(57)【要約】本発明は、豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患抑制及び予防用組成物に係り、さらに詳しくは、豆の生育段階の中でＲ６ないしＲ８段階の豆の葉抽出物を含むことにより、筋細胞に特異的に発現するＡｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１の過発現を抑制し、筋細胞の細胞活性を回復することで筋肉損失を抑制して予防する効果がある。
2018519274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）抑制及び予防用組成物。
【請求項２】
上記筋疾患は、筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋肉損失及び筋萎縮疾患からなる群からいずれか一つ以上選択されることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項３】
上記筋疾患は、老人性筋疾患であることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項４】
上記組成物は、筋細胞の細胞活性を増加させることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項５】
上記組成物は、骨格筋のユビキチンリガーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ）の発現または活性を抑制することを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項６】
上記組成物は、Ａｔｒｏｇｉｎ１またはＭｕｒｆ１遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項７】
上記豆の葉抽出物は、豆の生育段階の中でＲ６ないしＲ８期のうちのいずれか一段階にあたる豆の葉抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項８】
上記豆の葉抽出物は豆の生育段階の中でＲ７期の豆の葉抽出物であることを特徴とする請求項７に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項９】
上記豆は、タンキリマメ（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｉａ Ｎｏｌｕｂｉｌｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）、アズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、ヤブツルアズキ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｎｇｕｌａｒｉｓ Ｗ．Ｆ．ＷＩＧＨＴ．）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）及びツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＭＥＲＲ.）からなる群からいずれか一つ以上選択されることを特徴とする請求項７に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１０】
上記豆の葉抽出物は、水、有機溶媒またはこれらの混合物から選択される溶媒で抽出されることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１１】
上記豆の葉抽出物は、エタノール及びエチルアセテートで順次抽出されたことを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１２】
上記豆の葉抽出物は、
豆の葉を水、有機溶媒、またはこれらの混合物溶媒を加えて１次抽出する段階；
上記１次抽出物に有機溶媒を加えて２次抽出する段階；及び
上記１次及び２次抽出物を含む最終抽出物を減圧濃縮及び乾燥する段階を含む方法から収得されることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１３】
上記豆の葉抽出物は、生豆の葉抽出物、これの分画物、これの乾燥物、これの乾燥分画物、これの醗酵物、及びこれの濃縮物からなる群からいずれか一つ以上選択されることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１４】
上記組成物は、食品組成物、薬学組成物及び化粧料組成物のうちのいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【請求項１５】
上記薬学組成物は、経口投与剤形の組成物であることを特徴とする請求項１４に記載の筋疾患抑制及び予防用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月３０日付け韓国特許出願第１０-２０１５-００９２７０１号に基礎した優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されている全ての内容は本明細書の一部として含む。
【０００２】
本発明は、豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患抑制及び予防用組成物に係り、筋疾患に関する食品、薬学または化粧料組成物の製造分野で有用に活用することができる。
【背景技術】
【０００３】
人間が生まれて３０歳までは筋肉が成長しながら強くなるが、３０歳を過ぎてからは筋肉の密度と機能が次第に弱まり始める。特に、身体的運動をしない場合、３０歳以後には１０年ごとに３ないし５％程の筋肉量が減少することになり、運動を続くとしても、ある程度の筋肉損失を経験することになる。このように殆どの筋肉損失は、主に老化に伴って起きる現象であるが、その細部的な誘発機序においては多様な様相を持つ。
【０００４】
通常の単純老化による筋肉損失と違って、病理学的様相の筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）は直接筋力低下を誘発し、転倒や骨折の危険を高めることは勿論、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）の発病、各種身体機能の減少及び障害を起こし、糖尿病及び心血関系疾患に対する危険性もまた８．２倍以上増加させるなど、全体的に死亡の危険性を高める。
【０００５】
したがって、筋肉損失の抑制及び予防は、他に有機的に係る多様な筋疾患の改善と予防はもとより、全般的な健康の問題に直結する重要な解決課題の一つとして考えられてきた。また、現在、韓国は出産率の減少と平均寿命が延びることによって人口の高齢化が急激に進んでおり、特に、２０１０年の統計庁資料によると、６５歳以上のお年寄りの人口が２００５年の９．１％に比べて２０２０年は１５．７％、２０３０年は２４．１％に至ると見通しており、これはＯＥＣＤ加入国の中で最も速い増減率に該当し、社会福祉的観点から見て、やはり至急解決すべき課題として分類される。
【０００６】
このような流れによって、筋肉損失を抑制及び予防するための研究が多く進められている。そのうち、代表的なことは、筋肉を構成する必須アミノ酸の一つであるロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）を含むＢＣＡＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ-ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）に関する研究である。しかし、上記研究と係わって、ロイシンはお年寄りの骨格筋肉量の変化にはさほど影響を与えないという報告があって、これが筋肉減弱症の根本的な解決策になることは困難であると予想される。
【０００７】
一方、最近、筋肉減弱症と係り、Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１の特異的機能が明かされて注目を浴びている。Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１は筋細胞に特異的に発現するユビキチンリガーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ）で、これの発現増加により、筋肉タンパク質がユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）し、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）が依存的に分解されることにより、筋肉損失が誘発されると知られている。
【０００８】
本発明者らは、新しい観点で筋肉損失を解決できる方案を模索する過程で、上記メカニズムと関連して、豆の葉抽出物を有効成分として含む組成物を活用すれば、筋肉損失の抑制に相当な効果があることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国公開特許１０-２０１２-００２２０８５（豆の葉抽出物を有効成分として含む肥満、高脂血症、動脈硬化、脂肪肝、糖尿または代謝症侯群の予防または治療用剤形）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記問題点を解決するために、本発明は豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患抑制及び予防用組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
より詳細には、筋肉損失を抑制及び予防できる物質を提供することを目的とする。
【００１２】
同時に、収得し易いながらも副作用が最小化された天然来由の豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患抑制及び予防用食品組成物、薬学組成物または化粧料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患抑制及び予防用組成物を提供する。
【００１４】
上記豆の葉抽出物は、豆の生育段階の中でＲ６ないしＲ８期の豆の葉の抽出物であることを特徴とする。
【００１５】
上記豆の葉抽出物は、生豆の葉抽出物、これの分画物、これの乾燥物、これの乾燥分画物、これの醗酵物、及びこれの濃縮物のうち、いずれか一つ以上選択されることを特徴とする。
【００１６】
上記組成物は、食品、薬学または化粧料組成物などの形態で活用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
上記課題解決手段を通じて、本発明は筋疾患を抑制及び予防できる組成物を提供する。
【００１８】
より詳細には、豆の葉抽出物を有効成分として含めて筋肉損失を抑制及び予防できる物質を提供することにより、直・間接的に多様な筋疾患の改善または予防が可能な物質を提供する。
【００１９】
上記提供される有効成分である豆の葉抽出物は、天然成分として人体への副作用が少ないし、収得し易いうえ、従来産業上活用度が低かった豆の葉を十分活用するので、製造にも経済的である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨＰＬＣを利用して（ａ）豆の葉抽出物及び（ｂ）豆の抽出物の成分を比較分析した結果である。
【００２１】
【図２】正常の筋細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して各実験群、対照群及び比較群の相対的な細胞活性度（％）を示したグラフである。
【００２２】
【図３】正常の筋細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して各実験群、対照群及び比較群の相対的なＡｔｒｏｇｉｎ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量（％）を示したグラフである。
【００２３】
【図４】正常の筋細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して各実験群、対照群及び比較群の相対的なＭｕｒｆ１の遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量（％）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、豆の葉抽出物を有効成分として含む筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）抑制及び予防用組成物を提供する。
【００２５】
本発明の「筋疾患」とは、少なくとも後述するＡｔｒｏｇｉｎ１またはＭｕｒｆ１タンパク質の発現と直・間接的に係る筋疾患であれば、例外なく全て含むものとして理解しなければならない。限定されることはないが、好ましくは、主に筋肉減弱症、筋肉損失及び筋萎縮疾患を伴うことがある、これと直・間接的に係る全ての筋疾患を意味する。
【００２６】
以下、本発明の内容をより詳しく説明する。ただし、下記内容は本発明に対して理解し易くするために最も代表的な実施形態のみを記載したことであって、本発明の権利範囲はこれに限定されないし、下記内容と均等な全ての範囲を包括する。
【００２７】
本発明において、「豆」はその種類に制限されることなく、例えば、タンキリマメ（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｉａ Ｎｏｌｕｂｉｌｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）、アズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、ヤブツルアズキ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｎｇｕｌａｒｉｓ Ｗ．Ｆ．ＷＩＧＨＴ．）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）及びツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＭＥＲＲ.）から構成された群から選択されるいずれか一つ以上であっても良いが、これに制限されることはない。また、豆の形は有効成分を抽出するのに適する形態であれば、いずれも可能である。
【００２８】
ただし、本発明における抽出の対象は「豆の葉」に限定されるが、これは後述する実施例１及び図１で示すように、豆と豆の葉の成分物質が相違し、豆抽出物に比べて豆の葉抽出物で筋疾患抑制及び予防の効果が有意的なためである。また、本発明は、従来産業で活用度が低くて捨てられた豆の葉を積極的に活用できるので、経済的であり、製造し易い。
【００２９】
本発明において、より優れた筋疾患抑制及び予防効果を有する豆の葉抽出物は、下記豆の全体生育段階のうち、Ｒ６ないしＲ８時期の豆の葉抽出物である。
ＶＥ時期：種子を植えてから１ないし２週後の状態、土壌から二葉が出る。
ＶＣ時期：二葉が咲いて、その上に一節が育ち、単子葉が生成される。
Ｖ１時期：一つ目の単子葉から一節が生成されて３つの葉が生成される。
Ｖ２時期：Ｖ１ Ｓｔａｇｅから一節がさらに生成されて３つの葉が生成される。
Ｖ３時期：Ｖ２ Ｓｔａｇｅから一節がさらに生成されて３つの葉が生成される。
Ｖ４時期：Ｖ３ Ｓｔａｇｅから一節がさらに生成されて３つの葉が生成される。
Ｒ２時期：豆の花が満開した状態。
Ｒ４時期：豆がらの生成が完了した状態。
Ｒ５時期：豆がらの中に豆が生成される状態。
Ｒ６時期：豆がらの中に緑の豆の生成が完了した状態。
Ｒ７時期：豆がらと豆が黄色に変わっていく状態。
Ｒ８時期：葉が落ちながら豆がらと豆が完全に黄色に変わった状態。
【００３０】
好ましくは、Ｒ７ないしＲ８時期の豆の葉、より好ましくは、Ｒ７時期の豆の葉抽出物である。上記Ｒ７ないしＲ８時期の豆の葉は、葉の色が黄色く変わる時期の豆の葉と言って「紅葉した豆の葉」と称することもある。
【００３１】
本明細書における「抽出物」とは、天然物から抽出される成分物質を意味し、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分、または抽出物の形態を問わない。例えば、水や有機溶媒を利用して天然物から溶媒に溶解される成分を抽出したもの、天然物の特定成分、オイルのような特定成分だけを抽出して得られたものなどを全て含む広義の概念であり、抽出後の加工などを経て得られる物質も全て含む。具体的に、本発明の抽出物は、生の豆の葉抽出物、追加的加工や醗酵、または酵素処理された分画物、乾燥物、乾燥分画物、醗酵物及び濃縮物からなる群からいずれか一つ以上選択される形態であってもよい。
【００３２】
本発明の豆の葉抽出物を収得する方法は、当業界で一般的に用いられる方法であれば、特定の物へと制限されないが、通常、洗浄及び乾燥して細粉化された豆の葉の粉を水または有機溶媒に入れて抽出し、沈積した後で濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、上記分離されたろ液を減圧濃縮する方法で豆の葉抽出物を得ることができる。
【００３３】
抽出のための溶媒としては、水、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート、クロロホルム、またはこれら有機溶媒と水の混合溶媒のうちのいずれか一つ以上が選択されることができ、原料の安全性を考慮して水または３０〜７０％濃度のエタノールを使うことが好ましい。抽出物は、反復抽出を通じて得た各ろ液を混合して使用することが効果的である。例えば、上記のように、エタノールから１次抽出物を得た後、残渣に対してエチルアセテートを加えて２次抽出物を得るし、これの残渣に対してさらに１〜２回の追加抽出を繰り返して上記抽出物から濾過された濾液を混合する。
【００３４】
上記抽出物を得た後は、この技術分野に知られた通常の方法によって、常温で冷浸、加熱及び濾過して液状物を得ることができ、または追加で溶媒を蒸発、噴霧乾燥または凍結乾燥する過程をさらに経ることができる。
【００３５】
抽出物の濃度に特別な制限はないが、後述する実施例２、または実験例１〜２を参照すれば、通常１００ｐｐｍ内外でも十分な効果を奏するし、具体的には疾患の症状と度合、及び組成物の提供形態によって多様な濃度で活用できる。
【００３６】
本発明の豆の葉抽出物は、骨格筋のユビキチンリガーゼの発現または活性を抑制して筋疾患を抑制及び予防する。一般に、体内のユビキチンリガーゼは、消滅対象タンパク質の表面に一種の死滅信号としてユビキチンを付着させることで当該タンパク質が分解されるように誘導する酵素である。特に、骨格筋減少の際に特異的に発現するＡｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１というユビキチンリガーゼが存在する。しかし、上記Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１は不要なタンパク質の死滅を誘導する通常の体内ユビキチンリガーゼと違って、主に病理学的筋肉損失または筋萎縮が伴われる筋疾患患者から過発現する様相を見せ、現在、筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）を誘発する分子生物学的な直接原因の一つとして知られている。上記Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１が過発現されれば、筋細胞の合成に比べて分解経路が活性化し過ぎてしまい、これによって正常な筋細胞が消失される。
【００３７】
上記メカニズムと係り、本発明の豆の葉抽出物は、Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１遺伝子の過発現を抑制することで筋肉損失を防止し、ひいてはこれと有機的に係るその他の筋疾患も改善及び予防することができる。
【００３８】
大多数の筋肉損失疾患は、老化による退行性疾患の一種に分類されることを考慮した時、本発明の組成物はシニア（ｓｅｎｉｏｒ）層を対象にして積極的に活用することができる。
【００３９】
本発明の組成物は、食品、薬学及び化粧料組成物のいずれか一つの剤形として提供されることができる。
【００４０】
本発明の一活用形態として食品組成物は、主に健康機能食品の組成物であり、上記豆の葉抽出物を有効成分として含んで、従来の食品組成物に混合してそのまま添加されるか、または他の食品またはその食品の一成分と共に使われることもある。上記食品の種類には特別な制限がなく、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などを含んで、通常認められる全ての形態で活用することができる。
【００４１】
本発明の別の一活用形態として、薬学組成物は、上記豆の葉抽出物及びその他の有効成分以外に薬剤学的に許容できる担体を１種以上さらに含んで製造されることができる。例えば、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれら成分のうちのいずれか一つ以上を混合して使うことができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を加えることができる。
【００４２】
上記薬学組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、経口投与用剤形に製剤化することができる。
【００４３】
上記経口投与用剤形は、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、粉剤、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、乳濁剤、シロップ剤及びドリンク剤で構成された群から選択されるいずれか一つ以上の形態であってもよい。
【００４４】
本発明の別の一活用形態として、化粧料組成物は、上記豆の葉抽出物を有効成分として含み、その他の機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる全ての成分をさらに含むことができる。
【００４５】
上記機能性添加物としては、例えば、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスのうちのいずれか一つ以上である。また、必要に応じて乳脂成分、補習剤、エモリアント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などをさらに配合することもできる。
【００４６】
上記化粧料組成物の剤形は、適用特性によって適切に選択することができ、例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、パウダー、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション及びボディークレンザー、スプレーなどの剤形と提供される。
【００４７】
以下、本発明に関する実施例１〜２及び実験例１〜２を示す。下記実施例及び実験例は、本発明の実施及び効果に関する一例にすぎず、本発明の権利範囲及び効果がこれに限定されることはない。
【実施例１】
【００４８】
豆の葉と豆抽出物の成分比較
豆の葉と豆抽出物の構成成分が同じではないことを確認するために、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使った成分の分析を実施した。
【００４９】
ＨＰＬＣ分析条件
豆の葉、豆抽出物のそれぞれを７０％のエタノールに溶かして１０、０００ｐｐｍ溶液にした後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社、２６９５ｍｏｄｅｌ）を利用し、検出機（Ｗａｔｅｒｓ社、２９９６ＰＤＡ検出機）を使って成分分析を行った。固定像はＫａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ-１８ＧＰ２５０-４．６（５μｍ）コラムを利用し、移動像は水とアセトニトリルに対するアセト酸０．１％溶液を混合して使用した。
【００５０】
ＨＰＬＣ分析結果
ＨＰＬＣ成分の分析結果を図１で示す。図１の（ａ）は豆の葉抽出物、（ｂ）は豆抽出物である。
【００５１】
図１によれば、豆の葉抽出物と豆抽出物は、互いに異なる分離パターンを示す。各時点によってピークが現れる部分が全体的に相違するところ、豆抽出物と豆の葉抽出物の構成成分は互いに同じでないことを明確に確認することができる。
【実施例２】
【００５２】
豆の葉抽出物の製造
生長時期別（ＶＣ／Ｖ２／Ｖ４／Ｒ２／Ｒ４／Ｒ６／Ｒ７時期、総７時期）に採取したそれぞれの豆の葉を精製水で洗浄して乾燥させた後、細粉化した。上記豆の葉の粉１００gを７０重量％のエタノール水溶液１リットルに入れて常温（２５℃）で１２時間抽出した後、３００メッシュ濾過布で濾過した。
【００５３】
上記抽出液を３リットルの分液漏斗に入れてエチルアセテート１リットルを加えた後、振って混ぜた後、二つの層に完全に分離されれば、上層（エチルアセテート層）を取る。下層を分液漏斗でさらに二度抽出する。それぞれの分離された上層を全て合わせた後、冷却コンデンサーが付いた蒸溜装置を利用して５０℃に減圧濃縮して乾燥した。それから各段階の豆の葉抽出物を１０．３ｇ収得した。
【００５４】
[実験例１]筋細胞の細胞活性回復能評価
本実験例１では、豆の葉抽出物がデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）による筋肉損失誘発モデルから筋細胞の細胞活性減少に対する回復効能を評価するための実験を行った。
【００５５】
デキサメタゾンは糖質コルチコイドの一種であって、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）と生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＡｔｒｏｇｉｎ１とＭｕｒｆ１の発現を増加させてタンパク質の分解作用を促進することにより、骨格筋の減少を誘発して筋細胞の死滅を誘導し、細胞の活性を低下する。したがって、筋細胞にデキサメタゾンを処理する実験モデルは、筋肉減弱症に対する機能を評価するために有用な評価モデルであって、広く利用されている。
【００５６】
本実験例１に使われたＣ２Ｃ１２（マウスの根源細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で購入して使い、細胞の培養には１０％ＦＢＳと１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ培地を利用した。具体的な実験方法は下記のとおりである。
【００５７】
先ず、実験群を用意するために、Ｃ２Ｃ１２を１２ウェルプレートに分柱した後、細胞がプレートの８０〜９０％程融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで培養する。次いで、２％の馬血清（Ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）とＤＭＥＭ培地で交換して細胞の分化を誘導した。培地を交換した後、５〜７日さらに培養して細胞の分化が完了した後、デキサメタゾンを最終濃度が１ｕＭになるように処理し、これと同時に、上記実施例２で収得したＶＣ／Ｖ２／Ｖ４／Ｒ２／Ｒ４／Ｒ６／Ｒ７時期の豆の葉抽出物を最終濃度１００ｐｐｍになるように処理した。
【００５８】
一方、対照群としては、デキサメタゾンの他には何も処理しない細胞を使用し、比較群としては、豆の葉抽出物の代わりに、炎症を抑制して筋肉痛に効果のある物質として知られたデキシブプロフェン（ｄｅｘｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）を最終濃度１００ｕＭになるように処理した細胞を使った。
【００５９】
物質を処理してから２４時間が経過した後、ＣＣＫ８（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ８）溶液１０％を含む培地に交換して１０分間反応した後、４５０ｎｍで吸光度を測定して細胞活性を測定した。信頼度を高めるために、各試料は３回ずつ反復測定し、その平均値を導き出した。
【００６０】
実験の結果は、図２及び下記表１のとおりである。
【００６１】
【表１】
2018519274.tif 000003
【００６２】
図２は、正常な筋細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する実験群、対照群（Ｄｅｘ）及び比較群（ｄｅｘｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）の相対的細胞活性度を示すグラフである。上記表１は、対照群に対する実験群及び比較群の細胞活性度の変化量を記載したものである。
【００６３】
図２を参照すれば、正常な筋細胞と比べてデキサメタゾンで処理した対照群の場合、筋細胞活性が低下することを確認することができた。このような対照群に比べて、豆の葉抽出物で処理された実験群は、全体的に筋細胞の活性が回復されることが確認できた。
【００６４】
具体的に、上記表１を見れば、Ｒ４〜Ｒ７段階の豆の葉抽出物が処理された実験群では、対照群に比べて６．２〜１８．１％で筋細胞の活性が有意に増加し、特に、Ｒ７段階の豆の葉抽出物は、とても効果的に細胞活性を回復させることが分かった。
【００６５】
これにより、本発明の豆の葉抽出物は、筋肉損失の抑制及び予防効能を有することを確認することができた。
【００６６】
一方、比較群としてデキシブプロフェンで処理した群では、筋細胞の活性回復が観察されなかったが、この点から一般的な筋肉痛抑制物質は、筋肉損失の抑制または予防に適することなく、その作用機序も相違することが分かる。
【００６７】
[実験例２]Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現抑制能評価
【００６８】
本実験例２では、豆の葉抽出物がデキサメタゾンによる筋肉損失誘発モデルでＡｔｒｏｇｉｎ１とＭｕｒｆ１のｍＲＮＡの過発現に対する抑制効能を評価するための実験を行った。
【００６９】
本実験例２の実験群、対照群及び比較群は、上記実験例１と同様に用意した。
【００７０】
ただし、各最終物質を処理してから６時間が経過した時、冷たい食塩水で２回洗浄した後、トリゾール試薬（ＴＲＩｚｏｌ ａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。
【００７１】
以後、上記抽出して定量した１ｕｇ／ｕｌのＲＮＡと逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ及びＡｔｒｏｇｉｎ１、Ｍｕｒｆ１、ＧＡＰＤＨの各遺伝子に対して予めデザインされたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）とプローブ（ｐｒｏｂｅ）（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して各遺伝子の発現様相を測定した。このとき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応と分析は、ローター−ジン３０００システム（Ｒｏｔｏｒ-Ｇｅｎｅ３０００ｓｙｓｔｅｍ；Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を利用した。信頼度を高めるために、各試料は３回ずつ反復測定してその平均値を導き出した。
【００７２】
実験結果は、図３、図４及び下記表２及び表３のとおりである。
【００７３】
【表２】
2018519274.tif 000004
【００７４】
【表３】
2018519274.tif 000005
【００７５】
図３及び図４は、正常な筋細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する実験群、対照群（Ｄｅｘ）及び比較群（ｄｅｘｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）の相対的なＡｔｒｏｇｉｎ１、Ｍｕｒｆ１の遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量を示すグラフである。上記表２及び表３は、対照群に対する実験群及び比較群のＡｔｒｏｇｉｎ１、Ｍｕｒｆ１遺伝子（ｍＲＮＡ）発現変化量を記載したものである。
【００７６】
図３及び図４を参照すれば、正常な筋細胞に対してデキサメタゾンで処理した対照群の場合、Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１遺伝子が過発現されることを確認することができた。上記対照群と比べて豆の葉抽出物がさらに処理された実験群では、全体的にＡｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１遺伝子の発現量が減少するものと現われた。
【００７７】
具体的に、上記表２を通じて、Ａｔｒｏｇｉｎ１においては、対照群に対してＲ２〜Ｒ７段階の豆の葉抽出物が処理された実験群で遺伝子の発現量が８．２〜３１．６％と有意に減少し、特に、Ｒ７段階の豆の葉抽出物を処理した実験群で非常に効果的であった。
【００７８】
また、上記表３を見れば、Ｍｕｒｆ１では対照群に比べてＶ４〜Ｒ７段階の豆の葉抽出物が処理された実験群で遺伝子の発現量が８．５〜２４．１％と有意に減少し、特に、Ｒ７段階の豆の葉抽出物を処理した実験群で非常に効果的であった。
【００７９】
一方、デキシブプロフェンを処理した比較群では、Ａｔｒｏｇｉｎ１及びＭｕｒｆ１遺伝子の発現抑制効果が微々たるものであり、これにより、一般的な筋肉痛抑制物質は、筋肉損失の抑制または予防に適することなく、その作用機序も相違することが分かる。
【００８０】
上記の結果より、本発明の豆の葉抽出物を有効成分として含む組成物は、筋疾患の抑制及び予防に優れた効能を有するので、食品、薬学または化粧料組成物などの多様な形態で産業上の活用可能性が高いと期待される。
【図１】
2018519274.tif 000006
【図２】
2018519274.tif 000007
【図３】
2018519274.tif 000008
【図４】
2018519274.tif 000009
【国際調査報告】
2018519274.tif 000010
2018519274.tif 000011
2018519274.tif 000012
2018519274.tif 000013