(57)【要約】本明細書に記載の方法および組成物は、造血幹細胞を、ヒストンメチル化の調整;TGFβシグナル伝達の阻害;p38シグナル伝達の阻害;古典的Wntシグナル伝達の活性化;およびヒストンアセチル化の調整より選択される2つまたはそれ以上の作用を示す作用物質で処理することによって、エクスビボで造血幹細胞を生成し、増大させ、富化し、かつ/または維持することに関する。一部の態様において、本明細書に記載の技術は造血幹細胞の移植に関する。2018519298.tif 000070
2018519298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項２】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項３】
第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項４】
前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項１２】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項１３】
第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項１４】
前記1種類または複数種の作用物質が、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、請求項11〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、請求項11〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、請求項11〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、請求項22〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項３０】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項３１】
第1の造血幹細胞集団を接触させる工程を含み、造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該第1の作用物質および該第2の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項３２】
1種類または複数種の前記作用物質が、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第1の造血幹細胞集団が、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、前記対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、請求項3、13、および31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記造血幹細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記造血幹細胞がCD34+細胞である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記CD34+細胞の少なくとも10％が、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記造血幹細胞がヒト臍帯血に由来する、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記造血幹細胞がヒト動員末梢血に由来する、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記造血幹細胞がヒト骨髄に由来する、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記造血幹細胞がヒトから新鮮に単離されている、請求項38〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記造血幹細胞が以前に凍結保存されたことがある、請求項38〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物細胞がマウス細胞である、請求項38に記載の方法。
【請求項４８】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質と接触する、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と同時に接触される、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記造血幹細胞が、異なる時間に前記1種類または複数種の作用物質と接触される、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれより以降に)移植後に造血幹細胞機能的能力を維持する、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)長期生着能(long term engraftment potential)を維持する、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記造血幹細胞が、患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞の集団の回復を惹起する、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記造血幹細胞が、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記造血幹細胞が、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記造血幹細胞が、2〜20％酸素の存在下で培養される、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記造血幹細胞が、2〜12％酸素の存在下で培養される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記造血幹細胞が、約5％酸素の存在下で培養される、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;ならびに
b.請求項1、11、29のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させるか、または請求項3、13、および31〜64のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、該ポリヌクレオチドを該造血幹細胞集団に導入する方法。
【請求項６６】
(a)が(b)より先行する、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
(b)が(a)より先行する、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を提供する工程を含む、請求項65〜67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬が転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がクリスパー関連タンパク質を含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の作用物質がメガヌクレアーゼを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７３】
前記造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む、請求項65〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーション(squeeze-poration)によって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項65〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む、請求項65〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
マイクロインジェクションまたはレーザーフェクション(laserfection)によって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項65〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む、請求項65〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリヌクレオチドが、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする、請求項65〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが、化学修飾されたRNAである、請求項65〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
増大した前記造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む、請求項65〜79のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項1、11、29、および32〜64のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項８２】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項2、12、30、および32〜64のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された該細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項８３】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項3、13、および31〜64のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項８４】
a.請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項８５】
前記レシピエントがヒトである、請求項80〜84のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記造血幹細胞が、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
前記造血幹細胞が、前記ドナーの動員末梢血に由来する、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
前記ドナーが、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
前記造血幹細胞が、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質とさらに接触される、請求項1〜88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質がSR1またはその類似体である、請求項34、36、および89のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記造血幹細胞が、UM171、その類似体、または表11より選択されるUM171類似体とさらに接触される、請求項1〜90のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記造血幹細胞がプロスタグランジンとさらに接触される、請求項1〜91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記プロスタグランジンがdmPGE2またはその類似体である、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
前記造血幹細胞がNotchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される、請求項1〜93のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記造血幹細胞がSIRT1阻害物質とさらに接触される、請求項1〜94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記阻害物質またはSIRT1が、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
前記レシピエントが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全(Common variable immune deficiency)(CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症(Hemophagocytic lymphohistiocystosis)、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ(Sanfillipo)症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、請求項80〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記レシピエントが、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミス(Artemis)SCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病(Unicentric Castleman's Disease)、多中心性キャッスルマン病(Multicentric Castleman's Disease)、先天性無巨核球性血小板減少症(Congenital amegakaryocytic thrombocytopenia)(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症(X-linked Immunodysregulation, polyendocrinopathy, and enteropathy)(IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群(X-linked syndrome of polyendocrinopathy, immune dysfunction, and diarrhea)(XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群(X-Linked Autoimmunity-Allergic Dysregulation Syndrome)(XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、請求項80〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記レシピエントが、血液リンパ系(hematolymphoid)悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである、請求項80〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記造血幹細胞が自己由来または同系である、請求項80〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記造血幹細胞が同種異系である、請求項80〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
【請求項１０３】
前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、請求項102に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、請求項102または103に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項103に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、請求項105に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、請求項106に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項107に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項107に記載の組成物。
【請求項１１０】
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
【請求項１１１】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項110に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、請求項110に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項110〜112のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、請求項110〜113のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、請求項110〜114のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、請求項110〜115のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、請求項110〜116のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、請求項110〜117のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項118に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項118または119に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、請求項118〜120のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項118〜121のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、請求項118〜122のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項118〜123のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２５】
(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質とを含む、組成物。
【請求項１２６】
前記1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、請求項102〜125のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、請求項102〜125のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記1種類または複数種の作用物質が、少なくとも2日間前記造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する、請求項102〜125のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記1種類または複数種の作用物質が水溶液中に存在する、請求項126〜128のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記1種類または複数種の作用物質が凍結乾燥固体として存在する、請求項126〜128のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項126〜130のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項126〜130のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記1種類または複数種の作用物質が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の前記造血幹細胞と接触した後に移植後に、該造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する、請求項126〜130のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３４】
表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、組成物。
【請求項１３５】
請求項102〜134のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞培養培地。
【請求項１３６】
血清を実質的に含まない、請求項135に記載の細胞培養培地。
【請求項１３７】
前記1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含む、請求項102〜134のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質の存在下で培養されている、請求項137に記載の組成物。
【請求項１３９】
造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項１４０】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項１４１】
第1の造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項１４２】
請求項1〜101および139〜141のいずれか一項に記載の方法によって生成された、造血幹細胞集団。
【請求項１４３】
請求項102〜134、137、および138のいずれか一項に記載の組成物を備え、添付文書をさらに備える、キット。
【請求項１４４】
前記添付文書が、前記キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、造血幹細胞集団を富化するように、または造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するように指示している、請求項143に記載のキット。
【請求項１４５】
前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している、請求項143に記載のキット。
【請求項１４６】
前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞を患者に投与するように指示している、請求項143に記載のキット。
【請求項１４７】
造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項１４８】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整、および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項１４９】
第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整、および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項１５０】
前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、請求項147〜149のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、請求項147〜150のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項151に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、請求項152に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項154に記載の方法。
【請求項１５６】
前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項１５８】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項１５９】
第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項１６０】
前記1種類または複数種の作用物質が、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、請求項147〜159のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項147〜160のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、請求項147〜161のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項147〜162のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、請求項147〜163のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、請求項147〜164のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、請求項147〜165のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、請求項147〜166のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、請求項147〜167のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７０】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項168または169に記載の方法。
【請求項１７１】
前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、請求項168〜170のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項147〜171のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、請求項147〜172のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、請求項147〜173のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質がSR1またはその類似体である、請求項147〜174のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項１７７】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項147〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項147〜177のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項147〜178のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項147〜179のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記第1の造血幹細胞集団が、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、前記対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、請求項147〜180のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記造血幹細胞が哺乳動物細胞である、請求項147〜181のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項182に記載の方法。
【請求項１８４】
前記造血幹細胞がCD34+細胞である、請求項183に記載の方法。
【請求項１８５】
前記CD34+細胞の少なくとも10％が、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である、請求項184に記載の方法。
【請求項１８６】
前記造血幹細胞がヒト臍帯血に由来する、請求項183〜185のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記造血幹細胞がヒト動員末梢血に由来する、請求項183〜185のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記造血幹細胞がヒト骨髄に由来する、請求項183〜185のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記造血幹細胞がヒトから新鮮に単離されている、請求項183〜188のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記造血幹細胞が以前に凍結保存されたことがある、請求項183〜189のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記哺乳動物細胞がマウス細胞である、請求項182に記載の方法。
【請求項１９２】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される、請求項147〜191のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質と接触する、請求項147〜192のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と同時に接触される、請求項147〜193のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記造血幹細胞が、異なる時間に前記1種類または複数種の作用物質と接触される、請求項147〜194のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する、請求項147〜195のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)移植後に、造血幹細胞機能的能力を維持する、請求項196に記載の方法。
【請求項１９８】
前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)長期生着能を維持する、請求項47〜197のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記造血幹細胞が、患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞の集団の回復を惹起する、請求項147〜198のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される、請求項199に記載の方法。
【請求項２０１】
前記造血幹細胞が、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる、請求項147〜200のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記造血幹細胞が、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される、請求項147〜201のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記造血幹細胞が、2〜20％酸素の存在下で培養される、請求項147〜202のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記造血幹細胞が、2〜12％酸素の存在下で培養される、請求項203に記載の方法。
【請求項２０４】
前記造血幹細胞が、5％酸素の存在下で培養される、請求項203に記載の方法。
【請求項２０５】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する、請求項147〜204のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する、請求項147〜205のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する、請求項147〜206のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;ならびに
b.請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させるか、または請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、該ポリヌクレオチドを該造血幹細胞集団に導入する方法。
【請求項２０９】
(a)が(b)より先行する、請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】
(b)が(a)より先行する、請求項208に記載の方法。
【請求項２１１】
前記細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を提供する工程を含む、請求項208〜201のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項211に記載の方法。
【請求項２１３】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬が転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼを含む、請求項211に記載の方法。
【請求項２１４】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がクリスパー関連タンパク質を含む、請求項211に記載の方法。
【請求項２１５】
前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の作用物質がメガヌクレアーゼを含む、請求項211に記載の方法。
【請求項２１６】
前記造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む、請求項208〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１７】
エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項208〜216のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む、請求項208〜217のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
マイクロインジェクションまたはレーザーフェクションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、請求項208〜218のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む、請求項208〜219のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記ポリヌクレオチドが、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする、請求項208〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
前記ポリヌクレオチドが、化学修飾されたRNAである、請求項208〜221のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
増大した前記造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む、請求項208〜222のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２４】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項２２５】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された該細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項２２６】
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項２２７】
a.請求項147〜207のいずれか一項に記載の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
【請求項２２８】
前記レシピエントがヒトである、請求項224〜227のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記造血幹細胞が、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する、請求項228に記載の方法。
【請求項２３０】
前記造血幹細胞が前記ドナーの動員末梢血に由来する、請求項229に記載の方法。
【請求項２３１】
前記ドナーが、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある、請求項228または229に記載の方法。
【請求項２３２】
前記造血幹細胞が、UM171、その類似体、または表11より選択されるUM171類似体とさらに接触される、請求項147〜231のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記造血幹細胞が、表11より選択される化合物とさらに接触される、請求項147〜232のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記造血幹細胞がプロスタグランジンとさらに接触される、請求項147〜233のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記プロスタグランジンがdmPGE2またはその類似体である、請求項234に記載の方法。
【請求項２３６】
前記造血幹細胞がNotchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される、請求項147〜235のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３７】
前記造血幹細胞がSIRT1阻害物質とさらに接触される、請求項147〜236のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３８】
前記阻害物質またはSIRT1が、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される、請求項237に記載の方法。
【請求項２３９】
前記レシピエントが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全(CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、請求項224〜238のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
前記レシピエントが、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミスSCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病、多中心性キャッスルマン病、先天性無巨核球性血小板減少症(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症(IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群(XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群(XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、請求項224〜238のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記レシピエントが、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである、請求項224〜238のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
前記造血幹細胞が自己由来または同系である、請求項224〜241のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
前記造血幹細胞が同種異系である、請求項224〜241のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
【請求項２４５】
前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、請求項244に記載の組成物。
【請求項２４６】
前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、請求項244または245に記載の組成物。
【請求項２４７】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項244〜246のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４８】
前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、請求項244〜247のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４９】
前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、請求項244〜248のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５０】
前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項249に記載の組成物。
【請求項２５１】
前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、請求項244〜250のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５２】
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
【請求項２５３】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項252に記載の組成物。
【請求項２５４】
前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、請求項252に記載の組成物。
【請求項２５５】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項252〜254のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５６】
前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、請求項252〜255のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５７】
前記1種類または複数種の作用物質が、前記p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、請求項252〜256のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５８】
前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、請求項252〜257のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５９】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、請求項252〜258のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６０】
前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、請求項252〜259のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６１】
前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、請求項252〜260のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６２】
前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、請求項260または261に記載の組成物。
【請求項２６３】
前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、請求項260〜262のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６４】
前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項260〜263のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６５】
前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、請求項260〜264のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６６】
前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む、請求項260〜265のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６７】
アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する前記1種類または複数種の作用物質がSR1を含む、請求項244〜266のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６８】
前記1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、請求項244〜267のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６９】
前記1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、請求項244〜268のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７０】
前記1種類または複数種の作用物質が、少なくとも2日間前記造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する、請求項244〜269のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７１】
前記1種類または複数種の作用物質が水溶液中に存在する、請求項244〜270のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７２】
前記1種類または複数種の作用物質が凍結乾燥固体として存在する、請求項244〜271のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７３】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、請求項244〜272のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７４】
前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、請求項244〜273のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７５】
前記1種類または複数種の作用物質が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の前記造血幹細胞と接触した後に移植後に、該造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する、請求項244〜274のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７５】
表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、組成物。
【請求項２７６】
請求項244〜275のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞培養培地。
【請求項２７７】
血清を実質的に含まない、請求項276に記載の細胞培養培地。
【請求項２７８】
前記1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含む、請求項244〜277のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７９】
前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質の存在下で培養されている、請求項278に記載の組成物。
【請求項２８０】
造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と、ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
【請求項２８１】
1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
【請求項２８２】
第1の造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の該作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
【請求項２８３】
請求項147〜243および280〜282のいずれか一項に記載の方法によって生成された、造血幹細胞集団。
【請求項２８４】
請求項244〜279のいずれか一項に記載の組成物を備え、添付文書をさらに備える、キット。
【請求項２８５】
前記添付文書が、前記キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、造血幹細胞集団を富化するように、または造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するように指示している、請求項284に記載のキット。
【請求項２８６】
前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞内においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している、請求項284に記載のキット。
【請求項２８７】
前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞を患者に投与するように指示している、請求項284に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条(e)の下で、2015年6月25日に出願された米国特許仮出願第62/184,599号および2015年8月19日に出願された米国特許仮出願第62/207,136号の恩典を主張する。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。このASCIIコピーは2016年6月13日に作成され、701039-084082-PCT_SL.txtと命名され、サイズは3,946バイトである。
【０００３】
技術分野
本明細書に記載の技術は、造血幹細胞のエクスビボでの増大、富化、および富化のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
造血幹細胞には、かなり大きい治療上の可能性があるが、診療所での用途を妨げてきた制約は、これらの細胞を十分な数で入手することに関連する難しさであった。特に、造血幹細胞はエクスビボで維持、増殖、および増大しにくい。治療法としての造血幹細胞(HSC)の用途をさらに発展させるために克服すべき別の課題は、これらの細胞をエクスビボで培養した時に起こり得る多分化能の消失である。現在、これらの細胞の多分化能および造血機能を保存する、HSCのエクスビボでの維持、増殖、および増大のための組成物および方法が必要とされている。造血幹細胞のエクスビボでの維持、増殖、増大、および富化を可能にする多数の化合物を本発明者らが発見したことが本明細書において説明される。本発明の組成物および方法は、これらの細胞を維持するため、増殖するため、および増大させるための戦略を提供することによって、また、インビトロで、およびレシピエントに移植された時にエクスビボ培養細胞が自己複製し、多数の異なる血球タイプに分化する能力を保存しながら、HSCについて不均一な細胞集団を富化することによって従来のHSC療法が突きつけてきた課題に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、エクスビボ培養中の造血幹細胞の増大、富化、および維持のための組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法は、造血系統内の多数の細胞タイプに分化する能力を保持している増大した造血幹細胞集団を生成するのに使用することができる。さらに、本発明は、エクスビボ増殖中に造血幹細胞内にポリヌクレオチドを導入するための方法およびエクスビボ増殖中に造血幹細胞内でポリヌクレオチドの発現を調整するための方法を提供する。本発明の組成物および方法に従って生成された造血幹細胞もしくはその子孫、またはこれらの造血幹細胞に由来する細胞は、様々な病態を処置するためにヒト患者などのレシピエントに注入することができる。本発明はまた、これらの細胞の増大、富化、および維持に有用な作用物質を含有する、造血幹細胞を培養するための培地も提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載の本発明の組成物を含むキットを提供する。
【０００６】
第1の局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在するように、造血幹細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2つまたはそれ以上の作用を示す。
【０００７】
第2の局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在するように、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2つまたはそれ以上の作用を示す。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触された造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示すように、第1の造血幹細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法に関する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2つまたはそれ以上の作用を示す。
【０００９】
本発明の前記局面の態様において、ヒストンメチル化の調整は、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である。さらなる態様において、ヒストンアセチル化の調整は、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である。本発明の特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む。
【００１０】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む。一部の態様において、表11に列挙した1種類または複数種の化合物はUM171を含む。
【００１１】
本発明のある特定の態様において、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物はヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、TGFβシグナル伝達を阻害する化合物はTGFβ受容体阻害物質である。TGFβシグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質はTGFβ受容体阻害物質を含んでもよい。一部の態様において、TGFβ受容体阻害物質は、ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択される。一部の態様において、TGFβ受容体阻害物質はA83-01である。
【００１２】
特定の場合において、ヒストンデメチラーゼ阻害物質はLSD1阻害物質である。例えば、LSD1阻害物質はLSD1阻害物質IV RN-1またはトラニルシプロミンでもよく、TGFβ受容体阻害物質はALK5阻害物質II(E-616452)でもよい。一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質は、ヒストンメチル化を活性化するか、ヒストンメチル化を維持するか、またはヒストン脱メチルを阻害する。例えば、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質はヒストンデメチラーゼ阻害物質を含んでもよい。一部の態様において、ヒストンデメチラーゼ阻害物質は、LSD1阻害物質、例えば、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるLSD1阻害物質である。一部の態様において、LSD1阻害物質はトラニルシプロミンである。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在するように、造血幹細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を阻害する。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在するように、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法に関する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を阻害する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示すように、第1の造血幹細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を阻害する。
【００１６】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質はヒストンアセチル化を活性化するか、ヒストンアセチル化を維持するか、またはヒストン脱アセチルを阻害する。一部の態様において、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質は、ヒストン脱アセチル阻害物質、例えば、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質を含む。一部の態様において、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質はトリコスタチンAである。
【００１７】
本発明の上記局面のある特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む。
【００１８】
本発明の上記局面の特定の態様において、ヒストンデメチラーゼはLSD1である。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む。場合によっては、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質はTGFβ受容体である。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含む。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、前記化合物はSB203580である。さらに、または代わりに、1種類または複数種の作用物質は、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2(FGF塩基性、例えば、組換えマウスFGF2とも呼ばれる)からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含む。なおさらなる場合では、1種類または複数種の作用物質は、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodax(ロミデスピン(romidepsin))からなる群より選択される、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む。他の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する。ある特定の態様において、ヒストンデメチラーゼはLSD1である。さらなる態様において、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質はTGFβ受容体である。特定の場合において、1種類または複数種の作用物質は、LSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質II(E-616452)を含む。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む。さらに他の場合では、1種類または複数種の作用物質は、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む。他の態様において、1種類または複数種の作用物質は、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む。ある特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、表1〜10のいずれか1つにおいて指定された阻害物質または他の作用物質の組み合わせを含む。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodax (ロミデスピン)からなる群より選択される第2の作用物質と接触させることによって、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodax (ロミデスピン)からなる群より選択される第2の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法に関する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質、ならびに(b)ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodax (ロミデスピン)からなる群より選択される第2の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが第1の作用物質および第2の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、方法を提供する。
【００２２】
本発明の任意の上記局面の態様において、1種類または複数種の作用物質は、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせでもよい。本発明の上記局面のある特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞10％またはそれ以上、造血幹細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質(例えば、SR1とも呼ばれるステムレゲニン(Stem Regenin)1、もしくはその類似体)、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール(cambinol)、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について細胞集団を富化するのに十分な量で存在する。さらに他の態様では、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質(例えば、SR1もしくはその類似体)、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について細胞集団を富化するのに十分な量で存在する。
【００２３】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む。一部の態様において、表11に列挙した1種類または複数種の化合物はUM171を含む。
【００２４】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、TGFβシグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程をさらに含む。TGFβシグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質はTGFβ受容体阻害物質を含んでもよい。一部の態様において、TGFβ受容体阻害物質は、ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択される。一部の態様において、TGFβ受容体阻害物質はA83-01である。
【００２５】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質はヒストンメチル化を活性化するか、ヒストンメチル化を維持するか、またはヒストン脱メチルを阻害する。例えば、ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質はヒストンデメチラーゼ阻害物質を含んでもよい。一部の態様において、ヒストンデメチラーゼ阻害物質は、LSD1阻害物質、例えば、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるLSD1阻害物質である。一部の態様において、LSD1阻害物質はトラニルシプロミンである。
【００２６】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質はヒストンアセチル化を活性化するか、ヒストンアセチル化を維持するか、またはヒストン脱アセチルを阻害する。一部の態様において、ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質は、ヒストン脱アセチル阻害物質、例えば、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質を含む。一部の態様において、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質はトリコスタチンAである。
【００２７】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、
a.p38シグナル伝達の阻害;および
b.古典的Wntシグナル伝達の活性化
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。
【００２８】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質、例えば、SR1と接触させる工程を含む。
【００２９】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００３０】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００３１】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００３５】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む。
【００３６】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質と接触させる工程を含む。
【００３７】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質と接触させる工程を含む。
【００３８】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質と接触させる工程を含む。
【００３９】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、
a.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;ならびに
b.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む。
【００４０】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体を阻害する1種類または複数種の作用物質、例えば、SR1と接触させる工程を含む。
【００４１】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、BMPシグナル伝達を阻害する化合物と接触させる工程を含む。
【００４２】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００４３】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００４４】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の化合物および1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００４５】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、アリール炭化水素受容体を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００４７】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、アリール炭化水素受容体を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００４８】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程をさらに含む。
【００４９】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質と接触させる工程をさらに含む。
【００５０】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質と接触させる工程を含む。
【００５１】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質と接触させる工程を含む。
【００５２】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団を、
a.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;ならびに
b.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物
からなる群より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む。
【００５３】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞集団をSR1と接触させる工程を含む。
【００５４】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物、ならびに
a.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質;ならびに
f.SR1を含む、アリール炭化水素受容体阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物、ならびに1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００５５】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、UM171、ならびに
a.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質;ならびに
f.SR1を含む、アリール炭化水素受容体阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、UM171および1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、UM171、その構造類似体、および表11に列挙した化合物より選択される1種類または複数種の化合物、ならびに
a.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質;ならびに
f.SR1を含む、アリール炭化水素受容体阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたがUM171および1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００５７】
別の局面において、本発明は、造血幹細胞集団を、SR1、ならびに
a.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;ならびに
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程を含む、工程であって、SR1および1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法を提供する。
【００５８】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、SR1、ならびに
a. LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;ならびに
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、SR1および1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法を提供する。
【００５９】
別の局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、SR1、ならびに
a.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物;
d.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物;ならびに
e.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたがSR1および1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法を提供する。
【００６０】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質または化合物は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、1種類または複数種の作用物質または化合物と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する。
【００６１】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質または化合物は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する。
【００６２】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質または化合物は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、1種類または複数種の作用物質または化合物と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について細胞集団を富化するのに十分な量で存在する。
【００６３】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質または化合物は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について細胞集団を富化するのに十分な量で存在する。
【００６４】
一部の態様において、第1の造血幹細胞集団は、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す。
【００６５】
一部の態様において、造血幹細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。一部の態様において、造血幹細胞はCD34+細胞である。一部の態様において、CD34+細胞の少なくとも10％は、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である。一部の態様において、造血幹細胞はヒト臍帯血に由来する。一部の態様において、造血幹細胞はヒト動員末梢血に由来する。一部の態様において、造血幹細胞はヒト骨髄に由来する。一部の態様において、造血幹細胞はヒトから新鮮に単離されている。一部の態様において、造血幹細胞は以前に凍結保存されたことがある。一部の態様において、哺乳動物細胞はマウス細胞である。
【００６６】
造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する上記方法の態様において、造血幹細胞集団は、培養2日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す。
【００６７】
本発明の任意の上記局面の態様において、造血幹細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の場合では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。特定の態様において、ヒト細胞はCD34+細胞である。ある特定の場合では、CD34+細胞の少なくとも10％は、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である。ある特定の態様において、造血幹細胞はヒト臍帯血に由来する。他の態様において、造血幹細胞はヒト動員末梢血に由来する。代わりの態様において、造血幹細胞はヒト骨髄に由来する。ある特定の場合では、造血幹細胞はヒトから新鮮に単離されている。他の場合では、造血幹細胞は以前に凍結保存されたことがある。本発明の特定の態様において、哺乳動物細胞はマウス細胞である。
【００６８】
本発明の任意の上記方法のさらなる態様において、造血幹細胞は2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される。ある特定の場合では、造血幹細胞は2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれより以上)1種類または複数種の作用物質と接触する。場合によっては、造血幹細胞は1種類または複数種の作用物質と同時に接触される。他の態様において、造血幹細胞は異なる時間に1種類または複数種の作用物質と接触される。
【００６９】
本発明の上記方法のある特定の態様において、造血幹細胞は、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれより以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する。特定の場合において、造血幹細胞は、培養2日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)移植後に、造血幹細胞機能的能力を維持する。他の態様において、造血幹細胞は、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、長期生着能(long term engraftment potential)を維持する。ある特定の場合では、造血幹細胞は患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞集団の回復を惹起する。特定の態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される。ある特定の場合では、造血幹細胞は、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、造血幹細胞は、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される。ある特定の場合では、造血幹細胞は2〜20％酸素、2〜12％酸素、または約5％酸素の存在下で培養される。一部の態様において、造血幹細胞は2〜12％酸素の存在下で培養される。一部の態様において、造血幹細胞は約5％酸素の存在下で培養される。
【００７１】
本発明のさらなる態様において、造血幹細胞は、1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する。ある特定の場合では、造血幹細胞は、1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する。一部の態様において、造血幹細胞は、1種類または複数種の作用物質または化合物と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+EPCR+富化細胞画分中に元々存在する。特定の場合において、造血幹細胞は、1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する。
【００７２】
さらなる局面において、本発明は、
a.1つまたは複数のポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;および
b.本発明の上記方法に従って造血幹細胞集団を増大させるかまたは維持する工程
を含む、造血幹細胞集団において1つもしくは複数のポリヌクレオチドを導入し、かつ/または1つもしくは複数のポリヌクレオチドの発現を調整する方法を提供する。
【００７３】
ある特定の場合では、(a)は(b)より先行する。他の態様において、(b)は(a)より先行する。
【００７４】
別の局面において、本発明は、
a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;および
b.上記態様のいずれか1つの方法に従って造血幹細胞集団を増大させるか、または上記態様のいずれか1つの方法に従って造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に導入する方法を提供する。
【００７５】
一部の態様において、上記の工程(a)は工程(b)より先行する。一部の態様において、工程(b)は工程(a)より先行する。
【００７６】
さらなる態様において、前記方法は、細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を導入する工程をさらに含む。ある特定の場合では、細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クリスパー関連タンパク質、またはメガヌクレアーゼを含む。
【００７７】
本発明のある特定の態様において、造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス(例えば、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、およびAd48)、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)を含む二本鎖DNAウイルス、ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ(Ankara)、鶏痘、およびカナリアポックス))と接触させることによって、1つまたは複数のポリヌクレオチドは造血幹細胞に導入される。他の場合では、造血幹細胞を、転位因子(例えば、ピギーバック(piggybac)トランスポゾンまたはスリーピングビューティー(sleeping beauty)トランスポゾン)をコードするベクターと接触させることによって、1つまたは複数のポリヌクレオチドは造血幹細胞に導入される。
【００７８】
一部の態様において、前記方法は、造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む。
【００７９】
本発明のある特定の態様において、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーション(squeeze-poration)によって造血幹細胞に導入される。
【００８０】
一部の態様において、前記方法は、細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む。
【００８１】
一部の態様において、前記方法は、マイクロインジェクションまたはレーザーフェクション(laserfection)によってポリヌクレオチドを造血幹細胞に導入する工程を含む。
【００８２】
一部の態様において、ポリヌクレオチドは、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む。
【００８３】
一部の態様において、ポリヌクレオチドは、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、化学修飾されたRNAである。
【００８４】
本発明のある特定の態様において、造血幹細胞を、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、例えば、ジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストラン、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、磁気ビーズと接触させることによって、または造血幹細胞のマイクロインジェクションもしくはレーザーフェクションによって、1つまたは複数のポリヌクレオチドは造血幹細胞に導入される。
【００８５】
さらなる態様において、造血幹細胞を、1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むナノ粒子と接触させることによって、1つまたは複数のポリヌクレオチドは造血幹細胞に導入される。ある特定の態様において、造血幹細胞を、1つまたは複数のVSV-G誘導マイクロベシクル(ジェシクル(Gesicle)とも呼ばれる)と接触させることによって、1つまたは複数のポリヌクレオチドは造血幹細胞に導入される。
【００８６】
特定の場合において、造血幹細胞集団に導入される1つまたは複数のポリヌクレオチドは、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーを含有する。他の場合では、1つまたは複数のポリヌクレオチドはタンパク質またはRNA分子(例えば、mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、またはshRNA)をコードする。ある特定の態様において、造血幹細胞集団に導入される1つまたは複数のポリヌクレオチドは、化学修飾されたRNA分子である。
【００８７】
さらなる態様において、前記方法は、ポリヌクレオチドが挿入されている増大した造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む。
【００８８】
別の局面において、本発明は、
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.本発明の上記方法に従って造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、リンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法を提供する。
【００８９】
さらなる局面において、本発明は、
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.本発明の上記方法に従って造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、リンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法に関する。
【００９０】
別の局面において、本発明は、
a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.本発明の上記方法に従って造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、およびリンパ球、例えば、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法を提供する。
【００９１】
さらなる局面において、本発明は、
a.本発明の上記方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、リンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法を提供する。
【００９２】
本発明の上記方法の一部の態様において、レシピエントはヒトである。特定の態様において、造血幹細胞は、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する。ある特定の場合では、造血幹細胞はドナーの動員末梢血に由来する。さらなる態様において、ドナーは、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある。
【００９３】
本発明の任意の上記方法の一部の態様において、造血幹細胞は、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質とさらに接触される。例えば、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質はSR1またはその類似体でもよい。本発明のさらなる態様において、造血幹細胞はUM171もしくはその類似体とさらに接触される。さらに他の態様において、造血幹細胞は、プロスタグランジン、例えば、dmPGE2またはその類似体とさらに接触される。ある特定の場合では、造血幹細胞はNotchシグナル伝達アゴニストと接触されてもよい。さらなる態様において、造血幹細胞はSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触されてもよい。
【００９４】
一部の態様において、造血幹細胞は、Notchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される。
【００９５】
一部の態様において、造血幹細胞はSIRT1阻害物質とさらに接触される。一部の態様において、前記阻害物質またはSIRT1は、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される。
【００９６】
本発明の方法の一部の態様において、レシピエントは、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全(Common variable immune deficiency)(CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症(Hemophagocytic lymphohistiocystosis)、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ(Sanfillipo)症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である。
【００９７】
一部の態様において、レシピエントは、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミス(Artemis)SCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病(Unicentric Castleman's Disease)、多中心性キャッスルマン病(Multicentric Castleman's Disease)、先天性無巨核球性血小板減少症(Congenital amegakaryocytic thrombocytopenia)(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症(X-linked Immunodysregulation, polyendocrinopathy, and enteropathy)(IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群(X-linked syndrome of polyendocrinopathy, immune dysfunction, and diarrhea)(XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群(X-Linked Autoimmunity-Allergic Dysregulation Syndrome)(XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される遺伝性血液疾患に罹患しているヒト患者である。
【００９８】
一部の態様において、レシピエントは、血液リンパ系(hematolymphoid)悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである。
【００９９】
本発明の組成物および/または方法によって増大した、富化された、または維持された造血幹細胞集団ならびにその子孫はまた、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、またはタンパク質欠損症に罹患している患者(例えば、ヒト患者)を処置するのにも使用することができる。他の態様において、患者は組織または細胞移植片のレシピエントでもよく、造血幹細胞またはその子孫は、移植される組織または細胞に対する寛容を誘導するために投与される。
【０１００】
患者を造血幹細胞またはその子孫で処置する上記方法の一部の態様において、造血幹細胞は自己由来または同系である。または、造血幹細胞は同種異系でもよい。
【０１０１】
さらなる局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物を提供する。
【０１０２】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2つまたはそれ以上の作用を示す。
【０１０３】
別の局面において、本発明は、
a.表11に列挙した1種類または複数種の化合物、ならびに
b.TGFβシグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質;
c.ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質;
d.ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質;および
e.アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１０４】
別の局面において、本発明は、
a.アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質、ならびに
b.TGFβシグナル伝達を阻害する1種類または複数種の作用物質;
c.ヒストンメチル化を調整する1種類または複数種の作用物質;および
d.ヒストンアセチル化を調整する1種類または複数種の作用物質
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１０５】
一部の態様において、表11に列挙した化合物はUM171である。
【０１０６】
複数の態様において、ヒストンメチル化の調整は、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である。さらなる態様において、ヒストンアセチル化の調整は、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である。特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む。ある特定の場合では、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物はヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、TGFβシグナル伝達を阻害する化合物はTGFβ受容体阻害物質である。特定の態様において、ヒストンデメチラーゼ阻害物質はLSD1阻害物質である。さらなる態様において、LSD1阻害物質はLSD1阻害物質IV RN-1であり、TGFβ受容体阻害物質はALK5阻害物質II(E-616452)である。
【０１０７】
一部の態様において、アリール炭化水素受容体阻害物質はSR1である。
【０１０８】
一部の態様において、前記組成物は、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される1種類または複数種のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物を提供する。
【０１１０】
一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、上記の群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を阻害する。
【０１１１】
本発明のこの局面の一部の態様において、ヒストンデメチラーゼはLSD1である。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む。特定の場合において、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質はTGFβ受容体である。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は、ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含む。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、前記化合物はSB203580である。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2(例えば、組換えマウスFGF2)からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含む。さらに他の態様において、1種類または複数種の作用物質は、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodax(ロミデスピン)からなる群より選択される、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む。特定の場合において、1種類または複数種の作用物質は一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する。ある特定の態様において、ヒストンデメチラーゼはLSD1である。さらなる態様において、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質はTGFβ受容体である。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、LSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質II(E-616452)を含む。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む。他の態様において、1種類または複数種の作用物質は、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、
a.表11に列挙した化合物、ならびに
b.TGFβ受容体阻害物質;
c.ヒストンデメチラーゼ阻害物質;
d.ヒストンデアセチラーゼ阻害物質;および
e.アリール炭化水素受容体阻害物質
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１１３】
別の局面において、本発明は、
a.アリール炭化水素受容体阻害物質、ならびに
b.TGFβ受容体阻害物質;
c.表11に列挙した化合物;
d.ヒストンデメチラーゼ阻害物質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ阻害物質
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１１４】
一部の態様において、前記組成物は、
a.SB203580を含む、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物、ならびに
b.CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物
からなる群より選択される1種類または複数種の作用物質を含む。
【０１１５】
別の局面において、本発明は、
a.UM171、その構造類似体、または表11に列挙した化合物、ならびに
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;
d.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質;ならびに
e.SR1
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１１６】
別の局面において、本発明は、
a.SR1、ならびに
b.ALK5阻害物質II、LY364947、DMH1、およびA83-01からなる群より選択されるTGFβ受容体阻害物質;
c.LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質;ならびに
d.トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質
の1つまたは複数を含む、組成物を提供する。
【０１１７】
別の局面において、本発明は、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、 (b)ALK5阻害物質II(E-616452)、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodax (ロミデスピン)からなる群より選択される第2の作用物質とを含む、組成物を提供する。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する。さらなる態様において、1種類または複数種の作用物質は、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する。さらに他の態様において、1種類または複数種の作用物質は、少なくとも2日間造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する。特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は水溶液中に存在する。他の態様において、1種類または複数種の作用物質は凍結乾燥固体として存在する。
【０１１８】
本発明の上記の組成物の一部の態様において、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質(例えば、SR1もしくはその類似体)、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する。ある特定の場合では、1種類または複数種の作用物質は、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目後、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質(例えば、SR1もしくはその類似体)、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について細胞集団を富化するのに十分な量で存在する。特定の態様において、1種類または複数種の作用物質は、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の細胞と接触した後に移植後に、造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する。
【０１１９】
さらなる局面において、本発明は、表1〜10のいずれか1つにおいて指定された多成分組み合わせを含む、組成物を提供する。
【０１２０】
別の局面において、本発明は、本発明の上記の任意の組成物を含む、細胞培養培地を提供する。ある特定の場合では、細胞培養培地は血清を実質的に含まない。一部の態様において、例えば、造血幹細胞の増殖をさらに刺激するために、または望ましい血球集団への造血幹細胞の分化を誘導するために、サイトカインが本発明の細胞培養培地に添加されてもよい。
【０１２１】
本発明の上記の組成物の態様において、前記組成物は、1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含んでもよい。ある特定の場合では、造血幹細胞は1種類または複数種の作用物質の存在下で2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養されている。
【０１２２】
さらなる局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質、ならびにアリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体からなる群より選択される1種類または複数種の物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在するように、造血幹細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法であって、前記細胞が1種類または複数種の物質とさらに接触される、方法を提供する。
【０１２３】
さらなる局面において、本発明は、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質、ならびにアリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体からなる群より選択される1種類または複数種の物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在するように、1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法であって、前記細胞が1種類または複数種の物質とさらに接触される、方法を提供する。
【０１２４】
さらなる局面において、本発明は、第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法であって、第1の造血幹細胞集団が、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体からなる群より選択される1種類または複数種の物質とさらに接触され、2日後またはそれ以降に、第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、方法に関する。
【０１２５】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の上記の任意の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する。他の場合では、本発明は、本発明の上記の任意の方法によって生成された造血幹細胞に由来する細胞集団を提供する。
【０１２６】
さらなる局面において、本発明は、添付文書に加えて、本発明の上記の任意の組成物を備える、キットを提供する。ある特定の場合では、添付文書は、キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、富化するように、または維持するように指示している。他の場合では、添付文書は、使用者に、造血幹細胞においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している。さらなる態様において、添付文書は、使用者に、造血幹細胞をレシピエントに投与するように指示している。
【０１２７】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用するいくつかの用語および句の意味が以下で示される。特に定めのない限り、または文脈から暗に示されていない限り、以下の用語および句は、以下で示される意味を含む。定義は、特定の態様の説明を助けるために示され、本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるので本発明を限定することを目的としない。特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と、本明細書において示された用語の定義との間に明らかな矛盾があれば、本明細書において示された定義が優先されるものとする。
【０１２８】
本明細書で使用する、造血幹細胞または造血前駆細胞の「増大した集団」という用語は、集団中の造血幹細胞の量が、本明細書に記載のように1種類または複数種の作用物質(例えば、ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質)が投与される前のHSC数よりも多くなる(例えば、少なくとも10％多くなる、少なくとも20％多くなる、少なくとも30％多くなる)ような、少なくとももう1つの造血幹細胞を含む細胞集団を指す。一部の態様において、1種類または複数種の作用物質はTGFβシグナル伝達を調整するか、リジンメチル化を調整するか、p38シグナル伝達を調整するか、古典的Wntシグナル伝達を調整するか、ヒストンメチル化を調整するか、またはヒストンアセチル化を調整する。
【０１２９】
本明細書で使用する、ヒストン脱メチルを阻害する作用物質は、ヒストンデメチラーゼまたはヒストン脱メチルにつながる中間体の形成を触媒する他の酵素の活性を弱めることまたは阻止することができる物質または組成物(例えば、低分子、タンパク質、干渉RNA、メッセンジャーRNA、または他の天然化合物もしくは合成化合物、あるいは組成物、例えば、複数の物質で構成されるウイルス材料または他の材料)を指す。阻害は直接的な相互作用によって行われてもよく、間接的な手段を介して、例えば、細胞において産生されるヒストンデメチラーゼの量を低減することによって、またはヒストンデメチラーゼとメチル化ヒストン基質との相互作用を阻害することによって行われてもよい。ヒストンデメチラーゼには、リジン特異的デメチラーゼ、例えば、LSD1およびLSD2、ならびに他のFAD依存性ヒストンデメチラーゼが含まれる。ヒストンデメチラーゼには、二価鉄(Fe2+)を利用して、ヒストン残基の酸化的脱メチルを触媒するジオキシゲナーゼ、例えば、AlkB、およびJumonji C(JmjC)ドメイン含有ヒストンデメチラーゼ、例えば、JHDM1、JHDM2、およびヒストンデメチラーゼのJMJD2スーパーファミリーメンバーも含まれる。メチル化ヒストン残基を、後で酸化的脱メチルを受ける反応性中間体に変換する他の酵素にはモノアミンオキシダーゼが含まれる。ヒストン脱メチル阻害物質はヒストンデメチラーゼに直接結合し、酵素活性部位での結合においてメチル化ヒストン基質と競合してもよい。または、ヒストン脱メチルを阻害する作用物質は、活性部位から離れた場所でヒストンデメチラーゼに結合し、例えば、酵素のコンホメーション変化を誘導することによって酵素とメチル化ヒストン基質との相互作用を破壊または阻止してもよく、例えば、酵素補因子を不活化することまたは移動させることによって触媒サイクルを破壊または阻止してもよい。
【０１３０】
ヒストン脱メチルを阻害する作用物質は、当技術分野において公知の、または本明細書に記載のヒストン脱メチルアッセイ法から確かめられた時に、100μM以下(例えば、1nM〜100μM)の最大半量阻害濃度(half-maximal inhibitory concentration)(IC50)で脱メチルヒストン残基の形成を弱めることまたは阻止することができる。ヒストン脱メチル阻害物質の生物学的活性を解明するのに使用することができる例示的なアッセイ法には、特に、US8,735,622に記載のように細胞に基づく増殖阻害アッセイおよび解離増強ランタニド蛍光アッセイ法(dissociation-enhanced lanthanide fluorescence assay)、WO2014/151945に記載のように時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ法、ならびにWO2010/043866に記載のように質量分析法に基づくアッセイ法および共役-酵素ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼアッセイ法(coupled-enzyme formaldehyde dehydrogenase assay)が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１３１】
本明細書で使用する、TGFβシグナル伝達経路を阻害する作用物質とは、SMAD転写コアクチベータータンパク質の作用により転写される1つまたは複数の遺伝子の転写を弱めることまたは阻止することができる物質または組成物(例えば、低分子、タンパク質、干渉RNA、メッセンジャーRNA、または他の天然化合物もしくは合成化合物、あるいは組成物、例えば、複数の物質で構成されるウイルス材料または他の材料)を指す。TGFβシグナル伝達経路を阻害する作用物質は、この経路内の1つまたは複数の点において、SMAD誘導性遺伝子転写につながるシグナル伝達カスケードを破壊してもよい。例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、TGFβまたはTGFβスーパーファミリーリガンド、例えば、アクチビン、Nodal、骨形成タンパク質(BMP)、増殖分化因子(GDF)、またはミュラー管阻害因子(Mullerian inhibitory factor)(MIF)がその内因性受容体に結合するのを破壊または阻止し、従って、受容体関連SMADタンパク質のリン酸化および活性化を阻害してもよい。TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、例えば、SMADタンパク質に結合し、SMADタンパク質とヌクレオポリンとの相互作用を阻止または破壊することによって、1種類または複数種のSMADタンパク質の核への移動を阻止することによって機能してもよい。TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、1種類または複数種のSMADタンパク質と、受容体活性化のためのSMADアンカー(SMAD Anchor for Receptor Activation)(SARA)との相互作用を安定化してもよい。この安定化により、細胞質内にSMADタンパク質が隔離され、核への移動が組織される。TGFβシグナル伝達経路阻害物質の他の例には、SMADタンパク質に結合し、SMADタンパク質をDNA結合転写因子から隔離し、従って、標的遺伝子の転写を阻止する物質、例えば、ニューロゲニンが含まれる。代わりのTGFβシグナル伝達経路阻害物質には、1種類または複数種のSMADタンパク質のユビキチン結合を促進し、それによって、このタンパク質に、プロテアソームによる分解のための印を付け、標的遺伝子転写を阻止する物質が含まれる。
【０１３２】
TGFβシグナル伝達経路阻害物質の阻害活性を確かめるのに使用することができる例示的なアッセイ法には、特に、WO2006/012954に記載のように、電気泳動移動度シフト解析、抗体スーパーシフトアッセイ法、ならびにTGFβ誘導性遺伝子レポーターアッセイ法が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１３３】
本明細書で使用する、p38シグナル伝達経路を阻害する作用物質とは、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK、例えば、p38α、p38β、p38γ、もしくはp38δ)またはこれらの酵素の1つもしくは複数の活性化に直接的または間接的に関与する任意のタンパク質の活性を弱めることまたは阻止することができる物質または組成物(例えば、低分子、タンパク質、干渉RNA、メッセンジャーRNA、または他の天然化合物もしくは合成化合物、あるいは組成物、例えば、複数の物質で構成されるウイルス材料または他の材料)を指す。p38シグナル伝達経路を阻害する作用物質には、IL-1Rなどのサイトカイン受容体に結合し、この受容体を介したp38MAPキナーゼ活性化を阻止するモノクローナル抗体などの物質が含まれてもよい。または、p38シグナル伝達経路阻害物質はp38タンパク質に直接結合し、MAPキナーゼによるp38活性化ループのリン酸化を弱めてもまたは阻止してもよい。または、p38シグナル伝達経路を阻害する作用物質は、MAPK複合体のスキャフォールドとして役立つ、TNF受容体関連因子(TRAF)のリジン残基におけるポリユビキチン鎖の形成を破壊してもよい。他のp38シグナル伝達経路阻害物質には、活性化ループから離れた部位においてMAPキナーゼのリン酸化を促進し、p38との会合を阻止するもの、ならびに活性化ループ内にあるMAPキナーゼをアセチル化し、従って、MAPキナーゼのリン酸化と、同時に発生する活性化を阻止するものが含まれる。
【０１３４】
p38シグナル伝達経路を阻害する作用物質の阻害活性を確かめるのに使用することができる例示的なアッセイ法には、特に、WO2006/012954に記載のように、蛍光異方性競合結合アッセイ法(fluorescence anisotropy competitive binding assay)、ならびに時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ法が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１３５】
本明細書で使用する、ヒストン脱アセチルを阻害する作用物質とは、直接的な相互作用を介して、または間接的な手段を介して、例えば、細胞において産生されるヒストンデアセチラーゼの量を低減することによって、またはヒストンデアセチラーゼとアセチル化ヒストン基質との相互作用を阻害することによって、ヒストンデアセチラーゼの活性、さらに具体的には、その酵素活性を弱めることまたは阻止することができる物質または組成物(例えば、低分子、タンパク質、干渉RNA、メッセンジャーRNA、または他の天然化合物もしくは合成化合物、あるいは組成物、例えば、複数の物質で構成されるウイルス材料または他の材料)を指す。ヒストンデアセチラーゼ酵素活性を阻害するとは、ヒストンデアセチラーゼがヒストン残基(例えば、ヒストンタンパク質内の、モノメチル化、ジメチル化、もしくはトリメチル化したリジン残基;モノメチル化アルギニン残基、または対称性/非対称性ジメチル化アルギニン残基)からのアセチル基の除去を触媒する能力を低減することを意味する。好ましくは、ヒストン脱アセチルを阻害する作用物質が、別の関連しない生物学的効果を生じるのに必要な阻害物質の濃度より低い濃度で、ヒストンデアセチラーゼがヒストン残基からアセチル基を除去する能力を低減するように、このような阻害は特異的である。
【０１３６】
本明細書で使用する「ヒストンデアセチラーゼ」および「HDAC」という用語は、ヒストンのN末端にあるリジン残基のε-アミノ基からのアセチル基の除去を触媒する酵素ファミリーのいずれか1つを指す。文脈によって特に定めのない限り、「ヒストン」という用語は、任意の種に由来する、HI、H2A、H2B、H3、H4、およびH5を含む任意のヒストンタンパク質を指すことが意図される。ヒトHDACタンパク質または遺伝子産物には、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10、およびHDAC-11が含まれるが、これに限定されない。
【０１３７】
本明細書で使用する、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する作用物質には、β-カテニンリン酸化またはユビキチン結合を阻害する作用物質が含まれる。これらの作用物質は、例えば、β-カテニンを、ユビキチン結合のための基質およびプロテアソームを介した分解のための基質にする、(例えば、残基Ser33、Ser37、および/またはThr41にある)セリン残基および/またはスレオニン残基のリン酸化の触媒作用を弱めることによって、β-カテニン分解の速度または程度を低減することができる任意の物質(例えば、低分子、タンパク質、干渉RNA、メッセンジャーRNA、または他の天然化合物もしくは合成化合物、あるいは組成物、例えば、ウイルス材料または複数の物質で構成される他の材料)でよい。機能的β-カテニンの半減期を延ばすことによって、これらの作用物質は、β-カテニン転写コアクチベーターの作用により転写される遺伝子の転写の速度または程度の同時に発生する増加を促進する。β-カテニンリン酸化を阻害する例示的な作用物質には、リン酸化においてβ-カテニンと競合する基質を供給することによってグリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)の阻害を調整するシグナル伝達カスケードである古典的β-カテニン/Wntシグナル伝達経路のアゴニストが含まれる。
【０１３８】
本明細書で使用する「Wntシグナル伝達アゴニスト」とは、古典的Wntシグナル伝達経路のアゴニストを指す。この経路のアゴニストには、Wntタンパク質、または哺乳動物細胞の核内にあるβ-カテニンの濃度の上昇を促進するように、FrizzledおよびLRP5/6補助受容体タンパク質に直接結合する他の化合物がさらに含まれる。または、β-カテニン/Wnt経路アゴニストは、Wntタンパク質に結合して、Wntタンパク質を内因性Wnt補助受容体から隔離する、1種類または複数種の分泌型Frizzled関連タンパク質(SFRP)またはWnt阻害タンパク質(WIF)を阻害することによって機能してもよい。
【０１３９】
β-カテニン/Wnt経路アゴニストの活性を確かめるのに使用することができる例示的な方法には、US2014/0044763に記載のように、TCF/LEFファミリー転写因子の制御下にあるレポーター遺伝子の発現のモニタリング、ならびにTOPFlashルシフェラーゼレポーターアッセイ法が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１４０】
本明細書で使用する、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する化合物には、アリール炭化水素受容体とその活性化リガンドとの結合によって伝えられるシグナル伝達カスケードを阻害する作用物質が含まれる。アリール炭化水素受容体は、アゴニストリガンドに結合すると核に移動し、特異な配列モチーフを含有する標的遺伝子、例えば、上流ダイオキシン応答配列を含有するチトクロムP450A1酵素をコードする遺伝子の転写を促進するサイトゾルリガンド誘導性転写因子である。アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する作用物質の例には、アリール炭化水素受容体に直接結合し、従って、この受容体との結合においてアリール炭化水素受容体リガンドと競合する化合物、例えば、SR1を含んでもよいアリール炭化水素受容体阻害物質が含まれる。アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する作用物質のさらなる例には、活性アリール炭化水素受容体の核への移動を妨害する作用物質、およびアリール炭化水素受容体と、標的遺伝子のDNA(例えば、XRE部位を含有するプロモーター領域)との相互作用を阻害する作用物質が含まれる。
【０１４１】
本明細書で使用するNotchシグナル伝達アゴニストは、Notch経路機能の活性化を促進する作用物質である。本明細書で使用する「Notch経路機能」という用語は、Notchの細胞内ドメインの核移行、RBP-Jκまたはそのショウジョウバエ(Drosophila)ホモログSuppressor of Hairlessの核移行、Enhancer of Split複合体のbHLH遺伝子、例えば、Mastermindの活性化、HES-1遺伝子またはKBF2(CBF1とも呼ばれる)遺伝子の活性化、ショウジョウバエ神経芽細胞分離(neuroblast segregation)の阻害、およびNotchと、Deltaタンパク質、Jagged/Serrateタンパク質、Fringe、Deltex、またはRBP-Jκ/Suppressor of Hairless、またはそのホモログもしくは類似体との結合を含むが、これに限定されない、Notchシグナル伝達経路によって媒介される機能を指す。Notchシグナル伝達カスケードおよびNotchシグナル伝達によってもたらされる表現型は、例えば、Kopan et al., Cell 137:216 (2009)およびJarriault, et al., Mol. Cell. Biol. 18:7423 (1998)に記載されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。Notchアゴニストの例は、例えば、US2014/0369973およびUS7,399,633に記載されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。例示的なNotchアゴニストには、Notchタンパク質、ならびにその類似体、誘導体、および断片;Notchシグナル伝達経路を伝える他のタンパク質、ならびにその類似体、誘導体、および断片;Notch受容体活性を刺激する活性化抗体、およびアゴニスト活性を保持している、その抗原結合断片;Notchシグナル伝達を増強するタンパク質をコードする核酸;ならびにNotch経路活性が促進されるように、Notchタンパク質またはNotch経路にある他のタンパク質に結合するかまたは他のやり方で相互作用するタンパク質、その誘導体、および類似体が含まれるが、それに限定されるわけではない。このようなアゴニストには、Notchタンパク質およびNotch細胞内ドメインを含有するその誘導体、前述のものをコードするNotch核酸、ならびにNotchリガンドのNotch相互作用ドメイン(例えば、DeltaまたはSerrateの細胞外ドメイン)と接触するタンパク質が含まれるが、これに限定されない。他のアゴニストにはRBPJκ/Suppressor of HairlessまたはDeltexが含まれるが、これに限定されない。さらに、Fringeを、例えば、Deltaタンパク質と共に用いてNotch活性を増強することができる。これらのタンパク質、その断片および誘導体は組換えにより発現および単離されてもよく、当技術分野において公知のペプチド合成法およびタンパク質合成法を用いて化学合成されてもよい。
【０１４２】
本明細書で使用する「阻害物質」という用語は、標的タンパク質またはシグナル伝達経路の活性を低減することができる任意の天然または合成の化合物を指す。阻害物質は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物、または無機化合物でもよい。阻害物質は標的タンパク質の活性を直接的または間接的に弱めてもまたは阻止してもよい。直接的阻害は、例えば、タンパク質に結合し、タンパク質が内因性分子、例えば、酵素、基質、または他の結合パートナーと相互作用するのを阻止し、それによって、タンパク質の活性を減らすことによって得ることができる。例えば、阻害物質は酵素活性部位に結合し、この場所での内因性基質の結合を立体的に妨害し、従って、タンパク質の酵素活性を減らしてもよい。または、間接的阻害は、例えば、標的タンパク質の活性を促進するタンパク質に結合することによって、コンホメーション変化を誘導することによって、または標的タンパク質の化学修飾を触媒することによって得ることができる。例えば、標的タンパク質の間接的阻害は、標的タンパク質のリン酸化を触媒し、従って、標的タンパク質を活性化するキナーゼに結合し、不活化することによって成し遂げられてもよい。
【０１４３】
本明細書で使用する「造血幹細胞」(または「HSC」)という用語は、自己複製し、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、栓球(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞、およびT細胞)を含むが、これに限定されない多様な系統を含む成熟血球に分化する能力を有する未熟血球を指す。このような細胞はCD34+細胞を含んでもよく、含まなくてもよいことが当技術分野において公知である。CD34+細胞は、CD34細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ヒトでは、CD34+細胞は、上記で定義された幹細胞特性を有する細胞の亜集団を含むと考えられているのに対して、マウスでは、HSCはCD34-である。さらに、HSCはまた長期再構築(long term repopulating)HSC(LT-HSC)および短期再構築(short term repopulating)HSC(ST-HSC)を指す。LT-HSCおよびST-HSCは機能的能力および細胞表面マーカー発現に基づいて分化される。例えば、ヒトHSCは、CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+、およびlin-(CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235Aを含む成熟細胞系マーカー(lineage marker)が陰性)である。マウスでは、骨髄LT-HSCは、CD34-、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、CD48-、およびlin-(Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7raを含む成熟細胞系マーカーが陰性)であるのに対して、ST-HSCは、CD34+、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、およびlin-(Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7raを含む成熟細胞系マーカーが陰性)である。さらに、ST-HSCはホメオスタシス条件下ではLT-HSCより静止しておらず(すなわち、高活性である)、増殖性が高い。しかしながら、LT-HSCは自己複製能が高く(すなわち、成人期全体を通して生存し、歴代のレシピエントを通して連続して移植することができる)、これに対して、ST-HSCは自己複製が乏しい(すなわち、限られた期間にしか生存せず、連続移植能を有さない)。これらのHSCはどれも、本明細書に記載の全ての方法において使用することができる。任意で、ST-HSCは高増殖性であり、従って、分化した子孫を素早く生じることができるので有用である。
【０１４４】
本明細書で使用する「造血幹細胞機能的能力」という句は、(1)多分化能(顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、栓球(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞、およびT細胞を含むが、これに限定されない複数の異なる血液系統に分化する能力を指す)、(2)自己複製(造血幹細胞が、母細胞と同等の能力を有する娘細胞を生じる能力を指し、さらに、この能力は、使い果たされることなく個体の一生を通じて繰り返し発生することを指す)、ならびに(3)造血幹細胞またはその子孫が移植レシピエントに再導入され、その後に、造血幹細胞ニッチに帰り、生産的造血および持続的造血を再度確立する能力を含む、造血幹細胞の機能的特性を指す。
【０１４５】
造血幹細胞は任意で血液製剤から得られる。血液製剤には、身体から、または造血由来の細胞を含む身体の臓器から得られた製剤が含まれる。このような供給源には、未分画骨髄、臍帯、胎盤、末梢血、または動員末梢血が含まれる。上述の粗血液製剤または未分画血液製剤は全て、多くのやり方で、造血幹細胞特徴を有する細胞に関して富化することができる。例えば、もっと成熟した分化細胞は、この細胞が発現する細胞表面分子によって、除かれるように選択される。任意で、血液製剤は、CD34+細胞を正に選択することによって分画される。CD34+細胞は、自己複製、多分化能が可能であり、移植レシピエントに再導入されると、造血幹細胞ニッチに帰り、生産的造血および持続的造血を再度確立することができる造血幹細胞の亜集団を含む。このような選択は、例えば、市販の磁気抗CD34ビーズ(Dynal, Lake Success, N. Y.)を用いて成し遂げられる。未分画の血液製剤は、任意で、ドナーから直接得られるか、または冷凍保存貯蔵庫から取り出される。造血幹細胞はまた、任意で、分化した胚性幹細胞、分化した人工多能性幹細胞、または他のリプログラミングされた成熟細胞タイプからも得ることができる。
【０１４６】
本明細書で使用する「幹細胞」または「未分化細胞」という用語は、自己複製の性質を有し、複数の細胞タイプに分化する発生能を有する、未分化状態または部分的に分化した状態にある細胞を指す。幹細胞はその機能的能力を維持しながら、増殖し、かつもっと多くのこのような幹細胞を生じることができる。幹細胞は非対称的に分裂することができ、これは義務的非対称分化(obligatory asymmetrical differentiation)と知られ、一方の娘細胞は親幹細胞の機能的能力を保持し、他方の娘細胞は、親細胞とは異なる他の何らかの特異的な機能、表現型、および/または発生能を発現する。親の発生能を有する1つまたは複数の細胞も保持しながら、増殖し、かつ1つまたは複数の成熟した細胞タイプに後で分化する子孫を生じるように娘細胞そのものを誘導することができる。分化した細胞は、それ自体が多能性細胞に由来する多能性細胞などに由来してもよい。または、集団中の幹細胞の一部は2つの幹細胞に対称的に分裂することができる。従って、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、幹細胞よりも特殊化または分化した表現型に分化する発生能を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化することなく増殖する能力を保持している細胞の任意のサブセットを指す。一部の態様において、幹細胞という用語は、一般的に、子孫(子孫細胞)が、分化によって、例えば、胚細胞および組織の徐々に進行する多様化において起こるように、完全にそれぞれ異なる特徴を獲得することによって特殊化する、多くの場合、様々な方向に特殊化する、天然の親細胞を指す。分化した細胞の中には、より優れた発生能のある細胞を生じる能力を持つものもある。このような能力は天然でもよく、様々な因子で処理することによって人為的に誘導されてもよい。幹細胞として始まった細胞は、分化した表現型に進む可能性があるが、「逆戻り」し、次いで、幹細胞表現型を再発現するように誘導することができる。この用語は、当業者によって「脱分化」または「リプログラミング」または「逆分化(retrodifferentiation)」と呼ばれることが多い。
【０１４７】
本明細書で使用する「ホーミング能」とは、幹細胞が、骨髄などの生産的造血を支持することができるインビボ部位に局在する能力を指す。
【０１４８】
本明細書で使用する、特定の細胞タイプにおいて「富化された」細胞集団とは、特定のタイプの細胞の相対的割合が、以前の細胞集団と比較して(例えば、ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を用いて処理される前の細胞集団と比較して)増加している集団を指す。
【０１４９】
「多能性の」という用語は、「多能性細胞」に関して用いられる時、複数の異なる造血細胞タイプに分化する発生能を有する細胞を指す。造血幹細胞は多能性であり、多くの異なるタイプの血球(赤血球、白血球、血小板など)を形成することができるが、ニューロンを形成することができない。
【０１５０】
本明細書で使用する「多分化能を保存する」または「多分化能を維持する」という句は、細胞集団の多分化能の程度が、ある期間にわたって保存されるプロセスを指す。細胞集団の多分化能の程度は、細胞集団が分化することができる分化した細胞タイプの数および同一性を表している。例えば、エクスビボで(例えば、培養状態で)2日間にわたって維持されている多分化能を示す細胞集団は、細胞培養期間の初めに分化することができたので、少なくとも、同数の異なる細胞タイプに分化することができる。
【０１５１】
本明細書で使用する「動員物質」とは、対象の骨髄から末梢血への造血幹細胞の移動を誘導することができる作用物質である。例示的な動員物質には、CXCR4アンタゴニスト、例えば、AMD3100、ならびにGCSFおよびGROβが含まれる。
【０１５２】
本明細書で使用する、細胞集団を1種類または複数種の作用物質と「接触させる」工程は様々なやり方でなし遂げることができる。例えば、造血幹細胞集団は、造血幹細胞を、ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質(例えば、LSD1阻害物質IV RN-1;LSD1阻害物質II S2101;LSD1阻害物質LSD1-C76;LSD1阻害物質III CBB1007;LSD1阻害物質I;ALK5阻害物質II(E-616452);LY364947;A83-01;トリコスタチンA;トラニルシプロミン;SB203580;CHIR99021;DMH1;酢酸ナトリウム;およびistodax)の存在下で、ある期間にわたって、例えば、2日間またはそれ以上培養することによって、これらの作用物質と接触されてもよい。複数種の作用物質が細胞集団と接触される時に、細胞が1種類または複数種の作用物質に同時に曝露されるように、複数種の作用物質が一緒に細胞培養培地に存在することができる。または、1種類または複数種の作用物質は連続して細胞培養培地に添加されてもよい。例えば、1種類または複数種の作用物質は、特定のレジメンに従って、例えば、異なる作用物質が培養期間中に異なる時間に培養培地に添加されるように、培養中の細胞集団に添加されてもよい。
【０１５３】
本明細書で使用する「生着能」という用語は、造血幹細胞および前駆細胞が天然で循環しているか、移植によって提供されたかに関係なく、このような細胞が組織を再構築する能力を指すのに用いられる。この用語は、生着、例えば、細胞の組織ホーミングおよび関心対象の組織内での細胞のコロニー形成を取り囲むか、またはその下地を作る全ての事象を包含する。生着効率または生着速度は、当業者に公知の任意の臨床的に許容されるパラメータを用いて評価または定量することができ、例えば、競合的再構築単位(competitive repopulating unit)(CRU)の評価;幹細胞が帰ったか、コロニー形成したか、もしくは生着した組織におけるマーカーの組み込みまたは発現、あるいは疾患進行、造血系および前駆細胞の生存、またはレシピエントの生存による対象の進行の評価を含んでもよい。一態様において、生着は移植後期間に末梢血中の白血球数を測定することによって確かめられる。または、生着は、骨髄吸引液試料中のドナー細胞による骨髄細胞の回復を測定することによって評価することができる。
【０１５４】
本明細書で使用する「自己複製」という用語は、幹細胞が、最初の幹細胞と同じ表現型、特徴、および機能的能力を有する娘幹細胞を生じる能力を指す。特に、本明細書で使用する自己複製とは、未分化多能性幹細胞状態を維持しながら増殖を続ける能力と定義される。
【０１５５】
本明細書で使用する、ドナーから「新鮮に単離」されている細胞集団とは、注入前に凍結保存および解凍されることなくドナーから単離されている細胞集団を指す。細胞集団はドナーから単離され、2つの中間集団に分離されてもよく、中間集団の一方は患者に注入されてもよく、中間集団の他方は凍結保存されてもよい。この場合、患者に注入される中間集団は新鮮に単離されたとみなされる。細胞集団は患者に注入される前にエクスビボで培養されれば、ドナーから新鮮に単離されたとみなされる。例えば、この培養工程は、結果として生じた細胞が患者に投与される前に造血幹細胞集団を増大させるため、富化するため、および/または維持するために行われてもよい。これらの場合、結果として生じた細胞は、患者に投与される細胞が患者に注入される前に凍結保存および解凍されていなければ、ドナーから新鮮に単離されたとみなされる。
【０１５６】
本明細書で使用する「ZsGr」という用語は蛍光カセットZsGreenを指し、「Fdg5・ZsGr」への言及は、蛍光ZsGreenレポーターカセットがインフレームで内因性Fgd5遺伝子座にノックインされたことを示す。これらの場合、ZsGreen発現はFgd5プロモーターの制御下にある。以前に、本発明者らは、Fgd5がマウス造血系の造血幹細胞にしか発現していないことを示した。さらに、本発明者らは、Fdg5・ZsGreenマウスを使用した時に、単色ZsGreen蛍光に基づいて高純度の造血幹細胞を単離できることを示した。このようなマウスから単離した造血幹細胞はZsGr+またはFgd5・ZsGr+と呼ばれる。このレポーター構築物は、Gazit R, Mandal PK, Ebina W, Ben-Zvi A, Nombela-Arrieta C, Silberstein LE, Rossi DJ. Journal of Experimental Medicine. 211(7):1315-31 (2014)においてさらに詳述される。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
「減少させる」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語は全て、統計的に有意な量分だけ減少させることを意味するために本明細書において用いられる。一部の態様において、「低減する」、「低減」、または「減少させる」、または「阻害する」は、典型的には、参照レベル(例えば、ある特定の処理がない)と比較して少なくとも10％減少させることを意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％減少させること、またはそれを超えて減少させることを含んでもよい。本明細書で使用する「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較した完全な阻害または低減を包含しない。「完全な阻害」とは、参照レベルと比較して100％阻害することである。
【０１５８】
本明細書で使用する「CRU(競合的再構築単位)」とは、インビボ移植後に検出することができる長期生着幹細胞の測定単位を指す。
【０１５９】
本明細書で使用する「調整する」という用語は、特定の生物学的活性を変えること、または特定の生物学的活性の変化を誘導することを意味する。調整には、(例えば、シグナル伝達カスケードを開始するように、受容体がシグナル伝達経路を伝えないように受容体を活性化することによって、生物学的活性を弱める内因性阻害物質を活性化することによって、または特定の生物学的機能を阻害するタンパク質の活性を阻害することによって)活性を刺激または阻害することが含まれるが、これに限定されない。特定のシグナル伝達経路を伝えるタンパク質を調整すると、活性(例えば、ヒストンメチル化、TGFβシグナル伝達、p38シグナル伝達、Wntシグナル伝達、もしくはヒストンアセチル化)の増加もしくは減少、別のタンパク質に対する経路の中のある、あるタンパク質の親和性の変化、または経路もしくは経路内にあるタンパク質の活性に関連する構造特性、機能的特性、もしくは免疫学的特性の別の変化が起こることがある。
【０１６０】
「増加した」、「増加させる」、「増強する」、または「活性化する」という用語は全て、統計的に有意な量分だけ増加させることを意味するために本明細書において用いられる。一部の態様において、「増加した」、「増加させる」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％増加させること、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％増加させること、または100％まで、もしくは100％を含めて増加させること、または10〜100％増加させること、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍増加させること、または2倍〜10倍もしくはそれより多く増加させることを意味することがある。マーカーの文脈において、「増加」とは、このようなレベルの統計的に有意な増加である。
【０１６１】
本明細書で使用する「対象」とはヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル(cynomologous monkey)、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、およびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケが含まれる。一部の態様において、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「個体」、「患者」、および「対象」という用語は本明細書において同義に用いられる。
【０１６２】
本明細書で使用する「レシピエント」とは、造血幹細胞集団または分化した細胞の集団を含有する移植片などの移植片を受け取る患者である。レシピエントに投与される移植細胞は、例えば、自己由来細胞でもよく、同系細胞でもよく、同種異系細胞でもよい。
【０１６３】
本明細書で使用する「ドナー」とは、1つもしくは複数の細胞またはその子孫がレシピエントに投与される前に、1つもしくは複数の細胞が単離されるヒトまたは動物である。1つもしくは複数の細胞は、例えば、1つもしくは複数の細胞またはその子孫がレシピエントに投与される前に、本発明の方法に従って増大するか、富化されるか、または維持される造血幹細胞集団でもよい。
【０１６４】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでもよいが、これらの例に限定されない。疾患および/または処置の動物モデルに相当する対象として、ヒト以外の哺乳動物を都合よく使用することができる。対象は雄でもよく雌でもよい。
【０１６５】
本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって互いにつなげられた一連のアミノ酸残基を指定するために本明細書において同義に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸(例えば、リン酸化アミノ酸、糖化アミノ酸、グリコシル化アミノ酸など)およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドに関して用いられることが多いのに対して、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関して用いられることが多い。だが、当技術分野における、これらの用語の使い方は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指している時に、本明細書において同義に用いられる。従って、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、前述の変種、断片、および類似体を含む。
【０１６６】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはその類似体の単位を組み込んでいる任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖核酸は、変成した二本鎖DNAのうちの一方の核酸鎖でもよい。または、一本鎖核酸は、どの二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸でもよい。一局面において、核酸はDNAでもよい。別の局面において、核酸はRNAでもよい。別の局面において、核酸は、化学修飾されたRNAでもよい。例えば、核酸は、化学修飾されたメッセンジャーRNAでもよい。別の局面において、核酸は、天然または合成のヌクレオチド類似体を用いて合成されたRNAでもよい。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAを含むRNAである。
【０１６７】
本明細書で使用する「siRNA」という用語は、例えば、Bass, Nature 411: 428-429 (2001); Elbashir et al., Nature 411: 494-498 (2001);WO2000/044895;WO2001/036646;WO1999/032619;WO2000/001846;WO2001/029058;WO1999/007409;およびWO2000/044914に開示されるように、RNA干渉または「RNAi」が可能な二本鎖核酸分子を指す。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で使用するsiRNA分子は、RNAだけを含有する分子に限定されず、化学修飾されたヌクレオチド、およびRNAi能力または活性を有する非ヌクレオチドをさらに包含する。
【０１６８】
本明細書で使用する「miRNA」という用語は、典型的には、長さが18〜23ヌクレオチドの小さなノンコーディング一本鎖RNAのクラスを指す。miRNA分子は、特定のタンパク質をコードするmRNAの安定性および翻訳を調整することによって遺伝子発現を調節することができる。miRNAはまた、ヘテロクロマチン形成およびゲノム再編成などの他の核プロセスにも影響を及ぼす。
【０１６９】
本明細書で使用する「shRNA」(低分子ヘアピン型RNA)という用語は、一部がヘアピン構造をとる、siRNAを含有するRNA二重鎖を指す。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する2本の配列間に配置されたループ部分を含有することがある。ループは長さが異なってもよい。例えば、ループは長さが5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、または13ヌクレオチドでもよい。ヘアピン構造はまた3’オーバーハング部分または5’オーバーハング部分も含有してよい。例えば、オーバーハングは3’オーバーハングでも5’オーバーハングでもよく、長さが0ヌクレオチド、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、または5ヌクレオチドでもよい。
【０１７０】
本明細書で使用する「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば、製薬産業において一般的に用いられる担体と組み合わせた活性作用物質を指す。「薬学的に許容される」という句は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、過敏、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなくヒトおよび動物の組織との接触における使用に適しており、妥当なベネフィット/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために本明細書において用いられる。
【０１７１】
本明細書で使用する「投与する」という用語は、望ましい部位における作用物質の少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって、本明細書において開示された化合物、細胞、または細胞集団を対象に配置することを指す。本明細書において開示された化合物または細胞を含む薬学的組成物は、対象において効果的な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
【０１７２】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般的に、2標準偏差(2SD)または2SD超の差を意味する。
【０１７３】
作業実施例を除き、または特に定めのない限り、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す数字は全て、全ての場合において「約」という用語により修飾されていると理解しなければならない。本明細書で使用する「約」という用語は±10％のずれを示す。
【０１７４】
本明細書で使用する「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、組成物、方法、および方法または組成物に必要不可欠なその各成分に関して用いられるが、必要不可欠であっても必要不可欠でなくても、明記されていない要素の包含を認める。
【０１７５】
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各成分を指し、態様の説明において列挙されなかった、あらゆる要素を排除する。
【０１７６】
本明細書で使用する「から本質的になる」という用語は、ある特定の態様に必要な要素を指す。この用語があると、この態様の基本的かつ新規の、または機能的な特徴に大きく影響を及ぼさない要素が存在することが可能になる。
【０１７７】
「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単数形の用語は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。同様に、「または」という語句は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り「および」を含むことが意図される。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下で説明する。「例えば(e.g.)」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。従って、「例えば(e.g.)」という略語は「例えば(for example)」という用語と同義である。
【０１７８】
本明細書において特に定義のない限り、本願に関連して用いられる科学用語および技術用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されず、従って、変更してもよいことが理解されるはずである。本明細書において用いられる専門用語は特定の態様の説明だけを目的とし、本発明の範囲の限定を目的とせず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, 発行所Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 発行所Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 発行所VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, 発行所Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, 発行所Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005;およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)において見られる。これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
本明細書で使用する「LSD1阻害物質II S2101」は、式Iの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LSD1阻害物質II S2101の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、WO1998/009625;WO2003/016309;WO2004/087646;WO2005/033066;WO2006/034769;WO2007/068330;WO2009/147217;WO2014/194280;US2013/0178520;US5,426,196;EP764640;およびEP764632を参照されたい。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000003
【０１８０】
本明細書で使用する「LSD1阻害物質IV RN-1」は、式IIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LSD1阻害物質IV RN-1の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、WO2015/003643;WO2014/205266;WO2014/19428;WO2012/122405;WO2014/018375;WO2009/147217;WO2007/068330;WO2006/034769;WO2005/033066;WO2004/087646;WO2003/016309;WO1998/009625;WO1997/010822;WO1997/010825;WO1995/017408;およびUS2013/0178520を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000004
【０１８１】
本明細書で使用する「LSD1阻害物質LSD1-C76」は、式IIIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LSD1阻害物質LSD1-C76の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。
2018519298.tif 000005
【０１８２】
本明細書で使用する「LSD1阻害物質III CBB1007」は、式IVの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LSD1阻害物質III CBB1007の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。
2018519298.tif 000006
【０１８３】
本明細書で使用する「LSD1阻害物質I」は、式Vの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LSD1阻害物質Iは当技術分野ではBHC110阻害物質I、ヒストンリジンデメチラーゼ阻害物質III、および/またはKDM1阻害物質Iとも呼ばれる。LSD1阻害物質Iの合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。
2018519298.tif 000007
【０１８４】
本明細書で使用する「ALK5阻害物質II」(「RepSox」または「E-616452」とも呼ばれる)は、式VIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。ALK5阻害物質II(E-616452)は当技術分野ではトランスフォーミング成長因子-b I型受容体キナーゼ阻害物質IIまたはRepsoxとも呼ばれる。
2018519298.tif 000008
【０１８５】
本明細書で使用する「LY364947」は、式VIIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。LY364947は当技術分野ではALK5阻害物質I TbR-I阻害物質トランスフォーミング成長因子-b I型受容体キナーゼ阻害物質とも呼ばれる。LY364947およびALK5阻害物質IIの合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、US6,028,072;WO2002/062794;WO2004/026302;WO2004/026306;WO2004/072033;WO2007/088651;WO2007/070866;WO2007/039151;およびWO2007/052943を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000009
【０１８６】
本明細書で使用する「A83-01」は、式VIIIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。A83-01の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、US2003/0064997;US2003/0064997;US2003/0064997;US5,777,097;US5,871,934;GB2306108;WO1993/014081;WO1995/003297;WO1997/33883;WO1997/35855;およびWO1993/014081を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000010
【０１８７】
本明細書で使用する「トリコスタチンA」は、式IXの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。トリコスタチンAの合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、US4,690,918;US4,946,999;EP0827946;JP07206670;およびJP60149520を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000011
【０１８８】
本明細書で使用する「トラニルシプロミン」は、式Xの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。トラニルシプロミンの合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、US2,993,931;US2,997,422;US3,011,945;US3,079,403;US3,134,676;およびUS3,244,596を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000012
【０１８９】
本明細書で使用する「SB203580」は、式XIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。SB203580の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は、当技術分野において公知である。例えば、WO2007/070866;WO2008/022182;WO2010/065917;WO2010/077955;およびWO2010/102267を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000013
【０１９０】
本明細書で使用する「CHIR99021」は、式XIIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。CHIR99021の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、WO1999/065897;WO2002/020495;WO2005/003948;WO2006/001863;WO2006/117212;WO2007/016485;WO2007/075911;WO2007/083978;およびUS2002/0156087を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000014
【０１９１】
本明細書で使用する「DMH1」は、式XIIIの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。DMH1の合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、WO2012/115120;WO2013/016452;WO2013/163228;WO2013/166488;WO2014/138088;WO2014/176606;WO2014/200115;WO2014/062138;US2014/0248696;およびUS8,822,684を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000015
【０１９２】
本明細書で使用する「istodax」または「ロミデスピン」は、式XIVの構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を指す。istodaxの合成、ならびに類似する生物学的活性を有する化合物を含む、関連化合物、例えば、誘導体の構造および合成は当技術分野において公知である。例えば、WO14/102731;WO12/009336;WO13/106696;WO02/20817;US4,977,138;US7,611,721;US7,608,280;およびUS2012/046442;およびJ. Am. Chem. Soc. 118:7237-7238, 1996を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000016
【０１９３】
本発明の様々な局面の説明の中で他の用語が本明細書において定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】培養するとHSC能力が急速に失われることを示す。新鮮に単離したマウスHSC、またはS-clone+IL12/SCF/TPO+0.75％BSAの中でエクスビボで12日間培養したHSCを、致死的な放射線を照射した宿主に移植した後の末梢血分析。培養細胞が、多系統(B細胞、T細胞、骨髄系細胞、顆粒球)の末梢血ドナーキメリズムを生じる能力を保持していないのに対して、新鮮に移植したHSCは、B細胞、T細胞、骨髄系細胞、顆粒球を含む、分析した全血液系統で構成される力強いレベルのドナー末梢血キメリズムを生じることに留意のこと。
【図２】操作されたFgd5-ZsGreenレポーターマウスがHSCを忠実に標識することを示す。Fgd5-ZsGreenレポーターマウスに由来する骨髄細胞を、磁気ビーズを用いてcKit+細胞に関して富化し、ZsGreenの発現および1パネルのマーカー(細胞系(Lineage)(Ter119、CD3、CD4、CD8、B220、Mac1、Gr1、Il7RA)、cKit、Sca1、CD150、CD48)についてフローサイトメトリーによって分析した。示された幹/前駆亜集団についてZsGreen発現が示された。Fgd5-ZsGreen HSCレポーターマウスの構築、特徴付け、および特異性に関するさらなる詳細は、Gazit R, Mandal PK, Ebina W, Ben-Zvi A, Nombela-Arrieta C, Silberstein LE、Rossi DJ. Journal of Experimental Medicine, 211(7):1315-31 (2014)において見つけることができる。
【図３Ａ】図3AはHSCのエクスビボ培養中にFgd5・ZsGr+がHSC能力を標識することを示す。図3Aは概要を示す。Fgd5・ZsGr+HSCをレポーターマウスから単離し、S-clone+IL12/SCF/TPO+0.75％BSAの中で4日間培養した。4日目に、300個のZsGr+細胞および300個のZsGr-細胞を選別し、致死的な放射線を照射したマウスに競合移植した。このことから、図3Bに詳述したようにZsGr+画分では全てのHSC活性が保持されたことが分かる。
【図３Ｂ】図3Bは、HSCのエクスビボ培養中にFgd5・ZsGr+がHSC能力を標識することを示す。図3Bは、ZsGr+細胞およびZsGr-細胞を移植したマウスの末梢血キメリズムおよび末梢血顆粒球キメリズムを図示する。ZsGr+細胞およびZsGr-細胞の系統寄与。データから、ZsGr+細胞しかHSC活性を保持していないことが分かる。
【図４】HSCエクスビボ維持および増大を支持する化合物の低分子スクリーニングの模式図を示す。1)Fgd5・ZsGr+HSCレポーターマウス骨髄を用いてZsGr+HSCを分離した。2)ZsGrレポーターによって標識したHSCの単離。3)6日間のエクスビボ培養後に、培養HSCではDMSO対照を上回ってHSCレポーター発現が維持されることでヒットが明確化されるアッセイ法の開発。4)次いで、ヒット化合物をインビトロアッセイ法およびインビボ移植アッセイ法において機能的に検証した。
【図５】図5Aおよび5Bは、感度アッセイ法の開発を示す。図5Aは、1ウェルにつき合計200個のZsGr+HSC(Fgd5・ZsGreen HSCレポーターマウスに由来する)およびZsGr-HSC(Fgd5Zs+レポーターを有さない野生型マウスに由来する)を様々な比(1:0;1:1;1:10;1:20、1:100、0:1、ZsGr+パーセンテージで示した)で播種し、2日間エクスビボ培養した後にOperetta(Perkin Elmer)を用いて画像化した。1つ1つの細胞をZsGreen検出の閾値より上または下にプロットした。図5Bは、2日間培養した後にZsGreen+細胞のパーセンテージが求められたことを示す。これにより、2日間培養した後に力強くZsGr+シグナルを検出するための分析パラメータおよび感度が確かめられた。
【図６】一次低分子スクリーニングにおいて標的化された経路の内訳を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、様々な低分子および増殖因子ライブラリースクリーニングの初回スクリーニング結果を示す。図7Aは、キナーゼ、エピジェネティック制御因子、およびGタンパク質共役受容体(GPCR)を標的とする低分子、ならびに増殖因子ペプチドライブラリーの4つの異なるライブラリーそれぞれからの、スクリーニングされた化合物、初回ヒット(用量反応を示した)、および検証されたヒット(ZSGr+を定量するためのフローサイトメトリーによる)の数を示す。図7Bは、6点用量反応(10uM、5uM、1uM、0.5uM、0.1uM、0.05uM)からの代表的な結果を図示する。*はヒットを示す。
【図８】DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質(RepSox)、または両方の組み合わせ(C2)の存在下での、7日間または14日間にわたる20個のマウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+)のエクスビボ培養を示す。画像を4×倍率で撮った。LSおよびC2の存在下での培養物は均一性がより大きく、分化が少なないことに留意のこと。
【図９】図9Aおよび9Bは、エクスビボで14日間にわたる表現型マウスHSCの増大を示す。20個のマウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+)を、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養した。この方法はZsGr+HSCの維持および増大を支持する。図9Aは、DMSO、およびLSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで14日間培養したHSCの代表的なFACSプロットを図示する。これから、C2の存在下では表現型HSCのレベルが増加したことが分かる。図9Bは、エクスビボで14日間培養した後の各条件での細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+HSCの数を図示する。
【図１０】図10A〜10Cは、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)がZsGr+マウスHSCの維持および増大を支持することを示す。図10Aは、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで4.5日間培養した20個のFgd5・ZsGr+HSCの明視野およびZsGr画像を図示する。図10Bは、エクスビボで4.5日間培養した後に残っているZsGr+細胞の頻度を示す。図10Cは、4.5日間培養した後のZsGr+細胞およびZsGr-細胞の数を図示する。
【図１１】図11Aおよび11Bは、14日間培養した、DMSO、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)に曝露した精製マウスHSCのコロニー形成アッセイ法の結果を示す。HSCを、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養し、次いで、培養物の1/300を1mlのMethoCult3434にプレートした。プレートしてから10日後に、生じたコロニーを選別してメチルセルロースに入れた。図11Aはコロニーの数および組成を図示する。図11Bは、14日間培養したHSCによって生じた細胞の総数を図示する。
【図１２】図12A〜12Dは、14日間培養した、DMSO、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)に曝露した精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の競合移植の結果を示す。100個の出発マウスHSCから生じた培養物を、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで14日間培養した後に、致死的な放射線を照射したレシピエントに競合移植した。図12Aは、末梢血ドナーキメリズムのグラフを図示する。図12Bは、末梢血ドナー(CD45.2)顆粒球キメリズムのグラフを図示する。図12Cは、個々のレシピエントマウスドナーキメリズムのグラフを図示する。図12Dは、移植後24週目での、B細胞(B220+)、T細胞(CD3+)、および骨髄系細胞(Mac1+)を示したドナー再構成の系統寄与のグラフを図示する。
【図１３Ａ】図13Aは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Aは末梢血ドナーキメリズムを図示する。
【図１３Ｂ】図13Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Bは末梢血ドナー(CD45.2)顆粒球キメリズムを図示する。
【図１３Ｃ】図13Cは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Cは、B細胞(B220+)、T細胞(CD3+)、および骨髄系細胞(Mac1+)を示したドナー再構成の系統寄与を図示する。
【図１３Ｄ】図13Dは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Dは、個々のレシピエントのドナーキメリズムを図示する。
【図１３Ｅ】図13Eは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Eは、移植して20週間後の個々のレシピエントの顆粒球キメリズムを図示する。
【図１３Ｆ】図13Fは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Fは限界希釈頻度の計算を図示する。bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ Hu, Y, and Smyth, GK (2009). ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods 347, 70-78
【図１４】図14Aおよび14Bは、HSCエクスビボ維持および増大を支持するようにC2(LSD1阻害物質IVおよびTgfβ阻害物質)と相乗作用する化合物の二次低分子スクリーニングを示す。一次スクリーニング(図14A)および(図14B)二次スクリーニングの模式図。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングにおいて特定した124個の可能性のあるヒット化合物をC2の存在下で再スクリーニングした(スクリーニング2)。
【図１５】図15A〜15Cは、Tgfβ、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、p38シグナル伝達、およびWntシグナル伝達を含む関心対象の経路をとする、二次スクリーニングの可能性のあるヒットを示す。図15Aは、二次低分子スクリーニングにおいてヒットを特定するために使用した2つの戦略の概略を図示する(C2は、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせである)。図15Bは、ZsGreen+HSCパーセンテージに基づいた戦略(戦略1)に従うことによって発見されたヒットを図示する。図15Cは、ZsGreen+HSCの数に基づいた戦略(戦略2)に従うことによって発見されたヒットを図示する。
【図１６】図16Aおよび16Bは、一次スクリーニングにおいて特定し、次いで、C2(LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ)の存在下で再スクリーニングした化合物の二次スクリーニングのヒットを示す。図16Aは、ZsGreen+HSCパーセンテージに基づいた戦略に従うことによって発見されたヒットを図示する。図16Bは、ZsGreen+HSCの数に基づいた戦略に従うことによって発見されたヒットを図示する。
【図１７】マウスHSCを維持すると以前に報告された化合物を試験した実験の結果を示す。ZsGreen陽性HSCを、dmPGE2(North, Zon, Nature. 2007)、BIO(Ko et al, Stem Cells. 2011)、p38阻害物質(Wang et al, Stem Cells Dev. 2011)、DMSO:陰性対照の存在下で6日間培養する。D2は、エクスビボで2日間維持したZsGr+HSCである。ZsGreen+として特定した細胞(すなわち、HSC)の閾値を矢印で示した。
【図１８】図18Aおよび18Bは、エクスビボでのHSCの維持および増大に向けて候補経路を調整するための仮説駆動(hypothesis driven)戦略を示す。図18Aは、腸幹細胞および造血幹細胞の維持および増殖シグナルの比較による候補標的経路の選択を図示する。図18Bは作用物質/経路モジュレーターの選択を図示する。
【図１９】HSC維持および増大に対する経路モジュレーターの活性を評価するための模式図を示す。Fgd5-ZsGreen+免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD150+CD48-Fgd5・ZsGreen+)を選別し、サイトカインのみの存在下で(標準培地)、または7種類の候補経路モジュレーターをさらに加えて(W7培地)培養した。7つの経路を調整する化合物は、A83-01、トラニルシプロミン、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム(ここでは補充物と呼ぶ)である。14日間培養した後に、細胞免疫表現型のマルチパラメトリック解析をフローサイトメトリーによって行った。
【図２０】エクスビボ培養中に7つの候補経路の組み合わせ調整が免疫表現型HSCを維持しかつ増大させることを示す。50個のマウスHSCを、SCF、TPO、およびIL12を補充し7種類の候補経路モジュレーターを含むまたは含まない無血清培地中で培養した。15日目にフローサイトメトリー分析を行った。7つの経路を調整する化合物は、A83-01、トラニルシプロミン、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、および酢酸ナトリウムである。
【図２１Ａ】図21Aは、エクスビボ培養中に表現型HSCを維持しかつ増大させる能力における各化合物/経路の寄与を示す。50個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または7種類全ての化合物(W7)を加えて、もしくはそれぞれ1種類ずつ化合物(A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC))を取り去って培養した。フローサイトメトリー分析を14日目に行った。(図21A)は、細胞系+細胞への分化(B細胞、T細胞、骨髄系細胞、赤血球、顆粒球の抗原に対する抗体カクテルによって染色した)を示す。この場合、細胞系陽性は破線の右側にある。
【図２１Ｂ】図21Bは、エクスビボ培養中に表現型HSCを維持しかつ増大させる能力における各化合物/経路の寄与を示す。50個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または7種類全ての化合物(W7)を加えて、もしくはそれぞれ1種類ずつ化合物(A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC))を取り去って培養した。フローサイトメトリー分析を14日目に行った。図21Bは、示された条件で50個の出発HSCから14日間培養した後のHSCの絶対数を図示する。
【図２２】図22Aおよび22Bは、構造的に異なるHDAC阻害物質が免疫表現型HSCを維持するのに同等に機能することを示す。化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または、構造的に異なるHDAC阻害物質である化合物のカクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580)をさらに補充しバルプロ酸(VPA)もしくはトリコスタチンA(TSA)のいずれかを含んで、100個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を培養した。図22Aは7日目のフローサイトメトリー分析を図示する。図22Bは、それぞれの反復実験のFgd5-ZsGreen+Sca1+細胞の割合を図示する。
【図２３】エクスビボ培養中に、さらなる化合物を加えると、CD48発現およびSca1発現についてFgd5・ZsGr+HSC細胞の不均一性が低下することを示す。40個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、サイトカイン(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で、ならびにDNAメチルトランスフェラーゼ阻害物質(RG108)およびG9a阻害物質(UNC0638)のいずれかまたは両方を含む化合物カクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580、トリコスタチンA)の存在下で12日間培養した。示された培養条件からのFgd5+細胞系-細胞のフローサイトメトリープロットを示した。ヒストグラムは、示された亜集団の割合を示す。
【図２４】DMSO(標準)、またはTgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウムからなる7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。10個のHSCを、示された条件で14日間培養し、その後に、致死的な放射線を照射した宿主に(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。移植後の示された時間での末梢血ドナーキメリズムを示した。
【図２５Ａ】図25Aは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Aは、移植後の示された時点での末梢血ドナーキメリズムを図示する。
【図２５Ｂ】図25Bは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Bは、移植後の示された時点での顆粒球ドナーキメリズムを図示する。
【図２５Ｃ】図25Cは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Cは、示された条件で14日間培養したHSCを移植した移植レシピエントの骨髄中のドナーHSCキメリズムを図示する。
【図２６】免疫表現型マウスHSCを維持する/増大させるには4つの経路を調整することで十分なことを示す。50個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、DMSOの存在下で、または7種類の化合物からなる最初の一組(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)から特定した、4つの経路を標的とする化合物(W4:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、およびp38キナーゼ阻害物質SB203580)の存在下で、サイトカインを加えた無血清培地中で14日間培養した。免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD48-CD150+Fgd5ZsGreen+CD41-)をフローサイトメトリーによって分析した。
【図２７】CD34+富化臍帯血から初代ヒトHSCを得るための選別戦略を示す。選別したHSCはCD34+細胞系-CD38-CD45RA-CD90+の免疫表現型を有する。
【図２８】図28Aおよび28Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト臍帯血(CB)HSCを維持および増大できることを示す。図28Aは実験計画の模式図を図示する。図28Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の培養臍帯血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-。1ウェルあたり50個の細胞で最初に播種した)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(等高線プロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。
【図２９】図29Aおよび29Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト臍帯血HSCを維持および増大できることを示す。図29Aは、総生細胞に対するHSC(CD34+CD45RA-CD90+として定義した)のパーセンテージを図示する。図29Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1 IV阻害物質とRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で50個の臍帯血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-)を培養した後のHSCの絶対数を図示する。*p<0.05独立t検定。
【図３０】図30Aおよび30Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後にヒト臍帯血HSCの原始的なインビトロコロニー形成能を維持しかつ増大させることを示す。図30Aは、14日間のエクスビボ培養後のウェル全体を表すように調整したコロニーの数および組成を図示する(注:コロニー形成のためにウェルの一部分だけをメソカルト(methocult)に添加した)。図30Bは、14日間の臍帯血HSC培養物からの骨髄系コロニータイプの頻度を図示する。RS、LS、またはC2の中で培養した後に、最も原始的なGEMMコロニー(顆粒球、マクロファージ、赤血球、および巨核球系統で構成されるコロニー)の頻度が高くなったことに留意のこと。
【図３１】図31Aおよび31Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト骨髄HSCを維持および増大できることを示す。図31Aは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の、培養した骨髄由来HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した。1ウェルあたり80個の細胞)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(ドットプロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。図31Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で培養した後の免疫表現型HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-)のパーセンテージを図示する。*p<0.05、**p<0.005独立t検定。
【図３２Ａ】図32Aは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト動員末梢血HSCを維持および増大できることを示す。図32Aは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の、培養した動員末梢血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した。1ウェルあたり50個の細胞)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(等高線プロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。
【図３２Ｂ】図32Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト動員末梢血HSCを維持および増大できることを示す。図32Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養した後の、免疫表現型HSC(CD34+CD45RA-CD90+)ならびに幹細胞および前駆細胞(CD34+CD45RA-)のパーセンテージを図示する。
【図３３】図33Aおよび33Bは、マウス系において特定した、7つの経路を標的とする化合物を用いると、免疫表現型臍帯血HSCを維持および増大できることを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、DMSOの存在下で、または7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養した。(図33A)は、フローサイトメトリーによって分析した、培養後の細胞の免疫表現型を示す。(図33B)は、免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を示す。
【図３４】図34Aおよび34Bは、免疫表現型ヒト臍帯血HSCを維持しかつ増大させるには、3つの経路を標的化することで十分なことを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図34Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。図34Bは、示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を図示する。
【図３５】図35Aおよび35Bは、化学物質の最小限の組み合わせとp38阻害物質を加えるとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図35Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。図35Bは、示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図３６】低酸素分圧下で培養するとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、標準的な組織培養インキュベーター(大気中酸素、21％O2)または低酸素インキュベーター(5％O2)に入れて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)、ならびに3つの経路を標的とする化合物(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))を加えた無血清培地中で12日間培養した。示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)を、培養後に定量した。
【図３７Ａ】図37Aは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図３７Ｂ】図37Bは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図３７Ｃ】図37Cは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Cは、示された条件で12日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を図示する。
【図３８Ａ】図38Aは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図３８Ｂ】図38Bは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図３８Ｃ】図38Cは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Cは、示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する(W7:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC)、およびW3:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA))。
【図３９】化学物質の組み合わせを用いてヒト動員末梢血CD34+細胞をエクスビボで培養すると免疫表現型HSCが富化されることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、DMSO、示された個々の化学物質(ステムレゲニン(SR1)、UM171)、または4種類の化合物の組み合わせ(W4:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。エクスビボで培養する前(無培養)、または示された条件で7日間培養した後の、CD34+富化動員末梢血中の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の画分の定量。培養後に、HSCが8倍富化されたことが示される。
【図４０Ａ】図40Aは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図４０Ｂ】図40Bは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図４０Ｃ】図40Cは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Cは、示された条件で12日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図４１Ａ】図41Aは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Aは細胞の免疫表現型を図示する。
【図４１Ｂ】図41Bは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図４１Ｃ】図41Cは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Cは、示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図４２Ａ】図42Aは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。(図42A)は末梢血ドナーキメリズムを示す。
【図４２Ｂ】図42Bは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。図42Bは、移植後24週目および30週目での末梢血ドナーキメリズムの定量を図示する。
【図４２Ｃ】図42Cは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。図42Cは、移植後30週目での移植細胞の系統寄与を図示する。
【図４３】図44〜48Cに図示した結果を得るための実験手順の模式図を図示する。
【図４４】12日間培養した後のFACS分析の結果を図示する。
【図４５】DMSO、W7、またはW3の存在下で300個の出発細胞HSC同等物から12日間培養した後の総生細胞アウトプットのグラフを図示する。
【図４６】図46Aおよび46Bは、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞系-IL7R-ckit+Sca1+(LSK)細胞の頻度(図46A)および絶対数(図46B)のグラフを図示する。
【図４７】図47Aおよび47Bは、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞系-IL7R-ckit+Sca1+CD48-CD150+HSCの頻度(図47A)および絶対数(図47B)のグラフを図示する。
【図４８】図48A〜48Cは、実験模式図(図48A)、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した200個の出発細胞(HSC)同等物を移植して4週間後のドナー細胞生着のグラフ(図48B)、および系統寄与のグラフ(図48C)を図示する。Mac1+骨髄系細胞、CD3陽性(3)T細胞、およびB220陽性B細胞の系統分析。
【発明を実施するための形態】
【０１９５】
詳細な説明
本発明は、造血幹細胞を、ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される1つ、2つ、またはそれより多い作用を示す1種類または複数種の作用物質と接触させることによって、エクスビボで、造血幹細胞機能的能力を有する造血幹細胞集団を増大、富化、および維持できるという驚くべき発見に基づく。これらの生物学的事象を調整する、多種多様な構造的および機構的に異なる作用物質が当技術分野において公知である。例えば、これらの作用物質は、ある特定の経路内の特定の事象をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることができる低分子(例えば、シグナル伝達カスケードを伝えるタンパク質の酵素活性を阻害する低分子)でもよい。これらの作用物質はまた、特定のタンパク質に競合的に結合し、そのタンパク質とそのコグネイト結合パートナーとの会合を立体的に妨げることによって特定の相互作用(例えば、リガンド-受容体相互作用)を破壊する抗体、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片でもよい。大きい分子表面で起こるタンパク質間相互作用をアンタゴナイズするのに、他の作用物質、例えば、治療用タンパク質および構造的に制約された(structurally constrained)ペプチドが位相幾何学的によく適しており、従って、シグナル伝達経路内の、従来の低分子治療剤では破壊することが困難であった標的において介入することができる阻害物質のクラスである。他のクラスの阻害物質には、相補的水素結合を介してmRNAポリヌクレオチドに結合することによって、例えば、標的mRNAの分解を誘導することによって、またはリボソーム集合体の核形成を立体的に妨げることによって標的遺伝子の発現を弱めることができる干渉RNA分子が含まれる。以下のセクションは、造血幹細胞の増大、富化、および造血幹細胞機能的能力の維持を促進するために、本発明の組成物および方法と共に有用な作用物質のタイプの例の概略を示す。
【０１９６】
UM171およびその構造類似体
本発明の方法と共に使用することができるさらなる作用物質には、造血幹細胞の増大を誘導することが示されている低分子であるUM171が含まれる。UM171は、例えば、Fares et al. Science 345:1509 (2014)に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。造血幹細胞を増大させるのに、富化するのに、および維持するのに使用することができる他の作用物質には、UM171類似体、例えば、US2015/0011543の式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、および(VI)のいずれか1つに従うUM171構造類似体が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。例えば、本明細書に記載の組成物および方法と共に使用することができるUM171類似体には、以下の表11に列挙した化合物が含まれる。
【０１９７】
（表１１）UM171およびその構造類似体
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【０１９８】
低分子
本明細書に記載の方法と共に様々な低分子を使用することができる。これらの低分子の中には酵素-基質相互作用のモジュレーターが含まれる。酵素-基質相互作用をアンタゴナイズするために、またはシグナル伝達カスケード内の別個の点において介入するために様々な低分子が開発されている。例えば、トラニルシプロミンおよびその誘導体は、N-メチル化ヒストンテール残基の酸化的脱メチルを触媒するために、LSD1などのヒストンデメチラーゼが利用するFAD補因子のイソアロキサジン部分と共有結合付加物を形成することによって、これらの酵素に不可逆的に結合し、これらの酵素を阻害することができる阻害物質の頑強なクラスである。本発明の組成物および方法と共に有用な、ヒストン脱メチルの例示的な低分子阻害物質には、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I(BHC110阻害物質I、ヒストンリジンデメチラーゼ阻害物質III、および/またはKDM1阻害物質Iとも呼ばれる)、ならびに前記のトラニルシプロミンが含まれる。さらに、ヒストンデメチラーゼを阻害するのに有用な低分子の例には、US2013/0095067に記載のように、フェネルジン、プロパルギルアミン、およびその誘導体が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。他のトラニルシプロミン誘導体は、例えば、US2014/0163041に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９９】
ヒストンメチル化を調整するのに使用することができる低分子のさらなる例には、BIX01294(例えば、WO2014/057997に記載のH3K9メチル化阻害物質);UNC0638(例えば、WO2013/050422に記載のH3K9メチル化阻害物質)、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる;およびCARM1阻害物質(PRMT阻害物質V、3,5-bis(3-ブロモ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1-ベンジルピペリジン-4-オン、ヒストンアルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害物質)が含まれる。
【０２００】
TGFβシグナル伝達の低分子阻害物質のいくつかの構造的に異なるクラスが報告されている。これらの作用物質は、これらの分子のコア分子スキャフォールに基づいて分類することができる。例えば、TGFβシグナル伝達阻害物質は、分子のコア構造断片として、ジヒドロピリピラゾール(dihydropyrrlipyrazole)、イミダゾール、ピラゾロピリジン(pyrazolopyridine)、ピラゾール、イミダゾピリジン、トリアゾール、ピリドピリミジン、ピロロピラゾール、イソチアゾール、またはオキサゾール官能基を含有してもよい。TGFβシグナル伝達の低分子阻害物質の非限定的ないくつかの例には、前記のALK5阻害物質II(E-616452とも呼ばれる)、LY364947(ALK5阻害物質I、TbR-I阻害物質、トランスフォーミング成長因子-b I型受容体キナーゼ阻害物質とも呼ばれる)、A83-01、およびDMH1が含まれる。本発明の組成物および方法と共にTGFβシグナル伝達を調整するのに使用することができる低分子の他の例には、SB431542(4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピルジン(pyrldin)-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド水和物、4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド水和物、4-[4-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-5-(2-ピリジル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド水和物、Alk5阻害物質)、ガルニセルチブ(Galunisertib)(LY2157299、Alk5阻害物質)、LY2109761(4-[2-[4-(2-ピリジン-2-イル-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル)キノリン-7-イル]オキシエチル]モルホリン、Alk5/TGFβRII阻害物質)、SB525334(6-[2-tert-ブチル-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン、Alk5阻害物質)、GW788388(N-(オキサン-4-イル)-4-[4-(5-ピリジン-2-イル-1H-ピラゾール-4-イル)ピリジン-2-イル]ベンズアミド、Alk5阻害物質)、K02288(3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリジン-3-イル]フェノール、Alk4/Alk5阻害物質)、SD-208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-N-ピリジン-4-イルプテリジン-4-アミン、Alk5阻害物質)、EW-7197(N-((4-( [1,2,4]トリアゾール[1,5-a]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン、Alk4/Alk5阻害物質)、およびLDN-212854(5-[6-[4-(1-ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン、Alk4/Alk5阻害物質)が含まれる。
【０２０１】
低分子TGFβモジュレーターのさらなる例には、TGFβ受容体のアンタゴニスト、例えば、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5ナフチリジン(napththyridine)、[3-(ピリジン-2-イル)-4-(4-キノイル)]-1H-ピラゾール、および3-(6-メチルピリジン-2-イル)-4-(4-キノリル)-1-フェニルチオカルバモイル-1H-ピラゾールが含まれる。他の低分子阻害物質には、Halder et al. Neoplasia 7:509 (2005))に記載される、SB-431542、(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド、TGFβ受容体ALK5の低分子阻害物質であるSM16、この構造を以下に示した(Fu et al. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 28:665 (2008))、SB-505124(Dacosta Byfield et al. Molecular Pharmacology 65:744 (2004)に記載のAlk4/Alk5阻害物質。構造を以下に示した)、および6-ブロモ-インディルビン-3’-オキシム(US8,298,825に記載)が含まれるが、これに限定されない。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000031
【０２０２】
TGF-βシグナル伝達阻害物質のさらなる例は、例えば、Callahan et al. Journal of Medicinal Chemistry 45:999 (2002); Sawyer et al. Journal of Medicinal Chemistry 46:3953 (2003); Gellibert et al. Journal of Medicinal Chemistry 47:4494 (2004); Tojo et al. Cancer Science 96:791 (2005); Petersen et al. Kidney International 73:705 (2008); Yingling et al. Nature Reviews Drug Discovery 3:1011 (2004); Byfield et al. Molecular Pharmacology 65:744 (2004); Dumont et al. Cancer Cell 3:531 (2003); WO2002/094833;WO2004/026865;WO2004/067530;WO2009/032667;WO2004/013135;WO2003/097639;WO2007/048857;WO2007/018818;WO2006/018967;WO2005/039570;WO2000/031135;WO1999/058128;US6,509,318;US6,090,383;US6,419,928;US7,223,766;US6,476,031;US6,419,928;US7,030,125;US6,943,191;US2005/0245520;US2004/0147574;US2007/0066632;US2003/0028905;US2005/0032835;US2008/0108656;US2004/015781;US2004/0204431;US2006/0003929;US2007/0155722;US2004/0138188;およびUS2009/0036382に記載されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０３】
本発明の組成物および方法と共に有用な別のクラスの低分子には、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達のモジュレーターが含まれる。BMPはリガンドのTGFβスーパーファミリーのメンバーであり、BMPシグナル伝達モジュレーター、例えば、Alk2、Alk3、およびAlk6の阻害物質を、例えば、造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および/または造血幹細胞を多能性状態で維持するために本発明の方法と共に使用することができる。例示的なBMP阻害物質には、DMH1(4-[6-(4-イソプロポキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン、4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、K02288(3-(6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリジン-3-イル)フェノール)、LDN-212854(5-[6-[4-(1-ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、LDN-193189(4-[6-[4-(1-ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、LDN-214117(1-(4-(6-メチル-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリジン-3-イル)フェニル)ピペラジン)、およびML347(5-[6-(4-メトキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン)が含まれる。
【０２０４】
造血幹細胞の増大、造血幹細胞の富化、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力の維持を促進するために、受容体型チロシンキナーゼ、例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板由来成長因子(PDGF)シグナル伝達の阻害物質も本発明の組成物および方法と共に使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法と共に有用な例示的なVEGF/PDGF阻害物質は、ABT-869(リニファニブ(Linifanib)、1-[4-(3-アミノ-1H-インダゾール-4-イル)フェニル]-3-(2-フルオロ-5-メチルフェニル)尿素)である。
【０２０５】
本発明の組成物および方法と共に有用な他の低分子には、DNMT1、DNMT3a、およびDNMT3Bの化学モジュレーターを含むDNAメチル化阻害物質が含まれる。造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために本発明の組成物および方法と共に使用することができる、これらの標的の例示的な阻害物質はRG108(N-フタリル-L-トリプトファン)である。
【０２０６】
現在までに、ピリジニルイミダゾール化合物SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルフィニルフェニル)-5-(4-ピリジル)1H-イミダゾール)およびSB202190(4(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)1H-イミダゾール)を含む、p38 MAPKの様々な低分子阻害物質も報告されている。これらの化合物は、γ-またはδ-アイソフォームの酵素活性を破壊することなく、p38 MAPKα-およびβ-アイソフォームを選択的にアンタゴナイズする阻害物質のクラスである。これらの化合物はUS6,602,896に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。p38 MAPK阻害物質の他の例には、例えば、US2014/0127231に記載のように、SB203580、BIRB796(ドラマピモド(Doramapimod))、VX702、SB202190、LY2228820、VX745、ビノレルビン(ナベルビン)、PH797804、パマピモド(pamapimod)、CMPD-1、EO1428、JX401、ML3403、RWJ67657、SB239063、SCIO469塩酸塩、SKF86002二塩酸、SX011、およびTAK715が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物および方法と共に有用なp38阻害物質のさらなる例には、ペキシメチニブ(Pexmetinib)(ARRY-614)、PH-797804(3-(3-ブロモ-4-((2,4-ジフルオロベンジル)オキシ)-6-メチル-2-オキソピリジン-1(2H)-イル)-N,4-ジメチルベンズアミド)、ロスマピモド(Losmapimod)(GW856553X)、およびスケピノン(Skepinone)-Lが含まれる。
【０２０７】
β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害することができる低分子作用物質には、β-カテニンリン酸化を促進するタンパク質の活性を弱めることができる作用物質が含まれる。このような阻害物質は、この転写因子の核濃度を高めるのに役立ち、様々な例が当技術分野において公知である。β-カテニンリン酸化阻害物質には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)を阻害する化合物、例えば、前記のCHIR99021、ならびに6-ブロモ-インディルビン-3’-オキシム(Meijer et al. Chemistry and Biology 10:1255 (2003); Goessling et al. Cell 136:1136 (2009))、AR-A014418(Bhat et al. Journal of Biological Chemistry 278:45937 (2003)、および有機金属GSK-3阻害物質DW21(Williams et al. Angewandte Chemie International Edition 44:1984 (2005))が含まれる。これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために本発明の組成物および方法と共に有用な、Wntシグナル伝達の他の低分子モジュレーターには、GSK3aおよびGSK3bの阻害物質、例えば、CHIR99021および塩化リチウムが含まれる。
【０２０８】
ヒストン脱アセチルも低分子治療剤を用いた標的化に適用することができる。ヒドロキサム酸は、ヒストンデアセチラーゼの活性部位の内部にある、カチオン亜鉛に結合するヒドロキサメート官能基によってヒストンデアセチラーゼを阻害する、ヒストンデアセチラーゼの特に頑強なクラスである。例示的な阻害物質には、前記のトリコスタチンA、ならびにボリノスタット(Marks et al., Nature Biotechnology 25, 84-90 (2007); Stenger, Community Oncology 4, 384-386 (2007)に記載のN-ヒドロキシ-N’-フェニル-オクタンジアミン。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)が含まれる。他のヒストンデアセチラーゼ阻害物質には、Drugs of the Future 32(4): 315-322 (2007)に記載のパノビノスタット(Panobinostat)が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000032
【０２０９】
ヒストンデアセチラーゼのヒドロキサム酸阻害物質のさらなる例には、Bertrand, European Journal of Medicinal Chemistry 45:2095-2116(2010)に記載される、以下に示した化合物が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
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【０２１０】
バルプロ酸(Gottlicher et al. EMBO Journal 20: 6969 (2001)およびBalasubramanian et al. Cancer Letters 280: 211 (2009)に記載のモセチノスタット(Mocetinostat)(N-(2-アミノフェニル)-4-[[(4-ピリジン-3-イルピリミジン-2-イル)アミノ]メチル]ベンズアミドを含む、ヒドロキサメート置換基を含有しない他のヒストンデアセチラーゼ阻害物質も開発されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。ヒドロキサメートとは異なる化学官能性を利用する他の低分子阻害物質には、Bertrand, European Journal of Medicinal Chemistry 45:2095-2116 (2010)に記載の低分子阻害物質が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。ヒストンデアセチラーゼを阻害するために、ヒドロキサメートとは異なる化学官能性を利用する他の低分子阻害物質には、以下に示した低分子阻害物質が含まれる。
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【０２１１】
造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために本発明の組成物および方法と共に有用なヒストンアセチル化の化学モジュレーターのさらなる例には、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、Sirt1、Sirt2、および/またはHATのモジュレーター、例えば、ブチリルヒドロキサム酸、M344、LAQ824(ダシノスタット(Dacinostat))、AR-42、ベリノスタット(Belinostat)(PXD101)、CUDC-101、スクリプタイド、フェニル酪酸ナトリウム、タスキニモド(Tasquinimod)、クイシノスタット(Quisinostat)(JNJ-26481585)、プラシノスタット(Pracinostat)(SB939)、CUDC-907、エンチノスタット(Entinostat)(MS-275)、モセチノスタット(Mocetinostat)(MGCD0103)、ツバスタチン(Tubastatin)A HCl、PCI-34051、ドロキシノスタット(Droxinostat)、PCI-24781(アベキシノスタット(Abexinostat))、RGFP966、ロシリノスタット(Rocilinostat)(ACY-1215)、CI994(タセジナリン(Tacedinaline))、ツバシン、RG2833(RGFP109)、レスミノスタット(Resminostat)、ツバスタチン(Tubastatin)A、BRD73954、BG45、4SC-202、CAY10603、LMK-235、ネキシツラスタット(Nexturastat)A、TMP269、HPOB、カンビノール、およびアナカルジン酸が含まれる。
【０２１２】
抗体および他の治療用タンパク質
抗体は、受容体-リガンド相互作用などの細胞外タンパク質-タンパク質相互作用を標的とするのに独特に適している化学的空間領域である。これらの作用物質は、表層部の裂け目に限定されるのではなく、広大な表面に分散された相互作用の自由エネルギーに有利に寄与する残基を特徴とする、相互作用を阻害するのに有益な大きい分子容積を有する。抗体作用物質は、表層部の裂け目の内部ではなく、広大な表面に起こる相互作用を阻害するのに有益な大きい分子容積を有する。阻害性抗体は、細胞外受容体とコグネイトリガンドとの相互作用を立体的に妨げ、従って、細胞外受容体を不活性コンホメーションに維持するように細胞外受容体に結合することによって機能してもよい。例えば、TGFβ受容体活性を弱めることができる阻害性抗体には、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、およびTGFβ受容体II型に結合する抗体が含まれる。他の例には、ヒトTGFβの全アイソフォームに結合し、これらをアンタゴナイズする抗体であるGC-1008、ならびにマウスTGFβの全アイソフォームに結合する抗体であるID11が含まれる。これらの抗体は、例えば、US8,603,818に詳述される。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１３】
Wntシグナル伝達カスケードを伝えることによってβ-カテニンリン酸化を阻害するアンタゴニスト抗体も開発されている。このような抗体は、Frizzledを含むWnt受容体におよびLRPファミリータンパク質に結合し、GKS3によるβ-カテニンリン酸化を阻害する別個の分子事象を含むWntシグナル伝達経路の伝播を刺激する、同時に発生するコンホメーション変化を誘発し得る。例えば、Wntシグナル伝達のアゴニストとして抗体1D9が開発されており、US2014/0044717に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１４】
造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するための生物学的プロセスを阻害するために、他のクラスの治療用タンパク質をさらに使用することができる。重要なタンパク質間相互作用をアンタゴナイズまたは刺激するために、シグナル伝達事象を調整する内因性タンパク質が、エクスビボで、これらの事象を弱め、それによって、コグネイトリガンドに対する、これらのタンパク質の天然親和性を強化するのに用いられてもよい。例えば、この目的のために、TGFβ活性を負に調節する細胞外マトリックスプロテオグリカンであるデコリン(Decorin)、ならびにレフティー1、レフティー2、フォリスタチン、ノギン(Noggin)、コーディン、ケルベロス(Cerberus)、ジャームリン(Germlin)、インヒビン、シスタチンC、組換えマウス レフティー1(ACVR2B阻害物質)、ならびにR-Smadタンパク質のリン酸化を阻止するのに役立つか、またはTGFβ受容体I型の分解を促進するようにユビキチンリガーゼをTGFβ受容体I型に動員するのに役立つSmadタンパク質Smad6およびSmad7を含む、TGFβシグナル伝達カスケードをアンタゴナイズする様々なタンパク質を使用することができる。これらのタンパク質はUS8,298,825に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１５】
造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために本発明の組成物および方法と共に用いられ得る別のTGFβシグナル伝達モジュレーターは組換え両生類TGF-β5(ACVR2A、ACVR2B、TGFβRIIアクチベーター)である。
【０２１６】
前記の負のフィードバックタンパク質に加えて、β-カテニンリン酸化を阻害するようにWntシグナル伝達を誘導することができるタンパク質も述べられている。例えば、Rスポンジン(上衣板特異的スポンジン)タンパク質はβ-カテニンシグナル伝達を活性化することも知られている。Rスポンジンタンパク質はWntタンパク質と配列類似性を有さず、Frizzled非依存的機構を介してWntシグナル伝達を増強するようにみえる。このタンパク質は、Kazanskaya. O., et al., Dev. Cell 7, 525-534 (2004)に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１７】
干渉RNA
RNA干渉(RNAi)は、アンタゴニストRNA(例えば、内因性mRNA配列と水素結合を介して相補的に塩基対合することができるオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖RNA)が細胞内遺伝子発現を弱める能力を利用した阻害性療法である。機構的には、この現象は、相補的mRNAが分解されることで、またはmRNA転写物におけるリボソーム形成が立体的に阻害されることで働くことが多い。dsRNAの長い配列は、公知のリボヌクレアーゼであるダイサーによって真核細胞の細胞質内で切断されて、siRNAとして知られる短い21〜25ヌクレオチドの低分子干渉RNAになることが多い。その後に、これらのsiRNAはタンパク質成分と集合してRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)になり、このプロセスにおいて巻き戻る。次いで、活性化されたRISCは、siRNAアンチセンス鎖とmRNAとの間の塩基対合相互作用によって相補的転写物に結合する。結合したmRNAは切断され、mRNAが配列特異的に分解されることで遺伝子サイレンシングが起こる。RISCを介した遺伝子サイレンシングの基礎をなす分子事象は、例えば、US6,506,559; Fire et al., Nature 391(19):306-311 (1998); Timmons et al., Nature 395:854 (1998); Montgomery et al., TIG 14 (7):255-258 (1998); David R. Engelke, Ed., RNA Interference (RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology, DNA Press, Eagleville, Pa. (2003);およびGregory J. Hannon, Ed., RNAi A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2003)に記載されている。これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１８】
重要なことに、本発明の組成物および方法と共に有用なsiRNA分子は、RNAだけを含有するsiRNA分子に限定される必要はなく、例えば、RNA干渉をもたらす化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチド、ならびにリボース糖が別の糖分子またはその類似体と取り替えられた分子を含んでもよい。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然結合、例えば、ホスホジエステラーゼを介した分解を受けにくいホスホロチオエート結合を使用することができる。本発明の組成物および方法と共に有用なRNAオリゴヌクレオチドはまた、反応性官能基またはレポーター基、例えば、フルオロフォアを用いて誘導体化されてもよい。特に有用な誘導体は、RNA鎖の1つまたは複数の末端、典型的には、センス鎖の3’末端において修飾される。例えば、当技術分野において公知の標準的な求核置換法によって、3’末端にある2’-ヒドロキシルを様々な基を用いて容易に、かつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、修飾された炭水化物部分を有するヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドに高い構造安定性を付与する2’O-アルキル化残基または2’-O-メチルリボシル誘導体および2’-O-フルオロリボシル誘導体を組み込んでいる。siRNAの核酸塩基も化学修飾されてもよい。例えば、標的mRNAとの水素結合相互作用の強度を調整するために、siRNA分子に、5-ブロモウラシルおよび5-インドウラシルなどのハロゲン化塩基を組み込むことができる。核酸塩基はまた戦略的にアルキル化されてもよい。例えば、グアノシン残基の代わりに7-メチルグアノシンを組み込むことができる。標的遺伝子発現の阻害を促進する非天然塩基も干渉RNAに組み込まれてもよい。他のsiRNA修飾には、2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンまたはロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、およびホスホジエステルまたは様々な数のホスホロチオエート結合を含有するRNA二重鎖が含まれる。このような修飾は、例えば、Braasch et al., Biochemistry 42: 7967-7975 (2003)に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１９】
合成siRNA分子は、当業者に公知の多数の技法を用いて得ることができる。例えば、siRNA分子は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトと従来の固相オリゴヌクレオチド合成を用いて化学合成することができるか、または組換えにより産生することができる(例えば、Elbashir et al. Nature 411:494 (2001); Elbashir et al. Genes & Development 15:188 (2001); Harborth. et al. Journal of Cell Science 114:4557 (2001); Masters et al. Proceeding of the National Academy of Sciences USA 98:8012 (2001); およびTuschl et al. Genes & Development 13:3191 (1999)を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる)。さらに、プラスミドベクター、レトロウイルス、およびレンチウイルスによってコードされるステムループ構造としてdsRNAを発現させることができる(例えば、Paddison et al. Genes and Development 16:948 (2002); McManus et al. RNA 8:842 (2002); Paul et al. Nature Biotechnology 20:505 (2002); Miyagishi et al. Nature Biotechnology 20:497 (2002); Sui et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99:5515 (2002); Brummelkamp et al. Cancer Cell 2:243 (2002); Lee et al. Nature Biotechnology 20:500 (2002); Yu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99:6047 (2002); Zeng et al. Molecular Cell 9:1327 (2002); Rubinson et al. Nature Genetics 33:401 (2003); Stewart et al. RNA 9:493 (2003)を参照されたい。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２２０】
本発明の方法によって述べられた生物学的プロセスをアンタゴナイズするために、RNA干渉機構によって働く様々な阻害性物質が開発されている。例えば、ヒトTGFβRII配列に由来するTGFβ受容体II型siRNAポリヌクレオチド(Genbankアクセッション番号: M85079)が報告されている。TGFβ受容体II型遺伝子内の特定の標的配列に対して以下のsiRNA二重鎖配列が開発され、様々な全細胞モデルにおいて、この受容体の発現をノックダウンするのに用いられている。これらのsiRNA配列はUS8,067,389に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。他のオリゴヌクレオチドに基づくTGFβシグナル伝達モジュレーター、例えば、siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、US5,731,424;US6,124,449;US2008/0015161;US2006/0229266;US2004/0006030;US2005/0227936;およびUS2005/0287128に記載されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。TGFβR発現またはALK5発現を標的化するのに有用なsiRNAは容易に設計および試験することができる。siRNA配列およびsiRNA配列の予測変数のデータベースが確立されている(Chalk et al. (Nucleic Acids Research 33: D131 (2005)。このデータベースを用いて、特定のsiRNA-標的mRNA相互作用の熱力学的パラメータを予測し、オフターゲット相互作用について、設計されたsiRNA配列の特性を評価することができる。このデータベースは電子的情報源としてwww.siRNA.cgb.ki.seで入手することができる。
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【０２２１】
コンホメーションが制約されたペプチド
ペプチドに基づく治療剤は、多くの場合、他の手段では阻害することが困難だったタンパク質間相互作用の阻害に有用な化合物の新たに出現したクラスである。コンホメーションが制限されたペプチドには治療用途に特別の利点がある。なぜなら、これらの化合物は、特定のファーマコフォアが関心対象のタンパク質と空間的に相互作用しやすくなっている構造的に予め組織化されたエピトープを提示することによって高い標的親和性および選択性を示すことが多いからである。制約されたペプチドは、プロテアーゼが内部アミド結合に到達するのを制限することによって、制約されていない(例えば、直鎖)対応物と比べてプロテアーゼ抵抗性が高いという、さらなる利益を特徴とすることが多い。水素結合ドナーおよびアクセプターが水性溶媒から隔離されるために、これらの化合物の細胞透過能力も直鎖ペプチドの細胞透過能力より往々にして高い。本発明の組成物および方法と共に有用な例示的な制約されたペプチド阻害物質には、αヘリックスの同じ面にある残基間に共有結合架橋を挿入することによって構造的に堅くなっているαへリックスを特徴とすることが多いオレフィン「ステープルド(stapled)」ペプチドが含まれる。このクラスの制約されたペプチドは、例えば、Walensky et al. Journal of Medicinal Chemistry 57:6275 (2014)に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。アキシン(Axin)/β-カテニン相互作用を破壊することによって機能する、β-カテニンリン酸化のステープルドペプチド阻害物質が開発されている。アキシンは、β-カテニンを、GSK3を含むタンパク質複合体に固定するのに役立ち、この会合は、アキシンのαヘリックス領域を、β-カテニン表面にある表層部ポケットに挿入することによって媒介されることが示されている。残基R8((S)-α-(7-オクテニル)アラニン)とS5((S)-α-(4-ペンテニル)アラニン)におけるオレフィン架橋によってαヘリックスコンホメーションに構造的に制限された、配列
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のステープルドペプチドが報告されている(例えば、Cui et al. Cell Research 23: 581 (2013)を参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)。このペプチドはβ-カテニン表面での結合においてアキシンと競合し、GSK3含有複合体から、このタンパク質を遊離させ、従って、この転写因子の核濃度を増やすのに役立つ。
【０２２２】
制約されたペプチドはまた、N末端とC末端との間で共有結合により環化することでも開発されている。このクラスの例示的な阻害物質には、これらのペプチドを大環状にするラクトン部分を特徴とするデプシペプチドが含まれる。本発明の組成物および方法と共に有用なデプシペプチド阻害物質には、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質、例えば、ロミデスピン(istodaxとも呼ばれる; 構造を以下に示した)が含まれる。ロミデスピンは、例えば、Vinodhkumar et al., Biomedicine & Pharmacotherapy 62:85-93 (2008)に記載され、この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
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【０２２３】
ヒストンデアセチラーゼのデプシペプチド阻害物質のさらなる例には、Bertrand, European Journal of Medicinal Chemistry 45:2095-2116 (2010)に記載のアピシジン(Apicidin)が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
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【０２２４】
本発明の組成物および方法と共に有用な化合物の組み合わせ
本発明の組成物および方法の態様は、例えば、造血幹細胞集団を増大させるため、造血幹細胞集団を富化するため、および造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するために用いら得る上記の任意の化合物の組み合わせを含有してもよい。本発明の組成物および方法と共に有用な化合物の特定の組み合わせを以下の表1〜10に指定する。
【０２２５】
（表１）
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【０２２６】
（表２）
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【０２２７】
（表３）
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【０２２８】
（表４）
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【０２２９】
（表５）
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【０２３０】
（表６）
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【０２３１】
（表７）
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【０２３２】
（表８）
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【０２３３】
（表９）
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【０２３４】
（表１０）
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【０２３５】
エクスビボ培養中に造血幹細胞の増大、富化、および維持を誘導するのに使用することができるさらなる作用物質
エクスビボ培養中に造血幹細胞を増大させるため、富化するため、および/または維持するために、本発明の組成物および方法と共に他の化合物をさらに使用することができる。これらの化合物の例には、アリール炭化水素受容体(AHR)のアンタゴニスト、例えば、ヒトCD34+末梢血および臍帯血造血幹細胞の増大および自己複製を促進する低分子であるステムレゲニン1(SR1)が含まれる。SR1は、例えば、US2014/0369973; Boitano et al. Science 1345 (2010);およびSmith et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 338:318 (2011)に記載されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物および方法と共に使用することができる他のAHR阻害物質には、SR1類似体、例えば、6-アミノプリンコアの周りに様々なアリール置換基および脂肪族置換基を含有するSR1類似体(例えば、US2014/0369973に記載のもの。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)が含まれる。AHRアンタゴニストのさらなる例には、例えば、WO2004/041758に記載のように、スチルベン誘導体(E)-1-(4'-トリフルオロメチルフェニル)-2-(3,5-ジトリフルオロメチルフェニル)-エテン、(E)-1-(4'-メトキシフェニル)-2-(3,5-ジクロロフェニル)-エテン、および(E)-1-(4'-クロロフェニル)-2-(3,5-ジクロロフェニル)-エテンが含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。AHR阻害に有用な、さらなるスチルベン誘導体には、例えば、WO1999/056737に記載のように、3,5,4’-トリヒドロキシスチルベン(例えば、リスベラトロール、特に、trans-リスベラトロール);3,4,3’,5-テトラヒドロキシスチルベン(ピセアタンノールとも呼ばれる);2,3’,4’,5’-テトラヒドロスチルベン(オキシリスベラトロール(oxyresveratrol)とも呼ばれる);ならびに4,4’-ジヒドロキシスチルベンおよびグリコシド(例えば、そのガラクトシド、ラクトシド、マンノシド、ピセオシド(piceoside)、およびフルクトシド)が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。別の例示的なAHRアンタゴニストは、例えば、Kim et al. Molecular Pharmacology 69:1871 (2006)ならびにWO2009/115807において詳述される、2-メチル-2H-ピラゾール-3-カルボン酸-(2-メチル-4-o-トリルアゾフェニル)-アミド(CH-223191とも呼ばれる)。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる)である。
【０２３６】
本発明の方法と共に使用することができるさらなる作用物質には、造血幹細胞の増大を誘導することが示されている別の低分子であるUM171が含まれる。UM171は、例えば、Fares、et al., Science, 345(6203):1509-1512 (2014)に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物および方法と共に使用することができる他の作用物質には、UM171類似体、例えば、WO2013/110198に記載のUM171類似体が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物および方法と共に使用することができる、特に有用なUM171類似体には、WO2013/110198に列挙された化合物番号1〜55および本明細書中の表11に開示された化合物が含まれる。本発明の組成物および方法と共にさらに使用することができる化合物のクラスのさらなる例にはプロスタグランジンが含まれる。特に有用なプロスタグランジンには、例えば、US8,551,782およびUS8,168,428に記載のプロスタグランジンdmPGE2が含まれる。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の組成物および方法と共に使用することができるさらなる化合物には、サーチュイン(Sirtuin)1(SIRT1)タンパク質の阻害物質、例えば、ニコチンアミド(例えば、Peled et al. Experimental Hematology 40:342 (2012)に記載)およびカンビノール(例えば、Lugrin et al. Biochimica Biophysica Acta 1833:1498 (2013)に記載)が含まれる。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
2018519298.tif 000068
【０２３７】
ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と組み合わせて造血幹細胞と接触することができるさらなる作用物質には、Notchシグナル伝達経路のアクチベーターが含まれる。Notchシグナル伝達アゴニストには、Notchとの結合を媒介する、および/またはNotch活性を媒介する、トポリズミック(toporythmic)タンパク質の一部を含有するタンパク質、例えば、Delta、Serrate、またはJagged(例えば、Lindsell et al., Cell 80: 909-917 (1995)を参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)、ならびに前述のタンパク質をコードする核酸、ならびにこれらのタンパク質の活性または遺伝子発現を調節するタンパク質、その核酸、低分子、または誘導体が含まれるが、これに限定されない。Notchシグナル伝達アゴニストには、機能的に活性のある断片、例えば、Notchタンパク質との結合を媒介するNotchリガンド断片を含む、タンパク質またはその誘導体もしくは断片も含まれる。
【０２３８】
Notch活性は、Notchリガンド(例えば、DeltaリガンドおよびSerrateリガンド)がNotch受容体の細胞外部分に結合することによって促進される。内因性Notchリガンドは、典型的には、隣接する細胞に膜結合される。従って、本発明の組成物および方法と共に使用するためのNotchリガンドは、可溶性タンパク質因子として溶解状態で造血幹細胞とインキュベートされてもよく、固体表面(例えば、組織培養プレート、ビーズ、またはナノマトリックス(nanomatrix))に固定化されてもよい。例えば、細胞の表面に発現している完全長Notchリガンドは、このリガンドがNotch受容体と接触すると、隣接する細胞にあるNotchシグナル伝達カスケードの活性化を誘導する。従って、本発明の組成物および方法と共に使用するためのNotchシグナル伝達アゴニストには、細胞外ドメインまたはNotch結合部分を含有する可溶性の、任意で、切断型のDeltaまたはSerrate(例えば、Jagged)分子、ならびに表面、例えば、組織培養プレート、水混和性ビーズ、またはナノマトリックスの固体表面に固定化された形のこれらのタンパク質が含まれる。このような可溶性タンパク質は、US2014/0369973に記載のように、抗体もしくは相互作用タンパク質、例えば、DeltaもしくはSerrateが一緒に融合タンパク質として発現される、エピトープタグ(例えば、抗体9E10によって認識されるmycエピトープタグ)に対して作られた抗体、またはDeltaもしくはSerrateが一緒に融合タンパク質として発現される、エピトープタグ(例えば、プロテインAが結合する、免疫グロブリンエピトープタグ)と相互作用するタンパク質によって固体表面に固定化することができる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。例示的なNotchシグナル伝達アゴニストには、US2011/0091448に記載のように、notchポリペプチド、deltexポリペプチド、mastermindポリペプチド、splitポリペプチド、hairlessポリペプチド、RBP-Jκポリペプチド、またはheslポリペプチドが含まれる。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３９】
ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞と接触するさらなる化合物として、作用物質、例えば、前記の作用物質(例えば、AHRアンタゴニスト、例えば、SR1、任意で、UM171、dmPGE2、Notchシグナル伝達アゴニスト、および/またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミドもしくはカンビノールと組み合わせて)が含まれてもよい。例えば、これらの作用物質の1つまたは複数と接触している造血幹細胞は、AHRアンタゴニスト、UM171、dmPGE2、Notchシグナル伝達アゴニスト、および/またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミドもしくはカンビノールの1つまたは複数が培養期間中に様々な時間に造血幹細胞に導入されるように、別個のインキュベーションレジメンに従って、これらの化合物とさらに接触されてもよい。または、これらの作用物質は、望ましい時に、造血幹細胞と同時にインキュベートされてもよい。
【０２４０】
造血幹細胞の動員
本発明の組成物および方法と共に使用するための造血幹細胞は様々な細胞タイプから生じてもよい。例えば、本明細書において列挙された増大、富化、および造血幹細胞機能的能力の維持の方法のための造血細胞は、これらの細胞が、ヒストンメチル化の調整、TGFβシグナル伝達の阻害、p38シグナル伝達の阻害、古典的Wntシグナル伝達の活性化、およびヒストンアセチル化の調整からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質で処理される前に単核細胞から得られてもよい。ヒト造血幹細胞は、任意で、これらの作用物質の1つまたは複数で処理される前のCD34+細胞でもよい。例えば、ヒト造血幹細胞は、これらの作用物質の1つまたは複数で処理される前の、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞を含む細胞表面表現型を有する集団内にあってもよい。
【０２４１】
造血幹細胞はさらに、ヒト骨髄に由来してもよい。または、造血幹細胞はヒト臍帯血に由来してもよく、動員末梢血に由来してもよい。ヒト末梢血から得られた造血幹細胞は様々な戦略の1つによって動員することができる。骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員を誘導するのに使用することができる例示的な作用物質には、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)アンタゴニスト、例えば、AMD3100(プレリキサフォア(Plerixafor)およびMOZOBIL(商標)(Genzyme, Boston, MA)とも知られる)ならびに顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)が含まれ、これらの組み合わせは臨床実験においてCD34+細胞を急速に動員することが示されている。さらに、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド2(CXCL2。GROβとも呼ばれる)は、骨髄から末梢血に造血幹細胞動員を誘導することができる別の作用物質である。本発明の組成物および方法と共に使用するための造血幹細胞の動員を誘導することができる作用物質は互いに組み合わせて用いられてもよい。例えば、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、CXCL2、および/またはGCSFは、骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員を誘導するために対象に連続して投与されてもよく、1つの混合物にして同時に投与されてもよい。これらの作用物質を造血幹細胞動員の誘導物質として使用することは、例えば、Pelus, Current Opinion in Hematology 15:285 (2008)に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
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【０２４２】
造血幹細胞における標的遺伝子発現の調整
本発明の組成物および方法は、造血幹細胞集団における標的遺伝子の発現を調節するための戦略をさらに提供する。例えば、造血幹細胞集団は、本発明の方法に従ってエクスビボで増大してもよいか、富化されてもよいか、または維持されてもよく、さらに、変化した遺伝子発現パターンを示すように遺伝子組換えされてもよい。または、細胞集団は造血幹細胞について富化されてもよく、造血幹細胞集団は多能性状態で維持されてもよく、細胞は、当技術分野において公知の確立したゲノム編集法を用いて、さらに改変されてもよい。例えば、造血幹細胞内での外因性遺伝子の発現を促進するために、または内因性遺伝子の発現を阻害するためにゲノム編集手順が用いられてもよい。重要なことに、造血幹細胞集団は、本明細書において列挙された本発明の方法に従って増大するか、富化されるか、または多能性状態で維持され、その後に、望ましい標的遺伝子を発現するように遺伝子組換えされてもよい。または、これらの細胞の集団は、最初に、遺伝子組換えされてもよく、次いで、増大するか、富化されるか、または多能性状態で維持されてもよい。標的遺伝子の発現を容易にする目的で、このような遺伝子を細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞またはヒト細胞)のゲノムに組み込むために数多くのいろいろな方法が確立している。
【０２４３】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチド
造血幹細胞における標的遺伝子の発現を容易にするのに使用することができるプラットフォームの一例は、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞の核ゲノムに組み込むことによるものである。外因性遺伝子を真核生物ゲノムに導入するために様々な技法が開発されている。このような技法の1つは、標的遺伝子をウイルスベクターなどのベクターに挿入することを伴う。本発明の組成物および方法と共に使用するためのベクターは、形質転換、トランスフェクション、直接的な取り込み、プロジェクタイルボンバードメント(projectile bombardment)、およびリポソームへのベクターのカプセル化を含む様々な方法によって細胞に導入することができる。細胞をトランスフェクトまたは形質転換する適切な方法の例には、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション、および直接的な取り込みが含まれる。このような方法は、例えば、Green, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (2014);およびAusubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2015)においてさらに詳述される。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４４】
外因性遺伝子はまた、細胞膜リン脂質に向かう、関心対象の遺伝子を含有するベクターを用いることによって哺乳動物細胞に導入することもできる。例えば、ベクターは、ベクター分子を、全ての細胞膜リン脂質に対して親和性を有するウイルスタンパク質であるVSV-Gタンパク質に連結することによって、細胞膜の細胞外表面にあるリン脂質に標的化することができる。VSV-Gタンパク質を含有するウイルスベクターは、例えば、US5,512,421;およびUS5,670,354においてさらに詳述される。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４５】
哺乳動物RNAポリメラーゼが、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを認識して、これに結合することは、遺伝子発現が起こるための重要な分子事象である。従って、RNAポリメラーゼを動員し、転写開始点において転写複合体の集合を促進する転写因子に対して高親和性を示す配列エレメントをポリヌクレオチドの中に含めてもよい。このような配列エレメントには、例えば、特異的な転写開始因子が認識および結合し、最終的には、RNAポリメラーゼが認識および結合することができる配列である哺乳動物プロモーターが含まれる。または、哺乳動物細胞において標的遺伝子を安定発現するために、ウイルスゲノムに由来するプロモーターを使用することができる。これらの酵素の哺乳動物発現を促進するのに使用することができる機能的ウイルスプロモーターの例には、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVのLTRプロモーター、モロニーウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス(EBV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、およびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターが含まれる。さらなるウイルスプロモーターには、シミアンウイルス40に由来するSV40後期プロモーター、バキュロウイルス多角体エンハンサー/プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV tk)プロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルスに由来する35Sプロモーターが含まれる。本発明の組成物および方法と共に使用するための適切なファージプロモーターには、US5,547,892に記載のように、大腸菌(E.coli)T7およびT3ファージプロモーター、S.チフィリウム(typhimurium)ファージSP6プロモーター、B.サブティリス(subtilis)SP01ファージおよびB.サブティリスファージphi29プロモーター、ならびにN4ファージおよびK11ファージプロモーターが含まれるが、これに限定されない。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４６】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞のゲノム(例えば、造血幹細胞の核ゲノム)に組み込まれると、当技術分野において公知の方法によって、このポリヌクレオチドの転写を誘導することができる。例えば、発現は、哺乳動物細胞を外部化学試薬、例えば、転写因子および/またはRNAポリメラーゼと哺乳動物プロモーターとの結合を調整し、従って、遺伝子発現を調節する作用物質に曝露することによって誘導することができる。化学試薬は、例えば、哺乳動物プロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することによって、RNAポリメラーゼおよび/または転写因子と哺乳動物プロモーターとの結合を容易にするのに役立ってもよい。または、化学試薬は、哺乳動物プロモーターの下流に配置された遺伝子の転写速度が化学試薬の存在下では増加するように、RNAポリメラーゼおよび/または転写因子に対する哺乳動物プロモーターの親和性を増強するのに役立ってもよい。上述の機構によってポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例にはテトラサイクリンおよびドキシサイクリンが含まれる。これらの試薬は市販されており(Life Technologies, Carlsbad, CA)、確立したプロトコールに従って遺伝子発現を促進するために哺乳動物細胞に投与することができる。
【０２４７】
本発明の組成物および方法と共に使用するためにポリヌクレオチドに含まれ得る他のDNA配列エレメントにはエンハンサー配列が含まれる。エンハンサーは、転写開始部位での転写因子およびRNAポリメラーゼの結合に好ましい三次元方向をDNAがとるように、関心対象の遺伝子を含むポリヌクレオチドのコンホメーション変化を誘導する別のクラスの調節エレメントである。従って、本発明の組成物および方法と共に使用するためのポリヌクレオチドは、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、哺乳動物エンハンサー配列をさらに含む。現在、哺乳動物遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列が公知であり、例には、哺乳動物グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインシュリンをコードする遺伝子に由来するエンハンサーが含まれる。本発明の組成物および方法と共に使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質に由来するエンハンサーも含まれる。例には、複製起点の後期側にあるSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物遺伝子転写の活性化を誘導するさらなるエンハンサー配列は、Yaniv, et al., Nature, 297:17-18 (1982)に開示される。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。エンハンサーはスプライスされて、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターに、例えば、この遺伝子の5’側または3’側の位置に入れられてもよい。好ましい方向で、エンハンサーはプロモーターの5’側に配置され、次に、プロモーターは、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドに対して5’側に配置される。
【０２４８】
速い転写速度および翻訳速度を促進することに加えて、造血幹細胞における外因性遺伝子の安定発現を、この遺伝子を含むポリヌクレオチドを細胞の核DNAに組み込むことによって成し遂げることができる。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核DNAに送達する、および組み込むための様々なベクターが開発されている。発現ベクターの例は、例えば、WO1994/11026に開示される。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物および方法と共に使用するための発現ベクターは、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、ならびに、例えば、これらの酵素の発現および/または哺乳動物細胞ゲノムへの、これらのポリヌクレオチド配列の組み込みに用いられる、さらなる配列エレメントを含有する。標的遺伝子の発現に使用することができる、ある特定のベクターには、遺伝子転写を誘導する制御配列、例えば、プロモーターおよびエンハンサー領域を含有するプラスミドが含まれる。標的遺伝子を発現させるための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、または遺伝子転写に起因するmRNAの安定性もしくは核外輸送を改善する、ポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列エレメントは、発現ベクターに載せて運ばれる遺伝子の効率的な転写を誘導するために、RNA転写物内に、核外輸送、サイトゾル半減期、およびこれらの分子のリボソーム親和性を増強する特徴、例えば、5’非翻訳領域および3’非翻訳領域、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ならびにポリアデニル化シグナル部位をコードすることが多い。例示的な発現ベクターはまた、このようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドも含有してよい。適切なマーカーの非限定的な例には、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシン(nourseothricin)に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【０２４９】
標的遺伝子の発現のためのベクター
ウイルスゲノムは、外因性遺伝子を哺乳動物細胞に効率的に送達するのに使用することができる豊富なベクター供給源を提供する。ウイルスゲノムは遺伝子送達に特に有用なベクターである。なぜなら、このようなゲノムに含まれるポリヌクレオチドは、典型的には、一般的な形質導入または特殊な形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノムに組み込まれるからである。これらのプロセスは天然のウイルス複製サイクルの一部として行われ、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質または試薬を必要としないことが多い。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス(例えば、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、およびAd48)、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、鶏痘、およびカナリアポックス)を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)。ウイルスベクターの他の例には、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー(Mason Pfizer)サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。ベクターの他の例は、例えば、US5,801,030に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５０】
さらなるトランスフェクション方法
ポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNA(例えば、mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA、化学修飾RNA)を哺乳動物細胞に導入するのに使用することができる他の技法は当技術分野において周知である。例えば、エレクトロポレーションを用いて、静電ポテンシャルを加えることによって哺乳動物細胞を透過処理することができる。このように外部電場に供された哺乳動物細胞、例えば、造血幹細胞は、後で、外因性核酸を取り込みやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Chu et al. Nucleic Acids Research 15:1311 (1987)に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。同様の技法であるNucleofection(商標)では、真核細胞の核への外因性ポリヌクレオチドの更新(update)を刺激するために電場印加を利用する。この技法を行うのに有用なNucleofection(商標)およびプロトコールは、例えば、Distler et al. Experimental Dermatology 14:315 (2005)ならびにUS2010/0317114に詳述されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５１】
造血幹細胞のトランスフェクションに有用なさらなる技法にはスクイーズポレーション法が含まれる。この技法は、印加されたストレスに応答して形成する膜の孔を通って外因性DNAが取り込まれるのを刺激するために細胞の迅速な機械的変形を誘導する。この技術は、核酸を造血幹細胞などの細胞に送達するためにベクターが必要とされない点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Sharei et al. Journal of Visualized Experiments 81:e50980 (2013)に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５２】
リポフェクションは、造血幹細胞のトランスフェクションに有用な別の技法である。この方法は、核酸をリポソームに積み込む工程を伴う。このリポソームは、リポソーム外部に向かって、カチオン性官能基、例えば、第4級アミンまたはプロトン化アミンを提示することが多い。細胞膜がアニオン性であるので、これにより、リポソームと細胞との間の静電相互作用が促進され、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接的な融合によって、または複合体のエンドサイトーシスによって外因性核酸が取り込まれる。リポフェクションは、例えば、US7,442,386に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。外来核酸の取り込みを誘発するために細胞膜とのイオン相互作用を利用する同様の技法には、細胞とカチオン性ポリマー-核酸複合体との接触が含まれる。細胞膜との相互作用に好ましい正電荷を付与するようにポリヌクレオチドと会合する例示的なカチオン性分子には、活性化デンドリマー(例えば、Dennig, Topics in Current Chemistry 228:227 (2003)に記載される。この開示は参照により本明細書に組み入れられる)およびジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストランが含まれる。トランスフェクション剤としての、この使用は、例えば、Gulick et al. Current Protocols in Molecular Biology 40:I:9.2:9.2.1 (1997)に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。磁気ビーズは、この方法では、核酸の取り込みを誘導するために磁場印加を利用するので、穏やかで、かつ効率的なやり方で造血幹細胞をトランスフェクトするのに使用することができる別のツールである。この技術は、例えば、US2010/0227406に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５３】
造血幹細胞による外因性核酸の取り込みを誘導するのに有用な別のツールは、細胞を穏やかに透過処理し、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透するようにするために、特定の波長の電磁放射線に細胞を曝露することを伴う技法であるレーザーフェクションである。この技法は、例えば、Rhodes et al. Methods in Cell Biology 82:309 (2007)に詳述されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５４】
マイクロベシクルは、本明細書に記載の本発明の方法に従って造血幹細胞ゲノムを改変するのに使用することができる可能性のある別のビヒクルである。例えば、遺伝子または制御配列などの関心対象のポリヌクレオチドを共有結合によって組み込むために細胞ゲノムを調製する目的で、糖タンパク質VSV-Gと、例えば、ゲノム改変(genome-modifying)タンパク質、例えば、ヌクレアーゼとの同時過剰発現によって誘導されたマイクロベシクルを用いて、内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を後で触媒するタンパク質を細胞に効率的に送達することができる。真核細胞の遺伝子組換えのための、ジェシクルとも呼ばれる、このような小胞の使用は、例えば、Quinn, TP, et al. Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. In: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract], in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122に詳述されている。
【０２５５】
遺伝子編集法による標的遺伝子の組み込み
ウイルスベクターに加えて、外因性遺伝子を造血幹細胞に組み込むのに使用することができる様々なさらなるツールが開発されている。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを造血幹細胞に組み込むのに使用することができる、このような方法の1つはトランスポゾンを使用することを伴う。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードし、5’切除部位および3’切除部位に隣接する関心対象のポリヌクレオチド配列または遺伝子を含有するポリヌクレオチドである。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が開始し、トランスポゾンから関心対象の遺伝子を切断する活性酵素を生じる。この活性は、トランスポザーゼがトランスポゾン切除部位を部位特異的に認識することによって媒介される。ある特定の場合では、これらの切除部位は末端反復でもよく逆位末端配列でもよい。関心対象の遺伝子はトランスポゾンから切除されると、哺乳動物細胞の核ゲノム内に存在する同様の切除部位の、トランスポザーゼによって触媒される切断によって哺乳動物細胞ゲノムに組み込むことができる。これにより、切断された核DNAの相補的な切除部位に関心対象の遺伝子が挿入され、その後に、関心対象の遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのDNAにつなぐホスホジエステル結合の共有結合連結によって組み込みプロセスが完了する。ある特定の場合では、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が最初にRNA生成物に転写され、次いで、DNAに逆転写された後に、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれるようなレトロトランスポゾンでもよい。例示的なトランスポゾン系には、ピギーバックトランスポゾン(例えば、WO2010/085699において詳述される)およびスリーピングビューティートランスポゾン(例えば、US2005/0112764において詳述される)が含まれる。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５６】
標的遺伝子を造血幹細胞ゲノムに組み込むのに有用な別のツールは、元々、ウイルス感染に対する細菌および古細菌の適応防御機構として進化した系である、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(クリスパー)/Cas系である。クリスパー/Cas系は、プラスミドDNA内の回文配列リピート配列と、関連するCas9ヌクレアーゼを含む。この一組のDNAとタンパク質は、最初に、外来DNAをクリスパー遺伝子座に組み込むことによって、標的配列の部位特異的なDNA切断を誘導する。次に、これらの外来配列を含有するポリヌクレオチドと、クリスパー遺伝子座のリピート-スペーサーエレメントはガイドRNAを作り出すために宿主細胞内で転写され、その後に、ガイドRNAは標的配列にアニールして、この部位にCas9ヌクレアーゼを局在化することができる。このように、高度に部位特異的なcas9を介したDNA切断は外来ポリヌクレオチドにおいて起こすことができる。なぜなら、cas9を標的DNA分子に近づける相互作用はRNA:DNAハイブリダイゼーションによって支配されるからである。結果として、理論上では、関心対象の任意の標的DNA分子を切断するようにクリスパー/Cas系を設計することができる。この技法は真核生物ゲノムを編集するために利用されており(Hwang et al. Nature Biotechnology 31:227 (2013))、DNAを切断した後に、標的遺伝子をコードする遺伝子を組み込むために造血幹細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調整するためにクリスパー/Casを使用することは、例えば、US8,697,359において説明されている。この開示は参照により本明細書に組み入れられる。造血幹細胞においてゲノムDNAを部位特異的に切断した後に関心対象の遺伝子を組み込むための代替方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)と転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を使用することが含まれる。クリスパー/Cas系とは異なり、これらの酵素は、特異的な標的配列に局在させるためにガイドポリヌクレオチドを含有しない。その代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のDNA結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途におけるZFNとTALENの使用は、例えば、Urnov et al. Nature Reviews Genetics 11:636 (2010)およびJoung et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49 (2013)に記載されている。これらの両方の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５７】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを造血幹細胞ゲノムに組み込むのに使用することができるさらなるゲノム編集法には、ゲノムDNAを部位特異的に切断するように合理的に設計することができるARCUS(商標)メガヌクレアーゼを使用することが含まれる。このような酵素について証明されている、規定された構造活性相関を考慮すると、標的遺伝子をコードする遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムに組み込むために、これらの酵素を使用することは有利である。DNAの望ましい場所を選択的に切断して、標的遺伝子を造血幹細胞の核DNAに部位特異的に組み込むのを可能にするヌクレアーゼを作り出すために、単鎖メガヌクレアーゼを、ある特定のアミノ酸位置において改変することができる。これらの単鎖ヌクレアーゼは、例えば、US8,021,867およびUS8,445,251において広範に説明されている。これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５８】
造血幹細胞の分化の誘導
ある特定の場合では、本発明の方法に従って造血幹細胞集団を増大させるか、富化するか、または維持し、その後に、これらの細胞が造血レパートリーの血球に分化するのを誘導した後に、結果として生じた細胞をレシピエントに注入することが望ましい場合がある。これは、特定の血球タイプを、この血球タイプを必要とするレシピエントに投与するのに有用なパラダイムである。本発明の方法に従って増大し、富化され、かつ/または維持されている造血幹細胞集団は、これらの細胞が造血系統の細胞に分化するのを刺激するために、様々な条件、例えば、当技術分野において公知の条件に供されてもよい。例えば、確立したプロトコールを用いて、多数の血球タイプの1つ、例えば、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、例えば、NK細胞、B細胞、およびT細胞に分化するように造血幹細胞を誘導することができる。
【０２５９】
造血幹細胞療法の適応症
本発明の組成物および方法の使用によって生成された(例えば、増大した、富化された、または多分化能状態に維持された)造血幹細胞は様々なヒト疾患を処置するのに使用することができる。患者に投与される造血幹細胞またはその子孫は自己由来でもよく、同系でもよく、同種異系でもよく、インビボで造血幹細胞の増大を促進する1種類または複数種の作用物質と共に投与されてもよい。例えば、造血幹細胞またはその子孫は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全(CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ症候群、ならびにモルキオ症候群などの疾患を処置するために患者(例えば、ヒト患者)に投与されてもよい。
【０２６０】
造血幹細胞またはその子孫はまた、遺伝的血液障害、例えば、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミスSCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病、多中心性キャッスルマン病、先天性無巨核球性血小板減少症(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症(IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群(XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群(XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)を処置するためにヒト患者に投与することもできる。本発明の組成物および/または方法によって増大した、富化された、または維持された造血幹細胞集団ならびにその子孫はまた、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、またはタンパク質欠損症に罹患している患者を処置するのに使用することもできる。他の態様において、患者は組織移植レシピエントでも細胞移植レシピエントでもよく、造血幹細胞またはその子孫は、移植された組織または細胞に対する寛容を誘導するために投与される。
【０２６１】
本願全体を通して引用された、参照文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時継続中の特許出願を含む、特許および他の刊行物は全て、説明および開示する目的で、例えば、本明細書に記載の技術と共に用いられ得る、このような刊行物に記載の方法を説明および開示する目的で参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は本願の出願日前の刊行物の開示のためだけに提供される。この点に関して、先行発明によって、または他の任意の理由により本発明者らがこのような開示に先行する権利がないと認められると解釈されるものは何もない。日付に関する記載またはこれらの文書の内容に関する表記は全て出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付または内容の正確さに関する是認を構成するものではない。
【０２６２】
本開示の態様の説明は網羅的であることも、開示された厳密な形態に本開示を限定することも意図されない。本開示の特定の態様および実施例は例示目的で本明細書において説明されたが、関連する技術分野の当業者が認めるように、様々な等価な修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程または機能が、ある特定の順序で示されたが、代わりの態様が異なる順序で機能を果たしてもよく、実質的に同時に機能が成し遂げられてもよい。本明細書において提供される本開示の開示は、適宜、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。必要であれば、上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を用いるように、本開示の局面を修正して、本開示のなおさらなる態様を提供することができる。さらに、生物学的機能同等性の考えにより、種類または量の点で生物作用または化学作用に影響を及ぼすことなくタンパク質構造にいくらかの変化を加えることができる。詳細な説明を考慮して、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。このような修正は全て、添付の特許請求の範囲の中に含まれることが意図される。
【０２６３】
前述のどの態様の特定の要素も他の態様の要素と組み合わせることができるか、または他の態様の要素の代わりに使用することができる。さらに、これらの態様の文脈において、本開示のある特定の態様に関連する利点が説明されたが、他の態様もこのような利点を示してもよく、全ての態様が、必ず、本開示の範囲内にある、このような利点を示す必要があるとは限らない。
【０２６４】
本明細書に記載の技術の一部の態様は、番号が付与された以下の項目のいずれかによって定義されることができる。
1.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
2.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
3.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
4.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
5.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
6.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目4に記載の方法。
7.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目6に記載の方法。
8.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目7に記載の方法。
9.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目8に記載の方法。
10.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目8に記載の方法。
11.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
12.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
13.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
14.  前記1種類または複数種の作用物質が、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
15.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
16.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
17.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目11〜16のいずれかに記載の方法。
18.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目11〜17のいずれかに記載の方法。
19.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目11〜18のいずれかに記載の方法。
20.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目11〜19のいずれかに記載の方法。
21.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目11〜20のいずれかに記載の方法。
22.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目11〜21のいずれかに記載の方法。
23.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目22に記載の方法。
24.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目22または23に記載の方法。
25.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目22〜24のいずれかに記載の方法。
26.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目22〜25のいずれかに記載の方法。
27.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目22〜26のいずれかに記載の方法。
28.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、項目22〜27のいずれかに記載の方法。
29.  造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
30.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
31.  第1の造血幹細胞集団を接触させる工程を含み、造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該第1の作用物質および該第2の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
32.  1種類または複数種の前記作用物質が、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、項目29〜31のいずれかに記載の方法。
33.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
34.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
35.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
36.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
37.  前記第1の造血幹細胞集団が、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、前記対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、項目3、13、および31のいずれかに記載の方法。
38.  前記造血幹細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜37のいずれかに記載の方法。
39.  前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目38に記載の方法。
40.  前記造血幹細胞がCD34+細胞である、項目39に記載の方法。
41.  前記CD34+細胞の少なくとも10％が、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である、項目40に記載の方法。
42.  前記造血幹細胞がヒト臍帯血に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
43.  前記造血幹細胞がヒト動員末梢血に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
44.  前記造血幹細胞がヒト骨髄に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
45.  前記造血幹細胞がヒトから新鮮に単離されている、項目38〜44のいずれかに記載の方法。
46.  前記造血幹細胞が以前に凍結保存されたことがある、項目38〜44のいずれかに記載の方法。
47.  前記哺乳動物細胞がマウス細胞である、項目38に記載の方法。
48.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される、項目1〜47のいずれかに記載の方法。
49.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質と接触する、項目1〜48のいずれかに記載の方法。
50.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と同時に接触される、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
51.  前記造血幹細胞が、異なる時間に前記1種類または複数種の作用物質と接触される、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
52.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する、項目1〜51のいずれかに記載の方法。
53.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれより以降に)移植後に造血幹細胞機能的能力を維持する、項目52に記載の方法。
54.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)長期生着能を維持する、項目1〜53のいずれかに記載の方法。
55.  前記造血幹細胞が、患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞の集団の回復を惹起する、項目1〜54のいずれかに記載の方法。
56.  前記リンパ球が、ナチュラルキラー細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される、項目55に記載の方法。
57.  前記造血幹細胞が、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる、項目1〜56のいずれかに記載の方法。
58.  前記造血幹細胞が、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される、項目1〜57のいずれかに記載の方法。
59.  前記造血幹細胞が、2〜20％酸素の存在下で培養される、項目1〜58のいずれかに記載の方法。
60.  前記造血幹細胞が、2〜12％酸素の存在下で培養される、項目59に記載の方法。
61.  前記造血幹細胞が、約5％酸素の存在下で培養される、項目60に記載の方法。
62.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
63.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
64.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
65.  a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;ならびに
b.項目1、11、29のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させるか、または項目3、13、および31〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、該ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に導入する方法。
66.  (a)が(b)より先行する、項目65に記載の方法。
67.  (b)が(a)より先行する、項目65に記載の方法。
68.  前記細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を提供する工程を含む、項目65〜67のいずれかに記載の方法。
69.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
70.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬が転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
71.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がクリスパー関連タンパク質を含む、項目68に記載の方法。
72.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の作用物質がメガヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
73.  前記造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
74.  エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
75.  前記細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
76.  マイクロインジェクションまたはレーザーフェクションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
77.  前記ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
78.  前記ポリヌクレオチドが、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
79.  前記ポリヌクレオチドが、化学修飾されたRNAである、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
80.  増大した前記造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む、項目65〜79のいずれかに記載の方法。
81.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目1、11、29、および32〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
82.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目2、12、30、および32〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された該細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
83.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目3、13、および31〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
84.  a.項目1〜64のいずれかに記載の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
85.  前記レシピエントがヒトである、項目80〜84のいずれかに記載の方法。
86.  前記造血幹細胞が、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する、項目85に記載の方法。
87.  前記造血幹細胞が、前記ドナーの動員末梢血に由来する、項目86に記載の方法。
88.  前記ドナーが、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある、項目87に記載の方法。
89.  前記造血幹細胞が、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質とさらに接触される、項目1〜88のいずれかに記載の方法。
90.  前記アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質がSR1またはその類似体である、項目34、36、および89のいずれかに記載の方法。
91.  前記造血幹細胞が、UM171またはその類似体とさらに接触される、項目1〜90のいずれかに記載の方法。
92.  前記造血幹細胞がプロスタグランジンとさらに接触される、項目1〜91のいずれかに記載の方法。
93.  前記プロスタグランジンがdmPGE2またはその類似体である、項目92に記載の方法。
94.  前記造血幹細胞がNotchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される、項目1〜93のいずれかに記載の方法。
95.  前記造血幹細胞がSIRT1阻害物質とさらに接触される、項目1〜94のいずれかに記載の方法。
96.  前記阻害物質またはSIRT1が、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される、項目95に記載の方法。
97.  前記レシピエントが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全 (CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
98.  前記レシピエントが、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミス(Artemis)SCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病、多中心性キャッスルマン病、先天性無巨核球性血小板減少症(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症 (IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群 (XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群 (XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
99.  前記レシピエントが、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
100.  前記造血幹細胞が自己由来または同系である、項目80〜99のいずれかに記載の方法。
101.  前記造血幹細胞が同種異系である、項目80〜99のいずれかに記載の方法。
102.  a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
103.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目102に記載の組成物。
104.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目102または103に記載の組成物。
105.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目103に記載の組成物。
106.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目105に記載の組成物。
107.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目106に記載の組成物。
108.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目107に記載の組成物。
109.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目107に記載の組成物。
110.  a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
111.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目110に記載の組成物。
112.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目110に記載の組成物。
113.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目110〜112のいずれかに記載の組成物。
114.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目110〜113のいずれかに記載の組成物。
115.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目110〜114のいずれかに記載の組成物。
116.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目110〜115のいずれかに記載の組成物。
117.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目110〜116のいずれかに記載の組成物。
118.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目110〜117のいずれかに記載の組成物。
119.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目118に記載の組成物。
120.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目118または119に記載の組成物。
121.  前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目118〜120のいずれかに記載の組成物。
122.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目118〜121のいずれかに記載の組成物。
123.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目118〜122のいずれかに記載の組成物。
124.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目118〜123のいずれかに記載の組成物。
125.  (a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質とを含む、組成物。
126.  前記1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
127.  前記1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
128.  前記1種類または複数種の作用物質が、少なくとも2日間前記造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
129.  前記1種類または複数種の作用物質が水溶液中に存在する、項目126〜128のいずれかに記載の組成物。
130.  前記1種類または複数種の作用物質が凍結乾燥固体として存在する、項目126〜128のいずれかに記載の組成物。
131.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
132.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
133.  前記1種類または複数種の作用物質が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の前記造血幹細胞と接触した後に移植後に、該造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
134.  表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、組成物。
135.  項目102〜134のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養培地。
136.  血清を実質的に含まない、項目135に記載の細胞培養培地。
137.  前記1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含む、項目102〜134のいずれかに記載の組成物。
138.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質の存在下で培養されている、項目137に記載の組成物。
139.  造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
140.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
141.  第1の造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
142.  項目1〜101および139〜141のいずれかに記載の方法によって生成された、造血幹細胞集団。
143.  項目102〜134、137、および138のいずれかに記載の組成物を備え、添付文書をさらに備える、キット。
144.  前記添付文書が、前記キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、造血幹細胞集団を富化するように、または造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するように指示している、項目143に記載のキット。
145.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している、項目143に記載のキット。
146.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞を患者に投与するように指示している、項目143に記載のキット。
【０２６５】
本明細書に記載の技術の一部の態様は、番号が付与された以下の項目のいずれかによって定義されることができる。
1.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
2.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
3.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
4.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
5.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
6.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目4に記載の方法。
7.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目6に記載の方法。
8.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目7に記載の方法。
9.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目8に記載の方法。
10.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目8に記載の方法。
11.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
12.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
13.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
14.  前記1種類または複数種の作用物質が、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
15.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
16.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目11〜13のいずれかに記載の方法。
17.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目11〜16のいずれかに記載の方法。
18.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目11〜17のいずれかに記載の方法。
19.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目11〜18のいずれかに記載の方法。
20.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目11〜19のいずれかに記載の方法。
21.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目11〜20のいずれかに記載の方法。
22.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目11〜21のいずれかに記載の方法。
23.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目22に記載の方法。
24.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目22または23に記載の方法。
25.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目22〜24のいずれかに記載の方法。
26.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目22〜25のいずれかに記載の方法。
27.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目22〜26のいずれかに記載の方法。
28.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、項目22〜27のいずれかに記載の方法。
29.  造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
30.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
31.  第1の造血幹細胞集団を接触させる工程を含み、造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該第1の作用物質および該第2の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
32.  1種類または複数種の前記作用物質が、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、項目29〜31のいずれかに記載の方法。
33.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
34.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
35.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
36.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目1〜32のいずれかに記載の方法。
37.  前記第1の造血幹細胞集団が、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、前記対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、項目3、13、および31のいずれかに記載の方法。
38.  前記造血幹細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜37のいずれかに記載の方法。
39.  前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目38に記載の方法。
40.  前記造血幹細胞がCD34+細胞である、項目39に記載の方法。
41.  前記CD34+細胞の少なくとも10％が、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である、項目40に記載の方法。
42.  前記造血幹細胞がヒト臍帯血に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
43.  前記造血幹細胞がヒト動員末梢血に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
44.  前記造血幹細胞がヒト骨髄に由来する、項目38〜40のいずれかに記載の方法。
45.  前記造血幹細胞がヒトから新鮮に単離されている、項目38〜44のいずれかに記載の方法。
46.  前記造血幹細胞が以前に凍結保存されたことがある、項目38〜44のいずれかに記載の方法。
47.  前記哺乳動物細胞がマウス細胞である、項目38に記載の方法。
48.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される、項目1〜47のいずれかに記載の方法。
49.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質と接触する、項目1〜48のいずれかに記載の方法。
50.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と同時に接触される、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
51.  前記造血幹細胞が、異なる時間に前記1種類または複数種の作用物質と接触される、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
52.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する、項目1〜51のいずれかに記載の方法。
53.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれより以降に)移植後に造血幹細胞機能的能力を維持する、項目52に記載の方法。
54.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)長期生着能を維持する、項目1〜53のいずれかに記載の方法。
55.  前記造血幹細胞が、患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞の集団の回復を惹起する、項目1〜54のいずれかに記載の方法。
56.  前記リンパ球が、ナチュラルキラー細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される、項目55に記載の方法。
57.  前記造血幹細胞が、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる、項目1〜56のいずれかに記載の方法。
58.  前記造血幹細胞が、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される、項目1〜57のいずれかに記載の方法。
59.  前記造血幹細胞が、2〜20％酸素の存在下で培養される、項目1〜58のいずれかに記載の方法。
60.  前記造血幹細胞が、2〜12％酸素の存在下で培養される、項目59に記載の方法。
61.  前記造血幹細胞が、約5％酸素の存在下で培養される、項目60に記載の方法。
62.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
63.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
64.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する、項目1〜61のいずれかに記載の方法。
65.  a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;ならびに
b.項目1、11、29のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させるか、または項目3、13、および31〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、該ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に導入する方法。
66.  (a)が(b)より先行する、項目65に記載の方法。
67.  (b)が(a)より先行する、項目65に記載の方法。
68.  前記細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を提供する工程を含む、項目65〜67のいずれかに記載の方法。
69.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
70.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬が転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
71.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がクリスパー関連タンパク質を含む、項目68に記載の方法。
72.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の作用物質がメガヌクレアーゼを含む、項目68に記載の方法。
73.  前記造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
74.  エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
75.  前記細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
76.  マイクロインジェクションまたはレーザーフェクションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目65〜72のいずれかに記載の方法。
77.  前記ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
78.  前記ポリヌクレオチドが、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
79.  前記ポリヌクレオチドが、化学修飾されたRNAである、項目65〜76のいずれかに記載の方法。
80.  増大した前記造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む、項目65〜79のいずれかに記載の方法。
81.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目1、11、29、および32〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
82.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目2、12、30、および32〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された該細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
83.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目3、13、および31〜64のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
84.  a.項目1〜64のいずれかに記載の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
85.  前記レシピエントがヒトである、項目80〜84のいずれかに記載の方法。
86.  前記造血幹細胞が、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する、項目85に記載の方法。
87.  前記造血幹細胞が、前記ドナーの動員末梢血に由来する、項目86に記載の方法。
88.  前記ドナーが、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある、項目87に記載の方法。
89.  前記造血幹細胞が、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質とさらに接触される、項目1〜88のいずれかに記載の方法。
90.  前記アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質がSR1またはその類似体である、項目34、36、および89のいずれかに記載の方法。
91.  前記造血幹細胞が、UM171、その類似体、または表11より選択されるUM171類似体とさらに接触される、項目1〜90のいずれかに記載の方法。
92.  前記造血幹細胞がプロスタグランジンとさらに接触される、項目1〜91のいずれかに記載の方法。
93.  前記プロスタグランジンがdmPGE2またはその類似体である、項目92に記載の方法。
94.  前記造血幹細胞がNotchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される、項目1〜93のいずれかに記載の方法。
95.  前記造血幹細胞がSIRT1阻害物質とさらに接触される、項目1〜94のいずれかに記載の方法。
96.  前記阻害物質またはSIRT1が、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される、項目95に記載の方法。
97.  前記レシピエントが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全 (CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
98.  前記レシピエントが、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミス(Artemis)SCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病、多中心性キャッスルマン病、先天性無巨核球性血小板減少症(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症 (IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群 (XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群 (XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
99.  前記レシピエントが、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
100.  前記造血幹細胞が自己由来または同系である、項目80〜99のいずれかに記載の方法。
101.  前記造血幹細胞が同種異系である、項目80〜99のいずれかに記載の方法。
102.  a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
103.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目102に記載の組成物。
104.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目102または103に記載の組成物。
105.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目103に記載の組成物。
106.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目105に記載の組成物。
107.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目106に記載の組成物。
108.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目107に記載の組成物。
109.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目107に記載の組成物。
110.  a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
111.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目110に記載の組成物。
112.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目110に記載の組成物。
113.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目110〜112のいずれかに記載の組成物。
114.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目110〜113のいずれかに記載の組成物。
115.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目110〜114のいずれかに記載の組成物。
116.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目110〜115のいずれかに記載の組成物。
117.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目110〜116のいずれかに記載の組成物。
118.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目110〜117のいずれかに記載の組成物。
119.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目118に記載の組成物。
120.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目118または119に記載の組成物。
121.  前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目118〜120のいずれかに記載の組成物。
122.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目118〜121のいずれかに記載の組成物。
123.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目118〜122のいずれかに記載の組成物。
124.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目118〜123のいずれかに記載の組成物。
125.  (a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質とを含む、組成物。
126.  前記1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
127.  前記1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
128.  前記1種類または複数種の作用物質が、少なくとも2日間前記造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する、項目102〜125のいずれかに記載の組成物。
129.  前記1種類または複数種の作用物質が水溶液中に存在する、項目126〜128のいずれかに記載の組成物。
130.  前記1種類または複数種の作用物質が凍結乾燥固体として存在する、項目126〜128のいずれかに記載の組成物。
131.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
132.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
133.  前記1種類または複数種の作用物質が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の前記造血幹細胞と接触した後に移植後に、該造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する、項目126〜130のいずれかに記載の組成物。
134.  表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、組成物。
135.  項目102〜134のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養培地。
136.  血清を実質的に含まない、項目135に記載の細胞培養培地。
137.  前記1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含む、項目102〜134のいずれかに記載の組成物。
138.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質の存在下で培養されている、項目137に記載の組成物。
139.  造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
140.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
141.  第1の造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;および
e.ヒストンアセチル化の調整
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)SR1またはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
142.  項目1〜101および139〜141のいずれかに記載の方法によって生成された、造血幹細胞集団。
143.  項目102〜134、137、および138のいずれかに記載の組成物を備え、添付文書をさらに備える、キット。
144.  前記添付文書が、前記キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、造血幹細胞集団を富化するように、または造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するように指示している、項目143に記載のキット。
145.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している、項目143に記載のキット。
146.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞を患者に投与するように指示している、項目143に記載のキット。
147.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
148.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整、および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
149.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整、および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
150.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目147〜149のいずれかに記載の方法。
151.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目147〜150のいずれかに記載の方法。
152.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目151に記載の方法。
153.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目152に記載の方法。
154.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目153に記載の方法。
155.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目154に記載の方法。
156.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目155に記載の方法。
157.  造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
158.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
159.  第1の造血幹細胞集団を、
a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質と接触させる工程であって、該第1の造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該第1の造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが該1種類または複数種の作用物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
160.  前記1種類または複数種の作用物質が、表1、表2、表3、表4、表5、および表6の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、項目147〜159のいずれかに記載の方法。
161.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目147〜160のいずれかに記載の方法。
162.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目147〜161のいずれかに記載の方法。
163.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目147〜162のいずれかに記載の方法。
164.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目147〜163のいずれかに記載の方法。
165.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目147〜164のいずれかに記載の方法。
166.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目147〜165のいずれかに記載の方法。
167.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目147〜166のいずれかに記載の方法。
168.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目147〜167のいずれかに記載の方法。
169.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目168に記載の方法。
170.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目168または169に記載の方法。
171.  前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目168〜170のいずれかに記載の方法。
172.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目147〜171のいずれかに記載の方法。
173.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目147〜172のいずれかに記載の方法。
174.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、項目147〜173のいずれかに記載の方法。
175.  前記アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質がSR1またはその類似体である、項目147〜174のいずれかに記載の方法。
176.  造血幹細胞集団を、(a)LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択される第1の作用物質と、ならびに(b)ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム、およびistodaxからなる群より選択される第2の作用物質と接触させる工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
177.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目147〜176のいずれかに記載の方法。
178.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目147〜177のいずれかに記載の方法。
179.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、該1種類または複数種の作用物質と接触されていない造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目147〜178のいずれかに記載の方法。
180.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目147〜179のいずれかに記載の方法。
181.  前記第1の造血幹細胞集団が、培養3日目またはそれ以降に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、前記対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、項目147〜180のいずれかに記載の方法。
182.  前記造血幹細胞が哺乳動物細胞である、項目147〜181のいずれかに記載の方法。
183.  前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目182に記載の方法。
184.  前記造血幹細胞がCD34+細胞である、項目183に記載の方法。
185.  前記CD34+細胞の少なくとも10％が、CD34+CD38-細胞、CD34+CD38-CD90+細胞、CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+細胞である、項目184に記載の方法。
186.  前記造血幹細胞がヒト臍帯血に由来する、項目183〜185のいずれかに記載の方法。
187.  前記造血幹細胞がヒト動員末梢血に由来する、項目183〜185のいずれかに記載の方法。
188.  前記造血幹細胞がヒト骨髄に由来する、項目183〜185のいずれかに記載の方法。
189.  前記造血幹細胞がヒトから新鮮に単離されている、項目183〜188のいずれかに記載の方法。
190.  前記造血幹細胞が以前に凍結保存されたことがある、項目183〜189のいずれかに記載の方法。
191.  前記哺乳動物細胞がマウス細胞である、項目182に記載の方法。
192.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養される、項目147〜191のいずれかに記載の方法。
193.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質と接触する、項目147〜192のいずれかに記載の方法。
194.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と同時に接触される、項目147〜193のいずれかに記載の方法。
195.  前記造血幹細胞が、異なる時間に前記1種類または複数種の作用物質と接触される、項目147〜194のいずれかに記載の方法。
196.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)造血幹細胞機能的能力を維持する、項目147〜195のいずれかに記載の方法。
197.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)移植後に、造血幹細胞機能的能力を維持する、項目196に記載の方法。
198.  前記造血幹細胞が、培養2日目に(例えば、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)長期生着能を維持する、項目47〜197のいずれかに記載の方法。
199.  前記造血幹細胞が、患者に移植されると、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、小グリア細胞、破骨細胞、樹状細胞、およびリンパ球からなる群より選択される細胞の集団の回復を惹起する、項目147〜198のいずれかに記載の方法。
200.  前記リンパ球が、ナチュラルキラー細胞、T細胞(例えば、CD4+細胞またはCD8+細胞)、およびB細胞からなる群より選択される、項目199に記載の方法。
201.  前記造血幹細胞が、移植されたレシピエントにおいて造血組織に局在して生産的造血を再度確立することができる、項目147〜200のいずれかに記載の方法。
202.  前記造血幹細胞が、プラスチック表面上で、またはビトロネクチン、フィブロネクチン、もしくはマトリゲルを含む支持体上で培養される、項目147〜201のいずれかに記載の方法。
203.  前記造血幹細胞が、2〜20％酸素の存在下で培養される、項目147〜202のいずれかに記載の方法。
204.  前記造血幹細胞が、2〜12％酸素の存在下で培養される、項目203に記載の方法。
204.  前記造血幹細胞が、5％酸素の存在下で培養される、項目203に記載の方法。
205.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質で処理される前に、単核細胞画分中に元々存在する、項目147〜204のいずれかに記載の方法。
206.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90+CD45RA-、またはCD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49F+富化細胞画分中に元々存在する、項目147〜205のいずれかに記載の方法。
207.  前記造血幹細胞が、前記1種類または複数種の作用物質と接触する前に、非富化細胞画分中に元々存在する、項目147〜206のいずれかに記載の方法。
208.  a.ポリヌクレオチドを造血幹細胞集団に挿入する工程;ならびに
b.項目147〜207のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させるか、または項目147〜207のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程
を含む、該ポリヌクレオチドを該造血幹細胞集団に導入する方法。
209.  (a)が(b)より先行する、項目208に記載の方法。
210.  (b)が(a)より先行する、項目208に記載の方法。
211.  前記細胞中で核酸を切断する1種類または複数種の試薬を提供する工程を含む、項目208〜201のいずれかに記載の方法。
212.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項目211に記載の方法。
213.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬が転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼを含む、項目211に記載の方法。
214.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の試薬がクリスパー関連タンパク質を含む、項目211に記載の方法。
215.  前記細胞中で核酸を切断する前記1種類または複数種の作用物質がメガヌクレアーゼを含む、項目211に記載の方法。
216.  前記造血幹細胞を、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス)、および転位因子(例えば、ピギーバックトランスポゾンまたはスリーピングビューティートランスポゾン)からなる群より選択されるベクターと接触させる工程を含む、項目208〜215のいずれかに記載の方法。
217.  エレクトロポレーション、Nucleofection(商標)、またはスクイーズポレーションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目208〜216のいずれかに記載の方法。
218.  前記細胞を、カチオン性ポリマー(例えば、ジエチルアミノエチル-デキストラン)、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、活性化デンドリマー、および磁気ビーズからなる群より選択される形質転換物質と接触させる工程を含む、項目208〜217のいずれかに記載の方法。
219.  マイクロインジェクションまたはレーザーフェクションによって前記ポリヌクレオチドを前記造血幹細胞に導入する工程を含む、項目208〜218のいずれかに記載の方法。
220.  前記ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはサイレンサー配列からなる群より選択される制御配列を含む、項目208〜219のいずれかに記載の方法。
221.  前記ポリヌクレオチドが、タンパク質およびRNA(mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、shRNA)からなる群より選択される分子をコードする、項目208〜220のいずれかに記載の方法。
222.  前記ポリヌクレオチドが、化学修飾されたRNAである、項目208〜221のいずれかに記載の方法。
223.  増大した前記造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程をさらに含む、項目208〜222のいずれかに記載の方法。
224.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目147〜207のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を増大させる工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.増大した該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
225.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目147〜207のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団を富化する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.造血幹細胞について富化された該細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
226.  a.造血幹細胞集団を提供する工程;
b.項目147〜207のいずれかに記載の方法に従って該造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持する工程;
c.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
d.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
227.  a.項目147〜207のいずれかに記載の方法によって生成された造血幹細胞集団を提供する工程;
b.任意で、該造血幹細胞を、共通リンパ系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、巨核球-赤血球前駆細胞、顆粒球-巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、栓球、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、小グリア細胞、破骨細胞、ならびにリンパ球、NK細胞、B細胞、および/またはT細胞に分化させる工程;ならびに
c.該造血幹細胞集団またはその子孫をレシピエントに導入する工程
を含む、該レシピエントを造血幹細胞またはその子孫で処置する方法。
228.  前記レシピエントがヒトである、項目224〜227のいずれかに記載の方法。
229.  前記造血幹細胞が、ヒトドナーから単離された1つまたは複数の造血幹細胞に由来する、項目228に記載の方法。
230.  前記造血幹細胞が前記ドナーの動員末梢血に由来する、項目229に記載の方法。
231.  前記ドナーが、CXCR4アンタゴニスト(例えば、AMD3100)、GCSF、およびGROβからなる群より選択される1種類または複数種の動員物質を以前に投与されたことがある、項目228または229に記載の方法。
232.  前記造血幹細胞が、UM171、その類似体、または表11より選択されるUM171類似体とさらに接触される、項目147〜231のいずれかに記載の方法。
233.  前記造血幹細胞が、表11より選択される化合物とさらに接触される、項目147〜232のいずれかに記載の方法。
234.  前記造血幹細胞がプロスタグランジンとさらに接触される、項目147〜233のいずれかに記載の方法。
235.  前記プロスタグランジンがdmPGE2またはその類似体である、項目234に記載の方法。
236.  前記造血幹細胞がNotchシグナル伝達アゴニストとさらに接触される、項目147〜235のいずれかに記載の方法。
237.  前記造血幹細胞がSIRT1阻害物質とさらに接触される、項目147〜236のいずれかに記載の方法。
238.  前記阻害物質またはSIRT1が、ニコチンアミド、カンビノール、およびその類似体からなる群より選択される、項目237に記載の方法。
239.  前記レシピエントが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、骨髄機能不全、骨髄増殖性疾患、例えば、骨髄線維症、本態性血小板減少症、または真性赤血球増加症、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、分類不能型免疫不全(CVID、例えば、CVID1、CVID2、CVID3、CVID4、CVID5、およびCVID6)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、血球貪食性リンパ組織球症、アミロイドーシス、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、生殖細胞腫瘍、乳癌、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、および神経外胚葉性腫瘍、自己免疫疾患、例えば、硬皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、およびI型糖尿病、またはタンパク質欠乏症、例えば、副腎脳白質ジストロフィー(ALD)、異染性白質ジストロフィー(MLD)、血友病AおよびB、ハーラー症候群、ハンター症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、表皮水疱症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、サンフィリポ症候群、ならびにモルキオ症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目224〜238のいずれかに記載の方法。
240.  前記レシピエントが、鎌状赤血球性貧血、αサラセミア、βサラセミア、δサラセミア、ヘモグロビンE/サラセミア、ヘモグロビンS/サラセミア、ヘモグロビンC/サラセミア、ヘモグロビンD/サラセミア、慢性肉芽腫症(X連鎖性慢性肉芽腫症、常染色体劣性(AR)慢性肉芽腫症、慢性肉芽腫症AR I NCF1、慢性肉芽腫症AR CYBA、慢性肉芽腫症AR II NCF2、慢性肉芽腫症AR III NCF4)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、ADA SCID、IL7-RA SCID、CD3 SCID、Rag1/Rag2 SCID、アルテミスSCID、CD45 SCID、Jak3 SCID、先天性顆粒球減少症、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN1、先天性顆粒球減少症-先天性好中球減少症-SCN2、家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)、家族性血球貪食性リンパ組織球症2型(FHL2、パーフォリン変異)、無γグロブリン血症(X連鎖性無γグロブリン血症)、ウィスコット・オールドリッチ症候群、チェディアック・東症候群、赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症による溶血性貧血、発作性夜間血色素尿症、X連鎖性副腎脳白質ジストロフィー(X-ALD)、X連鎖性リンパ球増殖性疾患、単中心性キャッスルマン病、多中心性キャッスルマン病、先天性無巨核球性血小板減少症(CAMT)I型、細網系異形成症、ファンコーニ貧血、後天性特発性鉄芽球性貧血、全身性肥満細胞症、フォン・ヴィルブランド病(VWD)、先天性赤血球異形成貧血2型、軟骨毛髪形成不全症症候群、遺伝性球状赤血球症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、シュワックマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症・橈骨欠損症候群、大理石骨病、小児型大理石骨病、ムコ多糖症、レッシュ・ナイハン症候群、糖原貯蔵症、先天性肥満細胞症、オーメン症候群、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症(IPEX)、FOXP3変異を特徴とするIPEX、X連鎖免疫機能不全・多発性内分泌障害下痢症候群(XPID)、X連鎖自己免疫・アレルギー性調節異常症候群(XLAAD)、IPEX様症候群、高IgM 1型、高IgM 2型、高IgM 3型、高IgM 4型、高IgM 5型、X連鎖性高免疫グロブリンM、裸リンパ球症候群I型、および裸リンパ球症候群II型(裸リンパ球症候群II型、MHCクラスI欠損症;裸リンパ球症候群II型、相補群A;裸リンパ球症候群II型、相補群C;裸リンパ球症候群II型、相補群D;裸リンパ球症候群II型、相補群E)からなる群より選択される疾患に罹患しているヒト患者である、項目224〜238のいずれかに記載の方法。
241.  前記レシピエントが、血液リンパ系悪性腫瘍、非血液リンパ系悪性腫瘍、もしくはタンパク質欠損症に罹患しているヒト患者であるか、または(例えば、移植された組織もしくは細胞に対する寛容を誘導する)組織移植レシピエントもしくは細胞移植レシピエントである、項目224〜238のいずれかに記載の方法。
242.  前記造血幹細胞が自己由来または同系である、項目224〜241のいずれかに記載の方法。
243.  前記造血幹細胞が同種異系である、項目224〜241のいずれかに記載の方法。
244.  a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体の阻害
からなる群より選択される2つまたはそれ以上の作用を一緒になって示す1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
245.  前記ヒストンメチル化の調整が、ヒストンメチル化の活性化、ヒストンメチル化の維持、またはヒストン脱メチルの阻害である、項目244に記載の組成物。
246.  前記ヒストンアセチル化の調整が、ヒストンアセチル化の活性化、ヒストンアセチル化の維持、またはヒストン脱アセチルの阻害である、項目244または245に記載の組成物。
247.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンメチル化を活性化する化合物、ヒストンメチル化を維持する化合物、またはヒストン脱メチルを阻害する化合物、およびTGFβシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目244〜246のいずれかに記載の組成物。
248.  前記ヒストンメチル化を活性化する化合物、前記ヒストンメチル化を維持する化合物、または前記ヒストン脱メチルを阻害する化合物が、ヒストンデメチラーゼ阻害物質であり、前記TGFβシグナル伝達を阻害する化合物がTGFβ受容体阻害物質である、項目244〜247のいずれかに記載の組成物。
249.  前記ヒストンデメチラーゼ阻害物質がLSD1阻害物質である、項目244〜248のいずれかに記載の組成物。
250.  前記LSD1阻害物質がLSD1阻害物質IV RN-1であり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目249に記載の組成物。
251.  前記LSD1阻害物質がトラニルシプロミンであり、前記TGFβ受容体阻害物質がALK5阻害物質IIである、項目244〜250のいずれかに記載の組成物。
252.  a.ヒストンデメチラーゼ;
b.TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質;
c.p38シグナル伝達を伝えるタンパク質;
d.β-カテニン分解を促進するタンパク質;および
e.ヒストンデアセチラーゼ;および
f.アリール炭化水素受容体
からなる群より選択される2種類またはそれ以上のタンパク質の作用を一緒になって阻害する1種類または複数種の作用物質を含む、組成物。
253.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目252に記載の組成物。
254.  前記1種類または複数種の作用物質が、LSD1阻害物質IV RN-1、LSD1阻害物質II S2101、LSD1阻害物質LSD1-C76、LSD1阻害物質III CBB1007、LSD1阻害物質I、およびトラニルシプロミンからなる群より選択されるヒストンデメチラーゼ阻害物質を含む、項目252に記載の組成物。
255.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目252〜254のいずれかに記載の組成物。
256.  前記1種類または複数種の作用物質が、TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、ALK5阻害物質II、LY364947、A83-01、およびDMH1からなる群より選択される、項目252〜255のいずれかに記載の組成物。
257.  前記1種類または複数種の作用物質が、前記p38シグナル伝達を伝えるタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物がSB203580である、項目252〜256のいずれかに記載の組成物。
258.  前記1種類または複数種の作用物質が、β-カテニン分解を促進するタンパク質を阻害する化合物を含み、該化合物が、CHIR99021、塩化リチウム、BIO、およびFGF2からなる群より選択される、項目252〜257のいずれかに記載の組成物。
259.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含み、該化合物が、トリコスタチンA、バルプロ酸、ブチリルヒドロキサム酸、およびistodaxからなる群より選択される、項目252〜258のいずれかに記載の組成物。
260.  前記1種類または複数種の作用物質が一緒になって、ヒストンデメチラーゼの作用およびTGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質の作用を阻害する、項目252〜259のいずれかに記載の組成物。
261.  前記ヒストンデメチラーゼがLSD1である、項目252〜260のいずれかに記載の組成物。
262.  前記TGFβシグナル伝達を伝えるタンパク質がTGFβ受容体である、項目260または261に記載の組成物。
263.  前記1種類または複数種の作用物質がLSD1阻害物質IV RN-1およびALK5阻害物質IIを含む、項目260〜262のいずれかに記載の組成物。
264.  前記1種類または複数種の作用物質が、p38シグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目260〜263のいずれかに記載の組成物。
265.  前記1種類または複数種の作用物質が、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を含む、項目260〜264のいずれかに記載の組成物。
266.  前記1種類または複数種の作用物質が、BMPシグナル伝達を阻害する化合物を含む、項目260〜265のいずれかに記載の組成物。
267.  アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する前記1種類または複数種の作用物質がSR1を含む、項目244〜266のいずれかに記載の組成物。
268.  前記1種類または複数種の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目244〜267のいずれかに記載の組成物。
269.  前記1種類または複数種の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに十分な量で存在する、項目244〜268のいずれかに記載の組成物。
270.  前記1種類または複数種の作用物質が、少なくとも2日間前記造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するのに十分な量で存在する、項目244〜269のいずれかに記載の組成物。
271.  前記1種類または複数種の作用物質が水溶液中に存在する、項目244〜270のいずれかに記載の組成物。
272.  前記1種類または複数種の作用物質が凍結乾燥固体として存在する、項目244〜271のいずれかに記載の組成物。
273.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上前記細胞集団の増大を刺激するのに十分な量で存在する、項目244〜272のいずれかに記載の組成物。
274.  前記1種類または複数種の作用物質が、培養7日目またはそれ以降に(例えば、培養7日目、10日目、12日目、14日目、15日目、20日目、またはそれ以降に)、アリール炭化水素受容体シグナル伝達を阻害する物質、例えば、SR1もしくはその類似体、UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニストと接触された、またはSIRT1阻害物質、例えば、ニコチンアミド、カンビノール、もしくはその類似体と接触された造血幹細胞集団と比べて10％またはそれ以上造血幹細胞について前記細胞集団を富化するのに十分な量で存在する、項目244〜273のいずれかに記載の組成物。
275.  前記1種類または複数種の作用物質が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)培養状態の前記造血幹細胞と接触した後に移植後に、該造血幹細胞の長期生着能を維持するのに十分な量で存在する、項目244〜274のいずれかに記載の組成物。
275.  表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、および表10の作用物質の組み合わせより選択される作用物質の組み合わせを含む、組成物。
276.  項目244〜275のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養培地。
277.  血清を実質的に含まない、項目276に記載の細胞培養培地。
278.  前記1種類または複数種の作用物質と接触している造血幹細胞集団をさらに含む、項目244〜277のいずれかに記載の組成物。
279.  前記造血幹細胞が、2日間またはそれ以上(例えば、3日間、5日間、7日間、10日間、12日間、14日間、15日間、20日間、またはそれ以上)前記1種類または複数種の作用物質の存在下で培養されている、項目278に記載の組成物。
280.  造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と、ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、増大した造血幹細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、増大した造血幹細胞集団をエクスビボで生成する方法。
281.  1つまたは複数の造血幹細胞を含有する造血細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該第1の作用物質および該第2の作用物質が、造血幹細胞について富化された細胞集団を生成するのに一緒になって十分な量で存在する、工程を含む、造血幹細胞について細胞集団をエクスビボで富化する方法。
282.  第1の造血幹細胞集団を、
(1)a.ヒストンメチル化の調整;
b.TGFβシグナル伝達の阻害;
c.p38シグナル伝達の阻害;
d.古典的Wntシグナル伝達の活性化;
e.ヒストンアセチル化の調整;および
f.アリール炭化水素受容体シグナル伝達の阻害
からなる群より選択される1つまたは複数の作用を示す第1の作用物質と;ならびに
(2)UM171もしくはその類似体、表11より選択されるUM171類似体、プロスタグランジン、Notchシグナル伝達アゴニスト、またはSIRT1阻害物質からなる群より選択される第2の作用物質と
接触させる工程であって、該造血幹細胞集団が、2日後またはそれ以降に、該造血幹細胞集団と同じ条件下でかつ同じ時間にわたって培養されたが1種類または複数種の作用物質および1種類または複数種の物質と接触されていない対照造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力より優れた造血幹細胞機能的能力を示す、工程を含む、造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を少なくとも2日間エクスビボで維持する方法。
283.  項目147〜243および280〜282のいずれかに記載の方法によって生成された、造血幹細胞集団。
284.  項目244〜279のいずれかに記載の組成物を備え、添付文書をさらに備える、キット。
285.  前記添付文書が、前記キットの使用者に、エクスビボで造血幹細胞集団を増大させるように、造血幹細胞集団を富化するように、または造血幹細胞集団の造血幹細胞機能的能力を維持するように指示している、項目284に記載のキット。
286.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞内においてポリヌクレオチドを発現させるように指示している、項目284に記載のキット。
287.  前記添付文書が、前記使用者に、前記造血幹細胞を患者に投与するように指示している、項目284に記載のキット。
【実施例】
【０２６６】
実施例1.造血幹細胞特性を有する細胞をエクスビボ培養時に増大させ、富化し、かつ維持する化合物の組み合わせを特定するための低分子スクリーニング
図1は、培養するとHSC能力が急速に失われることを示す。新鮮に単離したマウスHSC(青色の線、丸)、またはS-clone+IL12/SCF/TPO+0.75％BSAの中でエクスビボで12日間培養したHSC(赤色の線、四角)を、致死的な放射線を照射した宿主に移植した後の末梢血分析。造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために使用することができる最適な化合物の組み合わせを確かめるために様々な低分子スクリーニングを行った。図4は、HSCエクスビボ維持および増大を支持する化合物の低分子スクリーニングの模式図を示す。1)HSCを分離するために使用したZs・Gr HSCレポーターマウス骨髄(図2および図3A〜3Cに記載)。2)ZsGrレポーターによって印を付けたHSCの単離。3)6日間のエクスビボ培養後にDMSO対照を上回ってHSCレポーター発現が維持されることでヒットが明確化されるアッセイ法の開発。4)インビトロおよびインビボでのヒットの機能的検証。図5A〜5Bは感度アッセイ法の開発を示す。図5A:1ウェルにつき合計200個のZsGr+HSCおよびZsGr-HSCを様々な比(1:0;1:1;1:10;1:20、1:100、0:1、ZsGr+パーセンテージで示した)で播種し、2日間エクスビボ培養した後にOperetta(Perkin Elmer)を用いて画像化した。1つ1つの細胞をZsGreen検出の閾値より上または下にプロットした。図5B:2日間培養した後に、ZsGreen+細胞のパーセンテージを求めた。これにより、2日間培養した後に、力強くZsGr+シグナルを検出するために1ウェルあたりに必要な細胞の最小数が確かめられた。図6は、一次低分子スクリーニングにおいて標的化された経路の内訳を示す。図7A〜7Bは、様々なライブラリースクリーニングの初回スクリーニング結果を示す。図7A:キナーゼ、エピジェネティック制御因子、およびGタンパク質共役受容体(GPCR)を標的とする低分子、ならびに増殖因子ペプチドライブラリーの4つの異なるライブラリーそれぞれからの、スクリーニングされた化合物、初回ヒット(用量反応を示す)、および検証されたヒット(ZSGr+を定量するためのフローサイトメトリーによる)の数。図7B:6点用量反応(10uM、5uM、1uM、0.5uM、0.1uM、0.05uM)からの代表的な結果。*はヒットを示す。(図16A〜16Bも参照されたい)。
【０２６７】
実施例2.HSCのエクスビボ培養中のヒストン脱メチルおよびTGFβシグナル伝達の阻害は造血幹細胞特性を有する細胞の増大、富化、および維持を促進する
造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために使用することができる最適な化合物の組み合わせには、ヒストンデメチラーゼ阻害物質およびTGFβ受容体Alk5阻害物質が含まれる。図8は、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質(RepSox)、または両方の組み合わせ(C2)の存在下での7日間または14日間にわたる20個のマウスHSC(LSK34-Flk2-150+ZsGr+)のエクスビボ培養を示す。画像を4×倍率で撮った。C2またはLSの存在下での培養物は均一性がより大きく、分化が少ないことに留意のこと。図9A〜9Bは、エクスビボで14日間の表現型HSCの増大を示す。20個のマウスHSC(LSK34-Flk2-150+ZsGr+)を、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養した。この方法はZsGr+HSCの維持および増大を支持する。図9A:DMSO、およびLSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで14日間培養したHSCの代表的なFACSプロット。これから、C2の存在下では表現型HSCのレベルが増加したことが分かる。図9B:エクスビボで14日間培養した後の各条件でのZsGr+HSCの数。図10A〜10Cは、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)がZsGr+HSCの維持および増大を支持することを示す。A)LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで4.5日間培養した20個のHSCの明視野およびZsGr画像。図10B:4.5日間のエクスビボ培養後に残っているZsGr+細胞の頻度。図10C:4.5日間の培養中のZsGr+(緑色)細胞およびZsGr-(黒色)細胞の数(図11A〜13Fおよび図28A〜32Bも参照されたい)。
【０２６８】
実施例3.HDAC阻害物質の存在下でのHSCをエクスビボ培養は造血幹細胞特性を有する細胞の増大、富化、および維持を促進する
ヒストン脱メチル阻害物質およびTGFβシグナル伝達阻害物質に加えて、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質もエクスビボで造血幹細胞の増大、富化、および維持を促進する。図22A〜22Bは、構造的に異なるHDAC阻害物質が免疫表現型HSCを維持するのに同等に機能することを示す。化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または、構造的に異なるHDAC阻害物質である化合物のカクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580)をさらに補充しバルプロ酸(VPA)もしくはトリコスタチンA(TSA)のいずれかを含んで、100個のマウスHSCを培養した。図22A:7日目のフローサイトメトリー分析。図22B:それぞれの反復実験のFgd5-ZsGreen+Sca1+細胞の割合。図41A〜41Cは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパンHDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41A:細胞の免疫表現型。図41B:示された集団のパーセンテージ。図41C:示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量。
【０２６９】
実施例4.造血幹細胞特性を有する細胞の増大、富化、および維持を促進する化合物をエクスビボで特定するための二次スクリーニング
造血幹細胞を増大させるため、造血幹細胞を富化するため、および造血幹細胞の造血幹細胞機能的能力を維持するために使用することができるさらなる化合物を特定するために様々な二次スクリーニングを行った。図14A〜14Bは、HSCエクスビボ維持および増大を支持するようにC2(LSD1阻害物質IVおよびTgfβ阻害物質)と相乗作用する化合物の二次低分子スクリーニングを示す。図14A:一次スクリーニングの模式図。図14B:二次スクリーニングの模式図。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングにおいて特定した、124個の可能性のあるヒット化合物をC2の存在下で再スクリーニングした。図15A〜15Cは、Tgfβ、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、p38シグナル伝達、およびWntシグナル伝達を含む関心対象の経路を標的とする、二次スクリーニングの可能性のあるヒットを示す。図15A:二次低分子スクリーニングにおいてヒットを特定するために使用した2つの戦略の概略。図15B:ZsGreen+HSCパーセンテージに基づいた戦略(戦略1)に従うことによって発見されたヒット。図15C:ZsGreen+HSCの数に基づいた戦略(戦略2)に従うことによって発見されたヒット。図17は、マウスHSCを維持すると報告された化合物を試験した実験の結果を示す。ZsGreen陽性HSCを、dmPGE2(North, Zon, Nature. 2007)、BIO(Ko et al, Stem Cells. 2011)、p38阻害物質(Wang et al, Stem Cells Dev. 2011)、DMSO:陰性対照の存在下で6日間培養した。D2は、エクスビボで2日間維持したZsGr+HSCである。ZsGreen+として特定した細胞(すなわち、HSC)の閾値を矢印で示した。図18A〜18Bは、HSC維持/増大に向けて候補経路を調整するための仮説駆動戦略を示す。図18A:腸幹細胞および造血幹細胞の維持/増殖シグナルの比較による候補標的経路の選択。図18B:作用物質/経路モジュレーターの選択。図19は、HSC維持/増大に対する経路モジュレーターの活性を評価するための模式図を示す。Fgd5-ZsGreen+免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD150+CD48-Fgd5-ZsGreen+)を選別し、サイトカインのみの存在下で(標準培地)、または7種類の候補経路モジュレーターをさらに加えて(W7培地)培養した。14日間培養した後に、細胞免疫表現型のマルチパラメトリック解析をフローサイトメトリーによって行った。図20は、7つの候補経路の組み合わせ調整が免疫表現型HSCを維持することおよび増大させることを示す。50個のマウスHSCを、SCF、TPO、およびIL12を補充し7種類の候補経路モジュレーターを含むまたは含まない無血清培地中で培養した。15日目にフローサイトメトリー分析を行った。ヒト臍帯血のフローサイトメトリー分析に使用した、例となる選別戦略の説明については、図27を参照されたい。
【０２７０】
実施例5.エクスビボ培養したHSCのインビボ機能
インビボ移植アッセイ法において、エクスビボで培養した造血幹細胞の活性を調べるために一連の実験を行った。図24は、DMSO(標準)、または7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ)(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。10個のHSCを、示された条件で14日間培養し、その後に、致死的な放射線を照射した宿主に(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。移植後の示された時点での末梢血ドナーキメリズムを示した。図25A〜25Cは、DMSO(S-標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W)(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSCを、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Aは、移植後の示された時点での末梢血ドナーキメリズムを示す。図25Bは、移植後の示された時点での顆粒球ドナーキメリズムを示す。図25Cは、示された条件で14日間培養したHSCを移植した移植レシピエントの骨髄中のドナーHSCキメリズムを示す。
【０２７１】
実施例6.HSCの増大、維持、および富化への化合物の相対的な寄与
造血幹細胞の増大への特定の経路を調整する化合物の相対的な寄与を確かめるために一連の実験を行った。図21A〜21Bは、エクスビボ培養中で表現型HSCを維持するおよび増大させる能力の点での各化合物/経路の寄与を示す。50個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または7種類全ての化合物(W7)と共に、もしくはそれぞれ1種類の化合物(A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC))を取り去って培養した。フローサイトメトリー分析を14日目に行った。図21Aは、細胞系+細胞への分化(B細胞、T細胞、骨髄系細胞、赤血球、顆粒球の抗原に対する抗体カクテルによって染色した)を示す。この場合、細胞系陽性は破線の右側にある。図21B:50個の出発HSCから、示された条件で14日間培養した後のHSCの絶対数。図23は、さらなる化合物を加えると、CD48発現およびSca1発現についてFgd5+細胞の不均一性が低下することを示す。40個のマウスHSCを、サイトカイン(SCF、TPO、およびIL12))の存在下でおよびDNAメチルトランスフェラーゼ阻害物質(RG108)およびG9a阻害物質(UNC0638)のいずれかまたは両方を含む化合物カクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580、トリコスタチンA)の存在下で12日間培養した。示された培養条件からのFgd5+細胞系-細胞のフローサイトメトリープロットを示した。ヒストグラムは、示された亜集団の割合を示す。図35A〜35Bは、化学物質の最小限の組み合わせとp38阻害物質を加えるとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSCを、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図35A:培養後の細胞の免疫表現型。図35B:示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量。
【０２７２】
実施例7.エクスビボ培養中の複数の経路の調整は造血幹細胞特性を有する細胞のHSC増大、富化、および維持を促進する
ヒストン脱メチル、TGFβシグナル伝達、およびヒストン脱アセチルに加えて、他の経路を調整すると、HSCの増大、富化、および造血幹細胞機能的能力の維持がさらに促進される。図26は、免疫表現型マウスHSCを維持する/増大させるには4つの経路を調整することで十分なことを示す。50個のHSCを、DMSOの存在下で、または7種類の化合物からなる最初の一組(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)から特定した、4つの経路を標的とする化合物(W4)(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、およびp38キナーゼ阻害物質SB203580)の存在下で、サイトカインを加えた無血清培地中で14日間培養した。免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD48-CD150+Fgd5ZsGreen+CD41-)をフローサイトメトリーによって分析した。図33A〜33Bは、マウス系において特定した、7つの経路を標的とする化合物を用いて、免疫表現型臍帯血HSCを維持/増大できることを示す。200個の臍帯血HSCを、DMSOの存在下で、または7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養した。図33Aは、フローサイトメトリーによって分析した培養後の細胞の免疫表現型を示す。図33Bは、免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を示す。図34A〜34B、図37A〜37C、および図40A〜40Cも参照されたい。
【０２７３】
図38A〜38Cは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持/増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38A:培養後の細胞の免疫表現型。図38B:示された集団のパーセンテージ。図38C:示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量(W7:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC)、およびW3:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA))。図39は、化学物質の組み合わせを用いてヒト動員末梢血CD34+細胞をエクスビボで培養すると免疫表現型HSCが富化されることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質(ステムレゲニン(SR1)、UM171)または4種類の化合物の組み合わせ(W4:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。エクスビボで培養する前(無培養)、および示された条件で7日間培養した後の、CD34+富化動員末梢血中の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の画分の定量。
【０２７４】
実施例8.低周囲酸素下でのHSCの培養
造血幹細胞を生理的レベルに比べて低い酸素条件下で培養することは造血幹細胞の増大に有利な可能性がある。図36は、低酸素分圧下で培養するとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSCを、標準的な組織培養インキュベーター(大気中酸素、21％O2)または低酸素インキュベーター(5％O2)に入れて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)と、3つの経路を標的とする化合物(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))を加えた無血清培地中で12日間培養した。示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)を培養後に定量した。
【０２７５】
実施例9.移植されたHSC
移植後のエクスビボで培養した造血幹細胞の機能を調べるために一連の実験を行った。図42A〜42Cは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血を移植した実験の結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。図42Aは、末梢血ドナーキメリズムを示す。図42Bは、移植後24週目および30週目での末梢血ドナーキメリズムの定量を示す。図42Cは、移植後30週目での移植細胞の系統寄与を示す。
【０２７６】
実施例10.移植されたHSC
移植後のエクスビボで培養した造血幹細胞の機能を評価するために一連の実験を行った。図43は実験手順を図示する。図44〜47Bは、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞の特徴決定を図示する。系統分析を、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞系-IL7R-ckit+Sca1+(LSK)(図46A〜46B)および細胞系-IL7R-ckit+Sca1+CD48-CD150+HSC(図47A〜47B)に対して行った。このエクスビボ培養プロトコールによって得られたドナー細胞を、放射線を照射したレシピエントに移植し(図48A)、200個の出発細胞(HSC)同等物を移植して4週間後に、ドナー細胞生着(図48B)および系統寄与(図48C)を分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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