(57)【要約】  本明細書に記載される方法および組成物は、驚くことに、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前および／または接触させた後に、細胞を幹細胞生存能力エンハンサーで一時的に処理することによって、幹細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集を増大する。さらに、この処理は、意外なことに、対象の標的組織中への幹細胞の生着の増大ももたらす。本開示は、幹細胞生存能力エンハンサーと組み合わせて使用されると、幹細胞における遺伝子編集頻度をさらに増加し、幹細胞生存能力を増大すると共に、幹細胞生着を増大する１つまたは複数の修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植のための修飾細胞を作製する方法であって、
（ａ）細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に、
（ｂ）前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と前記細胞を接触させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
細胞において標的核酸を修飾する方法であって、
幹細胞生存能力エンハンサー；
修飾ｇＲＮＡ分子；および
Ｃａｓ９分子
と前記細胞を接触させるステップ
を含む方法。
【請求項３】
対象に修飾細胞を移植する方法であって、
幹細胞生存能力エンハンサー；
ｇＲＮＡ分子；および
Ｃａｓ９分子
と細胞を接触させて、修飾細胞を作製するステップ、ならびに
前記修飾細胞を前記対象に移入するステップ
を含む方法。
【請求項４】
前記接触ステップが、
（ａ）前記細胞を前記幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に
（ｂ）前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、前記ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子と前記細胞を接触させるステップ
を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子と前記細胞を接触させるステップが、電気穿孔を用いて実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
電気穿孔の前に、前記細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
電気穿孔後に、前記細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、約３０℃〜約３２℃の温度で低温ショックに付される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記１２０時間未満の期間が、約７２時間である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１２０時間未満の期間が、約２４〜４８時間である、請求項１または４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１２０時間未満の期間が、前記細胞の拡大を促進する上で十分に長くない期間である、請求項１または４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）前記細胞を前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に７２時間未満の期間にわたって接触させるステップをさらに含む、請求項１または４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）の後の７２時間未満の前記期間が、前記細胞の拡大をもたらす上で十分に長くない期間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、細胞の集団であり、前記細胞の集団中の細胞の数が、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に５倍以上増加しない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、細胞の集団であり、前記細胞の集団中の細胞の数が、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に２倍以上増加しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）後の７２時間未満の前記期間が、ステップ（ｂ）後の約２４〜約４８時間の期間である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、前記接触ステップの終了から７２時間以内にヒト対象に移入される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、前記接触ステップの終了から７２時間以内に凍結保存される、請求項１、２、または４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、前記細胞の分化を阻害し、そのプログラム細胞死を阻害し、その老化を阻害し、その自然免疫応答を阻害する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、オートファジーまたはアポトーシスを阻害することにより、プログラム細胞死を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、対象の標的組織中に生着する、請求項３または請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、細胞の集団を含み、前記細胞の少なくとも２％が、前記対象の前記標的組織中に生着する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、細胞の集団を含み、前記細胞の少なくとも１５％が、前記対象の前記標的組織中に生着する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、前記対象の標的組織中に少なくとも１６週間生着したままである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的組織が、末梢血、骨髄、または脾臓である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞が、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触ステップの前に、前記対象から前記細胞を単離するステップをさらに含む方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）の後に、１つまたは複数のサイトカインを含む培地中で前記細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１、４、または１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数のサイトカインが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）の後に、前記細胞を培地中で培養するステップをさらに含み、ここで、前記培地が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達モジュレーター、ＴＧＦ−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン様成長因子３（ＩＧＦ３）、アンジオポエチン（ＡＮＧ１）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）、ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４伝達軸モジュレーター、Ｗｎｔシグナル伝達モジュレーター、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む、請求項１、４、または１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間培地中で培養される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡｈＲアンタゴニストが、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）、ＬＧＣ０００６、α−ナフトフラボン、およびＣＨ−２２３１９１からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡｈＲアンタゴニストが、ＳＲ１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記自然免疫応答アンタゴニストが、シクロスポリンＡ、デキサメタゾン、レスベラトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌ）、ＭｙＤ８８阻害ペプチド、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質、グルココルチコイド、ＯｘＰＡＰＣ、ＴＬＲアンタゴニスト、ラパマイシン、ＢＸ７９５、およびＲＬＲｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、ＭＧ１３２、ＳＢ４３１５４２、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、および１６、１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
第２のＣａｓ９分子と前記細胞を接触させるステップをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｃａｓ９分子が、標的核酸における一本鎖切断を触媒することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｃａｓ９分子が、標的核酸における二本鎖切断を触媒することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｃａｓ９分子が、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性はない、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｃａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性はない、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｇＲＮＡ分子と前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｇＲＮＡ分子が、修飾ｇＲＮＡ分子である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記修飾ｇＲＮＡ分子が、５’末端キャップ構造を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記修復ｇＲＮＡ分子が、３’末端ポリ−Ａテールを含む、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または組み込み欠陥ウイルス（ＩＬＤＶ）に存在する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞をトランスジーンと接触させるステップをさらに含み、ここで、前記接触ステップは、前記トランスジーンが、前記幹細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする条件下で行う、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記トランスジーンが、プロモーターとポリ−アデニンテールをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記トランスジーンが、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞をｅｉＣａｓ９分子と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｅｉＣａｓ９分子が、転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｇＲＮＡ分子が、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的遺伝子が、表４に記載されている、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
移植のための造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって、
（ａ）ＨＳＣを、幹細胞生存能力エンハンサーと７２時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に、
（ｂ）前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９ポリペプチドで前記ＨＳＣを電気穿孔するステップを含み、ここで、前記修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されており、前記修飾ｇＲＮＡ分子は、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含む５’末端修飾と、ポリアデニンテールを含む３’末端修飾とを含む方法。
【請求項７０】
ステップ（ａ）の間に、以下：幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインと前記ＨＳＣを接触させるステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、ＳＲ１、ｄｍＰＧＥ２、またはＳＲ１とｄｍＰＧＥ２の組み合わせである、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド、またはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９ポリペプチドである、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
電気穿孔後に低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法によって改変される細胞。
【請求項７５】
請求項７４に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項７６】
対象の疾患を治療または予防する方法であって、修飾細胞または請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法により改変された細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７７】
幹細胞生存能力エンハンサー；
修飾ｇＲＮＡ分子；および
Ｃａｓ９分子
を含む幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項７８】
幹細胞をさらに含み、ここで、前記幹細胞は、前記修飾ｇＲＮＡ分子と前記Ｃａｓ９分子を含む、請求項７７に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項７９】
幹細胞をさらに含み、ここで、前記幹細胞は、幹細胞生存能力エンハンサーを含む、請求項７７に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８０】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストからなる群から選択される、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８１】
前記ＡｈＲアンタゴニストが、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）、ＡｈＲＡ、ジメトキシフラボン、６，２’、４’−トリメトキシフラボン、ＬＧＣ０００６、α−ナフトフラボン、およびＣＨ−２２３１９１からなる群から選択される、請求項８０に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８２】
前記ＡｈＲアンタゴニストが、ＳＲ１である、請求項８１に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８３】
前記自然免疫応答アンタゴニストが、シクロスポリンＡ、デキサメタゾン、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、ＭｙＤ８８阻害ペプチド、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質、グルココルチコイド、ＯｘＰＡＰＣ、ＴＬＲアンタゴニスト、ラパマイシン、ＢＸ７９５、およびＲＬＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項８０に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８４】
前記幹細胞生存能力エンハンサーが、ＭＧ１３２、ＳＢ４３１５４２、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、および１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）からなる群から選択される、請求７７〜７９のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８５】
前記修飾ｇＲＮＡ分子が、５’末端キャップ構造を含む、請求項７７〜８４のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８６】
前記修飾ｇＲＮＡ分子が、３’末端ポリアデニンテールを含む、請求項７７〜８５のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８７】
第２のＣａｓ９分子をさらに含む、請求項７７〜８６のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８８】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）である、請求項７７〜８７のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項８９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸における一本鎖切断を触媒することができる、請求項８８に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９０】
前記ｅａＣａｓ９が、前記標的核酸における二本鎖切断を触媒することができる、請求項８８に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９１】
前記Ｃａｓ９分子が、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択される、請求項７７〜９０のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９２】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性はない、請求項７７〜８９のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９３】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項９２に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９４】
前記Ｃａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性はない、請求項７７〜８９のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９５】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項９４に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９６】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項７７〜９５のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９７】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項９６に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９８】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項９６に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項９９】
前記ｇＲＮＡ分子と前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項９６〜９８のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１００】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸である、請求項７７〜９５のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０１】
サイトカインをさらに含む、請求項７７〜１００のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０２】
前記サイトカインが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）からなる群から選択される、請求項１０１に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０３】
以下：塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達モジュレーター、ＴＧＦ−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン様成長因子３（ＩＧＦ３）、アンジオポエチン（ＡＮＧ１）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）、ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４伝達軸モジュレーター、またはＷｎｔシグナル伝達モジュレーターのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項７７〜１０２のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０４】
テンプレート核酸をさらに含む、請求項７７〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１０４に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０６】
前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または組み込み欠陥ウイルス（ＩＬＤＶ）に存在する、請求項１０４に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０７】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾、３’ホスホロチオエート修飾、または５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾の両方を含む、請求項１０５に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０８】
前記ｇＲＮＡ分子が、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む、請求項７７〜１０７のいずれか１項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１０９】
前記標的遺伝子が、表４に記載されている、請求項１０８に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
【請求項１１０】
標的核酸中に修飾を含む幹細胞であって、前記幹細胞を（ａ）幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させた後、（ｂ）前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触させた、幹細胞。
【請求項１１１】
前記幹細胞を（ｃ）前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に７２時間未満の期間にわたってさらに接触させた、請求項１１０に記載の標的核酸中に修飾を含む幹細胞。
【請求項１１２】
ステップ（ｂ）の後の７２時間未満の前記期間が、前記幹細胞の拡大をもたらすのに十分に長くない期間である、請求項１１０に記載の標的核酸中に修飾を含む幹細胞。
【請求項１１３】
標的核酸中に修飾を含む幹細胞の集団であって、前記幹細胞の集団を（ａ）幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させた後、（ｂ）前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触させた、幹細胞の集団。
【請求項１１４】
前記幹細胞の集団を（ｃ）前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に７２時間未満の期間にわたってさらに接触させた、請求項１１３に記載の幹細胞の集団。
【請求項１１５】
ステップ（ｂ）の後の７２時間未満の前記期間が、前記幹細胞の拡大をもたらすのに十分に長くない期間である、請求項１１３に記載の幹細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／１５９，７８５号明細書；２０１５年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２２０，６４８号明細書；２０１５年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２４４，５７７号明細書；および２０１６年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／２７９，０２０号明細書の優先権を主張するものであり、これら各々の内容全体は、本明細書に参照により明示的に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、その内容全体が、本明細書に参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年５月６日に作製され、２０１６−０５−０６＿１２６４５４−００５２０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズは１．０７メガバイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子療法は、個体の遺伝子の発現を修飾するか、または異常な遺伝子を修正するために使用される一連の戦略である。細胞療法は、疾患の治療を受ける患者に生存細胞を投与するか、またはその患者において特定の細胞集団を成熟させる。遺伝子療法および細胞療法は、核酸または細胞集団における疾患の原因を標的化することを目標とする、共通の分野である。例えば、造血器疾患は、対象への生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子修飾幹細胞（例えば、造血幹／前駆細胞および造血幹細胞、ＨＳＣとも呼ばれる）の移植によって治療することができる。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの発見および哺乳動物へのその適用によって、例えば、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、またはその他のＤＮＡ修復経路を介して、標的遺伝子の有効かつ正確な編集が達成される。任意選択的に供与体ＤＮＡ修復テンプレート分子と一緒に、Ｃａｓ９分子および標的特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を共送達すると、ゲノム内での標的配列の遺伝子編集（例えば、疾患関連突然変異）が促進される。従って、幹細胞中の遺伝子の修飾を目的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用は、複数の遺伝性疾患を治療する上で有望な戦略である。しかしながら、幹細胞は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での操作に対して極めて感受性が高いため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた幹細胞の操作は、今日まで非効率的であり、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で幹細胞の長期生存能力および生着をほとんど達成していない。
【０００５】
幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の使用を容易にするために、幹細胞を生体外で拡大する方法が開発されている。例えば、ある小分子は、長い曝露期間（典型的には、１週間を超える曝露期間）にわたって、幹細胞を生体外で拡大する、例えば、増殖を増大する、すなわち、培養中の幹細胞の数を数倍増加させるために使用されている。こうした事例では、幹細胞の拡大を促進する、例えば、生体外で培養物中の幹細胞の数の有意な増加をもたらすために、少なくとも７日の最小曝露期間が必要である。しかしながら、幹細胞集団を拡大するために必要なこの長い生体外培養期間は、臨床適用にとって最適ではない。
【０００６】
さらに、拡大した幹細胞を用いた細胞移植の臨床的有効性は、生着の閾値レベルの達成を条件とすることが多く、これは、今日まで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた幹細胞の操作後に達成することが極めて困難であった。例えば、Ｗａｌａｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１２），１２６６：１３８−１５０を参照されたい。実際に、これまで、拡大後であっても、いずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで操作されたＨＳＣも、１％を超える長期生着を示す報告は公開されていない。（Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５（５）：６４３−５２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗａｌａｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１２），１２６６：１３８−１５０
【非特許文献２】Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５（５）：６４３−５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）における遺伝子編集または調節を最適化して、幹細胞の生存能力、複能性、および自己再生能力を保存するために使用することができる別の方法および組成物の必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載される方法および組成物は、幹細胞、例えば、ＨＳＣにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集を増大する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム構成要素（例えば、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、もしくはテンプレート核酸）などの外来分子に幹細胞を曝露すると、幹細胞にストレスが加わり、自然免疫応答を誘導する可能性があり、これが、例えば、プログラム細胞死または幹細胞分化をトリガーする。本明細書に記載される方法およびシステムを使用すると、外来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への曝露後の幹細胞のプログラム細胞死を最終的に招き得る自然免疫応答シグナル伝達事象が低減または無効化する。具体的には、幹細胞を１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と接触させる前および／または接触後に、幹細胞を幹細胞生存能力エンハンサーに一時的に（例えば、１２０時間未満の期間にわたり）曝露することによって、外来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素に対する幹細胞の自然免疫応答が低減するか、または阻害され、これにより、幹細胞の生存能力が著しく増大する。
【００１０】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の送達前および／もしくは送達後に、生存能力を向上させ、細胞内自然免疫応答を阻止する、またはその両方を果たす幹細胞生存能力エンハンサー（例えば、小分子）による幹細胞の一時的処理によって、幹細胞の複能性および自己再生能力の増大ももたらされる。さらには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の送達前および／もしくは送達後に、生存能力を向上させ、細胞内自然免疫応答を阻害する、またはその両方を果たす幹細胞生存能力エンハンサー（例えば、小分子）による幹細胞の一時的処理によって、対象への修飾幹細胞の導入時に、標的組織における幹細胞の生着も増大する。本明細書に開示される試薬に対する幹細胞の一時的曝露の思いがけない利点は、これらが、典型的に幹細胞拡大剤として、例えば、幹細胞の増殖を増大し、その数を数倍増加させるために使用されたと考え、また、幹細胞の拡大の利益には、長期間にわたる薬剤との接触（例えば、培養物中での１週間超の曝露）が必要であることを考慮すれば、驚くべきことである。従って、本明細書に記載される方法および組成物は、生存幹細胞中の標的核酸配列の編集を最適化し、様々な臨床応用における幹細胞療法の分野を進化させる上で特に有利である。
【００１１】
一態様では、移植のための修飾細胞、例えば、幹細胞の作製方法が本明細書に開示され、これは、（ａ）細胞、例えば、幹細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させるステップ、続いて（ｂ）幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と上記細胞を接触させるステップを含む。
【００１２】
別の態様では、細胞、例えば、幹細胞において標的核酸を修飾する方法が本明細書に開示され、本方法は、幹細胞生存能力エンハンサー；修飾ｇＲＮＡ分子；およびＣａｓ９分子と上記細胞を接触させるステップを含む。一実施形態では、接触ステップは、（ａ）幹細胞生存能力エンハンサーと細胞を１２０時間未満の期間にわたって接触させるステップ、続いて（ｂ）幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と上記細胞を接触させるステップを含む。
【００１３】
別の態様では、修飾細胞、例えば、幹細胞を対象に移植する方法が本明細書に開示され、本方法は、細胞、例えば、幹細胞を、幹細胞生存能力エンハンサー；ｇＲＮＡ分子；およびＣａｓ９分子と接触させて、修飾細胞、例えば、修飾幹細胞を作製するステップ、ならびに、修飾細胞、例えば、修飾幹細胞を被験者に移入するステップを含む。一実施形態では、接触ステップは、（ａ）細胞、例えば、幹細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと１２０時間未満の期間にわたって接触させるステップ、続いて（ｂ）幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と上記細胞、例えば、幹細胞を接触させるステップを含む。
【００１４】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と細胞、例えば、幹細胞を接触させるステップは、電気穿孔を用いて実施する。
【００１５】
一実施形態では、本方法は、電気穿孔の前に、細胞、例えば、幹細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、電気穿孔後に、細胞、例えば、幹細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む。一実施形態では、細胞、例えば、幹細胞は、約３０℃〜約３２℃の温度で低温ショックに付される。
【００１６】
別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約９６時間である。一実施形態では、１２０時間未満の期間は、約７２時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約４８時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約３６時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約２４時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約１２時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約２４〜約４８時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約１〜約１２０時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約４８〜約１２０時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約２４〜約９６時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約２４〜約７２時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約３６〜約４８時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約２４〜約３６時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約１２〜約２４時間である。別の実施形態では、１２０時間未満の期間は、約１２〜約３６時間である。一実施形態では、１２０時間未満の期間は、幹細胞の拡大を促進するのに十分に長くない期間である。
【００１７】
一実施形態では、本方法は、（ｃ）細胞、例えば、幹細胞を幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に９６時間未満の期間にわたって接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、（ｃ）細胞、例えば、幹細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に８４時間未満の期間にわたって接触させるステップをさらに含む。
【００１８】
一実施形態では、本方法は、（ｃ）細胞、例えば、幹細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ（ｂ）の後に７２時間未満の期間にわたって接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後の７２時間未満の期間は、細胞の拡大をもたらすのに十分に長くない期間である。
【００１９】
一実施形態では、細胞は、細胞の集団であり、細胞の集団中の細胞の数は、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に１０倍以上増加しない。一実施形態では、細胞は、細胞の集団であり、細胞の集団中の細胞の数は、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に５倍以上増加しない。別の実施形態では、細胞は、細胞の集団であり、細胞の集団中の細胞の数は、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に４倍以上増加しない。別の実施形態では、細胞は、細胞の集団であり、細胞の集団中の細胞の数は、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に３倍以上増加しない。別の実施形態では、細胞は、細胞の集団であり、細胞の集団中の細胞の数は、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の間に２倍以上増加しない。
【００２０】
一実施形態では、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の期間は、ステップ（ｂ）後の約２４〜約４８時間の期間である。一実施形態では、ステップ（ｂ）後の７２時間未満の期間は、ステップ（ｂ）後の約１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または６０時間である。
【００２１】
一実施形態では、細胞、例えば、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から９６時間以内にヒト対象に移入する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から７２時間以内にヒト対象に移入する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から６０時間以内にヒト対象に移入する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から４８時間以内にヒト対象に移入する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から３６時間以内にヒト対象に移入する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から２４時間以内にヒト対象に移入する。
【００２２】
一実施形態では、細胞、例えば、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から９６時間以内に凍結保存する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から７２時間以内に凍結保存する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から６０時間以内に凍結保存する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から４８時間以内に凍結保存する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から３６時間以内に凍結保存する。一実施形態では、幹細胞は、１または複数の接触ステップの終了から２４時間以内に凍結保存する。
【００２３】
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の分化を阻害する。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のプログラム細胞死を阻害する。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の老化を阻害する。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の自然免疫応答を阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のオートファジーまたはアポトーシスを阻害することにより、幹細胞のプログラム細胞死を阻害する。
【００２４】
一実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に生着する。
【００２５】
一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも２％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも３％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも４％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも５％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも６％、７％、８％、９％、または１０％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも１５％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも２０％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも２５％が、対象の標的組織中に生着する。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞の集団を含み、ここで、幹細胞の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が、対象の標的組織中に生着する。
【００２６】
一実施形態では、細胞は、細胞の集団を含み、ここで、細胞の少なくとも１％が、対象の骨髄中に生着することができる。別の実施形態では、細胞の少なくとも５％が、対象の骨髄中に生着することができる。別の実施形態では、細胞の少なくとも１０％が、対象の骨髄中に生着することができる。別の実施形態では、細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が、対象の骨髄中に生着することができる。
【００２７】
一実施形態では、細胞は、細胞の集団を含み、細胞の少なくとも１％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも２．５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも１０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも２０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも２５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも３０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも３５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも４０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも４５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも５０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも５５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも６０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも６５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも７０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも７５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも８０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも８５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも８０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも８５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも９０％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも９５％が、対象の末梢血を再構成する。別の実施形態では、細胞の少なくとも１００％が、対象の末梢血を再構成する。一実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも１６週間生着したままである。別の実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも２０週間生着したままである。別の実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも２４週間生着したままである。別の実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも６ヵ月間生着したままである。別の実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも９ヵ月間生着したままである。別の実施形態では、幹細胞は、対象の標的組織中に少なくとも１年間生着したままである。別の実施形態では、細胞は、対象の余命にわたって、対象の標的組織中に生着することができる。
【００２８】
一実施形態では、標的組織は、末梢血、骨髄、または脾臓である。一実施形態では、細胞は、幹細胞である。一実施形態では、幹細胞は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である。本明細書で使用される場合、ＨＳＣという用語は、造血幹細胞と造血幹前駆細胞の両方を指す。一実施形態では、幹細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される。別の実施形態では、ＨＳＣは、非臍帯血由来、臍帯由来、または臍帯血由来である。一実施形態では、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞である。
【００２９】
一実施形態では、本方法は、１または複数の接触ステップの前に、対象から細胞、例えば、幹細胞を単離するステップをさらに含む。
【００３０】
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後に、１つまたは複数のサイトカインを含む培地中で細胞、例えば、幹細胞を培養するステップをさらに含む。一実施形態では、培地は、１つまたは複数のサイトカインと幹細胞生存能力エンハンサーを含む。一実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）からなる群から選択される。
【００３１】
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後に、細胞、例えば、幹細胞を培地中で培養するステップをさらに含み、ここで、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達モジュレーター、ＴＧＦ−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン様成長因子３（ＩＧＦ３）、アンジオポエチン（ＡＮＧ１）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）、ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４伝達軸モジュレーター、Ｗｎｔシグナル伝達モジュレーター、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。
【００３２】
一実施形態では、細胞、例えば、幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間培地中で培養する。
【００３３】
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストである。一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）、ＬＧＣ０００６、α−ナフトフラボン、およびＣＨ−２２３１９１からなる群から選択される。一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳＲ１である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、シクロスポリンＡ、デキサメタゾン、レスベラトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌ）、ＭｙＤ８８阻害ペプチド、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質、グルココルチコイド、ＯｘＰＡＰＣ、ＴＬＲアンタゴニスト、ラパマイシン、ＢＸ７９５、およびＲＬＲｓｈＲＮＡからなる群から選択される。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＭＧ１３２、ＳＢ４３１５４２、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、および１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）からなる群から選択される。
【００３４】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性はない。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性はない。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。
【００３５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９ポリペプチドは、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸である。
【００３６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’末端キャップ構造を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端ポリ−Ａテールを含む。
【００３７】
一実施形態では、本方法は、細胞をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と同じ接触ステップの間に、細胞をテンプレート核酸と接触させる。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。一実施形態では、ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾、３’ホスホロチオエート修飾、またはそれらの組合せを含む。
【００３８】
一実施形態では、本方法は、幹細胞をトランスジーンと接触させるステップをさらに含み、ここで、接触ステップは、トランスジーンが、幹細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする条件下で行う。一実施形態では、トランスジーンは、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子である。
【００３９】
一実施形態では、トランスジーンは、セーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。一実施形態では、セーフ・ハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座である。
【００４０】
一実施形態では、トランスジーンは、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である。一実施形態では、化学療法選択マーカーは、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型（Ｐ１４０Ｋ）をコードする遺伝子である。別の実施形態では、細胞表面抗原は、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）をコードする遺伝子または切断型ＣＤ２０（ｔＣＤ２０）をコードする遺伝子である。別の実施形態では、自殺遺伝子は、ｔＣＤ２０をコードする遺伝子または誘導性カスパーゼ９トランスジーン（ｉＣａｓｐａｓｅ−９）である。
【００４１】
一実施形態では、トランスジーンは、Ｐ１４０Ｋをコードする遺伝子、ｔＣＤ１９をコードする遺伝子、ｔＣＤ２０をコードする遺伝子、またはｉＣａｓｐａｓｅ−９をコードする遺伝子である。
【００４２】
別の実施形態では、複数のトランスジーンと細胞を接触させる。一実施形態では、複数のトランスジーンを細胞のゲノムに組み込む。別の実施形態では、複数のトランスジーンを細胞のゲノム内のセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込む。一実施形態では、セーフ・ハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座である。
【００４３】
一実施形態では、複数のトランスジーンは、以下：メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型をコードする遺伝子、ｔＣＤ１９をコードする遺伝子、ｔＣＤ２０をコードする遺伝子、またはｉＣａｓｐａｓｅ−９のうちの２つ、３つ、もしくは全部を含む。別の実施形態では、複数のトランスジーンは、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型をコードする遺伝子、およびｔＣＤ２０をコードする遺伝子を含むか、またはこれらから構成される。
【００４４】
一実施形態では、本方法は、酵素的に活性な（ｅｉＣａｓ９）分子と細胞を接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、ｅｉＣａｓ９を転写レプレッサーまたは転写アクチベーターに融合させる。
【００４５】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む。一実施形態では、標的遺伝子は表４に記載されている。
【００４６】
一態様では、本明細書に開示される方法により改変された細胞が本明細書に開示される。
【００４７】
別の態様では、本明細書に開示される細胞を含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【００４８】
一態様では、対象の疾患を治療または予防する方法が本明細書に開示され、これは、修飾細胞、または本明細書に開示される方法で改変された細胞を対象に投与するステップを含む。
【００４９】
一態様では、幹細胞遺伝子編集システムが本明細書に開示され、これは、幹細胞生存能力エンハンサー；ｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子を含む。ｇＲＮＡ分子は、修飾ｇＲＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、幹細胞遺伝子編集システムは、さらに幹細胞を含み、ここで、幹細胞は、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子を含む。一実施形態では、幹細胞遺伝子編集システムは、さらに幹細胞を含み、ここで、幹細胞は、幹細胞生存能力エンハンサーを含む。
【００５０】
一実施形態では、幹細胞遺伝子編集システムは、構成要素の各々を含むキットである。別の実施形態では、幹細胞遺伝子編集システムは、組成物である。一実施形態では、組成物は、キットの一部である。一実施形態では、キットは、さらに、幹細胞中の標的核酸を修飾するための指示を含む。
【００５１】
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストからなる群から選択される。一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）、ＡｈＲＡ、ジメトキシフラボン、６，２’，４’−トリメトキシフラボン、ＬＧＣ０００６、α−ナフトフラボン、およびＣＨ−２２３１９１からなる群から選択される。一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳＲ１である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、シクロスポリンＡ、デキサメタゾン、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、ＭｙＤ８８阻害ペプチド、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質、グルココルチコイド、ＯｘＰＡＰＣ、ＴＬＲアンタゴニスト、ラパマイシン、ＢＸ７９５、およびＲＬＲ阻害剤からなる群から選択される。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＭＧ１３２、ＳＢ４３１５４２、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、および１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）からなる群から選択される。
【００５２】
一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端キャップ構造を含む。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、３’末端ポリアデニンテールを含む。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端キャップ構造と３’末端ポリアデニンテールを含む。
【００５３】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）である。
【００５４】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性はない。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性はない。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。
【００５５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９ポリペプチドは、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸である。
【００５６】
一実施形態では、幹細胞編集システムは、さらにサイトカインを含む。一実施形態では、サイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）からなる群から選択される。
【００５７】
一実施形態では、組成物は、以下：塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達モジュレーター、ＴＧＦ−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン様成長因子３（ＩＧＦ３）、アンジオポエチン（ＡＮＧ１）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）、ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４伝達軸モジュレーター、またはＷｎｔシグナル伝達モジュレーターのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００５８】
一実施形態では、幹細胞編集システムは、さらにテンプレート核酸を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。一実施形態では、ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾、３’ホスホロチオエート修飾、または５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾の両方を含む。
【００５９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む。一実施形態では、標的遺伝子は表４に記載されている。
【００６０】
一態様では、本明細書に開示される組成物を含む細胞が本明細書に開示される。
【００６１】
別の態様では、本明細書に開示される組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書に開示される。別の態様では、本明細書に開示される細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【００６２】
一実施形態では、ＨＳＣ細胞は、移植後に生体内で分化する。一実施形態では、ＨＳＣ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球系細胞、および／または骨髄系細胞に分化する。一実施形態では、ＨＳＣ細胞は、対象において造血を再構成する。
【００６３】
一実施形態では、静脈内注入により細胞を対象に移植する。
【００６４】
一実施形態では、１または複数の接触ステップは、生体外で行う。
【００６５】
一実施形態では、本方法は、さらに、ｉＰＳ細胞から、または内皮細胞から細胞を作製するステップを含む。
【００６６】
一実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、下記特性の１つまたは複数を有する：細胞維持を増強する、細胞寿命を増加する、細胞生存能力を増強する、または細胞増殖を増大する。別の実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、下記特性の１つまたは複数を有する：分化を阻害する、アポトーシスによる細胞死を阻害する、壊死を阻害する、オートファジーを阻害する、または老化を阻害する。一実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、ＤＮＡ損傷応答に関連する老化を阻害する。
【００６７】
一実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答を阻害し、および／または細胞のアポトーシスを阻止する。別の実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答を阻害し、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素に応答する細胞のアポトーシスを阻止する。別の実施形態では、１つまたは複数の細胞生存能力エンハンサーは、外来核酸に対するインターフェロンまたはトール様受容体応答を阻害する。
【００６８】
一実施形態では、本方法は、細胞数を増加するために、化学療法薬と細胞を接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、細胞は、化学療法選択マーカーを含む。一実施形態では、化学療法選択マーカーは、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型である。一実施形態では、化学療法薬は、Ｏ６ＢＧ／ＢＣＮＵである。一実施形態では、接触ステップは、生体外または生体内で行う。
【００６９】
一実施形態では、本方法は、細胞の選択のための細胞表面抗原結合剤と細胞を接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、細胞は、細胞表面抗原を含む。別の実施形態では、細胞表面抗原は、ｔＣＤ１９またはｔＣＤ２０である。一実施形態では、細胞表面抗原は、ｔＣＤ１９結合試薬またはｔＣＤ２０結合試薬である。一実施形態では、接触ステップは、生体外または生体内で行う。
【００７０】
一実施形態では、本方法は、細胞死をもたらす薬剤と細胞を接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、細胞は、自殺遺伝子を含むＨＳＣである。
【００７１】
一実施形態では、本方法は、抗ＣＤ２０抗体と細胞を接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。
【００７２】
一実施形態では、本方法は、ｉＣａｓｐａｓｅ−９を二量体化する物質と細胞を接触させるステップをさらに含み、ここで、細胞は、ｉＣａｓｐａｓｅ−９を含む。一実施形態では、ｉＣａｓｐａｓｅ−９を二量体化する物質は、細胞透過性二量体化因子である。別の実施形態では、細胞透過性二量体化因子は、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３である。
【００７３】
一実施形態では、本方法は、トランスジーンを含むテンプレート核酸、およびトランスジーンが組み込まれた領域由来の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む１つまたは複数のｇＲＮＡと細胞を接触させるステップをさらに含む。
【００７４】
一実施形態では、本方法は、トランスジーンの発現を可能にする条件下で、細胞を培養するステップをさらに含む。
【００７５】
別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、標的遺伝子を調節する融合分子である。一実施形態では、標的遺伝子は、細胞死を一時的に阻止し、細胞寿命を増加し、細胞生存能力を増強するか、または増殖を増大する標的遺伝子である。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、ＫＲＡＢドメインと融合される。
【００７６】
一実施形態では、トランスジーンの発現は、複能性、細胞適合性、またはその両方を有意に低減しない。別の実施形態では、トランスジーンの発現は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への短時間の曝露後に、生存能力、複能性、細胞適合性、またはその両方を有意に低減しない。
【００７７】
一実施形態では、低酸素培養条件下で細胞を培養する。一実施形態では、低酸素培養条件は、１０％以下、８％以下、５％以下、３％以下、１％以下、または０．５％以下のＯ２を含む。
【００７８】
一実施形態では、細胞は、三次元培養システム中で培養する。一実施形態では、三次元培養システムは、ＮＡＮＥＸ（商標）３Ｄ培養システムである。
【００７９】
一実施形態では、本方法は、内皮細胞、間葉系細胞、またはその両方と一緒に細胞を共培養するステップをさらに含む。一実施形態では、内皮細胞は、ＶｅｒａＶｅｃｓ細胞である。別の実施形態では、間葉系細胞は、間葉系間質細胞、または血管周囲間葉系細胞である。
【００８０】
一実施形態では、本方法は、接触ステップ後に、細胞を洗浄するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、細胞生存能力エンハンサーとの接触ステップと、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子との接触ステップとの間に、細胞を洗浄するステップをさらに含む。
【００８１】
一実施形態では、対象は、細胞が単離されるのと同じ対象である。別の実施形態では、対象は、細胞が単離されるのとは別の対象である。
【００８２】
別の態様では、対象の疾患を治療または予防する方法が本明細書に開示され、これは、修飾細胞または本明細書に開示される方法により改変された細胞を対象に投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、表４に挙げる疾患に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある。別の実施形態では、疾患は、異常ヘモグロビン症、貧血、止血障害、代謝障害、重度の免疫不全、骨髄性免疫不全、Ｂリンパ球および免疫グロブリン免疫不全、血球減少障害、代謝性酵素欠乏、輸送および蓄積症、赤血球系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、血球減少障害は、神経学的合併症を有する。別の実施形態では、腫瘍性疾患は、リンパ腫または白血病である。
【００８３】
一実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１×１０５〜約１×１０８個の改変または修飾細胞を対象に投与する。別の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１×１０６〜約１×１０７個の改変または修飾細胞を対象に投与する。別の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１×１０６、約２×１０６、もしくは約５×１０６個の改変または修飾細胞を対象に投与する。
【００８４】
一実施形態では、細胞は、疾患を治療または予防するための薬剤の製造に使用される。一実施形態では、疾患は、表４に挙げる疾患である。
【００８５】
一実施形態では、細胞は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、ＨＳＣ細胞は、対象への移植後に生体内で分化することができる。一実施形態では、ＨＳＣ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球系細胞、および／または骨髄系細胞に分化することができる。別の実施形態では、ＨＳＣ細胞は、対象において造血を再構成することができる。
【００８６】
別の実施形態では、以下：（ａ）細胞；（ｂ）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素；および（ｃ）（ｉ）細胞生存能力エンハンサー；（ｉｉ）トランスジーン；または（ｉｉｉ）ｅｉＣａｓ９分子のうちの１つ、２つ、もしくは全部を含む、反応混合物が本明細書に開示される。
【００８７】
一実施形態では、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素は、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方を含む。別の実施形態では、反応混合物は、さらに供与体テンプレート核酸を含む。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、転写レプレッサーまたは転写アクチベーターに融合させる。
【００８８】
別の態様では、（ａ）（ｉ）細胞生存能力エンハンサー；（ｉｉ）トランスジーン；または（ｉｉｉ）ｅｉＣａｓ９分子のうちの１つ、２つ、もしくは全部；および（ｂ）細胞を改変するか、または修飾細胞を作製するための指示を含む、キットが本明細書に開示される。
【００８９】
一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合させる。別の実施形態では、細胞は、ＨＳＣである。
【００９０】
別の態様では、疾患を治療または予防するための薬剤の製造における細胞の使用が本明細書に開示される。一実施形態では、疾患は、表４に挙げる疾患である。
【００９１】
一態様では、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患、例えば、表４に挙げる疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、本明細書に記載の細胞の使用が本明細書に開示される。
【００９２】
一態様では、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患、例えば、表４に挙げる疾患を治療または予防するための本明細書に記載の細胞が本明細書に開示される。
【００９３】
本明細書で開示されるように、組成物、反応物混合物、およびキットはまた、例えば、本明細書で開示される支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子も含み得る。
【００９４】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本開示の実施形態の試験で使用され得るが、適切な方法および材料は下述の通りである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
【００９５】
数字およびアルファベットの見出しおよび小見出しをはじめとする見出しは、組織化と提示を目的とし、制限は意図されない。
【００９６】
本開示の実施形態の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡおよびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の送達後のＣＣＲ５遺伝子座のインデルの検出を描写する。
【図２】幹細胞表現型マーカーＣＤ３４およびＣＤ９０の共発現および生存能力（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−細胞）を決定するためのゲノム編集ＨＳＣのフローサイトメトリー分析を描写する。
【図３Ａ】ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡと組み合わせた表示のＣａｓ９変異型またはＧＦＰ発現プラスミド単独（ｐｍａｘＧＦＰ）の送達から９６時間後のヌクレオフェクト（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋細胞の数（例えば、生存の維持）の倍率変化を描写する。処理＋／−４０ｎＭ  ＵＭ１７１は、マイナス符号（−、ＵＭ１７１なし）またはプラス符号（＋、４０ｎＭ  ＵＭ１７１を含む）によって示す。
【図３Ｂ】表示のヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後のＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＴ７Ｅ１アッセイにより検出されたインデルのパーセンテージを描写する。処理±４０ｎＭ  ＵＭ１７１は、マイナス符号（−、ＵＭ１７１なし）またはプラス符号（＋、４０ｎＭ  ＵＭ１７１を含む）によって示す。
【図４Ａ】ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−２３１）およびＣＣＲ５ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５−Ｕ４３）プラスミドと組み合わせたＣａｓ９の共送達から９６時間後のクレオフェクト（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋細胞の数（例えば、生存および増殖能の維持）の倍率変化を描写する。
【図４Ｂ】ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４ゲノム遺伝子座で、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＴ７Ｅ１アッセイにより検出されるインデルのパーセンテージを描写する。
【図５Ａ】組み合わせたＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｓａ  Ｃａｓ９のいずれか）を伴う表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡによる電気穿孔後のＣＤ３４＋細胞数の倍率変化の動力学を描写する。
【図５Ｂ】組み合わせたＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｓａ  Ｃａｓ９のいずれか）を伴う表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡによる電気穿孔から７２時間後の総生存ＣＤ３４＋細胞の倍率変化を描写する。
【図５Ｃ】キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡによる電気穿孔後の生存（ヨウ化プロピジウム陰性）ヒトＣＤ３４＋細胞の維持を示す代表的なフローサイトメトリーデータを描写する。
【図６Ａ】キャップおよびテールなしＡＡＶＳ１ｇＲＮＡと比較して、キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの送達後のＣＤ３４＋細胞中に検出された挿入／欠失（インデル）のパーセンテージならびに標的化ＡＡＶＳ１遺伝子座でのそれらの造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）子孫を描写する。
【図６Ｂ】キャップ／テール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡによる編集後のＣＤ３４＋細胞における造血コロニー形成能（ＣＦＣ）の維持を描写する。キャップ／テールなしＡＡＶＳ１ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞のＣＦＣ能力の喪失に留意されたい。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【図６Ｃ】Ｋ５６２赤白血病細胞株中の効率的な標的化遺伝子座編集（％インデル）を描写し、ヒト赤白血病細胞株は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と共にキャップおよびテール付加ＨＢＢｇＲＮＡの送達後に、ＨＳＣと同様の特性を有する。
【図６Ｄ】ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞における表示標的化遺伝子座（ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、ＣＸＣＲ４）でのＣａｓ９媒介性／キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ媒介性編集（％インデル）を描写する。右：Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップおよびテール付加ＨＢＢ−８ｇＲＮＡ（本明細書ではＨＢＢ＿Ｓｐ８とも呼ばれる）（配列番号３８８）による電気穿孔後の臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＣＦＣ能力（非電気穿孔対照または２もしくは１０μｇＨＢＢ  ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞）。細胞は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたは２もしくは１０μｇのｇＲＮＡで電気穿孔された。
【図６Ｅ】２μｇまたは１０μｇのキャップ／テール付加ＨＢＢｇＲＮＡで電気穿孔された細胞のＣＦＣアッセイを描写する。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【図６Ｆ】キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、またはＣＸＣＲ４ｇＲＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡの送達から７２時間後の臍帯血ＣＤ３４＋細胞における表示の遺伝子座での切断を示す代表的なゲル画像（Ｔ７Ｅ１分析）を描写する。この例示ゲルは、図６Ｄに示す要約データと対応する。
【図６Ｇ】７−ＡＡＤおよびアネキシンＶでの共染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび表示のｇＲＮＡの送達から４８時間後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における細胞生存能力を示す。
【図７Ａ】ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるインビトロおよび生体外でのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰの安定性の分析を描写する。図７Ａは、１：１モル比ｇＲＮＡ：ＲＮＰで添加された表示のＨＢＢｇＲＮＡとＤ１０Ａタンパク質を複合体化した後の示差走査型蛍光定量シフトアッセイを描写する。図７Ｂは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰで、またはｇＲＮＡＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）を含むＤ１０ＡｍＲＮＡで電気穿孔してから７２時間後の細胞溶解物中のＣａｓ９タンパク質の検出を描写する。使用した電気穿孔プログラム（Ｐ２またはＰ３）は、画像の上部に表示する。２×ｇＲＮＡ：各々１０μｇのｇＲＮＡをＤ１０ＡｍＲＮＡ（５μｇの各ｇＲＮＡに対して）と共送達した。
【図７Ｂ】ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるインビトロおよび生体外でのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰの安定性の分析を描写する。図７Ａは、１：１モル比ｇＲＮＡ：ＲＮＰで添加された表示のＨＢＢｇＲＮＡとＤ１０Ａタンパク質を複合体化した後の示差走査型蛍光定量シフトアッセイを描写する。図７Ｂは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰで、またはｇＲＮＡＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）を含むＤ１０ＡｍＲＮＡで電気穿孔してから７２時間後の細胞溶解物中のＣａｓ９タンパク質の検出を描写する。使用した電気穿孔プログラム（Ｐ２またはＰ３）は、画像の上部に表示する。２×ｇＲＮＡ：各々１０μｇのｇＲＮＡをＤ１０ＡｍＲＮＡ（５μｇの各ｇＲＮＡに対して）と共送達した。
【図８Ａ】ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持することを示す。図８Ａは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、電気穿孔から７２時間後に幹細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ１３３の発現を維持することを示す。図８Ｂは、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡペアの電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋細胞数を描写する。図８Ｃは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持することを示す。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。
【図８Ｂ】ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持することを示す。図８Ａは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、電気穿孔から７２時間後に幹細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ１３３の発現を維持することを示す。図８Ｂは、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡペアの電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋細胞数を描写する。図８Ｃは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持することを示す。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。
【図８Ｃ】ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持することを示す。図８Ａは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、電気穿孔から７２時間後に幹細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ１３３の発現を維持することを示す。図８Ｂは、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡペアの電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋細胞数を描写する。図８Ｃは、遺伝子編集された成体型ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持することを示す。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。
【図９Ａ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集およびＨＤＲを支持することを示す。図９Ａは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ分析により検出される遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図９Ｂは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列決定分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）を表示する。ＲＮＰ＊は、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）電気穿孔プログラム（Ｐ３）の使用を指す。図９Ｃは、図９Ｂに示した条件で電気穿孔されたヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのｇＤＮＡ中で検出された編集事象のタイプのパーセンテージを描写する。データは、全ての遺伝子編集事象のパーセンテージとして示される。
【図９Ｂ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集およびＨＤＲを支持することを示す。図９Ａは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ分析により検出される遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図９Ｂは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列決定分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）を表示する。ＲＮＰ＊は、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）電気穿孔プログラム（Ｐ３）の使用を指す。図９Ｃは、図９Ｂに示した条件で電気穿孔されたヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのｇＤＮＡ中で検出された編集事象のタイプのパーセンテージを描写する。データは、全ての遺伝子編集事象のパーセンテージとして示される。
【図９Ｃ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集およびＨＤＲを支持することを示す。図９Ａは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ分析により検出される遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図９Ｂは、ヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列決定分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）を表示する。ＲＮＰ＊は、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）電気穿孔プログラム（Ｐ３）の使用を指す。図９Ｃは、図９Ｂに示した条件で電気穿孔されたヒト成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣからのｇＤＮＡ中で検出された編集事象のタイプのパーセンテージを描写する。データは、全ての遺伝子編集事象のパーセンテージとして示される。
【図１０】Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰ遺伝子編集成体型ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化した赤血球系子孫中のβヘモグロビン発現のフローサイトメトリー分析を描写する。Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞から分化したＣＦＵ−Ｅコロニー（左端）は、解離、固定、透過性化した後、ｂヘモグロビン発現について染色した。親ＣＤ３４＋細胞集団中で検出された遺伝子編集の頻度は、表示サンプルのヒストグラムの上方に表示する。各コロニー中のβヘモグロビン発現のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定し、各ヒストグラムの上部右側に表示する。
【図１１Ａ】ヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持したことを示す。図１１Ａは、遺伝子編集されたヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞が、電気穿孔後に生存能力を維持することを示す。右：Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡペアの電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数。図１１Ｂは、遺伝子編集ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持したことを描写する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。細胞百万個当たり送達されたＤ１０Ａ  ＲＮＰの量（５または１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１１Ｂ】ヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持したことを示す。図１１Ａは、遺伝子編集されたヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞が、電気穿孔後に生存能力を維持することを示す。右：Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ  ＨＢＢｇＲＮＡペアの電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数。図１１Ｂは、遺伝子編集ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持したことを描写する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。細胞百万個当たり送達されたＤ１０Ａ  ＲＮＰの量（５または１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１２Ａ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて遺伝子編集およびＨＤＲを支持したことを示す。図１２Ａは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって検出された遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図１２Ｂは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）は、総配列決定読み取りの分数として表示する。図１２Ｃは、検出された総数遺伝子編集事象に対する相対パーセンテージとして表される遺伝子編集事象のサブタイプを描写する。細胞百万個につき送達されたＤ１０Ａ  ＲＮＰの量（５または１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１２Ｂ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて遺伝子編集およびＨＤＲを支持したことを示す。図１２Ａは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって検出された遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図１２Ｂは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）は、総配列決定読み取りの分数として表示する。図１２Ｃは、検出された総数遺伝子編集事象に対する相対パーセンテージとして表される遺伝子編集事象のサブタイプを描写する。細胞百万個につき送達されたＤ１０Ａ  ＲＮＰの量（５または１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１２Ｃ】ＨＢＢ標的化ｇＲＮＡペアと共送達されたＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて遺伝子編集およびＨＤＲを支持したことを示す。図１２Ａは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって検出された遺伝子編集事象のパーセンテージを描写する。図１２Ｂは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ配列分析を描写する。遺伝子編集事象のサブタイプ（挿入、欠失、インデル、および遺伝子変換事象）は、総配列決定読み取りの分数として表示する。図１２Ｃは、検出された総数遺伝子編集事象に対する相対パーセンテージとして表される遺伝子編集事象のサブタイプを描写する。細胞百万個につき送達されたＤ１０Ａ  ＲＮＰの量（５または１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１３Ａ】遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの赤芽球への定方向分化を描写する。遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化した１８日赤芽球のフローサイトメトリー分析。図１３Ａは、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体およびＣＤ２３５（グリコホリンＡ）を描写する。図１３Ｂは、胎児型ヘモグロビン（ｇヘモグロビン）を描写する。図１３Ｃは、ｄｓＤＮＡの非存在（ｄｓＤＮＡ結合色素ＤＲＡＱ５について陰性）により示される通り、除核によるＣＤ４５およびｄｓＤＮＡの喪失を描写する。成体型ＣＤ３４＋細胞とは異なり、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、胎児型ｇヘモグロビン（成体型ｂヘモグロビンではなく）を発現する胎児型様赤芽球に分化する。
【図１３Ｂ】遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの赤芽球への定方向分化を描写する。遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化した１８日赤芽球のフローサイトメトリー分析。図１３Ａは、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体およびＣＤ２３５（グリコホリンＡ）を描写する。図１３Ｂは、胎児型ヘモグロビン（ｇヘモグロビン）を描写する。図１３Ｃは、ｄｓＤＮＡの非存在（ｄｓＤＮＡ結合色素ＤＲＡＱ５について陰性）により示される通り、除核によるＣＤ４５およびｄｓＤＮＡの喪失を描写する。成体型ＣＤ３４＋細胞とは異なり、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、胎児型ｇヘモグロビン（成体型ｂヘモグロビンではなく）を発現する胎児型様赤芽球に分化する。
【図１３Ｃ】遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの赤芽球への定方向分化を描写する。遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣから分化した１８日赤芽球のフローサイトメトリー分析。図１３Ａは、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体およびＣＤ２３５（グリコホリンＡ）を描写する。図１３Ｂは、胎児型ヘモグロビン（ｇヘモグロビン）を描写する。図１３Ｃは、ｄｓＤＮＡの非存在（ｄｓＤＮＡ結合色素ＤＲＡＱ５について陰性）により示される通り、除核によるＣＤ４５およびｄｓＤＮＡの喪失を描写する。成体型ＣＤ３４＋細胞とは異なり、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、胎児型ｇヘモグロビン（成体型ｂヘモグロビンではなく）を発現する胎児型様赤芽球に分化する。
【図１４Ａ】ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｃａｓ９変異型ＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持することを描写する。図１４Ａは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、ＷＴＣａｓ９エンドトキシンフリー（ＥＦ  ＷＴ）Ｃａｓ９、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、またはＨＢＢｇＲＮＡペアと共送達されるＤ１０Ａニッカーゼによる電気穿孔後に、生存能力を維持したことを描写する。電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数。図１４Ｂは、遺伝子編集ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持したことを描写する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。細胞百万個当たり送達されたＲＮＰの量（１０μｇ）および親ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１４Ｂ】ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｃａｓ９変異型ＲＮＰおよびＨＢＢターゲティングｇＲＮＡペアによる電気穿孔後に幹細胞表現型を維持することを描写する。図１４Ａは、遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、ＷＴＣａｓ９エンドトキシンフリー（ＥＦ  ＷＴ）Ｃａｓ９、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、またはＨＢＢｇＲＮＡペアと共送達されるＤ１０Ａニッカーゼによる電気穿孔後に、生存能力を維持したことを描写する。電気穿孔に対する表示時点での絶対生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数。図１４Ｂは、遺伝子編集ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）活性および複能性を維持したことを描写する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球ＣＦＣ。細胞百万個当たり送達されたＲＮＰの量（１０μｇ）および親ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１５Ａ】ＷＴおよびニッカーゼＣａｓ９変異型ＲＮＰにより媒介されるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集の比較を描写する。図１５Ａは、ＷＴＣａｓ９、エンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９（ＥＦ−ＷＴ）、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、およびＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰ（各々、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡペアと共送達される）の電気穿孔後のＨＢＢ遺伝子座における標的化部位での電気穿孔から７２時間後に検出されたインデルのパーセンテージのＴ７Ｅ１分析を描写する。図１５Ｂは、電気穿孔後の表示時点でのＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の細胞溶解物中のＣａｓ９変異型の検出を示すウエスタンブロット分析を描写する。細胞百万個当たり送達されたＲＮＰの量（１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１５Ｂ】ＷＴおよびニッカーゼＣａｓ９変異型ＲＮＰにより媒介されるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集の比較を描写する。図１５Ａは、ＷＴＣａｓ９、エンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９（ＥＦ−ＷＴ）、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、およびＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰ（各々、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡペアと共送達される）の電気穿孔後のＨＢＢ遺伝子座における標的化部位での電気穿孔から７２時間後に検出されたインデルのパーセンテージのＴ７Ｅ１分析を描写する。図１５Ｂは、電気穿孔後の表示時点でのＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の細胞溶解物中のＣａｓ９変異型の検出を示すウエスタンブロット分析を描写する。細胞百万個当たり送達されたＲＮＰの量（１０μｇ）および親ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の２時間の回復温度（括弧内）を表示する。
【図１６Ａ】ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＷＴＣａｓ９およびＤ１０Ａニッカーゼを用いた遺伝子編集後のＨＢＢ遺伝子座で検出されたＨＤＲおよびＮＨＥＪ事象の比較を描写する。図１６Ａは、ＤＮＡ配列決定分析により検出され、総配列読み取りのパーセンテージとして示される遺伝子編集事象（電気穿孔から７２時間後）のパーセンテージを描写する。ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡペアと共に、ＲＮＰ（ＷＴＣａｓ９、エンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９（ＥＦ−ＷＴ）、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、およびＤ１０Ａニッカーゼ）を受けた。図１６Ｂは、図１６Ａに示す条件で電気穿孔された細胞からのｇＤＮＡ中で検出された編集事象のタイプのパーセンテージを描写する。データは、全遺伝子編集事象のパーセンテージとして示す。左から右に：１０μｇのＷＴＣａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのエンドトキシンフリー（ＥＦ）ＷＴＣａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰ（３０℃）。
【図１６Ｂ】ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＷＴＣａｓ９およびＤ１０Ａニッカーゼを用いた遺伝子編集後のＨＢＢ遺伝子座で検出されたＨＤＲおよびＮＨＥＪ事象の比較を描写する。図１６Ａは、ＤＮＡ配列決定分析により検出され、総配列読み取りのパーセンテージとして示される遺伝子編集事象（電気穿孔から７２時間後）のパーセンテージを描写する。ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡペアと共に、ＲＮＰ（ＷＴＣａｓ９、エンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９（ＥＦ−ＷＴ）、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、およびＤ１０Ａニッカーゼ）を受けた。図１６Ｂは、図１６Ａに示す条件で電気穿孔された細胞からのｇＤＮＡ中で検出された編集事象のタイプのパーセンテージを描写する。データは、全遺伝子編集事象のパーセンテージとして示す。左から右に：１０μｇのＷＴＣａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのエンドトキシンフリー（ＥＦ）ＷＴＣａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰ（３７℃）、１０μｇのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰ（３０℃）。
【図１７Ａ】ＤＮＡ鋳型にコードされるポリＡテールと共に作製されたインビトロ転写ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡを描写する。図１７Ａは、表示長さのコードされたポリＡテールを有するＨＢＢｇＲＮＡ用のＤＮＡテンプレートのＰＣＲ産物を描写する。１０、２０および５０長ポリＡテールを有するｇＲＮＡ用の優勢なサイズ適正ＰＣＲ産物は、実線の四角内に示す。ＰＣＲ産物の分布は、点線の四角で示す。図１７Ｂは、ＤＮＡテンプレート内で改変されたか、または酵素的に付加された表示のテール長さを有する、インビトロ転写ｇＲＮＡのバイオアナライザー分析を描写する（Ｅ−ＰＡＰ）。
【図１７Ｂ】ＤＮＡ鋳型にコードされるポリＡテールと共に作製されたインビトロ転写ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡを描写する。図１７Ａは、表示長さのコードされたポリＡテールを有するＨＢＢｇＲＮＡ用のＤＮＡテンプレートのＰＣＲ産物を描写する。１０、２０および５０長ポリＡテールを有するｇＲＮＡ用の優勢なサイズ適正ＰＣＲ産物は、実線の四角内に示す。ＰＣＲ産物の分布は、点線の四角で示す。図１７Ｂは、ＤＮＡテンプレート内で改変されたか、または酵素的に付加された表示のテール長さを有する、インビトロ転写ｇＲＮＡのバイオアナライザー分析を描写する（Ｅ−ＰＡＰ）。
【図１８Ａ】１０および２０長のポリＡテールを有する改変されたｇＲＮＡが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集を支持したことを描写する。図１８Ａの左側パネルは、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡを含むＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰによる電気穿孔から７２時間後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける生存能力（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を示す代表的なフローサイトメトリー分析プロットを描写する。右側パネル：表示されるポリＡテールを有するＤ１０Ａ  ＲＮＰとＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化の動力学。図１８Ｂは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のテール長さを有する改変されたＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔から７２時間後の臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣの生存能力パーセント（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を描写する。図１８Ｃは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のポリＡテールを有するＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢゲノム遺伝子座のＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイおよびサンガーＤＮＡ配列決定により検出される遺伝子編集を描写する。
【図１８Ｂ】１０および２０長のポリＡテールを有する改変されたｇＲＮＡが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集を支持したことを描写する。図１８Ａの左側パネルは、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡを含むＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰによる電気穿孔から７２時間後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける生存能力（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を示す代表的なフローサイトメトリー分析プロットを描写する。右側パネル：表示されるポリＡテールを有するＤ１０Ａ  ＲＮＰとＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化の動力学。図１８Ｂは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のテール長さを有する改変されたＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔から７２時間後の臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣの生存能力パーセント（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を描写する。図１８Ｃは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のポリＡテールを有するＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢゲノム遺伝子座のＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイおよびサンガーＤＮＡ配列決定により検出される遺伝子編集を描写する。
【図１８Ｃ】１０および２０長のポリＡテールを有する改変されたｇＲＮＡが、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける遺伝子編集を支持したことを描写する。図１８Ａの左側パネルは、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡを含むＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰによる電気穿孔から７２時間後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける生存能力（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を示す代表的なフローサイトメトリー分析プロットを描写する。右側パネル：表示されるポリＡテールを有するＤ１０Ａ  ＲＮＰとＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化の動力学。図１８Ｂは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のテール長さを有する改変されたＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔から７２時間後の臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣの生存能力パーセント（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を描写する。図１８Ｃは、Ｄ１０ＡＲＮＰと、表示のポリＡテールを有するＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡによる電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＨＢＢゲノム遺伝子座のＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイおよびサンガーＤＮＡ配列決定により検出される遺伝子編集を描写する。
【図１９Ａ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図１９Ｂ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図１９Ｃ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図１９Ｄ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図１９Ｅ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図１９Ｆ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、１５人の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞のＨＢＢ遺伝子座で高度に効率的な遺伝子編集を支持することを証明する。（図１９Ａ）ｎ＝１５ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび１５実験からの合成データのＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集結果の概要。遺伝子編集は、臍帯血（ＣＢ）および成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナーについて示す。Ｃａｓ９変異型（Ｄ１０Ａニッカーゼまたは野生型、ＷＴ）を示す。（図１９Ｂ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝１０ドナー）をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のタイプの概要。（図１９Ｃ）電気穿孔から２〜３日後の、ＲＮＰ処理およびペアの非処理対照ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化。（図１９Ｄ）ヒトＣＤ３４＋細胞から分化した総コロニー、赤血球および骨髄サブタイプを示すＣＦＣデータの合成概要（ｎ＝１０ドナー）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図１９Ｅ）（図１９Ｅ）成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞および（図１９Ｆ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析。全てのプロットに平均値および標準偏差を示す。パネル図１９Ａ〜１９Ｄのデータに示す各ドナーペアについて、対応のあるｔ検定を実施した。
【図２０Ａ】免疫欠損マウスモデルにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の移植を表す。（図２０Ａ）ＨＳＣへのＲＮＰ送達ならびにＮＳＧマウスへの移植および長期追跡の実験概略図。（図２０Ｂ）ＨＳＣ移植に使用するために、新鮮なＣＤ３４＋細胞をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のサブタイプの概要。（図２０Ｃ）遺伝子編集ＨＳＣのＣＦＣ造血活性の分析（左側）、ならびにＣＦＣからのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析（右側）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図２０Ｄ）左側パネル：ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの細胞注入後の様々な時点で採取された血液サンプルから抽出されたｇＤＮＡにおけるＴ７Ｅ１アッセイによるインデルの検出。右側パネル：マウス末梢血サンプル中でのヒト細胞の検出。各々の線は、ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した４匹の個別のマウスにおいて検出された遺伝子編集のレベルに対応する。ヒトＨＳＣ移植から１２週間後にＲＮＰ処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ４５＋細胞は、血液中のマウスＣＤ４５＋細胞から識別された。ヒトリンパ球系列および骨髄系列が、ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出された（図２０Ｅ）。同じヒトＨＳＣドナーからのＲＮＰ処理および対照非処理ＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおけるヒトＣＤ４５＋細胞を含むＮＳＧマウスの造血再構成の動力学。下方パネル：移植されたマウスのヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出されたリンパ球および骨髄細胞ならびに赤血球前駆細胞のパーセンテージ。
【図２０Ｂ】免疫欠損マウスモデルにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の移植を表す。（図２０Ａ）ＨＳＣへのＲＮＰ送達ならびにＮＳＧマウスへの移植および長期追跡の実験概略図。（図２０Ｂ）ＨＳＣ移植に使用するために、新鮮なＣＤ３４＋細胞をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のサブタイプの概要。（図２０Ｃ）遺伝子編集ＨＳＣのＣＦＣ造血活性の分析（左側）、ならびにＣＦＣからのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析（右側）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図２０Ｄ）左側パネル：ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの細胞注入後の様々な時点で採取された血液サンプルから抽出されたｇＤＮＡにおけるＴ７Ｅ１アッセイによるインデルの検出。右側パネル：マウス末梢血サンプル中でのヒト細胞の検出。各々の線は、ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した４匹の個別のマウスにおいて検出された遺伝子編集のレベルに対応する。ヒトＨＳＣ移植から１２週間後にＲＮＰ処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ４５＋細胞は、血液中のマウスＣＤ４５＋細胞から識別された。ヒトリンパ球系列および骨髄系列が、ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出された（図２０Ｅ）。同じヒトＨＳＣドナーからのＲＮＰ処理および対照非処理ＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおけるヒトＣＤ４５＋細胞を含むＮＳＧマウスの造血再構成の動力学。下方パネル：移植されたマウスのヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出されたリンパ球および骨髄細胞ならびに赤血球前駆細胞のパーセンテージ。
【図２０Ｃ】免疫欠損マウスモデルにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の移植を表す。（図２０Ａ）ＨＳＣへのＲＮＰ送達ならびにＮＳＧマウスへの移植および長期追跡の実験概略図。（図２０Ｂ）ＨＳＣ移植に使用するために、新鮮なＣＤ３４＋細胞をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のサブタイプの概要。（図２０Ｃ）遺伝子編集ＨＳＣのＣＦＣ造血活性の分析（左側）、ならびにＣＦＣからのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析（右側）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図２０Ｄ）左側パネル：ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの細胞注入後の様々な時点で採取された血液サンプルから抽出されたｇＤＮＡにおけるＴ７Ｅ１アッセイによるインデルの検出。右側パネル：マウス末梢血サンプル中でのヒト細胞の検出。各々の線は、ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した４匹の個別のマウスにおいて検出された遺伝子編集のレベルに対応する。ヒトＨＳＣ移植から１２週間後にＲＮＰ処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ４５＋細胞は、血液中のマウスＣＤ４５＋細胞から識別された。ヒトリンパ球系列および骨髄系列が、ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出された（図２０Ｅ）。同じヒトＨＳＣドナーからのＲＮＰ処理および対照非処理ＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおけるヒトＣＤ４５＋細胞を含むＮＳＧマウスの造血再構成の動力学。下方パネル：移植されたマウスのヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出されたリンパ球および骨髄細胞ならびに赤血球前駆細胞のパーセンテージ。
【図２０Ｄ】免疫欠損マウスモデルにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の移植を表す。（図２０Ａ）ＨＳＣへのＲＮＰ送達ならびにＮＳＧマウスへの移植および長期追跡の実験概略図。（図２０Ｂ）ＨＳＣ移植に使用するために、新鮮なＣＤ３４＋細胞をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のサブタイプの概要。（図２０Ｃ）遺伝子編集ＨＳＣのＣＦＣ造血活性の分析（左側）、ならびにＣＦＣからのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析（右側）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図２０Ｄ）左側パネル：ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの細胞注入後の様々な時点で採取された血液サンプルから抽出されたｇＤＮＡにおけるＴ７Ｅ１アッセイによるインデルの検出。右側パネル：マウス末梢血サンプル中でのヒト細胞の検出。各々の線は、ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した４匹の個別のマウスにおいて検出された遺伝子編集のレベルに対応する。ヒトＨＳＣ移植から１２週間後にＲＮＰ処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ４５＋細胞は、血液中のマウスＣＤ４５＋細胞から識別された。ヒトリンパ球系列および骨髄系列が、ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出された（図２０Ｅ）。同じヒトＨＳＣドナーからのＲＮＰ処理および対照非処理ＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおけるヒトＣＤ４５＋細胞を含むＮＳＧマウスの造血再構成の動力学。下方パネル：移植されたマウスのヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出されたリンパ球および骨髄細胞ならびに赤血球前駆細胞のパーセンテージ。
【図２０Ｅ】免疫欠損マウスモデルにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の移植を表す。（図２０Ａ）ＨＳＣへのＲＮＰ送達ならびにＮＳＧマウスへの移植および長期追跡の実験概略図。（図２０Ｂ）ＨＳＣ移植に使用するために、新鮮なＣＤ３４＋細胞をＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた実験で検出された編集事象のサブタイプの概要。（図２０Ｃ）遺伝子編集ＨＳＣのＣＦＣ造血活性の分析（左側）、ならびにＣＦＣからのｇＤＮＡにおけるＨＢＢ遺伝子座での野生型ＤＮＡ配列（編集なし）、片アレルまたは両アレル編集事象の検出のためのＨＳＣクローン（赤血球および骨髄ＣＦＣ）のＤＮＡ配列分析（右側）。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。（図２０Ｄ）左側パネル：ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの細胞注入後の様々な時点で採取された血液サンプルから抽出されたｇＤＮＡにおけるＴ７Ｅ１アッセイによるインデルの検出。右側パネル：マウス末梢血サンプル中でのヒト細胞の検出。各々の線は、ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した４匹の個別のマウスにおいて検出された遺伝子編集のレベルに対応する。ヒトＨＳＣ移植から１２週間後にＲＮＰ処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ４５＋細胞は、血液中のマウスＣＤ４５＋細胞から識別された。ヒトリンパ球系列および骨髄系列が、ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出された（図２０Ｅ）。同じヒトＨＳＣドナーからのＲＮＰ処理および対照非処理ＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおけるヒトＣＤ４５＋細胞を含むＮＳＧマウスの造血再構成の動力学。下方パネル：移植されたマウスのヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内で検出されたリンパ球および骨髄細胞ならびに赤血球前駆細胞のパーセンテージ。
【図２１Ａ】移植ＮＳＧマウスの造血臓器における遺伝子編集ヒトＨＳＣの検出を描写する。（図２１Ａ）マウス造血臓器においてヒトＣＤ４５＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリーゲーティング概略図。下方パネル：表示のヒトＨＳＣ移植グループの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞の平均生着。右下パネル：マウスの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋ゲート内で検出されたヒトＣＤ３４＋細胞の平均パーセンテージ。（図２１Ｂ）ヒト細胞単離の前（上方パネル）および後（下方パネル）に、移植マウスからの骨髄のヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内のヒトＣＤ４５＋細胞およびヒトＣＤ３４＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリー分析。（図２１Ｃ）ＲＮＰ処理ＨＳＣを移植したマウスの造血臓器（選別されたヒト細胞）および血液サンプル（非選別）におけるＴ７Ｅ１分析により検出された遺伝子編集。
【図２１Ｂ】移植ＮＳＧマウスの造血臓器における遺伝子編集ヒトＨＳＣの検出を描写する。（図２１Ａ）マウス造血臓器においてヒトＣＤ４５＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリーゲーティング概略図。下方パネル：表示のヒトＨＳＣ移植グループの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞の平均生着。右下パネル：マウスの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋ゲート内で検出されたヒトＣＤ３４＋細胞の平均パーセンテージ。（図２１Ｂ）ヒト細胞単離の前（上方パネル）および後（下方パネル）に、移植マウスからの骨髄のヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内のヒトＣＤ４５＋細胞およびヒトＣＤ３４＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリー分析。（図２１Ｃ）ＲＮＰ処理ＨＳＣを移植したマウスの造血臓器（選別されたヒト細胞）および血液サンプル（非選別）におけるＴ７Ｅ１分析により検出された遺伝子編集。
【図２１Ｃ】移植ＮＳＧマウスの造血臓器における遺伝子編集ヒトＨＳＣの検出を描写する。（図２１Ａ）マウス造血臓器においてヒトＣＤ４５＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリーゲーティング概略図。下方パネル：表示のヒトＨＳＣ移植グループの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞の平均生着。右下パネル：マウスの骨髄および脾臓におけるヒトＣＤ４５＋ゲート内で検出されたヒトＣＤ３４＋細胞の平均パーセンテージ。（図２１Ｂ）ヒト細胞単離の前（上方パネル）および後（下方パネル）に、移植マウスからの骨髄のヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内のヒトＣＤ４５＋細胞およびヒトＣＤ３４＋細胞を検出するための代表的なフローサイトメトリー分析。（図２１Ｃ）ＲＮＰ処理ＨＳＣを移植したマウスの造血臓器（選別されたヒト細胞）および血液サンプル（非選別）におけるＴ７Ｅ１分析により検出された遺伝子編集。
【図２２Ａ】２０ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体（ＲＮＰ）で電気穿孔されたヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着および遺伝子編集頻度を描写する。実験１（「Ｅｘｐｔ１」、２６０，０００細胞／マウス）パネルは、図２１に描写したヒト／マウス異種移植片実験に対応する長期（４ヵ月）生着および遺伝子編集頻度を描写する）。
【図２２Ｂ】２０ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体（ＲＮＰ）で電気穿孔されたヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着および遺伝子編集頻度を描写する。実験１（「Ｅｘｐｔ１」、２６０，０００細胞／マウス）パネルは、図２１に描写したヒト／マウス異種移植片実験に対応する長期（４ヵ月）生着および遺伝子編集頻度を描写する）。
【図２２Ｃ】２０ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体（ＲＮＰ）で電気穿孔されたヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着および遺伝子編集頻度を描写する。実験１（「Ｅｘｐｔ１」、２６０，０００細胞／マウス）パネルは、図２１に描写したヒト／マウス異種移植片実験に対応する長期（４ヵ月）生着および遺伝子編集頻度を描写する）。
【図２２Ｄ】末梢血中のマウスおよびヒト造血ＣＤ４５＋細胞含量の相対パーセンテージを示すＥｘｐｔ１の代表的な動物からのマウス末梢血サンプルのフローサイトメトリー分析を示す。ヒトリンパ球サブセットは、総ヒト血液（ＣＤ４５＋）細胞ゲート内で分析した。
【図２２Ｅ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２２Ｆ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２２Ｇ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２２Ｈ】各グループからの代表的なＲＮＰ−ＨＳＣ移植片レシピエントの骨髄および脾臓からの選別ヒト細胞で検出される遺伝子編集事象の特定タイプの頻度を示す。４ヵ月前にＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの脾臓および骨髄から富化されたヒト細胞中に検出された、総遺伝子編集頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）、および遺伝子編集のタイプ。移植前の予備注入（生体外）細胞産物中に検出された遺伝子編集の頻度および代表的な移植レシピエントの生体内に検出された遺伝子編集の頻度を示す。
【図２２Ｉ】各グループからの代表的なＲＮＰ−ＨＳＣ移植片レシピエントの骨髄および脾臓からの選別ヒト細胞で検出される遺伝子編集事象の特定タイプの頻度を示す。４ヵ月前にＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの脾臓および骨髄から富化されたヒト細胞中に検出された、総遺伝子編集頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）、および遺伝子編集のタイプ。移植前の予備注入（生体外）細胞産物中に検出された遺伝子編集の頻度および代表的な移植レシピエントの生体内に検出された遺伝子編集の頻度を示す。
【図２３Ａ】２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中で予備刺激してから、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９とＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ＲＮＰの複合体で電気穿孔し、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中でさらに２日間培養したヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着、および細胞中の遺伝子編集頻度を描写する。実験２（「ＥＸＰＴ２」）の場合、各動物は、５７０，０００細胞を受けた。全てのパネルは、長期（１６週間または４ヵ月）生着を描写する。
【図２３Ｂ】２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中で予備刺激してから、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９とＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ＲＮＰの複合体で電気穿孔し、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中でさらに２日間培養したヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着、および細胞中の遺伝子編集頻度を描写する。実験２（「ＥＸＰＴ２」）の場合、各動物は、５７０，０００細胞を受けた。全てのパネルは、長期（１６週間または４ヵ月）生着を描写する。
【図２３Ｃ】２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンでプレコンディショニングした後、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中で予備刺激してから、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９とＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ＲＮＰの複合体で電気穿孔し、サイトカインとＰＧＥ２およびＳＲ−１を含む培地中でさらに２日間培養したヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植した免疫欠損ＮＳＧマウスの抹消血、脾臓、および骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着、および細胞中の遺伝子編集頻度を描写する。実験２（「ＥＸＰＴ２」）の場合、各動物は、５７０，０００細胞を受けた。全てのパネルは、長期（１６週間または４ヵ月）生着を描写する。
【図２３Ｄ】末梢血中のマウスおよびヒト造血ＣＤ４５＋細胞含量の相対パーセンテージを示すＥＸＰＴ２の代表的な動物からのマウス末梢血サンプルのフローサイトメトリー分析を示す。ヒトリンパ球サブセットは、総ヒト血液（ＣＤ４５＋）細胞ゲート内で分析した。
【図２３Ｅ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２３Ｆ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２３Ｇ】ＨＳＣ移植から１６週間後の血液、脾臓、および骨髄中の、ＤＮＡ配列決定により決定される、遺伝子編集頻度を示す。
【図２３Ｈ】代表的なＲＮＰ−ＨＳＣ移植片レシピエントの骨髄および脾臓からの選別ヒト細胞において検出される遺伝子編集事象の具体的なタイプを示す。４ヵ月前にＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの脾臓および骨髄から富化されたヒト細胞中に検出された、総遺伝子編集頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）、および編集のタイプ。移植前の予備注入（生体外）細胞産物中に検出された遺伝子編集の頻度および代表的な移植レシピエントの生体内に検出された遺伝子編集の頻度を示す。
【図２３Ｉ】代表的なＲＮＰ−ＨＳＣ移植片レシピエントの骨髄および脾臓からの選別ヒト細胞において検出される遺伝子編集事象の具体的なタイプを示す。４ヵ月前にＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの脾臓および骨髄から富化されたヒト細胞中に検出された、総遺伝子編集頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）、および編集のタイプ。移植前の予備注入（生体外）細胞産物中に検出された遺伝子編集の頻度および代表的な移植レシピエントの生体内に検出された遺伝子編集の頻度を示す。
【図２４Ａ】ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞の移植から４ヵ月後のヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ、ヒト骨髄（ＣＤ３３＋）、およびヒト赤血球（ＣＤ２３５＋）細胞を含むマウス骨髄の増殖についてのフローサイトメトリーデータを示す。
【図２４Ｂ】Ｔ７Ｅ１分析（左側パネル）およびＤＮＡ配列決定（右側パネル）によって決定される通り、移植したマウスの骨髄から富化された選別ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ、ヒトＣＤ３３＋骨髄細胞、およびヒト赤血球ＣＤ２３５＋細胞に検出された遺伝子編集を示す。
【図２５Ａ】Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析およびＤＮＡ配列決定によって決定される、１２週前のヒト成体型動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞中の遺伝子編集頻度を示す。
【図２５Ｂ】移植から１２週間後に生体内で、ＲＮＰ処理ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞または非処理対照ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞から分化したヒトＣＤ４５＋細胞リンパ球および骨髄細胞の短期生着を描写する。
【図２５Ｃ】遺伝子編集ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞によるヒトＣＤ４５＋細胞造血再構成の動力学を描写する。
【図２５Ｄ】ＲＮＰ処理または非処理対照ヒトｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスからの末梢血の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。
【図２６Ａ】非修飾５’および３’末端（ＮＭ）を有するか、または５’および３’末端の双方が１ホスホロチオエート基で修飾された（Ｐｈｘ）一本鎖オリゴヌクレオチド供与体（ｓｓＯＤＮ）の共送達を含む、または含まないＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰの電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度および相同組換え修復頻度を示す。図２６Ａは、様々な量のｓｓＯＤＮの送達後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより決定される）を示す。図２６Ｂは、Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））ならびに多量および少量の非修飾および修飾ｓｓＯＤＮによる電気穿孔の時点に対して経時的なヒトＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化によって測定される生存能力を示す。図２６Ｃは、ＤＮＡ配列決定分析により決定される総遺伝子編集タイプおよび遺伝子編集タイプのサブセットを描写する。遺伝子修飾は、標的部位（ＨＤＲ）でのｓｓＯＤＮ配列の検出を示すことに留意されたい。図２６Ｄは、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞へのｓｓＯＤＮの共送達で、または共送達なしに達成された総ＨＤＲ頻度（すなわち、遺伝子変換および遺伝子修飾の合計）を示す。
【図２６Ｂ】非修飾５’および３’末端（ＮＭ）を有するか、または５’および３’末端の双方が１ホスホロチオエート基で修飾された（Ｐｈｘ）一本鎖オリゴヌクレオチド供与体（ｓｓＯＤＮ）の共送達を含む、または含まないＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰの電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度および相同組換え修復頻度を示す。図２６Ａは、様々な量のｓｓＯＤＮの送達後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより決定される）を示す。図２６Ｂは、Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））ならびに多量および少量の非修飾および修飾ｓｓＯＤＮによる電気穿孔の時点に対して経時的なヒトＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化によって測定される生存能力を示す。図２６Ｃは、ＤＮＡ配列決定分析により決定される総遺伝子編集タイプおよび遺伝子編集タイプのサブセットを描写する。遺伝子修飾は、標的部位（ＨＤＲ）でのｓｓＯＤＮ配列の検出を示すことに留意されたい。図２６Ｄは、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞へのｓｓＯＤＮの共送達で、または共送達なしに達成された総ＨＤＲ頻度（すなわち、遺伝子変換および遺伝子修飾の合計）を示す。
【図２６Ｃ】非修飾５’および３’末端（ＮＭ）を有するか、または５’および３’末端の双方が１ホスホロチオエート基で修飾された（Ｐｈｘ）一本鎖オリゴヌクレオチド供与体（ｓｓＯＤＮ）の共送達を含む、または含まないＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰの電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度および相同組換え修復頻度を示す。図２６Ａは、様々な量のｓｓＯＤＮの送達後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより決定される）を示す。図２６Ｂは、Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））ならびに多量および少量の非修飾および修飾ｓｓＯＤＮによる電気穿孔の時点に対して経時的なヒトＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化によって測定される生存能力を示す。図２６Ｃは、ＤＮＡ配列決定分析により決定される総遺伝子編集タイプおよび遺伝子編集タイプのサブセットを描写する。遺伝子修飾は、標的部位（ＨＤＲ）でのｓｓＯＤＮ配列の検出を示すことに留意されたい。図２６Ｄは、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞へのｓｓＯＤＮの共送達で、または共送達なしに達成された総ＨＤＲ頻度（すなわち、遺伝子変換および遺伝子修飾の合計）を示す。
【図２６Ｄ】非修飾５’および３’末端（ＮＭ）を有するか、または５’および３’末端の双方が１ホスホロチオエート基で修飾された（Ｐｈｘ）一本鎖オリゴヌクレオチド供与体（ｓｓＯＤＮ）の共送達を含む、または含まないＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ＲＮＰの電気穿孔後のヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度および相同組換え修復頻度を示す。図２６Ａは、様々な量のｓｓＯＤＮの送達後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより決定される）を示す。図２６Ｂは、Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））ならびに多量および少量の非修飾および修飾ｓｓＯＤＮによる電気穿孔の時点に対して経時的なヒトＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化によって測定される生存能力を示す。図２６Ｃは、ＤＮＡ配列決定分析により決定される総遺伝子編集タイプおよび遺伝子編集タイプのサブセットを描写する。遺伝子修飾は、標的部位（ＨＤＲ）でのｓｓＯＤＮ配列の検出を示すことに留意されたい。図２６Ｄは、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞へのｓｓＯＤＮの共送達で、または共送達なしに達成された総ＨＤＲ頻度（すなわち、遺伝子変換および遺伝子修飾の合計）を示す。
【図２７Ａ】２００，０００細胞当たり１００ｐｍｏｌ未満に下方滴定されたＰｈｘ  ｓｓＯＤＮを含む、または含まない、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））の共送達後の遺伝子編集頻度およびＨＤＲ頻度を示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析により決定される遺伝子編集事象の頻度を描写する。図２７Ｃは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。図２７Ｄは、０、５０、７５、１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、または用いずに処理した細胞のＨＤＲ事象の頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を描写する。図２７Ｅは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｍ：マクロファージコロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図２７Ｂ】２００，０００細胞当たり１００ｐｍｏｌ未満に下方滴定されたＰｈｘ  ｓｓＯＤＮを含む、または含まない、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））の共送達後の遺伝子編集頻度およびＨＤＲ頻度を示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析により決定される遺伝子編集事象の頻度を描写する。図２７Ｃは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。図２７Ｄは、０、５０、７５、１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、または用いずに処理した細胞のＨＤＲ事象の頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を描写する。図２７Ｅは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｍ：マクロファージコロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図２７Ｃ】２００，０００細胞当たり１００ｐｍｏｌ未満に下方滴定されたＰｈｘ  ｓｓＯＤＮを含む、または含まない、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））の共送達後の遺伝子編集頻度およびＨＤＲ頻度を示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析により決定される遺伝子編集事象の頻度を描写する。図２７Ｃは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。図２７Ｄは、０、５０、７５、１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、または用いずに処理した細胞のＨＤＲ事象の頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を描写する。図２７Ｅは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｍ：マクロファージコロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図２７Ｄ】２００，０００細胞当たり１００ｐｍｏｌ未満に下方滴定されたＰｈｘ  ｓｓＯＤＮを含む、または含まない、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））の共送達後の遺伝子編集頻度およびＨＤＲ頻度を示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析により決定される遺伝子編集事象の頻度を描写する。図２７Ｃは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。図２７Ｄは、０、５０、７５、１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、または用いずに処理した細胞のＨＤＲ事象の頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を描写する。図２７Ｅは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｍ：マクロファージコロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図２７Ｅ】２００，０００細胞当たり１００ｐｍｏｌ未満に下方滴定されたＰｈｘ  ｓｓＯＤＮを含む、または含まない、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））の共送達後の遺伝子編集頻度およびＨＤＲ頻度を示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析により決定される遺伝子編集事象の頻度を描写する。図２７Ｃは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。図２７Ｄは、０、５０、７５、１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、または用いずに処理した細胞のＨＤＲ事象の頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を描写する。図２７Ｅは、非処理対照、ならびにｓｓＯＤＮと共に、またはｓｓＯＤＮなしで、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰと２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞における生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分化能または造血活性（すなわち、コロニー形成能）を示す。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、Ｍ：マクロファージコロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図２８】ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５  ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０Ａ  ＲＮＰ、ならびに細胞２００，０００個当たり１００ｐｍｏｌのＰｈｘ修飾ｓｓＯＤＮの電気穿孔後の２つの追加ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞供与体および１つの成体型ｍＰＢＣＤ３４＋細胞供与体における総遺伝子編集の頻度および遺伝子編集事象のタイプの頻度（ＤＮＡ配列決定分析により決定される）を示す。
【図２９Ａ】成体型ｍＰＢＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度、ならびにその造血能力（例えば、ＣＦＣ）に対する、ｇＲＮＡに３’末端修飾（例えば、規定長さのポリ（Ａ）テール、ポリ（Ｔ）テール、もしくはポリ（Ｇ）テール）を含む、または含まない５’末端修飾（例えば、ＡＲＣＡキャップ）の含有の作用を描写する。図２９Ａに描写される実験では、ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）は、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質と複合体化した表示の５’および３’末端修飾を用いてインビトロで転写された。図２９Ｂ遺伝子編集頻度は、ＤＮＡ配列決定分析により決定された。
【図２９Ｂ】成体型ｍＰＢＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集頻度、ならびにその造血能力（例えば、ＣＦＣ）に対する、ｇＲＮＡに３’末端修飾（例えば、規定長さのポリ（Ａ）テール、ポリ（Ｔ）テール、もしくはポリ（Ｇ）テール）を含む、または含まない５’末端修飾（例えば、ＡＲＣＡキャップ）の含有の作用を描写する。図２９Ａに描写される実験では、ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）は、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質と複合体化した表示の５’および３’末端修飾を用いてインビトロで転写された。図２９Ｂ遺伝子編集頻度は、ＤＮＡ配列決定分析により決定された。
【図２９Ｃ】二重ニッカーゼ戦略を用いて、ＨＢＢ遺伝子座を標的化するＤ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰによる電気穿孔後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のＣＦＣ能力を描写し、この場合、ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５はいずれも、５’および／または３’末端が、表示の修飾で修飾されている。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【図３０Ａ】二重ニッカーゼ戦略を用いて、ＨＢＢ遺伝子座を標的化するＤ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰによる電気穿孔後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集頻度およびＣＦＣ能力を描写し、この場合、２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）はいずれも、５’が修飾され、表示の３’末端修飾を有する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【図３０Ｂ】二重ニッカーゼ戦略を用いて、ＨＢＢ遺伝子座を標的化するＤ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰによる電気穿孔後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集頻度およびＣＦＣ能力を描写し、この場合、２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）はいずれも、５’が修飾され、表示の３’末端修飾を有する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【図３０Ｃ】二重ニッカーゼ戦略を用いて、ＨＢＢ遺伝子座を標的化するＤ１０Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰによる電気穿孔後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集頻度およびＣＦＣ能力を描写し、この場合、２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）はいずれも、５’が修飾され、表示の３’末端修飾を有する。Ｅ：赤血球、Ｇ：顆粒球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本明細書に記載される方法および組成物は、幹細胞、例えば、ＨＳＣにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を増大する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム構成要素（例えば、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、および／またはテンプレート核酸）などの外来分子に幹細胞を曝露すると、幹細胞にストレスが加わって、自然免疫応答を誘導し、これが、例えば、プログラム細胞死または幹細胞分化をトリガーする。本明細書に記載される方法およびシステムの使用によって、外来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への曝露後、最終的に幹細胞におけるプログラム細胞死または幹細胞分化を引き起こし得るストレス応答および自然免疫応答シグナル伝達事象を低減または無効化する。具体的には、幹細胞を１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と接触させる前および／または後に、幹細胞を幹細胞生存能力エンハンサーに一時的に（例えば、１２０時間未満の期間にわたり）曝露することによって、外来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素に対する幹細胞の自然免疫応答が低減するか、または阻止され、これにより、幹細胞の生存能力が著しく増大する。さらに、幹細胞生存能力エンハンサー（例えば、小分子）による幹細胞の短時間かつ一時的処理によって、幹細胞の複能性および自己再生能力の増大ももたらされる。さらには、本明細書に開示される方法および組成物によって、修飾幹細胞の対象への導入時に、標的組織における幹細胞の生着も増大する。
【００９９】
本明細書に開示される幹細胞生存能力薬剤に対する幹細胞の一時的曝露の思いがけない利点は、これらが、典型的に幹細胞拡大剤として、例えば、幹細胞の増殖を増大し、その数を数倍（例えば、少なくとも５倍）増加させるために使用されたことを考え、また、幹細胞の拡大の利益には、長期間にわたる薬剤との接触（例えば、細胞培養物中での１週間を超える曝露）が必要であることを考慮すれば、驚くべきことである。例えば、培養中の幹細胞の数の有意な増加を証明するために、Ｂｏｉｔｏｎｏらは、ＳＲ１の存在下で幹細胞を３週間培養し（Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０を参照）、Ｇｕらは、ＳＲ１と一緒に７日間培養した幹細胞が、非処理細胞と比較して、リンパ系再構成能力を喪失したことを立証したが、これは、ＳＲ１が、生存幹細胞の拡大に有効ではなかったことを示している。このような幹細胞の複能性の喪失は、Ｃａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１３）でも観察されており、その際、他のＡｈＲアンタゴニスト（ＡｈＲＡおよびジメトキシフラボン）ＤＭＦ））との幹細胞の１４日間の共培養によって、生体外リンパ系分化能の喪失が起こった。
【０１００】
従って、本明細書に記載される方法および組成物は、生存幹細胞をもたらす標的核酸配列の編集を最適化し、様々な臨床応用における幹細胞療法の分野を進化させる上で特に有利である。
【０１０１】
定義
用語「生存能力」は、本明細書の用法では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムへの曝露後に、幹細胞が、生存し、それ自体を維持し、かつ／またはその潜在力を回復する能力を指す。一実施形態では、生存幹細胞は、細胞培養物中に維持することができる。
【０１０２】
用語「拡大する」または「拡大」は、本明細書の用法では、少なくとも１６８時間（例えば、７日）の期間にわたって、かつ、少なくとも１６８時間（例えば、７日）の期間の終了までに、初期細胞数の５倍を超える細胞数増加をもたらす条件下で幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞）を培養することを指す。
【０１０３】
用語「維持」、「維持する」、「維持する（こと）」、または「維持される」は、本明細書の用法では、培養物中の細胞に関して使用されるとき、細胞の生存能力を支持する期間にわたって、かつそうした条件下で細胞を培養することを指すが、その場合、上記期間中または期間の終了までの細胞数の増加は、初期細胞数に比して５倍未満である。一実施形態では、細胞数の増加は、初期細胞数の４倍未満である。一実施形態では、細胞数の増加は、初期細胞数の３倍未満である。一実施形態では、細胞数の増加は、初期細胞数の２倍未満である。一実施形態では、細胞数の増加は、初期細胞数の１．６倍未満である。一実施形態では、細胞数の倍率変化は、初期細胞数の１倍超で、しかも２倍未満である。別の実施形態では、期間は、約７２時間未満である。一実施形態では、期間は、約４８時間未満である。別の実施形態では、期間は、約２４時間未満である。例えば、一実施形態では、維持という用語は、約９６時間の期間中、または約７２時間の期間終了までに、細胞数の増加が５倍未満である条件下で、約７２時間の期間にわたって幹細胞を培養することを指す。別の実施形態では、維持という用語は、約７２時間の期間中、または約７２時間の期間終了までに、細胞数の増加が４倍未満である条件下で、約７２時間の期間にわたって幹細胞を培養することを指す。
【０１０４】
用語「細胞生存能力エンハンサー」または「幹細胞生存能力エンハンサー」は、本明細書の用法では、幹細胞生存能力エンハンサーによる処理なしでＣａｓ９システムに曝露した後の同型の幹細胞の生存能力と比較して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９システム）への曝露（例えば、電気穿孔）後に幹細胞の生存能力を増大することができる化合物（例えば、ヌクレオチド、タンパク質、もしくは小分子）を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、タンパク質である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ペプチドである。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、小分子である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、細胞膜透過性である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、細胞膜透過性ではない。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、核膜透過性である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、核膜透過性ではない。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、アリール炭化水素受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ピリミドインドール誘導体である。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答アンタゴニストである。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＭＧ１３２である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＳＢ４３１５４２である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＵＭ１７１である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＵＭ７２９である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である。
【０１０５】
用語「自然免疫応答アゴニスト」は、本明細書の用法では、幹細胞の自然免疫応答（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触（例えば、電気穿孔による）に応答した）を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の自然免疫応答（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触（例えば、電気穿孔による）に応答した）が起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の細胞死（例えば、プログラム細胞死）を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のプログラム細胞死（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した）を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プログラム細胞死シグナル伝達事象（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した）が細胞に起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞における老化を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の分化を阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のアポトーシスを阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のオートファジーを阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞生存能力エンハンサーによる処理をしない標的組織への幹細胞の内植の頻度と比較して、標的組織への幹細胞の内植の頻度を増加する。
【０１０６】
自然免疫応答アンタゴニストの例は、当該技術分野において公知である。例えば、一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、シクロスポリンＡである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、デキサメタゾンである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、レスベラトロールである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＭｙＤ８８阻害ペプチドである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、グルココルチコイドである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＯｘＰＡＰＣである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＴＬＲアンタゴニストである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ラパマイシンである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＢＸ７９５である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＲＬＲ阻害剤である。
【０１０７】
用語「アリール炭化水素受容体アンタゴニスト」は、本明細書の用法では、アリール炭化水素受容体の活性を阻害する分子を指す。このような分子は、当該技術分野では公知である。一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）であり、これは、４−［２−［［２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル］アミノ］エチル］−フェノールとしても知られている。別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＡｈＲＡである。別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ジメトキシフラボン（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｔｅ）である。別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、６，２’，４’−トリメトキシフラボンである。別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＬＧＣ０００６である。別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、α−ナフトフラボンである。また別の実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＣＨ−２２３１９１である。
【０１０８】
用語「移植する」および「移植」は、本明細書の用法では、宿主対象中および／または上に細胞（例えば、本明細書に記載される修飾細胞）を移入するプロセスを指す。一実施形態では、移植は、患者の血流または骨髄中に幹細胞を導入することを含む。別の実施形態では、移植は、患者の固形組織または腫瘍への幹細胞の導入を含む。いくつかの実施形態では、移植後、移入された細胞は、対象組織中に生着する。
【０１０９】
用語「生着する」は、本明細書の用法では、組織との接触によって標的組織中に細胞を組み込むプロセスを指す。本明細書の用法では、用語「標的組織」は、類似細胞の任意の集団およびその周囲の細胞外物質を指す。いくつかの実施形態では、標的組織として、限定はしないが、上皮、結合組織（例えば、血液、骨および軟骨）、筋肉組織ならびに神経組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織として、限定はしないが、末梢血、骨髄、血管、脾臓、心臓、肝臓、腎臓、および皮膚が挙げられる。
【０１１０】
本明細書の用法では、細胞プロセスを記述する際用いられる用語「分化する」および「分化」は、移植前の細胞のものとは異なる１つまたは複数の特徴もしくは機能の獲得または所有を指す。いくつかの実施形態では、用語「分化」は、分化系列決定の発生過程を含む。「系列」は、細胞発生の経路を指し、ここで、前駆体、すなわち「前駆」細胞が、段階的な生理学的変化を経て、特有の機能（例えば、神経細胞、筋肉細胞、免疫細胞、または内皮細胞）を有する特殊化した細胞型になる。分化は、典型的に複数の段階で起こり、これによって、原始幹細胞はいくつかの段階を経て、そこで自己再生する能力および様々な細胞型を生み出す能力を失い、完全な成熟性に達するまで徐々に特殊化していくが、これは、「末端分化」とも呼ばれる。「末端分化細胞」は、特定の系列にコミットし、かつ分化の最終段階に到達した細胞（すなわち、十分に成熟した細胞）である。
【０１１１】
「前駆細胞」は、本明細書の用法では、幹細胞に由来し、有糸分裂能力および複能性を保持している（例えば、全部ではないが、２つ以上の成熟系列細胞型に分化または発生することができる）系列細胞を指す。
【０１１２】
「造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）」または「造血（ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）」は、本明細書の用法では、身体中（例えば、骨髄中）での多種の血球（例えば、赤血球、巨核球、骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージおよび好中球）、およびリンパ球）ならびに他の形成要素の形成および発生を指す。
【０１１３】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」、または「Ｃａｓ９システム」は、本明細書の用法では、多くのＤＮＡ修復経路の１つにより標的核酸を改変することができるシステムを指す。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９システムは、ＨＤＲ経路を介して標的核酸の修復を促進する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９システムは、さらに第２のｇＲＮＡ分子を含む。また別の実施形態では、Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、および第２のｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ分子、２つのＣａｓ９分子、および第２のｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９システムは、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第１のＣａｓ９分子、および第２のＣａｓ９分子を含む。例示的な実施形態では、Ｃａｓ９システムは、テンプレート核酸、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、「遺伝子編集システム」または「幹細胞遺伝子編集システム」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの構成要素を含むキットである。
【０１１４】
「Ｃａｓ９分子」は、本明細書の用法では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸を指す。「Ｃａｓ９ポリペプチド」は、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共同して、標的ドメインを含む部位、特定の実施形態では、ＰＡＭ配列に局在化することができるポリペプチドである。Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９分子の両方、ならびに操作、改変もしくは修復されたＣａｓ９分子、または参照配列、例えば、ほとんどの類似天然Ｃａｓ９分子とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるＣａｓ９ポリペプチドを含む。（改変、操作もしくは修復されたという用語は、本明細書で使用される場合、単純に参照配列または天然配列との違いを指すに過ぎず、具体的なプロセスまたは起源を限定するものではない）。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸であってもよい。Ｃａｓ９分子は、ヌクレアーゼ（二本鎖核酸の両鎖を切断する酵素）、ニッカーゼ（二本鎖核酸の一方の鎖を切断する酵素）、または酵素的に不活性な（または不活性型）Ｃａｓ９分子であってもよい。ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、「酵素的に活性なＣａｓ９分子」（「ｅａＣａｓ９」分子）と呼ばれる。標的核酸を切断する能力が欠如したＣａｓ９分子は、「酵素的に不活性なＣａｓ９分子」（「ｅｉＣａｓ９」分子）と呼ばれる。
【０１１５】
用語「ｇＲＮＡ分子」または「ｇＲＮＡ」は、本明細書の用法では、標的核酸にＣａｓ９分子を標的化することができるガイドＲＮＡを指す。一実施形態では、用語「ｇＲＮＡ分子」は、ガイドリボ核酸を指す。別の実施形態では、用語「ｇＲＮＡ分子」は、ｇＲＮＡをコードする核酸を指す。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、非天然である。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、合成ｇＲＮＡ分子である。
【０１１６】
「修飾ｇＲＮＡ分子」または「修飾ｇＲＮＡ」は、本明細書の用法では、細胞に導入された後の非修飾ｇＲＮＡ分子と比較して、細胞に導入された後に向上した半減期を有するｇＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露された（例えば、電気穿孔された）とき、その細胞における自然免疫応答を活性化しない。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、同型の細胞が非修飾ｇＲＮＡ分子に曝露された際の細胞の自然免疫応答と比較して、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、低い自然免疫応答をその細胞で活性化する。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、その細胞において、プログラム細胞死経路（例えば、アポトーシス細胞死経路、壊死細胞死経路（例えば、壊死細胞死経路）、オートファジー細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、フェロトーシス細胞死経路、エリプトーシス細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、またはアノイキス細胞死経路）を活性化しない。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ依存的細胞死経路を活性化しない。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ非依存的細胞死経路を活性化しない。
【０１１７】
一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端修飾を含む。一実施形態では、５’末端修飾は、以下：Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される。一実施形態では、５’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端修飾を含む。一実施形態では、３’末端修飾は、ポリアデニンテールである。一実施形態では、３’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。
【０１１８】
「テンプレート核酸」は、本明細書の用法では、標的位置の構造を改変するために、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子と一緒に使用することができる核酸配列を指す。一実施形態では、標的核酸は、典型的には切断部位もしくはその付近で、テンプレート核酸の配列の一部または全部を有するように修飾されている。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。別の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。一実施形態では、テンプレート核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。別の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖ＤＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、ＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡと同じベクター骨格、例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡにコードされる。一実施形態では、テンプレート核酸は、ベクター骨格から生体内で切除され、例えば、これは、ｇＲＮＡ認識配列によってフランキングされる。一実施形態では、テンプレートＤＮＡは、ＩＬＤＶ中にある。一実施形態では、テンプレート核酸は、外性核酸配列である。別の実施形態では、テンプレート核酸配列は、内在性核酸配列、例えば、内在性相同性領域である。一実施形態では、テンプレート核酸は、核酸配列のプラス鎖に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、テンプレート核酸は、核酸配列のマイナス鎖に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１１９】
「修飾テンプレート核酸」は、本明細書の用法では、細胞に導入された後の非修飾テンプレート核酸と比較して、細胞に導入された後に向上した半減期を有するテンプレート核酸、例えば、テンプレートとして役立つ一本鎖オリゴヌクレオチド分子を指す。一実施形態では、修飾テンプレート核酸は、修飾テンプレート核酸に曝露された（例えば、電気穿孔された）とき、細胞において自然免疫応答を活性化しない。一実施形態では、修飾テンプレート核酸は、同型の細胞が非修飾テンプレート核酸に曝露された際の細胞の自然免疫応答と比較して、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、低い自然免疫応答をその細胞で活性化する。別の実施形態では、修飾テンプレート核酸は、細胞が修飾テンプレート核酸に曝露されたとき、その細胞において、プログラム細胞死経路（例えば、アポトーシス細胞死経路、壊死細胞死経路（例えば、壊死細胞死経路）、オートファジー細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、フェロトーシス細胞死経路、エリプトーシス細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、またはアノイキス細胞死経路）を活性化しない。いくつかの実施形態では、修飾テンプレート核酸は、カスパーゼ依存的細胞死経路を活性化しない。別の実施形態では、修飾テンプレート核酸は、カスパーゼ非依存的細胞死経路を活性化しない。
【０１２０】
一実施形態では、修飾テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。一実施形態では、ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾を含む。一実施形態では、ｓｓＯＤＮは、３’ホスホロチオエート修飾を含む。一実施形態では、ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾を含む。
【０１２１】
「標的突然変異位置」は、本明細書の用法では、突然変異すると、突然変異タンパク質をもたらし、疾患、例えば、本明細書に記載される疾患を引き起こし得る、遺伝子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）内の標的位置を指す。
【０１２２】
「標的ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、改変されると、疾患、または、本明細書に記載される疾患の症状の改善をもたらす、遺伝子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）内の位置を指す。
【０１２３】
「標的ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子によって、標的化されると、機能性遺伝子産物の発現の低減または排除をもたらす、遺伝子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）内の位置を指す。
【０１２４】
「標的ノックイン位置」は、本明細書の用法では、遺伝子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）の配列の挿入によって修飾されると、例えば、野生型活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列を提供することにより、遺伝子活性の最適化をもたらす配列を指す。
【０１２５】
「標的位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載される通り、標的突然変異位置、標的ノックアウト位置、標的ノックダウン位置、または標的ノックイン位置のいずれかを指す。
【０１２６】
「ＨＤＲ」、または「相同組換え修復」は、本明細書の用法では、相同性核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外性核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、典型的に、二本鎖切断に有意な切除が存在した場合に作用し、ＤＮＡの少なくとも一本鎖部分を形成する。正常細胞では、ＨＤＲは、典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分割、および結合などの一連のステップを含む。このプロセスには、ＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２が必要であり、相同性核酸は、典型的には二本鎖である。
【０１２７】
「Ａｌｔ−ＨＤＲ」もしくは「代替ＨＤＲ」、または代替相同組換え修復は、本明細書の用法では、相同性核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外性核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。Ａｌｔ−ＨＤＲは、このプロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を使用し、標準ＨＤＲ媒介物質であるＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２により阻害することができる点で、標準ＨＤＲとは異なる。また、ａｌｔ−ＨＤＲは、切断の修復に一本鎖またはニック相同性核酸を使用する。
【０１２８】
特に断りのない限り、用語「ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、ＨＤＲおよびａｌｔ−ＨＤＲを包含する。
【０１２９】
「遺伝子変換」は、本明細書の用法では、テンプレート核酸として内在性核酸、例えば、姉妹染色分体またはプラスミドを用いて、相同組換え（ＨＤＲ）によりＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２および／またはＲＡＤ５１が、遺伝子変換に関与していると考えられる。いくつかの実施形態では、内在性核酸は、ＤＮＡ損傷または突然変異の部位に近いＤＮＡの断片と相同性、例えば、有意な相同性を有する核酸配列である。いくつかの実施形態では、テンプレートは、外性核酸ではない。
【０１３０】
「遺伝子修正」は、本明細書の用法では、外性核酸、例えば、供与体テンプレート核酸を用いた相同組換えによりＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、外性核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外性核酸は、二本鎖である。
【０１３１】
「遺伝子修飾」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、核酸を編集するプロセスを指す。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、遺伝子修正を含む。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、遺伝子変換を含む。
【０１３２】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、結合媒介性修復および／または非テンプレート媒介性修復を指し、このようなものとして、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存的マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）が挙げられる。
【０１３３】
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸のセグメントを記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いずれか特定の機能的特性を有する必要はない。
【０１３４】
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る薬剤などの実体を指す。一実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の形成を含む。一実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し得る。
【０１３５】
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
【０１３６】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
【０１３７】
例えば、参照Ｃａｓ９分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Ｃａｓ９分子などである対象Ｃａｓ９分子または対象ｇＲＮＡ分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有するとして特徴付けられ得る。参照Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子などである、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されるＣａｓ９分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配列などの配列である。
【０１３８】
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
【０１３９】
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。
【０１４０】
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は家禽である。
【０１４１】
「治療する（Ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、例えば、（ａ）疾患を阻害し、すなわち、その進行を抑止または予防し；（ｂ）疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こし；および（ｃ）疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類の疾患の治療を意味する。
【０１４２】
「予防する」、「予防する（こと）」および「予防」は、本明細書の用法では、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の予防を意味し、（ａ）疾患を回避または排除すること；（２）疾患に対する素因に影響を与えること、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を予防するか、または疾患の少なくとも１つの症状の発症を遅らせることを含む。
【０１４３】
「Ｘ」は、アミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
【０１４４】
Ｉ．幹細胞の最適化
幹細胞、例えば、本明細書に記載される幹細胞は、例えば、生体外または生体内で最適化もしくは操作することができる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、幹細胞の最適化もしくは操作によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集または調節のための、細胞の維持、持続、もしくは調節が可能になると考えられる。例えば、幹細胞、例えば、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の最適化もしくは操作によって、細胞適合性、機能性、自己再生、生着能を維持するか、または例えば、細胞死機構、例えば、オートファジー、アポトーシス、壊死、アポネクローシス、フェロトーシス、エリプトーシス、アノイキス、もしくは細胞老化などを介した細胞死を阻止することができる。
【０１４５】
特定の実施形態において、しかし理論による拘束は望まないが、幹細胞生存能力エンハンサーと細胞を接触させると、細胞適合性、機能性、自己再生、生着能を望ましく促進するか、または細胞死を阻止すると考えられる。幹細胞生存能力エンハンサーについては、以下により詳しく記載する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に、テンプレート核酸と細胞を接触させると、幹細胞におけるプログラム細胞死および／または自然免疫応答を引き起こす１つまたは複数の細胞事象（例えば、シグナル伝達事象）をトリガーし得る。従って、本明細書に記載される幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞を接触させることによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、幹細胞を容易に操作することができる。
【０１４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に、供与体テンプレート核酸と接触させる前、接触中、または接触後に、幹細胞を最適化または操作することができる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触中に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前および接触中に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触中および接触後に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前および接触後に幹細胞を最適化または操作する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前、接触中、および接触後に幹細胞を最適化または操作する。
【０１４７】
いくつかの異なる最適化または操作ステップを順次、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触に対し特定の時間間隔で、適用することができる。また、いくつかの異なる最適化または操作ステップを同時に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触に対し特定の時間間隔で、適用することもできる。
【０１４８】
例えば、１つまたは複数の幹細胞生存能力エンハンサー（例えば、細胞アゴニスト）と接触させることにより、幹細胞を最適化または操作することができる。別の例として、１つまたは複数のトランスジーンを含有するように、幹細胞を最適化または操作することができる。トランスジーンは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連機構によって、幹細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に組み込むことができる。一実施形態では、トランスジーンは、移植前に修飾細胞の富化および／または精製の調節を可能にし得るセイフティ・スイッチをもたらすことができる。また、一実施形態では、生着した細胞が十分に検出されない場合、トランスジーンは、修飾細胞の拡大を生体内で可能にし、あるいは、修飾細胞が機能不全であるか、または白血病性形質転換を被る場合には、修飾細胞の除去を生体内で可能にすると考えられる。また別の例として、幹細胞は、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子と接触させる、例えば、転写レプレッサーまたはアクチベーターと融合させることにより、最適化または操作することができる。
【０１４９】
幹細胞生存能力エンハンサー
本明細書に記載される幹細胞は、例えば、細胞生存を促進し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞の接触に対する応答（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素によりトリガーされるシグナル伝達事象（例えば、自然免疫応答）または遺伝子編集事象に応答した）を引き起こし得る細胞死を阻止するために、１つまたは複数の幹細胞生存能力エンハンサー（例えば、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニスト、自然免疫応答アンタゴニスト、もしくはその他の本明細書に記載の幹細胞生存能力エンハンサー）と接触させることができる。
【０１５０】
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＡｈＲアンタゴニストである。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ピリミド−［４，５−ｂ］−インドール誘導体である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答アンタゴニストである。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＮＦκＢ阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ｍＴＯＲ阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＭｙＤ８８阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＴＧＦ−β阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、トール様受容体（ＴＬＲ）阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、活性窒素および酸素種の阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プロテオソーム阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ｃ−ＭＰＬアゴニストである。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、Ｎｄｒキナーゼモジュレータである。
【０１５１】
これまでに、いくつかの幹細胞生存能力エンハンサーが、幹細胞集団の拡大を補助することが明らかにされている。しかし、本明細書に記載される方法は、幹細胞の拡大を促進するために十分長い期間にわたって幹細胞を接触させる必要がない。それどころか、本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への曝露前および／または後に、幹細胞の生存能力を増大する、例えば、自然免疫応答および／または自然免疫応答を阻害するのに十分な期間にわたって幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞を接触させるだけでよい。
【０１５２】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素（例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に、供与体テンプレート核酸）との接触の１〜１２０時間前およびその最大９６時間後に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよび任意選択的に１つまたは複数の幹細胞生存能力エンハンサーを含むＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ中で幹細胞を培養することができる。生存を向上させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後に、生存を向上させ、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を含有する外性もしくは外来／不慣れな核酸、タンパク質、またはウイルス粒子への曝露による細胞摂動時に起こり得る細胞死を阻止する目的で、以下の幹細胞生存能力エンハンサーのより多くと幹細胞を接触させてもよい。理論による拘束は望まないが、幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞の短時間の前処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前）および後処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後）によって、幹細胞の生存および維持を促進し、幹細胞の老化および細胞死を阻止する（例えば、プログラム細胞死経路を介して）ことができる。
【０１５３】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と幹細胞を接触させる前に、幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞を接触させる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と幹細胞を接触させた後に、幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞を接触させる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後に、幹細胞生存能力エンハンサーと標的幹細胞を接触させる。
【０１５４】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と幹細胞を接触させた後７２時間未満の期間にわたって幹細胞生存能力エンハンサーと幹細胞を接触させる。一実施形態では、７２時間未満の期間は、約４８時間である。一実施形態では、７２時間未満の期間は、約４８±約１２時間である。一実施形態では、７２時間未満の期間は、約２４時間である。一実施形態では、７２時間未満の期間は、約４８時間以下である。一実施形態では、７２時間未満の期間は、約２４時間以下である。特定の実施形態では、７２時間未満の期間の終了から約４８時間以内に幹細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、７２時間未満の期間の終了から約２４時間以内に幹細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、７２時間未満の期間の終了から約４８時間以内に幹細胞を対象（例えば、ヒト対象）に移入する。特定の実施形態では、７２時間未満の期間の終了から約２４時間以内に幹細胞を対象（例えば、ヒト対象）に移入する。
【０１５５】
一実施形態では、幹細胞は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、幹細胞は、循環血球である。一実施形態では、幹細胞は、動員血球である。一実施形態では、幹細胞は、骨髄細胞である。一実施形態では、幹細胞は、骨髄前駆細胞である。一実施形態では、幹細胞は、リンパ球前駆細胞である。一実施形態では、幹細胞は、リンパ球前駆細胞である。一実施形態では、幹細胞は、複能性前駆細胞である。一実施形態では、幹細胞は、系列特異的前駆細胞である。一実施形態では、幹細胞は、内皮細胞である。一実施形態では、幹細胞は、間葉系間質細胞である。一実施形態では、幹細胞は、幹細胞は、非臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞である。一実施形態では、幹細胞は、臍帯内皮細胞または臍帯血細胞である。一実施形態では、幹細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞である。
【０１５６】
一実施形態では、細胞生存能力エンハンサー（例えば、アリール炭化水素受容体、自然免疫応答アンタゴニスト、もしくはその他の本明細書に記載の細胞生存能力エンハンサー）の存在下で、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、もしくは４日以下、または９６、７２、６０、４８、３６、２４、１２、６、３、２、もしくは１時間以下にわたり、幹細胞を培養する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーの存在下で、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、または９６時間超にわたり、幹細胞を培養する。一実施形態では、細胞生存能力エンハンサーの存在下で、１２０時間未満の期間にわたり、幹細胞を培養する。
【０１５７】
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニスト
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストである。アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤもしくはジオキシン）およびその他のポリ塩化ビフェニルなどの環境有害物質に対する応答を媒介する転写因子であり、幹細胞の増殖および分化に関与している（例えば、Ｔｈｕｒｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８：３３−４０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７７，５７７−５８７；Ｅｓｓｅｒ（２０１２）Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．８６：１３２３−１３２９を参照のこと）。これまでに複数のＡｈＲアンタゴニストが同定されている。
【０１５８】
本明細書に開示される使用のための例示的なＡｈＲアンタゴニストとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：Ｓｔｅｍ  Ｒｅｇｅｎｉｎ  １（Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）、ジメトキシフラボン（Ｃａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、６，２’，４’−トリメトキシフラボン（ＣＡＳ  Ｎｏ．７２０６７５−７４−１；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３２（１）：１３５−４４）、ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミドとしても知られる；ＣＡＳ  Ｎｏ．３０１３２６−２２−７）、α−ナフトフラボン（ＡＮＦまたはα−ＮＦ）、ＬＧＣ００６（Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）；１−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（Ｌｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１３９：７４７−５６）、３’メトキシ−４’−ニトロフラボン（Ｈｅｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：７１６−２５）、レスベラトロール（Ｃｉｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５７０７−１２）、およびＧＮＦ−３５１（Ｎ−（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）−９−イソプロピル−２−（５−メチルピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミンとしても知られる；例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３８：３１８−２７を参照のこと）。本明細書に開示されるＡｈＲアンタゴニストのアナログをはじめとするその他のＡｈＲアンタゴニストは、当業者には周知である。
【０１５９】
一実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストは、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）である。ＳＲ１は、小分子（４−［２−［［２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル］アミノ］エチル］−フェノール）であり、これは、ＨＳＣ拡大を指示する分子のスクリーンで同定された（Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：１３４５−１３４８）。
【０１６０】
特定の実施形態では、１つのＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、２つ以上のＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前に、１つまたは複数のＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前および接触後に、１つまたは複数のＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前に、少なくとも１つの第１のＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させ、さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、第２のＡｈＲアンタゴニストと幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、前記第１および前記第２のＡｈＲアンタゴニストは、異なるＡｈＲアンタゴニストである。
【０１６１】
本明細書に開示される方法で使用するＡｈＲアンタゴニストの適正な濃度は、当業者には容易に明らかであろう（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８１：８４−９；およびＧａｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：６０７−１２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、５、４、３、２、または１μＭ未満のＡｈＲアンタゴニストを含む培地と幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｎＭ未満のＡｈＲアンタゴニストを含む培地と幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｎＭのＡｈＲアンタゴニストを含む培地と幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００ｎＭのＡｈＲアンタゴニストを含む培地と幹細胞を接触させる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストおよびサイトカイン（例えば、本明細書に開示されるサイトカイン）の双方を含む培地と幹細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、ＡｈＲアンタゴニストおよびピリミドインドール誘導体（例えば、ＵＭ７２９、ＵＭ１７１）の両方を含む培地と幹細胞を接触させる。例えば、一実施形態では、ＳＲ１およびＵＭ７２９と幹細胞を接触させる。別の実施形態では、ＳＲ１およびＵＭ１７１と幹細胞を接触させる。
【０１６３】
自然免疫応答
別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答アンタゴニストである。用語「自然免疫応答アンタゴニスト」は、本明細書の用法では、幹細胞の自然免疫応答（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触（例えば、電気穿孔による）に応答した）を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の自然免疫応答（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触（例えば、電気穿孔による）に応答した）が起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の細胞死（例えば、プログラム細胞死）を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のプログラム細胞死（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した）を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プログラム細胞死シグナル伝達事象（例えば、Ｃａｓ９システムの１つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した）が細胞に起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞における老化を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の分化を阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のアポトーシスを阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のオートファジーを阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞生存能力エンハンサーによる処理なしの標的組織への幹細胞の内植の頻度と比較して、標的組織への幹細胞の内植の頻度を増加する。
【０１６４】
自然免疫応答アンタゴニストの例は、当該技術分野において公知である。本明細書に開示される使用のための例示的な自然免疫応答アンタゴニストとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：シクロスポリンＡ、ＴＬＲ−４Ｃ３４（３，４，６−トリアセテート−１−メチルエチル２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＡＳ  Ｎｏ．４０５９２−８８−９としても知られる）、ＣＬＩ−０９５（ＴＡＫ−２４２もしくはレサトルビドとしても知られる）、ＴＬＲ−４阻害剤ペプチドＶＩＰＥＲ（例えば、Ｌｙｓａｋｏｖａ−Ｄｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：４２６１−４２７１を参照のこと）、レスベラトロール、一酸化窒素、カルボシステイン、ＣＧＳ２５４６２、ＣＨＳ８２８、クラリスロマイシン、ジピリダモール、ジスルフィラム、ジルチアゼム、フェノルドパム、フィブラート、フルバスタチン、グリベック、レフルノミド、モキシフロキサシン、ペリンドプリル、ラロキシフェン、ラパマイシン、リトナビル、テトラチオモリブデート、トリフルサール、トログリタゾン、ＭｙＤ８８阻害ペプチド、Ｍｙｄ８８を標的化するＲＮＡｉ剤、Ｂ１８Ｒ組換えタンパク質、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＯｘＰＡＰＣ）、ＴＬＲアンタゴニスト、ラパマイシン、バフィロマイシン、ＢＸ７９５、ＦＫ５０６（タクロリムス）およびレチノイン酸誘導性遺伝子１様受容体（ＲＬＲ）阻害剤（例えば、本明細書に記載されるＲＬＲ受容体の発現を阻害もしくは低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ））。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、シクロスポリンＡである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、デキサメタゾンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、レスベラトロールである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）Ｉ型受容体アクチビン受容体様キナーゼＡＬＫ５阻害剤ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド；ＣＡＳ  Ｎｏ．３０１８３６−４１−９としても知られる；例えば、Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（１）：６５−７４を参照のこと）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、プロテアーゼ阻害剤ＭＧ１３２（ベンジル（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｓ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イルアミノ）−１−オキソペンタン−２−イルアミノ）−１−オキソペンタン−２−イルカルバメートとしても知られる；例えば、Ｔｓｕｂｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：５７２−６を参照のこと）である。いずれの理論による拘束も望まないが、プロテアソーム阻害剤の使用は、幹細胞が曝露されるＣａｓ９分子の分解を阻止する上で、特に有利となり得る。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＭｙＤ８８阻害ペプチドＰｅｐｉｎＨ−ＭＹＤ（ＮＢＰ２−２９３２８，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＩＭＯ−８４００（例えば、Ｓｕａｒｅｚ−Ｆａｒｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（１２）：ｅ８４６３４を参照のこと）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＭｙＤ８８の核酸阻害剤（例えば、ＭｙＤ８８の発現を阻害または低減するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、Ｂ１８Ｒタンパク質（ワクシニアウイルスにコードされる中和Ｉ型インターフェロン受容体またはＩ型ＩＦＮ阻害剤としても知られる；例えば、Ｖａｎｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐｔ  ７）：１６４７−９を参照のこと）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、グルココルチコイド（例えば、アルドステロン、酢酸デオキシコルチコステロン、酢酸フルドロコルチゾン、ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾンおよびヒドロコルチゾン）である。いくつかの実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、酸化１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＯｘＰＡＰＣ）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、トール様受容体（ＴＬＲ）の核酸阻害剤（例えば、本明細書に記載されるＴＬＲの発現を阻害または低減するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ラパマイシンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ｍＴＯＲ阻害剤バフィロマイシンである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、Ｎ−［３−［［５−インド−４−［［３−［（２−チエニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−１−ピロリジンカルボキサミド（ＢＸ７９５；ＣＡＳ  Ｎｏ．７０２６７５−７４−９）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ様（ＲＩＧ−Ｉ様）受容体（ＲＬＲ）阻害剤である。一実施形態では、ＲＬＲ−Ｉ様受容体は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ２、ＳＴＩＮＧ、ＤＡＫおよびＲＮＦ１２５からなる群から選択される遺伝子によってコードされる受容体である。一実施形態では、ＲＬＲ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＲＩＧ−Ｉによりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＲＩＧ−Ｉの発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。別の実施形態では、ＲＬＲ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＭＤＡ−５によりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＭＤＡ−５の発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。別の実施形態では、ＲＩＧ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＬＧＰ２によりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＬＧＰ２の発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。別の実施形態では、ＲＬＲ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＳＴＩＮＧによりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＳＴＩＮＧの発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。別の実施形態では、ＲＩＧ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＳＡＫによりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＤＡＫの発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。別の実施形態では、ＲＩＧ−Ｉ様受容体阻害剤は、遺伝子ＲＮＦ１２５によりコードされる受容体の阻害剤（例えば、ＲＮＦ１２５の発現を阻害または低減する小分子、または阻害性核酸（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ））である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＧＷ７８８３８８（４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンザミド）；ＣＡＳ  Ｎｏ．４５２３４２−６７−５としても知られる）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、（４−［２−（６−メチルピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル］キノリン−６−カルボキサミド；６−キノリンカルボキサミド、４−［５，６−ジヒドロ−２−（６−メチル−２−ピリジニル）−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル］、ＬＹ−２１５７２９９；ＣＡＳ  Ｎｏ．７００８４７４−７２−２としても知られる）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、フレソルミマブ（ＧＣ１００８としても知られる）である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＴＬＲ−４Ｃ３４（３，４，６−トリアセテート−１−メチルエチル２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＡＳ  Ｎｏ．４０５９２−８８−９としても知られる）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＣＬＩ−０９５（ＴＡＫ−２４２またはレサトルビドとしても知られる）である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＴＬＲ−４阻害剤ペプチドＶＩＰＥＲである。
【０１６５】
一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、レスベラトロールである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、一酸化窒素である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、カルボシステインである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＣＧＳ  ２５４６２である。
【０１６６】
一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＣＨＳ  ８２８である。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、クラリスロマイシンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ジピリダモールである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ジスルフィラムである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ジルチアゼムである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、フェノルドパムである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、フィブラートである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、フルバスタチンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、グリベックである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、レフルノミドである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ペリドプリルである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、モキシフロキサシンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ラロキシフェンである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ラパマイシンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、リトナビルである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、テトラチオモリブデートである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、トリフルサールである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、トログリタゾンである。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ロバスタチンである。別の実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＮＲ−１０１（Ｎｉｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３７（１１）：１３６４−７７）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ｍｉｒ−１２５ａ（例えば、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：７０９６を参照のこと）である。一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、Ｎｄｒキナーゼモジュレータである。
【０１６７】
一実施形態では、自然免疫応答アンタゴニストは、ＮＦκＢ阻害剤（例えば、表１ａに開示されるＮＦκＢ）である。理論による拘束は望まないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への曝露に関連する幹細胞の生存能力を維持する、および／またはその自然免疫応答を低減するために、ＮＦκＢ阻害剤を用いることができる。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、デキサメタゾンである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、レセルバトロールである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ＭＧ１３２である。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、カルボシステインである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ＣＧＳ２５４６２である。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ＣＨＳ８２８である。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、クラリスロマイシンである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ジピリダモールである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ジスルフィラムである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ジルチアゼムである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、フェノルドパムである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、フィブラートである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、フルバスタチンである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、グリベックである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、レフルノミドである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、モキシフロキサシンである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ペリンドプリルである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ラロキシフェンである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、ラパマイシンである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、リトナビルである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、テトラチオモリブデートである。別の実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、トリフルサールである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、トログリタゾンである。一実施形態では、ＮＦκＢ阻害剤は、デノスマブである。
【０１６８】
理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載される免疫調節化合物（例えば、自然免疫応答アンタゴニスト）と幹細胞を接触させると、例えば、ＤＮＡ損傷に関連する遺伝子編集により誘導される細胞の自然免疫応答と、これに続く細胞老化応答を阻害することによって、幹細胞自己再生、維持、および生存を調節ことができると考えられる。別の実施形態では、本明細書に記載される自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞の接触により誘導される幹細胞のプログラム細胞死の活性化を阻害することができる。
【０１６９】
例えば、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロン［ＩＦＮ］）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびトール様受容体（ＴＬＲ）は、幹細胞、例えば、ＨＳＣに直接影響を与えることができ、これによって、ＨＳＣは、末梢血中の造血を維持しながら、有効な免疫応答を支持することができる。例えば、炎症性サイトカインは、ＨＳＣを生体内で活性化して、侵入病原体を遅らせるために必要な細胞事象（例えば、自然免疫抗菌エフェクター細胞としての骨髄系好中球の産生増加など）に基づいて、分化を骨髄系またはリンパ系子孫に向けることによって、免疫応答に参加することができる。従って、幹細胞を自然免疫応答アンタゴニストと接触させることによって、プログラム細胞死（例えば、アポトーシス）を阻止することができる。例示的な自然免疫応答構成要素および自然免疫応答アンタゴニストを表１ａに記載する。別の自然免疫応答アンタゴニストを表１ｂに記載する。
【０１７０】
【表１】
2018519801.tif 000002
【０１７１】
【表２】
2018519801.tif 000003
【０１７２】
【表３】
2018519801.tif 000004
【０１７３】
【表４】
2018519801.tif 000005
【０１７４】
さらに、特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣは、４、７、８、および９などのＴＬＲ受容体を発現する（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（２）：５７−６５で考察されている）。ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ３センス二本鎖および一本鎖リボ核酸はそれぞれ、ＴＬＲ９センスデオキシリボ核酸は。レチノイン酸誘導性遺伝子様受容体（例えば、ＲＩＧ−Ｉ）は、ＲＮＡを感知し、インターフェロン応答を誘導し得るＲＮＡヘリカーゼである（Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ（２０１５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２６：２０１−２０９により考察されている）。ＴＬＲシグナル伝達は、ＮＦκＢシグナル伝達を介して炎症性応答を引き起こすことができる。そのため、幹細胞、例えば、ＨＳＣにおける自然免疫応答に関与するこれらの要因をブロックする（例えば、インターフェロン応答を阻止するためにインターフェロンまたはＩＲＦ３などの転写因子をブロックするなど）ことによって、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触により誘導される幹細胞のプログラム細胞死（例えば、アポトーシス）を阻止することができる。臨床的に承認された免疫調節化合物シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）（いずれも、Ｃａ２＋依存的ホスファターゼカルシニューリンの阻害剤である）、ならびにラパマイシンは、ＨＳＣにおける自然免疫応答をブロックすることによってレンチウイルス媒介性形質導入を改善するために、生体外で使用されている（Ｐｅｔｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３（２）：３５２−６２）。カルシニューリン活性化の阻害は、炎症性サイトカインの発現を阻止する。ラパマイシン（ｍＴＯＲ）複合体の哺乳動物標的の阻害によるオートファジーの標準誘導剤であるラパマイシンは、オートファジーの誘導なしで、または細胞生着を損なうことなく、ＨＳＣのレンチウイルス形質導入を改善することが明らかにされている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  ２４：９１３０９２３）。
【０１７５】
一実施形態では、幹細胞を自然免疫応答阻害剤と接触させる。一実施形態では、免疫調節化合物は、表１ａまたは表１ｂに記載される経路または標的を調節、例えば、阻害する化合物である。幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触中、および／または接触後に、免疫調節化合物と接触させてよい。
【０１７６】
特定の実施形態では、１つの自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、２つ以上の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前に、１つまたは複数の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、１つまたは複数の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前および接触後に、１つまたは複数の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前に、少なくとも１つの第１の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞を接触させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、第２の自然免疫応答アンタゴニストと幹細胞をさらに接触させる。いくつかの実施形態では、前記第１および第２の自然免疫応答アンタゴニストは、異なる自然免疫応答アンタゴニストである。別の実施形態では、前記第１および第２の自然免疫応答アンタゴニストは、同じ自然免疫応答アンタゴニストである。
【０１７８】
他の幹細胞生存能力エンハンサー
特定の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、および１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２からなる群から選択される。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＵＭ１７１（（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４４８７２４−０９−１；例えば、Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（６２０３）：１５０９−１５１２を参照のこと）である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＵＭ７２９（メチル４−（（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４４８７２３−６０−１；例えば、Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（６２０３）：１５０９−１５１２を参照のこと）である。また別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（９−オキソ−１１α，１５Ｒ−ジヒドロキシ−１６，１６−ジメチル−プロスタ−５Ｚ，１３Ｅ−ジエン−１−オイン酸；ｄｍＰＧＥ２；ＣＡＳ  Ｎｏ．３９７４６−２５−３）である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＭＧ１３２である。また別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、ＳＢ４３１５４２である。
【０１７９】
サイトカイン
幹細胞を取得、作製、および／または単離した後、但しＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素（例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸）と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
【０１８０】
理論による拘束は望まないが、本明細書に開示されるサイトカインをさらに含む培地中で細胞を培養すると、細胞の細胞周期エントリーを誘導し得る。例示的なサイトカインとして、限定はしないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはヒトＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）；インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、アンジオポエチン様タンパク質１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）、およびアンジオポエチン様タンパク質５（ＡＮＧＰＴＬ５）（例えば、Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：７１−８０；およびＢｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８９：１９８−２０５を参照のこと）が挙げられる。
【０１８１】
一実施形態では、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。一実施形態では、２つ以上のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。一実施形態では、３つ以上のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。一実施形態では、４つ以上のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。一実施形態では、５つ以上のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。
【０１８２】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前に、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させる前および接触後に、１つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養する。一実施形態では、サイトカイン（例えば、本明細書に記載されるサイトカイン）を含有する培地中で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間幹細胞を培養する。一実施形態では、サイトカイン（例えば、本明細書に記載されるサイトカイン）を含有する培地中で１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１日未満にわたり、幹細胞を培養する。一実施形態では、サイトカイン（例えば、本明細書に記載されるサイトカイン）を含有する培地中で０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日超にわたり、幹細胞を培養する。例えば、幹細胞（例えば、幹もしくは前駆細胞、例えば、造血幹／前駆細胞）は、下記の培地：１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有し、かつ、各々５０〜１００ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびヒトＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）を添加されたＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１〜３日間培養することができる。培地はさらに、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、またはインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０１８３】
シグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサー
幹細胞を取得、作製、および／または単離した後、但しＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素（例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸）と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数のシグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数のシグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
【０１８４】
一実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前に、シグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーとさらに接触させる。別の実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後に、シグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーとさらに接触させる。別の実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前および後の双方で、シグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーとさらに接触させる。
【０１８５】
下記のシグナル伝達経路は、幹細胞、例えば、ＨＳＣの産生、自己再生、維持、増殖、および細胞運命決定の均衡に関与している。幹細胞、例えば、ＨＳＣを調節する重要な経路としては、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦβ−ＳＭＡＤ，ＣＸＣＲ５、およびＷｎｔシグナル伝達経路がある（Ｍｅｎｄｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｅｔｔｅ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０（８）：８３３−４６）。特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣは、細胞表面上にＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、およびＴＧＦβ受容体を発現し、幹細胞上のこれらの受容体へのコグネイトリガンドの結合によって、これらの細胞の自己再生、増殖、および分化能力が改変され得る。幹細胞、例えば、ＨＳＣにおけるこれらのシグナル伝達経路の協調的な順次もしくは同時調節（例えば、活性化または抑制）を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の送達系と幹細胞の接触時に摂動され得る自己再生、複能性、および増殖能を維持することができる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、シグナル伝達経路活性化または抑制因子による幹細胞の短時間の前処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前）および後処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後）により、細胞生存を促進して、細胞死を阻止することができると考えられる。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、幹細胞の複能性、自己再生、増殖能を維持すると共に、老化、および細胞死（例えば、アポトーシス、オートファジー、または壊死）を阻止するために、幹細胞上のコグネイト受容体に結合するシグナル伝達リガンドを使用する。表２は、本明細書に記載の方法に従って使用することができる例示的なシグナル伝達経路およびそのモジュレーターを記載し、その各々については、以下のサブセクションでさらに詳しく説明する。
【０１８６】
【表５】
2018519801.tif 000006
【０１８７】
ａ．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路
骨髄微小環境における血管内皮細胞および間質細胞は、特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣ上のコグネイト受容体に結合する膜結合Ｎｏｔｃｈリガンド（デルタ様リガンド［ＤＬＬ］およびジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）［ＪＡＧ］）を産生する。Ｎｏｔｃｈリガンドは、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）上のＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２受容体との結合について競合し、様々なＮｏｔｃｈリガンドの相対結合が、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）自己再生、維持、増殖、および分化を均衡させる。例えば、ＪＡＧ１は、生体内での恒常的かつ再生的造血のために必要であることが明らかにされている（Ｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４（５）：１０２２−１０３４）。プラスチック製培養プレートに固定化したＮｏｔｃｈリガンドデルタ様リガンド１（ＤＬＬ１）（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｄｅｌｔａ−１ｅｘｔ−ＩｇＧ）と臍帯血ＨＳＣの共培養は、ＣＤ３４＋細胞の拡大を支持し、同種異系二重臍帯血移植臨床試験において安全であることが証明されている（Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：２３２−６）。
【０１８８】
一実施形態では、１つまたは複数のＮｏｔｃｈシグナル伝達モジュレーターと幹細胞を接触させる。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド、例えば、ＤＬＬまたはＪＡＧである。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達モジュレーターは、ＲＮＡｉ剤、オリゴヌクレオチド、抗体、またはＮｏｔｃｈ経路特異的ｇＲＮＡと組み合わせたアクチベーター／レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子である。幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触中、および／または接触後に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達モジュレーターと接触させる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達モジュレーターと幹細胞を接触させることにより、細胞生存能力を維持すると共に限定的な幹細胞増殖を支持するために、細胞周期へのまたは細胞周期からの幹細胞の入退出を調節することができると考えられる。本明細書に記載される方法は、ヒト患者への幹細胞の長期生着を可能にする。
【０１８９】
ｂ．ＴＧＦβシグナル伝達経路
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、ＨＳＣの休眠および冬眠を調節する造血幹／前駆細胞ニッチ中に存在する成長因子である（Ｙａｍｚａｋｉ，２００９，Ｂｌｏｏｄ，１１３：１２５０−１２５５）。ＴＧＦβは、骨髄中の血管近傍の非髄鞘形成シュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞によって産生され（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ，１４７：１１４６−１１５８）、これは、ＨＳＣ休眠の調節が、血管（内皮）ニッチ内で起こることを示している。ゼブラフィッシュ胚をＴＧＦβシグナル伝達の小分子阻害剤（ＳＢ４３１５４２）で処理すると、血管周囲ニッチ内のＨＳＣ増殖を促進することが判明している（Ｔａｍｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１６０：２４１−２５２）。従って、中和抗体または小分子阻害剤、例えば、ＳＢ４３１５４２でＴＧＦβシグナル伝達をブロックすることは、外来核酸、例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡへの曝露時に、幹細胞、例えば、ＨＳＣの増殖能力を維持するための戦略である。あるいは、外来核酸への短時間の曝露による細胞死を阻止するために、遺伝毒性ストレスへの曝露直後の幹細胞（例えば、ＨＳＣ）とＴＧＦβの接触によって、ストレス幹細胞を強制的に冬眠させることができる。
【０１９０】
一実施形態では、幹細胞を１つまたは複数のＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターと接触させる。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦβリガンドである。別の実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦβシグナル伝達アンタゴニスト、例えば、ＳＢ４３１５２または抗ＴＧＦβＲ抗体である）。幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触中、および／または接触後に、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターと接触させる。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＲＮＡｉ剤、オリゴヌクレオチド、抗体、またはＴＧＦβ経路特異的ｇＲＮＡと組み合わせたアクチベーター／レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターと幹細胞を接触させることにより、細胞生存能力を維持すると共に限定的な幹細胞増殖を支持するために、細胞周期へのまたは細胞周期からの幹細胞の入退出を調節することができると考えられる。
【０１９１】
ｃ．ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体
ＣＸＣＲ４は、リンパ球およびＨＳＣの細胞表面上に存在するケモカイン受容体である。間質由来因子−１（ＳＤＦ１またはＣＸＣＬ１２）は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンドであり、骨髄中および他の組織中の細胞により産生される。細胞は、ケモカイン勾配に沿って下方に遊走するため、ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４シグナル伝達軸は、骨髄中のＨＳＣ局在化および保持、ならびに末梢血および他の組織中への遊走を調節する。ＳＤＦ１／ＣＸＲ４ケモカイン軸を利用するＨＳＣの遊走を調節するための小分子が開発されている。例えば、ｄｍＰＧＥ２の使用は、ＣＸＣＲ４の発現を上方制御して、移植時に骨髄への臍帯血細胞のホーミングおよび保持を増大する（Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｌｏｏｄ，１２２（１７）：３０７４−３０８１）。別の例として、プレリキシフロル（ＡＭＤ３１００）、すなわち、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ１の結合を破断するＣＸＣＲ４アンタゴニストは、同種異系またはオートロガス移植における収集および使用のために、骨髄から血液へのＨＳＣの動員を促進する。ＣＸＣＲ４シグナル伝達が細胞周期進行および生存に特定の役割を果たすとすれば、幹細胞におけるＣＸＣＲ４シグナル伝達の例えば生体外での操作を用いて、幹細胞死（例えば、アポトーシス）を阻止すると共に、細胞周期進行および増殖を調節することができる。
【０１９２】
一実施形態では、幹細胞をＣＸＣＲ４モジュレーターと接触させる。一実施形態では、ＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４アゴニスト、例えば、ｄｍＰＧＥ２である。別の実施形態では、ＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えば、プレリキシフロル（ＡＭＤ３１００）である。幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触中、および／または接触後に、ＣＸＣＲ４モジュレーターと接触させる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、幹細胞をＣＸＣＲ４モジュレーターと接触させることによって、幹細胞の自己再生、複能性、または増殖能力を維持することができると考えられる。
【０１９３】
ｄ．Ｗｎｔシグナル伝達経路
標準Ｗｎｔ経路阻害剤ＤＫＫ１の過剰発現は、生体内での造血再構成を低減することができる（Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２（３）：２７４−２８３）。標準ＷｎｔリガンドＷｎｔ３ａの欠失は、ＨＳＣの自己再生および再構成能も低減することができる。これらの知見は、ＨＳＣ自己再生および維持における標準Ｗｎｔシグナル伝達の特定の役割を示すものである。反対に、非標準的Ｗｎｔシグナル伝達（例えば、Ｗｎｔ５ａリガンド）は、ＨＳＣにおける標準Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、ＨＳＣの生体外増殖をブロックすると共に、再増殖能を増大することができる（Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０４（３９）：１５４３６−４１）。
【０１９４】
特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣは、非標準Ｗｎｔ受容体を発現する。Ｗｎｔリガンドと非標準Ｗｎｔ受容体の結合（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ８［Ｆｚｄ８］）は、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の核内因子の核局在化を阻止し、これによって、インターフェロン発現を阻止すると共に、ＨＳＣ休眠を維持する（Ｓｕｇｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ，１５０（２）：３５１−３６５）。ウイルス、外来核酸もしくはタンパク質、酸素圧の摂動（例えば、高酸素もしくは低酸素条件での細胞の培養）または電界への細胞の曝露（例えば、外来核酸もしくはタンパク質を送達するための細胞の電気穿孔）に関連するストレスは、非標準Ｗｎｔシグナル伝達（細胞の活性化を阻止すると共に、自己再生を維持する）と標準Ｗｎｔシグナル伝達（細胞を活性化すると共に、消耗を招き得る細胞増殖を誘導する）との間の均衡を改変し得る。特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣは、Ｗｎｔシグナル伝達に対して高度に感受性であり得る。
【０１９５】
従って、Ｗｎｔリガンドの注意深い滴定を用いて、特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣを維持すると共に、例えば、電気穿孔またはウイルスによって送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触時に起こり得るストレス応答を阻止することができる。
【０１９６】
一実施形態では、幹細胞をＷｎｔシグナル伝達の１つまたは複数のモジュレーターと接触させる。一実施形態では、幹細胞を標準Ｗｎｔリガンドと接触させる。別の実施形態では、幹細胞を非標準Ｗｎｔリガンドと接触させる。また別の実施形態では、幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤と接触させる。Ｗｎｔシグナル伝達経路の例示的な阻害剤として、限定はしないが、特定のＷｎｔ受容体に対する中和抗体、または限定はしないが、ＮＦＡＴおよびＩＦＮγ）をはじめとするＷｎｔシグナル伝達の下流標的に対するＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触中、および／または接触後に、Ｗｎｔシグナル伝達モジュレーターと接触させる。
【０１９７】
プログラム細胞死の阻害剤
幹細胞を取得、作製、および／または単離した後、但しＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素（例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸）と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数の細胞死の阻害剤を含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、１つまたは複数の細胞死の阻害剤を含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
【０１９８】
一実施形態では、幹細胞は、分子との接触前に、例えば、培地中で、プログラム細胞死または老化を阻害する分子とさらに接触させる。一実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート分子との接触前２４時間以内（例えば、１２時間もしくは６時間以内）に、化合物と接触させる。別の実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート分子との接触後２４時間以内（例えば、１２時間もしくは６時間以内）に、化合物と接触させる。別の実施形態では、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート分子との接触前２４時間以内（例えば、１２時間もしくは６時間以内）ならびに接触後２４時間以内（例えば、１２時間もしくは６時間以内）に、化合物と接触させる。一実施形態では、プログラム細胞死または老化を阻害する化合物による幹細胞の短時間の前処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触前）ならびに後処理（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触後）によって、例えば、オートファジー、アポトーシス、および老化をはじめとするプログラム細胞死の一時的阻害により、外来核酸への曝露時の幹細胞の生存または増殖能を増大することができる。
【０１９９】
一実施形態では、幹細胞は、プログラム細胞死もしくは老化に関連する標的遺伝子を調節するために、例えば転写レプレッサーまたは転写アクチベーター（例えば、ＫＲＡＢ）に融合したｅｉＣａｓ９分子を含むか、またはこれと接触させる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば、ｅｉＣａｓ９分子によるプログラム細胞死または老化に関連する標的遺伝子の調節によって、複能性を喪失することなく、細胞寿命、生存能力、増殖を向上させると共に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への短時間の曝露時に、細胞適合性を維持することができる。
【０２００】
一実施形態では、例えば、遺伝子編集および生存を増大する；細胞死（例えば、アポトーシス、オートファジーもしくは壊死）を低減する、または生着を増大するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触の最大１２０時間（例えば、最大９６、７２、６０、４８、３６、もしくは２４時間）前、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素との接触の最大７２時間後に、サイトカインおよび／またはシグナル伝達アクチベーターもしくはレプレッサーと一緒に、幹細胞生存能力エンハンサーの組み合わせと、幹細胞を接触させる。一実施形態では、本明細書に開示されるサイトカインもしくは小分子の１つと直接接触させるのではなく、前記サイトカインもしくは小分子のコグネイト受容体、例えば、表３に記載される受容体に結合する阻害剤（例えば、抗体）と幹細胞を接触させる。
【０２０１】
【表６】
2018519801.tif 000007
【０２０２】
切断型細胞表面抗原の導入
細胞表面抗原または選択マーカーを発現する修飾幹細胞の精製は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸が、細胞に、例えば、生体外で送達されたことを保証する手段を提供し得る。また、標的化細胞による細胞表面抗原の発現は、修飾幹細胞を生体内で追跡することも可能にする。
【０２０３】
一実施形態では、幹細胞は、細胞表面抗原または選択マーカーをコードする遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、細胞表面抗原または選択マーカーは、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）である。別の実施形態では、細胞表面抗原または選択マーカーは、切断型ＣＤ２０（ｔＣＤ２０）である。完全長細胞表面受容体ＣＤ１９およびＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に自然に発現される。ＣＤ１９またはＣＤ２０の切断は、細胞質ドメインが除去されていることから、受容体を介した細胞内シグナル伝達を妨げる（Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１３（８）：９１３−２４）。ＣＤ１９またはＣＤ２０の細胞外ドメインの発現は、細胞上での選別と、生体内で細胞の追跡を可能にし得る（例えば、遺伝子編集細胞の生着をモニターするために、採血し、抗ヒトＣＤ１９または抗ヒトＣＤ２０抗体で細胞を染色することにより）。一実施形態では、ｔＣＤ１９またはｔＣＤ２０トランスジーンを供与体テンプレート核酸として送達する。一実施形態では、トランスジーンが組み込まれる領域からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と幹細胞を接触させる。一実施形態では、ｔＣＤ１９またはｔＣＤ２０トランスジーンは、ゲノム中に、例えばセーフ・ハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、切断型ＣＤ１９またはＣＤ２０細胞表面抗原の導入もしくは同時導入（マルチプレックスゲノム編集）を用いて、ゲノム編集細胞を生体外で精製するか、またはゲノム編集細胞を生体内でモニターすることができると考えらる。
【０２０４】
化学療法耐性トランスジーンまたは自殺遺伝子の導入
本明細書に記載される方法は、所望の特性を有する修飾幹細胞を選択もしくは拡大することができるか、または不要な特性（例えば、白血病性形質転換）を有する修飾幹細胞を排除することができるように、幹細胞の調節を生体内または生体外で可能にする。
【０２０５】
一実施形態では、幹細胞は、例えば、生体外もしくは生体内での所望の幹細胞の選択、または例えば、生体外もしくは生体内での不要な幹細胞の排除を可能にするセイフティ・スイッチを含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、セイフティ・スイッチは、自殺遺伝子および／または化学療法選択マーカーをコードする遺伝子を含有する。例えば、幹細胞は、下記の２つの構成要素を含むセイフティ・スイッチを含有することができる：１）ゲノム編集細胞を生体外で選別するために用いることができ、細胞を生体内で追跡するために用いることができ、さらに、リツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体療法薬）の患者への投与により生体内で白血病性形質転換が起こった場合に、細胞を排除するためにも用いることができる、切断型細胞表面抗原（ｔＣＤ２０）および誘導性自殺遺伝子；ならびに２）アルキル化化学療法薬（Ｏ６−ベンジルグアニン［Ｏ６ＢＧ］およびＢＣＮＵ）による患者の治療時に、非編集細胞の除去によってゲノム編集細胞を生体内で選択し、これにより、ゲノム編集細胞を含む骨髄の生体内での再増殖を増大する、薬物誘導性化学療法耐性遺伝子（例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型［Ｐ１４０Ｋ  ＭＧＭＴ］）。
【０２０６】
一実施形態では、幹細胞は、自殺遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）をコードする。一実施形態では、幹細胞は、二量体化の化学誘導剤、例えば、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８とさらに接触させる。理論による拘束は望まないが、カスパーゼ−９は、二量体化の化学誘導剤による治療時に、アポトーシスを誘導すると考えられる（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｅｄ，３６５：１６７３−１６８３）。別の実施形態では、自殺遺伝子は、切断型ＣＤ２０（ｔＣＤ２０）をコードする。一実施形態では、幹細胞は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブとさらに接触させる。理論による拘束は望まないが、抗ＣＤ２０抗体は、免疫応答を誘導して、ＣＤ２０を発現する細胞死を引き起こすことができると考えられる（Ｒｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｓ０１６１−５８９０（１５）：００３６１−２）。
【０２０７】
一実施形態では、幹細胞は、化学療法選択マーカーをコードする遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、化学療法選択マーカーは、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼの変異型（例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型）である。一実施形態では、幹細胞は、化学療法薬、例えば、Ｏ６ＢＧ／ＢＣＮＵとさらに接触させる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、Ｏ６ＢＧ／ＢＣＮＵ化学療法と組み合わせたメチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型の使用は、レンチウイルス形質導入による送達後に、骨髄中の遺伝子修飾造血幹／前駆細胞のレベルを増加する上で有効であると考えられる（Ｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９（８）：１５２３−９；Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２０（７）：２３４５−５４）。
【０２０８】
一実施形態では、トランスジーンは、供与体テンプレート核酸上に提供されるか、または供与体テンプレート核酸として送達される。一実施形態では、トランスジーンが組み込まれる領域からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と幹細胞を接触させる。一実施形態では、トランスジーンは、ゲノム中に、例えばセーフ・ハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。一実施形態では、トランスジーンは、ｔＣＤ２０−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ２シストロン性トランスジーンカセットを含む。
【０２０９】
幹細胞の培養
本明細書に記載されるように、幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触後、またはその両方のいずれかに培養することができる。一実施形態では、幹細胞は、内皮細胞、例えば、ヒト内皮細胞（例えば、ＶｅｒａＶｅｃ（商標）、血管周囲内皮、またはその他の内皮細胞）と共培養する。別の実施形態では、幹細胞は、間葉系間質細胞、例えば、ヒト間葉系間質細胞と共培養する。一実施形態では、内皮または間葉系共培養細胞は、幹細胞のＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＴＧＦβ、および／またはＣＸＣＲ４シグナル伝達を活性化または抑制する１つまたは複数の膜結合リガンドを発現するように遺伝子修飾されている。一実施形態では、幹細胞は、２−Ｄ培養システム中に培養する。別の実施形態では、幹細胞は、３−Ｄ培養システム中に培養する。例えば、幹細胞は、幹または前駆細胞、例えば、ＨＳＣを培養するために設計されたシステム（例えば、ＮＡＮＥＸ（商標）拡大プレート、ＡＫ−ポリファイバー）中に培養することができる。一実施形態では、幹細胞は、例えば、細胞培養容器を低酸素チャンバー内に配置することにより、低酸素増殖条件下で培養する。例えば、低酸素チャンバーの酸素圧は、１０％〜０．１％のＯ２、例えば５％〜０．５％のＯ２、例えば１０％以下、８％以下、５％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、または０．２％以下のＯ２の範囲であってよい。一実施形態では、幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間培養する。一実施形態では、幹細胞は、移植前に、内皮または間質支持細胞から精製する。
【０２１０】
ｇＲＮＡ分子およびテンプレート分子の修飾
ウイルス−宿主共進化の間に、ｍＲＮＡのキャッピングを模倣するウイルスＲＮＡキャッピングは進化して、ウイルスＲＮＡが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした（例えば、Ｄｅｌｃｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５１−６５を参照のこと）。幹細胞（例えば、ＨＳＣ）内のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖ＲＮＡの存在を感知する（Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ（２０１５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２６：２０１−９）。初期実験の結果から、ＧＦＰｍＲＮＡ単独で電気穿孔された細胞と比較して、非修飾（例えば、５’キャップもしくは３’ポリＡ−テールなしで合成されたｇＲＮＡ）ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９ｍＲＮＡと共に電気穿孔されたヒトＨＳＣは、細胞寿命、増殖能、または複能性の低減（例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化能）を招くことが立証された。細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の幹細胞感知および自然免疫応答の誘導、ならびにこれに続くプログラム細胞死の誘導および増殖および分化能の喪失によるものであった可能性がある。外来核酸に対する細胞の自然免疫応答を回避するために、ｍＲＮＡを模倣するようにｇＲＮＡ分子を修飾すること（例えば、５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加）によって、細胞における自然免疫応答、細胞におけるインターフェロン応答、細胞老化、または外来核酸の感知に関連するプログラム細胞死を阻止することができる。
【０２１１】
「修飾ｇＲＮＡ分子」または「修飾ｇＲＮＡ」は、本明細書の用法では、細胞に導入された後の非修飾ｇＲＮＡ分子と比較して、細胞に導入された後、向上した半減期を有するｇＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露された（例えば、電気穿孔された）とき、細胞において自然免疫応答を活性化しない。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞が、非修飾ｇＲＮＡに曝露されたときの同型の細胞における自然免疫応答と比較して、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、細胞において低い自然免疫応答を活性化する。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡに曝露されたとき、細胞において、プログラム細胞死経路（例えば、アポトーシス細胞死経路、壊死細胞死経路（例えば、壊死細胞死経路）、オートファジー細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、フェロトーシス細胞死経路、エリプトーシス細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、またはアノイキス細胞死経路）を活性化しない。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ依存的細胞死経路を活性化しない。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ非依存的細胞死経路を活性化しない。
【０２１２】
一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端修飾を含む。一実施形態では、５’末端修飾は、以下：Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される。一実施形態では、５’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端修飾を含む。一実施形態では、３’末端修飾は、ポリアデニンテールである。一実施形態では、３’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。
【０２１３】
一実施形態では、幹細胞は、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ分子と接触させる。一実施形態では、本明細書でｇＲＮＡ分子を指すために使用される場合、用語「キャップ付加」は、５’末端キャップ構造を有するｇＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、５−末端キャップ構造は、以下：Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される。一実施形態では、本明細書でｇＲＮＡ分子を指すために使用される場合、用語「テール付加」は、３’末端修飾を有するｇＲＮＡ指す。一実施形態では、３’末端修飾は、ポリアデニンテールである。一実施形態では、３’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’ポリ−アデニンテールを含む。特定の実施形態では、前記ポリ−アデニンテールは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０アデニン残基長またはそれ以上である。一実施形態では、幹細胞は、キャプおよびテール付加ｇＲＮＡ分子を含有するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ分子と幹細胞を接触させると、修飾幹細胞の生存を増大し、幹細胞複能性もしくは生存能力を維持し、細胞生着を増大するか、または細胞老化およびプログラム細胞死を阻害することができると考えられる。
【０２１４】
一実施形態では、幹細胞は、供与体テンプレート核酸とさらに接触させる。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。理論による拘束は望まないが、前述した修飾ｇＲＮＡ分子と同様に、外来核酸に対する細胞の自然免疫応答を回避するために、５’末端修飾、３’末端修飾、または５’末端修飾と３’末端修飾の両方を含むように供与体テンプレート核酸を修飾することにより、細胞における自然免疫応答、細胞におけるインターフェロン応答、細胞老化、または外来核酸の感知に関連するプログラム細胞死を阻止することもできる。いくつかの実施形態では、供与体テンプレート核酸は、５’−ホスホロチオエート修飾を含む。いくつかの実施形態では、供与体テンプレート核酸は、３’−ホスホロチオエート修飾を含む。いくつかの実施形態では、供与体テンプレート核酸は、５’−ホスホロチオエート修飾と３’−ホスホロチオエート修飾の両方を含む。
【０２１５】
疾患を治療または予防する方法
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患を治療または予防する治療法、例えば、１回療法または複数回投与療法を提供する。一部の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、細胞、例えば、本明細書に記載される細胞を例えば、生体外または生体内で改変する。疾患に関連するあらゆる型の細胞を本明細書に記載の方法で改変することができる。例えば、細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞である。別の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子を、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集によって改変する。細胞または遺伝子の改変（例えば、修正、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、または活性化）は、疾患の発症前または疾患の発症後に実施することができる。本明細書に記載される方法により治療または予防することができる例示的な疾患として、限定はしないが、表４に列記する疾患が挙げられる。本明細書に記載される方法により改変することができる例示的な遺伝子として、限定はしないが、表４に列記する遺伝子が挙げられる。
【０２１６】
一実施形態では、遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介方法、あるいは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、レンチウイルスベクター、もしくはアデノ関連ウイルスベクターをはじめとするいずれか他のノックインまたは遺伝子送達方法を用いて、幹細胞中のセーフ・ハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座）、例えば、ＨＳＣにノックインする。
【０２１７】
一実施形態では、遺伝子は、分泌された可溶性タンパク質をコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、分泌された可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子のノックインを用いて、表４に列記する疾患をはじめとする疾患、例えば、リソソーム蓄積症、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、またはタンパク質の分泌が疾患を改善するいずれかの疾患を治療または治癒することができると考えられる。一実施形態では、疾患は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）である。別の実施形態では、疾患は、βサラセミアである。
【０２１８】
一実施形態では、疾患は、循環血液タンパク質の欠乏に関連する。例示的な疾患として、限定はしないが、血友病（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）、Ａ１ＡＴ欠乏症、またはライソゾーム酸性リパーゼ欠損症が挙げられる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、欠乏に関連する分泌可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、タンパク質の循環血液レベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、疾患は、血友病、例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂである。一実施形態では、遺伝子は、凝固因子ＶＩＩＩをコードするＦ８遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｆ８遺伝子をノックインするステップを含み、これによって血友病Ａを治療または治癒する。別の実施形態では、遺伝子は、凝固因子ＩＸをコードするＦ９遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｆ９遺伝子をノックインするステップを含み、これによって血友病Ｂを治療または治癒する。一実施形態では、疾患は、Ａ１ＡＴ欠乏症である。一実施形態では、遺伝子は、α−１−抗トリプシンをコードするＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子をノックインするステップを含み、これによってＡ１ＡＴ欠乏症を治療または予防する。一実施形態では、疾患は、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症である。一実施形態では、遺伝子は、ライソゾーム酸性リパーゼをコードするＬＡＬ遺伝子であり、これによってライソゾーム酸性リパーゼ欠損症を治療または予防する。
【０２１９】
一実施形態では、疾患は、糖尿病である。一実施形態では、遺伝子は、分泌された可溶性血液タンパク質をコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、分泌された可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子のノックインにより、このタンパク質の循環血液レベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、タンパク質インスリンをコードするＩＮＳ遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、タンパク質グルカゴンをコードするＧＣＧ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、ＩＮＳ遺伝子またはＧＣＧ遺伝子をノックインするステップを含み、これによって糖尿病を治療または予防する。
【０２２０】
一実施形態では、疾患は、成長ホルモン欠乏症である。一実施形態では、遺伝子は、成長ホルモンをコードするＧＨ遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下での、ＧＨ遺伝子のノックインにより、循環成長ホルモンレベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、本方法は、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、ＧＨ遺伝子をノックインするステップを含み、これによって成長ホルモン欠乏症を治療または予防する。
【０２２１】
一実施形態では、疾患は、がん、例えば、血液のがんである。一実施形態では、遺伝子は、がんにおいて過剰発現される遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子のノックダウンが、疾患を改善または治癒すると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＧＦＲ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、がんの進行および転移を治療または予防する。
【０２２２】
一実施形態では、疾患は、遺伝性血液浮腫である。一実施形態では、遺伝子は、遺伝性血液浮腫において低発現される遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒すると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、Ｃ１ＩＮＨ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｃ１ＩＮＨ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、血液浮腫を治療または予防する。
【０２２３】
一実施形態では、疾患は、フォン・ヴィレブランド病である。一実施形態では、遺伝子は、フォン・ヴィレブランド病において低発現される。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒すると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＶＷＦ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＶＷＦ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、フォン・ヴィレブランド病を治療または予防する。
【０２２４】
一実施形態では、疾患は、遺伝性または後天性貧血である。一実施形態では、遺伝子は、遺伝性または後天性貧血において低発現される遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒すると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯ遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、遺伝性または後天性貧血を治療または予防する。
【０２２５】
一実施形態では、疾患は、好中球減少症である。一実施形態では、遺伝子は、好中球減少症において低発現される遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＣＳＦ２遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＣＳＦ２遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、好中球減少症を治療または予防する。
【０２２６】
一実施形態では、疾患は、成長障害である。一実施形態では、遺伝子は、成長障害において低発現される遺伝子である。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＧＨ１である。一実施形態では、本方法は、ＧＨ１遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、成長障害を治療または予防する。
【０２２７】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子（例えば、誘導性ｅｉＣａｓ９分子）により、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子を一時的もしくは持続的に下方制御または阻害することによって、疾患が改善または治癒されることができると考えられる。一実施形態では、疾患は、血液のがんである。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯＲ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって血液のがんを治療または予防する。一実施形態では、疾患は、関節リウマチである。一実施形態では、遺伝子は、ＴＮＦ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＴＮＦ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって関節リウマチを治療または予防する。一実施形態では、疾患は、炎症性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、Ｃ５遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｃ５遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって炎症性疾患を治療または予防する。
【０２２８】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子（例えば、誘導性ｅｉＣａｓ９分子）により、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子を一時的もしくは持続的に上方制御または活性化することによって、疾患が改善または治癒されることができると考えられる。一実施形態では、疾患は、多発性硬化症である。一実施形態では、遺伝子は、ＩＦＮＢ１遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＩＦＮＢ１遺伝子を活性化するステップを含み、これによって多発性硬化症を治療または予防する。
【０２２９】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質受容体をコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子による、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子のノックアウトが、疾患を改善または治癒すると考えられる。一実施形態では、疾患は、ＨＩＶまたはＡＩＤＳである。一実施形態では、遺伝子はＣＣＲ５である。別の実施形態では、遺伝子は、ＣＸＣＲ４遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、または両方のノックアウトを含み、これによってＨＩＶまたはＡＩＤＳを治療または予防する。
【０２３０】
一実施形態では、疾患は、発作または心筋梗塞である。一実施形態では、遺伝子は、可溶性血液タンパク質、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータまたは尿プラスミノーゲンアクチベータをコードする。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば、転写に融合したｅｉＣａｓ９分子による、例えば、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または予防することができる、例えば、虚血を予防する、または血餅を溶解させると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＰＬＡＴ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＰＬＡＴ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって発作または心筋梗塞を治療または予防する。
【０２３１】
一実施形態では、疾患は、異常ヘモグロビン症である。一実施形態では、遺伝子は、異常ヘモグロビン症を引き起こす突然変異を含む。一実施形態では、遺伝子は、異常ヘモグロビン症を引き起こす突然変異を含まない。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックアウトまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、突然変異を含む遺伝子は、ＨＢＢ、ＨＢＡ１またはＨＢＡ２である。一実施形態では、本方法は、突然変異したＨＢＢ、ＨＢＡ１またはＨＢＡ２遺伝子を修正するステップを含み、これによって鎌状赤血球症、αサラセミア、またはβサラセミアを治療または予防する。一実施形態では、遺伝子は、ＢＣＬ１１Ａである。一実施形態では、本方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックアウトを含み、これによって鎌状赤血球症またはβサラセミアを治療または予防する。
【０２３２】
一実施形態では、疾患は、貧血である。一実施形態では、遺伝子は、例えば赤血球ピルビン酸キナーゼ欠乏による貧血、例えば、溶血性貧血を引き起こす突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正により貧血を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＰＫＬＲである。一実施形態では、本方法は、野生型ＰＫＬＲ遺伝子中のノックインを修正するステップまたは突然変異ＰＫＬＲ遺伝子を修正するステップを含み、これによって、貧血、例えば、溶血性貧血を治療または予防する。
【０２３３】
一実施形態では、疾患は、凝固因子障害、例えば、血友病Ａである。一実施形態では、遺伝子は、凝固因子障害を引き起こす突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子の修正が、凝固因子障害を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、Ｆ８である。一実施形態では、本方法は、突然変異Ｆ８遺伝子を修正するステップを含み、これによって血友病Ａを治療または予防する。
【０２３４】
一実施形態では、疾患は、代謝障害、例えば、ムコ多糖症Ｉ型である。一実施形態では、遺伝子は、代謝障害を引き起こす突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって代謝障害を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＩＤＵＡ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＩＤＵＡ遺伝子におけるノックインまたは突然変異ＩＤＵＡ遺伝子の修正を含み、これによってムコ多糖症Ｉ型を治療または予防する。
【０２３５】
一実施形態では、疾患は、免疫不全、例えば、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症である。一実施形態では、遺伝子は、免疫不全を引き起こす突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＩＬ２ＲＧ遺伝子のノックインまたは突然変異ＩＬ２ＲＧ遺伝子の修正を含み、これによってＸ連鎖重症複合免疫不全症を治療または予防する。
【０２３６】
一実施形態では、疾患は、骨髄性免疫不全、例えば、慢性肉芽腫性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、骨髄性免疫不全を引き起こす突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＮＣＦ１遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＮＣＦ１遺伝子のノックインまたは突然変異ＮＣＦ１遺伝子の修正を含み、これによって慢性肉芽腫性疾患を治療または予防する。
【０２３７】
一実施形態では、疾患は、βリンパ系または免疫グロブリン欠損症、例えば、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症である。一実施形態では、遺伝子は、βリンパ系または免疫グロブリン欠損症に関連する突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、遺伝子のノックインまたは修正が、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＢＴＫ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＢＴＫ遺伝子のノックインまたは突然変異ＢＴＫ遺伝子の修正を含み、これによってＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療または予防する。
【０２３８】
一実施形態では、疾患は、血球減少症、例えば、先天性無巨核球性血小板減少症Ｉ型である。一実施形態では、遺伝子は、血球減少症に関連する突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正により、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＭＰＬ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＭＰＬ遺伝子のノックインまたは突然変異ＭＰＬ遺伝子の修正を含み、これによって先天性無巨核球性血小板減少症Ｉ型を治療または予防する。
【０２３９】
一実施形態では、疾患は、代謝障害、酵素欠乏、輸送障害、または蓄積症、例えば、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型である。一実施形態では、遺伝子は、代謝障害、酵素欠乏、輸送障害、または蓄積症に関連する突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＳＧＳＨ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＳＧＳＨ遺伝子のノックインまたは突然変異ＳＧＳＨ遺伝子の修正を含み、これによってムコ多糖症ＩＩＩＡ型を治療または予防する。
【０２４０】
一実施形態では、疾患は、赤血球系疾患、例えば、原発性家族性先天性赤血球増加症である。一実施形態では、遺伝子は、赤血球系疾患に関連する突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、一時的または持続的のいずれかで、ＥＰＯＲ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって原発性家族性先天性赤血球増加症を治療または予防する。
【０２４１】
一実施形態では、疾患は、赤血球系疾患、例えば、原発性家族性先天性赤血球増加症である。一実施形態では、遺伝子は、赤血球系疾患に関連する突然変異を含む。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯＲ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするステップを含み、これによって原発性家族性先天性赤血球増加症を治療または予防する。
【０２４２】
表４は、本明細書に記載の方法によって治療または予防することができる例示的な疾患と、本明細書に記載の方法によって改変することができる例示的な遺伝子を記載する。
【０２４３】
【表７】
2018519801.tif 000008
【０２４４】
【表８】
2018519801.tif 000009
【０２４５】
【表９】
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【０２４６】
【表１０】
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【０２４７】
【表１１】
2018519801.tif 000012
【０２４８】
【表１２】
2018519801.tif 000013
【０２４９】
【表１３】
2018519801.tif 000014
【０２５０】
【表１４】
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【０２５１】
【表１５】
2018519801.tif 000016
【０２５２】
一実施形態では、治療は、疾患発症後の対象において開始される。一実施形態では、治療は、疾患の発症後であるが、例えば、疾患の進行を予防するために、疾患進行過程の早期に（例えば、特定症状の発生前に）対象において開始される。一実施形態では、本方法は、例えば、疾患の進行を遅らせるために、疾患の進行期に対象の治療を開始することを含む。
【０２５３】
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の疾患を有する対象を治療するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載の疾患の発症または進行を予防するか、または遅らせるために使用される。
【０２５４】
一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の修飾細胞の生存に対する選択的有利性をもたらす。一実施形態では、幹細胞は、修飾されて、遺伝子ノックアウト、ノックイン、ノックダウンまたは修正を有する。修飾されない疾患細胞は、アポトーシスを被り得る。このように、一実施形態では、本明細書に記載の治療後に、修飾細胞は生存するが、非修飾細胞は死滅する。この選択的有利性は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の修飾細胞を含む細胞の最終的なコロニー形成を駆動することができる。
【０２５５】
一実施形態では、本方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子に突然変異を見出す遺伝子検査を受ける対象において治療を開始するステップを含む。
【０２５６】
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の疾患についての検査結果が陽性である対象において治療を開始するステップを含む。
【０２５７】
一実施形態では、本方法は、疾患の症状もしくは兆候のいずれかを示す疾患の家族歴を有する、および／または疾患に関連する遺伝子に突然変異を有することが判明した対象において治療を開始するステップを含む。
【０２５８】
一実施形態では、本方法は、疾患と一致するか、または疾患に関連する症状が現れた対象を治療するステップを含む。
【０２５９】
一実施形態では、本方法は、対象から細胞を単離するステップを含む。一実施形態では、細胞を生体外で改変した後、対象に戻す（例えば、移植する）。一実施形態では、対象は、細胞を単離した者と同じ対象である。別の実施形態では、対象は、細胞を単離した者とは異なる対象である。一実施形態では、オートロガス幹／前駆細胞を生体外で改変した後、対象に戻す。別の実施形態では、異種幹／前駆細胞を生体外で改変した後、対象に戻す。
【０２６０】
一実施形態では、治療は、本明細書に記載の細胞へのｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、および任意選択的に、供与体テンプレート核酸の送達を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸は、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター、例えばインテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ）によって送達される。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子リボ核タンパク質複合体として送達される。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、ＲＮＡとして送達される。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的遺伝子の少なくとも１つのエキソンを含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、疾患に関連する突然変異を含まない。一実施形態では、テンプレート核酸は、プロモーター配列を含む。別の実施形態では、テンプレート核酸は、プロモーター配列を含まない。一実施形態では、テンプレート核酸は、スプライスドナーまたはアクセプターを含む。別の実施形態では、テンプレート核酸は、ポリアデニル化シグナルを含む。
【０２６１】
遺伝子の突然変異を修復する方法
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置（例えば、標的突然変異位置）を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、ＨＤＲにより、遺伝子における１つまたは複数の突然変異を修復（例えば、修正）することによって達成することができる。この手法では、突然変異対立遺伝子を修正して、野生型の状態に戻す。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子における突然変異の修正が、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
【０２６２】
遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置（例えば、標的ノックアウト位置または標的ノックダウン位置）を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、以下：（１）遺伝子のノックアウト：（ａ）遺伝子の初期コード領域近傍もしくは初期コード領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性挿入もしくは欠失）、または（ｂ）上記遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性欠失）によって、あるいは（２）遺伝子のプロモーター領域の標的化により、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写レプレッサーに融合した）で媒介される遺伝子をノックダウンすることによって達成することができる。
【０２６３】
全ての手法が、遺伝子の改変をもたらす。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
【０２６４】
遺伝子配列をノックインする方法
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置（例えば、標的ノックイン位置）を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、遺伝子配列、例えば本明細書に記載の遺伝子（例えば、本明細書に記載の遺伝子の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡ）を、例えばＨＤＲにより、ノックインすることによって達成することができる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子配列のノックインが、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
【０２６５】
遺伝子を活性化する方法
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子を活性化する方法が開示される。遺伝子の活性化は、遺伝子のプロモーター領域の標的化により、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写アクチベーターに融合した）により媒介され得る。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子の活性化が、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
【０２６６】
２つ以上の遺伝子の多重化改変
１つまたは複数の同じ細胞における２つ以上の遺伝子の改変は、本明細書では「多重化」と呼ぶ。多重化は、１つまたは複数の同じ細胞における少なくとも２つの遺伝子の修飾を構成する。
【０２６７】
例えば、２つ以上の遺伝子（例えば、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４）を改変のために標的化する場合、２つ以上の遺伝子（例えば、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４）は順次または同時に改変することができる。一実施形態では、ＣＸＣＲ４遺伝子の改変は、ＣＣＲ５遺伝子の改変前である。一実施形態では、ＣＸＣＲ４遺伝子の改変は、ＣＣＲ５遺伝子の改変と同時である。一実施形態では、ＣＸＣＲ４遺伝子の改変は、ＣＣＲ５遺伝子の改変に続いて実施する。一実施形態では、改変の効果は、相乗的である。一実施形態では、２つの標的位置を含むゲノム再編成（例えば、転位）を導入する可能性を低減するために、２つ以上の遺伝子（例えば、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４）を順次改変する。
【０２６８】
ＩＩ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
ｇＲＮＡ分子は、この用語の本明細書の用法では、標的核酸へのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の特異的ターゲティングまたはホーミングを促進する核酸である。ｇＲＮＡ分子は、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）（例えば、キメラもしくはモジュラー（２つ以上、典型的には２つの個別のＲＮＡ分子を含む）であってよい。本明細書で提供されるｇＲＮＡ分子は、標的ドメインと完全もしくは部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、第１の相補性ドメイン、結合ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、テールドメイン、および５’伸長ドメインをはじめとする１つまたは複数の追加ドメインをさらに含む。これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく述べる。ｇＲＮＡについてさらなる詳細は、国際公開第２０１５／０４８５７７号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に明示的に援用する）の「ｇＲＮＡ分子」と題するセクションＩに記載されている。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する天然に存在する配列と同一の、またはそれと配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、単分子、またはキメラ、ｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’の方向に以下：遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子中の標的ドメインと相補的な標的化ドメイン；第１の相補性ドメイン；結合ドメイン；第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインと相補的である）；隣接ドメイン；および任意選択的に、テールドメインを含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’の方向に以下：標的化ドメイン（遺伝子中の標的ドメインと相補的である；および第１の相補性ドメインを含む第１の鎖と；好ましくは５’から３’の方向に以下：任意選択的に、５’伸長ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；および任意選択的に、テールドメインを含む第２の鎖とを含む。
【０２７１】
これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく説明する。
【０２７２】
標的化ドメイン
標的化ドメイン（あるいは、ガイド配列または相補性領域と呼ばれることもある）は、標的核酸配列、例えば、標的遺伝子中の標的核酸配列と相補性な、または部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。標的化ドメインの全部もしくは一部が相補的であるか、または部分的に相補的である、標的遺伝子、例えば、ＨＢＢ中の核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ぶ。特定の実施形態では、標的ドメインは、標的遺伝子、例えば、ＨＢＢ内の標的位置を含む。他の実施形態では、標的位置は、標的ドメインの外部（すなわち、その上流もしくは下流）にある。特定の実施形態では、標的ドメインは、全体が標的遺伝子内に、例えば、コード領域、イントロン、またはエキソン内に位置する。他の実施形態では、標的ドメインの全部または一部は、標的遺伝子の外部、例えば、制御領域または非コード領域に位置する。
【０２７３】
標的化ドメインを選択する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｕ  ２０１４；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ２０１４を参照のこと）。
【０２７４】
標的ドメインを含む標的核酸の鎖は、それが標的化ドメイン配列と相補的であるため、本明細書では「相補鎖」と呼ばれる。標的化ドメインは、ｇＲＮＡ分子の一部であることから、これは、チミン（Ｔ）ではなく、塩基ウラシル（Ｕ）を含み；反対に、ｇＲＮＡ分子をコードするいずれのＤＮＡ分子も、ウラシルではなく、チミンを含むことになる。標的化ドメイン／標的ドメインペアでは、標的化ドメイン中のウラシル塩基は、標的ドメイン中のアデニン塩基と対合することになる。特定の実施形態では、標的化ドメインと標的ドメイン同士の相補性の程度は、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化することを可能にするのに十分なものである。
【０２７５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、コアドメインと任意選択の二次ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインの３’側に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’側またはその付近に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端の約８〜約１３ヌクレオチドから構成されるか、またはほぼこれらから構成される。特定の実施形態では、コアドメインだけが、標的ドメインの対応部分と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、二次ドメインも、標的ドメインの一部と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン中のコアドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であるのに対し、二次ドメインは、標的ドメイン中の二次ドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインは、標的ドメインのそれぞれの対応部分と同程度の相補性を有する。他の実施形態では、コアドメインとその標的同士の相補性の程度および二次ドメインとその標的同士の相補性の程度は異なっていてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインよりその標的に対する相補性の程度が高いのに対し、他の実施形態では、二次ドメインの方が、コアドメインより相補性の程度が高い。
【０２７６】
特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、または２０〜１００ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインまたはコアドメインは、３〜１５、３〜２０、５〜２０、１０〜２０、１５〜２０、５〜５０、または２０〜５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１０＋／−４、１０＋／−５、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、または１６＋／−２、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、あるいは、１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０２７７】
標的化ドメインがコアドメインを含む特定の実施形態では、コアドメインは、３〜２０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、５〜１５または８〜１３ヌクレオチド長である。標的化ドメインが二次ドメインを含む特定の実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。標的化ドメインが、８〜１３ヌクレオチド長のコアドメインを含む特定の実施形態では、標的化ドメインは、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６ヌクレオチド長であり、二次ドメインは、１３〜１８、１２〜１７、１１〜１６、１０〜１５、９〜１４、８〜１３、７〜１２、６〜１１、５〜１０、４〜９、または３〜８ヌクレオチド長である。
【０２７８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと完全に相補的である。同様に、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含む場合、特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと部分的に相補的であり、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含むこれらの実施形態のいくつかでは、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と部分的に相補的である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインの核酸配列、または標的化ドメイン内のコアドメインもしくは標的化ドメインは、標的ドメインまたは標的ドメインの対応部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と相補的ではない１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの１または複数個は、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインと相補的ではないその５’末端、３’末端、またはその５’末端と３’末端の両方の５ヌクレオチド内に１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない２個以上のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの２個以上は、互いに隣接しており、これらの実施形態のいくつかでは、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態では、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、いずれも、標的化ドメインの５’および３’末端から６ヌクレオチド以上に位置する。
【０２７９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、モジュラーｇＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子である。
【０２８０】
一実施形態では、核酸は、本明細書に記載される標的化ドメイン配列と同じか、または１、２、３、４、もしくは５個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、核酸は、本明細書に記載の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードする。
【０２８１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含む。
【０２８２】
特定の実施形態では、遺伝子と相補的な標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長以上である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。別の実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
【０２８３】
一実施形態では、核酸は、モジュラーｇＲＮＡ分子をコードし、例えば、１つまたは複数の核酸は、モジュラーｇＲＮＡ分子をコードする。別の実施形態では、核酸は、キメラｇＲＮＡ分子をコードする。核酸は、１６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、核酸は、１６ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。別の実施形態では、核酸は、１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。また別の実施形態では、核酸は、１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、１９ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。また別の実施形態では、核酸は、２０ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、２１ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。また別の実施形態では、核酸は、２２ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、２３ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。また別の実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。さらにまた別の実施形態では、核酸は、２６ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子をコードする。
【０２８４】
特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／もしくは二次ドメイン、またはそれらの中の１または複数個のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１または複数個のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化ドメインおよび／または標的化ドメインを含むｇＲＮＡを分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、それぞれの５’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾および／またはそれぞれの３’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０２８５】
標的化ドメインが、コアおよび二次ドメインを含む特定の実施形態では、コアおよび二次ドメインは、同じ数の修飾を含む。これらの実施形態のいくつかでは、いずれのドメインも修飾を含まない。他の実施形態では、コアドメインは、二次ドメインより多くの修飾を含むか、あるいは、その逆である。
【０２８６】
特定の実施形態では、コアまたは二次ドメイン内を含め、標的化ドメインにおける１または複数個のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、この効率は、以下に記載されるシステムを用いて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を備えた候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補標的化ドメインは、選択した標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０２８７】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの全部が、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８個以上のヌクレオチドが、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。
【０２８８】
第１および第２の相補性ドメイン
第１および第２の相補性（それぞれ、ｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列と呼ばれることもある）ドメインは、互いに完全または部分的に相補的である。特定の実施形態では、相補性の程度は、２つのドメインが少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメイン同士の相補性の程度は、ｇＲＮＡの他の特性と共に、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にする上で十分である。
【０２８９】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインとの相補性が不足した１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含む。例えば、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメイン中の対応ヌクレオチドと対合しない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、対応する相補性ドメインと相補的ではない第１または第２の相補性ドメイン上のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間に形成される二重鎖からループアウト（ｌｏｏｐ  ｏｕｔ）する。これらの実施形態のいくつかでは、不対ループアウトは、第２の相補性ドメイン上に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、不対領域は、第２の相補性ドメインの５’末端から、１、２、３、４、５、または６番目のヌクレオチドで開始する。
【０２９０】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインは、５〜３０、５〜２５、７〜２５、５〜２４、５〜２３、７〜２２、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、７〜１５、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第１の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、５〜２７、７〜２７、７〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、７〜２０、５〜２０、７〜１８、７〜１７、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第２の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、各々独立して、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２、２１＋／−２、２２＋／−２、２３＋／−２、または２４＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインよりも、例えば、２、３、４、５、または６個分長い。
【０２９１】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、第２の相補性ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインそれぞれ、と完全または部分的に相補的である。
【０２９２】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインは、４〜９ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’サブドメインは、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの５’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’ドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、または３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの３’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、３’サブドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの３’
サブドメインは、４〜９、例えば、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。
【０２９３】
第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、もしくは６個以下のヌクレオチドが異なる。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有し得る。
【０２９４】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインもしくはそれらの中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、第１および／もしくは第２の相補性ドメインならびに／または第１および／もしくは第２の相補性を含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に修飾を一切含まない。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインの一方または両方は、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０２９５】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムを用いて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補第１または第２の相補性ドメインを有するｇＲＮＡ分子は、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補相補性ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０２９６】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインによって形成される二重鎖領域は、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２塩基対長である（あらゆるループアウトまたは不対ヌクレオチドを除く）。
【０２９７】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１５の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２７のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１６の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２８のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、２１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２９のｇＲＮＡを参照のこと）。
【０２９８】
特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間で交換されて、ポリ−Ｕ配列が除去される。例えば、配列番号５のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と４８またはヌクレオチド２６と４５が交換されて、それぞれ、配列番号３０または３１のｇＲＮＡを生成することができる。同様に、配列番号２９のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と３９は、ヌクレオチド５０および６８と交換されて、配列番号３２のｇＲＮＡを生成することができる。
【０２９９】
連結ドメイン
単分子またはキメラｇＲＮＡ中では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインの間に配置されて、これらを結合する働きをする。特定の実施形態では、連結ドメインの一部は、ｃｒＲＮＡ由来領域から、別の部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域からのものである。
【０３００】
特定の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを共有結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、共有結合から構成されるか、またはこれを含む。他の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを非共有的に結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０以下のヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、連結ドメインは、１０を超えるヌクレオチド長、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、３０＋／−１０、４０＋／−５、４０＋／−１０、５０＋／−５、５０＋／−１０、６０＋／−５、６０＋／−１０、７０＋／−５、７０＋／−１０、８０＋／−５、８０＋／−１０、９０＋／−５、９０＋／−１０、１００＋／−５、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０３０１】
特定の実施形態では、連結ドメインは、天然起源の配列、例えば、第２の相補性ドメインの５’側にあるｔｒａｃｒＲＮＡの配列と相同性を共有するか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、本明細書に記載の連結ドメインと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、もしくは６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３０２】
特定の実施形態では、連結ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、連結ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾などの修飾を有する。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、連結ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、連結ドメインおよび／または連結ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、連結ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、連結ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３０３】
特定の実施形態では、連結ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムで候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補連結ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補連結ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３０４】
特定の実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補性ドメインの３’末端、および／または第２の相補性ドメインの５’末端に隣接するか、またはそれから１、２、または３ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含む。これらの実施形態のいくつかでは、連結領域の二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、または３０＋／−５塩基対の長さである。特定の実施形態では、連結ドメインの二重鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さである。特定の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列は、完全に相補的である。他の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列の一方または両方は、他方の二重鎖配列と相補的ではない１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド）を含む。
【０３０５】
５’伸長ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、５’伸長ドメイン、すなわち、第２の相補性ドメインの５’側に１つまたは複数の追加ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０以上、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
【０３０６】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、または以下に記載のその他の修飾で、修飾され得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、または以下に記載のその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位置での修飾）を含み得る。
【０３０７】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含み得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
【０３０８】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたクレオチドは、修飾されていない。
【０３０９】
５’伸長ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０３１０】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５’伸長ドメインと、本明細書に記載される５’伸長ドメインなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３１１】
隣接ドメイン
特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長である。
【０３１２】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、天然起源の隣接ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される隣接ドメイン、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の隣接ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３１３】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、隣接ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、隣接ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、隣接ドメインおよび／または隣接ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３１４】
特定の実施形態では、隣接ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムで候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補隣接ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３１５】
テールドメイン
多様なテールドメインが、本明細書に開示されるｇＲＮＡ分子での使用に好適である。
【０３１６】
特定の実施形態では、テールドメインは、存在しない。他の実施形態では、テールドメインは、１〜１００ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜５０、１０〜１００、２０〜１００、１０〜９０、２０〜９０、１０〜８０、２０〜８０、１０〜７０、２０〜７０、１０〜６０、２０〜６０、１０〜５０、２０〜５０、１０〜４０、２０〜４０、１０〜３０、２０〜３０、２０〜２５、１０〜２０、または１０〜１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、５＋／−５、１０＋／−５、２０＋／−５、２５＋／−１０、３０＋／−１０、３０＋／−５、４０＋／−１０、４０＋／−５、５０＋／−１０、５０＋／−５、６０＋／−１０、６０＋／−５、７０＋／−１０、７０＋／−５、８０＋／−１０、８０＋／−５、９０＋／−１０、９０＋／−５、１００＋／−１０または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０３１７】
特定の実施形態では、テールドメインは、天然起源のテールドメインもしくは天然起源のテールドメインの５’末端と相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される天然起源のテールドメイン、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）テールドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３１８】
特定の実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、しかも、少なくともいくつかの生理学的条件下で二重鎖領域を形成する配列を含む。これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、テール二重鎖領域を形成しうるテール二重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、テール二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対長である。特定の実施形態では、テールドメインは、二重鎖を形成しないテール二重鎖ドメインの３’側に一本鎖ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、一本鎖ドメインは、３〜１０ヌクレオチド長、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または４〜６ヌクレオチド長である。
【０３１９】
特定の実施形態では、テールドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、テールドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、テールドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、テールドメインおよび／またはテールドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、テールドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３２０】
特定の実施形態では、テールドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるように候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補テールドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３２１】
ｇＲＮＡの生体内または生体外転写
特定の実施形態では、テールドメインは、生体外または生体内転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの生体外転写のためにＴ７プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレートの３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。生体内転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。転写のためにＨ１プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵ配列であってもよい。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、例えば、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて様々な数のウラシル塩基であってもよいし、または交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）塩基を含んでもよい。特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒に、配列番号３３、３４、３５、３６、または３８に記載される配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。
【０３２２】
転写を開始するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＧを必要とすると仮定すると、Ｔ７プロモーターは、プロモーター下流のＲＮＡ配列全体の転写を確実にするために、典型的にその３’末端に２つのＧを有する。しかしながら、その結果、生成される転写物は、プロモーター配列由来の少なくとも１つのＧ、そうでなければ双方を含有し得るが、これは、ｇＲＮＡ特異性またはｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質同士の相互作用が改変し得る。ｇＲＮＡ標的配列がＧで開始する（例えば、ＨＢＢ＿８  ｇＲＮＡ標的領域ＤＮＡテンプレート：
【化１】
2018519801.tif 000017
場合のこの懸念事項に対処するため、新たな５’センスプライマー
【化２】
2018519801.tif 000018
（配列番号４８７、ここで、修飾Ｔ７プロモーター配列は下線で示す）を設計することによって、ｇＲＮＡ  ＰＣＲテンプレート中のＴ７プロモーター配列から２つのＧＧを除去することができる。Ｇで開始しないｇＲＮＡ標的配列（例えば、ＨＢＢ＿１５ｇＲＮＡ標的領域ＤＮＡテンプレート：
【化３】
2018519801.tif 000019
の場合には、ｇＲＮＡ  ＰＣＲテンプレート中でコードされるＴ７プロモーター配列は、Ｔ７プロモーターの３’末端のＧの１つだけが除去されるように修飾することができる：（修飾Ｔ７プロモーター配列：
【化４】
2018519801.tif 000020
。
【０３２３】
Ｔ７プロモーター配列および修飾Ｔ７プロモーター配列は、本明細書に記載される配列に限定されない。例えば、Ｔ７プロモーター配列（およびその修飾物）は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓの「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」（ｈｔｔｐ：／／  ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７に位置する）に示される配列の少なくともいずれかであってよい。本開示は、本明細書で開示されるｇＲＮＡが、本明細書で記載される修飾Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートからの生体外転写により生成され、ここで、３’末端のＧの１つまたは複数が除去される（例えば、配列
【化５】
2018519801.tif 000021
が、その５’末端でＧが欠失する標的化ドメインのすぐ上流に位置するか、または配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号４９０）が、その５’末端にＧを有する標的化ドメインのすぐ上流に位置する）方法を包含することは理解すべきである。これらの修飾Ｔ７プロモーターに対する他の改変は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓの「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」（ｈｔｔｐ：／／  ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７に位置し、その全体が参照により本明細書で援用される）に示される配列の少なくともいずれかを含む他のＴ７プロモーター配列に基づいて、当業者によって認識されるであろう。
【０３２４】
例示的な単分子／キメラｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、５’［標的化ドメイン］−［第１の相補性ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補性ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補性ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
第２の相補性ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第２の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
および
テールドメインは非存在であり、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有する。
【０３２５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子ｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１０〜５０ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドなどを含む第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３２６】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する。
【０３２７】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３２８】
特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３２９】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３３０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的であるか、もしくは部分的に相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的化ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０３３１】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくても、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子、またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０３３２】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくてもよいし、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０３３３】
例示的なモジュラーｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；第１の相補性ドメインを含む第１鎖と；好ましくは、５’から３方向に以下：任意選択的に５’伸長ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含む第２鎖とを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３３４】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
【０３３５】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３３６】
特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３３７】
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０３３８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなる。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０３３９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３４０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３４１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３４２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３４３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３４４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３４５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３４６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３４７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３４８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３４９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３５０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３５１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長であり；隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３５２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３５３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３５４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３５５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３５６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３５７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３５８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチド対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３５９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３６０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３６１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３６２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３６３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３６４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３６５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３６６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３６７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチド対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３６８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３６９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３７０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３７１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３７２】
ＩＩＩ．ｇＲＮＡ分子をデザインする方法
本明細書に記載のｇＲＮＡに使用するための標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法が本明細書に提供される。ｇＲＮＡへの組み込みのための例示的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供される。
【０３７３】
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は記載されている（例えば、Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｈｓｕ  ２０１３；Ｆｕ  ２０１４：Ｈｅｉｇｗｅｒ  ２０１４；Ｂａｅ  ２０１４；およびＸｉａｏ  ２０１４を参照のこと）。例えば、ソフトウェアツールを用いて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性の最小化など、使用者の標的配列に対応する候補標的化ドメインの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用するそれぞれの可能な標的化ドメイン選択のために、上記ツールは、特定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）以下のミスマッチ塩基対を含有するゲノム全域で、全てのオフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのどちらかに先行する）を同定することができる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測することができる。次に、考えられる標的化ドメインが各々、その全予測オフターゲット切断に従って格付けされ；最高位の標的化ドメインは、最大のオンターゲット切断と最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものを表す。例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイ用のプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補標的化ドメインおよびこれらの標的化ドメインを含むｇＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法によって、および／または本明細書に記載されるようにして、機能性について評価することができる。
【０３７４】
非限定的例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡでの使用のための標的化ドメインが、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを用いて同定されている。１７量体および２０量体標的化ドメインが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のためにデザインされており、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）標的については、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体標的化ドメインがデザインされている。ｇＲＮＡデザインは、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒ（Ｂａｅ  ２０１４）に基づくカスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して実施する。このソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に判定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約された。ＰＡＭ配列に隣接する可能な標的部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択された標的部位と、１、２、３つまたは３つ超のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。ＨＢＢ遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０３７５】
同定に続いて、標的ドメインは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性、および５’Ｇの存在に基づいて階層に格付けされた（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合はＮＧＧ  ＰＡＭ、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）の場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴＰＡＭ、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合はＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭなどの妥当なＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく）。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体標的化ドメインを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。
【０３７６】
標的ドメインは、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方で、ｇＲＮＡが同定された。標的ドメインを選択する基準、およびそれに対して標的ドメインがｇＲＮＡに組み込まれ得るかつ使用され得る、二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの判定は２つの考察に基づく：
１．
ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
２．
二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な出現頻度で全介在配列の欠失をもたらすという仮説。しかし、二重ニッカーゼ対による切断はまた、ｇＲＮＡ分子の１つのみの部位にインデル変異をもたらし得る。候補ペア構成要素は、１つのｇＲＮＡ分子の標的部位にインデル変異を引き起こす場合と比較して、全配列をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０３７７】
特定の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子を１つのＣａｓ９分子と一緒に使用する。別の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子を２つ以上のＣａｓ９分子と一緒に使用する場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子を２つのＣａｓ９分子と一緒に使用する場合、１つのＣａｓ９分子は１つの種に由来し、他方のＣａｓ９分子は、異なる種に由来し得る。双方のＣａｓ９分子を用いて、所望の一本鎖または二本鎖切断を生成する。
【０３７８】
特定の実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼ）が使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子が、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡ分子の５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含む任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。ニッカーゼペアで使用するためのｇＲＮＡ分子を選択する際、一方のｇＲＮＡ分子は、相補鎖におけるドメインを標的化し、第２のｇＲＮＡ分子は、非相補鎖におけるドメインを標的化し、例えば、いずれかのマイナス鎖標的化ドメインを含むｇＲＮＡは、同じ標的位置を標的化するプラス鎖標的化ドメインを含むいずれかのｇＲＮＡ分子と対合し得る。特定の実施形態では、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、２つのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または２つのＣａｓ９ニッカーゼ（例えば、２つのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼ）を標的化するために、２つの２０量体ｇＲＮＡが使用され、例えば、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）の標的化ドメインを含む２つのｇＲＮＡ分子が使用される。特定の実施形態では、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼを標的化するために、２つの１７量体ｇＲＮＡが使用される。本明細書に記載される表中の標的化ドメインのいずれも、一本鎖切断を生成するＣａｓ９分子（すなわち、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼ）または二本鎖切断を生成するＣａｓ９分子（すなわち、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）と一緒に使用することができる。
【０３７９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列と同じか、またはそれと１、２、３、４、もしくは５個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列である。
【０３８０】
本明細書に記載されるように、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’方向に；標的化ドメイン（「コアドメイン」、および任意選択的に「二次ドメイン」を含む）；第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでもよい。一実施形態では、隣接ドメインとテールドメインは、合わせて単一ドメインとされる。
【０３８１】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；ならびに１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含む。
【０３８２】
別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも２５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；ならびに１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含む。
【０３８３】
別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；ならびに１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含む。
【０３８４】
別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含む。
【０３８５】
２つのｇＲＮＡを２つのＣａｓ９分子と一緒に使用するためにデザインする場合、２つのＣａｓ９分子は、異なる種に由来する。所望の一本鎖または二本鎖切断を生成するために、両方のＣａｓ９種を用いてよい。
【０３８６】
本明細書では、本明細書に記載される任意の上流ｇＲＮＡを本明細書に記載される任意の下流ｇＲＮＡと対合させ得ることが考慮される。１つの種のＣａｓ９分子と使用するためにデザインされた上流ｇＲＮＡを、異なる種のＣａｓ９分子からの使用のためにデザインされた下流ｇＲＮＡと対合させる場合、所望の一本鎖または二本鎖切断を生成するために、両方のＣａｓ９種を用いてよい。
【０３８７】
ＩＶ．Ｃａｓ９分子
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）からのＣａｓ９分子を含む。例示的Ｃａｓ９オーソログのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３８６に記載されている。
【０３８８】
Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造は、２つの異なる天然細菌Ｃａｓ９分子（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）について、およびガイドＲＮＡがあるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物）（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；およびＡｎｄｅｒｓ  ２０１４）について評価された。
【０３８９】
天然Ｃａｓ９分子は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含み；そのそれぞれは、本明細書に記載されるドメインをさらに含む。本開示全体を通じて使用されるドメイン命名法および各ドメインに包含されるアミノ酸残基の番号付与は、前述した通りである（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９を参照する。
【０３９０】
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を有せず、それがＣａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは、長いαらせんおよびアルギニンに富む領域であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸６０〜９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはａｔｒａｃｒＲＮＡなどの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって標的配列を認識することでＣａｓ９活性に重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖一次構造内ではＲＥＣ２ドメインによって隔てられるが、三次構造に構築されてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその部分はまた、反復：抗反復二本鎖の認識における役割を有してもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１８０〜３０７を含む。
【０３９１】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリー構成要素との構造類似性を有して、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にある、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、当該技術分野で一般にＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内ではその他のドメインによって直線的に隔離されるが、三次構造内では、３つのＲｕｖＣモチーフに構築されてＲｕｖＣドメインが形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造的類似性を有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフの間にあり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸７７５〜９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９．配列のアミノ酸１０９９〜１３６８を含む。
【０３９２】
ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含み、これらの特定の実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのドメインの１つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０３９３】
ＲｕｖＣ様ドメイン
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長などの約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０３９４】
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含み、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
【０３９５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号８）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０３９６】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３９７】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。
【０３９８】
他の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
【０３９９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号９）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＬおよびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、ＩおよびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、ＳおよびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＶおよびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０４００】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号９の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４０１】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０４０２】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４０３】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＶ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号１１）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される。
【０４０４】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４０５】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、配列番号５４〜１０３のいずれか１つにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、配列番号５４〜１０３の高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０４０６】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、配列番号１０４〜１７７のいずれか１つにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、配列番号１０４〜１７７の高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０４０７】
追加的ＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
【０４０８】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式Ｖ：
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１２）
のアミノ酸配列を含んでよく、
式中、
Ｘ１は、ＶまたはＨであり；
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり；
Ｘ３は、ＭまたはＴである。
【０４０９】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩ：
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１３）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である。
【０４１０】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩＩ：
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４）のアミノ酸配列を含んでもよく、
式中、
Ｘ１は、ＨまたはＬであり；
Ｘ２は、ＲまたはＶであり；
Ｘ３は、ＥまたはＶである。
【０４１１】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含む。
【０４１２】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１２〜１５の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの側面に位置する配列は、式ＶＩＩＩ：Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号：１６）のアミノ酸配列を有し、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され；
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるような、例えば、５〜１２アミノ酸を有するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
【０４１４】
ＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、または２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
【０４１５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４１６】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１７の配列と、少なくとも１つであるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４１７】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。
【０４１８】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
【０４１９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｘ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１８）
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４２０】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１８の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０４２１】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩ、
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４２２】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１９の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０４２３】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩ、Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２０）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含み得る）。
【０４２４】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４２５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩＩ、
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含む。
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；および
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
【０４２６】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
【０４２７】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、配列番号１７８〜２５２などの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、配列番号１７８〜２５２で同定された高度に保存された残基のうち、片方または双方が存在する。
【０４２８】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、配列番号２５３〜３０２などの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、配列番号２５３〜３０２で同定された高度に保存された残基のうと、１つ、２つ、３つ全てが存在する。
【０４２９】
Ｃａｓ９機能
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断（またはその他の性質）を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書でｅａＣａｓ９分子（酵素的に活性なＣａｓ９）またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
【０４３０】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
特定の実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【０４３１】
特定の実施形態では、酵素的に活性なＣａｓ９またはｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方のＤＮＡ鎖を切断して、二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨドメインと、不活性のまたは切断能力がないＲｕｖＣドメインとを含む一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＲｕｖＣドメインとを含む。
【０４３２】
いくつかのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と連結してコア標的ドメインに局在するが、標的核酸を切断できず、あるいは効率的な速度で切断できない。皆無のまたはほぼ皆無の切断活性を有するＣａｓ９分子は、本明細書でｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドと称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性が欠損し得て、または本明細書に記載されるアッセイによる測定で、例えば、標準Ｃａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドの２０、１０、５、１または０．１％未満などの実質的により低い切断活性を有する。
【０４３３】
標的化およびＰＡＭ
ｇＲＮＡ分子と相互作用し得るＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメイン、および特定の実施形態では、ａＰＡＭ配列を含む部位に局在する。
【０４３４】
特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ，ＮＡＧ、ＮＧＡを認識して、その配列から、例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｍａｌｉ  ２０１３を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮ（配列番号５０６）Ｇおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ；配列番号５０７）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号５０８））を認識して、この配列の例えば、３〜５ｂｐなど１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列切断を誘導する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号５０９）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐの標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号５１０）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号５１１）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号５１２）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ２０１２に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。前述の実施形態では、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかの任意のヌクレオチド残基であり得る。
【０４３５】
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
【０４３６】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、上述されている（例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３を参照されたい）。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０４３７】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０４３８】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
配列番号１〜４と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
比較すると、２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、または生物種に由来するＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子配列と同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号１〜４あるいはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３またはＨｏｕ  ２０１３に記載される）。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
【０４３９】
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
【０４４０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜６を含み、十分な追加的Ｃａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域１〜６のそれぞれは、独立して、例えば、配列番号１〜４からの配列などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。
【０４４１】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含み：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と同一である。
【０４４２】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含み、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と同一である。
【０４４３】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含み：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と同一である。
【０４４４】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含み：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と同一である。
【０４４５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含み：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と同一である。
【０４４６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含み：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と同一である。
【０４４７】
遺伝子操作または改変Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
【０４４８】
Ｃａｓ９分子は、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドを含む（遺伝子操作は、この文脈の用法では、単にＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを意味して、プロセスまたは起源制限を暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、（天然またはその他の標準Ｃａｓ９分子と比較して）改変されたヌクレアーゼ活性、または改変されヘリカーゼ活性などの改変された酵素的性質を含み得る。本明細書で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性（二本鎖ヌクレアーゼ活性との対比で）を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のまたは任意のＣａｓ９活性に対する顕著な影響なしに、例えば、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失などの、そのサイズを変化させる改変を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含み得る。例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内在性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と、配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９機能に顕著な改変を有しない。
【０４４９】
所望の性質があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの親ポリペプチドの改変などの、いくつかの様式で生成されて、所望の性質を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、例えば、天然または遺伝子操作Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子との１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異としては、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失が挙げられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの標準と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含み得る。
【０４５０】
特定の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。他の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
【０４５１】
非切断および修飾切断Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖核酸切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【０４５２】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【０４５３】
特定の実施形態ではｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメインと、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにアスパラギン酸の変異を有し得て、例えば、配列番号２の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０４５４】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。（例えば、本明細書に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列（配列番号２）の位置８５６でＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得て；例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列（配列番号２）の位置８７０および／または８７９でＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０４５５】
特定の実施形態では、代表的なＣａｓ９機能は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の９つまたは複数を含む。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣドメイン；ＨＮＨドメイン；ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン外の領域に存在し得る。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインに存在する。一実施形態では、変異（ｓ）は、ＨＮＨドメインに存在する。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方に存在する。
【０４５６】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに起きてもよい代表的変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインに実施され得る例示的な突然変異として、Ｎ５８０Ａがある。
【０４５７】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ＲｕｖＣドメイン中に、および／またはＨＮＨドメイン中に、標準Ｃａｓ９分子と比較して１つまたは複数の差異を含む、ｅｉＣａｓ９分子であり、ｅｉＣａｓ９分子は、核酸を切断せず、または野生型（ｗｉｌｄｙｐｅ）よりも有意により低い効率で切断し、例えば、本明細書に記載されるような切断アッセイにおける野性型と比較して、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、標準Ｃａｓ９分子の５０、２５、１０、または１％未満で切断する。
【０４５８】
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで、評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
【０４５９】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖切断の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。特定の実施形態では、ニッカーゼは、配列番号４８４（Ｄ１０Ａ）または配列番号４８５（Ｎ５８０Ａ）の配列を含むＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９由来のニッカーゼである（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ２０１５）。
【０４６０】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含む、ｅａＣａｓ９分子である：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
【０４６１】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、核酸分子（二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のいずれも）を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で核酸分子を切断する、ｅｉＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドである。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、ＲｕｖＣドメインに関連する実質的切断活性およびＨＮＨドメインに関連する切断活性を欠く。
【０４６２】
特定の実施形態では、改変されたＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、２つ以上の異なるＣａｓ９分子、例えば、２つ以上の異なる種の天然起源のＣａｓ９分子の融合物であってよい。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
【０４６３】
ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９
天然起源Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
【０４６４】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同一ＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、それに最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性、または天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変されて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加する、および／またはＣａｓ９特異性を高レベルの同一性（例えば、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の９８％、９９％もしくは１００％のマッチ）まで向上させる、例えば、オフターゲット部位を減少させる、および／または特異性を増大するように、改変することができる。特定の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。一実施形態では、Ｃａｓ９特異性は、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を要求する。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作製することができる。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用することができる例示的な方法およびシステムは、記載されている（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ２０１１を参照のこと）。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、以下に記載される方法によって評価され得る。
【０４６５】
サイズ最適化Ｃａｓ９分子
本明細書に記載される遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、１つまたは複数の欠失および任意選択的に１つまたは複数のリンカーを含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるＣａｓ９分子を生成する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
【０４６６】
例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの欠失があるＣａｓ９分子は、例えば、低下したアミノ酸数を有するなど、対応する天然Ｃａｓ９分子よりも小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズは、送達方法の融通性を増大させ、その結果ゲノム編集の有用性を高める。Ｃａｓ９分子は、結果として生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない、１つまたは複数の欠失を含み得る。本明細書に記載される欠失を含むＣａｓ９分子中で維持される機能としては、ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力で、一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；ならびに例えば、標的核酸またはｇＲＮＡ分子などの核酸分子の認識活性。
【０４６７】
本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性は、本明細書または当該技術分野で記載される、活性アッセイを使用して評価することができる。
【０４６８】
欠失に適する領域を同定する
Ｃａｓ９分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。様々な細菌種に由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造にモデル化され得て（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたＣａｓ９オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面などのＣａｓ９活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
【０４６９】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。代表的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、上述されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ２０１３；Ｗａｎｇ  ２０１３；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照されたい）。
【０４７０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、（例えば、以下の全てなどの１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換される。
【０４７１】
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【０４７２】
さらに、または代案としては、ａＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
【０４７３】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号２２に記載されている。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号２３に記載されている。
【０４７４】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号２６、３９、４８２および４８３に記載されている。
【０４７５】
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
【０４７６】
その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
本明細書で開示される発明を実施するために、様々なタイプのＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、上述されている（例えば、Ｈａｆｔ  ２００５；Ｍａｋａｒｏｖａ  ２０１１を参照されたい）。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表５にもまた示される。
【０４７７】
【表１６】
2018519801.tif 000022
【０４７８】
【表１７】
2018519801.tif 000023
【０４７９】
【表１８】
2018519801.tif 000024
【０４８０】
Ｖ．候補分子の機能解析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価するための例示的な方法は、以前記載されている（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）。本明細書に記載される各方法は、単独で、または候補分子を評価するための１つまたは複数の技術と組み合わせて使用してよい。本明細書に開示される技術は、限定はしないが、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を決定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を決定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するための最適ｇＲＮＡを同定する方法、ならびに対象に投与するためのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を選択する方法をはじめとする、様々な方法に使用され得る。
【０４８１】
結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【０４８２】
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μＬでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μｌのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【０４８３】
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９分子の適合性が評価され得る。
【０４８４】
結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、上述されている（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）。
【０４８５】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μＬで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
【０４８６】
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性を測定する技術
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）およびその他の技術によって検知することができる。タンパク質の熱安定性は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る。従って、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを決定する上で有用である。
【０４８７】
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ＤＳＦは、タンパク質の熱安定性を測定するために用いることができる技術である。このアッセイは、いくつかの方法で適用することができる。例示的なプロトコルとして、限定はしないが、ＲＮＰ形成のための所望の溶液条件を判定するプロトコル（アッセイ１、以下を参照）、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論比を試験するプロトコル（アッセイ２、以下を参照）、Ｃａｓ９分子、例えば、野生型もしくは突然変異型Ｃａｓ９分子について有効なｇＲＮＡ分子をスクリーニングするプロトコル（アッセイ３、以下を参照）、ならびに標的ＤＮＡの存在下でＲＮＰ形成を調べるプロトコル（アッセイ４）が挙げられる。
【０４８８】
アッセイ１
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Ｃａｓ９の２μＭ水溶液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のｇＲＮＡ、および塩が添加される。室温で１０分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０４８９】
アッセイ２
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡ分子と２ｕＭ  Ｃａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０分間インキュベートすることを含む。等容積の最適緩衝液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための２０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０４９０】
アッセイ３
第３のアッセイでは、対象Ｃａｓ９分子（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、例えば、Ｃａｓ９変異タンパク質）を精製する。変異ｇＲＮＡ分子のライブラリーを合成し、２０μＭの濃度まで再懸濁させる。５×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）の存在下で予定緩衝液中に各々１μＭの最終濃度で、Ｃａｓ９分子をｇＲＮＡ分子と一緒にインキュベートする。室温で１０分間インキュベートしてから、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃ずつ昇温しながら、２０℃から９０℃への勾配を実行する。
【０４９１】
アッセイ４
第４のアッセイでは、次のサンプル：Ｃａｓ９タンパク質単独、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ、ならびにＣａｓ９タンパク質と標的ＤＮＡを用いて、ＤＳＦ実験を実施する。構成要素を混合する順序は、反応溶液、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの順である。反応溶液は、ＭｇＣｌ２の非存在または存在下で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃ずつ昇温しながら、２０℃から９０℃への勾配を実行する。
【０４９２】
ＶＩ．ゲノム編集アプローチ
標的遺伝子の突然変異は、本明細書で考察されるアプローチの１つを用いて修正することができる。一実施形態では、標的遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸（セクションＶ．１を参照）を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）により修正され、これは、本明細書で「遺伝子修正」と呼ばれる。別の実施形態では、標的遺伝子中の突然変異は、本明細書で遺伝子修正と呼ばれる、細胞外供給テンプレート核酸（セクションＶ．１を参照）を用いずに、相同組換え修復（ＨＤＲ）により修正される。
【０４９３】
Ｖ．１  ＨＤＲ修復およびテンプレート核酸
本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介性配列改変を用いて、ゲノム中の１または複数個のヌクレオチドの配列を改変および／または修正（例えば、修復または編集）する。理論による拘束は望まないが、標的遺伝子内の標的配列のＨＤＲ媒介性改変は、遺伝子修正と呼ばれるプロセスにおいて、細胞外供給供与体テンプレートまたはテンプレート核酸を用いるＨＤＲにより起こると考えられる。例えば、供与体テンプレートまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を可能にする。プラスミド供与体は、相同組換えのためのテンプレートとして使用できると考えられる。さらに、一本鎖供与体テンプレートは、標的配列と供与体テンプレートとの間のＨＤＲの代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の改変のためのテンプレートとして使用できることも考えられる。供与体テンプレートを用いて実施される標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み得る。
【０４９４】
他の実施形態では、細胞外供給供与体テンプレートまたはテンプレート核酸を用いずに、ゲノム中の標的配列の１つまたは複数のヌクレオチドの配列を改変および／または修正（例えば、修復もしくは編集）するために、ＨＤＲ媒介性配列改変が使用される。理論による拘束は望まないが、標的配列の改変は、本明細書で遺伝子変換と呼ばれるプロセスにおいて、内在性ゲノム供与体配列を用いたＨＤＲによって起こると考えられる。例えば、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列の改変を可能にする。一実施形態では、内在性ゲノム供与体配列を、標的配列と同じ染色体上に位置させることが検討される。さらに、別の実施形態では、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列とは異なる染色体上に位置させることが検討される。内在性ゲノム供与体配列による標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み得る。
【０４９５】
一実施形態では、標的位置または標的位置領域は、内在性相同配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の相同性を有する。
【０４９６】
一実施形態では、標的位置領域は、標的位置を除いて、内在性相同配列と１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４９７】
一実施形態では、標的位置領域は、内在性相同配列と、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１，０００、２５００、５０００、もしくは１００００ヌクレオチドにわたって、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、もしくは９９％の相同性を有する。
【０４９８】
一実施形態では、標的位置領域は、標的位置を除いて、内在性相同配列と、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１，０００、２５００、５０００、もしくは１００００ヌクレオチドにわたって、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４９９】
一実施形態では、内在性相同配列は、標的位置を含む遺伝子中に見出されるドメイン、例えば、触媒ドメイン、標的と結合するドメイン、構造ドメインなどを含む。
【０５００】
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介性改変を用いて、標的配列中の単一ヌクレオチドを改変する。これらの実施形態は、１つの二本鎖切断または２つの一本鎖切断のいずれを使用してもよい。特定の実施形態では、単一ヌクレオチド改変は、以下のものを用いて組み込まれる：（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的位置の両側でそれぞれ起こる切断を含む２つの二本鎖切断、（４）標的位置の両側で起こる二本鎖切断と２つの一本鎖切断を含む１つの二本鎖切断と２つの二本鎖切断、（５）標的位置の両側でそれぞれ起こる１対の一本鎖切断を含む４つの一本鎖切断、または（６）１つの二本鎖切断。
【０５０１】
一本鎖テンプレート核酸が用いられる特定の実施形態では、標的位置は、代替ＨＤＲによって改変することができる。
【０５０２】
標的位置の供与体テンプレートを用いて実施される改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、ニック、二本鎖切断、または２つの一本鎖切断、例えば、標的核酸の各鎖に１つずつを含み得る。標的核酸への切断の導入後、切断末端に切除が起こり、これによってＤＮＡ領域にオーバーラップする一本鎖が生じる。
【０５０３】
標準ＨＤＲでは、標的核酸に対する相同配列を含む二本鎖供与体テンプレートを導入するが、これは、標的核酸に直接組み込むか、または標的核酸の配列を変更するためのテンプレートとして使用する。切断における切除後、修復は、様々な経路、例えば、ダブルホリデイジャンクションモデル（ｄｏｕｂｌｅ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）（もしくは二本鎖切断修復、ＤＳＢＲ、経路）または合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）経路によって進行し得る。ダブルホリデイジャンクションモデルでは、供与体テンプレート中の相同配列に対する標的核酸の２つの一本鎖オーバーハングによる鎖浸潤が起こり、これによって、２つのホリデイジャンクションを含む中間体が形成される。これらのジャンクションは、新たなＤＮＡが、浸潤鎖の末端から合成されているため、移動して、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡの末端は、切除された末端と連結し、ジャンクションは分解されて、標的核酸の改変、例えば、対応する標的位置での供与体テンプレートの改変配列の組み込みが起こる。供与体テンプレート核酸との交差が、ジャンクションの分解時に起こり得る。ＳＤＳＡ経路では、唯一の一本鎖オーバーハングが供与体テンプレートを浸潤し、新たなＤＮＡが浸潤鎖の末端から合成されて、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡは、次に、残る一本鎖オーバーハングとアニールし、新たなＤＮＡが合成されて間隙を充填した後、鎖が連結されて、改変ＤＮＡ二重鎖を生成する。
【０５０４】
代替ＨＤＲでは、一本鎖供与体テンプレート、例えば、テンプレート核酸を導入する。所望の標的位置を改変するための標的核酸でのニック、一本鎖切断、または二本鎖切断は、例えば、本明細書に記載されるものなどのＣａｓ９分子によって媒介され、切断における切除が起こって、一本鎖オーバーハングが露出する。標的核酸の標的位置を修正または改変するためのテンプレート核酸の配列の組み込みは、典型的に、前述した通り、ＳＤＳＡ経路によって起こる。
【０５０５】
テンプレート核酸についてのさらなる詳細は、国際公開第２０１５／０４８５７７号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に明示的に援用する）として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７９０５号明細書の「テンプレート核酸（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」と題するセクションＩＶに記載されている。
【０５０６】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性と、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子、例えば、野生型Ｃａｓ９によって実施される。このような実施形態は、単一のｇＲＮＡ分子を必要とする。
【０５０７】
特定の実施形態では、１つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９ニッカーゼによって実施される。ニック標的核酸は、ａｌｔ−ＨＤＲ用の基質となり得る。
【０５０８】
他の実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、例えば、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性、またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性などのニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子によって実施される。このような実施形態は、通常、２つのｇＲＮＡを、すなわち各一本鎖切断の配置に１つずつ必要とする。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断するが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断しない。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断しないが、その代わり、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断する。
【０５０９】
特定の実施形態では、ニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０に突然変異を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異などＨＮＨ活性を有する。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上にＮＧＧ  ＰＡＭを有していない相補鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして用いることができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、その配列が、ｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｎ８６３突然変異、例えば、Ｎ８６３Ａ突然変異、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｎ８６３Ａは、ＨＮＨを不活性化することから、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｎ５８０突然変異、例えば、Ｎ５８０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｎ５８０Ａは、ＨＮＨを不活性化することから、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。
【０５１０】
ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡを用いて、２つの一本鎖ニックを配置する特定の実施形態では、１つのニックは、標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは、その−鎖上にある。ＰＡＭは、外側を向いても、または内側を向いてもよい。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ同士が、約０〜５０、０〜１００、または０〜２００ヌクレオチドによって隔てられるように選択することができる。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列の間にオーバーラップはない。一実施形態では、ｇＲＮＡは、オーバーラップせずに、５０、１００、または２００ヌクレオチド程によって隔てられている。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を低減することによって、特異性を増大することができる（Ｒａｎ  ２０１３）。
【０５１１】
特定の実施形態では、単一のニックを用いて、ＨＤＲ、例えば、ａｌｔ−ＨＤＲを誘導することができる。本明細書では、単一のニックを用いて、所与の切断部位でのＨＲとＮＨＥＪの比を増加し得ることが検討される。特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。
【０５１２】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断または一本鎖切断は、改変が所望の領域内で生じる、例えば、突然変異の修正が起こるように、標的位置に十分接近させるべきである。特定の実施形態では、距離は、５０、１００、２００、３００、３５０もしくは４００ヌクレオチド以下である。理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、標的位置が、末端切除中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領域内にあるように、切除は標的位置に十分接近させるべきであると考えられる。標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、改変しようとする配列が末端切除に包含されず、従って、改変されない場合がある。というのは、供与体配列（細胞外供給供与体配列または内在性ゲノム供与体配列のいずれも）は、いくつかの実施形態では、末端切除領域内の配列を改変するためだけに使用されるからである。
【０５１３】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖もしくは一本鎖切断が、改変しようとする領域、例えば、突然変異から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくは２００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、改変しようとする領域、例えば、突然変異の上流または下流に配置することができる。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域、少なくとも２つの突然変異ヌクレオチドにより画定される領域内に配置される。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域に直接隣接して、例えば、突然変異のすぐ上流または下流に位置する。
【０５１４】
特定の実施形態では、一本鎖切断には、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的一本鎖切断が伴う。例えば、標的化ドメインは、例えば、２つの一本鎖切断などの切断事象が、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ヌクレオチド内に位置するように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼを誘導すると、一本鎖切断が、前記第２のｇＲＮＡによって配置される互いに十分に近い追加的一本鎖切断を伴い、所望する領域の改変をもたらすように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、第２のｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、前記第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるように構成される。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド内に、切断を配置させるように設計されて、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣する。
【０５１５】
ＨＤＲ媒介性改変を誘導するために、ｇＲＮＡ（単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレアーゼが、二本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００塩基対）離れている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００塩基対）離れている。
【０５１６】
特定の実施形態では、ニッカーゼを用いることでＨＤＲを促進して、オーバーハングを含む切断を生成することができる。理論による拘束は望まないが、オーバーハングの一本鎖性質は、例えば、ＮＨＥＪとは反対に、ＨＤＲによって切断を修復する細胞の可能性を増大することができる。特に、特定の実施形態では、第１のニッカーゼを第１の標的配列に標的化する第１のｇＲＮＡと、第１の標的配列とは反対側のＤＮＡ鎖上にあり、しかも第１のニックからずれている第２の標的配列に第２のニッカーゼを標的化する第２のｇＲＮＡとを選択することによって、ＨＤＲを促進する。
【０５１７】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ヌクレオチドが改変されないように、予め選択したヌクレオチド、例えば、コード領域のヌクレオチドから十分遠くに、切断事象が位置するように設計される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、エキソン配列の改変または不要なスプライシング事象を回避するために、イントロン切断事象が、イントロン／エキソン境界または天然起源のスプライスシグナルから十分遠くに位置するように設計される。ｇＲＮＡ分子は、以下に記載するように、第１、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子であってよい。
【０５１８】
第１の切断および第２の切断同士の配置
特定の実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５１９】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５２０】
特定の実施形態では、第１および第２の一本鎖切断は、第３のｇＲＮＡ分子および第４のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５２１】
２つ以上のｇＲＮＡを用いて、標的核酸内に２つ以上の切断事象、例えば、二本鎖または一本鎖切断を配置する場合、同じまたは異なるＣａｓ９タンパク質によって２つ以上の切断事象を実施し得ることが検討される。例えば、２つのｇＲＮＡを用いて、２つの二本鎖切断を配置する場合、単一のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、双方の二本鎖切断を生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、２つ以上の一本鎖切断（ニック）を配置する場合、単一のＣａｓ９ニッカーゼを用いて、２つ以上のニックを生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、少なくとも１つの二本鎖切断と少なくとも１つの一本鎖切断を配置する場合、２つのＣａｓ９タンパク質、例えば、１つのＣａｓ９ヌクレアーゼと１つのＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を用いる場合、２つ以上のＣａｓ９タンパク質を順次送達することにより、標的核酸の所望の位置で、一本鎖切断に対して二本鎖の特異性を制御し得ることが検討される。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向鎖と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側に向くように設計される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが内側に向くように設計される。
【０５２３】
特定の実施形態では、互いに予め選択した距離にある２つの位置のＣａｓ９媒介性切断を指令するように、２つのｇＲＮＡを選択する。特定の実施形態では、２つの切断点は、標的核酸の対向鎖上にある。いくつかの実施形態では、２つの切断点は、平滑末端切断を形成し、他の実施形態では、これらは、ＤＮＡ末端が、１つまたは２つのオーバーハング（例えば、１つまたは複数の５’オーバーハングおよび／または１つまたは複数の３’オーバーハング）を含むようにずれている。いくつかの実施形態では、各切断事象は、ニックである。いくつかの実施形態では、ニックは、二本鎖切断機構により認識される切断を形成するように、互いに十分接近している（例えば、ＳＳＢｒ機構により認識されるのとは反対に）。特定の実施形態では、ニックは、それらが、ＨＤＲの基質であるオーバーハングを生成する、すなわち、切断の配置が、いくつかの切除を被ったＤＮＡ基質を模倣するように、十分離れている。例えば、いくつかの実施形態では、ニックは、プロセッシブ切除のための基質であるオーバーハングを生成するように隔てられている。いくつかの実施形態では、２つの切断は、互いに２５〜６５ヌクレオチド以内で隔てられている。２つの切断は、例えば、互いに約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに多くとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、２つの切断は、互いに約２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、または６０〜６５ヌクレオチドであってよい。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、切除された切断を模倣する切断は、３’末端オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは３’オーバーハングを残す）、５’オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは５’オーバーハングを残す）、３’および５’オーバーハング（例えば、３つの切断によって生成される）、２つの３’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）、または２つの５’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）を含む。
【０５２５】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する２つのｇＲＮＡ（独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）が、ＨＤＲ媒介性改変（例えば、修正）を誘導する目的で、２つの一本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、より近傍のニックは、標的位置から互いに０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、または７５〜１００塩基対）離れており、２つのニックは、理想的には互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、または６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、互いから９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５塩基対）離れている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００塩基対）離れている。
【０５２６】
いくつかの実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように設計される。他の実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に、二本鎖切断（すなわち、ｃａｓ９ヌクレアーゼと１つのｇＲＮＡの複合体）と２つの一本鎖切断または対合一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと２つのｇＲＮＡの複合体）を配置するように設計される。他の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に２対の一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと２対の２つのｇＲＮＡ分子の複合体）を生成するように設計される。二本鎖切断または１対において２つの一本鎖ニックの近い方は、理想的には標的位置の０〜５００塩基対以内（標的位置から、例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼを使用する場合、１対の２つのニックは、特定の実施形態では、互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、または６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０塩基対）離れている。
【０５２７】
２つのｇＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９分子を切断に標的化する場合、Ｃａｓ９分子の様々な組み合わせが考えられる。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡを用いて、第１のＣａｓ９分子を第１の標的位置に標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて、第２のＣａｓ９分子を第２の標的位置に標的化する。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９分子は、標的核酸の第１鎖にニックを生成し、第２のＣａｓ９分子は、対向鎖上にニックを生成し、これによって、二本鎖切断（例えば、平滑末端切断またはオーバーハングを含む切断）が生じる。
【０５２８】
１つの一本鎖切断を一方の鎖に、また第２の一本鎖切断を対向鎖に標的化するために、ニッカーゼの様々な組み合わせを選択することができる。組み合わせを選択する際、１つの活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと、１つの活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼがあることを考慮に入れることができる。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、標的核酸分子の非相補的鎖を切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、一本鎖相補的ドメイン、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖を切断する。一般的に、双方のＣａｓ９分子は、同じ活性ドメインを有し（例えば、双方が活性ＲｕｖＣドメインを有するか、または双方が活性ＨＮＨドメインを有する）、標的の対向鎖に２つの結合するｇＲＮＡを選択することになる。さらに詳細には、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させる。反対に、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させる。別の実施形態では、１つのＣａｓ９分子が活性ＲｕｖＣ様ドメインを有し、他方のＣａｓ９分子が活性ＨＮＨドメインを有する場合、双方のＣａｓ９分子のｇＲＮＡは、標的核酸の同じ鎖と相補的であり得るため、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するＣａｓ９分子は、非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインを有するＣａｓ９分子は、相補鎖を切断することになり、これによって二本鎖切断が生じる。
【０５２９】
供与体テンプレートの相同性アーム
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、供与体テンプレート内の相補的領域を見出すことができるように、末端切除が起こり得る領域と少なくとも同じくらい遠くまで延在すべきである。その全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメーターによって限定され得る。一実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復配列またはＬＩＮＥ反復配列中に延在しない。
【０５３０】
例示的な相同性アーム長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、相同性アーム長さは、５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、または４０００〜５０００ヌクレオチドである。
【０５３１】
標的位置は、本明細書の用法では、Ｃａｓ９分子依存的プロセスにより修飾される標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、標的核酸の修飾Ｃａｓ９分子切断および標的位置のテンプレート核酸指向性修飾、例えば、修正であり得る。一実施形態では、標的位置は、１つまたは複数のヌクレオチドが付加される標的核酸上の２つのヌクレオチド、例えば、隣接ヌクレオチド間の部位であってよい。標的位置は、テンプレート核酸により改変、例えば修正される１つまたは複数のヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）内にある。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の上流または下流である。
【０５３２】
テンプレート核酸は、この用語が本明細書で使用される場合、標的位置の構造を改変するために、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子と一緒に使用することができる核酸配列を指す。特定の実施形態では、標準核酸は、典型的に、切断部位またはその付近で、テンプレート核酸の配列の一部もしくは全部を有するように、改変される。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。他の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖ＤＮＡである。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡと同じベクター骨格、例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡ上にコードされる。一実施形態では、テンプレート核酸は、生体内でベクター骨格から切除され、例えば、これは、ｇＲＮＡ認識配列によりフランキングされる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、内在性ゲノム配列を含む。
【０５３３】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＨＤＲ事象に参加することによって、標的位置の構造を改変する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を改変する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾、または非天然塩基の組み込みをもたらす。
【０５３４】
典型的に、テンプレート配列は、標的配列による切断媒介性または触媒組換えを受ける。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介切断事象によって切断される標的配列上の１部位に対応する配列を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、第１のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第１部位と、第２のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第２部位の両方に対応する配列を含む。
【０５３５】
一実施形態では、テンプレート核酸は、翻訳配列のコード配列に改変をもたらす配列、例えば、突然変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に形質転換する、野生型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子に形質転換する、および／もしくは停止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス突然変異などの、例えば、タンパク質産物中の１アミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらす配列を含み得る。
【０５３６】
他の実施形態では、テンプレート核酸は、非コード配列の改変、例えば、エキソンあるいは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域での改変をもたらす配列を含み得る。このような改変として、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、およびシス作用もしくはトランス作用制御エレメントの改変が挙げられる。
【０５３７】
遺伝子中の標的位置との相同性を有するテンプレート核酸を用いて、標的配列の構造を改変する（例えば、内在性遺伝子の標的位置に存在する突然変異を修正する）ことができる。テンプレート配列を用いて、不要な構造、例えば、不要なまたは突然変異ヌクレオチドを改変することができる。
【０５３８】
テンプレート核酸は、典型的に、以下の構成要素：
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］
を含む。
【０５３９】
相同性アームは、染色体への組換え、従って、置換配列による、望ましくないエレメント、例えば、突然変異またはシグネチャの置換を提供する。特定の実施形態では、相同性アームは、最も遠位の切断部位とフランキングする。
【０５４０】
特定の実施形態では、５’相同性アームの３’末端は、置換配列の５’末端に隣接する位置である。一実施形態では、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド５’側に延在し得る。
【０５４１】
特定の実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、置換配列の３’末端に隣接する位置である。一実施形態では、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド３’側に延在し得る。
【０５４２】
特定の実施形態では、標的位置で１つまたは複数のヌクレオチドを改変する（例えば、突然変異を修正する）ために、相同性アーム、例えば、５’および３’相同性アームは、各々、最も遠位のｇＲＮＡ（例えば、標的位置（例えば、突然変異）両側の１０００塩基対の配列にフランキングする約１０００塩基対の配列を含み得る。
【０５４３】
本明細書では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復エレメントまたはＬＩＮＥエレメントの含有を回避するために、一方または双方の相同性アームを短縮し得ることが考慮される。例えば、配列反復エレメントを回避するために、５’相同性アームを短縮してよい。他の実施形態では、配列反復エレメントを回避するために、３’相同性アームを短縮してもよい。いくつかの実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの双方を短縮してもよい。
【０５４４】
本明細書では、標的位置の配列を改変する（例えば、突然変異を修正する）ためのテンプレート核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として使用するためにデザインされ得ることが検討される。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’および３’相同性アームは、約２００塩基対長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００塩基対長の範囲であってよい。オリゴヌクレオチド合成の改善が継続して実施されるため、より長い相同性アームもｓｓＯＤＮに検討される。いくつかの実施形態では、より長い相同性アームは、化学合成以外の方法、例えば、長い二本鎖核酸を変性させた後、例えば、固体支持体に固定させた鎖特異的配列に対するアフィニティにより鎖の一方を精製することによって実施される。
【０５４５】
理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸が、ニックの５’側に（すなわち、ニック鎖の５’方向に）延在する相同性を有するとき、より効率的に進行する。従って、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、長い相同性アームと短い相同性アームを有し、ここで、長い方の相同性アームが、ニックの５’側にアニールすることができる。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックから、または置換配列の５’もしくは３’末端から、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックの３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％長い。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックの３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍長い。ｓｓＤＮＡテンプレートが、インタクトな鎖または切断鎖にアニールすることができるか否かに応じて、ニックの５’側にアニールする相同性アームは、それぞれｓｓＤＮＡテンプレートの５’末端またはｓｓＤＮＡテンプレートの３’末端に位置し得る。
【０５４６】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックの５’側に延在する相同性を有するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、５’相同性アームと３’相同性アームは、実質的に同じ長さであってよいが、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠くに延在し得る。いくつかの実施形態では、置換配列は、ニックの３’末端よりもニックの５’末端側に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、２倍、３倍、４倍、または５倍遠くに延在する。
【０５４７】
理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸がニックの中心に位置するとき、より効率的に進行する。従って、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ほぼ同じサイズである２つの相同性アームを有する。例えば、テンプレート核酸の第１の相同性アームは、テンプレート核酸の第２の相同性アームの１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内の長さを有し得る。
【０５４８】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックの両側でほぼ同じ距離だけ延在するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、相同性アームは、異なる長さを有してよいが、置換配列は、これを補償するように選択され得る。例えば、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠く延在し得るが、ニックの５’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの３’側の相同性アームより短い。その逆も可能であり、例えば、置換配列は、ニックの５’側よりもニックの３’側で、より遠くに延在し得るが、ニックの３’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの５’側の相同性アームより短い。
【０５４９】
例示的なテンプレート核酸
好ましい実施形態では、また、遺伝子変換を介してＤＮＡ修復を増大するために、テンプレート核酸は、内在性相同領域である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。他の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖部分と二本鎖部分を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の両側に、約５０〜１００、例えば、５５〜９５、６０〜９０、６５〜８５、または７０〜８０塩基対の相同性を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックもしくは置換配列の５’側、ニックもしくは置換配列の３’側、またはニックもしくは置換配列の５’および３’側の双方に約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｂｐの相同性を含む。
【０５５０】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の３’側に約１５０〜２００塩基対、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、もしくは１７０〜１８０塩基対の相同性を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の３’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、もしくは２００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、もしくは１０塩基対未満の相同性を含む。
【０５５１】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の５’側に約１５０〜２００塩基対、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、もしくは１７０〜１８０塩基対の相同性を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１８０、１８５、１９０、１９５、もしくは２００塩基対の相同性を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の３’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、もしくは１０塩基対未満の相同性を含む。
【０５５２】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、これは、標的核酸に付加されるか、または標的核酸中の変化をテンプレートする。他の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置を改変するのに用いられ得るヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、例えば標的位置などの標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
【０５５３】
テンプレート核酸は、置換配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、３’
相同性アームを含む。
【０５５４】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、直鎖二本鎖ＤＮＡである。長さは、例えば、約１５０〜２００塩基対、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対以下である。いくつかの実施形態では、二本鎖テンプレート核酸は、約１６０、例えば、１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０塩基対の長さを有する。
【０５５５】
テンプレート核酸は、直鎖一本鎖ＤＮＡであり得る。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、（ｉ）標的核酸の切断鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉ）標的核酸のインタクトな鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、またはこれらの２つ以上である。長さは、例えば、約１５０〜２００ヌクレオチド、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、一本鎖テンプレート核酸は、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０ヌクレオチドの長さを有する。
【０５５６】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、環状二本鎖ＤＮＡ、例えば、プラスミドである。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいは、ニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０５５７】
特定の実施形態では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復エレメントまたはＬＩＮＥエレメントの含有を回避するために、一方または双方の相同性アームを短縮してもよい。例えば、配列反復エレメントを回避するために、５’相同性アームを短縮してもよいし、配列反復エレメントを回避するために、３’相同性アームを短縮してもよい。いくつかの実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの双方を短縮してもよい。
【０５５８】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、アデノウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされることを可能にする長さおよび配列のｓｓＤＮＡ分子である。ベクターは、例えば、５ｋｂ未満であってよく、キャプシド中へのパッケージングを促進するＩＴＲ配列を含んでもよい。ベクターは、組み込み欠陥であってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約１５０〜１０００ヌクレオチドの相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、多くとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。
【０５５９】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、レンチウイルスベクター、例えば、ＩＤＬＶ（組み込み欠陥レンチウイルス）である。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいは、ニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０５６０】
一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、または５０のサイレント突然変異を含んでもよい。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、または５０のサイレント突然変異を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、または５０のサイレント突然変異を含んでよい。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、または５０のサイレント突然変異を含む。
【０５６１】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＨＤＲ事象に参加することによって標的位置の構造を改変する。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を改変する。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾または非天然ヌクレオチド塩基の組み込みをもたらす。
【０５６２】
典型的に、テンプレート配列は、標的配列による切断媒介性または触媒による組換えを受ける。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介性切断事象によって切断される標的配列上の１部位に対応する配列を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、第１のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第１部位と、第２のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第２部位の両方に対応する配列を含む。
【０５６３】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、翻訳配列のコード配列に改変をもたらす配列、例えば、突然変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に形質転換する、野生型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子に形質転換する、および／もしくは停止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス突然変異などの、例えば、タンパク質産物中の１アミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらす配列を含み得る。
【０５６４】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、非コード配列の改変、例えば、エキソンあるいは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域に改変をもたらす配列を含み得る。このような改変として、制御エレメント、例えば、プロモーターもしくはエンハンサーの改変、またはシス作用もしくはトランス作用制御エレメントの改変が挙げられる。
【０５６５】
いくつかの実施形態では、標的位置の相同性を有するテンプレート核酸を用いて、標的配列の構造を改変することができる。テンプレート核酸配列を用いて、不要な構造、例えば、不要なまたは突然変異ヌクレオチドを改変することができる。
【０５６６】
いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、約５〜１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、約１０〜１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、約２０〜１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【０５６７】
いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、約５〜１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、約１０〜１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、約２０〜１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【０５６８】
本明細書では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復エレメント、ＬＩＮＥエレメントの含有を回避するために、一方または双方の相同性アームを短縮し得ることが検討される。例えば、配列反復エレメントを回避するために、５’相同性アームを短縮してよい。一実施形態では、配列反復エレメントを回避するために、３’相同性アームを短縮してもよい。一実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの双方を短縮してもよい。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、少なくとも５０ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、少なくとも１００ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。いくつかの実施形態では、５’相同性アームの長さは、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、少なくとも５０ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、少なくとも１００ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。いくつかの実施形態では、３’相同性アームの長さは、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるが、反復エレメントを含有するのに十分な長さではない。
【０５６９】
本明細書では、突然変異を修正するためのテンプレート核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドとして使用するためにデザインされ得ることが考慮される。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’および３’相同性アームは、約２００塩基対長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００塩基対長の範囲であってよい。オリゴヌクレオチド合成の改善が継続して実施されることから、より長い相同性アームもｓｓＯＤＮに対して考慮される。
【０５７０】
テンプレート核酸におけるサイレント突然変異
本明細書では、Ｃａｓ９は、恐らく相同組換え修復（例えば、相同組換え）前または後のいずれかで供与体構築物を切断し、これにより、対象染色体遺伝子座で、考えられる非相同末端結合事象、さらにはＤＮＡ配列突然変異を引き起こすと考えられる。従って、Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復前および／または後の供与体配列の切断を回避するために、いくつかの実施形態では、サイレント突然変異が導入された代替バージョンの供与体配列を使用してもよい。これらのサイレント突然変異は、Ｃａｓ９結合および切断を破壊するが、修復遺伝子のアミノ酸配列は破壊しない。
【０５７１】
Ｖ．２  遺伝子ターゲッティングのためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、ＮＨＥＪ媒介性欠失を使用して、標的遺伝子の全部または一部を欠失させる。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、対象遺伝子中の配列を除去する（例えば、欠失させる）のにも使用され得る。
【０５７２】
理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去、例えば、切除がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
【０５７３】
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て；最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐを超える範囲であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、４７、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００塩基対長以上である。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされている。
【０５７４】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それはまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁に望まれないヌクレオチドにおよび、したがってそれを除去する。より大型のＤＮＡ断片の欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に、インデル変異をなおも生成してもよい。
【０５７５】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルが生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の転写開始部位直後の配列を含む。
【０５７６】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる特定の実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡが、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
【０５７７】
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つのｇＲＮＡが、２つの一本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡが、標的位置のヌクレオチドにＮＨＥＪ修復を提供するように、２つの一本鎖切断を配置させるように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。特定の実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される。
【０５７８】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の両側に生成されて、２つの切断で核酸配列が除去されてもよい（例えば、２つの切断間の領域が欠失される）。特定の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される。特定の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置されるように構成される。他の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じるように構成される。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０５７９】
Ｖ．３  標的化ノックダウン
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Ｃａｓ９分子の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、触媒能のないＣａｓ９（本明細書において「ｅｉＣａｓ９」と称され、死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９分子としてもまた知られている）の生成をもたらす。ｅｉＣａｓ９はｇＲＮＡと複合体形成して、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって特定化されたＤＮＡ配列に局在するが、それは標的ＤＮＡを切断しない。ｅｉａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。ｅｉＣａｓ９それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写をブロックすることができるが、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＥＲＤ）をｅｉＣａｓ９に融合させて（本明細書では「Ｃａｓ９−受容体」と呼ばれる）、転写抑制ドメインを、標的ノックダウン位置、例えば、開始コドンの配列３’の１０００塩基対または遺伝子の開始コドンのプロモーター領域５’の５００塩基対内に動員することによって達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域（ＤＨＳ）は、ｅｉＣａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、恐らくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされ得る。特に遺伝子抑制については、内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。特定の実施形態では、１つまたは複数の内在性転写因子の結合をブロックするために、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を用いてもよい。いくつかの実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子をクロマチン改変タンパク質に融合させてもよい。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。クロマチン状態を改変するために、１つまたは複数のクロマチン改変タンパク質に融合した１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を用いてもよい。
【０５８０】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）に、および／または標的ＤＮＡの発現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、標的化され得る。
【０５８１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、望まれない対立遺伝子または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のＤＮＡ配列を切断して変異を引き起こし得るのに対し、Ｃａｓ９リプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Ｃａｓ９リプレッサーのオフターゲット効果が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、Ｃａｓ９リプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもはや存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復元する可能性が高い。
【０５８２】
Ｖ．４  一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
【０５８３】
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を改変または修正するのにテンプレート核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
【０５８４】
Ｖ．５  その他のＤＮＡ修復経路
ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０５８５】
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢｒを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢｒタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ機能を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０５８６】
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は損傷を受けているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、およびおよび／または損傷を受けた５’末端をリン酸部分に、回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
【０５８７】
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｃｕｌｅａｓｅ）１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
【０５８８】
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
【０５８９】
時に、ＳＳＢＲは、複製−共役する。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、ＤＮＡポリメラーゼイプシロン、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
【０５９０】
ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を包含する：切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Ｌｉ  ２００８に記載され、概要は、本明細書で提供される。
【０５９１】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
【０５９２】
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
【０５９３】
ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する。）これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を制御する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ  Ｐｏｌデルタ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
【０５９４】
塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０５９５】
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への所望のヌクレオチド挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
【０５９６】
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、段階３の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１個のヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８個のヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌデルタ、Ｐｏｌイプシロン、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
【０５９７】
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する加的な詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
【０５９８】
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行するこのプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  ＰｏｌεまたはＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップの実行のために、自己複製細胞が、ＤＮＡ  ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを利用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびｔｈｅＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を利用する傾向がある。
【０５９９】
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。ＮＥＲ修復経路を促進してもよい追加的要素としては、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡが挙げられる。
【０６００】
鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
【０６０１】
その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
【０６０２】
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
【０６０３】
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
【０６０４】
Ｖ．６  ゲノム編集法におけるｇＲＮＡの例
本明細書に記載されるようなｇＲＮＡ分子を二本鎖切断または一本鎖切断を生成するＣａｓ９分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核酸の配列が改変され得る。これらの方法で有用なｇＲＮＡ分子は、以下に記載される。
【０６０５】
特定の実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される；
ａ）それは、例えば、二本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、二本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように配置され得る；
ｂ）それは、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有する；
（ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含み；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み；または
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む。
【０６０６】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、またはｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
【０６０７】
特定の実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される；
（ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
（ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）、１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有し；
（ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｉｉ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または個の５４ヌクレオチドなどの第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含み；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み；または
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインなどの天然テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む。
【０６０８】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）；またはａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
【０６０９】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異を８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ８６３Ａ変異などの変異をＮ８６３に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ５８０Ａ変異などの変異をＮ５８０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１３】
一実施形態では、例えば、第１および第２のｇＲＮＡを含む１対のキメラｇＲＮＡなどの１対のｇＲＮＡは、それらが、以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される；
ａ）ｇＲＮＡ分子の片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有する；
（ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含み；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み；または
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、または４０個のヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む；
（ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、０〜５０、０〜１００、０〜２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０ヌクレオチドによって隔てられるように構成される；
（ｅ）第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡによって生成される切断が、異なる鎖上にある；
（ｆ）ＰＡＭが外側を向く。
【０６１４】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｅ；またはａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含むように構成される。
【０６１５】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１６】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａ変異などの変異をＨ８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１７】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ８６３Ａ変異などの変異をＮ８６３に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＮ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１８】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ５８０Ａ変異などの変異をＮ５８０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６１９】
ＶＩＩ．幹細胞
Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体など）、および任意選択的に供与体テンプレート核酸を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するために、細胞を操作することができる。しかしながら、幹細胞は、処理するのが特に難しく、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの外来分子の導入は、典型的に、非常に高い細胞死率および低い細胞生存率を招く。従って、驚くことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素への曝露に応答して、高い幹細胞生存の可能性および低い細胞死率をもたらす方法が、本明細書に開示される。
【０６２０】
一実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような標的遺伝子を編集する（例えば、変異を導入する）ことによって操作される。一実施形態では、１つまたは複数の非コード配列の編集、例えば、イントロンあるいは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域における改変によって、細胞、または細胞の集団を操作する。一実施形態では、例えば、プロモーター、エンハンサー、またはシス作用もしくはトランス作用制御エレメントなどの制御エレメントの配列を編集することによって、細胞、または細胞の集団を操作する。一実施形態では、例えば、１つまたは複数のコード配列の編集、例えば、エキソンにおける改変によって、細胞、または細胞の集団を操作する。いくつかの実施形態では、細胞、または細胞の集団をインビトロで操作する。他の実施形態では、細胞、または細胞の集団を生体外で操作する。いくつかの実施形態では、細胞、または細胞の集団を生体内で操作する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の標的遺伝子）の発現は、例えば、生体内で調節する。他の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の標的遺伝子）の発現は、例えば、生体外で調節する。他の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の標的遺伝子）の発現は、例えば、インビトロで調節する。
【０６２１】
一実施形態では、細胞、または細胞の集団は、例えば、本明細書に記載されているような標的遺伝子を編集する（例えば、そこに突然変異を誘導する）ことによって、操作する。一実施形態では、標的遺伝子の発現は、例えば、生体内で調節する。別の実施形態では、標的遺伝子の発現は、例えば、生体外で調節する。
【０６２２】
本明細書に記載されるＣａｓ９、ｇＲＮＡ、および任意選択的に供与体テンプレート核酸は、幹細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹／前駆細胞である。特定の実施形態では、造血幹／前駆細胞は、優先的に標的化され、例えば、標的化細胞の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、造血幹／前駆細胞である。例えば、生体内送達の場合には、造血幹／前駆細胞が優先的に標的化され、細胞を生体外で処理した後、対象に投与すると、造血幹／前駆細胞は、優先的に修飾される。特定の実施形態では、幹細胞は、循環血球、例えば、網状赤血球、巨核球・赤芽球前駆（ＭＥＰ）細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ球系前駆（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣもしくはＨＳＰＣ）、または内皮細胞（ＥＣ）である。特定の実施形態では、ＨＳＣは、ＨＳＣ前駆細胞を含む。特定の実施形態では、ＨＳＣは、造血幹細胞を含む。他の実施形態では、ＨＳＣは、造血幹細胞前駆細胞および造血幹細胞を含む。特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球系細胞（例えば、赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄前駆細胞、ＬＰ細胞、赤芽球前駆（ＥＰ）細胞、造血幹／前駆細胞、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、血管内皮（ＨＥ）細胞、間葉系幹細胞）である。特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄前駆細胞（例えば、一般骨髄前駆（ＣＭＰ）細胞または顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）である。特定の実施形態では、幹細胞は、リンパ球前駆細胞、例えば、一般リンパ球前駆（ＣＬＰ）細胞）である。特定の実施形態では、幹細胞は、赤血球系前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。特定の実施形態では、幹細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞、または系列特異的前駆細胞（ＬＲＰ）細胞）である。特定の実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞または胎盤造血ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、動員末梢血造血ＣＤ３４＋細胞（動員剤、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒで患者が処置された後）である。特定の実施形態では、幹細胞は、末梢血内皮細胞である。
【０６２３】
特定の実施形態では、幹細胞は、生体外で操作された後、対象に投与される。生体外操作のための幹細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。生体外操作のための幹細胞のその他の起源としては、例えば、異種ドナー血液、臍帯血、または骨髄が挙げられる。
【０６２４】
特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、対象から採取され、前述のように生体外で（例えば、遺伝子の編集により）操作された後、この細胞が対象に戻される。例えば、特定の実施形態では、骨髄系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で（例えば、遺伝子の編集により）操作された後、この骨髄系前駆細胞は対象に戻される。特定の実施形態では、赤血球系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この赤血球系前駆細胞は対象に戻される。特定の実施形態では、リンパ球系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、このリンパ球前駆細胞は対象に戻される。特定の実施形態では、複能性前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この造血幹細胞は対象に戻される。特定の実施形態では、造血幹／前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この造血幹／前駆細胞は対象に戻される。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋造血幹細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、このＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞は対象に戻される。
【０６２５】
特定の実施形態では、生体外で作製された修飾ＨＳＣは、骨髄破壊的前処置なしで対象に投与される。他の実施形態では、生着の後、造血細胞の一部が修飾ＨＳＣに由来するように、修飾ＨＳＣは、軽度の骨髄破壊的前処置の後に投与される。また別の実施形態では、生着の後、造血細胞の１００％が修飾ＨＳＣに由来するように、修飾ＨＳＣは、完全な骨髄破壊後に投与される。好適な細胞としては、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、血管内皮（ＨＥ）細胞（造血幹細胞および内皮細胞双方の前駆体）、および間葉系幹細胞などの幹細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞またはｉＰＳ細胞由来の細胞、例えば、対象から作製されるｉＰＳ細胞であり、これらは、本明細書に開示される方法を用いて修飾されて、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、赤血球系前駆細胞、複能性前駆細胞、または造血幹／前駆細胞などの臨床的に重要な細胞に分化される。また、好適な細胞には、造血幹細胞に分化される内皮細胞または羊膜細胞も含まれ得る。
【０６２６】
一実施形態では、ウイルスベクターを用いて、幹細胞に形質導入する。一実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６およびＡＡＶＤＪ）を幹細胞に形質導入する。一実施形態では、レンチウイルスベクターまたは組み込み欠陥レンチウイルスベクターを用いて、幹細胞に形質導入する。一実施形態では、リボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡ）を用いて、幹細胞を形質移入する。一実施形態では、タンパク質（例えば、Ｃａｓ９分子）およびリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子）を用いて、幹細胞を形質移入する。一実施形態では、リボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）を用いて、幹細胞を形質移入する。一実施形態では、デオキシリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、または双方をコードするＤＮＡ）を用いて、幹細胞を形質移入する。
【０６２７】
本明細書に記載される方法により生成される細胞は即座に使用してもよい。あるいは、細胞を凍結し（例えば、液体窒素で）、後の使用まで保存してもよい。細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般に用いられている溶液などいずれか他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍するために当該技術分野で公知の方法で解凍される。また、細胞は、長期保存のために熱安定化（例えば、４℃で）してもよい。
【０６２８】
ＶＩＩＩ．送達、製剤化および投与経路
例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）などの構成要素、ならびに供与体テンプレート核酸、または３つ全ては、多様な形態で送達、製剤化、または投与することができ、例えば、表６および７を参照されたい。特定の実施形態では、１つのＣａｓ９分子と２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子は、例えば、ＡＡＶベクターによって送達される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列と、２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ構成要素が送達され、ＤＮＡにコードされる場合、このＤＮＡは、典型的に、発現を実施するための制御領域（例えば、プロモーターを含む）を含むであろう。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＳＦＦＶ、ＥＦＳ、ＥＦ−１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、およびＣＢＨプロモーター、または血球特異的プロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。ｇＲＮＡの有用なプロモーターとしては、Ｔ７、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、Ｕ６、Ｕ１、およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度を有するプロモーターを選択して、構成要素の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列は、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
【０６２９】
表６に、構成要素を製剤化、送達、または投与する方法の例を記載する。
【０６３０】
【表１９】
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【０６３１】
【表２０】
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【０６３２】
表７は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステム構成要素の様々な送達方法を要約する。
【０６３３】
【表２１】
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【０６３４】
Ｃａｓ９分子およびもしくは１つまたは複数のｇＲＮＡ分子ならびに／または供与体テンプレートのＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）、ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、供与体テンプレート核酸、またはそれら（例えば、２つもしくは全て）の任意の組み合わせは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に、または細胞内に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびに供与体テンプレート核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合わせによって、送達することができる。
【０６３５】
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。供与体テンプレート分子も同様に、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。
【０６３６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【０６３７】
ベクターは、標的化される領域（例えば、標的配列）との高い相同性を有する、Ｃａｓ９分子および／もしくはｇＲＮＡ分子をコードする配列ならびに／または供与体テンプレートを含み得る。特定の実施形態では、供与体テンプレートは、標的配列の全部または一部を含む。例示的な供与体テンプレートは、修復テンプレート、例えば、遺伝子修正テンプレート、または遺伝子突然変異テンプレート、例えば、点突然変異（例えば、単一塩基（ｎｔ）置換）テンプレートである。ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０からの）を含み得る。
【０６３８】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、調節されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。別の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【０６３９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０６４０】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。他の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。他の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【０６４１】
一実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され；細胞型特異的受容体で改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、もしくは成長因子などの標的化リガンドを組み込むための１つまたは複数のウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または一端がウイルス糖タンパク質を認識すると共に、他端が幹細胞表面の１部分（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチンおよび化学共役）を認識する二重特異性を有する分子架橋を有するように改変され得る。
【０６４２】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレトロウイルスによって送達される。いくつかの実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするものなどの逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されるか、または欠失される。
【０６４３】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０６４４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えアデノウイルスによって送達される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
【０６４５】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、本明細書に記載されるような幹細胞などの宿主細胞のゲノムに、そのゲノムを組み込まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０６４６】
一実施形態では、本明細書に記載される方法で用いることができるＡＡＶキャプシドは、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ７ｍ８由来のキャプシド配列である。
【０６４７】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１由来のキャプシド配列と５０％以上、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列相同性を有する、再改変ＡＡＶキャプシドで送達される。
【０６４８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶキャプシドとしては、限定はしないが、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、またはＡＡＶ８Ｇ９が挙げられる。
【０６４９】
一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０６５０】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどのハイブリッドウイルスによって送達される。一実施形態では、ハイブリッドウイルスは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、またはＭＶＭと、ＡＡＶ（例えば、任意のＡＡＶ血清型の）とのハイブリッドである。
【０６５１】
パッケージング細胞が使用されて、幹細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。代表的なパッケージング細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または幹細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣａｓ９などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または幹細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、「Ｔｒｉｐｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」に記載されているように、パッケージング細胞株および／またはアデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含有するプラスミド、ならびにＡＡＶ由来のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするプラスミドによってトランスで供給することができる。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡは、アデノウイルス由来のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子を含有するプロデューサー細胞株にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスもしくはＨＳＶ）またはヘルパープラスミドは、ＡＡＶベクター複製と、ＩＴＲを有するヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【０６５２】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、または成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が幹細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０６５３】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、特異的幹細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと幹細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核エンベロープの分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【０６５４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照されたい）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０６５５】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０６５６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、ベクターと非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）とリポソームを結合させ、これによって、例えば、呼吸上皮細胞中に、ウイルスまたはリポソーム法単独のいずれよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０６５７】
前述したように、核酸は、（ａ）遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードする配列と、（ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列を含み得る。一実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、同じアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。本明細書に記載される組成物および方法のいずれかで使用することができる例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ８ベクターおよびＡＡＶ９ベクターが挙げられる。別の実施形態では、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し；（ｂ）は、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。また別の実施形態では、核酸分子は、さらに（ｃ）本明細書に記載される第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでもよい。一実施形態では、核酸分子は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む。（ａ）および（ｃ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、同じアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。
【０６５８】
別の実施形態では、（ａ）および（ｃ）は、異なるベクター上に存在する。例えば、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し；（ｃ）は、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在し得る。一実施形態では、第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターである。また別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の１つが、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上にコードされ；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２番目および３番目が、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上にコードされ得る。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０６５９】
一実施形態では、（ａ）は、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し；（ｂ）および（ｃ）は、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってよい。別の実施形態では、（ｂ）は、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し；（ａ）および（ｃ）は、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０６６０】
別の実施形態では、（ｃ）は、第１の核酸分子、例えば、第１のベクター、例えば、第１のウイルスベクター、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し；（ｂ）および（ａ）は、第２の核酸分子、例えば、第２のベクター、例えば、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってよい。
【０６６１】
別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在する。例えば、（ａ）は、第１の核酸分子上に、（ｂ）は、第２の核酸分子上に、また（ｃ）は、第３の核酸分子上に存在してもよい。第１、第２および第３の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０６６２】
別の実施形態では、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子が存在するとき、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在し得る。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在し得る。さらに別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｃ）（ｉｉｉ）の各々は、２つ以上の核酸分子であるが、５つ未満の核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在してもよい。
【０６６３】
別の実施形態では、（ｄ）テンプレート核酸が存在するとき、（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在し得る。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在し得る。さらに別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の各々は、２つ以上の核酸分子であるが、３つ未満の核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在してもよい。
【０６６４】
別の実施形態では、（ｄ）テンプレート核酸が存在するとき、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）および（ｄ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）および（ｄ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在し得る。さらに別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）および（ｄ）の各々は、２つ以上の核酸分子であるが、４つ未満の核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在してもよい。
【０６６５】
別の実施形態では、（ｄ）テンプレート核酸が存在するとき、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｄ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｄ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在し得る。さらに別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）および（ｄ）の各々は、２つ以上の核酸分子であるが、５つ未満の核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在してもよい。
【０６６６】
別の実施形態では、（ｄ）テンプレート核酸が存在するとき、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）および（ｄ）の各々は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。一実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）および（ｄ）の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、異なるウイルスベクター、例えば、異なるＡＡＶベクター上に存在し得る。さらに別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）および（ｄ）の各々は、２つ以上の核酸分子であるが、６つ未満の核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在してもよい。
【０６６７】
本明細書に記載される核酸は、（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、本明細書に記載されるプロモーターを含み得る。核酸分子は、（ｃ）の第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーター、例えば、本明細書に記載されるプロモーターをさらに含んでもよい。プロモーターと第２のプロモーターは、互いに異なる。一実施形態では、プロモーターと第２のプロモーターは、同じである。
【０６６８】
本明細書に記載される核酸は、（ｂ）のＣａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、本明細書に記載されるプロモーターをさらに含んでもよい。
【０６６９】
一実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。一実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。例示的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内のペイロードの捕捉）。代表的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質コーティングで被覆されたプロタミン核および酸複合体に加えて、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【０６７０】
遺伝子移入のための代表的脂質は、下で表８に示される。
【０６７１】
【表２２】
2018519801.tif 000028
【０６７２】
遺伝子移入のための代表的なポリマーは、下で表９に示される。
【０６７３】
【表２３】
2018519801.tif 000029
【０６７４】
一実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮａｃ））、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの幹細胞アップデートが増大される。一実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【０６７５】
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定組織を標的化する細菌；修飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスの生体外構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象（すなわち、患者）由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【０６７６】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数と同時に、送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子は、例えば、組み込み欠陥レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達することができ、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができるように、電気穿孔によって送達することができる。一実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、本明細書ＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。
【０６７７】
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される幹細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照されたい）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、幹細胞（例えば、本明細書に記載される幹細胞）による取り込みを促進する分子）と共役させることができる。
【０６７８】
一実施形態では、電気穿孔による送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、供与体テンプレート核酸分子と一緒に、もしくはこれなしで、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと細胞を混合し、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。一実施形態では、電気穿孔による送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、供与体テンプレート核酸分子と一緒に、もしくはこれなしで、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと細胞が混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、幹細胞（例えば、本明細書に記載される幹細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０６７９】
Ｃａｓ９の送達
Ｃａｓ９分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、ｂｙマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照されたい）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。Ｃａｓ９タンパク質は、幹細胞（例えば、本明細書に記載される幹細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０６８０】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子と、ドナー核酸ありまたはなしで混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子と、ドナー核酸ありまたはなしで混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、幹細胞（例えば、本明細書に記載される幹細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０６８１】
Ｃａｓ９タンパク質をｇＲＮＡ分子と組み合わせて、当該技術分野で公知の方法により、もしくは本明細書に記載のように、対象に投与されるか、または細胞に送達されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を細胞に直接送達すれば、核酸からの発現（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドの形質移入）の必要がなくなる。これはまた、核酸送達から生じるＤＮＡセグメントの不要な組み込み（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドの形質移入）も排除した。従って、これは、迅速な作用、高速ターンオーバー、高いオンターゲット修飾率、低いオフターゲット効果および細胞に対する低い毒性を提供する代替送達アプローチである。これは、細胞を形質移入するのが難しい（例えば、一次および多能性幹細胞を形質移入するのが難しい）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を送達するために使用することもできる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、通常、投与前に形成される（すなわち、事前に形成される）。複数の（例えば、２つ以上の）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が必要とされる場合、これらは、同時または順次送達（例えば、投与）することができる。一実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、電気穿孔によって細胞に送達される。
【０６８２】
投与経路
全身投与方法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路として、例えば、静脈内、髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、本明細書に記載される細胞、例えば、ＨＳＣ、または赤血球始原細胞もしくは前駆細胞を標的化するように、修飾または製剤化することもできる。
【０６８３】
局所投与方法として、例えば、骨梁への髄内注射、髄腔への大腿骨内注射、または門脈への注入が挙げられる。一実施形態では、極めて少量の構成要素（全身アプローチと比較して）は、全身（例えば、静脈内）に投与する場合と比較して、局所（例えば、骨髄中に直接）投与すれば、効果を及ぼし得る。局所投与方法は、治療有効量の構成要素を全身投与する場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減または排除することができる。
【０６８４】
投与は、定期的なボーラス（例えば、静脈内）として、または内部レザバーもしくは外部レザバー（例えば、静脈内バッグもしくは埋め込みポンプ）からの連続的注入として提供してもよい。構成要素は、例えば、徐放性薬物送達装置からの連続的放出によって局所投与してもよい。
【０６８５】
さらに、構成要素は、長期間にわたる放出を可能にするように、製剤化してもよい。放出系は、生分解性材料、または組み込まれた構成要素を拡散によって放出する材料からなるマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内に均一または不均一に分布することができる。多様な放出系が有用であるが、適切な系の選択は、具体的な適用により要求される放出速度に応じて変わり得る。非分解性および分解性放出系の双方を用いることができる。好適な放出系として、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または無機および有機賦形剤および希釈剤、例えば、限定はしないが、炭酸カルシウムおよび糖（例えば、トレハロース）などが挙げられる。放出系は、天然または合成のいずれであってもよい。しかしながら、一般的に、信頼性および再現性が高く、しかもより明確な放出プロフィールを生み出すことから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、様々な分子量を有する構成要素が、上記材料を介した拡散、またはその分解により放出されるように選択することができる。
【０６８６】
代表的な合成生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸グリコール酸共重合体、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；ならびにこれらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。代表的な合成非生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、その他のアリキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸などのビニルポリマー−ポリアクレートおよびポリメタクリレート、ならびにポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル）などのその他；ポリ（ウレタン）；アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々な酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；ポリシロキサン；ならびにこれらの任意の化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。
【０６８７】
また、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ミクロスフェアも注射に使用することができる。典型的に、ミクロスフェアは、乳酸およびグリコール酸のポリマーからなり、中空のスフェアを形成するような構造をしている。スフェアは、直径が約１５〜３０ミクロンであってよく、本明細書に記載される構成要素をロードすることができる。
【０６８８】
構成要素の２モードまたは差次的送達
Ｃａｓシステムの構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素の個別の送達、より具体的には、差次的モードによる構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することによって、性能を高めることができる。
【０６８９】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なるモード、または本明細書で差次的モードと呼ぶことがあるモードによって送達される。異なるまたは差次的モードは、本明細書の用法では、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、テンプレート核酸、またはペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性を付与する送達モードを指す。例えば、これらの送達モードにより、例えば、選択したコンパートメント、組織、または臓器において、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。
【０６９０】
例えば、細胞、または細胞の子孫において持続する核酸ベクターによる送達、例えば自立複製または細胞核酸への挿入による送達など、いくつかの送達モードは、構成要素のより持続的発現および存在をもたらす。例として、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどのウイルスによる送達がある。
【０６９１】
例として、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、送達される構成要素の、身体、または特定のコンパートメント、組織もしくは臓器において達成される半減期または持続性に関して異なるモードによって送達することができる。Ｃａｓ９分子構成要素は、身体、または特定のコンパートメントまたは組織もしくは臓器に対して、より低い持続性または曝露をもたらすモードによって送達することができる。
【０６９２】
より一般的には、一実施形態では、第１の送達モードを用いて、第１の構成要素を送達し、第２の送達モードを用いて、第２の構成要素を送達する。第１の送達モードは、第１の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。第２の送達モードは、第２の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。
【０６９３】
特定の実施形態では、例えば、分布、持続性、または曝露などの第１の薬力学的または薬物動態特性は、第２の薬力学的または薬物動態特性より限定されている。
【０６９４】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最小にするなど、最適化するように選択される。
【０６９５】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最大にするなど、最適化するように、選択される。
【０６９６】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、核酸、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスなどの比較的持続的な要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続的であるため、それらから転写された産物も比較的持続的となる。
【０６９７】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、比較的一過性の要素、例えば、ＲＮＡ分子またはタンパク質を含む。
【０６９８】
特定の実施形態では、第１の構成要素は、ｇＲＮＡ分子を含み、送達モードは、比較的持続的であり、例えば、ｇＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ｇＲＮＡは、単独で作用することができないため、これらの遺伝子の転写には生理学的結果がほとんどない。第２の構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、一過性様式で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、短い期間だけ存在し、活性である。
【０６９９】
さらに、構成要素は、互いに補完して、安全性および組織特異性を高める異なる分子形態で、または異なる送達ベクターを用いて送達することができる。
【０７００】
差次的送達モードの使用によって、性能、安全性および／または効率を高めることができ、例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドは、ＭＨＣ分子による細胞の表面に展示されるため、低持続性モードによる、例えばＣａｓ９分子などの免疫原性構成要素の送達は免疫原性を低減し得る。二部送達システムは、これらの問題を軽減し得る。
【０７０１】
差次的送達モードを用いて、異なっているが、オーバーラップする標的領域に構成要素を送達することができる。活性複合体の形成は、標的領域のオーバーラップの外側で最小にされる。従って、一実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ分子などの第１の構成要素は、第１の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第１の送達モードによって送達される。例えば、Ｃａｓ９分子などの第２の構成要素は、第２の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第２の送達モードによって送達される。一実施形態では、第１のモードは、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子、および例えばウイルスベクターなどの核酸から選択される第１の要素を含む。第２のモードは、上記の群から選択される第２の要素を含む。一実施形態では、第１の送達モードは、例えば、細胞特異的受容体もしくは抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達モードは、その要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、第２の細胞特異的受容体もしくは第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
【０７０２】
Ｃａｓ９分子をウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達する場合、単一の組織を標的化することだけが望ましいと考えられるとき、複数の組織への送達および複数の組織での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この課題を解決し、組織特異性を高めることができる。異なっているが、オーバーラップする組織屈性を有する別々の送達ビヒクル中にｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子をパッケージする場合、双方のベクターによって標的化された組織には、完全に機能性の複合体だけが形成される。
【０７０３】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、電気穿孔により幹細胞と接触させる。理論による拘束は望まないが、電気穿孔を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を幹細胞と接触させる場合、細胞を短時間低温ショックに付すことが特に有利であろう。本明細書の用法では、用語「低温ショック」または「低温ショックに付した」は、処理直前の環境と比較して低温環境に細胞を配置することを指す。一実施形態では、電気穿孔後、細胞を低温ショックに付す。一実施形態では、低温ショック温度は、約２７℃〜約３３℃である。一実施形態では、低温ショック温度は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３℃である。一実施形態では、低温ショック温度は、約３０℃〜約３２℃である。
【０７０４】
生体外送達
いくつかの実施形態では、表６に記載される構成要素を細胞に導入した後、これらの細胞を対象に導入する。構成要素を導入する方法は、表７に記載される送達方法のいずれかを含み得る。
【０７０５】
ＩＸ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡ分子などの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
【０７０６】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【０７０７】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０７０８】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【０７０９】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【０７１０】
一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
【０７１１】
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【０７１２】
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【０７１３】
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
【０７１４】
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０７１５】
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【０７１６】
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０７１７】
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【０７１８】
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
【０７１９】
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【０７２０】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【０７２１】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【０７２２】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【０７２３】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【０７２４】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【０７２５】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【０７２６】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【０７２７】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【０７２８】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【０７２９】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【０７３０】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【０７３１】
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【０７３２】
ウラシル
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウ���ジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０７３３】
シトシン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０７３４】
アデニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０７３５】
グアニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０７３６】
代表的修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。
【０７３７】
前述したように、また実施例において、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構成要素が、その５’末端またはその付近で修飾されているとき（例えば、ｇＲＮＡの５’末端が、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログの含有により修飾されるとき）、Ｔ細胞における遺伝子編集で、より効率的であることを見出した。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載されるこれらのｇＲＮＡおよび他の修飾ｇＲＮＡは、特定の循環細胞型（例えば、Ｔ細胞）からの低自然免疫応答を誘発すること、ならびにこれが、認められる改善の原因であり得ることが考えられる。
【０７３８】
本開示は、５’キャッピングｇＲＮＡで観察された改善が、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、または生体外転写ｇＲＮＡが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される場合など）。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する（例えば、修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチドおよび／または３’ポリＡ配列の含有により）１つまたは複数の修飾（例えば、修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチド）を含有してもよい。
【０７３９】
従って、一態様では、本明細書で考察される方法および組成物は、その５’末端またはその付近（例えば、それらの５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）で修飾されているｇＲＮＡを用いることによって遺伝子編集するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含み、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含み、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む。
【０７４０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、限定はしないが、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））の含有により修飾される。特定の実施形態では、５’キャップは、修飾グアニンヌクレオチドを含み、これは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りと連結されている。いくつかの実施形態では、５’キャップは、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含み、これらは、５’−５’三リン酸結合を介して連結されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化６】
2018519801.tif 000030
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化７】
2018519801.tif 000031
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’およびＹ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７４１】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７４２】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７４３】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化８】
2018519801.tif 000032
である。
【０７４４】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７４５】
一実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０７４６】
一実施形態では、Ｘ’およびＹ’は、Ｏである。
【０７４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化９】
2018519801.tif 000033
を有する。
【０７４８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１０】
2018519801.tif 000034
を有する。
【０７４９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１１】
2018519801.tif 000035
を有する。
【０７５０】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１２】
2018519801.tif 000036
を有する。
【０７５１】
一実施形態では、Ｘは、Ｓであり、ＹおよびＺは、Ｏである。
【０７５２】
一実施形態では、Ｙは、Ｓであり、ＸおよびＺは、Ｏである。
【０７５３】
一実施形態では、Ｚは、Ｓであり、ＸおよびＹは、Ｏである。
【０７５４】
一実施形態では、ホスホロチオエートは、Ｓｐジアステレオマーである。
【０７５５】
一実施形態では、Ｘ’は、ＣＨ２であり、Ｙ’は、Ｏである。
【０７５６】
一実施形態では、Ｘ’は、Ｏであり、Ｙ’は、ＣＨ２である。
【０７５７】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’四リン酸結合を介して連結される、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。
【０７５８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１３】
2018519801.tif 000037
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化１４】
2018519801.tif 000038
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７５９】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７６０】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７６１】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化１５】
2018519801.tif 000039
である。
【０７６２】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７６３】
一実施形態では、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０７６４】
一実施形態では、Ｘ’ Ｙ’、およびＺ’の各々は、Ｏである。
【０７６５】
一実施形態では、Ｘ’は、ＣＨ２であり、Ｙ’およびＺ’は、Ｏである。
【０７６６】
一実施形態では、Ｙ’は、ＣＨ２であり、Ｘ’およびＺ’は、Ｏである。
【０７６７】
一実施形態では、Ｚ’は、ＣＨ２であり、Ｘ’およびＹ’は、Ｏである。
【０７６８】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’五リン酸結合を介して連結される、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。
【０７６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１６】
2018519801.tif 000040
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化１７】
2018519801.tif 000041
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７７０】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７７１】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７７２】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化１８】
2018519801.tif 000042
である。
【０７７３】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７７４】
一実施形態では、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０７７５】
一実施形態では、Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、Ｏである。
【０７７６】
本明細書の用法では、用語「５’キャップ」は、伝統的なｍＲＮＡ５’キャップ構造を含むが、これらのアナログも含むと理解すべきである。例えば、上に示される化学構造によって含まれる５’キャップ構造に加えて、例えば、メチレン−ビス（リン酸）部分を有する四リン酸アナログ（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ，Ａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ７（２２）：４７６３−７６を参照）、非架橋酸素のイオウによる置換を有するアナログ（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，（２００７）ＲＮＡ  １３（１０）：１７４５−１７５５を参照）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸アナログ（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＲＮＡ  １０（９）：１４７９−１４８７を参照）、またはアンチリバースキャップアナログ（例えば、米国特許第７，０７４，５９６号明細書およびＪｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ  ９（９）：１  １０８−１  １２２  およびＳｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ  ７（１０）：１４８６−１４９５を参照）を使用してもよい。本出願はさらに、ＯＨまたはＯＭｅの代わりにハロゲン基を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，３０４，５２９号明細書を参照）；少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，１５３，７７３号明細書およびＫｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＲＮＡ  １４（６）：１  １  １９−１１３１を参照）；および少なくとも１つのボラノホスフェートまたはホスホロチオエート結合を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，５１９，１１０号明細書を参照）；ならびにアルキニル誘導体化５’キャップアナログ（例えば、米国特許第８，９６９，５４５号明細書を参照）の使用も包含する。
【０７７７】
通常、５’キャップまたはキャップアナログは、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写のどちらかの間に組み入れ得る。一実施形態では、５’キャップは使用されず、ｇＲＮＡ（例えば、生体外転写ｇＲＮＡ）が代わりにホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される。
【０７７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つまたは複数の（例えば、２５〜２００個の）アデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。ポリＡ配列は、ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルスゲノム）に含まれ得て、または化学合成中に、またはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用した生体外転写に続いて、ｇＲＮＡに付加され得る。
【０７７９】
本明細書で考察される方法および組成物は、ポリＡテール（本明細書では、ポリＡ配列とも呼ばれる）を含むｇＲＮＡ分子を用いることによって遺伝子編集するための方法および組成物も提供する。こうしたｇＲＮＡ分子は、例えば、ｇＲＮＡ分子前駆体のインビトロ転写後に、ポリアデノシンポリメラーゼを用いてｇＲＮＡ分子前駆体にポリＡテールを付加することにより、調製することができる。例えば、一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリメラーゼを用いて、ポリＡテールを酵素的に付加することができる。また、ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写によっても調製され得る。一実施形態では、限定的長さ（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１００、または１５０ヌクレオチド）のポリＡテールがＤＮＡテンプレート上にコードされて、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）を介してｇＲＮＡと共に転写される。ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼ（ｇＲＮＡ分子前駆体およびポリＡオリゴヌクレオチドと相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まない）を用いたインビトロ転写後に、ポリＡオリゴヌクレオチドをｇＲＮＡ分子前駆体と連結させることによって調製することもできる。例えば、一実施形態では、限定的長さのポリＡテール、一実施形態では、限定的長さ（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１００、または１５０ヌクレオチド）のポリＡテールは、合成オリゴヌクレオチドとして合成され、ｇＲＮＡの３’末端で、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼ（ガイドＲＮＡおよびポリＡオリゴヌクレオチドに相補的なスプリントオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まない）のいずれかと連結される。ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、１部または複数部として合成により調製することも可能であり、これらは、１つまたは複数のスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まないＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかによって互いに連結される。
【０７８０】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５０アデニンヌクレオチド未満、例えば、４５アデニンヌクレオチド未満、４０アデニンヌクレオチド未満、３５アデニンヌクレオチド未満、３０アデニンヌクレオチド未満、２５アデニンヌクレオチド未満または２０アデニンヌクレオチド未満を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５〜５０アデニンヌクレオチド、例えば、５〜４０アデニンヌクレオチド、５〜３０アデニンヌクレオチド、１０〜５０アデニンヌクレオチド、または１５〜２５アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、約２０アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８１】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００アデニンヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリＡテールは、５〜１００アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜８０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜７０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜６０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜５０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜４０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜３０アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８２】
別の実施形態では、ポリＡテールは、１５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、２５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、４５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、６５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８３】
別の実施形態では、ポリＡテールは、５〜７５アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、１０〜５０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、１５〜２５アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８４】
別の実施形態では、ポリＡテールは、２５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、３０〜７５アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、４０〜６０アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８５】
別の実施形態では、ポリＡテールは、４０〜９５アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、５５〜９０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリＡテールは、６０〜８５アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８６】
別の態様では、本明細書で考察される方法および組成物は、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡを用いることによって遺伝子編集するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの含有により、ｇＲＮＡに、非修飾ｇＲＮＡと比較して、特定の循環細胞型（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および／またはＢ細胞）での低減した自然免疫応答を誘発させる。
【０７８７】
このセクションで考察される例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内のどの位置に含有させてもよいが、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５、もしくは１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその付近（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、もしくは１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近の修飾とその３’末端またはその付近の修飾の双方を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、真核生物細胞に発現される遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含み、ここで、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端で修飾され、３’末端ポリＡテールを含む。ｇＲＮＡ分子は、例えば、５’三リン酸基が欠失してもよい（例えば、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している）。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、５’三リン酸基を除去し、かつ本明細書で記載するような３’ポリＡテールを含むように、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）での処理により修飾される。あるいは、ｇＲＮＡ分子は、５’キャップを含んでもよい（例えば、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む）。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、本明細書に記載されるような５’キャップ構造またはキャップアナログと３’ポリＡテールの双方を含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りと連結される修飾グアニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む（例えば、前述されるように）。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５〜５０アデニンヌクレオチド、例えば、５〜４０アデニンヌクレオチド、５〜３０アデニンヌクレオチド、１０〜５０アデニンヌクレオチド、１５〜２５アデニンヌクレオチド、３０アデニンヌクレオチド未満、２５アデニンヌクレオチド未満、または約２０アデニンヌクレオチドを含む。
【０７８８】
さらに別の実施形態では、本開示は、真核生物細胞で発現される遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子は、３０アデニンヌクレオチド未満（例えば、２５アデニンヌクレオチド未満、１５〜２５アデニンヌクレオチド、または約２０アデニンヌクレオチド）を含む３’ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、これらのｇＲＮＡ分子は、さらにその５’末端でも修飾される（例えば、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、５’リン酸基を除去するためにホスファターゼでの処理により修飾されるか、または５’キャップを含有するように修飾される）。
【０７８９】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端Ｕリボースで修飾してもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端および３’末端Ｕリボースが修飾される（例えば、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、５’リン酸基を除去するためにホスファターゼでの処理により修飾されるか、または５’キャップを含有するように修飾される）。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
【化１９】
2018519801.tif 000043
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
【０７９０】
【化２０】
2018519801.tif 000044
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０７９１】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシン、シチジンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシン、シチジンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシン、シチジンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【０７９２】
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡ分子に組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【０７９３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２）
ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
【０７９４】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【０７９５】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
【０７９６】
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡ分子に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡ分子に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【０７９７】
ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡｓ）は、天然細胞性１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどで、適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論による拘束は望まないが、この下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかにより起こると考えられる。例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡなどの本明細書で開示されるＲＮＡ種は、例えば、その３’ＵＴＲなどに、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型内の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ）の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
【実施例】
【０７９８】
以下の実施例は単なる例示であり、本明細書で提供される本開示の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
【０７９９】
実施例１：ｇＲＮＡのクローニングおよび最初のスクリーニング
候補ｇＲＮＡの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラｇＲＮＡについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーｇＲＮＡを評価するのにも使用され得る。
【０８００】
ベクターにｇＲＮＡをクローニングする
各ｇＲＮＡ毎に、１対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラｇＲＮＡの上流Ｕ６プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のＤＮＡを生成するために準備される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。
【０８０１】
直鎖ｄｓＤＮＡ分子中でｇＲＮＡをクローニングする（ＳＴＩＴＣＨＲ）
各ｇＲＮＡ毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。Ｕ６プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインをはじめとする、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む）は、別々にＰＣＲ増幅されて、ｄｓＤＮＡ分子として精製される。ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、Ｕ６およびｇＲＮＡスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ生成物）は、形質移入のために精製される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。任意のｇＲＮＡスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するＣａｓ９と適合性のｇＲＮＡが生成されてもよい。
【０８０２】
最初のｇＲＮＡスクリーニング
試験される各ｇＲＮＡは、プラスミド発現Ｃａｓ９および小量のＧＦＰ発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、９３Ｔ、Ｋ５６２またはＵ２ＯＳなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的（例えば、赤血球系細胞）に関連があってもよい。可能な治療幹細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内在性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
【０８０３】
形質移入は、（リポフェクタミンまたはＦｕｇｅｎｅなどの）脂質移入を使用して、または（ロンザヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）などの）電気穿孔によって実施されてもよい。形質移入に続いて、ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーのどちらかによって判定され、一貫した高レベルの形質移入が確認され得る。これらの予備形質移入は、異なるｇＲＮＡおよび異なる標的化アプローチ（１７量体、２０量体、ヌクレアーゼ、二重ニッカーゼなど）を含み、いずれのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ組み合わせが最大活性を与えるかが判定され得る。
【０８０４】
各ｇＲＮＡの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプアッセイまたは配列決定によって、標的遺伝子座におけるＮＨＥＪ誘導インデル形成を測定することで、評価されてもよい。代案としては、ＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなどのその他のミスマッチ感受性酵素もまた使用されてもよい。
【０８０５】
Ｔ７Ｅ１アッセイでは、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００〜７００ｂｐであり、意図される切断部位は、アンプリコン中に非対称的に配置される。ＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ検証に続いて、９５℃に加熱して、次に、緩慢に冷却することで、ＤＮＡは変性され再ハイブリダイズされる。ハイブリダイズＰＣＲ産物は、次に、非完全にマッチするＤＮＡを認識して切断する、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（またはその他のミスマッチ感受性酵素）で消化される。最初のテンプレートＤＮＡ中にインデルが存在する場合、アンプリコンは変性されて再アニールされ、それは異なるインデルを有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらし、ひいては完全にはマッチしない二本鎖ＤＮＡをもたらす。消化産物は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法によって視覚化されてもよい。切断されたＤＮＡの割合（切断および比切断密度で除した分解産物密度）を使用して、次の方程式を使用して、パーセントＮＨＥＪが推定されてもよい：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断割合）
１／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％ＮＨＥＪに至るまで感受性である。
【０８０６】
Ｔ７Ｅ１アッセイの代わりに、またはそれに加えて、配列決定が使用されてもよい。サンガー配列決定では、精製ＰＣＲアンプリコンがプラスミド骨格にクローン化され、形質転換されて、単一プライマーでミニプレップされて配列決定される。Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ比率を判定した後に、サンガー配列決定を使用して、インデルの正確な性質が判定されてもよい。
【０８０７】
配列決定はまた、次世代配列決定技術を使用して実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは３００〜５００ｂｐであってもよく、意図される切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低いＮＨＥＪ比率の検出を可能にする。
【０８０８】
実施例２：ＮＨＥＪによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【０８０９】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、所望の変異体（標的遺伝子のノックアウトまたは標的配列モチーフの除去のどちらか）を生成する遺伝子標的化効率が、配列決定によって判定されてもよい。サンガー配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、５００〜７００ｂｐ長であってもよい。次世代配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、３００〜５００ｂｐ長であってもよい。遺伝子機能のノックアウトが目的である場合、配列決定を使用して、遺伝子機能を破壊することが予期されるフレームシフトまたは大規模な欠失または挿入をもたらすＮＨＥＪ誘導インデルを、対立遺伝子の何パーセントが受けたかが評価されてもよい。特定の配列モチーフの除去が目的であれば、配列決定を使用して、この配列に広がる対立遺伝子の何パーセントが、ＮＨＥＪ誘導欠失を受けたかが評価されてもよい。
【０８１０】
実施例３：ＨＤＲによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡを選択することができる。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【０８１１】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、形質移入細胞の混合集団からゲノムＤＮＡを単離してもよく、ＰＣＲを使用して標的領域を増幅してもよい。ＰＣＲに続いて、遺伝子標的化効率を、いくつかの方法によって判定することができる。
【０８１２】
遺伝子標的化の頻度の決定は、細胞外から提供された供与体テンプレートまたは内在性ゲノム供与体配列を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）を受け、したがって、所望の修正を組み込んでいる対立遺伝子のパーセンテージを測定することを含む。所望のＨＤＲ事象が、制限酵素部位を生成または破壊する場合、遺伝子標的化の頻度は、ＲＦＬＰアッセイにより決定してもよい。制限部位が生成または破壊されない場合、配列決定を用いて、遺伝子標的化頻度を決定することもできる。ＲＦＬＰアッセイを使用する場合、やはり配列決定を用いて、所望のＨＤＲ事象を確認し、他の変異が存在しないことを確実にすることも可能である。細胞外から提供される供与体テンプレートを使用する場合、プライマーの少なくとも１つを相同性アームに含まれる領域外側の内在性遺伝子配列内に配置し、これによって、細胞中にまだ存在する供与体テンプレートの増幅を防止する。したがって、供与体テンプレート内に存在する相同性アームの長さは、ＰＣＲアンプリコンの長さに作用し得る。ＰＣＲアンプリコンは、供与体領域全体（相同性アームの外側に位置する双方のプライマー）に広がるか、またはこれらのアンプリコンは、供与体領域の一部のみと、供与体および内在性ＤＮＡ同士の単一結合とに広がる（１つの内部プライマーと１つの外部プライマー）。アンプリコンの広がりが、ドナー全体に満たない場合、２つの異なるＰＣＲを用いて、５’および３’結合の双方を増幅し、配列決定すべきである。
【０８１３】
ＰＣＲアンプリコンが短い（６００ｂｐ未満）場合、次世代配列決定を使用することが可能である。ＰＣＲの後、次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えば、Ｉｌｕｕｍｉｎａマルチプレックスアダプターおよびインデックス）を、例えば、ハイスループット配列決定（例えば、Ｉｌｕｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）に使用するために、アンプリコンの末端に付加してもよい。この方法は、非常に低い遺伝子標的化率の検出を可能にする。
【０８１４】
ＰＣＲアンプリコンが次世代配列決定には長すぎる場合、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定を実施することができる。サンガー配列決定のためには、精製されたＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローニングし（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングされたＴＯＰＯ）、形質転換し、ミニプレップした後、配列決定する。
【０８１５】
前述した同じまたは類似のアッセイを用いて、内在性ゲノム供与体配列によるＨＤＲを受け、従って、所望の修正を組み込んでいる対立遺伝子のパーセンテージを測定することができる。
【０８１６】
実施例４：ＣＣＲ５遺伝子座に標的化されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の試験
野生型ＣＣＲ５遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）は、通常、ＨＩＶ感染を受けやすいＨＩＶウイルスＨＳＣ子孫（例えば、マクロファージおよびＣＤ４Ｔリンパ球）の侵入を阻止する。臨床的に、ＣＣＲ５ケモカイン受容体のコード配列に遺伝子変異を含むＨＳＣの移植は、ＨＩＶ感染を長期間制御することが証明されている（Ｈｕｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９；３６０（７）：６９２−６９８）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームを用いたゲノム編集は、例えば、編集された遺伝子座での遺伝子発現の阻害をもたらし得る標的化切断部位にインデルを生成することによって、内在性遺伝子標的を正確に改変する。この実施例では、セクションＩＩ（ｇＲＮＡをデザインする方法）に記載される基準に基づいて選択された１１のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ｇＲＮＡ（表１０）を用いた遺伝子編集。
【０８１７】
ヒト２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡと、Ｕ６プロモーターから幹細胞において転写される別のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドで形質移入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、製造者の指示に従って）。形質移入に対して４８および７２時間の時点でゲノムＤＮＡを単離し、ＣＣＲ５遺伝子座ＰＣＲをｇＤＮＡで実施した後、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイによりインデルを分析した。表示する数値は、２つの反復測定値の平均値＋／−ｓ．ｄ．である（図１）。ＣＣＲ５遺伝子座のインデルを検出するために、形質移入からのゲノムＤＮＡサンプルから増幅したＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ産物についてＴ７Ｅ１アッセイを実施した後、ＣＣＲ５遺伝子座で検出されたインデルのパーセンテージを計算した。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＲ５ｇＲＮＡおよびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９プラスミドＤＮＡと接触させた細胞において、最大４０％のインデルが検出された。
【０８１８】
【表２４】
2018519801.tif 000045
【０８１９】
実施例５：サイトカインおよび小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１とヒト動員末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣとの接触は、細胞生存能力、寿命、およびＣＣＲ５ゲノム遺伝子座でのゲノム編集を改善した
この実施例では、ＣＤ３４＋細胞におけるゲノム編集を誘導するために、Ｃａｓ９と、ＣＣＲ５遺伝子座を標的化するｇＲＮＡとの共送達後のヒト動員末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるゲノム編集を評価した。
【０８２０】
動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からのヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、下記のサイトカイン：ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）（全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を各々１００ｎｇ／ｍＬ含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に解凍した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、細胞を３日間増殖させた。第３日に、ヒト１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよび４０ｎＭの小分子生存能力エンハンサーＵＭ１７１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏ）、ヒトＨＳＣ自己再生アゴニスト（Ｆａｒｅｓ  ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４；３４５（６２０３）：１５０９−１５１２）を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）と、培地を取り換えた。公開されたＵＭ１７１の使用には、生体外拡大のために、小分子への臍帯血ＨＳＣの長期間の曝露（１２日）が必要であった。この実験では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡプラスミドＤＮＡの送達前の２時間と、送達後の２４時間にわたり、ＨＳＣをＵＭ１７１に曝露した。このＵＭ１７１処理のプロトコルは、レンチウイルスベクター媒介性遺伝子送達前のＵＭ１７１による短時間の前処理が、ビヒクル（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）単独で処理したＨＳＣと比較して、ＨＳＣの生存能力を改善したことを示すパイロットスタディに基づくものであった。４０ｎＭのＵＭ１７１での２時間の前処理後、百万個のＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（商標）（Ｌｏｎｚａ）を用いて、製造者の指示に従い、Ａｍａｘａ（商標）４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）装置（Ｌｏｎｚａ）、Ｐｒｏｇｒａｍ  ＥＯ１００でヌクレオフェクト（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）した。手短には、百万個の細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液中に懸濁させた後、下記の量のプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に添加した：ヒトＵ６プロモーターからのＣＣＲ５ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５−Ｕ４３）を発現する１２５０ｎｇのプラスミドおよびＣＭＶプロモーターにより転写が調節される野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を発現する３７５０ｎｇのプラスミド。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよび４０ｎＭのＵＭ１７１を添加したＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）に細胞を播種した。一晩のインキュベーションの後、サイトカインを含むが、ＵＭ１７１を含まないＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）にＨＳＣを播種した。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、トリパンブルー色素排除法によってＣＤ３４＋細胞を計数し、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン−Ｖ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）−共役抗ヒトＣＤ３４抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ヒトＣＤ９０（いずれも、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）による同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球および骨髄血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能力を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１５００個の細胞を播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＣＣＲ５遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、ＨＳＣからゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。
【０８２１】
図２に示すように、小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１とＣＤ３４＋ＨＳＣの接触によって、Ｃａｓ９およびＣＣＲ５ｇＲＮＡプラスミドＤＮＡを用いたヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）（９６時間）後に幹細胞の表現型および生存能力が維持された。
【０８２２】
ＵＭ１７１、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＦＬによる前処理後にＣａｓ９およびＣＣＲ５ｇＲＮＡプラスミドでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣは、フローサイトメトリー分析により決定された通り、＞９３％の生存能力（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）を示すと共に、ＣＤ３４およびＣＤ９０の共発現を維持した（図２）。さらに、ＵＭ１７１処理したヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）細胞は分割することができ、非電気穿孔ＨＳＣで達成されたレベルと同様の細胞数の倍率変化で、ＣＤ３４＋ＨＳＣの変化があった（表１１）。対照的に、ＵＭ１７１前処理なしでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣは、生存能力が低下し、生存ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数にマイナスの倍率変化があった。
【０８２３】
【表２５】
2018519801.tif 000046
【０８２４】
ＣＣＲ５遺伝子座のインデルを検出するために、ヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣからのゲノムＤＮＡサンプルから増幅したＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ産物についてＴ７Ｅ１アッセイを実施した後、ＣＣＲ５遺伝子座で検出されたインデルのパーセンテージを計算した。ＵＭ１７１による前処理後にＣａｓ９およびＣＣＲ５ｇＲＮＡプラスミドでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣからのゲノムＤＮＡにおいて、２０％のインデルが検出された。
【０８２５】
ＨＳＣ力価および分化能力の維持を評価するために、ＣＤ３４＋ＨＳＣをＣＦＣアッセイにおいて播種してから２週間後、造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数、ならびに混合骨髄／赤血球（顆粒球−赤血球−単球マクロファージ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、骨髄（ＣＦＵ−マクロファージ（Ｍ）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ））および赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）コロニーを含む特定の血球表現型の頻度を計数することにより、ＨＳＣ子孫のスコアリングに基づいて造血活性を定量した。ＵＭ１７１前処理後にヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣは、非ヌクレオフェクト（ｕｎ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣと比較して、ＣＦＣ能力を維持した（表１２）。対照的に、ＵＭ１７１前処理なしでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣは、非ヌクレオフェクト（ｕｎ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣと比較して、ＣＦＣ能力が低下した（ＣＦＣ総数が低く、しかも混合表現型コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および赤血球コロニー（ＣＦＵ−Ｅ）の数が低い）。
【０８２６】
【表２６】
2018519801.tif 000047
【０８２７】
野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と単一ＣＣＲ５ｇＲＮＡプラスミドＤＮＡの共送達の送達は、細胞の生存能力、複能性、自己再生および分化能力を喪失することなく、ＣＤ３４＋ＨＳＣの２０％ゲノム編集を支持した。前処理およびＨＳＣ自己再生アゴニストＵＭ１７１との短時間（２４時間）の共培養は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＤＮＡでのヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後のＨＳＣ生存および増殖の維持に不可欠であった。臨床的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連方法により生成されるＣＣＲ５遺伝子に遺伝子変異を含むＨＳＣの移植を用いて、ＨＩＶ感染の長期制御を達成することができる。
【０８２８】
実施例６：サイトカインおよび小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１とヒト動員末梢血ＣＤ３４＋幹細胞との接触は、ＣＸＣＲ４ゲノム遺伝子座での細胞生存能力、生存期間、およびゲノム編集を改善した
この実施例では、小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１およびヒトサイトカインとの短時間の接触後に、ＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集を誘導するために、Ｃａｓ９と、ＣＸＣＲ４遺伝子座を標的化するｇＲＮＡとの共送達後のヒト動員末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるゲノム編集を評価した。この実施例では、ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡと組み合わせたＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９変異型を使用した。
【０８２９】
動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からのヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、下記のサイトカイン：ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）（全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を各々１００ｎｇ／ｍＬ含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に解凍した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、３日間細胞を増殖させた。第３日に、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ±４０ｎＭの小分子ＵＭ１７１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏ）を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭと、培地を取り換えた。この実験では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡプラスミドＤＮＡの送達前の２時間と、送達後の２４時間にわたって、ＨＳＣをＵＭ１７１に曝露した。ＵＭ１７１での２時間の前処理後、２×１０５個のＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（商標）（Ｌｏｎｚａ）の構成要素を用いて、製造者の指示に従い、Ａｍａｘａ（商標）４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）装置（Ｌｏｎｚａ）でヌクレオフェクト（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）した。手短には、２×１０５個のＣＤ３４＋細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液中に懸濁させ、下記の量のプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に添加した：ヒトＵ６プロモーターからＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−２３１；標的化ドメイン配列：ＧＣＧＣＵＵＣＵＧＧＵＧＧＣＣＣＵ；配列番号４９１）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−８３６；標的化ドメイン配列：ＧＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＵＡＧＡＧＧＡ；配列番号４９２）を発現する２５０ｎｇのプラスミド、これらは、ＣＭＶプロモーターにより各々調節される野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のいずれかを発現する７５０ｎｇのプラスミドとそれぞれペアとして組み合わせた。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬを、４０ｎＭのＵＭ１７１と共に、またはこれなしで添加したＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）に細胞を播種した。一晩のインキュベーションの後、サイトカインを含むが、ＵＭ１７１を含まないＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）にＨＳＣを播種した。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、トリパンブルー色素排除によってＣＤ３４＋細胞を計数し、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン−Ｖ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）−共役抗ヒトＣＤ３４抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ヒトＣＤ９０（いずれも、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）による同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球および��髄血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能力を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１５００個の細胞を播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＣＸＣＲ４遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、ＨＳＣからゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＸＣＲ４遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。
【０８３０】
図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、ＵＭ１７１で前処理したＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞数は、ｇＲＮＡ  ＣＸＣＲ４−８３６（配列番号４９２）およびＣＸＣＲ４−２３１（配列番号４９１）ｇＲＮＡとそれぞれ組み合わせたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｓａ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９を発現するプラスミドを用いたヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後に維持されると共に、ＣＸＣＲ４遺伝子座でのゲノム編集増大を示した。
【０８３１】
ＵＭ１７１による前処理後にＣａｓ９およびＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−２３１；配列番号４９１）プラスミドでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣは、フローサイトメトリー分析により決定された通り、＞９５％の生存能力（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）を示すと共に、ＣＤ３４およびＣＤ９０の共発現を維持した。さらに、ＵＭ１７１処理したヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）細胞が維持され、非電気穿孔ＨＳＣで達成されたレベルと同様の細胞数の倍率変化で、ＣＤ３４＋ＨＳＣの細胞数の倍率変化（増加）があった（図３Ａ）。対照的に、ＵＭ１７１前処理なしでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣは、生存能力が低下し、細胞数にマイナスの倍率変化（減少）があった。
【０８３２】
ＣＸＣＲ４遺伝子座のインデルを検出するために、ヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣからのゲノムＤＮＡサンプルから増幅したＣＸＣＲ４遺伝子座特異的ＰＣＲ産物についてＴ７Ｅ１アッセイを実施した後、ＣＸＣＲ４遺伝子座で検出されたＮＨＥＪのパーセンテージを計算した。ＵＭ１７１で前処理したＨＳＣは、ＵＭ１７１で前処理しなかったＨＳＣと比較して、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９およびＣＸＣＲ４ｇＲＮＡの送達後に細胞数の高い倍率変化およびＣＸＣＲ４遺伝子座でのゲノム編集の高いパーセンテージを示した（図３Ｂ）。
【０８３３】
ＨＳＣ力価および分化能の維持を評価するために、ＣＤ３４＋ＨＳＣをＣＦＣアッセイにおいて播種してから２週間後に、造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数、ならびに混合骨髄／赤血球（顆粒球−赤血球−単球マクロファージ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、骨髄（ＣＦＵ−マクロファージ（Ｍ）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ））および赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）コロニーを含む特定の血球表現型の頻度を計数することにより、ＨＳＣ子孫のスコアリングに基づいて造血活性を定量した。ＵＭ１７１で前処理した後、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９とＣＸＣＲ４−８３６ｇＲＮＡまたはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９とＣＸＣＲ４−２３１ｇＲＮＡのいずれかでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣは、非ヌクレオフェクト（ｕｎ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣと比較して、ＣＦＣ能力を維持した（表１３）。対照的に、ＵＭ１７１前処理なしで、ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡと組み合わせたいずれかのＣａｓ９変異型でヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣは、非ヌクレオフェクト（ｕｎ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣと比較して、ＣＦＣ能力が低下した（ＣＦＣ総数が低く、しかも混合表現型コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および赤血球コロニー（ＣＦＵ−Ｅ）の数が低い）。
【０８３４】
【表２７】
2018519801.tif 000048
【０８３５】
小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１との接触後に、野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９とＣＸＣＲ４−２３１ｇＲＮＡプラスミドＤＮＡまたはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９とＣＸＣＲ４−８３６ｇＲＮＡを共送達すると、細胞の生存能力、複能性、自己再生、または分化能力を喪失することなく、ＣＤ３４＋ＨＳＣの最大２５％ゲノム編集を支持した。前処理およびＨＳＣ自己再生アゴニストＵＭ１７１との短時間（２４時間）の共培養は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＤＮＡでのヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後のＨＳＣ生存および増殖の維持に不可欠であった。臨床的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連方法により生成されるＣＸＣＲ４遺伝子に遺伝子変異を含むＨＳＣの移植を用いて、ＨＩＶ感染の長期制御を達成することができる。
【０８３６】
実施例７：サイトカインおよび小分子細胞生存能力エンハンサーＵＭ１７１とヒト動員末梢血ＣＤ３４＋幹細胞との接触は、ｇＲＮＡの多重化後に、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５ゲノム遺伝子座での細胞生存能力、寿命、およびゲノム編集を改善した
野生型ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞もしくはＨＳＣとしても知られる）の移植は、通常ＨＩＶ感染を受けやすいＨＩＶウイルスＨＳＣ子孫（例えば、マクロファージおよびＣＤ４  Ｔリンパ球）の侵入を妨げる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームを用いた多重ゲノム編集は、２つの異なる切断部位にインデルを生成することによって、２つ以上の内在性遺伝子標的を正確に改変し、複数の編集遺伝子座での遺伝子発現のノックダウンを達成することができる。この実施例では、ＣＤ３４＋細胞において多重遺伝子編集を誘導するために、ＣＸＣＲ４遺伝子座を標的化する１つのｇＲＮＡおよびＣＣＲ５遺伝子座を標的化する１つのｇＲＮＡと、野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９との共送達後のヒト動員末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける多重ゲノム編集を評価した。
【０８３７】
動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からのヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、下記のサイトカイン：ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）（全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を各々１００ｎｇ／ｍＬ含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に解凍した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、細胞を３日間増殖させた。第３日に、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよび４０ｎＭの小分子ＵＭ１７１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏ）を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）で培地を取り換えた。この実験では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡプラスミドＤＮＡの送達前の２時間と、送達後の２４時間にわたって、ＨＳＣをＵＭ１７１に曝露した。ＵＭ１７１での２時間の前処理後、２×１０５個のＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（商標）（Ｌｏｎｚａ）の構成要素を用いて、製造者の指示に従い、Ａｍａｘａ（商標）４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）装置（Ｌｏｎｚａ）でヌクレオフェクト（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）した。手短には、２×１０５個のＣＤ３４＋細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液中に再懸濁させ、下記の量のプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に添加した：ヒトＵ６プロモーターからＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−２３１；配列番号４９１）を発現する２５０ｎｇのプラスミド、ヒトＵ６プロモーターからＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＣＲ５ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５−Ｕ４３；配列番号４９３）を発現する２５０ｎｇのプラスミド、およびＣＭＶプロモーターにより調節される野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を発現する７５０ｎｇのプラスミド。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよびＵＭ１７１を添加したＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭに細胞を再播種した。一晩のインキュベーションの後、サイトカインを単独で含むが、ＵＭ１７１を含まないＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）にＨＳＣを再播種した。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、トリパンブルー色素排除によってＣＤ３４＋細胞を計数し、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン−Ｖ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）−共役抗ヒトＣＤ３４抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ヒトＣＤ９０（いずれも、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）による同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球および骨髄血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）培地（Ｓ���ｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１５００個の細胞を播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）から９６時間後に、ＨＳＣからゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。
【０８３８】
図４Ａおよび４Ｂに示すように、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９を発現するプラスミド、１つのＣＸＣＲ４ｇＲＮＡおよび１つのＣＣＲ５ｇＲＮＡの共送達に基づくヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）後に、ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の有効な多重ゲノム編集が観察された。
【０８３９】
Ｃａｓ９ならびにＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４−２３１）およびＣＣＲ５（ＣＣＲ５−Ｕ４３）ｇＲＮＡプラスミドでヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣは、フローサイトメトリー分析により決定された通り、＞９０％の生存能力（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）を示すと共に、ＣＤ３４およびＣＤ９０の共発現を維持した。さらに、ヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）細胞数が維持され、非電気穿孔ＨＳＣで達成されたレベルと同様のＣＤ３４＋細胞数の倍率変化で、生存ＣＤ３４＋ＨＳＣの細胞数の倍率変化（増加）があった（図４Ａ）。
【０８４０】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５遺伝子座のインデルを検出するために、ヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣからのゲノムＤＮＡサンプルから増幅したＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ産物についてＴ７Ｅ１アッセイを実施した後、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５ゲノム遺伝子座で検出されたインデルのパーセンテージを計算した。ＣＤ３４＋ＨＳＣからのゲノムＤＮＡ中の２つの個別の標的化遺伝子座で、最大２２％のゲノム編集が検出された（図４Ｂ）。
【０８４１】
ＨＳＣ力価および分化能力の維持を評価するために、ＣＤ３４＋ＨＳＣをＣＦＣアッセイで播種してから２週間後に、造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数、ならびに混合骨髄／赤血球（顆粒球−赤血球−単球マクロファージ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、骨髄（ＣＦＵ−マクロファージ（Ｍ）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ））および赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）コロニーを含む特定の血球型の頻度を計数することにより、ＨＳＣ子孫のスコアリングに基づいて造血活性を定量した。ヌクレオフェクトした（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＳＣは、非ヌクレオフェクト（ｕｎ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（商標）ＨＳＣと比較して、ＣＦＣ能力を維持した（表１４）。
【０８４２】
【表２８】
2018519801.tif 000049
【０８４３】
野生型ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ、およびＣＣＲ５ｇＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドを共送達すると、細胞の生存能力、複能性、自己再生、および分化能を喪失することなく、２つの標的化遺伝子座での効率的なゲノム編集を支持した。臨床的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連多重化方法により生成されるＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４遺伝子の双方に遺伝子変異を含むＨＳＣの移植を用いて、ＨＩＶ感染の長期防御を達成することができる。
【０８４４】
実施例８：５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加によるｇＲＮＡの修飾は、標的ゲノム遺伝子座でのゲノム編集を増加すると共に、ＣＤ３４＋細胞生存能力および生存期間を改善する
ウイルス−宿主共進化の間に、ｍＲＮＡのキャッピングを模倣するウイルスＲＮＡキャッピングは進化して、ウイルスＲＮＡが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした（Ｄｅｌｃｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５１−６５）。造血幹／前駆細胞中のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖ＲＮＡの存在を感知する（Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，２０１５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２６：２０１−２０９）。初期実験の結果から、ＧＦＰｍＲＮＡ単独を用いて電気穿孔された細胞と比較して、非修飾標的特異的ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡを用いて電気穿孔されたヒト造血幹／前駆細胞は、細胞寿命、増殖能、複能性の低減（例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化）を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の幹細胞感知および自然免疫応答の誘導、さらにはこれに続くプログラム細胞死の誘導ならびに増殖能および分化能の喪失に起因すると仮定された。
【０８４５】
造血／幹前駆細胞におけるゲノム編集の最適化のために、ならびにこの仮定を検証する目的で、動員末梢血および骨髄由来のヒトＣＤ３４＋細胞を、５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加と共に、または付加なしで、インビトロ転写されたＨＢＢ（ＨＢＢ−８ｇＲＮＡ；配列番号３８８）またはＡＡＶＳ１（ｇＲＮＡ  ＡＡＶＳ１−１；配列番号４９４）標的化ｇＲＮＡと共送達されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡで電気穿孔した。
【０８４６】
図５Ａ〜５Ｃに示すように、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡの電気穿孔は、ヒトＣＤ３４＋細胞寿命および生存能力を高めた。ＣＤ３４＋細胞は、それぞれＣａｓ９ｍＲＮＡ（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓａ）Ｃａｓ９）と組み合わせた表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡで電気穿孔した。対照サンプルは、ＧＦＰｍＲＮＡ単独で電気穿孔された細胞または電気穿孔されていないが、表示の時間枠で培養した細胞を含む。
【０８４７】
単一のキャップおよびテールなしＨＢＢまたはＡＡＶＳ１ｇＲＮＡとそれぞれ組み合わせたＣａｓ９で電気穿孔したヒトＣＤ３４＋細胞は、５’キャップおよび３’ポリＡテールを含むようにインビトロで転写された同じｇＲＮＡ配列で電気穿孔した細胞と比較して、培養中の３日にわたって低い増殖能を示した（図５Ａ）。Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に送達された他のキャップおよびテール付加ｇＲＮＡ（ＨＢＢ（ＨＢＢ−８ｇＲＮＡ；配列番号３８８）、ＡＡＶＳ１（ＡＡＶＳ１−１ｇＲＮＡ；配列番号４９４）、ＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４−２３１ｇＲＮＡ；配列番号４９１）およびＣＣＲ５（ＣＣＲ−Ｕ４３ｇＲＮＡ；配列番号４９３）遺伝子座）に標的化されている）は、送達後３日にわたる生存ＣＤ３４＋細胞の総数の倍率変化の比較によって決定される通り、ＨＳＣ生存能力、増殖、または複能性にマイナスに影響を及ぼさなかった。重要なことには、ＧＦＰｍＲＮＡと接触させた細胞または非処理の細胞と比較して、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡと接触させたＣＤ３４＋細胞の増殖能に差はなかった。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡとの接触後７２時間時点での細胞生存能力の分析（７−アミノアクチノマイシンＤまたはヨウ化プロピジウムのいずれかとアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ抗体の同時染色、それに続くフローサイトメトリー分析による）から、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した細胞は、培養中に分化して、生存能力を維持したが、キャップおよびテールなしｇＲＮＡと接触させたＨＳＣは、生存細胞数に減少を示すことが判明した（図５Ｂ）。また、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した生存細胞（ヨウ化プロピジウム陰性）は、ＣＤ３４細胞表面マーカーの発現も維持した（図５Ｃ）。
【０８４８】
図６Ａ〜６Ｇに示すように、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップおよびテール付加ｇＲＮＡの電気穿孔は、ヒトＣＤ３４＋細胞における効率的な編集およびそれらの子孫を支持した。
【０８４９】
改善された生存期間に加えて、キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡと接触した幹細胞は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップ／テールなしｇＲＮＡと接触した細胞と比較して、より高いオンターゲットゲノム編集率（％インデル）も示した（図６Ａ）。さらに、キャップ／テール付加ｇＲＮＡを含むＣａｓ９ｍＲＮＡと接触したＣＤ３４＋細胞の子孫の方が、キャップ／テールなしｇＲＮＡを含むＣａｓ９ｍＲＮＡと接触したＣＤ３４＋細胞の子孫と比較して、より高いレベルの標的化編集が検出された（図６Ａ、ＣＦＣ）。キャップ／テールなしｇＲＮＡの送達は、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイで決定される通り、ＣＤ３４＋細胞の生体外造血能も低下した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に、キャップおよびテールなしｇＲＮＡと接触した細胞は、総コロニー形成能（例えば、力価）の喪失およびコロニーサブタイプの多様性の減少（例えば、赤血球および前駆細胞能の喪失ならびに子孫における骨髄マクロファージ表現型への歪み）を示した（図６Ｂ）。対照的に、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した細胞は、ＣＤ３４＋細胞から分化したコロニーの総数およびコロニー多様性（混合造血コロニー［ＧＥＭＭ］および赤血球コロニー［Ｅ］の検出）の双方に関してＣＦＣ能力を維持した。
【０８５０】
次に、キャップおよびテール付加ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡをいずれかのＣａｓ９ｍＲＮＡと共送達するか、またはＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）と複合体化した後、ＨＳＣの特定の特徴を模倣することが明らかにされた赤白血病細胞株であるＫ５６２細胞に電気穿孔した。キャップおよびテール付加ｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡまたはＲＮＰを共送達すると、ＨＢＢ遺伝子座ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１アッセイ分析によって決定される通り、ＨＢＢ遺伝子座で高レベルのゲノム編集がもたらされた（図６Ｃ）。次に、３つの異なるキャップおよびテール付加ｇＲＮＡ（ＨＢＢ、ＡＡＶＳ１、およびＣＸＣＲ４遺伝子座を標的化する）をＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に、臍帯血（ＣＢ）から単離されたＣＤ３４＋細胞に共送達した。この場合、様々な量のｇＲＮＡ（２もしくは１０μｇのｇＲＮＡおよび１０μｇのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）を細胞中に電気穿孔し、遺伝子座ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１アッセイ分析により標的遺伝子座でのゲノム編集のパーセンテージを評価した。対照的に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒にキャップおよびテールなしＨＢＢ  ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのゲノムＤＮＡにはＨＢＢ遺伝子座に切断が検出されなかった。この結果は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡとキャップおよびテール付加ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、増殖能およびコロニー形成能を維持することを示した。５〜２０％のインデルが標的遺伝子座で検出され、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ｇＲＮＡの量は、標的化編集のパーセンテージに影響しなかった（図６Ｄ）。Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した後の表示の遺伝子座特異的ＰＣＲ産物の代表的なゲル画像は、電気穿孔によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加遺伝子座特異的ｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、およびＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ）の送達から７２時間後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の標的化遺伝子座に切断を示している（図６Ｆ）。重要なことには、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡと接触しなかった細胞（すなわち、非処理対照）と比較して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡ、ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡ、もしくはＣＸＣＲ４特異的ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞の生存能力に差はなかった。フローサイトメトリー分析により決定される通り、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶについてのネガティブ染色法によって生存細胞が示される（フローサイトメトリープロットの左下部、図６Ｇ）。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡ、ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡ、またはＣＸＣＲ４特異的ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、ＣＦＣアッセイにより決定される通り、生体外造血コロニー形成能を維持した。ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡおよびＣａｓ９と接触した細胞についてのＣＦＣアッセイにおける生体外造血能のグラフを図６Ｅに示す。
【０８５１】
実施例９：ＨＢＢ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡと複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９リボ核タンパク質との接触は、成体型ヒト造血幹細胞におけるゲノム編集を支持する
非鎌状βヘモグロビン遺伝子（ＨＢＢ）を発現するレンチウイルスベクターで遺伝子修飾された、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症［ＳＣＤ］、βサラセミア）に罹患した患者から採取したオートロガスＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植は、機能性成体型ヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）の発現を回復し、したがって、形質導入ＣＤ３４＋細胞に由来する赤血球系細胞における鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳＳ）の形成を阻止すると共に、罹患した患者における臨床的症状を改善することが明らかにされている（Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｕｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏ，Ｊｕｎｅ  １３，２０１５，“ｂｌｕｅｂｉｒｄ  ｂｉｏ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｎｅｗ  Ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍａｊｏｒ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ＨＧＢ−２０５  ｓｔｕｄｙ  ａｔ  ＥＨＡ”）。しかしながら、非鎌状βヘモグロビンをコードするトランスジーンを送達しても、原因となる突然変異を修正せず、またはＨＢＢの突然変異型の発現（例えば、鎌状化）を阻止しない。さらに、ＣＤ３４＋細胞のレンチウイルスベクター形質導入は、細胞毎に複数のトランスジーン組み込み部位の発生を招く可能性があり、複数のトランスジーン組み込み部位の長期作用は現在のところ不明である。
【０８５２】
対照的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームを用いたゲノム編集は、編集遺伝子座での遺伝子破壊をもたらし得る切断部位に挿入または欠失（インデル）を生成することによって、内在性遺伝子標的を正確に改変することができる。ＨｂＳＳをコードする一塩基多型（ＳＮＰ）（例えば、グルタミン酸からバリンへのアミノ酸残基の変化をもたらす、ＧＡＧ→ＧＴＧ）に近位の領域を各々標的化する２つのｇＲＮＡの共送達が、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼと共送達されると、ヒト細胞株において低レベルの相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、ＤＮＡ修復テンプレートとして、ＨＢＤ遺伝子座における相同性領域を使用する遺伝子変換）を支持する。
【０８５３】
この実施例では、ＨＢＢ遺伝子座を標的化する２つのｇＲＮＡと、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼの共送達後の成体ヒト動員末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるゲノム編集を評価した。次に、編集ＣＤ３４＋細胞を骨髄および赤血球細胞に分化し、ＨＳＣの造血活性を決定する。ＨＢＢ遺伝子座を編集する遺伝子は、Ｔ７Ｅ１分析およびＤＮＡ配列決定によって評価した。また、ＨＢＢタンパク質の発現は赤血球子孫でも分析した。
【０８５４】
動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ（登録商標））からのヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、以下：各々３００ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、１００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ならびに６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、および１０μＭのＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；別に記載のない限り、その他の補充物は全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）製）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に解凍した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、３日間細胞を増殖させた。第３日（朝）に、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよびＰＧＥ２を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）と培地を取り換えた。第３日の午後に、サンプル当たり二百五十万個のＣＤ３４＋細胞を電気穿孔緩衝液中に懸濁させた。
【０８５５】
ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写により生成した。Ａ５’ＡＲＣＡキャップは、転写と同時にＲＮＡに付加したのに対し、ポリＡテールは、転写後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによりＲＮＡ種の３’末端に付加した。
【０８５６】
ｇＲＮＡをインビトロで転写させ、テールを付加した後、ＲＮＡ濃度を決定するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｃｈｉｐ（登録商標））を用いて、ならびにｇＲＮＡと複合体化する、および複合体化しないＣａｓ９タンパク質の熱変性温度での変化を定量するサーマルシフトアッセイである示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）アッセイにより、ｇＲＮＡの量および質を評価した。ＤＳＦアッセイでは、Ｃａｓ９タンパク質をｇＲＮＡと混合して、１０分かけて複合体を形成させた。１：１比のｇＲＮＡ：Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡが高品質であれば、サーマルシフトを支持するはずであることから、Ｃａｓ９タンパク質：ｇＲＮＡは、１：１のモル比で混合し、Ｃａｓ９安定性の測定として、ならびにｇＲＮＡ品質の間接的測定としてＤＳＦアッセイを実施した（図７Ａ）。
【０８５７】
サンプルの半分については、インビトロ転写キャップおよびテール付加ガイド（ｇ）ＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５を１２．５μｇのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）に対して２：１モル比で（百万個の細胞当たり５μｇのＲＮＰ）二百五十万個の細胞に添加した。「ＨＢＢ−８」は、ＧＵＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＵＣ（配列番号３８８）の標的化ドメイン配列を有し、「ＨＢＢ−１５」は、ＡＡＧＧＵＧＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧＡＡＧＵ（配列番号３８７）の標的化ドメイン配列を有する。Ｄ１０Ａタンパク質およびｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体は、電気穿孔緩衝液中で二百五十万個の成体型３４＋細胞に移入した。ＲＮＰ／細胞混合物を電気穿孔カートリッジに移した後、（「プログラム２」および「プログラム３」（Ａｌｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ））を用いて、細胞を電気穿孔した。
【０８５８】
ＣＤ３４＋細胞サンプルの第２の部分については、等量（各々５μｇまたは１０μｇ［２×ｇＲＮＡ］）のインビトロ転写キャップおよびテール付加誘導（ｇ）ＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５を１０μｇのインビトロ転写Ｃａｓ９Ｄ１０ＡｍＲＮＡに添加した。ｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ：細胞混合物は、プログラム２（Ｐ２）で電気穿孔した。
【０８５９】
全サンプルについて、細胞をカートリッジから回収し、３７℃で２０分間（回復時間）配置した。次に、細胞は、予熱サイトカインを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）培地に移した後、３０℃で２時間配置する（低温ショックサンプル）か、または３７℃に直接配置した。低温ショックサンプルの場合、細胞は、３０℃で２時間のインキュベーション後、３７℃のインキュベーターに移した。電気穿孔から２４、４８および７２時間後に、ＣＤ３４＋細胞をトリパンブルー排除法（細胞生存）により計数してから、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン−Ｖ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）共役抗ヒトＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＡＰＣ共役抗ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈによる同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球および骨髄系血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｈ４４３５）中に８００個の細胞を播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＨＢＢ遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析。電気穿孔から４８および７２時間後に、ＨＳＣからゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。精製ＰＣＲ産物を、Ｔ７Ｅ１アッセイで挿入／欠失（インデル）について分析し、さらに個々のクローンのＤＮＡ配列決定により分析した（ＰＣＲ産物を形質転換し、ＴＯＰＯ−ベクターにサブクローニングし、個々のコロニーを採取した後、個々のＰＣＲ産物を含有するプラスミドＤＮＡを配列決定した）。
【０８６０】
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ電気穿孔ＣＤ３４＋細胞から抽出された細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、Ｃａｓ９ＲＮＰおよびｇＲＮＡペアを受けたＣＤ３４＋細胞の電気穿孔の７２時間後にＣａｓ９タンパク質の存在を示した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡで電気穿孔された細胞の溶解物中に、非常に低レベルのＣａｓ９タンパク質が検出された（図７Ｂ）。
【０８６１】
電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞は、フローサイトメトリー分析により決定される通り、幹細胞表現型（例えば、ＣＤ３４およびＣＤ１３３の共発現）と生存能力（例えば、７５％アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を維持した（図８Ａ）。生存ＣＤ３４＋細胞の絶対数は、電気穿孔後７２時間の培養期間にわたって大部分のサンプルで維持された（図８Ｂ）。さらに、遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞は、赤血球（例えば、ＣＦＵ−ＥまたはＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および骨髄（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、−ＭもしくはＧＭ）を増大する能力によって示されるように、生体外造血活性および複能性を維持した（図８Ｃ）。
【０８６２】
次に、２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）と共送達されるＤ１０ＡｇＲＮＡまたはＲＮＰの電気穿孔から７２時間後に、ＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集を評価した。手短には、電気穿孔から７２時間後に、電気穿孔ＣＤ３４＋細胞からゲノム（ｇ）ＤＮＡを単離し、ＨＢＢ遺伝子座（２つのｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５により標的化された個別のゲノム位置の双方を捕捉した）の約６０７塩基対断片のＰＣＲ増幅を実施した。ＡＭＰＵＲＥビーズによるＨＢＢ  ＰＣＲ産物のクリーンアップ後、標的化ゲノム位置の挿入／欠失（インデル）をＴ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定により評価した。Ｄ１０ＡｍＲＮＡおよびＨＢＢを標的化するｇＲＮＡペアで電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞の場合、インデルは全く検出されなかった（表１５）。Ｄ１０Ａ  ｍＲＮＡの送達後に得られたマイナスの結果とは対照的に、ＨＢＢを標的化するｇＲＮＡペアと共にＤ１０Ａ  ＲＮＰで電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞のＴ７Ｅ１および配列決定分析によって約３０〜６０％のインデルが検出された（表１５、図９Ａ〜９Ｃ）。３０℃で２時間（３７℃で２０分の回復時間後）にわたって培養した細胞は、ＤＮＡ配列決定により決定される通り、５７％の編集を示した。さらに、遺伝子変換（例えば、破壊ＨＢＢ遺伝子座のＤＮＡ修復のためのテンプレートとして使用されるＨＢＤゲノム配列）は、「低温ショック」（３０℃でのインキュベーション）に付したＣＤ３４＋細胞からのｇＤＮＡにおいて、総遺伝子変換事象に対して３％の頻度で検出された（図９Ｃ）。
【０８６３】
【表２９】
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【０８６４】
ＨＢＢ遺伝子座の標的化された破壊が、ｂ−ヘモグロビンタンパク質の発現に変化を誘導したか否かを決定するために、ＣＦＵ−Ｅコロニーを採取し、解離し、固定し、透過性にした後、ＰＥ共役マウス抗ヒトβヘモグロビン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））で染色した。ＨＢＢ遺伝子編集細胞の赤血球子孫は、非処理の対照ＣＤ３４＋細胞から分化したＣＦＵ−Ｅと比較して、βヘモグロビン発現に７〜１０倍の低下を示した（図１０）。これらのデータは、遺伝子編集細胞の子孫が、赤血球分化能力を保持すること、および親ＣＤ３４＋細胞で検出された遺伝子編集事象が、赤血球子孫におけるタンパク質発現の低減を引き起こし得ることを明らかにしている。
【０８６５】
実施例１０：ＨＢＢ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡと複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼリボ核タンパク質との接触は、新鮮な臍帯血由来のヒトＣＤ３４＋造血幹細胞における遺伝子編集を支持する
この実施例では、ＨＢＢ遺伝子座を標的化する２つのｇＲＮＡとのＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼの共送達後に、新しく採取された臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるゲノム編集を評価した。次に、編集されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を骨髄系および赤血球系細胞に分化させて、ＨＳＣの造血活性を決定した。ＨＢＢ遺伝子座の標的化破壊をＴ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定により評価した。
【０８６６】
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、新しく取得したヒト臍帯血から、フィコール勾配密度遠心分離の後ヒトＣＤ３４細胞濃縮キットおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｏｔｅｃｈ製のＬＳ磁気カラムを用いた、マウス抗ヒトＣＤ３４＋免疫磁気ビーズを含むＭＡＣＳ（登録商標）（抗体結合免疫磁気ビーズ選別）によって単離した。細胞は、以下：各々１００ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、各々２０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＩＬ−６、ならびに１０μＭのＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；別に記載のない限り、その他の補充物は全てＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、３日間細胞を増殖させた。第３日（朝）に、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよびＰＧＥ２を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）と培地を取り換えた。第３日の午後に、サンプル当たり二百五十万個のＣＤ３４＋細胞を電気穿孔緩衝液中に懸濁させた。
【０８６７】
ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写により生成した。Ａ５’ＡＲＣＡキャップは、転写と同時にＲＮＡに付加したのに対し、ポリＡテールは、転写後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによりＲＮＡ種の３’末端に付加した。ｇＲＮＡをインビトロで転写させ、テールを付加した後、ＲＮＡ濃度を決定するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｃｈｉｐ）を用いて、ならびにＤ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰ安定性の測定として、ならびにＲＮＡ質の間接的測定として実施されるＤＳＦアッセイにより、ｇＲＮＡの量および質を評価した。
【０８６８】
インビトロ転写キャップおよびテール付加誘導ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５を１２．５μｇのＤ１０Ａニッカーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）に対して２：１モル比（総ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質）（細胞百万個当たり５μｇのＲＮＰ）で、二百五十万個のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞をそれぞれ含む２つのサンプルの各々に添加した。第３のＣＤ３４＋細胞アリコートは、２５μｇのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢ  ｇＲＮＡ（２：１の総ｇＲＮＡ：Ｄ１０Ａ比）と混合した。各実験サンプルについて、Ｄ１０ＡＲＮＰ／細胞混合物を電気穿孔カートリッジに移してから、細胞をプログラム２で電気穿孔した。
【０８６９】
全サンプルについて、細胞をカートリッジから回収し、３７℃で２０分間（回復時間）配置した。１２．５μｇのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰと接触させたＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの場合、予熱サイトカインを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）培地に１つのサンプルを移した後、３０℃で２時間配置する（低温ショックサンプル）か、または３７℃の同じ培地中に直接配置した。低温ショックサンプルの場合、細胞は、３０℃で２時間のインキュベーション後、３７℃のインキュベーターに移した。電気穿孔後２４、４８および７２時間の時点で、ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣをトリパンブルー排除法（細胞生存）により計数してから、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）−Ｖ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）共役抗ヒトＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＰＣ共役抗ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈによる同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球系および骨髄系血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｈ４４３５）中に８００個のＣＤ３４＋ＨＳＣを播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＨＢＢ遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析。電気穿孔から４８および７２時間後に、ＨＳＣからゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。精製ＰＣＲ産物を、Ｔ７Ｅ１アッセイで挿入／欠失（インデル）につい分析し、さらに個々のクローンのＤＮＡ配列決定により分析した（ＰＣＲ産物を形質転換し、ＴＯＰＯ−ベクターにサブクローニングし、個々のコロニーを採取した後、個々のＰＣＲ産物を含有するプラスミドＤＮＡを配列決定した）。
【０８７０】
電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、フローサイトメトリー分析により決定される通り、幹細胞表現型（例えば、ＣＤ３４およびＣＤ１３３の共発現、約９０％のＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋）と生存能力（例えば、９１％のアネキシンＶ−７ＡＡＤ−）を維持した（図１１Ａ）。生存ＣＤ３４＋細胞の絶対数は、電気穿孔後７２時間の培養期間にわたって大部分のサンプルで維持された。さらに、遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞は、赤血球系（例えば、ＣＦＵ−ＥまたはＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および骨髄系（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、−Ｍ、もしくはＧＭ）を生じさせる能力によって示されるように、生体外造血活性および複能性を維持した（図１１Ｂ）。
【０８７１】
次に、２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）と共送達されるＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰの電気穿孔から７２時間後に、ＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集を評価した。手短には、電気穿孔から７２時間後に、電気穿孔ＣＤ３４＋細胞からｇＤＮＡを単離し、ＨＢＢ遺伝子座の約６０７塩基対断片のＰＣＲ増幅（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５により標的化された個別のゲノム位置の双方を捕捉する）を実施した。ＡＭＰＵＲＥビーズによるＨＢＢ  ＰＣＲ産物のクリーンアップ後、標的化ゲノム位置での挿入／欠失（インデル）をＴ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定により評価した。細胞百万個当たり５μｇのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰおよびＨＢＢ特異的ｇＲＮＡペアで電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞の場合、Ｔ７Ｅ１アッセイによって約２０％のインデルが検出された（表１６）。成体型３４＋細胞とは対照的に、３０℃で２時間のインキュベーションは、Ｔ７Ｅ１分析またはＤＮＡ配列決定によって決定される通り、遺伝子編集のレベルを改変しなかった。さらに、細胞百万個当たり１０μｇのＲＮＰに対するＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰ／ｇＲＮＡ濃度を二倍にすると、ＤＮＡ配列決定によって決定される通り、ＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集が５７％までほぼ倍増した（表１６、図１２〜１２Ｃ）。ＤＮＡ配列決定分析によるＤＮＡ修復事象の階層化は、配列読み取りの約５０〜７０％が、小さな挿入を含み、約２０〜４０％が、大きな欠失を含み、また、約８％が、標的化ＨＢＢゲノム位置にＨＢＢ／ＨＢＤ遺伝子変換事象のエビデンスを示した（図１２Ｃ）。
【０８７２】
【表３０】
2018519801.tif 000051
【０８７３】
成体型ＣＤ３４＋細胞とは対照的に、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、本来胎児型であり、そのため、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の子孫は、βヘモグロビンではなく、γヘモグロビンを含有する胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を発現する。ＣＢ赤芽球によるβヘモグロビンの欠失を考慮すると、このモデル系におけるＨＢＢ遺伝子座の破壊は、ヘモグロビンタンパク質の発現に影響を与えないであろう。これらの臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞は、研究用途のために、容易に入手可能であり、成体型ＣＤ３４＋細胞と比較して、より効率的に免疫欠損マウス異種移植片を再構成することから、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、ＨＳＣでの遺伝子編集の評価のためのモデル系として使用される。
【０８７４】
遺伝子編集された細胞が、その赤血球分化能力を保持したか否かを決定するために、編集されたＣＤ３４＋細胞を誘導して、赤芽球に分化させた。手短には、ＣＤ３４＋細胞をヒト血漿、ホロトランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン、およびサイトカイン（エリスロポエチン、ＳＣＦ、ＩＬ３）と一緒に２０日間共培養したが、その際、後者の４つの成長因子は、赤血球特異化プログラムを指令するために、様々な分化段階で添加した。次に、以下のものを含む赤血球表現型特徴の獲得について、細胞をフローサイトメトリーにより評価した：トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）と糖タンパク質Ａ（ＣＤ２３５）の共発現；ＨｂＦの発現、および除核（ｄｓＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５により検出されるｄｓＤＮＡの非存在によって示される）およびＣＤ４５発現の喪失。分化の第１８日までに、編集されたＣＤ３４＋細胞の赤芽球子孫は、この赤血球表現型を有した（図１３Ａ〜１３Ｃ）。これらのデータは、図１１Ａ〜１１Ｂに示されるＣＦＣデータと共に、遺伝子編集が、ＣＤ３４＋細胞の分化能力にマイナス影響を与えないことを示している。
【０８７５】
要約すると、この実施例のデータから、１）Ｄ１０Ａニッカーゼとキャップ／テール付加ｇＲＮＡペアによる新鮮なＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣの電気穿孔が、細胞の生存能力、または複能性に影響を与えないこと；および２）ＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＣと１０μｇのＤ１０ＡＲＮＰ（細胞百万個当たり）の接触は、ＨＤＲ事象を伴う＞５０％の遺伝子編集（全体の８％の遺伝子変換事象）を支持することがわかる。
【０８７６】
実施例１１：ＨＢＢ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡと複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）野生型Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰとの接触は、ヒト臍帯血造血幹細胞において最大６０％の遺伝子編集を支持する
この実施例では、臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣをＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）野生型Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｎ８６３ＡニッカーゼＲＮＰ、またはＨＢＢ遺伝子座を標的化する２つのｇＲＮＡと複合体化したＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰと接触させた。遺伝子編集のパーセンテージおよび編集事象のタイプ（例えば、ＨＤＲ（例えば、遺伝子変換）またはＮＨＥＪ）を評価して、ＮＨＥＪ（例えば、切断後に露出したまま残るＤＮＡの末端、例えば、野生型Ｃａｓ９切断によりに残る平滑末端、Ｄ１０Ａニッカーゼにより残る５’オーバーハングまたはＮ８６３Ａニッカーゼ切断により残る３’オーバーハング）よりＨＤＲ（例えば、遺伝子変換）を選択するＨＳＣにおける遺伝子編集のための最適なＣａｓ９活性（例えば、切断のタイプ、例えば、野生型Ｃａｓ９からの二本鎖切断またはニッカーゼによる対向ＤＮＡ鎖でのオフセットニック）を決定する。その他の最適化には、以下が含まれた：１）Ｃａｓ９タンパク質の毒性を低減するためのＣａｓ９タンパク質調製物からのエンドトキシンの除去；２）遺伝子編集を増大するためのＣＤ３４＋細胞百万個当たり１０μｇのＲＮＰの使用（実施例１０に示すように、５μｇのＲＮＰと比較して、新鮮なＣＢ  ＣＤ３４＋細胞での遺伝子編集を倍増することが判明した）；３）臍帯血（ＣＢ）から単離し、凍結保存されたヒトＣＤ３４＋細胞を試験して、遺伝子編集が、（実施例１０に記載されるように、新しく単離されたＨＳＣと比較して）凍結保存による影響を受けなかったことを確認する；ならびに４）ＣＤ３４＋細胞におけるＣａｓ９  ＲＮＰレベルを経時的に評価して、ＨＳＣにおけるＣａｓ９ＲＮＰ安定性を理解する。
【０８７７】
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞は、新しく取得したヒト臍帯血から、フィコール勾配密度遠心分離の後、マウス抗ヒトＣＤ３４＋免疫磁気ビーズを用いたＭＡＣＳ選別によって単離した。ＣＤ３４＋細胞を凍結保存し、後日解糖してから、以下：各々１００ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、各々２０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＩＬ−６、ならびに１０μＭのＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；別に記載のない限り、その他の補充物は全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）製）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ（商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種した。加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２２０％Ｏ２で、３日間細胞を増殖させた。第３日（朝）に、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよびＰＧＥ２を添加した新鮮なＳｔｅｍｓｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）と培地を取り換えた。第３日の午後に、サンプル当たり二百二十万個のＣＤ３４＋細胞を電気穿孔緩衝液中に懸濁させた。
【０８７８】
ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写により生成した。Ａ５’ＡＲＣＡキャップは、転写と同時にＲＮＡに付加したのに対し、ポリＡテールは、転写後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによりＲＮＡ種の３’末端に付加した。ｇＲＮＡをインビトロで転写させ、テールを付加した後、ＲＮＡ濃度を決定するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｃｈｉｐ）を用いて、ならびにＤ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰ安定性の測定として、ならびにＲＮＡ質の間接的測定として実施されるＤＳＦアッセイにより、ｇＲＮＡの量および質を評価した。
【０８７９】
インビトロ転写キャップおよびテール付加ガイドｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５を、２：１モル比（総ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質）で細胞百万個当たり１０μｇのＲＮＰに添加した。試験したＲＮＰは、以下：野生型（ＷＴ）Ｃａｓ９、エンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９、Ｎ８６３Ａニッカーゼ、Ｄ１０Ａニッカーゼを含む。各実験サンプルについて、Ｄ１０ＡＲＮＰ／細胞混合物を電気穿孔カートリッジに移してから、細胞をプログラム２（Ｐ２）で電気穿孔した。
【０８８０】
全サンプルについて、細胞をカートリッジから回収し、３７℃で２０分間（回復時間）配置した。１０μｇのＤ１０ＡニッカーゼＲＮＰ（細胞百万個当たり）と接触させたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の場合、予熱サイトカインを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ（商標）培地に１つのサンプルを移した後、３０℃で２時間配置する（低温ショックサンプル）か、または３７℃の同じ培地中に直接配置した。低温ショックサンプルの場合、細胞は、３０℃で２時間のインキュベーション時間後、３７℃のインキュベーターに移した。電気穿孔から２４、４８および７２時間後に、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞をトリパンブルー排除（細胞生存）により計数してから、以下の分析のために３部に分割した：ａ）７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）−Ｖ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた同時染色による生存能力の評価のためのフローサイトメトリー分析；ｂ）ＨＳＣ表現型の維持についてのフローサイトメトリー分析（フィコエリスリン（ＰＥ）共役抗ヒトＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＰＣ共役抗ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈによる同時染色後；ｃ）ＨＳＣからの赤血球系および骨髄系血球コロニーの分化を支持すると共に、生体外でＨＳＣ複能性および分化能力を評価するための代替アッセイとして役立つ半固体メチルセルロースベースのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｈ４４３５）中に８００個の細胞を播種することによる、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）分析；ｄ）ＨＢＢ遺伝子座での編集の検出のためのゲノムＤＮＡ分析；ｅ）ＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるＣａｓ９ＲＮＰの安定性を評価するためのタンパク質のウエスタンブロット分析。電気穿孔から４８および７２時間後に、ＨＳＣからｇＤＮＡを抽出し、ＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ反応を実施した。精製ＰＣＲ産物を、Ｔ７Ｅ１アッセイで挿入／欠失（インデル）について分析し、さらに個々のクローンのＤＮＡ配列決定により分析した（ＰＣＲ産物を形質転換し、ＴＯＰＯ−ベクターにサブクローニングし、個々のコロニーを採取した後、個々のＰＣＲ産物を含有するプラスミドＤＮＡを配列決定した）。
【０８８１】
電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、フローサイトメトリー分析により決定される通り、幹細胞表現型（例えば、ＣＤ３４およびＣＤ１３３の共発現、＞９０％のＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋）を維持した。生存ＣＤ３４＋細胞の絶対数は、電気穿孔後７２時間の培養期間にわたって大部分のサンプルで維持された（図１４Ａ）。遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞は、赤血球（例えば、ＣＦＵ−Ｅ、またはＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および骨髄（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、−Ｍ、もしくは−ＧＭ）を生じさせる能力によって示されるように、生体外造血活性および複能性を維持した（図１４Ｂ）。
【０８８２】
次に、２つのｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）と共送達されたＷＴ  Ｃａｓ９、Ｎ８６３Ａ、またはＤ１０Ａニッカーゼの電気穿孔から７２時間後に、ＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集を評価した。手短には、電気穿孔から７２時間後に、電気穿孔ＣＤ３４＋細胞からｇＤＮＡを単離し、ＨＢＢ遺伝子座の約６０７塩基対断片のＰＣＲ増幅（ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５により標的化された個別のゲノム位置の双方を捕捉した）を実施した。ＡＭＰＵＲＥビーズによるＨＢＢ  ＰＣＲ産物のクリーンアップ後、標的化ゲノム位置の挿入／欠失（インデル）をＴ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定により評価した。ＷＴ  Ｃａｓ９およびエンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞の場合、７２時間時点でのＴ７Ｅ１分析により検出されたインデルのパーセンテージは、それぞれ５９％および５１％であった（表１５Ａ）が、これは、ＤＮＡ配列決定により検出されたインデル（表１７）と相関していた。Ｎ８６３ＡニッカーゼおよびＨＢＢ特異的ｇＲＮＡペアによるＣＤ３４＋細胞電気穿孔では、Ｔ７Ｅ１分析によりわずか１％のインデルが検出された。低温ショックに付して、または付さずに、Ｄ１０Ａニッカーゼで電気穿孔されたＣＤ３４＋ＨＳＣは、Ｔ７Ｅ１分析により検出されたそれぞれ３９％および４８％インデルのパーセンテージの遺伝子編集を支持した。Ｎ８６３Ａニッカーゼと接触させたＣＤ３４＋ＨＳＣに観察されるこの低いレベルの編集が、細胞と接触させるＮ８６３Ａ  ＲＮＰの欠失によるものではなかったことを確認するために、ウエスタンブロット分析を実施した（図１５Ｂ）。
【０８８３】
Ｃａｓ９タンパク質は、全ての電気穿孔サンプル（例えば、ＷＴＣａｓ９、Ｄ１０Ａニッカーゼ、およびＮ８６３Ａニッカーゼを受けた細胞）に存在した。これらのサンプルについて、電気穿孔から２４および４８時間後にＣａｓ９タンパク質が検出されたが、これは、ＣＤ３４＋ＨＳＣのＮ８６３Ａ活性の欠失が、タンパク質の欠失によるものではなかったことを示唆している。
【０８８４】
ＷＴ  Ｃａｓ９、エンドトキシンフリーＣａｓ９、およびＤ１０Ａニッカーゼと接触したＣＤ３４＋ＨＳＣでの遺伝子編集は、ＤＮＡ配列決定分析に基づき、５４〜６０％であった（表１７、図１６Ａ）。ＤＮＡ配列決定分析によるＤＮＡ修復事象の階層化は、遺伝子編集事象の＞９０％が、ＷＴ  Ｃａｓ９およびエンドトキシンフリーＷＴＣａｓ９と接触したＣＤ３４＋ＨＳＣにおける欠失であった（挿入または挿入と欠失の組み合わせが、残りの３〜６％の編集事象を占めた）（図１６Ａ）。対照的に、Ｄ１０Ａニッカーゼと接触したＣＤ３４＋ＨＳＣ由来のｇＤＮＡは、３％のＨＤＲ（例えば、遺伝子変換）、最大７５％の挿入、および最大２２％の欠失を有した（図１６Ｂ）。
【０８８５】
要約すると、本実施例のデータは、１）エンドキシン除去が、Ｃａｓ９機能性もしくはＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞生存能力、または複能性にマイナスの影響を与えなかった；２）１０μｇのＤ１０ＡＲＮＰの使用が、ＨＤＲ事象（例えば、遺伝子変換）を有するＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞における６０％遺伝子編集を支持し；３）ＣＤ３４＋ＨＳＣと接触後、ＷＴＣａｓ９およびニッカーゼＲＮＰは最大４８時間にわたり検出されたが、その後検出不可能であった。
【０８８６】
【表３１】
2018519801.tif 000052
【０８８７】
実施例１２：ＤＮＡテンプレート内でコードされたポリＡテールで改変され、インビトロで転写された修復ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質の送達後のヒトＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞におけるＨＢＢ遺伝子座での遺伝子編集
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートにおけるポリＡテールのコード化。
修飾されていない（例えば、ＡＲＣＡキャップおよびポリＡテールなし）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡで電気穿孔された成体型ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）は、インビトロで転写されたキャップおよびテール付加ｇＲＮＡで電気穿孔された成体型ヒトＨＳＣと比較して、生存期間、生存能力、および造血能力が低く、しかも、低いパーセンテージの遺伝子編集を有した（図５Ａ〜Ｃおよび図６Ａ〜Ｇ）。ＡＲＣＡキャップ付きｇＲＮＡのインビトロ転写（ｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）Ｔ７  Ｕｌｔｒａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）の後、ｇＲＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡテールポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）と一緒にインキュベートし、ＭｅｇａＣｌｅａｒ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ／テール付加ｇＲＮＡをクリーンアップした。Ｅ−ＰＡＰテール付加反応により付加されたポリＡテールは、実験によってまちまちであった。ｇＲＮＡの３’末端でのポリＡテールの長さを標準化するために、特定長さのポリＴ配列を含有して、特定長さのポリＡテールのためのＤＮＡテンプレートが得られるように、ｇＲＮＡｔｒａｃｒをコードする３’アンチセンスプライマーを改変した。アンチセンスプライマーにより生成されたポリＡテールの長さは、１０、２０、５０、および１００であった。ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））をコードするＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲにより生成してから、ポリＡテールはＤＮＡテンプレートでコードされたため、Ｅ−ＰＡＰテール付加反応を省く１つの変更を加えて、ｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）Ｔ７  Ｕｌｔｒａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、製造者のプロトコルに従い、インビトロで転写した。
【０８８８】
１０、２０、および５０長ポリＡテールを有するＨＢＢ  ｇＲＮＡのインビトロ転写ＤＮＡテンプレートの反応から生成されたＰＣＲ産物によって、純粋なＰＣＲ産物が得られた（図１７Ａ）。対照的に、１００長ポリＡテールを有するＨＢＢ  ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートによって、様々なサイズをしたいくつかの産物が得られた。従って、インビトロ転写は、テンプレート内でコードされた１０Ａ、２０Ａ、および５０Ａ長ポリＡテールを有するＨＢＢ  ｇＲＮＡ  ＤＮＡテンプレートのみを用いて実施した。テールは、各ｇＲＮＡについてＤＮＡテンプレート内でコードされることから、精製ＰＣＲ産物は、Ｅ−ＰＡＰテール付加反応を除き、ｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）Ｔ７  Ｕｌｔｒａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてインビトロで転写した。ＨＢＢ−８（配列番号３８８）ｇＲＮＡ産物のバイオアナライザーの結果から、ＤＮＡテンプレートと一致する適切なサイズの産物のｇＲＮＡが産生され（図１７Ｂ）、ＤＮＡテンプレート内でコードされた場合のポリＡテール長さによって、Ｅ−ＰＡＰとのインキュベーションにより酵素的に生成されたポリＡテールと共に産生されたｇＲＮＡと比較して、限定的サイズのｇＲＮＡ産物が得られることがわかった。
【０８８９】
本実施例では、次に、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣは、限定的長さ（例えば、１０Ａ、２０Ａ、５０Ａ）のポリＡテールを有するＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡと複合体化したＤ１０ＡＣａｓ９ＲＮＰで電気穿孔した。フローサイトメトリー（アネキシンＶ−７ＡＡＤ−）による生存能力分析から、Ｄ１０ＡＣａｓ９ＲＮＰおよびＥ−ＰＡＰにより酵素的に付加されたポリＡテールを有するｇＲＮＡで電気穿孔された細胞と比較して、限定的長さの改変されたポリＡテールを有するｇＲＮＡと複合体化したＤ１０ＡＣａｓ９ＲＮＰによる電気穿孔から７２時間後の生存ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージに差がないことが判明した（図１８Ａ〜１８Ｂ）。１０Ａまたは２０Ａ長ポリＡテールを含むＤ１０ＡＲＮＰおよびｇＲＮＡペア（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触した細胞の遺伝子編集は、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイに基づき、約５１％であった（図１８Ｃ）。ＨＢＢ遺伝子座のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ＤＮＡ配列決定によるＤＮＡ配列決定分析によって、１０Ａまたは２０Ａ長ポリＡテールを有するようにそれぞれ修飾されたｇＲＮＡを含むＣａｓ９ＲＮＰで電気穿孔されたヒトＣＤ３４＋細胞において、６１％および５９％の遺伝子編集が達成されたことが確認された（図１８Ｃ）。これらの知見は、特定長さの５’キャップおよび３’ポリＡテールを含むように修飾されたｇＲＮＡと複合体化したＤ１０ＡＣａｓ９タンパク質が、一次ヒト造血幹／前駆細胞における遺伝子編集を支持したことを示している。
【０８９０】
実施例１３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰは、１５の異なる幹細胞ドナーからのヒト成体型および臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞におけるＨＢＢ遺伝子座で非常に効率的な遺伝子編集を支持する。
造血幹／前駆細胞におけるＣａｓ９ＲＮＰ媒介性遺伝子編集の再現性を決定するために、１５人の異なる患者ドナー（すなわち、１２人の臍帯血ＣＤ３４＋細胞ドナーおよび３人の成体型動員末梢血ＣＤ３４＋細胞ドナー）から得た凍結保存ＣＤ３４＋細胞を、ヒトサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ、およびＩＬ６）を含むＳｔｅｍｓｐａｎ  ＳＦＥＭ培地中に、１μＭのＳｒ１と一緒に、またはなしで、４８〜７２時間かけて解凍した後、ＨＢＢを標的化するｇＲＮＡと事前に複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ＲＮＰ（Ｄ１０ＡニッカーゼもしくはＷＴ）（例えば、ＨＢＢ−８（配列番号３８８）もしくはＨＢＢ−１５（配列番号３８７）ｇＲＮＡと事前に複合体化したＤ１０Ａニッカーゼおよび混合されＣＤ３４＋細胞に添加された２つの事前に複合体化したＲＮＰ）またはＡＡＶＳ１（ｓｇＲＮＡ  ＡＡＶＳ１−１（配列番号４９４）を有するＷＴ  Ｃａｓ９）で電気穿孔した。本実施例に記載する全ての実験について、修飾Ｔ７プロモーター、ｇＲＮＡ、およびｇＲＮＡの３’側のポリＡテール（２０Ａ）をコードするＰＣＲテンプレートからｇＲＮＡはインビトロで転写された。インビトロ転写プロセスにおいてｇＲＮＡの５’末端にＡＲＣＡキャップを添加した。従って、これらの実験で試験した全てのｇＲＮＡは、修飾ｇＲＮＡである（すなわち、ＡＲＣＡキャップを有する５’末端およびポリＡテールを有する３’末端で修飾されている）。個別の実験で試験される１５のドナーＣＤ３４＋細胞集団について、５つの実験は、ＷＴＣａｓ９ＲＮＰ送達（例えば、ｓｇＲＮＡ、ＡＡＶＳ１−１またはＨＢＢ−８のいずれか）による遺伝子編集を試験するために実施され、１０の実験は、Ｄ１０Ａニッカーゼおよび２ｇＲＮＡ（すなわち、ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）による遺伝子編集を試験するために実施された。
【０８９１】
１５の個別の実験およびドナー全体についての合成解析は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞において５７％の編集（平均値±ｓｔｄｅｖ：５６．９±８％）（例えば、ＷＴＣａｓ９ＲＮＰ＋ｓｇＲＮＡでは５６％、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ＋２ｇＲＮＡでは５８％）を、成体型末梢血ＣＤ３４＋細胞において５２％の編集（平均値５２．３±１０％）を示した（図１９Ａ）。遺伝子編集は、Ｃａｓ９ＲＮＰで電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞から抽出されたゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列決定に分析により決定した。ＣＤ３４＋細胞が、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ  ＲＮＰおよび２つのｇＲＮＡ（すなわち、ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）と接触した後起こった編集事象のサブタイプの詳細分析から、事象の平均３１±１１％が、挿入であり（１１〜４１％の範囲）、１４±６％が、小さな欠失であり（５〜１７％の範囲）、３±２％が、遺伝子変換またはＨＤＲによって修復された（２〜７％の範囲）ことが判明した（図１９Ｂ）。ヒトＣＤ３４＋細胞が、電気穿孔による、または外来タンパク質および核酸との接触による摂動に対して高度に感受性であることを考慮して、Ｃａｓ９ＲＮＰとの接触後のＨＳＣの生存能力は、生存（７−ＡＡＤ−アネキシンＶ−）ＣＤ３４＋細胞の検出のためのフローサイトメトリー分析により評価した。生存ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析により測定した後、生存ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージに、電気穿孔後のトリパンブルー排除法により決定した総細胞数を掛けてから、これを投入細胞数で割ることによって、同じドナーに由来する非処理およびＲＮＰ電気穿孔（処理）ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化を算出した。複数のドナー（ｎ＝１０）についてＲＮＰ処理および対照（すなわち、非処理）細胞の平均および標準偏差を示す（図１９Ｃ）。各幹細胞ドナーについて、各ドナーからの非処理対照およびＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化を、対応のある両側ｔ検定で比較して、ＲＮＰ接触が、細胞生存能力を改変したか否かを決定した。これらデータの統計解析は、ＲＮＰ処理と対照ＣＤ３４＋細胞の間に統計的に有意な差がないこと（ＲＮＰ処理および対照の細胞数の平均倍率変化：１．５：２．０；有意ではないＰ値サマリー、Ｐ値＝０．１２１７）を示した。ＲＮＰ処理および遺伝子編集がＨＳＣの複能性および分化能に影響を与えたか否かを決定するために、平均コロニー形成細胞能力（ＣＦＣ）および個別のコロニーサブタイプをスコアリングした後、両側ｔ検定（ｎ＝１０）で分析した。ＲＮＰ処理と対照ＣＤ３４＋細胞の間で、総ＣＦＣまたはＣＦＣのサブセットに有意な差は検出されなかった（図１９Ｄ）。次に、ＣＦＣのＤＮＡ配列決定分析により、個々のＣＤ３４＋細胞の破壊のレベルを決定した（各ＣＦＣは、単一のＣＤ３４＋細胞から分化されることから、播種した細胞のクローン子孫をアッセイすることによってＨＳＣの単一細胞の分析が可能になる）。ＨＢＢ遺伝子座ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析は、ｍＰＢ  ＨＳＣのおよびＣＢ  ＨＳＣから分化したＣＤ３４＋（約８０〜９０％の編集ＣＦＣ）の赤血球系および骨髄系子孫中に検出された、より高レベルの遺伝子編集を示した（図１９Ｅ）。遺伝子座の片アレルおよび両アレル編集が検出された��電気穿孔後で、かつコロニーアッセイ中に細胞を播種する前の２時間の低温ショックは、編集されたＣＤ３４＋細胞の赤血球系および骨髄系ＣＦＣ子孫に検出された片アレルおよび両アレル編集の分布を改変した（図１９Ｅおよび１９Ｆ）。
【０８９２】
実施例１４：Ｃａｓ９ＲＮＰ遺伝子編集ヒトＣＤ３４＋細胞は、長期生着および生体内での造血再構成能力を保持する。
Ｃａｓ９ＲＮＰ接触および遺伝子編集が、ＨＳＣ生着能にマイナスの影響を与えないことを確認するために、生体内ヒトＨＳＣ／マウス異種移植片移植試験を開始したが、そのスキームを図２０Ａに示す。この実施例では、新鮮な（すなわち、凍結保存していない）ヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血幹細胞を、ヒトサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬおよびＩＬ６）ならびにＰＧＥ２を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ中に播種し、予備刺激のために４８時間培養した。ヒトＣＤ３４＋細胞を２つの等しい画分に分割し、細胞（すなわち、１画分）の１／２をＤ１０ＡニッカーゼＣａｓ９ＲＮＰ（すなわち、ｓｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７）と複合体化したＣａｓ９タンパク質で電気穿孔して、さらに４８時間培養したが、これにより、生体外での合計時間は４日となった。第２のＣＤ３４＋細胞画分は、Ｃａｓ９で処理せずに培養した（非処理対照）。ヒトＣＤ３４＋細胞注入の１日（約２４時間）前に、免疫欠損マウス（すなわち、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ
ＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ、ＮＳＧ）を２０ｍｇ／ｋｇのブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）で（ｉ．ｐ．）処置した。ブスルファン処置マウスに細胞を静脈内注入した：グループ１（対照）は、非処理ヒトＣＤ３４＋細胞を受け（ｎ＝５マウス）、細胞の「子孫」用量は、２６０，０００細胞／マウス（対照マウスに対する実日０の細胞用量：３２０，０００／細胞マウス）であった。細胞の「子孫」用量は、２日の予備刺激（２日細胞用量）後だが、対照培養条件（対照グループ）またはＣａｓ９ＲＮＰでの電気穿孔（ＲＮＰ処理）のいずれかに曝露する時点の前に計算される細胞数を指す。グループ２マウス（ＲＮＰ処理、ｎ＝７マウス）の各々に、２６０，０００細胞／マウス（対照マウスに対する実日０の細胞用量：２４０，０００細胞／マウス）の細胞の「子孫」用量を移植した。２週間毎に採血し、遺伝子編集事象の検出、ならびにマウス末梢血サンプル中のヒトＣＤ４５＋血球の存在により示されるヒト細胞生着の検出のために血液をアッセイした。ＣＤ３４＋細胞の移植から１２週間後に、各グループからの１／２のマウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、および末梢血を分析のために収集した。残る生存マウスは、ＣＤ３４＋細胞生着および二次ＣＤ３４＋細胞移植の長期追跡のために、さらに１〜４ヶ月にわたって試験を継続した。この特定の試験では、Ｄ１０Ａ  ＲＮＰ（ＨＢＢ−８（配列番号３８８）およびＨＢＢ−１５（配列番号３８７））と接触させた細胞における遺伝子編集の評価は、ＤＮＡ配列決定およびＴ７Ｅ１アッセイ分析により決定される通り、３０〜３５％の遺伝子編集を示した（図２０Ｂ）。編集事象のタイプの分析によって、ＨＢＢ遺伝子座に対する下記サブタイプの遺伝子変化が検出された：１４％の欠失、１４％の挿入、２％の遺伝子変換（ＨＤＲ）。ＲＮＰ処理および対照（非処理）ＣＤ３４＋細胞の赤血球系および骨髄系子孫のＣＦＣ分析は、短期コロニー形成能の若干の低下を示したが、この差は統計的に有意ではなかった（図２０Ｃ）。ＣＦＣアッセイから採取した個々のクローンのＤＮＡ配列決定分析は、ＢＦＵ−Ｅ／ＧＥＭＭおよびＣＦＵ−ＧＭ／Ｍにおける１対立遺伝子でそれぞれ最大４０％および６０％の編集（片アレル編集）を示し、両アレル編集は、１２．５％の頻度でＢＦＵ−Ｅ／ＧＥＭＭに検出された（ＢＦＵ−Ｅ／ＧＥＭＭ総編集：５２．５％、ＣＦＵ−ＧＭ／Ｍ総編集：６０％）（図２０Ｃ）。造血再構成の動力学を評価するために、６〜１２週間の間血液サンプルを収集した。血液サンプルは、マウス末梢血サンプルから抽出されたｇＤＮＡからのＰＣＲ産物（ヒトＨＢＢ特異的ＰＣＲプライマーから産生された）のＴ７Ｅ１分析により、遺伝子編集事象について分析した（図２０Ｄ）。ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの血液中に、ヒト細胞移植時間に対して複数の時点で遺伝子編集が検出された。ＲＮＰ処理ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスまたは非処理対照ヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの血液中に、複数の時点で、フローサイトメトリーによりヒトＣＤ４５＋血球も検出された（図２０Ｄ）。末梢血サンプルは、マウス骨髄中のヒト細胞生着の測定としてのフローサイトメトリーによる、ヒト血球（ヒトＣＤ４５���）の検出のためのフローサイトメトリーによっても分析した。マウスおよびヒトＣＤ４５＋細胞を明瞭に識別するために、血液サンプルをヒトＣＤ４５特異的抗体およびマウス特異的ＣＤ４５抗体で共染色した。血液サンプルはまた、ヒトリンパ球（例えば、ＣＤ２０、Ｂ細胞およびＣＤ３Ｔ細胞）、骨髄細胞（例えば、ＣＤ１４およびＣＤ３３）、ならびに赤血球前駆細胞（例えば、ＣＤ７１）と結合するヒト抗体でも染色した。ヒトＣＤ４５＋細胞が検出された。マウス血液サンプル中のヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内でリンパ球（ＣＤ２０Ｂ細胞）、骨髄細胞、および赤血球前駆細胞を識別することができた（図２０Ｄ）。移植から６〜１２週間後の末梢血の分析は、ＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの血液中に最大３３．６％のヒトＣＤ４５＋細胞が検出され、血液サンプル中に検出されたヒトＣＤ４５＋細胞のレベルは、経時的に増加した（移植から１２週間後の生着：対照グループの平均：１１％ｈＣＤ４５＋、ＲＮＰ処理グループの平均：１８％ｈＣＤ４５＋細胞：図２０Ｅ）ことを示した。重要なことには、これらのデータの統計分析は、ＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞と非処理対照ＣＤ３４＋細胞との間に生着のレベルに有意な差を示さなかった（対応のないｔ検定Ｐ値＝０．２３７６）。ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内の細胞のサブセット分析は、ＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞および非処理対照ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの間で、ヒト血球系列分布に有意な差を示さなかった（対応のないｔ検定）。文献に報告されているデータと一致して、ヒトＣＤ４５＋ゲート内の細胞のうち平均して約８０％のＲＮＰ処理：７６％、対照８２％）は、ＣＤ２０＋Ｂ細胞であり、約３％がＣＤ３＋Ｔ細胞であり、残り１５％が赤血球系（非処理グループの：６％およびＲＮＰ処理：１１％）ならびに骨髄系（非処理対照：９％およびＲＮＰ処理：４％）であった（図２０Ｅ）。
【０８９３】
移植から１２週間後に、造血臓器（骨髄および脾臓）を各コホートのマウスの１／２から収集し、単一細胞懸濁液に解離させた後、ＣＦＣアッセイ、フローサイトメトリー分析で、さらに、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定により決定される遺伝子編集について分析した。骨髄および脾臓のフローサイトメトリー分析は、ＲＮＰ処理細胞を移植したマウスと対照細胞を移植したマウスの間には生着に有意な差がなかったことを示した（図２１Ａ）。マウス骨髄中のヒトＣＤ４５＋細胞の平均生着は、ＲＮＰ処理細胞レシピエントおよび対照細胞レシピエントについてそれぞれ１９％および２１％であった。骨髄中のヒトＣＤ４５＋細胞画分内で、ＣＤ４５＋細胞の１３％は、両グループでＣＤ３４＋（ＨＳＣ）でもあった。脾臓では、平均２３％および２６％のヒトＣＤ４５＋細胞が、ＲＮＰ処理および非処理対照ＣＤ３４＋細胞のレシピエントに検出された。ヒトＣＤ４５＋細胞画分における遺伝子編集およびＣＦＣ能力を評価するために、免疫磁気細胞単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット）を用いて、骨髄および脾臓からヒト細胞を単離した。骨髄については、細胞を＞９８％純度まで選別し（図２１Ｂ）、ＣＦＣアッセイに配置して、遺伝子編集の分析のために、選別された細胞からｇＤＮＡを抽出した。ヒト細胞画分の選別後も、ＣＤ３４＋細胞含量は維持された。ヒトｇＤＮＡのＴ７Ｅ１分析によって、処置マウスの骨髄において最大２０％の遺伝子編集が明らかにされた。遺伝子編集は、脾臓（７０％ヒト細胞純度まで選別）および末梢血サンプル（非選別）においても、平均５％インデルで検索された（図２１Ｃ）。
【０８９４】
総合すると、これらのデータから、Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集ＨＳＣが、長期生着および造血再構成能力を保持すること、ならびにＲＮＰ処理が、ナイーブ非処理ドナー適合対照ＣＤ３４＋細胞と比較して、造血再構成または分化特性を改変しないことが判明した。さらに、これらのデータは、遺伝子編集細胞が、移植後に生体内で持続することも示した。
【０８９５】
実施例１５：遺伝子編集ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の長期生着
移植から４ヵ月後の長期生着を評価するために（図２０〜２２に描写する実験のために）、実験１（ＥＸＰＴ１）の試験について残りのマウスを安楽死させた後、遺伝子編集ヒト細胞の生着の分析のために造血臓器を採取した。さらに、第２の実験（ＥＸＰＴ２、図２３）をセットアップし、その場合、異なるドナーからのＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１）による前処理（これは、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞拡大のために用いられているが、ここでは、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ（すなわち、細菌タンパク質および外来核酸）への短時間の曝露後の細胞死を阻止するために使用した）の後に、非処理のまま残すか、または２つの修飾（キャップおよびテール付加）ｇＲＮＡ（ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５）を含むＤ１０ＡＣａｓ９ＲＮＡで電気穿孔した。２つの実験：実験１（ＥＸＰＴ１）および実験２（ＥＸＰＴ２）の実験デザインの違いを以下の表１８に示す。
【０８９６】
【表３２】
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【０８９７】
ＥＸＰＴ１のために、移植片レシピエントを移植から４ヵ月後に安楽死させ、総ヒトＣＤ４５＋細胞含量の分析、ヒトリンパ系、骨髄系、およびＣＤ３４＋ＨＳＣ含量、ならびにＤＮＡ配列決定分析により決定される通り、造血臓器から単離されたヒト細胞画分中の遺伝子編集の分析のために、その血液（図２２Ａ）、脾臓（図２２Ｂ）、および骨髄（図２２Ｃ）を採取した（図２２Ｅ〜Ｉ、右側パネル）。
【０８９８】
ＥＸＰＴ１からの移植片レシピエントからの細胞のフローサイトメトリー分析は、同じドナーからのＲＮＰ処理および非処理対照ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のレシピエントの血液、脾臓および骨髄において、約２０％のヒトＣＤ４５＋細胞生着が検出されたことを示した。ＲＮＰ処理および対照の非処理細胞のレシピエントの臓器中のヒト系列分布にはヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内の有意な差（対応のあるｔ検定、Ｐ＜０．０５）が観察されなかった。さらに、１５％ヒトＣＤ３４＋細胞が、両コホートの骨髄中に検出され、グループ間に長期生着の差はなかった。ＥＸＰＴ１の場合、脾臓および骨髄から単離された選別ヒト細胞のＤＮＡ配列決定分析によって、ＲＮＰ処理ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの臓器から回収された細胞の細胞画分中に約１０％の遺伝子編集が示されたが、対象の非処理ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞には示されなかった。ＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスから回収された脾臓および骨髄ヒト細胞中に検出された事象のサブタイプの分析から、挿入および欠失の双方が生着細胞に検出され、これらの細胞中に検出された遺伝子編集のレベルは、移植前の注入産物中に生体外で検出された遺伝子編集のレベルと同様であったことが判明した（図２２Ｈおよび２２Ｉ）。
【０８９９】
ＥＸＰＴ２において、注入前に検出された遺伝子編集事象の頻度は５０％であった。細胞移植前に、マウスはブスルファン（２５ｍｇ／ｋｇ）でコンディショニングした。コンディショニングから約２４時間後に、ＲＮＰ処理および非処理対照ヒトＣＤ３４＋細胞（５７０，０００ＣＤ３４＋細胞／マウス、ＥＸＰＴ１で動物１匹につき投与された２６０，０００細胞用量の２倍を超える用量）をマウスに静脈内注入した。
【０９００】
ＥＸＰＴ２に関しては、同じドナーからのＲＮＰ処理および非処理対照ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のレシピエントの血液中に約８０％のヒトＣＤ４５＋細胞生着が、また、脾臓および骨髄中に７０％が検出された（図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ）。ＲＮＰ処理および対照の非処理細胞のレシピエントの臓器中のヒト系列分布にはヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内の有意な差（対応のあるｔ検定、Ｐ＜０．０５）が観察されなかった。さらに、２２％ヒトＣＤ３４＋細胞が、両コホートの骨髄および脾臓中に検出され、グループ間に長期生着の差はなかった。ＥＸＰＴ２の場合、末梢血のＣＤ３＋リンパ球再構成および骨髄のＣＤ２３５＋赤血球再構成は、ＥＸＰＴ１で観察されたそれぞれの再構成より高かった。
【０９０１】
ＥＸＰＴ２の場合、マウス造血臓器から回収された濃縮ヒト細胞から抽出されたｇＤＮＡから産生されたＨＢＢ  ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定分析は、ＲＮＰ処理ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞移植から４ヵ月後の末梢血、脾臓、および骨髄中に約５０％の遺伝子編集が検出されたことを示した（図２３Ｅ、２３Ｆ、２３Ｇ、２３Ｈ、２３Ｉ：中央のパネル）。
【０９０２】
移植片レシピエントの脾臓および骨髄から濃縮されたヒト細胞画分中の総編集および検出された事象のサブタイプの分析から、挿入および欠失の双方が生着細胞に検出され、これらの細胞中に検出された遺伝子編集のレベルは、移植前の注入産物中に生体外で検出された遺伝子編集のレベルと同様であったことが判明した。骨髄系および赤血球系子孫および長期生着ヒトＨＳＣ全体の遺伝子編集のレベルを比較するために、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞、ヒトＣＤ２３５＋赤血球前駆細胞、およびＣＤ３３＋骨髄細胞を、骨髄から富化したヒト細胞画分（マウス細胞の枯渇のためのＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓヒトマウスキメラキットを用いて単離されたヒト細胞から連続的に選別した後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳシステムによる系列特異的濃縮を用いて、ヒトＣＤ３４＋、ＣＤ２３５＋およびＣＤ３３＋サブセットについての連続的陽性選択を実施した。ヒト細胞画分のフローサイトメトリー分析は、ヒトＣＤ２３５＋赤血球およびヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを含む実質的な再増殖を示した（図２４Ａ）。これらの選別された細胞画分中の遺伝子編集の分析から、ヒト細胞集団全体に検出された遺伝子編集のレベルが維持されており、選別されたヒトサブセット全体で一貫していたことが判明した（図２４Ｂ）。
【０９０３】
総合すると、これらのデータから、Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集ＨＳＣが、長期生着および造血再構成能力を保持すること、ならびにＲＮＰ処理が、ナイーブ非処理ドナー適合対照ＣＤ３４＋細胞と比較して、造血再構成または分化特性を改変しないことが判明した。さらに、これらのデータは、遺伝子編集細胞が、移植後に生体内で持続することも示した。
【０９０４】
実施例１６：遺伝子編集ヒト成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の短期生着
Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集後の成体型ＨＳＣの生着能を評価するために、修飾（キャップ／テール付加）ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５ｇＲＮＡを含むＤ１０ＡＣａｓ９ＲＮＡで、ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を電気穿孔した。ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞中の総遺伝子編集頻度は、予備注入産物中で約２２％であった（図２５Ａ）。２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンでコンディショニングした（移植の約２４時間前）マウスに、ドナー適合ＲＮＰ処理および非処理対照ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞（細胞約百万個／マウス、ｎ＝３マウス／グループ）を静脈内注入した。移植から１０週間後、末梢血中でヒトＣＤ４５＋細胞再構成を評価した。いずれのコホートについても、約１０％のＣＤ４５＋細胞が末梢血中に検出されたが、これは、ＲＮＰ処理および非処理対照成体型ＣＤ３４＋細胞の短期生着に差がないことを示している（図２５Ｂ〜２５Ｄ）。ヒトＣＤ４５＋細胞ゲート内では、リンパ球系（ＣＤ２０＋Ｂ細胞）および骨髄系（ＣＤ３３＋顆粒球）の双方が検出され、２つのコホート間で生体内造血に対する系列の寄与に差はなかった。これらのデータから、Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集ＨＳＣが、生着および造血再構成能を保持すること、ならびにＲＮＰ処理が、ナイーブ非処理ドナー適合対照ＣＤ３４＋細胞と比較して、造血再構成または分化特性を改変しないことが判明した。
【０９０５】
実施例１７：２ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ供与体テンプレートとＤ１０ＡＲＮＰの共送達後のヒトＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞における相同組換え修復機構を介した遺伝子修飾
ヒトＨＳＣにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）を評価するために、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、Ｄ１０ＡＲＮＰと、一本鎖オリゴヌクレオチド供与体修復テンプレート（ｓｓＯＤＮ）を有するＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５修飾ｇＲＮＡ（キャップ／テール付加）で電気穿孔した。修復テンプレートは、ＨＢＢ標的部位に対して高い相同性を有し、塩基変化（ＳＮＰ）が少数であるため、ＤＮＡ配列決定による遺伝子修飾事象の同定が可能になる。外来核酸、特にＤＮＡが、ヒトＣＤ３４＋細胞中に自然免疫応答を誘導することが明らかにされていることから、ｓｓＯＤＮ用量（細胞２００，０００個当たりのｐｍｏｌ）の範囲を評価し、Ｄ１０ＡＲＮＰおよびｇＲＮＡとのｓｓＯＤＮ共送達の毒性と、ｓｓＯＤＮなし、５’および３’末端修飾を含まないｓｓＯＤＮ供与体テンプレート（非修飾ｓｓＯＤＮ、［ＮＭ］）、またはホスホロチオエート修飾５’および３’末端を有するｓｓＯＤＮ供与体テンプレート（「Ｐｈｘ」もしくは「ＰｈＴｘ」）のいずれかを比較する。ＣＤ３４＋細胞に送達されるｓｓＯＤＮの量を漸減しても、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析またはＤＮＡ配列決定分析のいずれかにより検出される遺伝子編集は減少しなかった（図２６Ａ、２６Ｃ）。しかしながら、より低い量のｓｓＯＤＮに曝露すると、電気穿孔から数日にわたる生存ＣＤ３４＋細胞の数の倍率変化によって示されるように、細胞生存能力が向上した（図２６Ｂ）。ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートへの’５および３’ホスホロチオエート部分の含有は、遺伝子修飾および総ＨＤＲ（すなわち、遺伝子修飾および遺伝子変換）のレベルを高めた（図２６Ｃ、２６Ｄ）。１００ｐｍｏｌの５’および３’ホスホロチオエート修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートならびにＤ１０ＡＲＮＰおよび２つの修飾ｇＲＮＡで電気穿孔すると、１００ｐｍｏｌの５’および３’非修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートならびにＤ１０ＡＲＮＰおよび２つの修飾ｇＲＮＡで細胞を電気穿孔した場合に観察される７％ＨＤＲと比較して、ＨＤＲは約１２％まで増加した。
【０９０６】
ｓｓＯＤＮの質がさらに低下され得るか否かを決定するために、第２の実験を別のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞ドナーでセットアップし、その場合、０、５０、７５、および１００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ（２００，０００細胞当たり）をＤ１０ＡＣａｓ９ＲＮＡならびにＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５修飾ｇＲＮＡと一緒に共送達した。Ｔ７Ｅ１分析およびＤＮＡ配列決定によって決定される遺伝子編集から、５０、７５、または１００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮで処理した細胞の間の編集に差がないことが判明した（図２７Ａ）。重要なことには、処理した細胞集団の間で生存能力に差がなかった（図２７Ｂ）。ＤＮＡ配列決定分析によって決定されるＨＤＲから、５０、７５、または１００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ供与体テンプレートのいずれかを受けた細胞の間の遺伝子修飾（すなわち、ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートによるＤＮＡ損傷の修復）に差がないことが明らかになった（図２７Ｃ、２７Ｄ）。しかし、総ＨＤＲ（すなわち、遺伝子変換事象および遺伝子修飾事象の合計）は、５０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮで処理した細胞が最も高かった。さらに、ｓｓＯＤＮは、ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートの非存在下で、Ｄ１０ＡＲＮＰおよびｇＲＮＡで電気穿孔した細胞と比較して、造血コロニー形成能を実質的に低下しなかった（図２７Ｅ）。これらの結果をさらに検証するために、Ｄ１０ＡＲＮＰおよびＨＢＢ−８／ＨＢＢ−１５修飾ｇＲＮＡと一緒に共送達される１００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いて、２つの追加ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞供与体および１つの成体型ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞供与体で実験を反復した。ＨＤＲは、ＤＮＡ配列決定分析により全ての処理サンプル中に検出され、生存能力は供与体間で幾分の差があった（図２８）。総じて、これらの結果は、Ｄ１０ＡＣａｓ９ＲＮＰと２つの修飾ｇＲＮＡならびに５’および３’ホスホロチオエート修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートの共送達が、一次ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてＨＤＲを支持することを示している。
【０９０７】
実施例１８：Ｃａｓ９ＲＮＰによる処理前の小分子化合物でのヒトＣＤ３４＋細胞の前処理は、細胞寿命、生存能力および遺伝子編集を向上させる
ヒトＣＤ３４＋細胞は、特に、トール様受容体（ＴＬＲ）経路を介した細胞の自然免疫応答を活性化し、従って、プログラム細胞死（例えば、アポトーシスによる）、成長停止またはオートファジーを誘導し得る外来タンパク質および核酸への曝露に起因する、それらの細胞環境中の摂動に感受性であることを考慮して、以下：酸化リン脂質１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルクロリン（ＯｘＰＡＰＣ）、すなわち、ＴＬＲ経路を阻害することが知られている小分子化合物（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４経路は、それぞれ細菌成分およびＬＰＳによって活性化される）；バフィロマイシン、すなわち、細胞ストレス時のアポトーシスまたはオートファジーによる細胞死を阻止する化合物；ラパマイシン（ＨＳＣにおけるレンチウイルス遺伝子療法を改善するｍＴＯＲ阻害剤（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  １２４（６）：９１３−２３  ２０１４を参照；プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２（例えば、Ｓａｎｔｏｎｉ  ＤｉＳｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７（１１）：４２５７−４２６５を参照）、ＳＲ−１とＵＭ１７１、またはＵＭ１７１単独、すなわち、生存能力のあるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を生体外で拡大および維持することが既に立証されている分子（例えば、Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（６２０３）：１５０９−１５１２を参照）、またはＳＲ−１とＵＭ１７１の組み合わせでＣＤ３４＋細胞を（１８時間）前処理した。ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、Ｄ１０ＡＣａｓ９ＲＮＰ、ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５修飾ｇＲＮＡ、ならびに５’および３’ホスホロチオエート修飾ｓｓＯＤＮ供与体テンプレートを用いた電気穿孔前に１８時間にわたってこれらの幹細胞生存能力エンハンサー（表１９）の各々で前処理した。電気穿孔後、これらの幹細胞生存能力エンハンサーを含有するＨＳＣ培地中に細胞を播種し、さらに３日間培養した。
【０９０８】
ＤＮＡ配列決定分析により決定される通り、総遺伝子編集およびＨＤＲは、幹細胞生存能力エンハンサーで前処理しなかった細胞について最も高かった（表１９、それぞれ７１％および１２％）が、これらの細胞の生存能力は、４２％に過ぎなかった。対照的に、ＵＭ１７１、ＵＭ１７１とＳＲ１の組み合わせ、ラパマイシン、またはＯｘＰＡＰＣで前処理した細胞は、前処理を受けなかった電気穿孔細胞と比較して、生存能力が増大した。ＴＬＲ阻害剤ＯｘＰＡＰＣで処理した細胞において、２０％の生存能力向上、増大した総編集（７８％）、および維持されたＨＤＲ（８％）が観察された。これらのデータは、幹細胞生存能力エンハンサーによる前処理が、ＨＳＣの編集および生存能力を向上させ得ることを示している。
【０９０９】
【表３３】
2018519801.tif 000054
【０９１０】
実施例１９：ｇＲＮＡに対する２０Ａポリ（Ａ）テールの付加は、造血活性の細胞生存能力を低減することなく、ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の遺伝子編集を向上させる。
最適、最小、および特異的３’末端ｇＲＮＡ修飾を明確にすることができるか否かを決定するために、いくつかの異なる修飾をｇＲＮＡのインビトロ転写用のＰＣＲ  ＤＮＡテンプレートに操作により導入して、異なる３’末端を有するｇＲＮＡを作製した。３’末端の修飾が異なる全てのｇＲＮＡについて、各ｇＲＮＡをインビトロ転写させた後、インビトロ転写プロセス中に付加されたＡＲＣＡキャップで５’末端を修飾した。ＨＢＢ遺伝子座は、ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８が、以下の３’末端修飾：様々な長さ（例えば、２Ａ、５Ａ、１０Ａ、１５Ａ、２０Ａ、および２５Ａ）のポリ（Ａ）テール、様々な長さ（例えば、１０Ｔ、２０Ｔ）のポリ（Ｔ）テール、または様々な長さ（例えば、１０Ｇ、２０Ｇ）のポリ（Ｇ）テールを有するように修飾された、遺伝子修飾について標的化された。３’末端ｇＲＮＡ修飾の存在は、ゲル電気泳動により、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｃｈｉｐ（登録商標））を用いて検証した。検証後、ｇＲＮＡをＤＳＦシフトアッセイでＱＣ分析に付したが、その場合、野生型Ｃａｓ９タンパク質を様々なｇＲＮＡのモル比で複合体化して、Ｃａｓ９タンパク質が完全に占有されるか、またはｇＲＮＡと複合体化されるＣａｓ９タンパク質：ｇＲＮＡの最適モル比（例えば、１：１、１：１．５、１：２など）を決定した。次に、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化したｇＲＮＡの３’末端での修飾が異なるＣａｓ９ＲＮＰで、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を電気穿孔した。電気穿孔から３日後、コロニー形成能のＣＦＣ分析に細胞を播種することによって、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を細胞数の倍率変化について分析して、細胞生存能力、ＨＳＣ機能性を決定した後、ヒトＨＢＢ遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定分析による標的遺伝子座での遺伝子編集の評価のためにサンプルからｇＤＮＡを抽出した。この実験では、ポリ（Ａ）テール修飾を有するｇＲＮＡは、Ｔ７Ｅ１アッセイ分析（図２９Ａ）およびＤＮＡ配列決定分析（図２９Ｂ）の双方により決定される通り、最も高い遺伝子編集頻度を支持した。ＤＮＡ配列決定分析は、最適なポリ（Ａ）テール長さが、２０Ａであることを示した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。ＲＮＰ処理細胞のコロニー形成能のＣＦＣ分析から、遺伝子編集のレベルとは関係なく、全ての編集された細胞集団は、コロニー形成能を維持することがわかった（図２９Ｃ）。
【０９１１】
実施例２０：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９二重ニッカーゼ戦略を用いた５’および３’末端修飾を有するｇＲＮＡの使用は、生存能力および造血活性を生体外で維持するＨＳＣにおいて遺伝子編集を増大した
効率的な遺伝子編集を達成すると共に、ＨＳＣ生存能力および機能性を維持するために、５’および３’末端修飾の両方が必要であるか否かを決定するために、Ｄ１０ＡＣａｓ９変異型タンパク質を修飾ＨＢＢ−８ｇＲＮＡまたは修飾ＨＢＢ−１５ｇＲＮＡのいずれかと複合体化した。ＲＮＰ複合体を混合し、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞に電気穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）した。電気穿孔から３日後、ＨＢＢ遺伝子座を分析するためのＴ７Ｅ１アッセイを用いて遺伝子編集についてＣＤ３４＋細胞を分析し、ＣＦＣアッセイを用いて生体外での造血機能性を評価した。５’または３’末端修飾のないｇＲＮＡを含有するＣａｓ９  ＲＮＰで電気穿孔された細胞では、Ｔ７Ｅ１アッセイ分析により遺伝子編集は全く検出されなかった（図３０Ａ、左側パネル）。対照的に、様々な長さ（すなわち、１０Ａもしくは２０Ａ）の５’ＡＲＣＡキャップ、３’ポリＡテールのいずれかの付加、または５’キャップおよび３’
ポリ（Ａ）テールの両方が、ＨＢＢ遺伝子座で約１０％遺伝子編集を支持した。様々な長さ（１０Ａもしくは２０Ａ）の５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡテール末端修飾の組み合わせを含むｇＲＮＡを有するＲＮＰを用いて処理した細胞は、増大した遺伝子編集（最大約２．５倍）を示した。全ての細胞について、ＲＮＰ複合体の使用とは関係なく、造血機能性が維持された（図３０Ｂ、右側パネル）。
【０９１２】
これらの結果を検証するために、様々なドナー対象からのＣＤ３４＋細胞を、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ変異型タンパク質と複合体化したインビトロ転写ｇＲＮＡ  ＨＢＢ−８およびＨＢＢ−１５で電気穿孔した。ｇＲＮＡは、３’２０Ａテールと、非修飾５’末端（ｐ（Ａ））または５’ＡＲＣＡキャップ（Ｃ−ｐ（Ａ））のいずれかを有した。ＤＮＡ配列決定分析によって決定される通り、両タイプのｇＲＮＡを用いて、実質的な遺伝子編集が観察された（図３０Ｂ、左側パネル）。検出された編集事象のサブタイプは、挿入、欠失、および遺伝子変換を含む。２つのｇＲＮＡ処理グループの間の総遺伝子編集頻度（３５％および４７％）の差は、ｇＲＮＡ修飾に起因しない可能性がある。重要なことには、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡテールを双方有するｇＲＮＡを含むＤ１０Ａ  ＲＮＰ複合体で電気穿孔された細胞は、３’修飾ｇＲＮＡだけを含有するｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体で処理した細胞と比較して、細胞数およびコロニー形成能の高い倍率変化を有した（図３０Ｂ、中央および右側パネル）。
【０９１３】
相乗効果を確認するために、様々なドナー対象からＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を取得し、上の実験を繰り返した。３’ポリ（Ａ）テールを有するｇＲＮＡまたは５’ＡＲＣＡキャップと３’ポリ（Ａ）テールを有するｇＲＮＡのいずれかを含有するＲＮＰ複合体で処理した細胞は、最高レベルの遺伝子編集頻度を有したが、非修飾ｇＲＮＡは、最低レベルの遺伝子編集を有し、これに、５’ＡＲＣＡキャップ付加ｇＲＮＡだけを含有するＲＮＰ複合体で処理した細胞が続いた（図３０Ｃ、左側パネル）。３’ポリ（Ａ）テール（２０Ａ）だけを有するｇＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体および５’ＣＡＰおよび３’ポリＡテールを有するｇＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体を用いて、遺伝子編集頻度に有意な差は認められなかった。しかし、造血活性（ＣＦＣ能力）の分析は、非修飾ｇＲＮＡまたは３’末端だけが修飾されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰで処理した細胞も、より少数の造血コロニーをもたらすことを示した（図３０Ｃ、右側パネル）。これらのデータは、限定的長さ（２０Ａ）の５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリ（Ａ）テールを有するｇＲＮＡの修飾が、生体外での細胞数の倍率変化、生存能力、および造血能力を維持しながら、成体型および臍帯血ＣＤ３４＋細胞の双方で遺伝子編集を支持することを示唆している。
【０９１４】
参考文献
Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１３（７５１９）：５６９−５７３（２０１４）；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（１０）：１４７３−１４７５（２０１４）；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（２）：５７−６５（２０１１）；Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０（７）：２３４５−５４（２０１０）；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８９：１９８−２０５（２０１２）；Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：１３４５−１３４８（２０１０）；Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．９（８）：６１９−６３１（２００８）；Ｃａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １５：２２４−２３０（２０１３）；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９９（６１２１）：８１９−８２３（２０１３）；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．１０（５）：７２６−７３７（２０１３）；Ｃｉｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５７０７−１２（１９９８）；Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２２（１７）：３０７４−３０８１（２０１３）；Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：２３２−６（２０１０）；Ｄｅｌｃｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５１−６５（２０１２）；Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（４）：１３９０−１４００（２００８）；ＤｉＳｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０７（１１）：４２５７−４２６５（２００６）；Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：１６７３−１６８３（２０１１）；Ｅｓｓｅｒ  Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．８６：１３２３−１３２９（２０１２）；Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７２（７３４４）：４９９−５０３（２０１１）；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：７１−８０（２０１４）；Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（６２０３）：１５０９−１５１２（２０１４）；Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２（３）：２７４−２８３（２００８）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１６：２５７（２０１５）；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：２７９−２８４（２０１４）；Ｇａｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：６０７−１２；Ｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（８）：１５２３−９（２０１２）；Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５（４）：２２１−２３１（２０１４）；Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １（６）：ｅ６０（２００５）；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（２）：１２２−３（２０１４）；Ｈｅｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：７１６−２５（１９９９）；Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９６２）：１６７−１７０（２０１０）；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（９）：８２７−３２（２０１３）；Ｈｕｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０（７）：６９２−６９８（２００９）；Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（１）：６５−７４（２００２）；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３（６１７６）：１２４７９９７（２０１４）；Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２６：２０１−２０９（２０１５）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２（１２）：６３２２−６３２７（２０１２）；Ｌｉ  Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１８（１）：８５−９８（２００８）；Ｌｙｓａｋｏｖａ−Ｄｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：４２６１−４２７１；Ｌｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１３９：７４７−５６（１９８６）；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：４６７−４７７（２０１１）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９９（６１２１）：８２３−８２６（２０１３）；Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（７）：４６５−４８１（２０１４）；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８１：８４−９（１９９０）；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３２（１）：１３５−４４（２０１０）；Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（３９）：１５４３６−４１（２００７）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５６（５）：９３５−９４９（２０１４）；Ｎｉｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３７（１１）：１３６４−７７（２００９）；Ｐｅｔｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３（２）：３５２−６２（２０１５）；Ｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４（５）：１０２２−１０３４（２０１３）；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４（６）：１３８０−１３８９（２０１３）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：７０９６（２０１５）；Ｒｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓ０１６１−５８９０（１５）：００３６１−２（２０１５）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７７，５７７−５８７（２００９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３８：３１８−２７（２０１１）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９０）：６２−６７（２０１４）；Ｓｕａｒｅｚ−Ｆａｒｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（１２）：ｅ８４６３４（２０１３）；Ｓｕｇｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５０（２）：３５１−３６５（２０１２）；Ｔａｍｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６０：２４１−２５２（２０１４）；Ｔｅｙ  ｅｔ  ａ���．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３（８）：９１３−２４（２００７）；Ｔｈｕｒｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８：３３−４０（１９９９）；Ｔｓｕｂｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：５７２−６（１９９６）；Ｖａｎｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐｔ  ７）：１６４７−９（１９９８）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５３（４）：９１０−９１８（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２４：９１３−２３（２０１４）；Ｘｉａｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（８）：１１８０−１１８２（２０１４）；Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １４７：１１４６−１１５８（２０１１）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２（３）：ｅ１９（２０１４）
【０９１５】
参照による援用
全本明細書で言及される文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
【０９１６】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本開示の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。その他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２３Ｉ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2018519801.tif 000153
2018519801.tif 000154
2018519801.tif 000155
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