(57)【要約】  本開示は、一般的にはＣＤ４７に特異的に結合するモノクローナル抗体に関し、より詳細には、顕著な血小板凝集活性を有さず、また、顕著な赤血球凝集活性を有さないＣＤ４７抗体に関する。これらの抗体を作製する方法及びこれらのモノクローナル抗体を治療薬として使用する方法も提供される。
2018502060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質：
ａ．ＣＤ４７に特異的に結合すること、
ｂ．ＣＤ４７がシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と相互作用することを妨げること、
ｃ．顕著な血小板凝集活性を有さないこと、
を有する、単離抗体。
【請求項２】
前記抗体が、以下のＣＤ４７（シグナル配列を除く配列番号２１）のアミノ酸残基：
ａ．Ｑ１、Ｌ３、Ｎ２７、Ｅ２９、Ｅ９７、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４；
ｂ．Ｙ３７、Ｋ３９、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｔ４９、Ａ５３、Ｌ５４、Ｎ５５、Ｋ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｓ６４、Ａ６６、及びＫ６７；
ｃ．Ｅ３５、Ｋ３９、Ｙ３７、Ｄ４６、４９、Ｄ５１、Ａ５３、Ｌ５４、Ｋ５６、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｔ９９、Ｌ１０１、及びＴ１０２；又は
ｄ．Ｅ２９、Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｖ３６、Ｙ３７、Ｋ３９、Ｎ４１、Ｄ４６、Ｄ５１、Ａ５３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４
と相互作用することによってＣＤ４７に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒト又はカニクイザルＣＤ４７に特異的に結合し、配列番号４〜６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、単離抗体。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号７及び８からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号４〜６からなる群から選択されるＶＨ領域と、配列番号７及び８からなる群から選択されるＶＬ領域とを有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＶＨ鎖領域が、配列番号４又は配列番号５を有し、配列番号７を有するＶＬ鎖領域と組み合わされた、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＶＨ鎖領域が、配列番号６を有し、配列番号８を有するＶＬ鎖領域と組み合わされた、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号９又は配列番号１０に記載のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、配列番号１１又は配列番号１２に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１３又は配列番号１４に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１５又は配列番号１６に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列、配列番号１７又は配列番号１８に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９又は配列番号２０に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号９に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１３に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１５に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列、配列番号１７に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号１０に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、配列番号１２に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１４に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１６に記載のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体の前記ＶＨ鎖が、前記抗体の前記ＶＬ鎖よりもＣＤ４７とより広範囲の接触を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体の前記ＶＨ鎖が結合するエピトープは、ＣＤ４７発現細胞の膜の近くに位置し、前記抗体の前記ＶＬ鎖がＣＤ４７上のＳＩＲＰα結合部位を塞ぐ、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、顕著な赤血球凝集活性を有さない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体の血小板凝集活性が、前記抗体の非存在下で観察される血小板凝集度よりも１０％以下だけより高い、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＣＤ４７が、ヒトＣＤ４７又はカニクイザルＣＤ４７である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージ媒介貪食作用を促進する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプを有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を、該抗体の投与を必要とする対象に、前記対象の前記癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和するのに充分な量で投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記対象がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用することを妨げる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプを有する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
化学療法を投与することを更に含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１５年１１月５日に作成され、ファイル名はＰＲＤ３３６１ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは７２，８４２バイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書の主題は、一般的にはＣＤ４７に結合する抗体に関する。本明細書に述べられる抗ＣＤ４７抗体は、白血病などの血液学的疾患の治療薬として有用である。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４７タンパク質（protein cluster of differentiation 47）（分化抗原タンパク質群４７）は、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）、卵巣癌抗原ＯＡ３、及びＲｈ関連抗原としても知られ、遍在的に発現する細胞表面５回膜貫通型Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４７は、マクロファージ上のＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質α）と相互作用して、これにより貪食作用を抑制する。この経路を取り込んだ癌細胞は貪食作用を免れ、これにより癌細胞の生存率が高まる（Ｊａｉｓｗａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２１２〜２１９，２０１０）。これは、新たに発見された腫瘍免疫回避の機構である。このため、ＣＤ４７を治療の標的とすることは多くの癌で幅広い応用を有する。
【０００４】
ＣＤ４７の発現は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、卵巣癌、神経膠腫、膠芽腫などの多くの異なる悪性疾患のより悪い臨床転帰と相関している。更に、ＣＤ４７は、白血病及び固体腫瘍の両方で癌幹細胞マーカーとして同定されている（Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｃｅｌｌ，１３８（２）：２７１〜８５；Ｃｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０６（３３）：１４０１６〜２１；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｕｒｏｌ，２０（５）：３９３〜７；Ｍａｊｅｔｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３０（９）：１００９〜１９）。
【０００５】
ＣＤ４７遮断抗体は、複数のインビボ腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示すことが実証されている。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断することで、マクロファージによるＣＤ４７発現細胞の貪食作用を促進させることが可能である（Ｃｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４（２）：２２５〜３２に概説されている）。更にこれらのＣＤ４７遮断抗体は、腫瘍モデルにおいてリツキサン（登録商標）及びハーセプチン（登録商標）などの他の治療抗体と相乗作用を示すことが示されている。
【０００６】
しかしながら、ＣＤ４７抗体は、血小板凝集及び赤血球凝集反応を引き起こすことが報告されている。血小板凝集及び赤血球凝集反応は、同型相互作用の例であり、２価のＣＤ４７結合物質で処理された場合に２個のＣＤ４７発現細胞が凝集又は集合するものである。例えば、ＣＤ４７抗体ＭＡＢＬは、完全なＩｇＧ又はＦ（ａｂ’）2として赤血球凝集反応を引き起こし、ＭＡＢＬがｓｃＦｖ又は２価ｓｃＦｖに変化させられた場合にのみこの効果が低減されたことが報告されている（例えば、Ｕｎｏ  Ｓ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｙ，Ａｚｕｍａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ，１７（５）：１１８９〜９４を参照）。同様に、ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２は、Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩの特定の多型を有する特定の対象の血小板の直接的凝集を誘発することが報告されている（Ｄｏｒａｈｙ  ＤＪ，Ｔｈｏｒｎｅ  ＲＦ，Ｆｅｃｏｎｄｏ  ＪＶ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓ  ＧＦ，１９９７  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３２３〜１３３０）。したがって、血小板凝集及び赤血球（ＲＢＣ）の凝集反応は、既存のＣＤ４７抗体によってＣＤ４７を治療標的とする際の大きな制約となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、ＣＤ４７に特異的に結合し、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を阻害し、顕著な血小板凝集活性を有さない抗体について記載する。
【０００８】
一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７（シグナル配列を除く配列番号２１）のアミノ酸残基：Ｑ１、Ｌ３、Ｎ２７、Ｅ２９、Ｅ９７、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４と相互作用することによってＣＤ４７に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７（シグナル配列を除く配列番号２１）のアミノ酸残基：Ｙ３７、Ｋ３９、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｔ４９、Ａ５３、Ｌ５４、Ｎ５５、Ｋ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｓ６４、Ａ６６、及びＫ６７と相互作用する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７（シグナル配列を除く配列番号２１）のアミノ酸残基：Ｅ３５、Ｋ３９、Ｙ３７、Ｄ４６、４９、Ｄ５１、Ａ５３、Ｌ５４、Ｋ５６、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｔ９９、Ｌ１０１、及びＴ１０２と相互作用する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７（シグナル配列を除く配列番号２１）のアミノ酸残基：Ｅ２９、Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｖ３６、Ｙ３７、Ｋ３９、Ｎ４１、Ｄ４６、Ｄ５１、Ａ５３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４と相互作用する。
【０００９】
一部の記載される実施形態の別の態様は、配列番号４〜６から選択される重鎖可変領域を有する、ヒト又はカニクイザルＣＤ４７に特異的に結合する抗体に関する。抗体は、配列番号７及び８から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を必要に応じて有する。場合によっては、抗体は、配列番号４〜６から選択されるＶＨ鎖領域と、配列番号７及び８から選択されるＶＬ鎖領域とを有する。他の態様では、抗体は、配列番号４又は配列番号５を有し、配列番号７を有するＶＬ鎖領域と組み合わされた、ＶＨ鎖領域を有する。更なる別の態様では、抗体は、配列番号６を有し、配列番号８を有するＶＬ鎖領域と組み合わされた、ＶＨ鎖領域を有する。
【００１０】
一部の実施形態では、ＣＤ４７抗体は、配列番号９又は配列番号１０に記載のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、配列番号１１又は配列番号１２に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１３又は配列番号１４に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１５又は配列番号１６に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列、配列番号１７又は配列番号１８に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９又は配列番号２０に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する。例えば、ＣＤ４７抗体は、配列番号９に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１３に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１５に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列、配列番号１７に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する。別の例では、ＣＤ４７抗体は、配列番号１０に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、配列番号１２に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、配列番号１４に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、配列番号１６に記載のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を有する。
【００１１】
一部の実施形態では、抗体はある位置でＣＤ４７に結合し、ＶＨ鎖がＶＬ鎖よりもＣＤ４７とより広範囲の接触を有し、抗体のＶＨ鎖がＣＤ４７発現細胞の膜の近くに位置し、抗体のＶＬ鎖がＣＤ４７上のＳＩＲＰα結合部位を塞ぐ。
【００１２】
一部の実施形態では、抗体は顕著な赤血球凝集活性を有さない。一部の実施形態では、抗体の血小板凝集活性は、抗体の非存在下で観察される血小板凝集度よりも１０％以下だけより高い。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ４７又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ４７に結合する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージ媒介貪食作用を促進する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２アイソタイプから選択されるＩｇＧアイソタイプを有する。
【００１３】
本明細書では、本明細書に述べられる抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物についても述べる。記載される抗体はキットに含まれてもよい。記載される抗体をコードしたポリヌクレオチド、並びに記載されるポリヌクレオチドを発現するのに適したベクター及び細胞についても述べる。
【００１４】
別の実施形態は、本明細書に述べられる１つ以上の抗体を、抗体の投与を必要とする対象に投与することにより、癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和する方法を含み、ただし、抗体は投与後に顕著な血小板凝集活性を有さない。抗体は、対象の癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和するのに充分な量で投与される。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用することを妨げる。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプを有する。一部の実施形態では、記載される抗体とともに化学療法が投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ファージ由来のヒトＩｇＧ２  ＦｃサイレントｍＡｂによるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＳＩＲＰα−Ｆｃの結合の阻害（図１Ａ）。ファージ由来のヒトＩｇＧ２  ＦｃサイレントｍＡｂによるＪｕｒｋａｔ細胞への結合（図１Ｂ）。それぞれＭＳＤ（Ａ）アッセイ及びＦＡＣＳ（Ｂ）アッセイによって測定された、１０種類のファージ由来ｍＡｂのＳＩＲＰα遮断及びＣＤ４７結合活性を、ポジティブコントロールの抗ＣＤ４７ｍＡｂであるＢ６Ｈ１２．２及びヒトＩｇＧ２  Ｆｃサイレント（ＩｇＧ２σ）アイソタイプコントロールと比較して示している。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、２３種類のヒトＩｇＧ２  ＦｃサイレントｍＡｂのサブセットによるＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＳＩＲＰα−Ｆｃの結合の用量依存的阻害。細胞を用いたＳＩＲＰα遮断ＭＳＤアッセイにおける１７種類のハイブリドーマｍＡｂと３種類のファージｍＡｂの用量反応曲線を、ポジティブコントロールの抗ＣＤ４７ｍＡｂであるＢ６Ｈ１２．２と比較して示している。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、異なる用量の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＢ６Ｈ１２．２及び市販のＢＲＩＣ１２６に応じたヒト赤血球の血球凝集反応（図３Ａ）。２３種類の抗ＣＤ４７ｍＡｂを用いた赤血球凝集アッセイの代表的な結果である。Ｃ４７Ｂ９１、Ｃ４７Ｂ９８、Ｃ４７Ｂ１１６、Ｃ４７Ｂ１２３、及びＣ４７Ｂ１３１に応じた赤血球凝集反応の結果を示す（図３Ｂ）。
【図４】異なる用量の抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２に応じたヒト赤血球の血球凝集反応。赤血球凝集反応を誘発することが知られているＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ９８（図３Ｂを参照）をポジティブコントロールとして含めた。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、Ｃ４７Ｂ１１６のＨＦＡ変異体によるＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＳＩＲＰα−Ｆｃの結合の用量依存的阻害。細胞を用いたＳＩＲＰα遮断ＭＳＤアッセイにおける１２種類のヒトフレームワーク適合変異体の用量反応曲線を、親ハイブリドーマｍＡｂであるＣ４７Ｂ１１６と比較して示している。
【図６】Ｃ４７Ｂ１６１（現れる順番にそれぞれ配列番号５６、５７及び６２）、Ｃ４７Ｂ１６７（現れる順番にそれぞれ配列番号５６、５８及び６３）、Ｃ４７Ｂ２２２（現れる順番にそれぞれ配列番号５６、５９及び６４）、Ｃ４７Ｂ２２７（現れる順番にそれぞれ配列番号５６、６０及び６５）、及びＢ６Ｈ１２．２（現れる順番にそれぞれ配列番号５６、６１及び６６）のエピトープ及びパラトープ領域。ＣＤ４７  ＥＣＤ−Ｃ１５Ｇ突然変異体からのエピトープ残基（配列番号４９）、並びにＣ４７Ｂ１６１（配列番号５及び７）、Ｃ４７Ｂ１６７（配列番号５０及び５１）、Ｃ４７Ｂ２２２（配列番号６及び８）、Ｃ４７Ｂ２２７（配列番号４１及び４６）及びＢ６Ｈ１２．２（配列番号５２及び５３）のそれぞれのＶＨ及びＶＬからのパラトープ残基を影付きで示し、ＣＤＲ領域は下線及びラベル（Ｋａｂａｔ定義による）を付し、ＳＩＲＰα結合残基はＣＤ４７配列の上に点を付けて示している。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ピトープの位置、及びＣＤ４７とＣ４７Ｂ１６１との相互作用。Ｃ４７Ｂ１６１は、黒く示したエピトープビン２に結合する（図７Ａ）。ＣＤ４７とＣ４７Ｂ１６１との間の２Ｄ相互作用マップ。ＣＤＲ  Ｌ１及びＬ２は抗原との接触に関与するが、ＣＤＲ  Ｌ３はＣＤ４７と相互作用しない。すべての重鎖ＣＤＲからの残基はＣＤ４７と接触する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＣＤ４７、ＶＬ及びＶＨの残基は、グレーのボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触する残基を定義するために４Åのカットオフ距離を用いた（図７Ｂ）。Ｆａｂ軽鎖（図７Ｃ）及び重鎖（図７Ｄ）とＣＤ４７との主要な相互作用。長いＣＤＲ−Ｌ１が、残基Ｈ３１、Ｎ３３、Ｙ３５及びＹ３７によって表されている。水素結合は破線で示されている。ＣＤ４７の残基には下線を付している。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、エピトープの位置、及びＣＤ４７とＣ４７Ｂ１６７との相互作用。Ｃ４７Ｂ１６７は、黒く示したエピトープビン３領域を認識する。抗体は、Ｖ５９〜Ｔ６１のエピトープ領域の配列の相違のためにヒトＣＤ４７（配列番号６７）にはよく結合し、カニクイザルＣＤ４７（配列番号６８）には弱く結合する（図８Ａ）。ＣＤ４７とＣ４７Ｂ１６７との間の２Ｄ相互作用マップ。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＣＤ４７、ＶＬ及びＶＨの残基は、グレーのボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触する残基を定義するために４Åのカットオフ距離を用いた（図８Ｂ）。Ｆａｂ軽鎖（図８Ｃ）及び重鎖（図８Ｄ）とＣＤ４７との主要な相互作用。水素結合は破線で示されている。ＣＤ４７の残基には下線を付している。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ１６７の両方に結合したＣＤ４７。この三元複合体は、両方の複合体の同等なＣＤ４７のＣα原子の重ね合わせによって得られた（図９Ａ）。２個の抗体の間でエピトープの重複はない（図９Ｂ）。Ｃ４７Ｂ１６７複合体からのＣＤ４７の構造を図９Ｂに示す。Ｃ４７Ｂ１６７のエピトープは黒で示され、Ｃ４７Ｂ１６１のエピトープは白で示されている。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、エピトープの位置、及びＣＤ４７とＣ４７Ｂ２２２との相互作用。エピトープの全体的位置：Ｃ４７Ｂ１６１は、黒く示したエピトープビン１領域に結合する（図１０Ａ）。ＣＤ４７とＣ４７Ｂ２２２との間の２Ｄ相互作用マップ。ＬＣとＨＣとによって認識されるＣＤ４７残基の間には分離が存在する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＣＤ４７、ＶＬ及びＶＨの残基は、グレーのボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている（図１０Ｂ）。接触する残基を定義するために４Åのカットオフ距離を用いた。Ｆａｂ軽鎖（図１０Ｃ）及び重鎖（図１０Ｄ）とＣＤ４７との主要な相互作用。ＣＤＲ−Ｌ３はＣＤ４７に結合しない。水素結合は破線で示されている。ＣＤ４７の残基には下線を付している。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、エピトープの位置、及びＣＤ４７とＣ４７Ｂ２２７との相互作用。エピトープの全体的位置：Ｃ４７Ｂ２２７は、黒く示したエピトープビン１領域に結合する（図１１Ａ）。ＣＤ４７とＣ４７Ｂ２２７との間の２Ｄ相互作用マップ。ＬＣ又はＨＣによって認識される領域にはエピトープ分離が存在する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＣＤ４７、ＶＬ及びＶＨの残基は、グレーのボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触する残基を定義するために４Åのカットオフ距離を用いた（図１１Ｂ）。Ｆａｂ軽鎖（図１１Ｃ）及び重鎖（図１１Ｄ）とＣＤ４７との主要な相互作用。水素結合は破線で示されている。ＣＤ４７の残基には下線を付している。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、Ｃ４７Ｂ２２２とＣ４７Ｂ２２７との間のエピトープ及びパラトープの相違軽鎖相互作用の相違：ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３のＮ３０Ｇ、Ｎ３１Ｓ及びＹ９３Ｓ突然変異は、ＣＤ４７のＦＧループの再配置及び水素結合パターンの変化につながる（図１２Ａ）。重鎖相互作用の相違：Ｃ４７Ｂ２２２のＣＤＲ−Ｈ３ループの異なるコンフォメーションによって、Ｈ３ループにより形成される水素結合の数がＣ４７Ｂ２２７における０個からＣ４７Ｂ２２２における４個の結合（ＣＤ４７の残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｄ４６及びＤ５１による）に増える。この構造の重ね合わせは、両方の複合体の同等なＣＤ４７のＣα原子の重ね合わせによって得られた。ＣＤ４７の残基には下線を付している（図１２Ｂ）。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、エピトープの位置、及びＣＤ４７とＢ６Ｈ１２．２との相互作用。エピトープの全体的位置。Ｂ６Ｈ１２．２は、黒く示したエピトープビン１領域に結合する（図１３Ａ）。ＣＤ４７とＢ６Ｈ１２．２との間の２Ｄ相互作用マップ：ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＣＤ４７、ＶＬ及びＶＨの残基は、グレーのボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触する残基を定義するために４Åのカットオフ距離を用いた（図１３Ｂ）。Ｆａｂ軽鎖（図１３Ｃ）及び重鎖（図１３Ｄ）とＣＤ４７との主要な相互作用。水素結合は破線で示されている。ＣＤ４７の残基には下線を付している。
【図１４】異なる濃度の抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２による９０分間の処理に応じたヒトＰＢＭＣ由来マクロファージによるＪｕｒｋａｔ標的細胞の貪食作用。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、異なる濃度の抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２による２４時間の処理に応じた（図１５Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞及び（図１５Ｂ）ＨＬ６０細胞におけるアポトーシスの誘導。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、異なる濃度の抗ヒトＣＤ４７ＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｂ６Ｈ１２．２に応じたＷｉｌ２−ｓ標的細胞に対する補体依存性細胞傷害の促進。リツキシマブをポジティブコントロールとして含めた。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、多血小板血漿と（図１７Ａ）ＰＢＳ、２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＢ６Ｈ１２．２、及び１０μＭのＡＤＰ；（図１７Ｂ）ＰＢＳ、２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、及びＩｇＧ１  Ｂ６Ｈ１２．２；（図１７Ｃ）ＰＢＳ、２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１／ＩｇＧ２σ  Ｃ４７Ｂ１６１、及びＩｇＧ１  Ｂ６Ｈ１２．２；並びに（図１７Ｄ）ＰＢＳ、２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１／ＩｇＧ２σ  Ｃ４７Ｂ２２２、及びＩｇＧ１  Ｂ６Ｈ１２とのインキュベーションに応じたヒト血小板の凝集。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ＨＬ６０／ＮＳＧマウスモデルにおけるＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２のインビボ活性。ＮＳＧマウスに１０×１０6個のＨＬ６０細胞を静脈内で移植し、腫瘍細胞移植後６日目に抗体による治療を開始した。各群は５匹のマウスで構成した。合計で６回の用量を週２回、動物に投与した（最終投与は２３日目）。１４日目から始めて末梢血をマウスから週１回採取し、ＦＡＣＳにより分析して腫瘍細胞のアウトグロース（outgrowth）及び治療効果を評価した（最終の採取は４２日目）。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、ＭＶ４−１１／ＮＳＧマウスモデルにおけるＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２のインビボ活性。ＮＳＧマウスに５×１０6個のＭＶ４−１１細胞を静脈内で移植し、腫瘍細胞移植後６日目に抗体による治療を開始した。各群は５匹のマウスで構成した。合計で６回の用量を週２回、動物に投与した（最終投与は２３日目）。３４日目に末梢血をマウスから採取し、ＦＡＣＳにより分析して腫瘍細胞のアウトグロースに対する治療の効果を評価した。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄは、Ｋａｓｕｍｉ−３／ＮＳＧマウスモデルにおけるＩｇＧ１／ＩｇＧ２  ＦｃサイレントＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２のインビボ活性。ＮＳＧマウスに１０×１０6個のＫａｓｕｍｉ−３細胞を静脈内で移植し、腫瘍細胞移植後６日目に抗体による治療を開始した。各治療群は５匹のマウスで構成した。合計で１２回の用量を週２回、動物に投与した（最終投与は４４日目）。１４日目から始めて末梢血をマウスから週１回採取し、ＦＡＣＳにより分析して腫瘍細胞のアウトグロース（outgrowth）及び治療効果を評価した。グラフは、３４日目からのＣＤ４５細胞の割合（％）を示す。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、抗体の中和形態ＦａｂとＳＩＲＰαとの衝突の領域を示すＣＤ４７／ＳＩＲＰα複合体上へのＣＤ４７／Ｆａｂ複合体の構造の重ね合わせ。重ね合わせは、両方の複合体の同等なＣＤ４７のＣα原子を重ね合わせることによって得られた（図２１Ａ）。各エピトープとＳＩＲＰα結合部位との間の重複領域（図２１Ｂ）。Ｃ４７Ｂ２２２複合体からのＣＤ４７の構造を図２１Ｂで使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で述べる抗体のいくつかの特性としては、
・ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７に特異的に結合すること、
・ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断すること、
・顕著なヒト血小板凝集活性を有さないこと、
・顕著な赤血球凝集活性を有さないこと、
・マクロファージによる腫瘍細胞の貪食作用を促進することが可能であること、
・ヒトの癌のマウスモデルにおいて強い抗腫瘍活性を示すこと、が挙げられる。
【００１７】
したがって、本明細書に述べられる抗体は、様々な癌の治療において極めて重要なものとなるであろう。
【００１８】
多くの既存のＣＤ４７抗体がＳＩＲＰαを遮断する。しかしながら、本明細書に述べられる発明の主題以前には、ＳＩＲＰαを遮断する既存の完全なＩｇＧ  ＣＤ４７抗体は、血小板凝集及び／又は赤血球凝集の副作用を引き起こし、これは、上記に述べたように望ましくない特性である。２Ｄ３などの他の既存の抗体は赤血球凝集は引き起こさないものの、これらの抗体はＳＩＲＰαも遮断しない。したがって、血小板及び赤血球の凝集を引き起こさずにＳＩＲＰαを遮断する完全なＩｇＧの形のＣＤ４７抗体はこれまでに知られていなかった。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に述べられるＩｇＧ  ＣＤ４７は、顕著な血小板凝集及び赤血球凝集を示さないことから、ＣＤ４７を治療標的とする効果が高められ、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断する能力が維持され、これによりＣＤ４７発現細胞の貪食作用が促進される。詳細には、本開示の完全なＩｇＧ  ＣＤ４７抗体（例えばＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ２２２）は、顕著な細胞凝集活性を示さない。例えば、本明細書に述べられるＣＤ４７抗体は、顕著な血小板凝集及び赤血球凝集活性を有さない。したがって、これらを総合すると、本明細書に述べられる抗体（例えばＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ２２２並びにこれらの誘導体）は、顕著な血小板凝集及び赤血球凝集活性をともなわずにＳＩＲＰαを遮断する能力において既存のＣＤ４７抗体の中でも固有のものである。
【００２０】
概論
当業者であれば、本明細書における開示には具体的に記載されるもの以外の変更及び改変を行うことが可能である点は認識されるであろう。本開示は、すべてのそのような変更及び改変を包含するものとして理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及されるか又は示される工程、要素、組成物、及び化合物のすべてを個別に又は包括的に含み、また、前記工程又は要素のすべての組み合わせ又は任意の２つ以上も含むものである。
【００２１】
本開示は、本明細書に述べられる特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、これらの実施形態はあくまで例示を目的としたものにすぎない。機能的に同等な製品、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内に含まれる。
【００２２】
本明細書に述べられる組成物及び方法は、特に断らないかぎり、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、薬化学、医薬品化学、及び免疫学の従来の方法を用い、必要以上の実験を行うことなく製造又は実施される。医薬製剤、配合物、及び送達、並びに患者の治療には標準的技術が用いられる。
【００２３】
用語の定義
別途定義されないかぎり、本開示に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。
【００２４】
本開示に基づいて用いられる場合、以下の用語は特に断らないかぎりは、以下の意味を有するものとして理解される。
【００２５】
「及び／又は」なる用語、例えば「Ｘ及び／又はＹ」とは、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものとして理解され、両方の意味又はいずれかの意味に明確な支持を与えるものとして解釈される。
【００２６】
本明細書の全体を通じて、そうでない旨が具体的に明記されないかぎり、又は文脈上そうでない必然性がないかぎり、単一の工程、組成物、一群の工程又は一群の組成物への言及は、これらの工程、組成物、工程群、又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含するものとして解釈されるものとする。したがって、文脈上そうでない旨が明らかに示されないかぎり、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数の態様が含まれる。例えば、「ａ」と言う場合には、１つ、及び２つ以上が含まれ、「ａｎ」と言う場合には、１つ、及び２つ以上が含まれ、「ｔｈｅ」と言う場合には、１つ、及び２つ以上が含まれる、といった具合である。
【００２７】
本明細書で使用するところの「ＣＤ４７」、「インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）」、「卵巣癌抗原ＯＡ３」、及び「Ｒｈ関連抗原」なる用語は互いに同義語であり、互換可能に用いられうる。
【００２８】
「赤血球（red blood cell）」及び「赤血球（erythrocyte）」なる用語は互いに同義語であり、互換可能に用いられる。
【００２９】
本明細書で使用するところの「血小板凝集」なる用語は、活性化された血小板の凝集体又は凝塊の形成をもたらす、活性化された血小板の互いに対する接着のことを指す。血小板凝集は、実施例で述べるように、血小板凝集が起こる際の光の透過率の増大を測定する血小板凝集計を使用して測定される。「顕著な血小板凝集活性」は、本明細書に述べられる抗体の添加の６分後までに抗体添加前の光透過率に対して少なくとも２５％の光透過率の増大が認められる場合に生じる。
【００３０】
「凝集」なる用語が細胞の凝集を指すのに対して、「赤血球凝集」なる用語は、細胞の特定のサブセット、すなわち赤血球の凝集を指す。したがって、赤血球凝集は凝集の一種である。
【００３１】
本明細書に述べられる赤血球凝集アッセイでは、特定のウェル内で赤血球によって「ボタン」、「ハロー」、又はこれら２つの中間でありうるパターンが形成される。「顕著な赤血球凝集活性」なる用語は、本明細書に述べられる抗体を添加した際にウェル内に任意のハローパターンが存在することを指す。
【００３２】
本明細書で使用するところの「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有する分子）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分のことを指す。「〜に特異的に結合する」又は「〜と免疫反応する」又は「〜を標的とする」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないか又は大幅に低いアフィニティー（Ｋd＞１０-6）で結合することを意味する。抗体としては、これらに限定されるものではないが、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆv、ｓｃＦｖｓ、並びにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。
【００３３】
基本的な抗体構造単位は四量体からなることが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２組の同じペアからなり、各ペアは１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識の役割を担うアミノ酸約１００〜１１０個以上からなる可変領域を含んでいる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能の役割を担う定常領域を画定している。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのクラスのいずれかに分けられる。特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及び他のサブクラスのようなサブクラスを更に有する。更に、ヒトでは、軽鎖はκ鎖又はλ鎖でありうる。
【００３４】
本明細書で使用するところの「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、固有の軽鎖遺伝子産物と固有の重鎖遺伝子産物とから構成された１種類の抗体分子の分子種のみを含む抗体分子の集団のことを指す。詳細には、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は集団の分子のすべてで同じである。ＭＡｂは、抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位を有している。
【００３５】
一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのクラスのいずれかに分けられる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及び他のサブクラスのようなサブクラスを更に有する。更に、ヒトでは、軽鎖はκ鎖又はλ鎖でありうる。
【００３６】
「抗原結合部位」又は「結合部分」なる用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」鎖）及び軽鎖（「Ｌ」鎖）のＮ末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの特に変化の大きい領域が、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られる、より保存された隣接領域の間に挟まれるように位置している。したがって、「ＦＲ」なる用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間にかつそれらに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列のことを指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域と重鎖の３つの超可変領域とは、互いに対して３次元空間で配置されて抗原結合表面を形成している。抗原結合表面は結合する抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）、メリーランド州ベセスダ（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３（１９８９））の定義に従っている。
【００３７】
本明細書で使用するところの「エピトープ」なる用語には、免疫グロブリン若しくはそのフラグメント、又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定因子が含まれる。「エピトープ」なる用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定因子が含まれる。エピトープ決定因子は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。抗体は、解離定数が≦１μＭである場合に抗原と特異的に結合すると言われる。
【００３８】
本明細書で使用するところの「特異的に結合する」なる用語は、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じる種類の非共有結合的な相互作用のことを指す。免疫学的結合相互作用の強さ、すなわちアフィニティーは、相互作用の解離定数（Ｋd）で表すことができ、Ｋdが小さいほど強いアフィニティーを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野では周知の方法を用いて定量化することができる。そのような方法の１つでは、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを行うが、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、及び両方向で速度に同等の影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。したがって、「結合速度定数」（ｋon）及び「解離速度定数」（ｋoff）の両方を、濃度、並びに会合及び解離の実際の速度を計算することによって求めることができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６〜８７（１９９３）を参照）。ｋoff／ｋonの比は、アフィニティーと関係しないすべてのパラメータを消すことを可能とするものであり、解離定数Ｋdに等しい（一般論についてはＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９〜４７３を参照）。本開示の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、フローサイトメトリー結合アッセイ、又は当業者には周知の同様のアッセイのようなアッセイによって測定される、平衡結合定数（Ｋd）がＫd≦１μＭである場合にＣＤ４７に特異的に結合すると言われる。
【００３９】
「単離」抗体とは、同定されたものであり、その天然の環境の成分から分離及び／又は回収されたものである。その天然の環境の夾雑成分とは、抗体の診断的又は治療的使用の妨げとなる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質を含みうる。好ましい実施形態では、抗体は、ローリー法により測定した場合に９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超の抗体にまで精製されるか、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに充分な程度にまで精製されるか、又は（３）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いた還元若しくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質状態にまで精製される。単離抗体には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。しかしながら、通常は単離抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４０】
本明細書で使用するところの「ポリペプチド」なる用語は、天然タンパク質、フラグメント、又はポリペプチド配列のアナログを指す一般的用語として用いられる。したがって、天然タンパク質のフラグメント及びアナログはそのポリペプチド属の種である。
【００４１】
ある対象物に適用されて本明細書で使用するところの「天然に存在する」なる用語は、その対象物が天然に見出されることを指す。例えば、自然界の存在源から単離することができる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室において人為的に、又は他の形で改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、「天然に存在する」ものである。
【００４２】
本明細書で言うところの「オリゴヌクレオチド」なる用語には、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結部分及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結部分によって互いに連結された、天然に存在するヌクレオチド及び改変ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドとは、塩基２００個又はこれよりも少ない数の塩基の長さを一般的に有するポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基の長さであり、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、通常は例えばプローブ用では一本鎖であるが、例えば遺伝子突然変異体の構築に使用する目的では二本鎖の場合もある。本明細書に述べられるオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
【００４３】
「配列同一性」なる用語は、２個のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列同士が比較ウインドウにわたって同一である（すなわちヌクレオチド単位又は残基単位で）ことを意味する。「配列同一性の割合（％）」なる用語は、２個の最適に整列された配列同士を比較ウインドウにわたって比較し、同じ核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又はＩ）又は残基が両方の配列に生じる位置の数を求めることにより、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の割合（％）を得ることによって計算される。本明細書で使用するところの「実質的な同一性」なる用語は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特性を示すものであり、そのポリヌクレオチド又はアミノ酸が参照配列と比較した場合に少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置の比較ウインドウにわたって、多くの場合、少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置のウインドウにわたって少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より一般的には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有することを示し、ここで、配列同一性の割合（％）は、参照配列を、比較ウインドウにわたって全体で参照配列の２０％以下の欠失又は付加を含んでよい配列と比較することによって計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであってよい。
【００４４】
本明細書で使用するところの２０種類の標準アミノ酸及びそれらの略号は、従来の使用に従う（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．（１９９１）を参照））。２０種類の標準アミノ酸の立体異性体（例えばＤアミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸のような非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非標準アミノ酸も本開示のポリペプチドの適当な構成成分となりうる。非標準アミノ酸の例としては、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチドの表記法では、標準的な使用及び慣例に従い、左方向がアミノ末端の方向であり、右方向がカルボキシ末端の方向である。
【００４５】
同様に、特に断らないかぎりは、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写産物の５’→３’方向の付加の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にある配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にある配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【００４６】
ポリペプチドについて用いられる場合、「実質的同一性」なる用語は、例えばデフォルトのギャップ重みを用いてＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより最適に整列させた場合に、２個のポリペプチド配列同士が、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００４７】
好ましくは、同じでない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４８】
「保存的」アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性のことを指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンがある。
【００４９】
本明細書で述べるように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変異は、アミノ酸配列の変異が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％を維持するものとして、本開示に包含されるものとみなされる。詳細には、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換とは、それらの側鎖において関連したアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝子にコードされるアミノ酸は、大きく以下のファミリーに分けられる。すなわち、（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン、及びトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリン及びトレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。例えば、イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単独の置換、又は構造的に関連したアミノ酸によるあるアミノ酸の同様の置換は、特にこうした置換がフレームワーク部位内のアミノ酸をともなわない場合には、得られる分子の結合又は性質に大きな影響を及ぼさないであろうと予想することは妥当である。あるアミノ酸の変化が機能的ペプチドを生じるか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に判定することができる。これらのアッセイは本明細書に詳細に述べる。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント若しくはアナログは、当業者によって容易に調製することができる。フラグメント又はアナログのアミノ及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近くにあることが好ましい。構造ドメイン及び機能ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを、公的又は専用の配列データベースと比較することによって同定することができる。既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質に見られる配列モチーフ又は予想されるタンパク質コンフォメーションのドメインを同定するために、コンピュータ化された比較方法を用いることが好ましい。既知の３次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法は周知のものである（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１））。したがって、上記の例は、当業者であれば、本開示に従って構造及び機能ドメインを定義するために用いることができる配列モチーフ及び構造的コンフォメーションを認識しうることを示すものである。
【００５０】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解を受けにくくし、（２）酸化を受けにくくし、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティーを変化させ、（４）結合アフィニティーを変化させ、（５）そのようなアナログの他の物理化学的又は機能的特性を付与若しくは改変するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の各種のムテインを含みうる。例えば、１個又は複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を天然に存在する配列に（好ましくは分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分に）行うことができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を大きく変えるものであってはならない（例えば、置換アミノ酸は親配列中に存在する螺旋を壊したり、親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を壊す傾向を有してはならない）。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次構造及び三次構造の例については、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に述べられている。
【００５１】
「剤」なる用語は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生物学的材料から調製される抽出物を指して用いられる。
【００５２】
本明細書で使用するところの「標識」又は「標識された」なる用語は、例えば放射性標識されたアミノ酸の取り込み、又は標識されたアビジン（例えば蛍光マーカー、又は光学的若しくは熱量計による方法により検出することが可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出することが可能なビオチニル部分のポリペプチドへの結合による検出可能なマーカーの取り込みのことを指す。特定の状況では、標識又はマーカーは治療的なものであってもよい。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当該技術分野では知られており、使用することができる。ポリペプチドの標識の例としては、これらに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。本明細書で使用するところの「医薬品又は薬剤」なる用語は、患者に適正に投与された場合に所望の治療効果を誘発することが可能な化合物又は組成物のことを指す。
【００５３】
本明細書では「抗腫瘍薬」なる用語は、ヒトの腫瘍、特に癌、肉腫、リンパ腫、又は白血病などの悪性（癌性）病変などの発生又は進行を阻害する機能特性を有する薬剤のことを指して用いられる。転移の阻害はしばしば抗腫瘍薬の特性である。
【００５４】
本明細書における他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））により例示される、当該技術分野における従来の用法に従って用いられる。
【００５５】
ＣＤ４７抗体
本明細書に述べられるモノクローナル抗体は、ＣＤ４７に結合し、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との結合を阻害し、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαにより媒介されるシグナル伝達を低減させ、貪食作用を促進し、腫瘍の増殖及び／又は移動を阻害する能力を有するものである。阻害作用は、例えば本明細書の実施例で述べる細胞アッセイを用いて判定される。
【００５６】
本明細書に述べられる代表的な抗体には、配列番号４〜６から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７及び８から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）とを有する抗体が含まれる。具体的には、代表的な抗体として表１に示されるものが挙げられる。
【００５７】
【表１】
2018502060.tif 000003
【００５８】
ＣＤ４７抗体のＶＨ鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を具体的に示す。一部の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＤＹＮＭＨ（配列番号９）又はＤＹＷＩＧ（配列番号１０）である。一部の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＤＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１１）又はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１２）である。一部の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＧＧＷＨＡＭＤＳ（配列番号１３）又はＶＧＲＦＡＳＨＱＬＤＹ（配列番号１４）である。
【００５９】
一部の実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＲＳＲＱＳＩＶＨＴＮＲＹＴＹＬＡ（配列番号１５）又はＲＡＳＱＳＶＮＮＲＬＡ（配列番号１６）である。一部の実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１７）又はＷＡＳＴＲＡＩ（配列番号１８）である。一部の実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１９）又はＱＱＧＡＳＷＰＦＴ（配列番号２０）である。
【００６０】
本開示には、本明細書に述べられるＣＤ４７抗体と同じエピトープに結合する抗体も含まれる。例えば、本出願に述べられる抗体は、下記に示される代表的なヒトＣＤ４７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０８７２２．１（ＧＩ：１１７１８７９）、本明細書に参照により援用する）の１個以上のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。シグナル配列（アミノ酸１〜１８）は下線で示してある。
【化１】
2018502060.tif 000004
【００６１】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２１のＱ１、Ｌ３、Ｎ２７、Ｅ２９、Ｅ９７、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４と相互作用する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２１のＹ３７、Ｋ３９、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｔ４９、Ａ５３、Ｌ５４、Ｎ５５、Ｋ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｓ６４、Ａ６６、及びＫ６７と相互作用する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２１のＥ３５、Ｋ３９、Ｙ３７、Ｄ４６、４９、Ｄ５１、Ａ５３、Ｌ５４、Ｋ５６、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｔ９９、Ｌ１０１、及びＴ１０２と相互作用する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２１のＥ２９、Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｖ３６、Ｙ３７、Ｋ３９、Ｎ４１、Ｄ４６、Ｄ５１、Ａ５３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、及びＥ１０４と相互作用する。
【００６２】
当業者であれば、ある抗体が本明細書に述べられる抗体（例えばＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ２２２、又は配列番号４〜６から選択される重鎖可変領域、並びに配列番号７及び８から選択される軽鎖可変領域）のいずれかと同じ特異性を有するか否かを、前者が後者のＣＤ４７との結合を防止するか否かを確認することによって、不要な実験を行うことなく判定することが可能である点は認識されよう。試験される抗体が、本明細書に述べられる抗体の結合の低下によって示されるように本開示の抗体と競合する場合、２つの抗体は、同じか又は近いエピトープに結合する可能性が高い。
【００６３】
ある抗体が本明細書に述べられる抗体の特異性を有するか否かを判定するための別の方法としては、本明細書に述べられる抗体を可溶性のＣＤ４７タンパク質（これと抗体は通常は反応性を有する）と予めインキュベートし、次いで試験される抗体を加えることで、試験される抗体のＣＤ４７に結合する能力が阻害されるか否かを判定することがある。試験される抗体の結合が阻害された場合には、ほぼ確実に、その抗体は本開示の抗体と同じ、又は機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
【００６４】
本開示の抗体
本明細書に述べられる抗体は、ＣＤ４７によって、かつ／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰαによって媒介されるシグナル伝達を、調節、遮断、阻害、低下、拮抗、中和するか、又は他の形でこれを妨げる能力について評価を行うことができる。例えば、かかる評価法は、１つ以上の本明細書に述べられる抗体の存在下で、ＣＤ４７によって、かつ／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰαによって媒介されるシグナル伝達を測定することを含みうる。これらのアッセイは、競合的結合アッセイを含むものでもよく、又は例えば、実施例７に述べられるように、マクロファージによるＣＤ４７発現細胞の貪食作用を促進する能力などの生物学的測定値を測定するものでもよい。
【００６５】
当該技術分野の範囲内で知られる様々な方法を、ＣＤ４７を標的とした、又はその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ、若しくはオーソログを標的としたモノクローナル抗体の作製に使用することができる。（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照。これを本明細書に参照により援用する。）完全なヒト抗体とは、ＣＤＲを含む軽鎖及び重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子に由来する抗体分子である。そのような抗体は、本明細書では「ヒト抗体」又は「完全なヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、下記に示す実施例で述べられる手順を用いて調製される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照）、及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６を参照）を用いることによって調製することもできる。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを使用することにより（Ｃｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０を参照）、又はインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン・バール・ウイルスによって形質転換することにより（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６を参照）、利用及び作製することができる。
【００６６】
抗体は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇを使用したアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法によって精製され、主として免疫血清のＩｇＧ画分が与えられる。これに続いて、又はこれに代えて、得ようとする免疫グロブリンの標的である特異的抗原、又はそのエピトープをカラム上に固定化することによって、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製については、例えばＤ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎにより考察されている（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．社により発行、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（Ａｐｒ．１７，２０００），ｐｐ．２５〜２８）。
【００６７】
本開示のＣＤ４７抗体はモノクローナル抗体である。ＣＤ４７によって、かつ／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰαによって媒介される細胞シグナル伝達を、調節、遮断、阻害、低下、拮抗、中和するか、又は他の形でこれを妨げるモノクローナル抗体は、例えばヒトＣＤ４７又はその免疫原性フラグメント、誘導体若しくは変異体のような膜結合及び／又は可溶性ＣＤ４７で動物を免疫することによって作製される。あるいは、ＣＤ４７をコードした核酸分子を含むベクターをトランスフェクトした細胞で動物を免疫することによって、トランスフェクトされた細胞の表面にＣＤ４７が発現され、細胞の表面と会合するようにしてもよい。あるいは、抗体は、ＣＤ４７に結合するための抗体又は抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによっても得られる。このライブラリーは、例えばバクテリオファージにおいて、アセンブルされたファージ粒子の表面上に発現されたバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質又はペプチド融合体として調製され、タンパク質をコードしたＤＮＡ配列はファージ粒子内に含まれる（すなわち、「ファージディスプレイライブラリー」）。次に、ミエローマ／Ｂ細胞の融合により得られたハイブリドーマを、ＣＤ４７に対する反応性についてスクリーニングする。
【００６８】
モノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に述べられるようなハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法では、一般的にはマウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物を免疫化物質で免疫することによって、この免疫化物質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生する能力を有するリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫することもできる。
【００６９】
免疫化物質は一般的に、タンパク質抗原、そのフラグメント又はその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト由来の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球が用いられ、非ヒト哺乳動物源が望ましい場合には脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。次に、ポリエチレングリコールなどの適当な細胞融合剤を使用してリンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９〜１０３）。不死化細胞株は通常は、形質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ、及びヒト由来のミエローマ細胞である。通常は、ラット又はマウスのミエローマ細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、融合されなかった不死化細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む適当な培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを一般的に含む（「ＨＡＴ培地」）。
【００７０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。より好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株であり、例えばカリフォルニア州サンディエゴ所在のソーク研究所細胞譲渡センター（Cell Distribution Center）、及びバージニア州マナッサス所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）より入手することができる。モノクローナル抗体を産生させるためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についてもこれまでに述べられている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１〜６３）を参照）。
【００７１】
次に、ハイブリドーマ細胞が培養された培地を、抗原を標的としたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法によって、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定する。かかる方法及びアッセイは、当該技術分野では周知のものである。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によって測定することができる。更に、モノクローナル抗体の治療的用途では、標的抗原に対する高い特異性及び高い結合アフィニティーを有する抗体を同定することが重要である。
【００７２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９〜１０３を参照）。この目的に適した培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物体内の腹水としてインビボで増殖させることもできる。
【００７３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって培地又は腹水液から単離又は精製することができる。
【００７４】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に述べられるような組換えＤＮＡ法により作製することもできる。本明細書に述べられるモノクローナル抗体をコードしたＤＮＡは、従来の方法を用いて容易に単離及び配列決定することができる（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。本明細書に述べられるハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源である。このＤＮＡを単離した後、発現ベクターに組み入れ、次いでこれを、発現ベクターをトランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞、サルＣＯＤ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、又はミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。このＤＮＡは、ヒト重鎖及び軽鎖の定常領域のコード配列を相同なマウス配列に置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２〜１３（１９９４）を参照）、又は免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体又は一部を共有結合によって連結することによって改変することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドで本明細書に述べられる抗体の定常ドメインを置換するか、本明細書に述べられる抗体の１個の抗原結合部位の可変ドメインを置換することによって、キメラ二価抗体を作製することができる。
【００７５】
ヒト抗体及び抗体のヒト化
本明細書に述べられる抗体は、完全なヒト抗体又はヒト化抗体を含む。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫反応を生じることなくヒトに投与するのに適している。
【００７６】
ＣＤ４７抗体は、例えば、ヒト配列のみを含む抗体を用いたファージディスプレイ法によって作製される。このような手法は、例えば参照によって本明細書に援用するところの国際公開第９２／０１０４７号及び米国特許第６，５２１，４０４号に示されるように、当該技術分野では周知のものである。この手法では、軽鎖と重鎖のランダムなペアを有するファージのコンビナトリアルライブラリーを、天然又は組換えのＣＤ４７若しくはそのフラグメントの供給源を用いてスクリーニングする。別の手法では、ＣＤ４７抗体は、その少なくとも１つの工程が、トランスジェニック非ヒト動物をヒトＣＤ４７タンパク質で免疫することを含むプロセスによって作製することができる。この手法では、このゼノジェニック非ヒト動物の内因性の重鎖及び／又はκ軽鎖遺伝子座の一部の機能が欠損させられており、抗体に応答して免疫グロブリンをコードした遺伝子を生成するために必要とされる再構成ができなくなっている。更に、少なくとも１つのヒト重鎖遺伝子座及び少なくとも１つのヒト軽鎖遺伝子座が動物に安定的にトランスフェクトされている。このため、投与された抗原に応答してヒト遺伝子座が再構成されることで、その抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードした遺伝子が与えられる。したがって、免疫されると、このゼノマウスは完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。
【００７７】
ゼノジェニック非ヒト動物を作製するための様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、本明細書にその全容を参照により援用するところの米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい。この一般的な手法は、１９９４年に刊行されているように最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）系統の作製に関連して示されている。本明細書にその全容を参照により援用するところのＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１（１９９４）を参照されたい。また、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、及び同第５，９３９，５９８号、並びに日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、同第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、及び同第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号、並びに欧州特許第０  ４６３  １５１  Ｂ１号、並びに国際公開第９４／０２６０２号、同第９６／３４０９６号、同第９８／２４８９３号、同第００／７６３１０号、並びに関連するファミリーメンバーも参照されたい。
【００７８】
ヒト化、キメラ化、及び適当なライブラリーを用いたディスプレイ法によって免疫原性が低下させられた抗体の作製も実現されている。マウス抗体又は他の種からの抗体を、当該技術分野では周知の方法を用いてヒト化又は霊長類化できることも認識されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３  ４６（１９９３）及びＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５〜１６８（１９９２）を参照されたい。組換えＤＮＡ法によって対象とする抗体を操作することによってＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、及び／又はフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換することもできる（国際公開９２／１０２１９０号、並びに米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７９２号、同第５，７１４，３５０号、及び同第５，７７７，０８５を参照）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子を構築するためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用も当該技術分野では周知のものである（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８４：３４３９（１９８７）及びＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１（１９８７））。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡを作製する。この対象とするｃＤＮＡを、特定のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号、及び同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製してスクリーニングすることで、対象とする配列を単離してもよい。次に、抗体の可変領域をコードしたＤＮＡ配列をヒト定常領域の配列と融合する。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１〜３２４２に見ることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、既知のクローンから容易に得ることができる。アイソタイプの選択は、補体結合又は抗体依存性細胞傷害作用の活性などのエフェクター機能によって導かれる。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２である。ヒト軽鎖の定常領域であるκ又はλのいずれを使用することもできる。次に、このキメラヒト化抗体を従来の方法によって発現させる。
【００７９】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂのような抗体のフラグメントは、例えばプロテアーゼ又は化学的切断によって完全なタンパク質を切断することで調製することができる。あるいは、切断遺伝子を設計してもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントの一部をコードしたキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメイン及びＨ鎖のヒンジ領域をコードしたＤＮＡ配列と、これに続く翻訳終止コドンとを含むことで、切断分子を生じる。
【００８０】
Ｈ及びＬ鎖のＪ領域のコンセンサス配列を利用して、後でヒトＣ領域セグメントにＶ領域セグメントを連結するためにＪ領域に有用な制限部位を導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｃ領域のｃＤＮＡを部位誘導突然変異誘発によって改変して、ヒト配列の類似位置に制限部位を導入することができる。
【００８１】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。便宜のよいベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、任意のＶＨ又はＶＬ配列を簡単に挿入して発現させることができるように適当な制限部位を操作により導入したものである。そのようなベクターでは、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域内のスプライスドナー部位とヒトＣ領域の前のスプライスアクセプター部位との間で起き、更にヒトＣＨのエクソン内に存在するスプライス領域で起きる。ポリアデニル化及び転写終止は、コード領域の下流の天然の染色体部位で起きる。得られたキメラ抗体は、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：２８０（１９８３））、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７９：６７７７（１９８２））、及びモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４１：８８５（１９８５））などのレトロウイルスＬＴＲを含む、任意の強力なプロモーターに連結することができる。また、天然のＩｇプロモーター及びこれに類するプロモーターを使用できることも認識されよう。
【００８２】
更に、ヒト抗体又は他の種に由来する抗体を、当該技術分野では周知の方法を用い、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び他の方法を含むがこれらに限定されない、ディスプレイ方式の技術により作製することができ、得られた分子に、アフィニティー成熟化などの更なる成熟化を行うことができる（こうした方法は当該技術分野では周知のものである）（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５〜１６８（１９９２），Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４９３７〜４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ），Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５〜３１８（１９８８）（ファージディスプレイ），Ｓｃｏｔｔ，ＴＩＢＳ，ｖｏｌ．１７：２４１〜２４５（１９９２），Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８〜６３８２（１９９０），Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１〜１０８５（１９９３），Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３〜６８（１９９２），Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ；１０：８０〜８Ａ（１９９２），、及び米国特許第５，７３３，７４３号）。ディスプレイ技術を用いてヒト以外の抗体が作製される場合、そのような抗体は上記に述べたようにヒト化することができる。
【００８３】
これらの方法を用いて、ＣＤ４７発現細胞、ＣＤ４７の可溶性形態、ＣＤ４７のエピトープ又はペプチド、及びＣＤ４７に対する発現ライブラリーに対する抗体を作製し（例えば米国特許第５，７０３，０５７号を参照）、この後、これを上記に述べたようにして所望の特性について評価することができる。
【００８４】
本明細書に述べられるＣＤ４７抗体は、上記に述べた一本鎖抗体をコードしたＤＮＡセグメントを含むベクターによって発現させることができる。これらには、ベクター、リポソーム、裸ＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどが含まれる。ベクターとしては、ターゲティング部分（例えば細胞表面受容体に対するリガンド）及び核酸結合部分（例えばポリリシン）を有する、国際公開第９３／６４７０１号に記載されるような化学接合体、ウイルスベクター（例えばＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば標的細胞に対して特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えばプロタミン）を有する融合タンパク質である、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０号（国際公開第９５／２２６１８号）に記載されるような融合タンパク質、プラスミド、ファージなどが挙げられる。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、又は合成ベクターであってよい。
【００８５】
好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、及び化学接合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックス又はアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１１４９（１９９０）を参照）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）を参照）、及びアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照）が含まれる。
【００８６】
ポックスウイルスベクターは、細胞の細胞質中に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸を短期間のみ発現させる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、神経細胞に核酸を導入するうえで好ましい。アデノウイルスベクターによる発現は、ＨＳＶベクターよりも短期間であるアデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも短期間である（約２ヶ月）。選択される特定のベクターは、標的細胞及び治療される状態によって決まる。導入は、例えば感染、トランスフェクション、トランスダクション、又は形質転換などの標準的方法によって行うことができる。遺伝子移入の形態の例としては、例えば裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ4沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、及びウイルスベクターが挙げられる。
【００８７】
ベクターを用いて、基本的にあらゆる所望の標的細胞を標的とすることができる。例えば、定位注入を用いて、ベクター（例えばアデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に導入することができる。更に、粒子を、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプ注入システムを使用して脳室内（ｉｃｙ）注入によって送達することができる。対流と呼ばれるバルク流に基づいた方法が、脳の広い範囲に大きな分子を送達させるうえで効果的であることも示されており、ベクターを標的細胞に送達させるうえで有用となりうる（Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６〜２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２〜３０５（１９９４）を参照）。使用することができる他の方法としては、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、及び皮下注入、並びに経口又は他の周知の投与経路が挙げられうる。
【００８８】
これらのベクターを用いることで、様々な形で使用することができる大量の抗体を発現させることができる。例えば、試料中のＣＤ４７の存在を検出するために使用することができる。抗体は、ＣＤ４７に結合させ、ＣＤ４７及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰαの相互作用、及びＣＤ４７／ＳＩＲＰαにより媒介されるシグナル伝達を阻害させるために使用することもできる。
【００８９】
これらの方法は、本明細書に述べられる抗原性タンパク質に対して特異的な一本鎖抗体を作製するために適合することができる（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。更に、方法は、タンパク質又はその誘導体、フラグメント、アナログ若しくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの速やかかつ効果的な同定を可能とするＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１を参照）を構築するために適合することができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを有する抗体フラグメントを、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）2フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント、（ｉｉｉ）抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂフラグメント、及び（ｉｖ）Ｆvフラグメントを含むがこれらに限定されない、当該技術分野では周知の方法によって作製することができる。したがって、Ｆv、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）2ＣＤ４７フラグメント、一本鎖ＣＤ４７抗体、単一ドメイン抗体（例えばナノボディ又はＶＨＨ）、二重特異性ＣＤ４７抗体、及びヘテロ接合体ＣＤ４７抗体を含む、記載される実施形態の変形例が考えられる。
【００９０】
Ｆｃ改変
例えば異常なＣＤ４７シグナル伝達にともなう疾患及び障害の治療における抗体の有効性を高めるために、本明細書に述べられる抗体をエフェクター機能に関して改変することが望ましい場合がある。例えば、ＣＤ４７は遍在的に発現されるため、突然変異を抗体のＦｃ領域に導入することによってエフェクター機能を喪失させ、これにより正常な細胞傷害の確率を低下させることができる。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に述べられる抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。一部の実施形態では、抗体の定常領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【００９２】
一部の実施形態では、抗体の定常領域は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２アイソタイプのものである。
【００９３】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ２の定常領域は、Ｆｃ受容体相互作用を改変するためにアミノ酸Ｖａｌ２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｒｏ２３８、Ｈｉｓ２６８、Ｖａｌ３０９、Ａｌａ３２９、及びＰｒｏ３３０（Ｋａｂａｔ番号付与）において改変される（国際公開第１１／０６６５０１Ａ１号を参照）。例えば、Ｖａｌ２３４Ａｌａ、Ｇｌｙ２３７Ａｌａ（Ｇ２３７Ａ）、Ｐｒｏ２３８Ｓｅｒ（Ｐ２３８Ｓ）、Ｈｉｓ２６８Ａｌａ（Ｈ２６８Ａ）、Ｖａｌ３０９Ｌｅｕ（Ｖ３０９Ｌ）、Ａｌａ３２９Ｓｅｒ（Ａ３２９Ｓ）、及びＰｒｏ３３０Ｓｅｒ（Ｐ３３０Ｓ））である（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。一部の実施形態では、改変されたヒトＩｇＧ２の抗体の定常領域は配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００９４】
ＣＤ４７に対する抗体の使用
記載される実施形態に基づく治療薬は、適当な担体、賦形剤、及び改善された移動性、送達性、忍容性などを与えるために製剤に添加される他の物質とともに投与される点は認識されよう。すべての製薬化学者にとって周知の処方集である「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」（１５ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）（特にその中のＢｌａｕｇ、ＳｅｙｍｏｕｒによるＣｈａｐｔｅｒ  ８７））に多くの適当な製剤を見出すことができる。これらの製剤としては例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー剤、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）、ＤＮＡ接合体、無水吸収性ペースト、水中油型及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（異なる分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。製剤中の有効成分が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路において生理学的に適合性及び忍容性を示すものであるかぎり、上記の混合物のいずれも本開示に基づく治療及び療法における使用に適切となりうる。
【００９５】
一実施形態では、記載される抗体は、治療薬として使用することができる。かかる薬剤は、対象における異常なＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達にともなう疾患又は病態を治療、緩和及び／又は予防するために一般的に用いられる。治療レジメンは、標準的な方法を用いて、例えば異常なＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達にともなう疾患又は障害（例えば癌又は他の腫瘍性疾患）を罹患した（又はこれを発症するリスクを有する）ヒト患者などの対象を特定することによって行われる。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性及び高いアフィニティーを有するものが対象に投与されると、標的との結合による作用を一般的に示す。抗体の投与によって、標的（例えばＣＤ４７）の発現、活性及び／又はシグナル伝達機能を阻止若しくは阻害するか、又は妨げることができる。抗体の投与によって、標的（例えばＣＤ４７）が本来結合する内因性リガンド（例えばＳＩＲＰα）との標的の結合を阻止若しくは阻害するか、又は妨げることができる。例えば、抗体は標的と結合して、ＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達を調節、遮断、阻害、低下、拮抗、中和するか、又は他の形で妨げる。一部の実施形態では、表２に記載される重鎖及び軽鎖のＣＤＲを有する抗体を対象に投与することによって、異常なＣＤ４７の発現にともなう疾患又は障害を治療することができる。一実施形態では、異常なＣＤ４７の発現にともなう疾患又は障害は、癌でありうる。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
異常なＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達に関連した疾患又は障害としては、非限定的な例として、血液癌及び／又は固形腫瘍が挙げられる。血液癌としては、例えば白血病、リンパ腫、及び骨髄腫（ミエローマ）が挙げられる。白血病の特定の形態としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）、及び骨髄異形成症候群が挙げられる。リンパ腫の特定の形態としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、緩慢性及び侵攻性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、及び濾胞性リンパ腫（小細胞型及び大細胞型）が挙げられる。骨髄腫（ミエローマ）の特定の形態としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、及び軽鎖又はベンスジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝臓腫瘍、及び腎臓腫瘍が挙げられる。
【００９８】
癌及び他の腫瘍性疾患にともなう症状としては、例えば炎症、熱、全身倦怠感、熱、疼痛（しばしば炎症領域に限局する）、食欲減退、体重減少、浮腫、頭痛、疲労、発疹、貧血、筋力低下、筋疲労、及び例えば腹痛、下痢、又は便秘などの腹部症状が挙げられる。
【００９９】
本明細書に述べられる抗体の治療有効量は、治療目的を達成するために必要とされる量に一般的に関連する。上記に述べたように、これは、特定の場合には標的の機能を妨げる抗体とその標的抗原との結合相互作用でありうる。投与に必要とされる量は、特異的抗原に対する抗体の結合アフィニティーに更に依存し、投与された抗体が身体から除去される速度にも依存する。本明細書に述べられる抗体又は抗体フラグメントの治療有効用量の一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．３ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．６ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．９ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約２．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約３．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約４．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約４．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約５．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約６．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約６．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約７．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約７．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約８．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約９．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約９．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態では、本明細書に述べられる抗体の治療有効用量は、約１５．０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的な投与頻度は、例えば１日１回〜１日２回〜１日おきに１回〜１週間に１回の範囲とすることができる。
【０１００】
治療の有効性は、特定の炎症関連疾患を診断又は治療するための任意の公知の方法との関連で判定される。炎症関連疾患の１つ以上の症状の緩和は、抗体が臨床効果を与えることを示す。
【０１０１】
別の実施形態では、ＣＤ４７を標的とする抗体を、ＣＤ４７の局在化及び／又は定量に関連した、当該技術分野では周知の方法で使用することができる（例えば、適当な生理学的試料中のＣＤ４７及び／又はＣＤ４７とＳＩＲＰαの両方のレベルを測定するための使用、診断方法における使用、タンパク質のイメージングにおける使用など）。特定の実施形態では、抗体由来の抗原結合ドメインを含む、ＣＤ４７に対して特異的な抗体、又はその誘導体、フラグメント、アナログ若しくはホモログを、薬理学的に活性な化合物（以下、「治療薬」と呼ぶ）として使用する。
【０１０２】
別の実施形態では、ＣＤ４７に対して特異的な抗体を使用して、免疫アフィニティー、クロマトグラフィー又は免疫沈降法などの標準的な方法によってＣＤ４７ポリペプチドを単離することができる。ＣＤ４７タンパク質を標的とする抗体（又はそのフラグメント）を使用して、生物学的試料中のタンパク質を検出することもできる。一部の実施形態では、例えば特定の治療レジメンの有効性を判定する目的で、臨床試験手順の一環として生物学的試料中のＣＤ４７を検出することができる。検出は、抗体を検出可能な物質と結合する（すなわち物理的に連結する）ことによって促進することができる。検出可能な物質の例としては、各種の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシターゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、適当な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ又は3Ｈが挙げられる。
【０１０３】
更に別の実施形態では、本開示に基づく抗体を、試料中のＣＤ４７及び／又はＣＤ４７とＳＩＲＰαタンパク質（又はそれらのタンパク質フラグメント）の両方を検出するための薬剤として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は検出可能な標識を含む。抗体はポリクローナル抗体であるか、又はより好ましくはモノクローナル抗体である。完全な抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ’）2）が使用される。抗体に関して「標識された」なる用語は、検出可能な物質を抗体と結合する（すなわち物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識、及び、直接標識された別の試薬との反応性による抗体の間接的標識を包含することを意図している。間接的標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、及び、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出されるようにビオチンで抗体を末端標識することが挙げられる。「生物学的試料」なる用語は、対象から単離された組織、細胞及び生物学的液体、並びに対象の体内に存在する組織、細胞及び液体を含むことを意図している。したがって、「生物学的試料」なる用語の使用には、血液、及び血清、血漿、又はリンパ液を含む血液の画分又は成分が含まれる。すなわち、記載される実施形態の検出方法を用いて生物学的試料中の被検質であるｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡをインビトロ及びインビボで検出することができる。例えば、被検質ｍＲＮＡを検出するためのインビトロの方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。被検質タンパク質を検出するためのインビトロの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法、及び免疫蛍光法が挙げられる。被検質ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロの方法としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための手順は、例えば「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，１９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９６；及び「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に述べられている。更に、被検質タンパク質を検出するためのインビボの方法としては、標識した抗被検質タンパク質抗体を対象の体内に導入することが挙げられる。例えば、標準的なイメージング法によって対象の体内におけるその存在又は位置を検出することができる放射性マーカーで抗体を標識することができる。
【０１０４】
ＣＤ４７抗体の治療投与及び製剤
本明細書に述べられる抗体、並びにその誘導体、フラグメント、アナログ及びホモログは、投与に適した医薬組成物中に含有させることができる。かかる組成物を調製するうえで関係する原理及び考慮事項、並びに成分の選択におけるガイダンスは当該技術分野では周知のものであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９ｔｈ  ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；及びＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１０５】
かかる組成物は、抗体及び薬学的に許容される担体を一般的に含む。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害性フラグメントが好ましい場合がある。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を維持したペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成するか、かつ／又は組換えＤＮＡ技術によって作製することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９〜７８９３（１９９３）を参照）。
【０１０６】
本明細書で使用するところの「薬学的に許容される担体」なる用語は、薬務行政に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。適当な担体については、当該分野では標準的な参考書である「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」の最新版に述べられており、当該書籍を本明細書に参照によって援用するものである。かかる担体又は希釈剤の好ましい例としては、これらに限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム、及び固定油などの非水性溶媒を使用することもできる。薬学的活性物質におけるこうした媒質及び物質の使用は、当該技術分野では周知のものである。従来の媒質又は物質が抗体と不適合でないかぎり、組成物におけるその使用が考えられる。
【０１０７】
インビボ投与に使用するための製剤は無菌状態でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に実現される。
【０１０８】
記載される実施形態の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（例えば局所投与）、経粘膜投与、及び直腸内投与が挙げられる。非経口投与、皮内投与、又は皮下投与に使用される溶液又は懸濁液は以下の成分を含むことができる。すなわち、注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤；並びに塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度を調整するための物質。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作製されたアンプル、使い捨て注射器、又は多数回投与バイアルに封入することができる。
【０１０９】
注射による使用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与用では、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パーシッパニー）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌状態でなければならず、容易な注射性が得られる程度の流動性を有さなければならない。組成物は製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合物を含んだ溶媒又は分散媒であってよい。例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、また、界面活性剤の使用により、適正な流動性を保つことができる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの各種の抗細菌剤及び抗真菌剤によって実現することができる。多くの場合、組成物中に、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。組成物中に、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を含有させることによって、注射用組成物の長期的な吸収をもたらすことができる。
【０１１０】
滅菌注入用溶液は、必要量の抗体を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに適切な溶媒に添加した後、濾過による滅菌を行うことにより調製することができる。一般的に、分散液は、ベースとなる分散媒と上記に列挙したものから選ばれた他の必要な成分とを含む滅菌溶媒に抗体を添加することによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から有効成分及び任意の更なる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１１１】
吸入による投与では、化合物は、例えば二酸化炭素などの気体などの適当な推進剤が入った加圧された容器又はディスペンサ、又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で投与される。
【０１１２】
全身投与は、経粘膜的又は経皮的手段によって行うこともできる。経粘膜又は経皮投与では、浸透させようとする障壁に対する適当な浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当該技術分野で周知のものであり、例えば経粘膜投与では洗剤、胆汁酸、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤の使用によって行うことができる。経皮投与では、記載される抗体の１つ以上のものを、当該技術分野では周知であるように、軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに配合することができる。
【０１１３】
化合物は、直腸投与用に坐剤（例えばカカオバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースとともに）又は停留かん腸の形態で製剤化することもできる。
【０１１４】
一実施形態では、記載される抗体は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む持続／制御放出製剤などの、身体からの速やかな排出を防ぐ担体とともに製剤化することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。
【０１１５】
例えば、有効成分は、それぞれ、例えばコアセルベーション法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセルなど）中、又はマクロエマルション中でカプセル化することができる。
【０１１６】
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適当な例としては、抗体を含有した、例えばフィルムなどの成形物品の形態の固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス、又はマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸／グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとからなる注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸／グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸／グリコール酸のようなポリマーは、１００日間以上にわたって分子の放出が可能であり、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。
【０１１７】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞に標的化されたリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者には周知の方法に従って調製することができる。
【０１１８】
非経口組成物は投与を容易とし、用量を均一とするために単位剤形として製剤化することが特に有利である。本明細書で使用するところの単位剤形とは、治療される対象に適した単位投与量として物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の１つ以上の記載される抗体を、必要な医薬担体とともに含むものである。記載される実施形態の単位剤形の仕様は、抗体の固有の特性及び実現しようとする特定の治療効果と、個人を治療するためのそのような抗体を配合する技術分野に固有の制限とによって規定され、またこれらに直接依存する。
【０１１９】
記載される医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサに投与の説明書とともに入れることができる。
【０１２０】
本明細書に述べられる製剤は、治療される特定の適応症で必要とされる複数の記載される抗体、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補体活性を有するものを含んでもよい。これに代えるか、又はこれに加えて、組成物は、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は増殖阻害剤などのその機能を高める物質を含むことができる。かかる分子は、組み合わせで、意図される目的において有効な量で適当に存在する。
【０１２１】
一実施形態では、記載される抗体の１つ以上のものを、併用療法として、すなわち様々な形態の癌、自己免疫疾患、及び炎症性疾患などの病理学的状態又は疾患を治療するうえで有用な例えば治療薬などの他の薬剤と併用して投与することができる。これに関して「併用」なる用語は、複数の薬剤がほぼ同じ時点で、同時又は順次に投与されることを意味する。順次に投与される場合、第２の化合物の投与の開始時点で、２つの化合物の第１のものが治療部位において有効濃度でまだ検出可能であることが好ましい。
【０１２２】
例えば、併用療法は、下記により詳細に述べるように、１つ以上のサイトカイン及び増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、及び／又は細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制剤などの１つ以上の更なる治療薬と同時配合かつ／又は同時投与される、本明細書に述べられる１つ以上の抗体を含むことができる。かかる併用療法では、投与される治療薬をより低用量で使用することができるために有利であり、これにより各種の単独療法にともなう潜在的な毒性又は合併症を回避することができる。
【０１２３】
本明細書に述べられる抗体と併用される好ましい治療薬は、炎症反応の異なる段階を妨げる薬剤である。一実施形態では、本明細書に述べられる１つ以上の抗体を、他のサイトカイン若しくは増殖因子アンタゴニストなどの１つ以上の更なる薬剤（例えば可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合体）、又は他の標的に結合する抗体若しくは抗原結合フラグメント（例えば他のサイトカイン若しくは増殖因子、それらの受容体、又は他の細胞表面分子に結合する抗体）、及び抗炎症性サイトカイン又はそのアゴニストと同時配合及び／又は同時投与することができる。
【０１２４】
他の実施形態では、本明細書に述べられる抗体は、自己免疫疾患、炎症性疾患などに対するワクチンアジュバントとして使用される。これらの種類の疾患を治療するうえでのアジュバントの併用は、標的とする自己抗原、すなわち、自己免疫に関与する自己抗原（例えばミエリン塩基性タンパク質）、炎症性自己抗原（例えばアミロイドペプチドタンパク質）、又は移植抗原（例えばアロ抗原など）からの様々な抗原との併用に適している。抗原は、タンパク質から誘導されるペプチド又はポリペプチド、及び以下のもの、すなわち、糖類、タンパク質、ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲン、又は他の巨大分子成分のいずれかのフラグメントを含みうる。場合によっては、複数の抗原が抗原性組成物に含まれる。
【０１２５】
更なるスクリーニング法
本開示は、調節物質、すなわちＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合を調節するか又は他の形で妨げる候補又は試験化合物若しくは物質（例えばペプチド、ペプチド模倣体、小分子、又は他の薬剤）、又はＣＤ４７及び／若しくはＣＤ４７−ＳＩＲＰαのシグナル伝達機能を調節するか又は他の形で妨げる候補又は試験化合物若しくは物質を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。異常なＣＤ４７及び／又はＣＤ４７−ＳＩＲＰαの発現、活性及び／又はシグナル伝達にともなう疾患を治療するうえで有用な化合物を同定する方法も提供される。スクリーニング方法には、当該技術分野で知られているか若しくは用いられているもの、又は本明細書に述べられるものが含まれる。例えば、ＣＤ４７をマイクロタイタープレート上に固定化し、候補又は試験化合物（例えばＣＤ４７抗体）とＳＩＲＰαの存在下でインキュベートすることができる。この後、結合したＳＩＲＰαを二次抗体を使用して検出し、吸光度をプレートリーダーで検出することができる。
【０１２６】
マクロファージによる腫瘍細胞の貪食作用を促進することが可能な化合物を同定する方法も提供される。これらの方法には、当該技術分野で知られているか若しくは用いられているもの、又は本明細書に述べられるものが含まれる。例えば、マクロファージを、候補化合物（例えばＣＤ４７抗体）の存在下で、標識した腫瘍細胞とインキュベートする。所定時間の後、マクロファージを腫瘍標識の内在化について観察することで貪食作用を確認することができる。これらの方法（例えばＳＩＲＰα遮断アッセイ及び貪食作用アッセイ）に関する更なる詳細を、実施例で示す。本開示には、本明細書に述べられるスクリーニングアッセイで同定される化合物も含まれる。
【０１２７】
一実施形態では、ＣＤ４７のシグナル伝達機能を調節する候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス指定可能なパラレル固体相又は溶液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、当該技術分野では周知のコンビナトリアルライブラリー法における様々なアプローチのいずれを用いて得ることもできる。生物学的ライブラリー法がペプチドライブラリーに限定されるのに対して、他の４種類の方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（例えばＬａｍ，１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照）。
【０１２８】
本明細書で使用するところの「小分子」とは、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物のことを指すものとする。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、又は他の有機若しくは無機分子であってよい。化学的、及び／又は真菌、細菌、若しくは藻類抽出物などの生物学的混合物のライブラリーは当該技術分野では周知のものであり、本開示に述べられるアッセイのいずれによってスクリーニングすることもできる。分子ライブラリーを合成するための方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３のように当該技術分野に見ることができる。
【０１２９】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１を参照）、又はビーズ上（Ｌａｍ，１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４を参照）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６を参照）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号を参照）、胞子（米国特許第５，２３３，４０９号を参照）、プラスミド（Ｃｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９を参照）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；及び米国特許第５，２３３，４０９号を参照）に提示させることができる。
【０１３０】
一実施形態では、候補化合物を抗体／抗原複合体に導入し、候補化合物が抗体／抗原複合体を阻害するか否かを判定し、ここで、この複合体の阻害は、候補化合物がＣＤ４７のシグナル伝達機能及び／又はＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を調節することを示す。別の実施形態では、本明細書に述べられる可溶性ＣＤ４７及び／又はＣＤ４７とＳＩＲＰαの両方を提供し、少なくとも１種類の中和モノクローナル抗体に曝露する。抗体／抗原複合体の形成を検出し、１つ以上の候補化合物を複合体に導入する。抗体／抗原複合体が１つ以上の候補化合物の導入後に阻害された場合、その候補化合物は異常なＣＤ４７及び／又はＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達にともなう疾患の治療に有用である。
【０１３１】
抗体／抗原複合体を妨げるか又は阻害する試験化合物の能力の測定は、例えば、試験化合物を放射性同位体又は酵素標識と結合することによって行うことができ、これにより、複合体中の標識された化合物を検出することによって抗原又はその生物学的活性部分に対する試験化合物の結合を測定することができる。例えば、試験化合物を、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は3Ｈで直接的又は間接的に標識し、この放射性同位体を、放射線放射を直接カウントするか又はシンチレーションカウンティングによって検出することができる。あるいは、試験化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識し、適当な基質の生成物への変換を測定することによってこの酵素標識を検出することもできる。
【０１３２】
一実施形態では、アッセイは、抗体／抗原複合体を試験化合物と接触させることと、抗原と相互作用するか、又は存在する抗体／抗原複合体を他の形で阻害する試験化合物の能力を測定することとを含む。この実施形態では、抗原と相互作用するかかつ／又は抗体／抗原複合体を阻害する試験化合物の能力を測定することは、抗体と比較して抗原又はその生物学的活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１３３】
別の実施形態では、アッセイは、抗体／抗原複合体を試験化合物と接触させることと、抗体／抗原複合体を調節する試験化合物の能力を測定することとを含む。抗体／抗原複合体を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば、試験化合物の存在下で抗体に結合するか又は抗体と相互作用する抗原の能力を測定することによって行うことができる。
【０１３４】
本明細書に開示されるスクリーニング法のいずれにおいても、抗体は、ＣＤ４７の活性及び／又はシグナル伝達を調節するか又は他の形で妨げる中和抗体とすることができる点は当業者であれば認識されるところであろう。
【０１３５】
本明細書に開示されるスクリーニング法は、細胞を用いたアッセイとして、又は無細胞アッセイとして行うことができる。記載される実施形態の無細胞アッセイは、ＣＤ４７及びそのフラグメントの可溶性形態又は膜結合形態の使用に適している。ＣＤ４７の膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合、タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように、可溶化剤を用いることが望ましい場合もある。かかる可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。
【０１３６】
複数の実施形態において、候補化合物の導入後に抗体又は抗原の一方又は両方の複合体化された形態の複合体化されていない形態からの分離を促進するため、また、アッセイの自動化を可能とするために、抗体又は抗原を固定化することが望ましい場合もある。候補化合物の存在下及び非存在下での抗体／抗原複合体の観察は、反応物質を入れるのに適した任意の容器中で行うことができる。かかる容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微量遠心チューブが挙げられる。一実施形態では、これらのタンパク質の一方又は両方をマトリクスに結合させるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、ＧＳＴ−抗体融合タンパク質、又はＧＳＴ−抗原融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ、これを次に試験化合物と合わせ、混合物を複合体形成を促す条件下（例えば塩及びｐＨについて生理学的条件）でインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗って結合していない成分を除去し、ビーズの場合にはマトリクスを固定化して、複合体を直接的又は間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させてもよく、標準的な方法を用いて、抗体／抗原複合体の形成のレベルを測定することができる。
【０１３７】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の方法を、記載される実施形態のスクリーニングアッセイで使用することもできる。例えば、抗体（例えばＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ２２２、又は配列番号４〜６から選択される重鎖可変領域並びに配列番号７及び８から選択される軽鎖可変領域を有する抗体）又は抗原（例えばＣＤ４７タンパク質）のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化された抗体又は抗原分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から当該技術分野で周知の方法（例えばｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、イリノイ州ロックフォード）を用いて調製することができ、これを、ストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）のウェル内に固定化することができる。あるいは、対象とする抗体又は抗原と反応性を有するが、対象とする抗体／抗原複合体の形成を妨げない他の抗体をプレートのウェルに対して誘導体化し、結合しなかった抗体又は抗原を抗体結合によってウェル内に捕捉することもできる。かかる複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体について上記に述べたもの以外に、抗体又は抗原と反応性を有するそのような他の抗体を用いた複合体の免疫検出が含まれる。
【０１３８】
本開示は更に、上記に述べたスクリーニングアッセイのいずれかによって同定された新規物質、及び本明細書に述べられるような治療におけるその使用に関する。
【０１３９】
診断用及び予防用製剤
本明細書に述べられる抗体は、診断用及び予防用製剤に使用することができる。一実施形態では、記載される抗体の１つ以上のものを、例えばこれらに限定されないが癌又は他の腫瘍状態のような上記に述べた疾患の１つ以上を発症するリスクを有する対象に投与することができる。上記に述べた癌又は他の腫瘍状態の１つ以上のものに対する対象の臓器の疾病素質を、遺伝子型的、血清学的、又は生化学的マーカーを用いて判定することができる。
【０１４０】
本明細書に述べられる抗体は、患者試料中のＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαの検出にも有用であり、したがって診断法として有用である。例えば、本明細書に述べられるＣＤ４７抗体は、患者試料中のＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαレベルを検出するために例えばＥＬＩＳＡなどのインビトロアッセイで使用される。
【０１４１】
一実施形態では、本明細書に述べられる抗体は、固体支持体（例えばマイクロタイタープレートのウェル）上に固定化される。固定化された抗体は、試験試料中に存在しうる任意のＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαに対する捕捉抗体として機能する。固定化された抗体を患者試料と接触させるのに先立って、固体支持体を洗い流し、ミルクタンパク質又はアルブミンなどのブロッキング剤で処理して被検質の非特異的吸着を防止する。
【０１４２】
この後、抗原を含むことが疑われる試験試料又は基準量の抗原を含む溶液で、ウェルを処理する。かかる試料は例えば、病変に特徴的と考えられるレベルの循環抗原を有することが疑われる対象からの血清試料である。試験試料又は標準試料を洗い流した後、検出可能に標識された二次抗体で固体支持体を処理する。標識された二次抗体は検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルを測定し、試験試料中のＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαの濃度を、標準試料から作成した標準曲線との比較により求める。
【０１４３】
インビトロ診断アッセイにおいて記載される抗体を使用して得られた結果に基づけば、ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαの発現レベルに基づいて対象の疾患のステージ（例えば虚血、自己免疫疾患又は炎症性疾患にともなう臨床的指標）を判定することが可能であることが認識されよう。特定の疾患に対し、疾患の進行の異なるステージ及び／又は疾患の治療の異なる時点にあると診断された対象から血液の試料を採取する。疾患の進行又は治療の各ステージについて統計学的に有意な結果を与える試料の集団を使用して、各ステージに特徴的と考えられうる抗原の濃度の範囲が指定される。
【０１４４】
本明細書に含まれた文書、行為、材料、装置、物品などについてのいずれの考察も、これらの事物のいずれか又はすべてが、本出願の各請求項の優先日以前にそれが存在していたからといって、従来技術の基礎の一部をなすかあるいは本発明が関連する分野における一般的な知識であったことを容認するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１４５】
実施例１  ハイブリドーマ技術を用いたＣＤ４７抗体の生成
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスを、ヒトＣＤ４７−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ組換え体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）により免疫し、フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、ＩｎｔｅｒＦＡＤ（マウスインターフェロンα、ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ社）、又は２−ｄｏｓｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、標準的な免疫化のプロトコールを用いて抗ＣＤ４７抗体の産生を開始した。ＣＤ４７抗体を発現するハイブリドーマを作製するため、免疫したマウスから脾臓を収穫し、ＳＰ２０−Ｂｃｌ２ミエローマ細胞と融合させるためにＢ細胞を単離した。４つの融合体（Ｃ４７Ｙ１、Ｃ４７Ｙ２、Ｃ４７Ｙ３、及びＣ４７Ｙ４）からのハイブリドーマクローンを、ＣＤ４７に対する抗体結合についてＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｆｃ−Ｔａｇに対しては行わなかった）。ＣＤ４７に対して特異的結合を示したハイブリドーマ上清を、ｍｅｓｏ  ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）に基づいたアッセイによって、ＣＤ４７を発現したＪｕｒｋａｔ細胞（ＴＩＢ−１５２、ＡＴＣＣ）に対する結合について、また、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＳＩＲＰαの結合の遮断について更にスクリーニングした。
【０１４６】
簡単に述べると、Ｊｕｒｋａｔ細胞を洗い、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、３７℃で１．５時間インキュベートすることによってＭＳＤ９６ウェル高結合プレート上に３０，０００細胞／ウェルとなるように捕捉した。各プレートを、静かに揺動しながら１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（又は熱不活化ＦＢＳ）により室温で３０分間ブロッキングを行った。細胞結合活性については、ハイブリドーマ上清をＭＳＤ高結合プレート上に捕捉された細胞と４℃で１時間インキュベートし、結合した抗体をＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識したヤギ抗マウス抗体で検出した。
【０１４７】
ＳＩＲＰαブロッキング活性については、２μｇ／ｍＬの組換えＳＩＲＰα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、ハイブリドーマ上清の存在下でＪｕｒｋａｔ細胞と１〜１．５時間インキュベートし、結合したＳＩＲＰαをＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識したマウス抗ＳＩＲＰα抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）で検出した。各プレートをＳｅｃｔｏｒ  ６０００イメージャーで読み取り、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを記録した。阻害率（％）を、アッセイに含まれた、抗体を含まずＳＩＲＰαも含まないコントロールに対して正規化した。ＳＩＲＰα結合の中和を示したハイブリドーマのヒットを、抗体Ｖ領域の分子クローニング用に選択した。簡単に述べると、対象とするハイブリドーマヒットからのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡシステムを用いて逆転写酵素反応によって単離し、次いでＶ領域を予め混合したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した後、マウスＩｇＧ１／Ｋ定常領域上にＩｎｆｕｓｉｏｎクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での組換え発現の後、ｍＩｇＧ１  ｍＡｂを含む一過性トランスフェクション上清をＪｕｒｋａｔ細胞結合アッセイ及びＳＩＲＰα遮断アッセイで再度スクリーニングした。全体で２０種類の、確認されたＳＩＲＰα遮断活性（阻害率＞４０％、表３）を有する、固有の配列を有するｍＩｇＧ１  ｍＡｂを、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ−サイレント／ヒトκキメラｍＡｂに変換するために選択した。
【０１４８】
【表３】
2018502060.tif 000006
【０１４９】
実施例２：ファージディスプレイ技術を用いたＣＤ４７抗体の生成
ＣＤ４７試薬及び方法：Ｃ末端に６×ＨＩＳタグ（配列番号５５）を付加した組換えヒトＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（配列番号２２）を、ファージパンニング用に自社で作製した。ヒトＣＤ４７のｃＤＮＡクローンをＯｒｉｇｅｎｅ社より入手し、ＥＣＤ領域をＰＣＲにより増幅して哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションの後、分泌されたＨｉｓタグを付加したヒトＣＤ４７−ＥＣＤタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。ピーク画分をプールし、濃縮した後、２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でクロマトグラフにかけて最終的な磨き工程を行って、ＣＤ４７−ＥＣＤタンパク質のモノマー型及びダイマー型を得た。ＣＤ４７−ＥＣＤタンパク質を、ファージパンニング実験用に１０倍のモル過剰量のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）でビオチン化した。
【０１５０】
ファージディスプレイ：自社のデノボファージライブラリーについては詳細に記載されている（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜３９６；国際特許公開第０９／０８５４６２号）。これらのライブラリーは、ＣＤＲ−Ｈ３に高い多様性を有するように設計された３個のヒトＶＨ生殖系列遺伝子（ＩＧＨＶ１−６９、３−２３、５−５１）及び４個のヒトＶＬ生殖系列遺伝子（Ａ２７、Ｂ３、Ｌ６、Ｏ１２）上で構築されたものである。ファージコートタンパク質ｐＩＸ上にＦａｂ変異体をディスプレイした３つのデノボファージライブラリー（ＤＮＰ００００４−１６９ＨＣ／ＬＣミックス、ＤＮＰ００００５−３２３ＨＣ／ＬＣミックス、及びＤＮＰ００００６−５５１ＨＣ／ＬＣミックス）を、標準的なプロトコールに従ってダイマー型のビオチン化ヒトＣＤ４７−ＥＣＤに対してパンニングした。使用したパンニング条件としては、ビオチン化ヒトＣＤ４７  ＥＣＤダイマーと室温で１時間パンニングし、ラウンド１の抗原濃度は１００ｎＭとし、ファージの捕捉にストレプトアビジンビーズを使用する。ラウンド２の抗原濃度は１００ｎＭとし、ファージの捕捉にニュートラアビジンビーズを使用する。ラウンド３の抗原濃度は１０ｎＭとし、ファージの捕捉にストレプトアビジンビーズを使用する。Ｆａｂタンパク質を作製し、ポリクローナル抗Ｆｄ（ＣＨ１）抗体によってＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した。ビオチン化ＣＤ４７  ＥＣＤを所望のｎＭ濃度で加え、結合したビオチン化ＣＤ４７をＨＲＰ結合ストレプトアビジンにより検出し、化学発光をプレートリーダーで読み取った。Ｆａｂクローンは、それらのＶＨ及びＶＬ同一性についても配列決定した。選択したＦａｂからのＶＨを、ＰＣＲを用いて、対象とするＦａｂを発現しているＥ．ｃｏｌｉクローンからのフレームワーク特異的プライマーにより増幅し、哺乳動物での発現用のシグナルペプチド及びヒトＩｇＧ２エフェクター機能サイレント（ＩｇＧ２  Ｆｃサイレント）重鎖定常領域を含む哺乳動物発現用ベクターにサブクローニングした。同様にＶＬを増幅し、κ軽鎖の定常領域を含む哺乳動物発現用ベクターにサブクローニングした。サブクローニングは、表４に示すプライマーを用いてＩｎｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により行った。Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニングは、ライゲーション独立型クローニング（ＬＩＣ）としても知られ、ＤＮＡフラグメント同士が、制限エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡリガーゼを使用することなく、配列ホモロジーに基づいて互いに連結された。
【０１５１】
【表４】
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【０１５２】
これらの新たに作製されたＶＨ及びＶＬ哺乳動物発現用ＤＮＡコンストラクトを組み合わせて１０種類のｍＡｂを作製し、更なる特性評価を行った。これらのｍＡｂをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、得られたｍＡｂを含む上清を、上記に述べたようにしてＦＡＣＳによりＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ４７に結合する能力及びＳＩＲＰαのＪｕｒｋａｔ細胞への結合を遮断する能力について特性評価を行った。市販の抗ＣＤ４７  Ｂ６Ｈ１２．２をヒトＩｇＧ２σの定常領域にサブクローニングし、アッセイのポジティブコントロールとして用いた。図１は、１０種類のファージ由来のｍＡｂの活性を示しており、このうち４つは強いＳＩＲＰα遮断活性を示した。そのうちの３つ、Ｃ４７Ｂ９１（＝Ｃ４７Ｍ９１）、Ｃ４７Ｂ９６（＝Ｃ４７Ｍ９６）及びＣ４７Ｂ９８（＝Ｃ４７Ｍ９８）は、ＣＤ４７特異的に細胞に結合するものであることが確認されたため、更なる特性評価を行うために選択した。
【０１５３】
実施例３：ＣＤ４７抗体の生物活性
全体で２３種類の作製されたＣＤ４７抗体（ハイブリドーマ法による２０種類、及びファージディスプレイ法による３種類）の、ＣＤ４７に結合する能力及びＣＤ４７の特定の生物活性を阻害する能力を、下記に述べるような異なるインビトロアッセイを用いて分析した。
【０１５４】
ＣＤ４７結合アッセイ：ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７  ＥＣＤタンパク質を、実施例２で述べたようにしてＨｉｓタグを付加したタンパク質として自社で作製した。ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７  ＥＣＤタンパク質に対する反応速度論的結合アフィニティーを、タンパク質相互作用アレイシステム（ＰｒｏｔｅＯｎ社）により測定した。簡単に述べると、各ｍＡｂを、２００〜３５０ＲＵの表面密度に達するまで抗ＩｇＧ−Ｆｃを介してセンサーチップ上に捕捉した。ＣＤ４７  ＥＣＤモノマータンパク質を、３００ｎＭ〜３．７ｎＭにまで連続滴定し、５分間注入した。解離を３０分間観測した。データを１：１結合モデルにフィッティングした。２３種類のｍＡｂのＫD値、及びヒトＣＤ４７タンパク質に対するアフィニティーとカニクイザルＣＤ４７タンパク質に対するアフィニティーとの比を表３に示す。Ｃ４７Ｂ１２１、Ｃ４７Ｂ１２０、及びＣ４７Ｂ１３１を除く大部分のｍＡｂは、カニクイザルＣＤ４７に交差反応性を示した（ヒトＣＤ４７のアフィニティーの５倍以内）。
【０１５５】
ビニングアッセイ：このアッセイは、抗体のパネルを捕捉試薬及び検出試薬として個別にそのパネルの残りの抗体と評価することを可能とするものである。互いに有効な捕捉／検出試薬を形成する抗体は、理論上はモノマータンパク質上の空間的に離れたエピトープを認識することで、両方の抗体が標的タンパク質に同時に結合することを可能とする。パネル全体にわたって似通った活性のパターンを示すクローン群は、似通ったエピトープに結合すると仮定される。したがって、異なる群からクローンを選択することによって、異なるエピトープを認識する抗体が与えられるはずである。各ＣＤ４７抗体をＧＬＣセンサー（ＢｉｏＲａｄ社）上に直接固定化した。競合する試料を、２００ｎＭのＣＤ４７−ＥＣＤと４時間、予めインキュベートした後、チップ表面全体に４分間注入して会合させた。次いで、解離を４分間観測した。これらの結果は、４つの異なるエピトープ群が存在し、群１と群２とが互いに重複して競合するのに対して、群３は群１のみと重複し、群２とは重複していないことを示唆している。
【０１５６】
ＳＩＲＰα遮断活性：これら２３種類のＣＤ４７抗体によるＳＩＲＰα遮断能力を、各抗体を連続滴定し、ＭＳＤ高結合プレート上に捕捉されたＪｕｒｋａｔ細胞と１時間インキュベートしてから除去した後、組換えＳＩＲＰα−ＦｃをＪｕｒｋａｔ細胞に対して更に１．５時間インキュベートすることによって測定した。結合したＳＩＲＰαを、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇで、標識したマウス抗ＳＩＲＰα抗体により検出した。ＥＣＬシグナルを抗体濃度の関数としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの非線形回帰モデルを用いて用量反応曲線を当てはめることによりＥＣ50値を得た。すべての抗体が、ＣＤ４７発現細胞に対するＳＩＲＰαの結合の用量依存的阻害を示した。図２は、このアッセイにおける抗ＣＤ４７ｍＡｂのサブセットの用量反応曲線を示している。
【０１５７】
赤血球凝集活性：２３種類のｍＡｂの赤血球凝集アッセイにおける活性も評価した。簡単に述べると、健康なドナー志願者から血液をバキュテナー血液採取管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に採取し、クエン酸ナトリウムで緩衝した。血液をＰＢＳで３回洗い、２％赤血球懸濁液をＰＢＳ中で調製した。５０μｌの連続希釈したｍＡｂ（２倍）を５０μｌの２％赤血球懸濁液と透明な９６ウェル丸底プレート中、室温で２時間インキュベートした後、ＲＢＣがウェル中で堅いペレットとして現れなかった場合に赤血球凝集についてスコア評価した。２倍の連続希釈液を調製した出発濃度は、試験した大部分のｍＡｂについて２００μｇ／ｍｌとした。抗体のストック濃度があまり濃縮されていない場合（Ｃ４７Ｂ１１８及びＣ４７Ｂ１１９）には、抗体について調製した出発濃度を８５μｇ／ｍＬとした。試験したｍＡｂの大部分が赤血球凝集を誘発した（代表的な結果を図３及び図４に示す）が、赤血球凝集とこれらのｍＡｂの他のいずれの特性との関連も見られなかった。
【０１５８】
これらのアッセイにおける２３種類のｍＡｂの特性を表５にまとめた。これらのうち、Ｃ４７Ｂ１１６及びＣ４７Ｂ９１は、赤血球凝集を誘発せず、強いＳＩＲＰα遮断活性、並びにヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７の両方に対して高いアフィニティーを示したことから、更なる最適化を行うために選択した。
【０１５９】
【表５】
2018502060.tif 000008
【０１６０】
実施例４：Ｃ４７Ｂ１１６のヒトフレームワーク適合
Ｃ４７Ｂ１１６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）の初期の分析は、最も近いマウス生殖系列遺伝子はＨＶではＩＧＨＶ１Ｓ２９*０２であり、ＨＪではＩＧＨＪ４*０１であることを示唆している。Ｃ４７Ｂ１１６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）の初期の分析は、最も近いマウス生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ１１７*０１及びＩＧＫＪ２*０１であることを示唆している。ヒトにおける免疫原性を低下させるためのＣ４７Ｂ１１６のヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）を行うため、Ｃ４７Ｂ１１６のＶＬ及びＶＨ配列のマウスフレームワークを、ＣＤＲはそのままに維持しつつヒトのフレームワークで置換するために、自社のデノボライブラリーを用いた配列相同性分析及び将来的なアフィニティー成熟の考慮に基づいて４つのヒトＶＨ（ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−６９、及びＩＧＨＶ５−５１）及び３つのヒトＶＬ（ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１、及びＩＧＫＶ４−１）の変異体鎖を設計した。各ＶＨ（配列番号４、５、３１、及び３２）及びＶＬ（配列番号７、３３、及び３４）鎖のコンストラクトは遺伝子アセンブリーにより作製し、ヒトＩｇＧ２σ発現用のベクターにクローニングした。ＶＨ及びＶＬ変異体の組み合わせをＨＥＫ  ２９３Ｅｘｐｉ発現システムに同時トランスフェクトし、得られた１２ＨＦＡ変異体をプロテインＡクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製したＣ４７Ｂ１１６  ＨＦＡ変異体は、上記に述べたようにしてＳＩＲＰα遮断、ヒト及びカニクイザルＣＤ４７に対する結合アフィニティー、並びに赤血球凝集について再び特性評価を行った。赤血球凝集アッセイでは、２倍の連続希釈液を調製した出発濃度は、試験した大部分のｍＡｂについて２００μｇ／ｍｌとした。抗体のストック濃度があまり濃縮されていない場合には、連続希釈の出発濃度を１２５μｇ／ｍｌ（Ｃ４７Ｂ１６０）、１７０μｇ／ｍｌ４８７Ｂ１５６）、及び１９５μｇ／ｍｌ（Ｃ４７Ｂ１５９）で調製した。すべての変異体が、強いＳＩＲＰα遮断活性を示した（図５）。Ｃ４７Ｂ１４８、Ｃ４７Ｂ１５１、Ｃ４７Ｂ１５２、Ｃ４７Ｂ１５６、及びＣ４７Ｂ１６０は赤血球凝集を誘発し、フレームワークがこの活性に寄与している可能性を示唆している。反応速度論的結合実験で調べるために選択したＣ４７Ｂ１１６ＨＦＡ変異体は、ヒトＣＤ４７とカニクイザルＣＤ４７に同様のアフィニティーを示した。いくつかのＨＦＡ変異体（Ｃ４７Ｂ１５５、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１５９及びＣ４７Ｂ１６１）は、ＣＤ４７に対する高い結合アフィニティー（親ｍＡｂであるＣ４７Ｂ１１６の５倍以内）を維持したのに対して、他のもの（Ｃ４７Ｂ１４７、Ｃ４７Ｂ１４９、Ｃ４７Ｂ１５１及びＣ４７Ｂ１５３）は、より顕著なアフィニティーの喪失を示した（Ｃ４７Ｂ１１６と比較して６倍以上の低下）。これらのデータを表６にまとめる。Ｃ４７Ｂ１５７及びＣ４７Ｂ１６１は、強いＳＩＲＰα遮断活性、ヒト及びカニクイザルＣＤ４７の両方に対する高い結合アフィニティーを維持したが、赤血球凝集活性も生物物理学的特性上の懸念材料も示さなかったことから、更なる特性評価を行うために選択した。
【０１６１】
【表６】
2018502060.tif 000009
【０１６２】
実施例５：Ｃ４７Ｂ９１のアフィニティー成熟
Ｃ４７Ｂ９１の重鎖（配列番号３５）は５−５１生殖系列に由来し、軽鎖（配列番号３６）はＬ６生殖系列に由来するものである。Ｃ４７Ｂ９１のアフィニティー成熟を行うために２つのＦａｂライブラリーを設計した。Ｆａｂライブラリーの一方は重鎖ライブラリー（Ｃ４７Ｆ８Ｌ１）であり、デノボのＶ５．０からＣ４７Ｂ９１のＶＨのＣＤＲ１及びＣＤＲ２に多様性を付加したものであり（表７）、他方のＦａｂライブラリーは軽鎖ライブラリー（Ｃ４７Ｆ１８Ｌ１）であり、デノボのＶ５．０からＣ４７Ｂ９１のＶＬ生殖系列（Ｌ６）に基づいてＶＬの多様性を付加したものである（表８）。これらのＦａｂライブラリーは、米国特許第６，４７２，１４７号及び国際公開第０９／０８５４６２号に記載されるようにして、クローニングの目的で制限酵素部位に若干の変更を行って、ｐＩＸファージディスプレイシステムで構築した。
【０１６３】
【表７】
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【０１６４】
【表８】
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【０１６５】
ファージコートタンパク質ＩＸ上にディスプレイされたアフィニティー成熟用Ｆａｂライブラリーを、完全長のヒトＣＤ４７を発現するＣＨＯ−Ｓ哺乳動物細胞に対してパンニングした。ファージライブラリーは、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中、４℃で一晩、１×１０8個のＣＨＯ−Ｓ親細胞とインキュベートすることによってＣＨＯ−Ｓ親細胞でプレクリア処理を行った。プレクリアしたライブラリーを遠心分離により回収してＣＨＯ−Ｓ親細胞を除去し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降により濃縮した。約１×１０7個のＣＨＯ−Ｓ  ＣＤ４７発現細胞をパンニングの各ラウンドで使用し、パンニングは４℃で約２時間行った。ファージが結合した細胞を、４０％  Ｆｉｃｏｌｌ／２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で１回、更に氷冷したＰＢＳ／０．２％ＦＢＳで３回洗浄した。ラウンド１及び２では、ＣＨＯ−ＳのＣＤ４７高発現クローンを使用したのに対して、ラウンド３ではより強く結合するファージを濃縮するためにＣＨＯ−ＳのＣＤ４７高発現クローン又はＣＨＯ−ＳのＣＤ４７低発現クローンを使用した。同じライブラリーを、ビオチン化ＣＤ４７ヒトＣＤ４７ＥＣＤモノマーとパンニングするためにも使用した。パンニングは２５℃で１時間行い、抗原濃度をラウンド１では１ｎＭとし、ラウンド２では０．１ｎＭとし、又はラウンド３では０．０１ｎＭとした。結合したファージはストレプトアビジンビーズを加えることによりビーズ／抗原／ファージ複合体を形成させ、これをＴＢＳＴ中で洗浄することによって回収した。あるいは、解離速度がより遅い結合ファージを濃縮するために一晩洗浄を用いた。
【０１６６】
パンニング後に濃縮されたファージプラスミドＤＮＡからＦａｂ産生を誘導した。分泌されたＦａｂを含む上清を直接使用して、上記に述べたようにＪｕｒｋａｔ細胞上のヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰαの結合の阻害について試験を行い、ヒトＣＤ４７  ＥＣＤモノマー及びダイマーに対するそれらの結合をＥＬＩＳＡによって確認した。Ｆａｂクローンは配列決定も行ってそれらのＶＨ及びＶＬの同一性を確認した。固有の配列、ＥＣＤタンパク質に対する結合活性、及びＳＩＲＰα遮断活性に基づいてＦａｂのヒットを選択した。
【０１６７】
選択されたＦａｂからのＶHを、ＰＣＲを用い、対象とするＦａｂを発現するＥ．ｃｏｌｉクローンからのフレームワーク特異的プライマーによって増幅した。増幅されたフラグメントは、哺乳動物で発現させるためのシグナルペプチド及びヒトＩｇＧ２σ重鎖定常領域を含む哺乳動物発現用ベクターにサブクローニングした。同様にＶLフラグメントを増幅し、κ軽鎖の定常領域を含む哺乳動物発現用ベクターにサブクローニングした。サブクローニングは以下のプライマーを用いてＩｎｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により行った。すなわち、ＨｕＧ１＿ＤＮＶＨ＿Ｆ５５１、ＨｕＧ１＿ＤＮＶＨ＿Ｒ、ＨｕＫ＿ＤＮＶＬ＿ＦＡ２７Ｌ６ｍｕＳＰ、及びＨｕＫ＿ＤＮＶＬ＿Ｒ（表３に配列を示す）。これらの新たに作製されたＶH及びＶL哺乳動物発現用ＤＮＡコンストラクトを組み合わせてｍＡｂを作製し、更なる特性評価を行った。
【０１６８】
全体で３２種類のＣ４７Ｂ９１のアフィニティー成熟させたｍＡｂを、１０種類のアフィニティー成熟させたＶＨ鎖（配列番号６及び配列番号３７〜４５）を親ＶＬ鎖と、４種類のアフィニティー成熟させたＶＬ鎖（配列番号８及び配列番号４６〜４８）を親ＶＨ鎖と組み合わせるか、又は最良の鎖交差によって作製した。これらのｍＡｂを、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞で発現させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーで精製し、ＳＩＲＰα遮断活性、ヒト及びカニクイザルＣＤ４７に対する結合アフィニティー、並びに赤血球凝集活性について特性評価を行った。生化学アッセイを行って、各変異体がＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を遮断する能力を調べた。この場合、Ｈｉｓタグを付加したＣＤ４７−ＥＣＤダイマータンパク質を各ｍＡｂと予めインキュベートした後、ＭＳＤ標準プレート上に捕捉させたＳＩＲＰα−Ｆｃに加え、次いで結合したＣＤ４７の量を、ヒツジポリクローナル抗ＣＤ４７抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）とＭＳＤ  ＳｕｌｆｏＴａｇ標識した抗ヒツジ抗体（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）との組み合わせによって検出した。各抗体のＳＩＲＰα遮断活性を、抗体の非存在下（最大の結合）及びＣＤ４７の非存在下（バックグラウンド）のシグナルに対する阻害率（％）に対して正規化した。これらのｍＡｂの１０μｇ／ｍｌにおける阻害活性を表９に示したが、３２種類のｍＡｂのうち、２５種類が１０μｇ／ｍｌで親Ｃ４７Ｂ９１よりも高いＳＩＲＰα結合の阻害を示した。ヒト及びカニクイザルＣＤ４７に対する結合アフィニティーを、上記に述べたようにしてＰｒｏｔｅＯｎにより測定した。変異体の大部分のものが、親Ｃ４７Ｂ９１  ｍＡｂと比較して高いアフィニティーを示し、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２３、Ｃ２７Ｂ２２６及びＣ４７Ｂ２２７がＣ４７Ｂ９１と比較して最も高い、５〜７倍のより強いアフィニティーを示した。重要な点として、これらの変異体の一部のもので解離速度が顕著に高かった。一部の変異体は赤血球凝集を誘発し、ＣＤＲ配列の変異も赤血球凝集活性に寄与しうることが示唆された。ＳＩＲＰα遮断、ヒト及びカニクイザルＣＤ４７に対する結合アフィニティー、並びに赤血球凝集のデータを表８に示す。
【０１６９】
【表９】
2018502060.tif 000012
【０１７０】
実施例６：Ｘ線結晶解析によるエピトープ及びパラトープの同定
抗体Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７及びＢ６Ｈ１２．２の詳細なエピトープ及びパラトープを、それらの対応するＦａｂとＣＤ４７  ＥＣＤ−Ｃ１５Ｇ突然変異体［（配列番号４９）、以下、単にＣＤ４７と呼ぶ］との共結晶化及びＸ線結晶解析による構造決定によって決定した。Ｃ４７Ｂ１６７は、実施例４でＣ４７Ｂ１１６について述べたのと同様のアプローチを用いてエピトープビン３のＣ４７Ｂ１３１のヒトフレームワーク適合から誘導した。この抗体は、ＳＩＲＰα結合を遮断し（ＥＣ50＝０．７９μｇ／ｍｌ）、中度のアフィニティー（ｋＤ＝５．２ｎＭ）でヒトＣＤ４７に結合し、赤血球凝集を誘発しない。
【０１７１】
Ｈｉｓタグを付加したＣ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７  ＦａｂをＨＥＫ２９３細胞で発現させ、アフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。Ｈｉｓタグを付加したＣＤ４７を脱グリコシル化し、アフィニティークロマトグラフィーにより更に精製した。各Ｆａｂを過剰量のＣＤ４７と１．２：１．０〜１．５：１．０の範囲のモル比で混合することによって、ＣＤ４７：Ｆａｂ複合体を調製した。この複合体を４℃で一晩インキュベートし、複合体を形成しなかった化学種からサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分離し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール中で７．５〜２０ｍｇ／ｍＬにまで濃縮した。次いで濃縮された複合体を用い、２０℃でシッティングドロップ法を用いて結晶化試験を計画し、タンパク質：リザーバの比を変えることによって結晶を最適化した。Ｆａｂ−ＣＤ４７複合体のそれぞれについて最適化された結晶化条件を表１０に示す。
【０１７２】
【表１０】
2018502060.tif 000013
【０１７３】
Ｘ線データを収集するため、１個の結晶を、２０％グリセロールを添加した結晶化溶液を含む凍結保護溶液中に数秒間浸漬し、１００Ｋの窒素流中で瞬間凍結した。回折データは、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のビームライン１７−ＩＤでＤｅｃｔｒｉｓ  Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ  Ｐｉｘｅｌ  Ａｒｒａｙ検出器で２４０°の結晶回転角度にわたり、０．２５°の画像当たり２分の露光で収集し、ＨＫＬ２０００プログラムで処理した。Ｘ線データ統計を表１１及び１２に示す。
【０１７４】
【表１１−１】
2018502060.tif 000014
【０１７５】
【表１１−２】
2018502060.tif 000015
*最外郭の値は（）内に示す。
【０１７６】
【表１２−１】
2018502060.tif 000016
【０１７７】
【表１２−２】
2018502060.tif 000017
*最外郭の値は（）内に示す。
【０１７８】
全体の構造
各ＣＤ４７分子の構造モデルは、ＩｇＶドメインに相当する１〜少なくとも１１４番目までの残基を有し、位置５、１６、３２、５５、及び９３にグリカンを有している（確認できるグリカンのないＣ４７Ｂ１６１／Ｆａｂ複合体のＣＤ４７を除く）。ＣＤ４７のＣ末端６ｘＨｉｓ（配列番号５５）は無秩序となっている。各Ｆａｂの構造モデルは、軽鎖の１〜少なくとも２１１番目までの残基と重鎖の１〜少なくとも２１７番目までの残基を含んでいる。ＦａｂのＣ末端６ｘＨｉｓタグ（配列番号５５）及び鎖間ジスルフィド結合は無秩序となっている。Ｃ４７Ｂ２２２／Ｃ４７Ｂ２２７の重鎖の場合、残基１３５〜１４０も無秩序となっている。抗体／抗原結合部位は５つの複合体すべてにおいて電子密度により明確に示されており、これにより結合残基の位置を高い信頼性で決定することができる。各Ｆａｂはすべての図で順番に番号付けされており、ＣＤ４７の番号付けは成熟タンパク質のＮ末端から始まっている。
【０１７９】
各Ｆａｂ複合体内のＣＤ４７分子はそれらの間で重なり合い、０．４５〜０．９８ÅのＲＭＳＤでＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合しており（Ｈａｔｈｅｒｌｅｙ，２００８）、異なる複合体のＣＤ４７の高い構造的類似性、及びＦａｂ又は受容体の結合により誘発される大きなコンフォメーション変化がないことを示している。
【０１８０】
エピトープ、パラトープ、及び抗体／抗原相互作用
Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、及びＣ４７Ｂ２２２／Ｃ４７Ｂ２２７／Ｂ６Ｈ１２．２は、抗体競合ビンニングアッセイにより明らかとされたように３つの異なるエピトープビンに結合する。Ｃ４７Ｂ２２２及びＣ４７Ｂ２２７が同じ全体的位置に結合するのに対して、Ｃ４７Ｂ１６７は細胞膜のより近くに結合し、Ｃ４７Ｂ１６１及びＢ６Ｈ１２．２は、ＣＤ４７のより先端に近い領域に結合する。膜により近いエピトープへの結合によって、抗体の第２のＦａｂアームに伝播しうるＦａｂへの更なる束縛が生じ、別のＣＤ４７分子に対するこのアームの結合をより困難としうる。本発明者らは、エピトープの位置による第２のＦａｂアームへの束縛によって、ＣＤ４７／抗体／ＣＤ４７の架橋による細胞凝集が少なくなるものと考える。Ｃ４７Ｂ２２２のＦａｂの場合、ＨＣはＬＣよりも広い範囲でＣＤ４７と接触しており、膜により近い鎖である。
【０１８１】
これらのエピトープ及びパラトープの配列を図６に示す。ＣＤ４７とＦａｂのそれぞれとの間で生じる相互作用の詳細を下記に詳しく検討する。
【０１８２】
ＣＤ４７／Ｃ４７Ｂ１６１複合体
図７に見られるように、Ｃ４７Ｂ１６１は、ＣＤ４７のＮ末端（Ｑ１及びＬ３）、ＢＣ（Ｎ２７及びＥ２９）及びＦＧ（残基１０１−１０３）のループ領域、並びにＦ（残基Ｅ９７）及びＧ（Ｅ１０４）のβ鎖の残基で構成される構造エピトープを認識する。Ｍ２５９は、エピトープビン２領域に結合してＣＤ４７の約６９０Å2の範囲を覆っている。
【０１８３】
パラトープは、ＣＤＲ−Ｌ３を除く５つのＣＤＲからの残基で構成される。ＬＣは大部分がＣＤ４７のβシート上に位置するのに対して、ＨＣは抗原の先端ループ領域を覆っている。評価を行う他の抗ＣＤ４７Ｆａｂと比較して、Ｃ４７Ｂ１６１は位置３０に６個の残基が挿入された長いＣＤＲ−Ｌ１を有している。ＣＤＲ−Ｌ１ループの先端部に近いＹ３５及びＹ３７残基は、ＣＤ４７のβシートと水素結合することにより、その抗原に対する抗体のアフィニティーを高める（図７Ｃ）。Ｌ１ループ先端部の他の残基（Ｈ３１及びＮ３３残基）はＣＤ４７との直接的接触に関与していないが、これらは、ＣＤ４７との効果的な相互作用を与えるためにＹ３５及び特にＹ３７を方向付けるうえで重要な役割を担っている。ＶＨ側では、すべてのＣＤＲが抗原との、特に、ピログルタミン酸として環化しているＮ末端のＱ１残基並びに２７〜２９及び１０２〜１０３ループセグメントとの相互作用に関与している（図７Ｂ及び７Ｄ）。
【０１８４】
ＣＤ４７／Ｃ４７Ｂ１６７複合体
Ｃ４７Ｂ１６７は、図８に示されるようなＣ（Ｙ３７及びＫ３９）、Ｃ’（Ｒ４５、Ｄ４６及びＴ４９）及びＣ”（Ｎ５５〜Ｔ５８）のβ鎖、並びにＣ‘Ｃ”（Ａ５３、Ｌ５４）及びＣ”Ｅ（Ｖ５９〜Ｔ６１、Ｓ６４、Ａ６６、Ｋ６７）のループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。Ｃ４７Ｂ１６７は、エピトープビン３領域に結合してＣＤ４７の約９３０Å2の範囲を覆っている。
【０１８５】
Ｃ４７Ｂ１６７のパラトープは、６つのＣＤＲすべてからの残基で構成されている。Ｃ及びＣ’β鎖（Ｙ３７、Ｋ３９、Ｒ４５、Ｄ４６及びＴ４９）がＬＣの各ＣＤＲのみと相互作用するのに対して、ループ領域６４〜６７には、長いＣＤＲ−Ｈ３（９残基の挿入）のみが接触する。
【０１８６】
Ｃ４７Ｂ１６７は、エピトープ領域Ｖ５９〜Ｔ６１における配列の相違のためにカニクイザルＣＤ４７との交差反応性は低くなっている（図８Ａの配列アラインメントの範囲を参照）。Ｔ６１ＡのヒトからカニクイザルＣＤ４７への変化によって、カニクイザルの残基６１とＬＣ残基Ｄ４９及びＲ５２との間の水素結合がなくなっている（図８Ｃ）。更に、カニクイザルＣＤ４７の位置６２の潜在的なＮ結合グリコシル化部位は、Ｖ５９〜Ｔ６１領域への抗体結合に対する立体障害を形成しうる（ヒトでは形成しない）。Ｖ５９Ａの変化による影響は小さいはずである（図８Ｄ）。
【０１８７】
エピトープビン２と３との間に共通の残基は存在しない。Ｃ４７Ｂ１６１（ビン２）とＣ４７Ｂ１６７（ビン３）は、図９に示されるように衝突領域がないので同時にＣＤ４７に結合できる。この結果は、抗体競合ビンニングアッセイによっても示されている（実施例３を参照）。Ｃ４７Ｂ１６７は、Ｃ４７Ｂ１６１よりも大きなＣＤ４７βシートの範囲を認識し、大幅に細胞膜の近くに結合する。
【０１８８】
ＣＤ４７／Ｃ４７Ｂ２２２及びＣＤ４７／Ｃ４７Ｂ２２７複合体
Ｃ４７Ｂ２２２は、図１０に示されるように、Ｃ（Ｙ３７及びＫ３９）、Ｃ’（Ｄ４６、Ｔ４９、Ｄ５１）、Ｃ”（Ｋ５６、Ｔ５８）及びＦ（Ｔ９９）のβ鎖、並びにＢＣ（Ｅ３５）、Ｃ’Ｃ”（Ａ５３及びＬ５４）、Ｃ”Ｅ（Ｖ５９）及びＦＧ（Ｌ１０１、Ｔ１０２）ループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。Ｃ４７Ｂ２２２のエピトープはビン１領域に位置し、約７３０Å2のＣＤ４７の範囲を覆っている。Ｃ４７Ｂ２２２は、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２７及びＢ６Ｈ１２．２とＣＤ４７への結合について競合する。他のエピトープと重複するＣ４７Ｂ２２２エピトープの領域が図６に示されている。
【０１８９】
Ｃ４７Ｂ２２２パラトープは、ＣＤＲ−Ｌ３を除くすべてのＣＤＲからの残基で構成される。Ｃ４７Ｂ２２２のＣＤ４７との相互作用の大半は、水素結合とファンデルワールス接触との組み合わせを用いて重鎖によって生じる（図１０）。ＨＣパラトープとＬＣパラトープとによって認識されるエピトープ領域の間には明確な隔離がある。重鎖は、Ｃ’Ｃ”ループ、及びＦ鎖以外のすべてのβ鎖エピトープ領域とだけ相互作用する。軽鎖は、ＢＣ及びＦＧループ並びにＦ鎖と、やはりそれらだけで結合し、ＣＤ４７のより先端に近い位置を占有し、これによりＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を極めて効果的に遮断する役割を果たす。Ｃ’Ｃ”ループのロイシン５４は結合部位の中心位置にあり、３つの重鎖ＣＤＲのすべてと接触する（図１０Ｂ）。Ｃ”鎖はＣＤＲ−Ｈ２と水素結合し、Ｃ及びＣ’β鎖はＣＤＲ−Ｈ３と接触する。
【０１９０】
Ｃ４７Ｂ２２７の構造エピトープもビン１に位置している。このエピトープは、図１１に示されるように、すべてのβシートの鎖（Ｃ鎖：Ｙ３７、Ｃ’鎖：Ｔ４９及びＤ５１、Ｃ”鎖：Ｎ５５、Ｋ５６及びＴ５８、Ｆ鎖：Ｔ９９、Ｇ鎖：Ｅ１０４）と、ＢＣ（Ｅ３５）、Ｃ’Ｃ”（残基範囲５３〜５５）及びＦＧ（Ｌ１０１、Ｔ１０２）ループ領域のセグメントの残基で構成された約８００Å2のＣＤ４７の範囲を覆っている。
【０１９１】
Ｃ４７Ｂ２２７のパラトープは、すべてのＣＤＲからの残基で構成されている。Ｃ４７Ｂ２２２と同様、Ｃ４７Ｂ２２７の重鎖は、Ｃ，Ｃ’及びＣ”のβ鎖、並びにＣ’Ｃ”ループ領域の大部分とだけ相互作用する（Ｃ’Ｃ”ループ内にあり、ＣＤＲ−Ｌ３とファンデルワールス接触を有するＡ５３は例外である。）。Ｍ２６３の軽鎖はＦ及びＧ鎖、並びにＢＣ及びＦＧループに結合する。Ｃ４７Ｂ２２２とＣ４７Ｂ２２７とは同様の向きでＣＤ４７に結合し、多くのエピトープ及びパラトープ残基を共有している（図６）。
【０１９２】
Ｃ４７Ｂ２２２はＣ４７Ｂ２２７と９７％の配列同一性を有し、ＣＤＲに近い領域又はＣＤＲの領域に６個のアミノ酸変化を有している（Ｃ４７Ｂ２２２からＣ４７Ｂ２２７に、ＨＣ：Ｔ３０Ｄ、並びにＬＣ：Ｎ３０Ｇ、Ｎ３１Ｓ、Ｈ４９Ｙ、Ｉ５６Ｔ及びＳ９３Ｙの変化。図６を参照）。それにも関わらず、Ｃ４７Ｂ２２２とＣ４７Ｂ２２７とは、同じ全体の向きでＣＤ４７に結合し、同様のアフィニティー（約１ｎＭ）で概ね同じエピトープ領域を認識する。異なる軽鎖に対するこのようなエピトープの寛容性は、Ｃ４７Ｂ２２２／Ｃ４７Ｂ２２７によるＣＤ４７の認識が、ＨＣ接触及びＨＣパラトープとＬＣパラトープによって認識されるエピトープ領域間の間隔（エピトープ分離）に大きく依存していることの直接的な結果である。更に、Ｃ４７Ｂ２２２とＣ４７Ｂ２２７との間の残基変化の有効数は、重鎖のＴ３０Ｄ並びに軽鎖のＨ４９Ｙ及びＩ５６Ｔの変化が結合部位から遠すぎて（６Å以上）ＣＤ４７の認識に影響しないことから、わずかに３個である（Ｎ３０Ｇ、Ｎ３１Ｓ及びＳ９３Ｙ）。Ｃ４７Ｂ２２２のＧ３０のＡｓｎによる置換は、わずかに異なる位置へのＣＤ４７  ＦＧループの収容を誘導しただけで、図１１に示されるようにＬ１０１とＮ３０との立体衝突が回避されている。Ｎ３１Ｓ及びＳ９３Ｙの変化によって、Ｍ２６３のＴ１０２の骨格及びＥ３５との新たな水素結合が形成され、これにより、Ｃ４７Ｂ２２７  ＬＣとＣＤ４７との相互作用が強化され、異なるコンフォメーションを取り、ＣＤ４７の残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｄ４６及びＤ５１と固有に水素結合するＣ４７Ｂ２２２と比較して、Ｃ４７Ｂ２２７のＣＤＲ−Ｈ３によって形成されるより少ない水素結合の数に拮抗するようにバランスが取られている（図１０〜１２）。
【０１９３】
ＣＤ４７／Ｂ６Ｈ１２．２複合体
Ｂ６Ｈ１２．２は、エピトープビン１領域に結合し、コントロール抗体として使用された。Ｂ６Ｈ１２．２は、図１０に示されるように、Ｃ（Ｖ３６、Ｙ３７、Ｋ３９及びＫ４１）、Ｃ’（Ｄ４６、Ｄ５１）、Ｆ（Ｅ９７、Ｔ９９）及びＧ（Ｅ１０４）のβ鎖、並びにＢＣ（Ｅ２９、Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３４及びＥ３５）、Ｃ’Ｃ”（Ａ５３）及びＦＧ（Ｅ１００〜Ｒ１０３）ループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。やはりビン１にクラスター化しているＣ４７Ｂ２２２及びＣ４７Ｂ２２７と異なり、Ｂ６Ｈ１２．２は、Ｃ”β鎖及びＣ”Ｄループ領域のいずれの残基も認識しない。それにも関わらず、Ｂ６Ｈ１２．２は、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２及びＣ４７Ｂ２２７よりも大きなエピトープ範囲を有している（Ｃ４７Ｂ１６１の６９０Å2、Ｃ４７Ｂ１６７の９３０Å2、Ｃ４７Ｂ２２２の７３０Å2、及びＣ４７Ｂ２２７の８００Å2に対して約１０５５Å2）。
【０１９４】
Ｂ６Ｈ１２．２のパラトープは、すべてのＣＤＲからの残基で構成されている（図１３）。抗体／抗原認識は、主に水素結合によって引き起こされると思われる。軽鎖は、６個の水素結合をＣＤ４７の側鎖と、３個の水素結合を骨格の原子と形成している。一方、重鎖は、ＣＤ４７と１３個の水素結合を形成し、そのほとんどは骨格の原子とのものである。Ｂ６Ｈ１２．２は、結合部位深くに入り混み、ＦＧループを安定させ、更にＣＤＲ−Ｈ２がＢＣループの上に広がるためのスペースを与える短いＣＤＲ−Ｈ３を有している。重鎖が、ＢＣ（大部分はＣＤＲ−Ｈ２）、Ｃ’Ｃ”（ＣＤＲ−Ｈ３）、及びＦＧ（ＣＤＲ−Ｈ２及びＨ３）ループ領域の大部分とだけ接触するのに対して、ＬＣは、Ｃ’鎖及びＣ鎖の隣接するＣ末端領域とだけ接触する。しかしながら、Ｂ６Ｈ１２．２では、エピトープ分離はＣ４７Ｂ２２２及びＣ４７Ｂ２２７よりも小さくなっている。Ｆ鎖及びＦＧループにはＨＣ及びＬＣの両方と相互作用する複数のエピトープ残基が存在している。
【０１９５】
エピトープの概要
Ｃ４７Ｂ１６１と異なり、Ｂ６Ｈ１２．２はＣＤ４７のＮ末端領域を認識しない。Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＣ４７Ｂ２２７と異なり、Ｂ６Ｈ１２．２は、ＣＤ４７のＣ”β鎖又はＣ”Ｄループ領域のいずれの残基も認識しない（図６を参照）。詳細には、Ｂ６Ｈ１２．２で同定されたエピトープと一致しない各Ｆａｂのエピトープ残基は、
Ｃ４７Ｂ１６１：Ｎ末端（Ｑ１及びＬ３）及びＢＣループ（Ｎ２７）領域内の残基、
Ｃ４７Ｂ１６７：β鎖Ｃ’（Ｒ４５及びＴ４９）、Ｃ’Ｃ’’ループ（Ｌ５４）、β鎖Ｃ’’（Ｋ５６、Ｓ５７、及びＴ５８）及びＣ’’Ｄループ（Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｓ６４及びＫ６７）領域内の残基、
Ｃ４７Ｂ２２２：β鎖Ｃ’（Ｔ４９）、Ｃ’Ｃ’’ループ（Ｌ５４）、β鎖Ｃ’’（Ｋ５６及びＴ５８）及びＣ’’Ｄループ（Ｖ５９）領域内の残基、
Ｃ４７Ｂ２２７：Ｃ’Ｃ’’ループ（Ｌ５４）及びβ鎖Ｃ’’（Ｋ５６及びＴ５８）領域内の残基である。
【０１９６】
実施例７：ＣＤ４７抗体の特性評価
バイオアッセイで更なる評価を行うため、所望の特性を有するいくつかのヒトＣＤ４７  ＩｇＧ２σ抗体をＩｇＧ１  Ｆｃフォーマットに変換した。それらのＩｇＧ１変異体は、ヒトＣＤ４７に結合してＳＩＲＰα結合を遮断することが確認された。赤血球凝集を誘発しなかったＩｇＧ１／ＩｇＧ２σ  Ｆｃ変異体（Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ１５７、及びＣ４７Ｂ１６１）を、貪食作用の促進、アポトーシス、補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び血小板凝集活性について更にインビトロで評価した。更に、これら３つのｍＡｂの抗腫瘍活性をインビボで試験した。
【０１９７】
貪食作用：
Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２がヒトマクロファージによるＣＤ４７発現標的細胞の貪食作用を促進するか否かを評価するためにインビトロ貪食作用アッセイを行った。簡単に述べると、ＣＤ１４陽性単球を、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ＥａｓｙＳｅｐｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＣＤ１６  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎを使用して、ネガティブディプリーションによりｌｅｕｋｏｐａｋから精製したＰＢＭＣから単離した。精製した単球を、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び２５ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＸ−ＶＩＶＯ−１０培地（Ｌｏｎｚａ社）に０．１ｘ１０6細胞／ｃｍ2で播種し、７日間マクロファージに分化させた。ＩＦＮ−γ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を分化の最後の２４時間中に５０ｎｇ／ｍｌで加えた。この後、付着したマクロファージをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）処理により組織培養皿から剥離させ、このマクロファージ（１×１０5）を、９６ウェルＵ字底プレートに異なる濃度の抗ＣＤ４７ｍＡｂの存在下でＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０5）と１：１の比で播種した。細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、細胞をＰＢＳで１回洗い、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により剥離した（２０分間のインキュベーション）。細胞をペレット化して洗い、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でマクロファージを３０分間染色した後、Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で２回洗った。細胞をＭａｃｓＱｕａｎｔフローサイトメーター上に取った。ＦｌｏＪｏソフトウェアによりデータを分析した。貪食作用率（％）を以下の式によって求めた。すなわち、［（（ＧＦＰ陽性，Ｃｄ１１ｂ陽性細胞）／（ＧＦＰ陽性，ＣＤ１１ｂ陽性＋ＧＦＰ陽性細胞））×１００％］。
【０１９８】
これらの実験により、ＩｇＧ１  Ｂ１５７、Ｂ１６１、Ｂ２２２及びＢ６Ｈ１２．２が安定した貪食作用促進能を示したのに対して、ＩｇＧ２σＢ１５７、Ｂ１６１、Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２（図１４）による貪食作用の促進はわずかであることが示された。
【０１９９】
アポトーシス：
いくつかの抗ＣＤ４７ｍＡｂ（例えばＡＤ−２２、１Ｆ７及びＭＡＢＬ−１）が、ＣＤ４７がライゲーションされる際に可溶形態の標的細胞のアポトーシスを媒介することが述べられている。Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１及びＣ４７Ｂ２２２が、ＣＤ４７がライゲーションされる際にアポトーシスを媒介するか否かを試験するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＨＬ６０細胞（１００  μｌ中、１×１０6細胞／ｍｌ）を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＴ１６４０培地中、抗体（０．０５、０．５、及び５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。アポトーシスは、ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により検出した。アポトーシスは、初期アポトーシス（アネキシンＶ陽性／ＰＩ陰性）と後期アポトーシス（アネキシンＶ陽性／  ＰＩ陰性）との合計として表した。
【０２００】
これらの実験により、コントロールのｍＡｂであるＢ６Ｈ１２．２は、ＩｇＧ２σとしてＪｕｒｋａｔ細胞及びＨＬ６０細胞に安定したアポトーシスを誘発するが、ＩｇＧ１としては誘発しないことが示された（図１５を参照）。同様に、Ｃ４７Ｂ１５７及びＣ４７Ｂ１６１は、ＩｇＧ２σとしてＪｕｒｋａｔ細胞に低度のアポトーシスを誘発したが、ＩｇＧ１としては誘発しなかった。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２σとしてのＣ４７Ｂ１５７及びＣ４７Ｂ１６１は、ＨＬ６０細胞に対してアポトーシス促進作用を示さなかった。Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＨＬ６０細胞をＩｇＧ１又はＩｇＧ２σのＣ４７Ｂ２２２で２４時間処理した場合、アポトーシスの誘発は生じなかった。
【０２０１】
補体媒介性細胞傷害性：
補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）についてＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２を試験した。Ｗｉｌ２−Ｓ標的細胞を用いてＣＤＣアッセイを行った。５０，０００個のＷｉｌ２−Ｓ細胞を、不透明な白色９６ウェルプレート中、１０％熱不活化ＦＢＳ及び０．１ｍＭ  ＮＥＡＡを添加した２５μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に播種した（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手）。抗体を添加した、又は添加しない２５μｌの培地を加えた後、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。この後、５０μｌのヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社、補体が保存されたもの）を加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。最大溶解度を評価するため、２０μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００をコントロールウェルに加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、バッファーと基質のプレミクスチャ）を各ウェルに加え、内容物を静かに混合して細胞溶解を誘発し、発光を２１０４  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）で記録した。比溶解度を以下の式により計算した。すなわち、［比溶解度＝（（実験放出量−自然放出量）／（最大放出量−自然放出量））＊１００］。
【０２０２】
図１６に示されるように、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２σのＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２σとしてＣＤＣを促進しなかった。これに対して、ツール（tool）ｍＡｂ  Ｂ６Ｈ１２．２  ＩｇＧ１は、ポジティブコントロールのリツキシマブと同様の安定したＣＤＣを媒介したが、エフェクター機能を喪失させたＩｇＧ２σ骨格ではＣＤＣを促進しなかった。
【０２０３】
血小板凝集：
市販の抗ＣＤ４７ｍＡｂ  Ｂ６Ｈ１２（ｍＩｇＧ１）が、血小板凝集を誘発したという観察（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ＴＴ，Ｋａｔｓｕｔａｎｉ  Ｓ，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｋ．（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：２６６５５〜２６６６５）に基づき、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２の血小板凝集活性を測定するためのアッセイを確立した。簡単に述べると、健康なドナー志願者から血液をバキュテナー血液採取管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に採取し、クエン酸ナトリウムで緩衝した。多血小板血漿（ＰＲＰ）及び乏血小板血漿（ＰＰＰ）を、製造者のプロトコールに従ってＰＤＱ血小板機能遠心分離機（Ｂｉｏｄａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を使用して調製した。血小板凝集を、製造者により推奨されるようにＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集計（Ｂｉｏｄａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を使用して測定した。詳細には、２５μｌのＡＤＰ  （ポジティブコントロール、Ｂｉｏｄａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）又は抗体を、２２５μｌのＰＲＰに最終濃度１０μＭのＡＤＰ、又は１００、１４０、１５０、若しくは２００μｇ／ｍｌの試験抗体となるように（試験した抗体の入手しやすさに応じて）加えた。継続的な攪拌下、３７℃で２５０μｌの試料を透過する光の透過率を測定することによって凝集度を測定した。ＰＰＰの透過率を１００％とした。凝集度を全体で６分間にわたって記録した。
【０２０４】
本明細書に述べられる各ｍＡｂの血小板凝集活性を評価するため、独立したドナーを用いた８つのアッセイで評価を行った。すなわち、１）ＩｇＧ１／ＩｇＧ２σ  Ｂ６Ｈ１２．２の活性をポジティブコントロールである１０μＭ  ＡＤＰ及びネガティブコントロールのＰＢＳと比較した５つの実験、及び、２）ＩｇＧ１／ＩｇＧ２σ  Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２の活性をＩｇＧ１  Ｂ６Ｈ１２．２及びネガティブコントロールのＰＢＳと比較した３つの実験を行った。この血小板凝集アッセイによって、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２は、３人の独立したドナーにおいて１００〜２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験した場合、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２σ骨格のいずれでも血小板凝集を誘発しないことが示された（２００μｇ／ｍｌでの実験の実施の結果を示した図１７ｂ〜ｄを参照）。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２σとしてのＣ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２で観察された最大凝集度は０〜７％の範囲であり、ＰＢＳコントロール（８人の独立したドナー、最大凝集度は２〜１１％の範囲）で観察された結果と同様であった。これに対して、１００及び２００μｇ／ｍｌで試験した場合にＢ６Ｈ１２．２はＩｇＧ１として、ポジティブコントロールの１０μＭ  ＡＤＰ（５人のドナー、５５〜１２０％の範囲の凝集度）と同様の４０〜９３％（８人のドナー）の範囲の凝集を誘発したが、ＩｇＧ２σとしては同様の凝集は誘発せず、凝集度は１〜６％の範囲であった（５人の独立したドナー）。
【０２０５】
ＣＤ４７抗体のＦｃ変異体のインビボ抗腫瘍作用：
Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、及びＣ４７Ｂ２２２のインビボ抗腫瘍活性を３つのヒト腫瘍細胞モデルで試験した。簡単に述べると、最初の２つのモデルでは、１０×１０6個のＨＬ−６０細胞又は５×１０6個のＭＶ４−１１細胞をＮＳＧマウスに静脈内移植した。これらのモデルの両方で、腫瘍細胞の移植後６日目に抗体による治療を開始し、０．２及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射によって週２回、動物に投与した。合計で６回の用量を投与し（最終投与は２３日目）、各用量群は５匹のマウスで構成した。ＨＬ−６０／ＮＳＧマウスモデルでは、１４日目から始めて末梢血をマウスから週１回採取し、ＦＡＣＳにより分析して腫瘍細胞のアウトグロース（outgrowth）及び治療効果を評価した（最終の採取は４２日目）。ＭＶ４−１１／ＮＳＧモデルでは、３４日目に末梢血をマウスから採取し、ＦＡＣＳにより分析して末梢血中の腫瘍細胞のアウトグロースに対する治療の効果を評価した。第３のインビボモデルでは、１０×１０6個のＫａｓｕｍｉ−３細胞をＮＳＧマウスに静脈内移植し、腫瘍細胞の移植後６日目に治療を開始した。腹腔内注射により０．２及び１０ｍｇ／ｋｇで週２回、合計で１２回の用量を動物に投与した。最終の用量は４４日目に投与し、各用量群は５匹のマウスで構成した。１４日目から始めて末梢血をマウスから週１回採取し、ＦＡＣＳにより分析して末梢血中の腫瘍細胞のアウトグロースを評価した。
【０２０６】
試験した３つのモデルのすべてで、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２は抗腫瘍活性を示した。ＨＬ６０モデルで試験した場合（図１８を参照）、それぞれのｍＡｂの効果は、試験した用量及び各ｍＡｂのＦｃのエフェクター機能に依存していた。すべてのｍＡｂのエフェクター機能を有するＩｇＧ１及びエフェクター機能を喪失させたＩｇＧ２σ変異体は、用量依存型の活性を示した。ＩｇＧ１は１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞のアウトグロースを安定的に抑制し、０．２ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞のアウトグロースを遅らせた。ＩｇＧ２σは１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞のアウトグロースを遅らせたが、０．２ｍｇ／ｋｇでは目立った抗腫瘍作用は認められなかった。ＨＬ６０モデルと同様、ＭＶ４ー１１モデル内で試験した場合には（図１９）、ｍＡｂはＩｇＧ１として０．２及び１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制した。腫瘍細胞のアウトグロースの抑制効果は、各ｍＡｂをＩｇＧ２σ骨格で試験した場合には低かった。エフェクター機能はＨＬ６０及びＭＶ４ー１１モデルで効果を高めたが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２σ  Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ２２２、及びＢ６Ｈ１２．２は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２σ骨格で試験した場合に０．２及び１０ｍｇ／ｋｇの両方で安定した抗腫瘍活性を示した（図２０）。
【０２０７】
実施例８：抗体中和の形態
上記の実施例で述べたように、恐らくはマクロファージのＳＩＲＰα受容体に対する標的細胞のＣＤ４７の結合を遮断し、その結果として、結合が遮断されなければ標的細胞がマクロファージに送るであろう「私を食べないで（eat-me-not）」シグナルを遮断することにより、細胞貪食作用を促進することができる抗体が作製された。図２１のＣＤ４７／Ｆａｂ構造とＣＤ４７／ＳＩＲＰα構造との重ね合わせは、すべてのＦｖドメインとＳＩＲＰαのＤ１ドメインとがぶつかる領域を示しており、抗体とＳＩＲＰαが両方とも同時にＣＤ４７に結合することを不可能としている。
【０２０８】
【表１３−１】
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【０２０９】
【表１３−２】
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【０２１０】
【表１３−３】
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【０２１１】
【表１３−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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