(57)【要約】  本発明は、免疫賦活抗原提示細胞を産生するための方法に関する。本発明は、がんなどの過剰増殖性疾患に罹患している患者を処置するためのそのような細胞の使用にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）哺乳動物疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）ステップａ）とは別に、単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）とは別に、アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ、
ｄ）ステップｃ）の前記免疫賦活自己ＡＰＣをステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と組み合わせるステップ
を少なくとも含む方法。
【請求項２】
疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）哺乳動物疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）ステップａ）とは別に、単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原をステップｂ）の前記単球と組み合わせるステップ、
ｄ）アポトーシス剤の非存在下でステップｃ）の混合物中の前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法。
【請求項３】
腫瘍関連抗原を提示している前記自己抗原提示細胞が、ＴＡＡを提示している自己樹状細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
全体に活性化された単球および／または抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物の血液試料を用意するステップ、
ｂ）アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して、全体に活性化された単球および／または免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法。
【請求項５】
前記単球が、サイトカインを含む分子カクテルの添加を必要とすることなく、活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導される、請求項１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記単球が、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料をデバイスのフローチャンバーを通過させることによって、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を物理的な力に供することによって活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導され、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるように前記デバイスの前記フローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の固定または調節可能な調整を可能にする、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記単球が、アポトーシス剤の非存在下で血小板および／または血漿構成成分との相互作用を通じて活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導される、請求項１、２、３、４、５または６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記単球の活性化および免疫賦活自己抗原提示細胞への分化が、前記フローチャンバーの設計および寸法、前記単球が前記フローチャンバーを通過する流速、前記単球、血小板、血小板由来因子および／もしくは血漿構成成分が前記フローチャンバーを通過する温度、光への前記単球の曝露、前記単球、血小板、血小板由来因子および／もしくは血漿構成成分が前記フローチャンバーを通過する順序、血漿構成成分が前記フローチャンバーの表面にコーティングされる密度、血小板および／もしくは血小板由来因子が前記フローチャンバーの前記表面および／もしくは前記血漿構成成分に接着する密度、ならびに／または単球が前記血小板および／もしくは血小板由来因子に接着するならびに／または血漿構成成分が前記フローチャンバーの前記表面に接着する密度によって影響を受ける、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１のステップｃ）または請求項２のステップｄ）のアポトーシス剤の非存在下での前記単球の前記活性化および免疫賦活自己抗原提示細胞への分化が、
ｉ．前記単球を血漿構成成分および血小板と一緒に前記フローチャンバーを通過させるステップ、ならびに
ｉｉ．前記単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１のステップｃ）または請求項２のステップｄ）のアポトーシス剤の非存在下での前記単球の前記活性化および免疫賦活自己抗原提示細胞への分化が、
ｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血漿構成成分および血小板を、前記フローチャンバーの壁に接着できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ
ｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料に含有される前記単球を前記フローチャンバーを通過させるステップ
ｉｉｉ．前記単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１のステップｃ）または請求項２のステップｄ）のアポトーシス剤の非存在下での前記単球の前記活性化および免疫賦活自己抗原提示細胞への分化が、
ｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血漿構成成分または血漿を、前記フローチャンバーの前記壁に接着できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ
ｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血小板または血小板構成成分を、ステップｉの前記血漿構成成分と相互作用できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ
ｉｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料に含有される前記単球を前記フローチャンバーを通過させるステップ、および
ｉｖ．前記単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記血小板が、約４０：１から４００：１の幅高さ比を有する前記フローチャンバーを通過する、
請求項６、７、８、９、１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記フローチャンバーが、高さ約２０μｍから約２０００μｍまでの寸法を有する、請求項６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記フローチャンバーが、約０．２ｍｌから約５ｍｌの容積をもたらす寸法を有する、請求項６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記フローチャンバーが、高さ約２０μｍから約２０００μｍまでの寸法を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フローチャンバーが、高さ約２０μｍから約２０００μｍまで、幅約５ｍｍから約３０ｍｍ、および長さ約４０ｍｍから約８０ｍｍの寸法を有する、請求項６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記単球が、約０．０１から約１００．０ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断力を生じる流速で前記フローチャンバーを通過する、請求項６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス性にし、前記疾患関連抗原を放出させるために使用される前記アポトーシス剤が、ドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンもしくはゾレドロネートを含む群から選択される細胞傷害性物質ならびに／または８−ＭＯＰおよびＵＶＡの組合せである、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患エフェクター細胞が腫瘍から取られた細胞であり、前記放出された疾患関連抗原が放出された腫瘍関連抗原である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が固形腫瘍から得られるまたは脱落する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記固形腫瘍が、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、神経膠腫、脳がん、卵巣、筋肉、結合組織、腎臓がんまたはメラノーマなどの皮膚がんを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離された疾患関連抗原が単離された腫瘍関連抗原である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍関連抗原が固形腫瘍から得られるまたは脱落する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固形腫瘍が、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、脳がん、卵巣、筋肉、結合組織、腎臓がんまたはメラノーマなどの皮膚がんを含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）固形腫瘍由来の細胞の体外試料を用意し、前記腫瘍細胞を８−ＭＯＰおよびＵＶＡに供して腫瘍関連抗原を放出させるステップ、
ｂ）ステップａ）とは別に、単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）とは別に、８−ＭＯＰおよびＵＶＡの非存在下で前記単球の免疫賦活自己抗原提示細胞への分化を誘導するために、前記単球をフローチャンバーを通過させるステップ、
ｄ）ステップｃ）の前記免疫賦活自己抗原提示細胞をステップａ）の前記腫瘍関連抗原と組み合わせるステップ
を少なくとも含む、腫瘍関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための、請求項１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ａ）固形腫瘍由来の細胞の体外試料を用意し、前記腫瘍細胞を８−ＭＯＰおよびＵＶＡに供して腫瘍関連抗原を放出させるステップ、
ｂ）ステップａ）とは別に、単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）の前記腫瘍関連抗原をステップｂ）の前記単球と組み合わせるステップ、
ｄ）８−ＭＯＰおよびＵＶＡの非存在下で前記単球の免疫賦活自己抗原提示細胞への分化を誘導するために、ステップｃ）の前記混合物をフローチャンバーを通過させるステップ
を少なくとも含む、腫瘍関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための、請求項１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｂ）８−ＭＯＰおよびＵＶＡの非存在下で前記単球を活性化させて、全体に活性化された単球および／または免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む、全体に活性化された単球および／または抗原提示細胞を得るための、請求項４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記フローチャンバーが、高さ約２０μｍから約２０００μｍまでの寸法を有する、請求項２５、２６または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記フローチャンバーが、約０．２ｍｌから約５ｍｌの容積をもたらす寸法を有する、請求項２５、２６、２７または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
単球の前記活性化および前記単球の免疫賦活自己抗原提示細胞への分化が血小板および血漿または血漿構成成分の存在下で行われる、請求項２５、２６、２７、２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
方法ステップａ）が、細胞がアポトーシス剤と接触する唯一の方法ステップである、または方法ステップが細胞をアポトーシス剤に接触させるステップを含まない、請求項１から３および５から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
活性化リンパ球を得るための方法であって、
ａ）請求項１から３１のいずれかに記載の方法によって得ることができる疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を用意するステップ
ｂ）体外量のリンパ球を用意するステップ、および
ｃ）疾患関連抗原を提示している前記抗原提示細胞を前記リンパ球と組み合わせるステップ
を少なくとも含む方法。
【請求項３３】
前記活性化リンパ球が活性化Ｔリンパ球を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍の治癒的または予防的処置における使用のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１のいずれかに記載の方法によって得ることができる疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞。
【請求項３５】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項３４に記載の使用のための疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞。
【請求項３６】
前記固形腫瘍が、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、脳がん、卵巣、筋肉、結合組織、腎臓がんまたはメラノーマなど皮膚がんを含む群から選択される、請求項３４に記載の使用のための疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞。
【請求項３７】
腫瘍の治癒的または予防的処置における使用のための、請求項３２または３３に記載の方法によって得ることができる活性化リンパ球。
【請求項３８】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項３７に記載の使用のための活性化リンパ球。
【請求項３９】
前記固形腫瘍が、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、脳がん、卵巣、筋肉、結合組織、腎臓がんまたはメラノーマなどの皮膚がんを含む群から選択される、請求項３８に記載の使用のための活性化リンパ球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活抗原提示細胞を産生するための方法に関する。本発明は、がんなどの過剰増殖性疾患に罹患している患者を処置するためのそのような細胞の使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原を取り込み、処理し、それぞれ交差提示または外来性提示（exogenous presentation）として公知のプロセスを介してそれらを主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの構成成分として包まれた、ペプチド誘導体として提示する。樹状細胞は、異なるペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲを発現する２つの主なＴ細胞サブセット、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のメンバーと接触できる所属リンパ節に移動する。具体的な誘導ペプチドに対する膨大な特異性に対するこのＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用の能力は、単純な計算によって明らかになる。例えば、腫瘍特異的タンパク質由来の９〜１１アミノ酸長ペプチド断片がクラスＩ  ＭＨＣへの結合のために好ましい長さであり、アミノ酸に２０の異なる種類があることから、これらの複合体の多様性の潜在的に膨大なレベルは、２０１１である。クラスＩＩ−結合誘導ペプチドは、やや長く、そのためさらに大きな潜在的多様性および特異性を提供する。細胞傷害性Ｔ細胞を含むＣＤ８Ｔ細胞がクラスＩ  ＭＨＣに関連して提示される抗原性ペプチドを認識する一方で、ＣＤ４  Ｔ細胞はクラスＩＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドを認識する。抗原ロード樹状細胞が、同時刺激分子を発現する成熟状態にある場合、それらは増殖および分化するために活性化シグナルをＴ細胞に伝達し、次いで抗原に対する免疫応答を始める。異なるＭＨＣ提示抗原に対する受容体を有するＴ細胞からなり、多数の免疫原性および均衡する寛容原性の正味の免疫応答を可能にする細胞免疫系の優れた特異性は、理想的に作用する場合は驚くべき力を与え、機能障害の場合は危険なほどに破壊的である。
【０００３】
本特許の基本となる前提は、強力な治療薬によってだけ臨床的に管理可能であるように複雑であるよりむしろ、正味のＴ細胞応答を臨床的状況によって必要とされる望ましい方向に選択的に調整し、傾けるために通常の免疫生理学と治療的に連携することができることである。しかしこれは本発明の重要な点であるが、細胞免疫治療において免疫化することと寛容化することとの間の正味の効果の自然のバランスが、悪い方向に傾いた場合、一般に隠され、単純な疾患進行から識別することが困難である重篤な有害反応を誘導する。例えばがん抗原に不注意に誘導された寛容は、自発性のがん進行と誤解される場合がある一方で、組織抗原に対して不注意に誘導された免疫は、自然に制御されていない自己免疫または移植された器官の拒絶として誤解される場合がある。本発明は、これらの方向の抗原特異的応答の望ましい局在を可能にするので、免疫または寛容は所望により個々に最大化され得る。
【０００４】
抗腫瘍免疫応答は、がんと免疫系との間に境界面を形成すると考えられ得る。典型的には抗腫瘍免疫応答は、種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現している腫瘍環境にある腫瘍細胞で開始する。ＴＡＡは、変異した自己抗原、すなわち体細胞変異（１、２、３）から生じた新抗原、または腫瘍によって過剰発現されているまたは選択的に発現されている野生型自己抗原である場合がある。
【０００５】
がんワクチン接種手法は、ＴＡＡを提示している腫瘍細胞に対する免疫応答を始めるためにＤＣなどのＡＰＣ上にＴＡＡを提示することを目的としている。例えばＴＡＡ提示成熟ＤＣは、リンパ節から出て、それらが浸潤し、種々の死機構（death mechanism）によって腫瘍細胞死を引き起こす腫瘍微小環境に戻るように輸送されると考えられるＣＤ８＋細胞傷害性およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化する。
【０００６】
しかし、そのようなＤＣが成熟刺激を受けない場合、それらは代わりにＴ細胞欠失、アネルギーまたは制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の産生を介して寛容（「下方制御」）を誘導する。実際に腫瘍は、そうでなければ腫瘍縮小を生じるＴ細胞死滅に対抗する免疫抑制性防御機構を誘導することによって、抗腫瘍免疫応答を免れていると考えられている。
【０００７】
この背景に反してかなりの研究活動は、前立腺がんに対するＴＡＡでのがんワクチン接種を含む抗腫瘍応答（４）、Ｔ細胞が人工的な腫瘍特異性を発現するように外来性に遺伝的に修飾されているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）での養子細胞移入療法（５）、ならびにＣＴＬＡ−４−、ＰＤ−１−およびＰＤ−Ｌ１−抗体を含むチェックポイント阻害剤に関する免疫系の可能性を利用することに注目している。
【０００８】
体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を処置するために開発された（６，７）。ＥＣＰの際に患者の血液はアフェレーシスされる。赤血球は、直ちに患者に再注入で戻され、一方患者の血漿および白血球は、後毛細管小静脈、損傷された組織または創傷での力を再現する低流速条件下でポリスチレンプレートを通過させる。物理的な力を与えるこの第１のステップは、一般に「プレート通過」と称される。このプレート通過手順の際の一部の場合、患者の全身瘍細胞プールの約５％を構成する（大部分の悪性細胞が組織局在性であることから）単核白血球は、Ａ型紫外線（ＵＶＡ）の存在下で光活性化ソラレン薬、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）にｅｘ  ｖｉｖｏで、ソラレンおよびＵＶＡ（ＰＵＶＡ）と称される組合せ療法に曝露される。ＵＶＡを伴わないと８−ＭＯＰが不活性であり、励起した８−ＭＯＰ状態が数分の１秒だけ継続することから、薬物の活性の持続期間、したがってそのアポトーシス性効率はＵＶＡへの曝露によって制御される（８）。このように８−ＭＯＰは、ＤＮＡの塩基対を供給結合的に架橋するために誘導される。ＥＣＰの基礎となる元の概念は、ＣＴＣＬの転移性Ｔ細胞の増殖が破壊され、それにより疾患の症状が緩和され得るという想定であった。しかしそれは、実際にＣＴＣＬが一部の患者において治癒された際には驚くべきことであった。
【０００９】
さらにそのＦＤＡ認可のためにＥＣＰは、ＣＴＣＬだけでなく実質臓器移植拒絶（ＳＯＴＲ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（９）ならびに進行性全身性硬化症（１０、１１）および尋常性天疱瘡（１２）などの自己免疫疾患の処置においても有効であることが興味深いことに証明された。
【００１０】
これらの一見矛盾する治療設定におけるＥＣＰの有効性を説明するために、プレート通過ステップの際に単球に適用される物理的な力およびこれらの単球と血小板との相互作用が剪断ストレスを作りだし、最終的には、免役刺激の指標である種々のＤＣ分化マーカーを発現している同期化された、活性化単球を生じることが想定された（１４）。ＰＵＶＡは、広範囲に、遅いアポトーシスをリンパ球集団において優先的に誘導する追加的効果を有する（１５、１６、３４）。これは、ＣＴＬＣ患者を処置する場合のＥＣＰの有効性を説明できた。リンパ球のＰＵＶＡ誘導アポトーシスは、両方の賦活ＤＣのための抗原供給源を提供できる。次いでＤＣは、これらのペプチドを内部移行し、それらをクラスＩまたはＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子上に提示し、最終的には適応免疫系のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞をそれぞれ活性化する（１９）。
【００１１】
例えばＧｖＨＤを処置する場合のＥＣＰの下方制御または免疫抑制効果は、ＥＣＰの際のＤＣへのＰＵＶＡの効果によって説明できる。８−ＭＯＰおよびＵＶＡは、ＤＣ「抑制」遺伝子の発現を上方制御し、それにより免疫寛容原性または免疫抑制性ＤＣ（１５）の生成に好都合であり、移植片拒絶の阻害において役割を演じる（１６、１７）ことが示されている。
【００１２】
これらの複雑性を示して、ＥＣＰの根底にある事象を解明することおよび抗腫瘍治療のためにそれらを利用することに継続的な関心がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一目的は、疾患関連抗原を提示している免疫賦活自己樹状細胞を産生するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、免疫賦活自己抗原提示細胞、好ましくは疾患関連抗原を提示している免疫賦活自己樹状細胞を産生するための方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、患者から得られた体外の量の血液において樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞を産生するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、並行して寛容誘導自己樹状細胞を内在的に調製することなく、免疫賦活自己樹状細胞を調製することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、単球活性化ステップから抗原形成ステップを分けることである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、がんなどの疾患に罹患している患者を処置するための、樹状細胞などのそのような免疫賦活自己抗原提示の使用に関する。
【００１９】
本明細書以下の続く記載から明らかになるこれらおよび他の目的は、独立請求項の主題によって解決される。
【００２０】
本発明の一部の好ましい実施形態は、従属請求項の主題を形成する。本発明のさらに他の実施形態は、続く記載から理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
第１の態様では、記載は疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ、
ｄ）ステップｃ）の前記免疫賦活自己ＡＰＣをステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と組み合わせるステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００２２】
この第１の態様に関して、ステップａ）からｃ）は、この順序で行われる必要はない。例えば、最初に単球の活性化ステップを、次いで疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップを実施した後、続いてそれらを組み合わせてもよい。しかし、アポトーシスが疾患エフェクター細胞において誘導されているまたは疾患関連抗原が加えられた同じ試料中では単球の活性化は同時に生じないことから、それらは互いに別々に実施されなければならない。したがってアポトーシスの誘導および単球の活性化が別々である、すなわち同じ試料中で同時に行われないことから、方法は、非連続的プロセスであると考えられる。具体的には単球の活性化は、８−ＭＯＰ／ＵＶＡの存在下で同時に行われるべきではない。好ましい実施形態では、「別の」調製物もしくは「ステップａ）とは別」の単球、または免疫賦活自己ＡＰＣなどの任意のそれらのさらに分化した後代細胞は、本発明の方法のいかなるステップにおいても８−ＭＯＰ／ＵＶＡなどのアポトーシス剤と接触されない。したがって本実施形態では「別の」単球は、アポトーシス剤の非存在下で調製および活性化され、これらの単球とアポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と組み合わせた後に、活性化単球（すなわち免疫賦活自己ＡＰＣ）は、アポトーシス剤と接触されない。
【００２３】
ドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シクロホスファミド、ビンカアルカロイド、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンもしくはゾレドロネート、またはアポトーシス剤としてのデニロイキン、ジフチトクスなどの毒素を送達するものを含む抗腫瘍モノクローナル抗体などの生物学的腫瘍標的化剤を含む化学療法において使用される細胞傷害性物質は使用できる。そのようなアポトーシス剤の場合、ステップｄ）においてアポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原を免疫賦活自己ＡＰＣと組み合わせる前にアポトーシス剤を除去する必要がある場合がある。好ましいアポトーシス剤は、８−ＭＯＰのアポトーシス効力がステップｃ）におけるＵＶＡへの曝露を回避することによって切り替えられることから８−ＭＯＰの除去が必要でないことを考慮すると、８−ＭＯＰとＵＶＡ曝露との組合せ（本明細書においてＰＵＶＡとも称される）である。
【００２４】
一実施形態ではこの第１の態様のステップは、ヒトまたは動物の身体の外で行われる。
【００２５】
第２の態様では、記載は、疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原をステップｂ）の前記単球と組み合わせるステップ、
ｄ）アポトーシス剤の非存在下でステップｃ）の混合物中の前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００２６】
第１の態様に関して、疾患関連抗原を放出するように疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、および単球を活性化するステップは、アポトーシスが疾患エフェクター細胞において誘導されているまたは疾患関連抗原が加えられた同じ試料中では単球の活性化は同時に生じないことから、互いに別々に実施されなければならない。したがってアポトーシスの誘導および単球の活性化が別々である、すなわち同じ試料中で同時に生じないことから、方法は、非連続的プロセスであると考えられる。具体的には単球の活性化は、８−ＭＯＰ／ＵＶＡの存在下で同時に行われるべきではない。好ましい実施形態では、「別の」調製物もしくは「ステップａ）とは別」の単球、または免疫賦活自己ＡＰＣなどの任意のそれらのさらに分化した後代細胞は、本発明の方法のいかなるステップにおいても８−ＭＯＰ／ＵＶＡなどのアポトーシス剤と接触されない。したがって本実施形態では「別の」単球は、アポトーシス剤の非存在下で調製され、これらの単球とアポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と組み合わせた後に、細胞はアポトーシス剤と接触されない。本明細書において使用される用語「アポトーシス剤」は、細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを誘導するための有効量での任意の薬剤もしくは外部条件またはそれらの組合せを指す。当業者は、ＦＡＣＳ、アネキシンＶ、カスパーゼアッセイ、ミトコンドリアの膜貫通電位変化アッセイなどの標準的アッセイによって細胞がアポトーシス性であるか否かを決定する方法を知っている。
【００２７】
ドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シクロホスファミド、ビンカアルカロイド、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンもしくはゾレドロネートまたは、アポトーシス剤としてのデニロイキンジフチトクスなどの毒素を送達するものを含む抗腫瘍モノクローナル抗体などの生物学的腫瘍標的化剤を含む化学療法において使用される細胞傷害性物質は使用できる。この第２の態様に関してＰＵＶＡは、８−ＭＯＰのアポトーシス効力がステップｃ）におけるＵＶＡへの曝露を回避することによって切り替えられることから８−ＭＯＰの除去が必要でないことを考慮すると、アポトーシス剤として好ましい。
【００２８】
一実施形態では、この第２の態様のステップは、ヒトまたは動物の身体の外で行われる。
【００２９】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい一実施形態では、前記疾患エフェクター細胞は腫瘍細胞であり、前記疾患関連抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。そのような腫瘍細胞またはＴＡＡは、好ましくは固形腫瘍から得られる。腫瘍細胞またはＴＡＡは同種供給源から得ることができるが、腫瘍細胞またはＴＡＡが自己由来のものであることは好ましい。
【００３０】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて同様に好ましい一実施形態では、自己ＡＰＣは自己樹状細胞である。
【００３１】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、自己ＡＰＣはＴＡＡを提示している、例えば、ＴＡＡを提示している自己樹状細胞である。
【００３２】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、哺乳動物血液試料、疾患エフェクター細胞および疾患関連抗原はヒト由来のものである。したがって記載は、例えばヒト血液試料、ヒト腫瘍細胞およびヒトＴＡＡの使用を具体的に企図する。
【００３３】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、疾患エフェクター細胞および疾患関連抗原、好ましくは腫瘍エフェクター細胞および腫瘍関連抗原は、固形腫瘍からまたはそのような固形腫瘍から脱落した細胞または血液、髄液もしくはリンパから単離された腫瘍細胞から得られる。
【００３４】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、すべての疾患エフェクター細胞、疾患関連抗原、血液試料、単球などは、本明細書に記載の方法のために使用される場合ヒトまたは動物の身体の外にある。
【００３５】
第３の態様では、記載は全体に活性化された単球および／または抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｂ）アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して、全体に活性化された単球および／または免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００３６】
一実施形態ではこの第３の態様のステップは、ヒトまたは動物の身体の外で行われる。
【００３７】
この態様では、単球はヒトまたは動物の身体の外でアポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と接触されることなく、ヒトまたは動物の身体の外で最初に全体に活性化された単球、次いで抗原提示細胞になるように活性化される。したがって、単球が活性化された後、ヒト脳および身体への活性化単球の再導入前に、アポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と混合または、同時インキュベーションステップはない。アポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原の非存在下で得られたそのような活性化単球は、化学療法および／またはガンマ照射療法を受けている患者に例えば再導入されてよい。したがってそのような細胞は切除可能でなく、腫瘍関連抗原が化学療法および／またはガンマ照射を通じてヒトまたは動物の身体において放出されている腫瘍の処置のために特に有用である可能性がある。
【００３８】
第１のおよび第２の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、単球は、例えばＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αなどのサイトカインを含む分子カクテルの添加を必要とすることなく、活性化され、樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣに分化するように誘導される。
【００３９】
第１の、第２のおよび第３の態様についての記載全体を通じて好ましい別の実施形態では、単球は細胞をアポトーシス剤の非存在下、具体的にはＰＵＶＡの非存在下で、図１に記載のものに相当する寸法のフローチャンバーを有するデバイスを通過させることによって活性化され、免疫賦活自己ＡＰＣに分化するように誘導される。そのようなフローチャンバーは、０．２ｍｌから５ｍｌの範囲の容量を有する。そのようなフローチャンバーの高さは、約２０μｍから約２０００μｍの範囲、好ましくは約５０μｍから約１０００μｍの範囲であってよい。
【００４０】
本明細書に記載の第４の態様では、樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣまたは全体に活性化された単球は、第１の、第２のおよび第３の態様の方法ならびにその実施形態によって得られることから、疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原によって媒介される疾患に罹患している患者の治癒的または予防的処置における使用のためである。したがってそのような免疫賦活自己ＡＰＣは、腫瘍、好ましくは固形腫瘍の予防的または治癒的処置における使用のためであると具体的には考えられる。
【００４１】
さらなる実施形態は、本明細書以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ａ）実験１、２および３において使用されたフローチャンバーを示す図である。Ｂ）Ａ９に示すフローチャンバーを組み立てる１つの選択肢を示す図である。
【図２】個々のマウスについてのＹＵＭＭ腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通され、８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供された。破線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった個々の対照群マウスの腫瘍サイズを示す。実線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【図３】対照および処置群にわたって平均化された図１のＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。破線は、マウスがフローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった対照群の腫瘍サイズを示す。実線は、マウスがフローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された処置群の腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【図４】実験１の数匹の処置マウスを示す図である。
【図５】対照および処置群にわたって平均化されたＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡには供されなかった。破線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった個々の対照群マウスの腫瘍サイズを示す。実線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【図６】対照および処置群にわたって平均化されたＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。３個の処置群（各マウス５匹）は、８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置フローチャンバー通過Ｙｕｍｍ１．７だけを受けた（ＹＵＭＭ単独）、フローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されなかったＰＢＭＣだけを受けた（ＰＢＭＣ、ＰＰ  ｗ／ｏ  ＹＵＭＭ）、フローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されなかったＰＢＭＣを受け、−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置フローチャンバー通過Ｙｕｍｍ１．７細胞（群４、Ｏ／Ｎ  ＹＵＭＭＵＶＡ  ＰＰｎｏＵＶＡ）またはＰＢＳと一晩同時インキュベートされた。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【図７】Ａ）は、一部の例において使用されるデバイスの配置を示す図である。Ｂ）は、代替的デバイスの配置を示している。
【図８】図７のデバイスを通る単球の物理的活性化でのＨＬＡ−ＤＲの発現の増加を示すグラフである。
【図９】図７のデバイスを通る単球の物理的活性化でのＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加を示す図である。
【図１０】図７のデバイスを通過させることによる単球の物理的活性化でのＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加を示すグラフである。
【図１１】図７のデバイスを通る単球の物理的活性化でのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、ＰＬＡＵＲの発現およびまたはＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加を示す図である。
【図１２】対照および処置群にわたる平均されたＹＵＭＭ腫瘍の増殖阻害を組み合わせて示すグラフである。処置群は、フローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されていないＰＢＭＣを受け、−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置フローチャンバー通過Ｙｕｍｍ１．７細胞と一晩同時インキュベートされた、またはされなかった。腫瘍容積は、腫瘍容積の測定によって決定された。
【図１３】対照および処置群にわたる平均されたＹＵＭＭ腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞はＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通過し、８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されたまたは供されなかった。研究は２回反復された。実線は個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示している。腫瘍容積は、任意単位で表されている。
【図１４】対照および処置群にわたる平均されたＹＵＭＭ腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞はＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通過し、アポトーシス剤処置ＰＢＭＣと組み合わせられたまたは組み合わせられなかった。実線は個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示している。腫瘍容積は、任意単位で表されている。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明がそのいくつかの好ましい実施形態に関して詳細に記載される前に、次の全般的定義が示される。
【００４４】
次に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限の非存在下で好適に実施できる。
【００４５】
本発明は、具体的な実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００４６】
本記載および特許請求の範囲において用語「含む（comprising）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（consisting of）」は、用語「を構成する（comprising of）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。
【００４７】
本発明の目的のために用語「得られた（obtained）」は、用語「得ることができる（obtainable）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。
【００４８】
不定または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の内容では、用語「約（about）」または「およそ（approximately）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。
【００４９】
さらに、記載および特許請求の範囲における用語「第１の（first）」、「第２の（second）」、「第３の（third）」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などは、逐次的または時間的順序を記載する必要がない、類似の要素間を識別するために使用される。そのように使用される用語が適切な環境下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態が本明細書に記載または例示される以外の配列において運用できることは理解される。
【００５０】
用語「第１の（first）」、「第２の（second）」、「第３の（third）」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などが、方法または使用またはアッセイのステップに関する場合、他に示さない限りステップ間に時間または時間間隔の干渉性はない、すなわち本明細書上記または下記に明記された適用において他に示さない限り、ステップは同時に実行されてよいまたはそのようなステップ間に数秒、数分、数時間、数日、数週間、数カ月もしくは数年の時間間隔があってよい。
【００５１】
技術的用語は、それらの一般的な意味で使用される。具体的な意味が特定の用語に移される（conveyed）場合、用語の定義は次の用語が使用される内容において示される。
【００５２】
本明細書に示す実験データは、とりわけ、以下の観察を特に考慮している。ＥＣＰ手順のために使用されたものよりも比較的小さな寸法のフローチャンバーを有する新規デバイスを使用して、メラノーマ、すなわち固形腫瘍についてのマウスモデルにおいてＥＣＰの効果を再現することができた。この目標に向けて、アポトーシス性メラノーマ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と同時インキュベートされ、細胞は前記フローチャンバーを通過する間にＰＵＶＡ処置（すなわち８−ＭＯＰおよびＵＶＡの適用）に供された。続いてこれらの細胞はマウスの静脈内に再注射され、腫瘍増殖の阻害が観察された。これは、本質的に、ＣＴＬＣに罹患し、古典的ＥＣＰ手順を受けている患者について見られた一連のステップおよび効果を再現した。別の実験では、アポトーシス性メラノーマ細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）と同時インキュベートされたが、細胞は前記フローチャンバーを通過する間にＰＵＶＡ処置（すなわち８−ＭＯＰおよびＵＶＡの適用）には供されなかった。それにもかかわらず腫瘍増殖は、これらの細胞をマウスに静脈内再注射した場合に阻害された。
【００５３】
これらの観察から、古典的ＥＣＰ手順の特徴であるＰＵＶＡでのＰＢＭＣの処置が実際に、樹状細胞などの自己免疫賦活抗原提示細胞を産生するために必要でないことを結論付けることは合理的であると考えられる。むしろ、単球の活性化および単球の樹状細胞などの成熟自己免疫賦活抗原提示細胞への分化の誘導は、ＰＵＶＡ処置と無関係であると考えられ、任意選択で血小板および血漿構成成分の存在下で、単球を本明細書に記載のフローチャンバーを有するデバイスを通過させることによって達成され得る。それにも関わらずこれらの細胞は、腫瘍細胞にアポトーシス性を与えることによって別々に得られた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を取り込み、固形腫瘍に対する抗腫瘍応答を媒介することができ、それにより治癒的処置、すなわち既存の腫瘍の処置を可能にしていると考えられている。そのような手法が他の疾患媒介エフェクター細胞または他の種類の疾患関連抗原について、例えば細菌またはウイルス感染の処置のために実施された場合にもこれらの観察を適用できると結論付けることは妥当であると考えられる。これらの実験は、例えば疾患がまだ発症していない状況での予防的処置のために、樹状細胞などのそのような自己免疫賦活抗原提示細胞を産生し、それらをＴＡＡまたは他の疾患関連抗原と同時インキュベートできることも示唆している。
【００５４】
樹状細胞などの自己免疫賦活抗原提示細胞の生成からＴＡＡまたは他の疾患関連抗原の生成を分けることによって、樹状細胞などのそのように発達している自己免疫賦活抗原提示細胞のアポトーシスは妨げられないまでも低減され、それにより腫瘍が腫瘍監視を逃れられるようにすることによりがんの処置結果に悪影響を与える場合がある寛容原性樹状細胞の発達を回避する。
【００５５】
さらに、示されたデータに関して、樹状細胞などの自己免疫賦活抗原提示細胞の誘導以外の手段によって、腫瘍細胞などのアポトーシス性疾患エフェクター細胞またはＴＡＡなどの疾患関連抗原の生成を分けることは、アポトーシス剤として８−ＭＯＰおよびＵＶＡ（本明細書においてＰＵＶＡとも称される）を使用することに限定されないと想定することは妥当であると考えられる。したがって、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンもしくはゾレドロネートなどの化学療法において使用される公知の細胞傷害性物質、ならびにγ−照射、強ＵＶＢもしくはＵＶＣ照射などの直接照射または腫瘍細胞などのアポトーシス性疾患エフェクター細胞またはＴＡＡなどの疾患関連抗原を生成するための非常に高い温度を使用すること、およびこのステップをＤＣなどの自己免疫賦活抗原提示細胞の誘導から分けることは可能である、すなわちこの誘導ステップは、そのようなアポトーシス剤の非存在下で行われるべきである。これは、誘導ステップが実施される前に例えば細胞傷害性物質の除去を必要とする場合がある。この背景に反して当然のことながら、ＰＵＶＡは、８−ＭＯＰのアポトーシス可能性はＵＶＡを消すことによってスイッチを切ることができ、それにより誘導ステップは８−ＭＯＰの存在下で行われ得る、誘導ステップの前に８−ＭＯＰを除去する必要がないことを意味することを考慮すると、方法を連続的様式で実施できることから、本明細書に記載の方法のための特に好適なアポトーシス剤であり得る。
【００５６】
本明細書に示すデータは、古典的ＥＣＰについて観察された、いくつかの効果の説明をさらに助ける。ＥＣＰ処置サイクルは１週間に１回、２週間に１回、月に１回または四半期に１回行われる一方で、１回の処置サイクルは２日連続で２回のＥＣＰ処置を含む。文献は、この処置スケジュールに論理的根拠を与えていないが、全世界的容認および適用を考慮すると、この処置スケジュールが有効な処置と望ましくない副作用との間の合理的な妥協案を提供していることが証明されていることが実際に想定できる。この内容では、ＣＴＬＣに罹患し、真菌感染を併発している一部の患者がＥＣＰ処置の結果としてＣＴＬＣの改善を示した一方で真菌感染は実際には悪化したことが古典的ＥＣＰについて観察されたことが注目される。さらに、一部のＣＴＬＣ患者においてＥＣＰ処置は成功せず、疾患に悪影響さえ有したことが観察された。これらの観察を説明できる１つの仮説は、がん性Ｔ細胞の８−ＭＯＰ／ＵＶＡ誘導アポトーシスが、ＤＣへの８−ＭＯＰ／ＵＶＡの潜在的切断効果とは異なる時間スケールで進行することである。したがってＥＣＰ処置の初日に単球は、全体に活性化されるようになり、免疫賦活ＤＣへの分化を開始する可能性さえある。同時にアポトーシスががん性Ｔ細胞で誘導され、長期抗原脱落が開始される。ＥＣＰは、処置細胞が患者の身体に連続的に再導入される連続的なプロセスであることから、次の処置スケジュールが翌日に行われることを考慮すると、この種類の「一晩インキュベーション」は、抗原ロード免疫賦活完全活性化ＤＣの形成をもたらす可能性がある。このサイクルは、２日目に繰り返され、それにより処置の効率は潜在的に増加する。しかし同時に、２日目の８−およびｈｏｐｅＰ／ＵＶＡ処置は、免疫賦活ＤＣへの単球の分化を切るおよび／または抗原ロードＤＣを寛容原性ＤＣに寛容化する、のいずれかになる場合もある。当然のことながら、これらの種類のＤＣが８−ＭＯＰ／ＵＶＡでの２倍の処置に供されていることから、これは併発している真菌感染などの他の疾患に対して患者内で既に発達した抗原ロードＤＣに具体的には適用される。ある種のＣＴＬＣ患者がＥＣＰ処置に良好に反応しない理由を説明できる、すなわちそのような患者がいくらかの抗原ロードＤＣを既に有している場合、長期の８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置によって寛容原性ＤＣに切り替わりそれにより腫瘍に対して寛容化効果を有する。
【００５７】
したがってこれは、一見相反する結果を説明できる古典的ＥＣＰのさまざまな要因の連続的性質および複雑な相互作用である。
【００５８】
単球の全体的な活性化および免疫賦活ＤＣへのそれらの分化が、がん由来細胞におけるアポトーシスの相互作用（例えば８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置または他の細胞傷害性物質のいずれかによる）と分けられているこの本開示のデータでは、先行技術の上に述べた欠点が、克服され得ると想定することが妥当であると考えられる。免疫賦活ＤＣおよび腫瘍関連抗原または他の疾患関連抗原を非連続的様式で生成することによって、ＥＣＰにおいて生じると想定される発達中のＤＣの切断およびＤＣの免疫寛容化の両方が低減され得る。
【００５９】
この新たなプロセスで、単球を含むＰＢＭＣを処置サイクルの際の連続する２日でよりむしろ１日だけで得ることによって、ＣＴＬＣを含む腫瘍、具体的には固形腫瘍の処置を達成することが可能になる可能性がある。実際に、処置サイクル全体の数を付加的に低減できる。本明細書に開示の方法は、具体的には活性化単球および免疫賦活ＤＣを得ることと８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置によるがん細胞のアポトーシスを誘導するステップとの厳密な分離によって特徴付けられる。ＥＣＰの顕著な特性から逸脱している本明細書に開示の方法、すなわち処置サイクルの１つの相の間でのＰＢＭＣおよびがん性Ｔ細胞の同時処置は、それによりＣＴＬＣ処置を改善し、さらに固形腫瘍を処置できるようにする可能性がある。固形腫瘍の処置は、腫瘍から直接腫瘍細胞を得ることまたは血流から腫瘍脱落細胞（tumor-shedded cell）を得ることのいずれか、ならびに単球およびＰＢＭＣの活性化とは別のステップでそれをアポトーシス剤に供することによって達成され得る。
【００６０】
この背景に反して、上述の通り本明細書に記載の第１の態様は、疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供して疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ、
ｄ）ステップｃ）の前記免疫賦活自己ＡＰＣをステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と組み合わせるステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００６１】
本明細書に記載の第２の態様として、疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）疾患エフェクター細胞の体外試料を用意し、前記疾患エフェクター細胞をアポトーシス剤に供しておよび疾患関連抗原を放出させるステップ、または単離された疾患関連抗原を用意するステップ、
ｂ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｃ）ステップａ）の前記アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原をステップｂ）の前記単球と組み合わせるステップ、
ｄ）アポトーシス剤の非存在下でステップｃ）の混合物中の前記単球を活性化して免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００６２】
これらの態様は、一部の続く実施形態において（フローチャンバー、血小板および血漿構成成分による活性化など）腫瘍細胞をアポトーシス性にすることまたはＴＡＡを使用することに関して以下により詳細に考察される。さらにこれらの態様は、アポトーシスの誘導のためにＰＵＶＡを使用することおよびＰＵＶＡの非存在下での単球の活性化に関して考察される。自己ＡＰＣは、これらの構成成分のすべては好ましくはヒト由来であり、より好ましくは完全に自己である自己樹状細胞の内容において考察される。しかしこれらの実施形態が、非ヒト由来および／または非腫瘍由来の疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原などについても考慮されることは理解される必要がある。
【００６３】
上述の通り第１および第２の態様のステップは、ヒトまたは動物の身体の外で行われてよい。
【００６４】
第１のおよび第２の態様は、化学療法、放射線療法またはそれらの組合せを含む薬物療法下にある患者の試料を使用することを企図する。これらの薬物療法は、患者において例えば腫瘍細胞のアポトーシスをもたらし、結果として試料が例えば腫瘍関連抗原を含む一方で、そのような試料における単球の活性化は、試料が単球の活性化と同じ時に別のアポトーシス性刺激に供されないことから、アポトーシス性刺激と同時に生じるとは考えられない。したがって、化学療法を含む薬物療法、放射線療法またはそれらの組合せの下にある患者由来のそのような試料においてさえ単球の活性化は、アポトーシス剤の非存在下で生じると考えられる。それでもそのような患者がＰＵＶＡ処置の下にないことが好ましい場合がある。
【００６５】
第１および第２の態様は、化学療法を含む薬物療法、放射線療法またはそれらの組合せの下にない患者から得られた試料を使用することも検討する。
【００６６】
第３の態様では、記載は全体に活性化された単球および／または抗原提示細胞を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を用意するステップ、
ｂ）アポトーシス剤の非存在下で前記単球を活性化して、全体に活性化された単球および／または免疫賦活自己ＡＰＣへの分化を誘導するステップ
を少なくとも含む方法に関する。
【００６７】
この態様では、単球はヒトまたは動物の身体の外でアポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と接触されることなく、最初に全体に活性化された単球、次いで抗原提示細胞になるようにヒトまたは動物の身体の外で活性化される。したがって単球が活性化された後、ヒト脳および身体への活性化単球の再導入前に、アポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と合わされることも、同時インキュベーションステップもない。アポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原の非存在下で得られたそのような活性化単球は、例えば、化学療法、ガンマ照射療法などの放射線療法またはそれらの組合せを受けている患者に再導入されてよい。したがってそのような細胞は、切除可能でなく、腫瘍関連抗原が化学療法および／または放射線療法を通じてヒトまたは動物の身体において放出されている腫瘍の処置のために特に有用である場合がある。そのような放射線療法は、Ｘ線療法およびガンマ照射療法などの光子療法；ならびに電子療法、プロトン療法、中性子療法、炭素イオン療法、アルファ粒子療法およびベータ粒子療法などの粒子療法を含んでよい。
したがってこの態様は、単球の活性化に関して第１のおよび第２の態様と異ならないが、活性化単球がヒトまたは動物の身体の外でアポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と接触されないことにおいて異なっている。そのような活性化単球の価値は、化学療法および／またはガンマ照射によって処置されている患者に活性化単球が直接導入される前述のシナリオにある。ヒトまたは動物の身体に入ると、そのような活性化単球は、化学療法および／またはガンマ照射によって放出された腫瘍関連抗原を取り込むことができ、それにより腫瘍関連抗原を提示している完全に活性化された免疫賦活抗原提示細胞になる。
【００６８】
単球が下に記載の通り、物理的ストレスを除いて単球をフローチャンバーを通過させること、ならびに／または血漿および／もしくは血小板組合せとの相互作用を誘導することによって活性化されると、それらは、本開示によって「全体に活性化された単球」であると考えられるものを最初に形成する。言い換えると、全体に活性化された単球は、前記方法によって得ることができる細胞である。一実施形態では用語「全体に活性化された単球」は、未分化単球由来であり、免疫賦活抗原提示細胞よりまだあまり分化していない細胞を指す。
【００６９】
そのような細胞は、未処置単球と比較した場合に好適な分子マーカーの発現の増加によっても同定され得る。実験５に示すデータは、免疫賦活抗原提示細胞を得るプロセスが、全体的な単球活性化ステップおよび単球から免疫賦活抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への分化ステップを含むと考えられることを示唆している。これらのさまざまなステップは、上に記載の分子マーカーによって、ＦＡＣＳ分析によって決定可能である前方散乱／側方散乱複雑度（ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度）としておよびＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度によって追跡可能であると考えられる。分子マーカーは、それらの公知の機能、例えば抗原提示の分子マーカー、細胞接着の分子マーカーなどによりさらにグループ分けできる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０は、抗原提示を代表するものであると考えられる。ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１は、細胞接着を代表するものであると考えられる。
【００７０】
全体的に活性化された単球の同定のためおよび免疫賦活抗原提示細胞または免疫抑制抗原提示細胞に対する識別のために使用できるマーカーのセットは、下の表１に見出される。
【００７１】
【表１】
2018519823.tif 000002
【００７２】
ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１などのマーカーならびにＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度は、全体的な単球活性化の指標であるとさらに考えられる。
【００７３】
第１のおよび第２の態様に述べた通り、樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞への全体に活性化された単球のさらなる分化は、活性化単球をアポトーシス性疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原と接触させるステップによって支持され得ることから、追加的に例えばＣＤ８３（配列番号２７）、ＡＤＡＭ−デシシン（配列番号２８）、ＣＤ４０（配列番号２９）、ＣＤ８０（配列番号３０）、ＬＡＭＰ−３（配列番号３１）、ＮＥＵ１（配列番号３２）、ＬＯＸ１（配列番号３３）、ＦＰＲＬ２（配列番号３４）、ＧＰＮＭＢ（配列番号３５）およびＣＣＲ７（配列番号３６）の発現の増加によって検出され得る。発現の増加は、未処置単球との比較を指す。そのような免疫賦活抗原提示細胞は、全体に活性化された単球のマーカーを付加的に発現する。
【００７４】
上述の通り単球は、例えばＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αなどのサイトカインを含む分子カクテルの添加に対する必要性なく活性化され、樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣに分化するように誘導され得る。これは、できる限り少ない分子干渉に供されている樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣを得る有利点を有し得る。治療用抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生するために薬理学的濃度を超える増殖因子を使用しない有利点は、ｉｎ  ｖｉｖｏで再現されない条件下で分化された細胞が患者に戻された時に望ましい機能状態で存続しない可能性があることである。対照的にＥＣＰにおいて達成されると、単球から体外でさらに生理学的に分化されたＡＰＣは患者に戻された時に機能する可能性が高い。
【００７５】
単球が、アポトーシス剤の非存在下、具体的にはＰＵＶＡの非存在下で、細胞を、図１に記載のものに相当する寸法のフローチャンバーを有するデバイスを通過させることによって活性化されることは記載全体を通じてさらに好ましい。これは、上述の第３の態様にも適用され、以下でより詳細に考察される。
【００７６】
そのようなフローチャンバーは、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の幅高さ比を有してよい。そのような幅高さ比を有するフローチャンバーは、単球が付着およびそれによって活性化されるための十分な表面を有することを確実にすることによって効率的な活性化を通常可能にする。フローチャンバーは、例えば、高さ約２０μｍから高さ約２０００μｍまで、幅約５ｍｍから約１００ｍｍ、および長さ約４０ｍｍから長さ約１００ｍｍを有してよい。そのようなフローチャンバーは、０．２ｍｌから５ｍｌの範囲の容量を有してよい。例えばそのようなフローチャンバーは、５０：１から約３００：１の幅高さ比で、高さ約５０μｍから高さ約１０００μｍまでおよび幅約５ｍｍから約５０ｍｍを有してよい。
【００７７】
前述の幅高さ比は、単球を活性化するための本明細書に記載の方法を実施する場合に特に好ましいパラメーターであり得る。そのようなフローチャンバーについて、以降に述べる流速および剪断ストレスを使用できる。
【００７８】
最初に全体に活性化された単球へ、次いで免疫賦活抗原提示細胞への単球の活性化は、フローチャンバーの壁への単球の直接的または間接的な接着を含むことが想定される。間接的接着および活性化は、以下に記載の通り単球と同時または別々にフローチャンバーを通過し得る血漿、血漿構成成分および／または血小板によって具体的には媒介され得る。高さ約２０μｍから約２０００μｍまで、幅約５ｍｍから約３０ｍｍ、および長さ約４０ｍｍから約８０ｍｍの寸法ならびに上に述べた幅高さ比を有し得るフローチャンバーの相対的な寸法は、単球が付着のためのおよびそれによって活性化される十分な表面を有することを確実にすることによって効率的な活性化を可能にする。
【００７９】
例えば単球は、約０．２から約１０．０ｄｙｎ／ｃｍ２などの約０．０１から約１００．０ｄｙｎ／ｃｍ２、約０．０５から約５０．０ｄｙｎ／ｃｍ２、約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断力を生じる流速で前記フローチャンバーを通過し得る。
【００８０】
単球の活性化を可能にする好適な剪断力は、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の前述の幅高さ比を有するフローチャンバーによって達成され得る。
【００８１】
（３４）に記載の通り、単球の活性化および樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞への分化の誘導は、単球が以降に記載のデバイスによって提供され得る物理的な力を経験する状況における単球と活性化血小板および／または特定の血漿構成成分との相互作用によって影響される場合がある。したがってプロセスパラメーターの変更は、血漿構成成分の性質、純度および濃度、血小板の性質、純度および濃度、血漿構成成分および／または血小板がフローチャンバーに通されるおよび／または配置されるステップの順序、フローチャンバーが血漿構成成分および／または血小板でコートされる密度、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなフローチャンバーのフローチャンバーを通る流力、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなデバイスのフローチャンバーを通る温度および／または時間など、体外量の哺乳動物対象の血液試料に、具体的には単球に加えられるサイトカインなどの追加的因子の性質、純度および濃度を、変更することを含む。
【００８２】
単球の活性化および誘導は、前記体外量の血液試料の前におよび／または同時に前記フローチャンバーを通った血小板、血漿構成成分または血小板および血漿構成成分の両方の存在下で例えば行われ得る。
【００８３】
体外量の哺乳動物対象の血液に含有される単球を樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞への分化を誘導することは、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液に含まれる血小板が活性化され、前記デバイス中の少なくとも単球を含む体外量の前記哺乳動物対象の血液が、前記活性化血小板に結合することによって前記単球が活性化され樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞に分化するように誘導されるように物理的な力を前記体外量の前記哺乳動物対象の血液に含有される単球に適用することによって処置される場合に、比較的有効に作用できる。しかし単球の活性化は、血漿構成成分との直接的相互作用によって、すなわち活性化血小板との相互作用を伴わなくても達成され得る。
【００８４】
血小板を活性化するステップならびに続く単球の活性化およびＤＣへの分化は、（３４）から理解でき、例えば（ｉ）血漿タンパク質などの血漿構成成分はデバイスのフローチャンバーを通過し、それによりこれらの構成成分はフローチャンバーの壁に接着する、（ｉｉ）血小板はフローチャンバーを通過し、血漿構成成分への結合によって活性化される、および（ｉｉｉ）少なくとも単球を含む体外量の前記哺乳動物対象の血液などの単球含有画分は、フローチャンバーを通過し、活性化血小板への結合によって樹状細胞などの抗原提示細胞への分化のために活性化される、ことを含む。しかし、これらの活性が、全血画分が下に記載の通り体外の量の血液から得られた場合と同様に血漿画分または血漿タンパク質もしくはその断片、血小板画分および単球含有画分が、チャネルまたはチャネル様構造を同時に通る場合にも生じることは理解される。プロセスが、血漿構成成分だけをフローチャンバーの壁に接着させ、単球を血漿構成成分と相互作用させることによっても同じ有効性ではないが実施できることもさらに理解される。それでもこれらの態様は、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が実現される実施形態に関して次に考察される。
【００８５】
血漿構成成分は、フィブリノーゲンもしくはフィブロネクチン、またはフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片などのタンパク質を含んでよい。フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンなどの血漿タンパク質による血小板の活性化は十分であり、これらのタンパク質の組換え的に発現された形態が十分であると考えられるが、体外の量の血液試料から得られ、これらのタンパク質を含む血漿画分を使用することは、これらの血漿画分がさらに複雑な組成を有し、血小板の最適な活性化を提供するすべての血漿構成成分を含み得ることから、好ましい場合がある。
【００８６】
血漿タンパク質画分、血漿タンパク質またはその断片は、チャネルまたはチャネル様構造の壁に接着させるためにプラスチックまたはガラスなどの非プラスチック材料で作ることができるフローチャンバーを通すことができる。血漿画分または血漿タンパク質が、例えば具体的な圧力などの具体的な物理的な力でフローチャンバーを通される必要性はない。しかしプロセスを能率化するために、血漿画分または血漿タンパク質をフローチャンバーに、下により詳細に記載される単球活性化のために必要とされる剪断ストレスと同一でなくとも同等である剪断ストレスで通すことが構想される。一般に、血漿画分または血漿タンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンを含む血漿タンパク質でその表面をコートするために最初にフローチャンバーをポンプで通される。フローチャンバーを通る血漿タンパク質画分、血漿タンパク質またはその断片の流速は、プラスチック表面へのタンパク質接着の所望のレベルを得るために制御される。所望により流れは一定時間停止される場合があり、血漿構成成分はフローチャンバーの表面を「浸漬」する場合がある。フローチャンバーを通して血漿構成成分を進ませるポンプの速度および時間を制御することによって、コーティングの程度を制御できる。一手法では、血漿画分または血漿タンパク質は、フローチャンバー構造の表面に約１から６０分の間、約１から約３０分の間、約１から約２０分の間または約１から約１０分の間の時間曝露される。フローチャンバーの表面への血漿タンパク質接着を増強するために、流れは一時的に中止してよく（約６０分間まで）、再開の前に、または手順のこの相の際に流速は充填速度（１００ｍｌ／分まで）から５ｍｌ／分まで遅くしてよい。
【００８７】
フローチャンバーの表面が、例えば精製された血漿タンパク質またはフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片でプレコートされているフローチャンバーを有するデバイスが使用される筋書きも構想できる。そのようなプレコートされたデバイスは、例えば１回限りの使用のために構成されている、フローチャンバーを備えるカートリッジを含む手持ち式のデバイスでプロセスが実施される場合に使用できる。フローチャンバーの表面が、例えば血小板に富む血漿でプレコートされているフローチャンバーを有するデバイスのために使用される筋書きも構想できる。
【００８８】
血漿画分または血漿タンパク質もしくはその断片がフローチャンバーを通った後、その表面は血漿タンパク質でコーティングされており、血小板画分は例えばポンプによってフローチャンバーに入れて通過させてもよい。フローチャンバー内の血小板の流速および滞留時間は、フローチャンバーの表面に予め接着され、それにより活性化された血漿構成成分またはタンパク質もしくはその断片に血小板が結合できるように選択される。
【００８９】
血小板がフローチャンバーを通過し、フローチャンバーの表面に配置された血漿タンパク質またはそれらの断片によって活性化された後、単球含有画分、例えば体外量の前記哺乳動物対象の血液試料または体外の量の血液試料から得られた下に述べる白血球もしくはバフィーコート画分は、単球のＡＰＣへの分化を最終的にはもたらす物理的な力を適用することによって、例えばポンプによってフローチャンバーに入れて通過する。しかし、単球の活性化血小板、血小板由来因子または血漿構成成分との相互作用は、同時に物理的な力の適用を伴わないと単球の活性化および分化のためには不十分であることは理解される。
【００９０】
血小板および血漿構成成分を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料がフローチャンバーを通される場合に上記と同じ事象が起きることも理解される。この場合血漿構成成分は、フローチャンバーの壁に接着し、次いで血小板を活性化する。しかしこの筋書きでは、プロセスは制御可能ではない場合があり、血小板および血漿構成成分を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料のフローチャンバーでの滞留時間が増加することによりこのことが考慮される場合がある。
【００９１】
フローチャンバーを通して単球含有画分を動かすための物理的な力の適用は、好ましくは体外量の哺乳動物対象の血液試料などの単球含有画分が剪断ストレス下でフローチャンバーを通って動かされることを意味できる。典型的には単球含有画分は、上述の幅高さ比を有するフローチャンバーを約０．０１から約１００．０ｄｙｎ／ｃｍ２、約０．０５から約５０．０ｄｙｎ／ｃｍ２、または約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断力下で通過させてもよい。
【００９２】
いずれの場合でも、単球の活性化血小板への結合およびそのような活性化単球の免疫賦活ＤＣへの分化を可能にする剪断力が生じることは確認されなければならない。単球の活性化が、例えば活性化血小板、血小板由来因子または血漿構成成分と相互作用することによって、固定化をもたらすことは理解される。誘導された免疫賦活自己樹状細胞を採取するために、剪断ストレスを増大させてよい、および／またはＰｌａｖｉｃ、アスピリンまたは他の血液希釈剤などの因子を添加することによって活性化血小板、血小板由来因子もしくは血漿構成成分からの脱接着を可能にする因子で免疫賦活自己樹状細胞を処置してよい。
【００９３】
温度は、単球の活性化およびそれらの免疫賦活自己樹状細胞への分化に影響を与える別の因子である。本開示により企図される方法は、約１８℃から約４２℃の範囲、好ましくは約２２℃から約４１℃の範囲およびより好ましくは約３７℃から約４１℃の範囲で実施され得る。
【００９４】
単球の活性化を調節するために変更してよい１つのパラメーターは、フローチャンバーが血漿構成成分およびしたがって血漿構成成分に結合する血小板でコートされる密度である。一般に、フローチャンバーの表面が血漿構成成分および血小板でより高密度にコートされればされるほど、単球活性化はより効率的になる。
【００９５】
この背景に反して第１、第２および第３の態様の方法は実施されてよく、前記単球の活性化および免疫賦活自己抗原提示または樹状細胞への分化は、フローチャンバーの設計および寸法、単球がフローチャンバーを通過する流速、単球、血小板、血小板由来因子および／もしくは血漿構成成分がフローチャンバーを通過する温度、光への単球の曝露、単球、血小板、血小板由来因子および／もしくは血漿構成成分がフローチャンバーを通過する順序、血漿構成成分がフローチャンバーの表面にコーティングされる密度、血小板および／もしくは血小板由来因子がフローチャンバーの表面および／もしくは血漿構成成分に接着する密度、ならびに／または単球が血小板および／もしくは血小板由来因子に接着するならびに／または血漿構成成分がフローチャンバーの表面に接着する密度によって影響を受ける場合がある。
【００９６】
そのような方法について上に記載の通りアポトーシス剤の非存在下での前記単球の活性化および免疫賦活自己抗原提示または樹状細胞への分化は、
ｉ．単球を血漿構成成分および血小板と一緒に前記フローチャンバーを通過させるステップ、ならびに
ｉｉ．単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞または樹状細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む。
【００９７】
他の実施形態では、特許請求の範囲のステップｃ）または請求項２のステップｄ）に上に記載の通りアポトーシス剤の非存在下での前記単球の活性化および免疫賦活自己抗原提示もしくは樹状細胞への分化は、
ｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血漿構成成分および血小板を、前記フローチャンバーの壁に接着できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ、
ｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料に含有される前記単球を前記フローチャンバーを通過させるステップ、
ｉｉｉ．単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞または樹状細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む。
【００９８】
単球の活性化は、単球が血小板に結合でき、それにより活性化される流速などの条件を選択することによって達成され得る。
【００９９】
さらに他の実施形態では、上に記載の通りアポトーシス剤の非存在下での前記単球の活性化および免疫賦活自己抗原提示または樹状細胞への分化は、
ｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血漿構成成分または血漿を、前記フローチャンバーの壁に接着できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ、
ｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料中に含まれてもよい、または前記哺乳動物対象の血液試料とは別に提供されてもよい血小板または血小板構成成分を、ステップｉの前記血漿構成成分と相互作用できるように前記フローチャンバーを通過させるステップ、
ｉｉｉ．前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料に含有される前記単球を前記フローチャンバーを通過させるステップ、および
ｉｖ．単球が活性化され、免疫賦活自己抗原提示細胞または樹状細胞に分化するように誘導されるように前記単球に物理的な力を適用するステップ
を少なくとも含む。
【０１００】
単球の活性化は、単球が血小板に結合でき、それにより活性化される流速などの条件を選択することによって達成され得る。
【０１０１】
フローチャンバーは、表面積を増加させるまたは流れの状態を不均一でないようにするために内部サブ構造を有してよい。フローチャンバーは、表面積を増加させるまたは流れの状態を不均一でないようにするために粒子を充填されていてもよい。
【０１０２】
フローチャンバーの材料は、プラスチックまたは非プラスチックであってよい。非プラスチック材料を考慮する場合、ガラスを使用してよい。プラスチック材料を考慮する場合、アクリル、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、ポリスルホン、ポリフェニルスルホン、スチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）または任意の他の適切な医療グレードプラスチックを使用してよい。本発明の好ましい実施形態では、フローチャンバーはアクリルプラスチックから作られている。
【０１０３】
前述の通り、フローチャンバーを通る流速およびそれによって生じる剪断ストレスは、樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣへの単球の分化に影響を与える。流速とは別に、フローチャンバーの設計および寸法は、単球への物理的な力の適用を操作するおよびさらに改善するために変更されてよい。さらに、単球の処理量を増加させるために、図１Ａに示し、前述の寸法を有するデバイスは図１Ｂに示す通り組み合わされてよい。
【０１０４】
当業者は、ろ過、分画遠心分離を含む、全血、その白血球画分またはそのバフィーコート画分をどのように得るかに精通している（例えばBruil et al., Transfusion Medicine Reviews (1995), IX (2), 145-166を参照されたい）。好ましい方法は、例えばＰａｌｌから入手可能であるフィルターによる。そのようなフィルターは、体外試料の処理を手持ち式のデバイス中で行えるようにデバイスに組み入れられてよい。供給源として、例えば臍帯の血液も使用できる。遠心分離を使用する場合、例えば１７または１８ゲージゲージ針を有するシリンジを通して全血を得ることができる。そのような全血試料は、デブリおよび他の構成成分を除去するために遠心分離されてよい。次いで全血試料は、Ｐａｌｌから得られるなどの一般的フィルターを通してろ過されてよい。
【０１０５】
単核白血球画分を得るために、記載の全血試料を得る場合があり、次いでそのような試料を例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに重層できる。続いて遠心分離ステップが例えば１８０ｇなどの約１００ｇから約２００ｇで実施され、次いで単核白血球画分は界面から収集され、ＨＢＳＳなどの一般的緩衝液で洗浄されてよい。次いで洗浄された単核白血球画分は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）などの血清不含有細胞培養培地に再懸濁されてよい。単核白血球画分を得るための他の方法は、水簸、ろ過、密度遠心分離などを含む。
【０１０６】
望ましい血液試料を得るためにアフェレーシスおよび白血球アフェレーシスも使用できる。白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスは、当技術分野において公知の通り実施できる。したがって、２．５Ｌから６ｌなどの体外量の血液が対象から得られ、３つの画分、すなわち血漿、血小板およびバフィーコートを得るために従来の白血球アフェレーシスによって処置されてよい。フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンなどのタンパク質を含有する血漿は、最も軽い血液画分であり、したがって遠心分離によって選択的に除去され、チャネルまたはチャネル様構造を通される血液の第１の部分である。血漿がチャネルまたはチャネル様構造をポンプで通され、その表面が血漿タンパク質でコートされた後に、白血球アフェレーシス遠心分離物において二番目に軽い構成成分、血小板画分が、チャネルまたはチャネル様構造をポンプで入れられて通される。白血球アフェレーシス遠心分離物から溶出される三番目に軽い画分は、白血球細胞を含有するバフィーコートであり血液単球を含む。次いで単球を含むバフィーコートは、チャネルまたはチャネル様構造をポンプで通される。血液試料はＴｈｅｒａｋｏｓデバイス、Ｓｐｅｃｔｒａ  ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Andreu et al., (1994), Transf. Sci., 15(4), 443-454を参照されたい）、またはＭａｃｏｐｈａｒｍａからのＴｈｅｒａｆｌｅｘデバイスを使用して得られてもよい。
【０１０７】
上で指摘された通り、ＡＰＣ形成の誘導のためのステップは、血漿構成成分による血小板の活性化およびそのような活性化血小板による単球の活性化を含むと考えられる。原理上は、全血試料を剪断ストレス下でデバイスを通過させることができる。次いでそのような試料の血漿構成成分は、フローチャンバーの表面に結合し、血漿構成成分によるそのような試料内の血小板の接着および活性化を可能にする。次いでそのような試料の単球は、活性化血小板に結合し、それ自体を活性化させる。
【０１０８】
同様に、上に記載の通り得られた全血試料を全血試料のデブリを分離するために約１５０ｇなどの約１００ｇから約１８０ｇで、約１５分間などの約１０分間から約２０分間遠心分離することによって得ることできる画分を含有する血小板に富む血漿などの種々の構成成分の組合せを得ることができる。血小板に富む血漿層は、次いで収集され、約９００ｇなどの約７００ｇから約１０００ｇで、約５分間などの約３分間から約１０分間再遠心分離される。生じたペレットは、次いで血清不含有細胞培養培地に再懸濁される。
【０１０９】
しかし、プロセスについて制御を得るために、最初に血漿構成成分をフローチャンバーを通過させ、それらを接着させ、次に血小板、次いで単球含有画分であることは望ましい。この手法について、単球を含む単球画分またはバフィーコート画分を含み、血漿構成成分を含まず、血小板を含まない、白血球画分を得ることは望ましい場合がある。そのような血漿および血小板を含まない単球含有画分は、当技術分野において記載の通り得ることができる。白血球またはバフィーコート画分が上に記載の通り得られる場合、それらは血漿または血小板を本発明の目的のために十分な程度含まない。この手法のために血小板画分および／または血漿画分を有することが望ましい場合もある。
【０１１０】
したがって本記載は、体外量の前記哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に前記体外量の前記哺乳動物対象の血液から分離されている血小板を使用することを企図する。次いでこれらの血小板は、フィブロネクチンなどの血漿構成成分でコーティングされたフローチャンバーを通過させてもよい。
【０１１１】
別の実施形態では記載は、体外量の哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に前記体外量の前記哺乳動物対象の血液から分離された血漿構成成分を使用することを検討する。次いでこれらの血漿構成成分は、接着できるようにフローチャンバーを通過させてもよい。
【０１１２】
体外の量の血液から得られた血漿構成成分を使用する代わりに、例えば組換えタンパク質発現によるなど、他の供給源から単離された血漿構成成分を使用できる。そのような血漿構成成分は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｐ−セレクチンおよびフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片を含む。
【０１１３】
体外の量の血液から得られた血漿構成成分を使用する代わりに、例えば組換えタンパク質発現などの他の供給源から単離された血漿構成成分も使用できる。そのような血漿構成成分は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンまたはＰ−セレクチンを含む。アミノ酸４００〜４１１（配列番号３７、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）に対応するフィブリノーゲンのガンマ構成成分などの血漿タンパク質の断片も使用できる。このガンマ構成成分は、血小板を活性化できることが本明細書において表されるデータによって示されている。したがって、主にではなくても少なくともフィブロネクチンを含む血漿画分を使用することが好ましい場合がある。同様に、例えば組換え的に発現されたおよび／または精製されたフィブロネクチンまたはそのガンマ構成成分を、血小板を活性化するために使用することが好ましい場合がある。
【０１１４】
体外量の哺乳動物対象の血液は、それぞれの対象の総血液量の０．１％〜１０％の間で典型的には得ることができる。採血され、デバイスに適用された体外血液の量は、全血であってよい。代替的に前記体外量の前記哺乳動物対象の血液は、０．５＊１０６〜５０＊１０６個の間の単核細胞から白血球を単離することによって得られてもよい。
【０１１５】
活性化単球および免疫賦活抗原提示細胞は、流速を増加させて、例えば緩衝液で洗浄することによってフローチャンバーから除去され得る。活性化単球および免疫賦活抗原提示細胞がフローチャンバーの表面に直接的または間接的に付く傾向を有する場合があることから、除去は、フローチャンバーを穏やかに揺り動かすことよって、または支持するためにフローチャンバーで穏やかに叩くことによって支持され得る。
【０１１６】
活性化単球および免疫賦活抗原提示細胞が例えば第１の態様の方法によって得られたら、それらは疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原と接触されてよい。この接触させるステップは、少なくとも１２時間およびまたは少なくとも２４時間のインキュベーションステップの形態をとってよい。アポトーシス性疾患エフェクター細胞または単離された疾患関連抗原でのこのインキュベーションステップは、免疫賦活抗原提示細胞にそれらの成熟を完了させ、疾患関連抗原を提示できるようにする。一晩インキュベーションの形態をとってよいそのようなインキュベーションステップは、第１の態様の方法のステップｄ）のために特に好ましい場合がある。インキュベーションは、標準条件下、例えば３７℃、５％ＣＯ２、１５％  ＡＢ血清（例えばＧｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手できる）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（例えばＧＩＢＣＯから入手できる）中などのヒト細胞の培養のための標準的培地中で実施してよい。
【０１１７】
インキュベーション後、そのような細胞は、腫瘍関連抗原が活性化単球および免疫賦活抗原提示細胞と共にインキュベートされた、それぞれの腫瘍などのそれぞれの疾患を処置することにおける使用のために患者に導入されてよい。
【０１１８】
このように、樹状細胞などの成熟ＴＡＡ提示免疫賦活自己抗原提示細胞は、単球のＤＣ分化への誘導のためのサイトカインのかなり高価なカクテルを必要とすることなく得ることができる。必要ではないが、インキュベーション期間の間に、そのようなＡＡ提示抗原提示細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などの１つまたは複数のサイトカインを含む緩衝培養培地で培養することは検討されてよい。成熟カクテル（典型的にはＣＤ４０Ｌなどのリガンド、インターフェロンガンマ、ＴＮＦアルファ、インターロイキン１などのサイトカインもしくはプロスタグランジンＥ２または上に述べた要因の組合せからなる）は、同様に加えられてよい。
【０１１９】
既に述べた通り、本明細書に記載の物理的な力を適用することによって得られた自己抗原提示細胞は、樹状細胞などの自己ＴＡＡを提示している抗原提示細胞を生成するために少なくとも１つのＴＡＡまたは腫瘍試料と接触されてよい。開示は、自己ＴＡＡを提示している抗原提示細胞の生成に注目しているが、例えば細菌、真菌またはウイルス由来の他の疾患関連抗原を提示している自己抗原提示細胞は、同様に得ることができ、疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞も本明細書に記載の方法によって達成され得ることは理解される必要がある。
【０１２０】
したがって樹状細胞などの自己抗原提示細胞は、それらを免疫原性抗原、例えばアポトーシス性腫瘍細胞上に発現されているものにロードすることによってｅｘ  ｖｉｖｏで例えば処理され得る。述べた通りこれは、免疫賦活ＴＡＡを提示している抗原提示細胞をもたらす。免疫賦活自己抗原提示細胞を生成するために体外の量の血液が取られた対象から得られたがん性組織によって既に発現されている抗原が使用される場合、ＴＡＡロード、再導入免疫賦活自己抗原提示細胞はがんに対する免疫応答を始める場合がある。
【０１２１】
本発明の一実施形態では、樹状細胞は免疫原性抗原をロードされ、ここで免疫原性抗原は合成または組換えペプチドを含む。別の実施形態では、免疫原性抗原は核酸またはその化学的誘導体、好ましくはＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、さらにより好ましくはｍＲＮＡを含む。一実施形態では、ＲＮＡは非天然核酸塩基（すなわちＡ、Ｕ、ＣおよびＧ以外の核酸塩基）を含有する。上に記載の通り核酸は、化学的に修飾された、すなわちその化学的誘導体であり得る。
【０１２２】
したがって、上述の通り、本明細書に記載の第４の態様は、第１のおよび第２の態様ならびにそれらの実施形態の方法によって得られることから、樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞に、または第３の態様およびその実施形態の方法によって、疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原によって媒介される疾患に罹患している患者の治癒的または予防的処置における使用のために得られることから、全体に活性化された単球および／または樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞に関する。したがってそのような免疫賦活自己抗原提示細胞は、腫瘍、好ましくは固形腫瘍の予防的または治癒的処置における使用のために具体的には検討される。第１のおよび第２の態様ならびにそれらの実施形態または第３の態様およびその実施形態により得ることができる活性化単球は、第１のおよび第２の態様ならびにそれらの実施形態による活性化単球が、ヒトまたは動物の身体に再導入される前に、ヒトまたは動物の身体の外でアポトーシス性腫瘍エフェクター細胞などのアポトーシス性疾患エフェクター細胞および／または腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原と接触される一方で、第３の態様およびその実施形態による活性化単球が、ヒトまたは動物の身体の外でアポトーシス性腫瘍エフェクター細胞などのそのようなアポトーシス性疾患エフェクター細胞および／または腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原と接触されないことにおいて異なっている。
【０１２３】
第１のおよび第２の態様ならびにそれらの実施形態の方法によって得ることができる活性化単球は、がんに罹患している患者を処置するために使用され得る。それらが、化学療法および／または放射線療法を受けているがん患者の処置のためにおそらく好適である一方で、まだ化学療法および／またはガンマ照射療法を受けていない患者のために特に好適である可能性がある。それらは、ある種のがんに対する予防的ワクチン接種のためにも特に好適である可能性がある。第３の態様およびその実施形態の方法によって得ることができる活性化単球は、がんに罹患している患者を処置するためにも使用され得る。それらが、化学療法および／またはガンマ照射療法をまだ受けていないがん患者の処置のために好適であると想定される一方で、それらはそのような処置を受けている患者のために特に好適である可能性がある。しかし一実施形態では、第３の態様によって得ることができる全体に活性化された単球は、治療用抗体で処置されている患者では使用されない。
【０１２４】
用語「の処置における使用のため」は、疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原によって媒介される疾患を罹患している患者の予防的または治癒的処置、例えば腫瘍、好ましくは固形腫瘍の予防的または治癒的処置のための医薬の製造におけるそのような免疫賦活自己抗原提示細胞の使用と同等であると見なされる。
【０１２５】
用語「の処置における使用のため」も、それらが第１のおよび第２の態様ならびにそれらの実施形態の方法によって得られる樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞をそれを必要とする患者に投与することによる、疾患エフェクター細胞または疾患関連抗原によって媒介される疾患の治癒的または予防的処置、例えば腫瘍、好ましくは固形腫瘍の予防的または治癒的処置の方法と同等であると見なされる。
【０１２６】
本開示の目的のために用語「治癒的処置」は、疾患の治癒的緩和を指すが、用語「予防的処置」は予防的予防法（preventive prophylaxis）を指す。両用語は、それぞれの疾患の完全な寛解または予防ではなく、むしろ免疫賦活自己ＡＰＣが治癒的または予防的目的のいずれかのために投与されていない状況と比較して改善があることを意味していることは理解される。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、用語「疾患エフェクター細胞」または「疾患関連抗原」は、対象において疾患状態の因果関係の中核をなす細胞および抗原を指す。例えば樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞は、がん性組織において発現されていることが公知である抗原をロードされてよい。この目的に向けて、そのような抗原は、ＭＨＣクラス１およびＭＨＣクラス２分子上に提示されるように免疫賦活樹状細胞において発現され得る。単離された疾患関連抗原または単離された腫瘍関連抗原は、例えば精製、組換え発現または合成的製造によって腫瘍細胞などの疾患エフェクター細胞から得られた抗原を指す。例えば患者の腫瘍試料を分析し、最も高く発現された腫瘍関連抗原を同定でき、次いで例えば組換え発現または合成化学によってこれらの抗原の混合物を調製できる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、単離された疾患関連抗原は、合成または組換えペプチドを含む。
【０１２９】
そのような抗原で樹状細胞などの免疫賦活自己抗原提示細胞をロードすることによって、対象は、例えばがんまたは感染のその後の発症に対してワクチン接種され、それにより予防的処置が可能になる。免疫賦活抗原提示細胞を生成するために体外の量の血液が取られた対象から得られたがん性組織によって既に発現されている抗原が使用される場合、抗原がロードされ、再導入された、樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞は、がんに対する免疫応答を始めることができ、それにより治癒的処置を可能にする。
【０１３０】
ある種の環境では、これらの疾患エフェクター細胞および好ましくは腫瘍細胞は、血流中を循環する場合がある疾患の原因となる細胞であり、それにより体外の操作および処置に容易に到達できるようにする。そのような疾患の原因となる細胞の例は、例えば悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞および、微生物性（例えばウイルス性、細菌性、真菌性、マイコバクテリア、原生生物）のペプチドもしくはタンパク質または他の病原体関連分子を保有または発現できるウイルスまたは細菌に感染した白血球または赤血球を含む。疾患の原因となる細胞を生じさせる例示的疾患カテゴリーは、白血病などのリンパ球増殖性障害、リンパ腫、ならびにマラリア、ヒト免疫不全ウイルス（human-immunodeficiency virus）（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）、ライム病、ハンセン病、結核および他の血液媒介性病原体を含む感染を含む。
【０１３１】
他の腫瘍細胞およびＴＡＡ細胞は、肺、神経膠腫、乳房、結腸、前立腺、頭頸部がん、脳、結合組織、腎臓がんまたはメラノーマなどの皮膚がんなどの固形腫瘍から外科的に切除された検体から単離されたものを含む。そのような細胞は、固形腫瘍それ自体から得ることができる。これらの細胞はそのアポトーシスおよびＴＡＡの脱落を誘導するために体外で、すなわちヒトまたは動物の身体の外で操作され得る。代替的にまたは付加的に一部の場合では、固形腫瘍を有する患者の循環血は、腫瘍から分かれ、循環に進入した悪性細胞を含有する場合があることが示されている。固形腫瘍のこれらの循環腫瘍細胞は、がん細胞の容易に到達できる供給源を提供でき、それにより単離され得るＴＡＡは、アポトーシス性にされ、本明細書に記載され、特許請求される方法により樹状細胞によって貪食される。
【０１３２】
本明細書において開示する方法が固形腫瘍の処置を提供する一方で、当然のことながらそれらは、ＣＴＣＬまたは他のリンパ腫などのがんの処置も可能にする。本明細書に開示の方法を使用することは、上に記載の理由から、ＥＣＰの間の２日間処置サイクルとは異なり、処置サイクルが、患者から単球を１回得ることだけが必要であることを考慮すると、そのような腫瘍の処置を改善できる。
【０１３３】
ＴＡＡは、細胞傷害性物質またはＰＵＶＡによってアポトーシスを誘導することによって、そのようながんを生じる細胞からも得ることができる。細胞傷害剤は、ドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンもしくはゾレドロネートを含む。当然のことながら、単離されたもしくはさらに組換え的に発現されたＴＡＡまたは、同定され、おそらく有効なＴＡＡであることが公知であるそのような単離されたもしくは組換え的に発現されたＴＡＡの組合せも使用できる。
【０１３４】
例えば樹状細胞などの抗原提示細胞による、送達されたＴＡＡのタンパク質分解および可溶性ＴＡＡの非効率的なプロセシングを回避するために、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーから作ることができるポリマー性ナノ粒子（ＮＰ）中へのＴＡＡの封入によって自己ＴＡＡを提示している抗原提示細胞の形成を増強することが企図される（Waeckerle-Men et al., Adv Drug Deliv Rev (2005), 57:475-82）。ＡＰＣへのおよびそれによるＴＡＡの送達およびプロセシングを増大させるための他の手段は、当業者に公知であり、本開示によっても企図される。
【０１３５】
したがって本記載は、任意選択で樹状細胞などの免疫賦活自己ＡＰＣの形成をさらに増強するためのポリマー性ナノ粒子中への抗原の封入を使用することを企図する。
【０１３６】
本発明の別の好ましい実施形態では、疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を体外量のリンパ球と組み合わせる。体外量のリンパ球は、ナチュラルキラー細胞および／またはＴリンパ球（「Ｔ細胞」とも称される）を含む場合がある。リンパ球は、血液試料または組織試料などの哺乳動物対象の試料から細胞を単離することおよび任意選択でさらに細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって得ることができる。疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞を体外量のリンパ球と組み合わせた後、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも７日間または少なくとも１４日間培養されてよい。次いで疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞は、リンパ球を活性化する。インキュベーション後、細胞またはそれらの画分は、患者に投与されてよい。
【０１３７】
一実施形態ではリンパ球は、遺伝的に修飾されたリンパ球であり、細胞は当業者に公知の方法によって遺伝的に修飾されている。
【０１３８】
好ましい実施形態では、リンパ球はＴリンパ球を含み、Ｔリンパ球は好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。次いで疾患関連抗原を提示している抗原提示細胞は、抗原特異的様式でＴリンパ球を活性化する。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態では、活性化リンパ球は上に記載の固形腫瘍の処置における使用のためである。当然のことながらそれらは、ＣＴＣＬまたは他のリンパ腫などのがんの処置のためにも使用されてよい。
【０１４０】
本発明は、いくつかの具体的な実施例に関してここに記載されるが、それは例示的な目的であり、限定的なやり方で解釈されない。
【０１４１】
実験
実験１
材料および方法
メラノーママウスモデルの生成
公知のＹＵＭＭ１．７メラノーマ細胞株（Theodosakis, N et al., Mol Cancer Ther.Published OnlineFirst May 6, 2015; doi:10.1158/1535-7163.MCT-15-0080）がオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてメラノーマ腫瘍を生成するために使用された。ＰＢＳ中のＹＵＭＭ１．７細胞１０５個は、腫瘍形成を誘導するために９匹の４週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス右側腹皮下に注入された。
【０１４２】
マウスは約１０ｍｍ３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長させた。次いでマウスは２個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス４匹）は処置群（群１）と称され、第２のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群２）と称された。
【０１４３】
１１〜１３日後、群１についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３３＊１０８個／ｍｌの量で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図１に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ２および１００ｎｇ／ｍｌ  ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。
【０１４４】
次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣと混合され、同じフローチャンバーを通された。流速は０．１ｍｌ／分であり、８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（２Ｊ／ｃｍ２および１００ｎｇ／ｍｌ  ８−ＭＯＰ）に供された。
【０１４５】
細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。
【０１４６】
群２についてＰＢＭＣがＰＢＳ緩衝液で置き換えられたことを除いて同じ手順が実施された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【０１４７】
結果
個々のマウスについての結果は図２に示されている。組み合わされた結果は、図３に示されている。図４は数匹の処置マウスを示している。結果は、図５に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群１について観察されるが、群２についてはされない。
【０１４８】
実験２
材料および方法
ＹＵＭＭ１．７細胞は、実験１に記載の通り腫瘍を生成するように皮下に注入された。
【０１４９】
マウスは約１０ｍｍ３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長された。次いでマウスは２個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス５匹）は処置群（群１）と称され、第２のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群２）と称された。
【０１５０】
１１〜１３日後、群１についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３＊１０８個／ｍｌの量でＰＢＭＣを得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図１に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ２および１００ｎｇ／ｍｌ  ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。
【０１５１】
次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞はＰＢＭＣと混合され、８−ＭＯＰおよびＵＶＡに適用しないこと以外は実験１においてと同じフローチャンバーを通された。したがってＰＢＭＣはいかなるアポトーシス性チャレンジにも供されなかった。
【０１５２】
細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。
【０１５３】
群２についてＰＢＭＣがＰＢＳ緩衝液で置き換えられたことを除いて同じ手順が実施された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【０１５４】
結果
結果は図５に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群１について観察されるが、群２についてはされない。
【０１５５】
実験３
材料および方法
ＹＵＭＭ１．７細胞は、実験１に記載の通り腫瘍を生成するように皮下に注入された。
【０１５６】
マウスは約１０ｍｍ３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長させた。次いでマウスは４個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群１）と称され、３個のコホート（群２から４、各マウス５匹）は処置群であった。
【０１５７】
１１〜１３日後、群２についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３＊１０８個／ｍｌの量でＰＢＭＣを得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図１に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ２および１００ｎｇ／ｍｌ  ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。
【０１５８】
Ｙｕｍｍ１．７細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、ＰＢＭＣを含まずに（Ｙｕｍｍ単独）マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【０１５９】
群１について純粋なＰＢＳ（Ｙｕｍｍ細胞またはＰＢＭＣを含まない）がマウスに注射されたことを除いて同じ手順が実施された。
【０１６０】
群３について、ＰＢＭＣは群１について記載の通り得られた。ＰＢＭＣは、ＰＢＳに再懸濁され、図１のフローチャンバーに８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置を伴わずに０．１ｍｌ／分の流速で通された。フローチャンバー通過ＰＢＭＣは、遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、Ｙｕｍｍ細胞を含まずにマウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された（ＰＢＭＣ、ＰＰ  ｗ／ｏ  ＹＵＭＭ）。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【０１６１】
群４について、ＰＢＭＣは群３と同様に得られ、図１のフローチャンバーに８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置を伴わずに０．１ｍｌ／分の流速で通された。並行して、ＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図１に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ２および１００ｎｇ／ｍｌ  ８−ＭＯＰ）に供され、流速は０．１ｍｌ／分であった。
【０１６２】
次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞およびＰＢＭＣは１５％マウス血漿を補充したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩同時インキュベートされた。細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された（Ｏ／Ｎ  ＹＵＭＭＵＶＡ  ＰＰｎｏＵＶＡ）。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。
【０１６３】
結果
結果は図６に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群２および群３対対照群１について観察される。腫瘍低減は群４で最も進歩している。
【０１６４】
実験４
材料および方法
ＹＵＭＭ  １．７細胞は、実験１に記載の通り腫瘍を生成するために皮下注射された。
【０１６５】
マウスは、実験３に記載の通りおよそ１１〜１３日間、約１０ｍｍ３の小さな腫瘍を確立するために飼育された。次いでマウスは３つのコホートに分割された。１つのコホートはＰＢＳ対照群として指定され、実験３の群１に記載の通り得られた。他の２つのコホートは、フローチャンバー通過ＰＢＭＣおよびＰＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ  １．７細胞が一晩同時インキュベートされたか、されていないかを除いて実験３の群４について記載されたものと同じであった。
【０１６６】
結果
結果は図１２に示されている。
【０１６７】
実験５
単球をフローチャンバーを通過させた後の分子マーカーの発現およびＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の決定
材料および方法
単球は、図７に示すデバイスを通過させた。簡潔には、血液試料は、例えば細胞１０１０個／ｍｌの濃度の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料８ｍｌを例えば得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して低速で遠心した。チャンバーは、血小板でプレコーティングされた。試料は、約０．０２８Ｐａでチャンバーを通通した。次いでチャンバーは、ＲＰＭＩ  約３ｍｌ、０．０２８Ｐａで洗浄された。ＲＰＭＩ  ３０〜５５ｍｌでの２回目の洗浄は、約１．２Ｐａで実施された。収集された活性化単球は、組み合わせられ、１日インキュベートされ、さらなる分析のために使用された（ＰＰ  Ｄ１  ＰＢＭＣ）。対照としてＰＢＭＣは、デバイスを通過させずに、１日インキュベートされた（Ｄ１  ＰＢＭＣ）。別の対照として、未成熟ｆａｓｔ  ＤＣは、ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で直接培養することによって得られた（未成熟Ｆａｓｔ  ＤＣ）。さらにＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を通じた採取直後に分析された（新鮮（Ｆｉｃｏｌｌ）ＰＢＭＣ）。
【０１６８】
次いで細胞および対照は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＰＬＡＵＲの発現について分析された。それらは、ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度についてさらに分析された。結果は、ＨＬＡ−ＤＲについては図８に、ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度については図９および１０に示されている。要約は図１１に示されている。
【０１６９】
結果
結果は、これらの細胞を１日インキュベートした（Ｄ１  ＰＢＭＣ）ことから明らかになる通り、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を通じた遠心分離に供された細胞が分化し始めるために十分な物理的な力を既に経験したと考えられることを示している。しかし活性化および分化は、デバイスを通じたプレート通過でよりはっきりする（ＰＰ  Ｄ１  ＰＤＭＣ）。例えば８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａの非存在下で本発明による方法によって得られた樹状細胞は、サイトカインカクテルで得られた未成熟Ｆａｓｔ  ＤＣよりもさらに複雑で異なるパターンを有する。
【０１７０】
実験６
材料および方法
１×１０５個のＹＵＭＭ１．７細胞をＰＢＳ  １００μＬ中で同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹皮下に接種した。腫瘍接種７〜１０日後に（すべての動物において触知可能腫瘍）、２００μＬの末梢血液を各マウスの頬からヘパリン中に収集し、組み合わせた。ＰＢＭＣを等量のＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍ上で血液を層形成させることによって分離し、赤血球溶解緩衝液でのＰＢＭＣの処置が続いた。２．５×１０６個のＹＵＭＭ１．７細胞を３７℃、２０分間、１００ｎｇ／ｍＬ  ８−ＭＯＰとインキュベートし、４Ｊ／ｃｍ２  ＵＶＡ照射に曝露した。照射ＹＵＭＭ１．７細胞を２．５×１０６の単離したＰＢＭＣとＦＢＳ中、合計容量６００μＬ、１：１で組み合わせ、トランス免疫化（ＴＩ）プレートにおいて１時間、３７℃でインキュベートし、次いで０．０９ｍＬ／分の流速でＴＩプレートを通過させた。次いでプレートを６００μＬのＦＢＳ、０．４９ｍＬ／分でフラッシュし、素通り画分をプレート通過細胞に加えた。次いでプレート通過ＰＢＭＣおよびＹＵＭＭ１．７細胞を３７℃、２０分間、１００ｎｇ／ｍＬ  ８−ＭＯＰとインキュベートし、４Ｊ／ｃｍ２  ＵＶＡ照射に曝露した（「アポトーシス剤（＋）」）または細胞を８−ＭＯＰ／ＵＶＡに曝露しなかった（「アポトーシス剤（−）”）のいずれかであった。細胞をＬ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１５％ＦＣＳを補充したクリアＲＰＭＩ培地中、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、処置細胞を収集し、自己血漿中に細胞１×１０７個／ｍＬで再懸濁し、１００ｍＬを実験用腫瘍保有マウスの後眼窩神経叢に注射し、一方対照動物は１００μＬの自己血漿またはＰＢＳ（「ＰＢＳ」）を受けた。各マウスについて合計３週間／６回処置で、血液を月曜日および木曜日に収集し、細胞を火曜日および水曜日に再注射した。実験および対照動物の腫瘍容積を腫瘍の寸法のキャリパー測定によって実験を通じてモニターした。
【０１７１】
研究は２回反復した。
【０１７２】
結果
結果を図１３に示す。８−ＭＯＰ／ＵＶＡへの曝露を伴わずに、プレート通過ＰＢＭＣおよびＹＵＭＭ１．７細胞は、腫瘍容積を有意に低減する。動物をプレート通過ＰＢＭＣと８−ＭＯＰ／ＵＶＡに曝露したＹＵＭＭ１．７細胞との組合せで処置した場合に、腫瘍低減効果は、中和される（反復２）または腫瘍容積は陰性対照（反復１）と比較して増加さえしている。
【０１７３】
実験７
材料および方法
１×１０５個のＹＵＭＭ１．７細胞をＰＢＳ  １００μＬ中で同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹皮下に接種した。腫瘍接種７〜１０日後に（すべての動物において触知可能腫瘍）、２００μＬの末梢血液を各マウスの頬からヘパリン中に収集し、組み合わせた。ＰＢＭＣを等量のＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍ上で血液を層形成させることによって分離し、赤血球溶解緩衝液でのＰＢＭＣの処置が続いた。２．５×１０６個のＹＵＭＭ１．７細胞を３７℃、２０分間、１００ｎｇ／ｍＬ  ８−ＭＯＰとインキュベートし、４Ｊ／ｃｍ２  ＵＶＡ照射に曝露した。照射ＹＵＭＭ１．７細胞を２．５×１０６の単離したＰＢＭＣとＦＢＳ中、合計容量６００μＬ、１：１で組み合わせ、ＴＩプレートにおいて１時間、３７℃でインキュベートし、次いで０．０９ｍＬ／分の流速でＴＩプレートを通過させた。次いでプレートを６００μＬのＦＢＳ、０．４９ｍＬ／分でフラッシュし、素通り画分をプレート通過細胞に加えた。
【０１７４】
平行して、追加的ＰＢＭＣ細胞を腫瘍を保有しているが未処置のマウス対照から単離し、３７℃、２０分間、１００ｎｇ／ｍＬ  ８−ＭＯＰとインキュベートし、４Ｊ／ｃｍ２  ＵＶＡ照射に曝露した（「アポトーシス剤処置ＰＢＭＣ」）。
【０１７５】
次いでプレート通過ＰＢＭＣおよびＹＵＭＭ１．７細胞を２．５×１０６個アポトーシス剤処置ＰＢＭＣと組み合わせた（「アポトーシス剤処置ＰＢＭＣ（＋）」）または組み合わせなかった（「アポトーシス剤処置ＰＢＭＣ（−）」）。次いで細胞をＬ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１５％ＦＣＳを補充したクリアＲＰＭＩ培地中、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、処置細胞を収集し、自己血漿中に細胞１×１０７個／ｍＬで再懸濁し、１００ｍＬを実験用腫瘍保有マウスの後眼窩神経叢に注射し、一方対照動物は１００μＬの自己血漿またはＰＢＳ（「ＰＢＳ」）を受けた。各マウスについて合計３週間／６回処置で、血液を月曜日および木曜日に収集し、細胞を火曜日および水曜日に再注射した。実験および対照動物の腫瘍容積を腫瘍の寸法のキャリパー測定によって実験を通じてモニターした。
【０１７６】
結果
結果は図１４に示す。アポトーシス剤処置ＰＢＭＣの非存在下で、プレート通過ＰＢＭＣおよびＹＵＭＭ１．７細胞は、腫瘍容積を有意に低減する。腫瘍低減効果は、動物をインキュベーションの前にアポトーシス剤処置ＰＢＭＣと共にプレート通過ＰＢＭＣおよびＹＵＭＭ１．７細胞の混合物で処置した場合に中和される。
【０１７７】
（参考文献）
1. Matsushita H, Vesely MD, Koboldt DC, Rickert CG, Uppaluri R, et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature2012;482:400-404. 
2. Tran E, Turcotte S, Gros A, et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 2014;344:641-645 
3. van Rooij N, van Buuren MM, Philips D, et al. Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in an ipilimumab-responsive melanoma. J Clin Oncol 2013;31:e439-e442. 
4. Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med 2010;363:411-422. 
5. Kalos M, Levine BL, Porter DL, Katz S, Grupp SA, et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med 2011;3:95ra73. 
6. Edelson RL, Berger C, Gasparro F, Jegasothy B, Heald P, et al., Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. N Eng J Med 1987;316(6):297-303. 
7. Heald P, Rok A, Perez M, Wintroub B, Knobler R, et al. Treatment of erythrodermic cutaneous Tcell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. J Amer Acad Dermatol1992;17:427-33. 
8. Girardi M, Knobler R, Edelson RL. Selective immmunotherapy through extracorporeal photochemotherapy: yesterday, today, and tomorrow. Hematol Oncol Clin N Am2003;17:13911403. 
9. Greinix HT, Volc-Platzer B, Rabtsch W, Gmeinhart B, Guevara-Pineda C, et al. Successful use of extracorporeal photochemotherapy in the treatment of severe acute and chronic graft-versus-host disease. Blood 1998;92:3098-104. 
10. Rook AH, Freundlich B, Jegasothy BV, Perez MI, Barr WG, Jimenez SA, et al. Treatment of systemic sclerosis with extracorporeal photochemotherapy - results of a multicenter trial. Arch Dermatol. 1992;128:337-e46.  
11. Di Spaltro FX, Cottrill C, Cahill C, Degnan E, Mulford GJ, et al. Extracorporeal photochemotherapy in progressive systemic sclerosis. Int J Dermatol.1993;32:1-5. 
12. Wolfe JT, Lessin SR, Singh AH, Rook AH. Review of immunomodulation by photopheresis: treatment of cutaneous T-cell lymphoma, autoimmune disease and allograft rejection. Artif Organs. 1994;18(12): 888-97.
13. Gonzalez AI, Berger CL, Remington J, Girardi M, Tigelaar RE, Edelson RL. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy. Clin and Exp Immunology. 2013;175:449-457. 
14. Berger C, Hoffmann K, Vasquez JG, Mane S, Lewis J, et al., Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 2010. 116(23):4838-47. 
15. Futterleib JS, Feng H, Tigelaar RE, Choi J, Edelson RL. Activation of GILZ gene by photoactivated 8-methoxypsoralen: potential role of immunoregulatory dendritic cells in extracorporeal photochemotherapy. Transfus Apher Sci. 2014;50(3):379-87.  
16. de Saint-Vis B, Vincent J, Vandenabeele S, Vanbervliet B, Pin JJ, Ait-Yahia S, et al. A novel lysosome-associated membrane glycoprotein, DC-LAMP, induced upon DC maturation, is transiently expressed in MHC class II compartment. Immunity. 1998;9:325-36. 
17. Lamioni A, Parisi F, Isacchi G, Giorda E, Di CeSare S, et al., The immunological effects of extracorporeal photopheresis unraveled: Induction of tolerogenic dendritic cells in vitro and regulatory T cells in vivo. Transplantation. 2005. 79(7):846-50. 
18. Berger CL, Xu AL, Hanlon D, Girardi M, Edelson R. Induction of human tumor-loaded dendritic cells. Int J Cancer. 2001;91:438- 47. 
19. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2000;18(1):767-811. 
20. Sllusto F, Geginat J, Lanzavecchia A. Central and memory effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu Rev Immunol. 2004;22(1):745-63. 
21. Alanio C, Lemaitre F, Law HK, Hasan M, Albert ML. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood.2010;115(18):3718-3725. 
22. Coulie PG, Brichard V, Van Pel A, Wolfel T, Schneider J, et al. A new gene coding for a differentiation antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med 1994;180:35-42. 
23. Faure FA, Mantegazza C, Sadaka C, Sedlik F, Amigorena S. Long-lasting cross-presentation of tumor antigen in human DC. Eur. J. Immunol. 2009;39: 380-390. 
24. Bioley G, Jandus C, Tuyaerts S, Rimoldi D, Kwok WW, et al. MelanA/MART-1-specific CD4 T cells in melanoma patients: identification of new epitopes and ex vivo visualization of specific T cells by MHC class II tetramers. J Immunol2006;177:6769-6779.  
25. Griffoen AW, Rijkers GT, Keij J, Zegers BJ. Measurement of cytoplasmic calcium in lymphocytes during flow cytometry. J Immunol Methods 1989;120(1):23-27. 
26. Kvistborg P, Boegh M, Pederson AW, Claesson MH, Zocca MB. Fast generation of dendritic cells. Cell Immunol 2009;260(1):56-62. 
27. Yewdall AW, Drutman SB, Jinwala F, Bahjat KS, Bhardwaj N. CD8+ T cell priming by dendritic cell vaccines requires antigen transfer to endogenous antigen presenting cells. PLOS One 2010;5(6):1-10. 
28. Johnson LA, Heemskerk B, Powell DJ Jr, Cohen CJ, Morgan RA, et al. Gene transfer of tumorreactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J Immunol. 2006;177(9):6548-59. 
29. Stipdonk MJB, Lemmens EE, Schoenberger SP. Naive CTLs require a single, brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation. Nature Immunol. 2001;2(5):423-29.  
30. Irving M, Zoete V, Hebeisen M, Schmid D, Baumgartner P, et al. Interplay between T Cell Receptor Binding Kinetics and the Level of Cognate Peptide Presented by Major Histocompatibility Complexes Governs CD8 + T Cell Responsiveness. J Biol Chem2012;287(27):23068-78. 
31. Wolfl M, Greenberg PD. Antigen-specific activation and cytokine-facilitated expansion of naive human CD8+ T cells. Nature Protocols 2014;9(4):950-66. 
32. Beeson C, Rabinowitz J, Tate K, Gutgemann I, Chien Y, et al. Early biochemical signals arise from low affinity TCR-ligand reactions at the cell-cell interface. J Exp Med. 1996;184(2):777-82. 
33. Stern E, Steenbock ER, Reed MA, Fahmy TM. Label-free electronic detection of the antigen specific T-cell immune response. Nanoletters. 2008;8(10):3310-14. 
34. Durazzo TS, Tigelaar RE, Filler R, Hayday A, Girardi M, Edelson RL. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: initiation via direct platelet signaling. Transf and Apheresis Sc. 2014;50(3):370-78.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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