(57)【要約】  本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマー配列ＢＣ１、ＢＣ２およびＢＣ３について開示する。本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するＰＣＲベースの方法であって、プライマーセットＢＣ１、ＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーセットＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、方法についても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、
配列番号１および配列番号２で表されるＢＣ１、
配列番号３および配列番号４で表されるＢＣ２、ならびに
配列番号５および配列番号６で表されるＢＣ３の、
新規のオリゴヌクレオチドプライマー配列。
【請求項２】
ＢＣ１が、配列番号１のフォワードプライマー５’ＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧ３’、および配列番号２のリバースプライマー５’ＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
ＢＣ２が、配列番号３のフォワードプライマー５’ＧＡＡＴＧＣＡＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧ３’、および配列番号４のリバースプライマー５’ＣＣＡＧＧＣＴＴＡＡＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
ＢＣ３が、配列番号５のフォワードプライマー５’ＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＴＣＡＣＣＧ３’、および配列番号６のリバースプライマー５’ＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
【請求項５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ３６Ｄ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  Ｓ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＨＭ−０８からなる群から選択される、請求項１に記載の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプライマー。
【請求項６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株からＤＮＡを単離するステップ、および単離したＤＮＡを、請求項１に記載の新規のプライマーを使用して、サーモサイクラーにおいて９４℃で３０秒間（１サイクル）インキュベートし、その後９４℃で３０秒間、プライマーに特有のアニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクル、その後７２℃で５分間（１サイクル）最終インキュベーションを行い４℃で維持することにより増幅するステップを含む、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法。
【請求項７】
配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１のアニーリング温度が６０℃であり、それにより約９９０塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２のアニーリング温度が５８℃であり、それにより約５４３塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマー配列ＢＣ３のアニーリング温度が６８℃であり、それにより約３０１０塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ３６Ｄ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  Ｓ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＨＭ−０８からなる群から選択される、請求項６および請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、請求項１に記載のプライマーを含む検出キット。
【請求項１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、請求項６に記載の方法を使用する検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１日出願の米国仮出願第６２２３５５９３号の非仮出願である。
本発明は概して、分子生物学分野およびプロバイオティック乳酸菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ(バチルス  コアグランス)に関する。より詳細には、本発明は、（ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための新規のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
プロバイオティクスは今や、腸管感染症および尿路感染症を有効に管理するための栄養補助食品として広く使用されている。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ属のプロバイオティック細菌が、多くの販売業者から経口用栄養補助食品の形態で市販されている。プロバイオティック活性は細菌種／株の型と関連しているため、プロバイオティック栄養補助食品中の細菌種／株の型を同定することが急務となっている。乳、乳製品およびその他の栄養補助食品に混入するおそれのあるその他の病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種から、プロバイオティック細菌を同定および区別することも急務である。
【０００３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓは、広く使用されるプロバイオティック栄養補助食品の１つである。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを缶詰食品に混入する細菌の１つに挙げている（Landry et al.(2001) Bacteriological Analytical Manual Chapter 21A Examination of Canned Foods In: BAM: Examination of Canned Foods）。プロバイオティクスおよび混入物としてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓが生物学的に重要であることから、生物を有効に同定することが必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（Lei et al., Method for identifying Bacillus coagulans, CN104004846）、リアルタイムＰＣＲ（Liu et al., Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) method for detecting Bacillus coagulans quickly, CN102304559）、ＰＣＲ−ＲＡＰＤ（Sudha et al., (2010) Molecular Typing and Probiotic Attributes of a New Strain of Bacillus coagulans Unique IS-2: A Potential Biotherapeutic Agent, Genetic Engineering and Biotechnology Journal, 2010:1-20）、ＰＣＲ−変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Theunissen et al., (2005), Identification of probiotic microorganisms in South African products using PCR based DGGE analysis, International Journal of Food Microbiology, 98(1):11-21）などの分子技術を使用してＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法が、当技術分野において周知である。研究の大部分は、１６ｓ  ｒＲＮＡ配列のＢａｃｉｌｌｕｓ種間での差を標的とすることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するものである。迅速かつ信頼に足る検出様式のため、その他の機能遺伝子の種間での差を標的とすることでＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのオリゴヌクレオチドプライマーが必要である。本発明はこの技術的な問題を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の機能遺伝子の差を標的とすることによる、新規のプライマーを使用した鋭敏なＰＣＲベースの方法を開示することで解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主目的は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマーの使用について開示することである。
本発明のさらに別の目的は、前記プライマーを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するＰＣＲベースの方法について開示することである。
本発明は前記目的を実現し、さらなる関連の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマーＢＣ１（配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含む）、ＢＣ２（配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含む）、ＢＣ３（配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含む）、および（ｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するＰＣＲベースの方法であって、プライマーセットＢＣ１、ＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーセットＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、方法が開示される。
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の原理を例として示す添付画像と併せて、以下のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】プライマーセットＢＣ１を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。
【図２】プライマーセットＢＣ２を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。
【図３】プライマーセットＢＣ３を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
最も好ましい実施形態において、本発明は、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、
ａ）配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１、
ｂ）配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２、
ｃ）配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３
を含む新規のプライマー配列について開示する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法であって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓからＤＮＡを単離するステップ、および単離したＤＮＡを、上記のプライマーを使用して、９４℃で３０秒間（１サイクル）インキュベートし、その後９４℃で３０秒間、アニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクル、その後７２℃で５分間（１サイクル）最終インキュベーションを行い、４℃で維持することにより増幅するステップを含む方法について開示する。
【０００８】
関連実施形態において、配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１のアニーリング温度は６０℃であり、それにより約９９０塩基対の増幅産物が得られる。別の関連実施形態では、配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２のアニーリング温度は５８℃であり、それにより約５４３塩基対の増幅産物が得られる。本発明のさらに別の実施形態では、配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマー配列ＢＣ３のアニーリング温度は６８℃であり、それにより約３０１０塩基対の増幅産物が得られる。
別の実施形態において、本発明は、プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプロセスについて開示する。
本明細書で開示するプロセスにより、その他の株の中からＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ３６Ｄ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  Ｓ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＨＭ−０８を含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株が全て同定され、その他の株の中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属のその他の種全てと区別される。
【０００９】
本明細書に含まれる以下の特定の例では、本発明の前記最も好ましい実施形態を示す。
（例Ｉ）
プライマー設計および合成
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株に特有の領域を、データベースにおける入手可能な全ゲノム配列全てについて全ゲノムを広くデータマイニングすることで決定し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６と比較した。データの初期解析に基づいて特定の領域を３つ選択し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓと比較した。データのインシリコ解析により、これらの領域がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てには共通して存在するが、その他のＢａｃｉｌｌｕｓ種には存在しないことが示唆された。
【００１０】
インシリコ結果に基づく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプライマー合成用として可能性のある遺伝子標的を表１に示す。プライマー設計用の標的遺伝子を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ間での類似性、ならびにその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種すなわちＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓとの相違に基づいて選択した。
【表１】
2018533927.tif 000002
【００１１】
プライマーＢＣ１の配列は、鋳型としてｍａｒＣ膜内在性ファミリータンパク質遺伝子を使用して合成した。この遺伝子は、細胞膜を複数回貫通し、かつては複数抗生物質抵抗性タンパク質と考えられていたタンパク質ｍａｒＣを指定する。後の研究で、このタンパク質は複数抗生物質抵抗性には関与していないことが明らかとなった。この遺伝子ファミリーの正確な機能は未だ不明である（McDermott et al., (2008), The marC gene of Escherichia coli is not involved in multiple antibiotic resistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52:382-383）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．０（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約９９０塩基対の増幅産物（配列番号７）が得られる配列番号１および配列番号２のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。
【００１２】
増幅された配列（配列番号７）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であった（表２）こと、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓをその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別しうることが示された。
【００１３】
【表２】
2018533927.tif 000003
【００１４】
プライマーＢＣ２の配列は、鋳型としてＣｏｍＫファミリータンパク質遺伝子を使用して合成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種のＣｏｍＫは、コンピテンスシグナルトランスダクション（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ−ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ネットワークの中心的位置を占める正の自己調節タンパク質である。ＣｏｍＫは、ＤＮＡ結合および取り込み装置の構築に必要な形態形成タンパク質および構造タンパク質を指定する後期コンピテンス遺伝子の転写、ならびにｃｏｍＫ自体の転写を正に調節する（Kovacs et al., (2013), Functional Analysis of the ComK Protein of Bacillus coagulans. PLoS ONE 8(1): e53471）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約５４３塩基対の増幅産物（配列番号８）が得られる配列番号３および配列番号４のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。
【００１５】
増幅された配列（配列番号８）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であった（表３）こと、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓをその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別しうることが示された。
【００１６】
【表３】
2018533927.tif 000004
【００１７】
プライマーＢＣ３の配列は、鋳型としてメチル基受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）遺伝子を使用して合成した。メチル基受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）は、細菌の膜貫通型センサータンパク質である。ＭＣＰを使用することで細菌は細胞外マトリックスの分子濃度を検知することができ、それゆえに細菌は滑らかに泳ぐか急に方向転換することができる。細菌が誘引物質（栄養素）レベルの上昇または忌避物質（毒素）レベルの下降を検知すると、細菌は前方へ泳ぎ続けるか滑らかに泳ぎ続けることになる。細菌が誘引物質レベルの下降または忌避物質レベルの上昇を検知すると、細菌は急に方向転換して自身を新たな方向に再び方向づけることになる。このようにして、細菌は栄養素に向かって泳ぎ毒素から離れて泳ぐことができる（Derr et al., (2006) Changing the specificity of a bacterial chemoreceptor, Journal of Molecular Biology, 355 (5): 923-32）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．０（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約３０１０塩基対の増幅産物（配列番号９）が得られる配列番号５および配列番号６のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。
【００１８】
増幅された配列（配列番号９）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であったことが示された（表４）。
【００１９】
【表４】
2018533927.tif 000005
【００２０】
（例ＩＩ）
試料調製
ＤＮＡ単離
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６（ＬａｃｔｏＳｐｏｒｅ（登録商標）胞子１５０億／ｇｍ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ３１２８４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ１．０ｇｍを秤量し、それぞれ滅菌生理食塩水２５０ｍｌ（ＮａＣｌ０．９ｇｍ、ｗ／ｖ）に添加し、滅菌生理食塩水を使用して段階希釈した。プレートあたり３０〜３００コロニーを得るのに推奨される希釈度は２５０×１０6である。希釈した試料をウォーターバスにおいて７５℃で３０分間インキュベートし、４５℃未満まで速やかに冷却した。次いで、上記試料１．０ｍＬを滅菌ペトリ皿５枚それぞれに分配し、次いで各プレートにあらかじめ冷却しておいたグルコース酵母エキス培地（約４５℃）１５〜２０ｍｌを注いだ。プレートを転動および回転させて均一なスプレッドを形成させ、凝固させる。次いでプレートを３７℃±２℃で４８〜７２時間インキュベートした。プレートで増殖した、単離した純度の高いコロニーを、次いで滅菌ループを使用して注意深く取り出した。さらに、プレートから取り出した細胞を、２．０ｍＬ微量遠心チューブ中でＰＢＳ試薬１００μＬに懸濁させた。リゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを添加し、指ではじいて混合して、細胞が塊状になるまでチューブを３７℃で１０分間インキュベートした。次いでＤＮＡｚｏｌ（チオシアン酸グアニジン、サルコシルおよびトリス緩衝液−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより販売（カタログ番号１０５０３−０２７））３００μｌを添加し、１０秒〜３０秒間または細胞が試薬中で均質に懸濁されるまでチューブをボルテックスした。次いで１００℃に維持したウォーターバスで混合物を１０分間加熱し、１６，０００ｘｇで５分間遠心処理した。上清を新たな微量遠心チューブに注意深く移した。この溶液は細菌ゲノムＤＮＡを含む。解析前に、この溶液の一定分量を滅菌ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ−１：５０、ｖ／ｖ）で希釈して試料を調製した。これによりＤＮＡ約１０〜１００ｎｇ／μｌが生じることになる。
【００２１】
プライマー調製
プライマーＢＣ１：配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：１０、ｖ／ｖ）で希釈した。プライマーセットＢＣ１用のアニーリング温度は６０℃である。プライマーセットＢＣ１による陽性試験では、約９９０塩基対の増幅産物（配列番号７）が得られることが予期される。
【００２２】
プライマーＢＣ２：配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：５、ｖ／ｖ）で希釈する。プライマーセットＢＣ２用のアニーリング温度は５８℃である。プライマーセットＢＣ２による陽性試験では、約５４３塩基対の増幅産物（配列番号８）が得られることが予期される。
プライマーＢＣ３：配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：１０、ｖ／ｖ）で希釈する。プライマーセットＢＣ３用のアニーリング温度は６８℃である。プライマーセットＢＣ３による陽性試験では、３Ｋｂの増幅産物（配列番号９）が得られることが予期される。
【００２３】
（例ＩＩＩ）
ＰＣＲ増幅
プライマーセットごとに、２Ｘ  ＰＣＲマスターミックス（１Ｘ  ＰＣＲマスターミックスは０．１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１Ｘ  Ｔａｑｐｏｌアッセイ緩衝液および１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼを有する）２５μＬ、希釈したフォワードおよびリバースプライマー（１０〜２０ピコモル）１μＬ、鋳型ＤＮＡ（約１０ｎｇ〜１００ｎｇ）を含む希釈試料１μＬ、および滅菌水２２μＬを混合して、ＰＣＲ試料を調製した。希釈試料１μＬをヌクレアーゼ不含の水１μＬで置き換えてＰＣＲ陰性対照を調製した。
適切なサーマルサイクラーを使用して、以下のステップによりＰＣＲ増幅を実施した：
１．９４℃で３０秒間インキュベーション（１サイクル）、
２．９４℃で３０秒間変性、アニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間伸長（３０サイクル）、
３．７２℃で５分間最終インキュベーション（１サイクル）、４℃で維持。
アガロースゲル電気泳動（２％アガロースゲル）を実施して、各ＰＣＲ試料調製物およびＰＣＲ陰性対照のＰＣＲ増幅産物を解析し、ＤＮＡバンドをゲルドキュメンテーションシステムで視覚化した。
【００２４】
判定基準
プライマーＢＣ１：プライマーセットＢＣ１で調製したＰＣＲ試料調製物により、約９９０塩基対の増幅産物が得られる（陽性）［図１］。
プライマーＢＣ２：プライマーセットＢＣ２で調製したＰＣＲ試料調製物により、予期された約５４３塩基対の増幅産物が得られる（陽性）。［図２］
プライマーＢＣ３：プライマーセットＢＣ３で調製したＰＣＲ試料調製物では、約３０１０塩基対の増幅産物が得られない（陰性）。［図３］
本発明は、プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプロセスについて開示する。本発明は、栄養補助食品、乳および乳製品、飲料、菓子、缶詰食品を含むがこれらに限定されない食品中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、ならびに醸造所においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するのに役立つであろう。
【００２５】
本発明は好ましい実施形態を参照して記載されるが、本発明がそこに限定されるわけではないことを当業者は明確に理解すべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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