(57)【要約】  本開示は、細菌の菌株のコンソーシアムおよび本明細書中に開示される１つ以上の細菌の菌株を含む組成物に関する。単離された細菌培養物のこれらのコンソーシアムおよび前記培養物を含む組成物のコンソーシアムは、個々の細菌培養物および組成物について観察されるよりも高い活性を有する。本開示の組成物は、植物に対する土壌リンおよび他の主要栄養素および／または微量栄養素の利用可能性を高めるために有利に利用され得、それによって、それらの成長および収穫高を増強する。【選択図】図１
2018502596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機土壌リンが、表２．１で同定される群から選択される２つ以上の単離された細菌の菌株、および担体を含むオルトリン酸に変換される速度を高める組成物。
【請求項２】
２つ以上の細菌の菌株は、配列番号１〜４のうち１つと９７％同一性を有する２００を超えるヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細菌は、エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、サイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）、コナモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモーナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、およびそれらの組み合わせから本質的になる群から選択される、請求項１〜２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
リン動員コンソーシアム（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  Ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉａ）および／または鉱化コンソーシアム（Ｍｉｎｅｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉａ）を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組成物であって、ここで、２つ以上の細菌は、ＮＲＲＬ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３６、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３７、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３８、およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３９から選択される、上記組成物。
【請求項５】
担体は、アルファルファから抽出される１つ以上の化合物を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、液体である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、濃縮されて水を除去する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、使用前に水で希釈される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
次のステップを含む、有機土壌リンがオルトリン酸に変換される速度を高める方法：
表２．１で同定される群から選択される２つ以上の細菌種を土壌と接触させるステップ。
【請求項１０】
前記２つ以上の細菌種は、配列番号１〜４のうちの１つと少なくとも９７％の同一性を有する約２００ヌクレオチド超えのｒＲＮＡ  １６Ｓ配列をそれぞれ含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
土壌は、種子または植物を含む、請求項９〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
２つ以上の細菌は、ＮＲＲＬ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３６、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３７、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３８、およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３９から選択される、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
土壌中の種子または植物を成長させるステップをさらに含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
土壌を２つ以上の細菌と接触させた後、種子または植物を土壌に添加する、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
土壌は、土壌を２つ以上の細菌で噴霧することによって接触される、請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
２つ以上の細菌は、土壌に適用される粉末または顆粒化組成物に含まれる、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
２つ以上の細菌は、土壌と接触する前に水と混合される、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップを含む、植物の成長速度を増加させる方法；
土壌をＮＲＲＬ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３６、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３７、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３８、およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３９から選択される２つ以上の細菌種と接触させるステップ；
２つ以上の細菌種が１つ以上のリン化合物を可溶化することを可能にするステップ；
植物が可溶化リンを吸収することを可能にし、それによって植物の成長速度を増加させるステップ。
【請求項１９】
土壌は、全ての４つの細菌種と接触される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物の高さ、重量、色、または収穫高が測定されて成長を決定する、請求項１８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
植物の成長は、２つ以上の細菌種によって接触されていない土壌中で、成長した同様の植物よりも少なくとも２％大きい、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年１１月２５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０８４，３０３号および２０１５年６月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１７１，６４３号の米国特許法第３５条１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、これらは、それらの全体の参照によって、本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
配列表
コンピュータ可読フォーアットで提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。コンピュータで読み取り可能なファイルは、Ｐ２５３０３８ｕｓ０３_ＳｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａＣｏｎｓｏｒｔｉａ.ＴＸＴと命名され、２０１５年９月８日に作成され、１６キロバイトを含む。
【０００３】
分野
本開示は、単離された細菌培養物および前記培養物を含む組成物の組み合わせに関し、その組み合わせは、個々の細菌培養物について観察されるよりも高い活性を有する。本開示の組成物は、植物に対して土壌リンおよび他の主要栄養素および／または微量栄養素を増強するために有利に使用され得、それによって、それらの成長および収穫高を高める。
【０００４】
米国および世界のほとんどの地域において、多くの農業は、低リン（Ｐ）使用効率に苦しみ、Ｐの投入量（肥料または肥やし）は、穀物で収穫されたＰよりも大きいことを意味する。一見したところ、適切なＰ肥料が土壌に適用されても、７０〜９０％は、急速に植物の摂取に利用できなくなることができる。これは、主にＰが土壌プロファイル内の風化した鉱物表面に容易に吸着するためである。時間が経つにつれて、これは、植物摂取に利用できない残留土壌Ｐの大きなプールを作る。それに応じて、農家は植物の要求を超えるＰ肥料を適用することが多く、これは、地下水へのＰ流出および水界生態系の富栄養化に寄与する。
【背景技術】
【０００５】
環境意識、資源制約、および一般世論は、伝統的なＰ肥料に対する選択肢として、効率的なグリーン技術および生成物の需要を高めている。そのようなグリーン技術および生成物は、持続可能性を促進し、環境への最小限の影響を有するものである。グリーン技術および生成物を開発するために利用されている１つの領域は、微生物およびそれらの特殊な特性の使用である。ほとんどの土壌Ｐは、植物に利用できないが、いくつかの微生物は、無機Ｐおよび他の微量栄養素を可溶化し、有機Ｐを植物摂取のために利用可能である可溶性オルトリン酸中に鉱化する能力を有する。集合的に、これらの２つのプロセスは、土壌リンを動員し、植物へのその利用可能性を増加させる。
【０００６】
細菌および菌類の他の分離株も、リンを動員することが報告されている。微生物Ｐの動員を改善する大きな可能性があるが、微生物組成物の商業化の進展は、ほとんど制限されている。いくつかの場合、市販の細菌接種材料は、高温および高ｐＨなどの特定の条件下での不安定性によって、および接種材料での使用のための伝統的な培養技術による単一菌株の同定によって、高い使用濃度でさえＰの利用可能性または植物成長を有意に増強することができない。異なる細菌分離株の組み合わせは、機能的重複性のために、より広い範囲の土壌および気候において、増強された性能をさらに提供することができる。植物の健康を刺激することを主張する市場で、多くの他の微生物接種材料がある。これらの製品は、有機廃棄物で成長され、基本的に、定義された機構的機能性を有しない堆肥茶である微生物の定義されていない混合物を含む。それらは、広い主張をしているが、これらの製品は、あまり効果的ではなく、熱心な人のニッチ市場にしか浸透していない。
【０００７】
したがって、化学物質の投入量および環境影響を低減させる一方、様々な条件下で安定であり、有効な貯蔵寿命を有し、２つ以上の菌株を組み合わせ、植物の成長および健康を増加させるＰ動員のための微生物ベースの技術および生成物を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微生物分離株およびコンソーシアム（２つ以上の別個の細菌の菌株の混合物）が、微生物Ｐ動員を改善するために使用されることができ、よって、植物への土壌リンの利用可能性を高め、それらのリン摂取および成長を増加させる。用途は、農作物および芝草が含まれるが、これらに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、細菌分離株および群落を使用することを含む組成物および方法を対象とする。特に、本開示は、本明細書中に開示される細菌コンソーシアムからの１つ以上の微生物、特に表１またはそれらの混合物を含む組成物を対象とする。好ましい態様において、組成物は、表１に列挙されたものから２つ以上の菌株を含むだろう。
【００１０】
微生物は、配列番号１〜４に対応し、配列番号１〜４に対して少なくとも９７％同一の１６Ｓ  リボソーム遺伝子配列を同定することによって、および／またはＮＲＲＬ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３６、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３７、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３８、およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３９を有する細菌との比較によって特徴付けられることができる。
【００１１】
特定の態様において、細菌コンソーシアムに加えて、組成物は、添加剤、助剤および賦形剤などの追加の成分を含むだろう。そのような追加の成分は、細菌の増殖を支持し、細菌による特定の代謝産物の産生を誘導し、組成物の安定性を増強し、色を加え、栄養価を追加し、および／または本開示の組成物に他の特性を提供し得る。適切な添加剤は、炭素源、窒素源、キチン、キトサン、グルコサミン、アミノ酸、ミネラル、ビタミン、塩、防腐剤および成長を支持する技術で公知の他の添加剤を含み、特定の代謝生成物を誘導し、または組成物を安定化させる。
【００１２】
本明細書中に開示される組成物は、水性または乾燥形態であり得る。組成物は、液体（生存および／または休眠培養物、または抽出物を含み得る）、乾燥混合物、種子コーティング、または適用の他の形態として適用され得る。組成物は、希釈または濃縮された形態で提供され得る。１つの態様において、組成物は、濃縮される。別の態様において、組成物は、希釈される。
【００１３】
本開示の方法は、開示された組成物を使用して、土壌および／または植物を改良すること含む。組成物は、土壌、種子、および苗木、成熟しきった植物に適用されることができる。組成物は、液体または乾燥形態で土壌に適用され得る。組成物は、土壌表面に適用され得、または注射、耕うん、および／または耕起などの当該分野で公知の方法を使用して土壌中に混合され得る。組成物は、水耕栽培および天空栽培システムを含む土壌または水または肥料源に適用され得、次にこれは、液体または乾燥形態で、土壌および／または植物に送達され得る。別の側面において、組成物が使用されて植物を強化し得る。組成物は、水耕栽培システムおよび空中栽培システムを含む、土壌または水また肥料の供給源に提供され得、これは、次に、液体または乾燥形態で土壌および／または植物に送達される。別の側面において、組成物は、植え付け前に種子を改良するために使用され得る。様々な態様において、植物または種子は、田畑および容器を含む様々な環境で生育され得る。多くの態様において、植物または種子は、天然土壌、合成土壌、またはそれらの組み合わせで生育され得る。いくつかの態様において、土壌は、ココナツ繊維、ロックウール、および／または当該技術で周知の他の適切な培地を含み得る。いくつかの態様において、種子は、開示された組成物を含む水溶液に浸漬されてもよく、および／または種子は、組成物でコーティングされてもよい。土壌、種子、および苗木の処理はまた、上記組成物の繰り返し適用を含むことができる。
【００１４】
本開示の方法は、リン含有肥料の適用を回避または低減するための化学的置換または補足としての微生物組成物を使用することを含む。
【００１５】
開示された組成物の適用は、農業用途に使用される肥料、殺菌剤および／または殺虫剤の量の排除または有意な減少を可能にする。いくつかの態様において、細菌製剤の使用は、温室効果ガス排出量の減少をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１  散布図は、時間の関数として液体アルファルファ培地中のコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）として測定された安定な細菌増殖を示す。
【００１７】
【図２】図２  散布図は、ＰＯ４緩衝液の有するか、または有しない液体アルファルファ培地中で安定なｐＨレベルを示す。
【００１８】
【図３】図３  微生物無機Ｐ可溶化および天然草原土壌から単離された細菌群落における広い変動性を示す頻度ヒストグラム。
【００１９】
【図４】図４  細菌Ｐ可溶化能力は、発生＃１から徐々に急速に改善後の発生＃２７によって最終的な水平状態に達することを観察し；次の発生に通じてリン可溶化速度の改善のために選択されたますます優れたコンソーシアムを代表する。
【００２０】
【図５】図５は、オルトリン酸塩（ＰＯ４）をより有効にするために全ての微生物分離株および分離株の組み合わせの能力を示すグラフである。これらの知見は、どのように改良されたオルトリン酸塩（ＰＯ４）動員が、複数の細菌種の相乗効果により発生することができるかを証明する。より具体的には、エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（Ｅｃ）およびサイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）（Ｃｆ）の２つの種を有するコンソーシアムは、ＰＯ４動員で最も強力な相乗的改善を証明し；しかし、シュードモーナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（Ｐｐ）を含む場合、わずかに低い程度の相乗的改善も観察された。細菌分離株は、コンソーシアム効果と比較する場合、ＰＯ４動員を改善する同じ添加物の利点を証明しない。
【００２１】
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、２つの異なる小麦変種植物、図６Ａ  Ｂｙｒｄおよび図６Ｂ  Ｈａｔｃｈｅｒについて本開示の１つの側面の使用で改善された小麦バイオマスを示すグラフである。小麦バイオマスは、温室効果試験で成長期の終わりに採取された。結果は、伝統的な無機肥料を有する出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ）；開示された組成物の１つの態様）は、伝統的な無機肥料（ＢｉｏＡｐｔ ＩｎｏｃおよびＡｃｃｏｍｐｌｉｓｈ）と２つの競合微生物生体刺激生成物と比較して、より速い出現およびより多くの成長を証明することを示す。
【００２２】
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的無機肥料を植えつけてから８日目および１０日目の草の高さを示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、ペレニアルライグラス（Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｒｙｅ）図７Ａ、ヒロハノウシノゲグサ（Ｔａｌｌ  Ｆｅｓｃｕｅ）図７Ｂ、およびケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）図７Ｃにおいて、伝統的な無機肥料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）と比較して、より早い出現およびより大きい成長を証明したことを示す。
【００２３】
【図８】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的な無機肥料を使用して、ケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）図８Ａ、ヒロハノウシノゲグサ（Ｔａｌｌ  Ｆｅｓｃｕｅ）図８Ｂ、およびペレニアルライグラス（Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｒｙｅ）図８Ｃについて濃い緑色を示しているグラフである。結果は、本開示のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））の１つの態様が、伝統的な無機肥料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）に比べてより緑色を証明したことを示す。
【００２４】
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的な無機肥料を使用して、ブルーグラス（Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）図９Ｂ、ケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）図９Ｃ、ヒロハノウシノゲグサ（Ｔａｌｌ  Ｆｅｓｃｕｅ）図９Ａ、およびペレニアルライグラス（Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｒｙｅ）図９Ｄについて乾燥正規化ｇ／ｃｍ２として報告される植物の成長を示すグラフである。結果は、本開示のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）よりもより大きい植物の成長に導いたことを示す。
【００２５】
【図１０】図１０Ｃは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的な無機肥料を使用して、ケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）について乾燥正規化ｇ／ｃｍ２として報告される植物の成長を示すグラフである。結果は、本開示のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）よりも大きい植物の成長に導いたことを示す。
【００２６】
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、および１１Ｅは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的な無機肥料を使用して、ケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）について植物組織栄養摂取を示すグラフである。データは、本開示のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））を接種された種子は、伝統的な無機肥料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）と比較して、増加した土壌カルシウム（Ｃａ、図１１Ａ）、マグネシウム（Ｍｇ、図１１Ｂ）、ナトリウム（Ｎａ、図１１Ｃ）、カリウム（Ｋ、図１１Ｄ）、および鉄（Ｆｅ、図１１Ｅ）摂取を証明したことを示す。
【００２７】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的な無機肥料を用いてハラペノ植物について、最初の開花前の図１１Ａの日数、３週間後に出現した植物の図１１Ｂ＃、および１１Ｃ収穫高を示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）と比較して、より早い出現および開花を証明したことを示す。
【００２８】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的無機肥料とのチェリートマト植物について、４ヶ月後のトマトの図１３Ａ＃および３週間後に現われた植物の図１３Ｂ＃を示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）と比較して、より早い出現を証明したことを示す。
【００２９】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的無機肥料を用いてブランドワイントマトについて、３週間後に出現した植物の図１４Ａ＃および図１４Ｂ収穫高を示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）と比較して、より早い出現およびより多くの収穫高を証明したことを示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的無機肥料を用いてバジル植物について、３週間後に出現した植物の数を示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）と比較して、より早い出現を証明したことを示す。
【００３１】
【図１６】図１６は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））および伝統的無機肥料を用いてマリーゴールド植物について、３週間後に出現した植物の＃を示すグラフである。結果は、出願人のＰ動員微生物生体刺激剤（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ））は、伝統的な無機肥料（ＭＧ＝Ｍｉｒａｃｌｅ  Ｇｒｏ）と比較して、より早い出現を証明したことを示す。
【００３２】
【図１７】図１７は表であり、表４．１は、芝草元素分析を示す。提示されたデータは、生物刺激剤を接種した場合、いくつかの主要および微量栄養素についてより高い植物栄養摂取を証明する（より高い割合は、太字で示す）。＊Ｔ＝処理；Ｍ＝水分＊；処理１は、本開示のＰ動員微生物コンソーシアムであり；処理２は、微生物活性を有しない処理１（０．２μＭを使用する）に相当する滅菌培地であり；処理３は、対照（Ｈｏａｇｌａｎｄの溶液）として使用される一般的な栄養豊富な無機植物肥料である。
【００３３】
【図１８】図１８は、表であり、表４．２は、生物刺激剤を接種した場合、主要および微量栄養素のより高いレベルを証明する土壌栄養素元素分析を示す（より高い割合は、太字で示す）。＊Ｔ＝処理；処理１は、本開示のＰ動員微生物コンソーシアムであり；処理２は、微生物活性を有しない処理１（０．２μＭを使用する）に相当する滅菌培地であり；処理３は、対照（Ｈｏａｇｌａｎｄの溶液）として使用される一般的な栄養豊富な無機植物肥料である。
【００３４】
【図１９】図１９は、経時的な植物成長の様々な指標；ロゼット数、ロゼット直径、および開示された細菌の様々な組み合わせを有するか、または有しない成長した種子に対する植物の高さを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
表の簡単な説明
表１  リン動員細菌命名法（９７％類似性）
【００３６】
表２．１  第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）基質を使用する定義された培地の例。
【００３７】
表２．２  第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）培地における栄養素の化学両論的限界の例。
【００３８】
表３．１  改善されたオルトリン酸（ＰＯ４）動員に対する４つの標的種の間の相互作用を試験する完全な要因設計。以下の値は、９６穴ディーププレートの各ウェルに９５０μＬを加えるために５０μＬの最終体積を達成する相対的な割合（μＬ）を表す。各培養物は、混合時に１０９ＣＦＵでカウントであった。
【００３９】
表３．２  細菌群落構造、コロニー形成単位（ＣＦＵ）および我々の土壌ＰＯ４動員細菌コンソーシアムの相対的豊富さ。
【００４０】
表４．３  処理プロットレジェンド。
【００４１】
詳細な説明
他に示されない限り、本明細書および関連する特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量、反応条件などの性質を表す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、以下の明細書に記載される数値パラメータは、本態様によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、特許請求の範囲の均等物の原理の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効数字の数に照らして、および通常の丸め技術を適用することによって、解釈されるべきである。
【００４２】
本明細書中に開示される特徴を組み込んだ１つ以上の例示的な態様は、以下に示される。明確性のために、物理的な実行の全ての特徴が、必ずしも本願中に記載され、または示されるわけではない。本開示の態様を組み込んだ物理的態様の開発において、多数の実行特有の決定が、システム関連、ビジネス関連、政府関連および他の制約などの開発者の目標を達成するためにされることができ、これは、実行によって、および時間から時間で変化することが理解されるべきである。開発者の努力は、時間がかかるか一方、それにもかかわらず、そのような努力は、当業者にとって日常的な仕事であり、本開示の利益を有するだろう。
【００４３】
本開示を通じて、現在開示される組成物および方法の様々な側面は、範囲形式で提示されることができる。範囲形式の記載は、単に便宜上かつ簡潔さためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的な範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等などの部分的な範囲、並びにその範囲内のそれぞれの数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を具体的に開示すると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用する。
【００４４】
組成物および方法は、本明細書中で、様々な成分またはステップを「含む」の用語で開示され、組成物および方法はまた、様々な成分およびステップから「本質的になる」または「からなる」ことができる。
【００４５】
Ｉ．リン動員コンソーシアム
一般的に利用可能な市販の細菌接種材料は、Ｐ利用可能性または植物成長を有意に高めない。この非効果は、高温および高ｐＨなどの様々な条件下で、接種材料の不安定性に一部原因がある。対照的に、土壌（例えば、天然および合成、並びに水耕栽培および天空栽培システム）、条件、および気候の広範な範囲で向上した性能を提供する異なる細菌分離株の組み合わせを本明細書中に記載する。本開示の向上した性能は、部分的には、選択された細菌分離株の機能的助長性およびコンソーシアムの向上したリン動員活性をもたらす細菌を同定および修飾する選択プロセスにより、これは、次に、向上した植物の成長をもたらす。多くの場合、開示された組み合わせは、驚くべきことに、有意な向上したリン動員活性を提供する。
【００４６】
本開示の１つの側面によれば、リンを動員するための細菌のコンソーシアム（細菌の２つ以上の別個の菌株の混合物）が、作製される。リン動員コンソーシアムは、表１に列挙される菌株のうちの４つまでを含む。本開示の１つの側面によれば、表１の菌株の任意の２つ以上の組み合わせは、コンソーシアムで使用されることができ、他の態様において、全ての４つの菌株は、コンソーシアムに含まれる。多くの態様において、コンソーシアムで修飾された細菌の様々な菌株は、それらの１６Ｓリボソーム遺伝子配列によって同定される。
【００４７】
本開示は、単独で、または添加剤、担体および他の成分を含む接種材料組成物の一部としての使用のためのコンソーシアムを検討する。本開示はまた、植物によって直接吸収されることができる窒素、カリウム、およびリン化合物を提供し得る。本発明のコンソーシアムは、土壌の栄養および有機成分を修飾するので、植物は、周囲の土壌にすでに存在し得る化合物および添加剤をより効率的に利用することができる（すなわち、リンなどの化合物を動員する）。現在開示される組成物内で生存有益微生物（並びに微生物によって生成された化合物、分子酵素）は、土壌中に存在する有機物質を分解して、次いで植物によって吸収可能な形態に変換され得る。
【００４８】
本開示の組成物は、植物を処理するために、窒素、カリウム、およびリン化合物と共に使用され得る。いくつかの態様において、窒素、カリウムおよびリン化合物は、開示された組成物の適用の前、間、または後で添加される。いくつかの態様において、現在開示される組成物は、植物が適用された窒素、カリウム、およびリン化合物をより効率的に吸収することを可能にするのを助け得る。結果として、より少ない化学肥料およびより低い適用頻度が必要とされる。別の態様において、窒素、カリウム、およびリン化合物の少量は、本開示の組成物に添加されることができ、これは、コンソーシアムの有効性を助けることができる−すなわち、窒素、カリウム、およびリン化合物は、開示された組成物の適用の間、追加される。
【００４９】
開示された組成物は、植物または種子の成長を助けるために使用され得る。多くの態様において、植物の成長は、様々な方法でモニターされることができる。いくつかの態様において、植物の成長は、植物の高さ、重量、花または果実の収穫高（数または重さ）並びに植物から得られる糖含量、栄養素含量およびタンパク質などの化学的属性を測定することによってモニターされ得る。
【００５０】
開示された組成物の使用は、開示された組成物の使用なしに成長した植物と比較して、植物の成長を増加させるのに役立ち得る。多くの場合において、開示された組成物の使用は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または３０％より大きい、および約４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％未満の平均成長を促進し得る。開示された成長増強は、例えば、発芽から植物、その種子、花または果実の収穫まで、植物の成長中の様々な段階で測定され得る。
【００５１】
ＩＩ．組成物
本開示で有用な組成物は、表１に列挙された１つ以上の細菌微生物を含む。別の側面において、開示された組成物は、配列番号１〜４の１６Ｓリボソーム配列に少なくとも９５％以上同一性の相同性によって同定可能な少なくとも２つ以上の細菌微生物を含む。多くの態様において、１６Ｓ配列の量は、約１．２ｋｂ、１．１ｋｂ、１．０ｋｂ、０．９ｋｂ、８ｋｂ、０．７ｋｂ、０．６ｋｂ、０．５ｋｂ、０．４ｋｂ、０．３ｋｂ、０．２ｋｂ、または０．１ｋｂ未満および約５０ｎｔ、０．１ｋｂ、２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１．０ｋｂ、または１．１ｋｂ超えである。多くの態様において、１６Ｓリボソーム配列相同性の量は、約１５０ｎｔと５００ｎｔの間、例えば約２５０ｎｔである。
【００５２】
２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップは、第２の核酸配列との最適なアライメントのための第１の核酸配列の配列中に導入されることができる）。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、次に分子は、その位置で同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数Ｘ１００）。
【００５３】
表１  リン動員細菌の命名法（９７％類似性）
【表１−１】
2018502596.tif 000003
【表１−２】
2018502596.tif 000004
【表１−３】
2018502596.tif 000005
【００５４】
２つの配列の間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ (１９９０年) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムであり、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ (１９９３年) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７として修正された。そのようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(１９９０年) Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−４１０に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施され、本開示の核酸分子に類似または相同なヌクレオチド配列を得ることができる。比較目的のためにギャップのあるアラインメンを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(１９９７年) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用されることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用されることができる。これらのアルゴリズムは、ＲＮＡでＤＮＡをアラインするために使用され得、いくつのっ場合において、翻訳されたヌクレオチド配列でタンパク質をアラインするために使用され得る。
【００５５】
好ましくは、少なくとも２つ以上の微生物が、本開示の組成物に含まれる。２つ以上の微生物が組成物を形成する場合、微生物は、開示された組成物を製造するために共培養され得ると考えられる。他の態様において、開示された組成物は、２つ以上の菌株のそれぞれの培養物を組み合わせることによって形成され得る。微生物は、当該分野で公知の方法によって増殖され得る。例えば、微生物は、嫌気性または好気性条件下で液体培地中で増殖され得る。微生物を増殖させるために使用される適切な液体培地は、栄養ブロスおよびトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）等などの当該分野で公知のものを含む。最も好ましい態様において、組成物は、表１で列挙される４つの菌株の全リストを含む。
【００５６】
１つの側面において、組成物は、１ミリリットル当たり約１〜約１００億コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物の総数を含む。好ましくは、組成物は、１ミリリットル当たり約１００，０００〜約８００，０００ＣＦＵの微生物の総数を含む。より好ましくは、組成物は、１ミリリットル当たり約２５０，０００〜約６００，０００ＣＦＵの微生物の総数を含む。最も好ましくは、組成物は、１ミリリットル当たり約３００，０００ＣＦＵの微生物の総数を含む。
【００５７】
１つの側面において、組成物は、生存および非生存微生物を含む。別の側面において、組成物は、生存または非微生物を含む。非生存微生物を含む組成物は、微生物の抽出物、例えば、表１の微生物の抽出物、または他の細菌を含み得る。微生物の抽出物は、例えば、微生物によって産生され、環境に影響を及ぼすことができる酵素、代謝産物、タンパク質、および他の物質を含む。いくつかの態様において、抽出物は、表１のものなど、１つ以上の微生物の液体発酵生成物であり得る。いくつかの態様において、抽出物は、標準化された生化学的精製プロトコルを使用して精製され得る。
【００５８】
１つの側面において、組成物を発酵させて、発酵生成物を生成する。組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日以上発酵され得る。最も好ましくは、組成物は、少なくとも３日間発酵される。
【００５９】
組成物はまた、添加剤を含み得る。適切な添加剤は、成長、微生物による特定の代謝産物の産生、ｐＨを変更、標的代謝産物を富化、殺虫効を増強、およびそれらの組み合わせを支持しうる当該分野で公知の物質を含む。例示的な添加剤は、炭素源、窒素源、リン源、無機塩、有機酸、成長培地、ビタミン、ミネラル、酢酸、アミノ酸などを含む。
【００６０】
適切な炭素源の例は、限定されず、デンプン、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸、スクロース、グルコース、アラビノース、マンノース、グルコサミン、マルトース、サトウキビ、アルファルファ抽出物、糖蜜、ラムなどの糖類；酢酸、フマル酸、アジピン酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、マロン酸などの有機酸の塩；エタノール、グリセロールなどのアルコール類；大豆油、米ぬか油、オリーブオイル、トウモロコシ油、およびゴマ油などの油または脂肪を含む。添加される炭素源の量は、炭素源の種類によって異なり、典型的に培地の１リットル当たり１と１００ｇの間である。組成物中の炭素源の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下であり得る。好ましくは、アルファルファは、約１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で、主な炭素源として培地中に含まれる。より好ましくは、アルファルファは、約５〜１２％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【００６１】
適切な窒素源の例は、限定されず、アミノ酸、酵母エキス、アルファルファ抽出物、トリプトン、ビーフエキス、ペプトン、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニアまたはそれらの組み合わせを含む。窒素源の量は、窒素源に応じて、典型的に培地の１リットル当たり０．１〜３０の間で変動する。組成物中の窒素源の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下であり得る。
【００６２】
適切な無機塩の例は、限定されず、リン酸二水カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸第一マンガン、塩化第一マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸第二銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。組成物中の無機塩の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下であり得る。
【００６３】
別の態様において、本開示の組成物は、酢酸またはカルボン酸をさらに含み得る。適切な酢酸は、限定されず、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、イソ酪酸、３−メチルブタン酸、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、および２−メチルブチルアセテートを含む当該技術で公知のいずれかを含む。１つの態様において、酢酸は、酢を使用することによって含まれる。組成物中の酢酸の重量分率は、組成物の総量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
【００６４】
本開示の組成物は、液体または乾燥形態であり得る。組成物は、成分の水性懸濁液を含み得る。この水性懸濁液は、適用前に希釈される濃縮ストック溶液として、またはすぐに使用できる希釈溶液として提供され得る。また、組成物は、粉末、顆粒、粉剤、ペレットまたはコロイド状濃縮物であり得る。そのような乾燥形態は、制御放出、除放、または他の時間依存的な方法で湿潤または溶解するとすぐに溶解するように処方され得る。また、組成物は、有効である湿潤または溶解に依存しない乾燥形態であり得る。組成物は、噴霧することができる製剤で、さらに提供され得る。噴霧は、液体またはエアロゾルであり得る。
【００６５】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、少なくとも１つの任意の賦形剤を含み得る。適切な添加剤の非限定的な例は、抗酸化剤、添加剤、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、鉱物塩、ｐＨ調節剤、錠剤分解物質、崩壊剤、矯味剤、栄養剤、膨張および浸透圧製薬剤、安定剤、防腐剤、おいしさ促進剤および着色剤を含む。組み合わせを形成するために利用される賦形剤の量および種類は、化学の既知の原理に従って選択され得る。
【００６６】
１つの態様において、賦形剤は、少なくとも１つの希釈剤を含み得る。適切な希釈剤の非限定的な例は、微晶質セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸および酪酸混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、米デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−ラクトース、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングルコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラシトール、マンニトール、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、およびトレハロースを含む。
【００６７】
別の態様において、賦形剤は、結合剤を含み得る。適切な結合剤は、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
別の態様において、充填剤を含み得る。適切な充填剤は、炭水化物、無機化合物、およびポリビニルピロリドンを含むが、これらに限定されない。非限定的な例により、充填剤は、硫酸カルシウム、ジ−およびトリ−塩基性の両方、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、修飾デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであり得る。
【００６９】
また別の態様において、賦形剤は、緩衝剤を含み得る。適切な緩衝剤の代表的な例は、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液または緩衝生理食塩水塩（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝生理またはリン酸緩衝生理食塩水）を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
さらなる態様において、賦形剤は、錠剤分解物質を含み得る。適切な錠剤分解物質は、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、トマトデンプン、α化デンプンおよびそれらの修飾されたデンプンなどのデンプン、甘味料、ベントナイト、微晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウムなどのクレイ、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペシチン、およびトラガントなどのゴムを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
さらに別の態様において、賦形剤は、分散促進剤を含み得る。適切な分散促進剤は、デンプン、アルギン酸、ポリビイルピロリドン、ガアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファス（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ）ケイ酸塩、および微晶性セルロースを含み得るが、これらに限定されない。
【００７２】
さらなる態様において、賦形剤は、潤滑剤を含み得る。適切な潤滑剤の非限定的な例は、タルクまたはシリカなどの鉱物；および植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸などの脂肪を含む。
【００７３】
組み合わせにおける賦形剤（複数可）の重量分率は、組み合わせの総量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下であり得る。
【００７４】
本開示の組成物は、液体または乾燥形態として、細菌コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）濃度（図１）および経時的なｐＨレベル（図２）に関して様々な条件下で安定である。好ましくは、本開示の組成物は、室温で安定である。
【００７５】
本開示の別の側面において、コンソーシアムは、生存微生物の生存能力を有意に損なうことなく、貯蔵および輸送のために低温に保ち得る。コンソーシアムまたはそれを含む組成物は、冷凍、凍結または凍結乾燥され得る。組成物は、３２ｏＦ〜４４ｏＦの間で冷凍され得る。
【００７６】
本開示の別の側面において、コンソーシアムまたはそれを含む組成物は、冷凍状態で貯蔵および輸送されることができる。生きた有益な微生物は、組成物は、好ましくは通気および／または撹拌しながら、周囲温度にした後、迅速に再活性化されることができる。
【００７７】
本開示のさらに別の側面において、コンソーシアムは、凍結乾燥されることができる。コンソーシアムは、まず凍結される。次に水は、減圧下で除去される。このプロセスは、貯蔵および輸送のための組成物の重量をさらに減少させる。それを含む組成物のコンソーシアムは、適用前に再構成および再活性化されることができる。
【００７８】
本開示の別の側面において、濃縮されたコンソーシアムは、またはそれを含む組成物は、種子、植物、土壌などに対する適用前に水で希釈されることができる。希釈された組成物は、生存能力を失うことなく、長時間、例えば３０日間も長期間、保存されることができる。実質的に好気性の状態で生存する有用な微生物を維持するために、本開示の希釈された組成物中の溶存酸素は、好ましくは最適なレベルに保たれる。ゆっくりした曝気によって希釈された組成物に最適量の酸素を供給することが好ましい。
【００７９】
ＩＩＩ．方法
本明細書中に開示される組成物は、農業において有用であり、植物の利用可能なリンを増加させるための化学的／肥料の代替物として有用である。本明細書中に開示される組成物は、農業方法において有用である。本開示の方法は、土壌改良および植物改良を含む。
【００８０】
土壌処理の方法は、富化されるべき土壌に組成物を適用することを含む。組成物は、液体または乾燥形態であり得、当該分野で公知の方法によって、土壌に適用され得る。例示的な方法は、標的土壌を噴霧、滴下、散布、および散粉することを含む。また、組成物は、標的土壌を供給する水源に適用され得る。
【００８１】
別の側面において、組成物は、植物改良のために使用され得る。植物改良の方法は、本明細書中に記載されるように、本開示の組成物を植物の土壌または水源に提供することを含む。別の側面において、種子は、植え付け前に本開示の組成物に浸漬され得る。土壌および植物の改良のために本明細書中で記載される方法のいずれかを組み合わせることは、有益であり得ることが認識されるだろう。
【００８２】
微生物組成物は、乾燥または液体形態のいずれかで提供され得る。微生物組成物は、土壌または植物の重量に対して様々な量で提供され得る。いくつかの側面において、微生物組成物は、土壌または植物の総重量の約０．５〜５０重量％の範囲の量で提供される。別の側面において、微生物組成物は、土壌または植物の総重量の約１〜約３重量％の範囲の量で提供される。
【００８３】
微生物は、乾燥形態、液体形態またはスプレーを介して提供され得る。廃棄物を処理する方法は、噴霧、散布、散水、液体接種、ミスト化、薫蒸、エアロゾル化、および当該分野で公知の他の方法を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本開示の態様のより良い理解を容易にするために、以下の実施例を示す。以下の実施例は、本開示の範囲を制限するか、または定義するために決して読まれるべきではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１
出願人は、主な生産作物（大豆、小麦およびトウモロコシ）を広範囲の気候、土壌特性、および植生の農業および天然の牧草地および森林地から米国内の土壌から天然土壌微生物群落を抽出した。微生物は、異なるＰ−制限条件に似た定義された培地中で増殖した。培地は、土壌微生物の成長を多くの異なる環境条件に適応させるために、栄養素化学量論を制御することを出願人に可能にする唯一の環境を提供する。例えば、典型的な酸性土壌中の微生物を増殖させるために、栄養素化学量論は、第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）基質表２．１；２．２中で見られる不溶性Ｐを使用して、制御されるだろう。
【００８６】
表２．１  第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）基質を使用する定義された培地の例
【表２−１】
2018502596.tif 000006
【表２−２】
2018502596.tif 000007
【００８７】
表２．２  第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）培地中の栄養素化学量論限界の例
【表３】
2018502596.tif 000008
【００８８】
これらの土壌から微生物群落が可溶性オルトリン酸を産生した微生物増殖率が定量され、その結果を図３に示す。これらの微生物群落は、微生物バイオマス中のオルトリン酸塩鉱化のそれらの速度およびＰの蓄積において大きく異なっており、我々は、リン酸検出システムプロトコル（Ｔａｙｌｏｒら、２０１３年)を使用して分析した。続いて、このアプローチを使用して、出願人は、平均Ｐ−可溶速度または有機ＰＯ４鉱化特性の５〜１０倍を示す珍しい微生物コンソーシアムを選択することができ、最も速い速度および／またはＰ可溶化および鉱化のより大きい規模を有するものを含む（図３）。
【００８９】
次に、これらの微生物コンソーシアムによって証明された優れたＰ可溶化および鉱化を改善するために、（微生物物特性を評価するための）ハイスループット特性評価プラットフォームが指示された人工的選択と組み合わせられ、ここで、細菌は、増強されたリン動員活性をもたらす増殖プロセスを介して修飾された。指示された微生物群落オルトリン酸塩可溶化および鉱化選択は、増強された鉱化（微生物コンソーシアムＰ効果の特性評価およびスクリーニングの間に同定される）を我々の選択培地を含む９６ディープウェルプレート中に示した優れたコンソーシアムを最初に接種することによって達成された。相対的に小さな「種子」群落は、９６個の複製のそれぞれに追加され、群落組成物中のわずかなシフトは、群落組み立て中の動きで自然変動性およびランダムな生態学的要因によって、単にそれぞれの複製内で達成された（ＭｃＧｒａｄｙ−Ｓｔｅｅｄら, １９９７年；Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｇａｓｔら, ２００８年；Ｎｅｍｅｒｇｕｔら, ２０１３年）。それぞれその後の発生において、所望のコンソーシアムは、それらの能力に基づいて同定されて、オルトリン酸塩を可溶化または鉱化した（図４）。さらに、指示された選択中、微生物の突然変異および水平遺伝子伝達は、ＵＶ曝露または突然変異誘発剤を介して加速された。Ｐ可溶化の最も高い割合を有するコンソーシアムは、次の発生を接種するために使用される種子群落として選択された。得られたコンソーシアムは、天然の土壌中で見られる群落と実質的に異なる細菌の菌株の新規な組み合わせからなり、驚くべきことに、増強されたＰ動員を証明する。
【００９０】
現在開示されているコンソーシアムとの使用のための細菌は、表１に開示される（リン動員コンソーシアム）。菌株は、表で報告されるそれらの操作上の分類学的単位について１６Ｓリボソーム代表配列によって同定される。本開示によれば、これらの同定された菌株の２つ以上は、土壌中の植物の利用可能なリンを増加させるために使用され得る。好ましい態様において、菌株は、１６Ｓ配列の約０．２ｋｂに渡って少なくとも９７％類似性でそれぞれＯＴＵを含むものである。最適化されると、我々は、第２鉄（ＦｅＰＯ４）およびアルミニウム（ＡｌＰＯ４）基質表２．１を使用する酸性土壌で典型的に見られる可溶性Ｐ条件をシミュレートする培地を使用した。
【００９１】
我々は、アルファルファ培地などのいくつかの異なる培地で最初の発酵期間後に細菌増殖を首尾よく安定化させることができた。これらの実験のために、アルファルファ培地は、熱および水抽出プロトコルを使用することによって作製された。手短に、約８０ｇのアルファルファ基質（細かいメッシュナイロン沸騰バッグに含まれる）は、約１ガロンの水と組み合わせて、約６０分間、ステンレススチール醸造釜中で煮沸された（約１００℃）。熱および水は、開示された細菌コンソーシアムの成長を助けうるアルファルファから炭素化合物および栄養素を抽出するのに役立つ。６０分間沸騰させた後、水−アルファルファ混合物は、醸造釜中で覆われたままであり、加熱要素から除去され、次の１２時間に渡ってゆっくりと冷却されること（約６０℃まで）を可能にした。冷却期間後、アルファルファ−液体抽出物は、滅菌ガラス瓶に無菌で移され、使用するまで４℃で保存される。
【００９２】
他の方法は、最初の発酵期間後に増殖された細菌を安定化することができた。これらの方法の多くにおいて、様々な安定化処方が混合され、オートクレープ処理され、冷却され、次に異なる濃度および０．００１％〜５０％総体積の間の範囲の体積で細菌接種材料に組み込まれた。処方添加剤は、次のものを含み得る：ソルビトール、グルコース、ラクトース、トレハロース、グリセロール、ＰＥＧ、グリシン、および／またはプロリン。
【００９３】
実施例２−リンを動員するための細菌コンソーシアム改善の評価
我々は、他の細菌分離株（すなわち、純粋な培養物）と比較して、オルトリン酸塩（ＰＯ４）を動員する我々のコンソーシアムの能力の改善を定量化するインビトロアッセイを実施した。驚くべきことに、開示されたコンソーシアムは、予想量を超える増強された動員を示した。実際には、相乗効果は、２つ以上のそれぞれの細菌の菌株がコンソーシアム中に含まれる場合に見られた。これは、異なる細菌の菌株が通常はお互いを阻害することが予想されるので、驚くべきことであった。
【００９４】
細菌分離株（表１に列挙される）を比較するために、コンソーシアムとして一緒に働く分離株の様々な組み合わせが調製された。細菌は、様々な細菌種分離株の凍結保存サンプルから増殖された（我々の第二鉄およびアルミニウム培地（上記に列挙した）で以前に増殖され、次に−８０℃で２ｍＬの滅菌微小遠心管中にサブサンプルとして凍結保存された）。細菌分離株サンプルは、１ｍＬの濃縮細菌の総体積を１９ｍＬの滅菌アルファルファ培地（上記で開示されるように調製された）中に接種することによってこの実験のために増殖された。２０ｍＬの各細菌分離株（表１）は、１ｍＬの凍結細菌ストック培養物（各種について独立して）を１９ｍＬのアルファルファ培地中に接種することによって増殖された。各単離された細菌種培養物は、単離された培養物のそれぞれが約１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度になるまで、インキュベーター中で３日間（２５℃で）アルファルファ培地中で増殖された。
【００９５】
次に、我々は、９６−ディープウェルプレートフォーマットを使用してＰＯ４を動員するための細菌種の相互作用能力を試験するために、すべての因子群（表３．１）について４回の複製を使用して完全な要因計画を実施した。細菌分離株について、我々は、５０μｌの総成熟培養物を９５０μＬのアルファルファ培地中に接種した。しかしながら、分離株を異なる細菌コンソーシアム集合体中に組み合わせるために、我々は、同じ総接種率（９５０μｌのアルファルファ培地中への５０μｌの総成熟培養物）を使用したが、複数の細菌分離株を高スループット分子群落分析（表３．１；表３．２）で観察されるような細菌の相対的な割合に基づくコンソーシアム中に組み込んだ。細菌培養物は、単離された培養物のそれぞれが１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度に到達するまで、３日間（２５℃のインキュベーター中で）９６−ディープウェルプレート中で増殖した。３日間の増殖期間後、全てのサンプル（細菌分離株および異なるコンソーシアム集合体を表す細菌の組み合わせ）が、増加したＰＯ４利用可能性について同時に評価された。
【００９６】
このインキュベーション研究の所見は、どのようにして改良されたオルトリン酸（ＰＯ４）動員が達成されることができるか、およびコンソーシアム中の複数の細菌種を含む相乗効果を証明する。これらのデータは、リンを動員する能力が、２つ以上の開示された細菌種の添加によって大幅に改善されることを証明し、リン動員率は、単離でコンソーシアムメンバーの添加率よりもコンソーシアムの方が大きい。より具体的には、ＰＯ４動員における最も強力な相乗的改善は、２種のコンソーシアム（エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（Ｅ）およびサイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）（Ｃ）を含む）および３つの種のコンソーシアム（エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（Ｅ）およびサイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）（Ｃ）およびシュードモーナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（Ｐ））で観察された（図５）。この結果は、予想外であった。むしろほとんどの場合、１つの細菌種は、同じ培養物中で第２の細菌種の増殖および代謝を阻害するだろう。
【００９７】
表３．１  改善されたオルトリン酸（ＰＯ４）動員のための４つの標的種の間の相互作用効果を試験する完全な要因計画。以下の値は、９６−ディープウェルプレートの各ウェルで９５０μＬに加えるために５０μＬの最終体積を達成する相対的な割合（μＬ）を表す。各培養物は、混合時に１０９ＣＦＵカウントであった。
【表４】
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【００９８】
表３．２  細菌群落構造、コロニー形成単位（ＣＦＵ）および細菌コンソーシアムを動員する我々の土壌ＰＯ４の相対存在量
【表５】
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【００９９】
本開示のいくつかの態様において、コンソーシアムにおけるそれぞれの菌株の相対的存在量は、０．０５と０．９５の間であり得る。多くの態様において、１つの菌株の相対的存在量は、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、９６、０．９７、０．９８、または０．９９より大きく、および約０．９９、０．９８、０．９７、０．９６、０．９５、０．９０、０．８５、０．８０、０.７５、０．７０、０．６５、０．６０、０．５５、０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３０、０．２５、０．２０、０．１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０.０２または０．０１未満であり得る。したがって、例えば、コンソーシアム中の細菌種の比は、限定されず、０．５：０．５、０．１：０．９等（２つの菌株／種のコンソーシアムについて）、０．３３：０．３３：０．３３、０．１：０．４：０．５、０．２：０．６：０．２等（３つの菌株／種のコンソーシアムについて）、０．１：０．４：０．４：０．１、０．４：０．３：０．２：０．１等（４つの菌株／種のコンソーシアムについて）であり得る。
【０１００】
実施例３−温室効果試験における生物刺激剤性能の評価
出願人は、温室効果試験における小麦（図６４）、芝草（図７〜１１）、ジャラペノス（図１２）、トマト（図１３〜１５）、バジル（図１５）およびマリゴールド（図１６）の早期出芽、緑色、および一般的な健康を改善するために微生物Ｐ動員生物刺激剤の有効性および効能を試験した。これらの実験は、コロラド州立大学キャンパス（コロラド州、フォート・コリンズ）の植物成長施設温室で実施され、これは、植物の成長のための日光をシミュレートするための制御された１６時間光周期を提供する。温室の昼間の温度は、２３℃に、夜で１７℃に設定される。
【０１０１】
例えば、芝草の健康特性に対する微生物生物刺激剤の有効性を評価するための最初のパイロット研究において、我々は、リサイクルポリエチレン製で、底に排水孔があるフルサイズの種子トレイ（寸法は、５３．３４ｃｍ  Ｌ×２７．９４ｃｍ  Ｗ×５．８４ｃｍ  Ｈである）で４つの異なる草種を生育した。種子トレイは、収集した土壌で３／４フルを満たした。土壌を種子トレイに加えた後、土壌は、ビーカーを使用して１５０ｍＬの水で予水（ｐｒｅ−ｗａｔｅｒｅｄ）した。次に推奨種子密度を土壌の上部に散布した（ケンタッキーブルーグラスについては、１．６ｇ、およびペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ、およびベントグラスについては２．６６ｇ）。この実験で使用された土壌は、混合沖積層および／または風成堆積物親材料（微細ローム、混合、中温性のＨａｐｌｕｓｔａｌｆ）を有するＳｔｏｎｅｈａｍローム層として特徴付けられる（ＮＲＣＳ、２０１２年）。Ａｒｉｄｉｃ Ｈａｐｌｕｓｔａｌｆは、土壌秩序の下で分類され、典型的には、乾燥状態が長くなり、農業システムで広く使用され、地球の陸地表面の約１／１０を占める。これらの土壌は、粘度が豊富な底土を有し、世界の多くの地域で利用可能なリンが不足しているという特徴がある。一般的に、アルフィゾルは、高いアルミニウム（Ａｌ）および鉄（Ｆｅ）含有量を有し、これらの土壌は、比較的高いＰ吸着親和性を有することを示唆している。収集したら、土壌は、４ｍｍふるいを使用してふるい分けて大きな物体（岩石、根等）を除去し、次に、２ｍｍふるいで凝集体のサイズをより均一にした。均質化された畑土壌は、栄養分と微生物特性のために妥当な量の土畑土壌を維持しながら土壌の多孔性を最大にするために、１：１の比で滅菌砂混合物と混合された。土壌−砂混合物を作製する前に、砂（Ｑｕｉｋｒｅｔｅ； Ａｔｌａｎｔａ, ＧＡ）は、最初に１２１℃および１７ＰＳＩで３０分間オートクレープで滅菌され、次に、約８．０のｐＨに到達するまで滅菌ＤＩ水で（約３０分間隔で）飽和され、その場の畑土壌ｐＨ条件と一致させた（畑土壌ｐＨ平均±ＳＥ＝８．３±０．０５）。
【０１０２】
表４．１および４．２（図１７および１８で提示される）を参照して、異なる処理が、次のものを含むこの実験で適用された：処理１）我々のＰ動員微生物コンソーシアムからの微生物コンソーシアム；処理２）微生物活性を有しない処理１（０．２μＭを使用する）に対応する滅菌培地；および処理３）対照のために使用される一般的な栄養豊富な無機植物肥料（Ｈｏａｇｌａｎｄの溶液）であり、草の成長に制限のない栄養素源を表す。各草処理（１００ｍＬ）を、噴霧ボトルを使用して草種子に直接適用した。処理が適用されると、上部土壌の１ｃｍ層が添加されて種子を覆い、続いて５００ｍＬビーカーを使用して各種子ボックスに適用された４００ｍＬの水が加えられた。
【０１０３】
より速い出芽、より高い草の成長およびより緑の草が、全ての他の処理と比較して播種から８日後の処理１を接種された４つの草種のうちの３つ（ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ、およびケンタッキーブルーグラスを含む）で観察された（図６）。ケンタッキーブルーグラスによって示されるように、無機肥料添加を含む全ての他の処理と比較して、草の大部分は、より緑色であり（ＤＧＣＩ指数を用いた評価）（図７）、我々のＰ動員生物刺激剤を接種した場合、芝草はより多くのバイオマスを取り込んだ（図８〜９）。さらに、増加した土壌栄養素利用可能性とそれに続くいくつかの主要栄養素と微量栄養素のための植物摂取は、微生物生物刺激剤適用に対応した（図１１）。例えば、本開示のＰ動員微生物生物刺激剤組成物（エレベータＰ（Ｅｌｅｖａｔｅ  Ｐ）)を接種した種子は、伝統的な無機肥料（無機肥料）と比較して、増大した土壌カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、および鉄（Ｆｅ）摂取を証明した（図１１）。出願人の細菌接種材料はまた、それぞれ表４．２よび４．２、図１７および１８に示されるいくつかの他の栄養素の利用可能性および摂取を増加させた。
【０１０４】
したがって、本開示は、上述した目的および利点並びにその中に内在する目的および利点を達成するためによく適用される。上記の開示される特定の態様は、本開示が本明細書中で教示の利益を有する当業者にとって明らかに異なるが同等の方法で修正され、実施され得るように、例示的なだけである。さらに、以下の請求項で記載される以外に、本明細書中に示される構成または設計の詳細に対して、制限が意図されない。したがって、上記に開示された特定の例示的な態様は、変更、組み合わせ、または修正され得、全てのそのような変更は、本開示の範囲および精神の範囲内であると考えられることは明らかである。本明細書中に例示的に開示される本開示は、本明細書中に具体的に開示されないいくつかの要素および／または本明細書中に開示されるいくつかの任意の要素の非存在下で実施され得る。
【０１０５】
実施例４−植物成長に対するコンソーシアムの効果
現在主張される細菌がシロイヌナズナの成長について有する効果が研究された。なぜなら、その成長は、土壌接種材料によって影響されることが知られているからである（Ｓｗｅｎｓｏｎら、２０００年）。２つのシロイヌナズナの野生型種子（Ｅｖｏｔｅｋ Ｉｎｃ.、ワシントンＤＣ，ＵＳＡから）が、オートクレープされた土壌（５０％の農業表土および５０％の鉢植え用の土）の約１ポイントで満たされた４インチのポットに、ポットごとに植えられた。播種されたポッドは、発芽を確実にするために約２週間、ミスベンチの下で１日１６時間の補給光と共に７０ｏＦで維持された。種子を植えた直後に、５ｍＬの培地（以前に記載したアルファルファ茶）を各ポットに加えた。
【０１０６】
いくつかの培地は、細菌の種の１つ以上を含んだ。培地が細菌を含んでいた場合、培地中の細菌の総濃度は、６．５±２．１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。１組の植物が培地のみを受けた（「培地」または「０ｓｓｐ」）。１組の植物が細菌の全ての４つの種を含む培地（「４ｓｓｐ」）を受けた：コナモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（Ｃｅ）、サイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）（Ｃｆ）、エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（Ｅｃ）、およびシュードモーナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（Ｐｐ）。４組の植物は、Ｃｅ、Ｃｆ、Ｅｃ、またはＰｐのそれぞれ、１つの種を含む培地（「１ｓｓｐ」）を受けた。６組の植物は、それぞれ、Ｃｅ、Ｃｆ、Ｅｃ、およびＰｐ；Ｃｅ+ＣＦ、Ｃｅ+Ｅｃ、Ｃｅ＋Ｐｐ、Ｃｆ+Ｐｐ、およびＥｃ+Ｐｐから選択される２つの細菌種の当量を含む培地（「２ｓｓｐ」）を受けた。４組の植物は、それぞれ、Ｃｅ、Ｄｆ、Ｅｃ、およびＰｐ；Ｃｅ+Ｃｆ+Ｅｃ、Ｃｅ+Ｅｃ+Ｐｐ、Ｃｅ+Ｃｆ+Ｐｐ、およびＣｆ+Ｅｃ+Ｐｐから選択される３つの細菌種の当量を含む培地（「３ｓｓｐ」）を受けた。
【０１０７】
両方の種子が発芽した場合、２つのうちより小さいほうが、ポットから取り除かれた。発芽後、ポットは、もう一度、適切な細菌混合物を含む５ｍＬの培地、または細菌を含まない（０ｓｓｐ）培地を再度接種した。ポットは、発芽を確実にするために、ミストベンチ中で２週間、毎日散水によって湿りを保った。播種の２週間後、植物はミストベンチから除去されたが、毎日の散水が維持された。
【０１０８】
３つの変数が、各植物の成長を評価するために測定された：ロゼット葉の数、最大ロゼット直径、および植物の高さ。測定を行い、毎週２回記録した。３２日後にボイルイン（成長）することができなかった植物が、分析から除外された。ボルトインできなかったことは、全ての処理の間に均等に分配された。
【０１０９】
図１９は、これらの実験からの結果、具体的には、異なる数種を含む培地で接種された種子のシロイヌナズナの成長指標を示す。表５〜９は、図１９のグラフを作成するために使用されるデータを表す。図１９にグラフで示された点は、平均値を表し、誤差バーは、６〜８回反復の平均の標準誤差を示す。記号は、４種の処理からのデータを示し、４ｓｓｐは、ｐ＜０．０５（φφ）またはｐ＜０．１（φ）で有意に０より大きく、およびｐ＜０．０５（＊＊）またはｐ＜０．１（＊）で全ての他の処理よりも大きい４種である。驚くべきことに、測定された各変数について、植物の成長は、培地が全ての４種、４ｓｓｐを含む最大の増強を示した。この結果は、植物の開発を通じて一貫していた；初期相（ロゼット葉の数）、初期中期相（最大ロゼット直径）、および中間後期相（植物の高さ）。
【０１１０】
具体的には、薹立ち（茎を成長させる）を完全な４種の処理に開始した最初の５日後の成長率は、単に微生物を含まない培地を添加するよりも５倍以上の高さの成長率をもたらした。興味深いことに、１〜３種の間を添加することは、培地を添加するだけでは有意な効果がなかった。最後に、培地中の４つの細菌種の存在は、２倍（ｓｓｐ１、ｓｓｐ２、およびｓｓｐ３と比較して）および３倍（０ｓｓｐ、培地対照と比較して）のデータの変動性を減少させるのに役立った。
【０１１１】
表５は、処理における種の数によるシロイヌナズナの生産性を示す。表中の値の背後にある文字は、特定の列における値の間の関係、特に有意差（ｐ＜０．１；例えば「ａ」は「ａ」および「ａｂ」に類似するが「ｂ」ではない）を示す。受けた全ての処理は、肥料の適用を示した。処理ｓｓｐ４（マンモスＰ）は、評価された３つの生産性指標について２５％、７１％および５８％の生産性を増加させた。ロゼット葉の数は、１４日後に評価された；２５日後の最大ロゼット直径；植物の高さは、植え付けの３９日後に評価された。
【表６】
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【０１１２】
表６は、メートル法特異的ピーク時点の特異的処理によるシロイヌナズナの生産性を示す。ロゼット葉の数は、１４日後に評価され；２５日後の最大ロゼット直径；植物の高さは、植え付けの３９日後に評価された。
【表７】
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【０１１３】
表７は、すべての処理およびサンプリング時間について高さ（ｍｍ）によるシロイヌナズナの成長を示す。数字は、平均±ＳＥを示す。マンモスＰは、全ての４種を有する；Ｃｆ＝Ｅ．サイトオロバクター（Ｅ. Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅｃ＝Ｅ．エンテロバクター（Ｅ. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；Ｐｐ＝Ｐ．シュードモーナス（Ｐ. Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；Ｃｅ＝Ｃ．コナモナス（Ｃ. Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）。
【表８】
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【０１１４】
表８は、全ての処理およびサンプリング時間についての最大直径（ｍｍ）によるシロオイヌナズナの成長を示す。数字は、平均±ＳＥを示す。マンモスＰは全ての４種を有する；Ｃｆ＝Ｅ．サイトオロバクター（Ｅ. Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅｃ＝Ｅ．エンテロバクター（Ｅ. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；Ｐｐ＝Ｐ．シュードモーナス（Ｐ. Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；Ｃｅ＝Ｃ．コナモナス（Ｃ. Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）。
【表９】
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【０１１５】
表９は、全ての処理およびサンプリング時間についてのロゼット葉の数によるシロオイヌナズナの成長を示す。数字は、平均±ＳＥを示す。マンモスＰは全ての４種を有する；Ｃｆ＝Ｅ．サイトオロバクター（Ｅ. Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅｃ＝Ｅ．エンテロバクター（Ｅ. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；Ｐｐ＝Ｐ．シュードモーナス（Ｐ. Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；Ｃｅ＝Ｃ．コナモナス（Ｃ. Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）。
【表１０】
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【表１１】
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【０１１６】
寄託
出願人のリン動員コンソーシアムおよび出願人の鉱化コンソーシアムのコンソーシアムの寄託は、本出願の出願日前からコロラド州立大学によって維持されている。この寄託物へのアクセスは、本出願の係属中、特許および商標の長官および要請があった場合に長官によってそこに権利を与えられることが決定された人に利用可能であるだろう。本出願の任意の請求項の許可により、出願人（複数可）は、イリノイＰｅｏｒｉａ、６１６０４にある米国農務省国立農業利用研究センター（ＮＲＲＬ；「受託機関」）のＡＲＳカルチャーコレクションを有するコンソーシアム細菌の寄託を制限なく公衆に利用可能にするだろう。寄託された細菌は、上記のようにコロラド州立大学で維持されているのと同じ寄託から採取されるだろう。さらに、出願人は、寄託がされたときにサンプルの生存率の表示を提供することを含む、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.第１．８０１〜１．８０９の要求を全て合致するだろう。コンソーシアム細菌の１つの態様の寄託番号は、次の通りである：コマナス属エストステロン（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３６；サイトオロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）、ＮＲＲＬ Ｂ−６７１３７
；エンテロオバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３８；シュードモーナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１３９。
【０１１７】
上記の細菌のこの寄託は、公的受託機関である受託機関で、３０年、または最新の請求後５年の期間、または特許の有効期間のいずれか長いほうの期間中、維持され、その期間中生存できなくなった場合に交換されるだろう。しかしながら、出願人は、寄託材料の利用可能性に制限を課さない；しかしながら、出願人は、生物材料の移転または商業上のその輸送に関する法律によって課されたいかなる制限を放棄する権限を有さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018502596.tif 000043
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