(57)【要約】Ｅ−セレクチンに結合し得るがんを有する患者を識別し、処置するための方法およびシステムが開示される。Ｅ−セレクチンに結合するがんは、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘ炭水化物エピトープを発現するそれらの細胞表面によって識別され、このようながんは、シアリルＬｅａ／ｘに結合する抗体、例えばＨＥＣＡ−４５２によって識別され得る。このようながんは、Ｅ−セレクチンのアンタゴニスト、例えば炭水化物模倣化合物を用いて、およびＥ−セレクチンの結合を遮断し、かつ／または撹乱するシアリルＬｅａ／ｘドメインを含有する細胞表面炭水化物を標的とする免疫療法を用いて、処置することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する患者を処置する方法であって、
前記患者から、がん細胞、血液、または血液画分試料を得るステップと、
シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘ結合ドメインを有する抗体が、前記がん細胞に結合するかどうかを決定するステップと、
前記抗体が、前記がん細胞に結合する場合、有効量の少なくとも１つの炭水化物模倣化合物を、それを必要とする前記患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者に、化学療法および／または放射線治療を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者に、ボルテゾミブを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、式（Ｉ）の炭水化物模倣物
【化２】
2018533586.tif 000004
式（Ｉ）のプロドラッグ、および前述のいずれかの薬学的に許容される塩から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法［式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、非炭水化物模倣部分、およびリンカー−非炭水化物模倣部分から選択され、ここで、前記非炭水化物模倣部分は、ポリエチレングリコール、Ｎ−連結サイクラム、チアゾリル、クロメニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１〜４ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＹ基から選択され、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、およびＣ２〜Ｃ４アルキニル基から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ４は、−ＯＨおよび−ＮＺ１Ｚ２基から選択され、ここで、Ｚ１およびＺ２は、同じでも異なっていてもよく、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、Ｚ１およびＺ２は、一緒になって環を形成することができ、
Ｒ５は、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル基から選択され、
Ｒ６は、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ７は、−ＣＨ２ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択される］。
【請求項５】
前記がんが、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記がんが、固形腫瘍によって特徴付けられる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ＨＥＣＡ−４５２である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、Ｅ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４のアンタゴニストであるヘテロ二機能性化合物から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、ＧＭＩ−１２７１またはＧＭＩ−１３５９である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
がん幹細胞を識別する抗体を生成するための方法であって、がん細胞を宿主に投与するステップと、得られた抗体集団を、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む、方法。
【請求項１１】
シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘを発現するがん細胞を検出する方法であって、
患者から、がん細胞試料を得るステップと、
前記試料を、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体と接触させ、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘと前記抗体の結合を検出することによって、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘが前記試料中に存在するかどうかを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
患者ががんを有すると診断する方法であって、
前記患者から、がん細胞、血液、または血液画分試料を得るステップと、
前記試料を、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌ抗体と接触させ、ＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォーム、前記ＨＥＣＡ−４５２抗体、および前記ＣＤ６２Ｌ抗体との間の結合を検出することによって、ＣＤ６２Ｌの前記ＨＥＣＡ−４５２グリコフォームが前記試料中に存在するかどうかを検出するステップと、
前記試料中にＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの存在が検出される場合、前記患者が侵襲性がんを有すると診断するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
患者ががんを有すると診断する方法であって、
前記患者から、がん細胞、血液、または血液画分試料を得るステップと、
前記試料を、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体と接触させ、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘと前記抗体の結合を検出することによって、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘが前記試料中に存在するかどうかを検出するステップと、
前記試料中にシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘの存在が検出される場合、前記患者が侵襲性がんを有すると診断するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
患者ががんを有すると診断し、処置する方法であって、請求項１２または１３に記載の方法に従って、前記患者を診断し、有効量の少なくとも１つの炭水化物模倣化合物を、それを必要とする前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記患者に、化学療法および／または放射線治療を投与するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者に、ボルテゾミブを投与するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、式（Ｉ）の炭水化物模倣物
【化３】
2018533586.tif 000005
式（Ｉ）のプロドラッグ、および前述のいずれかの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１６に記載の方法［式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、非炭水化物模倣部分、およびリンカー−非炭水化物模倣部分から選択され、ここで、前記非炭水化物模倣部分は、ポリエチレングリコール、Ｎ−連結サイクラム、チアゾリル、クロメニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１〜４ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＹ基から選択され、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、およびＣ２〜Ｃ４アルキニル基から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ４は、−ＯＨおよび−ＮＺ１Ｚ２基から選択され、ここで、Ｚ１およびＺ２は、同じでも異なっていてもよく、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、Ｚ１およびＺ２は、一緒になって環を形成することができ、
Ｒ５は、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル基から選択され、
Ｒ６は、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ７は、−ＣＨ２ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択される］。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、Ｅ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４のアンタゴニストであるヘテロ二機能性化合物から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの炭水化物模倣化合物が、ＧＭＩ−１２７１またはＧＭＩ−１３５９である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんが、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが、固形腫瘍によって特徴付けられる、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、ＨＥＣＡ−４５２である、請求項１１および１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月３日に出願された米国仮出願番号第６２／２５０，４０６号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下の利益を主張しており、この仮出願はその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示は、薬物抵抗性がん、再発の可能性が高いがん、疾患進行が促進しているがん、および／または生存期間を短縮するがんを含めた侵襲性がんを有する患者を処置するための方法およびシステムを提供する。本開示はまた、がん幹細胞および／または侵襲性がん細胞（例えば、薬物抵抗性となる可能性が高いがん細胞、患者に再発させる可能性が高いがん、疾患進行を促進する可能性が高いがん、および／または生存期間の短縮に関連するがん）を識別するため、ならびにある特定の細胞表面炭水化物（細胞表面結合部位）を遮断および／または撹乱することによってこのようながんを処置するための方法および組成物を提供する。また、血液画分試料（例えば、血漿または血清試料）を含めた血液試料を使用して、このようながんを識別するための方法および組成物が開示される。
【背景技術】
【０００３】
すべてのがん細胞が同様であるとは限らない。関係するがん細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞株または前立腺がん腫瘍）の群の中でさえ、遺伝子発現および細胞表面エピトープは変わる。がん幹細胞と呼ばれる、ある特定のがん細胞は、新しい腫瘍を確立するおそれがあり、患者に存在するこれらの幹細胞の数が多いほど、予後不良に関連する。これらのがん幹細胞はまた、より侵襲性が高いがんの特色、例えば薬物抵抗性、疾患進行の促進、より短い生存期間、およびより高い再発発生率を示し得る。がん幹細胞を識別し、患者からこれらの細胞を排除することは、困難になっている。以下は、この困難を克服するための手段を提供することができる。
がん幹細胞は、Ｅ−セレクチンに結合し得る細胞表面炭水化物を発現することが見出されている。Ｅ−セレクチンに結合し得る細胞表面炭水化物は、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘ炭水化物として公知の炭水化物エピトープを含有する。これらのシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘ炭水化物は、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２に結合することも見出されている。すなわち、Ｅ−セレクチンおよびＨＥＣＡ−４５２抗体の両方に結合するシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘ（シアリルＬｅａ／ｘ）の両方に共通する三糖ドメインが存在する。参照によって本明細書に組み込まれる、Bergら、「A  Carbohydrate  Domain  Common  to  Both  Sialyl  Lea  and  Sialyl  Lex  Is  Recognized  by  the  Endothelial  Cell  Leukocyte  Adhesion  Molecule  ELAM  1」、J.  Biol.  Chem.（１９９１年）２６６巻：１４８６９〜７２頁を参照されたい。Ｅ−セレクチンに結合し得るがん細胞は、がんのある特定の標準処置、例えば化学療法に抵抗性を有することができる。すなわち、シアリルＬｅａ／ｘドメインに結合することができる（したがって、Ｅ−セレクチンに結合することもできる）がん細胞集団は、薬物抵抗性、疾患進行の促進、より短い生存期間、およびより高い再発発生率と相関する。シアリルＬｅａ／ｘ結合ドメインを有する抗体に結合する炭水化物エピトープを発現するがん細胞（例えば、ＨＥＣＡ−４５２抗体に結合し得るがん細胞）は、血管内皮上に発現したＥ−セレクチンに結合することもできるので、化学療法処置を切り抜けることができると考えられる。したがって、例えば、これらのがん細胞は、骨髄の防御的微小環境においてＥ−セレクチンに結合する場合、がん処置、例えば化学療法を切り抜けることができる。これらのがん細胞は、直接的に検出することができるか（例えば、がん細胞自体との結合）、または間接的に検出することができる（例えば、これらのがんと関連する血中分子の検出）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bergら、「A  Carbohydrate  Domain  Common  to  Both  Sialyl  Lea  and  Sialyl  Lex  Is  Recognized  by  the  Endothelial  Cell  Leukocyte  Adhesion  Molecule  ELAM  1」、J.  Biol.  Chem.（１９９１年）２６６巻：１４８６９〜７２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示によれば、がん幹細胞を識別するために使用され得るシアリルＬｅａ／ｘに結合する抗体を発見し、生成するための方法および組成物が提供される。本明細書では、これらの方法および組成物を利用するいくつかのがん処置も提供される。特に、本開示において提供された抗体は、Ｅ−セレクチンにも結合する細胞表面炭水化物を発現するがん細胞集団を識別することができる。この識別は、直接的であり得るか（例えば、細胞表面炭水化物を発現する細胞の検出）、または間接的であり得る（例えば、血中に分泌されたか、またはそうでなければ存在する分子上の炭水化物エピトープの検出）。シアリルＬｅａ／ｘに結合する任意の抗体、オリゴヌクレオチドまたはペプチド分子、例えばアプタマーまたはアフィマー（affimer）は、Ｅ−セレクチンにも結合する細胞表面炭水化物を発現するがん細胞集団を識別するため（または血中に存在する炭水化物エピトープを識別するため）に使用することができる。
【０００６】
血中に存在する分子上のがん細胞または炭水化物エピトープのいずれかとの、開示されるシアリルＬｅａ／ｘ−結合抗体の結合に基づいて、侵襲性がんを有するがん患者を識別することができる。本開示は、細胞表面炭水化物を発現するか、またはシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに共通するエピトープを有する血中分子上の炭水化物エピトープを生成するがんを有する患者を、その細胞表面炭水化物の機能を妨害する治療を用いて処置することを企図する。特に、Ｅ−セレクチンを遮断するか、またはそうでなければ阻害することによって、Ｅ−セレクチンは、腫瘍細胞表面炭水化物に結合できなくなると考えられる。がん幹細胞は、Ｅ−セレクチンに結合できなくなると、化学療法抵抗性になることができず、または骨髄の防御的微小環境に隠れることができず、化学療法処置から逃れることができなくなる。その例として、炭水化物模倣（glycomimetic）化合物などの化合物、またはシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに共通するエピトープを有する抗体に結合する細胞表面炭水化物を標的とし、その細胞表面炭水化物の機能を妨害する免疫療法を用いる処置が挙げられる。このような処置に適した炭水化物模倣化合物は、次式（Ｉ）を含むことができる：
【化１】
2018533586.tif 000002
式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、非炭水化物模倣部分、およびリンカー−非炭水化物模倣部分から選択され、ここで、前記非炭水化物模倣部分は、ポリエチレングリコール、Ｎ−連結サイクラム、チアゾリル、クロメニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１〜４ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＹ基から選択され、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、およびＣ２〜Ｃ４アルキニル基から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ４は、−ＯＨおよび−ＮＺ１Ｚ２基から選択され、ここで、Ｚ１およびＺ２は、同じでも異なっていてもよく、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、Ｚ１およびＺ２は、一緒になって環を形成することができ、
Ｒ５は、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル基から選択され、
Ｒ６は、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ７は、−ＣＨ２ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択され、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル基から選択される］。
【０００７】
また、このような処置に適切な化合物には、式（Ｉ）のプロドラッグ、および前述のいずれかの薬学的に許容される塩が含まれ得る。本開示は、その範囲内に、すべての可能な互変異性体を含む。さらに、本開示は、その範囲内に、個々の互変異性体およびこれらの任意の混合物の両方を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、先に定義される通りであり、Ｒ２は、リンカー−非炭水化物模倣部分であり、この非炭水化物模倣部分は、ポリエチレングリコールを含む。Ｅ−セレクチンの炭水化物模倣アンタゴニスト、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，１０９，００２号に開示されているＥ−セレクチンの炭水化物模倣アンタゴニストなどは、このような処置における使用に適し得る。このような炭水化物模倣化合物の１つは、ＧＭＩ−１２７１である。
【０００９】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、先に定義される通りであり、Ｒ２は、リンカー−非炭水化物模倣部分であり、この非炭水化物模倣部分は、Ｎ−連結サイクラムを含む。Ｅ−セレクチンおよびＣＸＣＲ４のアンタゴニストである炭水化物模倣性のヘテロ二機能性（heterobifunctional）化合物、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，４１０，０６６号に開示されているものなどは、このような処置における使用に適し得る。このような炭水化物模倣化合物の１つは、ＧＭＩ−１３５９である。例えば、すべて参照によって組み込まれる、Steele,  Maria  M.ら、「A  small  molecule  glycomimetic  antagonist  of  E-selectin  and  CXCR4  (GMI-1359)  prevents  pancreatic  tumor  metastasis  and  improves  chemotherapy  [abstract]」、Proceedings  of  the  106th  Annual  Meeting  of  the  American  Association  for  Cancer  Research、２０１５年４月１８〜２２日、Philadelphia、PA;  Philadelphia  (PA):  AACR、Cancer  Res  ２０１５年、７５巻（１５号付録）:  Abstract  nr  425.  doi:10.1158/1538-7445.AM2015-425；Gravina,  Giovanni  L.ら、「Dual  E-selectin  and  CXCR4  inhibition  reduces  tumor  growth  and  increases  the  sensitivity  to  docetaxel  in  experimental  bone  metastases  of  prostate  cancer  [abstract]」、Proceedings  of  the  106th  Annual  Meeting  of  the  American  Association  for  Cancer  Research、２０１５年４月１８〜２２日、Philadelphia、PA;  Philadelphia  (PA):  AACR、Cancer  Res  ２０１５年、７５巻（１５号付録）:  Abstract  nr  428.  doi:10.1158/1538-7445.AM2015-428を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＭＭ１Ｓｐａｒｅｎｔａｌ細胞集団のグラフであり、Ｙ軸にはＭＭ１Ｓｐａｒｅｎｔａｌ細胞の骨髄腫細胞のためのＣＤ１３８マーカーが示されており、Ｘ軸にはＨＥＣＡ−４５２に陽性のＭＭ１Ｓｐａｒｅｎｔａｌ細胞が示されている。
【００１１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞集団のグラフであり、Ｙ軸にはＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞の骨髄腫細胞のためのＣＤ１３８マーカーが示されており、Ｘ軸にはＨＥＣＡ−４５２に陽性のＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞が示されている。
【００１２】
【図２】図２は、ＭＭ１Ｓｐａｒｅｎｔａｌ細胞を注射された雌性ＳＣＩＤマウスおよびＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞を注射された雌性ＳＣＩＤマウスの生存率のグラフである。
【００１３】
【図３】図３は、ＭＭ１Ｓｐａｒｅｎｔａｌ細胞を注射し、ＧＭＩ−１２７１、ボルテゾミブ（ＢＴＺ）、ならびにＧＭＩ−１２７１およびボルテゾミブと、対照としての生理食塩水で処置したマウスの生存割合のグラフである。
【００１４】
【図４】図４は、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞を注射し、ＧＭＩ−１２７１、ボルテゾミブ、ならびにＧＭＩ−１２７１およびボルテゾミブと、対照としての生理食塩水で処置したマウスの生存割合のグラフである。
【００１５】
【図５】図５は、ＧＭＩ−１２７１を１回投薬した後に、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２を生着させたマウスの血流中に動員された、ヒトＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の数の経時的なグラフである。
【００１６】
【図６】図６は、再発患者のＡＭＬ芽球と比較した、新規に診断された患者から得られたＡＭＬ芽球によるｍＡｂ  ＨＥＣＡ−４５２によって検出された、Ｅ−セレクチンリガンドの発現のグラフである。
【００１７】
【図７】図７は、血清中のがん幹細胞および／または侵襲性がん細胞のためのマーカーを含めたがんマーカーを検出するための、ＨＥＣＡ−４５２捕捉／ＣＤ−Ｂアッセイの概念提示を提供する。
【００１８】
【図８】図８は、血清中のがん幹細胞および／または侵襲性がん細胞のためのマーカーを含めたがんマーカーを検出するための、ＣＤ−Ｂ捕捉／ＨＥＣＡ−４５２アッセイの概念提示を提供する。
【００１９】
【図９】図９は、フローサイトメトリーによって検出される通り、ＨＥＣＡ−４５２を発現する（すなわち、ＨＥＣＡ−４５２陽性である）ＫＧ１およびＫＧ１ａ細胞のパーセンテージを示す。
【００２０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＨＥＣＡ−４５２／ＣＤ６２ＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌ抗体の両方に結合する、ＫＧ１馴化培地中のリガンドの量を示す。
【００２１】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＨＥＣＡ−４５２／ＨＥＣＡ−４５２サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ＨＥＣＡ−４５２抗体に結合する、ＫＧ１馴化培地中のリガンドの量を示す。
【００２２】
【図１１】図１１は、ＨＥＣＡ−４５２／検出抗体サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ＨＥＣＡ−４５２抗体および様々な検出抗体（ＣＤ３３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ４３、ＣＤ４４、およびＣＤ１４７検出抗体）の両方に結合する、ＫＧ１ａ馴化培地中の様々なリガンドの量を示す。
【００２３】
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＣＤＬ６２Ｌ捕捉／ＨＥＣＡ−４５２検出ＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ＣＤ６２Ｌ抗体およびＨＥＣＡ−４５２抗体の両方に結合する、ＫＧ１馴化培地中のリガンドの量およびＫＧ１ａ馴化培地中のリガンドの量を示す。
【００２４】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＨＥＣＡ−４５２捕捉／ＣＤ６２Ｌ検出ＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌ抗体の両方に結合する、ＫＧ１馴化培地中のリガンドの量およびＫＧ１ａ馴化培地中のリガンドの量を示す結果（４５０ｎＭにおける吸光度）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ここで、本開示の本発明の実施形態（例示的な実施形態）について詳細に言及し、その例を、添付の図に示す。可能な限り、同じまたは類似の部分を指すために、図を通して同一参照番号が使用される。
【００２６】
本明細書で使用される略語は、一般に、化学技術および生物学技術におけるそれらの従来の意味を有する。
【００２７】
「抗体（単数）」、「抗体（複数）」、「ａｂ」または「免疫グロブリン」という用語は、最も広範な意味で交換可能に使用され、所望の生物活性を示す限り、それらには、単離された、工学的に操作された、化学的に合成された、または組み換えられた抗体（例えば、全長または無傷モノクローナル抗体）を含めたモノクローナル抗体、および抗体断片、オリゴヌクレオチドまたはペプチド分子（例えば、アプタマーまたはアフィマー）も含まれる。一実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体に関する。
【００２８】
抗体分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つまたは４つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、超可変性領域、より保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）、および古典的補体系の第１構成成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主組織または因子との免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００２９】
本開示による抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の標的に結合する能力を保持している任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すことを企図する。一実施形態では、標的は、シアリルＬｅａ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ／ｘ、および／またはＥ−セレクチンリガンドから選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって生成される。さらなる実施形態では、結合フラグメントは、無傷抗体の酵素的または化学的な開裂によって生成される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」という用語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち集団の個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能な変異を除いて、同一である。典型的に、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一エピトープを対象とする。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって生成することができる。モノクローナル抗体は、組換えであってよく、すなわちタンパク質工学によって生成することもできる。モノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。さらに、様々な決定因子またはエピトープを対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープを対象とする。本開示は、細胞から精製によって単離されたもしくは得られた抗体、または遺伝的組換えもしくは化学合成によって得られた抗体に関する。
【００３１】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合することができ、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するために動物において使用することができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有することができる。
【００３２】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、例えばポリペプチド決定因子または炭水化物決定因子などの任意の決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基が含まれ、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有することができる。エピトープは、抗体によって結合している抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するとされる。一実施形態では、抗体は、解離定数が、約１μＭまたはそれ未満である場合、例えば解離定数が約１００ｎＭまたはそれ未満である場合など、例えば解離定数が約１ｎＭまたはそれ未満である場合など、さらに例えば解離定数が約１００ｐＭまたはそれ未満である場合などに、抗原に特異的に結合するとされる。本明細書で使用される「に対して特異的な」および「特異的結合」という用語は、交換可能であり、所定の抗原、例えば、シアリルＬｅａ、シアリルＬｅｘ、およびシアリルＬｅａ／ｘに共通するエピトープに結合する抗体を指す。典型的に、抗体は、１０−６Ｍまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、または任意の他の特異的ポリペプチド）に結合するために、そのＫＤの少なくとも２分の１未満のＫＤで、所定の抗原に結合する。「抗原認識抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
【００３３】
本明細書で使用される「増殖」には、細胞数の任意の増大が含まれる。増殖には、例えば、培養を開始するために使用された細胞集団に存在するＨＳＣの数を上回って、造血幹細胞の数が増大することが含まれる。
【００３４】
シアリルＬｅａまたはシアリルＬｅｘエピトープへのＥ−セレクチンの結合を妨害する薬物を用いる処置は、他のがん処置、例えば化学療法の有効性を改善するために使用することができる。特に、液性がん、例えば多発性骨髄腫、および固形がん、例えば前立腺がんは、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合するがん細胞の侵襲性亜集団の識別、ならびにシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘエピトープを含有する細胞表面炭水化物を妨害し、それによって細胞がＥ−セレクチンに結合するのを妨害する薬物を用いる処置のための候補である。
【００３５】
多発性骨髄腫は、Ｂ細胞系列の完全に分化した細胞型である形質細胞の形質転換から生じる。他の血液がんは、正常なＢ細胞の分化における初期の細胞、例えば初期Ｂ細胞および前駆Ｂ細胞から生じる。初期Ｂ細胞系列に由来するこれらの形質転換した細胞は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として公知である。形質細胞および多発性骨髄腫とは対照的に、前駆Ｂ細胞およびＡＬＬ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２のための抗原（すなわちシアリルＬｅａ／ｘ）により高度にグリコシル化されており、このことは、この抗原が、このＢ細胞系列において発生上制御されることを示唆している。実際、参照によって本明細書に組み込まれるSipkinsら、Nature  ４３５巻：９６９〜９７３頁（２００５年）は、細胞が、骨髄脈管構造の微小領域に発現したＥ−セレクチンに結合できるようにするこの炭水化物エピトープにより、ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ−６がグリコシル化されることを実証した。
【００３６】
Ｂ細胞系列およびそれらの形質転換したリンパ腫のシアリルＬｅｘによる、発生上制御されたグリコシル化は、参照によって本明細書に組み込まれるKikuchiら、Glycobiology  １５巻：２７１〜２８０頁（２００５年）によって評価された。Kikuchiらは、シアリルＬｅｘが、Ｂ細胞系列の初期発生段階の細胞上に発現し、分化すると喪失することを示した。このグリコシル化パターンは、これらの発生段階から生じるリンパ腫と酷似している。したがって、クローン原性の初期段階のＢ細胞が多発性骨髄腫幹細胞である場合、それらは、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに共通するエピトープを発現するはずである。次に、これらのＭＭ幹細胞はまた、Ｅ−セレクチンに機能的に結合するはずである。
【００３７】
以下の実施例１〜４に示される通り、本開示は、ＭＭ細胞のある特定の亜集団が、機能的Ｅ−セレクチンリガンドを発現することを確認する。すなわち、ＭＭ細胞の約５％〜約１０％は、Ｅ−セレクチンリガンドのシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘを発現する。Ｅ−セレクチンリガンドを発現するＭＭ細胞のパーセンテージは、骨髄における低酸素状態に類似の低酸素状態下で増大し得る。
【００３８】
さらに、以下の実施例５〜８に示される通り、本開示はさらに、これらのＥ−セレクチンリガンドが、検出可能なレベルで分泌されることを確認する。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
ＭＭ細胞におけるＥ−セレクチンリガンドの発現
本開示は、多発性骨髄腫細胞株ＭＭ１Ｓ上の細胞表面炭水化物の発現に関する情報を提供する。細胞表面炭水化物の発現は、抗炭水化物抗体に結合した後、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）分析によって決定した。表１に示される通り、抗体ＨＥＣＡ−４５２、Ｅ−セレクチン／ｈＩｇキメラ、および他の抗炭水化物抗体に結合することによって決定される通り、ＭＭ１Ｓ細胞の大部分（例えば、９０％を超える）は、Ｌｅｘ炭水化物エピトープを発現したが、それよりもはるかに小さい亜集団（約５〜１０％）は、シアル酸付加されたＬｅａ／ｘエピトープを発現した。このようにして、Ｅ−セレクチンリガンドを発現するＭＭ１Ｓ細胞を、ＨＥＣＡ−４５２抗体へのそれらの結合によって識別した。
【表１】
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【００４０】
（実施例２）
マウス移植モデル−多発性骨髄腫
Ｅ−セレクチンに対する小分子炭水化物模倣アンタゴニストであるＧＭＩ−１２７１を、ＨＥＣＡ−４５２に結合するＭＭ１Ｓ細胞株由来のＭＭ細胞に、予め投与した。ＧＭＩ−１２７１の適用は、Ｅ−セレクチン上のＭＭ１Ｓ細胞のローリングを遮断した。またＧＭＩ−１２７１の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス移植モデルにおけるボルテゾミブ（抗骨髄腫薬物）の活性を増強することが見出された（参照によって本明細書に組み込まれるNatoniら、Blood、２０１４年を参照されたい）。
【００４１】
親の不均一系ＭＭ細胞株ＭＭ１ＳおよびＲＰＭＩ８２２６（それぞれＭＭ１Ｓｐａｒ、ＲＰＭＩ８２２６ｐａｒ）を、ＨＥＣＡ−４５２によって結合した細胞表面炭水化物（それぞれＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２、ＲＰＭＩ８２２６ＨＥＣＡ４５２）の発現について順次選別して、高度に富化された（＞８５％）細胞株を得た。図１Ａおよび１Ｂは、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞株を増殖させるために使用されるＨＥＣＡ−４５２陽性細胞を得るための、ＭＭ１Ｓ細胞の選別を裏付けるデータを提供する。例えば、図１Ａは、ＨＥＣＡ−４５２に対して陽性の細胞をおよそ５％含む親ＭＭ１Ｓ集団を示す。図１Ｂに示される通り、ＭＭ１ｓＨＥＣＡ−４５２細胞は、ＨＥＣＡ−４５２に対しておよそ８５％が陽性である。図１Ａおよび１Ｂは、生存骨髄腫細胞のためのマーカーとして、ＣＤ１３８を含む。
【００４２】
導出された細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代することができ、抗体ＨＥＣＡ−４５２によって識別された、富化されたＥ−セレクチンリガンドの発現に対して安定であった。ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２およびＲＰＭＩ８２２６ＨＥＣＡ４５２は共に、最小限の接着性を示した親細胞とは対照的に、静的接着性アッセイにおいてＥ−セレクチンへの強力な結合を示した。ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞は、Ｅ−セレクチンに結合すると明らかな形態的変化を示し、非接着性、円形、および屈折性を維持していた親細胞とは対照的に、広がり、反射性が低下した。ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２およびＲＰＭＩ８２２６ＨＥＣＡ４５２は共に、生理的血流を模倣するせん断応力下においてＥ−セレクチン上で強力なローリングを示した。ＭＭ１ＳｐａｒまたはＲＰＭＩ８２２６ｐａｒは、Ｅ−セレクチン上で十分にローリングしなかった。培養状態中にＧＭＩ−１２７１を封入することによって、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２の接着性は著しく低下し、Ｅ−セレクチン上の、富化されたＨＥＣＡ−４５２および親ＭＭ細胞株の両方のローリングが顕著に阻害された。
【００４３】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ知見の有意性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで研究した。雌性ＳＣＩＤベージュマウスに、ＭＭ１ＳｐａｒまたはＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２（５×１０５個の細胞、ｎ＝８／群）のいずれかをｉ．ｖ．注射し、生存について追跡した（例えば、図２を参照されたい）。別々のコホートで、生理食塩水対照、ＧＭＩ−１２７１、ボルテゾミブ（ＢＴＺ）またはそれら両方の組合せを用いる処置の効果を、ＭＭ１ＳｐａｒまたはＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２細胞のいずれかを移植したマウスにおいて決定した。図２に示される通り、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２を移植したマウスは、ＭＭ１Ｓｐａｒを移植したマウスと比較して、より侵襲性が高い疾患を有し、著しく生存期間が短かった。親細胞株とは対照的に（図３を参照されたい）、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２を生着させたマウスでは、ＢＴＺ処置に対する著しい抵抗性が実証された（図４を参照されたい）。図３に示される通り、ＧＭＩ−１２７１処置単独では、生存に対して影響がなかったが、ＧＭＩ−１２７１およびＢＴＺの組合せでは、ＭＭ１Ｓｐａｒを生着したマウスの生存を高度に有意に改善した（Ｐ＝０．０３６３）。重要なことに、図４に示される通り、ＧＭＩ−１２７１およびＢＴＺの組合せは、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２を生着したマウスにおける抵抗性を破壊し、ＢＴＺの抗骨髄腫活性を修復した（Ｐ＝０．００２８）。
【００４４】
多数のヒトＣＤ１３８＋ＭＭ細胞が、ＧＭＩ−１２７１を１回注射してから６０分以内に、ＭＭ１ＳＨＥＣＡ４５２腫瘍を有するマウスの血流に動員され（例えば、図５を参照されたい）、少なくとも２４時間持続した（２．３７％対０．０３％、ｐ＜０．００１）。この効果は、ＧＭＩ−１２７１と一致しており、腫瘍微細環境を撹乱し、ＢＭ微小環境から末梢血にＭＭ１ＳＨＥＣＡ−４５２細胞を動員した。
【００４５】
（実施例３）
ヒト多発性骨髄腫およびＥ−セレクチンリガンドの発現
これらの知見を前提として、ヒト患者から得られたＭＭ細胞試料からのＥ−セレクチンリガンドの発現を研究し、Ｅ−セレクチン発現レベルと疾患進行の相関を決定した。骨髄（ＢＭ）および／または末梢血（ＰＢ）を、ＭＭを有する患者のインフォームドコンセントに従って得た。形質細胞（ＣＤ３８＋／ＣＤ１３８＋）を、フローサイトメトリーによってＨＥＣＡ−４５２抗体を使用して、Ｅ−セレクチンリガンドの発現について分析した。すべての一次ＭＭ試料（ｎ＝２５）は、ＨＥＣＡ−４５２反応性細胞集団を含有していた（中央値２２％）。対応するＢＭ試料と比較して（ｎ＝１４）、患者のＰＢから単離された、一貫してより高い割合の循環ＭＭ細胞が、ＨＥＣＡ−４５２を発現し、中央値差は３３％である（ウィルコクソンの符号順位検定、ｐ＝０．０２）。ＰＢにおけるＭＭのＨＥＣＡ−４５２発現は、診断時に得た試料よりも再発時に得た試料において有意に高かった（平均で４０％以上）（独立ｔ試験、ｐ＝０．０００８）。
【００４６】
これらの研究は、Ｅ−セレクチンリガンドを担持している細胞が、ＭＭなどのがんの播種、疾患の進行、および／または薬物抵抗性において重要な役割を演じ得ることを示している。したがって、炭水化物模倣化合物を組み込む臨床的戦略、例えば参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，１０９，００２号に開示されている戦略によって、患者の転帰を改善することができる。
【００４７】
（実施例４）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるＥ−セレクチンリガンドの発現
ＡＭＬ患者の再発は、骨髄における防御的微小環境内で、おそらくＥ−セレクチンに結合することによって化学療法処置から逃れた白血病幹細胞から生じると考えられる。この機序によれば、再発した生存細胞は、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体、例えばＨＥＣＡ−４５２抗体によって検出可能なＥ−セレクチンリガンドの発現について選択されるはずである。患者由来のＡＭＬ芽球を、ＨＥＣＡ−４５２エピトープの細胞表面発現についてアッセイすると、ＡＭＬがんが再発している患者由来の細胞は、新規に診断されたＡＭＬ患者から得られたＡＭＬ芽球よりも、細胞表面上で著しく多いＨＥＣＡ−４５２抗原を発現した。この研究の結果は、図６のグラフに提示されている。
【００４８】
（実施例５）
ＥＬＩＳＡ血清アッセイ−実験手順
本開示はまた、がん細胞上に発現したシアリルＬｅｘまたはシアリルＬｅａエピトープを含有する炭水化物、血漿または血清などの血液画分を含む血中への、分子上に炭水化物エピトープを発現したような炭水化物の分泌または放出、ならびにがん幹細胞および／または侵襲性がんを含めたがんを検出するための、血中に分泌された分子上の炭水化物エピトープの検出に関する情報を提供する。ＥＬＩＳＡサンドイッチＨＥＣＡ−４５２捕捉／ＣＤ−Ｂ検出アッセイ手順の概要を、以下に提示する。類似の手順を、ＣＤ−Ｂ捕捉／ＨＥＣＡ−４５２検出アッセイについて行い、ＨＥＣＡ−４５２捕捉抗体の代わりにＣＤ−Ｂ捕捉抗体を使用した（逆もまた同じ）。
【００４９】
マイクロプレートを、炭酸塩緩衝液を用いてＨＥＣＡ−４５２捕捉抗体で一晩コーティングした。次に、コーティング緩衝液を破棄し、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、３分間インキュベートし、次に再び洗浄した。次に、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液を添加し、次にマイクロプレートを、ゆっくり振とうさせながら周囲温度で１時間インキュベートした。次に、血清試験試料を、試料希釈緩衝液で希釈した。ブロッキング緩衝液を廃棄し、試験試料を、ブロックしたウェルに、洗浄なしにすぐに添加した。次に、マイクロプレートを、ゆっくり振とうさせながら２時間インキュベートした。試験試料を破棄し、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、振とうさせながら３分間インキュベートした（このステップを３回反復した）。
【００５０】
ビオチン標識検出抗体を、試料希釈緩衝液で希釈することによって調製した。Ｅ−セレクチンリガンド検出抗体は、ＣＤ４３（クローンＭＥＭ−５９；Ｎｏｖｕｓ、最終濃度０．５μｇ／ｍＬ）、ＣＤ４４（クローンＦ１０−４４−２；Ｎｏｖｕｓ、最終濃度０．２５μｇ／ｍＬ）、ＣＤ６２Ｌ（Ｓｈｅｅｐ  ｐＡｂ；Ｒ＆Ｄ系、最終濃度０．２５μｇ／ｍＬ）、およびＣＤ１４７（クローンＭＥＭ−Ｍ６／１；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、最終濃度０．５μｇ／ｍＬ）であった。ＡＭＬマーカー検出抗体は、ＣＤ３３（クローンＨＩＭ３−４；Ｎｏｖｕｓ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）およびＣＤ１２３（クローン６Ｈ６；Ｎｏｖｕｓ、最終濃度０．５μｇ／ｍＬ）であった。
【００５１】
次に、試験した検出抗体ごとに、検出抗体溶液を各ウェルに添加し、ゆっくり振とうさせながら周囲温度で１．５〜２時間インキュベートした。検出抗体溶液を廃棄し、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、振とうさせながら３分間インキュベートした（このステップを３回反復した）。酵素コンジュゲートを、試料希釈緩衝液で希釈し、各ウェルに添加し、ゆっくり振とうさせながら周囲温度で４５分間インキュベートした。酵素コンジュゲートを破棄した。ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、振とうさせながら３分間インキュベートした（このステップを３回反復した）。ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、ゆっくり振とうさせながら周囲温度で１５〜２０分間インキュベートした。１０％リン酸溶液を添加することによって、反応を停止させた。次に、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定した。
【００５２】
図７は、分子（ＣＤ−Ｂによって表され、ＣＤ−Ｂに対する抗体によって検出される）上の炭水化物エピトープを検出する（ＨＥＣＡ−４５２  ｍＡｂを使用する）ために使用される、先に提示の概要と一致する検出／捕捉アッセイの概念提示を提供する。このアッセイでは、シアリルＬｅａまたはシアリルＬｅｘエピトープを発現するすべての血清分子を、固相上に捕捉し、目的の特異的グリコシル化分子（すなわちＣＤ−Ｂ）を、適正な抗体（すなわち抗ＣＤ−Ｂ）によって検出する。あるいは、炭水化物エピトープのシアリルＬｅａまたはシアリルＬｅｘを発現するすべての分子を、血清中のＡＭＬ幹細胞または侵襲性ＡＭＬ細胞を含めたＡＭＬのマーカーを検出するために、抗体ＨＥＣＡ−４５２を使用して捕捉および検出の両方について決定することができる。さらに、図８は、血清中のＡＭＬ幹細胞または侵襲性ＡＭＬ細胞を含めたＡＭＬのマーカーを検出するための、ＣＤ−Ｂ捕捉／ＨＥＣＡ−４５２検出アッセイの概念提示を提供する。
【００５３】
実験で使用するために、ＡＭＬ細胞馴化上清／培地も調製した。特に、ＫＧ１およびＫＧ１ａ細胞株を使用した。ＫＧ１細胞株を、ＡＭＬ患者から発生させたが、これらは、形態学的に、発生の骨髄芽球および前骨髄球段階にある細胞である。ＫＧ１ａ細胞株は、ＫＧ１細胞株のサブクローンである。これは、形態学的かつ組織化学的に、未分化の芽球細胞期にある細胞からなる。フローサイトメトリーを使用して、これらの細胞株のそれぞれにおけるＨＥＣＡ−４５２発現を検出した。図９に示される通り、ＫＧ１細胞の４０％超が、ＨＥＣＡ−４５２に対して陽性であり、ＫＧ１ａ細胞のほぼ７０％が、ＨＥＣＡ−４５２を発現する。ＫＧ１ａ細胞上の抗体ＨＥＣＡ−４５２によって検出されたＥ−セレクチン炭水化物リガンドのグリコシル化の増大は、親ＫＧ１株よりも、このサブクローンの方が、がん幹細胞に似た特性を多く有することと一致する。
【００５４】
（実施例６）
捕捉／検出サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによる、ＫＧ１試験試料におけるＣＤ６２ＬおよびＨＥＣＡ−４５２抗原の同時発現の検出
前述の実施例５のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイについて概説した一般手順を使用し、ＨＥＣＡ−４５２捕捉抗体を、捕捉抗体として使用し、ビオチン標識ＣＤ６２Ｌ抗体またはビオチン標識ＨＥＣＡ−４５２抗体を、検出抗体として使用した。
【００５５】
図１０Ａに示される通り、無希釈（「純粋（ｎｅａｔ）」）ＫＧ１培地、１：１６希釈のＫＧ１培地、および試料緩衝液の溶液を、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎＭにおける吸光度を調べて読み取って、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌの両方に結合する各溶液中のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量を決定した。
【００５６】
図１０Ｂに示される通り、無希釈（「純粋」）ＫＧ１培地、１：１６希釈のＫＧ１培地、および試料緩衝液の溶液を、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎＭにおける吸光度を調べて読み取って、ＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌの両方に結合する各溶液中のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量を決定した。
【００５７】
結果は、ＨＥＣＡ−４５２抗体を用いる（図１０Ｂ）よりも、ＣＤ６２Ｌに対する抗体を用いる（図１０Ａ）方が、ＨＥＣＡ−４５２捕捉分子を検出する特異性および感度が高かったことを示している。
【００５８】
（実施例７）
ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＨＥＣＡ−４５２捕捉を使用するＫＧ１ａ試験試料中のマーカーの様々なＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの検出
前述の実施例５のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイについて概説した一般手順を使用し、ＨＥＣＡ−４５２捕捉抗体を、捕捉抗体として使用し、Ｘ軸上に列挙されている様々なマーカーのためのビオチン標識抗体を、検出抗体として使用した。
【００５９】
図１１に示される通り、無希釈（「純粋」）ＫＧ１ａ培地、１：１６希釈のＫＧ１ａ培地、および試料緩衝液の溶液を、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎＭにおける吸光度を調べて読み取って、ＨＥＣＡ−４５２およびそれぞれのリガンド抗体の両方に結合する各溶液中のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量を決定した。ラットＩｇＭを用いる捕捉を、負の対照として使用した。
【００６０】
結果は、ＨＥＣＡ−４５２  ｍＡｂにより抗原を捕捉し、ＣＤ６２Ｌに対する抗体を用いて検出することによってＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームを検出することにより、最高感度が得られたことを実証している。さらに、ＡＭＬマーカーＣＤ３３およびＣＤ１２３のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームは、上清には検出されない。
【００６１】
（実施例８）
ＫＧ１およびＫＧ１ａ上清の希釈物におけるＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの比較
前述の実施例５のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイについて概説した一般手順を使用し、ＣＤ６２Ｌ捕捉抗体を、捕捉抗体として使用し、ビオチン標識ＨＥＣＡ−４５２抗体を、検出抗体として使用した。図１２Ａに示される通り、ＫＧ１およびＫＧ１ａ培地の様々な希釈物を、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎＭにおける吸光度を調べて読み取って、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌの両方に結合する各溶液中のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量を決定した。結果は、ＫＧ１細胞と比較して、ＫＧ１ａ細胞の上清において見出されたＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量がより多いことを示しており、このことは、図９に示される通り、ＫＧ１細胞と比較してＫＧ１ａ細胞の表面上のＨＥＣＡ−４５２グリコシル化（Ｅ−セレクチンリガンド）が多いことと一致する。
【００６２】
図１２Ａに示される結果について、前述の実施例５のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイについて概説した一般手順を使用し、ＨＥＣＡ−４５２捕捉抗体を、捕捉抗体として使用し、ビオチン標識ＣＤ６２Ｌ抗体を、検出抗体として使用した。図１２Ｂに示される通り、ＫＧ１およびＫＧ１ａ培地の様々な希釈物を、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎＭにおける吸光度を調べて読み取って、ＨＥＣＡ−４５２抗体およびＣＤ６２Ｌの両方に結合する各溶液中のＨＥＣＡ−４５２グリコフォームの量を決定した。結果は、抗体ＨＥＣＡ−４５２を用いて抗原を捕捉し、ＣＤ６２Ｌに対する抗体を用いて検出する形式の方が、ＣＤ６２Ｌに対する抗体を用いて抗原を捕捉し、ＨＥＣＡ−４５２に対する抗体を用いて検出するよりも感度が高いことを示している。
【００６３】
固形腫瘍におけるＥ−セレクチンリガンドの発現
参照によって本明細書に組み込まれるS.  Yasmin-Karinら、Oncotarget、２０１４年１０月６日は、流動条件下においてＥ−セレクチンにｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合する能力に基づいて、前立腺がん細胞を分離した。また、これらの細胞は、Ｅ−セレクチンに結合する能力に基づいて、それらの細胞表面上にＨＥＣＡ−４５２抗原を発現することができた。Ｅ−セレクチンへの結合について選択されたこれらの前立腺がん細胞は、Ｅ−セレクチンに結合しなかった前立腺がん細胞と比較して、腫瘍細胞の幹細胞性（sternness）の特性を示した。これらの特性には、（１）軟寒天におけるコロニー形成、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍球状体の形成、（３）マトリゲルへの侵襲性、ならびに（４）ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移挙動および腫瘍の成長および侵襲性が含まれていた。これらの前立腺がん腫瘍細胞、ならびにＥ−セレクチンリガンドを発現する他の固形腫瘍細胞も、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体による識別、ならびに患者の転帰を改善するための炭水化物模倣化合物、例えばＧＭＩ−１２７１を用いる処置のための候補である。
【００６４】
前述の実施例１〜４に示される通り、固形腫瘍のがん細胞の直接的な検出は、本明細書に開示される方法および組成物を使用して達成することができる。また、前述の実施例５〜９に示される通り、血中に分泌されたグリコフォームを検出することによる、このようながんの間接的な検出は、本明細書に開示される方法および組成物を使用して達成することもできる。
【００６５】
抗体
本開示は、細胞上の細胞表面炭水化物を直接的に検出することによって、または血中に分泌されたかもしくはそうでなければ存在するこのようなグリコフォームを検出することによって、がん幹細胞および／または侵襲性がん細胞を識別するために使用され得る抗体を発見し、生成するための方法および組成物に関する。
【００６６】
一実施形態では、本明細書に開示される技術は、侵襲性がんを検出するための診断抗体および治療抗体を速やかに開発するための新しい戦略を提供する。一実施形態では、本明細書に開示される技術は、Ｅ−セレクチンに結合するがん細胞の細胞表面炭水化物を妨害する化合物を用いて、検出された侵襲性がんを処置するための新しい戦略を提供する。一実施形態では、検出されたがん細胞は、液性がんに由来する。一実施形態では、検出されたがん細胞は、固形腫瘍に由来する。一実施形態では、がんは、血中に存在する炭水化物を検出することによって検出される。一実施形態では、検出されたがんは、ＭＭ、ＡＬＬ、ＡＭＬ、または前立腺がんである。一実施形態では、がんは、診断抗体によって検出された後、炭水化物模倣化合物を用いて処置される。
【００６７】
一実施形態では、本開示は、Ｅ−セレクチンリガンドを発現するがん細胞を識別するために使用され得る抗体に関する。一実施形態では、本開示は、血中に存在するがんリガンドを識別するために使用され得る抗体に関する。一実施形態では、抗体は、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘの両方に特異的である。一実施形態では、抗体は、ＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームを検出する。
【００６８】
一実施形態では、侵襲性がん細胞を識別するために使用され得る抗体を発見し、生成するための細胞集団が提供される。
【００６９】
一実施形態では、本開示は、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘの両方に特異的な抗体であって、宿主にがん細胞を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成される抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘの両方に特異的な抗体であって、宿主に侵襲性がん細胞（例えば、再発患者由来のがん細胞、化学療法に応答しない患者由来のがん細胞、またはそうでなければ識別された侵襲性がん細胞）を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたシアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成される抗体を提供する。
【００７０】
一実施形態では、本開示は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ方法において説明される通り、ＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームを検出するために一緒に使用され得る、ＨＥＣＡ−４５２に特異的な抗体およびＣＤ６２Ｌに特異的な抗体を提供する。ＨＥＣＡ−４５２抗体は、マウスに侵襲性がん細胞（例えば、再発患者由来のがん細胞、化学療法に応答しない患者由来のがん細胞、またはそうでなければ識別された侵襲性がん細胞）を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたＨＥＣＡ−４５２に結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成することができる。ＣＤ６２Ｌ抗体は、マウスに侵襲性がん細胞（例えば、再発患者由来のがん細胞、化学療法に応答しない患者由来のがん細胞、またはそうでなければ識別された侵襲性がん細胞）を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたＣＤ６２Ｌに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成することができる。
【００７１】
一実施形態では、本開示は、ＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌの両方に特異的であり、ＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームを検出することができる抗体であって、マウスにがん細胞を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成される抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、ＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌの両方に特異的な抗体であって、マウスに侵襲性がん細胞（例えば、再発患者由来のがん細胞、化学療法に応答しない患者由来のがん細胞、またはそうでなければ識別された侵襲性がん細胞）を注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上でコーティングされたＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌの両方に結合する抗体についてスクリーニングすることを含む方法によって生成される抗体を提供する。
【００７２】
本開示のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature  ２５６巻：４９５頁による標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含めた様々な技術によって生成することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順を使用することができ、または例えばＢ−リンパ球のウイルス性もしくは発癌性の形質転換を含めた、モノクローナル抗体を生成するための他の技術を用いることができる。
【００７３】
当業者は、ヒトＩｇ遺伝子座の大きい断片を用いて、マウス抗体生成におけるマウス株の欠損を工学的に操作することができ、したがって、このようなマウスは、マウス抗体がない状態でヒト抗体を生成する。大きいヒトＩｇ断片は、膨大な可変的な遺伝子多様性、ならびに抗体生成および発現の妥当な調節を保存することができる。抗体の多様化および選択に関するマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を活用することによって、これらのマウス株において再生成されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含めた目的の任意の抗原に対する高アフィニティー抗体をもたらす。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的なヒトＭＡｂを生成し、選択することができる。
【００７４】
一つの実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現させることができる。一つの実施形態では、適切な哺乳動物宿主細胞を形質変換するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。一つの実施形態では、形質転換は、例えば、ウイルス（またはウイルスベクター）にポリヌクレオチドをパッケージングすること、および宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入することを含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法を使用するか、または当技術分野で公知のトランスフェクション手順によって達成することができる。このような手順は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号によって例示されている。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に応じて変わり得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野で周知であり、それには、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが含まれるが、それらに限定されない。
【００７５】
一実施形態では、本開示は、Ｅ−セレクチンに結合することができる抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、ＨＥＣＡ−４５２抗体である。
【００７６】
一実施形態では、本開示は、がん細胞上に発現するかまたは存在するＥ−セレクチンリガンドに、特異的に結合することができる抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、血中に発現するかまたは存在するＥ−セレクチンリガンドに、特異的に結合することができる抗体を提供する。
【００７７】
シアリルＬｅａおよびシアリルＬｅｘに特異的に結合し、かつ／またはＥ−セレクチンリガンド（例えば、がん細胞によって発現されたＥ−セレクチンリガンド）に特異的に結合することができるハイブリドーマ／抗体のスクリーニングは、当業者に利用可能な複数の技術のいずれかによって達成することができる。
【００７８】
診断
一実施形態では、本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで侵襲性がんおよび／または侵襲性がん細胞を検出するために利用することもできる。一実施形態では、がん細胞は、患者から得ることができ、細胞を蛍光標識抗体と結合させることによってｅｘ  ｖｉｖｏで分析し、蛍光活性化細胞選別によって分析することができる。一実施形態では、血液は、患者から得ることができ、リガンドを蛍光標識抗体と結合させることによってｅｘ  ｖｉｖｏで分析し、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析することができる。一実施形態では、抗体は、ＨＥＣＡ−４５２およびＣＤ６２Ｌに結合し、それらにＣＤ６２ＬのＨＥＣＡ−４５２グリコフォームを検出させる。一部の実施形態では、複数の抗体が、検出において使用される。
【００７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出は、本明細書に記載される抗体を標識し、標識された抗体を対象に投与し、次に対象を画像化することによって達成される。本開示による画像診断に有用な標識の例は、放射標識、例えばＩ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１１１、Ｔｃ９９ｍ、Ｐ３２、Ｉ１２５、Ｈ３、Ｃ１４、およびＲｈ１８８、蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミン、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）走査装置によって検出可能な陽電子放出同位体、化学発光（chemiluminescence）、例えばルシフェリン、および酵素的マーカー、例えばペルオキシダーゼまたはホスファターゼである。短距離放射線放出体、例えば短距離検出器プローブ、例えば経直腸プローブによって検出可能な同位体を用いることもできる。抗体は、当技術分野で公知の技術を使用して、このような試薬を用いて標識することができる。例えば、抗体の放射標識に関する技術に関して参照によって本明細書に組み込まれる、WenselおよびMeares、Radioimmunoimaging  and  Radioimmunotherapy、Elsevier、N.Y.（１９８３年）を参照されたい。また、参照によって本明細書に組み込まれるD.  Colcherら、「Use  of  Monoclonal  Antibodies  as  Radiopharmaceuticals  for  the  Localization  of  Human  Carcinoma  Xenografts  in  Athymic  Mice」、Meth.  Enzymol.  １２１巻：８０２〜８１６頁（１９８６年）も参照されたい。
【００８０】
本開示に従って標識された抗体は、血流中に流れたがん抗原を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試験で使用することができる（例えば、前述の実施例５〜８を参照されたい）。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドの比活性は、放射性標識の半減期、同位体純度、および標識が生物学的作用物質に組み込まれる方法に応じて決まる。イムノアッセイ試験では、比活性が高いほど、一般に感度が良好である。抗体を放射性同位体で標識するための手順は、一般に当技術分野で公知である。
【００８１】
放射標識抗体は、患者に投与することができ、そこで放射標識抗体は、抗体が反応する抗原を担持するがん細胞に局在化され、公知の技術、例えば放射性核種（radionuclear）走査を使用して、例えば、ガンマカメラまたは放出断層撮影法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで検出または「画像化」される。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるA.  R.  Bradwellら、「Developments  in  Antibody  Imaging」、Monoclonal  Antibodies  for  Cancer  Detection  and  Therapy、R.  W.  Baldwinら（編）、６５〜８５頁（Academic  Press  １９８５年）を参照されたい。あるいは、陽電子放出横断断層撮影法走査装置、例えばブルックヘブン国立研究所にある、放射標識が陽電子を放出する（例えば、Ｃ１１、Ｆ１８、Ｏ１５、およびＮ１３）、指定のＰｅｔ  ＶＩを使用することができる。
【００８２】
フルオロフォアおよび発色団で標識された生物学的作用物質は、当技術分野で公知の標準部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、その蛍光部分は、３１０ｎｍを超える、例えば４００ｎｍを超える波長において実質的に吸収するように選択されるべきである。様々な適切な蛍光剤および発色団は、参照によって本明細書に組み込まれるStryer、Science、１６２巻：５２６頁（１９６８年）およびBrand,  L.ら、Annual  Review  of  Biochemistry、４１巻：８４３〜８６８頁（１９７２年）に記載されている。抗体は、従来の手順、例えば参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に開示されている手順によって、蛍光性発色団基で標識することができる。
【００８３】
治療
本開示による一つの実施形態では、処置し、治療的処置の進行および／または有効性をモニタリングするための方法が提供される。
【００８４】
本明細書に記載される治療方法のそれぞれの一実施形態では、対象は、最初にがんを有すると診断される。一実施形態では、対象は、最初に、侵襲性がんを有すると診断される。別の実施形態では、対象は、液性がん（例えば、ＭＭ、ＡＬＬ、およびＡＭＬ）および固形がん（例えば、前立腺がん）から選択される疾患を有する。一実施形態では、がん患者は、再発したと診断される。一実施形態では、本明細書の抗体は、がん患者を診断し、かつ／または処置するために使用される。一実施形態では、１つまたは複数の炭水化物模倣化合物は、がん患者を処置するために使用される。一実施形態では、患者は、本明細書に開示される抗体を使用して、侵襲性がんを有すると診断される。一実施形態では、患者は、本明細書に開示される抗体を使用して、侵襲性がんを有すると診断された後、１つまたは複数の炭水化物模倣化合物を用いて処置される。
【００８５】
本明細書に開示されるある特定の方法は、Ｅ−セレクチンリガンドの識別が、例えば臨床研究において、または薬物を発見するために望ましい、任意の状況に適用できる。
【００８６】
本明細書の一実施形態では、１つまたは複数の炭水化物模倣化合物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が記載される。一実施形態では、医薬組成物は、ＧＭＩ−１２７１、および薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、医薬組成物は、ＧＭＩ−１３５９、および薬学的に許容される担体を含む。
【００８７】
具体的な実施形態に応じて、本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、侵襲性がん細胞がＥ−セレクチンに結合できないようにするように、その細胞の細胞表面炭水化物の機能を妨害する薬剤を含むことができる。
【００８８】
医薬組成物の投与経路には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下経路が含まれるが、それらに限定されない。
【００８９】
別の実施形態では、処置を受ける対象は、開示される実施形態による医薬組成物の投与の補助物として（投与の前、投与と同時、または投与の後に）、化学療法を受ける。一実施形態では、処置を受ける対象は、ＧＭＩ−１２７１を含む医薬組成物の投与の補助物として（投与の前、投与と同時、または投与の後に）、化学療法を受ける。一実施形態では、処置を受ける対象は、ＧＭＩ−１３５９を含む医薬組成物の投与の補助物として（投与の前、投与と同時、または投与の後に）、化学療法を受ける。一実施形態では、補助的化学療法処置は、ボルテゾミブの投与を含む。
【００９０】
本開示の他の実施形態は、本明細書に開示される本開示の明細書および実施を考慮することによって当業者に明らかとなろう。
【図１Ａ】
2018533586.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018533586.tif 000013
【図８】
2018533586.tif 000014
【図９】
2018533586.tif 000015
【図１０Ａ】
2018533586.tif 000016
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2018533586.tif 000018
【図１２Ａ】
2018533586.tif 000019
【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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2018533586.tif 000022
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