(57)【要約】本発明は胎盤由来マトリックス、それを調製する方法、及びその使用方法に関する。本発明は、胎盤由来マトリックスを使用して、細胞を培養し、細胞を送達し、幹細胞又は組織特異的前駆細胞の分化を促進し、欠損の瘢痕を修復する、置き換える、再生する、充填する、減らす、又は阻害する方法にも関する。本発明は、表面を胎盤由来マトリックスで被覆する又は胎盤由来マトリックスを目的の部位に注入する方法にさらに関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胎盤組織を失活させて失活胎盤組織を製造するステップと、
（ｂ）前記失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと
を含む、ｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有する胎盤由来マトリックスを調製する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が前記胎盤組織を非変性洗浄剤で処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記失活胎盤組織をホモジナイズするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記失活胎盤組織を４℃でホモジナイズする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して海綿構造体を製造するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記海綿構造体の平均ボイド容量が１０％〜９５％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記失活胎盤組織が３７℃で消化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記消化液がペプシン、酸又はその組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記消化液がペプシン及び酸を含み、前記酸が塩酸（ＨＣｌ）であり、前記消化液のペプシンの濃度が４００〜７００ユニット／ｍｌであり、前記消化液のＨＣｌの濃度が０．０１Ｍ〜１．０Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１つ又は複数の生理活性サプリメントを前記失活胎盤組織又は前記胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む、細胞培養の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、幹細胞、脂肪由来幹細胞、後根神経節細胞、膵島細胞、心筋細胞、肝細胞、ｉＰＳＣ、がん細胞、及び臍帯静脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記胎盤由来マトリックス上又は内部で前記細胞を保存するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記胎盤由来マトリックス上又は内部の前記細胞が凍結保存により保存される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の喪失を阻害する又は減少する方法であって、前記タンパク質を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスに、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の喪失を阻害する又は減少するのに十分な有効量で曝露するステップを含む、方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスに細胞を混合させて、前記細胞と前記胎盤由来マトリックスの混合物を製造するステップと、
（ｂ）前記混合物を目的の部位に注入するステップと
を含む、細胞送達の方法。
【請求項１７】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の血管、筋、又は神経分化を促進する方法であって、前記多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を、請求項１０のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記多能性幹細胞が成体幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップと、
（ｂ）前記胎盤由来マトリックスの上の組織部分を切除するステップと
を含む、組織を切除する方法。
【請求項２０】
前記組織が胃腸管の固着又は扁平新生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
失活胎盤組織を含む胎盤由来マトリックスであって、ｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有する胎盤由来マトリックス。
【請求項２２】
ハイドロゲルである、請求項２１に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項２３】
失活胎盤組織から本質的になる、請求項２１に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項２４】
胎盤由来マトリックスの乾燥重量１ｍｇ当たり２００ｎｇ以下のＤＮＡを含む、請求項２１に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項２５】
前記胎盤由来マトリックスがＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンガンマ−１、フィブロネクチン、絨毛性乳腺刺激ホルモン（ｃｈｒｏｉｏｎｉｃ  ｓｏｍｍａｔｏｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ）、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＩＧＦ−２、ＥＧＦＬ−７、及びｂＦＧＦを含み、前記胎盤由来マトリックス中の前記Ｉ型コラーゲンの濃度が３５％を超えている、請求項２１に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項２６】
胎盤由来マトリックスを基質の表面に被覆する方法であって、前記胎盤由来マトリックスがｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有し、前記方法が
（ａ）胎盤組織の少なくとも一片を失活させて失活胎盤組織を製造するステップと、
（ｂ）前記失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと、
（ｃ）基質の表面の少なくとも一部を前記胎盤由来マトリックスで被覆するステップと
を含む、方法。
【請求項２７】
前記胎盤由来マトリックスがハイドロゲルであり、前記方法が前記胎盤由来マトリックスを前記表面でゲル化するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記胎盤由来マトリックスが前記失活胎盤組織及び前記消化液から本質的になる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記失活胎盤組織のＤＮＡ量が、ステップ（ａ）前の前記胎盤組織のＤＮＡ量と比べて少なくとも９０％減少している、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に胎盤由来のマトリックス並びにその調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は多くの細胞型を培養で生育するのに不可欠であり、動物疾患モデル（例えば、心虚血）に注射されて治療可能性を示す。ＥＣＭは動物組織から種々の方法により調製することができる。しかし、異種ＥＣＭは免疫応答を誘発する又は異種人畜共通感染症を伝染させ、臨床的有用性を制限することがある。臨床応用に、例えば、治療目的、及び生物学的研究に適したＥＣＭの必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は胎盤由来マトリックス及び胎盤由来マトリックスを調製する又は使用するための方法に関する。
【０００４】
本発明の第１の態様に従えば、胎盤由来マトリックスを調製する方法が提供される。方法は、（ａ）胎盤組織の少なくとも一片を脱細胞化する又は失活させて脱細胞化又は失活胎盤組織を製造するステップ、及び（ｂ）消化液で脱細胞化又は失活胎盤組織を消化し胎盤由来マトリックスを製造するステップを含む。
【０００５】
胎盤由来マトリックスは、例えば、約８．０又はそれよりも高い塩基性ｐＨを有することができる。調製法は、胎盤由来マトリックスのｐＨを８．０又はそれよりも高く調整するステップをさらに含むことができる。胎盤由来マトリックスはコラゲナーゼが実質的になくてもよい（例えば、約１０、０．１、０．０１又は０．００１重量％未満）。胎盤由来マトリックスは、脱細胞化又は失活胎盤組織及び消化液から実質的になることができる。胎盤組織は哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコ、好ましくはヒト由来であってもよい。
【０００６】
脱細胞化又は失活ステップは非変性洗浄剤で胎盤組織を処理するステップを含むことができる。非変性洗浄剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシネート（Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール、ポリオキシエチレンノニルフェノール（ｎｏｎｙｐｈｅｎｏｌ）、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、及びポリオキシエチレンソルビトールエステルからなる群から選択することができる。
【０００７】
調製法は、消化と同時に、前に又は後で脱細胞化又は失活胎盤組織をホモジナイズするステップをさらに含むことができる。消化は脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液中でホモジナイズするステップを含むことができる。脱細胞化又は失活胎盤組織は１０秒〜７２時間ホモジナイズすることができる。脱細胞化又は失活胎盤組織は４℃でホモジナイズすることができる。調製法はホモジナイジングに先立って胎盤組織を切り取るステップをさらに含むことができ、胎盤組織の一部のみがホモジナイズされる。
【０００８】
調製法では、胎盤由来マトリックスはハイドロゲル、例えば、熱可逆性ハイドロゲルでもよい。胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルでもよく、熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル及び／又はゲルから溶液転移温度は４℃〜４０℃までの温度でもよい。胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルでもよく、熱可逆性ハイドロゲルは約３７℃の温度でゲル化することができる。
【０００９】
一実施形態では、調製法は胎盤組織由来の天然の架橋に加えて追加の架橋を加えるステップを含まない。別の実施形態では、調製法は胎盤組織由来の天然のキャリアーに加えて追加のキャリアーを加えるステップを含まない。さらに別の実施形態では、調製法は光活性剤を添加するステップを含まない。さらなる実施形態では、調製法は、天然に存在しない結合により脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスを架橋するステップを含まない。
【００１０】
調製法は上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して凍結又は凍結乾燥胎盤由来マトリックスを製造するステップをさらに含むことができる。
【００１１】
調製法は、胎盤由来マトリックスを所定の形状を有する型に入れ、胎盤由来マトリックスをその型の中で凍結する又は凍結乾燥するステップをさらに含むことができる。
【００１２】
調製法は上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して海綿構造体を製造するステップと、任意選択で、海綿構造体を水置換剤（ｗａｔｅｒ  ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で処理するステップであって、凍結又は凍結乾燥胎盤由来マトリックスが湿潤状態で保存されるステップとをさらに含むことができる。水置換剤は、グリセロール（グリセリンＵＳＰ）、アドニトール、ソルビトール、リビトール、ガラクチトール、Ｄガラクトース、１，３−ジヒドロキシプロパノール、エチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルコース、スクロース、マンニトール、キシリトール、メソエリスリトール、アジピン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、ポリエチレングリコール、アルコール、及び脂質からなる群から選択される１つ又は複数を含むことができる。海綿構造体は１μｍ〜４０００μｍの平均径を有する細孔を含むことができる。海綿構造体の平均ボイド容量は１０％〜９５％であってもよい。
【００１３】
調製法は上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して海綿構造体を製造するステップと；海綿構造体を溶媒に溶解して胎盤由来溶液を製造するステップと；胎盤由来溶液を電界紡糸して（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎ）ナノファイバーを製造するステップとをさらに含むことができる。
【００１４】
調製法は胎盤由来マトリックスの海綿構造体をネガティブ静水圧下で処理して空隙率を増加するステップをさらに含むことができる。
【００１５】
調製法は胎盤由来マトリックスを電界紡糸してナノファイバーを製造するステップをさらに含むことができる。
【００１６】
調製法では、脱細胞化又は失活胎盤組織は３７℃で消化することができる。消化液はペプシン、酸又はその組合せを含むことができる。酸は塩酸（ＨＣｌ）などの強酸でもよい。一実施形態では、消化液はペプシン及びＨＣｌを含み、消化液のペプシンの濃度は４００〜７００ユニット／ｍｌであり；消化液のＨＣｌの濃度は０．０１Ｍ〜１．０Ｍである。消化液の脱細胞化又は失活胎盤組織の濃度は０．１〜４０ｍｇ／ｍＬであってもよい。胎盤由来マトリックスでのペプシン活性は、酸性ｐＨ（例えば、約１．５〜２．０）下で、好ましくはｐＨ２．０で試験された場合、消化液中のペプシン活性の約１０、５、１又は０．１％未満であってもよい。
【００１７】
調製法では、脱細胞化又は失活胎盤組織での胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で５０％〜１００％であってよい。胎盤由来マトリックスでの胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で５０％〜１００％であってよい。
【００１８】
調製法では、脱細胞化又は失活胎盤組織でのＤＮＡ量は脱細胞化又は失活ステップ前の胎盤組織でのＤＮＡ量と比べて少なくとも９０％減少させることができる。胎盤由来マトリックスは胎盤由来マトリックスの１ｍｇ乾燥重量当たり１０μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、２００ｎｇ又は１００ｎｇ以下のＤＮＡを含んでいてもよい。
【００１９】
調製法は移植に先立って胎盤由来マトリックスを保存するステップをさらに含むことができる。胎盤由来マトリックスは乾燥状態で保存してもよい。胎盤由来マトリックスは凍結保存により保存してもよい。
【００２０】
調製法は１つ又は複数の処理溶液で上記胎盤由来マトリックスを処理するステップをさらに含むことができる。処理溶液はイオン、酵素、若しくは化学架橋剤、光活性剤、又はポリマーを含んでいてもよい。イオン架橋剤は、カルシウム、バリウム、アルミニウム、ストロンチウム、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、及び鉄からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。酵素架橋剤は、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）、ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、及びジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。化学架橋剤は、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ゲニピン、グルコース又はリボース、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、並びにアクリルアジドからなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。ポリマーは、天然若しくは修飾コラーゲン、ゼラチン、アガロース、修飾ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ミネラル除去骨マトリックス、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、グリセロール、スクロースオクタ硫酸、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン（ａｃｒｙｌｏｉｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、ポリウレタン、並びにポリ乳酸からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００２１】
調製法は、１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）を脱細胞化若しくは失活胎盤組織又は胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むことができる。１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）は、ＦＧＦファミリー、ＴＧＦファミリーの成長又は分化因子、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨｒＰ、Ｉｈｈ、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ＩＴＳ、及びアスコルビン酸からなる群から選択してもよい。
【００２２】
調製法は、生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する１つ又は複数の薬剤（複数可）を脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むことができる。生理活性サプリメント結合部位（複数可）は上記胎盤由来マトリックスに対する増殖因子、分化因子、サイトカイン、抗菌薬又は抗炎症薬の親和性を増加させることができる。
【００２３】
調製法は胎盤組織を浄化し消毒するステップをさらに含むことができる。
【００２４】
調製法は胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織を減菌するステップをさらに含むことができる。
【００２５】
調製法は、胎盤組織の少なくとも一片を脱細胞化して脱細胞化胎盤組織を製造するステップをさらに含むことができる。
【００２６】
調製法は、１つ又は複数の骨片物質（複数可）を胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むことができる。骨片物質（複数可）は、非ミネラル除去骨、部分的にミネラル除去された骨、ミネラル除去された骨、セラミックス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び炭酸カルシウムからなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の調製法ごとに、上記方法により調製される胎盤由来マトリックスが提供される。
【００２８】
細胞培養の方法が提供される。方法は本発明の調製法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む。細胞は、幹細胞、脂肪由来幹細胞、後根神経節細胞、膵島細胞、心筋細胞、肝細胞、ｉＰＳＣ、がん細胞、及び臍帯静脈内皮細胞からなる群から選択することができる。方法は胎盤由来マトリックス上又は内部に細胞を保存するステップをさらに含むことができる。胎盤由来マトリックス上又は内部の細胞は凍結保存により保存してもよい。
【００２９】
凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する及び／又は減少する方法が提供される。方法は、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する又は減少するのに十分な有効量で、本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックスにタンパク質を曝露するステップを含む。
【００３０】
細胞送達の方法が提供される。方法は、本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックスに細胞を混合させて、細胞と胎盤由来マトリックスの混合物を製造するステップと、混合物を目的の部位に注入するステップとを含む。
【００３１】
細胞送達の方法が提供される。方法は、本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養して、細胞と胎盤由来マトリックスの培養物を製造するステップと、培養物を目的の部位に注入するステップとを含む。目的の部位は細胞送達を必要とする対象にあってもよい。
【００３２】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の分化を促進する方法が提供される。方法は、多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む。多能性幹細胞は、多能性幹細胞の分化を誘導する増殖因子又は別の二次因子を添加せずに胎盤由来マトリックス上又は内部で培養してもよく、多能性幹細胞の分化が増加される。多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞は、細胞の維持又は分化を誘導する１つ又は複数の増殖因子又は他の二次因子を添加して培養してもよい。多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、膵細胞、神経細胞、靭帯又は腱に分化することができる。多能性幹細胞は成体幹細胞であってもよい。多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞は、胚、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、胎盤膜、月経血、歯、髄核、脳、新生児包皮、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、肝臓、膵臓、又は筋肉由来でもよい。多能性幹細胞は多能性幹細胞でもｉＰＳＣでもよい。多能性幹細胞は、脂肪由来幹細胞及び歯髄幹細胞からなる群から選択することができる。
【００３３】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の血管、筋、又は神経分化を促進する方法が提供される。方法は、多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む。多能性幹細胞は成体幹細胞であってもよい。多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞は、胚、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、胎盤膜、月経血、歯、髄核、脳、新生児包皮、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、又は筋肉由来でもよい。多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞は多能性幹細胞でもｉＰＳＣでもよい。
【００３４】
組織特異的前駆細胞の自己再生能力の維持を増加する方法が提供される。方法は、組織特異的前駆細胞を本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む。一実施形態では、組織特異的前駆細胞の維持を誘導する増殖因子又は別の二次因子は添加されない。
【００３５】
組織の欠損を減少させる又は修復する方法が提供される。方法は本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックスを欠損の部位に移植するステップを含む。移植は胎盤由来マトリックスを欠損の部位に塗布する、エアブラシで吹き付ける、滴下する、又は注入することにより実施することができる。組織は心臓、肝臓、膵臓、骨、軟骨、又は軟組織でもよい。方法は、上記胎盤由来マトリックス上又は内部に生活細胞（ｖｉｔａｌ  ｃｅｌｌ）を播種して上記胎盤由来マトリックスに活力を与えるステップをさらに含むことができる。方法は、上記胎盤由来マトリックス上又は内部に生活細胞を播種して上記胎盤由来マトリックスに活力を与えるステップと、上記細胞播種胎盤由来マトリックスを移植前に培養するステップとをさらに含むことができる。方法は、移植に先立って胎盤由来マトリックスの水和を排除して、上記胎盤由来マトリックスに血液、体液、及び／又は自己細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで吸収させることができる。上記方法は、胎盤由来マトリックスを水和溶液で水和させ、任意選択で上記胎盤由来マトリックス上又は内部に生活細胞を播種して上記胎盤由来マトリックスに活力を与えるステップと、任意選択で上記細胞播種胎盤由来マトリックスを移植前に培養するステップとをさらに含むことができる。水和溶液は、血液又は骨髄吸引液、多血小板血漿、滑液、酵素、生理活性サプリメント、天然ポリマー、合成ポリマー、光活性剤、抗酸化剤、架橋剤、抗菌薬、生活細胞、及び生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する１つ又は複数の薬剤からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。生活細胞は、自己又は同種移植骨髄吸引液由来の細胞；骨髄由来の間質細胞；脂肪、滑膜、骨膜、軟骨膜、筋肉、真皮、臍帯血、及びホウォートンゼリー由来の間質細胞；並びに周皮細胞からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００３６】
目的の組織部分を標識する方法が提供される。方法は、本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップを含む。
【００３７】
組織を切除する方法が提供される。方法は、本発明の方法により調製される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップと、胎盤由来マトリックスの上の組織部分を切除するステップとを含む。移植は上記胎盤由来マトリックスを欠損の部位に塗布する、エアブラシで吹き付ける、滴下する、又は注入することにより実施することができる。組織は胃腸管の固着でも扁平新生物でもよい。方法は、胎盤由来マトリックスを移植後粘膜を切り取るステップと、組織を切断するステップと、残りの胃腸管から組織を持ち上げて離すステップとをさらに含むことができる。
【００３８】
本発明の第２の態様に従えば、胎盤由来マトリックスは脱細胞化又は失活胎盤組織を含み、胎盤由来マトリックスは、例えば、８．０又はそれよりも高い塩基性ｐＨを有する。胎盤由来マトリックスはコラゲナーゼが実質的になくてもよい（例えば、約１０、０．１、０．０１又は０．００１重量％未満）。胎盤由来マトリックスは脱細胞化又は失活胎盤組織から本質的になっていてもよい。
【００３９】
胎盤由来マトリックスはハイドロゲル、例えば、熱可逆性ハイドロゲルであってもよい。一実施形態では、胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルであり、熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル転移温度は４℃〜４０℃の温度である。別の実施形態では、胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルであり、熱可逆性ハイドロゲルは約３７℃の温度でゲル化する。
【００４０】
胎盤由来マトリックスは海綿構造体を含むことができる。胎盤由来マトリックスはナノファイバーを含むことができる。胎盤由来マトリックスでの胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で５０％〜１００％でもよい。脱細胞化又は失活胎盤組織は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコ、好ましくはヒトに由来していてもよい。胎盤由来マトリックスは、胎盤由来マトリックスの１ｍｇ乾燥重量当たり１０μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、２００ｎｇ又は１００ｎｇ以下のＤＮＡを含むことができる。胎盤由来マトリックスは、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンガンマ−１、フィブロネクチン、絨毛性乳腺刺激ホルモン（ｃｈｒｏｉｏｎｉｃ  ｓｏｍｍａｔｏｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ）、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＩＧＦ−２、ＥＧＦＬ−７、及びｂＦＧＦを含むことができ、胎盤由来マトリックスでのＩ型コラーゲンの濃度は３５％を超えている。
【００４１】
細胞培養の方法が提供される。方法は本発明の胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む。
【００４２】
凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する及び／又は減少する方法が提供される。方法は、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する又は減少するのに十分な有効量で、本発明の胎盤由来マトリックスにタンパク質を曝露するステップを含む。
【００４３】
細胞送達の方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックスに細胞を混合させて、細胞と胎盤由来マトリックスの混合物を製造するステップと、混合物を目的の部位に注入するステップとを含む。
【００４４】
細胞送達の方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養して、細胞と胎盤由来マトリックスの培養物を製造するステップと、培養物を目的の部位に注入するステップとを含む。
【００４５】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の分化を促進する方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックス上又は内部で多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を培養するステップを含む。
【００４６】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の血管、筋、又は神経分化を促進する方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックス上又は内部で多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を培養するステップを含む。
【００４７】
組織特異的前駆細胞の自己再生能力の維持を増加する方法が提供される。方法は、組織特異的前駆細胞を本発明の胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む。
【００４８】
組織の欠損を減少させる又は修復する方法が提供される。上記方法は本発明の胎盤由来マトリックスを欠損の部位に移植するステップを含む。
【００４９】
目的の組織部分を標識する方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップを含む。
【００５０】
組織を切除する方法が提供される。方法は、本発明の胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップと、胎盤由来マトリックスの上の組織部分を切除するステップとを含む。
【００５１】
本発明の第３の態様に従えば、胎盤由来マトリックスを基質の表面に被覆する方法が提供される。方法は、（ａ）胎盤組織の少なくとも一片を脱細胞化又は失活させて、脱細胞化又は失活胎盤組織を製造するステップと、（ｂ）脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと、（ｃ）基質の表面の少なくとも一部を胎盤由来マトリックスで被覆するステップとを含む。胎盤由来マトリックスは、被覆前は塩基性のｐＨを有していてもよい。被覆法は、被覆前に、胎盤由来マトリックスのｐＨを塩基性に、例えば、８．０又はそれよりも高いｐＨに調整するステップをさらに含むことができる。胎盤由来マトリックスはコラゲナーゼが実質的になくてもよい（例えば、約１０、０．１、０．０１又は０．００１重量％未満）。胎盤由来マトリックスは、脱細胞化又は失活胎盤組織及び上記消化液から本質的になっていてもよい。胎盤組織は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコ、好ましくはヒト由来であってもよい。
【００５２】
被覆法は、表面で胎盤由来マトリックスを電界紡糸するステップをさらに含むことができる。
【００５３】
被覆法は、消化と同時に又はこれに先立って胎盤組織をホモジナイズするステップをさらに含むことができる。消化は、脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液中でホモジナイズするステップを含むことができる。ホモジナイジングは１０秒〜７２時間実施してもよい。ホモジナイジングは４℃で実施してもよい。
【００５４】
被覆法はホモジナイジングに先立って胎盤組織を切り取るステップをさらに含むことができ、胎盤組織の一部分のみがホモジナイズされる。
【００５５】
胎盤由来マトリックスがハイドロゲルである場合、被覆法は胎盤由来マトリックスを表面でゲル化するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルであり、熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル転移温度は４℃〜４０℃の温度である。別の実施形態では、胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルであり、熱可逆性ハイドロゲルは約３７℃の温度でゲル化する。
【００５６】
一実施形態では、被覆法は、胎盤組織由来の天然のクロスリンカーに加えて追加のクロスリンカーを加えるステップを含まない。別の実施形態では、被覆法は、胎盤組織由来の天然のキャリアーに加えて追加のキャリアーを加えるステップを含まない。さらに別の実施形態では、被覆法は光活性剤を加えるステップを含まない。さらなる実施形態では、被覆法は、天然には存在しない結合により胎盤組織又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織を架橋するステップを含まない。
【００５７】
被覆法では、消化液はペプシン、ＨＣｌ又はその組合せを含むことができる。一実施形態では、消化液はペプシン及びＨＣｌを含み、ペプシンの濃度は４００〜７００ユニット／ｍｌであり、ＨＣｌの濃度は０．０１Ｍ〜１．０Ｍである。
【００５８】
被覆法では、消化液での脱細胞化又は失活胎盤組織の濃度は５〜５０ｍｇ／ｍＬでもよい。脱細胞化又は失活胎盤組織での胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で５０％〜１００％でもよい。胎盤由来マトリックスでの胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で５０％〜１００％でもよい。
【００５９】
被覆法では、脱細胞化又は失活胎盤組織でのＤＮＡ量は、脱細胞化ステップ前の胎盤組織でのＤＮＡ量と比べて少なくとも９０％減少していてもよい。胎盤由来マトリックスは、１ｍｇの胎盤由来マトリックス当たり１０μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、２００ｎｇ又は１００ｎｇ以下のＤＮＡを含んでいてもよい。
【００６０】
被覆法は移植に先立って基質を保存するステップをさらに含むことができる。基質は乾燥状態で保存してもよい。基質は凍結保存により保存してもよい。
【００６１】
被覆法は、上記胎盤由来マトリックスを被覆前に又は後で１つ又は複数の処理溶液で処理するステップをさらに含むことができる。上記１つ又は複数の処理溶液のうちの少なくとも１つは、イオン、酵素、若しくは化学架橋剤、光活性剤、又はポリマーを含むことができる。イオン架橋剤は、カルシウム、バリウム、アルミニウム、ストロンチウム、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、及び鉄からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。酵素架橋剤は、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）、ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、及びジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。化学架橋剤は、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ゲニピン、グルコース又はリボース、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、並びにアクリルアジドからなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。ポリマーは、天然若しくは修飾コラーゲン、ゼラチン、アガロース、修飾ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ミネラル除去骨マトリックス、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、グリセロール、スクロースオクタ硫酸、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、ポリウレタン、並びにポリ乳酸からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００６２】
被覆法は、被覆の前又は後で、１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）を脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むことができる。１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）は、ＦＧＦファミリー、ＴＧＦファミリーの成長又は分化因子、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨｒＰ、Ｉｈｈ、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ＩＴＳ、及びアスコルビン酸からなる群から選択することができる。
【００６３】
被覆法は、生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する１つ又は複数の薬剤（複数可）を脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むことができる。生理活性サプリメント結合部位（複数可）は上記胎盤由来マトリックスに対する増殖因子、分化因子、サイトカイン、抗菌薬又は抗炎症薬の親和性を増加させることができる。
【００６４】
被覆法は胎盤組織を浄化し消毒するステップをさらに含むことができる。被覆法は胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織を減菌するステップをさらに含むことができる。被覆法は胎盤組織を脱細胞化するステップをさらに含むことができる。被覆法は胎盤由来マトリックスをネガティブ静水圧下で加工して空隙率を増加するステップをさらに含むことができる。
【００６５】
本発明の被覆法ごとに、方法により製造されるスキャフォールドが提供される。
【００６６】
本発明の被覆法ごとに、方法により製造される胎盤由来マトリックスで被覆された表面が提供される。
【００６７】
本発明の被覆法ごとに、細胞培養の方法が提供される。細胞培養の方法は、被覆法により製造される胎盤由来マトリックスで被覆された細胞培養表面で細胞を培養するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は質量分析相対的存在量データを描いている表である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と比べた胎盤由来マトリックス試料で見出される主要ＥＣＭタンパク質の量は、胎盤由来マトリックス試料において今までのところ同定されているすべてのコラーゲンアイソフォーム（鎖）の一覧表と一緒に、オービトラップ質量分析により決定される相対的存在量により示されている。
【図２】図２は胎盤由来マトリックス試料ＨｕＭＡＴＲＩＸ及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に存在する残留ＤＮＡを描いている画像である。胎盤由来マトリックス試料に存在する残留ＤＮＡの量を定量するため、ピコグリーンアッセイを行った。開始胎盤組織、ＨｕＭＡＴＲＩＸ及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、１ｍｇの組織又はマトリックス当たりそれぞれ１１２４２．５２、１１９．６９及び１２６．５９ｎｇ（ｎｇ／ｍｇ組織）の平均ＤＮＡ濃度を有しており、開始組織と比べておおよそ９５％のＤＮＡの減少を示した。これは、Ｈ＆Ｅにより染色された胎盤由来マトリックス組織の組織学切片により確認された。
【図３】図３はアッセイ感度の評価を示すグラフである。０．７５ｍｇ／ｍｌよりも小さなペプシン濃度は試験試料の確定絶対吸収度と直線関係を生じた。０．７５ｍｇ／ｍｌよりも大きな濃度では、飽和に達した。個々の試験試料（ｎ＝４）間の高いレベルの再現性及び低い誤差範囲に注目されたい。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、ｐＨ７．４又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続く残留ペプシン活性に対する効果を示している。Ａ：調製され（０．７５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２．０）、それぞれｐＨ７．４（中性）又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続くペプシン活性アッセイにより確定された試験試料での絶対ペプシン活性。中性又はｐＨ８．２へのｐＨスイープにより非調整試料と比べてペプシンは著しく不活化し（＊、ｎ＝４、ｐ＜０．０１）、ｐＨ８．２スイープにかけられる試験試料は、ｐＨ７．４スイープに曝露される試験試料と比べた場合、中性ｐＨスイープに曝露された試験試料よりも有意に大きなレベルのペプシン不活化を示している（＊、ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、ｐＨ７．４又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続く残留ペプシン活性に対する効果を示している。Ｂ：非調整試験試料（ｐＨ２．０）と比べたｐＨスイープにかけられた試験試料での残留ペプシン活性の相対レベル。
【図５】図５は経時的ペプシン活性の消失を示す図である。ペプシン溶液及びＥＣＭ含有試験試料はタンパク質分解活性の経時的漸減を示している。初期の時点では、ＥＣＭ含有試験試料はペプシン溶液単独よりも有意に高いタンパク質分解活性を示していた。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、胎盤ＥＣＭ及びペプシン抽出に続く胎盤ＥＣＭ分解生成物の存在下でのｐＨ７．４又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続く残留ペプシン活性に対する効果を示している。Ａ：調製され（０．７５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２．０）、それぞれｐＨ７．４（中性）又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続くペプシン活性アッセイにより確定され、５、２４０、又は１４４０分間インキュベートされた試験試料での絶対ペプシン活性。中性又はｐＨ８．２へのｐＨスイープにより非調整試料と比べてペプシンは著しく不活化し（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）、ｐＨ８．２スイープにかけられる試験試料はｐＨ７．４スイープに曝露される試験試料と比べた場合、中性ｐＨスイープに曝露された試験試料（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）よりも有意に大きなレベルのペプシン不活化を示している。すべての試験群でのペプシン活性の経時的な観察された減少及び胎盤ＥＣＭに関連するタンパク質分解活性の増加したレベルに注目されたい。
【図６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、胎盤ＥＣＭ及びペプシン抽出に続く胎盤ＥＣＭ分解生成物の存在下でのｐＨ７．４又はｐＨ８．２へのｐＨスイープに続く残留ペプシン活性に対する効果を示している。Ｂ：非調整試験試料（ｐＨ２．０）と比べたｐＨスイープにかけられた試験試料での残留ペプシン活性の相対レベル、ｐＨ２．０（＊）及びｐＨ７．２スイープ（＃）まで群当たりｎ＝４  Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
［発明の詳細な説明］
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の臨床応用を治療目的に前進させることに向けて、胎盤由来マトリックスは調製されており、そのＥＣＭは、例えば、新規のｉｎ  ｖｉｖｏ送達について並びに異種成分不含有、無血清体細胞及び幹細胞培養物を支援することについてプロテオミクス的に評価されてきた。塩基性ｐＨを有する胎盤由来マトリックスは中性ｐＨを有する胎盤由来マトリックスを上回る改善効果を提供することが発見されていた。例えば、塩基性ｐＨはペプシンなどの消化酵素を不可逆的に不活化し、組織の消化の正確な制御を行ってＥＣＭを作る。さらに、塩基性ｐＨはＥＣＭにより優れたゲル化特性、例えば、より均質なＥＣＭをもたらす。さらに、塩基性ｐＨを有するＥＣＭはより優れた細胞機能、例えば、より優れた細胞接着を示す。胎盤組織を１つ又は複数の非変性洗浄剤で処理することを伴う脱細胞化又は失活化工程により調製される、抽出液、ハイドロゲル又は他の再構成されたスキャフォールドの形態の胎盤由来マトリックスは、胎盤組織の生物学的機能を実質的に維持できることも発見されている。
【００７０】
本発明は胎盤由来マトリックス、それを調製する方法、及び使用方法を提供する。本発明は、胎盤由来マトリックスを使用して、細胞を培養する、細胞を送達する、幹細胞又は組織特異的前駆細胞の分化を促進する、及び欠損の瘢痕を修復する、置き換える、再生する、充填する、減らす又は阻害する方法も提供する。本発明は、表面を胎盤由来マトリックスで覆う又は胎盤由来マトリックスを目的の部位に注入する方法をさらに提供する。
【００７１】
一態様では、本発明は胎盤由来マトリックスを調製する方法に関する。方法は胎盤組織を脱細胞化又は失活させて脱細胞化又は失活胎盤組織を製造するステップと、脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップとを含む。
【００７２】
本明細書で使用される用語「胎盤由来マトリックス」とは、胎盤組織から調製される細胞外マトリックスのことである。胎盤由来マトリックスは、胎盤組織中の細胞外分子（例えば、タンパク質、多糖及びプロテオグリカン）のうちのかなりの量（例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９９％、９９．９％又は９９．９９９％）を保持することができる。胎盤由来マトリックスは生活細胞を含まないことが好ましい。胎盤由来マトリックスは胎盤組織中の１つ又は複数の分子（例えば、コラゲナーゼ及び内毒素）が実質的になくてもよい（例えば、約１０、０．１、０．０１又は０．００１重量パーセント未満）。
【００７３】
胎盤由来マトリックスは塩基性ｐＨを有することができる。調製法は、脱細胞化又は失活胎盤組織の消化により製造される胎盤由来マトリックスのｐＨを塩基性、例えば、約８．０又はそれよりも高く、好ましくは、約８．２に調整するステップをさらに含むことができる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「塩基性ｐＨ」とは、約７．８よりも上のｐＨのことである。塩基性ｐＨは、約８．０〜１１．０、好ましくは、約８．０〜９．０、さらに好ましくは約８．０〜８．２の範囲であってもよい。例えば、塩基性ｐＨは、約７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０であってもよい。塩基性ｐＨは約８．２であることが好ましい。
【００７５】
本明細書で使用される用語「中性ｐＨ」とは、約６．０〜７．８、好ましくは約６．５〜７．５、さらに好ましくは約６．８〜７．２のｐＨのことである。例えば、中性ｐＨは約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７又は７．８であってもよい。中性ｐＨは約７．４であることが好ましい。
【００７６】
本明細書で使用される用語「酸性ｐＨ」とは約５．０より低いｐＨのことである。酸性ｐＨは約１．０〜５．０、好ましくは約１．０〜４．０、さらに好ましくは約１．５〜２．０の範囲であってもよい。例えば、酸性ｐＨは約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５又は４．０であってもよい。酸性ｐＨは約２．０であることが好ましい。
【００７７】
本明細書で使用される用語「脱細胞化」とは、組織、例えば、胎盤組織中の無傷の細胞のうちの相当量を、例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９９，９９．９又は９９．９９９％減らすための工程のことである。
【００７８】
本明細書で使用される用語「失活させる」とは、組織、例えば、胎盤組織中の生細胞のうちの相当量を、例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９９，９９．９又は９９．９９９％減らすための工程のことである。胎盤由来マトリックスは生細胞を含まないことが好ましい。
【００７９】
胎盤組織は哺乳動物由来であってよい。哺乳動物は、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ又はネコであってよい。胎盤組織はヒト胎盤組織であることが好ましい。一実施形態では、胎盤由来マトリックスは、胎盤由来マトリックスが、例えば、移植によりヒトに導入される場合、対象において免疫応答を誘導しない。
【００８０】
本明細書に記載される脱細胞化又は失活化工程は、胎盤組織の一片から細胞成分を取り除く。本明細書に記載される脱細胞化又は失活化工程は、米国特許第６，７３４，０１８号、米国特許第７，３３８，７５７号、米国特許第８，５７４，８２６号、米国特許第６，７４３，５７４号、及び米国特許第８，５６３，２３２号、並びに米国特許出願公開第２０１４／００６５２３８号及び米国特許出願公開第２０１４／０１５４６６３号に記載される方法に従って実施することができ、上記特許文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。脱細胞化又は失活化工程は、洗浄剤、エンドヌクレアーゼ、又はプロテアーゼを使用するステップを含まないでもよい。脱細胞化又は失活化工程は、胎盤組織のマトリックス及び／又は組織構造を損傷せずに実施することができ、洗浄剤、サルコシネート（ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅｓ）、エンドヌクレアーゼ、及び汚染除去剤（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を用いてもよい。洗浄剤は、組織、好ましくは胎盤組織、さらに好ましくはヒト胎盤組織を脱細胞化する又は失活させるのに適したいかなる洗浄剤でもよい。いくつかの実施形態では、失活胎盤組織は、洗浄剤、好ましくは非変性洗浄剤を使用して胎盤組織を失活させることにより製造される。非変性洗浄剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシネート、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール、ポリオキシエチレンノニルフェノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、及びポリオキシエチレンソルビトールエステルからなる群から選択することができる。洗浄剤は、好ましくは、陰イオン洗浄剤でも変性洗浄剤、例えば、ＳＤＳでもない。
【００８１】
マトリックス構造は、いくつかある成分の中で特にコラーゲン、ヒアルロニン（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｎｓ）、エラスチン、ムコ多糖及びプロテオグリカンを含むことができる。いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックスは、１つよりも多いタイプのコラーゲン並びに／又はコラーゲン、コラーゲンＩ型、及び／若しくはコラーゲンＩＶ型以外の１つよりも多いタンパク質を含んでいてもよい。脱細胞化又は失活化工程に先立つ胎盤組織でのＥＭＣタンパク質（例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及び胎盤性ラクトゲン）のうちの少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９重量パーセントは、得られる胎盤由来マトリックスに残ってもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、脱細胞化又は失活胎盤組織でのＤＮＡ量は、脱細胞化又は失活化工程前の胎盤組織でのＤＮＡ量と比べて、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％若しくはそれよりも多く；６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９、１００％若しくはそれよりも少なく；及び／又は５０〜１００％、７０〜１００％、９０〜１００％、９０〜９５％減少する。他の実施形態では、胎盤由来マトリックスは、胎盤由来マトリックスの１ｍｇ乾燥重量当たり１０μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、２００ｎｇ又は１００ｎｇ以下のＤＮＡを含む。
【００８３】
追加の実施形態では、本明細書に記載される胎盤組織は自家移植片、同種移植片、又は異種移植片である。追加の実施形態では、本明細書の胎盤組織は、とりわけ、ヒト、非ヒト動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又は魚起源を有していてもよい。さらなる実施形態では、本明細書に記載される胎盤組織は、（ｉ）プレート、羊膜及び絨毛膜を有する全完全胎盤、又は（ｉｉ）羊膜及び／又は絨毛膜を除外する胎盤組織の一部でもよい。胎盤組織はバイオテクノロジー的方法の産物、例えば、細胞培養法を使用して製造される組織操作された胎盤組織でもよく、そのようなバイオテクノロジー的方法の産物は本明細書に記載される胎盤組織として含まれてもよい。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態に従って胎盤由来マトリックスを調製する方法は、脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップを含む。本明細書に記載される消化液は、胎盤組織中のタンパク質の少なくとも一部を消化する酵素を含むことができる。例えば、消化液は、酸、強又は弱酸、並びに、パパイン、ペプシン、ペプシノーゲン、トリプシン、コラゲナーゼ、及び／又はディスパーゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼを含んでいてもよい。酸は、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸（ＨＮＯ３）、酢酸（ＨＣ２Ｈ３Ｏ２）、クエン酸（Ｈ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）及びトリフルオロ酢酸（ＣＦ３ＣＯ２Ｈ）からなる群から選択することができる。酸はＨＣｌが好ましい。本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」は関連する挙げられた項目のうちの１つ又は複数のありとあらゆる組合せを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、消化液中のペプシンの濃度は約３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、５０００又は８０００ユニット／ｍｌ若しくはそれよりも少ない；約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、５０００又は６０００ユニット／ｍｌ若しくはそれよりも多い：及び／又は約１００〜８０００、２００〜１０００、４００〜７００、１００〜６００、４００〜１０００、３００〜６００、若しくは５００〜６００ユニット／ｍｌでもよい。胎盤由来マトリックス中のペプシン活性は、適切な酸性ｐＨ、例えば、約２．０で試験した場合、消化液中のペプシン活性の約１０、５、１又は０．１％未満でもよい。
【００８６】
追加の実施形態では、消化液中の酸（例えば、ＨＣｌ）の濃度は、約０．００５、０．００２、０．００５、０．０２、０．２、０．３、０．４、０．６、０．８、１．０Ｍ若しくはそれよりも少ない；約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．１５、０．２、０．３、０．５、０．７Ｍ若しくはそれよりも多い；及び／又は約０．０００５〜１．０Ｍ、０．０１〜０．２Ｍ、０．００１〜０．５Ｍ、０．０２〜０．２、０．０２〜０．１、０．０１〜０．１、若しくは０．０００１〜０．５Ｍでもよい。さらなる実施形態では、消化液中の脱細胞化又は失活胎盤組織の濃度は、約０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｇ／ｍＬ若しくはそれよりも少ない；約０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｇ／ｍＬ若しくはそれよりも多い；及び／又は約０．１〜４０、１〜５０、１０〜４０、０．０１〜１００、若しくは１０〜１００ｍｇ／ｍＬでもよい。追加の実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間又は７２時間又はそれよりも多い時間消化される。追加の実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は約２０秒、３０秒、６０秒、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間又は７２時間又はそれよりも少ない時間消化される。さらなる実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は約２０秒〜７２時間、約１分〜２０分、約１分〜１０分、又は約１分〜６分間消化される。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態に従って胎盤由来マトリックスを調製する方法は、
脱細胞化又は失活胎盤組織を消化と同時に、前に又は後でホモジナイズして、ホモジナイズされた胎盤組織又は胎盤組織ホモジネートを含む胎盤由来マトリックスを製造するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、消化は脱細胞化又は失活胎盤組織を消化液中でホモジナイズするステップを含む。ホモジナイズされた胎盤組織又は胎盤組織ホモジネートは、ホモジナイジング前の組織又は組織断片と比べて小さい及び／又は均等に分配された粒子にまで減少された脱細胞化又は失活胎盤組織の少なくとも一片を含有する。ホモジナイズされた胎盤組織は、粒子に加えて、任意選択で、水、水溶液、又は水混和性極性有機溶媒のうちの少なくとも１つを含でいてもよい。本発明の方法で使用されるホモジナイズされた胎盤組織は、約１００ミクロン未満の平均径を有する粒子を含む。いくつかの実施形態では、ホモジナイズされた胎盤組織は、胎盤組織、並びに任意選択で、水、水溶液、及び水混和性極性有機溶媒のうちの少なくとも１つを含む組成物の剪断誘発破砕により調製することができる。ある特定の実施形態では、従来のブレンダーをホモジナイズされた胎盤組織を調製するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、胎盤組織は、（例えば、ブレンダー、打解機、及びミキサーにより）軟組織を切り刻む、薄く裂く、粉砕する（凍結粉砕を含む）、磨り潰す、薄切りにする及び／又は打ち砕くことにより機械的にホモジナイズしてもよい。例えば、本明細書に記載される胎盤組織は、ブレンダーにより、約１、３、又は５分間、約１０００、５０００、１００００、又は１５０００ｒｐｍ及び市販のブレンダーの最大剪断速度で機械的に改変することができる。追加の実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は、約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間又は７２時間又はそれよりも長い時間ホモジナイズされる。追加の実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は、約２０秒、３０秒、６０秒、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間又は７２時間又はそれよりも短い時間ホモジナイズされる。さらなる実施形態では、胎盤組織及び／又は脱細胞化若しくは失活胎盤組織は、約２０秒〜７２時間、約１分〜２０分、約１分〜１０分、又は約１分〜６分間ホモジナイズされる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、消化及び／又はホモジナイズは、約−２００、−１００、−８０、−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、−５、０、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６若しくは３７℃で；約−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、−５、０、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８若しくは３９℃より下で；約−８０、−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、−５、０、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６若しくは３７℃より上で；及び／又は約−８０〜約３７℃、−８０〜約２５℃、−８０〜約３８℃、−７０〜約３８℃、約−５０〜約３８℃、約−３０〜約３８℃、約−１０〜約３８℃、約０〜約３８℃、約５〜約３８℃、約１０〜約３８℃、約１５〜約３８℃、約−５〜約１０℃、約−５〜約５℃、若しくは約０〜約１０℃で実施することができる。追加の実施形態では、本明細書に記載される方法は、胎盤組織又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を、消化及び／又はホモジナイジングに先立って、その間、及び／又はその後に約２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００℃よりも高い熱で処理するステップを排除してもよい。いくつかの実施形態では、方法は胎盤組織又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を、消化及び／又はホモジナイジングに先立って、その間、及び／又はその後に約５０、７０、９０、１１０、２００、又は３００℃よりも低い熱で処理するステップを排除する。他の実施形態では、方法は胎盤組織又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を、消化及び／又はホモジナイジングに先立って、その間、及び／又はその後に、約２６〜約２００℃、約３０〜約１５０℃、約３９〜約３００℃、約４０〜約１２０℃、約５０〜約１１０℃、及び約５０〜約１００℃、約５０〜約３００℃の熱で処理するステップを排除する。別の態様では、方法は、当技術分野でいくつかある方法の中で特に、超音波処理、マイクロ波照射、又は発熱部品からの従来の熱伝達を排除してもよい。
【００８９】
別の態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスはハイドロゲルの形態でもよい。本明細書で使用されるとき、用語ハイドロゲルはその技術分野で理解されている意味を有しており、水を吸収して様々な弾性のゲルを形成することができる水膨潤性ポリマーマトリックスのことである。用語「マトリックス」とは、共有及び／又は非共有架橋により一つに保持されている三次元網目の巨大分子のことである。水性環境に置かれると、乾燥ハイドロゲルは架橋の度合いにより許容される程度にまで膨潤することができる。吸収される水の量は使用される巨大分子成分により制御可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは熱可逆性ハイドロゲルの形態である。本明細書に記載される熱可逆性ハイドロゲルとは、温度に応じてその秩序を変化させる温度感受性ゲルのことである。追加の実施形態では、熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル転移温度は、約４℃〜約４０℃、約１０℃〜約４０℃、約２０℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃、約３５℃〜約４０℃、約３６℃〜約３８℃、又は約２０℃〜約３８℃の温度である。熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル転移温度は、約５、１０、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、６０℃又はそれよりも低い温度でもよい。熱可逆性ハイドロゲルの溶液からゲル転移温度は、約３、５、１０、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、６０℃又はそれよりも高い温度でもよい。さらなる実施形態では、熱可逆性ハイドロゲルのゲルから溶液転移温度は、約−１℃〜約４℃、約０℃〜約１０℃、約５℃〜約１５℃、約４℃〜約４０℃、約１０℃〜約４０℃、約２０℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃、又は約３５℃〜約４０℃の温度である。熱可逆性ハイドロゲルのゲルから溶液転移温度は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５℃又はそれよりも低い温度でもよい。熱可逆性ハイドロゲルのゲルから溶液転移温度は、約−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０℃又はそれよりも高い温度でもよい。
【００９０】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスに（ｉ）胎盤組織由来の天然の架橋に加えて追加の架橋、（ｉｉ）胎盤組織由来の天然のキャリアーに加えて追加のキャリアー、及び／又は（ｉｉｉ）光活性剤を添加するステップを含まない。別の態様では、脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、１つ又は複数の胎盤組織（複数可）由来の天然のクロスリンカー（複数可）及び天然のキャリアー（複数可）に加えて追加のクロスリンカー又はキャリアーを含んでもよいし含まなくてもよい。しかし、上記方法は、胎盤組織を消化する及び／又はホモジナイズした後で、１つ又は複数の胎盤組織（複数可）由来の天然のクロスリンカー（複数可）及び天然のキャリアー（複数可）に加えて追加のクロスリンカー又はキャリアーを添加してもよく、胎盤由来マトリックスは、胎盤組織（複数可）由来の天然のクロスリンカー（複数可）及び天然のキャリアー（複数可）に加えて、下に記載される追加のクロスリンカー又はキャリアーを含むことができる。
【００９１】
本明細書に記載される胎盤組織は、胎盤組織を消化する、ホモジナイズする、収穫する、分散させる、凍結させる、及び／又は凍結乾燥させる前に又は後で、少なくとも胎盤組織の２つの部分間で物理及び／又は化学結合を生み出すように構成されている天然に存在するクロスリンカーを含むことができる。化学結合は、イオン、共有、及び／又は金属結合を含むことができる。例えば、胎盤組織の天然のクロスリンカーは、胎盤組織を消化する及び／又はホモジナイズした後で化学的、物理的、及び／又は温度処理により架橋されて物理及び／又は化学結合を形成してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、天然には存在しないクロスリンカーを使用して、天然には存在しない結合により脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスを架橋するステップを含まない。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、本明細書では架橋剤とも呼ばれる、天然には存在しないクロスリンカーを排除することができる。追加の実施形態では、本明細書に記載される消化された胎盤組織は天然には存在しないクロスリンカーを含まない。例えば、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、アルギン酸プロピレングリコール、グリセロール、スクロースオクタ硫酸、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、ポリウレタン、及びポリ乳酸、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）、ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、アクリルアジド、並びにその組合せからなる群から選択される天然には存在しないクロスリンカーを排除してもよい。追加の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、キサンテン色素、ナフタルイミド化合物、リボフラビン−５−ホスフェート、Ｎ−ヒドロキシピリジン−２−（１Ｈ）−チオン、Ｎ−（２０−エチルアミノエチル）−４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、ビス−ジアゾピルバミド（ｄｉａｚｏｐｙｒｕｖａｍｉｄｅ）−Ｎ，Ｎ９−ビス（３−ジアゾピルボイル（ｄｉａｚｏｐｙｒｕｖｏｙｌ）−２，２９−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）（ＤＰＤ）、ジアゾピルボイル（ＤＡＰ）、メチレンブルー、エリスロシン、フロキシム（ｐｈｌｏｘｉｍｅ）、チオニン、メチレングリーン、ローズベンガル、アクリジンオレンジ、キサンチン色素、チオキサンチン色素、エチルエオジン、エオジンＹ、及びその組合せからなる群から選択される光活性剤を排除してもよい。
【００９３】
別の態様では、本明細書に記載される胎盤組織は天然のキャリアーも含むこともできる。本明細書に記載されるキャリアーは三次元フレームワークを形成するように構成されて、創傷、欠損、及び／又は手術部位に注入又は移植される。いくつかの実施形態では、創傷は開放創でもトンネル傷でもよい。天然のキャリアーは胎盤組織に天然に存在するキャリアーであり、例えば、コラーゲン及びヒューロン酸（ｈｙｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）又はエラスチンなどの細胞外マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるホモジナイズされた及び／若しくは消化された胎盤組織並びに／又は生物学的に機能的なスキャフォールドは、ゼラチン、アガロース、修飾ヒアルロン酸、アルギン酸プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、架橋された又は機能化されたヒアルロナンベースのコラーゲン及びアルギン酸、ポリウレタン、ポリ乳酸、又は前述のポリマーのうちの少なくとも１つを含む組合せからなる群から選択される天然には存在しないキャリアーを排除してもよい。追加の実施形態では、本明細書に記載される消化された胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、カルシウム、バリウム、アルミニウム、ストロンチウム、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、又は鉄の塩、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）；ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、アクリルアジド、並びにその組合せを排除してもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、胎盤組織由来の天然のキャリアー（複数可）に加えて追加のクロスリンカーを含まない。追加の実施形態では、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、胎盤組織由来の天然のキャリアー（複数可）に加えて追加のキャリアーを含まない。例えば、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、天然の又は架橋されたキトサン、デンプン、ポリエチレングリコール、セルロース及びその誘導体（酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、及びメチルセルロースなどの）、キサンタンガム、デキストラン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ローカストビーンガム、ガムトラガカンス（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、アラビアゴム、カードラン、プルラン、スクレログルカン、低メトキシルペクチン、又はカラゲナンを含まなくてもよい。
【００９５】
脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、キャリアー溶液を含んでも含まなくてもよい。キャリアー溶液は、カルシウム、バリウム、アルミニウム、ストロンチウム、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、又は鉄の塩；グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ゲニピン、グルコース又はリボース、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）；ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、又はアクリルアジドを含んでいてもよい。キャリアー溶液は、天然若しくは修飾コラーゲン、ゼラチン、アガロース、修飾ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、グリセロール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、ヒアルロナンベースコラーゲン及びアルギン酸の架橋若しくは機能付与、ポリウレタン、ポリ乳酸、又は胎盤組織由来の天然のキャリアー（複数可）に加えて前述のポリマーのうちの少なくとも１つを含む組合せを含む群から選択される天然及び／又は合成ポリマーを含んでいてもよい。追加の実施形態では、例えば、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、胎盤組織由来の天然のキャリアー（複数可）に加えて、キャリアーを含んでも含まなくてもよく、キャリアーは天然のコラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、アルギン酸、ゲニピン、キトサン、デンプン、グルコース又はリボース、セルロース及びその誘導体（酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、及びメチルセルロースなどの）、キサンタンガム、デキストラン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ローカストビーンガム、ガムトラガカンス、アラビアゴム、カードラン、プルラン、スクレログルカン、低メトキシルペクチン、カラゲナン、並びにその組合せからなる群から選択される。さらに、さらなる実施形態では、本明細書に記載される脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び／又は胎盤由来マトリックスは、胎盤組織由来の天然のクロスリンカー（複数可）に加えてクロスリンカーを含んでも含まなくてもよく、クロスリンカーは、アルギン酸、デンプン、セルロース及びその誘導体（酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、及びメチルセルロースなどの）、キサンタンガム、デキストラン、カラゲナン、ゲニピン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ローカストビーンガム、ガムトラガカンス、アラビアゴム、カードラン、プルラン、スクレログルカン、及び低メトキシルペクチン、グルコース又はリボース、天然のコラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、キトサン、並びにその組合せからなる群から選択される。
【００９６】
別の態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び消化液から本質的になる並びに／又はからなる。用語「から本質的になる」は、最初の要素からなるマトリックスのタンパク質組成及び／又はゲル化に実質的に影響を与えない追加の要素を含むようにマトリックスの範囲を定義している。例えば、脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び消化液から本質的になる胎盤由来マトリックスは、脱細胞化若しくは失活胎盤組織及び消化液からなる胎盤由来マトリックスのタンパク質組成及び／又はゲル化に実質的に影響を与えない脱細胞化又は失活胎盤組織及び消化液に加えて要素を含んでいてもよい。本明細書でタンパク質組成に実質的に影響を与えるとは、タンパク質組成を少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、７、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、又は４０％変化させることを意味する。本明細書でマトリックスのゲル化に実質的に影響を与えるとは、マトリックスの粘度を少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、７、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、又は４０％変化させることを意味する。
【００９７】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して、凍結又は凍結乾燥した胎盤由来マトリックスを製造するステップをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックスは、凍結乾燥断片が約１０、５、４、３、２、１、０．５、又は０．１重量％未満の平均残留湿気を有するような点まで凍結乾燥させてもよい。
【００９８】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤由来マトリックスを所定の形状を有する型に入れるステップをさらに含むことができ、胎盤由来マトリックスは型の中で凍結又は凍結乾燥される。別の態様では、本明細書に記載される方法は、移植に先立って胎盤由来マトリックスを保存するステップをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックスは、乾燥状態で、凍結状態で、凍結保存で、又は湿潤状態で保存される。追加の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、胎盤由来マトリックスの海綿構造体及びナノからマイクロファイバーを含む胎盤由来マトリックスを水置換剤（ｗａｔｅｒ−ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で処理するステップをさらに含むことができる。さらなる実施形態では、胎盤由来マトリックスは湿潤状態で保存してもよい。
【００９９】
別の態様では、本明細書に記載される上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥するステップを含む方法は海綿構造体を製造する。いくつかの実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスは、平均で約１、５、１０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１５００、２０００、３０００、若しくは４０００μｍ又はそれよりも大きい平均径を有する細孔を含む。追加の実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスは、平均で約２、６、２０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、９００、１０００、１３００、１５００、２０００、３０００、若しくは４０００μｍ又はそれよりも小さい平均径を有する細孔を含む。さらなる実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスは、平均で約１μｍ〜４０００μｍ、１００μｍ〜１０００μｍ、約５０μｍ〜２０００μｍ、１００μｍ〜５００μｍの平均径を有する細孔を含む。
【０１００】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、例えば、米国特許第６，２９３，９７０号、米国特許第６，５６９，２００号、米国特許第６，５４４，２８９号、米国特許第７，０６３，７２６号、又は米国特許出願公開第２０１０／００３０３４０号、米国特許出願公開第２０１４／０１８０４３７号、米国特許出願公開第２０１１／００１５７５７号、及び米国特許出願公開第２０１３／０２１８２９４号に記載されるように、胎盤由来マトリックスの海綿構造体及びナノからマイクロファイバーを含む胎盤由来マトリックスを可塑化するステップをさらに含むことができ、上記特許文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。追加の実施形態では、方法は凍結又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスを水置換剤で処理するステップを含むことができる。水置換剤で処理された凍結又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスは湿潤状態で保存してもよい。さらなる実施形態では、水置換剤は、グリセロール（グリセリン  ＵＳＰ）、アドニトール、ソルビトール、リビトール、ガラクチトール、Ｄ−ガラクトース、１，３−ジヒドロキシプロパノール、エチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルコース、スクロース、マンニトール、キシリトール、メソ−エリスリトール、アジピン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、ポリエチレングリコール、アルコール、及び脂質からなる群から選択される１つ又は複数を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスの平均ボイド容量は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれよりも多い。追加の実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスの平均ボイド容量は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれよりも少ない。さらなる実施形態では、凍結及び／又は凍結乾燥された胎盤由来マトリックスの平均ボイド容量は、約１０％〜約９５％、約３０％〜９５％、約４０％〜約９０％、約５０％〜９０％、約６０％〜約９０％、又は約２０％〜６０％である。
【０１０２】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、任意選択で、上記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して海綿構造体を製造するステップと；本明細書に記載される胎盤由来マトリックス又は海綿構造体を溶媒に溶解して胎盤由来溶液を製造するステップと；胎盤由来溶液を電界紡糸してナノからマイクロファイバーを製造するステップとを含むことができる。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２０１１５号及び米国特許出願公開第２０１５／００１０６０７号、並びに国際公開第２０１４／１６０００２号に記載されるように、胎盤由来溶液は、電界紡糸してナノファイバーを製造することができ、上記特許文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス由来のナノからマイクロファイバーは、例えば、電界紡糸によるだけではなく、メルトブローイング（ｍｅｌｔｂｌｏｗｉｎｇ）、二成分紡糸（ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、フォース紡糸（ｆｏｒｃｅｓｐｉｎｎｉｎｇ）、フラッシュ紡糸（ｆｌａｓｈ−ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、押出し成形、共重合体と一緒の若しくはなしのコアシース電界紡糸、又は自己組織化によっても調製することができる。
【０１０４】
胎盤由来マトリックススキャフォールドでのナノからマイクロファイバーの整列は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析により測定することができる。例えば、ＦＦＴ解析は、Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ：  ａ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ２Ｄ  ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｙｒｅｓ  ＣＥ、Ｊｈａ  ＢＳ、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  Ｈ、Ｂｏｗｍａｎ  ＪＲ、Ｂｏｗｌｉｎ  ＧＬ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＣ、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＤＧ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．２００８年；１９巻（５号）：６０３〜２１ページに記載される方法により実施することができ、上記文献は参照によりその全体を組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス由来のナノからマイクロファイバーのＦＦＴ結果は隣接する主ピークを有し、約１８０°互いに離れている。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるナノファイバーは、約１０００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、９００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、８００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、７００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、６００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、５００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、４００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、３００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、２００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、１００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、５０ｎｍ若しくはそれよりも少ない、２０ｎｍ若しくはそれよりも少ない、又は１０ｎｍ若しくはそれよりも少ない平均径を有していてもよい。追加の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックススキャフォールドでの全ナノファイバーは、約１０００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、９００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、８００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、７００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、６００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、５００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、４００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、３００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、２００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、１００ｎｍ若しくはそれよりも少ない、５０ｎｍ若しくはそれよりも少ない、２０ｎｍ若しくはそれよりも少ない、又は１０ｎｍ若しくはそれよりも少ない平均径を有していてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマイクロファイバーは、約１００ミクロン若しくはそれよりも少ない、９０ミクロン若しくはそれよりも少ない、８０ミクロン若しくはそれよりも少ない、７０ミクロン若しくはそれよりも少ない、６０ミクロン若しくはそれよりも少ない、５０ミクロン若しくはそれよりも少ない、４０ミクロン若しくはそれよりも少ない、３０ミクロン若しくはそれよりも少ない、２０ミクロン若しくはそれよりも少ない、１０ミクロン若しくはそれよりも少ない、５ミクロン若しくはそれよりも少ない、２ミクロン若しくはそれよりも少ない、又は１ミクロン若しくはそれよりも少ない平均径を有していてもよい。追加の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックススキャフォールドでの全マイクロファイバーは、約１００ミクロン若しくはそれよりも少ない、９０ミクロン若しくはそれよりも少ない、８０ミクロン若しくはそれよりも少ない、７０ミクロン若しくはそれよりも少ない、６０ミクロン若しくはそれよりも少ない、５０ミクロン若しくはそれよりも少ない、４０ミクロン若しくはそれよりも少ない、３０ミクロン若しくはそれよりも少ない、２０ミクロン若しくはそれよりも少ない、１０ミクロン若しくはそれよりも少ない、５ミクロン若しくはそれよりも少ない、２ミクロン若しくはそれよりも少ない、又は１ミクロン若しくはそれよりも少ない平均径を有していてもよい。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるナノからマイクロファイバーは、約５ｎｍ、１０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２５０ｎｍ、５００ｎｍ、１ミクロン、５ミクロン、２０ミクロン、５０ミクロン、７５ミクロン又はそれよりも多い平均径を有していてもよい。
【０１０６】
一態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスナノファイバーは、約０．１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約２０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約３０ｃｍ、約１ｃｍ〜約３０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約３０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約３０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約４０ｃｍ、約１ｃｍ〜約４０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約５０ｃｍ、約１ｃｍ〜約５０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約４０ｃｍ〜約５０ｃｍ、０．１ｃｍ〜約６０ｃｍ、約１ｃｍ〜約６０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約６０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約６０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約６０ｃｍ、又は約４０ｃｍ〜約６０ｃｍの平均長さを有していてもよい。別の態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックススキャフォールドでの全ナノファイバーは、約０．１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約２０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約３０ｃｍ、約１ｃｍ〜約３０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約３０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約３０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約４０ｃｍ、約１ｃｍ〜約４０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約４０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約５０ｃｍ、約１ｃｍ〜約５０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約５０ｃｍ、約４０ｃｍ〜約５０ｃｍ、０．１ｃｍ〜約６０ｃｍ、約１ｃｍ〜約６０ｃｍ、約１０ｃｍ〜約６０ｃｍ、約２０ｃｍ〜約６０ｃｍ、約３０ｃｍ〜約６０ｃｍ、又は約４０ｃｍ〜約６０ｃｍの長さを有していてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、上記脱細胞化又は失活胎盤組織での上記胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９６、９８、１００％又はそれよりも多い。追加の実施形態では、上記脱細胞化又は失活胎盤組織での上記胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９３、９５、９７、９９、１００％又はそれよりも少ない。さらなる実施形態では、上記脱細胞化又は失活胎盤組織での上記胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約２％〜約１００％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８０％、６０％〜１００％、８０％〜約１００％、又は約９０％〜約１００％である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックスでの上記脱細胞化又は失活胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約５０、６０、７０、８０、９０、５、９８、９９％又はそれよりも多い。追加の実施形態では、胎盤由来マトリックスでの上記脱細胞化又は失活胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約５０、６０、７０、８０、９０、１００％又はそれよりも少ない。さらなる実施形態では、胎盤由来マトリックスでの上記脱細胞化又は失活胎盤組織の重量パーセントは乾燥状態で、約５０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、又は約９０％〜約１００％である。胎盤由来マトリックスでの上記脱細胞化又は失活胎盤組織の量は、胎盤由来マトリックスの密度、濃度、空隙率、及び／又は粘度特徴並びに多孔質構造の再水和特徴を調整するように変化させてもよい。
【０１０９】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤組織、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織、並びに／又は胎盤由来マトリックスを１つ又は複数の処理溶液で処理するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、凍結及び／又は凍結乾燥後で移植前に、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織、並びに／又は胎盤由来マトリックスを１つ又は複数の処理溶液で処理するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、処理溶液は、イオン、酵素、若しくは化学架橋剤、光活性剤、又はポリマーを含む。イオン架橋剤は、カルシウム、バリウム、アルミニウム、ストロンチウム、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、及び鉄からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。酵素架橋剤は、トランスグルタミナーゼ、エチレンジアミン、リシルオキシダーゼファミリー、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）、ジメチルスベリイミデート（ＤＭＳ）、及びジメチル−３−３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。化学架橋剤は、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ゲニピン、グルコース又はリボース、ポリ（エチレングリコール）ジエポキシドクロスリンカー、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ＥＤＣ及びＮＨＳ、並びにアクリルアジドからなる群から選択される１つ又は複数を含む。ポリマーは、天然若しくは修飾コラーゲン、ゼラチン、アガロース、修飾ヒアルロン酸、フィブリン、キチン、ビオチン、アビジン、ミネラル除去骨マトリックス、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ヘパリン、グリセロール、スクロースオクタ硫酸、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、ポリウレタン、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びメタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ヒドロキシアパタイト、ポリウレタン、並びにポリ乳酸からなる群から選択される１つ又は複数を含んでいてもよい。
【０１１０】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）を胎盤組織、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織並びに／又は胎盤由来マトリックスに添加するステップをさらに含むこともできる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）は、ＦＧＦファミリー、ＴＧＦファミリーの成長又は分化因子、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨｒＰ、Ｉｈｈ、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ＩＴＳ、及びアスコルビン酸からなる群から選択される。生理活性サプリメントは増殖因子、分化因子、サイトカイン、抗菌薬又は抗炎症薬でもよい。成長又は分化因子は、例えば、ＦＧＦファミリー若しくはＴＧＦファミリーの増殖因子、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨｒＰ、Ｉｈｈ（インディアンヘッジホッグ相同体）、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ＩＴＳサプリメント、アスコルビン酸、又はその組合せでもよい。サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＳＬＰ１、ＭＣＰ１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１８、アンジオポエチン、ＫＧＦ、エンドセリン、ＩＦＮ−α、又はＩＦＮ−βを含んでいてもよい。抗炎症薬の例は、ＩＬ−１βＲ抗体、ＴＮＦ−α受容体アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２特異的阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＮＯシンターゼ阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、又はＭＭＰの阻害剤を含んでいてもよい。種々の線維芽細胞増殖因子が存在する。例として、ヒトＦＧＦファミリーは、ＦＧＦ−１からＦＧＦ−２３まで２２のメンバーを含む（ＦＧＦ−１５はヒトＦＧＦ−１９のマウスオルソログなのでヒトＦＧＦ−１５は存在しない）。ＴＧＦファミリーのメンバーの例は、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βスーパーファミリーを含んでいてもよい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３などの）、アクチビン、インヒビン、骨形成因子（ＢＭＰ）、改変ＢＭＰ、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ミオスタチン、などを含む。ＢＭＰには２０のアイソタイプが存在する。ＢＭＰのアイソタイプは４つのサブファミリー、例えば、（１）ＢＭＰ２及びＢＭＰ４；（２）ＢＭＰ３及びＢＭＰ３Ｂ（成長／分化因子１０（ＧＤＦ１０）としても知られる）；（３）ＢＭＰ５、６、７及び８；並びに（４）ＧＤＦ５、６、及び７に分離することができる。追加の態様では、本明細書に記載される方法は、ミネラル除去骨マトリックス、基底膜、又は粘膜下マトリックスを含む組織から抽出した１つ又は複数の生理活性サプリメント（複数可）を添加するステップも含むことができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ニトロプルシドナトリウム、軟骨マトリックス糖タンパク質（ＣＭＧＰ）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、セレニウム、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）エストラジオール、グルタチオン、メラトニン、レスベラトロール、フラボノイド、カロテン、アミノグアニジン、又は生理活性成分を酸素ラジカル誘導損傷抗酸化剤から保護するリコピンを含む、１つ又は複数の抗酸化剤を添加するステップも含むことができる。
【０１１１】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する１つ又は複数の薬剤を胎盤組織、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織、並びに／又は胎盤由来マトリックスに添加するステップも含むことができる。いくつかの実施形態では、生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する薬剤は、ヒアルロナン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ベータグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、シンデカン、バイグリカン、又はデコリンを含んでいてもよい。追加の実施形態では、生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する薬剤（複数可）は、胎盤組織、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織、並びに／又は胎盤由来マトリックスに対する増殖因子、分化因子、サイトカイン、抗菌薬、又は抗炎症薬の親和性を増加させる。
【０１１２】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、平均で約０．５、１、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００ｍｍ又はそれよりも多い寸法を有するように、消化及び／又はホモジナイジングに先立って胎盤組織、並びに／又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を切り取るステップも含むことができる。追加の実施形態では、本明細書に記載される方法は、平均で約１、５、１０、２０、５０、１００、２００、５５０ｍｍ又はそれよりも少ない寸法を有するように、胎盤組織、並びに／又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を切り取るステップも含むことができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法は、平均で約１ｍｍ〜約６０ｃｍ、約１ｍｍ〜約５０ｃｍ、約１ｃｍ〜約６０ｃｍ、約１ｃｍ〜約５０ｃｍ、又は約１ｃｍ〜約１０ｃｍの寸法を有するように、胎盤組織、並びに／又は脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織を切り取るステップも含むことができる。
【０１１３】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤組織、脱細胞化及び／又は失活胎盤組織を浄化し消毒するステップを含むことができる。別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤組織、脱細胞化及び／又は失活胎盤組織を浄化し消毒し、胎盤組織に関連する外来性組織を取り除くステップも含むことができる。胎盤組織は、例えば、小片に切り取って粗く断片化された胎盤組織を製造し、任意選択で、粉砕し、とりわけ、等張食塩水などの蒸留／脱イオン内毒素のない水及び／又は水溶液で洗浄してもよい。加工中、いくつかの実施形態では、加工されている組織のおおよその容積の２、５、又は１０倍の容積の水溶液を使用して複数の「洗浄」又は「浄化」に影響を与えることができる。３つのそのような加工ステップを使用すれば、おおよそ１対１００、１対５００又は１対１０００希釈度の関連する可溶化型要素に影響を及ぼして、組織をそのような可溶化型要素が実質的にない（例えば、約１０、０．１、０．０１又は０．００１重量％未満）ようにすることができる。脱細胞化又は失活される胎盤組織片は、ある特定の実施形態では、約３０、２０、１５、１０、８、５、３、２、１、０．５、０．１、０．０５ｍｍ又はそれよりも少ない厚さを有していてよい。脱細胞化又は失活される胎盤組織片は、約３０、２０、１０、８、５、３、２、１、０．５、０．１、０．０５ｍｍ又はそれよりも多い厚さを有していてもよい。別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤組織、脱細胞化及び／若しくは失活胎盤組織、並びに／又は胎盤由来マトリックスを減菌するステップも含むことができる。減菌は、いくつかの実施形態では、電離放射線の使用を伴ってもよい。他の実施形態では、電離放射線の吸収線量は約１．０ＫＧｙ〜約５０ＫＧｙ、約８．０ＫＧｙ〜約５０ＫＧｙ、約８．０ＫＧｙ〜約２５ＫＧｙ、又は約８．０ＫＧｙ〜約１８ＫＧｙでもよい。いくつかの実施形態では、減菌ステップは、胎盤由来マトリックスを含むパッケージ化された組織修復移植片をドライアイス上に置き、パッケージ化された組成物を照射するステップを含むことができる。ある特定の実施形態では、減菌は約−２０℃〜−５０℃の温度で実施してよい。本発明の移植片は、ガンマ照射、超臨界二酸化炭素、エチレンオキシド、又は電子ビームを使用して減菌してもよい。
【０１１４】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数の骨片物質（複数可）を胎盤由来マトリックスに添加するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、骨片物質（複数可）は、骨、皮質骨、海綿骨、皮質海綿骨、セラミックス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び炭酸カルシウムからなる群から選択される１つ又は複数を含む。骨は、ミネラル除去骨でも非ミネラル除去骨でもよい。本明細書で使用される「ミネラル除去骨マトリックス（ＤＢＭ）」とは、約８重量％未満の残留カルシウムを有する骨のことである。ミネラル除去は、骨組織を処理してその無機ミネラルヒドロキシアパタイト物質を取り除くステップを伴う。骨組織のミネラル除去のレベルは、ミネラル除去骨に見出される残留カルシウムの量（重量％）により定義される。いくつかの実施形態では、ミネラル除去骨は、ミネラル除去処理後でさえ最初の骨から残っている生理的活性レベルの成長及び分化因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの骨形成増殖因子）をそれでも含有することがある。さらなる実施形態では、ミネラル除去骨は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、及びその混合物を含有してもよい。本出願で使用される「非ミネラル除去骨」とは、例えば、ヒドロキシアパタイトなどの存在するミネラルを取り除くために処理されたことがない骨のことである。本発明のある特定の生物学的に機能的なスキャフォールド及び／又は移植片は、ミネラル除去された骨粒子又は線維を含んでいてもよい。ミネラル除去された骨マトリックスは、凍結乾燥された又は凍結乾燥されておらず、粉砕されて／破砕されて／粉にされて骨粒子又は線維になった浄化され消毒された骨から調製することができる。骨粒子は、例えば、所望のサイズ範囲内の粒子を入手するための市販の篩い分け装置（すなわち、メッシュ篩い）を使用して選択することができる。そのようなミネラル除去された骨粒子は、約１２５ミクロン〜約４ｍｍ；約７１０ミクロン〜約２ｍｍ；約１２５ミクロン〜約５００ミクロン；約１２５ミクロン〜約８５０ミクロン；約１２５ミクロン〜約７１０ミクロン；約２５０〜１０００ミクロン；又は約２５０ミクロン〜約７１０ミクロンの平均径を有してもよい。本発明のある特定の実施形態は、市販のミネラル除去された骨粒子を含んでいてもよい。例えば、広く確実に入手可能である適切なミネラル除去された骨粒子は、ＬｉｆｅＮｅｔ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｅａｃｈ、Ｖｉｒｇｉｎｉａにより製造されている。本発明の一部の生物学的に機能的なスキャフォールド及び／又は移植片はミネラル除去された骨線維を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ミネラル除去された骨線維は、約０．１ｍｍ〜約０．３ｍｍの平均厚み及び約０．３ｍｍ〜約１．０ｍｍの平均幅を有することができる。線維の長さは変動してもよい。いくつかの実施形態では、ミネラル除去工程は、約１ｍｍ〜約２ｍｍの平均径サイズ範囲を有する骨粒子又は０．１ｍｍ〜０．３ｍｍ厚みの平均寸法及び約０．３ｍｍ〜約１ｍｍの平均幅を有する骨線維を製造することで始まる。断片は洗浄液で��理することができる。断片に加工される骨が以前浄化された及び／又は消毒されたことがなければ、洗剤、過酸化水素、抗生物質、及び／又はアルコールの使用により浄化する及び／又は消毒して、骨髄及び細胞要素などの関連する組織の除去に影響を与えてもよい。洗浄及び消毒に続いて、これらの断片（すなわち、粒子及び線維）は希塩酸に曝露することによりミネラル除去され、骨片（すなわち、粒子及び線維）のミネラル成分の除去／減少に影響を与えてもよい。そのような追加の加工は、いくつかの例では、潜在的なウイルス汚染（すなわち、とりわけ、ＨＩＶ及び肝炎ウイルス）を不活化することができる。
【０１１５】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、胎盤由来マトリックス及び／又は胎盤由来マトリックスを含むスキャフォールドを凍結する又は凍結乾燥する前にネガティブ静水圧下で加工して、空隙率を増加させるステップを含んでも含まなくてもよい。本発明の三次元（３−Ｄ）マクロ多孔質構造は、細胞が機能する組織に組織化されるまで細胞を支持するように設計される。移植後、マクロ多孔質構造の建築は血管新生及び組織内殖の程度を制御することができる。ポアサイズ及び容積は、胎盤由来マトリックスを凍結乾燥する前に又は後で、ポロゲンを添加する、不活性ガスを適用する、又はネガティブ静水圧を適用することにより調整することができる。
【０１１６】
別の態様では、本発明は脱細胞化又は失活胎盤組織を含む胎盤由来マトリックスに関する。胎盤由来マトリックスのｐＨは、約８．０又はそれよりも高い、例えば、８．０〜９．０、好ましくは、８．０〜８．５、さらに好ましくは、８．０〜８．２の範囲でもよい。例えば、マトリックスのｐＨは、少なくとも約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０、好ましくは、少なくとも約８．０である。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法により調製される胎盤由来マトリックスにも関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスを含むスキャフォールドに関する。スキャフォールドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されるように構成されたスキャフォールドである移植片を含んでいてもよい。本明細書に記載されるスキャフォールドは、多孔質海綿様構造を含む多孔質構造を有することができる。用語「多孔質海綿様構造」とは、多孔質で、凝集性で、弾性で、柔軟性で、線維性で、弾力的な三次元構造のことである。乾燥状態では、本発明の多孔質海綿様スキャフォールドは、液体を急速に吸収することができる。湿潤状態では、本発明の多孔質海綿様スキャフォールドは、多孔性、凝集性、及び／又は統合性を維持することができる。湿潤多孔質海綿様構造は、ある特定の引張応力に抵抗し、圧迫から解放された後は跳ね返り液体を再吸収することができる。多孔質海綿様スキャフォールド及び／又は生物学的に機能的なスキャフォールドは、欠損、皮膚病変、局所傷、潰瘍、乳腺腫瘍摘出若しくは腫瘤切除後の乳房、トンネル傷（例えば、瘻孔）の内部に若しくは表面でねじる、折り畳む、丸める、ぴったり合わせる、置く及び／若しくは挿入する、又は骨、軟骨若しくは軟組織の欠損の周囲を包むことができる。
【０１１８】
別の態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンガンマ−１、フィブロネクチン、絨毛性乳腺刺激ホルモン、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＩＧＦ−２、ＥＧＦＬ−７、及びｂＦＧＦを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックスでのＩ型コラーゲンの濃度は、約２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５％若しくはそれよりも多い；約２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５％若しくはそれよりも少ない；及び／又は約２０〜５０％、２５〜４５％、３０〜４０％、若しくは３３〜３８％である。
【０１１９】
本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、細胞遊走、接着、分化、増殖、及び生存などの重要な細胞事象を駆動するのに極めて重要な役割を果たしている、身体全体に見出されるＥＣＭタンパク質及び糖タンパク質が豊富にあってもよい。ヒト基底膜に見出される最も一般的な型のコラーゲンであるＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸）などの、胎盤由来マトリックスに存在するタンパク質は、細胞を支持し、細胞を土台となるコラーゲンマトリックスに結合させ、上皮を間充織／土台となる結合組織から分離することができる引張強さを基底膜に与えることができる。
【０１２０】
別の態様では、本明細書に記載されるホモジナイズされた胎盤組織は、薄片にする、挽く、切り分ける、細かく砕く、切り刻む、細かく刻む、切り取る、切り裂く、引き千切る、引き裂く、切断する、剪み切る、さいの目に切る、薄く削り取る、砕いて粉にする、又は刈り込んで断片にされた結合組織のことである、「粗く断片化された胎盤組織」を含んでも含まなくてもよい。そのような断片化された胎盤組織は、約５０ミクロンよりも大きく約０．５ｃｍよりも小さな平均径を有し、例えば、おおよそ０．５×０．５ｃｍのカット寸法、及び粗く断片化される組織に適した厚みを有してもよい。いくつかの実施形態では、粗い断片は均一なサイズでなくてもよい。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法により二次元又は三次元スキャフォールドとして調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む細胞培養の方法に関する。本明細書で使用されるとき、細胞培養とは、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境と呼ばれる人工的環境において細胞を維持することである。用語、細胞培養は総称であり、個々の細胞の培養だけではなく、組織、器官、器官系又は生物全体の培養も包含するのに使用してもよい。本明細書で開示される培養法で使用される細胞はいかなる原核細胞でも真核細胞でも可能である。本明細書で開示される培養法で使用される細胞型は、細胞支持組成物の由来と同じ種由来である必要はない。さらに、細胞は樹立細胞株由来でもよく、又は細胞は初代細胞でも遺伝的に操作された細胞でもよい。例えば、細胞は、幹細胞、脂肪由来幹細胞、後根神経節細胞、膵島ベータ細胞、心筋細胞、肝細胞、ｉＰＳＣ、がん細胞、及び臍帯静脈内皮細胞からなる群から選択することができる。
【０１２２】
例えば、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を生育する及び／又は培養するステップを提供する。「本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を生育する及び／又は培養する」は、伝統的細胞培養法並びに、天然又は合成の生体適合性マトリックス又は組織においてなどの任意の設定で本明細書に記載される胎盤由来マトリックスの表面に置くステップを含む。細胞は、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコなどしかしこれらに限定されない哺乳類でもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養される細胞は幹細胞である。本明細書で使用されるとき、幹細胞は当技術分野で使用されている通りに使用され、分裂し、少なくとも部分的に分化されることがある１つの娘細胞及び母細胞の発生潜在力を保持している別の娘細胞を生じる能力を有する細胞を意味する。本明細書で使用されるとき、幹細胞は、脂肪由来幹細胞、歯髄幹細胞、成体幹細胞（ＡＳＣ）、胚幹細胞（ＥＳＣ）、組織特異的前駆細胞、及び／又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でも可能である。ＡＳＣは、造血幹細胞、乳房幹細胞、腸管幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、及び精巣細胞を含んでいてもよいがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、細胞成長及び増殖を支援するための並びに本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養される幹細胞において、維持を増加させる又は骨形成、軟骨形成、若しくは靭帯／腱発生などの分化を促進するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法において使用することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養される細胞は、心筋細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、肝細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、後根神経節（ＤＲＧ）細胞、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚幹細胞、前駆細胞、分化細胞、未分化細胞、及び／又は多能性幹細胞でもよい。適切な細胞は、外胚葉分化系列の細胞、中胚葉分化系列の細胞、及び内胚葉分化系列の細胞も含んでいてもよいがこれらに限定されない。外胚葉分化系列の細胞の例は、ケラチノサイト、神経細胞を含むがこれらに限定されない。中胚葉分化系列の細胞の例は、筋芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、又は間質細胞を含むがこれらに限定されない。内胚葉分化系列の細胞の例は、耳管、気管、気管支、及び肺の肺胞などの気道、消化管、膀胱の上皮細胞、並びにあらゆる腺を裏打ちする上皮細胞を含むがこれらに限定されない。細胞は組織又は器官由来の初代細胞でもよい。本発明で使用される適切な細胞株は、間葉細胞株、前造骨性細胞株、骨芽細胞株、及び軟骨芽細胞株を含んでいてもよいがこれらに限定されない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、細胞は自家供給源由来でも同種供給源由来でもよい。
【０１２５】
細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、及び骨膜細胞を含む分化細胞でもよい。さらに、細胞は、全能性、多能性、多分化能、前駆細胞、組織特異的前駆細胞、又は成体体性幹細胞でもよい。幹細胞は、胚、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、胎盤膜、月経血、歯、髄核、脳、新生児包皮、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、肝臓、膵臓、又は筋肉由来でもよい。細胞は、骨格筋、平滑筋、及び心筋由来でもよい。幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの成熟細胞の遺伝的再プログラミング由来でもよい。あらゆる細胞は、さらに生存又は最近死亡したドナー由来でもよい。
【０１２６】
これと共に記載されるいかなる細胞も、ある特定の実施形態では、約１５分〜約１年、約１５分〜約６カ月、約１５分〜約３カ月、約１５分〜約４週間、約２時間〜約２週間、約２時間〜約１週間、約２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、又は約２４時間〜約９６時間、約２０℃〜約４０℃又は約３０℃〜約３７℃で、約１％ＣＯ２〜約１０％ＣＯ２又は約４％ＣＯ２〜約６％ＣＯ２を含有する雰囲気において、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される１つ又は複数の増殖因子の非存在下で又は存在下で、及び（１）組織若しくは器官、（２）マトリックス、又は（３）その組合せにおいて培養することができる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地において、本明細書に記載される１つ又は複数の増殖因子の非存在下で又は存在下で培養された細胞は、引き続いて、マトリックス、組織、器官又はその組合せに適用してもよい。
【０１２７】
細胞培養の方法は、胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を保存するステップをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、胎盤由来マトリックス上又は内部の細胞は、室温（すなわち、約２４℃）で、約４℃で、約−２０℃で、又は凍結保存で保存される。他の実施形態では、胎盤由来マトリックス上又は内部の細胞は、約−２００、−１８０、−１００、−５０、−４５、−４０、−３５、−３０、−２５、−２０、−１０、−５、０、１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、３６、３７、３８、又は３９℃〜約−１５０、−１４０、−１３０、−９０、−４０、−３５、−３０、−２５、−２０、−１５、−１０、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、３０、３５、３６、３７、３８又は４０℃の温度で保存される。他の実施形態では、胎盤由来マトリックス上又は内部の細胞は、約−２００〜５０℃、約−１６０〜３６℃、約−１６０〜２５℃、約−１６０〜５℃、約−５〜２３℃、約０〜３０℃、又は約１５〜４０℃の温度で保存される。
【０１２８】
別の態様では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは凍結保護物質として使用してもよい。本明細書に記載される凍結保存とは、−１５０℃（すなわち、１２３Ｋ）よりも低い温度での保存のことである。しかし、本明細書に記載される凍結保護物質とは、凍結保存後だけではなく、凍結又は凍結乾燥後でもタンパク質の生物活性を保つ保護剤のことである。いくつかの実施形態では、本発明は、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する及び／又は減少する方法であって、タンパク質を胎盤由来マトリックスに、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の消失を阻害する又は減少するのに十分な有効量で曝露するステップを含む方法に関する。さらなる実施形態では、タンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質などの、細胞のいずれかにおけるいかなるタンパク質でもよい。
【０１２９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスに細胞を混合させて細胞と胎盤由来マトリックスの混合物を製造するステップと、混合物を目的の部位上又は内部に塗布する、エアブラシで吹き付ける、滴下する又は注入するステップとを含む、細胞送達の方法に関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスで細胞を培養して細胞と胎盤由来マトリックスの培養物を製造するステップと、培養物を目的の部位上又は内部に塗布する、エアブラシで吹き付ける、滴下する又は注入するステップとを含む、細胞送達の方法にも関する。いくつかの実施形態では、目的の部位は、ヒト、非ヒト動物、ウシ及びブタを含むがこれらに限定されない対象中にある。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される幹細胞又は組織特異的前駆細胞の分化を促進する方法であって、本明細書に記載される方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で幹細胞又は組織特異的前駆細胞を培養するステップを含む方法に関する。例えば、幹細胞又は組織特異的前駆細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、膵細胞、神経細胞、靭帯又は腱に分化する。いくつかの実施形態では、組織特異的前駆細胞は、増殖因子を添加せずに目的の組織に分化する。別の態様では、本発明は、幹細胞又は組織特異的前駆細胞の血管、筋、又は神経分化を促進する方法であって、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で幹細胞又は組織特異的前駆細胞を培養するステップを含む方法にも関する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、組織特異的前駆細胞の幹細胞性（すなわち、延長された培養を通じて特定の組織に増殖する及び／又は分化する能力）及び／又は組織特異的前駆細胞の自己再生能力の維持を延ばすためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、任意選択で、増殖因子又は別の二次因子を添加することなく、胎盤由来マトリックス上又は内部で組織特異的前駆細胞を培養して細胞の維持を誘導するステップを含む方法において使用してもよい。さらなる実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、追加の増殖因子又は別の二次因子を添加することなく、多能性幹細胞の分化を促進して細胞の分化の誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法において使用することもできる。他の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、１つ又は複数の増殖因子若しくは他の二次因子を添加し、多能性幹細胞及び／又は組織特異的前駆細胞の分化を促進して細胞の維持又は分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法において使用することもできる。追加の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスは、多能性幹細胞及び／又は組織特異的前駆細胞の分化を促進する際に、細胞の維持又は分化を誘導する１つ又は複数の増殖因子若しくは他の二次因子の効果を増強するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法において使用することもできる。
【０１３２】
別の態様では、本発明は、瘢痕化又は欠損の部位に本明細書に記載される胎盤由来マトリックスを移植するステップを含む、欠損（複数可）を修復する、置き換える、充填する、再生する、又は組織での欠損（複数可）の瘢痕化を減らす若しくは阻害する方法にも関する。いくつかの実施形態では、移植は、欠損の部位に胎盤由来マトリックスを塗布する、エアブラシで吹き付ける、滴下する、若しくは注入する、胎盤由来マトリックスを組織若しくは器官の間、例えば、細胞又は筋肉若しくは神経束などの細胞構造体の周辺の間質腔に挿入する、又は胎盤由来マトリックスを欠損の上に置くことにより実施される。欠損のある組織は心臓、肝臓、膵臓、骨組織、軟骨、又は軟組織でもよい。欠損のある軟組織の例は、腱、靭帯、真皮、皮膚、声帯、神経、膀胱、膣、尿道、心臓、皮下組織、筋膜、乳房、筋肉、胎盤膜、胎盤、及び回旋筋腱板を含んでいてもよい。別の態様では、欠損のある組織は、筋骨格系、消化系、心血管系、呼吸器系、泌尿器系、生殖器系、神経系、及び／又は免疫系にあってもよい。いくつかの実施形態では、方法は移植に先立つ胎盤由来マトリックスの再水和を排除して、上記胎盤由来マトリックスに血液、体液、及び／又は自家細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで吸収させる。代わりに、胎盤由来マトリックスを含む組織修復移植片のヒト又は動物への移植は、組織修復移植片を再水和液で再水和させ；任意選択で、生活細胞を胎盤由来マトリックス及び／又は組織修復移植片上又は内部に播種して組織修復移植片に活力を与え；任意選択で、移植前に細胞播種組織修復移植片を培養し；組織修復移植片を欠損中に移植することにより実行することができる。別の態様では、方法は、胎盤由来マトリックスを含む組織修復移植片を再水和液で再水和させるステップと；任意選択で、生活細胞を上記胎盤由来マトリックス及び／又は組織修復移植片上又は内部に播種して上記組織修復移植片に活力を与えるステップと；任意選択で、移植前に上記細胞播種組織修復移植片を培養するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、再水和液は、血液又は骨髄吸引液、多血小板血漿、脳脊髄液、滑液、酵素、生理活性サプリメント、天然ポリマー、合成ポリマー、光活性剤、抗酸化剤、架橋剤、抗菌薬、生活細胞、及び生理活性サプリメント結合部位（複数可）を有する１つ又は複数の薬剤からなる群から選択される１つ又は複数を含む。追加の実施形態では、生活細胞は、自家又は同種移植骨髄吸引液由来の細胞；骨髄由来の間質細胞；脂肪、滑膜、骨膜、軟骨膜、筋肉、真皮、臍帯血、胎盤、胎盤膜、及びホウォートンゼリー由来の間質細胞；並びに周皮細胞からなる群から選択される１つ又は複数を含む。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスを組織嵩高剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、又は開放創若しくはトンネル傷のための創傷処置マトリックスとして使用する方法に関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分に隣接して移植するステップを含む、目的の組織部分を標識する方法にも関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップと、胎盤由来マトリックスの上の組織部分を切除するステップとを含む、組織を切除する方法にも関する。これらの実施形態では、胎盤由来マトリックスの移植は、切除される目的の組織部分を標識して、それ以上はいかなる標識もしないでよい。いくつかの実施形態では、組織を切除する方法は、例えば、目的の組織部分を組織又は器官の残りの部分から切断せずに目的の組織部分の縁（複数可）を切り取る又は引っ掻くことにより、胎盤由来マトリックスの移植に先立って目的の組織部分を追加で標識するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、移植は胎盤由来マトリックスを組織部分に隣接して注入するステップを含むことができる。追加の実施形態では、組織は胃腸管の表層（粘膜及び粘膜下層）に限局される固着又は扁平新生物でもよく、組織を切除する方法は、内視鏡的粘膜切除及び内視鏡的粘膜下層剥離のために使用してもよい。例えば、胎盤由来マトリックスは、Ｋａｎｔｅｓｅｖｏｙら、ｖｏｌ．６８、Ｎｏ．１、Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ（２００８年）に記載される、グリセロール及びヒアルロン酸などの粘膜下層注入用の溶液に取って代わる又はこれで補完してもよく、上記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。組織を切除する方法は、胎盤由来マトリックスを移植後に粘膜を切り取るステップと、組織を切断するステップと、組織を残りの胃腸管から持ち上げて離すステップとを含むこともできる。見本となる計画はｗｊｇｎｅｔ．ｃｏｍ／１９４８−５１９０／ｆｕｌｌ／ｖ４／ｉ１０／ＷＪＧＥ−４−４３８−ｇ００１．ｊｐｇに説明されている。
【０１３４】
例えば、本発明は、骨誘導性を促進する方法であって、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む方法にも関する。本明細書で使用されるとき、「骨誘導性」とは、細胞を表現型がもっと骨芽細胞様である細胞に分化させることを指すことができ、又は上記用語は骨芽細胞の増殖を増加させることを指すことができ、又はその両方ができる。胎盤由来マトリックス上又は内部での培養前の細胞は未分化細胞でも部分的な分化細胞でもよい。細胞は培養物に、又は組織、器官、若しくはその一部、又は生物中に存在していてもよい。対照の表面と比べて増強された活性を含むがこれに限定されない、胎盤由来マトリックスの骨誘導性活性は変化させてもさせなくてもよい。
【０１３５】
本発明は、軟骨誘導性（ｃｈｏｎｄｒｏｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を促進する方法であって、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む方法にも関する。本明細書で使用されるとき、「軟骨誘導性」とは、細胞を表現型がもっと軟骨細胞様である細胞に分化させることを指すことができ、又は上記用語は軟骨細胞の増殖を増加させることを指すことができ、又はその両方ができる。胎盤由来マトリックス上又は内部での培養前の細胞は未分化細胞でも部分的な分化細胞でもよい。細胞は培養物に、又は組織、器官、若しくはその一部、又は生物中に存在していてもよい。対照の表面と比べて増強された活性を含むがこれに限定されない、胎盤由来マトリックスの軟骨誘導性活性は変化させてもさせなくてもよい。
【０１３６】
本発明は、靭帯／腱分化を促進する方法であって、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む方法にも関する。本明細書で使用されるとき、「靭帯／腱分化」とは、細胞を表現型がもっと靭帯及び／若しくは腱様である細胞に分化させることを指すことができ、又は上記用語は靭帯及び／若しくは腱の増殖を増加させることを指すことができ、又はその両方ができる。胎盤由来マトリックス上又は内部での培養前の細胞は未分化細胞でも部分的な分化細胞でもよい。細胞は培養物に、又は組織、器官、若しくはその一部、又は生物中に存在していてもよい。対照の表面と比べて増強された活性を含むがこれに限定されない、胎盤由来マトリックスの靭帯／腱分化活性は変化させてもさせなくてもよい。
【０１３７】
それぞれ骨誘導性、軟骨誘導性、靭帯／腱分化を評価するために測定することができる骨芽細胞、軟骨細胞、靭帯／腱分化マーカーには多様なものがある。例えば、細胞は、骨芽細胞系列に向かう分化の初期段階中アルカリホスファターゼを発現する。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアルカリホスファターゼアッセイを使用すれば、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養される細胞で骨誘導性を評価することができる。筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）などの他の点では非骨形成細胞でアルカリホスファターゼ発現を刺激する又は誘導する胎盤由来マトリックスの能力は、胎盤由来マトリックスが骨誘導性活性を有することを示していると考えられる。これらのアッセイでは、胎盤由来マトリックス上又は内部で及び対照表面で培養される細胞は陰性対照として使用されて、非骨形成細胞上でのベースラインアルカリホスファターゼ発現を示す。陰性対照での骨芽細胞マーカーのベースラインはゼロである必要はなく、陰性対照群の細胞が少なくともある程度のレベルの表現型マーカー（複数可）を有する可能性があることを意味している。したがって、胎盤由来マトリックスの「骨誘導性」表面は実験細胞において骨芽細胞マーカーの増加を引き起こすだけであると考えられる。同様に、２、３例を挙げると、Ｘ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、Ｓｏｘ９、アグリカン、マトリリン−１及びＣＥＰ−６８を含むがこれらに限定されない軟骨細胞マーカーを使えば軟骨誘導性潜在力を評価することができる。さらに、スクレラキシスを含むがこれに限定されない靭帯／腱マーカーを使用すれば、靭帯／腱分化潜在力を評価することができる。
【０１３８】
さらに、骨誘導性、軟骨誘導性、及び靭帯／腱分化は、初代細胞、細胞株、又は外植片などの培養細胞において、骨芽細胞表現型、軟骨細胞表現型、靭帯／腱細胞表現型を分化させる又は誘導する胎盤由来マトリックスの能力を調べることにより組織培養で決定することができる。例えば、細胞は、アルカリホスファターゼ、等などの骨芽細胞に特徴的なマーカーの産生の増加を示すことがある。例えば、胎盤由来マトリックスの骨誘導性、軟骨誘導性、靭帯／腱分化潜在力の大きさは対照の０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍よりも多くてもよい。別の例では、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスの骨誘導性、軟骨誘導性、靭帯／腱分化潜在力の大きさは対照スキャフォールドの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００又は１０００倍もよりも多くてよい。
【０１３９】
筋肉などの位置で胎盤由来マトリックスにより誘導される骨、軟骨、靭帯又は腱形成潜在力を評価するための骨誘導性、軟骨誘導性、靭帯／腱分化は、適切な動物モデルを使用して評価してもよい。例えば、齧歯類への筋肉内移植は、胎盤由来マトリックスの骨誘導性活性を評価するためのモデルとして使用されてきた。
【０１４０】
本発明は、骨芽細胞、軟骨細胞、靭帯細胞、腱細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、及び／又は本明細書で開示される任意の細胞型の細胞血管形成、止血、生体適合性、感染抵抗性、付着、増殖を促進する又は分化状態を維持する又は脱分化を妨げる方法であって、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む方法にも関する。対照の表面と比べて増強された活性を含むがこれに限定されない、胎盤由来マトリックスの増殖活性は変化させてもさせなくてもよい。本発明は、脂肪細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び／又は血管内皮細胞の脂肪組織形成を促進する方法にさらに関する。本発明は、血管形成、止血機能、生体適合性、抗瘢痕化、抗炎症性、及び／又は感染抵抗性を増加する又は促進する方法にも関する。
【０１４１】
分裂促進性は、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物アッセイ、アラマーブルー（登録商標）アッセイ、等などの代謝活性を測定する種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して胎盤由来マトリックスにより誘導される細胞増殖を調べることにより評価することができる。アラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）（登録商標）アッセイは非細胞障害性還元酸化指示薬を使用して細胞代謝活性を測定し、本明細書に記載される胎盤由来マトリックスの細胞分裂活性を評価するための非破壊アッセイとなっている。増殖は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡアッセイ、［３Ｈ］チミジン標識などのＤＮＡ合成の放射活性標識又はＢｒｄＵ取り込みを使用することによりなどの、ＤＮＡ定量化を測定することにより評価することも可能である。増殖は、細胞をトリパンブルーで染色し血球計数器で計測するなどの、手動細胞計測により評価することも可能である。
【０１４２】
本発明は、細胞で骨形成、軟骨形成、又は靭帯／腱形成を増加させる又は促進する方法にも関する。方法は、本明細書に記載される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含むことができる。本明細書で使用されるとき、「骨形成」とは、膜内骨形成及び軟骨内骨形成を含むがこれらに限定されない、新しい骨物質の沈着又は新しい骨の形成である。本明細書で使用されるとき、「軟骨形成」とは、新しい軟骨物質の沈着又は新しい軟骨の形成である。本明細書で使用されるとき、「靭帯／腱形成」とは、新しい靭帯及び／若しくは腱物質の沈着又は新しい靭帯及び／若しくは腱の形成である。対照の表面と比べて増強された活性を含むがこれに限定されない、胎盤由来マトリックスの骨形成、軟骨形成、靭帯又は腱誘導活性は変化させてもさせなくてもよい。細胞は、骨、軟骨、靭帯、筋肉、腱、等などのしかしこれらに限定されない、骨、軟骨、靭帯又は腱形成が望ましい任意の組織の細胞を含んでいてよい。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、基質の表面に胎盤由来マトリックスを被覆する方法に関する。胎盤由来マトリックスは、例えば、約８．０又はそれよりも高い塩基性ｐＨを有することができる。塩基性ｐＨは、８．０〜９．０、好ましくは８．０〜８．５、さらに好ましくは８．０〜８．２の範囲であってもよい。例えば、マトリックスの塩基性ｐＨは、少なくとも約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０、好ましくは少なくとも約８．０である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、方法は、胎盤組織の少なくとも一片を脱細胞化又は失活させて、脱細胞化又は失活胎盤組織を製造するステップと；脱細胞化又は失活胎盤組織を消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと；基質の表面の少なくとも一部を胎盤由来マトリックスで被覆するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、消化と同時に又はこれに先立って胎盤組織をホモジナイズするステップをさらに含むことができる。追加の実施形態では、胎盤由来マトリックスは、表面に、例えば、ナノファイバーの形態で胎盤由来マトリックスを電界紡糸することにより表面に被覆することができる。本発明は、本明細書に記載される方法に従って胎盤由来マトリックスで被覆されたスキャフォールドにさらに関する。本発明は、本明細書に記載される方法により製造される胎盤由来マトリックスで被覆された合成表面にも関する。本発明は、本明細書に記載される方法により製造される胎盤由来マトリックスで被覆された細胞培養表面で細胞を培養するステップを含む細胞培養の方法にさらに関する。
【０１４５】
さらなる実施形態では、本発明はキャリアーとして胎盤由来マトリックスを使用する薬物送達にも関係することができる。例えば、胎盤由来マトリックスは本明細書に記載される生理活性サプリメントをカプセルに包み、そのような生理活性サプリメントを目的の部位に送達することができる。
【０１４６】
本発明の方法のいずれも、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定などの実質的にいかなる設定においても実施することが可能である。例えば、細胞で骨形成、軟骨形成、又は靭帯／腱誘導活性を促進する方法は、細胞培養で実施することができる、胎盤由来マトリックス表面に播種された細胞で実施することができる、又は無傷の生物で実施することができる。さらに、本明細書に記載される実施形態のいずれかのいかなる２つ又はそれよりも多い組合せが想定されている。
【０１４７】
本発明は、種々の特定の材料、手順及び例を参照することにより本明細書に記載され説明されてきたが、本発明はその目的のために選択される材料及び手順の特定の組合せに限定されないことは理解されている。そのような詳細な点の数多くの変動は、当業者であれば認識するように暗示することは可能である。明細書及び実施例は、以下の特許請求の範囲に示されている本発明の本当の範囲及び精神と共に、見本とのみ見なされていることが意図されている。本出願で参照される参考文献、特許及び特許出願はすべて参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
以下の実施例は説明的なものであり、本明細書に記載される本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：胎盤由来マトリックス（ＨｕＭＡＴＲＩＸ）の調製
−８０℃で保存された全凍結ヒト胎盤（又は心臓若しくは肝臓）をすぐに加工できるように又は４℃で一晩解凍できるようにのいずれかにした。消毒したデリスライサー（Ｃｈｅｆｓ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｓｌｉｃｅｒ  Ｖａｒｉ  Ｔｉｌｔ  Ｍ６４５）若しくはミートグラインダー又はバンドソーを使用して、胎盤組織を５０ｇの組織（湿重量）まで小さな断片（幅及び直径約０．５ｃｍ）に切断した。余分な血液を洗浄及び除去するために、胎盤組織を、１リットルの４℃の冷却水ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、次いで、容器内で１％のＡＢＡＭで補った１リットルの４℃の冷却水ＭｉｌｌｉＱ水でオービタルシェーカー上で１２００ＲＰＭで３０分間、激しく洗浄した。余分な血液がかなり減るまでこのプロセスを繰り返した。胎盤を脱細胞化するために、洗浄した組織を、２．５ｇのＮＥＭ、プロテアーゼ阻害剤、２０ｇのＮＬＳ、及び１％のＡＢＡＭで補った１リットルの失活バッファー中で２００ＲＰＭで室温で一晩振盪させた。
【０１５０】
次に、１０．２ｇの湿組織（＝約２ｇの凍結乾燥組織）を、１ｍｇ／ｍｌペプシン／０．１Ｍ  ＨＣＩ溶液に添加した。３つの濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、及び４０ｍｇ／ｍｌ）の胎盤由来マトリックスを作製した。約４０ｍｇ／ｍｌで、生成物は、流動不能な高い粘性を有した。組織をポリトロンホモジナイザーで５回の１０秒パルスでスラリーが均質に見えるまで混合した。得られた溶液を室温で約２４〜６０時間撹拌した。約６０時間後、水酸化ナトリウム及び塩酸を使用して、ペプシンＨＣｌを一時的にｐＨ８．０にし、次いで、ｐＨ７．０〜７．２にした。ＨｕＭＡＴＲＩＸ最終生成物は、見かけは粘性かつ半透明に近いように見えた。ゲル化特性を試験するために、ＨｕＭＡＴＲＩＸの試料を３７℃で１５分間加熱した。ＨｕＭＡＴＲＩＸ試料を、長期保管のために−８０℃で、又は２週間以内の使用のために４℃で保存した。ＨｕＭＡＴＲＩＸの最終生成物を約３７℃でハイドロゲルに変換した、又は凍結乾燥して海綿質を形成させた。凍結乾燥後、ＨｕＭＡＴＲＩＸ海綿質を有機溶媒（ヘキサフルオロイソプロパノール等）に溶解し、電界紡糸してナノファイバーシートにした。更に、ＨｕＭＡＴＲＩＸの凍結乾燥した海綿質は、驚くべきことに、０．５Ｍの酢酸中に再溶解し、中和して、再びハイドロゲルとして３７℃で注型することができた。
【０１５１】
別の例示的な方法では、水の代わりに生理食塩水溶液で胎盤組織を洗浄した。他の例示的な方法では、生理食塩水洗浄に加えて、界面活性剤を使用した、又は胎盤組織の脱細胞化により短い期間を採用した。プロセス後のマトリックス中の不純物の量と共に総タンパク質収量を決定した。プロテオミクスの結果により、水洗浄は、生理食塩水洗浄と比較して、細胞の残存デブリがより少なくなる結果になったが、生理食塩水洗浄は、最終マトリックス中により高濃度かつより多様な増殖因子をもたらしたことが示された。
【０１５２】
実施例２：胎盤由来マトリックスのタンパク質プロファイル
ＨｕＭＡＴＲＩＸのタンパク質プロファイルを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを行った。１０μｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）をそれぞれの試料に添加し、全ての既存のジスルフィド結合を破壊するために１００℃で５分間加熱した。試料を５分間加熱した後に、４０μｌの抽出物を１０μｌのＮｏｖｅｘシャープマーカーと共に１．５ｍｍの４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上にロードした。ゲルを１時間泳動し（２００Ｖ一定、１２５ｍＡ開始、８０ｍＡｍｐ終了）、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、クマシーブルーで一晩染色し、次いで、可視化した。多数のバンドが存在した。４名の異なるドナー由来の４つの胎盤由来マトリックス試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上でバッチ間での一貫性を示した。マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）（登録商標）からの主要なタンパク質バンドを対照として使用した。明確に異なるバンドパターン及び主要なタンパク質組成を、尿素での胎盤抽出物又は尿素抽出後の脱細胞化による胎盤抽出物と比較した。重いバンドは、コラーゲン鎖を示す１６０ｋＤａで観察された。タンパク質組成は、従来のマトリゲル／尿素抽出化学に対して相対的にＨｕＭＡＴＲＩＸ化学での群間で一貫していて、かつＮＬＳで脱細胞化し、次いで、尿素で抽出した胎盤マトリックスとは異なるように見えた。
【０１５３】
実施例３：胎盤由来マトリックスでの表面コーティング
細胞培養プラスチック製品に対する胎盤由来マトリックスのコーティング又は結合効率を測定するために、０．６〜１．３ｍｇ／ｃｍ２の多様な濃度のＨｕＭＡＴＲＩＸを２４ウェルプレートにアプライし、クマシーブルーで染色して、完全なかつ全ての染色及びしたがって、荷電した組織培養プラスチック製品上にこの濃度範囲においてあり得る細胞外マトリックスタンパク質の均一なコーティングを有する、ウェル上のＥＣＭ被度を評価した。
【０１５４】
実施例４：タンパク質、増殖因子、及びＤＮＡの同定及び定量
キットと共に供給された製造業者の説明書に従い、総タンパク質、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、及びヒト胎盤性ラクトゲンの量を定量するためのＥＬＩＳＡを、ＨｕＭＡＴＲＩＸ、僅かな化学バリエーションを有するＨｕＭＡＴＲＩＸ、及び対照マトリックスにおいて行い、マトリックスにおける相違を比較及び対比した。
【０１５５】
ヒト胎盤ハイドロゲル中のコラーゲンＩ、ＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及び胎盤性ラクトゲンの含有量を、それぞれ８名の固有のドナーからＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）及びＧｅｎｗａｙｂｉｏ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販の定量的サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイキットを使用して決定した。全てのアッセイは、製造業者の説明書により、各ドナー組織からの３通りずつの試料において行った。
【０１５６】
ＥＣＭタンパク質を、総タンパク質定量のためのＬｏｗｒｙ法によって決定されるような総タンパク質含有量を比較することによって重量パーセントとして標準化した。全てにおいて、コラーゲンＩ型は平均で組成の４１％であって、ＩＶ型コラーゲンは総マトリックスの約３％を構成しており、かつラミニンガンマ１及びフィブロネクチンは平均で組成の＜１％であった。ヒト絨毛性乳腺刺激ホルモン（別名胎盤性ラクトゲン）は、ＨｕＭＡＴＲＩＸにおいて平均で約１７５ｎｇ／ｍＬで見出された。胎盤性ラクトゲンは、高い生理活性があること、膵島細胞からのインスリン産生を刺激すること、ＭＣＦ７腫瘍細胞増殖において４．４倍の増加を引き起こすこと、血管新生を誘導すること、胎児性肝細胞ＤＮＡ合成を刺激すること、及びＨｕＭＡＴＲＩＸ中に存在する平均濃度レベルで又はそれ未満のレベルでの他の機能が文献において報告されている。
【０１５７】
ヒト胎盤ハイドロゲル試料を計量して衝撃耐性チューブ内に入れた。ＤＴＴ適合可能なＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して上清のタンパク質濃度を決定し、１００μｇの抽出したタンパク質試料を、ＮｕＰＡＧＥ還元ゲル（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上でＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  １×バッファーで２００Ｖで約１０分間泳動した。タンパク質バンドが３〜５ｍｍ移動した後に、ゲルをＰａｇｅ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で染色し、全てのタンパク質バンドを切り出した。ゲルを脱染色し、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３；５０％アセトニトリル及び８０％アセトニトリル中で３回洗浄した。ゲル結合タンパク質を１ｍｌの４０ｍＭ  ＤＴＴで５６℃で２５分間還元した。ゲルを１ｍｌの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３バッファーですすぎ、還元タンパク質を１ｍｌの５０ｍＭヨードアセトアミドで、暗所で一定に混合しながら２５℃で３０分間アルキル化した。ヨードアセトアミドを捨て、ゲル結合タンパク質を５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー中の０．５ｍｌのトリプシン（２０ｎｇ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、一定に混合しながら３７℃で１２時間消化した。消化後、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３でゲルを洗浄することによってトリプシンの画分を収集した。トリプシンペプチドを含む溶離液を、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して乾燥し、質量分析による分析の前に４℃で保存した。
【０１５８】
乾燥した試料を２０μｌの０．１％ギ酸／水で溶解し、次いで、２μｌの各試料をＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計上でＥａｓｙ  ＮａｎｏＬＣ−１０００システムを用い、動的排除（ＤＥ＝１）設定でデータ依存的獲得を使用して、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。使用したデータ依存的獲得設定は、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＭＳでは上位１２のより高いエネルギー衝突誘起解離であった。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅの解像力は、フルＭＳスキャンでは７０，０００に、ｍ／ｚ  ２００でのＭＳ／ＭＳスキャンでは１７，５００に設定した。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析は、Ｃ１８カラム（７５μｍ×１５０ｍｍ）を使用して行った。逆相クロマトグラフィーの移動相は、（Ａ）０．１％ギ酸／水及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。４ステップの直線勾配をＬＣ分離に使用した（２％のＢで１０分間のカラム前平衡化；最初の４７分に２％〜３０％のＢ、次いで、次の１分に８０％のＢ、８０％のＢで１２分間保持）。
【０１５９】
標識なしの前駆イオン検出法（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ、バージョン１．３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５ｐｐｍの質量精度の範囲内で前駆体／断片における特定の滞留時間で使用した。Ｓｅｑｕｅｓｔアルゴリズムを使用し、分類学「ヒト」を使用してＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（バージョン５７）から抜き出された組み合わされたヒトタンパク質データベース（合計２８，０００配列）に対して検索することにより、得られたＭＳ／ＭＳスペクトルからペプチドを同定した。親及び断片イオン耐性の検索パラメーターは、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＭＳ用に１５ｐｐｍ及び６０ｍｍｕとして設定した。使用した他のパラメーターは、カルバミドメチル化−Ｃｙｓの一定の修飾、リン酸化（Ｓ、Ｔ、Ｙ）及び酸化（Ｍｅｔ）の可変の修飾であった。トリプシンは、最大２つの切断ミスを有するプロテアーゼとして設定した。＞２つのペプチドが同定された（又は＞５０％のタンパク質が単一ペプチドによってカバーされた）タンパク質のみを比較定量分析ステップに含め、Ｐ＜０．０５の正確なタンパク質同定の確率の結果となった。タンパク質にまだ明確にリンクされていないペプチドは、更なる解析から除外した。
【０１６０】
ＨｕＭＡＴＲＩＸにおいて同定された総タンパク質の質量分析データから作成されたベン図は、代替の胎盤ＥＣＭ抽出戦略（Ｔ１及びＤ１として標識された、尿素抽出を用いたマトリゲル（登録商標）化学、対、Ｐ１として標識された、改変されたＭａｔｒＡＣＥＬＬ化学を使用したＨｕＭＡＴＲＩＸ群）及びマトリゲル（登録商標）と比較して、ＨｕＭＡＴＲＩＸ調製物間で高い相同性を示した。更に、ＨｕＭＡＴＲＩＸにおける機能的タンパク質群を細胞機能に基づいて分類した。一部の例では、構造的分子活性の分子機能に関連した６７４種のタンパク質を、ラミニン及びフィブロネクチンを含む、３つの抽出戦略から同定した。それらの例では、３つ全ての抽出戦略から同定されるタンパク質を含む９０種のグリカンには、プロテオグリカン、糖タンパク質、バイグリカン、及びホスホグリセリン酸キナーゼが含まれていた。
【０１６１】
水ですすいだ例示的な胎盤由来マトリックス試料は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する１種又は複数のタンパク質を含んでいてもよい：Ａ１ＹＺＬ０、Ｑ９ＵＨＳ６、Ｃ９ＪＫＷ４、Ｑ６ＬＥＵ９、Ｅ５ＲＦＤ４、Ｑ９ＵＨＴ９、Ｑ５９Ｆ８８、Ａ０Ｎ４Ｖ７、Ｑ６ＰＢ３０、Ｑ９ＢＸＹ１、Ｅ９ＰＳＩ６、Ｃ９ＪＬＥ０、Ｂ４Ｅ２Ｗ７、Ｄ８ＭＪ８４、Ｃ９Ｊ４３０、Ｑ０１６２９、Ａ６ＰＶＫ６、Ｂ５Ｍ０Ｙ２、Ｑ９６Ａ１０、Ｏ１９５２５、Ｑ９６９Ｒ７、Ｂ０ＵＺ３５、Ｑ９２４９４、Ｑ５ＴＢＥ３、Ｑ６ＵＷＰ５、Ｑ９ＵＦ７３、Ｑ６ＬＥＮ６、Ｑ７１ＲＧ２、Ｅ１Ｙ３Ｙ３、Ｂ３ＫＳ６８、Ｑ９Ｈ３Ｃ１、Ｂ３ＫＳＪ１、Ｃ９ＪＢ８７、Ｅ７ＥＵ９４、Ｑ９Ｐ１６９、Ｑ８ＷＵ３９、Ｑ６ＺＰ２５、Ａ２ＲＵＱ５、Ｂ７Ｚ５１５、Ｑ８ＩＺＹ５、Ｐ１３６４５、Ｄ６ＲＦＺ９、Ｑ７１ＪＢ４、Ｑ８Ｎ８Ｅ１、Ｅ９ＰＡＳ６、Ｃ６ＧＬＷ５、Ａ２ＮＺ５５、Ｑ８ＮＢＣ３、Ｅ９ＰＪＦ３、Ｄ６ＲＢＦ７、Ｑ４ＺＥＪ２、Ｑ５ＮＶ８４、Ｐ０１７６１、Ｅ９ＰＳ８４、Ａ１ＹＺＨ４、Ｑ５ＴＢＴ３、Ｂ４ＤＫＸ８、Ｃ９ＪＦ１５、Ｑ６ＹＬ４１、Ｄ６ＲＣＮ１、Ｑ６ＺＮＶ４、Ｂ４ＤＱＣ９、Ｑ５３ＧＦ３、Ｃ９Ｊ７Ｐ８、Ｂ７Ｚ３Ｐ２、Ｂ８Ａ４Ｋ４、Ｂ７Ｚ５Ｈ５、Ｑ５ＪＹＧ５、Ｑ９ＵＬ９０、Ｑ７Ｌ２Ｕ６、Ｂ７Ｚ７Ｅ１、Ｅ５ＲＩＩ８、Ｂ４ＤＥＥ８、Ｂ７Ｚ８Ｅ６、Ｅ７ＥＰＨ１、Ｂ１ＡＭＷ７、Ｅ７ＥＳ６１、Ｑ８ＴＤＡ６、Ｑ５Ｔ７Ｗ９、Ｑ９９６０４、Ｑ６ＺＰ６６、Ａ８ＭＱＵ８、Ｐ０４２６４、Ｂ４ＤＴ６４、Ｅ０ＣＸ０９、Ｅ５ＲＦＷ１、Ｂ４ＤＺ５０、Ｂ７Ｚ２Ｙ８、Ｑ５Ｔ４５０、Ｂ４Ｅ０Ｕ２、Ｅ５ＲＨ３８、Ｑ６ＺＭＣ９、Ｑ６ＸＹＢ５、Ｑ６ＺＮＶ２、Ｂ７ＷＰ１４、Ｐ０５４１３、Ｅ５ＲＫ９６、Ｅ５ＲＪＳ６、Ｂ７Ｚ１Ｆ８、Ｅ９ＰＥＰ２、Ｑ８Ｎ１Ｖ５、Ｄ６ＲＪＧ１、Ｅ９ＰＲＢ０、Ｄ３ＤＰＥ６、Ｑ８ＩＹＡ７、Ｑ８Ｎ５Ｍ１、Ｑ８ＮＦ１２、Ｑ９６ＧＡ９、Ｂ４ＤＧＭ４、Ｂ７Ｚ１Ｆ７、Ｂ３ＫＷＭ９、Ｑ９Ｈ８４１、Ａ０ＡＶＩ４、Ｂ４Ｅ０Ｃ８、Ｑ４Ｗ５Ｌ８、Ｑ６ＰＣＢ０、Ｑ９Ｈ３Ｗ０、Ｑ９２５６７、Ｑ５ＪＵ０４、Ｃ３ＶＮＣ３、Ｅ９ＰＮＱ０、Ｂ２ＢＤ３４、Ｑ９３０１５、Ｑ８ＮＡＴ４、Ｑ８ＩＸＲ４、Ｅ７ＥＮＷ１、Ｂ４ＤＥＴ２、Ｂ３ＫＵＵ３、Ｑ６ＩＡＮ５、Ｑ９ＢＳＤ０、Ｂ８ＺＺＹ８、Ｑ５ＪＱＱ４、Ｑ８ＮＡＰ１、Ｑ９Ｈ６Ｋ５、Ａ８ＭＱ１１、Ｑ６ＺＮＷ４、Ｏ６０７２１、Ｑ６ＩＲＺ０、Ｂ４ＤＩ０９、Ｂ４Ｅ０Ｄ３、Ｅ９ＰＤＡ１、Ｑ９ＵＪＣ５、Ｐ３００４２、Ｂ７ＺＭ７４、Ｑ９６ＲＹ６、Ｏ１５３０２、Ｑ４ＶＸＪ３、Ｂ４ＤＷＮ５、Ｂ３ＫＳＴ６、Ｃ９Ｊ５８６、Ｑ９ＮＰＢ６、Ｑ９Ｈ６Ｑ４、Ｑ９ＵＦ８３、Ｂ４Ｅ２Ｚ１、Ｄ３ＤＴＸ７、Ｑ０５ＣＵ２、Ｑ８Ｎ５８９、Ｄ３ＹＴＤ６、Ｑ９Ｙ３Ｄ８、Ｑ８ＩＺＥ８、Ｅ７ＥＮＶ３、Ｂ７Ｚ４Ｒ８、Ｂ２Ｒ８８８、Ｑ５ＳＱＩ７、Ｃ５Ｈ６Ｋ５、Ｑ６ＺＶ０１、Ｂ３ＵＹＦ０、Ｑ０６９４５、Ｐ０８１２３、Ｂ４ＤＬＹ８、Ｑ９ＢＰＵ６、Ｂ３ＫＰ９５、Ｑ６ＺＮＣ４、Ｑ９Ｈ７Ｖ２、Ｑ３Ｂ７Ｔ３、Ｂ４ＤＶ９０、Ｂ４ＤＵＪ３、Ｂ３ＫＳＺ４、Ｑ９ＢＷＮ１、Ｑ９ＢＴＱ８、Ｑ９ＢＹＥ７、Ｑ８６Ｙ３７、Ｃ９ＪＺ８８、Ｂ４ＤＷＵ６、Ｑ９Ｙ５Ｔ４、Ｑ６８ＣＪ６、Ｐ１１７６６、Ｑ５ＪＰＵ０、Ｑ１０７１３、Ｂ３ＫＳＧ５、Ｑ８Ｎ２５４、Ｂ３ＫＱＳ８、Ｑ９ＮＳＩ３、Ｑ９ＢＴＵ６、Ｃ９Ｊ６Ｆ７、Ａ８ＭＸ３９、Ｂ３ＫＮＬ１、Ｃ９ＪＦ３４、Ｑ２ＵＹ０９、Ｂ４ＤＦＲ７、Ｑ５２ＬＢ７、Ｑ８６Ｕ３３、Ａ８ＭＹ７１、Ｑ６ＦＨＷ５、Ｑ８ＴＢＸ０、Ｂ２ＲＴＳ９、Ｂ４ＤＶＤ７、Ｂ７ＺＭＢ３、Ｂ２Ｒ８Ｕ０、Ｑ５９Ｈ２２、Ｑ５ＳＹ０１、Ｂ７Ｚ８Ｄ８、Ｂ７ＺＬＮ９、Ｂ３ＫＳＵ４、Ｂ３ＫＷＬ２、Ｂ２ＲＣＫ１、Ｂ４ＤＶＲ４、Ｑ５Ｔ０Ｔ５、Ｑ６８ＤＳ７、Ｂ１ＡＴＬ７、Ｑ５９ＥＺ０、Ｂ４ＤＵ３３、Ｐ１２７２４、Ｑ８ＩＹＫ８、Ｂ５Ａ９４８、Ｂ２ＲＡＰ６、Ａ０ＰＪＸ８、Ｑ５ＴＣＺ１、Ｂ７Ｚ８Ｋ４、Ｑ５３ＴＸ７、Ｂ４ＤＨＹ８、Ｑ５３Ｇ１６、Ｑ９２５５６、Ｂ４ＤＭＷ０、Ｂ３ＫＭ３８、Ｑ６Ｙ８８１、Ｑ８ＮＧＩ８、Ｑ９Ｈ７４８、Ｑ８ＷＶＬ７、Ｅ５ＲＨＳ６、Ｑ６ＺＲＳ５、Ｑ９ＮＷＲ１、Ｂ７ＺＢＩ４、Ｑ７Ｌ３Ｓ４、Ｑ６ＺＭＨ４、Ｂ３ＫＰ６６、Ｂ０Ｖ３Ｌ４、Ａ６ＮＮＨ２、Ｑ９ＮＺＶ８、Ｅ９ＰＫＣ０、Ｂ４ＤＺ７９、Ｐ３４９８２、Ｂ７Ｚ６０９、Ａ８Ｋ９７９、Ｅ９ＰＥＩ６、Ｑ０８９９９、Ｑ９ＢＺ６８、Ｑ８Ｎ８０８、Ｑ５０２Ｖ２、Ｑ４ＺＨＧ４、Ｑ９Ｐ２０６、Ｂ、７ＺＫＹ６、Ｑ５Ｈ９Ｑ３、Ｑ９ＮＳＭ０、Ｑ５３Ｇ７９、Ｄ６ＲＣＭ８、Ｑ８ＮＧＩ４、Ｅ５ＲＧ３１、Ｑ９６ＬＴ６、Ｅ７ＥＰＥ７、Ａ８Ｋ９Ｐ０、Ｂ４ＤＲ２１、Ｑ６ＺＳ１１、Ｅ９ＰＣＰ１、Ｑ６Ｐ５Ｘ８、Ｐ０２４５２、Ｑ９Ｈ７Ｅ９、Ｐ７８５１７、Ｂ９ＺＶＡ０、Ｃ９ＪＢＦ１、Ｂ４ＤＵＥ５、Ｑ９Ｈ７Ｓ４、Ｑ９９４１９、Ｑ６ＺＵＦ６、Ｂ５ＭＣＶ７、Ｑ８ＩＹＩ６、Ｂ４ＤＹＢ３、Ｑ５ＴＢＮ９、Ｄ９ＺＧＧ０、Ａ６ＮＪＢ７、Ａ８Ｋ０Ｍ８、Ｂ３ＫＳＡ０、Ｑ６ＺＷＬ３、Ｑ９６Ｑ０６、Ｅ５ＲＪＡ７、Ｑ９６ＥＲ９、Ａ８Ｋ５５７、Ｃ９ＪＧＸ５、Ｑ９ＵＪＸ１、Ｂ５ＭＣＢ９、Ｑ９Ｈ２１０、Ｂ４Ｅ３３８、Ｑ６ＺＲＰ５、Ｑ１３５９６、Ｑ５９ＥＷ１、Ｅ９ＰＢＬ０、Ａ８ＭＴＬ３、Ｅ７ＥＵ４１、Ｂ３ＫＸＭ９、Ｑ９Ｈ６Ｃ４、Ｂ４ＤＨＡ３、Ｑ５ＦＣ０５、Ｏ９５４８４、Ｂ２Ｒ７Ｋ１、Ｏ１５４５７、Ｂ４Ｅ１８６、Ｑ５ＴＣＹ１、Ｑ０ＶＡＡ２、Ａ８ＭＷ６１、Ｅ７ＥＶＱ７、Ｅ９ＬＴ２８、Ｑ９Ｎ２Ｋ０、Ｅ５ＲＧ８２、Ｑ６ＮＴＦ９、Ｑ４ＪＮＹ３、Ｅ９ＰＡＶ３、Ｅ９ＰＣＤ７、Ｂ４ＤＳＮ３、Ｑ９ＵＪＴ０、Ｑ９Ｙ６６１、Ｑ８Ｎ５０６、Ｂ３ＫＳＰ５、Ｂ７Ｚ６Ｊ４、Ｑ９ＮＳ４０、Ｃ９ＪＥ７２、Ｐ０２４６１、Ｂ４ＤＪＮ５、Ｑ７０Ｚ４４、Ａ８ＭＲＴ１、Ｑ９ＵＮＹ４、Ｂ４ＤＳＨ１、Ｅ７ＥＶ４１、Ｑ９Ｐ２Ｖ４、Ｐ５０５５３、Ａ８Ｋ０７９、Ｑ９ＨＢＨ５、Ａ６ＮＣＳ９、Ｃ９ＪＲＰ７、Ｑ６９ＹＵ３、Ｑ９Ｙ４６７、Ａ６ＮＥＭ２、Ｑ８６ＴＶ２、Ｂ１ＡＰＲ７、Ｃ９ＪＴ３０、Ｑ６８Ｅ０２、Ｐ０１５７０、Ｂ２ＲＤＫ３、Ｑ９ＵＨＤ２、Ｂ５Ａ９４０、Ｑ８ＩＷ９０、Ｂ４ＤＲＦ４、Ａ８ＫＡ６４、Ｅ９ＰＤＣ８、Ｑ８ＮＦＷ５、Ｑ８ＩＹＸ３、Ｂ７ＺＬＦ０、Ｑ６ＺＮＥ１、Ｂ４Ｅ０７６、Ｑ６Ｎ０８９、Ｑ６ＩＰＪ９、Ｑ９Ｈ４２２、Ａ８Ｋ９Ｌ７、Ｂ５ＭＥ５８、Ａ６ＮＤＬ８、Ｅ９ＰＬＫ８、Ｑ６Ｂ０Ｉ６、Ｑ９２６３０、Ｂ７Ｚ５Ｊ４、Ｂ４ＤＹＶ１、Ｑ４ＥＹＭ８、Ａ６ＮＮＡ４、Ｑ８６ＴＷ２、Ｑ８ＴＦ７４、Ｑ５ＬＪＢ０、Ｑ８ＩＸＺ２、Ｑ７Ｚ３Ｒ８、Ｑ５ＪＶ４７、Ｑ９６ＪＢ５、Ｑ６８ＤＥ３、Ｑ２ＫＨＭ８、Ｑ６ＩＣＨ７、Ｑ５９ＧＬ７、Ｂ０ＱＹＹ４、Ｂ３ＫＳ８５、Ｑ９ＢＱＦ６、Ａ６ＮＣＢ９、Ｑ９Ｈ１Ｙ３、Ａ８Ｋ４３４、Ｑ９６Ｉ００、Ｂ３ＫＮＦ９、Ｂ２ＲＮＩ９、Ｑ８Ｎ２Ｑ７、Ｃ９ＪＭＫ７、Ｂ３ＫＸ４２、Ｑ９ＧＺＶ１、Ａ８Ｋ２５６、Ｑ６ＺＰ８５、Ｃ９ＪＹＢ８、Ｑ１４９９３、Ｂ７Ｚ３２１、Ｂ４ＤＱ５４、Ｑ７Ｌ８Ｋ４、Ｐ０８９０８、Ｂ４ＤＺ９７、Ｑ３ＬＦＤ５、Ａ８ＭＹ９４、Ｑ６０Ｉ３１、Ｂ７Ｚ８Ｘ３、Ｏ４３９１６、Ｑ８ＷＸ６９、Ｂ４ＤＳＱ７、Ｑ８Ｎ７Ｕ０、Ｂ４ＤＥ５９、Ｑ５ＪＷＭ１、Ｐ６０５０９、Ｂ４ＤＸＷ７、Ａ８ＭＷ３１、Ｑ５９ＦＺ７、Ｑ５Ｈ９Ｆ３、Ｂ４ＤＳ１４、Ｅ３Ｗ９８０、Ｐ３２９７１、Ｑ９６ＭＬ５、Ｅ７ＥＵＣ６、Ｂ４Ｅ０Ｆ４、Ｂ４ＤＪＡ０、Ｅ９ＰＥＨ８、Ｑ６Ｐ４Ｒ８、Ｂ７Ｚ６Ｉ９、Ｐ３０６２２、Ａ４ＱＰＢ０、Ｂ４ＤＰＩ０、Ｑ９２９１７、Ｂ２Ｒ７８７、Ｑ５８Ｆ０５、Ｂ９ＺＶＰ８、Ｑ０６４１８、Ｑ１４７２１、Ａ２ＲＲＥ８、Ｐ３５５２７、Ｑ６８ＣＸ１、Ｂ４Ｅ３Ｈ４、Ｂ３ＫＰ３２、Ｑ８Ｎ０Ｖ４、Ｂ４ＤＩＭ８、Ｑ８ＴＤ４９、Ｂ４ＤＩＸ２、Ａ８Ｋ８Ｔ９、Ａ８Ｋ１７９、Ｑ５ＪＺＹ３、Ｂ４ＤＧ７４、Ｂ７ＺＭＪ７、Ｂ４ＤＨ３０、Ｑ９ＮＲＲ２、Ｑ９ＵＦ１２、Ｏ９４９１９、Ｏ４３３１３、Ｑ２ＨＰＮ１、Ｑ６Ｐ３８７、Ａ０Ｍ８Ｘ１、Ｑ６ＺＲＲ９、Ｏ６０２４０、Ｂ４ＤＺ１６、Ａ８Ｋ９Ｕ６、Ａ７ＬＦＫ７、Ｑ９Ｈ７Ｕ１、Ｑ８ＴＢＮ０、Ｑ６ＺＵ６５、Ｂ４ＤＦＫ３、Ｑ６ＮＴ５５、Ｑ８ＩＶＪ１、Ａ０ＰＪＤ３、Ｂ３ＫＸＷ２、Ｃ９ＪＶＴ２、Ｑ９ＢＳＵ１、Ｂ５ＭＣ００、Ｑ９６ＡＣ１、Ｂ７Ｚ８Ｍ３、Ａ９ＮＩＵ４、Ｏ７５１３１、Ｂ４ＤＲ０１、Ｄ７ＰＢＮ３、Ｄ３ＤＸＧ４、Ｂ１ＡＮＨ６、Ｄ３ＹＴＩ９、Ｂ４Ｅ０５３、Ｑ９ＮＸＬ９、Ｑ８ＮＦＵ７、Ｑ６ＺＵ５２、Ｂ４ＤＦ１５、Ｂ１ＡＫＧ２、Ｑ５９ＥＷ６、Ｂ４ＤＤＳ３、Ｂ３ＫＮ０２、Ｐ０５９９７、Ｐ２０８０７、Ｂ４ＤＴ６６、Ｑ５９Ｆ７７、Ｑ９２５８５、Ｂ３ＫＸ９０、Ａ８ＭＵＷ４、Ｂ４Ｅ２Ｋ４、Ｑ８ＮＥＮ９、Ａ６ＮＣＢ３、Ｑ９２８５１、Ｐ３７０５９、Ｑ９６ＲＧ４、Ｃ９ＪＣ３７、Ａ６ＮＤＹ９、Ａ７Ｅ２３４、Ｄ６Ｗ６４６、Ｑ８ＮＣＮ５、Ｑ８６ＷＡ９、Ｅ７ＥＱＦ４、Ｂ０ＹＩＶ３、Ｑ６ＤＴ３７、Ｂ４ＤＨＪ４、Ｂ３ＫＶＥ５、Ｑ８６ＳＥ４、Ｅ２ＱＲＥ６、Ｂ４Ｅ３Ｎ７、Ｂ４ＤＳ４３、Ｂ４ＤＭＥ３、Ｑ５Ｔ５Ｃ０、Ａ６ＰＶＣ２、Ｏ００３７５、Ｑ０ＶＤＦ９、Ｃ９Ｊ１１９、Ｑ６Ｖ０Ｉ７、Ｑ９Ｐ０Ｇ３、Ｐ３０５１８、Ｂ７Ｚ２Ｖ３、Ｐ２５０９０、Ｂ４ＤＵ０９、Ｑ９Ｈ３Ｓ７、Ｑ５ＮＫＵ１、Ａ８ＫＡＰ０、Ｂ０Ｖ３Ｌ８、Ｂ４ＤＲＷ６、Ｐ４７９８９、Ｑ８ＮＣＶ１、Ｑ１３８２３、Ｑ８ＮＡＴ２、Ｑ８Ｎ８８３、Ｂ４ＤＩＭ２、Ｑ９ＮＳ４３、Ｂ２Ｒ６Ｖ９、Ｏ１５３９８、Ｑ５ＶＴＬ７、Ｑ９６Ａ３３、Ａ１Ｘ４Ｐ８、Ｑ７Ｚ５Ｐ９、Ｑ１６２０６、Ｑ２ＴＢ１２、Ｑ８Ｎ７Ｘ０、Ｃ９ＪＭＧ９、Ｑ８Ｎ４Ｃ９、Ａ６Ｈ８Ｘ９、Ｑ４Ｇ１１５、Ｂ４ＤＵＧ９、Ｑ６ＺＴ７３、Ｂ０Ｉ１Ｐ６、Ｑ１５７６１、Ｄ３ＤＴＰ５、Ｂ０Ｉ４Ｘ４、Ｑ５９ＧＤ４、Ａ２Ａ２Ｙ４、Ｂ２ＲＤＹ３、Ｂ５ＭＣＨ９、Ｐ２２７３６、Ｑ０９６６６、Ｂ１ＡＪＺ９、Ｑ４ＶＢ８８、Ｑ１４８２８、Ａ８Ｋ８Ｗ７、Ｑ９６ＲＫ０、Ｑ５９Ｆ０３、Ａ８ＭＴＣ３、Ｂ７Ｚ５４４、Ｂ４ＤＬＲ２、Ｑ８ＮＥＴ４、Ａ２Ａ３Ｃ３、Ｂ４ＤＴＸ１、Ｂ４ＤＤＱ０、Ｑ９Ｐ２１９、Ｑ５ＶＳＴ９、Ｑ１６１８７、Ａ８ＭＶＭ７、Ｂ３ＫＸＦ６、Ｂ９ＴＸ５５、Ｑ４９ＡＪ０、Ｑ８ＮＣＤ３、Ｑ９６ＦＶ９、Ｂ７Ｚ７Ｌ８、Ａ６ＮＣＦ６、Ｑ９ＵＭＵ８、Ｑ５Ｔ１９７、Ｂ４Ｅ３Ｊ９、Ｑ９６ＥＧ１、Ｂ３ＫＵ６０、Ｑ９ＨＣＫ４、Ｑ１５０２７、Ｑ８Ｎ９Ｎ０、Ｂ２ＲＣＣ７、Ｑ９６ＩＦ４、Ｑ５ＶＺＬ５、Ａ２ＢＦ２１、Ｑ８ＩＸ２７、Ｑ１２９６５、Ｅ７ＥＰＫ５、Ｂ１ＡＬ４６、Ｅ７ＥＰＺ１、Ｑ５ＶＵ４３、Ｑ８ＮＡＴ１、Ｑ２ＵＶＦ１、Ｑ９ＵＫＮ７、Ｏ７５１９７、Ｑ０５Ｄ３２、Ｑ９Ｃ０Ｄ５、Ｑ０７１５７、Ｂ４ＤＷＥ９、Ａ６Ｐ４Ｖ４、Ｑ８ＮＧＣ５、Ａ８Ｋ１６９、Ｑ４６１Ｎ２、Ｑ６ＺＳＪ９、Ｅ９ＰＰ００、Ｂ７Ｚ５Ｓ９、Ｂ０Ｌ３Ｐ６、Ｑ０３１６４、Ｑ９６ＡＹ４、Ｑ８ＮＥＹ１、Ｑ２Ｍ２Ａ３、Ｑ１６５１２、Ｂ４ＤＬＺ１、Ｑ８ＩＶＬ１、Ｑ９ＵＨＲ５、Ｑ８６ＸＸ４、Ｃ９ＪＩＰ０、Ｑ５９Ｇ３１、Ｂ４ＤＭ０５、Ｑ８ＮＩ２７、Ｑ２ＵＶＦ０、Ｑ５０４Ｘ９、Ｅ７ＥＶＫ１、Ｑ９６ＰＶ４、Ｑ５９Ｆ９０、Ｂ４ＤＨＱ７、Ａ８Ｋ５Ｗ７、Ｂ７Ｚ２Ｕ６、Ａ８ＫＡＬ５、Ｑ９６Ｑ０４、Ｑ５ＶＴ５２、Ａ８Ｋ８Ｘ０、Ａ８Ｋ６０２、Ｑ８ＩＶＥ３、Ｐ８３１１１、Ｑ７Ｚ７Ｇ８、Ｑ６ＲＡＱ８、Ａ６ＮＫ０３、Ｐ５１８４３、Ｑ５ＸＧ７９、Ａ８Ｋ５Ｕ８、Ｂ７Ｚ２１７、Ｂ３ＫＳＲ７、Ｂ４ＤＬＡ５、Ｂ４ＤＳ８０、Ｑ０８ＡＤ１、Ｂ２ＲＴＱ６、Ｅ７ＥＭＦ０、Ｅ７ＥＰＺ７、Ｂ９ＥＧＲ０、Ａ３ＫＮ８３、Ｑ１３３９５、Ｑ８ＷＸＩ７、Ｐ２０９２９、Ｑ８ＴＦ４６、Ｑ６ＰＩＡ２、Ｂ４ＤＨＮ９、Ｏ９５３９６、Ｑ１２９５５、Ｅ７ＥＳＤ２、Ｑ７Ｚ３Ｃ９、Ｑ６ＺＶＬ６、Ｑ８ＩＺＪ３、Ｑ９ＨＢ００、Ｂ４Ｅ０Ｈ３、Ｂ４ＤＲＲ２、Ｑ６ＮＶ７４、Ｃ９ＪＸＨ６、Ｅ７ＥＷＮ３、Ａ６ＮＪ８８、Ｂ７Ｚ４Ｊ０、Ｑ０９４７２、Ｂ３Ｖ８Ｓ３、Ｑ７Ｚ４Ｆ１、Ｑ８ＮＤ９９、Ｂ７Ｚ８Ｌ０、Ｂ４ＤＦ４８、Ａ、６ＮＩＢ１、Ｑ１３３１５、Ｑ１４５１７、Ｂ４ＤＨＤ６、Ｂ５ＭＤＱ０、Ｂ４ＤＤＲ２、Ｄ２ＪＹＨ６、Ｑ９ＵＥＦ７、Ｏ６０２３７、Ａ５Ｄ８Ｚ７、Ｂ７Ｚ６４６、Ｑ９ＢＺＶ３、Ｑ０６２７８、
Ｅ９ＰＧＹ５、Ａ６ＮＥＳ４、Ｑ４ＬＥ６１、Ｑ９６Ｍ８９、Ｑ５９ＥＺ３、Ｂ３ＫＶ５６、Ｃ９ＪＡＡ８、Ｑ５Ｔ８４８、Ｂ３ＫＸ２９、Ｂ４ＤＺＡ３、Ｅ９ＰＢＢ０、Ａ１ＫＺ９２、Ｑ６８ＢＬ７、Ｑ８Ｎ１Ｇ０、Ｐ１２８２１、Ｅ７ＥＲＥ５、Ｑ５ＪＶ７３、Ｑ６８Ｅ１０、Ｐ３５２４０、Ｑ６Ｗ４Ｘ９、Ｂ３ＫＵＹ５、Ｃ９ＪＬＶ４、Ｂ９ＺＶＮ９、Ｅ７ＥＮ６７、Ｑ８ＷＺ４２、Ｂ３ＫＷＵ８、Ｑ９Ｐ２７３、Ｂ４ＤＺＩ８、Ｂ７Ｚ４Ｈ４、Ｐ５４２５３、Ｃ９ＪＰ９８、Ｑ８ＮＦ４５、Ｑ６ＺＮＤ８、Ｅ９ＰＥＬ０、Ｑ９９７１５、Ｑ９６ＱＴ４、Ｂ７Ｚ８７９、Ａ７Ｅ２Ｄ７、Ｂ４Ｅ０４３、Ｑ８ＴＥＫ３、Ｏ４３１５７、Ｂ４Ｅ２Ｑ７、Ｅ７ＥＶＦ２、Ｑ６ＵＵＶ９、Ｏ９５３９３、Ｂ７Ｚ３Ｓ８、Ｄ３ＤＵＵ０、Ｑ９ＵＬＭ３、Ｄ６ＣＨＦ９、Ｐ３９８８０、Ｏ６０２８１、Ｅ７ＥＵＥ６、Ｂ２ＲＵＵ２、Ｐ１２８８２、Ｑ９Ｐ２Ｋ６、Ｑ５ＶＵＡ４、Ｑ５ＪＳＬ３、Ｃ９ＪＭＴ９、Ｄ６Ｗ５Ｓ０、Ｑ５ＩＢＰ５、Ｂ３ＫＸＦ７、Ｐ６３１３６、Ｏ００１８６、Ｃ９ＪＩ４６、Ｑ６ＺＮ９０、Ｑ９Ｙ２Ｑ１、Ｂ５ＢＵＡ４、Ｂ４Ｅ０Ｈ６、Ａ８Ｋ４Ａ８、Ｑ５ＶＺ８９、Ａ８ＭＶＹ７、Ｑ９ＮＲ０９、Ｑ９６ＩＣ２、Ｂ７ＷＰＫ８、Ｑ７Ｚ４７９、Ｑ９Ｃ０Ｄ２、Ｑ９６Ｌ９６、Ｏ６０２８７、Ｃ９Ｊ６Ｗ２、Ｂ７Ｚ６Ｋ４、Ｏ６０３１２、Ｑ６ＺＮＡ５、Ｃ９ＪＬ１４、Ｑ５ＴＢＡ９、Ｐ１０７４５、Ｂ８ＺＺＪ３、Ｑ９６ＫＶ７、Ｃ９ＪＶＪ３、Ｑ０ＶＤＤ８、Ｂ４Ｅ３Ｆ１、Ｃ９ＪＢＮ５、Ｑ６ＮＵＮ７、Ｑ９６ＲＬ７、Ｐ７８３５７、Ｑ４Ｇ０Ｕ５、Ｑ９ＢＱＳ８、Ｅ７ＥＮ９５、Ａ７Ｅ２Ｙ５、Ｂ４ＤＫ６３、Ｑ９ＨＣＭ２、Ａ５ＹＭ７２、Ｐ０Ｃ０９１、Ｐ９８１６０、Ｑ６ＺＮＩ２、Ｂ３ＫＷＵ３、Ｑ５０４Ｑ３、Ａ８ＭＱＶ７、Ｑ９ＵＩＧ０、Ｑ５ＨＹＣ２、Ｂ３ＫＸ５２、Ｏ１５２３０、Ｂ７ＺＬＥ６、Ｑ８ＮＡ７０、Ｑ９Ｙ６Ｒ７、Ｑ１０５７１、Ｑ５Ｔ４Ｓ７、Ｃ０ＪＹＺ１、Ｂ４ＤＳＫ８、Ｑ８ＷＸＨ０、Ｄ６ＲＧＶ７、Ｑ９ＢＱＧ０、Ｑ７ＬＣ５３、Ｂ７Ｚ３Ｅ３、Ａ６ＮＫＣ６、Ｑ９ＵＦＤ９、Ｂ１ＡＭＧ５、Ｐ３１６２９、Ｑ９ＵＤＲ５、Ｂ４ＤＲＩ７、Ｏ７５０５１、Ｄ３ＤＳＭ４、Ｑ１９Ｒ１８、Ｂ７Ｚ９Ｃ５、Ｑ９Ｙ４９３、Ｅ１Ａ６８９、Ｏ９５７１４、Ｅ７ＥＱＥ３、Ｑ０１１１８、Ｑ１３４７０、Ｑ５ＹＬＢ２、Ｑ９Ｐ２Ｐ６、Ｑ５９Ｈ９３、Ｑ６９ＹＮ４、Ｂ９ＥＧ７０、Ｐ９８０８８、Ｑ８ＮＤＡ２、Ｐ４９６４１、Ｑ９ＮＴＧ１、Ｅ９ＰＤ６６、Ｑ８ＩＶＦ２、Ｑ９ＵＭＺ３、Ｏ７５５９２、Ａ４ＵＧＲ９、Ｐ２１８１７、Ｑ５ＴＣＱ９、Ｑ９ＵＬＬ０、Ｂ２ＲＵ２７、Ｏ６０３１８、Ｑ９ＵＩＷ２、Ｐ４２６９４、Ｑ９Ｙ６Ｎ６、Ｅ７ＥＷＰ２、Ｅ９ＰＢＴ７、Ｑ６８ＤＮ１、Ｑ９ＮＺＲ２、Ｑ６ＩＥＨ８、及びＯ７５４４５
【０１６２】
生理食塩水溶液ですすいだ例示的な胎盤由来マトリックス試料は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する１種又は複数のタンパク質を含んでいてもよい：Ｂ４ＤＵＸ０、Ｂ２ＲＤＫ３、Ｂ４Ｅ１Ｕ３、Ｑ６９ＹＬ０、Ａ８ＭＴＣ３、Ｑ９ＵＬ３２、Ｑ９ＵＩＷ０、Ｅ５ＲＫ９６、Ｑ９ＵＮＹ４、Ｂ３ＫＳ９９、Ｅ７ＥＰＺ１、Ｑ５Ｔ２０５、Ｂ２ＲＣＨ０、Ｅ９ＰＪＬ５、Ｑ８６Ｗ２８、Ｅ７ＥＰＣ３、Ｅ７ＥＶＳ９、Ｑ９ＵＰＸ８、Ｑ７Ｚ７Ｇ８、Ｏ７５４１７、Ｑ７Ｚ５Ｐ９、Ａ１Ｌ３Ａ３、Ｂ７Ｚ３８７、Ｃ９Ｊ０６６、Ｏ１４９１０、Ｑ９６ＥＮ８、Ｑ２９９８８、Ｑ６ＹＨＵ３、Ａ０Ｎ４Ｖ７、Ｑ９Ｈ２Ａ３、Ｑ０２９５２、Ａ６ＮＨＭ９、Ｂ７ＺＬＭ６、Ｂ４Ｅ０１５、Ｐ５８１０７、Ｑ９ＨＣＬ０、Ｃ９ＪＴＩ１、Ｃ９ＪＺ００、Ｐ５５１９８、Ｑ９ＵＢＣ２、Ｃ９ＪＩ５２、Ｂ４ＤＶＲ２、Ｑ９Ｙ６Ｘ７、Ｑ９６ＮＧ３、Ｑ８ＮＥＴ４、Ｃ９ＪＶＴ２、Ｂ４ＤＬ５５、Ｑ５Ｔ９Ｓ２、Ｏ７５９６２、Ｅ７ＥＰＤ１、Ｑ０７３４３、Ｑ９ＵＰ９１、Ｅ０Ｘ０８４、Ｑ８ＮＦＵ７、Ｑ９６ＫＣ８、Ｃ９ＪＭＭ２、Ｑ９ＮＶＥ４、Ｑ６ＡＷ８３、Ｂ４Ｅ０Ｄ３、Ａ８Ｋ６Ａ６、Ｅ９ＰＪＴ０、Ｑ８ＮＦ２１、Ｐ４９７９２、Ｅ９ＰＢＴ７、Ｑ９６Ｐ０３、Ｑ９ＵＥＹ４、Ａ７Ｅ２２８、Ｑ３０８Ｍ６、Ｐ０８１２３、Ｑ８ＮＢ１４、Ｑ６ＺＮ１４、Ｑ９Ｈ４Ｍ７、Ｑ９ＵＦ８３、Ｑ８ＷＸＨ０、Ｑ８Ｎ３Ｓ３、Ｑ４ＬＥ４３、Ｑ８ＷＹＰ５、Ｅ７ＥＵＶ３、Ｑ８ＩＹＢ３、Ｏ１５０３４、Ｑ０ＶＦ９９、Ｑ５９ＧＧ３、Ｐ２２６７６、Ｏ９５３９６、Ａ６ＮＬ４６、Ｂ４ＤＰ１３、Ｑ９ＵＱ３５、Ｄ６ＲＡ６７、Ｑ５ＴＢ９３、Ｂ４ＤＺ５８、Ｏ６０３８２、Ｑ１２９５５、Ｑ９ＵＬＩ３、Ｑ９ＵＨＲ５、Ｏ９５３９３、Ｑ３２ＭＭ９、Ｑ６８ＤＥ３、Ｑ６ＺＱＹ３、Ｄ６ＲＣＤ０、Ａ８Ｋ１Ｔ０、Ｑ１４ＤＥ１、Ｑ５ＶＶＰ１、Ｑ３０ＫＱ９、Ｑ９Ｙ５Ｇ７、Ｑ７Ｚ４Ｙ３、Ｑ１２８４５、Ｐ０５９９７、Ｑ１４８３９、Ｂ１ＡＱＫ６、Ｑ６Ｐ３８７、Ｑ０ＶＡＢ１、Ａ８ＭＲＴ１、Ｂ４Ｅ２Ｇ５、Ｄ３ＤＳ９１、Ｐ０２４６１、Ａ８Ｋ６７０、Ｑ６ＵＸＹ１、Ｂ３ＫＶ７３、Ｐ１２１０９、Ｑ８ＩＷＸ８、Ｄ３ＤＵＪ０、Ｑ９ＵＫＸ３、Ｑ５ＶＴＲ２、Ａ６ＮＮＫ５、Ｑ１５６９９、Ｑ９Ｈ６Ａ９、Ｂ７Ｚ４Ｓ６、Ｄ６Ｒ９Ｎ８、Ｑ８ＷＸＩ７、Ｑ２ＴＡＩ４、Ｂ２ＲＴＴ４、Ａ５ＰＬ２０、Ｑ９ＮＵ２２、Ｑ９２６１５、Ｏ００４４４、Ａ４Ｄ２０９、Ａ７Ｅ２３４、Ｑ６ＰＨＲ２、Ｑ５ＳＸＸ８、Ａ８Ｋ５８６、Ｂ２ＲＢＭ１、Ｑ１３３１５、Ｑ９ＵＬＨ０、Ｐ３５５２７、Ｂ４Ｅ０Ｍ７、Ｑ６ＺＳＪ９、Ｂ９ＺＶＰ８、Ｄ３ＤＮＣ２、Ａ８ＫＡ０５、Ｏ１４７１５、Ｂ４ＤＴＵ７、Ｄ３ＤＳＹ９、Ｑ９ＢＺＣ７、Ｑ８ＮＥＱ５、Ｑ１４５１７、Ｅ９ＰＦＲ５、Ｑ９６ＬＭ６、Ｑ９ＮＲ０９、Ｑ９ＢＲＦ８、Ｑ６ＰＧＰ７、Ｂ４ＤＨＫ０、Ｑ５９ＨＢ８、Ｑ２ＴＢ１２、Ｏ７５５９２、Ｐ２５３９１、Ｃ９Ｊ５Ｒ８、Ｑ７１Ｆ７８、Ｑ７１ＲＤ０、Ｑ１３８６３、Ｑ１４５７３、Ｃ９Ｊ１Ｊ２、Ｑ９ＵＬＧ１、Ｅ９ＰＤＮ５、Ｑ９ＵＤＹ２、Ｅ９ＰＢ９２、Ｑ９ＮＵＧ４、Ｑ８ＷＵＧ５、Ｂ７ＺＬＥ６、Ｂ３ＫＭＳ０、Ａ８Ｋ５Ｅ６、Ｂ３ＫＸＭ５、Ｑ８ＩＷＰ４、Ｂ４ＤＭＡ７、Ａ０ＦＧＲ８、Ｑ９Ｈ１Ｈ９、Ｑ９Ｃ０Ｄ５、Ｂ４Ｅ３５４、Ｃ９Ｊ８Ｐ９、Ｑ９Ｙ６Ｎ６、Ａ８Ｋ４Ａ８、Ｂ３ＫＳＹ６、Ｄ３ＤＴＸ７、Ｏ６０２３７、Ｑ９ＮＳＹ１、Ｑ８ＴＤＷ７、Ｅ７ＥＷＡ１、Ｑ９６ＲＫ０、Ｑ６Ｙ８８１、Ｂ３ＫＷ４７、Ｑ８６Ｙ９１、Ｑ９ＮＴ６８、Ｅ７ＥＱＥ６、Ｑ６ＺＮＣ４、Ｐ０４２７５、Ｏ６０２８１、Ｏ００５５５、Ｐ０２４５２、Ｏ００３６８、Ｑ９６Ａ３３、Ｑ９ＵＧ０１、Ｏ１５５１６、Ｑ９６ＭＹ７、Ａ８Ｋ８Ｎ１、Ｂ３ＫＰ３２、Ｏ７５０５４、Ｂ４ＤＺＬ６、Ｐ１３６８６、Ｑ４ＫＮ０４、Ｐ０Ｃ０９１、Ｅ７ＥＮＮ３、Ｃ９ＪＥ６５、Ｏ９４９８６、Ｏ９４９９３、Ｂ４Ｅ１Ｔ５、Ｑ５ＪＳＧ７、Ｑ８ＴＦ０９、Ｅ７ＥＰＪ５、Ｄ３ＤＲＡ２、Ｅ７ＥＲ６０、Ｑ６８Ｄ６７、Ｂ７ＷＮＲ１、Ｂ４ＤＸ９１、Ｑ６ＡＩ０２、Ａ６ＮＧＱ３、Ｅ５ＲＪＡ７、Ｂ７Ｚ５Ｉ８、Ｑ９ＵＬＪ７、Ｂ７Ｚ５Ｈ７、Ｑ４ＺＧ２０、Ｂ７Ｚ７Ｙ５、Ｂ３ＫＵＶ３、Ｑ５ＶＶＤ７、Ｑ１３００９、Ｂ１ＡＲＭ６、Ａ８ＭＵＵ９、Ｂ４ＤＵＣ２、Ｑ９ＵＧＩ６、Ｑ６ＸＹＳ１、Ｑ９ＵＢＦ８、Ｑ０８ＡＬ８、Ｃ９ＪＬＢ７、Ｂ２ＲＡＨ２、Ｂ７Ｚ７５８、Ａ８Ｋ３３７、Ｑ８ＴＢＹ９、Ｃ９ＷＥＱ４、Ｑ９ＵＬＤ２、Ｑ１３０４６、Ｐ２０９３０、Ｂ０Ｉ１Ｓ０、Ｃ９ＪＰ９８、Ｏ１５２１３、Ｅ７ＥＮＬ６、Ｑ９ＮＲ９９、Ａ２ＢＤＫ６、Ｐ１６６６２、Ｑ６ＳＴＥ５、Ｑ６８Ｄ３９、Ｑ９ＵＫＺ４、Ａ８Ｋ８Ｐ１、Ｂ４Ｅ３Ｖ７、Ｑ９ＢＴＣ０、Ｃ９ＪＡＢ１、Ｐ７８３６３、Ｏ６０２８７、Ｅ９ＰＨ４４、Ｑ６Ｐ４Ｇ０、Ｑ８ＷＶＸ５、Ｃ９ＪＶ６４、Ｑ０８ＡＥ８、Ｑ８６ＸＥ３、Ｂ４ＤＴＴ９、Ｅ９ＰＦＱ４、Ｑ５９ＦＹ１、Ａ８ＭＵ０１、Ａ８Ｋ０Ｂ９、Ｑ９ＮＳＭ０、Ａ６ＮＫ２４、Ｃ９ＪＺＢ０、Ｂ５ＭＤＬ６、Ｑ５ＣＺＣ０、Ｑ９ＮＰＧ４、Ａ０ＡＵＨ１、Ｏ１４９３６、Ａ４Ｄ１９８、Ｏ６０７７４、Ｑ９ＮＸＣ５、Ｄ２ＩＹＫ５、Ｂ９ＥＧＲ５、Ｑ５９ＥＺ１、Ｑ９ＨＣＵ４、Ｑ９６ＪＮ８、Ａ８ＭＵ９９、Ｄ６ＲＣＭ８、Ｑ８Ｎ１Ｅ８、Ｑ９Ｃ０Ｇ６、Ａ５ＹＫＫ６、Ｑ９６ＥＲ９、Ｑ５ＪＶＴ２、Ｄ３ＤＳＵ３、Ｂ４ＤＪ２７、Ｑ９６ＢＴ１、Ｆ１Ｂ７Ｃ４、Ｐ２０９２９、Ｐ１５９２４、Ｑ９６ＧＤ７、Ｏ１５２４５、Ａ４Ｄ１Ｅ１、Ａ８Ｋ６０４、Ｑ６ＺＳＺ５、Ｏ４３１５７、Ｑ９ＮＱＵ５、Ｑ９ＢＳ９２、Ｑ６Ｐ０Ｑ８、Ｑ９Ｙ６Ｒ３、Ｑ９ＵＬＨ７、Ｑ８ＴＢＷ１、Ｂ３ＫＷ３６、Ｂ３ＦＬ７０、Ｂ０Ｉ１Ｔ１、Ｂ４Ｅ２Ｕ２、Ａ２ＲＵＵ９、Ｅ９ＰＮＥ２、Ｑ９ＮＳＩ６、Ｑ９Ｃ０Ａ１、Ｑ９６Ｑ１５、Ｂ７ＷＮＵ６、Ｂ４ＤＭＷ６、Ｂ７ＺＭ８６、Ａ４Ｄ２１２、Ｑ６５９Ｄ１、Ｑ９６ＤＣ９、Ｑ９Ｙ４Ｂ６、Ａ３ＫＮ８３、Ｂ４ＤＦ１５、Ｅ７ＥＰＱ３、Ｂ７ＺＬＷ５、Ｐ２１８１７、Ｅ７ＥＱＥ３、Ｑ８６Ｖ４０、Ｑ１４１３９、Ｑ９６ＭＥ４、Ｐ０２７５１、Ｑ６ＭＺＭ７、Ｑ９Ｐ０Ｘ４、Ａ４Ｄ０Ｑ３、Ｑ９ＨＣＪ３、Ｂ３ＫＲＳ１、Ｏ１４７０９、Ｑ９Ｈ７Ｄ０、Ｑ０８ＡＭ８、Ｂ４ＤＪＧ３、Ｃ９Ｊ３Ｋ０、Ｑ８ＷＶＤ３、Ｑ９Ｈ４Ｅ３、Ｂ４ＤＱＪ６、Ｑ６ＺＵ６５、Ｂ７ＺＭＪ０、Ａ６ＰＶＫ７、Ｏ１４６８６、Ｂ４ＤＮＩ０、Ｂ７ＷＰ０６、Ｑ８ＩＶＬ１、Ｂ３ＫＰＨ８、Ｑ５３ＧＡ０、Ｑ２ＴＡＺ０、Ｅ９ＰＥ７１、Ｑ６ＩＰＴ２、Ｅ２ＱＲＪ１、Ｂ３ＫＵＢ１、Ｏ６０４４７、Ｑ８ＩＷＵ２、Ｃ９ＪＸＨ６、Ｏ６０２９３、Ｑ６ＹＨＫ３、Ａ６ＮＫ８９、Ａ６ＮＪＢ７、Ｑ５ＴＦ０２、Ｏ６０６７１、Ｑ５Ｗ０２６、Ｑ４ＡＣ９４、Ｑ４Ｇ１Ａ２、Ａ８Ｋ９Ｉ５、Ｑ９Ｙ２Ｆ５、Ｐ１６１１８、Ｑ９Ｐ２２５、Ｃ９Ｊ２Ｙ８、Ｑ１４８６５、Ｑ５９ＥＥ７、Ｄ６ＲＦＺ９、Ｑ９６Ｋ３０、Ｑ４ＺＨＧ４、Ｑ１４９９３、Ｑ５ＴＺＡ２、Ｑ９ＵＰＪ０、Ｏ６０６７３、Ｂ４ＤＹＫ２、Ｐ５４７５６、Ｅ９ＰＡＶ３、Ｑ９ＢＺ２３、Ｑ６ＺＱＱ６、Ｂ４ＤＺＶ０、Ｄ２ＪＹＨ６、Ｏ７５４４５、Ｐ１２７５５、Ｄ３ＤＸ７０、Ｑ８Ｎ８Ｈ１、Ｂ４ＤＲＷ８、Ｑ１５１１３、Ｐ２９３２２、Ｂ４ＤＨＪ４、Ｐ２２７９２、Ｐ５２１７９、Ｑ５Ｗ０Ｃ６、Ａ６ＮＫＣ６、Ｑ６ＵＷＥ０、Ｑ９ＵＱＣ９、Ｄ１ＣＳ６８、Ｑ５Ｔ４４０、Ｂ３ＫＷ７２、Ｑ９ＵＰＡ５、Ｐ０４２６４、Ｑ８Ｎ９Ｂ５、Ｂ４ＤＮＤ４、Ｂ４ＤＮＢ０、Ａ８ＫＡ１６、Ｐ６３１３６、Ｑ４６０Ｎ５、Ａ８Ｋ６Ｖ７、Ｑ９６Ｔ５８、Ｂ４Ｅ０Ｈ３、Ｑ９２８０５、Ｂ２ＲＮＢ１、Ｂ５ＭＣＨ９、Ｅ９ＰＥＢ７、Ｐ２１６７５、Ｑ９ＵＩＧ０、Ｑ６８ＤＭ７、Ｑ９Ｙ４Ｇ６、Ｑ５ＳＹＢ０、Ｐ５３６７５、Ｏ９４９２７、Ｑ９２６２１、Ｅ７ＥＸ２０、Ｂ５ＭＣ１７、Ｑ９ＢＹＷ２、Ｃ９Ｊ６Ｐ４、Ｏ１５０６１、Ｑ９Ｐ２Ｐ６、Ｃ４Ｂ７Ｍ２、Ｑ６８Ｄ６９、Ｐ２３４７１、Ｑ５９ＧＥ５、Ｂ４ＤＩＷ８、Ａ８Ｋ９７９、Ｐ０６７２７、Ｏ１４６７２、Ｑ９ＢＲＸ５、Ｅ７ＥＱ８４、Ｑ９ＢＸＬ７、Ｐ４６０１３、Ｐ０１７０１、Ａ８Ｋ８Ｃ２、Ｏ７５９３４、Ｐ３９８８０、Ｑ１４７８９、Ｂ４Ｅ２Ｑ６、Ｅ７ＥＰＹ７、Ｐ１１６７８、Ｂ５ＭＤＴ７、Ｅ９ＰＭＺ５、Ｑ９６Ｄ６０、Ｑ９ＵＬＢ１、Ｑ６ＷＧ７３、Ｑ５９ＦＩ２、Ｂ４ＤＭ１７、Ｐ３５６５８、Ｐ５６７０３、Ｅ５ＲＪＨ９、Ａ８ＭＰＹ４、Ｂ４ＤＹＱ３、Ａ８Ｋ６Ｘ０、Ａ５ＹＭ５１、Ｂ３ＫＴＢ６、Ｐ２３２８４、Ｂ３ＫＵ９７、Ｑ５Ｔ１Ｍ５、Ｑ６ＰＪ２５、Ｑ８ＩＶＴ４、Ａ８Ｋ３Ｉ３、Ｐ０Ｃ７Ｎ８、Ｂ５Ｍ４４９、Ｂ７ＺＭ７８、Ｑ８Ｎ２Ｃ７、Ｑ８ＴＥＵ７、Ｑ６Ｖ０Ｉ７、Ａ６ＮＧ７４、Ｑ９６ＢＡ７、Ｑ９６ＰＫ６、Ｑ８ＮＢＺ０、Ｑ７Ｚ３Ｄ４、Ｃ９Ｊ６Ｗ２、Ｑ１３０８５、Ｑ５３ＥＹ８、Ｑ９６ＡＶ８、Ｅ９ＰＧＮ６、Ｑ９ＮＸＬ９、Ｑ０ＶＧ５５、Ｑ５ＲＫＶ４、Ａ６ＮＥＳ４、Ｑ１２８３０、Ｑ６ＺＴＦ９、Ｂ４Ｅ３Ｓ８、Ｑ９Ｈ９３０、Ｂ２ＲＡＩ２、Ｑ４ＦＤ３７、Ａ２ＶＣＴ８、Ａ６ＮＧＧ８、Ｑ９ＮＲＪ４、Ｑ９Ｙ５Ｊ５、Ｑ５Ｔ１Ｂ０、Ｑ８ＩＶ３２、Ｑ９９９６８、Ｂ３ＫＷＨ７、Ｐ５７０５８、Ｂ４ＤＩＸ５、Ｅ７ＥＶＶ２、Ｂ２ＲＤＮ４、Ａ８Ｋ０２４、Ｑ１４３１５、Ｑ１５１４９、Ｑ５ＴＣＵ６、Ｄ６ＲＧＧ３、Ｑ６ＮＸ５５、Ｅ９ＰＪＰ２、Ｑ１５７５１、Ｑ８６ＵＢ９、Ｑ９９４１９、Ａ６ＮＪ１１、Ｏ１５０２０、Ｑ８Ｎ３Ｋ９、Ｑ６Ｘ４Ｔ０、Ｂ４ＤＧ７２、Ｑ４９ＡＪ０、Ｂ４ＤＱ３９、Ｐ０ＣＧ４２、Ｂ４Ｅ２Ｄ６、Ｑ１２７６８、Ｑ８ＩＺＡ３、Ｑ６ＺＮＶ４、Ｑ９Ｈ６Ｒ３、Ｑ９ＢＶＲ０、Ｑ９ＢＸＡ６、Ｂ７ＺＬ０７、Ｑ９ＵＭＮ６、Ｑ８Ｎ３０７、Ｑ８ＮＤＵ６、Ｑ６ＺＲＴ１、Ｃ９ＪＷＰ３、Ｑ９Ｐ２Ｓ６、Ｂ７Ｚ４Ｃ４、Ａ６Ｈ８Ｗ６、Ｑ５ＳＮＶ９、Ｑ９６Ｑ０６、Ｂ１Ｎ９４９、Ｑ９Ｐ０９６、Ｅ９ＰＢ７０、Ｑ８ＮＨＱ９、Ｑ９ＨＢＷ１、Ｏ７５０９５、Ｂ４ＤＤＸ２、Ｐ６０００８、Ｑ６８ＤＫ７、Ｏ９５７１４、Ｂ４ＤＺ１５、Ｑ６９ＹＮ４、Ｂ３ＫＭＢ１、Ｑ６ＺＷＧ８、Ｂ７ＺＷ０５、Ｂ１ＡＬＭ３、Ｑ５Ｙ１９０、Ａ８ＭＵＴ５、Ｂ７Ｚ３Ｖ７、Ｏ７５９４９、Ｏ１５２９４、Ｂ４ＤＷＤ２、Ｐ１３６４５、Ｅ２ＱＲＫ８、Ｑ７０Ｊ９９、Ｑ７Ｚ３Ｒ０、Ｐ４７９７２、Ａ２ＢＤＦ５、Ｑ０Ｐ６７０、Ｑ９ＢＵＭ６、Ｂ３ＫＶＶ６、Ｑ９６Ｓ５９、Ｅ２ＱＲＦ０、Ｂ７Ｚ５Ｒ７、Ｅ９ＰＨ９４、Ｑ９ＨＢＡ０、Ｑ５ＶＸＴ８、Ｑ８ＮＥＹ２、Ｂ５Ａ９５２、Ｂ５Ａ９６８、Ｂ３ＫＸＤ７、Ｑ５Ｔ６７０、Ｑ５９ＧＹ９、Ｄ６ＲＤＧ０、Ｑ９ＵＧＪ１、Ｂ４ＤＦ３５、Ｂ７Ｚ１Ｍ３、Ｑ９ＢＳＤ０、Ａ６ＮＬＵ２、Ｄ３ＤＶＤ８、Ｑ１４１２６、Ｅ１Ｐ５４６、Ｑ６ＰＧＮ９、Ｑ５９ＧＳ５、Ｑ１４６９０、Ａ６ＮＭＺ７、Ｏ７５３７６、Ｑ８Ｎ８０８、Ｂ４ＤＹＨ２、Ｑ６ＵＸ４１、Ｐ００７４８、Ｑ０ＶＤＤ８、Ｂ４ＤＶＱ２、Ｑ８ＩＵ６２、Ｄ３ＤＳ１５、Ｑ９９８５５、Ｅ９ＰＡＪ９、Ｂ４ＤＲ５６、Ｐ４７９０１、Ｑ９Ｈ４７９、Ａ８ＴＸ７０、Ｂ１ＡＰＳ８、Ｐ２２６７０、Ｄ６ＲＤＩ８、Ｄ６ＲＣ６１、Ｑ８Ｎ５Ｃ８、Ｑ５３Ｇ４１、Ｂ４ＤＧＲ３、Ｃ９Ｊ１２０、Ｑ９ＵＱＣ２、Ｂ４ＤＺＥ６、Ｑ９Ｙ６Ｄ９、Ｑ５ＨＹＬ４、Ｃ０ＪＹＹ２、Ｑ１２８６０、Ｅ７ＥＳＫ８、Ｑ８ＮＦＹ９、Ｂ７Ｚ８Ｒ９、Ｑ７６ＬＸ８、Ｑ６Ｔ７７４、Ａ９ＪＲ７２、Ｑ９Ｐ２Ｈ５、Ｑ１４７５４、Ｑ７１１Ｑ０、Ｐ１２８８２、Ｑ８ＮＨ９４、Ｑ１５０５８、Ｐ７８５０９、Ｑ９Ｙ２Ｉ７、Ｑ５６９Ｊ４、Ｃ９Ｋ００２、Ｑ５３ＳＦ７、Ｑ８ＮＦＺ４、Ｑ５Ｔ４５０、Ｏ９５６０２、Ｂ４ＤＹＶ１、Ｑ８ＴＥＫ３、Ｂ４Ｅ３Ｅ１、Ｂ４Ｅ３８６、Ｑ８ＩＹＡ７、Ｑ９９４９０、Ｑ６Ｎ０２１、Ｐ３２４１８、Ｑ９Ｐ０Ｋ０、Ｃ９Ｋ０Ｈ８、Ｂ７ＺＣＡ０、Ｑ１４１１８、Ｂ４ＤＫＰ８、Ｐ１８４６３、Ｑ８ＩＺ２０、Ｐ０Ｃ６２９、Ａ１Ｌ４Ｋ１、Ｑ８ＮＡ９０、Ｑ９Ｃ０Ｆ０、Ｑ５ＴＨＪ４、Ｑ０１１１８、Ｑ８ＮＦ８２、Ｑ５ＴＣＱ３、Ｅ５ＲＩ６１、Ｅ９ＰＥＡ３、Ｄ３ＤＶＬ８、Ｄ３ＤＵＪ６、Ｂ４ＤＱ４４、Ｑ１５０５３、Ｅ７ＥＵＭ８、Ｑ９６Ａ４６、Ｑ９ＮＺＰ６、Ｑ０８Ｅ８６、Ａ８Ｋ１３４、Ｂ４Ｅ３Ｖ４、Ｂ７ＳＦＤ２、Ａ８ＭＶＭ７、Ａ８Ｋ６Ｄ４、Ｑ９６ＰＢ７、Ｑ５ＪＰＦ３、Ｂ３ＫＷＷ４、Ｑ３２Ｍ４７、Ｑ９２
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Ｎ０、Ｑ１３９４６、Ｐ１６４７３、Ｏ７５４７５、Ｑ９２５３９、Ｑ９６ＮＩ６、Ｑ９ＵＮＸ４、Ａ８Ｋ８Ｒ５、Ｑ８ＩＶＦ１、Ｑ８ＴＤＳ７、Ｑ１ＲＭＣ９、Ｑ９ＵＨＧ０、Ｑ９ＢＺ６８、Ｂ７Ｚ６１１、Ａ８ＭＱ７２、Ｑ５Ｔ７Ｑ５、Ｂ４ＤＩ０９、Ｂ２ＲＤＹ３、Ｄ６ＲＩＡ３、Ｑ０１８０４、Ｏ９５８１７、Ｂ７Ｚ１Ｑ８、Ｂ５ＭＤＤ８、Ｑ８６ＴＶ２、Ｑ６ＺＲＣ１、Ｐ０３９９９、Ｂ４ＤＫＨ１、Ｃ９ＪＣＨ２、Ｅ７ＥＴＡ２、Ｂ３ＫＰＷ１、Ｑ９ＵＮ７５、Ｑ６ＩＡ１７、Ｅ９ＰＨ２１、Ｑ９ＵＧＴ４、Ｑ８６Ｖ４８、Ｂ４ＤＲ９７、Ｐ１１０２１、Ｑ１７ＲＰ２、Ｑ０５ＣＵ２、Ｑ６ＰＩＡ２、Ｅ９ＰＰＬ０、Ｂ４ＤＷＳ６、Ｑ０ＶＦ９６、Ｑ１４００８、Ｂ３ＫＰＦ６、Ｅ９ＰＨＸ５、Ｄ３ＹＨＭ４、Ａ８Ｋ７Ｙ８、Ｐ４９７３６、Ｅ９ＰＪ７６、Ｂ２Ｒ８Ｑ２、Ｄ６ＲＦＫ８、Ｑ５ＩＲＮ２、Ｑ５９ＦＰ３、Ｑ９ＵＪＸ１、Ｑ８ＮＥＺ４、Ｂ４ＤＲＦ４、Ｏ００７６３、Ａ６ＮＦＥ０、Ｃ９ＪＴＡ７、Ｑ６ＮＵＳ１、Ｑ９ＨＣＤ５、Ｑ５ＪＰＴ５、Ｑ５９ＧＬ７、Ｂ４ＤＳＲ９、Ａ８Ｋ６１５、Ｑ８ＴＣＪ２、Ｂ３ＫＮＭ６、Ｂ４ＤＹＢ４、Ｑ６ＺＭＮ３、Ｂ４ＤＷＮ８、Ｑ９Ｙ５７６、Ｂ４ＤＴ６５、Ｑ９ＢＱＳ８、Ｃ４ＷＹＨ４、Ｑ５Ｔ５Ｐ２、Ｐ５８３０４、Ｑ６ＩＦＩ９、Ｏ９５７８９、Ａ０ＡＶＩ５、Ｑ９ＮＶＶ９、Ｂ４ＤＫ０２、Ｑ６ＺＶＴ６、Ｑ９６９Ｆ２、Ａ５Ｄ８Ｗ１、Ｑ８ＮＦＴ６、Ｂ７ＷＮＬ６、Ｑ７Ｚ５５４、Ｅ９ＰＧＮ２、Ｏ６０６６９、Ｑ５６９Ｉ７、Ｑ４９４Ｖ５、Ｑ１５１４２、Ｂ０ＵＺ１１、Ｑ５ＪＴＡ５、Ｂ４ＤＭＥ９、Ｂ７Ｚ６Ｎ７、Ｑ９Ｐ２Ｋ６、Ｑ８６Ｖ３５、Ｑ９ＨＣ１０、Ｑ８Ｎ９Ｎ０、Ｂ４ＤＥＡ６、Ｑ８６Ｕ９０、Ｑ３ＳＸＹ７、Ｑ９６Ｇ７４、Ｂ７Ｚ９Ｃ５、Ｂ３ＬＥＵ８、Ｐ５３４２０、Ｑ９ＢＴ５７、Ｂ４Ｅ０Ｖ１、Ｑ９ＮＰＧ３、Ｃ９ＪＳＣ３、Ｅ７ＥＶＡ０、Ｂ７ＺＬ６９、Ｑ９ＵＦＤ９、Ｃ９ＪＧ５８、Ｂ３ＫＷＢ５、Ｑ９ＨＣＥ６、Ｂ４Ｅ２Ｗ６、Ｑ５Ｔ８Ｒ８、Ｑ８ＮＣＵ４、Ｑ９６ＪＸ３、Ｑ９ＨＣＵ０、Ｑ９２９１１、Ｑ６ＦＧＹ５、Ｏ６０４７８、Ｑ９Ｈ６Ｘ５、Ｑ６ＺＭＴ４、Ｑ９６ＬＡ９、Ｑ８ＮＨＣ１、Ｑ６ＸＰ５０、Ｑ９Ｈ７Ｖ２、Ｑ５ＳＱＩ７、Ｂ４ＤＵＧ９、Ｑ９６ＢＰ３、Ｃ９ＪＧ８７、Ｑ２４ＪＲ０、Ｑ５ＶＳＺ０、Ｐ２０７４９、Ｑ６ＺＰ０１、Ｑ９Ｈ３Ｍ０、Ｃ９ＪＭ７６、Ｑ６Ｐ０Ｍ４、Ｑ０８２６６、Ｑ８ＴＢＢ７、Ｃ９ＪＦＷ８、Ｅ７ＥＰＸ９、Ｑ９６ＪＧ９、Ｐ０５５４６、Ｂ７ＺＭＦ２、Ｂ０ＦＰ４８、Ａ８ＫＡＬ３、Ｑ８ＴＣＪ６、Ａ８ＫＡＭ８、Ｑ６ＰＥＷ０、Ｂ１ＡＰＨ４、Ｂ４ＤＨＩ０、Ｑ８Ｎ７Ｈ９、Ｑ２ＨＸＶ３、Ｏ９５１２５、Ｑ１４３３０、Ｃ９ＪＫ８３、Ｐ５４８２６、Ｑ６６ＧＳ９、Ｑ９６Ａ７３、Ｑ４９ＭＩ３、Ｑ６ＺＴ２１、Ｑ９６Ｂ７７、Ｂ３ＫＷＩ６、Ｐ８３１１１、Ｂ３ＫＱＳ９、Ａ８Ｋ６Ｑ８、Ｑ０Ｐ６Ｄ９、Ｂ４ＤＺＲ３、Ｑ５ＪＷＱ６、Ｑ９Ｙ６Ｋ８、Ｑ４ＶＡＰ１、Ｂ３ＫＲＫ２、Ｑ７ＲＴＵ８、Ｑ８Ｎ４Ｆ４、Ｑ３Ｂ８２０、Ｂ３ＫＮ０２、Ｑ９ＭＹ６３、Ｑ９６ＬＸ７、Ｑ５ＳＲＥ５、Ｑ９ＮＰＨ３、Ｑ９ＵＬＲ０、Ｑ８ＩＶ５３、Ｑ９ＮＲＵ３、Ｑ８Ｎ９Ｗ８、Ｅ９ＰＥＦ０、Ｑ７Ｚ６Ａ７、Ｐ２３６３４、Ｂ４ＤＹＭ６、Ａ５ＰＫＷ４、Ａ６ＮＩＴ３、Ｐ５４２５７、Ｑ８ＴＤ２６、Ｏ１５０３３、Ｂ２Ｒ８Ｄ７、Ｑ９Ｐ２９１、Ｑ９Ｙ４Ｄ８、Ｏ９５６８０、Ｅ７ＥＴＩ５、Ｑ８ＮＧＲ３、Ｂ４ＤＵ１５、Ｑ５Ｔ９８５、Ｑ９６９Ｆ９、Ｑ７０Ｚ４４、Ｂ４ＤＨＪ９、Ｐ２９４７５、Ａ８ＭＳＱ６、Ｑ９ＮＲ４５、Ｑ６ＺＭＵ０、Ｑ１４７２１、Ｂ、７ＺＬＰ５、Ｂ４ＤＰＷ６、Ｐ７８３６７、Ｐ５０５５３、Ｂ７Ｚ５Ｓ９、Ｑ９ＢＸＦ６、Ｑ１７Ｒ８８、Ｑ１４７６７、Ｂ２ＲＣＩ６、Ｄ３ＤＵＡ９、Ｅ９ＰＳ９７、Ｃ９Ｊ０２２、Ｂ４ＤＷ８９、Ｂ３ＫＴＫ９、Ｑ９Ｙ６Ｙ１、Ｑ５ＶＺＹ９、Ｑ７ＲＴＮ０、Ａ７ＢＫＡ４、Ｑ１３５８６、Ｂ４Ｅ１２０、Ｑ８ＷＵＤ６、Ｑ９ＮＷＷ７、Ｑ１４Ｃ８７、Ａ４Ｄ２Ｇ３、Ｅ７ＥＲＴ５、Ｂ４Ｅ２Ｈ７、Ｑ８Ｎ４５０、Ｂ３ＫＸＷ２、Ｑ８ＴＦ６４、Ｑ８Ｎ２Ｇ６、Ｑ０１９５４、Ｂ３ＫＰ７１、Ｂ７Ｚ３Ｖ５、Ｑ９Ｙ２３９、Ｂ４ＤＫ４５、Ｐ５５８９５、Ｂ４ＤＲＢ７、Ｑ９Ｈ９Ｅ３、Ａ８Ｋ０Ｐ８、Ｑ８ＴＣ９２、Ｑ８ＮＤ２３、Ｂ３ＫＰＱ７、Ｐ２２３１４、Ｐ２７９８７、Ｏ６０４８７、Ｑ９ＢＶ１０、Ｃ９Ｊ３Ｖ６、Ｑ２ＱＤ２０、Ｑ５ＳＺＬ２、Ｑ８６ＷＺ０、Ａ８ＭＺＦ０、Ａ０ＰＪＥ２、Ａ５ＹＭ７４、Ｂ４ＤＵ９２、Ｂ４ＤＦ５４、Ｃ９Ｊ４Ｊ４、Ｐ０１０２４、Ｂ７Ｚ２Ｙ２、Ｑ９Ｈ４Ｌ７、Ｂ４Ｅ１８４、Ｑ６Ｎ０９０、Ｑ８ＴＢＦ４、Ｑ８６ＸＸ４、Ｑ９ＢＹＩ３、Ｏ９５１５５、Ｂ３ＫＶＸ６、Ｑ５ＳＹＷ２、Ｑ９ＢＸ６６、Ｑ３ＳＹ７７、Ｑ８ＴＤＭ６、Ｑ８ＮＨＨ１、Ｑ８ＩＹ９２、Ｂ７ＺＬＣ８、Ｑ５ＶＴ９７、Ｑ５ＶＹＶ７、Ｅ９ＰＢＳ６、Ｐ４１５９４、Ｑ５３ＦＪ３、Ｏ１４６５７、Ｂ５ＭＥ６７、Ｂ３ＫＮＺ１、Ｂ４ＤＴＤ３、Ｐ３５５７３、Ｂ４ＤＱＷ４、Ｑ６ＵＵＶ９、Ｂ９Ａ６Ｌ３、Ｂ３ＫＸＸ３、Ｑ９６ＭＣ４、Ｑ２Ｖ２Ｍ９、Ｑ６ＺＮＪ１、Ｂ４ＤＧ２１、Ｏ９４９８８、Ｑ５３Ｆ６５、Ｂ４ＤＲＷ６、Ｂ３ＫＳ４６、Ｑ５３ＲＴ３、Ｑ８ＩＺＭ８、Ｑ１７ＲＥ６、Ｑ５３ＦＸ３、Ｂ７Ｚ４Ｑ９、Ｑ８ＩＶ３９、Ｂ４ＤＴ９３、Ｑ９Ｈ６Ｍ６、Ｂ４Ｅ０Ｆ４、Ｑ２Ｍ３Ｔ９、Ｅ７ＥＷＫ２、Ｂ３ＫＳＡ０、Ｑ５９ＧＤ４、Ｑ９ＵＨ９０、Ｑ８ＩＺＪ３、Ｂ７Ｚ５Ｊ４、Ｑ６ＺＲ０３、Ｑ４ＥＹＭ８、Ｑ８ＩＸＳ２、Ｏ４３３１８、Ｐ３３９０８、Ｑ６ＡＩ５９、Ｂ４ＤＳＮ３、Ｂ４ＤＥＡ４、Ａ１ＫＺ９２、Ｐ２２３０４、Ｂ４ＤＬ８０、Ａ８Ｋ６Ｒ５、Ａ８Ｋ８Ｃ１、Ｑ８ＷＹＴ０、Ｅ７ＥＱＺ２、Ｂ４ＤＦ２７、Ｑ１５６５０、Ｅ９ＰＱＮ２、Ｂ７Ｚ４Ｅ２、Ｑ９ＢＺＦ１、Ｂ３ＫＸ４５、Ｑ０Ｄ２Ｎ５、Ｑ６ＩＣＨ７、Ｑ９６ＦＮ５、Ｑ５Ｈ９Ｑ３、Ｂ４ＤＳ３２、Ｐ４２２６３、Ｑ５３ＴＱ３、Ｑ８Ｎ５Ｓ１、Ｂ３ＫＴＣ９、Ｑ９２９５３、Ｑ５９ＦＰ５、Ｑ５Ｔ３６２、Ｑ５Ｗ０Ｇ０、Ｑ８６ＵＷ８、Ｑ５９Ｇ８０、Ｑ９ＨＢＥ４、Ｑ９ＮＸＹ１、Ｑ６ＤＳＵ６、Ｐ４８３５７、Ｂ４ＤＳ９５、Ｂ２ＲＮＩ９、Ｑ８ＮＧＩ８、Ｑ９Ｃ０Ｄ４、Ｄ６ＲＪＧ０、Ｂ４ＤＵ１８、Ｑ１５２６２、Ｑ１４０２８、Ｑ８Ｎ７Ｘ４、Ｑ６ＶＵ６７、Ｑ９６ＣＨ６、Ａ６ＧＶ７７、Ａ６ＮＣＱ９、Ｑ６ＺＰ８５、Ｐ５１５０８、Ｑ８Ｎ７Ａ７、Ｏ９４８０５、Ｂ３ＫＮＦ９、Ｐ２３３５２、Ｑ８Ｎ５Ｕ０、Ｑ８６ＶＰ３、Ｑ５ＴＹＪ８、Ｐ２６００６、Ｂ５ＭＤＴ１、Ｑ９Ｙ６Ｒ４、Ｅ９ＰＩＣ５、Ｅ５ＲＪＺ３、Ｂ４ＤＦＹ７、Ｂ９ＥＫ５５、Ｂ４ＤＥＹ３、Ａ８Ｋ８Ｚ０、Ｑ９ＵＰ５２、Ｂ９ＥＩＬ８、Ｑ４Ｗ４Ｙ１、Ｑ９ＵＬＤ９、Ｑ８ＴＣＴ３、Ｃ９ＪＵＫ７、Ｑ６Ｍ１Ｂ８、Ｅ７ＥＲＬ４、Ａ８Ｋ９Ｓ１、Ａ５Ｄ８Ｙ４、Ｐ２８０６９、Ｂ４ＤＨ９３、Ｏ４３３０４、Ｑ１７ＲＧ１、Ｑ６ＵＶＫ１、Ｄ３ＤＷＬ９、Ｑ９ＵＢＧ０、Ａ６ＮＫＱ７、Ｂ４ＤＧＴ７、Ａ６ＺＧＦ９、Ｂ３ＫＲＤ４、Ｅ９ＰＦＹ８、Ｑ９ＢＸ９５、Ｑ６Ａ１６３、Ｏ９５４５０、Ｑ９６ＢＨ１、Ｃ９ＪＶＮ５、Ｑ６ＵＸ０７、Ｄ３ＤＲＮ４、Ｏ４３７４９、Ｐ２７８１５、Ｐ４１２５０、Ｑ１４６７７、Ｑ９６ＰＬ２、Ｂ３ＫＵＸ３、Ｂ７Ｚ７４７、Ｂ７Ｚ８３１、Ｑ１３４７４、Ｑ８ＴＤ５７、Ｃ９ＪＪ５４、Ｑ５３ＥＵ２、Ａ８Ｋ５Ｂ８、Ａ７ＬＦＫ７、Ｑ９Ｙ２５０、Ｑ５ＪＷＭ１、Ｑ６ＲＪＶ８、Ｂ２ＲＢ９０、Ｏ９５３５９、Ｂ４ＤＵ２０、Ｑ９ＮＳＢ２、Ｂ２ＲＡＬ３、Ｑ５ＪＳＭ３、Ｂ３ＫＭＣ６、Ｂ３ＫＭＴ１、Ｂ２ＲＣＬ０、Ｐ３２９７１、Ｑ９ＮＺ５６、Ｑ９ＢＺＪ７、Ｂ４ＤＲ５０、Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｑ１４９２９、Ｂ７Ｚ４４５、Ｑ５６Ｐ０３、Ｑ９ＮＲ４８、Ｏ１４９１７、Ｂ４ＤＳＡ８、Ｏ６０３０９、Ｂ４ＤＬＲ８、Ｑ９Ｙ３Ａ２、Ｑ０９４７２、Ｐ１６２９８、Ｑ０８９４５、Ｑ６ＺＵ５２、Ｂ１ＡＬＹ６、Ｑ１３１５１、Ａ８Ｋ２１５、Ｅ９ＬＣＺ２、Ｑ８ＷＸＳ８、Ｑ５ＶＵ９７、Ｏ１４９２６、Ｂ５ＢＵＡ４、Ｐ２６２３２、Ｃ０ＫＷＦ０、Ａ４Ｄ１Ｓ０、Ｑ８ＮＧＣ９、Ｑ７Ｚ４Ｎ２、Ｑ８Ｎ７Ｒ７、Ｃ９ＪＬＶ４、Ｂ４ＤＺＵ９、Ｄ３ＤＮ９７、Ｑ９ＮＳＥ７、Ｑ５ＪＲ５９、Ｂ５ＦＸ４７、Ｑ７Ｌ５７６、Ｂ４Ｅ１Ｎ９、Ｐ０３９８６、Ｂ３ＫＵ９１、Ｑ８ＷＸＰ９、Ｑ６ＵＸＭ１、Ｐ１７０２６、Ｑ０２８４６、Ｂ２Ｒ６０４、Ｑ０５Ｃ４１、Ｂ７Ｚ５Ｌ６、Ｅ９ＰＩＣ８、Ｂ４ＤＩ２３、Ｂ３ＫＵＰ６、Ｑ９６ＰＱ０、Ｏ７５８２８、Ｂ３ＫＴ５８、Ｑ７Ｚ３Ｎ６、Ｑ１２９６５、Ｑ９２５０２、Ｏ７５１５７、Ｂ５ＭＤＱ０、Ｑ９６Ｆ４６、Ｑ１４９Ｎ８、Ｂ４ＤＧＷ１、Ｂ４ＤＬＳ９、Ｑ９６ＡＤ５、Ａ８Ｋ５Ｇ６、Ｅ７ＥＷＷ７、Ｐ５１６９２、Ｐ０１０２３、Ｂ３ＫＴＷ２、Ｑ８Ｎ３４４、Ｂ４ＤＩＭ８、Ｅ７ＥＴ１９、Ｑ７Ｚ２Ｙ８、Ｃ９ＪＵ３４、Ｅ７ＥＵＭ９、Ｃ５ＭＮ９７、Ｑ６ＸＺＢ０、Ｑ９ＮＷＲ８、Ｑ９Ｙ５Ｑ９、Ｑ５ＶＴＴ５、Ｐ１１１３７、Ｂ４ＤＪＴ３、Ｂ４ＤＸ９５、Ｑ９ＵＢＨ６、Ｑ７６Ｇ１９、Ｑ８ＮＥＦ９、Ｑ９ＮＹ７２、Ｐ０Ｃ７Ｕ０、Ａ６ＮＫＢ５、Ｑ９ＢＹＰ７、Ｑ８ＷＷＪ７、Ｑ８ＮＣＮ５、Ｐ７８３５７、Ｑ８ＮＤＨ２、Ｂ７Ｚ７Ｔ２、Ｑ９ＨＢＤ１、Ｅ９ＰＥＪ８、Ｅ２ＲＹＦ６、Ｑ３Ｂ７Ａ３、Ｑ６ＩＳ０１、Ｑ７Ｌ５Ｎ７、Ｑ６ＴＦＬ３、Ｏ４３６４１、Ｐ４５９７４、Ｃ９ＪＮＣ２、Ａ６ＮＬＥ６、Ｑ９Ｃ０Ｅ４、Ｏ７５１３２、Ｑ６ＶＢ８６、Ｃ９ＪＬＦ８、Ｂ４ＤＳＭ３、Ｑ９ＨＢＢ２、Ｂ５ＭＣ００、Ｑ１５８４９、Ｐ４７７３６、Ｑ８ＩＷＹ７、Ｐ３５３９８、Ａ７ＭＤ４８、Ｃ９ＪＧＩ３、Ａ８Ｋ２Ｎ３、Ｐ２２７３６、Ｑ９６９Ｇ３、Ｑ４ＶＣ１０、Ｑ９６ＪＣ４、Ｑ６ＺＲＩ０、Ａ５ＹＭ７２、Ｂ４ＤＺ１９、Ｅ７ＥＲＨ３、Ｄ６Ｒ９０５、Ｑ６ＺＲ０８、Ｅ９ＰＤＩ６、Ａ６ＮＰ６１、Ｑ９ＵＨＶ７、Ｂ４ＤＵ９６、Ｏ９５０６７、Ｂ３ＫＸＡ２、Ｏ１５３９８、Ｑ１４０３２、Ｑ３０４Ｚ４、Ａ２ＶＤＩ６、Ｅ７ＥＶ５２、Ｂ４ＤＵＶ２、Ｑ３０５Ｍ９、Ｂ７Ｚ４Ｕ６、Ｂ３ＫＸ９０、Ｅ９ＰＢ０８、Ｐ７８５５９、Ｑ８ＮＢＥ８、Ｑ９Ｙ２Ｖ３、Ａ８Ｋ１４３、Ｐ０９３２７、Ｑ９Ｐ２Ｇ４、Ｂ７ＺＬＷ７、Ｅ９ＰＧＮ７、Ｐ５０７４８、Ｑ９６ＪＰ２、Ｂ７ＺＬＴ７、Ｑ８６ＵＥ３、Ｑ９Ｙ６Ｘ８、Ｂ４ＤＰＰ５、Ｑ５９Ｅ９９、Ｑ８Ｎ５Ｃ６、Ｐ１０７４５、Ｑ９６Ｋ３７、Ｐ５１８２５、Ｅ７ＥＭ８３、Ｑ１４ＣＮ２、Ｑ６Ｐ９Ｆ７、Ｂ７ＺＬ９０、Ｑ１４７８１、Ｑ９ＵＨＬ４、Ｅ９ＰＩＲ９、Ｂ４ＤＶＧ５、Ｑ５０４Ｑ３、Ｅ７ＥＶＫ０、Ｏ６０３１２、Ａ８Ｋ５Ｄ９、Ａ６ＮＥＬ２、Ｑ９ＵＭＱ４、Ｏ７５１９７、Ｑ５６２Ｅ５、Ｑ５３ＥＶ６、Ｅ７ＥＰＧ６、Ｑ５ＦＷＥ３、Ｐ４９８１５、Ｐ１８１４６、Ｑ８Ｎ３５０、Ｂ４ＤＳＭ６、Ｑ５ＶＺＢ９、Ｑ１３５７６、Ｂ５ＭＥＡ１、Ａ６ＮＬＩ５、Ｑ１６８３２、Ｃ９ＪＳ３３、Ｑ８ＴＤ５５、Ｑ２Ｍ３Ｒ２、Ｂ４ＤＧ５８、Ａ０Ｓ２４４、Ｑ６８ＣＲ７、Ｑ５９Ｈ０５、Ｑ９Ｙ６６２、Ｑ９ＵＥＦ７、Ａ８ＭＵＷ４、Ｑ８６ＵＨ７、Ｑ５ＮＫＵ１、Ｑ５９Ｇ５０、Ｅ７ＥＳ８０、Ｑ６５９Ａ１、Ｅ７ＥＲＦ５、Ｑ９ＵＮ７１、Ｂ２ＲＢ５３、Ｂ９ＥＧＥ４、Ｑ１３０４９、Ｑ３ＬＦＤ５、Ｅ３Ｗ９８０、Ｐ０４１９８、Ｂ４ＤＳＨ５、Ｃ９ＪＴＱ０、Ａ８Ｋ０Ｙ１、Ｃ４Ｐ０９８、Ｄ３ＤＱＭ９、Ｑ２ＶＹ６９、Ｑ９ＮＹＺ６、Ｅ９ＰＡＵ４、Ｑ５３ＥＴ２、Ｂ４ＤＮ１３、Ｐ５９０４４、Ａ８Ｋ５５９、Ｂ４ＤＦ４８、Ｂ４ＤＷＧ１、Ｐ５４３１７、Ｑ９ＢＹＨ２、Ｂ４ＤＬＸ６、Ｃ９Ｊ６Ｕ６、Ｂ４Ｅ０Ｅ９、Ａ８Ｋ２Ｎ０、Ｂ７ＺＭＬ３、Ｂ４ＤＳＸ８、Ｑ６ＤＮ７２、Ｅ９ＰＢＫ０、Ｂ４ＤＧＡ３、Ｐ３０５３０、Ｏ００３７８、Ｑ９Ｈ９Ｌ３、Ｂ３ＫＳＥ７、Ａ８Ｋ２Ｄ２、Ｃ９ＪＨＤ２、Ｑ６ＭＺＷ２、Ｑ７Ｚ３Ｋ９、Ｑ６ＺＮＤ３、Ｂ３ＫＮ６８、Ｑ８Ｎ６Ｑ８、Ｑ９ＮＲＫ６、Ｑ１３９７２、Ｑ０６４８１、Ｑ５ＦＹＡ８、Ｑ６ＺＰＤ８、Ｂ４ＤＲ５９、Ｂ５Ｂ２Ｎ８、Ｂ４Ｅ２Ｈ９、Ｑ８Ｎ６Ｇ６、Ｐ３５５６８、Ｑ１６１８７、Ｏ９５８７６、Ｅ９ＰＣＡ６、Ｑ９ＮＶ５８、Ｃ９Ｊ１Ｅ９、Ｑ５９ＥＸ７、Ｑ８ＴＥ５７、Ｑ６ＡＺＷ６、Ｑ９６Ｑ１１、Ａ５ＹＭ４１、Ｏ４３８５４、Ｑ８ＴＥＦ４、Ｏ１４５２９、Ｂ８ＺＺＪ３、Ｂ３ＫＸＲ０、Ｑ９６ＥＫ５、Ｑ５９Ｈ３０、
Ａ６ＮＫ９７、Ａ８Ｋ６１７、Ｂ４ＤＳＹ１、Ｑ８ＨＷＳ３、Ｑ１３２２４、Ｄ６ＢＺＵ５、Ｑ５ＪＳＬ３、Ｑ６ＵＷＪ１、Ｑ２ＶＰＫ５、Ｂ５ＭＤＶ５、Ｏ６０３４６、Ｃ９ＪＣ３２、Ｂ７Ｚ７Ｅ７、Ａ６ＮＬＱ９、Ｅ７ＥＭＷ７、Ｑ８６Ｘ０６、Ｑ５９ＥＩ２、Ｑ６９ＹＲ０、Ｑ０Ｐ６Ｈ９、Ｑ７Ｚ３５０、Ｑ５ＴＣＱ９、Ｑ８ＴＤＶ５、Ｑ６Ｐ５９７、Ｏ９４８８５、Ｂ３ＫＸＫ２、Ｑ６ＲＩ４５、Ｄ３ＤＰ１２、Ｅ７ＥＰ１２、Ｑ４ＥＷＴ１、Ｃ９ＪＣＮ０、Ｐ３５５７９、Ｑ９６Ｌ５０、Ｅ７ＥＴＹ２、Ｃ９Ｊ１Ｉ５、Ｑ５Ｔ０Ｕ２、Ｑ５３ＴＡ０、Ｐ０Ｃ７Ｔ５、Ａ８Ｋ０Ｅ７、Ｑ６ＺＴ１６、Ｑ８ＩＵＸ６、Ｑ１６７６０、Ｑ８ＮＧＣ５、Ｐ５１５３１、Ｑ１５１４７、Ｑ０８ＥＲ８、Ｃ９ＪＣＣ７、Ｂ３ＫＸＷ８、Ｑ９ＵＫＮ７、Ｐ５１８２８、Ｑ１７ＲＶ３、Ｑ５Ｔ３Ｕ５、Ｑ９Ｃ０９３、Ｂ８ＺＺＸ６、Ｂ５ＭＤ８３、Ｂ４ＤＷＭ４、Ｂ４ＤＦＵ８、Ｏ１５０２７、Ｑ８ＮＨＰ８、Ｑ１４６７８、Ｂ３ＫＮＶ５、Ｑ９Ｙ４Ｄ７、Ｂ４ＤＧＡ８、Ｐ５８３９７、Ｑ０６４１８、Ｑ９６ＭＤ２、Ｑ９Ｐ２Ｋ８、Ｑ６Ｑ７５９、Ｂ３ＫＸ８６、Ｑ６ＵＢ９９、Ｂ７Ｚ７Ｗ１、Ｑ６８ＣＰ０、Ｑ９Ｐ２Ｐ５、Ｂ７Ｚ７Ｙ３、Ｂ２Ｒ５Ｕ１、Ｏ９５２２６、Ｑ５３ＧＸ１、Ｏ７５２９５、Ｑ２ＶＰＡ４、Ａ８ＭＴＰ９、Ｂ０ＱＹ７７、Ｑ９Ｈ３４７、Ｑ８６ＵＫ０、Ｐ７８３６２、Ｑ９ＵＦ７１、Ｑ１４ＤＲ２、Ｏ７６０８１、Ｑ９ＵＫＫ３、Ｂ７Ｚ２１７、Ｑ９６Ｔ８３、Ｑ９Ｈ８１６、Ｅ７ＥＰＢ６、Ｑ５ＳＸＭ２、Ｏ７５３６６、Ｑ８ＩＷ７０、Ａ４ＺＩ３２、Ｑ５３ＨＬ０、Ｑ８ＴＤＴ８、Ｐ２００６１、Ｅ５ＲＪＱ４、Ｅ１Ｐ５４１、Ｂ４ＤＫＺ７、Ｑ９Ｐ２Ｆ８、Ｑ９６Ｆ４４、Ｏ１５０４７、Ｂ４ＤＦＵ５、Ｅ９ＰＦＣ２、Ｐ１７０３２、Ｂ２ＲＡＮ０、Ｑ８ＮＦＵ０、Ｏ１５２３０、Ｑ６ＺＳＲ９、Ｑ５３ＳＷ３、Ｑ９ＢＴＧ３、Ｄ６ＲＴＫ６、Ａ８Ｋ９Ｚ８、Ｂ７ＺＭＩ０、Ｃ９ＪＩ１２、Ｄ３ＤＳ８６、Ｂ４ＤＩ４９、Ａ６ＮＥＭ４、Ｐ０９１７２、Ｂ７ＷＰＨ３、Ｑ８ＩＶＥ３、Ｏ９６０２８、Ｑ５ＶＷＮ６、Ｏ９４９１０、Ｑ６８ＤＳ０、Ａ６ＮＤＲ９、Ｂ２Ｒ７０８、Ｑ２ＮＬＡ０、Ｑ８ＩＹＵ４、Ｑ９６ＲＬ７、Ｑ１３０１７、Ｅ７ＥＷ２８、Ｏ４３５２０、Ｑ８ＩＶＵ１、Ｑ８ＴＤ８４、Ａ６ＮＩＲ３、Ｐ９８１９８、Ｑ６ＮＸ５２、Ｑ９ＵＢＣ３、Ａ６ＮＣＩ８、Ｑ８ＩＺＦ３、Ｄ６ＲＢＴ４、Ｑ８Ｎ９Ｈ８、Ｑ９２５７６、Ｄ６ＲＤＹ７、Ｑ５９ＧＩ４、Ｑ６ＺＭＲ１、Ｏ９４８０６、Ｐ８２９８７、Ｑ１６８２５、Ｂ３ＫＳ４９、Ｑ９ＮＱＡ５、Ｑ８ＮＦＭ４、Ｂ４ＤＦＤ６、Ｅ７ＥＰＵ５、Ｑ８ＩＶＦ６、Ｑ８６Ｙ３８、Ｑ５ＴＧＹ３、Ｑ０２２２４、Ｅ５ＲＩＭ３、Ｏ１４８３０、Ｑ１３６３４、Ｂ３ＫＵＸ７、Ｑ５ＨＹ５４、Ｅ１Ｐ５Ｇ４、Ａ６ＮＰ１１、Ｏ１５０１５、Ｅ７ＥＮＵ４、Ｏ１４９８１、Ｂ７ＺＬＺ２、Ａ８Ｋ１Ｚ４、Ｄ３ＤＵＵ２、Ｑ６ＺＵ６９、Ｑ７ＬＢＣ６、Ｑ８ＴＤＺ４、Ｑ７Ｚ６Ｇ８、Ｑ９６ＪＫ９、Ｑ９ＢＵＤ９、Ｐ３５５２３、Ｑ８ＮＢＨ６、Ｂ７Ｚ３Ｈ９、Ｑ６ＰＫＧ０、Ｑ６ＺＭＴ１、Ｑ２Ｍ２Ａ３、Ｄ３ＤＳＦ５、Ｑ５ＴＣＳ８、Ｑ９Ｈ７Ｆ０、Ｏ６０３７４、Ｅ７ＥＮＭ８、Ｑ７Ｚ６Ｅ９、Ｑ９ＵＫ６１、Ｑ９ＵＰＶ０、Ｂ４ＤＺＦ０、Ｑ９６ＪＱ０、Ｐ１１０４７、Ｅ９ＰＧ２２、Ｑ９ＮＺＪ４、Ｅ７ＥＷＭ０、Ｑ１４ＣＬ３、Ｂ７Ｚ７Ｘ４、Ｂ３ＫＷ６９、Ｑ６ＺＲＲ９、Ｂ２ＲＮＴ９、Ｑ８ＩＵＡ７、Ｑ９６ＰＥ２、Ｂ２ＲＴＳ２、Ｑ９Ｙ２３２、Ｑ７６ＮＩ１、Ｑ６ＺＵＡ９、Ａ４ＰＢ６７、Ｑ１５２８３、Ｑ５Ｃ９Ｚ４、Ｑ９ＮＺＲ２、Ａ８Ｋ３３０、Ｐ１１２１５、Ｏ４３１５１、Ｏ６０４４９、Ｑ８Ｎ５５６、Ｑ８ＴＣＮ５、Ｐ４６５３１、Ｂ７Ｚ９０４、Ｅ０ＣＸ０８、Ｂ４ＤＦ２２、Ｃ９ＪＹ６６、Ｑ７Ｚ４０１、Ｂ３ＫＰＮ９、Ｂ７ＺＬＪ８、Ｂ３ＫＷＷ９、Ｑ６ＩＥＨ８、Ｑ９ＮＲＤ８、Ｑ５ＴＢＡ９、Ｂ３ＫＭＢ８、Ｂ４Ｅ３Ｎ７、Ａ０ＡＶＩ２、Ｑ７ＲＴＹ７、及びＥ７ＥＵＮ６
【０１６３】
Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を更に使用して、マトリゲル（登録商標）に対して相対的に水ですすいだＨｕＭＡＴＲＩＸ中に見出される主要なＥＣＭタンパク質の相対存在量を定量した（図１）。
【０１６４】
他の増殖因子も質量分析によって同定され、細胞内線維芽細胞増殖因子ｉＦＧＦ−１２（発達中の心臓心房腔の心筋、及び四肢骨格の軟結合組織の発達、及び肋骨から椎骨の連結に関連する）及びｉＦＧＦ−１３（電位開口型ナトリウム及びカルシウムチャネルの細胞内モジュレーターとして、発達中の心臓心房腔及び心室腔の心筋内に、並びに末梢神経系及び発達中の中枢神経系の全体に見出される）、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２、胎児膵臓ベータ細胞発生及び幹細胞分化も促進する主要な胎児性増殖因子）、ＥＧＦＬ−７（虚血再灌流障害の修復、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける脈管の管形成の調節、ＥＣＭに対する内皮細胞接着及び血管形成の促進、ＨＵＶＥＣ及び神経幹細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害において役割を果たすことが示されており、かつ免疫系逃避を促進しうる）、並びにｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２、基底膜に見出されて新しい血管の形成と関連付けられており、かつ心発作に関連した損傷から心臓を保護することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されており、更に未分化の状態で細胞を維持するために胚性幹細胞培養に極めて重要な成分として注目される）が含まれていた。
【０１６５】
試料中に存在する残存ＤＮＡの量を定量的に測定するために、ピコグリーンアッセイを行った。対照として、１片の脱細胞化した組織及び１片の脱細胞化前の組織も消化した。得られた凍結乾燥材料のうちの２５ｍｇを１．０３ｍｌのプロテイナーゼ／１×ＴＥバッファー中に溶解し、５５℃で１２００ｒｐｍで３時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を標準的な添加方法によってアプライした。各消化物の２００μｌに多様な容積の１×ＴＥ及びｇＤＮＡスパイクを添加した。次いで、１００μｌの試料を９６ウェルマイクロタイタープレートにアプライし、その後、１００μｌのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素を９６ウェルプレートに添加し、蛍光プレートリーダー上で読み取りした（吸光４８５ｎｍ及び発光５３８ｎｍの設定）。図２に示しているように、胎盤ＥＣＭ試料のそれぞれにおいてＤＮＡが約９５％減少している。Ｈ＆Ｅによって染色したように、脱細胞化した胎盤組織の組織学切片によって除核を確認した（図２）。
【０１６６】
実施例５：胎盤由来マトリックスの上又は中での細胞の培養
ＨｕＭＡＴＲＩＸに直接接着する接着細胞型の能力を試験するために、標準的な無血清細胞付着アッセイを行った。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）を３７℃インキュベーター内でウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び抗菌性抗真菌薬（ＡＢＡＭ）で補ったＤＭＥＭ培地中で約７０〜８０％コンフルエンスを有するまで培養した。細胞をアッセイ前日にフィードした。４８ウェルプレートを、約２００μｌのセルスタート（ＣＥＬＬＳＴＡＲＴ）（登録商標）（ヒト血清アルブミンを有するフィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）又はＨｕＭＡＴＲＩＸで各時点（１５分、３０分、６０分、及び１２０分）について３通りずつでコーティングし、一晩乾燥できるようにした。対照として一群のウェルを未コーティングのまま残した。翌日、コーティングしたウェルに２００μｌの２％ＢＳＡを添加し、室温で３０分間インキュベートできるようにした。３０分後、ウェルを、（予め室温まで温めた）ハンクス平衡塩類溶液で洗浄し、乾燥させないようにした。準備したＤＰＢＳ及び０．０５％トリプシンを予め室温まで温めた。培地をプレートから除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＡＳＣを、トリプシンで、及びダイズトリプシン阻害因子で阻害したトリプシンで、分離させた。細胞をＤＭＥＭ（無血清）中に再懸濁し、計数して１．５×１０３細胞／ウェルにした。細胞をそれぞれのマトリックス上で１５分、３０分、６０分、及び１２０分間インキュベートし、全ての遊離細胞をＰＢＳで洗浄することによって除去した。プレートを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いで、クリスタルバイオレットで５分間染色した。各ウェルをｄＨ２Ｏで４回洗浄して全ての残りのクリスタルバイオレットを除去した。顕微鏡検査下での画像捕捉により、かつＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを使用して、各ウェル内の細胞の数を手動で計数した。
【０１６７】
無血清培養培地中での脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）付着を、細胞付着アッセイにおいてＡＳＣを使用して試験した。ＡＳＣを、セルスタート（登録商標）（ヒト血清アルブミンを有するフィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）又は胎盤由来マトリックス（ＨｕＭＡＴＲＩＸ）でコーティングした培養プレート又は培養プラスチック製品上に無血清培地中に配置した。付着動態を１５、３０、６０及び１２０分において決定した。２つのロットの胎盤由来マトリックス（ＨｕＭＡＴＲＩＸ）群のそれぞれは、セルスタート（登録商標）（フィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）、又は培養プラスチック製品単独と比較して、全ての時点でより高い付着を示した。無血清培地中で培養した通り、１、３、及び７日目にＡＳＣの典型的な形態を観察した。
【０１６８】
脂肪幹細胞も無血清／無異物条件で培養して、ＨｕＭＡＴＲＩＸと共に６フレンチ心臓カテーテルでカテーテル注射した後の代謝活性について試験し、アロマーブルーを使用して生存率を評価した。１００，０００、２００，０００又は４００，０００個のＡＳＣを、ピペットで、培地と共にカテーテルで、又は予め混合し６フレンチ心臓カテーテルを通過させた１ｍｌのＨｕＭＡＴＲＩＸと共にカテーテルでのいずれかで培養プレート上に送達した。送達した細胞の生存率を３日にわたって形態学的にかつアラマーブルーによって評価した。アラマーブルー（ウェル内に培地の１／１０の容積）を試料に添加し、４時間インキュベートできるようにした。４時間後、１００μｌの各試料を９６ウェルプレート内にロードし、蛍光を５７０ｎｍ（励起）５８５ｎｍ（発光）で読み取った。ＨｕＭＡＴＲＩＸに対してセルスタート上で培養した脂肪幹細胞の細胞生存率において有意な差はなかった。
【０１６９】
実施例６：後根神経節（ＤＲＧ）の培養
後根神経節（ＤＲＧ）を使用して、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上での外胚葉細胞の付着及び増殖の能力も評価した。ＨｕＭＡＴＲＩＸ、ラミニン、及び尿素抽出を用いた脱細胞化胎盤上でＤＲＧの１００％近い付着が観察されたが、培養プラスチック製品単独に付着したＤＲＧはほとんどなく、細胞形態を評価するためにベータ−ＩＩＩ−チューブリン及びＤＡＰＩについて細胞を染色した。ＨｕＭＡＴＲＩＸ上で培養した細胞のみが、より発達した表現型を示して神経節を有することが観察され、光学顕微鏡によっても認められるように、ＨｕＭＡＴＲＩＸの８つのバッチを含む多様な基質上のＤＲＧのアラマーブルー代謝活性はＥＣＭコーティング間で最小の差を示したが、培養プラスチック製品単独上のＤＲＧはゼロに近い活性を示した。
【０１７０】
組織を加工したＨｕＭＡＴＲＩＸ上でのＤＲＧ培養を更に評価するために、ＹＦＰを発現しているＤＲＧを７日齢の子及び成体マウスから単離して、ＨｕＭＡＴＲＩＸ、コーティング及び電界紡糸した線維の上に播種し、マトリゲル（登録商標）上及びＰＤＬをコーティングしたガラス製のカバーグラス上でのＤＲＧと比較した。神経芽細胞培地、Ｂ２７、Ｌ−Ｇｌｕｔ、抗菌性抗真菌薬（ＡＢＡＭ）からなるＤＲＧ培地を各ウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。培地をウェル内で３日毎に交換し、新しい培地を７日毎に作製した。４８ウェルプレートを２００μｌのアミノ酸ポリマーポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）で均一にコーティングし、室温で一晩インキュベートした（封じたプレート）。翌日に、残りのポリ−Ｄ−リシンをウェルから吸引した。ウェルをすすぎ、蒸発できるようにした。ウェルの蒸発後、ウェルをＨｕＭＡＴＲＩＸのゲル、及びマトリゲル（登録商標）で、均一にコーティングした。ＰＤＬのみを含むウェルを対照として使用した。約５００μｌのＤＲＧ培地を各ウェルに添加した。そのプレートを３７℃インキュベーター内に一晩置いた。全ての残りの（付着していない）細胞を翌日洗浄して取り除いた。１４日間、ＤＲＧの伸長を各ウェル内で蛍光顕微鏡下で調査した。ＩｍａｇｅＪ６４を使用して神経突起伸展の長さを測定した。ＨｕＭＡＴＲＩＸでコーティングしたウェルにおいて有意な神経突起伸展が観察された。ＨｕＭＡＴＲＩＸ及びマトリゲル（登録商標）の上で培養した後根神経節は、対照プレート（ＰＤＬ）よりも有意に多量の神経線維伸展を経験する。平均のＤＲＧ神経突起伸展の長さは、マトリゲル（登録商標）のものに匹敵した。
【０１７１】
実施例７：ヒト初代心筋細胞及びｉＰＳＣ由来の心筋細胞の培養
マトリックス依存的な付着を有する第２の中胚葉細胞型として心筋細胞もＨｕＭＡＴＲＩＸ上で培養した。ヒト初代心筋細胞を１ウェル当たり２０，０００細胞でＣｅｌｐｒｏｇｅｎ細胞外マトリックスコーティングプレート上に無血清／無異物条件で播種した。細胞を１週間培養した後に、それらを、３つの異なるロットからのＨｕＭＡＴＲＩＸ、０．１％ゼラチン、組織培養プラスチック製品、及びマトリゲル（登録商標）を含む、多様な基質に移した。１、３、５、及び７日目に、アラマーブルーを使用して細胞生存率を測定した。多様な異種細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上で培養した心筋細胞の生存率において、ＨｕＭＡＴＲＩＸと比較して有意な差はなかった。
【０１７２】
更に、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する（から分化した）心筋細胞を４ロットのＨｕＭＡＴＲＩＸ上で培養し、ゼラチン、フィブロネクチン、マトリゲル（登録商標）、及び培養プラスチック製品と比較した。ｉＰＳＣ−心筋細胞は、ＨｕＭＡＴＲＩＸに迅速に付着したが、他のマトリックスに最初に付着した細胞はほとんどなく、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上の細胞のみが付着後１日目に収縮性であった（他のマトリックスでは２〜３日目）。ｉＰＳＣ−心筋細胞は、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上で、フィブリノーゲンを含む他の基質上での培養に対して相対的に異なる形態も有していた。これらの心筋細胞を大きな３Ｄハイドロゲルディスク（約２００ミクロンの厚さ及び８ｍｍの直径）中に封入し、細胞は生存可能であって内部で収縮した。更に、ｉＰＳＣ−心筋細胞は、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上で、他の基質に対して相対的に１〜２日早く同期し、電気生理学によってカルシウム移行をモニターすることによって電気的に連関することが示された。
【０１７３】
心筋細胞の電気的な連関は、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上での培養１日目のｉＰＳＣ由来心筋細胞培養物の改変されたパッチクランプ電気生理学評価によって確認される。カルシウム移行は、色の移動で表され、個々の細胞数と共に時間に対して追跡され、強度変調表示の記録された動画と共に、３４０ｎｍで励起及び３８０ｎｍで発光することが示されるＦｕｒａ−２レシオメトリック色素レポーターを記録する。全ての細胞がカルシウム移行及び／又は収縮を同時に生じることが認められ、したがって、シンシチウムがこの培養系において生成されたことが示される。
【０１７４】
実施例８：胎盤由来マトリックス上での肝細胞の培養
肝細胞を、内胚葉細胞としてＨｕＭＡＴＲＩＸ上の増殖について試験した。ヒト肝細胞は、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上で、コラーゲンサンドイッチ培養を終えたマトリゲル（登録商標）に類似した、典型的な形態、及びマトリゲル単独に対する優れた付着を示すことが示され、１、３及び６日目にＨｕＭＡＴＲＩＸハイドロゲルの上又は内部のいずれかで培養した細胞で、６日目にアクチン染色によって強調されるように、マトリゲル（登録商標）群について、ＨｕＭＡＴＲＩＸに対して相対的に少ない付着が目立った。更に、多様な基質の上で培養した肝細胞についての培地中の尿素濃度は、ＨｕＭＡＴＲＩＸにおいて最も低いレベルを示し、より速い同化作用−異化作用の代謝変換を介したより速い肝細胞培養適応が示唆された。
【０１７５】
実施例９：胎盤由来マトリックスでのオーバーレイ
肝細胞を採取してディッシュ又はウェル上で培養する。多様な濃度（０．５、１．５、及び３ｍｇのタンパク質／ｍＬ）の胎盤由来マトリックスの溶液を調製し、培養培地と混合して、オーバーレイする培地を調製する。調製したオーバーレイする培地を氷上で維持する。それぞれのオーバーレイする培地を、上に肝細胞を接着させて培養するディッシュ又はウェル内に添加する。ディッシュ又はウェルを戻す。
【０１７６】
実施例１０：胎盤由来マトリックスをコーティングしたプレート上での膵島ベータ細胞株の培養
ラットＲｉｎ５ｆ膵島細胞（ＡＴＣＣ；ＣＬＲ２０５８）のバイアルを、３７℃のウォーターバス内での穏やかな撹拌（約２分）によって解凍し、９．０ｍＬの完全ＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ  ３０−２００１）を含む遠心分離チューブに移した。細胞懸濁液を約３００ｇで３分間遠心し、細胞ペレットを５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。１５μｌの細胞懸濁液を、１５μＬの０．４％トリパンブルーと共に、ラベル付けしたエッペンドルフチューブに添加した。約２０μＬの０．４％トリパンブルー細胞懸濁液をピペットでスライド上へ移し、セロメーターを使用して重複試料／群当たりの総細胞計数を決定した（細胞計数：１．５１×１０＾６細胞）。１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地を細胞懸濁液に添加し、５ｍｌの細胞懸濁液を２００００細胞／ｃｍ２の密度で３つのＴ２５培養フラスコ上に播種した。細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートし、培地を１日おきに交換した。Ｒｉｎ５ｆ細胞を７０〜８０％コンフルエントに到達するまで（約７日）培養し、培養培地をＴ２５フラスコから取り除いて捨てた。細胞層をＤＰＢＳ（−／−）で２回すすいで血清の全てのトレースを除去し、４ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅをＴ２５フラスコに添加した。細胞を倒立顕微鏡下で細胞層が分散するまで観察した。３ｍＬのベータ細胞完全培地を細胞／Ａｃｃｕｔａｓｅに添加して非活性化し、穏やかにピペット操作することによって細胞を吸引して、細胞懸濁液を５０ｍｌの円錐チューブに移し、フラスコ当たり７ｍｌの追加の完全ＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。細胞懸濁液を約３００ｇで３分間遠心し、細胞ペレットを５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。１５μｌの細胞懸濁液を、１５μｌのトリパンブルーと共に、ラベル付けしたエッペンドルフチューブに添加して、２０μＬのトリパンブルー細胞懸濁液をピペットでスライド上へ移し、セロメーターを使用して重複試料／群当たりの総細胞計数を決定した（細胞計数：４．５×１０＾６個の生細胞）。４８ウェルプレートを４０μｌのＨｕＭＡＴＲＩＸ（２ロット）又はマトリゲルで６通りずつコーティングした。プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。４．８×１０＾５個の生細胞を再遠心し、２５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。４８ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、５００μｌの細胞懸濁液を２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で各ウェルに添加した。ＥＣＭのいかなる更なるコーティングもない組織培養プラスチック製品を対照として使用する。細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートした。完全ＲＰＭＩ１６４０培地を２日毎に交換した。３及び７日後、細胞形態を顕微鏡下で調査した。
【０１７７】
上記のような異なるマトリックス上で培養した膵島ベータ細胞を、以下のプロトコールに従ってグルコースで刺激した：ｓｕｒｇｅｒｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｓｙｓｔｅｍ／ａｓｓｅｔｓ／３５４／Ｉｓｌｅｔ＿Ｇｌｕｃｏｓｅ＿Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ＿Ｉｎｓｕｌｉｎ＿Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ＿Ａｓｓａｙ．ｐｄｆ？１２６４１７６１１５。次いで、細胞によって分泌されたｃ−ペプチド（インスリン）を、ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＲＡＢ０３２６）及びその製造業者のプロトコールを使用して測定した（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ／Ｂｕｌｌｅｔｉｎ／１／ｒａｂ０３２６ｂｕｌ．ｐｄｆ）。
【０１７８】
実施例１１：胎盤由来マトリックス中での膵島ベータ細胞の培養
３．６×１０５個のＲｉｎ５ｆ膵島細胞を再遠心し、１．５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。０．５ｍｌの細胞懸濁液を０．５ｍｌのＨｕＭＡＴＲＩＸ（３つの固有のロット）及びマトリゲルの中に再懸濁した。７．２×１０５個の生細胞を再遠心し、１．５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。０．５ｍｌの細胞懸濁液を０．５ｍｌのＨｕＭＡＴＲＩＸ（３ロット）及びマトリゲルの中に再懸濁した。ＨｕＭＡＴＲＩＸ又はマトリゲルを有する１２０μｌの細胞懸濁液を４８ウェルプレートのウェルに６通りずつ添加した。プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、４８ウェルプレートをインキュベーターから除去し、及び５００ｕの完全ＲＰＭＩ１６４０を各ウェルに添加して、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２でインキュベートし、完全ＲＰＭＩ１６４０培地を２日毎に交換した。３及び７日後、細胞形態を顕微鏡下で調査し、コロニー形成を観察した。更に、胎盤マトリックスを使用してこれらの膵臓膵島細胞を凍結保存することができ、したがって、他の細胞型もそうである可能性が高い。３×１０６個のＲｉｎ５ｆ細胞を、胎盤ＥＣＭ単独、胎盤ＥＣＭ＋１０％ＤＭＳＯ、胎盤ＥＣＭ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＨＳＡ、ＲＰＭＩ単独、ＤＭＳＯ単独、ＨＳＡ単独、及び図１４Ｄによるこれらの組合せのいずれかの中で凍結させた。細胞を対照速度で液体窒素保管温度まで凍結して１カ月間保存し、解凍してその後の生／死細胞を計数した。ヒト胎盤マトリックス中でＤＭＳＯと共に凍結保存した細胞は、１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩの標準的な凍結培地中での凍結保存と比較して、生存可能な細胞数において２倍の増加を示し、ＤＭＳＯを含む胎盤ＥＣＭを１０％ＨＳＡで更に補ったとき、生存可能な細胞において４倍の増加を示し、黄金標準的な凍結保存方法と比較して、他の単一成分による凍結保存システムでは、低いＲｉｎ５ｆ細胞生存率が認められた。
【０１７９】
実施例１２：ｉＰＳＣの培養及び分化
多能性を誘導した多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、ＨｕＭＡＴＲＩＸ上での増殖及び分化について予備的に試験した。ＩＰＳＣ細胞をｍＴｅＳＲ１若しくはｍＴｅＳＲ２又はＳｔｅｍｇｅｎｔ無異物かつ無血清培地中で培養し、マトリゲル（登録商標）上に継代して細胞を無フィーダー培養に適合させ、混入しているフィーダー細胞を除去した。細胞を、ＨｕＭＡＴＲＩＸ、及びＨｕＭＡＴＲＩＸのナノファイバーでコーティングしたウェル上にディスパーゼ又はＴｒｉｐＬＥと共に継代し、ここで、培養の７日目に、Ｔｒａ−１−６０染色によって決定されたように、細胞が付着して多能性状態を維持しているのが観察された。クラスター化された細胞の集団が、ＴＲＡ−１−６０陽性で、ＨｕＭＡＴＲＩＸナノファイバー中に付着して埋め込まれ、ＨｕＭＡＴＲＩＸのゲル上に付着して増殖しているコロニーとして増殖していることが観察された。
【０１８０】
内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の３つの胚系列への分化を引き起こす能力も試験した。ｉＰＳＣを胚様体の中にクラスター化させて、ＨｕＭＡＴＲＩＸ（ＰｌａｃＢＭｓｕｐ）、マトリゲル（登録商標）（ＭＧ）、又はゼラチン（Ｇｅｌ）のいずれかに付着させ、ｉＰＳＣ（Ｆ１３線維芽細胞）及び多能性状態のｉＰＳＣ（Ｆ１３  ｐｌｕｒｉｐ  ｉＰＳＣ）細胞を作製するために使用したファウンダー線維芽細胞株の基礎発現レベルと比較した。いかなる更なる処理もないプラスチックプレートも対照として使用した。トリゾールを使用してＲＮＡを抽出し、外胚葉分化における相対遺伝子発現の測定にはｓｏｘ１及びネスチン、中胚葉分化における同測定にはＡｃｔｉｎａ２及びブラキウリ、また内胚葉分化における同測定にはＳｏｘ１７及びＦｏｘＡ２用のプライマーを使用した。試料の発現レベルを、ｉＰＳＣを作製するために使用したファウンダー線維芽細胞株（Ｆ１３線維芽細胞）の基礎発現レベル及びｉＰＳＣ（Ｆ１３  ｐｌｕｒｉｐ  ｉＰＳＣ）と比較した。ＨｕＭＡＴＲＩＸが各発生系列においてプラスチック製品上又はマトリゲル（登録商標）上での培養によって誘導されるレベルを超えて遺伝子を上方制御するのが観察された。
【０１８１】
実施例１３：臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮管形成に必要とされる成分をＨｕＭＡＴＲＩＸが含むかどうかを試験するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＴ７５フラスコ上に５００，０００細胞で播種し、組織培養プラスチック製品上で、ＬＳＧＳで補ったＭｅｄｉｕｍ  ２００培地中で６日間培養した。６日後、細胞を、２μｇ／ｍｌの濃度を有するようにＤＰＢＳ中に希釈したカルセインＡＭと共に３０分間インキュベートした。３０分後、細胞をトリプシン処理し、次いで、多様な基質（ＨｕＭＡＴＲＩＸ、アルギン酸、ゼラチン、マトリゲル（登録商標）、及びゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ）（登録商標））で予めコーティングした２４ウェルプレートに１ウェル当たり１００，０００細胞の密度で移した。５００μｌの培地を各ウェルに添加した。播種の約１６時間後、細胞をＺｅｉｓｓ顕微鏡下で調査し、ＧＦＰ下で内皮管形成を探した。４つの固有のロットのＨｕＭＡＴＲＩＸで予めコーティングしたＨＵＶＥＣ細胞において、マトリゲル陽性対照上と同様に、内皮管形成が生じたが、組織培養プラスチック製品単独上での二次元培養では脈管形成はなかった。
【０１８２】
実施例１４：生体適合性
ＨｕＭＡＴＲＩＸのｉｎ  ｖｉｖｏでの生体適合性を評価するために、マウス皮下注射アッセイを行い、１８ｇａ針を通して皮下注射したＨｕＭＡＴＲＩＸのハイドロゲル及び海綿質対マトリゲル（登録商標）を比較した。移植片を所定位置に２週間残して動物の体重及び一般的な健康状態をモニターしところ、有害事象は認められなかった。説明に応じて、注射した材料を留置し、次いで、Ｈ＆Ｅによる組織学的解析のために、上層の皮膚及び下層の筋肉と共に摘出した。Ｈ＆Ｅにより、マトリゲルは２週目に相対的に不活性であって十分に細胞化されていないことが示されたのに対して、ＨｕＭＡＴＲＩＸのゲル及び海綿質は埋め込まれた移植片の全体にわたって細胞を含んでいた。ＣＤ６８、ＣＤ２０６、及びＣＤ８６抗体を使用して、炎症促進性（Ｍ１）又はリモデリング（Ｍ２）のいずれかとして細胞を同定するためのＭ１及びＭ２マクロファージマーカーについて、移植片を更に染色した（２月にデータ検証保留中）。異種のヒト胎盤由来マトリックスをマウス内に埋め込んだにもかかわらず、移植片のＨ＆Ｅ染色により、胎盤由来マトリックス群では、目に見える被包形成なく、マトリゲル（登録商標）に対して相対的に多い細胞浸潤が見出されること示された。
【０１８３】
実施例１５：胎盤由来マトリックスの送達
ｉｎ  ｖｉｖｏでＨｕＭＡＴＲＩＸを送達する能力を更に試験し、生理食塩水注射と比較して、ハイドロゲルを、虚血状態（心筋梗塞）を誘発した後のラット心筋内に注射した。５〜０の縫合糸を使用した心臓の左前下行枝動脈（ＬＡＤ）の結紮によってラットを心筋梗塞にさせ、心臓の白化及びその後の超音波心臓検査を使用して梗塞の発生を確認した。注射した心臓を８週目に摘出し、光学マッピングにより、リスクのある虚血領域内の細胞の電気生理学活性におけるあらゆる差についてランゲンドルフチャンバーを使用して解析した。心臓を、ＴＴＣで染色もし、Ｈ＆Ｅ及びマッソンのトリクローム用の包埋のためにホルマリン中で固定して群間の心筋壁厚み及び瘢痕化を解析した。光学マッピングにより、結紮したＬＡＤの下の梗塞領域内に刺激性電極を設置したときに、平均して、生理食塩水処理群は、リスクのある領域の外で電気を伝導する能力を失っており（不整脈）、ここで、与えた５の電気刺激のうちの１又は２のみが遠位のパッチクランプにおいて記録できたのに対して、ＨｕＭＡＴＲＩＸを注射した群では典型的に５パルス全てが記録された。全体として、生理食塩水を注射した７匹の動物のうちの５匹は手術後２週間以内に死亡したのに対して、ＨｕＭＡＴＲＩＸを注射した５匹の動物のうちの５匹が８週間を通して生存した。手術前の駆出分画における術後８週間までの変化を比較して、この試行試験においてＨｕＭＡＴＲＩＸ群で５６％改良された駆出分画が示された。これらの結果により、ラット心筋内にヒトＨｕＭＡＴＲＩＸを注射することの安全性が示され、これは、このヒトＥＣＭハイドロゲルを、おそらくこのマトリックス内での細胞送達のために、心疾患及び他の疾患における推定の治療薬として使用することの実現可能性を支持する。
【０１８４】
ＨｕＭａｔｒｉｘは、ビオチン標識キット説明書によればビオチン結合型であった。２匹のラットにおいて上記のように心筋虚血を誘発させた。ビオチンで標識したＨｕＭａｔｒｉｘを左心室心筋の虚血領域内の処置部位内に注射した。ビオチン化ＨｕＭａｔｒｉｘ注射の３０分及び１時間後、ラットを安楽死させ、切片化及び組織学的解析のために心臓を採取した。心臓を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、最適な切断温度の化合物中で瞬間凍結させ、凍結切片化してスライド上に載置した。隣接した連続切片を、コラーゲンについてはシリウスレッドで又はビオチンについてはＦＩＴＣ結合型ストレプトアビジンのいずれかで染色した。連続切片におけるコラーゲン染色及びビオチン染色の両方の存在に基づいてＨｕＭＡＴＲＩＸゲル化を評価した。
【０１８５】
シリウスレッド（ダイレクトレッド８０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びファーストグリーン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１．３％ピクリン酸中に１％ｗｔ／ｖで溶解した。切片をシリウスレッドと共に２０分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄してファーストグリーンと共に１０分間インキュベートし、再び洗浄した後に永久的に封入した。ビオチン染色用の切片も心臓トロポニンＩについて染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。試料を、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で２０分間透過処理して、４％ウシ血清アルブミンで室温で１時間ブロックし、マウス抗ラット心臓トロポニンＩ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と共に４℃で一晩インキュベートして、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で洗浄し、ヤギ抗マウスアレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）５４６抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及びストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。カバーグラスをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ＨａｒｄＳｅｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で装着し、スライドをイメージングまで−２０℃で凍結維持した。
【０１８６】
手術の８週間後、動物を２％イソフルランで麻酔して５ｍｌのヘパリンを注射し、手術を行って心臓を摘出した。次いで、心臓を、氷冷タイロード（脱イオン水中に１２８．２ｍＭのＮａＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２（２Ｈ２Ｏ）、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．０５ｍＭのＭｇＣｌ２（６Ｈ２Ｏ）、１．１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１．１ｍＭのＤ−グルコース、ｐＨ＝７．３５±０．０５）溶液で満たした容器に体外移植し、特別注文のカニューレに連結した。冷却タイロード溶液は、心臓が生命維持システムに連結されるまで心臓の活性を停止させるのを補助しており、悪化を防ぐ。カニューレを挿入した心臓を、新しいタイロード溶液でランゲンドルフ灌流し、次いで、実験体制に移し、そこで、３７＋／−１℃のタイロード溶液で灌流及び超灌流した。タイロード溶液を、９５％Ｏ２で通気し、次いで、心臓内で５０〜６０ｍｍＨｇの圧力を維持する速度でポンプ注入した。収縮が安定し次第、１０ｍｌタイロード溶液中に溶解した約１０マイクロリットルの電位感受性色素、Ｄｉ−４−ＡＮＢＤＱＢＳをカニューレの近くに注射し、実験の残りの間再循環させた。色素灌流の数分後、３０μＭの溶液、２，３−ブタンジオンモノキシム（ＢＤＭ）、興奮収縮デカップラー、いずれかをタイロード溶液に添加していかなる人為的挙動もないようにした。
【０１８７】
使用した光学マッピングシステムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３４６９６９９にすでに詳細に記載されている。簡単に説明すると、心臓を照らす二色性ミラーによって赤色レーザー（６５０ｎｍ）が指向され、それが電位感受性色素を励起して蛍光が放出された。蛍光ビームを、波長７１５ｎｍのロングパス放出フィルター（７１５ｎｍ）によってフィルター処理し、最終的に高速ＣＣＤカメラによって記録した。このカメラは、８０×８０ピクセル解像度で１０００Ｈｚの捕捉速度を有する。
【０１８８】
脱細胞化を通して処理した組織を回収してＨ＆Ｅによって細胞除去を確認し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した切片を、包埋、切片化、及び染色のためにＤｅＰａｕｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＶＡ）に送付した。光学マッピングの終わりに、心臓を塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。１％Ｗ／ＶでＰＢＳ中に溶解したＴＴＣは、タイロード溶液と置き換わる。心臓をＴＴＣで１５分間灌流し、切片化のためにホルマリン中で保存した。次いで、心臓を、頂端から縫合糸の２ｍｍ上まで２ｍｍ毎に薄切りした。ＶＣＵ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）により、連続心臓切片をパラフィン中に包埋し、切片化して、載置し、マッソンのトリクローム及びＨ＆Ｅで染色した。実施例１６：代謝安定性スクリーニング
【０１８９】
上記のように調製した胎盤由来マトリックスで９６ウェルプレートをコーティングする。肝細胞を９６ウェルプレート内に１ウェル当たり５０μｌ中に３５，０００細胞の濃度で肝細胞代謝培地（ＨＭＭ）中に播種する。２倍濃度の評価する試験物を含む及び含まない５０μｌのＨＭＭ試料をウェルのそれぞれに添加した。プレートを３７℃で複数の時点まで（Ｔ１／２の決定には、親試験物の５０％の消失に至る時間）又は、スクリーニング目的では、単一の時点まで（例えば、３０分間）インキュベートする。アセトニトリルを添加して代謝を終了させる。遠心分離を使用して、残りの試験物を含む上清から肝細胞及び細胞高分子を除去する。以下の式により、インキュベーション後の親試験物濃度のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ定量を測定する：
％残存＝［（インキュベーション後の濃度）／（インキュベーション前の濃度）×１００％
【０１９０】
問題となっている新しい化学実体のヒトのｉｎ  ｖｉｖｏでの肝クリアランスの速度の最初の評価として、Ｔ１／２値からｉｎ  ｖｉｖｏの内因性肝クリアランスを更に算出する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト肝細胞及びヒトのｉｎ  ｖｉｖｏでの結果の間の相関は、代謝の速度だけでなく、タンパク質結合及び細胞内の取り込みも考慮することによって改良される。
【０１９１】
実施例１７：阻害性の薬物−薬物相互作用を評価するための肝細胞Ｐ４５０阻害アッセイ
本明細書中に記載のように調製した胎盤由来マトリックスで２４ウェルプレートをコーティングする。肝細胞を２４ウェルプレート内に１ウェル当たり４９０μｌ中に２５０，０００細胞の濃度で肝細胞代謝培地（ＨＭＭ）中に播種する。１００倍濃度の評価する試験物を含む及び含まない５μｌのＨＭＭ試料をウェルのそれぞれに添加した。プレートを予め３７℃で１５分間インキュベートして試験物が肝細胞と相互作用できるようにする。１００倍濃度の評価する試験物を含む及び含まない同じ５μｌのＨＭＭ試料を同じウェルに添加し、プレートを３０分間インキュベートする。アセトニトリルを添加して代謝を終了させ、遠心分離機を使用して細胞高分子を除去する。基質の薬剤代謝酵素代謝についてＬＣ／ＭＳ又はＨＰＬＣ定量を行う。阻害性薬物−薬物相互作用アッセイのために日常的に使用しているＰ４５０アイソフォーム特異的基質及びアイソフォーム特異的阻害剤をアッセイの陽性対照として使用することができる。阻害アッセイの結果は、相対活性として示される：
相対活性（％）＝［活性（処理）／活性（陰性対照）×１００％
相対性に基づき、ＥＣ５０値及びＫｉ値を算出する。
【０１９２】
実施例１８：誘導性の薬物−薬物相互作用を評価するための肝細胞Ｐ４５０誘導アッセイ
本明細書中に記載のように調製した胎盤由来マトリックスで２４ウェルプレートをコーティングする。平板培養可能な、凍結保存したヒト肝細胞又は新たに単離したヒト肝細胞を２４ウェルプレート内に１ウェル当たり５００μｌ中に３５０，０００〜４００，０００の濃度で肝細胞播種培地（ＨＰＭ）中に播種する。得られる単層培養物はほぼ１００％コンフルエントであり、肝細胞播種の日は０日目である。培養の４時間後、培地を、０．２５ｍｇ／ｍＬの胎盤由来マトリックスを含むものと交換する。一晩のインキュベーションの後（１日目）、培地を、肝細胞誘導培地（ＨＩＭ）と交換する。２日目に、培地を、酵素誘導可能性について評価する薬物を望ましい濃度で含むＨＩＭに交換する。３、４及び５日目に、培地を、評価する薬剤を含むＨＩＭに毎日交換し、合計７２時間の処理ができるようにする。６日目に、処理培地を除去して特定の薬剤代謝酵素基質を含む０．５ｍＬのＨＭＭと交換し、プレートを更に３０分間インキュベートする。アセトニトリルを添加して代謝を終了させ、遠心分離機を使用して細胞高分子を除去する。基質の薬剤代謝酵素代謝についてＬＣ／ＭＳ又はＨＰＬＣ定量を行う。誘導結果は、陰性（溶媒）対照の百分率として表される：
誘導（％）＝［活性（処理）／活性（溶媒対照）×１００％
結果を、陽性対照、オメプラゾール（１０μＭ；ＣＹＰ１Ａ２誘導用）及びリファンピン（１０μＭ；ＣＹＰ３Ａ４誘導用）からのものと比較する。
【０１９３】
実施例１９：肝毒性
本明細書中に記載のように調製した胎盤由来マトリックスで９６ウェルプレートをコーティングする。肝細胞を９６ウェルプレート内に１ウェル当たり１００μｌ中に３５，０００細胞の濃度で肝細胞代謝培地（ＨＭＭ）中に播種する。プレートを２４時間インキュベートして単層培養物が付着及び形成できるようにする。培地を、肝毒性可能性について評価する薬物を望ましい濃度で含む肝細胞インキュベーション培地に交換する。プレートを２４時間インキュベートし、望ましい細胞傷害性エンドポイントを使用して細胞傷害性をアッセイする（すなわち、細胞のＡＴＰ含有量の定量には、５０μｌの溶解バッファー、次いで、５０μｌのルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添加し、その後、マルチウェルプレートリーダーを使用して発光の定量を行う）。タモキシフェンを陽性対照として使用する。
【０１９４】
実施例２０：ＥＣＭ−ペプシン抽出物の塩基処理は、残存ペプシンを効果的に不活性化するために必要である
材料。塩酸（ＢＤＨ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ＮＪ）、ウシ血液からのヘモグロビン（Ｈ２６２５）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、トリクロロ酢酸（Ｔ０６９９）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、ペプシン（Ｐ７０００）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、水酸化ナトリウム（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）、及び胎盤由来ＥＣＭ（ＬｉｆｅＮｅｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ＩＲＭ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｅａｃｈ  ＶＡ）。
【０１９５】
ヘモグロビンに基づいたペプシン活性アッセイ。試験試料において異なる濃度のペプシンを用いた段階希釈実験を行い、このアッセイの感受性を決定してこの試験におけるその使用可能性を評価した。簡単に説明すると、１０ｍＭの塩酸中の０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲に及ぶペプシンの段階希釈物を２．０ｍｇ／ｍｌのストック溶液から調製した。０．５ｍｌの各試験溶液をガラスバイアル内で２．５ｍｌの２．０％ヘモグロビン基質溶液と混合して３７℃で正確に１０分間インキュベートし、その後、５．０ｍｌの５．０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液を添加することによって反応を停止させた。試料を１０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、上清を２８０ｎｍでのそのスペクトル吸収について試験した。試料の吸収を、ＴＣＡ溶液の添加後に添加した試験溶液に対して標準化した（内部ブランク）。
【０１９６】
ペプシン溶液の残存タンパク質分解活性に対するｐＨスイープの効果。制御したｐＨスイープを既知濃度のペプシン溶液に行い、ペプシンのタンパク質分解活性の不活性化に対するｐＨスイープの効果を決定した。簡単に説明すると、０．７５ｍｇ／ｍｌのペプシン溶液に、１．０ＭのＮａＯＨを使用してｐＨ７．４（「中性」）又はｐＨ８．２までｐＨスイープを行い、このｐＨで室温で１５分間保ち、その後、１．０ＭのＨＣｌを使用してそれをｐＨ２．０に戻した。後者の群においてｐＨスイープを達成するのに必要なＮａＯＨ及びＨＣｌ溶液の容積をモニターし、他の２群においてペプシン活性アッセイの完了前に１．０ＭのＮａＣｌを使用して塩分のレベルを調整した。
【０１９７】
ペプシン可溶化後のＥＣＭ及びＥＣＭ断片の存在下におけるペプシン溶液の残存タンパク質分解活性に対するｐＨスイープの効果。脱細胞化したヒト胎盤ＥＣＭを、０．１ＭのＨＣｌ抽出溶液中に１．０ｍｇ／ｍｌのペプシン中に５０ｍｇ／ｍｌの濃度で室温で撹拌下で５分間、４時間又は２４時間可溶化した。全ての残存ＥＣＭを遠心分離によって除去し、得られた試験試料に上記のｐＨスイープを行い、残存ペプシン活性を上記のように決定した。ＥＣＭを添加していない対応するペプシン溶液を使用して経時的なペプシン活性における変化をモニターした。
【０１９８】
試験試料において異なる既知濃度のペプシンに対する段階希釈を行い、Ａｎｓｏｎら（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９３８．２２（１）：ｐ．７９〜８９）によって記載されている従来のアッセイ形式によって定義される操作パラメーターで、ヘモグロビンに基づいたペプシン活性アッセイの感受性を評価した。吸収における変化は、ペプシン濃度の上昇に対して相対的に吸収率が上昇する、直線的挙動に従うことが見出された（図３）。この直線的挙動は、最高０．７５ｍｇ／ｍｌペプシンまでの試験試料濃度において観察された。より高い濃度では、１０分の反応時間を有する現在の形式においてこの反応に利用可能なヘモグロビン基質における限界がおそらく原因で、このパターンに従わなかった。それにもかかわらず、同じ試験群の中の異なる重複試料間の変動性のレベルは、１％未満で驚くほど低く、独立した操作間での再現性が高いことが見出された（図示せず）。その後の全ての実験について、試験溶液における０．１ＭのＨＣｌ中の０．７５ｍｇ／ｍｌペプシンの有用な濃度を選択して、全てのアッセイを、確実に、この直線領域内に当てはまるペプシン濃度で行うようにした。
【０１９９】
第１セットの実験により、ＥＣＭの非存在下におけるペプシン溶液の可逆及び不可逆の活性に対するｐＨスイープの効果を評価した。規定のペプシン溶液に、ｐＨ７．４の中性ｐＨ又はｐＨ８．２の高い塩基性ｐＨのいずれかまでの制御したｐＨスイープを行い、その後、それをｐＨ２．０に戻した（図４Ａ及び４Ｂ）。いずれのｐＨスイープも試験試料の残存ペプシン活性における有意な低下をもたらした。しかし、中性ｐＨスイープを行った試験試料はそのペプシン活性の３４．５±１．２％を保持しており、これにより、ｐＨスイープが不可逆のペプシン不活性化をもたらさなかったことが示された。反対に、ｐＨ８．２の塩基性ｐＨスイープを行った試験試料における残存ペプシン活性は、有意に低く、試料の最初のペプシン活性の５．２±１．０％の残存活性を示した。
【０２００】
試料の残存ペプシン活性に対する、ペプシン可溶化後のＥＣＭ及びＥＣＭ分解産物の効果、並びに２種のｐＨスイープ後のペプシン不活性化に対するＥＣＭ及びＥＣＭ分解産物の効果を評価するために、第２セットの実験を完了した。ヒト胎盤ＥＣＭをペプシン溶液中に懸濁し、最長２４時間インキュベートした。早い時点（５分のインキュベーション）では、認められる全ての効果が、一般的には、固体のＥＣＭの存在と関連しうる、限られたＥＣＭ加水分解を有する条件を表していることが想定された。少量のＥＣＭ分解産物は、小さな役割しか果たさないことが予想される。反対に、遅い時点（２４時間のインキュベーション）では、ＥＣＭ及びＥＣＭ分解産物の両方によって引き起こされる効果を評価することが予想される。ＥＣＭが存在しないペプシン溶液のインキュベーションでは、活性が経時的に徐々に失われる結果になった（図５）。活性におけるこの低下は、生物学的及び生化学的に活性な化合物において一般的であり、溶液中にあるときに、活性なタンパク質が経時的に徐々に変性することに起因していると考えることができる。ＥＣＭを含む試料で同様のパターンが観察された（図６）。興味深いことに、ＥＣＭを含む試験試料は、ＥＣＭを含まない試験試料よりも高いレベルのタンパク質分解活性を示した。この差は、タンパク質分解活性のある他の酵素の存在によって引き起こされる可能性がある。しかし、タンパク質分解活性が、ＥＣＭを含まない試験試料において観察されるレベルと等しくなるインキュベーション２４時間後には、これらの２群間のこの差を観察されることはできず、それらのプロテアーゼも酵素変性の事象に感受性でありうることが示唆された。
【０２０１】
ＥＣＭを含む試験試料に、中性ｐＨ（ｐＨ７．２）又は塩基性ｐＨ（ｐＨ８．２）のいずれかまでの２種のｐＨスイープを行い、ＥＣＭ及びＥＣＭ分解産物の存在下におけるペプシン不活性化に対するそれらの効果を評価した。全て時点で、いずれのｐＨスイープも試験試料の残存ペプシン活性における有意な低下をもたらした。しかし、中性ｐＨスイープ（ｐＨ７．２）を行った試験試料は、そのタンパク質分解活性の２９．５±５．６％〜３５．３±８．２％を保持したのに対して、ｐＨ８．２の塩基性ｐＨスイープを行った試験試料は、試料の最初のペプシン活性の１１．３±５．４％〜０．６±８．９％で有意に低いレベルの残存タンパク質分解活性を示した。表１に概説しているように、それぞれのｐＨスイープ中のペプシン阻害のレベルは、ＥＣＭの存在（５分）にも、又は潜在的に阻害性のＥＣＭ分解産物のレベルの上昇（４又は２４時間のインキュベーション）にも影響されなかった。
【０２０２】
【表１】
2018522824.tif 000003
【０２０３】
本試験により、以下の発見が強調された：１）中性ｐＨ（ｐＨ７．４）を乗り越えたｐＨスイープは、ペプシンの部分的な不活性化及び試料の最初のペプシン活性の約３５％の保持をもたらしただけであり、２）塩基性ｐＨ（ｐＨ８．２）を乗り越えたｐＨスイープは、ほぼ完全なペプシンの不活性化をもたらし、かつ３）ＥＣＭ及び／又はＥＣＭ分解産物の存在は、ペプシン不活性化をもたらさない。
【０２０４】
実施例２１：ヒト胎盤由来マトリックスの生物学的試験
実施例１に記載の方法によって温度感受性ヒト胎盤由来マトリックスを調製し、多様な型の細胞の培養を補助するための基質として試験した。この試験マトリックスは、温度依存的な様式でゲルに変化した。
取扱い。
【０２０５】
希釈。−８０℃で保存した試験マトリックスのストック溶液（約５ｍｇ／ｍｌ）を、試験マトリックスを液体で維持するために氷上でゆっくりと解凍した。次いで、試験マトリックス溶液を氷上で４℃のＤＰＢＳ又はＤＭＥＭのいずれかで１：２（２．５ｍｇ／ｍｌ）、１：５（１ｍｇ／ｍｌ）、１：１０（０．５ｍｇ／ｍｌ）、１：１５（０．３３ｍｇ／ｍｌ）、１：３０（０．１６ｍｇ／ｍｌ）、又は１：５０（０．１ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。
【０２０６】
コーティング。多様な濃度の試験マトリックスを組織培養プラスチックプレートに直接適用して４℃又は室温で２４時間置き（６ウェルプレートには１ｍｌ／ウェル；１２ウェルプレートには５００ｕｌ／ウェル）、試験マトリックスによってコーティングされたプレートを得た。ｐＨ８．０の試験マトリックス溶液は、組織培養プラスチックプレート上にｐＨ６．０の試験マトリックス溶液よりも均一なタンパク質粒子コーティングを生成した。
【０２０７】
試験マトリックス上での細胞培養。
細胞播種。細胞播種の前に、試験マトリックスでコーティングしたプレートに細胞培地を分注した。
【０２０８】
ヒトｉＰＳＣ培養。ヒトｉＰＳＣを凝集塊として継代し、単一細胞に分離しなかった。同様の数のｉＰＳＣ凝集塊を、対照マトリックス、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｔｗｅｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）によってコーティングしたプレートと比較して、多様な濃度の試験マトリックスでコーティングしたプレート上に播種した。両方のマトリックス上でのｉＰＳＣ播種の１日後、付着に成功したコロニーの数を計数した。
試験マトリックス上でのヒトｉＰＳＣの分化誘導。
【０２０９】
ｉＰＳＣの系列特異的な分化。ｉＰＳＣ分化誘導は、コラゲナーゼＩＶ処理による胚様体の形成によって開始された。特定の分化誘導培地条件下での懸濁培養において分化しているＥＢを、更なる成熟のために、試験マトリックスでコーティングした組織培養プレート上に播種した。神経の分化及び心筋細胞の分化を試験した。
【０２１０】
神経の分化。神経系列への分化を誘導するＥＢを、Ｎ２／Ｂ２７の存在下で７日間懸濁培養し、次いで、Ｎ２／Ｂ２７及びｂＦＧＦ処理での７〜１０日間の更なる成熟のために、試験マトリックスでコーティングしたプレート上に播種した。
【０２１１】
心筋細胞の分化。ＢＭＰ−４及びアクチビンＡを７日間処理することによって最初のＥＢ懸濁培養を行い、次いで、試験マトリックスでコーティングしたプレート上に播種してＢＭＰ−４、アクチビン−Ａ、ｂＦＧＦ及びアスコルビン酸の存在下で更に１０〜１４日間置いた。
【０２１２】
マーカー発現による、分化した細胞の特徴付け。ｉＰＳＣ由来の神経細胞又は心筋細胞を、神経（ネスチン、Ａ２Ｂ５、Ｔｕｊ−１）又は心筋細胞に特異的なマーカーで染色することによって同定し、次いで、イメージング又はフローサイトメトリーによって検出した。
【０２１３】
試験マトリックス上での細胞付着（ｐＨ依存性）。
試験マトリックスでコーティングしたプレート上にヒトｉＰＳＣを播種した。ヒトｉＰＳＣコロニーは９０％を超えてｐＨ８．０の試験マトリックス上に付着するのに成功したのに対して、ｐＨ６．０の試験マトリックスは約４０％のｉＰＳＣコロニーの付着を支持することしかできなかった。
【０２１４】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１５年５月２９日提出の米国特許仮出願第６２／１６８３９７号の利益を主張するものであり、当該出願の内容は参照によりその全体をすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月23日(2018.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胎盤組織を失活させて失活胎盤組織を製造するステップと、
（ｂ）前記失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと
を含む、ｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有する胎盤由来マトリックスを調製する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が前記胎盤組織を非変性洗浄剤で処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記失活胎盤組織をホモジナイズするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記失活胎盤組織を４℃でホモジナイズする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記胎盤由来マトリックスを凍結する又は凍結乾燥して海綿構造体を製造するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記消化液がペプシン、酸又はその組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記消化液がペプシン及び酸を含み、前記酸が塩酸（ＨＣｌ）であり、前記消化液のペプシンの濃度が４００〜７００ユニット／ｍｌであり、前記消化液のＨＣｌの濃度が０．０１Ｍ〜１．０Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で細胞を培養するステップを含む、細胞培養の方法であって、前記胎盤由来マトリックス上又は内部で前記細胞を保存するステップをさらに含む、方法。
【請求項９】
前記胎盤由来マトリックス上又は内部の前記細胞が凍結保存により保存される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の喪失を阻害する又は減少する方法であって、前記タンパク質を請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスに、凍結又は凍結乾燥に起因するタンパク質の生物活性の喪失を阻害する又は減少するのに十分な有効量で曝露するステップを含む、方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスに細胞を混合させて、前記細胞と前記胎盤由来マトリックスの混合物を製造するステップと、
（ｂ）前記混合物を目的の部位に注入するステップと
を含む、細胞送達の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞の血管、筋、又は神経分化を促進する方法であって、前記多能性幹細胞又は組織特異的前駆細胞を、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックス上又は内部で培養するステップを含む、方法。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される胎盤由来マトリックスを目的の組織部分のすぐ下に移植するステップと、
（ｂ）前記胎盤由来マトリックスの上の組織部分を切除するステップと
を含む、組織を切除する方法。
【請求項１４】
前記組織が胃腸管の固着又は扁平新生物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
失活胎盤組織を含む胎盤由来マトリックスであって、ｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有する胎盤由来マトリックス。
【請求項１６】
ハイドロゲルである、請求項１５に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項１７】
胎盤由来マトリックスの乾燥重量１ｍｇ当たり２００ｎｇ以下のＤＮＡを含む、請求項１５に記載の胎盤由来マトリックス。
【請求項１８】
胎盤由来マトリックスを基質の表面に被覆する方法であって、前記胎盤由来マトリックスがｐＨ８．０又はそれよりも高いｐＨを有し、前記方法が
（ａ）胎盤組織の少なくとも一片を失活させて失活胎盤組織を製造するステップと、
（ｂ）前記失活胎盤組織を消化液で消化して胎盤由来マトリックスを製造するステップと、
（ｃ）基質の表面の少なくとも一部を前記胎盤由来マトリックスで被覆するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
前記胎盤由来マトリックスがハイドロゲルであり、前記方法が前記胎盤由来マトリックスを前記表面でゲル化するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記失活胎盤組織のＤＮＡ量が、ステップ（ａ）前の前記胎盤組織のＤＮＡ量と比べて少なくとも９０％減少している、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2018522824.tif 000012