(57)【要約】  本発明は、サンプル中のアポリポタンパク質及びそのアイソフォームを検出及び定量化する方法、並びに本発明の検出方法によって決定されるアポリポタンパク質レベルに基づいて神経変性疾患又は心血管疾患の発症の可能性の予測方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）前記サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面への前記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、前記表面がそれに結合した前記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成される前記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した前記表面と該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを、前記抗体と前記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される前記複合体を検出することと、
を含み、前記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を前記サンプルの接触前に処理しないか、又は前記サンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法。
【請求項２】
前記アポリポタンパク質のアイソフォームがａｐｏＥ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択される所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）前記サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面への前記アポリポタンパク質の結合に好適な条件下で接触させることであって、前記表面がそれに結合した前記アポリポタンパク質に特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成される前記アポリポタンパク質が結合した前記表面と、前記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及び前記サンプル中に存在する前記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることであって、該接触を前記第１の抗体と前記アポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び前記第２の抗体と前記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行うことと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される前記第１の複合体及び前記第２の複合体を検出することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られる前記第１の複合体及び前記第２の複合体のレベルに基づいて、総アポリポタンパク質含量に対する前記アイソフォームの相対量を決定することと、
を含み、前記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を前記サンプルの接触前に処理しないか、又は前記サンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法。
【請求項４】
工程（ｉ）において使用する前記表面が複数の実体により形成され、工程（ｉｉ）における前記第１の抗体及び前記第２の抗体との接触を別個の容器において行い、各容器が前記表面を形成する前記複数の実体の一部を含有し、工程（ｉｉｉ）における検出を各容器において別個に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アポリポタンパク質がａｐｏＥであり、前記アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＥ４である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
被験体におけるａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定する方法であって、
（ｉ）前記アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する前記被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面への前記アポリポタンパク質アイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、前記表面がそれに結合した前記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成される前記アポリポタンパク質が結合した前記表面と、該アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、該抗体と前記アポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって、前記アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定することと、
を含み、前記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を前記サンプルの接触前に処理しないか、又は前記サンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法。
【請求項７】
前記アポリポタンパク質アイソフォームをコードする前記遺伝的変異体が、アポリポタンパク質アイソフォームａｐｏＥ４をコードする遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリスチレン表面を結合工程（ｉ）の前にブロッキングし、前記アルブミンがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリスチレン表面を結合工程（ｉ）の後に洗浄溶液で処理する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
被験体に由来するサンプルにおいてａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームのレベルを請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、ａｐｏＥ  Ｅ４レベルが基準値を超える場合に前記被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示される、方法。
【請求項１１】
被験体においてａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法によって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、前記被験体のゲノムにおける１つ又は２つのａｐｏＥ  Ｅ４対立遺伝子の存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示され、前記被験体のゲノムにおけるａｐｏＥ  Ｅ４対立遺伝子の非存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が低いことが示される、方法。
【請求項１２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ダウン症候群関連認知症、血管性認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症及びクロイツフェルト−ヤコブ病からなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを含むキットであって、該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な第２の抗体を含まない、キット。
【請求項１４】
前記キット内に存在する前記抗体がアポリポタンパク質アイソフォームに特異的である場合に、前記キットが前記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体を更に含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するための、請求項１３又は１４に記載のキットの使用であって、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がアルブミンでブロッキングされる、使用。
【請求項１６】
前記アルブミンがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のアポリポタンパク質及びそのアイソフォームを検出及び定量化する方法、並びに本発明の検出方法によって決定されるアポリポタンパク質レベルに基づいて神経変性疾患又は心血管疾患の発症の可能性を推定する予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、脂質代謝に関与する３４ｋＤａの糖タンパク質である。このタンパク質をコードするヒトＡＰＯＥ遺伝子は多型であり、１９番染色体上に位置する。３つのａｐｏＥタンパク質アイソフォームであるＥ２、Ｅ３及びＥ４をコードする３つの共通した相互顕性対立遺伝子（ε２、ε３及びε４）が存在する。これらのアイソフォームは、アミノ酸残基１１２及び１５８で異なる。アイソフォームＥ２は両方の部位にシステイン残基を有し、Ｅ４は両方の部位にアルギニン残基を有するが、最もよく見られる形態であるＥ３は１１２位にシステインを有し、１５８位にアルギニンを有する。これらの差異は、ａｐｏＥの生物学的機能に対して大きな影響を有する。これらのアイソフォームの脂質結合活性は異なる。Ｅ２及びＥ３は、優先的に高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合するが、Ｅ４では超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）が優先される。これらの生化学的な差異は、アイソフォームと種々の病理過程との関連性に関与する可能性がある。アイソフォームＥ４は、より高レベルのコレステロール、並びに冠動脈性心疾患及びアルツハイマー病のリスクの増大と関連する。対照的に、アイソフォームＥ２はアルツハイマー病に対する保護作用を示すが、家族性ＩＩＩ型高リポタンパク血症と関連する。このため、ＡＰＯＥ遺伝子型又はａｐｏＥアイソフォームへの高い関心が疫学的研究、臨床試験及び予防のための患者の層別化及び高リスクの患者の同定について見られる。
【０００３】
幾つかの方法が、３つの主要ＡＰＯＥハプロタイプの遺伝子型決定に一般に用いられている。より頻繁に用いられている方法は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ポリメラーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism））、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲに加えたシークエンシング又は質量分析、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ（増幅不応性突然変異系（Amplification Refractory Mutation System）−ＰＣＲ）及びＳＳＰ−ＰＣＲ（単純配列特異的プライマー（Simple Sequence Specific Primer）−ＰＣＲ）、蛍光融解曲線によるリアルタイムＰＣＲ検出、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance Energy Transfer））、対立遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲ、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。しかしながら、これらのＡＰＯＥ遺伝子ベースの方法は全て、ＤＮＡ抽出及び遺伝情報の分析のためにインフォームドコンセントを必要とし、臨床分析ルーチンにおいて容易に実行することができない。
【０００４】
主に研究目的で、幾つかの代替的な生化学的（非遺伝学的）方法が、ａｐｏＥアイソフォームの高感度特性化に用いられている。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）及びサンドイッチＥＬＩＳＡが最も一般的に用いられており、これらは血漿又はＣＳＦ等の体液に由来するａｐｏＥの特性化に基づく。ａｐｏＥの分析的ＩＥＦについては、固定化ｐＨ勾配でのタンパク質の等電点電気泳動（isoelectrofocusing）に続いて、抗ａｐｏＥ抗体を用いた分離アイソフォームの免疫検出を行う。特定のａｐｏＥバンドパターンにより、サンプル中に存在する種々のａｐｏＥアイソフォームの検出が可能となる。この技法は、ａｐｏＥ  Ｅ２、Ｅ３及びＥ４アイソフォーム以外の稀なａｐｏＥ変異体を検出することができるという利点を有するが、技術的に要求が厳しく、時間がかかる。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法では、標的タンパク質を捕捉するために抗体を使用する。サンドイッチＥＬＩＳＡは、ａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームの存在を調べるために用いることができ、一方がＥ４アイソフォームに特異的である必要がある２つの抗体（捕捉抗体及びレポーター抗体）の使用に基づく。ａｐｏＥ  Ｅ４の検出のための幾つかのＥＬＩＳＡキットが市販されているが（例えば、ＡｐｏＥ４／ｐａｎ−ＡｐｏＥ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、MBL  ＃７６３５）、おそらくは固有の技術的限界のために、この方法論は臨床ルーチン状況では実行されていない。
【０００６】
アポリポタンパク質レベルに基づいて疾患の発症を予測する方法が当該技術分野で記載されている。特許文献１は、ＰＣＲを用いたＡｐｏＥ対立遺伝子の遺伝子型決定に基づいて前立腺癌を発症する被験体の素因を評定する方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５９４５２８９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、現行の技術水準では、サンプル中のアポリポタンパク質の迅速で信頼性の高い決定を可能にする、アポリポタンパク質検出及びアポリポタンパク質アイソフォーム決定のための信頼性の高い正確な方法を開発することが依然として必要とされている。上記方法は、アポリポタンパク質又は特定のそのアイソフォームの存在又は非存在に関係する幾つかの疾患の発症を予測する上で関心が持たれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の著者らは、アポリポタンパク質及びそのアイソフォームを検出、定量化及び分析する方法論を開発した。この方法論は、表面、特にポリスチレン表面に対するアポリポタンパク質の特定の結合特性に基づき、検出又は定量化のための捕捉抗体の使用又は事前の単離手順の必要がない。著者らは、アポリポタンパク質、特にａｐｏＥがポリスチレン表面（ＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ、又は比濁ビーズ（turbidimetric beads）を含む）によって特異的に捕捉されることを示した。ａｐｏＥ  Ｅ４等の特定のアポリポタンパク質アイソフォームは、表面に結合した後に抗ａｐｏＥ４抗体によって検出することができるため、サンプル中のａｐｏＥ４アイソフォームの検出及び定量化が達成される。この定量化は、ヘテロ接合性（ε２／ε４、ε３／ε４）又はホモ接合性（ε４／ε４）のいずれかのＡＰＯＥ  ε４遺伝子型の存在と相関させることができる。これらの結合特性が他のアポリポタンパク質と共通していることを考慮すると、この方法論はａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ及びａｐｏＪ（クラステリン）を含む他のアポリポタンパク質にも適用することができる。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した表面と該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを、抗体とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体を検出することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択される所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質の結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質に特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及びサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることであって、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行うことと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される第１の複合体及び第２の複合体を検出することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量を決定することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、被験体におけるａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定する方法であって、
（ｉ）アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する上記被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質アイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、該アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、該抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と上記遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって、アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、被験体に由来するサンプルにおいてａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームのレベルを本発明の方法のいずれかによる方法によって決定することを含む、該被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、ａｐｏＥ  Ｅ４レベルが基準値を超える場合に被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示される、方法に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、被験体においてａｐｏＥ４アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を本発明の方法のいずれかによる方法によって決定することを含む、該被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける１つ又は２つのａｐｏＥ４対立遺伝子の存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示され、被験体のゲノムにおけるａｐｏＥ４対立遺伝子の非存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が低いことが示される、方法に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、被験体に由来するサンプルにおいてアポリポタンパク質アイソフォームのレベルを本発明の方法のいずれかによる方法によって決定することを含む、該被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、該アポリポタンパク質アイソフォームのレベルが基準値を超える場合に被験体が心血管疾患を患う可能性が高いことが示される、方法に関する。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、被験体においてアポリポタンパク質アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を本発明の方法のいずれかによる方法によって決定することを含む、該被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける該アポリポタンパク質アイソフォームの１つ又は２つの対立遺伝子の存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより高いことが示され、被験体のゲノムにおける該アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子の非存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより低いことが示される、方法に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを含むキットであって、該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な第２の抗体を含まない、キットに関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化する上記のキットの使用であって、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がアルブミンでブロッキングされる、使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ａｐｏＥ４アイソフォームを含有しない１５７個の血漿サンプル及びａｐｏＥ４を含有する７３個のサンプルにおけるａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームの存在の分析を示す図である。
【図２】遺伝子型に従って分配された、ａｐｏＥ  Ｅ４を含有する７３個のサンプル（図１）の吸光度ＥＬＩＳＡ読み取り値を示す図である。
【図３】分析され、ＡＰＯＥ遺伝子型に従って分配された２３０個のサンプルの平均吸光度読み取り値を示す図である。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図４】ＡＰＯＥ  ｅ４非キャリア（Ｅ３／Ｅ３）、並びにヘテロ接合性（Ｅ３／Ｅ４）及びホモ接合性（Ｅ４／Ｅ４）ＡＰＯＥ  ｅ４キャリアにおける種々の血漿希釈率でのａｐｏＥ  Ｅ４／総ａｐｏＥ吸光度（４Ｅ４／ｐａｎ−ａｐｏＥ）の比率を示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡプレートフォーマットでのポリスチレン表面への血漿サンプル（２００倍）に由来するアポリポタンパク質の結合を示す図である。
【図６】ＥＬＩＳＡプレートへのＡｐｏＥの結合に対する、塩（０Ｍ〜２．４Ｍ  ＮａＣｌ）又は洗浄剤（０％〜０．５％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含有する種々の緩衝液の影響を示す図である。濃い灰色及び薄い灰色のバーは、ＢＳＡベースのブロッキング溶液又はＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング溶液でそれぞれブロッキングしたウェルにおいて分析したサンプルを表す。
【図７】ＥＬＩＳＡプレートへのＡｐｏＥの結合に対するｐＨ（２〜１０）の影響を示す図である。薄い灰色及び濃い灰色のバーは、ＢＳＡベースのブロッキング溶液又はＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング溶液でそれぞれブロッキングしたウェルにおいて分析したサンプルを表す。
【図８】ＥＬＩＳＡプレートへのＡｐｏＥの結合に対する厳しい条件の影響を示す図である。
【図９】種々の時点でのＬＥＩＴによるａｐｏＥ  ｅ３／ｅ３サンプル及びａｐｏＥ  ｅ４／ｅ４サンプルの予備分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の著者らは、体液に由来するアポリポタンパク質、特にアポリポタンパク質ａｐｏＥ、より特にａｐｏＥのアイソフォーム４（ａｐｏＥ  Ｅ４）がポリスチレン表面に対して安定した高親和性結合能を有することを見出した。この特性に基づいて、本発明者らは、等電点電気泳動又は捕捉抗体を必要としないアポリポタンパク質を検出及び定量化する方法を開発した。本発明では、研究室内及び臨床分析状況で容易に実行することができる、単純で信頼性が高く、費用対効果の良い方法を記載する。アポリポタンパク質は心臓血管リスク及び神経血管リスク、並びに神経変性に関係付けられているため、本明細書で提供される方法は、患者の層別化並びにアルツハイマー病（ＡＤ）及び心血管障害のリスクが高い患者の特定についての有益な情報を与える。この方法論は、タンパク質バイオマーカーとしての他のアポリポタンパク質、すなわちａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＡＩ及びクラステリンの特性化にも利用することができ、血液又は尿等の容易に利用可能な体液の分析に適切である。
【００２１】
定義
本明細書で使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子、遺伝子座又は遺伝的多型の２つ以上の形態の１つに関する。異なる対立遺伝子が異なる形質をもたらし得る場合もあるが、異なる対立遺伝子が遺伝子の発現において同じ結果を有する場合もある。殆どの多細胞生物は二つ一組の染色体を有し、すなわち２倍体である。これらの染色体は相同染色体と称される。２倍体生物は、各染色体上に各遺伝子（及び１つの対立遺伝子）の１つのコピーを有する。両方の対立遺伝子が同じである場合、これらはホモ接合体である。対立遺伝子が異なる場合、これらはヘテロ接合体である。
【００２２】
本明細書で使用される「対立遺伝子量」という用語は、特定の対立遺伝子変異体のコピー数に関し、２倍体生物では０〜２の範囲である。
【００２３】
本明細書で使用される「アルツハイマー病」又は「ＡＤ」という用語は、進行性の記憶障害、錯乱、行動障害、自分では身の回りのことができないこと（inability to care for oneself）、段階的な身体的衰弱、最終的には死亡として臨床的に現れる、老人斑、神経のもつれ（neuritic tangles）及び進行性の神経細胞脱落を特徴とする特定の変性脳疾患と関連した精神機能の低下を指す。本明細書で使用される場合、この用語は全ての病期を含むことを意図したものである。
【００２４】
「抗体」、「免疫グロブリン」という用語及び同様の用語は、分析物（抗原）を特異的に結合及び認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数又は複数）又はそのフラグメントによって実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、これにより免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥがそれぞれ規定される。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は２対のポリペプチド鎖から構成され、各々の対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０ｋＤ〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。各重鎖のＣ末端は互いにジスルフィド結合しており、抗体の定常領域を形成する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。５つの主要抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらの幾つかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に更に分類することができる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａ又は約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の約１〜１０アミノ酸の可変領域と、ＣＯＯＨ末端のκ又はλ定常領域とを含む。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６アミノ酸）は同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）と上述の重鎖定常領域又はクラスの１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸）とを含む。種々の免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元配置が既知である。
【００２５】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質」という用語は、脂質に結合してリポタンパク質を形成するタンパク質に関する。このタンパク質は、組織におけるタンパク質の代謝及びそれらの取込みを調節する酵素補因子、受容体リガンド及び脂質輸送キャリアとして機能することができる。この用語は、以下のようなアポリポタンパク質の多数のクラスを包含する：ａｐｏＡ（アイソフォームａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＡ−ＩＩ、ａｐｏＡ−ＩＶ及びａｐｏＡ−Ｖを含む）、ａｐｏＢ（アイソフォームａｐｏＢ４８及びａｐｏＢ１００を含む）、ａｐｏＣ（アイソフォームａｐｏＣ−Ｉ、ａｐｏＣ−ＩＩ、ａｐｏＣ−ＩＩＩ及びａｐｏＣ−ＩＶを含む）、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ（ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４アイソフォームを含む）、ａｐｏＨ及びａｐｏＪ（クラステリン）、並びにａｐｏＦ、ａｐｏＧ、ａｐｏＬ、ａｐｏＭ、ａｐｏＮ及びａｐｏＯ。特定の実施形態では、アポリポタンパク質はａｐｏＥである。
【００２６】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ」又は「Ａｐｏ  Ａ−Ｉ」又は「ＡｐｏＡＩ」という用語は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要タンパク質構成成分であるタンパク質を指す。ＡｐｏＡＩは、殆どの血漿コレステリルエステルの形成に関与しているレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の補助因子である。ヒトにおいては、ａｐｏＡＩはＡＰＯＡＩ遺伝子によってコードされる。ａｐｏＡ−Ｉは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、ａｐｏ  Ａ−Ｉは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２６５４７（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。
【００２７】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」又は「Ａｐｏ  Ａ−ＩＶ」又は「ＡｐｏＡＩＶ」という用語は、３０６残基プロタンパク質の一次翻訳産物のタンパク質分解後に得られるタンパク質を指す。ａｐｏ  Ａ−ＩＶは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、Ａｐｏ  Ａ−ＩＶは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７２７（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。ヒトａｐｏＡ−ＩＶアイソフォームには、ａｐｏＡ−ＩＶ−１ａ（Ｔ３４７Ｓ）及びａｐｏＡ−ＩＶ−２（Ｑ３６０Ｈ）が含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ」又は「Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ」又は「ＡｐｏＣＩ」という用語は、リポタンパク質間のエステル化コレステロールの交換及び組織からのコレステロールの除去において重要な役割を有する、通常は血漿中に見られ、エステル化レシチンコレステロールの活性化に関与しているタンパク質を指す。ヒトにおいては、ａｐｏＣ−ＩはＡＰＯＣ１遺伝子によってコードされる。Ａｐｏ  Ｃ−Ｉは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、ａｐｏ  Ｃ−Ｉは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２６５４（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。ＡｐｏＣ−Ｉアイソフォームには、それらの算出される等電点に基づいて酸性（ａｐｏＣ−ＩＡ）及び塩基性（ａｐｏＣ−ＩＢ）のものが含まれる。
【００２９】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ」又は「Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩ」又は「Ａｐｏ  ＣＩＩ」という用語は、通常は血漿中に見られ、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロンの構成成分であるタンパク質を指す。ヒトにおいては、ａｐｏＣ−ＩＩはＡＰＯＣ２遺伝子によってコードされる。ａｐｏＣ−ＩＩは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、ａｐｏＣ−ＩＩは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２６５５（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。
【００３０】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ」又は「Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ」又は「Ａｐｏ  ＣＩＩＩ」という用語は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の構成成分として見られるタンパク質を指す。ＡｐｏＣＩＩＩは、トレオニン−７４でグリコシル化されることができる、７９個のアミノ酸を含有する比較的小さなタンパク質である。ＡｐｏＣＩＩＩは、リポタンパク質リパーゼ及び肝性リパーゼを阻害する。ヒトにおいては、ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩはＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされる。Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２６５６（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。ＡｐｏＣ−ＩＩＩは、タンパク質のオリゴ糖部分の末端のシアル酸分子の数（０〜２）に応じてａｐｏＣ−ＩＩＩ０、ａｐｏＣ−ＩＩＩ１及びａｐｏＣ−ＩＩＩ２と呼ばれる３つのアイソフォームで存在する。各アイソフォームは、それぞれ循環血液中の総ａｐｏＣ−ＩＩＩレベルのおよそ１０％、５５％及び３５％を占めることが示されている。
【００３１】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質−Ｅ」又は「Ａｐｏ−Ｅ」又は「ＡｐｏＥ」という用語は、高トリグリセリドリポタンパク質構成要素の正常な異化に不可欠なカイロミクロン及び中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）中に見られるタンパク質を指す。ヒトにおいては、アポリポタンパク質Ｅは、アイソフォームＡｐｏＥ２（ｃｙｓ１１２、ｃｙｓ１５８）、ＡｐｏＥ３（ｃｙｓ１１２、ａｒｇ１５８）及びＡｐｏＥ４（ａｒｇ１１２、ａｒｇ１５８）をコードする３つの主要対立遺伝子ε２、ε３及びε４を有する多型遺伝子である遺伝子ＡｐｏＥによってコードされる。アポリポタンパク質Ｅは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、Ａｐｏ  Ｅは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２６４９（２０１４年５月１６日公開）を有するヒトタンパク質である。
【００３２】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｅタイプ２アイソフォーム」又は「ａｐｏ  Ｅ２」という用語は、アミノ酸配列の１１２位及び１５８位におけるシステイン残基の存在によって規定されるタンパク質であるアポリポタンパク質ＥのアイソフォームＥ２を指す。
【００３３】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｅタイプ３アイソフォーム」又は「ａｐｏ  Ｅ３」という用語は、アミノ酸配列の１１２位におけるシステイン残基及び１５８位におけるアルギニン残基の存在によって規定されるタンパク質であるアポリポタンパク質ＥのアイソフォームＥ３を指す。
【００３４】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質Ｅタイプ４アイソフォーム」又は「ａｐｏ  Ｅ  ｃｏｄ変異体」又は「ａｐｏ  Ｅ４」という用語は、アミノ酸配列の１１２位及び１５８位におけるアルギニン残基の存在によって規定されるタンパク質であるアポリポタンパク質ＥのアイソフォームＥ４を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「アポリポタンパク質−Ｊ」又は「Ａｐｏ−Ｊ」又は「ＡｐｏＪ」又は「クラステリン」又は「補体溶解阻害因子（complement lysis inhibitor）」又は「ＣＬＩ」又は「硫酸化糖タンパク質２」又は「ＳＧＰ２」又は「ＳＰ−４０，４０」又は「テストステロン−抑制前立腺メッセージ２（testosterone-repressed prostate message 2）」又は「ＴＲＰＭ２」という用語は、免疫調節、細胞接着、形質転換、脂質輸送、組織リモデリング、膜リサイクリング及び細胞間相互作用に影響を与える分泌ヘテロ二量体糖タンパク質を指す。クラステリンは、Ａｒｇ  ２２７とＳｅｒ  ２２８との間の内部結合で翻訳後に切断される４４９アミノ酸ポリペプチドとして合成される。アポリポタンパク質Ｊは任意の起源、例えばヒト、ウシ、ネズミ、ウマ、イヌ等に由来し得る。特定の実施形態では、ＡｐｏＪは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１０９０９（２０１４年５月１６日）を有するヒトタンパク質である。
【００３６】
本明細書で使用される「心血管疾患」又は「心血管障害」という用語は、虚血、狭心症、浮腫状態、アテローム性動脈硬化、冠動脈性心疾患、ＬＤＬ酸化、内皮細胞への単球の接着、泡沫細胞形成、脂肪線条の発生、血小板の付着及び凝集、平滑筋細胞増殖、再灌流傷害、高血圧、血栓症、不整脈（心房性若しくは心室性、又はその両方）；心律動障害；心筋虚血；心筋梗塞；心臓瘤又は血管瘤；血管炎、脳卒中；四肢、器官又は組織の末梢閉塞性動脈症；脳、心臓、又は他の器官若しくは組織の虚血、内毒素性ショック、手術ショック又は外傷性ショック後の再灌流傷害；高血圧、心臓弁膜症、心不全、異常血圧；ショック；血管収縮（片頭痛を伴うものを含む）；単一の器官又は組織に限られる血管の異常、炎症及び不全を含むが、これらに限定されない、心臓若しくは血管、若しくはその両方に影響を及ぼすか、又は心肺系及び循環系に関連する疾患に関する。
【００３７】
「界面活性剤」としても知られる、本明細書で使用される「洗浄剤」という用語は、液体に添加した場合に液体の表面張力を洗浄剤の非存在下の同じ液体と比較して低減する両親媒性表面活性剤に関する。洗浄剤は、タンパク質の凝集を防ぎ、対象のタンパク質への汚染物質の非特異的な相互作用又は結合を防ぐことも可能である。本発明による洗浄剤としては、限定されるものではないが、非イオン性（中性）、陰イオン性、陽イオン性又は両性イオン性洗浄剤が挙げられる。
【００３８】
非イオン性又は中性洗浄剤の例としては、限定されるものではないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２１（ポリソルベート２１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ４０（ポリソルベート４０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６０（ポリソルベート６０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６１（ポリソルベート６１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６５（ポリソルベート６５）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０（ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８１（ポリソルベート８１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８５（ポリソルベート８５）等のＴｗｅｅｎシリーズ（ポリソルベート）の洗浄剤；Ｓｐａｎ（登録商標）  ２０等のＳｐａｎ（登録商標）シリーズの洗浄剤；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−１２等のＴｅｒｇｉｔｏｌシリーズの洗浄剤；Ｂｒｉｊ（登録商標）  ３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ５８Ｐ等のＢｒｉｊ（登録商標）シリーズの洗浄剤；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８５等のＴｗｅｅｎシリーズの洗浄剤；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ＧＲ−５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−７０５−７０等のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）シリーズの洗浄剤；又は上記洗浄剤の少なくとも１つの非イオン性の保守的な変形物（conservative variant）が挙げられる。
【００３９】
陰イオン性洗浄剤の例としては、限定されるものではないが、コール酸及びその誘導体、タウロコール酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｗ−３０、Ｔｒｉｔｏｎ−３０、Ｔｒｉｔｏｎ−７７０、ジオクチルスルホサクシネート、Ｎ５Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、１−アルキルスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン又は脂肪酸塩が挙げられる。
【００４０】
陽イオン性洗浄剤の例としては、限定されるものではないが、モノメチル脂肪族アミン及びジメチル脂肪族アミン、アルキルトリチメルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルアミンアセテート、トリアルキルアンモニウムアセテート、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、ジアルキルメチルベンジルアンモニウム塩、ハロゲン化アルキルピリジニウム及びアルキル（アルキル置換）ピリジニウム塩、アルキルチオメチルピリジニウム塩、アルキルアミドメチルピリジニウム塩、アルキルキノリニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、Ｎ，Ｎ−アルキルメチルピロリドニウム塩、１，１−ジアルキルピペリジニウム塩、４，４−ジアルキルチアモルホリニウム塩、４，４−ジアルキルチアモルホリニウム−１−オキシド塩、メチルビス（アルキルエチル）−２−アルキルイミダゾリニウムメチルスルフェート（及び他の塩）、メチルビス（アルキルアミドエチル）−２−ヒドロキシエチルアンモニウムメチルスルフェート（及び他の塩）、アルキルアミドプロピル−ジメチルベンジルアンモニウム塩、カルボキシアルキル−アルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルアミンオキシド、アルキルジメチルアミンオキシド、ポリ（ビニルメチルピリジニウム）塩、ポリ（ビニルピリジン）塩、ポリエチレンイミン、トリアルキルホスホニウムビカーボネート（及び他の塩）、トリアルキルメチルホスホニウム塩、アルキルエチルメチルスルホニウム塩及びアルキルジメチルスルホキソニウム塩が挙げられる。
【００４１】
両性イオン性洗浄剤の例としては、限定されるものではないが、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ−（アルキルＣ１０〜Ｃ１６）−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンベタイン（ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ）、カプリリルスルホベタイン（ＳＢ３−１０）、３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート（アミドスルホベタイン−１４；ＡＳＢ−１４）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−１４  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ；ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニウム−１−プロパンスルホネート、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ  ＣＢ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ  ＢＢ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ  ＣＢＲ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ  ＡＣＳ、Ｍｉｒａｃａｒｅ  ２ＭＨＴ及びＭｉｒａｃａｒｅ  ２ＭＣＡが挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用される「可能性を決定する」又は「可能性の予測」という表現又は同様の表現は、「可能性を評定する」又は「可能性の評定」という表現と同義であり、本発明により患者が疾患、特に神経変性疾患又は心血管疾患を発症する可能性を予測、推定又は評価することが可能となることを意味する。可能性の予測により、概して可能性が増大又は低下することのいずれかが示唆される。当業者に理解されるように、予測が評価される被験体の１００％で正確であることが好ましいが、その必要はない。しかしながら、この用語では、統計的に有意な割合の患者を疾患、特に神経変性疾患又は心血管疾患を有する可能性が高いとして特定することができる必要がある。当業者は、被験体が統計的に有意であるかを様々な既知の統計評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ検定、マン−ホイットニー検定等を用いることにより更なる面倒なしに決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見ることができる。好ましい信頼区間は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は０．０５、０．０２５、０．００１、０．０００１又はそれ以下であるのが好ましい。
【００４３】
本明細書で使用される「ハプロタイプ」という用語は、子孫が片方の親から受け継ぐ特定の遺伝子群を指す。特に、ハプロタイプは、一緒に受け継がれる可能性がある染色体上の特定の対立遺伝子の集合体を包含する。ハプロタイプは、２つ以上の対立遺伝子を含む場合もある。
【００４４】
本明細書で使用される「免疫比濁法」という用語は、沈殿し、サンプルの濁度を増大させる分析物と抗体との抗体−抗原免疫複合体の形成を生じる、分析物と抗体との反応に基づいてサンプル中の分析物を検出する技法に関する。結果として、光を反応溶液に通した場合に、一部の光がサンプルによって散乱し、一部の光がサンプルによって吸収され、残りがサンプルを通過する。吸収される光の量は分析物濃度に正比例し、又は言い換えると、透過（transmittal）光シグナルが分析物濃度に正比例する。本発明によると、免疫比濁法により検出される分析物は、アポリポタンパク質又はそのアイソフォーム、特にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質、並びにそのアイソフォーム、より特にａｐｏＥ及び／又はａｐｏＥアイソフォームａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４、より好ましくはａｐｏＥ４である。本発明の特定の実施形態では、免疫比濁アッセイは、ＬＥＩＴ（ラテックス増強免疫比濁法（Latex-Enhanced Immunoturbidimetry Technology））である。
【００４５】
「神経変性疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、時間とともに機能不全又は身体障害を引き起こす、神経組織、特にニューロンの変性又は劣化に起因する疾患に関係する。変性という用語には、細胞生存能力の喪失、細胞機能の喪失及び／又は細胞（ニューロン又は他の細胞）の数の減少が含まれる。例示的な神経変性疾患の非限定的な例としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症等が挙げられる。特定の実施形態では、上記神経変性疾患はＡＤである。
【００４６】
本明細書で使用される「酸化剤」という用語は、レドックス（酸化−還元）反応において電子を別の種から取り去る化学種に関する。
【００４７】
本明細書で使用される「ポリカーボネート」という用語は、それらの化学構造内にカーボネート基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−）を含有する熱可塑性ポリマーの群に関する。
【００４８】
本明細書で使用される「ポリスチレン」という用語は、スチレンモノマーから作製される合成芳香族熱可塑性ポリマーに関する。ポリスチレンは固体であっても又は発泡していてもよい。
【００４９】
「ペプチダーゼ」としても知られる、本明細書で使用される「プロテアーゼ」という用語は、タンパク質中のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。例示的なプロテアーゼの非限定的な例としては、セリンペプチダーゼ、トレオニンペプチダーゼ、システインペプチダーゼ、アスパルチルペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ及びグルタミルペプチダーゼが挙げられる。特定の実施形態では、プロテアーゼはペプシン、トリプシン又はキモトリプシンである。本明細書で使用される場合、「ペプシン」という用語は、疎水性アミノ酸、好ましくは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンの間のペプチド結合の加水分解を触媒するプロテアーゼを指す。
【００５０】
本明細書で使用される「還元剤」という用語は、レドックス（酸化−還元）化学反応において電子を別の化学種（酸化剤）へと失う化合物に関する。還元剤が電子を失うことで、その酸化が起こる。
【００５１】
本明細書で使用される「基準値」という用語は、被験体から採取されるサンプルから得られた値又はデータを評価するための基準として用いられる所定の尺度に関する。基準値又は基準レベルは絶対値、相対値、上限若しくは下限を有する値、値の範囲、代表値（average value）、中央値、平均値、又は特定の対照若しくはベースライン値と比較した値であり得る。基準値は、個々のサンプルの値、例えば試験対象の被験体に由来するサンプルからのものであるが、先の時点で得られた値に基づくものであってもよい。基準値は、例えば暦年齢適合群の被験体の集団に由来する多数のサンプルに基づくものであっても、又は試験対象のサンプルを含めた若しくは除外したサンプルのプールに基づくものであってもよい。
【００５２】
本明細書で使用される「塩」という用語は、イオン形態の、又は荷電し、対イオン（陽イオン又は陰イオン）と共役した、又は溶液中の任意の形態の化合物に関する。この定義には特に薬学的に許容可能な塩が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、被験体から単離された生体物質を指し、したがって生体サンプルを含む。上記サンプルは、所望のマーカーの検出に好適な任意の生体物質を含有していてもよく、被験体に由来する細胞及び／又は非細胞性物質を含んでいてもよい。概して、サンプルは、任意の好適な生体組織又は体液から単離することができる。本発明による特定の好ましいサンプルとしては、限定されるものではないが、、血液、血漿、血清、唾液、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルが挙げられる。本発明の実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。
【００５４】
「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」という用語は、療法が所望される任意の被験体、特に哺乳動物被験体を含む。哺乳動物被験体にはヒト、家畜、農用動物及び動物園の動物又は愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛等が含まれる。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【００５５】
本発明のアポリポタンパク質の検出及び定量化の方法
第１の態様では、本発明は、サンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した表面と該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを、抗体とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体を検出することと、
を含む、方法（本発明の第１の方法）に関する。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した表面と該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを、抗体とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体を検出することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【００５７】
本発明の第１の方法により検出及び／又は定量化されるアポリポタンパク質としては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）が挙げられる。検出及び／又は定量化されるアポリポタンパク質アイソフォームとしては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）のアイソフォームが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の第１の方法により検出及び／又は定量化されるアポリポタンパク質はａｐｏＥである。特定の実施形態では、本発明の第１の方法により検出及び／又は定量化されるアポリポタンパク質アイソフォームは、ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択されるａｐｏＥアイソフォームである。より特定の実施形態では、アポリポタンパク質はａｐｏＥであり、より特にアポリポタンパク質アイソフォームはａｐｏＥ４である。
【００５８】
このため、本発明の第１の方法の第１の工程では、サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該ポリスチレン表面又は該ポリカーボネート表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させるが、上記表面は、それに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【００５９】
サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面との接触は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下での直接的接触によって行うことができる。当業者により理解されるように、上記条件は、アポリポタンパク質又はそのアイソフォームとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面との相互作用に好適な条件、好ましくはアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面との静電相互作用及び／又は疎水性相互作用に好適な条件である。特定の好ましい実施形態では、表面はポリスチレン表面である。結合に好適な条件を当業者は決定することができ、適切な温度、インキュベーション時間、ｐＨ、サンプル濃度等が含まれる。特定の実施形態では、温度は４℃〜４０℃、特に１０℃〜３５℃、より特に１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃（室温）の範囲である。特定の実施形態では、上記接触工程中のｐＨはｐＨ２〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲である。特定の実施形態では、サンプルを表面、好ましくはポリスチレン表面と接触させて少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。本発明によるアポリポタンパク質含有サンプルは、予め希釈することなく、又は少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍、更により好ましくは少なくとも２００倍の希釈率で希釈して表面、好ましくはポリスチレン表面と接触させることができる。当業者により理解されるように、種々の緩衝液がサンプルの希釈に好適である。特定のサンプルでは、サンプルの希釈はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は炭酸／重炭酸緩衝液、より好ましくはＰＢＳで行う。
【００６０】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質又はそのアイソフォームとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面との結合は、任意のペプチド、任意のポリペプチド、任意の脂質又は任意の架橋剤によって仲介されない。特に、結合を仲介しない上記ペプチドは、アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに結合することが可能なペプチドであり、アミロイドペプチドが挙げられるが、これに限定されない。アミロイドペプチドとしては、限定されるものではないが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、β−アミロイドペプチド（Ａβ（１−５）、Ａβ（１−６）、Ａβ（１−１２）、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、Ａβ（１２−２８）、Ａβ（１３−２８）、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（３５−４２）、Ａβ（３３−４２）及びＡβ（３３−４０）（ここで、Ａβ（Χ−Ｙ）という表現は、Ｘ位のアミノ酸からＹ位のアミノ酸までからなるβ−アミロイドペプチドに由来するペプチドを指す）、Ａβ４０及びＡβ４２を含む、アルツハイマー病患者の脳内に見られるアミロイド斑の主成分としてアルツハイマー病に大きく関与する３６〜４３アミノ酸のペプチド）が挙げられる。結合を仲介しない脂質としては、限定されるものではないが、リン脂質及び脂肪酸が挙げられる。
【００６１】
特定の実施形態では、決定及び／又は定量化されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを含有するサンプルは、生体サンプルである。本発明による生体サンプルとしては、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、唾液、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）等の体液が挙げられる。サンプルを単離する方法は、当業者に既知である。特定の実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。本発明の第１の方法による血漿サンプルの好適な希釈率は１０倍〜１０００００倍、好ましくは１００倍〜１０００倍の範囲であり、より好ましくは、血漿サンプルの希釈率は２００倍である。
【００６２】
本発明によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくは、ポリスチレン表面は、それに結合し、検出及び／又は定量化が行われるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な任意の抗体を含有しない。本発明によるポリスチレン表面には、サンプル、特に生体サンプルと接触させることが可能な任意のポリスチレン表面が含まれ、限定されるものではないが、プレート、チューブ、ビーズ及びアレイ（その全てが市販されている）、並びに概してマイクロ流体ベースのアッセイに好適な任意のポリスチレン表面が挙げられる。特定の実施形態では、ポリスチレン表面はＥＬＩＳＡプレート、比濁ビーズ、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ、又は概してマイクロ流体ベースのアッセイに好適な任意のポリスチレン表面により構成される。本発明によるポリカーボネート表面には、サンプル、特に生体サンプルと接触させることが可能な任意のポリスチレン表面が含まれ、限定されるものではないが、プレート、チューブ、ビーズ及びアレイ（その全てが市販されている）が挙げられる。いずれの場合にも、上記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、該表面に結合するアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【００６３】
本発明によるポリスチレンプレートとしては、例えばNunc、Fisher Scientific、VWR、Greiner及びCorningから市販されているＥＬＩＳＡポリスチレンプレートが挙げられる。
【００６４】
本発明によるポリスチレンビーズとしては、限定されるものではないが、Sigma Aldrichから市販されているビーズが挙げられる。特定の実施形態では、ポリスチレンビーズは５０ｎｍ〜１μｍ、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは１５０ｎｍ〜４００ｎｍ、更により好ましくは２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、ポリスチレンビーズはアミン修飾ポリスチレンビーズである。特定の代替的な実施形態では、ポリスチレンビーズはカルボキシレート修飾ポリスチレンビーズである。本発明によるポリスチレンビーズとしては、限定されるものではないが、ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ及び比濁ビーズが挙げられる。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズは、Luminexから市販されているミクロスフェアである。
【００６５】
特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前に処理しない。代替的な好ましい実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前にブロッキングする。すなわち、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を本発明の第１の方法の結合工程（ｉ）の前にブロッキングする。特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を、結合工程の前にアポリポタンパク質以外のタンパク質及び／又は洗浄剤によりブロッキングする。表面、好ましくはポリスチレン表面を結合工程の前にブロッキングするのに好適なタンパク質としては、限定されるものではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミン、カゼイン及びゼラチン、並びにＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Pierce）等の市販のブロッキング溶液が挙げられる。ブロッキングに特に好ましいタンパク質はＢＳＡ、カゼイン及びゼラチン、より好ましくはＢＳＡ、更により好ましくは１％〜３％の範囲のＢＳＡ、より好ましくは１％ＢＳＡである。特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前にアルブミンでブロッキングし、より好ましくはアルブミンがＢＳＡである。特定の実施形態では、表面を１％ＢＳＡによりブロッキングする。アポリポタンパク質以外のタンパク質に加えて又はその代わりに、表面、好ましくは、ポリスチレン表面は、結合工程前に洗浄剤によりブロッキングされる。ポリスチレン表面を結合工程の前にブロッキングするのに好適な洗浄剤としては、限定されるものではないが、ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。特定の実施形態では、洗浄剤はポリソルベート２０である。特定の実施形態では、表面をポリソルベート２０によりブロッキングする。
【００６６】
本発明の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくはポリスチレン表面をサンプルとの接触後に洗浄溶液で処理する。すなわち、表面を本発明の第１の方法の結合工程（ｉ）の後に洗浄溶液で処理する。洗浄溶液での表面の処理は、本発明の第１の方法の結合工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に行うのが好ましい。特定の実施形態では、洗浄溶液は１つ以上の塩を含有する。洗浄溶液が含有する塩はＮａＣｌであり、トリス緩衝液（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により構成されるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は少なくとも１つの洗浄剤を含有する。洗浄剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択されるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酸を含有する。酸はＨＣｌ及びギ酸からなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、酸は２Ｍ  ＨＣｌ及び７０％ギ酸から選択される。付加的又は代替的には、洗浄溶液は塩基を含有する。好ましくは、塩基はＮａＯＨ、より好ましくは２Ｍ  ＮａＯＨである。付加的又は代替的には、洗浄溶液は還元剤を含有する。還元剤は２−メルカプトエタノールであるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酵素洗浄剤（プロテアーゼ等）、酸化試薬（次亜塩素酸ナトリウム等）又はそれらの組合せを含有しない。
【００６７】
本発明の第１の方法の第２の工程では、方法の第１の工程の結果としてアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合したポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくはポリスチレン表面を、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面に結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体と接触させる。この工程は、抗体とポリスチレン表面又はポリカーボネート表面に結合したアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で行う。
【００６８】
アポリポタンパク質に特異的な抗体は当業者に既知であり、市販されている。本発明において使用することができる非限定的な抗体の例としては、以下のものが挙げられる：
ａｐｏＡＩの検出及び／又は定量化については、Santa Cruz Biotechnology製のａｐｏＡＩに対するウサギポリクローナル抗体（ＦＬ−２６７、カタログ番号＃ｓｃ−３００８９）、Santa Cruz Biotechnology製のマウスモノクローナル抗ａｐｏＡＩ抗体（０６９−０１、カタログ番号＃ｓｃ−５８２３０）、Santa Cruz Biotechnology製のマウスモノクローナル抗ａｐｏＡＩ抗体（Ｂ１０、カタログ番号＃ｓｃ−３７６８１８）、Abcam製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＡＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ６４３０８）及びAbcam製のヤギポリクローナル抗ａｐｏＡＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ７６１３）。
ａｐｏＡＩＩの検出及び／又は定量化については、LifeSpan Biosciences製のマウスモノクローナル抗ａｐｏＡＩＩ抗体（カタログ番号＃ＬＳ−Ｂ４２８１）及びOriGene製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＡＩＩ抗体（カタログ番号＃ＴＡ３２８１１１）。
ａｐｏＡＩＶの検出及び／又は定量化については、Abcam製のヤギポリクローナル抗ヒトａｐｏＡＩＶ（カタログ番号＃ａｂ５９０３６）及びSigma-Aldrich製のウサギポリクローナル抗ヒトａｐｏＡＩＶ（カタログ番号＃ＨＰＡ００１３５２）。
ａｐｏＣＩの検出及び／又は定量化については、Abcam製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＣＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ２０７９３）及びAbcam製のヤギポリクローナル抗ａｐｏＣＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ１０４４４６）。
ａｐｏＣＩＩの検出及び／又は定量化については、Abcam製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＣＩＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ７６４５２）、Sigma-Aldrich製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＣＩＩ抗体（カタログ番号＃ＳＡＢ１３００９１７）及びNovus-Biologicals製のマウスモノクローナル抗ａｐｏＣＩＩ抗体（３Ｅ４、カタログ番号＃Ｈ０００００３４４−Ｍ０１）。
ａｐｏＣＩＩＩの検出及び／又は定量化については、Abcam製のヤギポリクローナル抗ａｐｏＣＩＩＩ抗体（カタログ番号＃ａｂ７６１９）及びSigma-Aldrich製のウサギポリクローナル抗ａｐｏＣＩＩＩ抗体（カタログ番号＃Ａ０７３４）。
ａｐｏＥの検出及び／又は定量化については、全ａｐｏＥに対するウサギポリクローナル抗体（SantaCruz Biotechnology, Inc.、＃ｓｃ−９８５７３）、及びTaKaRa Clontech製のウサギＩｇＧ抗ヒトａｐｏＥ（カタログ番号＃１８１７１Ａ及び＃１８１７１Ｂ）、及びAbcam製のウサギポリクローナル抗ヒトａｐｏＥ抗体（カタログ番号＃ａｂ７２３９８）。
ａｐｏＥ２アイソフォームの検出及び／又は定量化については、Biolegend製のマウスモノクローナル抗ヒトａｐｏＥ２（３Ｃ２クローン、カタログ番号＃８１５００１；クローン８Ｇ３、カタログ番号＃８１２７０１）。
ａｐｏＥ３アイソフォームの検出及び／又は定量化については、Preprotech製のウサギポリクローナル抗ヒトａｐｏＥ３（カタログ番号＃３５０−０２）。
ａｐｏＥ４アイソフォームの検出及び／又は定量化については、Merck Millipore製のマウスモノクローナル抗ヒトａｐｏＥ４（クローン４Ｅ４、カタログ番号＃ＭＡＢＮ４３）、BioLegend製のマウスモノクローナル抗ヒトａｐｏＥ４（クローン５Ｂ５、カタログ番号＃８１１６０１）、ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン４Ｅ４（Novus Biologicals、＃ＮＢＰ１−４９５２９）、ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン５Ｂ５（IBL  ＃１００２５）、ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン１Ｆ９（MBL、＃Ｍ０６７−３）及びThermo Scientific製のマウスモノクローナル抗体抗ａｐｏＥ４、クローン４Ｅ４（カタログ番号＃ＭＡ５−１６１４６）。
ａｐｏＪの検出及び／又は定量化については、Abcam製のマウスモノクローナル抗ａｐｏＪ抗体（ＣＬＩ−９、カタログ番号＃ａｂ１６０７７）及びSigma-Aldrich製のヤギポリクローナル抗ａｐｏＪ抗体（カタログ番号＃ＳＡＢ２５００２５１）。
【００６９】
工程（ｉ）の結果としてアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した表面と、該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体との接触は、抗体とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で行う。上記複合体の形成に好適な条件を当業者は決定することができ、適切な温度、インキュベーション時間及びｐＨが含まれる。特定の実施形態では、温度は４℃〜４０℃、特に１０℃〜３５℃、より特に１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃（室温）の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第１の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）における温度は実質的に同じである。特定の実施形態では、ｐＨはｐＨ２〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第１の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）におけるｐＨは実質的に同じである。特定の実施形態では、抗体を、表面に結合したアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとともに少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。
【００７０】
本発明の第１の方法の第３の工程では、方法の第２の工程の結果である、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面に結合したアポリポタンパク質又はそのアイソフォームと該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体との複合体を検出する。
【００７１】
アポリポタンパク質又はそのアイソフォームは単独で検出可能な分子ではないため、特定の実施形態では検出可能な分子又は複合体を用いて検出工程を行う。アポリポタンパク質−抗体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体は、当業者に既知の種々の方法によって検出することができる。本発明の特定の実施形態では、アポリポタンパク質−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体の検出は、アポリポタンパク質−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体に特異的に結合する検出可能な試薬を用いて行うが、検出可能な試薬は、測定することができるシグナルを生成することによって複合体の検出を容易にする。ポリペプチド及び抗体等の生体分子を標識化する方法は、当該技術分野で既知である。
【００７２】
広範な検出可能な試薬のいずれかを本発明の実施において使用することができる。好適な検出可能な試薬としては、様々なリガンド、放射性核種、蛍光色素、化学発光剤、微小粒子（例えば、量子ドット、ナノ結晶、蛍光体等）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに使用されるもの、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等）、比色標識、磁気標識及びビオチン、ジゴキシゲニン、又は抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能な他のハプテン及びタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
光学イメージングのために検出可能な試薬としては、例えばフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーンの誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリトロシン、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノゴールド（nanogold）スルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー染料、ｄａｐｏｘｙｌ染料、及び様々な他の蛍光化合物、例えばＣｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）蛍光標識ファミリー（Molecular Probes, Inc.）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。
【００７４】
特定の実施形態では、検出可能な試薬はタンパク質である。本発明における「タンパク質」という用語は、１つ以上のアミノ酸鎖からなる巨大分子を指す。タンパク質は、他の分子に特異的に結合するそれらの能力に基づく様々な細胞機能群の実行に関与している。タンパク質は、他のタンパク質及び小基質分子に結合することができる。検出可能な試薬として好適なタンパク質の非限定的な例としては、限定されるものではないが、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質及び抗原が挙げられる。
【００７５】
好ましい実施形態では、タンパク質は酵素である。本発明における「酵素」という用語は、高選択性触媒として働き、それが特異的な代謝反応の速度及び特異性の両方を加速するタンパク質を指す。本発明に好適な酵素の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼが挙げられる。当業者に理解されるように、本発明への使用に好適な酵素は比色法、化学発光法又は蛍光法によって検出可能な化合物中の基質の修飾を触媒するそれらの能力の結果として間接的に検出可能である。好適な基質の例としては、限定されるものではないが、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が挙げられる。
【００７６】
生物発光タンパク質又はフォトプロテイン（photoproteins）は、事前に励起する必要なしにそれらの特異的な補欠分子族の化学反応を行い、発光を生じることが可能である酸化酵素の特殊な例である。生物発光タンパク質の非限定的な例としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ及びイクオリンが挙げられる。
【００７７】
別の実施形態では、タンパク質は蛍光タンパク質である。本発明における「蛍光タンパク質」という用語は、励起に好適な波長で励起された場合に発光する能力を有するタンパク質を指す。本発明の複合体において使用することができる蛍光タンパク質の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＢＦＰ２、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｃｉｔｒｉｎｅ、ａｍＦＰ４８６、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｒＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄＴｏｍａｔｅ、ｍＴＦＰ１、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＫＯ２、ｍＲｕｂｙ、ｍＫａｔｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＲＥＡＣｈ、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が挙げられる。
【００７８】
別の実施形態では、タンパク質は発光タンパク質である。本発明における「発光タンパク質」という用語は、励起に好適な波長で励起された場合に発光することが可能なタンパク質を指す。
【００７９】
別の実施形態では、タンパク質は抗原である。本発明における「抗原」という用語は、体内で免疫応答を誘導する分子を指す。したがって、抗原はそれを認識し、それに特異的に結合する抗体を生成するために使用することができる。抗原の非限定的な例としては、特に腫瘍抗原、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及び組織プラスミノーゲン活性化因子、及びＡｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）等のその組換え変異体、並びに細菌抗原、アレルゲン等が挙げられる。当業者に理解されるように、本発明での使用に好適な抗原は、抗体によって特異的に認識されるそれらの能力の結果として間接的に検出可能である。
【００８０】
別の実施形態では、検出可能な試薬はハプテンである。本発明における「ハプテン」という用語は、抗原性であるが、単独では特異的免疫反応を誘導することができない、小さな分子サイズ（１００００Ｄａ未満）を有する化学化合物の群を指す。キャリアと呼ばれる大きな免疫原性タンパク質へのハプテンの化学共役により、特異的免疫反応を誘導することが可能なハプテン−免疫原性キャリアコンジュゲートが生成する。ビタミンの非限定的な例としては、ビオチン（ビタミンＢ７）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）及びニトロ−ヨードフェノール（ＮＩＰ）が挙げられる。特定の実施形態では、ビタミンはビオチンである。本発明における「ビオチン」という用語は、これまでの記載で最も高いＫｄ＝１０Ｍ〜１５Ｍという親和性でアビジンに特異的に結合することを特徴とする、ビタミンＨ及びビタミンＢ７とも称される、水及びアルコールに可溶性の熱安定性ビタミンを指す。当業者に理解されるように、ビオチンはアビジン、又はストレプトアビジン及びニュートラアビジン等のその変異体によって特異的に認識されるその能力の結果として間接的に検出可能である。
【００８１】
検出可能な試薬の検出は、当業者に既知であるように、試薬のタイプ及びサンプルのタイプに好適な装置を使用する蛍光法又は比色法を用いて行うことができる。
【００８２】
例としては、複合体のアポリポタンパク質が表面、好ましくはポリスチレン表面に付着したアポリポタンパク質−抗体の複合体を、予めアポリポタンパク質と複合させた抗アポリポタンパク質抗体に特異的な第２の抗体（レポーター抗体）とインキュベートする。したがって、本発明の第１の方法の特定の実施形態では、方法の工程（ｉｉ）において形成されるアポリポタンパク質−抗体の複合体は、抗アポリポタンパク質抗体に特異的なレポーター抗体を用いて検出される。特定の実施形態では、抗アポリポタンパク質抗体及びレポーター抗体は同じ抗体である。好ましい実施形態では、第２の抗体（レポーター抗体）を、表面とアポリポタンパク質とのインキュベーション及び／又はアポリポタンパク質に特異的な抗体と表面に結合したアポリポタンパク質とのインキュベーションの条件と同様の条件で酵素とコンジュゲートさせる。表面に結合した抗体−アポリポタンパク質の複合体は、酵素によって、例えば蛍光顕微鏡での蛍光法を用いて又は分光光度計での比色法により検出可能な生成物へと変換される基質を添加することで検出される。代替的な実施形態では、検出は、検出可能な試薬で適切に標識されたアポリポタンパク質に特異的なプローブの使用により同じように行うことができる。
【００８３】
このため、本発明によると、アポリポタンパク質−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体は、上記のように検出可能な分子又は複合体を用いて検出することができる。本発明の代替的な実施形態では、アポリポタンパク質−抗体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体は比濁法によって、特に免疫比濁アッセイを用いて検出される。アポリポタンパク質−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体の形成は、該アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームが分析対象のサンプル中に存在する場合に、アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームを含まないサンプルの濁度と比較して濁度の増大をもたらし、該濁度変動を（例えば、分光光度計を用いて）測定することができる。本発明の好ましい実施形態では、免疫比濁アッセイはＬＥＩＴ（ラテックス増強免疫比濁法）である。
【００８４】
特定の実施形態では、複合体の検出はＥＬＩＳＡによって行う。代替的な実施形態では、複合体の検出は免疫比濁アッセイによって行う。
【００８５】
アポリポタンパク質アイソフォームの相対量を決定する方法
本発明の発明者らは、特定のアポリポタンパク質アイソフォームが被験体内に存在するか否かを、被験体に由来する血漿サンプルの二重ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて決定する方法であって、一方のアッセイにより特定のアポリポタンパク質アイソフォームのレベルを決定し、他方のアッセイにより総アポリポタンパク質のレベルを決定する、方法を開発した。次いで、アポリポタンパク質アイソフォーム／総アポリポタンパク質の比率を算出する。実施例１の「血漿サンプルにおけるヘテロ接合性／ホモ接合性ＡＰＯＥ  ε４キャリアの識別」及び図４を参照されたい。ａｐｏＥのアポリポタンパク質アイソフォーム含量も免疫比濁アッセイによって決定した。実施例２の「比濁アッセイによるＡｐｏＥ４検出」を参照されたい。
【００８６】
このため、別の実施形態では、本発明は、サンプル中の所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、表面へのアポリポタンパク質の結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質に特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及びサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることであって、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行うことと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される第１の複合体及び第２の複合体を検出することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量を決定することと、
を含む、方法（本発明の第２の方法）に関する。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明は、サンプル中のａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択される所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質の結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質に特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及びサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることであって、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行うことと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される第１の複合体及び第２の複合体を検出することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量を決定することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【００８８】
本発明の第２の方法により決定されるアポリポタンパク質アイソフォームとしては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）のアイソフォームが挙げられる。特定の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質アイソフォームはａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択されるａｐｏＥアイソフォーム、好ましくはａｐｏＥ４である。より特定の実施形態では、アポリポタンパク質はａｐｏＥであり、アポリポタンパク質アイソフォームはａｐｏＥ４である。
【００８９】
本発明の第２の方法の第１の工程では、サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させるが、上記表面は、それに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【００９０】
ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくはポリスチレン表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件は、本発明の第１の方法において上述されており、本明細書の一部をなす。
【００９１】
特定の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを含有するサンプルは、生体サンプルである。好適な生体サンプルは、本発明の第１の方法において言及されており、本明細書の一部をなす。好ましいサンプルとしては血液、血漿、血清、尿、唾液、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）等の体液が挙げられる。特定の実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。血漿サンプルの好適な希釈率は１０倍〜１０００００倍、好ましくは１００倍〜１０００倍の範囲であり、より好ましくは、血漿サンプルの希釈率は２００倍である。
【００９２】
本発明によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、それに結合し、検出が行われるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な任意の抗体を含有しない。本発明によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、上述されており、本明細書の一部をなす。特定の実施形態では、ポリスチレン表面はＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって構成される。いずれの場合にも、上記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、該表面に結合するアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明の第２の方法によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、唯一の実体によって、該唯一の実体がアポリポタンパク質の結合に必要とされる表面、例えば単一ＥＬＩＳＡプレート又はＥＬＩＳＡプレート内の単一ウェル等の単一プレートをもたらすように形成される。この実施形態が、第１の抗体及び第２の抗体を、各抗体により生じるシグナルが第２の抗体によってもたらされるシグナルにより干渉されることなく決定することができるように異なる検出可能なマーカーを用いて検出する場合に用いられ得ることが理解される。代替的な実施形態では、本発明の第２の方法によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は複数の実体、すなわち上記表面へのアポリポタンパク質の結合に利用可能な表面をもたらす少なくとも２単位の実体、例えばｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等の複数のビーズによって形成される。本発明の第２の方法の特定の実施形態では、表面への上記サンプル中のアポリポタンパク質の結合に好適な条件下でサンプルと接触させるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、複数の実体によって形成される。上記表面は、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって形成されるのが好ましい。この実施形態は、工程（ｉ）において形成される複合体を、両方の抗体を各々の検出可能な試薬によりもたらされるシグナルによって区別することを可能にする検出可能な試薬で更に処理しない場合に有用である。例えば、比濁検出の場合、アポリポタンパク質と抗体との複合体の形成は、サンプルの濁度の増大によって検出される。この場合、濁度の増大がアポリポタンパク質アイソフォームと第１の抗体との複合体の形成によるものか、又は全アポリポタンパク質と第２の抗体との複合体によるものかを決定することは可能でない。この場合、各々の抗体型と接触する実体を、それらを異なる容器に入れることによって別個に検出することができるように、接触を複数の実体（例えば、微小粒子の形態）によって形成される表面を用いて行う必要がある。
【００９４】
特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前に処理しない。代替的な好ましい実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前にブロッキングする。すなわち、表面を本発明の第２の方法の結合工程（ｉ）の前にブロッキングする。特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を、結合工程の前にアポリポタンパク質以外のタンパク質及び／又は洗浄剤によりブロッキングする。本発明による表面のブロッキングに好適なタンパク質及び洗浄剤は上記されており、引用することにより本明細書の一部をなす。ブロッキングに特に好ましいタンパク質はＢＳＡ、カゼイン及びゼラチン、より好ましくはＢＳＡ、更により好ましくは１％〜３％の範囲のＢＳＡ、より好ましくは１％ＢＳＡである。表面を結合工程の前にブロッキングするのに好適な洗浄剤としては、限定されるものではないが、ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。
【００９５】
特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触後に洗浄溶液で処理する。すなわち、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を本発明の第２の方法の結合工程（ｉ）の後に洗浄溶液で処理する。洗浄溶液でのポリスチレン表面又はポリカーボネート表面の処理は、本発明の第２の方法の結合工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に行うのが好ましい。好適な洗浄溶液は上述されており、本明細書の一部をなす。特定の実施形態では、洗浄溶液は１つ以上の塩を含有する。洗浄溶液が含有する塩はＮａＣｌであるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は少なくとも１つの洗浄剤を含有する。洗浄剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択されるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酸を含有する。酸はＨＣｌ及びギ酸からなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、酸は２Ｍ  ＨＣｌ及び７０％ギ酸から選択される。付加的又は代替的には、洗浄溶液は塩基を含有する。好ましくは、塩基はＮａＯＨ、より好ましくは２Ｍ  ＮａＯＨである。付加的又は代替的には、洗浄溶液は還元剤を含有する。還元剤は２−メルカプトエタノールであるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酵素洗浄剤（プロテアーゼ等）、酸化試薬（次亜塩素酸ナトリウム等）又はそれらの組合せを含有しない。
【００９６】
本発明の第２の方法の第２の工程では、工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及びサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させ、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成に好適であり、かつ第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適である条件下で行う。
【００９７】
アポリポタンパク質に特異的な抗体及び特定のアポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体は、上記の本発明の第１の方法において引用されており、本明細書の一部をなす。
【００９８】
本発明の第２の方法によると、工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と第１の抗体及び第２の抗体とを接触させるが、第１の抗体は、決定されるアポリポタンパク質アイソフォームに特異的であり、第２の抗体は、上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能である。特定の実施形態では、アポリポタンパク質を結合させ、第１の抗体と接触させる表面は、アポリポタンパク質を結合させ、第２の抗体と接触させるのと同じ表面である。すなわち、接触を単一容器、例えばＥＬＩＳＡプレート等のプレートの単一ウェルにおいて行う。したがって、アポリポタンパク質が結合した表面と第１の抗体との接触を、第２の抗体との接触が行われるものと同じ容器において行う。代替的な実施形態では、アポリポタンパク質が結合した第１の表面を第１の抗体と接触させ、アポリポタンパク質が結合した第２の表面を第２の抗体と接触させ、上記第１の表面及び第２の表面は異なる表面、例えばプレート（ＥＬＩＳＡプレート等）における異なるウェル、異なるビーズ（ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等）又は異なる粒子である。したがって、アポリポタンパク質が結合した表面と第１の抗体との接触を、アポリポタンパク質が結合した表面と第２の抗体との接触を行う容器とは異なる容器において行う。すなわち、別個の容器を使用する。より特定の実施形態では、別個の容器を使用する場合、該容器の各々が複数の実体、例えば２つの別個のビーズ（ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等）の組又は２つの別個の粒子の組を含む。
【００９９】
本発明の第２の方法の好ましい実施形態では、工程（ｉ）において使用する表面は、複数の実体により形成され、工程（ｉｉ）における第１の抗体及び第２の抗体との接触は、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行われる。
【０１００】
工程（ｉ）の結果としてアポリポタンパク質アイソフォームが結合した表面と、該アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及び上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体との接触は、第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行う。上記複合体の形成に好適な条件を当業者は決定することができ、適切な温度、インキュベーション時間及びｐＨが含まれる。特定の実施形態では、温度は４℃〜４０℃、特に１０℃〜３５℃、より特に１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃（室温）の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第２の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）における温度は実質的に同じである。特定の実施形態では、ｐＨはｐＨ２〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第２の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）におけるｐＨは実質的に同じである。特定の実施形態では、第１の抗体を、表面に結合した決定されるアポリポタンパク質アイソフォームとともに少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。特定の実施形態では、第２の抗体を、表面に結合した決定されるアポリポタンパク質のアイソフォームとともに少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。
【０１０１】
本発明の第２の方法の第３の工程では、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体を検出する。
【０１０２】
上述のように、アポリポタンパク質を結合させ、第１の抗体と接触させる表面は、アポリポタンパク質を結合させ、第２の抗体と接触させる表面と同じであっても、又は異なっていてもよい。特定の実施形態では、上記表面が異なる表面であり、接触を別個の容器において行う場合、本発明の第２の方法の工程（ｉｉｉ）における検出は、各容器において別個に行われる。
【０１０３】
本発明の第２の方法の好ましい実施形態では、工程（ｉ）において使用される表面は、複数の実体によって形成され、工程（ｉｉ）における第１の抗体及び第２の抗体との接触は、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行われ、工程（ｉｉｉ）における検出は、各容器において別個に行われる。この実施形態は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がビーズ、好ましくはｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって構成され、検出が免疫比濁法を用いて行われる場合に特に好ましい。このため、本発明のこの実施形態によると、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体は比濁法によって、特に免疫比濁アッセイを用いて検出される。アポリポタンパク質（その全てのアイソフォーム）−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体の形成は、該アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームが分析対象のサンプル中に存在する場合に、アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームを含まないサンプルの濁度と比較して濁度の増大をもたらし、該濁度変動を（例えば、分光光度計を用いて）測定することができる。本発明の好ましい実施形態では、免疫比濁アッセイはＬＥＩＴである。
【０１０４】
特定の代替的な実施形態では、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体を、検出可能な試薬を用いて検出する。本発明において好適な検出可能な試薬は、本発明の第１の方法において上述されており、本明細書の一部をなす。好ましい実施形態では、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体を、抗アポリポタンパク質抗体及び／又は抗アポリポタンパク質アイソフォーム抗体に特異的なレポーター抗体を用いて検出する。好ましい実施形態では、第２の抗体（レポーター抗体）を、表面とアポリポタンパク質アイソフォームとのインキュベーション及び／又はアポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体と表面に結合したアポリポタンパク質アイソフォームとのインキュベーションの条件と同様の条件で酵素とコンジュゲートさせる。この実施形態は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がプレート、好ましくはＥＬＩＳＡプレートによって構成され、検出がＥＬＩＳＡアッセイを用いて行われる場合に特に好ましい。
【０１０５】
本発明の第２の方法の第４の工程では、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量を、工程（ｉｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて決定する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明の第２の方法の工程（ｉｉｉ）において検出される第１の複合体及び第２の複合体の検出に由来するシグナル間の比率を算出する。結果として、特定のアポリポタンパク質のアイソフォームの該アポリポタンパク質の総含量に対する相対量が決定される。当業者に認識されるように、比率は０（特定のアポリポタンパク質アイソフォームが分析対象のサンプル中に存在しない場合）から１（特定のアポリポタンパク質アイソフォームが、分析対象のサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の唯一のアイソフォームである場合）の範囲であり得る。
【０１０７】
本発明の対立遺伝子量の決定方法
本発明の発明者らは、被験体が特定のアポリポタンパク質アイソフォームのホモ接合性又はヘテロ接合性キャリアであるかを、被験体のサンプルの二重アッセイに基づいて決定する方法であって、一方のアッセイにより特定のアポリポタンパク質アイソフォームのレベルを決定し、他方のアッセイにより総アポリポタンパク質のレベルを決定する、方法を開発した。次いで、アポリポタンパク質アイソフォーム／総アポリポタンパク質の比率を算出し、この比率から対立遺伝子量を推測することができる。実施例１を参照されたい。アポリポタンパク質アイソフォーム含量も免疫比濁アッセイによって決定した。実施例２を参照されたい。
【０１０８】
このため、更なる態様では、本発明は、被験体におけるアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定する方法であって、
（ｉ）アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する上記被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、表面へのアポリポタンパク質アイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と上記遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって、アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定することと、
を含む、方法（本発明の第３の方法）に関する。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明は、被験体におけるａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定する方法であって、
（ｉ）アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する上記被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、表面へのアポリポタンパク質アイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と上記遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって、アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定することと、
を含み、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルの接触前に処理しないか、又はサンプルの接触前にアルブミンでブロッキングする、方法に関する。
【０１１０】
本発明の第３の方法により決定されるアポリポタンパク質アイソフォームとしては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）のアイソフォームが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の第３の方法により決定されるアポリポタンパク質アイソフォームはａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択されるａｐｏＥアポリポタンパク質アイソフォームである。より特定の実施形態では、本発明の第３の方法により決定されるアポリポタンパク質アイソフォームは、ａｐｏＥ４である。
【０１１１】
本発明の第３の方法の第１の工程では、アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させるが、上記表面は、それに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【０１１２】
ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくはポリスチレン表面へのサンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件は、本発明の第１の方法において上述されており、本明細書の一部をなす。
【０１１３】
サンプルは、アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来するタンパク質含有サンプルである。好適なサンプルとしては、上述のように血液、血漿、血清、尿、唾液、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）等の体液が挙げられる。特定の実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。血漿サンプルの好適な希釈率は１０倍〜１０００００倍、好ましくは１００倍〜１０００倍の範囲であり、より好ましくは、血漿サンプルの希釈率は２００倍である。
【０１１４】
本発明によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、それに結合し、検出が行われるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な任意の抗体を含有しない。本発明によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、上述されており、本明細書の一部をなす。特定の実施形態では、ポリスチレン表面はＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって構成される。いずれの場合にも、上記ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、該表面に結合するアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しない。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明の第３の方法によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、唯一の実体によって、該唯一の実体がアポリポタンパク質の結合に必要とされる表面、例えば単一ＥＬＩＳＡプレート等の単一プレートをもたらすように形成される。代替的な実施形態では、本発明の第３の方法によるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は複数の実体、すなわち上記表面へのアポリポタンパク質の結合に利用可能な表面をもたらす少なくとも２単位の実体、例えばｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等の複数のビーズによって形成される。本発明の第３の方法の特定の実施形態では、表面への上記サンプル中のアポリポタンパク質の結合に好適な条件下でサンプルと接触させるポリスチレン表面又はポリカーボネート表面は、複数の実体によって形成される。上記表面は、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって形成されるのが好ましい。
【０１１６】
特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前に処理しない。代替的な好ましい実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触前にブロッキングする。すなわち、表面を本発明の第３の方法の結合工程（ｉ）の前にブロッキングする。特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を、結合工程の前にアポリポタンパク質以外のタンパク質及び／又は洗浄剤によりブロッキングする。本発明による表面のブロッキングに好適なタンパク質及び洗浄剤は上記されており、本明細書の一部をなす。ブロッキングに特に好ましいタンパク質はＢＳＡ、カゼイン及びゼラチン、より好ましくはＢＳＡ、更により好ましくは１％〜３％の範囲のＢＳＡ、より好ましくは１％ＢＳＡである。表面を結合工程の前にブロッキングするのに好適な洗浄剤としては、限定されるものではないが、ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。
【０１１７】
特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面をサンプルとの接触後に洗浄溶液で処理する。すなわち、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を本発明の第３の方法の結合工程（ｉ）の後に洗浄溶液で処理する。洗浄溶液でのポリスチレン表面又はポリカーボネート表面の処理は、本発明の第３の方法の結合工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に行うのが好ましい。好適な洗浄溶液は上述されており、本明細書の一部をなす。特定の実施形態では、洗浄溶液は１つ以上の塩を含有する。洗浄溶液が含有する塩はＮａＣｌであるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は少なくとも１つの洗浄剤を含有する。洗浄剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択されるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酸を含有する。酸はＨＣｌ及びギ酸からなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、酸は２Ｍ  ＨＣｌ及び７０％ギ酸から選択される。付加的又は代替的には、洗浄溶液は塩基を含有する。好ましくは、塩基はＮａＯＨ、より好ましくは２Ｍ  ＮａＯＨである。付加的又は代替的には、洗浄溶液は還元剤を含有する。還元剤は２−メルカプトエタノールであるのが好ましい。付加的又は代替的には、洗浄溶液は酵素洗浄剤（プロテアーゼ等）、酸化試薬（次亜塩素酸ナトリウム等）又はそれらの組合せを含有しない。
【０１１８】
本発明の第３の方法の第２の工程では、工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させる。
【０１１９】
特定の好ましい実施形態では、本発明の第３の方法の第２の工程は、表面とサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることを更に含み、該接触を、第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行う。
【０１２０】
アポリポタンパク質に特異的な抗体及び特定のアポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体は、上記の本発明の第１の方法において引用されており、本明細書の一部をなす。
【０１２１】
第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件を当業者は決定することができ、上述のように適切な温度、インキュベーション時間及びｐＨが含まれる。特定の実施形態では、温度は４℃〜４０℃、特に１０℃〜３５℃、より特に１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃（室温）の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第３の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）における温度は、実質的に同じである。特定の実施形態では、ｐＨはｐＨ２〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲である。好ましい実施形態では、本発明の第３の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）におけるｐＨは、実質的に同じである。特定の実施形態では、第１の抗体を、表面に結合した決定されるアポリポタンパク質アイソフォームとともに少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。特定の実施形態では、第２の抗体を、表面に結合した決定されるアポリポタンパク質のアイソフォームとともに少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、更により好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。
【０１２２】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質を結合させ、第１の抗体と接触させる表面は、アポリポタンパク質を結合させ、第２の抗体と接触させるのと同じ表面である。すなわち、接触を単一容器、例えばＥＬＩＳＡプレート等のプレートの単一ウェルにおいて行う。したがって、アポリポタンパク質が結合した表面と第１の抗体との接触を、第２の抗体との接触が行われるものと同じ容器において行う。代替的な好ましい実施形態では、アポリポタンパク質が結合した第１の表面を第１の抗体と接触させ、アポリポタンパク質が結合した第２の表面を第２の抗体と接触させ、上記第１の表面及び第２の表面は異なる表面、例えばプレート（ＥＬＩＳＡプレート等）における異なるウェル、異なるビーズ（ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等）又は異なる粒子である。したがって、アポリポタンパク質が結合した表面と第１の抗体との接触を、アポリポタンパク質が結合した表面と第２の抗体との接触を行う容器とは異なる容器において行う。すなわち、別個の容器を使用する。より特定の実施形態では、別個の容器を使用する場合、該容器の各々が複数の実体、例えば２つの別個のビーズ（ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズ等）の組又は２つの別個の粒子の組を含む。
【０１２３】
本発明の第２の方法の好ましい実施形態では、工程（ｉ）において使用する表面は、複数の実体により形成され、工程（ｉｉ）における前記第１の抗体及び前記第２の抗体との接触は、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行われる。
【０１２４】
本発明の第３の方法の第３の工程では、工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と、上記遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって前記アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定する。
【０１２５】
特定の実施形態では、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量の決定は、工程（ｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて行い、アポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を、（ｉｉｉ）において決定された相対量から決定する。
【０１２６】
特定の実施形態では、工程（ｉｉ）において検出される第１の複合体及び第２の複合体の検出に由来するシグナル間の比率を算出する。結果として、特定のアポリポタンパク質のアイソフォームの該アポリポタンパク質の総含量に対する相対量が決定される。当業者に認識されるように、比率は０（特定のアポリポタンパク質アイソフォームが分析対象のサンプル中に存在しない場合）から１（特定のアポリポタンパク質アイソフォームが、分析対象のサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の唯一のアイソフォームである場合）の範囲であり得る。このため、ゼロに等しい比率は、分析サンプルにおけるアポリポタンパク質アイソフォームの非存在に関する。１に等しい比率（ここで、１は任意単位の任意の値である）は、アポリポタンパク質アイソフォームについてホモ接合性の被験体に関する。０．５に等しい比率（ここで、０．５は任意単位の任意の値である）は、アポリポタンパク質アイソフォームについてヘテロ接合性の被験体に関する。複合体を検出する方法は上述されており、本明細書の一部をなす。
【０１２７】
本発明の第２の方法の好ましい実施形態では、工程（ｉ）において使用される表面は、複数の実体によって形成され、工程（ｉｉ）における第１の抗体及び第２の抗体との接触は、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行われ、工程（ｉｉｉ）における検出は、各容器において別個に行われる。この実施形態は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がビーズ、好ましくはｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズによって構成され、検出が免疫比濁法を用いて行われる場合に特に好ましい。このため、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体は比濁法によって、特に免疫比濁アッセイを用いて検出される。アポリポタンパク質（その全てのアイソフォーム）−抗体の複合体又はアポリポタンパク質アイソフォーム−抗体の複合体の形成は、該アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームが分析対象のサンプル中に存在する場合に、アポリポタンパク質又はアポリポタンパク質アイソフォームを含まないサンプルの濁度と比較して濁度の増大をもたらし、該濁度変動を（例えば、分光光度計を用いて）測定することができる。本発明の好ましい実施形態では、免疫比濁アッセイはＬＥＩＴである。
【０１２８】
特定の代替的な実施形態では、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体を、検出可能な試薬を用いて検出する。本発明において好適な検出可能な試薬は、上述されており、本明細書の一部をなす。好ましい実施形態では、方法の第２の工程において形成される第１の複合体及び第２の複合体を、抗アポリポタンパク質抗体及び／又は抗アポリポタンパク質アイソフォーム抗体に特異的なレポーター抗体を用いて検出する。好ましい実施形態では、第２の抗体（レポーター抗体）を、表面とアポリポタンパク質アイソフォームとのインキュベーション及び／又はアポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体と表面に結合したアポリポタンパク質アイソフォームとのインキュベーションの条件と同様の条件で酵素とコンジュゲートさせる。この実施形態は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がプレート、好ましくはＥＬＩＳＡプレートによって構成され、検出がＥＬＩＳＡアッセイを用いて行われる場合に特に好ましい。
【０１２９】
結果として、ゼロに等しい比率により、分析サンプルにおけるアポリポタンパク質アイソフォームの非存在が特定される。すなわち、遺伝的変異体をコードする特定の対立遺伝子の量はゼロである。１に等しい比率は、アポリポタンパク質アイソフォームについてホモ接合性の被験体に関する。すなわち、遺伝的変異体をコードする特定の対立遺伝子の量は２である。０．５に等しい比率は、アポリポタンパク質アイソフォームについてヘテロ接合性の被験体に関する。すなわち、１という量の遺伝的変異体をコードする特定の対立遺伝子が存在する。
【０１３０】
本発明の第３の方法の特定の好ましい実施形態では、工程（ｉ）において使用される表面は複数の実体によって形成され、工程（ｉｉ）は、表面とサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることを更に含み、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行い、第１の抗体及び第２の抗体との接触を、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行い、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量の決定を、工程（ｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて行い、アポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を、工程（ｉｉｉ）において決定される相対量から決定する。
【０１３１】
神経変性疾患の発症を予測する方法
被験体における１９番染色体上のＡｐｏＥ  ε４遺伝子の存在は、該被験体においてアルツハイマー病（ＡＤ）を発症するリスクを増大することが知られている。したがって、被験体における１つのａｐｏＥ４対立遺伝子の存在が、ａｐｏＥ４対立遺伝子を保有しない被験体と比べたＡＤ発症の可能性の４倍の増大に関係し、被験体における２つのａｐｏＥ４対立遺伝子の存在が、ａｐｏＥ４対立遺伝子を保有しない被験体と比べたＡＤ発症の可能性の１５倍〜２０倍の増大に関係していると決定された。したがって、ａｐｏＥ４を含むアポリポタンパク質アイソフォームを決定する本発明の方法を、被験体におけるＡＤ発症の予測に適用することができる。
【０１３２】
このため、更なる態様では、本発明は、被験体に由来するサンプルにおいてａｐｏＥ４アイソフォームのレベルを上述の本発明の方法（第１、第２及び第３の方法）のいずれかによって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、ａｐｏＥ４レベルが基準値を超える場合に被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示される、方法に関する。
【０１３３】
神経変性疾患の発症の可能性を決定する本発明の方法による基準値は、ａｐｏＥ４対立遺伝子を保有しない被験体に由来するサンプルにおいて決定されるａｐｏＥ４のレベルである。
【０１３４】
本発明の方法による基準値又は基準レベルは絶対値、相対値、上限及び／又は下限を有する値、値の範囲、代表値、中央値、平均値、又は特定の対照若しくはベースライン値と比較した値であり得る。基準値は、個々のサンプルの値、例えば試験対象の被験体に由来するサンプルからのものであるが、先の時点で得られた値に基づくものであってもよい。基準値は、例えば暦年齢適合群の被験体の集団に由来する多数のサンプルに基づくものであっても、又は試験対象のサンプルを含めた若しくは除外したサンプルのプールに基づくものであってもよい。マーカーの基準値を決定する際に様々な検討事項が考慮される。かかる検討事項には、患者の年齢、体重、性別、全身的な身体状態等が含まれる。例えば、好ましくは上述の検討事項、例えば様々な年齢区分に従って分類された少なくとも２人、少なくとも１０人、少なくとも１００人から好ましくは１０００人を超える被験体の同数の群が参照群とみなされる。
【０１３５】
神経変性疾患を発症する高い可能性は、被験体が時間とともに上記疾患を発症する又は患う少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％の可能性を示す状況で見られる。特定の実施形態では、高い可能性は少なくとも１００％である。他の実施形態では、高い可能性は少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％及び少なくとも１０００％である。しかしながら、当業者により本発明を特徴付けるのに好適であるとみなされる他のカットオフ又は範囲も企図され、これらも本発明の範囲内である。本発明の予測方法によると、被験体が神経変性疾患を発症する高い可能性は、該被験体のゲノムにおける１つ又は２つのａｐｏＥ４対立遺伝子の存在に関係しており、該ａｐｏＥ４対立遺伝子の決定は、上述のように本発明の第１、第２又は第３の方法のいずれかによって行われる。
【０１３６】
神経変性疾患を発症する低い可能性は、被験体が時間とともに上記疾患を発症しない又は患わない少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％の可能性を示す状況で見られる。特定の実施形態では、低い可能性は少なくとも１００％である。他の実施形態では、低い可能性は少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％及び少なくとも１０００％である。しかしながら、当業者により本発明を特徴付けるのに好適であるとみなされる他のカットオフ又は範囲も企図され、これらも本発明の範囲内である。本発明の予測方法によると、被験体が神経変性疾患を発症する低い可能性は、該被験体のゲノムにおけるａｐｏＥ４対立遺伝子の非存在に関係しており、該ａｐｏＥ４対立遺伝子の決定は、上述のように本発明の第１、第２又は第３の方法のいずれかによって行われる。
【０１３７】
特定の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ダウン症候群関連認知症、血管性認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症及びクロイツフェルト−ヤコブ病からなる群から選択される。より特定の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。
【０１３８】
更なる態様では、本発明は、被験体においてＡｐｏＥ４アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を本発明の第３の方法によって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける１つ又は２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示され、被験体のゲノムにおけるＡｐｏＥ４対立遺伝子の非存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が低いことが示される、方法に関する。
【０１３９】
特定の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ダウン症候群関連認知症、血管性認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症及びクロイツフェルト−ヤコブ病からなる群から選択される。好ましい実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。
【０１４０】
心血管疾患の発症を予測する方法
アポリポタンパク質欠損は、心血管疾患の発症に関連付けられている。したがって、アポリポタンパク質及びアポリポタンパク質アイソフォームを決定する本発明の方法を、心血管疾患の発症リスクの予測にも適用することができる。
【０１４１】
このため、別の態様では、本発明は、被験体に由来するサンプルにおいてアポリポタンパク質アイソフォームのレベルを上述の本発明の方法（第１、第２及び第３の方法）のいずれかによって決定することを含む、被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、アポリポタンパク質アイソフォームレベルが基準値を超える場合に被験体が心血管疾患を患う可能性が高いことが示される、方法に関する。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、被験体においてアポリポタンパク質アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を本発明の第３の方法によって決定することを含む、被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける上記アポリポタンパク質アイソフォームの１つ又は２つの対立遺伝子の存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより高いことが示され、被験体のゲノムにおける上記アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子の非存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより低いことが示される、方法に関する。
【０１４３】
本発明の心血管疾患予測方法の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質アイソフォームは、特にａｐｏＥアイソフォームａｐｏＥ  Ｅ２、ａｐｏＥ  Ｅ３及びａｐｏＥ  Ｅ４からなる群から選択されるａｐｏＥアイソフォームであり、心血管疾患は、ＩＩＩ型高リポタンパク血症（脂質、特にコレステロール及びトリグリセリドの不適切な代謝を特徴とし、体内での脂質の異常蓄積又は高脂血症を引き起こす稀な遺伝性障害である、異常βリポタンパク質血症又はブロードβ病（broadbetadisease）としても知られる）、アポリポタンパク質ｅ−ｄの欠損に起因する異常βリポタンパク質血症、家族性高βリポタンパク質血症（血液中の低密度リポタンパク質又はβ−リポタンパク質の蓄積の増大）及びプレβリポタンパク質血症（prebetalipoproteinemia）（血液中の過剰な超低密度リポタンパク質又はプレβリポタンパク質）、高脂血症を伴う家族性高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症性黄色腫症を伴う高脂血症（体内での高コレステロール蓄積の沈着）、ブロードβリポタンパク質血症（broad-betalipoproteinemia）（身体の種々の部位における過剰脂肪領域の発生を特徴とし、脂肪が手掌、手指、膝、肘及び脇を含む全身の異常な位置に蓄積される病態）、浮性βリポタンパク質血症及び冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症、更には狭心症又は心臓発作を引き起こす心筋に血液を供給する動脈の硬化及び狭窄）からなる群から選択される。
【０１４４】
本発明の心血管疾患予測方法の別の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質はａｐｏＡＩであり、心血管疾患は、低αリポタンパク質血症（常染色体優性形式で受け継がれるＨＤＬ欠損症）である。
【０１４５】
本発明の心血管疾患予測方法の別の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質はａｐｏＣＩＩであり、心血管疾患は、Ｉｂ型高リポタンパク血症（高レベルのカイロミクロンを特徴とする、低ａｐｏＣＩＩレベルに起因する稀な遺伝性病態）である。
【０１４６】
本発明の心血管疾患予測方法の別の実施形態では、決定されるアポリポタンパク質はａｐｏＣＩＩＩであり、心血管疾患は、高トリグリセリド血症（トリグリセリドの血中レベルの増大）と関連したａｐｏＣＩＩＩ欠損症である。
【０１４７】
本発明のキット及びその使用
更なる態様では、本発明は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを含むキットであって、該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な第２の抗体を含まない、キットに関する。
【０１４８】
このため、本発明のキットの第１の要素は、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面である。本発明によるポリスチレン表面及びポリカーボネート表面は、本発明の第１の方法において上述されており、本明細書の一部をなす。表面はポリスチレン表面であるのが好ましい。特定の実施形態では、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面はＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ、比濁ビーズ又はタンパク質アレイによって構成される。特定の好ましい表面は、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡプレート等のプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ及び比濁ビーズ等のビーズ、並びに粒子を含むポリスチレン表面である。
【０１４９】
本発明のキットの第２の要素は、アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体である。本発明のキットによるアポリポタンパク質としては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）が挙げられる。本発明のキットによるアポリポタンパク質アイソフォームとしては、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）のアイソフォームが挙げられる。アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体は、上述されており、本明細書の一部をなす。特定の実施形態では、アポリポタンパク質はａｐｏＥであり、抗体は抗ａｐｏＥ抗体である。特定の実施形態では、アポリポタンパク質アイソフォームはａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択されるａｐｏＥアイソフォームであり、抗体は抗ａｐｏＥ２、抗ａｐｏＥ３及び抗ａｐｏＥ４抗体からなる群から選択される。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明のキットのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面、好ましくはポリスチレン表面に結合させる。
【０１５１】
本発明のキットは、キットにより構成される抗体が特異的な特定のアポリポタンパク質又は特定のそのアイソフォームに特異的な第２の抗体を含まない。しかしながら、特定の実施形態では、キットにより構成される抗体が特定のアポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体である場合、キットは、該特定のアポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体を更に含んでいてもよい。
【０１５２】
特定の実施形態では、本発明のキットはレポーター抗体を更に含み、該レポーター抗体は、上記キットにより構成されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体に特異的である。特定の代替的な実施形態では、本発明のキットのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体は、検出可能な試薬を含む。本発明において好適な検出可能な試薬は、本発明の第１の方法において上述されており、本明細書の一部をなす。
【０１５３】
更なる実施形態では、本発明は、サンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するか、サンプル中の所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するか、被験体におけるアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定するか、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定するか、又は被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定するための上記のキットの使用に関する。特定の実施形態では、本発明は、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するための上記のキットの使用に関する。更に特定の実施形態では、本発明は、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化する上に記載のキットの使用であって、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がアルブミンでブロッキングされ、更に好ましくはアルブミンがＢＳＡである、使用に関する。これらの決定の特定の詳細は本明細書において記載されており、本明細書の一部をなす。
【０１５４】
したがって、本発明は以下の態様に関する：
１．  サンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質又はそのアイソフォームが結合した表面と該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを、抗体とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体を検出することと、
を含む、方法。
２．  アポリポタンパク質がａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択される、態様１による方法。
３．  サンプル中の所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）サンプルとポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質の結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質に特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な第１の抗体及びサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることであって、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行うことと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される第１の複合体及び第２の複合体を検出することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量を決定することと、
を含む、方法。
４．  工程（ｉ）において使用する表面が複数の実体により形成され、工程（ｉｉ）における第１の抗体及び第２の抗体との接触を別個の容器において行い、各容器が表面を形成する複数の実体の一部を含有し、工程（ｉｉｉ）における検出を各容器において別個に行う、態様３による方法。
５．  アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアイソフォームである、態様３又は４による方法。
６．  アポリポタンパク質がａｐｏＥであり、ａｐｏＥアイソフォームがａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択される、態様５による方法。
７．  被験体におけるアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定する方法であって、
（ｉ）アポリポタンパク質アイソフォームが発現される組織に由来する上記被験体のタンパク質含有サンプルと、ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とを、該表面へのアポリポタンパク質アイソフォームの結合に好適な条件下で接触させることであって、表面がそれに結合した上記アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を含有しないことと、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されるアポリポタンパク質が結合した表面と、該アポリポタンパク質アイソフォームに特異的な少なくとも１つの抗体とを、該抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとの複合体の形成に好適な条件下で接触させることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成される複合体の量と遺伝的変異体をコードする対立遺伝子の数とを相関させることによって、アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子量を決定することと、
を含む、方法。
８．  工程（ｉ）において使用する表面が複数の実体により形成され、工程（ｉｉ）が、表面とサンプル中に存在する上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体とを接触させることを更に含み、該接触を第１の抗体とアポリポタンパク質アイソフォームとを含む第１の複合体の形成及び第２の抗体と上記アポリポタンパク質の全アイソフォームとを含む第２の複合体の形成に好適な条件下で行い、第１の抗体及び第２の抗体との接触を、各々が表面を形成する複数の実体の一部を含有する別個の容器において行い、総アポリポタンパク質含量に対するアイソフォームの相対量の決定を、工程（ｉｉ）において得られる第１の複合体及び第２の複合体のレベルに基づいて行い、アポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を、工程（ｉｉｉ）において決定される相対量から決定する、態様７の方法。
９．  アポリポタンパク質アイソフォームをコードする遺伝的変異体がａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアイソフォームをコードする遺伝子である、態様７又は８による方法。
１０．  アポリポタンパク質アイソフォームをコードする遺伝子が、ａｐｏＥ４をコードする遺伝子である、態様９による方法。
１１．  サンプルが血液、血漿、血清、唾液、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される、前述の態様のいずれかによる方法。
１２．  サンプルが好ましくは１０倍〜１０００００倍、好ましくは１００倍〜１０００倍、より好ましくは２００倍の範囲の希釈率の血漿である、前述の態様による方法。
１３．  ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面を結合工程（ｉ）の前にブロッキングする、前述の態様のいずれかによる方法。
１４．  表面をアポリポタンパク質以外のタンパク質及び／又は洗浄剤によりブロッキングする、前述の態様による方法。
１５．  表面をＢＳＡ、カゼイン及びゼラチンからなる群から選択されるタンパク質を用いてブロッキングし、洗浄剤がポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、ポリソルベート２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択される、前述の態様による方法。
１６．  表面をＢＳＡ、好ましくは１％ＢＳＡによりブロッキングする、前述の態様による方法。
１７．  ポリスチレン表面を結合工程（ｉ）の後に洗浄溶液で処理する、前述の態様のいずれかによる方法。
１８．  洗浄溶液が１つ以上の塩を含有する、前述の態様による方法。
１９．  塩がＮａＣｌである、前述の態様による方法。
２０．  洗浄溶液が少なくとも１つの洗浄剤を含有する、態様１７〜１９のいずれかによる方法。
２１．  少なくとも１つの洗浄剤がポリソルベート２０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択される、前述の態様による方法。
２２．  洗浄溶液が酸を含有する、態様１７〜２１による方法。
２３．  酸が２Ｍ  ＨＣｌ又は７０％ギ酸である、前述の態様による方法。
２４．  洗浄溶液が塩基を含有する、態様１７〜２１のいずれかによる方法。
２５．  塩基が２Ｍ  ＮａＯＨである、前述の態様による方法。
２６．  洗浄溶液が還元剤を含有する、態様１７〜２５のいずれかによる方法。
２７．  還元剤が２−メルカプトエタノールである、前述の態様による方法。
２８．  洗浄溶液がプロテアーゼ、酸化試薬又はそれらの組合せを含有しない、態様１７〜２７のいずれかによる方法。
２９．  ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズにより構成される、前述の態様のいずれかによる方法。
３０．  工程（ｉｉｉ）における複合体の検出をＥＬＩＳＡ又は免疫比濁アッセイによって行う、前述の態様のいずれかによる方法。
３１．  免疫比濁アッセイがＬＥＩＴ（ラテックス増強免疫比濁法）である、前述の態様による方法。
３２．  工程（ｉｉｉ）において形成される複合体の検出を、抗アポリポタンパク質抗体に特異的なレポーター抗体を用いて行う、態様１〜３０のいずれかによる方法。
３３．  被験体に由来するサンプルにおいてａｐｏＥ４アイソフォームのレベルを態様１〜３２のいずれかによる方法によって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、ａｐｏＥ４レベルが基準値を超える場合に被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示される、方法。
３４．  被験体においてａｐｏＥ  Ｅ４アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を態様７〜３２のいずれかによる方法によって決定することを含む、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける１つ又は２つのａｐｏＥ４対立遺伝子の存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が高いことが示され、被験体のゲノムにおけるａｐｏＥ４対立遺伝子の非存在により、該被験体が神経変性疾患を患う可能性が低いことが示される、方法。
３５．  神経変性疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ダウン症候群関連認知症、血管性認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症及びクロイツフェルト−ヤコブ病からなる群から選択される、態様３３又は３４による方法。
３６．  神経変性疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）である、前述の態様による方法。
３７．  被験体に由来するサンプルにおいてアポリポタンパク質アイソフォームのレベルを態様１〜３０のいずれかによる方法によって決定することを含む、被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、上記アポリポタンパク質アイソフォームのレベルが基準値を超える場合に被験体が心血管疾患を患う可能性が高いことが示される、方法。
３８．  被験体においてアポリポタンパク質アイソフォームをコードするハプロタイプの対立遺伝子量を態様７〜３０のいずれかの方法によって決定することを含む、被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定する方法であって、被験体のゲノムにおける上記アポリポタンパク質アイソフォームの１つ又は２つの対立遺伝子の存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより高いことが示され、被験体のゲノムにおける上記アポリポタンパク質アイソフォームの対立遺伝子の非存在により、該被験体が心血管疾患を患う可能性がより低いことが示される、方法。
３９．  アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＥアイソフォームであり、心血管疾患がＩＩＩ型高リポタンパク血症、アポリポタンパク質ｅ−ｄの欠損に起因する異常βリポタンパク質血症、家族性高βリポタンパク質血症及びプレβリポタンパク質血症、高脂血症を伴う家族性高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症性黄色腫症を伴う高脂血症、ブロードβリポタンパク質血症、浮性βリポタンパク質血症及び冠動脈疾患からなる群から選択される、態様３７又は３８による方法。
４０．  アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＡＩであり、心血管疾患が低αリポタンパク質血症である、態様３７又は３８による方法。
４１．  アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＣＩＩであり、心血管疾患がＩｂ型高リポタンパク血症である、態様３７又は３８による方法。
４２．  アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＣＩＩＩであり、心血管疾患が高トリグリセリド血症と関連したａｐｏＣＩＩＩ欠損症である、態様３７又は３８による方法。
４３．  ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面とアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体とを含むキットであって、該アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な第２の抗体を含まない、キット。
４４．  キット内に存在する抗体がアポリポタンパク質アイソフォームに特異的である場合に、キットが上記アポリポタンパク質の全アイソフォームに結合することが可能な第２の抗体を更に含む、態様４３によるキット。
４５．  アポリポタンパク質がａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択され、アポリポタンパク質アイソフォームがａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＶ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＥ及びａｐｏＪ（クラステリン）からなる群から選択されるアポリポタンパク質のアイソフォームである、態様４３又は４４によるキット。
４６．  アポリポタンパク質がａｐｏＥであり、ａｐｏＥアイソフォームがａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４からなる群から選択される、態様４５によるキット。
４７．  ポリスチレン表面又はポリカーボネート表面がＥＬＩＳＡプレート、ｌｕｍｉｎｅｘビーズ又は比濁ビーズにより構成される、態様４３〜４６のいずれかによるキット。
４８．  レポーター抗体を更に含み、該レポーター抗体がキットのアポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体に特異的である、態様４３〜４７のいずれかによるキット。
４９．  アポリポタンパク質又はそのアイソフォームに特異的な抗体が検出可能な試薬を含む、態様４３〜４７のいずれかによるキット。
５０．  サンプル中のアポリポタンパク質又はそのアイソフォームを検出及び／又は定量化するか、サンプル中の所与のアポリポタンパク質のアイソフォームの相対量を、該アポリポタンパク質の総含量に対して決定するか、被験体におけるアポリポタンパク質アイソフォームの発現と関連したハプロタイプの対立遺伝子量を決定するか、被験体が神経変性疾患を発症する可能性を決定するか、又は被験体が心血管疾患を発症する可能性を決定するための態様４３〜４９のいずれかによるキットの使用。
【０１５５】
本発明を以下の実施例を用いて下記に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単なる例示として解釈される。
【実施例】
【０１５６】
実施例１．  ＥＬＩＳＡによるＡｐｏＥ４検出
材料及び装置
高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルプレート）。同様の結果をもたらす代替的なＥＬＩＳＡプレートのタイプ及びブランドを使用することができる。
ＴＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Thermo-Fisher、＃ＰＩ−３７５３５）。特にゼラチン、ＢＳＡ、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ−２０を含む、同様の結果をもたらす代替的なブロッキング試薬が使用されている。
ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン４Ｅ４（NovusBiologicals、＃ＮＢＰ１−４９５２９）。代替的なａｐｏＥ  Ｅ４に特異的な抗体が使用されている（ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン５Ｂ５（IBL  ＃１００２５）；ａｐｏＥ  Ｅ４に特異的なマウスモノクローナル抗体、クローン１Ｆ９（MBL、＃Ｍ０６７−３））。
全ａｐｏＥに対するウサギポリクローナル抗体（SantaCruzBiotechnology,Inc.、＃ｓｃ−９８５７３）
Sigma-Aldrich製のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）
ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体
ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Biorad）
ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ（TECAN）
ＥＬＩＳＡ分光光度計（TECAN）
【０１５７】
検出方法
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＳＢ）を２００μｌ添加することによって、室温（ＲＴ）で１６時間ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングする。
ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎにおいて３００μｌのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で２回洗浄する。
ＴＢＳ＋２０％ＳＢ中の２００倍希釈血漿１００μｌをＲＴで１時間インキュベートする。
ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎにおいて３００μｌのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄する。
ＴＢＳ＋２０％ＳＢで２０００倍希釈した５０μｌのレポーター抗体：４Ｅ４抗体とともにＲＴで４５分間インキュベートする。
ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎにおいて３００μｌのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄する。
ＴＢＳ＋２０％ＳＢ中の抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（１００００倍）５０μｌとともに３０分間インキュベートする。
ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎにおいて３００μｌのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄する。
１００μｌの（de）ＴＭＢを添加することによって暗条件で１０分間展開させる。
１００μｌの２．１５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させる。
プレートを分光光度計において７５０ｎｍを参照として４５０ｎｍで読み取る。
【０１５８】
２０倍〜８００００倍超の範囲の異なる希釈率の血漿サンプルを分析した。最良の識別結果が１００倍〜１０００倍の範囲で得られる。本明細書により示されるアッセイについては、他に記述がない限り、用いる血漿希釈率は２００倍である。
【０１５９】
代替的には、５Ｂ５及び１Ｆ９等のａｐｏＥ  Ｅ４に特異的な他のモノクローナル抗体を使用したが、最良の結果が４Ｅ４クローンで得られた。
【０１６０】
インキュベーション時間は、結果の重大な変動なしに短縮することができる。
【０１６１】
種々の体液を本明細書により記載されるプロトコルによって分析することができるが、サンプルの最適な希釈率を出発ａｐｏＥ濃度に応じて決定する必要がある。
【０１６２】
結果
血漿サンプルにおけるａｐｏＥ  Ｅ４の非存在／存在の識別
ＡｐｏＥ４の存在／非存在を、上記のプロトコルを用い、ポリスチレンプレート及びＥ４アイソフォームに特異的なモノクローナル抗体を使用することによって検出した。リアルタイムＰＣＲによって予め遺伝子型決定した個体（ｅ２／ｅ３、ｎ＝１６；ｅ２／ｅ４、ｎ＝４；ｅ３／ｅ３、ｎ＝１４１；ｅ３／ｅ４、ｎ＝５９；ｅ４／ｅ４、ｎ＝１０）に由来する２３０個の血漿サンプルを分析した。アッセイ（７３個のＡｐｏＥ４キャリア、１５７個の非ＡｐｏＥ４キャリア）の検証により、リアルタイムＰＣＲによるＡｐｏＥ遺伝子型決定との１００％の一致が明らかとなった（図１及び表１を参照されたい）。
【０１６３】
【表１】
2018533022.tif 000002
【０１６４】
表１及び図２に示す結果によると、ホモ接合性ＡＰＯＥ  ｅ４／４に由来する血漿サンプルは、ヘテロ接合性ＡＰＯＥ  ｅ３／ｅ４及びｅ２／ｅ４よりも高い吸光度読み取り値を有する傾向があり、ｅ４ホモ接合性とヘテロ接合性とを区別することが可能であることが示唆されるが（図３を参照されたい）、群間に幾らかの重複が見られる。
【０１６５】
血漿サンプルにおけるヘテロ接合性／ホモ接合性ＡＰＯＥ  ε４キャリアの識別
代替的には、ヘテロ接合性サンプルとホモ接合性サンプルとの更なる識別は、一方がａｐｏＥ  Ｅ４に特異的であり、他方が総ａｐｏＥレベルを決定するための二重ＥＬＩＳＡアッセイを各サンプルについて行うことで達成することができる（レポーター抗体：ｐａｎ−ａｐｏＥ抗体、例えばポリクローナル−ｐａｎ−ａｐｏ、SantaCruzBiotech.、Ｈ−２２３、＃ｓｃ−９８５７３）。図４に示されるように、ａｐｏＥ  Ｅ４／総ａｐｏＥの比率は、ＡＰＯＥ  ε４対立遺伝子量の良好な代用となる。識別力は、研究した３つの希釈率について良好である（図４）。
【０１６６】
ポリスチレン表面への種々のアポリポタンパク質の結合
ポリスチレン表面への他のアポリポタンパク質の結合を調査するために、或る特定のアポリポタンパク質に特異的な種々のレポーター抗体を使用して、上記のＥＬＩＳＡプロトコルを行った。結果の分析により、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、総ａｐｏＥ及びクラステリンがａｐｏＥ  Ｅ４と同様にプレートに結合することが可能であることが示された（図５を参照されたい）。
【０１６７】
ポリスチレン表面へのａｐｏＥの安定した結合
ａｐｏＥ−ポリスチレン結合の性質を更に特性化するために、ポリスチレンプレートに結合したａｐｏＥを除去する、塩（０Ｍ〜２．４Ｍ  ＮａＣｌ）又は洗浄剤（０％〜０．５％のポリソルベート２０又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含有する種々の緩衝液の能力を分析した。この目的で、血漿（２００倍希釈）中に存在するａｐｏＥの結合後に、ウェルを対象の種々の緩衝液とともにＲＴで１時間インキュベートし、洗浄し、アッセイを上述のように継続した。図６に示されるように、漸増濃度のＮａＣｌ又は洗浄剤のいずれかの存在が、塩又は洗浄剤を含まない対照と比較してａｐｏＥの検出を向上させる。これらの結果により、結合が静電力及び疎水性力の両方の組合せによって仲介されることが示唆される（図６）。
【０１６８】
ｐＨ２〜１０の範囲のｐＨに応じたａｐｏＥ−ポリスチレン結合の安定性も、ＢＳＡベースのブロッキング溶液又はＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋのいずれかでブロッキングしたウェルにおいて分析した（図７）。ＢＳＡでブロッキングしたポリスチレンウェルへのａｐｏＥの結合は、研究した範囲のｐＨの影響を殆ど受けなかった。興味深いことに、ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋでブロッキングしたポリスチレンウェルへのａｐｏＥの結合は、５未満のｐＨで不安定であり（図７）、ＢＳＡの存在がそれ自身の緩衝能のために、より安定した微小環境を維持するのに役立ち得ることが示唆された。したがって、ＢＳＡ溶液でブロッキングしたウェル上で更なる安定性分析を行った。
【０１６９】
より厳しい条件も、以下のものによる５６℃で１時間の処理によってアッセイした（図８を参照されたい）：
強酸（２Ｍ  ＨＣｌ又は７０％ギ酸）、
強塩基（２Ｍ  ＮａＯＨ）、
陰イオン性洗浄剤と還元剤との組合せ（２％ＳＤＳ及び０．７％２−メルカプトエタノール、「ストリッピング緩衝液」）、
次亜塩素酸ナトリウム（２００００ｐｐｍ）、及び、
酵素洗浄剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｌｅｎｚ（登録商標）清浄剤、BeckmanCoulter）。
【０１７０】
興味深いことに、プレートに結合したａｐｏＥを完全に除去することが可能であった試薬は、消化（酵素洗浄剤）又は酸化（次亜塩素酸ナトリウム）のいずれかによりタンパク質を破壊する試薬のみである（図８）。
【０１７１】
これらの結果から、ａｐｏＥ−ポリスチレン結合相互作用が高度に安定し、強い洗浄剤、酸及び塩基洗浄に耐えることが示される。これらの特性により極めて厳しく、特異的な条件下での免疫測定、タンパク質−マイクロアレイ分析、比濁アッセイ等を行うことが可能であり、付加的な精製、分画又は濃縮手順の必要がなくなる。
【０１７２】
同様の結果が、ポリスチレンへの他のアポリポタンパク質の結合について観察された。したがって、同様の結論が異なるアポリポタンパク質についての他の手順にも当てはめられる。
【０１７３】
実施例２．  比濁アッセイによるＡｐｏＥ４検出
材料及び装置
血漿サンプル：１１個のＡＰＯＥ  ｅ３／ｅ３サンプル及び６個のＡＰＯＥ  ｅ４／ｅ４サンプル
ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋでコーティングされたＬＥＩＴ白色ミクロスフェア−ＮＨ２、Ｐｒｏｔ．２０１４１２２２１４３ＣＭ、＃１４３ＣＭ１
分光光度計、Ｒｅｆ．ＵＶ−３１００ＰＣ（VWR）、コード：ＰＤＸ−１００４
Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ  Ｆ１  ２μＬ〜２０μＬ、Ｒｅｆ．４６４１０６０（Thermoscientific、VWR）、コード：ＰＤＸ−１００９
Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ  Ｆ１  ２０μＬ〜２００μＬ、Ｒｅｆ．４６４１０８０（Thermoscientific、VWR）、コード：ＰＤＸ−１０１０
ＭＩＬＩ−Ｑ  ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＡ＋、Ｒｅｆ．Ｚ００ＱＳＶＣ０１
Ｃｏｍｂｉ  ｆｒｉｄｇｅ  Ｌｉｅｂｈｅｒｒ、Ｒｅｆ．ＣＮ４０５６、コード：ＰＤＭ−１０００
Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ、Ｒｅｆ．ＶＸ２００（Labnet、Erabiotech）、コード：ＰＤＸ−１０１３
Ｏｐｔｉｍａ加熱循環浴、Ｒｅｆ．ＴＣ１２０−ＳＴ１２（Grant、VWR）、コード：ＰＤＸ−１０２８
【０１７４】
ラテックス増強免疫比濁法（ＬＥＩＴ）に基づく比濁アッセイは、ポリスチレンビーズの使用に基づく。したがって、本発明者らは、この技術を、ＥＬＩＳＡプレートについて示されたようなポリスチレンとのそれらの高度に安定した高親和性相互作用を利用するａｐｏＥ  Ｅ４及び他のアポリポタンパク質の分析に用いた。
【０１７５】
ＬＥＩＴはＥＬＩＳＡよりも感度が低いが、興味深いことに、アポリポタンパク質等の比較的高濃縮の分析物に対して大きな利点をもたらす。ＬＥＩＴにより、完全に自動化されたランダムアクセス汎用臨床化学分析装置での５分間〜２０分間のランニング試験が可能となる。ＬＥＩＴに使用されるＥＬＩＳＡに対してより高い原料のコストは、時間の節約、臨床検査室における技術の容易さ及び有用性によって完全に埋め合わせられる。このため、ＬＥＩＴがａｐｏＥ決定について有用な技法と考えられる。
【０１７６】
ＬＥＩＴ技術及びモノクローナル４Ｅ４を用いたＡＰＯＥ  ｅ３／ｅ３血漿サンプル及び６個のＡＰＯＥ  ｅ４／ｅ４血漿サンプルの予備分析により、手順によりＡＰＯＥ  ｅ４キャリアと非キャリアとを区別することが可能であることが示された（図９）。
【０１７７】
検出方法（試験１）
希釈標準溶液の調製：
１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の０．１７６ｍｇ／ｍＬモノクローナル抗体抗ａｐｏＥ  ４溶液０．５ｍＬ。
８８μＬのモノクローナル抗体を４１２μＬに溶解する。
プロトコル：
１．  １４．６μＬのＬＥＩＴ白色ミクロスフェア−ＮＨ２をエッペンドルフチューブに移し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１３１．４μＬのＰＢＳを添加する。マイクロピペットで均質化し、３７℃で２分間インキュベートする。
２．  ３．８５μＬのａｐｏＥサンプル溶液を同じエッペンドルフチューブに添加し、マイクロピペットで均質化し、再び３７℃で２分間インキュベートする。
３．  ５０μＬのモノクローナル抗体溶液を添加し、マイクロピペットで均質化し、全量を石英キュベットに移す。
４．  ５分間の最短時間かつ１０分間の最長時間にわたって吸光度を読み取る。
【０１７８】
検出方法（試験２）
希釈標準溶液の調製：
１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の０．０４４ｍｇ／ｍＬモノクローナル抗体抗ａｐｏＥ  ４溶液０．５ｍＬ。
２２μＬのモノクローナル抗体を４７８μＬに溶解する。
プロトコル：
１．  １４．６μＬのＬＥＩＴ白色ミクロスフェア−ＮＨ２をエッペンドルフチューブに移し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１３１．４μＬのＰＢＳ（＃１４４ＣＭ１）を添加する。マイクロピペットで均質化し、３７℃で２分間インキュベートする。
２．  ３．８５μＬのａｐｏＥサンプル溶液を同じエッペンドルフチューブに添加し、マイクロピペットで均質化し、再び３７℃で２分間インキュベートする。
３．  ５０μＬのモノクローナル抗体溶液を添加し、マイクロピペットで均質化し、全量を石英キュベットに移す。
４．  ５分間の最短時間かつ１０分間の最長時間にわたって吸光度を読み取る。
【０１７９】
結果
試験１
異なる時点でのＬＥＩＴによるａｐｏＥ分析についての試験１及び試験２の結果を、表２及び表３にそれぞれ示す。
【０１８０】
【表２】
2018533022.tif 000003
【０１８１】
【表３】
2018533022.tif 000004
【０１８２】
試験１によるデータから、本発明の著者らにより、ＬＥＩＴアッセイが、１つの３／４血漿サンプルを除いて異なるａｐｏＥ血漿サンプルを区別することが可能であると結論付けられた（表２を参照されたい）。したがって、ＡｐｏＥ４ラテックス比濁アッセイに最適な以下の実験条件が開発された（表４を参照されたい）：
試験当たり２．７５μｇの抗ＡｐｏＥ４
３．８５μｌの血漿サンプル
２００μｌの全アッセイ量。
【図１】
2018533022.tif 000005
【図２】
2018533022.tif 000006
【図３】
2018533022.tif 000007
【図４】
2018533022.tif 000008
【図５】
2018533022.tif 000009
【図６】
2018533022.tif 000010
【図７】
2018533022.tif 000011
【図８】
2018533022.tif 000012
【図９】
2018533022.tif 000013
【国際調査報告】
2018533022.tif 000014
2018533022.tif 000015
2018533022.tif 000016
2018533022.tif 000017
2018533022.tif 000018
2018533022.tif 000019