(57)【要約】  経口投与用のブプレノルフィンの新規なエチレングリコールエーテル及び慢性疼痛の治療におけるその使用に関する。
2018531955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2018531955.tif 000014
の化合物又はその医薬的に許容される溶媒和物もしくは塩。
【請求項２】
請求項1に記載の化合物及び医薬的に許容される賦形剤又は担体を含む組成物。
【請求項３】
前記化合物の塩酸塩を含む，請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
経口錠剤，カプセルまたはフィルム，あるいは徐放性の経口錠剤，カプセルまたはフィルムの形態である，請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
治療的有効量の請求項1に記載の化合物を対象に経口投与することを含む，慢性疼痛を治療するための方法。
【請求項６】
治療的有効量の請求項2に記載の組成物を対象に経口投与することを含む，慢性疼痛を治療するための方法。
【請求項７】
治療的有効量の請求項4に記載の組成物を対象に経口投与することを含む，慢性疼痛を治療するための方法。
【請求項８】
治療的有効量の請求項1に記載の化合物又は請求項4に記載の組成物を対象に経口投与することを含む，慢性不安症および抑うつを治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は，その開示が参照により本明細書に援用される2015年10月26日に出願された米国仮特許出願第62／246，211号につき米国特許法下での優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究開発の下で行われた発明に関する権利に関する声明
該当なし
【０００３】
コンパクトディスクで提出される付録に掲載の「配列表」，表又はコンピュータープログラムに関する言及
該当なし
【背景技術】
【０００４】
慢性疼痛は，米国では医療機関を受診する主な要因であり，1億人もの患者が存在する。このような患者の60％以上は管理が不十分であり，その結果，生活の質が低下し，機能的な能力が低下し，生産性が低下する。慢性疼痛を治療するために使用される薬物にはいくつかのカテゴリーがある。継続的なオピオイド療法（COT）は，通常，保守的または介入的な方法で適切に管理されない難治性の慢性疼痛を有する人々のために使用される。慢性疼痛に対する治療の目的は，患者が日々の活動を再開することができるように痛みを軽減し機能を改善することである。
【０００５】
しかし，現在利用可能なオピオイド療法には，安全性や忍容性，乱用の可能性，誤用や流用，投与経路や剤形の制限といったいくつかの問題がある。慢性疼痛を有する患者にとって理想的な治療は，有害な副作用を最小限に抑えるかまたは全く与えずに，痛みを持続的に緩和できることである。また，管理が簡単かつ便利である必要もある。各個人に最も適切な用量で投与できるよういくつかの薬物強度が利用可能で，かつ経口で利用可能な（飲み込み可能な）医薬は，このような簡単かつ便利な薬剤としての基準を満たすであろう。
【０００６】
経口投与は，簡便で，患者が医師の監督下になくとも用量漸増が容易なので，慢性疼痛の治療に重要である。用量漸増は，慢性疼痛の性質が多様であるため不可欠である。異なる種類の痛みを治療するためには，異なる用量が必要なことが多い。時間の経過とともに起こりがちな痛みの強度変化のために，用量漸増は治療開始時のみならず，患者が最も効果的かつ安全な用量を摂取していることを確実にするために，治療過程でも必要なことが多い。
【０００７】
部分μアゴニストであり完全κアンタゴニストであるオピオイドブプレノルフィン（式I）は，慢性疼痛の治療に理想的な鎮痛薬となり得る。ブプレノルフィンは，以下の式Iの構造を有する：
【化１】
2018531955.tif 000003
【０００８】
ブプレノルフィンは強力な鎮痛薬であり，典型的にはモルヒネより約30倍強力な鎮痛薬である。この薬物は，乱用の可能性が低く，そして，その部分的μアゴニスト活性のために，用量の増加に伴う呼吸抑制に対する天井効果がある。さらに，ブプレノルフィンは二重の治療活性，すなわち，典型的にオピオイド依存症に要する用量の約1／10の用量で鎮痛に対する治療効果がある。
【０００９】
残念なことに，ブプレノルフィンは，他のほとんどのオピオイドのように経口投与することができない。というのは，ブプレノルフィンは，第II相代謝酵素によって胃腸管で失活し，水溶性エステル代謝産物であるO-グルクロニドとブプレノルフィンのフェノール性ヒドロキシル基を有する硫酸エステルを形成するからである。その結果，経口投与後のブプレノルフィンの絶対的生物学的利用能は一貫せず，10％未満である。したがって，オピオイド依存症または疼痛いずれかの治療に対するブプレノルフィン経口製剤をFDAが承認していないことは何ら驚くべきことではない（表1）。
【表１】
2018531955.tif 000004
【００１０】
ブプレノルフィンの特異的な治療特性を裏付ける受容体の薬理学的特性（表2）：
【表２】
2018531955.tif 000005
【発明の概要】
【００１１】
我々は，ブプレノルフィンのエチレングリコールエーテル（“EGE”）を合成した。その構造は以下の式2とおりである：
【化２】
2018531955.tif 000006
【００１２】
上記化合物の名称は，2-[（2S）-2-[（5R，6R，7R，14S）-9α-シクロプロピルメチル-4，5-エポキシ-6，14-エタノ-3-ヒドロキシ-6-メトキシモルフィナン-7-イル］-3，3-ジメチルブタン-2-オール］-エタノールである。その分子量は512である。
【００１３】
EGEブプレノルフィンは，経口投与後に胃腸管から吸収されるが，ブプレノルフィンとは異なり著しい初回通過代謝を受けない。本発明の化合物のオピオイド受容体の薬理学的特性はブプレノルフィンと類似していものの，ブプレノルフィンとは異なり全身循環へ吸収され迅速に代謝されるので経口投与による送達が可能である。
【００１４】
ブプレノルフィンは疼痛治療に適するものの経口的に送達される際の生物学的利用能が低いが，本発明の化合物はその受容薬理学的特性のために経口的に使用することができる。異なる投薬量で利用可能な経口剤として，本発明の化合物は有効で安全な最低用量まで容易に漸増することができ，様々な状況下，つまり，非オピオイド鎮痛薬がもはや有効でなくなったり利用できなくなったり，疼痛管理のために用量の増加が必要になったときにおける疼痛の治療に有用である。また，ナロキソンを乱用防止薬として処方することもできる。
【００１５】
注目すべきことに，本発明の化合物は，比較目的で我々が合成した対応するジエチレングリコールエーテルよりもかなり安定している。
【００１６】
一実施形態では，本発明は，慢性疼痛の治療における経口投与用のブプレノルフィンの新規なエチレングリコールエーテルを提供する。
【００１７】
別の態様では，本願は，患者における慢性疼痛を治療するための方法を提供する。この方法は，医薬的に許容される担体又は賦形剤及び上記式2のEGEブプレノルフィン又はその医薬的に許容される溶媒和物もしくは塩を含む医薬組成物を治療的有効量で患者に投与することを含む。
【００１８】
別の態様では，本願は，患者における慢性不安症および抑うつを治療するための方法を提供する。この方法は，医薬的に許容される担体又は賦形剤及び上記式2のEGEブプレノルフィン又はその医薬的に許容される溶媒和物もしくは塩を含む医薬組成物を治療的有効量で患者に投与することを含む。
【００１９】
EGEブプレノルフィン化合物は，医薬的に許容される賦形剤または担体と共に投与されように組み合わせてもよい。
【００２０】
上述のEGEブプレノルフィン遊離塩基は，それ自体で使用してもよく，あるいは，医薬的に許容される塩または溶媒和物の形態で使用してもよい。
【００２１】
医薬組成物は，経口錠剤，カプセルまたはフィルム，あるいは徐放性の経口錠剤，カプセルまたはフィルムとして製剤化してもよい。
【００２２】
本発明の他の目的，特徴および利点は，以下の詳細な説明および図面より当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は，本発明の化合物のミクロソーム代謝を示す。
【００２４】
【図２】図2は，本発明の化合物のオピオイド受容体結合プロファイル-ヒトμオピオイド受容体結合プロファイルを示す。
【００２５】
【図３】図3は，本発明の化合物のオピオイド受容体結合プロファイル-ヒトκオピオイド受容体結合プロファイルを示す。
【００２６】
【図４】図4は，本発明の化合物のオピオイド受容体機能アッセイ-ヒトμオピオイド受容体アゴニスト機能アッセイを示す。
【００２７】
【図５】図5は，本発明の化合物のオピオイド受容体機能アッセイ-ヒトμオピオイド受容体アンタゴニスト機能アッセイを示す。
【００２８】
【図６】図6は，IVおよび経口投与後の本発明の化合物のプロファイルを示す。
【００２９】
【図７】図7は，本発明の化合物の経時的な安定性を示す。
【００３０】
【図８】図8は，比較として，ブプレノルフィンのジエチレングリコールエーテルの不安定性を示す。
【００３１】
【図９】図9は，ホルマリン誘発ラット足痛モデルにおけるEGEブプレノルフィン塩酸塩の鎮痛効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本発明の化合物，組成物，方法およびプロセスについての記載に関し，下記の用語は，他に指示されない限り，以下の意味を有する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「a」，「an」または「the」は，単数の要素を有する態様のみではなく，複数の要素を有する態様も含む。例えば，単数形「a」，「an」および「the」は，文脈上明確に指示されない限り，複数の指示対象を含む。よって，例えば，「1つの細胞（a cell）」という記載は，かかる細胞が複数あることも含み，「1つの薬剤（the agent）」という記載は，当業者等に知られた1つまたは複数の薬剤を指すことも含む。
【００３４】
用語「約（about）」や「およそ（approximately）」は，一般に，測定の性質または精度を考慮した測定量に対する許容可能な程度の誤差を意味する。典型的な誤差の程度の例示として，所与の値または値の範囲の20パーセント（％）以内，好ましくは10％以内，より好ましくは5％以内がある。あるいは，特に生物学的な系において，用語「約」および「およそ」は，所与の値の1桁以内，好ましくは5倍以内，より好ましくは2倍以内の値を意味することもある。本明細書に記載の数値は，他に明記しない限りおおよそのものであり，用語「約」または「およそ」は，明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。本明細書に記載の数値は，他に明記しない限り大体のものであり，用語「約」または「およそ」は，明示的に記載されていない場合に推論可能なものである。
【００３５】
「急性疼痛」という用語は，3〜6ヶ月未満持続する疼痛を指す。
【００３６】
用語「投与する（administering）」，「投与（administration）」，およびそれらの派生語は，薬剤または組成物を所望の生物作用部位に送達可能にするために使用できる方法を指す。
【００３７】
用語「慢性疼痛」は，長期間，例えば3〜6ヶ月より長く持続する疼痛を指すが，疼痛に特徴的な兆候がこの期間の前後に起こることもある。慢性疼痛は，軽度又は重度であってもよく，一時的又は連続的なものであってもよい。
【００３８】
本明細書で使用される用語「組成物」は，特定量の特定成分を含む生成物，並びに特定成分の組み合わせから直接的または間接的に特定量が得られる任意の生成物を包含する意図である。
【００３９】
用語「医薬的に許容される」担体，希釈剤，または賦形剤は，製剤の他の成分と相溶性があり，レシピエントに有害ではない担体，希釈剤または賦形剤のことである。
【００４０】
用語「対象」，「個体」，または「患者」は，霊長類（例えば，ヒト），ウシ，ヒツジ，ヤギ，ウマ，イヌ，ネコ，ウサギ，ラット，マウスなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物などの動物を指す。
【００４１】
用語「治療的有効量」とは，治療対象の疾患の兆候に対して認識可能で有益な効果をもたらす治療薬の量を指す。
【００４２】
用語「治療する（treating）」，「治療（treatment）」，およびそれらの派生語は，哺乳動物（特にヒトまたは動物）等の患者における疾患または病状（例えば疼痛）を治療すること又はかかる治療を指し，疾患または病状を改善すること，つまり，患者における疾患または病状を排除することまたは退行を引き起こすこと；疾患または病状を抑制すること，つまり，患者の疾患または病状の進行を遅延または停止させること；あるいは，患者の疾患または病状の症状を軽減することを含む。
【００４３】
本明細書に開示される医薬組成物は，医薬的に許容される担体を含んでもよい。特定の態様において，医薬的に許容される担体は，投与する特定の組成物や組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って，本発明の医薬組成物に適切な様々な製剤が存在する（例えば，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)参照）。
【００４４】
理解されるように，本明細書で論じた組成物および治療方法の一部または全部において，EGEブプレノルフィンの代わりに，またはEGEブプレノルフィンに加えて，医薬的に許容される塩を使用してもよい。したがって，特定の実施形態では，EGEブプレノルフィンの医薬的に許容される塩（すなわち，任意の医薬的に許容される塩）が，本発明の方法において使用される。これらの塩は，例えば，化合物の最終的な単離および精製の間の現場において（in situ），あるいは遊離塩基形態にある精製化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させて形成された塩を単離することによって，調製できる。いくつかの実施形態において，EGEの医薬的に許容される塩は，酢酸，アルギン酸，アントラニル酸，ベンゼンスルホン酸，安息香酸，カンファースルホン酸，クエン酸，エテンスルホン酸，ギ酸，フマル酸，フロ酸，ガラクツロン酸，グルコン酸，グルクロン酸，グルタミン酸，グリコール酸，臭化水素酸，塩酸，イセチオン酸，乳酸，マレイン酸，リンゴ酸，マンデル酸，メタンスルホン酸，ムチン酸，硝酸，パモ酸，パントテン酸，フェニル酢酸，リン酸，プロピオン酸，サリチル酸，ステアリン酸，コハク酸，スルファニル酸，硫酸，酒石酸，またはp-トルエンスルホン酸を使用することにより調製される。本明細書に記載の方法で使用することができる医薬的に許容される塩のさらなる説明については，例えば，その全体が参照により本明細書に援用されるS.M. Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと。
【００４５】
本発明の化合物は，非溶媒和形態，並びに，水，エタノールなどの医薬的に許容される溶媒と共に溶媒和した形態で存在することができる。一般に，溶媒和形態は，本発明の目的に対し非溶媒和形態と同等であると考えられる。特定の実施形態では，EGEの溶媒和形態は水和物である。
【００４６】
一般に，塩の形成により得られる治療薬の貯蔵寿命が改善し得る。適切な塩の合成により，結晶性であり，酸化が起こりにくく取り扱いが容易な生成物を得ることができる。安定で結晶性の化合物をもたらす種々の塩を調製することができる。いくつかの例として，塩酸，硫酸，p-トルエンスルホン酸，メタンスルホン酸，マロン酸，フマル酸およびアスコルビン酸塩が挙げられる。
【００４７】
ある特定の実施形態では，このような医薬組成物は，経口錠剤またはカプセル，徐放性の経口錠剤またはカプセル（硬ゼラチンカプセル，軟ゼラチンカプセル），舌下錠剤またはフィルム，あるいは徐放性舌下錠剤またはフィルムとして製剤化される。例示的な医薬的に許容される担体および製剤の詳細を以下に記載する。
【００４８】
用量および投与経路
本発明の医薬組成物は，投与製剤に適合する方法で，疼痛，例えば急性または慢性疼痛，あるいはオピオイド依存症を改善するために治療的に有効であるような量で，投与される（後者の場合，μオピオイド受容体逆アゴニスト，例えば，ナロキソンと併用される）。投与量は，例えば，個体の年齢，体重，身体活動および食事，ならびに治療状態のステージまたは重症度を含む様々な因子に依存する。特定の実施形態では，投与量は，特定の個体における治療剤の投与に伴う有害な副作用の存在，性質および程度によって決定されることもある。
【００４９】
一般に，経口形態のEGEブプレノルフィンの投与は，現在のブプレノルフィンの慣行，モルヒネなどの経口活性オピオイドを用いた投与，EGEブプレノルフィンの様々な生物学的利用能および有効性が考慮される。モルヒネと比較した動物実験（下記実施例7）では，EGEブプレノルフィン塩酸塩はモルヒネより約40％少ない生物学的利用能および約2.5％低い活性を示した。
【００５０】
オピオイド耐性で成人対象（例えば，オピオイド依存性ではない対象）の疼痛に関し好ましい用量は，約0.3mg〜約16mg／日，より好ましくは約1mg〜約8mg／日を，最も好ましくは6時間ごとに等分した量での投与である。小児の疼痛に関し好ましい用量は，これらの範囲の下限値に近い値である。
【００５１】
オピオイド耐性で成人対象（例えば，オピオイド依存性でない対象）の慢性不安症およびうつ病に関し好ましい用量は，約0.3mg〜約48mg／日，より好ましくは約1mg〜約16mg／日を，最も好ましくは6時間ごとに等分した量での投与である。小児の疼痛に関し好ましい用量は，これらの範囲の下限値に近い値である。
【００５２】
乱用を防止するために，EGEブプレノルフィンは，μ逆アゴニスト，例えば，治療有効量のナロキソンまたはナルトレキソンと約1：1，2：1，3：1，又は4：1の比（EGEブプレノルフィンに対するμ逆アゴニスト（inverse μ agonist to EGE buprenorphine））で組み合わせて投与してもよい。
【００５３】
医薬組成物
本発明にかかる組成物は，カプセル，マイクロカプセル，錠剤，顆粒，粉末，トローチ，丸剤，坐剤，経口懸濁液，シロップ，経口ゲル，スプレー，溶液およびエマルジョンといった従来の形態の製剤にて対象に経口投与することができる。適切な製剤は，従来の，賦形剤（例えば，スクロース，デンプン，マンニトール，ソルビトール，ラクトース，グルコース，セルロース，タルク，リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウム），結合剤（例えば，セルロース，メチルセルロース，ヒドロキシメチルセルロース，ポリプロピルピロリドン，ポリビニルピロリドン，ゼラチン，アラビアゴム，ポリエチレングリコール，スクロースまたはデンプン），崩壊剤（例えば，デンプン，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルデンプン，低置換度ヒドロキシプロピルセルロース，重炭酸ナトリウム，リン酸カルシウムまたはクエン酸カルシウム），潤滑剤（例えば，ステアリン酸マグネシウム，軽質無水ケイ酸，タルクまたはラウリル硫酸ナトリウム），香味剤（例えば，クエン酸，メントール，グリシンまたはオレンジ粉末），保存剤（例えば，安息香酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウム，メチルパラベンまたはプロピルパラベン），安定剤（例えば，クエン酸，クエン酸ナトリウムまたは酢酸），懸濁化剤（例えば，メチルセルロース，ポリビニルピロリクロンまたはステアリン酸アルミニウム），分散剤（例えば，ヒドロキシプロピルメチルセルロース），希釈剤，（例えば，水），およびベースワックス（例えば，ココアバター，白色ワセリンまたはポリエチレングリコール）といった有機または無機添加剤を用いる従来の方法によって調製できる。
【００５４】
液状の剤形は，水性の塩水（例えば，0.9％w／vの塩化ナトリウム），水性デキストロース，グリセロール，エタノールなどの担体において，EGE化合物および場合により1つまたは複数の医薬的に許容される補助剤を溶解または分散させて，例えば経口投与用の溶液又は懸濁液にすることによって調製することができる。いくつかの実施形態では，液体剤形は殺菌されている。
【００５５】
治療的有効量は，凍結乾燥形態で提供することもできる。そのような剤形として，投与前の再構成用の緩衝液，例えば重炭酸塩，が例示でき，あるいは緩衝液を，例えば水を用いた再構成用の凍結乾燥剤形に含めてもよい。
【００５６】
そのような剤形を調製するための方法は，当業者に知られている（例えば，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)参照）。剤形としては，典型的には，従来の医薬担体又は賦形剤，その他の医薬剤，担体，補助剤，希釈剤，組織透過促進剤，可溶化剤などが挙げられる。適切な賦形剤は，当該分野で周知の方法によって特定の剤形に合わせて調製することができる（例えば，Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra参照）。
【００５７】
さらに，本発明の化合物は，単独で，あるいは，各投与経路に適した従来の無毒性の医薬的に許容される担体，補助剤およびビヒクルを含む適切な投与単位製剤内で一緒に製剤化してもよい。
【実施例】
【００５８】
実施例1：合成
EGEブプレノルフィンの塩酸塩を以下の3工程で合成した：
【化３】
2018531955.tif 000007
【００５９】
工程1-中間体2の合成：
マグネチックスターラー，添加漏斗，および窒素導入口を装備した250mLの三つ口丸底フラスコに，ブプレノルフィンHCl（5.0g，10.68mmol，1当量），無水DMSO（30mL），および粉末炭酸カリウム（2.94g，21.37mmol，2当量）を投入した。得られた混合物を55℃に加熱し，無水DMSO（20mL）で希釈した2-（2-ブロモエトキシ）テトラヒドロ-2H-ピラン（中間体6）を添加漏斗により1時間かけて滴下した。この混合物を55℃で一晩加熱した。TLCは反応が完了したことを示す。反応物を室温に冷却し，ジクロロメタン（10容量）で希釈し，水（15容量）で洗浄した。有機層を分離し，塩水で洗浄し，硫酸マグネシウム上で乾燥させ，濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（0-5％MeOH／DCM）にかけ，生成物2を泡状の固体として得た（5.4g，85％）。1H NMRは一致する。
【００６０】
工程2-中間体3の合成：
マグネチックスターラー，添加漏斗，および窒素導入口を装備した250mLの三つ口丸底フラスコに，中間体2（10g，16.78mmol，1.0当量）を投入した。100mLのメタノール／酢酸／水（7：3：1）を加え，混合物を55℃で一晩加熱した。TLC分析（5％MeOH／DCM）によって反応を完了し，室温に冷却した。反応混合物を100mLの水で希釈し，重炭酸ナトリウム水溶液を滴下して残りの酢酸を中和した。得られた混合物をジクロロメタンで抽出し，有機層を分離し，塩水で洗浄し，硫酸マグネシウム上で乾燥し，濃縮して粘稠な油状物を得た。  粗生成物をカラムクロマトグラフィー（0-5％MeOH／DCM）にかけして，生成物3を泡状の固体として得た（8.2g，95％）。1H NMRは一致する。
【００６１】
工程3-ブプレノルフィンのエチレングリコールエーテル誘導体の合成：
マグネチックスターラー，添加漏斗，および窒素導入口を装備した250mLの三つ口丸底フラスコに，化合物3（8.2g，16mmol）を投入し，酢酸エチル（41mL，5容量）に溶解し，1，4-ジオキサン中のHCl（1.2当量）を滴下して沈殿を開始させた。混合物を室温で30分間撹拌し，固体を真空濾過により集め，酢酸エチルで洗浄し，減圧下で乾燥させて，生成物4をオフホワイト色の固体として得た（8.4g，95％）。
【００６２】
上記反応物6の代わりに2-[2-（2-ブロモエトキシ）エトキシ）テトラヒドロ-2H-ピランを用いて，ブプレノルフィンのジエチレングリコールエーテル結合体を同様に合成した。
【００６３】
実施例2：インビトロアッセイ：EGEブプレノルフィンの代謝安定性
EGEブプレノルフィン塩酸塩（例えば，1μM）をヒト肝ミクロソーム（例えば，1mgのタンパク質／mL）と共に，Tecan Liquid Handling System (Tecan)又はその均等物を用い，37±1℃にて，リン酸カリウム緩衝液（50mM，pH7.4），MgCl2（3mM）およびEDTA（1mM，pH7.4）を含み，補因子NADPH生成系を用いる又は用いない0.2mLのインキュベーション混合物（最終容量）内で，96ウェルプレートフォーマットに示される最終濃度でインキュベーションした。NADPH生成系は，NADP（1mM，pH7.4），グルコース-6-リン酸（5mM，pH7.4）およびグルコース-6-リン酸脱水素酵素（1単位／mL）からなっていた。EGEブプレノルフィンをメタノール水溶液（メタノール0.5％v／v以下）に溶解した。反応は，典型的にこの補因子の添加によって開始し，等量の停止試薬（例えば，アセトニトリル，内部標準を含めて0.2mL）の添加によって4つの指定時点（例えば，120分まで）で停止した。ゼロ時間インキュベーションを100％の値とし，基質の損失率を決定した。インキュベーションは三重に実施したが，ゼロ時間サンプルは四重にインキュベートした。ゼロ補因子（NADPHなし）のインキュベーションは，ゼロ時間および最長時点で実施した。サンプルを遠心分離（例えば，920×g，10℃で10分間）にかけ，上清画分をLC-MS／MSにより分析した。陽性対照としてマーカー基質（例えば基質消失をモニターするためのデキストロメトルファン）で置換したミクロソームを用いて追加のインキュベーションを行い，試験系を代謝的にコンピテントにするか否かを決定した。
【００６４】
上記サンプルをLC-MS／MSにより分析した。各インキュベーション溶液のサンプルについて分析を行った。結果は，実験の時間経過にわたるピーク比の比較によって決定した（典型的には「親化合物残存％（% Parent Remaining）」として報告されている）。
【００６５】
データは，LIMS（Galileo,Thermo Fisher Scientific Inc.および報告ツールCrystal Reports,SAPを含む），スプレッドシートコンピュータプログラムMicrosoft Excel(Microsoft Corp.)又はその同等物で計算した。LIMS,Analyst Instrument Control and Data Processing Software(AB SCIEX)またはその同等物を使用して，未変化の親化合物の量を分析物／内部標準（IS）ピーク面積比に基づいて推定した（各インキュベーションにおける基質の残存率の概算値を決定するため）。
【００６６】
結果：図1に示される結果は，EGEブプレノルフィンが，アッセイの間，ミクロソーム酵素の存在下で迅速に代謝されることを示す。ミクロソーム酵素は，典型的には，ブプレノルフィンのような薬剤の代謝に関与する。
【００６７】
実施例3：受容体結合活性
本実施例は，EGEブプレノルフィン塩酸塩のμ-オピオイド受容体およびκ-オピオイド受容体への結合を示す。
【００６８】
A．ヒトμオピオイド受容体結合アッセイ
ガラス組織粉砕機，テフロン（登録商標）乳棒，および定常攪拌機（Fisher Scientific）を用いて，ヒトμオピオイド受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の膜（Perkin Elmer #RBHOMM400UA）をアッセイバッファー（50mM Tris,pH 7.5,5mM MgCl2を含む）内でホモジナイズした。膜の濃縮物を，96ウエルの丸底ポリプロピレン製のプレートであるアッセイプレート内で300μg／mLに調整した。試験対象の化合物を10mMのDMSO（Pierce）に可溶化し，次いでアッセイバッファーで3.6nMに希釈した。プレミックスプレートとして知られている第2の96ウェルの丸底ポリプロピレン製プレートにおいて，60μLの6X化合物を60μLの3.6nM 3H-ナロキソンと組み合わせた。プレミックスプレートから50μLを，膜を含むアッセイプレートへ移動することを二重に（in duplicate）行った。アッセイプレートを室温で2時間インキュベートした。GF／C 96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer#6005174）を0.3％ポリエチレンイミンで30分間前処理した。アッセイプレートの内容物を，Packard Filtermate Harvesterを使用してフィルタープレートを通して濾過し，4℃の0.9％塩水で3回洗浄した。フィルタープレートを乾燥させ，下面を密封し，30μLのMicroscint20（Packard＃6013621）を各ウェルに添加した。Topcount-NXTマイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard）を使用して，放出エネルギーを2.9〜35KeVの範囲で測定した。結果は，ウエルが阻害を受けなかった最大結合と比較した。非特異的結合は，50μMの非標識ナロキソンの存在下で測定した。EGEブプレノルフィン塩酸塩の生物学的活性を図2に示す。
【００６９】
結果：図2のグラフは，EGEブプレノルフィン塩酸塩がオピオイドμ受容体に対して有意な親和性を有することを示している。プロファイルはブプレノルフィンのものに類似していた。
【００７０】
B．ヒトκオピオイド受容体結合アッセイ
ガラス組織粉砕機，テフロン（登録商標）乳棒，および定常攪拌機（Fisher Scientific）を用いて，ヒトκオピオイド受容体を発現するクローン化HEK-293細胞由来の膜（Amersham Biosciences UK Ltd. 6110558 200U）をアッセイバッファー（50mM Tris,pH 7.5,5mM MgCl2を含む）内でホモジナイズした。膜の濃縮物を，96ウエルの丸底ポリプロピレン製のプレートであるアッセイプレート内で300μg／mLに調整した。試験対象の化合物を10mMのDMSO（Pierce）に可溶化し，次いでアッセイバッファーで3.6nMに希釈した。プレミックスプレートとして知られている第2の96ウェルの丸底ポリプロピレン製プレートにおいて，60μLの6X化合物を60μLの3.6nM 3H-ジプレノルフィン（DPN）と組み合わせた。プレミックスプレートから50μLを，膜を含むアッセイプレートへ移動することを二重に（in duplicate）行った。アッセイプレートを室温で18時間インキュベートした。GF／C 96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer＃6005174）を0.3％ポリエチレンイミンで30分間前処理した。アッセイプレートの内容物を，Packard Filtermate Harvesterを使用してフィルタープレートを通して濾過し，4℃の0.9％塩水で3回洗浄した。フィルタープレートを乾燥させ，下面を密封し，30μLのMicroscint20（Packard＃6013621）を各ウェルに添加した。Topcount-NXTマイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard）を使用して，放出エネルギーを2.9〜35KeVの範囲で測定した。結果は，ウエルが阻害を受けなかった最大結合と比較した。非特異的結合は，50μMの非標識ナロキソンの存在下で測定した。EGEブプレノルフィン塩酸塩の生物学的活性を図6に示す。
【００７１】
結果：図3は，EGEブプレノルフィン塩酸塩およびブプレノルフィンのオピオイドκ受容体アゴニストプロファイルを示す。EGEブプレノルフィンとブプレノルフィンのいずれもκ受容体に対する親和性を失っていなかった。定性的には，ブプレノルフィンと同様に，EGEのオピオイドκ受容体への結合は，濃度とともに増加する。約1μgで，EGEブプレノルフィンのオピオイドκ受容体親和性のプロファイルは，ブプレノルフィンのものと類似すると推定される。
【００７２】
実施例4：受容体刺激活性
本実施例は，μオピオイド受容体が介在するシグナル伝達を刺激するEGEブプレノルフィン塩酸塩の能力を示す。
μオピオイド受容体アゴニストおよびアンタゴニスト機能アッセイ：ヒトμ受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO-hMOR）細胞膜における[35S］GTPγS結合アッセイ
【００７３】
簡潔には，CHO-hMOR細胞膜は，Receptor Biology Inc．（Baltimore Md）から購入した。約10mg／mlの膜タンパク質を10mM TRIS-HCl pH7.2，2mMのEDTA，10％スクロース中に懸濁させ，懸濁液を氷上で維持した。1mLの膜を，50mMのHEPES，pH7.6，5mMのMgCl2，100mMのNaCl，1mMのDTTおよび1mMのEDTAを含む15mLの冷結合アッセイ緩衝液に添加した。膜懸濁液をポリトロンでホモジナイズし，3000rpmで10分間遠心分離した。上清を18，000rpmで20分間遠心分離した。ペレットを10mlのアッセイ緩衝液にポリトロンで再懸濁した。
【００７４】
膜を，小麦胚芽凝集素で被膜したSPAビーズ（Amersham）とともにアッセイ緩衝液中で25℃で45分間プレインキュベートした。次いで，膜（10μg／ml）と結合したSPAビーズ（5mg／ml）をアッセイ緩衝液中の0.5nMの[35S］GTPγSとともにインキュベートした。塩基結合は，添加された試験化合物の非存在下で起こっていた；この非修飾結合を100％とすると，アゴニスト刺激結合はこの値より有意に高いレベルに上昇した。様々な濃度の受容体アゴニストSNC80を用いて[35S］GTPγS結合を刺激した。アゴニストの非存在下で，塩基および非特異的結合の両方を試験した。非特異的結合の決定には，10μMの非標識GTPγSが含まれた。
【００７５】
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2（CTOP）を基準としアゴニスト刺激性GTPγS結合を阻害する能力を評価することによって，ブプレノルフィンおよびEGEブプレノルフィン塩酸塩をアンタゴニストとしての機能について試験した。Packard Top Countで放射能を定量した。以下のパラメータを算出した：
％刺激＝[（試験化合物cpm−非特異的cpm）／（塩基cpm−非特異的cpm）］＊100％
阻害＝（1μM SNC80による％刺激−試験化合物の存在下における1μM SNC80による％刺激）＊100／（1μM SNC80による％刺激−100）。
GraphPad Prismを用いてEC50を計算した。試験した化合物のグラフを図4および図5に示す。
結果：図4に示すデータは，EGEブプレノルフィン塩酸塩が強力なμアゴニストであることを示している。この結果はまた，10-6M（〜1μg）での当該化合物のオピオイドμ受容体活性がブプレノルフィンのものと類似していることも示している。図5のデータは，EGEブレオノルフィンがμアンタゴニストとして機能しないことを示している。
【００７６】
実施例5：In Vivoでの薬物動態研究
動物の薬物動態研究は，Johns Hopkins Medical Instituteにおいて，CD-1マウスを用いて行った（体重約35gm，n＝3時点ごと）。薬物動態分析は，ブプレノルフィンおよびEGEブプレノルフィン塩酸塩をそれぞれ10mg／kgの用量で経静脈投与（IV）および強制経口投与して実施した。投与後0，30分および1，2，6および24時間の時点で血液を採取した。血漿採取後，血液サンプルを薬剤についてLC／MS／MSによって以下のように分析した：
試験薬物（10〜25000nM）でスパイクしたマウス血漿で標準曲線を調製した。血漿サンプル（50μL）を，内部標準としてロサルタンまたはブプレノルフィン-d4を含有する300μLのアセトニトリル内に抽出した。抽出物を4℃で16000×gで5分間遠心分離した。上清（250μL）を新しいチューブに移し，45℃で1時間N2下で乾燥させた。サンプルを100μLの30％アセトニトリルで再構成し，ボルテックスし，遠心分離した。上清（90μL）をLCバイアルに移し，10μLをLC／MSに注入した。図10を参照のこと。
結果：図6は，10mgの経口およびIV投与後のEGEブプレノルフィンの血漿濃度プロファイルを示す。グラフは，二量体の絶対的生物学的利用能が，経口およびIV投与後の濃度曲線下面積の比としての測定によると約40％であることを示す。
【００７７】
実施例6：EGEブプレノルフィンおよびジエチレングリコールエーテルブプレノルフィン結合体の安定性
安定性調査の目的は，一定期間にわたる2つの薬剤のリアルタイム室温安定性を決定することであった。2つの複合体の塩酸塩を2013年5月に合成し，ポリシールコーンキャップ付きの透明ガラスバイアルに保存した。化合物の純度を，合成直後とその後の2015年9月にHPLCで比較することにより，安定性を決定した。
【００７８】
HPLC分析法：1mg／mlの2つの複合体をアセトニトリルに溶解し，その5μLを逆相C-18カラムに注入し，235nmの波長に設定したUV検出器を用いて溶離液を検出した。HPLC分析に使用した移動系は，0.5％酢酸とアセトニトリルを含む水の勾配混合物であった。2つの複合体のピーク純度に関する結果を以下の表に示す。データは，ジエチレングリコールエーテル複合体（ロット番号MT-A-104-1）が28ヶ月後では経時的に著しく分解することを示す。ジエチレングリコールエーテル複合体と比較して，EGE複合体は経時的に変化しなかった。2年経ったサンプルのHPLCクロマトグラムを図7および図8に示す。
【表３】
2018531955.tif 000008
【００７９】
実施例7：鎮痛-ホルマリン肢マウス研究
体重23±3gの雄ICRマウスをそれぞれ8匹ずつの群に分けた。すべての試験物質およびビヒクル対照を非絶食マウスに腹腔内投与しその後ホルマリン（0.02mlの2％溶液）を足底注射により一方の後肢に投与した。ビヒクル，アセトアミノフェン，およびモルヒネと比較して，試験化合物の鎮痛活性の尺度として，ホルマリンチャレンジ後，5分間隔で約35分間，後足の舐め時間を記録した。
【表４】
2018531955.tif 000009
【００８０】
一方向ANOVA分析に続いてDunnett検定を行いビヒクル対照群と試験化合物処置群とを比較した。結果を図9に示す。本発明の化合物は，迅速な鎮痛効果を示した。
【００８１】
実施例8：経口製剤
以下の組成物は，本発明の代表的な経口錠剤の一例である。
【表５】
2018531955.tif 000010
【００８２】
実施例9：μ逆アゴニストによる乱用抑制経口製剤
以下の組成物は，μオピオイド受容体逆アゴニスト，例えば，上述の本願発明者らによる米国特許出願第14／697，155号に記載のナロキソン，ナルトレキソンまたはこれらのホモ二量体と組み合わせた本発明の代表的な経口錠剤の例である。μ逆アゴニストは，μオピオイド受容体アンタゴニストとして文献においても認識されている。これらの化合物は，本発明の化合物がμオピオイド受容体に結合して活性化するのを妨げるので，これらの逆アゴニストまたはアンタゴニストとの一定の組み合わせは，本発明の化合物の乱用を防止する。最適な乱用防止を達成するために，本発明の化合物であるμアゴニストとμ逆アゴニストを，約1：1，2：1，3：1又は4：1の比で使用してもよい。
【表６】
2018531955.tif 000011
【００８３】
実施例10：混入防止（Blender-Proof）即時放出性経口製剤
以下の組成物は，本発明の代表的な不正操作防止（tamper-proof）経口錠剤の例である。本発明の化合物と，以下のポリマー：多糖類，糖類，糖由来のアルコール，デンプン，デンプン誘導体，セルロース誘導体，カラギーナン，ペクチン，アルギン酸ナトリウム，ジェランガム，キサンタンガム，ポロキサマー，Carbopol（登録商標），PolyOx（登録商標），ポビドン，ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC），ヒプロメロース（hypermellose），およびそれらの組み合わせの1つまたは複数との組み合わせは，粉砕されたときに，これらのポリマーが水分の存在下でゲル化し，それによって薬物製剤を吸入または注射することが不適切になるため，不正操作（tampering）を防止する。理想的には，ポリマーは，長時間作用性の徐放性薬物では全製剤の約50％であり，即時放出性の薬物では10％である。
【表７】
2018531955.tif 000012
【００８４】
実施例11：混入防止徐放性経口製剤
【表８】
2018531955.tif 000013
【００８５】
本明細書に記載されている実施例および実施形態は説明目的のみであり，かかる実施例および実施形態を考慮した様々な修正または変更が当業者によって示唆されるが，それらも本出願の精神および範囲，並びに添付の特許請求の範囲に含まれる。優先出願と本出願との間に矛盾がある場合には，本出願を優先して矛盾を解決しなければならない。本明細書で引用したすべての刊行物および特許は，あらゆる目的のために，その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2018531955.tif 000015
【図２】
2018531955.tif 000016
【図３】
2018531955.tif 000017
【図４】
2018531955.tif 000018
【図５】
2018531955.tif 000019
【図６】
2018531955.tif 000020
【図７】
2018531955.tif 000021
【図８】
2018531955.tif 000022
【図９】
2018531955.tif 000023
【国際調査報告】
2018531955.tif 000024