(57)【要約】組換えＤＮＡ技法を用いることにより、所望の脂肪酸プロフィール及び位置特異的又は立体特異的プロフィールを有するトリグリセリド油を産生する油産生組換え細胞が作製される。操作される遺伝子には、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、及び／又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードするものが含まれる。産生される油は高い酸化安定性又は熱安定性を有することができ、又はフライ油、ショートニング、ロールイン用ショートニング、テンパリング脂肪、ココアバター代用物として、潤滑油として、又は様々な化学プロセスの供給原料として有用であり得る。
2018512851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞であって、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする内因性ポリヌクレオチドの１つ以上の対立遺伝子のアブレーションを含む細胞。
【請求項２】
前記ＬＰＡＡＴをコードする前記内因性ポリヌクレオチドが配列番号１０５又は１０６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）；
（ｄ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼＬＰＡＡＴ；及び
（ｅ）脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）
からなる群から選択される活性酵素をコードする外来遺伝子を更に含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記外来遺伝子が、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、又は１０８と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼをコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記外来遺伝子が、配列番号９３のホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
外来遺伝子が、配列番号９５又は９６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項７】
前記外来遺伝子が、配列番号１２、２９、３０、３２、３３、又は３４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項８】
前記外来遺伝子が、配列番号１９、２０、８４又は８５のアミノ酸をコードする少なくとも８０、８５、９０又は９５％配列を有する脂肪酸エロンガーゼをコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項９】
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）；及び
（ｄ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼＬＰＡＡＴ
からなる群から選択される活性酵素をコードする第１の外来遺伝子と、
（ｅ）活性脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする第２の外来遺伝子と、
を含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項１０】
活性ショ糖インベルターゼ又はαガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞によって産生される油であって、前記細胞が、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする内因性ポリヌクレオチドの１つ以上の対立遺伝子のアブレーションを含む、油。
【請求項１２】
前記ＬＰＡＡＴをコードする前記内因性ポリヌクレオチドが、配列番号１０５又は１０６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の油。
【請求項１３】
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）；
（ｄ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）；及び
（ｅ）脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）
からなる群から選択される活性酵素をコードする外来遺伝子を更に含む、請求項１１又は１２に記載の油。
【請求項１４】
前記外来遺伝子が、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、又は１０８と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１３に記載の油。
【請求項１５】
前記外来遺伝子が、配列番号９３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項１３に記載の油。
【請求項１６】
前記外来遺伝子が、配列番号９５又は９６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項１３に記載の油。
【請求項１７】
前記外来遺伝子が、配列番号１２、２９、３０、３２、３３、又は３４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１３に記載の油。
【請求項１８】
前記外来遺伝子が、配列番号１９、２０、８４又は８５と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する脂肪酸エロンガーゼをコードする、請求項１３に記載の油。
【請求項１９】
前記細胞が、
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）；及び
（ｄ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
からなる群から選択される活性酵素をコードする第１の外来遺伝子と、
（ｅ）活性脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする第２の外来遺伝子と、
を含む、請求項１１又は１２に記載の油。
【請求項２０】
前記細胞が、活性ショ糖インベルターゼをコードする外来遺伝子を更に含む、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の油。
【請求項２１】
少なくとも１０％のＣ１８：２を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２２】
少なくとも１５％のＣ１８：２を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２３】
少なくとも１％のＣ１８：３を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２４】
少なくとも５％のＣ１８：３を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２５】
少なくとも１０％のＣ１８：３を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２６】
少なくとも１％のＣ２０：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２７】
少なくとも５％のＣ２０：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２８】
少なくとも７％のＣ２０：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項２９】
少なくとも１％のＣ２２：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項３０】
少なくとも５％のＣ２２：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項３１】
少なくとも７％のＣ２２：１を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の油。
【請求項３２】
細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞であって、以下のタイプのうちの１つの活性酵素：
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；又は
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）；
（ｄ）ＬＰＡＡＴ；
をコードする第１の外来遺伝子、
（ｅ）及び任意選択で以下をコードする第２の外来遺伝子
（ｆ）脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）
を含む、細胞。
【請求項３３】
配列番号２０、８４又は８５と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する脂肪酸エロンガーゼ酵素を含む、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記第１の外来遺伝子が、配列番号９３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項３２又は３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記第１の外来遺伝子が、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、又は１０８と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼをコードする、請求項３２又は３３に記載の細胞。
【請求項３６】
前記第１の外来遺伝子が、配列番号１２、２９、３０、３２、３３、又は３４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するＬＰＡＡＴをコードする、請求項３２又は３３に記載の細胞。
【請求項３７】
乾燥重量基準で少なくとも２０％の油を産生する細胞、任意選択で微細藻類細胞であって、前記油が５％以下の飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する、細胞。
【請求項３８】
前記脂肪酸プロフィールが４％以下の飽和脂肪酸を含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記脂肪酸プロフィールが３％以下の飽和脂肪酸を含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４０】
前記脂肪酸プロフィールが、（ａ）２．０％未満のＣ１６：０；（ｂ）２％未満のＣ１８：０；及び／又は（ｃ）２０より大きいＣ１８：１／Ｃ１８：０比を有する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
前記脂肪酸プロフィールが、（ａ）１．９％未満のＣ１６：０；（ｂ）１％未満のＣ１８：０；及び／又は（ｃ）１００より大きいＣ１８：１／Ｃ１８：０比を有する、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記脂肪酸プロフィールが、２．５％以下、又は任意選択で２．２％以下のＣ１６：０とＣ１８：０との合計を有する、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
ＫＡＳＩＩ遺伝子及びＳＡＤ遺伝子の両方を過剰発現する、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
前記ＫＡＳＩＩ遺伝子が、配列番号１８又は６４と少なくとも８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する成熟ＫＡＳＩＩタンパク質をコードし、及び／又は前記ＳＡＤ遺伝子が、配列番号６５と少なくとも８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する成熟ＳＡＤタンパク質をコードする、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
内因性ＦＡＴＡ遺伝子の破壊を更に含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を更に含む、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を更に含む、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
前記阻害性ＲＮＡが、ＦＡＤ２遺伝子を下方調節するヘアピンＲＮＡである、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記細胞が真核微細藻類細胞であり、前記油が、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５０】
請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞によって産生される油。
【請求項５１】
（ａ）請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の組換え細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記細胞から前記油を抽出する工程と、を含む方法。
【請求項５２】
請求項１１〜３１又は５０のいずれか一項に記載の油を化学反応に供する工程を含む、組成物の調製方法。
【請求項５３】
請求項１１〜３１又は５０のいずれか一項に記載の油を別の食用原料に添加する工程を含む、食品の調製方法。
【請求項５４】
細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞であって、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項５５】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項５４に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項５６】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする、請求項５４に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項５７】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項５４に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項５８】
リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項５９】
ショ糖インベルターゼ及びαガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素をコードする外因性核酸を更に含む、請求項５８に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６０】
デサチュラーゼ及び／又はケトアシルシンターゼをコードする外因性核酸を更に含む、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６１】
内因性ＦＡＴＡ遺伝子の破壊を更に含む、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６２】
内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を更に含む、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６３】
デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を更に含む、請求項６１又は６２に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６４】
前記細胞油が、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の油産生真核微細藻類細胞。
【請求項６５】
油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞によって産生される油であって、前記細胞が、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、油。
【請求項６６】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項６５に記載の油。
【請求項６７】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする、請求項６５に記載の油。
【請求項６８】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項６５に記載の油。
【請求項６９】
前記細胞が、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の油。
【請求項７０】
前記細胞が、ショ糖インベルターゼ及びαガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素をコードする外因性核酸を更に含む、請求項６９に記載の油。
【請求項７１】
少なくとも１０％のＣ１８：２を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７２】
少なくとも１５％のＣ１８：２を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７３】
少なくとも１％のＣ１８：３を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７４】
少なくとも５％のＣ１８：３を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７５】
少なくとも１０％のＣ１８：３を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７６】
少なくとも１％のＣ２０：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７７】
少なくとも５％のＣ２０：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７８】
少なくとも７％のＣ２０：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項７９】
少なくとも１％のＣ２２：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項８０】
少なくとも５％のＣ２２：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項８１】
少なくとも７％のＣ２２：１を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の油。
【請求項８２】
β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の油。
【請求項８３】
細胞油を産生するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の細胞であって、内因性遺伝子の内因性調節エレメントを置換する外因性ポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項８４】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である、請求項８３に記載の細胞。
【請求項８５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞である、請求項８４に記載の細胞。
【請求項８６】
前記内因性調節エレメントが、内因性アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの発現を制御するプロモーターである、請求項８５に記載の細胞。
【請求項８７】
前記外因性ポリヌクレオチドがＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＭＴ０３プロモーターである、請求項８６に記載の細胞。
【請求項８８】
活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性核酸を更に含む、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８９】
前記外因性核酸が配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項８８に記載の細胞。
【請求項９０】
前記外因性核酸が配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする、請求項８８に記載の細胞。
【請求項９１】
前記外因性核酸が配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項８８に記載の細胞。
【請求項９２】
リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９３】
デサチュラーゼ及び／又はケトアシルシンターゼをコードする外因性核酸を更に含む、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９４】
内因性ＦＡＴＡ遺伝子の破壊を更に含む、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９５】
内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を更に含む、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９６】
デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を更に含む、請求項９４又は９５に記載の細胞。
【請求項９７】
前記細胞油が、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む、請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９８】
請求項８３〜９７のいずれか一項に記載の細胞によって産生される油。
【請求項９９】
（ａ）請求項５４〜６４又は８３〜９７のいずれか一項に記載の細胞を培養して油を産生させる工程と、
（ｂ）前記細胞から前記油を抽出する工程と、
を含む方法。
【請求項１００】
請求項６５〜８２又は９８のいずれか一項に記載の油を化学反応に供する工程を含む、組成物の調製方法。
【請求項１０１】
請求項６５〜８２及び９８のいずれか一項に記載の油を別の食用原料に添加する工程を含む、食品の調製方法。
【請求項１０２】
配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
配列番号１４４のヌクレオチド配列を含む、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
配列番号１４３のヌクレオチド配列を含む、請求項１０４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
配列番号１４２のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅｓ）４８８４〜５８１６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
配列番号１４２のヌクレオチド４８８４〜５８１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
配列番号１４４のヌクレオチド配列によってコードされるケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ。
【請求項１０９】
配列番号１４３のヌクレオチド配列によってコードされるヒドロキシルアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ。
【請求項１１０】
配列番号１４２のヌクレオチド４８８４〜５８１６のヌクレオチド配列によってコードされるエノイル−ＣｏＡレダクターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、２０１５年４月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１４３，７１１号明細書、及び２０１５年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１４５，７２３号明細書の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、本明細書において全体として参照により援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は、詳細な説明の終わりに示すとおり、配列表を含む。
【０００３】
本発明の実施形態は、油／脂肪、燃料、食品、及び油脂化学品並びに遺伝子操作された細胞の培養物からのそれらの生成に関する。特定の実施形態は、グリセロール骨格に特定の位置特異的パターンで脂肪酸アシル基を有するトリグリセリドの含有量が高い油、高度に安定した油、高濃度のオレイン酸又は中鎖脂肪酸を含む油、及びかかる油から生成される製品に関する。
【背景技術】
【０００４】
国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット、国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレット及び国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレット、は、油及びそうした油を微細藻類を含めた微生物で生成するための方法を開示している。これらの公報はまた、かかる油を使用した食品、油脂化学品及び燃料の作製についても記載している。
【０００５】
脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長経路のある種の酵素は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子の長さを伸ばす働きをする。エロンガーゼ複合酵素は脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子を２炭素ずつ加えて伸ばし、例えばミリストイル−ＣｏＡからパルミトイル−ＣｏＡ、ステアロイル−ＣｏＡからアラキジル−ＣｏＡ、又はオレオイル−ＣｏＡからエイコサノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡからエルシル−ＣｏＡに伸ばす。加えて、エロンガーゼ酵素はまたアシル鎖長も２炭素ずつ増やして伸ばす。ＫＣＳ酵素はアシル−ＣｏＡ分子をマロニル−ＣｏＡの２つの炭素と縮合させてβ−ケトアシル−ＣｏＡにする。ＫＣＳ及びエロンガーゼは、特定の炭素長、修飾（ヒドロキシル化など）、又は飽和度のアシル基質の縮合に対して特異性を示し得る。例えば、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）のβ−ケトアシル−ＣｏＡ合成は、一価不飽和及び飽和Ｃ１８−及びＣ２０−ＣｏＡ基質に対する選択性によりトランスジェニック植物におけるエルカ酸の産生を上昇させることが実証されており（Ｌａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ  ８（２），ｐｐ．２８１−２９２）、一方、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉの特異的エロンガーゼ酵素は、短鎖及び中鎖飽和ＣｏＡ基質の伸長に選択性を示す（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ  １２６（４），ｐｐ．６９１−９）。
ＩＩ型脂肪酸生合成経路は、可溶性タンパク質によって触媒される一連の反応を利用し、酵素間で中間体がアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のチオエステルとしてやり取りされる。対照的に、Ｉ型脂肪酸生合成経路は単一の大型多官能性ポリペプチドを用いる。
油産生性の非光合成藻類であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、栄養炭素供給が過剰な、しかし他の必須栄養素は制限されているために細胞分裂が阻害される場合の条件下で、多量のトリアシルグリセリド油を蓄える。最大Ｃ１８の炭素鎖長を有する脂肪酸のバルク生合成がプラスチドで起こる；次に脂肪酸が小胞体に輸送され、そこでＣ１８を越える伸長及びトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）への取り込みが（それが起こる場合には）起こると考えられている。脂質は脂肪体と呼ばれる大きい細胞質小器官に蓄えられ、環境条件が成長に有利に変化すると直ちに動員され、同化代謝のためのエネルギー及び炭素分子を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／０６０３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ  ８（２），ｐｐ．２８１−２９２
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ  １２６（４），ｐｐ．６９１−９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態において、乾燥重量基準で少なくとも２０％の油を産生する細胞、任意選択で微細藻類細胞がある。この油は、飽和脂肪酸が５％以下、任意選択で飽和脂肪酸が４％未満、３．５％未満、又は３％未満である脂肪酸プロフィールを有する。この脂肪酸プロフィールは、（ａ）２．０％未満のＣ１６：０；（ｂ）２％未満のＣ１８：０；及び／又は（ｃ）２０より大きいＣ１８：１／Ｃ１８：０比を有し得る。或いは、この脂肪酸プロフィールは、（ａ）１．９％未満のＣ１６：０；（ｂ）１％未満のＣ１８：０；及び／又は（ｃ）１００より大きいＣ１８：１／Ｃ１８：０比を有し得る。この脂肪酸プロフィールは、Ｃ１６：０とＣ１８：０との合計が２．５％以下、又は任意選択で２．２％以下であり得る。
【０００９】
本細胞は、ＫＡＳＩＩ遺伝子とＳＡＤ遺伝子との両方を過剰発現し得る。任意選択で、ＫＡＳＩＩ遺伝子は、配列番号１８と少なくとも８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する成熟ＫＡＳＩＩタンパク質をコードし、及び／又はＳＡＤ遺伝子は、配列番号６５と少なくとも８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する成熟ＳＡＤタンパク質をコードする。任意選択で、本細胞は内因性ＦＡＴＡ遺伝子及び／又は内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を有する。場合によっては、本細胞は、デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含む。場合によっては、この阻害性ＲＮＡは、ＦＡＤ２遺伝子を下方調節するヘアピンＲＮＡである。
【００１０】
本細胞は真核微細藻類細胞であり得る；この油は、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を有する。
【００１１】
ある実施形態では、方法が、組換え細胞を培養する工程と、細胞から油を抽出する工程とを含む。任意選択で、この油は少なくとも１つの他の食用原料と共に食品中に使用され、又は化学反応に供される。
【００１２】
一実施形態において、細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞であって、この細胞は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする内因性ポリヌクレオチドの１つ以上の対立遺伝子のアブレーション（ノックアウト）を含む。一部の実施形態において、本細胞は、ＬＰＡＡＴの両方の対立遺伝子のアブレーションを含む。一部の実施形態において、本細胞は、ＬＰＡＡＴ１として同定されるＬＰＡＡＴの対立遺伝子のアブレーション又はＬＰＡＡＴ２として同定されるＬＰＡＡＴのアブレーションを含む。一部の実施形態において、本細胞は、ＬＰＡＡＴ１の両方の対立遺伝子のアブレーション及びＬＰＡＡＴ２の両方の対立遺伝子のアブレーションを含む。
【００１３】
一部の実施形態において、油産生真核微細藻類細胞は、内因性ＬＰＡＡＴのアブレーションと、活性ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＬＰＡＡＴ及びＦＡＥのうちの１つ以上をコードする組換え核酸との両方を有する。ＬＰＣＡＴは、配列番号８６、８７、８８、８９、９０、９１、又は９２と、又は配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、又は１０３の関連性のある部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する。ＰＤＣＴは、配列番号９３の関連性のある部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する。ＤＡＧ−ＣＰＴは、配列番号９４、９５、又は９６の関連性のある部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する。ＬＰＡＡＴは、配列番号１２、１６、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、６３、８２、又は８３の関連性のある部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する。ＦＡＥは、配列番号１９、２０、８４、又は８５の関連性のある部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有する。
【００１４】
一部の実施形態において、油産生真核微細藻類細胞は、内因性ＬＰＡＡＴのアブレーションと、活性ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及びＬＰＡＡＴのうちの１つ以上をコードする第１の組換え核酸及び活性ＦＡＥをコードする第２の組換え核酸との両方を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、油産生真核微細藻類細胞は、内因性ＬＰＡＡＴのアブレーションと、活性ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＬＰＡＡＴ及びＦＡＥのうちの１つ以上をコードする組換え核酸及び活性ショ糖インベルターゼをコードする別の組換え核酸との両方を有する。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明は、真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞によって産生される油であり、この細胞は、ＬＰＡＡＴをコードする内因性ポリヌクレオチドの１つ以上の対立遺伝子のアブレーションを含む。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、内因性ＬＰＡＡＴのアブレーションと、活性ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＬＰＡＡＴ及びＦＡＥのうちの１つ以上をコードする組換え核酸との両方を有する真核微細藻類細胞によって産生される油を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、内因性ＬＰＡＡＴのアブレーションと、活性ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及びＬＰＡＡＴのうちの１つ以上をコードする第１の組換え核酸及び活性ＦＡＥをコードする第２の組換え核酸との両方を有する油産生真核微細藻類細胞によって産生される油を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、本油は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は少なくとも２５％又はそれ以上のＣ１８：２を含む。他の実施形態において、本油は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、又は少なくとも２５％又はそれ以上のＣ１８：３を含む。一部の実施形態において、本油は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも７％、又は少なくとも１０％又はそれ以上のＣ２０：１を含む。一部の実施形態において、本油は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも７％、又は少なくとも１０％又はそれ以上のＣ２２：１を含む。
【００２０】
一部の実施形態において、本油は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％又はそれ以上のＣ２０：１とＣ２２：１との総量を含む。
【００２１】
一部の実施形態において、本油は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、又は２０％未満又はそれ以下のＣ１８：１を含む。
【００２２】
一部の実施形態においては、細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞であって、この細胞は、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＬＰＡＡＴ及びＦＡＥからなる群から選択される活性酵素の１つ以上をコードする組換え核酸を含む。他の実施形態において、この細胞は、活性ショ糖インベルターゼをコードする第２の外来遺伝子を含む。
【００２３】
ある実施形態では、油産生真核微細藻類細胞は細胞油を産生する。この細胞は、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞であり、以下のタイプのうちの１つの活性酵素：
（ａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）；
（ｂ）ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）；又は
（ｃ）ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、をコードする第１の外来遺伝子；
及び任意選択で、
（ｄ）油中のＣ２０：１及び／又はＣ２２：１脂肪酸の量を増加させる活性がある脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）、をコードする第２の外来遺伝子を含む。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明の組換え細胞の従属栄養培養方法が提供される。一部の実施形態において、組換え細胞を従属栄養的に暗所で培養する方法が提供される。培養細胞は脱水し、及び／又は乾燥させることができる。培養細胞からの油は機械的手段によって抽出することができる。培養細胞からの油は、ヘキサン、ヘプタン、ペンタンなどの非極性有機溶媒を使用して抽出することができる。或いは、メタノール、エタノール、又は他の極性有機溶媒を使用することもできる。エタノールなどの混和性溶媒を使用する場合、ＮａＣｌなどの塩を使用してエマルションを水相と有機相とに「分ける」こともできる。
【００２５】
一態様において、本発明は、上記又は本明細書で考察するとおりの油産生真核微細藻類細胞によって産生される油に関する。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明の油に対して１つ以上の化学反応を実施することにより、潤滑油、燃料、又は他の有用な製品が製造される。他の実施形態では、本発明の油を別の食用食品原料に添加することにより食品が調製される。
【００２７】
一態様において、本発明は、細胞油を産生する油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞に関し、本細胞は、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。一部の実施形態において、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする。一部の実施形態において、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。
【００２８】
場合によっては、本細胞は、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む。場合によっては、本細胞は、ショ糖インベルターゼ及びαガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素をコードする外因性核酸を更に含む。場合によっては、本細胞は、デサチュラーゼ及び／又はケトアシルシンターゼをコードする外因性核酸を更に含む。場合によっては、本細胞は内因性ＦＡＴＡ遺伝子の破壊を更に含む。場合によっては、本細胞は内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を更に含む。一部の実施形態において、本細胞は、デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を更に含む。
【００２９】
一部の実施形態において、本細胞油は、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む。
【００３０】
一態様において、本発明は、油産生真核微細藻類細胞、任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞によって産生される油を提供し、本細胞は、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。場合によっては、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする。場合によっては、この外因性ポリヌクレオチドは配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。
【００３１】
一部の実施形態において、本油は、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む細胞によって産生される。場合によっては、本細胞は、ショ糖インベルターゼ及びαガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素をコードする外因性核酸を更に含む。
【００３２】
場合によっては、本油は少なくとも１０％のＣ１８：２を含む。場合によっては、本油は少なくとも１５％のＣ１８：２を含む。場合によっては、本油は少なくとも１％のＣ１８：３を含む。場合によっては、本油は少なくとも５％のＣ１８：３を含む。場合によっては、本油は少なくとも１０％のＣ１８：３を含む。場合によっては、本油は少なくとも１％のＣ２０：１を含む。場合によっては、本油は少なくとも５％のＣ２０：１を含む。場合によっては、本油は少なくとも７％のＣ２０：１を含む。場合によっては、本油は少なくとも１％のＣ２２：１を含む。場合によっては、本油は少なくとも５％のＣ２２：１を含む。場合によっては、本油は少なくとも７％のＣ２２：１を含む。一部の実施形態において、本油は、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む。
【００３３】
一態様において、本発明は、細胞油を産生するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の細胞に関し、本細胞は、内因性遺伝子の内因性調節エレメントを置換する外因性ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、本細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。場合によっては、本細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞である。
【００３４】
一部の実施形態において、内因性調節エレメントは、内因性アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの発現を制御するプロモーターである。場合によっては、外因性ポリヌクレオチドはＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＭＴ０３プロモーターである。
【００３５】
場合によっては、本細胞は、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性核酸を更に含む。一部の実施形態において、この外因性核酸は配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。一部の実施形態において、この外因性核酸は配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする。一部の実施形態において、この外因性核酸は配列番号１４２のエノイル−ＣｏＡレダクターゼコード部分と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有し、活性エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする。
【００３６】
場合によっては、本細胞は、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）又は脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする外因性核酸を更に含む。場合によっては、本細胞は、デサチュラーゼ及び／又はケトアシルシンターゼをコードする外因性核酸を更に含む。場合によっては、本細胞は内因性ＦＡＴＡ遺伝子の破壊を更に含む。場合によっては、本細胞は内因性ＦＡＤ２遺伝子の破壊を更に含む。場合によっては、本細胞は、デサチュラーゼの発現を下方調節する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を更に含む。
【００３７】
一部の実施形態において、本細胞油は、β−シトステロールに対して過剰のエルゴステロール及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールを有するステロール類を含む。
【００３８】
一態様において、本発明は、上記又は本明細書で考察される細胞のいずれか一つによって産生される油を提供する。
【００３９】
一態様において、本発明は、（ａ）上記又は本明細書で考察するとおりの細胞を培養して油を産生させる工程と、（ｂ）細胞から油を抽出する工程とを含む方法を提供する。
【００４０】
一態様において、本発明は、上記又は本明細書で考察される油を化学反応に供する工程を含む組成物の調製方法を提供する。
【００４１】
一態様において、本発明は、上記又は本明細書で考察される油を別の食用原料に添加する工程を含む食品の調製方法を提供する。
【００４２】
一態様において、本発明は、配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。場合によっては、本ポリヌクレオチドは配列番号１４４のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
一態様において、本発明は、配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。場合によっては、本ポリヌクレオチドは配列番号１４３のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
一態様において、本発明は、配列番号１４２のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅｓ）４８８４〜５８１６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。場合によっては、本ポリヌクレオチドは配列番号１４２のヌクレオチド４８８４〜５８１６のヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
一態様において、本発明は、配列番号１４４のヌクレオチド配列によってコードされるケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）を提供する。場合によっては、このＫＣＲは、配列番号１４４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４６】
一態様において、本発明は、配列番号１４３のヌクレオチド配列によってコードされるヒドロキシルアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）を提供する。場合によっては、このＨＡＣＤは、配列番号１４３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４７】
一態様において、本発明は、配列番号１４２のヌクレオチド４８８４〜５８１６のヌクレオチド配列によってコードされるエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）を提供する。場合によっては、このＥＣＲは、配列番号１４２のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅｓ）４８８４〜５８１６と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４８】
本発明の様々な実施形態において、上記又は本明細書で考察される２つ以上の特徴を共に組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】１５Ｌ流加培養発酵ラン１４０５５８Ｆ２２及び１４０５７４Ｆ２４におけるＳ８１８８の総飽和脂肪酸レベルを示す。
【図２】実施例１７で考察する様々な細胞株から産生されたパーセント飽和物を示す。「ＭＣＢ」はマスターセルバンクを指し、及び「ＷＣＢ」はワーキングセルバンクを指す。株Ｓ８６９５及びＳ８６９６は、液体培養培地で培養したとき、それぞれ約３．６％及び３．７５％の総飽和物を有した。
【図３】Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ及び植物ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図４】Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ及び植物ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図５】Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ及び植物エノイル−ＣｏＡレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６Ａ】図６Ａ及び図６Ｂは、Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼタンパク質の２つの対立遺伝子ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１及びＰｍＡＣＣａｓｅ１−２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ及び図６Ｂは、Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼタンパク質の２つの対立遺伝子ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１及びＰｍＡＣＣａｓｅ１−２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
Ｉ．定義
「対立遺伝子」は、生物が同じ染色体上であっても複数の類似した又は同一の遺伝子コピーを有する遺伝子のコピーを指す。対立遺伝子は同じ又は類似したタンパク質をコードし得る。
【００５１】
脂肪酸プロフィール中の２つの脂肪酸に関連して、「バランスしている」は、２つの脂肪酸がそれらの平均面積パーセントの規定の割合の範囲内であることを意味するものとする。従って、ｘ％の存在量の脂肪酸ａ及びｙ％の存在量の脂肪酸ｂに関して、脂肪酸は、｜ｘ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜及び｜ｙ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜が≦１００（ｚ）であるならば、「ｚ％以内にバランスしている」。
【００５２】
「細胞油」又は「細胞脂肪」は、生物から得られる主にトリグリセリドの油を意味するものとし、ここでこの油は、トリグリセリドの脂肪酸プロフィールを実質的に変えるような別の天然油若しくは合成油とのブレンド、又は分画を受けていない。特定の位置特異性のトリグリセリドを含む油に関連して、細胞油又は細胞脂肪は、当該の位置特異的トリグリセリドプロフィールを得るためのエステル交換又は他の合成プロセスに供されておらず、むしろ位置特異性は細胞又は細胞集団によって自然に生じる。細胞によって産生される細胞油について、油のステロールプロフィールは、概して、細胞油を模倣するためステロールを添加することによる油の人工的な再構成によるのでなく、細胞が産生するステロールによって決定される。細胞油又は細胞脂肪に関連して、及び概して本開示全体を通じて使用されるとき、油及び脂肪という用語は、特に注記される場合を除き同義的に使用される。従って、「油」又は「脂肪」は、物質の組成及び他の条件に応じて室温で液体、固体、又は一部固体であり得る。ここで、用語「分画」は、どのように達成するにしても、生物が産生するプロフィールと比べて油の脂肪酸プロフィールを変化させる形で油から材料を取り出すことを意味する。用語「細胞油」及び「細胞脂肪」は、生物から得られるかかる油を包含し、ここで油は、精製、漂白及び／又は脱ガムを含めた、そのトリグリセリドプロフィールを実質的に変化させることのない最小限の処理を受けている。細胞油はまた、「非エステル交換細胞油」であってもよく、これは、脂肪酸がグリセロールに対するそのアシル結合において再分布されたプロセスをその細胞油が受けておらず、生物から回収したときと本質的に同じ配置のままであることを意味する。
【００５３】
「外来遺伝子」は、細胞に（例えば形質転換／トランスフェクションによって）導入されたＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードする核酸を意味するものとし、「導入遺伝子」とも称される。外来遺伝子を含む細胞は、組換え細胞と称することができ、そこにさらなる外来遺伝子が導入され得る。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種由来（従って異種）であってもよく、又は同じ種由来（従って同種）であってもよい。このように、外来遺伝子には、遺伝子の内在性コピーと比べて細胞のゲノムにおいて異なる位置を占めるか、又は異なる制御下にある同種遺伝子が含まれ得る。外来遺伝子は細胞に２つ以上のコピーで存在してもよい。外来遺伝子は、ゲノム（核又はプラスチド）への挿入として、又はエピソーム分子として細胞に維持され得る。
【００５４】
「ＦＡＤｃ」は、「ＦＡＤ２」とも称され、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子である。
【００５５】
「脂肪酸」は、グリセロ脂質中の遊離脂肪酸、脂肪酸塩、又は脂肪酸アシル部分を意味するものとする。グリセロ脂質の脂肪酸アシル基は、トリグリセリドが加水分解又は鹸化されるときに生成されるカルボン酸又はカルボン酸の陰イオンの観点で記載され得ることが理解されるであろう。
【００５６】
「固定炭素源」は、炭素を含有する分子、典型的には有機分子であり、そこで培養される微生物によって利用され得る培養培地中に周囲温度及び圧力で固体又は液体の形態で存在する。従って、二酸化炭素は固定炭素源ではない。
【００５７】
「作動可能に連結している」は、制御配列（典型的にはプロモーター）及び連結された配列（典型的にはタンパク質をコードする配列、コード配列とも称される）など、２つの核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、それが遺伝子の転写を仲介することができる場合、外来遺伝子と作動可能に連結している。
【００５８】
「微細藻類」は、葉緑体又は他のプラスチドを含有する、場合により光合成を行うことが可能な真核微生物、又は光合成を行うことが可能な原核微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光独立栄養生物、並びに唯一固定炭素源で生存し得る従属栄養生物が含まれる。微細藻類には、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓなどの、細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物、並びに、例えばＶｏｌｖｏｘなどの、２つの別個の細胞型の単純な多細胞光合成微生物である微生物が含まれる。微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの細胞が含まれる。微細藻類にはまた、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、及びＰｙｒｏｂｏｔｒｙｓなどの細胞間接着を呈する他の光合成微生物も含まれる。微細藻類はまた、特定の渦鞭毛藻類種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種など、光合成を行う能力を失った偏性従属栄養微生物も含まれる。
【００５９】
脂肪酸長さに関連して、「中鎖」は、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸を意味するものとする。
【００６０】
組換え細胞に関連して、用語「ノックダウン」は、遺伝子によりコードされるタンパク質の産生又は活性の点で部分的に（例えば約１〜９５％）抑制されている遺伝子を指す。
【００６１】
また、組換え細胞に関連して、用語「ノックアウト」は、遺伝子によりコードされるタンパク質の産生又は活性の点で完全に又はほぼ完全に（例えば＞９５％）抑制されている遺伝子を指す。ノックアウトは、コード配列への核酸配列の相同組換え、遺伝子欠失、突然変異又は他の方法により遺伝子をアブレーションすることにより調製することができる。相同組換えが実施されるとき、挿入（「ノックイン」）される核酸は、目的の外来遺伝子をコードする配列であるか、又は目的の遺伝子をコードしない配列であり得る。
【００６２】
「油産生」細胞は、天然に、又は組換えの若しくは古典的な株改良によって、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％の脂質を産生する能力を有する細胞である。「油産生微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」又は「油産生微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、微細藻を含め、油産生性の微生物（特に、脂質を蓄える真核微細藻）である。油産生細胞はまた、その脂質又は他の含有分の一部又は全てが取り除かれた細胞、並びに生細胞及び死細胞のいずれも包含する。
【００６３】
「規則性油（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｏｉｌ）」又は「規則性脂肪（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｆａｔ）」は、主として所与の多形構造である結晶を形成するものである。例えば、規則性油又は規則性脂肪は、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超がβ又はβ’多形形態である結晶を有し得る。
【００６４】
細胞油に関連して、「プロフィール」は、油中の特定の種又はトリグリセリド又は脂肪酸アシル基の分布である。「脂肪酸プロフィール」は、グリセロール骨格との結合に関係なく、油のトリグリセリド中の脂肪酸アシル基の分布である。脂肪酸プロフィールは、典型的には、実施例１のように、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への変換と、続く水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）によるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定される。脂肪酸プロフィールは、ある脂肪酸の曲線下面積から求めた全脂肪酸シグナルに対する当該の脂肪酸の１つ以上の百分率として表すことができる。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ計測値は、脂肪酸の重量百分率を概算する。「ｓｎ−２プロフィール」は、油中のトリアシルグリセリドのｓｎ−２位に見られる脂肪酸の分布である。「位置特異的プロフィール」は、立体特異性に関係なく、グリセロール骨格に対するアシル基結合の位置に関するトリグリセリドの分布である。換言すれば、位置特異的プロフィールは、ｓｎ−１／３と、対するｓｎ−２とにおけるアシル基結合を表す。従って、位置特異的プロフィールでは、ＰＯＳ（パルミチン酸塩−オレイン酸塩−ステアリン酸塩）及びＳＯＰ（ステアリン酸塩−オレイン酸塩−パルミチン酸塩）は同じものとして扱われる。「立体特異的プロフィール」は、ｓｎ−１、ｓｎ−２及びｓｎ−３におけるアシル基の結合を表す。特に指示されない限り、ＳＯＰ及びＰＯＳなどのトリグリセリドは同等と見なされる。「ＴＡＧプロフィール」は、結合の位置特異的な性質に関係なく、グリセロール骨格との結合に関してトリグリセリドに見られる脂肪酸の分布である。従って、ＴＡＧプロフィールでは、油中のＳＳＯの百分率はＳＳＯとＳＯＳとの合計であり、一方、位置特異的プロフィールでは、油中のＳＯＳ種を含めない、ＳＳＯの百分率が計算される。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ分析の重量百分率と対照的に、トリグリセリドの割合は、典型的にはモル百分率、すなわちＴＡＧ混合物中における所与のＴＡＧ分子の百分率として提供される。
【００６５】
用語「パーセント配列同一性」は、２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列との関連では、配列比較アルゴリズムを使用した又は目視検査による計測で最大の一致となるように比較及びアラインメントしたとき同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセントヌクレオチド又はアミノ酸同一性を決定する配列比較では、典型的には一方の配列が参照配列として働き、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、１つ又は複数の試験配列について参照配列と比べたパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータに設定したＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して実行することができる。例えば、２つの核酸配列の比較には、以下のデフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）でｂｌａｓｔｎを使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；マッチに対するリワード：１；ミスマッチに対するペナルティ：−２；開始ギャップ：５及び伸長ギャップ：２ペナルティ；ギャップｘドロップオフ：５０；期待値：１０；ワードサイズ：１１；フィルタ：オン。２つのアミノ酸配列のペアワイズ比較には、例えば以下のデフォルトパラメータに設定したｂｌａｓｔｐで「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）を使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；開始ギャップ：１１及び伸長ギャップ：１ペナルティ；ギャップｘドロップオフ５０；期待値：１０；ワードサイズ：３；フィルタ：オン。
【００６６】
「組換え」は、外来核酸の導入又は天然核酸の変化によって改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターである。従って、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞中には見られない遺伝子を発現し、又は当該の遺伝子が非組換え細胞によって発現する場合とは異なる形で天然遺伝子を発現することができる。組換え細胞には、限定なしに、遺伝子産物をコードするか、又は細胞中の活性遺伝子産物レベルを低下させる抑制エレメント、例えば突然変異、ノックアウト、アンチセンス、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又はｄｓＲＮＡをコードする組換え核酸が含まれ得る。「組換え核酸」は、概して、例えばポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼを使用した、化学合成を使用した核酸の操作により、当初インビトロで形成される核酸であるか、又はその他の天然では通常見られない形態である。組換え核酸は、例えば、２つ以上の核酸を作動可能に連結した状態に置くために作製されてもよい。従って、天然では通常つながっていないＤＮＡ分子をライゲートすることによりインビトロで形成される単離核酸又は発現ベクターは、両方とも、本発明の目的上組換えと見なされる。組換え核酸は、それを作製して宿主細胞又は生物に導入した後、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製し得る；しかしながら、かかる核酸は組換え産生後、続いて細胞内で複製されるが、それでもなお本発明の目的上組換えと見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち組換え核酸の発現によって作製されたタンパク質である。
【００６７】
用語「トリグリセリド」、「トリアシルグリセリド」及び「ＴＡＧ」は、当該技術分野において周知されているとおり同義的に使用される。
【００６８】
ＩＩ．概要
本発明の例示的な実施形態は、グリセロ脂質における変化した脂肪酸プロフィール及び／又は変化した脂肪酸位置特異的分布を生じる油産生細胞、及びその細胞から生成される生成物を特徴とする。油産生細胞の例としては、プラスチド油産生細胞、例えば油産生藻類のものを含めた、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する微生物細胞、並びに該当する場合には、限定はされないが市販の油糧種子作物、例えば、大豆、トウモロコシ、菜種／キャノーラ、綿、アマ、ヒマワリ、ベニバナ及びピーナッツを含めた高等植物の油生成細胞が挙げられる。細胞の他の具体的な例としては、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｔｙａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養又は偏性従属栄養微細藻類が挙げられる。油産生微細藻類及び培養方法の例はまた、偏性従属栄養生物を含む属であるＣｈｌｏｒｅｌｌａ属及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種を含め、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットにも提供される。油産生細胞は、例えば、細胞重量基準で２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は約９０％±５％の油を産生する能力を有し得る。場合により、産生される油は、高度不飽和脂肪酸、例えばＤＨＡ又はＥＰＡ脂肪酸が低くてもよい。例えば、油は、５％、２％、又は１％未満のＤＨＡ及び／又はＥＰＡを含み得る。上述の公報はまた、かかる細胞を培養して油を、特に微細藻類細胞から抽出する方法も開示している；かかる方法は本明細書に開示される細胞に適用することができ、これらの教示について参照により援用される。微細藻類細胞が使用される場合、それらは独立栄養で培養するか（偏性従属栄養生物でない限り）又は暗所で糖（例えば、グルコース、フルクトース及び／又はショ糖）を使用して培養することができる。本明細書に記載される任意の実施形態において、細胞は、細胞によるショ糖原料からの油の産生を可能にするため外来性インベルターゼ遺伝子を含む従属栄養細胞であってもよい。それに代えて、又は加えて、細胞はセルロース系原料からキシロースを代謝することができる。例えば、活性キシロース輸送体、キシルロース−５−リン酸輸送体、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシロースレダクターゼをコードする遺伝子など、１つ以上のキシロース代謝遺伝子を発現するように細胞を遺伝子操作することができる。キシロースを利用する遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の開示を含め、２０１２年１１月１５日に公開された国際公開第２０１２／１５４６２６号パンフレット、「ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＴＨＡＴ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＺＥ  ＸＹＬＯＳＥ」を参照のこと。
【００６９】
油産生細胞は、任意選択で、バイオリアクター／発酵槽で培養されてもよい。例えば、従属栄養油産生微細藻類細胞は、糖含有栄養ブロスで培養することができる。任意選択で、培養は二段階：シード段階及び脂質産生段階で進めることができる。シード段階では、細胞数がスターター培養物から増加する。従って、シード段階は、典型的には、急速な細胞分裂を促進するように設計された栄養リッチな窒素充満培地を含む。シード段階後、栄養制限（例えば窒素希薄）条件下で細胞に糖が供給されてもよく、これにより糖がトリグリセリドに変換されることになる。本明細書で使用されるとき、「標準脂質産生条件」は、培養条件が窒素制限であることを意味する。発酵中に糖及び他の栄養分は添加され得るが、追加の窒素は添加されない。細胞は存在する全て又はほぼ全ての窒素を消費することになるが、追加の窒素は供給されない。例えば、脂質産生段階における細胞分裂速度はシード段階と比べて５０％、８０％以上低下し得る。加えて、シード段階と脂質産生段階との間での培地の変動によって組換え細胞が誘導され、異なる脂質合成遺伝子が発現することにより、産生されるトリグリセリドが変化し得る。例えば、以下で考察するとおり、内在性又は外来性遺伝子の前に窒素感受性及び／又はｐＨ感受性プロモーターを置くことができる。これは、シード段階における細胞の最適成長を支持しない脂質産生段階で油が産生されるべきである場合に特に有用である。
【００７０】
油産生細胞は、脂肪酸生合成酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を発現する。結果として、一部の実施形態は、非植物油若しくは非種子油からは得ることのできなかった、又は全く得ることのできなかった細胞油を特徴とする。
【００７１】
油産生細胞（任意選択で微細藻類細胞）は、ＵＶ及び／又は化学的突然変異誘発と、続く化学的又は生化学的毒素での選択を含めた、環境条件下でのスクリーニング又は選択など、古典的な株改良技術によって改良することができる。例えば細胞は、脂肪酸合成阻害薬、糖代謝阻害薬、又は除草剤で選択することができる。選択の結果として、糖での収率が高い株、油産生（例えば、細胞容積、乾燥重量、又は細胞培養物１リットルの割合として）が多い株、又は脂肪酸若しくはＴＡＧプロフィールが改良された株を得ることができる。２０１５年３月３１日に出願された共有の米国仮特許出願第号６０／１４１１６７明細書が、油産生細胞を古典的に突然変異誘発する方法を記載している。
【００７２】
例えば、細胞は、１，２−シクロヘキサンジオン；１９−酢酸ノルエチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｏｎｅ）；２，２−ジクロロプロピオン酸；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、メチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ブチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、イソオクチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、メチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸、メチルエステル；２，６−ジクロロベンゾニトリル；２−デオキシグルコース；５−テトラデシルオキシ−ｗ−フロ酸；Ａ−９２２５００；アセトクロル；アラクロル；アメトリン；アムホテリシン；アトラジン；ベンフルラリン；ベンスリド；ベンタゾン；ブロマシル；ブロモキシニル；カフェンストロール；カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）；カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）；セルレニン；クロルプロファム；クロルスルフロン；クロフィブリン酸；クロピラリド；コルヒチン；シクロエート；シクロヘキサミド；Ｃ７５；ＤＡＣＴＨＡＬ（テトラクロロテレフタル酸ジメチル）；ジカンバ；ジクロロプロップ（（Ｒ）−２−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロパン酸）；ジフルフェニカン；ジヒドロジャスモン酸（ｄｉｈｙｒｏｊａｓｍｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、メチルエステル；ジクワット；ジウロン；ジメチルスルホキシド；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）；エンドサル；エタルフルラリン；エタノール；エトフメセート；フェノキサプロップ−ｐ−エチル；フルアジホップ−ｐ−ブチル；フルオメツロン；ホメサフェン（ｆｏｍａｓｅｆｅｎ）；ホラムスルフロン；ジベレリン酸；グルホシネートアンモニウム；グリホセート；ハロキシホップ；ヘキサジノン；イマザキン；イソキサベン；リパーゼ阻害薬ＴＨＬ（（−）−テトラヒドロリプスタチン）；マロン酸；ＭＣＰＡ（２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸）；ＭＣＰＢ（４−（４−クロロ−ｏ−トリルオキシ）酪酸）；メソトリオン；ジヒドロジャスモン酸メチル；メトラクロル；メトリブジン；ミルドロネート（Ｍｉｌｄｒｏｎａｔｅ）；モリナート；ナプタラム；ノルハルマン；オルリスタット；オキサジアゾン；オキシフルオルフェン；パラコート；ペンジメタリン；ペンタクロロフェノール；ＰＦ−０４６２０１１０；フェネチルアルコール；フェンメジファム；ピクロラム；プラテンシン；プラテンシマイシン；プロメトン；プロメトリン；プロナミド；プロパクロル；プロパニル；プロパジン；ピラゾン；キザロホップ−ｐ−エチル；ジプロピルチオカルバミン酸Ｓ−エチル（ＥＰＴＣ）；Ｓ，Ｓ，Ｓ−トリブチルホスホロトリチオエート；サリチルヒドロキサム酸；セサモール；シデュロン；メタンアルソン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｅ  ａｒｓｅｎａｔｅ）；シマジン；Ｔ−８６３（ＤＧＡＴ阻害薬）；テブチウロン；テルバシル；チオベンカルブ；トラルコキシジム；トリアレート；トリクロピル；トリクロサン；トリフルラリン；及びブルピン酸の１つ以上で選択することができる。
【００７３】
油産生細胞は貯蔵油を産生し、貯蔵油は主としてトリアシルグリセリドであり、細胞の貯蔵体に貯蔵され得る。生油は、細胞から、細胞を破壊して油を分離することにより得られ得る。生油は、細胞によって産生されるステロールを含み得る。国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４号パンフレットが、油産生微細藻類についての従属栄養培養及び油分離技術を開示している。例えば、細胞を提供又は培養し、乾燥させてプレスすることにより、油を得ることができる。生成された油は、当該技術分野において公知のとおり、又は国際公開第２０１０／１２０９３９号パンフレットに記載されるとおり、精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ）され得る。この生油又はＲＢＤ油は、様々な食品、化学及び工業製品又はプロセスに使用され得る。かかる処理の後であっても、油は供給源に特有のステロールプロフィールを維持し得る。微細藻類ステロールプロフィールは以下に開示する。特に本特許出願の第ＸＩＩＩ節を参照のこと。油の回収後、有用な残渣バイオマスが残る。残渣バイオマスの用途としては、紙、プラスチック、吸収剤、吸着剤、掘削液の製造、動物用飼料として、人間の栄養用、又は肥料用が挙げられる。
【００７４】
本発明の核酸は、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＦＡＥ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及び本明細書で考察するとおりの他の脂質生合成経路遺伝子を含めた目的の遺伝子と作動可能に連結して上流及び下流に制御配列を含有し得る。これらの制御配列には、プロモーター、ターゲティング配列、非翻訳配列及び他の制御エレメントが含まれる。
【００７５】
本発明の核酸は、標的宿主細胞における発現に（例えば、表１及び表２のコドン使用頻度表を使用して）コドンが最適化され得る。例えば、使用するコドンの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％が、表１又は表２による最も好ましいコドンであり得る。或いは、使用するコドンの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％が、表１又は表２による１番目又は２番目に最も好ましいコドンであり得る。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの好ましいコドンを以下のそれぞれ表１及び表２に示す。
【００７６】
【表１】
2018512851.tif 000003
【００７７】
【表２】
2018512851.tif 000004
【００７８】
本発明の細胞油は、ステロールプロフィールが従来の供給源と区別可能なものとして宿主生物の指標となる点で従来の植物性又は動物性トリアシルグリセロール供給源と区別することができる。従来の油供給源としては、大豆、トウモロコシ、ヒマワリ、ベニバナ、ヤシ、パーム核、ココナツ、綿実、キャノーラ、菜種、ピーナッツ、オリーブ、亜麻、獣脂、豚脂、ココア、シア、マンゴー、サラノキ、イリッペ、コクム、及びアランブラキアが挙げられる。微細藻類ステロール類の考察については、本開示の第ＸＩＩＩ節を参照のこと。
【００７９】
【表３】
2018512851.tif 000005
【００８０】
トリグリセリド（「トリアシルグリセリド」又は「ＴＡＧ」とも称される）細胞油の脂肪酸プロフィールが本明細書に提供される場合、それは、細胞から抽出した貯蔵油の非分画サンプルを、リン脂質が除去された条件下で分析するか、又はリン脂質の脂肪酸に対して実質的に感度のない分析方法で（例えばクロマトグラフィー及び質量分析法を使用して）分析したものを指すことが理解されるであろう。油はＲＢＤプロセスに供してリン脂質、遊離脂肪酸及び匂いを除去してもよく、しかし油中のトリグリセリドの脂肪酸プロフィールの変化はごく僅か又は無視し得る程度である。細胞は油を産生するため、ある場合には、貯蔵油が細胞における全ＴＡＧの大部分を占めることになる。以下の実施例１は、ＴＡＧ脂肪酸組成及び位置特異的構造を決定するための分析法を提供する。
【００８１】
大別すると、本発明の特定の実施形態は、（ｉ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードするポリヌクレオチドを含めた内因性ポリヌクレオチドの１つ又は２つ又は全ての対立遺伝子のアブレーションを含む組換え油産生細胞、又は（ｉｉ）不飽和脂肪酸に関して栄養要求性の細胞を含めた、低濃度の多価不飽和脂肪酸を有する油を産生する細胞；（ｉｉｉ）脂肪酸をグリセロール又はグリセロールエステルに転移させる酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子の発現に起因して高濃度の特定の脂肪酸を有する油を産生する細胞；（ｉｖ）位置特異的な油を産生する細胞、（ｖ）ＬＰＡＡＴ、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）又は脂肪酸アシルエロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードする遺伝子構築物又は細胞、（ｖｉ）低レベルの飽和脂肪酸及び／又は高レベルのＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１又はＣ２２：１を産生する細胞、（ｖｉｉ）及び改変されたプロフィールを有する細胞油の産生に関する他の発明を含む。これらの実施形態はまた、かかる細胞によって作られた油、油抽出後のかかる細胞由来の残渣バイオマス、これらの油から作られたオレオケミカル、燃料及び食品並びにこれらの細胞の培養方法も包含する。
【００８２】
以下の任意の実施形態において、使用される細胞は、場合により、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅに分類される細胞を含めた、従属栄養又は偏性従属栄養微細藻類細胞を含む微細藻類細胞などのＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する細胞であるか、又は合成生物学のツールを使用してＩＩ型脂肪酸生合成経路を有するように操作された細胞（すなわち、かかる経路を欠く生物にＩＩ型脂肪酸生合成の遺伝機構を移植する）である。ＩＩ型経路を有する宿主細胞を使用すると、外来性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ又は他のＡＣＰ結合酵素とＩ型細胞機構の多酵素複合体との間で相互作用が起こらない可能性が回避される。特定の実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ種、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ種、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ種又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ種の細胞であるか、又は配列番号２５と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。暗所で培養するか又は偏性従属栄養生物を使用することにより、産生される細胞油はクロロフィル又は他の色素が低下し得る。例えば、細胞油は、実質的な精製なしに１００、５０、１０、５、１、０．０．５ｐｐｍ未満のクロロフィルを有し得る。
【００８３】
安定炭素同位体値δ１３Ｃは、標準（例えばＰＤＢ、サウスカロライナ州のＰｅｅｄｅｅ層からのＢｅｌｅｍｎｉｔｅ  ａｍｅｒｉｃａｎａの化石骨格のカーボナイト）に対する１３Ｃ／１２Ｃの比の表現である。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（０／００）は、使用される供給原料のδ１３Ｃ値に関係し得る。一部の実施形態では、油は、トウモロコシ又はサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で従属栄養成長させた油産生生物から得られる。一部の実施形態では、油のδ１３Ｃ（０／００）は、−１０〜−１７０／００又は−１３〜−１６０／００である。
【００８４】
以下に考察する特定の実施形態及び例において、１つ以上の脂肪酸合成遺伝子（例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ケト−アシルＡＣＰシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＦＡＥ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は本明細書に記載される他のものをコードする）は、微細藻に組み込まれる。特定の微細藻について、植物脂肪酸合成遺伝子産物は、その遺伝子産物がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどの、機能するのにＡＣＰの結合を要求する酵素である場合にも、対応する植物アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）の非存在下で機能し得ることが分かっている。従って、場合により微細藻類細胞は、植物ＡＣＰ遺伝子の共発現なしにかかる遺伝子を利用して所望の油を作り得る。
【００８５】
外来遺伝子又は遺伝子の組み合わせを含む組換え細胞の様々な実施形態について、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸配列同一性を有する遺伝子によるそれらの遺伝子の置換は、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９又は９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の置換と同じく、同様の結果をもたらし得ることが考えられる。同様に、新規調節エレメントについて、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸を有する核酸によるそれらの核酸の置換が有効であり得ることが考えられる。様々な実施形態において、機能に不要な配列（例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ又は挿入された制限部位）は多くの場合に使用が省略され、又は遺伝子、タンパク質及び変異体の比較において無視されることは理解されるであろう。
【００８６】
微細藻類を使用して発見され又は微細藻類によって例示されているが、ここに報告される新規遺伝子及び遺伝子の組み合わせは、当該技術分野において周知されている技術を用いて高等植物で使用することができる。例えば、高等植物における外来性脂質代謝遺伝子の使用が、米国特許第６０２８２４７号明細書、同第５８５００２２号明細書、同第５６３９７９０号明細書、同第５４５５１６７号明細書、同第５，５１２，４８２号明細書、及び同第５，２９８，４２１号明細書に開示されており、外来性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含む高等植物を開示している。国際公開第２００９１２９５８２号パンフレット及び国際公開第１９９５０２７７９１号パンフレットは植物におけるＬＰＡＡＴのクローニングを開示している。高等植物におけるＦＡＤ２抑制が国際公開第２０１３１１２５７８号パンフレット、及び国際公開第２００８００６１７１号パンフレットに教示されている。
【００８７】
実施例７に記載するとおり、転写プロファイリングを用いて、低窒素条件に応答して発現を調節するプロモーターが発見された。このプロモーターは、様々な遺伝子を選択的に発現させ、及び微生物油の脂肪酸組成を変化させるのに有用である。ある実施形態においては、異種プロモーターと遺伝子とを含む非天然構築物があり、ここでプロモーターは、実施例７のプロモーター（例えば、配列番号４３〜５８）のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を含み、遺伝子は低窒素条件下と高窒素条件下とで示差的に発現する。任意選択で、発現のｐＨ感受性はＡＭＴ０３プロモーターより低い。例えば、このプロモーターをリノール酸要求株においてＦＡＤ２遺伝子の前に置くと、高窒素条件下、次に低窒素条件下で培養した後に、リノール酸が５、４、３、２、又は１％未満の油を生成することができる。
【００８８】
ＩＩＩ．ＬＰＡＡＴ及び／又はＦＡＴＡのアブレーション（ノックアウト）
ある実施形態において、本細胞は、脂質経路遺伝子の１つ、２つ又は全ての対立遺伝子がノックアウトされるように遺伝子操作される。ある実施形態において、脂質経路遺伝子はＬＰＡＡＴ遺伝子である。或いは、対立遺伝子の遺伝子産物の量又は活性が、例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス、及びヘアピンＲＮＡ技術を含めた阻害性ＲＮＡ技術によってノックダウンされる。脂質経路遺伝子の１つの対立遺伝子がノックアウトされる場合、対応する酵素活性の低下が観察される。脂質経路遺伝子の全ての対立遺伝子がノックアウトされるか、又は十分に阻害される場合、栄養要求体が作り出される。遺伝子の対立遺伝子の１つ以上と相同なドナー配列を有する第１の形質転換構築物を作成することができる。この第１の形質転換構築物が導入され、続く選択方法により、１つ以上の対立遺伝子破壊を特徴とする分離株が得られ得る。或いは、第１の対立遺伝子への挿入により第１の対立遺伝子を不活性化する選択可能なマーカーを発現するように操作された第１の株を作製してもよい。この株は、脂質経路遺伝子の残りの対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンするさらに別の遺伝子操作のための宿主として使用することができる（例えば、第２の選択マーカーを使用して第２の対立遺伝子を破壊する）。当初活性を消失させた内在性遺伝子を有するさらなる形質転換構築物の操作された発現によって、又は好適な異種遺伝子の発現によって、内在性遺伝子の補足を実現することができる。補足遺伝子の発現は、構成的に調節されても、或いは調節可能な制御によって調節されてもよく、それにより成長を可能にし、又は任意に栄養要求条件を作り出すための所望のレベルに至る発現の調整が可能となる。ある実施形態では、脂肪酸要求細胞の集団を使用して補足遺伝子が、例えば外因性脂肪酸合成酵素に対する特定の遺伝子候補、又はかかる候補を含むと考えられる核酸ライブラリによる形質転換により、スクリーニング又は選択される。
【００８９】
所望の遺伝子の全ての対立遺伝子のノックアウト及びノックアウトした遺伝子の補足は、順次行われる必要はない。目的の内在性遺伝子の破壊及び好適な補足遺伝子の構成的発現又は誘導性発現のいずれかによるその補足は、いくつかの方法で行うことができる。一つの方法では、これは好適な構築物の同時形質転換によって実現することができ、１つが目的の遺伝子を破壊し、２つ目が好適な代替的遺伝子座に補足を提供する。別の方法では、誘導性プロモーターの制御下で標的遺伝子を好適な遺伝子に直接置き換えることにより、標的遺伝子の消失を生じさせることができる（「プロモーターハイジャック法」）。このようにして、ここで標的遺伝子の発現が調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。さらなる手法は、遺伝子の内在性調節エレメントを外来性の誘導性遺伝子発現系に置き換えることである。かかるレジーム下では、ここで目的の遺伝子を、特定の必要性に応じてオン又はオフに切り換えることができる。さらに別の方法は、目的の遺伝子の補足能を有する外来遺伝子を発現する第１の株を作成し、次にこの第１の株における目的の遺伝子の全ての対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることである。外来遺伝子による複数の対立遺伝子のノックダウン又はノックアウト及び補足手法を使用して、操作される細胞の脂肪酸プロフィール、位置特異的プロフィール、ｓｎ−２プロフィール、又はＴＡＧプロフィールを変えてもよい。
【００９０】
調節可能なプロモーターが使用される場合、プロモーターはｐＨ感受性（例えば、ａｍｔ０３）か、窒素及びｐＨ感受性（例えば、ａｍｔ０３）か、又は窒素感受性であるがｐＨ非感受性である（例えば、実施例７の新規に発見されたプロモーター）か又は前述のプロモーターのいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を含むそれらの変異体であってもよい。プロモーターに関連して、ｐＨ非感受性（ｐＨ−ｉｎｅｎｓｉｔｉｖｅ）は、環境条件がｐＨ６．８から５．０にシフトしたときのそのプロモーターの感受性がａｍｔ０３プロモーターと比べて低い（例えば、プロモーターとしてａｍｔ０３を有する等価な細胞と比較したとき、ｐＨシフト時の活性の相対的変化が少なくとも５、１０、１５、又は２０％小さい）ことを意味する。
【００９１】
特定の実施形態において、組換え細胞は、内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；例えば長さＣ１８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖（例えば、ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）又はオレイン酸塩（Ｃ１８：１）、又はＣ８：０〜Ｃ１６：０脂肪酸の加水分解に対して選択性を有するＦａｔＡ又はＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性を低下させる働きをする核酸を含む。内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性は、ノックアウト又はノックダウン手法により低下させ得る。ノックダウンは、例えば、１つ以上のＲＮＡヘアピン構築物の使用によるか、プロモーターハイジャック法（低活性又は誘導性プロモーターを内在性遺伝子の天然プロモーターに代える置換）によるか、又は誘導性プロモーターの制御下にある同様の又は同一の遺伝子の導入と組み合わせた遺伝子ノックアウトにより実現され得る。実施例９は、内因性ＦＡＴＡ遺伝子座のアブレーション並びにアブレーションした遺伝子座からのショ糖インベルターゼ（ｉｎｖｅｒａｔａｓｅ）及びＳＡＤの発現について記載する。
【００９２】
従って、油産生細胞は、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する生物のものを含め、脂肪酸の補給又は遺伝的補足の非存在下における細胞の生存能力を消失させるか又は厳しく制限する程度に至るまでの、対立遺伝子をコードするアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ又はＬＰＡＡＴのノックアウト又はノックダウンを有することができる。このような株を使用して、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ又はＬＰＡＡＴ導入遺伝子を発現する形質転換体を選択することができる。
【００９３】
それに代えて、又は加えて、この株を使用して外因性アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼを完全に移し替え、かかる細胞によって産生される細胞油の劇的に異なる脂肪酸プロフィールを提供することができる。例えば、ＦＡＴＡ発現を完全に又はほぼ完全に消失させ、中鎖脂肪酸を産生するＦＡＴＢ遺伝子に置き換えることができる。或いは、ステアリン酸又はオレイン酸（Ｃ１８）と比べてパルミチン酸（Ｃ１６）に特異性を有する内在性ＦａｔＡ遺伝子を有する生物を、ステアリン酸（Ｃ１８：０）に対してより高い相対的特異性を有する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えるか、又はオレイン酸（Ｃ１８：１）に対してより高い相対的特異性を有する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えることができる。特定の具体的な実施形態において、このような内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの二重ノックアウトを有する形質転換体は、５０、６０、７０、８０、又は９０％超のカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸、又は１８炭素未満の鎖長の全脂肪酸を有する細胞油を産生する。かかる細胞は、ステアリン酸又はオレイン酸などのより長鎖の脂肪酸の補給、又はＦａｔＡ遺伝子を調節する誘導性プロモーターの場合には成長許容的な状態と成長制限的な状態との間での環境条件の切り替えを必要とし得る。
【００９４】
本明細書で考察するとおり、ＬＰＡＡＴ酵素は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への脂肪アシル基の転移を触媒する。詳細なＬＰＡＡＴに応じて、この酵素は短鎖、中鎖又は長鎖脂肪アシル基の基質を優先し得る。ある種のＬＰＡＡＴは広域の特異性を有し、短鎖及び中鎖脂肪アシル（ａｃｌｙ）基又は中鎖乃至長鎖脂肪酸アシル基を触媒し得る。
【００９５】
本発明の宿主細胞において、宿主細胞は１つ以上の内因性ＬＰＡＡＴ酵素を有するとともに、特定のＬＰＡＡＴをコードする１、２つ又はそれ以上の対立遺伝子を有し得る。ＬＰＡＡＴ及びそのそれぞれの対立遺伝子を指示するために本明細書で用いる表記法は、以下のとおりである。ＬＰＡＡＴ１−１は、ＬＰＡＡＴ１をコードする対立遺伝子１を意味し；ＬＰＡＡＴ１−２は、ＬＰＡＡＴ１をコードする対立遺伝子２を意味し；ＬＰＡＡＴ２−１は、ＬＰＡＡＴ２をコードする対立遺伝子１を意味し；ＬＰＡＡＴ２−２は、ＬＰＡＡＴ２をコードする対立遺伝子２を意味する。
【００９６】
本発明の宿主細胞において、宿主細胞は１つ以上の内因性チオエステラーゼ酵素を有するとともに、特定のチオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓ）をコードする１、２つ又はそれ以上の対立遺伝子を有し得る。チオエステラーゼ及びそのそれぞれの対立遺伝子を指示するために本明細書で用いる表記法は、以下のとおりである。ＦＡＴＡ−１は、ＦＡＴＡをコードする対立遺伝子１を意味し；ＦＡＴＡ−２は、ＦＡＴＡをコードする対立遺伝子２を意味し；ＦＡＴＢ−１は、ＦＡＴＢをコードする対立遺伝子１を意味し；ＦＡＴＢ−２は、ＦＡＴＢをコードする対立遺伝子２を意味する。
【００９７】
それに代えて、又は加えて、これらの株を使用して外因性ＬＰＡＴＴを完全に移植することにより、かかる細胞によって産生される細胞油の劇的に異なるＳＮ−２プロフィールをもたらすことができる。例えば、ＬＰＡＡＴ発現を完全に又はほぼ完全になくし、ＳＮ−２位への脂肪アシル基の転移を触媒するＬＰＡＡＴ遺伝子に置換することができる。或いは、長鎖脂肪アシル基に特異性を有する内因性ＬＰＡＡＴ遺伝子を持つ生物を、中鎖に相対的に高い特異性を有する外因性ＬＰＡＡＴ遺伝子で置換するか、又は短鎖脂肪アシル基に相対的に高い特異性を有する外因性ＬＰＡＡＴ遺伝子で置換することができる。
【００９８】
ある実施形態では、油産生細胞は培養される（例えば、バイオリアクター内で）。細胞は、１種以上の脂肪酸に関して完全に栄養要求性であるか又は部分的に栄養要求性（すなわち、致死性又は合成病（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｃｋｎｅｓｓ））である。細胞数を増やすため、脂肪酸を補給して細胞を培養し、次に細胞に油を蓄積させる（例えば乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％まで）。或いは、細胞が、環境条件に基づき活性を切り替えることのできる調節可能な脂肪酸合成遺伝子を含み、第１の細胞分裂期間における環境条件が脂肪酸の産生に有利であり、且つ第２の油蓄積期間における環境条件が脂肪酸の産生に不利である。誘導性遺伝子の場合、その誘導性遺伝子の調節は、限定なしに環境ｐＨによって（例えば、実施例に記載されるとおりのＡＭＴ３プロモーターを使用することにより）媒介され得る。
【００９９】
これらの補給又は調節方法のいずれかを適用する結果として、最適な細胞増殖に必須の１つ以上の脂肪酸の量が少ない細胞から細胞油が得られ得る。得ることのできる油の具体的な例としては、ステアリン酸、リノール酸及び／又はリノレン酸が低いものが挙げられる。
【０１００】
これらの細胞及び方法は、低多価不飽和油に関連してこの直後の章に例示される。
【０１０１】
同様に、脂肪酸要求株は、ＳＡＤ、ＦＡＤ、ＫＡＳＩＩＩ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＣＳ、ＦＡＥ、ＬＰＣＡＴ．ＰＤＣＴ．ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ又はＡＧＰＡＴ又はＰＡＰをコードするものを含め、他の脂肪酸合成遺伝子において作製することができる。これらの栄養要求株を使用して補足遺伝子を選択し、又はそれらの遺伝子の天然発現を消失させて所望の外来遺伝子に有利になるようにして、油産生細胞により産生される細胞油の脂肪酸プロフィール、位置特異的プロフィール、又はＴＡＧプロフィールを変えることもできる。
【０１０２】
従って、本発明のある実施形態には、油／脂肪の生成方法がある。この方法は、ある脂肪酸が存在することにより細胞数を増加させるための細胞分裂に対して許容的な第１の一連の条件下にある成長期間に組換え油産生細胞を培養する工程と、細胞分裂に対して制限的な、しかしその脂肪酸が欠乏している油の産生に対しては許容的な第２の一連の条件下にある油産生期間に細胞を培養する工程と、細胞から油を抽出する工程とを含み、ここで細胞は、脂肪酸合成酵素の活性を抑制する働きをする突然変異又は外来核酸を有し、その酵素は場合によりステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ、又はケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、ＦＡＤ、ＫＡＳＩＩＩ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＣＳ、ＦＡＥ、ＬＰＣＡＴ．ＰＤＣＴ．ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ又はＡＧＰＡＴ又はＰＡＰである。細胞により産生される油は、脂肪酸が少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％欠乏していてもよい。細胞は従属栄養培養することができる。細胞は、従属栄養培養又は独立栄養培養される微細藻類細胞であってよく、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の油を産生し得る。
【０１０３】
ＩＶ．飽和脂肪３％未満の細胞油
本発明のある実施形態において、本細胞によって産生される細胞油は総飽和脂肪酸が３％未満である。この細胞油は、位置特異的若しくは立体特異的油、又は一不飽和脂肪酸の含有量が高い油（以下に記載する）を含め、室温で液体又は固体、又は液体及び固体の油のブレンドであり得る。
【０１０４】
例えば、ＯＳＩ（酸化安定性指数）試験を１１０℃〜１４０℃の温度で実行することができる。油は、１つ以上の脂肪酸デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作された細胞（例えば、上記又は本明細書の他の部分で言及しているプラスチド微生物細胞のいずれか）を培養することにより生成される。例えば、細胞は、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２）への変換に関与する１つ以上の脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼ及び／又はリノール酸（１８：２）からリノレン酸（１８：３）への変換に関与する１つ以上の脂肪酸アシルΔ１５デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作されてもよい。コード領域又は調節領域にあるデサチュラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の対立遺伝子のノックアウト又は突然変異、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス、及びヘアピンＲＮＡ技術を含めた、ＲＮＡ転写、又は酵素の翻訳の阻害を含め、様々な方法を使用してデサチュラーゼを阻害することができる。阻害タンパク質又はデサチュラーゼに特異的な他の物質を産生する外来遺伝子の導入を含め、当該技術分野において公知の他の技法もまた用いることができる。具体的な例では、一方の脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼ対立遺伝子のノックアウトが第２の対立遺伝子のＲＮＡレベルの阻害と組み合わされる。実施例９は、ＦＡＤ遺伝子がノックアウトされた油産生微細藻類細胞によって産生される総飽和脂肪酸が３％未満の油について記載している。
【０１０５】
別の具体的な実施形態においては、ＰＡＮＡ及びパルミチン酸アスコルビルなどの抗酸化剤と組み合わされた油がある。トリグリセリド油及びこれらの抗酸化剤の組み合わせには、安定した生分解性潤滑油（例えば、ジェットエンジン潤滑油）の製造を含めた一般的な適用性があり得る。油の酸化安定性は、定義された温度におけるＡＯＣＳ  Ｃｄ  １２ｂ−９２標準試験を用いたランシマット法を含め、周知の技法によって決定することができる。例えば、ＯＳＩ（酸化安定指数）を、ある温度範囲、好ましくは１１０℃〜１４０℃で決定することができる。
【０１０６】
本発明の油で使用するのに好適な抗酸化剤としては、アルファ、デルタ、及びガンマトコフェロール（ビタミンＥ）、トコトリエノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、グルタチオン、リポ酸、尿酸、β−カロチン、リコペン、ルテイン、レチノール（ビタミンＡ）、ユビキノール（補酵素Ｑ）、メラトニン、レスベラトロール、フラボノイド、ローズマリー抽出物、没食子酸プロピル（ＰＧ）、第三ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、及びブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、Ｎ，Ｎ’−ジ−２−ブチル−１，４−フェニレンジアミン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、及びフェニル−α−ナフチルアミン（ＰＡＮＡ）が挙げられる。
【０１０７】
デサチュラーゼの改変に加え、関連する実施形態では、全体を通して記載するとおり、鎖長特異性が変化したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入又は置換及び／又はＫＡＳ、ＳＡＤ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ、ＫＡＳＩＩＩ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＣＳ、ＦＡＥ、ＬＰＣＡＴ．ＰＤＣＴ．ＤＡＧ−ＣＰＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ又はＡＧＰＡＴ又はＰＡＰ遺伝子をコードする内在性又は外来性遺伝子の過剰発現を含め、油の特性をさらに調整するため他の遺伝子改変が作製され得る。例えば、高いオレイン酸レベルを生じる株が、低レベルの多価不飽和物も生じ得る。かかる遺伝子改変には、外来性ＳＡＤ遺伝子の導入によってステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）の活性を増加させること、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の導入によってエロンガーゼ活性を増加させること、及び／又はＦＡＴＡ遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることが含まれ得る。実施例９を参照のこと。
【０１０８】
特定の実施形態では、低多価不飽和物の高オレイン酸細胞油が生成され得る。例えば、この油は、６０、７０、８０、９０、又は９５％超のオレイン酸及び５、４、３、２、又は１％未満の多価不飽和物を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する実施形態では、３％以下の多価不飽和脂肪酸であって６０％超のオレイン酸、２％未満の多価不飽和脂肪酸且つ７０％超のオレイン酸、１％未満の多価不飽和脂肪酸且つ８０％超のオレイン酸、又は０．５％未満の多価不飽和脂肪酸且つ９０％超のオレイン酸を有する油を産生するため、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性及び場合により脂肪酸Δ１５デサチュラーゼを低下させる働きをする組換え核酸を有する細胞により細胞油が生成される。オレイン酸を増加させる一つの方法は、ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を低下させるとともに、場合によりＫＡＳ  ＩＩ遺伝子を過剰発現させる働きをする組換え核酸を使用することであることが分かっている；かかる細胞は、７５％以上のオレイン酸を含む油を産生することができる。或いは、ＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンなしにＫＡＳＩＩの過剰発現を用いることができる。オレイン酸レベルは、上記の方法を用いてデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ活性を低下させ、それにより不飽和のリノール酸及びリノレン酸に変換されるオレイン酸の量を減少させることにより、さらに増加させることができる。従って、産生される油は、少なくとも７５％のオレイン酸及び高々３％、２％、１％、又は０．５％のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する例では、油は、８０〜９５％のオレイン酸及び約０．００１〜２％のリノール酸、０．０１〜２％のリノール酸、又は０．１〜２％のリノール酸を有する。別の関連する実施形態では、油は、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸、１％以下の多価不飽和脂肪酸、及び７％未満の飽和脂肪酸を有する細胞油が微生物によって産生されるように油産生細胞（例えば、微細藻）を培養することにより産生される。かかる油が、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトに加えて外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を有する微細藻で産生される。かかる油は低い凝固点を有して安定性に優れ、食品において、フライ用、燃料用に、又は化学的応用において有用である。更に、これらの油は、時間の経過に伴う変色を起こしにくい傾向を呈し得る。
【０１０９】
Ｖ．外来性アシルトランスフェラーゼを含む細胞
本発明の様々な実施形態において、細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変化させるため、アシルトランスフェラーゼ（脂肪酸とグリセロール又はグリセロール誘導体との縮合によるアシルグリセリドの形成に関与する酵素）をコードする１つ以上の遺伝子を油産生細胞（例えば、プラスチド微細藻類細胞）に導入することができる。この遺伝子は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）としても知られるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、又はアシル基をＤＡＧのｓｎ−３位に転移させて、それによりＴＡＧを産生するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の１つ以上をコードし得る。
【０１１０】
組換え核酸は細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。或いは、遺伝子は、上記のものとは別個の脂肪酸アシル−ＣｏＡ非依存経路でＴＡＧ前駆体分子を生成する脂質経路の酵素をコードする。アシル−ＡＣＰは、プラスチドＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素及び／又はミトコンドリアＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素の基質であり得る。ＴＡＧを産生するため（例えば膜リン脂質から）アシル基を取り入れる能力を有するさらなる酵素の中には、リン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）がある。さらに別のアシルトランスフェラーゼが、リゾホスホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、リゾホスホスファチジルセリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＳＡＴ）、リゾホスホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＥＡＴ）、及びリゾホスホスファチジルイノシトール（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＩＡＴ）を含め、トリグリセリド組成に影響を及ぼし得るリン脂質合成及びリモデリングに関与する。
【０１１１】
外来遺伝子は、特定の炭素原子数及び／又は特定の飽和度を含むアシル基質の転移に選択的な特異性を有するアシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができ、これが、所与の位置特異的トリグリセリドが高濃度化された油の産生のため、油産生細胞に導入される。例えば、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼは、他のアシル−ＣｏＡ基質よりＣ１２：０−ＣｏＡ基質に選択性を示すことが実証されており（Ｋｎｕｔｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２０，１９９９，ｐｐ  ７３９−７４６）、一方、成熟ベニバナ種子の１−アシル−ｓｎ−３−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、ステアロイル−ＣｏＡを含め、他のアシル−ＣｏＡ基質よりリノレオイル−ＣｏＡ及びオレオイル−ＣｏＡ基質に選択性を示す（Ｉｃｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１６７，１９８９，ｐｐ．３３９−３４７）。さらに、アシルトランスフェラーゼタンパク質が、１つ以上の短鎖、中鎖、又は長鎖アシル−ＣｏＡ又はアシル−ＡＣＰ基質に対する選択的特異性を示し得るが、この選択性は、リゾホスファチジン酸ドナー基質のｓｎ−１位又はｓｎ−３位に特定のアシル基、例えば中鎖アシル基が存在する場合にのみ起こり得る。外来遺伝子がある結果として、細胞により、ＴＡＧ分子の２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、又は９０％超で特定の脂肪酸がｓｎ−２位に見られるＴＡＧ油が生成され得る。
【０１１２】
本発明の一部の実施形態では、細胞は、飽和−不飽和−飽和（ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ）ＴＡＧリッチな油を作り出す。ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ  ＴＡＧとしては、１，３−ジヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−パルミトイルと称される）、１，３−ジオクタデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−ステアロイル−２−オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）、及び１−ヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−オクタデカノイ（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｙ）−グリセロール（１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）が挙げられる。これらの分子はより一般的には、それぞれ、ＰＯＰ、ＳＯＳ、及びＰＯＳと称され、ここで「Ｐ」はパルミチン酸を表し、「Ｓ」はステアリン酸を表し、及び「Ｏ」はオレイン酸を表す。飽和−不飽和−飽和ＴＡＧのさらなる例としては、ＭＯＭ、ＬＯＬ、ＭＯＬ、ＣＯＣ及びＣＯＬが挙げられ、ここで「Ｍ」はミリスチン酸を表し、「Ｌ」はラウリン酸を表し、及び「Ｃ」はカプリン酸（Ｃ８：０）を表す。３つの飽和脂肪酸アシル基を含むトリグリセリドであるトリ飽和物（ｔｒｉｓａｔｕｒａｔｅ）は、一般に、他の種類のトリグリセリドより高いその結晶化率のため、食品用途での使用が求められる。トリ飽和物の例としては、ＰＰＭ、ＰＰＰ、ＬＬＬ、ＳＳＳ、ＣＣＣ、ＰＰＳ、ＰＰＬ、ＰＰＭ、ＬＬＰ、及びＬＬＳが挙げられる。加えて、ＴＡＧにおける脂肪酸の位置特異的分布は、消化及び吸収中の食事性脂肪の代謝運命の重要な決定要因である。
【０１１３】
一部の実施形態において、アシルトランスフェラーゼ、例えばＬＰＡＡＴの発現によりＴＡＧのＣ１８：１含有量が低下し、及び／又はＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。実施例１０は、Ｃ１８：１の有意な低下及びＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の有意な増加を示す微細藻類におけるＬＰＡＡＴの発現について開示している。細胞油中に存在するＣ１８：１の低下量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、又は９５％未満だけ低下し得る。
【０１１４】
一部の実施形態において、アシルトランスフェラーゼ、例えばＬＰＡＡＴの発現によりＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。細胞油中に存在するＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の増加量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、１００％超、１００〜５００％超、又は５００％超だけ増加し得る。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態によれば、油産生細胞は組換え核酸によって形質転換され、それにより特定の位置特異的トリグリセリド、例えば１−アシル−２−オレイル−グリセロ−３−アシル、又は１−アシル−２−ラウリン酸−グリセロ−３−アシル（ここでは組換え核酸の導入の結果として、それぞれオレイン酸又はラウリン酸がｓｎ−２位にある）をより多量に含む細胞油が生産される。或いは、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸がｓｎ−２位にあってもよい。細胞油中に存在する特定の位置特異的トリグリセリドの量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００〜５００％超、又は５００％超増加し得る。結果として、細胞トリグリセリドのｓｎ−２プロフィールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超の特定の脂肪酸を有し得る。
【０１１６】
グリセロ脂質において個別の立体特異的又は位置特異的な位置にあるアシル鎖の同一性を、当該技術分野において公知の（Ｌｕｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４１，６９３−６９６（１９６４）、Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，６，１０−１５（１９６５）、Ａｎｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｒｙｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７６：４，（１９９９）、Ｂｕｃｈｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０６，６２１−６４８（２００４）を参照のこと）、又は、以下に提供する実施例１における１つ以上の分析法により評価することができる。
【０１１７】
トリグリセリド分子における脂肪酸の位置分布は、アシルトランスフェラーゼの基質特異性、並びに利用可能なアシル部分基質プールの濃度及び種類により影響を受け得る。組換え微生物で産生されるトリグリセリドの位置特異性を変化させるのに好適な酵素の非限定的な例を表４〜７に掲載する。当業者は、さらに好適なタンパク質を同定し得る。
【０１１８】
【表４】
2018512851.tif 000006
【０１１９】
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表５に掲載するものが挙げられる。
【０１２０】
【表５】
2018512851.tif 000007
【０１２１】
本発明の微生物及び方法での使用に好適なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表６に掲載するものが挙げられる。
【０１２２】
【表６】
2018512851.tif 000008
【０１２３】
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表７に掲載するものが挙げられる。
【０１２４】
【表７】
2018512851.tif 000009
【０１２５】
本発明のある実施形態では、既知又は新規のＬＰＡＡＴ遺伝子を油産生細胞に形質転換することにより、それらの細胞によって産生されるトリグリセリドの脂肪酸プロフィールを、トリグリセリドのｓｎ−２プロフィールの改変によるか又はトリグリセリドのＣ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量の増加によるか、又はトリグリセリドのＣ１８：１含有量の低下によって改変する。例えば、油産生細胞における外因性活性ＬＰＡＡＴの発現のおかげで、ｓｎ−２位における不飽和脂肪酸のパーセントが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又はそれ以上増加する。例えば、細胞は、ｓｎ−２位に３０％の不飽和物（これは主に１８：１及び１８：２及び１８：３脂肪酸であり得る）を含むトリグリセリドを産生し得る。別の実施形態では、活性ＬＰＰＡＴが発現することにより、Ｃ１８：１の産生が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％低下する。別の実施形態では、活性ＬＰＰＡＴが発現することにより、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の産生が、個々に、或いはまとめて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、又は５００％超増加する。或いは、外因性ＬＰＡＡＴを使用すると、ｓｎ−２位におけるＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０又はＣ１６：０部分などの飽和中鎖を含めた中鎖脂肪酸を増加させることができる。結果として、脂肪酸プロフィール全体における中鎖レベルが増加し得る。ＬＰＡＡＴの種類によって異なるアシル基鎖長又は飽和レベルへのｓｎ−２及び脂肪酸プロフィールのシフトが生じ得る点で、ＬＰＡＡＴ遺伝子の選択は重要である。
【０１２６】
本発明の具体的な実施形態は、核酸構築物、核酸構築物を含む細胞、トリグリセリドを生成するための細胞の培養方法、及び生成されるトリグリセリド油であり、ここで核酸構築物は、新規ＬＰＡＡＴコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを有する。このコード配列は、上流に開始コドン及び下流に終止コドンと、続く３  ＵＴＲ配列を有し得る。具体的な実施形態において、ＬＰＡＡＴ遺伝子はＬＰＡＡＴ活性を有し、コード配列は、配列番号２９〜３４のｃＤＮＡのいずれかと少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を含めたその機能断片を有する。イントロンも同様に配列に挿入され得る。微細藻類及び他の油産生細胞に加えて、導入遺伝子として新規ＬＰＡＡＴを発現する植物が、これらの実施形態に明示的に包含され、公知の遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
【０１２７】
ＶＩ．外因性エロンガーゼ又はエロンガーゼ複合体酵素を含む細胞
本発明の様々な実施形態において、エロンガーゼ又は脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長複合体の成分をコードする１つ以上の遺伝子を油産生細胞（例えばプラスチド微細藻類細胞）に導入することにより、細胞又は細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変えることができる。遺伝子は、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（エロンガーゼ、３−ケトアシルシンターゼ、β−ケトアシルシンターゼ又はＫＣＳとも称される）、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、又はエロンガーゼをコードし得る。これらの遺伝子によりコードされる酵素は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって遊離するアシル−ｃｏＡ分子の伸長に活性を有する。組換え核酸が細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞などの従属栄養細胞を含めた、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａの細胞である。
【０１２８】
本発明の微生物及び方法での使用に好適なβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ及びエロンガーゼ酵素としては、限定なしに、表８及び配列表に掲載するものが挙げられる。
【０１２９】
【表８】
2018512851.tif 000010
【０１３０】
本発明のある実施形態では、特定の炭素原子数及び／又は特定のアシル鎖飽和度を含むアシル基質の伸長に選択的特異性を有するβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ又はエロンガーゼ酵素をコードする外来遺伝子が油産生細胞に導入され、それにより特定の鎖長及び／又は飽和の脂肪酸が高濃度化された細胞又は油が生成される。実施例１０及び１５はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の操作について記載し、ここでは長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡの延長に選択性を有する外因性脂肪酸エロンガーゼを過剰発現させることによりＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、及びＣ２２：１の濃度を増加させた。
【０１３１】
特定の実施形態において、油産生細胞は、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０％超のリノール酸、リノレン酸、エルカ酸及び／又はエイコセン酸を含む油を産生する。或いは、細胞は、０．５〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％のリノール酸、リノレン酸、エルカ酸又はエイコセン酸を含む油を産生する。細胞は、オレオイル−ＣｏＡの伸長に活性を有する外因性β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをさらに導入することで、高オレイン酸油に関連して上記に記載する組換え酸を含み得る。外因性β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが発現する結果として、細胞によるエルカ酸又はエイコセン酸の天然産生が２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、１００、１３０、１７０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００倍超増加し得る。高エルカ酸及び／又はエイコセン酸油はまた、高い安定性の油；例えば、５、４、３、２、又は１％未満の多価不飽和物を含み及び／又は第ＩＶ節又は本願及び添付の実施例に記載されるＯＳＩ値を有するものであり得る。特定の実施形態において、細胞は微細藻類細胞であり、場合により従属栄養培養される。他の実施形態にあるとおり、油／脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養微細藻類を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成することができる。好ましくは、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であってもよい。
【０１３２】
具体的な実施形態において、油産生微生物細胞、任意選択で油産生微細藻類細胞、任意選択でＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科のものは、表８の酵素と８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する酵素を発現する。
【０１３３】
ＶＩＩ．位置特異的及び立体特異的油／脂肪
ある実施形態では、組換え細胞は、所与の位置特異的組成を有する細胞脂肪又は油を産生する。結果として、細胞は、所与の多形形態の結晶を（例えば、融解温度を上回るまで加熱し、次に脂肪の融解温度未満に冷却するとき）形成する傾向を有するトリグリセリド脂肪を産生することができる。例えば、脂肪は、テンパリングするかしないかに関わらず、β型又はβ’型の結晶多形（例えばＸ線回折解析によって決定するとき）を形成する傾向を有し得る。脂肪は規則性脂肪であってもよい。特定の実施形態において、脂肪は、冷却するとβ結晶或いはβ’結晶を直接形成し得る；或いは、脂肪はβ型を経てβ’型へと進み得る。かかる脂肪は、食品用途での構造化ラミネート用又はコーティング用脂肪として使用することができる。この細胞脂肪は、キャンディー、ダーク又はホワイトチョコレート、チョコレート風味の糖菓、アイスクリーム、マーガリン又は他のスプレッド、クリームの詰め物、ペストリー、又は他の食品に添合することができる。場合により、脂肪は（室温で）半固体であってもよいが、しかし人工的に作られたトランス脂肪酸は含まない。かかる脂肪はまた、スキンケア及び他の消費者製品又は工業製品においても有用であり得る。
【０１３４】
他の実施形態にあるとおり、脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養真核微細藻類を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成され得る。好ましくは、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であってもよい。脂肪はまた、独立栄養性の藻類又は植物においても産生され得る。場合により、細胞は、油を産生するためにショ糖を利用する能力を有し、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、及びＰＣＴ／ＵＳ１２／２３６９６号明細書に記載されるとおり、ショ糖を代謝させるため組換えインベルターゼ遺伝子が導入され得る。ここで言及する全ての遺伝子と同じく、インベルターゼはコドン最適化され、細胞の染色体に組み込まれてもよい。培養された組換え微細藻類は、ハードストック脂肪の融点未満の温度でハードストック脂肪を産生し得ることが分かっている。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、１５〜３０℃の範囲の温度で５０％超のステアリン酸を有するトリグリセリド油を従属栄養的に産生するように変化させることができ、ここでこの油は、３０℃に保たれると凝固する。
【０１３５】
ある実施形態では、細胞脂肪は、全体的な構造［飽和脂肪酸（ｓｎ−１）−不飽和脂肪酸（ｓｎ−２）−飽和脂肪酸（ｓｎ−３）］の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の脂肪を有する。これは以下にＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪として示される。特定の実施形態において、この構造中の飽和脂肪酸は、好ましくはステアリン酸又はパルミチン酸であり、不飽和脂肪酸は好ましくはオレイン酸である。結果として、脂肪は主にβ又はβ’多形結晶、又はそれらの混合物を形成し、対応する物理的特性を、食品又はパーソナルケア製品での使用に望ましいものを含めて有し得る。例えば、脂肪は、食品用には口腔体温で溶解し、又はクリーム、ローション又は他のパーソナルケア製品用には皮膚温度で（例えば、３０〜４０、又は３２〜３５℃の融解温度）溶解し得る。場合により、脂肪は、２Ｌ又は３Ｌラメラ構造を（例えば、Ｘ線回折解析によって決定するとき）有し得る。場合により、脂肪はテンパリングなしにこの多形形態を形成し得る。
【０１３６】
特定の関連する実施形態において、細胞脂肪トリグリセリドは高濃度のＳＯＳを有する（すなわち、グリセロール骨格の末端ｓｎ−１位及びｓｎ−３位にステアリン酸を含み、ｓｎ−２位にオレイン酸を含むトリグリセリド）。例えば、脂肪は、少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％のＳＯＳを含むトリグリセリドを有し得る。ある実施形態では、脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳのトリグリセリドを有する。場合により、ｓｎ−２結合脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％が不飽和脂肪酸である。特定の実施形態では、ｓｎ−２結合脂肪酸の少なくとも９５％が不飽和脂肪酸である。加えて、ＳＳＳ（トリステアリン酸）レベルは２０、１０又は５％未満であってもよく、及び／又はＣ２０：０脂肪酸（アラキジン酸）レベルは６％未満であってもよく、場合により１％超（例えば、１〜５％）であってもよい。例えば、特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも７０％のＳＯＳトリグリセリドを有し、少なくとも８０％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分である。別の特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳトリグリセリドを含み、且つ少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であるＴＡＧを有する。さらに別の特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳを含み、少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であり、且つ１〜６％がＣ２０脂肪酸であるＴＡＧを有する。
【０１３７】
さらに別の特定の実施形態において、細胞脂肪の脂肪酸プロフィールにおけるステアリン酸塩とパルミチン酸塩との合計割合は、オレイン酸塩の割合の２倍±１０、２０、３０又は４０％である［例えば、（％Ｐ＋％Ｓ）／％Ｏ＝２．０±２０％］。場合により、この脂肪のｓｎ−２プロフィールは、少なくとも４０％、及び好ましくは少なくとも５０、６０、７０、又は８０％オレイン酸である（ｓｎ−２位で）。また場合により、この脂肪は少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％ＳＯＳであってよい。場合により、脂肪は１〜６％のＣ２０脂肪酸を含む。
【０１３８】
これらの実施形態のいずれにおいても、高ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪は、β’多形結晶を形成する傾向を有し得る。ココアバターのようなこれまでに利用可能な植物脂肪とは異なり、この細胞によって産生されるＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪はテンパリングなしにβ’多形結晶を形成し得る。ある実施形態では、融解温度を上回るまで加熱して、融解温度未満に３、２、１、又は０．５時間冷却すると、多形が形成される。関連する実施形態において、６０℃を上回るまで加熱して、１０℃に３、２、１、又は０．５時間冷却すると、多形が形成される。
【０１３９】
様々な実施形態において、脂肪は、融解温度を上回って加熱して融解温度未満に冷却したときβ型、β’型、又は両方の多形を形成し、場合により融解温度を上回るまで加熱して、次に１０℃で冷却したとき、５、４、３、２、１、０．５時間以内又はそれ未満で少なくとも５０％の多形平衡まで進む。脂肪はココアバターより速い速度でβ’結晶を形成し得る。
【０１４０】
場合により、任意のこれらの脂肪が、２モル％未満のジアシルグリセロール、又は２モル％未満のモノアシルグリセロールとジアシルグリセロールとの合計を有し得る。
【０１４１】
ある実施形態では、脂肪は３０〜６０℃、３０〜４０℃、３２〜３７℃、４０〜６０℃又は４５〜５５℃の融解温度を有し得る。別の実施形態において、脂肪は２０℃で４０〜５０％、１５〜２５％、又は１５％未満の固形脂肪含有量（ＳＦＣ）を有し、及び／又は３５℃で１５％未満のＳＦＣを有し得る。
【０１４２】
脂肪を作るために使用される細胞は、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪の形成に有利となるように、細胞トリグリセリドにおける脂肪酸の飽和対不飽和比を改変する働きをする組換え核酸を含み得る。例えば、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子のノックアウト又はノックダウンを用いて、オレイン酸よりステアリン酸の形成に有利となるようにすることができ、又は外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現により、中鎖飽和レベルを増加させることができる。或いは、ＳＡＤ酵素をコードする遺伝子を過剰発現させて不飽和物を増加させることができる。
【０１４３】
特定の実施形態において、細胞は、細胞のステアリン酸レベルを上昇させる働きをする組換え核酸を有する。結果として、ＳＯＳの濃度が増加し得る。ステアリン酸レベルを増加させる別の遺伝子修飾としては、細胞におけるケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）活性を増加させることによりステアリン酸産生率を増加させることが挙げられる。細胞中のステアリン酸（ｓｔｅｒａｔｅ）レベルを増加させる方法については、国際公開第２０１２／１１０６５６０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレット、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５９１６１号明細書に記載されている。
【０１４４】
本発明の細胞油は、ステロールプロフィールが従来の供給源と区別可能なものとして宿主生物の指標となる点で従来の植物性又は動物性トリアシルグリセロール供給源と区別することができる。従来の油供給源としては、大豆、トウモロコシ、ヒマワリ、ベニバナ、ヤシ、パーム核、ココナツ、綿実、キャノーラ、菜種、ピーナッツ、オリーブ、亜麻、獣脂、豚脂、ココア、シア、マンゴー、サラノキ、イリッペ、コクム、及びアランブラキアが挙げられる。微細藻類ステロール類の考察については、本開示の第ＸＩＩＩ節を参照のこと。
【０１４５】
ＶＩＩＩ．ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＰＣＴ及び／又はＦＡＥをコードする組換え核酸を発現する細胞並びにＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１及びＣ２２：１を高濃度化した油
リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のアシル編集において中心的な役割を果たす。ＬＰＣＡＴ酵素は順方向反応及び可逆反応の両方のモードで働く。順方向モードでは、ＬＰＣＡＴ酵素は（両方の利用可能なｓｎ位における）ＰＣへの脂肪酸のチャネリングに関与する。逆方向反応モードでは、ＬＰＣＡＴ酵素は脂肪酸をＰＣからアシルＣｏＡプールに転移させる。遊離した脂肪酸は、次にＴＡＧの形成に取り込まれ、又は更に不飽和化若しくは伸長され得る。遊離オレイン酸の場合、それはＴＡＧの形成に取り込まれることができ、又は更に処理されてリノール酸、リノレン酸になるか、又は更に伸長されてＣ２０：１、Ｃ２２：１又はより高級な不飽和脂肪酸になることができ、次にはこれが取り込まれてＴＡＧを形成し得る。
【０１４６】
ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）及びジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）（ＤＡＧ−ＣＰＴ）は、ＰＣからのリノール酸又はリノレン酸の除去を触媒する。次に遊離した脂肪酸はＴＡＧの形成に取り込まれるか、又は更に伸長されてＣ２０：１又はＣ２２：１又はより高級な不飽和脂肪酸になることができ、次にはこれが取り込まれてＴＡＧを形成し得る。
【０１４７】
本発明の様々な実施形態において、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ及び／又はＦＡＥをコードする１つ以上の核酸を油産生細胞（例えば、プラスチド微細藻類細胞）に導入することにより、細胞又は細胞によって産生される細胞油の脂肪酸組成を改変し得る。組換え核酸は細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれ得る。具体的な実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものなどの従属栄養細胞を含めた緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）の細胞である。
【０１４８】
一部の実施形態において、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及び／又はＦＡＥの発現によりＴＡＧのＣ１８：１含有量が低下し、及び／又はＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。実施例１１、１２及び１６は、Ｃ１８：１の有意な低下及びＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の有意な増加を示す微細藻類におけるＬＰＣＡＴの発現を開示する。実施例１３及び１４は、Ｃ１８：１の有意な低下及びＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の有意な増加を示す微細藻類におけるＰＤＣＴの発現を開示する。実施例１５は、Ｃ１８：１の有意な低下及びＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の有意な増加を示す微細藻類におけるＤＡＧ−ＣＰＴの発現を開示する。細胞油中に存在するＣ１８：１の低下量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、又は９５％未満だけ低下し得る。
【０１４９】
一部の実施形態において、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及び／又はＦＡＥの発現によりＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。細胞油中に存在するＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の増加量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、１００％超、１００〜５００％超、又は５００％超だけ増加し得る。
【０１５０】
ＩＸ．内因性遺伝子のアブレーション及びＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＰＣＴ及び／又はＦＡＥをコードする組換え核酸を有する細胞並びにＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１及びＣ２２：１を高濃度化した油
本発明の一実施形態は、内因性遺伝子の１つ、２つ又は全ての対立遺伝子がアブレーション（ノックアウト）されていて、且つＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＰＣＴ、及び／又はＦＡＥをコードする１つ以上の組換え核酸が発現する組換え細胞である。任意選択で、アブレーションする遺伝子は脂質生合成経路遺伝子である。或いは、対立遺伝子の遺伝子産物の量又は活性が、例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス、及びヘアピンＲＮＡ技術を含めた阻害性ＲＮＡ技術によって、脂肪酸の補充が必要となるようにノックダウンされる。脂質経路遺伝子の１つの対立遺伝子がノックアウトされる場合、対応する酵素活性の低下が観察される。脂質経路遺伝子の全ての対立遺伝子がノックアウトされるか、又は十分に阻害される場合、栄養要求体が作り出される。本明細書で考察するとおり、遺伝子の対立遺伝子の１つ以上と相同なドナー配列を有する構築物を生成することができる。この第１の形質転換構築物が導入され、続く選択方法により、１つ以上の対立遺伝子破壊によって特徴付けられる単離株が得られ得る。或いは、第１の対立遺伝子への挿入から選択可能なマーカーを発現するように操作された第１の株が作成され、それにより第１の対立遺伝子が不活性化されてもよい。この株は、脂質経路遺伝子の残りの対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンするためなおも更なる遺伝子操作用の宿主として使用し得る（例えば、第２の選択可能なマーカーを使用して第２の対立遺伝子を破壊する）。
【０１５１】
一部の実施形態において、アブレーションする対立遺伝子はまた、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＰＣＴ及び／又はＦＡＥをコードする核酸を挿入するための遺伝子座である。一実施形態において、ノックアウトする対立遺伝子は、ＬＰＡＡＴをコードする遺伝子である。実施例１０では、ＬＰＡＡＴ１−１と称されるＬＰＡＡＴ１の１つの対立遺伝子をアブレーションし、これがＬＰＡＡＴをコードする核酸を挿入するための遺伝子座として働いた。また実施例１０では、６Ｓ部位も、ＦＡＥをコードする核酸を挿入するための遺伝子座として働いた。実施例１１では、ＬＰＡＡＴ１−１と称されるＬＰＡＡＴ１の１つの対立遺伝子をアブレーションし、これがＬＰＣＡＴをコードする核酸を挿入するための遺伝子座として働いた。実施例１１はまた、ＦＡＥをコードする核酸を挿入するための遺伝子座として働いたＬＰＡＡＴ１−１のアブレーションも開示している。実施例１３では、ＬＰＡＡＴ１−１（対立遺伝子１）、又はＬＰＡＡＴ１−２（対立遺伝子２）が、ＰＤＣＴをコードする核酸を挿入するための遺伝子座として働いた。実施例１３はまた、６Ｓ部位へのＦＡＥの挿入も開示している。実施例１４では、ＬＰＡＡＴ１−１が、ＰＤＣＴを挿入するための遺伝子座であった。実施例１５では、ＬＰＡＡＴ１−１又はＬＰＡＡＴ２−２が、ＤＡＧ−ＰＣＴを挿入するための遺伝子座であった。実施例１５はまた、６Ｓ部位へのＦＡＥの挿入も開示している。実施例１６では、ＬＰＡＡＴ１−１が、ＬＰＣＡＴを挿入するための遺伝子座であった。実施例１６はまた、６Ｓ部位へのＦＡＥの挿入も開示している。
【０１５２】
一部の実施形態において、脂質生合成経路遺伝子、任意選択でＬＰＡＡＴのアブレーション、及びＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及び／又はＦＡＥの発現により、ＴＡＧのＣ１８：１含有量が低下し、及び／又はＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。細胞油中に存在するＣ１８：１の低下量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、又は９５％未満だけ低下し得る。
【０１５３】
一部の実施形態において、脂質生合成経路遺伝子、任意選択でＬＰＡＡＴのアブレーション、ＬＰＣＡＴ、ＰＤＣＴ、ＤＡＧ−ＣＰＴ、及び／又はＦＡＥの発現により、ＴＡＧのＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１含有量が増加する。細胞油中に存在するＣ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、又はＣ２２：１の増加量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、１００％超、１００〜５００％超、又は５００％超だけ増加し得る。
【０１５４】
Ｘ．低飽和物油
ある実施形態では、細胞油は組換え細胞から産生される。産生される油は、４％、３％、２％、又は１％（面積％）未満の飽和脂肪酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。特定の実施形態において、油は０．１〜５％、０．１〜４％、０．１〜３．５％の飽和脂肪酸を有する。特定のかかる油を使用して、飽和脂肪酸の量が無視し得る程度である食品を製造することができる。場合により、これらの油は、少なくとも９０％のオレイン酸又は少なくとも９０％のオレイン酸と少なくとも３％の多価不飽和脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。ある実施形態では、組換え細胞によって産生される細胞油は少なくとも９０％のオレイン酸、少なくとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計、又は少なくとも２％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ４％未満、又は３．５％未満の飽和脂肪酸を有する。関連する実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞油は少なくとも９０％のオレイン酸、少なくとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ４％未満、又は３．５％未満の飽和脂肪酸を有し、飽和脂肪酸の大部分は鎖長１０〜１６が占める。関連する実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞油は少なくとも９０％のオレイン酸、少なくとも２％又は３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、３．５％未満の飽和脂肪酸を有し、且つ少なくとも０．５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％のパルミチン酸を含む。これらの油は、限定はされないが、本明細書及び米国特許出願第１３／３６５，２５３号明細書に記載されるものを含め、組換え油産生細胞によって産生され得る。例えば、高活性ＳＡＤを含む細胞におけるＫＡＳＩＩ酵素の過剰発現は、飽和物が３．７５％、３．６％、又は３．５％以下の高オレイン酸油を産生し得る。場合により、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び／又はノックアウト若しくは抑制されたＣ１８未満のアシル鎖を加水分解する傾向を有する内因性チオエステラーゼもまた過剰発現される。オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、産生される油の脂肪酸プロフィールにおけるパルミチン酸とステアリン酸との合計に対するオレイン酸の比が３、５、７、又は１０より大きくなるように、ＡＣＰ−パルミチン酸及びＡＣＰ−ステアリン酸に対する活性が低い導入遺伝子であってもよい。或いは、又はそれに加えて、ＦＡＴＡ遺伝子がノックアウト又はノックダウンされてもよい。ＦＡＴＡ遺伝子をノックアウト又はノックダウンし、且つ外来性ＫＡＳＩＩを過剰発現させてもよい。別の任意選択の改変は、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩＩ活性を増加させることであり、これは、より短鎖の飽和物の形成をさらに抑制し得る。場合により、置換グリセロールに対する不飽和脂肪酸アシル部分の転移に特異性を有する１つ以上のアシルトランスフェラーゼ（例えばＬＰＡＡＴ）もまた過剰発現され、及び／又は内因性アシルトランスフェラーゼがノックアウト又は減弱される。さらなる任意選択の改変は、不飽和脂肪酸の伸長に特異性を有するＫＣＳ酵素の活性を増加させることであり、及び／又は飽和脂肪酸の伸長に特異性を有する内因性ＫＣＳがノックアウト又は減弱される。場合により、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのノックアウト又はノックダウンにより、リノール酸産生を犠牲にしてオレイン酸が増加する。任意選択で、使用される外来遺伝子は植物遺伝子；例えば、油糧種子に見られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから得られるものであってもよい。実施例９は、飽和脂肪酸が３．５％未満の細胞油を開示する。
【０１５５】
上記の遺伝子改変に加え、低飽和物油は、多価不飽和脂肪酸が低量であるために高安定性の油であり得る。高安定性、低多価不飽和の油の方法及び特性決定は、内因性Δ１２脂肪酸デサチュラーゼの活性を低下させる方法を含め、本明細書に記載される。特定の実施形態において、油は、ＩＩ型脂肪酸合成経路を有する油産生微生物細胞によって産生され、飽和脂肪酸が３．５％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も３％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂肪酸が３％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も２％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂肪酸が３％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も１％以下である。別の具体的な実施形態において、真核微細藻類細胞は、微細藻類細胞において作動可能な調節エレメントに作動可能に連結した、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子を含む。細胞は、ＦＡＤ遺伝子のノックアウト又はノックダウンをさらに含む。遺伝子改変に起因して、細胞は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）に対するパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の比が０．１を超え、多価不飽和脂肪酸が３％以下である脂肪酸プロフィールを有する細胞油を産生する。任意選択で、パルミトレイン酸はプロフィールの０．５％以上を占める。任意選択で、細胞油は３．５％未満の飽和脂肪酸を含む。
【０１５６】
低コストで目標の飽和脂肪酸レベルに達するように、低飽和及び低飽和／高安定性の油を安価な油とブレンドすることができる。例えば、１％飽和脂肪の油を、７％の飽和脂肪を有する油（例えば高オレイン酸ヒマワリ油）とブレンドして、３．５％以下の飽和脂肪を有する油を提供することができる。
【０１５７】
本発明の実施形態により生成される油は、数ある用途の中でも特に、輸送燃料、油脂化学品、及び／又は食品及び化粧品工業において使用することができる。例えば、脂質のエステル転移反応により、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルが生じ得る。他の酵素的及び化学的プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びアルケンの産生に合わせて調整することができる。用途によっては、再生可能ディーゼル、ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物が生成される。本開示はまた、生産性の増加及び脂質収率の増加のため、及び／又は本明細書に記載される組成物のより費用対効果の高い生産のために微細藻類を培養する方法も提供する。本明細書に記載される方法は、プラスチド細胞培養物からの油の大規模な（例えば、１０００、１０，０００、１００，０００リットル又はそれを超える）生成を可能にする。
【０１５８】
ある実施形態では、細胞から抽出された油は、３．５％、３％、２．５％、又は２％以下の飽和脂肪を有し、食品に添合される。完成した食品は、３．５、３、２．５、又は２％以下の飽和脂肪を有する。例えば、かかる組換え微細藻類から回収される油は、フライ油に、又は飽和脂肪が低い加工食品の一成分として使用することができる。油はニートで使用されてもよく、又は食品が有する飽和脂肪が一食当たり０．５ｇ未満であり、従って（米国の規制に従い）ゼロ飽和脂肪を謳う表示が可能となるように、他の油とブレンドされてもよい。具体的な実施形態において、油は、少なくとも９０％のオレイン酸、３％未満の飽和脂肪、及びリノール酸より多いオレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。
【０１５９】
本特許出願に開示される他の油と同様に、本節に記載される低飽和油は、高レベルのパルミトレイン酸を有するものを含め、本願の第ＸＩＩＩ節に記載されるとおりの微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。例えば、外来性ＰＡＤ遺伝子の発現によって、ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミチン酸に対するパルミトレイン酸の比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付けられる脂肪酸プロフィールと、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールとを有する油を生成することができる。
【０１６０】
ＸＩ．微量油成分
上記の方法により産生される油は、ある場合には、微細藻類宿主細胞を使用して作製される。上記に記載したとおり、微細藻は、限定なしに、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅの分類に含まれる。Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻類は、そのステロールプロフィールに基づき植物油と区別できることが分かっている。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓにより産生される油は、ＧＣ−ＭＳによって検出したとき、ブラシカステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールであるように見えるステロールを産生することが見出された。しかしながら、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａによって産生されるステロールは全て、Ｃ２４β立体化学を有すると考えられる。従って、カンペステロール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールとして検出された分子は、実際には、それぞれ２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール及びクリオナステロールであると考えられる。従って、上記に記載する微細藻類によって産生される油は、Ｃ２４β立体化学を有するステロールの存在と、存在するステロールにおけるＣ２４α立体化学の非存在とにより植物油と区別することができる。例えば、産生される油は２２，２３−ジヒドロブラシカステロールを含有する一方、カンペステロールが欠損していてもよい；クリオナステロールを含有する一方、β−シトステロールが欠損していてもよく、及び／又はポリフェラステロールを含有する一方、スチグマステロールが欠損していてもよい。或いは、又は加えて、油は多量のΔ７−ポリフェラステロールを含有していてもよい。
【０１６１】
一実施形態において、本明細書に提供される油は植物油ではない。植物油は、植物及び植物の種子から抽出された油である。植物油は、本明細書に提供される非植物油と、それらの含油量に基づき区別することができる。含油量を分析するための様々な方法を用いて、油の供給源、又は本明細書に提供される油と異なる（例えば植物）由来の油との不純物混和が起こったかどうかを決定することができる。この決定は、分析法の１つ又は組み合わせに基づき行うことができる。これらの試験としては、限定はされないが、遊離脂肪酸、脂肪酸プロフィール、全トリアシルグリセロール含有量、ジアシルグリセロール含有量、過酸化物価、分光特性（例えば紫外吸収）、ステロールプロフィール、ステロール分解産物、抗酸化剤（例えばトコフェロール）、色素（例えばクロロフィル）、ｄ１３Ｃ値及び官能分析（例えば、味、匂い、及び口当たり）の１つ以上の分析が挙げられる。食用脂肪及び油に関するＣｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ規格など、市販の油用に多くのかかる試験が標準化されている。
【０１６２】
ステロールプロフィール分析は、生物学的有機物源の決定に特によく知られている方法である。カンペステロール、ｂ−シトステロール、及びスチグマステロールが一般的な植物ステロールであり、β−シトステロールは主要な植物ステロールである。例えば、β−シトステロールは、ある種の種子油の分析で最も多い存在量であることが見出されており、トウモロコシ油において約６４％、菜種油において２９％、ヒマワリ油において６４％、綿実油において７４％、大豆油において２６％、及びオリーブ油において７９％であった（Ｇｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：７１−７９，２００６）。
【０１６３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥＸ１４３５から分離した油を個別に清澄化（ＣＬ）、精製及び漂白（ＲＢ）するか、又は精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ）し、ＪＡＯＣＳ  ｖｏｌ．６０，ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ  １９８３に記載される手順に従いステロール含有量について試験した。分析結果を以下の表９に示す（ｍｇ／１００ｇ単位）。
【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
これらの結果は、３つの顕著な特徴を示す。第一に、あらゆるステロールのなかでエルゴステロールが最も豊富であり、全ステロールの約５０％以上を占めることが分かった。エルゴステロールの量は、カンペステロール、β−シトステロール、及びスチグマステロールを合わせた量より多い。エルゴステロールは真菌によく見られ、一般に植物には見られないステロイドであり、その存在、特に多量の存在は、非植物油の有用なマーカーとなる。第二に、この油はブラシカステロールを含有することが分かった。菜種油を除いては、ブラシカステロールは一般に植物系の油には見られない。第三に、２％未満のβ−シトステロールが存在することが分かった。β−シトステロールは、一般に微細藻類には見られない顕著な植物ステロールであり、その存在、特に多量の存在は、植物由来の油の有用なマーカーとなる。要約すれば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥＸ１４３５は、全ステロール含有量に対する割合として多量のエルゴステロールを含有すると共に、β−シトステロールは微量にしか含有しないことが見出された。従って、エルゴステロール：β−シトステロールの比又はブラシカステロールの存在との組み合わせを使用して、この油を植物油と区別することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のβ−シトステロールを含有する。他の実施形態では、油はβ−シトステロールを含まない。本願に開示される任意の油又は細胞油について、油は、上記の表９の任意の列のステロールプロフィールを有することができ、ステロール毎に３０％、２０％、１０％以下のばらつきがある。
【０１６７】
一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、又はスチグマステロールの１つ以上を含まない。一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、及びスチグマステロールを含まない。一部の実施形態では、油はカンペステロールを含まない。一部の実施形態では、油はスチグマステロールを含まない。
【０１６８】
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−エチルコレスタ−５−エン−３−オールを含む。一部の実施形態では、２４−エチルコレスタ−５−エン−３−オールはクリオナステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のクリオナステロールを含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールを含有する。一部の実施形態では、２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールは２２，２３−ジヒドロブラシカステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の２２，２３−ジヒドロブラシカステロールを含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の５，２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールを含有する。一部の実施形態では、５，２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールはポリフェラステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のポリフェラステロールを含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、エルゴステロール又はブラシカステロール又はこれらの２つの組み合わせを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも２５％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも４０％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールとブラシカステロールとの組み合わせを含有する。
【０１７２】
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％又は５％のブラシカステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満のブラシカステロールを含有する。
【０１７３】
一部の実施形態では、エルゴステロールとブラシカステロールとの比は、少なくとも５：１、１０：１、１５：１、又は２０：１である。
【０１７４】
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールと、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のβ−シトステロールとを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも２５％のエルゴステロール及び５％未満のβ−シトステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量はブラシカステロールをさらに含む。
【０１７５】
ステロールは２７〜２９個の炭素原子を含有し（Ｃ２７〜Ｃ２９）、あらゆる真核生物に見られる。動物はＣ２７ステロールをさらに改変してＣ２８及びＣ２９ステロールを生成する能力を有しないため、専らＣ２７ステロールを作る。しかしながら植物にはＣ２８及びＣ２９ステロールを合成する能力があり、Ｃ２８／Ｃ２９植物ステロールは多くの場合にフィトステロールと称される。所与の植物のステロールプロフィールはＣ２９ステロールが高く、植物における主要なステロールは、典型的にはＣ２９ステロールのｂ−シトステロール及びスチグマステロールである。対照的に、非植物生物のステロールプロフィールには、より大きい割合のＣ２７及びＣ２８ステロールが含まれる。例えば真菌類及び多くの微細藻類中のステロールは、主としてＣ２８ステロールである。このステロールプロフィール、特に、植物でＣ２８ステロールと比べてＣ２９ステロールが顕著に優勢であることが、土壌試料中の植物と海洋物との比率を決定する際に利用されている（Ｈｕａｎｇ，Ｗｅｎ−Ｙｅｎ，Ｍｅｉｎｓｃｈｅｉｎ  Ｗ．Ｇ．，“Ｓｔｅｒｏｌｓ  ａｓ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”；Ｇｅｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍｉａ  Ａｃｔａ．Ｖｏｌ  ４３．ｐｐ  ７３９−７４５）。
【０１７６】
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油中の主要ステロールは、ｂ−シトステロール及びスチグマステロール以外のステロールである。微細藻類油の一部の実施形態では、Ｃ２９ステロールは重量基準で総ステロール含有量の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％未満を占める。
【０１７７】
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油は、Ｃ２９ステロールより多いＣ２８ステロールを含有する。微細藻類油の一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールは、重量基準で総ステロール含有量の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％超を占める。一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールはエルゴステロールである。一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールはブラシカステロールである。
【０１７８】
ＸＩＩ．燃料及び化学品
上記で考察した油は、単独で、又は組み合わせで、食品、燃料及び化学品（プラスチック、発泡体、フィルム等を含む）の製造において有用である。油、トリグリセリド、油由来の脂肪酸は、Ｃ−Ｈ活性化、ヒドロアミノメチル化、メトキシ炭酸化（ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎａｔｉｏｎ）、オゾン分解、酵素変換反応、エポキシ化、メチル化、二量化、チオール化、メタセシス、ヒドロアルキル化、ラクトン化、又は他の化学的プロセスに供され得る。
【０１７９】
油はアルカン（例えば、再生可能ディーゼル）又はエステル（例えば、エステル転移反応によって生成されるバイオディーゼル（ｂｉｏｄｉｓｅｓｅｌ）用のメチル又はエチルエステル）に変換することができる。アルカン又はエステルは、燃料として、溶剤又は潤滑剤として、又は化学供給原料として用いられ得る。再生可能ディーゼル及びバイオディーゼルの製造方法は、当該技術分野で十分に確立されている。例えば、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットを参照のこと。
【０１８０】
本発明の特定の実施形態では、上記に記載する高オレイン酸油又は高オレイン酸−高安定性油がエステル化される。例えば、油は、オレイン酸メチルがリッチな油にメタノールをエステル転移反応させ得る。かかる配合は大豆油由来のオレイン酸メチルに遜色がないことが分かった。
【０１８１】
別の特定の例では、油はＣ３６二酸又はＣ３６二酸の生成物に変換される。油から生成される脂肪酸を重合して、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成を提供することができる。特定の例では、高オレイン酸油を分割して高オレイン酸脂肪酸材料が得られ、これを重合させると、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成が得られる。場合により、油は高オレイン酸高安定性油である（例えば、６０％超のオレイン酸で多価不飽和物が３％未満、７０％超のオレイン酸で多価不飽和物が２％未満、又は８０％超のオレイン酸で多価不飽和物が１％未満）。高オレイン酸、高安定性の出発物質を使用すると、生じる環状生成物の量が少なくなると考えられ、これは場合によって望ましいことがある。油の加水分解後、高濃度のオレイン酸が得られる。ダイマー酸の作製過程で、高オレイン酸流は「より清澄な」Ｃ３６ダイマー酸に変換され、トリマー酸（Ｃ５４）及び他のより複雑な環状副産物（これらはＣ１８：２酸及びＣ１８：３酸の存在に起因して得られる）を生じない。例えば、油を脂肪酸に加水分解し、その脂肪酸をモンモリロナイト粘土の存在下２５０℃で精製及び二量化することができる。ＳＲＩ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ，Ｍａｒｃｈ  ２００９を参照のこと。オレイン酸のＣ３６ダイマーリッチな生成物が回収される。
【化１】
2018512851.tif 000012
【０１８２】
さらに、Ｃ３６ダイマー酸は、エステル化及び水素化されることによりジオールを提供し得る。ジオールは、接触脱水により重合させることができる。ポリマーもまた、炭酸ジメチルによるダイマージオールのエステル転移反応により生成することができる。
【０１８３】
本発明の方法における燃料の製造について、本発明の細胞によって産生される脂質は、任意の好都合な手段により回収されるか、又は他の方法で収集される。脂質は全細胞抽出によって単離することができる。細胞が初めに破壊され、次に、遠心の使用によるなどして、細胞塊から細胞内及び細胞膜／細胞壁関連脂質並びに細胞外炭化水素が分離される。油産生細胞で産生される細胞内脂質は、一部の実施形態では、細胞を溶解した後に抽出される。抽出後、脂質をさらに精製することにより、油、燃料、又は油脂化学品が作られる。
【０１８４】
細胞溶解物からの脂質の分離には、様々な方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び炭化水素、例えばアルカンは、ヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７を参照）。脂質及び脂質誘導体はまた、液化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照のこと）；油液化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照）；及び超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照）を用いても抽出することができる。Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの培養物からの微細藻類脂質の回収プロトコルについて記載しており、ここでは細胞が遠心によって回収され、蒸留水で洗浄され、凍結乾燥によって乾燥された。得られた細胞粉末が乳鉢において粉砕され、次にｎ−ヘキサンで抽出された。Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
【０１８５】
脂質及び脂質誘導体は、有機溶媒による抽出によって回収することができる。ある場合には、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には有機溶媒は、溶解物成分を予め分離することなしに、溶解物に直接添加される。一実施形態において、上記に記載する方法の１つ以上によって生じる溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成し得るのに十分な期間にわたり有機溶媒と接触させる。ある場合には、次に溶液をさらに精製して、特定の所望の脂質又は炭化水素成分を回収することができる。ヘキサン抽出方法は当該技術分野において公知である。
【０１８６】
本明細書に記載されるとおりの、インビボで細胞によって産生された、又はインビトロで酵素的に改変された脂質は、場合により従来の手段によりさらに処理され得る。そうした処理には、炭化水素分子のサイズを低減し、それにより水素：炭素比を増加させる「クラッキング」が含まれ得る。炭化水素及びトリグリセリド油の加工では、通常、触媒及び熱クラッキング法が用いられている。触媒法は、固体酸触媒などの触媒の使用を伴う。触媒はシリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、炭素−炭素結合のヘテロリシスな、すなわち不均一な分解を生じさせてカルボカチオン及びヒドリドアニオンをもたらす。これらの反応中間体は、次に、別の炭化水素との転位又はヒドリド移動のいずれかを受ける。このように、この反応により中間体が再生され、自己増殖型の連鎖機構がもたらされ得る。炭化水素はまた、その中の炭素−炭素二重結合、又は三重結合の数が、場合によりゼロまで低下するように処理されてもよい。炭化水素はまた、その中の環状又は環式構造を除去し又は消失させるように処理されてもよい。炭化水素はまた、水素：炭素比を増加させるように処理されてもよい。これには、水素の添加（「水素化」）及び／又はより小さい炭化水素への炭化水素の「クラッキング」が含まれ得る。
【０１８７】
熱的方法は、高温高圧の使用による炭化水素サイズの低減を伴う。約８００℃の高温及び約７００ｋＰａの圧力が用いられ得る。これらの条件は、時に水素リッチな炭化水素分子（フォトンフラックスと区別されるとおり）を指して用いられる用語である「軽質」を生じる一方、縮合によって、比較的水素が欠乏したより重質の炭化水素分子もまた生じる。この方法は、ホモリシスな、すなわち均一な分解を提供し、場合により上記に記載したとおり酵素的に飽和していてもよいアルケンを生成する。
【０１８８】
触媒法及び熱的方法は、植物において炭化水素処理及び油精製の標準である。従って本明細書に記載されるとおりの細胞によって産生される炭化水素は、従来の手段によって収集及び処理され、又は精製され得る。微細藻類により産生される炭化水素の水素化分解に関する報告については、Ｈｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２））を参照のこと。代替的実施形態において、画分は、有機化合物、熱、及び／又は無機化合物などの別の触媒で処理される。脂質をバイオディーゼルに処理するため、本章で以下に記載するとおり、エステル転移反応プロセスが用いられる。
【０１８９】
本発明の方法によって生成される炭化水素は、様々な工業用途に有用である。例えば、ほぼ全種の洗浄剤及びクリーニング用配合物に使用される陰イオン界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）の製造では、一般に１０〜１４個の炭素原子の鎖を含む炭化水素が利用される。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号明細書；同第５，５０６，２０１号明細書；同第６，６９２，７３０号明細書；同第６，２６８，５１７号明細書；同第６，０２０，５０９号明細書；同第６，１４０，３０２号明細書；同第５，０８０，８４８号明細書；同第５，５６７，３５９号明細書を参照のこと。ＬＡＳなどの界面活性剤は、米国特許第５，９４２，４７９号明細書；同第６，０８６，９０３号明細書；同第５，８３３，９９９号明細書；同第６，４６８，９５５号明細書；同第６，４０７，０４４号明細書に記載されるものなど、パーソナルケア組成物及び洗浄剤の製造で使用することができる。
【０１９０】
化石燃料由来の出発物質に代替し得る再生可能な生物学的出発物質が利用可能となり、且つその使用が望ましいため、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料などの燃料における生物学的起源の炭化水素成分の使用に関心が高まっている。生物学的材料からの炭化水素成分の生成方法が、差し迫って必要とされている。本発明は、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料を製造するための生物学的材料として本明細書に記載される方法により生成される脂質を使用した、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料の製造方法を提供することにより、この必要性を満たす。
【０１９１】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油蒸留物である。その沸点範囲は３７０°Ｆ〜７８０°Ｆと広く、ディーゼルエンジン車両などの圧縮点火機関での燃焼に好適である。米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ＡＳＴＭ）が、沸点範囲に加えて他の燃料特性、例えばセタン価、雲り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄分、水分、灰分、銅板腐食、及び残留炭素などの許容範囲に従いディーゼルの等級を規定している。技術的には、バイオマスに由来する任意の炭化水素蒸留材料又はその他適切なＡＳＴＭ規格に適合するものを、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５）として、又はそれが脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１）として定義することができる。
【０１９２】
抽出後、本明細書に記載される微生物バイオマスから回収された脂質及び／又は炭化水素成分を化学的処理に供し、ディーゼル車両及びジェットエンジンで使用される燃料を製造することができる。
【０１９３】
バイオディーゼルは液体であり、製造原料に応じて色が異なる（琥珀色乃至暗褐色）。バイオディーゼルは水に対して実質的に不混和性であり、沸点が高く、且つ蒸気圧が低い。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車両で使用されるディーゼルと同等の処理燃料を指す。バイオディーゼルは生分解性且つ非毒性である。従来のディーゼル燃料と比べたバイオディーゼルのさらなる利点は、エンジン摩耗の低さである。典型的には、バイオディーゼルはＣ１４〜Ｃ１８アルキルエステルを含む。バイオマス又は本明細書に記載されるとおり生成及び単離された脂質は、種々のプロセスによってディーゼル燃料に変換される。バイオディーゼルの好ましい生成方法は、本明細書に記載されるとおりの脂質のエステル転移反応による。バイオディーゼルとしての使用に好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０１９４】
本明細書に記載される方法によって生成されるバイオディーゼルは、単独で使用することもでき、又はほとんどの現代のディーゼルエンジン車両では従来のディーゼル燃料と任意の濃度でブレンドすることもできる。バイオディーゼルは、従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）とブレンドされる場合、約０．１％〜約９９．９％存在し得る。世界の大部分で、任意の燃料混合物中のバイオディーゼルの量を記述するため、「Ｂ」ファクターとして知られるシステムが用いられている。例えば、２０％のバイオディーゼルを含有する燃料はＢ２０と表示される。純粋なバイオディーゼルはＢ１００と参照される。
【０１９５】
バイオディーゼルは、油リッチなバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル転移反応によって生成することができる。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼルの生成方法が提供される。好ましい実施形態では、このバイオディーゼルの生成方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質含有微生物を溶解して溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物をエステル転移反応させる工程とを含み、これによりバイオディーゼルが生成される。微生物を成長させる方法、微生物を溶解して溶解物を生成する方法、有機溶媒を含む培地で溶解物を処理することにより不均一混合物を形成する方法、及び処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は上記に記載しており、バイオディーゼルの製造方法においても用いられ得る。バイオディーゼルの脂質プロフィールは、通常、原料油の脂質プロフィールと極めて類似している。
【０１９６】
脂質組成物をエステル転移反応に供し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを得ることができる。好ましいエステル転移反応は以下に概説し、それには塩基触媒エステル転移反応及び組換えリパーゼを使用したエステル転移反応が含まれる。塩基触媒エステル転移反応プロセスでは、アルカリ触媒、典型的には水酸化カリウムの存在下で、トリアシルグリセリドをアルコール、例えばメタノール又はエタノールと反応させる。この反応により、メチル又はエチルエステル及び副産物としてのグリセリン（グリセロール）が形成される。
【０１９７】
エステル転移反応はまた、上記に考察したとおり、塩基の代わりにリパーゼなどの酵素を使用しても実施されている。リパーゼ触媒エステル転移反応は、例えば、室温乃至８０℃の温度、及び１：１より大きく、好ましくは約３：１のＴＡＧと低級アルコールとのモル比で実施することができる。エステル転移反応に有用なリパーゼの他の例が、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号明細書；同第４，９４０，８４５号明細書  同第５，１５６，９６３号明細書；同第５，３４２，７６８号明細書；同第５，７７６，７４１号明細書及び国際公開第８９／０１０３２号パンフレットに掲載されている。かかるリパーゼとしては、限定はされないが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、及びＨｕｍｉｃｏｌａの微生物によって産生されるリパーゼ並びに膵リパーゼが挙げられる。
【０１９８】
バイオディーゼルが特に低温で使用される場合、続くプロセスもまた用いられ得る。かかるプロセスには、脱ろう及び分画が含まれる。いずれのプロセスとも、雲り点（バイオディーゼルが結晶化し始める温度）を低下させることにより燃料のコールドフロー及び冬季性能を向上させるように設計される。バイオディーゼルの脱ろう手法はいくつかある。一つの手法は、バイオディーゼルを石油ディーゼルとブレンドすることである。別の手法は、バイオディーゼルの雲り点を低下させることのできる添加剤を使用することである。別の手法は、添加剤を混ぜ入れて飽和物を結晶化させ、次に結晶をろ去することにより、飽和メチルエステルを手当たり次第に除去することである。分画は、メチルエステルを個々の成分又は画分に選択的に分離して、特定のメチルエステルの除去又は混入を可能にする。分画法には、尿素分画、溶媒分画及び熱蒸留が含まれる。
【０１９９】
本発明の方法により提供される別の有益な燃料は再生可能ディーゼルであり、これは、アルカン、例えばＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０を含み、従って、バイオディーゼルとは区別することができる。高品質再生可能ディーゼルはＡＳＴＭ  Ｄ９７５規格に適合する。本発明の方法によって生成される脂質は、再生可能ディーゼルを製造するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様では、再生可能ディーゼルの製造方法が提供される。再生可能ディーゼルは少なくとも３つのプロセス、すなわち、熱水処理（水素処理）；水素化処理；及び間接液化により生成され得る。これらのプロセスから、非エステル蒸留物が得られる。これらのプロセスの間、本明細書に記載されるとおり生成及び単離されるトリアシルグリセリドは、アルカンに変換される。
【０２００】
一実施形態において、再生可能ディーゼルの製造方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）微生物を溶解して溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質を脱酸素及び水素処理してアルカンを生成する工程とを含み、これにより再生可能ディーゼルが生成される。再生可能ディーゼルの製造に好適な脂質は、微生物バイオマスからヘキサンなどの有機溶媒を使用して抽出することによるか、又は米国特許第５，９２８，６９６号明細書に記載されるものなど、他の方法によって得ることができる。一部の好適な方法には、機械的な圧搾及び遠心が含まれ得る。
【０２０１】
一部の方法では、微生物脂質は、初めにクラッキングを水素処理と併せて行うことにより、それぞれ炭素鎖長及び飽和二重結合を減少させる。次にこの材料を異性化し、これもまた水素処理と併用する。次にナフサ（ｎａｐｔｈａ）画分を蒸留によって除去し、続いてさらに蒸留することにより、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５規格に適合するためにディーゼル燃料中に求められる成分を気化させて蒸留し、一方で、Ｄ９７５規格に適合するために求められる成分より重い成分は残すことができる。トリグリセリド油を含めた、化学的に改変された油の水素処理、水素化分解、脱酸素及び異性化方法は、当該技術分野において公知である。例えば、欧州特許出願公開第１７４１７６８（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７４１７６７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８２４６６（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６４０４３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８１３３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７９５５７６（Ａ１）号明細書；及び米国特許第７，２３８，２７７号明細書；同第６，６３０，０６６号明細書；同第６，５９６，１５５号明細書；同第６，９７７，３２２号明細書；同第７，０４１，８６６号明細書；同第６，２１７，７４６号明細書；同第５，８８５，４４０号明細書；同第６，８８１，８７３号明細書を参照のこと。
【０２０２】
再生可能ディーゼルの製造方法の一実施形態において、脂質を処理してアルカンを生成する工程は、脂質組成物を水素処理することにより実施される。熱水処理では、典型的には、バイオマスを高温及び高圧の水中で反応させて油及び残留固形物を形成する。変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜６６０°Ｆであり、圧力は、水を主に液体として保つのに十分な１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は１５〜３０分程度である。反応完了後、水から有機物を分離する。それによりディーゼルに好適な蒸留物が生成される。
【０２０３】
再生可能ディーゼルを作製する一部の方法では、トリグリセリドを処理する初めの工程は、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次に水素及び触媒の存在下における高温での脱酸素が続く。一部の方法では、水素化及び脱酸素は同じ反応で起こる。他の方法では、脱酸素は水素化より前に起こる。次に、場合により、同様に水素及び触媒の存在下で異性化が実施される。ナフサ成分は、好ましくは蒸留によって除去される。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
【０２０４】
トリグリセリドを水素化するための一つの好適な方法には、銅、亜鉛、マグネシウム及びランタンの塩の水溶液、並びにアルカリ金属又は好ましくは炭酸アンモニウムの別の溶液の調製が含まれる。これらの２つの溶液を約２０℃〜約８５℃及の温度に加熱し、沈殿容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるような速度で沈殿容器に一緒に秤量することにより、触媒が形成され得る。追加の水を最初に沈殿容器に使用してもよく、又は塩溶液及び沈殿溶液と同時に加えてもよい。次に得られた沈殿物を十分に洗浄し、乾燥させ、約３００℃で焼成して、水素下約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で活性化させ得る。次に１つ以上のトリグリセリドを接触させ、反応槽において上述の触媒の存在下で水素と反応させ得る。反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡塔反応槽、連続撹拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野において周知されている任意の他の好適な反応槽タイプであってよい。このプロセスはバッチ式で行われてもよく、或いは連続方式で行われてもよい。反応温度は典型的には約１７０℃〜約２５０℃の範囲である一方、反応圧力は典型的には約３００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇの範囲である。さらに、本発明のプロセスにおける水素とトリグリセリドとのモル比は、典型的には約２０：１〜約７００：１の範囲である。このプロセスは、典型的には約０．１時間−１〜約５時間−１の範囲の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）で実施される。当業者は、用いられる温度、水素とトリグリセリドとのモル比、及び水素の分圧によって、反応に要する時間が異なり得ることを認識するであろう。かかる水素化プロセスによって生成される生成物には、脂肪アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセリドが含まれる。これらの生成物は、典型的には従来の手段、例えば、蒸留、抽出、ろ過、結晶化などによって分離される。
【０２０５】
石油精製装置は、原材料を水素で処理することにより、水素化処理を使用して不純物を除去する。水素化処理の変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜７００°Ｆである。圧力は、典型的には４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には１０〜６０分程度である。固体触媒を用いると、特定の反応速度が増加し、特定の生成物に対する選択性が向上し、且つ水素消費が最適化される。
【０２０６】
油の脱酸素に好適な方法には、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆの範囲の温度に加熱し、加熱した油を少なくともほぼ大気圧乃至それ以上の範囲の圧力下で少なくとも約５分間窒素と連続的に接触させることが含まれる。
【０２０７】
好適な異性化方法には、当該技術分野で周知されているアルカリ異性化及び他の油異性化を用いることが含まれる。
【０２０８】
水素処理及び水素化処理は、最終的にトリグリセリド原材料の分子量の低減をもたらす。トリグリセリド分子は、水素化処理条件下で４つの炭化水素分子、すなわちプロパン分子と、３つのより重い、典型的にはＣ８〜Ｃ１８範囲の炭化水素分子とに低減される。
【０２０９】
従って、一実施形態において、本発明の脂質組成物に対して行われる１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５再生可能ディーゼルを含むアルカン混合物である。微生物による炭化水素の生成について、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）により概説されている。
【０２１０】
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ１０％及び９０％の容積が蒸留されたときの温度）の点から記載される。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、本明細書に開示される方法に従い生成されるトリグリセリド油を使用して、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０及び６５℃などの他のＴ１０−Ｔ９０範囲の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
【０２１１】
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、及び少なくとも２９０のＴ１０などの他のＴ１０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
【０２１２】
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、及び少なくとも２９０のＴ９０などの特定のＴ９０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
【０２１３】
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、及び少なくとも３００のＦＢＰなどの他のＦＢＰ値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
【０２１４】
本発明の方法及び組成によって生成される他の油は、（ａ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４；（ｂ）少なくとも０．２５％〜１％、好ましくは少なくとも０．３％のＣ８；（ｃ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％のＣ１０；（ｄ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％のＣ１２；及び（３）少なくとも２０％〜４０％、好ましくは少なくとも３０％のＣ８〜Ｃ１４を含む脂質プロフィールの油を含め、水素処理、異性化、及び他の共有結合性改変の組み合わせに供してもよい。
【０２１５】
従来の超低硫黄ディーゼルは、任意の形態のバイオマスから二段階プロセスにより製造され得る。第一に、バイオマスが、水素及び一酸化炭素リッチなガス状混合物であるシンガスに変換される。次に、このシンガスが液体に触媒変換される。典型的には、液体の生成は、フィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）合成を用いて達成される。この技術は石炭、天然ガス、及び重油に応用されている。従って、再生可能ディーゼルの製造方法のさらに別の好ましい実施形態において、脂質組成物を処理することによりアルカンを生成する工程は、脂質組成物の間接液化によって行われる。
【０２１６】
本発明はまた、ジェット燃料の製造方法も提供する。ジェット燃料は、透明乃至淡黄色である。最も一般的な燃料は、航空機用Ａ−１（Ａｅｒｏｐｌａｎｅ  Ａ−１）に分類される無鉛／パラフィン油系燃料であり、これは国際的に標準化された一連の規格に合わせて製造される。ジェット燃料は、千種又はそれを超えて多い可能性もある多数の異なる炭化水素の混合物である。そのサイズ（分子量又は炭素数）の範囲は、生成物の要件、例えば凝固点又は発煙点によって制限される。ケロシン系の航空機用燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ａ−１を含む）は、約８〜１６炭素数の炭素数分布を有する。ワイドカット系又はナフサ系航空機用燃料（Ｊｅｔ  Ｂを含む）は、典型的には約５〜１５炭素の炭素数分布を有する。
【０２１７】
本発明の一実施形態では、藻類燃料を既存のジェット燃料とブレンドすることによりジェット燃料が製造される。本発明の方法によって生成される脂質は、ジェット燃料を製造するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様において、ジェット燃料の製造方法が提供される。本明細書によって、本発明の方法により生成される脂質からジェット燃料を製造する２つの方法、すなわち流動接触クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸素（ＨＤＯ）が提供される。
【０２１８】
流動接触クラッキング（ＦＣＣ）は、重質粗油画分からのオレフィン、特にプロピレンの生成に用いられる一つの方法である。本発明の方法によって生成される脂質はオレフィンに変換することができる。このプロセスには、生成された脂質をＦＣＣゾーンに流し、ジェット燃料として有用な、オレフィンを含む生成物流を収集することが含まれる。生成された脂質がクラッキング条件でクラッキング触媒と接触することにより、ジェット燃料として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流が提供される。
【０２１９】
一実施形態において、ジェット燃料の製造方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質含有微生物を溶解することにより溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物を処理する工程とを含み、これによりジェット燃料が製造される。ジェット燃料の製造方法の一実施形態では、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流すことができ、これは、一実施形態では、脂質組成物をクラッキング条件でクラッキング触媒と接触させることにより、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を提供することを含み得る。
【０２２０】
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物中に存在し得るいかなる汚染物質も除去することが望ましいとされ得る。従って、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流す前に、脂質組成物が前処理される。前処理には、脂質組成物をイオン交換樹脂と接触させることが含まれ得る。イオン交換樹脂は酸性イオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）−１５であり、脂質組成物が上向流又は下向流のいずれかで流れる反応槽中の床層として使用することができる。他の前処理には、硫酸、酢酸、硝酸、又は塩酸などの酸に脂質組成物を接触させることによる弱酸洗浄が含まれ得る。接触は、通常周囲温度及び大気圧下、希釈酸性溶液で行われる。
【０２２１】
場合により前処理された脂質組成物はＦＣＣゾーンに流れ、そこで炭化水素系成分がオレフィンへとクラッキングされる。触媒クラッキングは、反応ゾーンにおいて、微粉化された粒子状物質で構成される触媒に脂質組成物を接触させることにより達成される。水素化分解とは対照的に、この反応は触媒クラッキングであり、水素の添加又は水素の消費なしに行われる。クラッキング反応が進むに従い、触媒に相当量のコークスが堆積する。この触媒は、再生ゾーンで触媒からコークスを燃焼させることにより、高温で再生される。コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と称され、反応ゾーンから再生ゾーンへと連続的に輸送されて再生され、再生ゾーンからの本質的にコークスを含まない再生触媒に置き換わる。様々なガス流による触媒粒子の流動化が、反応ゾーンと再生ゾーンとの間の触媒の輸送を可能にする。流動化された触媒流中における、本明細書に記載される脂質組成物の炭化水素など炭化水素のクラッキング方法、反応ゾーンと再生ゾーンとの間での触媒の輸送方法、及び再生器におけるコークスの燃焼方法は、ＦＣＣプロセスの当業者には周知されている。例示的なＦＣＣ適用及び脂質組成物のクラッキングによるＣ２〜Ｃ５オレフィンの製造に有用な触媒が、米国特許第６，５３８，１６９号明細書、同第７，２８８，６８５号明細書（これらは全体として参照により援用される）に記載される。
【０２２２】
好適なＦＣＣ触媒は、概して、同じマトリックス上にあっても又はなくてもよい少なくとも２つの成分を含む。一部の実施形態では、２つの成分は両方とも反応槽全体にわたって循環し得る。第１の成分は、概して、活性非晶質粘土タイプの触媒及び／又は高活性結晶性分子篩など、流動接触クラッキングの技術分野で使用される周知の触媒のいずれかを含む。分子篩触媒は所望の生成物に対する選択性が大幅に向上しているため、非晶質触媒と比べて好ましいこともある。一部の好ましい実施形態では、ＦＣＣプロセスにおける分子篩としてゼオライトが使用される。好ましくは、第１の触媒成分が、大孔ゼオライト、例えばＹ型ゼオライト、活性アルミナ材料、バインダー材料（シリカ又はアルミナのいずれかを含むもの）及びカオリンなどの不活性充填剤を含む。
【０２２３】
一実施形態において、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー部、或いはリフト部で行われる。脂質組成物は、脂質組成物の急速蒸発を生じさせるノズルによってライザーに導入される。触媒との接触前、脂質組成物の温度は通常約１４９℃〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）であり得る。触媒がブレンド容器からライザーに流れ、そこで触媒が約２秒以下の間にわたり脂質組成物と接触する。
【０２２４】
ブレンドされた触媒及び反応脂質組成物の蒸気は、次にライザーの上から出口を通って吐き出され、オレフィンを含むクラッキング後の生成物蒸気流と、相当量のコークスで被覆された、概して「コークス化触媒」と称される一群の触媒粒子とに分けられる。脂質組成物と触媒との接触時間を最小限に抑えるため（これは所望の生成物から不要な他の生成物へのさらなる変換を促進し得る）、旋回アーム装置などの任意のセパレータ装置を使用して、生成物流からコークス化触媒を速やかに除去することができる。セパレータ、例えば旋回アームセパレータがチャンバの上部に位置し、ストリッピングゾーンがチャンバの下部にある。旋回アーム装置により分離された触媒はストリッピングゾーンに落ちる。軽質オレフィンを含む分解炭化水素と一部の触媒とを含む分解生成物蒸気流が、導管を通ってチャンバを出て、この導管はサイクロンと連通している。サイクロンによって生成物蒸気流から残りの触媒粒子が除去され、粒子濃度が超低濃度に低下する。次に生成物蒸気流が分離容器の上から出る。サイクロンによって分離された触媒は分離容器に戻され、次にストリッピングゾーンに戻される。ストリッピングゾーンは、蒸気との向流接触によって触媒の表面から吸着炭化水素を除去する。
【０２２５】
低い炭化水素分圧は、軽質オレフィンの生成に有利に働く。従って、ライザー圧力は約１７２〜２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）、炭化水素分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（５〜２５ｐｓｉａ）に設定され、好ましい炭化水素分圧は約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉａ）である。炭化水素のこの比較的低い分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜５５ｗｔ％、好ましくは脂質組成物の約１５ｗｔ％である範囲で蒸気を希釈剤として使用することにより実現される。乾性ガスなどの他の希釈剤を使用して、同等の炭化水素分圧を達成することができる。
【０２２６】
ライザー出口の分解流の温度は約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）となる。しかしながら、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を上回ると、ガスが一層乾燥し、オレフィンが増す。一方、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を下回ると、エチレン及びプロピレンが減る。従って、ＦＣＣプロセスは、約５６６℃〜約６３０℃の好ましい温度、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好ましい圧力で実施することが好ましい。別のプロセス条件は触媒の対脂質組成物比であり、これは約５から約２０、好ましくは約１０から約１５まで異なり得る。
【０２２７】
ジェット燃料の製造方法の一実施形態では、脂質組成物がＦＣＣ反応槽のリフト部に導入される。リフト部の温度は極めて高く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１４００°Ｆ）の範囲となり、触媒の対脂質組成物比は約１００〜約１５０である。脂質組成物をリフト部に導入すると、多量のプロピレン及びエチレンが生じることが予想される。
【０２２８】
本明細書に記載されるとおり生成された脂質組成物又は脂質を使用したジェット燃料の製造方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造が、水素化脱酸素（ＨＤＯ）と称されるプロセスによって壊される。ＨＤＯは、水素を用いた酸素の除去を意味し、すなわち、材料の構造を壊しながら酸素が除去される。オレフィン二重結合が水素化され、任意の硫黄及び窒素化合物が除去される。硫黄の除去は水素化脱硫（ＨＤＳ）と呼ばれる。原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度が、触媒の有効寿命に寄与する。
【０２２９】
一般に、ＨＤＯ／ＨＤＳ工程では、水素を供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合し、次に混合物を並流として、単相或いは二相供給原料として触媒床に通す。ＨＤＯ／ＭＤＳ工程の後、生成物画分が分離され、別個の異性化反応槽に送られる。生物学的出発物質用の異性化反応槽については、文献（ＦＩ  １００  ２４８）に並流反応槽として記載されている。
【０２３０】
供給炭化水素、例えば本明細書では脂質組成物又は脂質を水素化することによる燃料の製造方法はまた、脂質組成物又は脂質を水素ガスと共に並流として第１の水素化ゾーンに通して実施することもでき、その後、水素ガスを第２の水素化ゾーンに流出炭化水素に対する向流として通すことにより、流出炭化水素が第２の水素化ゾーンでさらに水素化される。Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを生成するための脂質組成物のクラッキングに有用な例示的ＨＤＯ適用及び触媒が、米国特許第７，２３２，９３５号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
【０２３１】
典型的には、水素化脱酸素工程では、本明細書における脂質組成物又は脂質などの生物学的成分の構造が分解され、酸素、窒素、リン及び硫黄化合物、並びにガスとしての軽質炭化水素が除去され、及びオレフィン結合が水素化される。このプロセスの第２の工程では、すなわちいわゆる異性化工程では、炭化水素鎖の分枝及び低温でのパラフィン性能の向上のため、異性化が実施される。
【０２３２】
クラッキングプロセスの第１の工程、すなわちＨＤＯ工程では、水素ガス及び水素化する本明細書の脂質組成物又は脂質が、並流又は向流のいずれかとしてＨＤＯ触媒床システムに送り込まれ、前記触媒床システムは１つ以上の触媒床、好ましくは１〜３つの触媒床を含む。ＨＤＯ工程は、典型的には並流方式で動作する。２つ以上の触媒床を含むＨＤＯ触媒床システムの場合、床のうち１つ以上を向流原理を用いて動作させてもよい。ＨＤＯ工程では、圧力は２０〜１５０バールの間、好ましくは５０〜１００バールの間で異なり、温度は２００〜５００℃の間、好ましくは３００〜４００℃の範囲で異なる。ＨＤＯ工程では、周期律表第ＶＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有する周知の水素化触媒が使用され得る。好ましくは、水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ３及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒が使用される。
【０２３３】
ＨＤＯ工程の前に、場合により本明細書の脂質組成物又は脂質は、より穏和な条件下で、従って二重結合の副反応を回避して予備的に水素化処理され得る。かかる予備水素化は、予備水素化触媒の存在下、５０〜４００℃の温度及び１〜２００バールの水素圧、好ましくは１５０〜２５０℃の温度及び１０〜１００バールの水素圧で実施される。触媒は、周期律表第ＶＩＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有し得る。好ましくは、予備水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。
【０２３４】
水素を含有するＨＤＯ工程のガス流が冷却され、次にそれから一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、リン及び硫黄化合物、ガス状軽質炭化水素及び他の不純物が除去される。圧縮後、精製水素又は再生水素が第１の触媒床及び／又は触媒床の間に戻され、抜き取られたガス流を補う。濃縮液体から水が除去される。この液体が第１の触媒床又は触媒床間に送り込まれる。
【０２３５】
ＨＤＯ工程の後、生成物は異性化工程に供される。このプロセスには、炭化水素を異性化触媒と接触させる前に可能な限り完全に不純物を除去することが重要である。異性化工程は任意選択のストリッピング工程を含み、ここではＨＤＯ工程からの反応生成物が、水蒸気又は好適なガス、例えば、軽質炭化水素、窒素又は水素によるストリッピングにより精製され得る。任意選択のストリッピング工程は、異性化触媒の上流のユニットにおいて向流方式で実施されるか（ここではガスと液体とが互いに接触する）、又は実際の異性化反応槽の前に、別個のストリッピングユニットにおいて向流原理を利用して実施される。
【０２３６】
ストリッピング工程の後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質、及び場合によりｎ−パラフィン混合物が、１つ又はいくつかの触媒床を含む反応異性化ユニットに送り込まれる。異性化工程の触媒床は並流方式又は向流方式のいずれで動作してもよい。
【０２３７】
このプロセスについては、異性化工程で向流原理が適用されることが重要である。異性化工程では、これは任意選択のストリッピング工程又は異性化反応工程の一方又は両方を向流方式で実施することにより行われる。異性化工程では、圧力は２０〜１５０バールの範囲、好ましくは２０〜１００バールの範囲で異なり、温度は２００〜５００℃、好ましくは３００〜４００℃である。異性化工程では、当該技術分野において公知の異性化触媒が使用され得る。好適な異性化触媒は、分子篩及び／又は第ＶＩＩ族の金属及び／又は担体を含有する。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１若しくはＳＡＰＯ４１又はＺＳＭ−２２若しくはＺＳＭ−２３又はフェリエライト及びＰｔ、Ｐｄ又はＮｉ及びＡｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２を含有する。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３及びＰｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化工程とＨＤＯ工程とは、同じ圧力容器で、又は別個の圧力容器で実施されてもよい。任意選択の予備水素化は、別個の圧力容器で、又はＨＤＯ工程及び異性化工程と同じ圧力容器で実施されてもよい。
【０２３８】
従って、一実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＨＲＪ−５を含むアルカン混合物である。別の実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、１０ｐｐｍ未満の硫黄分を有する。他の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２０５℃未満の蒸留曲線のＴ１０値を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、３００℃未満の終沸点（ＦＢＰ）を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも３８℃の引火点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３の密度を有する。さらに別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、−４７℃未満の凝固点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋの真燃焼熱を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも１３．４質量％の水素分を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２６０℃で定量重量分析ＪＦＴＯＴによって試験したとき、３ｍｍＨｇ未満である熱安定性を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７ｍｇ／ｄｌ未満の実在ガムを有する。
【０２３９】
従って、本発明は、微細藻類脂質の化学的改変を行うことにより様々な工業用途及び他の用途で有用な生成物を得る様々な方法を開示する。本明細書に開示される方法によって生成される油の改変方法の例としては、限定はされないが、油の加水分解、油の水素化処理、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的改変としては、限定なしに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類油の改変により基礎油脂化学品が生成され、これをさらに、所望の機能のための選択された誘導油脂化学品に改変することができる。上記に燃料製造方法に関連して記載した方法と同様の方法で、本明細書に記載される微生物培養物から産生された油に対してこれらの化学的改変を実施することもできる。基礎油脂化学品の例としては、限定はされないが、石鹸、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミドを含む脂肪窒素化合物、脂肪酸メチルエステル、及びグリセロールが挙げられる。誘導油脂化学品の例としては、限定はされないが、脂肪ニトリル、エステル、ダイマー酸、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（ベタインを含む）、界面活性剤、脂肪アルカノールアミド、脂肪アルコールスルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪アルコール、オレフィン、掘削泥水、ポリオール、ポリウレタン、ポリアクリレート、ゴム、ロウソク、化粧品、金属石鹸、石鹸、α−スルホン酸化メチルエステル、脂肪アルコールスルフェート、脂肪アルコールエトキシレート、脂肪アルコールエーテルスルフェート、イミダゾリン、界面活性剤、洗浄剤、エステル、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（ベタインを含む）、オゾン分解生成物、脂肪アミン、脂肪アルカノールアミド、エトキシスルフェート、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（中鎖トリグリセリドを含む）、潤滑剤、油圧作動油、グリース、誘電性流体、離型剤、金属加工液、熱伝導流体、他の機能性流体、工業化学品（例えば、クリーナー、繊維加工助剤、可塑剤、安定化剤、添加剤）、表面コーティング、ペンキ及びラッカー、電気配線絶縁体、及び高級アルカンが挙げられる。他の誘導体としては、脂肪アミドアミン類、アミドアミンカルボキシレート類、アミドアミンオキシド類、アミドアミンオキシドカルボキシレート類、アミドアミンエステル類、エタノールアミンアミド類、スルホネート類、アミドアミンスルホネート類、ジアミドアミンジオキシド類、スルホン化アルキルエステルアルコキシレート類、ベタイン類、四級化（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）ジアミドアミンベタイン類、及びスルホベタイン類が挙げられる。
【０２４０】
本発明の方法によって生成されるグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の加水分解により、他の有用な化学品を生成するため誘導体化することのできる遊離脂肪酸が得られる。加水分解は、水と、酸又は塩基のいずれかであってよい触媒との存在下で起こる。放出された遊離脂肪酸を誘導体化することにより、以下に報告されるとおり様々な生成物を産生することができる：米国特許第５，３０４，６６４号明細書（高度に硫酸化された脂肪酸）；同第７，２６２，１５８号明細書（クレンジング組成物）；同第７，１１５，１７３号明細書（織物柔軟剤組成物）；同第６，３４２，２０８号明細書（皮膚処置用のエマルション）；同第７，２６４，８８６号明細書（撥水組成物）；同第６，９２４，３３３（ペンキ添加剤）；同第６，５９６，７６８号明細書（脂質リッチの反芻動物飼料）；同第６，３８０，４１０号明細書（洗浄剤及びクリーナー用の界面活性剤）。
【０２４１】
一部の方法では、化学的改変の第１の工程は、水素化処理により二重結合を飽和させ、続いて水素及び触媒の存在下、高温で脱酸素することであり得る。他の方法では、水素化と脱酸素とを同じ反応内で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は水素化前に行われる。次に場合により異性化が、同様に水素及び触媒の存在下で実施されてもよい。最後に、必要であればガス及びナフサ成分を除去することができる。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
【０２４２】
本発明の一部の実施形態では、トリグリセリド油は部分的に又は完全に脱酸素される。脱酸素反応により、限定はされないが、脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオール、ケトン、及びアルデヒドを含めた所望の生成物が形成される。一般に、いかなる特定の理論によっても制限されることなしに、脱酸素反応は、限定なしに水素化分解、水素化、連続水素化−水素化分解、連続水素化分解−水素化、及び併用される水素化−水素化分解反応を含めた、様々な異なる反応経路の組み合わせを含み、脂肪酸又は脂肪酸エステルからの酸素の少なくとも部分的な除去を生じさせることにより、さらなる処理によって所望の化学品に容易に変換することのできる反応生成物、例えば脂肪アルコールを生成する。例えば、一実施形態において、脂肪アルコールがＦＣＣ反応によってオレフィンに変換されてもよく、又は縮合反応によって高級アルカンに変換されてもよい。
【０２４３】
かかる化学的改変の一つは水素化であり、これは、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪酸構成要素の二重結合に水素を添加するものである。水素化プロセスは、特定の用途により好適であり得る半固体又は固体脂肪への液体油の転換を可能にする。
【０２４４】
本明細書に記載される方法により生成される油の水素化は、以下に報告されるとおり、本明細書に提供される方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施することができる：米国特許第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第５，３４６，７２４号明細書（潤滑製品）；同第５，４７５，１６０号明細書（脂肪アルコール）；同第５，０９１，１１６号明細書（食用油）；同第６，８０８，７３７号明細書（マーガリン及びスプレッド用構造脂肪）；同第５，２９８，６３７号明細書（低カロリー脂肪代用物）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化触媒及び硫黄吸着剤）；同第５，２３３，０９９号明細書及び同第５，２３３，１００号明細書（脂肪アルコール）；同第４，５８４，１３９号明細書（水素化触媒）；同第６，０５７，３７５号明細書（泡止め剤）；同第７，１１８，７７３号明細書（食用エマルションスプレッド）。
【０２４５】
当業者は、様々なプロセスを用いて炭水化物を水素化し得ることを認識するであろう。一つの好適な方法としては、水素化反応槽において水素化生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び触媒と接触させることが挙げられる。水素化触媒は、概して、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独で、或いはＷ、Ｍｏ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせなどの助触媒と共に含むことができる。他の有効な水素化触媒材料としては、担持ニッケルか、或いはレニウムで修飾されたルテニウムが挙げられる。ある実施形態では、水素化触媒はまた、触媒の所望の機能性に応じた担体のうちいずれか一つも含む。水素化触媒は、当業者に公知の方法によって調製され得る。
【０２４６】
一部の実施形態では、水素化触媒には、担持第ＶＩＩＩ族金属触媒及び金属スポンジ材料（例えばスポンジニッケル触媒）が含まれる。ラネーニッケルは、この発明での使用に好適な活性スポンジニッケル触媒の例を提供する。他の実施形態では、本発明における水素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステン修飾ニッケル触媒を含む触媒を使用して実施される。本発明の水素化反応に好適な触媒の一例は、炭素担持ニッケル−レニウム触媒である。
【０２４７】
ある実施形態では、重量単位でほぼ等量のニッケル及びアルミニウムの合金を、約２５重量％の水酸化ナトリウムを例えば含有するアルカリ水溶液で処理することにより、好適なラネーニッケル触媒が調製されてもよい。アルミニウムはアルカリ水溶液に選択的に溶解し、大部分がニッケルで少量のアルミニウムを含むスポンジ型材料をもたらす。初期合金は、形成されたスポンジニッケル触媒中に約１〜２重量％が残るような量の助触媒金属（すなわちモリブデン又はクロム）を含む。別の実施形態では、水素化触媒は、水中のトリニトラトニトロシルルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の溶液を使用し、好適な担体材料を含浸させて調製される。次に溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未満の固体を形成する。次に固体を回転式ボール炉において４時間、大気圧下３００℃（焼成なし）又は４００℃（焼成あり）の水素流中で還元してもよい。冷却し、且つ窒素で触媒を不活性化した後、窒素中５容積％の酸素が触媒に２時間送られる。
【０２４８】
特定の実施形態において、記載される触媒は触媒担体を含む。触媒担体は触媒を安定化させ、担持する。使用される触媒担体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。本発明に好適な担体としては、限定はされないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキシアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレン及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２４９】
この発明で使用される触媒は、当業者に公知の従来の方法を用いて調製することができる。好適な方法としては、限定はされないが、初期湿潤、蒸発含浸、化学蒸着、洗浄−コーティング、マグネトロンスパッタリング技術などを挙げることができる。
【０２５０】
水素化反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、適切な反応条件を認識するであろう。一般に、水素化反応は８０℃〜２５０℃の温度で、好ましくは９０℃〜２００℃で、最も好ましくは１００℃〜１５０℃で行われる。一部の実施形態では、水素化反応は５００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０２５１】
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「外部水素」は、バイオマス反応それ自体から生じるのではなく、むしろ別の供給源からその系に添加される水素を指す。
【０２５２】
本発明の一部の実施形態では、出発炭水化物をより小さい分子に変換し、所望の高級炭化水素への変換を容易にすることが望ましい。この変換に好適な一つの方法は、水素化分解反応によるものである。炭水化物の水素化分解の実施については、様々なプロセスが知られている。一つの好適な方法としては、水素化分解反応槽においてより小さい分子又はポリオールを含む反応生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び水素化分解触媒と接触させることが挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「より小さい分子又はポリオール」は、より低い分子量を有する任意の分子を含み、これは出発炭水化物より少ない炭素原子数又は酸素原子数を含み得る。ある実施形態では、反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含むより小さい分子を含む。一部の当業者は、水素化分解反応の実施に適切な方法を選択することが可能であろう。
【０２５３】
一部の実施形態では、五炭糖及び／又は六炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を使用してプロピレングリコール、エチレングリコール、及びグリセロールに変換してもよい。水素化分解触媒は、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独で、或いはＡｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせなどの助触媒と共に含み得る。水素化分解触媒はまた、遷移金属（例えば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又は第ＶＩＩＩ族金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、及びオスミウム）を含有する炭素質パイロポリマー触媒も含み得る。特定の実施形態において、水素化分解触媒は、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせるか、又は触媒活性担体に付着した上記の金属のいずれかを含み得る。特定の実施形態において、水素化分解反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。
【０２５４】
水素化分解反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一般に、水素化分解反応は１１０℃〜３００℃の温度、好ましくは１７０℃〜２２０℃、最も好ましくは２００℃〜２２５℃で行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は塩基性条件下、好ましくは８〜１３のｐＨ、さらにより好ましくは１０〜１２のｐＨで行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５００ＫＰａの範囲、好ましくは１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
【０２５５】
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０２５６】
一部の実施形態では、上記で考察する反応生成物は、縮合反応槽において縮合反応によって高級炭化水素に変換されてもよい。かかる実施形態において、反応生成物の縮合は、高級炭化水素を形成することが可能な触媒の存在下で起こる。理論によって制限されることを意図するものではないが、高級炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素結合の形成を含め、段階的な付加反応によって進むものと考えられる。得られる反応生成物は、以下にさらに詳細に記載するとおり、これらの部分を含有する任意の数の化合物を含む。
【０２５７】
特定の実施形態において、好適な縮合触媒には、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「酸／塩基触媒」は、酸及び塩基の両方の機能性を有する触媒を指す。一部の実施形態では、縮合触媒として、限定なしに、ゼオライト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノケイ酸塩、リン酸塩、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化スカンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸修飾した樹脂、塩基修飾した樹脂、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、改変剤も含まれ得る。好適な改変剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、金属も含まれ得る。好適な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、合金、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２５８】
特定の実施形態において、縮合反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。特定の実施形態において、縮合触媒は自己担持型である。本明細書で使用されるとき、用語「自己担持型」は、その触媒が担体として機能するために別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触媒は、触媒を懸濁するのに好適な別の担体と併せて使用される。ある実施形態では、縮合触媒担体はシリカである。
【０２５９】
縮合反応が起こる条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一部の実施形態では、縮合反応は、提案されている反応の熱力学が有利となる温度で実施される。縮合反応の温度は、具体的な出発ポリオール又はアルコールに応じて異なり得る。一部の実施形態では、縮合反応の温度は、８０℃〜５００℃、好ましくは１２５℃〜４５０℃、最も好ましくは１２５℃〜２５０℃の範囲である。一部の実施形態では、縮合反応は、０ＫＰａ〜９０００ＫＰａの範囲、好ましくは０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらにより好ましくは０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で実施される。
【０２６０】
本発明により形成される高級アルカンとしては、限定はされないが、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルカン、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルケン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルカン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、及びケトンが挙げられる。好適なアルカンとしては、限定はされないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタデカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエイコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコセン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びその異性体が挙げられる。これらの生成物の一部は、燃料としての使用に好適であり得る。
【０２６１】
一部の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは非置換である。他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは一置換である。さらに他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは多置換である。置換シクロアルカン及びシクロアルケンを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。好適なシクロアルカン及びシクロアルケンとしては、限定はされないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペンタン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、異性体及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２６２】
一部の実施形態では、形成されるアリールは非置換である。別の実施形態において、形成されるアリールは一置換である。置換アリールを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。本発明に好適なアリールとしては、限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２６３】
本発明において生成されるアルコールは、４〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルコールは環式である。他の実施形態では、アルコールは分枝状である。別の実施形態では、アルコールは直鎖状である。本発明に好適なアルコールとしては、限定はされないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、トリエイコサノール、テトラエイコサノール、及びその異性体が挙げられる。
【０２６４】
本発明において生成されるケトンは、４〜３０個の炭素原子を有する。ある実施形態では、ケトンは環式である。別の実施形態では、ケトンは分枝状である。別の実施形態において、ケトンは直鎖状である。本発明に好適なケトンとしては、限定はされないが、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデカノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びその異性体が挙げられる。
【０２６５】
別のかかる化学的改変は、エステル交換である。天然で産生されるグリセロ脂質は、脂肪酸構成要素の分布が均一でない。油との関連において、エステル交換は、異なるグリセロ脂質の２つのエステル間でのアシル基の交換を指す。エステル交換プロセスは、グリセロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を転位させて分布パターンを改変し得る機構を提供する。エステル交換は周知の化学的プロセスであり、概して、油の混合物をある時間にわたり（例えば３０分間）、アルカリ金属又はアルキル化アルカリ金属（例えばナトリウムメトキシド）などの触媒の存在下で（約２００℃に）加熱することを含む。このプロセスを用いて油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は所望の分布パターンを生成するように指向させることができる。脂質を化学的に改変するこの方法は、脂質としての乾燥細胞重に対する割合が少なくとも２０％である微生物バイオマスなどの、本明細書に提供される材料に対して実施することができる。
【０２６６】
起こり得る一部のＴＡＧの融点未満の温度に油混合物を維持することにより、指向性エステル交換を実施することができ、ここでは脂肪酸の特定の分布パターンが求められる。これによりそれらのＴＡＧの選択的な結晶化がもたらされ、このようなＴＡＧは結晶化に伴い反応混合物から効果的に除去される。このプロセスは、例えば、油中の脂肪酸の大部分が沈殿し終えるまで続けることができる。指向性エステル交換プロセスを使用すると、例えば、より長鎖の脂肪酸をより短鎖のカウンターパートによって置換することで、より低いカロリー含有量の生成物を生成することができる。指向性エステル交換はまた、不要なトランス異性体を生じ得る水素化に頼ることなしに、食品添加剤又は生成物（例えばマーガリン）において求められる所望の融解特性及び構造的特徴を提供できる脂肪の混合物を含む生成物の生成にも用いられる。
【０２６７】
本明細書に記載される方法により生成される油のエステル交換は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，０８０，８５３号明細書（非可消化性脂肪代用物）；同第４，２８８，３７８号明細書（ピーナッツバター安定化剤）；同第５，３９１，３８３号明細書（食用スプレー油）；同第６，０２２，５７７号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，４３４，２７８号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，２６８，１９２号明細書（低カロリーナッツ製品）；同第５，２５８，１９７号明細書（低カロリー食用組成物）；同第４，３３５，１５６号明細書（食用脂肪生成物）；同第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第７，１１５，７６０号明細書（分画プロセス）；同第６，８０８，７３７号明細書（構造脂肪）；同第５，８８８，９４７号明細書（エンジン潤滑剤）；同第５，６８６，１３１号明細書（食用油混合物）；及び同第４，６０３，１８８号明細書（硬化性ウレタン組成物）。
【０２６８】
本発明における一実施形態では、上記に記載したとおりの油のエステル転移反応の後に、米国特許第６，４６５，６４２号明細書に報告されるとおり、エステル転移反応した生成物とポリオールとの反応が続き、ポリオール脂肪酸ポリエステルが生成される。かかるエステル化及び分離プロセスは、以下のとおりの工程を含み得る：石鹸の存在下で低級アルキルエステルをポリオールと反応させる工程；生成物混合物から残留石鹸を除去する工程；生成物混合物を水洗及び乾燥することにより不純物を除去する工程；精製のため生成物混合物を漂白する工程；生成物混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから未反応低級アルキルエステルの少なくとも一部を分離する工程；及び分離した未反応低級アルキルエステルを再生利用する工程。
【０２６９】
エステル転移反応はまた、米国特許第６，２７８，００６号明細書に報告されるとおり、短鎖脂肪酸エステルを含む微生物バイオマスに対して実施することもできる。一般に、エステル転移反応は、好適な触媒の存在下で油に短鎖脂肪酸エステルを添加し、混合物を加熱することによって実施され得る。一部の実施形態では、油は、重量単位で反応混合物の約５％〜約９０％を含む。一部の実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、重量単位で反応混合物の約１０％〜約５０％であってもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒、ナトリウムメトキシド、酸触媒、例えば、硫酸及び酸性粘土などの無機酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸、並びにＡｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５などの酸性樹脂が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムなどの金属、及び金属水素化物もまた、有用な触媒である。
【０２７０】
別のかかる化学的改変はヒドロキシル化であり、これには、二重結合への水の付加によってもたらされる飽和及びヒドロキシル部分の取り込みが関わる。ヒドロキシル化プロセスは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素からヒドロキシ脂肪酸への変換機構を提供する。ヒドロキシル化は、例えば米国特許第５，５７６，０２７号明細書に報告される方法を用いて実施することができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪酸は、食品添加剤、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、防水添加剤、可塑剤、化粧品用乳化剤及び／又は脱臭剤を含めたいくつかの工業用途、並びにエレクトロニクス、医薬品、ペンキ、インク、接着剤、及び潤滑剤における成分として有用である。グリセリドのヒドロキシル化がどのように実施され得るかについての一例は、以下のとおりである：脂肪を、ヘプタンと組み合わせて好ましくは約３０〜５０℃に加熱し、３０分間以上温度を維持し得る；次に混合物に酢酸を添加した後、硫酸水溶液を添加し、続いて過酸化水素水溶液を添加することができ、これは少量ずつ増加させながら１時間かけて混合物に添加される；過酸化水素水の後、次に温度を少なくとも約６０℃に上昇させ、少なくとも６時間撹拌し得る；撹拌後、混合物を沈殿させ、反応により形成された下層の水層を取り出すと同時に、反応により形成された上層のヘプタン層を約６０℃の温度の熱水で洗浄し得る；次に洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨ約５〜７に中和し、次に真空留去し得る；次に反応生成物を１００℃で真空乾燥させ、乾燥した生成物を真空条件下で蒸気脱臭し、珪藻土を使用して約５０°〜６０℃でろ過する。
【０２７１】
本明細書に記載される方法によって生成される微生物油のヒドロキシル化は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，５９０，１１３号明細書（油性コーティング及びインク）；同第４，０４９，７２４号明細書（ヒドロキシル化プロセス）；同第６，１１３，９７１号明細書（オリーブ油バター）；同第４，９９２，１８９号明細書（潤滑剤及び潤滑添加剤）；同第５，５７６，０２７号明細書（ヒドロキシル化乳）；同第６，８６９，５９７号明細書（化粧品）。
【０２７２】
ヒドロキシル化したグリセロ脂質は、エストライドに変換することができる。エストライドはグリセロ脂質からなり、ここではヒドロキシル化脂肪酸構成要素が別の脂肪酸分子とエステル化されている。ヒドロキシル化グリセロ脂質からエストライドへの変換は、Ｉｓｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＯＣＳ  ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）により記載されるとおり、グリセロ脂質と脂肪酸との混合物を加温し、混合物を鉱酸に接触させることによって行われ得る。エストライドは、限定なしに以下に報告されるものを含めた、様々な用途において有用である：米国特許第７，１９６，１２４号明細書（エラストマー材料及び床仕上げ材）；同第５，４５８，７９５号明細書（高温用途の濃化油）；同第５，４５１，３３２号明細書（工業用途の流体）；同第５，４２７，７０４号明細書（燃料添加剤）；同第５，３８０，８９４号明細書（潤滑剤、グリース、可塑剤、及び印刷インク）。
【０２７３】
別のかかる化学的改変は、オレフィンメタセシスである。オレフィンメタセシスでは、触媒がアルケン（オレフィン）中のアルキリデン炭素を切り離し、その各々を異なるアルキリジン炭素と対にすることにより新しいアルケンを形成する。オレフィンメタセシス反応は、エテノリシスによるアルケンでの不飽和脂肪酸アルキル鎖の切断、自己メタセシスによるアルケン結合を介した脂肪酸の架橋結合、及び誘導体化アルケンとのクロスメタセシスによる脂肪酸に対する新しい官能基の導入などのプロセスに対する機構を提供する。
【０２７４】
エステル転移反応及び水素化などの他の反応と併せて、オレフィンメタセシスは、不飽和グリセロ脂質を多様な最終生成物に変えることができる。これらの生成物としては、ワックス用のグリセロ脂質オリゴマー；潤滑剤用の短鎖グリセロ脂質；化学品及びポリマー用のホモ及びヘテロ二官能性アルキル鎖；バイオ燃料用の短鎖エステル；及びジェット燃料用の短鎖炭化水素が挙げられる。オレフィンメタセシスは、トリアシルグリセロール及び脂肪酸誘導体に対し、例えば、米国特許第７，１１９，２１６号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１６０５０６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０／０１４５０８６号明細書に報告される触媒及び方法を用いて実施することができる。
【０２７５】
バイオ油のオレフィンメタセシスは、概して、不活性条件下において、他のアルケンの存在下（クロスメタセシス）又はその非存在下（自己メタセシス）で不飽和脂肪酸エステルに約１０〜２５０ｐｐｍの負荷でＲｕ触媒の溶液を添加することを含む。こうした反応は、典型的には数時間乃至数日間進行させて、最終的にある分布のアルケン生成物が得られる。オレフィンメタセシスを脂肪酸誘導体に対してどのように実施し得るかについての一例は、以下のとおりである：触媒負荷２２２ｐｐｍの第１世代グラブス触媒（ジクロロ［２（１−メチルエトキシ−α−Ｏ）フェニル］メチレン−α−Ｃ］（トリシクロヘキシルホスフィン）のトルエン中溶液を、脱気して乾燥させたオレイン酸メチルが入った容器に加え得る。次に容器を約６０ｐｓｉｇのエチレンガスで加圧し、約３０℃以下に３時間維持すると、それにより約５０％の収率のメチル９−デセノエートが生成され得る。
【０２７６】
本明細書に記載される方法によって生成される油のオレフィンメタセシスは、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１４２７号明細書（α−オレフィン脂肪酸）及び米国特許出願第１２／２８１，９３８号明細書（石油クリーム）、同第１２／２８１，９３１号明細書（ペイントボールガンカプセル）、同第１２／６５３，７４２号明細書（可塑剤及び潤滑剤）、同第１２／４２２，０９６号明細書（二官能性有機化合物）、及び同第１１／７９５，０５２号明細書（ロウソクワックス）。
【０２７７】
微生物油に対して実施することのできる他の化学反応としては、米国特許第６，０５１，５３９号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールをシクロプロパン化剤と反応させることにより流動性及び／又は酸化安定性を増進させること；米国特許第６，７７０，１０４号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールからワックスを製造すること；及び「エポキシ化トリアシルグリセロールのアクリル化速度論に及ぼす脂肪酸組成の影響（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，７９：１，５９−６３，（２００１）及びＦｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７：１，１０４−１１４（２００４）に報告されるとおり、トリアシルグリセロールのエポキシ化が挙げられる。
【０２７８】
上記に記載したとおりの燃料及び化学製品用の油含有微生物バイオマスの生成は、脱脂バイオマスミールの生成をもたらす。脱脂ミールは、藻類油の調製の副産物であり、家畜、例えば、反芻動物、家禽、ブタ及び水産養殖の動物用飼料として有用である。得られるミールは、含油量が低いものの、高品質タンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油及び動物用飼料に適切な他の栄養素をなお含有する。細胞は主に油分離過程で溶解されるため、脱脂ミールはかかる動物によって容易に消化可能である。脱脂ミールは場合により、動物用飼料中で穀物などの他の成分と組み合わされ得る。脱脂ミールは粉末状の稠度を有するため、エクストルーダ又はエキスパンダー又は市販の別のタイプの機械を使用してペレットに圧縮することができる。
【０２７９】
上記では本発明を詳細に記載したが、本発明は以下の例に例示される。これらの例は、特許請求される本発明を限定するのではなく、例示するために提供される。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：脂肪酸メチルエステル検出による脂肪酸分析
乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製した。２０〜４０ｍｇの乾燥バイオマスを２ｍＬのＭｅＯＨ中５％Ｈ２ＳＯ４に再懸濁し、適切な量の好適な内部標準（Ｃ１９：０）を含有する２００ｕｌのトルエンを添加した。この混合物を短時間超音波処理してバイオマスを分散させ、次に７０〜７５℃で３．５時間加熱した。２ｍＬのヘプタンを添加して脂肪酸メチルエステルを抽出し、続いて２ｍＬの６％Ｋ２ＣＯ３（水溶液）を添加して酸を中和した。混合物を激しく撹拌し、標準ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ（脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出）法を用いるガスクロマトグラフィー分析のため、上層の一部を、Ｎａ２ＳＯ４（無水）が入ったバイアルに移した。以下に報告する脂肪酸プロフィールは、この方法によって決定した。
【０２８１】
実施例２：脂肪酸及びｓｎ−２プロフィールのため微生物を操作すると、外因性ＬＰＡＡＴ発現を介してラウリン酸が増加した
この例では、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ  １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＣＮ  ＬＰＡＡＴ）酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィール及びｓｎ−２プロフィールにおいてラウリン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
【０２８２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ａを、初めに、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物ｐＳＺ１２８３で形質転換した。本明細書により参照によって援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるｐＳＺ１２８３は、Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦＡＴＢ２（ＣｗＴＥ２）チオエステラーゼのコード配列（配列番号１０）、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。配列番号１１に示されるタンパク質配列を発現するＣｗＴＥ２タンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。ＣｗＴＥ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
【０２８３】
ｐＳＺ１２８３を株Ａに形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。次に一次形質転換体をクローン精製し、単一の形質転換体、株Ｂを、さらなる遺伝子改変用に選択した。この遺伝子操作株をプラスミド構築物ｐＳＺ２０４６で形質転換して株ＢのｐＬｏｏｐゲノム遺伝子座に割り込ませた。構築物ｐＳＺ２０４６は、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ  １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｃｎ  ＬＰＡＡＴ）酵素のコード配列（配列番号１２）、核ゲノムへの組み込み用のｐＬｏｏｐゲノム領域に対する５’（配列番号１３）及び３’（配列番号１４）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。Ｃｎ  ＬＰＡＡＴタンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｃｎ  ＬＰＡＡＴ及びＮｅｏＲのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。Ｃｎ  ＬＰＡＡＴのアミノ酸配列を、配列番号１６として提供する。
【０２８４】
ｐＳＺ２０４６を株Ｂに形質転換し、それにより株Ｃを作成した後、Ｇ４１８（ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））を含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な条件下、ｐＨ７．０で成長させた。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析した。単一炭素源としてグルコース上で成長させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５（Ｕ１）、非形質転換株Ｂ及び５つのｐＳＺ２０４６陽性形質転換体（株Ｃ、１〜５）の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表１０に提供する。
【０２８５】
【表１０】
2018512851.tif 000013
【０２８６】
表１０に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、非形質転換ＵＴＥＸ  １４３５株の脂肪酸プロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の組成の増加並びにＣ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわち株ＢにおけるＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさらに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少であるが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はない。これらのデータは、微生物宿主生物との関連においてＣｎＬＰＡＡＴが基質選択性を示すことを示している。
【０２８７】
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、０．５％未満のＣ１２脂肪酸及び１％未満のＣ１０〜Ｃ１２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる。対照的に、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、３１％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸が全脂肪酸の３６％超含まれた。さらに、高等植物チオエステラーゼ及びＣｎＬＰＡＡＴ酵素を発現する株Ｃの脂肪酸プロフィールは、４５．６７％〜４６．６３％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２％脂肪酸が全脂肪酸の７１〜７３％含まれた。外因性チオエステラーゼが発現した結果は、操作された微生物中に存在するＣ１２脂肪酸の割合の６２倍の増加であった。外因性チオエステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴが発現した結果は、操作された微生物中に存在するＣ１２脂肪酸の割合の９２倍の増加であった。
【０２８８】
株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油サンプルのＴＡＧ画分を、それらのトリアシルグリセリドのｓｎ−２プロフィールについて分析した。ＴＡＧを抽出して処理し、実施例１のとおり分析した。株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油のＴＡＧ画分の脂肪酸組成及びｓｎ−２プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表１１に提供する。報告されない値は「ｎ．ｒ．」と指示される。
【０２８９】
【表１１】
2018512851.tif 000014
【０２９０】
表１１に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂから単離したトリグリセリド（ＴＡＧ）の脂肪酸組成は、非形質転換株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸プロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸について増加し、Ｃ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸が減少した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわちＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさらに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少であったが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はなかった。これらのデータは、外因性ＣｎＬＰＡＡＴの発現により形質転換微生物の中鎖脂肪酸プロフィールが向上することを示している。
【０２９１】
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、約０．６％  Ｃ１４、約１．６％  Ｃ１６：０、約０．３％  Ｃ１８：０、約９０％  Ｃ１８：１、及び約５．８％  Ｃ１８：２のｓｎ−２プロフィールによって特徴付けられる。株Ａと対照的に、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株Ｂは、中鎖脂肪酸が高く、長鎖脂肪酸が低いｓｎ−２プロフィールによって特徴付けられる。Ｃ１２脂肪酸は株Ｂのｓｎ−２プロフィールの２５％を含んだ。形質転換株のｓｎ−２プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわちＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１２脂肪酸のさらに一層の増加（２５％から５２．８％）、Ｃ１８：１脂肪酸の減少（３６．６％から１７．５％）、及びＣ１０：０脂肪酸の減少であった（株Ｂ及び株ＣについてＣ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸のｓｎ−２プロフィール組成は比較的類似していた）。
【０２９２】
これらのデータは、外因性ＬＰＡＡＴ発現によって操作微生物の脂肪酸プロフィールを変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細には微生物細胞中のＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の濃度を増加させることにおける有用性及び有効性を実証している。これらのデータは、さらに、外因性チオエステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴ発現によって微生物細胞が産生するＴＡＧのｓｎ−２プロフィールを変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細にはｓｎ−２プロフィールのＣ１２組成を増加させ、且つｓｎ−２プロフィールのＣ１８：１組成を減少させることにおける有用性及び有効性を実証している。
【０２９３】
実施例３：位置特異的プロフィールの分析
ＡＰＣＩ源を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ  ８０３０トリプル四重極型質量分析器と結合したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ超高速液体クロマトグラフィー装置（ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラー、２つのＬＣ−３０ＡＤポンプ、ＤＧＵ−２０Ａ５インラインデガッサー、及びＣＴＯ−２０Ａカラムオーブンを含む）を使用して、ＬＣ／ＭＳ  ＴＡＧ分布解析を実施した。データは、ｍ／ｚ  ３５０〜１０５０のＱ３スキャンを使用し、陽イオンモードにおいて１４２８ｕ／秒の走査速度で、ＣＩＤガス（アルゴン）圧力を２３０ＫＰａに設定して取得した。ＡＰＣＩ、脱溶媒和ライン、及びヒートブロックの温度はそれぞれ３００、２５０、及び２００℃に設定し、噴霧ガス及び乾燥ガスの流速はそれぞれ３．０Ｌ／分及び５．０Ｌ／分であり、及び界面電圧は４５００Ｖであった。油サンプルを、濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるようにジクロロメタン−メタノール（１：１）中に溶解し、０．８μＬのサンプルを、３０℃に維持したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＸＲ−ＯＤＳ  ＩＩＩ（２．２μｍ、２．０×２００ｍｍ）に注入した。クロマトグラフ分離には、０．４８ｍＬ／分で２７分間の３０％ジクロロメタン−２−プロパノール（１：１）／アセトニトリルから５１％ジクロロメタン−２−プロパノール（１：１）／アセトニトリルに至る直線勾配を使用した。
【０２９４】
実施例４：エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣＯＡシンターゼの過剰発現によってエルカ酸の産生を増加させるための微生物の操作
本発明の実施形態において、場合によりプラスチドの油産生微生物で外因性エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する働きをする組換えポリヌクレオチド形質転換ベクターを構築し、それを利用して、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換法によりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を形質転換し、エルカ酸の産生が増加した細胞を得る。形質転換ベクターは、表８に掲載するようなエロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、外来遺伝子の発現を調節するプロモーター及び３’ＵＴＲ制御配列、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）核ゲノムへの組み込み用の組換えポリヌクレオチドを標的化する５’及び３’相同組換え標的配列、並びに選択可能なマーカーを発現する働きをするヌクレオチドを含む。形質転換ベクターのタンパク質コード配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）での発現用にコドンを最適化する。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）での発現用に働くプロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に開示される。
【０２９５】
形質転換ベクターをＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に、又はＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的な突然変異誘発株に形質転換した後、寒天プレート上で陽性クローンを選択する。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で培養する。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおり脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析する。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のエルカ酸の増加を呈し得る。
【０２９６】
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２株（Ｄ１５２０Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加と、付随するＣ１８：１及びＣ１８：２の減少を示す。トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ３株（Ｄ１５２１Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加と、付随するＣ１８：１の減少を示す。これらのトランスジェニック系におけるＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴの発現は、一般に中鎖脂肪酸の、特にラウリン酸の蓄積が増加する直接の原因であるものと思われる。トランスジェニック系は、より長鎖の脂肪酸（Ｃ１６：０以上）から中鎖脂肪酸へのシフトを示すが、このシフトは主にＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸が標的となり、Ｃ１４：０脂肪酸に対する効果は僅かである。提供されるデータはまた、Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３由来のＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子と、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のＦＡＴＢ２（株Ｂの株で発現する）との共発現が、Ｃ１２：０脂肪酸の蓄積に対して相加効果を有することも示している。
【０２９７】
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ  １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３のＬＰＡＡＴ酵素が活性であることを示唆している。これらの結果はまた、この酵素が、株Ｂで発現する異種性ＦａｔＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素（これはＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉに由来する）と共に機能することも示している。
【０２９８】
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘ株（Ｄ１５４２Ａ〜Ｅ）は、親の株Ｂと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な減少と、付随するＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２の増加を示す。これらのトランスジェニック系におけるＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘ遺伝子の発現は、中鎖脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ１４）の蓄積減少及びＣ１６：０及びＣ１８脂肪酸の蓄積増加の直接の原因であるものと思われ、最も顕著な増加はパルミチン酸（Ｃ１６：０）で観察された。提供されるデータはまた、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来の中鎖特異的ＦＡＴＢ２（株Ｂに存在する）の発現にも関わらず、ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘの発現がＴＡＧへのより長鎖の脂肪酸の取り込みに有利であるように見えることも示している。
【０２９９】
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ  １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３のＬＰＡＡＴｘ酵素が活性であることを示唆している。中鎖脂肪酸レベルを増加させるＣｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３とは対照的に、ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘはＣ１６：０及びＣ１８：０レベルの増加をもたらす。これらの結果は、ＣｕＰＳＲ２３に由来する異なるＬＰＡＡＴ（ＬＰＡＡＴ２、ＬＰＡＡＴ３、及びＬＰＡＡＴｘ）が、全体的な脂肪酸レベルに対するそれらの効果により判断するとき、株Ｂにおいて異なる脂肪酸特異性を呈することを示している。
【０３００】
実施例５：エイコセン酸及びエルカ酸脂肪酸の生成
この例では、本発明者らは、Ｃｒａｍｂｌｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（ＣａＦＡＥ、寄託番号ＡＹ７９３５４９）、Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ（ＬａＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７７）、及びＣａｒｄａｍｉｎｅ  ｇｒａｅｃａ（ＣｇＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７８）由来の、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）としても知られる異種脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子の発現が、ＵＴＥＸ  １４３５の古典的突然変異誘発誘導体、株Ｚにおいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）などの極めて長鎖の一価不飽和脂肪酸の産生をもたらすことを示す。他方でＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ由来の推定ＦＡＥ遺伝子（ＴｍＦＡＥ、ＡＢＤ７７０９７）及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ由来の２つのＦＡＥ遺伝子（ＢｎＦＡＥ１、ＡＡＡ９６０５４及びＢｎＦＡＥ２、ＡＡＴ６５２０６）は、株Ｚにおいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）の中程度の増加をもたらした一方、検出可能なエルカ酸を産生しなかった。興味深いことに、株ＺにおけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られる不飽和脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸（２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。全ての遺伝子は、ＵＴＥＸ  １４３５コドン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した。これらの結果は、ＣａＦＡＥ、ＬａＦＡＥ又はＣｇＦＡＥ遺伝子が、エイコセン酸及びエルカ酸含有量を向上させる特異な能力によって、一価不飽和及び飽和アシル基質を利用する超長鎖の生合成に関与する縮合酵素をコードすることを示唆している。
【０３０１】
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５株の株Ｚ）におけるＣｒａｍｂｌｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ脂肪酸エロンガーゼ（ＣａＦＡＥ）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ３０７０］：この例では、構築物ｐＳＺ３０７０で形質転換された株、株Ｚを作成し、これはショ糖インベルターゼ（ショ糖を含有する培地上でのその選択及び成長を可能にする）及びＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＦＡＥ遺伝子を発現する。株Ｚにおける発現のため導入された構築物ｐＳＺ３０７０は、６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓとして表すことができる。
【０３０２】
形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物における関連する制限部位を小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによる６Ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ｚ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字のイタリックにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在性ＡＭＴ３プロモーターが続く。ＣａＦＡＥのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ｚ  ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０３０３】
プラスミドｐＳＺ３０７０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化２】
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【化３】
2018512851.tif 000016
【化４】
2018512851.tif 000017
【０３０４】
株Ｚにおける高等植物由来のＦＡＥ遺伝子の発現に使用される構築物：ＣａＦＡＥ遺伝子（ｐＳＺ３０７０）に加え、Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ由来のＬａＦＡＥ（ｐＳＺ３０７１）、Ｃａｒｄａｍｉｎｅ  ｇｒａｅｃａ由来のＣｇＦＡＥ（ｐＳＺ３０７２）、Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ  ＴｍＦＡＥ（ｐＳＺ３０６７）及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ由来のＢｎＦＡＥ１（ｐＳＺ３０６８）及びＢｎＦＡＥ２（ｐＳＺ３０６９）遺伝子を、株Ｚにおける発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり表すことができる：
ｐＳＺ３０７１−  ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＬａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０７２−  ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣｇＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６７−  ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＴｍＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６８−  ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＢｎＦＡＥ１−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６９−  ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＢｎＦＡＥ２−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
【０３０５】
これらの構築物は全て、ｐＳＺ３０７０と同じベクター骨格、すなわち選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、それぞれのＦＡＥ遺伝子のみが異なる。これらの構築物における関連する制限部位もまた、ｐＳＺ３０７０と同じである。ＬａＦＡＥ、ＣｇＦＡＥ、ＴｍＦＡＥ、ＢｎＦＡＥ１及びＢｎＦＡＥ２の配列を以下に示す。ＳｐｅＩ及びＡｆｌＩＩを含む太字テキストのとおりの関連する制限部位を、それぞれ５’−３’で示す。
【０３０６】
ｐＳＺ３０７１に含まれるＬａＦＡＥのヌクレオチド配列：
【化５】
2018512851.tif 000018
【０３０７】
ｐＳＺ３０７２に含まれるＣｇＦＡＥのヌクレオチド配列：
【化６】
2018512851.tif 000019
【０３０８】
ｐＳＺ３０６７に含まれるＴｍＦＡＥのヌクレオチド配列：
【化７】
2018512851.tif 000020
【０３０９】
ｐＳＺ３０６８に含まれるＢｎＦＡＥ１のヌクレオチド配列：
【化８】
2018512851.tif 000021
【０３１０】
ｐＳＺ３０６９に含まれるＢｎＦＡＥ２のヌクレオチド配列：
【化９】
2018512851.tif 000022
【０３１１】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、ＰｍＡＭＴ３プロモーターにより駆動される、様々な異種ＦＡＥ遺伝子を含む上記の構築物を、独立して株Ｚに形質転換した。
【０３１２】
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ７．０で成長させた（いずれのプラスミドも、ｐＨ調節性ＰｍＡＭＴ０３プロモーターにより駆動されるとき、ＦＡＥ遺伝子発現の最大発現を可能にするためにはｐＨ７．０での成長を必要とする）。ｐＳＺ３０７０、ｐＳＺ３０７１、ｐＳＺ３０７２、ｐＳＺ３０６７、ｐＳＺ３０６８及びｐＳＺ３０６９によって株Ｚに形質転換することにより生じる一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ以下の表１２〜表１７に示す。
【０３１３】
異種ＦＡＥ遺伝子を発現するトランスジェニック株Ｚの株全てが、Ｃ２０：１及びＣ２２：１脂肪酸の蓄積増加を示す（表１２〜表１７を参照のこと）。野生型と比べたエイコセン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）のレベル増加は、一貫して野生型のレベルより高い。加えて、株ＺにおけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られた不飽和脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。株Ｚで発現した前述のＦＡＥのタンパク質アラインメントを図に示す。
【０３１４】
【表１２】
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【０３１５】
【表１３】
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【０３１６】
【表１４】
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【０３１７】
【表１５】
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【０３１８】
【表１６】
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【０３１９】
【表１７】
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【０３２０】
実施例６：Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現によるＵＴＥＸ１４３５におけるＴＡＧ位置特異性
本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５誘導株Ｓ２０１４におけるＣｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３（ＣｕＰＳＲ２３）由来の２個の異なる１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現が、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸レベルの上昇をもたらしたことを実証した。本例では、本発明者らは、Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２がＴＡＧにおけるｓｎ−２位でのＣ１０：０脂肪酸組み込みに対して高い特異性を呈することのエビデンスを提供する。Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ３は、ＴＡＧにおけるｓｎ−２位にＣ１８：２脂肪酸を特異的に組み込む。
【０３２１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）トランスジェニック株Ｂの組成及び特性、それぞれＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子を発現する形質転換ベクターｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ２３００、及びそれらの配列は、既に記載している。
【０３２２】
Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ遺伝子が得られる脂肪酸プロフィールに及ぼす影響を決定するため、本発明者らは、比較的高いレベルで中鎖及び長鎖脂肪酸の両方を合成する株Ｂを利用している。表１８に示すとおり、株ＢにおけるＬＰＡＡＴ２遺伝子（Ｄ１５２０）の発現は、Ｃ１０〜Ｃ１２：０レベルの（最良の株、Ｄ１５２０．３〜７で最大１２％の）増加をもたらしたことから、このＬＰＡＡＴが中鎖脂肪酸に特異的であることが示唆される。或いは、ＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現が比較的控えめな（最良の株、Ｄ１５２１．２８〜７で最大５％の）増加をもたらしたことから、中鎖レベルへの影響がほとんど又は全くないことが示される。
【０３２３】
【表１８】
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【０３２４】
Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ遺伝子の発現がｓｎ−２位における脂肪酸の位置特異性に影響を及ぼしたかどうかを決定するため、本発明者らは、ブタ膵リパーゼ法を利用して代表的なＤ１５２０及びＤ１５２１株のＴＡＧを分析した。表１９に示すとおり、Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２遺伝子はＣ１０：０脂肪酸に対して顕著な特異性を示し、ｓｎ−２位に５０％多いＣ１０：０脂肪酸を組み込むように見える。Ｃｕｐｈｅａ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ３遺伝子はＣ１８：２脂肪酸にのみ作用してｓｎ−２位へのＣ１８：２脂肪酸の再分布をもたらすように見える。従って、対応する特異性を有する外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を導入することにより、１５％又は２０％超のＣ１０：０又はＣ１８：２脂肪酸のｓｎ−２プロフィールを有する微生物トリグリセリド油を得ることが可能である。
【０３２５】
【表１９】
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【０３２６】
実施例７：脂質産生と同期して油産生細胞における遺伝子発現レベルを条件的に制御する一組の調節可能なプロモーター
Δｆａｄ２系、Ｓ２５３２においてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＦＡＴＡ１の両方のコピー（ＰＭＦＡＴＡ１）をノックアウトし、同時に内在性ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させることによりＳ５２０４を作成した。Ｓ２５３２それ自体はＦＡＤ２（ＦＡＤｃとしても知られる）二重ノックアウト株であり、先に、ＦＡＤ２遺伝子座においてＣｒＴＵＢ２プロモーターの制御下でＣ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  ＡＣＰチオエステラーゼ（寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）をＳ１３３１に挿入することにより作成された。Ｓ５２０４及びその親Ｓ２５３２は内在性ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の破壊を有するためΔ１２特異的デサチュラーゼ活性がなく、これはシード段階及び脂質産生段階の両方で０％のＣ１８：２（リノール酸）レベルとして現れる。Ｓ５２０４（及びその親Ｓ２５３２）にはＣ１８：２が全くないため成長不良となり、これはシード段階でリノール酸を外因的に添加することによって部分的に軽減し得る。しかしながら、ゼロリノール酸油の工業的応用には、リノール酸の外因的な添加はコストの増加を伴う。本発明者らは先に、Ｓ５２０４（及び他のΔｆａｄ２株Ｓ２５３０及びＳ２５３２）をｐＨ誘導性ＡＭＴ０３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完することにより、いかなるリノール酸も補足することなしにｐＨ７．０でＣ１８：２が野生型レベルに回復し、またシード段階の間の成長特性のレスキューももたらされることを示している。さらに、続いてｐＨ７．０で成長させた補完系のシードを、ｐＨが（ＡＭＴ０３駆動ＦＡＤ２タンパク質レベルを制御するため）５．０に調整された低窒素脂質産生フラスコに移したとき、得られる最終的な油プロフィールは親Ｓ５２０４又はＳ２５３２プロフィールと一致して、ゼロリノール酸レベルながら成長及び生産性の尺度がレスキューされる。従って本質的にはＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２−１によって、本発明者らは、所望の用途に応じた各種リノール酸レベルを有する油の作成に使用し得る可能性のあるｐＨ調節可能な株を開発している。
【０３２７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは発酵槽において最初の２４〜３０時間で急速な細胞分裂を起こした後、培地中の窒素を使い尽くし、細胞は脂質の貯蔵に切り換わる。発酵槽におけるこの初期の細胞分裂及び成長は株の全体的な生産性に重要であり、上記に報告したとおり、ＦＡＤ２タンパク質が、特定の株の持続的な力強い成長特性に決定的である。しかしながら、第一世代、単一の挿入の、遺伝的にクリーンなＰｍＦＡＤ２−１補完株（Ｓ４６９４及びＳ４６９５）のランを７Ｌ発酵槽においてｐＨ５．０で行ったとき（シードはｐＨ７．０で成長させた）、そのパフォーマンスは生産性の点で元の親基本株（Ｓ１３３１）と同等ではなかった。ウエスタンデータから、発酵槽ではＰｍＦＡＤ２−１を駆動するＡＭＴ０３ｐプロモーターが（ＦＡＤ２タンパク質レベルによって測定したとき）発酵槽のｐＨ（５．０又は７．０）に関係なく０〜３０時間の間に重度に下方調節されることが示唆された。発酵条件を動かすと（バッチ式対非バッチ式／制限的な初期Ｎ、産生期間中の種々の時点における７から５へのｐＨシフト）、初期脂質産生中の窒素の最初のバッチ（及び過剰量）が、発酵槽におけるＡＭＴ０３ｐプロモーター下方調節の原因である可能性が高かったことが示唆された。実際、ＡＭＴ０３のこの初期の抑制は、発酵中の転写物の経時的変化に直接見ることができる。Ａｍｔ０３発現の大幅な抑制がランの初期に観察されており、これは発酵槽中のＮＨ４レベルに直接対応する。
【０３２８】
制限Ｎで発酵を実施したとき、本発明者らはＡＭＴ０３ｐプロモーター活性を部分的にレスキューすることが可能であったとともに、Ｓ４６９４／Ｓ４６９５の細胞当たりの生産性は親Ｓ１３３１と同等であったが、全体的な生産性はなおも遅れを取っていた。これらの結果から、最適以下の又は不活性なＡＭＴ０３ｐプロモーター、従って発酵初期段階におけるＦＡＤ２タンパク質の制限によって、任意の補完株がその完全な成長能力及び全体的生産性の達成を阻まれることが示唆される。ここで本発明者らは、高窒素成長期間と低窒素脂質産生期間との間で示差的な遺伝子活性を可能にする新規の改良されたプロモーターを同定する。
【０３２９】
詳細には、本発明者らは以下を観察した。
・トランスクリプトームベースのバイオインフォマティクス手法を用いて同定された下方調節プロモーターエレメントの制御下におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来の脂肪酸デサチュラーゼ−２遺伝子（ＰｍＦａｄ２−１）のトランス発現では、ＰｍＦＡＤ２−１の機能的補完がもたらされ、Δｆａｄ２、Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４の成長が回復する。
・ロバストな成長表現型として現れるＳ５２０４の補完は、シード段階及び初期発酵段階において新規プロモーターエレメントが活性でＰｍＦＡＤ２−１の発現を駆動しているときにのみ起こる。
・細胞が活性脂質産生期間に入ると（およそ発酵槽においてＮが使い尽くされた時点）、新規に同定されたプロモーターは下方調節され、それ以上のＦＡＤ２タンパク質をもたらさず、補完系の最終的な油プロフィールは、成長特性がより良好ではあるが、親Ｓ５２０４と同じである。
・これらの株は、初期の補完株においてＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２で直面した問題を潜在的に軽減するはずである。
・重要なことには、本発明者らは、様々な強さの下方調節可能なプロモーターを同定しており、そのうちのいくつかは初めは比較的強力で、ランの残りの間は低度乃至中程度のレベルが提供される。従って、表現型に応じてこれらのプロモーターを選択し、所望の導入遺伝子レベルを微調整することができる。
【０３３０】
バイオインフォマティクス方法：典型的な発酵槽ランの間の８時点で採取した細胞からＲＮＡを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑでのラン用にＲＮＡをポリＡ選択した。Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンドデータ（１００ｂｐリード×２、約６００ｂｐ断片サイズ）を収集し、ＦａｓｔＱＣ［ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／］を使用してリードクオリティについて処理した。リードのデュプリケートを除去し、クオリティトリミングし、及び長さをトリミングするカスタムリード処理パイプラインを用いてリードをランにかけた。
【０３３１】
Ｏａｓｅｓ／ｖｅｌｖｅｔ［Ｖｅｌｖｅｔ：ド・ブラングラフを使用したデノボショートリードアセンブルのためのアルゴリズム（Ｖｅｌｖｅｔ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈｓ）．Ｄ．Ｒ．Ｚｅｒｂｉｎｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｂｉｒｎｅｙ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：８２１−８２９］を使用してＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドリードから転写物をアセンブルし、Ｎ５０及び他の尺度で評価した。ＣＤ−Ｈｉｔを使用して全８時点の転写物をさらに縮小（ｃｏｌｌａｐｓｅ）した。［Ｌｉｍｉｎ  Ｆｕ，Ｂｅｉｆａｎｇ  Ｎｉｕ，Ｚｈｅｎｇｗｅｉ  Ｚｈｕ，Ｓｉｔａｏ  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｅｉｚｈｏｎｇ  Ｌｉ，「ＣＤ−ＨＩＴ：次世代シーケンシングデータのクラスタリングに向けて加速される（ＣＤ−ＨＩＴ：ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｆｏｒ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２０１２），２８（２３）：３１５０−３１５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ５６５；「Ｃｄ−ｈｉｔ：大規模タンパク質又はヌクレオチド配列セットのクラスタリング及び比較のための高速プログラム（Ｃｄ−ｈｉｔ：ａ  ｆａｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」，Ｗｅｉｚｈｏｎｇ  Ｌｉ  ＆  Ａｄａｍ  Ｇｏｄｚｉｋ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２００６）２２：１６５８−９］。
【０３３２】
これらの転写物を発現レベル解析の基本（参照アセンブリ）として使用した。ローリードカウント並びに転写物百万分率（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ：ＴＰＭ）で提供される正規化値を提供するＲＳＥＭを使用して８つの時点からのリードを解析した。［Ｌｉ，Ｂｏ  ＆  Ｄｅｗｅｙ，Ｃｏｌｉｎ  Ｎ．（２０１１）．「ＲＳＥＭ：参照ゲノム有り又は無しでのＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの転写物定量化を加速させる（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」，ＢｉｏＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ．ウェブサイトｗｗｗ．ｔｅｍｏａ．ｉｎｆｏ／ｎｏｄｅ／４４１６１４のｔｅｍｏａ：Ｏｐｅｎ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＯＥＲ）Ｐｏｒｔａｌから２０１２年１０月１０日に検索］。ＴＰＭを使用して発現レベルを決定した。先に強力なプロモーターのスクリーニングで同定された遺伝子もまた使用して、どのレベルを有意に高い又は低いと見なすべきかを判断した。このデータをＰｏｓｔｇｒｅｓデータベースにロードし、遺伝子機能及び他の特性、例えば発現プロファイルに基づく分類を含む統合データと共にＳｐｏｔｆｉｒｅで視覚化した。これにより、発現が顕著に変化する遺伝子の迅速な且つ標的化した解析が可能となった。
【０３３３】
本発明者らが選択した遺伝子用プロモーターを、Ｓ３７６（本発明者らの参照Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株）のハイクオリティ参照ゲノムにマッピングした。簡潔に言えば、ＰａｃＢｉｏロングリード（約２ｋｂ）をハイクオリティＰａｃＢｉｏ  ＣＣＳリード（約６００ｂｐ）によってエラー修正し、ＳＭＲＴＰｉｐｅ［ｐａｃｂｉｏｄｅｖｎｅｔ．ｃｏｍ］のＡｌｌｏｒａアセンブラを使用してアセンブルした。この参照ゲノムをトランスクリプトームリードマッピングと併せて使用して正確な遺伝子構造、プロモーター及びＵＴＲ位置、及び目的領域内にあるプロモーターエレメントをアノテートし、次にはこれが、さらなる配列決定及びプロモーターエレメント選択をガイドした。
【０３３４】
新規プロモーターエレメントを同定するために使用した基準は、以下であった。
１．シード段階及び初期脂質産生段階（Ｔ０〜Ｔ３０時間）における下流遺伝子の妥当な発現（例えば、＞５００、＜１００、又は＜５０転写物百万分率［ＴＰＭ］）
２．発酵槽で窒素が枯渇したときの上記遺伝子の重度の下方調節（例えば、＞５倍、１０倍、又は１５倍）。
３．プロモーターエレメントのｐＨ中立性（例えば、培養条件がｐＨ５．０から７．０に移ったときのＴＰＭ変化が２倍未満）、又は少なくとも、ｐＨ５条件下での有効な作動。
【０３３５】
上述の基準を用いて、本発明者らは、いくつかの潜在的に下方調節されるプロモーターエレメントを同定し、最終的にＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２−１発現の駆動にそれらを使用した。種々のプロモーターを選択し、それらには、弱いプロモーターとして始まり極端に低いレベルまで下がるものから、非常に高く始まってやや低いレベルまでしか落ちないものまでが含まれた。このようにしたのは、ロバストな成長を支持するために初期のＦＡＤ２にどの程度の発現が必要になるのか、及びゼロリノール酸表現型を達成するために脂質産生期間中に要求されるＦＡＤ２がどの程度の少なさであるのかが、先験的に不明であったためである。
【０３３６】
スクリーニングに選択したプロモーターエレメント及びそれらの対立形質は、それらの下流遺伝子にちなんで命名し、以下のとおりである。
１．カルバモイルリン酸シンターゼ（ＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐ）
２．ジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＰｍＤＰＳ１ｐ及びＰｍＤＰＳ２ｐ）
３．無機ピロホスファターゼ（ＰｍＩＰＰ１ｐ）
４．アデノシルホモシステイナーゼ（ＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐ）
５．ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰｍＰＰＩ１ｐ及びＰｍＰＰＩ２ｐ）
６．ＧＭＰシンテターゼ（ＰｍＧＭＰＳ１ｐ及びＰｍＧＭＰＳ２ｐ）
７．グルタミン酸シンターゼ（ＰｍＧＳｐ）
８．クエン酸シンターゼ（ＰｍＣＳ１ｐ及びＰｍＣＳ２ｐ）
９．γグルタミルヒドロラーゼ（ＰｍＧＧＨ１ｐ）
１０．アセトヒドロキシ酸イソメラーゼ（ＰｍＡＨＩ１ｐ及びＰｍＡＨＩ２ｐ）
１１．システインエンドペプチダーゼ（ＰｍＣＥＰ１ｐ）
１２．脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１ｐ及びＰｍＦａｄ２−２ｐ）［対照］
【０３３７】
２つの代表的な遺伝子、即ちＰｍＩＰＰ（無機ピロホスファターゼ）及びＰｍＡＨＣ（アデノシルホモシステイナーゼ）の転写物プロフィールは極めて強力に始まり（４０００〜５０００ＴＰＭ）、しかし細胞が活性脂質産生に入ると、そのレベルは急速に下降する。ＰｍＩＰＰの転写物レベルはほぼ０ＴＰＭまで下落するが、ＰｍＡＨＣのレベルは約２５０ＴＰＭまで下落した後、残りの発酵にわたりそのまま留まる。他のプロモーターは全て（それらの下流遺伝子転写物レベルに基づけば）、同様の下方発現プロファイルを示した。
【０３３８】
エレメントをＰＣＲ増幅し、可能ならば対立遺伝子のプロモーターを同定し、クローニングし、それに従い命名し、例えばカルバモイルリン酸シンターゼの２つの遺伝子のプロモーターエレメントはＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐと命名した。比較としてＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２のプロモーターエレメントもまた増幅し、ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の駆動に使用した。一方、本例では、本発明者らはＦＡＤ２−１発現、従ってＣ１８：２レベルを使用して新規に同定される下方調節されるプロモーターを調べた（原則的にこれらのプロモーターエレメントは任意の目的遺伝子の下方調節に使用することができる）。
【０３３９】
Δｆａｄ２株Ｓ５２０４におけるＰｍＣＰＳ１ｐの発現下でのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ３３７７］：Δｆａｄ２Δｆａｔａ１  Ｓ５２０４株を構築物ｐＳＺ３３７７で形質転換した。この形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ３３７７（６Ｓ：：ＰｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｆＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ  １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメリビアーゼ（ＳｃＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ  １４３５由来のヘキソース輸送体（ＨＸＴ１）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＵＴＥＸ  １４３５  ＣＰＳ１ｐプロモーターが続く。ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ  １４３５  ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０３４０】
ｐＳＺ３３７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１０】
2018512851.tif 000031
【化１１】
2018512851.tif 000032
【化１２】
2018512851.tif 000033
【０３４１】
構築物ｐＳＺ３３７７におけるＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ間の組換えはトランスジェニック系においてＰｍＦＡＤ２−１の複数のコピーをもたらし、次にはこれが、最も高い可能性としては発酵終了時により高いＣ１８：２レベルとして現れ得る。目標は０％最終Ｃ１８：２の株を作り出すことであったため、本発明者らはこの組換えを回避する予防策を講じた。別のバージョンの上記プラスミドＳｃＭＥＬ１遺伝子は、後ろにＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ３’ＵＴＲの代わりにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）伸長因子１ａ（ＣｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲが続いた。構築物ｐＳＺ３３８４及びこの３’ＵＴＲを有する他の構築物（以下に記載される）で使用されるＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）伸長因子１ａ（ＣｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲの配列を以下に示す。プラスミドｐＳＺ３３８４は、６Ｓ：：ＰｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｐＥＦ１ａ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓと表すことができる。
【０３４２】
ｐＳＺ３３８４におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  （ＵＴＥＸ  ２５０）伸長因子１ａ  （ＣｐＥＦ１ａ）  ３’ＵＴＲのヌクレオチド配列：
【化１３】
2018512851.tif 000034
【０３４３】
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）伸長因子１ａ  ３’ＵＴＲ配列は、５’末端側に制限部位ＳｎａＢＩ及び３’末端側にＥｃｏＲＶ（小文字、太字の下線テキストで示される）が隣接する。ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣｐＥＦ１ａ  ３’ＵＴＲを含むプラスミド（ｐＳＺ３３８４及び以下に記載する他のもの）は、５’ＳｎａＢＩ部位の前に１０個の追加的なヌクレオチドを含むことが注記される。これらのヌクレオチドは、Ｓ．ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを含むプラスミドには存在しない。
【０３４４】
上記に記載する組換えＣｖＮＲ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ又は非組換えＣｐＥＦ１ａ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ発現ユニットのいずれかを発現するプラスミドｐＳＺ３３７７及びｐＳＺ３３８４に加えて、上述の他のプロモーターエレメントを使用するプラスミドをＳ５２０４での発現用に構築した。これらの構築物は、それらの形質転換識別名（Ｄ番号）と共に、以下のとおり記載することができる。
【０３４５】
【表２０】
2018512851.tif 000035
【０３４６】
上記の構築物は、ＰｍＦＡＤ２−１を駆動するプロモーターエレメントを除き、ｐＳＺ３３７７又はｐＳＺ３３８４と同じである。上記の構築物に使用した種々のプロモーターエレメントの配列を以下に示す。
【０３４７】
プラスミドｐＳＺ３３７８及びｐＳＺ３３８５に含まれるカルバモイルリン酸シンターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＰＳ２ｐプロモーター配列）：
【化１４】
2018512851.tif 000036
【０３４８】
プラスミドｐＳＺ３３７９及びｐＳＺ３３８６に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰＳ１ｐプロモーター配列）：
【化１５】
2018512851.tif 000037
【０３４９】
プラスミドｐＳＺ３３８０及びｐＳＺ３３８７に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰＳ２ｐプロモーター配列）：
【化１６】
2018512851.tif 000038
【０３５０】
プラスミドｐＳＺ３４８０及びｐＳＺ３４８１に含まれる無機ピロホスファターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＩＰＰ１ｐプロモーター配列）：
【化１７】
2018512851.tif 000039
【０３５１】
プラスミドｐＳＺ３５０９及びｐＳＺ３５１６に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ１ｐプロモーター配列）：
【化１８】
2018512851.tif 000040
【０３５２】
プラスミドｐＳＺ３５１０に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ２ｐプロモーター配列）：
【化１９】
2018512851.tif 000041
【０３５３】
プラスミドｐＳＺ３５１３及びｐＳＺ３６８９に含まれるペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ１ｐプロモーター配列）：
【化２０】
2018512851.tif 000042
【０３５４】
プラスミドｐＳＺ３５１４及びｐＳＺ３５１８に含まれるペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ２ｐプロモーター配列）：
【化２１】
2018512851.tif 000043
【０３５５】
プラスミドｐＳＺ３５１５及びｐＳＺ３５１９に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ１ｐプロモーター配列）：
【化２２】
2018512851.tif 000044
【０３５６】
プラスミドｐＳＺ３５２０に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ２ｐプロモーター配列）：
【化２３】
2018512851.tif 000045
【０３５７】
プラスミドｐＳＺ３６８４及びｐＳＺ３６８６に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＳ１ｐプロモーター配列）：
【化２４】
2018512851.tif 000046
【０３５８】
プラスミドｐＳＺ３６８５に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＳ２ｐプロモーター配列）：
【化２５】
2018512851.tif 000047
【０３５９】
プラスミドｐＳＺ３６８８に含まれるγグルタミルヒドロラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＧＨ１ｐプロモーター配列）：
【化２６】
2018512851.tif 000048
【０３６０】
プラスミドｐＳＺ３５１７に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ１ｐプロモーター配列）：
【化２７】
2018512851.tif 000049
【０３６１】
プラスミドｐＳＺ３５１１に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ２ｐプロモーター配列）：
【化２８】
2018512851.tif 000050
【０３６２】
プラスミドｐＳＺ３５１２に含まれるシステインエンドペプチダーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＥＰ１プロモーター配列）：
【化２９】
2018512851.tif 000051
【０３６３】
プラスミドｐＳＺ３３７５及び３３８２に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−１プロモーター配列）：
【化３０】
2018512851.tif 000052
【０３６４】
プラスミドｐＳＺ３３７６及び３３８３に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−２プロモーター配列）：
【化３１】
2018512851.tif 000053
【０３６５】
上述の構築物が成長及び脂肪酸プロフィールに及ぼす影響を決定するため、それらの構築物を独立にΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４に形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５．０又はｐＨ７．０で成長させた。形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、表２０〜表５０に示す。
【０３６６】
【表２１】
2018512851.tif 000054
【０３６７】
【表２２】
2018512851.tif 000055
【０３６８】
【表２３】
2018512851.tif 000056
【０３６９】
【表２４】
2018512851.tif 000057
【０３７０】
【表２５】
2018512851.tif 000058
【０３７１】
【表２６】
2018512851.tif 000059
【０３７２】
【表２７】
2018512851.tif 000060
【０３７３】
【表２８】
2018512851.tif 000061
【０３７４】
【表２９】
2018512851.tif 000062
【０３７５】
【表３０】
2018512851.tif 000063
【０３７６】
【表３１】
2018512851.tif 000064
【０３７７】
【表３２】
2018512851.tif 000065
【０３７８】
【表３３】
2018512851.tif 000066
【０３７９】
【表３４】
2018512851.tif 000067
【０３８０】
【表３５】
2018512851.tif 000068
【０３８１】
【表３６】
2018512851.tif 000069
【０３８２】
【表３７】
2018512851.tif 000070
【０３８３】
【表３８】
2018512851.tif 000071
【０３８４】
【表３９】
2018512851.tif 000072
【０３８５】
【表４０】
2018512851.tif 000073
【０３８６】
【表４１】
2018512851.tif 000074
【０３８７】
【表４２】
2018512851.tif 000075
【０３８８】
【表４３】
2018512851.tif 000076
【０３８９】
【表４４】
2018512851.tif 000077
【０３９０】
【表４５】
2018512851.tif 000078
【０３９１】
【表４６】
2018512851.tif 000079
【０３９２】
【表４７】
2018512851.tif 000080
【０３９３】
【表４８】
2018512851.tif 000081
【０３９４】
【表４９】
2018512851.tif 000082
【０３９５】
【表５０】
2018512851.tif 000083
【０３９６】
【表５１】
2018512851.tif 000084
【０３９７】
野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株（Ｓ３１５０、Ｓ１９２０又はＳ１３３１など）における内因性ＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２の組み合わせベースライン発現は、５〜７％のＣ１８：２として現れる。Ｓ５２０４はＰｍＫＡＳＩＩを過剰発現し、それによりＣ１６：０からＣ１８：０への伸長がもたらされる。このＣ１８：０プールの増加は、最終的にはＰｍＳＡＤ２によって不飽和化されるため、Ｃ１８：１レベルの上昇をもたらす。さらにＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２の両方のコピー（即ち、ＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２）の破壊がＣ１８：１からＣ１８：２へのさらなる不飽和化を防止し、０％リノール酸（Ｃ１８：２）のユニークな高オレイン酸油（Ｃ１８：１）をもたらす。しかしながら、上述のとおり、０％Ｃ１８：２のどの株も成長が極めて悪く、成長／生産性を維持するためにリノール酸の外因的な添加を必要とする。Ｓ５２０４などの株を誘導性ＰｍＡＭＴ０３ｐによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１で補完すると、０％のＣ１８：２レベルで最終的な高Ｃ１８：１を維持しながらも成長表現型をレスキューすることができる。しかしながら、データは、発酵の初期段階でＰｍＡＭＴ０３が止まり、従って任意の補完株がその完全な成長及び生産性の潜在的可能性を実現する能力が深刻に損なわれることを示唆している。本研究の目標は、発酵の初期段階に（Ｔ０〜Ｔ３０時間；発酵槽中の回分供給される過剰のＮとは関係なく）補完株の効率的な成長を可能にし、次に細胞が活性脂質産生に入ると（培地中のＮが枯渇したとき）有効に止まり、従って補完株がなおも極めて高いＣ１８：１及び０％のＣ１８：２レベルで終わり得るプロモーターエレメントを同定することであった。比較として、本発明者らはまた、ＰｍＦＡｄ２−１ｐ又はＰｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１でＳ５２０４を補完した。
【０３９８】
ＰｍＦＡＤ２−１ｐ又はＰｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１によるＳ５２０４の補完は、ＰｍＦＡＤ２−１コピー数を増幅するように設計されるか（例えばｐＳＺ３３７５又はｐＳＺ３３７６）、又はＰｍＦＡＤ２−１コピー数が１つに制限されたもの（ｐＳＺ３３８２又はｐＳＺ３３８３）のいずれかのベクターを使用すると、Ｃ１８：２レベルの完全な回復をもたらす。これらの株におけるＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が最終Ｃ１８：２レベルに及ぼす効果は極めてごく僅かであるように見える。
【０３９９】
他方で、新規プロモーターエレメントのいずれかによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１の発現は、最終的なＣ１８：２レベルの顕著な減少をもたらす。ＦＡＤ２−１を駆動する新規プロモーターを発現する様々な株の代表的なプロフィールを表２０〜表５０に示す。Ｃ１８：２レベルのこの低下は、ＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が１つに制限されている株ではなお一層明白である。ＰｍＤＰＳ１（Ｄ２０９１及びＤ２０９８）、ＰｍＤＰＳ２（Ｄ２０９２及びＤ２０９９）、ＰｍＰＰＩ１（Ｄ２２６３及びＤ２４４０）、ＰｍＰＰＩ２（Ｄ２２６４及びＤ２２６８）、ＰｍＧＭＰＳ１（Ｄ２２６５及びＤ２２６９）、ＰｍＧＭＰＳ２（Ｄ２２７０）などのプロモーターエレメントは、単一コピー又は複数コピーの両方のＰｍＦＡＤ２−１バージョンで０％又は０．５％未満の最終Ｃ１８：２レベルの株をもたらした。残りのプロモーターは、１〜５％の範囲の最終Ｃ１８：２レベルをもたらした。一つの予想外の結果は、Ｄ２４３４及びＤ２４３５におけるＰｍＦＡＤ２−１を駆動するＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐからのデータであった。これらのプロモーターは両方ともに、複数コピーＦＡＤ２−１バージョンで極めて高いレベルのＣ１８：２（９〜２０％）をもたらした。Ｄ２２６６における単一コピーバージョンでの最終Ｃ１８：２レベルは、よりトランスクリプトームデータと合致し、窒素枯渇環境で細胞が活性化して脂質を産生しているときにはＰｍＡＨＣプロモーター活性及び対応するＰｍＡＨＣ転写が重度に下方調節されることが示唆される。トランスクリプトームを簡単に見ると、ＰｍＡＨＣの初期転写が極めて高く（４０００〜５５００ＴＰＭ）、次にはそれが約２５０ＴＰＭまで急降下することが明らかになった。従って、ＰｍＦＡＤ２−１に複数のコピーを有する株（Ｄ２４３４及びＤ２４３５）においては、発酵初期に産生された多量のＰｍＦＡＤ２−１タンパク質が残存し、高いＣ１８：２レベルをもたらすことが考えられ得る。単一コピーＰｍＦＡＤ２−１株ではこれは該当せず、従ってＤ２２６６においてはＣ１８：２レベルの上昇は見られない。
【０４００】
０％の最終Ｃ１８：２レベルの補完株において、重要な問題は、それが最初の段階で補完されたかどうかであった。これを確かめるため、代表的な株を親Ｓ５２０４株及び先にＡＭＴ０３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完したＳ２５３２（即ちＳ４６９５）株と共に９６ウェルブロックにおいてシード培地で成長させた。培養物は０．１ＯＤ単位毎ｍｌで播種し、種々の時点でＯＤ７５０を確認した。成長が極めて悪かったＳ５２０４と比較して、Ｓ４６９５及び新規に補完した株のみが２０時間及び４４時間で任意の意味のあるＯＤまで成長し（表５１）、上記で同定されたプロモーターが初期に活性であり、細胞が活性脂質産生期間に入るとオフになることが実証された。
【０４０１】
【表５２】
2018512851.tif 000085
【０４０２】
【表５３】
2018512851.tif 000086
【０４０３】
【表５４】
2018512851.tif 000087
【０４０４】
ここで発見されたこれらのプロモーター、又はその変異体は、微細藻類細胞を含めた細胞で発現する脂肪酸合成遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、ＳＡＤ、ＦＡＤ２、ＫＡＳＩ／ＩＶ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ又はＫＣＳ遺伝子のいずれか）又は他の遺伝子若しくは遺伝子抑制エレメントの調節に使用し得ることが企図される。変異体は、ここに開示される配列と例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上の同一性を有し得る。
【０４０５】
実施例８：ＫＡＳＩＩ、ＦＡＴＡ及びＬＰＡＡＴ導入遺伝子を組み合わせることによるＳＯＳが高い油の生成
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩを過剰発現させ、内在性ＳＡＤ２対立遺伝子をノックアウトし、内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子をノックアウトし、並びにＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ由来のＬＰＡＡＴ及びＧａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＦＡＴＡ遺伝子（「ＧａｒｍＦＡＴ１」）の両方を過剰発現させた。得られた株は、５５％超のＳＯＳ、７０％超のＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ、及び８％未満のトリ飽和ＴＡＧを有する油を産生した。
【０４０６】
ＳＡＤ２部位における相同組換え用に設計されたフランキング領域を有する線状化プラスミドで基本株を形質転換した。構築物はＳＡＤ２を除去し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩを過剰発現した。ＴｈｉＣ選択マーカーを使用した。この株を、インベルターゼを選択マーカーとして使用する６Ｓ染色体部位における相同組換えによって、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＳＤ１プラスチド標的ペプチドを有するＧａｒｍＦＡＴＡ１を過剰発現するように設計された構築物でさらに形質転換した。得られた株は、約６２％のステアリン酸、６％のパルミチン酸、５％のリノール酸、４５％のＳＯＳ及び２０％のトリ飽和物を有する油を産生した。
【０４０７】
ＧａｒｍＦＡＴＡ１発現構築物（ｐＳＺ３２０４）からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号６１に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、６Ｓ遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性ショ糖の利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２（ＳｃＳＵＣ２）遺伝子の発現を駆動するＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。キメラＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿ＧａｒｍＦＡＴＡ１＿ＦＬＡＧ遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２（ＰｍＳＡＤ２−２）プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＣｐＳＡＤ１ｔｐをコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表し；ＧａｒｍＦＡＴＡ１成熟ポリペプチドをコードする配列は、小文字のイタリックにより示し；及び３Ｘ  ＦＬＡＧエピトープタグは、大文字、太字のイタリックにより表す。第２のＣｖＮＲ  ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
【０４０８】
ｐＳＺ３２０４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化３２】
2018512851.tif 000088
【化３３】
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【化３４】
2018512851.tif 000090
【化３５】
2018512851.tif 000091
【０４０９】
得られた株を、内在性ＦＡＴＡで組み換えられ（及びそれによりそれを破壊し）、またＵＡＰＡ１プロモーターの制御下でＢ．ｎａｐｕｓ由来のＬＰＡＡＴも発現するように設計された構築物で、且つメリビオース（ｍｅｌｂｉｏｓｅ）での選択を伴う選択可能なマーカーとしてαガラクトシダーゼを使用して、さらに形質転換した。得られた株は、ＳＯＳ（約５７〜６０％）及びＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ（約７０〜７６％）の産生の増加及びトリ飽和物量（４．８〜７．６％）の減少を示した。
【０４１０】
本発明者らがＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子及びＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ  ＲＮＡｉ構築物の両方をＦＡＴＡ−１遺伝子座に標的化することによってＳＯＳ産生を最大化し且つトリ飽和ＴＡＧの形成を最小化した高Ｃ１８：０  Ｓ６５７３バックグラウンドで、株を作成した。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ発現構築物ｐＳＺ４１６４からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号６２に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｆｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性メリビオースの利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１（ＳｃａｒＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＰｍＨＸＴ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＧＫ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）をコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。第２のスペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡヘアピン配列の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。フォワード方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字のイタリックで示し；ＦＡＤ２イントロン１配列は小文字、太字のイタリックで表し；ショートリンカー領域は小文字テキストで示し、及び逆方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字、下線のイタリックで示す。第２のＣｖＮＲ  ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
【０４１１】
ｐＳＺ４１６４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化３６】
2018512851.tif 000092
【化３７】
2018512851.tif 000093
【化３８】
2018512851.tif 000094
【化３９】
2018512851.tif 000095
【０４１２】
実施例９：一食当たり「ゼロ」飽和脂肪の藻類油
この例では、本発明者らは、分子遺伝学手法及び古典的な突然変異誘発手法の両方を利用して、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５から得た）のトリアシルグリセロールが飽和脂肪酸レベルを有意に低減し得ることを実証する。以下に記載するとおり、株Ｓ８１８８は複数回の発酵ランにおける総飽和脂肪酸が３％未満又は約３％の油を産生する。株８１８８は、内因性ＦＡＴＡ対立遺伝子の発現を破壊する挿入を含む、それぞれ配列番号６４及び６５の成熟ＫＡＳＩＩ及びＳＡＤタンパク質を産生する外来遺伝子を発現する。
【０４１３】
株Ｓ８１８８生成の概要。２つの連続的な形質転換によって株Ｓ８１８８を作成した。初めに、ＦＡＴＡ１対立遺伝子のシングルコピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩを過剰発現する構築物であるｐＳＺ３８７０（ＦＡＴＡ１  ３’：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２−ＣｐＳＡＤｔｐ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１  ５’）で高オレイン酸基本株Ｓ７５０５を形質転換した。得られた高オレイン酸低パルミチン酸株Ｓ７７４０は１．４％のパルミチン酸を産生し、発酵ランにおける総飽和物は７．３％である（表５２）。
【０４１４】
具体的には、Ｓ７５０５及びＳ５１００は、２０１５年３月３１日に出願された共有出願の米国仮特許出願第６２／１４１，１６７号明細書に開示される方法に従い作製した低Ｃ１６：０価及び高Ｃ１８：１価の株Ｓ３１５０のセルレニン（ｃｅｒｕｌｅｎｅｎ）耐性分離株である。
【０４１５】
続いて、ＰｍＫＡＳＩＩのもう一つのコピーを導入すると同時にＦＡＤ２（デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ）遺伝子座を標的化するＰｍＳＡＤ２−１遺伝子を過剰発現させるｐＳＺ４７６８（ＦＡＤ２−１  ５’：：ＰｍＨＸＴ１Ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ：ＰｍＳＡＤ２−２ｐ−ＣｐＳＡＤｔｐ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＣＰ１−ＰｍＳＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：ＦＡＤ２−１  ３’）でＳ７７４０を形質転換することにより、株Ｓ８１８８を得た。株Ｓ８１８８は１．７％のＣ１６：０及び０．５％のＣ１８：０を産生し、総飽和脂肪酸レベルが約３％である（表５２）。ＦＡＤ２を破壊すると多価不飽和物に対するオレイン酸レベルが上昇するが、低い不飽和物レベルを実現するのにこの破壊は不要であり得ることに留意されたい。
【０４１６】
【表５５】
2018512851.tif 000096
【０４１７】
ＰｍＫＡＳＩＩ発現の最適化による低パルミチン酸株の生成。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５株における主要な飽和脂肪酸はＣ１６：０及びＣ１８：０を含む。Ｃ１６：０脂肪酸レベルを最小限に抑えることを目的として、本発明者らは、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子発現を最適化すると更なるパルミチン酸の低下がもたらされ、それによって総飽和脂肪酸レベルが低下するかどうかを調べた。合計１４個の推定上の強力な内因性プロモーターを利用してＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動した（表５３）。これらのプロモーターは、個々に、ＦＡＴＡの単一の対立遺伝子を同時にノックアウトするカセットの一部としてＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の上流にクローニングした。
【０４１８】
【表５６】
2018512851.tif 000097
【０４１９】
これらの１４個の構築物は全て、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動するプロモーターが異なることを除いて同じ構成を有する。これらの形質転換ＤＮＡの配列を以下の配列に提供する。これらの構築物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）を選択可能なマーカーとして利用して、ショ糖上で成長する能力を株に付与した。得られた構築物は、初めに高オレイン酸基本株Ｓ５１００に形質転換し、各形質転換によって生じた最低でも２０個のトランスジェニック系をアッセイした。表５４に示すとおり、ＰｍＳＡＤ２−２、ＰｍＡＣＰ−Ｐ１、ＰｍＡＣＰ−Ｐ２、ＰｍＵＡＰＡ１、及びＰｍＨＸＴ１などのプロモーターによって駆動されるＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系は、Ｃ１６：０脂肪酸レベルの有意な低下を示す。本発明者らはまた、Ｃ１８：１脂肪酸の有意な蓄積も観察した。
【０４２０】
本発明者らは次に、これらの上位５つの構築物（ＰｍＳＡＤ２−２、ＰｍＡＣＰ−Ｐ１、ＰｍＡＣＰ−Ｐ２、ＰｍＵＡＰＡ１、及びＰｍＨＸＴ１）を高オレイン酸株Ｓ７５０５に形質転換した。この場合もまた、最低でも２０個のトランスジェニック系をアッセイした。全体的に見て、Ｓ７５０５で生成したトランスジェニック系によって達成される平均Ｃ１６：０レベルは、親株で観察されるレベルと一致して、Ｓ５１００で生成されるものよりも低い。他方で、最も低いＣ１６：０レベルをもたらしたプロモーターは、どの高オレイン酸基本株を試験したかによって異なった。例えば、ＰｍＡＣＰ−Ｐ２はＳ５１００においてＰｍＫＡＳＩＩの発現を駆動するのに最良のプロモーターであるように見え、一方、Ｓ７５０５では、ＰｍＳＡＤ２−２プロモーターが最良のパフォーマンスを示す（表５４）。
【０４２１】
【表５７】
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【０４２２】
株Ｓ７５０５においてＰｍＳＡＤ２−２プロモーターによって駆動したときのＦＡＴＡ１の不活性化及びＰｍＫＡＳＩＩの過剰発現によって見られた初期結果を考慮して、本発明者らはこれらのトランスジェニック系のいくつかを遺伝的安定性アッセイ及びサザンブロット解析による組み込みイベントの評価に移した。ＦＡＴＡ１遺伝子座へのＤＮＡの正しい組み込みを示す株Ｓ７７４０が、得られた安定系である。実験室規模の発酵槽で評価したときのＳ７７４０の脂肪酸プロフィールを表５５に示す。予想どおり、株Ｓ７７４０におけるＣ１６：０レベルは、同じ条件下で実行した前出の高オレイン酸リード株Ｓ５５８７で観察されたものより２．３％低い（表５５）。Ｓ５５８７は、Ｓ５１００においてｐＳＺ２５３３を発現させた株である。
【０４２３】
【表５８】
2018512851.tif 000099
【０４２４】
Ｓ７７４０は、ｐＳＺ３８７０（ＦＡＴＡ１  ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＳＡＤ２−２−ＣｐＳＡＤｔｐ：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１  ５’）がＳ７５０５を形質転換することにより生成された形質転換体の１つである。ｐＳＺ３８７０形質転換ＤＮＡの配列は配列番号６６に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＦＡＴＡ１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＦＡＴＡ１  ３’ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＦＡＴＡ１  ５’ゲノム領域が続く。先述したとおり、本発明者らは、ＰｍＫＡＳＩＩの発現の駆動に１３個の追加的なプロモーターを利用した。１４個全ての構築物が同じ構成及び関連する制限部位を有する。
【０４２５】
ｐＳＺ３８７０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化４０】
2018512851.tif 000100
【化４１】
2018512851.tif 000101
【化４２】
2018512851.tif 000102
【化４３】
2018512851.tif 000103
【０４２６】
ｐＳＺ２５３３に含まれるＰｍＵＡＰＡ１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化４４】
2018512851.tif 000104
【０４２７】
ｐＳＺ３８６９に含まれるＰｍＨＸＴ１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化４５】
2018512851.tif 000105
【０４２８】
ｐＳＺ３９３５に含まれるＰｍＳＯＤプロモーターのヌクレオチド配列：
【化４６】
2018512851.tif 000106
【０４２９】
ｐＳＺ３９３６に含まれるＰｍＡＴＰＢ１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化４７】
2018512851.tif 000107
【０４３０】
ｐＳＺ３９３７に含まれるＰｍＥｆ１−１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化４８】
2018512851.tif 000108
【０４３１】
ｐＳＺ３９３８に含まれるＰｍＥｆ１−２プロモーターのヌクレオチド配列：
【化４９】
2018512851.tif 000109
【０４３２】
ｐＳＺ３９３９に含まれるＰｍＡＣＰ１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５０】
2018512851.tif 000110
【０４３３】
ｐＳＺ３９４０に含まれるＰｍＡＣＰ２プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５１】
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【０４３４】
ｐＳＺ３９４１に含まれるＰｍＣ１ＬＹＲ１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５２】
2018512851.tif 000112
【０４３５】
ｐＳＺ３９４２に含まれるＰｍＡＭＴ１−１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５３】
2018512851.tif 000113
【０４３６】
ｐＳＺ３９４３に含まれるＰｍＡＭＴ１−２プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５４】
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【０４３７】
ｐＳＺ３９４４に含まれるＰｍＡＭＴ３−１プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５５】
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【０４３８】
ｐＳＺ３９４５に含まれるＰｍＡＭＴ３−２プロモーターのヌクレオチド配列：
【化５６】
2018512851.tif 000116
【０４３９】
Ｓ７７４０においてＰｍＳＡＤ２−１を発現させるとゼロＳＡＴ脂肪株Ｓ８１８８が得られた
次にＰｍＳＡＤ２−１遺伝子をＳ７７４０に導入してステアリン酸レベルを低下させた。株Ｓ８１８８は、ｐＳＺ４７６８  ＤＮＡ（ＦＡＤ２  ５’：：ＰｍＨＸＴ１Ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ：ＰｍＳＡＤ２−２ｐ−ＣｐＳＡＤｔｐ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＣＰ１−ＰｍＳＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：ＦＡＤ２  ３’）をＳ７７４０に形質転換することによって生成される安定系の一つである。この構築物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子を選択可能なマーカーとして使用することにより、ＰｍＳＡＤ２−１、及びＰｍＫＡＳＩＩの追加のコピーを先述の形質転換方法（微粒子銃）を用いた相同組換えによってＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｓ７７４０のＦＡＤ２−１遺伝子座に導入した。
【０４４０】
ｐＳＺ４７６８（Ｄ３８７０）形質転換ＤＮＡの配列は配列番号８５に提供する。ｐＳＺ４７６８中の関連する制限部位は小文字、太字及び下線で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＰａｃＩ、ＳａｃＩ  ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＦＡＤ２−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＦＡＤ２−１  ５’ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＨＸＴ１プロモーターを囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＧＫ  ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｍＳＡＤ２−２プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間に位置する。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、ＰｍＳＡＤ２−１遺伝子の発現を駆動するＰｍＡＣＰ１プロモーターが続く。ＰｍＡＣＰ１プロモーターは囲い文字のイタリックテキストにより示す。ＰｍＳＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＦＡＤ２−１  ３’ゲノム領域が続く。
【０４４１】
ｐＳＺ４７６８（Ｄ３８７０）に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化５７】
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【化５８】
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【化５９】
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【化６０】
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【０４４２】
ｐＳＺ４７６８（Ｄ３８７０）をＳ７７４０に形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られたプロフィールを表５６に示す。ＰｍＳＡＤ２−１遺伝子の過剰発現の影響はＣ１８：０鎖長の明らかな減少であり、それにより総飽和脂肪酸レベルが有意に低下している。株Ｓ８１８８は、形質転換体Ｄ３８７０−２１からの安定系の一つであり（表５６）、振盪フラスコ実験で評価したとき約４％の総飽和脂肪酸を産生する。Ｓ８１８８が低い総飽和物の油を産生可能であることを確認するため、Ｓ８１８８のパフォーマンスを発酵実験で更に評価した。図１に示すとおり、株Ｓ８１８８は両方の発酵ラン１４０５５８Ｆ２２及び１４０５７４Ｆ２４で２．９〜３．０％の総飽和物を産生する。
【０４４３】
【表５９】
2018512851.tif 000121
【０４４４】
実施例１０：高エルカ酸トランスジェニック微細藻類におけるＬＰＡＡＴの発現
以下に提供する例において、本発明者らは、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）を使用してある種の極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）が産生されるように本発明者らのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成を改変することの実現可能性を実証する。具体的には、本発明者らは、トランスジェニック高エルカ酸株Ｓ７２１１及びＳ７７０８においてＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ（ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｑ４２８７０、配列番号８２）又はＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ａｌｂａ（ＬｉｍａＬＰＡＡＴ、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号４２８６８、配列番号８３）由来の異種ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現させると、親と比べて個々の系統においてエルカ酸（２２：１Δ１３）含有量の３倍を超える高濃度化が得られることを示す。Ｓ７２１１及びＳ７７０８は、ＵＴＥＸ  １４３５及びＳ３１５０（高い油産生量のため選択された）のプールの古典的に突然変異誘発した誘導体において、共有出願の国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレットに開示されるとおり、それぞれＣｒａｍｂｅ  ｈｉｓｐａｎｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａとも称される）（配列番号８４）及びＬｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ（配列番号８５）脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）をコードするいずれかの遺伝子を発現させることによって生成した。
【０４４５】
この例では、構築物ｐＳＺ５１１９で形質転換されたＳ７２１１及びＳ７７０８株を生成した。これらはＳａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｏｂｉｓｅ）含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現する。Ｓ７２１１及びＳ７７０８における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５１１９は、
ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ−ＣｖＮＲ：：ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０４４６】
形質転換ＤＮＡの配列は配列番号１０４に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｏｂｉｓｅ）からグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ３プロモーターが続く。ＬｉｍｄＬＰＡＡＴのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０４４７】
エルカ酸株Ｓ７２１１及びＳ７７０８におけるＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ）の発現に用いられる構築物−［ｐＳＺ５１１９］。プラスミドｐＳＺ５１１９に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化６１】
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【化６２】
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【化６３】
2018512851.tif 000124
【０４４８】
Ｓ７２１１及びＳ７７０８における高等植物由来のＬｉｍｄＬＰＡＡＴ及びＬｉｍａＬＰＡＡＴ遺伝子の発現に用いられる構築物
ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＡＡＴ（ｐＳＺ５１１９）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＡＡＴ（ｐＳＺ５１２０）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ａｌｂａ  ＬＰＡＡＴ（ｐＳＺ５３４３）及びＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＬ．ａｌｂａ  ＬＰＡＡＴ（ｐＳＺ５３４８）を、Ｓ７２１１及びＳ７７０８における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５１２０：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’  フランク
ｐＳＺ５３４３：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍａＬＰＡＡＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
ｐＳＺ５３４８：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍａＬＰＡＡＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’  フランク
【０４４９】
これらの構築物は全て、ｐＳＺ５１１９と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに用いられるゲノム領域及び／又はそれぞれのＬＰＡＡＴ遺伝子のいずれかのみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５１１９と同じである。このすぐ下の配列は、それぞれＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク、ＬｉｍａＬＰＡＡＴの配列を示す。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０４５０】
ｐＳＺ５１２０及びｐＳＺ５３４８におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクの配列
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化６４】
2018512851.tif 000125
【０４５１】
ｐＳＺ５１２０及びｐＳＺ５３４８におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランクの配列
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク：
【化６５】
2018512851.tif 000126
【０４５２】
ｐＳＺ５３４３及びｐＳＺ５３４８に含まれるＬ．ａｌｂａ  ＬＰＡＡＴ（ＬｉｍａＬＰＡＡＴ）のヌクレオチド配列−ＬｉｍａＬＰＡＡＴ：
【化６６】
2018512851.tif 000127
【０４５３】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される全ての構築物を独立にＳ７２１１又はＳ７７０８のいずれかに形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。株Ｓ７２１１及びＳ７７０８は、ｐＨ調節されたＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でそれぞれＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ又はＬ．ａｎｎｕａ由来のＦＡＥを発現する。従って親（Ｓ７２１１及びＳ７７０８）及び得られるＬＰＡＡＴ形質転換株の両方ともに、最大限の脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。ｐＳＺ５１１９（Ｄ３９７９）、ｐＳＺ５１２０（Ｄ３９８０）、ｐＳＺ５３４３（Ｄ４２０４）、及びｐＳＺ５３４８（Ｄ４２０９）をＳ７２１１又はＳ７７０８に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを表５７〜表６２に示す。
【０４５４】
Ｌ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ又はＬ．ａｌｂａのいずれかのＬＰＡＡＴ遺伝子を発現するトランスジェニックＳ７２１１又はＳ７７０８株は全て、Ｃ２２：１脂肪酸の蓄積の２倍以上の増大を示す（表５７〜表６２を参照）。エルカ酸（Ｃ２２：１Δ１３）レベルの増大は、親Ｓ７７０８と比べてＳ７７０８；Ｔ１１２７；Ｄ３９７９−１５において４．２倍であり、親Ｓ７２１１と比べてＳ７２１１；Ｔ１１８１；Ｄ４２０４−５；ｐＨ７において３．７倍である。これらの結果は、ＬＰＡＡＴ遺伝子を用いたトランスジェニック藻類株におけるＶＬＣＦＡ含有量の改変を明らかに実証している。
【０４５５】
【表６０】
2018512851.tif 000128
【０４５６】
【表６１】
2018512851.tif 000129
【０４５７】
【表６２】
2018512851.tif 000130
【０４５８】
【表６３】
2018512851.tif 000131
【０４５９】
【表６４】
2018512851.tif 000132
【０４６０】
【表６５】
2018512851.tif 000133
【０４６１】
実施例１１：微細藻におけるＬＰＣＡＴの発現
ここで本発明者らは、高等植物リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）遺伝子を使用してリノール酸リッチの油が産生されるようにトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成を改変することの実現可能性を実証する。本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｓ７４８５において異種ＬＰＣＡＴ酵素を発現させると、親と比べて個々の系統においてリノール酸（Ｃ１８：２）の３倍を超える増大がもたらされることを実証する。
【０４６２】
低窒素脂質産生条件下で培養したときの野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は約５〜７％Ｃ１８：２レベルの抽出細胞油をもたらし、本発明者らの宿主における機能性内因性ＬＰＣＡＴ及び下流ＤＡＧ−ＣＰＴ及び／又はＰＤＣＴ酵素であることを示唆している。高等植物ＬＰＣＡＴ又はＤＡＧ−ＣＰＴをベイトとして使用したとき、両方の遺伝子の転写物がＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓトランスクリプトームであることが分かった。しかしながら対応するＰＤＣＴ様遺伝子のヒットは見出されなかった。
【０４６３】
本発明者らは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＬＰＣＡＴの両方の対立遺伝子を同定した（ＰｍＬＰＣＡＴ１）。両方の対立遺伝子とも全体的な転写は極めて低い。両方ともに転写物レベルは５０〜６０転写物百万分率で始まり、次に脂質産生の間にわたってゆっくりと増加する。ＰｍＬＰＣＡＴ１−１は約２１０転写物百万分率に達する一方、ＰｍＬＰＣＡＴ１−２は約１５０転写物百万分率まで増加する。
【０４６４】
公開データベースで利用可能なＡ．ｔｈａｌｉａｎａコードからの２つのＬＰＣＡＴ遺伝子（ＡｔＬＰＣＡＴ１  ＮＰ＿１７２７２４．２［配列番号８６］、ＡｔＬＰＣＡＴ２  ＮＰ＿１７６４９３．１［配列番号８７］）を使用して、本発明者らのＢ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ及びＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉを内部でアセンブルしたトランスクリプトームから対応するＬＰＣＡＴ遺伝子を同定した。５つの完全長配列が同定され、ＢｒＬＰＣＡＴ［配列番号９９］、ＢｊＬＰＣＡＴ１［配列番号１０８］、ＢｊＬＰＣＡＴ２［配列番号１０９］、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１［配列番号１０１］、及びＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２［配列番号１０２］と命名した。ＢｊＬＰＣＡＴ１を除くこれらの酵素のコドン最適化配列を、ＡｔＬＰＣＡＴ遺伝子と共に、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｓ７４８５で発現させた。Ｓ７４８５は、２０１５年３月３１日に出願された共有出願の米国仮特許出願第６２／１４１，１６７号明細書に開示される方法に従い作製された株である。具体的には、Ｓ７４８５は、低Ｃ１６：０価及び高Ｃ１８：１の株Ｋのセルレニン耐性分離株である。
【０４６５】
Ｓ７４８５におけるＢ．ｊｕｎｃｅａリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ−１（ＢｊＬＰＣＡＴ１）の発現に用いられる構築物［ｐＳＺ５２９８］：株Ｓ７４８５を構築物ｐＳＺ５２９８で形質転換して、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ遺伝子を発現させた。Ｓ７４８５における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５２９８は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０４６６】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に配列番号１１０として提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースからグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ３プロモーターが続く。ＢｊＬＰＣＡＴ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０４６７】
プラスミドｐＳＺ５２９８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化６７】
2018512851.tif 000134
【化６８】
2018512851.tif 000135
【化６９】
2018512851.tif 000136
【０４６８】
Ｓ７４８５における高等植物由来のＢｒＬＰＣＡＴ、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２、ＡｔＬＰＣＡＴ１及びＡｔＬＰＣＡＴ２遺伝子の発現に用いられる構築物
ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５２９８）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ｐＳＺ５２９９）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３００）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３０１）、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３０７）、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３０８）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ｐＳＺ５３０９）及びＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３１０）を、Ｓ７２１１における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５２９９：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＬＰＣＡＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３００：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３０１：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３０７：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３０８：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３０９：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＬＰＣＡＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３１０：    ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
【０４６９】
これらの構築物は全て、ｐＳＺ５２９８と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに用いられるゲノム領域及び／又はそれぞれのＬＰＣＡＴ遺伝子のいずれかのみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５２９８と同じである。図５〜図１１は、それぞれＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク、ＢｒＬＰＣＡＴ、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２、ＡｔＬＰＣＡＴ１及びＡｔＬＰＣＡＴ２の配列を示す。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０４７０】
ｐＳＺ５３０７、ｐＳＺ５３０８、ｐＳＺ５３０９、及びｐＳＺ５３１０におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクの配列。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化７０】
2018512851.tif 000137
【０４７１】
ｐＳＺ５３０７、ｐＳＺ５３０８、ｐＳＺ５３０９、及びｐＳＺ５３１０におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランクの配列。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク：
【化７１】
2018512851.tif 000138
【０４７２】
ｐＳＺ５２９９及びｐＳＺ５３０９に含まれるＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ＢｒＬＰＣＡＴ）のヌクレオチド配列。ＢｒＬＰＣＡＴ：
【化７２】
2018512851.tif 000139
【０４７３】
ｐＳＺ５３００に含まれるＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ１（ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１）のヌクレオチド配列。ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１：
【化７３】
2018512851.tif 000140
【０４７４】
ｐＳＺ５３０１及びｐＳＺ５３１０に含まれるＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２）のヌクレオチド配列。ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２：
【化７４】
2018512851.tif 000141
【０４７５】
ｐＳＺ５３０７に含まれるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ１（ＡｔＬＰＣＡＴ１）のヌクレオチド配列。ＡｔＬＰＣＡＴ１：
【化７５】
2018512851.tif 000142
【０４７６】
ｐＳＺ５３０８に含まれるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ＡｔＬＰＣＡＴ２）のヌクレオチド配列。ＡｔＬＰＣＡＴ２：
【化７６】
2018512851.tif 000143
【０４７７】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される全ての構築物を独立にＳ７２１１に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。Ｓ７２１１は、ｐＨ調節されたＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ由来のＦＡＥを発現する。従って親（Ｓ７２１１）及び得られるＬＰＣＡＴ形質転換株の両方ともに、最大限の脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。ｐＳＺ５２９８（Ｄ４１５９）、ｐＳＺ５２９９（Ｄ４１６０）、ｐＳＺ５３００（Ｄ４１６１）、ｐＳＺ５３０１（Ｄ４１６２）、ｐＳＺ５３０７（Ｄ４１６８）、ｐＳＺ５３０８（Ｄ４１６９）、ｐＳＺ５３０９（Ｄ４１７０）及びｐＳＺ５３１０（Ｄ４１７１）で形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表６３〜表７０に示す。
【０４７８】
Ｌ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２を除き、試験した全てのＬＰＣＡＴ酵素が親Ｓ７４８５と比べてＣ１８：２レベルの３倍の増加をもたらした。ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２の発現系の場合には、Ｃ１８：２の増加は、有意であったものの、親と比べて２倍に過ぎなかった。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座にＡｔＬＰＣＡＴ１を発現するＳ７２１１；Ｔ１１７２；Ｄ４１５７−１４；ｐＨ７におけるＣ１８：２の増加は、（親Ｓ７２１１と比べて）２．５４倍であった。これらの結果は、本発明者らの藻類宿主における異種ＬＰＣＡＴ遺伝子発現がＣ１８：１−ＣｏＡからＣ１８：１−ＰＣへの変換を増大させることを強く示唆している。続いてＰＣ会合Ｃ１８：１はＦＡＤ２などの下流酵素による作用を受けてＣ１８：２に変換される。上記で考察したとおり、ＬＰＣＡＴ遺伝子をエルカ酸株Ｓ７２１１（ＣｒｈＦＡＥを発現する）に形質転換したときも同様の結果が得られた。Ｓ７２１１においては、Ｃ１８：２レベルの増加はまた、エルカ酸含有量にも関連した。両方の実験からの結果を合わせると、Ｓ７２１１のＣｒｈＦＡＥは伸長の基質としてＣ１８：１−ＣｏＡよりむしろＣ１８：１−ＰＣを使用する可能性が最も高いことが示唆される。このシナリオでは、Ｓ７２１１においてＰｍＦＡＤ２及びＣｒｈＦＡＥは、Ｃ１８：２並びにＣ２０：１及びＣ２２：１などのＶＬＣＦＡの増大をもたらす同じ基質に関して競合し得る。本発明者らの仮説が正しいならば、現在のところ、ＰｍＦＡＤ２−１が基質に関してＣｒｈＦＡＥよりも良好に競合するように見える。伸長のためより多くの基質をチャネリングしようと現在探究されている手法の一つは、ＲＮＡｉ技術を用いてＰｍＦＡＤ２活性を低下させることである。
【０４７９】
この例は、操作された微細藻類におけるＣ１８：２及びＣ２２：１レベルの有意な増加を記載している。
【０４８０】
Ｃ１８：１からＣ１８：１−ＰＣへの変換を増加させるＬＰＣＡＴ酵素の同定により、Ｃ１８：１リン脂質プールをはるかに良好に制御できるようになり、次にはこれを、ＰｍＦＡＤ２−１活性の調整によるより多くの多価不飽和脂肪酸又はＶＬＣＦＡの作成に向けることができる。
【０４８１】
【表６６】
2018512851.tif 000144
【０４８２】
【表６７】
2018512851.tif 000145
【０４８３】
【表６８】
2018512851.tif 000146
【０４８４】
【表６９】
2018512851.tif 000147
【０４８５】
【表７０】
2018512851.tif 000148
【０４８６】
【表７１】
2018512851.tif 000149
【０４８７】
【表７２】
2018512851.tif 000150
【０４８８】
【表７３】
2018512851.tif 000151
【０４８９】
実施例１２：高エルカ酸トランスジェニック微細藻におけるＬＰＣＡＴの発現
この例では、本発明者らは、高等植物リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）遺伝子を使用したリノール酸及び／又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）リッチの油を産生するためのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成の改変を実証する。
【０４９０】
本明細書における実施例１１のＬＰＣＡＴ遺伝子をＳ７２１１において発現させた。Ｓ７２１１は、であった。本発明者らの結果は、Ｓ７２１１における異種ＬＰＣＡＴ酵素の発現により、親と比べて個々の系統においてリノール酸（Ｃ１８：２）及びエルカ酸（Ｃ２２：１）含有量の３倍を超える増大がもたらされることを示している。
【０４９１】
株Ｓ７２１１におけるＡ．ｔｈａｌｉａｎａリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼＡｔＬＰＣＡＴ）の発現に用いられる構築物［ｐＳＺ５２９６］：この例では、構築物ｐＳＺ５２９６で形質転換した、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ遺伝子を発現するＳ７２１１を生成した。構築物は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０４９２】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＰｍＳＡＤ２−２ｖ２プロモーターが続く。ＡｔＬＰＣＡＴ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０４９３】
プラスミドｐＳＺ５２９６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化７７】
2018512851.tif 000152
【化７８】
2018512851.tif 000153
【化７９】
2018512851.tif 000154
【０４９４】
Ｓ７２１１における高等植物由来のＡｔＬＰＣＡＴ１及びＡｔＬＰＣＡＴ２、ＢｒＬＰＣＡＴ、ＢｊＬＰＣＡＴ１、ＢｊＬＰＣＡＴ２、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１及びＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２遺伝子の発現に用いられる構築物：ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５２９６）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３０７）、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５２９７）、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３０８）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ｐＳＺ５２９９）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ｐＳＺ５３０９）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３４６）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３５１）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５２９８）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３５２）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３００）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ１（ｐＳＺ５３５３）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３０１）及びＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５３１０）を、Ｓ７２１１における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５３０７      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５２９７      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３０８      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５２９９      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＬＰＣＡＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３０９      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＬＰＣＡＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３４６      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３５１      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５２９８      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３５２      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３００      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３５３      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３０１      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３１０      −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
【０４９５】
これらの構築物は全て、ｐＳＺ５２９６と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに用いられるゲノム領域及び／又はそれぞれのＬＰＣＡＴ遺伝子のいずれかのみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５２９６と同じである。それぞれ、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク及びＡｔＬＰＣＡＴ１、ＡｔＬＰＣＡＴ２、ＢｒＬＰＣＡＴ、ＢｊＬＰＣＡＴ１、ＢｊＬＰＣＡＴ２、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１及びＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２遺伝子の配列。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示し、以下に示す。
【０４９６】
ｐＳＺ５３０７、ｐＳＺ５３０８、ｐＳＺ５３０９、ｐＳＺ５３１０、ｐＳＺ５３５１、ｐＳＺ５３５２及びｐＳＺ５３５３におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクの配列。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化８０】
2018512851.tif 000155
【０４９７】
ｐＳＺ５３０７、ｐＳＺ５３０８、ｐＳＺ５３０９、ｐＳＺ５３１０、ｐＳＺ５３５１、ｐＳＺ５３５２及びｐＳＺ５３５３におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランクの配列。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク：
【化８１】
2018512851.tif 000156
【０４９８】
ｐＳＺ５２９７及びｐＳＺ５３０８に含まれるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ  ２（ＡｔＬＰＣＡＴ２）のヌクレオチド配列。ＡｔＬＰＣＡＴ２：
【化８２】
2018512851.tif 000157
【０４９９】
ｐＳＺ５２９９及びｐＳＺ５３０９に含まれるＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ＢｒＬＰＣＡＴ）のヌクレオチド配列。ＢｒＬＰＣＡＴ：
【化８３】
2018512851.tif 000158
【０５００】
ｐＳＺ５３４６及びｐＳＺ５３５１に含まれるＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ１（ＢｊＬＰＣＡＴ１）のヌクレオチド配列。ＢｊＬＰＣＡＴ１：
【化８４】
2018512851.tif 000159
【０５０１】
ｐＳＺ５２９８及びｐＳＺ５３５２に含まれるＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ２（ＢｊＬＰＣＡＴ２）のヌクレオチド配列。ＢｊＬＰＣＡＴ２：
【化８５】
2018512851.tif 000160
【０５０２】
ｐＳＺ５３００及びｐＳＺ５３５３に含まれるＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ１（ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１）のヌクレオチド配列。ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１：
【化８６】
2018512851.tif 000161
【０５０３】
ｐＳＺ５３０１及びｐＳＺ５３１０に含まれるＬ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＣＡＴ２（ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２）のヌクレオチド配列。ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２：
【化８７】
2018512851.tif 000162
【０５０４】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される全ての構築物を独立にＳ７２１１に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０下でクローン的に精製して成長させた。Ｓ７２１１は、ｐＨ調節されたＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ由来のＦＡＥを発現する。従って親（Ｓ７２１１）及び得られるＬＰＣＡＴ形質転換株の両方ともに、最大限の脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。ｐＳＺ５２９６（Ｄ４１５７）、ｐＳＺ５３０７（Ｄ４１６８）、ｐＳＺ５２９７（Ｄ４１５８）、ｐＳＺ５３０８（Ｄ４１６９）、ｐＳＺ５２９９（Ｄ４１６０）、ｐＳＺ５３０９（Ｄ４１７０）、ｐＳＺ５３４６（Ｄ４２０７）、ｐＳＺ５３５１（Ｄ４２１２）、ｐＳＺ５２９８（Ｄ４１５９）、ｐＳＺ５３５２（Ｄ４２１３）、ｐＳＺ５３００（Ｄ４１６１）、ｐＳＺ５３５３（Ｄ４２１４）、ｐＳＺ５３０１（Ｄ４１６２）及びｐＳＺ５３１０（Ｄ４１７１）をＳ７２１１に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表７１〜表８４に示す。
【０５０５】
上述のＬＰＣＡＴ遺伝子のいずれかを発現するトランスジェニック系は全て、Ｃ１８：２の２倍を超える増加をもたらした。ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座にＡｔＬＰＣＡＴ１を発現するＳ７２１１；Ｔ１１７２；Ｄ４１５７−１４；ｐＨ７におけるＣ１８：２の増加は、（親Ｓ７２１１と比べて）２．５４倍であった。これらの結果は、本発明者らの藻類宿主における異種ＬＰＣＡＴ遺伝子発現がＣ１８：１−ＣｏＡからＣ１８：１−ＰＣへの変換を増大させることを実証している。続いてＰＣ会合Ｃ１８：１はＦＡＤ２などの下流酵素による作用を受け、Ｃ１８：２に変換される。Ｃ１８：２の増加と同時に、Ｃ２０：１及びＣ２２：１の有意で顕著な増加もあった。Ｃ２０：１レベルの増加は親と比べて１．５〜２倍に過ぎなかったが、ＬＰＡＡＴ１−１又はＬＰＡＡＴ１−２のいずれかの遺伝子座で試験した遺伝子の大部分でＣ２２：１レベルの増加は３倍超であった。Ｓ７２１１；Ｔ１１７４；Ｄ４１７１−１１；ｐＨ７の場合、Ｃ２２：１レベルの増加は親（１．３６％）と比べて５．３倍（７．２３％）であった。同様に、Ｓ７２１１；Ｔ１１７３；Ｄ４１６２−１０；ｐＨ７の場合、Ｃ２２：１の増加は親（１．３６％）と比べて３．８４倍（５．２３％）であった。これらは、本発明者らがこれまで任意の藻類基本株又はトランスジェニック株で達成した最も高いＣ２２：１レベルのうちの一部である。これらの結果は、Ｓ７２１１におけるＣｒｈＦＡＥが伸長の基質としてＣ１８：１−ＣｏＡよりむしろＣ１８：１−ＰＣを使用する可能性が最も高いことを示唆している。このシナリオでは、Ｓ７２１１においてＰｍＦＡＤ２及びＣｒｈＦＡＥは、Ｃ１８：２並びにＣ２０：１及びＣ２２：１などのＶＬＣＦＡの増大をもたらす同じ基質に関して競合し得る。ＰｍＦＡＤ２−１は基質に関してＣｒｈＦＡＥよりも良好に競合するものと見られ得る。
【０５０６】
Ｃ１８：１からＣ１８：１−ＰＣへの変換を増加させるＬＰＣＡＴ酵素の同定により、Ｃ１８：１リン脂質プールをはるかに良好に制御できるようになり、次にはこれを、ＰｍＦＡＤ２−１活性の調整によるより多くの多価不飽和脂肪酸又はＶＬＣＦＡの作成に向けることができる。
【０５０７】
【表７４】
2018512851.tif 000163
【０５０８】
【表７５】
2018512851.tif 000164
【０５０９】
【表７６】
2018512851.tif 000165
【０５１０】
【表７７】
2018512851.tif 000166
【０５１１】
【表７８】
2018512851.tif 000167
【０５１２】
【表７９】
2018512851.tif 000168
【０５１３】
【表８０】
2018512851.tif 000169
【０５１４】
【表８１】
2018512851.tif 000170
【０５１５】
【表８２】
2018512851.tif 000171
【０５１６】
【表８３】
2018512851.tif 000172
【０５１７】
【表８４】
2018512851.tif 000173
【０５１８】
【表８５】
2018512851.tif 000174
【０５１９】
【表８６】
2018512851.tif 000175
【０５２０】
【表８７】
2018512851.tif 000176
【０５２１】
実施例１３：高エルカ酸及び高オレイン酸トランスジェニック微細藻類におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴの発現
この例では、本発明者らは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＡｔＰＤＣＴ）遺伝子を使用したリノール酸及び／又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）リッチの油を産生するためのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成の改変を実証する。
プラスチドにおいて産生される脂肪酸は必ずしもＴＡＧ生合成に直ちに利用可能であるとは限らない。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、非極性脂質生合成と膜脂質生合成との間の重要な分岐点に相当する。ＤＡＧはＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）によってＰＣに変換されることができ、次にアシル残基が脂肪酸デサチュラーゼによって更に不飽和化される。ＰＣのアシル残基がＴＡＧに取り込まれる可能な経路は少なくとも２つある。第一に、ＰＣのＤＡＧ部分がＤＡＧ−ＣＰＴの可逆的作用によって（加水分解により）遊離して、ひいてはＤＧＡＴによるＴＡＧアセンブリに利用可能となり得る。第２の経路は、ホスファチジルコリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）として知られる酵素を伴うものである。ＤＡＧ−ＣＰＴと同様に、ＰＤＣＴはホスファチジルコリン（ＰＣ）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）との間の対称な相互変換を媒介し、ひいてはＴＡＧの形成に先立ちＤＡＧプール中のＰＣ修飾された脂肪酸−Ｃ１８：２及びＣ１８：３−を高濃度化する。
【０５２２】
ＡｔＰＤＣＴは、ＰＣとＤＡＧプールとの間の相互変換の主要な経路であり、一方、ＤＡＧ−ＣＰＴが果たす役割は小さいことが報告されている。この情報を踏まえて、本発明者らは我々の藻類宿主でＡｔＰＤＣＴを発現させることにした。本発明者らは高エルカ酸株Ｓ７２１１でＡｔＰＤＣＴを発現させた。本発明者らはまた、我々の基本株Ｓ３１５０（５７％）よりも有意に高いＣ１８：１（６８％）を産生するがエルカ酸を産生しない、古典的に突然変異誘発した高オレイン酸基本株Ｓ８０２８においてもＡｔＰＤＣＴを発現させた。Ｓ８０２８は、２０１３年３月１３日に出願された共有出願の米国仮特許出願第６１／７７９，７０８号明細書に開示される方法に従い作製した株である。具体的には、Ｓ８０２８は、米国仮特許出願第６１／７７９，７０８号明細書の実施例１４に従い作製した低Ｃ１６：０価及び高Ｃ１８：１価の株Ｋのセルレニン耐性分離株である。
【０５２３】
ＡｔＰＤＣＴの配列を本発明者らのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現にコドン最適化し、Ｓ７２１１及びＳ８０２８に形質転換した。本発明者らの結果は、エルカ酸株Ｓ７２１１及び高オレイン酸基本株Ｓ８０２８の両方においてＡｔＰＤＣＴの発現により個々の系統においてリノール酸（Ｃ１８：２）の３倍を超える増大がもたらされることを示している。加えて、Ｓ７２１１においては、親と比べて個々の系統においてエルカ酸（Ｃ２２：１）含有量の顕著な増加がある。
【０５２４】
Ｓ７２１１及びＳ８０２８におけるＡ．ｔｈａｌｉａｎａホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＡｔＰＤＣＴ）の発現に使用した構築物［ｐＳＺ５３４４］：構築物ｐＳＺ５３４４は、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ遺伝子を発現する。構築物ｐＳＺ５３４４は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＤＣＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０５２５】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｏｂｉｓｅ）からグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＰＭＳＡＤ２−２プロモーターが続く。ＡｔＰＤＣＴのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０５２６】
プラスミドｐＳＺ５３４４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化８８】
2018512851.tif 000177
【化８９】
2018512851.tif 000178
【化９０】
2018512851.tif 000179
【０５２７】
Ｓ７２１１及びＳ８０２８のＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座におけるＡｔＰＤＣＴの発現に用いられる構築物：ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴ（ｐＳＺ５３４４）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴ（ｐＳＺ５３４９）を、Ｓ７２１１及びＳ８０２８の両方で発現させるため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５３４９  −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＰＤＣＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
【０５２８】
ｐＳＺ５４３９は、ｐＳＺ５３４４と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに用いられるゲノム領域のみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５３４４と同じである。ｐＳＺ５３４９において使用されるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランクの配列を以下に示す。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０５２９】
ｐＳＺ５３４９におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化９１】
2018512851.tif 000180
【０５３０】
ｐＳＺ５３４９におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク。
【化９２】
2018512851.tif 000181
【０５３１】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載した両方の構築物を独立にＳ７２１１及びＳ８０２８に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。上記で考察したとおり、Ｓ７２１１は、ｐＨ調節されたＰＭＳＡＤ２Ｖ−２（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ由来のＦＡＥを発現する。従って親（Ｓ７２１１）及び得られるＰＤＣＴ形質転換株の両方ともに、最大限の脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。
【０５３２】
Ｓ８０２８及びＡｔＰＤＣＴで形質転換したその誘導体系をｐＨ５．０で培養した。ｐＳＺ５３４４（Ｄ４２０５）及びｐＳＺ５３４９（Ｄ４２１０）をＳ７２１１及びＳ８０２８に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表８５〜表８８に示す。
【０５３３】
本発明者らの宿主は、通常本発明者らの基本株において５〜７％のＣ１８：２をもたらす中程度のＬＰＣＡＴ活性を有するため、本発明者らの藻類宿主におけるＰＤＣＴの発現による予想は、やや増加したＣ１８：２及び／又はＶＬＣＦＡ（Ｓ７２１１において）であった。しかしながら、本発明者らの予想に反して、Ｓ７２１１及びＳ８０２８の両方においてＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１又はＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２のいずれかのゲノム遺伝子座にＰＤＣＴを発現する株においてＣ１８：２レベルの２．５倍を超える増加があった。最良のシナリオでは、Ｃ１８：２レベルの増加は親と比べてＳ７２１１；Ｔ１１８１；Ｄ４２１０−１０；ｐＨ７において２．８５倍（２７．１２に対して親Ｓ７２１１の９．５３％）及びＳ８０２８；Ｔ１２２６；Ｄ４２０５−１；ｐＨ５において３．１９倍（１８．７６％に対して親Ｓ８０２８の５．８８％）であった。ＰＤＣＴ発現はまた、Ｓ７２１１においてはＣ２２：１レベルの顕著な増加にもつながった。最良のシナリオでは、Ｃ２２：１は親の１．３６％からＳ７２１１；Ｔ１１８１；Ｄ４２１０−１０；ｐＨ７の５．０４％に増加した−３．７倍の増加。
【０５３４】
本明細書に報告するＰＤＣＴ発現系におけるＣ１８：２の増加は、高等植物ＬＰＣＡＴ遺伝子がＳ７２１１において発現するとき（以前報告した）よりも更に明白である。ＬＰＣＡＴ過剰発現はＣ１８：１−ＣｏＡからＣ１８：１−ＰＣへの変換の増加につながったが、次にはこれが、それぞれＦＡＤ２及びＦＡＥ酵素活性と競合することにより、更なる不飽和化及び／又は伸長に利用可能となる。ＰＤＣＴはＤＡＧプールへの最終的な取り込みのためＰＣ会合多価不飽和脂肪酸を効率的に除去するため、本発明者らの結果は、我々の宿主における内因性ＤＡＧ−ＣＰＴによるＰＣからＤＡＧへの変換がいくらか非効率であることを強く示唆している。高等植物ＰＤＣＴ遺伝子を本発明者らの藻類ゲノムに移植することにより、この非効率性が取り除かれる。更には、一旦ＡｔＰＤＣＴの発現によって効率的なＰＣからＤＡＧへの変換が所定位置に設定されると、これが上流の内因性ＰｍＬＰＣＡＴ酵素の効率を増加させて、Ｃ１８：１−ＣｏＡからＣ１８：１−ＰＣへの変換の増加をもたらすものと見込まれる。現段階では、ＰｍＦＡＤ２−１が基質に関してＣｒｈＦＡＥよりも良好に競合するように思われるため、ＣｒｈＦＡＥによる伸長が（Ｃ１８：１−ＣｏＡとは対照的に）Ｃ１８：１−ＰＣで起こるかどうかは不明である。ＦＡＤ２活性が極めて低い株におけるＣｒｈＦＡＥ及びＡｔＰＤＣＴの発現は、本発明者らの藻類宿主における不飽和化と伸長との間の関係を理解する助けとなり得る。
【０５３５】
要約すれば、Ｃ１８：１からＣ１８：１−ＰＣへの変換を増加させるＬＰＣＡＴ（上記で考察した）及びここでのＡｔＰＤＣＴ酵素の同定により、Ｃ１８：１リン脂質プールをはるかに良好に制御できるようになり、次にはこれを、ＰｍＦＡＤ２−１活性の調整によるより多くの多価不飽和脂肪酸又はＶＬＣＦＡの作成に向けることができる。
【０５３６】
【表８８】
2018512851.tif 000182
【０５３７】
【表８９】
2018512851.tif 000183
【０５３８】
【表９０】
2018512851.tif 000184
【０５３９】
【表９１】
2018512851.tif 000185
【０５４０】
実施例１４：高リノレン酸トランスジェニック微細藻におけるＰＤＣＴの発現
この例では、本発明者らは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＡｔＰＤＣＴ）遺伝子を使用したリノール酸及び／又はリノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）リッチの油を産生するためのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成の改変を実証する。
【０５４１】
本発明者らは、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕ  ＦＡＤ３デサチュラーゼを発現するリノレン酸株Ｓ３７０９のＣ１８：３レベルに対するＡｔＰＤＣＴ発現の効果を決定した。Ｓ３７０９は、共有出願の国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレットの実施例１１に従い調製した。ＡｔＰＤＣＴの配列を本発明者らの藻類宿主での発現にコドン最適化し、Ｓ３７０９に形質転換した。
【０５４２】
本発明者らの結果は、Ｓｏｌａｚｙｍｅリノレン酸株Ｓ３７０９におけるＡｔＰＤＣＴの発現により、親と比べて個々の系統においてリノレン酸（Ｃ１８：３）含有量の２倍を超える増大がもたらされることを示している。
【０５４３】
エルカ酸株Ｓ３７０９におけるＡ．ｔｈａｌｉａｎａホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＡｔＰＤＣＴ）の発現に用いられる構築物［ｐＳＺ５３４４］：構築物ｐＳＺ５３４４で形質転換した、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴ遺伝子を発現するＳ３７０９を生成した。Ｓ７２１１における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５３４４は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＰＤＣＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０５４４】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＰＭＳＡＤ２−ｖ２プロモーターが続く。ＡｔＰＤＣＴのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０５４５】
プラスミドｐＳＺ５３４４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化９３】
2018512851.tif 000186
【化９４】
2018512851.tif 000187
【化９５】
2018512851.tif 000188
【０５４６】
ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴ（ｐＳＺ５３４４）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＤＣＴ（ｐＳＺ５３４９）を、Ｓ７２１１における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５３４９  −  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＰＤＣＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
【０５４７】
ｐＳＺ５４３９は、ｐＳＺ５３４４と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに用いられるゲノム領域のみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５３４４と同じである。ｐＳＺ５３４４に使用したＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクの配列、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランクを以下に提供する。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０５４８】
ｐＳＺ５３４９におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化９６】
2018512851.tif 000189
【０５４９】
ｐＳＺ５３４９におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク：
【化９７】
2018512851.tif 000190
【０５５０】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載した両方の構築物を独立にＳ３７０９に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。Ｓ３７０９は、ｐＨ調節されたＰＭＳＡＤ２−ｖ２（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でＬｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕ由来のＬｎＦＡＤ３を発現する。従って親（Ｓ３７０９）及び得られるＰＤＣＴ形質転換株の両方ともに、最大限の脂肪酸デサチュラーゼ（ＬｎＦＡＤ３）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。ｐＳＺ５３４４（Ｄ４２０５）及びｐＳＺ５３４９（Ｄ４２１０）をＳ３７０９に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表８９及び表９０に示す。
【０５５１】
ＡｔＰＤＣＴ遺伝子を発現する個々のトランスジェニック系は、Ｃ１８：３の２倍を超える増加をもたらした（表８９及び表９０）。親Ｓ３７０９（６．６６％）と比べてＳ３７０９；Ｔ１２２８；Ｄ４２０５−３６；ｐＨ７におけるＣ１８：３の増加１２．１７倍（１４．５１％）、一方、Ｓ３７０９；Ｔ１２２８；Ｄ４２１０−４；ｐＨ７において増加は１．８９倍であった（１２．６１％）。上記の実施例１３で考察したとおり、ＡｔＰＤＣＴによるＰＣ会合多価不飽和脂肪酸の除去を促進すると、本発明者らの宿主において単に異種ＰＤＣＴを発現させる以上にＣ１８：２含有量が増加する。しかしながら、Ｓ３７０９親とは異なり、利用可能な全てのＣ１８：２がＣ１８：３に変換されるわけではない。これは、Ｓ３７０９におけるＬｎＦＡＤ３の発現が最適以下であることに起因する可能性が最も高い。
【０５５２】
ＬＰＣＡＴ酵素及びＰＤＣＴ酵素は両方ともに多価不飽和物をＤＡＧにチャネリングするため、これらの２つの活性を共に組み合わせて、Ｓ３７０９（リノレン酸株）、Ｓ８０２８（高オレイン酸基本株）又はＳ７２１１（エルカ酸株）などの様々なバックグラウンド株でそれらを発現させれば有益となり得る。
【０５５３】
【表９２】
2018512851.tif 000191
【０５５４】
【表９３】
2018512851.tif 000192
【０５５５】
実施例１５：高エルカ酸トランスジェニック微細藻におけるＤＡＧ−ＣＰＴの発現
この例では、本発明者らは、高等植物ＣＤＰ−コリン：１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）遺伝子を使用したリノール酸及び／又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）リッチの油を産生するためのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成の改変を実証する。
【０５５６】
本発明者らは、公開データベースで利用可能なＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ（ＮＰ＿１７２８１３）を使用して、本発明者らの内部でアセンブルしたＢ．ｒａｐａ、及びＢ．ｊｕｎｃｅａのトランスクリプトームから対応するＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子を同定した。内部で同定した全ての遺伝子（ＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ及びＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ）のコドン最適化配列を、ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子と共に、株Ｓ７２１１で発現させた。Ｓ７２１１の調製は上記で考察している。
【０５５７】
本発明者らの結果は、Ｓｏｌａｚｙｍｅエルカ酸株Ｓ７２１１におけるＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子の発現により、親と比べて個々の系統においてリノール酸（Ｃ１８：２）及びエルカ酸（Ｃ２２：１）含有量の増大がもたらされることを示している。
【０５５８】
エルカ酸株Ｓ７２１１におけるＡ．ｔｈａｌｉａｎａホスファチジルコリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ）の発現に用いられる構築物［ｐＳＺ５２９５］：この例では、構築物ｐＳＺ５２９５で形質転換したＳ７２１１由来のトランスジェニック系を生成した。これらの系統は、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子を発現する。Ｓ７２１１における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５２９５は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０５５９】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＰＭＳＡＤ２−ｖ２プロモーターが続く。ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０５６０】
プラスミドｐＳＺ５２９５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化９８】
2018512851.tif 000193
【化９９】
2018512851.tif 000194
【化１００】
2018512851.tif 000195
【０５６１】
Ｓ７２１１のＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１又はＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座におけるＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ、ＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ及びＢｒＤＡＧ−ＣＰＴの発現に用いられる構築物：ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５２９５）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５３０５）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５３４５）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５３５０）、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５３４７）及びＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−２遺伝子座を標的とするＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ（ｐＳＺ５３０６）を、Ｓ７２１１における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５３０５      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３４５      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３０６      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
ｐＳＺ５３４７      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
ｐＳＺ５３５０      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ−ＣｖＮＲ：：  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２
【０５６２】
これらの構築物は全て、ｐＳＺ５２９５と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、構築物ターゲティングに使用されるゲノム領域及び／又は関連するＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子のみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５２９５と同じである。図３〜図６は、それぞれＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク及びＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ及びＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ遺伝子の配列を示す。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０５６３】
ｐＳＺ５３０５、ｐＳＺ５３０６及びｐＳＺ５３５０におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク：
【化１０１】
2018512851.tif 000196
【０５６４】
ｐＳＺ５３０５、ｐＳＺ５３０６及びｐＳＺ５３５０におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク：
【化１０２】
2018512851.tif 000197
【０５６５】
ｐＳＺ５３４５及びｐＳＺ５３５０におけるＢｒＤＡＧ−ＣＰＴの配列：
【化１０３】
2018512851.tif 000198
【０５６６】
ｐＳＺ５３０６及びｐＳＺ５３４７におけるＢｊＤＡＧ−ＣＰＴの配列：
【化１０４】
2018512851.tif 000199
【０５６７】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される全ての構築物を独立にＳ７２１１に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。ｐＳＺ５２９５（Ｄ４１５６）、ｐＳＺ５３０５（Ｄ４１６６）、ｐＳＺ５３４５（Ｄ４２０６）、ｐＳＺ５３５０（Ｄ４２１１）、ｐＳＺ５３４７（Ｄ４２０８）及びｐＳＺ５３０６（Ｄ４１６７）をＳ７２１１に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールをＣ２２：１レベルでソートして、それぞれ表９１〜表９６に示す。
【０５６８】
本発明者らの宿主は、通常本発明者らの基本株において５〜７％のＣ１８：２をもたらす中程度のＬＰＣＡＴ活性を有するため、本発明者らの藻類宿主へのＤＡＧ−ＣＰＴの発現がＰＣからのＤＡＧ−アシル−ＣｏＡの除去を促進し、ＴＡＧにおける多価不飽和脂肪及び／又はＶＬＣＦＡの増加につながるのではないかという予想であった。本発明者らは、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１又はＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２のいずれかのゲノム遺伝子座にＤＡＧ−ＣＰＴを発現する株においてＣ１８：２及びＶＬＣＦＡレベルの顕著で持続的な増加を得た。
【０５６９】
これらの結果は、本発明者らの宿主における内因性ＤＡＧ−ＣＰＴによるＰＣからＤＡＧへの変換がいくらか非効率的であり、対応する高等植物ホモログ遺伝子を本発明者らの藻類ゲノムに移植することによって増強し得ることを示唆している。更には、一度効率的なＰＣからＤＡＧへの変換が所定位置に設定されると、これが上流内因性ＰｍＬＰＣＡＴ酵素の効率を増加させて、Ｃ１８：１−ＣｏＡからＣ１８：１−ＰＣへの変換の増加をもたらすものと見込まれる。
【０５７０】
要約すれば、Ｃ１８：１からＣ１８：１−ＰＣへの変換及びＤＡＧへの取り込みのためのそれらの最終的なＰＣからの除去を増加させる以前考察したＬＰＣＡＴ及びＰＤＣＴ及びＤＡＧ−ＣＰＴ酵素の同定により、Ｃ１８：１リン脂質プールをはるかに良好に制御できるようになり、次にはこれを、ＰｍＦＡＤ２−１活性の調整によるより多くの多価不飽和脂肪酸又はＶＬＣＦＡの作成に向けることができる。
【０５７１】
【表９４】
2018512851.tif 000200
【０５７２】
【表９５】
2018512851.tif 000201
【０５７３】
【表９６】
2018512851.tif 000202
【０５７４】
【表９７】
2018512851.tif 000203
【０５７５】
【表９８】
2018512851.tif 000204
【０５７６】
【表９９】
2018512851.tif 000205
【０５７７】
実施例１６：高リノレン酸トランスジェニック微細藻におけるＬＰＣＡＴの発現
この例では、本発明者らは、高等植物リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）遺伝子を使用したリノール酸及び／又はリノレン酸リッチの油を産生するためのトランスジェニック藻類株における油の含有量及び組成の改変を実証する。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ＡｔＬＰＣＡＴ２  ＮＰ＿１７６４９３．１）及びＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ＢｒＬＰＣＡＴ）核酸配列については、本明細書の実施例１１及び１２で考察した。ＡｔＬＰＣＡＴ１及びＢｒＬＰＣＡＴの両方の配列を本発明者らの宿主における発現にコドン最適化し、Ｓ３７０９で発現させた。Ｓ３７０９は実施例１４に記載される。本発明者らの結果は、Ｓ３７０９における異種ＬＰＣＡＴ酵素の発現により、親と比べて個々の系統においてＣ１８：３含有量が２倍超になったことを示している。
【０５７８】
リノレン酸株Ｓ３７０９におけるＡ．ｔｈａｌｉａｎａリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ−２（ＡｔＬＰＣＡＴ２）の発現に用いられる構築物［ｐＳＺ５２９７］：この例では、構築物ｐＳＺ５２９７で形質転換した、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ＡｔＬＰＣＡＴ２）遺伝子を発現するＳ３７０９由来のトランスジェニック系を生成した。Ｓ３７０９における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５２９７は、
ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＡｔＬＰＣＡＴ２−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１  ３’  フランク
と書くことができる。
【０５７９】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｏｂｉｓｅ）からグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによって示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＰＭＳＡＤ２−ｖ２プロモーターが続く。ＡｔＬＰＣＡＴ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方この遺伝子の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ１９２０  ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０５８０】
プラスミドｐＳＺ５２９７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１０５】
2018512851.tif 000206
【化１０６】
2018512851.tif 000207
【化１０７】
2018512851.tif 000208
【化１０８】
2018512851.tif 000209
【０５８１】
Ｓ３７０９におけるＢｒＬＰＣＡＴの発現に用いられる構築物：ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＰＣＡＴ２（ｐＳＺ５２９７）に加えて、ＰＬＳＣ−２／ＰｍＬＰＡＡＴ１−１遺伝子座を標的とするＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ｐＳＺ５２９９）もまた、Ｓ３７０９における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５２９９      ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＢｒＬＰＣＡＴ−ＣｖＮＲ：：ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−１
【０５８２】
ｐＳＺ５２９９は、ｐＳＺ５２９７と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、それぞれのＬＰＣＡＴ遺伝子のみが異なる。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５２９６と同じである。図５〜図４は、それぞれ、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランク、ＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク及びＡｔＬＰＣＡＴ１、ＡｔＬＰＣＡＴ２、ＢｒＬＰＣＡＴ、ＢｊＬＰＣＡＴ１、ＢｊＬＰＣＡＴ２、ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１及びＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２遺伝子の配列を示す。太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。ＢｒＬＰＣＡＴ配列は以下に示す。
【０５８３】
ｐＳＺ５２９９に含まれるＢ．ｒａｐａ  ＬＰＣＡＴ（ＢｒＬＰＣＡＴ）のヌクレオチド配列：
【化１０９】
2018512851.tif 000210
【０５８４】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される両方の構築物を独立にＳ３７０９に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。ｐＳＺ５２９７（Ｄ４１５８）及びｐＳＺ５２９９（Ｄ４１６０）をＳ３７０９に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、それぞれ表９７及び表９８に示す。
【０５８５】
上述のＬＰＣＡＴ遺伝子のいずれかを発現するトランスジェニック系は全て、Ｃ１８：３の有意な増加をもたらした。親Ｓ３７０９（６．６６％）と比べてＳ３７０９；Ｔ１２２８；Ｄ４１５８−１０；ｐＨ７におけるＣ１８：３の増加は１．８倍（１２％）であり、一方、Ｓ３７０９；Ｔ１２２８；Ｄ４１６０−１７；ｐＨ７では増加は１．７６倍（１１．７５％）であった。しかしながら、Ｓ３７０９親と異なり、最も高い可能性としてはＳ３７０９におけるＢｎＦＡＤ３の発現が最適以下であったことに起因して、利用可能な全てのＣ１８：２がＣ１８：３に変換されたわけではなかった。Ｓ３７０９におけるＢ．ｎａｐｕｓ  ＦＡＤ３活性を最適化するか、又は亜麻などの別の高等植物由来のより良好なＦＡＤ３酵素活性を発現させるかのいずれかにより、この変換は更に増大し得る。
【０５８６】
【表１００】
2018512851.tif 000211
【０５８７】
【表１０１】
2018512851.tif 000212
【０５８８】
本発明の記載される実施形態は単に例示に過ぎないことが意図され、当業者には多数の変形例及び改良例が明らかであろう。かかる変形例及び改良例は全て、本発明の範囲内にあることが意図される。例えば、遺伝子のノックアウトが指示される場合、突然変異及びＲＮＡｉ又はアンチセンスなどの阻害物質の発現を含めたノックダウン技術を用いて均等な結果を達成してもよい。
【０５８９】
実施例１７：４％未満の飽和脂肪、１％未満のＣ１８：２、及び９０％超のＣ１８：１を有する藻類株及び油
この例では、内因性ＦＡＴＡ又はＦＡＤ２活性の下方調節、ＫＡＳＩＩ又はＳＡＤ２遺伝子の過剰発現によってオレイン酸の蓄積が最大限となり、且つ総飽和物及び多価不飽和物が最小限となるように本発明者らが脂肪酸プロフィールを修飾した株について記載する。得られた株は、Ｓ８６９５を含め、＞９４％Ｃ１８：１、＜４％総飽和物、及び＜１％Ｃ１８：２の油を産生する。Ｓ８６９６は、Ｓ８６９５と同じように調製したクローン分離株であり、本質的に同一の脂肪酸プロフィールを有した。
【０５９０】
３つの連続形質転換により、株Ｓ８６９５を作成した。初めに高オレイン酸基本株Ｓ７５０５を、ＦＡＤ２対立遺伝子のシングルコピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ及びＰｍＳＡＤ２−１を過剰発現する構築物であるｐＳＺ４７６９（ＦＡＤ２  ５’１−ＰｍＨＸＴ１Ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ−ＰｍＳＡＤ２−２ｐ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ−ＰｍＳＡＤ２−２Ｐ−ＰｍＳＡＤ２−１−ＣｖＮＲ−ＦＡＤ２  ３’）で形質転換した。得られた株Ｓ８０４５は８７．３％Ｃ１８：１を産生して総飽和物７．３％であり、同じ条件下で；Ｓ７５０５は１８．９％総飽和物を産生する（表９９）。
【０５９１】
続いてＳ８０４５を、ＦＡＴＡ対立遺伝子１を破壊してＣ１６：０を更に低減し、且つヘアピンＦＡＤ２を発現してＣ１８：２を低減する構築物であるｐＳＺ５１７３（ＦＡＴＡ１  ３’：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＣｒＴＵＢ２−ＨｐＦＡＤ２−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１  ５’）で形質転換した。得られた株の１つ、Ｓ８１９７は０．５％Ｃ１８：２を産生し、Ｃ１６：０脂肪酸の低下に起因して総飽和物レベルは４．９％に降下する。本発明者らはまた、Ｓ８１９７がショ糖インベルターゼマーカーに関して安定しているにも関わらず、この株のショ糖加水分解活性は理想未満であることも観察した。
【０５９２】
次に株Ｓ８１９７を、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ由来のもう一つのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を過剰発現させるための構築物であるｐＳＺ５５６３（６ＳＡ：：ＰｍＬＤＨ１−ＡｔＴｈｉｃ−ＰｍＨＳＰ９０：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＰｍＰＧＨ−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２Ｖ２−ＯｅＳＡＤ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）で形質転換した。この形質転換の目標は、総飽和物レベルを更に低減することである。株Ｓ８１９７におけるショ糖加水分解活性を増加させるため、本発明者らはまた、ｐＳＺ５５６３にショ糖インベルターゼ遺伝子の追加のコピーも導入した。得られた株Ｓ８６９５は、Ｓ８１９７における２．１％とは対照的に１．６％Ｃ１８：０を産生し、従って、Ｓ８６９５における飽和物レベルはその親株Ｓ８１９７よりも約０．５％低い。
【０５９３】
【表１０２】
2018512851.tif 000213
【０５９４】
株Ｓ８０４５の生成：株Ｓ８０４５は、ｐＳＺ４７６９（ＦＡＤ２  ５’１−ＰｍＨＸＴ１Ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ−ＰｍＳＡＤ２−２ｐ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ−ＰｍＳＡＤ２−２Ｐ−ＰｍＳＡＤ２−１−ＣｖＮＲ−ＦＡＤ２  ３’）が形質転換する高オレイン酸基本株Ｓ７５０５から生成された形質転換体の１つである。ｐＳＺ４７６９形質転換ＤＮＡの配列は以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｐｅＩ、ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ、ＣｌａＩ、ＰａｃＩ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＦａｄ２−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＦＡＤ２−１  ５’ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＨＸＴ１プロモーターを囲い文字のテキストにより示す。ＭＥＬ１遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＧＫ  ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間に位置する。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される別のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２プロモーターが続く。ＰｍＳＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＦＡＤ２−１  ３’ゲノム領域が続く。
【０５９５】
ｐＳＺ４７６９に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１１０】
2018512851.tif 000214
【化１１１】
2018512851.tif 000215
【化１１２】
2018512851.tif 000216
【化１１３】
2018512851.tif 000217
【０５９６】
株Ｓ８１９７の生成：株Ｓ８１９７は、ｐＳＺ５１７３（ＦＡＴＡ１  ３’：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＣｒＴＵＢ２−ＨｐＦＡＤ２−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１  ５’）が形質転換する株Ｓ８０４５から生成された形質転換体の１つである。ｐＳＺ５１７３形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ，ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＦＡＴＡ１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＦＡＴＡ１  ３’ゲノムＤＮＡを表す。
【０５９７】
５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される別のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが続く。ヘアピンＦＡＤ２カセットを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、これに太字の小文字テキストにより示されるＦＡＴＡ１  ５’ゲノム領域が続く。
【０５９８】
ｐＳＺ５１７３に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１１４】
2018512851.tif 000218
【化１１５】
2018512851.tif 000219
【化１１６】
2018512851.tif 000220
【０５９９】
株Ｓ８６９５の生成：株Ｓ８６９５は、ｐＳＺ５５６３（６ＳＡ：：ＰｍＬＤＨ１−ＡｔＴｈｉｃ−ＰｍＨＳＰ９０：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＰｍＰＧＨ−ＣｖＮＲ：ＰｍＳＡＤ２−２Ｖ２−ＯｅＳＡＤ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）が形質転換する株Ｓ８１９７から生成された形質転換体の１つである。ｐＳＺ５５６３形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓｐＱ  Ｉ、ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ，ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによる６Ｓ遺伝子座への標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＬＤＨ１プロモーターを囲い文字のテキストにより示す。ＴＨＩＣ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＨＳＰ９０  ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが続く。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＧＨ  ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、小文字の下線テキストにより示されるＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが続く。囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２プロモーターを利用して、Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａ  ＳＡＤ遺伝子の発現を駆動する。ＯｅＳＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを大文字、太字のイタリックにより示し、一方このコード領域の残りを太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
【０６００】
ｐＳＺ５５６３に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１１７】
2018512851.tif 000221
【化１１８】
2018512851.tif 000222
【化１１９】
2018512851.tif 000223
【化１２０】
2018512851.tif 000224
【０６０１】
実施例１８：ケトアシル−ＣＯＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、ヒドロキシアシル−ＣＯＡヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）及びエノイル−ＣＯＡレダクターゼ（ＥＣＲ）の発現
この例では、極長鎖脂肪酸生合成に関与する酵素であるケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）における発現結果を開示する。具体的には、本発明者らは、本発明者らの内部でアセンブルしたＣｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａトランスクリプトーム由来の異種ＥＣＲ、ＨＡＣＤ又はＫＣＲ遺伝子をＳｏｌａｚｙｍｅエルカ酸株Ｓ７２１１及びＳ７７０８（上記で考察される）で発現させると、エイコセン酸（Ｃ２０：１）及びエルカ酸（Ｃ２２：１）の両方の増加がもたらされることを実証する。Ｓ７２１１及びＳ７７０８の調製については上記の実施例で考察している。
【０６０２】
高等植物及び他のほとんどの真核生物が、Ｃ１８を超える脂肪酸伸長に関して高度に特殊化した伸長システムを有する。各伸長反応毎に２つの炭素がマロニル−ＣｏＡからアシル基に一度に縮合し、続いて還元、脱水及び最終的な還元反応が起こる。サイトゾルに局在する膜結合タンパク質であるＦＡＥ（又はＫＣＳ）が、マロニル−ＣｏＡのアシル基との縮合を触媒する。この伸長システムの追加の成分については、高等植物ではそれ以上詳しくは特徴付けられていない。Ｐ．ｍｏｒｏｆｏｒｍｉｓにおける異種ＦＡＥの機能を以前実証したが（国際公開第２０１３／１５８９０８号パンフレット、参照によって援用される）、この例は、機能性ＦＡＥ遺伝子を既に発現する株における異種ＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲ酵素活性の発現を開示する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲタンパク質配列をベイトとして使用して、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ並びに本発明者らの内部でアセンブルしたＣｒａｍｂｅ  ａｂｂｙｓｉｎｉｃａ、Ａｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａ、Ｅｒｙｓｉｍｕｍ  ａｌｌｉｏｎｉ、Ｃｒａｍｂｅ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ及びＥｒｙｓｉｍｕｍ  ｇｏｌｄｅｎ  ｇｅｍトランスクリプトームから対応する完全長遺伝子をマイニングした。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓトランスクリプトームから同定されたＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲ遺伝子は、それらの高等植物ホモログとかなり異なることが分かった。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ及び高等植物ＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲタンパク質配列の配列アラインメントを図３〜図５に示す。以前、本発明者らは、Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＦＡＥ（ＫＣＳ）を本発明者らの宿主における最良の異種ＦＡＥの一つとして同定しており、従って本発明者らは、Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａからのＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲ遺伝子をコドン最適化して合成し、それらをＳ７２１１（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＦＡＥ株）及びＳ７７０８（Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ  ＦＡＥ株）で発現させることにした。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＣＲ、ＨＡＣＤ及びＥＣＲとそれぞれの植物配列との間の配列同一性を以下の表１００〜表１０２に示す。
【０６０３】
【表１０３】
2018512851.tif 000225
【０６０４】
【表１０４】
2018512851.tif 000226
【０６０５】
【表１０５】
2018512851.tif 000227
【０６０６】
エルカ酸株Ｓ７２１１及びＳ７７０８におけるＣｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｒｈＥＣＲ）の発現に用いられる構築物−［ｐＳＺ５９０７］
構築物ｐＳＺ５９０７で形質転換した、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及び内因性ＰｍＦＡＤ２−１ゲノム領域を標的とするＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＥＣＲ遺伝子を発現する株Ｓ７２１１及びＳ７７０８を生成した。Ｓ７２１１及びＳ７７０８における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５９０７は、以下のとおり書くことができる：
ｐＳＺ５９０７：  ＦＡＤ２−１−１  ５’  フランク：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：緩衝ＤＮＡ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＣｒｈＥＣＲ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＤ２−１  ３’  フランク
【０６０７】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＸｂａＩである。ＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＦＡＤ２−１遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｂｉｓｅ）からグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１  ｖ２プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。大文字のイタリックはＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓホスホグルコキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、小文字、太字のイタリックテキストにより示される緩衝／スペーサーＤＮＡ配列が続く。緩衝ＤＮＡの直後に、囲い文字のイタリック体のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＳＡＤ２−２プロモーターが続く。大文字、太字のイタリックはＣｒｈＥＣＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを示し、一方小文字のイタリックはこの遺伝子の残りを示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ３１５０  ＦＡＤ２−１ゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０６０８】
プラスミドｐＳＺ５９０７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１２１】
2018512851.tif 000228
【化１２２】
2018512851.tif 000229
【化１２３】
2018512851.tif 000230
【化１２４】
2018512851.tif 000231
【０６０９】
Ｓ７２１１及びＳ７７０８におけるＣｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）及びケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）遺伝子の発現に用いられる構築物
ＦＡＤ２−１遺伝子座を標的とするＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＫＣＲ（ｐＳＺ５９０９）に加えて、ＦＡＤ２−１遺伝子座を標的とするＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＥＣＲ（ｐＳＺ５９０７）及びＦＡＤ２−１遺伝子座を標的とするＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＨＡＣＤ（ｐＳＺ５９０８）を、Ｓ７２１１及びＳ７７０８における発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ５９０８  −  ＦＡＤ２−１−１  ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：Ｂｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＣｒｈＨＡＣＤ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＤ２−１  ３’
ｐＳＺ５９０９  −  ＦＡＤ２−１−１  ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：Ｂｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ：ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＤ２−１  ３’
【０６１０】
これらの構築物は両方ともに、ｐＳＺ５９０７と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、但しＣｒｈＥＣＲをそれぞれＣｒＨＡＣＤ又はＣｒＫＣＲに置き換えた。これらの構築物中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ５９０７と同じである。ＣｒｈＨＡＣＤ及びＣｒｈＫＣＲのヌクレオチド配列を以下に示す。太字のテキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０６１１】
ｐＳＺ５９０８におけるＣｒｈＨＡＣＤ遺伝子：
【化１２５】
2018512851.tif 000232
【０６１２】
ｐＳＺ５９０９におけるＣｒｈＫＣＲ遺伝子：
【化１２６】
2018512851.tif 000233
【０６１３】
ｐＳＺ５９０９におけるＣｒｈＫＣＲ遺伝子の発現
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載した３つの構築物全てを独立にＳ７２１１又はＳ７７０８のいずれかに形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。株Ｓ７２１１及びＳ７７０８は、ｐＨ調節されたＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターの制御下でそれぞれＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ又はＬ．ａｎｎｕａ由来のＦＡＥを発現する。従って、親（Ｓ７２１１及びＳ７７０８）及び得られるＫＣＲ、ＥＣＲ及びＨＡＣＤ形質転換株の両方とも、最大限の脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子発現を実現するにはｐＨ７．０で成長する必要がある。ｐＳＺ５９０７（Ｄ４９０５）、ｐＳＺ５９０８（Ｄ４９０６）及びｐＳＺ５９０９（Ｄ４９０７）をＳ７７０８及びＳ７２１１に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表１０３〜表１０５に示す。Ｓ７７０８及びＳ７２１１の両方で、ＣｒｈＥＣＲ、ＣｒｈＨＡＣＤ又はＣｒｈＫＣＲの発現がＣ２０：１及びＣ２２：１の両方の含有量の増加につながる。
【０６１４】
【表１０６】
2018512851.tif 000234
【０６１５】
【表１０７】
2018512851.tif 000235
【０６１６】
【表１０８】
2018512851.tif 000236
【０６１７】
実施例１９：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の発現
この例では、本発明者らは、エルカ酸株Ｓ７７０８及びＳ８４１４においてサイトゾルホモマーアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を上方調節することにより、得られたトランスジェニック株においてＣ２２：１含有量の３倍以上の増加がもたらされることを実証する。Ｓ７７０８は、上記で考察したとおりの、且つ共有の国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレットに従い調製した、Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ脂肪酸エロンガーゼを発現する株である。株Ｓ８４１４は、Ｃｒａｍｂｅ  ｈｉｓｐａｎｉｃａ脂肪酸エロンガーゼ／３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＦＡＥ／ＫＣＳ）を発現し、且つＳ７２１１（実施例１０）と組換え的に同一の分離株である。微細藻類におけるＣ１８を超える脂肪酸の伸長には、４つの主要なサイトゾル／ＥＲ酵素−ケトアシルＣｏ−Ａシンターゼ（ＫＣＳ  別名、脂肪酸エロンガーゼ、ＦＡＥ）、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、ヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）の協調的作用が必要である。各伸長反応毎に２つの炭素がマロニル−ＣｏＡからアシル基に一度に縮合し、続いて還元、脱水及び最終的な還元反応が起こる。ＫＣＳ（又はＦＡＥ）はマロニル−ＣｏＡとアシルプライマーの縮合を触媒する。マロニル−ＣｏＡは、マルチドメインサイトゾルホモマーＡＣＣａｓｅの作用によってサイトゾルアセチル−ＣｏＡの不可逆的カルボキシル化を通じて生成される。効率的且つ持続的な脂肪酸伸長にとって、十分なマロニル−ＣｏＡが利用可能でないことは妨げとなり得る。微細藻類細胞においては、マロニル−ＣｏＡはまた、フラボノイド類（ｆａｌｖｏｎｏｉｄｓ）、アントシアニン類、マロン酸化Ｄ−アミノ酸及びマロニル−アミノシクロプロパン−カルボン酸の産生にも用いられ、これによって脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃａｉｄ）伸長へのその利用可能性は更に低下する。本発明者らは、バイオインフォマティクス手法を用いて、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＡＣＣａｓｅの両方の対立遺伝子を同定した。ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１は２２５０アミノ酸タンパク質をコードし、一方、ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２は２５４０アミノ酸タンパク質をコードする。ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１とＰｍＡＣＣａｓｅ１−２とのペアワイズのタンパク質アラインメントを図６Ａ及び図６Ｂに示す。このタンパク質の大きいサイズを考慮して、本発明者らは、Ｓ７７０８及びＳ８４１４において内因性ＡＣＣａｓｅプロモーターを本発明者らの強力なｐＨ調節可能アンモニアトランスポート３（ＰｍＡＭＴ０３）プロモーターでハイジャックすることにした。「プロモーターハイジャック」は、Ｓ７７０８及びＳ８４１４の両方において内因性ＰｍＡＣＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２プロモーターとＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２タンパク質の開始コドンとの間にＡＭＴ０３プロモーターを挿入し、このようにして内因性プロモーターを破壊し、且つそれをＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＭＴ０３プロモーターに置き換えることにより達成した。これにより、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅの発現が内因性プロモーターではなく���ＭＴ０３プロモーターによって駆動されるようになる。Ｓ７７０８トランスジェニックでは、ＬａＦＡＥ及びハイジャックしたＡＣＣａｓｅが両方ともにＡＭＴ０３プロモーターによって駆動される。ＡＭＴ０３プロモーターは、ｐＨ７で発現を駆動するプロモーターであり、ｐＨ５で発現は最小限となる。Ｓ８４１４では、ＣｒｈＦＡＥがＰｍＳＡＤ２−２ｖ２プロモーターによって駆動され、このプロモーターはｐＨ調節されるプロモーターではなく、従ってＰｍＡＣＣａｓｅの効果はいずれもｐＨ７で脂質アッセイを行うことによって容易にモニタし得る。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅ１−１及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅ  １−２のアミノ酸アラインメントを図６Ａ及び図６Ｂに示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅ  １−１とａ−２との間の配列同一性は９２．３％である。
【０６１８】
エルカ酸株及びＳ７７０８におけるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰｍＡＣＣａｓｅ）の上方調節に用いられる構築物はｐＳＺ５３９１である。構築物ｐＳＺ５３９１で形質転換した、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース含有培地におけるそれらの選択及び成長を可能にする）及びＰｍＡＭＴ０３プロモーターによって駆動される上方調節されたＰ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅを発現する株Ｓ７７０８を生成した。Ｓ７７０８における発現のため導入される構築物ｐＳＺ５３９１は、以下のとおり書くことができる：
ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＨＸＴ１ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ：ＢＤＮＡ：ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
【０６１９】
形質転換ＤＮＡの配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＢｓａＢＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ及びＳｂｆＩである。ＢａｓＢＩ及びＳｂｆＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＡＣＣａｓｅ遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＥＬ１遺伝子（メリビオース（Ｍｅｌｉｏｂｉｓｅ）からグルコース及びガラクトースへの異化変換に必要なαガラクトシダーゼ酵素活性をコードし、それによりメリビオース上での形質転換株の成長を可能にする）の発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓヘキソース輸送体１  ｖ２プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。大文字のイタリックはＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓホスホグルコキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、小文字、太字のイタリックテキストにより示される緩衝／スペーサーＤＮＡ配列が続く。緩衝ＤＮＡの直後に、囲い文字の小文字テキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモーターが続き、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＰｍＡＣＣＣａｓｅ１−１ゲノム領域が続く。大文字、太字のイタリックは、先行するＰｍＡＭＴ０３プロモーターによる上方調節の標的となる内因性ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１遺伝子のイニシエーターＡＴＧを示す。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０６２０】
Ｓ７７０８に形質転換したプラスミドｐＳＺ５３９１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１２７】
2018512851.tif 000237
【化１２８】
2018512851.tif 000238
【化１２９】
2018512851.tif 000239
【０６２１】
上記に記載されるｐＳＺ５９３１に加えて、Ｓ７７０８又はＳ８４１４への形質転換用のＰｍＡＭＴ０３がＰｍＡＣＣａｓｅ１−２プロモーターをハイジャックする構築物もまた構築した。これらの構築物は以下のとおり記載される：
ｐＳＺ５９３２  −  ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２：：ＰｍＨＸＴ１ｖ２−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＰｍＰＧＫ−ＢＤＮＡ：ＢＤＮＡ：ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２
ｐＳＺ６１０６  −  ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０−ＢＤＮＡ：ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
ｐＳＺ６１０７  −  ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０−ＢＤＮＡ：ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２
【０６２２】
ｐＳＺ５９３２は、ｐＳＺ５９３１と同じベクター骨格；選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、組み込みに用いられるＰｍＡＣＣａｓｅフランクのみが異なる。ｐＳＺ５９３１はＰｍＡＣＣａｓｅ１−１を標的とする一方、ｐＳＺ５９３２はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２ゲノム遺伝子座を標的とする。ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２  ５’フランク及びＰｍＡＣＣａｓｅ１−２  ３’フランクのヌクレオチド配列を以下に示す。下線の太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０６２３】
それぞれＳ７７０８及びＳ８４１４に形質転換したプラスミドｐＳＺ５３９２及びｐＳＺ６１０７に含まれるＰｍＡＣＣａｓｅ  ５’フランクのヌクレオチド配列：
【化１３０】
2018512851.tif 000240
【０６２４】
それぞれＳ７７０８及びＳ８４１４に形質転換したプラスミドｐＳＺ５３９２及びｐＳＺ６１０７に含まれるＰｍＡＣＣａｓｅ  ３’フランクのヌクレオチド配列：
【化１３１】
2018512851.tif 000241
【０６２５】
選択可能なマーカーモジュールを除き、ｐＳＺ６１０６はｐＳＺ５９３１と同じであり、一方ｐＳＺ６１０７はｐＳＺ５９３２と同じである。ｐＳＺ５９３１及びｐＳＺ５９３２は両方ともに、選択可能なマーカーモジュールとしてＰｍＨＸＴ１ｖ２プロモーター（ｐｒｏｐｍｏｔｅｒ）によって駆動されるＳ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１及びＰｍＰＧＫを３’ＵＴＲとして使用するが、ｐＳＺ５０７３及びｐＳＺ５０７４は、代わりにｐｍＬＤＨ１  プロモーターによって駆動されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨｉＣ及びＰｍＨＳＰ９０  ３’ＵＴＲを使用する。ｐＳＺ６１０６及びｐＳＺ６１０７に含まれるＰｍＬＤＨ１プロモーター、ＡｔＴｈｉＣ遺伝子及びＰｍＨＳＰ９０  ３’ＵＴＲのヌクレオチド配列を以下に示す。
【０６２６】
Ｓ８４１４に形質転換したｐＳＺ６１０６及びｐＳＺ６１０７に含まれるＰｍＬＤＨ１プロモーター（囲い文字の小文字テキスト）、ＣｐＳＡＤトランジットペプチド（下線の小文字テキスト）及びＡｔＴｈｉＣ−Ｌ３３７Ｍ（小文字のイタリックテキスト）遺伝子及びＰｍＨＳＰ９０  ３’ＵＴＲ（小文字テキスト）のヌクレオチド配列。太字の下線テキストで示される５’−３’方向の制限部位は、それぞれ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＡｓｃＩ、ＳｎａＢＩ及びＢａｍＨＩである：
【化１３２】
2018512851.tif 000242
【０６２７】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される構築物を独立にＳ７７０８（ｐＳＺ５３９１；Ｄ４３８３及びｐＳＺ５３９２；Ｄ４３８４）又はＳ８４１４（ｐＳＺ６１０６；Ｄ５０７３及びｐＳＺ６１０７；Ｄ５０７４）に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。本発明者らのｐＨ調節されるＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターによる上方調節下にあるＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子の最大限の発現を実現するため、ｐＨ７を選択した。ｐＳＺ５３９１（Ｄ４３８３）、ｐＳＺ５３９２（Ｄ４３８４）、ｐＳＺ６１０６（Ｄ５０７３）及びｐＳＺ６１０７（Ｄ５０７４）で形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを以下の表１０６〜表１１０に示す。
【０６２８】
【表１０９】
2018512851.tif 000243
【０６２９】
【表１１０】
2018512851.tif 000244
【０６３０】
Ｄ４３８３−１（７．６１％Ｃ２２：１）及びＤ４３８４−１（６．７１％Ｃ２２：１）は、親Ｓ７７０８と比べて３倍を超えるＣ２２：１レベルの増加を示した。続いて両方の株とも、安定した表現型を有することが分かった。Ｄ５０７３−４５（１３．６１％Ｃ２２：１）及びＤ５０７４−１５（９．６２％Ｃ２２：１）は親Ｓ８４１４（４．６０％Ｃ２２：１）と比べて２．９５倍及び２．１１倍のＣ２２：１レベルの増加を示した。Ｄ５０７３又はＤ５０７４のいずれかで形質転換した選択のＳ８４１４系をｐＨ５及びｐＨ７で実行して、ＰｍＡＭＴ０３の駆動によるＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子発現を調節した（表１１０）。ｐＨ５．０でＰｍＡＣＣＡｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２を遮断すると、選択の系統全てでほぼ親のレベルのＣ２２：１となり、ＰｍＡＣＣａｓｅの上方調節が本発明者らの宿主における極長鎖脂肪酸生合成に及ぼす正の影響が確認された。これらの結果は、結論として、ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２の上方調節によるマロニル−ＣｏＡの増加が異種脂肪酸エロンガーゼを発現するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける極長鎖脂肪酸生合成の有意な増加をもたらすことを実証している。ｐＨ５／ｐＨ７実験はＳ７７０８由来の形質転換体では実施することができず、これは、親Ｓ７７０８における異種ＬａＦＡＥもＰｍＡＭＴ０３によって駆動され、ｐＨ５．０でこれらの系統を実行すれば同様にエロンガーゼの遮断も起こり得るためである。
【０６３１】
【表１１１】
2018512851.tif 000245
【０６３２】
【表１１２】
2018512851.tif 000246
【０６３３】
【表１１３】
2018512851.tif 000247
【０６３４】
実施例２０：３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）、ヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）、及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の発現
この例では、本発明者らは、極長鎖脂肪酸生合成に関与するケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）又はヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＡＣＤ）酵素（ｅｅｎｚｙｍｅｓ）のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）における共発現の結果を報告する。同時に、本発明者らはまたＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２のいずれかのプロモーターをハイジャックし、且つそれをＰｍＡＭＴ０３プロモーターに置き換えることにより、内因性サイトゾルホモマーアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）も上方調節した。本発明者らの結果は、Ｓ８４１４及びＳ８２４２において異種ＫＣＲ及びＥＣＲ又はＨＡＣＤ活性を上方調節した内因性ＡＣＣａｓｅ活性と組み合わせると、得られたトランスジェニック系においてＣ２２：１レベルの有意な増加（４倍超）が得られることを実証している。Ｓ８４１４は上記に記載される。Ｓ８２４２は、実施例１０で考察するとおり、Ｓ７７０８においてＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ  ＬＰＡＡＴを発現させることにより生成した。
【０６３５】
Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ脂肪酸エロンガーゼ（ＣｒｈＦＡＥ）は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける極めて活性の高いＦＡＥである。本発明者らは、ＣｒｈＫＣＲ、ＣｒｈＨＡＣＤ及びＣｒｈＥＣＲをコードする核酸をコドン最適化して合成し、それらをＳ７２１１（ＣｒｈＦＡＥ株）及びＳ７７０８（Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ  ＦＡＥ株）で発現させた。コドン最適化遺伝子を適切な発現ベクターにクローニングし、Ｓ７７０８及びＳ７２１１の両方に形質転換した。Ｓ７７０８及びＳ７２１１の両方でパートナー遺伝子の各々の発現によりＶＬＣＦＡ生合成の改善がもたらされた。Ｃ２２：１の増加は親株と比べて１．２〜１．９倍であった。更に、本発明者らは、本発明者らが内因性ＰｍＡＣＣａｓｅの上方調節によってマロニル−ＣｏＡの利用可能性を増加させており、これが既にＦＡＥを発現する株における長鎖脂肪酸生合成の有意な増加（Ｓ７７０８及びＳ８４１４バックグラウンドで３倍以上のＣ２２：１の増加）につながったことを上記に開示した。ＶＬＣＦＡ生合成を更に増加させるため、本発明者らは以下を実施した：既にＦＡＥを発現する株（Ｓ８４１４）においてＫＣＲ、ＥＣＲ及びＨＡＣＤ活性を上方調節したＰｍＡＣＣａｓｅと組み合わせてＶＬＣＦＡ生合成を最大にする；及び、ＦＡＥ活性に加えて、Ｓ８２４２はまたＬｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ（ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ）由来のエルカ酸選択的ＬＰＡＡＴも発現するため、Ｓ８２４２などの株における上記活性の発現はＶＬＣＦＡ生合成を更に増加させた。
【０６３６】
本発明者らは、Ｓ８４１４株（３．３％Ｃ２２：１；ＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＣｒｈＦＡＥ−ＰｍＨＳＰ９０）及びＳ８２４２株（５〜７％Ｃ２２：１；ＰｍＡＭＴ０３−ＬａＦＡＥ−ＣｖＮＲ及びＰｍＳＡＤ２−２ｖ２−ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ−ＣｖＮＲ）においてＣｒｈＫＣＲ（ＰｍＡＣＰＰ１又はＰｍＧ３ＰＤＨプロモーターのいずれかによって駆動される）をＣｒｈＥＣＲ又はＣｒｈＨＡＣＤ（ＰｍＧ３ＰＤＨ又はＰｍＡＣＰＰ１プロモーターによって駆動される）と共に共発現させるため構築物を作製した。これらの構築物はＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子座を標的にすると同時に、内因性ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣＡｓｅ１−２のプロモーターをｐＨ調節可能なアンモニアトランスポート３（ＰｍＡＭＴ０３）プロモーターでハイジャックするものであった。「プロモーターハイジャック」は、Ｓ８４１４及びＳ８２４２の両方において内因性ＰｍＡＣＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２プロモーターとＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子の開始コドンとの間にＰｍＡＭＴ０３プロモーターを挿入することにより達成した。
【０６３７】
エルカ酸株Ｓ８４１４及びＳ８２４２においてＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰｍＡＣＣａｓｅ）を上方調節すると同時にＥＣＲとＫＣＲとを共発現させるために用いられる構築物−［ｐＳＺｐＳＺ６１１４）
ＰｍＬＤＨ１ｖ２プロモーター（チアミン不含培地でのその選択及び成長を可能にする）によって駆動される突然変異体バージョン（Ｌ３３７Ｍ）のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴｈｉＣ遺伝子、ＰｍＡＣＰＰ１プロモーターによって駆動されるＣｒｈＥＣＲ、ＰｍＧ３ＰＤＨプロモーターによって駆動されるＣｒｈＫＣＲ及びＰｍＡＭＴ０３プロモーターによって駆動される内因性Ｐ．ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ  ＡＣＣａｓｅ（プロモーターハイジャック）を発現する構築物ｐＳＺ６１１４でＳ８４１４及びＳ８２４２株を形質転換した。構築物ｐＳＺ５３９１は上記に記載される。Ｓ８４１４及びＳ８２４２における発現用の構築物ｐＳＺ６１１４は、以下のとおり書くことができる：
ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）：ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＥＣＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＫＣＲＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
【０６３８】
形質転換ＤＮＡ（ｐＳＺ６１１４）の配列を以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、小文字、下線、太字で示され、５’−３’にそれぞれ、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ及びＳｂｆＩである。ＮｄｅＩ及びＡｓｅＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによるＡＣＣａｓｅ遺伝子座への標的化した組み込みを可能にするＳ３１５０のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨｉＣの発現を駆動する内因性Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。大文字のイタリックはＡｔＴｈｉＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｐ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、小文字、太字のイタリックテキストにより示される緩衝／スペーサーＤＮＡ配列が続く。緩衝ＤＮＡの直後に、囲い文字の小文字テキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰＰ１）プロモーターが続く。大文字のイタリックはＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｒｈＥＣＲ）遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その直後に、小文字の囲い文字テキストにより示される内因性Ｇ３ＰＤＨプロモーターが続く。大文字のイタリックはＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｒｈＫＣＲ）遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。ＣｖＮＲ  ３’ＵＴＲの直後に、囲い文字の小文字テキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモーターが続き、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＰｍＡＣＣＣａｓｅ１−１ゲノム領域が続く。大文字、太字のイタリックは、先行するＰｍＡＭＴ０３プロモーターによる上方調節の標的となる内因性ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１遺伝子のイニシエーターＡＴＧを示す。正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
【０６３９】
Ｓ８４１４及びＳ８２４２に形質転換したプラスミドｐＳＺ６１１４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１３３】
2018512851.tif 000248
【化１３４】
2018512851.tif 000249
【化１３５】
2018512851.tif 000250
【化１３６】
2018512851.tif 000251
【化１３７】
2018512851.tif 000252
【０６４０】
内因性ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１遺伝子を上方調節すると同時にＰｍＡＣＣａｓｅ１−１遺伝子座を標的とするＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＥＣＲ及びＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＫＣＲ遺伝子に加えて（ｐＳＺ６１１４）、Ｓ８４１４及びＳ８２４２への形質転換用にいくつかの他の構築物を設計した。これらの構築物は以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ６１１５−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：：ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＨＡＣＤ−ＣｖＮＲ：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
ｐＳＺ６１１６−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０；ＢＤＮＡ：：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＥＣＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
ｐＳＺ６１１７−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＨＡＣＤ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１
ｐＳＺ６１１８−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）：ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＥＣＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２
ｐＳＺ６１１９−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：：ＰｍＡＣＰＰ１−ＣｒｈＨＡＣＤ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２
ｐＳＺ６１２０−ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２：：ＰｍＬＤＨ１ｖ２ｐ−ＡｔＴＨＩＣ（Ｌ３３７Ｍ）−ＰｍＨＳＰ９０：ＢＤＮＡ：：ＰｍＧ３ＰＤＨ−ＣｒｈＨＡＣＤ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＣＰＰ１  ＣｒｈＫＣＲ−ＣｖＮＲ：  ＰｍＡＭＴ０３：：ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２
【０６４１】
ｐＳＺ６１１５は、遺伝子がＰｍＡＣＰＰ１プロモーターによって駆動されることを除き、あらゆる点でｐＳＺ６１１４と同様である。ｐＳＺ６１１５では、ＰｍＡＣＰＰ１プロモーターはＣｒｈＨＡＣＤ遺伝子の発現を駆動する一方、ｐＳＺ６１１４ではこれはＣｒｈＥＣＲの発現を駆動する。ＣｒｈＨＡＣＤのヌクレオチド配列は以下に示す。ｐＳＺ６１１６は、ＣｒｈＥＣＲがＰｍＧ３ＰＤＨによって駆動され、且つＣｒｈＫＣＲがＰｍＡＣＰＰ１プロモーターによって駆動される点（これはｐＳＺ６１１４の場合と逆である）がｐＳＺ６１１４と異なる。同様に、ｐＳＺ６１１８は、ＣｒｈＨＡＣＤがＰｍＧ３ＰＤＨによって駆動され、且つＣｒｈＫＣＲがＰｍＡＣＰＰ１プロモーターによって駆動される（これはｐＳＺ６１１５の場合と逆である）ことを除き、ｐＳＺ６１１６と同様である。ｐＳＺ６１１８、ｐＳＺ６１１９及びｐＳＺ６１２０は、それぞれｐＳＺ６１１４、ｐＳＺ６１１５及びｐＳＺ６１１７と同じであるが、但し前者の構築物はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子座を標的とする一方、後者の構築物はＰｍＡＣＣａｓｅ１−１遺伝子座を標的とする。ｐＳＺ６１１８、ｐＳＺ６１１９及びｐＳＺ６１２０において標的化のために用いられるＰｍＡＣＣａｓｅ１−２  ５フランク及びＰｍＡＣＣＡｓｅ１−２  ３’フランク配列を以下に示す。ＰｍＡＭＴ０３による上方調節下にある内因性ＰｍＡＣＣａｓｅ１−２のイニシエーターＡＴＧを大文字の太字及びイタリック文字で示す。下線の太字テキストとしての関連する制限部位は、それぞれ５’−３’に示す。
【０６４２】
ｐＳＳ６１１５、ｐＳＺ６１１７、ｐＳＺ６１１９及びｐＳＺ６１１２０におけるＣｒｈＨＡＣＤ遺伝子のヌクレオチド配列
【化１３８】
2018512851.tif 000253
【０６４３】
プラスミドｐＳＺ６１１８、ｐＳＺ６１１９及びｐＳＺ６１２０それぞれに含まれるＰｍＡＣＣａｓｅ  ５’フランクのヌクレオチド配列：
【化１３９】
2018512851.tif 000254
【０６４４】
プラスミドｐＳＺ６１１８、ｐＳＺ６１１９及びｐＳＺ６１２０に含まれるＰｍＡＣＣａｓｅ  ３’フランクのヌクレオチド配列：
【化１４０】
2018512851.tif 000255
【０６４５】
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、上記に記載される構築物を独立にＳ８４１４及びＳ８２４２に形質転換した。一次形質転換体をｐＨ７．０の標準脂質産生条件下でクローン的に精製して成長させた。本発明者らのｐＨ調節されるＡＭＴ０３（アンモニウムトランスポーター０３）プロモーターによる上方調節下にあるＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子の最大限の発現を実現するため、ｐＨ７を選択した。ｐＳＺ６１１４（Ｄ５０６２）、ｐＳＺ６１１５（Ｄ５０６３）、ｐＳＺ６１１６（Ｄ５０６４）、ｐＳＺ６１１７（Ｄ５０６５）、ｐＳＺ６１１８（Ｄ５０６６）、ｐＳＺ６１１９（Ｄ５０６７）及びｐＳＺ６１２０（Ｄ５０６８）をＳ８４１４及びＳ８２４２に形質転換することによって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィール、表１１１〜表１１７。Ｓ８４１４及びＳ８２４２の両方のバックグラウンドにおいてＣｒｈＥＣＲ及びＣｒｈＫＣＲ又はＣｒｈＨＡＣＤ及びＣｒｋＫＣＲのいずれかの組み合わせと上方調節したＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２とを発現する全てのトランスジェニック系において、Ｃ２２：１レベルの有意な増加があった。Ｓ８４１４バックグラウンド、系統Ｓ８４１４；Ｔ１４３５；Ｄ５０６２−６（１８．９２％）、Ｓ８４１４；Ｔ１４３５；Ｄ５０６３−５（１８．３６％）、Ｓ８４１４、Ｔ１４３９、Ｄ５０６５−４（１９．１５％）において、Ｃ２２：１レベルの増加は親Ｓ８４１４（４．６９％）と比べてそれぞれ４．０３倍、３．９１倍及び４．０８倍である。Ｓ８２４２、Ｔ１４３９；Ｄ５０６３−７（２０．４７％）及びＳ８２４２、Ｔ１４３９；Ｄ５０６５−２（１８．２１％）についても同じことが当てはまり、ここでＣ２２：１の増加は親Ｓ８２４２（５．０３％）と比べてそれぞれ４．０６倍及び３．６２倍である。Ｄ５０６２、Ｄ５０６３、Ｄ５０６４、Ｄ５０６５、Ｄ５０６６、Ｄ５０６７又はＤ５０６８のいずれかで形質転換した選択のＳ８４１４系をｐＨ５及びｐＨ７で実行してＰｍＡＭＴ０３の駆動によるＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２遺伝子発現を調節した（表１１８）。ｐＨ５．０で培養することによりＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２の発現を低下させると、選択の系統全てでＣ２２：１が有意に減少し（２．５倍以上の減少）、本発明者らの宿主における極長鎖脂肪酸生合成（ＶＬＣＦＡ）に対するＰｍＡＣＣａｓｅ上方調節の寄与が確認された。それにも関わらず、減少したＣ２２：１レベルは、ほぼ全ての系統で親Ｓ８４１４のレベルよりも高かったことから、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＶＬＣＦＡ生合成での異種ＫＣＲ及びＥＣＲ又はＨＡＣＤの正の影響が実証された（本発明者らのＳ７７０８バックグラウンドでの結果と一致する−前出のＩＰ実施例）。
【０６４６】
本明細書に開示される結果は、異種ＫＣＲ及びＥＣＲ又はＨＡＣＤ酵素活性の組み合わせ発現と共に、ＰｍＡＣＣａｓｅ１−１又はＰｍＡＣＣａｓｅ１−２の上方調節によって利用可能なマロニル−ＣｏＡを増加させると、既に異種脂肪酸エロンガーゼを発現するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株においてＶＬＣＦＡ生合成の有意な増加がもたらされることを実証している。
【０６４７】
【表１１４】
2018512851.tif 000256
【０６４８】
【表１１５】
2018512851.tif 000257
【０６４９】
【表１１６】
2018512851.tif 000258
【０６５０】
【表１１７】
2018512851.tif 000259
【０６５１】
【表１１８】
2018512851.tif 000260
【０６５２】
【表１１９】
2018512851.tif 000261
【０６５３】
【表１２０】
2018512851.tif 000262
【０６５４】
【表１２１】
2018512851.tif 000263
【０６５５】
配列
配列番号１
６Ｓ  ５’ゲノムドナー配列
【化１４１】
2018512851.tif 000264
配列番号２
６Ｓ  ３’ゲノムドナー配列
【化１４２】
2018512851.tif 000265
配列番号３
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅインベルターゼタンパク質配列
【化１４３】
2018512851.tif 000266
配列番号４
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）での発現にコドン最適化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅインベルターゼタンパク質コード配列
【化１４４】
2018512851.tif 000267
配列番号５
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２（Ｂ−ｔｕｂ）プロモーター／５’ＵＴＲ
【化１４５】
2018512851.tif 000268
配列番号６
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ
【化１４６】
2018512851.tif 000269
配列番号７
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子のコドン最適化発現カセットのヌクレオチド配列
【化１４７】
2018512851.tif 000270
配列番号８
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）Ａｍｔ０３プロモーター
【化１４８】
2018512851.tif 000271
配列番号９
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現にコドン最適化したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドｃＤＮＡ配列
【化１４９】
2018512851.tif 000272
配列番号１０
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼ核酸配列；Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０４
【化１５０】
2018512851.tif 000273
配列番号１１
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼアミノ酸配列；Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０４
【化１５１】
2018512851.tif 000274
配列番号１２
ｐＳＺ２０４６からのＣｏｃｕｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ  Ｃ１２：０選択的ＬＰＡＡＴのコドン最適化コード領域
【化１５２】
2018512851.tif 000275
配列番号１３
ｐＬｏｏｐ  ５’ゲノムドナー配列
【化１５３】
2018512851.tif 000276
配列番号１４
ｐＬｏｏｐ  ３’ゲノムドナー配列
【化１５４】
2018512851.tif 000277
配列番号１５
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを含むＮｅｏＲ発現カセット
【化１５５】
2018512851.tif 000278
配列番号１６
Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ  １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
【化１５６】
2018512851.tif 000279
配列番号１７
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ）
【化１５７】
2018512851.tif 000280
配列番号１８
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ）
【化１５８】
2018512851.tif 000281
配列番号１９
コドン最適化Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＦＡＥ３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＰ７４３７０）
【化１５９】
2018512851.tif 000282
配列番号２０
Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＦＡＥ３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＰ７４３７０）
【化１６０】
2018512851.tif 000283
配列番号２１
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＥＬＯ３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ７０６７３）
【化１６１】
2018512851.tif 000284
配列番号２２
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＥＬＯ３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ７０６７３）
【化１６２】
2018512851.tif 000285
配列番号２３
コドン最適化Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ３９５４０）
【化１６３】
2018512851.tif 000286
配列番号２４
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ３９５４０）
【化１６４】
2018512851.tif 000287
配列番号２５
ＵＴＥＸ  １４３９、ＵＴＥＸ  １４４１、ＵＴＥＸ  １４３５、ＵＴＥＸ  １４３７  Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化１６５】
2018512851.tif 000288
配列番号２６
Ｃｕ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ２−１
【化１６６】
2018512851.tif 000289
配列番号２７
Ｃｕ  ＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ３−１
【化１６７】
2018512851.tif 000290
配列番号２８
ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＰＡＴｘのアミノ酸配列
【化１６８】
2018512851.tif 000291
配列番号２９
ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘコード領域のｃＤＮＡ配列
【化１６９】
2018512851.tif 000292
配列番号３０
ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ  ２−１コード領域のｃＤＮＡ配列
【化１７０】
2018512851.tif 000293
配列番号３１
ＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡｘ  ３−１コード領域のｃＤＮＡ配列
【化１７１】
2018512851.tif 000294
配列番号３２
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにコドン最適化したＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴｘコード領域のｃＤＮＡ配列
【化１７２】
2018512851.tif 000295
配列番号３３
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにコドン最適化したＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡＴ  ２−１コード領域のｃＤＮＡ配列
【化１７３】
2018512851.tif 000296
配列番号３４
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにコドン最適化したＣｕＰＳＲ２３  ＬＰＡＡｘ  ３−１コード領域のｃＤＮＡ配列
【化１７４】
2018512851.tif 000297
配列番号３５
【化１７５】
2018512851.tif 000298
【化１７６】
2018512851.tif 000299
【化１７７】
2018512851.tif 000300
配列番号３６
【化１７８】
2018512851.tif 000301
配列番号３７
【化１７９】
2018512851.tif 000302
配列番号３８
【化１８０】
2018512851.tif 000303
配列番号３９
【化１８１】
2018512851.tif 000304
配列番号４０
【化１８２】
2018512851.tif 000305
配列番号４１
【化１８３】
2018512851.tif 000306
【化１８４】
2018512851.tif 000307
【化１８５】
2018512851.tif 000308
配列番号４２
【化１８６】
2018512851.tif 000309
配列番号４３
【化１８７】
2018512851.tif 000310
配列番号４４
【化１８８】
2018512851.tif 000311
配列番号４５
【化１８９】
2018512851.tif 000312
配列番号４６
【化１９０】
2018512851.tif 000313
配列番号４７
【化１９１】
2018512851.tif 000314
配列番号４８
【化１９２】
2018512851.tif 000315
配列番号４９
【化１９３】
2018512851.tif 000316
配列番号５０
【化１９４】
2018512851.tif 000317
配列番号５１
【化１９５】
2018512851.tif 000318
配列番号５２
【化１９６】
2018512851.tif 000319
配列番号５３
【化１９７】
2018512851.tif 000320
配列番号５４
【化１９８】
2018512851.tif 000321
配列番号５５
【化１９９】
2018512851.tif 000322
配列番号５６
【化２００】
2018512851.tif 000323
配列番号５７
【化２０１】
2018512851.tif 000324
配列番号５８
【化２０２】
2018512851.tif 000325
配列番号５９
【化２０３】
2018512851.tif 000326
配列番号６０
【化２０４】
2018512851.tif 000327
配列番号６１
【化２０５】
2018512851.tif 000328
【化２０６】
2018512851.tif 000329
【化２０７】
2018512851.tif 000330
配列番号６２
【化２０８】
2018512851.tif 000331
【化２０９】
2018512851.tif 000332
【化２１０】
2018512851.tif 000333
配列番号６３
Ｂｒａｓｓｉｃ  ｎａｐｕｓ  ＬＰＡＡＴ  ＣＤＳ
【化２１１】
2018512851.tif 000334
配列番号６４
成熟天然Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩアミノ酸配列
【化２１２】
2018512851.tif 000335
配列番号６５
成熟Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ２−１）
【化２１３】
2018512851.tif 000336
配列番号６６
ｐＳＺ３８７０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列
【化２１４】
2018512851.tif 000337
【化２１５】
2018512851.tif 000338
【化２１６】
2018512851.tif 000339
配列番号６７
ｐＳＺ２５３３に含まれるＰｍＵＡＰＡ１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２１７】
2018512851.tif 000340
配列番号６８
ｐＳＺ３８６９に含まれるＰｍＨＸＴ１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２１８】
2018512851.tif 000341
配列番号６９
ｐＳＺ３９３５に含まれるＰｍＳＯＤプロモーターのヌクレオチド配列
【化２１９】
2018512851.tif 000342
配列番号７０
ｐＳＺ３９３６に含まれるＰｍＡＴＰＢ１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２０】
2018512851.tif 000343
配列番号７１
ｐＳＺ３９３７に含まれるＰｍＥｆ１−１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２１】
2018512851.tif 000344
配列番号７２
ｐＳＺ３９３８に含まれるＰｍＥｆ１−２プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２２】
2018512851.tif 000345
配列番号７３
ｐＳＺ３９３９に含まれるＰｍＡＣＰ１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２３】
2018512851.tif 000346
配列番号７４
ｐＳＺ３９４０に含まれるＰｍＡＣＰ２プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２４】
2018512851.tif 000347
配列番号７５
ｐＳＺ３９４１に含まれるＰｍＣ１ＬＹＲ１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２５】
2018512851.tif 000348
配列番号７６
ｐＳＺ３９４２に含まれるＰｍＡＭＴ１−１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２６】
2018512851.tif 000349
配列番号７７
ｐＳＺ３９４３に含まれるＰｍＡＭＴ１−２プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２７】
2018512851.tif 000350
配列番号７８
ｐＳＺ３９４４に含まれるＰｍＡＭＴ３−１プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２８】
2018512851.tif 000351
配列番号７９
ｐＳＺ３９４５に含まれるＰｍＡＭＴ３−２プロモーターのヌクレオチド配列
【化２２９】
2018512851.tif 000352
配列番号８０
ｐＳＺ４７６８（Ｄ３８７０）に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列
【化２３０】
2018512851.tif 000353
【化２３１】
2018512851.tif 000354
【化２３２】
2018512851.tif 000355
配列番号８１
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２−２ｖ３プロモーター
【化２３３】
2018512851.tif 000356
配列番号８２
Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ（ＬｉｍｄＬＰＡＡＴ、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｑ４２８７０）
【化２３４】
2018512851.tif 000357
配列番号８３
Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ａｌｂａ（ＬｉｍａＬＰＡＡＴ、Ｕｎｉｒｐｒｏｔ寄託番号Ｑ４２８６８）
【化２３５】
2018512851.tif 000358
配列番号８４
Ｃｒａｍｂｅ  ｈｉｓｐａｎｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ  ＦＡＥ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ７９３５４９
【化２３６】
2018512851.tif 000359
配列番号８５
Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ  ＦＡＥ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣＪ６１７７７
【化２３７】
2018512851.tif 000360
配列番号８６
ＡｔＬＰＣＡＴ１  ＮＰ＿１７２７２４．２
【化２３８】
2018512851.tif 000361
配列番号８７
ＡｔＬＰＣＡＴ２  ＮＰ＿１７６４９３．１
【化２３９】
2018512851.tif 000362
配列番号８８
ＢｒＬＰＣＡＴ  Ｓ１６＿Ｂｒ＿Ｔｒｉｎｉｔｙ＿３８６５５−ＯＲＦ  １（フレーム２）
【化２４０】
2018512851.tif 000363
配列番号８９
ＢｊＬＰＣＡＴ１  Ｓ１５＿Ｂｊ＿Ｔｒｉｎｉｔｙ＿７３９０１−ＯＲＦ  １（フレーム３）
【化２４１】
2018512851.tif 000364
配列番号９０
ＢｊＬＰＣＡＴ２＿ＰＴＸ＿Ｓａｍｐｌｅ＿Ｓ１５＿Ｂｊ＿ｍｅｒｇｅｄ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ−ＯＲＦ  １（フレーム３）
【化２４２】
2018512851.tif 000365
配列番号９１
ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１  Ｓ０３＿Ｌｄ＿Ｔｒｉｎｉｔｙ＿３８９７８−ＯＲＦ  ２（フレーム３）
【化２４３】
2018512851.tif 000366
配列番号９２
ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２  Ｓ０３＿Ｌｄ＿Ｔｒｉｎｉｔｙ＿２９５９４−ＯＲＦ  １（フレーム１）
【化２４４】
2018512851.tif 000367
配列番号９３
ｐＳＺ５３４４；ＡｔＰＤＣＴ
【化２４５】
2018512851.tif 000368
【化２４６】
2018512851.tif 000369
配列番号９４
ＰＳＺ５２９５：ＡＴＤＡＧ−ＣＰＴ
【化２４７】
2018512851.tif 000370
【化２４８】
2018512851.tif 000371
配列番号９５
ｐＳＺ５３４５及びｐＳＺ５３５０におけるＢｒＤＡＧ−ＣＰＴ
【化２４９】
2018512851.tif 000372
配列番号９６
ｐＳＺ５３０６及びｐＳＺ５３４７におけるＢｊＤＡＧ−ＣＰＴ
【化２５０】
2018512851.tif 000373
配列番号９７
ＰＳＺ５２９６；ＡｔＬＰＣＡＴ１
【化２５１】
2018512851.tif 000374
【化２５２】
2018512851.tif 000375
【化２５３】
2018512851.tif 000376
【化２５４】
2018512851.tif 000377
配列番号９８
ＡｔＬＰＣＡＴ２
【化２５５】
2018512851.tif 000378
配列番号９９
ＢｒＬＰＣＡＴ
【化２５６】
2018512851.tif 000379
配列番号１００
ＢｊＬＰＣＡＴ
【化２５７】
2018512851.tif 000380
配列番号１０１
ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ１
【化２５８】
2018512851.tif 000381
配列番号１０２
ＬｉｍｄＬＰＣＡＴ２
【化２５９】
2018512851.tif 000382
配列番号１０３
ｐＳＺ５２９７：ＡｔＬＰＣＡＴ
【化２６０】
2018512851.tif 000383
【化２６１】
2018512851.tif 000384
配列番号１０４
ｐＳＺ５１１９
【化２６２】
2018512851.tif 000385
【化２６３】
2018512851.tif 000386
【化２６４】
2018512851.tif 000387
配列番号１０５
ｐＳＺ５１２０及びｐＳＺ５３４８におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ５’フランクの配列
【化２６５】
2018512851.tif 000388
配列番号１０６
ｐＳＺ５１２０及びｐＳＺ５３４８におけるＰＬＳＣ−２／ＬＰＡＡＴ１−２  ３’フランク
【化２６６】
2018512851.tif 000389
配列番号１０７
ｐＳＺ５３４３及びｐＳＺ５３４８に含まれるＬ．ａｌｂａ  ＬＰＡＡＴ（ＬｉｍａＬＰＡＡＴ）
【化２６７】
2018512851.tif 000390
配列番号１０８
ｐＳＺ５３４６及びｐＳＺ５３５１に含まれるＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ１（ＢｊＬＰＣＡＴ１）
【化２６８】
2018512851.tif 000391
配列番号１０９
ｐＳＺ５２９８及びｐＳＺ５３５２に含まれるＢ．ｊｕｎｃｅａ  ＬＰＣＡＴ２（ＢｊＬＰＣＡＴ２）
【化２６９】
2018512851.tif 000392
配列番号１１０
ｐＳＺ５２９８
【化２７０】
2018512851.tif 000393
【化２７１】
2018512851.tif 000394
配列番号１１１
【化２７２】
2018512851.tif 000395
配列番号１１２
【化２７３】
2018512851.tif 000396
配列番号１１３
【化２７４】
2018512851.tif 000397
配列番号１１４
【化２７５】
2018512851.tif 000398
配列番号１１５
【化２７６】
2018512851.tif 000399
配列番号１１６
【化２７７】
2018512851.tif 000400
配列番号１１７
【化２７８】
2018512851.tif 000401
【化２７９】
2018512851.tif 000402
配列番号１１８
【化２８０】
2018512851.tif 000403
配列番号１１９
【化２８１】
2018512851.tif 000404
配列番号１２０
【化２８２】
2018512851.tif 000405
配列番号１２１
【化２８３】
2018512851.tif 000406
配列番号１２２
【化２８４】
2018512851.tif 000407
配列番号１２３
【化２８５】
2018512851.tif 000408
配列番号１２４
【化２８６】
2018512851.tif 000409
配列番号１２５
【化２８７】
2018512851.tif 000410
配列番号１２６
【化２８８】
2018512851.tif 000411
【化２８９】
2018512851.tif 000412
【化２９０】
2018512851.tif 000413
配列番号１２７
【化２９１】
2018512851.tif 000414
配列番号１２８
【化２９２】
2018512851.tif 000415
配列番号１２９
【化２９３】
2018512851.tif 000416
【化２９４】
2018512851.tif 000417
【化２９５】
2018512851.tif 000418
配列番号１３０
【化２９６】
2018512851.tif 000419
配列番号１３１
【化２９７】
2018512851.tif 000420
配列番号１３２
【化２９８】
2018512851.tif 000421
【化２９９】
2018512851.tif 000422
【化３００】
2018512851.tif 000423
配列番号１３３
【化３０１】
2018512851.tif 000424
配列番号１３４
【化３０２】
2018512851.tif 000425
配列番号１３５
【化３０３】
2018512851.tif 000426
配列番号１３６
【化３０４】
2018512851.tif 000427
配列番号１３７
【化３０５】
2018512851.tif 000428
【化３０６】
2018512851.tif 000429
配列番号１３８
【化３０７】
2018512851.tif 000430
配列番号１３９
【化３０８】
2018512851.tif 000431
【化３０９】
2018512851.tif 000432
【化３１０】
2018512851.tif 000433
配列番号１４０
【化３１１】
2018512851.tif 000434
配列番号１４１
【化３１２】
2018512851.tif 000435
【化３１３】
2018512851.tif 000436
【化３１４】
2018512851.tif 000437
配列番号１４２
【化３１５】
2018512851.tif 000438
【化３１６】
2018512851.tif 000439
【化３１７】
2018512851.tif 000440
配列番号１４３
【化３１８】
2018512851.tif 000441
配列番号１４４
【化３１９】
2018512851.tif 000442
配列番号１４５
【化３２０】
2018512851.tif 000443
【化３２１】
2018512851.tif 000444
【化３２２】
2018512851.tif 000445
配列番号１４６
【化３２３】
2018512851.tif 000446
配列番号１４７
【化３２４】
2018512851.tif 000447
配列番号１４８
【化３２５】
2018512851.tif 000448
配列番号１４９
【化３２６】
2018512851.tif 000449
【化３２７】
2018512851.tif 000450
【化３２８】
2018512851.tif 000451
配列番号１５０
【化３２９】
2018512851.tif 000452
配列番号１５１
【化３３０】
2018512851.tif 000453
配列番号１５２
【化３３１】
2018512851.tif 000454
【図１】
2018512851.tif 000455
【図２】
2018512851.tif 000456
【図３】
2018512851.tif 000457
【図４】
2018512851.tif 000458
【図５】
2018512851.tif 000459
【図６Ａ】
2018512851.tif 000460
【図６Ｂ】
2018512851.tif 000461
【配列表】
2018512851000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512851000001.app
【国際調査報告】
2018512851.tif 000653
2018512851.tif 000654
2018512851.tif 000655
2018512851.tif 000656