(57)【要約】  そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのα鎖をコードする配列を含むことを特徴とする宿主細胞、および組換えｈＣＧを製造するための該宿主細胞の使用。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号４に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号１の核酸と少なくとも９７％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号４の核酸と少なくとも９７％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
そのゲノム中に組み込まれた、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性を有する配列；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列；および配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性を有する配列から選択されるｈＣＧのα鎖をコードする配列を含むことを特徴とする細胞。
【請求項６】
ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのα鎖をコードする配列をさらに含むことを特徴とする、ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞。
【請求項８】
そのゲノム中に組み込まれた、α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡをさらに含むことを特徴とする、請求項５から７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのβ鎖をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項５から８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
組換えタンパク質を細胞中で製造する方法であって、請求項５から９のいずれかに記載の細胞を適切な培地中で培養すること、ならびに前記細胞および／または前記培地から組換えタンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１１】
組換えｈＣＧを細胞中で製造する方法であって、適切な培地中で細胞を培養すること、ならびに前記細胞および／または前記培地から組換えタンパク質（ｈＣＧ）を回収することを含み、細胞が、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのα鎖をコードする配列を含むＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、方法。
【請求項１２】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えｈＣＧ（「ｒｈＣＧ」または「ｒｅｃｈＣＧ」）であって、請求項５から９のいずれかに記載の細胞中で製造される組換えｈＣＧ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症の治療における使用のためのゴナドトロピンに関する。特に、それはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピンは、男性および女性における性腺機能を調節する一群のヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。ゴナドトロピンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）を含む。
【０００３】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、妊娠中にヒト胎盤から主に分泌され、黄体の維持を補助する。ｈＣＧは、他の糖タンパク質ホルモンであるＬＨおよびＦＳＨとも共通な９２アミノ酸のアルファサブユニット（α鎖）、およびホルモン特異性を決定するｈＣＧに固有の１４５アミノ酸のベータサブユニット（β鎖）を含む。各サブユニットは、複雑な炭水化物残基の付加によって翻訳後に修飾される。アルファサブユニットは、アミノ酸５２および７８に２−Ｎ結合グリコシル化部位を含み、そして、ベータサブユニットは、アミノ酸１３および３０に２−Ｎ結合グリコシル化部位を含み、アミノ酸１２１、１２７、１３２および１３８に４つのＯ−結合グリコシル化部位を含む。
【０００４】
妊娠中の女性の尿から抽出されたｈＣＧ［Ｃｈｏｒａｇｏｎ（Ｆｅｒｒｉｎｇ）］が、不妊治療において長年にわたり使用されてきた。尿から抽出されたｈＣＧの製造は、大量の尿の収集および処理を伴う。ｈＣＧの組換え版であるＯｖｉｔｒｅｌｌｅ（Ｓｅｒｏｎｏ）も、不妊症治療に利用可能である。この組換え製品はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、ヒト尿から製造されるｈＣＧとは異なる薬物動態プロファイルを有する。
【０００５】
存在する種々のアイソフォームの量の差異に関係する、ｈＣＧの調製に関連するかなりの不均一性が存在する。個々のｈＣＧアイソフォームは、同一のアミノ酸配列を示すが、それらが翻訳後修飾される程度が異なる；特定のアイソフォームは、炭水化物分枝構造の不均一性と、異なる量のシアル酸（末端糖）取り込みを特徴とするが、その両方が特異的なアイソフォーム生物活性に影響を与えるようである。
【０００６】
組換えｈＣＧ（「ｒｈＣＧ」）産物のグリコシル化は、宿主細胞株中に存在するグリコシルトランスフェラーゼの範囲を反映する。既存のｒｈＣＧ製品であるＯｖｉｔｒｅｌｌｅは、改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）に由来する。ＣＨＯ由来ｒｈＣＧにおけるグリカン修飾の範囲は、尿由来の天然産物において見られる範囲よりも限定されている。ＣＨＯ由来ｒｈＣＧにおいて見られる減少したグリカン不均一性の例は、バイセクティンググルコサミンの欠如ならびにコアフコシル化およびアセチルラクトサミン伸長の含有量低下を含む。加えて、ＣＨＯ細胞はα２，３−結合を用いてシアル酸を付加することしかできない（Ｋａｇａｗａら，１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉら，１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎら，１９９０）。
【０００７】
これまでに不妊症の治療に使用されてきたヒト尿ｈＣＧ（すなわち、妊婦の尿から抽出されたｈＣＧ）は、実際には胎盤ｈＣＧ、（ヒトの）胎盤で産生され、次いで尿中に排泄されたｈＣＧである。このｈＣＧは医薬品としての使用のために尿から抽出される。Ｂｏｕｓｆｉｅｌｄら（Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ（２０１１）１２：２８９−３０２）は「下垂体性ゴナドトロピンはα２，３−結合シアル酸とα２，６−結合シアル酸の両方を有しているが、胎盤ｈＣＧとチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生された組換えゴナドトロピンはα２，３−結合シアル酸のみを有している」と述べている。よって、ヒト尿ｈＣＧ（胎盤で産生される）はα２，３−シアリル化のみを含む（ＣＨＯ細胞株由来の組換え産物と同様）。よって、ｈＣＧを含む既知の医薬組成物は、α２，３−結合シアル酸のみを含み、α２，６−結合シアル酸は含まない。
【０００８】
下垂体、血清または閉経後尿ＦＳＨと比較した場合、組換えＦＳＨ調製物（Ｏｒｇａｎｏｎ）は、等電点（ｐＩ）が４未満のＦＳＨ（酸性アイソフォームとみなされる）の量の点で異なることが実証されている（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，１９９５）。ＦＳＨの尿調製物における酸性アイソフォームの量は、組換え産物であるＧｏｎａｌ−ｆ（Ｓｅｒｏｎｏ）およびＰｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ）と比較してはるかに高かった（Ａｎｄｅｒｓｅｎら，２００４）。硫酸塩で修飾され負に荷電したグリカンの含有量がＦＳＨにおいては低いことから、これはｒＦＳＨ中のシアル酸のモル含有量がより低いことを反映しているにちがいない。天然のＦＳＨよりもシアル酸含有量が低いことは、市販されている両ＦＳＨ製品の特徴であり、したがって、製造プロセスの制限を反映しているにちがいない（ＢａｓｓｅｔｔとＤｒｉｅｂｅｒｇｅｎ，２００５）。ＦＳＨの循環寿命が、様々なソースからの物質について文書化されている。これらの物質の一部は、酸性の高さを負電荷の高さと同一視して、そのｐＩによって特徴づけられる全体的な分子の電荷に基づき分画されている。全体的な分子電荷への主要な寄与因子は、各ＦＳＨ分子の総シアル酸含有量である。例えば、ｒＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）は約８ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有するが、尿由来ＦＳＨはより高いシアル酸含有量を有する（ｄｅ  Ｌｅｅｕｗら，１９９６）。ラットにおける対応する血漿クリアランス速度は０．３４および０．１４ｍｌ／ｍｉｎである（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，２００３）。組換えＦＳＨのサンプルを高ｐＩ画分と低ｐＩ画分に分割した別の例では、高ｐＩ（低シアル酸含有量）画分のインビボ効力が低下しており、より短い血漿半減期を有していた（Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏら，１９９９）。出願人は、ＦＳＨと同様に、既知の、ＣＨＯ由来の、組換えｈＣＧ製品（例えばＯｖｉｔｒｅｌｌｅ）もまた、４未満の等電点（ｐＩ）を有するｈＣＧ（酸性アイソフォームと考えられる）の量が尿中ｈＣＧよりも少ないことを見出したが、これもまた、尿中ｈＣＧと比較して公知のｒｈＣＧ製品のシアル酸含有量が低いことを反映している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｇａｗａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３（３３），１７５０８−１７５１５，１９８８
【非特許文献２】Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３（８）．３６５７−３６６３，１９８８
【非特許文献３】Ｓｖｅｎｓｓｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６５（３４）：２０８６３−２０８６８，１９９０
【非特許文献４】Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ（２０１１）１２：２８９−３０２
【非特許文献５】Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．１６（６），７６５−７８７，１９９５
【非特許文献６】Ａｎｄｅｒｓｅｎら，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．９（２），２３１−２３６，２００４
【非特許文献７】ＢａｓｓｅｔｔとＤｒｉｅｂｅｒｇｅｎ，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．１０（２），１６９−１７７，２００５
【非特許文献８】Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．６９（２），３７９−３８９，２００３
【非特許文献９】Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １４，１１６０−１１６７，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人は、ＣＨＯ細胞株由来のｒｈＣＧ製品、Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅよりも高い酸性プロファイルを有し、また、より高いシアル酸含有量を有するヒト由来の組換えｈＣＧ（すなわち、例えばヒト細胞株を改変することによって作製されたヒト細胞株において産生または発現される組換えｈＣＧ）を開発した。このｒｈＣＧは、ＷＯ２０１１／０４２６８８として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４号の主題である。α２，３−結合シアル酸およびα２，６−結合シアル酸の両者の混合を有する組換えｈＣＧは、ｒｈＣＧとα２，３シアリルトランスフェラーゼの両方を発現するようにヒト細胞株を改変することにより作製された。発現産物は、高度に酸性であり、例えば１９．１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量［シアル酸とタンパク質のモル比で表される］を有し、α２，３−結合シアル酸およびα２，６−結合シアル酸の両者の混合を有し、後者は内因性のシアリルトランスフェラーゼ活性によって提供される。出願人の研究は、シアル酸結合のタイプα２，３−またはα２，６−がｈＣＧの生物学的なクリアランスに劇的な影響を及ぼし得ることを示している。ＣＨＯ細胞株とは対照的に、ヒト細胞株はα２，３結合とα２，６結合の両方によって結合されたシアル酸を有する組換えｈＣＧを発現することができる。
【００１１】
ＷＯ２０１１／０４２６８８の細胞株は、ヒト由来組換えｈＣＧをよく発現する。しかし、この細胞株はまた、比較的高レベルの遊離のβ鎖（遊離ベータサブユニット）も発現し、（この遊離β鎖をｈＣＧ製品から除去するための）精製が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願人は今回、ｒｈＣＧとα２，３シアリルトランスフェラーゼの両方を発現し、低下した量の遊離β鎖と共にｒｈＣＧを産生し、それにより収量を改善し、必要な製品精製レベルを低下させる、新たな細胞株を開発した（図７参照）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】最適化されたｈＣＧアルファ配列の核酸配列および導かれるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ｈＣＧベータ配列の核酸配列および導かれるアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＳＴ３ＧＡＬ４の核酸配列および導かれるアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ｐｈＣＧａｌｐｈａ／ｂｅｔａ発現ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図５】α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧＡＬ４）発現ベクターを示す図である。
【図６】クーマシーブルーでＩＥＦ染色した、本発明に従う組成物中のｒｈＣＧアイソフォーム（レーン４、５、６および７，１５μｇ／レーン）；先行技術のＣＨＯ由来組成物であるＯｖｉｔｒｅｌｌｅ（レーン２，１５μｇ）；および妊娠中の女性から得られたヒト尿製品であるＮｏｖａｒｅｌ（レーン３，１５μｇ）の検出を示す図である。
【図７】アルファサブユニットの「最適化された」核酸配列を含む本発明の細胞を用いて製造されたｈＣＧ（「アルファ−ベータｈＣＧ」）および遊離のベータ鎖（「ベータｈＣＧ」）の濃度を、ＷＴ（野生型）アルファサブユニットを含む比較例の細胞において製造されたｈＣＧ（「アルファ−ベータｈＣＧ」）および遊離のベータ鎖（「ベータｈＣＧ」）の濃度と比べた、比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明によれば、そのゲノムに組み込まれた、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列）；配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択されるｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列を含むことを特徴とする（例えば、宿主）細胞が提供される。好ましくは、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、ＡＨ００７３３８として登録されている配列ではない（すなわち、好ましくは、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は配列番号５に示されているものではない）。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ、例えば、配列番号３に記載の配列をさらに含んでいてもよい。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのβ鎖をコードする（核酸）配列、例えば、配列番号２に記載の配列をさらに含んでいてもよい。
【００１５】
宿主細胞は、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＧＴ−５ｓ細胞などであり得る。好ましくは、細胞は、ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００１６】
本発明によれば、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列をさらに含むことを特徴とする、ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞が提供される。ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択されうる。好ましくは、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、ＡＨ００７３３８として登録されている配列ではない。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号３に記載の配列をさらに含んでいてもよい。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのβ鎖をコードする（核酸）配列、例えば、配列番号２に記載の配列をさらに含んでいてもよい。
【００１７】
本明細書中で使用される「ｈＣＧのα鎖をコードする配列」または「ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列」という用語は、ｈＣＧのα鎖はＦＳＨ（およびＬＨ）のものと同じであるため、ＦＳＨのα鎖をコードする配列（またはＬＨのα鎖をコードする配列）もまた意味する。
【００１８】
本明細書における用語「核酸配列」は、ペプチド、タンパク質などのようなポリペプチドをコードする任意の核酸分子に関する。これらの核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体で出来ていてもよい。しかし、ＤＮＡで出来ている核酸分子が好ましい。
【００１９】
当業者は、出発ヌクレオチド配列の改変が、コドン使用に関する最適化のプロセスを説明することを明確に認識している。導入された変化は、改変された配列と出発配列とを比較することによって容易に同定されうる。さらに、両方の配列（すなわち、出発配列と最適化された配列）は、同じアミノ酸配列をコードすることになる。
【００２０】
ヒトｈＣＧのα鎖のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１１／０４２６８８に開示されており（その文献において配列番号１と呼ばれている）、ＦｉｄｄｅｓとＧｏｏｄｍａｎ  １９７９に記載されているものである。これはＡＨ００７３８８の下で登録されており、以下に配列番号５として示されている。ヒトｈＣＧのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号２に示されており、ＮＰ＿０００７２８として登録されている。これらのアミノ酸配列は、ヒトｈＣＧのα鎖およびβ鎖の野生型アミノ酸配列に対応している。本発明の目的のための「野生型核酸配列」または「出発核酸配列」という用語は、宿主細胞における（過剰）発現のために使用されることが意図された核酸であり、宿主細胞におけるコドン使用に適合されていない、タンパク質をコードする実際の野生型核酸配列である核酸配列に関する。本発明の目的のための「最適化された核酸配列」という用語は、非改変／出発核酸配列の配列を適合させることによって、宿主細胞における発現のために改変された配列に関する。最適化された核酸配列は、非改変配列によってコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。出願人は、ｈＣＧのα−鎖をコードする最適化された配列を開発した（例えば、配列番号１および４、図１を参照）。
【００２１】
本発明によれば、さらなる態様において、配列番号１に記載の核酸配列；配列番号４に記載の核酸配列；配列番号１の核酸と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する核酸配列（例えば、配列番号１の核酸と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する核酸配列）；および配列番号４の核酸と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する核酸配列（例えば、配列番号４の核酸と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する核酸配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ｈＣＧのα鎖をコードするポリヌクレオチド配列））が提供される。
【００２２】
本発明によれば、さらなる態様において、組換えｈＣＧを細胞中で製造する方法であって、適切な培地中で細胞を培養すること、ならびに前記細胞および／または前記培地から組換えタンパク質（ｈＣＧ）を回収すること（例えば、細胞培養上清から組換えｈＣＧを回収すること）を含み、細胞（宿主細胞）が、そのゲノム中に組み込まれた、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択されるｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列を含む、方法が提供される。好ましくは、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、ＡＨ００７３３８として登録されている配列ではない。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ、例えば、配列番号３に記載の配列をさらに含んでいてもよい。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのβ鎖をコードする（核酸）配列、例えば、配列番号２に記載の配列をさらに含んでいてもよい。本方法は、前記細胞および／または前記培地から得られた組換えｈＣＧを精製する（例えば、組換えｈＣＧを細胞培養上清から精製する）１つまたは複数の工程をさらに含むことができる。
【００２３】
（宿主）細胞は、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＧＴ−５ｓ細胞などであり得る。好ましくは、細胞は、ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００２４】
本発明によれば、さらなる態様において、組換えｈＣＧを細胞中で製造する方法であって、細胞を適切な培地中で培養すること、ならびに前記細胞および／または前記培地から組換えタンパク質（ｈＣＧ）を回収すること（例えば、細胞培養上清から組換えｈＣＧを回収すること）を含み、細胞が、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列を含む、（ＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号の下で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のような）ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、方法が提供される。ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）；配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択されうる。好ましくは、ｈＣＧのα鎖をコードする（核酸）配列は、ＡＨ００７３３８として登録されている配列ではない。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号３に記載の配列をさらに含んでいてもよい。細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、ｈＣＧのβ鎖をコードする（核酸）配列、例えば、配列番号２に記載の配列をさらに含んでいてもよい。本方法は、前記細胞および／または前記培地から得られた組換えｈＣＧを精製する（例えば、組換えｈＣＧを細胞培養上清から精製する）１つまたは複数の工程をさらに含むことができる。
【００２５】
本発明の目的のための「宿主細胞」という用語は、発現すなわち、例えば、ポリペプチドの生産のための核酸配列の転写および翻訳のために一般的に使用される任意の細胞を意味する。特に、「宿主細胞」または「生物体」という用語は、原核生物、下等真核生物、植物、昆虫細胞または哺乳動物細胞培養系に関する。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくは、宿主細胞はヒト細胞であり、さらに好ましくは、ＰＥＲＣ６（登録商標）細胞である。
【００２６】
本発明の意味の中における「組換え核酸分子」という用語は、宿主細胞に導入されることができ、組換え核酸分子内に含まれる核酸配列の発現をもたらすことができる、あらゆる種類の核酸分子を含むことが意図される。この用語は、当技術分野で周知であるような、例えば、プラスミドベクターおよびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスベクター）を含む。
【００２７】
本発明によれば、さらなる態様において、ｈＣＧのα鎖をコードする（第１の）核酸配列を含む組換え核酸分子が提供され、（第１の）核酸配列は、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１４の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列；および配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択される。好ましくは、本発明のこの態様の組換え核酸分子は、ヒトｈＣＧのα鎖をコードする最適化された核酸配列とｈＣＧのβ鎖をコードする核酸配列の両方を含む。好ましくは、（第１の）核酸配列は、宿主細胞において活性なプロモーターの制御下にある。好ましくは、組換え核酸分子は、ｈＣＧのβ鎖をコードする第２の核酸配列をさらに含む。ｈＣＧのβ鎖をコードする第２の核酸配列は、配列番号２に記載の配列であってもよい。第２の核酸配列は、宿主細胞において活性な別個のプロモーターの制御下にあってもよい。第１の核酸配列および／または第２の核酸配列は、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶｉｅプロモーター）の制御下にあってもよい。
【００２８】
本発明によれば、さらなる態様において、上述の組換え核酸分子を含む、または包含する宿主細胞（例えば、ｈＣＧのα鎖をコードする（第１の）核酸配列を含む組換え核酸分子を含む宿主細胞）が提供され、（第１の）核酸配列は、配列番号１に記載の配列；配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列）；配列番号１の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号１の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）；配列番号４に記載の配列；配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の相同性を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９６．５％の配列同一性を有する配列）；配列番号４の配列と少なくとも９７％の相同性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性）を有する配列（例えば、配列番号４の配列と少なくとも９７％の配列同一性（例えば、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する配列）から選択される。
【００２９】
出願人は、本発明の細胞（宿主細胞）、これらの宿主細胞を取り込んだ細胞株、組換え核酸分子、ポリヌクレオチドおよび方法が、高収率および高純度（例えば、遊離のベータ鎖をほとんど有さない）で組換えｈＣＧを製造できることを見出した。
【００３０】
本発明によれば、さらなる態様において、α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えｈＣＧ（「ｒｈＣＧ」または「ｒｅｃｈＣＧ」）が提供され、この組換えｈＣＧは本明細書に記載され、特許請求されているように細胞中で製造される。組換えｈＣＧは、１２ｍｏｌ／ｍｏｌから２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１５．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１４．９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量［シアル酸とタンパク質のモル比で表される］を有することができる。ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、１２．５ｍｏｌ／ｍｏｌから１４．５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量、例えば１２．８ｍｏｌ／ｍｏｌから１３．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有することができる。本発明に従うｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、１３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有することができる。
【００３１】
本発明の実施例において、ｒｈＣＧは単一のアイソフォーム、またはアイソフォームの混合物として存在してもよい。
【００３２】
本発明の方法および細胞によって製造される組換えｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）はα２，３−およびα２，６−シアリル化を含む。シアリル化によって、ｈＣＧ炭水化物構造上に存在するシアル酸残基の量が意味される。α２，３−シアリル化は（当該技術分野において周知のように）２，３位でのシアリル化を意味する；α２，６シアリル化は（これも当該技術分野において周知のように）２，６位のシアリル化を意味する。よって、本明細書において、「全シアリル化の〜％はα２，３シアリル化であり得る」という言い回しは、ｈＣＧ中に存在するシアル酸残基の総数のうち、２，３位においてシアリル化されている％を意味する。「全シアリル化の〜％はα２，６−シアリル化である」という用語は、ｈＣＧ中に存在するシアル酸残基の総数のうち、２，６位においてシアリル化されている％を意味する。「全シアリル化の〜％はα２，８−シアリル化である」という用語は、ｈＣＧ中に存在するシアル酸残基の総数のうち、２，８位においてシアリル化されている％を意味する。
【００３３】
本発明に従う方法および細胞によって製造されるｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の１％から９９％がα２，３−シアリル化であってもよい。本発明に従う方法および細胞によって製造されるｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の１％から９０％がα２，３−シアリル化であってもよい。本発明に従うｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化であってもよく、例えば、全シアリル化の１０％から９０％がα２，３−シアリル化であってもよい。例えば、全シアリル化の２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０または９０％以上がα２，３−シアリル化であり得る。全シアリル化の４５％から８０％がα２，３−シアリル化であってもよく、例えば、全シアリル化の５０％から７０％がα２，３−シアリル化であってもよく、例えば、全シアリル化の５５から６５％がα２，３−シアリル化であってもよい。ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の６５から９５％、例えば、全シアリル化の７０から９０％、例えば、全シアリル化の８５％から９０％である量においてα２，３−シアリル化を含むことができる。
【００３４】
本発明の方法および細胞によって製造されるｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の１％から９９％がα２，６−シアリル化であってもよい。本発明のｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の５から５０％がα２，６−シアリル化であってもよい。例えば、全シアリル化の５から４５％、例えば６から４０％、例えば７から３０％、例えば８から２０％がα２，６−シアリル化であり得る。ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の２０〜７５％、例えば、全シアリル化の３０〜６０％、例えば、全シアリル化の３５％〜４５％の量のα２，６−シアリル化を含むことができる。ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の５から３５％、例えば全シアリル化の１０から２０％の量のα２，６−シアリル化を含むことができる。例えば、全シアリル化の１１〜５５％がα２，６−シアリル化であり得る。
【００３５】
本方法および細胞によって製造されるｒｈＣＧまたはｒｈＣＧ調製物は、場合により、さらにα２，８シアリル化を含んでもよい。本発明のｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、全シアリル化の５％以下がα２，８−シアリル化であってもよく、例えば、全シアリル化の０から４％、例えば０．１〜４％がα２，８−シアリル化であってもよい。本発明のｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、α２，８シアリル化を有していなくてもよい。
【００３６】
本発明に従う方法および細胞によって製造されるｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、（タンパク質＋炭水化物の質量ではなく、タンパク質の質量に基づいて）質量の６％以上（例えば、６％〜１５％、例えば７％〜１３％、例えば８％〜１２％、例えば１１％〜１５％、例えば１２％〜１４％）のシアル酸含有量（ｈＣＧ分子あたりのシアリル化の量）を有しうる。
【００３７】
ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＨＴ１０８０細胞株などのヒト細胞株において製造または発現されてもよい。ｒｈＣＧ（またはｒｈＣＧ調製物）は、ヒト由来細胞株または改変ヒト細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）由来細胞株または改変ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、改変ＨＴ１０８０細胞株またはＨＴ１０８０由来細胞株などにおいて製造または発現されてもよい。好ましい例において、ｒｈＣＧはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）由来細胞株または改変ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株において製造または発現される。ヒト細胞株（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＨＴ１０８０細胞株、ＧＴ−５ｓ細胞株）において製造または発現されるｒｈＣＧは、［細胞株の］内因性シアリルトランスフェラーゼ活性により提供される、いくつかのα２，６−結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含み、また、［細胞株の］内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供される、いくつかのα２，３−結合シアル酸（α２，３シアリル化）を含むであろう。細胞株はα２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて改変されうる。代替的または追加的に、細胞株はα２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて改変されうる。シアリル化を保持するための例えば細胞増殖培地の操作および制御は、既知のプロセスによるよりも、重要性が低い可能性があることから、これは製造方法を簡素化（および、より効率化）しうる。また、本方法は、既知のｒｈＣＧ製品の製造に比べて、産生される塩基性ｒｈＣＧがほとんどないため、より効率的となりうる；より多くの酸性ｒｈＣＧが生成され、塩基性ｈＣＧの分離／除去が問題になることは少ない。
【００３８】
ｒｈＣＧは、例えばα２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて改変されたヒト細胞株を用いて製造されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて製造されうる。ｒｈＣＧは、内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供されるα２，６−結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含んでいてもよい。ｒｈＣＧは、例えばα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて改変されたヒト細胞株を用いて製造されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて製造されうる。
【００３９】
本発明によれば、さらなる態様において、本明細書に記載の方法によって製造または発現される、本明細書に記載の組換えｈＣＧまたは組換えｈＣＧ調製物が提供される。
【００４０】
ｒｈＣＧ構造は、グリカン部分を含む。分枝は、当技術分野で周知のように、グリカンが１，２，３，４もしくはそれ以上の末端糖残基または「アンテナ」を有しうるという結果を伴って、生じうる。本発明の態様に従うｒｈＣＧは、単アンテナ型および／または二アンテナ型および／または三アンテナ型および／または四アンテナ型のグリカン構造を持ったグリカンを有しうる。ｒｈＣＧは、例えば、以下のような相対量を有する、単アンテナ型および／または二アンテナ型および／または三アンテナ型および／または四アンテナ型のグリカン構造を含み得る：０．１から３％の単アンテナ型；６５％から８５％の二アンテナ型；１５から２５％の三アンテナ型および０．５から１．５％の四アンテナ型（例えば、荷電したグリカンのＷＡＸ分析によって示される）。
【００４１】
本発明によれば、さらなる態様において、α２，３−シアリル化およびα２，６−シアリル化を有する組換えｈＣＧ（ｒｈＣＧ）を含む医薬組成物であって、前記組換えｈＣＧが本明細書に開示されている方法および／または細胞によって製造される医薬組成物が提供される。ｒｈＣＧは（例えば、上述のように）１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１５．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１４．９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量［シアル酸対タンパク質のモル比で表される］を有しうる。ｒｈＣＧは、１２．５ｍｏｌ／ｍｏｌから１４．５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量、例えば１２．８ｍｏｌ／ｍｏｌから１３．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有することができる。好ましくは、本発明に従うｒｈＣＧは１３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。
【００４２】
医薬組成物は、ＦＳＨおよび／またはＬＨをさらに含み得る。
【００４３】
ＦＳＨは、当該技術分野において公知の任意の手段によって得ることができる。本明細書中で使用されるＦＳＨは、ヒト由来および組換えＦＳＨを含む。ヒト由来ＦＳＨは、任意の適切な供給源（例えば、尿）から当該技術分野において公知の任意の方法によって精製されうる。ＦＳＨは、例えば、ヒト細胞株において発現される組換えＦＳＨであり得る。組換えＦＳＨを発現および精製する方法は、当該技術分野において周知である。
【００４４】
ＬＨは、当該技術分野において公知の任意の手段によって得られうる。本明細書中で使用されるＬＨは、ヒト由来および組換えＬＨを含む。ヒト由来ＬＨは、任意の適切な供給源（例えば、尿）から当該技術分野において公知の任意の方法によって精製されうる。組換えＬＨを発現および精製する方法は、当該技術分野において既知である。
【００４５】
医薬組成物は、不妊症の治療のためのもの、または治療に使用するためのもの、例えば、補助生殖技術（ＡＲＴ）、排卵誘発または子宮内授精（ＩＵＩ）に使用するためのものであってもよい。医薬組成物は、最終成熟／排卵および黄体形成の誘発、重篤なＬＨおよびＦＳＨ欠乏症を有する女性における卵胞発達の刺激、および／もしくは、黄体サポート（ｒｈＣＧ／ｒＬＨ）のためのもの、またはそれに使用するためのものであってもよい。医薬組成物は、無排卵性ＷＨＯ  ＩＩ型女性の単卵胞発達の誘導のため、またはそれに使用するためのもの（例えば、ｒＬＨを伴うｒｈＣＧ）、ＣＯＨを受けている患者におけるＬＨ初回刺激による多卵胞応答の増強のためのもの（例えば、ｒＬＨを伴うｒｈＬＧ）、着床／妊娠率を改善するためのＣＯＨへの補充（例えば、ｒＬＨを伴うｒｈＬＧ）、および／または補助生殖技術における妊娠率の増大のためのものであってもよい。医薬組成物は、流産の予防および／または早産児の予防のためのもの、またはそれに使用するためのものであってもよい。医薬組成物は、子宮内膜症の治療のためのもの、または、それに使用するためのものであってもよい。
【００４６】
医薬組成物は、例えば、既知のｈＣＧ製剤が使用される医学的適応症において使用されうる。本発明はまた、不妊症の治療のための、またはそのための医薬品の製造における、本明細書に記載の（本発明の態様に従う）ｒｈＣＧおよび／またはｒｈＣＧ調製物の使用も提供する。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、薬物投与の任意の経路、例えば、経口、経腸、非経口、経皮（例えば、パッチ技術）、静脈内、筋肉内、皮下、嚢内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏またはドロップ）のための周知の組成物、または口腔もしくは鼻腔スプレーとして製剤化されうる。典型的な組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１５版（Ｍａｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）の第１４０５から１４１２頁および第１４６１〜８７頁、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ第１４版（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９７５）などに記載されているように、水溶液などの薬剤的に許容可能な担体、塩および防腐剤を含む非毒性の賦形剤、緩衝剤などを含む。適切な水性および非水性の薬剤担体、希釈剤、溶媒または媒体の例は、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような）ポリオール、カルボキシメチルセルロースおよびその適切な混合物、（オリーブ油などの）植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの添加剤も含むことができるが、これらに限定はされない。抗菌剤および抗真菌剤は、微生物の増殖を防ぐために含まれることができ、そして例えば、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含む。さらに、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合がある。
【００４８】
場合によっては、長期間作用させるために、ｈＣＧ（および存在する場合には他の活性成分）の皮下または筋肉内注射による吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性の低い結晶質または非晶質の液体懸濁液の使用によって達成されうる。ｈＣＧの吸収速度は、その溶解速度に依存し、さらには、その溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存しうる。あるいは、非経口的に投与されるｈＣＧ合剤形態の遅延吸収は、ｈＣＧ合剤を油性媒体に溶解または懸濁させることによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中にｈＣＧ（および存在する場合には他の薬剤）のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製されうる。ポリマーに対するｈＣＧの比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、ｈＣＧ放出速度が制御されうる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）などを含む。また、デポー注射用製剤も、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中にｈＣＧを封入することによって調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散されうる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。注射用製剤は、任意の適切な容器、例えば、バイアル、充填済シリンジ、注入カートリッジなどに入れて供給されうる。
【００４９】
製剤（例えば、注射用製剤）は（場合によりＦＳＨ、ＬＨなどと共に）ｈＣＧを含有する医薬組成物を有する製品として供給されうる。２つ以上の活性成分（すなわち、ｈＣＧおよび例えばＦＳＨもしくはＬＨ）が存在する場合、これらは別々にまたは一緒に投与するのに適している場合がある。別々に投与する場合、投与は逐次的でありうる。製品は適切なパッケージに入れて供給されうる。例えば、製品はｈＣＧ、ＦＳＨのいずれか、またはＦＳＨとｈＣＧの両方の組み合わせを含む、多数の充填済シリンジまたはバイアルを含むことができる。シリンジまたはバイアルは、無菌性を維持するために、ブリスターパッケージまたは他の手段で包装されてもよい。製品は、場合により、ｈＣＧおよびＦＳＨ製剤を使用するための説明書を含むことができる。
【００５０】
医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、この分野における日常的な実務に従って調節される。ＧＯＯＤＭＡＮとＧＩＬＭＡＮのＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，第７版を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、非経口投与のための組成物として供給される。非経口製剤の調製のための一般的な方法は、当該技術分野において公知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（前掲）の第７８０〜８２０頁に記載されている。非経口組成物は液体製剤、または投与直前に滅菌注射用媒体と混合される固体として供給されうる。一実施形態において、非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で供給される。
【００５１】
本発明はここに、以下の実施例および添付の図面を参照して、より詳細に記載される。
【実施例】
【００５２】
実施例１〜７
細胞株開発プロセスの概要
別個のＣＭＶｉｅプロモーターからそれぞれ制御されるｈＣＧアルファ鎖およびベータ鎖を保持する単一のプラスミドを、エレクトロポレーションによってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞にトランスフェクトした。
【００５３】
このプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを保持しており（図４）、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を用いたトランスフェクタントの選択を可能とした。トランスフェクタントのプールを増殖させ、次いでＧ４１８選択下で９６ウェルプレートにおいて限界希釈クローニングに供した。クローン株を増殖させ、細胞培養上清中のｈＣＧ力価に基づいて、高発現コロニーを同定した。
【００５４】
高い生産性に基づいて５つのリードクローンを選択し、次いで、ハイグロマイシン選択マーカーと共にα２，３−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ＳＴ３ＧＡＬ４を発現する第２のプラスミドをそれぞれにトランスフェクトした（図５）。５つのトランスフェクションプールのそれぞれを増殖させ、細胞培養上清をｈＣＧ濃度およびインビボ薬物動態（ＰＫ）につき評価した。
【００５５】
次いで、有望なプールに別のラウンドの限定希釈クローニングを施した。結果として得られたクローンを増殖させ、細胞培養上清をｈＣＧ濃度およびｈＣＧタンパク質上の露出したガラクトースについて（レクチンＥＬＩＳＡにより）評価した。低レベルの露出したガラクトースを有するものは、インビボＰＫを含むさらなるアッセイに供した。最適なＰＫプロファイルを有するｈＣＧを産生し、低露出ガラクトースを有し、高レベルでタンパク質を発現したクローンを評価し、生産性および増殖特性について選択した。
【００５６】
実施例１：配列選択およびプラスミドベクター
ｈＣＧアルファポリペプチドの遺伝子のコード領域を図１に示す。ｈＣＧアルファポリペプチド配列の遺伝子のコード領域は、本明細書において配列番号１として参照される。
【００５７】
ｈＣＧベータポリペプチドの遺伝子のコード領域は、ＦｉｄｄｅｓとＧｏｏｄｍａｎ（１９８０）に従って用いられた。この配列は、ＮＰ＿０００７２８として登録されており、ＣＧｂｅｔａ３、ＣＧｂｅｔａ５およびＣＧｂｅｔａ７のタンパク質配列と一致する。この配列は、本明細書において配列番号２として参照される。
【００５８】
β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３ＧＡＬ４）の遺伝子のコード領域は、ＫｉｔａｇａｗａとＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）に従って使用された。この配列はＬ２３７６７として登録されており、本明細書において配列番号３として参照される。
【００５９】
２つのプラスミドを使用した：第一のｐｈＣＧはｈＣＧのアルファ鎖とベータ鎖を同時に発現する；そして、第二のものはシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ＳＴ３ＧＡＬ４を発現する。
【００６０】
実施例２ａ：ｈＣＧ発現ベクターの構築
ｐｈＣＧは、ｈＣＧの合成アルファ鎖であり、哺乳類細胞におけるコドン使用のために最適化されており、天然のｈＣＧアルファシグナルペプチドを含む。それは当技術分野において周知の方法によって改変されうる。
【００６１】
当技術分野において周知の方法を用いて、ｈＣＧアルファポリペプチド（配列番号１）およびｈＣＧベータポリペプチド（ＮＰ＿０００７２８、配列番号２）のコード配列をＰＣＲにより増幅した（例えば、ＷＯ２０１１／０４２６８８として公開されている国際特許出願を参照）。ｐｈＣＧアルファＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＣＭＶ制御哺乳類発現ベクター（ＣｒｕｃｅｌｌベクターｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏ）上のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位に挿入した。これは、遺伝子をＣＭＶｉｅプロモーターによって制御される発現のために正しい向きに、下流にＢＧＨポリＡシグナルを伴って配置した。天然のシグナルペプチドを含む天然のｈＣＧベータ遺伝子を制限酵素ＡｓｃＩおよびＨｐａＩで消化し、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ部位に挿入し、追加の下流ＢＧＨポリＡシグナルを伴う第２のＣＭＶｉｅプロモーターによって、発現が制御されるようにした。ベクター骨格はまた、ネオマイシン耐性マーカーならびに原核細胞における選択および複製に必要な要素も含んでいた。ベクターは、当該技術分野で知られている一般的な方法を用いて増幅され、配列決定された。最適化されたｈＣＧアルファおよび天然（野生型）ベータ鎖の配列をそれぞれ図１および２に示す。
【００６２】
配列決定のために選択されたすべてのコロニーが、配列番号１および配列番号２に記載の正しい配列を含んでいた。プラスミドｐｈＣＧ  Ａ＋Ｂをトランスフェクションのために選択した（図４）。
【００６３】
実施例２ｂ：ＳＴ３発現ベクターの構築
ＳＴ３ＧＡＬ４遺伝子はｐＳＴ３において発現される。β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３、Ｌ２３７６７、配列番号３、図３）のコード配列を、２，３ＳＴｆｗおよび２，３ＳＴｒｅｖのプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲによって増幅した。
【００６４】
２，３ＳＴｆｗ  ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’
２，３ＳＴｒｅｖ  ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＧ−３’
【００６５】
結果として得られた増幅されたＳＴ３  ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ハイグロマイシン耐性マーカーを保有するＣＭＶ制御哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏベクター）上のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入して、それがＣＭＶｉｅプロモーターの下流およびＢＧＨポリＡ配列の上流に位置するようにした。ベクター骨格はまた、ハイグロマイシン耐性マーカーならびに原核細胞における選択および複製に必要な要素も含んでいた。ベクターを前述のようにして増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ３＃１（図５）は、配列番号３に記載の正しい配列を含んでおり、トランスフェクションのために選択された。
【００６６】
実施例３−プラスミドトランスフェクション
原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子中に位置する単一のＰｖｕＩ部位を有するプラスミドｐｈＣＧ（図４）をＰｖｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｒ０１５０）を用いて線状化した。線状化したプラスミドＤＮＡを以下のようにしてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞にトランスフェクトした。
【００６７】
２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で、細胞培養を完全ＰＥＲＭＡＢ培地（ＣＤ４ＰＥＲＭＡＢ（Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０８７１．０１）に３ｍＭの最終濃度のＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０−１２３）および１．０ｇ／Ｌの最終濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２４０４０−０３２）を補充）中で維持した。トランスフェクションの前に少なくとも１４日間、１００ｒｐｍ、５％ＣＯ2および３７℃に設定した振盪インキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ  ＣｌｉｍｏシェーカーＩＳＦ１−Ｘ）中で細胞を維持した。トランスフェクションの４８時間前に、細胞を０．５×１０6細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に移した。
【００６８】
トランスフェクションの日に、細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＶｉＣｅｌｌ  ＸＲで計数し、細胞密度を決定し、生存率が＞９０％であることを確保した。遠心分離によって細胞を回収し、線状化したｐｈＣＧ  ＤＮＡと混合する前に、新鮮なＰＥＲＭＡＢ培地中に再懸濁した。予熱したＰＥＲＭＡＢ培地１０ｍｌに素早く移す前に、２５０Ｖに設定したエレクトロポレーターのチャンバー内で５ミリ秒間、細胞／ＤＮＡ混合物に電気ショックを与えた。このプロセスを合計６回繰り返し、全６回のトランスフェクションを単一のＴ−１７５ｃｍ2組織培養フラスコにプールした。フラスコを３７℃、５％ＣＯ2に設定した静的インキュベーターに入れた。４８時間後、細胞を適切な量の選択的ＰＥＲＭＡＢ（完全ＰＥＲＭＡＢ培地＋Ｇ４１８（１２５μｇ／ｍｌ））中に再懸濁して、０．５×１０6細胞／ｍｌの生細胞密度を得た。
【００６９】
プール培養を毎週２回継代し、細胞生存率が＞５０％に増加するまで、選択培地中で０．３×１０6細胞／ｍｌの密度で細胞を維持した。この時点で、細胞を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中での振盪培養に移した。振盪培養で数週間後、プール上清をサンプリングし、ｈＣＧ濃度についてアッセイした。プールがｈＣＧ発現について陽性であることが確立された後、細胞を限界希釈クローニングのために調製した。
【００７０】
０．３生存細胞／ｍｌの細胞懸濁液を１２５μｇ／ｍｌのＧ−４１８を添加したＰＥＲＭＡＢ培地で調製した。細胞懸濁液を９６ウェル平底組織培養プレートに２００μｌ／ウェルで分注し、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中でインキュベートした（Ｂｉｎｄｅｒ  ＣＢ１５０）。Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｃｌｏｎｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｉｍａｇｅｒを用いてプレートを定期的にスキャンし、各ウェルにおける細胞の増殖を追跡した。
【００７１】
２週間後、活発に増殖する細胞コロニーを含む５３５個のウェルが同定された。これらのウェルからの上清をサンプリングし、市販のキット（ＤＲＧ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＨＣＧ  ＥＬＩＳＡカタログ番号ＥＩＡ１４６９）を用いてｈＣＧについてアッセイした。これらのアッセイの結果に基づいて、合計１６２のコロニーを０．５ｍｌ／ウェルの選択的ＰＥＲＭＡＢ培地を含む２４ウェルプレートに移した。ウェル中の細胞がコンフルエントに近いときに、１６２個のウェルのそれぞれからの上清をサンプリングし、ｈＣＧレベルについてアッセイした。これらの結果に基づいて、最も発現する細胞株のうち９１個を選択して、Ｔ−２５フラスコ中で増殖させた。これらの細胞株をもう一度コンフルエント近くまで増殖させ、その時点で上清をサンプリングし、上記のようにしてｈＣＧについてアッセイした。これらの結果に基づいて、５８個の最も発現する細胞株をＴ−７５フラスコ中で増殖させた。これら５８個の細胞株のそれぞれについて、当該技術分野で公知の方法によって比生産速度（ＳＰＲ）分析を実施し、比生産性をｐｇ／細胞／日で表した。
【００７２】
このようにして、この実施例では、ｈＣＧアルファ鎖およびベータ鎖を組み込んだプラスミドをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８を含む培地を用いてトランスフェクタントを選択した。増殖する細胞コロニーを上清中のｈＣＧ濃度についてスクリーニングし、最高レベルを発現するものをさらに増殖させた。その後の増殖およびスクリーニングラウンドの後、ｈＣＧを発現する２０個のクローンを増殖および生産性試験のために選択した。これらの試験の結果に基づいて、ＳＴ３ＧＡＬ４遺伝子を組み込んだ第２のプラスミドによるトランスフェクションのために５クローンを選択した。
【００７３】
実施例４−ＳＴ３ＧＡＬ４プラスミドｐＳＴ３によるトランスフェクション
実施例３において先に記載したようにして、安定なクローンを生成した。
【００７４】
実施例３に記載の方法により生成された５つの最良のクローンをＳＴ３ＧＡＬ４プラスミドｐＳＴ３でのトランスフェクションのために選択した（実施例２、図３および５を参照）。トランスフェクションは、Ｇ４１８の代わりに０．５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補充した完全ＰＥＲＭＡＢ培地中で形質転換体を選択した以外は、実施例３に記載したのと同じ方法を用いてエレクトロポレーションにより行った。この方法を用いて、ｈＣＧを発現する５つのプールが得られた。
【００７５】
トランスフェクションプールからの上清のサンプルをラットの薬物動態モデルにおいて評価し、このデータならびに（ｈＣＧ鎖上の露出したガラクトースを測定する）ＲＣＡ−レクチン結合アッセイのデータに基づいて、単一のプールを当該技術分野で公知の方法によるさらなる限界希釈クローニングのために選択した。
【００７６】
この希釈クローニングにより、＞６００個のクローンが得られ、そのそれぞれがｈＣＧ発現およびＲＣＡ−レクチン結合によって測定される露出したガラクトースの程度についてもスクリーニングされた。最も低いレベルの露出したガラクトースを有するクローンをさらに増殖させ、サンプルをインビボＰＫに供し、レクチン結合データを裏付けした。単一のプールに由来する５つのクローンを、増殖および生産性の特性についてさらに評価した。
【００７７】
これらのクローンのそれぞれを増殖させ、標準的な凍結保存手順に従って、シードストック細胞バンクを作製した。シードストック細胞バンクからのストックが解凍され、生存可能であることが見出された。
【００７８】
実施例５−等電点電気泳動による分析
電気泳動は、電場による溶媒を介した荷電分子の輸送として定義される。電場による生体分子の移動度は、電界強度、分子上の正味の電荷、分子のサイズおよび形状、イオン強度および分子が移動する媒体の性質に依存することになる。
【００７９】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、タンパク質のｐＩに基づいて、それらを分離するための電気泳動技術である。ｐＩは、タンパク質が正味電荷を持たず、電界中で移動しないｐＨである。ｈＣＧアイソフォームのシアル酸含有量は、各アイソフォームのｐＩ点を微妙に変化させるが、これを利用して、各クローンからのＰｅｒ．Ｃ６  ｈＣＧアイソフォームをこの技術を用いて視覚化することができる。
【００８０】
等電点電気泳動を用いて、Ｐｅｒ．Ｃ６産生ｈＣＧアイソフォームの等電点を分析した。Ｐｅｒ．Ｃ６  ｈＣＧを実施例６に記載のようにして製造した。
【００８１】
両性電解質溶液ｐＨ３．０〜７．０中のｐＨ３．０〜７．０の勾配上で非変性条件下、５％ポリアクリルアミドを含有するＮｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦゲル上でＰｅｒ．Ｃ６  ｈＣＧサンプルを分離した。当該技術分野で周知の方法を用いて、クーマシーブルー染色を用いてタンパク質を視覚化した。
【００８２】
図６は、クーマシーブルーでＩＥＦ染色した、実施例６に記載の方法によって作製したクローン化細胞株で製造した本発明に従う組成物中のｒｈＣＧアイソフォーム（レーン４、５、６および７，１５μｇ／レーン）；先行技術のＣＨＯ由来組成物であるＯｖｉｔｒｅｌｌｅ（レーン２，１５μｇ）；および妊娠中の女性から得られたヒト尿製品であるＮｏｖａｒｅｌ（レーン３，１５μｇ）の検出を示す。バンドは、異なる数のシアル酸分子を含むｈＣＧのアイソフォームを表している。図６は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（本発明に従う組成物）で改変されたヒト細胞株由来組換えｈＣＧが、Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅおよび妊婦由来の尿中ｈＣＧよりも酸性であることを示している。
【００８３】
図７は、「最適化された」アルファサブユニットを含む本発明の細胞を用いて（すなわち、実施例１から４に記載の方法によって作製された細胞株を用いて）製造されたｈＣＧ（「アルファ−ベータｈＣＧ」）および遊離のベータ鎖（「ベータｈＣＧ」）の濃度を、ＷＴ（野生型）アルファサブユニットを含む比較例細胞において製造されたｈＣＧ（「アルファ−ベータｈＣＧ」）および遊離のベータ鎖（「ベータｈＣＧ」）の濃度と比べた、比較を示している。図７は、本発明の細胞が、大量のｈＣＧと低過剰の遊離ベータサブユニットを発現することを示している。換言すれば、本発明の細胞および方法によって製造される組換えｈＣＧの収率および純度は、顕著に改善される。
【００８４】
表Ａは、疎水性フェニル−５ＰＷ  ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより測定した、「最適化された」アルファサブユニットを含む本発明の細胞（「Ｏｐｔ．アルファｈＣＧ」）を用いて（すなわち、実施例１から４に記載の方法によって作製された細胞株を使用して）製造されたｈＣＧの種々のバッチの半精製サンプル中の遊離β−ｈＣＧサブユニットの割合を、ＷＴ（野生型）アルファサブユニットを含む比較例の細胞（「ＷＴアルファｈＣＧ」）で製造されたｈＣＧの半精製サンプルにおける遊離β−ｈＣＧサブユニットの割合との比較で示している。
【００８５】
表Ａは、本発明の細胞が、ＷＴアルファサブユニットを含む細胞（６４〜６６％）と比較して、多量のｈＣＧと、かなり低過剰の遊離ベータサブユニット（５．７〜１０．６％）を発現することを示している。換言すれば、本発明の細胞および方法によって製造される組換えｈＣＧの収率および純度は顕著に改善される。
【００８６】
【表Ａ】
2018512885.tif 000003
【００８７】
実施例６−製造および精製の概要
無血清培地中で懸濁培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞中で組換えｈＣＧを製造するための手順が開発された。この手順は以下に記載され、いくつかのｈＣＧ産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞株に適用された。
【００８８】
α２，３−シアリルトランスフェラーゼをトランスフェクトしたクローン由来の組換えｈＣＧを上記の実施例１から４の方法を用いて調製した。
【００８９】
１×１０6から３×１０6細胞／ｍｌの細胞密度が達成されるまで、６ＧＲＯ培地（ＳＡＦＣ）中、振盪フラスコ中で細胞を増殖させた。細胞を約１×１０6細胞／ｍｌの密度で５Ｌガラス撹拌タンクバイオリアクターに移した。バイオリアクターはＰｒｏｐｅｒ１培地（Ｌｏｎｚａ）を用いて灌流モードで動作した。
【００９０】
その後、様々な限外濾過工程、アニオンおよびカチオン交換捕獲クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよび擬似アフィニティークロマトグラフィーを用いて、当該技術分野で周知の方法により、生成ｒｈＣＧの精製を行った。
【００９１】
すべてのクロマトグラフィー手順の間、免疫反応性の組換えｈＣＧの存在をＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １４６９）およびＩＥＦ（実施例５）によって確認した。
【００９２】
実施例７−シアル酸含有量
シアル酸は、単糖とみなされるタンパク質結合炭水化物であり、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミンおよびフコースのような他の単糖との組み合わせで生じる。本発明に従う精製ｒｈＣＧ上の全シアル酸は、Ｓｔａｎｔｏｎらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０（１９９５），３７−４８）に基づく方法を用いて測定した。
【００９３】
（実施例４および６の方法によって製造された）α２，３−シアリルトランスフェラーゼにより改変されたＰｅｒ．Ｃ６組換えｈＣＧのサンプルの全シアル酸含有量を測定し、その結果を以下の表１に示す［シアル酸とタンパク質のモル比で表される］。
【００９４】
実施例８−ＵＳＰに従ったｈＣＧバイオアッセイ
以下の表１のサンプルの各々について、ｈＣＧ比活性を決定するためにｈＣＧバイオアッセイを実施した。活性は、標準としてＯｖｉｔｒｅｌｌｅを用いて、ＵＳＰ（ＵＳＰ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ：Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，ＵＳＰＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ８／１／０９−１１／３０／０９）に従って測定した。Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅは２６，０００ＩＵ／ｍｇの生物学的活性を有する（Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ．２００５  Ｄｅｃ；２１（１２）：１９６９−７６）。許容限度は＞２１，０００ＩＵ  ｈＣＧ／ｍｇであった。α２，３−シアリルトランスフェラーゼにより改変されたヒト細胞株由来ｈＣＧ組換えｈＣＧのサンプルに関する生物学的活性を表１に示す。
【００９５】
【表１】
2018512885.tif 000004
【００９６】
上に見られるように、効力はＯｖｉｔｒｅｌｌｅ（例えば、実施例７を参照）と同様であり、より高い場合もある。
【００９７】
参考文献
2018512885.tif 000005
2018512885.tif 000006
【００９８】
最適化されたｈＣＧアルファ
最適化されたｈＣＧアルファのヌクレオチド配列（配列番号１）
2018512885.tif 000007
【００９９】
ｈＣＧ最適化アルファのタンパク質配列
2018512885.tif 000008
【０１００】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータポリペプチド
アクセッション番号ＮＰ＿０００７２８
ｈＣＧベータのヌクレオチド配列（配列番号２）
ヌクレオチド配列
2018512885.tif 000009
2018512885.tif 000010
【０１０１】
ｈＣＧベータのタンパク質配列
2018512885.tif 000011
【０１０２】
β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４
アクセッション番号Ｌ２３７６７
ＳＴ３ＧＡＬ４のヌクレオチド配列（配列番号３）
2018512885.tif 000012
2018512885.tif 000013
【０１０３】
ＳＴ３ＧＡＬ４のタンパク質配列
2018512885.tif 000014
【０１０４】
最適化されたｈＣＧアルファ鎖
最適化されたｈＣＧアルファ鎖のヌクレオチド配列（配列番号４）
2018512885.tif 000015
【０１０５】
ｈＣＧ最適化アルファ鎖のタンパク質配列
2018512885.tif 000016
【０１０６】
ｈＣＧアルファポリペプチド
アクセッション番号ＡＨ００７３３８
ｈＣＧアルファのヌクレオチド配列（配列番号５）
2018512885.tif 000017
【０１０７】
ｈＣＧアルファのタンパク質配列
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【図１】
2018512885.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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