(57)【要約】  本願は、修飾イズロン酸２−スルファターゼ、修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む組成物、ならびに修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法およびそのようなイズロン酸２−スルファターゼの治療的使用方法を開示する。特に、本願は、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まず、ここで、前記イズロン酸２−スルファターゼは、インビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性の少なくとも５０％の触媒活性を有する。
2018534917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾イズロン酸２−スルファターゼであって、インビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性の少なくとも５０％の触媒活性を有する、修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項２】
前記イズロン酸２−スルファターゼが、前記哺乳動物の脳において触媒活性を有する、請求項１に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項３】
前記イズロン酸２−スルファターゼが、末梢組織において触媒活性を有する、請求項１に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項４】
前記末梢組織が、関節、骨、結合組織、および／または軟骨である、請求項３に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項５】
未修飾組換えイズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分の含量の約３８％以下である、天然グリカン部分の相対含量を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項６】
前記イズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分が、単結合切断および二重結合切断によって破壊され、単結合切断の程度が、オリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項７】
配列番号１で規定するアミノ酸配列から成るポリペプチド、または配列番号１で規定するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものであって、ここで、前記エピトープが、８つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置６のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（６））、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））、位置１１９のＮ（Ｎ（１１９））、位置２２１のＮ（Ｎ（２２１））、位置２５５のＮ（Ｎ（２５５））、位置３００のＮ（Ｎ（３００））、位置４８８のＮ（Ｎ（４８８））および位置５１２のＮ（Ｎ（５１２））、のうちの少なくとも５つにおいて存在しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項８】
位置９０のグリコシル化位置のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））にエピトープが存在しない、請求項７に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項９】
前記エピトープが、前記８つのＮ−グリコシル化部位のすべてに存在しない、請求項７または８に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項１０】
配列番号１の位置５９にＣα−ホルミルグリシン残基を含み（ＦＧｌｙ５９）、前記触媒活性をもたらす、請求項７〜９のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼを含むイズロン酸２−スルファターゼ組成物であって、活性部位において、１を超えるＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比を有する、組成物。
【請求項１２】
修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法であって、該方法が：
ａ）グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、および
ｂ）前記イズロン酸２−スルファターゼを水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下の期間にわたり反応させること、
を含み；
それによって、該イズロン酸２−スルファターゼのグリカン部分を修飾し、インビトロにおける前記イズロン酸２−スルファターゼの少なくとも５０％の触媒活性を保持しながら、グリカン認識受容体に関して該イズロン酸２−スルファターゼの活性を低下させる、方法。
【請求項１３】
ステップａ）およびステップｂ）を、透析、限外濾過、沈殿または緩衝液の交換をおこなうことなく、順におこなわれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａ）が、以下のｉ）〜ｖ）：
ｉ）前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩がメタ過ヨウ素酸ナトリウムである；
ｉｉ）前記過ヨウ素酸塩が、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、０〜２２℃の温度、例えば０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度、例えば約８℃、例えば約０℃にておこなわれる；
ｉｖ）前記反応が、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる；および、
ｖ）前記ステップａ）の反応が、３〜７のｐＨにておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば少なくともすべてによってさらに特徴づけられる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）が、以下のｉ）〜ｉｖ）：
ｉ）前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が水素化ホウ素ナトリウムである；
ｉｉ）前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍以下の濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる；および、
ｉｖ）前記反応が、０〜８℃の温度にておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えばそのすべてによってさらに特徴づけられる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）が３時間以下の期間にわたりおこなわれ、およびステップｂ）が１時間以下にわたりおこなわれ、そして、前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下の濃度にて任意に使用される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ａ２）ステップａ）から生じた反応をクエンチングすること、及び／又はｂ２）ステップｂ）から生じた反応をクエンチングすること、をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記イズロン酸２−スルファターゼの活性部位を、ステップａ）およびｂ）の少なくとも一方の間、酸化および／または還元反応に利用不可能にする、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法のステップａ）およびｂ）の少なくとも一方が、保護リガンドの存在下でおこなわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法のステップａ）およびｂ）が、イズロン酸２−スルファターゼを樹脂で固定したままおこなわれる、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な修飾イズロン酸２−スルファターゼ。
【請求項２２】
治療法に使用するための、請求項１〜１１および２１のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼまたはイズロン酸２−スルファターゼ組成物。
【請求項２３】
リソソーム蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ）に罹患している哺乳動物の治療に使用するための、請求項２２に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼまたはイズロン酸２−スルファターゼ組成物。
【請求項２４】
リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ；ハンター症候群）に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、治療的有効量の、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼを該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、修飾イズロン酸２−スルファターゼ、修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む組成物、および修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法に関する。さらに、リソソーム蓄積症の処置のような治療における修飾イズロン酸２−スルファターゼの使用、ならびにリソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物を治療する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
背景
リソソーム蓄積症
リソソーム画分は、細胞内の廃棄物を分解する異化機構として機能する。分解は、リソソームに特異的に区画されたいくつかの加水分解酵素および輸送体によって達成される。今日、リソソームタンパク質をコードする遺伝子における突然変異と疾患との間に関連性が確立されている遺伝性疾患が４０以上同定されている。これらの疾患は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）と定義され、不十分な分解能力により分解することができない代謝産物（または代謝産物（複数））を蓄積することを特徴とする。代謝産物の過剰なリソソーム蓄積の結果として、リソソームはサイズが増加する。蓄積された蓄積物質がどのように病理を引き起こすかについては完全には理解されていないが、オートファジーの阻害および細胞アポトーシスの誘導などの機構を含む可能性がある（Cox&Cachon-Gonzalez、J Pathol 226:241-254(2012)）。
【０００３】
酵素補充療法
蓄積は、異種の供給源からのリソソーム酵素の投与によって減少させることができる。リソソーム酵素の静脈内投与は、受容体媒介エンドサイトーシスと呼ばれる機構を介した、細胞による迅速な取り込みをもたらすことが十分に確立されている。このエンドサイトーシスは、細胞表面上の受容体が媒介しており、特に、２つのマンノース−６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）は、特定のリソソーム酵素の取り込みに重要であることが示されている（Neufeld;Birth Defects Orig 16:77-84(1980)）。Ｍ６ＰＲは、リソソームタンパク質に特徴的なリン酸化オリゴマンノースグリカンを認識する。
【０００４】
受容体媒介エンドサイトーシスの原理に基づいて、７つのＬＳＤに対し酵素置換療法（ＥＲＴ）が今日利用可能である（ゴーシェ、ファブリー、ポンペ、ならびにムコ多糖症Ｉ、ＩＩ、ＩＶＡおよびＶＩ）。これらの療法は、様々な末梢器官におけるリソソーム蓄積を減少させるのに有効であり、それによって病理に関連するいくつかの症状を改善する。
【０００５】
Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）は、リソソーム酵素イズロン酸−２−スルファターゼの欠乏または低いレベルによって引き起こされる希なＸ連鎖劣性蓄積症（Ｉ２Ｓ）であるハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ、ＭＰＳＩＩ）を患っている患者の長期治療に適応されるオーファン医薬品である。この酵素は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸とヘパラン硫酸の両方の非還元イズロン酸残基のＣ２−硫酸エステル結合の加水分解に関与する。この酵素結果の活性の低減または欠如は、これらのＧＡＧの細胞内蓄積をもたらし、そしてそれが、多臓器および組織障害を伴った進行性かつ臨床的に異種の疾患の原因となる。
【０００６】
しかし、ＭＰＳＩＩを含めて、ＬＳＤの大部分は中枢神経系（ＣＮＳ）においてリソソーム蓄積の増大を引き起こし、結果としてＣＮＳ関連の徴候および症状のレパートリーを提示する。静脈内投与されたＥＲＴの主な欠点は、ＣＮＳへの不良分布である。ＣＮＳは、ＣＮＳ血管内皮によって形成された血液脳関門（ＢＢＢ）によって、血液を介する化合物への暴露から保護される。傍細胞の通過を妨げるタイトジャンクションを示すＢＢＢの内皮細胞は、制限した受動的エンドサイトーシスを示し、さらに、他の組織に見られるいくつかの受容体媒介トランスサイトーシス能力を欠く。特に、マウスにおいて、ＢＢＢを通過するＭ６ＰＲ媒介輸送は、出生後２週間までしか観察されない（Urayama et al,Mol Ther 16:1261-1266(2008)）。
【０００７】
ＭＰＳＩＩなどのＬＳＤの神経学的な要素に加えて、末梢病変もまた、ある程度、現在の酵素置換療法において準最適に対処される。患者は、重篤な運動の制限をもたらす関節痛および凝りという形で臨床的に表される関節症に罹患していることが多い。そのうえ、胸郭における進行性の変化は、呼吸制限を引き起こしかねない。
そのうえ、心臓の壁と併せて心臓弁の硬化につながる蓄積の蔓延は、心臓機能の進行性の低下をもたらす可能性がある。また、肺機能は、酵素置換療法にもかかわらず、さらに退縮し得る。
【０００８】
リソソーム酵素のグリコシル化
一般に、Ｎ−グリコシル化は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列モチーフで起こり得る。このモチーフに対して、Ｎ−グリカンの最初のコア構造は、グリコシルトランスフェラーゼオリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、網状管腔内（reticular lumen）に転移される。すべてのＮ−結合型グリカンのこの共通基盤は１４残基;３グルコース、９マンノース、および２Ｎ−アセチルグルコサミン、から構成されている。この前駆体は、次に、初期コアをトリミングして新しい糖部分を追加する多数の酵素の作用により、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマンノース、複合体およびハイブリッド（図７）へと変換される。各成熟Ｎ−グリカンは、Ａｓｎがタンパク質への結合点を表す、共通のコア、Ｍａｎ（Ｍａｎ）２−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを含んでいる。酵母では、オリゴマンノースグリカンは、図７でさらに右側に示した反復様式で最大２００個のマンノース残基を含むように伸長され得る（Dean, Biochimica et Biophysica Acta 1426:309-322 (1999)）。
【０００９】
さらに、リソソームを指向するタンパク質は、リン酸化された１つ以上のＮ−グリカンを保持する。リン酸化はゴルジ体で起こり、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンのマンノース残基のＣ−６にＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の付加によって開始される。Ｎ−アセチルグルコサミンは、Ｍ６ＰＲによって認識され、リソソームタンパク質のリソソームへの輸送を開始するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を生成するように切断される。次いで、得られたＮ−グリカンを、Ｍ６ＰがＮ−グリカン鎖の末端基であるポイントまでトリミングする（Essentials of Glycobiology. 2nd edition.Varki A,Cummings RD,Esko JD,et al,editors.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press;2009)）。
【００１０】
糖部分およびリン酸基の両方が受容体への結合に関与するので、Ｍ６ＰＲの結合部位は、完全な末端Ｍ６Ｐ基を必要とする（Kim et al,Curr Opin Struct Biol 19:534-42(2009)）。
【００１１】
グリカン修飾による脳を標的とする酵素補充療法
リソソーム（lysomal）酵素のＣＮＳへの分布を増加させる潜在的な戦略は、例えば、ＷＯ２００８／１０９６７７およびＵＳ２０１４／３７７２４６に開示されている。これらの公開広報では、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化ホウ素ナトリウムを使用するβ−グルクロニダーゼの化学修飾が記載されている（Grubb et al,Proc Natl Acad Sci USA 105:2616-2621(2008)も参照のこと）。２０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムによる６．５時間の酸化、その後のクエンチング、透析および１００ｍＭの水素化ホウ素ナトリウムでの一晩の還元（以後、既知の方法と呼ぶ）からなるこの修飾は、β−グルクロニダーゼのＣＮＳ分布を実質的に改善し、ＬＳＤムコ多糖症ＶＩＩのマウスモデルにおける神経記憶のクリアランスをもたらす。脳の分布の根底にあるメカニズムは不明であるが、化学修飾がβ−グルクロニダーゼ上のグリカン構造を破壊することに注目し、Ｍ６ＰＲによる受容体媒介エンドサイトーシスが著しく減少することがさらに証明された。
【００１２】
化学修飾戦略は、他のリソソーム酵素についても研究されている。例えば、既知の方法による修飾は、静脈内投与されたプロテアーゼトリペプチジルペプチダーゼＩの脳への分布を改善しなかった（Meng et al, PLoS One 7: e40509 (2012)）。スルファターゼについても満足のいく結果は実証されていない。既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファターゼは、実際にはマウスで半減期の増加を示したが、ＭＰＳ ＩＩＩＩＡマウスの脳では効果を示さなかった。化学的に修飾されたスルファターゼは、静脈内投与によって繰り返し投与された場合、脳実質には分布しなかった（Rozaklis et al,Exp Neurol 230:123-130(2011)）。
【００１３】
従って、例えばＭＰＳ−ＩＩのような、神経学的に関与があるＬＳＤに有効な静脈内投与ＥＲＴは依然として存在しない。酵素活性を維持したまま、ＢＢＢを通過して輸送することができる新規イズロン酸２−スルファターゼ化合物は、ＭＰＳ−ＩＩのようなＣＮＳ関連病理を有するＬＳＤを治療するための酵素補充療法用の全身投与化合物の開発において多大な価値がある。
【発明の概要】
【００１４】
発明の開示
本発明の目的は、ＭＰＳ−ＩＩのようなＬＳＤのための酵素補充療法の開発を可能にする新規イズロン酸２−スルファターゼポリペプチドを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、哺乳動物の血液脳関門を通過して輸送され得、該哺乳動物の脳において酵素的（触媒的）活性を呈し得る新規なイズロン酸２−スルファターゼポリペプチドを提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、関節、骨、結合組織、および／または軟骨などの末梢組織において触媒活性を有する新規なイズロン酸２−スルファターゼポリペプチドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、改善された構造的完全性などの改善された安定性を示す新規なイズロン酸２−スルファターゼポリペプチドを提供することである。
【００１７】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例４に開示される発明者によって開発された化学修飾方法と、ＷＯ２００８／１０９６７７に開示されている既知の方法との違いを概説する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、イズロン酸２−スルファターゼ（レーン２）および公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。グリカン修飾手順によって生成された、ＡおよびＢという名称の、２種類の追加のタンパク質バンドをレーン３で同定した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、イズロン酸２−スルファターゼ（レーン２）、公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（レーン３）、ならびに本明細書中に開示した新規方法１、２、３、４に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（それぞれレーン４、５、６、７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３】図３は、イズロン酸２−スルファターゼ（黒色バー）、公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（灰色バー）、ならびに新規方法１に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（市松模様バー）のペプチド断片の位置９０のアスパラギン（Ｎ（９０））の様々な天然グリカンの相対量を示す略図である。グリカンは；Ｇ０Ｆ：アシアロ−、アガラクト−、フコシル化二分岐オリゴ糖（オックスフォード表記法名：ＦＡ２）；Ｇ１Ｆ：モノガラクトシル化、フコシル化二分岐オリゴ糖（オックスフォード表記法名：ＦＡ２［３］Ｇ１またはＦＡ２［６］Ｇ１）；Ｇ２Ｆ：アシアロ−、フコシル化二分岐オリゴ糖（オックスフォード表記法名：ＦＡ２Ｇ２）；Ａ１Ｆ：モノシアロ−、フコシル化二分岐オリゴ糖（オックスフォード表記法名：ＦＡ２Ｇ２Ｓ１）；Ａ２Ｆ：ジシアロ−、フコシル化二分岐オリゴ糖（オックスフォード表記法名：ＦＡ２Ｇ２Ｓ２）に対応する。
【図４】図４は、イズロン酸２−スルファターゼならびに新規方法３および４に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの活性を示す略図である。
【図５】図５は、未修飾組換えイズロン酸２−スルファターゼ（黒四角）および本明細書中に記載の新規方法１に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（黒丸）のヒト初代繊維芽細胞における受容体媒介エンドサイトーシスを視覚化した略図である。
【図６Ａ】図６Ａは、１ｍｇ／ｋｇの用量でのｉ．ｖ投与後のマウスにおけるイズロン酸２−スルファターゼおよび新規方法２に従って化学修飾したイズロン酸２−スルファターゼの血清中濃度の時間依存性を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３ｍｇ／ｋｇの用量でのｉ．ｖ投与後のマウスにおけるイズロン酸２−スルファターゼおよび新規方法２に従って化学修飾したイズロン酸２−スルファターゼの血清中濃度の時間依存性を示す。
【図７】図７は、哺乳類起源のタンパク質中に一般的に存在する３つの典型的なＮ−グリカン構造および酵母タンパク質中に存在する典型的なＮ−グリカンの概略図である。左のグリカンはオリゴマンノース型、左から二番目は複合型、および右から二番目はハイブリッド型を表す。いちばん右のものはポリマンノース型の酵母タンパク質である。図では、以下の化合物が示されている：黒塗りのダイヤモンドは、Ｎ−アセチルノイラミン酸に対応する；黒塗りの円はマンノースに対応する；四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応する；黒塗りの三角はフコースに対応する；円はガラクトースに対応する。アスタリスクでマークされた糖部分は、本明細書に開示されている過ヨウ素酸／水素化ホウ素塩処理によって修飾され得る。
【図８】図８のＡは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断を示す概略図である。図８のＢは、Ｍａｎ−６グリカンのモデルを示す概略図である。過ヨウ素酸塩で酸化した場合に結合の切断に感受性を有する糖部分が示される。灰色の円はマンノースに対応し、黒い四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応し、Ｔ１３は、関連酵素スルファミダーゼの配列番号２のＮ−グリコシル化部位Ｎ（１３１）を含むトリプシンペプチドＮＩＴＲに対応する。
【図９Ａ】図９Ａは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法２（白色）、および新規方法３（クロスチェッカー）に従ってスルファミダーゼ、関連酵素スルファミダーゼを化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断合の程度を視覚化する図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法２（白色）、および新規方法３（クロスチェッカー）に従ってスルファミダーゼを化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの単結合切断の相対的存在量を視覚化する図である。
【図１０】図１０は、ヒトイズロン酸２−スルファターゼ（配列番号１）およびヒトスルファミダーゼ（配列番号２；実施例８および９に関連）のアミノ酸配列を列挙する表である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示から当業者には明らかであろうこれらの目的および他の目的は、添付の特許請求の範囲において定義され、本明細書に一般的に開示される本発明の異なる態様によって達成される。
【００２０】
本発明の一態様において、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾イズロン酸２−スルファターゼが提供され、ここで、前記イズロン酸２−スルファターゼが、インビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの少なくとも５０％、例えばインビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの少なくとも６０％、例えばインビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの少なくとも７０％、例えばインビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの少なくとも８０％、の触媒活性を有する。本発明による修飾イズロン酸２−スルファターゼは、ムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ）のより効果的な治療法を可能にし得る。インビトロにおいて触媒活性を計測するための方法や少なくとも５０％の活性を有する修飾イズロン酸２−スルファターゼは、実施例２および４で開示されている。そのうえ、添付の実施例は、すでに知られている方法によって修飾されたイズロン酸２−スルファターゼが、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの５０％未満のインビトロ触媒活性を有することを実証する。よって、本発明は、触媒活性に関して改善された修飾イズロン酸２−スルファターゼを有利に提供する。
【００２１】
従って、本発明の修飾イズロン酸２−スルファターゼは、例えば修飾されていないイズロン酸２−スルファターゼ（配列番号１）と比較して、グリカン認識受容体のエピトープが除去されている点で修飾されている。斯かる修飾イズロン酸２−スルファターゼは、２つのマンノース−６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）のようなグリカン認識受容体のエピトープの除去の結果、実施例５の細胞取り込み調査で実証されるように、細胞取り込みを受けにくい。これは、グリカン認識受容体に関して修飾イズロン酸２−スルファターゼの親和性を低下させ、特に、末梢組織中の修飾イズロン酸２−スルファターゼの受容体媒介エンドサイトーシスを減少させる可能性がある。これに関連して、肝臓などの末梢組織における細胞取り込みが低減され得る。哺乳動物に静脈内投与される時に、次々に血漿から修飾イズロン酸２−スルファターゼの除去を減少させ得る。投与の観点からは、修飾イズロン酸２−スルファターゼのクリアランスの減少は、患者にあまり頻繁に投与することができない長時間作用させる医薬品の開発を有利にし得る。
【００２２】
グリカン認識受容体とは、主としてタンパク質のグリカン部分を介してタンパク質を認識して結合する受容体を意味する。そのような受容体は、マンノース６−リン酸受容体に加えて、マンノース受容体によって例示され得；グリカンが露出した末端マンノース残基を示すタンパク質に選択的に結合する。レクチンは、グリカン上の末端ガラクトース残基を認識するアシアロ糖タンパク質受容体１を認識する末端ガラクトースによって例示され得るグリカン認識受容体の別の大きなファミリーを構成する。従って、グリカン認識受容体のエピトープは、そのような受容体によって認識される（一部の）グリカン部分として理解され得る。
【００２３】
これに関連して、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾イズロン酸２−スルファターゼは、好ましくは、グリカン認識受容体のエピトープをほとんど含まないか、または少量のそのようなエピトープを含む修飾イズロン酸２−スルファターゼとして理解されるべきである。好ましい実施形態において、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、グリカン認識受容体のための（検出可能な）エピトープを含まない。特に、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、エンドサイトーシスＭ６ＰＲタイプ１および２、マンノース受容体、ｎ−アセチルグルコサミンを結合するレクチンおよびガラクトース受容体それぞれのエピトープを構成する（検出可能な）マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分、Ｎ−アセチルグルコサミン部分またはガラクトース部分を含まない。前記修飾イズロン酸２−スルファターゼで実質的に存在しない前記エピトープは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼに存在する場合、マンノース−６−リン酸受容体タイプ１および２、マンノース受容体およびガラクトース受容体から選択されるグリカン認識受容体によって認識され得る。マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分およびガラクトース部分は、未修飾イズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分に見られる前記エピトープに相当し得る。特定の実施形態において、これらは、本明細書中に開示される修飾イズロン酸２−スルファターゼには存在しない。
【００２４】
一実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼは、前記哺乳動物の脳において触媒活性を有する。本明細書に記載の態様による修飾イズロン酸２−スルファターゼは、哺乳動物の脳に分布し得るだけでなく、該哺乳動物の脳内において（保持された）酵素活性または触媒活性を示し得る。このことは、修飾イズロン酸２−スルファターゼの酵素活性が、未修飾形態のイズロン酸２−スルファターゼと比較して、少なくとも部分的に保持されていることを意味する。従って、本明細書中に開示される修飾イズロン酸２−スルファターゼは、リソソーム蓄積、例えばデルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、およびヘパリンのリソソーム蓄積を減少させるなど、哺乳動物の脳におけるリソソーム蓄積に影響し得る。保持された触媒活性は、例えば、イズロン酸２−スルファターゼの活性部位における触媒アミノ酸残基の修飾に対する保存レベルに依存し得る。
【００２５】
一実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼは、末梢組織において触媒活性を有する。一般的に、前記末梢組織は、これに関連して、未修飾イズロン酸２−スルファターゼがあまり分布していない、および／またはそこではリソソーム蓄積を低減させる必要がある末梢組織として理解され得る。よって、斯かる末梢組織は、例えば、関節、骨、結合組織、骨格筋、心臓、肺、および／または軟骨である。特に、斯かる末梢組織は、関節、骨、結合組織、および／または軟骨である。本明細書中に開示した修飾イズロン酸２−スルファターゼの分布は、未修飾イズロン酸２−スルファターゼが一般的にあまり分布していない末梢組織に対して顕著に高められ得る。特に、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、静脈内注入によって投与されると、関節、結合組織、軟骨、および骨においてより高い曝露を示し得る。そのうえ、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、骨格筋、心臓、および／または肺により良好な分布を示し得る。
【００２６】
イズロン酸２−スルファターゼは、スルファターゼのタンパク質ファミリーに属する。スルファターゼは、種々の基質からの硫酸エステル結合の加水分解を触媒する共通の進化的起源を有するタンパク質ファミリーである。従って、本明細書で使用する修飾イズロン酸２−スルファターゼの「触媒活性」は、好ましくは哺乳動物の脳における末梢組織のリソソームおよび／またはリソソームにおける、硫酸エステル結合の加水分解を指してもよい。従って、修飾イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性は、リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物の脳または末梢組織における、ＧＡＧ、例えばデルマタン硫酸やヘパラン硫酸の蓄積などのリソソーム蓄積の減少をもたらし得る。触媒活性は、例えば、実施例７に記載されるように、動物モデルにおいて測定され得る。
【００２７】
スルファターゼは、１０個のβ鎖からなる中央のβシートと共通の折り畳みを共有する。イズロン酸２−スルファターゼの活性部位は中央のβシートの末端に位置し、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に翻訳後修飾された配列番号１の位置５９に保存されたシステインを含む。この反応は、小胞体においてＦＧｌｙ生成酵素によって起こる。位置５９のこのＦＧｌｙ残基（ＦＧｌｙ５９）は、硫酸エステル結合の加水分解に直接関与しており、該修飾が活性化には必要であるようである。特に、アリールスルファターゼＡおよびＢ中の保存されたシステインからセリン（Ｓｅｒ）への変異は、ＦＧｌｙの形成を妨げ、不活性酵素を生じる（Recksiek et al,J Biol Chem 13;273(11):6096-103(1998)）。関連するスルファターゼであるスルファミダーゼのグリカン修飾は、従来技術において開示された（Rozaklis et al、前掲）。しかしながら、スルファミダーゼを修飾するための既知の方法は、マウスの脳において触媒活性を欠いている修飾スルファミダーゼをもたらす。よって、このことは、触媒活性を危険にさらさないように酵素の修飾が慎重に実施されなければならないことを示している。イズロン酸２−スルファターゼの場合では、修飾が、修飾イズロン酸２−スルファターゼの不活性の状態にする、ＦＧｌｙ５９のＳｅｒ５９への前駆タンパク質転換酵素ズブチリシンなしに行われなければならない。本明細書において活性部位の保存について述べられる場合、それは主として配列番号１の翻訳後ＦＧｌｙ５９の保存として理解されるべきである。このような場合、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列で以下に定義される配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものとして理解されるべきである。
【００２８】
一実施形態において、前記活性部位は、前記触媒活性を提供する配列番号１の位置５９に対応する位置に触媒残基を含んでいる。この触媒残基はさらなる実施形態においてＦＧｌｙ５９である。
【００２９】
ヒトイズロン酸２−スルファターゼ（ＥＣ：３．１．６．１３、配列番号１）はＩＤＳ遺伝子によってコードされる。成熟タンパク質は、５２５個のアミノ酸から成り、約７６ｋＤａの分子量を有する。また、イズロン酸２−スルファターゼは、α−Ｌ−イズロネート硫酸スルファターゼやイズルスルファーゼ（ＩＮＮ名）の名称でも知られている。「イズロン酸２−スルファターゼ」という用語は、本明細書中で使用される場合、これらの代替名称と同義であると理解されるべきである。
【００３０】
イズロン酸２−スルファターゼは、複合、ハイブリッドおよび高いマンノース型オリゴ糖鎖によって占有された２個のジスルフィド結合および８個のＮ結合型グリコシル化部位を含んでいる。一実施形態において、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、未修飾組換えイズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分の含量に対する天然グリカン部分の相対含量が約３８％以下である。従って、グリカン認識受容体の前記エピトープは、天然グリカン部分上に見出され得、従って、このような天然グリカン部分は、本明細書に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼにおいて実質的に存在しない。天然のグリカン部分は、この点において、真核細胞の小胞体およびゴルジ画分において翻訳後修飾されたイズロン酸２−スルファターゼ内に自然に生じるグリカン部分と理解されるべきである。グリカン部分の相対的含量は、無傷の天然グリカン部分の含量として理解することができる。添付の実施例に示すように、糖ペプチドの相対定量は、ＬＣ−ＭＳおよび再構成イオンクロマトグラムのピーク面積に基づくことができる。別の定量方法は当業者に公知である。３８％未満のレベルの天然グリカンの相対的含量は、グリカン認識受容体を介してイズロン酸２−スルファターゼの受容体媒介エンドサイトーシスを有利に低下させ、血液脳関門を通じた輸送を改善し得る。
【００３１】
修飾イズロン酸２−スルファターゼ中の天然グリカンエピトープの相対含量は、好ましい実施形態において、３８％未満、例えば２５％未満、例えば１３％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満であり得る。特定の実施形態において、天然グリカンエピトープの含量は１％未満である。
【００３２】
修飾イズロン酸２−スルファターゼの前記天然グリカン部分は、先に説明されるように、修飾イズロン酸２−スルファターゼで欠如していてもよい。この不存在は、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分の中の、単結合の切断や二重結合の切断から成る破壊に相当し得る。単結合切断によるグリカン破壊は、一般的に優位になり得る。特に、前記イズロン酸２−スルファターゼの天然グリカン部分は、単結合切断および二重結合切断によって破壊され得、ここで、該単結合切断の程度は、オリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であり得る。特に、単結合切断の程度は、オリゴマンノース型のグリカンの少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８５％であり得る。単結合切断対二重結合切断の程度は、実施例１０および１１において記載されるように決定され得る。
【００３３】
一実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの９５％超の分子量、例えば未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの９６％超、例えば未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの９７％超、例えば未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの９８％超、例えば未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの９９％超を有する。添付の実施例４では、本発明による修飾イズロン酸２−スルファターゼは、（図８Ａに示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では未修飾イズロン酸２−スルファターゼと区別できず、主に単結合の切断が示唆された。添付の実施例２では、既知の方法による修飾イズロン酸２−スルファターゼは、（図８Ａに示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では未修飾イズロン酸２−スルファターゼより小さく、より高い程度の二重結合の切断が示唆された。
【００３４】
一実施形態において、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。非限定的な例において、前記ポリペプチドは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号１に定義されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。従って、本発明の修飾イズロン酸２−スルファターゼは、配列番号１の配列に高度に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。しかし、前記ポリペプチドは、例えば、１以上のＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸（単数または複数）によって伸長され、実際の修飾イズロン酸２−スルファターゼ配列を配列番号１の配列よりも長くすることができる。同様に、他の場合には、修飾イズロン酸２−スルファターゼは配列番号１のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有していてもよく、例えば、その配列の特定の位置（単数または複数）にあるアミノ酸残基（単数または複数）の欠損に起因する。
【００３５】
一実施形態において、前記エピトープは、８つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置６のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（６））、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））、位置１１９のＮ（Ｎ（１１９））、位置２２１のＮ（Ｎ（２２１））、位置２５５のＮ（Ｎ（２５５））、位置３００のＮ（Ｎ（３００））、位置４８８のＮ（Ｎ（４８８））および位置５１２のＮ（Ｎ（５１２））、のうちの少なくとも５つにおいて存在しない。よって、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、前記Ｎ−グリコシル化部位のうちの３つ未満にて無傷の天然グリカン部分を有する。同定された部位において無傷のまたは完全なグリカン部分を欠くこのような修飾イズロン酸２−スルファターゼの利点は、先に説明されている。すなわち、細胞取り込みがさらに減少し、血液脳関門を通じた輸送がさらに促進される可能性がある。
【００３６】
一実施形態において、前記エピトープは、８つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置６のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（６））、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））、位置１１９のＮ（Ｎ（１１９））、位置２２１のＮ（Ｎ（２２１））、位置２５５のＮ（Ｎ（２５５））、位置３００のＮ（Ｎ（３００））、位置４８８のＮ（Ｎ（４８８））および位置５１２のＮ（Ｎ（５１２））、のうちの少なくとも６つにおいて存在しない。一実施形態において、グリコシル化部位のエピトープ、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））は存在しない。一実施形態において、前記エピトープは、少なくとも８つの前記Ｎ−グリコシル化部位のうち７つで存在しない。特定の実施形態において、前記エピトープは、８つの前記Ｎ−グリコシル化部位のすべてが存在しない。前記エピトープを欠いている修飾イズロン酸２−スルファターゼは、例えば、哺乳動物における血漿クリアランスをさらに低下させることができるなどの、さらに改善された薬物動態を示し得る。結果として、修飾イズロン酸２−スルファターゼの投薬頻度もまた、さらに低減され得る。
【００３７】
本明細書中に開示された態様の一実施形態において、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、非共有結合形態で提供される。有利なことには、前記イズロン酸２−スルファターゼは、タンパク質の凝集を引き起こすことなく、および／またはより小さいペプチド断片へのタンパク質骨格の切断を引き起こすことなく、修飾された。
【００３８】
一実施形態において、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼが単離される。
【００３９】
一実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼはヒトイズロン酸２−スルファターゼである。
【００４０】
一実施形態において、修飾前の前記イズロン酸２−スルファターゼはグリコシル化されている。
【００４１】
一実施形態において、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは組換え体である。特に、イズロン酸２−スルファターゼは、ヒト連続細胞株で組換えにより作製され得る。イズロン酸２−スルファターゼは、Bielicki et al., Biochem J., 289: 241-246 (1993)に記載のように組換えにより作製され得る。
【００４２】
別の実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼは、哺乳動物、植物または酵母細胞において組換えにより作製された。細胞株の一例がＣＨＯ細胞株である。よって、得られたイズロン酸２−スルファターゼは、修飾前に１若しくは複数のオリゴマンノースＮ−グリカンによってグリコシル化される。
【００４３】
本発明の一実施形態において、先に開示した修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む、イズロン酸２−スルファターゼ組成物を提供し、前記組成物は、１よりも大きい活性部位におけるＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比を有する。
本発明の一態様において、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供し、それによって、前記イズロン酸２−スルファターゼを哺乳動物の血液脳関門を通じて輸送することを可能にし、ここで、前記イズロン酸２−スルファターゼは前記哺乳動物の脳において触媒活性を有する。この態様の実施形態は先に開示されている。
【００４４】
一態様において、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に有さない修飾イズロン酸２−スルファターゼを含むイズロン酸２−スルファターゼ組成物が提供されるものであり、それにより該イズロン酸２−スルファターゼを哺乳動物の血液脳関門を通じて輸送することを可能にし、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比が１よりも大きく、それにより哺乳動物の脳内で触媒活性を提供する。例えば、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号１で定義されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。そのような例では、ＦＧｌｙ対Ｓｅｒの比は、ＦＧｌｙ５９対Ｓｅｒ５０比と呼ばれることがある。このように、定義された比は、ＦＧｌｙ５９がＳｅｒ５０より大きい程度に存在することを意味する。好ましくは、比は１．５より大きく、より好ましくは２．３より大きく、より好ましくは４より大きく、最も好ましくは、比は約９である。より大きな比は、より大きいほど、修飾イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性が、イズロン酸２−スルファターゼの未修飾形態から維持され得ることを示す。
【００４５】
修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む組成物の利点は、それ自体修飾されたイズロン酸２−スルファターゼの利点と同様である。従って、修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む組成物は、未修飾イズロン酸２−スルファターゼまたは未修飾イズロン酸２−スルファターゼを含む組成物と比較して、血漿中で改善された半減期を示し得る。さらに、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、例えば、未修飾イズロン酸２−スルファターゼと比較して、哺乳動物の脳への改善された分布、並びに脳における保持された触媒活性を示しうる。
【００４６】
一実施形態において、イズロン酸２−スルファターゼ組成物は、未修飾組換えイズロン酸２−スルファターゼ組成物における天然グリカン部分の含量に対する天然グリカン部分の相対含量が約３８％以下である。従って、グリカン認識受容体の前記エピトープは、天然のグリカン部分上に見出され得、このような天然グリカン部分は、本明細書に記載のイズロン酸２−スルファターゼ組成物において実質的に存在しない。約３８％以下のレベルの天然グリカンの相対含量は、グリカン認識受容体を介した細胞内へのイズロン酸２−スルファターゼの受容体媒介エンドサイトーシスを有利に低減でき、そして、血液脳関門を通じた輸送を改善する。イズロン酸２−スルファターゼ組成物中の天然グリカンエピトープの相対的含量は、好ましい実施形態において２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満であり得る。場合によっては、天然グリカン部分の相対含量は、４％未満、３％、２％、１％、０．５％、例えば０．１％未満、例えば０．０１％未満である。特定の実施形態において、天然グリカン部分の含量は１％未満である。グリカン部分の相対含量は、完全な天然グリカン部分の含量として理解され得る。
【００４７】
組成物態様の１つの特定の実施形態において、前記エピトープが、８つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置６のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（６））、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））、位置１１９のＮ（Ｎ（１１９））、位置２２１のＮ（Ｎ（２２１））、位置２５５のＮ（Ｎ（２５５））、位置３００のＮ（Ｎ（３００））、位置４８８のＮ（Ｎ（４８８））および位置５１２のＮ（Ｎ（５１２））、のうちの少なくとも５つが存在しない。好ましくは、前記エピトープが、前記８つのＮ−グリコシル化部位のうちの少なくとも６つ、例えば前記Ｎ−グリコシル化部位の少なくとも７つ、例えば前記Ｎ−グリコシル化部位のすべてが存在しない。
【００４８】
組成物の態様の１つの実施形態において、１０％（重量）以下、例えば５％（重量）以下の前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、１０１０ｋＤａを超える分子量を有する多量体型で存在する。
【００４９】
組成物の態様の１つの実施形態において、前記修飾されたイズロン酸２−スルファターゼの１０％（重量）以下、例えば５％（重量）以下は共有結合したオリゴマー形態で存在する。該オリゴマー形態は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマーおよびオクタマーから選択されるか、または該オリゴマー形態は、１８０〜４８０ｋＤａの分子量を有する。オリゴマー、多量体または凝集形態の存在は、例えば、動的光散乱によってまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。この文脈において、凝集形態は、ネイティブに折り畳まれたモノマーから折り畳まれていないモノマーまでの範囲の構造から構成される高分子量タンパク質形態として理解されるべきである。タンパク質の凝集形態は、タンパク質のモノマー形態に対する免疫応答を増強することができる。増強された免疫応答の最も可能性の高い説明は、抗原の多価提示がＢ細胞受容体にクロスリンクし、従って免疫応答を誘導することである。これは、高い免疫応答を確実にするために、凝集形態にて抗原が宿主に提示されるワクチン製造に利用されている現象である。治療用タンパク質の場合、定説（dogma）とは反対である。免疫応答を最小限に抑えるために、高分子量形態の任意の含量を最小限にするか、または避けるべきである（Rosenberg,AAPS J,8:E501-7(2006)）。従って、オリゴマー、多量体および／または凝集体の形態の減少は、治療における使用により適した酵素を提供し得る。
【００５０】
そのうえ、タンパク質組成物中での凝集のごく少量の発生が、正常に折りたたまれたタンパク質のさらなる凝集を誘導し得ることである。凝集した材料は、一般に、残存活性がない、または低い残存活性であり、不十分な溶解性を有する。凝集体の出現は、生物学的薬剤の貯蔵寿命を決定する因子の１つであり得る（Wang,Int J Pharm,185:129-88(1999)）。
【００５１】
本明細書で使用される用語「組成物」は、固体および液体の形態を含むものとして理解されるべきである。組成物は、好ましくは、患者（例えば、哺乳動物）に、例えば注射または経口投与するのに適した医薬組成物であり得る。
【００５２】
さらに、修飾イズロン酸２−スルファターゼの態様に関連して開示された実施形態およびその利点は、組成物の態様の実施形態でもあることを理解すべきである。同様に、組成物の態様の実施形態は、適用可能である修飾イズロン酸２−スルファターゼの態様の実施形態とみなされるべきである。
【００５３】
本明細書中に開示された態様の一実施形態において、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼまたは前記イズロン酸２−スルファターゼ組成物は、治療に使用するためのものである。
【００５４】
一実施形態において、前記哺乳動物の脳は、ヒトの脳である。関連する実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。
【００５５】
一実施形態において、前記哺乳動物の脳はマウスの脳である。関連する実施形態において、前記哺乳動物はマウスである。
【００５６】
一実施形態において、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼまたはイズロン酸２−スルファターゼ組成物は、リソソーム（lysomal）蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ）に罹患した哺乳動物の治療に使用するためのものである。
【００５７】
一実施形態において、使用のための前記修飾イズロン酸２−スルファターゼまたはイズロン酸２−スルファターゼ組成物は、前記哺乳動物の脳におけるＧＡＧ蓄積を減少させる。特に、ヘパラン硫酸の蓄積および／またはデルマタン硫酸の蓄積が低減され得る。場合によっては、前記ヘパラン硫酸蓄積は、例えば動物モデルにおいて、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも８０％減少する。
【００５８】
一態様において、修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供するものであって、ここで、前記イズロン酸２−スルファターゼは、過ヨウ素酸アルカリ金属塩（alkali metal periodate）および水素化ホウ素アルカリ金属塩（alkali metal borohydride）との逐次反応によって調製され、それによってイズロン酸２−スルファターゼのグリカン認識受容体のエピトープを修飾し、イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を保持しながら、前記グリカン認識受容体に関して前記イズロン酸２−スルファターゼの活性を低下させる。従って、イズロン酸２−スルファターゼは、修飾前のその天然のグリコシル化形態で存在するそのエピトープまたはグリカン部分が前記修飾によって本質的に不活性化されている点で修飾されている。従って、グリカン認識受容体のエピトープの存在は、修飾イズロン酸２−スルファターゼにおいて低減されている。修飾イズロン酸２−スルファターゼ、組成物および調製方法に関連する態様のような、本明細書に開示される他の態様に関連して開示される実施形態およびその利点は、この態様の実施形態でもあることを理解すべきである。特に、以下に開示される様々な方法の実施形態は、特異的反応条件の点で前記修飾イズロン酸２−スルファターゼの調製のさらなる例示的な定義を提供する。同様に、上記の修飾イズロン酸２−スルファターゼおよび組成物の態様に関して開示された実施形態は、修飾イズロン酸２−スルファターゼのさらなる例示的な定義を提供する。
【００５９】
一態様において、修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法を提供し、前記方法は：
ａ）グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、および
ｂ）前記イズロン酸２−スルファターゼを水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下反応させること、を含み；それによって前記イズロン酸２−スルファターゼのグリカン部分を修飾し、前記イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を保持しながら、グリカン認識受容体に関して前記イズロン酸２−スルファターゼの活性を低下させる。
【００６０】
一態様において、修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法を提供し、前記方法は：
ａ）グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、および
ｂ）前記イズロン酸２−スルファターゼを水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下反応させること、を含み；それによって前記イズロン酸２−スルファターゼのグリカン部分を修飾し、インビトロにおける前記イズロン酸２−スルファターゼの少なくとも５０％の触媒活性を保持しながら、グリカン認識受容体に関して前記イズロン酸２−スルファターゼの活性を低下させる。よって、修飾イズロン酸２−スルファターゼは、インビトロにおいて未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの少なくとも５０％の触媒活性を有する。
【００６１】
従って、上記の方法は、グリカン認識受容体のエピトープの存在を減少させるイズロン酸２−スルファターゼのマイルドな化学修飾を提供し、前記エピトープは、例えば、本明細書に記載の天然のグリカン部分によって表される。これは、有利には、哺乳動物の脳、および／または他の未修飾イズロン酸２−スルファターゼがあまり分布していない末梢組織を標的化するのに適した修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供し得る。特に、該方法は、例えば、静脈内注入によって投与されると、関節、骨、結合組織、骨格筋、心臓、肺、および／または軟骨においてより高い曝露を有するイズロン酸２−スルファターゼを提供し得る。マイルドな方法はさらにイズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を実質的に変えることなく前記エピトープを修飾し得る。特に、イズロン酸２−スルファターゼの活性部位にＦＧｌｙ５９を保持することにより、触媒活性を保持することができる。従って、酵素の分布特性を改善する一方で、この方法は触媒活性を排除しない。
【００６２】
そのうえ、比較的にマイルドな化学修飾は、例えば改善された構造的完全性などの改善された品質および安定性を有する修飾酵素を提供し得る。既知の修飾方法と比較して、本明細書中に開示した修飾は、より少ないタンパク質凝集をもたらし、従って、高分子量形態のイズロン酸２−スルファターゼ出現の減少をもたらす。また、タンパク質鎖破壊も、本明細書中に開示した方法で頻度が低下する。従って、イズロン酸２−スルファターゼ断片の減少は、本明細書中に開示した方法によりもたらされた生成物で観察され得る。マイルドな方法によって調製された修飾イズロン酸２−スルファターゼの更なる利点は、上記に説明されているように、例えば、イズロン酸２−スルファターゼおよび組成物の態様に対するものである。
【００６３】
この方法は、グリカン（炭水化物）部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合の過ヨウ素酸切断によるグリカン修飾を可能にする。一般に、過ヨウ素酸酸化開裂は、隣接のジオールが存在する場所で起こる。ジオールは、赤道−赤道または軸−赤道位置に存在しなければならない。ジオールが剛性軸−軸位置に存在する場合、反応は起こらない（Kristiansen et al.,Car.Res(2010)）。過ヨウ素酸塩処理は、Ｍ６Ｐ部分のＣ２とＣ３および／またはＣ３とＣ４の間の結合を切断し、Ｍ６Ｐ受容体に結合することができない構造を生じる。一般的に、他の末端ヘキソースも同様の方法で処理される。非末端の１−４結合残基は、Ｃ２とＣ３の間のみが切断されるが、一方で、非末端（１−３）結合残基は、切断に耐性である。図７において、可能性がある修飾のポイントは、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマンノース、複合体およびハイブリッド、にアスタリスクでマークされている。添付の図８〜９にさらに示されるように、本明細書に開示される方法は、限られた数の結合の切断による天然のグリカン部分の破壊を提供する。一般的に、従来技術の方法の使用による修飾は、ポリペプチドスルファミダーゼの比較実験で実証されたように、大規模な破壊への増大をもたらす（実施例８〜９参照）。ステップａ）で使用される過ヨウ素酸塩は、イズロン酸２−スルファターゼに自然に生じるグリカン部分の構造を破壊し得る。修飾イズロン酸２−スルファターゼのグリカン構造の保持は、少なくとも１つの過ヨウ素酸塩が触媒した切断、すなわち少なくとも１つの単結合切断が天然に存在するグリカン部分のそれぞれで起きた際に、少なくとも部分的に破壊された。現在開示している方法は、イズロン酸２−スルファターゼのグリカン部分の糖部分における単独型の結合切断を主にもたらし得る。単独型の結合切断を主に示す修飾グリカン部分のレパートリーは、同様にして、静脈内投与後に生きている動物の脳におけるイズロン酸２−スルファターゼの分布および活性に有益であり得る。
【００６４】
本明細書に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼを調製する方法、および修飾イズロン酸２−スルファターゼは、従来技術の方法および化合物よりも改善されている。主に、新規な修飾イズロン酸２−スルファターゼが哺乳動物の脳に分布して触媒活性を示し得る。実施例２および４はさらに、既知の先行技術の方法、および本明細書中に開示されるイズロン酸２−スルファターゼを修飾するための新規の方法を提供する。これらの実施例は、既知の方法に従って修飾されたイズロン酸２−スルファターゼが少なくとも一つのアミノ酸残基修飾、ポリペプチド鎖切断およびタンパク質凝集を示すことを示す。従って、本明細書中に開示した方法は、そのうえ、例えば構造的完全性、に関して改善された品質および安定性を有する修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供し得る。
【００６５】
方法の態様の一実施形態において、前記イズロン酸２−スルファターゼポリペプチドは、配列番号１で規定されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、または配列番号１で規定されるポリペプチドと配列同一性を有するポリペプチドを含む。代表的な実施形態が、本明細書中に開示された他の態様に関連してさらに開示される。
【００６６】
方法の態様の一実施形態において、前記グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼは、ステップａ）の前に、８つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置６のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（６））、位置９０のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（９０））、位置１１９のＮ（Ｎ（１１９））、位置２２１のＮ（Ｎ（２２１））、位置２５５のＮ（Ｎ（２５５））、位置３００のＮ（Ｎ（３００））、位置４８８のＮ（Ｎ（４８８））および位置５１２のＮ（Ｎ（５１２））、にグリカン部分を含む。
【００６７】
方法の態様の一実施形態において、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、グリカン部分のｃｉｓ−グリコール基をアルデヒド基に酸化する。
【００６８】
方法の態様の一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記アルデヒドをアルコールに還元する。
【００６９】
方法の態様の一実施形態において、ステップａ）およびステップｂ）は、中間ステップを実行することなく、順番に実行される。
【００７０】
ステップｂ）を、ステップａ）の直後に、または以下に記載される任意のクエンチングステップａ２）の後に実施することによって、例えば、限外濾過、沈殿または緩衝液の交換によって、反応試薬を除去することなどの任意の中間ステップが省かれ、従って、イズロン酸２−スルファターゼが反応性アルデヒド中間体に長時間さらされることを回避する。ステップａ）、または任意にａ２）の後にステップｂ）を進行させると、全体の反応時間も有利に短縮される。
【００７１】
以下の段落において、ステップａ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、本明細書に開示される態様の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解すべきである。
【００７２】
一実施形態において、前記過ヨウ酸アルカリ金属塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００７３】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、実施される。特定の実施形態において、ステップａ）の反応は、少なくとも０．５時間実施される。反応は、好ましくは、約３時間、２時間、１時間、または１時間未満の持続時間を有する。本発明者らは、ステップａ）の持続時間が４時間以下であることにより、グリカン認識受容体のエピトープを効率的に不活性化することを見出した。さらに、４時間以下の比較的に限定された持続時間は、ポリペプチド鎖の鎖切断の限定された程度を生じさせると仮定される。
【００７４】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、（最終）濃度が２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用される。過ヨウ素酸塩は、８〜２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度で使用することができる。あるいは、過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ未満、例えば１０ｍＭ〜１９ｍＭの濃度で使用される。より低濃度の過ヨウ素酸アルカリ金属塩、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムが、ポリペプチド鎖の鎖切断の程度、並びにアミノ酸側鎖上の関連する酸化、例えば、メチオニン残基の酸化を減少させ得る。
【００７５】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、周囲温度、好ましくは０〜２２℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、前記ステップａ）の反応は、０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、ステップａ）の反応は、約８℃の温度、約４℃の温度または約０℃の温度で実施される。
【００７６】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、ｐＨ３〜７で実施される。当該ｐＨは、反応の開始時のｐＨとして理解されるべきである。特定の実施形態において、ステップａ）で使用されるｐＨは３〜６、例えば４〜５である。特定の実施形態において、ステップａ）で使用されるｐＨは、約６、約５、または約４である。ステップａ）のｐＨを低下させることによって、過ヨウ素酸塩の濃度またはステップａ）の反応時間を短縮してもよい。
【００７７】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用される。一実施形態において、前記メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、８〜２０ｍＭの濃度で使用される。好ましい実施形態において、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、約１０ｍＭの濃度で使用される。
【００７８】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、ステップａ）の前記反応が、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間実施される。２０ｍＭの過ヨウ素酸塩の濃度および４時間以下の反応時間は、有利なことには、より少ない鎖切断および酸化をもたらし得る。比較的短い反応時間を維持しながら過ヨウ素酸塩濃度をさらに低下させることは、鎖切断および酸化にさらに影響を及ぼし得る。さらに、比較的短い反応時間を維持しながら過ヨウ素酸塩濃度をさらに低下させることは、イズロン酸２−スルファターゼモノマーサブユニットの共有結合に影響を及ぼし得る（すなわち、共有結合したモノマーの発生を減少させる）。
【００７９】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、ステップａ）の前記反応が４時間以下の時間、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、０〜２２℃の温度で、例えば約８℃、例えば約０℃で実施される。
【００８０】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用され、ステップａ）の前記反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００８１】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で実施される。
【００８２】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップa）の反応は、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００８３】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、約８℃の温度で、２時間以下の期間実施される。
【００８４】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、０〜８℃の温度で、３時間以下の期間実施される。
【００８５】
以下の段落において、ステップｂ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、特定の実施形態、特にステップａ）およびステップｂ）の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解されたい。
【００８６】
一実施形態において、前記水素化ホウ素は、１０〜８０ｍＭの濃度、例えば１０〜８０ｍＭの濃度にて任意に使用される。一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、水素化ホウ素ナトリウムである。
【００８７】
いくつかの例において、ステップｂ）に使用される条件は、ステップａ）に使用される条件に部分的に依存することが見出されている。ステップｂ）において使用される水素化ホウ素塩（borohydride）の量は、好ましくは、できるだけ低く保たれる一方、水素化ホウ素塩対過ヨウ素酸塩（periodate）のモル比は、そのような場合０．５〜４：１である。従って、ステップｂ）において、水素化ホウ素塩は、ステップａ）において使用される過ヨウ素酸塩の量の４倍のモルで使用される。一実施形態において、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の（最終）濃度の４倍以下の（最終）モル濃度で使用される。例えば、水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下の濃度、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２倍以下、前記過ヨウ素酸塩の濃度の１．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度におおよそ対応する濃度で使用されてもよい。しかし、特定の実施形態において、過ヨウ素酸塩濃度の半分、または過ヨウ素酸塩濃度の０．５倍に相当する濃度で、水素化ホウ素塩が使用される。従って、過ヨウ素酸塩が約２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、８０ｍＭ以下の濃度、または１０〜８０ｍＭの濃度、例えば１０〜５０ｍＭの濃度で使用されてもよい。過ヨウ素酸塩が１０〜２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は５〜８０ｍＭ、例えば５０ｍＭの濃度で使用され得る。同様に、過ヨウ素酸塩が約１０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、４０ｍＭ以下の濃度、例えば、２５ｍＭ以下の濃度で使用され得る。さらに、そのような実施形態において、水素化ホウ素塩は、好ましくは、１２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で使用され得る。水素化ホウ素塩の濃度がイズロン酸２−スルファターゼの活性部位における触媒アミノ酸残基の保存度に影響を及ぼし、そのため、従って比較的低い濃度の水素化ホウ素塩が触媒活性を保持する修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供し得る。
【００８８】
一実施形態において、前記ステップｂ）の反応は、１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。反応時間は、好ましくは約１時間、または１時間未満である。さらなる例において、ステップｂ）の反応は、約０．２５時間の持続時間を有する。さらなる実施形態において、ステップｂ）の反応は、０．２５時間〜２時間の期間実施することができる。上記で説明されるように、還元ステップの持続時間は、イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性に影響を与え得る。従って、比較的短い反応時間は、Ｓｅｒ５９ではなくＦＧｌｙ５９を含む修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供し得る。そのうえ、より短い反応時間は、酵素の全体的な構造的完全性に有利に影響し得る。特に、イズロン酸２−スルファターゼの高分子量形態並びに鎖切断の発生を生じるタンパク質凝集は、少なくとも部分的に反応時間と関連し得る。
【００８９】
一実施形態において、前記ステップｂ）の反応は、０〜８℃の温度で実施される。ステップｂ）の反応温度は、反応生成物の触媒活性に少なくとも部分的に影響を及ぼし得る。従って、ステップｂ）を８℃未満の温度で実施することが有利であり得る。温度は好ましくは約０℃である。
【００９０】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムである。
【００９１】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。
【００９２】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９３】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度で、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用され、前記ステップｂ）の反応は１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９４】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９５】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は０〜８℃の温度で実施される。
【００９６】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、約０℃の温度で約０．５時間の期間実施される。
【００９７】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムである。
【００９８】
一実施形態において、ステップａ）およびステップｂ）のそれぞれは、２時間以下、例えば１時間以下、例えば約１時間または約０．５時間の期間、個別に実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜２．５倍の濃度で使用される。特定の実施形態において、前記水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍の濃度で、または前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される。
【００９９】
一実施形態において、ステップａ）は３時間以下の期間実施され、ステップｂ）は１時間以下実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下で使用される。
【０１００】
当業者は、化学反応の反応持続時間、例えばステップａ）およびｂ）のそれぞれの反応持続時間を制御する方法を認識している。従って、一実施形態において、前記方法の態様は、ａ２）ステップａ）から生じる反応のクエンチングをさらに含む。前記クエンチングは、３０分未満、例えば１５分未満の持続時間を有する。いくつかの例において、前記クエンチングは、ステップａ）の直後に実施される。クエンチングは、例えば、エチレングリコールまたは別のジオール、例えばｃｉｓ−シクロ−ヘプタン−１，２−ジオールなどの添加によって実施してもよい。好ましくは、ステップｂ）は、クエンチングの直後に続く。これにより、イズロン酸２−スルファターゼが反応性アルデヒド基に暴露される期間を最短にすることができる。反応性アルデヒドは、タンパク質の不活性化および凝集を促進することができる。
【０１０１】
一実施形態において、前記方法は、ｂ２）ステップｂ）から生じる反応の停止をさらに含む。このクエンチングは、ケトンまたはアルデヒド基、例えばシクロヘキサノンまたはアセトンを含有する分子を添加することによって実施することができ、前記分子は好ましくは水に可溶性であるか、あるいは、酢酸または他の酸の添加によって反応混合物をｐＨ６以下に低下させることによって実施することができる。いくつかの例において、前記クエンチングは、アセトンの添加によって実施される。任意のクエンチングステップは、ステップｂ）の反応時間の正確な制御を可能にする。このようにして反応時間を制御することは、ＦＧｌｙ５９含量に関してプロセスの再現性をさらに提供し得る。
【０１０２】
場合によっては、化学修飾は酵素の活性に影響し得る。化学修飾のこうした負の影響を最小限にするために、前記イズロン酸２−スルファターゼの活性部位を、ステップａ）およびｂ）のうちの少なくとも一方の酸化および／または還元反応において利用不可能にすることもできる。従って、一実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）のうちの少なくとも一方は、保護リガンドの存在下で行われる。特に、ステップａ）は、保護リガンドの存在下で行われ得る。リガンド、イズロン酸２−スルファターゼの基質、例えば４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ−スルファートまたはヘパリン硫酸塩など、あるいは阻害剤、例えばスルファートなどは、（単数若しくは複数の）酸化および／または還元のステップ中、および（単数若しくは複数の）任意のクエンチングステップ中、イズロン酸２−スルファターゼの活性部位を保護するのに役立ち得る。別の実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）は、イズロン酸２−スルファターゼが樹脂で固定されたままで行われる。従って、イズロン酸２−スルファターゼは最初に、樹脂または媒質で固定され得る。次に、ステップａ）およびｂ）の反応、ならびに任意のａ２）およびｂ２）の反応が、イズロン酸２−スルファターゼが樹脂または媒質に固定されたまま行われ得る。好適な樹脂または媒質が当業者に知られている。例えば、陰イオン交換性媒質または親和性媒質が使用され得る。
【０１０３】
一実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）が連続工程で行われる。「連続工程」という用語、本明細書中で使用される場合、連続的に操作されるプロセスと理解されるべきであり、そして、ここで、試薬はプロセスユニットに連続的に補給される。特に、ステップａ）、ａ２）、ｂ）、ｂ２）は、連続工程で行われ得る。例えば過ヨウ素酸アルカリ金属塩や水素化ホウ素アルカリ金属塩などの試薬をイズロン酸２−スルファターゼの流れに加えることによって、反応は連続方式で実施され得る。連続工程は、例えばマルチポンプＨＰＬＣシステムにおいて行われ得る。
【０１０４】
従って、本明細書に開示される方法は、改善された特性を有する修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供する。イズロン酸２−スルファターゼポリペプチド鎖の構造的完全性に対する最小の負の影響を伴うイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾条件が予想され、同時に、触媒活性を保持しながら８つの天然グリコシル化部位すべてにおいて、グリカンのほぼ完全な修飾を示唆する天然グリカン構造の実質的な欠如をもたらした。この方法の例示的な実施形態は、図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに示す。
【０１０５】
関連する態様において、イズロン酸２−スルファターゼを作製する方法を提供し、前記方法は：
哺乳動物、植物または酵母細胞において前記イズロン酸２−スルファターゼを発現させ、それによって、グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼを提供し；そして、
前記グリコシル化イズロン酸２−スルファターゼのグリカン認識受容体のエピトープを修飾し、それによって、前記グリカン認識受容体に関してイズロン酸２−スルファターゼの活性を低減すること、
を含む。細胞株の一例がＣＨＯ細胞株である。
【０１０６】
一実施形態において、前記修飾は、過ヨウ素酸アルカリ金属塩および水素化ホウ素アルカリ金属塩を用いた連続反応によって行われる。前記方法の他の実施形態は先に開示されている。
一態様において、本明細書中に開示された方法のいずれか１つによって獲得可能な修飾イズロン酸２−スルファターゼが提供される。
一態様において、治療法に使用するために、本明細書中に開示された方法のいずれか１つによって獲得可能な修飾イズロン酸２−スルファターゼが提供される。
【０１０７】
一態様において、リソソーム蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ；ハンター症候群）の治療に使用するための、本明細書中に開示された方法のいずれか１つによって獲得可能な修飾イズロン酸２−スルファターゼが提供される。
【０１０８】
一態様において、哺乳動物の脳における、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ；ハンター症候群）を治療するために血液脳関門を通過する、修飾のイズロン酸２−スルファターゼの薬物製造における使用が提供されるものであって、前記修飾は、酵素を過ヨウ素酸アルカリ金属塩および水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することによって化学的に修飾されたグリカン部分を有することを含み、それによって、前記イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を維持する一方、グリカン認識受容体、例えばマンノースおよびマンノース−６−リン酸細胞送達系に対するイズロン酸２−スルファターゼの活性を減少させる。一態様において、影響を受けた内臓における、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ；ハンター症候群）を治療するための、哺乳動物の影響を受けた内臓への高い分布のために、修飾のイズロン酸２−スルファターゼの薬物製造における使用が提供されるものであって、前記修飾は、酵素を過ヨウ素酸アルカリ金属塩および水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することによって化学的に修飾されたグリカン部分を有することを含み、それによって、前記イズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を維持する一方、グリカン認識受容体、例えばマンノースおよびマンノース−６−リン酸細胞送達系に対するイズロン酸２−スルファターゼの活性を減少させる。
【０１０９】
一態様において、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ；ハンター症候群）に罹患した哺乳動物を治療する方法が提供され、該方法は、哺乳動物に、治療上有効量の修飾イズロン酸２−スルファターゼを投与することを含み、前記修飾イズロン酸２−スルファターゼは、以下：
ａ）本明細書の態様および実施形態に記載の修飾イズロン酸２−スルファターゼ；そして、
ｂ）本明細書の態様および実施形態に記載のイズロン酸２−スルファターゼ組成物、
から選択される。
【０１１０】
その１つの実施形態において、前記治療が、３５日間の期間にわたり、５用量の修飾イズロン酸２−スルファターゼの投与後に、哺乳動物の脳からの少なくとも約５０％のリソソーム蓄積のクリアランスをもたらす。
【０１１１】
実施例
以下の実施例は、本開示による修飾イズロン酸２−スルファターゼポリペプチドの開発を開示する。
別段の記述のない限り、以下の実施例に使用する組換えイズロン酸２−スルファターゼは、医薬品Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）であった。Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）は、薬局（Apoteket farmaci, Sweden）から購入し、製造者の仕様書どおりに保存し、そして、無菌条件下で治療した。
【０１１２】
実施例１：
既知の方法によるイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾
【０１１３】
材料と方法
ＷＯ２００８／１０９６７７による化学修飾：グリカン部分を修飾するために、イズロン酸２−スルファターゼ（配列番号１）を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、０℃で６．５時間、２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムとともに最初にインキュベートした。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止（ｑｕｅｎｃｈ）した。クエンチングを０℃で１５分間進行させた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対して４℃で一晩透析をおこなった。透析後、反応混合物に１００ｍＭの最終濃度で水素化ホウ素ナトリウムを添加して還元をおこなった。還元反応を一晩進行させた。最後に、酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対して透析した。全てのインキュベーションは暗所でおこなった。
【０１１４】
実施例２：
既知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの分析
【０１１５】
材料と方法
実施例１に記載の公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを、以下の分析にかけた。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：５μｇのイズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼをＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上の各ウェルに充填した。シーブルー２プラスマーカーを使用し、ゲルをインスタントブルー（Ｃ．Ｂ．Ｓサイエンティフィック）で着色した。
【０１１７】
酵素活性：実施例１に記載の公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を、基質４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ−スルファートと共にイズロン酸２−スルファターゼの調製物をインキュベートすることによって評価した。反応混合物中の基質の濃度は５０μＭであり、そして、アッセイ緩衝液は５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ、０．０２５％のＡｎａｐｏｅ Ｘ−１００、１．５ｍＭのアジ化ナトリウム、ｐＨ５であった。インキュベーション後に、更なる脱硫酸化を、０．４Ｍのリン酸ナトリウム、０．２ＭのシトラートｐＨ４．５を含むストップ緩衝液の添加によって阻害した。イズロン酸２−スルファターゼ（アッセイ濃度０．８３μｇ／ｍＬ）を伴った第二の２４時間のインキュベーションを行って、生成物（４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ）を加水分解し、４−メチルウンベリフェロンを放出させ、そしてそれを、０．５Ｍの炭酸ナトリウム、０．０２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ１０．７を用いて反応を停止させた後に、４６０ｎｍの蛍光によって観察した。
【０１１８】
トリプシン断片のＬＣ／ＭＳによるグリカン分析：グリコシル化パターンを、製造された様々なイズロン酸−２−スルファターゼバッチについて測定した。イズロン酸−２−スルファターゼを還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。タンパク質の還元は、７０℃で１時間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中の５μＬのＤＴＴ １０ｍＭ中でインキュベーションした。その後のアルキル化を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド５μＬを用いて室温（ＲＴ）および暗所で４５分間おこなった。最後に、トリプシン消化を、３０μＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８、および５０ｍＭ酢酸中の０．２μｇ／μＬトリプシン（プロテアーゼ：タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ））の添加によって実施した。消化は３７℃で一晩おこなった。
【０１１９】
潜在的Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ（ｘ）（ｘは、配列番号１に規定されるイズロン酸−２−スルファターゼアミノ酸（ａａ）配列のアスパラギンの位置を指す）を含むトリプシン消化したイズロン酸−２−スルファターゼの７つのペプチド断片は：
Ｎ（６）ペプチド、ａａ１〜２３、２５００．３０Ｄａ、
Ｎ（９０）ペプチド、ａａ８６〜９９、１６０７．８１Ｄａ、
Ｎ（１１９）ペプチド、ａａ１１１〜１３９、３３０１．４７Ｄａ、
Ｎ（２２１）ペプチド、ａａ２１６〜２４６、３５０４．７６Ｄａ、
Ｎ（２５５）ペプチド、ａａ２４９〜２６９、２３５６．２１Ｄａ、
Ｎ（３００）ペプチド、ａａ２８９〜３２２、３６７８．８３Ｄａ、
Ｎ（４８８）およびＮ（５１２）ペプチド、ａａ４７４〜５２５、５９８０．７０Ｄａ、
であった。
それぞれのペプチド断片の分子量を示す。
【０１２０】
可能性のあるグリコシル化変異体の調査において、Ｎ（９０）トリプシンペプチド断片を、さらなる糖ペプチド分析のために選択した。分析は、液体クロマトグラフィーに続き、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５１０四極子飛行時間型質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ、Agilent Technologies）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを用いた質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によっておこなった。いずれのシステムもＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによって制御した。Ｗａｔｅｒｓ ＸＳＥＬＥＣＴ ＣＳＨ １３０ Ｃ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ）を用いてＬＣ分離を行い、カラム温度を４０℃に設定した。移動相Ａは、５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸、および０．０２％ＴＦＡから成り、移動相Ｂは、９５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸および０．０２％ＴＦＡからなる。０％〜１０％Ｂの勾配で１０分間、次いで１０％〜７０％Ｂでさらに２５分間、０．２ｍＬ／分の流速で使用した。注入量は１０μＬであった。Ｑ−ＴＯＦ ＭＳは、正のエレクトロスプレーイオンモードで操作した。データ取得の過程で、フラグメンター電圧、スキマー電圧、およびオクトポールＲＦはそれぞれ９０、６５および６５０Ｖに設定した。質量範囲は３００〜２８００ｍ／ｚであった。
【０１２１】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって明らかなとおり、モノマーイズロン酸２−スルファターゼのそれと異なったサイズの２種類の主要なペプチドが、化学修飾の結果として形成された（図２Ａ、レーン３）。Ａと称した第一のペプチドは、モノマーイズロン酸２−スルファターゼのサイズのおよそ２倍であるので、大部分がたぶん共有結合した二量体を表すのに対して、Ｂと称した第二のペプチドは、イズロン酸２−スルファターゼより小さいおよそ〜５ｋＤａであるので、ペプチド切断産物を表す。モノマーを表す、主たるペプチドバンドは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼと比較して、公知の方法を使用して修飾したイズロン酸２−スルファターゼでは小さく、化学修飾手順による分子量の低下を暗示している（図２Ａ、レーン３対レーン２）。グリカン部分内での結合切断により、イズロン酸２−スルファターゼの分子量は、修飾後にいくらか減少した。
【０１２２】
化学修飾の前後に、選択したＮ（９０）トリプシンペプチド断片に対して、グリカン分析をおこなった。化学修飾前には、シアリル化およびフコシル化複合オリゴ糖がこのアスパラギンにおいて見られた。化学修飾後には、天然のグリカン構造はこの位置に存在しなかった（図３）。
【０１２３】
公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの活性は、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの５０％未満であった（結果未掲載）。
【０１２４】
実施例３：
イズロン酸２−スルファターゼの化学修飾のための新規方法
【０１２５】
材料と方法
化学修飾前に、イズロン酸２−スルファターゼをＥｌａｐｒａｓｅ（登録商標）医薬品緩衝液で０．５８ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１２６】
新規方法１による化学修飾：イズロン酸２−スルファターゼを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、１５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムで０℃にて１時間インキュベートした。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。クエンチングを６℃にて１５分間進行させた。その後、反応混合物に水素化ホウ素ナトリウムを３５ｍＭの最終濃度まで添加し、そして、４℃にて１．５時間進行させた。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。化学修飾のための新規方法１を図１Ｂに示す。
【０１２７】
新規方法２による化学修飾：イズロン酸２−スルファターゼを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中にて、１５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて０．５時間インキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度９６ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。０℃にて１５分間クエンチングを進行させた。その後、反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が３８ｍＭになるまで加え、得られた混合物を０℃にて０．５時間保持した。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。化学修飾のための新規方法２を図１Ｃに示す。
【０１２８】
新規方法３による化学修飾：イズロン酸２−スルファターゼを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中にて、１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて０．５時間インキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度９６ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。０℃にて１５分間クエンチングを進行させた。その後、反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が１５ｍＭになるまで加え、得られた混合物を０℃にて０．５時間保持した。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。化学修飾のための新規方法３を図１Ｄに示す。
【０１２９】
新規方法４による化学修飾：反応条件は、新規方法２について記載したとおりのものであったが、過ヨウ素酸酸化を０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリンの存在下でおこなったというただ一つの例外を伴った。
【０１３０】
結果
既に本明細書の他の部分で説明したように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、炭水化物のｃｉｓ−グリコール基をアルデヒド基に変換する酸化剤であるのに対し、水素化ホウ素塩は、アルデヒドをより不活性なアルコールに還元する還元剤である。従って、炭水化物構造は不可逆的に破壊される。
【０１３１】
グリカンの化学修飾の改良方法を提供するために、特に改善された特性を有する修飾イズロン酸２−スルファターゼを提供する手順を提供するために、様々な反応条件が評価された。メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化と水素化ホウ素ナトリウムによる還元の両方が、触媒活性および免疫原性傾向に悪影響を与える特性の、ポリペプチドの修飾および凝集を導入したと結論付けることができた。
【０１３２】
改善された化学修飾手順についての条件を発見した。驚いたことに、これらの条件は、エチレングリコールクエンチングステップの直後に還元ステップができる、緩衝液交換の省略、およびイズロン酸２−スルファターゼの反応性アルデヒド中間体への長時間暴露といったことを容易にした。新規化学修飾手順を、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄに示す。
【０１３３】
実施例４：
新規方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの分析
【０１３４】
材料と方法
実施例３の新規方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを、以下の分析にかけた。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：公知の方法（実施例１）、ならびに新規方法１、２、３および４（実施例３）に従って修飾した２μｇのイズロン酸２−スルファターゼを、実施例２の説明に従って別個のそれぞれのウェルに添加した。
トリプシン断片のＬＣ／ＭＳによるグリカン分析：グリカン分析を、実施例２に記載のとおりおこなった。
酵素活性：活性を、実施例２に記載の手順に従って測定した。
【０１３６】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：新規化学修飾方法１、３〜４（図２Ｂ、レーン４、６、および７）は、未修飾完全長イズロン酸２−スルファターゼのものと同一のサイズの単一ペプチドをもたらした。しかしながら、新規方法２（図２Ｂ、レーン５）はまた、図２ＢでＡと称したバンドに相当するペプチドももたらした。しかしながら、公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼと比較して、新規方法２は、少量の望ましくない共有結合による二量体化をもたらした。従って、公知の方法で修飾されたイズロン酸２−スルファターゼについて明らかであるモノマーサイズの減少は、新規方法１〜４のいずれに関しても観察されなかった。加えて、新規方法で調製したイズロン酸２−スルファターゼポリペプチドにおける鎖切断は、観察できないか、または実施例１に従って調製したイズロン酸２−スルファターゼにおける鎖切断出現と比較して、非常に限定的であった。重要なことに、活性部位を保護するリガンド（新規方法４のヘパリン）の使用は、手順に適合し、リガンドが省略された場合がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって区別可能である修飾イズロン酸２−スルファターゼをもたらした（新規方法８）。
【０１３７】
結論として、修飾方法によって製造される薬物の工程に関連した不純物、品質の制限および安全性は、既知の方法と比較して、新規方法によって顕著に低減される。
トリプシン断片のＬＣ／ＭＳによるグリカン分析：選択されたＮ（９０）トリプシンペプチド断片のグリカン分析は、化学修飾後にこの位置に天然のグリカン構造が存在しないことを示し、グリカン修飾の完了または完了に近いことを暗示した（図３）。
酵素活性：新規方法１、２、３、および４に従って調製したイズロン酸２−スルファターゼは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれに匹敵する活性を示した（図４）。
【０１３８】
実施例５：
インビトロにおける受容体媒介エンドサイトーシス
【０１３９】
材料と方法
イズロン酸２−スルファターゼおよび新規方法１に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼのエンドサイトーシスを、Ｍ６Ｐ受容体を発現するヒト初代線維芽細胞において評価した。繊維芽細胞を、イズロン酸２−スルファターゼ（２、０．５、および０．１２μｇ／ｍＬ）、新規方法１に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼ（４、１、および０．２５μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートした。細胞を、ＤＭＥＭで二度洗浄し、０．９％のＮａＣｌで一度洗浄し、その後、１００μＬの１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００を使用して細胞溶解した。溶解物のイズロン酸２−スルファターゼタンパク質含量を、実施例６に記載の電気化学発光免疫測定法を使用して測定した。
【０１４０】
結果
エンドサイトーシスアッセイで評価された全ての調製物について、細胞ホモジネート中でイズロン酸２−スルファターゼ活性を検出することができた。新規方法１によって調製された修飾イズロン酸２−スルファターゼは、未修飾組換えイズロン酸２−スルファターゼで得られたものの２５％未満の細胞ホモジネートにおけるタンパク質濃度を有した（図５）。スルファミダーゼとともに最初にロードされ、次いでイズロン酸２−スルファターゼの非存在下で２日間増殖された細胞に保持されたタンパク質濃度は、化学修飾がリソソームの安定性に悪影響を及ぼさないことを示す全ての調製物と同等であった。
【０１４１】
従って、化学修飾により、Ｍ６ＰＲとしてのグリカン認識受容体に対するエピトープの除去の結果、イズロン酸２−スルファターゼの細胞への取り込みが起こりにくくなると結論付けることができる。巨視的レベルでは、この分子相互作用の喪失は、静脈内投与された場合に、血漿からのクリアランスの減少につながる。タンパク質クリアランスの減少は、患者への投与頻度を低減することが可能となる。
【０１４２】
実施例６：
新規方法２および３によって修飾したイズロン酸２−スルファターゼのインビボでの血清クリアランス
【０１４３】
材料と方法
未修飾および実施例３の新規方法２および３に従って修飾した修飾した、組換えイズロン酸２−スルファターゼの血清クリアランス（ＣＬ）を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）において調査した。マウスには、尾静脈に単回静脈内投与した。新規方法２に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを、１ｍｇ／ｋｇの用量にて未修飾イズロン酸２−スルファターゼと一緒に試験した。両方の酵素を０．２ｍｇ／ｍＬで処方し、そして、５ｍＬ／ｋｇにて投与した。新規方法３に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを、３ｍｇ／ｋｇの用量にて未修飾イズロン酸２−スルファターゼと一緒に試験した。両方の酵素を０．６ｍｇ／ｍＬで処方し、そして、５ｍＬ／ｋｇにて投与した。投与後２４時間までの異なる時点（時間点あたり３匹のマウス）で、血液サンプルを採取した。イズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼの血清レベルをＥＣＬによって分析した。血清クリアランスは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３（非コンパートメント分析、Phoenix, Pharsight Corp., USA）を用いて計算した。
【０１４４】
電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセによるイズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼの定量：血清ＰＫサンプル中のイズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いたＥＣＬイムノアッセにより決定した。９６ウェルストレプトアビジン金プレート（＃Ｌ１５ＳＡ−１、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ））のウェルを、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎでブロッキングし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、そして、ビオチン化、アフィニティー精製ヤギ−ａ−ヒトイズロン酸２−スルファターゼポリクローナル抗体（ＢＡＦ２４４９、R&D）と共にインキュベートし、洗浄後に、サンプル希釈剤（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＣ５７ＢＬ６血清プール中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎ）中の標準およびＰＫサンプルの様々な希釈物を、プレート内で７００ｒｐｍの振盪、ＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、イズロン酸２−スルファターゼ特異的Ｒｕｔｅｎｉｕｍ（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ、ＭＳＤ）タグ付与ヤギポリクローナル抗体（ＡＦ２４４９、R&D）を加え、捕捉されているイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼに結合させた。プレートを洗浄し、そして、２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ）を加えた。プレート内容物を、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ２４００ Ｉｍａｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して分析した。該器具は、プレート電極に電位をかけ、形成された免疫複合体を介して電極面に結合したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識を発光させる。器具は、サンプル中のイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼの量に比例する発光強度を計測する。イズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼの量を、関連するイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼ標準に対して決定した。
【０１４５】
結果
方法２による修飾イズロン酸２−スルファターゼのマウスにおける血清クリアランスは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼと比較して四分の一に低下した（下記表１および図６参照）。それに対し、方法３に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼに関して、それは１．７分の一に低下した。従って、両方の方法は、イズロン酸２−スルファターゼの血清半減期のロバストの延長をもたらした。これはおそらく、少なくとも部分的に、イズロン酸２−スルファターゼ化学修飾後の末梢組織における受容体媒介性取り込み阻害によるものであろう。
【０１４６】
【表１】
2018534917.tif 000003
【０１４７】
実施例７：
生きた動物の脳におけるグルコサミノグリカン蓄積に対する修飾イズロン酸２−スルファターゼの効果
【０１４８】
ＭＰＳ−ＩＩに関連した神経系合併症の治療に対する、実施例４に記載の新規方法に従って製造したイズロン酸２−スルファターゼの有用性を、Assunta-Polito et al, Hum Mol Genet. 19:4871-4885 (2010)に記載のものと類似した様式で疾患マウスモデルにおいて評価する。このマウスは、イズロン酸２−スルファターゼを欠いているので、ヒト患者と同様の細胞および病理学的表現型を示す。
【０１４９】
修飾イズロン酸２−スルファターゼを、例えば１カ月間にわたり一日おきに、ｉ．ｖ．投与した。修飾２−スルファターゼの有効性の最も重要な目安は、マウスの脳内のグルコサミノグリカンレベルである。
【０１５０】
実施例８：
既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造解析
【０１５１】
既知の方法による化学修飾の最終生成物を特徴づけするために、別のスルファターゼ、すなわち、スルファミダーゼ（配列番号２）を公知の方法によって化学修飾し、そして、特徴づけした。スルファミダーゼは、その糖ペプチドの特徴のため、化学修飾後の正確な生成物同定のための好適なモデルタンパク質である。
【０１５２】
材料と方法
既知の方法による化学修飾：既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾は、実施例１に記載したように実施した。
【０１５３】
グリコシル化分析：未修飾および様々な修飾スルファミダーゼバッチについてグリコシル化パターンを決定した。糖ペプチド分析の前に、スルファミダーゼ（約１０μｇ）を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。タンパク質の還元は、７０℃で１時間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中の５μＬのＤＴＴ １０ｍＭ中でインキュベーションした。その後のアルキル化を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド５μＬを用いて室温（ＲＴ）及び暗所で４５分間行った。最後に、トリプシン消化を、３０μＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８、及び５０ｍＭ酢酸中の０．２μｇ／μＬトリプシン（プロテアーゼ：タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ））の添加によって実施した。消化は３７℃で一晩行った。
【０１５４】
トリプシン消化スルファミダーゼの５つのペプチド断片は潜在的なＮ−グリコシル化部位を含んでいた。潜在的なグリコシル化部位Ｎ（ｘ）（式中、ｘは配列番号１で定義されたスルファミダーゼアミノ酸配列中のアスパラギンの位置を示す）を含むこれらのペプチド断片は：
【０１５５】
Ｎ（２１）含有断片（配列番号２の残基４〜３５、３２６９．６３Ｄａ）、
Ｎ（１２２）含有断片（配列番号２の残基１０５〜１３０、２９１０．３８Ｄａ）、
Ｎ（１３１）含有断片（配列番号２の残基１３１〜１３４、５０２．２９Ｄａ）、
Ｎ（２４４）含有断片（配列番号２の残基２３９〜２６２、２５０４．２５Ｄａ）、
Ｎ（３９３）含有断片（配列番号２の残基３７４〜３９４、２５４２．２２Ｄａ）
である。
【０１５６】
各ペプチド断片の分子量を示す。
【０１５７】
５つのトリプシンペプチド断片の可能なグリコシル化変異体を、糖ペプチド分析によって調べた。これは、液体クロマトグラフィーに続き、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５１０四極子飛行時間型質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを用いた質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって行った。いずれのシステムもＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによって制御した。Ｗａｔｅｒｓ ＸＳＥＬＥＣＴ ＣＳＨ １３０ Ｃ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ）を用いてＬＣ分離を行い、カラム温度を４０℃に設定した。移動相Ａは、５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸、及び０．０２％ＴＦＡから成り、移動相Ｂは、９５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸及び０．０２％ＴＦＡからなる。０％〜１０％Ｂの勾配で１０分間、次いで１０％〜７０％Ｂでさらに２５分間、０．２ｍＬ／分の流速で使用した。注入量は１０μＬであった。Ｑ−ＴＯＦは、正のエレクトロスプレーイオンモードで操作した。データ取得の過程で、フラグメンター電圧、スキマー電圧、及びオクトポールＲＦはそれぞれ９０、６５及び６５０Ｖに設定した。質量範囲は３００〜２８００ｍ／ｚであった。
【０１５８】
Ｎグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片上のグリカン部分の得られた修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０１５９】
結果
グリコシル化分析：化学修飾前の４つのグリコシル化部位に見出されるグリコシル化のタイプは、主にＮ（２１）及びＮ（３９３）上では複合型グリカン、及び、Ｎ（１３１）及びＮ（２４４）上ではオリゴマンノース型グリカンであった。
【０１６０】
化学修飾の後、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチド上に対し、修飾されたグリカン構造の詳細な特徴付けを実施した（化学的に修飾した後のグリカンの不均一性が増加した結果、有意な感度の低下が理由でグリカンは検出されなかった）。この実施例では、既知の方法による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾が調べられる。
【０１６１】
グリカンの過ヨウ素酸塩処理は、炭水化物部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合を切断し、グリカン鎖の分子量を変化させる。図８Ａは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断の例を示す。図８Ｂは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こりうる理論的な結合切断を示すＭａｎ−６グリカンのモデルを示す。
【０１６２】
既知の方法による化学修飾の前後に、Ｎ（１３１）に結合したＭａｎ−６グリカンを有するトリプシンペプチドＮＩＴＲ（Ｔ１３＋Ｍａｎ−６グリカン）を、質量スペクトルによって分析した（結果未掲載）。様々な程度の結合切断を有する化学修飾された糖ペプチドに対応するイオンが同定された。Ｍａｎ−６グリカンについては、理論的には、最大で３個の二重結合切断及び１個の単結合切断があり得る。修飾が既知の方法に従って行われた場合、質量スペクトルにおいて最も強いイオンシグナルは、２重結合切断及び２個の単結合切断に対応し、一方で２番目に強いイオンシグナルは３個の二重結合切断及び１個の単結合切断に相当することが見出され、それらは、最も可能性のある広範囲な結合切断である。既知の方法に従って化学修飾後のＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに見られる結合決断の程度を可視化する図を図９に示す（観察されたイオンからの同位体分布により、結果は近似的であるが比較可能である）。化学修飾の再現性は、以前に知られている方法に従って製造された化学的に修飾されたスルファミダーゼの３つの異なるバッチを用いて試験された。異なる程度の結合切断に対応するイオンは、３つの異なるバッチからのＭＳスペクトルにおいて非常に類似した分布を示した。
【０１６３】
実施例９：
新規方法１、２及び３によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造の分析
【０１６４】
材料と方法
以下の新規方法に従って、スルファミダーゼ、別のスルファターゼを化学修飾した。
【０１６５】
新規方法１：Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Icosagen AS）で産生したスルファミダーゼを、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液中にて、２０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃で１２０分間暗所にてインキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が５０ｍＭになるまで６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で１２０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過を行った。
【０１６６】
新規方法２：スルファミダーゼを、初期のｐＨが４．５〜５．７の酢酸塩緩衝液中、０℃、暗所で１８０分間、メタ過ヨウ素酸ナトリウム１０ｍＭと共にインキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を反応停止した。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。
【０１６７】
新規方法３：実施例１に記載の安定細胞株で産生されたスルファミダーゼを、初期ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中、暗所で８℃にて、１０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共に６０分間インキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を反応停止した。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。
【０１６８】
グリコシル化分析：グリコシル化分析は、実施例８に記載のＬＣ−ＭＳ法に従って実施した。Ｎグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）およびＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片のグリカン変異体上の得られる修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０１６９】
結果
グリコシル化分析：新規方法１、２および３に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼ上の修飾されたグリカンプロフィールの詳細な特徴付けを、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチドに対して実施した。この実施例では、新規方法１、２および３による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾を調べた。
【０１７０】
様々な程度の結合切断を伴う化学的に修飾された糖ペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに対応するイオンが同定された。理論的には、最大で３個の二重結合切断および１個の単結合切断が存在し得る（図８Ｂ参照、Ｍａｎ−６グリカンのモデルは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こり得る結合切断を示す）。修飾を新規方法１に従っておこなった場合、質量スペクトル（未掲載）における最も強いイオンシグナルは、１つの二重結合切断および３つの単結合切断に対応することが見出され、２番目に強いイオンシグナルは、２つの二重結合切断および２つの単結合が切断に対応することが見出された。新規方法２および３に従って修飾をおこなった場合、Ｍａｎ−６グリカンの結合切断は、さらに優先的に単結合切断へとシフトした。図９Ａには、化学修飾後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断の程度を視覚化する図を示す。
【０１７１】
化学的修飾の再現性を、三連（新規方法１）または二連（新規方法２）の化学修飾スルファミダーゼを使用することによって試験した。
【０１７２】
既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾と、新規方法１、２および３に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾とを比較すると、結合切断の程度に大きな違いがあった。これは図９Ａに示されており、異なる程度の結合切断の分布が４つの方法についてプロットされている（観察されたイオンからの同位体分布のため、結果は近似的であるが比較可能である）。
【０１７３】
図９Ｂは、使用された方法に対する単結合切断の相対的存在量を示す。既知の方法は、調べられたＭａｎ−６グリカン中に４５％の単結合切断を有する修飾スルファミダーゼを提供するが、新規方法１、２および３は、化学修飾後にそれぞれ７０、８０および８２％を有する。
【０１７４】
続いて、本明細書中に記載したよりマイルドな化学修飾方法は、修飾グリカン内の二重結合切断が顕著に少ない生成物を提供する。
【０１７５】
実施例１０：
既知の方法によるイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾後のグリカン構造解析
【０１７６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から明らかなとおり（図２Ａ）、既知の方法による化学修飾は、イズロン酸２−スルファターゼの分子量の低下をもたらした。既知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを特徴づけるために、グリコシル化分析を、実施例８に記載の方法に従っておこなう。
【０１７７】
材料と方法
公知の方法による化学修飾：公知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾を、実施例１に記載のとおりおこなう。
グリコシル化分析：グリコシル化分析を、実施例２および８に記載のＬＣ−ＭＳ法に従っておこなう。
【０１７８】
結果
公知の方法によるイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾は、修飾スルファミダーゼの糖ペプチドにおける結合切断の程度に類似した修飾糖ペプチドの結合切断の程度をもたらすと予想される（実施例８参照）。従って、公知の方法は、グリカン部分における二重結合切断を主に生じ、そしてそれで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ、レーン２対３）で観察された分子量の低下が説明できると予想する。
【０１７９】
実施例１１：
新規方法１、２、および３によるイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾後のグリカン構造解析
【０１８０】
材料と方法
実施例３に記載の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼを、グリコシル化分析にかける。
グリコシル化分析：グリコシル化分析を、実施例１０に記載のＬＣ−ＭＳ法に従っておこなう。
【０１８１】
結果
本明細書中に記載した化学修飾の新規方法は、修飾グリカンにおいて二重結合切断が顕著に少ない生成物を提供し、そしてそれはまた、別の方法によって製造されたイズロン酸２−スルファターゼの分子量の差にも反映される（図２Ｂ）。
【０１８２】
実施例１２
活性部位保護リガンドの存在下でのイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾
【０１８３】
実施例３新規方法６に記載のとおり、酸化（ステップａ）をリガンドの存在下で実施し得る。リガンドは、４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ−スルファートによって例示されるような基質であってもよい。あるいは、スルファートなどのイズロン酸２−スルファターゼのその他の公知のリガンドを使用してもよい。任意の起源のヘパリンまたはヘパリンスルファートもまた、１以上の反応ステップを通じた添加剤として使用されてもよい。
【０１８４】
実施例１３：
ゲルマトリックス上に固定したイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾
【０１８５】
本明細書中に記載した修飾方法、特に実施例３の新規方法１〜６を、イズロン酸２−スルファターゼをゲルマトリックスに固定しながらおこなった。ＰＯＲＯＳＲ ＸＱ Ｓｔｒｏｎｇ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅカラムを使用することによって、イズロン酸２−スルファターゼを、７．５のｐＨを有するリン酸ナトリウム緩衝液を使用したカラムに添加することによって固定した。
【０１８６】
イズロン酸２−スルファターゼの添加に続いて、カラムを、連続方式で、ステップａ）の溶液で平衡化し、ステップａ）のクエンチング、ステップｂ）、およびステップｂ）のクエンチングをおこなう。１００ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．６のｐＨを有する緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって、化学修飾イズロン酸２−スルファターゼの溶出をおこなう。
【０１８７】
実施例１４
連続工程によるイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾
本明細書中に記載した修飾方法、特に実施例３の新規方法１〜６、を連続方式でおこなう。例えば、ＨＰＬＣポンプまたは同様の装置を利用することにより、連続した流れを利用することによって、イズロン酸２−スルファターゼの溶液は配管に通して輸送する。配管は、任意の不活性物質、例えばエチレンテトラフルオロエチレンまたはポリテトラフルオロエチレンでできていてもよい。流速および配管の内径を調整することによって、システム内の輸送スピードを正確に調整する。規定した位置に入口を設けることによって、化学修飾の試薬の原液を連続方式で加える。これは、マルチポンプＨＰＬＣシステム、例えば、Ａｋｔａ ａｖａｎｔ（GE Healthcare）により達成できる。各入口地点に、ほとんどのマルチポンプＨＰＬＣシステムに存在しているものと同様の低容積の混合室を追加した。
【０１８８】
新規方法１〜６の具体的な連続方式の例では、試薬は、イズロン酸２−スルファターゼ溶液の流速の約１０％の流速にて入口（弁）で添加される。試薬の原液は、実施例３の新規方法１〜６について説明されているより１０倍高い濃度にて調製される。
【０１８９】
実施例１６：
イズロン酸２−スルファターゼ欠乏マウスにおける脳への修飾イズロン酸２−スルファターゼの分布
【０１９０】
材料と方法
実施例３の新規方法２に従って製造し、静脈内（ｉｖ）に投与された修飾イズロン酸２−スルファターゼのインビボにおける脳への分布を調査した。
【０１９１】
試験物調製：
修飾イズロン酸２−スルファターゼを、２ｍｇ／ｍＬにて処方し、濾過滅菌し、そして、使用するまで−７０℃にて冷凍した。
【０１９２】
動物：
雄マウス、ＩＤＳ−ＫＯ（Ｂ６Ｎ．Ｃｇ−Ｉｄｓｔｍ１Ｍｕｅｎ／Ｊ）（Jackson Laboratories, ME, USA）を使用した。動物を、２３±１℃および４０〜６０％の湿度にてケージ内に単独で収容し、水および標準的な飼料を自由摂取させた。１２／１２時間の光／暗サイクルに設定し、午後７時に点灯した。動物を、試験開始の少なくとも２週間前に馴化した。マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの修飾イズロン酸２−スルファターゼを尾静脈に静脈内投与した。最後の注射の２４時間後に、試験を完了した。マウスを、イソフルランで麻酔した。血液を、後眼窩静脈叢放血から採血した。潅流の後に、心臓の左心室を通した２０ｍＬの生理的食塩水のフラッシュが続いた。脳を、摘出し、計量し、そして、液体窒素中で急速に冷凍した。脳ホモジネートを調製し、そして、プロトコールに対する調整として１０ｍＭの酢酸鉛の添加を伴った実施例２に記載の方法を使用して、活性を評価した。
【０１９３】
結果：
ＩＤＳ−ＫＯマウスの灌流脳ホモジネート中の修飾イズロン酸２−スルファターゼの活性を、確認できた。１．８±０．４μＭ／分（ｎ＝４）の平均活性を、使用したアッセイ条件下で測定した。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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