(57)【要約】  非膵β細胞からヒトインスリン産生細胞の集団を製造するための方法が本明細書に開示され、結果として得られるインスリン産生細胞は、増加したインスリン含有量、もしくは増加したインスリンのグルコース調節分泌、または両方の組み合わせを有する。【選択図】図２８
2018502574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン産生細胞の集団の製造方法であって、
（ａ）成体ヒト肝組織を得るステップと、
（ｂ）前記肝組織を処理して、一次成体ヒト肝細胞を回収するステップと、
（ｃ）前記一次成体ヒト肝細胞を、既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、
（ｄ）前記増幅した細胞培養物を分化転換させるステップと、
（ｅ）前記分化転換した増幅細胞を採取するステップと、を含み、
それにより、対照非分化転換肝細胞と比較して、増加したインスリン含有量、または増加したグルコース調節インスリン分泌、またはこれらの任意の組み合わせを有する、前記ヒトインスリン産生細胞の集団を製造する、前記方法。
【請求項２】
前記グルコース調節インスリン分泌が、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．０１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトインスリン産生細胞の集団の７０％超が、内在性ＰＤＸ−１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤＸ−１を発現する細胞がまた、内在性ＮｅｕｒｏＤ１もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤＸ−１を発現する集団の５％未満が、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記増加したインスリン含有量が、前記対照細胞と比較して少なくとも５％の増加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、前記肝組織が、膵性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病に罹患している対象から入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、前記肝細胞の前記増殖及び増幅が、産生バイオリアクターシステムまでの一連の継代培養ステップを通じた増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオリアクターシステムが、単一のバイオリアクターまたは複数のバイオリアクターを備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクターが、単回使用バイオリアクター、複数回使用バイオリアクター、閉鎖系バイオリアクター、もしくは開放系バイオリアクター、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）において、前記増幅細胞の前記分化転換が、一連のバイオリアクターシステムを通じた分化転換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）において、前記分化転換が、
（ａ）前記増幅細胞に、ヒトＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第１の期間における、感染させることと、
（ｂ）前記（ａ）の増幅細胞に、ヒトＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはＰａｘ４ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第２の期間における、感染させることと、
（ｃ）前記（ｂ）の増幅細胞に、ヒトＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第３の期間における、感染させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）において、前記分化転換が、
（ａ）前記増幅細胞に、ヒトＰＤＸ−１ポリペプチドをコードし、かつ第２の膵転写因子ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第１の期間における、感染させることと、
（ｂ）前記（ａ）の増幅細胞に、ヒトＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第２の期間における、感染させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の膵転写因子が、ＮｅｕｒｏＤ１及びＰａｘ４から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の期間及び前記第２の期間が、同時である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
分化転換の素因がある細胞に関して、前記一次成体ヒト肝細胞を富化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記素因がある細胞が、中心周囲肝細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記一次成体ヒト肝細胞をリチウムでインキュベートすることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記インキュベートが、分化転換前である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記素因がある細胞が、
（ａ）活性Ｗｎｔシグナル伝達経路、
（ｂ）グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力、
（ｃ）ＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、ＢＭＰＲ２、ＩＴＧＡ６、ＤＣＢＬＤ２、ＴＨＢＳ１、もしくはＶＡＭＰ４、またはこれらの任意の組み合わせの増加した発現、
（ｄ）ＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、もしくはＰＲＮＰ、またはこれらの任意の組み合わせの減少した発現、あるいは
これらの任意の組み合わせを含む細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記既定数の細胞が、少なくとも１０億個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）成体ヒト肝組織を得るステップと、
（ｂ）前記肝組織を処理して一次成体ヒト肝細胞を回収するステップと、
（ｃ）前記一次成体ヒト肝細胞を、既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、
（ｄ）前記増幅した細胞を分化転換させるステップと、
（ｅ）前記分化転換した増幅培養物を採取するステップと、を含む方法によって製造されたヒトインスリン産生細胞の集団であって、
対照非分化転換肝細胞と比較して増加したインスリン含有量、もしくは増加したグルコース刺激インスリン分泌、またはこれらの任意の組み合わせを有する、前記ヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２３】
前記グルコース刺激インスリン分泌が、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．０１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む、請求項２２に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２４】
前記ヒトインスリン産生細胞の集団の７０％超が、内在性ＰＤＸ−１を発現する、請求項２２に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２５】
前記ＰＤＸ−１を発現する細胞がまた、内在性ＮｅｕｒｏＤ１もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせを発現する、請求項２４に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２６】
前記ＰＤＸ−１を発現する集団の５％未満がまた、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する、請求項２４に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２７】
前記増加したインスリン含有量が、前記対照細胞と比較して少なくとも５％の増加を含む、請求項２２に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２８】
膵炎またはインスリン依存性糖尿病に罹患している患者のための細胞ベース療法で使用するための、請求項２２に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項２９】
前記細胞が、前記患者の自己由来であるか、または同種異系である、請求項２８に記載のヒトインスリン産生細胞の集団。
【請求項３０】
請求項２２に記載のヒトインスリン産生細胞の集団、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に提示される開示は、ヒトインスリン産生細胞の大規模産生方法を提供し、このインスリン産生細胞は、グルコース調節様式でインスリンを産生する分化転換した非膵β細胞の細胞を含む。
【背景技術】
【０００２】
膵臓内のランゲルハンス島のβ細胞は、アミノ酸、グリセルアルデヒド、遊離脂肪酸、及び最も顕著にはグルコース等の因子に応答してインスリンを分泌する。正常な島β細胞が血糖濃度の上昇を感知し、インスリンを分泌することによって上昇したグルコースレベルに応答する能力は、血糖値の制御に重要である。グルコース負荷に応答する増加したインスリン分泌は、末梢組織、特に筋肉及び脂肪組織へのグルコース取り込みを刺激することによって正常な個体における高血糖を予防する。
【０００３】
島β細胞機能が減弱した個体は、糖尿病に罹患する。インスリン依存性真性糖尿病、すなわちＩＤＤＭ（若年性またはＩ型糖尿病としても知られる）は、全ヒト糖尿病のおよそ１０％を占める。ＩＤＤＭは、ＩＤＤＭのみがランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の特異的破壊に関与するという点で非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とは異なる。ＩＤＤＭにおけるβ細胞の破壊は、患者自身の免疫系が、島を含む周囲のα細胞（グルカゴン産生）またはδ細胞（ソマトスタチン産生）ではなく、β細胞を認識し、破壊する、特異的自己免疫攻撃の結果であると思われる。
【０００４】
ＩＤＤＭの治療オプションは、インスリンの自己注入を中心とするが、これは不便かつ不正確な解決策である。故に、新たな治療戦略の開発が非常に望ましい。島または膵臓断片移植の可能性は、永久的インスリン置換の手段として調査されてきた。現状の方法論は、死体材料（cadaverous material）またはブタ島のいずれかを移植片基質として使用する。しかしながら、克服すべき重大な問題は、ドナー組織の低い入手可能性、解離を介して得られた島の変動性及び低収率、ならびに単離プロセスの結果として起こり得る酵素的及び身体的損傷である。加えて、免疫拒絶反応の問題、及びブタ島を使用する異種移植に関する現状の課題が存在する。
【０００５】
インスリンの自己注入による糖尿病の治療に対する代替案を確立する重大な必要性が残ることは明らかである。幹細胞研究がこの点について見込みを示してきたが、大成功を収めたわけではなかった。糖尿病の治療に使用されるべき非膵細胞を単離、培養、及び分化転換させるための改善した手順の必要性が存在する。本明細書に開示される方法は、インスリンを分泌する、分化転換した非β膵細胞の大規模産生を含む。これらの分化転換細胞を移植療法に使用することができ、現在糖尿病の治療に必要とされるインスリンの多数の自己注入の必要性をなくす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１３８９４８号明細書
【特許文献２】米国特許第６７７４１２０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００９０４６５号明細書
【特許文献４】米国特許第４８７３３１６号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第２６４１６６号明細書
【特許文献６】国際公開第１９９４／００８５９８号
【特許文献７】米国特許第４８３７０２８号明細書
【特許文献８】米国特許第４７３７３２３号明細書
【特許文献９】米国特許第４５２２８１１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５７０３０５５号明細書
【特許文献１１】米国特許第５３２８４７０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cozar-Castellan and Stewart(2005)Proc Nat Acad Sci USA 102(22):7781-7782
【非特許文献２】"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)
【非特許文献３】Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.
【非特許文献４】Ausubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y
【非特許文献５】Goeddel;GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)
【非特許文献６】Smith and Johnson (1988)Gene 67:31-40
【非特許文献７】Amrann et al,(1988)Gene 69:301-315
【非特許文献８】Studier et al,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89
【非特許文献９】Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)119-128
【非特許文献１０】Wada et al.,(1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118
【非特許文献１１】Baldari,et al.,(1987)EMBO J 6:229-234
【非特許文献１２】Kujan and Herskowitz,(1982)Cell 30:933-943
【非特許文献１３】Schultz et al.,(1987)Gene 54:113-123
【非特許文献１４】Smith et al．(1983)Mol Cell Biol 3:2156-2165
【非特許文献１５】Lucklow and Summers(1989)Virology 170:31-39
【非特許文献１６】Seed(1987)Nature 329:840
【非特許文献１７】Kaufman et al.(1987)EMBO J 6:187-195
【非特許文献１８】Chapters 16 and 17 of Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989
【非特許文献１９】Pinkert et al.(1987)Genes Dev 1 :268-277
【非特許文献２０】Calame and Eaton(1988)Adv Immunol 43:235-275
【非特許文献２１】Winoto and Baltimore(1989)EMBO J 8:729-733
【非特許文献２２】Banerji et al.(1983)Cell 33:729-740
【非特許文献２３】Queen and Baltimore(1983)Cell 33:741-748
【非特許文献２４】Byrne and Ruddle(1989)PNAS 86:5473-5477
【非特許文献２５】Edlund et al.(1985)Science 230:912-916
【非特許文献２６】Kessel and Gruss(1990)Science 249:374-379
【非特許文献２７】Campes and Tilghman(1989)Genes Dev 3:537-546
【非特許文献２８】Weintraub et al.,"Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis",Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986
【非特許文献２９】Sambrook,et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989
【非特許文献３０】Goldspiel,et al.,1993.Clin Pharm 12:488-505
【非特許文献３１】Koller and Smithies,1989.Proc Natl Acad Sci USA 86:8932-8935
【非特許文献３２】Wu and Wu,1987.J Biol Chem 262:4429-4432
【非特許文献３３】Loeffler and Behr,1993.Meth Enzymol 217:599-618
【非特許文献３４】Stemple and Anderson,1992,Cell 71:973-985
【非特許文献３５】Saudek,et al.,1989.New Engl J Med 321:574
【非特許文献３６】Howard,et al.,1989.J Neurosurg 71:105
【非特許文献３７】Goodson,In:Medical Applications of Controlled Release 1984.(CRC Press,Boca Raton,Fla.)
【非特許文献３８】Joliot,et al.,1991.Proc Natl Acad Sci USA 88:1864-1868
【非特許文献３９】Chen et al.(1994)PNAS 91:3054-3057
【非特許文献４０】Sapir et al,(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:7964-7969
【非特許文献４１】Meivar-Levy et al,(2007)Hepatology 46:898-905
【非特許文献４２】Seijffers et al,(1999)Endocrinology 140:3311-3317
【非特許文献４３】He et al,(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:2509-2514
【非特許文献４４】Ber et al,(2003)J Biol Chem 278:31950-31957
【非特許文献４５】Aviv et al,(2009)J Biol Chem 284:33509-33520
【非特許文献４６】Gefen-Halevi et al,(2010)Cell Reprogram 12:655-664
【非特許文献４７】Meivar-Levy et al,(2011)J Transplant 2011:252387
【非特許文献４８】Kaneto et al,(2005)Diabetes 54:1009-1022
【非特許文献４９】Tang et al,(2006)Lab Invest.86:829-841
【非特許文献５０】Song et al,(2007)Biochem Biophys Res Commun.354:334-339
【非特許文献５１】Wang et al,(2007)Mol Ther 15:255-263
【非特許文献５２】Zhou et al,(2008)Nature 455:627-632
【非特許文献５３】Varda-Bloom et al,(2001)Gene Ther 8:819-827
【非特許文献５４】Eberhard et al,(2009)Curr Opin Genet Dev 19:469-475
【非特許文献５５】Borowiak,(2010)Rev Diabet Stud 7:93-104
【非特許文献５６】Ferber et al.,(2000)Nat Med 6:568-572
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団の製造方法が、本明細書に開示され、この方法は、成体ヒト肝組織を入手するステップと、該肝組織を処理して一次成体ヒト一次肝細胞を回収するステップと、該一次成体ヒト肝細胞を既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、該増幅細胞を採取するステップとを含み、それにより、対照非分化転換肝細胞と比較して増加したインスリン含有量、または増加したグルコース調節分泌、またはこれらの任意の組み合わせを有する、該ヒトインスリン産生細胞の集団を製造する。
【０００９】
関連態様において、該ヒトインスリン産生細胞の集団の７０％超が、内在性ＰＤＸ−１を発現する。さらなる関連態様において、ＰＤＸ−１を発現する細胞はまた、内在性ＮｅｕｒｏＤ１もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせを発現する。なおも別の関連態様において、ＰＤＸ−１を発現する集団の５％未満が、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。
【００１０】
関連態様において、産生された細胞の増加したインスリン含有量は、分化転換されていない該対照細胞と比較して少なくとも５％の増加を含む。
【００１１】
別の態様において、肝組織は、膵性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病に罹患している対象から入手される。関連態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団は、かかるインスリン療法を必要とする患者の自己由来である。別の関連態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団は、かかるインスリン療法を必要とする患者の同種異系である。
【００１２】
関連態様において、この方法は、産生バイオリアクターシステムまでの一連の継代培養ステップを通じて該肝細胞を増殖及び増幅させることを含む。別の関連態様において、バイオリアクターシステムは、単一のバイオリアクターまたは複数のバイオリアクターを備える。別の関連態様において、バイオリアクターは、単回使用バイオリアクター、複数回使用バイオリアクター、閉鎖系バイオリアクター、もしくは開放系バイオリアクター、またはそれらの任意の組み合わせを含む。さらなる関連態様において、該増幅細胞の分化転換は、一連のバイオリアクターシステムを通じた分化転換を含む。
【００１３】
関連態様において、分化転換は、該増幅細胞に、ヒトＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第１の期間における感染と、該（ａ）の増幅細胞に、ヒトＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはＰａｘ４ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第２の期間における感染と、該（ｂ）の増幅細胞に、ヒトＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第３の期間における感染とを含む。
【００１４】
別の関連態様において、分化転換は、該増幅細胞に、ヒトＰＤＸ−１ポリペプチドをコードし、かつ第２の膵転写因子ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第１の期間における感染と、該（ａ）の増幅細胞に、ヒトＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、第２の期間における感染とを含む。さらなる関連態様において、第２の膵転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１及びＰａｘ４から選択される。
【００１５】
別の関連態様において、この方法は、分化転換の素因がある細胞に関して、該一次成体ヒト肝細胞を富化することをさらに含む。さらなる関連態様において、素因がある細胞は、中心周囲肝細胞を含む。なおも別の関連態様において、素因がある細胞は、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路、グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力、ＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、ＩＴＧＡ６、ＤＣＢＬＤ２、ＴＨＢＳ１、ＶＡＭＰ４、もしくはＢＭＰＲ２の増加した発現、またはこれらの任意の組み合わせ、ＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、もしくはＰＲＮＰ、またはこれらの任意の組み合わせ、あるいはこれらの組み合わせを含む細胞を含む。
【００１６】
別の関連態様において、この方法は、一次成体ヒト肝細胞集団をリチウムで処置することをさらに含み、該処置された集団は、分化転換の素因がある細胞が富化される。別の関連態様において、リチウムでの処置は、分化転換前に起こる。
【００１７】
一態様において、成体ヒト肝組織を入手するステップと、該肝組織を処理して一次成体ヒト一次肝細胞を回収するステップと、該一次成体ヒト肝細胞を既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、該一次成体ヒト肝細胞を既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、該増幅細胞を分化転換させるステップと、該分化転換した増幅培養物を採取するステップとを含み、対照非分化転換肝細胞と比較して増加したインスリン含有量、または増加したグルコース調節分泌、またはこれらの任意の組み合わせを有する方法によって製造されるヒトインスリン産生細胞の集団が、本明細書に開示される。
【００１８】
別の関連態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団の７０％超が、内在性ＰＤＸ−１を発現する。さらなる関連態様において、ＰＤＸ−１を発現する細胞はまた、内在性ＮｅｕｒｏＤ１もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせを発現する。なおも別の関連態様において、ＰＤＸ−１を発現する集団の５％未満が、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。
【００１９】
別の関連態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団は、該対照細胞と比較して少なくとも５％の増加を含む、増加したインスリン含有量を含む。
【００２０】
別の関連態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団は、膵炎またはインスリン依存性糖尿病に罹患している患者のための細胞ベース療法で使用するためのものである。さらなる関連態様において、これらの細胞は、患者の自己由来であるか、または同種異系である。
【００２１】
別の態様において、ヒトインスリン産生細胞の集団、及び薬学的に許容される担体を含む組成物が、本明細書に開示される。
【００２２】
膵細胞の表現型及び機能を有する分化転換した非β膵細胞、及びその製造方法とみなされる主題が、具体的に指摘され、本明細書の結論部分において明示的に主張される。しかしながら、膵細胞の表現型及び機能を有する分化転換した非β膵細胞は、組織化及び操作方法の両方に関して、その目的、特徴、及び利点と一緒に、添付の図面と共に読まれるとき、以下の詳細な説明を参照することにより最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】インビトロでのヒト肝細胞中のＰＤＸ−１発現が、インスリン（ＩＮＳ）発現の漸進的活性化を誘導することを示す。結果を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化し、同日の対照ウイルス処置細胞に対する相対発現の平均±ＳＥとして提示する。２つの独立した実験においてｎ≧４（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１Ｂ】インビトロでのヒト肝細胞中のＰＤＸ−１発現が、グルカゴン（ＧＣＧ）発現の漸進的活性化を誘導することを示す。結果を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化し、同日の対照ウイルス処置細胞に対する相対発現の平均±ＳＥとして提示する。２つの独立した実験においてｎ≧４（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１Ｃ】インビトロでのヒト肝細胞中のＰＤＸ−１発現が、ソマトスタチン（ＳＳＴ）発現の漸進的活性化を誘導することを示す。（結果を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化し、同日の対照ウイルス処置細胞に対する相対発現の平均±ＳＥとして提示する。２つの独立した実験においてｎ≧４（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１Ｄ】インビトロでのヒト肝細胞中のＰＤＸ−１発現が、膵特異的転写因子（「ｐＴＦ」）（ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮｅｕｒｏＧ３）発現の漸進的活性化を誘導することを示す。結果を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化し、同日の対照ウイルス処置細胞に対する相対発現の平均±ＳＥとして提示する。２つの独立した実験においてｎ≧４（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図２Ａ】インビトロでのヒト肝細胞中の膵転写因子（ｐＴＦ）ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの異所性共発現が、ｐＴＦの各々単独により誘導されるものと比較して（プロ）インスリン分泌を促進することを示す図の一部である。免疫蛍光（ＩＦ）染色は、ｐＴＦ、ＰＤＸ−１（左パネル）、Ｐａｘ４（中央左パネル）、ＭａｆＡ（中央右パネル）の発現、及び３つのｐＴＦのマージ（右パネル）を示し、矢印は、３つのｐＴＦ全てを発現する細胞を示す。
【図２Ｂ】インビトロでのヒト肝細胞中の膵転写因子（ｐＴＦ）ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの異所性共発現が、ｐＴＦの各々単独により誘導されるものと比較して（プロ）インスリン分泌を促進することを示す図の一部である。示されたｐＴＦによるルシフェラーゼアッセイインスリンプロモーターの活性化。β−ｇａｌを対照として使用した。結果を、相対発光量（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表す。各データ点は、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥを表し、対照ウイルス処置細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＞４）。
【図２Ｃ】インビトロでのヒト肝細胞中の膵転写因子（ｐＴＦ）ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの異所性共発現が、ｐＴＦの各々単独により誘導されるものと比較して（プロ）インスリン分泌を促進することを示す図の一部である。免疫蛍光染色（左）は、示されたｐＴＦの異所性発現後のインスリン陽性細胞を示す。原倍率２０倍。表（右）はＩＦ染色の定量化。少なくとも２つの独立した実験から少なくとも５００個の陽性細胞を計数することによって、インスリン陽性細胞のパーセントを算出した。
【図２Ｄ】インビトロでのヒト肝細胞中の膵転写因子（ｐＴＦ）ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの異所性共発現が、ｐＴＦの各々単独により誘導されるものと比較して（プロ）インスリン分泌を促進することを示す図の一部である。示された濃度のグルコースでのインキュベーション後のインスリン分泌を、放射免疫測定によって検出した。５つの独立した実験において、＊ｐ＜０．０５、ｎ＞１２。有意性は、３重感染と全ての他の処置との間の差異を表す。
【図３Ａ】膵β細胞成熟に対する、ｐＴＦ  ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの一致した系列的発現の効果を示す図の一部である。ｐＴＦ（処置Ｂ〜Ｅ）または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、処置Ａ）の感染順序を示す概略。
【図３Ｂ】膵β細胞成熟に対する、ｐＴＦ  ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの一致した系列的発現の効果を示す図の一部である。インスリンの免疫蛍光染色：処置Ｂ（左パネル）、処置Ｃ（中央パネル）、処置Ｄ（右パネル）。原倍率は２０倍である。染色の定量化（パーセント）を、各画像の下に示す。少なくとも２つの独立した実験から少なくとも１０００個の陽性細胞を計数することによって、インスリン陽性細胞のパーセントを算出した。
【図３Ｃ】膵β細胞成熟に対する、ｐＴＦ  ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの一致した系列的発現の効果を示す図の一部である。示された濃度のグルコースでのインキュベーション後のインスリン分泌を、放射免疫測定によって検出した。感染処置をＸ軸に示し、図３Ａにおいて説明する。対照ウイルス処置細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。５つの独立した実験においてｎ＞１２。
【図３Ｄ】膵β細胞成熟に対する、ｐＴＦ  ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの一致した系列的発現の効果を示す図の一部である。示された濃度のグルコースでのインキュベーション後のＣ−ペプチド分泌を、放射免疫測定によって検出した。感染処置をＸ軸に示し、図３Ａにおいて説明する。対照ウイルス処置細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。５つの独立した実験においてｎ＞１２。
【図３Ｅ】膵β細胞成熟に対する、ｐＴＦ  ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの一致した系列的発現の効果を示す図の一部である。示された処置後の、示された内在性膵特異的転写因子の発現レベル（Ｘ軸）を、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、相対発現対対照ウイルス処置細胞の平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。４つの独立した実験において、＊ｐ＜０．０５、ｎ＞８。矢印は、処置Ｃ下でのＩｓｌ−１発現レベルの特異的減少を指す。
【図４Ａ】分化転換効率を示す３つのグラフを示し、階層的系列順の感染（処置Ｃ）が最も効率的であることを示す図の一部である。インスリンプロモーター活性化を、示された感染処置後のルシフェラーゼアッセイによって測定した。結果を、相対発光量（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表す。各データ点は、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥを表し、対照ウイルス処置細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＞４）。
【図４Ｂ】分化転換効率を示す３つのグラフを示し、階層的系列順の感染（処置Ｃ）が最も効率的であることを示す図の一部である。ＲＴ−ＰＣＲによるグルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）発現レベルの解析を、示された感染処置後に行った。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、対照ウイルス処置細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。対照ウイルス処置細胞と比較して、＊Ｐ＜０．０５、４つの独立した実験においてｎ＞８。
【図４Ｃ】分化転換効率を示す３つのグラフを示し、階層的系列順の感染（処置Ｃ）が最も効率的であることを示す図の一部である。プロホルモン転換酵素２（ＰＣ２、ＰＣＳＫ２）の発現レベルを、示された感染処置後にＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、対照ウイルス処置細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。４つの独立した実験において、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＞８。
【図５Ａ】階層的系列順の感染（処置Ｃ）後のＣ−ペプチド分泌を示すグラフを示す。Ｃ−ペプチド分泌を、直接「階層的」系列順（処置Ｃ）によって処置された細胞中０、５、１０、１５、２０ｍＭのグルコースで１５分間、放射免疫測定静的インキュベーションによって測定した。３つの独立した実験において、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＞７。
【図５Ｂ】階層的系列順の感染（処置Ｃ）後のＣ−ペプチド分泌を示すグラフを示す。Ｃ−ペプチド分泌について解析する前に、Ｃ−ペプチド分泌を、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム（ＩＴＳ）で補充した血清不含培地中で１３日間または２８日間にわたって、放射免疫測定によって測定した。２つの独立した実験において、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＞５。有意性は、標準プロトコル（６日目の処置Ｃ）と比較した差異を表す。
【図６Ａ】処置Ｃ感染順、及び各ｐＴＦの排除（Ｃ−ＰＤＸ−１、ＰＤＸ−１の排除；Ｃ−Ｐａｘ４、Ｐａｘ４の排除；及びＣ−ＭａｆＡ、ＭａｆＡの排除）を使用する分化転換プロセスにおける、ｐＴＦの個々の役割を示す４つのグラフの一部である。インスリンプロモーター活性化を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。結果を、平均±ＳＥとして提示する。直接「階層的」系列感染順（処置Ｃ）と比較して、＊ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０５。３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図６Ｂ】処置Ｃ感染順、及び各ｐＴＦの排除（Ｃ−ＰＤＸ−１、ＰＤＸ−１の排除；Ｃ−Ｐａｘ４、Ｐａｘ４の排除；及びＣ−ＭａｆＡ、ＭａｆＡの排除）を使用する分化転換プロセスにおける、ｐＴＦの個々の役割を示す４つのグラフの一部である。示された濃度のグルコースで１５分間のインキュベーション後のＣ−ペプチド分泌、放射免疫測定によって測定。直接「階層的」系列感染順（Ｃ）と比較して、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図６Ｃ】処置Ｃ感染順、及び各ｐＴＦの排除（Ｃ−ＰＤＸ−１、ＰＤＸ−１の排除；Ｃ−Ｐａｘ４、Ｐａｘ４の排除；及びＣ−ＭａｆＡ、ＭａｆＡの排除）を使用する分化転換プロセスにおける、ｐＴＦの個々の役割を示す４つのグラフの一部である。膵酵素の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ、グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、及びプロホルモン転換酵素（ＰＣＳＫ２）によって測定した。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図６Ｄ】処置Ｃ感染順、及び各ｐＴＦの排除（Ｃ−ＰＤＸ−１、ＰＤＸ−１の排除；Ｃ−Ｐａｘ４、Ｐａｘ４の排除；及びＣ−ＭａｆＡ、ＭａｆＡの排除）を使用する分化転換プロセスにおける、ｐＴＦの個々の役割を示す４つのグラフの一部である。示された内在性ｐＴＦの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図７Ａ】「階層的」系列順（処置Ｃ）による感染後の、分化転換肝細胞のβ細胞成熟に対するＩｓｌ１発現の効果を示す３つのグラフの一部である。インスリンの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、対照ウイルス処置細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図７Ｂ】「階層的」系列順（処置Ｃ）による感染後の、分化転換肝細胞のβ細胞成熟に対するＩｓｌ１発現の効果を示す３つのグラフの一部である。インスリン分泌を、放射免疫測定によって測定した。＊Ｐ＜０．０５、３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図７Ｃ】「階層的」系列順（処置Ｃ）による感染後の、分化転換肝細胞のβ細胞成熟に対するＩｓｌ１発現の効果を示す３つのグラフの一部である。グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。直接「階層的」系列感染順（Ｃ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、３つの独立した実験において、ｎ＞６。
【図８Ａ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。膵ホルモングルカゴン（ＧＣＧ）ならびにソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現レベルを、示された感染処置後に、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、対照ウイルス処置細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．１、ｎ＞６。
【図８Ｂ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。膵ホルモングルカゴン（ＧＣＧ）の発現レベルを、示された感染処置後に、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．１、ｎ＞６。
【図８Ｃ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。細胞特異的転写因子ＡＲＸ及びＢＲＡＩＮ４の発現レベルを、示された感染処置に関してＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＞６。
【図８Ｄ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。ソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現レベルを、示された感染処置後に、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＣＴ値を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化する。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＞６。
【図８Ｅ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。ソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現レベルを、Ｉｓｌ１（１００ＭＯＩ）での追加の感染後に、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果を、「階層的系列感染」処置した肝細胞と比較して、平均＋ＳＥの相対レベルとして提示する。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＞６。
【図８Ｆ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。処置Ｃ感染後（左パネル）、及び追加のＩｓｌ１感染を伴う処置Ｃ感染後（右パネル）の、ソマトスタチンの免疫蛍光染色。原倍率２０倍。
【図８Ｇ】階層的順序の感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を使用して、グルカゴン（α−細胞）及びソマトスタチン（δ−細胞）を産生するために、細胞の分化を促進することにおけるｐＴＦの個々の役割を示す図の一部である。直接階層的様式での転写因子の系列投与が、β様膵系統に沿って、分化転換細胞の増加した成熟をもたらすことを示す、ソマトスタチン及びインスリンの免疫蛍光染色。
【図９】肝臓から膵臓への膵転写因子誘導型分化転換の提案された機構の概略図を示す。３つのｐＴＦの一致した発現は、この因子の個々の効果の各々と比較して、分化転換肝細胞の増加した数をもたらす（処置Ｂ）。直接階層的様式での転写因子の系列的投与は、β様膵系統に沿って、分化転換細胞の増加した成熟をもたらす（処置Ｃ）。
【図１０Ａ】インビボでのマウスにおけるＰＤＸ−１誘導型インスリン産生細胞（ＩＰＣ）の活性化が、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現を特徴とする中心静脈に隣接した細胞に制限されることを示す図の一部である。Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後１４日目のＰｄｘ−１の免疫組織化学解析。原倍率４００倍。
【図１０Ｂ】インビボでのマウスにおけるＰＤＸ−１誘導型インスリン産生細胞（ＩＰＣ）の活性化が、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現を特徴とする中心静脈に隣接した細胞に制限されることを示す図の一部である。インスリンの免疫組織化学解析。矢印は、陽性細胞を示し、大部分が中心静脈（ｃｖ）の近接に位置する。原倍率４００倍。
【図１０Ｃ】インビボでのマウスにおけるＰＤＸ−１誘導型インスリン産生細胞（ＩＰＣ）の活性化が、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現を特徴とする中心静脈に隣接した細胞に制限されることを示す図の一部である。中心静脈に隣接した１〜２細胞層におけるＧＳの発現を示す、ヒト肝臓におけるＧＳ発現の解析。原倍率４００倍。
【図１０Ｄ】インビボでのマウスにおけるＰＤＸ−１誘導型インスリン産生細胞（ＩＰＣ）の活性化が、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現を特徴とする中心静脈に隣接した細胞に制限されることを示す図の一部である。中心静脈に隣接した１〜２細胞層におけるＧＳの発現を示す、マウス肝臓におけるＧＳ発現の解析。原倍率４００倍。
【図１１】グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）が、Ｗｎｔシグナル伝達応答要素−ＴＣＦ−ＬＥＦ結合部位を含有することを示す。ＴＣＦ−ＬＥＦ及びＳＴＡＴ５結合部位の存在を示す、ＧＳＲＥの概略図。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆよりなり、ＧＳＲＥが、インビトロでのヒト肝細胞の部分集団を標的とすることを示す。（図１２Ａ及び１２Ｄ）Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−ＰＤＸ−１またはＧＦＰ組み換えアデノウイルスの概略図。肝細胞に、Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１（図１２Ｃ）またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（図１２Ｂ）を感染させた。ＰＤＸ−１発現の免疫蛍光解析は、Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１を感染させたヒト肝細胞の１３±２％（図１２Ｃ）、一方Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１処置細胞の７０±１２％（図１２Ｂ）が、異所性核因子を発現したことを示した（ウサギ抗Ｐｄｘ−１、Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔからの寛大な寄贈、ピンク；それぞれ図１２Ｂ及び１２Ｃ）。Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−ｅＧＦＰを使用しても同様の結果が得られ、細胞の約１５％が、ｅＧＦＰに対して陽性であった（図１２Ｅ及び１２Ｆ）。Ａｄ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ感染は、３〜４日以内に約７５〜８０％のｅＧＦＰ陽性細胞をもたらした（データ提示せず）。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃよりなり、ＧＳＲＥが、分化転換し易い細胞を標的とすることを示す。肝細胞に、Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１（図１３Ｂ）またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（図１３Ａ）を５日間感染させた。（図１３Ａ及び１３Ｂ）インスリン（モルモット抗インスリン、Ｄａｋｏ、緑）及び（Ｐｄｘ−１ウサギ抗Ｐｄｘ−１、Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔからの寛大な寄贈、ピンク）の共染色の免疫蛍光解析。（図１３Ｃ）処置細胞におけるインスリンの活性化の統計解析；Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１は、Ｐｄｘ−１陽性細胞の５０％において、一方Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１は、わずか５％においてインスリン産生を活性化した。青−ＤＡＰＩ、核染色、原倍率２０倍。
【図１４Ａ】ヒト細胞を活性化するＧＳＲＥのインビトロ系統追跡を示す図の一部である。レンチウイルスベクターの概略図。
【図１４Ｂ】ヒト細胞を活性化するＧＳＲＥのインビトロ系統追跡を示す図の一部である。３〜１０継代の成体ヒト肝細胞に、二重レンチウイルス系を感染させた。肝細胞を、ＤｓＲｅｄ２（赤）またはｅＧＦＰ（緑）蛍光のために、感染後１０日目に撮像した（原倍率１０倍）。
【図１４Ｃ】ヒト細胞を活性化するＧＳＲＥのインビトロ系統追跡を示す図の一部である。ｅＧＦＰに対してフルオレセインイソチオシアネートフィルター（５３０／３０ｎｍ）、及びＤｓＲｅｄ２に対してＰｅ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄフィルター（６１０／２０ｎｍ）を用いる蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ、Ａｒｉａセルソーター、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって、細胞を分類した。
【図１４Ｄ】ヒト細胞を活性化するＧＳＲＥのインビトロ系統追跡を示す図の一部である。分離された細胞を、いくつかの継代にわたって別個に培養したうちの１つである（原倍率１０倍）。
【図１４Ｅ】ヒト細胞を活性化するＧＳＲＥのインビトロ系統追跡を示す図の一部である。分離された細胞を、いくつかの継代にわたって別個に培養したうちの１つである（原倍率１０倍）。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｅよりなり、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞が、同様の増殖速度及び同様の感染能力で、インビトロで効率的に増殖することを示す。別個の細胞集団を、約１ヶ月間別個に培養した。各群の増殖速度を解析した（図１５Ａ）ｅＧＦＰ＋（図１５Ｂ及び１５Ｃ）及びＤｓＲｅｄ２＋（図１５Ｄ及び１５Ｅ）細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（図１５Ｂ及び１５Ｄ）またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（図１５Ｃ及び１５Ｅ）を３日間感染させた。抗Ｐｄｘ−１（青）を使用する免疫蛍光解析は、ｅＧＦＰ細胞及びＤｓＲｅｄ２細胞両方のほぼ８０％が、アデノウイルスに感染したことを示した。
【図１６Ａ】ｅＧＦＰ＋細胞が、ｐＴＦ誘導型分化転換に対してＤｓＲｅｄ２＋より効率的に応答することを示す図の一部である。２つの群を、可溶性因子及びｐＴＦ、Ａｄ−Ｐｄｘ−１＋Ａｄ−Ｐａｘ−４＋ａｄ−ＭａｆＡまたは対照ウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）で６日間、同様に処置した。β細胞様特徴及び機能を、別個の群において比較した。分子レベルで、インスリン及びグルカゴン遺伝子発現を、対照処置細胞と比較して、定量的リアルタイムＰＣＲによって研究した。培養したヒト膵島細胞（継代３）を、陽性対照として使用した。スチューデントｔ検定解析を使用し、ＤｓＲｅｄ２＋細胞と比較して、＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ｂ】ｅＧＦＰ＋細胞が、ｐＴＦ誘導型分化転換に対してＤｓＲｅｄ２＋より効率的に応答することを示す図の一部である。機能レベルにおいて、グルコース調節インスリン分泌を、低グルコース濃度、続いて高グルコース濃度での静的インキュベーションによって解析した（それぞれ、クレブス・リンガー緩衝液（ＫＲＢ）中の２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコース）。インスリン分泌を、ヒトインスリン放射免疫測定キット（ＤＰＣ、３つの異なる実験からｎ≧８）を使用して測定した。スチューデントｔ検定解析を使用し、ＤｓＲｅｄ２＋細胞と比較して、＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ｃ】ｅＧＦＰ＋細胞が、ｐＴＦ誘導型分化転換に対してＤｓＲｅｄ２＋より効率的に応答することを示す図の一部である。Ｃ−ペプチド分泌を、ヒトＣ−ペプチド放射免疫測定キット（Ｌｉｎｃｏ、３つの異なる実験からｎ≧８）を使用して測定した。
【図１７】ｅＧＦＰ＋集団におけるより高い分化転換効率は、培養下の継代が増加するにつれて安定することを示す。２つの群は、分類後に別個に増殖し、数継代（分類後５〜７継代）またはより高次継代（分類後１０〜１２継代）後に、ｐＴＦ（Ａｄ−Ｐｄｘ−１＋Ａｄ−Ｐａｘ−４＋Ａｄ−ＭａｆＡ及び可溶性因子）で同様に処置した。調節インスリン分泌を、低グルコース濃度、続いて高グルコース濃度での静的インキュベーションによって解析した（それぞれ、ＫＲＢ中の２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコース）。インスリン分泌を、ヒトインスリン放射免疫測定キット（ＤＰＣ、２つの異なる実験からｎ≧６）を使用して測定する。両方の細胞集団において、低次継代と高次継代との間で統計的有意差は検出されず、ｅＧＦＰタグ付き細胞が、β細胞系統及び機能に沿ってｐＴＦ誘導型分化転換を受ける持続的傾向を示唆する。
【図１８】マイクロアレイ解析によって行われ、ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ６．７に従って解析された、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞の差次的遺伝子発現プロファイルを示す。差次的遺伝子の４％は、Ｗｎｔシグナル伝達経路に属する。
【図１９】活性Ｗｎｔシグナル伝達が、肝臓から膵臓への分化転換を促進することを示す。成体ヒト肝細胞を、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１及び可溶性因子で処置し、以前に報告されているように、Ｗｎｔ３Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ  Ｒ＆Ｄ）またはＤＫＫ３（３μｇ／ｍＬ  Ｒ＆Ｄ）で補充した。５日後に、インスリン分泌を、低グルコース濃度、続いて高グルコース濃度での静的インキュベーションによって解析した（それぞれ、ＫＲＢ中２ｍＭ及び１７．５ｍＭのグルコース）。インスリン分泌を、ヒトインスリン放射免疫測定キット（ＤＰＣ、３つの異なる実験からｎ≧８）を使用して測定し、未処置細胞（対照）と比較する。スチューデントｔ検定解析を使用し、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１単独と比較して、＊Ｐ＜０．０１。
【図２０】Ｗｎｔシグナル伝達経路の遮断が、ｅＧＦＰ＋細胞の分化転換を廃止することを示す。ｅＧＦＰ細胞は、５日間ＤＫＫ３（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３）（０．５μｇ／ｍＬ  Ｒ＆Ｄ）で補充したＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ）であった。膵ホルモン遺伝子発現を、対照処置細胞と比較して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって研究した。
【図２１Ａ】ｅＧＦＰ＋細胞は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞より低いレベルのＡＰＣ、及び高いレベルの活性β−カテニンを発現することを示す図の一部である。ＡＰＣ及びＤＫＫ１発現は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞において顕著に増加する。これは、これらの細胞が、ｅＧＦＰ＋細胞と比較して、より高いレベルのＷｎｔシグナル伝達経路抑制因子を発現することをさらに示唆し得る。ｎ≧６、スチューデントｔ検定解析を使用し、ｅＧＦＰ＋細胞と比較して、ＤｓＲｅｄ２＋において＊ｐ＜０．０１。
【図２１Ｂ】ｅＧＦＰ＋細胞は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞より低いレベルのＡＰＣ、及び高いレベルの活性β−カテニンを発現することを示す図の一部である。ｅＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ２陽性細胞抽出物中の活性化βカテニンに特異的な抗体（抗ＡＢＣクローン８Ｅ７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２０００）を使用したウェスタンブロット解析。β−アクチン（ＳＣ−１６１６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１０００）を標準化タンパク質として使用した。
【図２１Ｃ】ｅＧＦＰ＋細胞は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞より低いレベルのＡＰＣ、及び高いレベルの活性β−カテニンを発現することを示す図の一部である。β−カテニンタンパク質レベルの定量化を、ＩｍａｇｅＪ  １．２９ｘソフトウェアを使用して行った。活性化β−アクチン（ＳＣ−１６１６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１０００）を、標準化タンパク質として使用した。
【図２２】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、アデノウイルス感染を受け易いことを示す顕微鏡写真を提示する。ＭＳＣに、漸増ｍｏｉのＡｄ−ＧＦＰを感染させた。５日後、細胞を蛍光顕微鏡（倍率４倍）によって可視化した。Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰに感染したＭＳＣの代表的な位相差形態論（左パネル）、及び緑色蛍光（左パネル）。１０００ＭＯＩのＡｄ−ＧＦＰでのＭＳＣ細胞の感染は、肝細胞が通常７０〜８０％の陽性細胞を提示するとき、約２０〜６０％の陽性細胞（細胞株に依存して）をもたらした。
【図２３】ＭＳＣが、グルコース調節様式でインスリンを分泌したことを示す棒グラフを示す。細胞を、それらが分化転換を受ける能力について調べた。分化転換は、細胞にＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＭａｆＡを感染させることによってＭＳＣ上で誘導された。実験の６日目に、細胞は、インスリン検出のために分泌実験及びＲＩＡを受けた。グルコース調節様式でのインスリン分泌は、ＫＲＢ中の２ｍＭまたは１７．５ｍＭグルコースを用いた１５分間のインキュベーションによって測定した。
【図２４Ａ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目に、ナイーブ及びＧＳ富化細胞集団の複合インスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／１０６／時）として、低（２ｍＭ）及び高（１７．５ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２４Ｂ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目に、ナイーブ及びＧＳ富化細胞集団の複合インスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりのナノグラムインスリンとして、低（２ｍＭ）及び高（１７．５ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２５Ａ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目の、富化細胞集団の個々のインスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／１０６／時）として、低（２ｍＭ）及び高（１７．ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２５Ｂ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目の、富化細胞集団の個々のインスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／時）として、低（２ｍＭ）及び高（１７．ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２５Ｃ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目の、ナイーブ細胞集団の個々のインスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／１０６／時）として、低（２ｍＭ）及び高（１７．ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２５Ｄ】ＰＡＸ４対ＮｅｕｒｏＤ１の効果を比較する実験の６日目の、ナイーブ細胞集団の個々のインスリン分泌測定値を提示する。１時間当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／時）として、低（２ｍＭ）及び高（１７．ｍＭ）濃度のグルコースに応答するインスリン分泌の棒グラフを提示する。
【図２６Ａ】２ｍＭグルコース（低濃度）または１７．５ｍＭグルコース（高濃度）でのインキュベーションに続いて、実験の６日目に測定されたインスリン分泌を示す図の一部である。結果を、ヒトドナー（Ｍｕｈａｍｍａｄ）から入手された一次肝細胞の１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／ＩＮＳ／１０６／時）として提示する。
【図２６Ｂ】２ｍＭグルコース（低濃度）または１７．５ｍＭグルコース（高濃度）でのインキュベーションに続いて、実験の６日目に測定されたインスリン分泌を示す図の一部である。結果を、ヒトドナー（Ｐｅｄｒｏ）から入手された一次肝細胞の１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／ＩＮＳ／１０６／時）として提示する。
【図２６Ｃ】２ｍＭグルコース（低濃度）または１７．５ｍＭグルコース（高濃度）でのインキュベーションに続いて、実験の６日目に測定されたインスリン分泌を示す図の一部である。結果を、ヒトドナー（Ｌｅｏｎ）から入手された一次肝細胞の１時間当たりの細胞１００万個当たりのナノグラムインスリン（ｎｇ／ＩＮＳ／１０６／時）として提示する。
【図２７】ヒト肝臓由来細胞増幅及び分化転換プロセスの概略を提示し、前臨床Ｒ＆Ｄプロセス（細胞培養皿プロセス）及び臨床プロセス（Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクタープロセス）を示す。
【図２８】マルチトレイセルスタック（ＣＳ）１０プレートからＸＰ−２００バイオリアクターへのヒト肝臓由来一次細胞の典型的な種系列及び細胞増幅プロファイルを提示する。緑の点線は、患者１人当たりに必要な細胞数に関する目標（糖尿病細胞ベースの自己療法）を表し、示される目標数は、患者１人当たり１０億個の細胞である。ＰＤＬは、集団倍化限界を表す。ＣＳは、セルスタックマルチトレイを表す。
【図２９】ＸＰ−５０及びＸＰ−２００バイオリアクターにおける、ならびにそれらの対照伝統的マルチトレイサポート相対物（ＣＴＬ  ＸＰ５０及びＣＴＬ  ＸＰ−２００）における、数日間の集団倍化時間（ＰＤＴ）を提示する。データは、採取した細胞密度に基づく。各棒中の数字は、ＰＤＴを表す。
【図３０】ｐＨ（緑）、ＤＯ（青）、及び温度（赤）に関するバイオリアクター（ＸＰ−５０及びＸＰ−２００）内の調節傾向を示す。点線は、設定点を表し、ピークは、異なる操作（例えば、培地交換）のためのバイオリアクター切断に起因していた。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄよりなり、９日目の採取前の、Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクター（図３１Ａ及び３１Ｂ）及び対照マルチトレイシステム（図３１Ｃ及び３１Ｄ）内の細胞の顕微鏡観察を提示する。図３１Ａ及び３１Ｃは、Ｘｐａｎｓｉｏｎ  ５０バイオリアクター実行からの細胞を示し、一方図３１Ｂ及び図３１Ｄは、Ｘｐａｎｓｉｏｎ  ２００バイオリアクター実行からの細胞を示す。
【図３２】非特許文献１から適合された、肝細胞ベースの自己由来細胞療法スキームを提示する。
【図３３】分化転換及び最終品質保証／品質管理（ＱＡ／ＱＣ）試験前に１，０００倍増幅を受ける成体一次肝細胞を示す、製造プロセスを提示する。
【図３４】自己由来インスリン産生（ＡＩＰ）細胞製造プロセスの概要を提示する。ステップは、以下を含む。ステップ１−肝組織を入手する（例えば、肝生検）、ステップ２−一次肝細胞を回収するための組織の処理、ステップ３−一次肝細胞を既定の細胞数に増殖させる、ステップ４−一次肝細胞の分化転換、ステップ５−一次分化転換肝細胞の採取、及びステップ６−品質保証及び品質管理（すなわち、安全性、純度、及び能力）のために、分化転換細胞を試験する。オプショナルステップには、早期継代一次肝細胞を凍結保存すること（一実施形態において、早期継代は、継代１である）、後に使用するために凍結保存した細胞を解凍すること、及び後に使用するための分化転換細胞の保管が含まれる。
【図３５】出発密度が同等である、３つの個々の実行中に製造された細胞からの採取時における細胞密度の変動性を提示する。
【図３６Ａ】分化転換したヒト一次肝細胞の集団からの内在性遺伝子発現の典型的な結果を示す棒グラフの一部を提示し、これらの結果は、対照の未処置（非分化転換）細胞と比較して、膵細胞マーカー（ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＭａｆＡ）の内在性の増加を示す。
【図３６Ｂ】分化転換したヒト一次肝細胞の集団からの内在性遺伝子発現の典型的な結果を示す棒グラフの一部を提示し、これらの結果は、対照の未処置（非分化転換）細胞と比較して、膵細胞マーカー（グルカゴン、及びソマトスタチン）の内在性の増加を示す。
【図３７】ＡＩＰ細胞産生能力（ＥＬＩＳＡによってアッセイしたグルコース調節インスリン分泌）に関する試験の結果を提示する。
【図３８】３つの異なる「２＋１」分化転換プロトコルを示すフローチャートを提示し、ここでは肝細胞から開始することが示される、非膵細胞からのヒトインスリン産生細胞の産生のために、マルチシステムバイオリアクターを使用するプロトコルが含まれる。このフローチャートは、播種及び感染後プレーティング時の目標細胞密度、ならびにＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターでの感染を含む第１の感染、及びＭａｆＡをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターでの感染を含む第２の感染を示す。全てにおいて、播種から採取までは約８日以内に起こる。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｄよりなり、図３９Ａ〜３９Ｄはそれぞれ、未処置の対照細胞の画像を含む、第２の感染時における６日目の細胞密度の顕微鏡写真を提示する。
【図４０Ａ】Ｘｐａｎｓｉｏｎ−１０マルチシステムバイオリアクターのプレート３からの第２の感染時における６日目の細胞密度の顕微鏡写真を提示する。
【図４０Ｂ】Ｘｐａｎｓｉｏｎ−１０マルチシステムバイオリアクターのプレート５からの第２の感染時における６日目の細胞密度の顕微鏡写真を提示する。
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄよりなり、図４１Ａ〜４１Ｄはそれぞれ、未処置の対照細胞の画像を含む、最終採取時における８日目の細胞密度の顕微鏡写真を提示する。
【図４２】Ｘｐａｎｓｉｏｎ−１０マルチシステムバイオリアクターのプレート３及び５からの最終採取時における８日目の細胞密度の顕微鏡写真を提示する。
【図４３】「２＋１」プロトコル（図３８を参照されたい）を使用して細胞に関するインスリン含有量アッセイの結果を示すグラフを提示し、バイオリアクターシステムにおける分化転換が実行可能であるだけでなく、ヒトインスリン産生細胞を産出することを示し、これらの細胞は、対照の未処置細胞と比較して増加したインスリン含有量を有する。
【図４４Ａ】増幅及び分化転換した肝細胞のフローサイトメトリー解析の結果を提示する図の一部である。生細胞に依存する、いくつかの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）マーカーの代表的なＦＡＣＳプロットを示す。示されるマーカーには、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が含まれる。ネガティブカクテルは、造血マーカーを含む。
【図４４Ｂ】増幅及び分化転換した肝細胞のフローサイトメトリー解析の結果を提示する図の一部である。異なる細胞継代、Ｐ１２（第１２継代）、Ｐ１３（第１３継代）、Ｐ１４（第１４継代）、及び感染した細胞（Ｐ１６＿ＡｄＶ感染）におけるＭＳＣマーカーの頻度を示す。
【図４５Ａ】ＢＰ００１肝細胞の形質導入効率を示すための蛍光顕微鏡写真である。
【図４５Ｂ】ＢＰ００１肝細胞の形質導入効率を示すためのＦＡＣＳである。
【図４５Ｃ】ＢＰ００１肝細胞の形質導入効率を示すためのＦＡＣＳデータの要約である。
【図４６Ａ】ＴＳ００１肝細胞の形質導入効率を示すための蛍光顕微鏡写真である。
【図４６Ｂ】ＴＳ００１肝細胞の形質導入効率を示すためのＦＡＣＳである。
【図４６Ｃ】ＴＳ００１肝細胞の形質導入効率を示すためのＦＡＣＳデータの要約である。
【図４７】実施例１６の表２Ｂに列挙される、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞中の細胞表面分子の相対発現レベルの棒グラフを提示する。
【図４８Ａ】既存のＷＮＴ／β−カテニンシグナルが、細胞を効率的に分化転換させることを示す図の一部である。ＷＮＴシグナル伝達を、分化転換前の４８時間にわたってＬｉにより誘導し、次いで、分化転換プロトコル全体を通して除去（Ｌｉ  ２日目）または維持（Ｌｉ  ２日目以降）した。１７．５ｍＭグルコース刺激に応答するインスリン分泌を、ＥＬＩＳＡによって測定した。リチウムの前処置を伴わない（左）、または分化転換前４８時間のリチウム前処置を伴う（右）分化転換に続くインスリンの倍数増加を示す。
【図４８Ｂ】既存のＷＮＴ／β−カテニンシグナルが、細胞を効率的に分化転換させることを示す図の一部である。膵遺伝子Ｎｋｘ６．１、及びＩｓｌ−１の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって測定し、アクチンに対して標準化した。結果は、２人のドナーを代表する。
【図４８Ｃ】既存のＷＮＴ／β−カテニンシグナルが、細胞を効率的に分化転換させることを示す図の一部である。ヒトＰＤＸ１の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって測定し、アクチンに対して標準化した。結果は、２人のドナーを代表する。
【００２４】
図解の簡潔性及び明確性のために、図面に示される要素は、必ずしも原寸どおりに描かれていないことを理解されたい。例えば、要素のうちの一部の寸法は、明確性のために、他の要素に対して誇張される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下の詳細な説明において、膵細胞の表現型及び機能を有する非膵分化転換インスリン産生細胞、ならびにその製造方法に関する完全な理解を提供するために、多数の特定詳細が記載されている。他の例において、膵細胞の表現型及び機能を有する非膵分化転換ヒトインスリン産生細胞、ならびにその産生方法を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、及び構成要素は詳細に記載されていない。本出願は、２０１４年１２月３０日出願の米国仮出願第６２／０９８，０５０号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２６】
転写因子（ＴＦ）は、多数の細胞系統において分化転換を誘導することが示されてきた。熟練者であれば、「分化転換」という用語が、第１の細胞型が、識別特徴を喪失し、細胞が胚性特徴を有するステージを経ることなく、その表現型を第２の細胞型のものに変化させるプロセスを包含し得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、第１及び第２の細胞は、異なる組織または細胞系統に由来する。一実施形態において、分化転換は、成熟または分化細胞を、異なる成熟または分化細胞に変換することを必要とする。具体的に、系統特異的転写因子（ＴＦ）は、成体細胞を内分泌膵細胞、ニューロン、造血細胞、及び心筋細胞系統に変換することにおいて指示的役割を示すことが示唆されており、分化転換プロセスが、広範囲の環境で起こることを示唆する。全ての分化転換プロトコルにおいて、異所性ＴＦは、潜在的な広範囲の機能的かつ不可逆的な発達プロセスに対する短期トリガーとして役立つ。多数の研究が、個々のＴＦの異所性発現が、追加の関連する、そうでなければサイレントなＴＦの活性化を伴うプロセスにおいて、所望の代替レパートリー及び機能を活性化することを示唆した。しかしながら、誘導されたＴＦの時間経過、相対レベル、及び階層または順序は、依然として不明である。
【００２７】
個々の異所性ＴＦを導入することによる内在性転写因子（ＴＦ）誘導の相対的不足を利用することによって、ＴＦの階層的ネットワークによって影響される、系列的かつ時間的に制御されたプロセスとしての分化転換方法が本明細書に開示される。
【００２８】
ヒトインスリン産生細胞産物、及びこの産物を作製及び産生するその方法は、本明細書に開示されるように、ＴＦ誘導型の肝臓から膵臓への分化転換が、段階的かつ連続的なプロセスであるという知見に基づく。重要なことに、膵ＴＦの同時発現ではなく、系列的投与のみが、内分泌膵臓内で系統特定プログラムを選択的に駆動する。直接階層的モードでの膵ＴＦの系列的発現は、β細胞系統に沿って分化転換細胞成熟に必須であることが示されてきた。具体的に、膵β細胞特異的転写因子ＭａｆＡの役割は、分化転換プロセスの最終段階において特定されてきた。この段階でＭａｆＡは、Ｉｓｌ１及びソマトスタチン抑制に関連するプロセスにおいて、β細胞系統に沿った分化転換肝細胞の成熟を促進する。驚くべきことに、２＋１階層的方法（ＰＤＸ−１及びＰａｘ４またはＮｅｕｒｏＤ１、続いてＭａｆＡ）が、非膵細胞内の膵臓表現型及び機能へ向かう系統特定を選択的に駆動するのに良好であったことがわかった。
【００２９】
本明細書に記載される知見は、糖尿病を含む変性疾患を治療するために、ＴＦ誘導型成体細胞再プログラム化を使用する治療的利点の増加に貢献し得る、転写因子媒介型分化転換の基本的な時間的特徴を示唆する。
【００３０】
膵転写因子（ｐＴＦ）、例えば、Ｐｄｘ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｇｎ−３、及びＰａｘ４は、肝臓から膵臓への分化転換を活性化し、糖尿病マウスにおける高血糖の改善を個々に誘導する。さらに、成体ヒト肝細胞のインビトロ実験システムを使用して、Ｐｄｘ−１が、多数のβ細胞特異的マーカーの発現を活性化し、処理されたインスリンのグルコース調節分泌を誘導することが示された。誘導されたプロセスは、多数の重要な内在性ｐＴＦの発現に関連し、糖尿病マウスにおける分化転換成体ヒト肝細胞の移植時に、高血糖の改善が示された。しかしながら、多数の他の研究は、いくつかの重要なＴＦの組み合わせを使用することが、個々のＴＦの異所性発現によって誘導されるものと比較して、再プログラム化効率を顕著に増加させることが示されてきた。これは、個々の異所性因子が、内在性補完ＴＦを、効率的な分化転換プロセスに必要とされる十分なレベルに活性化する潜在的に制限された能力を示唆する。膵臓器官形成中の膵転写因子の標的破壊または時間的誤発現は、膵臓の発達ならびに島細胞の分化及び機能を妨げる。個々の異所性ＴＦによる内在性ＴＦ誘導の相対的不足を利用することによって、本明細書に提示される開示は、ＴＦの階層的ネットワークによって影響される、系列的かつ時間的に制御されたプロセスとしての分化転換に関する。
【００３１】
膵臓特定は、成体におけるβ細胞機能にも必要とされる、ホメオボックス転写因子Ｐｄｘ１によって開始される。次いで、内分泌分化は、ベーシック・ヘリックス・ループ・へリックス因子Ｎｇｎ３によって媒介される。ペアードホメオボックス因子Ｐａｘ４及びＡｒｘは、異なる内分泌細胞型の隔離において、重要な因子として関係するとされてきた。β細胞系統及び機能に沿った最終成熟は、成体膵臓内のβ細胞におけるＭａｆＡの選択的発現に起因する。
【００３２】
ヒト肝細胞が、直接分化転換して、全体的に異なる細胞型である、β細胞を含む膵ホルモン産生細胞を産生し得るという驚くべき知見に部分的に基づく、方法及びこれらの方法を使用して産生されたヒトインスリン産生細胞が、本明細書に開示される。時間的に調節された配列における選択転写因子の適用は、成体肝細胞から機能的成熟β細胞への分化転換を誘導した。本明細書に記載される方法は、成体細胞を増幅及び分化転換させるための方法を提供することによって、インスリン産生細胞、または膵β細胞の大集団の産生に関する問題を解決する。選択転写因子または生成された分化転換膵細胞の集団を含む組成物は、本明細書に記載される方法を使用して、膵障害を治療するために使用され得る。
【００３３】
非膵細胞を、β細胞等の膵細胞へと分化転換させるための以前の努力は、たった１つの転写因子、または１つを超える膵転写因子の一致した投与すなわち同時投与のいずれかを用いる。本明細書に開示される方法は、定義された時点における特異的転写因子の順序付き系列的投与を提供する。本明細書に開示される代替方法は、定義された時点における特異的転写因子の「２つのｐＴＦ＋１つのｐＴＦ」（２＋１）複合された順序付き系列的投与を提供する。さらに、本明細書に記載される方法は、個々の転写因子の各々単独により誘導されるものと比較して、分化転換効率を実質的に増加させる。
【００３４】
増加した分化転換能力を保有する細胞の集団が、本明細書に開示される。これらの細胞は、（１）潜在的細胞膜マーカー、（２）グルタミン合成酵素調節要素（ＧＳＲＥ）を活性化させる能力を保有すること、及び（３）活性Ｗｎｔシグナル伝達を固有に備えることを特徴とする。集団内の細胞の少なくとも３０％は、ＧＳＲＥを活性化することができる。例えば、これらの細胞は、内皮細胞、上皮細胞、間葉系細胞、線維芽細胞、または肝細胞である。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、膵系統に沿って、膵機能を有する成熟膵細胞へと分化転換され得る。他の実施形態において、細胞は、神経系統に沿って神経細胞へと分化転換され得る。
【００３５】
故に、本明細書に開示される方法は、多くの場合、制限された効率を有する、以前の分化転換または再プログラム化プロトコルに関する問題を解決する。例えば、重要な膵転写因子の異所性発現は、各宿主細胞における発現をもたらすが、細胞の最大１５％のみが、良好に分化転換され、膵機能を呈する。
【００３６】
さらに、富化または増加された分化転換能力を有する細胞集団の単離方法が、本明細書に開示される。例えば、これらの細胞を単離するための１つの方法は、グルタミン合成酵素調節要素またはその断片に操作可能に結合されたＧＦＰ発現を活性化する細胞を分類することによるものであり、それにより、ＧＳＲＥを活性化することができる細胞を単離する。細胞は、ＦＡＣＳによって分類されてもよく、富化された分化転換能力を有する細胞の急速増幅のために、細胞の残りとは別個に、培養下で増殖され得る。富化された分化転換能力を有する細胞集団は、インビボで組織を形成する細胞の小集団に過ぎない。例えば、所与の組織または細胞集団において、富化された分化転換能力を有する細胞集団は、所与の組織内の細胞集団全体の約１％、２％、３％、４％、５％未満、約１０％、約１５％に過ぎない。したがって、増加した分化転換能力を有する該細胞の、増加した分化転換能力を有しない細胞からの単離方法が、本明細書に開示される。したがって、本明細書に開示される富化された非膵β細胞は、分化転換の効率を高めて様々な疾患または障害の治療のための分化転換細胞を提供するために、増加した分化転換能力を有する細胞がより大きな割合を占める細胞集団の利点を有する。
【００３７】
非膵β細胞分化転換ヒトインスリン産生細胞産物、及び該産物の作製方法及び使用方法の趣旨及び範囲内で、本明細書に記載される方法に対して、様々な変更及び修正を行ってもよいことが、当業者には明らかとなるであろう。
【００３８】
膵β細胞の産生方法
【００３９】
哺乳類非膵細胞を、特定の時点において、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＭａｆＡ等の膵転写因子と接触させることによって、成熟膵β細胞の表現型を呈する細胞の産生方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＰａｘ−４と接触させることと、第３の期間において、第２のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。一実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＮｅｕｒｏＤ１と接触させることと、第３の期間において、第２のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及び第２の転写因子と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。なおもさらなる実施形態において、第２の転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１及びＰａｘ４から選択される。別の実施形態において、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｇｎ３、またはＳｏｘ−９を含む。別の実施形態において、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、Ｐａｘ−４を含む。別の実施形態において、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１を含む。別の実施形態において、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、Ｎｇｎ３を含む。別の実施形態において、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、Ｓｏｘ−９を含む。
【００４０】
他の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＮｇｎ３と接触させることと、第３の期間において、第２のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。他の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＳｏｘ９と接触させることと、第３の期間において、第２のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及び第２の転写因子と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含み、第２の転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｇｎ３、Ｓｏｘ９、及びＰａｘ４から選択される。
【００４１】
別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及びＰａｘ４と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及びＮｇｎ３と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。別の実施形態において、本方法は、第１の期間において、哺乳類非膵細胞をＰＤＸ−１及びＳｏｘ９と接触させることと、第２の期間において、第１のステップからの細胞をＭａｆＡと接触させることとを含む。
【００４２】
別の実施形態において、細胞は、３つの因子全て（ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１またはＰａｘ４またはＮｇｎ３、及びＭａｆＡ）と同時に接触させられるが、それらの発現レベルは、ＰＤＸ−１の場合は第１の期間、ＮｅｕｒｏＤ１またはＰａｘ４またはＮｇｎ３の場合は第２の期間、及びＭａｆＡの場合は第３の期間において、それらを細胞内で発現させるような方法で制御される。発現の制御は、各遺伝子上で適切なプロモーターを使用することによって達成することができ、それにより、遺伝子は、ｍＲＮＡのレベルを修正することによって、または当該技術分野において既知の他の手段によって系列的に発現される。
【００４３】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、上記ステップのうちのいずれかにおいて、その前または後に、細胞を転写因子Ｓｏｘ−９と接触させることをさらに含む。
【００４４】
一実施形態において、第１及び第２の期間は同一であり、第１の期間において、細胞集団を２つのｐＴＦと接触させ（少なくとも１つのｐＴＦは、ｐＤＸ−１を含む）、続いて第２の期間において、結果として得られる細胞集団を、第３のｐＴＦと接触させることになる（該第３のｐＴＦは、ＭａｆＡである）。
【００４５】
一実施形態において、第２の期間は、第１の期間の少なくとも２４時間後である。代替実施形態において、第２の期間は、第１の期間後２４時間未満である。別の実施形態において、第２の期間は、第１の期間の約１時間後、第１の期間の約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間後である。一部の実施形態において、第２の期間は、第１の期間の少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、及び少なくとも１週間以上後であり得る。
【００４６】
別の実施形態において、第３の期間は、第２の期間の少なくとも２４時間後である。代替実施形態において、第３の期間は、第２の期間の２４時間未満後である。別の実施形態において、第３の期間は、第２の期間と同時である。別の実施形態において、第３の期間は、第２の期間の約１時間後、第２の期間の約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間後である。他の実施形態において、第３の期間は、第２の期間の少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、及び少なくとも１週間以上後であり得る。
【００４７】
一実施形態において、第１、第２、及び第３の期間は同時であり、単一の期間に、細胞集団を３つのｐＴＦと接触させることになり、少なくとも１つのｐＴＦは、ｐＤＸ−１を含み、少なくとも１つのｐＴＦは、ＮｅｕｒｏＤ１またはＰａｘ４を含み、少なくとも１つのｐＴＦは、ＭａｆＡを含む。別の実施形態において、第１、第２、及び第３の期間は同時であり、単一の期間に、細胞集団を３つのｐＴＦと接触させることになり、１つのｐＴＦは、ｐＤＸ−１からなり、１つのｐＴＦは、ＮｅｕｒｏＤ１またはＰａｘ４からなり、１つのｐＴＦは、ＭａｆＡからなる。
【００４８】
一実施形態において、転写因子は、ポリペプチド、または転写因子ポリペプチドをコードするリボ核酸もしくは核酸を含む。別の実施形態において、転写因子は、ポリペプチドを含む。別の実施形態において、転写因子は、転写因子をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、転写因子は、転写因子をコードするデオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）を含む。さらに別の実施形態において、ＤＮＡは、ｃＤＮＡを含む。別の実施形態において、転写因子は、転写因子をコードするリボ核酸配列（ＲＮＡ）を含む。なおも別の実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含む。
【００４９】
本明細書に提示される開示において使用するための転写因子は、ポリペプチド、リボ核酸、または核酸であり得る。熟練者は、「核酸」という用語が、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または他のＲＮＡ誘導体）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ならびにその誘導体、断片、及び相同体を包含し得ることを理解するであろう。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態において、核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡである。ＰＤＸ−１の一過性発現は、膵β細胞を産生するのに十分であるため、ｍＲＮＡは、本明細書に開示される方法において特に有利である。ポリペプチド、リボ核酸、または核酸は、ウイルスベクターでの感染、エレクトロポレーション、及びリポフェクションが含まれるが、これらに限定されない当該技術分野において既知の手段によって細胞に送達され得る。
【００５０】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法において使用するための転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＭａｆＡからなる群から選択される。他の実施形態において、本明細書に記載される方法において使用するための転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、及びＳｏｘ９からなる群から選択される。
【００５１】
ホメオドメインタンパク質ＰＤＸ−１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）（ＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、ＳＴＦ−１、またはＩＵＦ−１としても知られる）は、膵島発達及び機能を調節することにおいて中心的役割を果たす。ＰＤＸ−１は、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、プロインスリン転換酵素１／３（ＰＣ１／３）、ＧＬＵＴ−２、及びグルコキナーゼ等の様々な遺伝子の島細胞特異的発現に、直接的または間接的に関与する。追加として、ＰＤＸ−１は、グルコースに応答するインスリン遺伝子転写を媒介する。ＰＤＸ−１をコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ３５６３２及びＡＡＡ８８８２０として入手可能なヒトＰＤＸ−１核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。一実施形態において、ＰＤＸ−１ポリペプチドのアミノ酸配列は、化１に記載される。
【００５２】
（化１)
2018502574.tif 000003
【００５３】
一実施形態において、ＰＤＸ−１ポリヌクレオチドの核酸配列は、化２に記載される。
（化２）
2018502574.tif 000004
【００５４】
ＰＤＸ−１の他の配列源には、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ３５６３２及びＡＡＡ１８３５５に示される、ラットＰＤＸ核酸及びタンパク質配列が含まれ、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。追加の源には、ゼブラフィッシュＰＤＸ−１核酸が含まれ、タンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３６３２５及びＡＡＣ４１２６０に示され、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００５５】
ペアードボックス４、ペアードボックスタンパク質４、ペアードボックス遺伝子４、ＭＯＤＹ９、及びＫＰＤとしても知られるＰａｘ−４は、グルカゴン、インスリン、及びソマトスタチンプロモーター内の要素に結合する膵特異的転写因子であり、膵島β細胞の分化及び発達において重要な役割を果たすと考えられる。一部の細胞状況において、Ｐａｘ−４は、抑制因子の活性を呈する。Ｐａｘ−４をコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６１９３．２及びＡＡＤ０２２８９．１として入手可能なヒトＰａｘ−４核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。
【００５６】
Ｖ−ｍａｆ筋腱膜の繊維肉腫発癌遺伝子相同体ＡまたはＲＩＰＥ３Ｂ１としても知られるＭａｆＡは、インスリン遺伝子発現のためのβ細胞特異的及びグルコース調節転写活性化因子である。ＭａｆＡは、β細胞の機能及び発達、ならびに糖尿病の病因に関与し得る。ＭａｆＡをコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿２０１５８９．３及びＮＰ＿９６３８８３．２として入手可能なヒトＭａｆＡ核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。一実施形態において、ＭａｆＡポリペプチドのアミノ酸配列は、化３に記載される。
【００５７】
（化３）
2018502574.tif 000005
【００５８】
別の実施形態において、ＭａｆＡポリヌクレオチドの核酸配列は、化４に記載される。
（化４）
2018502574.tif 000006
【００５９】
ニューロゲニン３またはＮｇｎ３としても知られるＮｅｕｒｏｇ３は、膵臓及び小腸における内分泌発達に必要なベーシック・ヘリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。Ｎｅｕｒｏｇ３をコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２０９９９．３及びＮＰ＿０６６２７９．２として入手可能なヒトＮｅｕｒｏｇ３核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。
【００６０】
神経分化１またはＮｅｕｒｏＤとしても知られるＮｅｕｒｏＤ１、及びβ−２（β２）は、ＮｅｕｒｏＤ型転写因子である。それは、他のｂＨＬＨタンパク質とのヘテロ二量体を形成し、Ｅ−ボックスとして知られる特定のＤＮＡ配列を含有する遺伝子の転写を活性化する、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子である。インスリン遺伝子の発現を調節し、この遺伝子における突然変異は、ＩＩ型真性糖尿病をもたらす。ＮｅｕｒｏＤ１をコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２５００．４及びＮＰ＿００２４９１．２として入手可能なヒトＮｅｕｒｏＤ１核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。
【００６１】
一実施形態において、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、化５に記載される。
（化５）
2018502574.tif 000007
【００６２】
別の実施形態において、ＮｅｕｒｏＤ１ポリヌクレオチドの核酸配列は、化６に記載される。
（化６）
2018502574.tif 000008
【００６３】
Ｓｏｘ９は、胚発生に関与する転写因子である。Ｓｏｘ９は、骨及び骨格発達におけるその重要性について具体的に調査されてきた。ＳＯＸ−９は、ＨＭＧ−ボックスクラスＤＮＡ結合タンパク質の他のメンバーと共に、配列ＣＣＴＴＧＡＧを認識する。本明細書に提示される開示の状況において、Ｓｏｘ９の使用は、分化転換の誘導前または誘導後のいずれかで、膵前駆細胞塊の維持に関与し得る。Ｓｏｘ９をコードする好適な核酸源には、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００３４６．３及びＮＰ＿０００３３７．１として入手可能なヒトＳｏｘ９核酸（及びコードされたタンパク質配列）が含まれる。
【００６４】
相同性は、一実施形態において、配列アラインメントのためのコンピュータアルゴリズムによって、当該技術分野において十分に記載される方法で決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、及びＴＲＥＭＢＬパッケージ等の入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含み得る。
【００６５】
別の実施形態において、「相同性」は、配列番号４〜９から選択される配列に対して６０％超の同一性を指す。別の実施形態において、「相同性」は、配列番号１〜７６から選択される配列に対して７０％超の同一性を指す。別の実施形態において、同一性は、７５％超、７８％超、８０％超、８２％超、８３％超、８５％超、８７％超、８８％超、９０％超、９２％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超である。別の実施形態において、同一性は１００％である。各可能性は、本明細書に提示される開示の別個の実施形態を表す。
【００６６】
別の実施形態において、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は、当該技術分野において十分に記載されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３、及び非特許文献４を参照されたい）。例えば、ハイブリダイゼーション方法は、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補完のために、適度〜ストリンジェントな条件下で実行されてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で終夜のインキュベーションである。
【００６７】
本明細書に列挙される任意のアミノ酸配列のタンパク質及び／またはペプチド相同性は、一実施形態において、イムノブロット解析を含む当該技術分野において十分に記載される方法によって、またはアミノ酸配列のコンピュータアルゴリズム解析を介して、多くの入手可能なソフトウェアパッケージのうちのいずれかを用いて、確立された方法を介して決定される。これらのパッケージの一部には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが含まれ得、例えば、解析のためのスミス・ウォーターマンアルゴリズム、及び／またはグローバル／ローカルもしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントの使用を用いてもよい。相同性を決定する各方法は、本明細書に提示される開示の別個の実施形態を表す。
【００６８】
細胞は、膵ホルモンを産生することができる任意の細胞、例えば、骨髄、筋肉、脾臓、腎臓、血液、皮膚、膵臓、または肝臓であり得る。一実施形態において、細胞は、非膵細胞である。別の実施形態において、細胞は、非膵β細胞である。一実施形態において、細胞は、膵島として機能することができ、すなわち、膵ホルモンを貯蔵、処理、及び分泌する。別の実施形態において、分泌は、グルコース調節される。
【００６９】
別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．００１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．００２ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．００３ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．００５ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．００７ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．０１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも０．５ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１０ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５０ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１００ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５００ｐｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１０ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５０ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１００ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５００ｎｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１μｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５μｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１０μｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも５０μｇインスリン／１０６細胞／時を含む。別の実施形態において、グルコース調節インスリン分泌は、高グルコース濃度に応答して少なくとも１００μｇインスリン／１０６細胞／時を含む。
【００７０】
別の実施形態において、膵ホルモンは、細胞外トリガー時に分泌され得るインスリンを含む。別の実施形態において、細胞は、肝細胞である。追加の実施形態において、細胞は、全能性または多能性である。代替実施形態において、細胞は、造血幹細胞、胚幹細胞、または好ましくは肝幹細胞である。他の実施形態において、細胞は、誘導された多能性幹細胞である。
【００７１】
一実施形態において、本明細書に開示される細胞集団の源は、ヒト源である。別の実施形態において、本明細書に開示される細胞集団の源は、インスリン療法を必要とする対象に対する自己由来ヒト源である。別の実施形態において、本明細書に開示される細胞集団の源は、インスリン療法を必要とする対象に対する同種異系ヒト源である。
【００７２】
ある特定の実施形態において、細胞は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）としても知られる、間葉系幹細胞、例えば、肝組織、脂肪組織、骨髄、皮膚、胎盤、臍帯、ウォートンゼリーまたは臍帯血から誘導されたＭＳＣである。「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」は、新生児または胎児、最も好ましくは新生児から得られた血液を指すことを意味し、また好ましくは、新生児の臍帯または胎盤から得られる血液を指す。これらの細胞は、当該技術分野において既知の任意の従来の方法に従って入手され得る。ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、及びＣＤ９０が含まれるが、これらに限定されない、ある特定の細胞表面マーカーの発現、ならびに骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨芽細胞含む複数の系統に分化する能力によって定義される。ＭＳＣは、プラスチック接着、ＳＴＲＯ−１等のモノクローナル抗体を使用するか、または上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受ける上皮細胞を通じた分離等の従来の単離技法によって組織から入手され得る。
【００７３】
熟練者は、「脂肪組織由来間葉系幹細胞」という用語が、脂肪組織から単離された未分化成体幹細胞を包含し得、また全く同じ質及び意味を有する、「脂肪幹細胞」という用語でもあり得ることを理解するであろう。これらの細胞は、当該技術分野において既知の任意の従来の方法に従って入手され得る。
【００７４】
熟練者は、「胎盤由来間葉系幹細胞」という用語が、胎盤から単離された未分化成体幹細胞を包含し得、また本明細書において、全く同じ意味及び質を有する「胎盤幹細胞」とも称され得ることを理解するであろう。
【００７５】
化合物（すなわち、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／もしくはＳｏｘ−９ポリペプチド、またはＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／もしくはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸）に曝露される、すなわち、接触される細胞集団は、任意の数の細胞、すなわち、１つ以上の細胞であり得、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供され得る。転写因子と接触される細胞集団は、転写因子と接触される前にインビトロで増幅され得る。産生された細胞集団は、成熟膵β細胞表現型を呈する。これらの細胞は、β細胞系統に沿った分化転換及び成熟前、及びそれを必要とする患者または対象への投与または送達前に、当該技術分野において既知の方法によってインビトロで増幅され得る。
【００７６】
対象は、一実施形態において、哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得る。
【００７７】
一部の実施形態において、転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９、またはこれらの組み合わせ等のポリペプチドであり、当該技術分野において既知の方法によって細胞に送達される。例えば、転写因子ポリペプチドは、細胞に直接提供されるか、または微粒子もしくはナノ粒子、例えば、リポソーム担体を介して送達される。
【００７８】
一部の実施形態において、転写因子は、核酸である。例えば、核酸は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする。転写因子をコードする核酸、またはかかる核酸の組み合わせは、当該技術分野において既知の任意の手段によって細胞に送達され得る。一部の実施形態において、核酸は、発現ベクターまたはウイルスベクターに組み込まれる。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、アデノウイルスベクターは、第１世代アデノウイルス（ＦＧＡＤ）ベクターである。別の実施形態において、ＦＧＡＤは、細胞のゲノムに組み込むことができない。別の実施形態において、ＦＧＡＤは、Ｅ１欠失組み換えアデノウイルスベクターを含む。別の実施形態において、ＦＧＡＤは、コードされたポリペプチドの一過性発現を提供する。
【００７９】
ウイルスベクターの発現は、以下、形質移入、エレクトロポレーション、感染、または形質導入のうちのいずれかによって細胞に誘導され得る。他の実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡであり、例えば、エレクトロポレーションによって送達される。一実施形態において、エレクトロポレーション方法は、フローエレクトロポレーション技術を含む。例えば、別の実施形態において、エレクトロポレーション方法は、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステム（ＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．Ｇｅｏｒｇｉａ  ＵＳＡ）の使用を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態において、製造されたヒトインスリン産生細胞の集団は、肝臓表現型マーカーの低減を含む。一実施形態において、アルブミン、α−１抗トリプシン、またはこれらの組み合わせの発現の低減がある。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１を発現する細胞集団の５％未満は、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１を発現する細胞集団の１０％、９％、８％、７％、６％、４％、３％、２％、または１％未満が、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。
【００８１】
分化転換の素因がある細胞集団
【００８２】
本明細書に提示される開示は、分化転換の素因がある肝臓由来細胞集団を提供する。細胞集団は、本明細書に記載される膵β細胞の産生方法において有用であり得る。本明細書に提示される開示の分化転換の素因がある細胞は、増加または富化された分化転換能力を有するとも称され得る。「増加した分化転換能力」とは、本明細書に提示される開示の細胞集団が、分化転換プロトコル（すなわち、膵転写因子の導入）に供される場合、細胞の１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、または８０％超が、代替細胞型に分化し得ることを意味する。一実施形態において、増加した分化転換能力を有する内皮細胞、上皮細胞、間葉系細胞、線維芽細胞、または肝細胞の集団は、成熟膵細胞または成熟神経細胞に分化（分化転換）され得る。
【００８３】
別の実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団は、グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力を有する。例えば、本明細書に提示される開示の細胞集団において、集団内の細胞の少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＧＳＲＥを活性化することができる。一実施形態において、集団内の細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＲＥを活性化することができる。グルタミン合成酵素は、脳、腎臓、及び肝臓内で主に発現される酵素であり、グルタミン酸塩及びアンモニアの凝縮を触媒してグルタミンを形成することにより、窒素の代謝において重要な役割を果たす。グルタミン合成酵素は、例えば、中心周辺肝細胞及び脳内の星状細胞において固有に発現される。ＧＳＲＥの活性化を示す本明細書に提示されるデータは、分化転換の素因がある細胞の単離のための、固有の選択的パラメータを提供する。別の実施形態において、素因がある細胞集団は、中心周辺肝細胞を含む。
【００８４】
ＧＳＲＥの活性化は、当業者に既知の方法によって測定され得る。例えば、蛍光タンパク質等のプロモーター及びレポーター遺伝子に操作可能に結合されたグルタミン合成酵素応答要素を含有する、組み換えアデノウイルスが生成され得る。ＧＳＲＥレポーターを有するこの組み換えアデノウイルスは、いくらかの割合の分化転換の素因がある細胞を含有する、細胞の異種混合物に導入され得る。ＧＳＲＥの活性化の能力があるそのような細胞は、当該技術分野において既知の方法によって検出され得る、レポーター遺伝子を発現し、それにより、分化転換の素因がある細胞を特定する。
【００８５】
分化転換の素因がある細胞そのような細胞が不明である、異種細胞集団は、最小ＴＫプロモーター及びｅＧＦＰに操作可能に結合されるＧＳＲＥを含有するアデノウイルスベクターと接触され得る。ＧＳＲＥを活性化する細胞は、ＧＦＰを発現し、当該技術分野において既知の様々な方法によって特定され、ＧＦＰ発現を検出することができる。例えば、分化転換の素因があるＧＳＲＥ活性化細胞の、分化転換の素因がない細胞からの分離は、当業者に既知のＦＡＣ装置、ソーター、及び技法を通じて達成され得る（図１４）。次いで、分化転換の素因がある分離された細胞は、インビトロで増殖または増幅され得る。本明細書に記載される結果は、５〜１２継代以上にわたって分化転換の素因がある細胞の継代が、それらの分化転換能力を保持することを示す。例えば、分化転換の素因がある単離された肝細胞は、培養下１２継代後でも、グルコース依存的にインスリンの産生及び分泌を継続する（図１７）。
【００８６】
別の実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団はまた、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を有する。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、発達中の幹細胞多能性及び細胞運命、ならびに体軸パターン化、細胞増殖、及び細胞移行において重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔ−タンパク質リガンドの、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリー受容体（Ｇ共役型タンパク質受容体）への結合によって活性化され、任意に、共受容体タンパク質を活性化し、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）と呼ばれる細胞質タンパク質を後次に活性化する。正準Ｗｎｔ経路において、共受容体ＬＲＰ−５／６も活性化され、β−カテニンが細胞質内に蓄積し、徐々に核内へと移行して、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の転写共活性因子として作用する。Ｗｎｔシグナル伝達経路なしに、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）、アキシン、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）、及びカゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）等のタンパク質を含む破壊複合体は、ユビキチン化及びプロテアソームによるその後次分解のためのβ−カテニンを標的とする。しかしながら、Ｗｎｔ結合によるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性化は、破壊複合体の崩壊を引き起こし、それによりβ−カテニンの蓄積を可能にする。
【００８７】
Ｗｎｔシグナル伝達経路はまた、異なる共受容体タンパク質を用い、異なる下流エフェクターを活性化する非正準経路を通じて起こり得、例えば、細胞骨格を調節し、小胞体からのカルシウム放出を刺激し、ｍＴＯＲ経路を活性化し、筋形成を調節する。
【００８８】
当業者は、当該技術分野において既知の方法を容易に使用して、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を決定することができる。例えば、Ｗｎｔ３ａを発現する細胞、減少レベルのＤＫＫ１またはＤＫＫ３、減少レベルのＡＰＣ、増加した活性化β−カテニンレベル、またはＳＴＡＴ３結合要素は、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を有する。ＤＫＫ１、ＤＫＫ３、及びＡＰＣは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の既知の阻害剤である。活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を示す他のシグナル伝達エフェクターは、当該技術分野において容易にわかる。
【００８９】
一実施形態において、開示される方法は、一次成体ヒト肝細胞集団をリチウムで処置することをさらに含み、該処置集団は、分化転換の素因がある細胞が富化される。別の実施形態において、開示される方法は、一次成体ヒト肝細胞集団をリチウムで処置することをさらに含み、集団内の該分化転換の素因がある細胞は、リチウムでの処置に続いて増加した素因を有する。故に、分化転換の素因がある富化された細胞集団は、一次成体細胞集団をリチウムで処置することによって確立され得る。
【００９０】
一実施形態において、一次成体細胞集団は、１０ｍＭのリチウムで処置される。別の実施形態において、一次成体細胞集団は、１ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、１〜１０ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、２ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、３ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、４ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、５ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、６ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、７ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、８ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、９ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、約１０〜２０ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、１５ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、２０ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、１０〜５０ｍＭのリチウムで処置される。一実施形態において、一次成体細胞集団は、１０〜１００ｍＭのリチウムで処置される。
【００９１】
別の実施形態において、細胞は、分化転換時の前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の１２時間前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の２４時間前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の３６時間前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の４８時間前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の６０時間前（第１の期間）に処置された。別の実施形態において、細胞は、分化転換の７２時間前（第１の期間）に処置された。なおも別の実施形態において、細胞は、分化転換時（第１の期間）に処置された。
【００９２】
一実施形態において、本明細書に開示される方法で使用される細胞集団は、膵系統への分化転換の素因があり、分化転換細胞は、膵臓表現型及び機能を呈する。例えば、分化転換細胞は、膵ホルモンの発現、産生、及び／または分泌が含まれるが、これらに限定されない成熟膵β細胞の表現型及び機能を呈する。膵ホルモンには、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、または島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）が含まれるが、これらに限定されない。インスリンは、肝インスリンまたは血清インスリンであり得る。一実施形態において、インスリンは、グルコース利用、ならびに炭水化物、脂肪、及びタンパク質代謝を促進することができる、完全に処理された形態のインスリンである。例えば、分化転換の素因がある細胞は、異種インビトロ一次ヒト肝細胞培養物中の全細胞の約１５％を包含し得る。細胞が、異所的にｐＴＦを発現する場合、培養下の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％超が、インスリンを産生するか、またはＣ−ペプチドを分泌する。
【００９３】
一実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団は、肝臓の中心静脈に密接して位置するか、または中心周辺肝細胞である。本明細書に示されるように、肝細胞の４０〜５０％超が、ＰＤＸ−１等の膵転写因子を異所的に発現するが、細胞の部分集合のみが、ｐＴＦ発現時にインスリンを産生した。これらのインスリン産生細胞（ＩＰＣ）は、図１０Ｂに示されるように、主に腹側静脈の近くに位置していた。これらの細胞はまた、グルタミン合成酵素の発現及び活性Ｗｎｔシグナル伝達を特徴とする。
【００９４】
別の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用される細胞集団は、神経系統への分化転換の素因があり、分化転換細胞は、神経マーカーを発現するか、神経表現型を呈するか、または神経機能を呈する。分化転換細胞は、ニューロンまたはグリア細胞であり得る。
【００９５】
別の実施形態において、分化転換の増加した素因を有する細胞は、特異的細胞表面マーカーを通じて特定され得る。例えば、増加したレベルのＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、またはＢＭＰＲ２を有する細胞は、分化転換の素因がない細胞と比較したときに、増加した分化転換能力を有する細胞を示す。減少したレベルのＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、またはＰＲＮＰを有する細胞は、分化転換の素因がない細胞と比較したときに、増加した分化転換能力を有する細胞を示す。記載される細胞表面マーカーの組み合わせを使用して、分化転換の素因がある細胞集団を、分化転換の素因がない細胞集団から区別することができる。これらの細胞表面マーカーに対する抗体は、商業的に入手可能である。当該技術分野において既知の免疫測定または免疫親和技法を用いて、増加した分化転換能力を有する細胞を、分化転換能力を有する細胞から区別することができる。
【００９６】
膵細胞表現型を呈する細胞を産生するための本明細書に提示される開示の細胞集団の使用は、膵細胞表現型を呈する細胞を産生するために非膵細胞の異種集団を分化することを超える、ある特定の利点を提供する。非膵細胞（すなわち、肝細胞）の異種集団内でＰＤＸ−１等の膵転写因子を発現することを記載する以前の研究は、最良でもＰＤＸ−１発現細胞のわずか１５％が、インスリン産生能力があることを示す。したがって、細胞のわずか１５％が、膵ホルモンを産生し、分泌することができる成熟膵β細胞へと良好に分化した。対照的に、本明細書に提示される開示の細胞集団にｐＴＦを導入することにより、細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％が、成熟膵β細胞表現型に分化され、例えば、インスリン、グルカゴンを産生し、かつ／またはｃ−ペプチドを分泌することになる。一実施形態において、本明細書に提示される開示の細胞集団が、膵転写因子を発現する場合、細胞の少なくとも３０％が、インスリンを産生するか、またはＣ−ペプチドを分泌する。
【００９７】
分化転換方法
【００９８】
本明細書に提示される開示はまた、成熟分化細胞型を呈する細胞を産生する、増加した分化転換能力を有する細胞集団の利用方法を提供し、分化した細胞は、出発細胞集団とは異なる表現型を有する。例えば、増加した分化転換能力を有する細胞（すなわち、上皮細胞、線維芽細胞、または肝細胞）の集団は、成熟分化した膵表現型または神経細胞表現型を呈するように、膵系統または神経系統に沿った細胞に分化され得る。細胞を膵系統または神経系統に分化するための、当該技術分野において既知の任意の手段を用いることができる。
【００９９】
一実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団は、神経転写因子の発現を通じて神経系統に沿って分化され得る。好適な神経転写因子は、当該技術分野において既知である。他の実施形態において、本明細書に提示される開示の細胞集団は、細胞を、様々なサイトカイン、成長因子、または細胞を神経系統へと分化するための当該技術分野において既知の他の薬剤と接触させることを通じて、成熟神経細胞に分化されてもよい。分化神経細胞は、神経マーカーを発現するか、神経表現型（すなわち、神経遺伝子発現プロファイル）を呈するか、または神経機能を呈する。分化細胞は、ニューロンまたはグリア細胞であり得る。
【０１００】
別の実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団は、膵転写因子の発現を通じて膵系統に沿って分化され得る。膵転写因子は、例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはこれらの組み合わせである。膵β細胞の産生方法は、特許文献２、及び特許文献３に記載され、それらの内容は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
【０１０１】
別の実施形態において、分化転換の素因がある細胞集団は、本明細書に記載の方法を通じて膵系統に沿って分化され得る。
【０１０２】
膵β細胞表現型
【０１０３】
本明細書に提供される方法は、成熟膵β細胞の表現型または機能を有する細胞を産生する。熟練者であれば、「膵β細胞の表現型または機能」という用語が、膵β細胞に典型的な１つ以上の特徴、すなわち、分泌顆粒における膵ホルモンの産生、処理、貯蔵、ホルモン分泌、膵遺伝子プロモーターの活性化、または特徴的なβ細胞遺伝子発現プロファイルを示す細胞を包含し得ることを理解するであろう。ホルモン分泌には、栄養的及び／またはホルモン的に調節された分泌が含まれる。一実施形態において、産生された細胞は、本明細書に記載されるように、少なくとも１つの膵β細胞の表現型または機能を呈する。
【０１０４】
膵ホルモンは、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）であり得る。インスリンは、肝インスリンまたは血清インスリンであり得る。別の実施形態において、膵ホルモンは、肝インスリンである。代替実施形態において、膵ホルモンは、血清インスリン（すなわち、例えば、グルコース利用、炭水化物、脂肪、及びタンパク質代謝を促進することができる完全に処理された形態のインスリン）である。
【０１０５】
一部の実施形態において、膵ホルモンは、「プロホルモン」形態をとる。他の実施形態において、膵ホルモンは、そのホルモンの完全に処理された生物活性形態をとる。他の実施形態において、膵ホルモンは、調節制御下にあり、すなわち、ホルモンの分泌は、内在的に産生される膵ホルモンと同様に、栄養及びホルモン制御下にある。例えば、本明細書に開示される一実施形態において、ホルモンは、グルコースの調節制御下にある。
【０１０６】
膵β細胞表現型は、例えば、膵ホルモン産生、すなわち、インスリン、ソマトスタチン、もしくはグルカゴンタンパク質ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定することによって決定され得る。ホルモン産生は、当該技術分野において既知の方法、すなわち、免疫測定、ウェスタンブロット、受容体結合アッセイによって、または糖尿病宿主に埋め込まれたときに高血糖を改善する能力によって機能的に決定され得る。インスリン分泌はまた、例えば、Ｃ−ペプチドの処理及び分泌によって測定され得る。別の実施形態において、高感度アッセイは、インスリン分泌を測定するために用いられ得る。別の実施形態において、高感度アッセイには、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、メソスケール発見アッセイ（ＭＳＤ）、または酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、または当該技術分野において既知のアッセイが含まれる。
【０１０７】
一部の実施形態において、細胞は、本明細書で特定される方法を使用してインスリンを産生及び分泌するように指向され得る。インスリンを産生する細胞の能力は、当業者に既知の多様な方法によってアッセイされ得る。例えば、インスリンｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出され得るか、またはインスリンは、インスリンに対して起こされた抗体によって検出され得る。加えて、膵分化の他の指標には、遺伝子Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、及びＧｌｕｔ−２の発現が含まれる。島細胞の特定のための他の表現型マーカーは、特許文献１に開示され、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
膵β細胞表現型は、例えば、膵特異的遺伝子のプロモーター活性化によって決定され得る。特定の関心対象の膵特異的プロモーターには、インスリン及び膵転写因子、すなわち内在性ＰＤＸ−１のプロモーターが含まれる。プロモーター活性化は、当該技術分野において既知の方法によって、例えば、ルシフェラーゼアッセイ、ＥＭＳＡ、または下流遺伝子発現の検出によって決定され得る。
【０１０９】
一部の実施形態において、膵β細胞表現型はまた、膵遺伝子発現プロファイルの誘導によって決定され得る。熟練者であれば、「膵遺伝子発現プロファイル」という用語が、非内分泌組織、すなわち、膵転写因子、膵酵素、または膵ホルモン内で通常は転写的にサイレントである、１つ以上の遺伝子の発現を含むプロファイルを包含し得ることを理解するであろう。膵酵素は、例えば、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２またはプロホルモン転換酵素）、ＰＣ１／３（プロホルモン転換酵素１／３）、グルコキナーゼ、グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ−２）である。膵特異的転写因子には、例えば、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮｅｕｒｏＧ３、Ｎｇｎ３、β−２、ＡＲＸ、ＢＲＡＩＮ４、及びＩｓｌ−１が含まれる。
【０１１０】
膵遺伝子発現プロファイルの誘導は、当業者に周知の技法を使用して検出され得る。例えば、膵ホルモンＲＮＡ配列は、膵ホルモンＲＮＡ配列は、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応等の増殖ベースの検出方法、またはマイクロアレイチップ解析による体系的検出において検出され得る。代替として、発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち、遺伝子によりコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって測定され得る。特定の実施形態において、ＰＣ１／３遺伝子またはタンパク質発現は、プロホルモンをそれらの活性成熟形態に処理することにおけるその活性によって決定され得る。かかる方法は、当該技術分野において周知の方法であり、例えば、遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体に基づく免疫測定、または処理されたプロホルモンのＨＰＬＣが含まれる。
【０１１１】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法によって生成された成熟β細胞表現型を呈する細胞は、元の細胞の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子発現プロファイルを抑制し得る。例えば、成熟β細胞表現型を呈するように誘導される肝細胞は、少なくとも１つの肝特異的遺伝子を抑制し得る。当業者であれば、当該技術分野において既知の方法を使用して、すなわち、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはポルペプチドのレベルを測定して、元の細胞及び産生された細胞の肝特異的遺伝子発現を容易に決定できるであろう。比較時に、肝特異的遺伝子発現の減少は、分化転換が起こったことを示す。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示される分化転換細胞は、肝表現型マーカーの低減を含む。一実施形態において、アルブミン、α−１抗トリプシン、またはこれらの組み合わせの発現の低減がある。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１を発現する細胞集団の５％未満は、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１を発現する分化転換細胞の１０％、９％、８％、７％、６％、４％、３％、２％、または１％未満が、アルブミン及びα−１抗トリプシンを発現する。
【０１１３】
膵障害の治療方法
【０１１４】
本明細書に提示される開示は、対象における膵障害の治療、すなわち、発症の予防もしくは遅延、または症状の緩和に使用するための方法を開示する。例えば、膵障害は、変性膵障害である。本明細書に開示される方法は、膵細胞、例えば、島β細胞の喪失、または膵細胞機能の喪失によって引き起こされるか、またはそれをもたらすような膵障害に特に有用である。
【０１１５】
一般的な変性膵障害には、糖尿病（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、または妊娠性）及び膵癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される方法を使用することによって治療され得る他の膵障害または膵関連障害は、例えば、高血糖、膵炎、膵仮性嚢胞、または傷害によって引き起こされる膵外傷である。追加として、膵切除を受けた個体もまた、開示される方法による治療に適している。
【０１１６】
糖尿病は、３つの形態、１型、２型、及び妊娠性で見出される代謝障害である。１型、すなわちＩＤＤＭは、自己免疫疾患であり、免疫系が、膵臓のインスリン産生β細胞を破壊し、インスリンを産生する膵臓の能力を低減または排除する。１型糖尿病患者は、生命を維持するために毎日のインスリン補添物を摂取しなければならない。典型的に、症状は急速に発達し、増加した喉の渇き及び排尿、慢性空腹、体重減少、霧視、及び疲労感が含まれる。２型糖尿病は、最も一般的であり、糖尿病罹患者の９０％〜９５％において見出される。加齢、肥満、家族歴、以前の妊娠性糖尿病、運動不足、及び人種に関連する。妊娠性糖尿病は、妊娠中にのみ起こる。妊娠性糖尿病を発症する女性は、５〜１０年以内に２型糖尿病を発症する可能性が２０％〜５０％である。
【０１１７】
糖尿病に罹患しているか、または発症する危険性のある対象は、血糖値を決定する等の、当該技術分野において既知の方法によって特定される。例えば、終夜絶食後の少なくとも２つの時点で１４０ｍｇ／ｄＬを超える血糖値は、個人が糖尿病を有することを意味する。糖尿病に罹患していないか、または発症する危険性のない個人は、７０〜１１０ｍｇ／ｄＬの絶食時糖レベルを有すると特徴付けられる。
【０１１８】
糖尿病の症状には、疲労感、吐き気、頻尿、過剰な喉の渇き、体重減少、霧視、頻繁な感染、及び創傷または傷の遅い治癒、一貫して１４０／９０以上の血圧、３５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロール、または２５０ｍｇ／ｄＬを超えるトリグリセリド、高血糖、低血糖、インスリン欠乏または耐性が含まれる。化合物が投与される糖尿病または前糖尿病の患者は、当該技術分野において既知の診断方法を使用して特定される。
【０１１９】
高血糖は、過剰量のグルコースが血漿中で循環する膵関連傷害である。これは、一般に（２００ｍｇ／ｄＬ）より高いグルコースレベルである。高血糖を有する対象は、糖尿病を有する場合と有しない場合がある。
【０１２０】
膵癌は、米国において第４の最も一般的な癌であり、主に６０歳を超える人々に起こり、いかなる癌よりも最低の５年生存率を有する。最も一般的な種類の膵癌である、腺癌は、膵管の内壁において起こり、嚢胞腺癌及び腺房細胞癌は稀である。しかしながら、良性腫瘍もまた膵臓内で成長し、そのようなものには、インスリンを分泌する腫瘍であるインスリノーマ、正常レベルより高いガストリンを分泌するガストリノーマ、及びグルカゴンを分泌する腫瘍であるグルカゴノーマが含まれる。
【０１２１】
膵癌は、既知の原因はないが、糖尿病、喫煙、及び慢性膵炎を含むいくつかの危険性を有する。症状には、上腹部痛、食欲不振、黄疸、体重減少、消化不良、吐き気もしくは嘔吐、下痢、疲労感、掻痒、または腹部器官の肥大が含まれ得る。診断は、超音波、コンピューター断層撮影、磁気共鳴画像、ＥＲＣＰ、経皮経肝胆管撮影、膵臓生検、または血液検査を使用して行われる。治療は、手術、放射線療法もしくは化学療法、疼痛もしくは掻痒のための薬物治療、経口酵素調製物、またはインスリン治療を必要とし得る。
【０１２２】
膵炎は、膵臓の炎症及び自己消化である。自己消化において、膵臓は、それ自体の酵素によって破壊され、これが炎症を引き起こす。急性膵炎は、典型的に単一発生のみを伴い、その後に膵臓は正常に戻ることになる。しかしながら、慢性膵炎は、膵臓及び膵機能の永久的損傷を伴い、線維症につながり得る。代替として、数回の発病後に解消し得る。膵炎は、膵管を遮断する胆石によって、またはアルコール乱用によって最も頻繁に引き起こされ、これが小さい膵管を遮断させ得る。他の原因には、腹部外傷もしくは手術、感染、腎不全、ループス、嚢胞性線維症、腫瘍、またはサソリの毒針が含まれる。
【０１２３】
膵炎に頻繁に関連する症状には、恐らく腰部もしくは胸部に広がる腹痛、吐き気もしくは嘔吐、速脈、熱、上腹部膨張、腹水、低下した血圧、または軽度黄疸が含まれる。症状は、膵炎に関連すると特定される前に他の病気に起因するとされる場合がある。
【０１２４】
神経障害の治療方法
【０１２５】
本明細書に提示される開示はまた、神経変性疾患障害等の神経疾患または障害を有する対象の治療方法を提供する。本明細書に記載される細胞の集団は、変性または非機能性細胞を補充することによって、神経細胞または神経機能の喪失を特徴とする神経疾患または障害を有する対象の治療に有用である。本明細書に記載される方法を使用して治療され得る神経変性疾患には、パーキンソン病、パーキンソン様症状、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体病、加齢性神経変性、神経癌、及び手術、事故、虚血、または脳卒中から生じる脳外傷が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載される細胞の集団は、神経機能を有する神経細胞集団に分化され得、分化した神経細胞集団は、神経疾患または障害を有する対象に投与されてもよい。
【０１２６】
組み換え発現ベクター及び宿主細胞
【０１２７】
本明細書に開示される別の実施形態は、ベクターに関する。一実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるベクターは、発現ベクターを含む。別の実施形態において、発現ベクターは、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＭａｆＡタンパク質、またはＮｇｎ３等の他の膵転写因子をコードする核酸、あるいはその誘導体、断片、類似体、相同体、または組み合わせを含む。一部の実施形態において、発現ベクターは、以下の転写因子、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、もしくはＳｏｘ−９のうちのいずれかをコードする単一核酸、またはその誘導体もしくは断片を含む。一部の実施形態において、発現ベクターは、以下の転写因子、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、もしくはＳｏｘ−９の任意の組み合わせをコードする２つの核酸、またはそれらの誘導体もしくは断片を含む。なおも別の実施形態において、発現ベクターは、ＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む。さらに別の実施形態において、発現ベクターは、ＰＤＸ−１及びＰａｘ４をコードする核酸を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、ＭａｆＡをコードする核酸を含む。
【０１２８】
熟練者であれば、「ベクター」という用語が、結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を包含することを理解するであろう。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントが結紮され得る、線形または円形二本鎖ＤＮＡループを包含する、「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに結紮され得る、ウイルスベクターである。ある特定のベクター（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）は、それらが導入される宿主細胞内で自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが操作可能に結合されるゲノムの発現を指向することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技法における有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態をとる。熟練者であれば、「プラスミド」及び「ベクター」という用語が、同義的に使用され得、全て同じ質及び意味を有することを理解するであろう。一実施形態において、「プラスミド」という用語は、最も一般的に使用される形態のベクターである。しかしながら、本明細書に提示される開示は、かかる他の形態の発現ベクター、例えば、等しい機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ関連ウイルス）を含むことが意図される。追加として、いくつかのウイルスベクターは、特定の細胞型を、特異的または非特異的に標的とすることができる。
【０１２９】
本明細書に開示される組み換え発現ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現に適した形態で、本明細書に開示される核酸を含み、組み換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含む、すなわち、発現される核酸配列に操作可能に結合されることを意味する。組み換え発現ベクター内で、熟練者であれば、「操作可能に結合される」という用語が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合に宿主細胞内で）、調節配列（複数可）に結合される関心対象のヌクレオチド配列を包含し得ることを理解するであろう。熟練者であれば、「調節配列」という用語が、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含し得ることを理解するであろう。かかる調節配列は、例えば、非特許文献４に記載される。調節配列には、多種の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、及びある特定の宿主細胞内のみでヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的配列）が含まれる。発現ベクターの設計が、変換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等のような因子に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。本明細書に開示される発現ベクターは、宿主細胞に導入されてもよく、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生する（例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９タンパク質、またはその突然変異体形態もしくは融合タンパク質等）。
【０１３０】
例えば、発現ベクターは、プロモーターに操作可能に結合される転写因子をコードする１つの核酸を含む。転写因子をコードする２つの核酸を含む発現ベクターにおいて、各核酸は、プロモーターに操作可能に結合され得る。各核酸に操作可能に結合されるプロモーターは、異なっても同じでもよい。代替として、２つの核酸が、単一プロモーターに操作可能に結合されてもよい。本明細書に開示される発現ベクターに有用なプロモーターは、当該技術分野において既知の任意のプロモーターであり得る。熟練者であれば、核酸が発現される宿主細胞に適したプロモーター、所望のタンパク質の発現レベル、または発現のタイミング等を容易に決定することができる。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得る。
【０１３１】
本明細書に開示される組み換え発現ベクターは、原核または真核細胞におけるＰＤＸ−１の発現のために設計され得る。例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／またはＳｏｘ−９は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター）、酵母細胞、または哺乳類細胞内で発現され得る。好適な宿主細胞は、非特許文献５においてさらに考察される。代替として、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳され得る。
【０１３２】
原核細胞内のタンパク質の発現は、最も多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ内で実行される。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、そこでコードされるタンパク質、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的に、３つの目的を果たす。（１）組み換えタンパク質の発現を増加させること、（２）組み換えタンパク質の可溶性を高めること、及び（３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組み換えタンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、原核細胞切断部位は、融合部分と組み換えタンパク質との接合部に導入され、融合タンパク質の精製に続いて、組み換えタンパク質の、融合部分からの分離を可能にする。かかる酵素及びそれらの同族認識配列は、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターには、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを、標的組み換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、（非特許文献６）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）が含まれる。
【０１３３】
好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（非特許文献７）、及びｐＥＴ  １１ｄ（非特許文献８）が含まれる。
【０１３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ内で組み換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が減衰した宿主細菌内でタンパク質を発現させることである。非特許文献９を参照されたい。別の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変化させることであり、それにより、各アミノ酸の個々のコドンは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で優先的に用いられるものとなる（非特許文献１０）。本明細書に開示される核酸配列のかかる変化は、標準ＤＮＡ合成技法によって実行され得る。
【０１３５】
別の実施形態において、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（非特許文献１１）、ｐＭＦａ（非特許文献１２）、ｐＪＲＹ８８（非特許文献１３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ）が含まれる。
【０１３６】
代替として、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞内で発現され得る。培養した昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に使用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系（非特許文献１４）及びｐＶＬ系（非特許文献１５）が含まれる。
【０１３７】
なおも別の実施形態において、本明細書に開示される核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（非特許文献１６）及びｐＭＴ２ＰＣ（非特許文献１７）が含まれる。哺乳類細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。真核細胞及び原核細胞の両方に適した他の発現系については、例えば、非特許文献１８を参照されたい。
【０１３８】
別の実施形態において、組み換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向することができる（例えば、組織特異的調節要素を使用して、核酸を発現させる）。組織特異的調節要素は、当該技術分野において既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定例には、アルブミンプロモーター（肝特異的、非特許文献１９）、リンパ球特異的プロモーター（非特許文献２０）、Ｔ細胞受容体の特定のプロモーター（非特許文献２１）、及び免疫グロブリン（非特許文献２２、非特許文献２３）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター、非特許文献２４）、膵特異的プロモーター（非特許文献２５）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、特許文献４、及び特許文献５）が含まれる。例えば、マウスｈｏｘプロモーター（非特許文献２６）及びα−胎児タンパク質プロモーター（非特許文献２７）等の発達的に調節されたプロモーターも包含される。
【０１３９】
本明細書における開示は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローン化される、本明細書に開示されるＤＮＡ分子を含む、組み換え発現ベクターをさらに提供する。つまり、ＤＮＡ分子は、ＰＤＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で、調節配列に操作可能に結合される。多様な細胞型のアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指向する、アンチセンス配向でクローン化された核酸に操作可能に結合された調節配列が選択され得、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーター及び／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が、高効率調節領域の制御下で産生される、組み換えプラスミド、ファージミド、または減衰したウイルスの形態をとり得、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節に関する考察については、非特許文献２８を参照されたい。
【０１４０】
本明細書に開示される別の実施形態は、本明細書に開示される組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書において同義的に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が後続世代において起こり得るため、かかる子孫は、実際に、親細胞と同一でない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。追加として、一旦ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９、またはこれらの組み合わせを発現すると、宿主細胞は変調され得、元の特徴を維持するか、または喪失するかのいずれかであり得る。
【０１４１】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９は、大腸筋等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。代替として、宿主細胞は、未熟哺乳類細胞、すなわち、多能性幹細胞であり得る。宿主細胞はまた、他のヒト組織に由来し得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１４２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換、形質導入、感染、または形質移入技法を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。熟練者であれば、「形質転換」、「形質導入」、「感染」、及び「形質移入」が、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための多様な技術分野で認識された技法（リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む）を包含し得ることを理解するであろう。加えて、形質移入は、形質移入剤によって媒介され得る。熟練者であれば、「形質移入剤」という用語が、宿主細胞内のＤＮＡの組み込みを媒介する任意の化合物、例えば、リポソームを包含し得ることを理解するであろう。宿主細胞を形質転換または形質移入するために適した方法は、非特許文献２９、及び他の研究室マニュアルに見出すことができる。
【０１４３】
形質移入は、「安定」（すなわち、宿主ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込み）または「一過性」であり得る（すなわち、ＤＮＡが宿主細胞内でエピソーム的に発現される、またはｍＲＮＡが細胞にエレクトロポレーションされる）。
【０１４４】
哺乳類細胞の安定した形質移入の場合、使用される発現ベクター及び形質移入技法に依存して、細胞の小分画のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができ、ＤＮＡの残りは、エピソームのままであることが知られている。これらの組み込み体を特定し、選別するために、選別可能なマーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子が、一般に関心対象の遺伝子に沿って宿主細胞に導入される。様々な選別可能なマーカーには、薬物への耐性を付与するもの、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、及びメトトレキサートが含まれる。選別可能なマーカーをコードする核酸は、ＰＤＸ−１をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、または別個のベクター上に導入され得る。導入された核酸で安定して形質移入された細胞は、薬物選別によって特定され得る（例えば、選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存することになるが、他の細胞は死滅する）。別の実施形態において、ＰＤＸ−１によって変調された細胞または形質移入された細胞は、内在性レポーター遺伝子の発現の導入によって特定される。特定の実施形態において、プロモーターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動するインスリンプロモーターである。
【０１４５】
一実施形態において、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９核酸は、ウイルスベクター内に存在する。一実施形態において、ＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１核酸は、同じウイルスベクター内に存在する。別の実施形態において、ＰＤＸ−１及びＰａｘ４核酸は、同じウイルスベクター内に存在する。別の実施形態において、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＳｏｘ−９核酸は、ウイルス内に被包される。別の実施形態において、ＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１は、ウイルス内に被包される（すなわち、ＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸は、同じウイルス粒子内に被包される）。別の実施形態において、ＰＤＸ−１及びＰａｘ４は、ウイルス内に被包される（すなわち、ＰＤＸ−１及びＰａｘ４をコードする核酸は、同じウイルス粒子内に被包される）。一部の実施形態において、ウイルスは、好ましくは、様々な組織型の多能性細胞、例えば、造血幹細胞、ニューロン幹細胞、肝幹細胞、または胚幹細胞に感染し、好ましくは、ウイルスは、肝臓指向性である。熟練者であれば、「肝臓指向性」という用語は、ウイルスが、好ましくは肝臓の細胞を特異的または非特異的に標的とする能力を有することを意味することを理解するであろう。さらなる実施形態において、ウイルスは、変調された肝炎ウイルス、ＳＶ−４０、またはエプスタイン・バーウイルスである。なおも別の実施形態において、ウイルスは、アデノウイルスである。
【０１４６】
遺伝子療法
【０１４７】
一実施形態において、本明細書に開示される、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、またはこれらの組み合わせ、あるいはそれらの機能的誘導体は、遺伝子療法によって投与される。遺伝子療法は、対象への特異的核酸の投与によって行われる療法を指す。一実施形態において、核酸は、そのコードされたペプチド（複数可）を産生し、次いで、前述の疾患または障害、例えば、糖尿病の機能を変調することによって治療効果を引き出す役割を果たす。当該技術分野内で使用可能な遺伝子療法に関する方法論のうちのいずれかが、本明細書に提示される開示の実施において使用されてもよい。例えば、非特許文献３０を参照されたい。
【０１４８】
別の実施形態において、治療薬は、前述のＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ペプチドのうちのいずれか１つ以上、またはそれらの断片、誘導体、もしくは類似体を、好適な宿主内で発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。一実施形態において、かかる核酸は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＳｏｘ−９ペプチドのコード領域（複数可）に操作可能に結合されるプロモーターを保有する。このプロモーターは、誘導性または構成的、及び任意に組織特異的であり得る。プロモーターは、例えば、ウイルスまたは哺乳類起源であり得る。別の特定実施形態において、コード配列（及び任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位において相同的組み換えを促進し、故に核酸の染色体内発現を提供する領域に隣接する核酸分子が使用される。例えば、非特許文献３１を参照されたい。なおも別の実施形態において、送達される核酸は、エピソームのままであり、内在性の、そうでなければサイレントな遺伝子を誘導する。
【０１４９】
患者への治療的核酸の送達は、直接的（すなわち、患者が、核酸もしくは核酸含有ベクターに直接曝露される）または間接的（すなわち、細胞を、最初にインビトロで核酸と接触させ、次いで患者に移植する）のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボ遺伝子療法として知られている。別の実施形態において、核酸は、インビボで直接投与され、コードされた産物を産生するように発現される。これは、該核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、それが細胞内になるような様式でそれを投与すること（例えば、欠陥もしくは減衰レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染によって、米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、裸のＤＮＡを直接注入すること、微粒子砲撃を使用すること（例えば、″Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ．ＲＴＭ；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）、該核酸を脂質でコーティングすること、関連した細胞表面受容体／形質移入剤を使用すること、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内に被包すること、核に進入することが知られているペプチドに結合した状態でそれを投与すること、または受容体媒介型エンドサイトーシスの素因があるリガンドに結合した状態でそれを投与することによるもの（例えば、非特許文献３２）が含まれるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の多数の方法のうちのいずれかによって達成されてもよく、これらを使用して、関心対象の受容体を特異的に発現する細胞型を「標的」とし得る。
【０１５０】
遺伝子療法に対する追加のアプローチは、遺伝子またはｍＲＮＡを、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介型形質移入、ウイルス感染等のような方法によって、インビトロ組織培養下の細胞に形質移入することを必要とする。一般に、形質移入の方法論には、選別可能なマーカーの、細胞への同時形質移入が含まれる。次いで、伝達された遺伝子を取り込んだ細胞、及びそれを発現している細胞の単離を促進するように、細胞を淘汰圧（例えば、抗生物質耐性）下に置く。次いで、それらの細胞を患者に送達する。別の実施形態において、結果として得られる組み換え細胞のインビボ投与前に、核酸は、当該技術分野内の既知の任意の方法によって細胞に導入され、形質移入、エレクトロポレーション、微量注入、関心対象の核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介型遺伝子伝達、微小核体媒介型遺伝子伝達、スフェロプラスト融合、及びレシピエント細胞の必須の発達的及び生理学的機能が、伝達によって破壊されないことを保証する同様の方法論が含まれるが、これらに限定されない。例えば、非特許文献３３を参照されたい。選択された技法は、核酸が細胞によって発現可能であるように、細胞への核酸の安定した伝達を提供すべきである。なおも別の実施形態において、該伝達された核酸は、細胞子孫によって遺伝性かつ発現可能である。代替実施形態において、伝達された核酸は、エピソームのままであり、そうでなければサイレントな内在性核酸の発現を誘導する。
【０１５１】
一実施形態において、結果として得られる組み換え細胞は、当該技術分野内で既知の様々な方法によって患者に送達されてもよく、上皮細胞の注入（例えば、皮下的に）、皮膚移植片としての組み換え皮膚細胞の患者への適用、及び組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞）または肝細胞の静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。使用のために想定される細胞の総数は、所望の効果、患者の状態等に依存し、当業者によって決定されてもよい。一実施形態において、少なくとも１０６個の分化転換細胞が、本明細書に開示される治療方法での使用に必要である。別の実施形態において、少なくとも１０７個の分化転換細胞、少なくとも１０８個の分化転換細胞、少なくとも１０９個の分化転換細胞、または少なくとも１０１０個の分化転換細胞が、本明細書に開示される治療方法での使用に必要である。なおも別の実施形態において、少なくとも１．８×１０９個の分化転換細胞が、本明細書に開示される治療方法での使用に必要である。
【０１５２】
遺伝子療法の目的で核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の使用可能な細胞型を包含し、異種、異種遺伝子型、同一遺伝子型、または自己遺伝子型であり得る。細胞型には、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、及び血液細胞等の分化細胞、または様々な幹細胞もしくは前駆細胞、具体的に、胚心筋細胞、肝幹細胞（特許文献６）、神経幹細胞（非特許文献３４）、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる、造血幹細胞もしくは前駆細胞等が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、遺伝子療法に用いられる細胞は、患者の自己由来である。
【０１５３】
遺伝子療法のためのＤＮＡは、非経口的に、例えば、静脈内的、皮下的、筋内的、及び腹腔内的に患者に投与され得る。ＤＮＡまたは誘導剤は、薬学的に許容される担体、すなわち、動物への投与に適した生体適合性媒体、例えば、生理食塩水中で投与される。治療上有効な量は、医学的に望ましい結果、例えば、処置された動物における膵遺伝子の増加を産生することができる量である。かかる量は、当業者によって決定され得る。医療分野において周知のように、任意の所与の患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、全般健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。投薬量は異なり得るが、ＤＮＡの静脈内投与のための好ましい投薬量は、およそ１０６〜１０２２コピーのＤＮＡ分子である。例えば、ＤＮＡは、１Ｋｇ当たりおよそ２×１０１２ビリオンで投与される。
【０１５４】
ヒトインスリン産生（ＩＰ）細胞の製造方法
【０１５５】
ヒトインスリン産生細胞の製造は、細胞ベース療法、例えば、Ｉ型真性糖尿病に罹患している対象を治療するために使用可能な組織の不足を克服することができる。十分な数のヒトインスリン産生細胞の製造方法は、一実施形態において、本明細書に開示されるように、これらの療法及び他の療法での使用のための細胞ベースの産物を提供する（図３２）。
【０１５６】
一実施形態において、自己由来または同種異系インスリン産生細胞（ＡＩＰ）であり得る、ヒトインスリン産生細胞産物の製造プロセスのフローチャートを提示する、図３４をここで参照する。図３４は、ヒトインスリン産生細胞の製造プロセスの一実施形態を説明し、出発物質は、肝組織を含む。熟練者であれば、非膵β細胞組織のいずれかの源が、この製造プロセスにおいて使用され得ることを認識するであろう。
【０１５７】
図３４に提示されるステップのうちの多くに関する実施形態は、本出願全体で詳述され、それらは本明細書において考慮されるべきであるが、本明細書では繰り返されない。これらのステップのうちの多くを例証する、実施例２０及び２１も参照する。要するに、製造プロセスは、以下に提示されるステップに基づいて理解され得る。
【０１５８】
ステップ１：肝組織を入手する、に示されるように一実施形態において、肝組織は、ヒト肝組織である。別の実施形態において、肝組織は、生検の一部として入手される。別の実施形態において、肝組織は、当該技術分野において既知の任意の外科的手順によって入手される。別の実施形態において、肝組織の入手は、熟練した医療実践者によって行われる。別の実施形態において、入手された肝組織は、健康な個人からの肝組織である。関連実施形態において、健康な個人は、グルコース調節様式で処理されたインスリンを提供する細胞ベース法を必要とする患者、例えば、Ｉ型真性糖尿病患者または膵炎に罹患している患者の同種異系ドナーである。別の実施形態において、ドナースクリーニング及びドナー検査を行い、ドナーから入手された組織が、ＡＩＰ細胞の製造に由来する、感染性または悪性疾患の臨床的もしくは身体的証拠、またはその危険因子がなかったことを示すことを保証した。なおも別の実施形態において、肝組織は、グルコース調節様式で処理されたインスリンを提供する細胞ベース療法を必要とする患者、例えば、Ｉ型真性糖尿病または膵炎を罹患している患者から入手される。さらに別の実施形態において、肝組織は、グルコース調節様式で処理されたインスリンを提供する細胞ベース療法を必要とする患者、例えば、Ｉ型真性糖尿病または膵炎を罹患している患者の自己由来である。
【０１５９】
ステップ２：一次肝細胞の回収及び処理、に示されるように肝組織は、さらなる処理に使用される付着細胞の回収のための、当該技術分野において周知の技法を使用して処理される。一実施形態において、肝組織は、約１〜２ｍｍの小片に切断され、ピペットで滅菌緩衝液中でやさしく上下させる。次いで、試料をコラゲナーゼでインキュベートして組織を消化させてもよい。一連の洗浄ステップに続いて、別の実施形態において、一次肝細胞を、前処置されたフィブロネクチンでコーティングした組織培養組織皿上にプレーティングしてもよい。熟練者であれば、肝細胞の増殖のための周知の技法に従い、細胞を次いで処理（継代）する方法を周知しているであろう。簡単に言えば、細胞は、増殖培地中で成長させてもよく、一連の播種及び採取を通して、細胞数が増加する。細胞は、８０％合流に到達すると分裂し、再プレーティングされ得る。図３３（０〜２週）は、一次肝細胞の２つの継代を表す、この回収及び処理ステップの一実施形態の概略を示す。
【０１６０】
熟練者であれば、プロトコルの増幅相を開始する前の、例えば２週間の期間に十分な細胞の必要性を理解するであろう（ステップ３）。熟練者であれば、２週間の期間が、細胞を増幅するための開始点の一例であることを認識するであろう。この場合、細胞は、この期間前または期間後に増幅の用意ができ得る。一実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも１×１０５個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも１×１０６個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも２×１０６個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも５×１０６個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも１×１０７個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に少なくとも１×１０５〜１×１０６個の細胞を産出する。別の実施形態において、一次細胞の回収及び処理は、細胞の２継代後に１×１０６〜１×１０７個の細胞を産出する。別の実施形態において、十分な出発組織を使用して、一次細胞の回収及び処理が、ステップ３の細胞の大規模増幅における適切な播種密度に対して２継代後に十分な細胞を産出することを保証する。
【０１６１】
一実施形態において、第１継代の一次細胞が、後の使用のために凍結保存される。別の実施形態において、早期継代の一次細胞が、後の使用のために凍結保存される。なおも別の実施形態において、第２継代の一次細胞が、後の使用のために凍結保存される。
【０１６２】
ステップ３：一次肝細胞の増殖／増幅
【０１６３】
ステップ３は、製造プロセスの大規模増幅相を表す。熟練者であれば、プロトコルの分化転換相を開始する前に、５週間の期間に十分な細胞の必要性を理解するであろう（ステップ４）。この場合、既定数の細胞が、患者を治療するために必要であると想定され得る。一実施形態において、分化転換前に必要とされる既定数の細胞は、約１×１０８個の一次細胞を含む。別の実施形態において、分化転換前に必要とされる既定数の細胞は、約２×１０８個の一次細胞を含む。一実施形態において、分化転換前に必要とされる既定数の細胞は、約３×１０８個の一次細胞、４×１０８個の一次細胞、５×１０８個の一次細胞、６×１０８個の一次細胞、７×１０８個の一次細胞、８×１０８個の一次細胞、９×１０８個の一次細胞、１×１０９個の一次細胞、２×１０９個の一次細胞、３×１０９個の一次細胞、４×１０９個の一次細胞、５×１０９個の一次細胞、６×１０９個の一次細胞、７×１０９個の一次細胞、８×１０９個の一次細胞、９×１０９個の一次細胞、または１×１０１０個の一次細胞を含む。
【０１６４】
一実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、１×１０３〜１０×１０３細胞／ｃｍ２を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、１×１０３〜８×１０３細胞／ｃｍ２を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、１×１０３〜５×１０３細胞／ｃｍ２を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、１×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、２×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、３×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、４×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、５×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、６×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、７×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、８×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、９×１０３を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種密度は、１０×１０３を含む。
【０１６５】
別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率の範囲は、６０〜１００％を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率の範囲は、約７０〜９９％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約６０％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約６５％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約７０％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約７５％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約８０％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約８５％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約９０％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約９５％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約９９％の生存率を含む。別の実施形態において、増幅時の細胞播種生存率は、約９９．９％の生存率を含む。
【０１６６】
図３３は、この増幅期間の一実施形態を概略的に示す。一実施形態において、増幅は、２週目〜５週目の間に起こる。熟練者であれば、出発組織材料内の変動性を認識するであろう（図２９）。したがって、一実施形態において、増幅は、２週目〜６週目の間に起こる。さらに別の実施形態において、増幅は、２週目〜７週目の間に起こる。別の実施形態において、増幅は、２週目〜４週目の間に起こる。なおも別の実施形態において、増幅は、必要数の一次細胞が増殖されるまで起こる。例えば、図２８は、培養３０日目までに目標の１０億個細胞に到達したことを示す。
【０１６７】
熟練者であれば、細胞の増幅と同時に、集団が分化転換のために強化され得ることを理解するであろう。分化転換のために強化された一次成体肝細胞、及びそれらの集団を富化するための方法に関する説明は、本明細書に開示され、実施例１０〜１７及び２３に例証される。一実施形態において、ＧＳＲＥ活性の選別を使用して、分化転換のための成体細胞の集団を富化する。別の実施形態において、遺伝子発現のレベルは、増加した発現または減少した発現のいずれかを有することが知られている遺伝子について測定され、かかる増加または減少は、分化転換の素因を示す。別の実施形態において、一次成体肝細胞は、分化転換前にリチウムでインキュベートされてもよく、このインキュベーションは、該一次成体肝細胞の集団内の細胞集団の素因を強化する。
【０１６８】
一実施形態において、バイオリアクターを使用して、分化転換ステップ前に一次細胞を増幅し、増殖させる。バイオリアクターを使用して、条件が高細胞濃度に適している、細胞の培養に使用してもよい（実施例２０を参照されたい）。別の実施形態において、バイオリアクターは、細胞の増幅のための閉鎖系を提供する。別の実施形態において、複数のバイオリアクターが、一連の細胞増幅において使用される。別の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるバイオリアクターは、単回使用バイオリアクターである。別の実施形態において、使用されるバイオリアクターは、多回使用バイオリアクターである。なおも別の実施形態において、バイオリアクターは、プロセスのパラメータを監視し、制御するための制御ユニットを備える。別の実施形態において、監視及び制御のためのパラメータは、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ガス、及び温度を含む。
【０１６９】
ステップ４：一次肝細胞の分化転換（ＴＤ）
【０１７０】
一実施形態において、分化転換は、本明細書に開示される任意の分化転換方法を含む。例えば、分化転換は、本明細書に開示される、階層（１＋１＋１）プロトコルまたは「２＋１」プロトコルを含み得る。
【０１７１】
一実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、膵臓の表現型及び機能を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、増加したインスリン含有量を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、処理されたインスリンをグルコース調節様式で分泌することができる分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、増加したＣ−ペプチドレベルを有する分化転換細胞を含む。
【０１７２】
別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、少なくとも１つの膵遺伝子マーカーの増加した内在性発現を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、内在性発現は、少なくとも２つの膵遺伝子マーカーに関して増加する。別の実施形態において、内在性発現は、少なくとも３つの膵遺伝子マーカーに関して増加する。別の実施形態において、内在性発現は、少なくとも４つの膵遺伝子マーカーに関して増加する。関連実施形態において、膵遺伝子マーカーは、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＭａｆＡ、Ｎｋｘ６．１、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰａｘ４を含む。
【０１７３】
一実施形態において、内在性ＰＤＸ−１発現は、非分化細胞の１０２倍より多い。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１発現は、非分化細胞の１０３倍より多い。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１発現は、非分化細胞の１０４倍より多い。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１発現は、非分化細胞の１０５倍より多い。別の実施形態において、内在性ＰＤＸ−１発現は、非分化細胞の１０６倍より多い。
【０１７４】
別の実施形態において、内在性ＮｅｕｒｏＤ１発現は、非分化細胞の１０２倍より多い。別の実施形態において、内在性ＮｅｕｒｏＤ１発現は、非分化細胞の１０３倍より多い。別の実施形態において、内在性ＮｅｕｒｏＤ１発現は、非分化細胞の１０４倍より多い。別の実施形態において、内在性ＮｅｕｒｏＤ１発現は、非分化細胞の１０５倍より多い。
【０１７５】
別の実施形態において、内在性ＭａｆＡ発現は、非分化細胞の１０２倍より多い。別の実施形態において、内在性ＭａｆＡ発現は、非分化細胞の１０３倍より多い。別の実施形態において、内在性ＭａｆＡ発現は、非分化細胞の１０４倍より多い。別の実施形態において、内在性ＭａｆＡ発現は、非分化細胞の１０５倍より多い。
【０１７６】
別の実施形態において、内在性グルカゴン発現は、非分化細胞の１０倍より多い。別の実施形態において、内在性グルカゴン発現は、非分化細胞の１０２倍より多い。別の実施形態において、内在性グルカゴン発現は、非分化細胞の１０３倍より多い。
【０１７７】
別の実施形態において、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせの内在性発現は各々、非分化細胞より６０％超多い。別の実施形態において、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせの内在性発現は各々、非分化細胞より７０％超多い。別の実施形態において、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＭａｆＡ、またはこれらの任意の組み合わせの内在性発現は各々、非分化細胞より８０％超多い。
【０１７８】
別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、少なくとも６０％の生存率を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、少なくとも７０％の生存率を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、少なくとも８０％の生存率を有する分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、少なくとも９０％の生存率を有する分化転換細胞を含む。
【０１７９】
別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、減少した肝細胞マーカーを示す分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、減少したアルブミンもしくはα−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、または任意の組み合わせを示す分化転換細胞を含む。別の実施形態において、分化転換に続いて結果として得られる細胞集団は、ＦＡＣＳにより１％未満のアルブミンもしくはα−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、または任意の組み合わせを含む分化転換細胞を含む。
【０１８０】
別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも６ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも１２ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも１８ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも２４ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも３６ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも４８ヶ月間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも４年間にわたって膵表現型及び機能を維持する。別の実施形態において、分化転換細胞は、少なくとも５年間にわたって膵表現型及び機能を維持する。
【０１８１】
一実施形態において、細胞数は、分化転換中に維持される。別の実施形態において、細胞数は、分化転換中に５％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、分化転換中に１０％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、分化転換中に１５％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、分化転換中に２０％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、分化転換中に２５％未満減少する。
【０１８２】
ステップ５：分化転換一次肝細胞の採取
【０１８３】
一実施形態において、ヒトインスリン産生細胞を含む分化転換一次肝細胞を採取し、細胞ベース療法に使用する。一実施形態において、細胞数は、採取中に維持される。別の実施形態において、細胞数は、採取中に５％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、採取中に１０％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、採取中に１５％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、採取中に２０％未満減少する。別の実施形態において、細胞数は、採取中に２５％未満減少する。
【０１８４】
一実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０７〜１×１０１０細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０８〜１×１０１０細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０７〜１×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０７細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約５×１０７細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約７．５×１０７細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約２．５×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約５×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約７．５×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約１×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約２×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約３×１０８細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約４×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約５×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約６×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約７×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約８×１０９細胞である。別の実施形態において、採取時に回収された分化転換細胞の数は、合計約９×１０９細胞である。
【０１８５】
一実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約１×１０３〜１×１０５細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約１×１０４〜５×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約１×１０４〜４×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約１×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約２×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約３×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約４×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約５×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約６×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約７×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約８×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約９×１０３細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約１×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約２×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約３×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約４×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約５×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約６×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約７×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約８×１０４細胞／ｃｍ２である。別の実施形態において、採取時の分化転換細胞の密度は、約９×１０４細胞／ｃｍ２である。
【０１８６】
別の実施形態において、採取時の細胞生存率の範囲は、５０〜１００％を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率の範囲は、６０〜１００％を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率の範囲は、５０〜９０％を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率の範囲は、約６０〜９９％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率の範囲は、約６０〜９０％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約６０％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約６５％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約７０％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約７５％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約８０％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約８５％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約９０％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約９５％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約９９％の生存率を含む。別の実施形態において、採取時の細胞生存率は、約９９．９％の生存率を含む。
【０１８７】
別の実施形態において、ヒトインスリン産生細胞を含む分化転換一次肝細胞を採取し、後に細胞ベース療法において使用するために貯蔵する。別の実施形態において、貯蔵は、細胞を凍結保存することを含む。
【０１８８】
ステップ６：品質解析／品質管理
【０１８９】
細胞ベース療法における分化転換細胞の任意の使用前に、分化転換細胞は、品質解析／品質管理評価を受けなければならない。ＦＡＣＳ解析及び／またはＲＴ−ＰＣＲを使用して、膜マーカー及び遺伝子発現を正確に決定することができる。さらに、インスリン分泌の解析方法論は、当該技術分野において周知であり、ＥＬＩＳＡ、ＭＳＤ、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣが含まれる。一実施形態において、インスリン分泌試験は、高グルコース濃度（約１７．５ｍＭ）と比較して、低グルコース濃度（約２ｍＭ）で行う。
【０１９０】
治療薬組成物
【０１９１】
本明細書に記載される分化転換誘導化合物、または異所性膵転写因子（すなわち、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ポリペプチド、リボ核酸、またはＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸）、及び本明細書に開示される方法によって産生された膵β細胞表現型を有する細胞は、治療的に使用される場合、「治療薬」と称される。治療薬の投与方法には、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に提示される開示の治療薬は、任意の便宜的な経路によって、例えば、注射またはボーラス注入によって、上皮または粘膜皮膚内壁（例えば、経口粘膜、直腸及び小腸粘膜等）を通じた吸収によって投与されてもよく、また他の生体活性剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身的または局所的であり得、例えば、肝臓への門静脈送達による。加えて、脳室内及び髄腔内注入を含む任意の好適な経路によって、中枢神経系に治療薬を投与することが有利であり得る。脳室内注入は、貯留器（例えば、Ｏｍｍａｙａ貯留器）に取り付けられた脳室内カテーテルによって容易になり得る。肺投与はまた、吸入器または噴霧器、及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって用いられてもよい。治療を必要とする領域に、局所的に治療薬を投与することが望ましい場合もあり、これは、例えば、手術中の局所注射、局所適用、注入によって、カテーテルによって、坐薬によって、または移植片によって達成され得るが、これらに限定されない。様々な送達系が知られており、それらを使用して本明細書に提示される開示の治療薬を投与することができ、例えば、（ｉ）リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内の被包、（ｉｉ）治療薬を発現することができる組み換え細胞、（ｉｉｉ）受容体媒介型エンドサイトーシス（例えば、非特許文献３２を参照されたい）、（ｉｖ）レトロウイルス、アデノウイルス、または他のベクターの一部としての治療薬核酸の構成等が含まれる。本明細書に提示される開示の一実施形態において、治療薬は、小嚢内、具体的にはリポソーム内で送達されてもよい。リポソーム内で、本明細書に提示される開示のタンパク質は、他の薬学的に許容される担体に加えて、水溶液中のミセル、不溶性単層、液晶、または層状層として凝集形態で存在する脂質等の両親媒性剤と複合される。リポソーム製剤に適した脂質には、制限なしに、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が含まれる。かかるリポソーム製剤の調製は、例えば、特許文献７、及び特許文献８（全てが参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、当該技術分野におけるスキルレベル内である。なおも別の実施形態において、治療薬は、例えば、送達ポンプ（例えば、非特許文献３５を参照されたい）及び半透過性ポリマー材料（例えば、非特許文献３６を参照されたい）を含む制御放出系において送達され得る。追加的に、制御放出系は、治療標的（例えば、脳）の近接に配置され得、故に、全身用量の分画のみを必要とする。例えば、非特許文献３７を参照されたい。
【０１９２】
一実施形態において、治療薬がタンパク質をコードする核酸である、本明細書に提示される開示の治療核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、それを細胞内になるように投与することによって（例えば、レトロウイルスベクターの使用によって、直接注入によって、微粒子砲撃の使用によって、脂質もしくは細胞表面受容体または形質移入剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに結合した状態でそれを投与することによって（例えば、非特許文献３８）インビボで投与され、そのコードされたタンパク質の発現を促進し得る。代替的に、核酸治療薬は、細胞内に導入され、相同性組み換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得るか、またはエピソームのままであり得る。
【０１９３】
一実施形態において、治療薬は、本明細書に開示される方法によって産生された膵β細胞表現型を有する細胞であり、治療薬は、静脈内的に投与される。具体的に、治療薬は、門静脈注射を介して送達され得る。
【０１９４】
熟練者であれば、「治療上有効な量」という用語が、有意義な患者利得、すなわち、関連病態の治療、治癒、予防、もしくは改善、またはかかる病態の治療、治癒、予防、もしくは改善の割合の増加を示すのに十分な薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を包含し得ることを理解するであろう。個々の活性成分に適用され、単独で投与される場合、この用語は、その成分単独を指す。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせで、連続的に、または同時に投与されるかを問わず、治療効果をもたらす活性成分の複合量を指す。
【０１９５】
本明細書に提示される開示の治療薬の静脈内投与に適した投薬量範囲は、一般に、少なくとも１００万個の分化転換細胞、少なくとも２００万個の分化転換細胞、少なくとも５００万個の分化転換細胞、少なくとも１０００万個の分化転換細胞、少なくとも２５００万個の分化転換細胞、少なくとも５０００万個の分化転換細胞、少なくとも１億個の分化転換細胞、少なくとも２億個の分化転換細胞、少なくとも３億個の分化転換細胞、少なくとも４億個の分化転換細胞、少なくとも５億個の分化転換細胞、少なくとも６億個の分化転換細胞、少なくとも７億個の分化転換細胞、少なくとも８億個の分化転換細胞、少なくとも９億個の分化転換細胞、少なくとも１０億個の分化転換細胞、少なくとも２０億個の分化転換細胞、少なくとも３０億個の分化転換細胞、少なくとも４０億個の分化転換細胞、または少なくとも５０億個の分化転換細胞である。一実施形態において、用量は、６０〜７５ｋｇの対象に対して１０〜２０億個の分化転換細胞である。当業者であれば、インビトロまたは動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から外挿され得ることを理解するであろう。別の実施形態において、有効用量が、肝門静脈に静脈内的に投与されてもよい。
【０１９６】
細胞は、かかる細胞に対する所望の効果またはその内部での活性を増幅または産生するために、本明細書に提示される開示の治療剤、核酸、またはタンパク質の存在下、エクスビボで培養されてもよい。次いで、処置された細胞は、治療目的で、本明細書に記載される投与経路を介してインビボで導入され得る。
【０１９７】
薬学的組成物
【０１９８】
化合物、例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ポリペプチド、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、またはＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、もしくはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸の発現を増加させる核酸もしくは化合物（本明細書において「活性化合物」とも称される）、及びそれらの誘導体、断片、類似体、及び相同体、ならびに本明細書に開示される方法によって産生される膵β細胞は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、またはタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌剤及び抗菌剤、等張性吸収遅延剤等を含むことが意図される。好適な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、この分野の標準参照テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。かかる担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、フィンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、及び固定油等の非水性ビヒクルが使用されてもよい。薬学的に活性な物質に対する、かかる媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が、活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物中のそれらの使用が企図される。補助的活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【０１９９】
本明細書に開示される薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝剤；及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度調整のための薬剤が含まれる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多回投与バイアルに封入され得る。
【０２００】
注入使用に適した薬学的組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）、または無菌注入溶液または分散剤の即時調製のための分散剤及び無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての例において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であるべきである。製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒質であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの例において、等張剤、例えば、糖、マニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム等のポリアルコールを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０２０１】
無菌注射液は、上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことによって、続いて必要に応じてフィルター処理による滅菌によって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒質及び上に列挙されるものから必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及び冷凍乾燥であり、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を、以前に無菌フィルター処理されたその溶液から産出する。
【０２０２】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤と組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために、流体担体を使用して調製され得、流体担体中の化合物を、経口的に適用し、濯いで吐き出すか、または飲み込む。薬学的に適合される結合剤、及び／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の成分、または同様の性質の化合物：微結晶セルロース、ガムトラガカント、もしくはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチ等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート等の潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素等の滑剤；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味等の風味剤のうちのいずれかを含有し得る。
【０２０３】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、一般に、当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に知られている軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０２０４】
一実施形態において、活性化合物は、移植片及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の、身体からの急速な排除から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。かかる製剤の調製方法は、当業者に明らかとなるであろう。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、特許文献９（参照により本明細書に完全に組み込まれる）に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製され得る。
【０２０５】
投与の容易性及び投薬量の均一性のために、投与単位形態で、経口または非経口組成物を製剤化することが特に有益である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される対象のための一体型剤形として適している物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と関連した所望の治療効果をもたらすように算出された既定量の活性化合物を含有する。本明細書に開示される投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特徴及び達成される特定の治療効果によって記され、それらに直接依存する。
【０２０６】
本明細書に開示される核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、特許文献１０に記載される多数の経路のうちのいずれかによって対象に送達され得る。故に、送達はまた、例えば、静脈内注入、局所投与（特許文献１１を参照されたい）、または定位的注入（例えば、非特許文献３９）を含み得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる遅効性マトリクスを含み得る。代替的に、完全な遺伝子送達ベクターが、例えば、レトロウイルスベクターが、組み換え細胞からインタクトに産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０２０７】
薬学的組成物は、投与のための指示書と一緒に、容器、パック、または分注器に含まれ得る。
【０２０８】
本明細書に提示される開示が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬、ならびに実施例に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語及び実施例は、単に特定の実施形態を説明する目的、熟練者にガイダンスを提供する意図及び目的であって、本明細書に提示される開示の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２０９】
実施例１：一般的方法
ヒト肝細胞
【０２１０】
成体ヒト肝組織を、３〜２３歳以上の個人から入手した。臨床調査委員会（施設内審査委員会）からの承認を得て、肝組織を使用した。ヒト肝細胞の単離は、記載の通り行った（非特許文献４０、非特許文献４１）。細胞を、１０％胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）で補充したダルベッコ最小必須培地（１ｇ／Ｌのグルコース）中で培養し、５％  ＣＯ２及び９５％空気の湿潤雰囲気下、３７℃で保持した。
【０２１１】
ウイルス感染
【０２１２】
本研究で使用されるアデノウイルスは、以下の通りであった。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（非特許文献４０、非特許文献４１）、Ａｄ−ＲＩＰ−ルシフェラーゼ（非特許文献４２）、Ａｄ−ＣＭＶ−β−Ｇａｌ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（Ｎｅｗｇａｒｄ，Ｃ．Ｂ．，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの寛大な寄贈）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｓｔ  Ｏｎｇｅ，Ｌ．ＤｅｖｅｌｏＧｅｎ  ＡＧ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙからの寛大な寄贈）、及びＡｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌ１（Ｋｉｅｆｆｅｒ，Ｔ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａからの寛大な寄贈）。ウイルス粒子は、標準プロトコルによって生成された（非特許文献４３）。
【０２１３】
肝細胞に、組み換えアデノウイルスを５〜６日間にわたって感染させ（表１）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｌａｂ，Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）及びニコチンアミド（１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）で補充した。最適感染多重度（ＭＯＩ）を、細胞生存率（７５％未満）及びＣ−ペプチド分泌の誘導に従って決定した。使用されるウイルスのＭＯＩは、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００  ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１００  ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（１０  ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌ１（１００  ＭＯＩ）であった。
【０２１４】
ＲＮＡ単離、ＲＴ及びＲＴ−ＰＣＲ反応
【０２１５】
以前に記載の通り、総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製及び増幅した（非特許文献４４、非特許文献４０）。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩステップ１プラス配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、以前に記載の通り行った（非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４５）。
【０２１６】
Ｃ−ペプチド及びインスリン分泌検出
【０２１７】
Ｃ−ペプチド及びインスリン分泌は、記載の通り、ウイルス治療への初期曝露の６日後に、成体肝細胞の一次培養物の静的インキュベーションによって測定した（非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４５）。グルコース調節Ｃ−ペプチド分泌は、２ｍＭ及び１７．５ｍＭのグルコースで測定し、これを用量依存的解析によって決定して、処置した細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく、分化転換肝細胞からのインスリン分泌を最大限に誘導した（非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４５）。Ｃ−ペプチド分泌は、ヒトＣ−ペプチド放射免疫測定キットを使用する放射免疫測定によって検出した（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ、ヒトプロインスリンに対して４％未満の交差反応性）。インスリン分泌は、ヒトインスリン放射免疫測定キットを使用する放射免疫測定によって検出した（ＤＰＣ，Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ、ヒトプロインスリンに対して３２％の交差反応性）。分泌を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットによって測定された総細胞タンパク質に対して標準化した。
【０２１８】
ルシフェラーゼアッセイ
【０２１９】
ヒト肝細胞に、Ａｄ−ＲＩＰ−ルシフェラーゼ（２００ｍｏｉ）及び様々なアデノウイルスを感染させた（下記の通り）。６日後に、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＬＫＢ  １２５０ルミノメーター（ＬＫＢ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定された総細胞タンパク質に対して標準化した。
【０２２０】
免疫蛍光
【０２２１】
様々なアデノウイルスで処置したヒト肝細胞を、１２ウェル培養プレートのガラスカバースライド上にプレーティングした（２×１０５細胞／ウェル）。３〜４日後に、細胞を固定し、記載の通り染色した（非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４５）。この研究で使用される抗体は、抗ウサギＰＤＸ−１、抗ヤギＰＤＸ−１（いずれも１：１０００、Ｃ．Ｖ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔからの寛大な寄贈）、抗ヒトインスリン、抗ヒトソマトスタチン（いずれも１：１００、Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗Ｐａｘ４（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、抗ＭａｆＡ（１：１６０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）であった。使用された二次抗体は、抗ウサギＩｇＧシアニン（ｃｙ２）複合抗体１：２５０、抗ウサギＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）複合抗体１：２５０、抗ヤギＩｇＧシアニン（ｃｙ２）複合抗体１：２００、抗ヤギＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）複合抗体１：２５０、及び抗マウスＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）複合抗体１：２５０（全てＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡから）であった。最後に、細胞を４′，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。スライドを撮像し、蛍光顕微鏡（Ｐｒｏｖｉｓ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して解析した。
【０２２２】
純度アッセイ
【０２２３】
フローサイトメトリーベースのアッセイは、細胞の９０％超が、増幅及び分化転換中に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様表現型を有することを保証する主要な純度アッセイとして開発されてきた。培養されたＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４に関して陽性染色するはずであり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、またはＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲ表面分子に関して陰性のはずである。
【０２２４】
図４４Ａ及び４４Ｂに示されるように、増幅した肝細胞及び感染細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、及びＣＤ７３マーカーを高レベル（≧９０％）で発現したが、それらは、系統陰性マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ１９、及びＨＬＡ−ＤＲのカクテル）を発現しなかった。ＣＤ１０５発現が、Ｐ１４での非感染細胞と比較して、Ｐ１６での感染細胞においてわずかに減少したことに留意されたい。この減少が有意であるかどうか、及びそれが継代数または分化転換と共に減少するかどうかを理解するために、追加の実験が必要である。これらの結果は、ＭＳＣマーカーが、経時的、及び肝細胞の分化転換中に安定していたことを示す。ＭＳＣマーカーのフローサイトメトリーは、実際にＱＣテストとして使用されてもよい。
【０２２５】
次のステップは、様々な外在性転写因子、及び理想的にはインスリンまたはＣ−ペプチドを発現または共発現する下位集団を定量化する、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光アッセイを開発することであろう。
【０２２６】
統計解析
【０２２７】
統計解析は、不均等な変数を想定し、２標本スチューデントｉ検定を用いて行った。
【０２２８】
実施例２：ＰＤＸ−１誘導型分化転換
以前の研究（非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７）は、ＰＤＸ−１が単独で、ヒト肝細胞においてβ細胞様表現型及び機能を、恐らくは肝臓内の多数の、そうでなければサイレントな内在性ｐＴＦを活性化するその能力に起因して誘導可能であることを示唆した。膵系統の活性化は速く、５日以内に起こった（非特許文献４０、非特許文献４４）。
【０２２９】
この実施例において、ＰＤＸ−１により誘導される肝臓から膵臓への分化転換を媒介する一連の事象を調べる。Ｐｄｘ−１をコードするアデノウイルスベクターを、成体ヒト肝細胞に導入し、異所性ＰＤＸ−１発現の効果を、感染後４日間連続して監視した（２〜５日目、図１Ａ〜１Ｄ）。膵ホルモン及び膵特異的転写因子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって毎日５日間にわたって決定した。結果を、同じｃＤＮＡ試料内のβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化し、同日の対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、１０００ＭＯＩ）処置細胞に対する相対発現の平均±ＳＥとして提示される。２つの独立した実験を行った（ｎ≧４、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。
【０２３０】
グルカゴン及びソマトスタチン遺伝子の両方を、Ａｄ−Ｐｄｘ−１感染後１日以内に速やかに活性化した（図１Ｂ及び１Ｃ）。しかしながら、インスリン発現は、感染後４日目〜５日目においてのみ検出された（図１Ａ）。３つの主要な膵ホルモンの別個の時間的活性化に関する機構的説明を提供するために、内在的に活性化された転写因子の発現レベルを、分化転換プロセス中に解析した。早期膵内分泌転写因子、ＮＧＮ３、及びＮＥＵＲＯＤ１は、速やかに活性化された（図１Ｄ）。しかしながら、ＮＫＸ６．１及びＭａｆＡ等のβ−細胞特異的ＴＦは、異所性ＰＤＸ−１発現に応答して段階的かつ中度に活性化されたに過ぎず、それぞれ４日目及び５日目にピーク発現レベルに到達する。５日目のインスリン遺伝子発現の活性化は、ＭａｆＡ発現の増加のみならず、Ｉｓｌ１発現の減少にも関連した（図１Ｄ）。これらのデータは、膵系統に沿ったヒト肝細胞の分化転換が、急速であるにもかかわらず、段階的かつ連続的なプロセスであることを示唆する。膵ホルモン遺伝子発現（ソマトスタチン及びグルカゴン等）の別個の時間的活性化は、部分的に時間経過、及び内在的に活性化されたｐＴＦ発現の相対レベルに起因し得る。
【０２３１】
実施例３：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの複合発現は、肝臓から膵臓への分化転換の効率を増加させる
以前の研究は、いくつかのｐＴＦの協奏発現が、個々のｐＴＦによって誘導されたものと比較して（非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１、非特許文献４６）、β細胞系統に沿った、ならびに他の系統に沿った分化転換効率を増加させることを示唆してきた。本明細書に記載される一次成体ヒト肝細胞の実験システムにおいてこの見解を解析するために、肝臓から膵臓への分化転換に対する３つの主要なｐＴＦの個々の、及び共同の貢献を調査した。膵臓器官生成において異なるステージを媒介する、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡは、組み換えアデノウイルスを使用して成体ヒト肝細胞の一次培養物中で異所的に共発現させた。培養した成体ヒト肝細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００  ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ−４（１００  ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（１０  ＭＯＩ）を単独で、または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、１０００  ＭＯＩ）と共に感染させ、膵分化転換マーカーを６日後に調べた。各因子の感染多重度（ＭＯＩ）を滴定し、感染した細胞生存率に対する最小の悪影響に関連した最大再プログラム化効率をもたらした。ＰＤＸ−１は、培養下の細胞の７０％において発現し、３つのｐＴＦ全ての共同共発現は、ＰＤＸ−１陽性細胞の４６．８％において証明された（図２Ａ）。極めて少ない細胞が、Ｐａｘ−４のみまたはＭａｆＡに関して陽性染色した。３つのｐＴＦ全てに関して陽性染色した細胞は、矢印で示される（図２Ａ、右パネル）。図２Ｂにおいて、肝細胞に、複合ｐＴＦ及びＡｄ−ＲＩＰ−ＬＵＣ（２００ｍｏｉ）を共感染させ、インスリンプロモーターのルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２３２】
３つのｐＴＦの複合発現は、ｐＴＦの各々を単独で誘導されたものと比較して、インスリンプロモーター活性化の実質的増加（図２Ｂ）、（プロ）インスリン産生細胞の数の３倍増加（図２Ｃ）、及びグルコース調節された（プロ）インスリン分泌の３０〜６０％増加（図２Ｄ）をもたらした。まとめると、これらの結果は、３つのｐＴＦの複合が、分化転換効率を増加させることを示唆し、また因子の各々が、その能力が制限されているか、または最大の分化転換を個々に促進するには不十分であることを示している（非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５２）。
【０２３３】
実施例４：分化転換細胞の異なるホルモン産生細胞の成熟及び分離は、階層的様式で時間的に制御される
この実施例において、異所性ｐＴＦ発現を時間的に制御することの影響を調査して、３つのｐＴＦの複合異所性発現による増加した分化転換効率が、上記で示唆されるように時間的に制御されるかどうかを決定した（図２Ａ〜２Ｄ）。膵臓分化転換において役割を有する時間的制御の支持を受けて、３つのｐＴＦ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡは、膵臓器官生成中に別個の時間的発現及び機能を示す。
【０２３４】
３つのｐＴＦ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡは、組み換えアデノウイルスを使用して、系列的に、または成体ヒト肝細胞の一次培養物と協奏して導入された。アデノウイルス媒介型異所性遺伝子発現は、感染後１７時間にピークを迎える（非特許文献５３）。したがって、ｐＴＦは、３連続日の間に系列的に投与され（実施例１のウイルス感染を参照されたい）、それらの個々の効果の出現を可能にする。細胞を、表１に示されるスケジュールに従って感染させた。
【表１】
2018502574.tif 000009
【０２３５】
細胞に、１日当たり１つのｐＴＦアデノウイルス構成体を、３日間にわたって３つの異なる順序、直接階層順（処置Ｃ＝Ｐｄｘ−１→Ｐａｘ４→ＭａｆＡ）、逆順（処置Ｄ＝ＭａｆＡ→Ｐａｘ４→Ｐｄｘ−１）、及びランダム順（処置Ｅ＝Ｐｄｘ−１→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）で系列的に感染させた。分化転換効率及びβ細胞様成熟に対する系列的ｐＴＦ投与の効果を、１日目の３つのｐＴＦ全ての協奏または同時投与の効果（処置Ｂ＝Ｐｄｘ−１＋Ｐａｘ４＋ＭａｆＡ）及び同様のＭＯＩの対照ウイルス（処置Ａ＝β−ｇａｌ）と比較した（表１及び図３Ａ）。具体的に、培養した成体ヒト肝細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００  ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ−４（１００  ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（１０  ＭＯＩ）を、一緒に、もしくは図３Ａ及び表１に要約される系列的様式で（処置Ｂ〜Ｅ）、または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、１０００  ｍｏｉ、処置Ａ）と共に感染させ、６日後にそれらの膵分化について解析した。
【０２３６】
インスリンプロモーター活性（図４Ａ）、インスリン産生細胞のパーセント（図３Ｂ）、及びグルコース調節（プロ）インスリン分泌（図３Ｃ）は、系列的に投与したｐＴＦの順序によって影響されなかった。興味深いことに、ランダム順（処置Ｅ＝Ｐｄｘ−１→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）での系列的ｐＴＦ投与は、増加したインスリンプロモーター活性をもたらしたが、インスリン分泌のグルコース調節の喪失及び減少したグルコース輸送体２（ＧＬＵＴ−２）発現に関連していた（図３Ｂ、３Ｃ、及び４Ｂ）。Ｐａｘ４及びＭａｆＡ投与の順序を変更した際のグルコース感知能力の喪失は、分化転換プロセスの効率に対してではなく、β細胞様成熟に対する発現ｐＴＦの順序の潜在的効果を示唆している。
【０２３７】
実施例５：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの階層的投与は、β様細胞への分化転換細胞の成熟を促進する
ＣＥＬＬＳ
以前の結果は、増加した分化転換効率がβ細胞系統に沿って強化された成熟と関連する程度及び条件を決定するために、さらなる調査を促した。成熟β細胞の顕著な特徴は、プロインスリンを処理する能力、及びそれをグルコース調節様式で分泌する能力である（非特許文献５４、非特許文献５５）。ｐＴＦ発現の時間的変化が、β細胞系統に沿った分化転換細胞成熟に明らかな影響を及ぼすかどうかを解析するために、プロインスリン処理及びグルコース調節Ｃ−ペプチド分泌に対する別個の処置Ａ〜Ｅ（表１及び図３Ａ）の効果を解析した。
【０２３８】
実際に、ｐＴＦの直接階層投与（処置Ｃ）のみが、処理されたインスリン及びそのグルコース調節分泌の顕著な産生をもたらし、生理学的グルコース用量応答特徴を示した（図３Ｃ及び５Ａ）。新たに取得された表現型及び機能は、インビトロで最大４週間にわたってグルコース調節様式でｃ−ペプチドを分泌する能力によって示されるように安定していた（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０２３９】
直接階層的ｐＴＦ投与（処置Ｃ）の場合のみに増加したプロホルモン処理は、ＰＣＳＫ２及びＧＬＵＴ２遺伝子発現の顕著な増加と関連し、それぞれプロホルモン処理及びグルコース感知能力における役割を保有する（図３Ａ〜３Ｅ及び４Ａ〜４Ｃ）。これらのデータは、β細胞系統に沿った分化転換肝細胞の成熟及び機能を促進することにおける、ｐＴＦの系列的かつ直接的な階層的発現の義務的役割を示唆する。協奏（処置Ｂ）及び間接階層的モードでの系列的ＴＦ投与（処置Ｄ及びＥ）の両方は、成熟β細胞様特徴を示す分化転換細胞を生成しなかった。
【０２４０】
β細胞様成熟状態の変化に関する機構的説明を提供するために、別個の時間的処置（Ｂ〜Ｅ）下の内在性活性化ｐＴＦのレパートリーを解析した。全ての処置（Ｂ〜Ｅ）は、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２等の多数の内在性ｐＴＦの増加した発現をもたらした（図３Ｅ）。しかしながら、「成熟」表現型（処置Ｃ）と「未熟」表現型（処置Ｂ、Ｅ、及びＤ）との間の最も頑強な差異は、内在性Ｉｓｌ１遺伝子発現のレベルにおいて提示された。故に、直接階層的ｐＴＦ投与（処置Ｃ）によって誘導されたβ細胞系統に沿って最も強化された成熟は、内在性Ｉｓｌ１発現の劇的な減少と相関する（図３Ｅ、矢印）。まとめると、これらのデータは、β細胞への分化転換細胞の成熟が、特定のｐＴＦの相対的かつ時間的発現レベルによって影響され得ることを示唆する。
【０２４１】
実施例６：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの階層的投与は、β様細胞とδ様細胞との間の分化転換細胞の分離を促進する
処置Ｃ（表１）からのＭａｆＡの除外は、Ｉｓｌ−１（図６Ｄ）及びソマトスタチン遺伝子発現（図８Ｄ）の両方を誘導した。ＭａｆＡ除外時の増加したＩｓｌ−１発現が、実際に増加したソマトスタチン遺伝子発現を引き起こすかどうかを解析するために、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌ−１を、３日目にＭａｆＡと一緒に付加した（処置Ｃ、表１）。実際に、Ｉｓｌ−１は、ソマトスタチン遺伝子発現を増加させた（図６Ｅ）。異所性Ｉｓｌ−１発現（Ｃ＋Ｉｓｌ−１）はまた、増加したソマトスタチンタンパク質産生（図６Ｆ）及びインスリン産生細胞におけるその共産生（図９、下パネル）を引き起こし、低いＩｓｌ−１発現に関連した高ＭａｆＡ発現が、インスリン産生細胞とソマトスタチン産生細胞との分離に重要であることを示唆する。
【０２４２】
実施例７：肝臓から膵臓への分化転換に対するＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの個々の貢献の解析
分化転換プロセスの系列的特徴は、機能の時間的利得の研究によって特定された。転写因子、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの各々の、階層的発達プロセスに対する別個の貢献に関するさらなる解析は、相対的かつ時間的「低減機能」アプローチによって行った。成体ヒト肝細胞を、直接時間的かつ系列的再プログラム化プロトコル（処置Ｃ）によって処置し、そこから異所性ｐＴＦのうちの１つを省略した。省略されたｐＴＦを、同様の感染多重度においてβ−ｇａｌ発現を運ぶ対照アデノウイルスによって置換した。具体的に、成体ヒト肝細胞を、直接「階層的」系列的感染順によって処置した（処置Ｃ、図３Ａ及び表１）。１つの単一転写因子（ｐＴＦ）を、ある時点で省略し、同一ｍｏｉのＡｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌによって置換した。Ｐｄｘ−１の省略は、（Ｃ−Ｐｄｘ−１）として示され、Ｐａｘ４の省略は、（Ｃ−Ｐａｘ４）として示され、ＭａｆＡの省略は、（Ｃ−ＭａｆＡ）として示される。
【０２４３】
ｐＴＦ各々の発現を別個に省略する機能的結果を、分子レベル及び機能レベルで解析した（図６Ａ〜６Ｄ）。別個のＰｄｘ−１及びＭａｆＡ省略（それぞれＣ−Ｐｄｘ−１及びＣ−ＭａｆＡ）は、減少したインスリンプロモーター活性化（図６Ａ）、処理されたインスリン分泌の切断されたグルコース応答（図６Ｂ）、及び減少したＧＬＵＴ２及びＧＫ発現（図６Ｃ）をもたらした。ＭａｆＡの除外は、プロホルモン転換酵素、ＰＣＳＫ２の減少した発現とも関連していた（図６Ｃ）。一方で、Ｐａｘ４の除外（Ｃ−Ｐａｘ４）は、インスリンプロモーター活性化に著しく影響しなかったばかりか、グルコース調節Ｃ−ペプチド分泌にも影響しなかった。Ｐａｘ−４省略は、減少したＧＬＵＴ２及びＰＣＳＫ２発現と関連しており（図６Ｃ）、恐らくは、ＧＫの発現が、ホルモン分泌のグルコース制御能力を得るために十分であることを示唆する。
【０２４４】
内在的に活性化されたｐＴＦ発現のレパートリーに対する時間的かつ別個のｐＴＦ除外の結果の解析を行い、これらの発達的変化を説明した。Ｐｄｘ−１及びＰａｘ４の除外は、大部分の他のｐＴＦ（ＮｅｕｒｏＧ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．２、及びＰａｘ６）の発現において顕著な減退を引き起こし、漸増する分化転換効率に対するそれらの潜在的貢献が、それらが内在性膵ＴＦを活性化する能力に関連する（図６Ｄ）。一方で、ＭａｆＡの除外は、内在性ｐＴＦ発現のさらなる活性化に貢献せず、恐らくは、膵β細胞においてのみ遅く制限された発現を反映する。対照的に、増加したインスリンプロモーター活性、プロホルモン処理、及びそのグルコース調節分泌に対するＭａｆＡの貢献は、減少したＩｓｌ−１発現とのみ関連していた（図６Ｄ）。これらのデータは、ＭａｆＡが、内在性ｐＴＦ発現及び肝臓から膵臓への分化転換の効率のさらなる促進に関与しないが、むしろ分化転換細胞の成熟の促進に関与することを示唆し得る。
【０２４５】
実施例８：ＩＳＬ−１は、分化転換細胞のβ細胞系統への成熟を防止する
β細胞様成熟に対するＭａｆＡの効果は、それがＩｓｌ１発現を抑制する能力と部分的に関連し得る。この仮説を検証するために、異所性Ｉｓｌ１を、アデノウイルス感染（Ａｄ−Ｉｓｌ１）によって分化転換細胞に導入した。簡潔に言うと、成体ヒト肝細胞を、直接「階層的」系列的感染順（処置Ｃ）によって処置し、Ａｄ−Ｉｓｌ１（１または１００ＭＯＩ）で３日目に補充した（Ｃ＋Ｉｓｌ１）。
【０２４６】
上に示されるように、直接階層様式での３つのｐＴＦの系列的投与（処置Ｃ）は、増加した分化転換効率及び新たに生成された細胞の、β細胞系統に沿った成熟の両方をもたらした。Ｉｓｌ１は、３日目にＭａｆＡと共同投与された（Ｃ＋Ｉｓｌ１）。実際に、３日目のＩｓｌ１過剰発現は、異種プロモーターの制御下で、インスリン遺伝子発現の大幅な減少及びグルコース調節（プロ）インスリン分泌の切断をもたらした（図７Ａ〜７Ｃ）。グルコース感知能力の喪失は、減少したＧＬＵＴ２発現と関連していた（図７Ｃ）。これらの結果は、分化転換プロトコルの最終段階における調節解除したＩｓｌ１発現が、β細胞系統に沿った成熟を潜在的に妨害し、低ＭａｆＡ発現下での切断された成熟を部分的に説明し得ることを示唆する。
【０２４７】
まとめると、これらのデータは、β細胞系統に沿って分化転換肝細胞成熟を促進することにおけるｐＴＦの直接階層的発現が、重要な義務的役割を果たすことを示唆する。さらに、系列的発達プロセスは、膵β細胞系統に沿った分化転換細胞の成熟を促進または妨害し得る、ｐＴＦの活性化及び抑制の両方と関連する。
【０２４８】
実施例９：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの階層的投与は、グルカゴン及びソマトスタチン発現を誘導する
内分泌膵系統に沿った分化転換は、多数の膵ホルモンの発現の活性化をもたらす。これらのホルモン発現レベルがｐＴＦの時間的操作によって影響される程度も調査した。膵ホルモングルカゴン（ＧＣＧ）（図８Ａ及び８Ｂ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）（図８Ａ、８Ｄ、及び８Ｅ）、または細胞特異的転写因子（図８Ｃ）の遺伝子発現を、示された処置後の定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２４９】
グルカゴン（ＧＣＧ）遺伝子及びソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子両方の転写は、個々に発現したｐＴＦの各々によって、主にＰｄｘ−１及びＭａｆＡによって誘導され、Ｐａｘ４によってより低い程度で誘導された（図８Ａ）。グルカゴン遺伝子転写のさらなる増加は、ｐＴＦの直接階層的投与時のみに起こった（図４Ａ、処置Ｃを参照されたい）。Ｐｄｘ−１及びＭａｆＡは、それぞれα−細胞特異的転写因子ＡＲＸ及びＢＲＡＩＮ４またはＡＲＸ単独の活性化と関連するプロセスにおいて、グルカゴン発現に対するそれらの効果を発揮した（図８Ｃ）。大部分の処置によって影響されないままであるソマトスタチン遺伝子発現（図８Ａ及び８Ｄ）は、時間的プロトコルが異所性Ｐａｘ４発現によって終了した場合に増加した（Ｅ＝Ｐｄｘ−１→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）。この系列的プロトコルはまた、グルコース調節（プロ）インスリン分泌に対する悪化の原因となるような影響を呈し、増加したＩｓｌ１内在性発現と関連していた（図３Ｃ及び３Ｅ）。β細胞系統に沿った切断成熟は、増加したソマトスタチン遺伝子発現及び増加したソマトスタチン陽性細胞数と関連していた（図８Ｆ）。細胞の多くは、ソマトスタチン及びインスリン共局在化を呈した（データ図示せず）。
【０２５０】
実施例６で考察される階層的投与（処置Ｃ）からの各ｐＴＦの除外も用いて、グルカゴン及びソマトスタチン発現における個々のｐＴＦの役割をさらに調査した（図８Ｂ及び８Ｄ）。Ｐａｘ４除外は、ソマトスタチン遺伝子発現を実質的に低減し、この遺伝子の転写を誘導することにおけるその潜在的な役割を示唆する（図８Ｄ）。興味深いことに、発達的プロセスの最後でのＭａｆＡの除外もまた、ソマトスタチン遺伝子発現を実質的に増加させ、ソマトスタチン遺伝子発現に対するＭａｆＡの潜在的な阻害効果を示唆する。この効果はまた、Ｉｓｌ１発現を抑制するＭａｆＡの能力に起因し得る。この仮説を説明するために、ソマトスタチン遺伝子発現に対する異所性Ｉｓｌ１の効果を解析した。実際に、ＭａｆＡと併せた３日目のＡｄ−Ｉｓｌ１投与（Ｃ＋Ｉｓｌ１）は、ソマトスタチン遺伝子発現を増加させ（図８Ｅ）、一方でインスリン遺伝子発現、ホルモン産生、及び分泌を減少させた（図８Ａ、８Ｂ、及び図７Ａ〜７Ｃ）。これらの実験条件下で、インスリン産生細胞の４０％が、ソマトスタチンに関して陽性染色し、ソマトスタチン単独を発現する細胞は極めて少なかった。
【０２５１】
これらの結果は、β細胞への分化転換細胞の成熟の一部が、分化転換プロセスの後期段階におけるＭａｆＡ発現に起因することを示唆する。この段階で、ＭａｆＡは、それがＩｓｌ１発現を阻害する能力と関連するプロセスにおいてソマトスタチン発現を制限する。
【０２５２】
図９は、膵転写因子の提案された機構が、肝臓から膵臓への分化転換を誘導したことを示す。ｐＴＦの各々は、制限数のヒト肝細胞において、中度のβ細胞様表現型を活性化することができる。ｐＴＦの協奏発現は、肝臓から内分泌膵臓への分化転換を顕著に増加させる。しかしながら、新たに生成された細胞は未熟であり、インスリン及びソマトスタチンの両方を共発現する。直接階層的様式での同じ因子の系列的投与のみが、分化転換効率及びβ細胞系統に沿った分化転換細胞の成熟の両方を増加させる。
【０２５３】
実施例１０：インビボで分化転換能力を有する細胞集団の特定
分化転換能力を有する細胞集団は、マウスにおいてインビボで特定された。Ｐｄｘ−１遺伝子の異所性発現は、マウス肝臓内で達成された。肝臓の細胞の約４０〜５０％における異所性Ｐｄｘ−１遺伝子の均一発現にもかかわらず（図１０Ａ）（非特許文献５６、及び非特許文献４４）、Ｐｄｘ−１処置したマウスにおけるインビボでのインスリン産生細胞（ＩＰＣ）は、主に中心静脈の近くに位置し（図１０Ｂ）、活性Ｗｎｔシグナル伝達及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）の発現を特徴とする（図１Ｃ）。ＧＳ発現の共局在化及びＰｄｘ−１によるインスリン活性化はまた、ＧＳＲＥを活性化することができるそれらの細胞が、増加した分化転換能力の素因を有することを示した。したがって、分化転換の素因がある細胞集団もまた、ＧＳＲＥ活性化または活性Ｗｎｔシグナル伝達経路によって特定され得る。
【０２５４】
実施例１１：アデノウイルスを使用して分化転換の素因があるヒト肝細胞を特定する
この実施例は、分化転換の素因があるヒト肝細胞を特定する組み換えアデノウイルスの使用を示す。培養下のヒト肝細胞は、細胞内ＷＮｔシグナル伝達経路及びＧＳの発現の活性化に関して異種性である。ＧＳは中心周辺肝細胞内で固有に発現されるため、したがってＧＳＲＥ（ＧＳ調節要素）を活性化する能力を、関連細胞の単離の選択的パラメータとして使用することができる。
【０２５５】
加えて、ＧＳＲＥは、ＳＴＡＴ３結合要素も含有するため、分化転換に対する細胞の素因は、この要素によって媒介され得る。ＳＴＡＴ３経路はまた、再プログラム化または分化転換の素因を有する細胞の付与に関与し得る（図１０Ａ〜１０Ｄ、１１、１４Ａ〜１４Ｅ、及び１９）。
【０２５６】
実施例１２：ＧＳＲＥは、培養下のヒト肝細胞の１３〜１５％を繰り返し標的とする。
ＧＳＲＥは、ＴＣＦ／ＬＥＦ及びＳＴＡＴ５結合要素を含む（図１１）。最小ＴＫプロモーターに操作可能に結合されたＧＳＲＥ（図１１）の制御下で、ｅＧＦＰ遺伝子またはＰｄｘ−１遺伝子の発現を運ぶ２つの組み換えアデノウイルスが生成された。これらのアデノウイルスは、Ｐｄｘ−１（図１２Ａ）またはｅＧＦＰ（図１２Ｂ）のいずれかの発現を駆動した。両方のタンパク質は、培養下のヒト肝細胞の約１３〜１５％において繰り返し発現され、特定の肝細胞集団の標的を示唆する。
【０２５７】
実施例１３：ＧＳＲＥ駆動型ＰＤＸ−１は、肝細胞におけるインスリン産生の活性化において、ＣＭＶ駆動型ＰＤＸ−１より効率的である。
ＧＳＲＥ駆動型ＰＤＸ−１の繰り返し発現にもかかわらず、培養下の脂肪の約１３＋２％のみが、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１によって誘導されるものと同様またはそれより高い分化転換能力を示し、培養下の細胞の６０〜８０％におけるＰｄｘ−１発現を駆動する（図１３）。ＧＳＲＥ活性化細胞は、培養下の成体ヒト肝細胞全体の分化転換能力の大部分を説明し得る。インスリン産生は、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１処置細胞の１％と比較して、Ａｄ−ＧＳＲＥ−Ｐｄｘ−１処置時にＰｄｘ−１陽性細胞の２５％において起こった。
【０２５８】
実施例１４：レンチウイルスを使用して、ＧＳＲＥ＋細胞をＥＧＦＰによって永続的に標識する
レンチウイルス構成体を使用して、永続的系統追跡を行った。肝細胞内のケラチノサイトまたはアルブミン発現におけるＫＲＴ５を追跡するために最近使用されている修飾された二重レンチウイルス系によって、ＧＳＲＥ活性に関するインビトロ系統追跡を行った。このレンチウイルス系（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｃｕｒｉｅ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）Ｐｒｏｆ．Ｐ．Ｒａｖａｓｓａｒｄとの共同、図１２）には、ＣＭＶ−ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄ２−ｌｏｘＰ−ｅＧＦＰ（Ｒ／Ｇ）レポーター、ならびにＧＳＲＥ及び最小ＴＫプロモーター（Ｐｒｏｆ．Ｇａｕｎｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ、図３Ａからの寛大な寄贈）の制御下で、Ｃｒｅ組み換え酵素の発現を運ぶ追加のレンチウイルスベクターが含まれる。故に、ＧＳＲＥ活性化細胞は、ｅＧＦＰ（ｅＧＦＰ＋）によって不可逆的にマークされるが、二重感染した細胞の残りは、ＤｓＲｅｄ２（ＤｓＲｅｄ２＋）によってマークされる。細胞の１０〜１４％は、１０日未満以内にｅＧＦＰ＋になった（図１４Ｂ）。セルソーターによって細胞を分離し（図１４Ａ〜１４Ｅ）、別個に増殖させた（図１５Ａ）。ｅＧＦＰ＋（ＧＳＲＥ活性因子）及びＤｓＲｅｄ２＋細胞の培養物を、１０人の異なるヒトドナー（３〜６０歳）から生成した。
【０２５９】
実施例１５：ＥＧＦＲ＋細胞は、一貫して優れた分化転換能力を呈した
ＧＳＲＥ活性に従い、系統追跡によって分離されたヒト肝細胞は、効率的に増殖し（図１５Ａ）、組み換えアデノウイルスによって同様に効率的に感染した。ｅＧＦＰ＋細胞は、培養下のヒト膵島（図１６Ａ）、グルコース調節インスリン分泌（図１６Ｂ）、及びグルコース調節Ｃ−ペプチド分泌（図１６Ｃ）に相当する、インスリン及びグルカゴン遺伝子発現によって提示される優れた分化転換能力（図１６Ａ〜１６Ｃ）を一貫して呈した。これらの能力は一貫し、広範囲の細胞増殖時に減少しなかった（図１７）。
【０２６０】
実施例１６：分化転換の素因がある細胞の特徴付け
ヒト肝細胞の別個の分化転換効率に潜在的に影響し得る因子を特定するために、２つの別個の集団の網羅的遺伝子発現プロファイルを、マイクロアレイチップ解析を使用して比較した。３人の異なるドナーに由来し、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞に分離されたヒト肝細胞培養物を、４継代にわたって増殖させた。抽出されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、一般ヒトアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  ２．０  Ａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してマイクロアレイチップ解析にかけた。遺伝子の大部分が、分離群に相当するレベルで発現されたが、約８００プローブの発現は、著しく異なっていた（図１８）。マイクロアレイチップ解析に従い、膜タンパク質をコードする約１００遺伝子は、分化転換しやすい（ｅＧＦＰ＋）細胞と非応答（ＤｓＲｅｄ２＋）細胞との間で差次的に発現される。これらのマーカーのうちのいくつかを、表２Ａ及び２Ｂに提示する。
【０２６１】
【表２Ａ】
2018502574.tif 000010
【０２６２】
【表２Ｂ】
2018502574.tif 000011
【０２６３】
図４７は、表２Ｂに提示された細胞表面分子の相対発現を示す。特定された分子の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって試験し、β−アクチン発現に対して標準化した。マイクロアレイデータは、ｅＧＦＰ＋細胞とＤｓＲｅｄ２＋細胞との間の差次的発現である、多数の膜タンパク質を示唆した（倍数＝ＤｓＲｅｄ２＋（ｌｏｇ２）と比較したｅＧＦＰ＋差次的発現）。全ての提示された抗原は、商業的に入手可能な抗体を有する。
【０２６４】
実施例１７：ＷＮＴシグナル伝達は、分化転換の素因がある細胞において活性である
肝臓分帯は、活性化β−カテニンレベルの勾配によって制御されることが示唆されてきたが、肝臓内の大部分の細胞は、非常に低いβ−カテニン活性を含み、中心周辺肝細胞は、活性Ｗｎｔシグナル伝達と関連した高いβ−カテニン活性を発現する。Ｗｎｔシグナル伝達は、競合β細胞活性に必須であるため、肝臓におけるｐＴＦ誘導型膵系統活性化は、プライオリが活性Ｗｎｔシグナル伝達を示す細胞に制限される。
【０２６５】
ＧＳＲＥは、ＧＳの５′エンハンサーから単離されたＴＣＦ調節要素を用いた。Ｐｄｘ−１誘導型肝臓から膵臓への分化転換が、細胞内Ｗｎｔシグナル伝達経路によって部分的に媒介される場合、Ｗｎｔシグナル伝達経路を変調する因子もまた、分化転換効率に影響し得る（図１９）。
【０２６６】
成体ヒト肝細胞におけるこのデータは、漸増濃度のＷｎｔ３ａが、Ｐｄｘ−１誘導型グルコース調節インスリン分泌を増加させ、一方ＤＫＫ３（Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤）が、プロセスに対するＰｄｘ−１の効果を完全に排除したことを示唆する（図１９）。ＤＫＫ３はまた、ＧＳＲＥを活性化する能力に従って単離されたｅＧＦＰ細胞の分化転換能力を完全に排除した（図２０）。
【０２６７】
ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ＋細胞集団におけるＷｎｔシグナル伝達経路活性の特徴付けを行った。β−カテニン不安定化、故にＷｎｔシグナル伝達の減少に関与するＡＰＣ発現は、ｅＧＦＰ＋細胞内よりもＤｓＲｅｄ２＋細胞において７００％高かった（図２１Ａ、インビボで示された分帯と相対的に一致する）。ｅＧＦＰ＋集団は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞において解析されたレベルと比較して、活性化β−カテニンレベルを増加させた（４０％）（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。これらのデータは、ＧＳＲＥ活性化の能力があり、分化転換の素因がある細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達が活性であることを示す。
【０２６８】
実施例１８：ＰＡＸ４及びＮＥＵＲＯＤ１によって誘導された分化転換の効率を比較する
目的
【０２６９】
この研究の目的は、Ａｄ−ＰＤＸ−１によって誘導される分化転換プロセスを促進することにおいて、ＰＡＸ４及びＮｅｕｒｏＤ１アデノウイルス（Ａｄ−ＰＡＸ４及びＡｄ−ＮｅｕｒｏＤ１）を比較することであった。
【０２７０】
材料及び方法
【０２７１】
Ａｄ−ＰＡＸ４またはＡｄ−ＮｅｕｒｏＤ１によって誘導される分化転換効率の比較を、ヒト対象Ｍｕｈａｍｍａｄ、Ｐｅｄｒｏ、及びＤｉｅｇｏから入手された３つのナイーブ培養物（未分類の一次肝細胞）、ならびにグルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）活性化（ＧＳ富化）の分類に続く４つの一次肝細胞培養物、Ｓｈａｌｏｓｈ、Ｅｄｅｎ、Ｍｕｈａｍｍａｄ、及びＹａｍに対して行った。
【０２７２】
実験設計
【０２７３】
実験の初日に、表３に従い、１００ｍｍＦａｌｃｏｎ皿上のウイルス感染後に、３００，０００個の細胞を播種した。実験の３日目に、細胞を計数し、Ａｄ−ＭａｆＡによって処置し、６ウェル皿のうち３ウェルに最終濃度１００，０００細胞／ウェルまで播種した。実験の６日目に、放射免疫測定を使用し、インスリン分泌に関して細胞を解析した。ＫＲＢ中の２ｍＭグルコース（低）または１７．５ｍＭグルコース（高）のいずれかを用いた１５分間の細胞のインキュベーションに続いて、インスリン分泌を測定した。
【０２７４】
【表３】
2018502574.tif 000012
【０２７５】
結果
【０２７６】
結果を表４、ならびに図２４Ａ〜２４Ｂ及び２５Ａ〜２５Ｄに要約する。
【０２７７】
【表４】
2018502574.tif 000013
【０２７８】
【表５】
2018502574.tif 000014
【０２７９】
２つの膵転写因子間で詳細な比較を行った。強化されたＧＳ発現（ＧＳ富化）の分類によって富化されたナイーブ一次肝細胞及び肝細胞集団の混合集団に関して比較を行った。
【０２８０】
図２４Ａ〜２４Ｂ及び２５Ａ〜２５Ｄは、棒グラフとして表にしたデータを提示する。
【０２８１】
インスリン分泌測定は、ＰＡＸ４またはＮｅｕｒｏＤ１を使用して誘導された分化転換において統計的差異がないことを明らかにした。この結論は、ナイーブ細胞及び富化ＧＳ細胞の両方に対して真であった。同じ傾向を示したのは、富化されたＧＳ集団及びナイーブ細胞の平均だけでなく、同じ培養物Ｍｕｈａｍｍａｄナイーブ及び富化Ｍｕｈａｍｍａｄ  ＧＳの結果を調べたときに、同じ結果が得られた（分化転換プロセスのためのモデル系として役立つＧＳ富化集団の能力を示す）。
【０２８２】
以前の結果は、ＧＳ富化集団が、分化転換効率に関して、完全肝細胞一次培養物を超える明らかな利点を有することを示した。したがって、ＧＳ富化集団及びＭｕｈａｍｍａｄの未分類集団が、同様の結果を示した（統計的有意性なし）のは驚くべきことであった。しかしながら、両方の集団の継代数に差異があったことを述べるべきである。ＧＳ富化集団は、１９継代において調べ、ナイーブ集団は、７継代において調べた。これらの結果は、ＧＳ富化集団が有効な分化転換を受けるのに失敗したと捉えるべきではなく、ＧＳ富化集団が高次継代において分化転換を受ける能力として捉えるべきであり、これはナイーブ細胞が達成できない場合がある。
【０２８３】
ＮｅｕｒｏＤ１でインキュベートされた細胞と比較して、ＰＡＸ４でインキュベートされた細胞の細胞死に有意差はなかった。明らかであった唯一の差異は、処置群（Ａｄ−ＰＡＸ４／Ａｄ−ＮｅｕｒｏＤ１）と比較して、対照群（未処置／Ａｄ−ヌル）のものであった。これは、総インスリンに関する結果を調べるか、またはｎｇ  ＩＮＳ／１０＾６細胞／時に関する結果を調べるかを問わず、ＰＡＸ４及びＮｅｕｒｏＤ１に関して至った同じ結論によって見られる。
【０２８４】
観察された１つの差異は、分化転換効率（特定のアデノウイルスを使用したときに得られた陽性分化転換のパーセント）を算出したときであった。Ａｄ−ＮｅｕｒｏＤ１の場合、効率は、８７．５％であり（８実験のうち７陽性分化転換）、Ａｄ−ＰＡＸ４の場合、７１％であった（７実験のうち５陽性分化転換）。
【０２８５】
結論
【０２８６】
Ａｄ−ＰＡＸ４及びＡｄ−ＮｅｕｒｏＤ１の両方は、同様の肝細胞の分化転換を支持する。
【０２８７】
実施例１９：分化転換プロセスに最適なプロトコルを決定する
目的
【０２８８】
この研究の目的は、完全な階層（１＋１＋１プロトコル）、２＋１プロトコルによる、及び３つのアデノウイルス全ての同時感染による分化転換効率を比較することであった。
【０２８９】
試験システム
【０２９０】
ＤＭＥＭ  １ｇ／Ｌグルコース中で成長させたヒト肝細胞、Ｌｅｏｎ、Ｍｕｈａｍｍａｄ、及びＰｅｄｒｏの３つの一次培養物上で異なる分化転換プロトコルを調べた。ウイルス感染後に、細胞を、５ｎＭ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、及び１０ｍＭニコチンアミドで補充したＤＭＥＭ  １ｇ／Ｌグルコース培地中で成長させた。
【０２９１】
実験設計
【０２９２】
異なる分化転換（ＴＤ）プロトコルを、以下の表６に従って調べた。簡潔に言うと、実験の初日に、３００，０００個の細胞を、ウイルス感染後に、プロコルＡ（ヌル）、Ｂ（２＋１）、及びＥ（階層１＋１＋１）に関する下の表６に従って、１００ｍｍ  Ｆａｌｃｏｎ皿上に播種した。実験の２日目に、プロトコルＣの場合（３因子同時）、１００，０００個の細胞を６ウェル皿上に播種し、プロトコルＤの場合（３因子同時）、７０，０００個の細胞を６ウェル皿上に播種した。実験の３日目に、細胞を計数し、Ａｄ−ＭａｆＡ（プロトコルＢ及びＥ）によって処置し、６ウェル皿のうちの３ウェル上に、最終濃度の１００，０００細胞／ウェルまで播種した。
【０２９３】
【表６】
2018502574.tif 000015
＊ＧＳＩＳ−グルコース刺激インスリン分泌
【０２９４】
実験の６日目に、２ｍＭグルコース（低）または１７．５ｍＭグルコース（高）の存在下で、細胞を分泌解析にかけた（図２６Ａ〜２６Ｃ）。ＫＲＢ中の２ｍＭグルコースまたは１７．５ｍＭグルコースを用いた１５分間の細胞のインキュベーションに続いて、インスリン分泌を測定した。
【０２９５】
結果及び解析
【０２９６】
本研究は、分化転換プロセスのための最適なプロトコルを決定することを目的とした。伝統的な階層プロトコル（１＋１＋１）において、細胞を３つの転写因子で系列的に処置した（１日目にＰＤＸ１、２日目にＮｅｕｒｏＤ１、及び３日目にＭａｆＡ）。効率的かつ容易なプロトコルを発達させる試みにおいて、伝統的なプロトコルの分化転換効率を、２＋１プロトコル及び提示された３つの転写因子全ての同時処置と比較した。
【０２９７】
この審査のためのリードアウトアッセイは、インスリン分泌であった。当該分野における知識に従い、効率における差異は、細胞の成熟においてのみ、例えば、Ｃ−ペプチド分泌によって測定されるように提示されるはずであるため、全ての処置は、同様レベルのインスリン分泌を提示したはずである。しかしながら、本実験において、インスリン分泌測定によって明らかに見られるように、分化転換効率に予想外の差異が存在した（図２６Ａ〜２６Ｃ）。最良の結果は、２＋１プロトコルにおいて得られた。これらの結果は、以下の表７に示されるように、統計的に有意であった。
【０２９８】
【表７】
2018502574.tif 000016
【０２９９】
２＋１プロトコル及び階層プロトコルのｐ値は、有意であるが、比較的高い。３つの因子全てによる同時処置は、２つの播種密度を調べたにもかかわらず最低の結果を提示した（階層プロトコルと比較して有意でない）。
【０３００】
実施例２０：ペトリ皿からＸＰＡＮＳＩＯＮマルチプレートバイオリアクターへの肝細胞増殖プロセスの産業化
目的
【０３０１】
前臨床適用のための細胞皿内のバイオプロセスが開発され、肝細胞増殖の後に、インスリン産生細胞への肝細胞分化転換が続く、２つの主なステップを含んでいた。ヒト臨床治験における患者の処置の場合、患者１人当たり約１０億個細胞の用量要件を使用して、１型糖尿病における高血糖を改善することになる。かかる産生規模は、細胞培養皿プロセス（図２７上）製造戦略では提供されない大きな培養表面積を必要とする。故に、この研究の目標は、ＸＰＡＮＳＩＯＮプラットフォーム（バイオリアクターシステム、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、細胞ベースの細胞培養皿プロセスを産業化することであった。
【０３０２】
材料及び方法
【０３０３】
使用される材料を以下に列挙する。
ｉ．生体材料：ヒト成体肝由来細胞（一次培養物）。
ｉｉ．成長培地：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号２１８８５−０２５）（１０％熱不活化胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１０５００−０６４）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アンフォテリシンＢ（１００Ｘ）（Ｌｏｎｚａカタログ番号１７−７４５Ｅ）、及び５ｎＭ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｅ７１４４で補充）
ｉｉｉ．他の試薬：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａカタログ番号１７−５１２Ｑ）、及びＴｒｙｐＬＥ＊Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１２５６３−０２９）。
ｉｖ．細胞培養サポート：ＣｅｌｌＢＩＮＤ＊ＣｅｌｌＳｔａｃｋ＊２−、５−、及び１０−チャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号ＣＯＳ−３３１０、ＣＯＳ−３３１１、及びＣＯＳ−３３２０）、Ｘｐａｎｓｉｏｎ  ５０プレート（ＸＰ−５０）バイオリアクター（カタログ番号ＸＰＡＮ０５０００００００）及びＸｐａｎｓｉｏｎ  ２００プレート（ＸＰ−２００）バイオリアクター（カタログ番号８１０１５５）。
ｖ．Ｐａｌｌの連続遠心分離のための細胞回収キット（アイテム６１０００４３）
ｖｉ．遠心分離対照：５００ｍＬ遠心分離ボウル内の細胞回収システム対照
【０３０４】
方法は、図２７に提示されるプロセスフローチャートに従う。簡潔に言うと、前培養は、伝統的なマルチトレイ培養として行った。継代１４及び１５において、細胞をＸｐａｎｓｉｏｎバイオリアクター（複数可）内で使用した。使用されるバイオリアクターシステムは、汚染の危険性を低減するために閉鎖系である。マルチトレイ培養は、細胞成長対照としてＸｐａｎｓｉｏｎ培養と平行して行った（ｐＨのコントローラー設定点：７．３〜７．６、溶存酸素（ＤＯ）：５０％より上で維持）。目標播種密度は、各継代で４，０００細胞／ｃｍ２であった。
【０３０５】
培養期間は、７〜９日であり、培地交換は２〜４日毎に適用して（ＸＰ−５０：４、６、及び８日目−ＸＰ−２００：４及び７日目）、培養物全体で０．５ｇ／Ｌを超えるグルコースレベルを維持した。
【０３０６】
結果
【０３０７】
ここに提示される結果は、ペトリ皿からＸｐａｎｓｉｏｎ  ２００バイオリアクター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）へのヒト肝由来細胞増殖相の良好なスケールアップを示す。
【０３０８】
細胞成長−図２８に提示される細胞増幅プロファイルは、細胞が最初の前培養ステップから最終バイオリアクター（ＸＰ−２００）培養への急激な成長相にあることを明らかに示す。４継代以内に、細胞は、２００万個から約１８億個へと増幅し、１，０００倍のバイオマス増加を表す。したがって、ヒト肝由来一次細胞の大規模産生の実現性が明らかに示され、目標の１０億細胞／患者、さらにはＸＰ−２００当たりほぼ１８億細胞／患者が達成された。
【０３０９】
継代１は、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ１０（ＣＳ１０）において実行し、継代２は、２×ＣＳ１０において実行し、継代３は、ＸＰ５０において実行し、継代４は、ＸＰ２００において実行した。
【０３１０】
集団倍加時間（ＰＤＴ）比較は、ヒト肝由来一次細胞が、伝統的なマルチトレイシステムよりＸｐａｎｓｉｏｎバイオリアクターにおいてより速く増殖したことを明らかにした（図２９）。採取した細胞密度は、Ｘｐａｎｓｉｏｎ  ５０バイオリアクターにおいて約１５，０００細胞／ｃｍ２、Ｘｐａｎｓｉｏｎ  ２００バイオリアクターにおいて１４，０００細胞／ｃｍ２であり、それらそれぞれのマルチトレイ対象の約１６０％を表す。より良い培養環境（ｐＨ、ＤＯ）の制御が、この結果を説明する主な仮説である。
【０３１１】
ｐＨ、溶存酸素、及びＸｐａｎｓｉｏｎバイオリアクター内の温度制御傾向（ｐＨ及びＤＯ）を、それぞれの予想範囲内で維持した（図３０）。ＤＯは、プロセス全体を通して空気飽和の最大５０％を維持し、ｐＨは、プロセスの最後の高い細胞数に起因して、各培養の最後の２日間に７．４から７．２へと漸次減少させた。両方の培養中に同様の傾向が観察され、良好な再現性及びスケーラビリティを示す。
【０３１２】
Ｏｖｉｚｉｏホログラフ顕微鏡（Ｏｖｉｚｉｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ／Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用する顕微鏡観察
【０３１３】
細胞合流及び形態論は、細胞療法プロセスにおいて監視するための重要なパラメータである。このために、Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクター内の上位１０プレートの観察を可能にする顕微鏡を使用した。
【０３１４】
図３１Ａ〜３１Ｄに提示される顕微鏡画像は、Ｘｐａｎｓｉｏｎプレート全体でヒト肝由来一次細胞の均一分布を確認する。細胞合流は、培養の９日後におよそ９０％であると決定され、ＸＰ−５０及びＸＰ−２００バイオリアクターの両方において等しいと推定された（図３１Ａ及び３１Ｂ）。５０プレート及び２００プレートスケールの両方で、Ｘｐａｎｓｉｏｎシステム内の合流は、対照マルチトレイシステムからのものよりわずかに高かった。これらの画像はまた、細胞形態論が、Ｘｐａｎｓｉｏｎシステム内の良好な培養によって、または細胞回収に使用される連続遠心分離によって影響されなかったことを示す。マルチトレイプロセスを使用して成長させた対照細胞を、図３１Ｃ及び３１Ｄに示す。Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクターを使用するヒト肝由来一次細胞増殖が、分化転換特性または分化転換細胞のインスリン分泌プロファイルを変化させなかったことを示した（データ図示せず）。
【０３１５】
結論
【０３１６】
バイオリアクターを良好に使用して、ヒト成体肝由来細胞増殖プロセスをスケールアップした。本明細書における結果は、バイオリアクタープラットフォームを含むプロセスを使用することによって、細胞が１００万個から最大１８億個の細胞へと容易に増殖し得ることを示す。このレベルのスケールアップは、潜在的に、糖尿病を標的とする細胞ベース自己療法中の患者への投与に対して１８億個の細胞を入手可能にする。これを、細胞皿プロセス、例えば、ペトリ皿を使用して産生されたわずか７００万個の細胞と比較する（データ図示せず）。重要なことに、バイオリアクターを使用するプロセスは、細胞の生存性、分化転換の能力、及び細胞のインスリン分泌プロファイルを保存した。
【０３１７】
実施例２１：糖尿病の治療のための自己インスリン産生（ＡＩＰ）細胞を産生するためのプロトコル
目的
【０３１８】
この研究の目的は、糖尿病の治療のために、非β膵細胞から自己インスリン産生（ＡＩＰ）細胞を産生するための産業スケールのプロトコルを開発することであった。患者自身の既存の臓器から生成された新たな機能的組織を用いて、機能不全の膵インスリン産生β細胞を機能的に補正することによって、細胞ベース自己療法は、対象における糖尿病を良好に標的とすることができる。
【０３１９】
本明細書に提示されるプロトコルは、転写因子誘導型分化転換によってヒト肝由来細胞を機能的インスリン産生細胞に変換することを目的とした分子的及び細胞的アプローチを用いる（図３２）。この治療的アプローチは、自己インスリン産生（ＡＩＰ）細胞を産業規模で生成し、ドナーからの組織入手可能性の不足を克服する。
【０３２０】
プロトコルの概要
【０３２１】
図３３は、本明細書に提供されるプロトコルの概要を提供し、各ステップにおけるおよその細胞数に沿って、生検から６週間の最終産生までのおよその時間を示す。図３４は、ヒトインスリン産生細胞産物製造プロセスのフローチャートを提示し、一実施形態において、自己由来または同種異系インスリン産生細胞（ＡＩＰ）であり得る。詳細を以下に提供する。
【０３２２】
肝組織を入手する  図３４のステップ１
【０３２３】
肝組織は、成体ヒト対象から入手した。入手した全ての肝組織は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの承認を得て受領した。したがって、全ての肝組織ドナーは、インフォームドコンセントにサインし、ドナースクリーニング及びドナー試験を行って、感染もしくは悪性疾患の臨床的もしくは身体的証拠、またはその危険因子を有するドナーからの検体が、ヒトインスリン産生細胞の製造から除外されたことを保証した。
【０３２４】
肝検体は、有資格の訓練された外科医によって手術室において入手された。約２〜４ｇのサイズの肝組織の検体を、適格患者から採取し、２〜８℃で滅菌バッグに入ったウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液中でＧＭＰ施設に輸送した。
【０３２５】
インビトロ培養／図３４のステップ２及び３
【０３２６】
製造施設において、肝検体を付着細胞に関して処理した。簡潔に言うと、生検組織を薄いスライスに切断し、Ｉ型コラゲナーゼによって２０分間３７℃で消化した。後次に、単離された単一細胞を得るために、細胞をトリプシンで繰り返し消化した。初期実験は、検体１グラム当たりおよそ０．５×１０６個の細胞が単離され得ることを示した。
【０３２７】
次いで、細胞を、１０％  ＦＣＳ、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及び抗生物質の混合（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシンＢ）で補充した細胞培地中でエクスビボで増幅させた。前処置したフィブロネクチンコーティング組織培養皿を使用して、５％ＣＯ２／９５％空気の湿潤雰囲気下、３７℃で細胞を継代させた（最大２０継代）。検体プレーティング後最初の３日間は毎日培地を変えて、非付着細胞を除去し、第１細胞継代後は１週間に２回変えた。第１細胞継代の時点で、少なくとも１分量の細胞を凍結保存した（以下を参照されたい。図３４のオプショナルステップ）。
【０３２８】
細胞を、所望の数の細胞が生成されるまで（約１０〜３０億個の細胞、約４〜７週間以内）、トリプシンを使用して１：３で継代した。細胞の増幅には、およそ４週間〜７週間における、実施例２０に記載され、図３３に示されるマルチプレートシステムの使用が含まれる。（図３４のステップ３）
【０３２９】
組織培養プレートに付着したヒト肝細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経て効率的に増殖した。これらのＥＭＴ様細胞のほぼ１００％が、既知の間葉的特徴（ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、及びＣＤ７３）を示したが、アルブミン及びＡＡＴ等の成体肝マーカーも発現した。細胞は、肝芽細胞も「幹細胞性」マーカーも発現しない。以下の表８は、分化転換（ＴＤ）前の培養肝細胞上の間葉、造血、及び肝マーカーの存在に関する、これらのＥＭＴ様培養肝細胞の解析の結果を示す。
【０３３０】
【表８】
2018502574.tif 000017
【０３３１】
表８に示されるパーセンテージは、低い継代数におけるものである。
【０３３２】
継代１細胞の凍結保存（図３４）
【０３３３】
簡潔に言うと、継代１細胞を、２ｍＬ凍結保存バイアル中の１０％  ＦＢＳ及び１０％  ＤＭＳＯで補充したＤＭＥＭ中で凍結保存した（最小０．５×１０６細胞）。できる限り最早の継代で細胞を凍結保存することが推奨される。冷凍細胞を、最初に−７０℃で２４〜４８時間保存し、次いで長期貯蔵のために液体Ｎ２に移した。
【０３３４】
凍結保存した細胞の解凍（図３４）
【０３３５】
凍結保存した細胞は、当該技術分野において周知の方法を使用して解凍した。簡潔に言うと、バイアルを液体Ｎ２から取り出し、側面は解凍されたが中心が依然として凍結している状態までゆっくり解凍した。細胞を、組織培養プレートに静かに移した。一旦細胞がプレートに付着すると、細胞培養物を増幅させるインビトロ処理（図３４のステップ２及び３）を行った。
【０３３６】
素因がある肝細胞を選別する（図３４）
【０３３７】
図３４のステップ３におけるオプションは、分化転換の素因がある細胞を富化するために、一次肝細胞を分類することである。例えば、細胞は、本明細書において上記の実施例１０〜１５に記載される、グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）活性化（ＧＳ富化細胞）に関して分類され得る。代替として、細胞は、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を有するために富化され得、それらは、本明細書において上記の実施例１７に記載される、Ｗｎｔシグナル伝達に応答する素因がある。加えて、細胞は、ある特定の遺伝子の発現の増加または減少、例えば、本明細書において上記の実施例１６に記載される、ＡＢＣＢ１、１ＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、もしくはＰＲＮＰの発現の減少、またはこれらの任意の組み合わせ、またはＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、ＢＭＰＲ２、ＩＴＧＡ６、ＤＣＢＬＤ２、ＴＨＢＳ１、もしくはＶＡＭＰ４の発現の増加、またはこれらの任意の組み合わせを監視することによって富化され得る。細胞集団は、細胞の分化転換への素因を強化するために、実施例２３に記載されるように、リチウムで処置され得る。分化転換への素因の強化に続いて、細胞を図３４のステップ４で使用した。
【０３３８】
分化転換（図３４のステップ４）
【０３３９】
分化転換の場合、細胞を追加の５日間にわたって分化転換培地中で成長させた。分化転換培地は、１０％  ＦＣＳ、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ニコチンアミド、ＥＧＦ、及び抗生物質の混合（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシンＢ）で補充したダルベッコ最小必須培地（１ｇ／Ｌのグルコース）である。
【０３４０】
２つの異なるプロトコルを、細胞の分化転換に使用した。階層（１＋１＋１）系列的プロトコルを使用するか、または２＋１プロトコルを使用して細胞を分化転換した。各方法の実施例を以下に提供する。
【０３４１】
階層（１＋１＋１）系列的プロトコル
【０３４２】
次いで、エクスビボで増幅した肝細胞に、３血清型−５組み換え複製欠乏アデノウイルスベクターを感染させ、各々が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で膵転写因子（ｐＴＦ）、ＰＤＸ−１、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、またはＭａｆＡのうちの１つのヒト遺伝子を運ぶ。３つのヒトｐＴＦ遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＦＧＡＤベクターの同じ骨格に挿入されてきた。ＣＭＶプロモーターは、通常は感染後３〜４週間以内に遮断される異種プロモーターである。それにもかかわらず、異所性ｐＴＦ遺伝子の短期発現は、内在性ヒト相同体を誘導するのに十分であった。
【０３４３】
ＦＧＡＤベクターは、発達的再指向を誘導するための差次的遺伝子送達ツールとして選別された。上記実施例は、一次成体ヒト肝細胞のこれらの異所性遺伝子の導入は、成体細胞の再プログラム化の不可逆的プロセスの短期トリガーとして作用する。一方で、組み換えアデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれず、したがって遺伝子情報の宿主配列を破壊しないため、比較的安全であった。ＰＤＸ−１は、クロマチン構造において後成的変化を誘導し、故にそうでなければサイレントな遺伝子情報の活性化を許す一方で、発現された遺伝子の宿主レパートリーを遮断する（表８及び１０の結果を比較する）。
【０３４４】
閉鎖自動Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクターシステム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、図３３に提示されるステップの流れに従って分化転換プロセスを行った。バイオリアクターシステムを、高細胞濃度に適した条件下で、細胞培養物の養成に使用した。バイオリアクターシステムは、２つの主なシステム、制御システム及びバイオリアクター自体（容器及び付属品）で構成された。
【０３４５】
プロセスのパラメータを監視し、プローブ用コネクター、モーター及びポンプ、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ガス制御システム、及び温度制御のためのインキュベーター内の場所を含む、制御コンソールによって制御された。制御されたプロセスパラメータ（温度、ｐＨ、ＤＯ等）は、オペレーターインターフェース上に表示され、指定されたコントローラーによって監視され得る。
【０３４６】
バイオリアクター内の細胞培養成長手順
【０３４７】
２５０±５０×１０６細胞を、無菌ＸＰ−２００バイオリアクター内に播種した。バイオリアクター内の成長培地を、以下の条件、３７℃、７０％溶存酸素（ＤＯ）、及びｐＨ７．３で保持した。ＤＯ値を７０％及びｐＨ値を７．３で保持するために、フィルター処理したガス（空気、ＣＯ２、Ｎ２及びＯ２）を、制御システムによって決定されるように供給した。培地グルコース濃度が５００ｍｇ／Ｌを下回って減少したとき、成長培地を変えた。培地は、無菌シリコーン管を使用して供給容器からバイオリアクターに圧送した。全ての管接続は、無菌コネクターを提供する管溶接器により行った。グルコース、乳酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、及びアンモニウム濃度の決定のために、成長培地の試料を、１〜２日毎に採取した。細胞培養物のグルコース消費速度及び乳酸塩形成速度は、細胞成長速度を測定するのを可能にした。これらのパラメータを使用し、蓄積された実験データに基づいて採取時間を決定した。
【０３４８】
バイオリアクターからの細胞の採取
【０３４９】
細胞採取プロセスは、成長相の最後（８〜１６日）に開始した。培養物を、クラス−１００層領域内で以下のように採取した。
【０３５０】
重力を使用し、配管を介して、バイオリアクター容器の中身を廃物容器に移した。次いで、バイオリアクター容器を２２Ｌの予熱したＰＢＳ（３７℃）で再充填した。配管を介し、圧力または重力によって、ＰＢＳを廃物瓶に排出した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３５１】
細胞を表面から離すために、２２Ｌの３７℃に予熱したトリプシン−ＥＤＴＡ（トリプシン０．２５％、ＥＤＴＡ１ｍＭ）をバイオリアクター容器に付加した。５００ｍＬ  ＦＢＳをバイオリアクター容器に付加し、細胞懸濁液を無菌容器に収集した。細胞懸濁液を遠心分離し（６００ＲＰＭ、１０分、４℃）、培養培地中に再懸濁した。
【０３５２】
階層（１＋１＋１）ウイルス感染ステップ
【０３５３】
異所性導入遺伝子を、３日連続で組み換えアデノウイルスにより系列的に投与した。異所性遺伝子の系列的投与は、分化転換効率を増加させると共に、具体的にβ細胞系統及び機能に沿って、細胞の成熟を増加させることが記録されてきた。
【０３５４】
分化転換手順は、およそ７日を要し、その最後に、細胞を洗浄して組み込まれなかった組み換えアデノウイルスを除去した。簡潔に言うと、
【０３５５】
１日目に、再懸濁した細胞に、１，０００のＭＯＩを使用して、ＰＤＸ−１アデノウイルスベクターを感染させた。次いで、培養皿の上に播種された細胞を、５％  ＣＯ２を供給した過失した３７℃インキュベーター内で終夜インキュベートする。
【０３５６】
２日目に、細胞を、トリプシンを使用して培養皿から取り出し、再懸濁した。再懸濁した細胞に、２５０のＭＯＩを使用して、ＮｅｕｒｏＤ１アデノウイルスベクターに感染させた。次いで、培養皿の上に播種された細胞を、５％  ＣＯ２が供給された加湿した３７℃インキュベーター内で終夜インキュベートする。
【０３５７】
３日目に、細胞を、トリプシンを使用して培養皿から取り出し、再懸濁した。再懸濁した細胞に、５０のＭＯＩを使用して、ＭａｆＡアデノウイルスベクターを感染させた。次いで、培養皿の上に播種された細胞を、５％  ＣＯ２が供給された加湿した３７℃インキュベーター内で３日間インキュベートする。
【０３５８】
次いで、細胞を回収し、マーカー及びグルコース調節処理されたインスリン分泌について解析した。対照細胞は、同じプロトコルに従うが、アデノウイルスを付加しないで増殖及びインキュベートされたものを含んでいた。
【０３５９】
材料及び実験方法
【０３６０】
膜マーカー−細胞のＦＡＣＳ解析は、以下のようにモノクローナル抗体で染色した。４００，０００〜６００，０００個の細胞を、５ｍＬの試験管内の０．１ｍＬフローサイトメーター緩衝液中に懸濁し、暗所、室温（ＲＴ）で１５分間、以下のものクローナル抗体（ＭＡｂ）の各々を用いてインキュベートした。
【表９】
2018502574.tif 000018
【０３６１】
ＡＩＰ細胞を採取する（図３４のステップ５）次いで、細胞をフローサイトメーター緩衝液で２回洗浄し、再懸濁して、ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーによって解析した。陰性対照を、関連アイソタイプ蛍光分子で調製した。
【０３６２】
パッケージ化及び発送
【０３６３】
製造の最後に、ＡＩＰ細胞は、出荷用にパッケージ化され、製造場所において発送されることになる。ＡＩＰ細胞を２〜８℃で病院に出荷することが計画されている。
【０３６４】
階層（１＋１＋１）プロトコルの結果
【０３６５】
細胞のアデノウイルス感染は、導入遺伝子の一時発現をもたらし、これが内在性遺伝子の永続的誘導を誘起し、ＡＩＰ細胞への安定した分化転換をもたらす（データ図示せず）。結果として、最終産物におけるウイルスＤＮＡの修飾または挿入はなかった。
【０３６６】
採取したＡＩＰ細胞の解析（図３４のステップ６）
【０３６７】
間葉、造血、及び肝マーカーの存在に関する分化転換肝細胞（ＡＩＰ細胞）の解析を、表１０に提示する。陰性マーカーには、造血マーカーが含まれる。
【０３６８】
【表１０】
2018502574.tif 000019
【０３６９】
Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクターにおいて異なる患者試料にわたって変動性が認められたが、全ての例において、採取した細胞の細胞密度は、出発培養物と比較して大幅に増加した（図３５）。
【０３７０】
採取したＡＩＰ細胞産物を解析して、多数のマーカーの発現を特定した。識別は、ＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳによるものであった。以下の表１１及び１２に提示される結果は、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、Ｎｋｘ６．１、及びインスリンを含むβ−細胞膵マーカー遺伝子の内在性発現の倍数増加を示す。
【０３７１】
【表１１】
2018502574.tif 000020
【０３７２】
【表１２】
2018502574.tif 000021
【０３７３】
図３６Ａ及び３６Ｂに提示される棒グラフは、階層プロトコルの使用に続いて得られた典型的な結果を示す。分化転換肝細胞（ＡＩＰ細胞）と、膵細胞及び非分化転換肝細胞の対照集団との比較が提示され、ＡＩＰ細胞が、対照と比較して膵細胞マーカーの著しい増加を示すことがわかる。
【０３７４】
ＡＩＰ細胞の機能の肝臓対膵臓表現型に関する細胞のさらなる特徴付けの結果を、以下の表１３に提示する。膵細胞マーカーの増加と複合されたＰＤＸ−１細胞中の肝マーカーの著しい減少は、肝細胞の、膵β細胞表現型及び機能を有する細胞への良好な変換を示す。
【０３７５】
【表１３】
2018502574.tif 000022
【０３７６】
採取したＡＩＰ細胞の集団内の死細胞に関する解析は、細胞の２０％未満が死亡したことを示した（データ図示せず）。
【０３７７】
採取したＡＩＰ細胞産物は、インスリンの機能分泌についても解析した。図３７は、ＡＩＰ細胞産物能力を示す（ＥＬＩＳＡを使用して測定される、インスリンのグルコース調節分泌）。試験したＡＩＰ細胞産物は、ＸＰ−２００バイオリアクター内で増幅されていた分化転換細胞集団を表す。ＧＳＩＳによってインスリン分泌を測定した（ＫＲＢ＋０．１％  ＢＳＡ  ＲＩＡグレードまたは組み換えＢＳＡによる、低（２ｍＭ）及び高（１７．５ｍＭ）グルコース濃度でのグルコース刺激インスリン分泌）。１時間当たりの細胞１００万個当たりのｎｇインスリンとして結果を提示し、ＡＩＰ細胞の応答の著しい増加を示す。
【０３７８】
２＋１分化転換（ＴＤ）プロトコル
【０３７９】
図３８は、Ｘｐａｎｓｉｏｎバイオリアクターシステムならびにプロセス対照を使用する、「２＋１」ＴＤプロトコルを提示する。マルチシステムバイオリアクターと複合した「２＋１」ＴＤプロトコルを使用することの結果は、このプロトコルの実現性を示し、ＡＩＰ産物細胞を効率的に産生した。第１の感染は、２つのアデノウイルスベクター（１つはＰＤＸ−１をコードする核酸を含み、もう１つはＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む）上のＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードした核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかを使用して３日目に行った。ＰＤＸ−１の場合、ＭＯＩは１：１，０００であり、ＮｅｕｒｏＤ１の場合、１：２５０であった。次いで、細胞を３日間インキュベートし、ＭａｆＡ（１：５０  ＭＯＩ）をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを使用して、６日目に第２の感染を行った。２日後の８日目に細胞を採取し、階層（１＋１＋１）プロトコルを使用した場合の上記と同様に、品質管理マーカーについてスクリーニングした。
【０３８０】
第２の感染時（６日目）の細胞培養物の観察は、使用した条件から独立して同様の合流を示した（図３９及び４０Ａ〜４０Ｂ）。最終採取の時点で、ＣＴＬ（対照）条件下で処理された細胞は、他の条件よりわずかに高い合流を提示した（図４１）。細胞密度の差異は、主に異なる播種密度、細胞回収率、及び感染後の致死率に起因していた。
【０３８１】
採取された細胞のインスリン含有量をアッセイし、図４２に提示される結果は、未処置の対照と比較して（ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＭａｆＡをコードする核酸を含むウイルスベクターに感染していない）、試験した３つの２＋１プロトコル全てにおいて分化転換した細胞について、増加したインスリン含有量（マイクロインターナショナル単位／１００万細胞）を示す。提示されたプロセス対照条件は、未処置細胞より著しく高いインスリン含有量（約２．５倍高い）をもたらす傾向を予想した。Ｘｐａｎｓｉｏｎ対照条件はまた、処置細胞が、未処置の細胞より著しく高いインスリン含有量（約１．７倍高い）を提示するという予想傾向を提示した。Ｘｐａｎｓｉｏｎ  １０システムにおいて分化転換した細胞は、Ｘｐａｎｓｉｏｎ対照条件の処置細胞と同様のインスリン含有量を提示した（未処置の対照より約１．７倍高い）。
【０３８２】
「２＋１」分化転換プロトコルの使用は、未処置肝細胞より著しく高いインスリン含有量を有するＡＩＰ細胞産物を産生することにおいて効率的であった（ステップ数及び細胞喪失の機会を低減した）。
【０３８３】
純度アッセイ
【０３８４】
純度アッセイを開発して、増幅及び分化転換ステップ中の細胞の９０％超が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様表現型を有することを保証した（上記の方法を参照されたい）。これらの純度アッセイは、分化転換に使用されるプロトコルから独立して使用した。養成したＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４に関して陽性染色するはずである。加えて、ＭＳＣは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、またはＣＤ７９＃、及びＨＬＡ−ＤＲ表面分子について陰性であるはずである。以前の結果（図４４Ａ及び４４Ｂ）は、ＭＳＣマーカーが、経時的、及び肝細胞の分化転換中に安定していたことを示した。ＡＩＰ細胞のＭＳＣ様表現型を示す結果を、表６及び７に提示する。フローサイトメトリー及び免疫蛍光アッセイの両方を使用して、これらのパラメータを調べた。
【０３８５】
実施例２２：消化方法の解析
目的
【０３８６】
この研究の目的は、異なる消化方法が、肝細胞がアデノウイルスによって形質導入される能力に影響しないことを検証することであった。
【０３８７】
方法
【０３８８】
簡潔に言うと、肝細胞に、Ａｄ．ＣＭＶ．ＧＦＰを感染させ、ＧＦＰの発現を９６時間後に測定した。肝細胞に、１０、１００、及び５００ｍｏｉのＡｄ５．ＣＭＶ．ＧＦＰウイルスを形質導入するか、または未処置のまま放置した。９６時間後に、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡によって（図４５Ａ、図４６Ａ）、及びＦＡＣＳによって（図４５Ｂ〜４５Ｃ、図４６Ｂ〜４６Ｃ）測定した。
【０３８９】
結果
【０３９０】
図４５Ａ〜４５Ｃは、Ｓｅｒｖａ及びＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎコラゲナーゼによる肝臓の消化に由来する、ＢＰ００１細胞の形質導入の効率を示す。形質導入細胞のパーセンテージは同様であったが、Ｓｅｒｖａコラゲナーゼで消化された肝臓は、ＧＦＰ蛍光強度によって示されるように、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎコラゲナーゼで消化された肝臓より多くのＧＦＰを産生した（図４５Ｂ及び４５Ｃ）。同様に、ＴＳ００１細胞の形質導入効率は、Ｓｅｒｖａコラゲナーゼによって影響されなかった（図４６Ａ〜４６Ｃ）。
【０３９１】
実施例２３：分化転換前のＷＮＴ処置は、分化転換能力を改善する
目的
【０３９２】
この研究の目的は、細胞集団内の分化転換能力を改善することであった。
【０３９３】
実施例１７において上述されるように、活性ＷＮＴシグナル伝達は、ｅＧＦＰ＋素因がある集団を特徴付けた。上記の実験は、ＷＮＴシグナル伝達の誘導が、分化転換転写因子と共に適用されたときに分化転換効率を改善したことを示したが、ｅＧＦＰ＋内の既存のＷＮＴシグナル伝達が、それらの分化運命を再指向する能力の増加と関連するかどうかを示さなかった。
【０３９４】
方法
【０３９５】
ＷＮＴシグナル伝達が分化転換の能力を細胞に付与するかどうかを試験するために、ｅＧＦＰ＋細胞を、１０ｍＭリチウム（Ｌｉ）で、分化転換因子の付加前に４８時間処置した。次いで、膵転写因子を付加したときにリチウムを培地から除去した。
【０３９６】
結果
【０３９７】
分化転換時に、Ｌｉで前処置した細胞は、インスリン分泌の増加（図４８Ａ）、ならびに膵遺伝子の発現（図４８Ｂ）を示し、ＷＮＴシグナル伝達が、「内蔵型」シグナル経路であり、細胞が効率的な分化転換を受けるのを可能にすることを示す。興味深いことに、内在性ＰＤＸ−１発現レベルは、Ｌｉ前処置によって上方調節されず（図４８Ｃ）、後期ＷＮＴシグナルが安定した膵レパートリーに必須であることを示唆する。
【０３９８】
本明細書に開示される、ある特定の特徴が本明細書において例証及び説明されてきたが、ここで多くの修正、置換、変更、及び同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、かかる修正及び変更の全てを網羅し、本明細書に開示される真の趣旨に含まれるものとして意図されることを理解されたい。
【図１Ａ】
2018502574.tif 000023
【図１Ｂ】
2018502574.tif 000024
【図１Ｃ】
2018502574.tif 000025
【図１Ｄ】
2018502574.tif 000026
【図２Ａ】
2018502574.tif 000027
【図２Ｂ】
2018502574.tif 000028
【図２Ｃ】
2018502574.tif 000029
【図２Ｄ】
2018502574.tif 000030
【図３Ａ】
2018502574.tif 000031
【図３Ｂ】
2018502574.tif 000032
【図３Ｃ】
2018502574.tif 000033
【図３Ｄ】
2018502574.tif 000034
【図３Ｅ】
2018502574.tif 000035
【図４Ａ】
2018502574.tif 000036
【図４Ｂ】
2018502574.tif 000037
【図４Ｃ】
2018502574.tif 000038
【図５Ａ】
2018502574.tif 000039
【図５Ｂ】
2018502574.tif 000040
【図６Ａ】
2018502574.tif 000041
【図６Ｂ】
2018502574.tif 000042
【図６Ｃ】
2018502574.tif 000043
【図６Ｄ】
2018502574.tif 000044
【図７Ａ】
2018502574.tif 000045
【図７Ｂ】
2018502574.tif 000046
【図７Ｃ】
2018502574.tif 000047
【図８Ａ】
2018502574.tif 000048
【図８Ｂ】
2018502574.tif 000049
【図８Ｃ】
2018502574.tif 000050
【図８Ｄ】
2018502574.tif 000051
【図８Ｅ】
2018502574.tif 000052
【図８Ｆ】
2018502574.tif 000053
【図８Ｇ】
2018502574.tif 000054
【図９】
2018502574.tif 000055
【図１０Ａ】
2018502574.tif 000056
【図１０Ｂ】
2018502574.tif 000057
【図１０Ｃ】
2018502574.tif 000058
【図１０Ｄ】
2018502574.tif 000059
【図１１】
2018502574.tif 000060
【図１２】
2018502574.tif 000061
【図１３】
2018502574.tif 000062
【図１４Ａ】
2018502574.tif 000063
【図１４Ｂ】
2018502574.tif 000064
【図１４Ｃ】
2018502574.tif 000065
【図１４Ｄ】
2018502574.tif 000066
【図１４Ｅ】
2018502574.tif 000067
【図１５】
2018502574.tif 000068
【図１６Ａ】
2018502574.tif 000069
【図１６Ｂ】
2018502574.tif 000070
【図１６Ｃ】
2018502574.tif 000071
【図１７】
2018502574.tif 000072
【図１８】
2018502574.tif 000073
【図１９】
2018502574.tif 000074
【図２０】
2018502574.tif 000075
【図２１Ａ】
2018502574.tif 000076
【図２１Ｂ】
2018502574.tif 000077
【図２１Ｃ】
2018502574.tif 000078
【図２２】
2018502574.tif 000079
【図２３】
2018502574.tif 000080
【図２４Ａ】
2018502574.tif 000081
【図２４Ｂ】
2018502574.tif 000082
【図２５Ａ】
2018502574.tif 000083
【図２５Ｂ】
2018502574.tif 000084
【図２５Ｃ】
2018502574.tif 000085
【図２５Ｄ】
2018502574.tif 000086
【図２６Ａ】
2018502574.tif 000087
【図２６Ｂ】
2018502574.tif 000088
【図２６Ｃ】
2018502574.tif 000089
【図２７】
2018502574.tif 000090
【図２８】
2018502574.tif 000091
【図２９】
2018502574.tif 000092
【図３０】
2018502574.tif 000093
【図３１】
2018502574.tif 000094
【図３２】
2018502574.tif 000095
【図３３】
2018502574.tif 000096
【図３４】
2018502574.tif 000097
【図３５】
2018502574.tif 000098
【図３６Ａ】
2018502574.tif 000099
【図３６Ｂ】
2018502574.tif 000100
【図３７】
2018502574.tif 000101
【図３８】
2018502574.tif 000102
【図３９】
2018502574.tif 000103
【図４０Ａ】
2018502574.tif 000104
【図４０Ｂ】
2018502574.tif 000105
【図４１】
2018502574.tif 000106
【図４２】
2018502574.tif 000107
【図４３】
2018502574.tif 000108
【図４４Ａ】
2018502574.tif 000109
【図４４Ｂ】
2018502574.tif 000110
【図４５Ａ】
2018502574.tif 000111
【図４５Ｂ】
2018502574.tif 000112
【図４５Ｃ】
2018502574.tif 000113
【図４６Ａ】
2018502574.tif 000114
【図４６Ｂ】
2018502574.tif 000115
【図４６Ｃ】
2018502574.tif 000116
【図４７】
2018502574.tif 000117
【図４８Ａ】
2018502574.tif 000118
【図４８Ｂ】
2018502574.tif 000119
【図４８Ｃ】
2018502574.tif 000120
【配列表】
2018502574000001.app
【国際調査報告】
2018502574.tif 000121
2018502574.tif 000122
2018502574.tif 000123
2018502574.tif 000124
2018502574.tif 000125
2018502574.tif 000126
2018502574.tif 000127