(57)【要約】  本発明は、一般的に、ぶた種被験体において免疫応答を誘発する方法に関する。特に、免疫応答を誘導し、感染性病原体を撃滅する被験体の能力を高めるための免疫調節薬組成物を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の免疫調節薬組成物をぶた種被験体に投与することを含み、前記免疫調節薬組成物が、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフ、少なくとも１つの非免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列と、カチオン性リポソームとを含むものである、レシピエントぶた種被験体において免疫応答を誘発する方法。
【請求項２】
前記リポソームの送達媒体が、多重層ベシクル脂質および押出し処理された脂質からなる群より選択される脂質を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポソームの送達媒体が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロールからなる群より選択される脂質のペアを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節薬組成物がさらに生物学的薬剤を含むものであるか、または該薬剤と併用して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与が感染性因子に対する曝露の前である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記投与が感染性因子に対する曝露の後である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫調節薬組成物が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的薬剤が、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌薬および任意のその組合せからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ぶた種被験体が食糧生産ブタ動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに薬学的に許容され得る担体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ブタに免疫調節薬組成物を投与することを含み、前記免疫調節薬組成物が、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列とカチオン性リポソームとを含むものである、農場飼育ブタの生産の改善方法。
【請求項１２】
ブタに免疫調節薬組成物を投与することを含み、前記免疫調節薬組成物が、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列とカチオン性リポソームとを含むものである、農場飼育ブタの生存性の改善方法。
【請求項１３】
豚に有効量の免疫調節薬組成物を投与することを含み、前記免疫調節薬が：
ａ．カチオン性脂質送達媒体；および
ｂ．免疫原をコードしていない核酸分子を含むものであり、前記投与により、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による抗原刺激後の前記豚の下痢が低減される、豚の下痢を低減させる方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が細菌由来の核酸ベクターまたはその断片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子がＤＮＡプラスミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポソーム送達媒体が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロールからなる群より選択される脂質のペアを含むものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
投与が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による前記抗原刺激前に行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫調節薬組成物がさらに生物学的薬剤を含むものであるか、または該薬剤と併用して投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
豚に免疫調節薬組成物を投与することを含み、前記免疫調節薬が：
ａ．カチオン性脂質送達媒体；および
ｂ．免疫原をコードしていない核酸分子を含むものであり、前記投与により、ぶた繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による抗原刺激後の前記豚の体重増加が増大する、豚の体重増加を増大させる方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が細菌由来の核酸ベクターまたはその断片である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子がＤＮＡプラスミドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソーム送達媒体が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロールからなる群より選択される脂質のペアを含むものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
投与がＰＲＲＳＶによる前記抗原刺激前に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫調節薬組成物がさらに生物学的薬剤を含むものであるか、または該薬剤と併用して投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的薬剤がＰＲＲＳＶワクチンである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年７月３１日に出願され、発明の名称が「ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＩＮ  ＰＯＲＣＩＮＥ  ＳＰＥＣＩＥＳ（ぶた種における免疫応答の増強）」である米国特許仮出願第６２／１９９，８４８の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）に基づく恩典を主張するものであり、この仮出願の内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般的に、自然免疫を賦活することにより被験体において免疫応答を誘発する方法に関する。特に、ぶた種の構成員の自然免疫を賦活するために免疫調節薬組成物を使用する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、ぶた種被験体の自然免疫を調節するために免疫賦活性プラスミドを使用する方法に関する。免疫賦活性プラスミドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４またはその組合せの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：１の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：４の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：２の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：３の配列を含むものであり得る。
【０００３】
他の態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４またはその組合せの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：１の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：４の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：２の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：３の配列からなるものであり得る。
【０００４】
いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含んでいないものである。他の態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子でない選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含むものである。
【０００５】
また、本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列と薬学的に許容され得る担体を含む医薬用製剤に関する。
【０００６】
さらに、本発明は、カチオン性リポソーム送達媒体と本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を含む免疫調節薬組成物に関する。
【０００７】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を使用する方法に関する。好適な使用方法としては、ぶた種の被験体への治療的投与が挙げられる。かかる治療的投与には、被験体（１例または複数例）の予防的処置、発症予防処置および感染後処置が包含される。
【０００８】
本発明は、被験体において免疫応答を賦活または誘発する方法に関する。いくつかの態様では、該方法は、被験体に本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することにより被験体において免疫応答を賦活することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、被験体に本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を投与することにより被験体において免疫応答を賦活することを含むものである。いくつかの態様では、該免疫調節薬が、生物学的薬剤（例えばワクチンなど）もまた含むものであり得るか、または該薬剤と併用して投与され得る。
【０００９】
また、本発明により、豚に有効量の免疫調節薬組成物を投与することを含み、該免疫調節薬がカチオン性脂質送達媒体および免疫原をコードしていない核酸分子を含むものであり、前記投与により、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による抗原刺激後の前記豚の下痢が低減される、豚の下痢を低減させる方法を提供する。
【００１０】
また、本発明により、豚に免疫調節薬組成物を投与することを含み、該免疫調節薬がカチオン性脂質送達媒体および免疫原をコードしていない核酸分子を含むものであり、前記投与により、ぶた繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による抗原刺激後の前記豚の体重増加が増大する、豚の体重増加を増大させる方法を提供する。
【００１１】
他の目的および特色は一部において自明であり、一部において本明細書に以下に示している。
【００１２】
以下の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の特定の態様のさらなる実例を示すために含めている。本発明は、この図面うちの１つ以上を、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細説明と合わせて参照することにより、よりよく理解され得よう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｐＭＢ７５．６プラスミド（配列番号：２）のマップを示す。
【図２】図２は、ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド（配列番号：１）のマップを示す。
【図３】図３は、ｐＬａｃＺ７５．６プラスミド（配列番号：４）のマップを示す。
【図４】図４は、０（無地，明るいグレー）、３（無地，暗いグレー）、７（斜線）、１０（黒のひし形）、１４（無地，暗い赤）、１８（無地，ピンク）、２１（無地，青）、２４（無地，明るい青）および２８（無地，暗い青）日目の各処置群（Ｔｘｔ  １：ワクチンのみ；Ｔｘｔ  ２：ワクチンおよび２００μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ３：ワクチンおよび５０μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ４：ワクチンおよび１０μｇの免疫調節薬組成物；ならびにＴｘｔ  ５：希釈剤（５％デキストロースと水））のＨ１Ｎ１に対する赤血球凝集抑制の幾何平均をグラフで示したものである。
【図５】図５は、０（無地，明るいグレー）、３（無地，暗いグレー）、７（斜線）および２１（無地，青）日目の各処置群（Ｔｘｔ  １：ワクチンのみ；Ｔｘｔ  ２：ワクチンおよび２００μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ３：ワクチンおよび５０μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ４：ワクチンおよび１０μｇの免疫調節薬組成物；ならびにＴｘｔ  ５：希釈剤（５％デキストロースと水））のＨ３Ｎ２に対する赤血球凝集抑制の幾何平均をグラフで示したものである。
【図６】図６は、０（無地，明るいグレー）、３（無地，暗いグレー）、７（斜線）、１０（黒のひし形）、１４（無地，暗い赤）、１８（無地，ピンク）、２１（無地，青）、２４（無地，明るい青）および２８（無地，暗い青）日目の各処置群（Ｔｘｔ  １：ワクチンのみ；Ｔｘｔ  ２：ワクチンおよび２００μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ３：ワクチンおよび５０μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ４：ワクチンおよび１０μｇの免疫調節薬組成物；ならびにＴｘｔ  ５：希釈剤（５％デキストロースと水））のＨ１Ｎ１に対する赤血球凝集抑制の実際の平均をグラフで示したものである。
【図７】図７は、０（無地，明るいグレー）、３（無地，暗いグレー）、７（斜線）および２１（無地，青）日目の各処置群（Ｔｘｔ  １：ワクチンのみ；Ｔｘｔ  ２：ワクチンおよび２００μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ３：ワクチンおよび５０μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ４：ワクチンおよび１０μｇの免疫調節薬組成物；ならびにＴｘｔ  ５：希釈剤（５％デキストロースと水））のＨ３Ｎ２に対する赤血球凝集抑制の実際の平均をグラフで示したものである。
【図８】図８は、２１日目において各処置群（Ｔｘｔ  １：ワクチンのみ；Ｔｘｔ  ２：ワクチンおよび２００μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ３：ワクチンおよび５０μｇの免疫調節薬組成物；Ｔｘｔ  ４：ワクチンおよび１０μｇの免疫調節薬組成物；ならびにＴｘｔ  ５：希釈剤（５％デキストロースと水））でＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２分離株に対してセロコンバージョンされた豚の割合をグラフで示したものである。
【図９】図９は、ワクチンなし／抗原刺激なし（白のひし形）、ワクチンなし／抗原刺激あり（黒四角）、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（白三角）、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（白四角）、Ｒｘ  ＩＩＩワクチン＋抗原刺激（星形）を含む各処置群の抗原刺激後の豚の毎日の平均挙動スコアをグラフで示したものである。
【図１０】図１０は、ワクチンなし／抗原刺激なし（白のひし形）、ワクチンなし／抗原刺激あり（白四角）、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（黒三角）、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（黒四角）、Ｒｘ  ＩＩＩワクチン＋抗原刺激（星形）を含む各処置群の抗原刺激前から抗原刺激後１０日目までの豚の平均体温をグラフで示したものである。
【図１１】図１１は、ワクチンなし／抗原刺激なし（黒のひし形）、ワクチンなし／抗原刺激あり（黒四角）、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（白三角）、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（バツ印）、Ｒｘ  ＩＩＩワクチン＋抗原刺激（星形）を含む処置群のビルレントＰＲＲＳウイルスでの抗原刺激前と後の群毎の平均体重をグラフで示したものである。
【図１２】図１２は、−３９日目から０日目まで（黒）、−３９日目から６日目まで（グレー）および−３９日目から１０日目まで（ドット柄）の増加量を含む−３９日目から１０日目までの群毎の平均体重増加量をグラフで示したものである。
【図１３】図１３は、０日目（黒）、６日目（グレー）および１０日目（ドット柄）の群毎の抗原刺激後の平均体重をグラフで示したものである。
【図１４】図１４は、０〜６日目（黒）、０〜１０日目（グレー）および６〜１０日目（ドット柄）の抗原刺激後の体重増加をグラフで示したものである。
【図１５】図１５は、０〜６日目（黒）、０〜１０日目（グレー）および６〜１０日目（ドット柄）の抗原刺激後の体重増加割合をグラフで示したものである。
【図１６】図１６は、抗原刺激なし（黒四角）、抗原刺激あり（白のひし形）、Ｒｘ  １ワクチン＋１０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（黒四角と白四角）、Ｒｘ  ２ワクチン＋５０μｇの免疫調節薬＋抗原刺激（白四角）およびＲｘ  ３（黒のひし形と白のひし形）を含む群毎の肺重量をグラフで示したものである。
【図１７】図１７は、ワクチンなし／抗原刺激なし、ワクチンなし／抗原刺激あり、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、およびＲｘ  ＩＩＩワクチン／抗原刺激ありを含む群毎の体重に対する割合としての肺重量をグラフで示したものである。
【図１８】図１８は、抗原刺激なし（白丸）、ワクチンなし／抗原刺激あり（黒四角）、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり（黒三角）、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり（黒丸）、およびＲｘ  ＩＩＩワクチン／抗原刺激あり（黒のひし形）を含む処置群から分離したＰＲＲＳウイルスをグラフで示したものである。
【図１９】図１９は、群毎の分離されたウイルスの肺内力価をグラフで示したものである。
【図２０】図２０は、対照、抗原刺激、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、およびＲｘ  ＩＩＩワクチン／抗原刺激ありを含む処置群の肺胞中隔の肥厚および肥厚の分布に基づいた肺の病態スコアをグラフで示したものである。
【図２１】図２１は、ワクチンなし／抗原刺激なし、ワクチンなし／抗原刺激、Ｒｘ  Ｉワクチン＋１０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、Ｒｘ  ＩＩワクチン＋５０μｇの免疫調節薬／抗原刺激あり、およびＲｘ  ＩＩＩワクチン／抗原刺激ありを含む各処置群の個々の動物のインターフェロン力価をグラフで示したものである。
【図２２】図２２は、微視的病変を評価するために組織試料を採取した肺領域を示す。
【図２３】図２３は、処置群のＰＲＲＳＶの肺内ウイルス負荷をプラセボ処置豚と比較してグラフで示したものである。
【図２４】図２４は、対照群と各免疫調節薬処置群間の各動物（−１日目、０日目および２日目）について肺葉スコアの総計で表されるグロスでの肺の病態を示す。
【図２５】図２５は、対照群と各免疫調節薬処置群（−１日目、０日目および２日目）の血清ＩＦＮ−αレベルを示す。
【図２６】図２６は、−２、４、７、１０および１４日目におけるプラセボ、２５μｇの免疫調節薬、５０μｇの免疫調節薬、７５μｇの免疫調節薬および陰性対照を含む処置群の平均血清ウイルス血症をグラフで示したものである。
【図２７】図２７は、プラセボ、２５μｇの免疫調節薬、５０μｇの免疫調節薬、７５μｇの免疫調節薬および陰性対照を含む処置群間のＰＲＲＳＶの平均肺内ウイルス負荷を示す。
【図２８】図２８は、プラセボ、２５μｇの免疫調節薬、５０μｇの免疫調節薬、７５μｇの免疫調節薬および陰性対照を含む処置群間の微視的肺病変スコアを示す。
【図２９】図２９は、処置群間の離乳子豚における腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｆ１８線毛、ＥＡＳＴ１、ＳＴａ、およびＳＴｂ毒素、ならびにＡＩＤＡアドヘシン遺伝子）と関連している下痢の有病率を示す。
【図３０】図３０は、磁気細胞分離を用いて分離された個々の血液細胞型を示す。
【図３１】図３１は、生理学的に重要な濃度のＩＣ−Ｅｘ．１によりＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＦＮ−αの発現が賦活されることを示す。
【図３２】図３２は、ＣＤ１７２ａ−細胞がＩＣ−Ｅｘ．１または既知の免疫賦活薬での賦活後にＩＦＮ−αを産生しないことをグラフで示したものである。
【図３３】図３３は、ＣＤ１７２ａ−細胞ではＴＮＦαが産生されないことをグラフで示したものである。
【図３４】図３４Ａ〜Ｄは、細胞培地対照での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図３５】図３５Ａ〜Ｄは、ＣｐＧ  ＯＤＮでの賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図３６】図３６Ａ〜Ｄは、ＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬ）での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図３７】図３７Ａ〜Ｄは、ＩＣ−Ｅｘ．１（１０ｎｇ／ｍＬ）での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図３８】図３８Ａ〜Ｄは、ＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬ０での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図３９】図３９Ａ〜Ｄは、リポソーム（１００ｎｇ／ｍＬ）での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図４０】図４０Ａ〜Ｄは、ＩＣ−Ｅｘ．１（１０ｎｇ／ｍＬ）での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図４１】図４１Ａ〜Ｄは、リポソーム（１０ｎｇ／ｍＬ）での賦活後のＣＤ１４＋、２つの型の伝統的樹状細胞および形質細胞様樹状細胞におけるＩＦＮ−α産生を示す。
【図４２】図４２は、ＩＦＮ−αを産生する細胞のパーセンテージをグラフで示したものである。
【図４３】図４３は、ＩＦＮ−α産生細胞によって生成された平均蛍光強度をグラフで示したものである。
【図４４】図４４は、いろいろな免疫賦活薬または免疫賦活薬濃度での賦活後のＩＦＮ−γ産生の比較をグラフで示したものである。
【図４５】図４５は、ＩＣ−Ｅｘ．１および既知の免疫賦活薬での賦活後のＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＬ−４産生を示す。
【図４６】図４６は、ＩＣ−Ｅｘ．１および既知の免疫賦活薬での賦活後のＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＬ−１β産生を示す。
【図４７】図４７は、ＩＣ−Ｅｘ．１および既知の免疫賦活薬での賦活後のＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＬ−６産生を示す。
【図４８】図４８は、ＩＣ−Ｅｘ．１および既知の免疫賦活薬での賦活後のＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＬ−８産生を示す。
【図４９】図４９は、対照またはＩＣ−Ｅｘ．１での処置後、ぶた繁殖呼吸障害症候群ウイルスに感染したマクロファージのパーセンテージを比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に従い、レシピエント被験体において免疫応答を誘発し得る組成物ならびに使用方法が見出された。特に、本発明は、核酸組成物または免疫調節薬組成物およびその使用に関する。かかる免疫調節薬組成物は、ぶた種の構成員の免疫機構を調節するために使用され得ることが見出された。本発明は、微生物、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、カビ、真菌、酵母、寄生虫および当該技術分野で知られた他の微生物によって引き起こされる感染性疾患の処置および予防に特に有用である。該組成物および該免疫調節薬組成物の使用方法を以下により詳細に論考する。
【００１５】
Ｉ．組成物
本発明において有用な組成物、例えば本明細書に記載のものは、一般的に、感染性疾患の予防的治療薬、発症予防的治療薬または処置治療薬として使用され得るものである。かかる組成物を本明細書において免疫調節薬組成物と称する。免疫調節薬組成物は、少なくとも、レシピエント被験体において免疫応答を誘導し得る免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫応答は自然免疫応答である。いくつかの態様では、免疫応答は自然免疫応答と獲得免疫応答の組合せである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はリポソーム送達媒体もまた含むものであり得る。
【００１６】
Ａ．核酸
いくつかの態様では、本発明は、感染性疾患原因因子の処置または予防に有用な核酸分子に関する。本明細書に記載の核酸分子は免疫賦活性プラスミド内に、線状の二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、アミノ酸配列、リボ核酸（ＲＮＡ）またはその組合せとして含められ得る。いくつかの態様では、本発明は、免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列を含む核酸分子、ベクターおよび宿主細胞（インビトロ、インビボまたはエキソビボ）に関する。
【００１７】
本明細書に記載の核酸分子はＣｐＧモチーフの含有量が高いものである。いくつかの態様では、該核酸分子は、脊椎動物の核酸配列にみられるＣｐＧモチーフの頻度と比べて２０％超のＣｐＧモチーフを含むものである。かかるＣｐＧモチーフは、免疫賦活性ＣｐＧモチーフおよび非賦活性ＣｐＧモチーフを包含している。
【００１８】
いくつかの態様では、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含んでいない免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列に関する。該プラスミドは、選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く欠いているものであり得る。例えば、本明細書に記載のｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く含んでいないものである。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列を配列番号：１に示す。
【００１９】
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含んでいないものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含んでいないものである。例えば、該プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含んでいないものである。いくつかの態様では、本明細書に記載のプラスミドは好ましくは、免疫原をコードしていないものである。
【００２０】
いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子でない選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を含むものであり得る。例えば、本明細書に記載のｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドは、スクリーニング可能マーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を含むものである。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のマップを図３に示し、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列を配列番号：４として示す。図３に示すように、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６はｐＧＣＭＢ７５．６と類似しているが、ＬａｃＺスクリーニング可能マーカーを含んでいる。
【００２１】
ｐＭＢ７５．６、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドのヌクレオチド配列は、その免疫賦活特性に有意に有害に影響を及ぼさない一定の程度までは異なっていてもよいことは認識されよう。いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）を含むものである。
【００２２】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）を含むものである。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：２の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：２の配列を含むものである。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：３の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：３の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：３の配列を含むものである。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）からなるものである。
【００２６】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）からなるものである。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：２の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：２の配列からなるものである。
【００２８】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：３の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：３の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：３の配列からなるものである。
【００２９】
本発明の別の重要な態様により、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４とハイブリダイズする核酸配列を含む、免疫応答を賦活し得る免疫賦活性ＤＮＡ配列または免疫賦活性プラスミドを提供する。好適な核酸配列としては、本発明の核酸と相同的である、実質的に類似している、または同一であるものが挙げられる。いくつかの態様では、相同核酸配列は、配列番号：１と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：４と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：２と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：３と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。配列類似性は、当該技術分野で知られたいくつかのアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載のＢＬＡＳＴを用いて計算され得る。該核酸は、遺伝コードの縮重のため上記の核酸と配列が異なる場合があり得る。一般に、参照配列は１８個のヌクレオチド、さらに通常は３０個以上のヌクレオチドであり、比較の目的のために該組成物の全核酸配列を含むものであってもよい。
【００３０】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が本明細書において想定される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションなどの条件が挙げられる。別の例は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性させ、断片化処理したサケ精子ＤＮＡの溶液中での一晩のインキュベーション後、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃での洗浄である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、上記の具体的な条件の少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％程度にストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件は当該技術分野で知られており、また、本発明の核酸のホモログを同定するためにも使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６，ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。
【００３１】
本明細書に記載のＤＮＡ分子の変異型ヌクレオチドもまた、該変異型が、本明細書に記載の自然免疫応答賦活能を維持している核酸配列を含むものである限り、使用され得る。かかる変異体のＤＮＡ配列は、通常、１個以上のヌクレオチドが異なっている。配列変更は置換、挿入、欠失またはその組合せであり得る。クローン化遺伝子の変異誘発のための手法は当該技術分野で知られている。部位特異的変異誘発のための方法は、Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２，１９９３；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３，１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９，１９８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８において知得され得、すべて、引用により本明細書に組み込まれる。要約すると、本発明は、被験体の自然免疫応答を賦活し得る核酸配列およびそのバリアントまたは変異型に関する。また、本発明は、本記載の核酸配列にコードされた中間ＲＮＡ、ならびに本明細書に記載の核酸にコードされた任意の結果物のアミノ酸配列も包含している。
【００３２】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が配列番号１、２、３および４に示す配列と異なっている場合、該プラスミド内のＣｐＧジヌクレオチドは好ましくはインタクトなままである。あるいはまた、該プラスミドのヌクレオチド配列が、ＣｐＧジヌクレオチドが除去されているように改変される場合、該プラスミドの配列は、別の位置が、該プラスミド内のＣｐＧジヌクレオチドの総数が同じままであるように改変され得る。また、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列に既に存在しているものに加えてさらなるＣｐＧジヌクレオチドを該プラスミドに導入してもよい。したがって、例えば、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドは好ましくは、少なくとも約２００個、少なくとも約２２０個、少なくとも約２４０個、少なくとも約２６０個、少なくとも約２７０個、少なくとも約２７５個、少なくとも約２８０個、少なくとも約２８３個、少なくとも約２８５個、または少なくとも約２８８個のＣｐＧジヌクレオチドを含むものである。例えば、免疫賦活性プラスミドは２８３個のＣｐＧジヌクレオチドを含むものであり得る。
【００３３】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が本明細書に示した配列から変更する場合、該プラスミド内のＣｐＧモチーフの型は、結果的にもたらされるサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化が調節されるように変更される。例えば、特定の閾値の免疫賦活性プラスミド／ＤＮＡに応答性の特定のサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化を増大させるために免疫賦活性ＣｐＧモチーフの数を増加させてもよい。さらなる一例として、特定のサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化を低減させるため、および／または他のＤＮＡ監視機構分子の活性化を増大させるために非免疫賦活性ＣｐＧモチーフの数を増加させてもよい。
【００３４】
特に、本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列と薬学的に許容され得る担体を含む医薬用製剤に関する。
【００３５】
Ｂ．免疫調節薬
本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドとの使用のための好適な免疫調節薬組成物は、米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１Ａ１号および同第２０１３／０２９５１６７Ａ１号に記載されており、どちらの内容も引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３６】
免疫調節薬組成物は、リポソーム送達媒体および本明細書に記載の少なくとも１種類の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を含むものである。
【００３７】
好適なリポソーム送達媒体の一例は、処置対象の被験体の組織に核酸分子を送達し得る脂質組成物を含むものである。リポソーム送達媒体は好ましくは、核酸分子および／または生物学的薬剤が送達されるのに充分な量の時間、被験体内で安定なままでいることができるものである。例えば、リポソーム送達媒体は、レシピエント被験体内で少なくとも約５分間、少なくとも約１時間または少なくとも約２４時間安定なものである。
【００３８】
本発明のリポソーム送達媒体の一例は、細胞内に核酸分子を送達するために細胞の原形質膜と融合し得る脂質組成物を含むものである。核酸分子が１種類以上のタンパク質をコードしているものである場合、該核酸：リポソーム複合体は、好ましくは少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）のタンパク質発現／ミリグラム（ｍｇ）全組織タンパク質／マイクログラム（μｇ）送達核酸のトランスフェクション効率を有するものである。例えば、核酸：リポソーム複合体のトランスフェクション効率は、少なくとも約１０ｐｇのタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸；または少なくとも約５０ｐｇのタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸であり得る。該複合体のトランスフェクション効率は１フェムトグラム（ｆｇ）のタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸という低値であってもよいが、上記の量がより好ましい。
【００３９】
本発明の好ましいリポソーム送達媒体の一例は、直径が約１００〜５００ナノメートル（ｎｍ）のものである。例えば、リポソーム送達媒体は、直径が約１５０〜４５０ｎｍまたは約２００〜４００ｎｍのものであり得る。
【００４０】
好適なリポソームとしては、任意のリポソーム、例えば、当業者に知られた遺伝子送達方法に一般的に使用されているものなどが挙げられる。好ましいリポソーム送達媒体は多重層ベシクル（ＭＬＶ）脂質および押出し処理された脂質を含むものである。ＭＬＶの調製方法は当該技術分野でよく知られている。より好ましいリポソーム送達媒体は、ポリカチオン性脂質組成物（すなわち、カチオン性リポソーム）を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールとコンジュゲートさせたコレステロール骨格を有するリポソームを含むものである。例示的なカチオン性リポソーム組成物としては、限定されないが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロール、およびその組合せが挙げられる。送達媒体としての使用に最も好ましいリポソーム組成物の一例は、ＤＯＴＩＭとコレステロールを含むものである。
【００４１】
好適な核酸分子としては、本明細書に記載の任意の免疫賦活性プラスミドが挙げられる。コード核酸配列は、タンパク質またはペプチドの少なくとも一部分をコードしているものであるが、非コード配列は、タンパク質またはペプチドのいずれの部分もコードしていないものである。本発明によれば、「非コード」核酸は、転写単位の調節領域、例えばプロモーター領域を含んでいてもよい。用語「空ベクター」は、用語「非コード」と互換的に使用される場合があり得、特に、タンパク質コード部分がない核酸配列、例えば、遺伝子挿入配列を有しないプラスミドベクターをいう。本明細書に記載のプラスミドにコードされたタンパク質の発現は免疫応答の誘導に必要とされない；したがって、該プラスミドに、転写制御配列に作動可能に連結されたなんらのコード配列を含める必要はない。しかしながら、該組成物に、免疫原および／またはサイトカインをコードしている核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含めることにより、さらなる利点が得られる場合があり得る（すなわち、抗原特異的な増強された免疫）。免疫原および／またはサイトカインをコードしているかかる核酸配列は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドに含めてもよく、該組成物中の別個の核酸（例えば、別個のプラスミド）に含めてもよい。
【００４２】
リポソームと本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列との複合体化は、当該技術分野で標準的な方法を用いて、または米国特許第６，６９３，０８６号（その内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行われ得る。リポソームに添加するプラスミドの好適な濃度としては、全身性免疫応答が誘発されるような充分な量のプラスミドが被験体に送達されるために有効な濃度が挙げられる。例えば、約０．１μｇ〜約１０μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得るか、約０．５μｇ〜約５μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得るか、または約１．０μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得る。組成物中の脂質に対するプラスミドの比（プラスミド（μｇ）：脂質（ｎｍｏｌ））は重量基準でプラスミド：脂質が少なくとも約１：１（例えば、プラスミド１μｇ：脂質１ｎｍｏｌ）であり得る。例えば、脂質に対するプラスミドの比は少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０または少なくとも約１：２０であり得る。本明細書において示す比は、組成物中のカチオン性脂質の量に対するものであり、組成物中の脂質の総量に対するものではない。本発明の組成物中の脂質に対するプラスミドの比は、好適には約１：１〜約１：８０のプラスミド：脂質（重量基準）；約１：２〜約１：４０のプラスミド：脂質（重量基準）；約１：３〜約１：３０のプラスミド：脂質（重量基準）；または約１：６〜約１：１５のプラスミド：脂質（重量基準）である。
【００４３】
Ｃ．生物学的薬剤
本明細書に記載の任意の免疫調節薬組成物は、リポソーム送達媒体および少なくとも１種類の本明細書に記載のプラスミドに加えて、さらに少なくとも１種類の生物学的薬剤を含むものであってもよい。
【００４４】
好適な生物学的薬剤は、疾患の予防または処置に有効な薬剤である。かかる生物学的薬剤としては、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌薬または任意のその組合せが挙げられる。好適な免疫増強タンパク質は、免疫を増強することが知られているタンパク質である。非限定的な一例として、サイトカイン（これは、１つのファミリーのタンパク質群を包含している）は既知の免疫増強タンパク質ファミリーである。好適な免疫原は、免疫原を被験体に投与すると、該被験体の組織内にみられるものと同じまたは類似のタンパク質に対して免疫原特異的免疫応答を起こすように体液性および／または細胞性免疫応答を誘発するタンパク質である。免疫原としては、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌によって発現される病原性の抗原が挙げられ得る。好ましい抗原としては、被験体において感染性疾患を引き起こす生物体に由来する抗原が挙げられる。本発明によれば、免疫原は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘発するタンパク質（天然に存在するか、または合成により誘導されたもの）のいずれかの部分であってもよい。そのため、抗原または免疫原のサイズは、約５〜１２個のアミノ酸という小さいものであってもよく、完全長のタンパク質という大きいものであってもよく、その間の任意のサイズが包含され得る。抗原は、多量体タンパク質または融合タンパク質であってもよい。抗原は、精製された抗原であってもよい。あるいはまた、該免疫増強タンパク質または免疫原は、該免疫賦活性プラスミドにコードさせてもよく、該免疫調節薬組成物中に含めた別の核酸にコードさせてもよい。該免疫増強タンパク質または免疫原を免疫調節薬組成物中の核酸分子にコードさせる場合、該免疫原が被験体の組織内で発現され、それにより、該被験体において非特異的免疫応答に加えて免疫原特異的免疫応答が誘発されるように、該免疫増強タンパク質または免疫原をコードしている核酸配列を転写制御配列に作動可能に連結させる。免疫原性、例えば、病原体抗原の免疫原性またはサイトカイン活性についてスクリーニングするための手法は当業者に知られており、さまざまなインビトロアッセイおよびインビボアッセイが挙げられる。
【００４５】
生物学的薬剤がワクチンである場合、ワクチンとしては、ウイルス、細菌もしくは寄生虫の感染性の生ワクチンまたはウイルス、細菌もしくは寄生虫の死菌／不活化ワクチンが挙げられ得る。１種類以上のワクチン、生ワクチンまたは不活化ワクチンが本発明の免疫調節薬組成物と併用して使用され得る。好適なワクチンとしては、当該技術分野で知られたぶた種に対するものが挙げられる。
【００４６】
生物学的薬剤は抗菌薬であってもよい。好適な抗菌薬としては：キノロン系、好ましくはフルオロキノロン系、β−ラクタム、およびマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミン（ＭＬＳ）系抗生物質が挙げられる。
【００４７】
好適なキノロン系としては、ベノフロキサシン、ビンフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、ジェミフロキサシン、イバフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、プラドフロキサシン、パーフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシンおよびトスフロキサシンが挙げられる。好ましいフルオロキノロン系としては、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシンおよびプラドフロキサシンが挙げられる。好適なナフチリドンとしてはナリジクス酸が挙げられる。
【００４８】
好適なβ−ラクタム系としては、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖ［すなわち、アモキシシリン／クラブラン酸］、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェノキシメチルペニシリン、ピペラシリン、プロカインペニシリン、テモシリンおよびチカルシリン）；セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファロニウム、セファマンドール、セファプリリン、セファゾリン、セフェピム、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフキノム、セフタジジム、セフチオフル、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファロチンおよびデフォテタン）；カルバペネムならびにペネム（例えば、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネムおよびメロペネム）；モノバクタム（例えば、アズトレオナム、ノカルジシンＡ、タブトキシニン−β−ラクタムおよびチゲモナム）；ならびにβ−ラクタマーゼ阻害薬（例えば、クラブラン酸、スルバクタムおよびタゾバクタム）が挙げられる。好ましいβ−ラクタム系としてはセファロスポリン、特に、セファゾリンが挙げられる。
【００４９】
好適なＭＬＳ系抗生物質としては、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシンおよび任意のマクロライド系抗生物質が挙げられる。好ましいリンコサミド系抗生物質はピルリマイシンである。
【００５０】
他の抗菌薬としては、アミノグリコシド、クロピドール、ジメトリダゾール、エリスロマイシン、フラミセチン、フラゾリドン、ハロフジノン、２−ピリドン、ロベニジン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、種々のプレウロムチリン（例えば、チアムリンおよびバルネムリン）、ならびに種々のストレプトマイシン（例えば、モネンシン、ナラシンおよびサリノマイシン）が挙げられる。
【００５１】
ＩＩ．方法
本発明の目的は、免疫調節薬組成物、免疫賦活性プラスミド（またはＤＮＡ配列）、および免疫を賦活して未感染被験体に対して防御免疫、感染被験体に対して防御免疫、未感染被験体に対して免疫の増強、感染被験体に対して免疫の増強、感染被験体に対して治療的免疫またはその組合せをもたらす方法を提供することである。そのため、本発明の組成物は、被験体を予防的に防御するために使用され得るか、または被験体を処置するために使用され得る。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を被験体に投与し、該被験体において免疫機構を賦活することを含むものである。
【００５２】
Ａ．被験体の免疫機構の不活方法
本発明は、レシピエント被験体において免疫機構を賦活または増強する方法に関する。該方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はレシピエント被験体における免疫応答を賦活するものであり、該免疫応答により感染の撃滅が補助される。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子を活性化させるものである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、少なくとも１種類の生物学的薬剤、例えばワクチンの前に投与した場合、ワクチンと共投与した場合、ワクチン接種後に投与した場合またはワクチンと混合した場合、かかるワクチンの作用を増強するものである。いくつかの態様では、該方法は、レシピエント被験体を感染性疾患から防御するため、および感染性疾患を有する集団を処置するための新たな処置ストラテジーをもたらすものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬をワクチンと併用して使用した場合、免疫調節薬組成物なしでのワクチンの使用と比べて、疾患に対してより速やかでより長期間でより良好な防御をもたらすものである。
【００５３】
免疫応答はレシピエント被験体において、有効量の免疫調節薬組成物を投与することにより活性化され得、該組成物は、本明細書に記載の任意のリポソーム送達媒体、本明細書に記載の任意の免疫賦活性プラスミド（またはＤＮＡ配列）を含むものであり、本明細書に記載の任意の生物学的薬剤と併用されてもよい。本明細書で用いる場合、「〜と併用して」は、生物学的薬剤は免疫調節薬と混合もしくは共投与され得るか、または独立していることを意味していると理解されたい。かかる独立投与は、免疫調節薬の投与の前であっても後であってもよい。また、併用投与が、１回より多くの免疫調節薬または生物学的薬剤の投与が使用され得ることを含むものであり得ることも想定される。さらに、１種類より多くの生物学的薬剤が免疫調節薬と共投与される、免疫調節薬の前に投与される、免疫調節薬の投与の後に投与される、または免疫調節薬と並行して投与される場合もあり得る。
【００５４】
Ｂ．被験体の生存性の改善方法
本発明は、ぶた種の構成員の生存性の改善方法に関する。該生存性の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の生存性の改善をもたらすものである。
【００５５】
Ｃ．生産の改善方法
本発明は、ぶた種の構成員の生産の改善方法に関する。該生産の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の生産の改善をもたらすものである。生産の改善の評価方法は当該技術分野で知られている。当業者には、生産の改善は、免疫調節薬組成物を受けた被験体と免疫調節薬組成物を受けていない被験体間で、健康状態、体重、サイズ、肉質および他のパラメータを比較して測定され得ることが認識されよう。
【００５６】
有効量の本明細書に記載の任意の免疫調節薬組成物が被験体に投与され得る。有効量は、レシピエント被験体において免疫応答を活性化させるに充分なものである。かかる活性化の測定方法は当該技術分野で知られている。また、当業者には、有効量は、年齢、体重、被験体の種および感染段階ならびに当該技術分野で知られた他の要素に依存することが認識されよう。好適な有効量は約０．１μｇ〜１，０００μｇ／被験体の範囲であり得る。いくつかの態様では、有効量は約０．１μｇ〜約１０μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約０．５μｇ〜約５μｇ、約０．２５μｇ〜約５μｇ、約０．０５μｇ〜約１０μｇ、約５μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約２０μｇ、約２０μｇ〜約３０μｇ、約３０μｇ〜約４０μｇ、約４０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約７０μｇ、約７０μｇ〜約９０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約１５０μｇ、約１５０μｇ〜約２００μｇ、約２００μｇ〜約２５０μｇ、約２５０μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約３５０μｇ、約３５０μｇ〜約４００μｇ、約４００μｇ〜約４５０μｇ、約４５０μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約５５０μｇ、約５５０μｇ〜約６００μｇ、約６００μｇ〜約６５０μｇ、約６５０μｇ〜約７００μｇ、約７００μｇ〜約７５０μｇ、約７５０μｇ〜約８００μｇ、約８００μｇ〜約８５０μｇ、約８５０μｇ〜約９００μｇ、約９００μｇ〜約９５０μｇ、約９５０μｇ〜約１０００μｇの範囲であり得る。好ましくはいくつかの態様では、有効量は約０．５μｇ〜約１０μｇの範囲である。だが、好ましくは他の態様では、有効量は約５０μｇ〜約１００μｇの範囲である。また、好ましくは他の態様では、有効量は約４０μｇ〜約７０μｇの範囲である。
【００５７】
Ｄ．使用のための条件
本発明の方法は、被験体が、免疫応答が誘発され易い疾患から防御されるように該被験体における免疫応答を活性化させるものである。本明細書で用いる場合、語句「疾患から防御される」とは、疾患の症状の低減；疾患の発生の低減；疾患の臨床的もしくは病理学的重症度の低減；または疾患を引き起こす病原体の排出の低減をいう。被験体の防御は、本発明の治療用組成物が被験体に投与されたとき、疾患の発生を予防する、治癒する、および／または疾患症状、臨床徴候、病態もしくは原因を緩和もしくは低減させる該組成物の能力を示す場合もあり得る。そのため、疾患からの被験体の防御は、疾患発生の予防（予防的処置）と疾患を有する被験体の処置（治療的処置）の両方を包含している。用語「疾患」は、被験体の正常な健康状態からの任意の逸脱をいい、疾患症状が存在している状態、ならびに逸脱（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝的欠陥など）が発生しているが症状はまだ現れていない病状を包含している。
【００５８】
本発明の方法は、疾患の予防、疾患に対するエフェクター細胞免疫の賦活、疾患の解消、疾患の緩和および原発性疾患の発生に起因する続発性疾患の予防のために使用され得る。
【００５９】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、ワクチンと共投与した場合、ワクチン単独の投与と比べて被験体の自然免疫応答を改善するために使用され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、ワクチンと共投与した場合、ワクチン単独の投与と比べて被験体の獲得免疫応答を改善するために使用され得る。一般的に、ワクチン１回の投与では、獲得免疫を賦活するために時間を要するため、被験体が即座に防御されることはない。用語「改善する」は、本発明では、ワクチンが被験体を防御し始めるまで、および／または防御期間を延長し始めるまでの、ワクチンによって付与された獲得免疫による被験体における自然免疫応答の誘発をいう。
【００６０】
いくつかの態様では、本発明の方法は、多種多様な病原体の感染に対して防御するために該組成物を投与することを含むものである。投与する組成物に、特異的応答を誘発させるための特異的抗原を含めてもよく、含めなくてもよい。本発明の方法は、レシピエント被験体を感染性の微生物因子、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫に起因する疾患から防御するものであることが想定される。いくつかの態様では、本発明の方法は、感染性因子による感染の症状または重症度を緩和または低減するために該組成物を投与することを含むものである。当業者には、本明細書に記載の免疫調節薬組成物は、数多くの感染性因子（これは、列挙するには数が多過ぎる）に対して有効であることが認識され、理解されよう。本明細書に示した感染性因子は例示の目的で示したものであり、使用範囲の限定のために示したものではない。
【００６１】
本明細書に記載の免疫調節薬組成物が有用であり得る例示的な病状としては、被験体において感染性因子によって引き起こされるものが挙げられる。かかる病状としては、限定されないが、アクチノバチルス症、アフリカ豚コレラ、炭疽、萎縮性鼻炎、オーエスキー病、ボツリヌス症、ブルセラ症、ブタの壊死性鼻炎（ｂｕｌｌｎｏｓｅ）、豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）、クロストリジウム腸毒素血症、大腸菌症、伝染性膿皮症（乳期子豚のもの）、脳心筋炎、エンテロウイルス感染、滲出性表皮炎、口蹄疫、腐蹄症、グレーサー病、豚の脂様皮膚症、豚コレラ（ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）、封入体鼻炎、腸腺腫症、臍帯感染症、レプトスピラ症、リステリア症（敗血症性／内蔵性）、肝臓病変、乳腺炎−子宮筋層炎−無乳症候群、悪性水腫、マイコプラズマ肺炎、マイコプラズマ多発性関節炎、マイコプラズマ多漿膜炎、豚の耳壊死症候群、壊死性鼻炎、壊死性口内炎、浮腫病、骨髄炎、外耳炎、パルボウイルス感染、パスツレラ症、バラ色粃糠疹、胸膜肺炎、多発性関節炎、ぶた伝染性下痢症、ぶた繁殖呼吸障害症候群（ＰＰＲＳ）、増殖性出血性腸炎、仮性結核、腎盂腎炎、狂犬病、白癬、ロタウイルス感染、サルモネラ中毒、連鎖球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎および関節炎、ブタ赤痢、ブタ丹毒、豚コレラ（ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）、ブタインフルエンザ、ブタ水痘、ブタ水胞病、タルファン病、テッシェン病、破傷風、伝染性胃腸炎、水胞病、ブタの水疱性発疹、水疱性口内炎、嘔吐性消耗性疾患、白斑がある腎臓、ならびに当該技術分野で知られた他の病状が挙げられ得る。
【００６２】
本明細書に記載の免疫調節薬組成物が処置または予防に有用であり得る例示的な感染性因子としては、被験体の自然免疫応答による影響を受ける感染性因子が挙げられる。かかる感染性因子としては、限定されないが、アクチノバチルス種、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス・ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アルファヘルペスウイルス亜科（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｒｓｖｉｒｉｎａｅ）、アフトウイルス属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ベータヘルペスウイルス亜科（Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カリシウイルス属、カンピロバクター種、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、カンピロバクター・ムコサリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｃｏｓａｌｉｓ）、カルジオウイルス属、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、悪性水腫菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コロナウイルス属、サイトメガロウイルス属、エンテロウイルス属、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム・スイス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｉｓ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、フラビウイルス科、壊死桿菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レリスタッドウイルス、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リッサウイルス属、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、マイコプラズマ種、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオシノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ペスチウイルス属、ピコルナウイルス科、ぶたアルテリウイルス、ぶたサーコウイルス（ＰＣＶ）、ぶたエンテロウイルス、ぶた（Ｐｒｏｃｉｎｅ）伝染性下痢症ウイルス（ＰＥＤｖ）、ぶたヘルペスウイルス１、ぶたヘルペスウイルス２、ぶたパルボウイルス、ペスチウイルス属、ラブドウイルス科、ロタウイルス属、サルモネラ種、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、セルプリナ・ハイオディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、スピロヘータ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、スイポックスウイルス属（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ブタインフルエンザウイルス、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、未分類ＤＮＡウイルス、ベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、および当該技術分野で知られた他のものが挙げられ得る。
【００６３】
本明細書に記載の免疫調節薬組成物は、感染性因子によって引き起こされる腸管の病状の処置または予防に特に有用であり得る。かかる病状としては、被験体の消化器／腸系に影響を及ぼす腸管の病状が挙げられる。このような腸管の病状としては、限定されないが、アフリカ豚コレラ、豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）、クロストリジウム腸毒素血症、大腸菌症、口蹄疫、豚コレラ（ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）、腸腺腫症、壊死性口内炎、浮腫病、ぶた伝染性下痢症、増殖性出血性腸炎、ロタウイルス感染、サルモネラ中毒、ブタ赤痢、ブタ水胞病、伝染性胃腸炎、ブタの水疱性発疹、水疱性口内炎、および当該技術分野で知られた他の病状が挙げられる。
【００６４】
本明細書に記載の免疫調節薬組成物が有用であり得る例示的な感染性因子としては、被験体の自然免疫応答による影響を受ける感染性因子が挙げられる。かかる感染性因子としては、限定されないが、アクチノバチルス種、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス・ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アフリカ豚コレラウイルス、アルファコロナウイルス、アルファヘルペスウイルス亜科（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｒｓｖｉｒｉｎａｅ）、アフトウイルス属、アスフィウイルス、アルテリウイルス、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ベータコロナウイルス、ベータヘルペスウイルス亜科（Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カリシウイルス属、カンピロバクター種、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、カンピロバクター・ムコサリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｃｏｓａｌｉｓ）、カルジオウイルス属、サーコウイルス、豚コレラウイルス、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、悪性水腫菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コロナウイルス属、サイトメガロウイルス属、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス属、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム・スイス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｉｓ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フラビウイルス科、壊死桿菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ）、レリスタッドウイルス、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リッサウイルス属、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、マイコプラズマ種、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオシノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ペスチウイルス属、ピコルナウイルス科、ぶたアルテリウイルス、ぶたエンテロウイルス、ぶた伝染性下痢症ウイルス、ぶたヘルペスウイルス１、ぶたヘルペスウイルス２、ぶたパルボウイルス、ぶた繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ぶたサペロウイルス、ぶたテスコウイルス、ペスチウイルス属、狂犬病ウイルス、ラブドウイルス科、ロタウイルス属、サルモネラ種、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、セルプリナ・ハイオディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、スピロヘータ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、豚痘ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、未分類ＤＮＡウイルス、ベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、および当該技術分野で知られた他のものが挙げられ得る。
【００６５】
本明細書に記載の免疫調節薬組成物は、感染性因子によって引き起こされる病状またはがんの処置または予防に特に有用であり得る。かかる病状としては、限定されないが、アクチノバチルス症、アフリカ豚コレラ、炭疽、萎縮性鼻炎、オーエスキー病、ボツリヌス症、ブルセラ症、ブタの壊死性鼻炎、豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）、クロストリジウム腸毒素血症、大腸菌症、先天性ＣＮＳ徴候、伝染性膿皮症（乳期子豚のもの）、脳心筋炎、エンテロウイルス感染、滲出性表皮炎、口蹄疫、腐蹄症、グレーサー病、豚の脂様皮膚症、豚コレラ（ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）、封入体鼻炎、腸腺腫症、臍帯感染症、レプトスピラ症、リステリア症（ｌｉｓｔｔｅｒｉｏｓｉｓ）（敗血症性／内蔵性）、肝臓病変、乳腺炎−子宮筋層炎−無乳症候群、悪性水腫、マイコプラズマ肺炎、マイコプラズマ多発性関節炎、マイコプラズマ多漿膜炎、豚の耳壊死症候群、壊死性鼻炎、壊死性口内炎、浮腫病、骨髄炎、外耳炎、パルボウイルス感染、パスツレラ症、バラ色粃糠疹、胸膜肺炎、多発性関節炎、ぶた伝染性下痢症、ぶた繁殖呼吸障害症候群（ＰＰＲＳ）、増殖性出血性腸炎、仮性結核、腎盂腎炎、狂犬病、白癬、ロタウイルス感染、サルモネラ中毒、連鎖球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎および関節炎、ブタ赤痢、ブタ丹毒、豚コレラ（ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）、ブタインフルエンザ、ブタ水痘、ブタ水胞病、タルファン病、テッシェン病、破傷風、伝染性胃腸炎、水胞病、ブタの水疱性発疹、水疱性口内炎、嘔吐性消耗性疾患、白斑がある腎臓、ならびに当該技術分野で知られた他のものが挙げられる。
【００６６】
Ｅ．投与
さまざまな投与経路が利用可能である。選択される具体的な様式はもちろん、選択される具体的な生物学的薬剤、被験体の年齢および一般健康状態、処置対象の具体的な病状ならびに治療有効性に必要とされる投薬量に依存する。本発明の方法は、臨床的に許容され得ない有害効果を引き起こすことなく有効な活性化レベルの免疫応答がもたらされる任意の投与様式を用いて実施され得る。該組成物は、簡便には単位投薬形態で提示され得、当該技術分野でよく知られた任意の方法によって調製され得る。
【００６７】
免疫調節薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、乳房内、経皮、直腸内、経粘膜、皮下、噴霧、経口、眼内、気管内、鼻腔内、経表面、接眼、または当該技術分野で知られた他の方法によって投与され得る。一態様では、該免疫調節薬は皮下投与される。別の態様では、該免疫調節薬は筋肉内投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は噴霧薬として投与される。別の態様では、該免疫調節薬は経口投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は皮下投与され得る。
【００６８】
一観点において、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）の前に単独で投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）後に単独で投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）と同時に単独で投与され得る。
【００６９】
いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、抗原刺激の前にワクチン接種と同時に共投与され得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、抗原刺激（または感染）と同時にワクチン接種と同時に共投与され得る。いくつかの態様では、共投与は、ワクチンと免疫調節薬を、被験体の概ね同じ位置の異なる２つの部位に互いに隣同士に投与すること（すなわち、被験体の首に互いに隣同士に注射）、被験体の概ね同じ位置の反対側に投与すること（すなわち、首の片側に一方）、または同じ被験体の異なる位置に投与することを含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、ワクチン接種および抗原刺激の前に投与され得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、ワクチン接種後だが抗原刺激の前に投与され得る。免疫調節薬組成物を、抗原刺激（または感染）前にワクチン接種を受けた被験体に、抗原刺激後に投与してもよい。
【００７０】
当業者には、投与経路は、被験体および被験体の健康または状態に応じて異なり得ることが認識されよう。示した投与経路は例示の目的のためのものであり、限定のために示したものではない。
【００７１】
ワクチン接種は、どの年齢で行ってもよい。ワクチンは、皮下、噴霧、経口、筋肉内、乳房内、皮内、経皮、直腸内、経粘膜、眼内、気管内、鼻腔内、経表面、接眼、または当該技術分野で知られた他の方法によって投与され得る。経口ワクチンは、飼料または水中に含めて投与され得る。さらに、本発明の方法は、ルーチンワクチン接種スケジュールに基づいて使用され得ることが想定される。
【００７２】
また、免疫調節薬組成物も、皮下、噴霧、経口、筋肉内、乳房内、皮内、経皮、直腸内、経粘膜、眼内、気管内、鼻腔内、経表面、接眼、または当該技術分野で知られた他の方法によって投与され得る。例えば、免疫調節薬組成物は筋肉内投与され得る。あるいはまた、免疫調節薬組成物は皮下投与され得る。
【００７３】
該免疫調節薬は、抗原刺激の前に被験体に約１〜約１４日間または抗原刺激後に約１〜約１４日間投与され得る。例えば、該免疫調節薬は、抗原刺激の前に約１〜約７日間または抗原刺激後に約１〜約７日間投与され得る。該免疫調節薬は好適には、抗原刺激の前に１、２、３、４、５、６、７日間または抗原刺激後に１、２、３、４、５、６、７日間投与される。
【００７４】
他の送達系としては、時限的、遅延放出または徐放送達系が挙げられ得る。かかる系により該組成物の反復投与を回避することができ、したがって簡便性が高まり得る。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。このようなものとしては、ポリマーベースの系、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物が挙げられる。薬物を含有している前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。
【００７５】
また、送達系としては、脂質、例えば、ステロール（コレステロール、コレステロールエステルなど）、ならびに脂肪酸または中性脂肪（モノ−、ジ−、およびトリ−グリセリドなど）；ハイドロゲル放出系；シリコン系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；慣用的な結合剤と賦形剤が使用された圧縮錠；部分溶融埋入物；などである非ポリマー系も挙げられる。具体例としては、限定されないが、本発明の薬剤が、ある形態でマトリックス内に含有された崩壊系（米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号および同第５，７３６，１５２号に記載のものなど）、ならびに活性成分がポリマーから制御された速度で透過する拡散系（例えば、米国特許第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載）が挙げられる。また、ポンプベースハードウェア送達系も使用され得、その一部のものは埋込み用に適合されたものである。
【００７６】
上記の組成物、生成物および方法において、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得るが、上記の説明および以下に示す実施例に含まれた事柄はすべて、実例であると解釈すべきであり、限定的な意味で解釈すべきでないことを意図する。
【００７７】
定義
用語「有効量」は、所望の生物学的効果が実現されるのに必要または充分な量をいう。例えば、感染性疾患を処置または予防するための免疫調節薬の有効量は、微生物に曝露されると免疫応答の発現を引き起こし、したがって、被験体内の微生物量の低減、好ましくは微生物の根絶を引き起こすのに必要な量である。任意の具体的な適用での有効量は、処置対象の疾患もしくは病状、被験体の体格または疾患もしくは病状の重症度などの要素に応じて異なり得る。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、経験的に免疫調節薬の有効量を決定することができよう。
【００７８】
用語「サイトカイン」は、免疫増強タンパク質ファミリーをいう。サイトカインファミリーには、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー分子ならびにケモカイン（すなわち、細胞、特に食細胞の遊走および活性化を調節するタンパク質）が含まれる。例示的なサイトカインとしては、限定されないが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。
【００７９】
用語「誘発する」は、活性化させる、賦活する、生じさせる、または上方調節するという用語と互換的に使用され得る。
【００８０】
被験体において「免疫応答を誘発する」という用語は、具体的には、免疫応答の活性をコントロールすること、または影響を及ぼすことをいい、免疫応答を賦活すること、免疫応答を上方調節すること、免疫応答を増強させること、および／または免疫応答を改変すること（例えば、被験体における優勢な型の免疫応答を有害または無効なものから有益または防御的なものにさらに変化させる型の免疫応答を誘発することによって）が包含され得る。
【００８１】
用語「作動可能に連結された」とは、核酸分子が転写制御配列に、該分子が宿主細胞内にトランスフェクト（すなわち、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）されると発現可能な様式で連結されていることをいう。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。さまざまなかかる転写制御配列が当業者に知られている。好ましい転写制御配列としては、トリ、魚類、哺乳動物、細菌、ウイルス、植物および昆虫の細胞内で機能するものが挙げられる。任意の転写制御配列が本発明で使用され得るが、該配列としては、免疫原または免疫賦活性タンパク質をコードしている配列と天然状態で会合している天然に存在している転写制御配列が挙げられ得る。
【００８２】
用語「核酸分子」および「核酸配列」は互換的に使用され得、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体が包含され得る。この用語はまた、オリゴヌクレオチドおよびより大きな配列、例えばプラスミド、例えば本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドも包含しており、タンパク質またはその断片をコードしている核酸分子および調節領域、イントロンまたは他の非コードＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸分子の両方を包含している。典型的には、オリゴヌクレオチドは約１〜約５００個のヌクレオチドの核酸配列を有するものであり、より典型的には少なくとも約５ヌクレオチド長である。核酸分子は、任意の供給源、例えば、哺乳動物、魚類、細菌、昆虫、ウイルス、植物、合成供給源またはその組合せに由来するものであり得る。核酸分子は、一般的に当該技術分野で知られた方法、例えば、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）または化学合成によって作製されたものであってもよい。核酸分子には、天然核酸分子およびそのホモログ、例えば限定されないが、天然の対立遺伝子バリアントおよび修飾核酸分子（かかる修飾が本発明の方法に有用な免疫応答を誘発する該核酸分子の能力に実質的に支障を来さないような様式でヌクレオチドが、挿入、欠失、置換または逆転しているもの）が包含される。核酸ホモログは、当業者に知られたいくつかの方法を用いて作製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」は、該遺伝子が発現された生物体を、通常であれば該生物体を死滅させるか、もしくはその増殖を抑止し得る選択的薬剤（例えば、抗生物質）または条件から保護する産物をコードしている遺伝子をいう。選択可能マーカー遺伝子は、最も一般的には抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）である。したがって、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、カナマイシン耐性遺伝子をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供し、次いで、カナマイシン含有培地上または該培地中で培養した場合、該プラスミドが成功裡に取り込まれ、カナマイシン耐性遺伝子が発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のみが生き残る。用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」はまた、生物体の増殖に必須の化合物の合成に関与している酵素をコードしている遺伝子も包含している。必須化合物を合成することができない栄養要求性生物体に導入した場合、かかる遺伝子により、該生物体が、該必須化合物を補給した培地中で増殖することが可能になる。例えば、リシンの生合成に関与している酵素における変異のため、または該酵素がないため、アミノ酸リシンに対して栄養要求性の細菌細胞は、通常、リシンが補給されていない培地上で増殖することができない。かかる細菌を、リシンの生合成に関与している酵素をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供した場合、該プラスミドが成功裡に取り込まれ、該酵素が発現された細菌が、リシンが補給されていない培地上で培養した場合に生き残る。用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」はさらに、毒／解毒剤選択を可能にする遺伝子も包含している。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、細胞分裂に必須の酵素であるＤＮＡジャイレースに結合するタンパク質をコードしている。ＤＮＡジャイレースに結合すると、ｃｃｄＢ遺伝子産物は遺伝子の複製を障害し、細胞死を誘導する。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子産物を発現している細菌は生き残ることができない。ｃｃｄＡ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子産物の天然の阻害薬として作用するタンパク質（「解毒剤」）をコードしている。したがって、自身の細菌ゲノム内にｃｃｄＢ遺伝子を有する細菌を、ｃｃｄＡ遺伝子産物をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供した場合、該プラスミドを成功裡に取り込み、ｃｃｄＡ遺伝子を発現する細胞のみが生き残る。
【００８４】
用語「スクリーニング可能マーカー」および「スクリーニング可能マーカー遺伝子」は、スクリーニング可能マーカー遺伝子を発現している細胞とスクリーニング可能マーカー遺伝子を発現していない細胞を観測者が識別することを可能にする産物をコードしている遺伝子をいう。スクリーニング可能マーカー遺伝子系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ｌａｃＺ遺伝子および蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青蛍光タンパク質（ＢＦＰ）またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をコードしている遺伝子が挙げられる。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「被験体」は、飼育用であれ野生であれ、イノシシ科またはぶた種の構成員をいう。特に、用語「被験体」は、繁殖または食肉生産のために商業的に育てられているものをいう。好適なぶた被験体としては、限定されないが、ブタ、ホッグ、豚、未経産豚、哺乳子豚、離乳子豚、育成豚、シード豚、および当該技術分野で知られた他のぶた種構成員が挙げられる。いくつかの態様では、被験体は感染性疾患を有すると診断されたものであり得るか、感染性疾患のリスクがあるものであり得るか、または感染性疾患が起こっているものであり得る。被験体は任意の年齢、例えば、未生、新生、幼若、成体、中年齢または高年齢のものであり得る。
【００８６】
本発明の要素またはその好ましい実施形態（１つもしくは複数）を紹介している場合、冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つ以上の該要素が存在していることを意味していることを意図している。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包含的であり、記載の要素以外のさらなる要素が存在していてもよいことを意味していることを意図している。
【００８７】
［実施例］
本発明のさらなる実例を示すために以下の非限定的な例を示す。
【００８８】
［実施例１］：免疫調節薬複合体は、市販のブタインフルエンザ不活化ワクチンとともに共投与した場合、赤血球凝集抑制抗体の誘導を増強する。
【００８９】
この実施例の目的は、市販のブタインフルエンザ不活化ワクチンとともに共投与した場合の免疫調節薬の赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体の誘導に対する効果を評価することであった。
【００９０】
方法
３５匹の豚を現場で受領し、５つの豚房（処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）に入れた。豚を、各処置群の体重が同様になるように無作為化した。０日目と１４日目、Ｔ２〜Ｔ４に、いろいろな量の該免疫調節薬を推奨用量の市販のＳＩＶワクチンとともに投与した。該免疫調節薬と市販のワクチンは、肩甲下領域内のリンパ節付近に近接して皮下接種によって投与した。Ｔ１には市販のワクチンのみを投与し、Ｔ５には希釈剤のみを投与した。血清用の血液を０、３、７、１０、１４、１８、２１、２４および２８日目に、豚ＩＤ１１４からは１８日目である以外、残りの各豚から採取した。血液を血清用に加工処理し、最終加工処理および赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験のために検査室に移した。
【００９１】
検査手順はすべて、標準的な方法に従って行った。血清試料を受容体破壊酵素で前処理し、ＨＡＩアッセイを開始する前、ニワトリの赤血球に吸着させてｃＲＢＣに対する非特異的結合を低減させた。非特異的相互作用は、赤血球凝集抑制の存在を示唆する偽陽性をもたらし得る。前処理により、ＨＡＩアッセイで試験される最初の希釈率が１：１０となるように１：５の初期希釈率を得た。前処理した血清を２倍段階希釈した。次いで、定量のウイルス（４〜８赤血球凝集単位）を各希釈物とともにインキュベートした。およそ４５分のインキュベーション時間後、１％の培養赤血球（ｃＲＢＣ）溶液を添加した。プレートを、赤血球凝集の抑制について観察した。力価を、すべての反復実験において、４〜８ウイルス赤血球凝集単位が完全に抑制された血清の最終希釈率として計算した。
【００９２】
０、３、７、１０、１４、１８、２１、２４および２８日目の血清試料を、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）Ｈ１Ｎ１に対する抗赤血球凝集抗体について試験した。また、０、３、７および２１日目の血清試料は、ＳＩＶ  Ｈ３Ｎ２の抗赤血球凝集抗体についても試験した。これらの特定の日にちは、Ｈ１Ｎ１での初期試験の際に得られた結果のため、試験した。
【００９３】
免疫調節薬
この試験では、本明細書に記載の免疫調節薬組成物を使用した。特に、配列番号：２、ＤＯＴＩＭおよび医薬用担体を含む本明細書に記載の免疫調節薬組成物を使用した（「ＩＣ−Ｅｘ．１」）。
【表１】
2018521109.tif 000002
【００９４】
動物
ブタは純血または雑種であり、試験場に輸送されるまで初乳を与えなかった。雌雄混合の合計３５匹の動物をブタインフルエンザ陰性飼育場から購入し、３５匹の動物を本試験に含めた。到着時の豚の最初の年齢はおよそ８週齢であり、接種時は９〜１０週齢であった。接種時、最初の体重は豚の年齢に適切であった。
【００９５】
子豚は生後、ワクチン接種を受けておらず、ワクチン接種に支障を来すことが知られているいずれの処置でも処置されていなかった。臨床現場に到着時、すべての子豚を、一般健康状態について観察した。動物を試験開始前に７日間馴化させた。動物を臨床徴候について１日１回、観察した。体温を１日１回、測定した。
【００９６】
子豚は、現状でブタインフルエンザ罹患歴がなく、雌の親豚／未経産豚がＳＩＶのワクチン接種を受けていない群から選択した。各個体を評価し、良好な健康状態であると判断した。子豚は、血清学的検査（赤血球凝集抑制（ＨＡＩ））によりブタインフルエンザウイルスについて陰性であった。−１または０日目、すべての子豚を臨床的に観察し、処置群に入れるか、または除外するかのいずれかにし、１つの処置群あたり最大７匹の子豚にした。動物は、処置の施与前の２１日以内にワクチン接種に支障を来す可能性のある処置を受けていた場合、試験から除外した。
【００９７】
試験計画
【表２】
2018521109.tif 000003
【００９８】
動物を臨床徴候について、全試験期間中および馴化中、観察した。抗原刺激投与日から開始して剖検日まで継続して、各試験動物を異常な呼吸、異常な挙動および発熱の臨床徴候について毎朝評価した。
【００９９】
以下の表を、異常な呼吸および挙動の臨床徴候に関する臨床スコア分類の指定のガイドとして使用した。臨床スコアは、現場の同様の正常な健常動物と比べて規定した。
【表３】
2018521109.tif 000004
【０１００】
動物は、異常な臨床徴候、例えば、食欲不振、咳、熱、目および鼻からの漿液性分泌物、運動失調、昏睡状態、痙攣、紅斑、異常興奮、過流涎、歩行困難、横臥、テネスムスならびに振戦について観察。
【０１０１】
試験０日目はすべての動物で同じであり、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４群の動物にとっては免疫調節薬での処置の施与日であった。免疫調節薬を受けた動物はすべて、皮下注射した。ワクチンを受けた動物はすべて、ラベル表示の使用説明に従って投与した。免疫調節薬を受けた動物はすべて、肩甲下領域内のリンパ節付近に注射した。ワクチンと免疫調節薬は別々に、互いに近接させて投与した。
【０１０２】
動物は、試験への組み入れの適性の判定の目的のため、生まれた飼育場に居るときに、離乳前および輸送前に血清用の採血を行った。最低３匹の豚／同腹豚をサンプリングした。
【０１０３】
ＳＩＶ血清学的検査用の血液試料（およそ５〜７ｍＬ／動物／採血）を、試験０日目（ワクチン接種前）ならびに３日目、７日目、１０日目、１４日目、１８日目、２１日目、２４日目および２８日目に採取した。
【０１０４】
血液試料を血清用に、ＢＢＬ標準作業手順（ＳＯＰ）を用いて加工処理し、各試料を、別個の２つの容量にアリコートに分けた。血清試料を、ＨＡＩアッセイによりＢＢＬ  ＳＯＰを用いて８単位の赤血球凝集（ＨＡ）ウイルスで試験した。血清試料は、同種および異種ウイルスで試験した。
【０１０５】
動物の体重を、試験−７、０、７、１４および２１日目ならびに２８日目または剖検前に測定した。死亡したか、または愛護的理由で安楽死させた動物のみを剖検し、疾病の原因を獣医が調べた。豚は、過剰用量のバルビツレートを担当獣医が投与することにより安楽死させた。剖検は、試験施設で所定のＳＯＰに従って行われた。試験２８日目、残りのすべての動物を、過剰用量のバルビツレートを担当獣医が施設のＳＯＰに従って投与することによる愛護的方法によって安楽死させた。
【０１０６】
結果
免疫調節薬被験物質に起因する明白な臨床症状発現はみられなかった。試験中、２匹の豚が死亡した。死因は、どちらの場合も直腸脱であった。さらに２匹の豚を、歩行困難およびストレスの徴候のため試験から除いた。２８日目、残りのすべての豚の体重を測定し、採血後に安楽死させた。
【０１０７】
表４に、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１分離株に対する抗赤血球凝集抗体について試験した０、３、７、１０、１４、１８、２１、２４および２８日目の血清試料のデータを示す。Ｓｌｙ  Ｈ３Ｎ２分離株に対する抗赤血球凝集抗体について試験した０、３、７および２１日目の血清試料のデータに関する表５も参照のこと。Ｈ１Ｎ１に対して２０およびＨ３Ｎ２に対して１０のＨＩ価を有する試験血清試料を陽性と報告した。これは、各ウイルス型に対する血清の非特異的バックグラウンドのためであった。
【表４】
2018521109.tif 000005
2018521109.tif 000006
【表５】
2018521109.tif 000007
2018521109.tif 000008
【０１０８】
考察
この試験の目的は、市販のブタインフルエンザ不活化ワクチンとともに共投与した場合の免疫調節薬組成物の赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体の誘導に対する効果を評価することであった。この目的のため、合計３５匹の初乳を与えていない豚を５つの処置群に分け、各処置群に、初回接種および１４日後に種々の量の免疫調節薬と市販のＳＩＶワクチンでの追加免疫を施した。２８日間の試験中、免疫調節薬被験物質に起因する明白な臨床症状発現はみられなかった。しかしながら、合計４匹の豚を死亡のため試験から除外するか、または愛護的理由で安楽死させた。
【０１０９】
採取したすべての血清試料をＨ１Ｎ１に対する赤血球凝集抑制についてアッセイした。また、選択した数の試験日に、Ｈ３Ｎ２に対する赤血球凝集抑制についてもアッセイした。図４および５に、各アッセイ日の各処置群について計算した幾何平均を示す。Ｈ１Ｎ１分離株に対する市販のワクチンと併用して２００ｕｇおよび１０ｕｇの免疫調節薬を受けた処置群では、ワクチンのみを接種した群と比べて幾何平均の顕著な増大がみられた。また、市販のワクチンとともに５０ｕｇの免疫調節薬を受けた処置群でも、ワクチンのみを接種した群と比べて、特に２１日目に幾何平均の増大がみられた。また、免疫調節薬を接種した場合の方がＨ３Ｎ２に対するセロコンバージョンが早いようであった。
【０１１０】
また、ＨＡＩ価の実際の平均を図６と７に示す。これらのグラフは、各処置群におけるさらなる個々の力価を表す。これは、１４日目の追加免疫後の処置群３で最も明白である。Ｈ１Ｎ１に対してセロコンバージョンされた豚は２匹だけであったが、１匹の豚は高いＨＡＩ価を有していた（表５参照）。
【０１１１】
両方のＳＩＶ分離株に対するセロコンバージョンがみられた。この方法を用いてセロコンバージョンが検出された豚の数を各処置群の豚の総数と比べて示した表６Ａおよび６Ｂならびに図８（２１日目の結果）を参照のこと。
【表６】
2018521109.tif 000009
【０１１２】
結論として、免疫調節薬複合体は、市販のブタインフルエンザ不活化ワクチンとともに共投与した場合、赤血球凝集抑制抗体の誘導を増強した。
【０１１３】
［実施例２］：ぶた繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ワクチンとの免疫調節薬は豚の肺における早期ウイルス排出を補助する。
【０１１４】
５０μｇ（ＲｘＩＩ）または１０μｇ（ＲｘＩ）用量の免疫調節薬と並行投与したＰＲＲＳ弱毒生ワクチン（ＭＬＶ）ワクチンによりブタにおいて誘発された免疫応答の強度および質ならびに防御免疫のレベルを評価するための試験を行った。パラメータを、免疫調節薬なしで投与した同じＭＬＶワクチンでの免疫処置に対する同じ宿主の応答と比較した。防御免疫レベルを、ワクチン接種したビルレントＰＲＲＳウイルス抗原刺激動物で観察された臨床症候群の低減をワクチン接種していない抗原刺激対照比較して測定することにより調べた。
【０１１５】
制御されたＰＲＲＳ抗原刺激では、ＲｘＩＩ（ＰＲＲＳワクチン＋５０マイクログラムの免疫調節薬）群は、すべての動物において、ＰＲＲＳワクチン単独を受けた群（ＲｘＩＩＩ）の動物と比べて体重増加が多く、肺内のウイルス負荷が少なく、検出可能なインターフェロンを有していた。この試験は、ＰＲＲＳワクチンとの免疫調節薬が肺内の早期ウイルスクリアランスを補助することを示唆し、これは、ＰＲＲＳワクチン接種（ＲｘＩＩＩ）動物では観察されなかった。
【０１１６】
試験計画
Ｒｘ  Ｉ群（Ｔ５）にはＰＲＲＳ  ＭＬＶ  ＰｒｉｍｅＰａｃワクチン＋１０μｇの免疫調節薬を投与した。Ｒｘ  ＩＩ群（Ｔ４）にはＰＲＲＳ  ＭＬＶ  ＰｒｉｍｅＰａｃワクチン＋５０μｇの免疫調節薬を投与した。Ｒｘ  ＩＩＩ群（Ｔ５）にはＰＲＲＳ  ＭＬＶ  ＰｒｉｍｅＰａｃワクチン単独を投与した。
【表７】
2018521109.tif 000010
【０１１７】
免疫調節薬
この試験で使用した免疫調節薬は実施例１で上記の免疫調節薬である。
【０１１８】
動物
免疫調節薬カチオン性リポソーム−プラスミド複合体を、５ｍＬ（１．２５ｍＬ充填）バイアル内に入れた凍結乾燥粉末として供給した。被験物質は２〜８℃で輸送および保存し、凍結させなかった。免疫調節薬をＴｒｉｓ−ＨＣｌラクトースバッファー（ｐＨ６．８）で製剤化した。免疫調節薬を使用直前に、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）ＵＳＰの添加によって再構成した。容器および再構成用量は以下のとおりである：
５ｍＬ容バイアルに４２５μｇ（ＣｏＡ参照）を含める：１．２５ｍＬのＳＷＦＩで再構成
１０ｍＬの水，滅菌，保存料無添加（注射用／ＵＳＰ），Ａｂｂｏｔｔ番号：４８８７１０１００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ４８８７−１０−１）
免疫調節薬は注射用滅菌水で、層流フード内で無菌的手法を用いて再構成した。凍結乾燥された免疫調節薬を冷蔵保存庫（２〜８℃）から取り出し、再構成の前にバイアルをおよそ５分間で室温にした。シリンジと１８−ゲージの針を用いて０．５ｍＬ（２ｍＬ容バイアル）または１．２５ｍＬ（５ｍＬ容バイアル）の注射用滅菌水を量り取り、凍結乾燥された免疫調節薬のそれぞれ２ｍＬまたは５ｍＬ容の一方のバイアル内に緩徐に注入した。再構成の時点をラベルおよび試験薬物調製ワークシートに記録した。バイアルを少なくとも３０秒間、静かに渦を巻くように回し（ボルテックスでなく）、少なくとも５分間放置した。バイアルを再度、少なくとも３０秒間、静かに渦を巻くように回した（ボルテックスでなく）。再構成された免疫調節薬物質は、白い半透明の外観を有していた。再構成バイアルを使用時まで氷嚢で保存した。再構成された免疫調節薬物質は、４〜６時間以内に使用した場合、安定であった。再構成された免疫調節薬をデキストロース５％含有滅菌水で、表８に示すとおりに希釈した。
【表８】
2018521109.tif 000011
【０１１９】
同様の体重（表９〜１３）であり、ＰＲＲＳウイルス、マイコプラズマおよびサーコウイルスを含む主要なブタ病原体にはすべて無感染の合計３９匹のＳＰＦ豚をこの試験に使用した。動物は、血清学的検査によりＰＲＲＳ抗体について陰性であった。豚の馴化時の最初の年齢はおよそ７〜９週齢であった。子豚はすべて、生後、ワクチン接種を受けておらず、ＰＲＲＳワクチン接種に支障を来すことが知られているいずれの処置でも処置されていなかった。動物を試験開始前に７日間馴化させた。動物を臨床徴候について１日１回、観察した。体温を１日１回、測定した。
【０１２０】
動物を臨床徴候について、全試験期間中および馴化中、観察した。抗原刺激投与日から開始して剖検日まで継続して、各試験動物を異常な呼吸、異常な挙動および発熱の臨床徴候について毎朝評価した。動物愛護の理由で、一部の動物は１日１回より多く観察した。呼吸スコアまたは挙動スコア３を有する動物はなく、したがって薬物治療の必要はなく、愛護的理由で試験担当医による安楽死は行わなかった。
【０１２１】
以下のものを、異常な呼吸および挙動の臨床徴候に関する臨床スコア分類の指定のガイドとして使用した。臨床スコアは、現場の同様の正常な健常動物と比べて規定した。動物間の通常の差異を考慮すること、および正常な生理学的応答を病理学的応答と識別することに注意を払った。
【０１２２】
呼吸スコアリング：
０＝正常。多少の腹部運動を伴う胸式呼吸。
【０１２３】
１＝軽度の呼吸困難。多少の腹式呼吸。
【０１２４】
２＝中等度の呼吸困難。過度の苦しい腹式呼吸。
【０１２５】
３＝重度の呼吸困難。非常に苦しい呼吸、腹式呼吸。開口状態、鼻と耳にチアノーゼ。
【０１２６】
活発さ／抑鬱スコアリング：
０＝正常。扉を開けると豚は快活に／ブーブー鳴いて反応する。豚は活発で、よくじゃれて、好奇心旺盛である。扉の方を見て、ゲートに近づき、臭いを嗅ぐ。餌と水に興味を示す。興奮すると、排尿および排便する場合があり得る。
【０１２７】
１＝軽度。刺激すると起き上がるが緩慢であるか、またはあまり興味や好奇心を示さない。すぐに戻って横になる。餌に多少の興味。
【０１２８】
２＝中等度。顕著な不活発、および起き上がる／動くことを嫌がる。虚脱、よろよろしている、協調不能。
【０１２９】
３＝重度。応答がなく、起き上がろうとしない。
【０１３０】
処置方法
７日間の馴化期間後、Ｔ３〜Ｔ５群（Ｒｘ  ＩＩＩ〜Ｒｘ  Ｉ）の動物にワクチン接種した。免疫調節薬を受けた動物はすべて（Ｔ４およびＴ５）皮下注射した。ＰＲＲＳワクチンＴ３〜Ｔ５を受けた動物はすべて、およそ５×１０４の５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）用量（２ｍｌ容量）のＰＲＲＳ  ＭＬＶ株ＰｒｉｍｅＰａｃを筋肉内投与した。本明細書で用いる場合、「ＴＣＩＤ５０」は、接種した細胞の５０％において病理学的変化をもたらすのに必要とされる病原性因子の量をいう。免疫調節薬を受けた動物はすべて、肩甲下領域内のリンパ節付近に注射した。ワクチンと免疫調節薬は別々に、互いに近接させて投与した。Ｔ１群とＴ２群の動物には、ウイルスを増殖させるために使用した非感染細胞（ＭＡＲＣ−１４５細胞）での２ｍｌの使用済み培養上清みを注射した。
【０１３１】
ワクチン接種の４週間後、Ｔ２〜Ｔ５群の動物を、およそ２×１０４  ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルス株ＮＡＤＣ−２０で２ｍｌ容量にて、用量の半分を筋肉内投与し、残りの半分を鼻腔内投与して抗原刺激した。Ｔ２群に割り付けたワクチン接種していない抗原刺激動物を、ビルレントＮＡＤＣ−２０  ＰＲＲＳウイルスによる感染に起因する臨床症候群の重症度を確立するために使用し、一方、Ｔ１群に割り当てた動物を、成長および健康の正常パラメータを提供するために使用した。
【０１３２】
ワクチン接種によって誘発された防御免疫の度合を、血清中および肺内のウイルス負荷に基づいて、ならびに体重（ＢＷ）の変化および抑鬱の症状発現および呼吸による徴候の比較によって調べた。臨床パラメータを、抗原刺激後１０日間、毎日モニタリングした。ウイルス血症レベル（血液）を抗原刺激後０、４、７および１０日目に、血清中の感染性ウイルス力価をＺＭＡＣ細胞において測定することにより調べた。肺組織内のウイルス負荷をウイルス学的方法によって測定した。
【０１３３】
抗原刺激後１０日目、すべての試験動物を安楽死させ、ウイルス負荷を調べるための肺試料を採取した。経験を積んだ病理医が、肺の病理学的変化を巨視的および微視的レベルで評価した。
【０１３４】
ウイルス特異的免疫の発現を測定するため、末梢血試料を各動物から、−７、０、４、７、１４および２８日目（抗原刺激前）ならびに免疫処置後および３８日目（安楽死前）に収集した。これらの試料から、血清およびＰＢＭＣを採取し、各動物の体液性免役および細胞媒介性免役の強度を測定した。抗体力価を血清ウイルス中和試験を用いて測定し、ワクチンウイルス（ＰｒｉｍｅＰａｃ）ならびに抗原刺激ウイルス（ＮＡＤＣ−２０）に対するＰＲＲＳウイルス特異的インターフェロン（ＩＦＮ）分泌細胞（ＩＦＮ−ＳＣ）の頻度を個々に調べた。
【０１３５】
動物の体重を、試験−７、０、７、１４および２１ならびに２８日目および安楽死前（３８日目）に測定した。試験中に死亡したか、または愛護的理由で安楽死させた動物はなく、したがって中間剖検は行わなかった。
【０１３６】
統計分析
取得し、分析したデータは、血清中（４、７および１０日目に測定）および肺内およびＩＦＮの力価、体重（０、６および１０日目に測定）、臨床スコアおよび温度（処置後１０日間、毎日測定）、ならびに剖検時の３つの型のスコアリングからなるものであった。肺胞中隔の肥厚、肥厚の分布および気道内の炎症細胞のスコアは０〜３の範囲で記録した。
【０１３７】
肺内力価はすべて、分析前に、各力価（自然対数を用いて変換）に１を加えること（＋１）により変換した。最小二乗平均を計算し、逆変換して、任意の期間での各群の中心傾向（すなわち、幾何平均）を示し、表形式にした）。ＩＦＮ力価は変換しなかった。
【０１３８】
多重測定値を記録する場合、反復測定分散分析を使用した（ベースライン（試験０日目に最も近い）が利用可能な場合、共変量分析を使用した）。パラメータを１回しか測定しない場合は、分散分析を使用した。すべてのモデルにおいて、ＴＲＴの固定効果を、５つの処置群間の差について試験した。多重処置群のため、ｐ値に対してボンフェローニの補正を使用した。
【０１３９】
剖検スコアおよび臨床スコアでは、カイ二乗検定を使用した。アルファレベル０．０５を統計学的に有意とみなした。分析はすべて、ＳＡＳ  ９．２ソフトウェアを用いて行った。
【０１４０】
結果および考察
処置関連有害事象はみとめられなかった。抗原刺激後の群毎の毎日の平均挙動スコアを図９に示す（毎日の挙動スコアの平均）。抗原刺激後の群毎の個々の動物の挙動スコアを表９〜１３に示す。ワクチン接種なし、抗原刺激なしの群は、試験全体を通して０の挙動スコアを有していた（表９：毎日の挙動スコア−Ｒｘ）。ワクチン接種なし、抗原刺激ありの群は、試験２〜１０日目で０．３〜１の範囲の平均挙動スコアを有していた（表１０：毎日の挙動スコア  ワクチン接種なし／抗原刺激あり）。ＰＰＲＳワクチン接種＋免疫調節薬１０μｇおよび抗原刺激ありの群（ＲｘＩ）は、試験２〜１０日目で０．１〜０．７の範囲の平均挙動スコアを有していた（表１１：毎日の挙動スコア−ＲｘＩ）。ＰＰＲＳワクチン接種＋免疫調節薬５０μｇおよび抗原刺激ありの群（ＲｘＩＩ）は、試験４〜８日目で０．１〜０．２の範囲の平均挙動スコアを有しており、試験７、９および１０日目では挙動スコアはなしであった（表１２：毎日の挙動スコア−ＲｘＩＩ）。ＰＰＲＳワクチン接種あり、抗原刺激ありの群（ＲｘＩＩＩ）は、試験２日目および４〜１０で０．１〜０．８の範囲の平均挙動スコアを有していた（表１３：毎日の挙動スコア−ＩＩＩ）。
【表９】
2018521109.tif 000012
【表１０】
2018521109.tif 000013
【表１１】
2018521109.tif 000014
【表１２】
2018521109.tif 000015
【表１３】
2018521109.tif 000016
【０１４１】
試験−１日目の群毎の平均体温は１０３．７°Ｆ〜１０４．３°Ｆの範囲であった。抗原刺激動物は試験５日目にピーク体温を有し、群毎では、図１０に示すとおり、１０４．０°Ｆ〜１０７．１°Ｆの範囲であった。個々の動物の日毎の体温を表１４〜１８に示す。
【表１４】
2018521109.tif 000017
【表１５】
2018521109.tif 000018
【表１６】
2018521109.tif 000019
【表１７】
2018521109.tif 000020
【表１８】
2018521109.tif 000021
【０１４２】
ビルレントＰＰＲＳウイルスでの抗原刺激前と後の群毎の平均体重を図１１に示す。群毎の−３９日目から１０日目までの平均体重増加量（１０日目の体重〜−３９日目の体重）を図１２に−３９日目から示す。ＰＲＲＳウイルス抗原刺激群の中でも、ＩＣ−Ｅｘ．１免疫調節薬投与群（ＲｘＩとＲｘＩＩ）は、ワクチン接種なしの群またはＰＲＲＳワクチン接種（ＲｘＩＩＩ）群と比べた場合、１０日目に、より大きな体重増加を有していた。個々の動物の体重を表１９〜２３に示す。試験終了時（１０日目）、ＰＲＲＳウイルス抗原刺激群の中でも、ＩＣ−Ｅｘ．１免疫調節薬群（ＲｘＩとＲｘＩＩ）は；それぞれ１１６．９ポンドおよび１１７．７ポンドであるワクチン接種なしの群またはＰＲＲＳワクチン接種（ＲｘＩＩＩ）群と比べて、より重い体重、それぞれ１２５．５ポンドおよび１２５．７ポンドを有していた（図１３）。抗原刺激後、ＰＲＲＳウイルス抗原刺激群の中でも、ＩＣ−Ｅｘ．１免疫調節薬＋ＰＲＲＳワクチン接種群（ＲｘＩおよびＲｘＩＩ）は；それぞれ７．５（６．８％）ポンドおよび１１．４（１０．８％）ポンドであるワクチン接種なしの群またはＰＲＲＳワクチン接種（ＲｘＩＩＩ）群と比べて、より大きな体重増加、それぞれ１４．２（１２．７％）ポンドおよび１３．９（１２．５％）ポンドを有していた（図１４および１５）。抗原刺激後の個々の動物の体重を表１９〜２３に示す。
【表１９】
2018521109.tif 000022
【表２０】
2018521109.tif 000023
【表２１】
2018521109.tif 000024
【表２２】
2018521109.tif 000025
【表２３】
2018521109.tif 000026
【表２４】
2018521109.tif 000027
【表２５】
2018521109.tif 000028
【表２６】
2018521109.tif 000029
【表２７】
2018521109.tif 000030
【表２８】
2018521109.tif 000031
【０１４３】
群毎の平均肺重量を図１６に示す。群毎の体重に対する割合としての平均肺重量を図１７に示す。抗原刺激群の動物はすべて、体重に対する肺の比率は、抗原刺激なし対照の０．７７と比べてより高く、１．０６（ＲｘＩ）〜１．１９（ワクチン接種なし対照）の範囲であった。
【０１４４】
ＰＲＲＳウイルスを血清試料から、抗原刺激後４、７および１０日目に分離した。抗原刺激なし対照動物はウイルスの分離について陰性のままであり、本試験で実施されたバイオセキュリティーの完全性が裏付けられた。試験１０日目、ワクチン接種なし抗原刺激ありの動物はすべての動物がウイルスの分離について陽性であり、０．０６×１０４〜３．１６×１０４  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲であった。ＰＲＲＳワクチンでのワクチン接種を受けた動物は１０日目、血清中のウイルス力価が低かった。ＲｘＩ群では、９匹の動物のうち７匹が１０日目、ウイルスの分離について陰性であった。ＲｘＩＩ群では、９匹の動物のうち５匹が１０日目、ウイルスの分離について陰性であった。ＲｘＩＩＩ群では、９匹の動物のうち７匹が１０日目、ウイルスの分離について陰性であった（表２９に示したとおり）。
【表２９】
2018521109.tif 000032
2018521109.tif 000033
【０１４５】
ＰＲＲＳウイルスを個々の動物の肺試料から分離した。抗原刺激なし対照動物の肺試料はウイルスの分離について陰性であり、本試験で実施されたバイオセキュリティーの完全性が裏付けられた。ＲｘＩＩ群では、９匹の動物のうち２匹がウイルスの分離について陰性であり、１匹の動物は、その肺試料中のウイルスが１０２未満であった。抗原刺激群の他の動物はすべて、肺試料は、１．７８×１０２〜１．０×１０５の範囲の力価を有していた（図１８および１９）。各動物の微視的肺病変を表３０〜３４に示す。抗原刺激動物の中でも、ＲｘＩＩ群の動物の肺は、最も少ない平均肺胞中隔の肥厚を有し、この群における低ウイルス回収に対応する肥厚の分布を有していた（図２０）。
【表３０】
2018521109.tif 000034
【表３１】
2018521109.tif 000035
【表３２】
2018521109.tif 000036
【表３３】
2018521109.tif 000037
【表３４】
2018521109.tif 000038
【０１４６】
個々の動物のインターフェロン力価を図２１および表３５に示す。ＲｘＩＩ（ＰＲＲＳワクチン＋５０μｇの免疫調節薬）群の９匹すべての動物およびＲｘＩ（ＰＲＲＳワクチン＋１０μｇの免疫調節薬）の９匹のうち７匹が、ＲｘＩＩＩ（ＰＲＲＳワクチン）群の９匹の動物のうちの４匹と比べて検出可能なインターフェロン力価を有していた。
【表３５】
2018521109.tif 000039
【０１４７】
結論として、制御されたＰＲＲＳ抗原刺激では、ＲｘＩＩ（ＰＲＲＳワクチン＋５０μｇの免疫調節薬）群は、ＰＲＲＳワクチン単独を受けた群（ＲｘＩＩＩ）の動物と比べて、より大きな体重増加、より少ない肺内ウイルス負荷を有し、すべての動物が検出可能なインターフェロンを有していた。この試験は、ＰＲＲＳワクチンとの免疫調節薬が肺内の早期ウイルスクリアランスを補助することを示唆し、これは、ＰＲＲＳワクチン接種（ＲｘＩＩＩ）動物では観察されなかった。
【０１４８】
［実施例３］
実施例３：ＰＲＲＳウイルスでの実験室的抗原刺激の前または後に豚に投与した免疫調節薬の単回筋肉内注射により肺病変が低減される。
【０１４９】
ＰＲＲＳ抗原刺激した最近離乳子豚において肺病変を低減させる免疫調節薬の有効性を調べるための試験を行った。豚をＰＲＲＳウイルスで試験０日目に人為的に抗原刺激した。この試験では、４×１０６  ＰＲＲＳＶ（ＮＡＤＣ−２０株）の１回の鼻腔内接種を行った４つの抗原刺激（Ｂ群［試験２日目に免疫調節薬を投与］、Ｃ群［試験−１日目に免疫調節薬を投与］、Ｄ群［試験０日目に免疫調節薬を投与］およびＥ群［プラセボ対照として５％デキストロースを投与］）と１つのシャム抗原刺激（Ａ群）群の５つの処置群を試験０日目に評価した。豚は、試験０日目、およそ９〜１０週齢であった。この４つのＰＲＲＳＶ抗原刺激群の各々を各豚房に提示した。臨床スコアを、試験−２日目から試験１６日目まで毎日記録した。豚は、２日間（試験１５日目と１６日目）にわたる剖検に供し、肺病変および肺洗浄によるＰＲＲＳＶの回収およびウイルスの分離を評価した。Ｃ群およびＤ群の免疫調節薬処置豚は、Ｅ群のプラセボ対照豚の全肺葉関与の平均３２．９％と比べて、統計学的に低い（ｐ値がそれぞれ０．００９５および０．０２４７の）肺病変スコア（それぞれ９．７％および１３．９％）を有していた。試験の経過中に一例の有害事象が報告されたが、試験下の本獣医学的製剤品とは無関連であると確認された。
【０１５０】
試験計画
【表３６】
2018521109.tif 000040
【表３７】
2018521109.tif 000041
【０１５１】
役割を分けることによりマスキングを行った。毎日の観察、臨床スコアリング、グロスおよび微視的肺の病態の評価、試料の加工処理または検査結果の解釈に関わった試験要員はいずれも、処置群番号と投与された試験物質の関係を知らされないままであった。割り付けリストおよび処置コードキーは試験現場から排除され、本試験のインライフフェーズ（ｉｎ−ｌｉｆｅ  ｐｈａｓｅ）の期間中、試験依頼主が保管した。
【０１５２】
動物
豚はヨークシャー×ランドレース×ハンプシャー交配品種であった。豚は、試験物質投与時、９〜１０週齢であった。試験集団の個体群統計を以下の表３８に示す。
【表３８】
2018521109.tif 000042
【０１５３】
ｎ＝４６のすべての候補豚から試験−１４日目（２０１１年４月２７日）に収集した血清を、ＰＲＲＳＶ抗体について、ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｈｅｒｄｃｈｅｋ  ＰＲＲＳウイルス抗体試験キットシリアル番号：０９４１８−ＬＦ１１３（使用期限：２０１１年１１月１日）を用いて分析した。候補豚はすべて、ＰＲＲＳＶについて陰性であると判定された。
【０１５４】
試験への組み入れのためには、豚は、いずれの時点でも、ＰＲＲＳワクチン接種を受けたことがあってはならない；出生日、原産地ならびにＰＲＲＳおよびマイコプラズマに関するＳＰＦ状態の証明を確認できる追跡可能な記録を有しているものでなければならない；試験−１日目の直腸温度が１０４°Ｆ；試験−１日目および０日目の呼吸スコアおよび抑鬱スコアが０；それぞれの試験物質投与日に、ＰＲＲＳ抗原刺激に関係していない傷害または疾病の合併症を有していないものでなければならない；試験−１日目の一般健康状態の観察による判定時、身体的に健常でなければならない。
【０１５５】
それぞれの試験物質投与日または抗原刺激感染時に、豚が以下の属性：試験結果を乱すであろう、もしくは試験完了を妨げるであろう傷害もしくは非対象全身性疾患の合併症の罹患；または試験−１日目および０日目に０でない呼吸スコアを有している場合、その豚を試験物質投与および抗原刺激感染の適格性から除外した。
【０１５６】
免疫調節薬
この試験で使用した免疫調節薬は、実施例１において上記のものである。
【０１５７】
免疫調節薬処置群に割り当てた豚に、５０μｇの免疫調節薬プラスミドＤＮＡが送達される免疫調節薬と５％デキストロース水の２ｍＬの懸濁液の１回の単回筋肉内注射を行った。豚を、一般健康状態の観察のために１日２回観察した。
【０１５８】
試験手順
直腸体温を、すべての豚において、試験−２、−１、０、２、４、７、１０、１４日目および剖検日に記録した。直腸体温は、Ｗｅｌｃｈ  Ａｌｌｙｎ  ＳｕｒｅＴｅｍｐ−ｐｌｕｓ（登録商標）デジタル温度計を用いてデータ収集した。
【０１５９】
体重を、すべての豚において、試験−１４（処置群への割り付けのため）、−７、０、７、１０および１４日目にデータ取得した。試験１０日目に記録された体重は、データフォームの不備により試験１０日目のデータセットが不完全になるため、分析に不適格であった。
【０１６０】
この試験の接種原は、ＺＭＡＣ細胞（ブタ肺胞マクロファージ）での単回継代により回収されたＮＡＤＣ−２０  ＰＲＲＳＶの２つの別々のストック（Ｓｔｏｃｋ＃３１４１１および＃４１９１１）プールから調製した。Ｓｔｏｃｋ  ＃３１４１１は５×１０６の力価を有しており、続いて、１：２５に希釈し、２×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌを得た。続いて、この希釈ストックを、元から２×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有するＳｔｏｃｋ  ４１９１１と合わせた。プールされた接種原を滴定し、１．８×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有すると測定された。滴定値を測定するため、接種原の１０倍段階希釈列を調製し、１００μｌ／ウェルの各希釈液を四連でプレーティングした。ウイルスの存在を、それぞれのウェルで観察されたＺＭＡＣ細胞のアポトーシスおよび／または細胞死に基づいてスコアリングした。力価を、リード・ミュンヒの方法を使用することにより計算した。
【０１６１】
続いて、各豚に、２ｍＬの１．８×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＰＲＲＳウイルス（１ｍＬ／鼻腔）を、およそ４×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＰＲＲＳＶの最終接種原で鼻腔内投与した。手順の実施を容易にし、かつ豚に対するストレスを最小限にするため、各豚を、Ｌｏｍｉｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｍａｌｏｎｅ，ＮＹ）から購入したＰａｎｅｐｉｎｔｏ吊り具にセットした。
【０１６２】
感染の成功を高めるため、ＰＲＲＳＶ懸濁液を、使い捨て３ｍＬ容シリンジの先端に取り付けた小児用の経粘膜霧化デバイス（Ｗｏｌｆｅ  Ｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の使用を伴って投与した。接種原は、吸息時に漸増的に投与された。
【０１６３】
血清ウイルス血症レベルを試験−２、４、７、１０および１４日目に、試験０日目のＰＲＲＳＶ抗原刺激と比較して調べた。豚の末梢血中の感染性ＰＲＲＳウイルスの存在は、凝固させた静脈血試料から得た血清で調べた。静脈血（５〜１０ｃｃ）を、上部が赤色のＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ内に収集し、凝固させた。血清（１〜２ｃｃ）をこれらのチューブから、収集後２時間以内に回収し、アリコートに分けて−８０℃で、さらなる分析まで保存した。ウイルス血症の測定は、ＲＰＭＩ−１６４０で血清の１０倍段階希釈列を調製することにより行った。０．１ｍｌ容量の希釈血清試料を三連で、およそ３×１０４個のＺＭＡＣ細胞（豚肺胞マクロファージ）の懸濁液（０．１ｍｌ容量）を入れた９６ウェル組織培養プレートに移した。５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で３日間の培養後、ウイルス誘導性細胞変性効果の存在をスコアリングした。５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）の数値を、リード・ミュンヒの方法を用いて求めた。
【０１６４】
肺組織内のウイルス負荷を、剖検に収集した肺組織試料において調べた。肺内のウイルス負荷は、右中葉から収集した気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液で調べた。ＢＡＬ試料は、１０ｍｌの滅菌生理食塩水を右中葉内に、この肺葉に至る気管支内に配置したカテーテルに接続した２０ｍＬ容シリンジを用いて注入することにより得た。この肺葉をやさしく揉んだ後、注入された液を、注入に使用したものと同じシリンジで液を吸引することによって取り出した。およそ５ｍｌの洗浄液が回収された。肺組織内のウイルス負荷の測定は、ＲＰＭＩ−１６４０でＢＡＬ液の１０倍段階希釈列を調製することにより行った。０．１ｍｌ容量の希釈血清試料を三連で、３×１０４個の豚肺胞マクロファージの懸濁液（０．１ｍｌ容量）を入れた９６ウェル組織培養プレートに移した。５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で３日間の培養後、ウイルス誘導性細胞変性効果の存在をスコアリングした。ＴＣＩＤ５０を、リード・ミュンヒの方法を用いて求めた。
【０１６５】
剖検時、肺を胸腔から取り出し、写真撮影し（背側面と腹側面，各写真には豚耳標を記録）、獣医学的病理研修医が、Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）に記載のスコアリングシステムに基づいてグロスでの病変をスコアリングした。簡単には、５（５．０）ポテンシャルポイントを前葉、中葉および副葉の背側面と腹側面の各々に割り付けた。１５ポイント（１５．０）を背側後葉に割り付け、１２半（１２．５）を後葉の腹側面に割り付けた。各肺葉（肺の背側面と腹側面）を観察し、グロスでの病変を有する罹患肺の推定パーセンテージを、試験依頼主支給のデータ入力フォームに記録した。肺葉の最大スコアに罹病肺葉の割合を乗算することにより、最終病変スコアを各肺葉に割り付けた。例えば、背側後葉の２０％に病変が観察された場合、この肺葉の病変スコアは、（２０＊１５）／１００＝病変スコア３であると計算された。
【０１６６】
肺組織切片における微視的病変を評価するため、およそ１ｃｍ厚×５ｃｍ長さ×５ｃｍ幅の次の試料を各肺から採取した（図２２参照）：
ａ）左前葉の前部、
ｂ）左前葉の後部および
ｃ）左後葉の前部。
【０１６７】
試料を少なくとも４８時間、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、次いで加工処理し、パラフィン中に包埋した（自動ティッシュプロセッサで）。３〜５μｍ厚の切片を切り出し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。組織の加工処理（パラフィン包埋、切片化および染色）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの組織学検査室で行われた。
【０１６８】
肺切片を検査し、以下の４つの基準に基づいて間質性肺炎の重症度の推定スコアを付与した：
Ａ．肺胞中隔の肥厚：０−肥厚なし（正常）；１−軽度（相対的）；２−中等度（相対的）；３−重度（相対的）
Ｂ．肺胞中隔の肥厚の分布：０−病変なし（正常）；１−中隔の巣状肥厚；２−中隔の多巣性肥厚；３−中隔のびまん性肥厚
Ｃ．気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）の発生：０−最小限数の細胞から通常のＢＡＬＴ；１−軽度の数増加；２−中等度の数増加；３−重度の数増加。
【０１６９】
Ｄ．気道における炎症の徴候：０−なし；１−軽度；２−中等度；３−重度。
【０１７０】
静脈血（８〜１０ｍＬ）を試験動物から試験−２、４、７および１４日目に、静脈穿刺により、上部が緑色のＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（ヘパリンナトリウム）を用いて採取した。この試料から末梢血単核細胞を、採血後４時間以内に、密度勾配遠心分離により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｅ１０７７を用いて分離した。分離した細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補給したＲＰＭＩ−１６４０培地中に懸濁させた。細胞を、外来性刺激因子は全くなしで（サイトカインの自然産生を測定するため）、または２μｇ／ｍＬのｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストＯＤＮ  Ｄ１９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）（これは、ＣｐＧ含有Ａ型オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である）の存在下でインキュベートした。続いて、１６時間の培養後に細胞培養上清みを収集し、さらなる使用時まで凍結させた。得られた培養上清み中のＩＦＮ−αの量を、特異的ＥＬＩＳＡを用いて既報のとおりに（Ｃａｌｚａｄａ−Ｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）測定した。
【０１７１】
統計的方法
疾患モデルの評価は、２つの対照群間でグロス肺データおよび微視的肺データを分析することからなるものであった。抗原刺激した対照群が抗原刺激していない厳密な対照群と比べて充分な疾患を示すことを示すために統計学的有意差が必要であった。グロス肺スコア（各肺葉の総計）を、群の効果について、分散分析法を用いて比較した。３つの微視的肺スコア（肺胞中隔の肥厚、気道の炎症およびＢＡＬＴ発生）の各々は、ノンパラメトリックウィルコクソンの順位和検定を用いて比較した。残りの分析には２〜５群（抗原刺激した対照群と免疫調節薬群）を含めた（ただし、上記の疾患モデル検証は条件を満たしているものとする）。
【０１７２】
反復測定したデータ（すなわち、ＩＦＮ−α）は、反復測定分散分析を用いて分析し、適用可能な場合は、ベースライン共変量を含めた。最小ＡＩＣ結果では共分散構造を使用した。近似的にデータが正規分布に近くなるように、必要に応じて角変換を適用した。
【０１７３】
単一のエンドポイントを有するデータ（グロス肺スコア）は分散分析により分析した。上記のモデルにはすべて、モデルの要素として豚房を組み込んだ。微視的肺（中隔、気道およびＢＡＬＴ）スコアは、ノンパラメトリックウィルコクソンの順位和検定を用いて分析した。分析はすべて、ＳＡＳ  ９．２を用いて行い、アルファ＝０．１を用いて有意な効果を識別した。
【０１７４】
結果
グロス肺スコアおよび微視的肺スコアはどちらも、厳密な対照と抗原刺激した対照群（対比）を比較した場合、有意な処置効果を示した（グロスでの中隔、気道およびＢＡＬＴのｐ値は、それぞれ０．００１５、０．００３７、０．０２４９および０．００１０）。したがって、疾患モデル検証は条件を満たすものであった。
【０１７５】
グロスでの肺の病態（各動物について肺葉スコアの総計で表される）では、図２４に示されたとおり、対照群と各免疫調節薬群間で統計学的有意差が示された（−１日目に免疫調節薬、０日目に免疫調節薬および２日目に免疫調節薬のｐ値は、それぞれ０．００９５、０．０２４７および０．０７３６）。微視的肺病態総合スコアでは、処置群間でなんら統計学的有意差は示されなかった（中隔、気道およびＢＡＬＴ組織で０．８７８６、０．５７８８および０．５８６５）。ＩＦＮ−αの結果（図２５に示す）は、試験のいずれの日でも、なんら統計学的有意差はもたらされなかった（全体的処置効果は０．１６５３であった）。
【０１７６】
考察および結論
この試験では、グロス肺病変スコアは、各処置群において、プラセボ対照動物と比べて有意に低下した。このデータに基づくと、免疫調節薬は、他のウイルスまたは細菌の呼吸器病原体に対する曝露が限定的な：換言すると、ＰＲＲＳＶ単独で呼吸器抗原刺激された最近離乳した健常子豚の肺病変スコアを低減させ得る
インターフェロンレベルは、予測通り、ＰＲＲＳＶ抗原刺激にもかかわらず変動した。ＩＦＮ−αレベルの抑制はＰＲＲＳＶ感染のホールマーク後遺症であり、この試験では、ＩＦＮ−αレベルが、試験４と７日目に収集した試料において試験−２日目と比べて大きく低下し、明白であった。免疫調節薬は、いずれの収集期間でもＩＦＮ−αレベルにおいて有意差をもたらさなかった。しかしながら、興味深いことに、免疫調節薬で試験−１日目に処置した豚（Ｃ群）および試験０日目に処置した豚（Ｄ群）から試験１４日目に収集したマクロファージのＩＦＮ−α産生はほぼ２倍増加である。このようなデータは、免疫調節薬が、おそらく、その後のＴＬＲ９シグナル伝達事象の活性化後に、存在するマクロファージが高レベルのＩＦＮ−αを産生する能力を増強させることにより、肺においてプライミング効果をもたらしているのかもしれないことを示唆する。この観察により、おそらく、豚を免疫調節薬で−１４日目に、および再度−１日目の抗原刺激の前に処置するというような２元処置ＰＲＲＳＶモデルにおけるさらなる利用が正当化され得る。
【０１７７】
ＰＲＲＳウイルス血症の統計学的に有意な低減は、免疫調節薬処置群では観察されなかった。しかしながら、７日目、−１日目処置群では、有意ではないが顕著な血清ウイルス血症の低減がみとめられた。肺内ウイルス負荷（図２３に示す）は、１つの免疫調節薬処置群すべてで、どちらの試験でもプラセボ処置豚と比べて算術的に低下した；しかしながら、この低減は統計学的に有意ではなかった。免疫調節薬の投与により肺内ウイルス負荷またはウイルス血症が増強されるという証拠または兆候はみられない。この後者の記載は、ＩＦＮ−αが高濃度でのブタ末梢血単核細胞のインビトロインキュベーションはＰＲＲＳＶの取込みを増強させることを示唆する文献に報告された以前の観察とは逆である。この試験では、免疫調節薬によりＰＲＲＳＶ血清ウイルス血症または肺内負荷が増強されることは示されていない。
【０１７８】
［実施例４］：ＮＡＤＣ．２株のＰＲＲＳウイルスでの実験室的抗原刺激の１日前の豚に単回筋肉内注射として投与した免疫調節薬のプラスの効果。
【０１７９】
成長中の豚における免疫調節薬の用量を滴定するための試験を行った。この試験系では、２ｍＬの５．３８×１０５  ＴＣＩＤ５０  ＰＲＲＳＶ（ＮＡＤＣ−２０株）懸濁液）の１回の鼻腔内投与を行った４つのＰＲＲＳウイルス抗原刺激群（Ａ群［５０μｇの免疫調節薬を試験−１日目に投与］、Ｂ群［５％デキストロース水を試験−１日目に投与］、Ｃ群［７５μｇの免疫調節薬を試験−１日目に投与］およびＤ群［２５μｇの免疫調節薬を試験−１日目に投与］）と１つのシャム抗原刺激群（Ｅ群−厳密な対照）の５つの処置群を試験０日目に評価した。豚は、試験０日目、およそ７．５〜８．５週齢であった。各免疫調節薬処置群を各豚房に２匹ずつの豚で提示し、豚が、８匹の豚の６つの豚房（１つの豚舎に３つの豚房および隣接する豚舎に３つの豚房）ならびに第３の豚舎に８匹の厳密な対照豚の１つの豚房に収容されるようにした。
【０１８０】
結果は、ｐ値が０．１０を統計学的に有意とみなした。有意な処置効力が試験１２日目に呼吸スコアについて観察された（ｐ値は０．０７１９）。試験３、４、６、７および１２日目における対照群（Ｂ群）と各免疫調節薬群間（対比）のペアワイズ比較では、対照群と比べて有意に大きい（より嗜眠性の）挙動スコアが免疫調節薬５０ｐｇ処置群で試験７日目に観察された（ｐ値は０．０９０２）。逆に、対照群と比べて有意に低い（正常に近い）挙動スコアが免疫調節薬７５μｇ処置群において試験１２日目に観察された（ｐ値は０．０９３２）。各日における各免疫調節薬群との対照群のペアワイズ比較により、２５μｇ（４日目と７日目）および７５μｇ（７日目のみ）の用量で投与した免疫調節薬では有意に低い血清ウイルス血症、および５０μｇ用量の投与では試験１４日目において有意に高い血清ウイルス血症がみられた。しかしながら、４日目に２５μｇ群で観察されたウイルス血症の転換数の差が１８に対してわずか２８であったため、試験７日目に２５μｇ群と７５μｇ群で観察された低減のみが臨床的に重要であるとみなす。グロス肺病変もしくは微視的肺病変、臨床スコア、肺内ウイルス負荷、体重、体温または肺重量に対する体重比において有意差は観察されなかった。この試験において１例の有害事象が報告されたが、試験下の本獣医学的製剤品との関連性はないと判断された。
【０１８１】
この試験の目的は、試験０日目のＮＡＤＣ−２０株のＰＲＲＳＶでの実験室的抗原刺激の１日前（試験−１日目）に、最近離乳子豚に２５μｇ、５０μｇまたは７５μｇの免疫調節薬の単回ｉ．ｍ．注射を投与することにより、免疫調節薬の用量を滴定することであった。免疫調節薬の有効性を、プラセボ処置ＰＲＲＳＶ抗原刺激豚と比較した。
【０１８２】
有効性に関する一次応答変数は、挙動および呼吸についての毎日の臨床スコア（試験−２日目から試験１４日目まで）、血清ウイルス血症（試験−２、４、７、１０日目および剖検日）、グロスおよび微視的肺の病態ならびに剖検日（ＰＲＲＳＶ抗原刺激後１４または１５［±１］日目）の肺ウイルス血症であった。体温（試験−２、−１、０、４、７、１０日目および剖検日）ならびに体重（試験０、７、１０および１４日目）を、有効性の二次的な間接的尺度として記録した。また、処置群および豚房への豚の割り付けのため、試験７日目（２０１１年６月７日）にも体重をデータ収集した。
【０１８３】
試験計画
これは、ＰＲＲＳＶおよびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）について血清反応陰性であると確認されている商業的に供給される最近離乳子豚を利用した実験的抗原刺激試験であった。処置群の一覧表を以下の表４０および表４１に示す。
【表３９】
2018521109.tif 000043
【表４０】
2018521109.tif 000044
【表４１】
2018521109.tif 000045
【０１８４】
役割を分けることによりマスキングを行った。毎日の観察、臨床スコアリング、グロスおよび微視的肺の病態の評価、試料の加工処理または検査結果の解釈に関わった試験要員はいずれも、処置群番号と投与された試験物質の関係を知らされないままであった。割り付けリストおよび処置コードキーは試験現場から排除され、試験のインライフフェーズの期間中、試験依頼主が保管した。
【０１８５】
豚を体重の降順により、性別に関係なく、エクセルのＲＡＮＤ（）関数を用いて連続的に最大体重から最小体重までソートしてブロックした。
【０１８６】
動物
この試験で使用した豚（単一の商業用ブタ飼育場に由来するものであり、ＰＲＲＳＶワクチン接種を全く受けたことがないものであった）は、ＰＲＶステージフリーおよびブルセラ症クラスフリーの状態の群であった。豚は、ＰＲＲＳＶおよびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）について血清反応陰性であると確認された。ＥＬＩＳＡの結果は試験ファイルに保持される。
【０１８７】
試験への組み入れのためには、豚は、いずれの時点でも、ＰＲＲＳＶワクチン接種を受けたことがあってはならない；およその年齢、生まれた飼育場、およびＰＲＲＳＶ状態の証明を確認できる追跡可能な記録を有しているものでなければならない；試験−１日目に１０５°Ｆの直腸温度を有しているものでなければならない；試験−１日目と０日目に呼吸スコアおよび抑鬱スコア０を有しているものでなければならない；試験−１日目および０日目の一般健康状態の観察による判定時、身体的に健常でなければならない。
【０１８８】
免疫調節薬
この試験で使用した免疫調節薬は、実施例１で上記のものと同じ免疫調節薬である。
【表４２】
2018521109.tif 000046
【０１８９】
免疫調節薬処置群に割り当てた豚に、２５、５０または７５μｇの免疫調節薬プラスミドＤＮＡが送達される免疫調節薬と５％デキストロース水の２ｍＬの懸濁液の１回の単回筋肉内注射を行った。豚を、一般健康状態の観察のために１日２回ならびに特に呼吸および挙動に関する臨床スコアの評価と記録のために１日１回観察した。
【０１９０】
試験手順
各登録豚の体温を、試験−２日目と−１日目（投与前）から開始して、０日目（抗原刺激前）、２、４、７、１０（剖検前）および剖検日に直腸で測定した。豚の体重を、試験−７（処置および豚房への割り付けのためだけ）、０、７、１０および１４日目にデータ取得した。
【０１９１】
ＮＡＤＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）−２０  ＰＲＲＳウイルスは最初に、１９９６年の異型ＰＲＲＳによる流産の嵐で流産し、診断検査の一環として安楽死させた繁殖豚（ＮＯ  ３５３５８）に由来する肝臓組織を接種したＭＡＲＣ−１４５細胞において分離された。この分離株はエームズ（アイオワ州）のＮＡＤＣに維持管理されている。
【０１９２】
続いて、各豚に、２ｍＬの５．３８×１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ懸濁液を鼻腔内投与した（１ｍＬ／鼻腔）。感染の成功を高めるため、ＰＲＲＳＶ懸濁液を、使い捨て３．０ｍＬ容シリンジの先端に取り付けた小児用の経粘膜霧化デバイス（Ｗｏｌｆｅ  Ｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の使用を伴って投与した。接種原は、吸息時に漸増的に投与された。
【０１９３】
感染性ＰＲＲＳウイルス負荷の定量的評価を、すべての豚において試験−２、４、７、１０日目および剖検日に、以下の手順に従うウイルスの分離（ＶＩ）によって行った。
【０１９４】
ウイルス血症の測定は、２％ウマ血清、１×抗生物質／抗かび薬および１×Ｌ−グルタミンを含有するＭＥＭ培地中の血清の１０倍段階希釈列を調製することにより行った。０．２ｍ１容量の希釈血清試料を三連で、事前に播種したＭａｒｃ−１４５細胞が入っている９６ウェル組織培養プレートに移した。５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４日間の培養後、ウイルスの存在を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）にてＰＲＲＳＶモノクローナル抗体ＳＤＯＷ−１７−Ｆを用いて調べた。ＴＣＩＤ５０を、スピアマン−カルバー法を用いて計算した。
【０１９５】
肺組織内のウイルス負荷を、剖検に収集した肺組織試料において調べた。肺内のウイルス負荷は、右中葉から収集した気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液で調べた。試料由来のウイルスの定量を行った。
【０１９６】
剖検時、肺を胸腔から取り出し、写真撮影し（背側面と腹側面，各写真には豚耳標を記録）、病理医が、Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）に記載のスコアリングシステムに基づいてグロスでの病変をスコアリングした。簡単には、５（５．０）ポテンシャルポイントを前葉、中葉および副葉の背側面と腹側面の各々に割り付けた。１５ポイント（１５．０）を背側後葉に割り付け、１２半（１２．５）を後葉の腹側面に割り付けた。
【０１９７】
各肺葉（肺の背側面と腹側面）を観察し、グロスでの病変を有する罹患肺の推定パーセンテージを、試験依頼主支給のデータ入力フォームに記録した。試験依頼主が、肺葉の最大スコアに罹病肺葉の割合を乗算することにより、最終病変スコアを各肺葉に割り付けた。例えば、背側後葉の２０％に病変が観察された場合、この肺葉の病変スコアは、（２０×１５）／１００＝病変スコア３であると計算された。
【０１９８】
肺組織切片における微視的病変を評価するため、およそ１ｃｍ厚×５ｃｍ長さ×５ｃｍ幅の次の試料を各肺から採取した（図２２）：
ａ）左前葉の前部、
ｂ）左前葉の後部および
ｃ）左後葉の前部。
【０１９９】
試料を少なくとも４８時間、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、次いで加工処理し、パラフィン中に包埋した（自動ティッシュプロセッサで）。
【０２００】
肺切片を検査し、以下の４つの基準に基づいて間質性肺炎の重症度の推定スコアを付与した：
Ａ．肺胞中隔の肥厚：０−肥厚なし（正常）；１−軽度（相対的）；２−中等度（相対的）；３−重度（相対的）
Ｂ．肺胞中隔の肥厚の分布：０−病変なし（正常）；１−中隔の巣状肥厚；２−中隔の多巣性肥厚；３−中隔のびまん性肥厚
Ｃ．ＢＡＬＴ発生：０−最小限数の細胞から通常のＢＡＬＴ；１−軽度の数増加；２−中等度の数増加；３−重度の数増加。
【０２０１】
Ｄ．気道における炎症の徴候：０−なし；１−軽度；２−中等度；３−重度。
【０２０２】
すべての豚を、試験−２日目から開始して試験１４日目まで、以下のスコアリング基準に従って呼吸および挙動について１日１回、観察してスコアリングした。
【表４３】
2018521109.tif 000047
【０２０３】
統計的方法
疾患モデルの評価は、２つの対照群間でグロス肺データおよび微視的肺データを分析することからなるものであった。抗原刺激した対照群が抗原刺激していない厳密な対照群と比べて充分な疾患を示すことを示すために統計学的有意差が必要であった。グロス肺スコア（各肺葉の総計）を、群の効果について、分散分析法を用いて比較した。４つの微視的肺スコア（肺胞中隔の肥厚、中隔内分布）肥厚、気道の炎症およびＢＡＬＴ発生）の各々は、ノンパラメトリックウィルコクソンの順位和検定を用いて比較した。
【０２０４】
残りの分析には２〜５群（抗原刺激した対照群と免疫調節薬処置群）を含めた（ただし、上記の疾患モデル検証は条件を満たしているものとする）。
【０２０５】
臨床スコア（呼吸スコアおよび挙動スコア）を各日について、フィッシャーの正確確率検定によって分析した。処置群の全体的効果が任意のある日において有意な場合、この日について対照群と各免疫調節薬群間（対比）でペアワイズ比較（３つの比較）を行った。
【０２０６】
反復測定したデータ（血清ウイルス血症、体重、体温）は、反復測定分散分析を用いて分析し、適用可能な場合は、ベースライン共変量を含めた。最小ＡＩＣ結果では共分散構造を使用した。近似的にデータが正規分布に近くなるように、必要に応じて角変換を適用した。
【０２０７】
単一のエンドポイントを有するデータ（グロス肺スコア、肺ウイルス血症（ＢＡＬ）および肺重量に対する体重比）は分散分析により分析した。上記のモデルにはすべて、モデルの要素として豚房を組み込み、適切な場合は従属変数の変換を組み込んだ。
【０２０８】
微視的肺（中隔、中隔内分布（Ｄｓｅｐｔａｌ）、気道およびＢＡＬＴ）スコアは、ノンパラメトリックウィルコクソンの順位和検定を用いて分析した。
【０２０９】
分析はすべて、ＳＡＳ  ９．２を用いて行い、アルファ＝０．１を用いて有意な効果を識別した。
【０２１０】
結果
グロス肺スコアおよび微視的肺スコアはどちらも、厳密な対照と抗原刺激した対照群（対比）を比較した場合、有意な処置効果を示した（グロスでの中隔、中隔内分布、気道およびＢＡＬＴのｐ値は、それぞれ０．００２１、０．００３８、０．０６３１、０．０００１および０．００１６）。したがって、疾患モデル検証は条件を満たすものであった。
【０２１１】
呼吸スコアでは、試験１２日目でのみ有意な処置群差が示された（ｐ値は０．０７１９）。その他の試験日では、呼吸スコアでは有意な処置群差はみられなかった（ｐ値は０．１２０２以上）。試験１２日目における対照群と各免疫調節薬群間（対比）のペアワイズ比較（３つの比較）では、ペアワイズによる有意な処置差は示されなかった（ｐ値は０．２１７４以上）。
【０２１２】
挙動スコアでは、３、４、６、７および１２日目に有意な処置群差が示された（ｐ値は、それぞれ０．０３４９、０．０８３１、０．０３４９、０．００７３、０．０６９９）。その他の試験日では、呼吸スコアでは有意な処置群差はみられなかった（ｐ値は０．１９６０以上）。試験３、４、６、７および１２日目における対照群と各免疫調節薬処置群間（対比）のペアワイズ比較では。対照群と比べて有意に大きい挙動スコアが、免疫調節薬５０μｇ処置群で試験７日目に観察された（ｐ値は０．０９０２）。逆に、対照群と比べて有意に低い挙動スコアが、免疫調節薬７５μｇ処置群において試験１２日目に観察された（ｐ値は０．０９３２）。
【０２１３】
血清ウイルス血症データでは、図２６に示されたとおり、統計学的に有意な処置ｘ日相互作用がみられた（ｐ＝０．０７９７）。各日における各免疫調節薬群との対照群のペアワイズ比較により、免疫調節薬２５μｇ（４日目と７日目）および免疫調節薬７５μｇ（７日目のみ）で有意に低い血清ウイルス血症ならびに免疫調節薬５０μｇで試験１４日目に有意に高い血清ウイルス血症がみられた。
【０２１４】
グロスでの肺の病態（各動物について肺葉スコアの総計で表される）では、統計学的に有意な処置群差は示されなかった（全体的処置効果は０．８６８５）。
【０２１５】
微視的肺病態総合スコア（図２８に示す）では、処置群間で、なんら統計学的有意差は示されなかった（中隔、気道およびＢＡＬＴ組織でのｐ値は０．６７２６、０．２８０１および０．２９０１）。中隔の肥厚の分布の総スコアでは有意な処置差が示された（ｐ値は０．００７５）。対照群と各免疫調節薬群間（対比）のペアワイズ比較では、有意差は、対照群と免疫調節薬７５μｇ群間でのみ観察することができた（ｐ値＝０．００４３）。
【０２１６】
考察および結論
幾何平均血清ウイルス血症は、すべての免疫調節薬処置群で試験７日目に、プラセボ抗原刺激群と比べて大きく低下した。また、平均肺内ウイルス負荷は、図２７に示されたとおり、２５μｇおよび５０μｇ処置豚ではプラセボ処置抗原刺激豚と比べて顕著に低かった。同様の結果が別の試験でも観察し、その場合も、免疫調節薬処置豚で平均肺内ウイルス負荷の顕著な低下が示された。免疫調節薬が肺内ＰＲＲＳＶ負荷の低減において測定可能なレベルの有効性をもたらしていることは明白である。
【０２１７】
［実施例５］新生子豚の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原刺激モデルにおける免疫調節薬組成物の有効性。
【０２１８】
この試験は、ビルレント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ８８抗原刺激により易感染性の新生子豚における免疫調節薬組成物の有効性を評価するために実施した。この試験の繁殖豚はすべて、便試料中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ８８について陰性であった。処置関連有害事象は報告されなかった。この試験の子豚はすべて、分娩から数時間後に抗原刺激した。繁殖豚４００９、２６９４、１００４０、４００１および２０８８からの子豚は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養バッチ１で抗原刺激した。繁殖豚２０８２、２１７および２１５からの子豚は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養バッチ２で抗原刺激した。
【０２１９】
３２匹の子豚を試験中に剖検した。３１匹の子豚の死亡または早期終了の原因は大腸菌症によるものであった。１匹の子豚（３０５  Ｔ２）は繁殖豚によって傷つけられ、死んでいるのが見つかった。１匹の豚（３３１  Ｔ１）以外、子豚はすべて、大腸菌症による体重減少のため死亡したか、または安楽死させた（３１匹の豚）。試験期間中、生き残った子豚はすべて（３７匹の豚）、体重が増加した。体重増加は２４０〜１，５４０グラムの範囲であった。繁殖豚２０８８から生まれた子豚は、他の繁殖豚から生まれた子豚と比べて臨床徴候を有していなかった。２匹の子豚だけ（３４２  Ｔ１と３３６  Ｔ３）が１回の観察で便スコア２を有した。分析は、この繁殖豚からの子豚を組み入れて、または組み入れなしで行った。生理食塩水で処置した豚２３匹のうち１３匹（５７％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物１×で処置した豚２２匹のうち９匹（４１％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物５×で処置した豚２３匹のうち９匹（３９％）が大腸菌症のため死亡した。１匹の繁殖豚（２０８８）からの子豚を除外すると、分析は以下のとおりになった：生理食塩水で処置した豚２０匹のうち１３匹（６５％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物１×で処置した豚１９匹のうち９匹（５３％）が大腸菌症のため死亡した。
【０２２０】
ＩＣ−Ｅｘ．１  ５×で処置した豚２０匹のうち９匹（４５％）が大腸菌症のため死亡した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＶＳ  ＃２は、出生日に抗原刺激した易感染性の新生子豚において死亡、臨床徴候および下痢を誘導することができるものであった。子豚を免疫調節薬組成物で処置すると、両方の処置群（１×および５×）において、対照と比べて死亡率が数値的に低下したが統計学的な差はなかった。
【０２２１】
材料および方法
試験動物。地方のウエストポイント（ネブラスカ州）のＫｌｉｔｚ飼育場所有の９匹のＨｅｒｍｉｔａｇｅ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｌｉｎｅｓ−ｃｌａｓｓｉｃ  ｈｙｂｒｉｄＴＭ妊娠繁殖豚を試験し、便中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ８８について陰性であることを確認した。８匹の妊娠繁殖豚を購入し、Ｋｌｉｔｚ飼育施設内の分娩ユニット４に移動させた。繁殖豚は、分娩前の少なくとも３０日間、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ８８ワクチンおよび抗菌剤を投与されていないものであった。８匹の同腹豚の新生子豚を試験にエントリーした。繁殖豚および子豚は、臨床データの解釈を混乱させる可能性のある併発疾患がないものであった。
【０２２２】
動物の飼料および水。繁殖豚は、給餌器から随意に授乳用飼料を受け、自動給水器から随意に水を摂取した。給水器および給餌器は毎日確認し、必要に応じて掃除した。子豚の餌の唯一の供給源は、繁殖豚による乳汁（哺乳）であった。
【０２２３】
併用薬物治療。モネンシンナトリウム混合飼料を繁殖豚に投与した。
【０２２４】
収容。繁殖豚は分娩ユニット４に収容した。試験中、動物を、１日あたりおよそ１２時間の光および７０°Ｆ〜７３°Ｆの範囲の上下温度ならびに４９〜６９％の範囲の湿度に曝露した。７３°Ｆおよび４９〜６９％の範囲の湿度
試験計画の概要。
【０２２５】
処置群の詳細を表５２に示す。試験は３つの子豚群を有した。Ｔ１、Ｔ２およびＴ３群の子豚には、それぞれ生理食塩水、ＩＣ−Ｅｘ．１  １×および５×を投与した。この試験の子豚にはすべて、２ｍＬの適切な試験物質を筋肉内経路によって注射した。
【０２２６】
Ｋ８８線毛抗原に関する試験。妊娠繁殖豚の便試料を収集し、ラボに送った。試料を希釈し、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレート上に画線培養し、約３７℃で一晩インキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）様コロニーをプレートから選択し、凝集試験において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ８８線毛（Ａｂｃａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）に特異的な抗血清を用いて試験した。本試験のために選択し、購入した妊娠繁殖豚は、Ｋ８８線毛を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について陰性であった。
【０２２７】
無作為化。各繁殖豚は７〜１２匹の子豚を出産した。子豚は、二重の独自の耳標で識別した。同腹豚において、子豚を体重の降順によってランク付けし、まず６位（１匹の繁殖豚は７匹の子豚を出産した）または９位（７匹の繁殖豚は１０〜１２匹の子豚を出産した）にランク付けされた子豚を試験に組み入れた。この試験での各同腹豚の子豚を、３つの処置群のうちの１つに無作為に割り付けた（表５２）。６９匹の子豚を試験に組み入れた。
【０２２８】
抗原刺激用培養物の調製。２つのバッチの抗原刺激用培養物を調製した。各バッチのため、１つのバイアルの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−８８分離株（ＭＶＳ  ＃２，４継代目）を超低温冷凍庫から取り出し、室温で解凍した。ループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−８８培養物をバイアルから取り出し、５％ヒツジ血液寒天（ＢＡ）プレート上で画線培養した。このＢＡプレートを５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて一晩、インキュベートした。ＢＡプレート上のコロニーを純度およびβ溶血性ゾーンについて観察した。ＢＡプレートから５つのβ溶血性コロニーを選出し、事前に昇温させた１０ｍＬのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙブイヨン培地（ＴＳＢ）を入れたチューブに移し、数回ピペッティングすることによって分散させて一様な懸濁液を形成した。この懸濁液を、事前に昇温させた２００ｍＬのＴＳＢを入れたフラスコに移した。このフラスコを３７℃でおよそ６時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物を６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）について試験した。バッチ１および２の培養物のＯＤはそれぞれ１．１６および１．１２であった。培養物を０．８５ＯＤまで希釈し、それぞれ５００ｍＬおよび４５０ｍＬのバッチ１および２で、抗原刺激のために分娩ユニット４に送った。
【０２２９】
抗原刺激手順。子豚を、抗原刺激前のおよそ１時間と抗原刺激後の１時間（合計２時間）繁殖豚から離した。この試験の子豚にはすべて、５ｍＬの調製した抗原刺激用培養物を経口で抗原刺激した。
【０２３０】
試験物質。
【０２３１】
生理食塩水：使用期限が２０１３年９月の生理食塩水ロット番号Ａ１１０９０１−３をＶｅｄｃｏから購入した。各１００ｍＬの生理食塩水は、０．９グラムの塩化ナトリウムと注射用水を含有するものであった。生理食塩水は対照物質として使用した。
【０２３２】
滅菌水：使用期限が２０１３年９月の注射用滅菌水，ロット番号６０００８４４（１００ｍＬ容バイアル入り）をＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣから購入した。滅菌水は、免疫調節薬組成物を再水和させるために使用した。
【０２３３】
５％デキストロース：使用期限が２０１４年１月の５％デキストロースＵＳＰ，ロット番号１９−１１２−ＪＴ（２５０ｍＬ容の袋入り）をＨｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ．から購入した。５％デキストロースは、再水和された免疫調節薬組成物を希釈するために使用した。
【０２３４】
免疫調節薬組成物の調製：免疫調節薬のバイアルを冷蔵庫から取り出し、室温まで昇温させた。各バイアルを、使用直前に２ｍＬの滅菌水の添加によって再水和させた。バイアルを３０秒間、渦を巻くように回し、室温で５分間放置した。再水和された免疫調節薬組成物を、５％デキストロースを用いて、表４５の希釈スキームに従って希釈した。希釈した免疫調節薬組成物を、使用時まで（およそ２時間）、氷嚢を用いて保存した。
【０２３５】
表４５．免疫調節薬組成物の希釈スキーム
【表４４】
2018521109.tif 000048
【０２３６】
処置。抗原刺激のおよそ２時間後、子豚を処置した。各子豚に２ｍＬの適切な処置薬（表４８〜５１参照）を筋肉内経路により、首の右側に投与した。Ｔ１、Ｔ２およびＴ３群の子豚には、それぞれ生理食塩水、免疫調節薬組成物１×および５×を投与した。
【０２３７】
臨床評価。登録前に、繁殖豚および子豚を試験担当獣医が観察し、健常であることがみとめられた。抗原刺激後、子豚を１日２回、５日目まで観察した。
【０２３８】
スコアリングの詳細。子豚を個々に検査し、便の軟度の評価を補助するために綿棒を直腸内に静かに挿入した。抗原刺激後、動物を１日２回スコアリングした（表４６および４７参照）：
表４６．便スコア
【表４５】
2018521109.tif 000049
【０２３９】
表４７．一般的な体調スコア
【表４６】
2018521109.tif 000050
【０２４０】
体重。抗原刺激の前（表４８〜５１）、終了前または死亡もしくは安楽死の日に子豚の体重を測定した。
【０２４１】
統計解析。動物は、５日間の観察期間中少なくとも１日で一般体調スコア２以上を有した場合、臨床的に病気とみなした。動物は、５日間の観察期間中少なくとも２回の観察で便スコア（ｓｏｒｅ）２以上を有した場合、便スコアについて陽性とみなした。
【０２４２】
結果
この試験の繁殖豚はすべて、便試料中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ８８について陰性であった。子豚は処置関連有害事象を有しなかった。この試験の子豚はすべて、分娩から数時間後に抗原刺激した。繁殖豚４００９、２６９４、１００４０、４００１および２０８８からの子豚は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養バッチ１で抗原刺激し、前後の力価は、それぞれ１．０４×１０９  ＣＦＵ／ｍＬおよび９．６×１０８  ＣＦＵ／ｍＬであった。繁殖豚２０８２、２１７および２１５からの子豚は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養バッチ２で抗原刺激し、前後の力価は、それぞれ９．９×１０８  ＣＦＵ／ｍＬおよび９．０×１０８  ＣＦＵ／ｍＬであった。
【０２４３】
３２匹の子豚を試験中に剖検した。３１匹の子豚の死亡または早期終了の原因は大腸菌症によるものであった。１匹の子豚（３０５  Ｔ２）は繁殖豚によって傷つけられ、死んでいるのが見つかった。
【０２４４】
１匹の豚（３３１  Ｔ１）以外、子豚はすべて、大腸菌症による体重減少のため死亡したか、または安楽死させた（３１匹の豚）。試験期間中、生き残った豚はすべて（３７匹の豚）、体重が増加した。
【０２４５】
体重増加は２４０〜１，５４０グラムの範囲であった。繁殖豚２０８８から生まれた子豚は、他の繁殖豚から生まれた子豚と比べて臨床徴候を有していなかった。２匹の子豚だけ（３４２  Ｔ１と３３６  Ｔ３）が１回の観察で便スコア２を有した。分析は、この繁殖豚からの子豚を組み入れて、または組み入れなしで行った。生理食塩水で処置した豚２３匹のうち１３匹（５７％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物１×で処置した豚２２匹のうち９匹（４１％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物５×で処置した豚２３匹のうち９匹（３９％）が大腸菌症のため死亡した。１匹の繁殖豚（２０８８）からの子豚を除外すると、分析は以下のとおりになった：生理食塩水で処置した豚２０匹のうち１３匹（６５％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物１×で処置した豚１９匹のうち９匹（５３％）が大腸菌症のため死亡した。免疫調節薬組成物５×で処置した豚２０匹のうち９匹（４５％）が大腸菌症のため死亡した。
【０２４６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＭＶＳ  ＃２は、出生日に抗原刺激した易感染性の新生子豚において死亡、臨床徴候および下痢を誘導することができるものであった。子豚を免疫調節薬組成物で処置すると、両方の処置群（１×および５×）において、対照と比べて死亡率が数値的に低下したが統計学的な差はなかった。本試験を、より大型のサンプルで繰り返すと、充分な統計解析検出力が得られ得よう。
【０２４７】
表４８．処置群への子豚の無作為化および割り付け（繁殖豚ＩＤ  ４００９および２６９４）
【表４７】
2018521109.tif 000051
【０２４８】
表４９．処置群への子豚の無作為化および割り付け（繁殖豚ＩＤ  １００４０および４００１）
【表４８】
2018521109.tif 000052
【０２４９】
表５０．処置群への子豚の無作為化および割り付け
【表４９】
2018521109.tif 000053
【０２５０】
表５１．処置群への子豚の無作為化および割り付け（繁殖豚ＩＤ  ２１７および２１５）
【表５０】
2018521109.tif 000054
【０２５１】
表５２．処置群
【表５１】
2018521109.tif 000055
【０２５２】
表５３．死亡時または安楽死時の豚の体重−（繁殖豚ＩＤ  ４００９および２６９４）
【表５２】
2018521109.tif 000056
【０２５３】
表５４．死亡時または安楽死時の豚の体重（繁殖豚ＩＤ  １００４０および４００１）
【表５３】
2018521109.tif 000057
【０２５４】
表５５．死亡時または安楽死時の豚の体重（繁殖豚ＩＤ  ２０８８および２０８２）
【表５４】
2018521109.tif 000058
【０２５５】
表５６．死亡時または安楽死時の豚の体重（繁殖豚ＩＤ  ２１７および２１５）
【表５５】
2018521109.tif 000059
【０２５６】
表５７．抗原刺激後の豚の体重の増加量または減少量（繁殖豚ＩＤ  ４００９および２６９４）
【表５６】
2018521109.tif 000060
【０２５７】
表５８．抗原刺激後の豚の体重の増加量または減少量（繁殖豚ＩＤ  １００４０および４００１）。
【表５７】
2018521109.tif 000061
【０２５８】
表５９．抗原刺激後の豚の体重の増加量または減少量（繁殖豚ＩＤ  ２０８８および２０８２）
【表５８】
2018521109.tif 000062
【０２５９】
表６０．抗原刺激後の豚の体重の増加量または減少量（繁殖豚ＩＤ  ２１７および２１５）
【表５９】
2018521109.tif 000063
【０２６０】
表６１．繁殖豚４００９から生まれた子豚の臨床スコア
【表６０】
2018521109.tif 000064
【０２６１】
表６２．繁殖豚２６９４から生まれた子豚の臨床スコア
【表６１】
2018521109.tif 000065
【０２６２】
表６３．繁殖豚１００４０から生まれた子豚の臨床スコア
【表６２】
2018521109.tif 000066
【０２６３】
表６４．繁殖豚４００１から生まれた子豚の臨床スコア
【表６３】
2018521109.tif 000067
【０２６４】
表６５．繁殖豚２０８８から生まれた子豚の臨床スコア
【表６４】
2018521109.tif 000068
【０２６５】
表６６．繁殖豚２０８２から生まれた子豚の臨床スコア
【表６５】
2018521109.tif 000069
【０２６６】
表６７．繁殖豚２１７から生まれた子豚の臨床スコア
【表６６】
2018521109.tif 000070
【０２６７】
表６８．繁殖豚２１５から生まれた子豚の臨床スコア
【表６７】
2018521109.tif 000071
【０２６８】
表６９．処置した豚の繁殖豚毎および群毎の抗原刺激後の死亡率
【表６８】
2018521109.tif 000072
【０２６９】
［実施例６］自然抗原刺激を受けた離乳子豚モデルにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と関連している下痢の予防または緩和における免疫調節薬（ＩＣ−Ｅｘ．１）組成物の有効性。
【０２７０】
この試験の目的は、商業的閉じ込め条件下に収容された離乳子豚において、大腸菌症と関連している下痢を予防または緩和するためにＩＣ−Ｅｘ．１を投与することの臨床的有効性を調べることであった。
【０２７１】
この試験系では、２つの別々の供給元飼育場の商業用離乳子豚の２つの集団：シード豚（Ｎ＝５０）集団と候補豚（Ｎ＝４５４）集団を使用した。シード豚は現場に試験−８日目に到着した。試験−４日目、シード豚の５０％が大腸菌症に臨床的に罹患状態であると記録され、β溶血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｂＨＥＣ）について陽性であると確認された。豚は、便スコア（０＝正常、１＝下痢）に基づいて臨床的に罹患状態であると判定した。登録豚に申請する際、便スコアリング方法を試験の有効性エンドポイントとして使用した。すべての候補豚（登録の候補）の重量を試験−１日目に測定した。候補の到着時の平均体重は１３．６ｌｂであった。候補豚は２１日齢であり、到着と同じ日に離乳させた。候補集団において大腸菌症のアウトブレイクを確立させるため、到着時、すべての候補豚を、単一の豚房内でシード豚と一緒にした。翌暦日、候補豚の８％（３６／４５４匹）が大腸菌症に臨床的に罹患状態であると記録され、これは、試験０日目を開始するのに必要な５％閾値の条件を満たしていた。
【０２７２】
試験０日目、すべてのシード豚を試験から除外し、各候補豚の個々の便スコアを記録し、臨床的に罹患状態の候補豚を除外し、１０個の豚房の４１匹の臨床的に正常な候補豚を試験に登録し、試験物質を投与した。すべての登録豚の便スコアを連続５日間（試験１日目から５日目まで）記録した。試験系は、５つの処置群：２ｍＬ容量の５％デキストロース水（Ｄ５Ｗ）を経口（ＰＯ）投与、２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１を２ｍＬ容量でＰＯ投与（ＰＯ＿２）、２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１を１０ｍＬ容量でＰＯ投与（ＰＯ＿１０）、２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１を２ｍＬ容量で筋肉内（ＩＭ）投与および２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１を１ｍＬ容量で直腸内（ＩＲ）投与からなるものであった。ＩＣ−Ｅｘ．１の用量はすべて、Ｄ５Ｗ中の懸濁液として調製した。０日目の体重の統計解析では処置群間に統計学的な差はみられなかった（ｐ＝０．１７２５）。この試験では、離乳時の２０μｇ  ＩＭ用量のＩＣ−Ｅｘ．１の投与により、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｆ１８）と関連している下痢の発生が対照群と比べて３３．３％抑制された（信頼区間［ＣＩ］；２１．９％、４３．１％）。また、ＰＯ＿２、ＰＯ＿１０、ＩＭおよびＩＲ処置群では、下痢の頻度が対照と比べて、それぞれ２２．４％（ＣＩ；１７．８％、２７．１％）、１８．５％（ＣＩ；８．６％、２８．４％）、６５．１％、（ＣＩ；５８．７％、７１．５％）および２０．４％（ＣＩ；１２．８％、２８％）緩和された。５つの処置群間の死亡率において統計学的に有意な（ｐ＞０．０５）差は観察されなかった。収集して培養のために提出した５０（シード豚）例の便試料のうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆ１８線毛抗原は提出された試料の９２．０％（ｎ＝４６）において検出された。このサンプル集団では、他の線毛抗原は検出されなかった。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）毒素遺伝子ＥＡＳＴ１（１００．０％，ｎ＝５０）、ＳＴａ（９２．０％，ｎ＝４６）およびＳＴｂ（１００．０％，ｎ＝５０）がＡＩＤＡアドへシンン（ａｄｈｅｓｉｏｎ）遺伝子（１２．０％，ｎ＝６）とともに、このサンプル集団において回収された。
【０２７３】
この試験では、離乳時の２ｍＬの筋肉内２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１の投与により、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｆ１８線毛抗原、ＥＡＳＴ１、ＳＴａおよびＳＴｂ毒素遺伝子ならびにＡＩＤＡアドヘシン遺伝子）と関連している下痢の発生が抑制された。また、すべての処置群で、対照と比べて下痢の頻度が緩和された。
【０２７４】
表７０．試験群
【表６９】
2018521109.tif 000073
【０２７５】
試験系の確立
表７１．豚を大腸菌症に「臨床的に罹患状態である」と分類するための臨床スコアリングの方法および基準
【表７０】
2018521109.tif 000074
【０２７６】
ｂＨＥＣ＋豚における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検査室診断
潜在的ｂＨＥＣ＋豚からの直腸スワブ収集。直腸スワブをシード豚から到着日に収集し、β溶血性（ｂＨＥＣ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の分離および半定量的評価のためにＭＲＩに送った。これらのうちおよそ５０％以上で大腸菌症の臨床徴候が示された場合、直腸試料を再度、シーダー／ｂＨＥＣ＋豚から試験現場で収集した。シーダー／ｂＨＥＣ＋豚のおよそ５０％が臨床的に罹患状態になり、ｂＨＥＣ＋と確認された後、４５４匹の豚の候補プールを購入し、試験現場に到着したら、単一の豚房内でシーダー／ｂＨＥＣ＋豚と一緒にした。
【０２７７】
スワブ収集、取扱いおよび検査手順。直腸スワブを収集し、Ａｍｉｅｓ輸送培地を入れたチューブ内に入れた。チューブに豚ＩＤ、試験番号、試料の型および収集日をラベル表示した。試料に氷嚢を配し、収集後２４時間以内に輸送した。すべての直腸スワブは、以下の手順に従って加工処理した：
直腸スワブを直接、５％ヒツジ血液寒天（ＢＡ）およびＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（ＭＡＣ）上に画線培養した。ＢＡプレートは第１四分区間内に画線培養し、分離のために交叉画線培養してｂＨＥＣの半定量が可能となるようにした。４つまでのスワブ試料をＭＡＣプレート上に画線培養した。ＢＡプレートとＭＡＣプレートを３６℃±２℃で一晩、好気的にインキュベートした。一次分離ＢＡプレートをｂＨＥＣについて、以下のスキームに従ってスコアリングした。ＭＡＣは、典型的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーが存在している場合に測定を補助するために使用した。
【０２７８】
一次ＢＡからの推定ｂＨＥＣコロニーを新鮮ＢＡおよびＭＡＣ上に継代培養した。評価担当技術者の自己判断で、１つ（またはそれ以上の）分離株が選択された。トリプルシュガーアイアン寒天（ＴＳＩ）斜面培地およびシモンズのクエン酸寒天（ＳＣ）斜面培地への接種には同じ接種原を使用した。ＢＡ、ＭＡＣおよびＴＳＩ斜面培地は３６±２℃で一晩、ＳＣ斜面培地は３６±２℃で２日間インキュベートした。
【０２７９】
分離株は、以下の基準を満たす場合、ｂＨＥＣであると確認された：
・分離株がＭＡＣにおいて典型的なコロニー形態を有し、ＢＡにおいてβ溶血を示した
・酸／酸／Ｈ２Ｓ−／ガスの典型的なＴＳＩ反応
・典型的な陰性ＳＣ反応
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）分離株を、ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いてさらに確認した。
【０２８０】
確認したすべての分離株に対してアイオワ州立大学で遺伝子型検定を行い、以下の遺伝子：ＥＡＳＴ  １毒素、ＬＴ毒素、ＳＴａ毒素、ＳＴｂ毒素、Ｓｔｘ１毒素、Ｓｔｘ２毒素、Ｓｔｘ２ｅ毒素、Ｆ１８線毛、Ｆ４１線毛、Ｋ８８線毛、Ｋ９９線毛、９８７Ｐ線毛、ＡＩＤＡアドヘシン、ＥＡＥＡアドヘシンおよびＰＡＡアドヘシンの存在を評価した。
【０２８１】
表７２．シード豚から分離された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子型の特徴のまとめ
【表７１】
2018521109.tif 000075
【０２８２】
動物の組み入れ基準
シード豚は、購入前にｂＨＥＣを有するものであること、および／または試験現場への搬送前にｂＨＥＣ＋であることが確認された同年出生のコホート豚であることが確認されたものであり、試験現場への搬送前の１４日間になんら抗生物質の投与を受けていないものであった。シード豚は離乳したばかりのものであり、目視評価による明白な傷害または身体の異常はないが、大腸菌症の臨床徴候を示しているかもしれないものであった。そして、シード豚は、候補豚と一緒にする前に、ｂＨＥＣを有することが検査室で確認され（およそ５０％）、「臨床的に罹患状態である」豚に分類され（本プロトコルの項目９のセクション１４に規定のとおり）、アルカリ性ｐＨの便を有するものであった。
【０２８３】
候補豚は、試験現場に到着前の１４日間以内になんら抗生物質処置を施されず、試験現場に到着前の２日間以下以内に離乳させ、離乳日に１９日齢以上であり、シード豚と一緒にする前に目視評価に基づいて概ね健康であるとみなされたものであり；到着時に荷重歩行困難な豚は、状態が獣医学的観察に基づいて重度とみなされない限り、本試験の登録に適格であるとして残した。輸送後、一部の動物は軽度の歩行困難が予測された。候補豚は、試験０日目、臨床的に正常（本プロトコルの項目８のセクション１５に規定のとおり）と分類されたが、その豚房の同房豚のおよそ５％以上は、記録されたスコアに基づくと大腸菌症に臨床的に罹患状態であった。
【０２８４】
動物の除外基準
候補豚は、試験０日目、豚房への収容／処置の割り付けまたは処置投与の時点で以下の属性のうちの１つ以上を有した場合、登録から除外した：鼠径および／または臍ヘルニア、状態の獣医学的評価による判定時、動物の正常な成長行動を乱し得る直腸脱または他の著しい身体の異常もしくは傷害、本プロトコルの項目９のセクション１５に規定された「臨床的に罹患状態である」と分類、獣医による確認時の免荷歩行困難、神経系の疾患の徴候、瀕死または末期の疾病の豚、予備の豚。除外した豚を動物除外フォームに記録した。
【０２８５】
処置後除外基準
大腸菌症のため瀕死とみなされた登録豚は、担当獣医の自己判断で試験から除外し、安楽死させた。このような豚は、処置不成功とみなした。大腸菌症以外の理由で瀕死になったか、または死亡した登録豚も除外した。このような豚は、最終分析において処置不成功とみなさなかった。試験目的を乱すか、または試験の完遂を妨げる可能性のある他のなんらかの疾患または病状に罹患した登録豚も試験から除外し、安楽死させた。このような動物は、処置不成功とみなさず、最終分析から除外した。
【０２８６】
表７３．試験群
【表７２】
2018521109.tif 000076
【０２８７】
陰性対照群に割り当てた豚には、単回ＰＯ投与でのＤ５Ｗを投与し、ＰＯ  ＩＣ−Ｅｘ．１処置群に割り当てた豚について記載のとおりに送達した。
【０２８８】
試験
５０匹のシード豚を入手し、一部の豚がｂＨＥＣを有することを確認した後、試験現場に搬送した。試験現場に到着後のすべてのシード豚の直腸スワブを収集した。スワブをｂＨＥＣの分離および同定のためにＭＲＩ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。シード豚を、大腸菌症の臨床徴候について、プロトコルに記載の臨床スコアリング基準を用いて毎日スコアリングした。この観察期間、臨床的に罹患状態であるシード豚のみを記録した。個々の直腸スワブのｐＨを、下痢スコアが１であった日の少なくとも１日に記録した。シード豚コホートのおよそ５０％が臨床的に罹患状態であると分類され、ｂＨＥＣを有すると確認された場合、候補豚プールを購入し、シード豚と一緒にした。
【０２８９】
自然抗原刺激フェーズ候補：シードとの合同および登録
自然抗原刺激フェーズの開始は、候補豚をシード豚と一緒にした日：試験−１日目であった。自然抗原刺激フェーズの終了は、候補豚プールのおよそ５％以上が大腸菌症に臨床的に罹患状態であると確認された日であった。試験０日目、３６匹の豚（７．９％；４５４匹のうち３６匹）が臨床的に罹患状態であるとみなされ、下痢スコア「１」を有し、試験から除外された（処置せず）。さらに８匹の組み入れ基準を満たす豚も除外した（余分な豚）。残りの豚はすべて、上記の組み入れ基準を満たしており、試験に登録した。シード豚はすべて、試験０日目に除き、記録した。
【０２９０】
この試験では、ブタの商業的閉じ込め施設から供給され、離乳前または離乳時に抗生物質の投与を受けていない豚を使用した。候補豚は、購入時点で健康であり、進行中の大腸菌症を有していなかった。豚はすべて、試験現場への到着日、２１日齢であった。すべての候補豚の体重を試験−１日目に記録し、体重フォームに記録した。毎日の一般健康状態の観察をすべての候補豚とシード豚に対して実施し、記録を到着の１日後から開始し、自然感染フェーズの終了時（試験０日目）まで行った。このフェーズ中、臨床的に罹患状態であるか、または異常な所見のみをスコアリングした。すべての候補豚を大腸菌症の臨床徴候について毎日観察した。
【０２９１】
臨床的有効性フェーズ：臨床スコアリングおよび有害事象の報告
治験担当医が、１日で候補プールのおよそ５％以上が大腸菌症に臨床的に罹患状態であると確信した場合、候補プールのすべての豚の便スコアを調べた。臨床下痢スコアによって大腸菌症アウトブレイクの閾値が確認された場合、候補豚プールを試験物質の投与に適格とみなした。すべての試験豚房に、順次、番号付けしながら（例：豚房１、２、３…）適格候補豚を入れた。全豚房間で豚の数のバランスが維持されるように努力した。試験０日目から開始して、すべての登録豚（４１０匹）を、有害事象および便スコアについて試験５日目まで毎日観察した。臨床観察時は、すべての登録豚について毎日の一般健康状態の観察を実施した。
【０２９２】
使用した統計的方法。信頼区間を伴う予防割合および緩和割合の計算、（Ｒ，バージョン３．１．３のＰＦおよびＭＦパッケージ）、一般化線形混合モデル（ＧＬＭＭ）および分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ＳＡＳ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．３；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用し、下痢、死亡率および平均毎日の増加量の一次パラメータを、それぞれ統計学的に有意としてアルファ＝０．０５を用いて評価した。豚は、この試験において実験単位とみなした。しかしながら、予防割合の分析では、豚房（ｎ＝２／群）を分析の実験単位とみなした。
【０２９３】
表７４．登録豚の体重とＡＤＧのまとめ（試験０日目と５日目）
【表７３】
2018521109.tif 000077
【０２９４】
モデル検証。５日間の試験期間の経過中に下痢を示した対照群の豚（試験群Ｔ０１）の数は、ｂＨＥＣと関連する下痢の発生の予防および／または下痢の頻度の緩和において処置群がプラスの効果を有し得るかどうかを試験するのに、この疾患モデルが充分であったことを示す。これを図２９および表７５に示す。
【０２９５】
表７５．試験１日目から５日目までの間の下痢の累積発生率および予防割合
【表７４】
2018521109.tif 000078
【０２９６】
表７６．下痢日数の平均割合（試験１日目から５日目まで）および緩和割合
【表７５】
2018521109.tif 000079
【０２９７】
ＳＴａおよびＳＴｂ毒素、ＥＡＳＴ１毒素、Ｆ１８線毛およびＡＩＤＡアドヘシン遺伝子が５０匹のｂＨＥＣ＋シード豚の大多数に存在していることがわかった。Ｄ５Ｗ処置群における下痢の高い発生率（９９％，ＳＤ４の差）は、候補豚が、シード豚集団と一緒にされることによりｂＨＥＣで充分に抗原刺激されたことを示す。
【０２９８】
離乳子豚における大腸菌症を予防または緩和するためのＩＣ−Ｅｘ．１の有効性。この試験では、離乳時の２ｍＬの筋肉内２０μｇ用量のＩＣ−Ｅｘ．１の投与により、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｆ１８線毛、ＥＡＳＴ１、ＳＴａ、およびＳＴｂ毒素、ならびにＡＩＤＡアドヘシン遺伝子）と関連している下痢の発生が抑制された。また、すべての処置群で、対照と比べて下痢の頻度が緩和された。
【０２９９】
［実施例８］
実施例８．免疫学的経路およびＩＣ−Ｅｘ．１での処置後のサイトカイン産生。
【０３００】
本実験手順の目的は、ＩＣ−Ｅｘ．１によって賦活される免疫学的経路を調べることであった。
【０３０１】
豚から血液を採取し、免疫細胞を血液試料から磁気細胞分離を用いて分離した（図３０）。樹状細胞および単球を含む１７２ａ＋細胞と、ナチュラルキラー、ＴおよびＢ細胞を含む１７２ａ−細胞をインビトロで培養した。表７７を参照されたい。培養物を、いろいろな濃度のＩＣ−Ｅｘ．１、充分に特性評価された免疫賦活薬ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ、ＰＡＭ３ＣｙｓおよびＬＰＳまたはブランク対照脂質で賦活し、１８時間インキュベートした。上清みを、ＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇを用いてＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ１β、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ４０、Ｉｌ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。
【０３０２】
フローサイトメトリーを使用し、ＩＣ−Ｅｘ．１処置後のサイトカイン産生を担う細胞型を調べた。細胞培養物をブレフェルジンＡで処理した。ブレフェルジンＡはゴルジ複合体を阻害して、細胞内で産生されたサイトカインが該細胞内に留まるようにする作用をする。保持されたこのサイトカインは、フルオロフォア標識抗体を用いて検出され得る。
【０３０３】
表７７．免疫賦活薬の濃度
【表７６】
2018521109.tif 000080
【０３０４】
結果
Ａ．生理学的に重要な用量のＩＣ−Ｅｘ．１によって大量のＩＦＮ−αが誘導される。
【０３０５】
図３１は、生理学的に重要な濃度のＩＣ−Ｅｘ．１により、ＣＤ１７２ａ＋細胞におけるＩＦＮ−αの発現が賦活されることを示す。ＩＦＮ−αは、ウイルスおよび他の細胞内病原体に対する宿主の防御において重要である。
【０３０６】
対照的に、ＣＤ１７２ａ−細胞は、ＩＣ−Ｅｘ．１での賦活後にサイトカインを産生せず、ＩＣ−Ｅｘ．１は、この細胞では強力なサイトカイン発現活性化因子ではないことが示唆される。この細胞は、活性化状態となるために活性化された単球または樹状細胞からの情報を必要とするため、該細胞はＩＣ−Ｅｘ．１の主要標的ではないようである。しかしながら、この細胞は、ＩＣ−Ｅｘ．１のインビボ応答に関与しているかもしれないが、その関与はＩＣ−Ｅｘ．１との直接的な相互作用を含むものではないかもしれない。図３２を参照されたい。ＣＤ１７２ａ−細胞は、ＩＣ−Ｅｘ．１または既知の免疫賦活薬での賦活後にＩＦＮ−αを産生しない。ＩＮＦαがＣＤ１７２ａ−では産生されないという同じ理由で、ＴＮＦαもまた、ＣＤ１７２ａ−細胞ではＩＣ−Ｅｘ．１または既知の賦活薬での賦活後に産生されない（図３３）。
【０３０７】
Ｂ．形質細胞様樹状細胞はＩＣ−Ｅｘ．１によって活性化されてＩＦＮ−αを産生する。
【０３０８】
フローサイトメトリーを使用し、ＩＣ−Ｅｘ．１によって活性化され、ＩＣ−Ｅｘ．１賦活の結果としてサイトカインを産生する細胞型（１つまたは複数）を同定した。図３４Ａ〜Ｄを参照されたい。対照脂質で賦活したＣＤ１４＋単球、伝統的樹状細胞（ｃＣＤ）または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は有意な量のＩＦＮ−αを産生することができなかった。同様に、図３５Ａ〜Ｃ、図３６Ａ〜Ｃおよび図３７Ａ〜Ｃは、それぞれＣｐＧ  ＯＤＮ、ＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＣ−Ｅｘ．１（１０ｎｇ／ｍＬ）がＣＤ１４＋単球またはｃＤＣを賦活しないことを示す。しかしながら、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＣ−Ｅｘ．１（１０ｎｇ／ｍＬ）はｐＤＣにおけるＩＦＮ−α産生を賦活した（それぞれ、図３５Ｄ、３６Ｄおよび３７Ｄ）。
【０３０９】
ＩＣ−Ｅｘ．１とリポソームとの直接比較は、おそらく、ｐＤＣにおける賦活効果は、リポソーム単独によるものではなく、むしろリポソームと上記の核酸分子の組合せによるものであることを示す。図３８Ａ〜Ｃおよび図３９Ａ〜Ｃは、１００ｎｇ／ｍＬ濃度のＩＣ−Ｅｘ．１も１００ｎｇ／ｍＬ濃度のリポソームもどちらも、ＣＤ１４＋単球またはｃＤＣにおけるＩＦＮ−α産生を誘発しなかったことを示す。図３８Ｄおよび図３９Ｄは、ｐＤＣにおけるＩＦＮ−α産生を賦活するＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬ）の能力を示すが、リポソーム（１００ｎｇ／ｍＬ）はｐＤＣにおいてＩＦＮ−αを産生することができなかったことを示す。
【０３１０】
ＩＣ−Ｅｘ．１は、１０ｎｇ／ｍＬであってもサイトカイン産生をもたらすのに充分である。ＩＣ−Ｅｘ．１（１０ｎｇ／ｍＬ）およびリポソーム（１０ｎｇ／ｍＬ）は、ＣＤ１４＋単球またはｃＤＣにおいてＩＦＮ−αを産生することができなかった（図４０Ａ〜Ｃおよび図４１Ａ〜Ｃ）が、１０ｎｇ／ｍＬのＩＣ−Ｅｘ．１は、ｐＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生を賦活するのには充分であった。１０ｎｇ／ｍＬのリポソームでは、１０ｎｇ／ｍＬのＩＣ−Ｅｘ．１と同様の結果を得ることができなかった（図４０Ｄおよび図４１  Ｄ）。
【０３１１】
図４２を参照されたい。インターフェロン産生細胞と同定された細胞のパーセンテージは、ｐＤＣではＣｐＧ  ＯＤＮならびにＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）で最も高い。また、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も、ｐＤＣではＣｐＧ  ＯＤＮならびにＩＣ−Ｅｘ．１（１００ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）で最も高い（図４３）。
【０３１２】
Ｃ．生理学的に重要な用量のＩＣ−Ｅｘ．１によりＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が誘導される。
【０３１３】
ＣＤ１７２＋高含有細胞は、生理学的に重要な用量のＩＣ−Ｅｘ．１で賦活した場合、ＩＦＮ−γを産生した。細胞型同士の相互作用にはＩＦＮ−γ産生が必要であるため、この産生は、ＣＤ１７２＋細胞画分中に残存しているＣＤ１７２−細胞に起因するものであり得る。図４４を参照されたい。その他の既知の免疫賦活薬との比較では、ＩＣ−Ｅｘ．１は、驚くべきことに、ＩＦＮ−γ産生の最も強力な誘導因子であり、さらには、ＩＣ−Ｅｘ．１は、最も少ない試験濃度（１ｎｇ／ｍＬ）であっても、検出可能な量のＩＦＮ−γの産生を誘導した。また、ｃＧＡＭＰも、ＩＦＮ−γの産生を誘導するその能力について試験した。図４４はまた、ｃＧＡＭＰがＩＦＮ−γ産生を誘導することも示し、これは、ＳＴＩＮＧ経路のＩＦＮ−γ産生活性化能を示す。
【０３１４】
また、ＣＤ１７２＋高含有細胞は、生理学的に重要な用量のＩＣ−Ｅｘ．１で賦活した場合、ＩＬ−４も産生した。図４５は、１μｇ／ｍＬのＩＣ−Ｅｘ．１が、ＩＬ−４の産生を、最高投薬量のＣｐＧ  ＯＤＮ（５μｇ／ｍＬ）と同等のレベルで誘導することを示す。
【０３１５】
また、ＩＣ−Ｅｘ．１での賦活後、他のサイトカインも産生されるが、陽性対照での賦活よりも低レベルである。例えば、ＩＣ−Ｅｘ．１はＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の弱い誘導因子であった。図４６〜４８は、ＩＣ−Ｅｘ．１がこれらのサイトカインの発現をＣｐＧ  ＯＤＮと同様のレベルで誘導したが、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）およびＰＡＭ３Ｃｙｓ（１０μｇ／ｍＬ）よりは下のレベルで誘導したことを示す。
【０３１６】
［実施例９］
実施例９：ＩＣ−Ｅｘ．１は、ＰＲＲＳウイルスに対する単球由来マクロファージを保護する。
【０３１７】
ＩＣ−Ｅｘ．１はＩＦＮ−αの誘導因子であるため、およびＩＦＮ−αはウイルス感染に対する宿主防御の鍵となる成分であるため、ウイルス感染に対する抵抗力を付与するＩＣ−Ｅｘ．１の能力を調べた。実施例８に記載のようにして豚の血液から誘導した単球のインビトロ培養物を、ＩＣ−Ｅｘ．１またはＩＦＮ−γ（これは、細菌感染に対する抵抗力を高めることが知られている）のいずれかで処理した。処置後、細胞にＰＲＲＳを接種し、感染率について評価した。
【０３１８】
結果
ＰＲＲＳに対する曝露前にＩＣ−Ｅｘ．１で処置した細胞の方が、処置しなかった細胞と比べて感染が少なかった。図４９は、ＩＣ−Ｅｘ．１での前処置では、ＰＲＲＳに感染した細胞のパーセンテージがＩＦＮ−γで前処理した細胞と同じくらいであったことを示す。ＩＣ−Ｅｘ．１での前処置後に感染した細胞のパーセンテージは、前処置なしでＰＲＲＳに感染させた細胞のパーセンテージの半分より少ない。
【０３１９】
上記のことに鑑みると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の好都合な結果が得られることがわかるであろう。
【０３２０】
上記の生成物、組成物および方法において、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得るため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示された事柄はすべて、実例であると解釈すべきであり、限定的な意味で解釈すべきでないことを意図する。
【図１】
2018521109.tif 000081
【図２】
2018521109.tif 000082
【図３】
2018521109.tif 000083
【図４】
2018521109.tif 000084
【図５】
2018521109.tif 000085
【図６】
2018521109.tif 000086
【図７】
2018521109.tif 000087
【図８】
2018521109.tif 000088
【図９】
2018521109.tif 000089
【図１０】
2018521109.tif 000090
【図１１】
2018521109.tif 000091
【図１２】
2018521109.tif 000092
【図１３】
2018521109.tif 000093
【図１４】
2018521109.tif 000094
【図１５】
2018521109.tif 000095
【図１６】
2018521109.tif 000096
【図１７】
2018521109.tif 000097
【図１８】
2018521109.tif 000098
【図１９】
2018521109.tif 000099
【図２０】
2018521109.tif 000100
【図２１】
2018521109.tif 000101
【図２２】
2018521109.tif 000102
【図２３】
2018521109.tif 000103
【図２４】
2018521109.tif 000104
【図２５】
2018521109.tif 000105
【図２６】
2018521109.tif 000106
【図２７】
2018521109.tif 000107
【図２８】
2018521109.tif 000108
【図２９】
2018521109.tif 000109
【図３０】
2018521109.tif 000110
【図３１】
2018521109.tif 000111
【図３２】
2018521109.tif 000112
【図３３】
2018521109.tif 000113
【図３４】
2018521109.tif 000114
【図３５】
2018521109.tif 000115
【図３６】
2018521109.tif 000116
【図３７】
2018521109.tif 000117
【図３８】
2018521109.tif 000118
【図３９】
2018521109.tif 000119
【図４０】
2018521109.tif 000120
【図４１】
2018521109.tif 000121
【図４２】
2018521109.tif 000122
【図４３】
2018521109.tif 000123
【図４４】
2018521109.tif 000124
【図４５】
2018521109.tif 000125
【図４６】
2018521109.tif 000126
【図４７】
2018521109.tif 000127
【図４８】
2018521109.tif 000128
【図４９】
2018521109.tif 000129
【国際調査報告】
2018521109.tif 000130
2018521109.tif 000131
2018521109.tif 000132