(57)【要約】  細胞を同時に固定および染色する方法の一例において、該細胞は、最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を含む溶液中でインキュベートされ、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である。前記インキュベートした細胞は、紫外（ＵＶ）光に曝露される。該細胞は、ＵＶ光曝露後に、該溶液中でインキュベートし続けることが許容される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくはインビトロにおいて、細胞を同時に固定および染色する方法であって：
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で前記細胞をインキュベートし、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベートした前記細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に前記溶液中で前記細胞をインキュベートし続けること、
を含む方法。
【請求項２】
前記溶液は、培地中にＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含し；該溶液中のＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体の濃度は、約９０μＭ〜約４００μＭの範囲に及ぶ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液中で前記細胞をインキュベートする前に、前記細胞を培養することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最初に、約１０分〜約３時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ１）にわたり、前記細胞をインキュベートし；
約５分〜約１０分の範囲に及ぶ時間（Ｔ２）にわたり、インキュベートした前記細胞をＵＶ光に曝露し；
約１時間〜約２時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ３）にわたり、前記細胞をインキュベートし続けること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
約１分〜約５分の範囲に及ぶ時間（Ｔ４）にわたり、インキュベートした前記細胞を、追加のＵＶ光に曝露することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＨＡ配位子は、ピラジンヒドロキシメート、キノキサリンヒドロキシメート、キナルジンヒドロキシメート、およびその組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、以下の：
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キノキサリンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；または、
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キナルジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン、
のうちの１つであり、前記Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
前記対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、メタラクラウン錯体の混合物を含み；
前記メタラクラウン混合物中の各種は、［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）x（キノキサリンヒドロキシメート）y（ピリジン）8］対イオン｛式中、ｘ＋ｙ＝１６であり、ここで、好ましくは、ｘは８〜１３の範囲に及び、かつ、ｙは３〜８の範囲に及び；
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
前記対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される｝である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記培地は血清添加培地である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＶ光はＵＶ−Ａ光である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＵＶ光曝露は、少なくともいくつかの前記細胞の死滅を引き起こし；かつ、前記細胞をインキュベートし続けた後、前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、少なくともいくつかの死細胞の核および細胞質内に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
好ましくはインビトロにおける、光学イメージング方法であって：
以下の：
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で細胞をインキュベートし、ここで、前記ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベートした前記細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に、前記溶液中で前記細胞をインキュベートし続けること、
によって同時に固定および染色された細胞を形成し；
前記同時に固定および染色された細胞を、落射蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、およびその組み合わせから成る群から選択される光学イメージング技術に供すること、
を含む方法。
【請求項１３】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＬｎ（ＩＩＩ）を変更することによって、前記同時に固定および染色された細胞、の励起応答を調整するか；または、
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のヒドロキシメート配位子を変更することによって、前記同時に固定および染色された細胞、の発光応答を調整すること、
のいずれかをさらに含む、請求項１２に記載の光学イメージング方法。
【請求項１４】
好ましくはインビトロにおける、壊死細胞の選択的標識方法であって、前記方法が、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を含む溶液中で細胞をインキュベートすることを含み、ここで、前記ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
光学デバイス、生物分析アッセイ、および生物学的イメージングプローブは、有機フルオロフォアおよび半導体ナノ粒子などの光学特性を示す成分を利用することが多い。いくつかの所望の光学特性としては、長いルミネセンス寿命、励起バンドと発光バンドの間の大きい有効エネルギー差、ならびに可視および近赤外（ＮＩＲ）スペクトル範囲全体わたる鋭い発光バンドが挙げられる。ＮＩＲ光学イメージングには、リアルタイムイメージング試験において様々なヒト疾患の診断を著しく改善する臨床上の可能性がある。現在使用されている核酸結合性ＮＩＲ色素（例えば、有機フルオロフォア）は、一部には、低量子収率、広いバンド幅（broad bandwith）、高いエネルギー励起波長、小さいＳｔｏｋｅｓシフト、難水溶性、および低い光安定性（すなわち、フォトブリーチングの傾向）の理由で、光学イメージングに関して完全に信頼できるというわけではない。核酸結合性ＮＩＲ色素のこれらの特徴は、検出感度を制限し、そして、画像の解像度に悪影響を及ぼす可能性がある。核酸結合性ＮＩＲ色素に比べて、量子ドットがフォトブリーチングに対する良好な抵抗性および高い量子収率を有する一方で、これらのイメージング剤は、ブリンキング（すなわち、光放出時の不規則変動）に悩まされ得る上に、インビトロ適用において、毒性であり得る。
【０００２】
図面の簡単な説明
本開示に関する例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照して明らかになるであろう。ここで、同様の参照番号は、恐らく同一ではないが、同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、参照番号または先に記載した機能を有する特徴は、それらが掲載された他の図面に関連して記載されても、またはされなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】図１は、ランタニドの正規化した発光スペクトルを例示するグラフである。
【０００４】
【図２】図２は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体、それが形成されたピラジンヒドロキサム酸（Ｈ2ｐｙｚＨＡ）のＸ線結晶学的表示を例示する。
【０００５】
【図３】図３は、水中のＨ2ｐｙｚＨＡ（係数１６を乗じた）、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］およびＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］ＭＣの吸収スペクトルを例示する（１５０μＭ、室温）。
【０００６】
【図４】図４は、上にＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の、そして、下にＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］ＭＣの正規化した励起（λem（Ｎｄ3+）＝１０７０ｎｍ、λem（Ｙｂ3+）＝９８０ｎｍ）および発光（λex＝３７０ｎｍ）スペクトルを例示する（固形物または２００μＭの溶液、室温）。
【０００７】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、様々な培地中でのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および／またはヨウ化プロピジウムの光安定性を例示するグラフである。
【０００８】
【図６】図６は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に２４および４８時間インキュベートし、その後、Ａｌａｍａｒブルー中でインキュベートしたＨｅＬａ細胞の細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【０００９】
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、４５μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄し、３μＭのヨウ化プロピジウムと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図７Ａは明視野像であり；図７Ｂは、１０秒間の励起（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するフィルタ）への曝露後に得られたＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルの画像であり；図７Ｃは、１００ミリ秒間の曝露時間（λem＝６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、およびλex＝５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）後に得られたヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナルを示し；図７Ｄは、図７Ｂと７Ｃの合成を示し；図７Ｅは、図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃの合成を示す。
【００１０】
【図８】図８Ａ〜８Ｊは、４５μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間または３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートした壊死性ＨｅＬａ細胞における落射蛍光顕微鏡法によって得られたフォトブリーチング試験の結果を例示する。（上段）ＰＩ、（８Ａ）１０秒間、（８Ｂ）５０秒間、（８Ｃ）１００秒間、（８Ｄ）２００秒間、（８Ｅ）５００秒間の、５５０ｎｍバンドパスフィルタ（２５ｎｍのバンド幅）を用いた連続励起後の可視発光（λex＝５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ；λem＝６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ；曝露時間：１００ミリ秒間）。（下段）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、（８Ｆ）１０秒間、（８Ｇ）５０秒間、（８Ｈ）１００秒間、（８Ｉ）２００秒間、（８Ｊ）５００秒間の、４４７ｎｍバンドパスフィルタ（６０ｎｍのバンド幅）を用いた連続励起後にＹｂ3+から生じたＮＩＲ発光（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ；λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ；曝露時間：１０秒間）。６３×の対物レンズ。
【００１１】
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、１５０μＭＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ、５０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）を８分間照射し、さらに１時間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄し、３μＭのヨウ化プロピジウムと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図９Ａは明視野像であり；図９Ｂは、８秒間の励起（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルの画像であり；図９Ｃは、８００ミリ秒間の曝露時間（λem＝６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、およびλex＝５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）後に得られたヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナルの画像を示し；図９Ｄは、一つに合成された図９Ｂと９Ｃであり；図９Ｅは、一つに合成された図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃである。
【００１２】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、１５０μＭのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を５分間照射し、さらに１時間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄したＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図１０Ａは明視野像であり；図１０Ｂは、１２秒間の励起（λex＝３７７ｎｍ、５０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルの画像であり；そして、図１０Ｃは、図１０Ａと１０Ｂの合成を例示する。
【００１３】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いて固定したＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。標準的なＣＣＤカメラ（Orca-R2、Hamamatsu）を用いたＮＩＲ発光の検出：（Ａ）λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：３０秒間、（Ｂ）λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：９９６ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８０秒間。６３×の対物レンズ。
【００１４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、３７７ｎｍバンドパスフィルタ（５０ｎｍのバンド幅）を通して得られたＵＶ−Ａ光を５分間照射したＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。固定後に、細胞を洗浄し、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートした。（１２Ａ）明視野。（１２Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１２Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１２Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１２Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００１５】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、３７７ｎｍバンドパスフィルタ（５０ｎｍのバンド幅）を通して得られたＵＶ−Ａ光を８分間照射したＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。固定後に、細胞を洗浄し、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートした。（１３Ａ）明視野。（１３Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１３Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１３Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１３Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００１６】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｅは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、３７７ｎｍバンドパスフィルタ（５０ｎｍのバンド幅）を通して得られたＵＶ−Ａ光を１０分間照射したＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。固定後に、細胞を洗浄し、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートした。（１４Ａ）明視野。（１４Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１４Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１４Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１４Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００１７】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｅは、１５μＭの濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、ＵＶ−Ａ光を８分間照射し、それに続いて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培地で洗浄し、さらに、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。（１５Ａ）明視野。（１５Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１５Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１５Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１５Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００１８】
【図１６】図１６は、３０μＭの濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、ＵＶ−Ａ光を８分間照射し、それに続いて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培地で洗浄し、さらに、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。（１６Ａ）明視野。（１６Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１６Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１６Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１６Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００１９】
【図１７】図１７は、６０μＭの濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］用いて固定し、そして、ＵＶ−Ａ光を８分間照射し、それに続いて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培地で洗浄し、さらに、３μＭのＰＩと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞に対して実施した落射蛍光顕微鏡試験の結果を例示する。（１７Ａ）明視野。（１７Ｂ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（λex：４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：８０５ｎｍロングパスフィルタ、曝露時間：８秒間）から生じたＮＩＲシグナル。（１７Ｃ）ＰＩ（λex：５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、λem：６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ、曝露時間：８００ミリ秒間）から生じた可視シグナル。（１７Ｄ）ＰＩとＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］画像の組み合わせによって得られた合成画像。（１７Ｅ）ＰＩ、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］、および明視野像の組み合わせによって得られた合成画像。６３×の対物レンズ。
【００２０】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｅは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１２時間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で５分間洗浄し、そして、３μＭのヨウ化プロピジウムと共にインキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法（４０×の倍率）の結果を例示する。図１８Ａは明視野像であり；図１８Ｂは、８秒間の励起（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルの画像である。図１８Ｃは、８０ミリ秒間の曝露時間後に得られたヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナルであり（λem＝６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタおよびλex＝５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）；図１８Ｄは、一つに合成された図１８Ｂと１８Ｃであり；図１８Ｅは、一つに合成された図１８Ａ、１８Ｂ、および１８Ｃである。
【００２１】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を８分間照射し、それに続いて、さらに１時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡画像（６３×の倍率、２×ズーム）である（λex＝４５８ｎｍ、λem＝４９９〜７９９ｎｍ）。図１９Ａは明視野像であり；図１９Ｂは、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた可視シグナルを示し；および図１９Ｃは、一つに合成された図１９Ａと１９Ｂである。
【００２２】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＵＶ曝露有りおよびＵＶ曝露無しの、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中と、ＨｅＬａ細胞内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の、補正したおよび正規化した励起（λem＝９８０ｎｍ）ならびに発光スペクトル（λex＝３７０ｎｍ）をそれぞれ例示するグラフである。
【００２３】
図２０Ｃおよび２０Ｄは、ＵＶ曝露有りおよびＵＶ曝露無しの、Ｎ−アセチル（aceytal）システインで処理した細胞上清中と、ＨｅＬａ細胞内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の、補正および正規化した励起（λem＝９８０ｎｍ）ならびに発光スペクトル（λex＝３７０ｎｍ）をそれぞれ例示するグラフである。
【００２４】
図２０Ｅおよび２０Ｆは、ＵＶ曝露有りおよびＵＶ曝露無しの、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中と、ＨｅＬａ細胞内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の補正および正規化した励起（λem＝１０６４ｎｍ）ならびに発光スペクトル（λex＝３７０ｎｍ）をそれぞれ例示するグラフである。
【００２５】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、（ａ）生存細胞、ならびに（ｂ）ＰＦＡ、（ｃ）メタノール、および（ｄ）Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］で固定した細胞の光学像と、ＣＨバンド強度の関連したラマン分光マッピングを例示する。図２１Ｅは、ａ〜ｄ（ａ〜ｄにおいて破線によって囲まれた領域）の最大ＣＨ ラマンシグナル部分に相当する関連平均スペクトルを示す。生存細胞に対して固定細胞のチトクロームｃでは７５１ｃｍ-1のピーク強度の低下が観察される（黒色の矢印）。
【００２６】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｆは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］および３μＭのヨウ化プロピジウムと共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を５分間照射し、さらに１時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図２２Ａは、明視野像であり；図２２Ｂは、８０ミリ秒間の曝露時間（λem＝６０５ｎｍ、７０ｎｍのバンドパスフィルタおよびλex＝５５０ｎｍ、２５ｎｍのバンドパスフィルタを用いた）後に得られたヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナルであり；図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２Ｅは、それぞれ５、１０、１５、および２０分間のインキュベーション後の８秒間の励起（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナル、ならびにＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルであり（図２２Ｅでは、ＰＩからの発光およびＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］からの発光を２０分後に観察した）；そして、図２２Ｆは、一つに合成された図２２Ａと２２Ｅである。
【００２７】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を５分間照射し、さらにインキュベート１時間し、そして、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で５分間洗浄した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図２３Ａは明視野像であり；図２３Ｂは、８秒間の励起（λex＝４４７ｎｍ、６０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナルの画像を示し；そして、図２３Ｃは、合成された図２３Ａと２３Ｂである。
【００２８】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を８分間照射し、それに続いて、さらに１時間インキュベートしたＭＳＣ（間葉系幹細胞）の共焦点顕微鏡画像（６３×の倍率、２×ズーム）である（λex＝４５８ｎｍ、λem＝４９９〜７９９ｎｍ）。図２４Ａは明視野像であり；図２４Ｂは、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた可視シグナルであり；図２４Ｃは、一つに合成された図２４Ａと２４Ｂである。
【００２９】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｃは、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）と共に１５分間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄し、そして、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図２５Ａは明視野像であり；図２５Ｂは、４００ミリ秒間の励起（λex＝３７７ｎｍ、４０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナル画像であり；および図２５Ｃは、一つに合成された図２５Ａと２５Ｂである。
【００３０】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｃは、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートし、次に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）と共に３０分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図２６Ａは明視野像であり；図２６Ｂは、４００ミリ秒間の励起（λex＝３７７ｎｍ、４０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じた発光シグナル画像であり；および図２６Ｃは、一つに合成された図２６Ａと２６Ｂである。
【００３１】
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、２００μＭのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］と共に３時間インキュベートし、そして、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄したＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（６３×の倍率）である。図２７Ａは明視野像であり；図２７Ｂは、２０秒間の励起（λex＝５３６ｎｍ、４０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］から生じた発光シグナル画像であり；および図２７Ｃは、合成された図２７Ａと２７Ｂである。
【００３２】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｅは、２００μＭのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］と共に３時間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄し、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を１０分間照射し、さらに１．５時間インキュベートし、そして、３μＭのヨウ化プロピジウムと共に５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の、ＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法を使用して得られた画像（４０×の倍率）である。図２８Ａは明視野像であり；図２８Ｂは、２０秒間の励起（λex＝５３６ｎｍ、４０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）への曝露後に得られた、ＮＩＲ範囲（λem＝８０５ｎｍロングパスフィルタ）内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］から生じた発光シグナルを示し；図２８Ｃは、８０ミリ秒間の曝露時間後に得られたヨウ化プロピジウムから生じた可視シグナルを示し（λem＝６１７ｎｍバンドパスフィルタおよびλex＝５３５ｎｍ、４０ｎｍのバンド幅を有するバンドパスフィルタ）；図２８Ｄは、合成された図２８Ｂと２８Ｃであり；そして、図２８Ｅは、合成された図２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃである。
【００３３】
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、落射蛍光顕微鏡法の下でＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いて固定したＨｅＬａ細胞の画像を例示する。固定細胞の明視野像は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中、３７℃にて異なるインキュベート時間後に記録された：（２９Ａ）１時間および（２９Ｂ）１カ月。
【００３４】
表１は、室温にて、固体の状態および溶液（２００μＭ）中でのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］ＭＣの光物理的特性を例示する。
【表１】
2018530743.tif 000002
a２σ値を括弧内に示す。実験試験誤差：τ、±２％、Ｑ、±１０％。b３５５ｎｍでの励起下。c配位水分子数（ｑ）を、方程式を使用して算出した：
【化１】
2018530743.tif 000003
（μｓ単位）および
【化２】
2018530743.tif 000004
；［２７４、２７５］推定誤差±０．２。d３７０ｎｍでの励起下。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
説明
本発明は、好ましくはインビトロにおいて、細胞を同時に固定および染色する方法であって、該方法は、
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で該細胞をインキュベートし、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベートした細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に該溶液中で該細胞をインキュベートし続けること、
を含む。
【００３６】
本発明は、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体の使用を含み、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である。
【００３７】
本発明に従って使用されるメタラクラウン錯体はまた、一般式Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］｛式中、ＨＡ配位子は、ヒドロキシメート配位子である｝によっても表され得る。
【００３８】
好ましいＨＡ配位子は、以降に詳細に記載される。好ましくは、ＨＡ配位子は、ピラジンヒドロキシメートである。
【００３９】
ある実施形態によると、本発明によるメタラクラウン錯体は、以下の式：Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］によって表され得る。
【００４０】
ある実施形態によると、上記溶液は、培地中にＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含し；該溶液中のＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体の濃度は、約９０μＭ〜約４００μＭの範囲に及ぶ。
【００４１】
ある実施形態によると、本発明による方法は、該溶液中で該細胞をインキュベートする前に該細胞を培養することをさらに含む。
【００４２】
好ましくは、本発明による方法は、以下の工程：
最初に、約１０分〜約３時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ１）にわたり、細胞をインキュベートし；
約５分〜約１０分の範囲に及ぶ時間（Ｔ２）にわたり、該インキュベート細胞をＵＶ光に曝露し；
約１時間〜約２時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ３）にわたり、該細胞をインキュベートし続けること、
を含む。
【００４３】
好ましくは、本発明による方法は、約１分〜約５分の範囲に及ぶ時間（Ｔ４）にわたり、該インキュベート細胞を追加のＵＶ光に曝露することをさらに含む。
【００４４】
好ましい実施形態によると、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＨＡ配位子は、ピラジンヒドロキシメート、キノキサリンヒドロキシメート、キナルジンヒドロキシメート、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００４５】
好ましくは、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、以下の：
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キノキサリンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；または、
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キナルジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン、
のうちの１つであり、該Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
該対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される。
【００４６】
ある実施形態によると、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体はメタラクラウン錯体の混合物を含み；該メタラクラウン混合物中の各種は、［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）x（キノキサリンヒドロキシメート）y（ピリジン）8］対イオン｛式中、ｘ＋ｙ＝１６であり、ここで、好ましくは、ｘは８〜１３の範囲に及び、かつ、ｙは３〜８の範囲に及び；
該Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
該対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される｝である。
【００４７】
ある実施形態によると、上記の培地は、血清添加培地である。
【００４８】
好ましくは、ＵＶ光はＵＶ−Ａ光である。
【００４９】
好ましい実施形態によると、本発明による方法では、ＵＶ光曝露は、少なくともいくつかの細胞の死滅を引き起こし；かつ、細胞をインキュベートし続けた後、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、少なくともいくつかの死細胞の核および細胞質内に位置する。
【００５０】
本発明はまた、好ましくはインビトロにおける、光学イメージング方法であって：
以下の：
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で細胞をインキュベートし、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベート細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に、該溶液中で該細胞をインキュベートし続けること、
によって同時に固定および染色された細胞を形成し；
該同時に固定および染色された細胞を、落射蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、およびその組み合わせから成る群から選択される光学イメージング技術に供すること、
を含む方法に関する。
【００５１】
ある実施形態によると、前述の光学イメージング方法は：
Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＬｎ（ＩＩＩ）を変更することによって前記同時に固定および染色された細胞の励起応答を調整するか；または、
Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のヒドロキシメート配位子を変更することによって前記同時に固定および染色された細胞の発光応答を調整すること、
をさらに含む。
【００５２】
本発明はまた、好ましくはインビトロにおいて、壊死細胞の選択的標識方法にも関し、該方法は、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で細胞をインキュベートすることを含み、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である。
【００５３】
ある実施形態によると、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、先に規定したものである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
本明細書中に開示した例示の方法では、ランタニドベースのメタラクラウン錯体が壊死細胞にプローブとして使用される。特に、ランタニドベースのメタラクラウン錯体は、壊死細胞の核および細胞質のＮＩＲおよび／または可視染色としての効果がある。加えて、当該発明者らは、紫外（ＵＶ）光への短時間の暴露と高濃度のランタニドベースのメタラクラウン錯体の組み合わせが、光化学効果を引き起こし、そしてそれが、ホルムアルデヒドまたはメタノールを使用して得ることができる細胞固定と同様であることを見出した。本明細書中に開示した様式による死細胞の固定細胞は、死細胞の形態を維持し、その結果、該死細胞は溶解もしないし、崩壊もしない。
【００５５】
このように、本明細書中に開示した実施例において、細胞は、同時に染色および固定される。「同時に染色および固定される」とは、細胞が対比染色（counter staining）に供され、そして、同じ手順の間に固定を受けることを意味し、染色と固定の行為が、まさに同時に起こり得る。染色方法および混合方法の例は、以下でさらに詳細に考察されるであろう。
【００５６】
前述のとおり、ランタニドベースのメタラクラウン錯体は、光学イメージング剤／プローブおよび細胞固定剤として利用される。ランタニド（ＩＩＩ）金属イオン（Ｌｎ（ＩＩＩ）またはＬｎ3+）は、４ｆ軌道を持ち、独特な発光特徴を示す。しかしながら、Ｌｎ3+イオンのｆ−ｆ遷移の大部分は、低吸収率を引き起こす量子力学規則による禁則であり、非効率的な直接励起をもたらす。このように、光学イメージングにおけるランタニドシグナルの使用は一般的ではない。本明細書中に開示した例では、ランタニドベースのメタラクラウン錯体の構造は、ランタニドカチオンの最適化された増感、ならびに非放射失活に対する保護を提供するように形成中に制御され得る。
【００５７】
本明細書中に開示したランタニドベースのメタラクラウン錯体は、遷移金属と；メタラクラウン錯体中に取り込まれたときに中心イオンにエネルギーを輸送すること及び／又は配位子ベースの電荷移動状態を生じることができる四座配位子と；ランタニドイオン（Ｌｎ3+）との三成分超分子アセンブリである。四座配位子は、環化して、反復［−Ｍ−Ｎ−Ｏ］x（式中、Ｍは遷移金属イオンである）サブユニットを形成する。クラウンエーテルと同様に、メタラクラウンはあるサイズの範囲で合成されることができ、そして内側に向いたオキシム酸素原子は中心金属イオンに結合することができる。
【００５８】
前述のとおり、ランタニドベースのメタラクラウン錯体の構造は、所望の応答を達成するように制御され得る。例えば、ランタニドベースのメタラクラウン錯体の配位子を変更することによって、そのメタラクラウン錯体の励起応答が変更され得る。別の例に関しては、ランタニド金属を変更することによって、そのメタラクラウン錯体の発光応答が変更され得る。本明細書中に開示したランタニドベースのメタラクラウン錯体のランタニド金属イオンの特徴的なＮＩＲ発光（すなわち、ＮＩＲルミネセンス特性）は、ＵＶから可視域の範囲に及ぶ励起波長下で観察され得る。
【００５９】
本明細書中に開示した例では、ランタニドベースのメタラクラウン錯体は、Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体と呼ぶこともでき、ここで、Ｌｎ（ＩＩＩ）はランタニド金属イオンであり、ＴＭは遷移金属イオンであり、ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である。メタラクラウン錯体の化学式は、少なくとも１個のランタニド金属イオン、１６個の遷移金属イオン、および１６個のＨＡ配位子を含む。該１６個の遷移金属イオンと１６個のＨＡ配位子は、一緒にメタラクラウン錯体全体を形成している２つのキャッピングクラウン（すなわち［１２−ＭＣ−４］2）とカプセル化クラウン（すなわち［２４−ＭＣ−８］）に分配される。メタラクラウン用語体系を使用すると、ランタニドベースのメタラクラウン錯体は、Ｌｎ（ＩＩＩ）［１２−ＭＣ−４］2［２４−ＭＣ−８］と示すこともできる。「ＭＣ」は、遷移金属イオン（Ｍ（ＩＩ））とヒドロキシメート（ＨＡ）配位子から成る反復サブユニットを有するメタラクラウン大員環を指す。
【００６０】
Ｌｎ（ＩＩＩ）は、キャッピングクラウン［１２−ＭＣ−４］に（例えば、配位結合を介して）結合される中央イオンである。Ｌｎ3+が、任意のランタニドイオン、例えばジスプロシウム（Ｄｙ3+）、イッテルビウム（Ｙｂ3+）、ネオジム（Ｎｄ3+）、ガドリニウム（Ｇｄ3+）、テルビウム（Ｔｂ3+）、ユーロピウム（Ｅｕ3+）、エルビウム（Ｅｒ3+）、ランタン（Ｌａ3+）、セリウム（Ｃｅ3+）、プラセオジミウム（Ｐｒ3+）、プロメチウム（Ｐｍ3+）、サマリウム（Ｓｍ3+）、ホルミウム（Ｈｏ3+）、ツリウム（Ｔｍ3+）、またはルテチウム（Ｌｕ3+）などを含み得ることは理解されるべきである。当該出願を通じて、「Ｌｎ3+」、「Ｌｎ（ＩＩＩ）」、または「ランタニド」は、例えばイットリウム（Ｙ3+）やスカンジウム（Ｓｃ3+）などの他の希少土類金属イオンに置換されてもよい。図１は、ルミネセンスランタニドの発光スペクトルを例示する。この図は、各ランタニドの鋭い発光バンド、および様々なランタニドの間にスペクトル識別が存在することを明確に例示する。
【００６１】
遷移金属イオン（ＴＭ（ＩＩ））は、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｒｈ2+、Ｐｄ2+、Ａｇ2+、Ｃｄ2+、Ｉｒ2+、Ｐｔ2+、Ａｕ2+、またはＨｇ2+から成る群から選択され得る。
【００６２】
ＨＡ配位子は、ピラジンヒドロキシメート、キノキサリンヒドロキシメート、キナルジンヒドロキシメート、またはその組み合わせであり得る。ピラジンヒドロキシメート（ｐｙｚＨＡ）は、以下の構造：
【化３】
2018530743.tif 000005
を有し、ピラジンヒドロキサム酸：
【化４】
2018530743.tif 000006
の脱プロトン反応から形成される。
同様に、キノキサリンヒドロキシメート（ｑｕｉｎｏＨＡ、未掲載）は、キノキサリンヒドロキサム酸：
【化５】
2018530743.tif 000007
の脱プロトン反応から形成され、およびキナルジンヒドロキシメート（ｑｕｉｎＨＡ、未掲載）は、キナルジンヒドロキサム酸（キナルジンヒドロキサム酸（quinaldichydroxamic acid）と呼ばれることもある）：
【化６】
2018530743.tif 000008
の脱プロトン反応から形成される。
【００６３】
先に列挙したヒドロキサム酸（構造２、３、４）の誘導体もまた、好適なヒドロキシメート配位子を形成するのに使用され得る。例えば、Ｒ基の任意の組み合わせが、構造２の３、５および６位、構造３の３、５〜８位、ならびに構造４の３〜８位に結合され得る（１位が環の最上部のＮ原子である場合には、付番された位置は（単数若しくは複数の）環を右周りに続き、ここで、２つの環の間で共有される構造３や４の炭素原子には付番されない）。例において、Ｒ基は独立して、−Ｈ、−Ｄ（重水素）、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＦ3、−ＯＣＨ3、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＨ3及び−ＣＮから選ばれる。別の例において、Ｒ基は縮合芳香環であってもよい。縮合芳香環の例としては、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、クリセン又はピレンが挙げられる。縮合芳香環上の各々の位置も、それに結合したＲ基（例えば、−Ｈ、−Ｄ（重水素）、−ＯＨなど）を有することができることは理解されるべきである。なおさらなる例において、構造１の３〜８位のいずれかの位置でのＲ基は縮合複素環であってもよい。縮合複素環の例としては、フラン、チオフェン、ピロール、ピリジン、イミダゾール、チアゾール、ピリミジン、インドール、イソインドール、インドリジン、プリン、カルバゾール、ジベンゾフラン、オキサゾール又はイソオキサゾールが挙げられる。縮合複素環上の各々の位置も、それに結合したＲ基（例えば、−Ｈ、−Ｄ（重水素）、−ＯＨなど）を有することができることは理解されるべきである。なおも別に例において、Ｒ基（単数又は複数）はアミド、又は発色若しくは認識領域、例えば、ビオチン、糖、オリゴ、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、抗体などであってもよい。なおも他の例において、Ｒ基は＝Ｏ、＝Ｎ、−Ｎ3、−ＮＲ’Ｈ、−ＮＲ’2、−ＮＲ’3+、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＨ2−Ｒ’、−ＣＨＲ2、−ＣＨＲ’Ｒ’’、−ＣＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＲ’などであってもよく、ここで、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は上記のＲ基のいずれかから独立して選択されてもよい。
【００６４】
他の誘導体の例としては、構造２および３の４位における炭素（窒素の代わりに）、または構造４の３〜８位における窒素、酸素または硫黄（炭素の代わりに）を含むヒドロキサム酸から誘導される複素環が挙げられる。これらの誘導体は３〜８位に個々に又は組み合わせで窒素、酸素又は硫黄原子を含むことができることは理解されるべきである。
【００６５】
本明細書中に開示したＨＡ配位子は、錯体にユニークな分子構造を与える。さらに、この配位子又は誘導体は効果的に励起光を吸収し、そして得られたエネルギーをＬｎ（ＩＩＩ）イオンに輸送する。（単数若しくは複数の）ＨＡ配位子又はその誘導体を用いて形成されたメタラクラウン錯体は近可視の配位子ベースの電荷移動吸収、顕著に高い量子収率（強い近赤外ルミネッセンスを示す）及び長い発光寿命の組み合わせを与えることを予期せず発見した。これらの特性を有する錯体は、本明細書中に開示した例示の同時の細胞染色およびイメージング方法を含めた様々な用途に使用され得る。
【００６６】
前述のとおり、メタラクラウン錯体は、２つのキャッピングクラウン［１２−ＭＣ−４］を含む。［１２−ＭＣ−４］キャッピングクラウンの例示の構造を、５０％熱変形パラメーターおよび部分的な付番スキームと共に以下に示す：
【化７】
2018530743.tif 000009
【００６７】
構造５及び６は各キャッピングクラウンの４つの内側に向いているヒドロキシメート酸素原子に結合しているＬｎ（ＩＩＩ）イオン（これらの例でＤｙ）を示している。構造５において、これらの内側に向いているヒドロキシメート酸素原子をＯ６、Ｏ６Ａ、Ｏ６Ｂ及びＯ６Ｃとラベル化し、構造６において、これらの内側に向いているヒドロキシメート酸素原子をＯ４、Ｏ４Ａ、Ｏ４Ｂ及びＯ４Ｃとラベル化している。メタラクラウン錯体の製造（後述）の間に、ＨＡ配位子は環化して、反復［Ｍ（ＩＩ）ＨＡ］サブユニットを形成し、該サブユニットは［１２−ＭＣ−４］中で４回繰り返されている。結果として、各［１２−ＭＣ−４］キャッピングクラウンはマクロ環状環中に合計で１２個の原子を有する（例えば、４個のＺｎ、４個のＯ及び４個のＮ）。
【００６８】
メタラクラウン錯体はまた、カプセル化クラウン［２４−ＭＣ−８］をも含む。［２４−ＭＣ−８］カプセル化クラウンの例示の構造を、５０％熱変形パラメーター及び部分的な付番スキームと共に以下に示す：
【化８】
2018530743.tif 000010
【００６９】
この例において、ＨＡ配位子は環化して、反復［Ｍ（ＩＩ）ＨＡ］サブユニットを形成し、該サブユニットは［２４−ＭＣ−８］中８回繰り返されている。結果として、各［２４−ＭＣ−８］カプセル化クラウンはマクロ環状環中に合計で２４個の原子を有する（すなわち、８個のＺｎ、８個のＯ及び８個のＮ）。
【００７０】
構造７はまた、結合していない中心Ｌｎ（ＩＩＩ）イオン（例えば、Ｄｙ１）を例示している。破線は中心クラウンブリッジがより小さい凹状のキャッピングクラウンにどのように結合しているかを示している（構造５及び６）。
【００７１】
メタラクラウン錯体を形成するために使用される方法はピリジン又は特定の他の溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド又はメタノール）を使用し、そのため、カプセル化クラウン（構造７）はそれに結合した８個のピリジン環又は特定の他の配位性溶媒分子をも有することができる。
【００７２】
前述のとおり、遷移金属はいかなる遷移金属（ＩＩ）イオンであってもよい。本明細書中に開示した例において、Ｚｎ2+は使用される遷移金属イオンである。［２４−ＭＣ−８］（Ａ）及び［１２−ＭＣ−４］（Ｂ）中のＺｎ2+の配位幾何形状を下記に示す。
【化９】
2018530743.tif 000011
【００７３】
Ｚｎの配位幾何形状は、明確なメタラクラウン環が橋掛け酸素原子、すなわち、［１２−ＭＣ−４］カルボキシレート酸素原子（実線矢印で特定）及び［２４−ＭＣ−８］ヒドロキシメート酸素原子（破線矢印で特定）を介して結合されていることを示している。別の言い方をすれば、［２４−ＭＣ−８］単位はその中心にキャビティーを有し、そしてＬｎ3+イオンと２つの［１２−ＭＣ−４］単位との間に形成されたサンドイッチ錯体が橋掛け酸素原子を通してそのキャビティー内で結合されている。上記の（Ｂ）に示されるとおり、Ｌｎ3+イオンは［１２−ＭＣ−４］ヒドロキシメート酸素原子（点線矢印で特定）に結合している。
【００７４】
形成されるメタラクラウン錯体の電荷バランスは、結合されていない対イオン（例えば、（単数若しくは複数の）トリフラート、（単数若しくは複数の）メシラート、（単数若しくは複数の）ベシラート、（単数若しくは複数の）カンシラート、（単数若しくは複数の）エジシラート、（単数若しくは複数の）エストラート、（単数若しくは複数の）エシラート、（単数若しくは複数の）ナプシラート、（単数若しくは複数の）トシラート、（単数若しくは複数の）フルオリド、（単数若しくは複数の）クロリド、（単数若しくは複数の）ブロミド、（単数若しくは複数の）ヨージド、（単数若しくは複数の）ニトレート、（単数若しくは複数の）スルファート、（単数若しくは複数の）カルボナート、（単数若しくは複数の）アセタート、（単数若しくは複数の）スルホナート又は（単数若しくは複数の）ホスファートなどの負に荷電された化学種の存在により得ることができる。
【００７５】
Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体の具体例としては：
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）16（ピリジン）8］対イオン；
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キノキサリンヒドロキシメート）16（ピリジン）8］対イオン；または、
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キナルジンヒドロキシメート）16（ピリジン）8］対イオン、が挙げられる。別の例として、Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、少なくとも２つの異なるＨＡ配位子を有する混合配位子メタラクラウン錯体であり得る。混合配位子メタラクラウン錯体が形成されるとき、その成果はメタラクラウン錯体の混合物であり得、ここで、メタラクラウン混合物中の各種は［Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子１）x（ＨＡ配位子２）y（ピリジン）8］対イオン｛式中、ｘ＋ｙ＝１６であり、かつ、式中、好ましくは、ｘは８〜１３の範囲に及び、それにより、ｙは８〜３の範囲に及ぶ｝である。より具体的な例として、前記混合物としては、［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）x（キノキサリンヒドロキシメート）y（ピリジン）8］対イオンが挙げられ、ここで、主な種はｘ＝１２およびｙ＝４（例えば、［Ｎｄ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）12（キノキサリンヒドロキシメート）4（ピリジン）8］（ＣＦ3ＳＯ3））であるが、他の種（ｘ＝１３およびｙ＝３、ならびにｘ＝１１およびｙ＝５のもの）もまた存在し得る。
【００７６】
ランタニドベースのメタラクラウン錯体を製造するための方法に関する例では、ＨＡ配位子のヒドロキサム酸前駆体、遷移金属塩、および希土類金属塩の例は、溶媒中に溶解されて、溶液を形成する。ランタニドベースのメタラクラウン錯体を製造するための方法の別の例では、ＨＡ配位子のヒドロキサム酸前駆体は、溶媒中に溶解されて、溶液を形成し、次に、遷移金属塩と希土類金属塩が加えられる。例示の溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、ピリジン、水、およびその組み合わせが挙げられる。
【００７７】
ＨＡ配位子のヒドロキサム酸前駆体は、単一の工程において調製され得る。ある例において、新鮮なヒドロキシルアミンは、最初に、約０℃にてメタノール中でヒドロキシルアミンヒドロクロリド及び水酸化カリウムを混合することにより調製される。この溶液は撹拌され（例えば、約２０分又はそれ以上）、そしてろ過されて、塩化カリウムを除去することができる。キナルジン酸及びＮ−メチルモルホリンはジクロロメタン中で撹拌しながら混合される。この溶液は約０℃に冷却され、その時点でエチルクロロホルメートが添加されてよい。この反応物を約２０分〜１時間撹拌し、そしてその後に、ろ過することができる。ヒドロキシルアミン溶液を約０℃でろ液に添加する。この反応混合物を室温に温め、そして約１．５時間撹拌することができる。その後、体積を真空中で約２００ｍＬに低減し、そして水を添加して、白色固形分の沈殿を誘発する。固形分をろ過により回収し、そして熱（約４０℃）ジクロロメタンで研和し、キナルジンヒドロキサム酸を白色粉末として生じる。該ヒドロキサム酸は、ＭＣ錯体の合成に使用され得る。合成中、該ヒドロキサム酸は脱プロトン反応を受けるであろう。
【００７８】
任意の遷移金属塩を使用することができる。ある例において、遷移金属塩はＣｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｒｈ2+、Ｐｄ2+、Ａｇ2+、Ｃｄ2+、Ｉｒ2+、Ｐｔ2+、Ａｕ2+又はＨｇ2+のいずれかのトリフラート（−Ｏｔｆ）、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストラート、エシラート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート又はスルホナートである。
【００７９】
希土類金属塩はＹ3+、Ｓｃ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+又はＬｕ3+のいずれかのトリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストラート、エシラート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート又はスルホナートであってもよい。
【００８０】
前述のとおり、前記方法のいくつかの例では、ＨＡ配位子の前駆体、遷移金属塩及び希土類金属塩は溶媒中に溶解されて、溶液を形成する。該例示の方法は、キナルジンヒドロキサム酸が前駆体としてＨＡ配位子に使用されるとき、好適であり得る。この例示の方法では、塩基は、その後、溶液に添加される。適切な塩基の例としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリメチルアミン又は他のブロンステッド塩基が挙げられる。ある例において、塩基が溶液に添加されるときに、得られる混合物は黄色に変色する。
【００８１】
この例示の方法では、反応混合物（すなわち、溶液及び塩基）は、その後、所定の温度で所定の時間撹拌される。ある例において、温度は室温（例えば、約１８℃〜約２２℃）であり、そして時間は約１２時間〜約２４時間の範囲に及ぶ。
【００８２】
反応混合物は、その後、精製方法を受け、高度に純粋なメタラクラウン錯体を生じる。適切な精製方法の例としては、溶媒の緩慢な蒸発による再結晶化、蒸気拡散による再結晶化、溶媒層化による再結晶化、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はフラッシュクロマトグラフィーが挙げられる。１つの例において、ピリジンは精製プロセスにおいて使用され、ピリジン配位子のメタラクラウン錯体への導入をもたらす。
【００８３】
また、前述のように、前記方法のその他の例では、ＨＡ配位子の前駆体が溶媒中に溶解されて、溶液を形成する。この例示の方法は、ピラジンヒドロキサム酸および／またはキノキサリンヒドロキサム酸が前駆体としてＨＡ配位子に使用されるとき、好適であり得る。
【００８４】
この例示の方法では、ＨＡ配位子が溶媒中に溶解されて、溶液を形成する。該溶液は、固形物を完全に溶解するように撹拌されてもよい。遷移金属塩および希土類金属塩は、その後、溶液に追加され得る。該溶液は、室温または高温にて予定された時間撹拌され、次に、濾過され得る。
【００８５】
以下のものは、この例示の方法の三つの例である：
【００８６】
［Ｚｎ16Ｌｎ（ｐｙｚＨＡ）16（ｐｙ）8］（ＯＴｆ）3の合成
【００８７】
ピラジンヒドロキサム酸（４５．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのピリジンおよび１０．０ｍＬの水を含有する溶液に加える。該溶液を約５分間撹拌して、固形物を完全に溶解する。亜鉛トリフラート（１１６．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）およびランタニドトリフラート（０．０４ｍｍｏｌ）を加え、黄色い溶液を、約５分間室温にて撹拌し、次に、濾過する。その濾液を乱さないまま静置して、３日後に黄色の結晶をもたらし得る。結晶を濾過によって回収し、空気中で乾燥させ得る。
【００８８】
［Ｚｎ16Ｌｎ（ｑｕｉｎｏＨＡ）16（ｐｙ）8］（ＯＴｆ）3の合成
【００８９】
キノキサリンヒドロキサム酸（６０．５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのピリジン、５．０ｍＬのＤＭＦ、および５．０ｍＬの水を含有する溶液に加える。該溶液を約５分間撹拌して、固形物を完全に溶解する。亜鉛トリフラート（１１６．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）およびランタニドトリフラート（０．０４ｍｍｏｌ）を加え、オレンジ色の溶液を、８０℃にて約２時間撹拌し、室温まで冷まし、次に、濾過する。その濾液を乱さないまま静置して、１週間後に赤色の結晶をもたらし得る。結晶を濾過によって回収し、水で洗浄し、そして、空気中で乾燥させ得る。
【００９０】
［Ｚｎ16Ｌｎ（ｐｙｚＨＡ）x（ｑｕｉｎｏＨＡ）y（ｐｙ）8］（ＯＴｆ）3の合成
【００９１】
ピラジンヒドロキサム酸（３７．５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびキノキサリンヒドロキサム酸（１７．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのピリジンおよび５．０ｍＬの水を含有する溶液に加える。該溶液を５分間撹拌して、固形物を完全に溶解する。亜鉛トリフラート（１３１．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）およびランタニドトリフラート（０．０４５ｍｍｏｌ）を加え、オレンジ色の溶液を室温にて約２０分間撹拌し、次に、濾過する。該濾液を乱さないまま静置して、１週間後に黄色／赤色の結晶の混合物をもたらし得る。該結晶を、濾過によって回収し、水で洗浄し、そして、空気中で乾燥させる。
【００９２】
メタラクラウン錯体を、本明細書中に開示した方法の例に使用し得る。ある例示の方法は、細胞の同時に対比染色および固定のためのものであり、そして、別の例示の方法は、壊死細胞の光学イメージング方法である。
【００９３】
細胞を同時に染色および固定するための方法の一例では、まず、細胞を入手し、調製し得る。好適な細胞の例としては、ヒト上皮性子宮頚癌（ＨｅＬａ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または他の好適な細胞が挙げられる。細胞の調製は、細胞を播種し、そして、培養することを伴ってもよい。選択される細胞培養培地が、利用される細胞株によって変化し得ることは、理解すべきである。細胞は、新鮮な培地で洗浄され得る。
【００９４】
前記方法の工程を通じて、少なくともいくつかの細胞（例えば、少なくとも９０％）、そして多くの場合、細胞のすべてが、壊死（プログラムされていない細胞死）を経験する。これらの細胞はまた、壊死細胞とアポトーシス細胞の組み合わせであってもよい。
【００９５】
細胞を、培地の状態で（単数若しくは複数の）Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を含む溶液と共に（最初に）インキュベートする。この例示の方法の考察を通じて、Ｌｎ（ＩＩＩ）ＴＭ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、（単数若しくは複数の）Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］メタラクラウン錯体とも呼ばれるであろう。選択される培地が、利用される細胞株によって異なる可能性があることは、理解されるべきである。前記培地は、血清を補った還元培地（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補ったＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地など）であってもよい。溶液中のＬｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］メタラクラウン錯体の濃度は、約４５μＭ〜約４００μＭの範囲に及び得る。具体例として、溶液のＬｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］メタラクラウン錯体の濃度は、約４５μＭ、１５０μＭまたは２００μＭであってもよい。
【００９６】
最初のインキュベーションは、使用される細胞株およびメタラクラウン錯体に依存して、予定された時間実施され得る。最初のインキュベーション時間（Ｔ１）は、約１０分〜約３時間の範囲に及び得る。例として、Ｙｂ3+やＮｄ3+を用いて形成されたメタラクラウン錯体は、最初に約１５分間インキュベートし得る。
【００９７】
最初のインキュベーション時間中、少なくともいくつかの細胞が死滅し得る。方法のこの部分の間に死滅する細胞のパーセンテージは、Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］メタラクラウン錯体の濃度および最初のインキュベーション時間（Ｔ１）に依存し得る。最初のインキュベーション時間（Ｔ１）は２４時間未満であり、濃度は約２．５μＭ〜約１００μＭの範囲に及ぶとき、最大１０％の細胞が死滅し得る。
【００９８】
次に、前記インキュベート細胞をＵＶ光に曝露する。例では、ＵＶ光はＵＶ−Ａ光である。ＵＶ光曝露は、約５分〜約１０分の範囲に及ぶ時間（Ｔ２）にわたって実施され得る。高濃度のＬｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］メタラクラウン錯体と組み合わせたＵＶ光への短い曝露は、光化学効果を引き起こし、そしてそれは、ホルムアルデヒドまたはメタノールを使用して得られる細胞固定に類似している。
【００９９】
ＵＶ光曝露後に、細胞を、溶液中でインキュベートし続ける。例では、溶液中での細胞の連続したインキュベーションは、約１時間〜約２時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ３）にわたって起こる。ＵＶ光曝露後の連続した細胞インキュベーションは、Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］メタラクラウン錯体が（全部ではないが）少なくともいくつかの固定細胞の核および細胞質を染色することを可能にした。
【０１００】
前記方法のいくつかの例では、インキュベート細胞は、任意の追加ＵＶ光に曝露されない。前記方法のある他の例では、インキュベート細胞は、約１分〜約５分の範囲に及ぶ時間（Ｔ４）にわたって追加ＵＶ光に曝露され得る。
【０１０１】
連続インキュベーション後、および実施される場合には、追加ＵＶ光曝露後に、染色および固定された細胞は（例えば、新鮮な培地で）洗浄され得る。同時に染色および固定された細胞は、例えば、落射蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡、またはその組み合わせなど光学イメージング技術であり得る。
【０１０２】
本明細書中に開示した光学イメージング方法の例は、本明細書中に開示した方法を介して同時に固定および染色された細胞を形成し、そして、その同時に固定および染色された細胞を光学イメージング技術に供することを含む。
【０１０３】
本開示をさらに例示するために、実施例をここに提供する。これらの例は例示の目的で提供され、そして非限定的なものと解釈されると理解されるべきである。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例では、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（ＹｂＺｎ16（ｐｙｚ）16ＭＣとも記載し得る）錯体、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（ＮｄＺｎ16（ｐｙｚ）16ＭＣとも記載し得る）錯体、またはＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］（ＮｄＺｎ16（ｐｙｚ）x（ｑｕｉｎｏ）yＭＣ）錯体を利用する。それぞれの錯体を、以下の手順で形成した： 
【０１０５】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体またはＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の合成
【０１０６】
ピラジンヒドロキサム酸（４５．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのピリジンおよび１０．０ｍＬのＨ2Ｏを含有する溶液に加えた。該溶液を５分間撹拌して、固形物を完全に溶解した。亜鉛トリフラート（１１６．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）およびイッテルビウムトリフラートまたはネオジムトリフラート（０．０４ｍｍｏｌ）を加え、黄色い溶液を、５分間室温にて撹拌し、次に、濾過した。その濾液を乱さないまま静置して、３日後に黄色の結晶を得た。結晶を濾過によって回収し、空気中で乾燥させた。
【０１０７】
Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］錯体の合成
【０１０８】
ピラジンヒドロキサム酸（３７．５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびキノキサリンヒドロキサム酸（１７．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、１．０ｍＬのピリジンおよび５．０ｍＬのＨ2Ｏを含有する溶液に加えた。該溶液を５分間撹拌して、固形物を完全に溶解した。亜鉛トリフラート（１３１．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）およびネオジムトリフラート（０．０４５ｍｍｏｌ）を加え、オレンジ色の溶液を室温にて２０分間撹拌し、次に、濾過した。該濾液を乱さないまま静置して、１週間後に黄色／赤色の結晶の混合物を得た。該結晶を、濾過によって回収し、Ｈ2Ｏで洗浄し、そして、空気中で乾燥させた。
【０１０９】
以下の実施例のいくつかでは、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を形成した。図２の左側は、ピラジンヒドロキサム酸を例示する。図２の右側は、制御された比での亜鉛およびイッテルビウム塩と（ｐｙｚ ＨＡ配位子を形成する）ヒドロキサム酸ユニットの超分子集合によって形成される（Ｘ線構造から得る）メタラクラウン構造を代表する。Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体は、ランタニドイオンが構造（ターコイズの球）の中心に置かれ、および亜鉛（灰色の球）で囲まれた独特な剛構造を有する。
【０１１０】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体および他のＭＣ錯体の構造は、増感およびルミネセンスランタニドに対する保護を提供する。これらのメタラクラウンは、量子収率およびルミネセンス寿命に関して最高の価値を共有する有望な光物理的特性を示す。以下の実施例で図示されるとおり、ＭＣ錯体のいくつかが、顕著なＮＩＲルミネセンス特性を実証した（一部のものが、選択されたＮＩＲ放射性ランタニド（Ｙｂ3+、Ｎｄ3+）に関してこれまで報告された最も高いルミネセンス量子収率値を示す）。図４（上部）に示したとおり、イッテルビウムを用いて形成したメタラクラウンは、最大４８０ｎｍまで励起され得る。以下の実施例のいくつかで例示するとおり、これらのメタラクラウンは、良好なシグナル対ノイズ比、および高い検出感度のための癌細胞における強烈な近赤外シグナルを実証した。
【０１１１】
実施例１−ＨｅＬａ癌細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いたＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体のＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法
【０１１２】
試験条件
【０１１３】
ＡＴＣＣ（Molsheim、France）から入手したＨｅＬａ（ヒト上皮性子宮頚癌）細胞株を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％の１００×非必須アミノ酸溶液、１％のＬ−グルタミン（GlutaMAX）、および１％のストレプトマイシン／ペニシリン抗生物質を補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を、８ウェルＬａｂ Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒカバーガラス（Nunc, Dutsher S.A., Brumath, France）内に６×１０4細胞／ウェルの密度にて播種し、５％に加湿したＣＯ2雰囲気下、３７℃にて培養した。
【０１１４】
ＭＳＣ（間葉系幹細胞）細胞株を、Ｏｒｌｅａｎｓの大学の１３ＭＴＯ研究室（Orleans、France）から入手した。受け入れたＭＳＣ細胞株は、ラットの骨髄から得られた。ＭＳＣ細胞株を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のＬ−グルタミン（GlutaMAX）、および１％のストレプトマイシン／ペニシリン抗生物質を補った最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。ＭＳＣもまた、ＨｅＬａ細胞と同様の様式で播種した。
【０１１５】
２４時間後、それぞれの細胞培養培地を取り除き、そして、ＨｅＬａ細胞またはＭＳＣを、以下の手順のうちの１つに従ってＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体と共にインキュベートした。
【０１１６】
長時間インキュベーション、ＵＶ光曝露なし：一部のＨｅＬａ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、そして、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の１５０μＭ Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて１２時間インキュベートした。
【０１１７】
短時間インキュベーション、ＵＶ光曝露＃１：一部のＨｅＬａ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の１５０μＭ Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を８分間照射し、次に、インキュベートを１時間続けた。連続インキュベーションは、錯体の内在化を可能にした。
【０１１８】
短時間インキュベーション、ＵＶ光曝露なし：一部のＨｅＬａ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の４５μＭ Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて１５分間インキュベートした。
【０１１９】
先に言及したインキュベートＨｅＬａ細胞のすべてを、次に、新鮮なＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で洗浄し、３μＭのヨウ化プロピジウムと共に５分間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムは、壊死細胞のための市販の染色（可視域内の発光）であり、細胞壊死を確認するのに使用された。
【０１２０】
短時間インキュベーション、ＵＶ光曝露＃２：一部のＨｅＬａ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体および３μＭのヨウ化プロピジウムの溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を５分間照射し、次に、１時間インキュベートし続けた。連続インキュベーションは、錯体の内在化を可能にした。
【０１２１】
短時間インキュベーション、ＵＶ光曝露＃３：ＭＳＣ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を８分間照射し、次に、１時間インキュベートし続けた。
【０１２２】
落射蛍光イメージングの前に、全ての非特異的に結合したＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を取り除くために、ＨｅＬａおよびＭＳＣ細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で二回洗浄した（室温）。該細胞を、ＥＭＣＣＤ Ｅｖｏｌｖｅ５１２（Roper Scientific）測光カメラまたはＯｒｃａ−Ｒ２高解像度ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１蛍光倒立顕微鏡（Zeiss, Le Pecq, France）で観察した。光源（Ｚｅｉｓｓ ＨＸＰ１２０）を、以下のフィルタキューブ：
ｉ．励起のための５０ｎｍのバンド幅を有する５０ｎｍバンド−パスフィルタを備えた３７７ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＹｂＩＩＩ発光のための７０ｎｍのバンド幅を有する８０５ｎｍロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは９９６ｎｍバンド−パスフィルタ、
ｉｉ．励起のための６５０ｎｍのバンド幅を有する４４７８０ｎｍバンド−パスフィルタ、およびＮＩＲ範囲内のＹｂＩＩＩ発光のための７０ｎｍのバンド幅を有する８０５ｎｍロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは９９６ｎｍバンド−パスフィルタ、
と組み合わせた。
【０１２３】
試験結果
【０１２４】
図１８Ａ〜１８Ｅに示した結果は、長時間インキュベーションおよびＵＶ光曝露なし細胞に関するものである。図１８Ｂの結果は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とのＨｅＬａ癌細胞のインキュベーションが細胞死につながることを示す。これらの結果から、ＭＣが、１２時間にわたるインキュベーションに関して１５０μＭの濃度にてＨｅＬａ細胞に対して毒性であると結論づけられ得る。図１８Ｃに示したように、細胞死を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とのインキュベーションによって確認した。一つに合成した図面（図１８Ｄと１８Ｅ）で例示されるとおり、同じ細胞コンパートメント内にＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とＰＩが共局在化し、そして、シグナルを、それぞれＭＣとＰＩから生じるＮＩＲ領域（図１８Ｂ）とＶＩＳ領域（図１８Ｃ）で観察した。
【０１２５】
図９Ａ〜９Ｅに示した結果は、短時間インキュベーションおよびＵＶ光曝露＃１を用いた細胞に関するものである。未掲載であるが、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から生じたＮＩＲシグナルを、落射蛍光イメージングを使用して得、１カ月後に、対比染色および固定のための手順を実施した。１カ月後の結果を、図９Ｂ（染色および固定法を実施した後のＮＩＲシグナル光）と比較し、該比較では、染色および固定された細胞が同じ形状および形態を維持することを例示した。この試験では、高濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］のインキュベーションと組み合わせた、ＵＶ−Ａ光（３７７ｎｍ）へのＨｅＬａ癌細胞の曝露から生じた新しい光化学現象が観察された。この効果は、ホルムアルデヒドまたはメタノールを用いて古典的に得られる細胞固定と同様であった。図９Ｂはまた、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］は、固定ＨｅＬａ癌細胞の核ならびに細胞質のＮＩＲ染色として効果があることも例示する。細胞死を、市販のマーカー、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で確認した（図９Ｂ）。一つに合成した図面（図９Ｄと９Ｅ）で例示されるとおり、同じ細胞コンパートメント内にＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とＰＩが共局在化し、そして、シグナルを、それぞれＭＣとＰＩから生じるＮＩＲ領域（図９Ｂ）とＶＩＳ領域（図９Ｃ）で観察した。
【０１２６】
図７Ａ〜７Ｅに示した結果は、短時間インキュベーションおよびＵＶ光曝露なし細胞に関するものである。図１８Ａ〜１８Ｅの結果に加えて、図７Ａ〜７Ｅの結果は、メタラクラウン（例えば、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］）が壊死細胞内に排他的に入ることを実証する。核および細胞質のＮＩＲ染色もまた、これらの結果から明白であった。
【０１２７】
図２２Ａ〜２２Ｆに示した結果は、短時間インキュベーションおよびＵＶ光曝露＃２を用いた細胞に関するものである。これらの結果でもまた、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］が壊死細胞内に入ることを確認した。２０分間のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］およびヨウ化プロピジウムとＨｅＬａ細胞のインキュベーション後に、細胞膜に損傷を与え、細胞死（壊死および／またはアポトーシス）を誘発するために、細胞に５分間ＵＶ光を照射した。１５分間のインキュベーション後に、ヨウ化プロピジウムからの発光を可視域で観察し、そして、さらに５分後に、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］からのＮＩＲの発光を観察した。この試験から、両方の色素が異なる動態で死細胞およびアポトーシス細胞に特異的であると結論づけできる。
【０１２８】
図２３Ａ〜２３Ｃに示した結果は、短時間インキュベーションおよびＵＶ光曝露＃３を用いた細胞に関するものである。ＨｅＬａ細胞株で見られたのと同じ光化学効果は、ＭＳＣ細胞でも起こった。ＭＳＣ細胞の場合には、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］はまた、ＮＩＲ色素および細胞固定液としても機能している。
【０１２９】
実施例２−Ｎ−アセチルシステインで処理したＨｅＬａ癌細胞を用いたＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体のＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法
【０１３０】
細胞外嚢状体の形成は、ＲＯＳ（反応性酸素分子種）の過剰産生を示す酸化ストレスに対する細胞応答の結果である。ＲＯＳがＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の二重機能に関して応答性であるかどうかを調査するために、ＨｅＬａ癌細胞を、ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）で処理し、そしてそれは、効率的に反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を妨げる周知の抗酸化剤である。
【０１３１】
試験条件
【０１３２】
ＡＴＣＣ（Molsheim、France）から入手したＨｅＬａ（ヒト上皮性卵巣癌）細胞株を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％の１００×非必須アミノ酸溶液、１％のＬ−グルタミン（GlutaMAX）および１％のストレプトマイシン／ペニシリン抗生物質を補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を、６×１０4細胞／ウェルの密度で８ウェル−Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒカバーガラス（Nunc, Dutsher S.A., Brumath, France）内に播種し、５％の加湿したＣＯ2雰囲気下、３７℃にて培養した。
【０１３３】
先にＮＡＣインキュベーション：２４時間後に、細胞培養培地を取り除いた。一部の細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）で１５分間インキュベートし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し、そして、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートした。
【０１３４】
先にＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］インキュベーション：２４時間後に、細胞培養培地を取り除いた。一部の細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、１５０μＭのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に１５分間インキュベートした。Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加え、そして、該細胞をさらに３０分間インキュベートした。前記細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄した。
【０１３５】
落射蛍光イメージング前に、全ての非特異的に結合したＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を取り除くために、細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で二回（洗浄した（室温）。該細胞を、ＥＭＣＣＤ Ｅｖｏｌｖｅ５１２（Roper Scientific）測光カメラまたはＯｒｃａ−Ｒ２高解像度ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１蛍光倒立顕微鏡（Zeiss, Le Pecq, France）で観察した。光源（Ｚｅｉｓｓ ＨＸＰ１２０）を、以下のフィルタキューブ：励起のための３７７ｎｍバンドパス５０ｎｍフィルタ、およびＮＩＲ範囲内のＹｂIII発光のためのロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは９９６ｎｍバンドパスフィルタ７０ｎｍ、と組み合わせた。
【０１３６】
試験結果
【０１３７】
先にＮＡＣインキュベーションの試験からの結果を図２５Ａ〜２５Ｃに示す。図２５Ｂは、非常に短い曝露時間（４００ミリ秒間）を用いたＮＩＲ内の非常に良好なシグナルを示し、そしてそれは、癌細胞におけるシグナル伝達経路による代謝の調節が、ＮＩＲ色素としてのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の効率、ならびに細胞内へのそれらの内在化に影響を与えることを示す。これらの結果から、ＲＯＳの産生が、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の二重機能に関与していないと結論づけられる。
【０１３８】
先にＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］インキュベーションの試験からの結果を、図２６Ａ〜２６Ｃを示す。図２６Ｂは、まさに細胞培養培地中である細胞の外側のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］のＮＩＲシグナルを示す。これらの結果は、細胞の内側へのＭＣ錯体の内在化を示さない。これらの結果は、（それがＲＯＳ種の産生を停止している特定の方法で）細胞の代謝が変更されていない場合、細胞内へのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の内在化が存在しないであろうことを示す。これらの結果は、癌細胞におけるシグナル伝達経路による代謝の調節が、ＮＩＲ色素としてのＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（ＹｂＺｎ16（ｐｙｚ）16ＭＣとも記載し得る）錯体の効率、ならびに細胞内へのそれらの内在化に影響を与えることを示した先の試験（先にＮＡＣインキュベーション）の結果を裏付ける。
【０１３９】
実施例３−ＨｅＬａ癌細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いたＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の共焦顕微鏡法
【０１４０】
試験条件
【０１４１】
これらの共焦顕微鏡試験のために、ＨｅＬａまたはＭＳＣ細胞を、落射蛍光顕微鏡試験と同様の方法で調製した（実施例１を参照のこと、短時間のインキュベーション、ＵＶ光曝露＃１および＃３）。細胞を、ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ走査デバイス（Zeiss, France）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡による共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）を用いて観察した。錯体を、４５８ｎｍのＡｒｇｏｎレーザーを用いて励起し、そして、発光シグナルを４９９ｎｍ〜７９９ｎｍにて回収した。この試験中、６３×Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを使用した（２×ズーム）。
【０１４２】
試験結果
【０１４３】
図１９Ａ〜１９Ｃは、ＨｅＬａ細胞の共焦点像であり、図２４Ａ〜２４Ｃは、ＭＳＣ幹細胞の共焦点像である。図１９Ｂおよび２４Ｂでは、発光を、可視範囲内に、配位子から生じる、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］から観察した。この発光は、共焦点顕微鏡の使用を可能にした。この試験は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（および他のＬｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］）がＨｅＬａ癌細胞およびＭＳＣ幹細胞の核内ならびに細胞質に特異的に位置することを裏付けた。
【０１４４】
実施例４−細胞毒性試験
【０１４５】
ＬｎＺｎ16（ｐｙｚ）16ＭＣ錯体（Ｌｎ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣHA］）が生細胞にとって毒性であるかどうかを判定するために、Ａｌａｍａｒブルーを用いて細胞毒性試験を実施した。
【０１４６】
Ａｌａｍａｒブルーは、様々なヒトおよび動物細胞株の増殖を定量的に計測するために生細胞の還元力を使用することによって細胞健康指標として機能する生存率試薬である。これは、様々な化学複合体の細胞毒性を判定することを可能にする。Ａｌａｍａｒブルーの有効成分はレサズリンであり、そしてそれは、無毒であり、細胞浸透性化合物であり、そして、細胞内に入ることによって、それは強い蛍光を発するレゾルフィンに還元される。
【０１４７】
試験条件
【０１４８】
細胞毒性試験をＡｌａｍａｒブルーアッセイ（Invitrogen, France）を用いて実施した。ＨｅＬａ細胞を、１ウェルあたり１*１０4細胞の密度にて９６ウェルプレート内に播種し、５％の加湿したＣＯ2雰囲気下、３７℃にて培養した。接着の２４時間後に、該細胞を、細胞培地中の様々な濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共に２４および４８時間インキュベートし、それに続いて、Ａｌａｍａｒブルー（１０％ ｖ／ｖ）と共に５％の加湿したＣＯ2雰囲気下、３７℃にて３〜４時間インキュベートした。
【０１４９】
Ａｌａｍａｒブルーの蛍光を、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］と共にインキュベートした細胞および未処理細胞（対照）に関して、５３０のｎｍにおける励起および５９０ｎｍにおける発光で、プレートリーダー（Victor 3V, Perkin Elmer, France）を用いて計測した。
【０１５０】
試験結果
【０１５１】
様々な濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］に２４および４８時間曝露した細胞に関する細胞毒性試験の結果を図１３に示し、様々な濃度のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］に５時間曝露した細胞に関する細胞毒性試験の結果を、図６に示す。図６に例示されるとおり、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］は、４５μＭの濃度から顕著に毒性になり始め、ここでは、約７０％の細胞が生き残った。
【０１５２】
実施例５−ＨｅＬａ癌細胞を用いたＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体のＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法
【０１５３】
試験条件
【０１５４】
ＨｅＬａ細胞を、実施例１に先に記載したように培養し、そして、播種した。この実施例では、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を使用した。ＨｅＬａ細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄し（室温）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の１５０μＭのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体の溶液と共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて１５分間インキュベートし、ＵＶ光（３７７ｎｍ）を８分間照射し、次に、１時間インキュベートし続けた。連続インキュベーションは、錯体の内在化を可能にした。
【０１５５】
落射蛍光イメージング前に、全ての非特異的に結合したＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を取り除くために、ＨｅＬａ細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で二回洗浄した（室温）。該細胞を、ＥＭＣＣＤ Ｅｖｏｌｖｅ５１２（Roper Scientific）測光カメラまたはＯｒｃａ−Ｒ２高解像度ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１蛍光倒立顕微鏡（Zeiss, Le Pecq, France）で観察した。光源（Ｚｅｉｓｓ ＨＸＰ１２０）を、以下のフィルタキューブ：励起のための５０ｎｍバンドパスフィルタを備えた３７７ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＮｄ3+発光のためのロングパスフィルタ８０５ｎｍ、と組み合わせた。
【０１５６】
試験結果
【０１５７】
落射蛍光イメージングの結果を、図２４Ａ〜２４Ｃに示す。ＨｅＬａ細胞を、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を用いて固定し、そして、染色し、それらはＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体に関するものと同程度であった。
【０１５８】
実施例６−ＨｅＬａ癌細胞を用いたＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］錯体のＮＩＲ落射蛍光顕微鏡法
【０１５９】
試験条件
【０１６０】
ＨｅＬａ細胞を、実施例５に先に記載したのと同じ様式で培養した。８ウェル−Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒカバーガラス（Nunc, Dutsher S.A., Brumath, France）内での２４時間の細胞培養後に、細胞培地を取り除いて、細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回洗浄した（室温）。
【０１６１】
細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（２％のＦＢＳを補った）中の２００μＭのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］（または、ＮｄＺｎ16（ｐｙｚ）x（ｑｕｉｎｏ）yＭＣ）錯体の溶液でと共に５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃にて３時間インキュベートした。細胞のアポトーシスを引き起こし、核の内側へのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］錯体の内在化を可能にするために、インキュベート細胞を、ＵＶ−Ａ光を１０分間照射し、それに続いて、さらに１．５時間インキュベーションを続けた。次に、一部の細胞もまた、３μＭのヨウ化プロピジウムと共に５分間インキュベートした。
【０１６２】
落射蛍光イメージングの前に、全ての非特異的に結合したＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］錯体を取り除くために、細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地で二回（trice）洗浄した（室温）。該細胞を、ＥＭＣＣＤ Ｅｖｏｌｖｅ５１２（Roper Scientific）測光カメラまたはＯｒｃａ−Ｒ２高解像度ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１蛍光倒立顕微鏡（Zeiss, Le Pecq, France）で観察した。光源（Ｚｅｉｓｓ ＨＸＰ１２０）を、以下のフィルタキューブ：
ａ．励起のための５０ｎｍバンドパスフィルタを備えた３７７ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＮｄIII発光のための９０ｎｍバンドパスフィルタを備えたロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは８９５ｎｍ、
ｂ．励起のための４０ｎｍバンドパスフィルタを備えた５３６ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＮｄIII発光のための９０ｎｍバンドパスフィルタを備えたロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは８９５ｎｍ、
ｃ．励起のための５０ｎｍバンドパスフィルタを備えた４８０ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＮｄIII発光のための９０ｎｍバンドパスフィルタを備えたロングパスフィルタ８０５ｎｍまたは８９５ｎｍ、
と組み合わせた。
【０１６３】
試験結果
【０１６４】
ＵＶ曝露のない細胞の結果を、図１６Ａ〜１６Ｃに示す。２つの異なる配位子（ＰｙｚＨＡおよびＱｕｉｎｏＨＡ）を用いて形成したＭＣは、生物学的状況の固有の特性を示す。これらのＭＣは、（図１６Ｂで証明されるように）細胞膜のためのＮＩＲ色素として役立つ。
【０１６５】
そのうえ、ＭＣのこの組成物で、これらの錯体が最大５３６ｎｍで励起され得る場合には、励起波長が低エネルギーに向かってシフトした。励起エネルギーにおけるこのシフトは、これらの波長に関して生物学的分子（脂質、タンパク質、ヘモグロビンなど）の低吸収による、組織の貫通ならびにより良好な検出感度を可能にするので、重要である。
【０１６６】
ＵＶ曝露を伴う細胞の結果を、図１７Ａ〜１７Ｅに示す。１０分間のＵＶ−Ａ光（３７７ｎｍ）へのＨｅＬａ細胞の曝露が、細胞膜に損傷を与え、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）および／または壊死（非プログラム細胞死）を誘発した。これは、（図１７Ｂで例示するように）核内へのＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣ(pyzHA)x(quinoHA)y］錯体の内在化を可能にする。この試験はまた、（Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いても見られるのと）同じ光化学効果が起こることを示す。
【０１６７】
実施例７−光安定性／光物理的特性
【０１６８】
光安定性ストレス試験
【０１６９】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（Ｙｂλem＝９８０ｎｍ）、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］（Ｎｄλem＝１０６４ｎｍ）、および壊死細胞向けの市販の色素（ヨウ化プロピジウム）の光安定性ストレス試験を実施した。錯体（１５０μＭ）または色素（５０μＭ）を水中に溶解し、そして、錯体はまた、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中にも溶解した。ＭＣ溶液を、５時間のＵＶ照射（３７７ｎｍ）に曝露した。ヨウ化プロピジウム溶液を、５時間のＵＶ照射（５３０ｎｍ）に曝露した。結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。結果は、両方のＭＣ錯体が、３７７ｎｍの光を用いた５時間の照射の間、完全に光安定性であり、その一方で、ヨウ化プロピジウムの蛍光強度は、５３０ｎｍにおける照射によって当初の強度の半分に低下したことを示す。
【０１７０】
ＨｅＬａ癌細胞におけるＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の光物理的特性
【０１７１】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を、２％のＳＶＦ（細胞なし）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中に溶解し、そして、ＵＶ光への曝露ありまたはなしの両方で、ＨｅＬａ細胞に取り込まれた。結果を、図２０Ａ（補正および正規化した励起）および２０Ｂ（補正および正規化した発光）に示す。これらの試験は、ＭＣ（Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］）のスペクトル特性を、異なる試験条件下、細胞培養培地中およびＨｅＬａ癌細胞内で制御できることを示した。当該発明者らは、癌細胞内部のＭＣの光物理的特性を収集するために計装を開発した。彼らは、固形物または濃縮された溶液において（量子収率および寿命）の測定のために通常適合される装置を用いて定量的な光物理的パラメーター（量子収率および寿命）を細胞内部で計測した。結果は、それらの構造が元のまま維持される徴候のとおり、細胞内のＭＣ錯体のルミネセンス特性は変更されなかったことを示した。
【０１７２】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を、ＵＶ光への曝露ありおよび曝露なしで、細胞上清（ＳＮ）と一緒に、およびＮ−アセチルシステインで処理したＨｅＬａ細胞と一緒に回収した。ＳＮ１および細胞１に関しては、ＮＡＣとのインキュベーションを３０分間実施し、次に、その細胞を洗浄し、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とのインキュベーションを１５分間実施した。ＳＮ２および細胞２に関しては、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］とのインキュベーションを１５分間実施し、次に、ＮＡＣを加え、そして、ＮＡＣとのインキュベーションを３０分間実施した。結果を、図２０Ｃ（補正および正規化した励起）および２０Ｄ（補正および正規化した発光）に示す。Ｙｂｆ−ｆ遷移から生じた、独特な発光（図２０Ｂ）は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体のルミネセンス特性が、細胞上清または（ＵＶ光への曝露あり／なしの）ＨｅＬａ細胞の内部で変更されなかったことを示す。これらの結果は、細胞構造が元の状態のまま維持されていることを示す。
【０１７３】
表１は以下に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体、細胞上清（ＳＮ）およびＨｅＬａ細胞（ＵＶ光への曝露の有／無およびＮ−アセチルシステインを用いた処理の有／無）内の光物理的パラメーターの一部を例示する。
表１
【表２】
2018530743.tif 000012
【０１７４】
Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］は有望な光物理的特性を示し、そしてそれは、量子収率およびルミネセンス寿命に関して最高値である。表１のデータは、様々な試験条件下、ＭＣが細胞培養培地中および細胞内で完全な状態でとどまることを示す追加的な定量データである。
【０１７５】
細胞培養培地中では、２つの寿命の始まりを観察し、ここで、第１の寿命は、Ｈ2Ｏ中のＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］に関して得られたものに匹敵し、それに対し、第２の寿命は、はるかに長かった。ＵＶ光に曝露したＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を伴ったＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地では、より高いパーセンテージの２．寿命（３９％）が見られたが、それに対して、ＵＶへの曝露なしでは、２．寿命は１１％であった。
【０１７６】
これらの結果から、すべての試験条件下で、「細胞内」が長寿命の成分に影響を及ぼしていることを強調することは非常に重要である。
【０１７７】
ＨｅＬａ細胞内部において、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］が、すべての試験条件の９０％超で、支配的な長寿命を有したという事実を説明するために、さらなる試験を実施する必要がある。
【０１７８】
ＨｅＬａ癌細胞におけるＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の光物理的特性
【０１７９】
Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（無細胞）に組み入れ、そして、ＵＶ光への曝露ありまたはなしで、ＨｅＬａ細胞内に組み込んだ。結果を、図２０Ｅ（補正および正規化した励起）および２０Ｆ（補正および正規化した発光）に示す。Ｎｄから生じた、独特な発光（図２１Ｂ）は、Ｎｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体のルミネセンス特性が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地または（ＵＶ光への曝露あり／なしの）ＨｅＬａ細胞の内部で変更されなかったことを示す。これらの結果は、細胞構造が元の状態のまま維持されていることを示す。
表２は、以下で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中およびＨｅＬａ細胞（ＵＶ光への曝露あり／なし）内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］錯体に関する光物理的パラメーターの一部を例示する。
表２
【表３】
2018530743.tif 000013
【０１８０】
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中およびＨｅＬａ細胞内のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］の光物理的結果は、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］のものと同様であった。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中では、長寿命の成分が存在し始める。その培地をＵＶ光に曝露したときに、長寿命の成分のより高い貢献があった。ＨｅＬａ細胞内部のＮｄ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］に関して、長寿命の成分の１００％が存在した。
【０１８１】
実施例８−ラマン分光法
【０１８２】
ラマン分光法マップを、生きているＨｅＬａ細胞、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって固定したＨｅＬａ細胞、メタノール（ＭｅＯＨ）によって固定したＨｅＬａ細胞、ならびに（実施例１に記載の）本明細書中に開示した例示の方法を使用してＹｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］によって固定および染色したＨｅＬａ細胞、について収集した。
【０１８３】
ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を用いた細胞の固定：細胞を、実施例１で先に記載したとおり、８ウェルＬａｂ Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒカバーガラス内に播種した。細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（室温）で二回洗浄し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の４％ ＰＦＡ溶液と共に室温にて３０分間インキュベートした。ＰＦＡとのインキュベーション後に、細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（室温）で二回洗浄し、そして、新しい還元培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）＋２％のＳＶＦ）をその細胞に加えた。
【０１８４】
メタノールを用いた細胞の固定：細胞を、実施例１で先に記載したとおり、８ウェルＬａｂ Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒカバーガラス内に播種した。細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（室温）で二回洗浄し、１００％の氷冷メタノールと共に−２０℃にて１０分間インキュベートした。細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（室温）で二回洗浄し、そして、新しい還元培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）＋２％のＳＶＦ）をその細胞に加えた。
【０１８５】
細胞質および核に相当する領域を、様々なマップ、図２１Ａ〜２１Ｄ上にて手作業で選択した。様々なサンプル間の変化を試験するために、バックグランド除去法を適用し、そして、シグナルを、様々な細胞構造、細胞質および核において０〜４０００ｃｍ-1の範囲で収集し、核酸およびタンパク質から生じる特定の振動のバリエーション、特に、細胞内の、タンパク質、脂質、および炭水化物の分布を反映するので、細胞オルガネラを局在化するのに使用されることも多い、２８００〜３３００ｃｍ-1におけるＣＨ振動バンド、ならびに３１００〜３６５０ｃｍ-1の範囲に及ぶＯＨバンド、を観察することを可能にした。最大ＣＨバンドシグナルを有するものに相当する平均スペクトルを（例えば、細胞質および核）、各サンプルについて抽出した。結果では、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いて固定したＨｅＬａ細胞が、ＰＦＡおよびメタノールで固定したものと非常に類似した生体分子プロファイルを示す。よって、生細胞に関する主な違いは、ＰＦＡを用いた固定で既に報告されているチトクロームｃに相当する７５２ｃｍ-1ピーク強度の低下であった（Okada et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012) 28-32）。
しかしながら、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いた固定に関して観察される生体分子プロファイルにおける変化を完全に理解するために対応するピークを完全に定量化および同定するには、ラマン発光シグナルのより詳細な分析が必要である。
【０１８６】
落射蛍光顕微鏡によるフォトブリーチング試験
落射蛍光顕微鏡下で実施したフォトブリーチング試験の間、ＰＩで標識した壊死性ＨｅＬａ細胞に、５５０ｎｍバンドパス２５ｎｍフィルタを用いて８分間照射し、そして、以下のフィルタキューブ：励起のための５５０ｎｍバンドパス２５ｎｍ、および発光のための６０５ｎｍバンドパス７０ｎｍ、を用いて１０秒毎に画像を得た。同じ試験を、４４７ｎｍバンドパス６０ｎｍフィルタを用いて励起され、そして、以下のキューブ：励起のための４４７ｎｍバンドパス６０ｎｍ、およびＮＩＲ範囲内のＹｂ3+発光のためのロングパス８０５ｎｍフィルタを用いて１０秒毎に画像を得る、Ｙｂ3+［Ｚｎ（ＩＩ）ＭＣpyzHA］を用いて実施した。
【０１８７】
本明細書中に提供された範囲は、記載範囲及び記載範囲内の任意の値又は副次範囲を包含することは理解されるべきである。例えば、約４５μＭ〜約４００μＭは約９０μＭ〜約４００μＭの明確に示された制限値だけでなく、９９．５μＭ、２００μＭなどの個々の値及び約１００μＭ〜約３５０μＭなどの副次範囲をも包含するものと解釈されるべきである。さらに、値を記載するために「約」を使用するときに、これは記載値からの小さい変動（＋／−１０％まで）を包含することが意図される。
【０１８８】
「一例」、「別の例」、「ある例」などの本明細書全体にわたる参照は、該例との関係で記載される特定の要素（例えば、特徴、構造及び／又は特性）は本明細書中に記載される少なくとも１つの例に含まれ、そして他の例では存在しても又はしなくてもよいことを意味する。さらに、任意の例に関して記載される要素は文脈が明らかに指示しない限り、様々な例で任意の適切な様式で組み合わされることができることは理解されるべきである。
【０１８９】
本明細書中に開示した例を記載しそして請求する際に、単一形「a」、「an」及び「the」は、文脈が別の指示をしない限り、複数の指示物を包含する。
【０１９０】
いくつかの実施例を詳細に記載してきたが、開示の実施例が変更され得ることは当業者に明らかであろう。それゆえ、上記の記載は非限定的であると考えられるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月10日(2018.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を同時に固定および染色する方法であって：
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で前記細胞をインキュベートし、ここで、該ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベートした前記細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に前記溶液中で前記細胞をインキュベートし続けること、
を含む方法。
【請求項２】
前記溶液は、培地中にＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含し；該溶液中のＬｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体の濃度は、約９０μＭ〜約４００μＭの範囲に及ぶ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液中で前記細胞をインキュベートする前に、前記細胞を培養することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最初に、約１０分〜約３時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ１）にわたり、前記細胞をインキュベートし；
約５分〜約１０分の範囲に及ぶ時間（Ｔ２）にわたり、インキュベートした前記細胞をＵＶ光に曝露し；
約１時間〜約２時間の範囲に及ぶ時間（Ｔ３）にわたり、前記細胞をインキュベートし続けること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
約１分〜約５分の範囲に及ぶ時間（Ｔ４）にわたり、インキュベートした前記細胞を、追加のＵＶ光に曝露することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＨＡ配位子は、ピラジンヒドロキシメート、キノキサリンヒドロキシメート、キナルジンヒドロキシメート、およびその組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、以下の：
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キノキサリンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン；または、
［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（キナルジンヒドロキシメート）１６（ピリジン）8］対イオン、
のうちの１つであり、前記Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
前記対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、メタラクラウン錯体の混合物を含み；
前記メタラクラウン混合物中の各種は、［Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ピラジンヒドロキシメート）x（キノキサリンヒドロキシメート）y（ピリジン）8］対イオン｛式中、ｘ＋ｙ＝１６であり；
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）は、Ｙ3+、Ｌａ3+、Ｃｅ3+、Ｐｒ3+、Ｎｄ3+、Ｐｍ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｔｍ3+、Ｙｂ3+、およびＬｕ3+から成る群から選択され；そして、
前記対イオンは、トリフラート、メシラート、ベシラート、カンシラート、エジシラート、エストレート、エシレート、ナプシラート、トシラート、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、スルファート、カルボナート、アセタート、ホスファート、およびスルホナートから成る群から選択される｝である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記培地は血清添加培地である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＶ光はＵＶ−Ａ光である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＵＶ光曝露は、少なくともいくつかの前記細胞の死滅を引き起こし；かつ、前記細胞をインキュベートし続けた後、前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体は、少なくともいくつかの死細胞の核および細胞質内に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
光学イメージング方法であって：
以下の：
最初に、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を包含する溶液中で細胞をインキュベートし、ここで、前記ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子であり；
インキュベートした前記細胞を紫外（ＵＶ）光に曝露し；そして、
ＵＶ光曝露後に、前記溶液中で前記細胞をインキュベートし続けること、
によって同時に固定および染色された細胞を形成し；
前記同時に固定および染色された細胞を、落射蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、およびその組み合わせから成る群から選択される光学イメージング技術に供すること、
を含む方法。
【請求項１３】
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のＬｎ（ＩＩＩ）を変更することによって、前記同時に固定および染色された細胞、の励起応答を調整するか；または、
前記Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体のヒドロキシメート配位子を変更することによって、前記同時に固定および染色された細胞、の発光応答を調整すること、
のいずれかをさらに含む、請求項１２に記載の光学イメージング方法。
【請求項１４】
壊死細胞の選択的標識方法であって、前記方法が、Ｌｎ（ＩＩＩ）Ｚｎ16（ＨＡ配位子）16メタラクラウン錯体を含む溶液中で細胞をインキュベートすることを含み、ここで、前記ＨＡ配位子はヒドロキシメート配位子である、方法。
【国際調査報告】
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2018530743.tif 000044
2018530743.tif 000045