(57)【要約】  本発明の方法を用いて、光学顕微鏡で検査される試料媒質の波長依存性屈折率が決定される。光学顕微鏡を用いて、未知の屈折率を有する試料媒質における試料測定が実行されて、照明光が試料媒質に照射され、その試料媒質から来る検出光が検出される。試料測定を用いて、照明及び／又は検出光の試料測定焦点位置が測定される。照明及び／又は検出光の焦点位置が媒質の屈折率に依存して規定される数学的モデルを使用して、試料測定焦点位置から試料媒質の屈折率が規定される。さらに、この方法を実行する光学顕微鏡が記述される。
2018533014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡で検査される試料媒質（１２）の波長依存性屈折率（ｎ１）を決定する方法であって、
前記光学顕微鏡を使って、未知の屈折率（ｎ１）を有する前記試料媒質（１２）の試料測定を実行するステップであって、照明光（２２）が前記試料媒質（１２）に照射され、前記試料媒質（１２）から来る検出光が検出される、ステップと、
前記試料測定により前記照明及び／又は検出光の試料測定焦点位置（２５）を測定するステップと、
照明（２２）及び／又は検出光の焦点位置（Zmax、Xmax）が媒質の屈折率（ｎ１）に依存して規定される数学的モデルを使用して、前記試料測定焦点位置（２５）から前記試料媒質（１２）の屈折率（ｎ１）を導出するステップと、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記数学的モデルが、焦点位置（Zmax、Xmax）が屈折率（ｎ１）＋定数（Offset）から線形に依存する等式によって形成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光学顕微鏡を用いて少なくとも１回の校正測定を実行して、前記数学的モデルの少なくとも一つのパラメータ（ｃ、Offset）を決定するステップであって、前記校正測定においては、
既知の屈折率（ｎ１）を有する媒質が照明光（２２）で照射され、
既知の屈折率（ｎ１）を有する前記媒質から来る検出光が、少なくとも一つの顕微鏡イメージを得るために測定され、
前記照明（２２）及び／又は検出光の校正測定焦点位置（２７、２８）が前記少なくとも一つの顕微鏡イメージから決定され、
前記既知の屈折率（ｎ１）及び前記決定された校正測定焦点位置（２７、２８）に基づいて、前記数学的モデルの少なくとも一つのパラメータ（ｃ、Offset）が計算されること、
を特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２回の校正測定を実行し、前記校正測定がお互いに、
それぞれ既知の屈折率（ｎ１）を有する異なる媒質を使用する、
既知の様式でお互いに異なる形状を有する異なる試料容器（１０）を使用する、
前記校正測定焦点位置（２７、２８）に影響する異なる顕微鏡設定を使用する、
という様式の一つ又はそれ以上において相違していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２回の校正測定のために使用される前記異なる顕微鏡設定が、
前記顕微鏡設定は、それぞれ発せられる照明光（２２）の波長が異なる、
前記顕微鏡設定は、記録された検出光の波長が異なる、
前記顕微鏡設定は、照明光（２２）が前記媒質に照射されるときの開口数（ＮＡ）が異なる、
前記顕微鏡設定は、照明光（２２）が前記媒質に照射される照明方向が異なる、
前記顕微鏡設定は、検出光学系のズーム設定及びこれよりイメージフィールドサイズが異なる、
という様式の一つ又はそれ以上において相違していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各校正測定において、いくつかの顕微鏡イメージを記録するステップであって、前記いくつかの顕微鏡イメージについて、前記光学顕微鏡の検出光学系が異なる高さ平面をイメージングする、ステップと、
前記顕微鏡イメージの中から最大のシャープさを有する顕微鏡イメージを決定するステップと、
前記最大のシャープさを有する顕微鏡イメージの高さ平面を校正測定焦点位置（２７、２８）として使用するステップと、
を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記試料測定において、いくつかの顕微鏡イメージを記録するステップであって、前記いくつかの顕微鏡イメージについて、前記光学顕微鏡の検出光学系が異なる高さ平面をイメージングする、ステップと、
前記顕微鏡イメージの中から最大のシャープさを有する顕微鏡イメージを決定するステップと、
前記最大のシャープさを有する顕微鏡イメージの高さ平面を試料測定焦点位置（２５）として使用するステップと、
を特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１回の校正測定の間に、前記照明光（２２）を構造化照明光（２２）として、既知の屈折率（ｎ１）を有する媒質に照射するステップ、及び／又は、
前記試料測定の間に、前記照明光（２２）を構造化照明光（２２）として、試料媒質（１２）に照射するステップ、
を備えて、
照明光路（４１）が検出光路に交差し、前記構造化照明光（２２）の断面積が、前記構造化照明光（２２）の進行方向にて変化することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
照明光（２２）の照明光路（４１）が検出光の検出光路（６１）に交差し、
照明光（２２）が、既知の屈折率（ｎ１）を有する媒質及び／又は試料媒質（１２）にフォーカスされるように照射され、
前記校正測定の間に、前記少なくとも一つの顕微鏡イメージにおいて、前記照明光（２２）が最小の断面積を有する点を決定し、その位置を校正測定焦点位置（２７、２８）として使用し、
前記試料測定の間に少なくとも一つの試料イメージを記録し、そのイメージにおいて、前記照明光（２２）が最小の断面積を有する点を決定し、その位置を試料測定焦点位置（２５）として使用する、
ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２回の校正測定を実行し、
前記校正測定の一つについて、前記照明光（２２）の校正測定焦点位置（２８）が進行方向においてイメージフィールドの中心の正面にあり、
前記校正測定の他の一つについて、前記照明光（２２）の校正測定焦点位置（２７）が進行方向においてイメージフィールドの中心の後ろにあるように、前記２回の校正測定が、前記照明光（２２）の出射において、お互いに異なることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料媒質（１２）の決定された屈折率（ｎ１）を出力するか、又は、
前記試料媒質（１２）の決定された屈折率（ｎ１）に依存して、ユーザに、又は顕微鏡設定の自動又は非自動調整のための制御及び評価ユニットに、ある指令を出力する、
ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
照明光（２２）を検査対象の試料媒質（１２）の方向に発する照明光源（４０、５０）と、
前記試料媒質（１２）から来る検出光を測定するための対物レンズ（４４）及びカメラ装置（６０）と、
を備える光学顕微鏡であって、
前記光学顕微鏡が、照明及び／又は検出光の焦点位置（Zmax、Xmax）が媒質の屈折率（ｎ１）に依存して表現されるような数学的モデルが含まれる制御及び評価ユニットを備えており、
前記制御及び評価ユニットが、検査対象の試料媒質（１２）に対して且つ前記数学的モデルの助けを借りて、入力されるべき焦点位置（Zmax、Xmax）から前記試料媒質（１２）の屈折率（ｎ１）を決定するように構成されている、
ことを特徴とする、光学顕微鏡。
【請求項１３】
前記制御及び評価ユニットがさらに、
未知の屈折率（ｎ１）を有する試料媒質（１２）にて、試料測定を実行し、
前記試料測定によって、前記照明及び／検出光の試料測定焦点位置（２５）を決定し、
前記決定された試料測定焦点位置（２５）を入力されるべき焦点位置（Zmax、Xmax）として使用して、前記屈折率（ｎ１）を決定する、
ように構成されていることを特徴とする、請求項１２に記載の光学顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その第１の局面において、請求項１の前提部に従った光学顕微鏡を使って検査される試料媒質の波長依存性屈折率を決定するための方法に関する。
【０００２】
本開示において、「試料媒質」という用語は、検査対象の試料が後で添加される媒質、例えば液体を示し得る。しかし、「試料媒質」という用語はまた、試料が既に添加されている媒質も示し得る。
【０００３】
第２の局面において、本発明は請求項１２の前提部に従った光学顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００４】
一般に、異なる種類の光学顕微鏡の多くは試料を検査するために存在する。一般的に、試料媒質の内部にある試料が照明光で照射されて、試料から来る検出光が検出される。
【０００５】
これより、一般的な光学顕微鏡は、検査対象の試料媒質の方向に照明光を発する照明光源を備える。さらに、一般的な光学顕微鏡は、試料媒質から来る検出光を測定するための対物レンズ及びカメラ装置を備える。
【０００６】
試料媒質内の照明光及び検出光の伝搬は、実質的に試料媒質の屈折率に依存する。屈折率（refractive index）はまた、refractive number又はindex of refractionとも称される。屈折率はまた、波長依存性であり得る。通常は、光学顕微鏡は、ある一つの屈折率に対して又は屈折率の分布／範囲に対して構成されて、そこではまた、使用されるカバーガラスの屈折率も考慮される。光学顕微鏡はまた、波長依存性屈折率に対しても構成され得る。すなわち、光学顕微鏡の光学特性が、異なる波長の照明及び／又は検出光が共通の又は同様の光路を有するように、波長に依存して設計される。特に、アクロマティック又はアポクロマティック対物レンズが使用され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
光学顕微鏡が調整／構成されていないときの屈折率で試料媒質が使用されると、測定の質は負に影響される。例えば、イメージング時に収差又は色誤差が生じ得ると、シャープさが損なわれ得る。
【０００８】
これらの問題を避けるために、既知の波長依存性屈折率を有する特定の試料媒質が使用される。しかし、これは高コストを導き得る。さらに、屈折率は通常は、実際の試料がこの媒質に添加される前に、その試料媒質について所望の値に調整されるのみである。試料それ自身が屈折率にインパクトを有するかどうかは、典型的には考慮されない。
【０００９】
一般的に、試料媒質の屈折率を前もって決定することは可能である。しかし、これは、装置及びユーザに求められる時間に関して追加の労力を伴う。これより、実用的には、測定は非常にしばしば、試料媒質の屈折率が未知であって、最善の画質が達成されるはずの理想的な値から外れている光学顕微鏡を用いて実行される。
【００１０】
以下では、上記の問題が特に関連するケースが記述される。光学顕微鏡の重要なグループは、光シート蛍光顕微鏡である。これらの顕微鏡では、照明光路は検出光路に対して交差していて、通常は直交している。この目的のために、照明対物レンズは検出対物レンズに対して垂直である。あるいは、照明光路及び検出光路はまた、単一の対物レンズを通してお互いに交差していてもよい。照明光は、シート／平面としての試料媒質に向けられる。これは光シートと称される。検出光路は光シートに交差するか又は垂直である。照射される平面状のエリアにおいて、試料内の蛍光物質が励起される。この例では、検出対象の検出光は、これより蛍光であり得る。しばしば、水の屈折率すなわちn=1.33に近い屈折率ｎを有する水溶液が、試料媒質として使用される。試料の理想化された屈折率は、しばしば同じ様なオーダの大きさである。照明対物レンズ及び検出対物レンズは、通常はこの場合に対して調整され、シャープな試料イメージを作り出す。しかし、試料が、例えば深組織層における蛍光測定のために透明になるように化学的に処理／透明化されていると、問題が生じる。このために、屈折率ｎ及び屈折率の波長依存性ｎ(λ)、すなわち分散が、水の屈折率及び分散より強く外れ得る。これより、屈折率における飛躍を避けるために、通常は、試料の屈折率に調節されている屈折率を有する試料媒質が使用される。例えば、試料媒質は、使用される透明媒質に直接的に対応し得る。検出及び照明対物レンズは、これに光学的に調節される。しかし、波長依存性屈折率は、一般的には試料媒質のそれぞれの組成／配分に強く依存する。実験室における試料媒質の個別の製造において、波長依存性屈折率はまた、バッチ間で変動し得る。これは、照明及び検出光路の両方に負に影響する。いくつかの光学顕微鏡は、補正（Corr）リング又はその他の補正手段を備えていて、光学顕微鏡を試料媒質の他の屈折率に調整する。しかし、そのような手段は通常は、その時点で検査される試料媒質の屈折率が既知であるときのみ、有用に実行され得る。通常は、そうではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、それらを用いることで試料媒質の波長依存性屈折率を特に容易な方法で決定することができる光学顕微鏡及び方法を提供することである。
【００１２】
この目的は、請求項１の特徴を備える方法、及び請求項１２の特徴を備える光学顕微鏡を用いて達成される。
【００１３】
本発明の光学顕微鏡及び本発明の方法の有益な別形は従属請求項の主題であり、やはり以下の記述の中で説明される。
【００１４】
光学顕微鏡で検査される試料媒質の波長依存性屈折率を決定する本発明の方法は、
光学顕微鏡を使って、未知の屈折率を有する試料媒質にて試料測定を実行するステップであって、その試料測定に対して、照明光が試料媒質に照射され、試料媒質から来る検出光が検出され、検出光が特に試料媒質内の散乱及び／又は蛍光によって生成される、ステップと、
試料測定により照明及び／又は検出光の焦点位置（以下では試料測定焦点位置）を測定するステップと、
照明及び／又は検出光の焦点位置が媒質の屈折率に依存して記述される数学的モデルを使用して、試料測定焦点位置から試料媒質の屈折率を導出するステップと、
を包含する。
【００１５】
本発明によれば、上記で参照された種類の光学顕微鏡は、制御及び評価ユニットを備えている。この制御及び評価ユニットには、照明及び／又は検出光の焦点位置が媒質の屈折率に依存して表現されるような数学的モデルが含まれている。この制御及び評価ユニットは、検査対象の試料媒質に対して且つ数学的モデルの助けを借りて、入力されるべき焦点位置から試料媒質の屈折率を決定するように構成されている。
【００１６】
本発明の方法の主要なアイデアとして、最初に、照明及び／又は検出光の焦点位置が決定される。この試料測定焦点位置は、試料媒質の屈折率に依存する。さらに、この焦点位置は光学顕微鏡の特性に依存し、これらの特性は、例えば既知の試料媒質を用いた校正を通して、前もって決定されることができる。このようにして、試料測定焦点位置の知識は、試料媒質の屈折率を直接的に導出することを可能にする。
【００１７】
同様に、本発明の光学顕微鏡の制御及び評価ユニットは、
未知の屈折率を有する試料媒質にて、試料測定を実行し、
この試料測定によって、試料媒質における照明光及び／検出光の試料測定焦点位置を決定し、
決定された試料測定焦点位置を入力されるべき焦点位置として使用して、屈折率を決定する、
ように構成されている。
【００１８】
記述される方法はまた、既に試料を含んでいる試料媒質における測定のためにも、直接的に使用され得る。
【００１９】
重要な効果として、実際の試料試験が実行されるときに使われる光学顕微鏡は、これより、屈折率を決定又は導出するために使用され得る。別個の又は追加の測定ユニットは、これのために必要とされない。むしろ、本発明に従って、屈折率は試料エリアで直接的に決定される。
【００２０】
他の重要な効果は、試料媒質の屈折率が、光学顕微鏡で使われているときに決定され得ることに見られ得る。検査される媒質は、これより、実際の試料を含み得る。すなわち、測定は、試料がまだ試料媒質に添加されていない試料準備の間又はその前の時点に実行される必要はない。あるいは、試料媒質の屈折率はまた、試料が添加される前に決定されてもよい。特に、屈折率の決定のために、同じ試料容器が、その光学顕微鏡を使用した後の測定のために使用され得る。これは、試料容器それ自身が屈折にインパクトを有し得るので、有益である。「試料媒質の波長依存性屈折率」という表現は、これよりまた、試料媒質と試料容器との組み合わせの波長依存性屈折率としても理解され得る。
【００２１】
決定された試料媒質の屈折率はそれから、例えばスクリーン又はデータインターフェースを介して、ユーザに出力され得る。あるいは又は付加的に、試料媒質の決定された屈折率に依存して、顕微鏡設定を変更する動作に対するある指令もまた、ユーザに又は制御及び評価ユニットに対して出力され得る。屈折率に依存した動作に対するあり得る指令は、ストレジにセーブされ得る。動作に対する指令は、例えば、ズーム光学系の調整、照明対物レンズの調整、検出対物レンズの調整、その時点で使用される試料容器の交換、又は光学顕微鏡の光学要素の変更を示し得る。あるいは、制御及び評価ユニットはまた、それ自身によって又は自動的に、動作に対するこの指令を自動的に実行する様にも構成され得る。これらの動作によって、照明及び／又は検出光の光路が影響され得て、これにより、検査される試料媒質の屈折率の、その時点で使用されている構成要素とともにその光学顕微鏡が設計されている理想的な屈折率からのずれの影響を、少なくとも部分的に補正することが、特に可能になり得る。
【００２２】
原理的には、任意の適切な数学的モデルが、焦点位置から屈折率を導出するために使用され得る。例えば、数学的モデルは、焦点位置が屈折率＋定数に線形に依存する等式によって形成され得る。以下の例においてZmaxとも称される試料測定焦点位置はこれより、屈折率n1と「オフセット（offset）」とも称される定数とに依存し、Zmax＝c*n1+offsetとなる。ここで「c」及び「offset」は光学顕微鏡に依存する定数であり、例えばズーム設定又は使用される対物レンズの開口数に依存する。定数ｃ及びOffsetが既知ならば、その時点で使用される光の波長に対する屈折率n1は焦点位置Zmaxから計算され得る。
【００２３】
試料測定が他の波長で実行されると、これらの波長に対する屈折率は、再び同様の方法で計算されることができる。
【００２４】
一般に、さらなる表現が上述の等式に付加され得て、例えば屈折率に２乗で依存する表現が付加され得る。原理的には、このようにすることで、より正確な結果が可能になり得るが、光学顕微鏡に依存するさらなる定数が最初に決定されなければならない。決定されるべき値がほとんどないので、等式に従って校正測定焦点位置が定数「Offset」＋屈折率への線形依存性に等しければ、有益であり得る。等式のさらなる簡単化のためにOffsetは零とも設定され得るが、これは、屈折率の決定の正確さに負に影響する。
【００２５】
この数学的モデルの一つ又はそれ以上のパラメータ、例えば定数ｃ、あるいはOffsetも、校正測定を通して決定され得る。これらのパラメータはそれぞれの光学顕微鏡に依存し、特にその時点での光学顕微鏡の構成に依存する。
【００２６】
数学的モデルの少なくとも一つのパラメータを決定するための好適な実施形態では、少なくとも１回の校正測定が光学顕微鏡を用いて実行され、そこでは、
既知の屈折率を有する媒質が（未知の屈折率を有する試料媒質の代わりに）照明光で照射され、
既知の屈折率を有する媒質から来る検出光が、少なくとも一つの顕微鏡イメージを記録するために測定され、
その少なくとも一つの顕微鏡イメージを用いて、照明及び／又は検出光の校正測定焦点位置（すなわち校正測定で決定された照明光及び／又は検出光の焦点位置）が決定される。
【００２７】
既知の屈折率及び決定された校正測定焦点位置を使用することで、数学的モデルの少なくとも一つのパラメータをそれから計算することが可能になる。
【００２８】
一般に、各校正測定にて一つのパラメータが計算されることができる。例えば、上記で参照されたモデルZmax＝c*n1+offsetが使用されるならば、そのときには、Zmaxが１回の校正測定で測定又は決定されて、既知の屈折率n1を有する媒質がその校正測定で使用されているので、n1は既知である。定数Offsetもまた最初に既知であれば、例えばそれが顕微鏡製造業者によって提供されたり他の測定で決定されていたりすれば、そのときには、定数ｃをただ１回の校正測定で計算することが可能である。
【００２９】
定数ｃ及びOffsetを決定するために、２回（又はそれ以上）の校正測定を実施することも可能である。
【００３０】
少なくとも２回の校正測定が実行されるならば、これらの測定は、好ましくは以下の様式のうちの一つ又はそれ以上で異なる：
それぞれ既知の屈折率を有する異なる媒質を使用する、
既知の様式でお互いに異なる形状を有する異なる試料容器を使用する、
校正測定焦点位置に影響する異なる顕微鏡設定を使用する。
【００３１】
異なる校正測定は、校正測定間で異なる要因がどのようにして照明及び／又は検出光路に影響するかが既知であれば、意味を成す。この知識があれば、そのときには、既知の光学的な計算を用いて、使用されている数学的モデルのパラメータに対するこの要因の影響が決定され得る。例えば、異なる試料容器が異なる校正測定のために使用され得て、それらの異なる試料容器は、それらの形状が異なることによって光を異なって屈折するか又は光に異なる影響を与える。この影響を計算することが可能である。したがって、異なる試料容器を用いた２回の校正測定において、モデルのパラメータ、例えば定数ｃ及び／又はOffsetは異なり得る。しかし、１回の校正測定のパラメータから、他の校正測定のパラメータを導出することが可能である。異なる顕微鏡設定が使われても同じであって、それは以下にさらに詳細に説明される。
【００３２】
使用されている既知の屈折率を有する媒質が異なる校正測定の場合には、これはモデルのパラメータには何の影響も与えない。すなわち、上記の例では、定数ｃ及びOffsetには影響がない。むしろ、未知の屈折率を有する２つの媒質の２つの屈折率n1及びn2に対する焦点位置Zmax1及びZmax2が、２回の測定を通して決定され得る。そのときには、第１及び第２の校正測定に対して、
Zmax1＝c*n1+offset及びZmax2＝c*n2+offset
という等式を使用して、定数ｃ及びOffsetが計算され得る。
【００３３】
少なくとも２回の校正測定のために使用される異なる顕微鏡設定は、具体的には、以下の様式のうちの一つ又はそれ以上で異なり得る：
顕微鏡設定は、それぞれ発せられる照明光の波長が異なる、
顕微鏡設定は、記録された検出光の波長が異なる、
顕微鏡設定は、照明光が媒質に照射されるときの開口数（ＮＡ）が異なる、
顕微鏡設定は、照明光が媒質に照射される照明方向が異なる、
顕微鏡設定は、検出光学系のズーム設定及びこれより特にイメージフィールドサイズが異なる。
【００３４】
ふたたび、異なる顕微鏡設定に対して（例えば光学的計算技法を通してシミュレーション又は計算された）、この相違がどのようにして照明及び検出光路、及びこれよりこれらの測定の焦点位置に影響するかが既知であることが関係する。
【００３５】
一般に、「校正測定」という表現は、既知の屈折率を有する試料又は媒質の一つ又はそれ以上の顕微鏡イメージが記録されるというように理解され得る。記録されるべき顕微鏡イメージの数は、どの焦点位置が決定されるべきであるかに、特に依存し得る。
焦点位置は、照明光又は検出光の焦点を示し得る。
【００３６】
検出光の場合には、焦点位置は、利用されているカメラ装置にシャープにイメージングされるのはどの平面であるかを示す。この平面は検出光路に交差又は直交し、試料エリアに向かう検出光路の方向は、ｚ方向とも称される。焦点位置を決定するために、ここではいくつかの顕微鏡イメージが記録され得て、構造化媒質／構造化試料が異なるｚ位置に動かされる。対応する顕微鏡イメージが最高のシャープさを有するｚ位置が、焦点位置として使用される（上記で示された数学的モデルではZmax）。
【００３７】
しかし、一般に且つ上記で参照された等式では、表現Zmaxは、焦点位置が決定される方向を制限すると見られるべきではない。例えば、この方向はまた、照明光の進行方向にも決定され得て、これは検出方向と交差し得て、これよりｘ方向と記述され得る。この場合、焦点位置はXmaxとも称されて、Zmaxに対する記述は同様にXmasにもあてはまる。
【００３８】
媒質／試料の構成は、顕微鏡イメージに任意のコントラストが存在し且つシャープさがこれにより決定されることができるので重要である。したがって、一般に、任意の媒質は、明るさの変動を有する顕微鏡イメージをもたらす限りは、構造化媒質とみなされ得る。
【００３９】
上記のアイデアによれば、各校正測定においていくつかの顕微鏡イメージを記録することが好ましくあり得て、そこでは、光学顕微鏡の検出光学系、特に検出対物レンズが異なる高さ平面をイメージングする。異なる高さ平面のイメージを記録するために、特に、検出対物レンズ又は試料マウントが、高さ方向に可変され得る。それから、顕微鏡イメージの中から最大のシャープさを有する顕微鏡イメージが決定される。最大のシャープさを有する顕微鏡イメージに対応する高さ平面が、それから校正測定焦点位置として使用される。この方法は例えば、反射光配置（すなわち偏向されずに通過する照明光は測定されない）における通過光測定又は蛍光測定に対して適している。さらに、この方法は、構造化照明を使用するときに可能である。この場合、構造化照明が構造化試料の代わりに又は構造化媒質の代わりに使用され得て、これについてはさらに以下に、より詳細に記述される。
【００４０】
焦点位置の決定は、校正測定に対してと同様の方法で試料測定に対して実行され得る。試料測定ではいくつかの試料イメージが記録され得て、そこでは、光学顕微鏡の検出光学系が異なる高さ平面をイメージングする。それから、試料イメージの中から最大のシャープさを有する試料イメージが決定される。最大のシャープさを有する試料イメージに対応する高さ平面が、それから試料測定焦点位置として使用される。
【００４１】
焦点位置の決定はまた、構造化照明が使われて、それが検出光路に交差するように、特に直交するように、試料上に照射されるならば、容易な方法で可能である。これは、光シート顕微鏡又は光シート蛍光顕微鏡の場合に、特にそうである。試料エリアにおける構造化照明パターンの位置は、試料媒質の屈折率、又は校正測定で使用された媒質の屈折率に依存する。したがって、構造化照明パターンの位置もまた、屈折率の決定のために決定され且つ使用され得る。試料媒質それ自身はこれより、イメージコントラストを作り出す構造を備える必要はない。照明光が試料に明るさのコントラストを作り出せば十分である。構造化照明光は、この点に関して、一般的に試料エリア内部に焦点を有すると理解され得る。例えば、丸い断面を有する光ビームが使用され得て、それは照明光学系を通して試料エリア内のある領域にフォーカスされて、この領域は、とりわけｚ方向における位置によって特徴付けられ得る。（試料）媒質の屈折率に依存して、構成は、異なるｚ位置に対して異なってシャープにイメージングされる。異なるｚ位置に対して、構造の最大のシャープさを有するイメージを決定することによって、構造化試料に対するものと類似して、校正測定焦点位置を導出することが可能である。
【００４２】
さらに、（試料）媒質の屈折率に依存して、照明光の焦点の位置が影響される。検出方向は、記録された顕微鏡イメージから照明光の焦点の位置が決定されることができるように、照明方向に交差している。この場合、焦点位置はｚ位置ではなく、照明光の進行方向ｘにおける位置、すなわちｘ位置であり、ｘ及びｚ位置はお互いに交差又は直交している。また、より複雑な構造化光源、例えばグリッド状の照明も、ここでは使用され得る。
【００４３】
これらのことを考慮すると、少なくとも１回の校正測定において、照明光を構造化照明光として既知の屈折率を有する媒質に照射し、及び／又は、照明光を構造化照明光として試料測定にて試料媒質に照射することが、好ましくあり得る。照明光路は、ここでは検出光路に交差し、構造化照明光の断面は、構造化照明光の進行方向で変わる。構造化照明光が最小の断面を有する位置が、焦点位置として使用される。
【００４４】
好適な実施形態では、構造化照明光は、フォーカスされた光ビームである。照明光の照明光路はこれより、検出光の検出光路に交差し得る。照明光は、既知の屈折率を有する媒質に、及び／又は、試料媒質に、フォーカスされ得る。校正測定では、少なくとも一つの顕微鏡イメージにおいて、照明光が最小の断面を有する位置が決定され、この位置が校正測定焦点位置として使用され、且つ／又は、試料測定において、少なくとも一つの試料イメージが記録され、このイメージにおいて、照明光が最小の断面を有する位置が決定され、この位置が試料測定焦点位置として使用される。
【００４５】
少なくとも２回の校正測定が実行されるなら、これらの校正測定はお互いに、少なくとも照明光の出射において、以下の様式で異なり得る：
校正測定の一方について、照明光の校正測定焦点位置が進行方向においてイメージフィールドの中心の正面にあり、
校正測定の他方について、照明光の焦点が進行方向においてイメージフィールドの中心の後ろにある。
【００４６】
このようにして、校正測定は、ここで決定されるパラメータが、試料測定で決定されている焦点位置から屈折率を導出するために適する様に、可能な焦点位置のかなり大きな範囲をカバーする。上記で参照されたイメージフィールドの中心は、検出光学系及びカメラ装置を用いて記録されるイメージの中心点とみなされ得る。
【００４７】
以下では、この文にて使用されるいくつかの表現が、よりよい明瞭さのために説明される。
【００４８】
波長依存性屈折率は、屈折率が、異なる波長に対して異なる数値を有し得ることと理解され得る。
【００４９】
試料測定は試料媒質の検査を示す。それに対して校正測定は、他の媒質の検査を示す。この媒質は、その屈折率（及び屈折率の波長依存性）が最初から／先に既知であるという点で、試料媒質とは区別される。試料測定及び校正測定は各々、いくつかのイメージ記録を包含し得て、それらの間に、例えば試料位置、あるいは照明又は検出設定が可変される。試料エリアにおける（すなわち試料媒質内又はその近く、あるいは既知の屈折率を有する媒質内又はその近くにおける）照明光の又は検出光の焦点位置が試料測定又は校正測定から決定されることができることは、原理的には関連事項に過ぎない。
【００５０】
検出光は、試料から来る光であると理解され得る。検出光は例えば、試料にて散乱、反射、又は回折された照明光であり得る。あるいは、検出光はまた、蛍光又は燐光の光であり得るか又はそれらを含み得る。蛍光物質、例えばいわゆるビーズ（蛍光球体）又はいわゆる起点（定着マーカー）が、蛍光を用いた焦点の決定を実行することを可能にするように、試料媒質に添加され得る。
【００５１】
上述の数学的モデルは一般的に、ここで検査される媒質／試料媒質の屈折率に対する焦点位置の依存性を表現する。モデルはこれより、少なくとも焦点位置及び屈折率を変数として備える等式を備える。校正測定が実行されると、同じ等式がモデルとして使用され得て、それによって等式の定数の値が決定され得る。その値がそれから、試料測定のために使用される。
【００５２】
「試料」及び「試料媒質」という表現は同義であり得る。あるいは、「試料媒質」という表現は、試料が後で添加される媒質を示し得る。後者の別形の使い方は、試料それ自身が焦点の位置に影響することなく（この場合、これは分析を難しくする）、試料媒質内での構造化照明光の伝搬及び焦点位置を容易に決定するために、有益である。
【００５３】
一つの対物レンズは、照明光を試料に向けること及び試料から来る検出光を向けることの両方のために作用し得る。顕微鏡検査の方法に依存して、２つ又はそれ以上の異なる対物レンズが照明光及び検出光のために使用され得て、それらは本開示ではまた、照明対物レンズ及び検出対物レンズとも称され得る。この場合には、一つの対物レンズはまた、照明対物レンズ又は検出対物レンズのいずれかであるとも理解され得る。
【００５４】
カメラ装置は、空間的に分解されたイメージを記録する様に構成された任意の手段／ユニットであり得る。これよりカメラ装置は、例えば一つ又はそれ以上の１Ｄ又は２ＤのＣＣＤ又はＣＭＯＳチップを備え得る。
【００５５】
光学顕微鏡の制御及び評価ユニットは、原理的には任意の種類の計算手段であり得る。これは、光学顕微鏡スタンドに一体化されるか又はそこに存在し得て、あるいはまた、そこから距離を置いて、例えばネットワーク手段を通して接続されたパーソナルコンピュータ又はコンピュータに、配置され得る。制御及び評価ユニットは特に、ここで方法の別形として記述される本発明の実施形態を実行する様に構成され得る。
【００５６】
したがって、追加の装置特徴として記述される本発明の特徴はまた、本発明の方法の別形とみなされ得て、且つその逆も成立する。
【発明の効果】
【００５７】
本発明のさらなる効果及び特徴は、添付の図面を参照して以下に記述される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の光学顕微鏡の第１の例示的な実施形態を示す図である。
【図２】本発明の光学顕微鏡の第２の例示的な実施形態を示す図である。
【図３】校正測定を説明するために、照明光路の模式的な描写とともに図１の詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
同様の且つ同様に機能する構成要素は、一般に図面で同じ参照符号で示される。
【００６０】
本発明の光学顕微鏡１００の第１の例示的な実施形態が、模式的に図１に示される。
【００６１】
この例では、光学顕微鏡１００は、光シート顕微鏡検査のために構成される。この場合、それに沿って照明光２２が試料エリアに到達する照明光路は、それにそって試料エリアからの検出光が検出される検出光路に交差している。
【００６２】
光学顕微鏡１００はこれより、照明対物レンズ２０と、照明対物レンズ２０とは異なる検出対物レンズ３０と、を備える。
【００６３】
検査対象の試料媒質は、試料チャンバ１０に置かれている。一例として、検出対物レンズ３０は、試料チャンバ１０の試料媒質に浸されて示されている。
【００６４】
照明光源（ここでは示されていない）の照明光２２は、照明対物レンズ２０を介して試料媒質に照射される。試料媒質における照明光２２の進行方向は、ｘ方向として示されている。それに交差又は直交して、検出光が、ここには示されていないカメラ装置まで、ある方向に向けられ、この方向はｚ方向と示されている。検出光は特に、散乱された照明光又は蛍光であり得る。
【００６５】
照明光２２は、試料媒質の界面で試料媒質の屈折率に依存して屈折される。これは、試料チャンバ１０の端で、照明対物レンズ２０から距離d0にて示されている。照明対物レンズ２０は、試料媒質内に照明光２２の焦点を作り出す。この焦点位置は、試料チャンバ１０の端から距離d1だけ離れており、参照符号２５で示されている。焦点位置２５は、試料媒質の屈折率n1に依存する。
【００６６】
照明光２２をフォーカスすること、すなわち照明光２２の断面を減らすことは、図１に示されるようにｚ方向だけではなく、ｙ方向でも、すなわち紙面に垂直な方向でも、実行される。ｙ方向は、ｘ及びｙ方向に延在している顕微鏡イメージが記録されることができるように、検出光路に直交している。照明光２２の焦点位置２５として、照明光２２のｙ延長が最小になるｘ方向における位置が、それから決定され得る。
【００６７】
照明光２２は、この例では丸い又は円形の断面を有し得る。しかし、パターンの他の形状も、焦点が決定されることができる限りは可能である。
【００６８】
光シート顕微鏡検査のためにシリンドリカルレンズが使用され得て、これによって照明光がｚ方向のみにフォーカスされる。しかし、ｙ方向では照明光は延在して、光シート又は薄い照明された層を、試料媒質に形成する。焦点位置の決定が可能になるために、そのような場合には、照明光２２がｙ方向にもフォーカスされるように、シリンドリカルレンズは試料測定に対しては取り外し又は交換され得る。
【００６９】
ここで焦点のｘ位置は材質の屈折率についての情報を含む。屈折率n1の焦点位置２５が（試料）媒質に依存する数学的モデルが使われる。現在の例では、焦点位置２５はｘ位置であり、これよりXmaxとも称され得る。
【００７０】
一例として、以下の等式が数学的モデルとして使用される：
Xmax＝c*n1+Offset
ここで、ｃは屈折率n1に乗算される定数であり、Offsetは加算される定数である。
【００７１】
一例として、定数ｃが、以下の等式を介してスネルの法則の助けを借りて、図１の構成に対して描かれ得る：
d1＝[(r0−NA d0)／NA]n1＝c n1
ここで、d1は試料容器の端から焦点位置２５までの距離を示し、d0は照明対物レンズ２０から試料容器の端までの距離を示す。屈折率n0は距離d0に対してあてはまり、上記の等式では、空気に対してn0＝１であると選ばれる。ＮＡは照明開口数であり、照明対物レンズ２０を出た時の照明光２２の半径である。
【００７２】
上記で参照された等式における定数Offsetは特に、カメラ装置に対するイメージフィールドの位置に依存し得る。
【００７３】
２つの定数ｃ及びOffsetは、さらに以下により詳細に記述されるように、最初に既知であってもよく、且つ／又は、校正測定を通して決定されてもよい。
【００７４】
屈折率n1の知識は、特に高い質でのイメージ記録のために重要である。特に、屈折率が波長依存性であるならば、屈折率の決定は、その時点で使用されている照明光又は検出光の波長に対して有益である。
【００７５】
図１を参照して、焦点位置の決定が、光シート顕微鏡検査に対して適している光学顕微鏡について記述されてきた。しかし、焦点位置はまた、異なって設計された光学顕微鏡にても使用され得る。例えば、図２は、反射光測定及び／又は通過光測定に対して適した光学顕微鏡１００を示す。
【００７６】
光学顕微鏡１００は、通過光測定のための照明光源４０と、反射光測定のための照明光源５０と、を備える。照明光源４０の照明光は、オプションとして提供されるフィルタ４２を介して、照明光路４１に沿って試料媒質１２に向けられる。試料を通過した照明光は検出光と称されるが、検出光路６１に沿って検出対物レンズ４４及びオプションのフィルタ６２を通ってカメラ装置６０に向けられる。
【００７７】
対照的に、照明光源５０の照明光は、反射光配置で試料媒質１２に向けられる。このために、照明光は、オプションのビームスプリッタ４５を介して、検出光と共通である光路に向けられ、このようにして、対物レンズ４４を通って試料媒質１２に向けられる。試料媒質１２はそれから、例えば蛍光を検出光として発し得る。検出光はそれから、対物レンズ４４を通ってカメラ装置６０に導かれる。対物レンズ４４はここでは、検出対物レンズとして、且つまた照明対物レンズとしても、機能する。
【００７８】
試料媒質１２は、この場合には、構造化試料を備える。構造化試料は、試料媒質１２が、その断面に渡って照明光に対して均一に作用しないというように理解され得る。このようにして、カメラ装置６０で記録されたイメージはコントラストを備えており、イメージのシャープさを決定することを可能にする。
【００７９】
試料の異なる高さ平面のイメージを連続して記録することが、今は可能である。高さ平面は、検出光の方向にお互いにオフセットしている層／平面として理解される。異なる高さ平面を記録するために、例えば試料が移動され得て、あるいは、連続して異なる高さ平面がシャープにカメラ装置上にイメージングされるように、照明光路又は検出光路が可変され得る（すなわち、連続して異なる高さ平面が、カメラ装置が置かれているイメージ平面に光学的に重畳される）。
【００８０】
このようにして記録されたイメージから、ここで焦点位置が決定されることができる。例えば、最大のシャープさを有するイメージが、記録されたイメージから選ばれ得る。このイメージに対応している高さ平面が、焦点位置とみなされる。
【００８１】
図１の例示的な実施形態を参照して既に記述されたように、試料媒質の屈折率n1が、ここで焦点位置から導出され得る。このために上述の等式が使用され得て、焦点位置は図２の実施形態におけるｚ位置であり、これよりZmaxと称される：
Zmax1＝c*n1+Offset
測定配置に依存して、決定された屈折率n1は照明又は検出光の波長を示し得る。図２の実施形態が蛍光測定のためであれば、検出光の焦点が決定される。屈折率n1は、この場合には検出光を示す。対照的に図１の実施形態では照明光の焦点位置が決定され、これより、決定される屈折率n1は照明光を示す。通過光測定では、照明光及び検出光は、上記の相違がなくなるように同じ波長を有し得る。
【００８２】
図２の実施形態では、構造化試料が、記録されるイメージのシャープさを決定するために使用される。あるいは、構造化照明もまた使用され得る。一例として、構造化照明は、図１を参照して説明されたように、ｘ方向に、すなわち検出光路に交差又は直交して伝搬するフォーカスされた照明光によって形成され得る。構造化試料を参照して記述されたように、この照明光ビームもまた、ここではｚ方向に変位され得て、あるいは、検出光路がいくつかの高さ平面を連続して測定する様に調整される。異なる高さ平面は、照明光路に対してであると理解される。このようにして高さ平面が決定されることができて、そこに照明光ビームがフォーカスされる。すなわち、ｚ位置は、照明光ビームがｙ方向に最小の延長を有する位置として決定される。この焦点位置に基づいて試料媒質の屈折率が、上記のように決定されることができる。
【００８３】
以下では校正測定が記述される。校正測定により等式のパラメータが決定されることができ、そのパラメータが、測定された焦点位置から屈折率を導出するために使用される。上記で参照された例示的な等式では、これらのパラメータは定数ｃ及びOffsetである。
【００８４】
校正測定は、既知の屈折率n1を有する媒質の一つ又はそれ以上の顕微鏡イメージが記録される点で、試料測定から異なっている。焦点位置Zmax又はXmaxがそれから、顕微鏡イメージから決定される。そのときにはパラメータｃ及びOffsetのみが未知であり、決定される必要がある。これら２つのパラメータは、例えば、２回の校正測定によって決定され得る。あるいはまた、これらのパラメータの一つが校正測定で決定され、他のパラメータが他の方法で（特に光学顕微鏡を使わずに）決定されてもよい。
【００８５】
図１の設定に対する校正測定が、以下に図３を参照して記述される。この図は、図１を参照して記述されたように、ｙ方向にフォーカスされて試料エリアを通って照射される照明光２２を、再び示している。検出対物レンズ３０は再びそれに垂直に、すなわちｚ方向に測定する。
【００８６】
図３は、試料エリアに且つ既知の屈折率を有する媒質を通って照射される照明光２２の異なる４つのケースａ）〜ｄ）を示している。
【００８７】
理想的には、照明光の焦点位置２５、Xmaxは、イメージフィールドの中心x1にあるべきである。なぜなら、検出光路の光学要素は、通常はこれのために設計されているからである。そのような理想的なケースａ）が、図３に模式的に示されている。
【００８８】
ケースａ）〜ｄ）で、描かれた光ビーム２２の可変の厚さが特にｙ厚さであることが、考慮に入れられなければならない。光ビーム２２のｙ延長が、検出対物レンズ３０を介して決定される。
【００８９】
試料媒質では、焦点位置は、試料媒質の屈折率に依存して、イメージフィールドの中心から変位する。一例として、これはケースｂ）に示されており、そこでは焦点位置２６はx1から離れた位置x2にある。
【００９０】
ケースｃ）及びｄ）は２回の異なる校正測定を示している。これらの測定はお互いに、例えば照明光の波長に関して異なり得る。校正測定のために試料エリアに配置される試料は、波長依存性の既知の屈折率を有し得る。このため、２つの焦点位置２７及び２８は、ケースｃ）及びｄ）でお互いに異なる。２つの焦点位置２７及び２８は各々、それぞれの屈折率n1に属する値Xmaxに対応する。上述の等式Xmax＝c*n1+Offsetを使用して、２つの定数ｃ及びOffsetがここで決定される。異なる波長の照明光の代わりに、校正測定は例えば、異なる照明方向又は異なる照明ズーム設定において異なっていてもよい。これもまた定数ｃ及び／又はOffsetを変えるが、しかし、この変化は計算されることができて、この場合にもまた、２つの未知のパラメータｃ及びOffsetが、ある照明方向又は照明ズーム設定に対して、２つの校正測定を使用して決定されることができる。
【００９１】
それから、未知の屈折率を有する試料媒質が試料エリアに置かれ得る。焦点位置の決定を用いて、及び使用されている数学的モデルの既知の定数を用いて（特に校正測定を通して既知である）、試料媒質の屈折率が相違に決定されることができる。それから、試料が試料媒質に置かれ得る。あるいは、試料が既に、焦点位置の決定の前に試料媒質に加えられていてもよい。
【００９２】
試料媒質の屈折率が分かると、続く検査が有益に調整され得て、これによりイメージ記録の質が増す。例えば、照明光学系が動かされ得て、あるいは、対物レンズが横方向にシフトされ得る。
【図１】
2018533014.tif 000003
【図２】
2018533014.tif 000004
【図３】
2018533014.tif 000005
【国際調査報告】
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