(57)【要約】本発明は、ヒトのがんまたは感染症の処置のための組成物および方法を提供する。本発明は、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは含むか、または含まない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するガンマデルタＴ細胞の生成および投与を含む。ガンマデルタＴ細胞におけるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを除外したＣＡＲ配列の発現は、in vivoでＣＡＲ−Ｔ療法を提供し、これは、ガンマデルタＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化のためのリガンドを提供する標的細胞においてのみ細胞崩壊を生じさせるだろう。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体を含む修正γδＴ細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）ＣＤ３ゼータドメインが欠如している（調製可能である）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータドメイン（調製可能）、または
（ｉｉｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または
（ｉｖ）１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、修正γδＴ細胞。
【請求項２】
キメラ抗原受容体を含む修正γδＴ細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、修正γδＴ細胞。
【請求項３】
前記非機能性ＣＤ３ゼータドメインは、前記キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータドメインの欠如により提供される、請求項１または２に記載の修正γδＴ細胞。
【請求項４】
少なくとも２つのキメラ抗原受容体を含み、前記キメラ抗原受容体は異なる疾病抗原に対し結合特異性を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の修正γδＴ細胞。
【請求項５】
阻害性キメラ抗原受容体（ＩＣＡＲ）をさらに含む請求項１〜４の何れか一項に記載の修正γδＴ細胞であって、前記阻害性キメラ抗原受容体による抗原の結合は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）ＣＤ３ゼータドメインが欠如している（調製可能である）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータドメイン（調製可能）、または
（ｉｉｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または
（ｉｖ）１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータドメインを含むキメラ抗原受容体の、前記疾病抗原に対する任意の結合により提供されるシグナルを阻害して、腫瘍外細胞における前記γδＴ細胞の活性化を最小化する、修正γδＴ細胞。
【請求項６】
前記ガンマデルタペアリングはＶγ１〜９およびＶδ１〜８からである、請求項１〜５の何れか一項に記載のγδＴ細胞。
【請求項７】
Ｖγ９Ｖδ２サブタイプである、請求項１〜６の何れか一項に記載のγδＴ細胞。
【請求項８】
前記キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、細胞感染症、細菌感染症、真菌感染症、または原虫感染症に見られるまたは関連する、細胞表面標的または天然リガンド；活性または非活性のウイルス断片；ペプチド；タンパク質；ウイルス由来の抗原セグメント；腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に結合することが可能である、請求項１〜７の何れか一項に記載のγδＴ細胞。
【請求項９】
がんまたは感染症の処置で用いる、請求項１〜８の何れか一項に記載の修正γδＴ細胞。
【請求項１０】
がんまたは感染症の処置で用いる、請求項２〜８の何れか一項に記載の修正γδＴ細胞。
【請求項１１】
同種移植により対象に提供される、請求項９に記載のがんまたは感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞。
【請求項１２】
同種移植により対象に提供される、請求項１０に記載のがんまたは感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞。
【請求項１３】
請求項９〜１２の何れか一項に記載の感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞であって、前記感染症はウイルス、細菌、真菌、または原虫の感染症から選択される、修正γδＴ細胞。
【請求項１４】
自家移植により対象に提供される、請求項９に記載のがんまたは感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞。
【請求項１５】
自家移植により対象に提供される、請求項１０に記載のがんまたは感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞。
【請求項１６】
請求項１４または１５の何れか一項に記載の感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞であって、前記感染症はウイルス、細菌、真菌、または原虫の感染症から選択される、修正γδＴ細胞。
【請求項１７】
請求項９〜１５の何れか一項に記載のがんまたは感染症の処置で用いる修正γδＴ細胞であって、前記修正γδＴ細胞は、アミノビスフォスフォネートまたはその代替品と共に対象に同時投与され、前記代替品は、生理学的なメバロン酸経路の調節不全を介して、標的細胞に存在するリン酸化抗原のレベルを高めることが可能である、修正γδＴ細胞。
【請求項１８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列であって、前記ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）ＣＤ３ゼータドメインが欠如している（調製可能である）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータドメイン（調製可能）、または
（ｉｉｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または
（ｉｖ）１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、核酸配列。
【請求項１９】
疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１８に記載の核酸配列。
【請求項２０】
前記非機能性ＣＤ３ゼータドメインは、前記キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータドメインの欠如により提供される、請求項１８または１９に記載の核酸配列。
【請求項２１】
核酸配列SEQ ID NO:1を含み、または核酸配列SEQ ID NO:1からなり、アミノ酸配列SEQ ID NO:2〜6をコードすることが可能な、請求項１８に記載の核酸配列。
【請求項２２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする請求項１８〜２０の何れか一項に記載の核酸配列であって、前記ＣＡＲは、Ｂ細胞タンパク質ＣＤ１９を認識するｓｃＦｖである細胞外抗原認識ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域を含むが、前記ＣＡＲにおいて機能性ＣＤ３ゼータドメインは欠如している、核酸配列。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列SEQ ID NO:7を含み、またはヌクレオチド配列SEQ ID NO:7からなり、アミノ酸配列SEQ ID NO:8〜11をコードすることが可能な、請求項１８に記載の核酸配列。
【請求項２４】
請求項１８〜２３の何れか一項に記載の核酸をγδＴ細胞に組み込んで、または形質導入して、前記γδＴ細胞を遺伝子改変するステップを含む、ＣＡＲ修正γδＴ細胞を提供するプロセス。
【請求項２５】
形質導入するステップはレンチウイルスＣＡＲ構成物を用いる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
請求項１８〜２３の何れか一項に記載の核酸を細胞に同時に形質導入し、ＣＡＲ形質導入γδＴ細胞を選択的に増殖させるステップを含む、請求項２４または２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域およびＣＤ３ゼータドメインを含むＣＡＲと、ＣＤ３ゼータドメインが欠如したＣＡＲを検出する方法であって、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13と、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15の群から選択される少なくとも１つのプライマー対を、テストするＣＡＲをコードする核酸に結合させるステップを含む、方法。
【表１】
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【請求項２８】
処置が必要なレシピエント対象に、ドナー対象から採取され、前記レシピエント対象に治療的に有効な量のγδＴ細胞の同種的投与が可能になるように処理されたドナー細胞を投与するステップを含み、前記処理ステップは前記γδＴ細胞を修正してキメラ抗原受容体を組み込むステップを含む、処置方法。
【請求項２９】
処置が必要なドナー対象に、前記ドナー対象から採取され、前記ドナー対象に治療的に有効な量のγδＴ細胞を投与できるように処理されたドナー細胞を投与するステップを含み、前記処理ステップは前記γδＴ細胞を修正してキメラ抗原受容体を組み込むステップを含み、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、処置方法。
【請求項３０】
前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、請求項２８に記載の処置方法。
【請求項３１】
前記非機能性ＣＤ３ゼータドメインは、前記キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータドメインの欠如により提供される、請求項２９または３０に記載の処置方法。
【請求項３２】
前記γδＴ細胞を投与される対象は、ウイルス、細菌、真菌、もしくは原虫の感染症、またはがんを有する、請求項２８〜３１の何れか一項に記載の処置方法。
【請求項３３】
前記γδＴ細胞を投与される対象は、免疫抑制剤を同時に、連続的に、または別々に投与される、請求項２８〜３２の何れか一項に記載の処置方法。
【請求項３４】
自家的または同種的な移植により対象を処置するために組み合わせて用いる、請求項１〜８の何れか一項に記載のγδＴ細胞とピロフォスファート／フォスフォネート薬物とを含む、キット。
【請求項３５】
自家的または同種的な移植により対象を処置するために組み合わせて用いる、請求項２〜８の何れか一項に記載のγδＴ細胞とピロフォスファート／フォスフォネート薬物とを含む、キット。
【請求項３６】
請求項１〜８の何れか一項に記載のγδＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項３７】
請求項２〜８の何れか一項に記載のγδＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項３８】
個体に治療的効果を提供するのに適切な、統一用量のγδＴ細胞を含む、請求項３６または３７に記載の医薬品組成物。
【請求項３９】
がんの処置で用いる抗体免疫療法を含む、請求項３６〜３８の何れか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項４０】
がんの処置で用いる、サイトカイン、インターフェロンガンマ、ＩＬ−２、化学療法薬、生物製剤、またはその組み合わせを含む、請求項３６〜３９の何れか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項４１】
ウイルスの処置で用いる療法薬を含む、請求項３６〜３８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
ドナー対象から採取したドナー細胞を、レシピエント対象に治療的に有効な量のγδＴ細胞を同種的に投与できるように処理するステップであって、前記処理ステップは前記γδＴ細胞を修正してキメラ抗原受容体を組み込むステップを含む、ステップと、オプションとして前記γδＴ細胞を前記レシピエント対象に投与するステップとを含む、処置を準備する方法。
【請求項４３】
ドナー対象から採取したドナー細胞を、前記ドナー対象に治療的に有効な量のγδＴ細胞を投与できるように処理するステップであって、前記処理ステップは前記γδＴ細胞を修正してキメラ抗原受容体を組み込むステップを含み、前記キメラ抗原受容体は疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、ステップと、オプションとして前記γδＴ細胞を前記ドナー対象に投与するステップとを含む、処置を準備する方法。
【請求項４４】
前記非機能性ＣＤ３ゼータドメインは、前記キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータドメインの欠如により提供される、請求項４２または４３に記載の処置を準備する方法。
【請求項４５】
請求項１８〜２３の何れか一項に記載の核酸を含むレンチウイルスＣＡＲ構成物。
【請求項４６】
１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域およびＣＤ３ゼータドメインを含むＣＡＲと、ＣＤ３ゼータドメインが欠如したＣＡＲを検出するキットであって、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13と、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15の群から選択される少なくとも１つのプライマー対を含む、キット。
【表２】
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【請求項４７】
キメラ抗原受容体を含む修正γδＴ細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域を含み、機能性シグナル１提供ドメインは欠如している、修正γδＴ細胞。
【請求項４８】
キメラ抗原受容体を含む機能性γδＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作したＴ細胞であるγδＴ様細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）ＣＤ３ゼータドメインが欠如している（調製可能である）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータドメイン（調製可能）、または
（ｉｉｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または
（ｉｖ）１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、γδＴ様細胞。
【請求項４９】
機能性γδＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作したαβＴ細胞である、請求項４８に記載のγδＴ様細胞。
【請求項５０】
キメラ抗原受容体を含む、定義された抗原特異性を有するＴ細胞またはＴ細胞様細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）ＣＤ３ゼータドメインが欠如している（調製可能である）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータドメイン（調製可能）、または
（ｉｉｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または
（ｉｖ）１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む、Ｔ細胞またはＴ細胞様細胞。
【請求項５１】
α-GalCerに対し特異性を有するＮＫＴ細胞、およびビタミンＢ関連抗原に対し特異性を有する粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞から選択される、請求項５０に記載の定義された抗原特異性を有するＴ細胞またはＴ細胞様細胞。
【請求項５２】
処置が必要な対象に、請求項１〜８または４７〜５１の何れか一項に記載の細胞を投与するステップを含む、処置方法。
【請求項５３】
前記投与ステップは自家移植による、請求項５２に記載の処置方法。
【請求項５４】
前記投与ステップは同種移植による、請求項５２に記載の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）を調製し用いる方法、適切には、ウイルス感染症、真菌感染症、原虫感染症、およびがんを含む病状の処置のための、同種または自家のレシピエント対象におけるガンマデルタＴ細胞の使用、具体的には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修正ガンマデルタ細胞の使用に関する。本発明はまた、キメラ抗原受容体を発現するγδＴ細胞の生成とＣＡＲ発現を検出するプロセスに関する。加えて、本発明は、がんおよび感染症などの疾病の処置における、本明細書で開示するプロセスで生成される細胞の医薬的使用に関する。
【０００２】
ガンマデルタＴリンパ球は、ヒトの末梢血の小サブセットである（１０％未満）。Ｖγ９Ｖδ２（ガンマ９デルタ２）Ｔ細胞受容体を発現しているガンマデルタＴ細胞は、調節不全のメバロン酸経路の結果としてがん細胞で過剰産生される内因性のイソペンテニルピロフォスファート（ＩＰＰ）を認識する。ＩＦＮ−ガンマのような豊富な炎症誘発性サイトカインを産生するガンマデルタＴリンパ球の機能、その強力な細胞毒性効果機能、およびＭＨＣ非依存性抗原認識は、ガンマデルタＴ細胞をがん免疫療法の重要な層にする。ガンマデルタＴ細胞は、in vitroで、白血病、神経芽細胞腫、および種々の癌腫を含む、多くの異なるタイプの腫瘍細胞株および腫瘍を殺傷できることが示されている。さらに、ガンマデルタＴ細胞は、自然発生的に、またはゾレドロネートを含む異なるビスフォスフォネートで処置した後で、多くの異なる分化した腫瘍細胞を認識し殺傷し得ることが実証されている。ヒト腫瘍細胞は、ガンマデルタＴ細胞にアミノビスフォスフォネートおよびピロホスホモノエステル化合物を効果的に提示し、ガンマデルタＴ細胞の増殖およびＩＦＮガンマの産生を誘発する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ガンマデルタＴ細胞の自家移植戦略が、同種幹細胞移植に関連する欠点を克服するのに利用されてきた。このような自家移植技法の一部として、自家的に治療効果を発揮するのに十分な数のガンマデルタＴ細胞を誘発し培養する方法が、例えば米国特許出願公開第２００２／０１０７３９２号明細書など、以前より開示されてきた。しかしながら、自家処置戦略はいくつかの欠点を有する。
【０００４】
したがって、代わりのおよび／または改善されたガンマデルタＴ細胞を用いる処置戦略が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
がん特異的なＴ細胞クローンを特定し増殖させる難しさが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の開発につながった。ＣＡＲはモノクローナル抗体を用いて、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド認識に依存せず、Ｔ細胞特異性の対象を標的抗原に変える。これまでは多数の臨床研究においてアルファベータ（αβ）Ｔ細胞のＣＡＲ形質導入が利用されてきた一方、誰もガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞／リンパ球を用いてそうすることはなかった。本研究者らは、ガンマデルタＴ細胞／リンパ球のＣＡＲ形質導入が有利であり得ることを明らかにした。
【０００６】
前述のように、末梢血内の大部分のγδＴリンパ球はＶガンマ９Ｖデルタ２イソタイプである。Ｖガンマ９Ｖデルタ２Ｔ細胞受容体を発現しているγδＴ細胞は、調節不全メバロン酸経路の結果としてがん細胞において過剰産生される内因性イソペンテニルピロフォスファート（ＩＰＰ）を認識する。発明者らは、ＩＦＮ−ガンマのような豊富な炎症誘発性サイトカインを産生するガンマデルタ（γδ）Ｔリンパ球の機能、その強力な細胞毒性エフェクター機能およびＭＨＣ非依存性抗原認識は、γδＴリンパ球をがん免疫療法の重要なプレーヤーにすると考える。
【０００７】
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞の効力を高めるＣＡＲの機能を調べるために、in vitroに限定して研究が行われた（Rischer et al., 2004, Deniger et al., 2013）。しかしながら、このような研究では、１個の対象に由来するＣＡＲ修正γδＴ細胞を用いて第２の異なる対象に治療を提供する（同種使用の）可能性は実現されなかった。このような研究はさらに、「調整可能な」反応が提供されるようにＣＡＲ修正γδＴ細胞を提供し得る方法も実現していない。
【０００８】
したがって、本発明の第１態様は、疾病抗原に対し結合特異性を有する、キメラ抗原受容体を発現する修正γδＴ細胞を提供する。
【０００９】
適切には、修正γδＴ細胞はキメラ抗原受容体を含み、該キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータ活性化／シグナル伝達ドメイン（調整可能ＣＡＲ）、または
（ｉｉ）ＣＤ３ゼータ活性化／シグナル伝達ドメイン、または
（ｉｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および機能性ＣＤ３ゼータ活性化／シグナル伝達ドメインを含む。
【００１０】
実施形態では、修正γδＴ細胞はキメラ抗原受容体を含み得、該キメラ抗原受容体は、疾病抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および非機能性ＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。
【００１１】
実施形態では、修正γδＴ細胞は、キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータ活性化ドメインの欠如により提供される非機能性ＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含み得る。
【００１２】
適切には、実施形態において、γδＴ細胞は、Ｖγ１〜９およびＶδ１〜８に由来する任意のガンマデルタＴＣＲペアリングのＴＣＲを発現する。実施形態では、γδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２サブタイプである。
【００１３】
本発明の第２態様により、がんまたは感染症などの病状の処置で用いる、本発明の第１態様の修正γδＴ細胞を提供する。
【００１４】
本発明の第３態様により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を提供するが、該ＣＡＲは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの細胞外抗原認識ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域、および任意選択的にＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。適切なＣＤ３ゼータドメインはまた、ＣＤ３ゼータ活性化ドメインまたはシグナル伝達ドメインであるとも考えられる。非機能性ＣＤ３ゼータドメインにより、シグナル伝達が提供されない、または、活性化を引き起こすほど十分には提供されないと考えられる。
【００１５】
実施形態において、核酸配列はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることが可能であり、該ＣＡＲは細胞外抗原認識ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに
（ｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域および非機能性ＣＤ３ゼータ活性化ドメイン、または
（ｉｉ）ＣＤ３ゼータ活性化ドメイン、または
（ｉｉｉ）１つもしくは複数の共刺激性シグナル伝達領域およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。
【００１６】
実施形態において、非機能性ＣＤ３ゼータ活性化ドメインは、キメラ抗原受容体におけるＣＤ３ゼータ活性化ドメインの欠如により提供され得る。
【００１７】
前述のように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は免疫療法技法であり、Ｔ細胞は、ＨＬＡの制限とは無関係に、特定の抗原またはタンパク質（細胞表面標的）を認識し標的化する合成受容体で遺伝子改変されている。
【００１８】
典型的には、「伝統的な」第２または第３世代のＣＡＲは、モジュール方式で設計されており、典型的には、細胞外標的結合ドメイン、通常は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ領域、ＣＡＲを細胞膜に固定する膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞間シグナル伝達ドメインを含む。シグナル伝達ドメインには、通常、ＴＣＲ様刺激（シグナル１と呼ばれる）を提供するＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖活性化ドメインという要素と、共刺激性シグナル（シグナル２と呼ばれる）を提供するＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２４４、またはＩＣＯＳシグナル伝達部という要素が含まれる。このような典型的なＣＡＲ発現Ｔ細胞では、シグナル１とシグナル２の両方がＴ細胞を静止状態から解放するのに必要である。追加の共刺激性シグナル（シグナル２）がない場合、シグナル１の存在だけではＴ細胞を活性化するのに不十分であり、Ｔ細胞を非反応性／アネルギー性にする場合がある。したがって、両シグナルの存在がＴ細胞の活性化を誘発するのに必要である。
【００１９】
ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を利用する臨床試験によりＣＡＲ−Ｔアプローチが証明され、２０１４年に抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞療法がアメリカ合衆国のＦＤＡにより承認された。目覚ましい反応率がＣＡＲ−Ｔ試験で観察されているが、現時点で該技術は、真の疾病抗原、つまり、健常な細胞ではなく疾病状態の細胞でのみ発現する抗原を欠くことにより、いくらか制限がある。これまでは大部分のＣＡＲ−Ｔ療法がＣＤ１９を標的にしていた。ＣＤ１９はＢ細胞悪性腫瘍で発現するが、それは健常なＢ細胞でも発現する。この文脈においてＣＤ１９標的ＣＡＲ−Ｔ治療は許容され得るが、患者は、免疫システムが著しく低下することから感染症のリスクの上昇に悩まされている。これは、他の腫瘍タイプの大部分、特に固形腫瘍では当てはまらないが、健常な組織の標的化は耐えがたいだろう。
【００２０】
これまで臨床的に試験されたＣＡＲ−Ｔ療法のさらなる限界は、ＣＡＲ−Ｔ療法に対し耐性ができることによる再発である。これはＣＤ１９標的ＣＡＲ−Ｔ療法の臨床試験で観察されており、それは、標的（ＣＡ１９）遺伝子の選択的スプライシングおよび／または有害な突然変異を呈するがん細胞の発生により現実のものとなる。これらの「エスケープ変異体」は、（遺伝子の機能性は十分に維持しているものの）ＣＡＲのｓｃＦｖ部により認識できない修正標的（ＣＤ１９）タンパク質の原因となる。これが任意の単一標的アプローチの限界であり、細胞つまりがんを増殖させる文脈では、これにより標的抗原発現を阻害する正の選択圧が提供される。
【００２１】
本発明は、ストレスのかかった／疾病細胞（つまり、がん細胞または感染細胞）を特異的に認識するγδＴ細胞の天然機能を、キメラ抗原受容体技術の強力な抗原標的細胞毒性エフェクター機能と組み合わせて利用する。伝統的なＣＡＲを形質導入したガンマデルタＴ細胞は、ＣＡＲ誘発抗原を発現する標的細胞に対するエフェクター機能の向上と、in vivoでの持続性の増大を示す。発明者らは、ＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞は、通常のγδＴ細胞に対して耐性を持つ場合があるがん細胞または感染細胞を、γδＴ細胞が介在する殺傷の影響を受けやすくさせることができると考える。適切には、理論に縛られることを望むものではないが、発明者らは、伝統的なＣＡＲを共発現するγδＴ細胞は、リン酸化抗原またはＣＡＲ標的抗原のいずれかを発現する細胞を認識可能であるため、細胞崩壊のために該細胞を標的化し得、したがってこのような修正ガンマデルタＴ細胞が標的化し得る細胞の幅が広がると考える。さらに、現在のＣＡＲ−Ｔ療法の限界、ＣＡＲ抗原を発現しないがん細胞の正の選択による耐性の発現は、二重抗原特異性を有するであろうＣＡＲ発現γδＴ細胞により緩和されると考えられる。適切には、このようなＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞は、同種対象、つまり、ガンマデルタＴ細胞を最初に得た対象とは異なる対象に提供することが可能である。
【００２２】
当業者には理解されようが、本明細書で論じるＣＡＲ配列をγδＴ細胞に供給することにより得られる効果およびその使用は、適切には、ＣＡＲ配列をγδＴ様細胞に供給することにより得ることができる。適切には、γδＴ様細胞には、機能性γδＴＣＲを発現するように遺伝子改変した任意の細胞が含まれ得る。例えば、Ｖガンマ９Ｖデルタ２ＴＣＲの文脈では、機能性γδＴＣＲを発現させるように遺伝子改変し、それにより細胞の特異性の対象をＩＰＰなどの定義したγδＴＣＲ抗原に変更した、αβＴ細胞またはＮＫＴ細胞である。
【００２３】
従来のＣＡＲ−Ｔ技術は、健常な組織におけるＣＡＲ誘発抗原の発現が原因の、in vivoで適用した場合にアプローチの成功を妨げるいくつかの安全性問題、つまり、「標的上」だが「腫瘍外」の毒性により妨害されると考えられる。実施形態では、（例えば、ｓｃＦｖを介した）ＭＨＣ非依存性抗原認識機能および（１つまたは複数の共刺激性ドメインを介した）共刺激性機能は維持しつつ、ＣＤ３ζドメインを除去したかまたは非機能的にした、ＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞を提供する。
【００２４】
実施形態において、非機能性または不活性のＣＤ３ゼータドメインは、本明細書で論じるようにシグナル１を提供することができない。適切には、キメラ抗原受容体を含む修正γδＴ細胞を提供し得、該キメラ抗原受容体は、疾病関連抗原に対し結合特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域を含み、機能性シグナル１提供ドメインを欠く。当業者に理解されるように、シグナル１はＣＤ３ゼータドメインなどにより提供され得る。
【００２５】
このような実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激性ドメインの存在によるシグナル２機能は維持する一方、シグナル１を提供することはできない。有利なことに、これにより、ＴＣＲシグナル／シグナル１を欠く場合、ＣＡＲが細胞毒性エフェクター機能を引き出すことは不可能になる。理論に縛られることを望むものではないが、発明者らは、このＣＡＲ設計はシグナル１の欠如により多クローン性αβＴ細胞集団では効果的ではない一方、in vitroで増殖させたγδＴ細胞集団においての斯かるＣＡＲの発現は、該γδＴＣＲが活性化している場合、効果的なＣＡＲを提供すると考える。実施形態では、ＣＡＲＣＤ３ζドメインを除去したか、または不活性もしくは非機能的にした、Ｖγ９Ｖδ２イソタイプのＣＡＲ発現γδＴ細胞を提供することが可能である。このような実施形態では、シグナル１はＶγ９Ｖδ２ＴＣＲのリン酸化抗原刺激により提供され得る。このような実施形態では、適切にはリン酸化抗原の存在下でのみ、ＣＡＲは細胞介在性細胞毒性およびサイトカイン産生を引き起こし得る。適切には、このようなＣＡＲ設計は、（ストレスのかかった細胞にのみ存在する）リン酸化抗原に対し定義されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の特異性を利用することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達により調整可能な活性化を可能にする。
【００２６】
実施形態では、本発明のガンマデルタＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２細胞またはガンマデルタＴ細胞の細胞集団をキメラ抗原受容体を含むように修正して、該ガンマデルタＴ細胞の標的を特定の抗原またはタンパク質（細胞表面標的（細胞表面標的には、特定の細胞環境（つまり、腫瘍環境）で見られるが標的細胞とは結合しないリガンドが含まれ得る））にすることが可能である。実施形態において、細胞表面標的は、標的細胞に結合することが可能である。これは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ガンマＴ細胞を標的細胞、特に細胞表面標的を含む標的細胞に近接させ、ガンマデルタＴ細胞の活性化を誘発することを可能にする。このようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ガンマＴ細胞が本発明の態様を形成する。
【００２７】
実施形態では、ＣＡＲ構成体の抗原認識ドメインは、細胞表面標的または標的細胞の同族受容体に連結する天然リガンドを特異的に認識し結合することが可能なライブラリより選択される、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）ドメインまたは断片抗原結合（Ｆａｂ）ドメインとすることが可能である。
【００２８】
実施形態において、本明細書で論じるキメラ抗原受容体が結合する疾病抗原は、細胞表面標的、がんもしくは感染症などの疾病状態に関連する抗原といった疾病関連抗原とすることができ、該疾病関連抗原は、γδＴ細胞に標的にされる細胞上にまたはその周辺に存在し得、その結果、γδＴ細胞は標的化すべき細胞を標的化することができる。実施形態において、細胞表面標的は、細胞感染症、細菌感染症、真菌感染症、または原虫感染症に見られる抗原とするか、または、斯かるウイルスの活性もしくは非活性のウイルス断片、ペプチド、タンパク質、もしくは抗原セグメントとすることが可能である。あるいは、細胞表面標的には、腫瘍特異的抗原および／または腫瘍関連抗原が含まれ得る。
【００２９】
実施形態において、ＣＡＲ、例えばガンマデルタＴ細胞の細胞外表面に備わるＳｃＦＶは、細胞膜を横断し細胞内のシグナル伝達ドメインに連結する膜貫通ドメインに、スペーサを介して連結するか、または直接融合することが可能である。
【００３０】
実施形態において、ＣＡＲ、例えばＳｃＦｖは、膜貫通ドメインを介して（シグナル１を提供する）ＣＤ３ゼータと、共刺激性免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）（シグナル２）に融合することが可能である。
【００３１】
ＣＡＲは、概して、Ｔ細胞特異性の対象を細胞表面標的に変えると考えられ、Ｔ細胞耐性に関する問題を克服する。理解されるだろうが、典型的には、ガンマデルタＴ細胞が対象の細胞、例えば、健常な細胞よりむしろ腫瘍細胞またはウイルス感染した細胞を確実に標的化するように、細胞表面標的を選択することが可能である。
【００３２】
理解されるだろうが、例えば、細胞表面標的が発現する標的腫瘍細胞および正常な組織の両方において、キメラ抗原受容体技術は非常に強力であるものの、「標的上、腫瘍外毒性」の影響を受けやすい可能性がある。
【００３３】
前述のように、キメラ抗原受容体がシグナル１およびシグナル２の要素を一体化させ単一構成物にするＣＡＲ標的系において、該系は、非常に強力かつ選択的な標的依存性エフェクター反応を提供することが可能である。しかしながら、斯かるＣＡＲ標的系は、標的細胞に発現する細胞表面標的のレベルに対し調整可能というわけではない。
【００３４】
Ｖγ９Ｖδ２ＴＣＲ介在性認識は、ＣＡＲ反応を「調整」し、その結果、ＣＡＲからの刺激シグナルがＶγ９Ｖδ２ＴＣＲ刺激の文脈においてのみ機能的反応に翻訳されることを可能にする、さらなるＣＡＲ非依存性標的戦略を提供すると考えられる。これは、例えば幅広い範囲の腫瘍標的（ＨＭＢＰＰ／ＩＰＰストレス関連経路標的）を、追加の細胞表面標的を用いてＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞により標的化することを可能にする。これらの本発明のＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞は調整可能な反応を提供し、所与の腫瘍関連抗原、ピロフォスファート／フォスフォネート（薬物）用量に対し、特定の「共刺激性ＣＡＲ」からのシグナル２との相乗作用を生む機能を有する、次善のシグナル１強度反応が生成される。
【００３５】
実施形態では、in vitro活性化アッセイを用いて最適な「調整反応」用の関連薬物用量を求めて、高レベルの腫瘍関連抗原を発現する（よりシグナル２強度の高い）標的腫瘍株と、より低いレベルを発現する（より低いシグナル強度を生成する）関連非形質転換細胞を最大限に区別することが可能である。実施形態では、多数のＣＡＲを利用して異なる腫瘍／細胞タイプを標的することができた。このような多数のＣＡＲは、１つのガンマデルタＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２細胞に設けることが可能であるか、または、各細胞において異なるＣＡＲを有する多数のガンマデルタＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２細胞（処置バンク）を生成することが可能であり、各ＣＡＲガンマデルタ細胞は特定の腫瘍および／または細胞タイプに用いられる。
【００３６】
ＭＨＣ分子を認識しないガンマデルタＴ細胞におけるヘテロ二量体γδＴＣＲの発現は、斯かるガンマデルタ細胞が強力なエフェクター反応をし得ることを意味すると考えられる。特に斯かる細胞（例えば、Ｖγ９Ｖδ２）は細胞毒性が高く、１ＦＮγおよびＴＮＦαを含む高レベルのＴｈ１サイトカインを産生する可能性がある。
【００３７】
実施形態では、ガンマデルタＴ細胞はさらに阻害性キメラ抗原受容体（ＩＣＡＲ）を含み得、該ＩＣＡＲは、腫瘍外細胞、例えば、細胞表面標的が腫瘍関連的ではあるものの腫瘍特異的抗原ではない、非腫瘍細胞の活性化を最小にする。例えば、斯かる「標的上で腫瘍外の毒性」を最小化するように、阻害性ＣＡＲに結合し得る標的細胞上または標的細胞外の第２抗原の存在が、細胞表面標的とＣＡＲの任意の結合により生成されるシグナルを阻害するだろう。
【００３８】
実施形態において、ガンマデルタ細胞は、標的細胞に存在する異なる抗原に結合することが可能な、または、例えば腫瘍もしくはウイルス感染した細胞環境、例えば、ガンマデルタＴ細胞の活性化および漸増を刺激し得るＩＬ−１２に存在する可溶性シグナル伝達タンパク質に結合することが可能な、さらなるＣＡＲを含み得る。
【００３９】
実施形態において、少なくとも第１キメラ抗原受容体を有し、任意選択的に少なくとも第１阻害性キメラ抗原受容体を有するガンマデルタＴ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞である。
【００４０】
キメラ抗原受容体のガンマデルタＴ細胞への提供は、キメラ抗原受容体をＴ細胞に提供するための、当技術分野で既知の手段によるものであり得る。
【００４１】
本発明の第４態様により、第３態様の核酸をγδＴ細胞に組み込んで／形質導入してγδＴ細胞を遺伝子改変した、ＣＡＲ修正γδＴ細胞を提供するプロセスを提供する。適切には、前記プロセスはレンチウイルスＣＡＲ構成物を利用することが可能である。適切には、前記プロセスは同時にＣＡＲ構成物を細胞に形質導入し、選択的にＣＡＲ形質導入γδＴ細胞を増殖させる。
【００４２】
前記プロセスの実施形態は、「ＴＣＲ調整可能な」または「共刺激性の」ＣＡＲを提供することが可能だと考えられる。
【００４３】
前述のように、斯かる実施形態では、共刺激性ＣＡＲを発現するγδＴ細胞は、健常な細胞ではなく（感染したまたはがんの細胞表面に存在する）リン酸化抗原がある場合にのみ活性化されるだろう。これは、従来のＣＡＲ−Ｔ療法で見られる、「標的上」だが「腫瘍外」の毒性を回避すると考えられる。斯かる実施形態では、共刺激性ＣＡＲの活性は、γδＴ細胞受容体を通した付随のＴＣＲシグナル伝達により調整され得ると考えられる。
【００４４】
本発明の第３態様の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は、タンパク質を細胞膜（ＧＭＣＳＦ−Ｒ分泌性シグナルまたはＣＤ８など）に向かわせるリーダー配列、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達領域を含み得、ＣＤ３ゼータシグナル伝達シグナル伝達ドメインはある場合もない場合もある。本明細書で論じるように、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの欠如は、不活性または非機能的なＣＤ３ゼータドメインにより提供され得る。
【００４５】
ＣＤ３ゼータドメインを含む核酸の実施形態では、ＣＡＲは「伝統的」または「調整不可」であると考えられる。ＣＤ３ゼータドメインが削除された実施形態では、ＣＡＲは「共刺激性の」または「ＴＣＲ調整可能な」なＣＡＲである。
【００４６】
実施形態において、「伝統的な」または「調整不可の」ＣＡＲをコードする核酸配列は、Ｂ細胞タンパク質ＣＤ１９を認識するｓｃＦｖを含み得る。特定の実施形態では、「伝統的な」ＣＡＲは、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:1を含み得、これは適切にはアミノ酸配列SEQ ID NO:2〜6をコードし得る。
【００４７】
核酸配列が「共刺激性の」または「ＴＣＲ調整可能の」ＣＡＲをコードする実施形態では、核酸はＢ細胞タンパク質ＣＤ１９を認識するｓｃＦｖを含み得る。特定の実施形態では、核酸配列はヌクレオチド配列SEQ ID NO:7を含み得、これはアミノ酸配列SEQ ID NO:8〜11をコードし得る。
【００４８】
実施形態において、核酸は、細胞表面標的を特異的に認識しそれに結合することが可能な、単一ｓｃＦｖである細胞外抗原結合ドメインをコードすることが可能である。適切には、実施形態において、ＦＭＣ６３として知られるクローンの細胞外抗原結合ドメイン、好適にはｓｃＦｖは、前述のＢ細胞抗原ＣＤ１９を認識し、それに結合する（Nicholson IC et al., 1997）。
【００４９】
実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、細胞表面標的、腫瘍抗原、および／または腫瘍関連抗原に結合する。実施形態において、細胞表面標的は、細胞感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、またはウイルス感染症に見られる抗原とするか、または、斯かるウイルスの活性もしくは非活性のウイルス断片、ペプチド、タンパク質、もしくは抗原セグメントなどとすることが可能である。
【００５０】
適切には、本発明の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍細胞にのみ存在し、任意の他の細胞には存在しない腫瘍特異的抗原、および／または、一部の腫瘍細胞にも一部の正常細胞にも存在する腫瘍関連抗原を認識し、結合することが可能である。このような腫瘍特異的抗原としては、限定されるわけではないが、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＲＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＷＴ１、がん胎児性抗原、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−３、上皮性腫瘍抗原、および、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＣ２を含むＭＡＧＥタイプ抗原、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＸＡＧＥ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ１、ＳＳＸ２、ＬＡＧＥ１、ウイルス抗原、もしくはその組み合わせ、または、限定されるわけではないが、カルバミル化タンパク質およびシトルリン化タンパク質を含み得る翻訳後修飾タンパク質を含み得る。
【００５１】
実施形態において、細胞表面抗原は、免疫チェックポイントリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１とすることが可能である。
【００５２】
実施形態において、抗原結合ドメインは細胞表面受容体の細胞外部分であってよく、これは次に、前述のように膜貫通ドメインおよび共刺激性ドメインに融合する。
【００５３】
実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３またはＣＤ４またはＣＤ８またはＣＤ２８の、１つまたは複数の膜貫通ドメインを含み得る。
【００５４】
実施形態において、ＣＡＲの共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＬＦＡ１、ＰＤ−１、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４、ＮＫＧ２Ｄの、１つまたは複数の細胞内ドメインを含み得る。
【００５５】
適切には、本発明で用いるγδＴ細胞は、血液単核細胞（ＢＭＣ）またはがんもしくは感染組織の生検より生成することができる。適切には、ＢＭＣは、当業者に既知である任意の密度遠心分離法により、全血、白血球除去材、または臍帯血（ＵＣＢ）から得ることができる。密度遠心分離法としては、限定されるわけではないが、フィコール比重またはリンホプレップ（lymphoprep）が挙げられる。加えて、細胞単離は、ＭＡＣＳ（magnetic-activated cell sorting）法またはＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting）法により実行することが可能である。
【００５６】
適切には、実施形態において、γδＴ細胞は、限定されるわけではないが、ＲＰＭＩ培地、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＩＭＤＭ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地、またはＡＩＭ−Ｖ培地が例として挙げられ得る化学的に定義された培養培地において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）、または、組織由来細胞から増殖させることができる。細胞培養培地には、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヒトＡＢ血清、自家血漿、ヒト血小板溶解物、または、化学的に定義された血清代替品を補充することが可能である。さらに、血清／血漿／代替品は、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）の量で培養溶液に加える。
【００５７】
適切には、実施形態において、Ｖガンマ９サブタイプのγδＴ細胞は、ＩＬ−２、血清／血漿、およびソレドロン酸などのアミノビスフォスフォネートの提供による活性化を含む化学的に定義された培養培地において、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣまたは組織由来の細胞より選択的に増殖させることができる。多数のγδＴＣＲイソタイプを、Ｖγ１〜９およびＶδ１〜８からの任意のガンマデルタＴＣＲペアリングより用いることができる。当業者には、培養条件、特にＴＣＲ活性化方法により増殖されるイソタイプが定義されるだろうことが理解されよう。例として、γδＴ細胞はアミノビスフォスフォネートなどにより活性化され、増殖する一方、δ１細胞は、好適には、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドを用いて増殖させることができる。単離したＰＢＭＣ／ＣＢＭＣは、培養物中で増殖させる前に新たに単離するかまたは凍結保存することができる。
【００５８】
ビスフォスフォネートは二リン酸のアナログであり、二リン酸骨格Ｐ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）がＣ（炭素原子）で置換された化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。ビスフォスフォネートは、概して、骨粗しょう症の治療薬物として用いられる。アミノビスフォスフォネートは、ビスフォスフォネート中にＮ（窒素原子）を有する化合物を指す。例えば、本発明で用いるアミノビスフォスフォネートは特に限定されず；その例としては、パミドロン酸とその塩および／またはその水和物、アレンドロン酸とその塩および／またはその水和物、ならびにゾレドロン酸とその塩および／またはその水和物が挙げられる。アミノビスフォスフォネートの濃度は、好適には、パミドロン酸とその塩および／またはその水和物では１〜３０μＭ、アレンドロン酸とその塩および／またはその水和物では１〜３０μＭ、ゾレドロン酸とその塩および／またはその水和物では０．１〜１０μＭである。ここでは例として５μＭのゾレドロン酸を加える。
【００５９】
適切には、サイトカインＩＬ−２も、５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍＬ、より好適には４００ＩＵ／ｍＬ〜１０００ＩＵ／ｍＬで含まれ得る。適切には、培養物には、５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍｌで、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、またはＩＬ−２１などの１つまたは複数のサイトカインを捕捉することもできる。
【００６０】
適切には、アミノビスフォスフォネートを介した抗原の提供は、イソペンチルピロフォスファート（ＩＰＰ）、ホスホスチム／ブロモヒドリンピロホスフェート（ＢｒＨＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ｂｕｔ−２−エニルピロフォスフェート（ＨＭＢＰＰ）またはＤＭＡＰＰなどの合成抗原で代用することができる。抗原刺激はまた、放射線を照射した細胞および／または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とともに共培養することにより提供することができる。このような成分の添加により、典型的には、培養サンプル中の総細胞数の７０〜１００％のガンマデルタＴ細胞の正の選択を可能にする、培養環境が提供される。
【００６１】
γδＴ細胞の増殖は、ＣＤ３、ガンマデルタＴＣＲ、ＣＤ２８、およびＣＤ１３７に対する１つまたは複数の抗体で刺激することもできる。これらは可溶性であるか、プレート結合するか、または、ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）もしくはＭＡＣＳｉｂｅａｄｓなどの適切なビーズに共役することが可能である。γδＴ細胞は、以前開示された任意の方法論を用いて増殖および拡大させることができる。
【００６２】
適切には、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲにより認識される組換タンパク質、例えば、ＣＤ１９標的ＣＡＲの場合は組み換えＣＤ１９−Ｆｃキメラまたは組み換えＣＤ１９を用いて選択的に増殖させることが可能である。これは、プレート結合しているか、可溶性であるか、または、ｄｙｎａｂｅａｄｓもしくはＭＡＣＳｉｂｅａｄｓなどの適切なビーズ上にあり得る。任意のイソタイプのγδＴ細胞は、少なくとも７日間、より好適には１４日間という時間枠の間で選択的に増殖させることができる。適切には、培養期間は、実質的に精製された多数のＣＡＲ発現ガンマデルタＴ細胞集団を得るために約９日間以上実行してよい。γδＴ細胞は、ＴＣＲ抗原またはＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドを用いて増殖させることができる。単離したＰＢＭＣは、培養物中で増殖させる前に、新たに単離するかまたは凍結保存することができる。増殖させたγδ細胞は、培養物中において、さらなる増殖のために、凍結保存し、後になって蘇生することができる。
【００６３】
γδＴ細胞を遺伝子改変してＣＡＲ設計をコードする核酸を組み込む方法には、当業者に既知の任意の技法が含まれ得る。適切な方法論としては、限定されるわけではないが、レンチウイルス／レトロウイルス／アデノウイルスを用いたウイルス形質導入、エレクトロポレーション、脂質ベースのトランスフェクション試薬、ナノ粒子、塩化カルシウムに基づくトランスフェクション法、またはバクテリア由来のトランスポゾンによる細胞トランスフェクションが挙げられる。
【００６４】
実施形態において、レンチウイルス／レトロウイルス／アデノウイルスを形質導入に利用する場合、当業者に理解されるように、このプロセスを強化するために化学試薬の包含を用いることが可能である。該試薬としては、限定されるわけではないが、例えば、臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）、（RetroNectin-Takara Clontechなどの）組換ヒトフィブロネクチン、および、TransPlus Virus Transduction Enhancer（ALSTEM Cell Advancements）が挙げられる。
【００６５】
適切には、ＣＡＲをコードする核酸の組み込みは、培養期間の任意の時点で、ＰＢＭＣ、ＣＢＭＣ、または組織由来の増殖させたγδＴ細胞に導入することができる。
【００６６】
γδＴ細胞によるＣＡＲ構成物の形質導入および発現の有効性の検出には、当業者に既知の任意の技法が含まれ得、該技法としては、限定されるわけではないが、定量ＰＣＲおよびフローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングなどの抗体ベースの検出方法が挙げられる。
【００６７】
本発明の態様により、伝統的なＣＡＲと共刺激性ＣＡＲを、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13と、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15の群から選択される少なくとも１つのプライマー対を用いて検出する方法を提供する。
【００６８】
【表１】
2018512161.tif 000003
【００６９】
適切には、前記方法は伝統的なＣＡＲと共刺激性ＣＡＲの量的検出を可能にし得る。適切には、前記方法は、伝統的なＣＡＲと共刺激性ＣＡＲの識別を可能にする。
【００７０】
フローサイトメトリーを利用する一実施形態では、例えば、蛍光色素または蛍光標識したストレプトアビジンなどの第２試薬を用いて検出することが可能な抗原に共役した、ｓｃＦｖのイディオタイプに対する抗体を用いることができる。実施形態において、ＣＡＲを検出するために用いる試薬は、ＣＡＲにより認識される組換タンパク質を含み哺乳類抗体のＦｃ断片と融合したキメラタンパク質、例えばＣＤ１９−Ｆｃキメラとすることが可能である。これは、タンパク質のＦｃ部分に対する抗体を用いて検出することが可能である。これらの試薬は、限定されるわけではないが、Ｖガンマ９、ＣＤ３、ガンマデルタＴＣＲ、アルファベータＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ５６が例として挙げられる免疫表現型検査マーカーに対する蛍光色素共役抗体と組み合わせることが可能である。
【００７１】
ＣＡＲ修正ガンマデルタ細胞を用いた処置方法
本発明の第２態様の実施形態において、調整可能／共刺激性ＣＡＲまたは伝統的なＣＡＲを発現したγδＴ細胞を、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、またはがんなどの疾病を処置するために患者に投与することが可能である。
【００７２】
実施形態では、調整可能／共刺激性ＣＡＲ発現γδＴ細胞とアミノビスフォスフォネートまたはその代替品を、対象に同時投与するが、該代替品は、生理学的なメバロン酸経路の調節不全を介して、標的細胞に存在するリン酸化抗原のレベルを高めることが可能である。斯かる同時投与はＶγ９Ｖδ２ＴＣＲ認識に影響を及ぼして、リン酸化抗原が結合したγδＴＣＲからのシグナル１強度の「薬物調整可能」滴定を可能にするのに有利であり得ると考えられる。調整可能／共刺激性ＣＡＲは、ＣＡＲ標的疾病関連抗原に基づき、細胞に限定された新規のシグナル２を提供し得る。
【００７３】
特定の実施形態では、所与の疾病関連抗原に対しアミノビスフォスフォネート用量またはその代替品を調整して、次善のシグナル１強度を生成し、特定の調整可能／共刺激性ＣＡＲからのシグナル２との相乗機能を得ることが可能である。in vitroでの活性化を用いて最適な「調整」のための関連薬物用量を推定して、高レベルの抗原（より高いシグナル２強度）を発現する疾病関連抗原発現細胞株と、（より低いシグナル２強度を生成する）より低いレベルを発現する非形質転換細胞を、最大限識別することができた。例えば、本発明で用いる同時投与するアミノビスフォスフォネートとしては、ゾレドロン酸とその塩および／またはその水和物、アレンドロン酸とその塩および／またはその水和物、ならびにパミドロン酸とその塩および／またはその水和物が挙げられる。
【００７４】
治療における本発明のガンマデルタＴ細胞の同種使用では、ガンマデルタＴ細胞は本発明のＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞を使用するが、斯かる同種使用は、典型的には、免疫系が介在する拒絶反応に関連した潜在的な問題により検討されてこなかった。発明者らは、ガンマデルタＴ細胞は、典型的には移植片対宿主病を引き起こさず、同種移植のためのガンマデルタＴ細胞を選択すれば、Ｔ細胞を移植片対宿主病のリスクを最小限にしてレシピエントに提供することが可能になると考える。ガンマデルタＴ細胞はＭＨＣ拘束的ではないことから、同種移植は、実行可能な治療であると考えられ、ガンマデルタＴ細胞はＭＨＣハロタイプとは無関係に細胞崩壊のために細胞を標的化することが可能である。ガンマデルタＴ細胞がＭＨＣ提示抗原を認識しないことを鑑み、本発明者らは、Ｂ細胞およびアルファベータＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞を含む、他の白血球から十分に精製されたガンマデルタＴ細胞の高純度の同種移植では、ＧＶＨＤのリスクは最小化されると考える。加えて、限定されるわけではないが、例えば、エボラ、ＨＩＶ、およびインフルエンザといったいくつかのウイルス感染症の患者ならびにＰＴＬＤ−ＥＢＶ患者および他のがんタイプの患者を含む、ある疾病状態にあるレシピエントの免疫力の低下に起因する移植片拒絶の可能性は低いと考えられる。
【００７５】
述べたように、以前の処置戦略には、同種幹細胞移植の前に、負の選択または正の選択の方法論を用いて、ドナーの血液、特に末梢血からＴ細胞を除去することが含まれていた。
【００７６】
細胞をドナー対象から採取するステップ、斯かるドナー細胞を十分な数のガンマデルタＴ細胞を同種的にレシピエント対象に提供できるように処理するステップを含む処置方法であって、前記処理ステップには、ガンマデルタＴ細胞を修正してキメラ抗原受容体に組み込み、その結果、該修正ガンマデルタＴ細胞を同種対象に提供してレシピエント対象に治療効果を与えるようにするステップが含まれる、方法を提供する。
【００７７】
例えば、ガンマデルタＴ細胞増殖法には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法を用いて、血液または白血球除去材から単離するステップが含まれ得る。単離したＰＢＭＣは、培養物中で増殖させる前に凍結保存することができる一方、血漿を共抽出して、後続のガンマデルタＴ細胞培養ステップで用いる自家賦形剤として保持する。実施形態では、新たに単離したＰＢＭＣ（または凍結保存から蘇生したもの）を、ヒト組み換えＩＬ−２（例えば、最大１０００ｕ／ｍＬ濃度）とゾレドロン酸（例えば、５μＭ）を含有する増殖培地に接種することが可能である。ゾレドロン酸の添加（０日目）と、１４日間の増殖期間にわたる継続したＩＬ−２の含有により、γδＴリンパ球集団を活性化させ、ＰＢＭＣから選択的に増殖させることができる。細胞懸濁物質はこの期間にわたり、（典型的には１：２の継代比率で）順次増殖させることができる。培養開始から１４日目に、細胞を採取し、乳酸リンゲル液およびＨＳＡに再懸濁させてから、１００ｍＬの食塩溶液を入れた注入ボトルに移すことが可能である。あるいは、後で蘇生するために凍結保存してよい。
【００７８】
増殖後、実施形態において、ガンマデルタＴ細胞生成物は、以下の最低限の仕様を満たす；総細胞の８０％超がＴリンパ球（ＣＤ３陽性）であり、ガンマデルタＴリンパ球は、総Ｔリンパ球集団の６０％以上を含み（Ｖガンマ９陽性）、ＮＫ細胞は総Ｔリンパ球集団の２５％未満であり（ＣＤ３陰性／ＣＤ５６陽性）、細胞毒性Ｔ細胞は総Ｔリンパ球集団の１０％未満であり（ＣＤ３／ＣＤ８陽性）、Ｔヘルパー細胞は総Ｔリンパ球集団の５％未満である（ＣＤ３／ＣＤ４陽性）。実施形態において、これらの仕様を満たす細胞集団を、９９％超のガンマデルタＴ細胞を有することを目標にする高純度同種細胞バンク生成の開始材料として用いることが可能である。
【００７９】
したがって、以下のステップ
−第１対象からガンマデルタＴ細胞のサンプルを提供するステップと：
−前記ガンマデルタＴ細胞を培養して、それを第２対象に投与するステップであって、前記ガンマデルタＴ細胞はＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞を提供するように修正されている、ステップとを含む、第２対象にガンマデルタＴ細胞を同種的に提供するプロセスを提供する。
【００８０】
実施形態において、提供ステップには、ガンマデルタＴ細胞を第１対象から採取するステップが含まれ得る。採取は、即時に健康だと認められる状態ではないドナー対象からとすることが可能である。適切には、レシピエント対象は、脊椎動物、例えば哺乳類、例えばヒト、または商業的に加値のある家畜類、研究動物、ウマ、ウシ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ、およびブタなどとすることができる。実施形態では、第１および第２の対象はヒトとすることができる。理解されるように、本発明の文脈において、第１対象は、ガンマデルタＴ細胞を採取するドナー対象であり、細胞は異なる第２の（レシピエント）対象の同種治療に用いる。適切には、第１の対象は病気にかかる前の状態である。本明細書で用いる場合、用語「疾病前の」状態は、「健康な」、「疾病のない」という絶対的な用語と、「疾病の潜在的進行の段階的変化」、病気にかかった状態よりも「健康である」、または「病的ではない」という相対的な用語をカバーする。「疾病前の」は、第１対象が病気であると診断されるより前の時間により定義され得るため、第１対象は絶対的に健康であるか、または、すでに病気であっても、その病気自体が発症していないか、または診断も検出もされていない場合もある。実施形態において、プロセスは、第１対象から得られたガンマデルタＴ細胞を培養して、該ガンマデルタＴ細胞を第２対象に提供できるようにするステップを含み得る。
【００８１】
実施形態において、ガンマデルタＴ細胞は、アフェレーシスもしくは白血球除去療法に従って得られる末梢血もしくは末梢血単核細胞、または臍帯血から採取することが可能である。ex vivoにおける末梢血由来のガンマデルタＴ細胞の増殖は、リン酸化抗原またはアミノビスフォスフォネートで活性化した場合、Ｖγ９Ｖδ２表現型のガンマデルタＴ細胞を優先的に生じさせるだろう。ex vivoでの増殖のために出発材料として臍帯血を使用すると、活性化抗原次第でいくつかのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブタイプの選択的増殖が可能になる。これらのＴＣＲイソタイプには、Ｖγ１〜９およびＶδ１〜８、例えば、限定されるわけではないが、Ｖδ１、Ｖδ２、およびＶδ３ＴＣＲ変異体からの任意のガンマデルタＴＣＲペアリングが含まれ得る。別のサブタイプのガンマデルタＴ細胞は、別個の抗原を認識するため、標的細胞により提示される抗原次第で異なるレベルの細胞毒性が示されるだろう。各デルタＴＣＲサブタイプの相対的存在量は、培養条件および提示される特異的抗原に大きく左右される。培養条件は、臍帯血から所望のＴＣＲイソタイプを優先的に増殖させるように調整することができる。例えば、特異なＴＣＲイソタイプを発現しているガンマデルタＴ細胞が、特定のがんタイプの処置において、または特定のウイルス感染症の処置により有効な場合がある。
【００８２】
実施形態において、採取ステップには、第１の対象からガンマデルタＴ細胞を採取する前に、第１の対象にガンマデルタＴ細胞強化剤を投与するステップが含まれ得る。
【００８３】
実施形態において、ガンマデルタＴ細胞を採取する方法は、第１の対象に、Ｇ−ＣＳＦ、アミノビスフォスフォネート、特にパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物といった、骨髄からの白血球動員を誘発する成長因子などの強化剤を投与するステップを含み得る。
【００８４】
実施形態において、処理ステップまたはプロセスは、
−第１の対象（ドナー）から、血液、例えば、臍帯血、または除去療法／白血球除去療法由来の細胞を提供するステップと、
−前記血液から末梢血単核細胞を分離するステップと、
−アミノビスフォスフォネートおよび標的抗原を前記末梢血単核細胞に加えるステップと、
−前記末梢血単核細胞を培養して標的抗原特異性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびガンマデルタＴ細胞を増殖／誘発するステップと、
−前記ガンマデルタＴ細胞を修正して、本明細書で論じるＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞を提供し、任意選択的に、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣまたはＴ細胞を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共に共培養して標的抗原特異性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびガンマデルタＴ細胞を増殖／誘発するステップのうち１つまたは複数を含み得る。
【００８５】
本発明者らは、全血の他の成分から実質的に単離したガンマデルタＴ細胞の提供により、その実質的に単離したガンマデルタＴ細胞を同種的に第２の対象に投与する場合の移植不全が減少すると考える。結果として、本発明のプロセスは、全血またはその成分からガンマデルタＴ細胞を精製するステップを含み得る。末梢血の細胞総数の１０％未満がガンマデルタＴ細胞から構成されるため、試料の１０質量％超がガンマデルタＴ細胞からなるように、例えば抗ガンマデルタＴ細胞抗体を用いて全血またはその成分の試料を精製することは、レシピエント対象を同種的に処置することの有効性を向上させると考えられる。結果として、本発明のプロセスは、精製した試料における細胞総数の１０、２５、５０、７５、８５、９０、９５、または９８％超がガンマデルタＴ細胞であることを達成するために、全血またはその成分の試料を精製するステップを含み得る。
【００８６】
全血、臍帯血、またはその成分からガンマデルタＴ細胞を精製することが可能な当業者に既知の任意の方法は、本発明の一部をなし得る。明らかに、精製ステップはガンマデルタＴ細胞の生存能力に影響を与えないか、または影響は最小限であるべきである。例えば、以下のステップは、前述のガンマデルタＴ細胞の精製を達成するために、組み合わせてまたは単独で用いることができる：−透析プロセス（例えば除去療法および／または白血球除去療法）；分画遠心分離；培養物中でのガンマデルタＴ細胞の増殖（例えば培養物中での優先増殖）。
【００８７】
精製ステップは、少なくとも部分的に、培養ステップの間で実行することが可能である。例えば、培養ステップの間、アミノビスフォスフォネート、特にパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物など特有の成分の少なくとも１つまたは組み合わせを加えると、ガンマデルタＴ細胞が培養物中で増殖することが可能になる。細胞培養中の精製は、また、ホスホスチム／ブロモハロヒドリンピロフォスファート（ＢｒＨＰＰ）、合成イソペンテニルピロフォスファート（ＩＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ｂｕｔ−２−エニルピロフォスファート（ＨＭＢ−ＰＰ）などの合成抗原の添加または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）との共培養によっても達成することができる（Wang et al., 2011）。こうした成分の添加により、典型的には精製試料の総細胞数の７０％以上の数のガンマデルタＴ細胞の正の選択を可能にする、培養環境が提供される。このような成分の添加により、典型的には精製された試料の総細胞数の７０％の数のガンマデルタＴ細胞の正の選択を可能にする、培養環境が提供される。
【００８８】
アミノビスフォスフォネートは、ガンマデルタＴ細胞を培養する初日よりいつでも加えることが可能である。アミノビスフォスフォネートは、０．０５〜１００マイクロモル、好適には０．１〜３０マイクロモルの濃度で末梢血単核細胞に加えることが可能である。適切には、ビスフォスフォネートは、二リン酸アナログであり、二リン酸骨格Ｐ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）がＣ（炭素原子）で置換された化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。ビスフォスフォネートは、概して、骨粗しょう症の治療薬物として用いられる。アミノビスフォスフォネートは、ビスフォスフォネート中にＮ（窒素原子）を有する化合物を指す。例えば、本発明において用いるアミノビスフォスフォネートは特に限定されず、国際公開第２００６／００６７２０号および国際公開第２００７／０２９６８９号に開示されているようなアミノビスフォスフォネートなどを用いてよい。その特定の例としては、パミドロン酸とその塩および／またはその水和物、アレンドロン酸とその塩および／またはその水和物、ならびにゾレドロン酸とその塩および／またはその水和物が挙げられる。アミノビスフォスフォネートの濃度は、好適には、パミドロン酸とその塩および／またはその水和物では１〜３０μＭ、アレンドロン酸とその塩および／またはその水和物では１〜３０μＭ、ゾレドロン酸とその塩および／または水和物では０．１〜１０μＭである。ここでは、５μＭのゾレドロン酸を例として加える。
【００８９】
適切には、培養期間が７日間以上の場合、ガンマデルタＴ細胞を含む細胞群が高純度で得ることができるが、しかしながら、培養は、好ましくは、ガンマデルタＴ細胞の数をさらに増加させるために約１４日間実行する。
【００９０】
実施形態において、培養の期間は、約７日間以上とすることができる。適切には、培養期間は、実質的に精製されたガンマデルタＴ細胞集団を多数得るために約１４日間以上実行してよい。培養は典型的には１４日間実行し、その後ガンマデルタＴ細胞は急激な増殖の継続を停止する。しかしながら、ある実施形態は、培養の延長およびより大きな数までのガンマデルタＴ細胞の選択的増殖を提供する。こうした実施形態には、培養物への合成抗原（例えば合成ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、Ｂｒ−ＨＰＰ、ＨＭＢ−ＰＰ）の供給、人工のもしくは照射した抗原提示細胞への繰返し暴露、固定した抗原もしくは抗体の提供、または細胞培養の出発原料としての臍帯血の使用が含まれる。
【００９１】
適切には、細胞は、最低少なくとも２集団を倍加させた後、その細胞表面受容体プロファイルをリセットするために少なくとも７日という期間この環境で培養してよい。
【００９２】
任意選択的に、ガンマデルタＴ細胞を培養するステップは、ガンマデルタＴ細胞表面受容体プロファイルを変更するためのステップを含んでいてよい。
【００９３】
例えば、培養ステップは、第１の対象由来の試料において提供されたガンマデルタＴ細胞に存在する１つまたは複数のガンマデルタＴ細胞表面受容体タイプを減少または除去する、１つまたは複数のサブステップを含んでよい。こうしたステップは、ガンマデルタＴ細胞の受容体プロファイルを「リセット」または「部分的にリセット」して、未処置のまたは部分的に未処置の形態に戻すと考えられ得る。こうしたリセットは、ガンマデルタＴ細胞のがんおよびウイルス感染症を処置する機能を向上させると考えられる。一部のＴ細胞受容体は、該Ｔ細胞が由来する対象におけるがんまたはウイルスの存在によって誘発され得ることが知られており、かつこれらの受容体は、一部の場合ではＴ細胞による腫瘍またはウイルス感染への反応性を抑制し得ることが分かっている。結果として、こうした受容体を除去することは、本発明のガンマデルタＴ細胞の効力を増大し得る。
【００９４】
１つまたは複数のガンマデルタＴ細胞受容体タイプの減少または除去は、細胞集団の大きさが数倍に拡大する数日間にわたって第１の対象由来のガンマデルタＴ細胞を培養することによる、本発明のプロセスによって達成することができる。例えば、細胞を、最低少なくとも２集団を倍加させた後、その細胞表面受容体プロファイルをリセットするために少なくとも７日という期間培養してよい。
【００９５】
ガンマデルタＴ細胞表面受容体プロファイルがリセットされた場合、腫瘍特異的細胞表面受容体Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４など、初期の未培養ガンマデルタ細胞上に存在した細胞表面受容体は、培養増殖期間の間になくなるか、または実質的に数を減少させることができる。
【００９６】
培養ステップは、選択したガンマデルタＴ細胞表面受容体（例えば、上述の受容体のいずれか１つまたは任意の組み合わせ）を著しく減少または除去するのに必要な培養ステップの適切な期間を決定するために、ガンマデルタＴ細胞の表面受容体プロファイルを観察するステップをさらに含んでよい。ガンマデルタＴ細胞受容体を観察するプロセスは、例えば、Chan et al , Genes and Immunity (2014) 15, 25 to 32によって概説されているようなフローサイトメトリー技術を用いて実行することができる。簡単に言えば、免疫チェックポイント阻害剤受容体および／またはリガンドに特異的な抗体が、その細胞表面上の免疫チェックポイント阻害剤を発現している（例えば抗Ｖガンマ９で共染色した）ガンマデルタＴ細胞の部分集団を特定するために用いられるであろう。
【００９７】
加えて、または任意選択的に、本発明の培養ステップは、第１の対象から抽出された際には未培養ガンマデルタ細胞の表面に存在しなかったガンマデルタＴ細胞表面受容体タイプの発現をガンマデルタＴ細胞において誘発するステップ、または、第１の対象から抽出された際に未培養ガンマデルタ細胞の表面上に存在した細胞表面受容体タイプの発現量の増加を誘発するステップを含んでいてよい。これは、がん、細菌、真菌、原虫、またはウイルスに由来する抗原でガンマデルタＴ細胞を攻撃することによって達成することができる。この抗原を培養増殖培地に加えて、増殖させたガンマデルタＴ細胞の有効性、抗原提示可能性、および細胞毒性を向上させることが可能である。適切には、抗原は、限定されるわけではないが、固定した抗原または抗体、照射した腫瘍細胞株、人工抗原提示細胞、および合成可溶性抗原の添加を含む、種々の形式で提供することができる。抗原は、培養の初日に培養増殖培地に加えてよい。実施形態において、ウイルスは、インフルエンザ、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘルペス変異体、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス、水痘、パピローマウイルス、エボラ、水痘帯状疱疹ウイルス、または天然痘から選択することができる。代わりに、抗原を、細胞感染症、細菌感染症、真菌感染症、または原虫感染症で見られる抗原とすることが可能である。特に、標的抗原は、インフルエンザ、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘルペス変異体、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エボラウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘、パピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、または天然痘に由来し得る。
【００９８】
適切には、抗原は、斯かるウイルス生物の、活性または不活性のウイルス断片、ペプチド、タンパク質、抗原セグメントなどを含み得る。
【００９９】
適切には、抗原には、腫瘍細胞上にのみ存在し、任意の他の細胞上には存在しない腫瘍特異的抗原、および／または、一部の腫瘍細胞にも一部の正常細胞にも存在する腫瘍関連抗原が含まれ得る。斯かる腫瘍特異的抗原としては、限定されるわけではないが、がん胎児抗原、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原およびＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＣ２を含むＭＡＧＥタイプ抗原、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＸＡＧＥ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ１、ＳＳＸ２、またはＬＡＧＥ１、またはその組み合わせが含まれ得る。
【０１００】
適切には、適した抗原を提供するために、感染細胞、壊死細胞、またはがん細胞の溶解物を利用することができる。実施形態において抗原は、合成抗原、例えば、合成ペプチドであってよい。あるいは、抗原は対象から採取してよい。適切には、抗原１ｍＬ当たり約０．０２〜２マイクログラムを培養ステップの間に細胞に提供することができる。
【０１０１】
実施形態では、ガンマデルタＴ細胞の増殖およびＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１８などの細胞表現型の維持を促進する因子（Garcia V. et al., 1998, Nussbaumer O. et al., 2013）を、末梢血単核細胞を培養するステップで提供することができる。適切には、こうした実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−１８、またはその組み合わせを、５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好適には４００〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲で培養培地に提供することができる。培養は、典型的には２から１０％、より好適には５％のＣＯ２の存在下で摂氏３４度から３８度、より好ましくは摂氏３７度で実行される。培養培地は、培養する細胞の数に応じて追加してよい。適切には、血清は０．１〜２０％の量で培養液に加えてよい。血清として、例えば、ウシ胎児血清ＡＢ血清、または自家血漿を用いることができる。適切には、化学的に定義した血清代替品を、血清または血漿の代わりに用いてよい。
【０１０２】
実施形態において、消耗したまたはアネルギー性のガンマデルタＴ細胞の回復を促進する因子を、培養培地に加えてよい。適切には、これらの因子としては、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１８などのサイトカインまたは特定の免疫チェックポイント阻害剤受容体もしくはリガンドを標的化する抗体、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体が挙げられるが（Chang K. et al., 2014）、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＬＡＧ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３またはＡ２ａＲを対象とする抗体も含まれ得る。
【０１０３】
実施形態において、提供ステップには、ドナー対象からの血液または臍帯血の採取が含まれ得る。こうした採血は、例えば、ドナー対象からの約１５〜２５ｍＬの血液とすることができる。実施形態において、提供ステップには採取ステップが含まれ得、該採取ステップは、単一の採取プロセスにおいて第１の対象から少なくともガンマデルタＴ細胞を採取することである。実施形態において、採取ステップは、複数の採取セッションにわたっていてよい。
【０１０４】
本発明の実施形態において、ガンマデルタＴ細胞を提供するプロセスには、第１の対象から採取した細胞の少なくとも１つの特徴を決定する分析ステップが含まれ得る。実施形態において、細胞の少なくとも１つの特徴は、細胞のＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、もしくはアミノ酸配列、細胞のプロテオーム、または細胞の細胞表面マーカーとすることができる。実施形態において、プロセスには、ガンマデルタＴ細胞の組織型を決定するステップが含まれ得る。ガンマデルタ細胞表面マーカー特徴としては、（限定されるわけではないが）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ５６、ＣＤ２７ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５、ＴＣＲ−Ｖｇ９、ＴＣＲ−Ｖｄ２、ＴＣＲ−Ｖｄ１、ＴＣＲ−Ｖｄ３、ＴＣＲ−ｐａｎ ｇ／ｄ、ＮＫＧ２Ｄ、モノクローナルケモカイン受容体抗体ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、もしくはＣＸＣＲ５、またはその組み合わせが挙げられる。この分類には、遺伝子型または表現型の情報が含まれ得る。表現型の情報には、顕微鏡、細胞、または分子レベルで観察可能または測定可能な特性が含まれ得る。遺伝子型の情報は、例えば、ヒト白血球抗原（ドナーのＨＬＡ型）の、特有の遺伝的変異または突然変異に関連し得る。
【０１０５】
適切には、本発明のガンマデルタＴ細胞は、多数の患者で使用するために増殖および分化させることが可能な臨床等級の細胞株バンクを提供し得る。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞を臍帯血出発原料からex vivoで増殖させ、複数のドナーに由来するものと組み合わせて、細胞バンクを充実させるのに十分な数のガンマデルタＴ細胞を生成することができる。斯かる細胞バンクおよびその中の単離細胞は、本発明の別個の態様を形成する。実施形態において、斯かるバンクには、適切には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチングの可能性を最大化するように選択され、それによって同種移植拒絶のリスクまたは免疫抑制剤の実質的な使用の必要性を最小化する、血液型Ｏの健常なボランティアドナーから得られたガンマデルタＴ細胞が入れられるだろう。例えば、ＵＫ／ＥＵ患者向けの斯かるバンクは以下のものを含み得、これは拒絶のリスクを減少しつつかなりの割合のＵＫ／ＥＵ人口の治療を可能にする。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
実施形態において、本発明の採取し処理したガンマデルタＴ細胞を、今後の使用のために細胞バンクまたは保管所に預けることが可能である。したがって、細胞は、ＤＭＳＯまたはＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）などの凍結保存物質内で貯蔵され、制御された凍結速度および液体窒素内での貯蔵に供され得る。ガンマデルタＴ細胞は、単一または多数の処置ステップで必要とされる定義した単位または投薬量のユニット化ストレージで保存することができる。
【０１０８】
一実施形態において、プロセスは、採取試料内のガンマデルタＴ細胞の貯蔵、生存能力、または治療能力を向上させる薬剤で第１の対象から採取した細胞集団を処置するステップを含み得る。一実施形態において、プロセスは、ガンマデルタＴ細胞試料中のガンマデルタＴ細胞に凍結保存剤を与える保存ステップを含み得る。
【０１０９】
実施形態において、ガンマデルタＴ細胞は、リン酸化抗原イソペンテニルピロフォスファート（ＩＰＰ）増殖ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞であり得る。
【０１１０】
支配的な末梢血γδＴ細胞サブセットは、標準的なＶγ９Ｖδ２ＴＣＲを発現し、これはＴＣＲ依存的な方法で、メバロン酸経路の調節不全に基づき、小分子量（〜３５０Ｄａ）のピロフォスファート抗原のレベル上昇の感知を介して、標的細胞を認識する。これらは、細菌感染症を意味する外来由来であるか（ＨＭＢＰＰなど）、または、腫瘍化時のイソプレノイド合成の増加を指す内因性（ＩＰＰ）の何れかであり得る。
【０１１１】
Ｖγ９Ｖδ２細胞は、非常に広範囲の標的細胞に発現し、ピロフォスファート抗原に特異的に結合する細胞質Ｂ３０．２ドメインを含有する細胞表面糖たんぱく質ＢＴＮ３Ａ１を認識するために出現し、ＢＴＮ３Ａ１のクラスタリングおよび生産的ＴＣＲ認識に至る。重要なことに、Ｖγ９Ｖδ２の活性化はＣＤ３ゼータおよびＺＡＰ−７０が介在するＴＣＲシグナル伝達に依存するが、それは、ＴＣＲ介在性シグナル伝達と最終的に統合するＰＩ３−キナーゼ経路シグナルを強めるＣＤ２８などの共刺激性受容体またはＮＫＧ２Ｄなどの「ストレスのかかった」受容体が介在し得る、共刺激性経路に強く影響される。
【０１１２】
実施形態において、ガンマデルタＴ細胞は増殖したヒトＶδ１Ｔ、Ｖδ２Ｔ、またはＶδ３Ｔ細胞であり得る。
【０１１３】
個体の感染症またはがんを処置する方法であって、前記個体に別の固体から得たガンマデルタＴ細胞を提供するステップを含む方法も提供する。したがって、ドナーのガンマデルタＴ細胞を、例えばウイルス、細菌、真菌、もしくは原虫の感染症の処置、またはレシピエント対象のがんの処置に用い、ここではドナーとレシピエントは同一の固体ではない。理解されるように、ガンマデルタＴ細胞を第２対象に提供する前、このガンマデルタＴ細胞を本明細書で論じるように修正して、ＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞を提供する。
【０１１４】
適切には、ガンマデルタＴ細胞をレシピエント対象に提供する投与法には、静脈内注射、皮内注射、または皮下注射が含まれ得る。投与は、個体に対し、患部にまたは全身的になされ得る。適切には、投与法は、個体に利益を示すのに十分な「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」のガンマデルタＴ細胞を提供する、予防法（場合によっては、予防は治療と考えられる場合もあるが）とすることが可能である。実際の投与量、投与速度、および投与の時間的経過は、処置するものの性質および重症度に左右されるだろう。処置についての処方、例えば投与量などの決定は、総合診療医および他の医師の責任の範囲内にある。
【０１１５】
実施形態において、第１の対象に由来するガンマデルタＴ細胞を、ウイルス、細菌、真菌、または原虫に感染した第２の異なる対象の治療で用いるために提供し、前記対象の治療は同種的である。
【０１１６】
実施形態において、第１の対象に由来するガンマデルタＴ細胞を、ウイルスに感染した第２の異なる対象の治療のために提供し、前記ウイルスは、ＨＩＶ、インフルエンザ、または肝炎から選択され、前記治療は同種的である。実施形態において、ウイルスは、Ｂ肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ヘルペス変異体、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス、水痘、パピローマウイルス、エボラ、水痘帯状疱疹ウイルス、または天然痘であり得る。
【０１１７】
実施形態において、インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザ（ＦｌｕＡ）ウイルスであり得る。実施形態において、インフルエンザウイルスは、鳥類またはブタ由来のパンデミックインフルエンザウイルス、例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２（鳥類サブタイプ）またはＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２Ｈ２Ｎ３（ブタサブタイプ）であり得る。
【０１１８】
実施形態において、がんを有する対象の治療のためのガンマデルタＴ細胞を提供し、前記治療は同種的である。
【０１１９】
実施形態において、第１の対象に由来するガンマデルタＴ細胞を、ウイルス、真菌、または原虫の少なくとも１つに感染している第２の対象の治療で用いるために提供する。実施形態において、ガンマデルタＴ細胞を提供された対象には、免疫抑制剤を同時に、連続的に、または別々に投与することが可能である。免疫抑制剤の投与は、ガンマデルタＴ細胞に対する任意の有害なシステム反応の緩和に役立ち得る。
【０１２０】
実施形態において、エプスタインバーウイルス誘発性リンパ増殖性疾患（ＥＢＶ−ＬＰＤ）を有する対象の治療のためのガンマデルタＴ細胞を提供する。
【０１２１】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ガンマヘルペスウイルスファミリーのメンバーであり、西欧人の間でよく見られる（＞９０％の成人が血清陽性である）。ＥＢＶは、ウイルスの再活性化を防ぐ宿主の細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって潜在性感染として維持されるため、ＥＢＶが宿主のβ細胞において潜在性感染として無症候的に残ることが可能である。
【０１２２】
ＥＢＶは、鼻咽頭癌（ＵＰＣ）および胃がんなどの上皮由来のがんに加えて、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）などのβ細胞由来のいくつかの悪性腫瘍に関連する。
【０１２３】
ＰＴＬＤは、固形臓器移植および造血幹細胞移植に関連する一般的なリスクである。
【０１２４】
実施形態において、第１の対象に由来するガンマデルタＴ細胞を、ＥＶＢ関連の悪性腫瘍を有する第２対象の治療で用いるために提供する。
【０１２５】
実施形態において、対象の自家的または同種的治療で用いるための、少なくとも１つの共刺激性ＣＡＲを含む、特にＶγ９Ｖδ２細胞を有するガンマデルタＴ細胞を提供する。
【０１２６】
実施形態において、異なるウイルス徴候の治療のための１つまたは複数の特異的ガンマデルタＴＣＲイソタイプのガンマデルタＴ細胞を提供する。例えば、Ｖδ２ｐｏｓサブタイプが、ＨＩＶおよびインフルエンザ感染の治療において最も有効で有り得る一方で（Wallace M. et al., 1996 Tu W. et al. 2011）、ＥＢＶ感染細胞のコントロールにおける少なくとも２つのガンマデルタＴ細胞サブタイプ；Ｖδ１ｐｏｓ（Farnault L, et al., 2013）およびＶδ２ｐｏｓ細胞（Xiang Z. et al., 2014）の役割についてもエビデンスが存在する。適切には、ガンマデルタＴ細胞療法の有効性を高めるようにガンマデルタＴ細胞サブタイプの組み合わせを選択し、患者に投与することができる。適切には、これらは、個別の培養条件を用いて生成された単一のイソタイプガンマデルタＴ細胞集団または定義された細胞培養パラメータの単一セットを用いて同時に生成された多価のガンマデルタＴ細胞集団を含み得る。
【０１２７】
実施形態において、対象を自家的または同種的に治療する際に用いるガンマデルタＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２細胞と、ピロフォスファート／フォスフォネート薬物を提供する。
【０１２８】
また、ガンマデルタＴ細胞を自家的に対象に提供するプロセスであって、
−対象由来のガンマデルタＴ細胞のサンプルを提供するステップと；
−前記ガンマデルタＴ細胞を培養してそれらを前記対象に再び投与するステップであって、前記培養ステップは前記ガンマデルタＴ細胞を修正してＣＡＲ修正ガンマデルタＴ細胞、好適には本明細書で論じる「共刺激性」または「ＴＣＲ調整可能」ＣＡＲを提供することを含む、ステップとを含む、プロセスを提供する。
【０１２９】
上記の提供ステップおよび培養ステップは何れも本発明のガンマデルタＴ細胞に適用することができる。例えば、ガンマデルタＴ細胞を培養するステップは、上記で論じたように、ガンマデルタＴ細胞表面受容体プロファイルを変更するステップを含んでいてよい。
【０１３０】
また、個体の感染症またはがんを処置する方法であって、前記個体にその固体から得たガンマデルタＴ細胞を提供するステップを含み、前記ガンマデルタＴ細胞は本発明により記載するプロセスによって提供された、方法を提供する。
【０１３１】
実施形態においてがんは、骨髄腫または黒色腫であり得る。実施形態において、がんとしては、限定されるわけではないが、胃がん、腎細胞がん、肝細胞がん、膵臓がん、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、非小細胞肺がん、ＥＢＶ−ＬＰＤ、バーキットリンパ腫、およびホジキン病を含む腫瘍型が挙げられる。
【０１３２】
本発明のさらなる態様に従って、本発明で用いる単離したガンマデルタＴ細胞、特に、少なくとも１つの共刺激性ＣＡＲを含むＶγ９Ｖδ２細胞を提供する。実施形態において、単離したガンマデルタＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２細胞、具体的にはガンマデルタＴ細胞、例えば、少なくとも１つの共刺激性ＣＡＲを含むＶγ９Ｖδ２細胞と、ピロフォスファート／フォスフォナート薬物を、対象を自家的または同種的に処置するために組み合わせて用いるキットとして提供する。
【０１３３】
本発明のさらなる態様に従って、本発明のまたは本発明のプロセスのいずれかのガンマデルタＴ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０１３４】
実施形態において、組成物は、個体に提供して治療効果をもたらすのに適した、統一用量のガンマデルタＴ細胞を含む。
【０１３５】
実施形態において、医薬組成物は、一人当たり２５×１０９個のガンマデルタＴ細胞を超える総用量を含み得る。
【０１３６】
実施形態において、がんの処置で用いるための、本発明のガンマデルタＴ細胞および抗体免疫療法を含む医薬組成物を提供する。
【０１３７】
実施形態において、抗体免疫療法は、例えば、ＲｏｃｈｅおよびＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたような、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、および／またはＣＴＬＡ−４阻害剤などの免疫カスケードブロッキング剤とすることが可能である。
【０１３８】
実施形態において、医薬組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害シグナルをブロックできる抗体を含んでいてよい。ＣＴＬＡ−４シグナルをブロックすることにより、Ｔリンパ球が細胞を認識および破壊することが可能になる。実施形態において、斯かる抗体は、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１）であり得る。
【０１３９】
実施形態において、抗体は、プログラムされたデスリガンド１（ＰＤＬ−１）を阻害し得る。実施形態において斯かる抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）またはＭＤＸ−１１０５から選択することが可能である。
【０１４０】
実施形態において、医薬組成物は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１２と組み合わせることができる。実施形態において医薬組成物は、インターフェロンガンマを含んでいてよい。
【０１４１】
実施形態において、がんの治療において用いるための、本発明のガンマデルタＴ細胞と化学療法薬を含む医薬組成物を提供する。
【０１４２】
実施形態において、ウイルスの処置において用いるための、本発明のガンマデルタＴ細胞と療法薬を含む医薬組成物を提供する。
【０１４３】
実施形態において医薬組成物を、がんまたは感染症用の治療剤または予防剤として用いることが可能である。
【０１４４】
本発明の実施形態において、ガンマデルタＴ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞とすることが可能である。
【０１４５】
適切には、実施形態において、本発明は、共刺激性ＣＡＲ配列を、定義された抗原特異性を有するＴ細胞またはＴ細胞様細胞、例えば、α-GalCerに対し特異性を有するＮＫＴ細胞、または、例えば、ビタミンＢ関連抗原に対し特異性を有する粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞に提供することを包含し得る。実施形態では、（伝統的（機能性ＣＤ３ゼータドメインを含む）または共刺激性（非機能性のＣＤ３ゼータドメインを有する／ＣＤ３ゼータドメインを欠く）の）ＣＡＲをγδＴ様細胞に提供することができ、該γδＴ様細胞は、機能性ガンマデルタＴ細胞受容体を発現するように遺伝子改変したαβＴ細胞である。適切には、このような修正細胞が本発明の態様を形成する。実施形態では、（伝統的または共刺激性の）ＣＡＲをγδＴ様細胞に提供することが可能であり、該γδＴ様細胞は、機能性ガンマデルタＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作した任意のＴ細胞である。適切には、このような修正細胞が本発明の態様を形成する。
【０１４６】
実施形態において、（非機能性のＣＤ３ゼータドメインを有する／ＣＤ３ゼータドメインを欠く）共刺激性ＣＡＲを、定義した抗原特異性を備えたＴ細胞受容体を有する（伝統的または非伝統的な）任意のＴ細胞に提供することが可能である。このような修正細胞が本発明の態様を形成する。適切には、本発明の第１態様に関連して論じた実施形態を、本発明のさらなる態様であるこれらの修正細胞に適用することが可能である。適切には、このような修正細胞は、本発明の第１態様およびその実施形態の細胞に関連して本明細書で論じるように用いることができる。
【０１４７】
本発明の各態様の好ましい特徴および実施形態は、文脈上、他が求められる場合を除き、他の態様のそれぞれについても必要な変更を加えれば同様である。
【０１４８】
本文で引用する各文書、参考文献、特許出願、または特許は、参照によってそれらの全体が本明細書に明白に組み込まれ、これは読者によって本文の一部として読まれ、考慮されるべきであることを意味する。本文で引用する各文書、参考文献、特許出願、または特許が本文において繰り返されないのは、単に簡潔さのためである。
【０１４９】
本文に引用されている資料または含まれている情報への言及は、該資料または情報が常識の一部であったまたは任意の国において既知であったことの承認として理解されるべきではない。
【０１５０】
本明細書を通して、文脈上、他が求められる場合を除き、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形形態は、言明した整数または整数の群の包含を意味するが、他の任意の整数または整数の群の除外を意味するものではないと理解されたい。
【０１５１】
本発明の実施形態を単なる例示として、添付図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１Ａ】伝統的なＣＡＲを発現しているＶガンマ９サブタイプのγδＴ細胞の長所と短所についての図式的表示を提供する図である。これらの、γδＴ細胞は、ＣＡＲ誘発抗原を発現している健常な細胞により活性化されるため、「標的上、腫瘍外」毒性の傾向がある（上部パネル）。しかしながら、これらの細胞は、ＣＡＲおよびγδＴＣＲを介した二重のシグナル伝達により、ＣＡＲ標的抗原を発現している感染細胞またはがん細胞に対する活性の増大を示し得る（下部パネル）。
【図１Ｂ】共刺激性ＣＡＲを発現するＶガンマ９タイプのγδＴ細胞の長所についての図式的表示を提供する図である。共刺激性ＣＡＲを発現しているγδＴ細胞は、（ＣＤ３ゼータドメイン／シグナル１を欠くため）「標的上、腫瘍外」毒性を欠くが、高レベルのリン酸化抗原（そのためγδＴＣＲを介してシグナル１が提供される）およびＣＡＲ誘発抗原を発現する感染または形質転換細胞に対しては、細胞毒性活性の増加を引き出すだろう。
【図２】伝統的および共刺激性の構成物の設計についての例示的な実施形態を提供する図である。（Ａ）は、ＧＭＣＳＦ−Ｒ分泌シグナルドメイン、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、および活性化ドメイン、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）活性化ドメイン、ならびにＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、伝統的なＣＡＲ構成物の設計を示す。（Ｂ）は、ＧＭＣＳＦ−Ｒ分泌シグナルドメイン、ＣＤ１９に対するｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、および活性化ドメイン、ならびにＣＤ１３７（４−１ＢＢ）活性化ドメインを含む共刺激性ＣＡＲ構成物を示す。
【図３Ａ】本発明で用いる伝統的なＣＡＲ構成物の配列を提供する図である。「伝統的な」／「調整不可の」ＣＡＲのヌクレオチド配列を提供する。機能性ドメインはそれぞれアミノ酸配列内にアノテーションされ、これには、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ配列、ＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）活性化ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインが含まれる。
【図３Ｂ】本発明で用いる伝統的なＣＡＲ構成物の配列を提供する図である。「伝統的な」／「調整不可の」ＣＡＲのアミノ酸配列を提供する。
【図４Ａ】本発明で用いる共刺激性ＣＡＲ構成物の配列を提供する図である。「共刺激性の」／「ＴＣＲ調整可能な」ＣＡＲのヌクレオチド配列を提供する。機能性ドメインはそれぞれアミノ酸配列内にアノテーションされ、これには、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ配列、ＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、細胞内活性化ドメイン、およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）活性化ドメインが含まれる。
【図４Ｂ】本発明で用いる共刺激性ＣＡＲ構成物の配列を提供する図である。「共刺激性の」／「ＴＣＲ調整可能な」アミノ酸配列を提供する。
【図５】伝統的ＣＡＲおよび共刺激性ＣＡＲの両方にある、ＣＤ２８配列およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）配列にまたがる標的を増幅するように設計したユニバーサルプライマー対を示す図である。ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）配列とＣＤ３ζ活性化ドメインを含有する配列からアンプリコンを生成し、そのために伝統的なＣＡＲから生成物を増幅することはできるが、共刺激性ＣＡＲヌクレオチド配列からは生成物を増幅できないように、差別的プライマー対を設計した。（Ａ）伝統的ＣＡＲ配列および共刺激性ＣＡＲ配列を検出するために用いる、２つのプライマー対のヌクレオチド配列を提供する。（Ｂ）伝統的ＣＡＲ設計におけるユニバーサルプライマーおよび差別的プライマーのアニーリング位置についてのメモリ付き図である。（Ｃ）共刺激性ＣＡＲ設計におけるユニバーサルプライマーのアニーリング位置についてのメモリ付き図である。
【図６】ユニバーサルプライマーを用いて伝統的ＣＡＲプラスミド（ｒ２＝０．９９８）（Ａ）と共刺激性ＣＡＲプラスミド（ｒ２＝０．９８７）の標準曲線（Ｃ）を生成する、段階的に希釈したプラスミドＤＮＡのｑＰＣＲ増幅を示す図である。したがって、ユニバーサルプライマー対を用いて、ｑＰＣＲにより両配列のレベルを量的に検出することが可能である。ｑＰＣＲは、いずれかのウイルスを形質導入した細胞において実行した。４０サイクルのＰＣＲ増幅の後に実行した融解曲線分析は、両プライマー対が、伝統的なＣＡＲ形質導入細胞に由来するＲＮＡから単一アンプリコンを生成する一方（Ｂ）、ユニバーサルプライマー対（薄灰色）のみが共刺激性ＣＡＲ形質導入細胞からの抽出ＲＮＡよりアンプリコンを生成することが可能である（Ｄ）ことを示す。このデータは、両プライマー対が１つのみの生成物を増幅し、差別的プライマー対（濃い灰色）は２つの転写物を区別することが可能であるという点で特異的であることを示す。
【図７】２つのＢ細胞リンパ腫細胞株を、フローサイトメトリーによりＣＤ１９標的抗原発現について評価した；Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞（上部パネル）およびＲａｍｏｓバーキットリンパ腫細胞（下部パネル）。各細胞株の９８％がＣＤ１９を発現する一方、ＭＦＩにより求められるように、Ｄａｕｄｉ細胞はより高い強度／発現レベルを示した（Ａ）。非形質導入γδＴ細胞と比較し、ＣＤ１９＋がん細胞株に対し伝統的なＣＡＲ構成物を発現するＶガンマ９γδＴ細胞の細胞毒性機能の増大が観察された。ゾレドロン酸を用いた刺激の４８時間後、ＰＢＭＣに伝統的ＣＡＲを含有するレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入した細胞をさらに７日間増殖させ、ＣＤ１９陽性細胞株Ｄａｕｄｉ（上部パネル）およびＲａｍｏｓ（下部パネル）に対するその細胞毒性機能をフローサイトメトリーにより調べた。Ｄａｕｄｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を、フローサイトメトリーによる検出を可能にする非毒性細胞膜マーカーＰＫＨ６７で蛍光標識した。蛍光性標識細胞を、形質導入した伝統的ＣＡＲ（右手側）または（非形質導入の）γδＴ細胞（左手側）とともに４．５時間共培養した。標的がん細胞株の生存能力をＡｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩの染色により評価した（Ｂ）。Ａｎｎｅｘｉｎ ＶまたはＡｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩを発現するがん細胞を、それぞれ、早期アポトーシスおよび後期アポトーシスと考えた。Ｄａｕｄｉ細胞は、γδＴ細胞介在性殺傷に対しより高い相対感度を呈し（７６．４％特異性細胞死）、これはさらに、Ｄａｕｄｉ細胞を伝統的ＣＡＲγδＴ細胞とともに共培養した場合に高まった（８６．４％特異性細胞死）。Ｒａｍｏｓ細胞は、γδＴ細胞介在性殺傷に対し比較的感度が低かったが（３９％特異性細胞死）これは、Ｒａｍｏｓ細胞を伝統的ＣＡＲγδＴ細胞とともに共培養した場合に著しく高まった。著しく高いレベルの細胞崩壊が観察された（５５％特異性細胞死）。このデータは、伝統的ＣＡＲ発現γδＴ細胞が、非形質導入γδＴ細胞と比較した場合、ＣＤ１９陽性がん細胞株に対する細胞毒性機能を高めたことを明確に示す。伝統的ＣＡＲγδＴ細胞での特異的細胞死の増加率は、Ｄａｕｄｉ細胞（〜１３％）よりもＲａｍｏｓ細胞株（〜４６％）でより高かった（Ｃ）。このデータは、伝統的ＣＡＲを形質導入したγδＴ細胞が、耐性細胞株の細胞崩壊に対する感受性を高め得ることを示す。
【図８】白血球除去材から単離したＰＢＭＣを、５μＭのゾレドロン酸と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を共に培養物に入れた。培養物中において４８時間後、細胞に、ＭＯＩ１０で伝導的ＣＡＲ構成物を含有するレンチウイルスとウイルス形質導入の効率性を高めるための５μｇ／ｍＬのポリブレンの包含物を用いて形質導入した。レンチウイルス形質導入を２４時間後（３日目）に繰り返した。１０日目に、抗ＣＤ３抗体および抗Ｖガンマ９抗体を用いて、細胞のγδＴ細胞の純度についてフローサイメトリーにより評価した。一貫して、高純度γδＴ細胞集団が形質導入した構成物に関係なく細胞集団の全てにおいて産生された；非形質導入対照（８１％γδＴ細胞）、伝統的ＣＡＲ（８６％γδＴ細胞）、共刺激性ＣＡＲ（８９％γδＴ細胞）（Ａ）。５日目に、ＲＮＡを１×１０５細胞と、ランダムヘキサマーおよび逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡと、ＳＹＢＲグリーンおよび前述のユニバーサルプライマーを用いてｑＰＣＲを実行した。同等レベルのＣＡＲ転写産物発現を示す形質導入後５日目の形質導入細胞において、伝統的なＣＡＲｍＲＮＡおよび共刺激性ＣＡＲｍＲＮＡのＣＡＲ転写産物発現の相対定量を、構成物に関わらず検出する（データは１８ＳリボソーマルＲＮＡレベルに対し正規化し、レトロネクチン系形質導入におけるＣＡＲ発現に関連して表現した）（Ｂ）。形質導入した細胞を、ＣＤ１９陽性細胞株ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓに対する細胞毒性機能について調べた。Ｄａｕｄｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を、２４時間、＋／−５μＭゾレドロン酸で予め処置し、次にフローサイトメトリーによる検出を可能にする非毒性細胞膜マーカーＰＫＨ６７で蛍光標識した。蛍光性標識細胞を、形質導入した伝統的ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ、または（非形質導入の）γδＴ細胞とともに４．５時間共培養した。標的がん細胞株の生存能力をＡｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩの染色により評価した。Ｄａｕｄｉ細胞はγδＴ細胞介在性細胞崩壊の影響を受けやすく（３６％特異性細胞死）、これはゾレドロン酸の前処理により上昇した（４８％特異性細胞死）。Ｄａｕｄｉ細胞を、伝統的ＣＡＲまたは共刺激性ＣＡＲの何れかを発現しているγδＴ細胞とともに共培養した場合、アポトーシスのレベルはさらに上昇した（伝統的ＣＡＲでは６４％特異性細胞死、共刺激性ＣＡＲでは５４％特異性細胞死）（Ｃ）。これは、共刺激性ＣＡＲは単独では両方のシグナルを提供することはできないが、活性化γδＴ細胞の文脈で発現する場合は追加の効果を呈し得ることを示す。この観測を拡大するため、感受性の低いＲａｍｏｓ細胞株を用いた。γδＴ細胞は、これらの細胞においてはより低いレベルのアポトーシスを媒介した一方（１１％特異性細胞死）、ゾレドロン酸の前処理は効果がなかった（１０％特異性細胞死）。しかしながら、γδＴ細胞が伝統的ＣＡＲまたは共刺激性ＣＡＲの何れかを発現した場合、アポトーシスのレベルは著しく上昇した（伝統的ＣＡＲでは２５％特異性細胞死、共刺激性ＣＡＲでは３０％特異性細胞死）（Ｄ）。このデータは、抗原が活性化γδＴ細胞の文脈に関与する場合、ＣＤ３ζを欠くＣＡＲ（つまり、共刺激性ＣＡＲ）の機能性へのさらなる裏付けを提供する。
【実施例】
【０１５３】
実施例１
ＰＢＭＣを密度遠心分離法（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）により白血球除去材から単離し、凍結保存した。ＰＢＭＣを蘇生させ、ゾレドロン酸（５μＭ）で刺激したＰＢＭＣをＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）と５％ヒトＡＢ血清の存在下で、増殖培地において培養した。培養物において４８時間後（３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気）、細胞に、伝統的ＣＡＲ配列（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ）または共刺激性ＣＡＲ配列（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ１３７）のいずれかと、ＭＯＩ１０の５μｇ／ｍＬのポリブレンと共に、レンチ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１ａ−ｐｕｒｏ構成物を含有するレンチウイルスを形質導入した。形質導入を２４時間後に繰り返した。ＣＡＲｍＲＮＡ発現を、５日目に両構成物の発現を検出するユニバーサルプライマーを用いて、ＱＰＣＲにより検証した。各構成物の特異的な発現を、差別的プライマーおよびユニバーサルプライマーの組み合わせを用いて確かめた（図５、６のように）。
【０１５４】
実施例２
細胞に伝統的ＣＡＲ配列を含有するレンチウイルスを形質導入し、例１に記載したように増殖させた。形質導入後７日目に、形質導入したまたは形質導入していないγδＴ細胞を、ＣＤ１９陽性標的細胞株、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓと共に共培養することにより細胞毒性活性を評価した。標的細胞株を、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１９標的集団の特異的視覚化のために、非毒性膜染料ＰＫＨ６７（５μＭ）で染色した。ガンマデルタＴ細胞または伝統的なＣＡＲを発現するγδＴ細胞と共に４．５時間共培養した後、共培養物をａｎｎｅｘｉｎ Ｖおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色してアポトーシス細胞を可視化した。特異性細胞死率を標的細胞集団においてのみ計算した。非形質導入γδＴ細胞と比較し、ＣＡＲ形質導入γδＴ細胞の効能はＣＤ１９陽性標的細胞において増大した（図７）。
【０１５５】
実施例３
細胞に伝統的ＣＡＲ配列または共刺激性ＣＡＲ配列を含有するレンチウイルスを形質導入し、実施例１に記載したように増殖させた。ＣＤ１９陽性標的細胞株、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓを２４時間、＋／−５μＭゾレドロン酸で前処理した。細胞毒性活性を実施例２に記載するように評価した。ＰＫＨ６７染色標的細胞（＋／−ゾメタ前処理）を形質導入したまたは形質導入していないγδＴ細胞とともに共培養した。共刺激性ＣＡＲ発現γδＴ細胞は、ＣＤ３ζ活性化ドメインを欠くにも関わらず、ＩＰＰ感知によるγδＴＣＲを介した活性化により代わりにシグナル１が提供され、ＣＤ１９陽性標的細胞に対して伝統的ＣＡＲ発現γδＴ細胞と同様の細胞毒性を呈した。両ＣＡＲは、非形質導入γδＴ細胞と比較した場合、γδＴ細胞に対し細胞毒性の増大を提供した（図８）。
【０１５６】
本発明は特定の例に関連して特に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変更を本発明の範囲から外れることなく本明細書において行えることが当業者により理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2018512161.tif 000016
【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
2018512161.tif 000019
【配列表】
2018512161000001.app
【国際調査報告】
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2018512161.tif 000021
2018512161.tif 000022