散液は、例えば水または生理食塩水で調製することができる。
【００４０】
ＤＮＡデンドリマー組成物を含む医薬製剤は患者における癌の治療に有用であり、腫瘍細胞増殖を阻害、および／または腫瘍成長を阻害する。腫瘍細胞増殖を阻害、および／または腫瘍増殖を阻害するための方法は、癌患者の治療のためにインビボで、あるいは研究または診断目的などのためにインビトロで適用され得る。一般的に、インビボで癌患者に投与される医薬製剤の量は、患者における腫瘍細胞増殖を阻害、腫瘍成長を阻害、および／または癌を治療するのに効果的な量である。効果的な量は投与される用量、投与期間、投与プロトコル、および投与経路の組み合わせに基づいている。当業者は、患者の体組成または治療に対する反応に基づく患者に合わせた投与量が医学的に必要または望まれ得ることを認識するものである。
【００４１】
患者における癌の治療方法は、非経口、腹腔内、静脈内、腫瘍内、または経口経路による対象者への投与を含み得る。特に投与の有用な経路には、注射、注入、または経口投与が含まれる。癌の治療に関して、投与の一般的な経路には、数週間にわたる連続的または断続的な静脈内投与が含まれ得、しばしば無投与期間ついで断続投与計画が少なくとも１回反復される。
【００４２】
実施例
ｓｉＲＮＡ安定性、機能性、および体内分布に関するインビトロアッセイ
【００４３】
ｓｉＨｕＲ安定性をＰＢＳ、血清フリー培地、および培地＋１０％血清で評価した。ｓｉＨｕＲの１０％ＴＢＵ  ＰＡＧＥは、センスおよびアンチセンス鎖がサンプルのいずれでも分解されなかったことを示した。
【００４４】
機能性の評価のため、葉酸、ｓｉＨｕＲ配列、および蛍光標識（Ｃｙ３）が様々な組み合わせで結合された２層ＤＮＡデンドリマーを調製した。ｓｉＲＮＡ安定性を、ｓｉＨｕＲ＋リポフェクタミン、葉酸と結合されたＤＮＡデンドリマー、および葉酸とｓｉＨｕＲの両方と結合されたＤＮＡデンドリマーによって細胞をトランスフェクションして試験した。コントロールは非トランスフェクション細胞およびリポフェクタミン単独だった。
【００４５】
ｓｉＨｕＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をリポフェクタミンまたは標的化ＤＮＡデンドリマーのいずれかと組み合わせて、１０％血清含有培地でＡ２７８０細胞（ヒト卵巣腫瘍細胞株）とともに一昼夜インキュベーションした。各例におけるＨｕＲ  ｍＲＮＡ発現を非トランスフェクション細胞（１００％ＨｕＲ発現）と比較した。結果を次の表に示す。
【表１】
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【００４６】
ＤＮＡデンドリマーと結合された葉酸を用いた卵巣癌細胞に対するｓｉＨｕＲの標的化は、ｓｉＨｕＲのみのトランスフェクションと比べてＨｕＲ  ｍＲＮＡノックダウンを有意に高めた。
【００４７】
ＣＹ３および葉酸と結合されたＤＮＡデンドリマーが全身投与された卵巣腫瘍を有するマウスにおける体内分布試験は、正常組織（脳、肝臓、脾臓、肺、心臓、および正常な卵巣）ではほとんどまたは全く蛍光を示さず、卵巣腫瘍において、非常に高い蛍光を示した。これらの結果は癌治療の特異性が、葉酸受容体を過剰発現する癌に対して、ＤＮＡデンドリマーと結合された標的化部分として葉酸を用いて達成される可能性があることを示唆する。
【００４８】
卵巣腫瘍成長の阻害に関するインビボ試験：卵巣腫瘍を有するマウスに、葉酸およびｓｉＨｕＲと結合されたＤＮＡデンドリマー、ｓｉＨｕＲと結合されたＤＮＡデンドリマー、ならびに葉酸および陰性コントロールｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマーとして、２μｇのｓｉＨｕＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を週に２回、腹腔内に注射した。コントロールは非誘導体化ＤＮＡデンドリマーおよび０．９％生理食塩水（無処理）だった。注射は４週間継続した。
【００４９】
モデル系はＩＤ８−Ｆｌｕｃネズミ卵巣癌細胞を腹腔内注射された雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスであり、治療群あたりマウス６匹だった。腫瘍は腹腔全体に発達した。注射後おおよそ４週に、腫瘍を有するマウスを光学的に画像化して、ＩＤ８−ｌｕｃ由来腫瘍負荷の指標であるベースラインの生物発光を確立し、ついで４種のＤＮＡデンドリマー製剤の１種または０．９％生理食塩水で週に２回、４週間処置した（ｎ＝５〜６／群）。４種のＤＮＡデンドリマー製剤は、１）葉酸およびｓｉＨｕＲと結合されたＤＮＡデンドリマー、２）ｓｉＨｕＲと結合されたＤＮＡデンドリマー、３）葉酸および陰性コントロールｓｉＲＮＡと結合されたＤＮＡデンドリマー、ならびに４）非誘導体化ＤＮＡデンドリマーだった。処置に対する腫瘍の反応を光学的画像化によって週に１回評価した。結果を図に示す。ベースライン腫瘍負荷を用いて比較して、腫瘍成長は葉酸およびｓｉＨｕＲに結合されたＤＮＡデンドリマーで処理したマウスでは４週間をとうして約３倍抑制された。これはｓｉＨｕＲに結合されたＤＮＡデンドリマー（ｐ＝０．１３）を含むすべての処置群で最大の抑制であり、葉酸および陰性コントロールｓｉＲＮＡに結合されたＤＮＡデンドリマー（ｐ＝０．２２）、非誘導体化ＤＮＡデンドリマー（ｐ＝０．１０）、または０．９％生理食塩水（ｐ＝０．１０）よりも十分優れていた。これらの結果は、葉酸およびｓｉＨｕＲと結合されたＤＮＡデンドリマーを用いた癌の処置で観察し得る増強された治療効果を裏付ける。
【００５０】
本明細書における発明は特定の実施形態を参考に説明されているが、これらの実施形態は発明の原理および応用の単なる説明であると理解されるべきである。様々な改善および変更が本発明の方法および装置に、本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施できることは従来技術の当業者には明らかである。従って、本発明は添付の請求の範囲内の改善および変更ならびにこれらの同等物を含むことが意図されている。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月30日(2017.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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