(57)【要約】  新規な抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、およびこのようなＡＤＣを使用して増殖性障害を治療する方法が提供される。
2018511579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体であって、不対システイン残基が、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まない、操作抗体。
【請求項２】
ＩｇＧ１抗体を含む、請求項１に記載の操作抗体。
【請求項３】
操作抗体がＣＬドメインを含み、ＣＬドメインがカッパＣＬドメインを含む、請求項１または２に記載の操作抗体。
【請求項４】
操作抗体がＣＬドメインを含み、ＣＬドメインがラムダＣＬドメインを含む、請求項１または２に記載の操作抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の操作抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の操作抗体。
【請求項７】
２つの不対システイン残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の操作抗体。
【請求項８】
２つの軽鎖を含み、それぞれの軽鎖が、２つの不対システイン残基のうちの１つを含む、請求項７に記載の操作抗体。
【請求項９】
２つの不対システイン残基のそれぞれが、軽鎖のＣＬドメインに存在する、請求項８に記載の操作抗体。
【請求項１０】
２つの不対システイン残基のそれぞれが、軽鎖のＣＬドメインのＣ末端領域に存在する、請求項８に記載の操作抗体。
【請求項１１】
２つの不対システイン残基のそれぞれが、ＣＬドメインの露出したループ構造に位置する、請求項８に記載の操作抗体。
【請求項１２】
２つの不対システイン残基のそれぞれが、ＣＬドメインの残基１２１−１２８、残基１８２−１９１、または残基２０１−２１３のうちのいずれか１つから選択される位置にあり、これらの残基は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされる、請求項８に記載の操作抗体。
【請求項１３】
抗体軽鎖が、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、および配列番号５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＬを含む、請求項８に記載の操作抗体。
【請求項１４】
２つの重鎖を含み、それぞれの重鎖が２つの不対システイン残基のうちの１つを含む、請求項７に記載の操作抗体。
【請求項１５】
２つの不対システイン残基のそれぞれが、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインからなる群から選択される抗体ドメイン内に位置する、請求項１４に記載の操作抗体。
【請求項１６】
１つ以上の不対システイン残基にコンジュゲートしている薬物をさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載の操作抗体。
【請求項１７】
ＤＬＬ３、ＳＥＺ６、およびＣＤ３２４からなる群から選択される決定基と反応する、請求項１から１６のいずれかに記載の操作抗体。
【請求項１８】
式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬物コンジュゲートまたはその医薬として許容される塩
（式中、ａ）Ａｂは、１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体を含み、１つ以上の不対システイン残基は、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まず、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｎは、約１から約１２の整数である）。
【請求項１９】
操作抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項１８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
操作抗体が、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体を含む、請求項１８または１９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
操作抗体が、２つの不対システイン残基を含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
操作抗体が２つの軽鎖を含み、それぞれの軽鎖が、２つの不対システイン残基のうちの１つを含む、請求項２１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
不対システインのそれぞれが、軽鎖のＣＬドメインに存在する、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
薬物が、ドラスタチン、オーリスタチン、カリケアマイシン、マイタンシノイド、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される細胞毒素を含む、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作抗体または請求項１８から２４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
対象におけるがんを治療する方法であって、対象に請求項２５に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２７】
抗体薬物コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体を用意するステップであって、１つ以上の不対システイン残基が、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まない、ステップ、
ｂ）操作抗体を選択的に還元するステップ、および
ｃ）選択的に還元した操作抗体を薬物にコンジュゲートさせるステップ
を含む方法。
【請求項２８】
操作抗体を選択的に還元するステップが、操作抗体を安定化剤と接触させるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上の不対システイン残基が、ＣＬドメインに位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の不対システイン残基が、導入されたシステイン残基または置換されたシステイン残基を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体であって、１つ以上の不対システイン残基が天然の鎖間ジスルフィド結合システインではない、操作抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年３月４日に出願された米国仮出願第６２／１２８，４２４号に対する優先権が主張される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出され参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年３月３日に作成されたこのＡＳＣＩＩのコピーは、「ｓｃ０００４ｐｃｔ＿０３０３１６．ｔｘｔ」という名称であり、サイズが５５４ＫＢ（５６７，４０２バイト）である。
【０００３】
本出願は、概して、細胞毒素にコンジュゲートしている１つ以上の不対システイン残基を有する部位特異的抗体またはその免疫反応性フラグメントを含む新規な化合物、ならびにがんおよびがんの任意の再発または転移の治療または予防のためのこの化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
一般的に用いられている多くのがん療法は、増殖している腫瘍細胞を選択的に標的とすることができないため、実質的な毒性を誘発する傾向にある。むしろ、これらの従来的な化学療法剤は非特異的に作用し、腫瘍細胞とともに正常に増殖している健常な組織を損傷し、または消失させることが多い。この意図しない細胞毒性は、患者が耐え得る投薬量またはレジメンを制限し、これにより、薬剤の治療指数を事実上制限することが極めて多い。結果として、細胞毒性治療剤を腫瘍部位にターゲティングする多数の試みがなされているが、成功の度合いは様々である。１つの有望な研究領域は、治療的に有効な局所化された薬物濃度をもたらすように細胞毒性剤を腫瘍に指向させる抗体の使用が関与している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに関して、選択された細胞毒性剤にコンジュゲートしているターゲティングモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）の使用は、このような細胞毒性ペイロードを比較的高いレベルで腫瘍部位に直接的に送達し、同時に正常組織がこれらに曝露されるのを低減することを実現することは、以前から認識されている。このような抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）の使用は、実験室状況または前臨床状況では広範に検討されているが、病院におけるこれらの実際の使用は、はるかに制限されている。ある特定の場合において、これらの制限は、弱いまたは効果のない毒素を、選択性が十分でないまたは腫瘍に効果的に会合できない腫瘍ターゲティング分子と組み合わせた結果であった。他の場合では、分子構築物は、投与すると不安定であることが判明し、または血流から早く除去されすぎて治療的に有意な濃度で腫瘍部位に蓄積されなかった。このような不安定性は、リンカー選択またはコンジュゲーション手順の結果であり得るが、ターゲティング抗体に毒性ペイロードを過剰に負荷し（すなわち、薬物抗体比すなわち「ＤＡＲ」が高すぎる）、これにより、薬物調製物に不安定なコンジュゲート種が生じることの結果でもあり得る。一部の場合には、構築物の不安定性は、設計に由来するか不安定なＤＡＲ種に由来するかに関係なく、ターゲティングされていないペイロードを身体が除去しようと試みる際に、強力な細胞毒性ペイロードが早期に薬物コンジュゲートから浸出し、注射部位もしくは重要な器官に蓄積されるため、許容できない非特異的な毒性をもたらしている。このため、現在までにＦｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎに認可されているＡＤＣは比較的少数であるが、いくつかのこのような化合物が、現在臨床試験中である。したがって、好ましい治療指数を示す、安定で比較的均質な抗体薬物コンジュゲート調製物が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの目的および他の目的が本発明により提供されるが、本発明は、広義において、好ましい薬物動態特性および薬力学特性を呈する改善された部位特異的抗体およびコンジュゲートを提供する新規な方法、化合物、組成物および製品を対象とする。本発明によって提供される利点は、抗体治療薬および診断薬の分野において広く適用可能であり、様々な標的と反応する抗体と併せて使用することができる。以下で詳細に考察されるように、開示される部位特異的コンジュゲートは、新規な選択的還元技法を使用して治療または診断ペイロードに優先的にコンジュゲートさせることができる１つ以上の不対システインを有する操作抗体構築物を含む。このような部位特異的コンジュゲート調製物は、従来的なコンジュゲート調製物と比較して、比較的安定であり、平均ＤＡＲ分布およびペイロード位置に関して実質的に均質である。添付の実施例に示されるように、開示される部位特異的コンジュゲート調製物の安定性および均質性（平均ＤＡＲ分布およびペイロードの配置の両方に関して）は、治療指数の向上に寄与する好ましい毒性プロファイルをもたらす。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、１つ以上の不対システイン残基を含む部位特異的操作抗体を対象とする。当業者であれば、不対システイン残基が、医薬として活性な部分の選択的な制御されたコンジュゲーションのための部位となって、本明細書の教示に従って操作コンジュゲートを生成することが理解されよう。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの不対システイン残基を含む部位特異的操作ＩｇＧ１アイソタイプ抗体を対象とする。一部の実施形態において、不対システイン残基は、重鎖／重鎖の鎖間残基とは対照的に、重鎖／軽鎖の鎖間残基を含む。他の実施形態において、不対システイン残基は、鎖内ジスルフィド結合（または「鎖内ジスルフィド架橋」）から生成される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、部位特異的操作抗体を構成する軽鎖のＣ２１４残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる）が別の残基と置換されているまたは欠失している、操作抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、操作抗体を構成する重鎖のＣ２２０残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる）が別の残基と置換されているまたは欠失している、操作抗体を提供する。
【００１０】
他の選択された実施形態において、操作抗体は、１つ以上の不対システイン残基を含み、これらの不対システイン残基は、天然の鎖間ジスルフィド結合システインではない。本発明のさらに他の態様は、１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体であって、これらの不対システイン残基が天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まない、操作抗体を対象とする。ある特定の他の態様において、不対システインは、天然のシステインを含まない。
【００１１】
選択された実施形態において、不対システインは、抗体軽鎖のＣＬドメインに存在し、ある特定の態様では、ＣＬドメインのＣ末端領域に存在する。他の選択された実施形態では、遊離システイン残基は、抗体軽鎖の定常領域の露出したループ構造のうちの１つに組み込まれている。このような実施形態において、遊離システイン残基は、（組込みまたは置換によって）残基１２１−１２８、残基１８２−１９１または残基２０１−２１３（Ｋａｂａｔの番号付け）に配置される。他の好ましい実施形態において、遊離システイン残基は、（組込みまたは置換によって）ＣＬ領域のベータシートに露出している残基を含む。
【００１２】
ある特定の選択された態様において、本発明の部位特異的抗体は、少なくとも１つの非天然のシステインを含む軽鎖定常領域を含む。このような実施形態において、軽鎖定常領域は、少なくとも１つの非天然のシステインを含むカッパ軽鎖定常領域または少なくとも１つの非天然のシステインを含むラムダ軽鎖定常領域を含み得る。さらに他の実施形態は、残基位置１２２、１９０、２０６、２０８、２１０、２１１、２１２、または２１３に、少なくとも１つの非天然のシステインを含むカッパ軽鎖定常領域を含む。他の好ましい実施形態において、部位特異的操作抗体は、重鎖および軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３および配列番号５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。
【００１３】
他の実施形態において、操作抗体は、抗体重鎖に位置する不対システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ１ドメイン内に配置される。なおも他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ２ドメインに配置される。なおも他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ３ドメインに配置される。
【００１４】
好ましい実施形態において、部位特異的操作抗体は、腫瘍原性細胞に存在する抗原マーカーと免疫特異的に反応する。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明は、１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体であって、それぞれ腫瘍マーカーであることが知られているＤＬＬ３、ＳＥＺ６、およびＣＤ３２４の群から選択される決定基と反応する操作抗体を対象とする。
【００１５】
関連する実施形態において、部位特異的抗体は、遊離システインが治療剤または診断剤にコンジュゲートしている操作コンジュゲートを作製するために使用される。これに関連して、本発明は、次式の抗体薬物コンジュゲート
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎまたはその医薬として許容される塩（式中、
Ａｂは、１つ以上の不対システイン残基を含む抗体を含み、不対システイン残基は、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まず、
Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
Ｄは、薬物を含み、
ｎは、約１から約１２の整数である）
を含む。
【００１６】
前述の抗体薬物コンジュゲートに加えて、本発明は、開示されるＡＤＣを一般に含む医薬組成物、およびこのようなＡＤＣを使用して、患者におけるがんを含む障害を診断または治療する方法をさらに提供する。特に好ましい実施形態において、操作抗体またはコンジュゲートは、ＤＬＬ３、ＳＥＺ６およびＣＤ３２４からなる群から選択される決定基と会合する。
【００１７】
関連する実施形態において、本発明は、腫瘍細胞または腫瘍原性細胞を殺滅する、その頻度を低下させるまたはその増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞または腫瘍原性細胞を本発明の部位特異的ＡＤＣで処置することを含む方法を対象とする。関連する実施形態において、本発明は、がんを治療する方法であって、対象に本発明の部位特異的コンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体薬物コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）１つ以上の不対システイン残基を含む操作抗体を用意するステップであって、不対システイン残基が、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まない、ステップ、
ｂ）操作抗体を選択的に還元するステップ、および
ｃ）選択的に還元した操作抗体を薬物にコンジュゲートさせるステップ
を含む方法を含む。
【００１９】
関連する好ましい実施形態において、抗体を選択的に還元するステップは、抗体を安定化剤と接触させるステップを含む。さらに別の実施形態において、このプロセスは、抗体を緩徐な還元剤と接触させるステップをさらに含んでもよい。
【００２０】
示されるように、このようなコンジュゲートは、増殖性障害またはその再発もしくは進行の治療、管理、緩和、または予防に使用することができる。本発明の選択された実施形態は、好ましくは腫瘍開始細胞頻度の低下を含む、悪性腫瘍の免疫療法による治療のための、このような部位特異的コンジュゲートの使用を提供する。開示されるＡＤＣは、単独で使用してもよく、または化学療法剤もしくは免疫療法剤（例えば、治療的抗体）または生体応答修飾物質のような広範な抗がん化合物とともに使用してもよい。他の選択された実施形態において、２つ以上の別個の部位特異的抗体薬物コンジュゲートを組み合わせて使用して、抗新生物作用の強化をもたらすことができる。
【００２１】
上述の治療的使用以外にも、本発明の操作コンジュゲートは、障害、具体的には、増殖性障害を検出、診断または分類するために使用され得ることも理解される。これらはまた、このような障害の予後および／またはセラグノシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）において使用することもできる。一部の実施形態において、部位特異的コンジュゲートを対象に投与し、インビボで検出または監視することができる。当業者であれば、このようなモジュレーターを、以下に開示されるエフェクター、マーカー、またはレポーターで標識またはこれらと会合させ、いくつかの標準的な技法（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）のうちのいずれか１つを使用して検出することができることを理解する。
【００２２】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、増殖性障害の診断、検出または監視を、それを必要とする対象においてインビボで行う方法であって、操作コンジュゲートを投与するステップを含む方法を含む。
【００２３】
他の事例において、本コンジュゲートは、当該技術分野で認識されている手順（例えば、免疫組織化学法または「ＩＨＣ」）を使用して、インビトロ診断環境において使用することができる。そのため、好ましい実施形態は、増殖性障害の診断を、それを必要とする対象において行う方法であって、
ａ．対象から組織試料を得るステップ、
ｂ．この組織試料を少なくとも１つの部位特異的コンジュゲートと接触させるステップ、および
ｃ．試料と会合した部位特異的コンジュゲートを検出または定量化するステップ
を含む方法を含む。
【００２４】
このような方法は、本出願と併せて容易に認識することができ、自動プレートリーダー、専用のレポーターシステムなどのような一般的に利用可能な市販の技術を使用して容易に実行することができる。選択された実施形態において、操作コンジュゲートは、試料中に存在する腫瘍永続細胞（すなわち、がん幹細胞）と会合する。他の好ましい実施形態において、検出または定量化ステップは、本明細書に記載されるように監視することができるがん幹細胞頻度の低下を含む。
【００２５】
本発明はまた、がんのような増殖性疾患の治療に有用である、本明細書に開示される部位特異的コンジュゲートおよび本明細書に開示される操作コンジュゲートの医薬組成物を用いる、キットまたはデバイスおよび関連する方法も提供する。この目的で、本発明は、好ましくは、このような障害を治療するのに有用な製品であって、部位特異的抗体薬物コンジュゲートを含む容器、およびコンジュゲートを増殖性障害またはその進行もしくは再発の治療、緩和、または予防に使用するための指示材料を含む、製品を提供する。選択された実施形態において、デバイスおよび関連する方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を接触させるステップを含む。
【００２６】
上記は、概要であり、したがって、必然的に、詳細の単純化、一般化および省略を含み、結果として、当業者であれば、この概要が、例示にすぎず、決して制限することを意図するものではないことを理解する。本明細書に記載される方法、組成物および／またはデバイスおよび／または他の主題の他の態様、特徴および利点は、本明細書に記載される教示において明らかとなる。この概要は、単純化された形式で概念の選択を導入するために提供されており、この概念は、以下の発明を実施するための形態にさらに記載されている。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴または必須の特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲の決定を支援するものとして使用されることを意図するものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】鎖内および鎖間ジスルフィド結合を示すヒトＩｇＧ１抗体の構造の図である。
【図２Ａ】本明細書の実施例に記載されるように単離、クローニングおよび操作された、開示される抗体薬物コンジュゲートと適合性のあるいくつかの例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号５１９−５２３）を、表形式で示す。
【図２Ｂ】本明細書の実施例に記載されるように単離、クローニングおよび操作された、開示される抗体薬物コンジュゲートと適合性のあるいくつかの例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号５２４−５２８）を、表形式で示す。
【図３Ａ】本明細書の実施例に記載されるように単離、クローニングおよび操作された、開示される抗体薬物コンジュゲートと適合性のあるいくつかの例示的なヒト化ＳＥＺ６抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０および１９２）を、表形式で示す。
【図３Ｂ】本明細書の実施例に記載されるように単離、クローニングおよび操作された、開示される抗体薬物コンジュゲートと適合性のあるいくつかの例示的なヒト化ＳＥＺ６抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１および１９３−１９９）を、表形式で示す。
【図４】本明細書の実施例に記載されるように単離、クローニングおよび操作された、開示される抗体薬物コンジュゲートと適合性のある例示的なマウスＣＤ３２４抗体およびヒト化ＣＤ３２４抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号５２９−５３２）を、表形式で示す。
【図５Ａ】本教示に従って生成した例示的な部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０７および５０９−５１０）を示す。
【図５Ｂ】本教示に従って生成した例示的な部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０８および５１１−５１２）を示す。
【図６Ａ】本教示に従って生成した例示的な部位特異的抗ＳＥＺ６抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号５１３および５１５−５１６）を示す。
【図６Ｂ】本教示に従って生成した例示的な部位特異的抗ＳＥＺ６抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号５１４および５１７−５１８）を示す。
【図７】本教示に従って生成した例示的なＣＤ３２４ｓｓ３部位特異的抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４３−５４４）を示す。
【図８】本明細書に記載されるように作製された天然の結合特性および部位特異的構築物の結合特性を示す。
【図９】操作抗体を細胞毒素にコンジュゲートさせるプロセスを示す概略図である。
【図１０Ａ】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）の軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す、グラフ表示である。
【図１０Ｂ】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体（ｈｓＣ１７ｓｓ１−ＡＤＣ）の軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す、グラフ表示である。
【図１１Ａ】ＨＩＣを使用して判定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す、グラフ表示である。
【図１１Ｂ】ＨＩＣを使用して判定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１７ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す、グラフ表示である。
【図１２Ａ】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）の軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図１２Ｂ】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体（ｈｓＣ１７ｓｓ１−ＡＤＣ）の軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図１３Ａ】ＨＩＣを使用して判定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す、グラフ表示である。
【図１３Ｂ】ＨＩＣを使用して判定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１７ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す、グラフ表示である。
【図１４Ａ】ＨＩＣを使用して判定される、安定化剤および／または緩徐な還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す。
【図１４Ｂ】ＨＩＣを使用して判定される、安定化剤および／または緩徐な還元剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１７ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す。
【図１５】ＨＩＣを使用して判定される、様々な安定化剤を使用してコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物（ｈｓＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣ）のＤＡＲ分布を示す。
【図１６】本教示に従って生成される部位特異的抗体を作製するために使用することができる、例示的な軽鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号５０２、５０３および５５０−５６４）を示す。
【図１７】ＨＩＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示す、グラフ表示である。
【図１８】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物から誘導される抗体軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図１９】ＨＩＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を例示する。
【図２０】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物から誘導される抗体軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図２１】ＨＩＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示す。
【図２２】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物から誘導される抗体軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図２３】ＨＩＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示す。
【図２４】ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物から誘導される抗体軽鎖および重鎖のコンジュゲーションの割合を示す。
【図２５】ＨＩＣを使用して判定される、様々な選択的にコンジュゲートさせた部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を例示する。
【図２６】部位特異的カリケアマイシンコンジュゲートがインビトロでＤＬＬ３＋細胞を殺滅させる能力を例示する。
【図２７】部位特異的ドラスタチンコンジュゲートがインビトロでＤＬＬ３＋細胞を殺滅させる能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｉ．序説
本発明は、多数の異なる形態で実施され得るが、本明細書では、本発明の原理を例示する、その特定の例示的な実施形態が開示される。本発明は、例示される特定の実施形態に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。最後に、本開示の目的で、すべての配列識別受託番号は、別途示されない限り、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアーカイブ配列データベースにおいて見出すことができる。
【００２９】
まず、本発明の部位特異的抗体および部位特異的コンジュゲートが、いずれの特定の標的または抗原にも限定されないことに留意することが重要である。むしろ、いずれの既存の抗体または本明細書に記載されるように生成され得るいずれの抗体も、部位特異的抗体に変換することができるため、本発明によって得られる利点は、広く適用可能であり、任意の標的抗原（または決定基）とともに使用することができる。より具体的には、不対システインコンジュゲーション部位およびその選択的還元を使用することによって得られる有益な特性（例えば、コンジュゲート安定性の強化および非特異的毒性の低減）は、特定の標的とは無関係に、治療抗体および診断抗体に広く適用可能である。したがって、ある特定の非限定的な決定基が、本発明の利点の説明および実証の目的で使用されているが、それらは、決して、その範囲を制限するものではない。
【００３０】
いずれの場合においても、本発明の部位特異的抗体コンジュゲートは、それらを治療用化合物および組成物として使用するのに特に好適なものにする、好ましい特徴を呈することが見出されている。この点に関して、本明細書に記載されるコンジュゲートは、様々な増殖性障害と関連することが見出され、有効な治療剤であることが示されている決定基と、免疫特異的に反応する。加えて、ある特定の好ましい実施形態において、本発明の構築物は、分子操作技法を通じて得られる、天然のジスルフィド結合の破壊に由来する特定のシステイン位置における選択的コンジュゲーションを提供する。他の好ましい実施形態において、また、以下により詳細に考察されるように、不対または遊離システインを操作して、選択された抗体またはその免疫反応性フラグメントに存在する任意の残基部位にすることができる（すなわち、このような部位は、天然に存在するジスルフィド結合の破壊を必要としない）。
【００３１】
遊離システインを事前選択した部位に導入するのか天然のジスルフィド結合を破壊するのかに関係なく、本明細書に記載される抗体の操作は、制御された化学量論的コンジュゲーションをもたらすが、このコンジュゲーションは、薬物対抗体比（「ＤＡＲ」）が、実質的にＤＡＲが均質な調製物の生成がもたらされる精度で、主に一定となることを可能にする。さらに、開示される部位特異的構築物は、さらに、抗体におけるペイロードの位置に関して実質的に均質な調製物を提供する。本明細書に記載されるように安定化剤を使用した操作構築物の選択的コンジュゲーションは、所望されるＤＡＲ種の割合を増加させ、形成される不対または遊離システイン部位とともに、コンジュゲートに安定性および均質性を与え、これにより、細胞毒素の不用意な浸出により引き起こされる非特異的毒性が低減される。遊離システインの選択的コンジュゲーションおよび調製物の相対的均質性（コンジュゲーション位置およびＤＡＲの両方における）によってもたらされるこの毒性の低減はまた、腫瘍部位における細胞毒素ペイロードレベルの増加を可能にする治療指数の向上をもたらす。加えて、結果として得られる部位特異的コンジュゲートは、所望されるＤＡＲ種（例えば、ＤＡＲ＝２）を７５％、８０％、８５％、９０％またはさらには９５％を上回って含む高度に均質な部位特異的コンジュゲート調製物が得られるように、様々なクロマトグラフィー法を使用して任意選択的に精製することができる。このようなコンジュゲートの均質性は、毒性を増加させる可能性のあるＤＡＲが高い望ましくないコンジュゲート不純物（比較的不安定であり得る）を制限することによって、開示される調製物の治療指数をさらに高めることができる。
【００３２】
開示される操作コンジュゲート調製物が呈する好ましい特性は、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを特異的に指向し、形成されるコンジュゲートを、コンジュゲーション位置および絶対ＤＡＲの点で大幅に制限する能力に基づいて予測されることが、理解される。ほとんどの従来的なＡＤＣ調製物とは異なって、本発明は、抗体の部分的還元または完全な還元に完全に依存することなく、ランダムなコンジュゲーション部位および比較的制御されないＤＡＲ種の生成をもたらす。むしろ、本発明は、ターゲティング抗体を操作して天然に存在する（すなわち、「天然の」）鎖間もしくは鎖内ジスルフィド結合を破壊するまたは任意の位置にシステインを導入することによって、１つ以上の所定の不対（または遊離）システイン部位を提供する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基が、標準的な分子操作技法を使用して、抗体（またはその免疫反応性フラグメント）の重鎖もしくは軽鎖の任意の場所に組み込まれるまたはそこに結合され得ることが理解される。他の好ましい実施形態において、天然のジスルフィド結合の破壊は、非天然のシステインの導入（これが、遊離システインを構成する）と組み合わせて実行され、この非天然のシステインが、次いで、コンジュゲーション部位として使用され得る。
【００３３】
遊離システインを提供するための１つまたは複数のシステイン残基の導入または付加（天然に存在するまたは天然のジスルフィド結合または架橋を破壊することとは対照的）に関して、抗体または抗体フラグメントの適合性のある位置は、当業者には容易に認識され得る。本発明において、「ジスルフィド結合」および「ジスルフィド架橋」という用語は、文脈により別途示されない限り、同等であり、互換的に使用することができることに留意されたい。したがって、ある特定の実施形態において、遊離または不対システインは、天然の鎖間ジスルフィド結合システインを含まず、むしろ、非天然の位置へのシステイン残基の導入または鎖内ジスルフィド結合の破壊によって提供される。選択された実施形態において、開示される操作抗体は、１つ以上の不対システイン残基を含み、ここで、これらの不対システイン残基は、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まない。例として、ＩｇＧ１操作抗体を含むこのような実施形態は、遊離システイン残基を、軽鎖のＣ２１４位または重鎖のＣ２２０位、Ｃ２２６位もしくはＣ２２９位（すべてＫａｂａｔの番号付け）に含まない（概して、図１を参照されたい）。当然ながら、天然に存在するジスルフィド結合または天然のジスルフィド結合の位置は、抗体のすべてのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）ならびにすべてのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）で周知であり、それぞれの場合において、当業者であれば、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを容易に認識することができる。
【００３４】
他の選択された実施形態において、不対システイン残基は、重鎖に導入され得る。より具体的には、１つ以上の不対システイン残基は、所望されるＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロードおよび抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組合せに配置され得る。他の好ましい実施形態において、システイン残基は、カッパまたはラムダＣＬドメインに導入され得、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入され得る。それぞれの場合において、システイン挿入の部位に近接する他のアミノ酸残基が、分子の安定性、コンジュゲーション効率を促進する、または結合後のペイロードの保護環境を提供するように、改変、除去、または置換されてもよい。具体的な実施形態において、置換残基は、抗体の任意の利用可能な部位に生じる。このような表面残基をシステインと置換することにより、反応性チオール基が、これによって抗体の容易に利用できる部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように選択的に還元することができる。
【００３５】
したがって、本明細書に使用されるとき、「遊離システイン」または「不対システイン」という用語は、文脈により別途示されない限り、互換的に使用され得、天然に存在するか分子操作技法を使用して選択された残基位置に特異的に組み込まれるかに関係なく、通常の生理学的条件下において同じ抗体の別のシステインに結合していない抗体の任意のシステイン構成要素を意味するものとする。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、遊離システインは、生理学的条件下で天然に存在するジスルフィド結合を破壊するように天然の鎖間または鎖内ジスルフィド架橋パートナーが置換、排除、または他の形で改変されており、それによって、不対システインが部位特異的コンジュゲーションに好適な状態となっている、天然に存在するシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離または不対システインは、抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置される、システイン残基を含む。コンジュゲーション前には、遊離または不対システインは、系の酸化状態に応じて、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングシステイン（酸化）としてまたは同じ抗体上の別の遊離システインとの非天然の分子内ジスルフィド結合（酸化）として、存在し得ることが理解される。以下により詳細に考察されるように、この抗体構築物の緩徐な還元が、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。特に好ましい実施形態において、遊離または不対システイン（天然に存在するか組み込まれたものかに関係なく）が、選択的還元およびその後のコンジュゲーションを受け、開示される均質なＤＡＲ組成物が得られる。
【００３６】
より具体的には、結果として得られる遊離システインが、次いで、本明細書に開示される新規な技法を使用して、無傷な天然のジスルフィド架橋を実質的に破壊することなく、選択的に還元されて、選択されたシステイン部位に優先的に反応性チオールがもたらされ得る。次いで、これらの作製されたチオールは、実質的な非特異的コンジュゲーションを伴うことなく、開示される薬物−リンカー化合物との指向的コンジュゲーションに供される。すなわち、本明細書に開示される操作構築物、および任意選択として、選択的還元技法は、毒素ペイロードの非特異的なランダムコンジュゲーションを大幅に消失させる。有意義なことに、これは、ターゲティング抗体におけるＤＡＲ種の分布およびコンジュゲーション位置の両方が実質的に均質な調製物をもたらす。以下に考察されるように、比較的高ＤＡＲの混入物を消失させることそれ自体が、非特異的毒性を低減させ、調製物の治療指数を向上させ得る。さらに、このような選択性により、ペイロードの大部分を、（軽鎖定常領域の末端領域のような）特に有利な所定の位置に配置することが可能となり、これは、ペイロードが腫瘍に到達するまではある程度保護されるが、標的に到達すると好適に提示され、処理される位置である。したがって、特定のペイロード配置を促進するような操作抗体の設計もまた、開示される調製物の非特異的毒性を低減させるために使用することができる。最後に、選択的および再生可能に抗体のコンジュゲーションを指向する能力により、結果として得られる組成物の特徴付けが大幅に単純化され、これによって、薬物開発が促進される。
【００３７】
以下に考察され、実施例に示されるように、これらの所定の遊離システイン部位の作出は、当該技術分野で認識されている分子操作技法を使用して、システインを抗体上の所定の部位に導入する、またはジスルフィド結合を構成するシステイン残基のうちの１つを除去する、改変するもしくは置き換えることで達成され得る。これらの技法を使用して、当業者であれば、任意の抗体クラスまたはアイソタイプを、本発明に従って選択的にコンジュゲートさせることができる１つ以上の遊離システインを呈するように操作することができることを理解する。さらに、選択された抗体は、所望されるＤＡＲに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはさらには１２個の遊離システインを呈するように操作することができる。より好ましくは、選択された抗体は、２または４つの遊離システインを含むように、さらにより好ましくは２つの遊離システインを含むように、操作される。遊離システインは、非特異的毒性を低減させながら、標的への選択された細胞毒素の送達を促進するように、操作抗体に配置され得ることもまた、理解される。この点に関して、ＩｇＧ１抗体を含む本発明の選択された実施形態は、ペイロードをＣＨ１ドメインに配置し、より好ましくは、ドメインのＣ末端に配置する。他の好ましい実施形態において、構築物は、ペイロードを軽鎖定常領域に配置するように、より好ましくは定常領域のＣ末端に配置するように、操作される。さらに他の選択された態様において、構築物は、ペイロードを、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインに選択的に配置するように操作することができる。
【００３８】
有意義なことに、ペイロードを操作遊離システインに限定することは、以下に記載される新規な安定化剤を使用した構築物の選択的還元によっても促進され得る。本明細書に使用される「選択的還元」とは、操作構築物を、無傷な天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システインを還元する（これによって反応性チオールをもたらす）還元条件に曝露することを意味する。一般に、選択的還元は、無傷なジスルフィド結合を破壊することなく、所望されるチオールをもたらす、任意の還元剤またはその組合せを使用して実行され得る。ある特定の好ましい実施形態において、また以下の実施例に記載されるように、選択的還元は、コンジュゲーションのための操作構築物を調製するために、安定化剤および緩徐な還元条件を使用して実行され得る。本明細書においてより詳細に考察されるように、適合性のある安定化剤は、一般に、それほどストリンジェントでない還元条件下において、遊離システインの還元を促進し、所望されるコンジュゲーションを進行させる。これは、天然のジスルフィド結合の事実上大半が、無傷なままとなることを可能にし、非特異的コンジュゲーションの量を著しく低減させ、これによって、望ましくない混入物および毒性の可能性が制限される。比較的緩徐な還元条件は、いくつかの系を使用することで実現することができるが、好ましくは、チオール含有化合物の使用を含む。当業者であれば、本開示を考慮して、適合性のある還元系を容易に導くことができることが理解される。
【００３９】
ＩＩ．決定基
当業者であれば、操作抗体またはコンジュゲートが、任意の関連する決定基を特異的に認識するまたはそれと会合する任意の抗体から生成され得ることを理解する。本明細書に使用されるとき、「決定基」とは、特定の細胞、細胞集団または組織と識別可能に会合するまたはこれらの内部もしくは表面上に特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカーまたは因子を意味する。決定基は、本質的に、形質学的、機能的または生化学的であり得るが、一般には、表現型である。ある特定の好ましい実施形態において、決定基は、その物理的構造および／もしくは化学組成に関して異なって修飾されたタンパク質、または特定の細胞型によってもしくはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の時点もしくは特定のニッチにおける細胞）によって異なって発現される（上方制御もしくは下方調節される）タンパク質である。本発明の目的で、決定基は、好ましくは、化学修飾、提示形態（例えば、スプライス変異形）、タイミングまたは量から明らかなように、異常細胞によって異なって発現される細胞表面抗原またはタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、決定基は、ＳＥＺ６、ＤＬＬ３もしくはＣＤ３２４タンパク質、またはこれらの変異形、アイソフォームもしくはファミリーメンバーのいずれか、ならびにこれらの特定のドメイン、領域もしくはエピトープを含み得る。「免疫原性決定基」または「抗原性決定基」または「免疫原」または「抗原」とは、免疫応答性動物に導入したときに、免疫応答を刺激することができ、免疫応答から生成される抗体によって認識される、ポリペプチドの任意のフラグメント、領域またはドメインを意味する。本明細書に企図される決定基は、それらの存在（正の決定基）または非存在（負の決定基）によって、細胞、細胞小集団または組織（例えば、腫瘍）を識別することができる。
【００４０】
本明細書に考察され、また以下の実施例に記載されるように、本発明の選択された実施形態は、選択された決定基に免疫特異的に結合するマウス抗体に由来する完全または部分的な可変領域を含み得、このマウス抗体は、「供給源」抗体とみなすことができる。このような実施形態において、本発明によって企図される抗体は、このような「供給源」抗体から、供給源抗体の定常領域またはエピトープに結合するアミノ酸配列の任意選択的な修飾を通じて誘導することができる。一実施形態において、抗体は、供給源抗体における選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せにより改変された場合、供給源抗体から「誘導」される。別の実施形態において、「誘導」抗体は、供給源抗体のフラグメント（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは可変領域全体）が、アクセプター抗体配列と組み合わされるまたはそこに組み込まれて、誘導体抗体（例えば、キメラ、ＣＤＲグラフトまたはヒト化抗体）が得られたものである。有意義なことに、これらの誘導体抗体は、例えば、ドナー抗体の抗原結合領域が、１つ以上の不対システインを含む定常領域と会合した、本発明の部位特異的抗体を含み得る。これらの「誘導」（例えば、キメラ、ヒト化または部位特異的構築物）抗体は、例えば、遊離システインの提供、決定基に対する親和性の向上、細胞培養における産生および収率の改善、インビボでの免疫原性の低減、毒性の低減、活性部分のコンジュゲーションの促進または多重特異的抗体の作製のような様々な理由のために、標準的な分子生物学技法を使用して生成することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、供給源抗体から誘導することもできる。当然ながら、供給源抗体（例えば、マウス抗体）を、抗体構造にさらなる修飾を行うことなく、所望されるコンジュゲーション部位をもたらすように操作してもよいことが理解される。
【００４１】
重ねて、本明細書に記載される部位特異的コンジュゲーション技術は、一般に、抗体治療薬または診断薬の分野において適用可能であり、既存の抗体または抗体標的に関係なく生成することができる任意の抗体とともに機能し得ることを強調すべきである。この文脈において、本発明により得られる利点を示すために使用されるある特定の非限定的な決定基を、以下に記載する。
【００４２】
ＣＤ３２４（Ｅ−カドヘリン、上皮カドヘリンまたはＣＤＨ１としても知られる）は、カドヘリンの古典的サブファミリーのメンバーであり、そのため、同一型（すなわち、上皮−上皮）の細胞間接着を媒介する、カルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質である。ＣＤ３２４の細胞内部分は、α−カテニン、β−カテニンおよびｐ１２０を含む細胞内の様々なタンパク質と相互作用し、それ自体が細胞骨格のアクチンフィラメントと相互作用する（Ｐｅｒｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏら、２００３年）。ＣＤ３２４は、細胞接着機構と細胞骨格との間の架橋として作用し、重層上皮のような組織において細胞を配向するコンパスを細胞に与えると考えられる。がんの発症と関連して、ＣＤ３２４の発現の乱れは、腫瘍形成および転移の初期および後期における主な事象の１つである。構造的に改変されたＣＤ３２４タンパク質またはＣＤ３２４発現の完全な消失をもたらすＣＤＨ１の生殖系変異の不活性化は、胃がん、乳がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、および卵巣がんと相関していた。高分化型腫瘍は、低分化型腫瘍と比較して、ＣＤ３２４／カテニンの強力な染色パターンを呈することが長年知られていた。したがって、ＣＤ３２４は、免疫組織化学的検査によって様々な種類のがんを診断するための重要な予後マーカーとして、病理学者により使用されてきた。細胞の機械的支持の提供、細胞の局在化および運動性の表現型の調節、ならびに細胞の分化状態との関連性におけるＣＤ３２４の機能的役割に関する報告は、ＣＤ３２４を、抗がん療法の開発の非常に興味深い標的としている。ＣＤ３２４遺伝子は、転写され、スプライシングされて、４８１５ｂｐの成熟ｍＲＮＡ転写産物となり、これは、シグナルペプチドを含む８８２個のアミノ酸のプレプロタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する。ＣＤ３２４オルトログは、異なる種の間で十分に保存されており、カドヘリンファミリーの様々なメンバー間の配列相同性は、一般的に高い。ＣＤ３２４タンパク質は、およそ１１０個のアミノ酸の４つの細胞外カドヘリンリピート（ＥＣ１−ＥＣ４）、他のカドヘリンリピートとの関連性が低い膜近接細胞外ドメイン（ＥＣ５）、膜貫通ドメイン、ならびに膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）および高度にリン酸化されたβ−カテニン結合ドメイン（ＣＢＤ）にさらに細分割され得る高度に保存された細胞内ドメインから構成される。カルシウムイオンが、カドヘリンのＥＣリピートの間の部位に結合し、これらのタンパク質の細胞外部分に強固なロッド様構造をもたらす。
【００４３】
ＳＥＺ６（発作関連６相同体としても知られている）は、元々はけいれん薬であるペンチレンテトラゾールで処置したマウスの大脳皮質由来細胞からクローニングされた、Ｉ型膜貫通タンパク質である（Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、１９９５年、ＰＭＩＤ：７７２３６１９）。ＳＥＺ６は、２つのアイソフォームを有し、一方は、９９４アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿８４９１９１）をコードするおよそ４２１０塩基のもの（ＮＭ＿１７８８６０）であり、もう一方は、９９３アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００１０９２１０５）をコードするおよそ４１９４塩基のもの（ＮＭ＿００１０９８６３５）である。これらは、ＥＣＤにおける最後の１０個のアミノ酸残基のみが異なる。ＳＥＺ６は、ＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２の２つの他のファミリーメンバーを有する。「ＳＥＺ６ファミリー」という用語は、ＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＥＺ６Ｌ２およびこれらの様々なアイソフォームを指す。成熟ＳＥＺ６タンパク質は、一連の構造ドメイン：細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインから構成され、細胞外ドメインは、固有のＮ末端ドメイン、続いて２つの交互になったＳｕｓｈｉおよびＣＵＢ様ドメイン、ならびに３つの追加のタンデムＳｕｓｈｉドメインリピートを含む。ヒトＳＥＺ６遺伝子における変異は、体温の上昇を伴うけいれんであり、小児における発作の最も一般的な種類である、熱性発作と関連づけられている（Ｙｕら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７０８６５４３）。相同性および配列分析によって特定されるＳＥＺ６タンパク質の構造モジュールの分析は、シグナル伝達、細胞間連絡、および神経発達における役割の可能性を示唆する。抗ＳＥＺ６ヒト化抗体を、以下に記載されるように、ＳＥＺ６抗原で免疫付与したマウスから単離した抗体から生成した。
【００４４】
以下の実施例に記載されるように、本発明の操作コンジュゲートの特に好ましい決定基は、ＳＥＺ６、ＣＤ３２４およびＤＬＬ３を含む。ＤＬＬ３（デルタ様リガンド３またはＳＣＤＯ１としても知られている）は、Ｎｏｔｃｈ  ＤＳＬリガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルトログとしては、ヒト（受託番号ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受託番号ＮＰ＿０３１８９２）、およびラット（受託番号ＮＰ＿４４６１１８）が挙げられるがこれらに限定されない。ヒトにおいて、ＤＬＬ３遺伝子は、１９ｑ１３染色体に位置する９．５ｋＢｐに及ぶ８つのエクソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングにより、２つのプロセシングされた転写産物が生じ、１つが２３８９塩基（受託番号ＮＭ＿０１６９４１）、もう１つが２０５２塩基（受託番号ＮＭ＿２０３４８６）である。前者の転写産物は、６１８アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿０５８６３７）をコードし、一方で後者は、５８７アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿９８２３５３）をコードする。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメインおよびそれらの膜貫通ドメインにわたり全体として１００％の同一性を共有し、長い方のアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端に３２個の追加の残基を含む延長した細胞質テイルを含むことのみが異なる。
【００４５】
一般に、ＤＳＬリガンドは、一連の構造ドメインから構成されている：固有のＮ末端ドメイン、続いて、保存されたＤＳＬドメイン、複数のタンデム上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピート、膜貫通ドメイン、およびリガンド全体では高度に保存されていないが、固有なＥ３ユビキチンリガーゼによるユビキチン化のための可能性のある部位である複数のリジン残基を含む細胞質ドメイン。ＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用に必要であるが、十分ではない、変性ＥＧＦドメインである。加えて、ほとんどのＤＳＬリガンドの最初の２つのＥＧＦ様リピートは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する際にＤＳＬドメインと協働的に相互作用する、ＤＯＳドメインとして知られるより小さなタンパク質配列モチーフを含む。
【００４６】
ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、ｈＤＬＬ３のアミノ酸残基約２１６−２４９（ドメイン１）、２７４−３１０（ドメイン２）、３１２−３５１（ドメイン３）、３５３−３８９（ドメイン４）、３９１−４２７（ドメイン５）および４２９−４６５（ドメイン６）に生じ、ＤＳＬドメインは、アミノ酸残基約１７６−２１５に生じ、Ｎ末端ドメインは、アミノ酸残基約２７−１７５に生じるとして認識される。ＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインは、別個のアミノ酸配列によって定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的のため、それぞれのＥＧＦ様ドメインは、ＥＧＦ１からＥＧＦ６と称され得、ＥＧＦ１がタンパク質のＮ末端部分に最も近いことに留意されたい。タンパク質の構造組成に関して、本発明の１つの重要な態様は、開示されるＤＬＬ３抗体が、選択されたドメイン、モチーフまたはエピトープと反応するように生成、作製、操作または選択することができることである。ある特定の事例において、このような部位特異的抗体は、それらの主な作用モードに応じて、反応性および／または有効性の強化をもたらすことができる。
【００４７】
本発明と適合性があり、供給源抗体として使用することができる、ＤＬＬ３抗体は、開示される抗体に関して参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ出願第ＵＳ２０１３／００２７３９１号に開示されている。
【００４８】
より一般的に、本発明により企図される操作抗体は、「供給源」抗体から、供給源抗体のエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択的な修飾および部位特異的遊離システイン残基の導入によって、誘導することができる。一実施形態において、操作抗体は、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む操作抗体を産生するように、供給源抗体における選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せにより改変された場合、供給源抗体から「誘導」される。別の実施形態において、「誘導」抗体は、供給源抗体のフラグメント（例えば、１つ以上のＣＤＲ）が、１つ以上の遊離システイン残基を含むアクセプター抗体配列と組み合わされるまたはそこに組み込まれて、誘導体抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）が得られたものである。これらの「誘導」抗体は、例えば、標的に対する親和性の向上、細胞培養における産生および収率の改善、インビボでの免疫原性の低減、毒性の低減、活性部分のコンジュゲーションの促進または多重特異的抗体の作製のような様々な理由のために、生成され得る。最も重要なことには、これらは、１つ以上の医薬として活性な部分の部位特異的コンジュゲーションをもたらす。分子操作の他に、このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、供給源抗体から誘導することもできる。
【００４９】
本発明は、概して、決定基に結合することができる任意の操作抗体を対象とするが、操作抗ＳＥＺ６抗体、操作抗ＤＬＬ３抗体および操作抗ＣＤ３２４抗体が、本発明の実施形態を例示する例として使用されるべきである。
【００５０】
ＩＩＩ．細胞結合剤
１．抗体構造
上に言及されたように、本発明の特に好ましい実施形態は、選択された決定基上の１つ以上のエピトープと優先的に会合する部位特異的抗体またはその免疫反応性フラグメントの形態で、細胞結合剤を有する開示されるコンジュゲートを含む。この点に関して、抗体ならびにその部位特異的変異形および誘導体は、認められている命名法および番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０年）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＣｏｍｐａｎｙまたはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１年）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに広く記載されている。
【００５１】
本出願の目的で、「モジュレーター」および「抗体」という用語は、文脈により別途示されない限り、互換的に使用され得ると理解されることに留意されたい。同様に、考察目的で、本発明の実施形態は、一方の決定基または他方に関して表現され得る。しかしながら、文脈により別途指定または要求されない限り、このような名称は、単に説明を目的としたものであり、記載されている一般概念または本発明の範囲を制限するものではない。したがって、「抗ＤＬＬ３コンジュゲート」および「ＤＬＬ３コンジュゲート」または単に「コンジュゲート」という用語は、すべて、本明細書に記載される部位特異的コンジュゲートを指し、文脈により別途示されない限り、互換的に使用され得る。
【００５２】
「抗体」または「無傷な抗体」は、典型的に、共有結合的ジスルフィド結合および非供給結合的相互作用によって一緒に保持される２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖を含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、定常ドメインは、アミノ酸配列および遺伝子座に基づいてカッパまたはラムダとして容易に分類することができる。それぞれの重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域を含み、これは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合には、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは、４番目のドメインＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤクラスでは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、可撓性ヒンジ領域によって分離されており、この領域は、プロリンおよびシステインが豊富で長さが可変のセグメントである（ＩｇＧでは一般に約１０から約６０個のアミノ酸）。軽鎖および重鎖の両方において可変ドメインは、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに接合され、重鎖は、約１０個の追加のアミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体のそれぞれのクラスは、さらに、対合システイン残基によって形成される鎖間および鎖内ジスルフィド結合を含む。
【００５３】
免疫グロブリン分子の場合は、鎖間および鎖内ジスルフィド結合の２種類の天然のジスルフィド架橋または結合がある。鎖間ジスルフィド結合の位置および数は、免疫グロブリンのクラスおよび種に応じて多様である。本発明は、任意の特定のクラスまたはサブクラスの抗体に限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンを、単なる例示目的で使用するものとする。鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能であり、通常、比較的容易に還元される。ヒトＩｇＧ１アイソタイプには、それぞれの重鎖から軽鎖に１つずつ、重鎖間に２つの、４つの鎖間ジスルフィド結合がある。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合には必須ではない。周知のように、重鎖のシステインが豊富なＩｇＧ１ヒンジ領域は、一般に、上部ヒンジ、コアヒンジ、および下部ヒンジの３つの部分からなると考えられている。当業者であれば、ＩｇＧ１ヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合（２つの重鎖／重鎖、２つの重鎖／軽鎖）を構成するシステインを重鎖に含んでおり、これらのジスルフィド結合が、Ｆａｂの動きを容易にする構造上の可撓性をもたらすことを理解する。
【００５４】
ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上部ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される（図１）。重鎖間の鎖間ジスルフィド結合は、Ｃ２２６位およびＣ２２９位にある。（すべて、Ｋａｂａｔら（後述）によるＥＵインデックスに従って番号付けされる）。
【００５５】
本明細書に使用されるとき、「抗体」という用語は、広義に捉えることができ、これには、ＤＬＬ３決定基との優先的な会合または結合を呈する限り、ポリクローナル抗体、多クローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体、組換えにより産生した抗体、イントラボディ、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそれらの変異形を含む合成抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）フラグメントのような免疫特異的抗体フラグメント、一本鎖フラグメント（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）、ならびにＦｃ融合体および他の修飾形を含むこれらの誘導体、ならびに任意の他の免疫反応性分子が含まれる。さらに、文脈上の制約によりそうでないことが示されない限り、この用語は、抗体のすべてのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）、ならびにすべてのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）をさらに含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、典型的に、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμによって示される。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２つの明確に異なる種類のうちの１つが割り当てられ得る。
【００５６】
選択された実施形態において、また以下により詳細に考察されるように、ＣＬドメインは、遊離システインを呈するカッパＣＬドメインを含み得る。他の実施形態において、供給源抗体は、遊離システインを呈するラムダＣＬドメインを含み得る。すべてのヒトＩｇＧ  ＣＬドメインの配列は周知であるため、当業者であれば、本開示に従ってラムダおよびカッパの両方の配列を容易に分析し、それを用いて適合性のある抗体構築物を得ることができる。同様に、説明および実証の目的で、以下の考察および添付の実施例は、主に、ＩｇＧ１型の抗体を特徴的に述べる。軽鎖定常領域と同様に、異なるアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に由来する重鎖定常ドメイン配列が周知であり、特徴付けられている。したがって、当業者であれば、任意のアイソタイプまたはサブクラスを含む抗体を容易に利用し、本明細書に教示されるように、それぞれを、開示される薬物とコンジュゲートさせて、本発明の部位特異的抗体薬物コンジュゲートを得ることができる。
【００５７】
抗体の可変ドメインは、抗体によってアミノ酸組成に大幅な変動を示し、主として、抗原認識および結合を担う。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷なＩｇＧ抗体が２つの結合部位を有する（すなわち、二価となる）ように、抗体の結合部位を形成する。ＶＨおよびＶＬドメインは、可変性が極めて大きい３つの領域を含み、これらの領域は、超可変領域と称されるまたはより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている４つの可変性の低い領域によって枠組みされ、分離されている。ＶＨ領域とＶＬ領域との間の非共有結合的会合は、Ｆｖフラグメント（「可変フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）」を表す）を形成し、このフラグメントは、抗体の２つの抗原結合部位のうちの１つを含む。遺伝子操作により得ることができるＳｃＦｖフラグメント（一本鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を表す）は、一本のポリペプチド鎖において、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とを、ペプチドリンカーを隔てて会合させる。
【００５８】
本明細書に使用されるとき、各ドメイン、フレームワーク領域およびＣＤＲへのアミノ酸の割当ては、別途示されない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ  ｏｒ  ＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されている番号付けスキームのうちのいずれかによるものであり得る。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）およびＡｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（後述）から得られるＡｂＭによって定義されるＣＤＲを構成するアミノ酸残基を、以下に記載する。
【００５９】
【表１】
2018511579.tif 000003
【００６０】
抗体配列の可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野で開発された（上に記載のように、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのような）一般的規則に従って、または既知の可変領域のデータベースに対して配列をアライメントすることによって特定することができる。これらの領域を特定する方法は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、２００１年およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、２０００年に記載されている。例示的な抗体配列データベースは、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５年）に記載されるように、「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄにより維持されている）およびＶＢＡＳＥ２ウェブサイトｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇに記載されており、これらを通じてアクセスすることができる。
【００６１】
好ましくは、配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースを通じて分析され、このデータベースは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合するものである。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎの著書、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌの章Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．（編：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも入手可能）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用することができるＣＤＲを特定するために開発された一般規則もさらに含む。別途示されない限り、本明細書に記載されるすべてのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトにより得られる。
【００６２】
本発明において考察される重鎖定常領域のアミノ酸位に関して、番号付けは、配列決定が行われた最初のヒトＩｇＧ１であることが報告されている骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列について記載しているＥｄｅｌｍａｎら、１９６９年、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８−８５頁に初めて記載されたＥｕインデックスに従っている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１年（上述）にも記載されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」または単に「ＥＵインデックス」という用語は、Ｋａｂａｔら、１９９１年（上述）に記載されているＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列に使用される番号付けシステムも同様に、Ｋａｂａｔら、１９９１年に記載されている。
【００６３】
本発明と適合性のある、例示的な野生型カッパＣＬおよびＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ、添付の配列表に配列番号４０３および４０４として記載されている。同様に、例示的な野生型ラムダＣＬ軽鎖定常領域は、添付の配列表に配列番号５０４として記載されている。当業者であれば、不対システインをもたらすように本明細書に開示される通り操作されたこのような軽鎖定常領域配列（例えば、配列番号５０２、５０３、５０５、５０６および５５０−５６４を参照されたい）は、標準的な分子生物学技法を使用して、軽鎖可変領域に接合することができることを理解する。次いで、これらの操作軽鎖が、野生型または操作重鎖と対合されて、本発明の抗体コンジュゲートに組み込むことができる全長抗体が得られる。この点に関して、配列番号５０２、５０３、５０５および５０６は、好ましくは、野生型ＩｇＧ１重鎖（例えば、配列番号４０４を含むもの）と対合して、重鎖に遊離システインをもたらし、一方で、配列番号５５０−５６４を含む軽鎖は、好ましくは、操作重鎖（例えば、Ｃ２２０が欠失または置き換えられるように操作されている配列番号５００および５０１を含むもの）と対合して、軽鎖に遊離システインをもたらす。当然ながら、抗体１つ当たり２つを上回るシステインが所望される場合、配列番号５５０−５６４に記載されているＣＬドメインを含む軽鎖は、２２０位にシステインを有する野生型重鎖（例えば、配列番号４０４）と対合してもよい。
【００６４】
いずれの場合においても、本発明の部位特異的抗体または免疫グロブリンは、任意の決定基を特異的に認識するまたはそれと免疫特異的に会合する、任意の抗体を含み得るまたはそれから誘導され得る。本明細書に使用されるとき、「決定基」または「標的」とは、特定の細胞、細胞集団または組織と識別可能に会合するまたはこれらの内部もしくは表面上に特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカーまたは因子を意味する。決定基または標的は、本質的に形質学的、機能的または生化学的であり得るが、好ましくは、表現型である。ある特定の好ましい実施形態において、決定基は、特定の細胞型によってまたはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の時点もしくは特定のニッチにおける細胞）によって異なって発現される（高または低発現される）タンパク質である。本発明の目的で、決定基は、好ましくは、異常ながん細胞において異なって発現され、特定のタンパク質（例えば、ＣＤ３２４、ＳＥＺ６もしくはＤＬＬ３）、またはそのスプライス変異形、アイソフォームもしくはファミリーメンバー、またはその特定のドメイン、領域もしくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原性決定基」または「免疫原」とは、免疫応答性動物に導入したときに、免疫応答を刺激することができ、動物の免疫応答から生成される抗体によって認識される、任意のタンパク質またはその任意のフラグメント、領域、ドメインもしくはエピトープを意味する。本明細書に企図される決定基の存在または非存在は、細胞、細胞小集団または組織（例えば、腫瘍、腫瘍原性細胞またはＣＳＣ）を特定するために使用することができる。
【００６５】
以下の実施例に記載されるように、本発明の選択された実施形態は、ＳＥＺ６に免疫特異的に結合するマウス抗体を含み、この抗体は、「供給源」抗体とみなすことができる。他の実施形態において、本発明により企図される抗体は、このような「供給源」抗体から、供給源抗体の定常領域（すなわち、部位特異的抗体をもたらす）またはエピトープに結合するアミノ酸配列の任意選択的な修飾を通じて誘導することができる。一実施形態において、抗体は、供給源抗体における選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せにより改変された場合、供給源抗体から「誘導」される。別の実施形態において、「誘導」抗体は、供給源抗体のフラグメント（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは可変領域全体）が、アクセプター抗体配列と組み合わされるまたはそこに組み込まれて、誘導体抗体（例えば、キメラ、ＣＤＲグラフトまたはヒト化抗体）が得られたものである。これらの「誘導」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフト）抗体は、例えば、決定基に対する親和性の向上、細胞培養における産生および収率の改善、インビボでの免疫原性の低減、毒性の低減、活性部分のコンジュゲーションの促進または多重特異的抗体の作製のような様々な理由のために、標準的な分子生物学技法を使用して生成することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、供給源抗体から誘導することもできる。当然ながら、本明細書に詳しく考察されるように、これらの誘導抗体は、１つ以上の遊離システインを含む所望される部位特異的抗体をもたらすように、さらに操作してもよい。
【００６６】
本発明の文脈において、添付の配列表に記載されるマウス可変領域アミノ酸配列（抗ＳＥＺ６抗体）から誘導された開示される軽鎖および重鎖ＣＤＲのいずれも、本教示による最適化された抗ヒトＳＥＺ６（例えば、ヒト化またはキメラ抗ｈＳＥＺ６）部位特異的抗体をもたらすように、アクセプター抗体と組み合わされ得るまたは再構成され得ることが理解される。すなわち、添付の配列表（配列番号２０−１６９とともに）に記載されている連続的軽鎖可変領域アミノ酸配列から誘導されるまたは得られるＣＤＲのうちの１つ以上は、部位特異的構築物に組み込むことができ、特に好ましい実施形態では、１つ以上のＳＥＺ６アイソフォームまたはファミリーメンバーと免疫特異的に会合する、ＣＤＲグラフトまたはヒト化部位特異的抗体に組み込むことができる。このようなヒト化モジュレーターの「誘導」軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列の例はまた、抗ＤＬＬ３抗体については図２Ａおよび２Ｂ（配列番号５１９−５２８）、抗ＳＥＺ６抗体については図３Ａおよび３Ｂ（配列番号１７０−１９９）、ならびに抗ＣＤ３２４抗体については図４（配列番号５３１および５３２）にも記載されている。
【００６７】
図２Ａおよび２Ｂ、３Ａおよび３Ｂならびに４において、注釈のＣＤＲおよびフレームワーク配列は、専売の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用してＫａｂａｔに従って定義されている。しかしながら、本明細書に考察されるように、当業者であれば、添付の配列表に記載されるそれぞれの重鎖および軽鎖配列について、Ｋａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭまたはＭａｃＣａｌｌｕｍらによって定義されるように、ＣＤＲを容易に定義、特定、誘導および／または列挙することができる。したがって、すべてのこのような命名法によって定義される対象ＣＤＲおよびＣＤＲを含む抗体のそれぞれが、本発明の範囲内に明示的に含まれる。より広義には、「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」またはより単純に「ＣＤＲ」という用語は、上に記載される任意の配列または構造に基づく方法に使用して特定される、ＣＤＲのアミノ酸を含む。この文脈において、図３Ａおよび３Ｂの例示的なヒト化抗体のＫａｂａｔ  ＣＤＲは、添付の配列表に配列番号４０５−４７０として提供されている。
【００６８】
本発明の別の態様は、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９およびＳＣ１７．２００、または上に特定した抗体またはそのキメラもしくはヒト化バージョンのいずれかから得られるまたは誘導される部位特異的抗ＳＥＺ６抗体を含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、前述のモジュレーターのいずれかに由来する１つ以上のＣＤＲ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを有するＳＥＺ６抗体を含む。注釈の配列表は、前述の抗ＳＥＺ６抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖可変領域について、個別の配列番号を提供する。
【００６９】
２．部位特異的抗体
本開示に基づいて、当業者であれば、本明細書に記載される操作構築物を容易に作製することができる。本明細書に使用されるとき、「操作抗体」、「操作構築物」または「部位特異的抗体」とは、重鎖または軽鎖のいずれかにおける少なくとも１つのアミノ酸が、少なくとも１つの遊離システインをもたらすように組込み、欠失、改変、または置換（好ましくは、別のアミノ酸と）が行われている、抗体、またはその免疫反応性フラグメントを意味する。同様に、「操作コンジュゲート」または「部位特異的コンジュゲート」は、操作抗体、および不対または遊離システインにコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞毒素を含む、抗体薬物コンジュゲートを意味するように理解するものとする。上述のように、組込み、欠失、改変または置換は、天然のジスルフィド架橋の破壊またはアミノ酸配列へのシステインの導入もしくは付加により、遊離システインをもたらすことができる。したがって、ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内残基を含む。他の好ましい実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。操作抗体は、様々なアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものであり得、これらのクラスの中で、抗体は、様々なサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。このようなＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、カッパまたはラムダアイソタイプのいずれかを含み、これらのアイソタイプは、それぞれ、Ｃ２１４を組み込む、または配列番号５５０−５６４に記載されるように、ＣＬドメインの別の位置のシステインを組み込み、これらのシステインは、いずれの場合も、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基の欠如に起因して不対であり得る。
【００７０】
選択された実施形態において、操作抗体は、鎖内または鎖間システイン残基の、少なくとも１つのアミノ酸の欠失または置換を含む。本明細書に使用されるとき、「鎖間システイン残基」とは、抗体の軽鎖と重鎖との間または抗体の２つの重鎖の間のいずれかにおける天然のジスルフィド結合に関与しているシステイン残基を意味し、一方で鎖内システイン残基は、同じ重鎖または軽鎖内において別のシステインと天然に対合したものである。一実施形態において、欠失または置換された鎖間システイン残基は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与する。別の実施形態において、欠失または置換されたシステイン残基は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与する。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインと対合し、一方の重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが相補的な重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと対合する、抗体の相補的な構造に起因して、軽鎖または重鎖のいずれかにおける単一のシステインの変異または欠失が、操作抗体に２つの不対システイン残基をもたらす。
【００７１】
一部の実施形態において、鎖間システイン残基が、欠失される。他の実施形態では、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸）と置換される。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインと、中性残基（例えば、セリン、スレオニンまたはグリシン）または親水性残基（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）との置き換えをもたらし得る。１つの特に好ましい実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられる。
【００７２】
本発明により企図される一部の実施形態において、欠失または置換されたシステイン残基は、軽鎖（カッパまたはラムダのいずれか）におけるものであり、これによって、重鎖（例えば、配列番号４０４のＣ２２０）に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失または置換されたシステイン残基は、重鎖のものであり、軽鎖定常領域（例えば、配列番号４０３、５０４および５５０−５６４を参照されたい）に遊離システインが残る。図１は、例示的なＩｇＧ１／カッパ抗体における天然または天然に存在する鎖間および鎖内ジスルフィド結合（または架橋）に関与するシステインを示す。前述のように、それぞれの場合において、定常領域のアミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに基づいて番号付けされる。図９の例示的な実施形態に示されるように、無傷な抗体の軽鎖または重鎖のいずれかにおける単一のシステインの欠失または置換が、２つの不対システイン残基を有する操作抗体をもたらす。
【００７３】
特に好ましい実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が、欠失または置換される。別の好ましい実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が、欠失または置換される。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位または２２９位のシステインが、欠失または置換される。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンと置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、所望される遊離システインが軽鎖に生じる。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンと置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、所望される遊離システインが重鎖に生じる。実施例６−８により提供されるこのような部位操作構築物は、それぞれ、例示的な抗ＤＬＬ３抗体ＳＣ１６．５６を使用して図５Ａおよび５Ｂに示され、例示的な抗ＳＥＺ６抗体ＳＣ１７．２００を使用して図６Ａおよび６Ｂに示され、例示的な抗ＣＤ３２４抗体ＳＣ１０．１７を使用して図７に示される。また、追加の例が、例示的な抗ＳＥＺ６抗体ＳＣ１７．１７に関して、添付の配列表（配列番号５３７−５４２）に提供される。
【００７４】
例示的な構築物の概要は、すぐ下の表２に示されており、この表では、すべての番号付けは、Ｋａｂａｔによるものであり、ＷＴは、「野生型」または改変を有さない天然の定常領域配列を表す。表２に示される特定の置換（例えば、Ｃ２２０Ｓ）が、例示にすぎないこと、および所望される遊離システインをもたらす任意の適合性のある残基（例えば、天然または非天然のアミノ酸）が、代わりに置換されてもよい（例えば、Ｃ２２０ＧまたはＣ２２Ａに）ことが理解される。参照される配列の多くは、一般に、カッパＣＬから誘導されるが、Ｃ２１４を含む例示的なラムダ軽鎖もまた、本明細書に記載されるように使用して、所望される遊離システインを得ることができることに留意されたい。さらに、本明細書に使用されるとき、デルタ（Δ）は、アミノ酸残基の欠失を示すものとする（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステインが欠失していることを示す）。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
本明細書に記載されるように、ある特定の実施形態において、遊離システインは、抗体の重鎖または軽鎖を構成するアミノ酸配列に導入または付加される。このような実施形態には、ある特定の非システイン残基が、システインで変異または置換されて、所望される遊離システインが得られる事例が含まれる。以下の実施例に記載される選択された実施形態において、遊離システイン残基は、抗体軽鎖の定常領域の露出したループ構造のうちの１つに組み込まれる。このような実施形態において、遊離システイン残基は、（組込みまたは置換によって）残基１２１−１２８、残基１８２−１９１または残基２０１−２１３（Ｋａｂａｔの番号付け）に配置される。他の好ましい実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＬ領域のベータシートに露出した残基を含む（組込みまたは置換により）。さらに他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ１ドメイン内に配置される。なおも他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ２ドメインに配置される。なおも他の実施形態において、遊離システイン残基は、ＣＨ３ドメインに配置される。さらに他の好ましい実施形態において、以下の残基のうちのいずれか１つ以上が、システインと置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵの番号付け）および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵの番号付け）。遊離システインを含み得る他の適合性のある位置としては、（ＥＵの番号付けに従って）４１、８８、１１６、１２０、１７１、２８２または３７５が挙げられる。遊離システインの配置に関係なく、導入または置換されたシステイン残基を含むそれぞれのこのような構築物は、前述の構築物のそれぞれを含め、本明細書に記載されるように選択的にコンジュゲートさせることができ、本発明の範囲内に明示的に含まれることを強調することが重要である。
【００７７】
本明細書に開示されるように、薬物ローディングの部位および化学量論が定義されている抗体−薬物コンジュゲートを生成するための戦略は、主として、抗体の保存されている定常ドメインの操作を伴うため、他の抗体に広く適用可能である。抗体の各クラスおよびサブクラスのアミノ酸配列および天然のジスルフィド架橋は、十分に文書化されているため、当業者であれば、不必要な実験を行うことなく、様々な抗体の操作構築物を容易に作製することができ、したがって、このような構築物は、本発明の範囲内であることが明示的に企図される。
【００７８】
３．抗体生成
ａ．ポリクローナル抗体
ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野で周知である。一部の実施形態において、ポリクローナル抗体を含有する血清は、動物に採血または殺処分を行うことによって得られる。血清は、動物から得られた形態で研究目的に使用してもよく、または代替として、抗体を、部分的もしくは完全に精製して、免疫グロブリン画分もしくは均質な抗体調製物を得ることもできる。
【００７９】
簡単に言うと、選択された動物に、免疫原（例えば、可溶性ＤＬＬ３またはｓＤＬＬ３）で免疫付与し、この免疫原は、例えば、選択されたアイソフォーム、ドメインおよび／もしくはペプチド、またはＤＬＬ３もしくはその免疫反応性フラグメントを発現する生細胞もしくは細胞集団を含み得る。接種する種に応じて、免疫応答を増加させるために使用することができる当該技術分野で既知のアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンのような表面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（バチル・カルメット・ゲラン（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム・パルバムのような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントは、抗原を局所沈降物中に封鎖することにより、抗原を急速な分散から保護してもよく、またはマクロファージおよび免疫系の他の構成要素に対して走化性である因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有してもよい。好ましくは、免疫付与スケジュールは、選択された免疫原の２回以上の投与を、所定の期間にわたって展開することを伴う。
【００８０】
例として、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸配列を分析して、抗体を生成するためのＤＬＬ３タンパク質の特定の領域を選択することができる。例えば、ＤＬＬ３アミノ酸配列の疎水性分析および親水性分析を使用して、ＤＬＬ３構造における疎水性領域を特定する。免疫原性構造を示すＤＬＬ３タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ分析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ分析またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析のような、当該技術分野で既知の様々な他の方法を使用して、容易に特定することができる。平均可撓性プロファイルは、Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．、１９８８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５頁の方法を使用して生成することができる。ベータターンプロファイルは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．、１９８７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４頁の方法を使用して生成することができる。したがって、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって特定されるそれぞれのＤＬＬ３領域、ドメインまたはモチーフは、本発明の範囲内であり、所望される特性を含むモジュレーターを生じる免疫原をもたらすように、単離または操作することができる。ＤＬＬ３抗体の生成のための好ましい方法は、本明細書に提供される実施例を用いてさらに例示される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当該技術分野で周知である。タンパク質と、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他の担体タンパク質のような担体との免疫原性コンジュゲートを調製するための方法もまた、当該技術分野で周知である。一部の状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用した直接的コンジュゲーションが使用され、他の事例では、結合試薬が有効である。ＤＬＬ３免疫原の投与は、当該技術分野で理解されているように、好適な期間にわたる注射によっておよび好適なアジュバンドを用いて、行われることが多い。免疫付与スケジュール中に、抗体の力価を、以下の実施例に記載されるように取得して、抗体形成の適正さを判定することができる。
【００８１】
ｂ．モノクローナル抗体
加えて、本発明は、モノクローナル抗体の使用を企図する。当該技術分野で既知のように、「モノクローナル抗体」（またはｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る潜在的な変異（例えば、天然に存在する変異）を除いて、同一である。ある特定の実施形態において、このようなモノクローナル抗体は、抗原に結合または会合するポリペプチド配列を含む抗体であって、抗原に結合するポリペプチド配列が、複数のポリペプチド配列から、標的に結合する単一のポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られた、抗体を含む。
【００８２】
より一般的に、また本明細書の実施例に記載されるように、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で既知の広範な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、ならびにＡｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版、２００９年；Ｓｈｉｒｅら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版、２０１０年；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１年）により詳細に記載されるような、当該技術分野で認識されている生化学技法および遺伝子操作技法を使用して、産生することができ、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。選択された結合配列を、例えば、標的に対する親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養におけるその産生の改善、インビボでのその免疫原性の低減、多重特異的抗体の作製などを行うようにさらに改変してもよいこと、ならびに改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本発明の抗体であることを理解されたい。本発明と適合性のあるマウスモノクローナル抗体は、以下の実施例に記載されるように得られる。
【００８３】
ｃ．キメラおよびヒト化抗体
別の実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種または抗体クラスに由来する、共有結合で結合したタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含み得る。「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種から誘導された抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方で鎖の残りの部分が、別の種から誘導された抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である、構築物を対象とする（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。
【００８４】
一実施形態において、キメラ抗体は、マウスＶＨおよびＶＬアミノ酸配列、ならびにヒト供給源、例えば、以下に記載されるヒト化抗体から誘導された定常領域を含み得る。一部の実施形態において、抗体は、「ＣＤＲグラフト」であってもよく、その場合、抗体は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する１つ以上のＣＤＲを含むが、抗体鎖の残りの部分が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である。ヒトにおける使用のために、選択された齧歯類ＣＤＲ、例えばマウスＣＤＲを、ヒト抗体にグラフトし、ヒト抗体の天然に存在するＣＤＲのうちの１つ以上を置き換えることができる。これらの構築物は、一般に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、完全な強度の抗体機能、例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を提供する利点を有する。
【００８５】
ＣＤＲグラフト抗体と類似しているのが、「ヒト化」抗体である。本明細書に使用されるとき、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、１つ以上の非ヒト免疫グロブリンから誘導されたアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの１つ以上のＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の１つ以上のＣＤＲに由来する残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター抗体）である。ある特定の好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン内の１つ以上のＦＲにある残基が、グラフトＣＤＲの適切な三次元構造を維持し、これにより親和性を向上するのを補助するように、ドナー抗体に由来する対応する非ヒト残基により置き換えられる。これは、「復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」の導入と称され得る。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに精緻するために、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含み得る。本発明と適合性のあるヒト化抗ＤＬＬ３抗体は、以下の実施例３に提供され、得られたヒト化軽鎖および重鎖アミノ酸配列は図２Ａおよび２Ｂに示される。ヒト化抗ＳＥＺ６抗体は、実施例４により提供され、得られたヒト化軽鎖および重鎖アミノ酸配列は図３Ａおよび３Ｂに示され、一方でヒト化抗ＣＤ３２４抗体は、実施例５により提供され、対応する配列は図４に示されていた。図５Ａおよび５Ｂ、６Ａおよび６Ｂならびに７は、それぞれ、３つの抗原に対する例示的な部位特異的ヒト化抗体の重鎖および軽鎖の注釈付きアミノ酸を示す。
【００８６】
様々な供給源を使用して、どのヒト配列をヒト化抗体に使用するかを決定することができる。このような供給源としては、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ  Ａ．ら（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８頁；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７−２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７頁；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８頁に開示されているヒト生殖系配列；ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリを提供するＶ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４頁、２００５年）（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．らによる編纂、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；または例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトＦＲが挙げられる。
【００８７】
ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、ＰＭＩＤ：３７１３８３１）ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および７，０８７，４０９を参照されたい。
【００８８】
別の方法は、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００５／０００８６２５に記載される「ヒト操作（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）」と称される。別の実施形態において、非ヒト抗体は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープまたは「脱免疫化」の特異的欠失によって、修飾することができる。
【００８９】
上記に考察されるように、選択された実施形態において、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体の重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％が、レシピエントのヒト配列のものに対応する。他の実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基の少なくとも８３％、８５％、８７％または９０％が、レシピエントのヒト配列のものに対応する。さらに好ましい実施形態において、ヒト化抗体可変領域のそれぞれの９５％超が、レシピエントのヒト配列のものに対応する。
【００９０】
ヒトアクセプター可変領域に対するヒト化抗体可変領域の配列同一性または相同性は、既に考察されているように決定することができ、このようにして測定したときに、好ましくは、少なくとも６０％または６５％の配列同一性を共有し、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を共有し、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる。「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なっている場合には、配列同一性パーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質に関して補正するように上方調節され得る。
【００９１】
ｄ．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するものを有する抗体、および／またはヒト抗体を作製する技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体を指す。
【００９２】
ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。１つの技法は、抗体（好ましくはヒト抗体）のライブラリーをファージにおいて合成し、このライブラリーを目的の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、そこから免疫反応性フラグメントを得ることができる、ファージディスプレイである。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は、当該技術分野で周知であり、ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットが、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに使用することができる他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０、およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２頁（１９９１年）を参照されたい）。
【００９３】
一実施形態において、組換えヒト抗体を、上述のように調製した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。一実施形態において、このライブラリーは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成された、ｓｃＦｖファージライブラリーである。
【００９４】
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）によって産生された抗体は、親和性が中等度（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）であり得るが、親和性成熟は、当該技術分野で説明されている二次ライブラリーから構築し、再選択することによってインビトロで模倣することもできる。例えば、変異が、エラープローンポリメラーゼを使用してインビトロでランダムに導入されてもよい（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５頁（１９８９年））。加えて、親和性成熟は、例えば、選択された個々のＦｖクローンにおいて、目的のＣＤＲにわたるランダムな配列を有するプライマーでＰＣＲを使用して、１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させ、親和性の高いクローンに関してスクリーニングすることによって行うことができる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲにおいて変異生成を誘発して、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製するための方法について記載している。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３頁（１９９２年）に記載されるように、ファージディスプレイによって選択されたＶＨまたはＶＬドメインを、免疫付与していないドナーから得た天然に存在するＶドメイン変異形のレパートリーで組み換え、複数回の鎖の再シャッフリングにおいてより高い親和性に関してスクリーニングすることである。この技法は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下の抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。
【００９５】
他の実施形態において、表面上に結合対を発現する真核生物細胞（例えば、酵母）を含むライブラリーを使用した類似の手順を用いてもよい。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態において、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、ここで、このファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４頁（１９９６年）：Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２頁（１９９８年）。他の実施形態では、ヒト結合対は、酵母のような真核生物細胞において生成されるコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技法は、有利なことに、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能にし、候補配列の比較的容易な操作（例えば、親和性成熟または組換えシャッフリングによる）をもたらす。
【００９６】
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することによって、作製することもできる。感作すると、ヒト抗体の産生が観察され、このヒト抗体産生は、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトにおいて見られるものに近似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７、５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５、５，６６１，０１６、ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および６，１５０，５８４、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁（１９９５年）に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によって調製してもよい（このようなＢリンパ球は、新生物障害を患う個体から回収されたものであってもよく、またはインビトロで免疫付与が行われていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５年）、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６−９５頁（１９９１年）およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。
【００９７】
４．抗体の組換え産生
部位特異的抗体およびそのフラグメントは、抗体産生細胞から得た遺伝子材料および組換え技術を使用して産生または修飾することができる（例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２年）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年までの増補）；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照されたい）。
【００９８】
より具体的には、本発明の別の態様は、本発明の部位特異的抗体をコードする操作核酸分子に関する。核酸は、全細胞で存在してもよく、細胞溶解物で存在してもよく、または部分的に精製した形態もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で周知のその他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞内核酸もしくはタンパク質から精製される場合、「単離」されているまたは「実質的に純粋」となっている。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含む場合も含まない場合もある。より一般的には、「核酸」という用語は、本明細書に使用されるとき、一本鎖か二本鎖かに関係なく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含む。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【００９９】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して得ることができ、操作することができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに説明されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマにより作製した抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅技法またはｃＤＮＡクローニング技法に従って得ることができる（例えば、実施例１を参照されたい）。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）得られた抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収することができる。
【０１００】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られると、これらのＤＮＡフラグメントを、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作して、例えば、可変領域の遺伝子を全長抗体鎖の遺伝子、Ｆａｂフラグメントの遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントが、抗体定常領域または可撓性リンカーのような別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに動作可能に結合される。「動作可能に結合される」という用語は、この文脈で使用されるとき、２つのＤＮＡフラグメントが、これら２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように接合されることを意味することが意図される。
【０１０１】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、本明細書に記載されるように操作されている場合も操作されていない場合もある重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に結合させることにより、全長重鎖遺伝子に変換させることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行番号９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。以下でより詳細に考察されるように、本明細書の教示と適合性のある例示的なＩｇＧ１定常領域は、添付の配列表に配列番号４０４として記載されており、適合性のある操作ＩｇＧ１定常領域は、配列番号５００および５０１として記載されている。Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子に関しては、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に結合することができる。
【０１０２】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に結合することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行番号９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。これに関して、例示的な適合性のあるカッパ軽鎖定常領域は、添付の配列表に配列番号４０３として記載されており、一方で適合性のあるラムダ軽鎖定常領域は、配列番号５０４に記載されている。カッパおよびラムダ軽鎖領域の適合性のある操作バージョンは、それぞれ、５０２、５０３および５５０−５６４ならびに５０５、５０６に示されている。
【０１０３】
本発明はまた、プロモーター（例えば、ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８９／０１０３６、およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４を参照されたい）ならびに真核生物分泌経路の他の転写調節エレメントおよびプロセシング制御エレメントに動作可能に結合され得る、上述のこのような核酸を含むベクターも提供する。本発明はまた、これらのベクターを保持する宿主細胞および宿主発現系を提供する。
【０１０４】
本明細書に使用されるとき、「宿主発現系」という用語は、本発明の核酸またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを生成するように操作することができる、任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、組換えバクテリオファージＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡで形質転換されたもしくはこれらがトランスフェクトされた微生物（例えば、エシェリキアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターがトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス）；または哺乳動物細胞もしくはウイルスのゲノムに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。宿主細胞に、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターを共トランスフェクトしてもよい。
【０１０５】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１、および４，９５９，４５５を参照されたい。宿主細胞はまた、様々な特徴（例えば、修飾糖形態またはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作してもよい。
【０１０６】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準的な技法を使用して操作してもよく、また本発明の一部を形成し得る。ウイルスの複製起源を有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換してもよい。ある特定の条件下で発現を強化するための効率的なアプローチを提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含む、当該技術分野で周知の選択系のうちの任意のものを使用することができる。ＧＳ系は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および５，８７９，９３６に関連して、全体的または部分的に考察されている。安定な細胞株を開発するための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１０７】
本発明の抗体を組換え発現技法または開示される技法のうちの任意の他のものによって生成した後、これを、当該技術分野で既知の方法によって精製または単離することができるが、これは、この抗体が、特定され、その天然の環境から分離および／または回収され、抗体のコンジュゲーションまたは診断上もしくは治療上の使用を妨げる混入物から分離されていることを意味する。単離抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
【０１０８】
これらの単離調製物は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、透析濾過、および親和性クロマトグラフィー、特に、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーのような、当該技術分野で認められている様々な技法を使用して精製することができる。
【０１０９】
５．抗体フラグメントおよび誘導体
ａ．フラグメント
本発明を実施するためにどの形態の部位特異的抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択するかに関係なく、部位特異的抗体の免疫反応性フラグメントを、本明細書の教示に従って使用することができることが理解される。「抗体フラグメント」は、無傷な抗体の少なくとも一部分を含む。本明細書に使用されるとき、抗体分子の「フラグメント」という用語には、抗体の抗原結合フラグメントを含み、「抗原結合フラグメント」という用語は、少なくとも１つの遊離システインを含む免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントであり、選択された抗原またはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合するもしくはそれと反応する、またはフラグメントが誘導される無傷な抗体と特定の抗原結合に関して競合するものを指す。
【０１１０】
例示的な部位特異的フラグメントとしては、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。加えて、活性な部位特異的フラグメントは、抗原／基質または受容体と相互作用し、それらを、無傷な抗体のものに類似の様式で修飾する能力を保持する、抗体の一部分を含む。
【０１１１】
他の実施形態において、部位特異的抗体フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、無傷な抗体に存在する場合に、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調整、ＡＤＣＣ機能および補体結合のような、通常Ｆｃ領域と関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持するものである。一実施形態において、部位特異的抗体フラグメントは、無傷な抗体に実質的に類似するインビボ半減期を有する一価の抗体である。例えば、このような抗体フラグメントは、インビボでの安定性をフラグメントに与えることができる少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含み得る。
【０１１２】
当業者には十分に認識されるように、フラグメントは、分子操作により、または無傷もしくは完全な抗体もしくは抗体鎖の化学的もしくは酵素的処理（パパインもしくはペプシンのような）により、または組換え手段により、得ることができる。例えば、抗体フラグメントのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９年）を参照されたい。
【０１１３】
ｂ．多価抗体
一実施形態において、本発明の部位特異的コンジュゲートは、一価または多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書に使用されるとき、「価数」という用語は、抗体に付随する潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的部位が、１つの標的分子または標的分子上の特定の位置もしくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価の場合、分子の各結合部位は、単一の抗原位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が１つを上回る標的結合部位を含む場合（多価）、それぞれの標的結合部位が、同一分子に特異的に結合してもよく、または異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原に結合してもよく、同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照されたい。それぞれの場合において、結合部位のうちの少なくとも１つが、ＤＬＬ３アイソフォームと関連するエピトープ、モチーフまたはドメインを含む。
【０１１４】
一実施形態において、モジュレーターは、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９頁に記載されるように、２つの鎖が異なる特異性を有する二重特異的抗体である。他の実施形態には、三重特異的抗体のようなさらなる特異性を有する抗体が含まれる。他のより洗練された適合性のある多重特異的構築物およびそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５、ならびにＷＯ９４／０４６９０、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０頁およびＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１１５】
上に言及されたように、多価抗体は、所望される標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合することができ、または標的分子ならびに異種ポリペプチドもしくは固体支持材料のような異種エピトープの両方に免疫特異的に結合することもできる。抗ＤＬＬ３抗体の好ましい実施形態は、２つの抗原に結合するだけである（すなわち、二重特異的抗体）が、三重特異的抗体のようなさらなる特異性を有する抗体もまた、本発明に包含される。二重特異的抗体にはまた、架橋型抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体のうちの一方が、アビジンに結合され、他方がビオチンに結合され得る。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞にターゲティングすることが提案されており（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）、ＨＩＶ感染の治療用に提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の従来的な架橋方法を使用して作製することができる。好適な架橋剤は当該技術分野で周知であり、多数の架橋技法とともにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１１６】
さらに他の実施形態において、所望される結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体の可変ドメインが、当業者に周知の方法を使用して、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインのような、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。
【０１１７】
ｃ．Ｆｃ領域の修飾
遊離システインを生じるものを含む、上に記載した、開示される部位特異的コンジュゲートの可変領域または結合領域に対する様々な修飾、置換、付加または欠失に加えて、当業者であれば、本発明の選択された実施形態が、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または修飾も含み得ることを理解する。より具体的には、本発明の部位特異的抗体が、とりわけ、薬物動態の改変、血清半減期の増加、結合親和性の向上、免疫原性の低減、産生の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃリガンドの結合の改変、「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）活性または「ＣＤＣ」（補体依存性細胞毒性）活性の増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の改変ならびに結合特異性の修飾を含むがこれらに限定されない好ましい特徴を有する化合物をもたらす、１つ以上の追加のアミノ酸残基の置換、変異および／または修飾を含み得ることが企図される。この点に関して、これらのＦｃ変異形は、開示されるモジュレーターの有効な抗新生物特性を強化するのに有利に使用することができることが理解される。
【０１１８】
この目的で、本発明のある特定の実施形態は、遊離システインを生成するのに必要とされるもの以外のＦｃ領域の置換または修飾、例えば、強化されたまたは好ましいＦｃエフェクター機能を有する化合物を生成するための１つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、変異および／または修飾を含んでもよい。例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＢ、ＦｃγＲＩＩＩならびにＦｃＲｎ）との間の相互作用に関与するアミノ酸残基の変化は、細胞毒性の増加および／または血清半減期の増加のような薬物動態の変化をもたらし得る（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２頁（１９９１年）、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４頁（１９９４年）およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１頁（１９９５年）を参照されたい）。
【０１１９】
選択された実施形態において、インビボ半減期が増加した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するとして特定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）することによって生成することができる（例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号、同第ＷＯ０４／０２９２０７号、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照されたい。このような実施形態に関して、Ｆｃ変異形は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日間を超える、１０日間を超える、１５日間を超える、好ましくは２０日間を超える、２５日間を超える、３０日間を超える、３５日間を超える、４０日間を超える、４５日間を超える、２カ月間を超える、３カ月間を超える、４カ月間を超える、または５カ月間を超える半減期をもたらし得る。半減期の増加は、結果として、より高い血清中力価をもたらし、これにより、抗体の投与頻度を減少するおよび／または投与される抗体の濃度を低減する。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトしたヒト細胞株において、または変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類において、アッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が改善されたまたは減少した抗体変異形について記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４頁（２００１年）も参照されたい。
【０１２０】
他の実施形態において、Ｆｃ改変は、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の増強または低減をもたらし得る。当該技術分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃＲに結合することにより、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素により標的細胞を殺滅させることを可能にする、細胞毒性の形態を指す。本発明の文脈において、親抗体もしくは未修飾抗体または天然配列のＦｃＲを含む抗体と比較して、結合が増強または減少した「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有する抗体変異形が、提供される。減少した結合を呈するこのような変異形は、認識できる結合をほとんど有さないまたは全く有さず、例えば、ＦｃＲに対する結合は、例えば、当該技術分野で周知の技法により判定すると、天然配列と比較して０−２０％である。他の実施形態において、変異形は、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して、結合の増強を呈する。これらの種類のＦｃ変異形は、開示される抗体の有効な抗新生物特性を強化するために有利に使用することができることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増強、免疫原性の低減、産生の増加、グリコシル化および／もしくはジスルフィド結合の改変（例えば、コンジュゲーション部位に関して）、結合特異性の修飾、ファゴサイトーシスの増加、ならびに／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などをもたらす。
【０１２１】
ｄ．グリコシル化の改変
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作された糖形態、例えば、グリコシル化パターンの改変またはタンパク質（例えば、Ｆｃドメインにおいて）に共有結合した炭水化物組成の改変を含む、ＤＬＬ３部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁を参照されたい。操作された糖形態は、エフェクター機能の増強もしくは低減、標的に対するモジュレーターの親和性の増強またはモジュレーターの生成の促進を含むがこれらに限定されない、様々な目的に有用であり得る。エフェクター機能の低減が所望されるある特定の実施形態では、分子は、非グルコシル化形態を発現するように操作することができる。１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失をもたらし、これによってその部位でのグルコシル化を消失させることができる置換が、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および６，３５０，８６１を参照されたい）。逆に、エフェクター機能の増強または結合の改善は、１つ以上の追加のグリコシル化部位を操作することによって、Ｆｃ含有分子に付与することができる。
【０１２２】
他の実施形態には、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体のような、改変されたグリコシル化組成を有するＦｃ変異形が含まれる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増強することが実証されている。操作された糖形態は、当業者に既知の任意の方法によって、例えば、操作型または変異形の発現株を使用することによって、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））との共発現によって、様々な生物もしくは様々な生物に由来する細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後に炭水化物を修飾することによって、生成することができる（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２を参照されたい）。
【０１２３】
ｅ．さらなるプロセシング
部位特異的抗体またはコンジュゲートは、生成中または生成後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによって、異なって修飾してもよい。多数の化学修飾のうちのいずれかを、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下における代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技法によって、行うことができる。
【０１２４】
本発明にさらに包含される様々な翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型炭化水素鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。さらに、モジュレーターはまた、モジュレーターの検出および単離が可能となるように、酵素標識、蛍光標識、放射性同位体標識または親和性標識のような検出可能な標識で修飾することもできる。
【０１２５】
６．部位特異的抗体の特徴
部位特異的コンジュゲートがどのようにして得られ、または上述の形態のうちのどれをとるかに関係なく、開示される抗体の様々な実施形態は、ある特定の特徴を呈し得る。選択された実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、例えば、堅強な成長、高い抗体産生、および以下により詳細に考察されるように、望ましい部位特異的抗体の特徴を含む好ましい特性に関して、選択し、クローニングし、さらにスクリーニングしてもよい。他の事例において、抗体の特徴は、特定の抗原（例えば、特定のＤＬＬ３アイソフォーム）または標的抗原の免疫反応性フラグメントを動物の接種のために選択することによって、付与され得るまたは影響を受け得る。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、親和性または薬物動態のような免疫化学的特徴を強化または洗練するように、上述のように操作することができる。
【０１２６】
ａ．中和抗体
ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、「中和」抗体またはその誘導体もしくはフラグメントを含む。すなわち、本発明は、特定のドメイン、モチーフまたはエピトープに結合し、例えば、ＤＬＬ３の生物学的活性を遮断、低減または阻害することができる、抗体分子を含み得る。より一般的に、「中和抗体」とは、標的分子またはリガンドに結合するまたはそれと相互作用し、標的分子と、受容体または基質のような結合パートナーとの結合または会合を防止し、これによって、通常であれば分子の相互作用により生じるはずの生物学的応答を妨げる、抗体を指す。
【０１２７】
当該技術分野で既知の競合的結合アッセイを使用して、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメントもしくは誘導体の結合および特異性を評価することができることが、理解される。本発明に関して、抗体またはフラグメントは、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体活性またはインビトロ競合的結合アッセイにおいて測定したときに、過剰な抗体がＤＬＬ３に結合する結合パートナーの数を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上低減させる場合に、結合パートナーまたは基質へのＤＬＬ３の結合を阻害または低減すると考えられる。例えば、ＤＬＬ３に対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、好ましくは、Ｎｏｔｃｈ受容体活性を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上改変させる。この修飾された活性は、当該技術分野で認められている技法を使用して直接測定することもでき、または改変された活性が下流に与える影響（例えば、腫瘍形成、細胞生存またはＮｏｔｃｈ応答性遺伝子の活性もしくは抑制）によって測定することもできる。好ましくは、抗体がＤＬＬ３活性を中和する能力は、Ｎｏｔｃｈ受容体へのＤＬＬ３の結合の阻害によって、またはＤＬＬ３により媒介されるＮｏｔｃｈシグナル伝達の抑制を緩和するその能力を評価することによって、評価される。
【０１２８】
ｂ．内部移行抗体
いくつかの適合性のある決定基が、腫瘍原性細胞の表面と会合したままとなり、これにより、開示される部位特異的コンジュゲートの局在化および内部移行が可能となるという根拠が存在する。好ましい実施形態において、このようなモジュレーターは、操作された遊離システイン部位を通じて１つ以上の薬物と会合またはコンジュゲートし、これらが内部移行すると細胞を殺滅させる。特に好ましい実施形態において、部位特異的コンジュゲートは、内部移行ＡＤＣを含む。
【０１２９】
本明細書に使用されるとき、「内部移行する」モジュレーターは、関連する抗原または受容体に結合すると（任意のペイロードとともに）細胞によって取り込まれるものである。理解されるように、内部移行抗体は、選択された実施形態において、その抗体フラグメントおよびその誘導体、ならびにおよそ２のＤＡＲを含む抗体コンジュゲートを含む。内部移行は、インビトロで生じる場合もインビボで生じる場合もある。治療用途については、内部移行は、好ましくは、それを必要とする対象においてインビボで生じる。内部移行される部位特異的抗体コンジュゲートの数は、抗原発現細胞、特に、抗原を発現するがん幹細胞を殺滅させるのに十分であるまたは適正であり得る。ペイロードまたは全体としての部位特異的抗体コンジュゲートの効力に応じて、一部の事例では、細胞内への単一の操作抗体分子の取込みが、抗体が結合した標的細胞を殺滅させるのに十分である。例えば、ある特定の薬物は、非常に効力が高いため、抗体にコンジュゲートしている毒素分子数個が、腫瘍細胞の殺滅には十分である。抗体が哺乳動物細胞に結合すると内部移行するかどうかは、Ｆａｂ−ＺａｐおよびＭａｂ−Ｚａｂアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｋｉｔ−４８）を含む当該技術分野で認められている様々なアッセイによって判定することができる。抗体が細胞内に内部移行するかどうかを検出する方法はまた、参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８に記載されている。
【０１３０】
ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、部位特異的コンジュゲートは、枯渇抗体またはその誘導体もしくはフラグメントを含む。「枯渇」抗体という用語は、好ましくは細胞表面上またはその付近で抗原に結合するまたはそれと会合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞毒性剤の導入により）細胞の死滅または消失を誘発する、促進するまたは引き起こす、抗体を指す。好ましい実施形態において、選択された枯渇抗体は、薬物に会合またはコンジュゲートしている。
【０１３１】
好ましくは、枯渇抗体はまた、定義される細胞集団におけるＤＬＬ３発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去、不能化、消失または殺滅させることができる。一部の実施形態において、細胞集団は、富化、切断、精製または単離された腫瘍永続細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料またはがん幹細胞を含む異種腫瘍抽出物を含み得る。当業者であれば、本明細書の教示に従って、標準的な生化学的技法を使用して、腫瘍原性細胞または腫瘍永続細胞の枯渇の監視および定量化を行うことができることを理解する。
【０１３２】
ｄ．ビニングおよびエピトープマッピング
開示される部位特異的抗体コンジュゲートは、選択された標的またはそのフラグメントによって提示される異なるエピトープまたは免疫原性決定基と会合するまたはそれに結合することが、さらに理解される。ある特定の実施形態において、エピトープまたは免疫原性決定基としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面基が挙げられ、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。したがって、本明細書に使用されるとき、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるまたは別様に分子と相互作用することができる、任意のタンパク質決定基を含む。ある特定の実施形態において、抗体がタンパク質および／または巨大分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗体は、抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合するもしくは反応する）と言われる。好ましい実施形態において、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が、１０−６Ｍ以下または１０−７Ｍ以下である場合、より好ましく平衡解離定数が１０−８Ｍ以下である場合、さらにより好ましくは解離定数が１０−９Ｍ以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１３３】
より直接的には、「エピトープ」という用語は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体モジュレーターによって認識され、特異的に結合され得る標的抗原の部分を指す。抗原が、ＤＬＬ３のようなポリペプチドである場合、エピトープは、一般に、連続的アミノ酸およびタンパク質が三次元に折り畳まれて近接した非連続的アミノ酸（「立体配座エピトープ」）の両方から形成され得る。このような立体配座エピトープにおいて、相互作用の箇所は、互いに線状に分離されたタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。連続的アミノ酸から形成されたエピトープ（「線状」または「連続的」エピトープと称されることが多い）は、典型的に、タンパク質変性の際に保持されるが、三次元折り畳みにより形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質変性の際に失われる。いずれの場合においても、抗体エピトープは、固有の空間配置において、典型的には少なくとも３個のアミノ酸を含み、より通例的には少なくとも５または８−１０個のアミノ酸を含む。
【０１３４】
これに関連して、ある特定の実施形態では、エピトープが、例えば、ＤＬＬ３タンパク質の１つ以上の領域、ドメインまたはモチーフと関連するかまたはこれらに存在することが、理解される。本明細書においてより詳細に考察されるように、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメインおよび１つのＤＳＬドメインを含む、一連の一般に認識されているドメインを含む。本開示の目的で、「ドメイン」という用語は、その一般的に受け入れられている意味に従って使用され、独特な二次構造内容を呈するタンパク質内の、特定可能または定義可能な保存された構造実体を指すものと考えられる。多くの場合において、共通の機能を有する相同のドメインは、通常、配列類似性を示し、多数の異なるタンパク質において見出される（例えば、ＥＧＦ様ドメインは、少なくとも４７１種類の異なるタンパク質に見出されることが報告されている）。同様に、当該技術分野で認識されている「モチーフ」という用語は、その一般的な意味に従って使用され、一般に、典型的には１０から２０個の連続的アミノ酸残基であるタンパク質の短い保存された領域を指すものとする。全体を通して考察されるように、選択された実施形態は、ＤＬＬ３の特定の領域、ドメインまたはモチーフ内のエピトープと会合するまたはそれに結合する部位特異的抗体を含む。
【０１３５】
ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０にさらに詳細に考察されるように、例示的な部位特異的抗体コンジュゲートが結合するヒトＤＬＬ３の特に好ましいエピトープは、すぐ下の表３に記載されている。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
類似の論理に従って、選択された抗体のためのＳＥＺ６抗原のエピトープを決定した。この点において、またこれに関して本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７４７６に記載されるように、本発明の部位特異的抗ＳＥＺ６コンジュゲートは、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体を含み、このエピトープは、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１およびＱ７８２、（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。
【０１３８】
いずれの場合においても、抗原上の所望されるエピトープが決定されると、例えば、本発明に記載される技法を使用して、そのエピトープを含むペプチドで免疫付与を行うことによって、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセス中に、抗体の生成および特徴付けにより、特定のドメインまたはモチーフ内に位置する望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合に関して、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合に関して競合する抗体を見出すための競合研究を実施することである。抗体をそれらの交差競合に基づいてビニングするための高スループットのプロセスは、ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。酵母における抗体の競合または抗原フラグメント発現を含む、他のビニング方法、ドメインレベル方法またはエピトープマッピング方法が、当該技術分野で周知である。
【０１３９】
本明細書に使用されるとき、「ビニング」という用語は、抗体を、それらの抗原結合の特徴および競合に基づいて群分けまたは分類するために使用される方法を指す。この技法は、本発明のモジュレーターの定義および類別に有用であるが、ビンは必ずしもエピトープと直接相関するわけではなく、エピトープの結合に関するこのような初期決定は、本発明に記載される他の当該技術分野で認められている手法によってさらに精査し、確認され得る。しかしながら、抗体モジュレーターを個々のビンに経験的に割り当てることにより、開示されるモジュレーターの治療能力を示し得る情報を得ることができる。
【０１４０】
より具体的には、当該技術分野で既知の方法および本明細書の実施例に記載される方法を使用することによって、選択された基準抗体（またはそのフラグメント）が、第２の試験抗体と同じエピトープに結合し、または第２の試験抗体と結合に関して交差競合する（すなわち、同じビン内にある）かどうかを決定することができる。一実施形態において、基準抗体モジュレーターを、飽和条件下においてＤＬＬ３抗原と会合させ、次いで、第２の抗体モジュレーターまたは試験抗体モジュレーターがＤＬＬ３に結合する能力を、標準的な免疫化学的技法を使用して判定する。試験抗体が、実質的に、基準の抗ＤＬＬ３抗体と同時にＤＬＬ３に結合することができる場合、二次抗体または試験抗体は、一次抗体または基準抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が、実質的に、同時にＤＬＬ３に結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または一次抗体が結合するエピトープに近接する（少なくとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、試験抗体は、抗原結合に関して基準抗体と競合し、基準抗体と同じビンに存在する。
【０１４１】
開示される抗体の文脈で使用されるとき、「競合する」または「競合抗体」という用語は、試験下の試験抗体または免疫学的に機能的なフラグメントが、共通の抗原に対する基準抗体の特異的な結合を防止または阻害するアッセイによって判定される、抗体間の競合を意味する。典型的には、このようなアッセイは、固体表面に結合した精製抗体（例えば、ＤＬＬ３またはそのドメインもしくはフラグメント）またはこれらのいずれかを保有する細胞、標識されていない試験免疫グロブリンならびに標識されている基準免疫グロブリンの使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下において固体表面また細胞に結合した標識の量を判定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在するおよび／または最初に結合することが可能である。競合アッセイ（競合抗体）によって特定される抗体には、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体および基準抗体が結合するエピトープに立体障害が生じるのに十分な近接性で隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。競合的結合を判定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、競合抗体は、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。一部の事例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上阻害される。
【０１４２】
逆に、基準抗体が結合される場合、基準抗体は、好ましくは、続いて添加される試験抗体（すなわち、ＤＬＬ３モジュレーター）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。一部の事例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上阻害される。
【０１４３】
本発明に関して、また抗ＤＬＬ３抗体ビンに関して本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０に記載されるように、ＤＬＬ３の細胞外ドメインは、競合的結合により本明細書において「ビンＡ」から「ビンＩ」と称される少なくとも９個のビンを定義することが、（表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により）判明している。モジュレータービニング技法によって提供される分解能を考慮すると、これらの９個のビンは、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域に存在するビンの大半を含むと考えられる。
【０１４４】
これに関して、また当該技術分で既知のように、所望されるビニングデータまたは競合的ビニングデータは、直接的もしくは間接的な固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接的もしくは間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡもしくはＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システム（すなわち、表面プラズモン共鳴−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（すなわち、バイオレイヤー干渉法−ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）またはフローサイトメトリー手法を使用して得ることができる。「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書に使用されるとき、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムの特異的相互作用の分析を可能にする、光学現象を指す。「バイオレイヤー干渉法」という用語は、バイオセンサーチップ上に固定されたタンパク質の層および内部基準層の２つの表面から反射した白色光の干渉パターンを分析する、光学的解析技法を指す。バイオセンサーチップに結合する分子数の何らかの変化が、リアルタイムで測定することができる干渉パターンのシフトをもたらす。特に好ましい実施形態において、分析（表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法またはフローサイトメトリー）は、当該技術分野で既知のＢｉａｃｏｒｅ機器またはＦｏｒｔｅＢｉｏ機器またはフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ）を使用して行われる。
【０１４５】
開示されるＤＬＬ３抗体モジュレーターが会合または結合するエピトープをさらに特徴付けるために、ドメインレベルのエピトープマッピングが、Ｃｏｃｈｒａｎら（参照により本明細書に組み込まれるＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８７（１−２）：１４７−１５８頁（２００４年））に記載されるプロトコルの修正形を使用して行われ得る。簡単に言うと、特定のアミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインを、酵母の表面上に発現させ、各ＤＬＬ３抗体による結合を、フローサイトメトリーを通じて判定した。
【０１４６】
他の適合性のあるエピトープマッピング技法としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３頁）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはペプチド切断分析が挙げられる。加えて、このようなエピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾のような方法を、用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６頁）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の実施形態では、抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる修飾支援型プロファイリング（ＭＡＰ）により、同じ抗原を対象とする多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を化学的または酵素的に修飾した抗原表面に対するそれぞれの抗体の結合プロファイルの類似性に従って類別する方法を、提供する（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーが表すエピトープとははっきりと異なるまたはそれと部分的に重複するかのいずれかである固有のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けの焦点を遺伝子的に異なる抗体に当てることができるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングが可能である。ＭＡＰを使用して、本発明のｈＤＬＬ３抗体モジュレーターを、異なるエピトープに結合する抗体群に分類することができることが、理解される。
【０１４７】
固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質としては、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）のような酵素が挙げられる。固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質はまた、スクシンイミジルエステルおよびそれらの誘導体、第一級アミン含有化合物、ヒドラジンおよびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸などのような化学物質であってもよい。
【０１４８】
抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面またはポリスチレンビーズのいずれかに固定することができる。後者は、例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）のようなアッセイで処理することができる。ＬＵＭＩＮＥＸは最大１００種類の異なるビーズによる多重分析を処理することができるため、ＬＵＭＩＮＥＸは、様々な修飾を有するほぼ無制限の抗原表面を提供し、その結果、バイオセンサーアッセイ全体にわたり抗体エピトーププロファイリングにおける分解能の改善をもたらす。
【０１４９】
ｅ．結合親和性
エピトープ特異性の他に、開示される部位特異的抗体は、例えば、結合親和性のような物理的特徴を使用して特徴付けることができる。この点に関して、本発明は、１つ以上の決定基アイソフォームに対するまたはパン抗体の場合には決定基ファミリーの１つを上回るメンバーに対する、高い結合親和性を有する抗体の使用をさらに包含する。本明細書に使用されるとき、ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して、１０−８Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤ、またはさらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて多様であり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合とは、１０−７Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【０１５０】
「ＫＤ」という用語は、本明細書に使用されるとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことを意図する。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合すると言われる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に、抗原に高親和性で特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合には、非常に高親和性で特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤおよび約１×１０−４／秒のオフ速度を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤでＤＬＬ３に結合し、さらに別の実施形態では、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満または５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１５１】
具体的な実施形態において、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
【０１５２】
別の実施形態において、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−ｌｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５ｘ１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満または１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
【０１５３】
本発明の他の選択された実施形態において、抗体は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１または少なくとも５×１０１５Ｍ−１の親和性定数またはＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。
【０１５４】
前述のモジュレーターの特徴の他に、本発明の抗体は、さらに、例えば、熱安定性（すなわち、融解温度、Ｔｍ）および等電点を含む、追加の物理的特徴を使用して、特徴付けることができる。（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら、１９９３年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １４：１０２３頁；Ｖｅｒｍｅｅｒら、２０００年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：３９４−４０４頁；Ｖｅｒｍｅｅｒら、２０００年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：２１５０−２１５４頁を参照されたい）。
【０１５５】
ＩＶ．部位特異的コンジュゲート
本発明の部位特異的コンジュゲートを使用して、細胞毒素または他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍原性細胞）に送達することができる。本明細書に使用されるとき、「薬物」または「ウォーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）」という用語は、互換的に使用され、以下に記載される抗がん剤を含む、生物学的に活性な分子もしくは薬物または検出可能な分子もしくは薬物を意味する。「ペイロード」は、任意選択的なリンカー化合物と組み合わせた薬物または「ウォーヘッド」を含み得る。コンジュゲートの「ウォーヘッド」は、ペプチド、タンパク質またはインビボで代謝されて活性物質となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子および放射性同位体を含み得る。有利な実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロードを、比較的非反応性非毒性の状態で標的部位へと指向した後に、ウォーヘッドを放出し、活性化する。ウォーヘッドのこのターゲティングされた放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、操作抗体上の１つ以上のシステインを介した）および過剰にコンジュゲートする毒性種を最小限に抑えるＡＤＣ調製物の比較的均質な組成を通じて達成される。ウォーヘッドが腫瘍部位に送達された後にウォーヘッドの大部分を放出するように設計された薬物リンカーと結合させると、本発明のコンジュゲートは、実質的に、望ましくない非特異的毒性を低減させることができる。これは、有利なことに、比較的高いレベルの活性な細胞毒素を腫瘍部位に提供し、同時に、標的とされていない細胞および組織の曝露を最小限に抑え、それによって従来的な薬物コンジュゲートと比較して治療指数の向上をもたらす。
【０１５６】
この点に関して、「操作コンジュゲート」または「部位特異的コンジュゲート」または単純に「コンジュゲート」という用語は、広義に使用され、１つ以上の遊離システインを通じて開示されるターゲティング部分と会合された生物学的に活性または検出可能な分子または薬物を含む、任意の部位特異的構築物を意味すると考えられる。したがって、本発明の一部の実施形態は治療的部分（例えば、細胞毒素）を組み込んだペイロードを含むが、診断剤および生体適合性修飾因子を組み込んだ他のペイロードが、開示されるコンジュゲートによってもたらされるターゲティング放出から利益を得ることができることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードを対象とする任意の開示はまた、文脈により別途示されない限り、本明細書に考察される診断剤または生体適合性修飾因子を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合または非共有結合で抗体に結合することができ、コンジュゲーションを実行するのに使用された方法に少なくとも部分的に応じて、様々な化学量論的モル比を呈し得る。
【０１５７】
本質的には、当該技術分野で認められている技法を使用して従来的な抗体のシステイン残基に結合させることができるいずれのペイロードも、本明細書に開示される新規な技法を使用して、本発明の操作構築物の遊離システインと会合させることができる。
【０１５８】
より具体的には、開示されている本発明の部位特異的抗体が、本明細書の教示に従って生成および／または作製され、選択された後に、これらを、以下に記載されるように１つ以上の医薬として活性な部分もしくは診断的部分または生体適合性修飾因子と結合、融合、コンジュゲート、または別様に会合させることができる。この点に関して、文脈により別途示されない限り、本発明の部位特異的コンジュゲートは、次式
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎまたはその医薬として許容される塩（式中、
ａ）Ａｂは、１つ以上の不対システイン残基を含む抗体を含み、不対システイン残基は、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含まず、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約１２の整数である）
によって表されることが理解される。
【０１５９】
当業者であれば、前述の式による部位特異的コンジュゲートが、多数の異なるリンカーおよび薬物を使用して作製され得ること、ならびに作製またはコンジュゲーションの手法が、構成要素の選択に応じて多様であることを理解する。そのため、部位特異的抗体の反応性システイン上のチオールと反応する任意の薬物または薬物リンカー化合物は、本明細書の教示と適合性がある。同様に、操作抗体への選択された薬物の部位特異的コンジュゲーションを可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。上記にかかわらず、本発明の特に好ましい実施形態は、本明細書に記載され、また以下の実施例に記載されるように、安定化剤を緩徐な還元剤と組み合わせて使用した薬物または薬物リンカーの選択的コンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび混入物が少なく、そのため毒性が低い、より均質な調製物をもたらす傾向にある。
【０１６０】
本明細書の教示と適合性のある例示的なペイロードを、以下に列挙する。
【０１６１】
１．治療剤
示されるように、本発明の部位特異的抗体は、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法剤、標的抗がん剤、生物学的応答修飾因子、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移薬および免疫療法剤が挙げられるがこれらに限定されない、抗がん剤のような治療的部分または薬物である、医薬として活性な部分とコンジュゲート、結合もしくは融合、または別様に会合させることができる。
【０１６２】
例示的な抗がん剤（その相同体および誘導体を含む）は、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリケアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ）、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）のようなマイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テノポシド、テトラカインおよび上述のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を含む。
【０１６３】
追加の適合性のある細胞毒素は、ドラスタチンならびにモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を含むオーリスタチン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチンまたはイプシロン−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）のようなアマニチン、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）のようなＤＮＡ副溝結合剤、修飾型または二量体ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）のようなアルキル化剤、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、メアヤマイシン（ｍｅａｙａｍｙｃｉｎ）類似体または誘導体のようなスプライシング阻害剤（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に記載されているＦＲ９０１４６４）、エポチロン類似体およびチューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）のような微小管結合剤、パクリタキセルならびにカリケアマイシンおよびエスペラミシンのようなＤＮＡ損傷剤、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルデカルバジンのような抗代謝剤、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのような抗有糸分裂剤、ならびにダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシンのようなアントラサイクリン、ならびに上述のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を含む。
【０１６４】
一実施形態において、本発明の抗体を、抗ＣＤ３結合分子と会合させて、細胞毒性Ｔ細胞を動員し、それらに腫瘍原性細胞を標的とさせることができる（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら（２０１０年）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ要旨番号５６２５を参照されたい）。
【０１６５】
さらなる実施形態において、本発明の操作コンジュゲートは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートしている治療用放射性同位体を含み得る。このような実施形態と適合性であり得る例示的な放射性同位体としては、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒａ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒおよび２１１Ａｔが挙げられるがこれらに限定されない。他の放射性核種、特に、６０から４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲のものも、診断剤および治療剤として利用可能である。
【０１６６】
ある特定の一部の実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ、およびそれらの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸、または誘導体を、ウォーヘッドとして含み得る。ＰＢＤは、副溝内のＤＮＡに共有結合し、核酸合成を阻害することによって抗腫瘍活性を発揮する、アルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有するが、最小限の骨髄抑制を呈することが示されている。本発明と適合性のあるＰＢＤは、数種類のリンカー（例えば、遊離スルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に結合させることができ、ある特定の実施形態では、ＰＢＤは、二量体形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせることができる適合性のあるＰＢＤ（および任意選択的なリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７ならびにＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３およびＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。
【０１６７】
他の選択された実施形態において、本発明の部位特異的ＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体ウォーヘッドにコンジュゲートしている。開示される抗体にコンジュゲートさせることができる適合性のあるベンゾジアゼピン誘導体（および任意選択的なリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２ならびにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８およびＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。前述のＰＢＤと同様に、適合性のあるベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの副溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告されており、そのため、本発明のＡＤＣにおける使用に特に好適である。
【０１６８】
前述の薬剤に加えて、本発明の抗体はまた、生体応答修飾因子にコンジュゲートさせることもできる。例えば、一部の実施形態において、薬物部分は、所望される生物学的活性を有するポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（または別の細胞毒性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４年、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）およびＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）のようなアポトーシス剤、血栓剤、抗血管形成剤、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または成長因子、例えば成長ホルモン（ＧＨ）を挙げることができる。
【０１６９】
２．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態において、本発明の部位特異的抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア、または放射性同位体であり得る診断剤または検出可能な薬剤、マーカーまたはレポーターにコンジュゲートしている。標識された抗体は、過剰増殖性障害の発症または進行の監視に有用であり得、または本開示の抗体を含む特定の治療法の有効性を決定するため（すなわち、セラグノスティック）もしくは将来の治療経過を決定するための臨床試験手順の一部として有用であり得る。このようなマーカーまたはレポーターはまた、抗体解析（例えば、エピトープ結合もしくは抗体ビニング）、腫瘍原性細胞の分離もしくは単離または前臨床手順もしくは毒性学研究に使用するために選択された抗体を精製するのにも有用であり得る。
【０１７０】
このような診断分析および／または検出は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む様々な酵素；ストレプトアビジン／ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｌｂｉｏｔｉｎ）およびアビジン／ビオチンのようなものであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンのようなものであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールのようなものであるがこれに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンのようなものであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎのようなものであるがこれらに限定されない放射性材料；様々なポジトロン放出断層撮影法を使用したポジトロン放出金属、非放射性（ｎｏｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ）常磁性金属イオン、ならびに放射標識されたまたは特定の放射性同位体にコンジュゲートしている分子を含むがこれらに限定されない検出可能な物質に、モジュレーターを結合させることによって達成することができる。このような実施形態において、適切な検出手法は、当該技術分野で周知であり、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。
【０１７１】
上述のように、他の実施形態では、部位特異的抗体またはそのフラグメントを、ペプチドまたはフルオロフォアのようなマーカー配列または化合物に融合またはコンジュゲートさせて、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣｓなどのような、精製手順または診断手順または解析手順を容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーは、市販されている多くのものの中でもとりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるもののようなｈｉｓ−タグを含む。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）および「ｆｌａｇ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の操作抗体は、所望される抗体特徴を調節、改変、改善または緩和するために使用することができる、生体適合性修飾因子とコンジュゲートさせることができる。例えば、増加したインビボ半減期を有する抗体または融合構築物は、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または類似の生体適合性ポリマーのような比較的高分子量のポリマー分子を結合することによって、生成することができる。当業者であれば、ＰＥＧが、抗体に特定の特性を付与するように選択することができる（例えば、半減期を調整することができる）、多数の異なる分子量および分子構造で得ることができることを理解する。ＰＥＧは、抗体または抗体のフラグメントもしくは誘導体に、多官能性リンカーありまたはなしで、抗体もしくは抗体フラグメントのＮ末端もしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを通じてまたはリジン残基に存在するイプシロンアミノ基を介してのいずれかで、結合され得る。生物学的活性の喪失を最小限に抑える直鎖状または分枝状ポリマー誘導体化を使用してもよい。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって厳密に監視して、抗体分子へのＰＥＧ分子の最適なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。類似の様式で、開示される抗体は、抗体または抗体フラグメントを、インビボでより安定にするためまたはインビボでの半減期をより長くするために、アルブミンにコンジュゲートさせることができる。これらの技法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７ならびにＥＰ  ０  ４１３，６２２を参照されたい。他の生体適合性コンジュゲートは、当業者には明らかであり、本明細書の教示に従って容易に特定することができる。
【０１７３】
４．リンカー化合物
前述のペイロードと同様に、多数のリンカー化合物が、本発明と適合性であり、開示される部位特異的コンジュゲートをもたらすために本明細書の教示と組み合わせて良好に使用し得る。広い意味では、リンカーは、単に、遊離システインによってもたらされる反応性チオールおよび選択された薬物化合物と共有結合する必要があるだけである。しかしながら、他の実施形態において、適合性リンカーは、任意の置換基を含む任意の到達可能な部位で、選択された薬物に共有結合することができる。したがって、操作抗体の遊離システインと反応し、比較的安定な本発明の部位特異的コンジュゲートをもたらすために使用することができるいずれのリンカーも、本明細書の教示と適合性がある。
【０１７４】
選択的に還元された遊離システインへの効果的な結合に関して、当該技術分野で認められているいくつかの化合物は、チオールの良好な求核性を利用し、したがって、適合性のあるリンカーの一部としての使用に利用可能である。遊離システインのコンジュゲーション反応としては、チオール−マレイミド反応、チオール−ハロゲノ（ハロゲン化アシル）反応、チオール−エン反応、チオール−イン反応、チオール−ビニルスルホン反応、チオール−ビスルホン反応、チオール−チオスルホネート反応、チオール−ピリジルジスルフィド反応およびチオール−パラフルオロ反応が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書においてさらに考察され、また以下の実施例に示されるように、チオール−マレイミドバイオコンジュゲーションは、その高速な反応および緩徐なコンジュゲーション条件のために、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチに伴う１つの問題は、逆マイケル反応ならびに抗体または他の標的タンパク質からのマレイミド−結合ペイロードの消失または血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンなどへの移入の可能性である。しかしながら、選択的還元の使用および本明細書に記載される部位特異的抗体を使用して、コンジュゲートを安定化させ、この望ましくない移入を低減させることができる。チオール−ハロゲン化アシル反応は、逆マイケル反応を受けることができず、したがって、より安定である、バイオコンジュゲートをもたらす。しかしながら、チオール−ハロゲン化物反応は、一般に、マレイミド系コンジュゲーションと比較して反応速度が遅く、したがって、それほど効率的ではない。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、別の普及しているバイオコンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの急速な交換を受け、混合ジスルフィドをもたらし、ピリジン−２−チオンの放出をもたらす。混合ジスルフィドは、還元性の細胞環境において切断され、ペイロードが放出され得る。バイオコンジュゲーションにおいてさらなる関心を集めている他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン反応およびチオール−ビスルホン反応であり、これらの反応のそれぞれは、本明細書の教示と適合性があり、本発明の範囲内に明示的に含まれる。
【０１７５】
適合性のあるリンカーに関して、開示されるＡＤＣに組み込まれる化合物は、好ましくは、細胞外で安定であり、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、ＡＤＣを水性媒体中に自由に可溶性に保ち、単量体状態に保つ。細胞内への輸送前または送達前は、抗体−薬物コンジュゲートは、好ましくは、安定であり、無傷なままである、すなわち、抗体は、薬物部分に結合したままである。リンカーは、標的細胞の外部で安定であるが、リンカーは、細胞の内部では何らかの効率的な速度で切断または分解されるように設計されている。したがって、有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがそのターゲティング部位に送達または輸送されるまで、安定で無傷なままである、すなわち、切断も分解もされず、（ｉｖ）薬物部分の細胞毒性効果、細胞殺滅効果または細胞増殖抑制効果を維持する。添付の実施例にさらに詳細に考察されるように、ＡＤＣの安定性は、質量分析法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳによる分離／分析技法のような標準的な解析技法によって測定することができる。上に記載されるように、抗体および薬物部分の共有結合は、リンカーが２つの反応性官能基を有することを必要とする、すなわち、反応性の意味で二価性を有することを必要とする。ＭＭＡＥおよび部位特異的抗体のような、２つ以上の機能性部分または生物学的に活性な部分を結合するのに有用な二価リンカー試薬が既知であり、それらの結果として得られるコンジュゲートを提供するための方法が、説明されている。
【０１７６】
本発明と適合性のあるリンカーは、切断型リンカーおよび非切断型リンカーとして広く分類され得る。酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断型リンカーおよびジスルフィドリンカーを含み得る、切断型リンカーは、標的細胞による内部移行およびエンドソーム−リソソーム経路における切断を利用する。細胞毒素の放出および活性化は、ヒドラゾンまたはオキシムのような酸不安定性の化学結合の切断を促進するエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リンカー内にリソソーム特異的プロテアーゼ切断部位を操作する場合、細胞毒素は、それらの細胞内標的の近傍で放出される。あるいは、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞毒性ペイロードが、血流中の酸素が豊富な環境においては切断されないが、細胞の還元条件下においては選択的に切断されるため、細胞内に放出されるアプローチを提供する。対比の目的で、アミド結合型ポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する、適合性のある非切断型リンカーは、標的細胞内での抗体−薬物コンジュゲートのリソソーム分解中に、毒性ペイロードを遊離させる。いくつかの点で、リンカーの選択は、部位特異的コンジュゲートに使用される特定の薬物に依存する。
【０１７７】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断物質によって切断される、リンカーを含む。このリンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼ酵素またはプロテアーゼ酵素によって切断される、ペプチジルリンカーであり得る。一部の実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断物質としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを挙げることができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞内での活性薬物の放出をもたらすことが既知である。チオール依存性プロテアーゼカテプシンＢによって切断される例示的なペプチジルリンカーは、カテプシンＢががん性組織内で高度に発現することが見出されているため、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、このようなリンカーに関して参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。具体的な好ましい実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されるようなＶａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−ＡｌａリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク質分解型放出を使用することの１つの利点は、この治療剤が、典型的に、コンジュゲートすると減弱化され、コンジュゲートの血清中での安定性が、典型的に高いことである。
【０１７８】
他の実施形態において、切断型リンカーは、ｐＨ感受性である、すなわち、ある特定のｐＨ値において、加水分解に対して感受性である。典型的に、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下において加水分解性である。例えば、リソソーム内で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニチンアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８、５，８２４，８０５、５，６２２，９２９を参照されたい）。このようなリンカーは、血中ｐＨのような中性のｐＨ条件下において比較的安定であるが、リソソームの近似ｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。
【０１７９】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成することができるものを含む、様々なジスルフィドリンカーが、当該技術分野で既知である。さらに他の具体的な実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４頁）または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２頁）である。
【０１８０】
特に好ましい実施形態（リンカーに関して、本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に記載される）において、適合性のあるペプチジルリンカーは、
【０１８１】
【化１】
2018511579.tif 000006
【０１８２】
を含み、式中、アスタリスクは、薬物への結合点を示し、ＣＢＡは、部位特異的抗体であり、Ｌ１は、リンカーであり、Ａは、Ｌ１を部位特異的抗体の不対システインに接続する接続基であり、Ｌ２は、共有結合であるまたは−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自壊型リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は、切断型リンカーである。
【０１８３】
Ｌ１は、好ましくは、切断型リンカーであり、切断のためにリンカーの活性化のためのトリガーと称することができる。
【０１８４】
Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得る。これらの基は、それらの切断特徴に基づいて選択され、これらの特徴は、コンジュゲートが送達される部位における条件によって決定され得る。酵素の作用によって切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸または塩基不安定性）、温度の変化または照射時の変化（例えば、光不安定性）によって切断可能なリンカーもまた、使用され得る。還元条件下または酸化条件下において切断可能なリンカーもまた、本発明における用途を見出し得る。
【０１８５】
Ｌ１は、連続的なアミノ酸配列を含み得る。アミノ酸配列は、酵素切断のための標的基質であり得、これによって薬物の放出が可能となる。
【０１８６】
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用によって切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
【０１８７】
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表すことができ、式中、−ＮＨ−および−ＣＯ−は、アミノ酸基Ｘ１およびＸ２それぞれのＮ末端およびＣ末端を表す。ジペプチド内のアミノ酸は、天然のアミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーが、カテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシンに媒介される切断のための作用部位であり得る。
【０１８８】
加えて、カルボキシル側鎖官能性またはアミノ側鎖官能性を有するアミノ酸基、例えば、それぞれ、ＧｌｕおよびＬｙｓについては、ＣＯおよびＮＨは、その側鎖の官能性を表し得る。
【０１８９】
一実施形態において、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、式中、Ｃｉｔはシトルリンである。
【０１９０】
好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
【０１９１】
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
【０１９２】
一実施形態において、Ｌ２が存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性のための基質であり、これによって、薬物の放出が可能となる。
【０１９３】
一実施形態において、Ｌ１が、酵素の作用により切断され、Ｌ２が存在する場合、酵素が、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０１９４】
Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって接続され得る。
【０１９５】
Ｌ２に接続されるＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であってもよく、またはアミノ酸側鎖、例えば、リジンアミノ酸側鎖のアミノ基から誘導されてもよい。
【０１９６】
Ｌ２に接続されるＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であってもよく、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基から誘導されてもよい。
【０１９７】
Ｌ２に接続されるＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基から誘導され得る。
【０１９８】
「アミノ酸側鎖」という用語には、（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンのような天然に存在するアミノ酸、（ｉｉ）オルニチンおよびシトルリンのような希少なアミノ酸、（ｉｉｉ）非天然のアミノ酸、ベータ−アミノ酸、天然に存在するアミノ酸の合成類似体および誘導体、ならびに（ｉｖ）これらのすべてのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体富化形態、同位体標識（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）形態、保護形態、およびラセミ混合物に見出される基が含まれる。
【０１９９】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は、一緒になって、基：
【０２００】
【化２】
2018511579.tif 000007
【０２０１】
を形成し、式中、アスタリスクは、薬物または細胞毒性剤位置への結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは、０から３である。フェニレン環は、本明細書に記載される１つ、２つまたは３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、ＲまたはＯＲで置換されていてもよい。
【０２０２】
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
【０２０３】
一実施形態において、ｎは、０または１である。好ましくは、ｎは、０である。
【０２０４】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自壊型リンカーは、ｐアミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０２０５】
別の特に好ましい実施形態において、リンカーは、自壊型リンカーを含み得、ジペプチドは、一緒になって、以下に示される−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成し、
【０２０６】
【化３】
2018511579.tif 000008
【０２０７】
式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートさせることができるリンカーの残りの部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す。酵素によりジペプチドが切断されると、自壊型リンカーは、遠隔部位が活性化され、保護された化合物（すなわち、細胞毒素）の完全な放出が可能となり、以下に示される流れに沿って進行するが、
【０２０８】
【化４】
2018511579.tif 000009
【０２０９】
式中、Ｌ＊は、ここで切断されたペプチジル単位を含むリンカーの残りの部分の活性化形態である。薬物の完全な放出により、薬物が所望される毒性活性を維持することが確実となる。
【０２１０】
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とが、直接接続される。例えば、Ｌ１が、連続的なアミノ酸配列を含む場合、この配列のＮ末端は、遊離システインに直接接続し得る。
【０２１１】
別の実施形態では、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とは、間接的に接続される。
【０２１２】
Ｌ１とＡとは、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって接続され得る。
【０２１３】
以下にさらに詳細に考察され、また以下の実施例１０−１３に記載されるように、本発明の薬物リンカーは、遊離システイン上の反応性チオール求核試薬に結合される。この目的で、遊離システイン部位特異的抗体は、ＤＴＴもしくはＴＣＥＰまたは本明細書に記載される緩徐な還元剤のような様々な還元剤での処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にすることができる。
【０２１４】
好ましくは、リンカーは、モジュレーター上の求核性官能基との反応のための求電子性官能基を含有する。抗体上の求核性基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合には糖ヒドロキシル基または糖アミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン基、チオール基、およびヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステルのような活性エステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物、ならびに（ｉｖ）ハロアセトアミドのようなアルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物、ならびに（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含み、一部が以下に例示されている、リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して、これらと共有結合を形成することができる。
【０２１５】
【化５】
2018511579.tif 000010
【０２１６】
特に好ましい実施形態において、部位特異的抗体と薬物−リンカー部分との接続は、操作抗体の遊離システインのチオール残基およびリンカーに存在する末端マレイミド基を介する。このような実施形態において、細胞結合剤と薬物−リンカーとの間の接続は、
【０２１７】
【化６】
2018511579.tif 000011
【０２１８】
であり、式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残りの部分への結合点を示し、波線は、操作抗体の残りの部分への結合点を示す。この実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、遊離システイン抗体から誘導される。他の適合性のあるリンカーに関して、結合部分は、活性化されたチオールと反応して、所望される部位特異的コンジュゲートをもたらすことができる、末端ヨードアセトアミドを含む。このリンカーの好ましいコンジュゲーション手順は、他の実施形態に見出され以下の実施例に記載される選択的還元を含むマレイミド結合基の好ましいコンジュゲーション手順とは若干異なる。いずれの場合も、当業者であれば、開示される薬物−リンカー化合物のそれぞれを、本開示を踏まえて、適合性のある部位特異的抗体と容易にコンジュゲートさせることができる。
【０２１９】
５．コンジュゲーション
上述のように、本発明によって提供されるコンジュゲート調製物は、本明細書に記載される操作されたシステインおよび／または新規なコンジュゲーション手順の提供に少なくとも部分的に起因して、安定性の向上および実質的な均質性を呈する。抗体の鎖内または鎖間ジスルフィド結合のそれぞれを完全にまたは部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来的なコンジュゲーション手法とは異なり、本発明は、有利なことに、ある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元および遊離システイン部位への薬物−リンカーの指向を提供する。操作部位およびそれに伴う選択的還元により促進されるコンジュゲーション特異性は、所望される位置における高い割合の部位指向性コンジュゲーションを可能にする。重要なことに、軽鎖定常領域の末端領域に存在するもののような、これらのコンジュゲーション部位の一部は、典型的に、それらが他の遊離システインと交差反応するため、効果的にコンジュゲートさせることが困難である。しかしながら、分子の操作および結果として得られる遊離システインの選択的還元を通じて、効率的なコンジュゲーション率を得ることができ、これにより、望ましくない高ＤＡＲの混入物および非特異的毒性を大幅に低減させる。より一般的には、操作構築物および選択的還元を含む開示される新規なコンジュゲーション方法は、明白に、改善された薬物動態および／または薬力学を有し、改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
【０２２０】
これに関して、部位特異的構築物は、遊離システインを提示するが、この遊離システインは、還元されると、求核性であり、直前に開示されたもののようなリンカー部分上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる、チオール基を含む。本発明の好ましい抗体は、還元性不対鎖間または鎖内システインを有する、すなわち、このような求核性基を提供するシステインを有する。他の好ましい実施形態において、不対または遊離システインは、抗体の重鎖または軽鎖に導入または付加されたシステイン残基によって提供される。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物−リンカーの末端マレイミド基またはハロアセトアミド基との反応が、所望されるコンジュゲーションをもたらす。このような場合、また以下の実施例１０および１１に記載されるように、抗体の遊離システインは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元剤での処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にすることができる。それぞれの遊離システインは、したがって、理論上、反応性チオール求核試薬を提示する。このような試薬は適合性があるが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に既知の様々な反応、条件および試薬を使用して実行され得ることが理解される。
【０２２１】
逆に、本発明者らは、操作抗体の遊離システインを、選択的に還元して、部位指向性コンジュゲーションの強化および望ましくない潜在的な毒性混入物質の低減をもたらすことができることを発見した。より具体的には、アルギニンのような「安定化剤」が、タンパク質において分子内および分子間相互作用を調整することが見出されており、これらの安定化剤を、選択された還元剤（好ましくは比較的緩徐なもの）と併せて使用して、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に記載される部位特異的コンジュゲーションを促進することができる。本明細書に使用されるとき、「選択的還元」または「選択的に還元する」という用語は、互換的に使用することができ、操作抗体に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することのない、遊離システインの還元を意味するものとする。選択された実施形態において、これは、ある特定の還元剤によって実行され得る。他の好ましい実施形態において、操作構築物の選択的還元は、還元剤（緩徐な還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。「選択的コンジュゲーション」という用語は、本明細書に記載されるように、選択的に還元されている操作抗体と、細胞毒素とのコンジュゲーションを意味する。これに関して、また実施例１２−１３に実証されるように、還元剤と組み合わせたこのような安定化剤の使用は、抗体の重鎖および軽鎖におけるコンジュゲーションの程度および調製物のＤＡＲ分布によって判定される、部位特異的コンジュゲーションの効率性を著しく改善することができる。
【０２２２】
任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、このような安定化剤は、所望されるコンジュゲーション部位における静電的微小環境を調整するおよび／または立体配置の変化を調整するように作用し得、これによって、比較的緩徐な還元剤（無傷な天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）が所望されるシステイン部位におけるコンジュゲーションを促進することが可能となり得る。このような薬剤（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩架橋（水素結合および静電相互作用を介する）を形成することが既知であり、好ましい立体配置の変化を引き起こすことができるおよび／または望ましくないタンパク質間相互作用を低減させることができる、安定化作用を付与するような方式でタンパク質間相互作用を調整することができる。さらに、このような薬剤は、還元後の望ましくない分子内（および分子間）におけるシステイン間結合の形成を阻害するように作用し得、これによって、操作部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合される所望のコンジュゲーション反応が促進される。反応条件は、無傷な天然のジスルフィド結合の著しい還元をもたらさないため、コンジュゲーション反応は、自然と、遊離システイン上の比較的少数の反応性チオール（例えば、好ましくは２個の遊離チオール）に向けられる。示唆されるように、これにより、本明細書に記載されるように作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルが大幅に低減される。
【０２２３】
選択された実施形態において、本発明と適合性のある安定化剤は、一般に、塩基性のｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、アミン部分は、第一級アミンを含むが、他の好ましい実施形態では、アミン部分は、第二級アミンを含む。さらに他の好ましい実施形態では、アミン部分は、第三級アミンを含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含むが、他の適合性のある実施形態では、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質を構成するアミノ酸を含む。なおも他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質を構成しないアミノ酸を含む。特に好ましい実施形態において、適合性のある安定化剤は、アルギニン、リジン、プロリンおよびシステインを含み得る。加えて、適合性のある安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
【０２２４】
ある特定の実施形態において、適合性のある安定化剤は、約７．５を上回るｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態では、対象アミン部分は、約８．０を上回るｐＫａを有し、さらに他の実施形態では、アミン部分は、約８．５を上回るｐＫａを有し、なおも他の実施形態では、安定化剤は、約９．０を上回るｐＫａを有するアミン部分を含む。他の好ましい実施形態は、アミン部分が約９．５を上回るｐＫａを有する安定化剤を含むが、ある特定の他の実施形態は、約１０．０を上回るｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を呈する安定化剤を含む。さらに他の好ましい実施形態において、安定化剤は、約１０．５を上回るｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態では、安定化剤は、約１１．０を上回るｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１１．５を上回るｐＫａを有するアミン部分を含む。なおも他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０を上回るｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１２．５を上回るｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者であれば、関連するｐＫａが、標準的な技法を使用して容易に計算または判定できること、および選択された化合物を安定化剤として使用することの適用可能性を判定するために使用できることを理解する。
【０２２５】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わせた場合に、コンジュゲーションを遊離部位特異的システインにターゲティングすることに特に有効であることが示されている。本発明の目的で、適合性のある還元剤には、操作抗体の天然のジスルフィド結合を著しく破壊することなく、コンジュゲーションのための、還元された遊離部位特異的システインをもたらす、任意の化合物が含まれ得る。選択された安定化剤および還元剤の組合せによってもたらされるこのような条件下において、活性化薬物リンカーは、結合が、所望される遊離部位特異的システイン部位に大部分が制限される。緩徐な条件をもたらすような比較的緩徐な還元剤または比較的低濃度で使用される還元剤が、特に好ましい。本明細書に使用されるとき、「緩徐な還元剤」または「緩徐な還元条件」という用語は、操作抗体に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位にチオールを提供する還元剤（任意選択的に、安定化剤の存在下において）によってもたらされる、任意の薬剤または状態を意味すると理解されるものとする。すなわち、緩徐な還元剤または緩徐な還元条件は、タンパク質の天然のジスルフィド結合を著しく破壊することなく、遊離システイン（チオールをもたらす）を効果的に還元することができる。所望される還元条件は、選択的コンジュゲーションに適した環境を確立する、いくつかのスルフヒドリル系化合物によってもたらされ得る。好ましい実施形態において、緩徐な還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得るが、特に好ましい実施形態では、緩徐な還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明と適合性のある還元剤の非限定的な例には、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオールおよび２−ヒドロキシエタン−１−チオールが含まれる。
【０２２６】
上述の選択的還元プロセスは、遊離システインを標的とするコンジュゲーションに特に有効であることが理解される。これに関して、部位特異的抗体における所望される標的部位へのコンジュゲーションの程度（本明細書において「コンジュゲーション効率」として定義される）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技法によって判定することができる。抗体への薬物の部位特異的コンジュゲーションの効率は、標的コンジュゲーション部位（本発明では、軽鎖のＣ末端上の遊離システイン）におけるコンジュゲーションの割合を、すべての他のコンジュゲーション部位と対比して評価することによって判定することができる。ある特定の実施形態において、本明細書の方法は、遊離システインを含む抗体への薬物の効率的なコンジュゲーションを提供する。一部の実施形態において、コンジュゲーション効率は、すべての他のコンジュゲーション部位と対比した標的コンジュゲーションの割合によって測定すると、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはそれ以上である。
【０２２７】
コンジュゲーションが可能な操作抗体は、抗体が生成または保管される場合にはブロッキングまたはキャッピングされるスルフヒドリル基を含む、遊離システイン残基を含有し得ることが、さらに理解される。このようなキャップとしては、スルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲートの形成を防止または阻害する、タンパク質、ペプチド、イオンまたは他の材料が挙げられる。一部の場合には、コンジュゲートしていない操作抗体は、同じ抗体上または異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含み得る。実施例で考察されるように、このような交差反応性は、作製手順中に、様々な混入物をもたらし得る。一部の実施形態において、操作抗体は、コンジュゲーション反応の前に脱キャッピングすることを必要とする場合がある。具体的な実施形態において、本明細書の抗体は、脱キャッピングされ、コンジュゲーションが可能なスルフヒドリル基を提示する。具体的な実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を妨害または再配置することのない脱キャッピング反応に供される。多くの場合、脱キャッピング反応は、通常の還元反応（還元または選択的還元）中に生じることが理解される。
【０２２８】
６．ＤＡＲ分布および精製
本発明の利点の１つは、綿密に調整されたＤＡＲ分布を含む、比較的均質なコンジュゲート調製物を生成する能力である。この点に関して、開示される構築物および／または選択的コンジュゲーションは、薬物と操作抗体との化学量論比の点で、試料内でのＡＤＣ種の均質性をもたらす。上に簡略的に考察されたように、「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」という用語は、部位特異的抗体に対する薬物のモル比を指す。一部の実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して、実質的に均質であり得るが、これは、調製物内には、特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有し、ローディング部位（すなわち、遊離システイン上の）に関してもまた均一な、主要な特異的ＡＤＣ種が存在することを意味する。本発明のある特定の実施形態において、部位特異的抗体または選択的組合せの使用を通じて、所望される均質性を達成することが可能である。他の好ましい実施形態では、所望される均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成され得る。さらに他の特に好ましい実施形態では、調製物は、解析クロマトグラフィー技法または分取クロマトグラフィー技法を使用してさらに精製してもよい。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）またはキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して分析することができる。
【０２２９】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、標準的な医薬調製方法を用いて、所望される純度を得ることができることが理解される。以下の実施例で実証されるように、逆相（ＲＰ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のような液体クロマトグラフィー法は、薬物ローディング値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合には、混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）もまた、特定の薬物ロードを有する種を単離するために使用することができる。より一般的には、不溶性の混入物を除去した後、モジュレーター調製物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーのような標準的な技法を使用してさらに精製することができるが、親和性クロマトグラフィーが特に関心の高い技法である。この点に関して、プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができるが、プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に推奨される。イオン交換カラム、エタノール沈殿、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂でのセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿のような他のタンパク質精製技法もまた、回収される抗体またはコンジュゲートに応じて利用可能である。
【０２３０】
この点に関して、開示される部位特異的コンジュゲートおよびその調製物は、薬物および抗体部分を、操作構築物の構造に応じて、またコンジュゲーションを実行するのに使用される方法に少なくとも部分的に応じて、様々な化学量論的モル比で含み得る。ジスルフィド結合が破壊される数ならびにどの鎖間および鎖内ジスルフィド結合が破壊されるかに応じて、理論上の薬物ローディングは比較的高くなり得るが、遊離システインの交差反応性のような実際上の制限により、凝集物および他の混入物に起因して、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は制限される。すなわち、例えば、６を上回る高薬物ローディングは、ある特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞内透過性の喪失をもたらし得る。このような懸念事項を考慮して、本発明によって提供される実際の薬物ローディングは、操作抗体１個当たり１から１２個の薬物の範囲にわたり得る、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の薬物が、それぞれの部位特異的抗体に共有結合する（例えば、ＩｇＧ１に関して、他の抗体は、ジスルフィド結合の数に応じて、異なるローディング量を有し得る）。選択された実施形態は、１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物がそれぞれの部位特異的抗体に共有結合した操作抗体を含む。より好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４または６であり、特に好ましい実施形態では、ＤＡＲは、およそ２を含む。
【０２３１】
本発明によって提供される比較的高レベルの均質性にもかかわらず、開示される組成物は、実際には、１から８個の範囲の薬物化合物（ＩｇＧ１の場合）を有する操作コンジュゲート混合物を含む。このため、開示されるＡＤＣ組成物は、構成要素である抗体の大半が、１つ以上の薬物部分に共有結合しており、（選択的還元のコンジュゲート特異性にもかかわらず）薬物部分を様々なチオール基により抗体に結合させることができる、コンジュゲート混合物を含む。すなわち、コンジュゲーションの後、本発明のＡＤＣ組成物は、異なる薬物ロード（例えば、ＩｇＧ１抗体１個当たり１から８個の薬物）を様々な濃度で有するコンジュゲートの混合物を（主に遊離システインの交差反応性によって生じるある特定の反応混入物とともに）含む。選択的還元および作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望されるＡＤＣ種（例えば、薬物ローディングが２のもの）を主に含有し、他のＡＤＣ種（例えば、薬物ローディングが１、４、６などのもの）が比較的低いレベルである点に到達させることができる。平均ＤＡＲ値は、全体としての（すなわち、すべてのＡＤＣをまとめた）組成物の薬物ローディングの加重平均を表す。用いられる定量化法における固有の不確実さおよび商業環境での主要でないＡＤＣ種の完全な除去が困難であることに起因して、許容されるＤＡＲの値または規格は、平均、範囲または分布（すなわち、２±０．５の平均ＤＡＲ）として提示されることが多い。好ましくは、測定された平均ＤＡＲが範囲内（すなわち、１．５から２．５）に含まれる組成物が、医薬環境で使用される。
【０２３２】
したがって、ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８、それぞれ±０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の好ましい実施形態では、本発明は、２、４、６または８、±０．５の平均ＤＡＲを含む。最後に、選択された好ましい実施形態では、本発明は、２±０．５の平均ＤＡＲを含む。範囲または偏差は、ある特定の好ましい実施形態では、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７または８、それぞれ±０．３の平均ＤＡＲを含み、２、４、６または８±０．３の平均ＤＡＲを含み、さらにより好ましくは、２または４±０．３の平均ＤＡＲを含み、さらには２±０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７または８、それぞれ±０．４の平均ＤＡＲおよび比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）の主要でないＡＤＣ種を有する組成物を含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６または８、それぞれ±０．４の平均ＤＡＲを含み、主要でないＡＤＣ種が比較的低いレベル（３０％未満）である。特に好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２±０．４の平均ＤＡＲを含み、主要でないＡＤＣ種が比較的低いレベル（３０％未満）である。さらに他の実施形態において、主要なＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２のもの）は、他のＤＡＲ種に対して測定した場合に、７０％を上回る濃度、７５％を上回る濃度、８０％を上回る濃度、８５％を上回る濃度、９０％を上回る濃度、９３％を上回る濃度、９５％を上回る濃度またはさらには９７％を上回る濃度で存在する。
【０２３３】
さらに他の実施形態において、本発明の操作コンジュゲート組成物は、１から１２の範囲内のＤＡＲを含む。このような実施形態は、１から３の範囲内の平均ＤＡＲ、２から４の範囲内の平均ＤＡＲ、３から５の範囲内の平均ＤＡＲ、４から６の範囲内の平均ＤＡＲ、５から７の範囲内の平均ＤＡＲ、６から８の範囲内の平均ＤＡＲ、７から９の範囲内の平均ＤＡＲ、８から１０の範囲内の平均ＤＡＲ、９から１１の範囲内の平均ＤＡＲまたは１０から１２の範囲内の平均ＤＡＲを有する組成物を含み得る。好ましくは、組成物は、１から３の範囲内の平均ＤＡＲまたは３から５の範囲内の平均ＤＡＲを有する。
【０２３４】
以下の実施例に詳述されるように、コンジュゲーション反応によるＡＤＣ調製物における抗体当たりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ、および電気泳動のような従来的な手段によって特徴付けることができる。抗体当たりの薬物数の点で、ＡＤＣの定量的分布を判定することもできる。ＥＬＩＳＡによって、特定のＡＤＣ調製物中の抗体当たりの薬物の平均値を判定することができる。しかしながら、抗体当たりの薬物値の分布は、抗体−抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界により、認識できない。また、抗体−薬物コンジュゲートの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が、重鎖フラグメントまたは軽鎖フラグメントまたは特定のアミノ酸残基のような、抗体のどの位置に結合しているかは判定しない。残基。
【０２３５】
Ｖ．医薬調製物および治療的使用
１．製剤および投与経路
選択された部位特異的コンジュゲートの形態、意図される送達モード、治療または監視されている疾患および多数の他の変数に応じて、本発明の組成物は、当該技術分野で認められている技法を使用して所望されるように製剤化することができる。一部の実施形態において、本発明の治療用組成物は、未希釈で投与されてもよく、または最小限の追加の成分を伴って投与されてもよいが、その他に、任意選択的に、当該技術分野で周知の賦形剤および補助剤を含む好適な医薬として許容される担体を含有して製剤化されてもよい（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：  Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２００３年）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４年）；Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照されたい）。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含む様々な医薬として許容される担体が、多数の商業的供給源から容易に入手できる。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などのような、医薬として許容される各種の補助物質もまた、入手可能である。ある特定の非限定的な例示的担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せが挙げられる。
【０２３６】
より具体的には、一部の実施形態において、本発明の治療用組成物は、未希釈で投与されてもよく、または最小限の追加の成分を伴って投与されてもよいことが理解される。逆に、本発明の部位特異的ＡＤＣは、任意選択的に、当該技術分野で周知であり、コンジュゲートの投与を容易にするまたは活性な化合物を処理して作用部位への送達に関して医薬として最適化された調製物にするのを助ける比較的不活性な物質である、賦形剤および補助剤を含む好適な医薬として許容される担体を含有して製剤化されてもよい。例えば、賦形剤は、ＡＤＣの薬物動態または安定性を改善するための形態もしくは稠度をもたらし得るまたはそのための希釈剤として作用し得る。好適な賦形剤または添加剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、オスモル濃度を変化させるための塩、封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透増強剤が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の好ましい実施形態において、医薬組成物は、例えば、凍結乾燥形態で提供され、投与の前に、例えば、緩衝食塩水中で再構成され得る。このような再構成された組成物は、好ましくは、静脈内投与される。
【０２３７】
開示される全身投与用ＡＤＣは、腸内投与用、非経口投与用または局所投与用に製剤化することができる。実際には、３種類すべての製剤を同時に使用して、活性成分の全身投与を達成してもよい。非経口および非経口でない薬物送達用の賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に記載されている。非経口投与に好適な製剤には、水溶性形態、例えば、水溶性の塩の形態の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、油性注射用懸濁液として適切な活性化合物の懸濁液を、投与してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ヘキシル置換ポリ（ラクチド）、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含み得る。任意選択的に、懸濁液は、安定化剤もまた含有し得る。また、リポソームを使用して、細胞内送達のために薬物を封入することもできる。
【０２３８】
腸内投与に好適な製剤としては、硬ゼラチンカプセルもしくは軟ゼラチンカプセル、丸剤、コーティングされた錠剤を含む錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップ剤または吸入剤ならびにこれらの制御放出形態が挙げられる。
【０２３９】
非経口投与（例えば、注射による）に好適な製剤としては、活性成分が溶解、懸濁または別様に提供された（例えば、リポソームまたは他の微粒子）、水性または非水性の等張で発熱物質不含の滅菌の液体（例えば、水溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張性にする溶質のような、他の医薬として許容される成分をさらに含有してもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤で使用するのに好適な等張性担体の例としては、注射用塩化ナトリウム、リンガー溶液、または注射用乳酸加リンガー液が挙げられる。
【０２４０】
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合性の製剤は、約１０μｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌのＡＤＣ濃度を含む。ある特定の選択された実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌを含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌを含む。
【０２４１】
一般に、部位特異的ＡＤＣを含む本発明の化合物および組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、心室内、気管内、頬内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内を含むがこれらに限定されない様々な経路によってまたは埋め込みもしくは吸入による他の手段で、投与され得る。本主題の組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルを含むがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物に製剤化することができる。適切な製剤および投与経路は、意図される用途および治療レジメンに従って選択され得る。特に好ましい実施形態において、本発明の化合物は、静脈内送達される。
【０２４２】
２．投薬量
同様に、特定の投薬レジメン、すなわち、用量、時期および反復回数は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに薬物動態のような経験的な検討事項（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与頻度は、治療過程にわたって決定および調節され得、増殖性細胞もしくは腫瘍原性細胞の数の減少、このような新生物細胞の減少の維持、新生物細胞の増殖の低減、または転移発生の遅延に基づく。他の実施形態において、投与される投薬量は、可能性のある副作用および／または毒性を管理するために、調節または減量され得る。あるいは、対象の治療組成物の連続的持続放出製剤が、適切な場合がある。
【０２４３】
当業者であれば、コンジュゲート化合物およびコンジュゲート化合物を含む組成物の適切な投薬量が、患者によって多様であり得ることを理解する。最適な投薬量を決定することは、一般に、治療上の利点のレベルと、任意の危険性または有害な副作用とのバランスを取ることを伴う。選択される投薬量レベルは、具体的な化合物の活性、投与経路、投与時期、化合物の排出速度、治療期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、状態の重症度、ならびに患者の種、性別、年齢、体重、状態、一般的な健康状態、およびこれまでの病歴を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存する。化合物の量および投与経路は、最終的には、医師、獣医師、または臨床医の判断に委ねられるが、一般的には、投薬量は、実質的な有害な副作用または望ましくない副作用を引き起こすことなく、所望される効果を達成する、局所濃度を作用部位に達成するように選択される。
【０２４４】
一般に、本発明の部位特異的ＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、１回の投与当たり約５μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重、１回の投与当たり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、１回の投与当たり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。他の範囲としては、１回投与当たり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重および１回の投与当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。ある特定の実施形態において、投薬量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２４５】
選択された実施形態において、部位特異的ＡＤＣは、１回の投与当たりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内）投与される。他の実施形態は、１回の投与当たり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｇ／ｋｇ体重でのＡＤＣの投与を含む。他の好ましい実施形態において、開示されるコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、１回の投与当たり１２、１４、１６、１８または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。なおも他の実施形態において、コンジュゲートは、１回の投与当たり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を踏まえて、当業者であれば、前臨床動物研究、臨床観察ならびに標準的な医療上および生化学上の技法および測定値に基づいて、様々な部位特異的ＡＤＣの適切な投薬量を容易に決定することができる。特に好ましい実施形態において、このようなコンジュゲートの投薬量は、ある期間にわたって静脈内投与される。さらに、このような投薬量は、既定の治療過程にわたって複数回投与されてもよい。
【０２４６】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されるように、体表面積（ＢＳＡ）の計算値に基づいて予測することができる。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、対象の身体の表面積により表される対象のサイズの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与されてもよく、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２または４５０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与されてもよい。当該技術分野で認められている技法および経験的技法を使用して、適切な投薬量を決定することができることもまた、理解される。
【０２４７】
いずれの場合においても、開示されるコンジュゲートは、好ましくは、必要に応じて、有益な治療指数をもたらす方式で対象に投与される。投与頻度の決定は、治療されている状態、治療を受けている対象の年齢、治療されている状態の重症度、治療を受けている対象の一般的な健康状態の考慮に基づいて、担当医のような当業者によって行われ得る。一般に、有効用量のＤＬＬ３コンジュゲートは、１回以上、対象に投与される。より具体的には、有効用量のＡＤＣは、１カ月に１回、１カ月に２回以上、または１カ月に１回未満で、対象に投与される。ある特定の実施形態において、有効用量のＤＬＬ３  ＡＤＣは、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間または数年間の期間を含む期間で、複数回投与され得る。さらに他の実施形態において、開示されるモジュレーターの投与の間に、数日間（２、３、４、５、６もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）またはさらには１年間もしくは数年間が経過する場合がある。
【０２４８】
ある特定の好ましい実施形態において、コンジュゲートしているモジュレーターを伴う治療過程は、選択された薬物製品を数週間または数カ月間の期間にわたって複数回投与することを含む。より具体的には、本発明のコンジュゲートしているモジュレーターは、１日１回、２日に１回、４日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、６週間に１回、２カ月に１回、１０週間に１回または３カ月に１回投与され得る。この点に関して、患者の応答および臨床的実践に基づいて、投薬量を変化させてもよく、または間隔を調節してもよいことが理解される。
【０２４９】
投薬量およびレジメンはまた、開示される治療用組成物に関して、１回以上の投与を受けた個体において経験的に決定することもできる。例えば、個体に、漸増投薬量の、本明細書に記載されるように生成した治療用組成物を与えてもよい。選択された実施形態において、投薬量は、それぞれ、経験的に決定された副作用もしくは毒性または観察された副作用もしくは毒性に基づいて、徐々に増加または低減もしくは減少させることができる。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害または状態のマーカーを、前述のように追跡してもよい。がんに関して、これらのマーカーには、触診もしくは目視観察による腫瘍サイズの直接的な測定；ｘ線もしくは他の撮像技法による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡検査によって評価される改善；間接的腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんのＰＳＡ）または本明細書に記載される方法に従って特定された腫瘍原性抗原の測定；疼痛もしくは麻痺の減少；発話、視力、呼吸もしくは腫瘍と関連する他の機能障害の改善；食欲の増加；または認められている試験により測定される生活の質の向上もしくは生存の延長が挙げられる。当業者には、投薬量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の段階、新生物状態が個体における他の位置への転移を開始しているかどうか、ならびに使用されている過去および現在の治療に応じて多様であることが明らかである。
【０２５０】
３．組合せ療法
本発明によると、組合せ療法が、望ましくない新生物細胞増殖の低減もしくは阻害、がんの発生の減少、がんの再発の減少もしくは予防、またはがんの拡がりもしくは転移の減少もしくは予防に、特に有用であり得る。このような場合には、本発明のＡＤＣは、通常であれば腫瘍塊を支持し永続させるＣＳＣを除去することによって感作剤または化学感作剤として機能し得、これによって、現在の標準的な治療法である減量剤または抗がん剤のより効果的な使用が可能となる。すなわち、開示されるＡＤＣは、ある特定の実施形態において、別の投与される治療剤の作用モードを強化する、効果の増強（例えば、本質的に相加的または相乗的なもの）をもたらす。本発明の文脈において、「組合せ療法」は、広義に解釈されるべきであり、単に、部位特異的ＡＤＣおよび１つ以上の抗がん剤の投与を指し、この１つ以上の抗がん剤には、特異的アプローチおよび非特異的アプローチの両方を含め、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的抗がん剤（モノクローナル抗体および小分子実体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、照射療法および抗転移剤ならびに免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５１】
組み合わせた結果が、それぞれの治療（例えば、ＡＤＣおよび抗がん剤）を別個に行った場合に観察される効果の相加物となるような要件は存在しない。一般に、少なくとも相加的効果が望ましいが、単独療法のものよりも高い抗腫瘍効果の増加が有益である。さらに、本発明は、組合せ治療が相乗効果を呈することを要するものではない。しかしながら、当業者であれば、好ましい実施形態を含むある特定の選択された組合せにより、相乗作用が観察され得ることを理解する。
【０２５２】
組合せ療法を実施する際、コンジュゲートおよび抗がん剤は、単一の組成物中または同一もしくは異なる投与経路を使用する２つ以上の異なる組成物中のいずれかで、対象に同時に投与され得る。あるいは、ＡＤＣは、例えば、数分から数週間の範囲にわたる間隔で、抗がん剤治療よりも先に行われてもよく、またはその後に続いてもよい。各送達間の期間は、抗がん剤およびコンジュゲートが、腫瘍に対して組合せ効果を発揮することができるようなものである。少なくとも１つの実施形態において、抗がん剤およびＡＤＣの両方は、互いに約５分以内から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、ＡＤＣの投与と抗がん剤の投与との間に、数日間（２、３、４、５、６もしくは７日間）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８日間）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８カ月間）が経過する場合がある。
【０２５３】
組合せ療法は、１回、２回、または少なくとも状態が治療、緩和もしくは治癒されるまでのある期間にわたり、投与され得る。一部の実施形態において、組合せ療法は、例えば、１日３回から６カ月に１回まで、複数回投与される。投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回のようなスケジュールで行われてもよく、またはミニポンプを用いて連続的に投与されてもよい。組合せ療法は、上述のように、任意の経路で投与され得る。組合せ療法は、腫瘍の部位から離れた部位に投与されてもよい。
【０２５４】
一実施形態において、部位特異的ＡＤＣは、１つ以上の抗がん剤と組み合わせて、短い治療サイクルで、それを必要とする対象に投与される。本発明はまた、断続的な投与または１日の用量を複数回の部分投与に分割したものも企図する。コンジュゲートおよび抗がん剤は、隔日または隔週で交互に投与されてもよく、一連の抗体治療を施した後に、抗がん剤療法の１回以上の治療を施してもよい。いずれの場合においても、当業者には理解されるように、化学療法剤および開示されるコンジュゲートの適切な用量は、一般に、臨床治療で既に用いられているものに近くなり、ここで、化学療法剤は、単独で投与されるまたは他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
【０２５５】
別の好ましい実施形態において、本発明の部位特異的コンジュゲートは、疾患の最初の発症後に、腫瘍の再発の可能性を低減または消失させるための維持療法において使用することができる。好ましくは、障害には治療が行われ、最初の腫瘍塊が消失、低減またはそれ以外では軽減されており、したがって、患者は無症状または寛解状態である。このような時点で、対象は、標準的な診断手順を使用して疾患の兆候がほとんどないまたは全くないとしても、医薬として有効な量の開示されるコンジュゲートが１回以上投与され得る。一部の実施形態において、ＡＤＣは、１週間毎、２週間毎、１カ月毎、６週間毎、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎または１年毎のような、ある期間にわたって、定期的なスケジュールで投与される。本明細書の教示を踏まえて、当業者であれば、疾患再発の可能性を低減させるのに好ましい投薬量および投与レジメンを容易に決定することができる。さらに、このような治療は、患者の応答ならびに臨床上および診断上のパラメータに応じて、数週間、数カ月間、数年間または無期限に継続されてもよい。
【０２５６】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣは、予防的に使用されてもよく、または減量手技後に腫瘍転移の可能性を予防もしくは低減させるための補助療法として使用されてもよい。本開示に使用されるとき、「減量手技」は、広義に定義され、腫瘍または腫瘍増殖を消失、低減、治療または緩和する任意の手技、技法または方法を意味するものとする。例示的な減量手技としては、外科手術、照射治療（すなわち、ビーム照射）、化学療法、免疫療法または切除が挙げられるがこれらに限定されない。本開示を踏まえて当業者により容易に判定される適切な時点で、開示されるＡＤＣは、腫瘍転移を低減させるための臨床手技、診断手技またはセラグノスティック手技により提案されるように投与され得る。コンジュゲートは、標準的な技法を使用して決定される医薬として有効な投薬量で、１回以上投与され得る。好ましくは、投薬レジメンは、それを修正することを可能にする適切な診断技法または監視技法を伴う。
【０２５７】
本発明のさらに他の実施形態は、無症状であるが、増殖性障害を発症する危険性にある対象に、開示されるコンジュゲートを投与することを含む。すなわち、本発明のコンジュゲートは、真に予防的な意味で使用され、検査または試験が行われ、１つ以上の明記される危険因子（例えば、ゲノム的兆候、家族歴、インビボもしくはインビトロでの試験結果など）を有しているが、新生物を発症していない患者に提供されてもよい。このような場合において、当業者であれば、経験的観察を通じてまたは臨床的慣例を通じて、有効な投薬レジメンを決定することができる。
【０２５８】
４．抗がん剤
「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、がんのような細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を意味し、これらには、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、照射療法および抗転移剤ならびに免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。上述の選択された実施形態において、このような抗がん剤は、コンジュゲートを構成することができ、投与前に開示される部位特異的抗体と会合することができることが、理解される。より具体的には、ある特定の実施形態において、選択された抗がん剤が、操作抗体の不対システインと結合して、本明細書に記載される操作コンジュゲートが得られる。したがって、このような操作コンジュゲートは、本発明の範囲内に含まれることが明示的に企図される。他の実施形態において、開示される抗がん剤は、上に記載されている異なる治療剤を含む部位特異的コンジュゲートと組み合わせて提供される。
【０２５９】
本明細書に使用されるとき、「細胞毒性剤」という用語は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を減少もしくは阻害するおよび／または細胞の破壊を引き起こす、物質を意味する。ある特定の実施形態において、この物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞毒性剤の例としては、細菌の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素および外毒素、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ）、真菌の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素（例えば、アブリン、リシン、モデッシン、ビスキュミン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、大麦毒素、アレウリテスフォルディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカチャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素（例えば、細胞外膵臓ＲＮａｓｅのような細胞毒性ＲＮａｓｅ；ＤＮａｓｅ  Ｉ、これらのフラグメントおよび／もしくは変異形を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６０】
本発明の目的で、「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖、および／または生存を非特異的に減少または阻害する、化学的化合物（例えば、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤）を含む。このような化学物質は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内プロセスを対象とすることが多く、したがって、一般的に成長および分裂が急速ながん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合させるため、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、がん性細胞またはがん性となる可能性のある細胞もしくは腫瘍原性の後代を発生させる可能性のある細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害するまたは阻害するように設計されている、任意の化学物質が含まれ得る。このような薬剤は、組み合わせて、例えば、ＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩのようなレジメンにおいて投与されることが多く、最も有効であることが多い。
【０２６１】
本発明の部位特異的構築物と組み合わせて使用することができる抗がん剤の例としては（部位特異的コンジュゲートの成分としてまたコンジュゲートしていない状態として）、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチラメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）、パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）、サルコジクチイン、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗体謝剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、フロリン酸のような葉酸補給剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビスアントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジン、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＰＫＣ−アルファの阻害剤、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、細胞増殖を低減させるＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ−Ａ、ならびに上述のもののいずれかの医薬として許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。この定義には、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーターのような、腫瘍におけるホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、副腎におけるエストロゲン産生を制御するアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害剤、および抗アンドロゲン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤のようなリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシン、ならびに上述のもののいずれかの医薬として許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
【０２６２】
特に好ましい抗がん剤は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））のような、市販の化合物または臨床で利用可能な化合物を含む。追加の市販の抗がん剤または臨床で利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ  ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ��ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（クレモホール不含）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）；クエン酸タモキシフェンを含む、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン）ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ならびにＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
【０２６３】
他の実施形態において、本発明の部位特異的コンジュゲートは、現在臨床試験中であるまたは市販されている多数の抗体（または免疫療法剤）のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。この目的で、開示されるコンジュゲートは、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イマガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラムシルマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用することができる。
【０２６４】
さらに他の好ましい実施形態は、がん療法に関して試験中であるまたは認可されている、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、オファツムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブベドチンを含むがこれらに限定されない抗体の使用を含む。当業者であれば、本明細書の教示と適合性のあるさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
【０２６５】
５．放射線療法
本発明はまた、部位特異的コンジュゲートと放射線療法（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などのような、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内で局所的に誘発するための任意の機構）との組合せを提供する。放射性同位体の腫瘍細胞を対象とする送達を使用する組合せ療法もまた企図され、開示されるコンジュゲートは、標的抗がん剤または他の標的手段と併せて使用することができる。典型的には、照射療法は、約１週間から約２週間の期間にわたって、パルス投与される。照射療法は、約６週間から７週間、頭頸部がんを有する対象に施され得る。任意選択的に、照射療法は、単回投与として施されてもよく、または複数回の逐次投与として施されてもよい。
【０２６６】
ＶＩ．適応症
本発明のＡＤＣを使用して、任意の増殖性障害の発症または再発を治療、予防、管理または阻害することができることが理解される。したがって、単独で投与されるか、抗がん剤もしくは放射線療法と組み合わせて投与されるかにかかわらず、本発明のＡＤＣは、患者または対象における新生物状態を一般に治療するのに特に有用であり、これらの状態としては、良性腫瘍または悪性腫瘍（例えば、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、甲状腺、肝、子宮頸、子宮内膜、食道および子宮の癌；肉腫；膠芽腫；ならびに様々な頭頸部腫瘍）；白血病およびリンパ系悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、間質および胚盤胞の障害のような他の障害；ならびに炎症性障害、血管形成性障害、免疫性障害および病原体によって引き起こされる障害を挙げることができる。具体的には、治療の主要な標的は、固形腫瘍を含む新生物性状態であるが、造血系悪性腫瘍も本発明の範囲内である。
【０２６７】
状態を治療するという文脈において本明細書に使用される「治療」という用語は、概して、ヒトのものか動物（例えば、獣医学用途）のものかにかかわらず、何らかの所望される治療効果、例えば、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の退縮、状態の緩和、および状態の治癒を含む、状態の進行の阻害が達成される治療および治療法に関する。予防的措置（すなわち、予防、防止）としての治療もまた含まれる。
【０２６８】
「治療有効量」という用語は、本明細書に使用されるとき、所望される治療レジメンに従って投与したときに、何らかの所望される治療効果をもたらすのに有効であり、妥当な利益／危険性比に見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物もしくは投薬形態の量に関する。
【０２６９】
同様に、「予防有効量」という用語は、本明細書に使用されるとき、所望される治療レジメンに従って投与したときに、何らかの所望される予防効果をもたらすのに有効であり、妥当な利益／危険性比に見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物もしくは投薬形態の量に関する。
【０２７０】
より具体的には、本発明に従って治療に供される新生物状態は、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞状軟部肉腫、星細胞腫瘍、膀胱がん（扁平上皮細胞癌および移行上皮細胞癌）、骨のがん（アダマンチノーマ、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨種、骨肉腫）、脳および脊髄のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈小体腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸がん、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌など）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、まれな造血系障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん（子宮頸の癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。
【０２７１】
ある特定の好ましい実施形態において、増殖性障害は、副腎腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍（小細胞および非小細胞の両方）、甲状腺腫瘍、癌、肉腫、膠芽腫および様々な頭頸部腫瘍を含むがこれらに限定されない、固形腫瘍を含む。他の好ましい実施形態において、また以下の実施例に示されるように、開示されるＡＤＣは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮細胞性非小細胞肺がんまたは扁平上皮細胞性小細胞肺がん）の治療に特に有効である。一実施形態において、肺がんは、難治性であるか、再発性であるか、または白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）および／もしくはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセルもしくはカバジタキセル）に対して耐性である。
【０２７２】
特に好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、小細胞肺がんの治療に使用することができる。このような実施形態に関して、コンジュゲートしているモジュレーターは、限局型病期の疾患を呈する患者に投与され得る。他の実施形態において、開示されるＡＤＣは、進展型病期の疾患を呈する患者に投与される。他の好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、難治性の患者（すなわち、初期治療過程中もしくはその完了直後に再発する患者）または再発性小細胞肺がんの患者に投与される。さらに他の実施形態は、感受性の患者（すなわち、再発が一次治療後２−３カ月よりも長い患者への開示されるＡＤＣの投与を含む。それぞれの場合において、適合性のあるＡＤＣは、選択された投薬レジメンおよび臨床診断に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて使用することができることが理解される。
【０２７３】
上述のように、開示されるＡＤＣは、さらに、神経内分泌腫瘍を含む、神経内分泌特性または表現型を有する腫瘍を予防、治療または診断するために使用することができる。散在した内分泌系から生じる真性またはカノニカル神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的珍しく、発症は１００，０００人に２−５人であるが、非常に侵攻性である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、泌尿生殖器（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、ならびに肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）に生じる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として知られる消耗性の症状を引き起こし得るセロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含む複数のホルモンを分泌し得る。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしても知られている、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（もしくはＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、およびシナプトフィジン（ＳＹＰ）のような陽性の免疫組織学マーカーによってまたはＡＳＣＬ１のような発現の上昇を呈することが既知の遺伝子によって、表され得る。残念なことに、従来的な化学療法剤は、ＮＥＴの治療に特に有効ではなく、肝臓転移が一般的な予後である。
【０２７４】
開示されるＡＤＣは、神経内分泌腫瘍の治療に有利に使用することができるが、これらのＡＤＣは、遺伝子型または表現型に関して、カノニカル神経内分泌腫瘍を模倣する、類似するまたはこれらと共通の形質を呈する、疑似神経内分泌腫瘍（ｐｓｅｕｄｏ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ、ｐＮＥＴ）の治療、予防または診断にも使用することができる。疑似神経内分泌腫瘍または神経内分泌特性を有する腫瘍は、散在する神経内分泌系の細胞または神経内分泌の分化カスケードが発がんプロセス中に異常に再活性化した細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは、共通して、生物学的に活性なアミン、神経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含む、ある特定の表現型特徴または生化学特徴を従来から定義されている神経内分泌腫瘍と共有している。組織学的には、このような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、細胞病理が穏やかな最小限の細胞質および円形から楕円形をした点状の核を有する、緊密に結合した小細胞を示すことの多い共有した外観を共有している。本発明の目的で、神経内分泌腫瘍および疑似神経内分泌腫瘍を定義するために使用することができる共通して発現される組織学マーカーまたは遺伝子マーカーとしては、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７５】
したがって、本発明のＡＤＣは、疑似神経内分泌腫瘍およびカノニカル神経内分泌腫瘍の両方の治療に有利に使用することができる。この点に関して、ＡＤＣは、本明細書に記載されるように、腎臓、尿生殖器（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、ならびに肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）から生じる、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）を治療するために使用することができる。さらに、本発明のＡＤＣは、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する腫瘍を治療するために使用することができる。すなわち、本発明は、ＮＳＥ＋またはＣＤ５６＋またはＰＧＰ９．５＋またはＡＳＣＬ１＋またはＳＹＰ＋またはＣＨＧＡ＋またはこれらの組合せである腫瘍を患う対象を治療するために使用することができる。
【０２７６】
造血系悪性腫瘍に関しては、本発明の化合物および方法は、低悪性度の／ＮＨＬ濾胞性細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腺症、小リンパ球性リンパ芽球腫、濾胞性リンパ芽球腫、びまん性大細胞リンパ芽球腫、びまん性小型切れ込み細胞性リンパ芽球腫、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非切れ込み細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫、大細胞を主とする濾胞性リンパ腫、小型切れ込み細胞を主とする濾胞性リンパ腫、ならびに小型切れ込み細胞および大細胞が混合した濾胞性リンパ腫を含む、様々なＢ細胞リンパ腫を治療するのに特に有効であり得ることが、さらに理解される。Ｇａｉｄｏｎｏら、「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、第２巻：２１３１−２１４５頁（ＤｅＶｉｔａら編、第５版、１９９７年）を参照されたい。これらのリンパ腫は、分類システムの変更のために別の名称を有することが多いこと、また異なる名称で分類されたリンパ腫を有する患者も、本発明の組合せレジメンにより利益を得ることができることが、当業者には明らかである。
【０２７７】
本発明はさらに、良性腫瘍または前がん性腫瘍を呈する対象の防止的治療または予防的治療も提供する。ＤＬＬ３関連障害以外の、任意の特定の種類の腫瘍または増殖性障害を、本発明を使用した治療から除外するべきであるとは考えられない。しかしながら、腫瘍細胞の種類は、二次治療剤、特に化学療法剤および標的抗がん剤と組み合わせた本発明の使用に関連する場合がある。
【０２７８】
好ましくは、治療を受ける「対象」または「患者」は、ヒトであるが、本明細書に使用されるとき、これらの用語は、すべての哺乳動物を含め、任意の種を含むことが明示的に意図される。したがって、対象／患者は、動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋動物（例えば、カンガルー、ウオンバット）、単孔動物（例えば、カモノハシ）、げっ歯動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えば、マウス）、ウサギ目動物（例えば、ウサギ）、鳥類（例えば、鳥）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ウシ属（例えば、ウシ）、霊長類、真猿類（例えば、サルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトであり得る。
【０２７９】
ＶＩＩ．診断およびスクリーニング
１．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断または監視するためのインビトロ方法およびインビボ方法、ならびに患者由来の細胞をスクリーニングして腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞を特定する方法を提供する。このような方法は、がんの治療またはその進行の監視のためにがんを有する個体を特定することを含み、この特定には、患者または患者から得た試料を（インビボまたはインビトロのいずれかで）本明細書に記載される抗体と接触させること、および試料中の抗体の存在もしくは非存在、結合した標的分子もしくは遊離標的分子への抗体の会合レベルを検出することが含まれる。一部の実施形態において、抗体は、本明細書に記載される検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
【０２８０】
一部の実施形態において、試料中での抗体と特定の細胞との会合により、試料が、腫瘍原性細胞を含有している可能性があることを示すことができ、これにより、がんを有する個体を、本明細書に記載される抗体で効果的に治療することができることを示すことができる。
【０２８１】
試料は、多数のアッセイ、例えば、放射免疫測定法、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合的結合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫ブロッティングアッセイ、ウエスタンブロットアッセイおよびフローサイトメトリーアッセイによって分析することができる。適合性のあるインビボセラグノスティックアッセイまたは診断アッセイは、当該技術分野で認められている撮像技法または監視技法、例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法（例えば、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影法（例えば、ＰＥＴスキャン）、放射線撮影法、超音波などを含み得る。
【０２８２】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血清または血液）中の特定の決定基（例えば、ＳＥＺ６、ＤＬＬ３またはＣＤ３２４）のレベルを検出および定量化するために使用することができ、このレベルを使用して、関連する決定基と関連する増殖性障害の検出、診断または監視を行うことができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、インビボまたはインビトロのいずれかで循環腫瘍細胞を検出、監視および／または定量化するために使用することができる（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍原性細胞を含み得る。
【０２８３】
本発明のある特定の実施形態において、対象または対象由来の試料中の腫瘍原性細胞は、ベースラインを確立するために治療法またはレジメンの前に、開示される抗体を使用して評価または特徴付けが行われ得る。他の実施例において、腫瘍原性細胞は、治療を受けた対象に由来する試料から評価することができる。
【０２８４】
２．スクリーニング
ある特定の実施形態において、抗体は、決定基と相互作用することにより腫瘍細胞の機能または活性を改変させる化合物または薬剤（例えば、増殖性疾患の治療用の薬物）を特定するために、試料をスクリーニングするために使用することができる。一実施形態において、系または方法は、ある特定の決定基（例えば、ＳＥＺ６、ＤＬＬ３またはＣＤ３２４）を発現する腫瘍細胞および化合物または薬剤（例えば、薬物）を含み、この細胞と化合物または薬剤とは、互いに接触している。このような実施形態において、対象細胞は、開示される抗体を使用して特定、監視および／または富化されている。
【０２８５】
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞と試験薬剤または化合物とを直接的または間接的に接触させ、試験薬剤または化合物が、決定基関連腫瘍細胞の活性または機能、例えば、細胞の形態もしくは生存率の変化、マーカーの発現、分化もしくは脱分化、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟、増殖、生存率、アポトーシスまたは細胞死を調整するかどうかを決定することを含む。直接的な相互作用の一例は、物理的相互作用であり、一方で間接的相互作用としては、例えば、中間分子に対する組成物の作用であり、これが、基準となる実体（例えば、細胞または細胞培養物）に対して作用する。
【０２８６】
スクリーニング方法としては、高スループットスクリーニングが挙げられ、このスクリーニング方法は、任意選択として所定の場所、例えば培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトルまたはプレートに位置するまたは配置される細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。高スループットのロボットまたは人力による処理方法により、短い時間で、化学的相互作用を調べ、多数の遺伝子の発現レベルを判定することができる。分子シグナルを用いる技法、例えば、フルオロフォアまたはマイクロアレイによるものおよび非常に高速で情報を処理する自動化分析を用いた技法が、開発されている。スクリーニングすることができるライブラリーとしては、例えば、小分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ，ＬＬＣ）、ｓｉＲＮＡライブラリー、およびアデノウイルストランスフェクションベクターが挙げられる。
【０２８７】
ＶＩＩＩ．製品
１つ以上の容器を含み、１回以上の用量の部位特異的ＡＤＣを含む、医薬用のパックおよびキットもまた、提供される。ある特定の実施形態において、例えば、抗ＤＬＬ３コンジュゲートを、１つ以上の追加の薬剤ありまたはなしで含む、所定の量の組成物を含有する、単位投薬量が提供される。他の実施形態では、このような単位投薬量は、使い切りの充填済み注射用シリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位投薬量中に含有される組成物は、生理食塩水、スクロースなど、リン酸などのような緩衝液を含み得る、および／または安定で効果的なｐＨ範囲内で製剤化され得る。あるいは、ある特定の実施形態において、コンジュゲート組成物は、適切な液体、例えば、滅菌水または生理食塩水を添加したときに再構成され得る、凍結乾燥粉末として提供されてもよい。ある特定の好ましい実施形態において、組成物は、スクロースおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない、タンパク質凝集を阻害する１つ以上の物質を含む。容器上の任意のラベルまたは容器と関連する任意のラベルにより、中に含まれるコンジュゲート組成物が、選択した新生物疾患状態を治療するために使用されることを示す。
【０２８８】
本発明はまた、単回用量または複数回用量の投与単位の部位特異的コンジュゲートおよび任意選択として１つ以上の抗がん剤を生成するためのキットも提供する。キットは、容器および容器上または容器と関連するラベルもしくは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成されていてもよく、医薬として有効な量の開示されるコンジュゲートをコンジュゲート形態または非コンジュゲート形態で含み得る。他の好ましい実施形態において、容器は、滅菌のアクセスポートを備える（例えば、容器は、静注バッグまたは皮下注射針によって穿刺することができるストッパーを有するバイアルであり得る）。このようなキットは、一般に、好適な容器に、操作コンジュゲートの医薬として許容される製剤を含み、任意選択として、同じであるまたは異なる容器に、１つ以上の抗がん剤を含む。これらのキットはまた、診断療法または組合せ療法のいずれかのための他の医薬として許容される製剤を含み得る。例えば、本発明の部位特異的コンジュゲートに加えて、このようなキットは、化学療法薬もしくは放射線療法薬；抗血管形成剤；抗転移剤；標的抗がん剤；細胞毒性剤；ならびに／または他の抗がん剤のような、ある範囲の抗がん剤のうちの任意の１つ以上を含み得る。
【０２８９】
より具体的には、キットは、開示されるＡＤＣを追加の成分ありまたはなしで含む単一の容器を有してもよく、またはキットは、それぞれの所望される薬剤のための別個の容器を有してもよい。コンジュゲーションのための組合せの治療薬が提供される場合、単一の溶液を、モル当量の組合せでまたは一方の成分が他方よりも過剰な状態で、事前に混合してもよい。あるいは、キットのコンジュゲートおよび何らかの任意選択的抗がん剤は、患者に投与する前には、別々の容器内に分かれて保持されてもよい。キットはまた、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液およびデキストロース溶液のような滅菌の医薬として許容される緩衝液または他の希釈剤を格納するための第２／第３の容器手段を含み得る。
【０２９０】
キットの構成要素が、１つ以上の溶液中で提供される場合、溶液は、好ましくは、水溶液であり、滅菌水溶液または生理食塩水が、特に好ましい。しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬または構成要素が、乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が、別の容器で提供され得ることも想定される。
【０２９１】
上で簡略的に示されたように、キットは、抗体コンジュゲートおよび何らかの任意選択の構成要素を動物または患者に投与するための手段、例えば、１つ以上の針、静注用バッグもしくはシリンジ、またはさらには点眼器、ピペット、または他のこのような装置を含み得、このような装置から、製剤が動物に注射もしくは導入され得るまたは身体の疾患部位に適用され得る。本発明のキットは、典型的に、市販のために、バイアルなどと他の構成要素とをしっかりと閉じ込めて格納するための手段、例えば、所望されるバイアルおよび他の装置が中に設置および保持される射出成形またはフロー成形したプラスチック容器も含む。任意のラベルまたは添付文書により、操作コンジュゲート組成物が、がん、例えば小細胞肺がんを治療するために使用されることを示す。
【０２９２】
他の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、増殖性障害の予防または治療に有用な診断デバイスまたは治療デバイスと併せて使用してもよく、またはこれらを含んでもよい。例えば、１つの好ましい実施形態において、本発明の化合物および組成物は、増殖性障害の病因または操作に関与する細胞またはマーカー化合物を検出、監視、定量化またはプロファイリングするのに使用することができるある特定の診断デバイスまたは診断機器と組み合わせてもよい。選択された実施形態について、マーカー化合物は、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、およびＰＧＰ９．５を含み得る。
【０２９３】
特に好ましい実施形態において、デバイスは、インビボまたはインビトロのいずれかで循環腫瘍細胞を検出、監視および／または定量化するために使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照されたい）。さらに他の好ましい実施形態において、また上述のように、循環腫瘍細胞は、がん幹細胞を含み得る。
【０２９４】
ＩＸ．その他
本明細書に別途定義されない限り、本発明と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、細胞の混合物を含むなどである。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両端点および端点間のすべての点を含む。したがって、２．０から３．０という範囲には、２．０、３．０、および２．０と３．０との間のすべての点が含まれる。
【０２９５】
一般に、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されているものである。本発明の方法および技法は、一般に、別途示されない限り、当該技術分野で周知であり、また様々な一般文書ならびに本明細書を通じて列挙および考察されるより具体的な参考文献に記載されている、従来的な方法に従って行われる。例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２年）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野で一般に行われているようにまたは本明細書に記載されるように、行われる。解析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および医薬化学と関連して使用される命名法ならびにこれらの実験室手順および技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
【０２９６】
本明細書に使用されるとき、腫瘍細胞型は、次のように略記される：腺癌（Ａｄｅｎｏ）、副腎（ＡＤ）、乳房（ＢＲ）、エストロゲン受容体陽性乳房（ＢＲ−ＥＲ＋）、エストロゲン受容体陰性乳房（ＢＲ−ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陽性乳房（ＢＲ−ＰＲ＋）、プロゲステロン受容体陰性乳房（ＢＲ−ＰＲ−）、ＥＲｂ２／Ｎｅｕ陽性乳房（ＢＲ−ＥＲＢ２／Ｎｅｕ＋）、Ｈｅｒ２陽性乳房（ＢＲ−Ｈｅｒ２＋）、低クローディン乳房（ＢＲ−ＣＬＤＮ−ｌｏ）、トリプルネガティブ乳がん（ＢＲ−ＴＮＢＣ）、結腸直腸（ＣＲ）、子宮内膜（ＥＭ）、胃（ＧＡ）、頭頸部（ＨＮ）、腎臓（ＫＤＹ）、大細胞神経内分泌（ＬＣＮＥＣ）、肝臓（ＬＩＶ）、リンパ節（ＬＮ）、肺（ＬＵ）、肺カルチノイド（ＬＵ−ＣＡＲ）、肺紡錘体細胞（ＬＵ−ＳＰＣ）、黒色腫（ＭＥＬ）、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、卵巣（ＯＶ）、漿液性卵巣（ＯＶ−Ｓ）、漿液性乳頭状卵巣（ＯＶ−ＰＳ）、卵巣悪性混合型中胚葉性腫瘍（ＯＶ−ＭＭＭＴ）、粘液性卵巣（ＯＶ−ＭＵＣ）、卵巣明細胞（ＯＶ−ＣＣ）、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、膵臓（ＰＡ）、前立腺（ＰＲ）、扁平上皮細胞（ＳＣＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）および皮膚（ＳＫ）由来の腫瘍。
【０２９７】
Ｘ．参考文献
ただし、本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、例としてＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列の寄託、ならびに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列の寄託、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きのコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、特定の参考文献に関して「参照により組み込まれる」という語句が使用されているかどうかに関係なく、参照により本明細書に組み込まれる。上述の詳細な説明および以下の実施例は、理解の明確さのためだけに提供されている。不必要な制限がそこから理解されるものではない。本発明は、示され、説明されている厳密な詳細に限定されるものではない。当業者には明白である変化形は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれる。本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
【０２９８】
ＸＩ．配列表の概要
本出願には、多数の核酸配列およびアミノ酸配列を含む配列表が添付されている。以下の表４は、含まれている配列の概要を提供する。
【０２９９】
【表４】
2018511579.tif 000012
2018511579.tif 000013
2018511579.tif 000014
2018511579.tif 000015
2018511579.tif 000016
2018511579.tif 000017
2018511579.tif 000018
【実施例】
【０３００】
このように一般的に記載した本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるが、これらの実施例は、例示を目的として提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。実施例は、以下の実験が、実施されるすべての実験または唯一の実験であることを表すように意図されるものではない。
【０３０１】
［実施例１］
抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体を、以下のように生成した。第１の免疫付与操作において、３匹のマウス（次の株のそれぞれから１匹ずつ：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウバンアジュバントで乳化させたヒトＤＬＬ３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物は、Ａｄｉｐｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３）から購入した。初回免疫付与は、マウス１匹当たり１０μｇのｈＤＬＬ３−ＦｃのＴｉｔｅｒＭａｘ中エマルジョンで行った。次いで、マウスに、マウス１匹当たり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃ（ミョウバンアジュバント中）で２週間おきに追加免疫付与を行った。融合前の最後の注射は、マウス１匹当たり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃ（ＰＢＳ中）で行った。
【０３０２】
第２の免疫付与操作において、６匹のマウス（次の株のそれぞれから２匹ずつ：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウバンアジュバントで乳化させたヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質を、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように操作したＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。初回免疫付与は、マウス１匹当たり１０μｇのｈＤＬＬ３−ＨｉｓのＴｉｔｅｒＭａｘ中エマルジョンで行った。次いで、マウスに、マウス１匹当たり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ（ミョウバンアジュバント中）で２週間おきに追加免疫付与を行った。最後の注射は、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作した２×１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で行った。
【０３０３】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血清を、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体に関してスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特異的な抗体を示す。簡単に言うと、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓで一晩コーティングした。０．０２％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、室温で１時間、ＰＢＳ中３％（重量／体積）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、ブロッキングした。マウス血清を滴定し（１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００）、ＤＬＬ３でコーティングしたプレートに、５０μＬ／ウェルで添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％ＢＳＡ−ＰＢＳまたは２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）に１：１０，０００で希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧとともに、室温で１時間インキュベートした。再度プレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）を室温で１５分間添加した発色させた後、等体積の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させ、プレートを分光光度計によってＯＤ４５０で分析した。
【０３０４】
血清陽性の免疫付与マウスを殺処理し、流入領域リンパ節（膝窩、鼠径部、および内側腸骨）を切除し、抗体産生細胞の供給源として使用した。Ｂ細胞（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与マウスに由来するおよそ２２９×１０６個の細胞、およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与マウスに由来する５１０×１０６個の細胞）の細胞懸濁液を、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）モデルを使用した電気細胞融合により、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比で融合させた。細胞を、アザセリン、１５％胎児クローンＩ血清、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ  ペニシリン−ストレプトマイシン、および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地中に再懸濁させ、４つのＴ２２５フラスコにおいて、フラスコ１つ当たり１００ｍＬの選択培地で培養した。フラスコを、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータに、６から７日間置いた。
【０３０５】
融合後６日目または７日目に、ハイブリドーマライブラリー細胞をフラスコから回収し、２００μＬの補充ハイブリドーマ選択培地（上述の通り）中で１ウェル当たり１個の細胞で（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞分取器を使用して）６４枚のＦａｌｃｏｎ  ９６ウェルプレートに播種し、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与操作については４８枚の９６ウェルプレートに播種した。ライブラリーの残りは、液体窒素中で保管した。
【０３０６】
ハイブリドーマを１０日間培養し、上清を、以下の通り実施されるフローサイトメトリーを使用して、ｈＤＬＬ３に特異的な抗体に関してスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マウスＤＬＬ３（色素で事前染色したもの）、またはカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００で事前染色したもの）を過剰発現するように操作した１ウェル当たり１×１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２５μＬのハイブリドーマ上清とともに３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し、次いで、１試料当たり２５μＬの、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で１：３００に希釈したＤｙｅＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的二次抗体とともにインキュベートした。１５分間のインキュベーションの後に、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによってアイソタイプ対照抗体で染色した細胞の蛍光を上回る蛍光に関して分析した。残っている未使用のハイブリドーマライブラリー細胞は、将来のライブラリー試験およびスクリーニングのために液体窒素中で凍結させた。
【０３０７】
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与操作により、およそ５０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体が得られ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与操作により、およそ９０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体が得られた。
【０３０８】
［実施例２］
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
上記に基づいて、固定化したヒトＤＬＬ３またはｈ２９３−ｈＤＬＬ３細胞に明らかに高い親和性で結合するいくつかの例示的な異なるモノクローナル抗体を、配列決定およびさらなる分析に選択した。実施例１において生成された、選択したモノクローナル抗体に由来する軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列分析により、多くが、新規な相補性決定領域を有し、しばしば、新規なＶＤＪ配置を呈することが確認された。
【０３０９】
最初に選択した、所望される抗体を発現するハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に溶解させて、抗体をコードするＲＮＡを調製した。１０４から１０５個の細胞を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させ、２００μＬのクロロホルムを添加した後、激しく振盪させた。試料を、次いで、４℃で１０分間遠心分離し、水相を新しい微量遠心チューブに移し、等体積の７０％エタノールを添加した。試料をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラムに入れ、２ｍＬの回収チューブに取り付け、製造業者の説明書に従って処理した。全ＲＮＡを、溶出により、１００μＬのＲＮａｓｅ不含水を有するスピンカラム膜に直接抽出した。ＲＮＡ調製物の品質を、１％アガロースゲル中に３μＬを分画することによって判定した後、使用するまで−８０℃で保管した。
【０３１０】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全なマウスＶＨレパートリーを標的とするように設計された３２個のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む、５’プライマーミックスを、全マウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと組み合わせて使用して、増幅させた。同様に、カッパ軽鎖を増幅させ、配列決定するために、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅させるように設計された３２個の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一の逆方向プライマーと組み合わせて使用した。ラムダ軽鎖を含有する抗体については、増幅は、３つの５’ＶＬリーダー配列を、マウスラムダ定常領域に特異的な１つの逆方向プライマーと組み合わせて使用して行った。ＶＨおよびＶＬ転写産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡから増幅させた。Ｖκ軽鎖に４回およびＶγ重鎖に４回、合計８回のＲＴ−ＰＣＲ反応を、各ハイブリドーマに行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマーのいずれかを０．５μＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより特注で合成）、５μＬの５倍ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰｓ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックス、ならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含んでいた。サーマルサイクラーのプログラムは、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間のＲＴステップ、続いて３０回のサイクル（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間）であった。次いで、最終インキュベーションを７２℃で１０分間行った。
【０３１１】
抽出したＰＣＲ産物に、可変領域の増幅に関して上述のものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定を行った。直接的なＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を調製するために、それらを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して精製した。ＤＮＡを、５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムから溶出させ、次いで、両方の鎖から直接配列決定した（ＭＣＬＡＢ）。
【０３１２】
選択したヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ配列分析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析して、最も高い配列相同性を有する生殖系Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを特定した。これらの得られた配列を、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を専売の抗体配列データベースを使用して、マウス生殖系データベースとアライメントすることにより、既知の生殖系のＩｇ  Ｖ−およびＪ−領域のＤＮＡ配列と比較した。
【０３１３】
得られたマウス重鎖および軽鎖可変領域の配列は、添付の配列表に提示されており、また、注釈付きの形式では、このような配列に対する参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０に提示されている。
【０３１４】
［実施例３］
ヒト化抗ＤＬＬ３抗体の生成
実施例１により生成されたある特定のマウス抗体（ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６と称される）を使用して、ヒトアクセプター抗体にグラフトされたマウスＣＤＲを含むヒト化抗体を誘導した。好ましい実施形態において、本実施例に記載されるヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、以下に記載のように、開示される部位特異的コンジュゲートに組み込むことができる。
【０３１５】
これに関して、マウス抗体を、以下のように、専売のコンピュータ支援型ＣＤＲグラフト方法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）および標準的な分子操作技法を用いて、ヒト化した。全ＲＮＡを、ハイブリドーマから抽出し、実施例２に記載のように増幅させた。マウス抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータは、誘導された核酸配列から得た。ヒトフレームワーク領域は、ヒト生殖系抗体配列のフレームワーク配列およびＣＤＲカノニカル構造と、選択したマウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づいて、選択および／または設計した。分析の目的で、ＣＤＲドメインのそれぞれに対するアミノ酸の割当てを、Ｋａｂａｔらの番号付けに従って行った。ヒトレセプター可変領域のフレームワークを選択し、マウスＣＤＲと組み合わせた後、適切な制限部位を含む一体型重鎖および軽鎖可変領域配列を、合成により（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）生成する。
【０３１６】
ヒト化可変領域を、次いで、操作全長重鎖および軽鎖の構成要素として発現させて、本明細書に記載される部位特異的抗体を得る。より具体的には、ヒト化抗ＤＬＬ３操作抗体を、以下のように、当該技術分野で認められている技法を使用して生成した。抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のリーダー配列に特異的なプライマーのセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨフラグメントについてはＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＶＬフラグメントについてはＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、ＶＨフラグメントについては制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩで消化させ、ＶＬフラグメントについてはＸｍａｌおよびＤｒａＩＩＩで消化させた。ＶＨおよびＶＬの消化ＰＣＲ産物を精製し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域発現ベクターまたはカッパＣＬヒト軽鎖定常領域発現ベクターにライゲーションした。以下に詳細に考察されるように、重鎖および／または軽鎖定常領域は、アセンブルした抗体に部位特異的コンジュゲーション部位を呈するように操作することができる。
【０３１７】
ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物、ならびに２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡを含む総体積１０μＬにおいて、以下のように行った。コンピテントなエシェリキアコリＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックにより、３μＬのライゲーション産物で形質転換させ、１００μｇ／ｍＬの濃度でアンピシリンプレートに播種した。増幅させたライゲーション産物の精製および消化に続いて、ＶＨフラグメントを、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬフラグメントを、ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングしたが、ＨｕＩｇＧ１発現ベクターおよび／またはＨｕ−カッパ発現ベクターのいずれかが、天然の定常領域または操作定常領域のいずれかを含み得る。
【０３１８】
ヒト化抗体を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターの共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で標準条件下において、１５０ｍｍのプレートで培養した。一過性トランスフェクションのために、細胞は、８０％コンフルエンシーまで成長させた。ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１ベクターおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターのＤＮＡそれぞれ１２．５μｇを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬に添加した。このミックスを室温で３０分間インキュベートし、播種した。上清を、トランスフェクションの３から６日後に採取した。組換えヒト化抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することによって細胞片から除去し、４℃で保管した。組換えヒト化抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製した。より大規模な抗体発現のために、ＣＨＯ−Ｓ細胞を、１Ｌ体積中で一過性にトランスフェクトし、１ｍＬ当たり２．２ｅ６個の細胞で播種した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、トランスフェクション試薬として使用した。抗体発現の７−１０日後に、組換え抗体を含有する培養上清を、遠心分離により細胞片から除去し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０３１９】
選択したヒトアクセプター可変領域の遺伝子組成は、表５において、ヒト化ＤＬＬ３抗体のそれぞれのすぐ下に示されている。表５に示される配列は、対象クローンに関して図２Ａおよび２Ｂに記載された注釈付きの重鎖配列および軽鎖配列に対応する。図２Ａおよび２Ｂに記載されている相補性決定領域およびフレームワーク領域は、Ａｂｙｓｉｓデータベース（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）の専売バージョンを使用して、Ｋａｂａｔら（上述）に従って定義される。
【０３２０】
より具体的には、以下の表５のエントリーは、配列番号５１９および５２４（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号５２０および５２５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号５２１および５２６（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号５２２および５２７（ｈＳＣ１６．３４）ならびに配列番号５２３および５２８（ｈＳＣ１６．５６）に記載される連続的可変領域配列に対応する。遺伝子組成の他に、表５は、これらの選択された実施形態において、選択された抗体の好ましい結合特性を維持するために、フレームワークの変化も復帰変異も必要なかったことを示す。当然ながら、他のＣＤＲグラフト構築部では、このようなフレームワークの変化または復帰変異が望ましい場合があり、そのため、それらは本発明の範囲内にあるものとして明示的に企図されることが理解される。
【０３２１】
【表５】
2018511579.tif 000019
【０３２２】
フレームワーク領域には残基の改変はなかったが、ヒト化クローンの１つ（ｈＳＣ１６．１３）には、安定性の問題に対処するために変異を重鎖ＣＤＲ２に導入した。修飾されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性を評価して、対応するマウス抗体のいずれとも同等であったことを確認した。
【０３２３】
すべての選択された抗体をＣＤＲのグラフトによりヒト化した後、結果として得られた軽鎖および重鎖の可変領域アミノ酸配列を分析して、マウスドナーおよびヒトアクセプターの軽鎖および重鎖の可変領域に関して、それらの相同性を判定した。すぐ下の表６に示される結果により、ヒト化構築物が、一貫して、マウスドナー配列よりもヒトアクセプター配列に対して、高い相同性を呈したことがわかる。より具体的には、マウス重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト化抗体およびドナーハイブリドーマタンパク質の配列の相同性（７４％−８３％）と比較して、ヒト生殖系遺伝子の最も高い一致に類似する全体的な相同性の割合（８５％−９３％）を示す。
【０３２４】
【表６】
2018511579.tif 000020
【０３２５】
試験すると、誘導したヒト化構築物のそれぞれが、マウス親抗体により示される結合特徴とほぼ同等の好ましい結合特徴を呈した。
【０３２６】
［実施例４］
抗ＳＥＺ６抗体の生成およびヒト化
ＳＥＺ６抗原を、標準的な分子技法を使用して、ヒトＳＥＺ６タンパク質のＥＣＤ部分をヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに融合することにより生成した。ＳＥＺ６抗原の生成に関するより詳細な説明は、これに関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／００２７３９１に提供される。６匹の雌性マウスの接種後に、抗体産生ハイブリドーマを、実質的に実施例１に記載されるように生成した。ハイブリドーマを前述のようにスクリーニングし、目的のハイブリドーマから遺伝子材料を得た。抗ＳＥＺ６抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を、実質的に実施例２に記載されるように決定した。
【０３２７】
いくつかの抗ＳＥＺ６マウス抗体を、前述の実施例に記載される技法に類似の技法を使用してヒト化した。重鎖および軽鎖のヒトフレームワークを、機能的ヒト生殖系遺伝子に関する配列および構造類似性に基づいて選択した。この点に関して、構造類似性は、マウスのカノニカルＣＤＲ構造を、Ｃｈｏｔｈｉａら（上述）に記載されるように、同じカノニカル構造を有するヒト候補と比較することによって評価した。
【０３２８】
より具体的には、１１種類のマウス抗体ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１およびＳＣ１７．２００を、コンピュータ支援型ＣＤＲグラフト分析（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｌｃ．）および標準的な分子操作技法を用いてヒト化して、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１およびｈＳＣ１７．２００モジュレーターを得た。可変領域のヒトフレームワーク領域を、対象のマウスフレームワーク配列およびそのカノニカル構造に対する最も高い配列相同性に基づいて選択した。ヒト化分析の目的で、ＣＤＲドメインのそれぞれに対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔらの番号付け（上述）に従う。
【０３２９】
ヌクレオチド配列情報から、対象マウス抗体の重鎖および軽鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータを得た。配列データに基づいて、抗体のＩｇ  ＶＨおよびＶＫ軽鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを、組換えモノクローナル抗体のクローニングのために設計した。続いて、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列を、マウスＩｇ生殖系配列とアライメントした。１１種類のヒト化構築物のそれぞれに対して得られた遺伝子配置を、すぐ下の表７に示す。
【０３３０】
【表７】
2018511579.tif 000021
【０３３１】
表７に列挙されるヒト化抗体は、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号１７０−１９９）に記載されている注釈付きの軽鎖および重鎖の可変領域配列に対応している。軽鎖および重鎖の可変領域の対応する核酸配列は、添付の配列表に記載されている。表７は、結合モジュレーターの好ましい特性を維持するために必要なフレームワーク変化はほとんどなかったことをさらに示す。この点に関して、フレームワークの変化または復帰変異は、重鎖可変領域のうちの３つにおいてのみ行われ、フレームワーク修飾は、２つだけ軽鎖可変領域に行われた。
【０３３２】
一部のヒト化軽鎖および重鎖可変領域（例えば、ｈＳＣ１７．２００、ｈＳＣ１７．１５５およびｈＳＣ１７．１６１）については、保存的アミノ酸変異が、抗原結合を維持すると同時に安定性の問題に対処するためにＣＤＲに導入されたことに留意されたい。それぞれの場合において、修飾されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性は、対応するキメラまたはマウス抗体のいずれかと同等であることが見出された。９種類の例示的なヒト化変異形鎖（軽鎖および重鎖）の配列が、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号１９２−１９９）の最後に列挙され、これらは、改変されていることを示すための表記法によるヒト化親鎖の名称を保持する（例えば、ｈＳＣ１７．２００ｖＬ１、ｈＳＣ１７．１５５ｖＨ１−６およびｈＳＣ１７．１６１ｖＨ１）。
【０３３３】
すべての選択された抗体をＣＤＲのグラフトによりヒト化した後、結果として得られた軽鎖および重鎖の可変領域アミノ酸配列を分析して、マウスドナーおよびヒトアクセプターの軽鎖および重鎖の可変領域に関して、それらの相同性を判定した。以下の表８に示される結果により、ヒト化構築物が、一貫して、マウスドナー配列よりもヒトアクセプター配列に対して、高い相同性を呈したことがわかる。より具体的には、ヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、一般に、ヒト化可変領域の配列およびドナーハイブリドーマタンパク質の配列の相同性（７４％−８９％）と比較して、ヒト生殖系遺伝子の最も高い一致よりも高い相同性の割合（８４％−９５％）を示す。
【０３３４】
【表８】
2018511579.tif 000022
【０３３５】
試験すると、ヒト化構築物のそれぞれが、マウス親抗体により示される結合特徴とほぼ同等の好ましい結合特徴を呈した（データは示されない）。
【０３３６】
［実施例５］
ヒト化抗ＣＤ３２４抗体の生成
抗ＣＤ３２４ヒト化抗体を、上述の実施例１−３に実質的に記載されるように、生成した。ＣＤ３２４抗原および対応する抗体の生成に関するより詳細な説明は、これに関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／２５３５６に提供される。６匹の雌性マウスの接種後に、抗体産生ハイブリドーマを、実質的に実施例１に記載されるように生成した。ハイブリドーマを前述のようにスクリーニングし、目的のハイブリドーマから遺伝子材料を得た。抗ＳＥＺ６抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を、実質的に実施例２に記載されるように決定した。
【０３３７】
図４は、例示的な抗ＣＤ３２４マウス抗体ＳＣ１０．１７の軽鎖（配列番号５２９）および重鎖（配列番号５３０）の可変領域の連続的アミノ酸配列を示す。マウス重鎖および軽鎖に対応する核酸配列は、本明細書に添付の配列表（配列番号５３１および５３２）に提供される。ＳＣ１０．１７ならびに抗ＣＤ３２４抗体由来の他の適合性のある軽鎖および重鎖可変領域の配列は、これらの配列に関して本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／２５３５６に示されている。
【０３３８】
ＳＣ１０．１７抗ＣＤ３２４マウス抗体を、標準的な分子操作技法を使用して、実質的に上述の実施例３に記載のようにヒト化した。Ｋａｂａｔの番号付けを使用して、図４は、Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅを使用して決定した、マウス親抗体および誘導したヒト化構築物の重鎖および軽鎖のＣＤＲおよびフレームワーク領域を示す。図４の考察により、マウス重鎖および軽鎖ＣＤＲが、ＣＤＲへのごくわずかな変化を伴ってヒトアクセプター分子に移入されたことを示す。より具体的には、図４は、ｈＳＣ１０．１７と称される例示的なヒト化抗ＣＤ３２４抗体の軽鎖（配列番号５３１）および重鎖（配列番号５３２）のアミノ酸配列を示す。親マウス抗体と同様に、対応する核酸配列は、添付の配列表（配列番号５３５および５３６）に記載されている。ｈＳＣ１０．１７の軽鎖および重鎖可変領域は、マウスドナー配列と比較して、ヒトアクセプター配列の軽鎖および重鎖可変領域とのより高い相同性を示した（データは示されない）。
【０３３９】
［実施例６］
部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の作製
４種類の操作ヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、構築した。４種類の操作抗体のうちの２種類は、天然の軽鎖定常領域を含み、重鎖に変異を有していたが、この変異では、軽鎖のシステイン２１４と鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖の上部ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）が、セリンで置換されていた（Ｃ２２０Ｓ）または除去されていた（Ｃ２２０Δ）。残りの２種類の操作抗体は、天然の重鎖定常領域および変異軽鎖を有したが、この変異において、軽鎖のシステイン２１４は、セリンで置換されていた（Ｃ２１４Ｓ）または除去されていた（Ｃ２１４Δ）。アセンブルすると、重鎖と軽鎖とが、治療剤とのコンジュゲーションに好適な２つの遊離システインを有する抗体を形成する。例示的なｈＳＣ１６．５６構築物のそれぞれの抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、図５Ａおよび５Ｂに示すが、すぐ下の表９には、改変についてまとめる。図５Ａおよび５Ｂに関して、反応性（または遊離）システインは、重鎖については２２０位、軽鎖については２１４位の変異残基（ｓｓ１およびｓｓ４）と同様に、下線で示す。別途示されない限り、定常領域残基のすべての番号付けは、Ｋａｂａｔらに記載されるＥＵ番号付けスキームに従う。
【０３４０】
【表９】
2018511579.tif 000023
【０３４１】
操作抗体を、以下のように生成した。
【０３４２】
実施例３に記載されるように誘導したヒト化抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６軽鎖（配列番号５０７）または重鎖（配列番号５０８）をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位指向的変異生成の鋳型として使用した。部位指向的変異生成は、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【０３４３】
２つの重鎖変異体については、ｈＳＣ１６．５６の変異体Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０Δ重鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１６．５６の天然のＩｇＧ１カッパ軽鎖とともに、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０Δ変異体を含む操作抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、それぞれ、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（配列番号５０９および５０７）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（配列番号５１０および５０７）と称した。
【０３４４】
２つの軽鎖変異体については、ｈＳＣ１６．５６の変異体Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４Δ軽鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１６．５６の天然のＩｇＧ１重鎖とともに、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。操作抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）を使用して精製し、適切な緩衝液中で保管した。Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４Δ変異体を含む操作抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、それぞれ、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（配列番号５０８および５１１）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（配列番号５０８および５１２）と称した。
【０３４５】
操作抗ＤＬＬ３抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けして、適正な変異体が生成されたことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の成型済み１０％トリス−グリシンミニゲルにおいて、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような還元剤の存在下および非存在下で行った。電気泳動後に、ゲルを、コロイド状クマシー溶液で染色した（データは示されない）。
【０３４６】
２つの重鎖（ＨＣ）変異体であるｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（Ｃ２２０Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（Ｃ２２０Δ）ならびに２つの軽鎖（ＬＣ）変異体であるｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（Ｃ２１４Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（Ｃ２１４Δ）のバンドパターンを観察した。還元条件下では、それぞれの抗体について、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドが観察された。このパターンは、還元条件下のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下では、４つの操作抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）が、天然のＩｇＧ分子とは異なったバンドパターンを呈し、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の非存在が示された。４つすべての変異体が、ＨＣ−ＨＣ二量体に対応する９８ｋＤ付近のバンドを呈した。ＬＣに欠失または変異を有する変異体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）は、遊離ＬＣに対応する２４ｋＤ付近の単一のバンドを呈した。重鎖に欠失または変異を含む操作抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２）は、遊離ＬＣに対応する微弱なバンドおよびＬＣ−ＬＣ二量体に対応する４８ｋＤ付近の主要なバンドを有した。ｓｓ１およびｓｓ２構築物には、それぞれの軽鎖のＣ末端における遊離システインに起因して、いくらかの量のＬＣ−ＬＣ種の形成が予測される。
【０３４７】
［実施例７］
抗ＳＥＺ６抗体の作製
４種類のヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＳＥＺ６部位特異的抗体を、ヒト化抗体ｈＳＣ１７．２００を開始点として使用して、実質的に実施例６に記載されるように構築した。４種類の操作抗体のうちの２種類は、天然の軽鎖定常領域を含み、重鎖に変異を有していたが、この変異では、軽鎖のシステイン２１４と鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖の上部ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）が、セリンで置換されていた（Ｃ２２０Ｓ）または除去されていた（Ｃ２２０Δ）。残りの２種類の操作抗体は、天然の重鎖定常領域および変異軽鎖を有したが、この変異において、軽鎖のシステイン２１４は、セリンで置換されていた（Ｃ２１４Ｓ）または除去されていた（Ｃ２１４Δ）。アセンブルすると、重鎖と軽鎖とが、治療剤とのコンジュゲーションに好適な２つの遊離システインを有する抗体を形成する。例示的なｈＳＣ１７．２００構築物のそれぞれの抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、図６Ａおよび６Ｂに示すが、すぐ下の表１０には、改変についてまとめる。図６Ａおよび６Ｂに関して、反応性システインは、重鎖については２２０位、軽鎖については２１４位の変異残基（ｓｓ１およびｓｓ４）と同様に、下線で示す。別途示されない限り、定常領域残基のすべての番号付けは、Ｋａｂａｔらに記載されるＥＵ番号付けスキームに従う。
【０３４８】
【表１０】
2018511579.tif 000024
【０３４９】
部位特異的操作ｈＳＣ１７．２００抗体の重鎖および軽鎖を含む発現ベクターを、ＣＨＯ細胞または２９３細胞に導入し、次いで、これらの細胞を使用して、本明細書に記載される部位特異的抗体を生成した。
【０３５０】
ｈＳＣ１７．２００に加えて、部位特異的抗体ｈＳＣ１７．１７抗体を、実質的に同じ方式で生成および発現させることができる。例示的なｈＳＣ１７．１７部位特異的抗体は、すぐ下に記載される表１１にまとめたようなものであり、全長重鎖および全長軽鎖アミノ酸配列は、示されるように添付の配列表に含まれている。
【０３５１】
【表１１】
2018511579.tif 000025
【０３５２】
［実施例８］
部位特異的抗ＣＤ３２４抗体の作製
４種類の操作ヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＣＤ３２４部位特異的抗体を、構築した。４種類の操作抗体のうちの２種類は、天然の軽鎖を含み、重鎖に変異を有していたが、この変異では、軽鎖のシステイン２１４と鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖の上部ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）が、セリンで置換されていた（Ｃ２２０Ｓ）または除去されていた（Ｃ２２０Δ）。残りの２種類の操作抗体は、天然の重鎖および変異軽鎖を有したが、この変異において、軽鎖のシステイン２１４は、セリンで置換されていた（Ｃ２１４Ｓ、図７を参照されたい）または除去されていた（Ｃ２１４Δ）。操作抗体を、次のように生成した。
【０３５３】
適切な可変領域（配列番号５３１および５３２）を含むヒト化抗ＣＤ３２４  ｈＳＣ１７．１０抗体の軽鎖または重鎖をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位指向的変異生成のための鋳型として使用した。部位指向的変異生成は、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【０３５４】
２つの重鎖変異体については、ｈＳＣ１０．１７の変異体Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０Δ重鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１０．１７の天然のＩｇＧ１カッパ軽鎖とともに、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０Δ変異体を含む操作抗ＣＤ３２４部位特異的抗体は、それぞれ、ＳＣ１０．１７ｓｓ１またはＳＣ１０．１７ｓｓ２と称した。
【０３５５】
２つの軽鎖変異体については、ｈＳＣ１０．１７の変異体Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４Δ軽鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１０．１７の天然のＩｇＧ１重鎖とともに、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。操作抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅプロテインＡ樹脂）を使用して精製し、適切な緩衝液中で保管した。Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４Δ変異体を含む操作抗ＣＤ３２４部位特異的抗体は、それぞれ、ＳＣ１０．１７ｓｓ３またはＳＣ１０．１７ｓｓ４と称した。
【０３５６】
ｈＳＣ１０．１７ｓｓ３の天然の重鎖全体のアミノ酸配列を、図７に配列番号５４３として示し、一方で操作軽鎖全体のアミノ酸配列は、同じ図に配列番号５４４として示す。カッパ軽鎖のＣ２１４Ｓ位（Ｋａｂａｔの番号付け）を、重鎖の２２０位の遊離システイン（これもＫａｂａｔ番号付けのＥＵインデックス）と同様に、＊で示す。
【０３５７】
［実施例９］
部位特異的構築物は結合特徴を保持する
前述の実施例に記載されるように作製した部位特異的抗ＤＬＬ３抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングして、それらがＤＬＬ３精製タンパク質に結合したかどうかを判定した。親天然抗体を対照として使用し、部位特異的抗ＤＬＬ３抗体と並行して実施した。ＤＬＬ３への抗体の結合を、ヒトＩｇＧ１分子に存在するエピトープに結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）レポーター抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＢ９０５２−０５）を用いて、検出した。ＨＲＰは、その基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応する。加水分解されたＴＭＢの量は、ＤＬＬ３に結合した試験抗体の量に正比例する。
【０３５８】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの精製ＤＬＬ３でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。過剰なタンパク質を、洗浄によって除去し、ウェルを、室温で１時間、０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中２％（重量／体積）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルでブロッキングした。洗浄した後、１００μＬ／ウェルの連続希釈した抗体またはＡＤＣを、室温で１時間ＰＢＳＴに添加した。プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルの０．５ｕｇ／ｍｌの適切なレセプター抗体を、室温で１時間ＰＢＳＴに添加した。もう一度洗浄した後、プレートを、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１５分間添加することにより発色させた。等体積の２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させた。試料を、次いで、分光光度計によりＯＤ４５０で分析した。
【０３５９】
ＥＬＩＳＡの結果を、図８に結合曲線として示す。データの考察は、軽鎖定常領域に遊離システインをもたらすように重鎖ＣＨ１ドメインを操作することは、標的抗原への抗体の結合に悪影響を及ぼさなかったことを示す。様々な部位特異的構築物を用いて行った類似のアッセイ（データは示されない）は、遊離システインをもたらすように軽鎖定常領域またはＣＨ１領域を操作することが、結果として得られる抗体またはＡＤＣの結合特徴にほとんど影響を有さないことを示す。
【０３６０】
［実施例１０］
部位特異的抗ＳＥＺ６  ＡＤＣのコンジュゲーション
部位特異的抗体コンジュゲーションは、実施例７に記載されるような操作抗ＳＥＺ６抗体を、ｖａｌ  ｃｉｔリンカー（ｖｃＭＭＡＥ、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７６５９２４１を参照されたい）を介してチオール反応性モノメチルオーリスタチンＥにコンジュゲートさせて行った。部位特異的コンジュゲーションにより、種のヘテロ原性および複雑性が低減されたＡＤＣ集団が生じる。上述のように、同種組成物を含む相同なＡＤＣ集団は、安定性、薬物動態、凝集および最終的には安全性のプロファイルに好ましい影響を有し得る。
【０３６１】
より具体的には、操作ヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＳＥＺ６抗体を構築したが、ここで、軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖の上部ヒンジ領域のシステイン（Ｃ２２０）が、セリンで置換されており（Ｃ２２０Ｓ）、細胞毒素をコンジュゲートさせることができる２つの不対システインを有する抗体（ｈＳＣ１７．２００ｓｓ１）が得られた。操作重鎖全体のアミノ酸配列を、図６Ａに配列番号５１５として示し、一方で軽鎖全体のアミノ酸配列は、同じ図に配列番号５１３として示す。重鎖のＣ２２０Ｓ位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を、カッパ軽鎖の２１４位（これもＫａｂａｔによる番号付け）の遊離システインと同様に、太字と下線で示す。
【０３６２】
ｈＳＣ１７．２００Ｓを、還元ステップ、再酸化ステップおよびコンジュゲーションステップの３つの異なる段階において、ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートさせた。このプロセスの概略図は、図９に見ることができる。
【０３６３】
ｈＳＣ１７．２００Ｓを、水中に４０モル当量の１０ｍＭ  ＤＴＴを添加することにより完全に還元した。還元反応を、室温で一晩（１２時間超）進行させた。還元された抗体を、次いで、３０ｋｄの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）および１０透析当量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の緩衝液交換を使用して、ｐＨ７．５のトリス緩衝液に緩衝液交換した。還元されたｈＳＣ１７．２００Ｓを、次いで、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の１０ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）を４．５モル当量添加することのいずれかにより再び酸化させた。再酸化反応を、室温で６０分間進行させた。再酸化した抗体を、次いで、ＤＭＡ中のｖｃＭＭＡＥの１０ｍＭストックから、遊離チオール１モル当たり１．２モルのｖｃＭＭＡＥを添加することによりコンジュゲートさせた。追加のＤＭＡを、反応混合物中のＤＭＡの最終濃度が、およそ６％体積／体積となるように、コンジュゲーションの前に添加した。コンジュゲーションを３０分間進行させた後、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液から１．２モル過剰量のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、４％体積／体積の０．５Ｍ酢酸の添加により５．５±０．３に調節した。コンジュゲートしているｈＳＣ１７．２００ＳｖｃＭＭＡＥを、１０ｋＤａの膜および１０透析量の緩衝液交換を使用して定容透析濾過により、２０ｍＭヒスチジンクロリドｐＨ６．０中に透析濾過した後、滅菌濾過および最終製剤化を行った。結果として得られたＡＤＣは、コンジュゲートしている天然のＳＣ１７．２００抗体の結合に匹敵するＳＥＺ６抗原への結合、および比較的高い割合のＤＡＲ＝２化合物を呈した。
【０３６４】
［実施例１１］
部位特異的抗体のコンジュゲーション
上の実施例６および７に記載されるように作製した部位特異的抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１およびｈＳＣ１７．２００ｓｓ１）を、部位特異的コンジュゲーションを実証するために、ＤＴＴを使用して完全に還元させたまたはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を使用して部分的に還元させた後、ｖｃＭＭＡＥを含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０３６５】
重ねて、このプロセスの概略図は、図９に見ることができる。この構築物の標的コンジュゲーション部位は、各軽鎖定常領域の不対システイン（Ｃ２１４）である。コンジュゲーション効率（対標的コンジュゲーションおよび標的外コンジュゲーション）は、軽鎖における対標的コンジュゲーションと重鎖における標的外コンジュゲーションとを対比して追跡することができる逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）アッセイを使用して監視することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）アッセイを使用して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）種の分布を監視してもよい。この実施例では、所望される生成物は、逆相クロマトグラフィーにより決定される軽鎖におけるコンジュゲーション（標的）が最大であり、過剰にコンジュゲートする（ＤＡＲ＞２）種を最小限に抑えると同時にＤＡＲ＝２種を最大にする、ＡＤＣである。
【０３６６】
ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１またはｈＳＣ１７．２００ｓｓ１の異なる調製物を、４０モル当量の１０ｍＭ  ＤＴＴの添加により完全に還元させたまたは２．６モル当量の１０ｍＭ  ＴＣＥＰの添加により部分的に還元させた。
【０３６７】
１０ｍＭ  ＤＴＴで還元させた試料を、室温で一晩（１２時間超）還元させた後、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）および１０透析量に相当する緩衝液交換を使用してｐＨ７．５のトリス緩衝液に緩衝液交換した。得られた完全に還元された調製物を、次いで、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の１０ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）を４．０モル当量添加することにより再び酸化させた。試料の遊離チオール濃度（Ｅｌｌｍａｎ法により測定される、抗体１つ当たりの遊離チオールの数）は、１．９から２．３であり、抗体のシステインを、室温で最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＭＭＡＥ細胞毒素にコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）の添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−ＭＭＡＥの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に緩衝液交換した。
【０３６８】
１０ｍＭ  ＴＣＥＰで部分的に還元させた試料を、室温で最低９０分間還元させた。試料の遊離チオール濃度が１．９から２．３だった場合、部分的に還元された抗体を、ここでもマレイミドリンカーを介して室温で最低３０分間ＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液から１．２モル過剰量のＮＡＣを添加することにより停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。コンジュゲートしている抗体−ＭＭＡＥの調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に緩衝液交換した。
【０３６９】
最終的な抗体−薬物調製物（ＤＴＴで還元したものおよびＴＣＥＰで還元したもの）を、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＭＭＡＥ（図１０Ａ）またはｈＳＣ１７．２００ｓｓ１−ＭＭＡＥ（図１０Ｂ）の対標的コンジュゲーションの割合を判定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比して定量化した。分析は、Ａｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ３．６μｍ  Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用い、移動相Ａとして水中０．１％体積／体積のＴＦＡおよび移動相Ｂとして９０％体積／体積アセトニトリル中０．１％体積／体積のＴＦＡを用いた。試料を、分析の前にＤＴＴで完全に還元させ、次いで、カラムに注入し、そこで、勾配３０−５０％の移動相Ｂを１０分間にわたって適用した。２１４ｎｍでのＵＶシグナルを収集した後、重鎖および軽鎖のコンジュゲーションの程度の計算に使用した。
【０３７０】
より具体的には、ＤＴＴおよびＴＣＥＰを使用してコンジュゲートさせたｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＭＭＡＥおよびｈＳＣ１７．２００ｓｓ１−ＭＭＡＥにおける重鎖と軽鎖との間のペイロード分布を、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。重鎖および軽鎖におけるコンジュゲーションパーセントは、既に確立されているピーク（軽鎖、軽鎖＋１薬物、重鎖、重鎖＋１薬物、重鎖＋２薬物など）のＲＰ−ＨＰＬＣ曲線下面積を統合し、各鎖のコンジュゲーション％を別個に計算することによって得た。本明細書全体に考察されるように、本発明の選択された実施形態は、軽鎖におけるペイロードの配置に好ましいコンジュゲーション手順を含む。
【０３７１】
同じ調製物はまた、ＨＩＣを使用して分析して、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＭＭＡＥ（図１１Ａ）およびｈＳＣ１７．２００ｓｓ１−ＭＭＡＥ（図１１Ｂ）に対する望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した。この点に関して、ＨＩＣは、ＰｏｌｙＰＲＯＰＹＬ  Ａ  ３μｍカラム（ＰｏｌｙＬＣ）を使用し、移動相Ａとして水中１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび２５ｍＭリン酸カリウムならびに移動相Ｂとして水中０．２５％重量／体積のＣＨＡＰＳおよび２５ｍＭリン酸カリウムを使用して、行った。試料を、直接カラムに注入し、そこで、勾配０−１００％の移動相Ｂを１５分間にわたって適用した。２８０ｎｍでのＵＶシグナルを収集し、クロマトグラムをコンジュゲートしている抗体およびＤＡＲの高い種に関して分析した。ＤＡＲの計算は、既に確立されているピーク（ＤＡＲ＝０、ＤＡＲ＝１、ＤＡＲ＝２、ＤＡＲ＝４など）のＨＩＣ曲線下面積を統合し、各ピークの％を計算することにより行った。結果として得られた、ＤＴＴおよびＴＣＥＰを使用してコンジュゲートしているｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＭＭＡＥおよびｈＳＣ１７．２００ｓｓ１−ＭＭＡＥにおけるＤＡＲ分布を、それぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
【０３７２】
ｈＳＣ１６部位特異的コンジュゲート調製物のＨＩＣにより判定したＤＡＲ分布は、ＤＴＴ／ＤＨＡＡ完全還元および再酸化法は約６０％のＤＡＲ＝２種をもたらすが、典型的な部分的ＴＣＥＰ還元法は、約５０％のＤＡＲ＝２をもたらすことを示す。完全還元および再酸化法はまた、望ましくない高ＤＡＲ＞２種（２０−２５％）をもたらし、部分的ＴＣＥＰ還元法は、１０−１５％のＤＡＲ＞２をもたらす（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＴＣＥＰ部分還元は、より低いレベルのＤＡＲ＞２種を有したが、ＤＡＲ＝２の割合がたった５０％であることに留意されたい。ＴＣＥＰシステムにおいてＤＡＲ＝２種％を高めることにより、対応する望ましくないＤＡＲ＞２種の増加が生じる。ＤＴＴ／ＤＨＡＡ完全還元試料の高ＤＡＲ種の増加は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより示される重鎖の標的外コンジュゲーションが高いことに帰属し得（図１０Ａおよび１０Ｂ）、これは、還元の駆動力が増加するため、ヒンジ領域のシステイン残基の非特異的還元に起因する。したがって、開示される部位特異的構築物は、天然の抗体と比べて改善されたＤＡＲおよびより少ない望ましくない高ＤＡＲ不純物をもたらすが、従来的な還元法では、意図される操作部位とは異なるシステイン残基に細胞毒性剤を含む非特異的コンジュゲートが少なくともいくつか生じる。
【０３７３】
［実施例１２］
選択的還元プロセスを使用した操作抗体のコンジュゲーション
最終生成物のコンジュゲーション特異性および均質性をさらに改善するために、実施例６および７に記載されるように作製した部位特異的抗体を、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および緩徐な還元剤（例えば、グルタチオン）を含む新規なプロセスを使用して選択的に還元した後、ＭＭＡＥを含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。上述のように、選択的コンジュゲーションは、細胞毒素を遊離システインに優先的にコンジュゲートさせ、非特異的コンジュゲーションをほとんどなかった。
【０３７４】
実施例６および７によると、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１構築物の標的コンジュゲーション部位は、各軽鎖の不対システインである。コンジュゲーションをこれらの操作部位に指向させるために、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１およびｈＳＣ１７．２００ｓｓ１の調製物を、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液において、室温で最低１時間、部分的に還元させた。加えて、対照として、各抗体調製物を、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０緩衝液および２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／５ｍＭ  ＧＳＨ、ｐＨ８．２緩衝液において、１時間以上別個にインキュベートした。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物（アルギニンおよびグルタチオン中で一緒にインキュベートした試料に関して）は、１．９から２．３の遊離チオール濃度を有しており、すべての調製物を、次いで、室温で最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−ＭＭＡＥの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０３７５】
最終的な抗体−薬物調製物を、対標的軽鎖コンジュゲーションの割合を判定するために、前述のようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比させて定量化した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。試料を、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。比較目的で、前述の実施例で得られた結果を、ＤＴＴ／ＤＨＡＡおよびＴＣＥＰ還元試料に関して図１２および１３に含める。ＥＤＴＡ／ＧＳＨ対照のＨＩＣ分析を、図１４Ａおよび１４Ｂに示し、これらの図において、対照のＨＩＣ分析は、選択的に還元した試料の隣に示される。
【０３７６】
図１２および１３は、選択的還元プロセスを使用して還元した抗体のＨＩＣ  ＤＡＲ分布および軽鎖コンジュゲーション％を、標準的な完全または部分的還元プロセス（実施例１０および１１に記載される）と比較してまとめる。操作構築物と組み合わせた選択的コンジュゲーション方法の利点は、容易に明らかであり、所望される軽鎖コンジュゲーション部位の優れた選択性をもたらし（図１２Ａおよび１２Ｂ）、６０−７５％の平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらすと同時に、望ましくないＤＡＲ＞２種を１０％未満に維持する（図１３Ａおよび１３Ｂ）。図１２および１３に示される結果は、選択的還元が、標準的な部分的または完全還元手順よりも高いレベルのＤＡＲ＝２およびより少ない望ましくないＤＡＲ＞２種をもたらす反応を促進させることを示す。図１４Ａおよび１４Ｂに示されている対照手順は、緩徐な還元剤（例えば、ＧＳＨ）では、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）の非存在下において所望されるコンジュゲーションを実行することができないことを示す。
【０３７７】
これらのデータは、選択的還元が、従来的な部分的および完全な還元コンジュゲーション方法よりも優れた利点を提供することを示す。これは、新規な選択的還元手順が、不対（または遊離）システイン残基をもたらすように操作した抗体と併せて使用される場合に、特に当てはまる。安定化剤と組み合わせた緩徐な還元（すなわち、選択的還元）は、様々なリンカー−薬物に容易にコンジュゲートする安定な遊離チオールをもたらしたが、ＤＨＡＡ再酸化は、時間に敏感であり、ＴＣＥＰ還元は、特に本明細書に記載される操作構築物については、成功とはいかなかった。
【０３７８】
［実施例１３］
異なる系での選択的還元
安定化剤と還元剤との様々な組合せを使用した選択的還元の利点をさらに示すために、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１を、異なる緩徐な還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システインまたはＮＡＣ）と組み合わせた異なる安定化剤（例えば、Ｌ−リジン）を使用して選択的に還元させた後、コンジュゲートさせた。
【０３７９】
それぞれ３つのｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の調製物を、３つの異なる緩衝液系を使用して選択的に還元した：（１）１Ｍ  Ｌ−アルギニン／６ｍＭ  ＧＳＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、（２）１Ｍ  Ｌ−アルギニン／１０ｍＭ  ＮＡＣ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、および（３）１Ｍ  Ｌ−リジン／５ｍＭ  ＧＳＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。加えて、対照として、抗体調製物を、２０ｍＭトリス／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ  ＮＡＣ、ｐＨ８．０緩衝液および２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／５ｍＭ  ＧＳＨ、ｐＨ８．２緩衝液において、別個にインキュベートした。すべての調製物を、室温で最低１時間インキュベートした後、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用した透析濾過によって、２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液に緩衝液交換した。１．７から２．４の遊離チオール濃度を有することが判明した結果として得られた選択的に還元された調製物を、次いで、マレイミドリンカーを介してＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。コンジュゲーション反応を室温で最低３０分間進行させた後、反応を、１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣを添加することにより停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−ＭＭＡＥの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に緩衝液交換した。最終的な抗体−薬物調製物を、次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、ＤＡＲ分布を判定した（図１５）。
【０３８０】
ＨＩＣによって判定したＤＡＲ分布は、利用した３つの異なる選択的還元系（Ａｒｇ／ＧＳＨ、Ｌｙｓ／ＧＳＨおよびＡｒｇ／ＮＡＣ）で類似の結果を示す。より具体的には、ＤＡＲ＝２レベルは、異なる調製物では６０−６５％であり、高ＤＡＲ種（ＤＡＲ＞２）は、すべての選択的還元系およびリンカー−薬物の組合せで２０％未満に維持され、軽鎖の定常領域内の操作システイン残基に対する高い特異性を示す。重ねて、実施例１２において既に示されているように、緩徐な還元剤単独（例えば、ＧＳＨまたはＮＡＣ）では、十分なコンジュゲーション選択性を提供しなかったが、安定化剤の添加により、有意な改善がもたらされる。
【０３８１】
［実施例１４］
部位特異的コンジュゲートは結合特徴を保持する
前述の実施例に記載されるように調製した部位特異的抗ＤＬＬ３  ＡＤＣをスクリーニングして、ＤＬＬ３精製タンパク質に結合するかどうかを判定する。代表的なスクリーニングアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、本質的に以下に記載されるように行われる。ＥＬＩＳＡは、結合特徴を保持する操作抗体を選択するために使用される。
【０３８２】
親非操作抗体を、対照として、コンジュゲート形態および非コンジュゲート形態で使用し、部位特異的抗ＤＬＬ３抗体および抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートと並行して実施する。ＤＬＬ３への抗体の結合を、ヒトＩｇＧ１分子に存在するエピトープに結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）レポーター抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＢ９０５２−０５）を用いて、検出する。ＤＬＬ３へのＡＤＣの結合（部位特異的または従来的）を、ＡＤＣ上の薬物または薬物リンカーに結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしている抗体を使用して、検出する。ＨＲＰは、その基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応する。加水分解されたＴＭＢの量は、ＤＬＬ３に結合した試験品目の量に正比例する。
【０３８３】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの精製ＤＬＬ３でコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。過剰なタンパク質を洗浄によって除去し、ウェルを、室温で１時間、０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中２％（重量／体積）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルでブロッキングする。洗浄した後、１００μＬ／ウェルの連続希釈した抗体またはＡＤＣを、室温で１時間ＰＢＳＴに添加する。プレートを再度洗浄し、０．５ｕｇ／ｍｌの適切なレポーター抗体を、室温で１時間、１００μＬ／ウェルでＰＢＳＴに添加する。もう一度洗浄した後、プレートを、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１５分間添加することにより発色させる。等体積の２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させる。試料を、次いで、分光光度計によりＯＤ４５０で分析する。
【０３８４】
［実施例１５］
部位特異的コンジュゲートのインビトロ細胞毒性
アッセイを行って、部位特異的コンジュゲートが、インビトロで、ヒトＤＬＬ３抗原を発現する細胞を効果的に殺滅させる能力を実証する。例えば、アッセイを使用して、抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートが、ヒトＤＬＬ３を発現するように操作したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を殺滅させる能力を測定することができる。このアッセイにおいて、殺滅するには、ＡＤＣ（部位特異的または対照）が細胞表面のＤＬＬ３標的に結合し、続いてＡＤＣが内部移行することが必要とする。内部移行すると、リンカー（例えば、上述のＶａｌ−Ａｌａプロテアーゼリンカー）が、切断され、細胞内に細胞毒素を放出し、細胞死をもたらす、細胞死は、細胞生存率の代替としてＡＴＰ含量を測定する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を使用して測定する。
【０３８５】
代表的なアッセイは、本質的に以下のように行われる。細胞は、抗体薬物コンジュゲートを添加する１日前に、９６ウェルの組織培養処理プレートに、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマシンを補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ完全培地）において、１ウェル当たり５００個の細胞で播種する。播種の２４時間後に、細胞を、ＤＭＥＭ完全培地において、連続希釈したＳＣＡｂ−細胞毒素対照またはＳＣＡｂｓｓ１−細胞毒素で処理する。細胞を、処置後９６時間培養し、その後、生存細胞数を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って使用して数える。
【０３８６】
［実施例１６］
血清中での部位特異的コンジュゲートの安定性
本発明の部位特異的コンジュゲートによってもたらされる安定性の改善を実証するために、選択されたコンジュゲートを、長期間インビトロでヒト血清に曝露させる。ＡＤＣの分解を経時的に測定する。例えば、代表的なアッセイは、本質的に以下のように行われる。
【０３８７】
それぞれが同じ細胞毒素を含むＳＣＡｂ  ＡＤＣおよびＳＣＡｂｓｓ１  ＡＤＣを、市販のヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２において長期間インキュベートする。試料を、添加後０、２４、４８、９６および１６８時間の時点で収集し、安定性を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定して、全抗体含量およびＡＤＣレベルの両方を測定する。
【０３８８】
全抗体含量の測定値に関して、ＥＬＩＳＡは、コンジュゲートおよび非コンジュゲートの両方のＳＣＡｂまたはＳＣＡｂｓｓ１抗体を検出するように構成されている。このアッセイは、コンジュゲートしている細胞毒素ありまたはなしのＳＣＡｂおよびＳＣＡｂｓｓ１を特異的に捕捉し、検出する、抗イディオタイプ抗体対を用いる。機械的には、アッセイは、感度および直線性を増加させるために電気化学発光を使用するＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を使用して行う。
【０３８９】
この目的で、ＭＳＤ高結合プレートを、４℃で一晩、２ｕｇ／ｍＬの捕捉抗イディオタイプ（ＩＤ−１６）抗体でコーティングする。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡ１５０ｕＬでブロッキングする。２５ｕＬの血清試料を、ＡＤＣ標準曲線とともに、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートさせる。インキュベーション後に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、２５ｕＬのスルホタグ化検出抗イディオタイプ（ＩＤ−３６）抗体を０．５ｕｇ／ｍＬで各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートを洗浄し、１５０ｕＬの１倍ＭＳＤ読取り用緩衝液をウェル毎に添加し、ＭＳＤリーダーで読み取る。データを、最初にヒト血清に添加した全ＡＤＣに対する割合としてグラフにする。
【０３９０】
全抗体濃度の監視に加えて、ＥＬＩＳＡアッセイを、残っている抗体薬物コンジュゲートのレベルを判定するために、収集した試料に行う。すなわち、このアッセイにより、概してすぐ上に記載されているようにＥＬＩＳＡ手法を使用して、無傷なＳＣＡｂ−細胞毒素およびＳＣＡｂｓｓ１−細胞毒素のレベルを測定する。しかしながら、以前のＥＬＩＳＡアッセイとは異なり、このＥＬＩＳＡは、１つ以上の細胞毒素分子にコンジュゲートしているＳＣＡｂまたはＳＣＡｂｓｓ１抗体を定量化するが、検出されたＡＤＣの上に実際に存在する細胞毒素の数は判定できない。全抗体アッセイとは異なり、このアッセイは、抗イディオタイプｍＡｂと抗細胞毒素特異的ｍＡｂとの組合せを使用し、コンジュゲートしていないＳＣＡｂ抗体を検出しない。
【０３９１】
このＥＬＩＳＡアッセイは、ＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用してデータを生成し、代表的なアッセイは、本質的に以下のように行われる。ＭＳＤ標準結合プレートを、４℃で一晩、４ｕｇ／ｍＬの抗細胞毒素特異的ｍＡｂでコーティングする。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡ１５０ｕＬでブロッキングする。２５ｕＬの血清試料を、ＡＤＣ標準曲線およびＱＣ試料とともに、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートさせる。インキュベーション後に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、２５ｕＬのスルホタグ化検出抗イディオタイプ抗体（ＩＤ−３６）を０．５ｕｇ／ｍＬで各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートを洗浄し、１５０ｕＬの１倍ＭＳＤ読取り用緩衝液をウェル毎に添加し、ＭＳＤリーダーで読み取る。このデータを分析して、遊離細胞毒素によりもたらされる非特異的毒性および対応する治療指数の低下を回避するために、最小限のＡＤＣ分解を示すＡＤＣを選択する。
【０３９２】
［実施例１７］
血清中での部位特異的コンジュゲートのアルブミン移入
従来的なＡＤＣでは、血清中のアルブミンが、コンジュゲートしている細胞毒素に浸出し、それによって、非特異的細胞毒性が増加し得ることに留意されてきた。アルブミン移入によって媒介される部位特異的ＡＤＣ分解の量を判定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを開発して、ＳＣＡｂ−細胞毒素およびＳＣＡｂｓｓ１−細胞毒素に曝露した血清中のアルブミン−細胞毒素（ｈＡｌｂ−細胞毒素）の量を測定した。このＥＬＩＳＡは、抗細胞毒素特異的ｍＡｂを使用して、ｈＡｌｂ−細胞毒素を捕捉し、抗ヒトアルブミンｍＡｂは、検出抗体として使用される。遊離ＡＤＣは、ｈＡｌｂ−細胞毒素と競合するため、血清試料は、試験前にＡＤＣを枯渇させる。定量化は、ｈＡｌｂ−細胞毒素標準曲線から外挿する。前の実施例と同様に、このアッセイは、ＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用してデータを生成する。代表的なアッセイは、本質的に以下のように行われる。
【０３９３】
最初に、血清試料を、最終濃度１０μｇまで、関連する対照とともに、ＳＣＡｂ−細胞毒素またはＳＣＡｂｓｓ１−細胞毒素に接種する。前の実施例と同様に、試料は、添加後０、２４、４８、９６および１６８時間の時点で採取する。ＭＳＤ標準結合プレートを、４℃で一晩、４ｕｇ／ｍＬの抗細胞毒素特異的ｍＡｂでコーティングする。翌日、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、室温で３０分間、２５ｕＬのＭＳＤ希釈液２＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングする。血清試料を、ＭＳＤ希釈液２＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中に１：１０で希釈し（１０ｕＬ血清＋９０ｕＬ希釈液）、２０ｕＬのＧＥ製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂とともに、ボルテックス浸透器において１時間インキュベートする。抗イディオタイプ抗体による無傷なＳＣＡｂ−細胞毒素またはＳＣＡｂｓｓ１−細胞毒素の枯渇後に、試料を、９６ウェルの３Ｍフィルタープレートを使用して樹脂から分離させる。２５ｕＬの枯渇血清試料を、次いで、ｈＡｌｂ−６．５標準曲線とともにブロッキングしたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＭＳＤ希釈液３＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した１ｕｇ／ｍＬのスルホタグ化抗ヒトアルブミンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０２４１）２５ｕＬを添加する。次いで、プレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、１５０ｕＬの１倍ＭＳＤ読取り緩衝液で読み取る。データを分析して、最小限のアルブミン移入率を示すＡＤＣを選択する。
【０３９４】
［実施例１８］
部位特異的構築物はインビボでの有効性を示す
インビボ実験を行って、本明細書に記載される部位特異的構築物の細胞殺滅能力を確認する。この目的で、前の実施例に記載されるように調製した部位特異的ＤＬＬ３  ＡＤＣを、皮下に患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍を有する免疫不全ＮＯＤＳＣＩＤマウスにおけるインビボでの治療効果に関して、本質的に次のように試験する。抗ＤＬＬ３−細胞毒素コンジュゲート（ＳＣＡｂ−ＡＤＣ）、ＨＩＣ精製抗ＤＬＬ３−細胞毒素コンジュゲート（ＳＣＡｂ−ＡＤＣＤ２）、およびＨＩＣ精製部位特異的抗ＤＬＬ３−細胞毒素コンジュゲート（ＳＣＡｂｓｓ１−ＡＤＣＤ２）を、それぞれ、３つの異なるＳＣＬＣモデルにおいて試験する。
【０３９５】
ＳＣＬＣ−ＰＤＸ株であるＬＵ１２９、ＬＵ６４、およびＬＵ１１７を、それぞれ、乳房脂肪体領域付近の皮下に解離細胞接種材料として注入し、ノギスを用いて週１回測定する（楕円体積＝ａｘｂ２／２、式中、ａは、楕円の長径であり、ｂは短径である）。腫瘍を、平均サイズ２００ｍｍ３（範囲は１００−３００ｍｍ３）まで成長させた後、マウスを、等しい腫瘍体積平均の処置群（１群当たりｎ＝５匹のマウス）に無作為化する。マウスを、腹腔内注射によりビヒクル（滅菌水中５％グルコース）、対照ヒトＩｇＧ１  ＡＤＣ（ＩｇＧ−ＡＤＣ、１ｍｇ／ｋｇ）、またはＳＣＡｂ−ＡＤＣ調製物（０．７５−１．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの単回用量（１００μＬ）で処置し、治療効果を、週１回の腫瘍体積測定値（上述のようにノギスを用いて）および体重測定値によって評価する。個々のマウスまたは治療群のエンドポイント基準としては、健康状態の評価（任意の疾病兆候）、体重減少（研究開始から２０％を上回る体重減少）、および腫瘍量（１０００ｍｍ３を上回る腫瘍体積）が挙げられる。有効性は、群が平均およそ８００−１０００ｍｍ３に達するまで、週１回の腫瘍体積測定値（ｍｍ３）によって監視する。腫瘍体積を、治療群のすべてのマウスの平均値の標準誤差を伴う平均として計算し、初回処置からの時間（日数）に対してプロットする。処置の結果を、１治療群当たり５匹のマウスにおける平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を用いた腫瘍体積平均値として示す。
【０３９６】
従来の戦略（ＳＣＡｂ−細胞毒素もしくはＳＣＡｂ−ＡＤＣＤ２）または抗体１つ当たり２つの薬物分子を含有する分子種のＨＩＣ精製（２つの調製物）による部位特異的戦略（ＳＣＡｂｓｓ１−ＡＤＣＤ２）のいずれかを使用してコンジュゲートしているＤＬＬ３結合ＡＤＣを、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ−ＬＵ１２９、ＰＤＸ−ＬＵ６４、またはＰＤＸ−ＬＵ１１７を保持するマウスにおいて評価する。結果を分析して、ＤＬＬ３結合ＡＤＣのＨＩＣ精製および／または部位特異的コンジュゲーションが治療効果に及ぼす効果を評価する。
【０３９７】
［実施例１９］
部位特異的コンジュゲートは毒性の低減を示す
開示されるコンジュゲートの治療指数をさらに拡大するために、研究を行って、これらの毒性プロファイルを記録する。具体的には、これらの研究は、より良好に耐容される（例えば、同じ投与回数で死亡なし、皮膚毒性の発生率の低減、骨髄毒性の低減、リンパ系組織の所見による重症度の低下など）、抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートを選択するために行われる。有意義なことに、毒性の低減により、著しく高い投薬量およびそれに対応して腫瘍部位におけるより高い局所細胞毒素濃度がもたらされるという点で、毒性の低減は、実質的に治療指数を増加させる。代表的なアッセイは、本質的に以下のように行われる。
【０３９８】
ＤＡＲ２精製部位特異的ＡＤＣ（ＳＣＡｂｓｓ１−ＡＤＣＤ２）の毒性を、従来的なコンジュゲート（ＳＣＡｂ−ＡＤＣ）またはそのＤＡＲ２精製バージョン（ＳＣＡｂ−ＡＤＣＤ２）の毒性と比較する。調製物のそれぞれは、同じ細胞毒素を含む。研究は、カニクイザルを試験系として使用して行う。生存率、臨床徴候、体重、食物摂取、臨床病変（血液学、凝固、臨床化学、および尿検査）、毒物動態、全体的な剖検所見、器官重量、および病理組織検査を記録し、比較する。
【０３９９】
［実施例２０］
操作部位特異的コンジュゲート
上の実施例において作製および特徴付けした部位特異的抗体に加えて、導入システインまたは修飾システイン近傍の残基を含むいくつかの例示的な構築物を作製した。より具体的には、カッパＣＬ領域を、操作抗体およびコンジュゲートをもたらすように、本発明に従って複数の異なる様式で修飾した。この点に関して、各ＣＬドメインを、ＤＬＬ３を認識する対照ＶＬドメインと会合させ、軽鎖を、Ｃ２２０Ｓ置換を含む修飾抗ＤＬＬ３重鎖と対合させた。修飾ＣＬドメインの配列を、野生型カッパＣＬ（配列番号４０３）とともに図１６（配列番号５０２、５０３および５５０−５６４）に示し、変更／導入した残基を下線で示す。カッパＣＬを、実証目的で使用したが、適合性のあるラムダＣＬを、容易に選択し、本明細書に記載されるように操作して、本発明の操作抗体を得ることができることが理解される。いずれの場合においても、この実施例におけるすべての番号付けは、ＥＵ番号付けスキームに従う。
【０４００】
ＣＬドメインに対する修飾は、一般に、組み込まれる変異の種類に応じて３つのカテゴリーのうちの１つに含まれる。第１のカテゴリーは、選択的還元の好ましい効果を模倣または強化するために、追加または修飾された負電荷を組み込む。この点に関して、ｓｓ５は、Ｅ２１３Ｄ変異を含むが、ｓｓ６は、親軽鎖のＥ２１３およびＣ２１４の間に追加のグルタメートの挿入を含む。
【０４０１】
第２のカテゴリーは、親Ｃ２１４残基に近接し、溶媒に曝露される、カッパ定常領域の可撓性ループ上の代替的な部位を組み込む。これらの構築物のすべてが、コンジュゲーションのシステイン部位をＣ２１４から軽鎖の他の位置に移動させるために、Ｃ２１４Ｓ変異またはＣ２１４の欠失を有する。これには、１８２位から１９１位の領域が含まれ、これについては、ｓｓ１０（Ｋ１９０Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）が代表的な構築物である。これには、１２１位から１２８位の領域も含まれ得、これについては、ｓｓ９（Ｄ１２２Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）が代表的な構築物である。これにはまた、２１０位から２１３位の領域が含まれ得、これらは、ｓｓ１３（Ｎ２１０Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）、ｓｓ１４（Ｒ２１１Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）、ｓｓ１５（Ｇ２１２Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）、ｓｓ１６（Ｅ２１３Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）およびｓｓ１９（Ｇ２１２Ｃ、Ｅ２１３−Ｃ２１４が欠失）により表される。
【０４０２】
第３のカテゴリーは、親Ｃ２１４残基に近接するカッパ定常領域のＩｇ折り畳みのベータシート上の露出した残基により、本明細書に考察される潜在的な遊離システイン部位がもたらされることを示す。このような実施形態において、Ｃ２１４は、競合する可能性のあるシステインを除去するように優先的に排除されるまたはセリンと置換される。ｓｓ１１（Ｔ２０６Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）およびｓｓ１２（Ｓ２０８Ｃ  Ｃ２１４Ｓ）は、この第３のカテゴリーの代表的な構築物である。
【０４０３】
３つカテゴリーから戦略を組み合わせることにより、操作構築物にさらなる改善をもたらし、部位特異的コンジュゲーションを強化することもできる。例えば、ｓｓ７（Ｅ２１３Ｃ  Ｃ２１４Ｅ）およびｓｓ８（Ｇ２１２Ｃ  Ｃ２１４欠失）は、Ｃ末端の負に荷電した残基を有するカテゴリー１からの戦略と、部位特異的コンジュゲーションのためのシステインの新しい位置を有するカテゴリー２の戦略とを組み合わせる。複数の構築物が、Ｃ末端からの残基の切断と、３つのカテゴリーのうちの１つ以上の戦略とを組み合わせる。ｓｓ１７（Ｒ２１１Ｃ  Ｇ２１２Δ、Ｅ２１３Δ、Ｃ２１４Δ）は、カテゴリー２のＣ２１４部位とは異なる位置のシステインを用い、システインのＣ末端における残基の切断によってコンジュゲーションのためのＣ末端システインの作出をする。ｓｓ１８（Ｒ２１１Ｃ、Ｇ２１２Ｅ、Ｅ２１３−Ｃ２１４Δ）は、カテゴリー２の２１１位のシステイン、カテゴリー１のＣ末端グルタミン酸、および残りのＣ末端の切断の組合せを用いる。
【０４０４】
前述の軽鎖定常領域変異の概要を、すぐ下の表１２に示す。
【０４０５】
【表１２】
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【０４０６】
選択されたＶＬを含む軽鎖構築物のすべては、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してまたは特注の遺伝子合成（ＩＤＴ）により作製した。前述のように、これらの軽鎖構築物を、発現ベクターにクローニングし、選択した重鎖ベクターとともにＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトした。この点に関して、１００μｇの全ベクターＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のＰＥＩトランスフェクション試薬３００μｇに添加し、このミックスを、室温で１０分間インキュベートした後、細胞に添加した。アセンブルされた部位特異的構築物を含む上清を、トランスフェクション後６から８日で採取した。
【０４０７】
上述のように、欠失または置換された天然のシステインのみを含む改変されたカッパＣＬを含む軽鎖（配列番号５０２および５０３）を、Ｃ２２０残基を有する野生型定常領域を含む重鎖（例えば、配列番号４０４）とともに共発現させて、抗体重鎖に２つの不対システインを含む抗体を得る。逆に、図１６に記載される残りのＣＬ構築物を含む軽鎖（配列番号５５０−５６４）を、Ｃ２２０残基が欠けた重鎖（例えば、配列番号５００および５０１）とともに共発現させて、軽鎖のＣＬドメインに２つの遊離システインが得られる。概して、上述の表２を参照されたい。いずれの場合においても、組換え抗体を含有する上清から、８００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞片を除去した。次いで、組換え抗体を、プロテインＡビーズで精製し、使用するまで４℃で保管した。
【０４０８】
［実施例２１］
操作部位特異的コンジュゲート
操作遊離システイン残基の選択的還元のための新規なプロセスの有用性をさらに実証するために、実施例２０に記載されるように構築した様々な部位特異的抗体（ＳＣ１６ｓｓ５、ＳＣ１６ｓｓ６、ＳＣ１６ｓｓ８、ＳＣ１６ｓｓ１１、ＳＣ１６ｓｓ１４、およびＳＣ１６ｓｓ１７）を、選択的に還元させた後、末端マレイミド基を含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０４０９】
ＳＣ１６ｓｓ５、ＳＣ１６ｓｓ６、ＳＣ１６ｓｓ８、ＳＣ１６ｓｓ１１、ＳＣ１６ｓｓ１４、およびＳＣ１６ｓｓ１７の調製物を、室温で最低１時間、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で部分的に還元させた。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物を、次いで、室温で最低３０分間、ＬＤ６．５（ＰＢＤ）とコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。様々なコンジュゲートしているＡＤＣ調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭヒスチジン塩化物（Ｈｉｓ  Ｃｌ）ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０４１０】
最終的な抗体−薬物調製物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図１７）。結果は、不対システイン残基を有する様々な部位特異的抗体への選択的還元プロセスの適用可能性をはっきりと示す。選択された操作抗体のそれぞれについて、ＤＡＲ＝２コンジュゲーションの程度は、６０％以上であり、このような構築物を使用してＡＤＣを提供することの利点を示す。
【０４１１】
［実施例２２］
操作部位特異的抗体の選択的結合
本発明の最終的な生成物のコンジュゲーション特異性および均質性をさらに実証するために、実施例２０に記載されるように作製した部位特異的抗体を、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および緩徐な還元剤（例えば、グルタチオン）を含む新規なプロセスを使用して選択的に還元した後、末端マレイミド基を含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０４１２】
実施例２０に記載されるように、それぞれのＳＣ１６ｓｓ５−１９構築物の標的コンジュゲーション部位は、それぞれの軽鎖の不対システインである。コンジュゲーションをこれらの操作部位に指向させるために、ｈＳＣ１６ｓｓ５−１９の調製物を、室温で最低１時間、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で部分的に還元させた。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物は、１．９から２．３の遊離チオール濃度を有しており、次いで、すべての調製物を、室温で最低３０分間マレイミド基を介して薬物リンカーにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭヒスチジン塩化物、ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０４１３】
最終的な抗体−薬物調製物を、対標的軽鎖コンジュゲーションの割合を判定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比させて定量化した（図１８）。試料を、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図１９）。
【０４１４】
図１９に示されるように、ｓｓ５、ｓｓ８、ｓｓ１４、ｓｓ１７およびｓｓ１８構築物は、６０％を上回る平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらしながら、望ましくないＤＡＲ＞２種は２０％未満であった。これらの構築物はまた、図１８に示されるように、最も高い所望される軽鎖コンジュゲーション（＞７０％）をもたらした。構築物ｓｓ１５およびｓｓ１６は、最も低いＤＡＲ２種のレベルを呈し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分解されなかったが、構築物ｓｓ１２およびｓｓ１９は、最も低い軽鎖コンジュゲーション（＜４０％）を呈し、緩衝液交換の際の不安定性を示し、これにより、全体的な収率およびＤＡＲを低下させた。このような結果は、選択された操作構築物を使用して達成される効果的および均質なコンジュゲーションをさらに実証する。
【０４１５】
［実施例２３］
ＭＭＡＥへの操作部位特異的抗体の選択的結合
最終生成物のコンジュゲーション特異性および均質性をさらに改善するために、実施例２０に記載されるように作製した数種類の選択された部位特異的抗体を、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および緩徐な還元剤（例えば、グルタチオン）を使用して選択的に還元した後、ＭＭＡＥを含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０４１６】
実施例２０に記載されるように、それぞれのｈＳＣ１６ｓｓ５−１９構築物の標的コンジュゲーション部位は、それぞれの軽鎖の不対システインである。コンジュゲーションをこれらの操作部位に指向させるために、ｓｓ５、ｓｓ６、ｓｓ８、ｓｓ１４、ｓｓ１７、ｓｓ１８およびｓｓ１９の調製物を、室温で最低１時間、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で部分的に還元させた。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物は、１．９から２．３の遊離チオール濃度を有しており、次いで、すべての調製物を、室温で最低３０分間マレイミドリンカーを介してＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−ＰＢＤの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０４１７】
最終的な抗体−薬物調製物を、対標的軽鎖コンジュゲーションの割合を判定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比させて定量化した（図２０）。試料を、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図２１）。
【０４１８】
図２１に示されるように、ｓｓ１４、ｓｓ１７およびｓｓ１８構築物は、６０％以上の平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらしながら、望ましくないＤＡＲ＞２種は２０％未満であった。図２０に示されるように、ｓｓ８、ｓｓ１７、ｓｓ１８およびｓｓ１９は、すべてが、ＲＰ−ＨＰＬＣで許容できる分解能を示した。これらの４つの構築物のうち、ｓｓ１７およびｓｓ１８が、最も高い所望される軽鎖コンジュゲーションレベル（８０％）を示し、前述の実施例においてこれらの構築物で得られたデータと相関していた。重ねて、これは、操作構築物を選択的に還元させて、有効な治療指数を有する高度に均質な組成物を得ることができることを示す。
【０４１９】
［実施例２４］
カリケアマイシンへの操作部位特異的抗体の選択的結合
本発明の多用途性を実証するために、実施例２０に記載されるように作製した抗体を、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および緩徐な還元剤（例えば、グルタチオン）を使用して選択的に還元した後、カリケアマイシンを含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０４２０】
実施例２０に記載されるように、それぞれのＳＣ１６ｓｓ５−１９構築物の標的コンジュゲーション部位は、それぞれの軽鎖の不対システインである。コンジュゲーションをこれらの操作部位に指向させるために、ｓｓ５、ｓｓ６、ｓｓ８、ｓｓ１４、ｓｓ１７およびｓｓ１８の調製物を、室温で最低９０分間、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／６ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で部分的に還元させた。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物は、１．１から２．０の遊離チオール濃度を有しており、次いで、すべての調製物を、室温で一晩最低１２時間マレイミドリンカーを介してカリケアマイシンにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−カリケアマイシンの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０４２１】
最終的な抗体−薬物調製物を、対標的軽鎖コンジュゲーションの割合を判定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比させて定量化した（図２２）。試料を、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図２３）。
【０４２２】
図２３に示されるように、ｓｓ５構築物は、７５％を上回る平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらしながら、望ましくないＤＡＲ＞２種は１０％未満であった。図２２に示されるように、ｓｓ５、ｓｓ６、ｓｓ８、ｓｓ１７およびｓｓ１８は、すべてが、ＲＰ−ＨＰＬＣで許容できる分解能を示した。これらの５つの構築物のうち、ｓｓ５が、最も高い所望される軽鎖コンジュゲーションレベル（７９％）を示し、前述の実施例においてこの構築物で得られたデータと相関していた。重ねて、これは、操作構築物を選択的に還元させて、有効な治療指数を有する高度に均質な組成物を得ることができることを示す。
【０４２３】
［実施例２５］
ドラスタチンへの操作部位特異的抗体の選択的結合
本発明と適合性のある広範な細胞毒性剤をさらに例示するために、実施例２０に記載されるように作製した部位特異的抗体を、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および緩徐な還元剤（例えば、グルタチオン）を使用して選択的に還元した後、ドラスタチンを含むリンカー−薬物とコンジュゲートさせた。
【０４２４】
実施例２０に記載されるように、それぞれのＳＣ１６ｓｓ５−１９構築物の標的コンジュゲーション部位は、それぞれの軽鎖の不対システインである。コンジュゲーションをこれらの操作部位に指向させるために、ｓｓ５、ｓｓ６、ｓｓ８、ｓｓ１４、ｓｓ１７およびｓｓ１８の調製物を、室温で最低９０分間、１Ｍ  Ｌ−アルギニン／８ｍＭグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で部分的に還元させた。すべての調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して２０ｍＭトリス／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７緩衝液に緩衝液交換した。結果として得られた部分的に還元された調製物は、１．６から２．３の遊離チオール濃度を有しており、次いで、すべての調製物を、室温で最低６０分間マレイミドリンカーを介してドラスタチンにコンジュゲートさせた。次いで、反応を、水中に調製した１０ｍＭストック溶液を使用して１．２モル過剰量のＮＡＣの添加により停止させた。最低２０分間の反応停止処理時間の後、ｐＨを、０．５Ｍ酢酸の添加により６．０に調節した。抗体−ドラスタチンの様々なコンジュゲーション調製物を、次いで、３０ｋＤａの膜を使用した透析濾過によって、２０ｍＭのヒスチジン塩化物ｐＨ６．０中に透析濾過した。
【０４２５】
最終的な抗体−薬物調製物を、対標的軽鎖コンジュゲーションの割合を判定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、重鎖コンジュゲーション部位と軽鎖コンジュゲーション部位とを対比させて定量化した（図２４）。試料を、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析して、望ましくないＤＡＲ＞２種と対比して、ＤＡＲ＝２種の量を判定した（図２５）。
【０４２６】
図２５に示されるように、ｓｓ６構築物は、８５％を上回る平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらしながら、望ましくないＤＡＲ＞２種は５％未満であった。図２４に示されるように、ｓｓ５、ｓｓ６、ｓｓ８、ｓｓ１４、ｓｓ１７およびｓｓ１８は、すべてが、ＲＰ−ＨＰＬＣで許容できる分解能を示した。これらの６つの構築物のうち、ｓｓ５およびｓｓ６が、最も高い所望される軽鎖コンジュゲーションレベル（＞８０％）を示し、前述の実施例においてこれらの構築物で得られたデータと相関していた。重ねて、これは、操作構築物を選択的に還元させて、有効な治療指数を有する高度に均質な組成物を得ることができることを示す。
【０４２７】
［実施例２６］
部位特異的コンジュゲートはインビトロでＤＬＬ３＋細胞を効果的に殺滅させる
上述のコンジュゲーションの成功を考慮して、アッセイを行って、部位特異的コンジュゲートがインビトロにおいてヒトＤＬＬ３抗原を発現する細胞を効果的に殺滅させる能力を実証する。より具体的には、選択された、カリケアマイシンまたはドラスタチンを含む部位特異的ＡＤＣを試験して、これらがインビトロでＤＬＬ３＋細胞を殺滅させる能力にアクセスした。この目的で、ＤＬＬ３＋２９３細胞を、ＳＣ１６．ｓｓ１、ＳＣ１６ｓｓ５、ＳＣ１６ｓｓ１４およびＳＣ１６ｓｓ１８を含むカリケアマイシン部位特異的コンジュゲート、ならびにＳＣ１６．ｓｓ１、ＳＣ１６ｓｓ５およびＳＣ１６ｓｓ６を含むドラスタチン部位特異的コンジュゲートに曝露した。カリケアマイシンコンジュゲートの結果を図２６に示し、一方でドラスタチンコンジュゲートの結果を図２７に示す。
【０４２８】
アッセイを行うために、ｈＤＬＬ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、１ウェル当たり５００個の細胞で、ＢＤ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。１日後に、様々な濃度の精製したｈＳＣ１６．５６部位特異的ＡＤＣを、培養物に添加した。細胞を９６時間インキュベートした。インキュベーション後に、生存細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って使用して、計数した。未処置細胞を含有する培養物を使用した未加工発光計数を、１００％の基準値として設定し、すべての他の計数は、基準値に対する割合として計算した。
【０４２９】
図２６の考察により、４つのＤＬＬ３＋部位特異的カリケアマイシンコンジュゲート（ＳＣ１６．ｓｓ１、ＳＣ１６ｓｓ５、ＳＣ１６ｓｓ１４およびＳＣ１６ｓｓ１８）が、ＩｇＧ１対照カリケアマイシンコンジュゲートと比較すると、ＤＬＬ３＋細胞を効果的に殺滅させたことを示す。同様に、図２７は、ドラスタチンＤＬＬ３＋部位特異的コンジュゲート（ＳＣ１６．ｓｓ１、ＳＣ１６ｓｓ５およびＳＣ１６ｓｓ６、ＳＣ１６ｓｓ１は２つの異なるドラスタチン毒素ロットを含む）が、ＩｇＧ１部位特異的ドラスタチン対照よりも実質的に低い濃度でＤＬＬ３＋細胞を殺滅させることを図示する。
【０４３０】
合わせると、図２６および２７に提示した結果は、結論として、異なるコンジュゲーション部位および異なる毒素を有する様々な部位特異的コンジュゲートが、選択された決定基を発現する細胞への細胞毒性ウォーヘッドの内部移行および送達を特異的に媒介する能力を実証する。これらの結果は、開示される部位特異的部位特異的コンジュゲートが、臨床環境において標的治療法として効果的に使用され得ることを示す。
【０４３１】
当業者であれば、本発明が、本発明の趣旨または中心的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得ることをさらに理解する。この点において、本発明の前述の説明は、本発明の例示的な実施形態を開示するにすぎず、他の変化形が、本発明の範囲内であることが企図されることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容を示すものとして添付の特許請求の範囲への参照がなされるべきである。
【図１】
2018511579.tif 000027
【図２Ａ】
2018511579.tif 000028
【図２Ｂ】
2018511579.tif 000029
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2018511579.tif 000033
【図５Ｂ】
2018511579.tif 000034
【図６Ａ】
2018511579.tif 000035
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2018511579.tif 000040
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2018511579.tif 000042
【図１１Ｂ】
2018511579.tif 000043
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2018511579.tif 000050
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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