(57)【要約】人工転写ターミネーターおよびそれらの使用が本明細書で提供される。一態様において、非天然核酸配列はＹ−Ｘ−Ｚステム−ループを含むことができ、ここで：Ｙは、１０−３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり；Ｘは、３−１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、ここで、各ヌクレオチドは、Ｘ内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず；Ｚは、１０−５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙに対して少なくとも７０％相補性を有する。
2018534944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ−Ｙ−Ｚステム−ループを含む非天然核酸配列であって、ここで：
Ｙは、１０−３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり；
Ｘは、３−１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、ここで、各ヌクレオチドは、Ｘ内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず；
Ｚは、１０−５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙに対して少なくとも７０％相補性を有する、非天然核酸配列。
【請求項２】
Ｙが、多くても６０％、好ましくは多くても５０％、より好ましくは多くても４０％のＧ／Ｃ含量を有する、請求項１に記載の非天然核酸配列。
【請求項３】
Ｙが、Ｘに対して５’にあるように操作される、請求項１に記載の非天然核酸配列。
【請求項４】
Ｙが、Ｘに対して３’にあるように操作される、請求項１に記載の非天然核酸配列。
【請求項５】
Ｙが、１２−１８ヌクレオチド長、または１４−１６ヌクレオチド長、または１６−１８ヌクレオチド長、または１７−１９ヌクレオチド長、または１５−３０ヌクレオチド長、または１８−２７ヌクレオチド長、または２１−２４ヌクレオチド長、または２４−２８ヌクレオチド長、または２５−２９ヌクレオチド長である、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項６】
Ｘが、３−８ヌクレオチド長、好ましくは４−６ヌクレオチド長、より好ましくは５−６ヌクレオチド長である、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項７】
Ｚが、Ｙと同じ長さを有し、Ｙとの１以上のミスマッチを有する、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項８】
Ｚが、Ｙと異なる長さを有し、Ｙと比較して１以上の挿入または欠失を有する、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項９】
ＡＡＧＣを含む、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項１０】
ＣＡＴＣを含む、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項１１】
配列番号３、４または６の配列を有する、請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
【請求項１２】
第１のステム−ループおよび第２のステム−ループを含む転写ターミネーターであって、該第１のステム−ループが請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有し、該第１のステム−ループが第２のステム−ループに対して５’にあるように操作される、転写ターミネーター。
【請求項１３】
第２のステム−ループが短いステム−ループである、請求項１２に記載の転写ターミネーター。
【請求項１４】
第２のステム−ループが請求項１−４のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有する、請求項１２に記載の転写ターミネーター。
【請求項１５】
さらに第３のステム−ループを含む、請求項１２に記載の転写ターミネーター。
【請求項１６】
第３のステム−ループが短いステム−ループである、請求項１５に記載の転写ターミネーター。
【請求項１７】
第３のステム−ループが請求項１−１１のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有する、請求項１５に記載の転写ターミネーター。
【請求項１８】
配列番号２または５の配列を有する、請求項１２に記載の転写ターミネーター。
【請求項１９】
転写ターミネーターがＤＮＡインサートに作動可能に連結される、請求項１２に記載の転写ターミネーターを含むベクター。
【請求項２０】
配列番号１の配列を有する、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のベクターを含む操作された細胞。
【請求項２２】
転写ターミネーターがＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作されている、ベクターにおいて請求項１２に記載の転写ターミネーターを提供することを含む、ベクターを操作する方法。
【請求項２３】
ＤＮＡインサートの転写を終結させる方法であって、
ａ．該ＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作された、請求項１２に記載の転写ターミネーターを提供すること；
ｂ．該ＤＮＡインサートの転写を可能にすること；および
ｃ．該転写ターミネーターで該ＤＮＡインサートの転写を終結させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／２６０，７００号の利益および優先権を主張し、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
一般に、本開示は、分子クローニングに有用な非天然合成遺伝子構成要素に関する。より詳細には、天然または非天然ＤＮＡインサートのクローニングにおける使用のために人工転写ターミネーターを提供する。
【背景技術】
【０００３】
分子クローニングおよび組換えＤＮＡ技術において、遺伝子またはそのフラグメントのような種々のＤＮＡインサートは、ベクター中へしばしば導入され、その後、宿主培養物中で増殖される。しかしながら、例えば、生存に不必要な二次タンパク質への、ＤＮＡインサートの不所望の発現は、宿主の健康および生育に有害である。発現率および細胞代謝に対する修飾の特定の調整を可能にする制御可能な発現系が、所望される。組換え発現系の１つの重要な態様は、終結効率を包含する転写効率である。低終結効率は、読み通し転写（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｃｒｉｐｔｉｏｎ）およびそれ自身で細胞にストレスを与える長いｍＲＮＡの製造を引き起こすが、とりわけプラスミドベクターの分野において、それにまして、不必要なタンパク質の発現を引き起こし、または導入遺伝子構築物の複製制御を妨害し得る。
【０００４】
従って、転写ターミネーターのような改良されたベクター構成要素、とりわけ、高終結効率を有する合成非天然ターミネーターに対する要望が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
要約
本開示は、多重クローニング、多重シークエンシング、および定方向性クローニング（ｆｉｘｅｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）のために構築されるベクターおよびベクター構成要素を提供する。本明細書で記載されるベクターおよびベクター構成要素は、宿主に対して有害であり得る挿入配列を首尾よくクローン化させる。本明細書で記載されるベクターは、該挿入DNAがクローン化されるべき領域を活発に転写するプロモーターを含有する直接選択ベクターの不利益にも対抗する。いくつかの実施形態において、該挿入DNAフラグメントを転写しない低バックグラウンドベクターが提供される。従って、挿入DNAが運ばれる宿主に対して有害なまたはストレスをかける、有毒なまたはそうでなければ有害なペプチドまたはタンパク質をコードする挿入DNAは、該宿主により容認されることができる。
【０００６】
一態様において、１以上の非天然人工転写ターミネーターは、該インサートが導入される該ベクターの一部として、あるいは合成されるまたはアセンブルされる該インサートの一部としてベクター中に含まれることができる。本明細書で提供される転写ターミネーターは、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）の転写の休止を容易にするために使用されることができる。いくつかの実施形態において、該転写ターミネーターは、１以上のステム−ループ配列を含むことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｘ−Ｙ−Ｚステム−ループを含む非天然核酸配列を提供し、ここで：Ｙは、１０−３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり；Ｘは、３−１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その中の各ヌクレオチドは、Ｘ内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず；Ｚは、１０−５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙに対して少なくとも７０％相補性を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、Ｙは、多くても６０％、多くても５０％、または多くても４０％のＧ／Ｃ含量を有する。Ｙは、Ｘに対して５’またはＸに対して３’にあってもよい。ある特定の実施形態において、Ｙは、１２−１８ヌクレオチド長、１４−１６ヌクレオチド長、１６−１８ヌクレオチド長、１７−１９ヌクレオチド長、１５−３０ヌクレオチド長、１８−２７ヌクレオチド長、２１−２４ヌクレオチド長、２４−２８ヌクレオチド長、または２５−２９ヌクレオチド長であることができる。
【０００９】
Ｘは、該ステム−ループのループ部分であり、いくつかの実施形態において、３−８ヌクレオチド長、４−６ヌクレオチド長または５−６ヌクレオチド長であり得る。
【００１０】
Ｚは、Ｙと同じまたは異なる長さを有することができる。Ｚは、Ｙとの１以上のミスマッチを有し得る。Ｚは、Ｙと比較して１以上の挿入または欠失を有することができ、故に、Ｙと共にアニールされた場合、突出またはループを形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態におけるステム−ループは、ＡＡＧＣおよび／またはＣＡＴＣの配列を含むことができる。いくつかの例において、該ステム−ループは配列番号３、４または６の配列を有することができる。
【００１２】
さらなる態様は、第１のステム−ループおよび第２のステム−ループを含む転写ターミネーターに関し、ここで、該第１のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか１つを有し、ここで、該第１のステム−ループは、該第２のステム−ループに対し５’にある。いくつかの実施形態において、該第２のステム−ループは短いステム−ループである。該第２のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか１つを有してもよい。該転写ターミネーターは、短いステム−ループであり得る第３のステム−ループをさらに含むことができ、または本明細書で開示される非天然核酸配列のいずれか１つをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、該転写ターミネーターは配列番号２または５の配列を有する。
【００１３】
ＤＮＡインサートに作動可能に連結された、本明細書で開示される１以上の転写ターミネーターを含むベクターも本明細書で提供される。一実施形態における該ベクターは配列番号１の配列を有する。ＤＮＡインサートは、遺伝子、遺伝子フラグメント、およびオープンリーディングフレームのような目的の（例えば、クローニング目的のための）任意の核酸であることができる。いくつかの実施形態において、該ＤＮＡインサートは非天然核酸分子である。ある特定の実施形態において、該ＤＮＡインサートおよび／または転写ターミネーターのようなベクターの任意の部分は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５１６９６、ＷＯ２０１４／００４３９３、ＷＯ２０１３／１６３２６３、ＷＯ２０１３／０３２８５０、ＷＯ２０１２／０７８３１２、ＷＯ２００４／２４８８６、ＷＯ２００８／０２７５５８、ＷＯ２０１０／０２５３１０およびＷＯ２０１６／０６４８５６（その全ての開示は参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる）中に記載されるような種々の合成およびアセンブリー戦略により作成される合成分子であることができる。
【００１４】
別の態様は、本明細書で開示されるベクターを含む操作された細胞に関する。
【００１５】
さらなる態様は、ベクターにおいて本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供することを含み、ここで、該転写ターミネーターは、ＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作されている、ベクターを操作する方法に関する。
【００１６】
さらなる態様は、（ａ）ＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作された、本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供すること；（ｂ）該ＤＮＡインサートの転写を可能にすること；および（ｃ）該転写ターミネーターで該ＤＮＡインサートの転写を終結させることを含む、ＤＮＡインサートの転写を終結させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】例示的ベクターマップを説明する図である。
【００１８】
【図２】２つのターミネーター（「Ｔ」）を有するベクターのスキームを説明する図である。
【００１９】
【図３】転写ターミネーターの例示的実施形態を説明する図である。
【００２０】
【図４】転写ターミネーターの例示的実施形態を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示は、多重クローニング、多重シークエンス、および／または定方向性クローニングのために構築されたベクター、ベクター構成要素およびポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、宿主に有害であり得る挿入配列は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを用いて首尾よくクローン化されることができる。このことは、自然遺伝学としばしば２つの点で異なる遺伝子操作においてとりわけ有利である。第一に、非常に強力なプロモーターが高流量のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を生成する合成回路に頻繁に必要とされる。第二に、次の転写ユニットに干渉しないために、設計は比較的短い一本鎖ＤＮＡに沿ってモジュール的に体系化され、該高流量のＲＮＡＰは敏速に止められる必要がある。このハードスタート−ハードストップ設計は、強力なターミネーターの必要性を導入する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、挿入DNAフラグメントを転写しない低バックグラウンドベクターが提供される。該ベクターは、本明細書で記載される特性を有する１以上の合成非天然ポリヌクレオチド配列を含むことができる。該ポリヌクレオチドは、（通常は、ターミネーターをコードする）ＤＮＡ、または（通常は、ヘアピン構造へ折り畳まれることができ、該ターミネーターを含み得る）ＲＮＡであることができる。該ポリヌクレオチドは、（とりわけＲＮＡについては）一本鎖、または（とりわけＤＮＡについては）二本鎖であることができる。
【００２３】
ある特定の実施形態において、該ポリヌクレオチド配列は転写ターミネーターである。１以上のターミネーターは、挿入配列の５’および／または３’において、および／または該挿入配列内に含まれることができる。該ターミネーターは、ベクター中へ構築されることができる。いくつかの実施形態において、該ターミネーターは、該ベクター中にその後に導入される挿入配列の一部として、合成またはアセンブルされることができる。種々の合成およびアセンブリー戦略は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５１６９６、ＷＯ２０１４／００４３９３、ＷＯ２０１３／１６３２６３、ＷＯ２０１３／０３２８５０、ＷＯ２０１２／０７８３１２、ＷＯ２００４／２４８８６、ＷＯ２００８／０２７５５８、ＷＯ２０１０／０２５３１０およびＷＯ２０１６／０６４８５６（その全ての開示は参照により全内容が本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、１以上の標的核酸の合成またはアセンブリー後、それらはベクター中へ個々にクローン化されることができ、またはかかるクローニングは平行して多重化様式で実施されることができる。本明細書で開示される１以上の転写ターミネーターの組み込みにより、クローニング成功率および効率を増加させることができる。
【００２５】
定義
便宜のため、本明細書、実施例および特許請求の範囲中で使用される特定の用語がここに集められる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野における通常の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書で、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または１より多い（すなわち、少なくとも１の）該冠詞の文法上の目的語を示すために使用される。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１より多い要素を示す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「約」なる語は、２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。「実質上」なる語は、５０％より大きい、好ましくは８０％より大きい、最も好ましくは９０％または９５％より大きいことを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」なる語は、任意の長さの連続するアミノ酸残基の配列を示す。ここで、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、または「タンパク質」なる語は、「アミノ酸配列」なる語と交換可能に用いられ得る。
【００２９】
遺伝的要素（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、プラスミドまたはベクターの「コピー数」は、宿主細胞中にいくつのコピーが存在するかを示す。一般に、コピー数は、使用される複製起点（「ＯＲＩ」）により決定され、該ＯＲＩ中の変異を用いて操作されることができる。例えば、ｐＭＢ１  ＯＲＩが、１細胞あたり約２０コピーを維持する一方、２つのみの変異により異なるｐＭＢ１  ＯＲＩの誘導体を含有するｐＵＣは、１細胞あたり７００ものコピーを製造するであろう。「高コピー数」遺伝的要素またはプラスミドは、例えば、少なくとも１細胞あたり１００コピーが存在するまでそれ自身を複製することができるものである。一般に使用される高コピー数プラスミドは、ｐＵＣ（ｐＭＢ１誘導体ＯＲＩ）、Ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＣｏｌＥ１誘導体ＯＲＩ）、およびｐＧＥＭ（ｐＭＢ１誘導体ＯＲＩ）を包含する。「低コピー数」遺伝的要素またはプラスミドは、例えば１細胞あたり約２０未満コピーで存在する。一般に使用される低コピー数プラスミドは、ｐＢＲ３２２（ｐＭＢ１  ＯＲＩ）、ｐＥＴ（ｐＭＢ１  ＯＲＩ）、ｐＧＥＸ（ｐＭＢ１  ＯＲＩ）、ｐＣｏｌＥ１（ＣｏｌＥ１  ＯＲＩ）、ｐＲ６Ｋ（Ｒ６Ｋ  ＯＲＩ）、ｐＡＣＹＣ（ｐ１５Ａ  ＯＲＩ）、ｐＳＣ１０１（ｐＳＣ１０１  ＯＲＩ）およびｐＬｙｓ（ｐ１５Ａ  ＯＲＩ）を包含する。
【００３０】
「遺伝的要素」は、自己複製を行うことができる任意のコーディングまたは非コーディング核酸配列であり得る。遺伝的要素は、１以上の複製起点、オペロン、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、マーカー、調節配列、プロモーター、オペレーター、カタボライトアクチベータータンパク質（サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質、「ＣＡＰ」としても知られる）結合部位、エンハンサー、転写ターミネーター、または作動可能に共に連結されることができる任意のそれらの組み合わせを包含し得る。例えば、プラスミド、ファージベクター、ファージミド、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオン等を包含する。いくつかの例において、「遺伝的要素」および「ベクター」は交換可能に使用される。
【００３１】
「宿主」は、ベクターに対するまたは外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質の組み込みに対するレシピエントであることができる、または該レシピエントである、任意の個々のウイルスまたは細胞またはその培養物を包含することが意図される。また、それは、単一のウイルスまたは細胞の子孫を包含することも意図される。該子孫は、天然の、偶発的または意図的な変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に（形態学的に、あるいはゲノムまたは全ＤＮＡ相補体において）同一でなくてもよい。ウイルスは、ファージであることができる。細胞は、原核性または真核性であってもよく、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞およびほ乳類細胞、例えば、ネズミ、ラット、サルまたはヒト細胞を包含する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列マッチングを最大にするように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮して配列が並べられる場合、２以上の配列中の対応する位置の同一ヌクレオチドの割合を意味する。同一性を決定する方法は、テストされる配列間の最大のマッチングを与えるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。２配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法は、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡを包含する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公的に入手可能である。よく知られたスミス  ウォーターマン  アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）は、同一性を決定するために用いられてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴＮは、１１．０のオープンギャップペナルティーおよび１．０の拡張ギャップペナルティーを有するデフォルトのパラメーターを用い、ｂｌｏｓｕｍ−６２  ｍａｔｒｉｘを利用して実行されることができる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」および本明細書でのそれらのバリエーションは、その後に挙げられる項目およびその等価物並びに追加の項目を包含することを意図される。「−からなる」は、限定された範囲の要素または特徴に関するクローズエンデッド（ｃｌｏｓｅ−ｅｎｄｅｄ）として理解される。「本質的に−からなる」は、明記された要素および工程に範囲を限定するが、特許請求の範囲に記載された発明の基礎的で新規な特性に実質的に影響しないものを除外しない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「インサート」は、ベクター内の適合領域にライゲートされる非相同核酸配列である。インサートは、ポリペプチドをコードする１以上の核酸配列（例えば、遺伝子またはそのフラグメント）を含み得る。インサートは、例えば、該インサートの転写および／または翻訳を可能にする調節領域または他の核酸要素を含み得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」または他の文法上の同意義語は、共有結合した少なくとも２つのヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログを意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、２０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００等を包含する任意の長さのポリマーである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの共有結合したヌクレオチド残基を含む核酸分子であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０−１，０００ヌクレオチド長であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１０−５００ヌクレオチド長、または５００−１０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約２０−約３００ヌクレオチド長（例えば、約３０−２５０、約４０−２２０ヌクレオチド長、約５０−２００ヌクレオチド長、約６０−１８０ヌクレオチド長、あるいは約６５−約１５０ヌクレオチド長）、約１００−約２００ヌクレオチド長、約２００−約３００ヌクレオチド長、約３００−約４００ヌクレオチド長、または約４００−約５００ヌクレオチド長であり得る。しかしながら、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、天然または非天然合成ポリマー形態のヌクレオチドを示す。一般に、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の両方を包含し、ここで、「ポリヌクレオチド」はより長い核酸（例えば、１，０００より多い塩基または塩基対、５，０００より多い塩基または塩基対、１０，０００より多い塩基または塩基対、等）を示してもよく、「オリゴヌクレオチド」はより短い核酸（例えば、１０−５００塩基または塩基対、２０−４００塩基または塩基対、４０−２００塩基または塩基対、５０−１００塩基または塩基対、等）を示してもよい。本開示の核酸分子は、天然ヌクレオチド、例えば、形成途中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子から形成され得る。あるいは、天然核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）におけるような、その性質を改変する構造修飾を包含し得る。天然または合成塩基を用いた核酸分子の固相合成は、当該分野では周知である。該用語は、等価物、ヌクレオチドアナログから作成されるＲＮＡまたはＤＮＡいずれかのアナログ、および記載されている実施形態に適用可能であるように一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを包含すると理解されるべきである。本開示において有用なヌクレオチドは、例えば、天然ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）、またはヌクレオチドの天然または合成修飾、または人工塩基を包含する。いくつかの実施形態において、核酸の配列は天然に存在しない（例えば、ｃＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ配列、または人工設計配列）。
【００３７】
通常、核酸において、ヌクレオシドはリン酸ジエステル結合により連結される。核酸が文字配列により表示される場合はいつでも、該ヌクレオシドは左から右へ５’から３’の順序であることが理解されるだろう。ＩＵＰＡＣ表記法（ＩＵＰＡＣ  ｎｏｔａｔｉｏｎ）に従い、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示し、「Ｕ」はリボヌクレオシド、すなわちウリジンを示す。加えて、１より多い種類のヌクレオチドがその位置で生じる場合に使用される文字もある：「Ｗ」（すなわち、弱い結合）はＡまたはＴを示し、「Ｓ」（強い結合）はＧまたはＣを示し、「Ｍ」（アミノに対して）はＡまたはＣを示し、「Ｋ」（ケトに対して）はＧまたはＴを示し、「Ｒ」（プリンに対して）はＡまたはＧを示し、「Ｙ」（ピリミジンに対して）はＣまたはＴを示し、「Ｂ」はＣ、ＧまたはＴを示し、「Ｄ」はＡ、ＧまたはＴを示し、「Ｈ」はＡ、ＣまたはＴを示し、「Ｖ」はＡ、ＣまたはＧを示し、「Ｎ」は任意の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ（Ｕ）を示す。核酸配列は４つの天然デオキシヌクレオチドに限定されず、リボヌクレオシドおよび非天然ヌクレオチドも含み得ることが理解される。括弧中に与えられるヌクレオチド配列またはヌクレオチド中の「／」は、ＤＮＡ配列中のＴに代わるＲＮＡ配列中の代替のＵのような、代替のヌクレオチドを示す。従って、Ｕ／ＴまたはＵ（Ｔ）は、ＵまたはＴのいずれかであり得る１つのヌクレオチド位置を示す。同様に、Ａ／Ｔは、ヌクレオチドＡまたはＴを示し；Ｇ／Ｃは、ヌクレオチドＧまたはＣを示す。ＵとＴとの間の機能的同一性のため、本明細書でのＵまたはＴへのいずれかの言及は、ＴまたはＵのもう一方としての開示としても見るべきである。例えば、（ＲＮＡ配列上の）配列ＵＵＣＧへの言及は、（対応するＤＮＡ上の）配列ＴＴＣＧの開示としても理解される。便宜のみのため、これらの選択肢の１つのみが本明細書で記載される。相補的ヌクレオチドまたは塩基は、ＡおよびＴ（またはＵ）；ＧおよびＣ；ＧおよびＵのような塩基対合可能なものである。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結され」または「作動可能に配置され」なる語は、第１の活性（例えば、ターミネーター活性）を有する遺伝子構成要素が、第２の活性を有する別の遺伝子構成要素（例えば、プロモーター、オペレーター、カタボライトアクチベータータンパク質結合領域、エンハンサー、遺伝子、遺伝子フラグメント、オープンリーディングフレーム、等）と同じ核酸分子内にあるように操作され、機能的関係性があることを意味する。例えば、ターミネーターがインサートに作動可能に連結されることは、該インサートからの転写がターミネーターで終結されることができるように、該ターミネーターおよびインサート（例えば、遺伝子）がともに操作される（例えば、発現カセットにおいて）ことを意味する。
【００３９】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、アミノ酸残基のポリマーを示す。これらの語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含有するもの、および非天然アミノ酸ポリマーにも適用する。本出願の場合、「ポリペプチド」なる語は、抗体またはそのフラグメントを包含する。
【００４０】
「プラスミド」は、宿主の染色体ＤＮＡから独立して複製するＤＮＡの小円状体である。宿主は、細菌、酵母、植物、またはほ乳類細胞であることができる。典型的に、プラスミドは、複製起点、選択マーカー、および１以上のクローニング部位を有する。プラスミドは、２以上の異なる宿主間でシャトル可能なように、２以上の異なる複製起点を含有することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」なる語は、目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御し得るＤＮＡ配列を示し、一般に、他の転写因子の結合のためのＲＮＡポリメラーゼ結合部位および１以上のオペレーターおよび／またはカタボライトアクチベータータンパク質（サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質、「ＣＡＰ」としても知られる）結合部位を含有する。プロモーターは、構成的にアクティブであり得るか（「構成的プロモーター」）、または化学薬品、熱または光のような他の因子により制御され得る。「誘導可能プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」の活性は、存在または不在、あるいは生物的または非生物的因子により誘導される。一般に使用される構成的プロモーターは、（エタノールにより抑制される）ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒト  ベータ  アクチン、ＣＡＧ、Ａｃ５、Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、Ｔ７、および（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）ＳＰ６を包含する。一般的な誘導可能プロモーターは、（テトラサイクリンまたはその誘導体により誘導可能な；ＴｅｔＲレセプターにより抑制可能な）ＴＲＥ、（ガラクトースにより誘導可能な；グルコースを用いて抑制可能な）ＧＡＬ１＆ＧＡＬ１０、（ｌａｃレセプター（ＬａｃＩ）の不在において構成的である；ＩＰＴＧまたはラクトースにより誘導可能な）ｌａｃ、（Ｔ７およびｌａｃのハイブリッド；ｌａｃオペレーターによっても制御されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする；ＩＰＴＧまたはラクトースにより誘導可能な）Ｔ７ｌａｃ、（リプレッサーＡｒａＣに結合して転写を活性化させるアラビノースによって誘導可能な；ＣＡＰ結合部位を介するグルコースの存在下で、または抗インデューサーフコース（ａｎｔｉ−ｉｎｄｕｃｅｒ  ｆｕｃｏｓｅ）の競合結合によってカタボライト抑制を抑制する）ａｒａＢＡＤ、（ＴｒｐＲリプレッサーと結合する際にトリプトファンにより抑制可能な）ｔｒｐ、（ｌａｃおよびｔｒｐのハイブリッド；ｌａｃプロモーターのように制御される；例えば、ｔａｃＩおよびｔａｃＩＩである）ｔａｃ、および（温度により制御される）ｐＬを包含する。該プロモーターは、宿主に応じて、原核生物のまたは真核生物のプロモーターであることができる。一般的なプロモーターおよびそれらの配列は、当該分野において周知である。
【００４２】
一般に、「ステム−ループ」配列（「ヘアピン」と交換可能に使用される）は、互いの逆相補体である単一の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその他）分子内の少なくとも２つの領域が１以上の非相補的領域によって隔てられ、そのため、該非相補的領域が「ループ」を形成する一方、該相補的領域がハイブリダイズして「ステム」を形成する配列を示す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」は、他に注記が無ければ、転写終結を示すものとする。「終結シグナル」または単に「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの転写を妨げるまたは止める核酸配列を示す。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるターミネーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと関連して使用されるが、他のＲＮＡポリメラーゼのための終結ももたらすことができる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、他に明記されない限り、「転写」なる語は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を示し；「翻訳」なる語は、ｍＲＮＡ鋳型からのポリペプチドの合成を示す。転写および翻訳はまとめて「発現」として知られる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」なる語は、外因性核酸を宿主細胞中に移入または導入させる過程を示す。トランスフェクトまたは形質導入細胞は、一次対象細胞およびその子孫を包含する。該宿主細胞は、細菌、酵母、ほ乳類細胞、および植物細胞であることができる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を示す。ベクターは、適切なコントロール要素と結合された場合に複製が可能であり（例えば、複製装置タンパク質をリクルートすることにより複製の開始を可能にするＤＮＡ配列である複製起点を含有する）、遺伝子配列を宿主中へまたは宿主間で移動させることができる、プラスミド、ファージベクター、ファージミド、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオン等のような任意の遺伝的要素を包含する。１つのタイプのベクターは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。別のタイプのベクターは、宿主細胞の遺伝物質に再結合するように設計される統合的ベクターである。ベクターは、自立複製性および統合的であってもよく、ベクターの特性は細胞環境により異なり得る（すなわち、ベクターは、ある宿主細胞タイプにおいて自立的に複製し、別の宿主細胞タイプにおいて完全に統合的であり得る）。一般に、ベクターは、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または部位特異的組換えのための部位を含有する。外来ＤＮＡフラグメントは、切断され、これらの部位で該ベクター中にライゲートされ得る。該ベクターは、形質転換またはトランスフェクト細胞の同定における使用に適切なマーカーを含有し得る。例えば、マーカーは、抗生物質耐性、蛍光性、酵素性、並びに他の特性を提供し得る。第２の例として、マーカーは、栄養要求性欠陥を補足し、または培養培地中にない重要な栄養素を供給し得る。
【００４７】
本明細書で使用する場合、組換え核酸技術、微生物学、遺伝子工学、および分子細胞生物学の分野において使用される他の用語は、適用可能な分野における通常の当業者によって一般に理解されるだろう。
【００４８】
転写ターミネーター
転写は、遺伝子発現の中心的工程であり、故に単一遺伝子または遺伝子群の発現を扱うための強力な選択肢を与え得る。ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）がｍＲＮＡ転写産物の合成を触媒する、ｍＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡポリメラーゼ三重構造が形成されるＤＮＡ鋳型上で、転写は起こる。該三重複合体が形成されると、非終結転写休止または遅滞の間、ＲＮＡＰの解離なしに、１秒あたり１００塩基もの取り込みを可能にするのに十分なほど、それは安定である必要がある。従って、伸長ＲＮＡＰと鋳型ＤＮＡおよび結果として生じるＲＮＡ転写産物との密接な結合は、数百または数千ヌクレオチドの長さを有するｍＲＮＡを製造する能力には不可欠である。
【００４９】
転写開始および並外れて安定な三重複合体の形成後、ＲＮＡＰ酵素は鋳型に沿って移動し、ヌクレオチドを１つずつ取り込み、所望のｍＲＮＡ鎖を製造する。ｍＲＮＡの合成および単一遺伝子または転写オペロンのｍＲＮＡの放出は、鋳型上の別個の部位で止められなければならない。この過程は、転写終結と呼ばれ、逆の順序であるが転写開始中の事象と似ており、ＲＮＡＰの解離および転写ＲＮＡの放出をもたらす。終結は、鋳型ＤＮＡ内のよく定義されたシグナルいわゆる転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒまたはｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）または単にターミネーターに応答して起こる。ほとんどの生物学的過程のように、終結は、運命を左右する（ｍａｋｅ−ｏｒ−ｂｒｅａｋ）決定ではなく、故に１００％の程度では起こらない。実際、ターミネーターによっては、終結の効率が幅広く異なり、終結効率（ＴＥ）において大きな違いがある。実際、終結シグナルは、所与のＲＮＡポリメラーゼに対して非常に特異的である。非終結事象は、ポリメラーゼの読み飛ばし（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）としても記載される。
【００５０】
固有の転写ターミネーターまたはＲｈｏ−独立性ターミネーターは、伸長転写産物上での自己アニーリングヘアピン構造の形成を必要とし、ｍＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡポリメラーゼ三重複合体の崩壊をもたらす。天然ターミネーター配列は、二者対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）の２０塩基対ＧＣ−リッチ領域、次いで、ＲＮＡに転写して終結ヘアピンおよび７−９ヌクレオチド「Ｕトラック（Ｕ  ｔｒａｃｋ）」をそれぞれ形成する短いポリ−Ｔトラクト（ｐｏｌｙ−Ｔ  ｔｒａｃｔ）または「Ｔストレッチ（Ｔ  ｓｔｒｅｔｃｈ）」を含有する。（一般に、二者対称は、その塩基対配列が互いの逆反復であるＤＮＡ鎖の２領域を示す。それらはしばしばパリンドロームとして記載される。）天然および合成ターミネーターの研究は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５８２  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，６５９-６６４（２０１３）において提供される。
【００５１】
終結のメカニズムは、該ＲＮＡＰとのヘアピン結合相互作用のアロステリック効果による解離の直接的促進と「競争的キネティクス」との組み合わせにより起こると仮説立てられる。該ヘアピン形成は、ＲＮＡＰ失速（ｓｔａｌｌｉｎｇ）および不安定化を引き起こし、その部位で休止される時間の増加および複合体の安定性減少により、該複合体の解離がその場所で起こる可能性がより高まる。
【００５２】
長期間、ステム構造内でＧ−Ｃ対により仲介されるヘアピンの安定性は、ＴＥに影響するためのヘアピン構造の最も不可欠な部分であると考えられていた。理論的に、ステム構造中への推定上の塩基の挿入は、より高い全ＡＧ価をもたらすはずであり、故に全ＴＥが増加するはずである。驚くべきことに、Ｇ−Ｃ対を挿入することによる熱力学的安定性の増加は、より高いＴＥをもたらさず、これは該ヘアピン構造の安定性が終結の不可欠な唯一の決定因子ではないことを示している。安定性に加え、ヘアピンの三次元構造は、終結において重要な役割を果たすことが仮定される。最も特徴的な固有ターミネーターについて、ステム構造の第１の閉鎖塩基対から第１の終結位置までの距離は保存される。該不変性は、該三次元構造の重要性に対する推定上の証拠として見ることができる。結論として、該ヘアピンは、伸長ポリメラーゼと相互作用するために、別個の三次元形であると想定されなければならないようである。
【００５３】
一態様において、本明細書において、非天然人工転写ターミネーターが提供される。いくつかの実施形態において、転写ターミネーターは、１以上のステム−ループ配列を包含することができる。いくつかの場合において、ステム−ループ配列は、約７−約２００ヌクレオチド長、１０−１００ヌクレオチド長、１５−８０ヌクレオチド長、２０−５０ヌクレオチド長、または３０−４０ヌクレオチド長であることができる。該ステム−ループ配列は、設計に応じてより短くてもより長くてもよい。
【００５４】
各ステム−ループ内で、１以上のループ構造が設計されることができる。該ループは、該ループの根元の、該ステムと結合している２つのヌクレオチドが相補的である（例えば、Ａ−ＴまたはＧ−Ｃ）フルループ（ｆｕｌｌ  ｌｏｏｐ）であることができる。一般に、ステムの頂上にあるループはフルループである。該ループの根元の、ステムと結合している２つのヌクレオチドが塩基対を形成しない場合（例えば、ＡおよびＡ、ＴおよびＴ、ＡおよびＧ、ＴおよびＣ、等）、該ループはハーフループ（ｈａｌｆ  ｌｏｏｐ）であることもできる。ステム−ループは、１以上のフルおよび／またはハーフループを有することができる。該ループの根元の、ステムと結合している２つのヌクレオチドを除き、ループのサイズは、宿主がＥ．ｃｏｌｉのような細菌である場合、３−１２ヌクレオチド、または４−１０ヌクレオチド、または５−８ヌクレオチドのいずれかであることができる。宿主が酵母またはほ乳類細胞である場合、ループサイズはより大きい、例えば、最高１５ヌクレオチドまたは最高２０ヌクレオチドまたはより大きくてもよい。
【００５５】
ステム部分は、２つの塩基対フラグメントの間で１００％相補性を有する必要はない。便宜のため、ステム中の一方のフラグメントを陽性または＋フラグメント、もう片方を陰性または−フラグメントと名付ける。いくつかの実施形態において、該ステムは、２つの塩基対フラグメントの間で少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％の相補性を有することができる。１００％未満の相補性がある場合、陰性フラグメントと比較して、陽性フラグメントは、１以上のミスマッチ、（ループを形成するため連続的に、または非連続的に）１以上の挿入および／または（陰性フラグメント上でループを形成するため連続的に、または非連続的に）１以上の欠失を含有し得る。
【００５６】
ある特定の実施形態において、ステム−ループ配列は、長いステムを有する「高い（ｔａｌｌ）」ステム−ループまたは短いステムを有する「短い（ｓｈｏｒｔ）」ステム−ループであることができる。一般に、高いステム−ループは、一方の鎖上で折り畳まれると、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のサイズの少なくとも２倍（２Ｘ）、例えば２Ｘ  ＲＮＡＰ、３Ｘ  ＲＮＡＰ、またはそれより長い、またはその間のいずれかのサイズのステムを有することができる。一般に、短いステム−ループは、ＲＮＡＰのサイズの２倍より短い、例えば１Ｘ  ＲＮＡＰ、２Ｘ  ＲＮＡＰ、またはそれより短い、またはその間のいずれかのサイズのステムを有する。ＲＮＡＰは、約５−１０ヌクレオチド長、または約６−９ヌクレオチド長、または約７−８ヌクレオチド長を占めることができ、１Ｘ  ＲＮＡＰステムの長さであることができる。従って、２Ｘ  ＲＮＡＰステムは、約１０−２０ヌクレオチド長、約１２−１８ヌクレオチド長、約１４−１６ヌクレオチド長、約１６−１８ヌクレオチド長、約１７−１９ヌクレオチド長であり得る。３Ｘ  ＲＮＡＰステムは、約１５−３０ヌクレオチド長、約１８−２７ヌクレオチド長、約２１−２４ヌクレオチド長、約２４−２８ヌクレオチド長、または約２５−２９ヌクレオチド長であり得る。その他も同様である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ターミネーター配列を（十分な終結効率を有したまま）可能な限り短く保ち、大きいインサートに適合するようにベクターの全サイズを最小限にすることが望まれ得る。これらの場合、該高いステム−ループは、３Ｘ  ＲＮＡＰ以下または２Ｘ  ＲＮＡＰ以下のステム長を有するように設計されることができる。ベクターサイズがあまり問題でない場合、より長いステム（例えば、３Ｘ  ＲＮＡＰまたはより長い）を含むことができる。
【００５８】
転写ターミネーターは、１より多いステム−ループ配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、転写ターミネーターは、少なくとも２ステム−ループ、少なくとも３ステム−ループ、少なくとも４ステム−ループ、少なくとも５ステム−ループ、少なくとも６ステム−ループ、あるいはより多いまたはより少ないステム−ループを有することができる。宿主がＥ．ｃｏｌｉのような細菌である場合、ベクターサイズを小さく保つため、該ターミネーターは、３ステム−ループまたはより少ないステム−ループを含み得る。
【００５９】
転写ターミネーターは、１以上の高いステム−ループおよび１以上の短いステム−ループの混合物を含むことができる。各ターミネーター内のステム−ループは、高いおよび短いステム−ループの任意の組み合わせまたは配置であることができる。例えば、該ターミネーターは、５’から３’へ、高いステム−ループの次に短いステム−ループ、その次に高いステム−ループを含むことができる。該ターミネーターは、３つの高いステム−ループを含むこともできる。別の例において、該ターミネーターは、５’から３’へ高−高−短−短−高−高の順序で、６つのステム−ループを有し得る。２つの隣接したステム−ループは、互いに、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１８、または少なくとも２０ヌクレオチド離れているように設計されることができる。２つの隣接したステム−ループは、互いに、多くても２００、多くても１５０、多くても１００、多くても９０、多くても８０、多くても７０、多くても６０、多くても５０、多くても４０、多くても３０または多くても２０ヌクレオチド離れているように設計されることができる。
【００６０】
１以上のターミネーターは、コーディング配列の転写に影響するように該コーディング配列に作動可能に連結されることができる。かかる作動可能な連結は、例えば、遺伝子のためのコーディング配列と同じＤＮＡ分子上でターミネーターを提供することによることができる。２以上のターミネーターは、前に置かれたコーディング配列の協調した終結を提供するために互いに関連して配置される場合、作動可能に連結されることができる。例えば、インサートは、本明細書に提供されるアンチセンスターミネーター配列の３’および／または転写ターミネーターの５’に配置されることができる。いくつかの実施形態において、ターミネーター配列は、コーディング配列の下流に、すなわち、コーディング配列の３’末端上に配置されることができる。ターミネーター配列は、コーディング配列の上流にあることもできる。該ターミネーターは、例えば、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００ヌクレオチド、該コーディング配列の下流または上流にあるか、または該コーディング配列に直接隣接していることができる。コーディング配列と組み合わせてまたはコーディング配列から独立して、該ターミネーター配列は、１００００未満、８０００未満、６０００未満、５０００未満、４５００未満、４０００未満、３５００未満、３０００未満、２５００未満、２０００未満、１５００未満、１０００未満、７５０未満、５００未満、２５０未満、１００未満ヌクレオチド、該コーディング配列の下流にあることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｘ−Ｙ−Ｚステム−ループを含む非天然核酸配列を提供し、ここで：Ｙは、１０−３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり；Ｘは、３−１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、Ｘ内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず；Ｚは、１０−５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙに対して少なくとも７０％相補性を有する。Ｘは、該ステム−ループのループ部分であり、いくつかの実施形態において、３−８ヌクレオチド長、４−６ヌクレオチド長または５−６ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態におけるステム−ループは、ＡＡＧＣおよび／またはＣＡＴＣ配列を含むことができる。いくつかの例において、該ステム−ループは、配列番号３、４、または６の配列を有することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、Ｙは、多くても６０％、多くても５０％、または多くても４０％のＧ／Ｃ含量を有する。Ｙは、Ｘに対して５’またはＸに対して３’にあり得る。ある特定の実施形態において、Ｙは、１２−１８ヌクレオチド長、１４−１６ヌクレオチド長、１６−１８ヌクレオチド長、１７−１９ヌクレオチド長、１５−３０ヌクレオチド長、１８−２７ヌクレオチド長、２１−２４ヌクレオチド長、２４−２８ヌクレオチド長、または２５−２９ヌクレオチド長であることができる。いくつかの実施形態において、Ｙは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
【００６３】
Ｙの長さは、Ｙと実質上同じヌクレオチド長を有するように選択され得るＺの長さを（相補性によって）決定する。Ｚは、Ｙと同じ長さを有することができ、Ｙとの１以上のミスマッチを有し得る。Ｚは、Ｙと比較して１以上の挿入を有することもでき、故に、Ｙとアニールされた場合、１以上の突起またはループを形成し得る。ヘアピンのステムである実質上相補的なＹおよびＺの長さは、塩基対中のステム長を決定する。該ステムは、本明細書で記載されるように必ずしも１００％相補的ではないが、ＹおよびＺに対する限定された非相補的対向塩基を有することができる。
【００６４】
とりわけ、ＹおよびＺは、それぞれｍおよびｎヌクレオチド長であることができ、ここで、Ｙはヌクレオチドｙ１、ｙ２…ｙｍから構成され、Ｚはヌクレオチドｚ１、ｚ２…ｚｎから構成される。ヘアピンのステムの終点が相補的であるように、好ましくは、ｚ１はｙ１に相補的であり、ｚｎはｙｍに相補的である。ＹおよびＺは、少なくとも６０％相補的、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％さえ相補的であることができる。相補性は、最も好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。ミスマッチ、挿入および／または欠失のような非相補性は、可能性であるが、上記の相補性割合を満たすように限定されるべきである。いくつかの限定された非相補性は、１以上の追加のループを形成するように互いに隣接して配置され得る。
【００６５】
さらなる態様は、第１のステム−ループおよび第２のステム−ループを含む転写ターミネーターに関し、ここで、該第１のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか１つを有し、ここで、該第１のステム−ループは、該第２のステム−ループに対し５’にある。いくつかの実施形態において、該第２のステム−ループは、短いステム−ループである。該第２のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか１つを有してもよい。転写ターミネーターは、短いステム−ループであることができ、または本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか１つを有することができる第３のステム−ループをさらに含むことができる。該開示の例示的ターミネーターは、配列番号２または５の配列を有する。配列番号２または５のターミネーターに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する相同性ターミネーターも、本開示中に包含される。配列番号２および５は、下線が引かれた数個のステム−ループを有する人工最適化ターミネーターを記載する。それらの二次構造をそれぞれ図３および４に示す。
【００６６】
ベクター
ＤＮＡインサートに作動可能に連結される、本明細書に開示される１以上の転写ターミネーターを含むベクターも本明細書で提供される。１つのベクター中に２以上のターミネーターが包含される場合、各ターミネーターは、他のターミネーターから独立して配置されてよく、例えば、インサートまたはインサートが挿入され得るクローニング部位に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、ステム−ループまたはターミネーターは、その５’および／または３’末端でエンドヌクレアーゼ制限部位が側面に配置されるように設計される。末端制限部位は、ベクターまたは発現カセットのような他の核酸分子中への組み込みのため、ステム−ループまたはターミネーターの容易な操作を可能にする。
【００６７】
インサートは、任意の天然または合成核酸配列であることができる。いくつかの実施形態において、該インサートは、インビトロ合成されたまたはアセンブルされた核酸である。種々の合成およびアセンブリー戦略は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５１６９６、ＷＯ２０１４／００４３９３、ＷＯ２０１３／１６３２６３、ＷＯ２０１３／０３２８５０、ＷＯ２０１２／０７８３１２、ＷＯ２００４／２４８８６、ＷＯ２００８／０２７５５８、ＷＯ２０１０／０２５３１０、およびＷＯ２０１６／０６４８５６中に記載され、それらの全ての開示は、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、１以上の標的核酸の合成またはアセンブリー後、それらはベクター中へ個々にクローン化されることができ、またはかかるクローニングは平行して多重化様式で実施されることができる。
【００６９】
ベクターは、容易な操作に適切な形式で、例えば、限定された長さで提供されるべきである。いくつかの実施形態において、該ベクターは、最高３０，０００ｎｔ（ヌクレオチド）、最高２５，０００ｎｔ、最高２０，０００ｎｔ、最高１５，０００ｎｔ、最高１２，５００ｎｔ、最高１０，０００ｎｔ、最高９，０００ｎｔ、最高８，０００ｎｔ、最高７，０００ｎｔ、最高６，０００ｎｔを含む。
【００７０】
ベクターは、該ターミネーターの他に、複製起点、選択可能なマーカーまたは抗生物質耐性遺伝子配列、ＤＮＡインサートの挿入のための多重クローニング部位、および／またはプロモーターのような１以上の遺伝子構成要素を含むことができる。該プロモーターは、該ターミネーターに作動可能に連結されることができる。該ターミネーターの側面に位置する制限部位および／またはターミネーターの上流のクローニング部位、または該ターミネーターの上流のインサートも包含されることができる。かかるベクターは、作動可能に連結したインサートの転写の間、機能的に高い転写率を可能にする。該ターミネーターは、（インサートが挿入され得る）多重クローニング部位の転写産物の終結のために作動可能に配置され得る。「多重クローニング部位」なる語は、制限酵素のための少なくとも２つの部位を含む部位を示すが、好ましくは、種々の制限酵素のための多数の部位を含む。
【００７１】
一実施形態におけるベクターは配列番号１の配列を有する。図１および２は例示的ベクターのスキームである。
【００７２】
とりわけ、図１は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、選択可能なマーカー（例えば、ａｍｐすなわちアンピシリン耐性）、１以上の他の遺伝子（またはＯＲＦ）、ｐＢＲ３２２起点および数個の固有制限部位を含有する２０１７ｂｐ長のベクターを説明する。図２は、図１と同じベクターの簡易化されたスキームであり、２つのターミネーター（「Ｔ」）の相対位置を示す。
【００７３】
別の態様は、本明細書で開示されるベクターを含む操作された宿主細胞に関する。宿主細胞は、培養下で生育され、拡大され得る。宿主細胞は、１以上の目的のＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、治療用、産業用、農業用、および／または医療用タンパク質）を発現させるために使用され得る。発現されたポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドであり得る。該ポリペプチドは、その後の使用のために単離または精製され得る。あるいは、インビトロ発現系が使用され得る。
【００７４】
ベクターを操作する方法に関するさらなる態様は、ベクターにおいて本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供することを含み、ここで、該転写ターミネーターは、ＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作される。
【００７５】
（ａ）ＤＮＡインサートに作動可能に連結するように操作された、本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供すること；（ｂ）該ＤＮＡインサートの転写を可能にすること；および（ｃ）該転写ターミネーターで該ＤＮＡインサートの転写を終結させることを含む、ＤＮＡインサートの転写を終結させる方法も本明細書で提供される。
【００７６】
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせて、または前述において記載される実施形態においてとりわけ議論されるわけではない様々な配置で用いられてよく、故に、その適用において、前述の記載中で示される、または図面中で説明される構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態において記載される態様は、他の実施形態において記載される態様と任意の方法で組み合わせ得る。
【００７７】
下記の実施例は、本開示の代表として示される。これらの実施例は、それ自体、開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでなく、他の均等な実施形態は、本開示、図面および添付の特許請求の範囲を考慮すると明らかであるだろう。
【００７８】
実施例
転写ターミネーターを有する低コピーカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）ベクターが設計される。ベクターマップを図１および２に説明する。配列を配列番号１に示し、ここで２つのターミネーターに下線が引かれる。ミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）において、約２．５μｇのプラスミド（ベースベクターｗ／ｏ挿入）を１０ｍＬの培養物から回収した。該ターミネーターは、配列番号２および５の配列を有し、それらの二次構造を図３および４に示す。該ステム−ループは、配列番号２および５において下線が引かれる。３つの高いステム−ループは、配列番号３、４および６の配列を有する。
【００７９】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００８０】
均等
本開示は、とりわけ、合成転写ターミネーターを使用する改良されたクローニング効率のための新規な方法およびシステムを提供する。本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、本明細書は、説明するためのものであり、限定するものではない。該開示の多くのバリエーションは、本明細書のレビューに際して当業者に明らかになるであろう。該開示の全範囲は、その均等なものの全範囲と合わせた特許請求の範囲、およびかかるバリエーションと合わせた本明細書の参照により決定されるべきである。
【００８１】
参照による組み込み
「１２７６６２０１５２０１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の、２０１６年１１月２９日に作成された、４，２８５バイトのサイズを有する、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書で提示されるＡＳＣＩＩテキストファイルは、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
本明細書に言及される全ての出版物、特許、および配布データベースエントリーは、あたかも個々の出版物または特許が出典明示により特別かつ個々に組み込まれることが示されていたかのごとく、出典明示により、全内容が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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