(57)【要約】本発明は、免疫系を賦活することができ、ＨＥＲ−３タンパク質の過剰発現と関連がある悪性腫瘍を治療するために使用することができる組成物、方法およびワクチンを提供する。そのような組成物は、ＨＥＲ−３タンパク質のエピトープを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）、ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）、ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）、ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）、ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）からなる群から選択される単離ペプチド。
【請求項２】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドを含む免疫調節剤。
【請求項３】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドおよび薬学的に許容できる塩を含むワクチン。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドと接触させてある細胞。
【請求項６】
抗原提示細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
Ｔ細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
対象において免疫応答を惹起する方法であって、請求項１に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項９】
対象において癌を治療する方法であって、１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記対象が、ヒトであり、癌を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、胃腸癌、脳癌およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞を活性化させる方法であって、前記細胞を１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞が抗原提示細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
免疫療法において使用するために、ペプチドが負荷された活性化樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
前記ＤＣに、１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドをパルス添加するステップと、
前記ＤＣを、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストを用いて活性化させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記ＤＣを、前記ＤＣ中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる薬剤と接触させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、カルシウムイオノフォアを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＣを凍結保存するステップをさらに含み、前記ＤＣを解凍させた場合、前記ＤＣにより、有効量の少なくとも１つのサイトカインが生成して、Ｔ細胞応答を発生させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法から生成される細胞。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法から生成された細胞を含むワクチン。
【請求項２１】
前記ワクチンが、注射用多回用量ワクチンの形態をとる、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、請求項２０に記載の方法から生成された細胞集団を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
哺乳動物において疾患または障害を治療する方法であって、請求項２０に記載の方法から生成された細胞集団を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
バレット食道を有する被験体における胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行を検出するためのバイオマーカーであって、前記被験体におけるＨＥＲ３の過剰発現を検出することを含むバイオマーカー。
【請求項２５】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１を喪失した患者を治療する方法であって、ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩでパルスされた前記患者の単球性樹状細胞（ＤＣ）前駆体に由来する抗原パルスＤＣ１ワクチンの少なくとも１用量を前記患者に投与することを含む方法であって、前記ペプチドが、ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）からなる群から選択される免疫原性ペプチド、ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項２６】
前記患者が三重陰性浸潤性乳癌を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者における抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１喪失を検出する方法であって、
ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドを有する前記患者に由来する末梢血単核細胞をパルスし、前記ペプチドは、ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）、ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、そして、それによって生じる免疫応答を検出する、方法。
【請求項２８】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答の検出が、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される、請求項２８に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年３月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／２１０４２の一部継続出願であり、該出願は、２０１５年７月１７日にＰＣＴ／ＵＳ１５／４１０３４の一部継続出願である。該出願は、２０１４年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／０７６，７８９号、および２０１４年７月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０２５，６８１号についての優先権を主張する。それぞれの特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年６月１４日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、３１９−００３＿ＰＣＴ＿ＣＩＰ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは２，６６６バイトである。
【背景技術】
【０００３】
乳癌の２５-３０％において、増殖因子受容体遺伝子ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体−２、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２としてもまた公知である）の増幅および過剰発現は、腫瘍の侵襲性の増強ならびに再発および死亡の高いリスクと関連がある（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７頁；Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１頁）。この癌遺伝子は、１８５キロダルトン（ｋＤａ）の膜貫通受容体チロシンキナーゼ（“ＲＴＫ”）をコードする。ＨＥＲ２は、ヒト上皮増殖因子受容体（“ＥＧＦＲ”）ファミリーの４つのメンバーの１つとしては、いくつかの面で他から際立つ。第１に、ＨＥＲ２は、オーファン受容体である。高親和性リガンドが同定されていない。第２に、ＨＥＲ２は、その他のＥＧＦＲファミリーメンバー（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）にとっての好ましいパートナーとなって、ヘテロ二量体を形成し、これらの二量体は、高いリガンド親和性および優れたシグナル伝達活性を示す。第３に、完全長ＨＥＲ２は、タンパク質切断を受けて、可溶性細胞外ドメイン（“ＥＣＤ”）を放出する。ＥＣＤの脱落は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で完全長ＨＥＲ２の代替の活性化機構となることが示されており、これは、キナーゼ活性を有する膜アンカー断片は残るからである。ＥＧＦＲファミリーシグナル伝達におけるＨＥＲ２の中心的役割は、その発現レベルにかかわらず、いくつかのタイプの癌、例として、乳癌、卵巣癌、結腸癌および胃癌の発癌におけるその関与と相関する（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７頁；Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９８：１６５頁）。ＨＥＲ２はまた、腫瘍細胞に、特定の化学療法に対する抵抗性をもたらす場合もある（Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．ら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：５３７頁）。ＨＥＲ２は、腫瘍形成におけるその非常に重要な役割を考慮すると、癌治療剤にとって重要な標的となる。
【０００４】
ＲＴＫのヒトＥＧＦ受容体（“ＨＥＲ”）ファミリーは、細胞の増殖、遊走、浸潤および生存を含む、非常に多様な生物学的プロセスを調節する。このファミリーは、４つのメンバー：ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）からなる。現時点では、上皮増殖因子（“ＥＧＦ”）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（“ＨＢ−ＥＧＦ”）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン、ベータセルリンおよびヘレグリンを含む、１１個のリガンドが報告されている。これらのリガンドは、それらの同族受容体に直接結合し、この結合によって、複数のシグナル伝達経路の活性化を引き起こす、受容体のホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に至る。ＨＥＲ−ファミリーのメンバーの、突然変異の活性化、受容体過剰発現または異常なリガンドの放出のいずれかによる調節不全によって、多様なヒト腫瘍発生に至る。ＨＥＲ３は、乳癌、卵巣癌および肺癌中で過剰発現し、この遺伝学的特徴は、芳しくない予後と相関している。ＨＥＲ３は、ヘレグリンにより活性化されると、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲと二量体化して、強力な発癌性の受容体ヘテロ二量体を形成する。この複合体内で、ＨＥＲ３は、ＰＩ３キナーゼをその細胞質のドッキング部位に優先的に動員し、それにより、細胞の増殖および生存を調節する。今までは、ＨＥＲ３は、そのキナーゼドメイン中の明らかに異常な配列の特徴に起因して、キナーゼとして不活性であり、シグナル伝達事象を開始するためには、ＨＥＲ−ファミリーの、キナーゼ活性が損なわれていないメンバーとのヘテロ二量体化を必要とすることが推測されていた。このことと一致して、ＨＥＲ２が、乳腺腫瘍の細胞増殖を駆動するのにＨＥＲ３を必要とすることが示された。しかし、最近の知見により、ＨＥＲ３もまた、Ｐｙｋ２をリン酸化することが可能であり、その結果、ヒト神経膠腫細胞中でＭＡＰＫ経路を活性化させることが示された。さらに、ＨＥＲ３に特異的なモノクローナル抗体は、癌性の細胞株の増殖および遊走を阻害することもできる。興味深いことに、最近になって、癌細胞が、ＨＥＲ−ファミリー阻害剤療法をＨＥＲ３シグナル伝達の上方制御により回避し、ＨＥＲ３阻害が、乳癌細胞中でＨＥＲ２駆動性のタモキシフェン抵抗性を抑止することが示された。さらに、ＥＧＦＲ低分子阻害剤であるゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）療法に対する抵抗性は、ＨＥＲ３のシグナル活性化に結び付けられることも示された。
【０００５】
ＨＥＲ３は、受容体タンパク質であり、正常な細胞の成長を調節する重要な役割を果たす。ＨＥＲ３は、それ固有のキナーゼ活性を欠き、ＨＥＲ２の存在に依存して、細胞膜を横切ってシグナルを伝達する。転写当初、ＨＥＲ３のｍＲＮＡ前駆体は、２８個のエクソンおよび２７個のイントロンを含有する。イントロンをスプライスし終わり、完全にスプライスされたＨＥＲ３  ｍＲＮＡは、２８個のエクソンで構成される。
【０００６】
過去１０年の間に、標的療法が癌治療剤の基盤として出現した。ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、すなわち、ＥＧＦＲ（またはＨＥＲ１）およびＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）が、特に興味をそそる標的とみなされるようになってきており、というのは、これらのＲＴＫは、多数の癌において調節解除されるからである。ＥＧＦ受容体ファミリーの別のメンバーであるＥｒｂＢ３またはＨＥＲ３の発癌機能が、ＨＥＲ２に対する抵抗性を媒介することおよびＰＩ３Ｋ経路を対象とする療法におけるその主要な役割に起因して、ようやく最近になって吟味されるようになった。ＨＥＲ３中の突然変異の活性化および／またはその過剰発現が、乳癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌およびメラノーマを含む、いくつかの異なる腫瘍のタイプにおいて同定されており、これらの腫瘍におけるより悪い全体的な予後の前兆となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７頁
【非特許文献２】Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１頁
【非特許文献３】Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７頁
【非特許文献４】Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９８：１６５頁
【非特許文献５】Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．ら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：５３７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当分野の進歩にもかかわらず、ＨＥＲ３を標的とする、細胞またはタンパク質に基づくワクチン戦略を使用して、有効な免疫応答をヒトにおいて発生させることができるかどうかは依然として不確かである。したがって、当技術分野には、ＨＥＲ３タンパク質の過剰発現が関連する乳癌およびその他の悪性腫瘍を治療または予防するためのさらなる免疫療法のアプローチを手にする必要性がある。本実施形態は、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読解する場合に、より良好に理解されるであろう。本発明を例証するために、現在好ましい実施形態を図面において示す。しかし、本発明は、図面に示す実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】多くの患者にわたってＣＤ４Ｔ細胞を活性化させる能力を示す、ＨＥＲ３に由来する免疫原性ペプチドを示すグラフである（それぞれ、外観の順序で、配列番号１−３）。
【図２】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（出現順にそれぞれ配列番号４−７）。
【図３】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（それぞれ、配列番号４および７、外見上の順序で）。
【図４】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（それぞれ、配列番号１−３、外見上の順序で）。
【図５】異なるＨＥＲ３ペプチドからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図６】異なるＨＥＲ３ペプチドからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図７】あらかじめペプチドを同定してから、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図８】あらかじめペプチドを同定してから、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図９】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、ペプチドを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図１０】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、全ペプチドライブラリーを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図１１】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、全ペプチドライブラリーを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図１２】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、ペプチドを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの生成を示すグラフである。
【図１３】ＵＰＣＣ１５１０７−２４番のドナーにおける、連続的なペプチドのスクリーンを示すグラフである。
【図１４】ＵＰＣＣ１５１０７−３８番のドナーにおける、連続的なペプチドのスクリーンを示すグラフである。
【図１５】ＵＰＣＣ１５１０７−３８番およびＵＰＣＣ１５１０７−２４番のドナーにおける、「逆」感作（「ＲＥＶＥＲＳＥ」  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を示すグラフである。
【図１６】ＵＰＣＣ１５１０７−３０番およびＵＰＣＣ１５１０７−３２番のドナー（両方の患者が、同定したＨＥＲ３ペプチドおよび／またはネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤに対して、抗ＨＥＲ３反応性を示さないことが分かっている）において、免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１が、ＣＤ４＋Ｔｈ１を感作し、抗ＨＥＲ３免疫寛容を克服したことを示すグラフである。
【図１７】ＣＤ４＋ＨＥＲ３エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ無差別性を示すことを示すグラフである。
【図１８】チャンバー中で、活性化されたＨＥＲ−３  ＣＤ４＋細胞を、ＨＥＲ−３を発現する細胞の横に置くと、ＨＥＲ−３  ＣＤ４＋細胞は、ＨＥＲ−３を発現する乳癌細胞のアポトーシスまたは死を引き起こすことを示す図である。
【図１９】抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１細胞性免疫を発生させるために、ＨＥＲ３のＥＣＤを腫瘍抗原として使用して、免疫原性、クラスＩＩ無差別性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するための方法を示す図である。
【図２０】同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性を、「逆」感作により確認したことを示すグラフである。ＨＥＲ３  ＥＣＤのスクリーンを、示した単一のペプチドを用いて実施した。
【図２１】同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性を、「逆」感作により確認した追加の結果を示すグラフである。
【図２２】ＨＥＲ染色の免疫組織化学スコアリングの写真を示す。
【図２３】ＡとＢは、低悪性度形成異常（ＬＧＤ）または高悪性度形成異常（ＨＧＤ）（図２２Ａ）を伴うバレット食道におけるＨＥＲファミリーの過剰発現率、および高悪性度の異形成バレット病変（癌腫を伴うＨＧＤ）又は、関連する浸潤性癌（ＨＧＤ）を伴わないものを示すヒストグラムである（図２２Ｂ）。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｃは、ＨＤ（健常ドナー）からＥＲ  ＩＢＣ／ＥＲｐｏｓＩＢＣ（エストロゲン受容体陽性浸潤性乳癌（ＩＢＣ））およびＴＮ  ＩＢＣ（トリプルネガティブＩＢＣ）に対する抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下を示す。図は、全身性ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞応答のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析のヒストグラム（左パネル）を示す。研究された患者群は、ＨＤ；  ＢＤ（良性胸部生検）；  ＤＣＩＳ（ＨＥＲ２陽性（「ＨＥＲ２ｐｏｓ」）管腔癌）  ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ；  ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ（エストロゲン受容体陽性ＩＢＣ）；およびＴＮ  ＩＢＣ（トリプルネガティブＩＢＣ）。それぞれのヒストグラムの右側の対応する表は、一度に２つの群の間の生徒のｔ検定による個々の比較である。一元配置ＡＮＯＶＡ検定をすべての群で行った。図２４Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して百万細胞あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定された累積抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が、ＨＤＳからＢＤへとＤＣＩＳからＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣからＥＲｐｏｓ  ＩＢＣへ、そして最終的にはＴＮ  ＩＢＣから減少したことを示す（９０対８０対６６対７９対４８対４０、それぞれｐ＝０．０１）。図２４Ｂは、レパートリー、または陽性ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有するＨＥＲ３ペプチドの数が、ＨＤからＢＤ、ＤＣＩＳからＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣからＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ、および最終的にはＴＮ  ＩＢＣ（１．０対０．６対０．８対０．８対０．５対０．３、それぞれｐ＝０．００３）。図２４Ｃは、応答性、少なくとも１つのペプチドに応答する被験体のパーセント、ＤＣＩＳからＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ−ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ、および最終的にはＴＮ  ＩＢＣ（７６．７％対６３．６％対５３．８％対６６．７％対４５．０％対３３．３％、それぞれｐ＝０．０２）。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、テストされた患者群の間でのテトラトヌスまたは抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に差異がないので、ＣＤ４Ｔ細胞応答の喪失がＨＥＲ３に特異的であることを示す。図は、全身性ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞応答のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析のヒストグラム（左パネル）を示す。研究された患者群は、ＨＤ；  ＢＤ；  ＤＣＩＳ；  ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ；  ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ；およびＴＮ  ＩＢＣ。それぞれのヒストグラムの右側の対応する表は、一度に２つの群の間の生徒のｔ検定による個々の比較である。一元配置ＡＮＯＶＡ検定をすべての群で行った。図２５Ａは、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣの間のＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して２００，０００細胞あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定した場合の破傷風応答に統計的に有意な差異がないことを示す（３７対３０対１９対３４対２４対２９、それぞれｐ＝０．６５）。図２５Ｂは、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ間のＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して２００，０００細胞あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定した抗ＣＤ３  ／抗ＣＤ２８ポリクローナル刺激に統計的に有意な差異がないことを示す（６８８対５４９対８０４対６９９対６２９対６７５、それぞれｐ＝０．６８）。
【図２６】図２６Ａ−２６Ｃは、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が、新アジュバント化学療法に対する再発および応答と相関するが、リンパ節転移では相関しないことを示す。図２６Ａは、初期手術（リンパ節陽性（「ＬＮ＋」または「ＬＮｐｏｓ」対リンパ節陰性（「ＬＮ−」または「ＬＮｎｅｇ」））におけるリンパ節状態によるＩＢＣ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムを有する（第２パネル）（０．４対０．６、それぞれｐ＝０．０８）、応答性（第３パネル）（３５．７％対５４．８％、それぞれｐ＝０．１９）、累積応答（上部パネル）（４０対５６、それぞれｐ＝０．１２）、レパートリー、または破傷風応答（下パネル）（２２対２９、それぞれｐ＝０．３５）を示した。図２６Ｂは、我々の診断からの累積応答が有意に低い（上のパネル）（１７対６６、ｐ＝０．０４）の少なくとも１年間の患者における再発対非再発（無病）に対するＩＢＣ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムを有する）、レパートリー（第２パネル：０．０対０．６、それぞれｐ＜０．０５）および応答性（第３パネル）（０％対５５．６％、それぞれｐ＝０．０１）。再発性および非再発性のＩＢＣ患者（下パネル）間の破傷風応答に差はなかった（それぞれ２７対３５、ｐ＝０．６５）。図２６Ｃは、新アジュバント化学療法（病理学的完全応答（「ｐＣＲ」）対残存疾患（「＜ｐＣＲ」）に対する応答によるＩＢＣ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムを有する。新アジュバント化学療法を受けている患者のうち、ｐＣＲを有する患者と比較して、ｐＣＲを有する患者と比較して、有意に高い累積応答を示した（上のパネルは１４４対３２、それぞれｐ＝０．００４）およびレパートリー（第二パネル）（０．８対０．４、それぞれｐ＝０．０５）。ｐＣＲと＜ｐＣＲ患者の免疫応答の間には、応答性（第３のパネル）（８０．０％対２７．３％、それぞれｐ＝０．１０）または破傷風応答（下側パネル）（１７対５９、それぞれｐ＝０．１５）はなかった。
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が更年期後のＨＤ／ＢＤにおいて有意に高いが、年齢、人種又は妊娠歴によって変化しないことを示す。図２７Ａは、ＨＤ患者の免疫応答を年齢（５０歳未満（５０歳未満）対５０歳未満）と比較する４つのヒストグラムを有する。レパートリー（第２パネル：０．８対１．１、それぞれｐ＝０．３８）、応答性（第３パネル）（第２パネル）：累積応答における年齢別に統計的に有意な差はなかった（７２．０％対７５．０％、それぞれｐ＝１．０）または破傷風応答（下側パネル）（それぞれ３９対３０、ｐ＝０．４０）。図２７Ｂは、ＨＤ患者の免疫応答を人種（コーカサス人対アフリカ系アメリカ人対その他）で比較した４つのヒストグラムを有する。累積応答におけるレース（上のパネル）では統計的に有意差はなかった（８７対８３対９５、それぞれｐ＝０．９６）、第３のパネル（６９．０％対７１．４％対１００％、それぞれｐ＝０．３５）または破傷風応答（下部パネル）（第２パネル）（３３対５１対２６、それぞれｐ＝０．３０）。図２７Ｃは、妊娠歴／妊娠によるＨＤ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムを有する（妊娠０回と１回以上の妊娠）妊娠歴により累積応答（上パネル）において統計的に有意な差はなかった（８２対９１、それぞれｐ＝０．７１）、（第２パネル）（１．０対０．９、それぞれｐ＝０．６２）または応答性（第３パネル）（７６．５％対７０．８％、それぞれｐ＝０．７４）。興味深いことに、破傷風反応（下パネル）は、少なくとも１つの妊娠を有する患者（４７対２７、それぞれｐ＝０．０４）と比較して、未経産婦で有意に高かった。図２７Ｄは、ＨＤ患者の免疫応答を更年期の状態（更年期前−更年期後）と比較した４つのヒストグラムを有する。閉経前のＨＤ／ＢＤと比較して、閉経前ＨＤ／ＢＤと比較して、有意に高い累積応答を示した（上パネル）（それぞれ、百万細胞に対して１３６スポット対７０スポット、ｐ＝０．００５）、レパートリー（第２パネル）（１．４対０．８ペプチド、それぞれｐ＝０．０３）。応答性（第３パネル）（９０．９％対６６．７％、それぞれｐ＝０．２３）または破傷風応答（下側パネル）（３８対２８、ｐ＝０．３７）によって、閉経後および閉経前のＨＤ／ｓＢＤ間に差はなかった。
【図２８】図２８はＥＬＩＳｐｏｔの直線性の決定のグラフである。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、既知の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞レスポンダーを培地に段階希釈することにより、この研究のための全てのアッセイを行ったオペレーターの下で直線的かつ正確であると決定された。累積応答は、１．０から０．１の０．０１から０．００１（百万細胞あたり２３０から３５から１２から５スポット、それぞれｐ＜０．０００１、ｒ２＝０．８８）の希釈からなる直線回帰曲線をたどった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＥＲ−１のエピトープに相当する。一実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＥＲ−３のエピトープに相当する。一実施形態では、本発明のペプチドは、ｃ−ＭＥＴのエピトープに相当する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、対応するＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼのエピトープは、免疫原性である。本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む組成物をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、キメラペプチドを提供し、このキメラペプチドは、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、多価ペプチドを含む組成物を含む。多価ペプチドは、２つ以上の本発明のペプチドを含む。
【００１４】
免疫応答を賦活する方法および対象において癌を治療する方法をさらに提供する。また、治療および予防に使用するためのワクチンも提供する。本実施例のペプチドは、本明細書に記載するように、単独またはキメラペプチドの状況で、免疫応答を引き起こすことが可能である。一実施形態では、免疫応答は液性応答である。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性応答である。いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドは、防御効果を付与する。
【００１５】
別の実施形態において、ＨＥＲ３発現は、胃食道接合部の前癌病変における腫瘍進行のマーカーとして使用することができる。
【００１６】
別の実施形態では、ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドの使用を含む抗ＨＥＲ３ＣＤ４  Ｔｈ１損失が決定される。
【００１７】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明に関わる当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料に類似するまたはそれらと同等である任意の方法および材料を本発明の実行または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００１８】
一般に、本明細書で使用する命名法も、細胞培養、分子遺伝学、有機化学ならびに核酸の化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室の手順も、当技術分野では周知であり、通常利用されるものである。
【００１９】
核酸およびペプチドの合成については、標準的な技法を使用する。技法および手順は一般的に、当技術分野の従来法および種々の一般的な参考文献（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、２０１２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ）に従って実施し、これらは、本記載全体を通して提供されている。
【００２０】
本明細書で使用する命名法ならびに下記に記載する分析化学および有機合成において使用する実験室の手順は、当技術分野では周知であり、通常利用されるものである。標準的な技法またはそれらの改変形態を使用して、化学合成および化学分析を行う。
【００２１】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションの用語と関連がある意味を有する。
【００２２】
本明細書では、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を使用して、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２３】
測定可能な値、例として、量、時間的な期間等を指す場合の「約」は、本明細書で使用する場合には、特定の値からの±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含することを意図し、そうした変動は、開示する方法を実施するのに適切である。
【００２４】
生物、組織、細胞またはそれらの構成成分の文脈で使用する場合、用語「異常」は、少なくとも１つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、１日のうちの時間等）が、「正常な」（予想される）それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞またはそれらの構成成分とは異なる生物、組織、細胞またはそれらの構成成分を指す。１つの細胞または組織の型にとって、正常であるまたは予想される特徴が、異なる細胞または組織の型にとっては異常である場合もあるであろう。
【００２５】
本明細書で使用される乳癌の「補助療法」は、長期生存の機会を増加させるための一次療法（すなわち、手術）の後に与えられる任意の治療を指す。「ネオアジュバント療法または新アジュバント療法」または一次療法前に投与される治療である。
【００２６】
用語「抗原」または「ａｇ」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を引き起こす分子と定義する。この免疫応答は、抗体の生成または特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれかまたはそれらの両方に関与することができる。当業者であれば、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、任意の巨大分子が、抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原を、組換えまたはゲノムのＤＮＡから得ることもできる。免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、したがって、本明細書で使用する場合の用語「抗原」をコードすることを当業者であれば理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長のヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明は、これらに限定されないが、１つ超の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列を種々に組み合わせて配置して、所望の免疫応答を惹起することが容易に明らかになる。さらに、抗原は「遺伝子」によりコードされることが全く必要ないことも当業者は理解するであろう。抗原を、合成により生成してもよく、または生物学的試料から得てもよいことは容易に明らかである。そのような生物学的試料として、これらに限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的液体を挙げることができる。
【００２７】
「抗原提示細胞」（“ＡＰＣ”）は、Ｔ細胞を活性化させることが可能な細胞であり、これらに限定されないが、単核球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【００２８】
「抗原が負荷されたＡＰＣ」または「抗原をパルス添加したＡＰＣ」は、抗原に曝露させ、抗原により活性化させてあるＡＰＣを含む。例えば、ＡＰＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、抗原の存在下で培養する間に、Ａｇ負荷となすことができる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露させることによって、ＡＰＣに負荷を行うこともできる。「抗原が負荷されたＡＰＣ」は従来、２つの方法：（１）抗原性ペプチドとして既知である小型のペプチド断片を、ＡＰＣの外部上に直接「パルス添加する」か、または（２）ＡＰＣを、全タンパク質もしくはタンパク質粒子と共にインキュベートし、次いで、全タンパク質もしくはタンパク質粒子をＡＰＣに摂取させるかのいずれかの方法で調製される。これらのタンパク質は、ＡＰＣにより小型のペプチド断片に消化され、最終的に、ＡＰＣ表面に輸送され、そこで提示される。さらに、抗原が負荷されたＡＰＣはまた、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することによっても生成することができる。
【００２９】
「抗ＨＥＲ３応答」、「抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答」、「抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答」などは、ＨＥＲ３タンパク質に対して特異的な免疫応答を意味する。
【００３０】
用語「抗腫瘍作用」は、本明細書で使用する場合、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、または癌性状態と関連がある種々の生理学的症状の寛解により明らかにすることができる生物学的作用を指す。そもそも、「抗腫瘍作用」はまた、腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることもできる。
【００３１】
用語「自己免疫疾患」は、本明細書で使用する場合、自己免疫応答の結果生じる障害と定義する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。とりわけ、自己免疫疾患の例として、これらに限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「自家」は、個体から得、後にその同じ個体内へ再導入しようとしている任意の材料を指すことを意図する。
【００３３】
用語「Ｂ細胞」は、本明細書で使用する場合、骨髄および／または脾臓に由来する細胞と定義する。Ｂ細胞は形質細胞に発達することができ、形質細胞は抗体を生成する。
【００３４】
用語「癌」は、本明細書で使用する場合、細胞の過剰増殖と定義し、癌の独特な形質である正常な制御の放棄の結果、無秩序な成長、分化の欠如、局所組織への浸潤および／または転移が生じる。例として、これらに限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、生殖細胞腫瘍等が挙げられる。
【００３５】
「表面にＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞」、「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞」などは、表面タンパク質ＣＤ４を発現し、高レベルのＴヘルパー細胞を産生するＴヘルパー細胞のサブタイプ  サイトカインＩＦＮ−γ。  「Ｔヘルパー細胞」も参照のこと。
【００３６】
「累積応答」は、所与の患者からのすべてのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドからの反応スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析からの１０  ６細胞あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の総和として表される患者群の複合免疫応答を意味する  グループ。
【００３７】
「ＤＣワクチン接種」、「ＤＣ免疫化」、「ＤＣ１免疫化」などは、免疫系を利用して特定の分子を認識し、それらに対する特異的応答を獲得するための自己樹状細胞を使用する戦略を指す。
【００３８】
「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、インビボ、インビトロ、エキソビボ、または宿主もしくは被験体に存在するか、または造血幹細胞または単球に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞およびその前駆体は、種々のリンパ器官、例えば脾臓、リンパ節、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞本体から複数の方向に伸びる薄いシート（ラメリポディア）を有する特徴的な形態を有する。典型的には、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子を発現する。樹状細胞は、インビトロでＴ細胞の抗原特異的分化を誘導することができ、インビトロおよびインビボで初代Ｔ細胞応答を開始することができる。ワクチン製造の文脈において、「活性化されたＤＣ」は、リポ多糖類「ＬＰＳ」のようなＴｏｌｌ様受容体アゴニストに曝露されたＤＣである。活性化されたＤＣには抗原が充填されていてもいなくてもよい。
【００３９】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が寛解しないならば、動物の健康状態は悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００４０】
動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することは可能であるが、動物の健康状態が、障害が存在しない場合に比して好ましくない場合を指す。障害は、治療せずに放置しても、必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００４１】
患者が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の重症度または頻度が低下する場合、疾患または障害は「軽減」される。
【００４２】
「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では交換可能に使用し、本明細書に記載する場合、特定の生物学的結果を達成するのに有効な化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。そのような結果として、これに限定されないが、当技術分野の適切な任意の手段により決定する場合のウイルス感染の阻害を挙げることができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「内因性」は、生物、細胞、組織もしくは系に属するまたは生物、細胞、組織もしくは系の内部で生成する任意の材料を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織もしくは系から導入されるまたは生物、細胞、組織もしくは系の外部で生成する任意の材料を指す。
【００４５】
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）受容体、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）受容体、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）受容体を含む。ＨＥＲ受容体は一般に、ＨＥＲリガンドに結合することおよび／または別のＨＥＲ受容体分子と二量体化することができる、細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存されている細胞内チロシンキナーゼドメイン；ならびにリン酸化され得るいくつかのチロシン残基をもつ、カルボキシル末端のシグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ受容体は、「ネイティブ配列」のＨＥＲ受容体であっても、またはその「アミノ酸配列バリアント」であってもよい。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、ネイティブ配列のヒトＨＥＲ受容体である。
【００４６】
「ＨＥＲ経路」は、ＨＥＲ受容体ファミリーが媒介するシグナル伝達ネットワークを指す。
【００４７】
「ＨＥＲの活性化」は、任意の１つまたは複数のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲの活性化の結果、シグナル伝達（例えば、ＨＥＲ受容体中のチロシン残基または基質のポリペプチドをリン酸化するＨＥＲ受容体の細胞内キナーゼドメインが引き起こすシグナル伝達）が生じる。ＨＥＲの活性化は、ＨＥＲリガンドが目的のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合することによって媒介され得る。ＨＥＲリガンドの、ＨＥＲ二量体への結合が、二量体中の１つまたは複数のＨＥＲ受容体のキナーゼドメインを活性化させることができ、それにより、１つもしくは複数のＨＥＲ受容体中のチロシン残基のリン酸化および／または追加の基質のポリペプチド、例として、Ａｋｔ細胞内キナーゼもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼ中のチロシン残基のリン酸化が生じる。
【００４８】
「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮成長因子受容体（「ＥＧＦＲ」）ファミリーのメンバーである。  ＨＥＲ２はヒト乳癌の約２０−２５％において過剰発現され、他の多くの癌で発現される。
【００４９】
「ＨＥＲ２ｐｏｓ」は、ある種の乳癌ならびに多数の他の癌の分類または分子サブタイプである。  ＨＥＲ２陽性は、現在、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）アッセイによる遺伝子増幅および病理学的染色強度の２＋または３＋によって定義される。
【００５０】
「ＨＥＲ２ｎｅｇ」は、ＦＩＳＨによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの場合、病的染色形態０−２＋の範囲を包含することができる。
【００５１】
「ＨＥＲ３」および「ＥｒｂＢ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにＫｒａｕｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３-９１９７頁（１９８９）に開示されている受容体ポリペプチドを指す。
【００５２】
「ＨＥＲ３の細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ３ＥＣＤ」は、その断片を含む、細胞の外側にあり、細胞膜に固定されているまたは循環しているＨＥＲ３のドメインを指す。一実施形態では、ＨＥＲ３の細胞外ドメインは、４つのドメイン：ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶを含み得る。一実施形態では、ＨＥＲ３  ＥＣＤは、アミノ酸１-６３６（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。一実施形態では、ＨＥＲ３ドメインＩＩＩは、アミノ酸３２８-５３２（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。
【００５３】
本明細書中で使用されるＨＥＲ３免疫原性ペプチド、「ＨＥＲ３結合ペプチド」、「ＨＥＲ３エピトープ」などは、ＨＥＲ３タンパク質、具体的にはＨＥＲ３ＥＣＤの配列に由来するかまたはそれらに基づくＭＨＣクラスＩＩペプチドおよびそれらの同等物をいう。ＨＥＲ３ペプチドは、多くの患者にわたってＣＤ４  Ｔ細胞を活性化することができる。このペプチドは、樹状細胞をパルスし、ＨＥＲ３を認識するようにＴ細胞を教えるために使用することができる。ＨＥＲ３は、三重陰性乳癌で発現され、ＥＲｐｏｓ乳癌において抗エストロゲンに対する耐性を付与することができる。ＨＥＲ３はまた、メラノーマ、肺、結腸、前立腺癌、および転移性脳腫瘍を含む他の癌でも発現される。好ましい実施形態によれば、４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチド（エピトープ）または結合ペプチドが以下のように同定されている：
ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）。
ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）。
ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）。  そして
ｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）。
【００５４】
「相同」は、本明細書で使用する場合、２つの高分子性分子、例えば、２つの核酸分子、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子、または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方において、あるサブユニットの位置を、同じ単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占めるならば、これらの分子は、その位置では完全に相同または１００％相同である。２つの配列間のパーセント相同性は、一致するまたは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２つの化合物の配列において、位置の半分（例えば、１０個のサブユニットの長さの高分子中の５つの位置）が相同であるならば、これら２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％、例えば、１０個のうち９つがマッチするまたは相同であるならば、これら２つの配列は９０％相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＧＣＣ３’と５’ＴＡＴＧＧＣ３’とは、５０％相同性を共有する。
【００５５】
さらに、本明細書で用語「相同性」または「同一性」を使用して、核酸およびタンパク質を指す場合には、核酸およびアミノ酸の配列レベルの両方における相同性または同一性に適用されると解釈すべきである。
【００５６】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖の結果生じる疾患と定義する。例示的な過剰増殖性疾患として、これらに限定されないが、癌または自己免疫疾患が挙げられる。その他の過剰増殖性疾患として、例えば、血管閉塞、再狭窄、アテローム動脈硬化または炎症性腸疾患を挙げることができる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「使用説明資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、略図または任意のその他の表現媒体を含む。本発明のキットの使用説明資料を、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含有する容器に添付すること、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含有する容器と一緒に発送することができる。代わりに、使用説明資料と化合物とがレシピエントにより併せて使用されることを意図して、使用説明資料を容器とは別途に発送することもできる。
【００５８】
「免疫応答」は、本明細書で使用する場合、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答の形態、または両方の形態をとり得る。
【００５９】
「単離された」は、天然の状態から変化させたまたは取り出した状態を意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離状態」でないが、その天然の状態の共存する材料から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離状態」である。単離状態の核酸またはタンパク質は、実質的に精製した形態で存在してもよく、または例えば、宿主細胞等、外から加えた環境下に存在してもよい。
【００６０】
用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」によって、本明細書で使用する場合には、治療もしくは化合物の非存在下での対象における応答レベルと比較した場合、および／または他の点では同一であるが未治療の対象における応答レベルと比較した場合に、対象における応答レベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブのシグナルもしくは応答を動揺させ、および／またはそれに影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくは、ヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００６１】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１免疫応答について分析された各対象群について、ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１応答または「免疫応答のメトリック」の「メトリクス」が定義される：（ａ）全体的な抗ＨＥＲ３応答性（≧１免疫原性ペプチド  ）；  （ｂ）応答レパートリー（各対象群によって認識される免疫原性ペプチドの平均数として表される）；  （ｃ）各被験者群からの４つのＭＨＣクラスＩＩ  ＨＥＲ３免疫原性ペプチドからの反応性スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析からの１０  ６細胞あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の合計として表される累積応答。
【００６２】
「ペプチド」、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸を連結した配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の改変形態もしくは組合せであり得る。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「集団」は、同種の、実質的に同種の、または異種の細胞培養物を含む単離状態の培養物についての言及を含む。一般にまた、「集団」は、「単離状態」の細胞培養物とみなすことができる。
【００６４】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、およびホルモンの高親和性細胞表面受容体である。  ＲＴＫのヒトＥＧＦ受容体（「ＨＥＲ」）ファミリーは、細胞増殖、遊走、浸潤および生存を含む多種多様な生物学的プロセスを調節する。  家族は、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の４つのメンバーからなる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「組換え細胞」は、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００６６】
「応答性」または「抗ＨＥＲ３応答性」は、本明細書中では交換可能に使用され、４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチドの少なくとも１つに応答する被験体のパーセンテージを意味する。
【００６７】
「応答レパートリー」は、各対象群によって認識されるＨＥＲ３免疫原性ペプチドの平均数（「ｎ」）として定義される。
【００６８】
「試料」または「生物学的試料」は、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、臓器、組織、エキソソーム、血液、血漿、唾液、尿およびその他の体液を含む、対象から得られた生物学的材料を意味する。試料は、任意の供給源の、対象から得られる材料であり得る。
【００６９】
「シグナル１」は、本明細書で使用する場合一般に、活性化したＤＣからＴ細胞に渡される、第１の生化学的シグナルを指す。シグナル１は、ＤＣの表面に発現する抗原により提供され、Ｔ細胞により、Ｔ細胞受容体を通して感知される。
【００７０】
「シグナル２」は、本明細書で使用する場合一般に、ＤＣによりＴ細胞に提供される第２のシグナルを指す。シグナル２は、活性化したＤＣ上の「同時刺激」分子、通常、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６（ただし、その他の同時刺激分子も公知である）により提供され、Ｔ細胞により、表面受容体ＣＤ２８を通して感知される。
【００７１】
「シグナル３」は、本明細書で使用する場合一般に、活性化したＤＣにより生成された可溶性タンパク質（通常、サイトカイン）から発生するシグナルを指す。これらは、Ｔリンパ球上の受容体を通して感知される。第３のシグナルは、現在の脅威に最良に対処するためには、Ｔ細胞がどの表現型または機能上の特徴を獲得すべきであるかについて、Ｔ細胞に指示する。
【００７２】
用語「特異的に結合する」によって、本明細書で使用する場合には、試料中で、別の分子または特徴を認識し、それに結合するが、その他の分子または特徴を実質的に認識することもそれらに結合することもない分子、例として、抗体を意味する。
【００７３】
用語「対象」、「患者」、「個体」等は、本明細書では交換可能に使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであれｉｎ  ｓｉｔｕであれ、本明細書に記載する方法に適している任意の動物またはそれらの細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【００７４】
本明細書で使用する用語「標的療法」は、通常、抗腫瘍効果を達成するために正常細胞にほとんど損傷を与えずに、癌細胞の増殖に関与する特定の標的分子を妨害する薬物または他の物質を使用する癌治療を指す。  対照的に、伝統的な細胞傷害性化学療法薬は、活発に分裂する細胞すべてに対して作用する。  乳癌治療モノクローナル抗体では、具体的には、トラスツズマブ／  ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ＨＥＲ２  ／  ｎｅｕ受容体を標的とする。
【００７５】
用語「Ｔ細胞」は、本明細書で使用する場合、多様な細胞媒介性免疫反応に関与する、胸腺に由来する細胞と定義する。
【００７６】
用語「Ｔ−ヘルパー」は、本明細書で細胞に言及して使用する場合には、当業者が同定することができる異なる細胞型を含む、リンパ球のサブグループ（白血球細胞または白血球の型）を示す。特に、本開示に従うＴ−ヘルパー細胞は、エフェクターＴｈ細胞（例として、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７）を含む。これらのＴｈ細胞は、その他の白血球を賦活するまたはそれらと相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。
【００７７】
本明細書において、「ヘルパーＴ細胞」、「ヘルパーＴ細胞」、「Ｔｈ細胞」などの用語は、細胞を参照して、異なる細胞を含むリンパ球（白血球または白血球の一種）のサブグループを示す  当該分野の当業者によって同定可能なタイプを含む。  特に、Ｔヘルパー細胞は、主要な機能が他のＢおよびＴリンパ球および／またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターＴ細胞である。  ヘルパーＴ細胞は、「Ｔｈ１」または「タイプ１」および「Ｔｈ２」または「タイプ２」表現型として知られる２つの主要なサブタイプの細胞に分化する。  これらのＴｈ細胞は、他の白血球を刺激または相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞」などは、表面糖タンパク質ＣＤ４を発現した成熟Ｔ細胞を指す。  ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー細胞は、樹状細胞などの抗原提示ペプチド（「ＡＰＣ」）の表面上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。  ＭＨＣ抗原複合体によるＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー細胞の活性化に際して、インターフェロンγ（「ＩＦＮ−γ」）などの高レベルのサイトカインを分泌する。  このような細胞は、宿主細胞の内部に存在する特定の疾患を引き起こす微生物に対して非常に有効であると考えられており、宿主細胞内に存在する特定の疾患を引き起こす微生物および癌に対してもヒト癌における抗腫瘍応答に重要である。
【００７９】
「Ｔｈ１７  Ｔ細胞」は、本明細書で使用する場合、サイトカインＩＬ−１７およびＩＬ−２２を高いレベルで生成し、粘膜表面上に生存する、疾患を引き起こす微生物に対して極めて有効であると考えられているＴ細胞を指す。
【００８０】
「治療有効量」は、患者に投与する場合、疾患の症状を寛解させる、本発明の化合物の量である。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患の状態およびその重症度、治療しようとする患者の年齢等に応じて変化する。治療有効量は、当業者であれば、当業者自身の知識および本開示を考慮して日常的に決定することができる。
【００８１】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載する治療または予防の方策を指す。「治療」の方法は、障害もしくは再発障害の１つもしくは複数の症状の予防、治癒、遅延、重症度の低下もしくは寛解のためまたはそのような治療を施さない場合に予想される生存を上回る、対象の生存の延長のために、本発明の組成物を、そのような治療を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に罹患している対象またはそのような疾患もしくは障害を最終的に獲得する恐れがある対象に投与することを利用する。
【００８２】
「トリプルネガティブ」および「ＴＮ」乳癌は、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）、プロゲステロン受容体（「ＰＲ」）およびＨＥＲ２について陰性で試験する任意の乳癌細胞を指す。
【００８３】
用語「ワクチン」は、本明細書で使用する場合、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに投与した後に免疫応答を引き起こすために使用する材料と定義する。ワクチンは、対象内に導入されると、これらに限定されないが、抗体、サイトカインおよび／またはその他の細胞性応答の生成を含む、免疫応答を引き起こすことが可能になる。
【００８４】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸配列がアミノ酸の挿入、欠失または保存的置換により異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。また、バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する場合もある。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当技術分野では典型的には、軽微な変化が生じていると認識されている。これらの軽微な変化は一部、当技術分野における理解に従って、アミノ酸の疎水性親水性指数を検討することによって同定することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５-１３２頁（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷の検討に基づく。類似の疎水性親水性指数のアミノ酸を置換し、タンパク質の機能を依然として保持することができることが、当技術分野では公知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用しても、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を示すことができる。ペプチドの状況では、アミノ酸の親水性を検討することによって、そのペプチドの最も大きな局所平均親水性を計算することが可能になり、このことは、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な方策である。全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，５５４，１０１号。当技術分野で理解されているように、類似の親水性の値を有するアミノ酸の置換から、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。相互に±２内の親水性の値を有するアミノ酸を用いて、置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性の値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。そうした観察結果と一致して、生物学的機能に対応するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよびその他の特性により示される、アミノ酸の相対的な類似性、特に、それらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００８５】
範囲：本開示全体を通して、本発明の種々の態様を、範囲フォーマットとして提示することができる。範囲フォーマットとしての記載は、単に利便性および簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する確固たる制限であると解釈してはならないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の可能な部分的範囲および個々の数値全てを具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、範囲の記載、例として、１-６は、部分的範囲、例として、１-３、１-４、１-５、２-４、２-６、３-６等、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を具体的に開示しているとみなすべきである。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００８６】
説明
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼのペプチドを含む免疫学的組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明のペプチドは、免疫応答を惹起するのに有用である。本発明のペプチドを含む組成物は、初期防御のための予防的治療剤としても有用であり、進行中の状態の治療のための治療剤としても有用である。
【００８７】
本発明はまた、癌を治療または予防するための方法も提供する。そのような方法は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。そのようなペプチドの投与の結果、抗腫瘍免疫が誘導される。したがって、本発明は、対象において抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供し、そのような方法は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せ、ならびにそれに由来する医薬組成物および細胞組成物を対象に投与するステップを含む。
【００８８】
本発明は、哺乳動物においてＴ細胞応答を誘導するための方法を包含する。この方法は、Ｔ細胞の増殖を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含む。一実施形態では、方法は、本発明のペプチドをパルス添加した樹状細胞ワクチンを投与し、それにより、ペプチドに対応する抗原に対してＴ細胞の増殖を特異的に誘導するステップを含む。
【００８９】
一実施形態では、本発明のペプチドをパルス添加したＡＰＣを使用して、Ｔ細胞を培養し拡大することができる。ＡＰＣを使用し、Ｔ細胞を拡大増殖して、十分な数の抗原特異的Ｔ細胞を得たら、そうして得た抗原特異的Ｔ細胞を哺乳動物に投与し、それにより、哺乳動物において抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する。
【００９０】
本発明は、活性化したＤＣの調製物を含む。一実施形態では、ＤＣ調製物は、９０％超の純度である。別の実施形態では、ＤＣ調製物を、完全に活性化させる。例えば、ＤＣをＴＬＲアゴニスト（例えば、ＬＰＳ）と接触させることを含むＤＣ活性化レジメンを用いて、ＤＣを活性化させる。別の実施形態では、カルシウムを動員する処理を、異なる第３シグナルのサイトカインを増強するその他のＤＣ活性化レジメン（例えば、活性化剤）と併せて用いて、ＤＣを活性化させる。
【００９１】
本発明は、成熟した、抗原が負荷されたＤＣであって、任意のＤＣ活性化レジメンにより活性化させたＤＣを含む。本発明のＤＣは、望ましいレベルのサイトカインおよびケモカインを生成させる。一実施形態では、本発明は、細胞にパルス添加を行い、活性化させる方法であって、それによって、細胞が、凍結保存の後に活性状態を維持する方法を提供する。本発明のＤＣ調製物の利益は、単一の白血球アフェレーシス（患者からの収集物）から、細胞が、最初のワクチンに加えて、複数回（例えば、１０回以上）の「ブースター」用量に効率的に凍結保存され、これらの用量は、遠隔の治療場所で、必要に応じて解凍することができ、いずれの特殊な細胞処理施設もさらに必要な品質管理試験もいらないことである。
【００９２】
本発明はまた、これらの活性化したＤＣの凍結保存にも関し、ＤＣは、解凍しても、抗原の提示における効力および機能ならびに種々のサイトカインおよびケモカインの生成を保持するように凍結保存され、したがって、凍結保存し、その後に解凍した活性化したＤＣは、新たに収集し、活性化させたＤＣと同じレベルで、臨床的に有効である。
【００９３】
本明細書では、本発明が、Ｔ細胞に対してより強力なシグナルを発生させる点で優れた機能を有するＤＣを生成し、凍結保存するための方法を提供することを企図し、したがって、より強力な、ＤＣに基づくワクチンが得られる。そのような細胞を有効に凍結保存することによって、試料を保存し、解凍して、後に使用することができ、それにより、ワクチンを生成する間にフェレーシスおよびエルトリエーションのプロセスを繰り返す必要性を低下させる。ＤＣを凍結し、次いで後に、それらを解凍して取り出すことが可能になることは、利点であり、これは、単回で生成したワクチンを、小分けし、凍結しておき、次いで、数週間、数ヵ月または数年にわたり、一回に１つずつ患者に投与して、免疫を強化する「ブースター」ワクチン接種を行うことができることを意味するからである。
【００９４】
本実施形態はまた、バレット食道としても知られている胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行のマーカーとしてのＨＥＲ３発現の使用を含む。  このマーカーは、浸潤性食道胃癌において予後および治療的使用を有する。
【００９５】
組成物
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明のペプチドは、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープに相当する。いくつかの実施形態では、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープは、免疫原性である。
【００９６】
本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、１つまたは複数のキメラペプチドを含む組成物も提供する。一実施形態では、キメラペプチドは、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープをさらに１つ含む。
【００９７】
さらに、１つまたは複数の多価ペプチドを有する組成物も提供する。これらの多価ペプチドは、２つ以上の本発明のエピトープを含む。
【００９８】
本発明の組成物を使用して免疫応答を賦活させる方法および対象において癌を治療する方法は、本発明に含まれる。また、ワクチンも、治療および予防に使用するために提供する。本発明のエピトープは、本明細書に記載するように、単独またはキメラペプチドの状況で、免疫応答を引き起こすことが可能である。一実施形態では、免疫応答は液性応答である。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性応答である。いくつかの実施形態によれば、本発明のエピトープまたはペプチドは、防御効果を付与する。
【００９９】
一実施形態では、本発明のＨＥＲ３のエピトープまたはその他のペプチドは、
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）；
ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）；
ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）；
ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；
ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；
ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；
ｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）
を含む。
【０１００】
本発明のＨＥＲ３ペプチドまたは任意のペプチドは、環状であっても、または直鎖状であってもよい。エピトープは、環状の場合、任意の適切な様式で環状となすことができる。例えば、所望の立体構造をもたらすために、ジスルフィド結合を選択されたシステイン（Ｃｙｓ）の対の間で形成することができる。環状エピトープの形成により、液性応答を改善する、したがって、防御効果を改善する立体構造をもたらすことができると考えられている。
【０１０１】
配列番号４により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の５６〜７０位に相当する。配列番号５により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４０１〜４１５位に相当する。配列番号６により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４１６〜４３０位に相当する。配列番号７により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４５１〜４６５位に相当する。
【０１０２】
本明細書に記載するように、本発明のＨＥＲ３のエピトープはまた、配列番号により同定されるペプチドの機能上の均等物であるペプチドも包含する。そのような機能上の均等物は変化した配列を有し、この場合、対応するＨＥＲ３エピトープの配列中の１つもしくは複数のアミノ酸が置換されている、または１つもしくは複数のアミノ酸が、対応する参照配列から欠失しているもしくはそれに付加している。例えば、１〜３つのアミノ酸を、アミノ末端、カルボキシ末端または両方に付加することができる。いくつかの例では、ＨＥＲ３エピトープは、グリコシル化されている。
【０１０３】
その他の例では、ＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３エピトープのレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）異性体であり得る。レトロ−インベルソ改変は、ペプチド骨格内の全てのアミド結合の逆転を含む。配列の方向を逆転させ、各アミノ酸残基の不斉を、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用することにより反転させることによって、この逆転を達成することができる。このレトロ−インベルソ異性体の形態は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性および立体構造の制約を保持することができる。
【０１０４】
非保存的アミノ酸置換および／または保存的置換を作製することができる。置換アミノ酸が、参照配列中の対応するアミノ酸に類似する構造的または化学的な特性を有する場合には、置換は保存的アミノ酸置換である。例として、保存的アミノ酸置換には、１つの脂肪族または疎水性のアミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを、別のそうしたアミノ酸で置換する場合；１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリンおよびスレオニンを、別のそうしたアミノ酸で置換する場合；１つの酸性の残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸を、別のそうした残基で置換する場合；１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンを、別のそうした残基で交換する場合；１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンを、別のそうした残基で交換する場合；１つの塩基性の残基、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを、別のそうした残基で交換する場合；ならびに１つの小型のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニンおよびグリシンを、別のそうしたアミノ酸で交換する場合がある。
【０１０５】
いくつか例では、欠失および付加は、本発明のペプチドの１つの配列のアミノ末端、カルボキシ末端または両方に位置する。例えば、ＨＥＲ３エピトープの均等物は、対応するＨＥＲ３エピトープの配列と、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は、参照配列の１０個のアミノ酸当たり、１つだけの変化、すなわち、欠失、付加または置換の任意の組合せを有する。当技術分野で公知のまたは開発したプログラムを使用して、バリアントのアミノ酸配列を参照配列と比較することによって、パーセント同一性を決定する。
【０１０６】
対応するＨＥＲ３エピトープの配列よりも長い機能上の均等物の場合には、機能上の均等物は、ＨＥＲ３エピトープの配列と少なくとも９０％同一である配列、および野生型ＨＥＲ３タンパク質中でＨＥＲ３エピトープの配列に隣接する配列を有し得る。
【０１０７】
エピトープの配列を改変し、次いで、得られたポリペプチドを、免疫応答、例えば、抗体の生成を賦活する能力についてアッセイすることによって、ＨＥＲ３エピトープの機能上の均等物を同定することができる。そのような抗体は、血清および腹水を含む、多様な体液中に見出すことができる。手短に述べると、ＨＥＲ３ポリペプチドに特異的な抗体が存在するかどうかを決定することが所望される温血動物、例として、ヒトから、体液試料を単離する。体液を、ＨＥＲ３ポリペプチドと共に、ポリペプチドとタンパク質に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成させるのに十分な条件下でかつそうさせるのに十分な時間にわたりインキュベートし、次いで、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイする。
【０１０８】
本発明のその他の実施形態によれば、キメラペプチド、および１つまたは複数のキメラペプチドを含む組成物を提供する。種々の実施形態によれば、キメラペプチドは、ＨＥＲ３エピトープ、別のエピトープ、およびＨＥＲ３エピトープをその他のエピトープにつなぐリンカーを含む。一実施形態では、その他のエピトープとして、これらに限定されないが、別のＨＥＲ３エピトープ、ＨＥＲ１エピトープ、ＨＥＲ２エピトープおよびｃ−ＭＥＴエピトープを挙げることができる。任意の適切なリンカーを使用してよいことがさらに理解される。例えば、使用するエピトープに依存して、ＨＥＲ３エピトープを、その他のエピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結することができる。その他のエピトープの場所および選択は、ＨＥＲ３エピトープの構造的な特徴、すなわち、アルファへリックスまたはベータ−ターンまたは鎖かどうかに依存する。
【０１０９】
一実施形態では、リンカーは、約２-約１５個のアミノ酸、約２-約１０個のアミノ酸、または約２-約６個のアミノ酸の長さのペプチドであり得る。キメラペプチドは、直鎖状であっても、または環状であってもよい。さらに、ＨＥＲ３エピトープ、その他のエピトープおよび／またはリンカーは、レトロ−インベルソの形態であってよい。したがって、ＨＥＲ３エピトープは単独で、レトロ−インベルソの形態であってもよい。代わりに、ＨＥＲ３エピトープおよびその他のエピトープが、レトロ−インベルソの形態であってもよい。別の例では、ＨＥＲ３エピトープ、その他のエピトープおよびリンカーが、レトロ−インベルソの形態であってもよい。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、キメラペプチドの形態をとる代わりに、一緒にして混合物となすこともできる。いずれにしても、ペプチドを含む本発明の組成物は、細胞ワクチンを生成するために、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）にパルス添加するのに有用な薬剤となり得る。別の実施形態では、ペプチドを含む本発明の組成物は、抗体の生成を誘導するのに有用な免疫原となり得る。また、本発明の組成物を使用して、対象を免疫化し、腫瘍の発生を遅延させるまたは予防することもできる。本発明の組成物をワクチン中で使用して、防御効果をもたらすことができる。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のペプチドまたはキメラペプチドのうちの２つ以上の混合物を含む組成物を提供する。いくつか例では、それら２つ以上のキメラペプチドのそれぞれのＨＥＲ３エピトープが異なる。その他の例では、ＨＥＲ３エピトープの１つは、配列番号１〜７から選択される。
【０１１２】
キメラペプチドを含む、本発明のペプチドは、周知の技法を使用して調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成のいずれかを使用して、ペプチドを合成して調製することができる。本発明のペプチドは、個々に合成しても、または２つ以上のペプチドで構成される、より長いポリペプチドとして合成してもよい。本発明のペプチドは、好ましくは、単離され、すなわち、その他の天然に存在する宿主細胞のタンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しない。
【０１１３】
市販されているペプチド合成機を使用して、本発明のペプチドおよびキメラペプチドを合成することができる。例えば、本明細書に参照により具体的に組み込まれている、Ｋａｕｍａｙａら、“Ｄｅ  Ｎｏｖｏ”  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４）、１３３-１６４頁に記載されている化学的な方法を使用することができる。例えば、ＨＥＲ−３エピトープを、その他のエピトープと共に同じ直鎖上に（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒｌｙ）合成して、キメラペプチドを形成することができる。Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を使用して、ペプチド合成を実施することができる。ペプチドおよびキメラペプチドは、任意の適切な様式で環状となすことができる。例えば、システイン残基を示差的に保護し、ヨウ素酸化を行い、水を添加して、Ａｃｍ基の除去を促進し、ジスルフィド結合を同時に形成する方法、および／またはシリルクロリド−スルホキシド法を使用して、ジスルフィド結合を得ることができる。
【０１１４】
また、無細胞翻訳系、およびエピトープまたはペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡ分子を使用しても、ペプチドおよびキメラペプチドを生成することができる。代わりに、エピトープまたはキメラペプチドは、宿主細胞に、それぞれのエピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターをトランスフェクトし、次いで、宿主細胞中でポリペプチドの発現を誘発することによって作製することもできる。組換え体の生成の場合には、エピトープ、キメラペプチドまたはそのバリアントをコードする配列の１つまたは複数を含む組換えコンストラクトを、従来法、例として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介型トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌａｄｉｎｇ）、弾道導入、または感染により、宿主細胞内に導入する。
【０１１５】
本発明のペプチドは、改変、例として、グリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化を含有することができるが、このことは、改変が、ペプチドの生物学的活性を破壊しない場合に限られる。その他の改変として、例えば、ペプチドの血清半減期を延長するために使用することができるＤ−アミノ酸またはその他のアミノ酸模倣物質の組込みが挙げられる。
【０１１６】
本発明のペプチドは、組合せとして調製することができ、この組合せは、疾患、例えば、癌のためのワクチンとして使用するために、２つ以上の本発明のペプチドを含む。ペプチドは、カクテルになしてもよく、または標準的な技法を使用して、相互にコンジュゲートさせてもよい。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができる。組合せ中のペプチドは、同じであっても、または異なっていてもよい。
【０１１７】
また、本発明は、本発明のペプチド（または前記ペプチドをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」および「バリアント」も包含すると解釈すべきであり、これらの突然変異体、誘導体およびバリアントは、１つまたは複数のアミノ酸が変化しているペプチドであり（または、前記アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す場合には、１つまたは複数の塩基対が変化している）、したがって、得られたペプチド（またはＤＮＡ）は、本明細書に列挙する配列と同一ではないが、本明細書に開示するペプチドと同じ生物学的特性を有する。
【０１１８】
本発明はまた、配列番号１〜７のうちの任意の１つまたは複数の配列を有するペプチドから選択される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列およびペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。その他の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野で公知であるように、重複するコドンに起因して、いくつかの代替のポリヌクレオチドが可能であるが、これらは、翻訳されたペプチドの生物学的活性は保持する。
【０１１９】
さらに、本発明は、本明細書に開示するペプチドに対して実質的な相同性を有するペプチドをコードする単離核酸も包含する。好ましくは、本発明のペプチドをコードする単離核酸のヌクレオチド配列は、「実質的に相同」、すなわち、本発明のペプチドをコードする単離核酸のヌクレオチド配列と、約６０％相同、より好ましくは、約７０％相同、さらにより好ましくは、約８０％相同、より好ましくは、約９０％相同、さらにより好ましくは、約９５％相同、さらにより好ましくは、約９９％相同である。
【０１２０】
本発明の範囲は、より短いおよびより長いペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、相同体、類似体、バリアント、誘導体および塩；ならびに１つまたは複数のアミノ酸または核酸の置換を有するペプチドおよびポリヌクレオチドの類似体；ならびに当技術分野で公知であるアミノ酸または核酸の誘導体、非天然のアミノ酸または核酸および合成のアミノ酸または核酸を包含するが、ただし、これらの改変は、元々の分子の生物学的活性を保存しなければならないことを明確に理解されたい。具体的には、本発明の原理に従って、活性なペプチドの任意の活性な断片、ならびに伸長体、コンジュゲートおよび混合物を開示する。
【０１２１】
本発明は、本明細書において記載したり、参照したりする核酸に対して相同であるあらゆる単離核酸を含むが、ただし、これらの相同なＤＮＡは、本明細書に開示するペプチドの生物学的活性を有すると解釈すべきである。
【０１２２】
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列を包含し、細胞を伴わない場合であってもまたは細胞を伴う場合であっても、ヌクレオチド配列をより安定にする、ＤＮＡまたはＲＮＡの化学的改変を含む、任意のその改変形態も包含することを、当業者であれば理解するであろう。また、ヌクレオチドの化学的改変を使用して、細胞がヌクレオチド配列を取り込む効率または細胞中でヌクレオチドが発現する効率を増強することもできる。本発明は、ヌクレオチド配列の改変のあらゆる組合せを企図する。
【０１２３】
さらに、当技術分野で周知である組換えＤＮＡの方法、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、上記、に記載されている方法等を使用する、本発明のタンパク質の突然変異体、誘導体またはバリアントの形態の生成のためには、任意の数の手順を使用することもできる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることによって、ペプチドまたはポリペプチド中にアミノ酸の変化を導入するための手順は、当技術分野で周知であり、また、これらおよびその他の論文にも記載されている。
【０１２４】
本発明のペプチドをコードする核酸を、適切なベクター、例えば、レトロウイルスベクター内に組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野で周知である。核酸、または核酸を有用に含有するベクターを、所望の細胞内に移入することができ、こうした細胞は、好ましくは、患者から得る。好都合なことに、本発明は、すぐに使用可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）組成物を提供し、この組成物により、患者自身の細胞（または別の哺乳動物自体の細胞）を迅速に改変して、優れた癌細胞死滅特性を有する改変細胞を迅速かつ容易に生成するのが可能になる。
【０１２５】
ベクター
その他の関連の態様では、本発明は、配列番号１-７からなる群から選択される配列を有するペプチドの１つまたは複数をコードする単離核酸を含む。
【０１２６】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドをコードする核酸配列を含み、この配列は、プロモーター／調節配列を含む核酸に作動可能に連結しており、したがって、後者の核酸は、好ましくは、前者の核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能である。したがって、本発明は、外因性ＤＮＡを細胞内に導入して、細胞中で外因性ＤＮＡを同時に発現させるための発現ベクターおよび方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているもの等を包含する。所望のポリヌクレオチドのベクター内への組込み、およびベクターの選択は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記、に記載されているように、当技術分野で周知である。
【０１２７】
ポリヌクレオチドを、いくつかのタイプのベクター内にクローニングすることもできる。しかし、本発明がいずれかの特定のベクターに限定されると解釈してはならない。代わりに、本発明は容易に入手可能であり、かつ／または当技術分野で周知である、非常に広範なベクターを包含すると解釈すべきである。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含む、ベクター内にクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。
【０１２８】
特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。多数の発現ベクター系が存在し、それらは、上記で論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む。原核生物ベクターおよび／または真核生物ベクターに基づく系を利用し、本発明と共に使用して、ポリヌクレオチドまたはそれらの同族のポリペプチドを生成することができる。多くのそのような系が、市販され、広く入手可能である。
【０１２９】
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することもできる。ウイルスベクターの技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）ならびにその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製開始点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する。（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。
【０１３０】
所望の本発明のヌクレオチド配列を発現させるためには、各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールを、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置付けるように機能させる。この最良の公知の例が、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーター、例として、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０遺伝子のプロモーターにおいては、開始部位に重なる別個の要素自体が、開始の場所を固定するのを支援する。
【０１３１】
追加のプロモーター要素、すなわち、エンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位から３０-１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近になって、いくつかのプロモーターが、開始部位の下流にも機能性の要素を含有することが示されている。プロモーター要素間の間隔は、多くの場合融通が利き、したがって、要素が、反転したまたは相互に移動した場合でも、プロモーターの機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）のプロモーターにおいては、活性が減退し始めるまでに、プロモーター要素間の間隔は、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターによって異なるが、個々の要素が協働してまたは独立に機能して、転写を活性化させることができるように見える。
【０１３２】
プロモーターは、遺伝子またはポリヌクレオチド配列に天然に付随するプロモーターであり得、これは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる。そのようなプロモーターを、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーも、ポリヌクレオチド配列に天然に付随するエンハンサーであり得、これは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する。代わりに、組換えまたは異種のプロモーターの制御下にポリヌクレオチドのコードセグメントを置くことによって、特定の利点が得られ、この場合のプロモーターは、ポリヌクレオチド配列にその天然の環境下では通例付随しないものを指す。また、組換えまたは異種のエンハンサーも、ポリヌクレオチド配列にその天然の環境下では通例付随しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、その他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに任意のその他の原核生物、ウイルスまたは真核生物細胞から単離したプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変化させる突然変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して、配列を生成することもでき、それらは、本明細書に開示する組成物に関連するＰＣＲ（商標）を含む（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号）。さらに、非核性のオルガネラ、例として、ミトコンドリア、葉緑体等内で配列の転写および／または発現を導く制御配列も同様に利用することができることも企図する。
【０１３３】
当然ながら、発現させるために選ばれた細胞型、オルガネラおよび生物中でＤＮＡセグメントの発現を有効に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要である。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合せの使用方法を知っており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２）を参照されたい。利用するプロモーターは、構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入するＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を導くのに適切な条件、例として、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な生成に好都合である条件下で有用なプロモーターであり得る。プロモーターは、異種性であっても、または内因性であってもよい。
【０１３４】
本明細書に提示する実験実施例で例示するプロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最早期プロモーターの配列である。このプロモーター配列は、強力な構成性のプロモーター配列であり、それに作動可能に連結している任意のポリヌクレオチド配列の高いレベルの発現を駆動することが可能である。しかしまた、その他の構成性プロモーターの配列も使用することができ、それらとして、これらに限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス最早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例として、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよび筋肉クレアチンプロモーターが挙げられる。さらに、本発明を、構成性プロモーターの使用に限定すべきでもない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。本発明では誘導性プロモーターを使用することによって、誘導性プロモーターが作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現を所望する場合にはオンにし、または発現を所望しない場合には発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、これらに限定されないが、メタロチオネインのプロモーター、糖質コルチコイドのプロモーター、プロゲステロンのプロモーターおよびテトラサイクリンのプロモーターが挙げられる。さらに、本発明は、組織特異的なプロモーターの使用も含み、こうしたプロモーターは、所望の組織中でのみ活性である。
【０１３５】
本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を評価するためには、細胞内に導入しようとする発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有して、ウイルスベクターによるトランスフェクションまたは感染を狙った細胞集団から発現している細胞を同定し、選択するのを促進することもできる。その他の実施形態では、選択マーカーを、別個のＤＮＡ小片上に載せ、コトランスフェクションの手順において使用することができる。選択マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて、宿主細胞中での発現を可能にし得る。有用な選択マーカーは、当技術分野で公知であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例として、ｎｅｏ等が挙げられる。
【０１３６】
レポーター遺伝子を使用して、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能を評価する。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が、当技術分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織中に存在することも、レシピエントの生物または組織が発現することもなく、何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が明らかになるタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡをレシピエント細胞内に導入した後の適切な時期にアッセイする。
【０１３７】
適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含むことができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉら、２０００年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９：７９-８２頁を参照されたい）。適切な発現系が周知であり、それらを、周知の技法を使用して調製しても、または商業的に得てもよい。内部に欠失を有するコンストラクトを、特有の内部制限部位を使用して、または特有でない制限部位の部分消化により生成することができる。次いで、コンストラクトを、ｓｉＲＮＡのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現の高いレベルを示す細胞内にトランスフェクトすることができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現を示す、最低限の５’隣接領域を有するコンストラクトを、プロモーターであると同定する。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーターが駆動する転写を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）能力について、薬剤を評価するために使用することができる。
【０１３８】
ワクチン
一実施形態では、本発明の対象は、本発明のペプチドを含むワクチンである。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象の癌の特定の予防または治療に、特定のペプチドの任意の組合せを提供することができる。
【０１３９】
本発明のワクチンは、抗原特異的Ｔ細胞応答および／または高いタイターの抗体応答を誘導することができ、それにより、抗原を発現する癌もしくは腫瘍に向けられた、またはそれに対して反応性である免疫応答が誘導または惹起される。いくつかの実施形態では、誘導または惹起された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性の両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または惹起された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌を含むことができる。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の対象は、抗癌ワクチンである。ワクチンは、１つまたは複数の癌抗原を含むことができる。ワクチンは、腫瘍の成長を阻止することができる。ワクチンは、腫瘍の成長を低下させることができる。ワクチンは、腫瘍細胞の転移を阻止することができる。癌抗原に応じて、ワクチンを標的化して、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、メラノーマ、血液癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、再発性呼吸器乳頭腫、肛門癌、子宮頸癌、脳腫瘍等を治療することができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、ワクチンは、（１）望ましい抗体を生成するＢ細胞応答を介する液性免疫；（２）腫瘍細胞を攻撃し、死滅させる細胞傷害性Ｔリンパ球、例として、ＣＤ８＋（ＣＴＬ）の増加；（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加；ならびに（４）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αを介する炎症性応答の増加、または好ましくは、上記の全てを誘導することによって、腫瘍細胞の成長の一掃または阻止を媒介することができる。ワクチンは、無腫瘍生存を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％および４５％増加させることができる。ワクチンは、免疫化の後に、腫瘍量を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％および６０％低下させることができる。
【０１４２】
ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与した対象における細胞性免疫応答を、約５０倍-約６０００倍、約５０倍-約５５００倍、約５０倍-約５０００倍、約５０倍-約４５００倍、約１００倍-約６０００倍、約１５０倍-約６０００倍、約２００倍-約６０００倍、約２５０倍-約６０００倍、または約３００倍-約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与した対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍または６０００倍増加させることができる。
【０１４３】
ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）のレベルと比較して、ワクチンを投与した対象中のＩＦＮ−γレベルを、約５０倍-約６０００倍、約５０倍-約５５００倍、約５０倍-約５０００倍、約５０倍-約４５００倍、約１００倍-約６０００倍、約１５０倍-約６０００倍、約２００倍-約６０００倍、約２５０倍-約６０００倍、または約３００倍-約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象中のＩＦＮ−γのレベルと比較して、ワクチンを投与した対象中のＩＦＮ−γのレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍または６０００倍増加させることができる。
【０１４４】
本発明のワクチンは、有効なワクチンに必要な特徴を有し、例えば、本発明のワクチンは、安全であり、したがって、ワクチン自体は疾病も死亡も引き起こさず；疾病に対する防御をもたらし；中和抗体を誘導し；防御性Ｔ細胞応答を誘導し；投与が容易であり、副作用がほとんどなく、生物学的に安定であり、１用量当たりのコストが低い。ワクチンは、これらの特徴の一部または全部を、下記で論じるように癌抗原を含有することによって達成することができる。
【０１４５】
負荷（パルス添加）された免疫細胞の生成
本発明は、本発明の抗原または本発明のその他のペプチドに曝露させてある、またはそうでなければそれを「パルス添加」してある細胞を含む。例えば、ＡＰＣ、例としてＤＣは、例えば、抗原の存在下のｅｘ  ｖｉｖｏで培養することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｇにより負荷された状態になり得る。
【０１４６】
また、ＡＰＣを抗原に曝露させる様式で、ＡＰＣに「パルス添加する」ことができ、この曝露は、ＡＰＣの表面上にその抗原を提示するのを促進するのに十分な時間行われることも、当業者であれば容易に理解するであろう。例えば、ＡＰＣを、抗原性ペプチドとして既知である、小型のペプチド断片の形態の抗原に曝露させることができ、これらの断片は、ＡＰＣの外部上に直接「パルス添加される」（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４年）；またはＡＰＣを、全タンパク質またはタンパク質粒子と共にインキュベートすることができ、次いで、これらのタンパク質は、ＡＰＣにより摂取される。これらの全タンパク質は、ＡＰＣにより小型のペプチド断片に消化され、最終的に、ＡＰＣ表面に運ばれ、ＡＰＣ表面上に提示される（Ｃｏｈｅｎら、１９９４年）。ペプチドの形態の抗原を、本明細書に記載する標準的な「パルス添加」の技法により、細胞に曝露させることができる。
【０１４７】
いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、外来抗原または自己抗原の形態の抗原は、抗原の免疫原性の形態を保持するために、本発明のＡＰＣによりプロセシングされる。抗原の免疫原性の形態とは、抗原が断片化によりプロセシングされて、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞により認識され、それらを賦活することができる抗原の形態が生成されることを意味する。好ましくは、そのような外来抗原または自己抗原は、ＡＰＣによりペプチドにプロセシングされるタンパク質である。ＡＰＣにより生成される関連するペプチドを、抽出し、精製して、免疫原性組成物として使用することができる。また、ＡＰＣによりプロセシングされたペプチドを使用して、ＡＰＣによりプロセシングされたタンパク質に対する寛容を誘導することもできる。
【０１４８】
抗原が負荷されたＡＰＣは、別の表現によれば、本発明の「パルス添加したＡＰＣ」として知られ、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでＡＰＣを抗原に曝露させることによって生成される。ＡＰＣにｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルス添加する場合には、ＡＰＣを、培養皿上に蒔き、抗原がＡＰＣに結合するのを可能にするのに十分な量で十分な期間にわたり、抗原に曝露させることができる。抗原のＡＰＣへの結合を達成するのに必要な量および時間は、当技術分野で公知である方法または本明細書に開示するその他の方法を使用することによって決定することができる。当業者に公知のその他の方法、例えば、イムノアッセイまたは結合アッセイを使用して、抗原への曝露の後のＡＰＣ上の抗原の存在を検出することができる。
【０１４９】
本発明のさらなる実施形態では、ＡＰＣによる特定のタンパク質の発現を可能にするベクターを、ＡＰＣにトランスフェクトすることができる。次いで、ＡＰＣが発現するタンパク質は、プロセシングされ、細胞表面上に提示され得る。次いで、トランスフェクトされたＡＰＣを免疫原性組成物として使用して、ベクターがコードするタンパク質に対する免疫応答を発生させることができる。
【０１５０】
本明細書の他の箇所で論じたように、免疫原性応答が所望されるタンパク質をコードし発現する特定のポリヌクレオチドを含むように、ベクターを調製することができる。好ましくは、レトロウイルスベクターを使用して、細胞を感染させる。より好ましくは、アデノウイルスベクターを使用して、細胞を感染させる。
【０１５１】
別の実施形態では、ウイルスベクターを、ＡＰＣ上の受容体により認識されるタンパク質またはその部分をコードするように改変することによって、ベクターを標的のＡＰＣに差し向けることができ、それによって、ベクターがＡＰＣ受容体を占有すると、ベクターのエンドサイトーシスが始まって、ウイルスベクターの核酸がコードする抗原がプロセシングされ、提示されるのが可能になる。ウイルスが送達する核酸は、ウイルスにとってネイティブであり得、この核酸は、ＡＰＣ上で発現する場合でも、ウイルスタンパク質をコードし、次いで、このウイルスタンパク質は、プロセシングされ、ＡＰＣのＭＨＣ受容体上に提示される。
【０１５２】
本明細書が企図するように、種々の方法を使用して、ポリヌクレオチドを宿主細胞内にトランスフェクトすることができる。それらの方法として、これらに限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、コロイド分散液系（すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む、脂質に基づく系）が挙げられる。これらの方法は、当技術分野では理解されており、公開されている文献に記載されており、したがって、当業者がこれらの方法を実施することが可能である。
【０１５３】
別の実施形態では、別の方法により、負荷されたＡＰＣを生成するために、抗原をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター中にクローニングすることができ、このベクターをＡＰＣ内に導入することが可能になる。核酸を細胞内に導入する種々のタイプのベクターおよび方法は、入手可能な公開文献中で論じられている。例えば、物理的、化学的または生物学的な手段により、発現ベクターを宿主細胞内に移入することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入によりパルス添加した細胞が得られることは容易に理解される。
【０１５４】
本発明は、ＡＰＣにパルス添加するための種々の方法を含み、それらとして、これに限定されないが、ＡＰＣに、タンパク質、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの形態の抗原全体を負荷することが挙げられる。しかし、本発明は、ＡＰＣにパルス添加するために使用する抗原の特定の形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、本発明は、抗原を負荷されたＡＰＣを生成するための、当技術分野で公知のその他の方法を包含する。好ましくは、ＡＰＣに、定義された抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトする。適切なプライマー、および転写反応とカップリングさせた逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、配列が既知である遺伝子産物に対応するｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に生成することができる。パルス添加したＡＰＣを生成する場合、ＡＰＣのｍＲＮＡを用いるトランスフェクションにより、抗原を負荷するその他の技法を上回る利点が得られる。例えば、微小量の組織、すなわち、腫瘍組織からＲＮＡを増幅することが可能であることは、ＡＰＣを使用して、多数の患者にワクチン接種を行うことにつながる。
【０１５５】
抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原組成物が、抗原に対する免疫応答を、細胞、組織または哺乳動物（例えば、ヒト）中で誘導しなければならない。本明細書で使用する場合、「免疫学的組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）、または抗原もしくは細胞構成成分を発現もしくは提示する細胞を含むことができる。特定の実施形態では、抗原組成物は、本明細書に記載する任意の抗原の全部もしくは一部、またはその免疫学的機能上の均等物を含むまたはコードする。その他の実施形態では、抗原組成物は、追加の免疫賦活剤またはそのような薬剤をコードする核酸を含む混合物をなす。免疫賦活剤は、これらに限定されないが、追加の抗原、免疫調節物質、抗原提示細胞またはアジュバントを含む。その他の実施形態では、追加の薬剤の１つまたは複数が、抗原または免疫賦活剤に、任意の組合せで共有結合する。特定の実施形態では、抗原組成物は、ＨＬＡアンカーモチーフのアミノ酸にコンジュゲートされる、またはそれらを含む。
【０１５６】
ワクチンは、本明細書が企図するように、核酸および／または細胞構成成分のその組成が変化し得る。非限定的な例ではまた、抗原をコードする核酸は、アジュバントと共に製剤化することもできるであろう。もちろん、本明細書に記載する種々の組成物は追加の構成成分をさらに含むことができることが理解されるであろう。例えば、１つまたは複数のワクチン構成成分を、脂質またはリポソーム中に含めることができる。別の非限定的な例では、ワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含むことができる。本発明のワクチンおよびその種々の構成成分は、本明細書に開示する任意の方法により調製および／もしくは投与することができ、またはこのことは、当業者であれば、本開示に照らして理解するであろう。
【０１５７】
本発明の抗原組成物を、当技術分野で周知である方法により作製することができることが理解され、そうした方法には、これらに限定されないが、固相合成により化学合成し、ＨＰＬＣにより化学反応のその他の生成物から精製して取り出す方法、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの翻訳系においてもしくは生きている細胞中で、本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を発現させることによって生成する方法がある。さらに、抗原組成物は、生物学的試料から単離した細胞構成成分を含むこともできる。抗原組成物は、単離し、十分に透析して、１つまたは複数の望ましくない低分子量の分子を除去すること、および／または所望のビヒクル内に凍結乾燥して、製剤の即時使用性を高める。ワクチン構成成分中にもたらす追加のアミノ酸、突然変異、化学的改変等があれば、それらは、好ましくは、抗体がエピトープ配列を認識するのを実質的に妨げないことをさらに理解されたい。
【０１５８】
抗原提示細胞療法
本発明は、本発明のペプチドを表面上に提示するＡＰＣ（例えば、樹状細胞；ＤＣ）の集団を生成し、続いて、その集団を療法において使用する方法を包含する。そのような方法は、患者から入手した細胞の試料に対して、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。したがって、このようにして生成したＡＰＣは、癌の治療または予防において使用することができる医薬剤を形成する。これらの細胞は、個体の免疫系により受容されるはずであり、というのは、そうした細胞は、その個体に由来するからである。このようにして生成された細胞を、細胞を当初得た個体に送達し、こうして、本発明の治療の実施形態を形成する。
【０１５９】
ＤＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働く多能性単核球に由来する。ＤＣは、末梢組織中に偏在し、そこで、抗原を捕捉するように待機している。ＤＣは、抗原を捕捉すると、抗原を小型のペプチドにプロセシングし、二次リンパ器官に向かって移動する。ＤＣが抗原ペプチドをナイーブＴ細胞に提示するのは、リンパ器官の内部においてであり、ペプチドの提示により、Ｔ細胞分化を偏向させるシグナルカスケードが開始される。ＤＣは、曝露されると、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの結合性ペプチドに結合した抗原分子を提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ活性化させる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、２４５〜２５２頁；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ  ４４９：４１９〜４２６頁；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：３１３３〜３１４６頁；Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２００６年、Ｂｌｏｏｄ  １０８：２６５５〜２６６１頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：６１１〜６１４頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：２５７〜２７２頁）。
【０１６０】
ＤＣは、適応免疫応答の誘導、協調および調節に関与し、また、免疫系のエフェクターの自然アームと適応アームとの間の連絡を統合するようにも働く。これらの特徴から、ＤＣが、免疫療法のための強力な候補になっている。ＤＣは、マクロピノサイトーシスおよび受容体媒介性エンドサイトーシスにより環境を見極める特有の能力を有する（Ｇｅｒｎｅｒら、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１５５〜１６４頁；Ｓｔｏｉｔｚｎｅｒら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５７：１６６５〜１６７３頁；Ｌａｎｚｅｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３４８〜３５４頁；Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０７（５７１５）：１６３０〜１６３４頁）。
【０１６１】
また、ＤＣは、その抗原提示能力を増強するために、成熟シグナルも必要とする。追加の成熟シグナル、例として、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌまたはカルシウムシグナル伝達物質を提供することによって、ＤＣは、表面分子、例として、ＣＤ８０およびＣＤ８６（第２のシグナル分子としてもまた公知である）の発現を上方制御する（Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３８２３〜３８３７頁；Ｂｅｄｒｏｓｉａｎら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：３１１〜３２０頁；Ｍａｉｌｌｉａｒｄら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、５９３４〜５９３７頁；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４２３８〜４２４７頁；Ｊｉｎら、２００４年、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：９３〜１０３頁）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含むサイトカインの混合物が、ＤＣを成熟させる能力を有することが確立されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｒｅｓ．２９２：３２５〜３３２頁）。また、ＤＣを、抗原をパルス添加する前に、カルシウムイオノフォアを用いて成熟させることもできる。
【０１６２】
ＤＣは、病原体を認識する受容体、例として、ＰＫＲおよびＭＤＡ−５（Ｋａｌａｌｉら、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：２６９４〜２７０４頁；Ｎａｌｌａｇａｔｌａら、２００８年、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．５（３）：１４０〜１４４頁）に加えて、また、トール様受容体（ＴＬＲ）として公知である一連の受容体も含有し、これらの受容体もまた、病原体に由来する危険を感知することが可能である。これらのＴＬＲが刺激されると、ＤＣ中で、一連の活性変化が誘導され、これは、成熟およびＴ細胞シグナル伝達をもたらす（Ｂｏｕｌｌａｒｔら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７（１１）：１５８９〜１５９７頁；Ｋａｉｓｈｏら、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３７３〜３８５頁；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５２８）：２５３〜２５６頁；Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉら、２００５年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（８）：７６９〜７７６頁）。ＤＣは、細胞媒介性応答の種々のアーム、例として、ナチュラルキラーγ−δ  Ｔ細胞およびα−β  Ｔ細胞を活性化させ、その作用を延長させることができ、ＤＣは、活性化させたら、それらの免疫化能力を保持させる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５〜２５２頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：２５７〜２７２頁）。
【０１６３】
また、本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを使用して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法も提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、抹消血単核球から樹状細胞を誘導し、次いで、それらを、１つまたは複数の本発明のペプチドと接触させること（賦活）によって、ＡＰＣを誘導することができる。本発明のペプチドを、それらを必要とする哺乳動物に投与すると、本発明のペプチドが固定されたＡＰＣが、哺乳動物の体内で誘導される。代わりに、本発明のペプチドをＡＰＣに固定してから、それらの細胞を、ワクチンとして対象に投与することもできる。例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの投与は、哺乳動物からＡＰＣを収集するステップと、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるステップとを含むことができる。
【０１６４】
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と１つまたは複数の本発明のペプチドとの間で形成された複合体を提示するＡＰＣも提供する。ＡＰＣは、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドとの接触により得られるが、好ましくは、治療および／予防を施そうとする対象に由来し、ワクチンとして、単独で、またはペプチドを含む、その他の薬物、エキソソームもしくは本発明のＴ細胞と組み合わせて投与することができる。
【０１６５】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を賦活するための免疫療法の状況で、ＡＰＣ、好ましくは、ＤＣを賦活するための組成物および方法を提供する。ＤＣが、抗腫瘍免疫を、それを必要とする哺乳動物において賦活させるように、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを用いてＤＣを賦活させ、ＤＣの成熟を引き起こすことによって、ＤＣを操作することができる。
【０１６６】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＴ細胞応答を誘導するための方法を含む。この方法は、ＡＰＣ、例として、ＤＣを投与するステップを含み、この場合、ＡＰＣを本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せと接触させることによって、ＡＰＣを活性化させてあり、それにより、ペプチドを負荷されたＡＰＣとなっている。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、とりわけ、所望のＴ細胞を拡大増殖する目的、Ｔ細胞を活性化させる目的、特定のＴ細胞を拡大増殖する目的で生成した新規ＡＰＣ、およびそれらの目的でそうしたＡＰＣを使用するための方法に関し、さらに、本発明のペプチド負荷ＡＰＣおよびペプチドを使用するＴ細胞の拡大増殖および賦活に関係がある、治療のための多数の使用にも関する。場合によっては、ＯＣＴ４により賦活させたＤＣを使用して、ペプチドに特異的なＴ細胞を拡大増殖することもできる。
【０１６８】
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せと接触させたＤＣを使用して、ペプチドに特異的なＴ細胞の拡大増殖を誘導することができるという発見に関する。当業者であれば、本発明のペプチドと接触させたＤＣは、プライムされていると、または別の表現によれば、ペプチドを負荷されたとみなされることを認識するであろう。本発明の、ペプチドを負荷されたＤＣは、所望の抗原、例えば、ＨＥＲ−３に対する免疫応答を惹起するのに有用である。したがって、本発明の、ペプチドを負荷されたＤＣを使用して、ＨＥＲ−３の無秩序な発現と関連がある疾患を治療することができる。
【０１６９】
疾患を治療するための方法
本発明はまた、病原性微生物が引き起こす疾患、自己免疫障害および／または過剰増殖性疾患を治療および／または予防する方法も包含する。
【０１７０】
本発明を使用することによって治療または予防することができる疾患は、ウイルス、細菌、酵母、寄生生物、原生動物、癌細胞等が引き起こす疾患を含む。本発明の医薬組成物を、全般的な免疫増強剤（ＤＣを活性化させる組成物または系）として使用することができ、それ自体が、疾患の治療における有用性を有する。本発明の医薬組成物を利用して治療および／または予防することができる例示的な疾患として、これらに限定されないが、ウイルスを病因とする感染、例として、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水疱、パピローマウイルス等；または細菌を病因とする感染、例として、肺炎、結核、梅毒等；または寄生生物を病因とする感染、例として、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症等が挙げられる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物（本発明の形質導入されたＤＣ、発現ベクター、発現コンストラクト等）を使用して治療または予防することができる前腫瘍状態または過形成状態として、これらに限定されないが、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房の病変およびその他等の前腫瘍状態または過形成状態が挙げられる。
【０１７２】
本発明の組成物を使用して治療することができる癌として、これらに限定されないが、原発性または転移性のメラノーマ、腺癌、扁平上皮細胞癌、腺扁平上皮細胞癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、胃腸癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸癌等が挙げられる。
【０１７３】
本発明のＤＣ活性化系を使用して治療することができるその他の過剰増殖性疾患として、これらに限定されないが、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム動脈硬化、前腫瘍状態の病変（例として、腺腫性の過形成および前立腺上皮内の新生物）、上皮内癌、口腔毛状白板症または乾癬が挙げられる。
【０１７４】
本発明の組成物を使用して治療することができる自己免疫障害として、これらに限定されないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸促迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、アテローム動脈硬化、気管支炎、胆のう炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群および自己免疫性甲状腺炎；癌、血液透析および体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、原生動物およびゼン虫による感染；ならびに外傷が挙げられる。
【０１７５】
治療の方法において、本発明の組成物の投与は、「予防」のためまたは「治療」のためのいずれであってもよい。本発明の組成物は、予防のために提供する場合には、任意の症状に先立って提供するが、特定の実施形態では、１つまたは複数の症状が発症してから、ワクチンを提供して、さらなる症状が発症するのを予防する、または出現している症状が悪化するのを予防する。組成物の予防のための投与は、任意の後の感染または疾患を予防するまたは寛解させるのに役立つ。医薬組成物は、治療のために提供する場合には、感染または疾患の症状が発症した時点またはその後に提供する。したがって、本発明は、疾患を引き起こす物質への曝露が予期されるもしくは疾患状態が生じる前にまたは感染もしくは疾患が始まった後に提供することができる。
【０１７６】
組成物の有効量は、免疫応答を増強する、選択されたこうした結果を達成する量であり、そのような量は、当業者であれば日常的な事項として決定することができるであろう。例えば、癌または病原体に対する免疫系の不全を治療するための有効量は、抗原への曝露により、免疫系の活性化を引き起こして、抗原特異的免疫応答を発生させるのに必要な量であろう。この用語はまた、「十分な量」と同義でもある。
【０１７７】
いずれの特定の適用例の場合の有効量も、治療される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、および／または疾患もしくは状態の重症度等の因子によって変化させることができる。当業者であれば、本発明の特定の組成物の有効量を、過度の実験を必要とすることなく経験的に決定することができる。
【０１７８】
ワクチン製剤
本発明は、免疫療法において使用するのに適切なワクチン製剤をさらに含む。特定の実施形態では、ワクチン製剤を、疾患、例として、癌および感染性疾患を予防および／または治療するために使用する。一実施形態では、癌を予防および／または治療するための本発明に従うワクチンの患者への投与を、癌を除去するための外科的な手順の前または後、癌を治療するための化学療法の手順の前または後、および癌を治療するための放射線療法の前または後に、ならびにそれらを任意に組み合わせて行うことができる。その他の実施形態では、ワクチン製剤は、別の組成物または医薬製品と同時にまたは組み合わせて患者に投与することができる。本発明はまた、癌を有さないが、癌を発症するリスクがある可能性があるであろう個体において癌を予防するためにも使用することができることを理解すべきである。
【０１７９】
本発明に従って調製される癌ワクチンの投与は、癌ワクチンの抗原を形成する部分の選択によってある程度決定される癌の予防または治療に広く適用できる。本発明の実行手順に従って適切に治療することができる癌は、非限定的に、肺、乳房、卵巣、子宮頚部、結腸、頭部および頸部、膵臓、前立腺、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、食道、脳、精巣、子宮の癌、ならびに種々の白血病およびリンパ腫を含む。
【０１８０】
一実施形態では、本発明に従うワクチンは、治療しようとする腫瘍または癌細胞に由来し得る。例えば、肺癌の治療においては、肺癌ワクチンを生成するために、本明細書上記の記載に従って肺癌細胞が処理されるであろう。同様に、乳癌ワクチン、結腸癌ワクチン、膵臓癌ワクチン、胃癌ワクチン、膀胱癌ワクチン、腎臓癌ワクチン等も、免疫治療剤として生成され、ワクチンの生成源となった腫瘍または癌細胞を予防および／または治療するための実行手順に従って利用される。
【０１８１】
別の実施形態ではまた、記述したように、哺乳動物に影響を及ぼす種々の感染性疾患を治療するために、病原体が培地内に排出した適切な抗原を収集することによって、本発明に従うワクチンを調製することもできるであろう。同じ疾患を引き起こす異なる多様な生物によって発現される免疫原性および防御性抗原のタイプが異種混交であるため、異なる重要な抗原を発現する生物のプールからワクチンを調製することによって、多価ワクチンを調製することができる。
【０１８２】
本発明の別の実施形態では、ワクチンを、鼠径部リンパ節内への節内注射により投与することができる。代わりに、およびワクチンの標的に応じて、ワクチンを、治療される患者の四肢、腕および脚に皮内または皮下投与することもできる。このアプローチは一般に、メラノーマの場合にもその他の癌の場合にも満足なものになるが、感染性疾患の予防または治療を含む、その他の投与経路、例として、筋肉内または血流内経路もまた使用することができる。
【０１８３】
さらに、ワクチンをアジュバントおよび／または免疫調節物質と一緒に投与して、ワクチンの活性および患者の応答をブーストすることもできる。そのようなアジュバントおよび／または免疫調節物質は、当業者により理解されており、入手可能な公開文献に分かり易く記載されている。
【０１８４】
本明細書が企図するように、生成されるワクチンのタイプに応じて、所望により、細胞を大量に成長させるのに適切なバイオリアクターもしくは発酵槽またはその他のそのような槽もしくはデバイスで細胞を培養することによって、ワクチンの生成をスケールアップことができる。そのような装置においては、培養培地から任意の材料または抗原を、そのような材料または抗原が培養培地中で分解する前に回収するために、培養培地は、定期的、頻繁または連続的に収集されるであろう。
【０１８５】
ワクチンまたは抗原を含有するデバイスまたは組成物であって、本発明に従って生成し、回収し、持続性または間欠性の放出に適切であるデバイスまたは組成物は、所望により実際に、体内に埋め込み、または身体に外用適用して、体内にそのような材料を比較的緩慢にまたは決められた時間で放出させることができるであろう。
【０１８６】
ワクチンの調製におけるその他のステップは、特定のワクチンの要件を満たすための個別化であり得る。当業者であれば、そのような追加のステップを理解するであろう。例えば、特定の収集した抗原性の材料を濃縮し、場合によっては、洗剤を用いて処理し、超遠心して、移植アロ抗原を除去することができる。
【０１８７】
疾患の診断および治療のためのバイオマーカーとしてのＨＥＲ３発現
別の実施形態において、ＨＥＲ３発現は、バレット食道および高悪性度形成異常（ＨＧＤ）を有する患者における潜在性侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立ち得る。さらに、いくつかの患者において胃食道癌の二次予防をもたらすことができるＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とするための治療薬が本明細書中に企図される。
【０１８８】
本明細書に記載するこれらの方法は決して、全てを包括するものではなく、特定の適用例に適するさらなる方法が当業者には明らかになるであろう。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知である化合物から類推することによって、より正確な近似値を求めることもできる。
【０１８９】
＜実験実施例＞
本発明をさらに、以下の実験実施例を参照することにより、詳細に記載する。これらの実施例は、例証の目的に限って提供し、別段の特定がない限り、本発明を制限する意図はない。したがって、本発明は、いかなる場合であっても以下の実施例に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、本明細書に提供する教示の結果として明らかになるあらゆる変更形態を包含すると解釈すべきである。
【０１９０】
さらなる説明がなくても、当業者であれば、前記の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製し、利用すること、および請求する方法を実行することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するのであって、いかなる場合であっても本開示の残りの部分を制限すると解釈してはならない。
【実施例１】
【０１９１】
乳癌およびその他の固形癌を引き起こすその他の受容体チロシンキナーゼに対するペプチドワクチンの創出
ＢＲＣＡ突然変異の保有者と指定された患者に対する代替の療法を開発するために、実験を設計した。すなわち、両側乳房切除術の代替を求めており、乳癌の遺伝学的リスクがあるより若年の患者の必要性が満たされていない。
【０１９２】
乳癌遺伝子突然変異ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２を有する女性は、７０％の、乳癌を発症する生涯リスクを有し、ＢＲＣＡ１突然変異の保有者はしばしば、三種陰性乳癌を発症する。この群のためのワクチンを開発し、免疫誘導治験においてそれらの安全性を評価するために、実験を設計した；これは、乳癌の一次的な予防のためのワクチン接種の、これまでで最初の試みである。また、ＢＲＣＡ２突然変異の保有者も含めて、エストロゲン受容体−陽性乳癌を、本発明の多価ワクチンを使用して予防することができるかを観察する。
【０１９３】
乳癌中の受容体チロシンキナーゼの発現、およびＢＲＣＡ突然変異の保有者からのＤＣＩＳを研究するために、実験を設計した。ＢＲＣＡ突然変異の保有者からの腫瘍は頻繁に、ｃ−ＭＥＴ癌遺伝子およびＨＥＲ−３を早くから過剰発現し、一方、非突然変異または孤発性の患者からの腫瘍は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を発現することが観察された。このことは重要である；というのは、孤発性およびＢＲＣＡ突然変異の保有者ためのワクチンを開発するために使用することができる腫瘍免疫療法のための標的が、本明細書に提示する開示に基づいて、今や知られるようになったからである。これは、最初の、際立った特徴であり、予防のために免疫応答を使用する標的とすることができる。したがって、本発明は、ワクチンを開発するための組成物および方法、ならびに両側乳房切除術の代替としての予防のためのそれらの使用を含む。
【０１９４】
ペプチドワクチンの創出
ＨＥＲファミリーは、４つの関連するシグナル伝達分子、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなり、これらは、多様な癌に関与する。ＨＥＲ２の過剰発現が、乳癌の２０％〜３０％において見出されることは公知である。本明細書に提示する結果は、その他のＨＥＲファミリーメンバーが、早期および浸潤性の両方の乳癌、ならびにその他の癌に関与することを示している。例えば、ＨＥＲ１は、少数の乳癌上に発現し、それらの癌は一般に、三種陰性である。ｃ−ＭＥＴは、多くの癌の再発に関与する増殖因子受容体であり、この受容体は、ＨＥＲ３を活性化させる。ＨＥＲ３は、結腸、前立腺、乳房およびメラノーマにおいて過剰発現する。ＨＥＲ３は、多数のＤＣＩＳ病変および乳癌において発現する。ＨＥＲ２ワクチンを投与された一部の患者において、ＨＥＲ３を、手術時に残余のＤＣＩＳ中に検出する場合がある。これらの知見の結果として、乳癌において、ＨＥＲ２に加えて、これらの分子を標的とする可能性は有益であると考えられる。
【０１９５】
ＨＥＲ３に由来する免疫原性ペプチドが同定されており（図１および図２）、これらを以下に示す：
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）；
ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）；
ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）；
ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；
ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；
ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；および
ｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）。
【０１９６】
本明細書に提示する結果は、これらのペプチドが、多くの患者にわたってＣＤ４Ｔ細胞を活性化させることができることを示している。ペプチドを樹状細胞にパルス添加し、Ｔ細胞を、ＨＥＲ３を認識するように教育することができる。ＨＥＲ３は、三種陰性乳癌中で発現し、ＥＲ−陽性乳癌において、抗エストロゲン剤に対する抵抗性をもたらす恐れがある。ＨＥＲ３はまた、メラノーマ、肺癌、結腸癌、前立腺癌および転移性脳腫瘍を含む、その他の癌においても発現する。いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、分子の細胞内部分に由来するペプチドも好都合であり得る。
【０１９７】
本明細書に提示する開示に基づけば、受容体チロシンキナーゼ分子であるＨＥＲ１およびｃ−ＭＥＴについての免疫原性ペプチドを、ＨＥＲ３についての免疫原性ペプチドを同定した手順に基づいて、スクリーニングし、同定することができる。本発明の免疫原性ペプチドを使用して、乳癌およびその他の癌のための多価の予防ワクチンを調製することができる。
【０１９８】
本明細書に提示する結果は、乳癌におけるＨＥＲ２のシスタータンパク質の役割の同定を示している。これらのシスタータンパク質は有効な標的となり得、その他の固形腫瘍のためワクチンを開発することができる。ＨＥＲ１およびＨＥＲ３を標的とするのに使用することができるペプチドを開発するに至った。具体的には、ＤＣＩＳにおいて、患者中の特異的な抗ＨＥＲ１応答、抗ＨＥＲ２応答および抗ＨＥＲ３応答を、ワクチン接種の前および後に同定するに至り、このことは、癌を早期に予防するまたはＤＣＩＳを有する女性を治療するために使用することができる多価ワクチンの開発を支援する。本発明の組成物は、これらに限定されないが、結腸癌、メラノーマ、脳腫瘍、肺癌、卵巣癌およびその他の腫瘍を含む、その他の癌を治療するのに有用である。
【０１９９】
メラノーマ
メラノーマは、早期に発見されないと命にかかわる恐れがある侵襲性の皮膚癌である。マウスにおいて、標準的な樹状細胞ワクチンを使用して、実験を実施し、約７０％のメラノーマを引き起こす、突然変異させたタンパク質（ＢＲＡＦ）を呈するように、樹状細胞を工学的に操作した。これらの樹状細胞を用いてワクチン接種すると、マウスは、メラノーマ細胞を用いたチャレンジから防御され、このことは、メラノーマのためのワクチンの開発が可能であることを示している。いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、ＢＲＡＦおよびＨＥＲ３を組み合わせた標的化は、メラノーマ、さらに、これらに限定されないが、固形癌、例として、結腸癌、膵臓癌および肺癌ならびにその他の胃腸腫瘍を含む、その他の癌を治療するのに有用であり得る。
【０２００】
さらに、メラノーマ腫瘍は、Ｂ細胞を使用して、免疫監視を回避することも示されており、したがって、特定のＢ細胞を排除することによって、療法を改善することができると考えられる。Ｔｈ１型応答に対する腫瘍の微小環境を変化させることが、回避を阻止するのを支援することができるかどうかを評価するために、実験を設計することができる。
【０２０１】
場合によっては、本発明のワクチンを使用して、蔓延してしまったメラノーマを治療することもできる。場合によっては、本発明は、しばしば薬物療法に対して抵抗性になる、残存する細胞を排除するための療法も提供する。
【実施例２】
【０２０２】
ワクチン接種において利用するために、腫瘍抗原から、ＭＨＣクラスＩＩ−無差別性ＣＤ４＋ペプチドを同定するための新規の戦略
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は歴史的には抗腫瘍免疫の主要なエフェクターであるとみなされていたが、種々の腫瘍のタイプにおいて、ＣＴＬ応答を、ＣＤ８＋ワクチンを用いてブーストするだけだと、予測不能な臨床結果を生じており、恐らくこれは、ＣＴＬが、適切なＣＤ４＋Ｔリンパ球の助けがない場合には、最適以下にしか機能しないからであろう。ＣＤ４＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞は、ＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−αを分泌して、腫瘍の老化およびアポトーシスを誘導する。しかし、癌ワクチンを構築する際にＣＤ４＋エピトープを良好に組み込み、耐久性のある、抗原特異的ＣＤ４＋免疫を発生させることは、課題として残っている。ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を候補「発癌ドライバー」腫瘍抗原として使用して、ワクチンコンストラクト中に包含させる目的で、クラスＩＩ無差別性を示し、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４＋免疫を発生させる免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するために実験を実施した。
【０２０３】
これらの実験で利用した材料および方法を、ここに記載する。
【０２０４】
材料および方法
抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１細胞性免疫を発生させるために、ＨＥＲ３のＥＣＤを腫瘍抗原として使用して、免疫原性、クラスＩＩ−無差別性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するように、実験を設計した。
【０２０５】
プロトコールの概説
５つのアミノ酸だけオーバーラップする、１５マーの長さのペプチドのライブラリーを、ＨＥＲ３  ＥＣＤから作り出した。これらのペプチドを、ドナーから得られた単核球由来ＤＣ上にパルス添加し、１型に偏向した（ＤＣ１；ＩＬ−１２を分泌する）表現型に成熟させた。ＤＣ１を収集し、我々のＤＣＩＳワクチン研究に属し、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答を有することが分かっている対象から得、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞と共に同時培養した。１０個のペプチドの大規模なプールを使用し、同定のプロセスを次第に絞り込んで、ＣＤ４＋Ｔ細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌により測定して、単一の反応性エピトープを得た。５-６人の対象をスクリーニングして、ほとんどのドナーにわたって反応するようである４つのペプチド、すなわち、ＨＥＲ３５６〜７０（配列番号４）、ＨＥＲ３４０１〜４１５（配列番号５）、ＨＥＲ３４１６〜４３０（配列番号６）、およびＨＥＲ３５１〜４６５（配列番号７）を同定した。ＨＥＲ３細胞外ドメインのＣＤ４＋Ｔ細胞認識に対する反応性の証拠を示さない対象を同定し、それらの対象のＤＣ１に、４つのＨＥＲ３ペプチドをパルス添加し、パルス添加したＤＣ１を、ＣＤ４Ｔ細胞と共に１週間培養し、次いで、ＨＥＲ２ペプチドに対する反応性および細胞外ＨＥＲ３タンパク質に対する反応について試験した。いずれの場合も、少なくとも１つのペプチドが、単核球上にパルス添加したペプチドおよびＨＥＲ３の全タンパク質の両方の認識をもたらし、このことは、一次感作がｅｘ  ｖｉｖｏで生じたことを示唆する。また、健常ドナーは、これらのペプチドに反応することができ、三種陰性乳癌患者においては、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答が喪失していることも示された。また、Ｇａｌａ，Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；２０：１４１０〜１４１６頁、およびＤａｔｔａ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ＣＤ４＋  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  Ｔｙｐｅ  １  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ」、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（近刊）も参照されたい。
【０２０６】
図１９にさらに示すプロトコールの主要点：
−  ５つのアミノ酸だけオーバーラップする、１５アミノ酸長のペプチド断片１２３個を含むライブラリーを、ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から生成した。
−  ドナーから得られた自家単核球由来樹状細胞（ＤＣ）を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳにより、１型に偏向した（ＤＣ１→ＩＬ−１２を分泌する）表現型に迅速に成熟させ、関係するペプチド（指定に従って、例えば、ＨＥＲ３  ＥＣＤまたはＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチド）をパルス添加した。ＤＣ１は、ＩＬ−１２の産生（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）により、Ｔｈ１応答を偏向する。
−  収集したＤＣ１を、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、８〜１０日間同時培養してアロ感作した。
−  目的の特異的ＣＤ４＋ペプチド（例えば、ＨＥＲ３ライブラリーペプチドのクラスター）、または無関係のクラスＩＩペプチドの対照をパルス添加した未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に対して、感作ＣＤ４＋Ｔ細胞（それらの大部分が抗原特異的となると予想される）を再賦活させた。
−  次いで、これらの同時培養物から上清を収集した。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにより測定したＴｈ１応答を、ＩＦＮ−γの生成が無関係な対照による生成の少なくとも２倍である場合に、抗原特異的であるとみなした。
−  ＣＤ４＋Ｔｈ１応答のＭＨＣクラスＩＩ無差別性を評価するために、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ検査室により、ドナーに対するＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱタイピングが実施された。
【０２０７】
オーバーラップを有する１５アミノ酸長のペプチド断片１２３個を含むライブラリーを、ＨＥＲ３−ＥＣＤから生成した。ドナーから得られた自家単核球由来ＤＣに、ＤＣ１に成熟させ、ＨＥＲ３−ＥＣＤをパルス添加した。収集したＤＣ１を、精製ＣＤ４Ｔ細胞と共に同時培養した。１０日後、感作したＣＤ４Ｔ細胞を、ＨＥＲ３ライブラリーペプチドのクラスターまたは無関係のＣＤ４対照ペプチド１をパルス添加した未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に対して再賦活させた。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにより測定したＴｈ１応答を、ＩＦＮ−γの生成が無関係な対照による生成の少なくとも２倍である場合に、抗原特異的であるとみなした。
【０２０８】
１）免疫原性ＣＤ４＋ペプチドを同定するために、抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を、ＨＥＲ２をパルス添加したＤＣ１ワクチンの後に示したことが分かっている乳癌患者を得；２）これらのペプチドの免疫原性を、同じ患者において「逆」感作のプロセスにより確認し；３）抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ非反応性を、ワクチン接種の後に示したことが分かっている患者を得、ＣＤ４＋ペプチドを同定するために使用して、細胞がネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤに対して感作される、したがって、自己抗原（すなわち、ＨＥＲ３）に対する寛容が克服／無効にされるかを観察するという３段階のプロセスで、実験を実施した。
【０２０９】
実験の結果を、ここに記載する。
【０２１０】
ＨＥＲ３  ＥＣＤ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞が認識する免疫原性エピトープを同定するための、ＨＥＲ３  ＥＣＤペプチドライブラリーの連続的なスクリーニング
最初に、単一の免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋エピトープを同定するために、抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を有することが分かっている５人の乳癌患者において、Ｔｈ１感作を実施した。これを達成するため、１０個のペプチドのクラスター（１〜１０、１１〜２０、・・・等）から始め、３個のペプチドのクラスター（１〜３、３〜６、７〜１０、・・・等）、最終的には、単一の免疫原性ＨＥＲ３ペプチドに絞って、それらに対して連続的に、ＨＥＲ３  ＥＣＤ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１を再賦活させた。代表的なスクリーンを、図２、図１３および図１４に示す。４つの免疫原性ペプチド、すなわち、ＨＥＲ３（５６〜７０）（配列番号４）、ＨＥＲ３（４０１〜４１５）（配列番号５）、ＨＥＲ３（４１６〜４３０）（配列番号６）およびＨＥＲ３（４５１〜４６５）（配列番号７）を再現性よく同定され、これらは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰおよびＤＱのサブタイプにわたって無差別性であった。４人の非ＨＥＲ３反応性ドナーから得られたＴｈ１細胞を、４つの同定したＨＥＲ３ペプチドをパルス添加したＤＣ１を使用して感作し、続いて、これらの細胞を、ＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣを認識するにようにチャレンジした場合、全てのドナーが、個々の免疫原性ＨＥＲ３ペプチドに対して良好な感作を示すのみならず、また、ネイティブのＨＥＲ３−ＥＣＤも認識した。
【０２１１】
本明細書に提示する結果は、オーバーラップを有する腫瘍抗原由来ペプチドのライブラリーをパルス添加したＤＣ１は、ＣＤ４Ｔ細胞ワクチンの開発ために、無差別性クラスＩＩペプチドを同定することができることを示している。この研究では、免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４ペプチドは、自己腫瘍抗原に対する免疫寛容を有効に克服している。構築する際にこれらのＨＥＲ３  ＣＤ４ペプチドを利用したワクチンを、ＨＥＲ３を過剰発現する癌を有する患者に適用することができる。さらに、これらの結果から、ＤＣ１−Ｔｈ１プラットフォームを使用して癌免疫療法を行うために、任意の腫瘍抗原から得られるクラスＩＩ無差別性の免疫原性ＣＤ４エピトープを迅速にかつ再現性よく同定するための新規の戦略も示される。下記の表１は、抗ＨＥＲ３反応性を有することが分かっている患者中の免疫原性ＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤペプチドの最初の同定を示す。表２は、連続的なスクリーニングにより同定した４つの免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋エピトープのアミノ酸配列を示す。
【０２１２】
【表１】
2018521953.tif 000003
【０２１３】
【表２】
2018521953.tif 000004
【０２１４】
「逆」感作による、同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性、すなわち、個々のエピトープ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１の、ネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤを認識する能力の確認
図１５は、ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を有することが分かっているドナーにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、それぞれのドナー特異的、免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１によって感作され、それぞれのＨＥＲ３エピトープおよびネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣに対して再賦活されたことを示す。
【０２１５】
図２０および図２１は、「逆」感作の追加の結果を示す。
【０２１６】
免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１を用いて感作したＣＤ４＋Ｔｈ１は、抗ＨＥＲ３免疫自己寛容を無効にするように見える
図１６に認められるように、４人のＨＥＲ３  ＥＣＤ非反応性ドナーから得られたＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を、４つの同定したＨＥＲ３ペプチドをパルス添加したＤＣ１を使用して感作し、続いて、これらの細胞を、ＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣを認識するようにチャレンジした場合、全てのドナーが、個々のＨＥＲ３エピトープに対して良好な感作を示すのみならず、また、ネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤも認識した。
【０２１７】
ＣＤ４＋ＨＥＲ３エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ無差別性を示す
図１７に見られるように、ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、候補「発癌ドライバー」腫瘍抗原として使用して実験を実施して、クラスＩＩ無差別性を示し、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４＋免疫を発生させる免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定した；これらのペプチドは、ワクチンコンストラクト中で使用することができる。
【０２１８】
腫瘍抗原に由来するペプチド
本明細書に提示する結果は、
−  ＣＤ４＋Ｔ細胞ワクチンを開発するために、腫瘍抗原から得たオーバーラップを有するペプチドのライブラリーをパルス添加したＤＣ１により、無差別性ＭＨＣクラスＩＩペプチドを同定することができること、
−  免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドは、自己腫瘍抗原に対する免疫寛容を有効に克服すること、
−  これらの結果から、ＤＣ１−ＣＤ４＋Ｔｈ１プラットフォームを使用して癌免疫療法を行うために、任意の腫瘍抗原から得られるクラスＩＩ無差別性の免疫原性ＣＤ４＋エピトープを迅速にかつ再現性よく同定するための新規の戦略が示されていること、
−  これらのＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを利用して構築したワクチンは、ＨＥＲ３を過剰発現する癌を有する患者において研究するのに値すること
を示している。
【実施例３】
【０２１９】
ＨＥＲ３発現は、胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行のマーカーである
ＨＥＲファミリーのメンバーを含むＲＴＫの過剰発現は、浸潤性食道胃癌において予後および治療上の意義を有する。前悪性胃食道病変におけるＲＴＫ発現は以前は広範に調査されていなかった。
【０２２０】
バレット食道、または遠位食道の化生円柱上皮の存在は、食道腺癌の発生の素因となる。異形成から浸潤性悪性腫瘍への組織学的転移は十分に特徴付けられているが、化生細胞における発癌は、不完全に理解されている遺伝子変化を伴うものである（Ｃａｍｅｒｏｎ、Ａ．Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９（５）：１５４１−６（１９９５））。いくつかの最近の報告は、異形成を伴うバレット食道病変のサブセットにおけるヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）発現を同定している。（Ａｌｍｈａｎｎａ、Ｋ．ら、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｊｕｌｙ  １６  ２０１５）（Ａｌｍｈａｎｎａ、ｅｔ  ａｌ．）；Ｆａｓｓａｎ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６１（５）：７６９−７６（２０１２）（Ｆａｓｓａｎ、ｅｔ  ａｌ．）；およびＲｏｓｓｉ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．１３（９Ｂ）：３８２６−３３（２００９）（Ｒｏｓｓｉら）。さらに、ＨＥＲ２発現の割合は異形成の程度と相関し、腫瘍形成における関連する経路を示唆している。
【０２２１】
間葉系上皮移行因子であるＨＥＲファミリー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３）およびｃＭＥＴのメンバーを含むＲＴＫ分子の過剰発現は、乳癌、肺癌および胃腸癌を含むより一般的な悪性疾患の多くにおいて実証されている（Ｙｏｋａｔａ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ  １：７６５−７６７（１９８６）および食道胃がんでの乳癌のサブセットにおけるＨＥＲ２過剰発現の同定、ＨＥＲ２の過剰発現とより積極的な生物学および効果的な標的  モノクローナル抗体によるＨＥＲ２の阻害は、固形腫瘍の治療のための標的療法の進化における中心的な出来事であった（Ｊｏｅｎｓｕｕ、Ｈ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４（８）：８０９−２０（２００６））。この経験は、他の悪性腫瘍の治療においてＲＴＫ分子を標的とするさらなる努力の基礎を提供している。
【０２２２】
ＨＥＲ２の過剰発現は、少数の胃癌で実証されており、結果にわずかな影響を与えて転移性の環境下でトラスツズマブの標的となっている（Ｂａｎｇ、Ｙ．Ｊら、Ｌａｎｃｅｔ  ３７６（９７４２）６８７−９７（２０１０）（Ｂａｎｇら））。ＨＥＲ２の過剰発現は、より遠位の胃の腺癌と比較して、近位の胃および胃食道接合部においてより頻繁に発現される（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｉ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｒｅｓ．９（３）：ＥＣ０６−１０（２０１５））、トラスツズマブを転位の標的とし、転帰に適度な影響を与えた。（ＢａｎｇらおよびＦｉｃｈｔｅｒ、ＣＤら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １３５（７）：１５１７−３０（２０１４）（Ｆｉｃｈｔｅｒら））胃癌におけるＨＥＲ１およびＨＥＲ３発現は関連しているほとんどの研究で予後不良である。（Ｋａｎｄｅｌ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６７（４）：３０７−１２（２０１４）およびＨａｙａｓｈｉ、Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２３）：７８４３−９（２００８））。ＣＭＥＴの過剰発現は食道腺癌の不良予後と関連し、ｃＭＥＴ依存性シグナル伝達の阻害はＨＥＲ１およびＨＥＲ３の活性を調節する。これらのデータは、食道胃がんおよび前駆病変におけるＲＴＫ発現を特徴付けるさらなる努力の根拠を提供する（Ｌｉｕ、Ｘ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７（２２）：７１２７−３８（２０１１））。以下に記載される研究は、治療および一次予防のための潜在的な標的を同定する努力において、胃食道接合部の形成異常病変におけるＲＴＫ発現を特徴づけることを目的とする。
【０２２３】
方法
ペンシルバニア大学インスティテュートレビュー委員会の承認後、異形成（低悪性度形成異常（ＬＧＤ）、ｎ＝３２、高悪性度形成（ＨＧＤ）、ｎ＝５９）のＢａｒｒｅｔｔ食道を有する７３人の患者の臨床記録および組織学的標本を遡及的にレビューした。２００３−２０１２年の保存された内視鏡生検および粘膜切除標本からのホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを、プラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で５μｍで切片化し、続いて脱パラフィンして再水和させた。すべての生検材料を、ＨＥＲ１（クローンＨ１１；  １：５０；  ＤＡＫＯ）、ＨＥＲ２（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）およびＨＥＲ３（クローンＲＴＪ．２；  １：３０；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）  Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ装置）、顕微鏡下で（Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ）単一の病理学者によって評価した。膜の３＋ＨＥＲ染色は、図２２に見られるように腫瘍細胞の１０％以上で膜２＋ＨＥＲ２染色と同様に陽性とみなした。十分な組織が利用可能であった４２例においてｃＭＥＴ免疫組織化学を実施した。腫瘍細胞の５０％以上の中等度または強膜性染色は陽性とみなされた。ＲＴＫ過剰発現は臨床データと相関して、浸潤性癌、対形成異常腺癌生検標本またはその後の生検標本における腺癌の診断のいずれかとの関連性を評価した。
【０２２４】
統計分析
すべての分析に２つのテールテストを使用した。記述的統計量は、連続変数のカテゴリ変数および中央値（四分位間範囲（ＩＱＲ））の頻度として示されます。ピアソンのχ２またはフィッシャーの正確確率検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を用いて、それぞれカテゴリ変数と連続変数を分析した。Ｐ値≦０．０５は統計的に有意であると考えられた。全ての試験は両面であった。分析は、ＳＰＳＳ  ｖ２２．０（ＩＢＭ、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）を用いて行った。
【０２２５】
結果
低悪性度異形成（ｎ＝３２）または高悪性度形成（ｎ＝５９）を有するバレット食道患者７３人を同定し、免疫組織化学によってＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびｃＭＥＴ発現について分析した。コホートの年齢の中央値は６５歳（ＩＱＲ  ６０−７３歳）であった。８１．９％が男性、８７．５％が白人であった。コホートでのアルコール使用率は１４．３％であり、アクティブタバコ使用率は６．３％であったが、以前の喫煙者では５５．６％であった。２６．４％は悪性腫瘍の家族歴があった。以下の表３に示すように、測定された臨床的および人口統計学的変数におけるＬＧＤおよびＨＧＤコホート間の有意差はなかった。
【０２２６】
【表３】
2018521953.tif 000005
【０２２７】
高悪性度形成異常（ＨＧＤ）は、ＨＥＲ１の過剰発現（２２．４％対３．１％、ｐ＝０．０１６）、ＨＥＲ２（５．３％対０．０％、ｐ＝０．１８７）およびＨＥＲ３（４５．６％対９．４％、ｐ＜０．００１）低悪性度異形成（ＬＧＤ）と比較した。
【０２２８】
侵襲性食道腺癌の病巣は、６例で異形成病変と関連しており、そのすべてがＨＧＤ（ＨＧＤ：１０．２％対ＬＧＤ：０．０％、ｐ＜０．００１）と関連して発生した。追加の９人の患者が、その後の生検検体（ＨＧＤ：１７．０％対ＬＧＤ：０．０％、ｐ＝０．０１７）で侵襲性食道腺癌と診断された。ＨＥＲ１の増加（ＨＥＲ１の増加（２６．７％対２０．５％、ｐ＝０．６１６）およびＨＥＲ２（１４．３％対２．３％、ｐ＝０．０７７）、ＨＧＤ病変における過剰発現は、ＨＥＲ３の有意な関連があった  図２３Ａおよび２３Ｂに見られるように、浸潤癌の病巣がない患者（７１．４％対３８．６％、ｐ＝０．０３２）。
【０２２９】
ｃＭＥＴの過剰発現は、ＬＧＤ検体（５８．３％対３６．７％、ｐ＝０．２００）と比較してＨＧＤで４２例（４２．９％）の検体で観察され、ＨＥＲ３で最も頻繁に発現した  ＨＥＲ３陽性検体対ＨＥＲ３陰性検体の３８．２％であった（ｐ＝０．２１２）。ＨＥＲ１陽性（ｐ＝０．７２９）またはＨＥＲ２陽性（ｐ＝ＮＡ）検体でも同様の傾向は認められなかった。４２人中１人（５．６％）の患者が侵襲性がんが確認された。この患者ではｃＭＥＴが過剰発現していた（ｐ＝０．２４３）。
【０２３０】
討論
胃食道接合部の異形成病変におけるＲＴＫ発現のこの分析は、（１）ＨＥＲファミリータンパク質がバレット食道で異形成をアップレギュレートすること、（２）ＨＥＲファミリーおよびｃＭＥＴ過剰発現の頻度は、異形成の程度と正の相関がある；（３）ＨＥＲタンパク質のアップレギュレーションは、特に異形成病変において、関連する浸潤性癌の発生率の増加と関連している。
【０２３１】
したがって、ＨＥＲ３は、バレット食道およびＨＧＤ患者の潜在的な侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。さらに、ＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とする治療薬は、患者のサブセットにおける胃食道癌の二次予防をもたらすことができる。
【０２３２】
バレット食道におけるＨＥＲ発現の以前の評価は、少数の症例で過剰発現するＨＥＲ２の評価に限られていた。Ａｌｍｈａｎｎａら、Ｆａｓｓａｎら、およびＲｏｓｓｉら参照。この研究におけるＨＥＲ２の過剰発現は、生検標本の３．３％に存在し、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３の過剰発現率より低かった。このパターンは、ＨＥＲ３がＨＥＲ２よりもより一般的に過剰発現する浸潤性胃食道接合部癌におけるＨＥＲファミリータンパク質発現と一致する。Ｆｉｃｈｔｅｒ、ｅｔ  ａｌ。ＬＧＤからＨＧＤへの進行に伴うＨＥＲ３タンパク質の過剰発現の増加および特にＨＥＲ３の頻繁な過剰発現は、予期せぬ新規な知見である。ＨＥＲ受容体のホモ二量体化およびヘテロ二量体化は信号活性化を駆動する。ＨＥＲファミリーの複数のメンバーのクラスター化された過剰発現が、他の腫瘍型で観察されている。併せて、活性化されたｃ−ＭＥＴは、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３１１の活性を正に調節する。実際に、これらの受容体間の相互作用は、複数のＲＴＫを標的とする多価治療法の理論的根拠を提供している。（Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６（２）：１０９−１９（２０１２）；Ｗａｄｄｅｌｌ、Ｔ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．１４（６）：４８１−４８９（２０１３））
【０２３３】
現在のデータは、まだ調査されていない胃食道癌の標的二次予防の機会を示唆している。乳房の腺管癌（ＤＣＩＳ）における以前に標的化されたＨＥＲ２発現は有望な結果を標的としていた。米国特許出願公開第２０１５／０３２３５４７号明細書；２０１９年１２月３０日に出願された米国特許出願第１４／９８５，３０３号、Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｏｎｃｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：８  ｅ１０２２３０１（２０１５）ＤＯＩ：１０．  １０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１５．１０２２３０１；Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７（１）：７１（２０１５）。このようなアプローチは、胃腸の悪性腫瘍にとってより遠い目標のままである。それにもかかわらず、内視鏡的切除および切除様式および根治的手術を含むバレット食道の現在の治療選択肢はすべて、重大な制限がある。罹患率を救済し、侵襲性癌のリスクを軽減する代替戦略が必要である。胃食道接合部の異形成病変におけるＲＴＫ発現のこの分析は、（１）ＨＥＲファミリータンパク質がバレット食道で異形成をアップレギュレートすること、（２）ＨＥＲファミリーおよびｃＭＥＴ過剰発現の頻度は、異形成の程度と正の相関がある；（３）ＨＥＲタンパク質のアップレギュレーションは、特に異形成病変において、関連する浸潤性癌の発生率の増加と関連している。
【０２３４】
したがって、ＨＥＲ３は、バレット食道およびＨＧＤ患者の潜在的な侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。さらに、ＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とする治療薬は、患者のサブセットにおける胃食道癌の二次予防をもたらすことができる。
【０２３５】
要約すると、本データは、胃食道接合部の高悪性度異形成病変、特に潜在性浸潤癌および悪性形質転換を伴うものにおけるＨＥＲ３の頻繁な過剰発現と、これらの知見は、ＨＥＲ３発現性異形成病変のより積極的な管理アプローチを正当化する可能性があり、当業者によって容易に理解されるであろう早期疾患設定におけるＨＥＲ３標的治療薬の将来的な適用の根拠を提供する。
【０２３６】
私たちは以前に、ＨＥＲ−２ｐｏｓ胸部腫瘍発生の間、天然の抗ＨＥＲ−２  ＣＤ４  Ｔｈ１の進行性喪失を示した。この応答の喪失は、ネオアジュバント治療に対する病理学的完全応答（「ｐＣＲ」）の欠如に関連し、乳癌の再発リスクの上昇と相関し、ワクチン接種で回復することができた。下記の実施例４は、乳癌発生中の抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答に同様の喪失があるかどうかを調べる。
【実施例４】
【０２３７】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１の喪失は、乳腫瘍形成に起こり、結果と負の関連がある
全体的な実施例４のまとめ
我々は以前に、ＨＥＲ２ｐｏｓ胸部腫瘍発生の間、天然の抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１において進行性の喪失を示した。この応答の喪失は、ネオアジュバント治療に対する病理学的完全応答（「ｐＣＲ」）の欠如に関連し、乳癌の再発リスクの上昇と相関し、ワクチン接種で回復することができた。この実施例は、胸部腫瘍発生中の抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答に同様の喪失があるかどうかを調べる。
【０２３８】
健康なドナー（「ＨＤ」）、良性乳房疾患（「ＢＤ」）、現場管腺癌（「ＤＣＩＳ」）および浸潤性乳癌（「ＩＢＣ」）患者を含む１３１人の被験者からの末梢血を採取した。上記の実施例１および２で同定された４つの異なるＨＥＲ３免疫原性ペプチドに対する免疫応答を、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを介して試験し、免疫応答のすべての評価指標を分析した。
【０２３９】
ＨＤからＩＢＣへの抗ＨＥＲ３応答の有意な低下があった。トリプルネガティブ（「ＴＮ」）ＩＢＣは、３つの免疫パラメータ全てにわたって最も低い応答を示した。ＨＤは、３つの免疫パラメータすべてにわたってＥＲｐｏｓ  ＩＢＣおよびＴＮ  ＩＢＣ患者よりも有意に高い免疫応答を有した。興味深いことに、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣは、ＨＤおよびＢＤと同様の免疫応答を示した。再発乳癌および新アジュバント療法に対するｐＣＲの欠如を有する患者は、その後の再発のない患者またはｐＣＲからネオアジュバント療法を有する患者よりも有意に低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有した。
【０２４０】
したがって、ＣＤ４  Ｔｈ１抗ＨＥＲ３は、胸部腫瘍発生の間に失われることが判明し、特に、限定された治療選択肢を有する群であり、ＨＥＲ３過剰発現の著しい予後を有する群であるＴＮ  ＩＢＣにおいて顕著であることが見出された。これらの知見は、再発を防ぐためにこの反応を回復させようとする試みに含意している。
【０２４１】
バックグラウンド
約８人に１人の女性が生涯に乳がんを発症します。これらのうち、ＨＥＲ２を過剰発現する癌は、遠隔転移の割合が高く、予後が全体的に悪い。ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブの導入は、ＨＥＲ２陽性の癌患者における無増悪生存期間および全生存期間を劇的に向上させ、乳癌進行の調節におけるＨＥＲ２の重要な役割を指摘する。Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１４年）：ＪＣＯ−２０１３［２０１４年５月５日印刷前にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１３．５４．０９４８］。
【０２４２】
免疫系は、ＨＥＲ２発現腫瘍の調節において重要な役割を果たす。健康な被験者からＨＥＲ２ｐｏｓ  ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＨＥＲ２ｎｅｇ  ＩＢＣに移行するネイティブの抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が段階的に低下することが以前に示されている。さらに、より低い抗ＨＥＲ２免疫応答はその後の乳癌再発と相関し、一方、より高い抗ＨＥＲ２免疫応答は、術前化学療法に対する病理学的完全応答と相関し、ＨＥＲ２ｐｏｓ腫瘍形成における免疫系の役割を示唆した。Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｏｎｃｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４（１０）：ｅ１０２７４７４を参照されたい。ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１５。１０２２３０１（２０１５）および米国特許出願公開第２０１５／０３２３５４７Ａ１号（総称して以下「Ｄａｔｔａら」）に記載されている。我々のグループは、ＤＣＩＳおよびＩＢＣ患者の両方で抗ＨＥＲ２  ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を回復させるＨＥＲ２パルス樹状細胞ワクチンを開発した。Ｓｈａｒｍａ、Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  １１８（１７）：４３５４−４３６２（２０１２）。Ｋｏｓｋｉ、Ｇ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（１）：５４−６５（２１０２）；および米国公開出願第２０１５／０３２３５４７Ａ１号に記載されている。
【０２４３】
ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３も含むＲＴＫ群であるＥＧＦＲファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２が自己二量体化することはよく知られているが、シグナル伝達におけるＨＥＲ３の役割はあまり明確ではなく、ＨＥＲ２自体とＨＥＲ２の両方を二量体化するように作用する可能性がある。ＨＥＲ２によるＨＥＲ３二量体化は、トラスツズマブで治療された乳癌患者における逃避機構として提案されている。Ｃｚｏｐｅｋ、Ｊ．ら、Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｏｎｃｏｌ．１７（５）：４４６−９（２０１３）（「Ｃｚｏｐｅｋら」）およびＢａｅ、Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９（３）：７４１−５０（２０１３）（「Ｂａｅ、ｅｔ  ａｌ．」）。Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂは、市場への最近の追加であり、ネオアジュバント治療としてのＦＤＡ承認の加速を受ける最初の腫瘍治療薬であり、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化を阻害し、乳癌患者のためにトラスツズマブと組み合わせて使用すると全体的な生存利益を有することが示されている。Ｊｈａｖｅｒｉ、Ｋ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．１２（４）：５９１−８（２０１４）およびＨａｒｂｅｃｋ、Ｎ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｅ  ８（１）：４９−５５（２０１３）に記載されている。
【０２４４】
ＥＲ陽性、ＨＥＲ２陽性および三重陰性（「ＴＮ」）サブタイプに見られる過剰発現があるが、ＨＥＲ３発現は、乳癌の亜型間であまり明確に描写されていない。Ｍｏｅｄｅｒ、Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  １１５（１１）：２４００−９（２００９）。  ＨＥＲ３過剰発現はＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣにおいてより一般的であり得るが、その予後値は、ＴＮ  ＩＢＣにおいてより重要であることは興味深い。ＥＲｐｏｓ／ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣにおけるＨＥＲ３発現は無病生存期間（「ＤＦＳ」）または全生存期間（「ＯＳ」）に影響しなかったが、ＴＮ  ＩＢＣにおけるＨＥＲ３発現は、５年間のＤＦＳおよび１０年間のＯＳの悪化と相関していた。Ｂａｅら、および、Ｃｚｏｐｅｋら。注目すべきことに、ＨＥＲ３過剰発現を有するＴＮ  ＩＢＣ患者のかなりのサブセット、定義により古典的治療オプションのいずれも持たないグループは、認識可能な新たな標的から利益を得ることができる。抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答が健康なドナーに存在するかどうか、およびこの応答が胸部腫瘍発生の間に変化するかどうかは不明である。本研究は、これらの質問に対する答えを求めている。
【０２４５】
方法
サブジェクト登録
全部で１３１名の被験者が試験基準を満たし、インフォームドコンセントでペンシルベニア大学に連続して登録された。この研究は、ペンシルバニア大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄとＡｂｒａｍｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの承認を受け、登録を受ける前に行われた。１３１名の被験者のうち、９名は末梢血単球を不足してアッセイを実施し、１２２名の被験者に免疫応答データをレビューのために残した。（ＨＤ、ｎ＝３０）、良性乳房疾患（ＢＤ、ｎ＝１１）、ＤＣＩＳ（ｎ＝１３）、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ（ｎ＝２１）、およびＨＥＲ２ポリペプチドに対する４つの異なるＨＥＲ３免疫原性ペプチドに対するＣＤ４  Ｔ細胞応答を比較した。ＥＲｐｏｓ浸潤性乳癌（ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ、ｎ＝２０）および三重陰性ＩＢＣ（ＴＮ  ＩＢＣ、ｎ＝２７）が含まれる。
【０２４６】
末梢血単球コレクション
末梢血は静脈穿刺により採取した。血液をハンクス緩衝液またはＰＢＳで１：１の比で希釈し、リンパ球分離培地をコニカルチューブ中の希釈血液の下に重ねた。その後、１２００ｒｐｍで３０分間の密度遠心分離によって血液を分離した。単核細胞層を収集し、ハンクス緩衝液またはＰＢＳで２回洗浄した。細胞を計数し、１ミリリットル当たり１０００万個の細胞で再懸濁し、マイナス２００℃に移す前にマイナス８０℃で２４−４８時間凍結した。ここで、細胞は実験アッセイまで保存されたままであった。
【０２４７】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答の測定
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、製造業者のプロトコールに従って測定した。要するに、９６ウェルＰＶＤＦ膜プレートを７０％エタノールで活性化し、ＰＢＳで洗浄し、抗ＩＦＮ−γ（抗ＩＦＮ−γ）抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。２４時間後、プレートを再びＰＢＳで洗浄し、１０％ヒト血清を含むＩｓｃｏｖｅの培地で１時間ブロックした。末梢血単球を３７℃で解凍し、ＰＢＳまたはハンクス緩衝液で洗浄し、１ミリリットルあたり１００万細胞で再懸濁し、４つの免疫原性ＨＥＲ３ペプチド（ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡｇｒｉｙｉｓａｎＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（ポリクローナル刺激、陽性対照）破傷風トキソイド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、または何もない（非刺激対照）アッセイを三連で行った。４８時間後、プレートをＰＢＳで洗浄し、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体を添加し、プレートを３８℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで再度洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰをプレートを３８℃で１時間インキュベートし、最後にプレートをＰＢＳで洗浄し、次いでＴＭＢ基質溶液を添加した。色現像は、水道水で十分に洗浄することによって５分後に停止した。プレートを４℃で一晩乾燥させた。
【０２４８】
免疫応答解析
スポットはイムノスポットソフトウェアによって計数された。（１）累積応答、または百万細胞あたりのスポットでの４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチドすべてに対する合計応答、（２）レパートリー、または２０以上のスポットを有する被験者あたりのペプチドの数、（３）応答性、または少なくとも１つのペプチド（２０以上の閾値の閾値として定義される）に応答する対象のパーセント、の３つのパラメータまたはメトリクスを定量化した。２００，０００細胞あたりのスポットにおける破傷風応答および２００，０００細胞あたりのスポットにおける抗ＣＤ３／ＣＤ２８応答も、対照として定量した。すべての免疫応答測定基準をグラフパッドプリズムソフトウェアで分析した。
【０２４９】
結果
研究対象の特性
合計１３１名の被験者が試験基準を満たし、ペンシルバニア大学の病院でインフォームド・コンセントで連続して登録された。９人の被験者は、分析に不十分な細胞しか持たず、１２２人の被験者を残した。このうち、平均年齢は５０歳で、２５歳から８３歳の間であった。コーカサス人は７２．１％、アフリカ系アメリカ人は１８．０％、別のレースは９．８％であった。ＨＤ（ｎ＝３０）、ＢＤ（ｎ＝１１）、ＤＣＩＳ（ｎ＝１３）、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ（ｎ＝２１）、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ（ｎ＝２０）またはＴＮ  ＩＢＣ（ｎ＝２７）。６８名のＩＢＣ被験者のうち、ステージＩは３５名（５１．５％）、ステージＩＩは２２名（３２．４％）、ステージＩＶは９名（１３．２％）、ステージＩＶは２名（２．９％）であった。化学療法および／またはハーセプチンおよび／またはタモキシフェン治療を受けた患者は５２人（７６．５％）、治療未経験者は１６人（２３．５％）であった。３人のＤＣＩＳ患者および３人のＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ患者は、ＨＥＲ２パルス樹状細胞ワクチン接種を受けた。他の特性を以下の表４に報告する。
【０２５０】
【表４】
2018521953.tif 000006
【０２５１】
健康なドナーから浸潤性乳癌のサブセットまでのＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ３免疫応答の低下がある
ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ、およびＴＮ  ＩＢＣを比較すると、３つの免疫パラメータのすべてが低下し、ＴＮ  ＩＢＣの最低点に達した：累積応答（９０対８０対６６対７９対４８対４０、ｐ＝０．０１、それぞれ、図２４Ａに示すように）レパートリー（図２４Ｂに示すように、１．０対０．６対０．８対０．８対０．５対０．３、ｐ＝０．００３）および応答性（それぞれ、図２４Ｃに示すように、７６．７％対６３．６％対５３．８％対６６．７％対４５．０％対３３．３％、ｐ＝０．００２）。特に、これらの差異は、累積応答（９０対４０、ｐ＝０．００２）、レパートリー（１．０対０．３、ｐ＝０．００４）、応答性（７６．７％対３３．３％、ｐ＝０．００１）の３つの免疫パラメータすべてにわたるＴＮ  ＩＢＣ患者と比較して、ＨＤにおいて統計的に有意に高いだけでなく、２倍以上を示した。ＴＮ  ＩＢＣ患者と比較して、ＢＤは、有意に高い累積応答（それぞれ４０対８０、ｐ＝０．００７）を有し、ＤＣＩ患者は有意に高いレパートリーを示し（それぞれ０．８対０．３、ｐ＝０．０４）、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣは有意に高いレパートリーを示した（０．３対０．８、ｐ＝０．０１）および応答性（３３．３％対６６．７％、それぞれｐ＝０．０４）。ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣ患者は、累積応答（それぞれ４８対９０、ｐ＝０．０３）、レパートリー（０．５対１．０、ｐ＝０．００８）の３つの免疫パラメータすべてにわたって、ＨＤに比べて２番目に低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有し、応答性（それぞれ４５．０％対７６．７％、それぞれｐ＝０．０３）。注目すべきは、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ抗ＨＥＲ３応答が、ＨＤ、ＢＤまたはＤＣＩＳ被験体から有意に変化しなかったという事実である。
【０２５２】
浸潤性乳癌患者におけるＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ３免疫応答の低下は、ＨＥＲ３に特異的であり、免疫応答の広範な欠損には帰属しない
破傷風応答および抗ＣＤ３／ＣＤ２８応答を用いたポリクローナル刺激を分析して、全体の免疫応答性を比較および制御した。ＨＤＩＳ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣ患者の間で、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して測定した場合、ＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗破傷風応答に差はなかった（３７対３０対１９対３４対２４  ２９に対して、ｐ＝０．６５）。重要なことに、ＨＤとＴＮ  ＩＢＣ患者との間の抗破傷風応答（最も発散する抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答を有する群）は類似していた（３７対２９、ｐ＝０．３７）。同様に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８とのポリクローナル刺激には差がなく、各群の被験者の大多数は、驚異的なスポット発達を有し、それは数えきれなかった。計算可能な患者のうち、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣ、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣ患者（６８８対５４９対８０４対６９９対６２９対６７５、ｐ＝０．６８、それぞれ、図２５に示すように）の間に統計的に有意な差はなかった。
【０２５３】
侵襲性乳癌患者の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答は、腫瘍浸潤の予後および特徴と相関する
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が腫瘍浸潤の特徴と相関するかどうかを判定するために、初期手術（リンパ節陽性（「ＬＮｐｏｓ」）対リンパ節陰性（「ＬＮｎｅｇ」）のリンパ節状態によってＩＢＣ患者の免疫応答を比較した（「ｐＣＲ」）対残存疾患（「ｐＣＲ」）の診断および応答から少なくとも１年間の患者における再発対非再発との間の関係を示す。ＬＮｐｏｓ  ＩＢＣ患者（ｎ＝２８）は、ＬＮｎｅｇ患者（ｎ＝３１）と比較して、３つのパラメーターの全体にわたって免疫応答が全体的に低かったが、統計的に有意なものはなかった：累積応答（それぞれ４０対５６、ｐ＝０．１２）、レパートリー（図２６Ａに示すように、それぞれ、０．４対０．６、ｐ＝０．０８）および応答性（それぞれ３５．７％対５４．８％、ｐ＝０．１９）。注目すべきことに、ＬＮｐｏｓ被験者には、術前化学療法後のリンパ節転移を有する被験者が含まれていた。ＬＮｎｅｇ術後化学療法後の被験者は、治療前に陽性の節を有していたかどうかは不明であったため、分析から除外した。診断から少なくとも１年以上経過した患者のうち、再発乳癌（局所転移または遠隔転移のいずれかがｎ＝７）は、３つの免疫パラメータすべてにおいて、無病のままであった（ｎ＝３６）：図２６Ｂに示すように、累積応答（それぞれ１７対６６、ｐ＝０．０４）、レパートリー（それぞれ０．０対０．６、ｐ＜０．０５）および応答性（それぞれ０％対５５．６％、ｐ＝０．０１）。最後に、図２６Ｃに示すように、術前化学療法（ｎ＝１６）を受けた患者のうち、ｐＣＲ（ｎ＝１１）と比較してｐＣＲ（ｎ＝５）は有意に高い累積応答（それぞれ１４４対３２、ｐ＝０．００４）およびレパートリー（それぞれ、０．８対０．４、ｐ＝０．０５）を有していた。ｐＣＲと＜ｐＣＲとの間には、統計的に有意な差はなかった（それぞれ８０．０％対２７．３％、ｐ＝０．１０）。ＬＮｐｏｓ患者とＬＮｎｅｇ患者との間の破傷風応答に差はなかったが（２２対２９、それぞれｐ＝０．３５）、再発対非再発患者（それぞれ２７対３５、ｐ＝０．６５）およびｐＣＲ対＜ｐＣＲの差がなかった（それぞれ１７対５９、ｐ＝０．１５）。したがって、より攻撃的な腫瘍の特徴を有するＩＢＣ患者におけるＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下は、ＨＥＲ３に特異的である。
【０２５４】
健康なドナーの特徴による抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答
５０歳未満（ｎ＝２５）または５０歳以上（ｎ＝１６）、人種（Ｃａｕｃａｓｉａｎ（ｎ＝２９）、アフリカ系アメリカ人（ｎ＝１２））までＨＤとＢＤで抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１反応を比較した。妊娠状態（０（ｎ＝１７）または１以上の妊娠（ｎ＝２４））および更年期状態（閉経前（ｎ＝３０）または閉経後（ｎ＝１１））。年齢（図２７Ａ）、レース（図２７Ｂ）または過去の妊娠歴（図２７Ｃ）による累積ペプチド応答、レパートリーまたは応答性に差はなかった。しかし、閉経後の女性と比較して、閉経後の女性は、図２７Ｄに示すように、閉経前の女性と比較して有意に高い累積応答を示した（それぞれ、百万細胞に対して１３６スポット対ｐ＝０．００５）（上パネル）およびレパートリー（１．４対０．８ペプチド、それぞれｐ＝０．０３）（第２パネル）。応答性（９０．９％対６６．７％、それぞれｐ＝０．２３）（第３パネル）では統計的に有意な差はなかった。更年期前後の女性（下パネル）間の破傷風反応に統計学的に有意な差はなく、更年期障害による免疫応答の差異はＨＥＲ３に特異的であることを示した。
【０２５５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、直線性精密アッセイによって証明されるように正確である
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、当研究室で以前に検証されている。この研究のためにすべての実験を行ったオペレーターのもとでこのアッセイの精度を確認するために、既知の高抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答者からの連続希釈で直線性精度アッセイを実施した。末梢血単球を１．０−０．１−０．０１−０．００１の濃度で連続的に培地に希釈し、累積抗ＨＥＲ３免疫応答を百万細胞あたりのスポットで測定した。図２８は、累積値が２３０から３５から１２から５になる点の線形減少があったことを示している（ｐ＜０．０００１、ｒ＝０．８８）。
【０２５６】
討論
癌の発生、進行および予後における免疫系の役割についての知識は急速に拡大している。免疫不全状態は、ウイルス起源の腫瘍だけでなく、非ウイルス起源の腫瘍からも、癌発生のリスクを増加させることが十分に確立されている。Ｂｏｓｈｏｆｆ、Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：３７３−８２（２００２）。  Ｓｈｅｉｌ、Ａ．Ｇ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．１０：３８９−９６（１９８６）；  Ｐｅｎｎ、Ｉ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６１：２７４−７８（１９９６）；およびＰｅｎｎ、Ｉ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：１４８５−９１（１９９５）を参照のこと。特定の免疫表現型が乳癌と関連していることも知られている。循環炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は乳癌患者においてより高く、低ＣＤ４ｐｏｓ／ＣＤ８ｐｏｓＴ細胞比はより攻撃的な乳癌表現型に関連するが、腫瘍浸潤リンパ球は一部の乳癌においてより良好な予後と関連する。Ａｌｏｋａｉｌ、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．３１（８）：３８（２０１４）ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３２−０１４−００３８−０；Ｊａｉ、Ｙ．ら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．３１：９８１（２０１４）；およびＭａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｃｌｉｎｐａｔｈ−２０１５−２０２９４４。しかしながら、他の免疫担当宿主における特定の分子オンコドリアに対する免疫認識の喪失に関連する証拠は、比較的新しいものである。最近では、健康なドナーからＨＥＲ２ｐｏｓ  ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣへ移行するネイティブ抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の減少が示されており、乳癌発生におけるこの特定のオンコドライバへの免疫応答の消失を示す最初の研究の１つである。当業者であれば、そのような特定の損失の同定および理解が特定の免疫ターゲティング療法の可能性を多く有することを容易に理解するであろう。
【０２５７】
この研究は、（１）ＨＤからＥＲｐｏｓおよびＴＮ  ＩＢＣに向かう抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下、（２）抗ＨＥＲ３応答が予後と相関していること、具体的にはより低い応答は再発と関連し、（３）更年期後のＨＤは、有意により高い抗ＨＥＲ３免疫応答を有することを示している。これらの知見のすべては、抗ＨＥＴ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の診断的および臨床的用途を有するであろう。
【０２５８】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答は、ＨＤで最も高く、予後がＨＥＲ３過剰発現により他のタイプのＩＢＣよりもより深刻な影響を受けるＴＮ  ＩＢＣにおいて最も低かった。Ｂａｅら、および、Ｃｚｏｐｅｋ、Ｊ．ら。ＨＥＲ３の発現はＩＢＣ患者の現在抱えているコホートでは未知であるが、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣコホートと比較して、ＴＮ  ＩＢＣおよびＥＲｐｏｓ  ＩＢＣグループはＨＥＲ３発現のレベルが高く、ＨＤの応答と同様の応答を示した。実際、我々の以前の研究は、抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答がＨＥＲ２発現と直接相関することを示した；  ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣの有意な減少があったが、ＨＥＲ２ｎｅｇ  ＩＢＣの減少はなかった。ＨＥＲ３は、受容体発現乳癌と比較してＴＮ  ＩＢＣの予後に大きな影響を及ぼすだけでなく、ＴＮ  ＩＢＣにおいてさえ、ＨＥＲ２（１＋）腫瘍と比較してＨＥＲ２（０）の予後に大きな影響を及ぼす可能性がある。  Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．２９０：１２２１−２９（２０１４）これは、ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣとＨＤとの間の免疫応答における類似性を部分的に説明することができる。ＨＥＲ２の過剰発現のために腫瘍がすでに浸潤している場合、腫瘍の進展が免疫監視を回避することはできない。しかしながら、免疫系が既にＨＥＲ２を認識して標的化している場合、腫瘍はＨＥＲ３過剰発現によって適応し得、ここで免疫回避は腫瘍細胞の生存にとって進化的に有利になる。
【０２５９】
興味深いことに、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣは、ＴＮ  ＩＢＣと同様の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を示し、ＨＤまたはＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣよりも有意に低かった。ＨＥＲ３発現は、ＴＮＦ−ＩＢＣと比較してＥＲｐｏｓ  ＩＢＣにおいて予後が有意ではないが、ＨＥＲ３  ｍＲＮＡ発現がＥＲ発現と正の相関があることを示す証拠がある。  Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｓ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２１：４７２−８１（２０１４）これは、ＩＢＣのこのサブグループで見られるより低い免疫応答を説明することができる。
【０２６０】
再発性疾患を有する乳癌患者は、無病のままである患者と比較して、より低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有し、免疫監視が長期治療の成功のための重要な機構であり得ることを示している。再発性の患者は、ＨＥＲ３を発現する腫瘍が高い可能性がより高く、再発、転移、および全生存期間のリスクが高いことと相関する可能性もある。  Ｌｉ、Ｑ．ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３０：２５６３−７０（２０１３）；  Ｓｍｉｒｎｏｖａ、Ｔ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３１：７０６−１５（２０１２）；およびＯｃａｎａ、Ａ。ら、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．  １０５巻（４号）：２６６−７３頁（２０１３年）。さらに、免疫編集は、新生細胞が、免疫認識を回避するＨＥＲ３のような分子オンコドリアを発現するように進化するまで、新生細胞が免疫系によって選択的に排除される脱出機構として提案されている。  Ｄｕｎｎ、Ｇ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３（１１）：９９１−８（２００８）。したがって、ＨＥＲ３の発現は、免疫監視の欠如のために可能であり、それにより再発のリスクが高まる。興味深いことに、最近の証拠は、再発腫瘍が原発腫瘍と病理学的に同一ではない可能性があることを示唆している。原発腫瘍と二次腫瘍との間の不一致率は、プロゲステロン受容体にとって特に高く、任意のタイプポイントの不一致は、再発腫瘍の予後を悪化させる。  Ｉｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ、Ｐ．Ｋ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４１６−２９（２０１０）；  Ｂｒｏｏｍ、Ｒ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：１５５７−６２（２００９）；  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｉｅｄｔｋｅ、Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０：１９５３−５８（２００９）。今日までの研究は、原発腫瘍と二次腫瘍との間のＨＥＲ３発現を比較したとは考えられていない。ＨＥＲ３発現が原発腫瘍と再発腫瘍との間に不一致であるかどうか、およびＨＥＲ３発現が起こる再発の回避メカニズムを表しているかどうかは不明である。もしそうなら、低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有する患者を標的とすることは、免疫監視を向上させ、長期再発を防ぐのに役立ち得る。
【０２６１】
また、免疫系の予後における役割を示唆しているが、ｐＣＲと術前化学療法との患者は、＜ｐＣＲを有する患者よりも有意に高い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有していた。ＨＥＲ３シグナル伝達は、標的療法に対する獲得した耐性を媒介することが示されている。Ｓｅｒｇｉｎａ、Ｎ．Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：４３７−４１（２００７）；  およびＦｒｏｇｎｅ、Ｔ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１１４：２６３−７５（２００９）。ここでは、それは獲得された耐性ではなく、初期耐性に関与し、抗ＨＥＲ３免疫応答を、新アジュバント治療から最も利益を受ける患者の潜在的な予後マーカーとする。さらなる研究は、抗ＨＥＲ３免疫応答が予後だけでなく、治療への応答を促進するために介入することができるかどうかを明らかにするべきである。
【０２６２】
現在の研究では、ＨＤのサブセット、特に閉経後の女性は、より高い抗ＨＥＲ３応答を示した。しかし、抗ＨＥＲ２応答の以前の所見とは異なり、妊娠歴に基づいて差はなかった。生物学的には、このより高い抗ＨＥＲ２応答は、乳房の退縮およびそれに続く妊娠による免疫監視への細胞タンパク質の曝露に起因する可能性があるが、このような胸部実質の変化は、閉経期において起こりにくい。Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｆ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３−６２（１９９０）。妊娠中の乳房退縮を模倣し、同様に乳房組織で通常発現される細胞タンパク質を免疫系に暴露するイメージングでは、ホルモン変化を伴う乳腺密度の変化（閉経時）が観察されている。Ｃｌｅｎｄｅｎｅｎ、Ｔ．Ｖ．ら、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３１：１−９（２０１３）。代替的な説明は、更年期後の女性におけるより高い抗ＨＥＲ３免疫応答がリスクの差に帰することを示し得る。様々な乳癌発症者の発現は明らかに年齢に依存する：ＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣは年齢とともに低下する可能性が低く、ＥＲｐｏｓ  ＩＢＣはより起こりやすくなる。Ｃｌａｒｋ、Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２：１１０２−０９（１９８４）；Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ−Ｃａｓｔｏｒｉ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．およびＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３４：１３１８−３０（２００２）を参照のこと。さらに、これらの２つの受容体は、年齢がＨＥＲ２に依存するＥＲ／ＰＲ発現およびその逆のため、互いに独立していない。Ｎｅｖｅｎ、Ｐ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１１０：１５３−５９（２００８）。最も低い抗ＨＥＲ３免疫応答を有し、ＨＥＲ３過剰発現に対して予後が最も高い群であるＴＮ  ＩＢＣ患者は、閉経前の女性においてより頻繁に生じる。Ｂａｅら、及び、Ｈｏｗｌａｎｄｅｒ、Ｎ．ら、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．１０６（５）：１−８（２０１４）。したがって、閉経前ＨＤのサブセットは、ＴＮ  ＩＢＣを発症するリスクが高い群であり、閉経後ＨＤは、このより高いリスク期間を既に超えており、実際にＨＥＲ２およびＨＥＲ３の両方を有するリスクの低い群である乳癌を過剰発現する。また、若年女性ではＴＮ  ＩＢＣがより一般的であるが、高齢者ではその原因は未知の理由により予後が良好であることを示していることも注目に値する。より高い抗ＨＥＲ３免疫応答が実際にリスク回避群ではなく閉経期に起こる生物学的機構によるものである場合には、これは、更年期後の女性におけるＴＮ  ＩＢＣの良好な予後を部分的に説明することができる。
【０２６３】
結論
この実施例は、ＨＤ、ＢＤおよびＤＣＩＳからＥＲｐｏｓおよびＴＮ  ＩＢＣに向かう抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答の低下を実証した。さらに、より低い抗ＨＥＲ３応答は、再発および＜ｐＣＲとネオアジュバント治療との相関があり、この免疫応答が浸潤性乳癌において予後の役割を果たしている可能性があることを示している。最も重要なことは、これらの結果は、ＨＤからＨＥＲ２ｐｏｓ  ＤＣＩＳへのＨＥＲ２免疫応答の低下がＨＥＲ２ｐｏｓ  ＩＢＣに移行しているという先行研究の結果と一致している。このような類似の結果は、以前の知見を確認するだけでなく、分子オンコドライバのパトロールにおける免疫系のより大きな役割を指摘する上で有望である。興味深いことに、閉経後のＨＤは、一般に、ＨＥＲ３を過剰発現する乳癌の発症のリスクがより高く、潜在的にこのリスクを媒介するメカニズムを指している閉経前のＨＤよりも有意に高い免疫応答を有していた。ＨＥＲ３パルスＤＣ１ワクチン接種が、ＨＥＲ３過剰発現乳癌の発症に対して治療効果および／またはリスク修飾効果を有し得るかどうかを決定することは重要である。他のオンコドライバ特異的な癌における免疫系の役割を調べ続けることも同様に重要であろう。
【０２６４】
結論：ＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ−３免疫応答は健康なドナーから浸潤性乳癌、特に限定された治療選択肢およびＨＥＲ−３過剰発現の著しい予後を有する群であるＴＮ  ＩＢＣにおいて失われる。抗ＨＥＲ３免疫応答はまた、処置および予後に対する応答を緩和し、潜在的な免疫療法標的を指し示す。ＨＥＲ３免疫原性ペプチドをＤＣ１ワクチンに添加すると、ワクチン接種の恩恵を受けるＩＢＣ患者の集団が増加する可能性がある。最も重要なのは、これらの結果が以前の所見を反映しており、分子オンコドリアのパトロールにおける免疫系の役割が大きいことを指摘している。
【０２６５】
この実施例の知見、すなわち、ＨＤＳからＩＢＣに向かう乳房腫瘍形成における抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１の有意な喪失があることは、当業者には、ＨＥＲ３の診断および治療に有用であることが理解でき、特に乳癌、特にトリプルネガティブＩＢＣを発現する。これらの知見を利用するために被験者における循環抗癌ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１応答を検出するために血液検査を開発することができると考えられる。好ましくは、そのような血液検査は、本明細書中で使用される４種のＨＥＲ３免疫原性ペプチドまたは患者が罹患している癌のタイプに基づく任意の他のＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドのようなＨＥＲ３免疫原性ペプチドを使用し、非限定的な例として、再発性乳癌およびネオアジュバント療法に対するｐＣＲの欠如を有する患者を、そのような血液検査でモニタリングして、それらの抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を判定し、それに応じて処置することができる。
【０２６６】
患者の血液検査または他の手段によって検出された低い抗ＨＥＲ３応答は、例えばワクチン、および好ましくはＨＥＲ３免疫原性ペプチドでパルス／インキュベートされた患者の単球由来樹状細胞に基づくワクチンなどの回復方法によって、例えば、本明細書の実施例で使用される４ＨＥＲ３免疫原性ペプチドのようなものである。当業者は、患者の免疫応答を回復させる他の方法があることを容易に理解するであろう。特に、ＴＮ  ＩＢＣ患者にとって、本質的に治療選択肢が限られている群、ＨＥＲ３応答を測定する方法、および必要であれば、そのような応答をＤＣ１ワクチンを介して回復させる方法は非常に貴重である。抗ＨＥＲ３免疫応答は、ネオアジュバント治療を必要とする患者の潜在的な予後バイオマーカーとして使用することもできる。ＨＥＲ３パルスＤＣ１ワクチンまたは他の適切なワクチンは、ＨＥＲ３過剰発現乳癌ならびに他のＨＥＲ３発現癌の発症に対して治療効果および／またはリスク修飾効果を有し得る。本明細書の知見は、診断および／または治療のために本明細書で企図されるアレイ血液検査および検査の開発に有用であると評価することができる。
【０２６７】
本明細書に引用するありとあらゆる特許、特許出願の開示および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明を、特定の実施形態を参照して開示してきたが、本発明のその他の実施形態および変更形態を、本発明の真性の精神および範囲から逸脱することなく考案することができることは、当業者に明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および均等な変更形態を全て含むと解釈されるものとする。
【図１】
2018521953.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年1月24日(2018.1.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年３月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／２１０４２の一部継続出願であり、該出願は、２０１５年７月１７日にＰＣＴ／ＵＳ１５／４１０３４の一部継続出願である。該出願は、２０１４年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／０７６，７８９号、および２０１４年７月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０２５，６８１号についての優先権を主張する。それぞれの特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年６月１４日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、３１９−００３＿ＰＣＴ＿ＣＩＰ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは２，６６６バイトである。
【背景技術】
【０００３】
乳癌の２５-３０％において、増殖因子受容体遺伝子ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体−２、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２としてもまた公知である）の増幅および過剰発現は、腫瘍の侵襲性の増強ならびに再発および死亡の高いリスクと関連がある（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７頁；Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１頁）。この癌遺伝子は、１８５キロダルトン（ｋＤａ）の膜貫通受容体チロシンキナーゼ（“ＲＴＫ”）をコードする。ＨＥＲ２は、ヒト上皮増殖因子受容体（“ＥＧＦＲ”）ファミリーの４つのメンバーの１つとしては、いくつかの面で他から際立つ。第１に、ＨＥＲ２は、オーファン受容体である。高親和性リガンドが同定されていない。第２に、ＨＥＲ２は、その他のＥＧＦＲファミリーメンバー（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）にとっての好ましいパートナーとなって、ヘテロ二量体を形成し、これらの二量体は、高いリガンド親和性および優れたシグナル伝達活性を示す。第３に、完全長ＨＥＲ２は、タンパク質切断を受けて、可溶性細胞外ドメイン（“ＥＣＤ”）を放出する。ＥＣＤの脱落は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で完全長ＨＥＲ２の代替の活性化機構となることが示されており、これは、キナーゼ活性を有する膜アンカー断片は残るからである。ＥＧＦＲファミリーシグナル伝達におけるＨＥＲ２の中心的役割は、その発現レベルにかかわらず、いくつかのタイプの癌、例として、乳癌、卵巣癌、結腸癌および胃癌の発癌におけるその関与と相関する（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７頁；Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９８：１６５頁）。ＨＥＲ２はまた、腫瘍細胞に、特定の化学療法に対する抵抗性をもたらす場合もある（Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．ら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：５３７頁）。ＨＥＲ２は、腫瘍形成におけるその非常に重要な役割を考慮すると、癌治療剤にとって重要な標的となる。
【０００４】
ＲＴＫのヒトＥＧＦ受容体（“ＨＥＲ”）ファミリーは、細胞の増殖、遊走、浸潤および生存を含む、非常に多様な生物学的プロセスを調節する。このファミリーは、４つのメンバー：ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）からなる。現時点では、上皮増殖因子（“ＥＧＦ”）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（“ＨＢ−ＥＧＦ”）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン、ベータセルリンおよびヘレグリンを含む、１１個のリガンドが報告されている。これらのリガンドは、それらの同族受容体に直接結合し、この結合によって、複数のシグナル伝達経路の活性化を引き起こす、受容体のホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に至る。ＨＥＲ−ファミリーのメンバーの、突然変異の活性化、受容体過剰発現または異常なリガンドの放出のいずれかによる調節不全によって、多様なヒト腫瘍発生に至る。ＨＥＲ３は、乳癌、卵巣癌および肺癌中で過剰発現し、この遺伝学的特徴は、芳しくない予後と相関している。ＨＥＲ３は、ヘレグリンにより活性化されると、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲと二量体化して、強力な発癌性の受容体ヘテロ二量体を形成する。この複合体内で、ＨＥＲ３は、ＰＩ３キナーゼをその細胞質のドッキング部位に優先的に動員し、それにより、細胞の増殖および生存を調節する。今までは、ＨＥＲ３は、そのキナーゼドメイン中の明らかに異常な配列の特徴に起因して、キナーゼとして不活性であり、シグナル伝達事象を開始するためには、ＨＥＲ−ファミリーの、キナーゼ活性が損なわれていないメンバーとのヘテロ二量体化を必要とすることが推測されていた。このことと一致して、ＨＥＲ２が、乳腺腫瘍の細胞増殖を駆動するのにＨＥＲ３を必要とすることが示された。しかし、最近の知見により、ＨＥＲ３もまた、Ｐｙｋ２をリン酸化することが可能であり、その結果、ヒト神経膠腫細胞中でＭＡＰＫ経路を活性化させることが示された。さらに、ＨＥＲ３に特異的なモノクローナル抗体は、癌性の細胞株の増殖および遊走を阻害することもできる。興味深いことに、最近になって、癌細胞が、ＨＥＲ−ファミリー阻害剤療法をＨＥＲ３シグナル伝達の上方制御により回避し、ＨＥＲ３阻害が、乳癌細胞中でＨＥＲ２駆動性のタモキシフェン抵抗性を抑止することが示された。さらに、ＥＧＦＲ低分子阻害剤であるゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）療法に対する抵抗性は、ＨＥＲ３のシグナル活性化に結び付けられることも示された。
【０００５】
ＨＥＲ３は、受容体タンパク質であり、正常な細胞の成長を調節する重要な役割を果たす。ＨＥＲ３は、それ固有のキナーゼ活性を欠き、ＨＥＲ２の存在に依存して、細胞膜を横切ってシグナルを伝達する。転写当初、ＨＥＲ３のｍＲＮＡ前駆体は、２８個のエクソンおよび２７個のイントロンを含有する。イントロンをスプライスし終わり、完全にスプライスされたＨＥＲ３  ｍＲＮＡは、２８個のエクソンで構成される。
【０００６】
過去１０年の間に、標的療法が癌治療剤の基盤として出現した。ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、すなわち、ＥＧＦＲ（またはＨＥＲ１）およびＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）が、特に興味をそそる標的とみなされるようになってきており、というのは、これらのＲＴＫは、多数の癌において調節解除されるからである。ＥＧＦ受容体ファミリーの別のメンバーであるＥｒｂＢ３またはＨＥＲ３の発癌機能が、ＨＥＲ２に対する抵抗性を媒介することおよびＰＩ３Ｋ経路を対象とする療法におけるその主要な役割に起因して、ようやく最近になって吟味されるようになった。ＨＥＲ３中の突然変異の活性化および／またはその過剰発現が、乳癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌およびメラノーマを含む、いくつかの異なる腫瘍のタイプにおいて同定されており、これらの腫瘍におけるより悪い全体的な予後の前兆となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７頁
【非特許文献２】Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１頁
【非特許文献３】Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．ら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７頁
【非特許文献４】Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９８：１６５頁
【非特許文献５】Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．ら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：５３７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当分野の進歩にもかかわらず、ＨＥＲ３を標的とする、細胞またはタンパク質に基づくワクチン戦略を使用して、有効な免疫応答をヒトにおいて発生させることができるかどうかは依然として不確かである。したがって、当技術分野には、ＨＥＲ３タンパク質の過剰発現が関連する乳癌およびその他の悪性腫瘍を治療または予防するためのさらなる免疫療法のアプローチを手にする必要性がある。本実施形態は、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読解する場合に、より良好に理解されるであろう。本発明を例証するために、現在好ましい実施形態を図面において示す。しかし、本発明は、図面に示す実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】多くの患者にわたってＣＤ４Ｔ細胞を活性化させる能力を示す、ＨＥＲ３に由来する免疫原性ペプチドを示すグラフである（それぞれ、図示順で配列番号１−３）。
【図２】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（それぞれ、図示順で配列番号４−７）。
【図３】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（それぞれ、図示順で配列番号４および７）。
【図４】１０個のペプチド断片からなる群を用いた、ＨＥＲ３の全体的なスクリーンを示すグラフである。また、単一のペプチドを用いた、ＨＥＲ３のスクリーンのグラフも示す（それぞれ、図示順で配列番号１−３）。
【図５】異なるＨＥＲ３ペプチドからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図６】異なるＨＥＲ３ペプチドからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図７】あらかじめペプチドを同定してから、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図８】あらかじめペプチドを同定してから、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図９】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、ペプチドを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図１０】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、全ペプチドライブラリーを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図１１】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、全ペプチドライブラリーを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図１２】ＨＥＲ細胞外ドメインにあらかじめ感作していない患者における、ペプチドを用いて開始し、ペプチドおよびＨＥＲ３細胞外ドメインに対して感作する「逆」スクリーンからのＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図１３】ＵＰＣＣ１５１０７−２４番のドナーにおける、連続的なペプチドのスクリーンを示すグラフである。
【図１４】ＵＰＣＣ１５１０７−３８番のドナーにおける、連続的なペプチドのスクリーンを示すグラフである。
【図１５】ＵＰＣＣ１５１０７−３８番およびＵＰＣＣ１５１０７−２４番のドナーにおける、「逆」感作（「ＲＥＶＥＲＳＥ」  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を示すグラフである。
【図１６】ＵＰＣＣ１５１０７−３０番およびＵＰＣＣ１５１０７−３２番のドナー（両方の患者が、同定したＨＥＲ３ペプチドおよび／またはネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤに対して、抗ＨＥＲ３反応性を示さないことが分かっている）において、免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１が、ＣＤ４＋Ｔｈ１を感作し、抗ＨＥＲ３免疫寛容を克服したことを示すグラフである。
【図１７】ＣＤ４＋ＨＥＲ３エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ無差別性を示すことを示すグラフである。
【図１８】チャンバー中で、活性化されたＨＥＲ−３  ＣＤ４＋細胞を、ＨＥＲ−３を発現する細胞の横に置くと、ＨＥＲ−３  ＣＤ４＋細胞は、ＨＥＲ−３を発現する乳癌細胞のアポトーシスまたは死を引き起こすことを示す図である。
【図１９】抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１細胞性免疫を発生させるために、ＨＥＲ３のＥＣＤを腫瘍抗原として使用して、免疫原性、クラスＩＩ無差別性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するための方法を示す図である。
【図２０】同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性を、「逆」感作により確認したことを示すグラフである。ＨＥＲ３  ＥＣＤのスクリーンを、示した単一のペプチドを用いて実施した。
【図２１】同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性を、「逆」感作により確認した追加の結果を示すグラフである。
【図２２】ＨＥＲ染色の免疫組織化学スコアリングの写真を示す。
【図２３】低度異形性（ＬＧＤ）または高度異形性（ＨＧＤ）のバレット食道におけるＨＥＲファミリーの過剰発現率を示すヒストグラム（図２３Ａ）、および、関連する浸潤性癌を有する高度異形成バレット病変（癌腫を伴うＨＧＤ）または関連する浸潤性癌を有さない高度異形成バレット病変（ＨＧＤ）の過剰発現率を示すヒストグラム（図２３Ｂ）である。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｃは、ＨＤ（健常ドナー）からＥＲ  ＩＢＣ／ＥＲ陽性ＩＢＣ（エストロゲン受容体陽性浸潤性乳癌（ＩＢＣ））およびＴＮ  ＩＢＣ（トリプルネガティブＩＢＣ）への抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下を示す。図は、全身性ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞応答のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析のヒストグラム（左パネル）を示す。研究された患者群は、ＨＤ；ＢＤ（良性胸部生検）；ＤＣＩＳ（ＨＥＲ２陽性（「ＨＥＲ２陽性」）非浸潤性乳管癌）；ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ；ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲ陽性  ＩＢＣ（エストロゲン受容体陽性ＩＢＣ）；およびＴＮ  ＩＢＣ（トリプルネガティブＩＢＣ）である。それぞれのヒストグラムの右側の対応する表は、一度に行った２つの群の間のスチューデントのｔ検定による個々の比較である。一元配置ＡＮＯＶＡ検定をすべての群で行った。図２４Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して細胞１００万個あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定された累積抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が、ＨＤＳからＢＤへ、ＤＣＩＳへ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへ、ＥＲ陽性  ＩＢＣへ、そして最終的にはＴＮ  ＩＢＣへと有意に減少したことを示す（それぞれ、９０対８０対６６対７９対４８対４０、ｐ＝０．０１）。図２４Ｂは、ＨＤからＢＤ、ＤＣＩＳへ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへ、ＥＲ陽性  ＩＢＣへ、そして最終的にはＴＮ  ＩＢＣへと数が有意に減少する（それぞれ、１．０対０．６対０．８対０．８対０．５対０．３、ｐ＝０．００３）、陽性ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有するＨＥＲ３ペプチドの数であるレパートリーを示す。図２４Ｃは、ＨＤからＢＤへ、ＤＣＩＳへ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへ、ＥＲ陽性  ＩＢＣへ、そして最終的にはＴＮ  ＩＢＣへと有意に減少する（それぞれ、７６．７％対６３．６％対５３．８％対６６．７％対４５．０％対３３．３％、ｐ＝０．０２）応答性（少なくとも１つのペプチドに応答する被験体の割合（％））を示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、テストされた患者群の間で破傷風または抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に差異がないため、ＣＤ４Ｔ細胞応答の喪失がＨＥＲ３に特異的であることを示す。図は、全身性ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞応答のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析のヒストグラム（左パネル）を示す。研究された患者群は、ＨＤ；ＢＤ；ＤＣＩＳ；ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ；  ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲ陽性  ＩＢＣ；およびＴＮ  ＩＢＣである。それぞれのヒストグラムの右側の対応する表は、一度に行った２つの群の間のスチューデントのｔ検定による個々の比較である。一元配置ＡＮＯＶＡ検定をすべての群で行った。図２５Ａは、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ、ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲ陽性  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣの間のＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して細胞２００，０００個あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定した破傷風応答に統計的に有意な差異がないことを示す（それぞれ、３７対３０対１９対３４対２４対２９、ｐ＝０．６５）。図２５Ｂは、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２  ＩＢＣ  ／  ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ、ＥＲ  ＩＢＣ  ／  ＥＲ陽性  ＩＢＣ間のＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して細胞２００，０００個あたりのＩＦＮ−γスポットによって測定した抗ＣＤ３  ／抗ＣＤ２８ポリクローナル刺激に統計的に有意な差異がないことを示す（それぞれ、６８８対５４９対８０４対６９９対６２９対６７５、ｐ＝０．６８）。
【図２６】図２６Ａ−２６Ｃは、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が、ネオアジュバント化学療法に対する再発および応答と相関するが、リンパ節転移とは相関しないことを示す。図２６Ａは、最初の手術におけるリンパ節状態（リンパ節陽性（「ＬＮ＋」または「ＬＮ陽性」対リンパ節陰性（「ＬＮ−」または「ＬＮ陰性」））によるＩＢＣ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムであって、ＬＮ陽性  ＩＢＣ患者とＬＮ陰性  ＩＢＣ患者との間で、累積応答（上部パネル）（それぞれ、４０対５６、ｐ＝０．１２）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ、０．４対０．６、ｐ＝０．０８）、応答性（第３パネル）（それぞれ、３５．７％対５４．８％、ｐ＝０．１９）または破傷風応答（下パネル）（それぞれ、２２対２９、ｐ＝０．３５）の統計的有意差がないことを示している。図２６Ｂは、診断から少なくとも１年間経過したＩＢＣ患者における、再発対非再発（疾患なし）による免疫応答を比較する４つのヒストグラムを示し、累積応答、レパートリーおよび応答性は有意に低かった：累積応答（上パネル）（それぞれ、１７対６６、ｐ＝０．０４）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ０．０対０．６、ｐ＜０．０５）および応答性（第３パネル）（それぞれ、０％対５５．６％、ｐ＝０．０１）。再発患者ＩＢＣ患者および非再発ＩＢＣ患者間の破傷風応答に差はなかった（下パネル）（それぞれ２７対３５、ｐ＝０．６５）。図２６Ｃは、ネオアジュバント化学療法（病理学的完全奏効（「ｐＣＲ」））対疾患残存（「＜ｐＣＲ」）を比較する４つのヒストグラムを有する。ネオアジュバント化学療法を受けている患者のうち、＜ｐＣＲを有する患者と比較して、ｐＣＲを有する患者は有意に高い累積応答およびレパートリーを示した（累積応答（上のパネル）（１４４対３２、それぞれ、ｐ＝０．００４）およびレパートリー（第二パネル）（それぞれ、０．８対０．４、ｐ＝０．０５））。ｐＣＲと＜ｐＣＲ患者の免疫応答の間には、応答性（第３のパネル）（それぞれ、８０．０％対２７．３％、ｐ＝０．１０）または破傷風応答（下側パネル）（それぞれ、１７対５９、ｐ＝０．１５）の相違はなかった。
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が閉経後のＨＤ／ＢＤにおいて有意に高いが、年齢、人種又は妊娠歴によって変化しないことを示す。図２７Ａは、ＨＤ患者の免疫応答を年齢（５０歳未満対５０歳超）と比較する４つのヒストグラムを有する。累積応答、レパートリー、応答性または破傷風応答に年齢による統計的有意差はなかった：累積応答（上パネル）（それぞれ、７７対１０３、ｐ＝０．２５）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ、０．８対１．１、ｐ＝０．３８）、応答性（第３パネル）（それぞれ、７２．０％対７５．０％、ｐ＝１．０）または破傷風応答（下側パネル）（それぞれ、３９対３０、ｐ＝０．４０）。図２７Ｂは、ＨＤ患者の免疫応答を人種（白人対アフリカ系アメリカ人対その他）で比較した４つのヒストグラムを有する。累積応答、レパートリー、応答性または破傷風応答に人種による統計的有意差はなかった（（累積応答）（それぞれ、８７対８３対９５、ｐ＝０．９６）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ、０．９対０．７対１．４、ｐ＝０．３１）、応答性（第３のパネル）（それぞれ、６９．０％対７１．４％対１００％、ｐ＝０．３５）または破傷風応答（下部パネル）（それぞれ、３３対５１対２６、ｐ＝０．３０））。図２７Ｃは、妊娠歴／妊娠によるＨＤ患者の免疫応答を比較する４つのヒストグラムを有する（妊娠０回対１回以上の妊娠）。妊娠歴により累積応答、レパートリーまたは応答性に統計的有意差はなかった：累積応答（上パネル）（それぞれ、８２対９１、ｐ＝０．７１）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ、１．０対０．９、ｐ＝０．６２）または応答性（第３パネル）（それぞれ、７６．５％対７０．８％、ｐ＝０．７４）。興味深いことに、破傷風反応（下パネル）は、少なくとも１回の妊娠歴を有する患者と比較して、未経産婦で有意に高かった（それぞれ、４７対２７、ｐ＝０．０４）。図２７Ｄは、ＨＤ患者の免疫応答を閉経状態（閉経前−閉経後）により比較した４つのヒストグラムを有する。閉経前のＨＤ／ＢＤと比較して、閉経後のＨＤ／ＢＤは有意に高い累積応答およびレパートリーを示した：累積応答（上パネル）（それぞれ、細胞１００万個に対して１３６スポット対７０スポット、ｐ＝０．００５）、レパートリー（第２パネル）（それぞれ、１．４対０．８ペプチド、ｐ＝０．０３））。応答性または破傷風応答によって閉経後および閉経前のＨＤ／ｓＢＤ間に差はなかった：応答性（第３パネル）（それぞれ、９０．９％対６６．７％、ｐ＝０．２３）または破傷風応答（下側パネル）（それぞれ、３８対２８、ｐ＝０．３７））。
【図２８】図２８はＥＬＩＳｐｏｔの直線性の決定のグラフである。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、既知の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞レスポンダーを培地に段階希釈することにより、この研究のための全てのアッセイを行ったオペレーターの下で直線的かつ正確であると決定された。累積応答は、１．０倍希釈から０．１倍希釈、０．０１倍希釈、０．００１倍希釈（それぞれ、細胞１００万個あたり２３０個から３５個、１２個、５個のスポット）で直線回帰線をたどった（ｐ＜０．０００１、ｒ２＝０．８８）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチドは、ＨＥＲ−１のエピトープに相当する。一実施形態では、ペプチドは、ＨＥＲ−３のエピトープに相当する。一実施形態では、ペプチドは、ｃ−ＭＥＴのエピトープに相当する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、対応するＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼのエピトープは、免疫原性である。本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む組成物をさらに提供する。一実施形態では、キメラペプチドを提供し、このキメラペプチドは、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む。
【００１３】
一実施形態は、多価ペプチドを含む組成物を含む。多価ペプチドは、２つ以上の本発明のペプチドを含む。
【００１４】
免疫応答を賦活する方法および対象において癌を治療する方法をさらに提供する。また、治療および予防に使用するためのワクチンも提供する。本実施例のペプチドは、本明細書に記載するように、単独またはキメラペプチドの状況で、免疫応答を引き起こすことが可能である。一実施形態では、免疫応答は液性応答である。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性応答である。いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドは、防御効果を付与する。
【００１５】
別の実施形態において、ＨＥＲ３発現は、胃食道接合部の前癌病変における腫瘍進行のマーカーとして使用することができる。
【００１６】
別の実施形態では、ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドを使用して抗ＨＥＲ３ＣＤ４  Ｔｈ１損失が決定される。
【００１７】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明に関わる当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料に類似するまたはそれらと同等である任意の方法および材料を本発明の実行または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００１８】
一般に、本明細書で使用する命名法も、細胞培養、分子遺伝学、有機化学ならびに核酸の化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室の手順も、当技術分野では周知であり、通常利用されるものである。
【００１９】
核酸およびペプチドの合成については、標準的な技法を使用する。技法および手順は一般的に、当技術分野の従来法および種々の一般的な参考文献（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、２０１２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ）に従って実施し、これらは、本記載全体を通して提供されている。
【００２０】
本明細書で使用する命名法ならびに下記に記載する分析化学および有機合成において使用する実験室の手順は、当技術分野では周知であり、通常利用されるものである。標準的な技法またはそれらの改変形態を使用して、化学合成および化学分析を行う。
【００２１】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションの用語と関連がある意味を有する。
【００２２】
本明細書では、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を使用して、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２３】
測定可能な値、例として、量、時間的な期間等を指す場合の「約」は、本明細書で使用する場合には、特定の値からの±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含することを意図し、そうした変動は、開示する方法を実施するのに適切である。
【００２４】
生物、組織、細胞またはそれらの構成成分の文脈で使用する場合、用語「異常」は、少なくとも１つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、１日のうちの時間等）が、「正常な」（予想される）それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞またはそれらの構成成分とは異なる生物、組織、細胞またはそれらの構成成分を指す。１つの細胞または組織の型にとって、正常であるまたは予想される特徴が、異なる細胞または組織の型にとっては異常である場合もあるであろう。
【００２５】
本明細書で使用される乳癌の「補助療法」は、長期生存の機会を増加させるための一次療法（すなわち、手術）の後に与えられる任意の治療を指す。「ネオアジュバント療法」は一次療法前に与えられる治療である。
【００２６】
用語「抗原」または「ａｇ」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を引き起こす分子と定義する。この免疫応答は、抗体の生成または特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれかまたはそれらの両方に関与することができる。当業者であれば、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、任意の巨大分子が、抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原を、組換えまたはゲノムのＤＮＡから得ることもできる。免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、したがって、本明細書で使用する場合の用語「抗原」をコードすることを当業者であれば理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長のヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明は、これらに限定されないが、１つ超の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列を種々に組み合わせて配置して、所望の免疫応答を惹起することが容易に明らかになる。さらに、抗原は「遺伝子」によりコードされることが全く必要ないことも当業者は理解するであろう。抗原を、合成により生成してもよく、または生物学的試料から得てもよいことは容易に明らかである。そのような生物学的試料として、これらに限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的液体を挙げることができる。
【００２７】
「抗原提示細胞」（“ＡＰＣ”）は、Ｔ細胞を活性化させることが可能な細胞であり、これらに限定されないが、単核球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【００２８】
「抗原を取り込んだＡＰＣ」または「抗原をパルス添加したＡＰＣ」は、抗原に曝露させ、抗原により活性化させてあるＡＰＣを含む。例えば、ＡＰＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、抗原の存在下で培養する間に、抗原を取り込んだ状態とされうる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露させることによって、ＡＰＣに取り込むこともできる。「抗原を取り込んだＡＰＣ」は従来、２つの方法：（１）抗原性ペプチドとして既知である小型のペプチド断片を、ＡＰＣの外部上に直接「パルス添加する」か、または（２）ＡＰＣを、全タンパク質もしくはタンパク質粒子と共にインキュベートし、次いで、全タンパク質もしくはタンパク質粒子をＡＰＣに摂取させるかのいずれかの方法で調製される。これらのタンパク質は、ＡＰＣにより小型のペプチド断片に消化され、最終的に、ＡＰＣ表面に輸送され、そこで提示される。さらに、抗原を取り込んだＡＰＣはまた、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することによっても生成することができる。
【００２９】
「抗ＨＥＲ３応答」、「抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答」、「抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答」などは、ＨＥＲ３タンパク質に対して特異的な免疫応答を意味する。
【００３０】
用語「抗腫瘍作用」は、本明細書で使用する場合、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、または癌性状態と関連がある種々の生理学的症状の寛解により明らかにすることができる生物学的作用を指す。そもそも、「抗腫瘍作用」はまた、腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることもできる。
【００３１】
用語「自己免疫疾患」は、本明細書で使用する場合、自己免疫応答の結果生じる障害と定義する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。とりわけ、自己免疫疾患の例として、これらに限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「自家」は、個体から得、後にその同じ個体内へ再導入しようとしている任意の材料を指すことを意図する。
【００３３】
用語「Ｂ細胞」は、本明細書で使用する場合、骨髄および／または脾臓に由来する細胞と定義する。Ｂ細胞は形質細胞に発達することができ、形質細胞は抗体を生成する。
【００３４】
用語「癌」は、本明細書で使用する場合、細胞の過剰増殖と定義し、癌の独特な形質である正常な制御の放棄の結果、無秩序な成長、分化の欠如、局所組織への浸潤および／または転移が生じる。例として、これらに限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、生殖細胞腫瘍等が挙げられる。
【００３５】
「ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞」、「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞」などは、表面タンパク質ＣＤ４を発現し、高レベルのサイトカインＩＦＮ−γを産生するＴヘルパー細胞のサブタイプとして定義される（「Ｔヘルパー細胞」も参照のこと）。
【００３６】
「累積応答」は、所与の患者群からのすべてのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドからの反応性スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析からの細胞１０６個あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の総和として表される、患者群の総合免疫応答を意味する。
【００３７】
「ＤＣワクチン接種」、「ＤＣ免疫化」、「ＤＣ１免疫化」などは、免疫系を利用して特定の分子を認識し、それらに対する特異的応答を獲得するために自己樹状細胞を使用する戦略を指す。
【００３８】
「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、インビボ、インビトロ、エキソビボ、または宿主もしくは被験体に存在するか、または造血幹細胞または単球に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞およびその前駆体は、種々のリンパ器官、例えば脾臓、リンパ節、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞本体から複数の方向に伸びる薄いシート（ラメリポディア）を有する特徴的な形態を有する。典型的には、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子を発現する。樹状細胞は、インビトロでＴ細胞の抗原特異的分化を誘導することができ、インビトロおよびインビボで一次Ｔ細胞応答を開始することができる。ワクチン製造の文脈において、「活性化されたＤＣ」は、リポ多糖類「ＬＰＳ」のようなＴｏｌｌ様受容体アゴニストに曝露されたＤＣである。活性化されたＤＣは抗原を有していてもいなくてもよい。
【００３９】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が寛解しないならば、動物の健康状態は悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００４０】
動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することは可能であるが、動物の健康状態が、障害が存在しない場合に比して好ましくない場合を指す。障害は、治療せずに放置しても、必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００４１】
患者が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の重症度または頻度が低下する場合、疾患または障害は「軽減」される。
【００４２】
「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では交換可能に使用し、本明細書に記載する場合、特定の生物学的結果を達成するのに有効な化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。そのような結果として、これに限定されないが、当技術分野の適切な任意の手段により決定する場合のウイルス感染の阻害を挙げることができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「内因性」は、生物、細胞、組織もしくは系に属するまたは生物、細胞、組織もしくは系の内部で生成する任意の材料を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織もしくは系から導入されるまたは生物、細胞、組織もしくは系の外部で生成する任意の材料を指す。
【００４５】
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）受容体、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）受容体、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）受容体を含む。ＨＥＲ受容体は一般に、ＨＥＲリガンドに結合することおよび／または別のＨＥＲ受容体分子と二量体化することができる、細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存されている細胞内チロシンキナーゼドメイン；ならびにリン酸化され得るいくつかのチロシン残基をもつ、カルボキシル末端のシグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ受容体は、「ネイティブ配列」のＨＥＲ受容体であっても、またはその「アミノ酸配列バリアント」であってもよい。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、ネイティブ配列のヒトＨＥＲ受容体である。
【００４６】
「ＨＥＲ経路」は、ＨＥＲ受容体ファミリーが媒介するシグナル伝達ネットワークを指す。
【００４７】
「ＨＥＲの活性化」は、任意の１つまたは複数のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲの活性化の結果、シグナル伝達（例えば、ＨＥＲ受容体中のチロシン残基または基質のポリペプチドをリン酸化するＨＥＲ受容体の細胞内キナーゼドメインが引き起こすシグナル伝達）が生じる。ＨＥＲの活性化は、ＨＥＲリガンドが目的のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合することによって媒介され得る。ＨＥＲリガンドの、ＨＥＲ二量体への結合が、二量体中の１つまたは複数のＨＥＲ受容体のキナーゼドメインを活性化させることができ、それにより、１つもしくは複数のＨＥＲ受容体中のチロシン残基のリン酸化および／または追加の基質のポリペプチド、例として、Ａｋｔ細胞内キナーゼもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼ中のチロシン残基のリン酸化が生じる。
【００４８】
「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮成長因子受容体（「ＥＧＦＲ」）ファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２はヒト乳癌の約２０−２５％において過剰発現され、他の多くの癌で発現される。
【００４９】
「ＨＥＲ２陽性」は、ある種の乳癌ならびに多数の他の癌の分類または分子サブタイプである。ＨＥＲ２陽性は、現在、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）アッセイによる遺伝子増幅および病理学的染色強度の２＋または３＋によって定義される。
【００５０】
「ＨＥＲ２陰性」は、ＦＩＳＨによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの場合、病的染色形態０〜２＋の範囲を包含することができる。
【００５１】
「ＨＥＲ３」および「ＥｒｂＢ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにＫｒａｕｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３-９１９７頁（１９８９）に開示されている受容体ポリペプチドを指す。
【００５２】
「ＨＥＲ３の細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ３ＥＣＤ」は、その断片を含む、細胞の外側にあり、細胞膜に固定されているまたは循環しているＨＥＲ３のドメインを指す。一実施形態では、ＨＥＲ３の細胞外ドメインは、４つのドメイン：ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶを含み得る。一実施形態では、ＨＥＲ３  ＥＣＤは、アミノ酸１-６３６（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。一実施形態では、ＨＥＲ３ドメインＩＩＩは、アミノ酸３２８-５３２（シグナルペプチドを含む番号付け）を含む。
【００５３】
本明細書中で使用される「ＨＥＲ３免疫原性ペプチド」、「ＨＥＲ３結合ペプチド」、「ＨＥＲ３エピトープ」などは、ＨＥＲ３タンパク質、具体的にはＨＥＲ３ＥＣＤの配列に由来するかまたはそれらに基づくＭＨＣクラスＩＩペプチドおよびそれらの同等物をいう。ＨＥＲ３ペプチドは、多くの患者にわたってＣＤ４  Ｔ細胞を活性化することができる。このペプチドは、樹状細胞をパルスし、ＨＥＲ３を認識するようにＴ細胞を教育するために使用することができる。ＨＥＲ３は、トリプルネガティブ乳癌で発現され、ＥＲ陽性乳癌において抗エストロゲンに対する耐性を付与することができる。ＨＥＲ３はまた、メラノーマ、肺、結腸、前立腺癌、および転移性脳腫瘍を含む他の癌でも発現される。好ましい実施形態によれば、４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチド（エピトープ）または結合ペプチドが以下のように同定されている：
ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）。
ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）。
ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）。  そして
ｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）。
【００５４】
「相同」は、本明細書で使用する場合、２つの高分子性分子、例えば、２つの核酸分子、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子、または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方において、あるサブユニットの位置を、同じ単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占めるならば、これらの分子は、その位置では完全に相同または１００％相同である。２つの配列間のパーセント相同性は、一致するまたは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２つの化合物の配列において、位置の半分（例えば、１０個のサブユニットの長さの高分子中の５つの位置）が相同であるならば、これら２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％、例えば、１０個のうち９つがマッチするまたは相同であるならば、これら２つの配列は９０％相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＧＣＣ３’と５’ＴＡＴＧＧＣ３’とは、５０％相同性を共有する。
【００５５】
さらに、本明細書で用語「相同性」または「同一性」を使用して、核酸およびタンパク質を指す場合には、核酸およびアミノ酸の配列レベルの両方における相同性または同一性に適用されると解釈すべきである。
【００５６】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖の結果生じる疾患と定義する。例示的な過剰増殖性疾患として、これらに限定されないが、癌または自己免疫疾患が挙げられる。その他の過剰増殖性疾患として、例えば、血管閉塞、再狭窄、アテローム動脈硬化または炎症性腸疾患を挙げることができる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「使用説明資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、略図または任意のその他の表現媒体を含む。本発明のキットの使用説明資料を、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含有する容器に添付すること、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含有する容器と一緒に発送することができる。代わりに、使用説明資料と化合物とがレシピエントにより併せて使用されることを意図して、使用説明資料を容器とは別途に発送することもできる。
【００５８】
「免疫応答」は、本明細書で使用する場合、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答の形態、または両方の形態をとり得る。
【００５９】
「単離された」は、天然の状態から変化させたまたは取り出した状態を意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離状態」でないが、その天然の状態の共存する材料から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離状態」である。単離状態の核酸またはタンパク質は、実質的に精製した形態で存在してもよく、または例えば、宿主細胞等、外から加えた環境下に存在してもよい。
【００６０】
用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」によって、本明細書で使用する場合には、治療もしくは化合物の非存在下での対象における応答レベルと比較した場合、および／または他の点では同一であるが未治療の対象における応答レベルと比較した場合に、対象における応答レベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブのシグナルもしくは応答を動揺させ、および／またはそれに影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくは、ヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００６１】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１免疫応答について分析された各被験体群について、以下のＣＤ４  ＋  Ｔｈ１応答の「評価指標」または「免疫応答の評価指標」が定義される：（ａ）全体的な抗ＨＥＲ３応答性（１つ以上の免疫原性ペプチドに応答する対象の割合（％）として表される）；（ｂ）応答レパートリー（各被験体群によって認識される免疫原性ペプチドの平均数（ｎ）として表される）；および、（ｃ）累積応答（各被験体群からの４つのＭＨＣクラスＩＩ  ＨＥＲ３免疫原性ペプチドからの反応性スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析からの細胞１０６個あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の合計として表される）。
【００６２】
「ペプチド」、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸を連結した配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の改変形態もしくは組合せであり得る。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「集団」は、同種の、実質的に同種の、または異種の細胞培養物を含む単離状態の培養物についての言及を含む。一般にまた、「集団」は、「単離状態」の細胞培養物とみなすことができる。
【００６４】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、およびホルモンの高親和性細胞表面受容体である。ＲＴＫのヒトＥＧＦ受容体（「ＨＥＲ」）ファミリーは、細胞増殖、遊走、浸潤および生存を含む多種多様な生物学的プロセスを調節する。このファミリーは、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の４つのメンバーからなる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「組換え細胞」は、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００６６】
「応答性」または「抗ＨＥＲ３応答性」は、本明細書中では交換可能に使用され、４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチドの少なくとも１つに応答する被験体のパーセンテージを意味する。
【００６７】
「応答レパートリー」は、各対象群によって認識されるＨＥＲ３免疫原性ペプチドの平均数（「ｎ」）として定義される。
【００６８】
「試料」または「生物学的試料」は、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、臓器、組織、エキソソーム、血液、血漿、唾液、尿およびその他の体液を含む、対象から得られた生物学的材料を意味する。試料は、任意の供給源の、対象から得られる材料であり得る。
【００６９】
「シグナル１」は、本明細書で使用する場合一般に、活性化したＤＣからＴ細胞に渡される、第１の生化学的シグナルを指す。シグナル１は、ＤＣの表面に発現する抗原により提供され、Ｔ細胞により、Ｔ細胞受容体を通して感知される。
【００７０】
「シグナル２」は、本明細書で使用する場合一般に、ＤＣによりＴ細胞に提供される第２のシグナルを指す。シグナル２は、活性化したＤＣ上の「同時刺激」分子、通常、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６（ただし、その他の同時刺激分子も公知である）により提供され、Ｔ細胞により、表面受容体ＣＤ２８を通して感知される。
【００７１】
「シグナル３」は、本明細書で使用する場合一般に、活性化したＤＣにより生成された可溶性タンパク質（通常、サイトカイン）から発生するシグナルを指す。これらは、Ｔリンパ球上の受容体を通して感知される。第３のシグナルは、現在の脅威に最良に対処するためには、Ｔ細胞がどの表現型または機能上の特徴を獲得すべきであるかについて、Ｔ細胞に指示する。
【００７２】
用語「特異的に結合する」によって、本明細書で使用する場合には、試料中で、別の分子または特徴を認識し、それに結合するが、その他の分子または特徴を実質的に認識することもそれらに結合することもない分子、例として、抗体を意味する。
【００７３】
用語「対象」、「患者」、「個体」等は、本明細書では交換可能に使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであれｉｎ  ｓｉｔｕであれ、本明細書に記載する方法に適している任意の動物またはそれらの細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【００７４】
本明細書で使用する用語「標的療法」は、通常、抗腫瘍効果を達成するために正常細胞にほとんど損傷を与えずに、癌細胞の増殖に関与する特定の標的分子を妨害する薬物または他の物質を使用する癌治療を指す。対照的に、伝統的な細胞傷害性化学療法薬は、活発に分裂する細胞すべてに対して作用する。乳癌治療モノクローナル抗体では、具体的には、トラスツズマブ／ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を標的とする。
【００７５】
用語「Ｔ細胞」は、本明細書で使用する場合、多様な細胞媒介性免疫反応に関与する、胸腺に由来する細胞と定義する。
【００７６】
用語「Ｔ−ヘルパー」は、本明細書で細胞に言及して使用する場合には、当業者が同定することができる異なる細胞型を含む、リンパ球のサブグループ（白血球細胞または白血球の型）を示す。特に、本開示に従うＴ−ヘルパー細胞は、エフェクターＴｈ細胞（例として、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７）を含む。これらのＴｈ細胞は、その他の白血球を賦活するまたはそれらと相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。
【００７７】
本明細書において、「Ｔヘルパー細胞」、「ヘルパーＴ細胞」、「Ｔｈ細胞」などの用語は、細胞を参照して、当該分野の当業者によって識別可能な様々な細胞タイプを含むリンパ球（白血球の一種）のサブグループを示す。特に、Ｔヘルパー細胞は、主要な機能が他のＢリンパ球およびＴリンパ球および／またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターＴ細胞である。ヘルパーＴ細胞は、「Ｔｈ１」または「タイプ１」および「Ｔｈ２」または「タイプ２」表現型として知られる２つの主要なサブタイプの細胞に分化する。これらのＴｈ細胞は、他の白血球を刺激または相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞」などは、表面糖タンパク質ＣＤ４を発現した成熟Ｔ細胞を指す。ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー細胞は、樹状細胞などの抗原提示ペプチド（「ＡＰＣ」）の表面上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。ＣＤ４  ＋  Ｔヘルパー細胞は、ＭＨＣ抗原複合体により活性化されると、高レベルのインターフェロンγ（「ＩＦＮ−γ」）などのサイトカインを分泌する。このような細胞は、宿主細胞の内部に存在する特定の疾患を引き起こす微生物に対して非常に有効であると考えられており、宿主細胞内に存在する特定の疾患を引き起こす微生物および癌に対してもヒト癌における抗腫瘍応答に重要である。
【００７９】
「Ｔｈ１７  Ｔ細胞」は、本明細書で使用する場合、サイトカインＩＬ−１７およびＩＬ−２２を高いレベルで生成し、粘膜表面上に生存する、疾患を引き起こす微生物に対して極めて有効であると考えられているＴ細胞を指す。
【００８０】
「治療有効量」は、患者に投与する場合、疾患の症状を寛解させる、本発明の化合物の量である。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患の状態およびその重症度、治療しようとする患者の年齢等に応じて変化する。治療有効量は、当業者であれば、当業者自身の知識および本開示を考慮して日常的に決定することができる。
【００８１】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載する治療または予防の方策を指す。「治療」の方法は、障害もしくは再発障害の１つもしくは複数の症状の予防、治癒、遅延、重症度の低下もしくは寛解のためまたはそのような治療を施さない場合に予想される生存を上回る、対象の生存の延長のために、本発明の組成物を、そのような治療を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に罹患している対象またはそのような疾患もしくは障害を最終的に獲得する恐れがある対象に投与することを利用する。
【００８２】
「トリプルネガティブ」および「ＴＮ」乳癌は、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）、プロゲステロン受容体（「ＰＲ」）およびＨＥＲ２についての試験で陰性である任意の乳癌細胞を指す。
【００８３】
用語「ワクチン」は、本明細書で使用する場合、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに投与した後に免疫応答を引き起こすために使用する材料と定義する。ワクチンは、対象内に導入されると、これらに限定されないが、抗体、サイトカインおよび／またはその他の細胞性応答の生成を含む、免疫応答を引き起こすことが可能になる。
【００８４】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸配列がアミノ酸の挿入、欠失または保存的置換により異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。また、バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する場合もある。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当技術分野では典型的には、軽微な変化が生じていると認識されている。これらの軽微な変化は一部、当技術分野における理解に従って、アミノ酸の疎水性親水性指数を検討することによって同定することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５-１３２頁（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷の検討に基づく。類似の疎水性親水性指数のアミノ酸を置換し、タンパク質の機能を依然として保持することができることが、当技術分野では公知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用しても、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を示すことができる。ペプチドの状況では、アミノ酸の親水性を検討することによって、そのペプチドの最も大きな局所平均親水性を計算することが可能になり、このことは、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な方策である。全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，５５４，１０１号。当技術分野で理解されているように、類似の親水性の値を有するアミノ酸の置換から、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。相互に±２内の親水性の値を有するアミノ酸を用いて、置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性の値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。そうした観察結果と一致して、生物学的機能に対応するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよびその他の特性により示される、アミノ酸の相対的な類似性、特に、それらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００８５】
範囲：本開示全体を通して、本発明の種々の態様を、範囲フォーマットとして提示することができる。範囲フォーマットとしての記載は、単に利便性および簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する確固たる制限であると解釈してはならないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の可能な部分的範囲および個々の数値全てを具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、範囲の記載、例として、１-６は、部分的範囲、例として、１-３、１-４、１-５、２-４、２-６、３-６等、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を具体的に開示しているとみなすべきである。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００８６】
説明
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼのペプチドを含む免疫学的組成物を提供する。一実施形態では、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチドは、免疫応答を惹起するのに有用である。本発明のペプチドを含む組成物は、初期防御のための予防的治療剤としても有用であり、進行中の状態の治療のための治療剤としても有用である。
【００８７】
本発明はまた、癌を治療または予防するための方法も提供する。そのような方法は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。そのようなペプチドの投与の結果、抗腫瘍免疫が誘導される。したがって、本発明は、対象において抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供し、そのような方法は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せ、ならびにそれに由来する医薬組成物および細胞組成物を対象に投与するステップを含む。
【００８８】
本発明は、哺乳動物においてＴ細胞応答を誘導するための方法を包含する。この方法は、Ｔ細胞の増殖を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含む。一実施形態では、方法は、本発明のペプチドをパルス添加した樹状細胞ワクチンを投与し、それにより、ペプチドに対応する抗原に対してＴ細胞の増殖を特異的に誘導するステップを含む。
【００８９】
一実施形態では、本発明のペプチドをパルス添加したＡＰＣを使用して、Ｔ細胞を培養し拡大することができる。ＡＰＣを使用し、Ｔ細胞を拡大増殖して、十分な数の抗原特異的Ｔ細胞を得たら、そうして得た抗原特異的Ｔ細胞を哺乳動物に投与し、それにより、哺乳動物において抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する。
【００９０】
本発明は、活性化したＤＣの調製物を含む。一実施形態では、ＤＣ調製物は、９０％超の純度である。別の実施形態では、ＤＣ調製物を、完全に活性化させる。例えば、ＤＣをＴＬＲアゴニスト（例えば、ＬＰＳ）と接触させることを含むＤＣ活性化レジメンを用いて、ＤＣを活性化させる。別の実施形態では、カルシウムを動員する処理を、異なる第３シグナルのサイトカインを増強するその他のＤＣ活性化レジメン（例えば、活性化剤）と併せて用いて、ＤＣを活性化させる。
【００９１】
本発明は、成熟した、抗原を取り込んだＤＣであって、任意のＤＣ活性化レジメンにより活性化させたＤＣを含む。本発明のＤＣは、望ましいレベルのサイトカインおよびケモカインを生成させる。一実施形態では、本発明は、細胞にパルス添加を行い、活性化させる方法であって、それによって、細胞が、凍結保存の後に活性状態を維持する方法を提供する。本発明のＤＣ調製物の利益は、単一の白血球アフェレーシス（患者からの収集物）から、細胞が、最初のワクチンに加えて、複数回（例えば、１０回以上）の「ブースター」用量に効率的に凍結保存され、これらの用量は、遠隔の治療場所で、必要に応じて解凍することができ、いずれの特殊な細胞処理施設もさらに必要な品質管理試験もいらないことである。
【００９２】
本発明はまた、これらの活性化したＤＣの凍結保存にも関し、ＤＣは、解凍しても、抗原の提示における効力および機能ならびに種々のサイトカインおよびケモカインの生成を保持するように凍結保存され、したがって、凍結保存し、その後に解凍した活性化したＤＣは、新たに収集し、活性化させたＤＣと同じレベルで、臨床的に有効である。
【００９３】
本明細書では、本発明が、Ｔ細胞に対してより強力なシグナルを発生させる点で優れた機能を有するＤＣを生成し、凍結保存するための方法を提供することを企図し、したがって、より強力な、ＤＣに基づくワクチンが得られる。そのような細胞を有効に凍結保存することによって、試料を保存し、解凍して、後に使用することができ、それにより、ワクチンを生成する間にフェレーシスおよびエルトリエーションのプロセスを繰り返す必要性を低下させる。ＤＣを凍結し、次いで後に、それらを解凍して取り出すことが可能になることは、利点であり、これは、単回で生成したワクチンを、小分けし、凍結しておき、次いで、数週間、数ヵ月または数年にわたり、一回に１つずつ患者に投与して、免疫を強化する「ブースター」ワクチン接種を行うことができることを意味するからである。
【００９４】
本実施形態はまた、バレット食道としても知られている胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行のマーカーとしてのＨＥＲ３発現の使用を含む。このマーカーは、浸潤性食道胃癌において予後および治療的使用を有する。
【００９５】
組成物
本発明は、ＨＥＲファミリーのタンパク質およびその他の受容体チロシンキナーゼの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびｃ−ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数からの単離ペプチドを提供する。一実施形態では、本発明のペプチドは、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープに相当する。いくつかの実施形態では、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープは、免疫原性である。
【００９６】
本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、１つまたは複数のキメラペプチドを含む組成物も提供する。一実施形態では、キメラペプチドは、対応するＨＥＲタンパク質またはｃ−ＭＥＴタンパク質のエピトープをさらに１つ含む。
【００９７】
さらに、１つまたは複数の多価ペプチドを有する組成物も提供する。これらの多価ペプチドは、２つ以上の本発明のエピトープを含む。
【００９８】
本発明の組成物を使用して免疫応答を賦活させる方法および対象において癌を治療する方法は、本発明に含まれる。また、ワクチンも、治療および予防に使用するために提供する。本発明のエピトープは、本明細書に記載するように、単独またはキメラペプチドの状況で、免疫応答を引き起こすことが可能である。一実施形態では、免疫応答は液性応答である。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性応答である。いくつかの実施形態によれば、本発明のエピトープまたはペプチドは、防御効果を付与する。
【００９９】
一実施形態では、本発明のＨＥＲ３のエピトープまたはその他のペプチドは、
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）；
ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）；
ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）；
ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；
ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；
ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；
ｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）
を含む。
【０１００】
本発明のＨＥＲ３ペプチドまたは任意のペプチドは、環状であっても、または直鎖状であってもよい。エピトープは、環状の場合、任意の適切な様式で環状となすことができる。例えば、所望の立体構造をもたらすために、ジスルフィド結合を選択されたシステイン（Ｃｙｓ）の対の間で形成することができる。環状エピトープの形成により、液性応答を改善する、したがって、防御効果を改善する立体構造をもたらすことができると考えられている。
【０１０１】
配列番号４により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の５６〜７０位に相当する。配列番号５により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４０１〜４１５位に相当する。配列番号６により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４１６〜４３０位に相当する。配列番号７により同定されるＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３タンパク質の４５１〜４６５位に相当する。
【０１０２】
本明細書に記載するように、本発明のＨＥＲ３のエピトープはまた、配列番号により同定されるペプチドの機能上の均等物であるペプチドも包含する。そのような機能上の均等物は変化した配列を有し、この場合、対応するＨＥＲ３エピトープの配列中の１つもしくは複数のアミノ酸が置換されている、または１つもしくは複数のアミノ酸が、対応する参照配列から欠失しているもしくはそれに付加している。例えば、１〜３つのアミノ酸を、アミノ末端、カルボキシ末端または両方に付加することができる。いくつかの例では、ＨＥＲ３エピトープは、グリコシル化されている。
【０１０３】
その他の例では、ＨＥＲ３エピトープは、ＨＥＲ３エピトープのレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）異性体であり得る。レトロ−インベルソ改変は、ペプチド骨格内の全てのアミド結合の逆転を含む。配列の方向を逆転させ、各アミノ酸残基の不斉を、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用することにより反転させることによって、この逆転を達成することができる。このレトロ−インベルソ異性体の形態は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性および立体構造の制約を保持することができる。
【０１０４】
非保存的アミノ酸置換および／または保存的置換を作製することができる。置換アミノ酸が、参照配列中の対応するアミノ酸に類似する構造的または化学的な特性を有する場合には、置換は保存的アミノ酸置換である。例として、保存的アミノ酸置換には、１つの脂肪族または疎水性のアミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを、別のそうしたアミノ酸で置換する場合；１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリンおよびスレオニンを、別のそうしたアミノ酸で置換する場合；１つの酸性の残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸を、別のそうした残基で置換する場合；１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンを、別のそうした残基で交換する場合；１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンを、別のそうした残基で交換する場合；１つの塩基性の残基、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを、別のそうした残基で交換する場合；ならびに１つの小型のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニンおよびグリシンを、別のそうしたアミノ酸で交換する場合がある。
【０１０５】
いくつか例では、欠失および付加は、本発明のペプチドの１つの配列のアミノ末端、カルボキシ末端または両方に位置する。例えば、ＨＥＲ３エピトープの均等物は、対応するＨＥＲ３エピトープの配列と、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は、参照配列の１０個のアミノ酸当たり、１つだけの変化、すなわち、欠失、付加または置換の任意の組合せを有する。当技術分野で公知のまたは開発したプログラムを使用して、バリアントのアミノ酸配列を参照配列と比較することによって、パーセント同一性を決定する。
【０１０６】
対応するＨＥＲ３エピトープの配列よりも長い機能上の均等物の場合には、機能上の均等物は、ＨＥＲ３エピトープの配列と少なくとも９０％同一である配列、および野生型ＨＥＲ３タンパク質中でＨＥＲ３エピトープの配列に隣接する配列を有し得る。
【０１０７】
エピトープの配列を改変し、次いで、得られたポリペプチドを、免疫応答、例えば、抗体の生成を賦活する能力についてアッセイすることによって、ＨＥＲ３エピトープの機能上の均等物を同定することができる。そのような抗体は、血清および腹水を含む、多様な体液中に見出すことができる。手短に述べると、ＨＥＲ３ポリペプチドに特異的な抗体が存在するかどうかを決定することが所望される温血動物、例として、ヒトから、体液試料を単離する。体液を、ＨＥＲ３ポリペプチドと共に、ポリペプチドとタンパク質に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成させるのに十分な条件下でかつそうさせるのに十分な時間にわたりインキュベートし、次いで、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイする。
【０１０８】
本発明のその他の実施形態によれば、キメラペプチド、および１つまたは複数のキメラペプチドを含む組成物を提供する。種々の実施形態によれば、キメラペプチドは、ＨＥＲ３エピトープ、別のエピトープ、およびＨＥＲ３エピトープをその他のエピトープにつなぐリンカーを含む。一実施形態では、その他のエピトープとして、これらに限定されないが、別のＨＥＲ３エピトープ、ＨＥＲ１エピトープ、ＨＥＲ２エピトープおよびｃ−ＭＥＴエピトープを挙げることができる。任意の適切なリンカーを使用してよいことがさらに理解される。例えば、使用するエピトープに依存して、ＨＥＲ３エピトープを、その他のエピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結することができる。その他のエピトープの場所および選択は、ＨＥＲ３エピトープの構造的な特徴、すなわち、アルファへリックスまたはベータ−ターンまたは鎖かどうかに依存する。
【０１０９】
一実施形態では、リンカーは、約２-約１５個のアミノ酸、約２-約１０個のアミノ酸、または約２-約６個のアミノ酸の長さのペプチドであり得る。キメラペプチドは、直鎖状であっても、または環状であってもよい。さらに、ＨＥＲ３エピトープ、その他のエピトープおよび／またはリンカーは、レトロ−インベルソの形態であってよい。したがって、ＨＥＲ３エピトープは単独で、レトロ−インベルソの形態であってもよい。代わりに、ＨＥＲ３エピトープおよびその他のエピトープが、レトロ−インベルソの形態であってもよい。別の例では、ＨＥＲ３エピトープ、その他のエピトープおよびリンカーが、レトロ−インベルソの形態であってもよい。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、キメラペプチドの形態をとる代わりに、一緒にして混合物となすこともできる。いずれにしても、ペプチドを含む本発明の組成物は、細胞ワクチンを生成するために、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）にパルス添加するのに有用な薬剤となり得る。別の実施形態では、ペプチドを含む本発明の組成物は、抗体の生成を誘導するのに有用な免疫原となり得る。また、本発明の組成物を使用して、対象を免疫化し、腫瘍の発生を遅延させるまたは予防することもできる。本発明の組成物をワクチン中で使用して、防御効果をもたらすことができる。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のペプチドまたはキメラペプチドのうちの２つ以上の混合物を含む組成物を提供する。いくつか例では、それら２つ以上のキメラペプチドのそれぞれのＨＥＲ３エピトープが異なる。その他の例では、ＨＥＲ３エピトープの１つは、配列番号１〜７から選択される。
【０１１２】
キメラペプチドを含む、本発明のペプチドは、周知の技法を使用して調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成のいずれかを使用して、ペプチドを合成して調製することができる。本発明のペプチドは、個々に合成しても、または２つ以上のペプチドで構成される、より長いポリペプチドとして合成してもよい。本発明のペプチドは、好ましくは、単離され、すなわち、その他の天然に存在する宿主細胞のタンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しない。
【０１１３】
市販されているペプチド合成機を使用して、本発明のペプチドおよびキメラペプチドを合成することができる。例えば、本明細書に参照により具体的に組み込まれている、Ｋａｕｍａｙａら、“Ｄｅ  Ｎｏｖｏ”  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４）、１３３-１６４頁に記載されている化学的な方法を使用することができる。例えば、ＨＥＲ−３エピトープを、その他のエピトープと共に同じ直鎖上に（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒｌｙ）合成して、キメラペプチドを形成することができる。Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を使用して、ペプチド合成を実施することができる。ペプチドおよびキメラペプチドは、任意の適切な様式で環状となすことができる。例えば、システイン残基を示差的に保護し、ヨウ素酸化を行い、水を添加して、Ａｃｍ基の除去を促進し、ジスルフィド結合を同時に形成する方法、および／またはシリルクロリド−スルホキシド法を使用して、ジスルフィド結合を得ることができる。
【０１１４】
また、無細胞翻訳系、およびエピトープまたはペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡ分子を使用しても、ペプチドおよびキメラペプチドを生成することができる。代わりに、エピトープまたはキメラペプチドは、宿主細胞に、それぞれのエピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターをトランスフェクトし、次いで、宿主細胞中でポリペプチドの発現を誘発することによって作製することもできる。組換え体の生成の場合には、エピトープ、キメラペプチドまたはそのバリアントをコードする配列の１つまたは複数を含む組換えコンストラクトを、従来法、例として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介型トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌａｄｉｎｇ）、弾道導入、または感染により、宿主細胞内に導入する。
【０１１５】
本発明のペプチドは、改変、例として、グリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化を含有することができるが、このことは、改変が、ペプチドの生物学的活性を破壊しない場合に限られる。その他の改変として、例えば、ペプチドの血清半減期を延長するために使用することができるＤ−アミノ酸またはその他のアミノ酸模倣物質の組込みが挙げられる。
【０１１６】
本発明のペプチドは、組合せとして調製することができ、この組合せは、疾患、例えば、癌のためのワクチンとして使用するために、２つ以上の本発明のペプチドを含む。ペプチドは、カクテルになしてもよく、または標準的な技法を使用して、相互にコンジュゲートさせてもよい。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができる。組合せ中のペプチドは、同じであっても、または異なっていてもよい。
【０１１７】
また、本発明は、本発明のペプチド（または前記ペプチドをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」および「バリアント」も包含すると解釈すべきであり、これらの突然変異体、誘導体およびバリアントは、１つまたは複数のアミノ酸が変化しているペプチドであり（または、前記アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す場合には、１つまたは複数の塩基対が変化している）、したがって、得られたペプチド（またはＤＮＡ）は、本明細書に列挙する配列と同一ではないが、本明細書に開示するペプチドと同じ生物学的特性を有する。
【０１１８】
本発明はまた、配列番号１〜７のうちの任意の１つまたは複数の配列を有するペプチドから選択される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列およびペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。その他の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野で公知であるように、重複するコドンに起因して、いくつかの代替のポリヌクレオチドが可能であるが、これらは、翻訳されたペプチドの生物学的活性は保持する。
【０１１９】
さらに、本発明は、本明細書に開示するペプチドに対して実質的な相同性を有するペプチドをコードする単離核酸も包含する。好ましくは、本発明のペプチドをコードする単離核酸のヌクレオチド配列は、「実質的に相同」、すなわち、本発明のペプチドをコードする単離核酸のヌクレオチド配列と、約６０％相同、より好ましくは、約７０％相同、さらにより好ましくは、約８０％相同、より好ましくは、約９０％相同、さらにより好ましくは、約９５％相同、さらにより好ましくは、約９９％相同である。
【０１２０】
本発明の範囲は、より短いおよびより長いペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、相同体、類似体、バリアント、誘導体および塩；ならびに１つまたは複数のアミノ酸または核酸の置換を有するペプチドおよびポリヌクレオチドの類似体；ならびに当技術分野で公知であるアミノ酸または核酸の誘導体、非天然のアミノ酸または核酸および合成のアミノ酸または核酸を包含するが、ただし、これらの改変は、元々の分子の生物学的活性を保存しなければならないことを明確に理解されたい。具体的には、本発明の原理に従って、活性なペプチドの任意の活性な断片、ならびに伸長体、コンジュゲートおよび混合物を開示する。
【０１２１】
本発明は、本明細書において記載したり、参照したりする核酸に対して相同であるあらゆる単離核酸を含むが、ただし、これらの相同なＤＮＡは、本明細書に開示するペプチドの生物学的活性を有すると解釈すべきである。
【０１２２】
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列を包含し、細胞を伴わない場合であってもまたは細胞を伴う場合であっても、ヌクレオチド配列をより安定にする、ＤＮＡまたはＲＮＡの化学的改変を含む、任意のその改変形態も包含することを、当業者であれば理解するであろう。また、ヌクレオチドの化学的改変を使用して、細胞がヌクレオチド配列を取り込む効率または細胞中でヌクレオチドが発現する効率を増強することもできる。本発明は、ヌクレオチド配列の改変のあらゆる組合せを企図する。
【０１２３】
さらに、当技術分野で周知である組換えＤＮＡの方法、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、上記、に記載されている方法等を使用する、本発明のタンパク質の突然変異体、誘導体またはバリアントの形態の生成のためには、任意の数の手順を使用することもできる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることによって、ペプチドまたはポリペプチド中にアミノ酸の変化を導入するための手順は、当技術分野で周知であり、また、これらおよびその他の論文にも記載されている。
【０１２４】
本発明のペプチドをコードする核酸を、適切なベクター、例えば、レトロウイルスベクター内に組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野で周知である。核酸、または核酸を有用に含有するベクターを、所望の細胞内に移入することができ、こうした細胞は、好ましくは、患者から得る。好都合なことに、本発明は、すぐに使用可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）組成物を提供し、この組成物により、患者自身の細胞（または別の哺乳動物自体の細胞）を迅速に改変して、優れた癌細胞死滅特性を有する改変細胞を迅速かつ容易に生成するのが可能になる。
【０１２５】
ベクター
その他の関連の態様では、本発明は、配列番号１-７からなる群から選択される配列を有するペプチドの１つまたは複数をコードする単離核酸を含む。
【０１２６】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドをコードする核酸配列を含み、この配列は、プロモーター／調節配列を含む核酸に作動可能に連結しており、したがって、後者の核酸は、好ましくは、前者の核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能である。したがって、本発明は、外因性ＤＮＡを細胞内に導入して、細胞中で外因性ＤＮＡを同時に発現させるための発現ベクターおよび方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているもの等を包含する。所望のポリヌクレオチドのベクター内への組込み、およびベクターの選択は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記、に記載されているように、当技術分野で周知である。
【０１２７】
ポリヌクレオチドを、いくつかのタイプのベクター内にクローニングすることもできる。しかし、本発明がいずれかの特定のベクターに限定されると解釈してはならない。代わりに、本発明は容易に入手可能であり、かつ／または当技術分野で周知である、非常に広範なベクターを包含すると解釈すべきである。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含む、ベクター内にクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。
【０１２８】
特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。多数の発現ベクター系が存在し、それらは、上記で論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む。原核生物ベクターおよび／または真核生物ベクターに基づく系を利用し、本発明と共に使用して、ポリヌクレオチドまたはそれらの同族のポリペプチドを生成することができる。多くのそのような系が、市販され、広く入手可能である。
【０１２９】
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することもできる。ウイルスベクターの技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）ならびにその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製開始点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する。（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。
【０１３０】
所望の本発明のヌクレオチド配列を発現させるためには、各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールを、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置付けるように機能させる。この最良の公知の例が、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーター、例として、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０遺伝子のプロモーターにおいては、開始部位に重なる別個の要素自体が、開始の場所を固定するのを支援する。
【０１３１】
追加のプロモーター要素、すなわち、エンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位から３０-１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近になって、いくつかのプロモーターが、開始部位の下流にも機能性の要素を含有することが示されている。プロモーター要素間の間隔は、多くの場合融通が利き、したがって、要素が、反転したまたは相互に移動した場合でも、プロモーターの機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）のプロモーターにおいては、活性が減退し始めるまでに、プロモーター要素間の間隔は、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターによって異なるが、個々の要素が協働してまたは独立に機能して、転写を活性化させることができるように見える。
【０１３２】
プロモーターは、遺伝子またはポリヌクレオチド配列に天然に付随するプロモーターであり得、これは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる。そのようなプロモーターを、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーも、ポリヌクレオチド配列に天然に付随するエンハンサーであり得、これは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する。代わりに、組換えまたは異種のプロモーターの制御下にポリヌクレオチドのコードセグメントを置くことによって、特定の利点が得られ、この場合のプロモーターは、ポリヌクレオチド配列にその天然の環境下では通例付随しないものを指す。また、組換えまたは異種のエンハンサーも、ポリヌクレオチド配列にその天然の環境下では通例付随しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、その他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに任意のその他の原核生物、ウイルスまたは真核生物細胞から単離したプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変化させる突然変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して、配列を生成することもでき、それらは、本明細書に開示する組成物に関連するＰＣＲ（商標）を含む（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号）。さらに、非核性のオルガネラ、例として、ミトコンドリア、葉緑体等内で配列の転写および／または発現を導く制御配列も同様に利用することができることも企図する。
【０１３３】
当然ながら、発現させるために選ばれた細胞型、オルガネラおよび生物中でＤＮＡセグメントの発現を有効に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要である。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合せの使用方法を知っており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２）を参照されたい。利用するプロモーターは、構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入するＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を導くのに適切な条件、例として、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な生成に好都合である条件下で有用なプロモーターであり得る。プロモーターは、異種性であっても、または内因性であってもよい。
【０１３４】
本明細書に提示する実験実施例で例示するプロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最早期プロモーターの配列である。このプロモーター配列は、強力な構成性のプロモーター配列であり、それに作動可能に連結している任意のポリヌクレオチド配列の高いレベルの発現を駆動することが可能である。しかしまた、その他の構成性プロモーターの配列も使用することができ、それらとして、これらに限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス最早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例として、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよび筋肉クレアチンプロモーターが挙げられる。さらに、本発明を、構成性プロモーターの使用に限定すべきでもない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。本発明では誘導性プロモーターを使用することによって、誘導性プロモーターが作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現を所望する場合にはオンにし、または発現を所望しない場合には発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、これらに限定されないが、メタロチオネインのプロモーター、糖質コルチコイドのプロモーター、プロゲステロンのプロモーターおよびテトラサイクリンのプロモーターが挙げられる。さらに、本発明は、組織特異的なプロモーターの使用も含み、こうしたプロモーターは、所望の組織中でのみ活性である。
【０１３５】
本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を評価するためには、細胞内に導入しようとする発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有して、ウイルスベクターによるトランスフェクションまたは感染を狙った細胞集団から発現している細胞を同定し、選択するのを促進することもできる。その他の実施形態では、選択マーカーを、別個のＤＮＡ小片上に載せ、コトランスフェクションの手順において使用することができる。選択マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて、宿主細胞中での発現を可能にし得る。有用な選択マーカーは、当技術分野で公知であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例として、ｎｅｏ等が挙げられる。
【０１３６】
レポーター遺伝子を使用して、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能を評価する。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が、当技術分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織中に存在することも、レシピエントの生物または組織が発現することもなく、何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が明らかになるタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡをレシピエント細胞内に導入した後の適切な時期にアッセイする。
【０１３７】
適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含むことができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉら、２０００年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９：７９-８２頁を参照されたい）。適切な発現系が周知であり、それらを、周知の技法を使用して調製しても、または商業的に得てもよい。内部に欠失を有するコンストラクトを、特有の内部制限部位を使用して、または特有でない制限部位の部分消化により生成することができる。次いで、コンストラクトを、ｓｉＲＮＡのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現の高いレベルを示す細胞内にトランスフェクトすることができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現を示す、最低限の５’隣接領域を有するコンストラクトを、プロモーターであると同定する。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーターが駆動する転写を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）能力について、薬剤を評価するために使用することができる。
【０１３８】
ワクチン
一実施形態では、本発明の対象は、本発明のペプチドを含むワクチンである。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象の癌の特定の予防または治療に、特定のペプチドの任意の組合せを提供することができる。
【０１３９】
本発明のワクチンは、抗原特異的Ｔ細胞応答および／または高いタイターの抗体応答を誘導することができ、それにより、抗原を発現する癌もしくは腫瘍に向けられた、またはそれに対して反応性である免疫応答が誘導または惹起される。いくつかの実施形態では、誘導または惹起された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性の両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または惹起された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌を含むことができる。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の対象は、抗癌ワクチンである。ワクチンは、１つまたは複数の癌抗原を含むことができる。ワクチンは、腫瘍の成長を阻止することができる。ワクチンは、腫瘍の成長を低下させることができる。ワクチンは、腫瘍細胞の転移を阻止することができる。癌抗原に応じて、ワクチンを標的化して、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、メラノーマ、血液癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、再発性呼吸器乳頭腫、肛門癌、子宮頸癌、脳腫瘍等を治療することができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、ワクチンは、（１）望ましい抗体を生成するＢ細胞応答を介する液性免疫；（２）腫瘍細胞を攻撃し、死滅させる細胞傷害性Ｔリンパ球、例として、ＣＤ８＋（ＣＴＬ）の増加；（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加；ならびに（４）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αを介する炎症性応答の増加、または好ましくは、上記の全てを誘導することによって、腫瘍細胞の成長の一掃または阻止を媒介することができる。ワクチンは、無腫瘍生存を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％および４５％増加させることができる。ワクチンは、免疫化の後に、腫瘍量を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％および６０％低下させることができる。
【０１４２】
ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与した対象における細胞性免疫応答を、約５０倍−約６０００倍、約５０倍−約５５００倍、約５０倍−約５０００倍、約５０倍−約４５００倍、約１００倍−約６０００倍、約１５０倍−約６０００倍、約２００倍−約６０００倍、約２５０倍−約６０００倍、または約３００倍−約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与した対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍または６０００倍増加させることができる。
【０１４３】
ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）のレベルと比較して、ワクチンを投与した対象中のＩＦＮ−γレベルを、約５０倍−約６０００倍、約５０倍−約５５００倍、約５０倍−約５０００倍、約５０倍−約４５００倍、約１００倍−約６０００倍、約１５０倍−約６０００倍、約２００倍−約６０００倍、約２５０倍−約６０００倍、または約３００倍−約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与しなかった対象中のＩＦＮ−γのレベルと比較して、ワクチンを投与した対象中のＩＦＮ−γのレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍または６０００倍増加させることができる。
【０１４４】
本発明のワクチンは、有効なワクチンに必要な特徴を有し、例えば、本発明のワクチンは、安全であり、したがって、ワクチン自体は疾病も死亡も引き起こさず；疾病に対する防御をもたらし；中和抗体を誘導し；防御性Ｔ細胞応答を誘導し；投与が容易であり、副作用がほとんどなく、生物学的に安定であり、１用量当たりのコストが低い。ワクチンは、これらの特徴の一部または全部を、下記で論じるように癌抗原を含有することによって達成することができる。
【０１４５】
抗原取り込み（抗原パルス添加）免疫細胞の生成
本発明は、本発明の抗原または本発明のその他のペプチドに曝露させてある、またはそうでなければそれを「パルス添加」してある細胞を含む。例えば、ＡＰＣ、例としてＤＣは、例えば、抗原の存在下のｅｘ  ｖｉｖｏで培養することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原を取り込んだ状態になり得る。
【０１４６】
また、ＡＰＣを抗原に曝露させる様式で、ＡＰＣに「パルス添加する」ことができ、この曝露は、ＡＰＣの表面上にその抗原を提示するのを促進するのに十分な時間行われることも、当業者であれば容易に理解するであろう。例えば、ＡＰＣを、抗原性ペプチドとして既知である、小型のペプチド断片の形態の抗原に曝露させることができ、これらの断片は、ＡＰＣの外部上に直接「パルス添加される」（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４年）；またはＡＰＣを、全タンパク質またはタンパク質粒子と共にインキュベートすることができ、次いで、これらのタンパク質は、ＡＰＣにより摂取される。これらの全タンパク質は、ＡＰＣにより小型のペプチド断片に消化され、最終的に、ＡＰＣ表面に運ばれ、ＡＰＣ表面上に提示される（Ｃｏｈｅｎら、１９９４年）。ペプチドの形態の抗原を、本明細書に記載する標準的な「パルス添加」の技法により、細胞に曝露させることができる。
【０１４７】
いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、外来抗原または自己抗原の形態の抗原は、抗原の免疫原性の形態を保持するために、本発明のＡＰＣによりプロセシングされる。抗原の免疫原性の形態とは、抗原が断片化によりプロセシングされて、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞により認識され、それらを賦活することができる抗原の形態が生成されることを意味する。好ましくは、そのような外来抗原または自己抗原は、ＡＰＣによりペプチドにプロセシングされるタンパク質である。ＡＰＣにより生成される関連するペプチドを、抽出し、精製して、免疫原性組成物として使用することができる。また、ＡＰＣによりプロセシングされたペプチドを使用して、ＡＰＣによりプロセシングされたタンパク質に対する寛容を誘導することもできる。
【０１４８】
抗原を取り込んだＡＰＣは、別の表現によれば、本発明の「パルス添加したＡＰＣ」として知られ、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでＡＰＣを抗原に曝露させることによって生成される。ＡＰＣにｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルス添加する場合には、ＡＰＣを、培養皿上に蒔き、抗原がＡＰＣに結合するのを可能にするのに十分な量で十分な期間にわたり、抗原に曝露させることができる。抗原のＡＰＣへの結合を達成するのに必要な量および時間は、当技術分野で公知である方法または本明細書に開示するその他の方法を使用することによって決定することができる。当業者に公知のその他の方法、例えば、イムノアッセイまたは結合アッセイを使用して、抗原への曝露の後のＡＰＣ上の抗原の存在を検出することができる。
【０１４９】
本発明のさらなる実施形態では、ＡＰＣによる特定のタンパク質の発現を可能にするベクターを、ＡＰＣにトランスフェクトすることができる。次いで、ＡＰＣが発現するタンパク質は、プロセシングされ、細胞表面上に提示され得る。次いで、トランスフェクトされたＡＰＣを免疫原性組成物として使用して、ベクターがコードするタンパク質に対する免疫応答を発生させることができる。
【０１５０】
本明細書の他の箇所で論じたように、免疫原性応答が所望されるタンパク質をコードし発現する特定のポリヌクレオチドを含むように、ベクターを調製することができる。好ましくは、レトロウイルスベクターを使用して、細胞を感染させる。より好ましくは、アデノウイルスベクターを使用して、細胞を感染させる。
【０１５１】
別の実施形態では、ウイルスベクターを、ＡＰＣ上の受容体により認識されるタンパク質またはその部分をコードするように改変することによって、ベクターを標的のＡＰＣに差し向けることができ、それによって、ベクターがＡＰＣ受容体を占有すると、ベクターのエンドサイトーシスが始まって、ウイルスベクターの核酸がコードする抗原がプロセシングされ、提示されるのが可能になる。ウイルスが送達する核酸は、ウイルスにとってネイティブであり得、この核酸は、ＡＰＣ上で発現する場合でも、ウイルスタンパク質をコードし、次いで、このウイルスタンパク質は、プロセシングされ、ＡＰＣのＭＨＣ受容体上に提示される。
【０１５２】
本明細書が企図するように、種々の方法を使用して、ポリヌクレオチドを宿主細胞内にトランスフェクトすることができる。それらの方法として、これらに限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、コロイド分散液系（すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む、脂質に基づく系）が挙げられる。これらの方法は、当技術分野では理解されており、公開されている文献に記載されており、したがって、当業者がこれらの方法を実施することが可能である。
【０１５３】
別の実施形態では、別の方法により、抗原を取り込んだＡＰＣを生成するために、抗原をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター中にクローニングすることができ、このベクターをＡＰＣ内に導入することが可能になる。核酸を細胞内に導入する種々のタイプのベクターおよび方法は、入手可能な公開文献中で論じられている。例えば、物理的、化学的または生物学的な手段により、発現ベクターを宿主細胞内に移入することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入によりパルス添加した細胞が得られることは容易に理解される。
【０１５４】
本発明は、ＡＰＣにパルス添加するための種々の方法を含み、それらとして、これに限定されないが、ＡＰＣに、タンパク質、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの形態の抗原全体を取り込むことが挙げられる。しかし、本発明は、ＡＰＣにパルス添加するために使用する抗原の特定の形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、本発明は、抗原を取り込んだＡＰＣを生成するための、当技術分野で公知のその他の方法を包含する。好ましくは、ＡＰＣに、定義された抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトする。適切なプライマー、および転写反応とカップリングさせた逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、配列が既知である遺伝子産物に対応するｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に生成することができる。パルス添加したＡＰＣを生成する場合、ＡＰＣのｍＲＮＡを用いるトランスフェクションにより、抗原を取り込むその他の技法を上回る利点が得られる。例えば、微小量の組織、すなわち、腫瘍組織からＲＮＡを増幅することが可能であることは、ＡＰＣを使用して、多数の患者にワクチン接種を行うことにつながる。
【０１５５】
抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原組成物が、抗原に対する免疫応答を、細胞、組織または哺乳動物（例えば、ヒト）中で誘導しなければならない。本明細書で使用する場合、「免疫学的組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）、または抗原もしくは細胞構成成分を発現もしくは提示する細胞を含むことができる。特定の実施形態では、抗原組成物は、本明細書に記載する任意の抗原の全部もしくは一部、またはその免疫学的機能上の均等物を含むまたはコードする。その他の実施形態では、抗原組成物は、追加の免疫賦活剤またはそのような薬剤をコードする核酸を含む混合物をなす。免疫賦活剤は、これらに限定されないが、追加の抗原、免疫調節物質、抗原提示細胞またはアジュバントを含む。その他の実施形態では、追加の薬剤の１つまたは複数が、抗原または免疫賦活剤に、任意の組合せで共有結合する。特定の実施形態では、抗原組成物は、ＨＬＡアンカーモチーフのアミノ酸にコンジュゲートされる、またはそれらを含む。
【０１５６】
ワクチンは、本明細書が企図するように、核酸および／または細胞構成成分のその組成が変化し得る。非限定的な例ではまた、抗原をコードする核酸は、アジュバントと共に製剤化することもできるであろう。もちろん、本明細書に記載する種々の組成物は追加の構成成分をさらに含むことができることが理解されるであろう。例えば、１つまたは複数のワクチン構成成分を、脂質またはリポソーム中に含めることができる。別の非限定的な例では、ワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含むことができる。本発明のワクチンおよびその種々の構成成分は、本明細書に開示する任意の方法により調製および／もしくは投与することができ、またはこのことは、当業者であれば、本開示に照らして理解するであろう。
【０１５７】
本発明の抗原組成物を、当技術分野で周知である方法により作製することができることが理解され、そうした方法には、これらに限定されないが、固相合成により化学合成し、ＨＰＬＣにより化学反応のその他の生成物から精製して取り出す方法、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの翻訳系においてもしくは生きている細胞中で、本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を発現させることによって生成する方法がある。さらに、抗原組成物は、生物学的試料から単離した細胞構成成分を含むこともできる。抗原組成物は、単離し、十分に透析して、１つまたは複数の望ましくない低分子量の分子を除去すること、および／または所望のビヒクル内に凍結乾燥して、製剤の即時使用性を高める。ワクチン構成成分中にもたらす追加のアミノ酸、突然変異、化学的改変等があれば、それらは、好ましくは、抗体がエピトープ配列を認識するのを実質的に妨げないことをさらに理解されたい。
【０１５８】
抗原提示細胞療法
本発明は、本発明のペプチドを表面上に提示するＡＰＣ（例えば、樹状細胞；ＤＣ）の集団を生成し、続いて、その集団を療法において使用する方法を包含する。そのような方法は、患者から入手した細胞の試料に対して、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。したがって、このようにして生成したＡＰＣは、癌の治療または予防において使用することができる医薬剤を形成する。これらの細胞は、個体の免疫系により受容されるはずであり、というのは、そうした細胞は、その個体に由来するからである。このようにして生成された細胞を、細胞を当初得た個体に送達し、こうして、本発明の治療の実施形態を形成する。
【０１５９】
ＤＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働く多能性単核球に由来する。ＤＣは、末梢組織中に偏在し、そこで、抗原を捕捉するように待機している。ＤＣは、抗原を捕捉すると、抗原を小型のペプチドにプロセシングし、二次リンパ器官に向かって移動する。ＤＣが抗原ペプチドをナイーブＴ細胞に提示するのは、リンパ器官の内部においてであり、ペプチドの提示により、Ｔ細胞分化を偏向させるシグナルカスケードが開始される。ＤＣは、曝露されると、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの結合性ペプチドに結合した抗原分子を提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ活性化させる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、２４５〜２５２頁；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ  ４４９：４１９〜４２６頁；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：３１３３〜３１４６頁；Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２００６年、Ｂｌｏｏｄ  １０８：２６５５〜２６６１頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：６１１〜６１４頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：２５７〜２７２頁）。
【０１６０】
ＤＣは、適応免疫応答の誘導、協調および調節に関与し、また、免疫系のエフェクターの自然アームと適応アームとの間の連絡を統合するようにも働く。これらの特徴から、ＤＣが、免疫療法のための強力な候補になっている。ＤＣは、マクロピノサイトーシスおよび受容体媒介性エンドサイトーシスにより環境を見極める特有の能力を有する（Ｇｅｒｎｅｒら、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１５５〜１６４頁；Ｓｔｏｉｔｚｎｅｒら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５７：１６６５〜１６７３頁；Ｌａｎｚｅｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３４８〜３５４頁；Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０７（５７１５）：１６３０〜１６３４頁）。
【０１６１】
また、ＤＣは、その抗原提示能力を増強するために、成熟シグナルも必要とする。追加の成熟シグナル、例として、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌまたはカルシウムシグナル伝達物質を提供することによって、ＤＣは、表面分子、例として、ＣＤ８０およびＣＤ８６（第２のシグナル分子としてもまた公知である）の発現を上方制御する（Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３８２３〜３８３７頁；Ｂｅｄｒｏｓｉａｎら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：３１１〜３２０頁；Ｍａｉｌｌｉａｒｄら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、５９３４〜５９３７頁；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４２３８〜４２４７頁；Ｊｉｎら、２００４年、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：９３〜１０３頁）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含むサイトカインの混合物が、ＤＣを成熟させる能力を有することが確立されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｒｅｓ．２９２：３２５〜３３２頁）。また、ＤＣを、抗原をパルス添加する前に、カルシウムイオノフォアを用いて成熟させることもできる。
【０１６２】
ＤＣは、病原体を認識する受容体、例として、ＰＫＲおよびＭＤＡ−５（Ｋａｌａｌｉら、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：２６９４〜２７０４頁；Ｎａｌｌａｇａｔｌａら、２００８年、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．５（３）：１４０〜１４４頁）に加えて、また、トール様受容体（ＴＬＲ）として公知である一連の受容体も含有し、これらの受容体もまた、病原体に由来する危険を感知することが可能である。これらのＴＬＲが刺激されると、ＤＣ中で、一連の活性変化が誘導され、これは、成熟およびＴ細胞シグナル伝達をもたらす（Ｂｏｕｌｌａｒｔら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７（１１）：１５８９〜１５９７頁；Ｋａｉｓｈｏら、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３７３〜３８５頁；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５２８）：２５３〜２５６頁；Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉら、２００５年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（８）：７６９〜７７６頁）。ＤＣは、細胞媒介性応答の種々のアーム、例として、ナチュラルキラーγ−δ  Ｔ細胞およびα−β  Ｔ細胞を活性化させ、その作用を延長させることができ、ＤＣは、活性化させたら、それらの免疫化能力を保持させる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５〜２５２頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：２５７〜２７２頁）。
【０１６３】
また、本発明は、１つまたは複数の本発明のペプチドを使用して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法も提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、抹消血単核球から樹状細胞を誘導し、次いで、それらを、１つまたは複数の本発明のペプチドと接触させること（賦活）によって、ＡＰＣを誘導することができる。本発明のペプチドを、それらを必要とする哺乳動物に投与すると、本発明のペプチドが固定されたＡＰＣが、哺乳動物の体内で誘導される。代わりに、本発明のペプチドをＡＰＣに固定してから、それらの細胞を、ワクチンとして対象に投与することもできる。例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの投与は、哺乳動物からＡＰＣを収集するステップと、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるステップとを含むことができる。
【０１６４】
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と１つまたは複数の本発明のペプチドとの間で形成された複合体を提示するＡＰＣも提供する。ＡＰＣは、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドとの接触により得られるが、好ましくは、治療および／予防を施そうとする対象に由来し、ワクチンとして、単独で、またはペプチドを含む、その他の薬物、エキソソームもしくは本発明のＴ細胞と組み合わせて投与することができる。
【０１６５】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を賦活するための免疫療法の状況で、ＡＰＣ、好ましくは、ＤＣを賦活するための組成物および方法を提供する。ＤＣが、抗腫瘍免疫を、それを必要とする哺乳動物において賦活させるように、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを用いてＤＣを賦活させ、ＤＣの成熟を引き起こすことによって、ＤＣを操作することができる。
【０１６６】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＴ細胞応答を誘導するための方法を含む。この方法は、ＡＰＣ、例として、ＤＣを投与するステップを含み、この場合、ＡＰＣを本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せと接触させることによって、ＡＰＣを活性化させてあり、それにより、ペプチドを取り込んだＡＰＣとなっている。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、とりわけ、所望のＴ細胞を拡大増殖する目的、Ｔ細胞を活性化させる目的、特定のＴ細胞を拡大増殖する目的で生成した新規ＡＰＣ、およびそれらの目的でそうしたＡＰＣを使用するための方法に関し、さらに、本発明のペプチドを取り込んだＡＰＣおよびペプチドを使用するＴ細胞の拡大増殖および賦活に関係がある、治療のための多数の使用にも関する。場合によっては、ＯＣＴ４により賦活させたＤＣを使用して、ペプチドに特異的なＴ細胞を拡大増殖することもできる。
【０１６８】
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せと接触させたＤＣを使用して、ペプチドに特異的なＴ細胞の拡大増殖を誘導することができるという発見に関する。当業者であれば、本発明のペプチドと接触させたＤＣは、プライムされていると、または別の表現によれば、ペプチドを取り込んだとみなされることを認識するであろう。本発明の、ペプチドを取り込んだＤＣは、所望の抗原、例えば、ＨＥＲ−３に対する免疫応答を惹起するのに有用である。したがって、本発明の、ペプチドを取り込んだＤＣを使用して、ＨＥＲ−３の無秩序な発現と関連がある疾患を治療することができる。
【０１６９】
疾患を治療するための方法
本発明はまた、病原性微生物が引き起こす疾患、自己免疫障害および／または過剰増殖性疾患を治療および／または予防する方法も包含する。
【０１７０】
本発明を使用することによって治療または予防することができる疾患は、ウイルス、細菌、酵母、寄生生物、原生動物、癌細胞等が引き起こす疾患を含む。本発明の医薬組成物を、全般的な免疫増強剤（ＤＣを活性化させる組成物または系）として使用することができ、それ自体が、疾患の治療における有用性を有する。本発明の医薬組成物を利用して治療および／または予防することができる例示的な疾患として、これらに限定されないが、ウイルスを病因とする感染、例として、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水疱、パピローマウイルス等；または細菌を病因とする感染、例として、肺炎、結核、梅毒等；または寄生生物を病因とする感染、例として、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症等が挙げられる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物（本発明の形質導入されたＤＣ、発現ベクター、発現コンストラクト等）を使用して治療または予防することができる前腫瘍状態または過形成状態として、これらに限定されないが、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房の病変およびその他等の前腫瘍状態または過形成状態が挙げられる。
【０１７２】
本発明の組成物を使用して治療することができる癌として、これらに限定されないが、原発性または転移性のメラノーマ、腺癌、扁平上皮細胞癌、腺扁平上皮細胞癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、胃腸癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸癌等が挙げられる。
【０１７３】
本発明のＤＣ活性化系を使用して治療することができるその他の過剰増殖性疾患として、これらに限定されないが、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム動脈硬化、前腫瘍状態の病変（例として、腺腫性の過形成および前立腺上皮内の新生物）、上皮内癌、口腔毛状白板症または乾癬が挙げられる。
【０１７４】
本発明の組成物を使用して治療することができる自己免疫障害として、これらに限定されないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸促迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、アテローム動脈硬化、気管支炎、胆のう炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群および自己免疫性甲状腺炎；癌、血液透析および体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、原生動物およびゼン虫による感染；ならびに外傷が挙げられる。
【０１７５】
治療の方法において、本発明の組成物の投与は、「予防」のためまたは「治療」のためのいずれであってもよい。本発明の組成物は、予防のために提供する場合には、任意の症状に先立って提供するが、特定の実施形態では、１つまたは複数の症状が発症してから、ワクチンを提供して、さらなる症状が発症するのを予防する、または出現している症状が悪化するのを予防する。組成物の予防のための投与は、任意の後の感染または疾患を予防するまたは寛解させるのに役立つ。医薬組成物は、治療のために提供する場合には、感染または疾患の症状が発症した時点またはその後に提供する。したがって、本発明は、疾患を引き起こす物質への曝露が予期されるもしくは疾患状態が生じる前にまたは感染もしくは疾患が始まった後に提供することができる。
【０１７６】
組成物の有効量は、免疫応答を増強する、選択されたこうした結果を達成する量であり、そのような量は、当業者であれば日常的な事項として決定することができるであろう。例えば、癌または病原体に対する免疫系の不全を治療するための有効量は、抗原への曝露により、免疫系の活性化を引き起こして、抗原特異的免疫応答を発生させるのに必要な量であろう。この用語はまた、「十分な量」と同義でもある。
【０１７７】
いずれの特定の適用例の場合の有効量も、治療される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、および／または疾患もしくは状態の重症度等の因子によって変化させることができる。当業者であれば、本発明の特定の組成物の有効量を、過度の実験を必要とすることなく経験的に決定することができる。
【０１７８】
ワクチン製剤
本発明は、免疫療法において使用するのに適切なワクチン製剤をさらに含む。特定の実施形態では、ワクチン製剤を、疾患、例として、癌および感染性疾患を予防および／または治療するために使用する。一実施形態では、癌を予防および／または治療するための本発明に従うワクチンの患者への投与を、癌を除去するための外科的な手順の前または後、癌を治療するための化学療法の手順の前または後、および癌を治療するための放射線療法の前または後に、ならびにそれらを任意に組み合わせて行うことができる。その他の実施形態では、ワクチン製剤は、別の組成物または医薬製品と同時にまたは組み合わせて患者に投与することができる。本発明はまた、癌を有さないが、癌を発症するリスクがある可能性があるであろう個体において癌を予防するためにも使用することができることを理解すべきである。
【０１７９】
本発明に従って調製される癌ワクチンの投与は、癌ワクチンの抗原を形成する部分の選択によってある程度決定される癌の予防または治療に広く適用できる。本発明の実行手順に従って適切に治療することができる癌は、非限定的に、肺、乳房、卵巣、子宮頚部、結腸、頭部および頸部、膵臓、前立腺、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、食道、脳、精巣、子宮の癌、ならびに種々の白血病およびリンパ腫を含む。
【０１８０】
一実施形態では、本発明に従うワクチンは、治療しようとする腫瘍または癌細胞に由来し得る。例えば、肺癌の治療においては、肺癌ワクチンを生成するために、本明細書上記の記載に従って肺癌細胞が処理されるであろう。同様に、乳癌ワクチン、結腸癌ワクチン、膵臓癌ワクチン、胃癌ワクチン、膀胱癌ワクチン、腎臓癌ワクチン等も、免疫治療剤として生成され、ワクチンの生成源となった腫瘍または癌細胞を予防および／または治療するための実行手順に従って利用される。
【０１８１】
別の実施形態ではまた、記述したように、哺乳動物に影響を及ぼす種々の感染性疾患を治療するために、病原体が培地内に排出した適切な抗原を収集することによって、本発明に従うワクチンを調製することもできるであろう。同じ疾患を引き起こす異なる多様な生物によって発現される免疫原性および防御性抗原のタイプが異種混交であるため、異なる重要な抗原を発現する生物のプールからワクチンを調製することによって、多価ワクチンを調製することができる。
【０１８２】
本発明の別の実施形態では、ワクチンを、鼠径部リンパ節内への節内注射により投与することができる。代わりに、およびワクチンの標的に応じて、ワクチンを、治療される患者の四肢、腕および脚に皮内または皮下投与することもできる。このアプローチは一般に、メラノーマの場合にもその他の癌の場合にも満足なものになるが、感染性疾患の予防または治療を含む、その他の投与経路、例として、筋肉内または血流内経路もまた使用することができる。
【０１８３】
さらに、ワクチンをアジュバントおよび／または免疫調節物質と一緒に投与して、ワクチンの活性および患者の応答をブーストすることもできる。そのようなアジュバントおよび／または免疫調節物質は、当業者により理解されており、入手可能な公開文献に分かり易く記載されている。
【０１８４】
本明細書が企図するように、生成されるワクチンのタイプに応じて、所望により、細胞を大量に成長させるのに適切なバイオリアクターもしくは発酵槽またはその他のそのような槽もしくはデバイスで細胞を培養することによって、ワクチンの生成をスケールアップことができる。そのような装置においては、培養培地から任意の材料または抗原を、そのような材料または抗原が培養培地中で分解する前に回収するために、培養培地は、定期的、頻繁または連続的に収集されるであろう。
【０１８５】
ワクチンまたは抗原を含有するデバイスまたは組成物であって、本発明に従って生成し、回収し、持続性または間欠性の放出に適切であるデバイスまたは組成物は、所望により実際に、体内に埋め込み、または身体に外用適用して、体内にそのような材料を比較的緩慢にまたは決められた時間で放出させることができるであろう。
【０１８６】
ワクチンの調製におけるその他のステップは、特定のワクチンの要件を満たすための個別化であり得る。当業者であれば、そのような追加のステップを理解するであろう。例えば、特定の収集した抗原性の材料を濃縮し、場合によっては、洗剤を用いて処理し、超遠心して、移植アロ抗原を除去することができる。
【０１８７】
疾患の診断および治療のためのバイオマーカーとしてのＨＥＲ３発現
別の実施形態において、ＨＥＲ３発現は、バレット食道および高度異形性（ＨＧＤ）を有する患者における潜在性侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立ち得る。さらに、いくつかの患者において胃食道癌の二次予防をもたらすことができる、ＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とするための治療薬が本明細書中に企図される。
【０１８８】
本明細書に記載するこれらの方法は決して、全てを包括するものではなく、特定の適用例に適するさらなる方法が当業者には明らかになるであろう。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知である化合物から類推することによって、より正確な近似値を求めることもできる。
【０１８９】
＜実験実施例＞
本発明をさらに、以下の実験実施例を参照することにより、詳細に記載する。これらの実施例は、例証の目的に限って提供し、別段の特定がない限り、本発明を制限する意図はない。したがって、本発明は、いかなる場合であっても以下の実施例に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、本明細書に提供する教示の結果として明らかになるあらゆる変更形態を包含すると解釈すべきである。
【０１９０】
さらなる説明がなくても、当業者であれば、前記の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製し、利用すること、および請求する方法を実行することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するのであって、いかなる場合であっても本開示の残りの部分を制限すると解釈してはならない。
【実施例１】
【０１９１】
乳癌およびその他の固形癌を引き起こすその他の受容体チロシンキナーゼに対するペプチドワクチンの創出
ＢＲＣＡ突然変異の保有者と指定された患者に対する代替の療法を開発するために、実験を設計した。すなわち、両側乳房切除術の代替を求めており、乳癌の遺伝学的リスクがあるより若年の患者の必要性が満たされていない。
【０１９２】
乳癌遺伝子突然変異ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２を有する女性は、７０％の、乳癌を発症する生涯リスクを有し、ＢＲＣＡ１突然変異の保有者はしばしば、三種陰性乳癌を発症する。この群のためのワクチンを開発し、免疫誘導治験においてそれらの安全性を評価するために、実験を設計した；これは、乳癌の一次的な予防のためのワクチン接種の、これまでで最初の試みである。また、ＢＲＣＡ２突然変異の保有者も含めて、エストロゲン受容体−陽性乳癌を、本発明の多価ワクチンを使用して予防することができるかを観察する。
【０１９３】
乳癌中の受容体チロシンキナーゼの発現、およびＢＲＣＡ突然変異の保有者からのＤＣＩＳを研究するために、実験を設計した。ＢＲＣＡ突然変異の保有者からの腫瘍は頻繁に、ｃ−ＭＥＴ癌遺伝子およびＨＥＲ−３を早くから過剰発現し、一方、非突然変異または孤発性の患者からの腫瘍は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を発現することが観察された。このことは重要である；というのは、孤発性およびＢＲＣＡ突然変異の保有者ためのワクチンを開発するために使用することができる腫瘍免疫療法のための標的が、本明細書に提示する開示に基づいて、今や知られるようになったからである。これは、最初の、際立った特徴であり、予防のために免疫応答を使用する標的とすることができる。したがって、本発明は、ワクチンを開発するための組成物および方法、ならびに両側乳房切除術の代替としての予防のためのそれらの使用を含む。
【０１９４】
ペプチドワクチンの創出
ＨＥＲファミリーは、４つの関連するシグナル伝達分子、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなり、これらは、多様な癌に関与する。ＨＥＲ２の過剰発現が、乳癌の２０％〜３０％において見出されることは公知である。本明細書に提示する結果は、その他のＨＥＲファミリーメンバーが、早期および浸潤性の両方の乳癌、ならびにその他の癌に関与することを示している。例えば、ＨＥＲ１は、少数の乳癌上に発現し、それらの癌は一般に、三種陰性である。ｃ−ＭＥＴは、多くの癌の再発に関与する増殖因子受容体であり、この受容体は、ＨＥＲ３を活性化させる。ＨＥＲ３は、結腸、前立腺、乳房およびメラノーマにおいて過剰発現する。ＨＥＲ３は、多数のＤＣＩＳ病変および乳癌において発現する。ＨＥＲ２ワクチンを投与された一部の患者において、ＨＥＲ３を、手術時に残余のＤＣＩＳ中に検出する場合がある。これらの知見の結果として、乳癌において、ＨＥＲ２に加えて、これらの分子を標的とする可能性は有益であると考えられる。
【０１９５】
ＨＥＲ３に由来する免疫原性ペプチドが同定されており（図１および図２）、これらを以下に示す：
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）；
ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）；
ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）；
ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；
ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；
ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；および
ｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）。
【０１９６】
本明細書に提示する結果は、これらのペプチドが、多くの患者にわたってＣＤ４Ｔ細胞を活性化させることができることを示している。ペプチドを樹状細胞にパルス添加し、Ｔ細胞を、ＨＥＲ３を認識するように教育することができる。ＨＥＲ３は、三種陰性乳癌中で発現し、ＥＲ−陽性乳癌において、抗エストロゲン剤に対する抵抗性をもたらす恐れがある。ＨＥＲ３はまた、メラノーマ、肺癌、結腸癌、前立腺癌および転移性脳腫瘍を含む、その他の癌においても発現する。いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、分子の細胞内部分に由来するペプチドも好都合であり得る。
【０１９７】
本明細書に提示する開示に基づけば、受容体チロシンキナーゼ分子であるＨＥＲ１およびｃ−ＭＥＴについての免疫原性ペプチドを、ＨＥＲ３についての免疫原性ペプチドを同定した手順に基づいて、スクリーニングし、同定することができる。本発明の免疫原性ペプチドを使用して、乳癌およびその他の癌のための多価の予防ワクチンを調製することができる。
【０１９８】
本明細書に提示する結果は、乳癌におけるＨＥＲ２のシスタータンパク質の役割の同定を示している。これらのシスタータンパク質は有効な標的となり得、その他の固形腫瘍のためワクチンを開発することができる。ＨＥＲ１およびＨＥＲ３を標的とするのに使用することができるペプチドを開発するに至った。具体的には、ＤＣＩＳにおいて、患者中の特異的な抗ＨＥＲ１応答、抗ＨＥＲ２応答および抗ＨＥＲ３応答を、ワクチン接種の前および後に同定するに至り、このことは、癌を早期に予防するまたはＤＣＩＳを有する女性を治療するために使用することができる多価ワクチンの開発を支援する。本発明の組成物は、これらに限定されないが、結腸癌、メラノーマ、脳腫瘍、肺癌、卵巣癌およびその他の腫瘍を含む、その他の癌を治療するのに有用である。
【０１９９】
メラノーマ
メラノーマは、早期に発見されないと命にかかわる恐れがある侵襲性の皮膚癌である。マウスにおいて、標準的な樹状細胞ワクチンを使用して、実験を実施し、約７０％のメラノーマを引き起こす、突然変異させたタンパク質（ＢＲＡＦ）を呈するように、樹状細胞を工学的に操作した。これらの樹状細胞を用いてワクチン接種すると、マウスは、メラノーマ細胞を用いたチャレンジから防御され、このことは、メラノーマのためのワクチンの開発が可能であることを示している。いかなる特定の理論によっても拘束される意図はないが、ＢＲＡＦおよびＨＥＲ３を組み合わせた標的化は、メラノーマ、さらに、これらに限定されないが、固形癌、例として、結腸癌、膵臓癌および肺癌ならびにその他の胃腸腫瘍を含む、その他の癌を治療するのに有用であり得る。
【０２００】
さらに、メラノーマ腫瘍は、Ｂ細胞を使用して、免疫監視を回避することも示されており、したがって、特定のＢ細胞を排除することによって、療法を改善することができると考えられる。Ｔｈ１型応答に対する腫瘍の微小環境を変化させることが、回避を阻止するのを支援することができるかどうかを評価するために、実験を設計することができる。
【０２０１】
場合によっては、本発明のワクチンを使用して、蔓延してしまったメラノーマを治療することもできる。場合によっては、本発明は、しばしば薬物療法に対して抵抗性になる、残存する細胞を排除するための療法も提供する。
【実施例２】
【０２０２】
ワクチン接種において利用するために、腫瘍抗原から、ＭＨＣクラスＩＩ−無差別性ＣＤ４＋ペプチドを同定するための新規の戦略
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は歴史的には抗腫瘍免疫の主要なエフェクターであるとみなされていたが、種々の腫瘍のタイプにおいて、ＣＴＬ応答を、ＣＤ８＋ワクチンを用いてブーストするだけだと、予測不能な臨床結果を生じており、恐らくこれは、ＣＴＬが、適切なＣＤ４＋Ｔリンパ球の助けがない場合には、最適以下にしか機能しないからであろう。ＣＤ４＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞は、ＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−αを分泌して、腫瘍の老化およびアポトーシスを誘導する。しかし、癌ワクチンを構築する際にＣＤ４＋エピトープを良好に組み込み、耐久性のある、抗原特異的ＣＤ４＋免疫を発生させることは、課題として残っている。ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を候補「発癌ドライバー」腫瘍抗原として使用して、ワクチンコンストラクト中に包含させる目的で、クラスＩＩ無差別性を示し、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４＋免疫を発生させる免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するために実験を実施した。
【０２０３】
これらの実験で利用した材料および方法を、ここに記載する。
【０２０４】
材料および方法
抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１細胞性免疫を発生させるために、ＨＥＲ３のＥＣＤを腫瘍抗原として使用して、免疫原性、クラスＩＩ−無差別性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定するように、実験を設計した。
【０２０５】
プロトコールの概説
５つのアミノ酸だけオーバーラップする、１５マーの長さのペプチドのライブラリーを、ＨＥＲ３  ＥＣＤから作り出した。これらのペプチドを、ドナーから得られた単核球由来ＤＣ上にパルス添加し、１型に偏向した（ＤＣ１；ＩＬ−１２を分泌する）表現型に成熟させた。ＤＣ１を収集し、我々のＤＣＩＳワクチン研究に属し、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答を有することが分かっている対象から得、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞と共に同時培養した。１０個のペプチドの大規模なプールを使用し、同定のプロセスを次第に絞り込んで、ＣＤ４＋Ｔ細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌により測定して、単一の反応性エピトープを得た。５-６人の対象をスクリーニングして、ほとんどのドナーにわたって反応するようである４つのペプチド、すなわち、ＨＥＲ３５６〜７０（配列番号４）、ＨＥＲ３４０１〜４１５（配列番号５）、ＨＥＲ３４１６〜４３０（配列番号６）、およびＨＥＲ３５１〜４６５（配列番号７）を同定した。ＨＥＲ３細胞外ドメインのＣＤ４＋Ｔ細胞認識に対する反応性の証拠を示さない対象を同定し、それらの対象のＤＣ１に、４つのＨＥＲ３ペプチドをパルス添加し、パルス添加したＤＣ１を、ＣＤ４Ｔ細胞と共に１週間培養し、次いで、ＨＥＲ２ペプチドに対する反応性および細胞外ＨＥＲ３タンパク質に対する反応について試験した。いずれの場合も、少なくとも１つのペプチドが、単核球上にパルス添加したペプチドおよびＨＥＲ３の全タンパク質の両方の認識をもたらし、このことは、一次感作がｅｘ  ｖｉｖｏで生じたことを示唆する。また、健常ドナーは、これらのペプチドに反応することができ、三種陰性乳癌患者においては、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答が喪失していることも示された。また、Ｇａｌａ，Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；２０：１４１０〜１４１６頁、およびＤａｔｔａ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ＣＤ４＋  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  Ｔｙｐｅ  １  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ」、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（近刊）も参照されたい。
【０２０６】
図１９にさらに示すプロトコールの主要点：
−  ５つのアミノ酸だけオーバーラップする、１５アミノ酸長のペプチド断片１２３個を含むライブラリーを、ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から生成した。
−  ドナーから得られた自家単核球由来樹状細胞（ＤＣ）を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳにより、１型に偏向した（ＤＣ１→ＩＬ−１２を分泌する）表現型に迅速に成熟させ、関係するペプチド（指定に従って、例えば、ＨＥＲ３  ＥＣＤまたはＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチド）をパルス添加した。ＤＣ１は、ＩＬ−１２の産生（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）により、Ｔｈ１応答を偏向する。
−  収集したＤＣ１を、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、８〜１０日間同時培養してアロ感作した。
−  目的の特異的ＣＤ４＋ペプチド（例えば、ＨＥＲ３ライブラリーペプチドのクラスター）、または無関係のクラスＩＩペプチドの対照をパルス添加した未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に対して、感作ＣＤ４＋Ｔ細胞（それらの大部分が抗原特異的となると予想される）を再賦活させた。
−  次いで、これらの同時培養物から上清を収集した。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにより測定したＴｈ１応答を、ＩＦＮ−γの生成が無関係な対照による生成の少なくとも２倍である場合に、抗原特異的であるとみなした。
−  ＣＤ４＋Ｔｈ１応答のＭＨＣクラスＩＩ無差別性を評価するために、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ検査室により、ドナーに対するＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱタイピングが実施された。
【０２０７】
オーバーラップを有する１５アミノ酸長のペプチド断片１２３個を含むライブラリーを、ＨＥＲ３−ＥＣＤから生成した。ドナーから得られた自家単核球由来ＤＣに、ＤＣ１に成熟させ、ＨＥＲ３−ＥＣＤをパルス添加した。収集したＤＣ１を、精製ＣＤ４Ｔ細胞と共に同時培養した。１０日後、感作したＣＤ４Ｔ細胞を、ＨＥＲ３ライブラリーペプチドのクラスターまたは無関係のＣＤ４対照ペプチド１をパルス添加した未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に対して再賦活させた。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにより測定したＴｈ１応答を、ＩＦＮ−γの生成が無関係な対照による生成の少なくとも２倍である場合に、抗原特異的であるとみなした。
【０２０８】
１）免疫原性ＣＤ４＋ペプチドを同定するために、抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を、ＨＥＲ２をパルス添加したＤＣ１ワクチンの後に示したことが分かっている乳癌患者を得；２）これらのペプチドの免疫原性を、同じ患者において「逆」感作のプロセスにより確認し；３）抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ非反応性を、ワクチン接種の後に示したことが分かっている患者を得、ＣＤ４＋ペプチドを同定するために使用して、細胞がネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤに対して感作される、したがって、自己抗原（すなわち、ＨＥＲ３）に対する寛容が克服／無効にされるかを観察するという３段階のプロセスで、実験を実施した。
【０２０９】
実験の結果を、ここに記載する。
【０２１０】
ＨＥＲ３  ＥＣＤ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞が認識する免疫原性エピトープを同定するための、ＨＥＲ３  ＥＣＤペプチドライブラリーの連続的なスクリーニング
最初に、単一の免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋エピトープを同定するために、抗ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を有することが分かっている５人の乳癌患者において、Ｔｈ１感作を実施した。これを達成するため、１０個のペプチドのクラスター（１〜１０、１１〜２０、・・・等）から始め、３個のペプチドのクラスター（１〜３、３〜６、７〜１０、・・・等）、最終的には、単一の免疫原性ＨＥＲ３ペプチドに絞って、それらに対して連続的に、ＨＥＲ３  ＥＣＤ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１を再賦活させた。代表的なスクリーンを、図２、図１３および図１４に示す。４つの免疫原性ペプチド、すなわち、ＨＥＲ３（５６〜７０）（配列番号４）、ＨＥＲ３（４０１〜４１５）（配列番号５）、ＨＥＲ３（４１６〜４３０）（配列番号６）およびＨＥＲ３（４５１〜４６５）（配列番号７）を再現性よく同定され、これらは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰおよびＤＱのサブタイプにわたって無差別性であった。４人の非ＨＥＲ３反応性ドナーから得られたＴｈ１細胞を、４つの同定したＨＥＲ３ペプチドをパルス添加したＤＣ１を使用して感作し、続いて、これらの細胞を、ＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣを認識するにようにチャレンジした場合、全てのドナーが、個々の免疫原性ＨＥＲ３ペプチドに対して良好な感作を示すのみならず、また、ネイティブのＨＥＲ３−ＥＣＤも認識した。
【０２１１】
本明細書に提示する結果は、オーバーラップを有する腫瘍抗原由来ペプチドのライブラリーをパルス添加したＤＣ１は、ＣＤ４Ｔ細胞ワクチンの開発ために、無差別性クラスＩＩペプチドを同定することができることを示している。この研究では、免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４ペプチドは、自己腫瘍抗原に対する免疫寛容を有効に克服している。構築する際にこれらのＨＥＲ３  ＣＤ４ペプチドを利用したワクチンを、ＨＥＲ３を過剰発現する癌を有する患者に適用することができる。さらに、これらの結果から、ＤＣ１−Ｔｈ１プラットフォームを使用して癌免疫療法を行うために、任意の腫瘍抗原から得られるクラスＩＩ無差別性の免疫原性ＣＤ４エピトープを迅速にかつ再現性よく同定するための新規の戦略も示される。下記の表１は、抗ＨＥＲ３反応性を有することが分かっている患者中の免疫原性ＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤペプチドの最初の同定を示す。表２は、連続的なスクリーニングにより同定した４つの免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋エピトープのアミノ酸配列を示す。
【０２１２】
【表１】
2018521953.tif 000043
【０２１３】
【表２】
2018521953.tif 000044
【０２１４】
「逆」感作による、同定したＣＤ４＋ＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープの免疫原性、すなわち、個々のエピトープ感作ＣＤ４＋Ｔｈ１の、ネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤを認識する能力の確認
図１５は、ＨＥＲ３  ＥＣＤ反応性を有することが分かっているドナーにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、それぞれのドナー特異的、免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１によって感作され、それぞれのＨＥＲ３エピトープおよびネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣに対して再賦活されたことを示す。
【０２１５】
図２０および図２１は、「逆」感作の追加の結果を示す。
【０２１６】
免疫原性ＨＥＲ３エピトープをパルス添加したＤＣ１を用いて感作したＣＤ４＋Ｔｈ１は、抗ＨＥＲ３免疫自己寛容を無効にするように見える
図１６に認められるように、４人のＨＥＲ３  ＥＣＤ非反応性ドナーから得られたＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を、４つの同定したＨＥＲ３ペプチドをパルス添加したＤＣ１を使用して感作し、続いて、これらの細胞を、ＨＥＲ３  ＥＣＤをパルス添加したｉＤＣを認識するようにチャレンジした場合、全てのドナーが、個々のＨＥＲ３エピトープに対して良好な感作を示すのみならず、また、ネイティブのＨＥＲ３  ＥＣＤも認識した。
【０２１７】
ＣＤ４＋ＨＥＲ３エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ無差別性を示す
図１７に見られるように、ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、候補「発癌ドライバー」腫瘍抗原として使用して実験を実施して、クラスＩＩ無差別性を示し、抗ＨＥＲ３  ＣＤ４＋免疫を発生させる免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを同定した；これらのペプチドは、ワクチンコンストラクト中で使用することができる。
【０２１８】
腫瘍抗原に由来するペプチド
本明細書に提示する結果は、
−  ＣＤ４＋Ｔ細胞ワクチンを開発するために、腫瘍抗原から得たオーバーラップを有するペプチドのライブラリーをパルス添加したＤＣ１により、無差別性ＭＨＣクラスＩＩペプチドを同定することができること、
−  免疫原性ＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドは、自己腫瘍抗原に対する免疫寛容を有効に克服すること、
−  これらの結果から、ＤＣ１−ＣＤ４＋Ｔｈ１プラットフォームを使用して癌免疫療法を行うために、任意の腫瘍抗原から得られるクラスＩＩ無差別性の免疫原性ＣＤ４＋エピトープを迅速にかつ再現性よく同定するための新規の戦略が示されていること、
−  これらのＨＥＲ３  ＣＤ４＋ペプチドを利用して構築したワクチンは、ＨＥＲ３を過剰発現する癌を有する患者において研究するのに値すること
を示している。
【実施例３】
【０２１９】
ＨＥＲ３発現は、胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行のマーカーである
ＨＥＲファミリーのメンバーを含むＲＴＫの過剰発現は、浸潤性食道胃癌において予後および治療上の意義を有する。前悪性胃食道病変におけるＲＴＫ発現は以前は広範に調査されていなかった。
【０２２０】
バレット食道、または遠位食道の化生円柱上皮の存在は、食道腺癌の発生の素因となる（Ｃａｍｅｒｏｎ、Ａ．Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９（５）：１５４１−６（１９９５））。異形成から浸潤性悪性腫瘍への組織学的転移は十分に特徴付けられているが、化生細胞における発癌は、不完全に理解されている遺伝子変化を伴うものである。いくつかの最近の報告は、異形成を伴うバレット食道病変のサブセットにおけるヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）発現を同定している。（Ａｌｍｈａｎｎａ、Ｋ．ら、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｊｕｌｙ  １６  ２０１５）（Ａｌｍｈａｎｎａら）；Ｆａｓｓａｎ、Ｍ．ら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６１（５）：７６９−７６（２０１２）（Ｆａｓｓａｎら）；およびＲｏｓｓｉ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．１３（９Ｂ）：３８２６−３３（２００９）（Ｒｏｓｓｉら）。さらに、ＨＥＲ２発現の割合は異形成の程度と相関し、腫瘍形成における関連する経路を示唆している。
【０２２１】
間葉系上皮移行因子であるＨＥＲファミリー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３）およびｃＭＥＴのメンバーを含むＲＴＫ分子の過剰発現は、乳癌、肺癌および胃腸癌を含むより一般的な悪性疾患の多くにおいて確かめられており（Ｙｏｋａｔａ、Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  １：７６５−７６７（１９８６）また食道胃癌でも確かめられている。乳癌のサブセットにおけるＨＥＲ２過剰発現の同定、ＨＥＲ２の過剰発現とより攻撃的な生態との関連付け、および、モノクローナル抗体によるＨＥＲ２の効果的な標的化は、固形腫瘍の治療のための標的療法の進化における中心的な出来事であった（Ｊｏｅｎｓｕｕ、Ｈ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４（８）：８０９−２０（２００６））。この経験は、他の悪性腫瘍の治療においてＲＴＫ分子を標的とするさらなる努力の基礎を提供している。
【０２２２】
ＨＥＲ２の過剰発現は、少数の胃癌で確認されており、アウトカムへの影響は僅かで転移性の環境下でトラスツズマブの標的となっている（Ｂａｎｇ、Ｙ．Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３７６（９７４２）６８７−９７（２０１０）（Ｂａｎｇら））。ＨＥＲ２の過剰発現は、より遠位の胃の腺癌と比較して、近位の胃および胃食道接合部においてより頻繁に発現される（Ｒａｊａｇｏｐａｌ、Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｒｅｓ．９（３）：ＥＣ０６−１０（２０１５））、アウトカムへの影響は僅かでトラスツズマブの標的となる（ＢａｎｇらおよびＦｉｃｈｔｅｒ、Ｃ．Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １３５（７）：１５１７−３０（２０１４）（Ｆｉｃｈｔｅｒら））。胃癌におけるＨＥＲ１およびＨＥＲ３発現は、ほとんどの研究で予後不良と関連付けられている（Ｋａｎｄｅｌ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６７（４）：３０７−１２（２０１４）およびＨａｙａｓｈｉ、Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２３）：７８４３−９（２００８））。ＣＭＥＴの過剰発現は食道腺癌の不良予後と関連付けられており、ｃＭＥＴ依存性シグナル伝達の阻害はＨＥＲ１およびＨＥＲ３の活性を調節する（Ｌｉｕ、Ｘ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７（２２）：７１２７−３８（２０１１））。これらのデータは、食道胃がんおよび前駆病変におけるＲＴＫ発現を特徴付けるためにさらに努力することへの根拠を提供する。以下に記載される研究は、治療および一次予防のための潜在的な標的を同定するために、胃食道接合部の形成異常病変におけるＲＴＫ発現を特徴づけることを目的とする。
【０２２３】
方法
ペンシルバニア大学インスティテュートレビュー委員会の承認後、異形成（低度異形性（ＬＧＤ）、ｎ＝３２、高度異形性（ＨＧＤ）、ｎ＝５９）のＢａｒｒｅｔｔ食道を有する７３人の患者の臨床記録および組織学的標本を遡及的にレビューした。２００３−２０１２年の保存された内視鏡生検および粘膜切除標本からのホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを、プラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で５μｍで切片化し、続いて脱パラフィンして再水和させた。すべての生検材料を、ＨＥＲ１（クローンＨ１１；  １：５０；  ＤＡＫＯ）、ＨＥＲ２（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）およびＨＥＲ３（クローンＲＴＪ．２；  １：３０；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）  Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ装置）について免疫染色し、顕微鏡下で（Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ）一人の病理学者によって評価した。３＋  ＨＥＲ染色のメンブレンは、図２２に見られるように腫瘍細胞の１０％以上が染色された２＋  ＨＥＲ２染色のメンブレンと同様に陽性とみなした。十分な組織が利用可能であった４２例においてｃＭＥＴ免疫組織染色を実施した。腫瘍細胞の５０％以上の中等度または強膜性染色は陽性とみなされた。ＲＴＫ過剰発現を、形成異常−腺癌生検標本のペアまたはその後の生検標本における腺癌の診断のいずれかの臨床データと相関させて、浸潤性癌との関連性を評価した。
【０２２４】
統計解析
すべての解析について両側検定を行った。記述的統計量は、連続変数のカテゴリ変数および中央値（四分位間範囲（ＩＱＲ））の頻度として示されている。ピアソンのχ２検定またはフィッシャー直接検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を用いて、それぞれカテゴリ変数と連続変数を解析した。Ｐ値≦０．０５を統計的に有意であると考えた。全ての試験は両側であった。解析は、ＳＰＳＳ  ｖ２２．０（ＩＢＭ、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）を用いて行った。
【０２２５】
結果
低度異形性（ｎ＝３２）または高度異形性（ｎ＝５９）を有するバレット食道患者合計７３人に対して、免疫組織染色によってＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびｃＭＥＴの発現を同定・分析した。コホートの年齢の中央値は６５歳（ＩＱＲ  ６０〜７３歳）であった。８１．９％が男性、８７．５％が白人であった。コホートでのアルコール使用率は１４．３％であり、積極的なタバコの使用率は６．３％であったが、５５．６％は喫煙経験者であった。２６．４％は悪性腫瘍の家族歴があった。以下の表３に示すように、測定された臨床的および人口統計学的変数におけるＬＧＤおよびＨＧＤコホート間の有意差はなかった。
【０２２６】
【表３】
2018521953.tif 000045
【０２２７】
高度異形性（ＨＧＤ）は、低度異形成（ＬＧＤ）と比較して、ＨＥＲ１の過剰発現（２２．４％対３．１％、ｐ＝０．０１６）、ＨＥＲ２（５．３％対０．０％、ｐ＝０．１８７）の過剰発現、およびＨＥＲ３３の過剰発現（４５．６％対９．４％、ｐ＜０．００１）と関連していた。
【０２２８】
侵襲性食道腺癌の病巣は、６例で異形性病変と関連しており、そのすべてがＨＧＤと関連して発生した（ＨＧＤ：１０．２％対ＬＧＤ：０．０％、ｐ＜０．００１）。追加の９人の患者が、その後の生検検体で侵襲性食道腺癌と診断された（ＨＧＤ：１７．０％対ＬＧＤ：０．０％、ｐ＝０．０１７）。図２３Ａおよび２３Ｂに見られるように、ＨＧＤ病変における過剰発現は、浸潤癌の病巣がないＨＧＤ病変と比較して、ＨＥＲ３は有意に関連していたが（７１．４％対３８．６％、ｐ＝０．０３２）、ＨＥＲ１またはＨＥＲ２では有意に関連していなかった（ＨＥＲ１の増加：２６．７％対２０．５％、ｐ＝０．６１６、ＨＥＲ２の増加：１４．３％対２．３％、ｐ＝０．０７７）。
【０２２９】
ｃＭＥＴの過剰発現は、４２例の評価検体中１８例（４２．９％）で観察され、ＬＧＤ検体と比較してＨＧＤ検体でより多く観察され（５８．３％対３６．７％、ｐ＝０．２００）、また、ほとんどの場合でＨＥＲ３と共発現した（ＨＥＲ３陽性検体の６２．５％対ＨＥＲ３陰性検体の３８．２％（ｐ＝０．２１２））。ＨＥＲ１陽性（ｐ＝０．７２９）またはＨＥＲ２陽性（ｐ＝ＮＡ）検体では同様の傾向は認められなかった。４２人中１人（５．６％）の患者に侵襲性がんが確認された。この患者ではｃＭＥＴが過剰発現していた（ｐ＝０．２４３）。
【０２３０】
討論
胃食道接合部の異形性病変におけるＲＴＫ発現のこの分析は、（１）ＨＥＲファミリータンパク質が異形性を有するバレット食道でアップレギュレートされること、（２）ＨＥＲファミリーおよびｃＭＥＴ過剰発現の頻度は、異形成の程度と正の相関があること；（３）ＨＥＲタンパク質のアップレギュレーションは、特に異形成病変において、関連する浸潤性癌の発生率の増加と関連していること、を確認する。
【０２３１】
したがって、ＨＥＲ３は、バレット食道およびＨＧＤ患者の潜在的な侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。さらに、ＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とする治療薬は、患者のサブセットにおける胃食道癌の二次予防をもたらすことができる。
【０２３２】
バレット食道におけるＨＥＲ発現の以前の評価は、少数の症例で過剰発現するＨＥＲ２の評価に限られていた（Ａｌｍｈａｎｎａら、Ｆａｓｓａｎら、およびＲｏｓｓｉらを参照）。この研究におけるＨＥＲ２の過剰発現は、生検標本の３．３％に存在し、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３の過剰発現率より低かった。このパターンは、ＨＥＲ３がＨＥＲ２よりもより一般的に過剰発現する浸潤性胃食道接合部癌におけるＨＥＲファミリータンパク質発現と一致する（Ｆｉｃｈｔｅｒら）。ＬＧＤからＨＧＤへの進行に伴うＨＥＲ３タンパク質の過剰発現の増加および特にＨＥＲ３の頻繁な過剰発現は、意外ではないが新規な知見である。ＨＥＲ受容体のホモ二量体化およびヘテロ二量体化はシグナル活性化を駆動する。ＨＥＲファミリーの複数のメンバーのクラスター化された過剰発現が、他の腫瘍型で観察されている。併せて、活性化されたｃ−ＭＥＴは、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３の活性を正に調節する１１。実際に、これらの受容体間の相互作用は、複数のＲＴＫを標的とする多価治療法の理論的根拠を提供している（（Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６（２）：１０９−１９（２０１２）；Ｗａｄｄｅｌｌ、Ｔ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．１４（６）：４８１−４８９（２０１３）））。
【０２３３】
本データはまた、まだ調査されていない胃食道癌の標的化二次予防の機会を示唆している。乳房の非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）における以前に標的化されたＨＥＲ２発現は有望な結果を標的としていた（米国特許出願公開第２０１５／０３２３５４７号明細書；２０１９年１２月３０日に出願された米国特許出願第１４／９８５，３０３号、Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｏｎｃｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：８  ｅ１０２２３０１（２０１５）ＤＯＩ：１０．  １０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１５．１０２２３０１；Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７（１）：７１（２０１５）を参照）。このようなアプローチは、胃腸の悪性腫瘍にとってより遠い目標のままである。それにもかかわらず、内視鏡的切除および切除様式および根治的手術を含むバレット食道の現在の治療選択肢はすべて、重大な制限がある。病的状態を排除し、侵襲性癌のリスクを軽減する代替戦略が必要である。胃食道接合部の異形成病変におけるＲＴＫ発現のこの分析は、（１）ＨＥＲファミリータンパク質が異形性を有するバレット食道でアップレギュレートされること、（２）ＨＥＲファミリーおよびｃＭＥＴ過剰発現の頻度は、異形成の程度と正の相関があること；（３）ＨＥＲタンパク質のアップレギュレーションは、特に異形成病変において、関連する浸潤性癌の発生率の増加と関連していること、を確認する。
【０２３４】
したがって、ＨＥＲ３は、バレット食道およびＨＧＤ患者の潜在的な侵襲性疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。さらに、ＨＥＲ３またはＣＭＥＴを標的とする治療薬は、患者のサブセットにおける胃食道癌の二次予防をもたらすことができる。
【０２３５】
要約すると、本データは、胃食道接合部の高度異形成病変、特に潜在性浸潤癌を伴う高度異形成病変におけるＨＥＲ３の頻繁な過剰発現と悪性形質転換との関係を示す。これらの知見は、ＨＥＲ３発現性異形成病変のより積極的な管理アプローチを正当化する可能性があり、当業者によって容易に理解されるとおり、早期疾患設定におけるＨＥＲ３標的治療薬の将来的な適用の根拠を提供する。
【０２３６】
我々は以前に、ＨＥＲ−２陽性胸部腫瘍発生の間、ネイティブな抗ＨＥＲ−２  ＣＤ４  Ｔｈ１が進行的に喪失することを示した。この応答の喪失は、ネオアジュバント治療に対する病理学的完全奏効（「ｐＣＲ」）の欠如に関連し、乳癌の再発リスクの上昇と相関し、ワクチン接種で回復することができた。下記の実施例４は、胸部腫瘍発生の間、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答に同様の喪失があるかどうかを調べる。
【実施例４】
【０２３７】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１の喪失は、胸部腫瘍形成に起こり、アウトカムと負の関連がある
全体的な実施例４のまとめ
我々は以前に、ＨＥＲ２陽性胸部腫瘍発生の間、ネイティブな抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１が進行的に喪失することを示した。この応答の喪失は、ネオアジュバント治療に対する病理学的完全奏効（「ｐＣＲ」）の欠如に関連し、乳癌の再発リスクの上昇と相関し、ワクチン接種で回復することができた。この実施例は、胸部腫瘍発生の間、抗ＨＥＲ３  Ｔｈ１応答に同様の喪失があるかどうかを調べる。
【０２３８】
健康なドナー（「ＨＤ」）、良性乳房疾患（「ＢＤ」）、非浸潤性乳管癌（「ＤＣＩＳ」）および浸潤性乳癌（「ＩＢＣ」）患者を含む１３１人の被験者からの末梢血を採取した。上記の実施例１および２で同定された４つの異なるＨＥＲ３免疫原性ペプチドに対する免疫応答を、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを介して試験し、免疫応答のすべての評価指標を分析した。
【０２３９】
ＨＤからＩＢＣに向かって、抗ＨＥＲ３応答の有意な低下があった。トリプルネガティブ（「ＴＮ」）ＩＢＣは、３つの免疫パラメータ全てにわたって最も低い応答を示した。ＨＤは、３つの免疫パラメータすべてにわたってＥＲ陽性  ＩＢＣおよびＴＮ  ＩＢＣ患者よりも有意に高い免疫応答を有した。興味深いことに、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣは、ＨＤおよびＢＤと同様の免疫応答を示した。再発乳癌およびネオアジュバント療法に対するｐＣＲの欠如を有する患者は、その後の再発のない患者またはネオアジュバント療法に対してｐＣＲである患者よりも有意に低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有した。
【０２４０】
このように、ＣＤ４  Ｔｈ１抗ＨＥＲ３は、胸部腫瘍発生の間に失われることが判明し、特に、治療の選択肢が限定され、ＨＥＲ３が過剰発現して予後が著しく悪い群であるＴＮ  ＩＢＣにおいて顕著であることが見出された。これらの知見は、再発を防ぐためにこの反応を回復させようとする試みに影響を与える。
【０２４１】
背景
約８人に１人の女性が生涯に乳がんを発症する。これらのうち、ＨＥＲ２を過剰発現する癌は、遠隔転移の割合が高く、予後が全体的に悪い。ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブの導入は、ＨＥＲ２陽性の癌患者における無増悪生存期間および全生存期間を劇的に向上させ、乳癌進行の調節におけるＨＥＲ２の重要な役割を指摘する。Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１４年）：ＪＣＯ−２０１３［２０１４年５月５日印刷前にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１３．５４．０９４８］。
【０２４２】
免疫系は、ＨＥＲ２発現腫瘍の調節において重要な役割を果たす。健康な被験者からＨＥＲ２陽性  ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへ向かってネイティブの抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が段階的に低下するが、ＨＥＲ２陰性  ＩＢＣでは低下しないことが以前に示されている。さらに、より低い抗ＨＥＲ２免疫応答はその後の乳癌再発と相関し、一方、より高い抗ＨＥＲ２免疫応答は、ネオアジュバント化学療法に対する病理学的完全奏効と相関し、ＨＥＲ２陽性腫瘍形成における免疫系の役割を示唆している（Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｏｎｃｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４（１０）：ｅ１０２７４７４．ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１５。１０２２３０１（２０１５）および米国特許出願公開第２０１５／０３２３５４７Ａ１号（総称して以下「Ｄａｔｔａら」）を参照されたい）。我々のグループは、ＤＣＩＳおよびＩＢＣ患者の両方で抗ＨＥＲ２  ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を回復させるＨＥＲ２パルス樹状細胞ワクチンを開発した（Ｓｈａｒｍａ、Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  １１８（１７）：４３５４−４３６２（２０１２）。Ｋｏｓｋｉ、Ｇ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（１）：５４−６５（２１０２）；および米国公開出願第２０１５／０３２３５４７Ａ１号）。
【０２４３】
ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３も含むＲＴＫ群であるＥＧＦＲファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２が自己二量体化することはよく知られているが、シグナル伝達におけるＨＥＲ３の役割はあまり明確ではなく、自身およびＨＥＲ２の両方と二量体化するように作用する可能性がある。ＨＥＲ３のＨＥＲ２との二量体化は、トラスツズマブで治療された乳癌患者における逃避機構として提案されている。Ｃｚｏｐｅｋ、Ｊ．ら、Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｏｎｃｏｌ．１７（５）：４４６−９（２０１３）（「Ｃｚｏｐｅｋら」）およびＢａｅ、Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９（３）：７４１−５０（２０１３）（「Ｂａｅら」）。ペルツズマブは近年市場へ追加され、ネオアジュバント治療としてＦＤＡの早期承認を受けた最初の腫瘍治療薬であり、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化を阻害し、乳癌患者のためにトラスツズマブと組み合わせて使用すると全体的な生存利益を有することが示されている（Ｊｈａｖｅｒｉ、Ｋ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．１２（４）：５９１−８（２０１４）およびＨａｒｂｅｃｋ、Ｎ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｅ  ８（１）：４９−５５（２０１３）。
【０２４４】
いくつかのＥＲ陽性、ＨＥＲ２陽性およびトリプルネガティブ（「ＴＮ」）サブタイプに見られる過剰発現があるが、ＨＥＲ３発現は、乳癌のサブタイプ間であまり明確に線引きされていない。Ｍｏｅｄｅｒ、Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  １１５（１１）：２４００−９（２００９）。ＨＥＲ３過剰発現はＨＥＲ２陽性  ＩＢＣにおいてより一般的であり得るが、その予後値は、ＴＮ  ＩＢＣにおいてより顕著であることは興味深い。ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣにおけるＨＥＲ３発現は無病生存期間（「ＤＦＳ」）または全生存期間（「ＯＳ」）に影響しなかったが、ＴＮ  ＩＢＣにおけるＨＥＲ３発現は、５年間のＤＦＳおよび１０年間のＯＳの悪化と相関していた。Ｂａｅら、および、Ｃｚｏｐｅｋら。注目すべきことに、ＨＥＲ３過剰発現を有するＴＮ  ＩＢＣ患者のかなりのサブセット（定義上、古典的治療オプションのいずれも持たないグループ）は、認識可能な新たな標的から利益を得ることができる。抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答が健康なドナーに存在するかどうか、およびこの応答が胸部腫瘍発生の間に変化するかどうかは不明である。本研究は、これらの質問に対する答えを求めている。
【０２４５】
方法
被験者の登録
全部で１３１名の被験者が試験基準を満たし、インフォームド・コンセントを受けてペンシルベニア大学に連続して登録された。この研究は、被験者登録前にペンシルバニア大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄとＡｂｒａｍｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの承認を受けた。１３１名の被験者のうち、９名はアッセイをするための末梢血単球が不足していたため、免疫応答データをレビューのための被験者は１２２名となった。（ＨＤ、ｎ＝３０）、良性乳房疾患（ＢＤ、ｎ＝１１）、ＤＣＩＳ（ｎ＝１３）、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ（ｎ＝２１）、ＥＲ陽性浸潤性乳癌（ＥＲ陽性  ＩＢＣ、ｎ＝２０）およびトリプルネガティブＩＢＣ（ＴＮ  ＩＢＣ、ｎ＝２７）の間で、ＨＥＲ２ポリペプチドに対する４つの異なるＨＥＲ３免疫原性ペプチドに対するＣＤ４  Ｔ細胞応答を比較した。
【０２４６】
末梢血単球の収集
末梢血は静脈穿刺により採取した。血液をハンクス緩衝液またはＰＢＳで１：１の比で希釈し、リンパ球分離培地をコニカルチューブ中の希釈血液の下に重ねた。その後、１２００ｒｐｍで３０分間の密度遠心分離によって血液を分離した。単核細胞層を収集し、ハンクス緩衝液またはＰＢＳで２回洗浄した。細胞を計数し、１ミリリットル当たり１０００万個の細胞で再懸濁し、マイナス２００℃に移す前にマイナス８０℃で２４−４８時間凍結した。細胞を実験アッセイまで保存した。
【０２４７】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答の測定
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、製造業者のプロトコールに従って測定した。簡潔に説明すると、９６ウェルＰＶＤＦ膜プレートを７０％エタノールで活性化し、ＰＢＳで洗浄し、抗ＩＦＮ−γ（抗ＩＦＮ−γ）抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。２４時間後、プレートを再びＰＢＳで洗浄し、１０％ヒト血清を含むＩｓｃｏｖｅの培地で１時間ブロックした。末梢血単球を３７℃で解凍し、ＰＢＳまたはハンクス緩衝液で洗浄し、１ミリリットルあたり１００万細胞で再懸濁し、４つの免疫原性ＨＥＲ３ペプチド（ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）；ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）；ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）；およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）のうちの１つ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（ポリクローナル刺激、陽性対照）、破傷風トキソイド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、またはブランク（非刺激対照）と共に２００，０００個／ウェルで播種した。アッセイは三連で行った。プレートを３８℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、プレートをＰＢＳで洗浄し、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体を添加し、プレートを３８℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで再度洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを３８℃で１時間インキュベートし、最後にプレートをＰＢＳで洗浄し、次いでＴＭＢ基質溶液を添加した。発色は、水道水で十分に洗浄することによって５分後に停止させた。プレートを４℃で一晩乾燥させた。
【０２４８】
免疫応答解析
スポットはイムノスポットソフトウェアによって計数された。（１）累積応答、すなわち細胞百万個あたりのスポットでの４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチドすべてに対する合計応答、（２）レパートリー、すなわち２０以上のスポットを有する被験者一人あたりのペプチドの数、（３）応答性、すなわち少なくとも１つのペプチドに応答（スポット２０個以上を閾値として定義）する対象の割合（％）、の３つのパラメータ（評価指標）を定量化した。細胞２００，０００個あたりのスポットによる破傷風応答および細胞２００，０００個あたりのスポットによる抗ＣＤ３／ＣＤ２８応答も、対照として定量した。すべての免疫応答測定指標をグラフパッドプリズムソフトウェアで分析した。
【０２４９】
結果
研究対象の特性
合計１３１名の被験者が試験基準を満たし、ペンシルバニア大学の病院でインフォームド・コンセントを受けて連続して登録された。９人の被験者は、分析に不十分な細胞しか持たず、被験者は１２２人となった。このうち、平均年齢は５０歳で、２５歳から８３歳の間であった。白人は７２．１％、アフリカ系アメリカ人は１８．０％、別の人種は９．８％であった。被験者は、ＨＤ（ｎ＝３０）、ＢＤ（ｎ＝１１）、ＤＣＩＳ（ｎ＝１３）、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ（ｎ＝２１）、ＥＲ陽性  ＩＢＣ（ｎ＝２０）、ＴＮ  ＩＢＣ（ｎ＝２７）の６グループのうちの１つに属する。６８名のＩＢＣ被験者のうち、ステージＩは３５名（５１．５％）、ステージＩＩは２２名（３２．４％）、ステージＩＶは９名（１３．２％）、ステージＩＶは２名（２．９％）であった。化学療法および／またはハーセプチンおよび／またはタモキシフェン治療を受けた患者は５２人（７６．５％）、治療未経験者は１６人（２３．５％）であった。３人のＤＣＩＳ患者および３人のＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ患者は、ＨＥＲ２パルス樹状細胞ワクチン接種を受けた。他の特性を以下の表４に報告する。
【０２５０】
【表４】
2018521953.tif 000046
【０２５１】
健康なドナーから浸潤性乳癌のサブセットまでのＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ３免疫応答の低下がある
ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ、ＥＲ陽性  ＩＢＣ、およびＴＮ  ＩＢＣを比較すると、３つの免疫パラメータのすべてが低下し、ＴＮ  ＩＢＣにおいて最低点に達した：累積応答（図２４Ａに示すように、それぞれ、９０対８０対６６対７９対４８対４０、ｐ＝０．０１）、レパートリー（図２４Ｂに示すように、それぞれ、１．０対０．６対０．８対０．８対０．５対０．３、ｐ＝０．００３）および応答性（それぞれ、図２４Ｃに示すように、７６．７％対６３．６％対５３．８％対６６．７％対４５．０％対３３．３％、ｐ＝０．００２）。特に、これらの差異は３つの免疫パラメータすべてにわたって、ＴＮ  ＩＢＣ患者と比較して、ＨＤにおいて統計的に有意に高いだけでなく、２倍以上を示した：累積応答（９０対４０、ｐ＝０．００２）、レパートリー（１．０対０．３、ｐ＝０．００４）、応答性（７６．７％対３３．３％、ｐ＝０．００１）。ＴＮ  ＩＢＣ患者と比較して、ＢＤは、有意に高い累積応答（それぞれ４０対８０、ｐ＝０．００７）を有し、ＤＣＩ患者は有意に高いレパートリーを示し（それぞれ０．８対０．３、ｐ＝０．０４）、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣは有意に高いレパートリー（０．３対０．８、ｐ＝０．０１）および応答性（それぞれ３３．３％対６６．７％、ｐ＝０．０４）を示した。ＥＲ陽性  ＩＢＣ患者は２番目に低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有し、３つの免疫パラメータすべてにわたって、ＨＤに比べて、統計的に有意により低い応答を示した：累積応答（それぞれ４８対９０、ｐ＝０．０３）、レパートリー（０．５対１．０、ｐ＝０．００８）および応答性（それぞれ４５．０％対７６．７％、ｐ＝０．０３）。注目すべきは、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ抗ＨＥＲ３応答が、ＨＤ、ＢＤまたはＤＣＩＳ被験体から有意に変化しなかったという事実である。
【０２５２】
浸潤性乳癌患者におけるＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ３免疫応答の低下は、ＨＥＲ３に特異的であり、免疫応答の広範な欠損には帰属しない
破傷風応答および抗ＣＤ３／ＣＤ２８応答を用いたポリクローナル刺激を分析して、全体の免疫応答性を比較および制御した。ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ、ＥＲ陽性  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣ患者の間で、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを介して細胞２０００００個あたりのスポットで測定したＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗破傷風応答に差はなかった（図２５に示すとおり、それぞれ、３７対３０対１９対３４対２４対２９、ｐ＝０．６５）。重要なことに、ＨＤとＴＮ  ＩＢＣ患者（最も発散する抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答を有する群）との間の抗破傷風応答は類似していた（３７対２９、ｐ＝０．３７）。同様に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８とのポリクローナル刺激には差がなく、各群の被験者の大多数は、驚異的なスポット発達を有し、それは数えきれなかった。計算可能な患者のうち、ＨＤ、ＢＤ、ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣ、ＥＲ陽性  ＩＢＣまたはＴＮ  ＩＢＣ患者（図２５Ｂに示すように、それぞれ、６８８対５４９対８０４対６９９対６２９対６７５、ｐ＝０．６８）の間に統計的に有意な差はなかった。
【０２５３】
侵襲性乳癌患者の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答は、腫瘍浸潤の予後および特徴と相関する
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答が腫瘍浸潤の特徴と相関するかどうかを判定するために、最初の手術のリンパ節の状態（リンパ節陽性（「ＬＮ陽性」）対リンパ節陰性（「ＬＮ陰性」）、診断から少なくとも１年経過した患者における再発対非再発、および、ネオアジュバント化学療法に対する応答（病理学的完全奏効（「ｐＣＲ」））対疾患残存（「＜ｐＣＲ」）によりＩＢＣ患者の免疫応答を比較した。ＬＮ陽性  ＩＢＣ患者（ｎ＝２８）は、ＬＮ陰性患者（ｎ＝３１）と比較して、３つのパラメータの全体にわたって免疫応答が全体的に低かったが、統計的に有意なものはなかった：図２６Ａに示すように、累積応答（それぞれ４０対５６、ｐ＝０．１２）、レパートリー（それぞれ、０．４対０．６、ｐ＝０．０８）および応答性（それぞれ３５．７％対５４．８％、ｐ＝０．１９）。注目すべきことに、ＬＮ陽性被験者には、ネオアジュバント化学療法後のリンパ節転移を有する被験者が含まれていた。ネオアジュバント療法後のＬＮ陰性被験者は、治療前に陽性リンパ節を有していたかどうかは不明であったため、分析から除外した。診断から少なくとも１年以上経過した患者のうち、再発乳癌（局所転移または遠隔転移、ｎ＝７）は、３つの免疫パラメータすべてにおいて、病気なしの患者（ｎ＝３６）と比較して、有意に低い抗ＨＥＲ３応答を示した：図２６Ｂに示すように、累積応答（それぞれ１７対６６、ｐ＝０．０４）、レパートリー（それぞれ０．０対０．６、ｐ＜０．０５）および応答性（それぞれ０％対５５．６％、ｐ＝０．０１）。最後に、図２６Ｃに示すように、ネオアジュバント化学療法を受けた患者（ｎ＝１６）のうち、ｐＣＲ（ｎ＝１１）と比較してｐＣＲ（ｎ＝５）は有意に高い累積応答（それぞれ１４４対３２、ｐ＝０．００４）およびレパートリー（それぞれ、０．８対０．４、ｐ＝０．０５）を有していた。ｐＣＲと＜ｐＣＲとの間には、統計的に有意な差はなかった（それぞれ８０．０％対２７．３％、ｐ＝０．１０）。なお、ＬＮ陽性患者とＬＮ陰性患者との間、再発対非再発患者およびｐＣＲ対＜ｐＣＲに破傷風応答の差異はなかった：破傷風応答（それぞれ、２２対２９、ｐ＝０．３５）、再発対非再発患者（それぞれ２７対３５、ｐ＝０．６５）およびｐＣＲ対＜ｐＣＲ（それぞれ１７対５９、ｐ＝０．１５）。したがって、より攻撃的な腫瘍の特徴を有するＩＢＣ患者におけるＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下は、ＨＥＲ３に特異的である。
【０２５４】
健康なドナーの特徴による抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答
年齢（５０歳未満（ｎ＝２５）または５０歳以上（ｎ＝１６））、人種（白人（ｎ＝２９）、アフリカ系アメリカ人（ｎ＝１２））、妊娠状態（０（ｎ＝１７）または１以上の妊娠（ｎ＝２４））および閉経状態（閉経前（ｎ＝３０）または閉経後（ｎ＝１１））により、ＨＤとＢＤで抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１反応を比較した。年齢（図２７Ａ）、人種（図２７Ｂ）または過去の妊娠歴（図２７Ｃ）による累積ペプチド応答、レパートリーまたは応答性に差はなかった。しかし、閉経後の女性は、図２７Ｄに示すように、閉経前の女性と比較して有意に高い累積応答およびレパートリーを示した：累積応答（それぞれ、細胞百万個あたり１３６スポット対７０スポット、ｐ＝０．００５）（上パネル）、レパートリー（それぞれ、１．４対０．８ペプチド、ｐ＝０．０３）（第２パネル））。応答性では統計的に有意な差はなかった（それぞれ、９０．９％対６６．７％、ｐ＝０．２３）（第３パネル）。閉経前後の女性間の破傷風反応に統計学的に有意な差はなく（下パネル）、閉経状態による免疫応答の差異はＨＥＲ３に特異的であることを示した。
【０２５５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、直線性精密アッセイによって証明されるように正確である
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、当研究室で以前に検証されている。この研究のためにすべての実験を行ったオペレーターのもとでこのアッセイの精度を確認するために、既知の高抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答者からの連続希釈で直線性精度アッセイを実施した。末梢血単球を１．０から０．１、０．１から０．０１、０．０１から０．００１の濃度に連続的に培地に希釈し、累積抗ＨＥＲ３免疫応答を細胞百万個あたりのスポットで測定した。図２８は、累積値が２３０から３５、３５から１２、１２から５になるスポットの直線的な減少があったことを示している（ｐ＜０．０００１、ｒ＝０．８８）。
【０２５６】
討論
癌の発生、進行および予後における免疫系の役割についての知識は急速に拡大している。免疫不全状態は、ウイルス起源の腫瘍だけでなく、非ウイルス起源の腫瘍からも、癌発生のリスクを増加させることが十分に確立されている。Ｂｏｓｈｏｆｆ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：３７３−８２（２００２）。  Ｓｈｅｉｌ、Ａ．Ｇ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．１０：３８９−９６（１９８６）；  Ｐｅｎｎ、Ｉ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６１：２７４−７８（１９９６）；およびＰｅｎｎ、Ｉ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：１４８５−９１（１９９５）を参照のこと。特定の免疫表現型が乳癌と関連していることも知られている。循環炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は乳癌患者においてより高く、低ＣＤ４陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞比はより攻撃的な乳癌表現型に関連するが、腫瘍浸潤リンパ球は一部の乳癌においてより良好な予後と関連する。Ａｌｏｋａｉｌ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．３１（８）：３８（２０１４）ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３２−０１４−００３８−０；Ｊａｉ、Ｙ．ら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．３１：９８１（２０１４）；およびＭａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｃｌｉｎｐａｔｈ−２０１５−２０２９４４。しかしながら、免疫応答宿主における免疫認識の喪失と特定の分子発癌ドライバとをリンクする証拠は、比較的新しいものである。健康なドナーからＨＥＲ２陽性  ＤＣＩＳ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへのネイティブ抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の減少が示されたのはつい最近であり、胸部腫瘍発生におけるこの特異的な発癌ドライバへの免疫応答の消失を示す最初の研究の１つである。当業者であれば、そのような特異的な損失を同定および理解することが特異的な免疫ターゲティング療法へとつながる可能性が大きいことを容易に理解するであろう。
【０２５７】
この研究は、（１）ＨＤからＥＲ陽性およびＴＮ  ＩＢＣに向かう抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の低下があること、（２）抗ＨＥＲ３応答が予後と相関していること、具体的には、より高い応答はネオアジュバント療法に対するｐＣＲと関連するが、より低い応答は再発と関連していること、（３）閉経後のＨＤは、有意により高い抗ＨＥＲ３免疫応答を有することを示している。これらの知見のすべては、抗ＨＥＴ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答の診断的および臨床的用途を有するであろう。
【０２５８】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答は、ＨＤで最も高く、予後がＨＥＲ３過剰発現により他のタイプのＩＢＣよりもより深刻な影響を受けるＴＮ  ＩＢＣにおいて最も低かった。Ｂａｅら、および、Ｃｚｏｐｅｋ、Ｊ．ら。ＨＥＲ３の発現は本研究のＩＢＣ患者のコホートでは未知であるが、ＨＤと同様の応答を示したＨＥＲ２陽性  ＩＢＣコホートと比較して、ＴＮ  ＩＢＣおよびＥＲ陽性  ＩＢＣグループはＨＥＲ３発現のレベルが高いと思われる。実際、我々の以前の研究は、抗ＨＥＲ２  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞応答がＨＥＲ２発現と直接相関することを示し、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣでは有意な減少があったが、ＨＥＲ２陰性  ＩＢＣでは有意な減少はなかった。ＨＥＲ３は、受容体発現乳癌と比較してＴＮ  ＩＢＣの予後に大きな影響を及ぼすだけでなく、ＴＮ  ＩＢＣにおいてさえ、ＨＥＲ２（１＋）腫瘍と比較してＨＥＲ２（０）の予後に大きな影響を及ぼす可能性がある。  Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．２９０：１２２１−２９（２０１４）。これは、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣとＨＤとの間の免疫応答における類似性を部分的に説明することができる。ＨＥＲ２の過剰発現のために腫瘍がすでに浸潤している場合、腫瘍の進展が免疫監視を回避することはできない。しかしながら、免疫系が既にＨＥＲ２を認識して標的化している場合、腫瘍はＨＥＲ３過剰発現によって適応し得、ここで免疫回避は腫瘍細胞の生存にとって進化的に有利になる。
【０２５９】
興味深いことに、ＥＲ陽性  ＩＢＣは、ＴＮ  ＩＢＣと同様の抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を示し、ＨＤまたはＨＥＲ２陽性  ＩＢＣよりも有意に低かった。ＨＥＲ３発現は、ＴＮＦ−ＩＢＣと比較してＥＲ陽性  ＩＢＣにおいて予後が有意ではないが、ＨＥＲ３  ｍＲＮＡ発現がＥＲ発現と正の相関があることを示す証拠がある。Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｓ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２１：４７２−８１（２０１４）これは、ＩＢＣのこのサブグループで見られるより低い免疫応答を説明することができる。
【０２６０】
再発性疾患を有する乳癌患者は、無病のままである患者と比較して、より低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を有し、免疫監視が長期治療の成功のための重要な機構であり得ることを示している。再発性の患者は、ＨＥＲ３を高発現する腫瘍を有する可能性がより高い可能性があり、このこと自身は、再発、転移、および全生存期間が悪くなるリスクが高いことと相関する。Ｌｉ、Ｑ．ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３０：２５６３−７０（２０１３）；  Ｓｍｉｒｎｏｖａ、Ｔ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３１：７０６−１５（２０１２）；およびＯｃａｎａ、Ａ．ら、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．  １０５巻（４号）：２６６−７３頁（２０１３年）。さらに、免疫編集は、新生細胞が、免疫認識を回避するＨＥＲ３のような分子発癌ドライバを発現するように進化するまで、新生細胞が免疫系によって選択的に排除される脱出機構として提案されている。Ｄｕｎｎ、Ｇ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３（１１）：９９１−８（２００８）。したがって、ＨＥＲ３の発現は、免疫監視の欠如のために可能であり、それにより再発のリスクが高まる。興味深いことに、最近の証拠は、再発腫瘍が原発腫瘍と病理学的に同一ではない可能性があることを示唆している。原発腫瘍と二次腫瘍との間の不一致率は、プロゲステロン受容体の場合に特に高く、任意のタイプの不一致は、再発腫瘍という悪い予後の傾向を示す。Ｉｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ、Ｐ．Ｋ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４１６−２９（２０１０）；  Ｂｒｏｏｍ、Ｒ．Ｊ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：１５５７−６２（２００９）；  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｉｅｄｔｋｅ、Ｃ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０：１９５３−５８（２００９）。原発腫瘍と二次腫瘍との間のＨＥＲ３発現を比較した研究は今日までないと考えられる。ＨＥＲ３発現が原発腫瘍と再発腫瘍との間に不一致であるかどうか、およびＨＥＲ３発現が起こる再発の回避メカニズムを表しているかどうかは不明である。もしそうなら、低い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有する患者を標的とすることは、免疫監視を向上させ、長期再発を防ぐのに役立ち得る。
【０２６１】
また、免疫系の予後における役割を示唆しているが、ネオアジュバント化学療法に対してｐＣＲである患者は、＜ｐＣＲを有する患者よりも有意に高い抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有していた。ＨＥＲ３シグナル伝達は、標的療法に対する獲得した耐性を媒介することが示されている。Ｓｅｒｇｉｎａ、Ｎ．Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：４３７−４１（２００７）；  およびＦｒｏｇｎｅ、Ｔ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１１４：２６３−７５（２００９）。ここでは、それは獲得された耐性ではなく、初期耐性に関与し、抗ＨＥＲ３免疫応答を、ネオアジュバント治療から最も利益を受ける患者の潜在的な予後マーカーとする。さらなる研究は、抗ＨＥＲ３免疫応答が予後だけでなく、治療への応答を促進するために介入することができるかどうかを明らかにするべきである。
【０２６２】
本研究では、ＨＤのサブセット、特に閉経後の女性は、より高い抗ＨＥＲ３応答を示した。しかし、抗ＨＥＲ２応答の以前の所見とは異なり、妊娠歴に基づいて差はなかった。生物学的には、このより高い抗ＨＥＲ２応答は、乳房の退縮およびそれに続く妊娠による免疫監視への細胞タンパク質の曝露に起因する可能性があるが、このような胸部柔組織の変化は、閉経期において起こりにくい。Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｆ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３−６２（１９９０）。妊娠中の乳房退縮を模倣し、同様に乳房組織で通常発現される細胞タンパク質を免疫系に暴露するイメージングでは、（閉経時のように）ホルモン変化による乳腺密度の変化が観察されている。Ｃｌｅｎｄｅｎｅｎ、Ｔ．Ｖ．ら、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３１：１−９（２０１３）。あるいは、閉経後の女性におけるより高い抗ＨＥＲ３免疫応答はリスクの差に起因すると説明され得る。様々な発癌ドライバの発現は明らかに年齢に依存する：ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣは年齢とともに低下する可能性が低く、ＥＲ陽性  ＩＢＣはより起こりやすくなる。Ｃｌａｒｋ、Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２：１１０２−０９（１９８４）；Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ−Ｃａｓｔｏｒｉ、Ｓ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．およびＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３４：１３１８−３０（２００２）を参照のこと。さらに、これらの２つの受容体は互いに独立していない。年齢によるＥＲ／ＰＲ発現はＨＥＲ２依存性であり、または逆もそうだからである。Ｎｅｖｅｎ、Ｐ．ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１１０：１５３−５９（２００８）。最も低い抗ＨＥＲ３免疫応答を有し、ＨＥＲ３過剰発現に対して予後の感度が最も高い群であるＴＮ  ＩＢＣ患者は、閉経前の女性においてより頻繁に生じる。Ｂａｅら、及び、Ｈｏｗｌａｎｄｅｒ、Ｎ．ら、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．１０６（５）：１−８（２０１４）。したがって、閉経前ＨＤのサブセットは、ＴＮ  ＩＢＣを発症するリスクが高い群である一方、閉経後ＨＤは、このより高いリスク期間を既に超えており、実際にはＨＥＲ２およびＨＥＲ３の両方を過剰発現する乳癌に罹るリスクの低い群である。また、若年女性ではＴＮ  ＩＢＣがより一般的であるが、高齢者での発生は未知の理由により良好な予後を予兆していることも注目に値する。Ａａｐｒｏ，  Ｍ．，ら，  ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（６）ｋｏｒｏｎｖｉ５２−５５  （２０１２）。より高い抗ＨＥＲ３免疫応答が実際にリスク回避群ではなく閉経期に起こる生物学的機構によるものである場合には、これは、閉経後の女性におけるＴＮ  ＩＢＣの良好な予後を部分的に説明することができる。
【０２６３】
結論
この実施例は、ＨＤ、ＢＤおよびＤＣＩＳからＥＲ陽性およびＴＮ  ＩＢＣに向かう抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔ細胞応答の低下を実証した。さらに、より低い抗ＨＥＲ３応答は、再発およびネオアジュバント治療に対する＜ｐＣＲとの相関があり、この免疫応答が浸潤性乳癌において予後の役割を果たしている可能性があることを示している。最も重要なことは、これらの結果は、ネイティブ抗ＨＥＲ２免疫応答がＨＤからＨＥＲ２陽性  ＤＣＩＳへ、ＨＥＲ２陽性  ＩＢＣへと減少することを示す先行研究の結果と一致していることである。このような類似の結果は、以前の知見を確認するだけでなく、分子発癌ドライバのパトロールにおける免疫系のより大きな役割を示す上で有望である。興味深いことに、閉経後のＨＤは、一般に、ＨＥＲ３を過剰発現する乳癌の発症のリスクがより高く、潜在的にこのリスクを媒介するメカニズムを示す群である閉経前のＨＤよりも有意に高い免疫応答を有していた。ＨＥＲ３パルスＤＣ１ワクチン接種が、ＨＥＲ３過剰発現乳癌の発症に対して治療効果および／またはリスク修飾効果を有し得るかどうかを決定することは重要である。他の発癌ドライバ特異的な癌における免疫系の役割を調べ続けることも同様に重要であろう。
【０２６４】
結論：ＣＤ４  Ｔｈ１細胞の抗ＨＥＲ−３免疫応答は健康なドナーから浸潤性乳癌、特に限定された治療選択肢およびＨＥＲ−３過剰発現の著しい予後を有する群であるＴＮ  ＩＢＣにおいて失われる。抗ＨＥＲ３免疫応答はまた、処置および予後に対する応答を緩和し、潜在的な免疫療法標的を指し示す。ＨＥＲ３免疫原性ペプチドをＤＣ１ワクチンに添加すると、ワクチン接種の恩恵を受けるＩＢＣ患者の集団が増加する可能性がある。最も重要なのは、これらの結果が以前の所見を反映しており、分子発癌ドライバのパトロールにおける免疫系の役割が大きいことを指摘している。
【０２６５】
この実施例の知見、すなわち、ＨＤＳからＩＢＣに向かって乳房腫瘍形成における抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１の有意な喪失があることは、ＨＥＲ３を発現する癌、特に乳癌、特にトリプルネガティブＩＢＣの診断および治療に有用であることが当業者に理解される。被験者における循環抗癌ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１応答を検出してこれらの知見を利用するために血液検査を開発することができると考えられる。好ましくは、そのような血液検査は、患者が罹患している癌のタイプに基づいて、本明細書中で使用される４種のＨＥＲ３免疫原性ペプチドまたは任意の他のＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドのようなＨＥＲ３免疫原性ペプチドであって、当該患者に免疫応答を誘発させることができるもの使用する。非限定的な例として、再発性乳癌およびネオアジュバント療法に対するｐＣＲの欠如を有する患者を、そのような血液検査でモニタリングして、それらの抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答を判定し、それに応じて処置することができる。
【０２６６】
患者の血液検査または他の手段によって検出された低い抗ＨＥＲ３応答は、例えば、ワクチン、好ましくは、ＨＥＲ３免疫原性ペプチド（例えば、本明細書の実施例で使用される４つのＨＥＲ３免疫原性ペプチド）でパルス／インキュベートされた患者の単球由来樹状細胞に基づくワクチンなどの回復方法で対抗することができる。当業者は、患者の免疫応答を回復させる他の方法があることを容易に理解するであろう。特に、本質的に治療選択肢が限られている群であるＴＮ  ＩＢＣ患者にとって、ＨＥＲ３応答を測定する方法、および必要であれば、そのような応答をＤＣ１ワクチンを介して回復させる方法は非常に貴重であると思われる。抗ＨＥＲ３免疫応答は、ネオアジュバント治療を必要とする患者の潜在的な予後バイオマーカーとして使用することもできる。ＨＥＲ３パルスＤＣ１ワクチンまたは他の適切なワクチンは、ＨＥＲ３過剰発現乳癌ならびに他のＨＥＲ３発現癌の発症に対して治療効果および／またはリスク修飾効果を有し得る。本明細書の知見は、診断および／または治療のために本明細書で企図されるアレイ血液検査およびアッセイの開発に有用であると評価することができる。
【０２６７】
本明細書に引用するありとあらゆる特許、特許出願の開示および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明を、特定の実施形態を参照して開示してきたが、本発明のその他の実施形態および変更形態を、本発明の真性の精神および範囲から逸脱することなく考案することができることは、当業者に明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および均等な変更形態を全て含むと解釈されるものとする。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ１１〜１３（ペプチド５１〜７５）：ＫＬＹＥＲＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨＮＡＤＬＳＦＬＱＷ（配列番号１）、ｐ８１〜８３（ペプチド４０１〜４２５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮ（配列番号２）、ｐ８４〜８６（ペプチド４１６〜４４０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬＬＩＭＫＮＬＮＶＴＳ（配列番号３）、ｐ１２（ペプチド５６〜７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）、ｐ８１（ペプチド４０１〜４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６〜４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１〜４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）からなる群から選択される単離ペプチド。
【請求項２】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドを含む免疫調節剤。
【請求項３】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドおよび薬学的に許容できる塩を含むワクチン。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドと接触させてある細胞。
【請求項６】
抗原提示細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
Ｔ細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
対象において免疫応答を惹起する方法であって、請求項１に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項９】
対象において癌を治療する方法であって、１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記対象が、ヒトであり、癌を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、胃腸癌、脳癌およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞を活性化させる方法であって、前記細胞を１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞が抗原提示細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
免疫療法において使用するために、ペプチドを取り込んだ活性化樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
前記ＤＣに、１つまたは複数の請求項１に記載のペプチドをパルス添加するステップと、
前記ＤＣを、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストを用いて活性化させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記ＤＣを、前記ＤＣ中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる薬剤と接触させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、カルシウムイオノフォアを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＣを凍結保存するステップをさらに含み、前記ＤＣを解凍させた場合、前記ＤＣにより、有効量の少なくとも１つのサイトカインが生成して、Ｔ細胞応答を発生させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法から生成される細胞。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法から生成された細胞を含むワクチン。
【請求項２１】
前記ワクチンが、注射用多回用量ワクチンの形態をとる、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、請求項２０に記載の方法から生成された細胞集団を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
哺乳動物において疾患または障害を治療する方法であって、請求項２０に記載の方法から生成された細胞集団を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
バレット食道を有する被験体における胃食道接合部の前悪性病変における腫瘍進行を検出するためのバイオマーカーであって、前記被験体におけるＨＥＲ３の過剰発現を検出することを含むバイオマーカー。
【請求項２５】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１を喪失した患者を治療する方法であって、ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩでパルスされた前記患者の単球性樹状細胞（ＤＣ）前駆体に由来する抗原パルスＤＣ１ワクチンの少なくとも１用量を前記患者に投与することを含む方法であって、前記ペプチドが、ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）からなる群から選択される免疫原性ペプチド、ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項２６】
前記患者が三重陰性浸潤性乳癌を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者における抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  ＋  Ｔｈ１喪失を検出する方法であって、
ＨＥＲ３  ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドを有する前記患者に由来する末梢血単核細胞をパルスし、前記ペプチドは、ｐ１２（ペプチド５６−７０）：ＣＥＶＶＭＧＮＬＥＩＶＬＴＧＨ（配列番号４）、ｐ８１（ペプチド４０１−４１５）：ＳＷＰＰＨＭＨＮＦＳＶＦＳＮＬ（配列番号５）、ｐ８４（ペプチド４１６−４３０）：ＴＴＩＧＧＲＳＬＹＮＲＧＦＳＬ（配列番号６）、およびｐ９１（ペプチド４５１−４６５）：ＡＧＲＩＹＩＳＡＮＲＱＬＣＹＨ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、そして、それによって生じる免疫応答を検出する、方法。
【請求項２８】
抗ＨＥＲ３  ＣＤ４  Ｔｈ１応答の検出が、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される、請求項２８に記載の方法
【国際調査報告】
2018521953.tif 000047
2018521953.tif 000048
2018521953.tif 000049
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