(57)【要約】  本発明は、脂質に富む微細藻類の粉末を調製するための方法であって、（ａ）バイオマスの乾燥重量当たり５０％超の脂質を含む微細藻類のバイオマスを提供する工程と；（ｂ）微細藻類を溶解させる工程と；（ｃ）微細藻類溶解物を、２５重量％超の固形分に、好ましくは３５重量％〜５０重量％の固形分に濃縮する工程と；（ｄ）このように濃縮された溶解物に熱処理を適用する工程と；（ｅ）安定したエマルジョンが得られるように、工程（ｄ）で得られた溶解物を高圧下で均質化する工程と；（ｆ）微細藻類粉末を得るために前記エマルジョンを乾燥させる工程と、を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質に富む微細藻類粉末を調製するための方法であって、
（ａ）バイオマスの乾燥重量で５０％超の脂質を含む微細藻類バイオマスを提供する工程と；
（ｂ）前記微細藻類を溶解させる工程と、
（ｃ）前記微細藻類溶解物を、２５重量％超の固形分に、好ましくは３５重量％〜５０重量％の固形分に濃縮する工程と、
（ｄ）このように濃縮された前記溶解物に熱処理を適用する工程と、
（ｅ）安定したエマルジョンを得るように、工程（ｄ）で得られた前記溶解物を高圧で均質化する工程と、
（ｆ）前記エマルジョンを乾燥させて、前記微細藻類粉末を得る工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類溶解物の前記濃縮が、蒸発によって行われることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶解物の前記濃縮が、以下の条件下で：
−フラッシュ入口温度：６０〜７５℃、好ましくは６８℃
−前記フラッシュ中の温度：３５〜６０℃、好ましくは４０℃
−再循環流量：２５〜４５ｍ３／時、好ましくは４０ｍ３／時
蒸発器中で、高温で行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記高圧均質化が、
−第１の段階で、１５０〜１７０バール、好ましくは１６０バールの圧力、および
−第２の段階で、３５〜４５バール、好ましくは４０バールの圧力で、
２段階デバイス中で行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記エマルジョンの前記乾燥が、微粒子化によって行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い固形分を有するバイオマスから、粉砕された微細藻類の脂質に富む粉末を調製するための方法であって、微細藻類が、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のものである方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類は、タンパク質および他の必須栄養素が豊富であるため、潜在的な食物源であることが当業者に周知である。
【０００３】
平均すると、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類は、４５％のタンパク質、２０％の脂肪、２０％の炭水化物、５％の繊維ならびに１０％のミネラルおよびビタミンを含有する。
【０００４】
したがって、一価不飽和油から実質的に構成される、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のバイオマスの油留分は、従来の食品によく見られる飽和油、水素化油および多価不飽和油と比較して栄養および健康上の利点を提供する。
【０００５】
ここで、クロレラは、
−全バイオマスの形態で、
−または特に機械的手段によって細胞壁が破壊されたクロレラのバイオマスを乾燥させることによって得られる粉末の形態で
ヒトまたは動物の栄養に利用される。
【０００６】
微細藻類粉末は、微量栄養素、食物繊維（可溶性および不溶性炭水化物）、リン脂質、糖タンパク質、植物ステロール、トコフェロール、トコトリエノールおよびセレンなどの他の利益も提供する。
【０００７】
食品組成物に組み込まれることになるバイオマスを調製するために、バイオマスは、培養培地（光バイオリアクターにおける光独立栄養によって、または暗所でかつクロレラによって吸収可能な炭素源の存在下で従属栄養的に培養する）から採取される。クロレラの従属栄養培養が好ましい（発酵経路と呼ばれる）。
【０００８】
発酵培地からの微細藻類バイオマスの採取時に、バイオマスは、大部分が水性培養培地中で懸濁状態にある無傷の細胞を含む。
【０００９】
バイオマスを濃縮するために、次に、固液分離工程が、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過、遠心分離または当業者にさらに公知の任意の手段によって行われる。
【００１０】
このように単離される微細藻類バイオマスは、真空パックされたケーキ、藻類フレーク、藻類ホモジネート、無傷藻類粉末、粉砕された藻類粉末または藻類油を生成するために直接処理され得る。
【００１１】
無傷の全微細藻類バイオマスはまた、その後の処理を容易にするために、またはその様々な用途、特に食品用途でバイオマスを使用するために乾燥される。
【００１２】
微細藻類バイオマスは、主に、粉砕された乾燥細胞物質の形態で、脂質に富む微細藻類
粉末の形態で改良される。
【００１３】
従来、脂質に富む微細藻類粉末は、以下のように、約２０〜２５％の固形分を含有するバイオマスから調製される：
−増殖培地から分離される微細藻類の収集、
−対象の分子を細胞から放出するような細胞の破壊、
−６．５〜７．５の値へのｐＨの調整、
−低温殺菌および洗浄、
−乾燥。
【００１４】
細胞の収集の第１の工程は、１つまたは複数の固液分離工程を実施することによって行われる。
【００１５】
バイオマスは、通常、沈降、遠心分離またはろ過によって収集され、場合によりさらなる凝集工程が必要である。
【００１６】
細胞破壊の第２の工程において、いくつかの経路が可能である：機械的経路（ホモジナイザー、ビーズミルもしくは超音波処理）または非機械的経路（アルカリ性経路（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｒｏｕｔｅ）、凍結融解サイクル、有機溶媒もしくは浸透圧衝撃）。
【００１７】
方法の選択は、特に、破壊される微細藻類の細胞壁の性質に左右される。
【００１８】
次に、脂質に富む微細藻類粉末は、機械的に溶解および均質化された２５％以下の固形分を通常有する微細藻類バイオマスから調製され、次に、ホモジネートは、微粒子化またはフラッシュ乾燥される。
【００１９】
この微細藻類溶解物を機械的に得るために、圧力破壊器を用いて、例えば、微細藻類細胞を含有する懸濁液を、細胞を溶解させるように制限された開口部に送り込んでもよい。
【００２０】
高圧（最大で１５００バール）がかけられた後、ノズルを通って即座に膨張する。
【００２１】
細胞は、３つの異なる機構によって溶解（または粉砕）され得る：弁への流し込み、開口部における液体の高せん断、および出口における圧力の急低下により、細胞を破裂させる。
【００２２】
Ｎｉｒｏホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ）または任意の他の高圧ホモジナイザーを用いて、主に０．２〜５μｍのサイズを有する細胞を処理してもよい。
【００２３】
高圧下での藻類バイオマスのこの処理（約１０００バールでの数回の処理）は、一般に、９０％超の細胞を溶解させ、サイズを５μｍ未満に減少させる。
【００２４】
あるいは、ビーズミルがむしろ微細藻類溶解物を得るために使用される。
【００２５】
ビーズミルでは、細胞は、小さい球形粒子を含む懸濁液中で撹拌される。細胞の破壊は、せん断力、ビーズ間の粉砕、およびビーズによる衝突によって引き起こされる。
【００２６】
これらのビーズは、細胞含有物を細胞から放出するように細胞を破壊する。適切なビーズミルの説明は、例えば、米国特許第５３３０９１３号明細書に示されている。
【００２７】
次に、元の細胞より小さいサイズの粒子の懸濁液が得られ、前記懸濁液は、「水中油型
」エマルジョンの形態である。
【００２８】
次に、このエマルジョンは噴霧乾燥され、水が除去されて、細胞残屑、細胞内液体および油を含有する乾燥粉末が残される。
【００２９】
第３の工程において、次に、得られた細胞抽出物を安定させるために、ｐＨ調整が行われる。
【００３０】
第４の工程の低温殺菌は、短時間にわたって高温で（ＨＴＳＴ、または超高温、ＵＨＴ）、例えば６秒間にわたって１４０℃で、従来行われる熱処理からなる。
【００３１】
洗浄については、それにより、可溶性不純物を除去することができる。
【００３２】
下流の処理の最後の工程は、前記懸濁液（溶解細胞）を脱水することにある。いくつかの方法が、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）およびスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）の微細藻類を乾燥させるのに用いられている。最も慣例的なものは、好ましくは酸化防止剤の存在下での、微粒子化、乾燥ドラムにおける乾燥および凍結乾燥である。微粒子化は、工業規模で最もよく使用される方法である。
【００３３】
しかしながら、この従来の方法によれば、微細藻類バイオマスが、５０重量％以上の含量で油を含有するため、後に溶解される微細藻類バイオマスの固形分を制限する必要がある。
【００３４】
特に、高い固形分を有する脂質に富むバイオマス（油）から生成される場合、溶解細胞の懸濁液は、相分離を起こす自然な傾向を有する。
【００３５】
使用される出発材料が、２５％超、特に２８％超の固形分を有するバイオマスである場合、脂質に富む微細藻類粉末を得るのはさらに難しく、またはバイオマスの固形分が３５％を超える場合、不可能でさえある。
【００３６】
特に、脂質に富む微細藻類バイオマスの粉砕された材料が処理される場合、３５％超の固形分で、粉末の製造のための微粒子化工程の前に使用される蒸発デバイス（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（登録商標）などのデバイス）において、油滴の合一の残念な形成が起こる。
【００３７】
こうして得られた「水中油型」エマルジョンは、不安定であり、それゆえ粘着性の「バター」の質感の形成をもたらすため、効率的に乾燥させることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
しかしながら、工業レベルで処理された体積に関して、２５％超の固形分を有するバイオマスから微細藻類粉末を調製するための方法を使用することがより経済的であると思われる。
【００３９】
したがって、低い固形分で機能することを必要としない、脂質に富む微細藻類粉末を調製するための方法に対する満たされていないニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
広範囲の研究の後、本出願人は、以下の工程：
（ａ）バイオマスの乾燥重量で５０％超の脂質を含む微細藻類バイオマスを提供する工
程と；
（ｂ）微細藻類を溶解させる工程と、
（ｃ）微細藻類溶解物を、２５重量％超の固形分に、好ましくは３５重量％〜５０重量％の固形分に濃縮する工程と、
（ｄ）このように濃縮された微細藻類溶解物に熱処理を適用する工程と、
（ｅ）安定したエマルジョンを得るように、このように得られた濃縮された溶解物を高圧で均質化する工程と、
（ｆ）前記エマルジョンを乾燥させて、微細藻類粉末を得る工程と
を含む、脂質に富む微細藻類粉末を調製するための方法を提供することによって、このニーズを満たすことができることを見出した。
【００４１】
本発明の趣旨では、「脂質に富む」という用語は、５０％超の脂質を含有することを意味する。
【００４２】
本発明の趣旨では、「安定したエマルジョン」という用語は、油相および水相の相分離がないことを指す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明によれば、工程（ａ）において、対象とする微細藻類は、好ましくはクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、さらにより特定的には、（培養が、当業者に周知の特定の動作条件下で、暗所で行われるため、またはクロロフィル色素をもはや生成しないように菌株が突然変異されたため）当業者にそれ自体公知の任意の方法によってクロロフィル色素を取り除かれたクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類である。
【００４４】
微細藻類バイオマスは、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の、従属栄養条件下かつ光の非存在下で、優先的に発酵によって調製されるバイオマスである。
【００４５】
発酵条件は、当業者に周知である。使用される適切な培養条件は、Ｉｋｕｒｏ  Ｓｈｉｈｉｒａ−ＩｓｈｉｋａｗａおよびＥｉｊｉ  Ｈａｓｅによる論文、“Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ”，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５，１９６４に特に記載されている。
【００４６】
Ｈａｎ  Ｘｕ、Ｘｉａｏｌｉｎｇ  Ｍｉａｏ、Ｑｉｎｇｙｕ  Ｗｕによる論文、“Ｈｉｇｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｉｃｒｏａｌｇａ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２６，（２００６），４９９−５０７などの他の論文は、従属栄養培養条件が、すなわち光の非存在下で、微細藻類細胞中に脂質の高い含量を有する増加されたバイオマスを得ることを可能にすることを示す。
【００４７】
固体および液体増殖培地は、一般に、文献において入手可能であり、様々な微生物菌株に好適な特定の培地を調製するための推奨事項が、例えば、オースティンのテキサス大学藻類カルチャーコレクション（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｌｇａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＵＴＥ
Ｘ））によって維持されているウェブサイトｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／で、オンラインで見られる。
【００４８】
一般知識および上記の先行技術を考慮して、微細藻類細胞の培養を担当する当業者は、好ましくは脂質に富む好適なバイオマスを得るために培養条件を全体的に調整することができるであろう。
【００４９】
バイオマスの生成は、発酵槽（またはバイオリアクター）中で行われる。バイオリアクター、培養条件、ならびに従属栄養培養および増殖方法の特定の例は、微生物増殖および脂質の効率を向上させるために、任意の適切な方法で組み合わされ得る。
【００５０】
特定の一実施形態において、発酵は、３〜１０ｇ／ｌの残留グルコース濃度を維持するように調整されたグルコース流量で、流加方式で行われる。
【００５１】
グルコース供給段階中、培養培地中の窒素含量は、３０％、４０％、５０％または６０％の量で、脂質の蓄積を可能にするように制限されることが好ましい。発酵温度は、適切な温度、好ましくは２５〜３５℃、特に２８℃に維持される。溶解された酸素は、発酵槽の通気量、逆圧および撹拌を制御することによって、最小で３０％に維持されることが好ましい。
【００５２】
好ましくは、本発明においてこのように有用な、得られたバイオマスは、乾燥重量で５０％超の脂質含量を含み、少なくとも２０％、好ましくは２０％〜４０％の固形分を有する。
【００５３】
例えば、本発明の主題である方法に使用されるバイオマスは、乾燥重量で５０％超の脂質含量、乾燥重量で１０％〜５０％の繊維含量、乾燥重量で２％〜１５％のタンパク質含量および１０重量％未満の糖含量を含み、少なくとも２０％、好ましくは２０％〜４０％の固形分を有する。
【００５４】
本発明によれば、工程（ｂ）において、微細藻類粉末の生成に使用されるバイオマス細胞は、それらの油または脂質を放出するために溶解される。
【００５５】
細胞壁および細胞内成分は、例えばビーズミルを用いて、凝集していない細胞粒子または細胞残屑へと、粉砕または小さくされる。
【００５６】
ミルにおいて、細胞は、小さいビーズにより懸濁液中で撹拌される。細胞の破壊は、せん断力、ビーズ間の粉砕、およびビーズとの衝突によって引き起こされる。実際に、これらのビーズは、細胞含有物を細胞から放出するように細胞を破壊する。適切なビーズミルの説明は、例えば、米国特許第５３３０９１３号明細書に示されている。
【００５７】
好ましくは、酸化防止剤が、溶解を行う前にバイオマスに加えられる。
【００５８】
このようにして、「水中油型」エマルジョンの粒子懸濁液の形態の微細藻類溶解物が得られる。
【００５９】
本発明によれば、工程（ｃ）において、溶解物は、２５重量％超、好ましくは３５重量％〜５０重量％の固形分を有する溶解物を得るように濃縮される。
【００６０】
この濃縮は、遠心分離によらず、高温で水を蒸発させることによって行われることが好ましい。
【００６１】
使用される蒸発器は、好ましくは、以下のとおりである：
−３３％以下の固形分を有するバイオマスのための流下膜式蒸発器、
−２０〜４５％の固形分を有するバイオマスのための強制流式蒸発器、
以下の条件下で：
−フラッシュ入口温度：６０〜７５℃、好ましくは６８℃
−フラッシュ中の温度：３５〜６０℃、好ましくは４０℃
−再循環流量：２５〜４５ｍ３／時、好ましくは４０ｍ３／時。
【００６２】
本発明によれば、工程（ｄ）において、濃縮された溶解物は、熱処理される。この熱処理は、特に、高い固形分を有する溶解物の脱酸素／脱臭を可能にする。
【００６３】
好ましくは、工程（ｄ）は、短時間にわたって高温で（ＨＴＳＴ、または超高温、ＵＨＴ）、例えば６秒間にわたって１４０℃で行われる。
【００６４】
本発明によれば、工程（ｅ）は、前記溶解物の高い固形分にもかかわらず、安定した水中油型エマルジョンを生成するように、工程（ｄ）の終了時に得られる溶解物を均質化することにある。
【００６５】
この均質化は、
−第１の段階で、１５０〜１７０バール、好ましくは１６０バールの圧力、および
−第２の段階で、３５〜４５バール、好ましくは４０バールの圧力で、
２段階デバイス、例えばＡＰＶ社によって販売されるＧａｕｌｉｎホモジナイザー中で行われるのが好ましい。
【００６６】
本発明によれば、最後の工程（工程ｆ）は、エマルジョンを乾燥させて、微細藻類粉末を得ることにある。
【００６７】
乾燥は、微粒子化によって行われることが好ましい。水が除去されるこの工程の終了時に、細胞残屑および脂質を含有する乾燥粉末が得られる。
【００６８】
乾燥後、粉末の含水量または水分含量は、一般に１０％未満、優先的に５％未満である。
【００６９】
任意選択的に、熱処理工程の前に溶解物のｐＨ調整が行われてもよい。
【００７０】
特に、溶解物の高圧均質化に続く熱処理のために、本発明の主題である方法は、有利なことに、５０％超の脂質を含有し、かつ、少なくとも２０％の固形分を有する、微細藻類、特にクロレラの、バイオマスから脂質に富む粉砕された微細藻類粉末を得ることを可能にする。
【国際調査報告】
2018502593.tif 000002
2018502593.tif 000003
2018502593.tif 000004
2018502593.tif 000005
2018502593.tif 000006
2018502593.tif 000007