(57)【要約】本発明は、細胞シグナル伝達経路並びに他の細胞内及び細胞外タンパク質−タンパク質相互作用を調節する新規のリガンド誘導性ポリペプチドカップリング系並びに方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、核内受容体タンパク質の異なる断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドとを含む２つのポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドが活性化リガンドに結合することができ、前記第２のポリペプチドが前記活性化リガンドの存在下で前記第１のポリペプチドと結合することができ、前記第１及び第２のポリペプチドの活性化リガンドにより誘導される結合が、活性化した機能的、生物学的、又は細胞シグナル伝達状態をもたらすように、前記第１及び第２のポリペプチドの各々が異種アミノ酸又はポリペプチド配列をさらに含む、２つのポリペプチド。
【請求項２】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインが、節足動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項３】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインがグループＨ核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドの核内受容体アミノ酸配列が、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項５】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項６】
前記哺乳動物核内受容体タンパク質断片又はドメインが、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む、請求項５に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項７】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はその置換変異体のキメラを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項８】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む、請求項７に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項９】
ａ）節足動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、
ｂ）節足動物及び／又は哺乳動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドと
を含み、
前記第１及び第２のポリペプチドが、活性化リガンドと接触した後に活性化した機能的、生物学的又は細胞シグナル伝達状態を生ずることができる追加の異種配列を含む、リガンド誘導性ポリペプチドカップリング（ＬＩＰＣ）系。
【請求項１０】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインがグループＨ核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む、請求項９又は１０に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１２】
前記第２のポリペプチドが哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む、請求項１２に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドが、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はその置換変異体のキメラを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１５】
前記第２のポリペプチドが、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む、請求項１４に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１６】
前記核内受容体タンパク質断片の少なくとも１つが、スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、タバコスズメガＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）ＬＢＤ、ニセアメリカタバコガＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）ＬＢＤ、ユスリカ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カイコガ（ボンビックス・モリ）ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、ミバエ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、蚊（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カピタータ）ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カプリナ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、地中海ミバエ（セラチチス・カピタータ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、バッタ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、アブラムシ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、コナジラミ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（ＢａＥｃＲ）ＬＢＤ、ヨコバイ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（ＮｃＥｃＲ）ＬＢＤ、及びマダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）ＬＢＤから成る群から選択されるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド、又は請求項９〜１５のいずれか一項に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１７】
前記核内受容体タンパク質断片の少なくとも１つが、配列番号１（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号２（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号３（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号４（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号５（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドによりコードされるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド、又は請求項９〜１５のいずれか一項に記載のＬＩＰＣ系。
【請求項１８】
前記エクジソン受容体ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号６（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号７（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号８（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号９（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号１０（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む、請求項１６又は１７に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項１９】
前記エクジソン受容体ポリペプチド配列が、対応する野生型エクジソン受容体ポリペプチドと比べて約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、又は置換変異を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２０】
前記エクジソン受容体ポリペプチドが、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン変異を含むポリヌクレオチドによりコードされ、前記アミノ酸残基が、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基９５及び１１０、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１７５、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１２７、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１２７、及び１７５、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基５２、１０７、及び１７５、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基９６、１０７、及び１７５、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１１０、及び１７５、ｋ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、若しくは２１７、又はｌ）配列番号１９のアミノ酸残基９１若しくは１０５に相当する又は類似した位置にある、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２１】
前記置換変異が、ａ）配列番号１７のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、又はＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換変異、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、又はＣ２１７Ｓ置換変異、及びｃ）配列番号１９のＧ９１Ａ又はＡ１０５Ｐ置換変異から成る群から選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２２】
前記レチノイドＸ受容体ポリペプチドが、脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド、無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド（ＵＳＰ）、並びに脊椎動物及び無脊椎動物ＲＸＲ由来のポリペプチド断片を含むキメラレチノイドＸポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２３】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、及び非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片から成る群から選択される少なくとも２つの異なるレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含む、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２４】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、ＥＦドメインヘリックス１、ＥＦドメインヘリックス２、ＥＦドメインヘリックス３、ＥＦドメインヘリックス４、ＥＦドメインヘリックス５、ＥＦドメインヘリックス６、ＥＦドメインヘリックス７、ＥＦドメインヘリックス８、ＥＦドメインヘリックス９、ＥＦドメインヘリックス１０、ＥＦドメインヘリックス１１、ＥＦドメインヘリックス１２、Ｆドメイン、及びＥＦドメインβプリーツシートから成る群から選択される少なくとも１つのレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドを含み、前記レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片が、前記第２のレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片と異なる種のレチノイドＸ受容体ポリペプチド又は異なるアイソフォームのレチノイドＸ受容体ポリペプチド由来である、請求項２３に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２５】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、a）配列番号１１、b）配列番号１２のヌクレオチド１〜３４８及び配列番号１３のヌクレオチド２６８〜６３０、ｃ）配列番号１２のヌクレオチド１〜４０８及び配列番号１３のヌクレオチド３３７〜６３０、ｄ）配列番号１２のヌクレオチド１４６５及び配列番号１３のヌクレオチド４０３〜６３０、ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１〜５５５及び配列番号１３のヌクレオチド４９０〜６３０、ｆ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６２４及び配列番号１３のヌクレオチド５４７〜６３０、ｇ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６４５及び配列番号１３のヌクレオチド６０１〜６３０、並びにｈ）配列番号１２のヌクレオチド１〜７１７、配列番号１３のヌクレオチド６１３〜６３０の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２６】
前記キメラレチノイドＸポリペプチドが、ａ）配列番号１４、ｂ）配列番号１５のアミノ酸１〜１１６及び配列番号１６のアミノ酸９０〜２１０、ｃ）配列番号１５のアミノ酸１〜１３６及び配列番号１６のアミノ酸１１３〜２１０、ｄ）配列番号１５のアミノ酸１〜１５５及び配列番号１６のアミノ酸１３５〜２１０、ｅ）配列番号１５のアミノ酸１〜１８５及び配列番号１６のアミノ酸１６４〜２１０、ｆ）配列番号１５のアミノ酸１〜２０８及び配列番号１６のアミノ酸１８３〜２１０、ｇ）配列番号１５のアミノ酸１〜２１５及び配列番号１６のアミノ酸２０１〜２１０、並びにｈ）配列番号１５のアミノ酸１〜２３９、配列番号１６のアミノ酸２０５〜２１０のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２７】
一方又は両方の追加の異種配列が膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２８】
前記膜貫通ドメインのうちの少なくとも１つがＩ型１回膜貫通ドメインである、請求項２７に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１又は第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド、及び請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチドの１つを含むベクター。
【請求項３２】
請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチドの両方を含むベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項３１又は３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が哺乳動物Ｔ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞がヒトＴ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣ系、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を活性化リガンドと接触させるステップとを含む、細胞シグナル伝達を誘導する方法。
【請求項３８】
前記活性化リガンドが、
ｃ）式：
【化１】
2018511602.tif 000011
（式中、
Ｅは、三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキル又は三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮ、又はＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであり、又はＲ３並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、若しくは酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであり、又はＲ２並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、又は酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ、又はＳｅｔである）の化合物、又は
ｄ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、若しくは幼若ホルモンＩＩＩ
である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣ系、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記活性化リガンドが、式：
【化２】
2018511602.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、ａ）Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）シアノアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ３−Ｃ５）シクロアルキル；又はｂ）置換基が独立して１〜５Ｈ、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、（Ｃｉi−Ｃ６）アルキル、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである非置換又は置換ベンジルであり；並びに
Ｒ５はＨ；ＯＨ；Ｆ；Ｃｌ；又は（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシであり、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ５がＨ、ヒドロキシル、メトキシ、又はフルオロである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＨではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１つのみがメチルであり、Ｒ５がＨ又はヒドロキシルである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの残りはＨではなく；
Ｒ４並びにＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの１つが両方ともメチルである場合、Ｒ５はＨでもヒドロキシルでもなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が全てメチルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が全てＨであり、Ｒ５がヒドロキシルである場合、Ｒ４はエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、アリル、又はベンジルではないことを条件とする）の化合物である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣ系、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記活性化リガンドが、式：
【化３】
2018511602.tif 000013
（式中、Ｘ及びＸ’は独立してＯ又はＳであり；
Ｙは：
（ａ）置換基が独立して１〜５Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換フェニル；又は
（ｂ）置換基が独立して１〜４Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換２−ピリジル、３−ピリジル、若しくは４−ピリジル
であり；
Ｒ１及びＲ２は独立して：Ｈ；シアノ；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルキル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニルアルキルであり；又はＲ１及びＲ２の原子価は一緒になって、（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換若しくは非置換アルキリデン基（ＲａＲｂＣ＝）（Ｒａ及びＲｂの非置換基炭素の合計は０〜６である）を形成し；
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、又はシアノであり；
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり；並びに
Ｒ５及びＲ６は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ４）アルケニルアルキル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロであり、又は一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖として、Ｒ５及びＲ６が結合したフェニル炭素と環を形成し；ここで、Ｒ９及びＲ１０は独立して：Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ベンゾイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ホルミル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）チオ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり；ここで、ｎ＝１〜３であり、Ｒｃ及びＲｄは示された長さの直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｅ、ＲｆはＨ又は示された長さの直鎖若しくは分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｇはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又はアリールを表し、並びにＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立であり、
但し、
ｉ）Ｒ９及びＲ１０が両方ともＨである場合、又は
ｉｉ）Ｒ９若しくはＲ１０のどちらかがハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又はベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである場合、又は
ｉｉｉ）Ｒ５及びＲ６が一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖を形成しない場合、
シアノ置換のものを除く、基Ｒ１又はＲ２のどちらか又は両方の炭素原子の数は４より大きく、シアノ置換のものを除く、基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の合計の炭素原子の数は１０、１１、又は１２であることを条件とする）の化合物である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣ系、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣ系、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に導入するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を活性化リガンドと接触させるステップと、
ｃ）リガンドにより誘導される生物学的活性又はポリペプチドオリゴマー化の絶対量又は相対量を定量するステップと
を含む、リガンドにより誘導される細胞シグナル伝達を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]本発明の分野は細胞分子生物学である。詳細には、本発明の分野は、細胞シグナル伝達及び細胞シグナル伝達を遺伝子改変又は遺伝子修飾する方法である。より詳細には、本発明は、宿主細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用を調節する新規の核内受容体ベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[002]遺伝子工学及び医学の分野では、細胞シグナリング経路の的確なコントロール及び調節は、発生及び他の生理学的プロセス（例えば病的状態）を研究、操作、及びコントロールするための有益な需要が高いツールである。シグナリング経路は、増殖、分化、及びアポトーシスを含む多様な細胞プロセス及び機能を制御することが知られている。シグナリング経路は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化等）及びタンパク質−タンパク質相互作用等の幾つかの機構により制御され得る。シグナリング経路を活性化又は制御する１つの一般的な機構は、タンパク質−タンパク質相互作用を介した多タンパク質複合体（例えば、二量体、三量体、及びオリゴマー）の形成による。そのような複合体は、同じタンパク質の多重コピー（ホモ複合体）又は異なるタンパク質のコピー（ヘテロ複合体）を含み得る。タンパク質−タンパク質相互作用の誘導及び複合体の形成は、幾つかの場合においてメンバータンパク質（例えば受容体分子）のうちの１つ又は複数へのリガンドの結合により引き起こされる。多数のそのような細胞シグナリング経路が発見され、特徴付けられているが、医薬的に許容可能な及び利用可能な活性化リガンドを用いて、迅速、効率的、確実な方法でそのような経路を標的とし、操作することができる必要性が残っている。
【０００３】
[003]細胞シグナリング経路の調節系が比較的希少であるのとは対照的に、転写因子間のタンパク質−タンパク質相互作用の誘導により遺伝子発現を制御する方法が開発及び使用されている。遺伝子発現がタンパク質合成の第一歩として必要なＲＮＡを産生するように遺伝子発現が引き起こされるためには、遺伝子転写をコントロールするプロモーターに転写活性化因子を近接させなければならない。典型的には、転写活性化因子自体を、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質と結合させる。故に、遺伝子発現が生じるためには、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインから適切な距離に位置する活性化ドメインを含むタンパク質が、遺伝子のプロモーター領域の正しい位置に動員されなければならない。
【０００４】
[004]タンパク質−タンパク質相互作用を誘導する１つの方法は、イムノフィリン、ＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができるＦＫ５０６、ラパマイシン、及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制分子に依存する。２つのタンパク質の各々にＦＫ５０６を配置することにより、又は一方にＦＫ５０６、他方にシクロスポリンＡを配置することにより、任意の２つのタンパク質を結び付ける一般的な戦略が考案されている。次いで、これらの分子の二量体化を誘導するのに、ＦＫ５０６の合成ホモ二量体（ＦＫ１０１２）又はＦＫ５０６−シクロスポリンの融合から生じる化合物（ＦＫＣｓＡ）が使用され得る（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９〜２４頁；Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：４６０４〜７頁）。Ｇａｌ４結合部位を含有するプロモーターコントロール下のレポーター遺伝子のヘテロ二量体化及び活性化を示すのに、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン及びシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン、並びにＦＫＣｓＡ化合物が使用された。残念なことに、この系は望ましくない副作用を有し得る免疫抑制剤を含み、したがって、様々な哺乳動物適用での使用は限定される。
【０００５】
[005]制御遺伝子発現を示すために、ステロイドホルモン受容体系等の高等真核生物転写活性化系も使用されている。ステロイドホルモン受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物及び無脊椎動物細胞で見出される。残念なことに、特に植物及び哺乳動物において、遺伝子発現を制御する受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、ステロイド化合物がそのような生物における多くの他の天然の生物学的経路に関与することから限定される。そのような問題を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いて代替系が開発された。
【０００６】
[006]昆虫における成長、脱皮、及び発生は、エクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）及び幼若ホルモンにより制御される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ４３：５４５〜５６９頁）。昆虫におけるエクジソンの分子標的は、少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）及びウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）から成る。ＥｃＲは、シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ＤＮＡ及びリガンド結合ドメイン、並びに活性化ドメインを特徴とする核内ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら  １９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９〜７７頁）。ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡ及びムリステロンＡ等の幾つかのステロイド化合物に応答する。市販の殺虫剤、テブフェノジド及びメトキシフェノジドを含む、エクジステロイドアゴニスト活性を有する非ステロイド化合物も記載されている（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号及び米国特許第５，５３０，０２８号を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。両方の類似体は、他の生物において並外れた安全性プロファイルを有する。
【０００７】
[007]昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の昆虫ホモログであるウルトラスピラクル（ＵＳＰ）とヘテロ二量体化し、リガンド結合ドメインを通じてエクジステロイドに結合し、及びエクジソン受容体応答エレメントにも結合してエクジソン応答性遺伝子の転写を活性化する（Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄら、２０００）。
【０００８】
[008]ＥｃＲは、５つの分子ドメイン、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体化））、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロ二量体化及びトランス活性化）及びＦ（トランス活性化）ドメインを有する。Ａ／Ｂ、Ｃ及びＥ等のこれらのドメインの幾つかは、他のタンパク質に融合されたときその機能を保持する。ＥｃＲは核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、グループＨに分類される（本明細書では「グループＨ核内受容体」と呼ばれる）。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインにおいて４０〜６０％アミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔら、Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９；Ｃｅｌｌ  ９７：１６１〜１６３頁）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、グループＨの他のメンバーには、ユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、及びファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）が含まれる。
【０００９】
[009]哺乳動物細胞において昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化することができ、標的遺伝子の発現をリガンド依存的に制御するのに使用できることが示されている。しかし、そのような発現系成分の使用は、タンパク質−タンパク質相互作用を制御するために、又は例えば、細胞外及び細胞内シグナル伝達経路並びにタンパク質−タンパク質結合の制御、コントロール、誘導、若しくは抑制に使用するために企図、実証、又は適用されていない。
【００１０】
[010]他の遺伝子発現系が開発されているが、植物及び動物の両方においてタンパク質−タンパク質相互作用の制御を介して細胞シグナリング経路の的確な調節を可能にする系の必要性は残っている。
【００１１】
[011]様々な刊行物が本明細書に引用されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１２】
[012]幾つかの実施形態において、本発明は、核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、核内受容体タンパク質の異なる断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドとを含む２つのポリペプチドであって、第１のポリペプチドが活性化リガンドに結合することができ、第２のポリペプチドが活性化リガンドの存在下で第１のポリペプチドと結合することができ、第１及び第２のポリペプチドの活性化リガンドにより誘導される結合が、活性化した機能的、生物学的、又は細胞シグナル伝達状態をもたらすように、第１及び第２のポリペプチドの各々が異種アミノ酸又はポリペプチド配列をさらに含む、２つのポリペプチドを含む。
【００１３】
[013]本発明の特定の実施形態において、一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインは、節足動物核内受容体アミノ酸配列を含む。
【００１４】
[014]本発明の幾つかの実施形態において、一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインはグループH核内受容体アミノ酸配列を含む。
【００１５】
[015]本発明の特定の実施形態において、第１のポリペプチドの核内受容体アミノ酸配列は、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む。
【００１６】
[016]本発明の幾つかの実施形態において、第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインは、哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む。
【００１７】
[017]本発明の特定の実施形態において、哺乳動物核内受容体タンパク質断片又はドメインは、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む。
【００１８】
[018]本発明の幾つかの実施形態において、第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインは、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む。
【００１９】
[019]本発明の特定の実施形態において、第２のポリペプチド 核内受容体タンパク質断片又はドメインは、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む。
【００２０】
[020]幾つかの実施形態において、本発明は、ａ）節足動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、ｂ）節足動物及び／又は哺乳動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドとを含み、第１及び第２のポリペプチドが、活性化リガンドと接触した後に活性化した機能的、生物学的又は細胞シグナル伝達状態を生ずることができる追加の異種配列を含む、リガンド誘導性ポリペプチドカップリング（ＬＩＰＣ）系を含む。
【００２１】
[021]本発明の幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣの一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインはグループＨ核内受容体アミノ酸配列を含む。
【００２２】
[022]本発明の特定の実施形態において、ＬＩＰＣの第１のポリペプチドは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む。
【００２３】
[023]本発明の幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣの第２のポリペプチドは哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む。
【００２４】
[024]本発明の特定の実施形態において、ＬＩＰＣの第２のポリペプチドは、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む。
【００２５】
[025]本発明の幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣの第２のポリペプチドは、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む。
【００２６】
[026]本発明の特定の実施形態において、ＬＩＰＣの第２のポリペプチドは、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む。
【００２７】
[027]本発明の幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣを含む本発明の第１及び第２のポリペプチドの核内受容体タンパク質断片は、スプルースバッドワーム（ｓｐｒｕｃｅ  ｂｕｄｗｏｒｍ）（トウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ））ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ））ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）ＬＢＤ、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）ＬＢＤ、ユスリカ（キミドリユスリカ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ））ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カイコガ（ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、ミバエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、蚊（ネッタイシマカ）（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カピタータ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ））ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カプリナ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ））ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、地中海ミバエ（セラチチス・カピタータ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ））ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、バッタ（トノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ））ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、アブラムシ（モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ））ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、シオマネキ（セルカ・プギレーター（Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ））ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、コナジラミ（シルバーリーフコナジラミ（Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ））ＥｃＲ（ＢａＥｃＲ）ＬＢＤ、ヨコバイ（ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ））ＥｃＲ（ＮｃＥｃＲ）ＬＢＤ、及びマダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ））ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）ＬＢＤから成る群から選択されるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する。
【００２８】
[028]本発明の特定の実施形態において、ＬＩＰＣを含む本発明の第１及び第２のポリペプチドの核内受容体タンパク質断片は、配列番号１（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号２（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号３（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号４（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号５（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドにコードされるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する。
【００２９】
[029]本発明の特定の実施形態において、エクジソン受容体ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号６（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号７（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号８（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号９（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号１０（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む。
【００３０】
[030]本発明の特定の実施形態において、エクジソン受容体ポリペプチド配列は、対応する野生型エクジソン受容体ポリペプチドと比べて約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、又は置換変異を含む。
【００３１】
[031]本発明の特定の実施形態において、エクジソン受容体ポリペプチドは、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン変異を含むポリヌクレオチドによりコードされ、上記アミノ酸残基は、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基９５及び１１０、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１７５、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１２７、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１２７、及び１７５、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基５２、１０７、及び１７５、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基９６、１０７、及び１７５、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１１０、及び１７５、ｋ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、若しくは２１７、又はｌ）配列番号１９のアミノ酸残基９１若しくは１０５に相当する又は類似した位置にある。
【００３２】
[032]本発明の特定の実施形態において、エクジソン受容体ポリペプチドの置換変異は、ａ）配列番号１７のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、又はＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換変異、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、又はＣ２１７Ｓ置換変異、及びｃ）配列番号１９のＧ９１Ａ又はＡ１０５Ｐ置換変異から成る群から選択される。
【００３３】
[033]本発明の幾つかの実施形態において、レチノイドＸ受容体ポリペプチドは、脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド、無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド（ＵＳＰ）、並びに脊椎動物及び無脊椎動物ＲＸＲ由来のポリペプチド断片を含むキメラレチノイドＸポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを含む。
【００３４】
[034]本発明の特定の実施形態において、キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドは、脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、及び非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片から成る群から選択される少なくとも２つの異なるレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含む。
【００３５】
[035]本発明の幾つかの実施形態において、キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドは、ＥＦドメインヘリックス１、ＥＦドメインヘリックス２、ＥＦドメインヘリックス３、ＥＦドメインヘリックス４、ＥＦドメインヘリックス５、ＥＦドメインヘリックス６、ＥＦドメインヘリックス７、ＥＦドメインヘリックス８、ＥＦドメインヘリックス９、ＥＦドメインヘリックス１０、ＥＦドメインヘリックス１１、ＥＦドメインヘリックス１２、Ｆドメイン、及びＥＦドメインβプリーツシートから成る群から選択される少なくとも１つのレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドを含み、上記レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片は、第２のレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片と異なる種のレチノイドＸ受容体ポリペプチド又は異なるアイソフォームのレチノイドＸ受容体ポリペプチド由来である。
【００３６】
[036]本発明の特定の実施形態において、キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドは、ａ）配列番号１１、ｂ）配列番号１２のヌクレオチド１〜３４８及び配列番号１３のヌクレオチド２６８〜〜６３０、ｃ）配列番号１２のヌクレオチド１〜４０８及び配列番号１３のヌクレオチド３３７〜６３０、ｄ）配列番号１２のヌクレオチド１４６５及び配列番号１３のヌクレオチド４０３〜６３０、ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１〜５５５及び配列番号１３のヌクレオチド４９０〜６３０、ｆ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６２４及び配列番号１３のヌクレオチド５４７〜６３０、ｇ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６４５及び配列番号１３のヌクレオチド６０１〜６３０、並びにｈ）配列番号１２のヌクレオチド１〜７１７、配列番号１３のヌクレオチド６１３〜６３０の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３７】
[037]本発明の幾つかの実施形態において、キメラレチノイドＸポリペプチドは、ａ）配列番号１４、ｂ）配列番号１５のアミノ酸１〜１１６及び配列番号１６のアミノ酸９０〜２１０、ｃ）配列番号１５のアミノ酸１〜１３６及び配列番号１６のアミノ酸１１３〜２１０、ｄ）配列番号１５のアミノ酸１〜１５５及び配列番号１６のアミノ酸１３５〜２１０、ｅ）配列番号１５のアミノ酸１〜１８５及び配列番号１６のアミノ酸１６４〜２１０、ｆ）配列番号１５のアミノ酸１〜２０８及び配列番号１６のアミノ酸１８３〜２１０、ｇ）配列番号１５のアミノ酸１〜２１５及び配列番号１６のアミノ酸２０１〜２１０、並びにｈ）配列番号１５のアミノ酸１〜２３９、配列番号１６のアミノ酸２０５〜２１０のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む。
【００３８】
[038]本発明の特定の実施形態において、第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系の一方又は両方の追加の異種配列は膜貫通ドメインを含む。
【００３９】
[039]本発明の特定の実施形態において、第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣ系の膜貫通ドメインのうちの少なくとも１つはＩ型１回膜貫通である。
【００４０】
[040]本発明の特定の実施形態において、ＬＩＰＣ成分は、リガンドにより誘導される二量体化が起きると細胞死又はアネルギーをもたらす又は生ずる異種ポリペプチドに融合される。そのような系は、「自殺」又は「死滅」スイッチと呼ばれることがある。
【００４１】
[041]幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載された第１又は第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
[042]特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド、及び本明細書に記載された第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
[043]幾つかの実施形態において、本発明は、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つを含むベクターを含む。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された第１及び第２のポリヌクレオチドの両方を含むベクターを含む。幾つかの実施形態において、本発明のベクターは発現ベクターである。
【００４４】
[044]特定の実施形態において、本発明は、上記のベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を含む。幾つかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物Ｔ細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞はヒトＴ細胞である。
【００４５】
[045]幾つかの実施形態において、本発明は、第１及び第２のポリペプチド、ＬＩＰＣ系、ポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載されたいずれかのベクターを導入するステップと、宿主細胞を活性化リガンドと接触させるステップとを含む、細胞シグナル伝達を誘導する方法を含む。
【００４６】
[046]本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載された第１及び第２のポリペプチド、ＬＩＰＣ系、ポリヌクレオチド、ベクター、並びに／又は方法の活性化リガンドは、
ａ）式：
【化１】
2018511602.tif 000002
（式中、
Ｅは、三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキル又は三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮ、又はＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであり、又はＲ３並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、若しくは酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであり、又はＲ２並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、又は酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ、又はＳｅｔである）の化合物、又は
ｂ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ  、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、若しくは幼若ホルモンＩＩＩ
である。
【００４７】
[047]本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載された第１及び第２のポリペプチド、ＬＩＰＣ系、ポリヌクレオチド、ベクター、並びに／又は方法の活性化リガンドは、式：
【化２】
2018511602.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、ａ）Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）シアノアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ３−Ｃ５）シクロアルキル；又はｂ）置換基が独立して１〜５Ｈ、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、（Ｃｉ−Ｃ６）アルキル、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである非置換又は置換ベンジルであり；並びに
Ｒ５はＨ；ＯＨ；Ｆ；Ｃｌ；又は（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシであり、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ５がＨ、ヒドロキシル、メトキシ、又はフルオロである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＨではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１つのみがメチルであり、Ｒ５がＨ又はヒドロキシルである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの残りはＨではなく；
Ｒ４並びにＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの１つが両方ともメチルである場合、Ｒ５はＨでもヒドロキシルでもなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が全てメチルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が全てＨであり、Ｒ５がヒドロキシルである場合、Ｒ４はエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、アリル、又はベンジルではないことを条件とする）の化合物である。
【００４８】
[048]本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載された第１及び第２のポリペプチド、ＬＩＰＣ系、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は方法の活性化リガンドは、式：
【化３】
2018511602.tif 000004
（式中、Ｘ及びＸ’は独立してＯ又はＳであり；
Ｙは：
（ａ）置換基が独立して１〜５Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換フェニル；又は
（ｂ）置換基が独立して１〜４Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換２−ピリジル、３−ピリジル、若しくは４−ピリジル
であり；
Ｒ１及びＲ２は独立して：Ｈ；シアノ；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルキル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニルアルキルであり；又はＲ１及びＲ２の原子価は一緒になって、（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換若しくは非置換アルキリデン基（ＲａＲｂＣ＝）（Ｒａ及びＲｂの非置換基炭素の合計は０〜６である）を形成し；
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、又はシアノであり；
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり；並びに
Ｒ５及びＲ６は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ４）アルケニルアルキル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロであり、又は一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖として、Ｒ５及びＲ６が結合したフェニル炭素と環を形成し；ここで、Ｒ９及びＲ１０は独立して：Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ベンゾイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ホルミル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）チオ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり；ここで、ｎ＝１〜３であり、Ｒｃ及びＲｄは示された長さの直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｅ、ＲｆはＨ又は示された長さの直鎖若しくは分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｇはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又はアリールを表し、並びにＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立であり、
但し、
ｉ）Ｒ９及びＲ１０が両方ともＨである場合、又は
ｉｉ）Ｒ９若しくはＲ１０のどちらかがハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又はベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである場合、又は
ｉｉｉ）Ｒ５及びＲ６が一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖を形成しない場合、
シアノ置換のものを除く、基Ｒ１又はＲ２のどちらか又は両方の炭素原子の数は４より大きく、シアノ置換のものを除く、基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の合計の炭素原子の数は１０、１１、又は１２であることを条件とする）の化合物である。
【００４９】
[049]本発明のより完全な理解は、添付図面を参照することにより、その後の詳細な説明と合わせて考察される場合に得ることができる。図面に例示された実施形態は、本発明を例証することのみを意図され、例示された実施形態に本発明を限定すると解釈されるべきではない。追加の実施形態及び構成は、さらなる有用な実施形態を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＥｃＲ及びＲＸＲ成分を用いた例示的な転写スイッチの作動の構成及び形態を示す略図である。
【図２】リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）成分の概念を示す概略図である。活性化リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、融合成分（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、及びタンパク質サブユニット）の結合をもたらす。
【図３】細胞内ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が、膜貫通ドメインを介して細胞外成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）に融合されるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である。リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、細胞外融合成分の結合をもたらす。
【図４Ａ】細胞外ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が、膜貫通ドメインを介して細胞内成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）に融合されるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である（図４Ａ）。リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、細胞内融合成分の結合をもたらす。細胞内ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が膜にテザリングされ、細胞内成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）に融合されるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である（図４Ｂ）。リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、細胞内融合成分の結合をもたらす。
【図４Ｂ】細胞外ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が、膜貫通ドメインを介して細胞内成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）に融合されるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である（図４Ａ）。リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、細胞内融合成分の結合をもたらす。細胞内ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が膜にテザリングされ、細胞内成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）に融合されるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である（図４Ｂ）。リガンドの存在下、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、細胞内融合成分の結合をもたらす。
【図５】ＥｃＲ又はＲＸＲ成分は膜にテザリングされるが、他方の相補成分は細胞質に遊離しているリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を示す概略図である。リガンドの存在下、膜にテザリングされたＥｃＲ又はＲＸＲ成分が細胞質ＥｃＲ又はＲＸＲ成分と結合し、融合成分（例えば、シグナリング分子又はドメイン）の結合をもたらす。
【図６】スプリットルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系の略図である。リガンドの存在下でのみＥｃＲ及びＲＸＲ成分が結合し、スプリットｆＬｕｃの結合及びその後の活性を駆動する。
【図７】本明細書に記載されたリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）が、活性化リガンドの存在下でのみスプリットｆＬｕｃシグナルを駆動することを示すデータである。
【図８】本明細書に記載されたリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系の構築に使用された例示的な構築物の概略図である。
【図９】Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンドを用いたＲｘＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＥｃＲ及びＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＲｘＲのリガンド用量応答曲線を示す図である。
【図１０】Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンドを用いたＲｘＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＥｃＲ及びＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＲｘＲのリガンド用量応答曲線を示す図である。
【図１１】Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンドを介したＥｃＲ二量体化誘導を示す図である。
【図１２】Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンドを介したＥｃＲ二量体化誘導を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
[062]本明細書に提供される本発明は、宿主細胞において又は宿主細胞により発現されて融合タンパク質成分の結合をコントロール、制御又は調節することができるＥｃＲ−ＲＸＲ転写スイッチ系の成分（例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２００１／０７０８１６号、国際公開第２００２／０６６６１２号、国際公開第２００２／０６６６１３号、国際公開第２００２／０６６６１４号、国際公開第２００２／０６６６１５号、国際公開第２００３／０２７２６６号、国際公開第２００３／０２７２８９号、及び国際公開第２００５／１０８６１７号を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用する。タンパク質−タンパク質相互作用の１つの役割は、受容体−リガンド結合相互作用を介して、細胞質及び／若しくは細胞外シグナリングドメインを活性化すること、又は断片化タンパク質若しくは分裂タンパク質に機能性を取り戻させること等により、細胞シグナル伝達プロセスを開始することである。故に、この天然に存在する系は、（ＥｃＲリガンドの存在下）ＥｃＲ成分とＲＸＲ成分の間の「橋」の誘導形成により２つの不活性シグナリングドメインの結合を駆動して人工的に調節することができる（後者の成分は、シグナリングドメインポリペプチドと共に組み込まれ（すなわち融合され）ている）。
【００５２】
[063]特定の実施形態において本明細書に記載されているのは、リガンドにより誘導されるポリペプチドカップリングを介した細胞シグナリングドメインの選択的活性化に関する系及び方法である。上記系及び方法は、タンパク質−タンパク質相互作用の誘導（例えば、調節、コントロール、制御）及び（「オンデマンドの」）シグナリングドメインの活性化、又はシグナリングドメインの不活性化／抑制を可能にする、リガンドにより誘導されるポリペプチドカップリング系を提供する。
【００５３】
[064]したがって、本明細書に開示されているのは、（活性化リガンドを介した）互いとの物理的結合を誘導して他の結合タンパク質又はドメインの複合体を形成する（すなわち、タンパク質−タンパク質相互作用を誘導する）ために、（宿主細胞で発現される）遺伝子転写スイッチ系のタンパク質成分を使用する系及び方法である。リガンドにより誘導されるタンパク質結合は、例えば、活性化リガンドの存在下での細胞質及び／又は細胞外シグナリングドメインの活性化等の機能を開始することができる。故に、活性化リガンドの存在下、通常は不活性な２つのシグナリングドメインが、ＥｃＲ成分とＵＳＰ／ＲＸＲ成分の間の「橋」を介して結び付くことにより活性化され得る。
【００５４】
[065]特許請求の範囲及び／又は本明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用される場合、語「ａ」又は「ａｎ」の使用は「１つ」を意味し得るが、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１つを超える複数」の意味とも一致する。
【００５５】
[066]用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」及びその対応する略語「例えば（ｅ．ｇ．）」（イタリック体であってもなくても）の使用は、引用された特定の用語が代表例に過ぎず（すなわち、見本、サンプル、例示、モデル等）、特に明記されない限り、本発明の実施形態を参照又は引用された特定の例に限定することを意図するものではないことを意味する。
【００５６】
[067]遺伝子又はポリペプチド成分に関連して本明細書で使用される場合、フォワードスラッシュ文字（「／」）は（特に指示のない限り）、語「及び／又は」の略語である。例えば、特に指定のない限り、用語「ＵＳＰ／ＲＸＲ」は、ＵＳＰポリペプチド及びＲＸＲポリペプチド若しくはその断片の両方の成分の混合物（例えば、キメラポリペプチド）、又はＵＳＰポリペプチド成分若しくはこの断片（例えばドメイン）のみ、又はＲＸＲ成分若しくはこの断片（例えばドメイン）のみを有し得るポリペプチドを示す。
【００５７】
[068]本明細書及び請求項（請求項の範囲）で使用されるとき、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」等の有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等の含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包含的又は非限定的であり、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。本明細書に論じられた任意の実施形態は、本発明の任意の方法、系、宿主細胞、発現ベクター、又は組成物に関して実施できることが企図される。さらに、本発明の系、宿主細胞、発現ベクター、及び／又は組成物は、本発明の方法を達成するのに使用することができる。
【００５８】
[069]「合成の」は本明細書で使用されるとき、天然起源の化合物とは対照的に人力により化学反応を通じて形成される化合物を指す。
【００５９】
[070]「単離された」により、核酸、ペプチド、又はポリペプチドをその天然の環境から取り除くことが意味される。「精製された」により、任意の核酸（天然から取り除かれたもの（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む）であれ、又は実験室条件下で合成（ｃＤＮＡを含む）及び／若しくは増幅されたものであれ）、ペプチド、又はポリペプチドの純度が向上したことが意味される（ここで「純度」は相対語であり、「絶対純度」ではない）。しかし、核酸、ペプチド、及びポリペプチドは希釈剤又は補助剤と配合され、さらに実用目的のために単離され得ることが理解されるべきである。例えば、核酸は典型的には、細胞への導入に使用される場合、許容可能な担体又は希釈剤と混合される。
【００６０】
[071]「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合サブユニットから成る高分子化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これらは両方とも一本鎖又は二本鎖であってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。ＤＮＡは、線状、環状、又はスーパーコイルであってもよい。
【００６１】
[072]「核酸分子」は、一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスのどちらかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）若しくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、又はホスホロチオエート及びチオエステル等のこれらの任意のリン酸エステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが考えられる。用語核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、分子の一次及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定しない。故に、この用語は、特に環状又は線状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミド、及び染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる上で、５’配列は、ＤＮＡの非転写鎖、すなわち、ｍＲＮＡに相補的な配列を有する鎖に沿って５’から３’方向の配列のみを示す通常の慣習に従って本明細書に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００６２】
[073]用語「断片」は、ポリヌクレオチドに関連して、参照核酸と比べて長さが縮小し、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を共通部分にわたって含むヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、上記断片が構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれてもよい。そのような断片は、長さが本発明による核酸の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００若しくは６０００連続ヌクレオチドにわたるオリゴヌクレオチドを含む、又は代わりにそれから成る。特定の実施形態においてそのような断片は、長さが例えば６〜６，０００ヌクレオチドにわたる任意の整数のオリゴヌクレオチドを含んでもよく、又は代わりにそれから成ってもよい。特定の実施形態においてそのような断片は、（例えば、ポリヌクレオチドが完全又は部分的ポリペプチドオープンリーディングフレームをコードするように）長さが３で割り切れる任意の整数であってもよい。特定の実施形態においてそのような部分的ポリペプチド断片は、（例えば、ポリヌクレオチドが、ＰＣＲプライマー若しくは他のハイブリダイズ可能な断片として、又は合成若しくは制限断片長ポリヌクレオチドの生成に使用するために使用され得るように）長さが任意の整数であってもよい。
【００６３】
[074]本明細書で使用されるとき、「単離核酸断片」は、合成の非天然又は改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含有する一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態での単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡのうちの１つ又は複数のセグメントから成ってもよい。
【００６４】
[075]「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」はまた、コード配列に先行（５’非コード配列）及び後続（３’非コード配列）する制御配列を含む特異的タンパク質又はポリペプチドを発現する核酸断片も指す。「天然の遺伝子」は、自身の制御配列を有する状態で天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、一緒には天然に見出されない制御配列及び／又はコード配列を含む、天然の遺伝子ではないいずれの遺伝子も指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列された制御配列及びコード配列を含み得る。キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来するコード配列及び／又は異なる供給源に由来する制御配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおける天然の位置の天然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子又は「異種」遺伝子は、宿主生物又は細胞において通常は見出されないが、遺伝子導入により宿主生物又は細胞に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物及びキメラ遺伝子に挿入された天然の遺伝子を含み得るが、これに限定されない。「導入遺伝子」は、宿主生物又は細胞のゲノムに導入された外来又は異種遺伝子である。「異種」ＤＮＡは、細胞、又は細胞のゲノムの染色体部位に天然には位置しないＤＮＡを指す。幾つかの実施形態において、異種ＤＮＡは細胞にとって異質の遺伝子を含む。
【００６５】
[076]「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのどちらか）のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。故に、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。上記用語はまた、ポリヌクレオチドの例えばメチル化及び／又はキャッピングによる修飾形態、並びに非修飾形態も含む。上記用語はまた、天然に存在しない又は合成ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミド  ＤＮＡ又はｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドは、（例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、又はビオチン等の標識を共有結合させたヌクレオチドを用いて）標識することができる。幾つかの実施形態において、標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するプローブとして使用することができる。オリゴヌクレオチド（この１つ又は両方が標識され得る）は、完全長の核酸若しくは核酸の断片をクローニングするための、又は核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子と三重らせんを形成するのに使用することもできる。特定の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、例えば核酸合成装置で合成的に調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等の天然に存在しないリン酸エステル類似体結合により調製することができる。
【００６６】
[077]核酸及び／又は核酸配列は、これらが共通の祖先核酸又は核酸配列に天然又は人工的に由来する場合、「相同」である。タンパク質及び／又はタンパク質配列は、このコードＤＮＡが共通の祖先核酸又は核酸配列に天然又は人工的に由来する場合、相同である。相同分子はホモログと呼ばれてもよい。例えば、本明細書に記載された任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な変異誘発方法により修飾されてもよい。発現されると、この変異誘発核酸は、最初の核酸によりコードされたタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２個以上の核酸間又はタンパク質間（又はその配列間）の配列同一性から推測される。相同性の確立に有用な配列間の同一性の正確なパーセンテージは、問題の核酸及びタンパク質によって異なるが、わずか２５％の配列同一性が相同性を確立するのに日常的に使用される。より高いレベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％又はそれ以上も、相同性を確立するのに使用することができる。配列同一性のパーセンテージを決定する方法（例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載されており、一般に利用可能である。
【００６７】
[078]ＤＮＡ「コード配列」は、適切な制御配列のコントロール下に置かれる場合、インビトロ又はインビボで細胞において転写され及びポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適切な制御配列」は、コード配列内の上流（５’非コード配列）、又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、結合コード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造を含み得る。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンにより決定される。コード配列には、原核生物配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。コード配列が真核生物細胞での発現を意図するものである場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、コード配列の３’に位置する。
【００６８】
[079]ＯＲＦと略される「オープンリーディングフレーム」は、ＡＴＧ又はＡＵＧ等の翻訳開始シグナル又は開始コドン及び終結コドンを含み、ポリペプチド配列に翻訳され得る可能性がある核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）の長さを意味する。
【００６９】
[080]「相同組換え」は、別のＤＮＡ分子への外来ＤＮＡ配列の挿入（例えば、染色体へのベクターの挿入）を指す。幾つかの実施形態において、ベクターは相同組換えに特異的な染色体部位を標的とする。特異的相同組換えに関してベクターは、相補結合及び染色体へのベクターの組み込みを可能にする、染色体の配列に対する十分に長い相同領域を含有する。相同領域が長いほど、及び配列類似度が大きいほど、相同組換えの効率を高めることができる。
【００７０】
[081]「ベクター」又は「発現ベクター」は、宿主細胞に核酸をクローニング及び／又は導入するための任意の様式である。ベクター、付着セグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントを付着することができるレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、細胞においてＤＮＡ複製の自律単位として機能する任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方を含む。
【００７１】
[082]用語「プラスミド」は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態となり得る遺伝子をしばしば保有する染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有の構築物に、幾つかのヌクレオチド配列が連結され又は組換えられている、任意の供給源に由来する自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状、環状、又はスーパーコイルの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【００７２】
[083]ベクターは、当技術分野で既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターにより、所望の宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｗｕら、１９９２、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：９６３〜９６７頁；  Ｗｕ及びＷｕ、１９８８、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１４６２１〜１４６２４頁；並びに１９９０年３月１５日に出願されたＨａｒｔｍｕｔら、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
[084]ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入することも可能である（例えば、米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号及び第５，５８０，８５９号を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。受容体媒介ＤＮＡ送達アプローチも使用することができる（例えば、Ｃｕｒｅｌら、１９９２、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：１４７〜１５４頁；並びにＷｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９〜４４３２頁を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７４】
[085]用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性又は異種ＲＮＡ又はＤＮＡの取り込みを意味する。そのようなＲＮＡ又はＤＮＡが細胞内に導入されたとき、細胞は外来性又は異種ＲＮＡ又はＤＮＡを「トランスフェクトされ」ている。トランスフェクトされたＲＮＡ又はＤＮＡが表現型変化をもたらすとき、細胞は外来性又は異種ＲＮＡ又はＤＮＡにより「形質転換され」ている。形質転換ＲＮＡ又はＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込む（共有結合する）ことができる。
【００７５】
[086]「形質転換」は、遺伝的に安定な継承をもたらす宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」生物と呼ばれる。
【００７６】
[087]用語「選択可能なマーカー」は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカー等に基づき選択することができる同定因子、通常は抗生物質又は化学薬品耐性遺伝子を意味する。マーカー遺伝子の効果は、目的とする核酸の遺伝を追跡し、及び／又は目的とする核酸を受け継いだ細胞若しくは生物を同定するのに使用される。当技術分野で既知の及び使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を与える遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、例えば、アントシアニン制御遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
[088]用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づき同定することができる同定因子をコードする核酸を意味する。レポーター遺伝子の効果は、目的とする核酸の遺伝を追跡し、目的とする核酸を受け継いだ細胞若しくは生物を同定し、及び／又は遺伝子発現誘導又は転写を測定するのに使用される。当技術分野で既知の及び使用されるレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、及びβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が含まれるが、これらに限定されない。選択可能なマーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考えることもできる。
【００７８】
[089]「作動可能に連結された」は本明細書で使用されるとき、意図された様式でセグメントが機能できるようにするような方法でのＤＮＡセグメントの別のＤＮＡセグメントへの物理的及び／又は機能的連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はサイレンサー等の制御配列に、ＤＮＡ配列の転写の調節を直接又は間接的に可能にする様式で連結される場合、制御配列に作動可能に連結される。例えば、ＤＮＡ配列は、転写開始部位に関して正しいリーディングフレームで、プロモーターの転写開始部位に関して下流でプロモーターにライゲートされ、転写伸長がＤＮＡ配列の中を進めるようにする場合、プロモーターに作動可能に連結される。エンハンサー又はサイレンサーは、ＤＮＡ配列の転写をそれぞれ増加又は減少させるような様式でＤＮＡ配列にライゲートされる場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結される。エンハンサー及びサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流、下流に位置してもよく、又はＤＮＡ配列のコード領域内に埋め込まれてもよい。シグナル配列のＤＮＡは、シグナル配列がポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。用語「カセット」、「発現カセット」、及び「遺伝子発現カセット」は、（例えば、特異的制限部位又は相同組換えにより）核酸又はポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、カセット及び制限部位は、転写及び翻訳に適したリーディングフレームにカセットを確実に挿入するように設計することができる。「形質転換カセット」は、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、及び上記ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有するベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット及び形質転換カセットは、宿主細胞において目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を可能にするエレメントも含むことができる。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等が含まれ得るが、これらに限定されない。「制御領域」は、第２の核酸配列の発現を制御する核酸配列を意味する。制御領域は、特定の核酸の発現に天然に関与する配列（相同領域）を含んでもよく、又は異なるタンパク質若しくは合成タンパク質の発現に関与する異なる起源の配列（異種領域）を含んでもよい。特に、配列は、原核生物、真核生物、若しくはウイルス遺伝子の配列、又は特異的若しくは非特異的及び誘導的若しくは非誘導的に遺伝子の転写を刺激若しくは抑制する由来配列であってもよい。制御領域は、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、及びポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと導くシグナル配列を含む。「異種供給源」由来の制御領域は、天然では、発現される核酸に付随しない制御領域である。異種制御領域に含まれるのは、異なる種由来���制御領域、異なる遺伝子由来の制御領域、ハイブリッド制御配列、及び天然には存在しない制御配列である。
【００７９】
[090]「ペプチド」は、鎖中に連結された２個以上のアミノ酸残基を含有する化合物を指すのに本明細書で使用される。「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から成る高分子化合物である。アミノ酸は、以下の一般構造：
【化４】
2018511602.tif 000005
を有する。
【００８０】
[091]アミノ酸は、側鎖Ｒに基づき７つのグループに分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）硫黄原子を含有する側鎖、（４）酸性基又はアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側鎖、（６）芳香環を含有する側鎖、及び（７）プロリン（側鎖がアミノ基に融合されたイミノ酸）。
【００８１】
[092]「タンパク質」はポリペプチドを含む。「単離されたポリペプチド」又は「単離されたタンパク質」は、天然の状態では通常、そのポリペプチド又はタンパク質と結合している化合物（例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチド又はタンパク質である。「単離された」は、他の化合物との人工若しくは合成混合物、又は生物学的活性を妨げず、例えば不完全な精製、安定剤の添加、若しくは医薬的に許容可能な調製物への配合により存在し得る不純物の存在を排除することを意味するものではない。
【００８２】
[093]「置換変異体ポリペプチド」又は「置換変異体」は本明細書で使用されるとき、野生型又は天然に存在するポリペプチドと比べて、異なるアミノ酸との、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上の野生型又は天然に存在するアミノ酸の置換（複数可）を含む（又は置換（複数可）から成る）ポリペプチドを意味する。野生型又は天然に存在するポリペプチドと比較してたった１個のアミノ酸置換を含む置換変異体ポリペプチドは、「点変異体」又は「単一点変異体」ポリペプチドと呼ばれ得る。
【００８３】
[094]置換変異体ポリペプチドが１つ又は複数の野生型又は天然に存在するアミノ酸の置換を含む又はから成るとき、この置換は、置換のために欠失された同数の野生型若しくは天然に存在するアミノ酸、すなわち、２個の非野生型若しくは天然に存在しないアミノ酸により置き換えられた２個の野生型若しくは天然に存在するアミノ酸、又は置換のために欠失された同数でない野生型アミノ酸、例えば、１個の非野生型アミノ酸により置き換えられた２個の野生型アミノ酸（置換＋欠失変異）、又は３個の非野生型アミノ酸により置き換えられた２個の野生型アミノ酸（置換＋挿入変異）のどちらかを含み得、又はから成り得る。置換変異体は、参照ポリペプチド配列及び新たな置換アミノ酸残基内の置換されたアミノ酸残基及び数を示す省略命名法体系を用いて記載することができる。例えば、ポリペプチドの２０番目のアミノ酸残基が置換された置換変異体は「ｘ２０ｚ」と略すことができる（「ｘ」は親の、通常生じる、又は置き換えられる天然に存在するアミノ酸であり、「２０」はポリペプチド内の言及されたアミノ酸残基の位置又は数であり、「ｚ」は新たに置換されたアミノ酸である）。したがって、「Ｅ２０Ａ」又は「Ｇｌｕ２０Ａｌａ」と互換的に略された置換変異体は、上記置換変異体が、ポリペプチドの２０位のグルタミン酸（典型的には当技術分野で「Ｅ」又は「Ｇｌｕ」と略される）の代わりにアラニン残基（典型的には当技術分野で「Ａ」又は「Ａｌａ」と略される）を含むことを示す。
【００８４】
[095]ポリペプチドとの関連で使用される場合、「断片」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列が参照ポリペプチドのアミノ酸配列より短く、参照ポリペプチドの部分全体にわたって同一のアミノ酸配列を含む又はから成るポリペプチドを意味する（特に明記されない限り、例えば「．．．と９５％同一の断片」）。そのような断片は、断片が一部となるより大きなポリペプチドに必要に応じて含まれてもよい。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、長さが少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、又は５０００アミノ酸残基にわたるポリマーを含み得、又は代わりにそれから成り得る。特定の実施形態において、そのような断片は、長さが例えば４〜５，０００残基にわたる任意の整数のアミノ酸ポリマー（すなわち、ペプチド、ポリペプチド）を含み得、又は代わりにそれから成り得る。
【００８５】
[096]ポリペプチドとの関連で使用される場合、「トランケートする」又は「トランケートされた」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列が（Ｎ末端、Ｃ末端のどちらか、又はＮ末端及びＣ末端の両方で）より短いポリペプチド断片である（例えば、アミノ酸残基の欠失又は酵素的プロセシングから生じ得るような）。
【００８６】
[097]ポリペプチド又はタンパク質の「バリアント」は、類似のポリペプチド又はタンパク質に由来する（又は異なる）が、最初の又は参照ポリペプチド又はタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する任意の類似体、断片、トランケーション、誘導体、又は変異体である。ポリペプチド又はタンパク質の種々のバリアントが天然に存在し得る。これらのバリアントは、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いを特徴とする天然の対立遺伝子変異であってもよく、又はディファレンシャルスプライシング若しくは翻訳後修飾を伴ってもよく、又はバリアントは人工的に（例えば、遺伝的に、合成的に、組換えにより）改変されてもよい。当業者は、単一又は複数のアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、欠失、付加、又は置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有するバリアントを作製することができる。これらのバリアントは、特に：（ａ）１つ若しくは複数のアミノ酸残基が保存的若しくは非保存的アミノ酸により置換されたバリアント、（ｂ）１つ若しくは複数のアミノ酸がポリペプチド若しくはタンパク質に付加されたバリアント、（ｃ）アミノ酸のうちの１つ若しくは複数が置換基を含むバリアント、及び／又は（ｄ）ポリペプチド若しくはタンパク質が別のポリペプチドと融合されたバリアントを含み得る。遺伝的（抑制、欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含むこれらのバリアントを得るための手法は、当業者に既知である。本明細書に開示されたタンパク質の「機能的バリアント」又は「機能的断片」は、参照タンパク質の機能の少なくともの一部を保持する。例えば、タンパク質「機能的バリアント」又は「機能的断片」は、比較される参照タンパク質の生物学的活性又は機能の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％を保持し得る。さらに、タンパク質の「機能的バリアント」又は「機能的断片」は、例えば、１００連続アミノ酸残基ごとに少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の保存的アミノ酸置換を有する参照タンパク質のアミノ酸配列を含み得、又はから成り得る。句「保存的アミノ酸置換」又は「保存的変異」は、共通の特性（例えば、疎水性、親水性、イオン電荷、塩基性、酸性、極性、非極性等）を有する別のアミノ酸による１個のアミノ酸の置き換えを指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を明確にする機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化頻度を分析することである（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｕｌｚ、Ｇ．  Ｅ．及びＳｃｈｉｒｍｅｒ、Ｒ．  Ｈ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｕｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９））。そのような分析により、グループ内のアミノ酸が互いに優先的に交換し、それ故にタンパク質構造全体に対する影響が互いに最も似ているアミノ酸のグループを明確にすることができる（Ｓｃｈｕｌｚ、Ｇ．  Ｅ．及びＳｃｈｉｒｍｅｒ、Ｒ．  Ｈ．、上記参照）。保存的変異の例には、上記のサブフループ内のアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、正電荷が維持され得るようにアルギニンをリジンに及び逆もまた同様；負電荷が維持され得るようにアスパラギン酸をグルタミン酸に及び逆もまた同様；遊離−ＯＨが維持され得るようにスレオニンをセリンに；並びに遊離−ＮＨ２が維持され得るようにアスパラギンをグルタミンに）が含まれる。幾つかの例において、保存的アミノ酸置換が機能的バリアントの生物学的活性を妨げない又は抑制しないことが好ましい場合がある。幾つかの例において保存的アミノ酸置換は、親分子と比較して機能的バリアントの生物学的活性が増加するように機能的バリアントの生物学的活性を高めることができる。他の例において、保存的置換が少なくとも１つ又は複数の生物学的活性を妨げ、排除し、又は低減することが望ましい場合がある。
【００８７】
[098]或いは又はさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する参照タンパク質のアミノ酸配列を含み得、又はから成り得る。「非保存的変異」は、異なるグループ間のアミノ酸置換（すなわち、最初の及び置換されたＡＡが、疎水性、親水性、イオン電荷、極性、非極性、酸性、塩基性特性等に関する特性の違い等の異なる化学的特性を有する）を伴う。非保存的置換の幾つかの例は、トリプトファン（非極性）若しくはグルタミン酸（酸性）に対してリジン（塩基性）、チロシン（極性）若しくはヒスチジン（塩基性）に対してアスパラギン酸（酸性）、又はアルギニン（塩基性）若しくはセリン（極性）に対してフェニルアラニン（非極性）等であろう。幾つかの例において、非保存的アミノ酸置換が機能的バリアントの生物学的活性を妨げない又は抑制しないことが好ましい場合がある。幾つかの例において非保存的アミノ酸置換は、親分子と比較して機能的バリアントの生物学的活性が増加するように機能的バリアントの生物学的活性を高めることができる。他の例において、非保存的置換が少なくとも１つ又は複数の生物学的活性を妨げ、排除し、又は低減することが望ましい場合がある。
【００８８】
[099]「異種タンパク質」は、細胞において天然には産生されないタンパク質を指す。「成熟タンパク質」は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド（すなわち、一次翻訳産物に存在する任意のプレペプチド又はプロペプチドが取り除かれたもの）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわち、プレペプチド又はプロペプチドが依然として存在した）を指す。プレペプチド及びプロペプチドは、シグナルペプチド又は細胞内局在化シグナルであってもよいが、これらに限定されない。
【００８９】
[0100]用語「シグナルペプチド」は、分泌された成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から切断され、それ故に成熟タンパク質に存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜を越えて分泌タンパク質を指示し移行させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００９０】
[0101]「シグナル配列」は、細胞の表面で発現されるタンパク質のコード配列の最初に含まれる。この配列は、ポリペプチドを移行させるよう宿主細胞に指示するシグナルペプチド（成熟ポリペプチドのN末端）をコードする。用語「移行シグナル配列」は、このタイプのシグナル配列を指すのに使用することもできる。移行シグナル配列は、真核生物及び原核生物由来の様々なタンパク質と関連して見出され得、両方の種類の生物においてしばしば機能する。
【００９１】
[0102]用語「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド分子間の同一性のパーセントを指す。１つの分子の配列と別の分子の配列の一致は、当技術分野で既知の手法により決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により決定することができる。或いは、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化、及び消化断片のサイズ決定により決定することができる。
【００９２】
[0103]したがって、用語「配列類似性」は全てのその文法形態において、共通の進化的起源を共有し得る又はし得ないタンパク質の核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性、相同性、又は一致の程度を指す（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７頁を参照のこと）。特定の実施形態において、ＤＮＡ配列又はアミノ酸配列の定義された長さに対して、ヌクレオチドの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％がマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」している。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的ソフトウェアを用いて、又は例えば当業者により理解されるストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比較して同定することができる。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、セ氏約４５度で標的、「プローブ」、若しくは検出試薬ＤＮＡのいずれかとフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、これに続く０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、セ氏約５０〜６５度で１回若しくは複数回の洗浄と、これに続く０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、セ氏約６８度で１回又は複数回の洗浄；又は、当業者に既知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．  Ｍ．ら編、１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６．３．１−６．３．６及び２．１０．３頁を参照のこと）を含み得、又は代わりにそれから成り得る。そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【００９３】
[0104]ポリペプチドの２つの核酸配列又はアミノ酸配列という文脈において用語「同一の」又は「配列同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致について整列された場合に同じである２つの配列の残基を指す。「比較ウィンドウ」は本明細書で使用されるとき、２つの配列が最適に整列された後で、配列が同数の連続位置の参照配列と比較され得る少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、又は少なくとも約１０００残基のセグメントを指す。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２頁の局所相同性アルゴリズム；その全体が参照により本明細書に組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３頁のアライメントアルゴリズム；その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４頁の類似性の検索方法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない）により行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７〜２４４頁、並びにＨｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３頁；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１〜１０８９０頁；Ｈｕａｎｇら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５〜１６５頁；及びＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７〜３３１によりよく記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。コンピュータソフトウェアベースのアライメントに加えて、アライメントは、手動検査及び手動アライメントにより行うこともできる。
【００９４】
[0105]実施形態の１つのクラスにおいて、ポリペプチドは、デフォルトパラメータを用いて（例えば、ＢＬＡＳＴＰ若しくはＣＬＵＳＴＡＬ、又は他のアライメントソフトウェアにより測定されるとき）参照ポリペプチド又はその断片と７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一である。同様に、核酸も出発核酸に関して記載することができ、例えば、核酸は、（例えば、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＮ若しくはＣＬＵＳＴＡＬ、又は他のアライメントソフトウェアにより測定されるとき）参照核酸又はその断片と５０％、少なくとも５０％、６０％、少なくとも６０％、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。１つの分子がより大きな分子と特定のパーセンテージの配列同一性を有すると言われるとき、２つの分子が最適に整列されている場合、２つの分子が最適に整列される順に従って、より小さな分子における前記パーセンテージの残基がより大きな分子におけるマッチ残基となり、「％」（パーセント）同一性はより小さな分子の長さに合わせて計算されることを意味する。
【００９５】
[0106]用語「実質的に同一の」は核酸又はアミノ酸配列に適用されるとき、核酸又はアミノ酸配列が、参照配列と比較して７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、又は少なくとも９９％、又は１００％を有する配列を含む又はから成ることを意味する。上記に示されているように、配列同一性は、例えば、当業者に公知の、及び日常的に使用されるプログラムを用いて計算されてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁（１９９２）を参照のこと）。配列同一性のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の合計数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。実質的な同一性は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、又は少なくとも約１０００残基長の配列の領域にわたって存在することが好ましい。最も好ましい実施形態において、配列はコード領域の長さ全体にわたって実質的に同一である。
【００９６】
[0107]本明細書に開示されたタンパク質（機能的部分及びその機能的バリアントを含む）は、１つ又は複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでもよい。そのような合成アミノ酸は当技術分野で知られており、そのような合成アミノ酸には、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、ｔｒａｎｓ−３−及びｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロへキシルアラニン、シクロへキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロペタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、並びにα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
[0108]用語「実質的に精製された」は、その核酸、ポリペプチド、タンパク質、又は他の化合物が天然では結合しているポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、及び他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％超含まない、約７０％超含まない、約９０％超含まない核酸配列、ポリペプチド、タンパク質、又は他の化合物を指す。
【００９８】
[0109]「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブリすることができる。これらの構成単位は、ライゲート及びアニールされて遺伝子セグメントを形成し、遺伝子セグメントは次いで酵素的にアセンブリされて遺伝子全体を構築する。「化学的に合成された」はＤＮＡの配列に関連するとき、成分ヌクレオチドがインビトロでアセンブリされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は、確立した手順を用いて達成することができる。コドン利用が、コドンが発現される宿主細胞又は生物に好まれるコドンに偏るならば、当業者は遺伝子発現の増大の可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいてもよい。
【００９９】
[0110]ポリペプチド、ヌクレオチド、又はその断片に関連して使用される場合、用語「ハイブリッド」は本明細書で使用されるとき、そのアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列が天然には見出されないポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はその断片を指す。例えば、２つの異種タンパク質又はポリペプチドの融合タンパク質、又は融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【０１００】
[0111]「リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｕｐｌｅｒ）」及び「リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓ）」は、「ＬＩＰＣ」及び「ＬＩＰＣｓ」と本明細書において互換的に使用される（すなわち、「ＬＩＰＣ」が「カプラー（Ｃｏｕｐｌｅｒ）」（単数形）を意味するか又は「カプラー（Ｃｏｕｐｌｅｒｓ）」（複数形）を意味するかに関係なく）。そのため、ＬＩＰＣは、本明細書に記載された融合タンパク質への核内受容体ポリペプチド成分の組み込み（例えば、ＥｃＲリガンド結合ポリペプチド及び核内受容体ＵＳＰ及び／又はＲＸＲ核内受容体ポリペプチド成分（例えば、そのポリペプチド断片又はドメイン）を含む、グループＨ核内受容体及びＥｃＲ受容体ポリペプチド成分（例えば、ＥｃＲポリペプチド断片又はドメイン）の使用により、小分子リガンド依存的にポリペプチドを結び付ける（「カップリングする」；すなわち、オリゴマー化する、二量体化する）ための系及びこの系のポリペプチド成分を指す。
【０１０１】
[0112]活性化リガンドの投与及びＬＩＰＣ成分の立体配置は、二量体化及びポリペプチドカップリング活性化のタイミング及び位置を制御するのに使用することができる。ＬＩＰＣは、宿主に由来しない及び異種配列によりコードされた遺伝子によりコードされたタンパク質因子に依存する。宿主系におけるポリペプチド成分の空間的及び時間的結合をコントロールするのに使用されるＬＩＰＣは、細菌、酵母、植物、昆虫、又はウイルス等の外来供給源に由来し得る。故に、ＬＩＰＣ核内受容体ポリペプチド成分は、ＬＩＰＣ成分が「融合」される（すなわち、融合タンパク質となるように改変される）ポリペプチド又はタンパク質の結合（例えば、二量体化、オリゴマー化）をコントロールする機構を提供して宿主における有用性を与える。
【０１０２】
[0113]「遺伝子スイッチ（ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈ）」又は「転写スイッチ」とも呼ばれる「遺伝子スイッチ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈ）」は、遺伝子発現をコントロールするのに使用され、導入遺伝子の意図的な制御のために人工的に設計される。遺伝子スイッチは典型的には、活性が制御され得るトランス活性化因子又はトランス抑制因子（ｔｒａｎｓ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び目的とする遺伝子をコントロールするためのトランス活性化因子応答性又はトランス抑制因子感受性プロモーターをコードする。これらの因子は、それぞれＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン及び転写活性化ドメイン、又は抑制ドメインを含有するリガンド応答性キメラタンパク質であってもよい。これらには、例えば、テトラサイクリンセンサリートランス活性化因子及びトランス抑制因子、哺乳動物又は昆虫ステロイド受容体由来トランス活性化因子、並びにラパマイシンにより誘導されるトランス活性化因子に基づく抗生物質応答性スイッチが含まれる。他の遺伝子スイッチは、物理的合図又はシグナルにより意図的に活性化することができ、一過性の活性化が宿主細胞により許容される内因性転写因子を利用する。この種類の系の例には、例えば熱又は電離放射線により活性化され得る転写因子を利用する遺伝子スイッチが含まれる。例えば、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ、Ｓ．及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、Ｍ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（電子リリース）１〜１４頁；Ｖｉｌａｂｏａ  Ｎ、Ｂｏｅｌｌｍａｎｎ  Ｆ、Ｖｏｅｌｌｍｙ  Ｒ（２０１１）Ｇｅｎｅ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｎｄｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２：１０７頁を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
[0114]１つの実施形態において、遺伝子スイッチは以下の成分を含む：１）アクチベーターリガンド非存在下で不安定な非生産的ヘテロ二量体を形成する同時活性化パートナー（ＣＡＰ）及びリガンド誘導性転写因子（ＬＴＦ）；２）アクチベーターリガンド：分子（例えば、エクジソン類似体又は他の非ステロイド小分子）；並びに３）誘導性プロモーター（例えば、ＬＴＦを結合するカスタマイズ可能なプロモーター）。１つの実施形態において、遺伝子スイッチは、小分子アクチベーターリガンドがスイッチ成分（ＣＡＰ及びＬＴＦ）と結合し、これにより誘導性プロモーターからの遺伝子転写を活性化し、最終的に所望のタンパク質の発現をもたらす場合にのみ、形質導入遺伝子の発現を可能にする。遺伝子スイッチのタイミング、位置、及び濃度は、アクチベーターリガンドにより用量依存的に制御することができる。特定の実施形態において、本出願人により開発されたＥｃＲベースの遺伝子スイッチの成分（例えば、商標ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）の下で言及される）は、本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣｓ）を生成する成分部分として使用される（例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２００１／０７０８１６号、国際公開第２００２／０６６６１２号、国際公開第２００２／０６６６１３号、国際公開第２００２／０６６６１４号、国際公開第２００２／０６６６１５号、国際公開第２００３／０２７２６６号、国際公開第２００３／０２７２８９号、及び国際公開第２００５／１０８６１７号を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
[0115]本発明において、ＥｃＲベースの「遺伝子スイッチ」の成分は、本明細書における開示により記載され、想定された「リガンド誘導性ポリペプチドカプラー」を作成するのに使用される。「エクジソン受容体」及び「ＥｃＲ」は本明細書において互換的に使用され、及びサブファミリー１、グループＨに分類される核内受容体の節足動物スーパーファミリーのメンバーを指す（本明細書では「グループＨ核内受容体」と呼ばれる）。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインにおいて４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＬａｕｄｅｔら、Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９；Ｃｅｌｌ  ９７：１６１〜１６３頁）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、グループＨの他のメンバーには、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、及びファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）が含まれる。ＥｃＲタンパク質は、シグネチャＤＮＡ及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、並びに活性化ドメインを特徴とする（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｅｌｌｅら  １９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９〜７７頁）。ＥｃＲ受容体は、幾つかのステロイド及び非ステロイド化合物、すなわち活性化リガンドに応答する。
【０１０５】
[0116]「レチノイドＸ受容体」及び「ＲＸＲ」は、本明細書において互換的に使用され、並びに核内ホルモン受容体ファミリー、特にステロイド及び甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーを指す。脊椎動物ＲＸＲは、特異的プロモーター利用及び選択的スプライシングにより多数のタンパク質産物を生ずる少なくとも３つの異なる遺伝子（ＲＸＲアルファ、ベータ、及びガンマ）を含む。ＲＸＲの無脊椎動物ホモログ（例えば、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）タンパク質）は広範な種で見出され、本発明での使用に想定される。
【０１０６】
[0117]「活性化リガンド」は本明細書で使用されるとき、核内ステロイド受容体スーパーファミリー（例えば、ＥｃＲ及びＲＸＲ）のメンバーに結合し、核内受容体成分の結合（例えば、二量体化、オリゴマー化、又はタンパク質−タンパク質相互作用）を誘導してメンバーを活性化することができる化合物を指す。本発明の例示的な活性化リガンドは以下に提供される。
【０１０７】
[0118]不活性なポリペプチド、ドメイン、シグナリング分子、タンパク質若しくはポリペプチド断片、又はポリペプチドのタンパク質サブユニットに言及する場合、用語「不活性な」又は「不活性化された」は本明細書で使用されるとき、固有の生物学的機能又は活性のうちの１つ又は複数の全て又は実質的に全てを現在発現していないタンパク質又はポリペプチドを指す。幾つかの実施形態において、不活性又は不活性化タンパク質又はポリペプチドは、別のタンパク質又はポリペプチドとの結合、すなわち、タンパク質−タンパク質相互作用により活性化する。そのような活性化は、例えば、第１の核内受容体リガンド結合タンパク質断片の第２の核内受容体タンパク質断片への結合により誘導されるオリゴマー化により生じ得る。第１及び第２の核内受容体断片は、２つの別個のより大きな第１及び第２の異種ポリペプチドの部分であり、第１及び第２の異種ポリペプチドは、リガンドにより誘導されるオリゴマー化が起きると、生物学的に不活性な状態から生物学的に活性な状態へ変化する。
【０１０８】
[0119]「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は本明細書で使用されるとき、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たすリンパ球のタイプである。Ｔ細胞は細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞及び天然キラー細胞（ＮＫ細胞）等の他のリンパ球と区別され得る。
【０１０９】
[0120]「抗体」は本明細書で使用されるとき、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指す。用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、同じエピトープに結合する抗体（例えば、Ｂ細胞の単一クローンにより産生される抗体等）を指す。対照的に、「ポリクローナル抗体」は、同じ抗原の種々のエピトープに結合する抗体（例えば、異なるＢ細胞の異種混合物により産生される抗体等）の集団を指す。本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）。
【０１１０】
[0121]本明細書に記載されるのは、別個のタンパク質又はドメインを結び付け、及びさもなければ別個のタンパク質又はドメイン（例えば、活性なシグナリング複合体を形成するために典型的には二量体化を必要とする受容体チロシンキナーゼポリペプチド（ＲＴＫ）等の、別個の生物学的に不活性なポリペプチド単量体）の結合（例えば、二量体化、オリゴマー化）を誘導する一対の相互作用核内受容体タンパク質の能力を利用する（融合タンパク質を生成するようにＬＩＰＣ（すなわち核内受容体）成分を改変して）、リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）である。特定の実施形態において、本発明のスイッチ系は、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースの系である。エクジソン受容体ベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラーは、「親」の非核内受容体（ＬＩＰＣ）ポリペプチド成分又はドメインに関して、ヘテロ二量体又はホモ二量体のどちらであってもよい。一方、機能的核内受容体（例えば、ＥｃＲ複合体）は、ステロイド受容体ファミリーの２つ以上のメンバーを含有するヘテロ二量体タンパク質複合体を指すと一般に理解されている。例えば、様々な昆虫から得られるエクジソン受容体タンパク質、及びウルトラスピラクル（ＵＳＰ）タンパク質又はＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）タンパク質（例えば、Ｙａｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６、４７６−４７９頁、及びＹａｏら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１、６３〜７２頁を参照のこと。これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
[0122]本発明は、２つ以上の発現カセット（例えば、別個のポリペプチド又はドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）に融合されたＥｃＲ及びＵＳＰ／ＲＸＲ成分をコードする）を含むことができる。活性化リガンドの存在下、ＥｃＲ含有ポリペプチドとＵＳＰ／ＲＸＲ含有ポリペプチドとの相互作用は、付加（融合）タンパク質又はドメインを近接近させ、それらの結合（タンパク質−タンパク質相互作用）を可能にする。例えば、図２〜６を参照のこと。
【０１１２】
[0123]エクジソン受容体複合体は、全てのメンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、及びヒンジ領域によりＤＢＤから隔てられたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在を一般に特徴とする、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を典型的には含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、４つ又は５つのドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及び幾つかのメンバーではＦ（例えば、米国特許第４，９８１，７８４号及びＥｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８８９〜８９５頁（１９８８）を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の存在も特徴とする。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、及び「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーの幾つかのメンバーは、ＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインも有し得る（「Ｆ」に対応）。
【０１１３】
[0124]これらのドメインは、異なる核内受容体タンパク質由来の、天然（すなわち天然に存在する）、修飾、又はキメラ（すなわち異種融合タンパク質）のドメインのいずれかであってもよい。ＥｃＲ、ＵＳＰ、及びＲＸＲのドメインは本来はモジュラーであるため、ＬＢＤ、ＤＢＤ、及びトランス活性化ドメインは互換することができる。
【０１１４】
[0125]特定の実施形態において、双翅類（ミバエ（キイロショウジョウバエ））又は鱗翅類（スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ））ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）がＬＩＰＣ系の一部として利用される。特定の実施形態において、脊椎動物又は哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００１／０７０８１６号を参照のこと）は、ＬＩＰＣ系の一部として利用される。特定の実施形態において、トノサマバッタのウルトラスピラクルタンパク質（「ＬｍＵＳＰ」）及びマダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）のＲＸＲホモログ１及びＲＸＲホモログ２（それぞれ「ＡｍａＲＸＲ１」及び「ＡｍａＲＸＲ２」）及びこれらの非双翅類、非鱗翅類ホモログ（シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、及びアブラムシ（モモアカアブラムシ）ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）を含むが、これらに限定されない。これらの全ては、本明細書ではまとめて無脊椎動物ＲＸＲと呼ばれる（及び脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と類似した機能を果たすことができる）がＬＩＰＣ系の一部として利用される。
【０１１５】
[0126]ＥｃＲ成分
[0127]本発明は、本明細書に記載されたリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系において使用されるエクジソン受容体（ＥｃＲ）ポリペプチド成分、例えば、ＥｃＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を提供する。本発明で使用することができる例示的なＥｃＲ成分は、例えば、国際ＰＣＴ国際公開第２００１／０７０８１６号、国際公開第２００２／０６６６１２号、国際公開第２００２／０６６６１３号、国際公開第２００２／０６６６１４号、国際公開第２００２／０６６６１５号、国際公開第２００３／０２７２６６号、国際公開第２００３／０２７２８９号、国際公開第２００５／１０８６１７号、及び国際公開第２００９／１１４２０１号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
[0128]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＥｃＲ成分は、ＥｃＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、又は関連したステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体ファミリーメンバーＬＢＤ、それらの類似体、組み合わせ、修飾、又は断片である。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣ  ＬＢＤは、トランケートＥｃＲポリペプチド又はＥｃＲ  ＬＢＤ由来である。トランケーション又はその置換変異は、制限エンドヌクレアーゼ消化／欠失、ＰＣＲ媒介オリゴヌクレオチド特異的欠失、化学的変異誘発、ＤＮＡ鎖破壊等を含むがこれらに限定されない当技術分野で使用される任意の方法により作製されてもよい。
【０１１７】
[0129]ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチド成分は、例えば節足動物綱から選択される無脊椎動物ＥｃＲであってもよい。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチド成分（又はその断片）は、鱗翅類ＥｃＲ、双翅類ＥｃＲ、直翅類ＥｃＲ、同翅類ＥｃＲ、及び半翅類ＥｃＲから成る群から選択される。特定の実施形態において、ＥｃＲは、スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、タバコスズメガＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、ニセアメリカタバコガＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、ユスリカ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、カイコガ（ボンビックス・モリ）ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ミバエ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、蚊（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ（ルシリア・カピタータ）ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）、クロバエ（ルシリア・カプリナ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）、地中海ミバエ（セラチチス・カピタータ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、バッタ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）、マダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）、コナジラミ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」、配列番号２０）、又はヨコバイ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」、配列番号２１）由来である。１つの実施形態において、ＬＩＰＣ  ＬＢＤ（又はその断片）は、スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）又はミバエ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）由来である。
【０１１８】
[0130]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＬＢＤは、トランケートＥｃＲポリペプチド由来である。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチドトランケーションは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、又は２６５個のアミノ酸の欠失をもたらす。ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチドトランケーションは、少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失をもたらすことが好ましい。ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチドトランケーションは、少なくともポリペプチドドメイン全体の欠失をもたらすことがより好ましい。特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチドトランケーションは、少なくともＡ／Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｆドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｆドメイン、部分的Ｅドメイン、又は部分的Ｆドメインの欠失をもたらす。幾つかの完全及び／又は部分的ドメイン欠失の組み合わせも行うことができる。
【０１１９】
[0131]幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣエクジソン受容体ポリペプチド成分又はその断片は、配列番号２２（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号２３（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号２４（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、若しくは配列番号２５（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）の核酸配列、又はそれらの断片を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１２０】
[0132]幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣエクジソン受容体ポリペプチド成分又はその断片は、配列番号１（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号２（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号３（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号４（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）若しくは配列番号５（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）、又はそれらの断片の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１２１】
[0133]特定の実施形態において、ＬＩＰＣエクジソン受容体ポリペプチド成分は、配列番号２６（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号２７（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号２８（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、若しくは配列番号２９（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）のアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣエクジソン受容体ポリペプチド成分は、配列番号６（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号８（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号７（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号９（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、若しくは配列番号１０（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む。
【０１２２】
[0134]さらに、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現（「遺伝子スイッチ」）系においてリガンド感受性及び遺伝子発現誘導の大きさに影響を与えるグループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン（例えば、ＥｃＲリガンド結合ドメイン）へのリガンド結合に関与するアミノ酸残基が同定されている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０２／０６６６１２号を参照のこと）。これらの置換変異体核内受容体ポリペプチド及びＬＩＰＣ系におけるその使用は、リガンド感受性の制御（調節、コントロール）及びリガンドにより誘導されるオリゴマー化の大きさが適用に応じて望み通りに選択され得る、宿主細胞及び生物における改善された、リガンドにより誘導される（「活性化」）ポリペプチドカップリングをもたらすことができる。以下にさらに記載されるように、置換変異（本明細書では「置換変異体」と呼ばれる）を含むグループＨ核内受容体が、本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）に使用され得る。
【０１２３】
[0135]本発明で使用されるＬＩＰＣエクジソン受容体（ＥｃＲ）ポリペプチド成分（ＥｃＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む）は、例えば節足動物綱ＥｃＲから選択される無脊椎動物ＥｃＲ由来であってもよい。特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチド成分は、鱗翅類ＥｃＲ、双翅類ＥｃＲ、直翅類ＥｃＲ、同翅類ＥｃＲ、及び半翅類ＥｃＲから成る群から選択される。特定の実施形態において、本発明で使用するためのＥｃＲリガンド結合ドメインは、スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、タバコスズメガＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、ニセアメリカタバコガＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、ユスリカ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｔＥｃＲ」）、カイコガ（ボンビックス・モリ）ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、スクインティングブッシュブラウン（ｓｑｕｉｎｔｉｎｇ  ｂｕｓｈ  ｂｒｏｗｎ）（ビシクラス・アニナナ（Ｂｉｃｙｃｌｕｓ  ａｎｙｎａｎａ））ＥｃＲ（「ＢａｎＥｃＲ」）、バックアイ（ｂｕｃｋｅｙｅ）（アメリカタテハモドキ（Ｊｕｎｏｎｉａ  ｃｏｅｎｉａ））ＥｃＲ（「ＪｃＥｃＲ」）、ミバエ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、蚊（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ（ルシリア・カピタータ）（「ＬｃＥｃＲ」）、クロバエ（ルシリア・カプリナ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）、クロバエ（カリフォラ・ビチニア（Ｃａｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎｉａ））ＥｃＲ（「ＣｖＥｃＲ」）、地中海ミバエ（セラチチス・カピタータ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、バッタ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）、マダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）、コナジラミ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ、又はヨコバイ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ由来である。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣポリペプチド成分はＣｆＥｃＲ、ＤｍＥｃＲ、又はＡｍａＥｃＲ由来である。
【０１２４】
[0136]特定の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基９５及び１１０、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１７５、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１２７、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１２７、及び１７５、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基５２、１０７、及び１７５、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基９６、１０７、及び１７５、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１１０、及び１７５、ｋ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、若しくは２１７、又はｌ）配列番号１９のアミノ酸残基９１若しくは１０５の置換をもたらすコドン変異を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる。特定の実施形態において、グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体由来である。特定の実施形態において、置換変異を含むＬＩＰＣ  ＥｃＲポリペプチド成分は、野生型又は天然に存在するＥｃＲ受容体リガンド結合ドメインポリペプチドと比べて、異なるアミノ酸との約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上の野生型又は天然に存在するアミノ酸の置換を含み得、又はから成り得る。
【０１２５】
[0137]別の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体リガンドポリペプチド成分は、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基５２に相当する若しくは類似した位置のアラニン、バリン、イソロイシン、若しくはロイシン残基、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のアラニン、スレオニン、アスパラギン酸、若しくはメチオニン残基、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン、セリン、メチオニン、若しくはロイシン残基、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２３に相当する若しくは類似した位置のフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基９５に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン残基、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｋ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｌ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１２７に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｍ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基並びに配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｎ）配列番号１７のアミノ酸残基に相当する若しくは類似した位置のバリン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｏ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｐ）配列番号１７のアミノ酸残基５２に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｑ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のスレオニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｒ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、配列番号１７のアミノ酸１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン残基、及び配列番号１７のアミノ酸１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｓ）２５配列番号１８のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のプロリン、ｔ）配列番号１８のアミノ酸残基１２１に相当する若しくは類似した位置のアルギニン若しくはロイシン、ｕ）配列番号１８のアミノ酸残基２１３に相当する若しくは類似した位置のアラニン、ｖ）配列番号１８のアミノ酸残基２１７に相当する若しくは類似した位置のアラニン若しくはセリン、ｗ）配列番号１９のアミノ酸残基９１に相当する若しくは類似した位置のアラニン、又はｘ）配列番号１９のアミノ酸残基１０５に相当する若しくは類似した位置のプロリンの置換をもたらすコドン変異を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる。特定の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分はエクジソン受容体由来である。
【０１２６】
[0138]別の実施形態において、置換変異を有するＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、ａ）配列番号１７のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａｌ１０Ｐ、Ａｌ１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ又はＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換変異、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、又はＣ２１７Ｓ置換変異、及びｃ）配列番号１９のＧ９１Ａ又はＡ１０５Ｐ置換変異から成る群から選択される置換変異をもたらすコドン変異を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる置換変異を含む又はから成る、エクジソン受容体リガンド結合ドメインである。
【０１２７】
[0139]他の実施形態において、置換変異を有するＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、５００ｍＭ未満の塩中少なくともセ氏３７度でのハイブリダイゼーションステップと、２×ＳＳＰＥ中少なくともセ氏６３度での洗浄ステップとを含むハイブリダイゼーション条件下で、ａ）配列番号１７のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、又はＡ１１０Ｍ、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、及びｃ）配列番号１９のＡ１０５Ｐから成る群から選択される置換変異をもたらすコドン変異を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる置換変異を含む又はから成る、エクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションステップに２００ｍＭ未満の塩及び少なくともセ氏３７度を含む。別の実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションステップ及び洗浄ステップの両方に２×ＳＳＰＥ及びセ氏６３度を含む。別の実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、又はムリステロンＡ結合活性等のステロイド結合活性を欠く、又は上記ステロイド結合活性の低下を示す。
【０１２８】
[0140]別の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基９５及び１１０、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１７５、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１２７、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１２７、及び１７５、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基５２、１０７、及び１７５、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基９６、１０７、及び１７５、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１１０、及び１７５、ｋ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、若しくは２１７、又はｌ）配列番号１９のアミノ酸残基９１若しくは１０５に相当する若しくは類似した位置に置換変異を有する。特定の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分はエクジソン受容体由来である。
【０１２９】
[0141]幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基５２に相当する若しくは類似した位置のアラニン、バリン、イソロイシン、若しくはロイシン残基、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のアラニン、スレオニン、アスパラギン酸、若しくはメチオニン残基、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン、セリン、メチオニン、若しくはロイシン残基、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２３に相当する若しくは類似した位置のフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基９５に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン残基、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、ｌ）配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｋ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｌ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基及び配列番号１７のアミノ酸残基１２７に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｍ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基並びに配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｎ）配列番号１７のアミノ酸残基５２に相当する若しくは類似した位置のバリン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｏ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｐ）配列番号１７のアミノ酸残基５２に相当する若しくは類似した位置のアラニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｑ）配列番号１７のアミノ酸残基９６に相当する若しくは類似した位置のスレオニン残基、配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、及び配列番号１７のアミノ酸残基１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｒ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のイソロイシン残基、配列番号１７のアミノ酸１１０に相当する若しくは類似した位置のプロリン残基、及び配列番号１７のアミノ酸１７５に相当する若しくは類似した位置のグルタミン残基、ｓ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７に相当する若しくは類似した位置のプロリン、ｔ）配列番号１８のアミノ酸残基１２１に相当する若しくは類似した位置のアルギニン若しくはロイシン、ｕ）配列番号１８のアミノ酸残基２１３に相当する若しくは類似した位置のアラニン、ｖ）配列番号１８アミノ酸残基２１７に相当する若しくは類似した位置のアラニン若しくはセリン、ｗ）配列番号１９のアミノ酸残基９１に相当する若しくは類似した位置のアラニン、又はｘ）配列番号１９アミノ酸残基１０５に相当する若しくは類似した位置のプロリンの置換を有する。特定の実施形態において、ＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分はエクジソン受容体由来である。
【０１３０】
[0142]別の実施形態において、置換変異を有するＬＩＰＣグループＨ核内受容体ポリペプチド成分は、置換変異が、ａ）配列番号１７のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｌ  Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ  Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、又はＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換変異、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、又はＣ２１７Ｓ置換変異、及びｃ）配列番号１９のＧ９１Ａ又はＡ１０５Ｐ置換変異から成る群から選択される、置換変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドである。
【０１３１】
特定の実施形態において、本発明のＬＩＰＣタンパク質において使用されるＥｃＲポリペプチド成分（アミノ酸配列）は、表１に示された置換から成る群から選択される１つ又は複数の置換変異を含む又は代わりにそれから成る。
【表１】
2018511602.tif 000006
【０１３２】
[0143]ＲＸＲ成分
[0144]本発明は、本明細書に記載されたリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）において使用される、ＲＸＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む特定のＲＸＲ成分を提供する。本発明において使用することができる例示的なＲＸＲ成分には、例えば、国際ＰＣＴ公開：国際公開第２００１／０７０８１６号；国際公開第２００２／０６６６１２号；国際公開第２００２／０６６６１３号；国際公開第２００２／０６６６１４号；国際公開第２００２／０６６６１５号；国際公開第２００３／０２７２６６号；国際公開第２００３／０２７２８９号；国際公開第２００５／１０８６１７号及び、国際公開第２００９／１１４２０１号に記載されているものが含まれる。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる.
【０１３３】
[0145]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲ成分は、マウス、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）又はヒト、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＲＸＲ（ＨｓＲＸＲ）である。ＬＩＰＣ  ＲＸＲ成分はＲＸＲα、ＲＸＲβ、若しくはＲＸＲγアイソフォーム、又はその断片であってもよい。
【０１３４】
[0146]幾つかの実施形態において、ＲＸＲ  ＬＩＰＣ成分はトランケートＲＸＲである。ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、又は２６５個のアミノ酸の欠失を含み得、又はから成り得る。特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む又はから成る。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少なくともポリペプチドドメイン全体の欠失を含む又はから成る。特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少なくともＡ／Ｂドメイン欠失、Ｃドメイン欠失、Ｄドメイン欠失、Ｅドメイン欠失、Ｆドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃドメイン欠失、Ａ  Ｂ／Ｃ／Ｄドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ  Ｄ／Ｆドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆドメイン、及びＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆドメイン欠失の欠失を含む又はから成る。幾つかの完全及び／又は部分的ドメイン欠失の組み合わせも行うことができる。
【０１３５】
[0147]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチド成分は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９から成る群から選択される核酸配列、又はそれらの断片を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３６】
[0148]別の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲ成分は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９から成る群から選択されるポリペプチド配列、又はそれらの断片を含む又はから成る。
【０１３７】
[0149]特定の実施形態において、本発明のＬＩＰＣには、１）脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、２）無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び３）非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片から成る群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含むキメラＲＸＲポリペプチドが含まれる。本発明のＬＩＰＣキメラＲＸＲポリペプチド成分は、２つの異なる動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含み得、若しくはから成り得、又は動物種が同じ場合、２つ以上のポリペプチド断片は、上記動物種のＲＸＲポリペプチド断片の２つ以上の異なるアイソフォーム由来であってもよい。
【０１３８】
[0150]幾つかの実施形態において、脊椎動物種のＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチド断片は、マウス、ハツカネズミＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）若しくはヒト、ホモ・サピエンスＲＸＲ（ＨｓＲＸＲ）、又はその断片を含む又はから成る。ＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチド成分は、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、若しくはＲＸＲγアイソフォーム、又はその断片を含み得、又はから成り得る。
【０１３９】
[0151]幾つかの実施形態において、脊椎動物種のＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチド断片は、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、及び配列番号６７から成る群から選択される核酸配列、又はそれらの断片を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる脊椎動物種のＲＸＲ由来である。別の実施形態において、脊椎動物種のＬＩＰＣ  ＲＸＲポリペプチド断片は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、及び配列番号７３から成る群から選択されるアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む又はから成る脊椎動物種のＲＸＲ由来である。
【０１４０】
[0152]別の実施形態において、ＬＩＰＣ無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片は、バッタ（トノサマバッタ）ウルトラスピラクルポリペプチド（ＬｍＵＳＰ）、マダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＲＸＲホモログ１（ＡｍａＲＸＲ１）、マダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＲＸＲホモログ２（ＡｍａＲＸＲ２）、シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＲＸＲホモログ（ＣｐＲＸＲ）、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＲＸＲホモログ（ＴｍＲＸＲ）、ミツバチ（セイヨウミツバチ）ＲＸＲホモログ（ＡｍＲＸＲ）、及びアブラムシ（モモアカアブラムシ）ＲＸＲホモログ（ＭｐＲＸＲ）由来である。
【０１４１】
[0153]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、若しくは配列番号５５の核酸配列、又はその断片を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド由来である。別の実施形態において、ＬＩＰＣ無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、若しくは配列番号６１のアミノ酸配列、又はその断片を含む又はから成る無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド由来である。
【０１４２】
[0154]特定の実施形態において、ＬＩＰＣ無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片は、非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲホモログ由来である。
【０１４３】
[0155]幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４４】
[0156]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４５】
[0157]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４６】
[0158]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの異なる脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４７】
[0159]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの異なる無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４８】
[0160]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、少なくとも１つの非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの異なる非双翅類  非鱗翅類無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む又はから成る。
【０１４９】
[0161]特定の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、ＥＦドメインヘリックス１、ＥＦドメインヘリックス２、ＥＦドメインヘリックス３、ＥＦドメインヘリックス４、ＥＦドメインヘリックス５、ＥＦドメインヘリックス６、ＥＦドメインヘリックス７、ＥＦドメインヘリックス８、及びＥＦドメインヘリックス９、ＥＦドメインヘリックス１０、ＥＦドメインヘリックス１１、ＥＦドメインヘリックス１２、Ｆドメイン、及び／又はＥＦドメインβプリーツシートから成る群から選択される少なくとも１つのポリペプチド断片を含むＲＸＲ領域を有し、２つ以上のドメインのうちの少なくとも１つは、異なる種のＲＸＲ（例えば、ヒトＲＸＲポリペプチド断片及びマウスＲＸＲポリペプチド断片）由来である。
【０１５０】
[0162]別の実施形態において、それぞれ、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は、第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜６、ヘリックス１〜７、ヘリックス１〜８、ヘリックス１〜９、ヘリックス１〜１０、ヘリックス１〜１１、又はヘリックス１〜１２を含む又はから成り、キメラＬＩＰＣ  ＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は、第２の種のＲＸＲのヘリックス７〜１２、ヘリックス８〜１２、ヘリックス９〜１２、ヘリックス１０〜１２、ヘリックス１１〜１２、ヘリックス１２、又はＦドメインを含む又はから成る。
【０１５１】
[0163]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜６を含む７〜１２又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックスを含む。
【０１５２】
[0164]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜７を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックス８〜１２を含む又はから成る。
【０１５３】
[0165]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜８を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックス９〜１２を含む又はから成る。
【０１５４】
[0166]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜９を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックス１０〜１２を含む又はから成る。
【０１５５】
[0167]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜１０を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックス１１〜１２を含む又はから成る。
【０１５６】
[0168]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜１１を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのヘリックス１２を含む又はから成る。
【０１５７】
[0169]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第１のポリペプチド断片は第１の種のＲＸＲのヘリックス１〜１２を含む又はから成り、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分の第２のポリペプチド断片は第２の種のＲＸＲのＦドメインを含む又はから成る。
【０１５８】
[0170]別の実施形態において、ＬＩＰＣ  ＲＸＲ成分はトランケートキメラＲＸＲを含む又はから成る。キメラＲＸＲトランケーションは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、又は２４０個のアミノ酸の欠失を含み得る。特定の実施形態において、キメラＲＸＲトランケーションは、少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失をもたらす。他の実施形態において、キメラＲＸＲトランケーションは、少なくともポリペプチドドメイン全体の欠失をもたらす。別の実施形態において、キメラＲＸＲトランケーションは、少なくとも部分的Ｅドメイン、完全Ｅドメイン、部分的Ｆドメイン、完全Ｆドメイン、ＥＦドメインヘリックス１、ＥＦドメインヘリックス２、ＥＦドメインヘリックス３、ＥＦドメインヘリックス４、ＥＦドメインヘリックス５、ＥＦドメインヘリックス６、ＥＦドメインヘリックス７、ＥＦドメインヘリックス８、及びＥＦドメインヘリックス９、ＥＦドメインヘリックス１０、ＥＦドメインヘリックス１１、ＥＦドメインヘリックス１２、及び／又はＥＦドメインβプリーツシートの欠失をもたらす。幾つかの部分的及び又は完全ドメイン欠失の組み合わせも行うことができる。
【０１５９】
[0171]特定の実施形態において、ＬＩＰＣトランケートキメラＲＸＲ成分は、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、若しくは配列番号７９の核酸配列、又はその断片を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態において、ＬＩＰＣトランケートキメラＲＸＲ成分は、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、若しくは配列番号８５の核酸配列、又はその断片を含む又はから成る。
【０１６０】
[0172]別の実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、ａ）配列番号１１、ｂ）配列番号１２のヌクレオチド１〜３４８及び配列番号１３のヌクレオチド２６８〜６３０、ｃ）配列番号１２のヌクレオチド１〜４０８及び配列番号１３のヌクレオチド３３７〜６３０、ｄ）配列番号１２のヌクレオチド１〜４６５及び配列番号１３のヌクレオチド４０３〜６３０、ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１〜５５５及び配列番号１３のヌクレオチド４９０〜６３０、ｆ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６２４及び配列番号１３のヌクレオチド５４７〜６３０、ｇ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６４５及び配列番号１３のヌクレオチド６０１〜６３０、並びにｈ）配列番号１２のヌクレオチド１〜７１７及び／又は配列番号１３のヌクレオチド６１３〜６３０の核酸配列、又はそれらの断片を含む又はから成るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６１】
[0173]別の好ましい実施形態において、ＬＩＰＣキメラＲＸＲ成分は、ａ）配列番号１４、ｂ）配列番号１５のアミノ酸１〜１１６及び配列番号１６のアミノ酸９０〜２１０、ｃ）配列番号１５のアミノ酸１〜１３６及び配列番号１６のアミノ酸１１３〜２１０、ｄ）配列番号１５のアミノ酸１〜１５５及び配列番号１６のアミノ酸１３５〜２１０、ｅ）配列番号の１５アミノ酸１〜１８５及び配列番号１６のアミノ酸１６４〜２１０、ｆ）配列番号１５のアミノ酸１〜２０８及び配列番号１６のアミノ酸１８３〜２１０、ｇ）配列番号１５のアミノ酸１〜２１５及び配列番号１６のアミノ酸２０１〜２１０、並びに／又はｈ）配列番号１５のアミノ酸１〜２３９若しくは配列番号１６のアミノ酸２０５〜２１０のアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む又はから成る。
【０１６２】
[0174]ＥｃＲ及び／又はＲＸＲポリペプチド成分
特定の実施形態において、本発明のＬＩＰＣにおいて使用されるＥｃＲ及び／又はＵＳＰ／ＲＸＲポリペプチドは、国際ＰＣＴ公開国際公開第２００１／０７０８１６号、国際公開第２００２／０６６６１２号、国際公開第２００２／０６６６１３号、国際公開第２００２／０６６６１４号、国際公開第２００２／０６６６１５号、国際公開第２００３／０２７２６６号、国際公開第２００３／０２７２８９号、及び国際公開第２００５／１０８６１７号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のうちのいずれか１つ又は複数に記載された置換変異体から成る群から選択される、少なくとも１つ又は複数のＥｃＲ及び／又はＲＸＲ置換変異体を含む又はから成る。
【０１６３】
[0175]本発明の遺伝子発現カセット
[0176]本発明の１つの実施形態は、ａ）ｉ）核内受容体ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第１の不活性シグナリングドメインとを含む第１の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞において発現され得る第１の発現カセットと、ｂ）ｉ）第２の核内受容体ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第２の不活性シグナリングドメインとを含む第２の別個の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞において発現され得る第２の発現カセットとを含み、上記２つの融合タンパク質が互いに結合すると、第１及び第２の不活性シグナリングドメインが活性化される、リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を含む。
【０１６４】
[0177]本発明の別の実施形態は、ａ）ｉ）節足動物核内受容体ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第１の不活性シグナリングドメインとを含む第１の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞において発現され得る第１の発現カセットと、ｂ）ｉ）第２の非節足動物核内受容体ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第２の不活性シグナリングドメインとを含む第２の別個の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞において発現され得る第２の発現カセットとを含み、上記２つの融合タンパク質が互いに結合すると、第１及び第２の不活性シグナリングドメインが活性化される、リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を含む。別の実施形態において非節足動物核内受容体は、非双翅類／非鱗翅類核内受容体ポリペプチド又はその断片を含む。別の実施形態において非節足動物核内受容体は、哺乳動物核内受容体ポリペプチド又はその断片を含む。別の実施形態において非節足動物核内受容体は、ヒト核内受容体ポリペプチド又はその断片を含む。別の実施形態において非節足動物核内受容体は、マウス核内受容体ポリペプチド又はその断片を含む。別の実施形態において非節足動物核内受容体は、キメラ核内受容体ポリペプチド又はその断片を含み、キメラは２つ以上の異なる種由来のポリペプチド成分を含む。
【０１６５】
[0178]本発明の１つの実施形態は、ａ）ｉ）エクジソン受容体（ＥｃＲ）ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第１の不活性シグナリングドメインとを含む第１の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞において発現され得る第１の発現カセットと、ｂ）ｉ）レチノイドＸ受容体ポリペプチド又はその断片と、ｉｉ）第２の不活性シグナリングドメインとを含む第２の別個の融合タンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞において発現され得る第２の発現カセットとを含み、上記２つの融合タンパク質が互いに結合すると、第１及び第２の不活性シグナリングドメインが活性化される、リガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）系を含む。
【０１６６】
[0179]以下に記載されるように本発明において任意選択で使用するためのリガンドは、本明細書に記載されたＥｃＲリガンド結合ドメイン及びＲＸＲリガンド結合ドメインと組み合わされる場合、シグナリングドメイン（複数可）の外的時間的制御（活性化又は活性化の中止；すなわち、リガンドの投与の停止又はリガンドとの接触の停止による）の手段を提供する。ＬＩＰＣ  ＥｃＲ及びＲＸＲポリペプチド成分へのリガンドの結合は、ＬＩＰＣ−融合タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用、及び特定の実施形態においてシグナリングドメインの活性化を可能にする。幾つかの実施形態において、ＬＩＰＣドメインのうちの１つ又は複数は、ハイブリッドＬＩＰＣを生成しながら変化する。特定の実施形態において、ハイブリッド遺伝子及び得られるハイブリッドタンパク質は、選択された宿主細胞又は生物においてリガンドの所望の活性及び相補結合のために最適化される。
不活性シグナリングドメイン
【０１６７】
[0180]本発明の実施形態は、不活性ドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然の又は改変された部分的又はトランケートタンパク質）のタンパク質−タンパク質相互作用又は結合による目的に合わせた（例えば、用量制御された、誘導性）活性化を可能にするリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系を含む。
【０１６８】
[0181]特定の実施形態において、活性が調節されるシグナリングタンパク質及び／又はポリペプチドドメインは、宿主細胞に関して相同なタンパク質又はその断片である。他の実施形態において、活性が調節されるシグナリングタンパク質及び／又はポリペプチドドメインは、宿主細胞に対して異種のタンパク質又はその断片である。
【０１６９】
[0182]本発明の実施形態は、疾患、障害、機能障害、遺伝的欠損、創薬のための標的、並びにプロテオミクス解析及びアプリケーション等に関与するポリペプチド又はシグナリングドメインをコードするシグナリングタンパク質及びポリペプチドドメインの組成物及び使用を含む。
【０１７０】
[0183]活性化のために結合（例えば、二量体化又はオリゴマー化）又はタンパク質−タンパク質相互作用を必要とする多数の細胞シグナリングポリペプチド及びドメイン（例えばシグナリングタンパク質）が広範囲の生物で同定されており、本発明において使用することができる。これらのシグナリング分子の多くは、多数の生物にわたって保存されているシグナリング経路に関与する。
【０１７１】
[0184]例えば、１回膜貫通ドメインを有する膜に固定された多くの細胞表面受容体は、内因性（すなわち天然に存在する）リガンドにより誘導される二量体化又はオリゴマー化により主に活性化される。一般に、これらの分子は自身では結合しないが、内因性細胞外リガンドとの相互作用を通じて結び付けられる（又はその結合パートナーに近接近される）。内因性の天然に存在する細胞シグナルタンパク質活性化とは対照的に、本発明は、小分子核内受容体活性化リガンドの「オンデマンドの」投与（又は投与の中止）により、細胞シグナリングタンパク質及びドメインの活性、すなわち、二量体化又はオリゴマー化を調節する（すなわち、活性化する、遮断する、増加させる又は減少させる）小分子リガンド誘導性ポリペプチドカプラー系を提供する。活性化にタンパク質二量体化又はオリゴマー化を利用する様々な分子及び経路の概説には、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｌｅｍｍら  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：５６９〜９２頁（１９９８）を参照のこと。
【０１７２】
[0185]特定の実施形態において、細胞表面受容体、細胞内シグナリングタンパク質、及びこれらの結合経路メンバー由来の以下のシグナリング分子及び／又はドメインが、本発明の第１及び／又は第２の不活性シグナリングドメイン、シグナリング分子、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、又は天然の若しくは改変された部分的若しくはトランケートタンパク質として、本発明と共に使用するために想定される。
【０１７３】
[0186]ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）（ＥｒｂＢファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＰＤＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶ（ＶＥＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩＩ（Ｔｒｋ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩＩＩ（Ｅｐｈ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸ（ＬＴＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＶ（ＲＥＴ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）、及びＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）を含む受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）受容体及びその結合経路メンバー。
【０１７４】
[0187]Ｉ型サイトカイン受容体（例えば、Ｉ型インターロイキン受容体、エリスロポエチン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、オンコスタチンＭ受容体、及び白血病抑制因子受容体）、ＩＩ型サイトカイン受容体（例えば、ＩＩ型インターロイキン受容体、インターフェロンアルファ／ベータ受容体、及びインターフェロンガンマ受容体）、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（例えば、インターロイキン−１受容体、ＣＳＦ１、Ｃ−ｋｉｔ受容体、及びインターロイキン−１８受容体）を含むサイトカイン受容体及びその結合経路メンバー。腫瘍壊死因子受容体ファミリー（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ１２０、及びリンホトキシンベータ受容体）。ケモカイン受容体（例えば、インターロイキン−８受容体、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ４、ＭＣＡＦ受容体、及びＮＡＰ−２受容体）。ＴＧＦベータ受容体（例えば、ＴＧＦベータ受容体１及びＴＧＦベータ受容体２）。抗原受容体シグナリング受容体（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞抗原受容体）。
【０１７５】
[0188]本発明と共に使用されることが想定される追加のシグナリングタンパク質及び／又はドメインには、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）タンパク質、ＮＦ−κＢタンパク質、抗体（抗体断片を含む）、転写因子、核内ホルモン受容体を含む核内受容体、１４−３−３タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、Ｇタンパク質、キネシン、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）、アルコール脱水素酵素、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、Ｔｏｌｌ様受容体、フィブリノーゲン、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、Ｓｍａｄファミリーメンバー等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
[0189]特定の実施形態において、本発明の不活性シグナリングドメインは膜貫通ドメインを有する。幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは１回膜貫通ドメインである。特定の実施形態において、１回膜貫通ドメインはＩ型１回膜貫通ドメインである。他の実施形態において、膜貫通ドメインは複数回膜貫通ドメインである。特定の実施形態において、膜貫通ドメイン（複数可）は親水性アルファヘリックスモチーフを有する。
活性化リガンド
【０１７７】
[0190]本発明と共に使用することができる許容される活性化リガンドは、リガンドの存在下で不活性シグナリングドメインの活性化をもたらすスイッチ系のシグナリングドメインのタンパク質−タンパク質相互作用を調節する全てのものである。そのようなリガンドには、国際ＰＣＴ公開国際公開第２００２／０６６６１２号、国際公開第２００２／０６６６１４号、国際公開第２００３／１０５８４９号、国際公開第２００４／０７２２５４号、国際公開第２００４／００５４７８号、国際公開第２００４／０７８９２４号、国際公開第２００５／０１７１２６号、国際公開第２００８／１５３８０１号、国際公開第２００９／１１４２０１号、国際公開第２０１３／０３６７５８号、国際公開第２０１４／１４４３８０号、並びに米国特許第６２５８６０３号及び第８７４８１２５号に開示されたものが含まれる。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
[0191]例示的なリガンドには、ポナステロン、ムリステロンＡ、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、米国特許第６０１３８３６号、第５１１７０５７号、第５５３００２８号及び第５３７８７２号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたもの等のＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；その全体が参照により本明細書に組み込まれる欧州出願第４６１８０９号に開示されたもの等のジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５２２５４４３号に開示されたもの等のＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；その全体が参照により本明細書に組み込まれる欧州出願第２３４９９４号に開示されたもの等のＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４９８５４６１号に記載されたもの等のＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、並びに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド等を含む他の類似した物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
[0192]特定の実施形態において、本発明の方法において使用するリガンドは、式：
【化５】
2018511602.tif 000007
（式中、Ｅは三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキル又は三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮ、又はＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであり、又はＲ３並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、若しくは酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであり、又はＲ２並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、若しくは酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ、又はＳｅｔである）の化合物である。
【０１８０】
[0193]幾つかの実施形態において、本発明の方法と共に使用するリガンドは、式：
【化６】
2018511602.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は：
a）Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）シアノアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ３−Ｃ５）シクロアルキル；ハロ、シアノ、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換されたオキシラニルであり；又は
ｂ）置換基が独立して１〜５Ｈ、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである非置換若しくは置換ベンジルであり；並びにＲ５はＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである）の化合物である。
【０１８１】
[0194]幾つかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がＨである場合、Ｒ５はＨ又はヒドロキシではない。
【０１８２】
[0195]特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＨではない。別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも２つはＨではない。別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも３つはＨではない。別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々はＨではない。
【０１８３】
[0196]幾つかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がＨである場合、Ｒ５はメトキシでなく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシではなく、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がＨであり及びＲ５がヒドロキシである場合、Ｒ４はメチル又はエチルではない。
【０１８４】
[0197]特定の実施形態においてに、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は：ａ）Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）シアノアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；ハロ、シアノ、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換されたオキシラニル；又はｂ）置換基が独立して１〜５Ｈ、ハロ、シアノ、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである非置換若しくは置換ベンジルであり；並びにＲ５はＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである。
【０１８５】
[0198]他の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；２’−エチルオキシラニル、又はベンジルであり；並びにＲ５はＨ；ＯＨ；又はＦである。
【０１８６】
[0199]特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；Ｒ５がＨ、ヒドロキシル、メトキシ、又はフルオロである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＨではなく；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の１つのみがメチルであり、並びにＲ５がＨ又はヒドロキシルである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの残りはＨではなく；Ｒ４並びにＲ１、Ｒ２、及びＲ３の１つが両方ともメチルである場合、Ｒ５はＨでもヒドロキシルでもなく；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が全てメチルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；並びにＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全てＨであり、並びにＲ５がヒドロキシルである場合、Ｒ４はエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、アリル、又はベンジルではない。
【０１８７】
[0200]本発明の特定の実施形態には、以下のステロイドリガンド：２０−ヒドロキシエクジソン、２−メチルエーテル；２０−ヒドロキシエクジソン、３−メチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、１４−メチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２，２２−ジメチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、３，２２−ジメチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、１４，２２−ジメチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２，２５−ジメチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２，３，１４，２２−テトラメチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２−Ｈ−プロピルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２−ｎ−ブチルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２−アリルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２−ベンジルエーテル：２０−ヒドロキシエクジソン、２２−（２８Ｒ，Ｓ）−２’−エチルオキシラニルエーテル：ポナステロンＡ、２−メチルエーテル：ポナステロンＡ、１４−メチルエーテル：ポナステロンＡ、２２−メチルエーテル：ポナステロンＡ、２，２２−ジメチルエーテル：ポナステロンＡ、３，２２−ジメチルエーテル：ポナステロンＡ、１４，２２−ジメチルエーテル：ダクリハイナンステロン（ｄａｃｒｙｈａｉｎａｎｓｔｅｒｏｎｅ）、２２−メチルエーテルの使用が含まれる。
【０１８８】
[0201]本発明の追加の実施形態には、以下のステロイドリガンド：２５，２６−ジデヒドロポナステロンＡ、（イソ−スタキステロンＣ（Δ２５（２６）））、シダステロン（ｓｈｉｄａｓｔｅｒｏｎｅ）（スタキステロンＤ）、スタキステロンＣ、２２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン（タキステロン（ｔａｘｉｓｔｅｒｏｎｅ））、ポナステロンＡ、ポリポルステロンＢ、２２−デヒドロ−２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ  ２２−メチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン、プテロステロン、（２５Ｒ）−イノコステロン、（２５Ｓ）−イノコステロン、ピンナタステロン（ｐｉｎｎａｔａｓｔｅｒｏｎｅ）、２５−フルオロポナステロンＡ、２４（２８）−デヒドロマキステロンＡ、２４−エピ−マキステロンＡ、マキステロンＡ、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−メチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン−２５−メチルエーテル、アブタステロン、２２，２３−ジ−エピ−ゲラジアステロン（ｇｅｒａｄｉａｓｔｅｒｏｎｅ）、２０，２６−ジヒドロキシエクジソン（ポドエクジソン（ｐｏｄｅｃｄｙｓｏｎｅ）Ｃ）、２４−エピ−アブタステロン、ゲラジアステロン、２９−ノルシアステロン（ｎｏｒｃｙａｓｔｅｒｏｎｅ）、アジュガステロンＢ、２４（２８）［Ｚ］−デヒドロアマラステロンＢ、アマラステロン（ａｍａｒａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、マキステロンＣ、ラピステロン（ｒａｐｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ｃ、２０−ヒドロキシエクジソン−２２，２５−ジメチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−エチルエーテル、カルタモステロン（ｃａｒｔｈａｍｏｓｔｅｒｏｎｅ）、２４（２５）−デヒドロプレシアステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｅｃｙａｓｔｅｒｏｎｅ）、ロイゼアステロン（ｌｅｕｚｅａｓｔｅｒｏｎｅ）、シアステロン、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−アリルエーテル、２４（２８）［Ｚ］−デヒドロ−２９−ヒドロキシマキステロンＣ、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−アセテート、ビチコステロンＥ（２０−ヒドロキシエクジソン２５−アセテート）、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ｎ−プロピルエーテル、２４−ヒドロキシシアステロン、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ｎ−ブチルエーテル、ポナステロンＡ  ２２−ヘミスクシネート、２２−ａｃｅｔｏアセチル−２０−ヒドロキシエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ベンジルエーテル、カネセンステロン（ｃａｎｅｓｃｅｎｓｔｅｒｏｎｅ）、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ヘミスクシネート、イノコステロン−２６−ヘミスクシネート、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ベンゾエート、２０−ヒドロキシエクジソン−２２−β−Ｄ−グルコピラノシド、２０−ヒドロキシエクジソン−２５−β−Ｄ−グルコピラノシド、シレネオシド（ｓｉｌｅｎｅｏｓｉｄｅ）Ａ（２０−ヒドロキシエクジソン−２２α−ガラクトシド）、３−デオキシ−１β，２０−ジヒドロキシエクジソン（３−デオキシインテグリステロン（ｄｅｏｘｙｉｎｔｅｇｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ）、２−デオキシインテグリステロンＡ、１−エピ−インテグリステロンＡ、インテグリステロンＡ、シレネオシドＣ（インテグリステロンＡ  ２２α−ガラクトシド）、２，２２−ジデオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン−３−アセテート、２−デオキシ−２０，２６−ジヒドロキシエクジソン、２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン−２２−アセテート、２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン−３，２２−ジアセテート、２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン−２２−ベンゾエート、ポナステロンＡ  ２−ヘミスクシネート、２０−ヒドロキシエクジソン−２−メチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン−２−アセテート、２０−ヒドロキシエクジソン−２−ヘミスクシネート、２０−ヒドロキシエクジソン−２−β−Ｄ−グルコピラノシド、２−ダンシル−２０−ヒドロキシエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン−２，２２−ジメチルエーテル、ポナステロンＡ  ３Ｂ−Ｄ−キシロピラノシド（リムナンテオシド（ｌｉｍｎａｎｔｈｅｏｓｉｄｅ）Ｂ）、２０−ヒドロキシエクジソン−３−メチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン−３−アセテート、２０−ヒドロキシエクジソン−３β−Ｄ−キシロピラノシド（リムナンテオシドＡ）、２０−ヒドロキシエクジソン−３−β−Ｄ−グルコピラノシド、シレネオシドＤ（２０−ヒドロキシエクジソン−３α−ガラクトシド）、２０−ヒドロキシエクジソン３β−Ｄ−グルコピラノシル−［ｌ−３］−β−Ｄ−キシロピラノシド（リムナンテオシドＣ）、２０−ヒドロキシエクジソン−３，２２−ジメチルエーテル、シアステロン−３−アセテート、２−デヒドロ−３−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン、３−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン（ｃｏｒｏｎａｔａｓｔｅｒｏｎｅ））、ラピステロン（ｒａｐｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ｄ、３−デヒドロ−２０−ヒドロキシエクジソン、５β−ヒドロキシ−２５，２６−ジデヒドロポナステロンＡ、５β−ヒドロキシスタキステロンＣ、２５−デオキシポリポジンＢ、ポリポジンＢ、２５−フルオロポリポジンＢ、５β−ヒドロキシアブタステロン、２６−ヒドロキシポリポジンＢ、２９−ノルセンゴステロン（ｎｏｒｓｅｎｇｏｓｔｅｒｏｎｅ）、センゴステロン（ｓｅｎｇｏｓｔｅｒｏｎｅ）、６β−ヒドロキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、６α−ヒドロキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン−６−オキシム、ポナステロンＡ  ６−カルボキシメチルオキシム、２０−ヒドロキシエクジソン−６−カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンＣ、ラピステロンＢ、ムリステロンＡ、アトロトステロン（ａｔｒｏｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）Ｂ、アトロトステロンＡ、ツルケステロン−２−アセテート、プニステロン（ｐｕｎｉｓｔｅｒｏｎｅ）（ラポンチステロン）、ツルケステロン、アトロトステロンＣ、２５−ヒドロキシアトロトステロンＢ、２５−ヒドロキシアトロトステロンＡ、パキシロステロン（ｐａｘｉｌｌｏｓｔｅｒｏｎｅ）、ルルケステロン（ｒｕｒｋｅｓｔｅｒｏｎｅ）−２，２２−ジアセテート、ツルケステロン−２２−アセテート、ツルケステロン−１１α−アセテート、ツルケステロン−２，１１α−ジアセテート、ツルケステロン−１１α−プロピオネート、ツルケステロン−１１α−ブタノエート、ツルケステロン−１１α−ヘキサノエート、ツルケステロン−１１α−デカノエート、ツルケステロン−１１α−ラウレート、ツルケステロン−１１α−ミリステート、ツルケステロン−１１α−アラキデート、２２−デヒドロ−１２β−ヒドロキシノルセンゴステロン、２２−デヒドロ−１２β−ヒドロキシシアステロン、２２−デヒドロ−１２β−ヒドロキシセンゴステロン、１４−デオキシ（１４α−Ｈ）−２０−ヒドロキシエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン−１４−メチルエーテル、１４α−ペルヒドロキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン１４，２２−ジメチルエーテル、２０−ヒドロキシエクジソン−２，３，１４，２２−テトラメチルエーテル、（２０Ｓ）−２２−デオキシ−２０，２１−ジヒドロキシエクジソン、２２，２５−ジデオキシエクジソン、（２２Ｓ）−２０−（２，２’−ジメチルフラニル）エクジソン、（２２Ｒ）−２０−（２，２’−ジメチルフラニル）エクジソン、２２−デオキシエクジソン、２５−デオキシエクジソン、２２−デヒドロエクジソン、エクジソン、２２−エピ−エクジソン、２４−メチルエクジソン（２０−デオキシマキステロンＡ）、エクジソン−２２−ヘミスクシネート、２５−デオキシエクジソン−２２−β−Ｄ−グルコピラノシド、エクジソン−２２−ミリステート、２２−デヒドロ−２０−イソ−エクジソン、２０−イソ−エクジソン、２０−イソ−２２−エピ−エクジソン、２−デオキシエクジソン、シレネオシドＥ（２−デオキシエクジソン３β−グルコシド：ブレクノシド（ｂｌｅｃｈｎｏｓｉｄｅ）Ａ）、２−デオキシエクジソン−２２−アセテート、２−デオキシエクジソン−３，２２−ジアセテート、２−デオキシエクジソン−２２−β−Ｄ−グルコピラノシド、２−デオキシエクジソン２５−β−Ｄ−グルコピラノシド、２−デオキシ−２１−ヒドロキシエクジソン、３−エピ−２２−イソ−エクジソン、３−デヒドロ−２−デオキシエクジソン（シレノステロン（ｓｉｌｅｎｏｓｔｅｒｏｎｅ））、３−デヒドロエクジソン、３−デヒドロ−２−デオキシエクジソン−２２−アセテート、エクジソン−６−カルボキシメチルオキシム、エクジソン−２，３−アセトニド、１４−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン−２，３−アセトニド、２０−ヒドロキシエクジソン−２，３−アセトニド、２０−ヒドロキシエクジソン−２０，２２−アセトニド、１４−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン−２，３，２０，２２−ジアセトニド、パキシロステロン−２０，２２−ｐ−ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン、（２０Ｓ）−ジヒドロポストステロン、（２０Ｓ）ジヒドロポストステロン、ポストステロン−２０−ダンシルヒドラジン、（２０Ｓ）−ジヒドロポストステロン−２，３，２０−トリベンゾエート、（２０Ｒ）−ジヒドロポストステロン−２，３，２０−トリベンゾエート、（２０Ｒ）ジヒドロポストステロン−２，３−アセトニド、（２０Ｓ）ジヒドロポストステロン−２，３−アセトニド、（５α−Ｈ）−ジヒドロルブロステロン、２，１４，２２，２５−テトラデオキシ−５α−エクジソン、５α−ケトジオール、ボンビコステロール、２α，３α，２２Ｓ，２５−テトラヒドロキシ−５α−コレスタン−６−��ン、（５α−Ｈ）−２−デオキシ−２１−ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、２４−エピ−カスタステロン、（５αα−Ｈ）−２−デオキシインテグリステロンＡ、（５α−Ｈ）−２２−デオキシインテグリステロンＡ、（５α−Ｈ）−２０−ヒドロキシエクジソン、２４，２５−ジデヒドロダクリハニナンステロン、２５，２６−ジデヒドロダクリハイナンステロン、５−デオキシカラダステロン（ダクリハイナンステロン）、（１４α−Ｈ）−１４−デオキシ−２５−ヒドロキシダクリハイナンステロン、２５−ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、（５β−Ｈ）−ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン−１７β−アセテート、シジステロン（ｓｉｄｉｓｔｅｒｏｎｅ）、２０−ヒドロキシエクジソン−２，３  ，２２−トリアセテート、１４−デオキシ（１４β−Ｈ）−２０−ヒドロキシエクジソン、１４−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン、９α，２０−ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン（ｍａｌａｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、２−デオキシポリポジンＢ−３−β−Ｄ−グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントン（ｃｈｅｉｌａｎｔｈｏｎｅ）Ｂ、２β，３β，６α−トリヒドロキシ−５β−コレスタン、２β，３β，６β−トリヒドロキシ−５β−コレスタン、１４−デヒドロシダステロン、スタキステロンＢ、２β，３β，９α，２０Ｒ，２２Ｒ，２５−ヘキサヒドロキシ−５β−コレスト−７、１４−ジエン−６−オン、カラダステロン、（１４β−Ｈ）−１４−デオキシ−２５−ヒドロキシダクリハイナンステロン、４−デヒドロ−２０−ヒドロキシエクジソン、１４−メチル−１２−エン−シダステロン、１４−メチル−１２−エン−１５，２０−ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソンＢ、２β，３β，２０Ｒ，２２Ｒ−テトラヒドロキシ−２５−フルオロ−５β−コレスト−８，１４−ジエン−６−オン（２５−フルオロポドエクジソンＢ）、カロニステロン（ｃａｌｏｎｙｓｔｅｒｏｎｅ）、１４−デオキシ−１４，１８−シクロ−２０−ヒドロキシエクジソン、９α，１４α−エポキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、９βα，１４β−エポキシ−２０−ヒドロキシエクジソン、９α，１４α−エポキシ−２０−ヒドロキシエクジソン２，３，２０，２２−ジアセトニド、２８−ホモブラシノライド、イソ−ホモブラシノライドの使用が含まれる。
【０１８９】
[0202]幾つかの実施形態において、本発明の方法と共に使用するリガンドは、一般式：
【化７】
2018511602.tif 000009
[0203]（式中、Ｘ及びＸ’は独立してＯ又はＳであり；
[0204]Yは：
[0205]（ａ）置換基が独立して１〜５Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換フェニル；又は
[0206]（ｂ）置換基が独立して１〜４Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換２−ピリジル、３−ピリジル、若しくは４−ピリジル
であり；
[0207]Ｒ１及びＲ２は独立して：Ｈ；シアノ；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルキル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニルアルキルであり；又はＲ１及びＲ２の原子価は一緒になって、（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換若しくは非置換アルキリデン基（ＲａＲｂＣ＝）（Ｒａ及びＲｂの非置換基炭素の合計は０〜６である）を形成し；
[0208]Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、又はシアノであり；
[0209]Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり；並びに
[0210]Ｒ５及びＲ６は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ４）アルケニルアルキル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロであり、又は一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖として、Ｒ５及びＲ６が結合したフェニル炭素と環を形成し；ここで、Ｒ９及びＲ１０は独立して：Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ベンゾイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ホルミル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）チオ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり；ここで、ｎ＝１〜３であり、Ｒｃ及びＲｄは示された長さの直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｅ、ＲｆはＨ又は示された長さの直鎖若しくは分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｇは（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又はハロ若しくは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルにより任意選択で置換されたアリールを表し、並びにＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立であり
[0211]但し、
[0212]ｉ）Ｒ９及びＲ１０が両方ともＨである場合、又は
[0213]ｉｉ）Ｒ９若しくはＲ１０のどちらかがハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、若しくはベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである場合、又は
[0214]ｉｉｉ）Ｒ５及びＲ６が一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖を形成しない場合、
[0215]シアノ置換のものを除く、基Ｒ１又はＲ２のどちらか又は両方の炭素原子の数は４より大きく、シアノ置換のものを除く、基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の合計の炭素原子の数は１０、１１、又は１２であることを条件とする）の化合物である。
【０１９０】
本発明のポリヌクレオチド
[0216]本発明の新規のエクジソン受容体／レチノイドＸ受容体ベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系は、ＥｃＲ核内受容体ポリペプチド成分及び不活性シグナリングドメイン、又はＲＸＲ核内受容体ポリペプチド成分及び不活性シグナリングドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する発現カセットを含んでもよい。これらの発現カセット、上記発現カセットが含むポリヌクレオチド、及び上記ポリヌクレオチドがコードするハイブリッドポリペプチドは、宿主細胞内のシグナリングドメインの活性を調節するためのＥｃＲ／ＲＸＲベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系の成分として有用である。
【０１９１】
[0217]故に、本発明は、ＥｃＲ核内受容体ポリペプチド成分及び不活性シグナリングドメイン並びに／又はＲＸＲ核内受容体ポリペプチド成分及び不活性シグナリングドメインを有するハイブリッドポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のＥｃＲ及び／又はＲＸＲ核内受容体ポリペプチド成分をコードする単離されたポリヌクレオチドは、上記に記載されたポリヌクレオチド配列（野生型、トランケートを含む）、及び本明細書に記載された置換変異含有ＥｃＲポリペプチド、並びに／又は野生型、トランケート、及び本明細書に記載されたキメラＲＸＲポリペプチド（これらの組み合わせを含む）を含むが、これらに限定されない。
【０１９２】
[0218]さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されたものを含むシグナリングドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有してもよい。そのようなシグナリングドメインのポリヌクレオチド配列は、当業者に既知の公的に利用可能なデータベースにより容易に利用できる。そのようなデータベースには、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）等が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチド
【０１９３】
[0219]本発明の新規のエクジソン受容体／レチノイドＸ受容体ベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系は、ＥｃＲポリペプチド及び／若しくは不活性シグナリングドメイン、又はＲＸＲポリペプチド及び不活性シグナリングドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現カセットを含んでもよい。これらの発現カセット、上記発現カセットが含むポリヌクレオチド、及び上記ポリヌクレオチドがコードするハイブリッドポリペプチドは、宿主細胞内のシグナリングドメインの活性を調節するためのＥｃＲ／ＲＸＲベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系の成分として有用である。
【０１９４】
[0220]故に、本発明はまた、本発明によるＥｃＲポリペプチド及び不活性シグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）、並びに／又はＲＸＲポリペプチド及び不活性シグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）を有する単離されたハイブリッドポリペプチドにも関する。本発明の単離されたポリペプチドのＥｃＲ及び／又はＲＸＲドメインは、野生型、トランケート、機能的断片を含む本明細書に記載されたポリペプチド配列、並びに本明細書に記載された置換変異含有ＥｃＲリガンド結合ドメイン及び／又は野生型、トランケート、機能的断片、並びに本明細書に記載されたキメラＲＸＲポリペプチド（これらの組み合わせを含む）を含んでもよいが、これらに限定されない。
【０１９５】
[0221]さらに、本発明の単離されたハイブリッドポリペプチドは、本明細書に記載されたものを含むシグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）を有してもよい。そのようなシグナリングドメインのアミノ酸配列は、当業者に既知の公的に利用可能なデータベースにより容易に利用できる。そのようなデータベースには、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本発明の発現ベクター
[0222]本発明の新規のエクジソン受容体／レチノイドＸ受容体ベースのリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系は、ＥｃＲリガンド結合ドメイン及び不活性シグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）、並びに／又はＲＸＲポリペプチド及び不活性シグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）を含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。これらの発現カセット、上記発現カセットが含むポリヌクレオチド、及び上記ポリヌクレオチドがコードするハイブリッドポリペプチドは、任意の適切な発現ベクターを用いて宿主細胞で発現され得る。適切な発現ベクターは当業者に公知であり、所望の宿主細胞を考慮した発現ベクターの選択及び最適な発現条件は、当業者により容易に決定することができる。本発明と共に使用され得る例示的な発現ベクターには、上記に記載された発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞
【０１９７】
[0223]上記に記載されているように、本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系は、タンパク質−タンパク質相互作用、すなわち、宿主細胞内での結合を調節するために使用することができる。トランスジェニック宿主細胞における調節は、目的とする様々なタンパク質の調節に有用であり得る。故に、本発明は、本発明によるリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系を含む単離された宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明による１つ又は複数の発現カセットを含むリガンド誘導性ポリペプチドカプラー系を含む単離された宿主細胞も提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む単離された宿主細胞も提供する。単離された宿主細胞は、原核生物又は真核生物宿主細胞のどちらかであってもよい。
【０１９８】
[0224]特定の実施形態において、単離された宿主細胞は、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞である。別の特定の実施形態において、単離された宿主細胞は無脊椎動物宿主細胞又は脊椎動物宿主細胞である。そのような宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、及び哺乳動物細胞から選択することができる。より詳細には、宿主細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、乳牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）細胞、サル（ｍｏｎｋｅｙ）細胞、チンパンジー細胞、又はヒト細胞である。宿主細胞の例には、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラ等の真菌若しくは酵母種、又はシネコシスティス属、シネココッカス属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、大腸菌属、シュードモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、及びクレブシエラ属のもの等の細菌種、動物、並びに哺乳動物宿主細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
[0225]特定の実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス、ピキア、及びカンジダ宿主細胞から成る群から選択される酵母細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞はカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）線虫細胞である。別の特定の実施形態において、宿主細胞はハムスター細胞である。別の実施形態において、宿主細胞はマウス細胞である。別の実施形態において、宿主細胞はサル細胞である。別の特定の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。
【０２００】
[0226]別の実施形態において、宿主細胞はハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、乳牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、及びヒト細胞から成る群から選択される哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は不死化細胞、免疫細胞、又はＴ細胞である。
【０２０１】
[0227]宿主細胞形質転換は当技術分野で公知であり、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介トランスフェクション、微粒子銃等を含むがこれらに限定されない様々な方法により達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適切な条件下で形質転換宿主細胞を培養するステップ、及び形質転換遺伝子の発現を誘導するステップを含む。原核生物及び真核生物細胞における培養条件及び遺伝子発現プロトコルは当技術分野で公知である。遺伝子産物に特異的なプロトコルに従って細胞が回収され得、遺伝子産物が単離され得る。
【０２０２】
[0228]さらに、挿入されたポリヌクレオチドの発現を調節し、又は所望の特異的様式でポリペプチド産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞が選択されてもよい。
【０２０３】
[0229]本発明はまた、本発明による単離された宿主細胞を含むヒト以外の生物にも関する。特定の実施形態において、ヒト以外の生物は、細菌、真菌、酵母、動物、及び哺乳動物から成る群から選択される。幾つかの実施形態において、ヒト以外の生物は酵母、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サル、又はチンパンジーである。
【０２０４】
[0230]特定の実施形態において、ヒト以外の生物はサッカロミセス、ピキア、及びカンジダから成る群から選択される酵母である。別の実施形態において、ヒト以外の生物はハツカネズミマウスである。
【０２０５】
転写後活性を調節する方法
[0231]本出願者の発明は、ＬＩＰＣをポリペプチド（異種ポリペプチドを生成する）に組み込んで宿主細胞におけるシグナリングドメインの活性を調節するための方法を包含する。詳細には、本出願者の発明は、宿主細胞で発現されたシグナル活性化又は抑制ポリペプチドへのＬＩＰＣ成分の組み込みにより、シグナリングタンパク質及び経路の活性化を誘導又は抑制し、宿主細胞をリガンドと接触させてシグナル伝達活性化又は抑制を引き起こす方法を提供する。
【０２０６】
[0232]１つの実施形態において、細胞シグナル伝達は、シグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）のオリゴマー化のＬＩＰＣにより誘導される二量体化により活性化される。
【０２０７】
[0233]別の実施形態において、細胞シグナル伝達は、細胞シグナル伝達（活性化）経路ポリペプチドに対する抑制ポリペプチドのＬＩＰＣにより誘導される二量体化により抑制される。１つの実施形態において、ＬＩＰＣ単独の成分（例えば、ＥｃＲ又はＲｘＲ／ＵＳＰポリペプチド）は抑制ポリペプチドである。
【０２０８】
[0234]１つの実施形態において、ＬＩＰＣポリペプチドは、細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を調節する（すなわち、活性化又は抑制する）ために使用される。別の実施形態において、ＬＩＰＣポリペプチドは、細胞外タンパク質−タンパク質相互作用を調節する（すなわち、活性化又は抑制する）ために使用される。別の実施形態において、ＬＩＰＣポリペプチドは、膜貫通タンパク質−タンパク質相互作用を調節する（すなわち、活性化又は抑制する）ために使用される。
【０２０９】
[0235]宿主細胞においてＬＩＰＣにより活性を発現及び調節するための目的とする遺伝子及びタンパク質は、内因性遺伝子又は異種遺伝子であってもよい。所望の遺伝子又はタンパク質の核酸又はアミノ酸配列情報は、多くの公共アクセスデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＰＩＲ）の１つ、又は多数の生物学関連ジャーナル刊行物にある場合がある。故に、当業者は、事実上全て既知の遺伝子及びタンパク質の核酸配列及び／又はアミノ酸配列情報を入手できる。そのような情報は次いで、本明細書に記載された本出願者の方法に使用される発現カセット内の目的とするタンパク質（例えばシグナリングドメイン）を発現する所望の構築物を構築するために使用することができる。
【０２１０】
[0236]本出願者の方法を用いた宿主細胞における発現のための目的とする遺伝子及びタンパク質の例には、酵素、レポーター遺伝子、構造タンパク質、膜貫通受容体、核内受容体、遺伝子（疾患、障害、機能障害、遺伝的欠損、抗体、創薬のための標的、並びにプロテオミクス解析及び適用等に関与するポリペプチド又はシグナリングドメインをコードする）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）が、生物学的細胞シグナル伝達系に対する効果、又は生物学的細胞シグナル伝達系のコントロールに利用され及び組み込まれ得る多くの及び多様な様式の中で、１つの一般的な例は、任意の他のリガンド誘導性二量体化又は多量体化系（ＦＫ５０６又はラパマイシンを利用するもの等）の、本発明のＬＩＰＣ成分による置換である。
【０２１２】
本発明のリガンド誘導性ポリペプチドカプラー（ＬＩＰＣ）が、生物学的細胞シグナル伝達系のコントロールに利用され及び組み込まれ得る特定の例は、遺伝子修飾Ｔ細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞）の破壊に使用するために提案されているような、誘導性細胞「死滅スイッチ」又は「自殺スイッチ」の生成に使用するためである。
【０２１３】
上述の系の幾つかの例は、
公開番号国際公開第２０１５１５７２５２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２４６７１）「抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を用いた癌の治療」；
公開番号国際公開第２０１１１４６８６２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７３８１）「選択的アポトーシスを誘導する方法」；
公開番号国際公開第２０１４１６４３４８号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４）「修飾カスパーゼポリペプチド及びその使用」；
公開番号国際公開第２０１４１５１９６０号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６７３４）「Ｔ細胞増殖をコントロールする方法」；
公開番号国際公開第２０１４１２７２６１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１６５２７）「キメラ抗原受容体及びその使用方法」；
Ａｕｓｌａｎｄｅｒら、「Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  ３１、ｎｏ．  ３  １５５〜１６８頁（２０１３）；
Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ-ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  ３３、ｉｓｓｕｅ  ８、４４９〜４６１頁（２０１５）；
Ｃｉｃｅｒｉら、「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｉｃｉｄｅ-ｇｅｎｅ-ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ-ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  （ｔｈｅ  ＴＫ００７  ｔｒｉａｌ）：  Ａ  ｎｏｎ-ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  Ｉ-ＩＩ  ｓｔｕｄｙ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  １０、４８９〜５００頁（２００９）：Ｍｅｄｌｉｎｅ  ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０−２０４５（０９）７００７４−９；
Ｗｕら「Ｒｅｍｏｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ-ｇａｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｂ４０７７（２０１５）；
Ｖｉｌａｂｏａら、「Ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｒｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ」、Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｎｄｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２：１０７．  ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５７−７４１２．１０００１０７；
Ｓｔｉｅｇｅｒら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ-ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６１：５２７〜５４１頁（２００９）：
に概説され、記載されている。上記の参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２１４】
実施例１−ＬＩＰＣ活性化ルシフェラーゼ
[0237]本出願者のＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）遺伝子スイッチ技術は、活性化リガンドの存在下で転写を駆動する。リガンドは、ＧＡＬ４−ＥｃＲ融合タンパク質のＥｃＲリガンド結合ドメイン部分に結合し、これがＲＸＲ−ＶＰ１６成分を動員する（例えば図１を参照のこと）。本発明者らは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）系において使用されるもの等のＥｃＲ及びＲＸＲドメインは、リガンド誘導性ポリペプチドカプラーとして作用し、ＥｃＲ及びＲＸＲドメインに融合された他のタンパク質の結合を駆動することができると断定した。
【０２１５】
[0238]リガンド誘導性ポリペプチドカプラーは、転写遺伝子スイッチとは異なった形で作動する。ＬＩＰＣ系を用いて、遺伝子発現ではなくタンパク質−タンパク質相互作用がコントロールされる。小分子リガンド投与の濃度及び量によりコントロールされるため、活性化のレベルを用量依存的に制御することができる。
【０２１６】
[0239]本明細書に記載されているように、リガンド誘導性ＥｃＲ−ＲＸＲ融合タンパク質結合を示すために、スプリットホタルルシフェラーゼ系を使用した。この系は、タンパク質スイッチ成分を使用する新たな方法となる。そのようなスイッチは、タンパク質発現のコントロールを目的とする遺伝子転写活性化スイッチとは根本的に異なる。結合させようとする（例えば、二量体化又はオリゴマー化される）分子は、結合したとき何らかの異なる機能を有さなければならず、非リガンド条件下では互いに対する天然の親和性が限られる、又は天然の親和性を有してはならないため、タンパク質−タンパク質相互作用、すなわち結合のコントロールは、慎重で特異的な操作を必要とする。
方法及び分析的アプローチ
【０２１７】
[0240]一連のＥｃＲ及びＲＸＲ融合（幾つかはスプリットホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）との）タンパク質を着想し、設計した（図２〜６を参照のこと）。スプリットルシフェラーゼ系を使用して、他の細胞系におけるタンパク質−タンパク質相互作用を調べた（例えば、Ｌｕｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１（３３）：１２２８８〜９３頁（２００４）、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ及びＧａｍｂｈｉｒ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７５（５）：１２９５〜３０２頁（２００５）、Ｆｕｊｉｋａｗａ及びＫａｔｏ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５２（１）：１８５〜９５頁（２００７）、並びにＬｅｎｇら、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ８（４）：ｅ６２２３０頁（２０１３）を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。スプリットルシフェラーゼ系は、結合したとき成分が共有結合しないので、オフレート分析が可能になる点でスプリットＧＦＰ系に勝る利点を有する。
【０２１８】
[0241]タンパク質−タンパク質結合をテストする系として使用するために、ｆＬｕｃタンパク質を、互いに対して内在的親和性を有さない二片に分けた（融合タンパク質エレメントにより近接結合されるまで不活性であるように）。ＨＥＫ２９３細胞に、ＥｃＲ及びＲＸＲドメインに融合されたスプリットｆＬｕｃを以下のようにトランスフェクトした。
トランスフェクション
【０２１９】
[0242]トランスフェクション前日に１０，０００細胞（２９３Ｔ細胞）を、抗生物質を含まない１００μｌの増殖培地（１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地）を含有する９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。対のプラスミド、ＲｘＲ＿ＮｌｕｃとＣｌｕｃ＿ＥｃＲ及びＥｃＲ＿ＮｌｕｃとＣｌｕｃ＿ＲｘＲ（図８を参照のこと；図８に描かれた構築物のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８７〜９２に示されている。配列番号９１及び９２は、それぞれ図８の構築物に使用されたＥｃＲ及びＲＸＲアミノ配列に対応する）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を製造者の仕様書に従ってトランスフェクトした。簡単には、個々のプラスミドＤＮＡ（０．２μｇ）及び０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（登録商標）を２５．０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地に希釈し、室温で５分間インキュベートし、容量を共トランスフェクションのために２倍にした。希釈プラスミドＤＮＡを希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００と合わせ、室温で２０分間インキュベートした。５０μｌのＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００複合体を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。活性化リガンドＶｅｌｅｄｉｍｅｘの添加前に、細胞を５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間インキュベートした。
生物発光アッセイ 
【０２２０】
[0243]トランスフェクションの２４時間後、９６ウェルプレートの各ウェルからの細胞培養培地を、１００ｎＭ  Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ活性化リガンド及びジメチルスルホキシド−ＤＭＳＯ（陰性対照）と交換した。各成分を１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で千倍に希釈し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃、６時間インキュベートした。ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液を、５’−フルオロルシフェリン（ルシフェリン類似体）を含有するＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質と合わせた。この試薬を再構成後に凍結し、使用まで−２０℃で保管した。ルシフェラーゼ  ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質を水浴で室温に解凍した。９６ウェルプレートをインキュベーターから除去し、室温で約１時間平衡化し、基質を添加する前に、プレート底をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルマイクロプレートアルミニウムシーリングテープで被覆した。１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬緩衝液を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。完全な細胞溶解を確保するために室温で３分間インキュベーション後、９６ウェルプレートをＧｌｏＭａｘ（商標）  ９６  マイクロプレートルミノメーターに入れて各ウェルからの生物発光を測定した。
【０２２１】
[0244]活性化リガンドの非存在下で、バックグラウンドシグナルのみが観察された。活性化リガンドの添加後にｆＬｕｃシグナルを検出した（図７：ＲＸＲ−ＥｃＲリガンド−及び＋、右端）。活性化リガンドを添加した６時間後にｆＬｕｃアッセイを行った。同一のスプリットｆＬｕｃ系を用いてホモ二量体化することが示されたタンパク質である、ＳＴＡＴ１を用いた構築物（例えばＬｕｋｅｒら（２００４）を参照のこと）を陽性対照に含めた（表２を参照のこと）。陽性対照のシグナルは、活性化リガンドにより影響を受けないようである（図７：陽性対照、ＳＴＡＴ１、リガンド−及び＋）。陰性対照として、ｅＧＦＰ及び活性化リガンド単独（ビヒクルのみ）試料は、バックグラウンド読み取り値のみを示した（図７：ｅＧＦＰ、リガンド−、及びリガンド＋）。このランでは、リガンド＋ウェルは他のウェルよりわずかに低い細胞数であったことに留意されるべきである（図７；リガンド＋＊）。データを平均バックグラウンドに対して正規化し、相対発光量で報告した。標準ｆＬｕｃは追加の対照として実行した。
【０２２２】
[0245]活性化リガンドを付加すると、明確なｆＬｕｃシグナルがＥｃＲ及びＲＸＲＬＩＰＣ系を用いて生成される。バックグラウンドのみが非存在下でリガンド観察される（図７を参照のこと）。
【表２】
2018511602.tif 000010
【０２２３】
[0246]陽性シグナルは、活性化リガンドに曝露され、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分の結合を駆動し、ｆＬｕｃ活性を回復させたベクターの相補対においてのみ観察されるはずである。リガンド用量応答曲線を図９及び図１０に示す。この作業は、タンパク質−タンパク質相互作用及び結合を転写後レベルでコントロールすることができるリガンド誘導性ポリペプチドカップリング、すなわちリガンド媒介結合又はオリゴマー化を駆動する、ＥｃＲ及びＲＸＲの能力を示すのに役立つ。
【０２２４】
[0247]Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンドを介したＥｃＲ二量体化誘導結果を図１１及び図１２に示す。
【０２２５】
[0248]本系により生成されたデータは、今後の追加の系に関する分子設計における情報源として使用することができる。そのような系の追加の使用には、タンパク質−タンパク質相互作用を通じて活性化されるシグナリングドメイン（例えば、シグナリング分子、シグナリングドメイン、相補タンパク質断片、タンパク質サブユニット、及び天然又は改変部分又はトランケートタンパク質）のスクリーニングが含まれるが、これに限定されない。
【０２２６】
[0249]細胞内スプリットｆＬｕｃレポーターを用いた実験及び結果に基づき、ＬＩＰＣ系の新たな設計に着手する。ＥｃＲ、ＲＸＲ、及びスプリットｆＬｕｃエレメントの追加の立体配置をアッセイして追加のペアリングを示す。この情報の全ては、タンパク質の比較モデルの生成における情報源として使用することができ、上記比較モデルは今度は今後の設計に関する手引きを提供することができる。現在のスプリットｆＬｕｃベクターも、他の重要な細胞タイプにおいて一致した活性についてテストする。タンパク質は本例では構成的に発現されるため、活性化リガンドが投与されたとき二量体化事象は急速であるはずである。反対に、ｆＬｕｃの半分は互いに対して親和性を有さず、共有結合的に相互作用しないことから、この系は活性化リガンドの除去後のオフレート動態を調べるのに使用することもできるであろう。シグナル発生及び減衰実験の両方を想定し、着手している。
【０２２７】
[0250]さらに、追加のＬＩＰＣ設計を進めている。設計の幾つかは上記のｆＬｕｃ系の設計と類似しており、違いは、例えば、相互作用に関与する分子がＩ型１回膜貫通タンパク質であり得ることである。最初の設計及び実験は、細胞外に位置する融合タンパク質の少なくとも一部と共に細胞内に局所化されたＥｃＲ及びＲＸＲを用いる（図３を参照のこと）。しかし、実際のアッセイ読み出し値に応じて幾つかの追加の立体配置を設計し、テストすることもできる。追加の設計には、ＥｃＲ及びＲＸＲが細胞外に局在化し融合タンパク質が細胞内に位置している、ＥｃＲ及びＲＸＲに融合された膜貫通ドメインを有する分子が含まれるが、これらに限定されない（図４Ａ及び図４Ｂを参照のこと）。別の立体配置は、ＥｃＲ及びＲＸＲ成分が膜貫通ドメインに融合され、それにもかかわらずＥｃＲ、ＲＸＲ、及び融合シグナリングドメインが全て細胞内に位置する場合である（図５を参照のこと）。ｆＬｕｃは別にして追加のシグナリングドメインは、上記に概説した様々な立体配置に使用できることに留意すべきである。
【０２２８】
[0251]さらなる研究には、所望の活性化作用を駆動し、潜在的なバックグラウンド（例えば、リガンドの非存在下でパートナーがいないタンパク質の生物学的作用）を（必要に応じて）低減するのに必要とされるオンレート及びオフレートの最適な発現レベルを理解するための実験が含まれる。
【０２２９】
実施例２−核内受容体成分のリガンドにより誘導される二量体化
[0252]リガンドを添加するとホモ二量体化するように核内受容体ドメイン（すなわち、ＥｃＲ及びＲｘＲポリペプチド）が誘導され得るかをテストする実験を行った（図１１及び１２）。ＳＴＡＴ１は、リガンド添加と関係なく自己二量体化することが報告されているため、ＳＴＡＴ１を対照ポリペプチドとして使用した。図１１及び１２の略語は：
[0253]「ＥｃＲ」はエクジソン受容体であり；
[0254]「ＥｃＲ−ＥｃＲ」は、ＥｃＲポリペプチドがルシフェラーゼポリペプチド断片のＮ末端に融合され（ＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ）、ルシフェラーゼの別の断片がこのＣ末端に融合されたＥｃＲポリペプチドを有し（Ｃｌｕｃ＿ＥｃＲ）：これによりＥｃＲホモ二量体化時にルシフェラーゼを活性化（生物発光を生成）するように、２つの半分に分けられたルシフェラーゼポリペプチドである「ＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＥｃＲ」を意味し；
[0255]「ＲｘＲ」はレチノイドＸ受容体であり；
[0256]「偽」はベクターが添加されていないことを意味し；
[0257]「ｅＧＦＰ」は増大したＧＦＰ（陰性対照として使用される）であり；
[0258]「ＲｘＲ＿ＥｃＲ」は、ＥｃＲポリペプチドがルシフェラーゼポリペプチド断片のＮ末端に融合され（ＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ）、ルシフェラーゼの別の断片がこのＣ末端に融合されたＲｘＲポリペプチドを有し（Ｃｌｕｃ＿ＲｘＲ）：これによりＥｃＲホモ二量体化時にルシフェラーゼを活性化（生物発光を生成）するように、２つの半分に分けられたルシフェラーゼポリペプチドである「ＥｃＲ＿Ｎｌｕｃ＋Ｃｌｕｃ＿ＲＸＲ」を意味する。
【０２３０】
[0259]結果（図11及び12）は、リガンド添加時にホモ二量体化するようにＥｃＲドメインが誘導され得ることを示している。しかし、生物発光シグナルの差は比較的低かった。これは、ＥｃＲドメイン間の自力での低い親和性に起因している可能性がある。生物発光出力に基づき、リガンド添加時のＥｃＲドメインの統計的に有意なホモ二量体があった。対照的に、ＲｘＲドメインは驚くべきことに、リガンドに関係なくホモ二量体化することが観察された。さらに、最も強いシグナル（生物発光）は、リガンドにより誘導されるＲｘＲ及びＥｃＲドメインのヘテロ二量体化により観察された。したがって、これらの結果は、リガンドにより誘導されるヘテロ二量体化によるＲｘＲドメインとＥｃＲドメインの間の比較的強い相互作用を示すものである。実際、各ドメインのホモ二量体化は親和性がより限定的であったが、ＲｘＲドメインのリガンド依存的ホモ二量体化を観察及び発見したことは驚くべきことであった。
【０２３１】
[0260]特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語並びにいずれの頭字語も、本発明の分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０２３２】
[0261]本明細書に引用された全ての参考文献は、法により許される最大限の範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。それらの参考文献の考察は、参考文献の著者によりなされた主張を要約することが単に意図される。任意の参考文献（又は任意の参考文献の一部）が関連のある技術であるという承認はなされない。本出願者は、任意の引用文献の正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。
【０２３３】
[000]本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年３月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは０１００−００１３ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１９２，８３７バイトである。
【図１】
2018511602.tif 000014
【図２】
2018511602.tif 000015
【図３】
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【図４Ａ】
2018511602.tif 000017
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2018511602000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月29日(2017.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、核内受容体タンパク質の異なる断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドとを含む２つのポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドが活性化リガンドに結合することができ、前記第２のポリペプチドが前記活性化リガンドの存在下で前記第１のポリペプチドと結合することができ、前記第１及び第２のポリペプチドの活性化リガンドにより誘導される結合が、活性化した機能的、生物学的、又は細胞シグナル伝達状態をもたらすように、前記第１及び第２のポリペプチドの各々が異種アミノ酸又はポリペプチド配列をさらに含む、２つのポリペプチド。
【請求項２】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインが、節足動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項３】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインがグループＨ核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドの核内受容体アミノ酸配列が、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項５】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項６】
前記哺乳動物核内受容体タンパク質断片又はドメインが、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む、請求項５に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項７】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はその置換変異体のキメラを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項８】
前記第２のポリペプチド核内受容体タンパク質断片又はドメインが、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む、請求項７に記載の第１及び第２のポリペプチド。
【請求項９】
ａ）節足動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第１の天然に存在しないポリペプチドと、
ｂ）節足動物及び／又は哺乳動物核内受容体タンパク質の断片又はドメインを含む第２の天然に存在しないポリペプチドと
を含み、
前記第１及び第２のポリペプチドが、活性化リガンドと接触した後に活性化した機能的、生物学的又は細胞シグナル伝達状態を生ずることができる追加の異種配列を含む、リガンド誘導性ポリペプチドカップリング（ＬＩＰＣ）のための組成物。
【請求項１０】
一方又は両方の核内受容体タンパク質断片又はドメインがグループＨ核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン、ポリペプチド断片、又はその置換変異体を含む、請求項９又は１０に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１２】
前記第２のポリペプチドが哺乳動物核内受容体アミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが、ＲＸＲ核内受容体ポリペプチド断片又はその置換変異体を含む、請求項１２に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドが、無脊椎動物及び哺乳動物核内受容体アミノ酸配列又はその置換変異体のキメラを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１５】
前記第２のポリペプチドが、無脊椎動物ＵＳＰ（ＲＸＲホモログ）及び哺乳動物ＲＸＲ核内受容体アミノ酸配列又はそれらの置換変異体のキメラを含む、請求項１４に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１６】
前記核内受容体タンパク質断片の少なくとも１つが、スプルースバッドワーム（トウヒノシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、タバコスズメガＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）ＬＢＤ、ニセアメリカタバコガＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）ＬＢＤ、ユスリカ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、カイコガ（ボンビックス・モリ）ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、ミバエ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、蚊（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カピタータ）ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ（ルシリア・カプリナ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、地中海ミバエ（セラチチス・カピタータ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、バッタ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、アブラムシ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、シオマネキ（セルカ・プギレーター）ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、コナジラミ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（ＢａＥｃＲ）ＬＢＤ、ヨコバイ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（ＮｃＥｃＲ）ＬＢＤ、及びマダニ（アンブリオンマ・アメリカヌム）ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）ＬＢＤから成る群から選択されるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド、又は請求項９〜１５のいずれか一項に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１７】
前記核内受容体タンパク質断片の少なくとも１つが、配列番号１（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号２（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号３（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号４（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号５（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドによりコードされるエクジソン受容体ポリペプチドに由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド、又は請求項９〜１５のいずれか一項に記載のＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１８】
前記エクジソン受容体ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号６（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号７（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号８（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号９（ＴｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号１０（ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ）のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む、請求項１６又は１７に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項１９】
前記エクジソン受容体ポリペプチド配列が、対応する野生型エクジソン受容体ポリペプチドと比べて約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、又は置換変異を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２０】
前記エクジソン受容体ポリペプチドが、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン変異を含むポリヌクレオチドによりコードされ、前記アミノ酸残基が、ａ）配列番号１７のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、若しくは２３８、ｂ）配列番号１７のアミノ酸残基９５及び１１０、ｃ）配列番号１７のアミノ酸残基２１８及び２１９、ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１７５、ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基１２７及び１７５、ｆ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７及び１２７、ｇ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１２７、及び１７５、ｈ）配列番号１７のアミノ酸残基５２、１０７、及び１７５、ｉ）配列番号１７のアミノ酸残基９６、１０７、及び１７５、ｊ）配列番号１７のアミノ酸残基１０７、１１０、及び１７５、ｋ）配列番号１８のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、若しくは２１７、又はｌ）配列番号１９のアミノ酸残基９１若しくは１０５に相当する又は類似した位置にある、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２１】
前記置換変異が、ａ）配列番号１７のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、又はＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換変異、ｂ）配列番号１８のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、又はＣ２１７Ｓ置換変異、及びｃ）配列番号１９のＧ９１Ａ又はＡ１０５Ｐ置換変異から成る群から選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２２】
前記レチノイドＸ受容体ポリペプチドが、脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド、無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチド（ＵＳＰ）、並びに脊椎動物及び無脊椎動物ＲＸＲ由来のポリペプチド断片を含むキメラレチノイドＸポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２３】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片、及び非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片から成る群から選択される少なくとも２つの異なるレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含む、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２４】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、ＥＦドメインヘリックス１、ＥＦドメインヘリックス２、ＥＦドメインヘリックス３、ＥＦドメインヘリックス４、ＥＦドメインヘリックス５、ＥＦドメインヘリックス６、ＥＦドメインヘリックス７、ＥＦドメインヘリックス８、ＥＦドメインヘリックス９、ＥＦドメインヘリックス１０、ＥＦドメインヘリックス１１、ＥＦドメインヘリックス１２、Ｆドメイン、及びＥＦドメインβプリーツシートから成る群から選択される少なくとも１つのレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドを含み、前記レチノイドＸ受容体ポリペプチド断片が、前記第２のレチノイドＸ受容体ポリペプチド断片と異なる種のレチノイドＸ受容体ポリペプチド又は異なるアイソフォームのレチノイドＸ受容体ポリペプチド由来である、請求項２３に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２５】
前記キメラレチノイドＸ受容体ポリペプチドが、a）配列番号１１、b）配列番号１２のヌクレオチド１〜３４８及び配列番号１３のヌクレオチド２６８〜６３０、ｃ）配列番号１２のヌクレオチド１〜４０８及び配列番号１３のヌクレオチド３３７〜６３０、ｄ）配列番号１２のヌクレオチド１４６５及び配列番号１３のヌクレオチド４０３〜６３０、ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１〜５５５及び配列番号１３のヌクレオチド４９０〜６３０、ｆ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６２４及び配列番号１３のヌクレオチド５４７〜６３０、ｇ）配列番号１２のヌクレオチド１〜６４５及び配列番号１３のヌクレオチド６０１〜６３０、並びにｈ）配列番号１２のヌクレオチド１〜７１７、配列番号１３のヌクレオチド６１３〜６３０の核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はこれと実質的に同一である機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２６】
前記キメラレチノイドＸポリペプチドが、ａ）配列番号１４、ｂ）配列番号１５のアミノ酸１〜１１６及び配列番号１６のアミノ酸９０〜２１０、ｃ）配列番号１５のアミノ酸１〜１３６及び配列番号１６のアミノ酸１１３〜２１０、ｄ）配列番号１５のアミノ酸１〜１５５及び配列番号１６のアミノ酸１３５〜２１０、ｅ）配列番号１５のアミノ酸１〜１８５及び配列番号１６のアミノ酸１６４〜２１０、ｆ）配列番号１５のアミノ酸１〜２０８及び配列番号１６のアミノ酸１８３〜２１０、ｇ）配列番号１５のアミノ酸１〜２１５及び配列番号１６のアミノ酸２０１〜２１０、並びにｈ）配列番号１５のアミノ酸１〜２３９、配列番号１６のアミノ酸２０５〜２１０のポリペプチド配列、又はこれと実質的に同一のポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２７】
一方又は両方の追加の異種配列が膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２８】
前記膜貫通ドメインのうちの少なくとも１つがＩ型１回膜貫通ドメインである、請求項２７に記載の第１及び第２のポリペプチド又はＬＩＰＣのための組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１又は第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド、及び請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチドの１つを含むベクター。
【請求項３２】
請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチドの両方を含むベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項３１又は３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が哺乳動物Ｔ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞がヒトＴ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣのための組成物、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を活性化リガンドと接触させるステップとを含む、細胞シグナル伝達を誘導する方法。
【請求項３８】
前記活性化リガンドが、
ｃ）式：
【化１】
2018511602.tif 000027
（式中、
Ｅは、三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキル又は三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮ、又はＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであり、又はＲ３並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、若しくは酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであり、又はＲ２並びにＲ２及びＲ３が結合したフェニル炭素と連結されてエチレンジオキシ、酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロフリル環、又は酸素がフェニル炭素に隣接しているジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ、又はＳｅｔである）の化合物、又は
ｄ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、若しくは幼若ホルモンＩＩＩ
である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣのための組成物、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記活性化リガンドが、式：
【化２】
2018511602.tif 000028
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、ａ）Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）シアノアルキル；（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、若しくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ３−Ｃ５）シクロアルキル；又はｂ）置換基が独立して１〜５Ｈ、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、（Ｃｉi−Ｃ６）アルキル、若しくは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである非置換又は置換ベンジルであり；並びに
Ｒ５はＨ；ＯＨ；Ｆ；Ｃｌ；又は（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシであり、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ５がＨ、ヒドロキシル、メトキシ、又はフルオロである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＨではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１つのみがメチルであり、Ｒ５がＨ又はヒドロキシルである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの残りはＨではなく；
Ｒ４並びにＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの１つが両方ともメチルである場合、Ｒ５はＨでもヒドロキシルでもなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が全てメチルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が全てＨであり、Ｒ５がヒドロキシルである場合、Ｒ４はエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、アリル、又はベンジルではないことを条件とする）の化合物である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣのための組成物、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記活性化リガンドが、式：
【化３】
2018511602.tif 000029
（式中、Ｘ及びＸ’は独立してＯ又はＳであり；
Ｙは：
（ａ）置換基が独立して１〜５Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換フェニル；又は
（ｂ）置換基が独立して１〜４Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、若しくはニトロである置換若しくは非置換２−ピリジル、３−ピリジル、若しくは４−ピリジル
であり；
Ｒ１及びＲ２は独立して：Ｈ；シアノ；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルキル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニル；シアノ置換若しくは非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖若しくは直鎖アルケニルアルキルであり；又はＲ１及びＲ２の原子価は一緒になって、（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換若しくは非置換アルキリデン基（ＲａＲｂＣ＝）（Ｒａ及びＲｂの非置換基炭素の合計は０〜６である）を形成し；
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、又はシアノであり；
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり；並びに
Ｒ５及びＲ６は独立して：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ４）アルケニルアルキル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロであり、又は一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖として、Ｒ５及びＲ６が結合したフェニル炭素と環を形成し；ここで、Ｒ９及びＲ１０は独立して：Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ベンゾイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ホルミル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１〜Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）チオ（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり；ここで、ｎ＝１〜３であり、Ｒｃ及びＲｄは示された長さの直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｅ、ＲｆはＨ又は示された長さの直鎖若しくは分岐鎖炭化水素鎖を表し、Ｒｇはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルにより任意選択で置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又はアリールを表し、並びにＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立であり、
但し、
ｉ）Ｒ９及びＲ１０が両方ともＨである場合、又は
ｉｉ）Ｒ９若しくはＲ１０のどちらかがハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又はベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである場合、又は
ｉｉｉ）Ｒ５及びＲ６が一緒になってタイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖を形成しない場合、
シアノ置換のものを除く、基Ｒ１又はＲ２のどちらか又は両方の炭素原子の数は４より大きく、シアノ置換のものを除く、基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の合計の炭素原子の数は１０、１１、又は１２であることを条件とする）の化合物である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣのための組成物、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１及び第２のポリペプチド若しくはＬＩＰＣのための組成物、請求項２９若しくは３０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に導入するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を活性化リガンドと接触させるステップと、
ｃ）リガンドにより誘導される生物学的活性又はポリペプチドオリゴマー化の絶対量又は相対量を定量するステップと
を含む、リガンドにより誘導される細胞シグナル伝達を測定する方法。
【国際調査報告】
2018511602.tif 000030
2018511602.tif 000031