(57)【要約】  本発明は、特に、炎症性皮膚疾患、より詳しくは、座瘡の予防および／または治療のための薬物として使用するための、ヒトフィブリノゲンから得られた単離されたペプチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメント、それらをコードする核酸分子、それらを含有する発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物および組合せ物、ならびに炎症性皮膚疾患、特に座瘡を治療および／または予防するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド、または、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、そのフラグメント。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２、５および７〜１３および４７、または最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
皮膚炎症性疾患の治療および／または予防のための、請求項１または請求項２に記載の薬剤として使用するための請求項１または請求項２に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４】
前記皮膚炎症性疾患が、座瘡である、請求項３に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項５】
宿主細胞への細菌接着に関与する少なくとも１つの微生物タンパク質のフィブリノゲンとの相互作用を阻害することができ、前記細菌は好ましくはアクネ菌であり、フィブリノゲンは好ましくはヒトフィブリノゲンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項６】
前記皮膚炎症性疾患が、乾癬である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項７】
最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのフラグメントであって、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７の１つから選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記フラグメント。
【請求項８】
１５０個以下のアミノ酸を有する、請求項７に記載のフラグメント。
【請求項９】
配列番号２、５および７〜１３および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７または請求項８に記載のフラグメント。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のフラグメント、請求項１０に記載の単離された核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物と薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤として使用するための、請求項１０に記載の単離された核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
乾癬および／または座瘡から選択される皮膚炎症性疾患、好ましくは座瘡の治療および／または予防において使用するための、請求項１０に記載の単離された核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤としての同時、個別または逐次使用のための、
請求項７〜９のいずれか一項に記載のフラグメント、請求項１０に記載の単離された核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物；および
好ましくは、乾癬および／または座瘡から選択される皮膚炎症性疾患、好ましくは座瘡の治療および／または予防のために使用される別の薬剤
を含んでなる、組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野、特に炎症性皮膚疾患の分野にあり、より詳しくは、本発明は、特に、炎症性皮膚疾患、より詳しくは、座瘡の予防および／または治療のための薬物として使用するための、ヒトフィブリノゲンから得られた単離されたペプチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメント、それらをコードする核酸分子、それらを含有する発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物および組合せ物、ならびに炎症性皮膚疾患、特に座瘡を治療および／または予防するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性皮膚障害は、軽度の掻痒から重度の医学的合併症までの重篤度範囲の多くの病態を含む広いカテゴリーを包含する。これらの障害は、あらゆる年齢層および人種に共通している。これらの障害は皮膚の刺激および炎症を特徴とする。これらの疾患は時にひどくなり、罹患者に多大な不快を引き起こし得る。炎症性皮膚障害の周知の例は座瘡である。
【０００３】
座瘡は、８０％を超える若年成人を侵す皮膚の多因子性疾患である。この疾患は毛包脂腺嚢に局在し、炎症性病巣と非炎症性病巣の両方を特徴とする。患者は、非炎症性の面皰と炎症性の丘疹、膿疱および小結節の混合状態を呈することがある。炎症性座瘡の発生を促す要因の１つが嫌気性アクネ菌(Proprionibacterium acnes)(P. acnes)株による毛包脂腺管の細菌定着である。
【０００４】
実際に、アクネ菌は、イン・ビトロ（in vitro）においてはケラチノサイト、皮脂細胞および単球による炎症性分子（インターロイキンＩＬ−１α／β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、β−デフェンシン）の生産を誘導でき、イン・ビボ（in vivo）においては座瘡病巣においても同様である。この生産は、ＴＬＲ２受容体およびＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路ならびにＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の活性化を含む。アクネ菌はまたケラチノサイトによる反応性酸素種（ＲＯＳ）の定量生産を誘導し、炎症反応の開始に寄与する    （Ｇｒａｈａｍ  ２００４；Ｇｒａｎｇｅ  ２００９ａ；Ｇｒａｎｇｅ  ２００９ｂ；Ｋａｎｇ  ２００５；Ｎａｇｙ  ２００５；Ｔｒｉｖｅｄｉ  ２００６；Ｑｉｎ  ２０１４；Ｋｉｓｔｏｗｓｋａ  ２０１４；Ｊｕｇｅａｕ  ２００５）。
【０００５】
現在、レチノイド（ビタミンＡ誘導体）、アゼライン酸、サリチル酸、過酸化ベンゾイル、局所および経口抗生剤などのいくつかの抗座瘡処置が存在する。
【０００６】
これらの処置の作用は様々であり、異なる効果を有する。一般に、抗生剤は細菌を死滅させ、レチノイドおよびアゼライン酸は微小面皰の発生を予防し、抗微生物特性および抗炎症特性を有する。
【０００７】
他の化学化合物は、細菌侵入に関連する特定の機構を標的とする。
【０００８】
アクネ菌は、ヒト皮膚に接着することができ（Ｇｒｉｃｅ  ２００９）、非特異的相互作用を用いてその播種領域から感染部位へ移動し、その後、特異的結合を介して不可逆的接着プロセスが生じることにより、より深層への感染も引き起こし得る（Ｇｒｉｓｔｉｎａ  １９８８）。さらに、これまでの研究で、アクネ菌のフィブロネクチンとしての細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ）への、ならびにヒト上皮細胞への（Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ  １９９０）結合能（Ｙｕ  １９９７）が示されている。
【０００９】
接着防止剤を有する化学薬物として、Ｐａｐｕｌｅｘ（登録商標）が周知である。
【００１０】
しかしながら、上記に引用された処置には多くの副作用がある。例えば、抗生剤コースは時間的に限定するべきであり、多くの場合、脱感作または応答の喪失が見られる。さらに、化学化合物の使用は、暗色の皮膚の患者での色素脱失または治療不耐性による他の副作用などのいくつかのリスクを患者に引き起こす。座瘡治療に化学化合物を使用することのもう１つの欠点はそれらのコストが高いことである（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ、２０１３）。
【発明の概要】
【００１１】
これらの理由で、座瘡を治療および予防するための、副作用無しで処置の良好な有効性および低生産コストを可能とする他の手段、好ましくは、生物学的手段が開発されるべきである。
【００１２】
本発明に関して、本発明者らは、今般、ヒトフィブリノゲンにより特異的に認識される５８ｋＤａのアクネ菌表面タンパク質を同定し、それをＰｆｇと命名した。より詳しくは、本発明者らは、ヒトフィブリノゲンのサブユニットが接着タンパク質Ｐｆｇと特異的に結合し、従って、そのアクネ菌との接着を阻害することができることを見出した。
【００１３】
本知見は、本発明者らが知る限り、ヒトフィブリノゲン認識能を有するアクネ菌表面糖タンパク質が特性決定されたのは初めてであるので、予期されないことであった。
【００１４】
本知見は、皮膚細胞への細菌接着を阻害し、それにより、細菌接着により誘発される皮膚感染および炎症を予防および／または治療することにより座瘡を処置するための別の手段の開発を可能とするので極めて重要である。加えて、本発明者らは、前記フィブリノゲンサブユニットがより全般的な抗炎症特性を有していること、従って、より一般には、他の炎症性皮膚障害、好ましくは、乾癬を予防および／または治療するために使用可能であることを見出した。
【００１５】
よって、第１の側面において、本発明は、薬剤として使用するための、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド、または、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、そのフラグメントに関する。
【００１６】
配列番号１は、フィブリノゲンのヒトＢβサブユニットに相当し、配列番号２、５および７〜１３および４７は、この配列のフラグメントに相当する。
【００１７】
本発明によるポリペプチドは、アクネ菌を認識してそれと結合することができ、また、そのリガンドであるフィブリノゲンおよび皮膚細胞へのアクネ菌の接着を阻害することができる。
【００１８】
よって、本発明による治療的使用のためのポリペプチドは、好ましくは、座瘡を予防および／または治療するために使用され得る。
【００１９】
本発明者らはまた、本発明による治療的使用のための単離されたポリペプチドは、他の炎症性皮膚疾患、好ましくは、乾癬の治療および／または予防のために使用可能であることも見出した。
【００２０】
本発明者らはまた、アクネ菌の接着タンパク質を認識してそれと結合し、そのリガンドであるフィブリノゲンへのおよび皮膚細胞へのアクネ菌の接着を阻害する、ヒトフィブリノゲンＢβサブユニットのフラグメントも単離した。
【００２１】
よって、第２の側面において、本発明は、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのフラグメントに関し、前記フラグメントは、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
第３の側面において、本発明はまた、本発明のフラグメントをコードする単離された核酸分子、本発明の核酸を含んでなるベクター、および本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明のフラグメントは、アクネ菌を認識してそれと結合することができ、また、アクネ菌のそのリガンドであるフィブリノゲンおよび皮膚細胞への接着を阻害することもできる。結果として、これらのフラグメントは、炎症性疾患、特に座瘡を予防および／または治療するための薬物における抗接着剤として大きな可能性を持ち得る。
【００２４】
よって、第４の側面において、本発明は、本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクターまたは宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物と薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物に関する。
【００２６】
好ましくは、本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、座瘡の治療および／または予防のために使用される。
【００２７】
本発明者らはまた、本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、他の炎症性皮膚疾患、好ましくは、乾癬の治療および／または予防のために使用可能であることも見出した。
【００２８】
本発明のフラグメント、単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、単独で、または座瘡予防および／もしくは治療ならびに／または他の炎症性疾患、好ましくは、乾癬の予防および／もしくは治療に関与する別の治療剤と組み合わせて使用可能である。
【００２９】
よって、第５の側面において、本発明は、薬剤としての同時、個別または逐次使用のための、
本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクターおよび宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物；および
好ましくは、乾癬および／または座瘡から選択される皮膚炎症性疾患、好ましくは、座瘡の治療および／または予防に使用される別の薬剤
を含んでなる組合せ物に関する。
【００３０】
本発明による組合せ物の目的は、本発明によるフラグメントの治療効果を増強することである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フィブリノゲンにより認識される５８ｋＤａアクネ菌表面タンパク質の同定。アクネ菌６９１９株を３７℃、嫌気条件下、ＲＣＭ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０を添加したＲＣＭおよび５％ヒツジ血液を添加したコロンビアで増殖させた。（Ａ）アクネ菌表面タンパク質（７５μｇ）を、ＰＢＳ中６０℃（レーン２）および１Ｍ  ＬｉＣｌ中４５℃（レーン３）で加熱抽出し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、室温で２時間、ビオチン化フィブリノゲン、コラーゲンＩ、ＩＶ、ＶＩおよびＶＩＩＩ（０．１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。ＨＲＰ−ストレプトアビジン単独を使用することにより、対照実験を行った。レーン１：分子量標準。
【図２】アクネ菌表面タンパク質と精製ヒトフィブリノゲンの結合。（Ａ）アクネ菌表面タンパク質（０．８〜５０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルポリスチレンプレートに固定化し、室温で２時間、ビオチン化フィブリノゲン（０．１μｇ／ｍｌ）でプローブした。（Ｂ）アクネ菌表面タンパク質（２５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルポリスチレンプレートに固定化し、室温で２時間、０．１〜１６μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のビオチン化フィブリノゲンでプローブした。結合したビオチン化フィブリノゲンを、材料および方法に記載されるようにＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出した。
【図３】Ｐｆｇの同定。ｃＰＡＨＥ（２００μｇ）を二次元電気泳動により分離した。（Ａ）タンパク質は銀染色により検出した。（Ｂ）フィブリノゲン結合活性は、材料および方法に記載されるようにウエスタンリガンドブロットアッセイを使用することにより、ビオチン化フィブリノゲンで決定した。レーン１、分子量標準；レーン２、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ＤＥ）だけによって分離されたサンプル（５０μｇのタンパク質）；レーン３、材料および方法に記載されるような２ＤＥ後のサンプル。矢印はＭＡＬＤＩ−ＴｏＦによる同定のために切り出されたスポットを示す。（Ｃ）対象スポットに関して得られたＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトル。モノアイソトピックペプチド質量を用いてタンパク質データベースを検索し、一致させ、続いてタンパク質スポットを同定した。
【図４】Ｐｆｇの精製。アクネ菌表面タンパク質を４２℃で２時間、１％ＬｉＣｌにより抽出した後、８０％飽和での硫酸アンモニウム沈澱により濃縮した。（Ａ）ｃＰＡＨＥ（８５ｍｇ）をＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラムに２４ｍｌ／時でロードした。２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０中で平衡化したタンパク質を、６０分間０〜１６０ｍＭおよび９０分間１６０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０の直線勾配で溶出させた（●）。プールしたＰｆｇ含有画分を脱塩し、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中で平衡化した。（Ｂ）タンパク質をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ３００カラムにて６ｍｌ／時でゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。排除容量(Void volume)（Ｖｏ）をチログロブリン（６６９ｋＤａ）で決定し、ウシグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３ｋＤａ）の溶出位置を矢印で示す。タンパク質濃度は２８０ｎｍでモニタリングした（●）。フィブリノゲン結合活性（■）を材料および方法に記載されるようにビオチン化フィブリノゲンで決定した。水平の線Ｆ２、Ｆ２．２は、フィブリノゲン結合活性を含むプール画分を示す。（Ｃ）タンパク質は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルー染色により検出した。（Ｄ）電気泳動分離の後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、フィブリノゲン結合活性をビオチン化フィブリノゲンで検出した。レーン１ａ／ｂは、それぞれ非染色およびビオチン化分子量マーカーを含む。レーン２：アクネ菌表面リチウム全タンパク質抽出物（１０μｇ）。レーン３：濃縮表面タンパク質抽出物（１０μｇ）。レーン４および５：それぞれ１０μｇのプールＦ２およびＦ２．２画分。
【図５】図５：アクネ菌表面タンパク質とフィブリノゲンの結合。（Ａ）４℃で１８時間、種々の量のヒトフィブリノゲン（ｈＦｇ）およびウシフィブリノゲン（ｂＦｇ）を９６ウェルポリスチレンプレートに固定化し、２３℃で２時間、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化Ｐｆｇとともにインキュベートした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として使用した。結合した材料を、ＨＲＰ−ストレプトアビジン結合体を使用することにより検出した。ペルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳ基質を使用することにより４０５ｎｍで測定した。タンパク質（レーン当たり１０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、（Ｂ）クーマシーブルー染色により検出し、ニトロセルロース膜に転写し、（Ｃ）ＨＲＰ−ストレプトアビジン単独、および（Ｄ）ビオチン化Ｐｆｇ（０．１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。レーン１：分子量標準。レーン２：ＢＳＡ。レーン３：ｈＦｇ。レーン４：ｂＦｇ。
【図６】Ｎ−脱グリコシル化フィブリノゲンに対するＰｆｇ認識。精製ヒトフィブリノゲン（ｈＦｇ）およびウシフィブリノゲン（ｂＦｇ）に、材料および方法に記載されるようにＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧＡｓｅ  Ｆ）処理を施した。無処理（レーン２および４）および処理（レーン３および５）サンプル（レーン当たりタンパク質１０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。（Ａ）タンパク質はクーマシーブルー染色により検出した。（Ｂ）ビオチン化Ｐｆｇ（０．１μｇ／ｍｌ）による結合活性。（Ｃ）ビオチン化ＲＣＡ−Ｉレクチン結合活性を脱グリコシル化対照として使用した。レーン１：分子量標準。
【図７】Ｏ−脱グリコシル化フィブリノゲンに対するＰｆｇ認識。精製ヒトフィブリノゲンに、材料および方法に記載されるようにＯ−グリコシダーゼ処理を施した。無処理（レーン２）および処理（レーン３）サンプル（レーン当たりタンパク質１０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。（Ａ）タンパク質は、クーマシーブルー染色により検出した。（Ｂ）ビオチン化Ｐｆｇ（０．１μｇ／ｍｌ）による結合活性。（Ｃ）ビオチン化ジャカリンレクチン結合活性を脱グリコシル化対照として使用した。レーン１ａおよび１ｂは、分子量標準に相当する。
【図８】ＢβヒトフィブリノゲンフラグメントのクローニングおよびＰｆｇによる結合。（Ａ）組換えヒトＢβフィブリノゲンフラグメントＦｇ１、Ｆｇ２、Ｆｇ３およびＦｇ４のクローニングおよび発現。フィブリノゲンフラグメントはＲＴ−ＰＣＲにより得、発現プラスミドを材料および方法に記載されるように構築した。（Ｂ）ＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌で発現させ、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、クーマシーブルー染色（Ｂ）により検出し、材料および方法に記載されるように、ビオチン化Ｐｆｇ（０．１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした（Ｃ）。
【図９】フィブリノゲン由来ペプチドによるフィブリノゲンへのビオチン化Ｐｆｇの結合の用量依存的阻害。ビオチン化ＰＦｇ（０．４ｍｇ）を漸増量の組換えペプチドＦｇ１（◆）、Ｆｇ２（n）または対照としてのＢＳＡ（●）で３７℃にて１時間前処理し、ポリスチレンプレート上のコーティングフィブリノゲン（２５μｇ／ウェル）に対する結合活性を評価した。結果を平均±ＳＤとして表す。各点４反復で実施した。
【図１０】Ｆｇ１およびＦｇ２組換えペプチドで処理した後の細胞生存率の評価。ヒト不死化および初代ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴおよびＮＨＤＫ；不死化単球細胞株ＴｈＰ１、および不死化および初代線維芽細胞細胞株ＭＲＣ５およびＨＤＦを、０．２２〜７ｍＭの範囲の濃度のＦｇ１およびＦｇ２組換えペプチドとともに３７℃で１８時間インキュベートした。細胞生存率は、材料および方法に記載されるようにＭＴＴアッセイを用いて評価した。
【図１１】種々の細胞株に対するアクネ菌ＲＯＮ株の結合活性の用量依存性。ビオチン化アクネ菌ＲＯＮ株を６００ｎｍでの吸光度が０．０１、０．１および０．５となるように調整した濃度で、３７℃で１時間、ヒト不死化および初代ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴおよびＮＨＤＫとともに；不死化単球細胞株ＴｈＰ１とともに、また、不死化および初代線維芽細胞細胞株ＭＲＣ５およびＨＤＦとともにインキュベートした。結合しなかった細菌を除去した後、接着活性を４１０ｎｍで検出した。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１２】ケラチノサイトへのアクネ菌の結合の用量依存的阻害。ビオチン化アクネ菌６９１９株を６００ｎｍでの吸光度が０．１となるように調整した濃度で、０．０１〜０．５ｍＭの範囲の濃度の全ヒト（濃い灰色のバー）およびウシ（薄い灰色のバー）フィブリノゲンで前処理し、３７℃で１時間、ヒトＨａＣａＴケラチノサイト細胞株とともにインキュベートした。結合していない細菌を除去した後、接着活性を４１０ｎｍで検出した。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１３】単球細胞株に対するアクネ菌ＲＯＮの結合の用量依存的阻害。ビオチン化アクネ菌ＲＯＮ株を６００ｎｍでの吸光度が０．１となるように調整した濃度で、組換えペプチドＦｇ１およびＦｇ２で前処理し、３７℃で１時間、ヒト不死化単球細胞株ＴｈＰ１とともにインキュベートした。結合していない細菌を除去した後、接着活性を４１０ｎｍで検出した。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１４】組換えペプチドで前処理したアクネ菌により刺激されたケラチノサイトによるＯ２・−生産の用量依存的阻害。ＨａＣａＴ細胞を１８時間、６００ｎｍでの吸光度が０．２となるように調整した濃度のアクネ菌ＰＩＥ株とともに（青色のバー）、また、組換えペプチドＦｇ１（薄い灰色のバー）およびＦｇ２（濃い灰色のバー）で前処理したアクネ菌とともにインキュベートした。スーパーオキシドアニオン生産の測定は、材料および方法に記載されるように分光蛍光測定法により実施した。対照実験は無刺激ＨａＣａＴ細胞（赤色のバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１５】組換えペプチドで前処理したアクネ菌により刺激された線維芽細胞によるＩＬ−８生産の用量依存的阻害。ＭＲＣ５細胞を１８時間、６００ｎｍでの吸光度が０．２となるように調整した濃度のアクネ菌ＲＯＮ株（青色のバー）とともに、また、組換えペプチドＦｇ１（薄い灰色のバー）およびＦｇ２（濃い灰色のバー）で前処理したアクネ菌とともにインキュベートした。ＩＬ−８生産は、材料および方法に記載されるようにＥＬＩＳＡにより測定した。対照実験は無刺激ＨａＣａＴ細胞（赤色のバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１６】ケラチノサイトに対する小Ｆｇ１生成ペプチド処理後の細胞生存率の評価。ＨａＣａＴ細胞を２４時間、２．５〜２０μＭの範囲の濃度の小ペプチドＦｇ１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．５（ドットのバー）とともにインキュベートした。細胞傷害性の測定値は、材料および方法に記載されるようにＭＴＴアッセイにより行った。対照実験は、ＰＢＳとともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（生細胞に相当）；および０．２％トリトンＸ１００とともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（死細胞に相当）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。
【図１７】小Ｆｇ１生成ペプチドで前処理され、かつ、アクネ菌で刺激された線維芽細胞によるＨ２Ｏ２生産の用量依存的阻害。ＭＲＣ５細胞を２．５〜２０μＭの範囲の濃度の小ペプチドＦｇ１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．５（ドットのバー）とともに２４時間インキュベートした。過酸化水素生産の測定は、材料および方法に記載されるように分光蛍光測定法により実施した。対照実験は無刺激ＭＲＣ５細胞（白いバー）およびアクネ菌で刺激したＭＲＣ５（黒いバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１８】小Ｆｇ１生成ペプチドで前処理し、かつ、リポテイコ酸（ＬＴＡ）で刺激したケラチノサイトによるＨ２Ｏ２生産の用量依存的阻害。ＮＨＤＫ細胞を、２４時間、１．７５〜７μＭの範囲の濃度の組換えペプチドＦｇ１（薄い灰色のバー）およびＦｇ２（濃い灰色のバー）とともにインキュベートした。過酸化水素生産の測定は、材料および方法に記載されるように分光蛍光測定法により実施した。対照実験は無刺激ＮＨＤＫ細胞（白いバー）および１０μｇ／ｍｌのＬＴＡで刺激したＨＤＦ（黒いバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図１９】小Ｆｇ１生成ペプチドで前処理し、かつ、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）で刺激したケラチノサイトによるＩＬ−８生産の用量依存的阻害。ＮＨＤＫ細胞を、２４時間、１．７５〜７μＭの範囲の温度の組換えペプチドＦｇ１（薄い灰色のバー）およびＦｇ２（濃い灰色のバー）とともにインキュベートした。ＩＬ−８生産の測定は、材料および方法に記載されるようにＥＬＩＳＡにより実施した。対照実験は無刺激ＮＨＤＫ細胞（白いバー）および１０μｇ／ｍｌのＰＧＮで刺激したＨＤＦ（黒いバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２０】ケラチノサイトに対する小Ｆｇ１．１生成ペプチド処理後の細胞生存率の評価。ＨａＣａＴ細胞を、２４時間、２．５〜２０μＭの範囲の濃度の小ペプチドＦｇ１．１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．６（ドットのバーとともにインキュベートした。細胞傷害性の測定は、材料および方法に記載されるようにＭＴＴアッセイにより行った。対照実験はＰＢＳとともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（生細胞に相当）で、また、０．２％トリトンＸ１００とともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（死細胞に相当）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。
【図２１】ケラチノサイトに対する、Ｆｇ１．１生成ペプチド溶液を調製するために使用したビヒクルで処理した後の細胞生存率の評価。ＨａＣａＴ細胞を２４時間、Ｆｇ１．１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．６（ドットのバー）とともに使用される条件に相当するビヒクル希釈溶液とともにインキュベートした。細胞傷害性の測定は、材料および方法に記載されるようにＭＴＴアッセイにより行った。対照実験はＰＢＳとともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（生細胞に相当）で、また、０．２％トリトンＸ１００とともにインキュベートしたＨａＣａＴ細胞（死細胞に相当）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。
【図２２】小Ｆｇ１．１生成ペプチドで前処理したアクネ菌により刺激されたケラチノサイトによるＩＬ−８生産の用量依存的阻害。ＨａＣａＴ細胞を、２４時間、２．５〜２０μＭの範囲の濃度の小ペプチドＦｇ１．１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．６（ドットのバー）とともにインキュベートした。ＩＬ−８生産の測定は、材料および方法に記載されるようにＥＬＩＳＡにより実施した。対照実験は無刺激ＨａＣａＴ細胞（白いバー）およびアクネ菌で刺激したＨａＣａＴ（黒いバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２３】小Ｆｇ１．１生成ペプチドで前処理され、かつ、アクネ菌で刺激された線維芽細胞によるＩＬ−８生産の用量依存的阻害。ＭＣＲ５細胞は、２４時間、２．５〜２０μＭの範囲の濃度の小ペプチドＦｇ１．１．１（薄い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．２（水平線のバー）、Ｆｇ１．１．３（斜線のバー）、Ｆｇ１．１．４（濃い灰色のバー）、Ｆｇ１．１．６（ドットのバー）とともにインキュベートした。ＩＬ−８生産の測定は材料および方法に記載されるようにＥＬＩＳＡにより実施した。対照実験は無刺激ＭＣＲ５細胞（白いバー）およびアクネ菌で刺激したＭＣＲ５（黒いバー）で行った。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２４】イン・ビボにおけるアクネ菌により誘導される炎症に対する５％Ｆｇ１．１．１ペプチドゲルの効果。マウスの耳の皮内にアクネ菌（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．０  ＰＢＳ中２．１０７ＣＦＵ／２０μｌに相当）を注射し、炎症を誘導した。次に、５％Ｆｇ１．１．１ペプチドゲルをマウスの耳の皮膚表面に３日間毎日塗布した（矢印）。耳の厚さ、落屑および発赤に相当するスコアを９６時間、毎日測定した。データは８回の個々の実験の平均±Ｓ．Ｄである。ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した無処置群に相当する。ＰＡ＋ビヒクルＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリン単独処置に相当する。ＰＡ＋ペプチドＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリンに５％Ｆｇ１．１．１ペプチドを混合したものによる処置に相当する。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２５】アクネ菌をＦｇ１．１．１で前処理した場合のイン・ビボにおけるアクネ菌により誘導される炎症に対するＦｇ１．１．１ペプチドの効果。アクネ菌株（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．５）を３７℃で１時間、Ｆｇ１．１．１ペプチド（１４０μＭ）（ＰＡ＋ペプチドＩＮＪＥＣＴ）またはビヒクル（ＰＢＳ中最終１％ＤＭＳＯ）（ＰＡ＋ビヒクルＩＮＪＥＣＴ）で前処理した後、マウスの耳の皮内に注射し（およそ２．０７ＣＦＵ／２０μｌ）、炎症を誘導した。対照群にはＰＢＳ単独を注射した。耳の厚さ、落屑および発赤に相当するスコアを９６時間、毎日測定した。データは８回の個々の実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２６】マウスにおけるアクネ菌により誘導される炎症に対するＦｇ１．１．１ペプチドの皮内注射および局所塗布の効果。（１）耳にＰＢＳ単独を注射した。（２）アクネ菌刺激（ＰＢＳ中２．１０７ＣＦＵ／２０μｌ）の９６時間後。（３）最終１％ＤＭＳＯと混合したアクネ菌の９６時間後。（４）ワセリン局所塗布を伴うアクネ菌刺激の９６時間後。（５）Ｆｇ１．１．１ペプチドと混合したアクネ菌の９６時間後。（６）Ｆｇ１．１．１ペプチド局所塗布を伴うアクネ菌刺激の９６時間後。
【図２７】マウス耳の組織病理学的分析。（１）耳にＰＢＳ単独を注射した。（２）アクネ菌刺激（ＰＢＳ中２．１０７ＣＦＵ／２０μｌ）９６時間後の耳の腫脹および浸潤炎症性細胞。（３および４）耳の腫脹およびほとんどの浸潤炎症性細胞はそれぞれビヒクル注射および塗布によって変化しなかった。（５および６）耳の腫脹および浸潤炎症性細胞はそれぞれＦｇ１．１．１ペプチド注射および局所塗布により軽減された。データは、同様の結果の８回の個々の実験の代表的なものである。
【図２８】マウスにおけるアクネ菌により誘導されるリンパ球活性化に対するＦｇ１．１．１ペプチドの皮内注射および局所塗布効果。（Ａ）マウスの耳の皮内にアクネ菌（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．０  ＰＢＳ中２．１０７ＣＦＵ／２０μｌに相当）を注射し、炎症を誘導した。次に、５％Ｆｇ１．１．１ペプチドゲルをマウスの耳の皮膚表面に３日間毎日塗布した（矢印）。ＰＡ＋ビヒクルＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリン単独処置に相当する。ＰＡ＋ペプチドＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリンに５％Ｆｇ１．１．１ペプチドを混合したものによる処置に相当する。ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した無処置群に相当する。（Ｂ）アクネ菌株（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．５）を３７℃で１時間、Ｆｇ１．１．１ペプチド（１４０μＭ）（ＰＡ＋ペプチドＩＮＪＥＣＴ）またはビヒクル（ＰＢＳ中最終１％ＤＭＳＯ）（ＰＡ＋ビヒクルＩＮＪＥＣＴ）で前処理した後、マウスの耳の皮内に注射し（およそ２．０７ＣＦＵ／２０μｌ）、炎症を誘導した。対照群にはＰＢＳ単独を注射した。感染後９６時間に、マウスを安楽死させ、耳の神経節を摘出し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で７２時間増殖させた後、それらの増殖能を試験した。増殖測定はＵｐｔｉｂｌｕｅ試薬を用いて行った。データは８回の個々の実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図２９】Ｆｇ１またはＦｇ１．１．１ペプチドで前処理したアクネ菌で刺激されたケラチノサイトによるＩＬ−８生産の用量依存的阻害。ＨａＣａＴ細胞を、２．５〜１０μＭの範囲の濃度のＦｇ１ペプチド（薄い灰色のバー）およびＦｇ１．１．１ペプチド（濃い灰色のバー）で３７℃にて１時間前処理したアクネ菌とともに３７℃で２４時間インキュベートした。対照実験は、無刺激ＨａＣａＴ細胞（細胞単独）および非前処理アクネ菌で刺激したＨａＣａＴ細胞（細胞＋ＰＡ）で行った。ＩＬ−８生産の測定は、材料および方法に記載されるようにＥＬＩＳＡにより実施した。データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄである。
【図３０】Ｉｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−αで刺激されたケラチノサイトによるＩｌ−８生産の阻害。ＮＨＥＫ細胞をＩｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−α（各３ｎｇ／ｍｌ）の組合せで刺激し、１０μＭのＪＡＫ阻害剤（陽性対照）または１．５２〜１２．２μＭの範囲の濃度のＦｇ１．１．１で４８時間処理した。材料および方法に記載されるように、ＩＬ−８生産の測定はＥＬＩＳＡにより実施し、細胞傷害性はＭＴＴアッセイにより決定した。対照実験は無処理かつ無刺激のＮＨＥＫ細胞（細胞単独）およびＩｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−αの組合せで刺激した無処理ＮＨＥＫで行った。データは３回の個々の実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、および＊＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【図３１】Ｉｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−αで刺激されたケラチノサイトによるｈＢＤ−２生産の阻害。ＮＨＥＫ細胞をＩｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−α（各５ｎｇ／ｍｌ）の組合せで刺激し、１０μＭのＪＡＫ阻害剤（陽性対照）または１．５２〜１２．２μＭの範囲の濃度のＦｇ１．１．１で７２時間処理した。材料および方法に記載されるように、ｈＢＤ−２生産の測定はＥＬＩＳＡにより実施し、細胞傷害性はＭＴＴアッセイにより決定した。対照実験は無処理かつ無刺激のＮＨＥＫ細胞（細胞単独）およびＩｌ−１７、ＯＳＭおよびＴＮＦ−αの組合せで刺激した無処理ＮＨＥＫで行った。データは３回の個々の実験の平均±Ｓ．Ｄである。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、および＊＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
別の定義がされない限り、本明細書に使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の直鎖ポリマーを意味する。タンパク質は大きなポリペプチドであり、この２つの用語は一般に互換的に使用される。
【００３４】
本明細書において、互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、フラグメントまたは核酸の一領域を定義する、修飾型または非修飾型のヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【００３５】
これにはまた、本発明はそれらの天然染色体環境にある、すなわち天然状態にあるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関するものではないことが含まれるべきである。本発明の配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えばコピーにより直接または間接的にサンプル採取されたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られる、または化学合成により得られる単離された核酸またはアミノ酸配列もここに述べられるべきである。
【００３６】
本明細書において、用語「細菌株」または「株」は、何らかの微細ではあるが識別可能な違いにより同じ種の他の細菌とは異なる、細菌種のサブセットを意味する。例えば、本発明によれば、アクネ菌株は、アクネ菌６９１９株、ＲＯＮ株および／またはＰＩＥ株であり得る。
【００３７】
本出願において、用語「フラグメント」は、配列、好ましくは、アミノ酸配列の一部を意味する。
【００３８】
本明細書において、用語「フィブリノゲン」または「Ｆｇ」は、ジスルフィド結合により互いに連結された３つの異なる鎖（Ａα、Ｂβ、およびγ）の２組を含有するヘキサマーである、血餅の形成に関与する糖タンパク質を意味する。これらの３つの鎖のＮ末端セクションは、鎖の架橋に関与するシステインを含む。Ａα、Ｂβおよびγ鎖のＣ末端部分は、分子認識単位として機能し得る、約２２５アミノ酸残基のドメインを含む。このドメインはタンパク質間相互作用に関連付けられている。
【００３９】
本明細書において、用語「座瘡」（acne）または「尋常性座瘡」（acne vulgaris）は、ホルモン機構、免疫機構および微生物学的機構を含む多因子性の病因を有する一般的な障害を意味する。この疾患は、毛包脂腺嚢に局在し、炎症性と非炎症性の両方の臨床病巣をもたらす。ほとんどの患者は非炎症性の面皰と炎症性の丘疹、膿疱および小結節の混合物を有する。座瘡形成に関与する主要な因子のうちの１つは、脂腺の微生物定着である。数系統のエビデンスがプロピオニバクテリウム・アクネス（アクネ菌）の座瘡および整形外科的感染における病原体としての重要な役割を含意している（Ａｎｔｔｉ−ｐｏｉｋａ  １９９０）。
【００４０】
本発明による治療的使用のための単離されたポリペプチド
多くの病原性細菌に関して、宿主細胞の侵襲は、特異的リガンドを認識する細菌表面タンパク質またはアドヘシンにより媒介される。ブドウ球菌および連鎖球菌属などの皮膚関連細菌は、宿主細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）と特異的に結合してそれらの標的細胞への接着を促進し、続いて定着および感染を誘発する、ＭＳＣＲＡＭＭ(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules)と呼ばれる多数の細胞表面アドヘシンを発現する（Ｐａｔｔｉ  １９９４）。宿主ＥＣＭ成分は、多くの病原体が組織への定着および感染の開始のために用いている理想的な微生物接着標的である。
【００４１】
よって、本発明において、本発明者らは、まず、アクネ菌表面タンパク質とＥＣＭ成分の相互作用を検討した。直接的結合アッセイを用い、本発明者らは、５８ｋＤａの糖タンパク質がヒトフィブリノゲンにより特異的に認識されることを初めて実証した。このタンパク質はＰｆｇと命名された。エンドグリコシダーゼ消化試験では、Ｐｆｇとフィブリノゲンの間の相互作用はヒトフィブリノゲンの非グリコシル化部分を含んでいることが示された。さらなる実験で、フィブリノゲンのＮ末端部分はＰｆｇにより認識され、フィブリノゲンへのＰｆｇの結合を阻害し得ることが実証された。
【００４２】
フィブリノゲン、特に、そのサブユニットＢβのこの特性は、細菌タンパク質のそれらの宿主への接着を阻害するために、療法に使用可能である。
【００４３】
よって、１つの側面において、本発明は、薬剤として使用するための、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド、または、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、そのフラグメントに関する。
【００４４】
配列番号１は、ヒトフィブリノゲンのサブユニットＢβに相当し、配列番号２、５および７〜１３および４７はこの配列のフラグメントに相当する。
【００４５】
フィブリノゲンのＢβ鎖はＦＧＢ遺伝子によりコードされ、この遺伝子は、ヒトおよび同様の血液凝固システムを持つほとんどの他の脊椎動物に見られる遺伝子である。アミノ酸配列は、約４５０アミノ酸の長さである。
【００４６】
１つの態様によれば、本発明の治療的使用のためのポリペプチドは、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、または最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００４７】
別の態様では、本発明による治療的使用のための単離されたポリペプチドは、配列番号２、５および７〜１３および４７、または最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７の１つと少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００４８】
配列番号１３および配列番号４７は、１０６個のアミノ酸を有し、Ｆｇ１と呼称される、ヒトフィブリノゲンのＢβ鎖の特定のフラグメントのアミノ酸配列に相当する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なグローバルアラインメントの後に得られる比較する２配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、２配列間の違いはその長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、慣例的に、それらをその全長にわたって完全に最適にアラインした後に配列を比較することにより行われ、前記比較は、「Ｂｌｏｓｕｍ  ６２」マトリックスで１０．０に等しい「Ｇａｐ  ｏｐｅｎ」パラメーター、０．５に等しい「Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ」パラメーターを用いるニードルソフトウエア（needle software）などの当業者に周知の任意のソフトウエアによって実行される。ニードルソフトウエアは、例えば、ウェブサイトebi.ac.uk worldwideから「Ａｌｉｇｎ」の名称で入手可能である。
【００５０】
次に、２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージをグローバルにかつ最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定するが、この場合、比較する核酸またはアミノ酸配列は、それら２配列間の最適なグローバルアラインメントのために参照配列に対して置換、付加または欠失を有することができる。同一性パーセンテージは、２配列間でアミノ酸またはヌクレオチドが同一の位置の数を求め、その同一の位置の数を最適なグローバルアラインメント内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けてその２配列間の同一性パーセンテージを得ることより計算される。ニードルソフトウエアなどの最適なグローバルアラインメントに好適なソフトウエアを使用する場合、比較する２配列間の同一性パーセンテージは、このソフトウエアにより直接計算される。
【００５１】
参照アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例として、参照配列における特定の改変、特に、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の保存的または非保存的アミノ酸の置換の場合、好ましい置換は、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換されるものである。ここで、「等価なアミノ酸」という表現は、いずれのアミノ酸も対象ポリペプチドの生物活性を変更することなく構造アミノ酸のうちの１つで置換され得ることを示すものとし、特に、以下に定義される具体例が含まれる。
【００５２】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性において、または生成される可能性のある種々の抗体間での生物活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。
【００５３】
限定されない例として、以下の表１は、対象ポリペプチドの生物活性に有意な変更をもたらさずに実施され得る置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も可能である。
【００５４】
【表１】
2018512844.tif 000002
【００５５】
上記のようなポリペプチドおよびそれらのフラグメントは、本発明者らにより同定されたアクネ菌表面タンパク質（Ｐｆｇ）を認識し、それと結合し、皮膚細胞へのアクネ菌の接着を阻害する。
【００５６】
本発明において、本発明者らは、ビオチン化リガンド結合アッセイを使用することにより、驚くべきことに、ヒトフィブリノゲンにより特異的に認識される５８ｋＤａのアクネ菌表面タンパク質（Ｐｆｇ）を同定した。Ｐｆｇはさらに２Ｄ電気泳動およびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析により、そのＣ末端にＬＰＸＴＧモチーフを含有する推定接着表面タンパク質として同定された。Ｐｆｇはほとんどが静置培養相で発現され、ＧａｌＮＡｃ残基を含み、高グリコシル化されているものと思われる。精製Ｐｆｇは、ＦｇのＡαおよびＢβサブユニットを強く認識する。Ｆｇの特定の酵素的脱グリコシル化は、そのタンパク質骨格が認識プロセスに関与していたことを示した。
【００５７】
本発明者らはまた、ＦｇのＢβサブユニットおよびそのフラグメントが接着タンパク質Ｐｆｇとその標的リガンド（Ｆｇ）または標的細胞（皮膚細胞）との相互作用を阻害できることも実証した。特に、上記のようなポリペプチドおよびそれらのフラグメントは、この相互作用と競合することができ、従って、宿主細胞への細菌の接着の防止に関与することができる。
【００５８】
この能力に加え、上記のようなポリペプチドおよびそれらのフラグメントは、薬物として、特に座瘡を治療および／または予防するために使用可能である。
【００５９】
本発明者らはまた、上記のようなポリペプチドおよびそれらのフラグメントは、アクネ菌の存在とは無関係に全般的な抗炎症特性を有することも見出し、よって、薬物として、特に、他の炎症性皮膚疾患、好ましくは、乾癬を治療および／または予防するために使用可能である。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「炎症性皮膚疾患」は、皮膚掻痒および発赤を伴う偶発的発疹から、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬などの慢性症状まで、多くの形態で現れる疾患である。皮膚炎症は急性または慢性として特徴付けることができる。急性炎症は、紫外線（ＵＶＲ）、電磁放射線、アレルゲンへの暴露、または化学刺激物（ソープ、ヘアダイなど）との接触から生じ得る。このタイプの炎症は一般に、組織破壊をほとんど伴わずに１〜２週間内に消散する。これに対して、慢性炎症は、皮膚自体の内部の持続的な免疫細胞介在炎症性応答から生じる。この炎症は長期間持続し、重大かつ重篤な組織破壊を引き起こし得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「乾癬」は、鱗状紅斑、丘疹、および斑を含む、通常は掻痒性の皮膚病巣を特徴とする一般的な慢性、再発／寛解性、免疫介在性の全身性疾患を意味する。乾癬に見られる皮膚病巣は、軽度の局在斑から全身を覆うまで重篤度が多様である。乾癬の５つの主要なタイプは、斑状、滴状、倒置、膿疱性、および紅皮性である。
【００６２】
本発明の特定のフラグメント
フィブリノゲンのサブユニットＢβの配列から始め、本発明者らは、アクネ菌の接着タンパク質Ｐｆｇと結合することができ、従って、その標的タンパク質（フィブリノゲン）および宿主皮膚細胞へのアクネ菌の接着を阻害することができる特定のフラグメントを同定した。
【００６３】
よって、別の側面では、本発明は、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのフラグメントに関し、前記フラグメントは、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号２、５および７〜１３および４７のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００６４】
これらの特定のフラグメントを得るために、ヒトフィブリノゲンのサブユニットＢβを同じ長さの４つのセグメント（Ｆｇ１、Ｆｇ２、Ｆｇ３およびＦｇ４と呼称）に分割し、クローニングし、細菌ベクター内で生産した。フィブリノゲンのサブユニットＢβおよびこれらのフラグメントのアミノ酸配列は以下の表２ａに示す。
【００６５】
【表２】
2018512844.tif 000003
【００６６】
試験後、フラグメントＦｇ１、Ｆｇ２、Ｆｇ３およびＦｇ４のうち活性なフラグメントはＦｇ１であるものと思われる。
【００６７】
さらに、フラグメントＦｇ１を、まず、およそ同じ長さ（それぞれ３５、３５および３６アミノ酸）の３つの非オーバーラップフラグメント（表２ｂに示されるＦｇ１．１、Ｆｇ１．２およびＦｇ１．３）に分割し、その後、同じ３０アミノ酸長で、フラグメントＦｇ１．１、Ｆｇ１．２およびＦｇ１．３とオーバーラップするもう２つのフラグメント（表２ｂに示されるＦｇ１．４およびＦｇ１．５）が得られるように、アミノ酸１５個を各切断領域に付加した。
【００６８】
試験後、フラグメントＦｇ１．１、Ｆｇ１．２、Ｆｇ１．３、Ｆｇ１．４およびＦｇ１．５のうち活性なフラグメントはＦｇ１．１およびＦｇ１．４であるものと思われる。
【００６９】
フラグメントＦｇ１．１を、さらに６つの別のフラグメント（表２ｂに示されるＦｇ１．１．１、Ｆｇ１．１．２、Ｆｇ１．１．３、Ｆｇ１．１．４、Ｆｇ１．１．５およびＦｇ１．１．６）に分割した。
【００７０】
【表３】
2018512844.tif 000004
【００７１】
本発明のフラグメントを療法でのより効率的な使用に適合させて最小のコストでその合成を増進するため、本発明者らは長さを短縮したフラグメントを提供する。
【００７２】
よって、本発明の１つの態様によれば、これらのフラグメントは１５０個以下、１３０個以下、好ましくは１１０個以下のアミノ酸または９０個以下のアミノ酸の長さを有する。
【００７３】
より好ましくは、本発明のフラグメントは、配列番号１３および配列番号４７（フラグメントＦｇ１）に相当する１０６個のアミノ酸の長さを有する。
【００７４】
いっそうより好ましくは、本発明のフラグメントは、５〜５０個の間、好ましくは５〜４０個の間、より好ましくは５〜３５個の間のアミノ酸を含む長さを有する。１つの態様によれば、本発明によるフラグメントは、２５〜４０個の間のアミノ酸、好ましくは３０〜３５個の間のアミノ酸を含む長さを有し得る。
【００７５】
別の態様によれば、本発明によるフラグメントは、５〜２０個の間のアミノ酸、好ましくは５〜１５個の間、より好ましくは５〜１０個の間のアミノ酸を含む長さを有し得る。
【００７６】
好ましくは、本発明によるフラグメントは、配列番号２、５および７〜１２、より好ましくは配列番号２および５に相当する配列を有する。
【００７７】
本発明による単離された核酸、ベクターおよび宿主細胞
別の側面において、本発明は、本発明によるフラグメントをコードする単離された核酸分子に関する。
【００７８】
核酸配列はまた、最適なグローバルアラインメントの後に好ましい配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性パーセンテージを示し得る。それは核配列が参照核配列に比べて特定の修飾、例えば、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に、点状の（punctual）修飾を示すことを意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重に関連する）、または好ましくは高ストリンジェント条件下で参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列である。
【００７９】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含んでなるベクターを提供する。
【００８０】
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味するものとする。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」ベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターのもう１つのタイプはウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主ゲノムとともに複製される。
【００８１】
本発明によるベクターは、好ましくは、宿主細胞または対象内で本明細書に記載の任意の核酸分子の送達、増殖および／または発現を可能とするのに必要なエレメントもまた含む。特に、本発明によるベクターでは、本発明による核酸分子は、好ましくは、適当な調節配列に作動可能なように連結されている。本明細書で使用する場合、用語「調節エレメント」または「調節配列」は、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含め、所与の宿主細胞または対象内で核酸分子の発現を可能とする、寄与するまたは調節するいずれのエレメントも意味する。当業者には、調節配列の選択がベクター自体、宿主細胞または対象、所望の発現レベルなどの因子によって異なり得ることを認識するであろう。
【００８２】
本発明で使用されるこのような好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定されるものではないが、原核生物ではｐＢＳＫベクター、ｐＥＴ、ｐＤＥＳＴ、ｐＲＳＥＴベクター；酵母ではｐＹＥＳ；真核生物ではｐＤＥＳＴ、ｐｃＤＮＡが挙げられる。
【００８３】
さらに、本発明の核酸分子およびこれらの分子を含んでなる本発明のベクターは、好適な宿主細胞の形質転換のために使用可能である。用語「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドまたはフラグメントを発現させるために組換え発現ベクターが導入された細胞を意味するものとする。このような用語は特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の後代も意味するものと理解されるべきである。続いての世代では突然変異または環境的影響のいずれかのためにある種の改変が起こり得るので、このような後代は実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用する「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。本発明に関して好適な宿主細胞の非限定例としては、大腸菌（特に、ＤＨ５α株）などの細菌細胞、酵母細胞（特に、サッカロミケス属cerevisiae）、哺乳動物細胞（特に、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、３Ｔ３細胞株）が挙げられる。
【００８４】
形質転換は、細胞宿主にポリヌクレオチドを導入するためのいずれの既知の方法によって行ってもよい。このような方法は当業者に周知であり、デキストラン媒介形質転換、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド封入、微粒子銃インジェクションおよび核へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。
【００８５】
宿主細胞は、２以上の核酸分子、または本発明のポリペプチドまたはフラグメントを発現するベクターを含む発現ベクターで同時トランスフェクトしてもよい。
【００８６】
医薬組成物、薬物および組合せ物
本発明者らは、本発明のフラグメント、好ましくは、配列番号２、５および７〜１３および４７に相当するアミノ酸配列を有するフラグメントがアクネ菌のＰｆｇ接着タンパク質を認識してそれと結合し、従って、その標的リガンド（フィブリノゲン）および宿主皮膚細胞へのアクネ菌接着を阻害することを実証した。
【００８７】
よって、別の側面において、本発明は、本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクターまたは宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物と薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能なビヒクル」は、生理学上適合する溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれか、また総てを含む。担体のタイプは意図される投与経路に基づいて選択することができる。種々の態様では、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、経皮的なまたは経口投与に好適である。薬学上許容可能な担体には、無菌水溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調合製剤用の無菌散剤が含まれる。薬学上活性な物質のための媒体および剤の使用は当技術分野で周知である。静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液と１００ｍｇの本組合せを含有するように作製することができる。非経口的に投与可能な化合物を製造するための実際の方法は当業者に既知または自明であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)ならびにその第１８版および第１９版により詳細に記載されている。本組成物中の化合物は好ましくは、有効量で処方される。「有効量」は、炎症性皮膚障害、特に座瘡の予防または治療などの所望の結果を達成するために必要な用量で、必要な期間での有効な量を意味する。「治療上有効な量」は、特定の病態の治療経過に影響を与えるのに十分な量を意味する。治療上有効な量はまた、その剤の有毒または有害な作用に治療上有益な効果が上回るものである。
【００８９】
投与経路、投与計画および最適な剤形は、例えば、患者の齢、患者の健康状態の重篤性、その処置に対する患者の忍容性および受ける副作用など、患者に適切な処置を確立する際に一般に考慮される基準に従って決定され得ると理解される。
【００９０】
例えば、本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクターまたは宿主細胞は、本発明による医薬組成物中に０．１〜１０％重量／重量（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５〜２％ｗ／ｗ、より好ましくは０．５〜４％ｗ／ｗ、いっそうより好ましくは２〜６％ｗ／ｗの範囲で存在してよい。
【００９１】
別の側面によれば、本発明は、薬剤として使用するための本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物に関する。
【００９２】
好ましい態様では、本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、座瘡の治療および／または予防において使用される。
【００９３】
本発明者らはまた、本発明による単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、他の炎症性疾患、好ましくは、乾癬の治療および／または予防においても使用可能であることを示した。
【００９４】
本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、単独で使用してもよいし、またはそれらの治療効果を増進するために他の抗炎症剤と併用してもよい。
【００９５】
よって、別の側面において、本発明はまた、薬剤としての同時、個別または逐次使用のための、
本発明によるフラグメント、単離された核酸分子、ベクター、および宿主細胞から選択される少なくとも１つの化合物；および
好ましくは、乾癬および／または座瘡から選択される皮膚炎症性疾患、好ましくは座瘡の治療および／または予防のために使用される別の薬剤
を含んでなる、組合せ物に関する。
【００９６】
このような他の薬剤は、ドキシサイクリン、イソトレチノイン、トレチノイン、アダパレン、過酸化ベンゾイル、クリンダマイシンおよびエリスロマイシンからなる群から選択され得る。
【実施例】
【００９７】
材料および方法
細菌株および増殖条件
アクネ菌６９１９株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナサス、ＶＡ）から入手し、アクネ菌ＲＯＮおよびＰＩＥは、関節感染患者から単離した。総ての株を嫌気条件下、補強クロストリジウム液体および固体培地（ＲＣＭ）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ＭＩ）中で増殖させた。アクネ菌を細菌保存株からＲＣＭ寒天プレートに移し、ＧａｓＰａｋ（商標）ＥＺ嫌気容器システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ  ＭＤ、ＵＳＡ）を使用することにより、嫌気条件下で５日間インキュベートした。単一コロニーを１００ｍｌのＲＣＭに移し、上記のように増殖させた。次に、細菌懸濁液を最終１０％のグリセロールの存在下、−８０℃で凍結保存した。この保存株は「スタートストック」と呼ばれ、総ての実験に使用した。通常培養では、１００ｍｌのＲＣＭまたは０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を添加したＲＣＭ（ＲＣＭ＋Ｔ８０）を使用し、細菌を３７℃で５日後に、４℃で１０分間、７，０００×ｇで遠心分離することにより採取した。ペレットをプールし、約３０ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄し、再び上記のように遠心分離した。最後に、細菌ペレットをＰＢＳ［１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］に懸濁させた（培養物容積から１：１０）。細菌はまた、５％ヒツジ血液を補足したコロンビア寒天上でも、上記のように嫌気条件下、３７℃で５〜８日間増殖させた。細菌をＰＢＳ中でばらばらにし（３ｍｌのＰＢＳ／ペトリ皿）、表面タンパク質抽出に使用した。大量の培養物の場合、５日経過したアクネ菌のＲＣＭ培養物２００ｍｌを、予め３７℃で平衡化した２リットルのＲＣＭに対する接種物として使用した。嫌気条件を確保するために、培養物にＮ２を１０分間大量に流し、封止した。２時間ごとに、１０ｍｌの培養物を採取して６００ｎｍでの吸光度およびｐＨを測定し、上記のように培養物にＮ２を流した。細菌を１０分間、７，０００×ｇで遠心分離し、ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。全表面タンパク質抽出物を以下のように得た。
【００９８】
全表面タンパク質の抽出
表面タンパク質をＰＢＳ単独で、または２％ＳＤＳの存在下、６０℃で２０分間もしくは１％ＬｉＣｌの存在下、４５℃で２時間、加熱抽出した（Ｓｈｅｎ  １９９３）。４℃、２０分間、１６，０００×ｇでの遠心分離により細菌を除去した。過剰なＳＤＳおよびＬｉＣｌはＰＢＳに対する透析下で除去した。得られた溶液をアクネ菌加熱抽出物（ＰＡＨＥ）と呼び、濃縮のため、４℃、撹拌下で１時間、８０％飽和での硫酸アンモニウム沈降を施した。沈澱したタンパク質を４℃、３０分間、２２，０００×ｇでの遠心分離後に取り出した後、ＰＢＳに再懸濁させ、ＰＢＳに対して徹底的に透析した。このタンパク質溶液を濃縮アクネ菌加熱抽出物（ｃＰＡＨＥ）と呼んだ。タンパク質濃度を、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  １９８３）により記載された、標品としてＢＳＡを用いるローリー法により決定した。
【００９９】
ビオチン化
ｃＰＡＨＥ、精製Ｐｆｇおよび市販のＥＣＭリガンドを、ＰＢＳ中に１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、４℃で一晩、［７４ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、６０ｍＭホウ酸（ｐＨ８．８）］に対して透析した。全アクネ菌を上記のようにＰＢＳ中に回収し、ペレットをホウ酸バッファーに再懸濁させた。この操作を２回繰り返した。タンパク質および全細菌を外的標識試薬スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇのタンパク質に対して２５０μｇのＮＨＳ−ビオチンの比率で用い、４℃で４時間、転倒撹拌しながらインキュベートした。反応を、１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌを加えることにより停止させた。余分なビオチン−ＮＨＳは、タンパク質溶液については４℃でＰＢＳに対する透析によって、全細菌については遠心分離によって除去した。ビオチン化タンパク質調製物を−８０℃で保存し、ビオチン化細菌を使用前に＋４℃で保存した。ビオチン化細菌の調製物は調製後５日以内に使用した。
【０１００】
結合活性
アクネ菌とリガンドの間の相互作用を特性評価するために、本発明者らは、定量的および定性的アッセイでビオチン化分子を使用した。アッセイの第１セットでは、標識タンパク質としてＥＣＭリガンド（フィブリノゲン、コラーゲンＩ、ＩＶ、ＶＩおよびＶＩＩＩ）をビオチンとともに使用した。アッセイの第２セットでは、アクネ菌表面タンパク質（総抽出物および精製Ｐｆｇ）をビオチン化した。定量分析については、非標識タンパク質を５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６バッファーに希釈して０．０１〜５０μｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度とし、次に、４℃で一晩、９６ウェルポリスチレンプレートに固定化した。これらのウェルを０．２ｍｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回すすいだ。ビオチン化タンパク質（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中０．０１〜１６μｇ／ｍｌ）をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルを０．２ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回すすいだ。ストレプトアビジンにコンジュゲートしたペルオキシダーゼ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中０．５μｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合したペルオキシダーゼを、発色性ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを用いて検出した。定性分析については、非標識タンパク質（１レーン当たり１０〜７５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次に、従前に記載されているように（Ｔｏｗｂｉｎ、１９７９）ニトロセルロース膜（孔径０．４５μｍ）に転写した。その後、膜を５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＴバッファー）中、４℃で一晩、飽和させた。結合活性は、２０ｍｌのビオチン化タンパク質（０．１μｇ／ｍｌ）含有ＰＢＴとともに室温にて２時間、膜をインキュベートした後、ＰＢＴで３回洗浄することにより検出した。結合したビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンにコンジュゲートしたペルオキシダーゼ（ＰＢＴ中０．５μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間、膜をインキュベートすることにより検出した。洗浄後、結合したペルオキシダーゼ活性を、ＣｏＣｌ２およびＨ２Ｏ２の存在下で３，３’−ジアミノベンジジンを用いて検出した（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。
【０１０１】
二次元電気泳動
１３ｃｍ  ｐＨ  １０−３固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧストリップ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、スウェーデン）を、２０℃で１３時間、２００μｇのｃＰＡＨＥ由来タンパク質を含有したＩＥＦ溶液（８Ｍ尿素−２％ＣＨＡＰＳ（ｗｔ／ｖｏｌ）−０．５％ＩＰＧバッファーｐＨ４−７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）−０．００２％ブロモフェノールブルー）２５０μｌで再水和物させた。等電点電気泳動は、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用い、２０℃にて、１時間２００Ｖ、１時間５００Ｖ、３０分８０００Ｖ（勾配モード）、および３時間８０００Ｖの４段階で行った。二次元に関しては、このＩＰＧストリップを１５分間、６Ｍ尿素−３０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）−０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ−２％ＳＤＳ（ｗｔ／ｖｏｌ）−０．００２％ブロモフェノールブルー−１００ｍＭ  ＤＴＴの溶液中で、および１５分間、６Ｍ尿素−３０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）−０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ−２％ＳＤＳ（ｗｔ／ｖｏｌ）−０．００２％ブロモフェノールブルー−４００ｍＭヨードアセトアミド溶液中で揺動することにより平衡化した。次に、このＩＰＧストリップを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せた。一般に、２つのゲルを７０ｍＡの一定電流で６時間、並行して泳動した。タンパク質を、グルタルアルデヒド工程を用いない銀染色によりゲル上で検出した。目的のスポットは、従前に記載されているようにＢＯＡを用いて可視化した。銀染色されたゲルおよび膜を照合し、目的のスポットをゲルから切り出した。
【０１０２】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−タイム・オブ・フライト（ＴｏＦ）質量分析によるペプチドマスフィンガープリンティング
二次元タンパク質スポットのゲル内トリプシン消化を、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを含有する２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファー（ｐＨ８．０）中で行った後、真空乾燥させた（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ２００１）。再水和を０．０２ｇ／ｌのシーケンシンググレードの改変ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を含有する５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファー（ｐＨ８．０）で行い、３７℃で１８時間消化を行い、０．４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリフルオロ酢酸を加えることにより停止させた。回収したペプチド溶液をマトリックスフィルム上にスポットし、室温で乾燥させた。サンプル付着物を純水ですすいだ後、３３７ｎｍ  Ｎ２レーザーを備えたＭＡＬＤＩ質量分光光度計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ｓｕｐｅｒ  ＳＴＲ）内に挿入した。高速蒸発マトリックスフィルムは、アセトン中、４−ヒドロキシ−α−シアノケイ皮酸（Ｓｉｇｍａ）の飽和溶液を使用することにより、従前に記載されているように（Ｖｏｒｍ、１９９４）作製した。総てのスペクトルの内部質量較正は、ブタトリプシン自己消化ペプチドを用いることにより達成した。ペプチド質量はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＧｅｎｐｅｐｔデータベースで検索した。
【０１０３】
Ｐｆｇの精製
ｃＰＡＨＥ（１６ｍｌ中９０ｍｇ）を室温にて１０分間５，０００×ｇで遠心分離し、不溶性の材料を除去し、バッファーＡ［２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）］で平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅＱ陰イオン交換カラム（２．５×１０ｃｍ）（ＢｉｏＲａｄ）にて流速２４ｍｌ／時で実施するイオン交換クロマトグラフィーにより分画した。非結合タンパク質をバッファーＡ（２４ｍｌ）で洗浄し、結合したタンパク質を、バッファーＡ＋２Ｍ  ＮａＣｌを用い、０〜１６０（２８ｍｌ）、１６０〜２００ｍＭ（４０ｍｌ）で段階的に溶出させた。Ｆｇ結合活性を含有する画分（１．５ｍｌ）をプールし、４℃で、バッファー０．１  Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０に対して徹底的に透析することにより脱塩し、凍結乾燥させた。Ｐｆｇの最終精製は、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲカラム（１×１２０ｃｍ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、３ｍｇのタンパク質を５ｍｌの容量でロードすることにより、流速６ｍｌ／時（１．５ｍｌ／画分）にて２４時間行った。Ｆｇ結合活性を含有する画分（１．５ｍｌ）をプールし、−２０℃で保存した。
【０１０４】
フィブリノゲンの脱グリコシル化
フィブリノゲンのどの部分がアクネ菌表面タンパク質により認識されるのか評価するために、タンパク質骨格の完全性を保持するためのグリカン部分を酵素的に除去した。フィブリノゲンはＮ結合およびＯ結合両方のグリカンを含有する糖タンパク質であることが示されているので（Ｄｅｂｅｉｒｅ  １９８５；Ｒｅｉｄ  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  １９８２；Ｌ’Ｈｏｔｅ  １９９６）、グリカンを除去するためのエンドグリコシダーゼ、Ｎ−グリカナーゼおよびＯ−グリカナーゼを使用した。使用した酵素および試薬は総てＰｒｏＺｙｍｅ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、サンリアンドロ、カリフォルニア州）から購入した。精製市販ヒトおよびウシＦｇ（１００μｇ；Ｓｉｇｍａ）を、［０．４％ＳＤＳ、２００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］を含有するバッファー中、５分間１００℃で変性させ、室温で冷却した後、３％ＮＰ−４０を加えた。Ｎ結合グリカンを除去するため、大腸菌(Escherichia coli)中のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)リコンビナントＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎ−グリカナーゼ）０．５Ｕを加え、３７℃で２４時間インキュベートした（最終容量５０μｌ）。Ｏ結合グリカンを除去するため、Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃコアだけがタンパク質と結合した状態で残るまで単糖類が除去されなければならないので、まず、変性ヒトフィブリノゲンを０．２５Ｕのコレラ菌シアリダーゼＡ、ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ、およびジャックビーンミールβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼの存在下、３７℃で３時間インキュベートした。次に、大腸菌中の肺炎連鎖球菌リコンビナント  エンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ（Ｏ−グリカナーゼ）０．５Ｕを加え、３７℃で２４時間インキュベートした。酵素反応は、サンプルに電気泳動サンプルバッファーを加え、１００℃で３分間変性させることにより停止させた。次に、Ｎ−およびＯ−脱グリコシル化Ｆｇを、ビオチン化Ｐｆｇとの結合能に関して上記の結合アッセイを用いて試験した。脱グリコシル化反応は、クーマシーブルー染色の後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、脱グリコシル化前と後のフィブリノゲンの移動度のシフトによりモニタリングした。モニタリングはまた、下記のようにＲＣＡ−Ｉおよびジャカリン植物レクチンを用いることでも行った。
【０１０５】
プラスミドの構築
ヒトフィブリノゲンのＢβ−サブユニットのフラグメントは、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコの改変培地で培養したヒト肝細胞腫細胞株Ｈｅｐ−Ｇ２から抽出した全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得た。簡単に述べれば、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ、ペイズリー、ＵＫ）を製造者の説明書に従って用いて単離し、ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で処理した。ＲＮＡ濃度をサンプルのＡ２６０値により決定した。相補的ＤＮＡを２μｇ全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）プライマーおよび２００Ｕのスーパースクリプト（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．、ペイズリー、ＵＫ）を用いて作製し、その後、標準的ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。０．５ＵのハイフィデリティＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．、ペイズリー、ＵＫ）を用い、最終容量２５μｌで、９４℃１５秒、５０℃３０秒および６８℃４５秒に設定した合計３５サイクルのサイクル条件により標準的増幅を行った。プライマーは、フィブリノゲンｃＤＮＡの３１８、４４１、４６２および４６２ｂｐフラグメントを増幅した。
【０１０６】
次のような特定のプライマー対を使用した。
【化１】
2018512844.tif 000005
【０１０７】
ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの制限部位をセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーそれぞれに付加した。フィブリノゲンＰＣＲフラグメントを精製し、まず、ｐＢＳＫベクターに挿入した。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩでフラグメントを消化した後、これらのフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−２に挿入した。
【０１０８】
ＧＳＴ融合タンパク質の発現および精製
大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓ株を種々のＧＳＴ−フィブリノゲン−フラグメント融合タンパク質を生産するために使用した。細菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地（１０ｍｌ）で一晩増殖させ、１ｌのＬＢ培地への播種に使用した。３０℃でインキュベートした培養物がＯＤ６５０＝０．７に達した際に、０．５ｍＭイソプロピルα−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによりタンパク質発現を誘導し、培養物をさらに４時間拡大増殖させた。培養物を５０００×ｇで１０分間の遠心分離により採取した。ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファーＴＥＮ−Ｔ（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ：７．５、ＥＤＴＡ  ０．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、トリトンＸ−１００  １％）に再懸濁させ、氷上バーストにより３０秒音波処理を施し、ＤＴＴ  ２ｍＭ、Ｎ−ラウリルサルコシン１．５％を添加した。この溶解液を２０分、２００００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。ＧＳＴ融合タンパク質を含有する不溶性のペレット画分をＴＥＮ−Ｔバッファー＋８Ｍ尿素に溶かし、この溶液を２０分、２０，０００×ｇでの遠心分離により明澄化した。可溶化したタンパク質をＰｒｏｔｉｎｏ  ＧＳＴ／４Ｂカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）にロードし、バッファー５０ｍＭトリス、１０ｍＭグルタチオン、ｐＨ８．０を用いて溶出させた。組換えペプチドを含有する画分（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定）をプールした。最初の工程で、利用の直前に上清をＰＢＳに対して透析し、尿素を除去した。
【０１０９】
細胞培養および刺激
不死化ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、線維芽細胞ＭＲＣ５は、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地−グルタマックス−Ｉ（ＤＭＥＭ）で増殖させた。不死化ヒト単球細胞株ＴｈＰ１は、ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地−グルタマックス−Ｉ（ＲＰＭＩ）で増殖させた。記載のように（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩには、０．１％および１０％熱失活ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および抗生剤／抗真菌剤溶液（１０Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアムホテリン）を添加した。初代ヒトケラチノサイト（ＮＨＤＫ）および線維芽細胞（ＨＤＦ）をＫＧＭ−ＧｏｌｄおよびＦＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔキットで、製造者（Ｌｏｎｚａ）によりそれぞれ記載されているように増殖させた。不死化細胞株に、マイコプラズマ感染症の不在を評価するために慣例の検査をした。
【０１１０】
アクネ菌による刺激実験については、細胞を、０．８７、１．７５、３．５または７μＭの濃度のフィブリノゲン組換えペプチドＦｇ１およびＦｇ２で３７℃にて１時間前処理した、または前処理しなかったアクネ菌懸濁液を適当な濃度に調整したものとともに、５％ＣＯ２中、３７℃にて所望の時間インキュベートした。
【０１１１】
ＬＴＡ（リポテイコ酸）、ＰＧＮ（ペプチドグリカン）またはＬＰＳ（リポ多糖）による刺激実験については、細胞を７、３．５または１．７５μＭの濃度のフィブリノゲン組換えペプチドＦｇ１およびＦｇ２で５％ＣＯ２中、３７℃にて２４時間前処理し、または前処理せず、次に、終濃度１０μｇ／ｍｌのＬＴＡまたはＰＧＮまたはＬＰＳで３７℃にて１８時間刺激した。
【０１１２】
イン・ビトロ乾癬モデルを用いる実験については、皮膚初代ヒトケラチノサイト（ＮＨＤＫ）を培養培地で２４時間増殖させた。次に、細胞を１．５２、３．０５、６．１および１２．２μＭの濃度のペプチドＦｇ１．１．１または参照（１０μＭのＪＡＫ阻害剤Ｉ；陽性対照）により処理し、または処理せず（陰性対照）、２または２４時間プレインキュベートした。このプレインキュベーションの後、培地を除去し、１．５２、３．０５、６．１および１２．２μＭの濃度のＦｇ１．１．１または１０μＭの濃度のＪＡＫ阻害剤および炎症誘発性混合物（ＩＬ−１７＋ＯＳＭ＋ＴＮＦ−αの組合せ、各３または５ｎｇ／ｍｌ）を含有するまたは含有しない培養培地に置き換え、細胞を４８または７２時間インキュベートした。
【０１１３】
接着アッセイ
細菌懸濁液を６００ｎｍで所望の濃度に調整し、０．８７〜７μＭの範囲の終濃度のペプチドＦｇ１およびＦｇ２で３７℃にて１時間前処理し、２時間、ＰＢＳ  ＳＶＦ２％の溶液で予め飽和させたセルに付着させた。３７℃で１時間のインキュベーションの後、結合していない細菌をＰＢＳで３回洗浄することにより除去し、固定された細菌を０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ溶液により３０分間検出する。３回の  洗浄の後、検出された細菌を基質ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩）により３０分間現像し、４１０ｎｍで読み取る。
【０１１４】
分光光度蛍光分析によるＲＯＳ生産の測定
総ての細胞株（５．１０４〜１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ブリュトマ、フランス）に播種し、従前に記載されているように処理した。刺激後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの５μＭ  ＤＨＥ（Ｏ２・−の決定のため）または５μＭ  Ｈ２−ＤＣＦＤＡ（Ｈ２Ｏ２の決定のため）とともに３０分間、従前に記載されているようにインキュベートし、蛍光強度を５時間にわたり、１時間毎に記録した。蛍光励起／発光極大はＤＨＥ：４８０／６１０ｎｍおよびＨ２−ＤＣＦＤＡ：５０７／５２５ｎｍであった。実験の終了時に、接着細胞の数を下記のようにクリスタルバイオレットアッセイにより評価した。Ｏ２・−、およびＨ２Ｏ２は、Ｆｕｓｉｏｎ分光蛍光計（ＰａｃｋａｒｄＢｅｌｌ、パリ、フランス）での分光光度蛍光測定法によりアッセイした。ＲＯＳのレベルを以下のように各サンプルで計算し、任意単位（Ａ．Ｕ．）として表した：反応性酸素種率（任意単位／分／１０６細胞）＝（Ｔ５ｈでの蛍光強度［任意単位］−Ｔｏでの蛍光強度［任意単位］／３００分／クリスタルバイオレットアッセイにより測定された接着細胞の数。
【０１１５】
細胞生存率アッセイ
９６ウェルプレートにて接着細胞の数を決定するためにクリスタルバイオレット染色を使用した。簡単に述べれば、試験化合物とともにインキュベートした後、培養培地を廃棄し、細胞を０．０５％クリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１００％メタノールを加え、吸光度をＥＬＩＳＡマルチウェルリーダーにて５４０ｎｍで分光光度測定法により測定した。９６ウェルプレートにて細胞生存率を試験するためにＭＴＴ（１−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルホルマザン）アッセイを行った。細胞を細胞培養培地中０．２％ＭＴＴ溶液とともに３７℃で４時間インキュベートした。次に、ＭＴＴ溶液を廃棄し、ＤＭＳＯを加えて、生細胞で産生されるＭＴＴ−ホルマザン結晶を可溶化した。十分に混合した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ｈＢＤ−２、およびＴＮＦ−αタンパク質濃度は、刺激した細胞の上清において、種々のＥＬＩＳＡセットキット（座瘡試験用にはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＲｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏキット、乾癬試験用にはＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＤｕｏセットＩＬ−８キットおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのＢＤ−２  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ｈＢＤ−２））を製造者の説明書に従って使用して測定した。本発明者らは、標準曲線のために組換えヒトＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの連続希釈液を使用した。５４０ｎｍの波長補正で４５０ｎｍにて光学密度を決定した。
【０１１７】
統計分析
試験群からのデータ間の差の統計的有意性は、対応のあるスチューデント検定により分析した。Ｐ≦０．０５のレベルは有意であると認められる。統計的有意性はそれぞれ＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、および＊＊＊（Ｐ≦０．００１）で示す。
【０１１８】
結果
真核生物リガンドによるアクネ菌細胞表面タンパク質の同定
ＥＣＭリガンドにより認識されるアクネ菌表面タンパク質を同定するために、本発明者らは皮膚関連細菌により認識されるコラーゲンおよびフィブリノゲンなどの最も一般的なＥＣＭタンパク質を使用した。アクネ菌株をその推定表面タンパク質の発現を可能とするために３種類の異なる培地上で増殖させ、それらのタンパク質を、細菌懸濁液を塩化リチウムの存在下または不在下で加熱することにより抽出した。表面タンパク質を同定するために、アクネ菌の全タンパク質加熱抽出物を電気泳動により分離し、銀染色により検出した（図１Ｂ）。１４〜１００ｋＤａの範囲のいくつかのバンドが検出され、見掛けの分子量が５８ｋＤａの１つのタンパク質は全タンパク質抽出物のおよそ＞９０％を占めた（図１Ｂ、レーン２）。ＲＣＭおよびＲＣＭ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０培地の間で大きな差は見られなかったが、加熱抽出単独よりもリチウムの存在下でより多くのタンパク質が抽出されるものと思われる。アクネ菌を、血液を濃縮した固形培地上で増殖させた場合には、両抽出物に５８ｋＤａが存在したが、リチウム加熱抽出物にのみ約９０ｋＤのタンパク質バンドと約２０ｋＤａの別のバンドが存在した（図１Ｂ、レーン３）。次に、推定アクネ菌表面アドヘシンを、ビオチン化リガンドを用いたウエスタンブロット法により同定した（図１Ａ）。本発明者らは、５８ｋＤａタンパク質が、加熱抽出物およびリチウム加熱抽出物の両方で、用いられた増殖培地に依存せずにビオチン化フィブリノゲンにより認識されたことを見出した（図１Ａ、レーン２）。コラーゲンによる認識は見られなかった（図１、レーン２）。コラーゲンＶＩでごくわずかで再現性のない認識が見られたが、特有なものとは考えられなかった。リチウム抽出物では認識の強度が高いことに着目することが興味深く、この方法を用いた回収がより良いことが示唆される。また、アクネ菌が異なる培地上で増殖していることが、認識される表面タンパク質の発現に劇的な影響を及ぼすことはなかった。これらの結果に従い、アクネ菌をＲＣＭ培地で増殖させ、リチウムの存在下で表面タンパク質を加熱抽出した。これらの結果を確認するために、アクネ菌全表面タンパク質をポリスチレンプレート上に固定化し、ビオチン化ＦｇおよびコラーゲンＩでプローブした（図２）。まず、数濃度のタンパク質抽出物を試験し、フィブリノゲンに対する結合活性がウェル当たり約６．２５μｇ／ｍｌタンパク質でプラトーに達すること、一方、コラーゲンＩに関しては結合活性が検出されなかったことが示された。この結果を確認するために、ウェル当たり２５μｇ／ｍｌのタンパク質を固定化し、種々の量のビオチン化ＦｇおよびコラーゲンＩで試験した（図２Ｂ）。プラトーに達するフィブリノゲンとの強い結合活性が示され、認識される部位の飽和の可能性が示唆された。コラーゲンＩとの結合活性は検出されず、フィブリノゲンとアクネ菌タンパク質抽出物の間の特異的相互作用が示された。これらの結果は、従前に示されている定性結果と一致する。５８ｋＤａタンパク質はまだ記載されたことがなく、従って、その特性評価をさらに進めた。５８ｋＤａはアクネ菌の表面から抽出されたフィブリノゲン結合タンパク質であることから、ＰＦｇと命名した��
【０１１９】
Ｐｆｇの特性評価
アクネ菌表面抽出物を二次元ゲル電気泳動により分離した。一次元目は、１０〜３の広い範囲にわたるＩＥＦであった。二次元目は、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、その後、タンパク質を銀染色により検出した（図３Ａ）。分離の後におよそ５０のタンパク質スポットが見られた（図３Ａ）。Ｐｆｇに相当するスポットの位置を決定するために、第２のゲルで並行泳動し、ビオチン化フィブリノゲンを用いてウエスタンリガンドブロットアッセイを行った（図３Ｂ）。Ｐｆｇは、２〜３個の主要スポットの下に見られ（図３Ｂ、レーン３）、銀染色ゲルにおけるスポットと一致していた（図３Ａ、レーン３）。総てフィブリノゲンにより認識されるいくつかのスポットの存在は、Ｐｆｇがグリコシル化されているであろうことを示唆し、従って、一次元目でいくつかの等電点下で分離した。対象とするタンパク質スポットを切り出し、ゲル内消化後のペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦによって同定した。図３Ｃは、図３Ａに矢印で示したタンパク質スポットから生成されたトリプシンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。実験的に得られた２２のトリプシンペプチド質量は、予想ペプチド質量と、アミノ酸配列の５７％にわたる０．１Ｄａ内で一致することが判明した。タンパク質配列データベース検索は、このタンパク質をアクネ菌仮想タンパク質、推定接着またはＳ−層タンパク質ＹＰ＿０５６７９２（表３）（遺伝子ＩＤ  ２９３３１９８、遺伝子座タグ  ＰＰＡ２１２７）の遺伝子の産物として同定した（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ２００４）。ＰＰＡ２１２７遺伝子産物は、Ｃ末端に反復するプロリンおよびトレオニンリッチ領域を有する４０５アミノ酸の仮想タンパク質（プロリン−トレオニン反復タンパク質［ＰＴＲＰ］）である。ＰＴＲＰのアミノ酸配列分析は、Ｃ末端領域の３２４〜３５５番におけるモチーフＰｒｏ−ＴｈｒまたはＰｒｏ−Ｌｙｓの１６タンデムリピートの存在を示した。このタンパク質の理論的分子量は４１．７ｋＤａである。タンパク質配列分析によれば、ソルターゼの潜在的細胞アンカーモチーフに相当し、かつ、アクネ菌の膜上に存在する表面タンパク質との一致を支持する、Ｃ末端の４００番におけるＬＰＸＴＧモチーフの存在が明らかとなった。
【０１２０】
【表４】
2018512844.tif 000006
【０１２１】
Ｐｆｇの精製
典型的なＰｆｇ精製の結果を表４にまとめる。大容量のアクネ菌リチウム抽出物の塩沈澱は、タンパク質の濃縮および得られる濃縮抽出物の比活性の若干の増加（１ユニットのタンパク質当たり１．４５倍のフィブリノゲン結合活性）をもたらした（表４および図４Ｃ、Ｄ  レーン３）。濃縮アクネ菌表面タンパク質を陰イオン交換カラムで分画した（図４Ａ）。このステップで１８０ｍＭ濃度のＮａＣｌから始め、多量のタンパク質夾雑物が除かれた。フィブリノゲン結合活性を含有する画分は、１６０ｍＭで始まるＮａＣｌ濃度で溶出された（図４Ａ）。この画分はいくつかのわずかなタンパク質夾雑物とともに大きな割合のＰｆｇを含有する（図４ＣおよびＤ、レーン４）。Ｐｆｇの最終精製はＳｅｐｈａｃｒｙｌ高分解ゲル濾過により達成され、その際に総てのタンパク質夾雑物が完全に除去された（図４ＢおよびＣ、Ｄ、レーン５）。この工程の後に得られた純粋なＰｆｇの量は０．２３ｍｇであり、比活性は１８４０Ｕ／ｍｇであった（表４）。
【０１２２】
【表５】
2018512844.tif 000007
【０１２３】
Ｐｆｇの結合特異性
Ｐｆｇがフィブリノゲンにより認識されることが示されたので、このＥＣＭリガンドをこの相互作用の性質を分析するために使用した。まず、フィブリノゲンの精製Ｐｆｇにより認識される能力を分析した（図５）。ヒトおよびウシＦｇ（ｈＦｇ、ｂＦｇ）をポリスチレンプレートに固定化しビオチン化Ｐｆｇの結合活性を測定した。ＰｆｇのｈＦｇおよびｂＦｇに対する結合は用量依存的であり、ｈＦｇに対してより高い親和性を有することが示された。ウシ血清アルブミンを、結合活性を示さない陰性対照として使用した（図５Ａ）。ＦｇのどのサブユニットがＰｆｇにより認識されるかを決定するために、Ｆｇを電気泳動により分離し、結合アッセイを行った（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。ｈＦｇ（図５Ｄ、レーン３）およびｂＦｇ（図５Ｄ、レーン４）がＰｆｇにより認識されることが示された。さらに、ＢβサブユニットはｈＦｇおよびｂＦｇの両方において強く認識され、ｈＦｇにおいてはＡαサブユニットのみが認識されると思われる。γサブユニットならびに対照として用いた血清アルブミンに対する認識は見られなかった（図５Ｄ、レーン２）。これらの結果は、固定化フィブリノゲンで得られた結果と一致し、ＰｆｇのＦｇに対する特異的認識を示した。フィブリノゲンはＮ結合グリカンおよびＯ結合グリカンの両方を含有する糖タンパク質であることが示されている（Ｄｅｂｅｉｒｅ  １９８５；Ｒｅｉｄ  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  １９８２；Ｌ’Ｈｏｔｅ  １９９６）。糖タンパク質のどの部分がアクネ菌表面タンパク質による認識に関与するか決定するために、精製フィブリノゲンをＰＮＧａｓｅ  Ｆ−グリコシダーゼおよびＯ−グリコシダーゼで処理して、タンパク質骨格からそれぞれＮ結合グリカンおよびＯ結合グリカンを特異的に除去し、アクネ菌表面タンパク質抽出物により認識されるその能力に関して試験した（図６および７）。Ｎ結合グリカンを除去した後には、フィブリノゲンはなおＰｆｇにより強く認識された（図６Ｂ、レーン３および５）。並行して、脱グリコシル化を、電気泳動分離およびクーマシーブルー染色の後の移動度のシフトの可視化により（図６Ａ、レーン３および５）、また末端位のβ結合ガラクトシル残基を認識できるＲＣＡ−Ｉ植物レクチンを使用することにより評価した（図６Ｃ）（Ｇｒｅｅｎ、１９８７）。本発明者らは、脱グリコシル化されたＦｇはＲＣＡ−Ｉレクチンによってはもはや認識されなかったことを示した（図６Ｃ、レーン３および５）。同じ結果がＯ結合グリカンを除去した後にも得られ（図７Ｂ、レーン３）、脱グリコシル化対照は、移動度シフトにより（図７Ａ、レーン３）、またＯ結合グリカン上のＧａｌβ（１−３）残基を特異的に認識しているジャカリン植物レクチン（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ２００６）により（図７Ｃ、レーン３）検出されるように、酵素処理は総ての炭水化物を除去したことを示した。これらの結果は、フィブリノゲンのタンパク質骨格がアクネ菌表面タンパク質による認識プロセスに関与していたことを示す。
【０１２４】
Ｐｆｇにより認識されるＢβヒトフィブリノゲン配列の詳細説明
ヒトフィブリノゲンのＢβサブユニットを４つの同等配列（Ｆｇ１、Ｆｇ２、Ｆｇ３、Ｆｇ４）に任意に分割し、これらをヒト肝細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得た。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの制限部位を含有するアンプリコンを精製した後、これらのＦｇインサートの生産のためのプラスミドｐＢＳＫにクローニングし、それらをｐＧＥＸ−４Ｆ−２発現プラスミドにクローニングした（図８Ａ）。組換え大腸菌クローンに対してＩＰＴＧ誘導を行い、全タンパク質を電気泳動により分析した。Ｆｇ１およびＦｇ２、Ｆｇ３、Ｆｇ４のそれぞれに関して３７ｋＤａおよび４３ｋＤａの見掛けの分子量の組換えタンパク質が誘導後に過剰発現された（図８Ｂ）。ビオチン化Ｐｆｇとの接触はＦｇ１のみが認識されたことを示した（図８Ｃ）。
【０１２５】
フィブリノゲン由来ペプチドはＰｆｇとフィブリノゲンの間の相互作用を阻害する
Ｆｇ１のみがＰｆｇを認識できることが示されたことから、ビオチン化Ｐｆｇを種々の濃度の精製Ｆｇ１で前処理し、固定化されたフィブリノゲンを認識するその能力を試験した。Ｆｇ２およびＢＳＡを陰性対照として使用した（図９）。Ｆｇ１はＰｆｇとヒトフィブリノゲンの間の認識を劇的に低下させたが、Ｆｇ２およびＢＳＡは低下させなかったことが示された。
【０１２６】
これらの結果は、Ｐｆｇとフィブリノゲンの間の相互作用がフィブリノゲンのタンパク質骨格を必要とすることを示す。従って、ヒトフィブリノゲンのＢβサブユニット由来の組換えペプチドを使用すれば、Ｐｆｇとフィブリノゲンの間の相互作用を阻害することができる。
【０１２７】
アクネ菌の種々の株に対するＦｇ１抗接着効果の評価
全アクネ菌をビオチン化により標識し、ペプチドで前処理し、または前処理せずに、種々の細胞株と接触させた。固定されていない細菌を除去した後、接着活性をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色性基質を使用することにより、分光光度的に測定した。全ロットのＦｇ１  Ｆｇ２産物およびペプチドを、本発明で使用する５つの細胞株で細胞傷害性を試験した。Ｆｇ１およびＦｇ２は総ての細胞株で細胞傷害活性を示さないことが示された（図１０）。
【０１２８】
アクネ菌６９１９、ＲＯＮおよびＰＩＥ株のこの能力は、種々の細胞株に接着させるために３つの濃度で試験した。アクネ菌の供試株は供試した３種類の細胞株（ケラチノサイト、単球および線維芽細胞）に結合し、ケラチノサイトに対して最大接着強度が見られたことが示された（図１１）。アクネ菌はフィブリノゲンを認識できることが分かっているので、細菌と標的細胞の間の相互作用に競合させるためにヒトおよびウシ全フィブリノゲンを使用した。漸増量のヒトおよびウシの両フィブリノゲンとも、ケラチノサイトへのアクネ菌の接着を阻害できることが示された（図１２）。次に、細菌およびＲＯＮ  ＰＩＥの接着を阻害するＦｇ１の能力を３つの主要なタイプの細胞に対して評価した。Ｆｇ１ペプチドはケラチノサイト（ＮＨＤＫ）、単球（ＴＨＰ−１）、および線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するＲＯＮ株の接着を用量依存的に阻害することが示された。並行して、陰性対照として使用したＦｇ２ペプチドは抗接着活性を示さない（図１３）。同じ結果が６９１９およびＰＩＥアクネ菌株でも見られた。
【０１２９】
よって、アクネ菌株は種々の標的細胞に接着でき、ケラチノサイトに対してより親和性が高いことが示された。全フィブリノゲンは、細菌とケラチノサイトの間の接着に競合することができる。フィブリノゲンのＢβサブユニットに由来するＦｇ１組換えペプチドを用いる場合、標的細胞に対する全細菌の接着は有意に低下した。
【０１３０】
アクネ菌で刺激した細胞においてＦｇ１の抗炎症活性の評価
Ｆｇ１組換えペプチドの有効性を評価するために、前処理したアクネ菌６９１９、ＲＯＮおよびＰＩＥ株により刺激されたＨａＣａＴ細胞ＮＨＤＫ、ＴＨＰ−１、ＭＲＣ５およびＨＤＦによるＯ２・−およびＨ２Ｏ２の生産を評価した。生産されたＲＯＳの量を無処理細菌で刺激した細胞により生産されたものと比較した。生産ベースラインは、無刺激細胞でＲＯＳを測定することにより得た。ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの生産もまた、上記に挙げた総ての条件で測定した。ＲＯＳの生産の測定は、単層細胞上で直接、特異的蛍光色素の存在下で分光光度蛍光測定により行った。並行して、サイトカイン生産の測定を細胞培養上清で行った。
【０１３１】
２セットの実験を実施した：１）細胞を、０．８７〜７μＭの範囲の終濃度のＦｇ１およびＦｇ２ペプチドで３７℃にて１時間予め前処理したアクネ菌株により刺激した（３７℃で１８時間）；および２）細胞を、まず、０．８７〜７μＭの範囲の終濃度のＦｇ１およびＦｇ２ペプチドで３７℃にて２４時間前処理し、アクネ菌株により刺激した（３７℃で１８時間）。
【０１３２】
Ｏ２・−の生産は、アクネ菌の３つ総ての株により刺激した場合、供試した総ての細胞株で重要であることが示されたが、これらの結果は対照実験に相当する。これに対し、Ｆｇ１ペプチドによるアクネ菌株の前処理は、５つの細胞株および３つの供試株に対してＯ２・−の生産を用量依存的に阻害する。両セットの実験で、Ｈ２Ｏ２の生産についても同種の結果が得られた（表５）。図１４は、ケラチノサイトＨａＣａＴ細胞株に対するアクネ菌ＰＩＥ株で得られた結果に相当し、総てのアクネ菌および供試細胞株で得られた結果の代表的なものである。
【０１３３】
ＩＬ−１βの生産は単球にのみ有効であることが示された。使用するアクネ菌の株が何であれ、Ｆｇ１はＩＬ−１βの生産に効果が無い（表５）。ＴＮＦ−α生産は単球および線維芽細胞には有効であるが、ケラチノサイトにおいてはよりランダムである。供試した３つの細菌株では、単球および線維芽細胞によるＴＮＦ−α生産の低下にＦｇ１用量応答効果が示された。ＩＬ−１２の生産は、供試した総ての細菌株および細胞株で極めて低いか、または存在せず、このモデルにおいて炎症の不十分なマーカーであることを証明する（表５）。ＩＬ−８の生産は、アクネ菌（６９１９、ＲＯＮおよびＰＥＩ）の３つの株により刺激した場合、ケラチノサイト（ＨａＣａＴおよび初代）および線維芽細胞（ＭＲＣ５および初代）に関して重要である。ＩＬ−８の生産が無いのは単球である。３つの供試細菌株に対する、ケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるＩＬ−８の生産の低下に及ぼすＦｇ１の用量応答効果を示した。代表的な結果を図１５に示し、これはアクネ菌ＲＯＮ株を用いてＭＲＣ５細胞株で得られたＩＬ−８の生産に関する。
【０１３４】
【表６】
2018512844.tif 000008
2018512844.tif 000009
【０１３５】
Ｆｇ１から生成された小ペプチドの抗炎症活性の評価
１０６残基を含有するＦｇ１アミノ酸配列を、３０〜３６の間のアミノ酸残基を含有する３つの非オーバーラップ小配列に分割した（小Ｆｇ１関連ペプチド；Ｆｇ１．１、Ｆｇ１．２、およびＦｇ１．３）。切断領域における推定活性の損失を避けるため、この切断部位から２つの切断領域でオーバーラップする２つの配列を作製した（Ｆｇ１．４およびＦｇ１．５）（図１６）。
【０１３６】
まず、総ての小Ｆｇ１関連ペプチドの細胞傷害性を評価したところ、供試した総ての小ペプチドが２．５〜２０μＭの範囲で細胞に毒性が無かったことが示された。図１に、不死化ケラチノサイトＨａＣａＴ細胞株で得られた結果を示した。同じ結果が不死化単球ＴｈＰ１および線維芽細胞ＭＲＣ５細胞株でも得られた。
【０１３７】
小Ｆｇ１関連ペプチドの有効性を評価するため、３つのアクネ菌株６９１９、ＲＯＮおよびＰＩＥで刺激したいくつかの細胞株（ＨａＣａＴ、ＮＨＤＫ、ＴＨＰ−１、ＭＲＣ５およびＨＤＦ）によるＨ２Ｏ２の生産をこれらの小ペプチドの存在下または不在下で測定した。Ｈ２Ｏ２の生産量を無処理細菌で刺激した細胞により生産された量と比較する。生産ベースラインは、無刺激細胞でＨ２Ｏ２を測定することにより得る。Ｈ２Ｏ２生産の測定は、単層細胞上で直接、特異的蛍光色素の存在下で分光光度蛍光測定により行った。
【０１３８】
２セットの実験を行った：
Ｉ）細胞を、２．５〜２０μＭの範囲の終濃度のＦｇ１．１、Ｆｇ１．２、Ｆｇ１．３、Ｆｇ１．４、およびＦｇ１．５  小ペプチドで３７℃にて１時間予め前処理したアクネ菌株により刺激する（３７℃で１８時間）；
ＩＩ）細胞を、まず、２．５〜２０μＭの範囲の終濃度の５つの小ペプチドで３７℃にて２４時間で前処理し、アクネ菌株により刺激した（３７℃で１８時間）。
【０１３９】
アクネ菌の３つ総ての株で刺激した場合、総ての供試細胞株においてＨ２Ｏ２の生産は十分であることが示されたが、これらの結果は対照実験に相当する。これに対し、Ｆｇ１．１およびＦｇ１．４  小ペプチドによるアクネ菌株の前処理は、５つの細胞株および３つの供試株で用量依存的にＨ２Ｏ２の生産を阻害するが、小ペプチドＦｇ１．２、Ｆｇ１．３およびＦｇ１．５は阻害しない。図１７は、線維芽細胞ＭＲＣ５細胞株に対してアクネ菌ＲＯＮ株で得られた結果に相当し、供試した総てのアクネ菌および細胞株で得られた結果の代表的なものである（表６）。
【０１４０】
【表７】
2018512844.tif 000010
【０１４１】
アクネ菌の不在下でのＦｇ１フラグメントの抗炎症特性
Ｆｇ１およびＦｇ２フラグメントの抗炎症特性をより一般に評価するために、ＬＴＡ（リポテイコ酸、ＬＰＳ（リポ多糖）およびＰＧＮ（ペプチドグリカン）で刺激したいくつかの細胞株（ＮＨＤＫ、ＴＨＰ−１、およびＨＤＦ）によるＨ２Ｏ２の生産をＦｇ１またはＦｇ２の存在下または不在下で測定した。
【０１４２】
ＬＴＡで刺激したＮＨＤＫ細胞に関して得られた結果を図１８に示すが、Ｆｇ１はＬＴＡ刺激ＮＨＤＫ細胞によるＨ２Ｏ２の生産を有意に低下させるが、Ｆｇ２はそうではないことを示す。類似の結果が、ＬＴＡ、ＬＰＳおよびＰＧＮで刺激した初代線維芽細胞（ＨＤＦ）および単球（ＴｈＰ１）でも得られた。
【０１４３】
ＩＬ−８の生産もまた、Ｆｇ１またはＦｇ２の存在下または不在下で、ＬＴＡ、ＬＰＳおよびＰＧＮで刺激したＮＨＤＫ細胞で測定した。ＰＧＮで刺激したＮＨＤＫ細胞に関して得られた結果を図１９に示すが、ＰＧＮ刺激ＮＨＤＫ細胞によるＩＬ−８の生産をＦｇ１は有意に低下させるが、Ｆｇ２はそうではないことを示す。類似の結果が、ＬＴＡおよびＬＰＳで刺激したＮＨＤＫ細胞でも得られた。
【０１４４】
これらの結果は、Ｆｇ１は、アクネ菌の存在とは無関係に、ケラチノサイトに対して抗炎症性特性も有することを示す。
【０１４５】
Ｆｇ１．１から生成された小ペプチドの抗炎症活性の評価
小フラグメントＦｇ１．１．１、Ｆｇ１．１．２、Ｆｇ１．１．３、Ｆｇ１．１．４およびＦｇ１．１．６の抗炎症性活性を評価した。
【０１４６】
本発明者らはまず、総ての小Ｆｇ１．１生成ペプチドの細胞傷害性を評価し、供試した総てのペプチドが２．５〜２０μＭの範囲で細胞に毒性が無かったことを示した。図２０は、不死化ケラチノサイトＨａＣａＴ細胞株で得られた結果を示す。類似の結果が不死化線維芽細胞ＭＲＣ５細胞株でも得られた。
【０１４７】
図２１は、ペプチドを溶解させるために使用した希釈剤（ビヒクル）を同じ濃度で使用して行った同じ実験を示す。保存溶液は、Ｆｇ１．１．４ではＰＢＳ、Ｆｇ１．１．１およびＦｇ１．１．３では６０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ、Ｆｇ１．１．２では１００％ＤＭＳＯで作製した。
【０１４８】
これらの結果は、２０個までのアミノ酸、好ましくは１５個までのアミノ酸の配列を有する本発明の小フラグメントはケラチノサイトに対して毒性作用を持たないことを明らかに示す。
【０１４９】
次に、本発明者らは、小フラグメントＦｇ１．１．１、Ｆｇ１．１．２、Ｆｇ１．１．３、Ｆｇ１．１．４およびＦｇ１．１．６の、アクネ菌刺激後に細胞の炎症性応答を軽減する能力を評価した。アクネ菌６９１９株で刺激した細胞株（ＨａＣａＴおよびＭＲＣ５）によるＩＬ−８の生産を測定した。ＩＬ−８の量を、無処理細菌で刺激した細胞により生産された量と比較した。生産ベースラインは、無刺激細胞でＩＬ−８を測定することにより得た。ＩＬ−８生産の測定は、ＥＬＩＳＡアッセイにより行った。Ｉ）アクネ菌株を、まず、２．５〜２０μＭの範囲の終濃度のペプチドで前処理する（図２２参照）；およびＩＩ）細胞を、まず、上記のようにペプチドで前処理し、次に、アクネ菌で刺激する（図２３参照）ことからなる２セットの実験を行った。この場合、ＩＬ−８分泌レベルが低いほど、供試フラグメントの抗炎症能は高くなる。
【０１５０】
結果は、アクネ菌で刺激した場合、総ての細胞株でＩＬ−８の生産は十分であることを示す。しかしながら、アクネ菌株をＦｇ１．１．１ペプチドで前処理した場合では、ＩＬ−８の生産は用量依存的に低下する。他の小フラグメントでもＩＬ−８生産のいくらかの阻害が見られるが、その効果はＦｇ１．１．１の場合ほど顕著でない。図２２は、ＨａＣａＴ細胞に対して、前処理細菌で得られた結果に相当する。類似の結果が、線維芽細胞ＭＲＣ５細胞でも、ならびに細胞株をまず前処理した場合にも得られた（図２３）。
【０１５１】
小ペプチドＦｇ１．１．１の抗炎症活性のイン・ビボ評価
抗炎症応答に対するＦｇ１．１．１ペプチドのイン・ビトロ有効性を示すこれまでの結果に従い、本発明者らは、イン・ビボ炎症モデルにおいてアクネ菌により誘導される炎症反応を阻害するその能力を試験した。
【０１５２】
このモデルは、アクネ菌が皮内注射された際のマウス耳の反応力に基づく。炎症反応は、アクネ菌注射後、１４日間毎日、耳の厚さの測定、発赤ならびに落屑および／または小膿疱胞の存在により評価した。実験の終了時に、炎症の最終測定を行い、耳の写真を撮影した。その後、マウスを安楽死させ、耳ならびに耳関連神経節を摘出した。耳はすぐに、さらなる組織学的分析のためにホルマリン含有バッファーで固定した。耳関連神経節は氷上の適当な細胞培養培地に入れ、すぐにリンパ球を抽出する処理を施した。全リンパ球懸濁液を計数し、抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（２．５μｇ／ｍｌ）で予めコーティングした９６ウェルプレートで、ウェル当たり２．１０５細胞となるように調整した。７２時間の増殖の後、細胞代謝に関連する酸化還元指示薬（ＵｐｔｉＢｌｕｅ）に基づき、増殖率を測定した。
【０１５３】
実験計画は、各８個体のマウスを含む５群からなった。１）ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した無処置群に相当する。２）ＰＡ＋ビヒクルＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリン単独処置に相当する。３）ＰＡ＋ペプチドＴＯＰＩＣは、耳へのアクネ菌注射とワセリンに混合した５％Ｆｇ１．１．１ペプチドによる処置に相当する。４）アクネ菌株（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．５）をＦｇ１．１．１ペプチド（１４０μＭ）で３７℃にて１時間前処理した（ＰＡ＋ペプチドＩＮＪＥＣＴ群）または５）ビヒクル単独で処理（ＰＢＳ中最終１％ＤＭＳＯ）（ＰＡ＋ビヒクルＩＮＪＥＣＴ群）、次いで、マウスの耳に皮内注射（およそ２．０７ＣＦＵ／２０μｌ）して炎症を誘導。
【０１５４】
５％Ｆｇ１．１．１ペプチドゲルの調製は、１５ｍｇのペプチドと３００ｍｇのワセリンを室温（２１℃）で１分間即座に穏やかに混合することからなり、次いで、マウスの耳に直接塗布した。
【０１５５】
結果は、Ｆｇ１．１．１ペプチドが無処理の耳に比べて、局所塗布において（図２４、図２６＃６）ならびに細菌の前処理で（図２５、図２６＃５）耳の炎症を軽減できることを示す。組織学的分析により、Ｆｇ１．１．１が塗布された場合に浸潤免疫細胞の数が最低であること（図２７＃５および６）、ならびにリンパ球活性化レベルの低減（図２８）が明らかになった。
【０１５６】
大フラグメントＦｇ１（１０６アミノ酸）および小フラグメントＦｇ１．１．１（１５アミノ酸）のＩＬ−８分泌阻害能を比較して図２９に表し、これは、１０％ＳＶＦ含有ＤＭＥＭ、１０％ＳＶＦ含有ＲＰＭＩ、ＫＧＭ−Ｇｏｌｄ、ＦＧＭ培地のそれぞれで５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させ、種々の濃度のペプチドＦｇ１またはＦｇ１．１．１の存在下、５．１０４〜１０５細胞／ウェルで播種した不死化ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）、線維芽細胞（ＭＲＣ５）、単球（ＴｈＰ１）細胞株および初代ケラチノサイト（ＮＨＤＫ）、線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞株からのＩＬ−８生産の阻害パーセンテージを正規化したものを示す。
【０１５７】
この場合、阻害が大きいほど、供試フラグメントの抗炎症性能が大きくなる。図２９は、細胞を１５アミノ酸の小フラグメントＦｇ１．１．１で処理した方が、２１１アミノ酸の大フラグメントＦｇ１で処理した場合より、ＩＬ−８生産の阻害パーセンテージが高いことも示す。
【０１５８】
乾癬モデルにおけるＦｇ１．１．１の抗炎症特性
乾癬は、表皮ケラチノサイトの病態生理学的応答を誘発するＴｈ１７リンパ球浸潤により媒介される慢性炎症性疾患である。これに関して、ケラチノサイトは、炎症性応答に寄与することによってそれらの生物学的特性の調節に寄与する多くのサイトカインの標的である。このケラチノサイトの応答は、それらの分化および移動能の変動、ならびにサイトカイン、ケモカインおよび抗微生物ペプチドにより特徴付けられ、とりわけ、ＩＬ−８、ｈＢＤ−２、Ｓ１００Ａ７、ＩＬ−１２ＲＡ２の分泌が良好なマーカーとなる。
【０１５９】
不死化ケラチノサイトＨａＣａＴ細胞を、９６ウェルプレートに１０５細胞／ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）で播種し、３７℃にて１時間、濃度２．５、５および１０μＭのＦｇ１およびＦｇ１．１．１ペプチドで前処理したアクネ菌６９１９株（Ｏ．Ｄ．６２０ｎｍ＝０．３）で、５％ＣＯ２下、３７℃にて１８時間刺激した。次に、培養上清を除去し、ＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡアッセイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により測定した。
【０１６０】
乾癬に対するＦｇ１．１．１の抗炎症性活性を評価するために、本発明者らは、「乾癬」の表現型を生じる炎症誘発混合物（ＩＬ−１７＋ＯＳＭ＋ＴＮＦ−αの組合せ）により刺激した正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）のイン・ビトロモデルを使用した。従って、本発明者らは、この条件で刺激されたケラチノサイトによるＩｌ−８およびβ−デフェンシン−２タンパク質（ｈＢＤ−２）の放出を阻害するＦｇ１．１．１の能力を評価した。
【０１６１】
Ｉｌ−８生産に対するＦｇ１．１．１の活性（図３０）：
図３０は、基底状態で、正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）が少量のＩｌ−８を放出したことを示す（細胞単独）。この放出は、３つのサイトカインの組合せで処理することにより大幅に増加した（刺激細胞）。参照としてのＪａｋ阻害剤Ｉ（陽性対照）は、この会合の刺激効果を強く阻害した（６７％阻害）。
【０１６２】
本試験の実験条件下では、６．１および１２．２μＭで試験したＦｇ１．１．１は、濃度依存的効果を伴って、ＮＨＥＫによるＩｌ−８の放出を有意に阻害した（２５％および４９％阻害）。濃度が低いほど（１．２５および３．０５μＭ）、見られる効果は小さかった。
【０１６３】
ｈＢＤ−２生産に対するＦｇ１．１．１の活性（図３１）：
図３１は、基底状態で、正常ヒト表皮ケラチノサイトは極めて少量のβ−デフェンシン−２  タンパク質（ｈＢＤ−２）を放出したことを示す（細胞単独）。この放出は、Ｉｌ−１７、ＴＮＦ−αおよびＯＳＭの組合せで処理することにより大幅に増加した（刺激細胞）。参照としてのＪａｋ阻害剤Ｉ（陽性対照）は、この会合の刺激効果を強く阻害した（８０％阻害）。
【０１６４】
本試験の実験条件下では、１２．２μＭで試験したＦｇ１．１．１は、ＮＨＥＫによるｈＢＤ−２の放出を有意に阻害した。さらに、Ｆｇ１．１．１は、供試した総ての濃度で細胞生存率に影響を及ぼさなかった。
【０１６５】
イン・ビトロ乾癬モデルを用いた場合、本発明者らは、Ｆｇ１．１．１ペプチドが、いずれの細胞傷害性もなく、用量依存的にＩＬ−８およびｈＢＤ−２分子の生産を阻害できたことを示した。さらに、供試した濃度範囲でｈＢＤ−２抗微生物ペプチド生産よりもＩＬ−８ケモカイン生産の阻害が強く、より高い用量で両方の抗炎症性分子の生産を損なうであろうことが示唆される。よって、Ｆｇ１．１．１ペプチドは、乾癬様炎症を軽減するための良好な候補である。
【０１６６】
参照文献
2018512844.tif 000011
2018512844.tif 000012
【図１】
2018512844.tif 000013
【図２】
2018512844.tif 000014
【図３Ａ−３Ｂ】
2018512844.tif 000015
【図３Ｃ】
2018512844.tif 000016
【図４Ａ】
2018512844.tif 000017
【図４Ｂ】
2018512844.tif 000018
【図４Ｃ−４Ｄ】
2018512844.tif 000019
【図５Ａ】
2018512844.tif 000020
【図５Ｂ−５Ｄ】
2018512844.tif 000021
【図６】
2018512844.tif 000022
【図７】
2018512844.tif 000023
【図８Ａ】
2018512844.tif 000024
【図８Ｂ−８Ｃ】
2018512844.tif 000025
【図９】
2018512844.tif 000026
【図１０】
2018512844.tif 000027
【図１１】
2018512844.tif 000028
【図１２】
2018512844.tif 000029
【図１３】
2018512844.tif 000030
【図１４】
2018512844.tif 000031
【図１５】
2018512844.tif 000032
【図１６】
2018512844.tif 000033
【図１７】
2018512844.tif 000034
【図１８】
2018512844.tif 000035
【図１９】
2018512844.tif 000036
【図２０】
2018512844.tif 000037
【図２１】
2018512844.tif 000038
【図２２】
2018512844.tif 000039
【図２３】
2018512844.tif 000040
【図２４】
2018512844.tif 000041
【図２５】
2018512844.tif 000042
【図２６】
2018512844.tif 000043
【図２７】
2018512844.tif 000044
【図２８】
2018512844.tif 000045
【図２９】
2018512844.tif 000046
【図３０】
2018512844.tif 000047
【図３１】
2018512844.tif 000048
【配列表】
2018512844000001.app
【国際調査報告】
2018512844.tif 000049
2018512844.tif 000050
2018512844.tif 000051
2018512844.tif 000052