(57)【要約】約10kDalを超える分子量を有する長い繰り返し単位に基づく改善されたタンパク質性ブロックコポリマー繊維に関する方法および組成物を提供する。各繰り返し単位は、いくつかの「準繰り返し単位」に構成される約150個を超えるアミノ酸残基を含む。繊維は、天然シルク繊維の機械的特性をよりよく再現する改善された機械的特性を有する。2018512407.tif 000013
2018512407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性ブロックコポリマー繊維であって、
該ブロックコポリマーが少なくとも2個存在する繰り返し単位を含み、
該繰り返し単位が、
150個を超えるアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも10kDalの分子量を有し；
少なくとも80％のアラニン分を含む、6個以上の連続したアミノ酸を有するアラニンリッチ領域と；
少なくとも40％のグリシン分および30％未満のアラニン分を含む、12個以上の連続したアミノ酸を有するグリシンリッチ領域と
を含み、
該繊維が、550cN/texを超える弾性率、少なくとも10％の伸び率、および少なくとも15cN/texの最大抗張力からなる群より選択される少なくとも一つの特性を含む、タンパク質性ブロックコポリマー繊維。
【請求項２】
繰り返し単位が、150〜1000個のアミノ酸残基を含む、請求項1に記載の繊維。
【請求項３】
繰り返し単位が、10kDal〜100kDalの分子量を有する、請求項1または2に記載の繊維。
【請求項４】
前記繰り返しが、2〜20個のアラニンリッチ領域を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の繊維。
【請求項５】
各アラニンリッチ領域が、80％〜100％のアラニン分を含む6〜20個の連続したアミノ酸を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の繊維。
【請求項６】
前記繰り返しが、2〜20個のグリシンリッチ領域を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の繊維。
【請求項７】
各グリシンリッチ領域が、40％〜80％のグリシン分を含む12〜150個の連続したアミノ酸を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の繊維。
【請求項８】
繰り返し単位が、315個のアミノ酸残基、6個のアラニンリッチ領域、および6個のグリシンリッチ領域を含み、
該アラニンリッチ領域が、7〜9個の連続したアミノ酸、および100％のアラニン分を含み、かつ
該グリシンリッチ領域が、30〜70個の連続したアミノ酸、および40〜55％のグリシン分を含む、請求項1に記載の繊維。
【請求項９】
弾性率が550cN/tex〜1000cN/texである、請求項1〜8のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１０】
伸び率が10％〜20％である、請求項1〜9のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１１】
最大抗張力が15cN/tex〜100cN/texである、請求項1〜10のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１２】
弾性率が550cN/texを超える、請求項1〜11のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１３】
伸び率が少なくとも10％である、請求項1〜12のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１４】
最大抗張力が少なくとも15cN/texである、請求項1〜13のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１５】
弾性率が550cN/texを超え、伸び率が少なくとも10％であり、かつ最大抗張力が少なくとも15cN/texである、請求項1〜14のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１６】
各繰り返し単位が、2〜20個の準繰り返し単位を含む配列との少なくとも95％の配列同一性を有し、
各準繰り返し単位が、以下：
｛GGY-［GPG-X1］n1-GPS-（A）n2｝
を含む組成を有し、
式中、各準繰り返し単位について、
X1が、SGGQQ、GAGQQ、GQGPY、AGQQ、およびSQからなる群より独立して選択され、
n1が4〜8であり、n2が6〜10である、
請求項1〜15のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１７】
少なくとも半分の準繰り返し単位について、n1が4〜5である、請求項16に記載の繊維。
【請求項１８】
少なくとも半分の準繰り返し単位について、n2が5〜8である、請求項16〜17のいずれか一項記載の繊維。
【請求項１９】
準繰り返し単位が、MaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２０】
ポリアラニン領域が、複数のナノ結晶βシートを形成し、かつ
グリシンリッチ領域が、複数のβターン構造を形成する、
請求項1〜19のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２１】
タンパク質性ブロックコポリマーの繰り返し単位がSEQ ID NO:1を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２２】
以下の工程を含む、タンパク質性ブロックコポリマー繊維を合成する方法：
ブロックコポリマーポリペプチドを発現させる工程であって、
該ブロックコポリマーが、少なくとも2個の繰り返し単位を含み、
各繰り返し単位が、
150個を超えるアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも20kDalの分子量を有し、
少なくとも80％のアラニン分を含む、6個以上の連続したアミノ酸を有するアラニンリッチ領域と、
少なくとも40％のグリシン分および30％未満のアラニン分を含む、12個以上の連続したアミノ酸を有するグリシンリッチ領域と
を含む、工程;
該発現ポリペプチドおよび少なくとも一つの溶媒を含む、紡糸ドープを配合する工程;および
該紡糸ドープを紡糸口金および少なくとも一つの凝固浴を通して押し出す工程であって、
400cN/texを超える弾性率、少なくとも10％の伸び率、および少なくとも15cN/texの最大抗張力からなる群より選択される特性を備える繊維を形成する、工程。
【請求項２３】
繰り返し単位が、150〜1000個のアミノ酸残基を含む、請求項22に記載の繊維。
【請求項２４】
繰り返し単位が、10〜100kDalの分子量を有する、請求項22〜23のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２５】
前記繰り返しが、2〜20個のアラニンリッチ領域を含む、請求項22〜24のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２６】
各アラニンリッチ領域が、80％〜100％のアラニン分を含む6〜20個の連続したアミノ酸を含む、請求項22〜25のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２７】
前記繰り返しが、2〜20個のグリシンリッチ領域を含む、請求項22〜26のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２８】
各グリシンリッチ領域が、40％〜80％のグリシン分を含む12〜150個の連続したアミノ酸を含む、請求項22〜27のいずれか一項記載の繊維。
【請求項２９】
繰り返し単位が、315個のアミノ酸残基、6個のアラニンリッチ領域、および6個のグリシンリッチ領域を含み、
該アラニンリッチ領域が、7〜9個の連続したアミノ酸、および100％のアラニン分を含み、かつ
該グリシンリッチ領域が、30〜70個の連続したアミノ酸、および40〜55％のグリシン分を含む、請求項22に記載の繊維。
【請求項３０】
繊維の弾性率が550cN/tex〜575cN/texである、請求項22〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
繊維の伸び率が10％〜20％である、請求項22〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
15cN/tex〜20cN/texの繊維最大抗張力である、請求項22〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
繊維の弾性率が400cN/texを超える、請求項22〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
繊維の伸び率が少なくとも10％である、請求項22〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
繊維最大抗張力が少なくとも15cN/texである、請求項22〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
繊維の弾性率が400cN/texを超え、伸び率が少なくとも10％であり、かつ最大抗張力が少なくとも15cN/texである、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも一つの凝固浴を通して繊維を押し出す工程が、該繊維を、第1の化学組成を有する第1の凝固浴、および該第1の化学組成とは異なる第2の化学組成を有する第2の浴に順次通して押し出すことを含む、請求項22〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
第1の化学組成が、第1の溶媒ならびに第1の酸および第1の塩のうちの少なくとも一つを含み;かつ
第2の化学組成が、第2の溶媒ならびに第2の酸および第2の塩のうちの少なくとも一つを含み;
該第2の溶媒の濃度が、該第1の溶媒の濃度よりも高い、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
第1の溶媒と第2の溶媒が同じである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
第1の溶媒と第2の溶媒が異なる、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
第1の酸と第2の酸が同じである、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
第1の酸と第2の酸が異なる、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
繊維が、第1の凝固浴内で半透明である、請求項22〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
準繰り返し単位が、MaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項22〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
ブロックコポリマーの繰り返し単位がSEQ ID NO:1を含む、請求項22〜44のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のデータ
本出願は、2015年3月16日に出願された米国特許仮出願第62/133895号の恩典を主張し、この開示の全体が、あらゆる目的のために参照により組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は概して、スパイダーシルクタンパク質から生成されたシルク繊維に関する。具体的には、本開示は、改善されたスパイダーシルクタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ポリペプチドからスパイダーシルクに合成されたポリマー繊維は、商業規模の製造における困難、および糸、ヤーン、または他の繊維に製造できる繊維の生産における技術的課題のために市販されていない。
【０００４】
天然のスパイダーシルクタンパク質は、大きな（＞150kDa、1000個を超えるアミノ酸）ポリペプチドであり、以下の3つのドメインに分けられる:N末端非繰り返しドメイン（NTD）、繰り返しドメイン（REP）、およびC末端非繰り返しドメイン（CTD）。繰り返しドメインは、天然ポリペプチドの約90％を構成し、一方、NTDおよびCTDは比較的小さい（それぞれ、約150個、約100個のアミノ酸）。NTDおよびCTDは十分研究されており、ポリペプチド鎖全体に、水溶液中での安定性、pH感受性、および会合時の分子配列をもたらすと考えられる。
【０００５】
クモの一種は様々な繊維を作り出し、そのそれぞれが、異なる機能のために使用される。これらの異なる機能の例には、牽引糸、クモの巣の捕獲渦、獲物の固定、および卵嚢を保護するためのシルクが含まれる。牽引糸シルクはひときわ優れた機械的特性を有する。これらは、その重量および直径の割には非常に強く、また、高い伸び率と共に高い最大抗張力の組み合わせを示す。
【０００６】
アミノ酸組成およびタンパク質構造は、シルクのタイプおよびクモの種類の間でかなり異なる。例えば、円網を張るクモは、環境ニッチまたはライフサイクルニッチ（environmental or lifecycle niche）に適合するように調整された繊維へと重合される異なるシルクポリペプチド配列を生成する、6つの特有のタイプの腺を有する。繊維は、それらが生じる腺にちなんで名付けられ、ポリペプチドには、腺の略記が付けられる（例えば、スピドロイン（クモフィブロインの短縮形）については「Sp」）。円網を張るクモの場合、例には、大嚢状腺（Major Ampullate）（MaSp、牽引糸とも呼ばれる）、小嚢状線（Minor Ampullate）（MiSp）、鞭毛状腺（Flagelliform）（Flag）、葡萄状腺（Aciniform）（AcSp）、管状腺（Tubuliform）（TuSp）、および梨状腺（Pyriform）（PySp）が含まれる。
【０００７】
繰り返しドメインが、（おそらくαヘリックスおよび/またはβターンを含む）繊維の非晶領域に関連するグリシンリッチ領域と、繊維のβシート結晶領域に関連するポリアラニン領域とを含む、円網を張るクモのMaSp牽引糸シルク（例えば、ネフィラ・クラヴィペス（Nephila clavipes）MaSp1）について、一般的な分類が存在する。アミノ酸組成および配列、ならびに繊維形成の詳細のいずれもが繊維の機械的特性に影響を与える。
【０００８】
スパイダーシルクの商業的応用は可能と考えられるが、スパイダーシルクは、カイコ絹と同じように商業的に飼育および採取することができない。これは、一部、クモの攻撃的で縄張りを持つ性質による。したがって、合成的に生産されるスパイダーシルクが、ほぼ間違いなく費用効果が高く、実行可能な商業化への道筋であると考えられる。
【０００９】
現在、組換えシルク繊維は市販されておらず、ひと握りの例外はあるが、大腸菌（Escherichia coli）および他のグラム陰性原核生物以外の微生物においては生産されていない。現在までに生産された組換えシルクは、大部分が、時にはNTDおよび/またはCTDと組み合わせられた、重合された短いシルク配列モチーフまたは天然繰り返しドメインの断片のいずれかからなるものであった。これらの方法は、細胞内発現およびクロマトグラフィーまたはバルク析出による精製を用いて、小規模の組換えシルクポリペプチド（実験室規模で数ミリグラム、バイオプロセッシング規模で数キログラム）を生産することができるが、従来の紡織繊維に対応する規模になっていない。シルクポリペプチドを生産するために利用された別の生産宿主には、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックカイコ、および植物が含まれる。同様に、これらの宿主は、おそらく遅いエンジニアリングサイクルのために、商業規模のシルクの生産を可能にしていない。
【００１０】
したがって、必要とされているものは、改善されたスパイダーシルク由来の組換えタンパク質設計、それらの高速での生産のための発現コンストラクト、これらのタンパク質を発現させる微生物、ならびに天然のスパイダーシルク繊維の多くの望ましい機械的および形態学的特性を示す、これらのタンパク質から作られた合成繊維である。
【発明の概要】
【００１１】
概要
いくつかの態様において、本発明は、タンパク質性ブロックコポリマー繊維を提供し、ここで、ブロックコポリマーは少なくとも2個存在する繰り返し単位を含み、この繰り返し単位は：150個を超えるアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも10kDalの分子量を有し；少なくとも80％のアラニン分を含む6個以上の連続したアミノ酸を有するアラニンリッチ領域を含み；かつ少なくとも40％のグリシン分および30％未満のアラニン分を含む12個以上の連続したアミノ酸を有するグリシンリッチ領域を含み、かつ、この繊維は、550cN/texを超える弾性率、少なくとも10％の伸び率、および少なくとも15cN/texの最大抗張力からなる群より選択される少なくとも一つの特性を備える。
【００１２】
いくつかの態様において、繰り返し単位は、150〜1000個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、繰り返し単位は、10kDal〜100kDalの分子量を有する。
【００１３】
いくつかの態様において、繰り返しは、2〜20個のアラニンリッチ領域を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、各アラニンリッチ領域は、80％〜100％のアラニン分を含む、6〜20個の連続したアミノ酸を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、繰り返しは、2〜20個のグリシンリッチ領域を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、各グリシンリッチ領域は、40％〜80％のグリシン分を含む、12〜150個の連続したアミノ酸を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、弾性率は、550cN/tex〜1000cN/texである。
【００１８】
いくつかの態様において、伸び率は、10％〜20％である。
【００１９】
いくつかの態様において、最大抗張力は、15cN/tex〜100cN/texである。
【００２０】
いくつかの態様において、弾性率は、550cN/texを超える。
【００２１】
いくつかの態様において、伸び率は、少なくとも10％である。
【００２２】
いくつかの態様において、最大抗張力は、少なくとも15cN/texである。
【００２３】
いくつかの態様において、弾性率は550cN/texを超え、伸び率は少なくとも10％であり、かつ最大抗張力は少なくとも15cN/texである。
【００２４】
いくつかの態様において、各繰り返し単位は、2〜20個の準繰り返し（quasi-repeat）単位を含む配列との少なくとも95％の配列同一性を有し、各準繰り返し単位は、｛GGY-［GPG-X1］n1-GPS-（A）n2｝（式中、各準繰り返し単位について、X1は、SGGQQ、GAGQQ、GQGPY、AGQQ、およびSQからなる群より独立して選択され、n1は4〜8であり、n2は6〜10である）を含む組成を有する。
【００２５】
いくつかの態様において、準繰り返し単位は、MaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との少なくとも95％の配列同一性を有する。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のブロックコポリマーを発現させ、発現ポリペプチドおよび少なくとも一つの溶媒を含む紡糸ドープを配合し、かつ紡糸ドープを紡糸口金および少なくとも一つの凝固浴を通して押し出して繊維を形成することによってタンパク質性ブロックコポリマー繊維を合成する方法を提供し、ここで、この繊維は、400cN/texを超える弾性率、少なくとも10％の伸び率、および少なくとも15cN/texの最大抗張力からなる群より選択される特性を備える。
【００２７】
いくつかの態様において、少なくとも一つの凝固浴を通して繊維を押し出す工程は、繊維を、第1の凝固浴および第2の浴に順次通して押し出すことを含み、第1の凝固浴は第1の化学組成を有し、第2の浴は、第1の化学組成とは異なる第2の化学組成を有する。
【００２８】
いくつかの態様において、第1の化学組成は、第1の溶媒ならびに第1の酸および第1の塩のうちの少なくとも一つを含み;かつ第2の化学組成は、第2の溶媒ならびに第2の酸および第2の塩のうちの少なくとも一つを含み;ここで、第2の溶媒の濃度は、第1の溶媒の濃度よりも高く、ここで、第1および第2の溶媒は同じか、または異なり、第1および第2の酸は同じか、または異なる。
【００２９】
いくつかの態様において、繊維は、第1の凝固浴内で半透明である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ある態様における本開示のブロックコポリマーの分子構造を略図で示す。
【図２】ある態様における中空コアを有する本開示の繊維の拡大像である。
【図３】ある態様におけるひだ状表面を有する本開示の繊維の拡大像である。
【図４Ａ】複数の態様における本開示の複数の繊維で測定された機械的特性を示す。
【図４Ｂ】複数の態様における本開示の複数の繊維で測定された機械的特性を示す。
【図４Ｃ】複数の態様における本開示の複数の繊維で測定された機械的特性を示す。
【図４Ｄ】複数の態様における本開示の複数の繊維で測定された機械的特性を示す。
【図５】ある態様における本開示の繊維で測定された第1の応力-ひずみ曲線である。
【図６】ある態様における本開示の繊維で測定された第2の応力-ひずみ曲線である。
【図７】ある態様における本開示の繊維で測定された応力-ひずみ曲線のセットである。
【００３１】
図は、例示のみを目的として本開示の様々な態様を示す。本明細書に記載の原則から逸脱することなく本明細書に例示される構造および方法の代替の態様が用いられ得ることを以下の議論から当業者は容易に理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
概要
本開示の態様は、ナガコガネグモ（Argiope bruennichi）種からなど、MaSp2由来の組換えスパイダーシルクタンパク質のタンパク質性コポリマーから合成される繊維を含む。それぞれ合成された繊維は、2〜20個の繰り返し単位を含むタンパク質分子を含み、各繰り返し単位の分子量は約20kDalを超える。コポリマーの各繰り返し単位内には、いくつかの「準繰り返し単位」に構成される約60個を超えるアミノ酸残基が存在する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの繰り返し単位は、MaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との少なくとも95％の配列同一性を有する。
【００３３】
組換えスパイダーシルク繊維を作り出すために、より少数の長く正確な繰り返し単位を有する長いポリペプチドを利用することは、より多数の、より短い正確な繰り返し単位を有するポリペプチドを利用することよりも多くの利点を有する。重要な違いは、「長く正確な繰り返し」が、その中に、連鎖されたより短い正確な繰り返しのないアミノ酸配列と定義されることである。長く正確な繰り返しを有する長いポリペプチドは、より多数の短い繰り返しを有する長いポリペプチドよりも容易に加工されるが、その理由は、それらが、DNA断片化を引き起こす相同組換えが起こりにくく、非晶ドメイン対結晶ドメインの組成ならびにナノ結晶ドメインの平均サイズおよびサイズ分布をよりいっそう制御し、かつ繊維形成前の中間加工工程の間に望ましくない結晶化が起こらないからである。本開示全体にわたって、「繰り返し単位」という用語は、さらに大きな配列内で正確に繰り返される部分配列を指す。
【００３４】
本開示全体にわたって、ある範囲の値が記載されている場合、その範囲は、明示的に記載されている場合と同様に、範囲内に入るすべての値を含み、範囲の境界をなす値をさらに含む。したがって、「X〜Y」の範囲は、X〜Yの間に入るすべての値を含み、かつXおよびYを含む。
【００３５】
パーセント「同一性」という用語は、2個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下で説明する配列比較アルゴリズム（例えば、BLASTPおよびBLASTNまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの一つを利用して、あるいは目視検査で測定され、最も一致するよう比較および整列されたときに、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基について指定のパーセントを有する2個以上の配列または部分配列を指す。適用に応じて、パーセント「同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することができ、あるいは、比較される2個の配列の全長にわたって存在することができる。本開示内において、「領域」は、ポリペプチド内の一続きの6個以上のアミノ酸と見なされる。
【００３６】
配列比較においては、典型的には1個の配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを利用するとき、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、部分配列座標が指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列と比較した試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３７】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith ＆ Waterman, Adv.Appl.Math.2:482（1981）の局所相同性アルゴリズム、Needleman ＆ Wunsch, J.Mol.Biol.48:443（1970）の相同性整列アルゴリズム、Pearson ＆ Lipman, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444（1988）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）、または目視検査（概略は以下のAusubelらを参照されたい）によって行われる。
【００３８】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの一例はBLASTアルゴリズムであり、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410（1990）に記述されている。BLAST解析を実施するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公に利用できる。このようなソフトウェアを利用して、このような配列のポリペプチド配列内またはドメイン内に見られる任意の指定のアミノ酸のモルパーセントを求めることもできる。当業者が理解するように、このようなパーセントは、検査および手計算によって求めることもできる。
【００３９】
複数の態様において、合成された繊維の形態は、中空断面、または繊維の長軸に平行なひだを有するひだ状の外面を有する繊維を含む。複数の態様において、合成された繊維は、10％を超える、または20％を超える、または100％を超える、または200％を超える、または300％を超える、または400％を超える破断ひずみを示す。複数の態様において、合成された繊維は、1％〜400％、または1〜200％、または1〜100％、または1〜20％、または10〜200％、または10〜100％、または10〜50％、または10〜20％、または50％〜150％、または100％〜150％、または300％〜400％の破断ひずみを示す。複数の態様において、合成された繊維は、1500MPaを超える、または2000MPaを超える、または3000MPaを超える、または5000MPaを超える、または6000MPaを超える、または7000MPaを超える弾性率を示す。複数の態様において、合成された繊維は、5200〜7000MPa、または1500〜10000MPa、または1500〜8000MPa、または2000〜8000MPa、または3000〜8000MPa、または5000〜8000MPa、または5000〜6000MPa、または6000〜8000MPaの弾性率を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100cN/texを超える、または200cN/texを超える、または300cN/texを超える、または400cN/texを超える、または500cN/texを超える、または550cN/texを超える、または600cN/texを超える弾性率を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100〜600cN/tex、または200〜600cN/tex、または300〜600cN/tex、または400〜600cN/tex、または500〜600cN/tex、または550〜600cN/tex、または550〜575cN/tex、または500〜750cN/tex、または500〜1000cN/tex、または500〜1500cN/texの弾性率を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100MPaを超える、または120MPaを超える、または140MPaを超える、または160MPaを超える、または180MPaを超える、または200MPaを超える、または220MPaを超える、または240MPaを超える、または260MPaを超える、または280MPaを超える、または300MPaを超える、または400MPaを超える、または600MPaを超える、または1000MPaを超える最大引張強度を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100〜1000MPa、または100〜500MPa、または100〜300MPa、または100〜250MPa、または100〜200MPa、または100〜150MPaの最大引張強度を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100MPaを超える、または120MPaを超える、または140MPaを超える、または160MPaを超える、または180MPaを超える、または200MPaを超える、または220MPaを超える、または240MPaを超える、または260MPaを超える、または260MPaを超える、または280MPaを超える、または300MPaを超える、または400MPaを超える、または600MPaを超える、または1000MPaを超える最大抗張力を示す。複数の態様において、合成された繊維は、100〜1000MPa、または100〜500MPa、または100〜300MPa、または100〜250MPa、または100〜200MPa、または100〜150MPaの最大抗張力を示す。複数の態様において、合成された繊維は、5cN/texを超える、または10cN/texを超える、または15cN/texを超える、または20cN/texを超える、または25cN/texを超える最大引張強度を示す。複数の態様において、合成された繊維は、5〜30cN/tex、または5〜25cN/tex、または10〜30cN/tex、または10〜20cN/tex、または15〜20cN/tex、または15〜50cN/tex、または15〜75cN/tex、または15〜100cN/texの最大引張強度を示す。複数の態様において、合成された繊維は、5cN/texを超える、または10cN/texを超える、または15cN/texを超える、または20cN/texを超える、または25cN/texを超える最大抗張力を示す。複数の態様において、合成された繊維は、5〜30cN/tex、または5〜25cN/tex、または10〜30cN/tex、または10〜20cN/tex、または15〜20cN/tex、または15〜50cN/tex、または15〜75cN/tex、または15〜100cN/texの最大抗張力を示す。いくつかの態様において、合成された繊維は、0.2cN＊cmを超える、または0.4cN＊cmを超える、または0.8cN＊cmを超える、または0.9cN＊cmを超える、または1.3cN＊cmを超える、または2cN＊cmを超える、あるいは0.2〜2cN＊cm、または0.4〜2cN＊cm、0.6〜2cN＊cm、または0.5〜2cN＊cm、または0.5〜1.3cN＊cm、または0.7〜1.1cN＊cmの破断仕事量を示す。いくつかの態様において、合成された繊維は、5dtex未満、または3dtex未満、または2dtex未満、または1.5dtex未満の、あるいは1.5dtexを超える、または1.7dtexを超える、または2dtexを超える、あるいは1〜5dtex、または1〜3dtex、または1.5〜2dtex、または1.5〜2.5dtexの線密度を示す。
【００４０】
分子構造
図1は、ある態様における本開示のコポリマー分子を略図で例示する。本開示のブロックコポリマー分子は、各繰り返し単位内に、60個を超える、または100個を超える、または150個を超える、または200個を超える、または250個を超える、または300個を超える、または350個を超える、または400個を超える、または450個を超える、または500個を超える、または600個を超える、または700個を超える、または800個を超える、または900個を超える、または1000個を超えるアミノ酸残基、あるいは60〜1000個、または100〜1000個、または200〜1000個、または300〜1000個、または400〜1000個、または500〜1000個、または150〜1000個、または150〜400個、または150〜500個、または150〜750個、または200〜400個、または200〜500個、または200〜750個、または250〜350個、または250〜400個、または250〜500個、または250〜750個、または250〜1000個、または300〜500個、または300〜750個のアミノ酸残基を含む。本開示のポリペプチド分子の各繰り返し単位は、20kDal〜100kDalの、あるいは20kDalを超える、または10kDalを超える、または5kDalを超える、あるいは5〜60kDal、または5〜40kDal、または5〜20kDal、または5〜100kDal、または5〜50kDal、または10〜20kDal、または10〜40kDal、または10〜60kDal、または10〜100kDal、または10〜50kDal、または20〜100kDal、または20〜80kDal、または20〜60kDal、または20〜40kDal、または20〜30kDalの分子量を有することができる。本開示のコポリマー分子は、各繰り返し単位内に300個を超えるアミノ酸残基を含むことができる。本開示のコポリマー分子は、各繰り返し単位内に約315個のアミノ酸残基を含むことができる。これらのアミノ酸残基は、分子内にいくつかの異なるレベルで構成される。本開示のコポリマー分子は、2〜20個存在する繰り返し単位を含む。繰り返し単位を連鎖させた後、本開示のポリペプチド分子は、20kDal〜2000kDalにすることができ、あるいは20kDal、または10kDal、または5kDalを超えることができ、あるいは5〜400kDal、または5〜300kDal、または5〜200kDal、または5〜100kDal、または5〜50kDal、または5〜500kDal、または5〜1000kDal、または5〜2000kDal、または10〜400kDal、または10〜300kDal、または10〜200kDal、または10〜100kDal、または10〜50kDal、または10〜500kDal、または10〜1000kDal、または10〜2000kDal、または20〜400kDal、または20〜300kDal、または20〜200kDal、または40〜300kDal、または40〜500kDal、または20〜100kDal、または20〜50kDal、または20〜500kDal、または20〜1000kDal、または20〜2000kDalにすることができる。図1に示す通り、コポリマー繊維の各「繰り返し単位」は、2〜20個の「準繰り返し」単位を含む（すなわち、n3は2〜20である）。準繰り返しは、正確な繰り返しである必要はない。各繰り返しは、連鎖された準繰り返しで構成することができる。式1は、本開示による準繰り返し単位の組成を示す。
｛GGY-［GPG-X1］n1-GPS-（A）n2｝n3      （式1）
【００４１】
可変の構成要素X1（「モチーフ」と呼ぶ）は、式2に示す以下のアミノ酸配列のいずれか一つにしたがい、X1は、各準繰り返し単位内でランダムに変化する。
X1＝SGGQQまたはGAGQQまたはGQGPYまたはAGQQまたはSQ      （式2）
【００４２】
式1を再び参照して、式1において「GGY-［GPG-X1］n1-GPS」で表される準繰り返し単位の構成要素は「第1の領域」と呼ばれる。準繰り返し単位は、部分的に、準繰り返し単位内で第1の領域を4〜8回繰り返すことによって形成される。すなわち、n1の値は、単一の準繰り返し単位内で繰り返される第1の領域単位の数を示し、n1の値は、4、5、6、7または8のいずれか一つである。「（A）n2」で表される構成要素は「第2の領域」と呼ばれ、各準繰り返し単位内でアミノ酸配列「A」をn2回繰り返すことによって形成される。すなわち、n2の値は、単一の準繰り返し単位内で繰り返される第2の領域単位の数を示し、n2の値は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のいずれか一つである。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドの繰り返し単位は、式1および2で記述される準繰り返しを含む配列との少なくとも95％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドの繰り返し単位は、式1および2で記述される準繰り返しを含む配列との少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。
【００４３】
式1において記述される第1の領域は、グリシンリッチ領域と見なされる。配列内の6個以上の連続したアミノ酸が、45％超グリシンである場合、領域はグリシンリッチであり得る。配列内の12個以上の連続したアミノ酸が、45％超グリシンである場合、領域はグリシンリッチであり得る。配列内の18個以上の連続したアミノ酸が、45％超グリシンである場合、領域はグリシンリッチであり得る。配列内の4個以上、または6個以上、または10個以上、または12個以上、または15個以上、または20個以上、または25個以上、または30個以上、または40個以上、または50個以上、または60個以上、または70個以上、または80個以上、または100個以上、または150個以上の連続したアミノ酸が、30％超、または40％超、または45％超、または50％超、または55％超グリシン、または60％超グリシン、または70％超グリシン、または80％超グリシン、あるいは30％〜80％、または40％〜80％、または45％〜80％、または30％〜55％、または30％〜50％、または30％〜45％、または30％〜40％、または40％〜50％、または40％〜55％、または40％〜60％グリシンである場合、領域はグリシンリッチであり得る。配列内の5〜150個、または10〜150個、または12〜150個、または12〜100個、または12〜80個、または12〜60個、または20〜60個の連続したアミノ酸が、30％超、または40％超、または45％超、または50％超、または55％超グリシン、または60％超グリシン、または70％超グリシン、または80％超グリシン、あるいは30％〜80％、または40％〜80％、または45％〜80％、または30％〜55％、または30％〜50％、または30％〜45％、または30％〜40％、または40％〜50％、または40％〜55％、または40％〜60％グリシンである場合、領域はグリシンリッチであり得る。さらに、グリシンリッチ領域は、10％未満、または20％未満、または30％未満、または40％未満のアラニン、あるいは約0％〜10％、または約0％〜20％、または約0％〜30％、または約0％〜40％、あるいはアラニンを有することができる。配列内の4個以上、または6個以上、または8個以上、または10個以上の連続したアミノ酸が、70％超、または75％超、または80％超、または85％超、または90％超アラニン、あるいは70％〜約100％、または75％〜約100％、または80％〜約100％、または85％〜約100％、または90％〜約100％アラニンである場合、領域はアラニンリッチであり得る。配列内の4〜10個、または4〜12個、または4〜15個、または6〜10個、または6〜12個、または6〜15個、または4〜20個、または6〜20個の連続したアミノ酸が、70％超、または75％超、または80％超、または85％超、または90％超アラニン、あるいは70％〜約100％、または75％〜約100％、または80％〜約100％、または85％〜約100％、または90％〜約100％アラニンである場合、領域はアラニンリッチであり得る。本開示に記載の繰り返しは、6個の、あるいは2個を超える、または4個を超える、または6個を超える、または8個を超える、または10個を超える、または15個を超える、または20個を超える、あるいは2〜25個、または2〜10個、または4〜10個、または2〜8個、または4〜8個のアラニンリッチ領域を有することができる。本開示に記載の繰り返しは、6個の、あるいは2個を超える、または4個を超える、または6個を超える、または8個を超える、または10個を超える、または15個を超える、または20個を超え��、あるいは2〜25個、または2〜10個、または4〜10個、または2〜8個、または4〜8個のグリシンリッチ領域を有することができる。
【００４４】
さらに以下で説明する通り、コポリマー分子の一例は、3個の「長い」準繰り返しと、その後に続く3個の「短い」準繰り返し単位を含む。「長い」準繰り返し単位は、連続で2回を超えて、または繰り返し単位内で2回を超えて（式2に示す）同じX1成分を使用しない準繰り返し単位で構成される。各「短い」準繰り返し単位は、式2に示すアミノ酸配列のいずれかを含むが、使用されるアミノ酸配列に関わらず、同じ配列が分子内の同じ場所に存在する。さらに、この例のコポリマー分子において、6個のうち3個を超えない準繰り返しが、同じX1を共有する。「短い」準繰り返し単位は、（式1に示す）n1＝4または5のものである。長い準繰り返し単位は、（式1に示す）n1＝6、7または8のものと定義される。
【００４５】
いくつかの態様において、コポリマーの繰り返し単位は、Xqr個の準繰り返し単位から構成され、ここで、Xqrは2〜20の数であり、短い準繰り返し単位の数はXsqrであり、長い準繰り返し単位の数はXlqrであり、ここで
Xsqr＋Xlqr＝Xqr      （式3）
かつ、Xsqrは、1〜（Xqr-1）の数、Xlqrは、1〜（Xqr-1）の数である。
【００４６】
別の態様において、少なくとも半分の準繰り返し単位について、n1は4〜5である。さらに別の態様において、少なくとも半分の準繰り返し単位について、n2は5〜8である。
【００４７】
本開示のコポリマー分子の一つの特徴は、理論によって制限されることは本意ではないが、βシート領域と、αヘリックス構造、βターン構造、または両方から構成される非晶領域との積層によって形成されると考えられるナノ結晶領域の形成である。分子内のポリアラニン領域（またはいくつかの種においては（GA）n領域）は、大嚢状腺（MA）繊維内で結晶βシートを形成する。大嚢状腺および鞭毛状腺のスパイダーシルクの繰り返し単位内の他の領域（例えば、GPGGX、GPGQQ、GGX（式中、X＝A、SまたはY）、GPG、SGGQQ、GAGQQ、GQGPY、AGQQ、およびSQを含む）が、αヘリックスおよびβターンを含む構造を含む非晶質のゴム状構造を形成することもある。さらに、アミノ酸配列および長さ、ならびに繊維が形成、加工および後加工される条件によって、二次、三次および四次構造が繊維の形態に与えられる。材料の特性評価法（NMR、FTIRおよびX線回折など）は、天然のMAスパイダーシルク内、およびMAスパイダーシルク配列由来の組換えシルク内のポリアラニン結晶ドメインが、通常は非常に小さい（＜10nm）ことを示唆している。繊維は、高結晶領域または高非晶領域、あるいは結晶領域および非晶領域の両方のブレンドにすることができるが、最適な機械的特性を有する繊維は、体積で10〜40％の結晶性物質から構成されると推測されている。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のMA牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のMaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のクモ牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの準繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のMA牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの準繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のMaSp2牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示に記載のポリペプチドの準繰り返し単位は、少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のクモ牽引糸シルクタンパク質配列との配列同一性を有する。
【００４８】
良好な機械的特性を有する繊維を形成するタンパク質性ブロックコポリマーの繰り返し単位は、シルクポリペプチドの一部を使用して合成することができる。本開示のタンパク質性ブロックコポリマー内の繰り返しとして用いることができるいくつかの例示的な配列を表1に示す。これらのポリペプチド繰り返し単位は、アラニンリッチ領域およびグリシンリッチ領域を含み、長さが150個またはそれより長いアミノ酸である。これらの例示的な配列は、共有されるPCT国際公開第2015042164号において教示の通り、ピキア発現系を用いて発現されることが示されている。
【００４９】
（表１）繰り返し単位として使用することができる例示的な配列
2018512407.tif 000003
2018512407.tif 000004
2018512407.tif 000005
2018512407.tif 000006
2018512407.tif 000007
2018512407.tif 000008
2018512407.tif 000009
2018512407.tif 000010
2018512407.tif 000011
2018512407.tif 000012
【００５０】
ある態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するブロックコポリマーポリペプチド繰り返し単位は、SEQ ID NO.1を使用して合成される。この繰り返し単位は6個の準繰り返しを含み、そのそれぞれが、本明細書に記載の通り、組成が変化するモチーフを含む。この繰り返し単位は、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回または20回連鎖して、20kDal〜535kDalの、あるいは20kDalを超える、または10kDalを超える、または5kDalを超える、あるいは5〜400kDal、または5〜300kDal、または5〜200kDal、または5〜100kDal、または5〜50kDal、または5〜600kDal、または5〜800kDal、または5〜1000kDal、または10〜400kDal、または10〜300kDal、または10〜200kDal、または10〜100kDal、または10〜50kDal、または10〜600kDal、または10〜800kDal、または10〜1000kDal、または20〜400kDal、または20〜300kDal、または20〜200kDal、または20〜100kDal、または20〜50kDal、または40〜300kDal、または40〜500kDal、または20〜600kDal、または20〜800kDal、または20〜1000kDalのポリペプチド分子を形成することができる。このポリペプチド繰り返し単位は、ナノ結晶領域に関連するポリアラニン領域、およびより少ない結晶領域を含むβターンに関連するグリシンリッチ領域も含む。他の態様において、繰り返しは、Seq ID No.2〜97として列挙した配列のいずれかから選択される。
【００５１】
いくつかの態様において、ポリペプチドの準繰り返し単位は、式｛GGY-［GPG-X1］n1-GPS-（A）n2｝（式中、X1は、SGGQQ、GAGQQ、GQGPY、AGQQおよびSQからなる群より独立して選択され、n1は4〜8の数であり、n2は6〜20の数である）により記述することができる。繰り返し単位は、複数の準繰り返し単位から構成される。別の態様において、3個の「長い」準繰り返しは、その後に3個の「短い」準繰り返し単位が続く。前述のように、短い準繰り返し単位は、n1＝4または5のものである。長い準繰り返し単位は、n1＝6、7または8のものと定義される。いくつかの態様において、すべての短い準繰り返しは、繰り返し単位の各準繰り返し単位内の同じ位置に同じX1モチーフを有する。いくつかの態様において、6個のうち3個を超えない準繰り返し単位が同じX1モチーフを共有する。
【００５２】
別の態様において、繰り返し単位は、同じX1を繰り返し単位内で連続で2回を超えて使用しない準繰り返し単位から構成される。別の態様において、繰り返し単位は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個または20個の準繰り返しが、繰り返し単位の単一の準繰り返し単位内で同じX1を2回を超えて使用しない準繰り返し単位から構成される。
【００５３】
いくつかの態様において、記載のポリペプチドから形成される繊維の構造は、βシート構造、βターン構造、またはαヘリックス構造を形成する。いくつかの態様において、形成された繊維の二次、三次および四次タンパク質構造は、ナノ結晶βシート領域、非晶βターン領域、非晶αヘリックス領域、非結晶マトリックス内に埋め込まれたランダムに空間的に分布したナノ結晶領域、または非結晶マトリックス内に埋め込まれたランダムに配向したナノ結晶領域を有すると記述される。
【００５４】
いくつかの態様において、本明細書に記載の機械的特性を有する繊維の形成に利用されるポリペプチドは、4〜20アミノ酸長のポリアラニン領域と連鎖された20〜100アミノ酸長のグリシンリッチ領域を含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、5〜25％のポリアラニン領域（4〜20個のポリアラニン残基）を含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、25〜50％のグリシンを含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、15〜35％のGGX（式中、Xは任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、15〜60％のGPGを含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、10〜40％のアラニンを含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、5〜20％のプロリンを含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、10〜50％のβターンを含む。いくつかの態様において、良好な機械的特性を有する繊維を形成するために利用されるポリペプチドは、10〜50％のαヘリックス組成を含む。いくつかの態様において、これらの成分範囲のすべてが、同じポリペプチドに適用される。いくつかの態様において、2つ以上のこれらの成分範囲が、同じポリペプチドに適用される。
【００５５】
繊維の紡糸ドープおよび紡糸のパラメータ
いくつかの態様において、紡糸ドープは、本開示のポリペプチドのいずれかから発現されたタンパク質を含んで合成される。紡糸ドープは、国際公開第2015042164（A2）号に記載のものなど、公開された技術を用いて調製される。いくつかの態様において、繊維の紡糸溶液は、精製および乾燥したブロックコポリマーポリペプチドを、標準的な技術を用いてギ酸ベースの紡糸溶液に溶解することにより調製された。紡糸ドープは、回転振盪機で35℃で3日間、時々混合しながらインキュベートされた。3日後に、紡糸ドープは16000rcfで60分間遠心分離され、紡糸前に少なくとも2時間、室温と平衡させた。
【００５６】
ある態様において、所期の長さの少なくともある程度のパーセント（例えば80％）であるタンパク質の割合は、サイズ分離プロセスの結果を定量分析することによって求められる。ある態様において、サイズ分離プロセスは、サイズ排除クロマトグラフィーを含むことができる。ある態様において、サイズ分離プロセスは、ゲル電気泳動を含むことができる。定量分析は、クロマトグラムまたはデンシトメトリーのスキャンピークの面積を積分することによる、指定のサイズ範囲内に入る総タンパク質量の割合の測定を含むことができる。例えば、サンプルをサイズ分離プロセスにかけて、全長、全長の60％および全長の20％に対応するピークの下の相対面積が3:2:1である場合は、全長である割合は、合計6部のうちの3部＝50％に対応する。
【００５７】
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドのいずれかから発現された、紡糸ドープのタンパク質は、実質的に単分散であり、＞5％、または＞10％、または＞15％、または＞20％、または＞25％、または＞30％、または＞35％、または＞40％、または＞45％、または＞50％、または＞55％、または＞60％、または＞65％、または＞70％、または＞75％、または＞80％、または＞85％、または＞90％、または＞95％、または＞99％のタンパク質を、コードされたタンパク質の分子量の＞5％、または＞10％、または＞15％、または＞20％、または＞25％、または＞30％、または＞35％、または＞40％、または＞45％、または＞50％、または＞55％、または＞60％、または＞65％、または＞70％、または＞75％、または＞80％、または＞85％、または＞90％、または＞95％、または＞99％の分子量を有する紡糸ドープ中に有する。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドのいずれかから発現された、紡糸ドープのタンパク質は、5％〜99％、または5％〜50％、または50％〜99％、または20％〜80％、または40％〜60％、または5％〜30％、または70％〜99％、または5％〜20％、または5％〜10％、または80％〜99％、または90％〜99％のタンパク質を、コードされたタンパク質の分子量の5％〜99％、または5％〜50％、または50％〜99％、または20％〜80％、または40％〜60％、または5％〜30％、または70％〜99％、または5％〜20％、または5％〜10％、または80％〜99％、または90％〜99％の分子量を有する紡糸ドープ中に有する。「コードされたタンパク質」は、タンパク質発現において利用されるDNAによってコードされるポリペプチドアミノ酸配列と定義される。言い換えれば、「コードされたタンパク質」は、タンパク質産生時の任意の段階において、不完全な過程（例えば、転写エラー、タンパク質分解、相同組換え、切断、タンパク質断片化、タンパク質凝集）がない場合に産生されるであろうポリペプチドである。紡糸ドープ中のタンパク質のより高い単分散性、つまり、より高い純度は、より高いヤング率、より高い伸び率、より高い最大抗張力、およびより高い最大引張強度など、よりよい機械的特性を有する繊維を生じる利点を有する。
【００５８】
一つの態様において、紡糸ドープ中のタンパク質の31％は、産生が意図されたタンパク質（すなわち、コードされたタンパク質）の80％を超える分子量を有する。この場合、紡糸ドープ中のタンパク質の70％が、産生が意図されたタンパク質以外のタンパク質であろう。これらの他のタンパク質の一例は、コードされたタンパク質の分解したタンパク質断片である。これらの他のタンパク質の別の例は、コードされたタンパク質を発現させるために使用される生物に由来するタンパク質など、いずれかの精製プロセスの間に除去されなかった外来タンパク質である。
【００５９】
他の態様において、低い単分散性を有し、タンパク質発現において利用されるDNAによってコードされたタンパク質の分子量の＞5％、または＞10％、または＞15％、または＞20％、または＞25％、または＞30％、または＞35％、または＞40％、または＞45％、または＞50％、または＞55％、または＞60％、または＞65％、または＞70％、または＞75％、または＞80％、または＞85％、または＞90％、または＞95％、または＞99％の分子量を有する紡糸ドープ中の、＜5％、または＜10％、または＜15％、または＜20％、または＜25％、または＜30％、または＜35％、または＜40％、または＜45％、または＜50％、または＜55％、または＜60％、または＜65％、または＜70％、または＜75％、または＜80％、または＜85％、または＜90％、または＜95％、または＜99％のタンパク質を有する繊維は、依然として、良好な機械的特性を有する繊維を作り出すことができた。他の態様において、低い単分散性を有し、タンパク質発現において利用されるDNAによってコードされたタンパク質の分子量の5％〜99％、または5％〜50％、または50％〜99％、または20％〜80％、または40％〜60％、または5％〜30％、または70％〜99％、または5％〜20％、または5％〜10％、または80％〜99％、または90％〜99％の分子量を有する紡糸ドープ中の、5％〜99％、または5％〜50％、または5％〜30％、または10％〜50％、または20％〜50％、または50％〜99％、または20％〜80％、または40％〜60％、または5％〜30％、または70％〜99％、または5％〜20％、または5％〜10％、または80％〜99％、または90％〜99％のタンパク質を有する繊維は、依然として、良好な機械的特性を有する繊維を作り出すことができた。低純度の紡糸ドープから形成された繊維の本明細書に記載の機械的特性（例えば、高いヤング率（すなわち弾性率）および/または伸び率（すなわちパーセントひずみ））は、本開示の他の場所に記載の長いポリペプチド繰り返し単位、適したポリペプチド組成ならびに紡糸ドープおよび繊維の紡糸パラメータの使用によって実現した。
【００６０】
他の態様において、タンパク質は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）などの微生物、または哺乳類細胞からの分泌によって産生される。任意で、分泌速度は、少なくとも20mg/g DCW/hr（DCW＝乾燥細胞重量）であってもよい。次いで、任意で、タンパク質が回収、分離されて、溶媒を含む紡糸ドープを使用して繊維に紡糸される。紡糸ドープ中で使用することができる溶媒のクラスのいくつかの例は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、t-ブチルアルコール、酢酸エチル、およびエチレングリコールであるが、これらに限定されない、水性、無機性または有機性である。組換えタンパク質性ブロックコポリマーを合成するための様々な方法は、国際公開第2015042164（A2）号に記載のものなど、公開されている。
【００６１】
他の態様において、湿式紡糸の凝固浴条件は、特定の機械的特性を伴って繊維形成を促進するよう選ばれる。任意で、凝固浴は、0〜90℃、より好ましくは20〜60℃の温度に保たれる。任意で、凝固浴は、約60％、70％、80％、90％、またはさらに100％のアルコール、好ましくはイソプロパノール、エタノール、またはメタノールを含む。任意で、凝固浴は、体積で95:5％、90:10％、85:15％、80:20％、75:25％、70:30％、65:35％、60:40％、55:45％または50:50％のメタノール:水である。任意で、凝固浴は、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、または20〜60℃の温度でタンパク質を沈殿させる他の塩を含む添加剤など、繊維の機械的特性を向上させる添加剤を含む。
【００６２】
いくつかの態様において、押し出されたフィラメントまたは繊維は、一つを超える浴を通過する。一つを超える浴が使用される態様では、異なる浴は、異なる化学組成または同じ化学組成のいずれかを有する。いくつかの態様において、押し出されたフィラメントまたは繊維は、一つを超える凝固浴を通過する。一つを超える凝固浴が使用される態様では、異なる凝固浴は、異なる化学組成または同じ化学組成のいずれかを有する。滞留時間は、機械的特性を改善するために、凝固剤浴内で2秒〜100分など、調整することができる。繰糸/延伸速度は、繊維の機械的特性を改善するために、0.1〜100メートル/分の速度など、調整することができる。
【００６３】
延伸比も繊維の機械的特性を改善するために調整することができる。異なる態様において、延伸比は1.5倍〜30倍であった。一つの態様において、より低い延伸比が繊維の伸び率を改善した。一つの態様において、より高い延伸比が繊維の最大引張強度を改善した。延伸は、溶液中、湿潤空気中、または高温など、異なる環境で行うこともできる。
【００６４】
開示の範囲の上限の凝固浴内の滞留時間で加工された本開示の繊維は、図3に示す通り、ひだ状の断面を生じる。すなわち、各繊維は、繊維の外面に配置された複数のひだ（あるいは「溝」）を有する。これらのひだはそれぞれ、ひだが配置された対応する繊維の長軸に平行である。凝固浴中のより高いエタノール分で加工された本開示の繊維は、図2に示す通り、中空コア繊維を生じる。すなわち、繊維は、内面および外面を含む。内面は、繊維の長軸に平行な中空コアを画定する。
【００６５】
いくつかの態様において、凝固浴または第1の凝固浴は、次のクラスの化学物質（ブレンステッド-ローリー酸、ルイス酸、二元ヒドリド酸（binary hydride acid）、有機酸、金属陽イオン酸、有機溶媒、無機溶媒、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩）を含むが、これらに限定されない、水、酸、溶媒および塩のうちの一つまたは複数の組み合わせを用いて調製される。凝固浴または第1の凝固浴の調製において使用される酸のいくつかの例は、希塩酸、希硫酸、ギ酸および酢酸である。第1の凝固浴の調製において使用される溶媒のいくつかの例は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、t-ブチルアルコール、酢酸エチル、およびエチレングリコールである。凝固浴または第1の凝固浴の調製において使用される塩の例には、LiCl、KCl、BeCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、および硝酸、硫酸またはリン酸の他の塩が含まれる。
【００６６】
いくつかの態様において、凝固浴または第1の凝固浴の化学組成および押出パラメータは、繊維が凝固浴内または第1の凝固浴内で半透明のままであるように選ばれる。いくつかの態様において、凝固浴または第1の凝固浴の化学組成および押出パラメータは、凝固浴内または第1の凝固浴内で繊維の凝固速度を遅らせるよう選ばれ、これは、得られる繊維をその後の延伸工程で延伸できる能力を向上させる。様々な態様において、これらのその後の延伸工程は、湿潤環境、乾燥環境、および湿潤空気環境を含む様々な環境で行われる。湿潤環境の例には、一つまたは複数の別の浴または凝固浴が含まれる。いくつかの態様において、繊維は、第1の凝固浴の後に一つまたは複数の浴を通過する。一つもしくは複数の別の浴、または凝固浴は、複数の態様において、次のクラスの化学物質（ブレンステッド-ローリー酸、ルイス酸、二元ヒドリド酸、有機酸、金属陽イオン酸、有機溶媒、無機溶媒、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩）を含むが、これらに限定されない、水、酸、溶媒および塩のうちの一つまたは複数の組み合わせを用いて調製される。第2の浴または凝固剤浴の調製において使用される酸のいくつかの例は、希塩酸、希硫酸、ギ酸および酢酸である。第2の凝固剤浴の調製において使用される溶媒のいくつかの例は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、t-ブチルアルコール、酢酸エチル、およびエチレングリコールである。第2の浴または凝固浴の調製において使用される塩のいくつかの例には、LiCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaCl、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、および硝酸、硫酸、またはリン酸の他の塩が含まれる。いくつかの態様において、2つの凝固浴が存在し、ここで、第1の凝固浴は、第2の凝固浴とは異なる化学組成を有し、第2の凝固浴は、第1の凝固浴よりも高い溶媒の濃度を有する。いくつかの態様において、2つを超える凝固浴が存在し、第1の凝固浴は、第2の凝固浴とは異なる化学組成を有し、第2の凝固浴は、第1の凝固浴よりも低い溶媒の濃度を有する。いくつかの態様において、2つの浴が存在し、第1の浴は凝固浴であり、第2の浴は洗浄浴である。いくつかの態様において、第1の凝固浴は、第2の洗浄浴とは異なる化学組成を有し、第2の洗浄浴は、第1の浴よりも高い溶媒の濃度を有する。いくつかの態様において、2つを超える浴が存在し、第1の浴は、第2の浴とは異なる化学組成を有し、第2の浴は、第1の浴よりも低い溶媒の濃度を有する。
【００６７】
いくつかの態様において、紡糸ドープは、次のクラスの化学物質（ブレンステッド-ローリー酸、ルイス酸、二元ヒドリド酸、有機酸、金属陽イオン酸、有機溶媒、無機溶媒、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩）を含むが、これらに限定されない、水、酸、溶媒および塩のうちの一つまたは複数の組み合わせを用いてさらに調製される。紡糸ドープの調製において使用される酸のいくつかの例は、希塩酸、希硫酸、ギ酸および酢酸である。紡糸ドープの調製において使用される溶媒のいくつかの例は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、t-ブチルアルコール、酢酸エチル、およびエチレングリコールである。紡糸ドープの調製において使用される塩のいくつかの例は、LiCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaCl、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、および硝酸、硫酸またはリン酸の他の塩である。
【００６８】
いくつかの態様において、紡糸口金は、繊維の機械的特性を向上させるよう選ばれる。紡糸口金の寸法は、長さ0.001cm〜5cm、および25〜35ゲージにすることができる。いくつかの態様において、紡糸口金は、複数の繊維を同時に紡糸する複数のオリフィスを含む。いくつかの態様において、紡糸口金の断面は、オリフィスでの最小径に向かって徐々に細くなるか、まっすぐの壁であり次いでオリフィスに向かって急に細くなるか、または、複数の絞りを含む。繊維の機械的特性に影響を与えるために、紡糸口金からの紡糸ドープの押出圧力も10〜1000psiの範囲で変化させることができる。繊維の特性と押出圧力との間の相互作用は、紡糸ドープの粘度、延伸/繰糸速度、および凝固浴の化学によって影響され得る。
【００６９】
紡糸ドープ中の溶媒に対するタンパク質の濃度も重要なパラメータである。いくつかの態様において、溶媒および残りの部分を構成する他の添加剤を含む溶液中のタンパク質の濃度は、重量比で、20％、または25％、または30％、または35％、または40％、または45％または50％、または55％、または20％〜55％、または20％〜40％、または30％〜40％、または30％〜55％、または30％〜50％である。
【実施例】
【００７０】
実施例1:繊維の紡糸
本開示のコポリマーは、国際公開第2015042164（A2）号に記載のものなど、公開された技術を用いて、組換えDNAの発現に一般に使用されるピキア・パストリスから分泌された。いくつかの態様において、少なくとも20mg/g DCW/hr（DCW＝乾燥細胞重量）の分泌速度が観察された。均質な紡糸ドープを生成する標準的な技術を用いて、分泌されたタンパク質を精製、乾燥し、ギ酸ベースの紡糸溶媒に溶解した。
【００７１】
長さ対直径の比が2:1の直径50〜200μmのオリフィスから、紡糸ドープを、20％ギ酸を含む室温のアルコールベースの凝固浴内に滞留時間28秒で押し出した。繊維を緊張下で凝固浴から引き出し、100％アルコールからなる洗浄浴に通し、その長さの4倍に延伸し、続いて乾燥させた。
【００７２】
実施例2:繊維断面
上述の合成法を用い、凝固浴の様々なパラメータを調整することによって、押し出される繊維の形態を変化させた。例えば、上述の通り、より高いエタノール分の凝固浴を有することにより、（図2に示す）中空コア繊維を合成した。別の例では、凝固浴内の滞留時間を2〜100秒の範囲で長くすることによって、（図3に示す）ひだ状の形態を生じさせた。
【００７３】
開示の範囲の上限の凝固浴内の滞留時間で加工された本開示の繊維は、図3に示し、上述した通り、ひだ状の断面を示す傾向がある。
【００７４】
凝固浴中のより高いエタノール分で加工された本開示の繊維は、図2に示し、上述した通り、中空コアを含む。
【００７５】
実施例3:繊維の機械的特性
図4A〜図4Dおよび図5〜図7は、本明細書に記載の組成を有し、本明細書に記載の方法によって生成された測定サンプルの様々な機械的特性を示す。
【００７６】
本開示における繊維の機械的特性の一部は、MPa（すなわち106N/m2、つまり単位面積あたりの力）の単位で報告され、一部は、cN/tex（線密度あたりの力）の単位で報告される。MPaで報告される繊維の機械的特性の測定値は、カスタム測定器を使用して得られ、この測定器はリニアアクチュエータおよび校正済みのロードセルを含み、繊維径は光学顕微鏡法によって測定された。cN/texで報告される繊維の機械的特性の測定値は、FAVIMAT試験装置を使用して得られ、これには、振動法（例えば、ASTM D1577による）を用いる繊維の線密度の測定が含まれる。測定値をMPaからcN/texに正確に換算するために、繊維のかさ密度（例えば、g/cm3の単位）の推定値が用いられる。かさ密度（g/cm3）「BD」を用いて、単位面積あたりの力（MPa）「FA」を、線密度あたりの力（cN/tex）「FLD」に換算するために用いることができる式は、FLD＝FA/（10＊BD）である。組換えシルクのかさ密度は変動し得るため、MPaでの所与の繊維強度の値は、cN/texでの所与の繊維強度の値にはならない。しかし、組換えシルクのかさ密度が1.1〜1.4g/cm3と想定される場合は、機械的特性値を、ある一定の誤差の範囲内で、ある組の単位から別の組の単位へと換算することができる。例えば、100MPaの最大引張応力は、繊維の質量密度が1.1g/cm3である場合、約9.1cN/texと同等であり、100MPaの最大引張応力は、繊維の質量密度が1.4g/cm3である場合、約7.1cN/texと同等である。
【００７７】
リニアアクチュエータおよび校正済みのロードセルを含む測定器を使用して、4本の繊維の組を引張機械特性について試験した。その結果を図4Aに示す。1秒あたり1％のひずみ速度で、破断するまで繊維を引っ張った。光学顕微鏡法を20倍の倍率で用い、画像処理ソフトウェアを使用して、繊維径を測定した。平均径は、10.25um、+/-1標準偏差＝6.4〜14.1umであった。平均最大引張応力は、97.9MPa、+/-1標準偏差＝68.1〜127.6MPaであった。平均最大ひずみは、37.2％、+/-1標準偏差＝-11.9〜86.3％であった。平均降伏応力は、87.4MPa、+/-1標準偏差＝59.2〜115.6MPaであった。平均初期弾性率（弾性率と同じ、ヤング率と同じ）は、5.2GPa、+/-1標準偏差＝3.5〜6.9GPaであった。
【００７８】
図4Bに示す通り、リニアアクチュエータおよび校正済みのロードセルを含む測定器を使用して、7本の繊維の組を引張機械特性について試験した。1秒あたり1％のひずみ速度で、破断するまで繊維を引っ張った。光学顕微鏡法を20倍の倍率で用い、画像処理ソフトウェアを使用して、繊維径を測定した。平均径は、6.2um、+/-1標準偏差＝4.9〜7.5umであった。平均最大引張応力は、127.9MPa、+/-1標準偏差＝106.4〜149.3MPaであった。平均最大ひずみは、105.5％、+/-1標準偏差＝61.0〜150.0％であった。平均降伏応力は、109.8MPa、+/-1標準偏差＝91.4〜128.2MPaであった。平均初期弾性率（弾性率と同じ、ヤング率と同じ）は、5.5GPa、+/-1標準偏差＝4.4〜6.6GPaであった。
【００７９】
図4Cに示す通り、リニアアクチュエータおよび校正済みのロードセルを含む測定器を使用して、4本の繊維の組を引張機械特性について試験した。1秒あたり1％のひずみ速度で、破断するまで繊維を引っ張った。光学顕微鏡法を20倍の倍率で用い、画像処理ソフトウェアを使用して、繊維径を測定した。平均径は、8.9um、+/-1標準偏差＝6.9〜11.0umであった。平均最大引張応力は、93.2MPa、+/-1標準偏差＝81.4〜105.0MPaであった。平均最大ひずみは、128.9％、+/-1標準偏差＝84.0〜173.8％であった。平均降伏応力は、83.3MPa、+/-1標準偏差＝64.9〜101.7MPaであった。平均初期弾性率（弾性率と同じ、ヤング率と同じ）は、2.6GPa、+/-1標準偏差＝1.5〜3.8GPaであった。
【００８０】
図4Dは、本開示の繊維の応力-ひずみ曲線を示し、図中、最大引張応力は100MPaを超え、最大引張応力は111MPa〜130MPaであり、初期弾性率（すなわちヤング率）は6GPa〜7.1GPaであり、最大ひずみ（すなわち伸び率）は18％〜111％であり、降伏応力は107MPa〜112MPaである。この図の繊維のうちの一つについては、最大引張応力も100MPaを超える。
【００８１】
理論によって制限されることは本意ではないが、スパイダーシルク内のタンパク質の構造特性は、繊維の機械的特性に関連すると理論づけられる。繊維内の結晶領域は繊維の引張強度と関連づけられ、非晶領域は、繊維の伸び率と関連づけられた。大嚢状腺（MA）シルクは、鞭毛状腺シルクよりも高い強度および低い伸び率を有する傾向があり、同じくMAシルクは、鞭毛状腺シルクと比較して結晶領域の体積分率がより高い。さらに、スパイダーシルクタンパク質の結晶領域および非晶領域の分子動力学に基づく理論モデルは、結晶領域が繊維の引張強度と関連づけられ、非晶領域が繊維の伸び率と関連づけられたという主張を支持する。さらに、理論モデリングは、組換えタンパク質繊維の機械的特性に対する二次、三次および四次構造の重要性を裏づける。例えば、ランダムで平行かつ連続的な空間分布のナノ結晶ドメイン、ならびに非晶領域内の絡み合った鎖の間、および非晶領域とナノ結晶領域との間の相互作用力の強度の両方の組み合わせは、得られる繊維の理論上の機械的特性に影響を与えた。
【００８２】
リニアアクチュエータおよび校正済みのロードセルを含む測定器を使用して、本明細書に記載の1組の繊維を引張機械特性について試験した。1秒あたり1％のひずみ速度で、破断するまで繊維を引っ張った。光学顕微鏡法を20倍の倍率で用い、画像処理ソフトウェアを使用して、繊維径を測定した。平均最大応力は、24〜172MPaの範囲であった。平均最大ひずみは、2〜342％の範囲であった（例えば図5を参照）。平均初期弾性率は、1617〜7040MPaの範囲であった（図6参照）。3本の繊維の平均靭性は、0.5MJ m-3（標準偏差0.2）、20MJ m-3（標準偏差0.9）、および59.2MJ m-3（標準偏差8.9）と測定された。直径は、4.48〜12.7μmの範囲であった。繊維断面の一部は滑らかな表面を有する円形に加工され、一部は中空コアを有し、一部はひだ状と記述した粗いひだ状表面を有する（それぞれ図2および図3）。
【００８３】
図7は、本開示の23本の繊維の応力-ひずみ曲線を示し、これには、20cN/texを超える最大引張応力を有する繊維が含まれ、23本の繊維の最大引張応力の平均は約18.6cN/texである。最大引張応力は、約17〜21cN/texの範囲であり、最大引張応力の標準偏差は、この実施例において、約1.0cN/texである。23本の繊維の平均初期弾性率（すなわちヤング率）は約575cN/texであり、標準偏差は、この実施例において、約6.7cN/texである。23本の繊維の平均最大伸び率は約10.2％であり、標準偏差は、この実施例において、約3.6％である。23本の繊維の平均破断仕事量（靭性の尺度）は約0.92cN＊cmであり、標準偏差は、この実施例において、約0.43cN＊cmである。23本の繊維の平均線密度は約3.1dtexであり、標準偏差は、この実施例において、約0.11dtexである。
【００８４】
さらに考慮すべき事項
本開示の態様の前述の説明は例示の目的のために提示されたものであり、網羅的であること、または開示されている厳密な形態に特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、上述の開示に照らして多くの修正および変形が可能であることを理解することができる。
【００８５】
本明細書で使われた言葉は、主に読みやすさおよび説明の目的のために選択され、本発明の主題を叙述または制限するために選択されていない場合がある。したがって、本開示の範囲は、この詳細な説明によってではなく、本明細書に基づいて記載されるいずれかの請求項によって限定されることが意図される。したがって、態様の開示は例示するためのものであって、以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
2018512407.tif 000014
【図２】
2018512407.tif 000015
【図３】
2018512407.tif 000016
【図４Ａ】
2018512407.tif 000017
【図４Ｂ】
2018512407.tif 000018
【図４Ｃ】
2018512407.tif 000019
【図４Ｄ】
2018512407.tif 000020
【図５】
2018512407.tif 000021
【図６】
2018512407.tif 000022
【図７】
2018512407.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月16日(2017.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512407000001.app
【国際調査報告】
2018512407.tif 000024
2018512407.tif 000025