(57)【要約】改変初代血液及び単球由来樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、上記樹状細胞、ならびにこれを作製及び使用する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2018531022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変初代血液樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、ＣＤ２０５＋及びＣＤ１１ｃ＋である、前記樹状細胞。
【請求項２】
前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項４】
前記樹状細胞が、構成的な成熟及び活性化表現型を有する、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項５】
前記樹状細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項６】
１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項７】
前記樹状細胞成熟及び活性化マーカーが、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項６に記載の樹状細胞。
【請求項８】
外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項９】
１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項１０】
ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている、請求項９に記載の樹状細胞。
【請求項１１】
１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を提示する、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項１２】
前記抗原が、がん抗原である、請求項１１に記載の樹状細胞。
【請求項１３】
前記抗原が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体である、請求項１２に記載の樹状細胞。
【請求項１４】
前記抗原が、全長ヒトＩκＢα、及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素の配列番号９のアミノ酸３０１〜７００を含むフラグメントを含む融合タンパク質を含む、請求項１３に記載の樹状細胞。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、配列番号１３を有する、請求項１４に記載の樹状細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、ＨＬＡ−制限方式で前記抗原を提示する、請求項１１に記載の樹状細胞。
【請求項１７】
前記抗原が、ウイルス形質転換によって導入される、請求項１１に記載の樹状細胞。
【請求項１８】
前記ウイルスが、レンチウイルスである、請求項１７に記載の樹状細胞。
【請求項１９】
抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球をプライミングすることが可能である、請求項１１に記載の樹状細胞。
【請求項２０】
非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球をプライミングすることが可能である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項２１】
改変単球由来樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、ＣＤ２０５＋である、前記樹状細胞。
【請求項２２】
前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、請求項２１に記載の樹状細胞。
【請求項２３】
ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ７０からなる群から選択される１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、請求項２１に記載の樹状細胞。
【請求項２４】
改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、前記方法。
【請求項２５】
改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、前記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）前記細胞を培養して、成熟樹状細胞への分化を誘導することと；
ｉｖ）前記培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、前記方法。
【請求項２６】
改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）ＰＢＭＣを含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）培養下の前記細胞を有効量のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）によって処理することと；
ｉｉｉ）培養下の前記細胞を有効量のＩＬ−２によって処理することと；
ｉｖ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、前記細胞を培養することと；
ｖ）前記培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、及びＨＴＬＶ−３からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
単球に由来する未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、前記方法。
【請求項２９】
単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｉｉ）前記細胞を培養して樹状細胞への分化を誘導することと
を含む、前記方法。
【請求項３０】
単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において前記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｖ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において細胞を発現する前記機能性Ｔａｘタンパク質を培養することと
を含む、前記方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の方法によって作製される樹状細胞。
【請求項３２】
細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって：
請求項１に記載の樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒にある期間培養することを含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、前記方法。
【請求項３３】
前記ナイーブリンパ球を含む細胞が、ナイーブＰＢＭＣを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナイーブリンパ球及び前記樹状細胞が、同種異系である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞毒性Ｔリンパ球が、抗原特異的であり、ＨＬＡ−制限方式で、標的細胞の細胞溶解を誘導する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞毒性Ｔリンパ球が、非ＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷する可能性があるＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
対象において疾患または状態を処置する方法であって：
前記対象に、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与すること
を含み、前記細胞毒性Ｔリンパ球が、請求項３２に記載の方法によって産生される、前記方法。
【請求項３８】
対象において疾患または状態を処置する方法であって：
前記対象に、有効量の、請求項１に記載の樹状細胞を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記疾患が、がんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が、がんである、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
この出願は、２０１５年１０月１９日に提出された米国仮特許出願第６２／２４３，１７７号の利益を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された材料の参照による組み込み
同時に提出されたコンピュータ読み取り可能な配列リストは、全体が参照により本明細書に組み込まれ、以下のように同定される：２０１６年１０月１９日に作成された名称「ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、の１つの６０，９９０Ｂｙｔｅ  ＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００３】
本発明の分野は、生物学及び医薬の分野に概して関する。上記分野はまた、がんなどの疾患の処置において有用である、樹状細胞の産生のための方法及び関連組成物にも関する。
【背景技術】
【０００４】
プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中でも、樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的な適応免疫応答を媒介する際にナイーブＴリンパ球をプライミングする独特の能力を保持する。Ｐａｌｕｃｋａ，Ｋ．＆  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，２６５−２７７（２０１２）。ＤＣはまた、γσＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖を誘導して、先天免疫を適応免疫応答にブリッジングする能力も保有する。Ｔｙｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｇ．，Ｍｏｓｅｒ，Ｂ．＆  Ｅｂｅｒｌ，Ｍ．ｈｕｍａｎ  Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｎａｔｅ  ａｄａｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９６，１０−２１（２０１５）；ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｊ．Ｊ．，Ｗｉｍｍｅｒｓ，Ｆ．，Ｈａｔｏ，Ｓ．Ｖ．，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｉ．Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｋｏｌｄ，Ａ．Ｅ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ  ｗｉｔｈ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＣ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（商標）ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３４：５１７−５３６（２０１４）。ＤＣは、骨髄から進化し、血液循環を介してリンパ及び非リンパ組織に移動する。血液中では、ＤＣの大部分が未成熟であり、また、侵入する病原体から外来抗原を取り込む可能性がある。外来抗原の取り込みの際、未成熟ＤＣは、多くの病原体認識受容体（ＰＲＲ）、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、及びサイトカイン受容体の活性化を通した複合体成熟及び活性化プロセスを経る。Ｐｒａｄｅｒｅ，Ｊ．−Ｐ．，Ｄａｐｉｔｏ，Ｄ．Ｈ．＆  Ｓｃｈｗａｂｅ，Ｒ．Ｆ．Ｔｈｅ  Ｙｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３３，３４８５−３４９５（２０１４）；Ｄｚｏｐａｌｉｃ，Ｔ．，Ｒａｊｋｏｖｉｃ，Ｉ．，Ｄｒａｇｉｃｅｖｉｃ，Ａ．＆  Ｃｏｌｉｃ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２，２０−３３（２０１２）；Ｈａｍｍｅｒ，Ｇ．Ｅ．＆  Ｍａ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，７４３−７９１（２０１３）。成熟しかつ活性化されたＤＣは、細胞表面共刺激分子、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６を特徴的に発現し、抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体をアセンブルし、二次リンパ組織に移動して抗原特異的なＴ細胞増加を促進する。
【０００５】
ＤＣは、血液中、１％の免疫細胞を構成する。ＣＤ１１ｃ＋骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）及びＣＤ３０３＋形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含めた２つの主なタイプの血液ＤＣが特徴付けられている。Ｍｉｌｄｎｅｒ，Ａ．＆  Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，６４２−６５６（２０１４）。ｐＤＣは、病原体に遭遇する際に多量のインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）を分泌することによって抗炎症性応答を媒介するのに重要であるが、ｍＤＣは、ナイーブＴ細胞をプランミングするように抗原提示において重要な役割をする。Ｏｓｕｇｉ，Ｙ．，Ｖｕｃｋｏｖｉｃ，Ｓ．＆  Ｈａｒｔ，Ｄ．Ｎ．Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ１１ｃ＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １００，２８５８−２８６６（２００２）；Ｋａｓｓｉａｎｏｓ，Ａ．Ｊ．，Ｊｏｎｇｂｌｏｅｄ，Ｓ．Ｌ．，Ｈａｒｔ，Ｄ．Ｎ．＆  Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｋ．Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ＤＣ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，４５−５４（２０１０）。ｍＤＣのＣＤ１１ｃ＋サブセットは比較的豊富であり、主要でないサブセットまたはＣＤ１４１＋ｍＤＣは、ＣＤ８Ｔ細胞に対してＭＨＣ−Ｉにおいて細胞外抗原を交差提示して、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に分裂する潜在能力を示す。Ｊｏｎｇｂｌｏｅｄ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４１＋  （ＢＤＣＡ−３）＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ）  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ＤＣ  ｓｕｂｓｅｔ  ｔｈａｔ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７，１２４７−１２６０（２０１０）；Ｂａｃｈｅｍ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＸＣＲ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１４１＋  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７，１２７３−１２８１（２０１０）。ヒト及びマウスのＤＣサブセットの比較評価によって転写プロファイリングを分析することにより、ヒトＣＤ１４１＋ＤＣが、抗原交差提示を媒介する際のＤＣの主なサブセットの、マウスＣＤ８＋ＤＣの対応部分に密に関係することが提案されている。ＤＣは、侵入する病原体によってほとんど感染されないため、最終分化した細胞毒性エフェクタＴ細胞のＤＣ−媒介交差提示及び誘導は、そのため、病原性ウイルス及びがん細胞に対する適応免疫を発達させるのに必須のステップである。
【０００６】
少量の血液ＤＣのため、現在のＤＣ法においては、サイトカイン及びＰＲＲ刺激因子の混合物による複合体成熟及び活性化プロセスを通して抗原負荷単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）が頻繁に利用されている。Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ，Ｐ．，Ｂｏｇｈ，Ｍ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｏｎ，Ｍ．＆  Ｚｏｃｃａ，Ｍ．Ｆａｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６０，５６−６２（２００９）；Ｊｏｌａｎｄａ，Ｉ．，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｍ．，Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．，Ｐｕｎｔ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１１３−１２５（２００５）。この方法は、臨床がんワクチン試験において広く利用されてきたが、かかるアプローチの臨床的有益性はむしろ限定されている。このアプローチには、見たところいくつかの欠点があるようである。初代血液ＤＣと比較して、ＭｏＤＣは、インビトロ由来マクロファージに、より密接に関係している。Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，Ｒ１７（２００８）。加えて、インビトロ発達ＭｏＤＣは、制限された成長可能性を有しており、また、培養において長時間ほとんど維持され得ないため、いくつかの一連のワクチン供給には繰り返しのＭｏＤＣ調製が必要である。これらの制限に対処するために、いくつかのヒトＤＣモデルが、ＤＣ生物学を理解し、かつ、がんワクチンとしての潜在的用途を評価するために開発されている。ｖａｎ  Ｈｅｌｄｅｎ，Ｓ．Ｆ．，ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，Ｆ．Ｎ．＆  Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１７，１９１−１９７（２００８）。例えば、ＭＵＴＺ−３骨髄性白血病細胞株は、インビトロで成熟してＤＣ様細胞に分化することができる。Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＭＵＴＺ−３，ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ３４＋ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １００，７０１−７０３（２００２）。ＭＵＴＺ−３細胞は、培養において前ＤＣ段階で安定して維持されて、がんワクチンの開発のための適量の誘導性ＤＣ様細胞を付与することができる。Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓ，Ｓ．Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ａ．Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｏｏｓｄｒｅｃｈｔ，Ａ．Ａ．，Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｒ．Ｊ．＆  ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｌ，Ｔ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ＤＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＤＣ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８４，１３６４−１３７３（２００８）；Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＭＵＴＺ−３  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５５，１４８０−１４９０（２００６）。
【０００７】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を一次感染させて、感染個体の３〜５％の間でＴ細胞の悪性転換及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬ）の発症を引き起こす。Ｉｓｈｉｔｓｕｋａ，Ｋ．＆  Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １５，ｅ５１７−ｅ５２６（２０１４）。他のＨＴＬＶウイルスも知られている。例えば、ＨＴＬＶ−２は、その病原性の対応部分、ＨＴＬＶ−１に関係するが、ＨＴＬＶ−２は、ヒトにおける白血病の発症と関連していなかった。Ｃｉｍｉｎａｌｅ，Ｖ．，Ｒｅｎｄｅ，Ｆ．，Ｂｅｒｔａｚｚｏｎｉ，Ｕ．＆  Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｇ．ＨＴＬＶ−１  ａｎｄ  ＨＴＬＶ−２：ｈｉｇｈｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（３９８）：１−９（２０１４）。ＨＴＬＶ−１のウイルスＴａｘタンパク質は、プロセスにおいて中心的な役割をして、成人Ｔ細胞白血病をもたらすと考えられている。Ａｚｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔａｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−Ｉ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４１：２０（２００４）。ＨＴＬＶ−１もまた、樹状細胞を感染させて、細胞フリーウイルスをＣＤ４＋Ｔ細胞に伝染性にさせる。Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｐｅｔｒｏｗ−Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｅ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｒｕｓｃｅｔｔｉ，Ｆ．Ｗ．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＨＴＬＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４，４２９−４３６（２００８）；Ｊａｉｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，１０９０８−１０９２１（２００９）。ＨＴＬＶ−１感染患者の非常に低い割合で、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症及び熱帯性痙性不全対まひ（ＨＡＭ／ＴＳＰ）と呼ばれる神経炎症性障害が生じる。Ｙａｍａｎｏ，Ｙ．＆  Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｔｙｐｅ  １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ／ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，３８９（２０１２）。Ｔａｘ−反応性ＣＤ８＋ＣＴＬの発生はＨＡＭ／ＴＳＰの病因において役割を果たすが、Ｔａｘ特異的なＣＴＬは、ＡＴＬに対して防御免疫を発揮することが認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特に血液から樹状細胞を生成するための、樹状細胞ワクチンとしての使用のための、及び対象において治療的に使用され得る細胞毒性Ｔリンパ球を活性化するための新規の方法を開発する必要性がある。本発明は、この必要性を満たし、また、さらなる利益も提供する。
【０００９】
この背景情報は、情報目的のみで提供されている。必ずしも承認を意図するものではなく、また、前述の情報のいずれも、本発明に対する先行技術を構成するものであると解釈されるべきでない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
実施形態の上記の概要及び以下の詳細な説明の両方が例示的であること、そのため、実施形態の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００１１】
本明細書において、白血病を引き起こさないレトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−２）、その病原性の対応部分ＨＴＬＶ−１に関係するウイルスからのウイルスタンパク質Ｔａｘによって初代樹状細胞を開発するための方法を提供する。
【００１２】
Ｔａｘは樹状細胞を活かして、その成熟／活性化、及び、その後の、分裂した細胞毒性Ｔリンパ球の応答の誘導をもたらすことができることが本明細書において示されている。本開示において、ＨＴＬＶ−２Ｔａｘは、初代血液樹状細胞株及び単球由来樹状細胞を確立する分子ツールとして利用されている。かなり強力な抗がん細胞毒性リンパ球の生成を可能にするヒト初代血液樹状細胞及び単球由来樹状細胞を、これを作製及び使用する方法と併せて提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、改変初代血液樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、上記樹状細胞を提供する。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。改変初代血液樹状細胞はＣＤ２０５＋及びＣＤ１１ｃ＋である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４＋である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＴＬＲ７の切断型を発現する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、ＴＬＲ９を発現する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＩＬ−１５を産生する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、無視できるレベルのＩＬ−１０及びＴＧＦβを産生する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、リン酸化ｐＲｂ、リン酸化ｃｄｃ、リン酸化Ｓｔａｔ１、リン酸化Ｓｔａｔ３、及びリン酸化Ｓｔａｔ５の１以上を発現する。いくつかの実施形態において、転写因子ＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１は、改変初代血液樹状細胞において活性である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２．１である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、１以上の外生的に添加された抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を収容する。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する。いくつかの実施形態において、抗原は、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３を含む。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−制限方式でがん抗原を提示する。いくつかの実施形態において、がん抗原が、ウイルス形質転換によって導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、上記方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、ｉｉｉ）上記細胞を培養してその成熟及び活性化を誘導することをさらに含む。改変初代血液樹状細胞の成熟及び活性化を誘導する培養ステップは、限定的でない。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のサイトカインの存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、有効量のＩＬ−２を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、上記方法は、培養細胞からＴ細胞を枯渇させることをさらに含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、上記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）上記細胞を培養して、成熟樹状細胞への分化を誘導することと；
ｉｖ）培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、上記方法を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプル、例えばＰＢＭＣのサンプルを付与することと；
ｉｉ）培養下の上記細胞を有効量のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）によって処理することと；
ｉｉｉ）培養下の上記細胞を有効量のＩＬ−２によって処理することと；
ｉｖ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、上記細胞を培養することと；
ｖ）培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、上記方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、ロイコパックから単離されている。いくつかの実施形態において、ＰＨＡの濃度は、約１〜５μｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、細胞は、約１２時間〜約３６時間、ＰＨＡで処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理されて、ＩＬ−２を含む培地において、ある期間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−２を含む培地において約４〜５日間の期間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、ステップｉｉｉ）の後、機能性Ｔａｘタンパク質を発現するようにマニピュレートされる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞は、機能性Ｔａｘタンパク質をコードするウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、細胞は、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地においてさらに培養される。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、ＩＬ−２を含む培地において約２〜３ヶ月間さらに培養される。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、ヒト血清及び約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、ヒト血清及び約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地において約２〜３ヶ月間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、５％熱不活化ヒトＡＢ血清及び約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地において培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、１０％ウシ胎児血清及び約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地を含む培地において培養される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞に結合する分子を含む組成物によって枯渇される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗体によって枯渇される。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、電磁ビーズにコンジュゲートされている。
【００２６】
別の態様において、本発明は、改変単球由来樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、上記樹状細胞を提供する。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである。改変単球由来樹状細胞は、ＣＤ２０５＋である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ７０からなる群から選択される１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、４−１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４をさらに発現する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、培養で最大３ヶ月間増殖することが可能である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＴＬＲ７の切断型を発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＴＧＦβを産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＩＬ−１５を産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、以下：ｃ−Ｍｙｃ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、リン酸化ｐＲｂ、リン酸化ｃｄｃ２、リン酸化Ｓｔａｔ１、リン酸化Ｓｔａｔ３、及びリン酸化Ｓｔａｔ５；の１以上を発現する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を発現する。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する。いくつかの実施形態において、抗原は、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＬＡ−制限方式でがん抗原を提示する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球、例えばＰＢＭＣの集団をプライミングすることが可能である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球、例えばＰＢＭＣの集団をプライミングすることが可能である。
【００３１】
別の態様において、本発明は、単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）単球由来の未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、上記方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記方法は、パートｉ）の前に、単球細胞を培養して未成熟樹状細胞へのその分化を誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、分化は、単球を、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４：ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３；ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１５；ならびにＩＦＮαを含む、未成熟樹状細胞への単球の分化を誘導する有効量の組成物を含む培養培地と接触させることによって誘導される。いくつかの実施形態において、単球は、未成熟樹状細胞への分化を誘導するための有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において培養される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞を培養してその成熟及び活性化を誘導することを含む、パートｉｉ）後のステップをさらに含む。単球由来樹状細胞の成熟及び活性化を誘導するための培養ステップは、限定的でない。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のサイトカインの存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地においてさらに培養される。
【００３４】
別の態様において、本発明は、単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において上記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｖ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において細胞を発現する機能性Ｔａｘタンパク質を培養することと
を含む、上記方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ステップｉｖ）の後に、上記方法は、有効量のＩＬ−２を含む培地において上記細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−４及び／またはＧＭ−ＣＳＦは、Ｆｃ４に融合されている。いくつかの実施形態において、接着単球は、ＰＢＭＣ、例えば、約４００００００のＰＢＭＣに由来する。いくつかの実施形態において、パートｉｉ）の培養は、細胞を、２９３細胞を産生するＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４からの馴化培地を含む培地において培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、約１：１０希釈で約７日間、馴化培地を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質をコードするウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態において、細胞は、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、細胞は、約１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ１６４０を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、培養ステップｉｖ）は、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４及びＩＬ−４−Ｆｃ４の存在下で約５〜７日間、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地において細胞を発現するＴａｘタンパク質を培養し、約１００〜２００ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、培養において上記細胞を維持することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、単球由来樹状細胞を活性化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、活性化することは、有効量のＴＮＦα及びＬＰＳによって細胞を刺激することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、約２日間刺激される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって、初代血液または単球由来樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒にある期間培養することを含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって
ｉ）本発明の樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒に第１期間培養して、細胞の混合培養物を作り出すことと；
ｉｉ）細胞の混合培養物をＩＬ−２で処理し、上記細胞を第２期間培養し続けることと
を含み、
これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球を含む細胞は、ナイーブＰＢＭＣを含む。いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球は、ロイコパックから単離されている。いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球及び樹状細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態において、樹状細胞対ナイーブＰＢＭＣの比は、約１：１００である。いくつかの実施形態において、ステップｉ）の培養は、外因性サイトカインを添加することなく行われる。いくつかの実施形態において、第１期間は、約２〜３日間である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、約１００〜２００ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、第２期間は、２〜６週間である。いくつかの実施形態において、細胞毒性Ｔリンパ球は、抗原特異的であり、ＨＬＡ−制限方式で、標的細胞の細胞溶解を誘導する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、細胞毒性Ｔリンパ球は、非ＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷する可能性があるＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、４−１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、４−１ＢＢＬを発現するように改変されている。いくつかの実施形態において、細胞の非ＨＬＡ−制限殺傷は、ＮＫＧ２Ｄのリガンド結合によって媒介される。
【００４２】
別の態様において、本発明は、医薬組成物であって、本発明の方法によって産生される、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を含む、上記医薬組成物を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、細胞毒性Ｔリンパ球が、本発明の初代血液樹状細胞及び／または単球由来樹状細胞を使用して産生される、上記方法を提供する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、細胞毒性Ｔリンパ球が本発明の方法によって産生される、上記方法を提供する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に、有効量の、本発明の初代血液樹状細胞及び／または単球由来樹状細胞を投与することを含む、上記方法を提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に、有効量の、本発明の方法によって産生される初代血液樹状細胞及び／または単球由来樹状細胞を投与することを含む、上記方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、処置される疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、がん細胞は、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。いくつかの実施形態において、処置される対象は、ヒトである。
【００４８】
本発明の他の目的、特徴及び利益は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内での種々の変更及び修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、例示目的のみで付与されていることが理解されるべきである。
【００４９】
当業者は、以下に説明される図が、例示目的のみであることを理解する。図は、本教示の範囲を限定することは何ら意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】樹立ｉｈｖ−ＤＣ細胞株の免疫表現型分析。（ａ）ｉｈｖ−ＤＣ１。（ｂ）ｉｈｖ−ＤＣ２。（ｃ）健常な血液ドナーの接着単球からのＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４刺激／分化ＤＣの画像。（ｄ）Ｔａｘ−ＧＦＰレンチウイルスが形質導入されたＭｏＤＣから生成されたＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞の免疫表現型。
【図２】ｉｈｖ−ＤＣにおけるＴＬＲ、サイトカイン及び細胞内シグナル伝達分子の発現プロファイル。（ａ）ＦＡＣＳによって試験されたｉｈｖ−ＤＣ及びＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞におけるＴＬＲ３及びＴＬＲ４の発現。（ｂ）関連の抗体を使用した樹立ＤＣにおけるＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９のイムノブロット分析。サイトカイン発現プロファイルを、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞（ｃ）、ｉｈｖ−ＤＣ２細胞（ｄ）、ＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞（ｅ）及びＴＮＦα／ＬＰＳ−活性化ＭｏＤＣ（ｆ）においてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（ｇ）種々のＤＣにおけるｃ−Ｍｙｃの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（ｈ）樹立ＤＣにおけるＴａｘ−ＧＦＰ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１の発現のイムノブロット分析。ＰＢＬ（正常なドナーからの末梢血リンパ球）及びＭＴ４を対照に使用した。（ｉ）Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、ｐＲｂまたはｃｄｃ２のリン酸化状態を特定の抗リン特異的抗体を使用して試験した。（ｊ）ｉｈｖ−ＤＣから調製された核抽出物を使用したＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１の転写活性の検出のためのＥＭＳＡアッセイ。
【図３】ｉｈｖ−ＤＣによる抗原特異的なＣＴＬの誘導。（ａ）２色ＦＡＣＳ分析によるｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬの免疫表現型。（ｂ）６の血液ドナーから生成されたｉｈｖ−ＤＣ−活性化ＣＴＬにおけるパーフォリン及びグランザイムＢのレベルを関連の抗体を使用したイムノブロットによって評価した。（ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲによるｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬのサイトカイン発現プロファイル。（ｄ）ＭＴ４Ｌ細胞（ルシフェラーゼを発現するＭＴ４細胞）をＨＬＡ−Ａ２．１レンチウイルスによって形質導入してＭＴ４Ｌ−Ａ２．１細胞を生成する。ＭＴ４Ｌ及びＭＴ４Ｌ−Ａ２．１細胞におけるＨＬＡ−Ａ２発現を、抗ＨＬＡ−Ａ２−ＡＰＣを使用したＦＡＣＳによって検証した。（ｅ）ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬによる改変ＭＴ４細胞の細胞溶解を決定するための細胞生存アッセイ。（ｆ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ルシフェラーゼ及びＨＬＡ−Ａ２レンチウイルスによって、Ｔａｘ−ＦＬＡＧレンチウイルスと一緒にまたはこれを用いずに形質導入して、３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１及び３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１／Ｔａｘ細胞を生成する。ＦＡＣＳによる３Ｔ３細胞におけるＨＬＡ−Ａ２染色を左パネルに示しているが、Ｔａｘ発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した免疫蛍光イメージングによって決定した（右パネル）。細胞生存アッセイを実施して、ルシフェラーゼアッセイ（ｇ）及び細胞画像解析（ｈ）を使用して、ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬによる３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１及び３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１／Ｔａｘ細胞の細胞溶解を決定した。＊＊：２−テイルスチューデントｔ−検定によって決定されたｐ＜０．０１。
【図４】ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬによるＨＬＡ−制限がん殺傷。ルシフェラーゼアッセイ及び細胞画像解析（ｄ）を使用して、ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬによるＡ３７５細胞（ａ）、ＰＡＮＣ−１細胞（ｂ）及びＨ１２９９細胞（ｃ）の細胞溶解を決定するための細胞生存アッセイ。（ｅ）Ａ３７５、ＰＡＮＣ−１、Ｈ１２９９及びＨ１２９９−ＨＬＡ−Ａ２．１細胞におけるＨＬＡ−Ａ２発現のＦＡＣＳ分析。Ｈ１２９９−ＨＬＡ−Ａ２．１細胞をＨ１２９９細胞へのＨＬＡ−Ａ２．１のレンチウイルス形質転換によって生じさせた。細胞生存アッセイを行って、ルシフェラーゼアッセイ（ｆ）及び細胞画像解析（ｇ）を使用して、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによるＨ１２９９／ＨＬＡ−Ａ２．１細胞の細胞溶解を決定した。＊＊：２−テイルスチューデントｔ−検定によって決定されたｐ＜０．０１。
【図５】ｈＴＥＲＴ特異的なＣＴＬを生成させるためのｉｈｖ−ＤＣ１細胞におけるｈＴＥＲＴフラグメントの発現。（ａ）ＨＬＡ−Ａ２．１レンチウイルスによって形質導入されたｉｈｖ−ＤＣ１細胞におけるＨＬＡ−Ａ２発現。（ｂ）ｈＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）における６つのＨＬＡ−Ａ２−制限ＣＴＬエピトープを表示した。（ｃ）ＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）によるＩκＢαの融合によってｐＴＥＲＴを生成し、これを、レンチウイルス形質転換を介してｉｈｖ−ＤＣ１細胞内に送達した。ｐＴＥＲＴの発現を、ＤＭＳＯによってまたはＭＧ１３２（５μＭ）によって１時間にわたって前処理したｉｈｖ−ＤＣからの全細胞抽出物を使用して抗ＩκＢαイムノブロットによって検証した。（ｄ）抗ＦＬＡＧ抗体染色を使用した、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）発現の画像。細胞生存アッセイを行って、ルシフェラーゼアッセイ（ｅ）及び細胞画像解析（ｆ）を使用して、ｉｈｖ−ＤＣ１−またはｉｈｖ−ＤＣ１／ｐＴＥＲＴ−活性化ＣＴＬによる３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１／ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）細胞の細胞溶解を決定した。＊＊：２−テイルスチューデントｔ−検定によって決定されたｐ＜０．０１。
【図６】ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋ＣＴＬによる非ＨＬＡ−制限がん細胞殺傷。（ａ）ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬの免疫表現型。（ｂ）ＦＡＣＳによって試験された種々のがん細胞株におけるＭＩＣＡ／Ｂ発現。細胞生存アッセイを行って、ルシフェラーゼアッセイを使用して、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによるＨ１２９９細胞（ｃ）、ＨｅＬａ細胞（ｄ）及びＡ３７５細胞（ｅ）の細胞溶解を決定した。示されたＥ：Ｔ比においてｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによってインキュベートした種々のがん細胞株（ｆ）及び正常な線維芽細胞（ｇ）の細胞画像解析。＊＊：２−テイルスチューデントｔ−検定によって決定されたｐ＜０．０１。
【図７】ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＮＫＧ２Ｄ及びそのリガンドの相互作用を介してがん細胞を殺傷する。（ａ）Ｋ５６２細胞を、アイソタイプＩｇＧ抗体または抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、示したＥ：Ｔ比においてｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬと４時間混合した。細胞溶解をルシフェラーゼアッセイによって決定した。（ｂ）Ｋ５６２細胞を、アイソタイプＩｇＧ抗体及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下、示した用量で４時間、固定のＥ：Ｔ比（２．５：１）でｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬと混合した。（ｃ）Ａ３７５細胞を、アイソタイプＩｇＧ抗体及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、示したＥ：Ｔ比においてｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬと混合した。細胞溶解をルシフェラーゼアッセイによって決定した。（ｄ）３Ｔ３Ｌ細胞をｈＭＩＣＡレンチウイルスによって形質導入し、ｈＭＩＣＡの発現をＦＡＣＳによって試験した。細胞生存アッセイを行って、ルシフェラーゼアッセイ（ｅ）及び細胞画像解析（ｆ）を使用して、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによる３Ｔ３Ｌ／ベクター及び３Ｔ３Ｌ／ｈＭＩＣＡ細胞の細胞溶解を決定した。＊＊：２−テイルスチューデントｔ−検定によって決定されたｐ＜０．０１。
【図８】ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＮＫＧ２Ｄ依存性で、乳がん細胞を殺傷する。細胞生存アッセイを行って、ルシフェラーゼアッセイ（ａ）及び細胞画像解析（ｂ）により、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによるＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ及びＨＣＣ１９５４細胞の細胞溶解を決定した。（ｃ）ＦＡＣＳによって試験したＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ及びＨＣＣ１９５４細胞におけるＭＩＣＡ／Ｂ発現。（ｄ）ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ及びＨＣＣ１９５４細胞を、アイソタイプＩｇＧ抗体（１００μｇ／ｍｌ）またはＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（１００μｇ／ｍｌ）の存在下、示したＥ：Ｔ比においてｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによってインキュベートした。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによる種々のがん細胞株の細胞溶解をルシフェラーゼアッセイによって決定した。
【図９】ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＮＳＧマウスにおけるＨＣＣ１９５４腫瘍の成長を阻害する。乳がん異種移植及びＣＴＬ治療を方法において説明した。（ａ）対照及びＣＴＬ処置群のマウスの腫瘍体積。（ｂ）終点において採取した腫瘍の画像。（ｃ）終点における腫瘍重量。（ｄ）対照群及びＣＴＬ処置群における肺組織のＨＥ染色。（ｅ）ＩＨＣ法を使用した腫瘍及び種々の組織の抗ヒトＣＤ３染色。
【図１０】ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＮＳＧマウスにおけるＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍の成長を阻害する。（ａ）腫瘍体積。（ｂ）終点における腫瘍重量。（ｃ）マウス体重。（ｄ）対照群及びＣＴＬ処置群におけるマウスの肺組織のＨＥ染色。（ｅ）ＩＨＣ法を使用した腫瘍及び種々の組織の抗ヒトＣＤ３染色。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明者は、驚くべきことに、改変樹状細胞を調製する方法を発見した。改変樹状細胞は、初代血液樹状細胞、または単球に由来する樹状細胞のいずれかであり得る。改変樹状細胞は、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する。本発明は、改変樹状細胞、当該細胞を作製及び使用する方法、ならびに当該細胞を含む医薬及びワクチン組成物を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗原負荷樹状細胞は、疾患の処置もしくは防止において、またはＴ細胞の活性化のためのワクチンとして有用であり、そして治療において使用され得る。例えば、抗原負荷樹状細胞は、抗原に対する免疫応答を引き起こすのに使用され得る。これらの細胞は、将来の感染もしくは疾患を防止する、または免疫系を活性化して、限定されないが病原体感染もしくはがんを含めた現在進行中の疾患を処置するためのワクチンとして使用されてよい。抗原負荷樹状細胞は、好適な担体、例えば生理的緩衝液または他の注入可能な液体と共に、ワクチンまたは医薬組成物としての使用のために製剤化され得る。ワクチンまたは医薬組成物は、免疫応答を引き起こすのに十分な治療有効量で投与され得る。
【００５３】
本発明の原理を説明する働きをする、本発明の現在好ましい実施形態を、図及び以下の実施例と一緒に、詳細にここで参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実行するのを可能にするのに十分詳しく記載しており、他の実施形態が利用されてよいこと、ならびに、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、構造的、生物学的、及び化学的変更がなされてよいことが理解される。別途定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語が、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００５４】
本発明の実行は、別途示されていない限り、当該技術分野の技能の範囲内にある、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を用いる。かかる技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５））；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．（１９８８））；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．（１９９９））；及びＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
【００５５】
分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって発行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、２０００（ＩＳＢＮ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓによって発行された、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４（ＩＳＢＮ０６３２０２１８２９）；及びＷｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃによって発行された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５（ＩＳＢＮ０４７１１８６３４１）において見出され得る。
【００５６】
この明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数で使用されている用語が複数も含み、また、その逆も然りである。以下に記載されているいずれかの定義が、参照によって本明細書に組み込まれるあらゆる文献を含めたいずれかの他の文献における語の用法と矛盾している事象では、（例えば用語が元々使用されている文献において）反対の意味が明確に意図されていない限り、以下に記載されている定義が、この明細書及びその付随する特許請求の範囲を解釈する目的で常に支配する。「または（ｏｒ）」の使用は、別途記述されていない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。本明細書及び特許請求の範囲で使用されているとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示していない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「１つの（ａ）細胞」は、その混合物を含めて複数の細胞を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、互換可能であり、限定的であることは意図されていない。さらに、１以上の実施形態の詳細な記載において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用されている場合、当業者は、いくつかの特定の場合において、この実施形態または複数の実施形態が、語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用して代替的に記載され得ることを理解する。
【００５７】
本明細書において使用されているとき、用語「約」は、共に使用されている数字の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
【００５８】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに有効な量である。有効量は、１以上の投与、適用または投薬において投与され得る。例えば、活性化リンパ球に関しての用語「有効量」は、投与されて、例えば、がん細胞の成長を阻害するまたはがん細胞を殺傷する、所望の効果を生じさせる量が意図される。樹状細胞に関連して、「有効量」は、免疫応答を誘導する、例えば、Ｔリンパ球の活性化を誘導することが可能である量が意図される。活性化Ｔリンパ球は、ＨＬＡまたは非ＨＬＡ制限形式で機能することができる。正確な量は、具体的な剤、処置される対象に依り、有効用量を決定するための公知の方法及び技術を使用して当業者によって解明可能である。
【００５９】
本明細書において使用されているとき、「処置する（ｔｒｅａｔ）」ならびにその形態及び時制の全て（例えば、処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」、及び処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」を含む）が、治療的または予防的処置を指すことができる。本発明のある特定の態様において、処置を必要とするものは、（例えば、がんを含む）本発明の病的状態を既に有するものを含み、この場合、処置することは、対象において本発明の病的状態の兆候または症状が改善するように対象（例えば、処置を必要とするヒトまたは他の哺乳動物を含む）に治療有効量の組成物を投与することを指す。かかる改善は、いずれの観察可能または測定可能な改善であってもよい。そのため、当業者は、処置が患者の状態を改善する場合があるが、病的状態の完全な治癒ではない場合があることを理解する。本発明の他のある特定の態様において、処置を必要とするものは、がんを既に有しているもの、ならびに、がんを有する傾向があるもの、またはがん転移が防止されるべきものを含む。
【００６０】
「がん」は、がん細胞が、細胞増殖制御のかなりの損失を特徴とする異常成長表現型を示すように、比較的自律的な増殖を示す細胞の異常な存在を意味している。がん性細胞は、良性または悪性であり得る。種々のタイプのがんが公知であり、処置されるべきがんは、限定的でない。がん細胞は、本明細書において使用されているとき、初代がん細胞だけでなく、がん細胞に由来するいずれの細胞も含む。これは、転移したがん細胞、ならびにがん細胞に由来するインビトロでの培養物及び細胞株を含む。がんとして、限定されないが、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍が挙げられる。
【００６１】
用語「抗原」は、当該分野においてよく理解されており、免疫原性である物質、すなわち、免疫原、ならびに抗原性エピトープを含む。いくつかの実施形態において、本発明の改変初代血液樹状細胞及び単球由来樹状細胞には、他の細胞、例えば、Ｔリンパ球への提示のための１以上の抗原が負荷され得る。抗原負荷樹状細胞は、ワクチンとして、及びＴ細胞のインビトロでの刺激に有用である。
【００６２】
いずれの抗原の使用も、本発明における使用が想定されており、そのため、限定されないが、自己抗原（正常もしくは疾患関連）、感染抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原など）、またはいくつかの他の外来抗原（例えば、食品成分、花粉など）が挙げられることが認識される。用語「抗原」または代替的には「免疫原」もまた、１を超える免疫原の集合に適用され、その結果、複数の免疫原に対する免疫応答が同時に調節され得るようになっている。また、上記用語は、免疫原または抗原の種々の異なる製剤化のいずれかを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗原は、がん細胞または病原体からのものである。いくつかの実施形態において、がん細胞は乳がん細胞である。
【００６４】
抗原は、未成熟または成熟樹状細胞に負荷され得る。抗原が未成熟樹状細胞に負荷されるとき、未成熟樹状細胞は、次いで、自身の負荷のプロセスによって、または本明細書に記載されている他の成熟方法もしくは当業者に公知の代替の成熟方法によって成熟され得る。樹状細胞における抗原の負荷は、限定的でない。いくつかの実施形態において、抗原は、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション及びペプチドパルスを含めた本明細書に記載されている方法を使用して負荷され得る。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ウイルス形質転換によって導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、抗原は、単離されている、またはがん細胞もしくは病原体に由来する核酸の形態で、本明細書に記載されている樹状細胞に送達される。いくつかの実施形態において、抗原は、樹状細胞を感染させることが可能であるウイルスによってコードされる。「由来する」として、限定されないが、関連しないまたは関連する配列への融合を含めた、自然発生の配列の組み換え変異体が挙げられる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、抗原（複数可）は、抗原自身（例えば、タンパク質、ペプチド、エピトープ、細胞溶解物、ウイルス粒子など）として負荷され得、または抗原（複数可）をコードする核酸（複数可）として負荷され得る。樹状細胞をペプチド及びタンパク質抗原、細胞、細胞または組織溶解物、ウイルスまたはウイルス粒子、核酸などによって負荷するための方法は、当業者に公知である。
【００６６】
抗原は、いずれの供給源からであってもよい。しかし、いくつかの実施形態において、抗原または抗原（複数可）は、対象に自家移植性である。対象に自家移植性であるとは、抗原が対象から得られるまたは対象に由来することを意味している。非限定例として、抗原は、対象から得られるがん細胞または腫瘍組織からのものであってよい。がん抗原は、抽出物中に存在しようと、精製されていようと、増幅されていようと、インビトロで翻訳されていようと、がん細胞としての樹状細胞、がん細胞もしくは組織溶解物、がん細胞もしくは組織からの抽出物、がん細胞または組織の精製もしくはクローン成分、全ＲＮＡもしくは全ｍＲＮＡ、またはかかる細胞もしくは組織からの選択ＲＮＡもしくはｍＲＮＡとして負荷され得る。一実施形態において、がん抗原は、未成熟または成熟樹状細胞への投与のためのウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに改変される。いくつかの実施形態において、抗原は、対象に存在する病原体または病原体−感染細胞から得られ得、またはこれに由来し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原であり、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を含む。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びがん細胞からの配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＩκＢαは、配列番号１１で示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列、ならびに配列番号１２で示されるヌクレオチド配列をそれぞれ有する。いくつかの実施形態において、がん細胞からの配列は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号９で示されるアミノ酸配列及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、がん抗原は、全長ＩκＢα及びｈＴＥＲＴフラグメント（ａａ３０１−７００）融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３を含む。
【００６８】
本明細書において使用されているとき、用語「サイトカイン」は、細胞に対して種々の効果を発揮する、例えば、成長または増殖を誘発する多数の因子のいずれか１つを指す。本発明の実行において単独でまたは組み合わせて使用されてよいサイトカインの非限定例として、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＭＩＰ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−キットリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びｆｌｔ３リガンドが挙げられる。サイトカインは、いくつかのベンダー、例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）及びＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）から市販されている。常に明白に記述されているわけではないが、野生型または精製サイトカイン（例えば、組み換え産生されたまたはその突然変異タンパク質）と同様の生物活性を有する分子が、本発明の精神及び範囲内で使用されることが意図されることが意図される。
【００６９】
用語「樹状細胞（ＤＣ）」は、種々のリンパ及び非リンパ組織において見出される形態学的に同様の細胞タイプの集団を指す。Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６（１９９１）。樹状細胞は、生命体において最も強力かつ好ましいＡＰＣを構成する。樹状細胞は、単球とは区別され得、単球とは違った表現型を保有する。例えば、特定の分化マーカー、ＣＤ１４抗原は、樹状細胞においては見出されないが、単球によって保有されている。成熟ＤＣは、Ｔ細胞活性化及び増殖に必要なシグナルの全てを提供し得ることが示されている。また、成熟樹状細胞は食細胞ではないが、単球及び未成熟樹状細胞は、強く食菌性の細胞である。未成熟ＤＣは、エンドサイトーシス、食作用、マクロピノサイトーシスまたは吸着性飲作用及び受容体媒介抗原取り込みによって抗原を捕捉することが可能であり、表現型的にＣＤ８０−またはＣＤ８０低、ＣＤ８３−またはＣＤ８３低、ＣＤ８６低であり、高い細胞内濃度のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する。成熟ＤＣは、未成熟ＤＣと比較して、不明瞭な形態、より低いエンドサイトーシス能力を有し、表現型的にＣＤ８０高、ＣＤ８３高、ＣＤ８６高である。
【００７０】
本明細書において使用されているとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、かつ／またはｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【００７１】
用語「遺伝子操作されている」は、次に細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含有すること及び／または発現することを意味する。
【００７２】
用語「単離されている」は、細胞構成要素、あるいは他の場合には、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、もしくはそのフラグメント、または細胞が本質的に正常に会合している構成要素から分離されていることを意味する。例えば、哺乳動物細胞に関しては、いくつかの実施形態において、単離されている哺乳動物細胞は、体内で正常に見出されて分離されており、または体から除去されている。例えば、白血球除去輸血によって収集された白血球が「単離されており」、単球から分化した樹状細胞またはインビトロでの他の細胞が「単離されている」。樹状細胞はまた、細胞、例えば、会合しているリンパ球の不均質な集団からさらに単離され精製され得る。
【００７３】
用語「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、Ｔ細胞への抗原提示及び迅速な移植片拒絶に必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトにおいて、ＭＨＣは、「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」複合体としても知られている。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に結合しているＭＨＣにおいてコードされるα鎖から構成されている膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞により発現され、ＣＤ８Ｔ細胞への抗原提示において機能を果たすことが示されている。クラスＩ分子として、ヒトではＨＬＡ−Ａ、Ｂ、及びＣが挙げられる。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子もまた、非共有結合的に会合しているα及びβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において機能を果たすことが示されており、ヒトにおいて、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、及びＤＲを含む。
【００７４】
「病原体」は、本明細書において使用されているとき、いずれかの疾患を引き起こす生命体、例えば、細菌、菌類、寄生生物またはウイルスなどを指し、また、これらの減衰誘導体も指す。
【００７５】
「医薬組成物」は、活性剤（例えば抗原負荷樹状細胞及び／または活性化リンパ球）と、インビトロ、インビボまたはエキソビボでの診断的または治療的使用に好適な組成物を作製するのに不活性または活性な担体との組み合わせを含むことが意図される。
【００７６】
本明細書において使用されているとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、標準的な医薬担体、例えば熱不活性化血清＋１０％  ＤＭＳＯ＋５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、及びエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、ならびに種々のタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。組成物はまた、アジュバント、安定剤及び保存剤を含むこともできる。担体、安定剤及びアジュバントの例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１８．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９９０））を参照されたい。
【００７７】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指すのに互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらのアナログを含有していてよい。ヌクレオチドは、いずれの三次元構造を有していてもよく、知られているまたは知られていないいずれの機能を実施してもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一本鎖、二本鎖及び三重らせん分子、遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。ネイティブ核酸分子に加えて、本発明の核酸分子はまた、修飾核酸分子を含んでいてもよい。
【００７８】
用語「ペプチド」は、２以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣薬の化合物を指すのに最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって結合されていてよい。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって結合されていてよい。本明細書において使用されているとき、用語「アミノ酸」は、グリシンならびにＤ及びＬ光学異性体の両方を含めた天然及び／もしくは非天然または合成アミノ酸のいずれか、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣薬を指す。３以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短いとき、オリゴペプチドと一般的に呼ばれる。ペプチド鎖が長いとき、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質と一般的に呼ばれる。
【００７９】
本明細書において使用されているとき、「対象」は、あらゆる鳥類、魚類、爬虫類、両生類、または哺乳動物を指す。いくつかの実施形態において、対象は、霊長類、齧歯動物、イヌまたはネコである。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【００８０】
本明細書において使用されているとき、「単球」は、樹状細胞に分化する能力を有するＣＤ１４＋白血球を指す。単球は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４に応答して、未成熟樹状細胞に分化する可能性がある。単球は、いずれの動物からのものであってもよく、いくつかの実施形態において、ヒト単球である。単球は、限定されないが、血液、血液分画（例えば、白血球（ＷＢＣ）、軟膜、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの組成物において、ならびに単球がさらに富化された組成物において提供及びインキュベートされ得る。一実施形態において、単球は、他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と一緒に、例えば、白血球除去輸血製品として提供される。別の実施形態において、単球は、ＰＢＭＣから富化されており、または末梢血から直接単離されている。単球または単球を含有するＰＢＭＣを単離する方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、単球は、白血球除去輸血によって他のＰＢＭＣと一緒に収集される。白血球除去輸血の方法は当該分野において知られている。本発明のいくつかの実施形態において、単球を含むＰＢＭＣは、病院、医院、医師の事務所などで白血球除去輸血によって対象から収集される。白血球除去輸血は、対象の血液から白血球を除去する手法であり、その残りは次いで対象に輸血して戻される。白血球除去輸血製品は、典型的には、ＰＢＭＣが富化された血液分画であり、低濃度の汚染赤血球、顆粒球及び血小板を有している。白血球除去輸血を実施するための方法及び機器は、当該分野においてよく知られている。例えば、白血球除去輸血の詳細な情報については、ｇａｍｂｒｏｂｃｔ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿＆＿Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／を参照されたい。白血球除去輸血装置の例として、ＧＡＭＢＲＯ  ＢＣＴ製のＣＯＢＥＳｐｅｃｔｒａ（商標）、及びＢａｘｔｅｒ  Ｆｅｎｗａｌ製のＣＳ３０００  ｐｌｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒが挙げられる。
【００８１】
「機能性Ｔａｘタンパク質」は、Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）からの野生型Ｔａｘタンパク質の１以上の機能を実施することが可能であるタンパク質である。機能性Ｔａｘタンパク質は、細胞においてＮＦ−κＢ活性化を誘導するその活性によって定義される。本発明の改変初代血液樹状細胞及び単球由来樹状細胞は、機能性Ｔａｘタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである。いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからの全長タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１からのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１からのものであり、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−２からのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−２からのものであり、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−３からのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−３からのものであり、配列番号５のアミノ酸配列及び配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−４からのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−４からのものであり、配列番号７のアミノ酸配列及び配列番号８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ヒトにおいて白血病を引き起こさないウイルスであるＨＴＬＶ−２からのものである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質の核酸配列は、Ｔａｘポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度に同一である、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質の核酸配列は、配列番号２、４、６または８のいずれかに記載されているヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全長ポリペプチドもしくはそのフラグメントそれ自体のコード配列；または他のコード配列とのリーディングフレームにおける全長ポリペプチドもしくはフラグメントのコード配列を含んでいてよい。ポリヌクレオチドはまた、非コーティング５’及び３’配列、例えば転写された非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定させる配列を含有していてもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、３、５もしくは７のいずれかでアミノ酸配列を有するＴａｘタンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｂ）（ａ）におけるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明での使用のための機能性Ｔａｘタンパク質は、配列番号３を含む。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、配列番号３の生物活性フラグメントまたは変異体を含む。いくつかの実施形態において、生物活性フラグメントまたは変異体を含むＴａｘタンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％同一性を有する。いくつかの実施形態において、生物活性フラグメントまたは変異体は、配列番号３のポリペプチドと少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質は、全長Ｔａｘタンパク質またはその生物活性フラグメントを含む融合タンパク質を含む。フラグメントは、上記のＴａｘポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部と全体が同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５または７のいずれかにおいて同定される少なくとも約１５０の隣接アミノ酸を構成していてよい。いくつかの実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５または７のいずれかにおいて同定される少なくとも約１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、または３３０の隣接アミノ酸である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、フラグメントは、アミノ末端を含む連続する一連の残基、もしくはカルボキシ末端を含む連続する一連の残基の欠失、または２つの連続する一連の残基、アミノ末端を含むもの及びカルボキシ末端を含むものの欠失を除く、例えば、Ｔａｘのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを含む。
【００８８】
一実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５または７のいずれかの最後の約２９０、３００、３１０、３２０、または３３０のアミノ酸を含む。
【００８９】
一実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５または７のいずれかの最初の２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０または３３０のアミノ酸を含む。
【００９０】
Ｔａｘタンパク質の生物活性または機能性フラグメントまたは変異体は、配列番号１、３、５または７のいずれかの対応するフラグメントと少なくとも８０％の同一性を有する、配列番号１、３、５または７のいずれかと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。この群には、所定の配列及びフラグメントの変異体が含まれる。いくつかの実施形態において、変異体は、保存アミノ酸置換により参照から変動するもの、すなわち、同様の特徴の別のものを有する残基に取って代わるものである。典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間；Ｓｅｒ及びＴｈｒ間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕ間；Ａｓｎ及びＧｌｎ間；ならびに塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇ、または芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、いくつかの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸が、任意の組み合わせで、置換、欠失または付加されている変異体である。
【００９１】
公知のコンピュータプログラム、例えばＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）を利用した従来の手段を利用して、特定の配列のパーセント同一性を決定してよい。
【００９２】
本明細書における方法において記載されているように、未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現するようにマニピュレートされる。本発明による、本明細書に記載されているような樹状細胞に存在する機能性Ｔａｘタンパク質は、未成熟樹状細胞のＴ細胞白血病ウイルス（すなわち、非改変ウイルスまたは野生型ウイルス）の感染の結果としては発現されない。代わりに、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸が、他の機構、例えば、機能性Ｔａｘタンパク質を含む核酸構築物を改変すること、及び未成熟樹状細胞への当該構築物の送達によって細胞に送達される。いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて改変されて、細胞を形質導入するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【００９３】
細胞を形質導入するのに使用され得るウイルスベクターは、限定的でない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、高度に減衰された、非複製ウイルスを典型的には含む。ウイルスベクターとして、限定されないが、アデノ関連ウイルスを含めた、ＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルスをベースとするもの、単純ヘルペスウイルス、鳥ウイルス、例えばニューカッスル病ウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、及びパルボウイルス；ならびに、限定されないが、レトロウイルスベクターを含めたＲＮＡウイルスベクターが挙げられる。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、例えばヒト免疫欠損ウイルスを含む。Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７。レトロウイルスゲノムの一部として対象のヌクレオチド配列を収容する複製欠損レトロウイルスベクターが使用され得る。かかるベクターは、詳細に記載されている。（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９；Ｋｏｌｂｅｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ  Ｒｅｓ．４：４３；Ｃｏｒｎｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２１５）。
【００９４】
本発明において有用なアデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターは、当該分野において既に教示されている方法に従って産生されてよい。（例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ  ５：２３７７；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９２）ｅｄ．Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい）。いくつかの異なるアプローチが実現可能である。
【００９５】
アルファウイルスベクター、例えばベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルスベクターが、十分な遺伝子導入に使用され得る。複製欠損性ベクターが利用可能である。
【００９６】
本発明の方法において使用され得るウイルスベクターを記載しているさらなる文献として、以下が挙げられる：Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６７９−１７２１、１９９０）；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．１０９−１２８  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９：１９０−１９９，Ｓｃｈｒｅｉｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ  ６８：１４５−１５９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｃｈ（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：１９３７−１９４２；Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｒａｐｙ  ３：１４７−１５４；ＷＯ９５／００６５５；ＷＯ９５／１６７７２；ＷＯ９５／２３８６７；ＷＯ９４／２６９１４；ＷＯ９５／０２６９７（１９９５年１月２６日）；及びＷＯ９５／２５０７１。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス／レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルスまたは単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００９８】
Ｉ．改変初代血液樹状細胞及び作製の方法
Ａ．改変初代血液樹状細胞
一実施形態において、本発明は、改変初代血液樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、上記樹状細胞を提供する。本発明によると、初代血液樹状細胞はＣＤ２０５＋及びＣＤ１１ｃ＋である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、本明細書に記載されているような方法によって作製される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される１以上の成熟及び活性化マーカーを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、種々のサイトカインを産生し、懸濁培養において成長する能力による、種々のマーカーの存在または非存在をさらに特徴とし得る。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＴＬＲ７の切断型を含む。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＴＬＲ９を発現する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＩＬ−１５を産生する。
【０１０１】
ある特定のマーカーの存在または非存在は、公知の技術、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用してアッセイされ得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、無視できるレベルのＩＬ−１０及びＴＧＦβを産生する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、懸濁培養における成長が可能である。
【０１０３】
細胞の供給源は、特に限定的でない。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、または哺乳動物からの血液細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、霊長類、齧歯動物、例えばラット、マウスもしくはモルモット、イヌ、またはネコからの血液細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトからの血液細胞に由来する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ｃ−Ｍｙｃをさらに発現する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、リン酸化ｐＲｂ、リン酸化ｃｄｃ２、リン酸化Ｓｔａｔ１、リン酸化Ｓｔａｔ３、及びリン酸化Ｓｔａｔ５の１以上をさらに発現する。いくつかの実施形態において、転写因子ＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１が活性である。
【０１０５】
改変初代血液樹状細胞は、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作され得る。ＨＬＡは、ヒトに特異的な主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原である。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体のタイプである。受容体は、ヘテロ二量体であり、重α鎖及びより小さなβ鎖から構成されている。α鎖は、変異体ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ遺伝子によってコードされ、β鎖は、変異体β２ミクログロブリン分子にある。β２ミクログロブリンタンパク質は、ヒトゲノムの別個の領域によってコードされる。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃの１以上を発現するように遺伝子操作され得る。一実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａを発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ａ２．１のアミノ酸配列は、配列番号１５である。
【０１０６】
改変初代血液樹状細胞には、１以上の抗原が負荷され得る。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を収容する。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、病原性生命体からの抗原である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ナイーブリンパ球の増殖を含む。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、実施例１に記載されている細胞株ｉｈｖ−ＤＣ１及びｉｈｖ−ＤＣ２を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球（例えばＰＢＭＣの集団）をプライミングすることが可能である。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−制限方式で抗原を提示する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球（例えばＰＢＭＣの集団）をプライミングすることが可能である。
【０１１０】
Ｂ．改変初代血液樹状細胞を作製する方法
本発明の改変初代血液樹状細胞は、種々の方法によって調製され得、限定的でない。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、本明細書に記載されている方法によって調製される。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、上記方法を提供する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上記方法は、ｉｉｉ）上記細胞を培養してその成熟及び活性化を誘導することをさらに含む。改変初代血液樹状細胞の成熟及び活性化を誘導する培養ステップは、限定的でない。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のサイトカインの存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、有効量のＩＬ−２を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１０ユニット／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約５０ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、約１００〜２００ユニット／ｍｌの範囲である。ＩＬ−２は、組み換え形態で提供され得る。組み換えＩＬ−２は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔプログラム（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られ得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、上記方法は、培養細胞からＴ細胞を枯渇させることをさらに含む。
【０１１４】
一実施形態において、本発明は、改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）培養下の上記細胞を有効量のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）によって処理することと；
ｉｉｉ）培養下の上記細胞を有効量のＩＬ−２によって処理することと；
ｉｖ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｖ）培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、上記方法を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルは、ＰＢＭＣのサンプルを含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、樹状細胞によって活性化された樹状細胞またはＴリンパ球によって後に処理される対象からのものである。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、ロイコパックから単離されている。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、健常な血液ドナーから調製される。例えば、健常な血液ドナーからのロイコパックは、血液バンクから得られ得る。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法を使用して単離され得る。例えば、ロイコパックからの１０ｍｌの血液は、５０ｍｌの円錐管において１０ｍｌのＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ緩衝液と混合され得る。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、別個の５０ｍｌのチューブにピペットで分注され得る。２０ｍｌの希釈された血液は、Ｆｉｃｏｌｌ上に層状化され得る。サンプルは、４００×ｇで３０分間、室温（ＲＴ）において回転され得る。ＰＢＭＣ層は、希釈血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面で収集され、ＰＢＳ緩衝液は、全体積が４０ｍｌで添加され、次いで、２００×ｇで１０分間、ＲＴで回転され得る。ペレットは、ＰＢＳによって洗浄され、２００×ｇで１０分間、ＲＴで再び回転され得る。細胞数は、計数され得、新たな２００００００のＰＢＭＣが、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２（１００ｕ／ｍｌ）によって刺激され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、パートｉｉ）のＰＨＡの濃度は、少なくとも約１μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＰＨＡの濃度は、約１〜３０μｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、パートｉｉ）のＰＨＡの濃度は、約１〜５μｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、パートｉｉ）のＰＨＡの濃度は、少なくとも約５μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、細胞は、約１２時間〜約３６時間、ＰＨＡで処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、約２４時間、ＰＨＡで処理される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＨＡによる処理の後、ＩＬ−２によって処理された。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約１０ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、機能性Ｔａｘタンパク質の発現の前に、約１０〜５００ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理され、ＩＬ−２を含む培地においてある期間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理され、ＩＬ−２を含む培地においてある期間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−２を含む培地において２〜１０日の範囲の期間培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地において約４〜５日の期間培養される。
【０１１８】
細胞は、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現するようにマニピュレートされる。本発明による、本明細書に記載されている樹状細胞に存在する機能性Ｔａｘタンパク質は、未成熟樹状細胞のＴ細胞白血病ウイルス（すなわち、非改変ウイルスまたは野生型ウイルス）の感染の結果としては発現されない。代わりに、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸が、他の機構、例えば、機能性Ｔａｘタンパク質を含む核酸構築物を改変すること、及び未成熟樹状細胞への当該構築物の送達によって細胞に送達される。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ヒトにおいて白血病を引き起こさないウイルスであるＨＴＬＶ−２からのものである。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて改変されて、細胞を形質導入するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス／レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルスまたは単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質は、レンチウイルスベクターにおいて調製され、細胞は、以下のように培養及び形質導入される。ＨＴＬＶ−２からのｔａｘ遺伝子は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするフラグメントによって融合され、Ｔａｘ２−ＧＦＰ融合フラグメントは、レンチウイルスベクターにクローン化され得る。いくつかの実施形態において、Ｔａｘ２−ＧＦＰ融合は、配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号１７のヌクレオチド配列を有する。Ｔａｘ２−ＧＦＰレンチウイルスを生成するために、レンチウイルスＴａｘ２−ＧＦＰベクターは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２９３細胞内にＶＳＶ−Ｇ、Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＲｅｖ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の発現プラスミドを含有するパッケージングプラスミドミックスによって共トランスフェクトされ得る。ウイルス上澄みは、収集され得、２５，０００ｒｐｍ／４℃で２時間の超遠心分離に供され得る。ウイルスペレットは、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁され、−８０℃で保存され得る。２００００００の新たに単離されたＰＢＭＣは、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）によって２４時間刺激され得る。次の日、細胞は、一旦、完全ＲＰＭｌ１６４０培地によって洗浄され、続いて組み換えＩＬ−２（１００ユニット／ｍｌ）が添加され得る。活性化ＰＢＭＣは、４〜５日間培養され得る。２００００００の活性化ＰＢＭＣは、約２０のＭＯＩ（非常に多数の感染）及びポリブレン（６μｇ／ｍｌ）の添加においてＴａｘ２−ＧＦＰレンチウイルスと混合され得る。細胞−レンチウイルスミックスは、細胞培養インキュベータにおいて３２℃／５％ＣＯ２で１６時間インキュベートされる。次の日、形質導入細胞は、完全ＲＰＭｌ１６４０培地によって一旦洗浄され、次いで、培養フラスコにおいて、組み換えＩＬ−２（１００ユニット／ｍｌ）が補充された完全ＲＰＭｌ１６４０培地と置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、完全培地における１０％ＦＢＳは、Ｓｉｇｍａからの５％の熱不活化ヒトＡＢ血清によって置き換えられ得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、その成熟及び活性化を容易にする有効量のＩＬ−２を含む培地においてさらに培養される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１０ユニット／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約５０ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、有効量のＩＬ−２を含む培地において約２〜３ヶ月間さらに培養される。いくつかの実施形態において、培地は、１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２及び血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約１０％ウシ胎児血清及び１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約５％のヒト血清及び１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態において、形質導入細胞は、ＩＬ−２及びヒト血清を含む培地において約２〜３ヶ月間培養される。いくつかの実施形態において、培地は、５％の熱不活化ヒトＡＢ血清及び１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む。培地は、基本培地を概して含む。基本培地は、限定的でない。いくつかの実施形態において、基本培地は、完全ＲＰＭＩ１６４０培地である。
【０１２２】
Ｔ細胞は、公知の方法を使用して培養細胞から枯渇され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞に結合する分子を含む組成物によって枯渇される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗体によって枯渇される。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、電磁ビーズにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞分類またはフローサイトメトリーによって枯渇される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、以下のように枯渇される。１０００００００の形質導入細胞は、レンチウイルス形質転換後２〜３週間、１００μｌの抗ＣＤ３電磁ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって４℃で３０分間インキュベートされ得る。磁気バー下でビーズに結合していない細胞は、６−ウエル培養プレートにおいてＩＬ−２が補充された完全ＲＰＭｌ１６４０培地において吸引及び培養され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ３−ネガティブ選択細胞は、細胞純度を決定するＦＡＣＳによって試験され得る。いくつかの実施形態において、さらなる一連の抗ＣＤ３ネガティブ選択は、取り出された細胞集団が純粋でないとき、所望により実施され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の枯渇した細胞集団は、有効量のＩＬ−２を含む培地においてさらに培養され得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、約１００〜２００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３−ネガティブ細胞集団は、１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２が補充された完全ＲＰＭｌ１６４０培地において培養される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３−ネガティブ細胞集団は、ＣＤ３ネガティブ選択後約２ヶ月、免疫表現型を決定するＦＡＣＳを使用して抗体のパネルによって分析され得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、上記方法によって産生される改変初代血液樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７、４−１ＢＢＬ、及びＨＬＡ−ＤＲならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される成熟及び活性化マーカーを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を初代血液樹状細胞に負荷することをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体をコードするウイルスベクターによって細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、初代血液樹状細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原性フラグメントもしくは誘導体を発現する。いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アミノ酸配列は、配列番号９を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１０を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の核酸配列は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度に同一である、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の核酸配列は、配列番号１０に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドは、全長ポリペプチドもしくはそのフラグメントそれ自体のコード配列；または他のコード配列とのリーディングフレームにおける全長ポリペプチドもしくはフラグメントのコード配列を含んでいてよい。ポリヌクレオチドはまた、非コーティング５’及び３’配列、例えば転写された非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定させる配列を含有していてもよい。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号９でアミノ酸配列を有するヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列；または（ｂ）（ａ）におけるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本発明での使用のためのヒトテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号９を含む。いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号９の抗原フラグメントまたは変異体を含む。いくつかの実施形態において、抗原フラグメントまたは変異体を含むヒトテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号９と少なくとも８０％同一性を有する。いくつかの実施形態において、抗原フラグメントまたは変異体は、配列番号９のポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素は、全長ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原性フラグメントもしくは誘導体を含む融合タンパク質を含む。フラグメントは、上記のヒトテロメラーゼ逆転写酵素の全てではなく一部と全体に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラグメントは、配列番号９において同定される少なくとも約２５０の隣接アミノ酸を構成していてよい。いくつかの実施形態において、フラグメントは、配列番号９において同定される少なくとも約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、または１０５０の隣接アミノ酸である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、フラグメントは、アミノ末端を含む連続する一連の残基、もしくはカルボキシ末端を含む連続する一連の残基の欠失、または２つの連続する一連の残基、アミノ末端を含むもの及びカルボキシ末端を含むものの欠失を除く、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素のアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを含む。
【０１３４】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の抗原フラグメントまたは変異体は、配列番号９の対応するフラグメントと少なくとも９０％の同一性を有する、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。この群には、所定の配列及びフラグメントの変異体が含まれる。いくつかの実施形態において、変異体は、保存アミノ酸置換により参照から変動するもの、すなわち、同様の特徴の別のものを有する残基に取って代わるものである。典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間；Ｓｅｒ及びＴｈｒ間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕ間；Ａｓｎ及びＧｌｎ間；ならびに塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇ、または芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、いくつかの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸が、任意の組み合わせで、置換、欠失または付加されている変異体である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、抗原は、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、抗原に融合されたＩκＢαを含む。いくつかの実施形態において、ＩκＢαのアミノ酸配列は、配列番号１１を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列を含み、抗原、例えばがん抗原を含む。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントに融合され、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むＩκＢαを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、初代血液樹状細胞を遺伝子操作して１以上のＨＬＡタンパク質を発現することをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、初代血液樹状細胞を遺伝子操作してＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃの１以上を発現することを含む。いくつかの実施形態において、初代血液樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ａ２．１のアミノ酸配列は、配列番号１５である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、改変初代血液樹状細胞の機能性は、ナイーブリンパ球をプライミングする能力によって決定され得る。いくつかの実施形態において、このことは、混合白血球反応（ＭＬＲ）と呼ばれるアッセイによって実施される。いくつかの実施形態において、約２００００００の刺激されていない（ナイーブ）同種異系ＰＢＭＣは、いずれのサイトカイン及び成長因子も添加することなく約１００：１の比で改変初代血液樹状細胞（例えば、２×１０４細胞）と混合される。１０〜１４日後、ＩＬ−２は、細胞培養物内に添加され得る。増殖型細胞の免疫表現型及び腫瘍殺傷活性は、ＦＡＣＳ及び細胞毒性アッセイによってそれぞれ決定され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記方法のいずれかによって調製される初代血液樹状細胞を提供する。
【０１３９】
ＩＩ．改変単球由来樹状細胞及び作製方法
Ａ．改変単球由来樹状細胞
いくつかの実施形態において、本発明は、改変単球由来樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、上記樹状細胞を提供する。単球由来樹状細胞は、ＣＤ２０５＋である。
【０１４０】
細胞の供給源は、特に限定的でない。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、または哺乳動物からの単球細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、霊長類、齧歯動物、例えばラット、マウスもしくはモルモット、イヌ、またはネコからの単球細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトからの単球細胞に由来する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、樹状細胞成熟及び活性化マーカーは、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ７０からなる群から選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、種々のサイトカインを産生する能力、及びその成長特性による、種々のマーカーの存在または非存在をさらに特徴とし得る。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＴＬＲ７の切断型を発現する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＴＧＦβを産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＩＬ−１５を産生する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、以下：ｃ−Ｍｙｃ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、リン酸化ｐＲｂ、リン酸化ｃｄｃ２、リン酸化Ｓｔａｔ１、リン酸化Ｓｔａｔ３、及びリン酸化Ｓｔａｔ５；の１以上を発現する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、４−１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４をさらに発現する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、懸濁培養における成長が可能である。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、培養で最大３ヶ月間増殖することが可能である。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である。
【０１４４】
改変単球由来樹状細胞は、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃの１以上を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａを発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ａ２．１のアミノ酸配列は、配列番号１５である。
【０１４５】
改変単球由来樹状細胞には、１以上の抗原が負荷され得る。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を提示する。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、病原性の生命体からの抗原である。
【０１４６】
改変単球由来樹状細胞への抗原の負荷は、限定的でない。いくつかの実施形態において、抗原は、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション及びペプチドパルスを含めた本明細書に記載されている方法を使用して負荷され得る。いくつかの実施形態において、抗原は、ウイルス形質転換によって導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ナイーブリンパ球の増殖を誘導し得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球（例えばＰＢＭＣの集団）をプライミングすることが可能である。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、ＨＬＡ−制限方式で抗原を提示する。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブリンパ球（例えばＰＢＭＣの集団）をプライミングすることが可能である。
【０１４９】
Ｂ．改変単球由来樹状細胞を作製する方法
本発明の改変単球由来樹状細胞は、種々の方法によって調製され得、限定的でない。いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞は、本明細書に記載されている方法によって調製される。
【０１５０】
一実施形態において、本発明は、単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）単球由来の未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、上記方法を提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、パートｉ）の前に、単球細胞を培養して未成熟樹状細胞へのその分化を誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、分化は、未成熟樹状細胞、例えば、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４：ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３；ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１５；ならびにＩＦＮαへの単球の分化を誘導する有効量の組成物を含む培養培地と接触させることによって誘導される。いくつかの実施形態において、単球は、未成熟樹状細胞への分化を誘導する有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において培養される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞を培養してその成熟及び活性化を誘導することを含む、パートｉｉ）後のステップをさらに含む。単球由来樹状細胞の成熟及び活性化を誘導するための培養ステップは、限定的でない。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のサイトカインの存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地においてさらに培養される。
【０１５３】
単球及び単球を含むＰＢＭＣを対象から収集するための種々の方法が、当業者に公知である。例えば、収集ＰＢＭＣのための白血球除去輸血及び単球の精製のための水簸の詳細な情報については、ｇａｍｂｒｏｂｃｔ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿＆＿Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／を参照されたい。一実施形態において、ＰＢＭＣは、血液をヘパリン化シリンジにおいて収集し、ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）上に積層し、遠心分離し、界面においてＰＢＭＣを回収することによって得られる。Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：１０５１−１０６１を参照されたい。ＰＢＭＣを収集、精製または分画するさらなる方法が、当業者に公知である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、方法は、富化単球培地を使用する。単球の富化方法は、当業者に公知であり、限定されないが、密度勾配遠心分離（例えば、希釈フィコール密度勾配遠心分離、希釈パーコール密度勾配遠心分離など）、水簸、プラスチックへの付着、タンジェンシャルフローろ過、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫細胞分離技術（単球を選択するまたは非単球（例えば、白血球、マクロファージ、顆粒球など）を除去するための抗体パンニング、示差溶解、磁気細胞分類など）、プラスチックマイクロ担体ビーズによってコーティングされたプラスチック培養袋における培養などが挙げられる。例えば、Ｏ’ｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：１０６７−１０７６；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７１：１３１５−１３３２；Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：７６９８−７７０２；Ｂｅｒｎｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１０９９−１１０４；Ｃａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８−２６１；Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｌｏｓｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｄｅｌｌ（ＤＣ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｎｉｎｔｈ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＳＣＴ；Ｍｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５８：５７８−５８６；Ｍａｆｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０：１４１９−１４２０；ｍｉｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ；Ｍｅｙｅｒ−Ｗｅｎｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １２：２８９−２９９；及びＷＯ２００４／０００４４４を参照されたい。これらの内容は、参照により組み込まれる。例えば、磁気細胞分類は、ポジティブ選択（ＣＤ１４＋細胞）によって、またはネガティブ選択（すなわち、単球でない細胞；例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋及びＣＤ２＋細胞の除去）によって形態単球を富化するのに使用され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、単球は、対象の白血球除去輸血から単球を単離するための自動化方法、水簸により白血球除去輸血製品から富化される。白血球除去輸血の方法は、当該分野において知られている。例えば、水簸は、Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ  Ｅｌｕｔｒａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）において実施され得る。水簸緩衝液は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）の４Ｌ袋に１０００ｍＬの５％ヒトアルブミン血清（ＨＳＡ）を添加することによって調製され得る。細胞は、製造業者のプロトコルにしたがって水簸によって分画され得る。一実施形態において、製造業者（Ｇａｍｂｒｏ）のプロトコルの改変バージョンが水簸に使用され、ここでは、最終ローターオフフラクションが５番目のフラクションの代わりに４番目のフラクションである。示差分析によるＣＢＣは、純度及び回収を検証するために単球フラクションにおいて実施され得る。いくつかの実施形態において、単球純度は、ＣＤ１４による免疫表現型決定により評価され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、単球は、樹状細胞への細胞の分化の前に富化される。特に、ＰＢＭＣは、さらに精製されてよく、または、単球が、このインキュベーションの間にＰＢＭＣから富化されてよい。一実施形態において、単球は、容器（好ましくはプラスチック容器）における培養によるインキュベーション期間及び接着単球の選択の後に、ＰＢＭＣから富化され得る。
【０１５７】
一実施形態において、単球は、未成熟または成熟樹状細胞への単球の分化を誘導する組成物を含む培地において培養される。未成熟樹状細胞への単球の分化を誘導する組成物は、当業者に公知である。かかる組成物として、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４；ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１３；ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１５；ＩＦＮα；及びＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦαが挙げられる。いくつかの実施形態において、分化を誘導する組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４である。いくつかの実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の濃度は、各サイトカインが約４００〜２０００ユニット／ｍｌの範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の濃度は、各サイトカインが５００〜１０００ユニット／ｍｌの範囲である。一実施形態において、単球は、約４〜７日間、いくつかの実施形態においては約５〜６日間ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と接触し、この間に、単球が未成熟樹状細胞に分化する。有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む馴化培地もまた利用され得る。いくつかの実施形態において、培養は、２９３細胞を産生するＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４からの馴化培地を含む培地において上記細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、約１：１０希釈において馴化培地を含む培地において培養される。
【０１５８】
未成熟樹状細胞への単球の分化、及び機能性Ｔａｘタンパク質の発現の後、いくつかの実施形態において、未成熟樹状細胞は、成熟した樹状細胞に成熟され得る。一実施形態において、未成熟樹状細胞は、有効量のＩＬ−２を含む培地との接触によって成熟される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１０ユニット／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約５０ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、約１００〜２００ユニット／ｍｌの範囲である。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明は、単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において上記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）上記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｖ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において細胞を発現する機能性Ｔａｘタンパク質を培養することと
を含む、上記方法を提供する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、接着単球細胞は、ＰＢＭＣから単離されている。いくつかの実施形態において、接着単球は、約４００００００のＰＢＭＣから単離されている。いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において培養するステップの後に、上記方法は、上記細胞を、（例えば、約１００〜２００ユニット／ｍｌを含む）ＩＬ−２を含む培地において培養することをさらに含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−４及び／またはＧＭ−ＣＳＦは、Ｆｃ４に融合されている。いくつかの実施形態において、ＩＬ−４及び／またはＧＭ−ＣＳＦは、馴化培地によって提供され得る。いくつかの実施形態において、パートｉｉ）の培養は、２９３細胞を産生するＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４からの馴化培地を含む培地において上記細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、約１：１０希釈で約７日間、馴化培地を含む培地において培養される。
【０１６２】
上記細胞は、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現するようにマニピュレートされる。本発明による、本明細書に記載されているような樹状細胞に存在する機能性Ｔａｘタンパク質は、未成熟樹状細胞のＴ細胞白血病ウイルス（すなわち、非改変ウイルスまたは野生型ウイルス）の感染の結果としては発現されない。代わりに、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸が、他の機構、例えば、機能性Ｔａｘタンパク質を含む核酸構築物を改変すること、及び未成熟樹状細胞への当該構築物の送達によって細胞に送達される。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである。いくつかの実施形態において、Ｔａｘタンパク質は、ヒトにおいて白血病を引き起こさないウイルスであるＨＴＬＶ−２からのものである。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、機能性Ｔａｘタンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて改変されて、上記細胞を形質導入するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、有効量のポリブレン、例えば約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス／レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルスまたは単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１６４】
細胞を培養するための基本培地は、限定的でない。いくつかの実施形態において、培地は、約１０％ウシ胎児血清によるＲＰＭＩ１６４０培地を含む。いくつかの実施形態において、パートｉｖ）の培養は、有効量のＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４及びＩＬ−４−Ｆｃ４の存在下で約５〜７日間、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地において細胞を発現するＴａｘタンパク質を培養し、続いて、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養において細胞を維持することを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、単球由来樹状細胞を活性化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、有効量のＴＮＦα及びＬＰＳで刺激される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、約１０〜２５０ｎｇ／ｍｌの量で投与され、ＬＰＳは、約１〜５μｇ／ｍｌの量で投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、１〜５日間刺激される。いくつかの実施形態において、細胞は、約２日間刺激される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、上記方法によって産生される単球由来樹状細胞は、構成的な成熟及び活性化表現型を有する。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞成熟及び活性化マーカーは、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ７０からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、４−１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４をさらに発現する。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、培養で最大３ヶ月間増殖することが可能である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を単球由来樹状細胞に負荷することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体をコードするウイルスベクターによって細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。いくつかの実施形態において、単球由来樹状細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する。いくつかの実施形態において、がん抗原が、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように単球由来樹状細胞を遺伝子操作することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、１以上のＨＬＡタンパク質をコードするウイルスベクターによって細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃの１以上を発現するように単球由来樹状細胞を遺伝子操作することを含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ａ２．１のアミノ酸配列は、配列番号１５である。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、改変単球由来樹状細胞の機能性は、ナイーブリンパ球をプライミングする能力によって決定され得る。いくつかの実施形態において、このことは、混合白血球反応（ＭＬＲ）と呼ばれるアッセイによって実施される。いくつかの実施形態において、約２００００００の非刺激（ナイーブ）同種異系ＰＢＭＣは、いずれのサイトカイン及び成長因子も添加することなく、約１００：１の比で改変単球由来樹状細胞（例えば、２×１０４細胞）と混合される。１０〜１４日後、ＩＬ−２が細胞培養物に添加され得る。増殖型細胞の免疫表現型及び腫瘍殺傷活性は、それぞれ、ＦＡＣＳ及び細胞毒性アッセイによって決定され得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記方法のいずれかによって調製される単球由来樹状細胞を提供する。
【０１７２】
ＩＩＩ．細胞毒性Ｔリンパ球を産生する方法
別の実施形態において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって、本発明の初代血液樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と共に、ある期間培養することを含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって、本発明の単球由来樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と共に、ある期間培養することを含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【０１７４】
別の実施形態において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって
ｉ）本発明の初代血液樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒に、第１期間培養して、細胞の混合培養物を作り出すことと；
ｉｉ）細胞の混合培養物を有効量のＩＬ−２によって処理し、上記細胞を第２期間培養し続けることと、
を含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって
ｉ）本発明の単球由来樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒に、第１期間培養して、細胞の混合培養物を作り出すことと；
ｉｉ）細胞の混合培養物を有効量のＩＬ−２によって処理し、上記細胞を第２期間培養し続けることと、
を含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、上記方法を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球を含む細胞は、ナイーブＰＢＭＣを含む。いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球は、ロイコパックから単離されている。いくつかの実施形態において、ナイーブリンパ球及び樹状細胞は、同種異系である。
【０１７７】
樹状細胞対ナイーブＰＢＭＣの比は、特に限定的ではない。いくつかの実施形態において、樹状細胞対ナイーブＰＢＭＣの比は、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：２５０または約１：５００である。いくつかの実施形態において、樹状細胞対ナイーブＰＢＭＣの比は、約１：１００である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ステップｉ）の培養は、外因性サイトカインを添加することなく行われる。いくつかの実施形態において、第１期間は、約２〜３日間である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１０ユニット／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約５０ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、約１００〜２００ユニット／ｍｌである。いくつかの実施形態において、第２期間は、約２〜６週間である。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、細胞毒性Ｔリンパ球は、抗原特異的であり、ＨＬＡ−制限方式で、標的細胞の細胞溶解を誘導する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、細胞毒性Ｔリンパ球は、非ＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷する可能性があるＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、４−１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、４−１ＢＢＬを発現するように改変されている。いくつかの実施形態において、細胞の非ＨＬＡ−制限殺傷は、ＮＫＧ２Ｄのリガンド結合によって媒介される。
【０１８２】
ＩＶ．細胞毒性Ｔリンパ球による処置の方法
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、上記細胞毒性Ｔリンパ球が、本発明の改変初代血液樹状細胞を使用して産生される、上記方法を提供する。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、上記細胞毒性Ｔリンパ球が、本発明の方法によって産生された改変初代血液樹状細胞を使用して産生される、上記方法を提供する。
【０１８４】
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、上記細胞毒性Ｔリンパ球が、本発明の改変単球由来樹状細胞を使用して産生される、上記方法を提供する。
【０１８５】
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、上記細胞毒性Ｔリンパ球が、本発明の方法によって産生された改変単球由来樹状細胞を使用して産生される、上記方法を提供する。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、約１×１０８〜１×１０１０の細胞毒性Ｔリンパ球が、注入の前に投与される。いくつかの実施形態において、約５×１０９の細胞が、注入の前に投与される。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、処置される疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、がん細胞は、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。
【０１８８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法によって産生される有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を含む医薬組成物を提供する。
【０１８９】
細胞毒性Ｔリンパ球は、薬学的に許容可能な担体において投与される。いくつかの実施形態において、細胞毒性Ｔリンパ球は、抗凍結剤の存在下、例えば、貯蔵及び／または輸送のために凍結され、その後、投与の前に解凍される。例示的な抗凍結剤組成物については以下のパートＶを参照されたい。
【０１９０】
細胞は、医療分野において公知の方法を使用して対象または患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に注入される。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に移植される。細胞は、ある期間にわたって単回投与または複数投与として投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約１〜２週間毎、約３週間毎、約４週間毎、約５週間毎、約６週間毎、約７週間毎、約８週間毎、約３ヶ月毎、約４ヶ月毎、約５ヶ月毎、約６ヶ月毎、または約１年毎に投与される。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１以上の他の公知の処置と組み合わされる。がんの処置において、１以上の他の公知の処置として、放射線、手術、化学療法または他の抗がん剤の投与、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態において、本発明の処置は、化学療法剤と組み合わされる。
【０１９２】
Ｖ．樹状細胞ワクチン及び使用方法
本明細書に記載されている樹状細胞及びその調製のための方法は、ワクチンを調製するのに特に有用である。そのため、関連する樹状細胞組成物及びワクチンを本明細書において提供する。一実施形態において、ワクチンは、対象に自家移植性である。いくつかの実施形態において、ワクチンは、対象と同種異系である。いくつかの実施形態において、樹状細胞ワクチンには、対象において存在するがん細胞または病原体からの抗体が負荷される。
【０１９３】
樹状細胞は、成熟または未熟抗原が負荷されていようといなかろうと、抗凍結剤を含む組成物において凍結され得る。多数の抗凍結剤が当業者に公知である。抗凍結剤の例として、限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エタノール、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、プロパンジオール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ラクトース、ｉ−イノシトール、塩化コリン、アミノ酸、アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミン）、ポリビニルピロリドン、デキストラン、スクロース、フィコール、無機塩、及びヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。好ましい実施形態において、抗凍結剤はＤＭＳＯである。いくつかの実施形態において、ＤＭＳＯの濃度は、２〜２０％、より好ましくは５〜１５％、最も好ましくはおよそ１０％である。また、凍結培地は、炭水化物に由来する１以上のポリオール化合物、例えばグルコース、デキストロース、スクロースなどを、好ましくは２〜３０％、より好ましくは５〜１０％、最も好ましくは５％のデキストロース濃度で含有していてよい。樹状細胞を凍結するための方法は、当業者に公知である。例えば米国特許出願公開公報第２００４／０２５３５７４を参照されたい。その内容は、参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、抗凍結剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。いくつかの実施形態において、ＤＭＳＯの濃度は、５％〜２０％である。最も好ましくは、組成物におけるＤＭＳＯの濃度は、およそ１０％である。
【０１９４】
投与のための他の好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び意図されるレシピエントの血液を製剤と等張性にする溶質を含有することができる等張滅菌注射水溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、保存剤、免疫賦活剤、サイトカイン及びアジュバントを含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液を挙げることができる。
【０１９５】
一実施形態において、治療的細胞は、熱不活化自己血漿及び１０％デキストロースに、約１×１０８細胞／ｍｌの最終濃度で懸濁される。これらの細胞は、次いで、５％デキストロース及び１０％ＤＭＳＯを含有する熱不活性化自己血漿において、熱不活化自己血漿及び２０％ＤＭＳＯの混合物によって１：１希釈される。最終的な充填された製剤は、凍結保存に好適な容器において貯蔵される。ワクチンは、次いで、乾燥液体窒素凍結剤において≦１５０℃で凍結され保存される。ワクチンは、洗浄及び再懸濁の必要性なしに解凍後に投与の準備がされ得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本発明は、疾患、例えばがんまたは病原体感染の処置または防止のための凍結薬剤の調製のための、本発明による抗原負荷樹状細胞の使用であって、上記薬剤が、薬学的に許容可能なビヒクルであり、解凍の際に投与の準備がされる、上記使用を提供する。
【０１９７】
別の実施形態において、本発明は、対象にワクチン接種をする方法であって：
ｉ）本発明の凍結された樹状細胞ワクチンを解凍することと；
ｉｉ）解凍されたワクチンを対象に投与することと
を含む、上記方法を提供する。
【０１９８】
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に、有効量の本発明の改変初代血液樹状細胞を投与することを含む、上記方法を提供する。
【０１９９】
別の実施形態において、本発明は、対象において疾患または状態を処置する方法であって、対象に、有効量の本発明の改変単球由来樹状細胞を投与することを含む、上記方法を提供する。
【０２００】
樹状細胞ワクチンは、種々の方法、例えば、限定されないが、注入（例えば、皮下、皮内、静脈内、リンパ管内、関節内、筋肉内、腹腔内）によって、持続注射、移植片からの徐放などによって投与され得る。いくつかの実施形態において、樹状細胞ワクチンは、２〜４週間隔で投与される。樹状細胞ワクチンは、生理的に許容可能な担体、緩衝剤、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤などと共に投与され得る。いくつかの実施形態において、樹状細胞ワクチンは、投与されたまたはＨＬＡ適合の患者に自家移植性である。
【０２０１】
対象に投与される細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、または樹状細胞）の用量は、対象において所望の有益な治療応答を経時的に達成する、例えば、がん細胞の成長を阻害する、または感染を阻害するのに有効な、有効量である。一実施形態において、用量は、およそ１０７〜１０１０細胞である。生物反応修飾物質が、本発明の樹状細胞または活性化Ｔ細胞による処置のために任意選択的に添加される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、アジュバント、またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２またはＩＬ−２と共に任意選択的に投与される。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、対象への投与の前に照射される。いくつかの実施形態において、注入当たり約１×１０８〜約１×１０１０の細胞が投与される。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、処置される疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、がん細胞は、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する。いくつかの実施形態において、がんは、乳がんである。
【０２０３】
細胞は、医療分野において公知の方法を使用して対象または患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に注入される。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に移植される。細胞は、ある期間にわたって単回投与または複数投与として投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約１〜２週間毎、約３週間毎、約４週間毎、約５週間毎、約６週間毎、約７週間毎、約８週間毎、約３ヶ月毎、約４ヶ月毎、約５ヶ月毎、約６ヶ月毎、または約１年毎に投与される。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１以上の他の公知の処置と組み合わされる。がんの処置において、１以上の他の公知の処置として、放射線、手術、化学療法または他の抗がん剤の投与、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態において、本発明の処置は、化学療法剤と組み合わされる。
【０２０５】
ＶＩ．サンプル実施形態
このセクションは、一連の項として、限定することなく提示される本発明の例示的な組成物及び方法を記載しており、そのいくらかまたは全てが、明確さ及び効率性のために英数字順に記載されている場合がある。これらの項のそれぞれが、１以上の他の項、及び／または参照によって組み込まれる材料を含めたこの出願のいずれかの箇所からの開示内容と、好適に組み合わされ得る。以下の項のいくらかは、他の項を明確に引用しかつさらに限定しており、好適な組み合わせのいくらかの例を限定することなく付与している。
【０２０６】
１．Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、改変樹状細胞。
【０２０７】
２．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、項１に記載の樹状細胞。
【０２０８】
３．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、項１〜２のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２０９】
４．構成的な成熟及び活性化表現型を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１０】
５．ヒト細胞である、項１〜４のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１１】
６．ＣＤ２０５＋である、項１〜５のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１２】
７．ＣＤ１１ｃ＋である、項１〜６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１３】
８．１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、項１〜７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１４】
９．前記樹状細胞成熟及び活性化マーカーが、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、項８に記載の樹状細胞。
【０２１５】
１０．懸濁培養における成長が可能である、項１〜１０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１６】
１１．ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である、項１〜１０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１７】
１２．ＴＬＲ７の切断型を発現する、項１〜１１のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１８】
１３．ＴＬＲ９を発現する、項１〜１２のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２１９】
１４．ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する、項１〜１３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２０】
１５．ＩＬ−１５を産生する、項１〜１４のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２１】
１６．無視できるレベルのＩＬ−１０及びＴＧＦβを産生する、項１〜１５のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２２】
１７．ｃ−Ｍｙｃを発現する、項１〜１６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２３】
１８．転写因子ＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１が、活性である、項１〜１７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２４】
１９．外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である、項１〜１８のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２５】
２０．１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、項１〜１９のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２６】
２１．ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている、項１〜２０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２７】
２２．１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を提示する、項１〜２１のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２８】
２３．前記抗原が、がん抗原である、項１〜２２のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２２９】
２４．ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する、項１〜２３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３０】
２５．前記抗原が、全長ＩκＢα、及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のアミノ酸３０１〜７００を含むフラグメントを含む融合タンパク質を含む、項２４に記載の樹状細胞。
【０２３１】
２６．前記融合タンパク質が、配列番号１３を有する、項２５に記載の樹状細胞。
【０２３２】
２７．ＨＬＡ−制限方式で前記がん抗原を提示する、項１〜２６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３３】
２８．前記がん抗原が、ウイルス形質転換によって導入される、項１〜２７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３４】
２９．前記ウイルスがレンチウイルスである、項１〜２８のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３５】
３０．抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項１〜２９のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３６】
３１．非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項１〜３０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２３７】
３２．改変単球由来樹状細胞であって、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現する、前記樹状細胞。
【０２３８】
３３．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、項３２に記載の樹状細胞。
【０２３９】
３４．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、項３２〜３３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４０】
３５．構成的な成熟及び活性化表現型を有する、項３２〜３４のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４１】
３６．ヒト細胞である、項３２〜３５のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４２】
３７．ＣＤ２０５＋である、項３２〜３６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４３】
３８．１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、項３２〜３７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４４】
３９．前記樹状細胞成熟及び活性化マーカーが、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ７０からなる群から選択される、項３８に記載の樹状細胞。
【０２４５】
４０．４−１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４をさらに発現する、項３８に記載の樹状細胞。
【０２４６】
４１．懸濁培養における成長が可能である、項３２〜４０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４７】
４２．培養で最大３ヶ月間増殖することが可能である、項３２〜４１のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４８】
４３．ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である、項３２〜４２のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２４９】
４４．ＴＬＲ７の切断型を発現する、項３２〜４３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５０】
４５．ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する、項３２〜４４のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５１】
４６．ＴＧＦβを産生する、項３２〜４５のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５２】
４７．ＩＬ−１５を産生する、項３２〜４６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５３】
４８．ｃ−Ｍｙｃを発現する、項３２〜４７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５４】
４９．外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である、項３２〜４８のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５５】
５０．１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、項３２〜４９のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５６】
５１．ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている、項３２〜５０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５７】
５２．１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を発現する、項３２〜５１のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５８】
５３．前記抗原が、がん抗原である、項３２〜５２のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２５９】
５４．ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する、項３２〜５３のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６０】
５５．前記抗原が、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む、項５４に記載の樹状細胞。
【０２６１】
５６．前記融合タンパク質が、配列番号１３を有する、項５５に記載の樹状細胞。
【０２６２】
５７．ＨＬＡ−制限方式で前記がん抗原を提示する、項３２〜５６のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６３】
５８．前記抗原が、ウイルス形質転換によって導入される、項３２〜５７のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６４】
５９．前記ウイルスがレンチウイルスである、項３２〜５８のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６５】
６０．抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項３２〜５９のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６６】
６１．非ＨＬＡ制限方式で細胞を殺傷することが可能である細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項３２〜６０のいずれかに記載の樹状細胞。
【０２６７】
６２．改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞、例えばＰＢＭＣを含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）培養下の前記細胞を有効量のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）によって処理することと；
ｉｉｉ）培養下の前記細胞を有効量のＩＬ−２によって処理することと；
ｉｖ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、前記細胞を培養することと；
ｖ）前記培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、前記方法。
【０２６８】
６３．前記ＰＢＭＣが、ロイコパックから単離されている、項６２に記載の方法。
【０２６９】
６４．前記ＰＨＡの濃度が、約１〜５μｇ／ｍｌの範囲である、項６２〜６３のいずれかに記載の方法。
【０２７０】
６５．前記ＰＨＡの濃度が、約５μｇ／ｍｌである、項６２〜６４のいずれかに記載の方法。
【０２７１】
６６．前記細胞が、約１２時間〜約３６時間、ＰＨＡで処理される、項６２〜６５のいずれかに記載の方法。
【０２７２】
６７．前記細胞が、約２４時間からＰＨＡで処理される、項６２〜６６のいずれかに記載の方法。
【０２７３】
６８．前記細胞が、ＰＨＡによる処理の後ＩＬ−２によって処理される、項６２〜６７のいずれかに記載の方法。
【０２７４】
６９．前記細胞が、ＰＨＡによる処理の後ＩＬ−２によって処理される、項６２〜６８のいずれかに記載の方法。
【０２７５】
７０．前記細胞が、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２によって処理されて、ＩＬ−２を含む培地においてある期間培養される、項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【０２７６】
７１．前記細胞が、ＩＬ−２を含む培地において２〜１０日の範囲の期間培養される、項６２〜７０のいずれかに記載の方法。
【０２７７】
７２．前記細胞が、約１００〜２００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地において約４〜５日の期間培養される、項６２〜７１のいずれかに記載の方法。
【０２７８】
７３．前記細胞が、ステップｉｉｉ）の後、機能性Ｔａｘタンパク質を発現するようにマニピュレートされる、項７１〜７２のいずれかに記載の方法。
【０２７９】
７４．前記細胞が、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質をコードするウイルスによって形質導入される、項７３に記載の方法。
【０２８０】
７５．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、及びＨＴＬＶ−３からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、項７４に記載の方法。
【０２８１】
７６．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、項７５に記載の方法。
【０２８２】
７７．前記ウイルスがレンチウイルスである、項７４〜７６のいずれかに記載の方法。
【０２８３】
７８．前記細胞が、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される、項７４〜７７のいずれかに記載の方法。
【０２８４】
７９．前記形質導入細胞が、約１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地においてさらに培養される、項７３〜７８のいずれかに記載の方法。
【０２８５】
８０．前記形質導入細胞が、ＩＬ−２を含む培地において約２〜３ヶ月間さらに培養される、項７３〜７９のに記載の方法。
【０２８６】
８１．前記形質導入細胞が、ヒト血清及びＩＬ−２を含む培地において培養される、項７３〜７８のいずれかに記載の方法。
【０２８７】
８２．前記形質導入細胞が、ヒト血清を含む培地において約２〜３ヶ月間培養される、項８１に記載の方法。
【０２８８】
８３．前記細胞が、５％熱不活化ヒトＡＢ血清を含む培地において培養される、項８２に記載の方法。
【０２８９】
８４．前記培地が、１０％ウシ胎児血清を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地を含む、項７０〜８０のいずれかに記載の方法。
【０２９０】
８５．前記培地が、完全ＲＰＭＩ１６４０培地を含む、項８１〜８３のいずれかに記載の方法。
【０２９１】
８６．前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞に結合する分子を含む組成物によって枯渇される、項６２〜８５のいずれかに記載の方法。
【０２９２】
８７．前記Ｔ細胞が、抗体によって枯渇される、項８６に記載の方法。
【０２９３】
８８．前記抗体が、抗ＣＤ３抗体である、項８７に記載の方法。
【０２９４】
８９．前記抗体が、電磁ビーズにコンジュゲートされている、項８７〜８８のいずれかに記載の方法。
【０２９５】
９０．前記樹状細胞が、構成的な成熟及び活性化表現型を有する、項６２〜８９のいずれかに記載の方法。
【０２９６】
９１．前記樹状細胞が、ヒト細胞である、項６２〜９０のいずれかに記載の方法。
【０２９７】
９２．前記樹状細胞が、ＣＤ２０５＋である、項６２〜９１のいずれかに記載の方法。
【０２９８】
９３．前記樹状細胞が、ＣＤ１１ｃ＋である、項６２〜９２のいずれかに記載の方法。
【０２９９】
９４．前記樹状細胞が、１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、項６２〜９３のいずれかに記載の方法。
【０３００】
９５．前記樹状細胞成熟及び活性化マーカーが、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、項９４に記載の方法。
【０３０１】
９６．前記樹状細胞が、懸濁培養における成長が可能である、項６２〜９５のいずれかに記載の方法。
【０３０２】
９７．前記樹状細胞が、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である、項６２〜９６のいずれかに記載の方法。
【０３０３】
９８．前記樹状細胞が、ＴＬＲ７の切断型を発現する、項６２〜９７のいずれかに記載の方法。
【０３０４】
９９．前記樹状細胞が、ＴＬＲ９を発現する、項６２〜９８のいずれかに記載の方法。
【０３０５】
１００．前記樹状細胞が、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する、項６２〜９９のいずれかに記載の方法。
【０３０６】
１０１．前記樹状細胞が、ＩＬ−１５を産生する、項６２〜１００のいずれかに記載の方法。
【０３０７】
１０２．前記樹状細胞が、無視できるレベルのＩＬ−１０及びＴＧＦβを産生する、項６２〜１０１のいずれかに記載の方法。
【０３０８】
１０３．前記樹状細胞が、ｃ−Ｍｙｃを発現する、項６２〜１０２のいずれかに記載の方法。
【０３０９】
１０４．前記転写因子ＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１が、活性である、項６２〜１０３のいずれかに記載の方法。
【０３１０】
１０５．前記樹状細胞が、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である、項６２〜１０４のいずれかに記載の方法。
【０３１１】
１０６．前記樹状細胞が、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、項６２〜１０５のいずれかに記載の方法。
【０３１２】
１０７．前記樹状細胞が、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている、項６２〜１０６のいずれかに記載の方法。
【０３１３】
１０８．前記樹状細胞が、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を提示する、項６２〜１０７のいずれかに記載の方法。
【０３１４】
１０９．前記抗原が、がん抗原である、項６２〜１０８のいずれかに記載の方法。
【０３１５】
１１０．前記細胞が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する、項６２〜１０９のいずれかに記載の方法。
【０３１６】
１１１．前記がん抗原が、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む、項１１０に記載の方法。
【０３１７】
１１２．前記融合タンパク質が、配列番号１３を有する、項１１１に記載の方法。
【０３１８】
１１３．前記細胞が、前記がん抗原をＨＬＡ−制限方式で提示する、項６２〜１１２のいずれかに記載の方法。
【０３１９】
１１４．前記がん抗原が、ウイルス形質転換によって導入される、項６２〜１１３のいずれかに記載の方法。
【０３２０】
１１５．前記ウイルスがレンチウイルスである、項１１４に記載の方法。
【０３２１】
１１６．前記樹状細胞が、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項６２〜１１５のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
１１７．単球由来樹状細胞を生成する方法であって：単球に由来する未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、前記方法。
【０３２３】
１１８．単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において前記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｖ）有効量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地において細胞を発現する前記機能性Ｔａｘタンパク質を培養することと
を含む、前記方法。
【０３２４】
１１９．ステップｉｖ）の後、ＩＬ−２を含む培地において前記細胞を培養することをさらに含む、項１１８に記載の方法。
【０３２５】
１２０．ＩＬ−４及び／またはＧＭ−ＣＳＦが、Ｆｃ４に融合されている、項１１７〜１１９のいずれかに記載の方法。
【０３２６】
１２１．前記接着単球が、約４００００００のＰＢＭＣに由来している、項１１７〜１２０のいずれかに記載の方法。
【０３２７】
１２２．パートｉｉ）の前記培養が、２９３細胞を産生するＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４からの馴化培地を含む培地において前記細胞を培養することを含む、項１１７〜１２１のいずれかに記載の方法。
【０３２８】
１２３．前記細胞が、約１：１０希釈で約７日間、前記馴化培地を含む培地において培養される、項１２２に記載の方法。
【０３２９】
１２４．前記細胞が、Ｔ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質をコードするウイルスによって形質導入される、項１１７〜１２３のいずれかに記載の方法。
【０３３０】
１２５．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、及びＨＴＬＶ−３からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、項１２４に記載の方法。
【０３３１】
１２６．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、項１２４に記載の方法。
【０３３２】
１２７．前記ウイルスがレンチウイルスである、項１２３〜１２６のいずれかに記載の方法。
【０３３３】
１２８．前記細胞が、約１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される、項１２３〜１２７のいずれかに記載の方法。
【０３３４】
１２９．前記培地が、約１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ１６４０培地を含む、項１１７〜１２８のいずれかに記載の方法。
【０３３５】
１３０．前記培養ステップｉｖ）が、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４及びＩＬ−４−Ｆｃ４の存在下で約５〜７日間、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地において、前記のＴａｘタンパク質発現細胞を培養し、続いて、培養において前記細胞を約１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２の存在下で維持することを含む、項１１７〜１２９のいずれかに記載の方法。
【０３３６】
１３１．前記単球由来樹状細胞を活性化させることをさらに含む、項１１７〜１３０のいずれかに記載の方法。
【０３３７】
１３２．前記活性化させることが、ＴＮＦα及びＬＰＳによって前記細胞を刺激することを含む、項１３１に記載の方法。
【０３３８】
１３３．前記ＴＮＦαが、約１０〜２５０ｎｇ／ｍｌの量で投与され、ＬＰＳが、約１〜５μｇ／ｍｌの量で投与される、項１３２に記載の方法。
【０３３９】
１３４．前記細胞が、１〜５日間刺激される、項１３１〜１３３のいずれかに記載の方法。
【０３４０】
１３５．前記細胞が、約２日間刺激される、項１３４に記載の方法。
【０３４１】
１３６．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−４からなる群から選択されるヒトＴ細胞白血病ウイルスからのものである、項１１７〜１３５のいずれかに記載の方法。
【０３４２】
１３７．前記Ｔａｘタンパク質が、ＨＴＬＶ−２からのものである、項１１７〜１３６のいずれかに記載の方法。
【０３４３】
１３８．前記樹状細胞が、構成的な成熟及び活性化表現型を有する、項１１７〜１３７のいずれかに記載の方法。
【０３４４】
１３９．前記樹状細胞が、ヒト細胞である、項１１７〜１３８のいずれかに記載の方法。
【０３４５】
１４０．前記樹状細胞が、ＣＤ２０５＋である、項１１７〜１３９のいずれかに記載の方法。
【０３４６】
１４１．前記樹状細胞が、１以上の樹状細胞成熟及び活性化マーカーを発現する、項１１７〜１４０のいずれかに記載の方法。
【０３４７】
１４２．前記樹状細胞成熟及び活性化マーカーが、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０からなる群から選択される、項１１７〜１４１に記載の方法。
【０３４８】
１４３．前記樹状細胞が、４−１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４をさらに発現する、項１４２に記載の方法。
【０３４９】
１４４．前記樹状細胞が、懸濁培養における成長が可能である、項１１７〜１４３のいずれかに記載の方法。
【０３５０】
１４５．前記樹状細胞が、培養で最大３ヶ月間増殖することが可能である、項１１７〜１４４のいずれかに記載の方法。
【０３５１】
１４６．前記樹状細胞が、ＴＬＲ３＋及びＴＬＲ４−である、項１１７〜１４５のいずれかに記載の方法。
【０３５２】
１４７．前記樹状細胞が、ＴＬＲ７の切断型を発現する、項１１７〜１４６のいずれかに記載の方法。
【０３５３】
１４８．前記樹状細胞が、ＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを産生する、項１１７〜１４７のいずれかに記載の方法。
【０３５４】
１４９．前記樹状細胞が、ＴＧＦβを産生する、項１１７〜１４８のいずれかに記載の方法。
【０３５５】
１５０．前記樹状細胞が、ＩＬ−１５を産生する、項１１７〜１４９のいずれかに記載の方法。
【０３５６】
１５１．前記樹状細胞が、ｃ−Ｍｙｃを発現する、項１１７〜１５０のいずれかに記載の方法。
【０３５７】
１５２．前記樹状細胞が、外生的に添加されたＩＬ−２の非存在下でナイーブリンパ球の増殖を誘導することが可能である、項１１７〜１５１のいずれかに記載の方法。
【０３５８】
１５３．前記樹状細胞が、１以上のＨＬＡタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、項１１７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【０３５９】
１５４．前記樹状細胞が、ＨＬＡ−Ａ２．１を発現するように遺伝子操作されている、項１１７〜１５３のいずれかに記載の方法。
【０３６０】
１５５．前記樹状細胞が、１以上の抗原もしくは抗原フラグメントまたはその変異体を発現する、項１１７〜１５４のいずれかに記載の方法。
【０３６１】
１５６．前記抗原が、がん抗原である、項１１７〜１５５のいずれかに記載の方法。
【０３６２】
１５７．前記樹状細胞が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはその抗原フラグメントもしくは変異体を発現する、項１１７〜１５６のいずれかに記載の方法。
【０３６３】
１５８．前記がん抗原が、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素のフラグメントを含む融合タンパク質を含む、項１５７に記載の方法。
【０３６４】
１５９．前記融合タンパク質が、配列番号１３を有する、項１５８に記載の方法。
【０３６５】
１６０．前記細胞が、ＨＬＡ−制限方式で前記抗原を提示する、項１５４〜１５９のいずれかに記載の方法。
【０３６６】
１６１．前記抗原が、ウイルス形質転換によって導入される、項１５４〜１６０のいずれかに記載の方法。
【０３６７】
１６２．前記ウイルスがレンチウイルスである、項１６１に記載の方法。
【０３６８】
１６３．前記樹状細胞が、抗原を認識する細胞毒性リンパ球を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能である、項１１７〜１６２のいずれかに記載の方法。
【０３６９】
１６４．項６２〜１６３のいずれかに記載の方法によって作製される樹状細胞。
【０３７０】
１６５．細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって
項１〜６１のいずれかに記載の樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒に、ある期間培養すること
を含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、前記方法。
【０３７１】
１６６．細胞毒性Ｔリンパ球を産生するための方法であって
ｉ）項１〜６１のいずれかに記載の樹状細胞を、ナイーブリンパ球を含む細胞と一緒に、第１期間培養して、細胞の混合培養物を作り出すことと；
ｉｉ）前記細胞の混合培養物を有効量のＩＬ−２によって処理して、前記細胞を、第２期間、培養し続けることと
を含み、これにより、細胞毒性Ｔリンパ球が産生される、前記方法。
【０３７２】
１６７．前記ナイーブリンパ球を含む細胞が、ナイーブＰＢＭＣを含む、項１６５〜１６６のいずれかに記載の方法。
【０３７３】
１６８．前記ナイーブリンパ球が、ロイコパックから単離されている、項１６５〜１６７のいずれかに記載の方法。
【０３７４】
１６９．前記ナイーブリンパ球及び前記樹状細胞が、同種異系である、項１６５〜１６８のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
１７０．前記樹状細胞対ナイーブＰＢＭＣの比が、約１：１００である、項１６５〜１６９のいずれかに記載の方法。
【０３７６】
１７１．前記ステップｉ）の培養が、外因性サイトカインを添加することなく行われる、項１６６〜１７０のいずれかに記載の方法。
【０３７７】
１７２．前記第１期間が、約２〜３日間である、項１６６〜１７２のいずれかに記載の方法。
【０３７８】
１７３．前記ＩＬ−２の濃度が、約１００〜２００ユニット／ｍｌである、項１６６〜１７２のいずれかに記載の方法。
【０３７９】
１７４．前記第２期間が、２〜６週間である、項１６６〜１７３のいずれかに記載の方法。
【０３８０】
１７５．前記細胞毒性Ｔリンパ球が、抗原特異的であり、ＨＬＡ−制限方式で、標的細胞の細胞溶解を誘導する、項１６６〜１７４のいずれかに記載の方法。
【０３８１】
１７６．前記細胞毒性Ｔリンパ球が、非ＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷する可能性があるＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を含む、項１６６〜１７５のいずれかに記載の方法。
【０３８２】
１７７．前記樹状細胞が、４−１ＢＢＬを発現する、項１６６〜１７６のいずれかに記載の方法。
【０３８３】
１７８．前記樹状細胞が、４−１ＢＢＬを発現するように改変されている、項１６６〜１７７のいずれかに記載の方法。
【０３８４】
１７９．前記の細胞の非ＨＬＡ−制限殺傷が、ＮＫＧ２Ｄのリガンド結合によって媒介される、項１７６〜１７８のいずれかに記載の方法。
【０３８５】
１８０．有効量の、項１６５〜１７９のいずれかに記載の方法によって産生される細胞毒性Ｔリンパ球を含む、医薬組成物。
【０３８６】
１８１．対象において疾患または状態を処置する方法であって、前記対象に、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、前記細胞毒性Ｔリンパ球が、項１〜６１のいずれかに記載の樹状細胞を使用して産生される、前記方法。
【０３８７】
１８２．対象において疾患または状態を処置する方法であって、前記対象に、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球を投与することを含み、前記細胞毒性Ｔリンパ球が、項１６５〜１７９のいずれかに記載の方法によって産生される、前記方法。
【０３８８】
１８３．対象において疾患または状態を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、項１〜６１のいずれかに記載の樹状細胞を投与することを含む、前記方法。
【０３８９】
１８４．前記疾患が、がんである、項１８１〜１８３のいずれかに記載の方法。
【０３９０】
１８５．前記がん細胞が、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する、項１８４に記載の方法。
【０３９１】
１８６．前記がんが乳がんである、項１８１〜１８５のいずれかに記載の方法。
【０３９２】
１８７．前記対象が、哺乳動物である、項１８１〜１８６のいずれかに記載の方法。
【０３９３】
１８８．前記対象が、ヒトである、項１８１〜１８７のいずれかに記載の方法。
【０３９４】
１８９．改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）未成熟樹状細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと
を含む、前記方法。
【０３９５】
１９０．改変初代血液樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）樹状前駆体細胞を含む細胞のサンプルを付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現し、前記細胞を培養することと；
ｉｉｉ）前記細胞を培養して樹状細胞への分化を誘導することと；
ｉｖ）前記培養細胞からＴ細胞を枯渇させることと
を含む、前記方法。
【０３９６】
１９１．単球由来樹状細胞を生成する方法であって：
ｉ）接着単球細胞を付与することと；
ｉｉ）前記細胞においてＴ細胞白血病ウイルスからの機能性Ｔａｘタンパク質を発現することと；
ｉｉｉ）前記細胞を培養して樹状細胞への分化を誘導することと
を含む、前記方法。
【０３９７】
特定の課題に対する本発明の教示の適用は、本明細書に含有される教示に照らして当業者の能力の範囲内である。本発明の組成物及び方法の例は、以下の非限定例において明らかである。
【実施例】
【０３９８】
実施例１．ヒト初代血液及び単球由来樹状細胞株の開発
ＨＴＬＶ−２Ｔａｘを、ＤＣ機能の調節における役割の分子ツールとして利用した。Ｔａｘ−形質導入ＰＢＭＣの培養の間のＤＣの潜在的損失を防止するために、形質導入細胞を、抗ＣＤ３電磁ビーズを使用してネガティブ選択して、Ｔ細胞を枯渇させた。１０の血液ドナーの形質導入ＰＢＭＣからの２つのＣＤ３−ネガティブＴａｘ−ＧＦＰ＋細胞株を、成長可能性を損失することなく６ヶ月にわたって連続して進化及び成長させた。２つの異なる血液ドナーから樹立したこれらの２つのＤＣ細胞株は、樹状細胞関連マーカーを表した。これらの細胞は、系列−ネガティブであり、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ２０５、ならびに、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲを含めたＤＣ成熟及び活性化分子を発現した（図１ａ及び１ｂ）。これらの２つの細胞株をｉｈｖ−ＤＣ１及びｉｈｖ−ＤＣ２と命名し、これらは、構成的な成熟及び活性化表現型を維持するヒトＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ２０５＋血液樹状細胞のサブセットを表した。
【０３９９】
ｉｈｖ−ＤＣは、通常の培養条件において懸濁で成長し、いくつかの細胞が接着して、典型的な樹状突起を示した。ＤＣ成長を促進する際のＴａｘの能力を実証するために、ＰＢＭＣからの接着単球をまずＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４によって刺激して、単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を生成した（図１ｃ）。これらのＭｏＤＣのいくらかは樹状突起を提示し、ＭｏＤＣを続いてＴａｘレンチウイルスによって形質導入した。形質導入ＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞を培養の間に分離させ、これらの細胞は、最大３ヶ月間増殖することが可能であった。ＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞は、成熟及び活性化表現型を提示した（図１ｄ）。これらの結果は、Ｔａｘが、通常の培養条件で細胞接着を損失した血液及び単球由来ＤＣの両方の成長を促進することができたことを示唆した。
【０４００】
結果
ｉｈｖ−ＤＣにおけるＴＬＲ、サイトカイン及び細胞内シグナル伝達分子の発現
細胞内ｄｓＲＮＡ−センシングＴＬＲ３受容体は発現されたが、ＴＬＲ４はｉｈｖ−ＤＣ及びＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞の両方においてネガティブであった（図２ａ）。ＴＬＲ７の切断型はｉｈｖ−ＤＣ及びＭｏＤＣ−Ｔａｘの両方において検出されたが、ＭｏＤＣにおいては検出されず（図２ｂ）、これは、ＴａｘがＤＣにおいてＴＬＲ７を上方調節したことを示唆した。ＴＬＲ９は、ｉｈｖ−ＤＣ２において高度に、ＭｏＤＣにおいて僅かに発現された（図２ｂ）。ＴＬＲ発現ステータスに関わらず、これらの受容体は、これらの樹立ＤＣ細胞株が、高レベルの共刺激分子、例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０及びＣＤ８３を持続的に発現したため、ＤＣの成熟及び活性化を誘導するのにもはや必要ではなかった。
【０４０１】
炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１Ａ及びＴＮＦαを全てのｉｈｖ−ＤＣ及びＭｏＤＣにおいて産生した一方で、ＩＬ−１０及びＴＧＦβを含めた免疫調節因子をｉｈｖ−ＤＣにおいて無視できるレベルで発現し、ＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞がＴＧＦβを産生した（図２ｃ〜２ｆ）。ＣＤ８＋細胞毒性リンパ球の発生に有利に働くＩＬ−１５を、全ての樹立ＤＣ細胞株及び活性化ＭｏＤＣにおいて高レベルで産生した（図２ｃ〜２ｆ）。これらの結果を合わせて考えると、ｉｈｖ−ＤＣにおけるＴＬＲ及びサイトカインの発現プロファイルは、従来の方法によって生成した成熟及び活性化血液ＤＣの表現型とよく関連していた。
【０４０２】
Ｔａｘは、ｉｈｖ−ＤＣ及びＭｏＤＣ−Ｔａｘ細胞の両方におけるｃ−Ｍｙｃの過剰発現によって証明されているように、細胞周期の進行を駆動する能力を有した（図２ｇ）。生存促進性Ｂｃｌ−２タンパク質、Ｂｃｌ−ｘＬを、Ｔａｘを発現したＤＣにおいてのみとりわけ上方調節した（図２ｈ）。細胞サイクル調節因子、ｐＲｂ及びｃｄｃ２を、ｉｈｖ−ＤＣにおいてリン酸化した（図２ｉ）。Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ５のリン酸化形態は全てのＤＣにおいて検出され（図２ｌ）、ＮＦ−κＢ、Ｓｔａｔ３及びＡＰ−１を含めた転写因子の活性もｉｈｖ−ＤＣにおいて観察された（図２ｊ）。これにより、Ｔａｘが、腫瘍形成活性化及び細胞周期進行の誘導を通して、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴａｘ−媒介不死化と同様のメカニズムによって血液ＤＣを不死化させたと思われた。
【０４０３】
ｉｈｖ−ＤＣによる抗原特異的ＣＴＬの誘導
ｉｈｖ−ＤＣからのＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子をクローン化し、配列決定した。配列分析は、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞はＨＬＡ−Ａ３０／Ｂ７１であったがｉｈｖ−ＤＣ２細胞はＨＬＡ−Ａ２．１／Ｂ４０であったことを示した。ＨＬＡ−Ａ２は、最も頻繁なＨＬＡ対立遺伝子の１つであるため、これをまず決定して、細胞毒性リンパ球の誘導におけるｉｈｖ−ＤＣ２の機能性を試験した。混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイを、１：１００の比で、ＨＬＡ−Ａ２＋の健常な血液ドナーから直接単離したナイーブＰＢＭＣとｉｈｖ−ＤＣ２細胞を混合することによって設定した。ｉｈｖ−ＤＣ２細胞は、最初の２〜３日で組み換えＩＬ−２の非存在下にドナーリンパ球の劇的な増加を誘導したことが観察された。反応性リンパ球は、４〜６週間、組み換えＩＬ−２の存在下で増殖し続けた。ＭＬＲの２週間後、種々のドナーのＰＢＭＣから生成した、ｉｈｖ−ＤＣ−活性化された、増殖しているリンパ球が、エフェクタＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な免疫表現型を表し、豊富な量の細胞毒性成分、パーフォリン及びグランザイムＢを発現し、多量のＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生した（図３ａ、３ｂ及び３ｃ）。ｉｈｖ−ＤＣ細胞は、ＭＬＲ培養物におけるＴａｘ−ＧＦＰ緑色蛍光シグナルの欠失によって証明されているように完全に消失した。ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬを、Ｔａｘ抗原の認識について評価した。ＨＬＡ−Ａ２．１を、まず、ＨＬＡ−Ａ２−ネガティブＭＴ４細胞（Ｔａｘ＋ＨＴＬＶ−１−形質転換Ｔ細胞）内に発現させた（図３ｄ）。ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬは、ＭＴ４細胞のものよりも強力にＭＴ４−Ａ２．１細胞の細胞溶解を誘導したことが見出された（図３ｅ）。標的細胞モデルを、Ｔａｘ−ＦＬＡＧを用いてまたはこれを用いずに、ルシフェラーゼ、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びＨＬＡ−Ａ２．１の逐次的なレンチウイルス形質転換によって改変ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して発生させた（図３ｆ）。Ｔａｘを細胞質点斑において主に局在化させた（図３ｆ）。ｉｈｖ−ＤＣ−活性化ＣＴＬが、１０：１のＥ：Ｔ比において、およそ９０％のＴａｘ−発現のＨＬＡ−Ａ２＋３Ｔ３細胞の細胞溶解を誘導したことが示された（図３ｇ及び３ｈ）。
【０４０４】
Ｔａｘ−不死化ＤＣが、がん原遺伝子タンパク質、例えばｃ−Ｍｙｃを過剰発現及び活性化して、細胞周期の進行及び増殖を促進したため、ｉｈｖ−ＤＣによって活性化されたＣＴＬは、これらのがんタンパク質が無秩序化される場合が多いがん細胞を認識することができたと思われる。この仮説を試験するために、２つのＨＬＡ−Ａ２＋がん細胞株、Ａ３７５（転移性黒色腫）及びＰＡＮＣ−１（膵臓がん）、ならびに１つのＨＬＡ−Ａ２−ネガティブ細胞株、Ｈ１２９９（肺がん）を選択した。ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬはＡ３７５及びＰＡＮＣ−１細胞の細胞溶解を効果的に誘導したが、Ｈ１２９９細胞において見かけの殺傷活性を有さなかったことが示された（図４ａ〜４ｄ）。ＨＬＡ−Ａ２．１ｃＤＮＡを次にＨ１２９９細胞（図４ｅ）に導入したところ、ＨＬＡ−Ａ２．１＋Ｈ１２９９細胞が、ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬによって媒介される殺傷に感受性になったことが見出された（図４ｆ、４ｇ）。まとめて、これらの結果は、ｉｈｖ−ＤＣ２−活性化ＣＴＬが、Ｔａｘ−発現細胞及びがん細胞においてＨＬＡ−制限標的細胞殺傷を媒介する能力を有したという見解を支持した。
【０４０５】
ｈＴＥＲＴ特異的なＣＴＬを発生させるｉｈｖ−ＤＣにおけるｈＴＥＲＴフラグメントの発現
樹立樹状細胞株の有意な利点の１つは、初代ＤＣとは違って、ＤＣ細胞株が、抗原提示において機能を向上させるように遺伝子操作され得ることである。この考えを検証するために、ＨＬＡ−Ａ２．１をＨＬＡ−Ａ２−ネガティブｉｈｖ−ＤＣ１細胞内に導入して、ｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１細胞を生成させた。ほぼ１００％のｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１細胞がＨＬＡ−Ａ２＋であった（図５ａ）。公知の汎用腫瘍抗原を選択してｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１細胞内に導入した。ｈＴＥＲＴは、９０％超のヒトのがんにおいて過剰発現し、無数の認識されたＣＴＬエピトープ２４を構成する。抗原処理を容易にするために、融合構築物、ｐＴＥＲＴを設計し、これは、ＩκＢαのプロテアソーム標的配列、及び６つのＨＬＡ−Ａ２−制限ＣＴＬエピトープをカバーするｈＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）のフラグメントからなった（図５ｂ、５ｃ）。ｉｈｖ−ＤＣがＮＦ−κＢの構成的な活性を示したため、ｐＴＥＲＴは、予測通り高速で退化して、ＨＬＡ分子との複合体の形成において豊富な量のＴＥＲＴペプチドを潜在的に産生した。ｐＴＥＲＴを、レンチウイルス形質転換を介してｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１細胞に導入した。ｐＴＥＲＴがＤＭＳＯ処理ｉｈｖ−ＤＣ１／ｐＴＥＲＴ細胞において辛うじて検出され、これらのＤＣの、ＭＧ１３２、プロテアソームの化学的阻害剤による前処理がｐＴＥＲＴの蓄積を誘導したことが見出された（図５ｃ）。次に、標的細胞モデルを、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）のレンチウイルス形質転換による改変３Ｔ３Ｌ−Ａ２．１細胞を使用して設計した（図５ｄ）。ｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１及びｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１／ｐＴＥＲＴ細胞を使用してナイーブＰＢＭＣをプライミングし、細胞毒性リンパ球を生成した。ｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１／ｐＴＥＲＴ−活性化ＣＴＬがｉｈｖ−ＤＣ１−Ａ２．１−活性化ＣＴＬよりもかなり強力に改変ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞溶解を誘導したことが見出された（図５ｅ、５ｆ）。これらの所見は、樹立ｉｈｖ−ＤＣが、細胞内に所与の腫瘍抗原を送達するようにさらに改変され得るという考えを支持した。
【０４０６】
ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによる非ＨＬＡ−制限がん細胞殺傷
ｉｈｖ−ＤＣ２細胞とは異なり、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞の主な集団を構成し（図６ａ）、これは、非ＨＬＡ−制限方式でＮＫＧ２Ｄ及びそのリガンドの相互作用を通してがん細胞を殺傷するサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）の組成と類似した。ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを含むＮＫＧ２Ｄリガンドは、がん細胞及びウイルス感染細胞の表面において選択的に発現されたが、正常な細胞２５，２６においては非常に低いレベルでも検出または発現されなかった。この独自の特徴は、がん細胞におけるＣＴＬ−媒介殺傷に選択的な標的として機能する。図６ｂに示すように、ＭＩＣＡ／Ｂは、Ｈ１２９９、ＨｅＬａ及びＡ３７５細胞において発現されたが、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）においては検出されなかった。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＨＬＡのタイプに関わらず、全てのこれらのがん細胞の細胞溶解を強力に誘導したことが見出された（図６ｃ〜６ｆ）。対照的に、これらのＣＴＬは、ＮＨＦ細胞において殺傷活性を有さなかった（図６ｇ）。
【０４０７】
この細胞傷害機序をさらに調査するために、遮断抗体をＮＫＧ２Ｄに利用した。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡ分子の表面発現を欠失するが、ＮＫＧ２Ｄ及びそのリガンドの相互作用を介して標的細胞を殺傷するＮＫ細胞に感受性であったため、ＣＴＬ−媒介殺傷に耐性であることが知られていた。固定量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（５０μｇ／ｍｌ）では、より低いＥ：Ｔ比（１．２５：１及び２．５：１）でのｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによる殺傷からＫ５６２細胞を効果的に防御した（図７ａ）。より高いＥ：Ｔ比（５：１及び１０：１）では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、Ｋ５６２細胞を殺傷から保護するのにあまり有効でないようであった（図７ａ）。次に、固定のＥ：Ｔ比（２．５：１）及び増加量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いた。この遮断抗体は、用量依存でＫ５６２細胞のｉｈｖ−ＤＣ１−ＣＴＬ−媒介殺傷を防止したことが示された（図７ｂ）。同様に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（５０μｇ／ｍｌ）は、より低いＥ：Ｔ比においてｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬによる細胞溶解からメラノーマ細胞を救出したことが見出された（図７ｃ）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ヒトＭＩＣＡを用いてまたは用いずにルシフェラーゼを発現することによってさらに改変した（図７ｄ）。ヒトＨＬＡ対立遺伝子はＮＩＨ３Ｔ３細胞に存在しなかったため、ヒトＣＴＬによるこれらの標的細胞の殺傷がＴＣＲ認識を通して媒介される可能性は低かった。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬが３Ｔ３Ｌ／ベクター細胞の殺傷よりも強力に３Ｔ３Ｌ／ｈＭＩＣＡ細胞の細胞溶解を誘導することも実際に見出された（図７ｅ、７ｆ）。まとめて、これらの所見は、図５に示すように、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬが、ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞の主な組成物と共に、がん細胞において発現されるＮＫＧ２Ｄ及びそのリガンドの相互作用を介してがん細胞の細胞溶解を誘導し、また、ＨＬＡ依存で標的細胞を殺傷する能力も有したことを示した。さらに、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬにおいて発現された高密度のＮＫＧ２Ｄは、可溶性のＮＫＧ２Ｄリガンドからの中和効果に潜在的に打ち勝つことができた。
【０４０８】
ＮＳＧマウスモデルにおけるヒト乳がんのｉｈｖ−ＤＣ１ベースの免疫療法
ｉｈｖ−ＤＣベースの免疫療法の適用を検討するために、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞を、非ＨＬＡ−制限方式でがん細胞を殺傷する豊富な量のＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を生成する独自の能力について選択した。ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ（ＭＣＦ−７の複数の化学療法剤耐性の誘導体）及びＨＥＲ２／Ｎｅｕ＋ＨＣＣ１９５４細胞を含めた３の乳がん細胞株を選んだ。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、これらの乳がん細胞の細胞溶解を非常に強力に誘導したことが観察された（図８ａ、８ｂ）。ＭＩＣＡ／Ｂを全ての被験乳がん細胞株において高度に発現させた（図８ｃ）。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（１００μｇ／ｍｌ）は、ＣＴＬからのがん細胞殺傷を効率的に防止した（図８ｄ）。
【０４０９】
これらの有望なインビトロでの結果は、本発明者らに、同所性乳がんＮＳＧマウスモデルにおいてＴ細胞治療を調査することを促した。第１動物実験において、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、上記方法において記載されているＴ細胞治療法の後、乳腺脂肪体における樹立ＨＣＣ１９５４腫瘍の成長を劇的に抑制した（図９ａ〜９ｃ）。より顕著には、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＨＣＣ１９５４腫瘍の肺転移を効率的に阻害した。ＣＴＬ処置群の全てのマウスにおいて、転移箇所が見られなかった一方で、非処置群の全てのマウスからの肺では微小転移が検出された（図９ｄ）。抗ヒトＣＤ３染色を次いで適用して、注入されたＣＴＬのインビボ輸送パターンを評価した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞が、腫瘍塊、脾臓及び肺組織において検出され、いくつかのＣＤ３＋細胞が、ＣＴＬ群マウスにおける肝臓において見出されたことが示された（図９ｅ）。浸潤性Ｔ細胞は、ＣＴＬ群マウスにおける心臓及び腎臓において見出されなかった（図９ｅ）。第２動物実験は、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ乳がんＮＳＧマウスモデルを利用した。ＨＣＣ１９５４ＮＳＧモデルと同様に、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、乳腺脂肪体におけるＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍の成長を阻害したことが観察された（図１０ａ〜１０ｂ）。実験期間の６０日間で、ＣＴＬ群マウスにおいて体重減少及び他の副作用が見られなかった（図１０ｃ）。より重要なことには、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＣＴＬ群マウスにおけるＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍の肺転移を効果的に阻害した（図１０ｄ）。注入されたＣＴＬは、腫瘍塊、肝臓、脾臓及び肺組織に浸潤したが、心臓及び腎臓には浸潤しなかった（図１０ｅ）。これらのデータは、そのため、マウスモデルにおけるｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬの治療効果を実証し、また、所望のインビボ輸送パターンを示した。
【０４１０】
腫瘍形成活性化を通して細胞周期進行を誘導するウイルスＴａｘタンパク質を発現することによる、不死化され構造的に活性化されたヒト初代血液樹状細胞（ＤＣ）株、ｉｈｖ−ＤＣの発生を本明細書において記載する。ｉｈｖ−ＤＣは、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ２０５＋ＤＣのサブセットであり、共刺激分子を持続的に表し、ドナー由来のリンパ球をプライミングして、ＨＬＡ−制限方式でＴａｘ−発現細胞及びがん細胞を認識及び殺傷することができるＣＤ８＋エフェクタの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成することができる。ｉｈｖ−ＤＣは、Ｔ細胞をプライミングしてＨＬＡ−Ａ２−制限のｈＴＥＲＴ特異的なＣＴＬを生成する際にヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）フラグメントを発現するように遺伝子操作され得る。Ｔ細胞をプライミングしてＨＬＡ−制限標的細胞殺傷を媒介することに加えて、ｉｈｖ−ＤＣ株の１つ、ｉｈｖ−ＤＣ１が、ＮＫＧ２Ｄと、がん細胞において発現されるそのリガンドとの相互作用を通して、広範な抗がん活性によってＣＤ３＋／ＣＤ５６＋ＣＴＬの確固たる増加を促進する。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、樹立腫瘍の成長を強力に阻害し、同所性ＮＳＧマウスモデルにおける乳がん細胞の肺転移を抑制する。より重要なことには、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、原発腫瘍遺伝子座及び転移部位に浸潤して、天然のインビボでのＣＴＬ輸送特徴を模倣することができる。これらの樹立ヒト血液ＤＣは、細胞ベースの免疫療法の開発を容易にする。
【０４１１】
血液ドナーからＰＨＡ／ＩＬ−２刺激Ｔａｘ−形質導入ＰＢＭＣを選択することによってヒト血液樹状細胞株を発生させる新規の方法を本明細書において記載する。樹立ｉｈｖ−ＤＣは、その成熟及び活性化表現型を損失することなく長時間の培養において確実に成長及び維持され得る。接着単球から分化したＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４−誘導ＤＣにおいてＴａｘを発現させることによって単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を増幅する方法も本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、第２の方法は、最大３ヶ月間、成熟及び活性化ＭｏＤＣの成長を可能にする。この方法は、数百万のＰＢＭＣから適当な数の活性化ＭｏＤＣを生成することができ、これは、望ましくないアフェレーシス手法を排除することによる、従来のＭｏＤＣ方法よりも有意な利点である。その上、初代ＤＣとは違って、樹立ＤＣは、細胞内に所与の腫瘍抗原を発現させることによって容易に修飾されることにより、ＣＤ８Ｔ細胞をプライミングする際に複数の抗原性エピトープを提示し、かつ、抗がん免疫の発生を高めることができる。
【０４１２】
血液ＤＣを不死化及び活性化する際のＴａｘの能力は、これまでに報告されていない。理論に拘束されることなく、取り組みの達成は、いくつかのレベルでの細胞選択及び培養技術に起因している。まず、ＰＨＡ／ＩＬ−２がＴ細胞増殖を刺激し、活性化Ｔ細胞は、初代未成熟ＤＣがレンチウイルス形質転換に高度に耐性であるため、血液未成熟ＤＣがＴａｘレンチウイルスによって形質導入されることを場合により可能にする可溶性因子を分泌し得る。第２に、Ｔａｘ−形質導入リンパ球の大部分が、Ｔａｘ−形質導入ＤＣよりもかなり速く増殖するため、早期の選択段階でのＴ細胞の枯渇は、少数のＤＣが健康に育つことを可能にする必須のステップである。第３に、大部分のＴａｘ−形質導入ＤＣは、形質転換後の３ヶ月目に「成長の転換点」を経験し得、そのいくらかは、この段階を通った後にその成長強度を取り戻す。そのため、Ｔａｘ−形質導入ＤＣが不死になるのを助ける継続的な培養の取り組みが必要である。
【０４１３】
重要な表現型の１つは、ｉｈｖ−ＤＣが、さらなる刺激を必要とせず、構造的に活性化されていることである。Ｔａｘは、ＤＣの成熟及び活性化を促進する能力を一見有する。ＮＦ−κＢシグナル伝達のＴａｘ−誘導活性化は、ＤＣの成熟及び活性化のプロセスにおいて重要な役割をすることが推論される。侵入する病原体に遭遇する際、病原体の成分は、未成熟ＤＣにおけるＴＬＲ、例えばＴＬＲ３及びＴＬＲ４を刺激する。ＴＬＲ３またはＴＬＲ４結合は、受容体−関連ＴＲＡＦ６を活性化し、ＩκＢキナーゼ複合体、ＮＦ−κＢシグナル伝達の中心的調節因子を含めた下流のシグナル伝達分子の活性化を次いで誘発する。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＴＲＡＦ６  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，３５３−３６３（２００３）；Ｈｕｌｌ，Ｃ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｇ．，Ｗｏｎｇ，Ｆ．，Ｄｕｒｉｅｚ，Ｐ．Ｊ．＆  Ｋａｒｓａｎ，Ａ．Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９，２６１１−２６１８（２００２）。ＮＦ−κＢは、ＤＣの成熟及び活性化を誘導する際に重要なメディエータであることがよく認識されている。Ｒｅｓｃｉｇｎｏ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｏ，Ｍ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｏｌｄ，Ｍ．Ｒ．＆  Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ，Ｐ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８８，２１７５−２１８０（１９９８）；Ａｒｄｅｓｈｎａ，Ｋ．Ｍ．，Ｐｉｚｚｅｙ，Ａ．Ｒ．，Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓ．＆  Ｋｈｗａｊａ，Ａ．Ｔｈｅ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ，ｐ３８  ＳＡＰ  ｋｉｎａｓｅ，ａｎｄ  ＮＦ−κＢ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ  ９６，１０３９−１０４６（２０００）。ＴＲＡＦ６はまた、ＭＡＰキナーゼを活性化し、ＡＰ−１活性化を結果として誘導するのにも必要である。Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．＆  Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ（ＴＲＡＦｓ）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０  ，６４８２−６４９１（２００１）。さらに、Ｓｔａｔ３活性は、ＩＬ−１５由来ＤＣが抗原提示能力を取得し、かつ分裂したＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を媒介するのに重要である。Ｏｋａｄａ，��．，Ｈａｎ，Ｓ．，Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．−Ｊ．＆  Ｃｈａｎｇ，Ｌ．−Ｊ．ＳＴＡＴ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９３，４６１−４７１（２０１５）。これらの報告と一致して、ｉｈｖ−ＤＣは、Ｔａｘ、ならびに場合により炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１及びＴＮＦαによって誘導される、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１及びＳｔａｔ３の構造的活性を示すことにより、その成熟及び活性化に寄与することが実証されている。
【０４１４】
ｉｈｖ−ＤＣ１及びｉｈｖ−ＤＣ２細胞の両方が、ＨＬＡ−制限方式で標的細胞の細胞溶解を誘導する抗原特異的ＣＴＬを生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングする能力を有する。しかし、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞は、非ＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷することができるＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞を誘導し増加させることもできるため、ｉｈｖ−ＤＣ２細胞とは一見異なる。ＤＣマーカー、共刺激分子及びサイトカインの発現プロファイルを分析することによって、４−１ＢＢＬのレベル及びＣＤ１１ｃ／４−１ＢＢＬ比が、細胞毒性リンパ球の組成物の運命を決定するのに重要な役割をする傾向があるとされている。ｉｈｖ−ＤＣ１細胞と比較して、ｉｈｖ−ＤＣ２細胞は、より低いレベルの４−１ＢＢＬ及びより高いレベルのＣＤ１１ｃを発現し、ＣＤ３＋／ＣＤ５６−Ｔ細胞の生成を促進する。逆に、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞は、より高いレベルの４−１ＢＢＬ及びより低いレベルのＣＤ１１ｃを発現することにより、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋Ｔ細胞の生成及び増加を誘導する。この可能性を検証するために、４−１ＢＢＬの発現を、低いレベルの４−１ＢＢＬを発現するＤＣにおいて向上させた。本発明者らは、はるかにより高いレベルの４−１ＢＢＬを有するＤＣが、ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞（データは示さず）を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングしたことを実際に見出した。この現象は、将来の研究において調査される。そのため、ｉｈｖ−ＤＣ１細胞は、ＨＬＡのタイプに関わらず、種々のがん細胞を殺傷することができる豊富な量のＣＤ３＋／ＣＤ５６＋エフェクタＴ細胞を生成するようにナイーブＰＢＭＣをプライミングすることが可能であるため、独特である。
【０４１５】
理論上では、ＤＣプライミングＴ細胞は、抗原特異的であり、自家移植設定においてＨＬＡ−制限方式で標的細胞を殺傷する。しかし、健常なドナーにおける腫瘍抗原特異的なリンパ球の数は極めて低く、そのため、自家移植設定を使用してがん治療に適切な数の腫瘍抗原特異的ＣＴＬを生成することは困難な仕事である。とりわけ、最大で１０％のナイーブリンパ球が、同種反応性を示し、非同系設定において腫瘍抗原／ＨＬＡ複合体を認識する。Ｒｏｓｓｊｏｈｎ，Ｊ．＆  ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｊ．Ｈｏｗ  ａ  ｈｏｍｅ−ｇｒｏｗｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｃｅｌｌ  １２９，１９−２０（２００７）；Ｇｒａｓ，Ｓ．，Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｒｏｓｓｊｏｈｎ，Ｊ．＆  ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８９，３８８−３９５  （２０１１）；Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．＆  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ｗ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９６，１２５−１４６（２００３）。ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化同種異系ＣＴＬは抗原特異的であり、Ｔａｘ抗原／ＨＬＡ−Ａ２複合体及び腫瘍抗原／ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示する標的細胞を認識することが見出された。加えて、ＮＫ細胞と同様に、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、そのリガンド、がん細胞及びウイルス感染細胞において典型的に発現される応力誘導表面分子群を標的するＮＫＧ２Ｄを通して広範なヒトのがんを殺傷する。Ｎａｕｓｃｈ，Ｎ．＆  Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．ＮＫＧ２Ｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７，５９４４−５９５８（２００８）．Ｒａｕｌｅｔ，Ｄ．Ｈ．，Ｇａｓｓｅｒ，Ｓ．，Ｇｏｗｅｎ，Ｂ．Ｇ．，Ｄｅｎｇ，Ｗ．＆  Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＮＫＧ２Ｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，４１３−４４１（２０１３）；Ｖｅｒｎｅｒｉｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｋａｒａｍｉ，Ｍ．，Ｂａｋｅｒ，Ｊ．，Ｊａｙａｓｗａｌ，Ａ．＆  Ｎｅｇｒｉｎ，Ｒ．Ｓ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＫＧ２Ｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３，３０６５−３０７２（２００４）；Ｋａｒｉｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＮＫＧ２Ｄ，ＤＡＰ１０，ａｎｄ  ＤＡＰ１２  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏ���ｙ  １７５，７８１９−７８２８（２００５）。ＣＴＬにおけるＮＫＧ２Ｄとがん細胞におけるそのリガンドとの相互作用を通して、ｉｈｖ−ＤＣ１誘導ＣＴＬは、パーフォリン及びグランザイムを含む細胞毒性成分を放出して、がん細胞死を引き起こす。これに関して、ｉｈｖ−ＤＣ１−活性化ＣＴＬは、ＮＫ細胞、または、非ＨＬＡ−制限方式でがん細胞を殺傷するサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）と同様に機能する。Ｍａｒｔｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８６，１０２９−１０３７（２００１）；Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｈａｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｎ  ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２９，１８４１−１８５０（２０１３）；Ｗｏｎｇｋａｊｏｒｎｓｉｌｐ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＣＤ３＋  ＣＤ５６＋  ｓｕｂｓｅｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ７８９８０（２０１３）；Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｅ．Ｆ．，Ｓｔｏｎｉｅｒ，Ｓ．Ｗ．，Ｆｒａｓｃａ，Ｌ．＆  Ｓｃｈｌｕｎｓ，Ｋ．Ｓ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＩＬ−１５  ｔｒａｎｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８３，４９４８−４９５６（２００９）；Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＩＬ−２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３０２６４（２０１２）；Ｄｏｍｏｇａｌａ，Ａ．，Ｍａｄｒｉｇａｌ，Ｊ．Ａ．＆  Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，２６４（２０１５）；Ｃｈｉｌｄｓ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｃａｒｌｓｔｅｎ，Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｆｏｒｃｅ  ａｗａｋｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １４，４８７−４９８（２０１５）。さらに、これらのＣＴＬは、腫瘍抗原／ＨＬＡ複合体を介して標的細胞を認識する能力を依然として保持する。さらに、ＨＬＡ−対応条件下で、これらのＣＴＬが２つの機序：ＴＡＡ／ＨＬＡ複合体におけるＴＣＲ認識及びＮＫＧ２Ｄとそのリガンドとの相互作用；を介してがん細胞を攻撃し、最適な治療効率を潜在的に付与する。
【０４１６】
まとめると、ｉｈｖ−ＤＣモデルは、いくつかの顕著な特徴を付与する。（ａ）ｉｈｖ−ＤＣは、活性化され成熟したＤＣであり、これにより、機能性ＤＣを取得するための、複合体の成熟及び活性化プロセスの必要性を排除する。（ｂ）ｉｈｖ−ＤＣ細胞は、抗原特異的なＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞を刺激して増殖する、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ７０を含めた、豊富な量の共刺激受容体を構成的に発現する。（ｃ）ｉｈｖ−ＤＣはまた、ケモカイン受容体ＣＣＲ７、リンパ組織ホーミング受容体も発現する。（ｄ）ｉｈｖ−ＤＣモデルは、樹状細胞生物学を研究するための特に有用なツールを提供することができる。これらのＤＣは、防御抗がんまたは抗ウイルス免疫を媒介または向上する既存のまたは推定の共刺激受容体の役割を調査するために遺伝子操作され得る。
【０４１７】
材料及び方法
細胞株、抗体及びサイトカイン。Ｈ１２９９、ＰＡＮＣ−１、ＨＣＣ１９５４、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞株をＡＴＣＣから得た。ＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞株は先に記載した。Ｗｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ＭＣＦ−７／ＡＤＲ  ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１１２１３２（２０１４）。Ａ３７５及びＮＨＦ細胞株は、それぞれ、Ｄｒｓ．Ｉｓａｉａｈ  Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ及びＪｉｅｙｕ  Ｚｈｕによって親切にも提供された。ＭＴ４細胞をＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラムから得た。
【０４１８】
組み換えＩＬ−２を、エイズ研究及び参考試薬プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）から取得した。ＴＮＦαは、Ｒ＆Ｄから購入し、ＬＰＳは、Ｓｉｇｍａからであった。パーフォリン（ＰＲＦ１）及びグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）の抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからであり、抗ベータ−アクチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からであった。抗リン−Ｓｔａｔタンパク質及び抗Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから得た。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体及びアイソタイプＩｇＧ対照抗体ならびに種々のＡＰＣ−またはＦＩＴＣ−標識抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４及びＩＬ−４−Ｆｃ４タンパク質を、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＩｇＧ４のｃＤＮＡによるＰＣＲベースのクローニング方法を使用してレンチウイルス融合遺伝子構築物によって形質導入された２９３細胞から生成した。
【０４１９】
レンチウイルスベクター、ウイルス産生及び形質転換。ＨＴＬＶ−２からのＴａｘ遺伝子を、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするフラグメントと融合し、ｔａｘ２−ｇｆｐ融合フラグメントを、ヒト伸長因子プロモータが導入遺伝子の発現を駆動するレンチウイルスベクターにクローニングした。ＨＬＡ−Ａ２（Ａ３７５細胞からのｃＤＮＡ）、Ｂ２Ｍ（正常なリンパ球からのｃＤＮＡ）及びＭＩＣＡ（Ａ３７５細胞からのｃＤＮＡ）を発現するレンチウイルスベクターを、ＰＣＲベースのクローニング方法を使用して構築した。融合遺伝子構築物を生成するために、ｐＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）、ＩκＢα（正常なリンパ球からのｃＤＮＡ）及びｈＴＥＲＴ（ａａ３０１−７００）（Ｕ２ＯＳ細胞からのｃＤＮＡ）をハイフィデリティＰＣＲによって増幅し、酵素消化し、レンチウイルスベクター内に挿入した。
【０４２０】
組み換えレンチウイルスを生成するために、レンチウイルス構築物を、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２９３細胞内にＶＳＶ−Ｇ、Ｇａｇ−Ｐｏｌ及びＲｅｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の発現プラスミドを含有するパッケージングプラスミドミックスと共にトランスフェクトした。ウイルス上澄みを収集し、２５，０００ｒｐｍ／４℃で２時間の超遠心分離に供した。ウイルスペレットを再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。
【０４２１】
ルシフェラーゼを発現する標的細胞株を生成するために、ＰＡＮＣ−１、Ａ３７５、ＨｅＬａ、Ｈ１２９９、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ、ＨＣＣ１９５４、ＭＴ４及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０の多重感染度（ＭＯＩ）でルシフェラーゼレンチウイルスによって形質導入した。これらの細胞株におけるルシフェラーゼの発現を、製造業者の推奨プロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａからのキットを使用してルシフェラーゼ活性アッセイによって検証した。ｐＴＥＲＴ発現ＤＣを、ＭＯＩ２０においてｉｈｖ−ＤＣのためのｐＴＥＲＴレンチウイルス形質転換によって生成した。
【０４２２】
ｉｈｖ−ＤＣ細胞株の生成。ロイコパックをニューヨークの血液バンクから得た。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパックから単離し、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）によって２４時間刺激し、続いて、組み換えＩＬ−２（１００ユニット／ｍｌ）を添加した。活性化ＰＢＭＣを４〜５日間培養し、次いで、ポリブレン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＴａｘ２−ＧＦＰレンチウイルスによって形質導入した。形質導入細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）及び１００ユニット／ｍｌの組み換えＩＬ−２を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地において連続的に培養した。代替的には、形質導入細胞を、５％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。形質転換の２〜３週間後、形質導入細胞を、抗ＣＤ３電磁ビーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってネガティブ選択し、Ｔ細胞を枯渇させた。ＣＤ３−ネガティブ細胞を培養において連続的に維持し、形質転換の約３ヶ月後、免疫表現型について分析した。２つのＤＣ細胞株を２つの血液ドナーから樹立させ、ｉｈｖ−ＤＣ１及びｉｈｖ−ＤＣ２と命名した。ｉｈｖ−ＤＣ１細胞は、培養の経過の際にＣＤ４０を損失し、ＣＤ４０を、ＣＤ４０レンチウイルス形質転換によって回復させた。ｉｈｖ−ＤＣを、ＩＬ−２（５０〜１００ユニット／ｍｌ）の存在下、１０％ＦＢＳまたは５％熱不活化ヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において成長させた。
【０４２３】
単球由来ＤＣを生成するために、４００００００のＰＢＭＣからの接着単球を、１：１０希釈で７日間、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４産生２９３細胞の馴化培地を使用して、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４によって刺激した。分化ＤＣをＴａｘ２−ＧＦＰレンチウイルスによって続いて形質導入した。Ｔａｘ発現ＭｏＤＣ（ＭｏＤＣ−Ｔａｘ）を、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４の存在下で５〜７日間、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地において培養し、次いで、１００ユニット／ｍｌで、組み換えＩＬ−２の存在下で培養において維持し続けた。活性化ＭｏＤＣを、２日間、ＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によってＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ４／ＩＬ−４−Ｆｃ４分化ＭｏＤＣを刺激することによって生成した。成熟及び活性化ＭｏＤＣは、典型的な樹状突起を示し、ＭｏＤＣをＲＮＡ及びタンパク質抽出で採取した。
【０４２４】
フローサイトメトリーによる免疫表現型分析。ｉｈｖ−ＤＣ細胞、ＭｏＤＣ−Ｔａｘ及びＤＣ−活性化リンパ球の免疫表現型を、ＦＡＣＳによって分析した。細胞を、製造業者の指示に従って、図において示すようにアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって染色した。染色した細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＴＬＲ３の細胞内染色のために、ｉｈｖ−ＤＣ細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの細胞内染色キットを製造業者の指示に従って使用して浸透後にＡＰＣ−コンジュゲート抗ＴＬＲ３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体で染色した。
【０４２５】
同種異系混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ。ｉｈｖ−ＤＣを、１：１００の比でロイコパックから単離されたナイーブＰＢＭＣと混合した。混合細胞を、外因性サイトカインを添加することなく２〜３日間、培養において保持し、続いて、組み換えＩＬ−２（１００ｕ〜２００ユニット／ｍｌ）を添加した。ｉｈｖ−ＤＣ−反応性リンパ球の増殖をＦＡＣＳによってモニタリングし、混合培養物におけるｉｈｖ−ＤＣの存在を、蛍光顕微鏡検査法を使用してモニタリングした。ＭＬＲの２〜３週間後、ｉｈｖ−ＤＣ活性化リンパ球をＦＡＣＳによって分析し、標的細胞における細胞毒性活性について試験した。
【０４２６】
細胞毒性アッセイ。ルシフェラーゼを発現するように修飾された種々の細胞株を標的として使用した一方で、ＭＬＲをエフェクタとして機能させた後、１８〜２１日でｉｈｖ−ＤＣ活性化リンパ球を生成した。がん細胞をまず２４ウェルプレートに２時間置いて完全付着させた。ｉｈｖ−ＤＣ活性化リンパ球を、次いで、示したＥ：Ｔ比でがん細胞に置いた。エフェクタ及び標的細胞の共培養後４時間及び１６時間の時点で、生存細胞をＰＢＳ緩衝液によって洗浄して細胞デブリを除去し、Ｐｒｏｍｅｇａからのキットを使用したルシフェラーゼ活性アッセイに供した。ｉｈｖ−ＤＣ活性化リンパ球の細胞毒性活性を、そのため、示したＥ：Ｔ比で細胞毒性リンパ球によらずにまたはこれによって処理した標的細胞おけるルシフェラーゼ活性を比較することによって決定した。
【０４２７】
電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。核抽出物を、ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して種々の細胞株から調製した。オリゴヌクレオチドは、ビオチン（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による５’末端標識であり、その相補ストランドにアニーリングした。結合活性を、光シフト化学発光ＥＭＳＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＥＭＳＡによって、先に報告されているプロトコル（Ｊａｉｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，１０９０８−１０９２１（２００９）．）に従って試験した。オリゴヌクレオチドプローブは、ＳＴＡＴ３（５’−ＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＴＣ−３’）（配列番号１８）、ＮＦ−κＢ（５’−ＧＡＴ−ＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣ−３’）（配列番号１９）及びＡＰ−１（５’−ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧ−ＣＣＧＧＡＡ−３’）（配列番号２０）用である。
【０４２８】
免疫蛍光イメージング。細胞をＰＢＳによって洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドによって２０分間、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で１０分間固定した。洗浄後、細胞をブロッキング溶液としての５％ヤギ血清アルブミンによってインキュベートした。一次抗体、抗Ｆｌａｇ（１：１００、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、続いて、二次抗体、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ）を１：２００の希釈で適用した。冷ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、細胞核をＤＡＰＩ（１：２０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ）によって染色した。染色細胞を、蛍光顕微鏡検査法（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００、Ｊａｐａｎ）を使用して試験した。
【０４２９】
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。全てのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、その濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。全ＲＮＡの量及び完全性を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにおいて評価した。ｃＤＮＡを、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して合成した。３つのテンプレートサンプルを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ  ｓｙｓｔｅｍ）に供した。プライマー配列を表１に列挙する。
【表１】
2018531022.tif 000003
2018531022.tif 000004
【０４３０】
動物及び異種移植モデル。動物実験を、承認されているＩＡＣＵＣのプロトコルを使用して実施した。雌性ＮＳＧマウス（４〜６週、体重１８〜２２ｇ）をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの動物センターから得、特定の病原体を含まない室内で飼育した。ＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞（４００００００）、ＨＣＣ１５５４細胞（１００００００）を収集し、等体積のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のＨａｎｋｓ緩衝液に再懸濁し、次いで、雌性ＮＳＧマウスの乳腺脂肪体内に注入した。がん細胞移植後、マウスを２つの群（ＣＴＬ及び対照）に無作為化した。腫瘍が触診可能であったときに処置が始まった。処置群マウスにマウスの尾静脈を介してｉｈｖ−ＤＣ１活性化ＣＴＬ（ｑ５ｄ×８、１００μＬ＋１，０００ｕ組み換えＩＬ−２中２０００００００）を注入し、対照群マウスにマウスの尾静脈を介してＨａｎｋｓ緩衝液（ｑ５ｄ×８、ｉｖ、１００μＬ＋１，０００ｕ組み換えＩＬ−２）を注入した。動物の体重を２日毎に測定した。腫瘍成長を処置の第１日目から開始して記録し、２日毎に異種移植の体積について測定した。腫瘍体積（Ｖ）を式Ｖ＝πａ＊ｂ２／６：式中、ａ及びｂは、それぞれ、最長及び最短径である；を使用して算出した。
【０４３１】
免疫組織化学及びＨＥ染色。組織片を６０℃で１０分間インキュベートし、次いで、キシレンにおいて、続いてＥＴＯＨ及びＤＩ水において脱パラフィンした。脱パラフィン後、組織片を、予備加熱した抗原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）に浸漬し、圧力クッカー内に５〜１０分間置き、次いで冷水下で室温に冷却した。抗ヒトＣＤ３抗体（１：１００）を使用して、予備加熱した組織片を染色した。内因性過酸化物活性を、ＰＢＳ中３％過酸化水素によって１０分間、組織片のインキュベーションによってブロッキングした。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（１：２００）（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を二次抗体として適用した。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＨＲＰ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を色原体として使用し、ヘマトキシリン対比染色も実施した。プロトコルを表２に詳述する。ＨＥ染色（パラフィン埋め込み）をＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって行った。
【表２】
2018531022.tif 000005
【０４３２】
本教示は、種々の実施形態と連動して記載されているが、本教示は、かかる実施形態に限定されることは意図されていない。反対に、本教示は、当業者に認識されるように、種々の代替、修飾、及び等価物を包含する。
【０４３３】
この開示を通して、種々の公開公報、特許及び公開特許出願が、確認引用によって参照されている。これらの公開公報、特許及び公開特許出願の開示は、この発明が関係する技術の水準をより完全に記載するために本開示に参照により組み込まれる。
【図１Ａ−１】
2018531022.tif 000006
【図１Ａ−２】
2018531022.tif 000007
【図１Ａ−３】
2018531022.tif 000008
【図１Ｂ−１】
2018531022.tif 000009
【図１Ｂ−２】
2018531022.tif 000010
【図１Ｂ−３】
2018531022.tif 000011
【図１Ｃ】
2018531022.tif 000012
【図１Ｄ−１】
2018531022.tif 000013
【図１Ｄ−２】
2018531022.tif 000014
【図２Ａ】
2018531022.tif 000015
【図２Ｂ−Ｄ】
2018531022.tif 000016
【図２Ｅ−Ｇ】
2018531022.tif 000017
【図２Ｈ−Ｊ】
2018531022.tif 000018
【図３Ａ】
2018531022.tif 000019
【図３Ｂ】
2018531022.tif 000020
【図３Ｃ】
2018531022.tif 000021
【図３Ｄ】
2018531022.tif 000022
【図３Ｅ−Ｆ】
2018531022.tif 000023
【図３Ｇ】
2018531022.tif 000024
【図３Ｈ】
2018531022.tif 000025
【図４Ａ−Ｂ】
2018531022.tif 000026
【図４Ｃ】
2018531022.tif 000027
【図４Ｄ】
2018531022.tif 000028
【図４Ｅ】
2018531022.tif 000029
【図４Ｆ−Ｇ】
2018531022.tif 000030
【図５Ａ】
2018531022.tif 000031
【図５Ｂ−Ｆ】
2018531022.tif 000032
【図６Ａ】
2018531022.tif 000033
【図６Ｂ】
2018531022.tif 000034
【図６Ｃ−Ｅ】
2018531022.tif 000035
【図６Ｆ】
2018531022.tif 000036
【図６Ｇ】
2018531022.tif 000037
【図７Ａ−Ｃ】
2018531022.tif 000038
【図７Ｄ−Ｅ】
2018531022.tif 000039
【図７Ｆ】
2018531022.tif 000040
【図８Ａ】
2018531022.tif 000041
【図８Ｂ】
2018531022.tif 000042
【図８Ｃ】
2018531022.tif 000043
【図８Ｄ】
2018531022.tif 000044
【図９Ａ】
2018531022.tif 000045
【図９Ｂ−Ｅ】
2018531022.tif 000046
【図１０Ａ】
2018531022.tif 000047
【図１０Ｂ】
2018531022.tif 000048
【図１０Ｃ−Ｄ】
2018531022.tif 000049
【図１０Ｅ】
2018531022.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月26日(2018.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018531022000001.app
【国際調査報告】
2018531022.tif 000051
2018531022.tif 000052
2018531022.tif 000053
2018531022.tif 000054