(57)【要約】  非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体を提供する。グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の特異的エピトープを認識して、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断することができる抗体を提供する。いくつかの態様において、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端位置でグリコシル化アミノ酸残基を含むＰＤ−Ｌ１ポリペプチドも同様に提供する。そのような抗体およびポリペプチドを作製および使用する方法（例えば、がんの処置のための）も同様に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に選択的に結合して、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する単離抗体。
【請求項２】
組み換えにより改変された、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して、配列番号１における３５、１９２、２００、および／または２１９位のアミノ酸を含むＰＤ−Ｌ１タンパク質の領域内のアミノ酸残基に選択的に結合する、請求項１または２に記載の単離抗体。
【請求項４】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体結合によって示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体結合によって示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項４に記載の単離抗体。
【請求項６】
５〜２０ｎＭの親和性でグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項７】
前記抗体が、蛍光標識によって直接または間接的に検出可能であり、細胞フローサイトメトリーアッセイにおいて非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への抗体結合によって示される平均蛍光強度（ＭＦＩ）より２倍から１０倍高いＭＦＩでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に優先的に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項８】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への抗体結合によって示されるＭＦＩより３倍〜５倍、またはそれより高いＭＦＩでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に優先的に結合する、請求項７に記載の単離抗体。
【請求項９】
配列番号１の５６、６２、６９、および７５位のアミノ酸の少なくとも１つを含むグリコシル化ＰＤ−Ｌ１のエピトープに特異的に結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１０】
前記エピトープが、配列番号１のＬ４８〜Ｈ７８の領域内のアミノ酸を含む、請求項９に記載の単離抗体。
【請求項１１】
前記エピトープが、配列番号１のＤ６１〜Ｈ７８の領域内のアミノ酸を含む、請求項９に記載の単離抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５によって認識されるＰＤ−Ｌ１のエピトープに特異的に結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１３】
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５と競合するかまたは交叉競合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１４】
ＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５の重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたは軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１５】
ＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５の重鎖ＣＤＲ１〜３および／または軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１６】
ＶＨドメインが、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１７】
ＶＬドメインが、配列番号１１または配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項１から８または１６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１８】
ＶＨドメインが配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１９】
ＶＨドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を有し、ＶＬドメインが配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２０】
ＶＨドメインが、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から８または１７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２１】
ＶＬドメインが、配列番号１１または配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から８、１６または２０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２２】
ヒト定常ドメインを含む、請求項１４または１６から２１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２３】
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ３を含むＶＨドメイン、または配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ３を含むＶＨドメインを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２４】
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ３を含むＶＬドメインを有する、請求項１から８、または２３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２５】
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ３を含むＶＨドメイン、または配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ２、および配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ３を含むＶＨドメインを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２６】
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ３を含むＶＬドメインを有する、請求項１から８または２５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２７】
配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有する、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶＨドメインを有する、請求項１から８または２４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２８】
配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含むＶＬドメインを有する、請求項１から８、２３、または２６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２９】
配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有する、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶＨドメインを有する、請求項１から８または２６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３０】
配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含むＶＬドメインを有する、請求項１から８、２５、または２９のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３１】
ヒトフレームワーク領域を有する、請求項１５、または２３から３０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３２】
１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換を有する重鎖または軽鎖ヒトフレームワーク領域を有する、請求項１５、または２３から３０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３３】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種にコンジュゲートされる、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号２または１８のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項３７】
配列番号１０または２６のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項３８】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項３９】
薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクル中に請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項４０】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体の有効量を、がんを有する対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性がんを処置する方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頚部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、皮膚がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
がんが、血液のがんである、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、薬学的に許容される組成物中で投与される、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、全身、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも第２の抗がん剤および／または抗がん治療を対象に投与することをさらに含む、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の抗がん治療が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
生物試料中のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在をアッセイする方法であって、請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体を生物試料に接触させることを含み、前記抗体の結合の検出は、試料がグリコシル化ＰＤ−Ｌ１を含むことを示す、方法。
【請求項４９】
前記試料が細胞試料である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞試料が、対象のがんまたは腫瘍に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの連続したアミノ酸の断片を含む単離ポリペプチドであって、ＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応するアミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されている、単離ポリペプチド。
【請求項５２】
ヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも８〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項５１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、および／またはＮ２１９位に対応するグリコシル化アミノ酸を含む、請求項５１または請求項５２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５４】
そのアミノ末端またはカルボキシ末端で免疫原性ポリペプチドに融合またはコンジュゲートされる、請求項５１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、またはビヒクル中に請求項５１から５４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項５６】
免疫原性組成物である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
アジュバントをさらに含む、請求項５６に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
配列番号２または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０〜９８％同一である、請求項１に記載の抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号１９または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９０〜９８％同一である、請求項１に記載の抗体のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項５９】
前記ＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列が、配列番号２または１８と９５〜９９％同一であり、および／または前記ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１０または２６と９５〜９９％同一である、請求項５８に記載の単離核酸分子。
【請求項６０】
ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合を遮断する薬剤による処置のための候補がん患者を同定する方法であって、請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体を使用して、患者のがん細胞の試料に由来する細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在に関して試験することを含み、前記細胞がグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に関して陽性であれば、前記患者は前記処置の候補である、方法。
【請求項６１】
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を防止する薬剤の有効量を、候補がん患者として同定された患者に投与することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を防止する前記薬剤が、請求項１から３４のいずれか一項に記載の単離抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記単離抗体が、別の抗がん剤または治療薬と併用して投与される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出され、参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年３月２５日に作製されたＡＳＣＩＩのコピーは、名称が２４２５８．１０５００３ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、大きさは４１，７０６バイトである。
【０００２】
関連分野
本開示は、全般的に分子生物学、医学、および腫瘍学の分野に関する。より詳しくは、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する新規抗体およびがんを処置するためのその使用が提供される。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞活性化の永続化によって、広いスペクトルの悪性がんの処置は劇的に変化している。例として、ＦＤＡによって初めて承認された、Ｔ細胞応答を標的とするチェックポイント遮断薬であるイピリムマブの開発によって、転移性黒色腫の処置が可能となった（Hodi, F.S. et al., 2010, NEJM, 363:711-723; Robert, C. et al., 2013, Clin. Cancer Res., 19:2232-2239；およびRobert, C. et al., 2011, NEJM, 364:2517-2526）。抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）モノクローナル抗体は、黒色腫患者の処置において有望な結果を示したが、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とする第二世代のチェックポイント阻害剤は、フェーズＩＩＩ臨床試験においてより良好な臨床活性および安全性を証明している（Topalian, S.L. et al., 2012, NEJM, 366:2443-54；およびBrahmer, J.R. et al., 2012, NEJM, 366:2455-2465）。ＰＤ−Ｌ１はまた、その免疫抑制活性に加えて、がん細胞の進行を誘導する腫瘍形成能も有することから（Topalian, S.L. et al., Id.；Page, D.B. et al., 2014, Ann. Rev. Med., 65:185-202）、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を標的とすることは、ＰＤ−Ｌ１を介して細胞進行を低減しながら、ＰＤ−１を介して免疫抑制を遮断することによって、二重の有効性を提供し、より感受性の高い転帰を有すると期待される（Topalian, S.L. et al., Id.; Brahmer, J.R. et al., Id.; and Hamid, O., 2013, NEJM, 369:134-144）。米国ＦＤＡは、ある特定のがんの処置に関して２つの抗ＰＤ−１治療抗体、すなわち、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）を承認している。有望な転帰を有するいくつかの成功した臨床試験があるが（Page, D.B. et al., Id.）、ＰＤ−Ｌ１の病理生理学機能および調節機構の定義は、不完全なままである。
【０００４】
サイレントな免疫応答、特にエフェクターＴ細胞を再び目覚めさせることにより、最近、外科的切除、化学療法、放射線療法、および標的化治療後の処置選択肢のレパートリーが増加している。抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（Dunn et al., 2002, Nature immunology, 3:991-998；およびLeach et al., 1996, Science, 271:1734-36）の使用は、当初、転移性黒色腫の処置において成功することが証明されたが、自己免疫応答も誘導することが示されている。免疫細胞のみに影響を及ぼす抗ＣＴＬＡ−４抗体とは異なり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＰＤ−１抗体は、細胞レベルおよび腫瘍部位で作用して、ＰＤ−１発現エフェクターＴ細胞と、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞との間の相互作用を遮断する。これによって腫瘍細胞とＴ細胞の両方からの二重の影響が起こり、それによって、有害な作用を制限して、より良好な治療有効性をもたらす（Okazaki, T. et al., 2013, Nature immunology, 14:1212-1218）。腫瘍細胞を攻撃してがんを処置するために、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を首尾よく標的として、免疫系のエフェクター細胞を活性化する、新規でより有効な治療および方法論がなおも必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、腫瘍細胞上に発現されるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１Ｌ１、またはＢ７−Ｈ１としても知られる）のグリコシル化が、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞上で発現したＰＤ−１への結合を促進または増強し、それによって、腫瘍細胞に対するＴ細胞活性の抑制を増大させることを発見した。本発明者らは、非グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドと比較してグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに特異的かつ優先的に結合し、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１の結合を遮断または阻害する抗体を同定した。本明細書において使用されるように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に対して特異的で、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害するそのような抗体を、「抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体」と呼ぶ。
【０００６】
さらに、これらの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の１つまたは複数を投与することによって、それを必要とする対象におけるがん、特にその細胞がＰＤ−Ｌ１を発現または過剰発現するがん、を処置する方法が提供される。本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を阻害または遮断して、次にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に起因する免疫抑制を阻害し、このように、腫瘍細胞によって発現される免疫抑制性リガンドであるＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対するＰＤ−１発現エフェクターＴ細胞の細胞傷害活性の永続化を可能にする。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害することによって、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、エフェクターＴ細胞応答を増強して、抗腫瘍活性を媒介することができる。本明細書において使用される、用語非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１およびグリコシル化されていないＰＤ−Ｌ１は互換的に使用される。特に示していなければ、本明細書において使用される「ＰＤ−Ｌ１」は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、特にヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１である、シグナル配列を含むアミノ酸配列）を指し、「ＰＤ−１」は、ＰＤ−１タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、特にヒトＰＤ−１を指す。
【０００７】
本発明者らはさらに、ヒトＰＤ−Ｌ１が、例えば配列番号１に記載されるヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）におけるアミノ酸Ｎ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、および／またはＮ２１９位の４つの部位でグリコシル化されることを見出した。記載の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、これらの部位の１つまたは複数に結合しうるが、例えばこれらのグリコシル化部位の１つまたは複数において変異（例えば、グリコシル化コンセンサス配列内のアスパラギンのグルタミンへの置換）を有し、このためこれらの部位の１つまたは複数でグリコシル化されないＰＤ−Ｌ１には結合しない。したがって、いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１グリコポリペプチドまたはそのペプチドにおける１つまたは複数のグリコシル化モチーフに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化モチーフおよび隣接ペプチドを含むＰＤ−Ｌ１グリコペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、３次元で１つまたは複数のグリコシル化モチーフの近傍に位置するペプチド配列に結合する。したがって、実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のコンフォメーションエピトープを認識して、これに選択的に結合する。例として、ある特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの８５％より小さい、８０％より小さい、７５％より小さい、７０％より小さい、６５％より小さい、６０％より小さい、５５％より小さい、５０％より小さい、４５％より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−１に結合するが、実施形態において、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの５％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下で結合する。前述のＫｄ値の間の値および前述のＫｄ値に等しい値が包含されると理解すべきである。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合するが、それでもなお二重の抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１機能を示す。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質と比較して示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。ある特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、細胞フローサイトメトリーアッセイにおいてアッセイした場合、ＷＴグリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞より少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい頻度で優先的に結合し、このアッセイにおいて、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞と非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞とを混合して、識別的に標識した後、例えば実施例５に記載される検出可能なマーカーによって標識された、アッセイされる���体と接触させて、抗体が、ＦＩＴＣなどの蛍光標識またはマーカーによって直接または間接的に検出可能であるときの二つの細胞集団に関して測定された蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定する。一実施形態において、抗体は、ＦＩＴＣなどの蛍光標識またはマーカーによって直接標識される。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に、５〜２０ｎＭ、５〜１０ｎＭ、または１０〜２０ｎＭの親和性で選択的に結合する。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、キメラまたはヒト化またはヒト抗体である。用語「特異的に結合する」および「選択的に結合する」は、本明細書において互換的に使用される。
【０００８】
特定の態様において、シグナルペプチド配列を含む、配列番号３および１１（成熟ＶＨおよびＶＬ領域アミノ酸配列）または配列番号８６および８８のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＳＴＭ００４、ならびにその抗原結合部分、ならびにそのヒト化およびキメラ形態が提供される。ＳＴＭ００４は、本明細書において配列番号１に記載されるヒトＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列のＹ５６、Ｋ６２、およびＫ７５位のアミノ酸残基に対応し、コンフォメーションエピトープであるＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合することが決定されている。ＳＴＭ００４  ＭＡｂエピトープを包含するヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの部分は、配列ＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨ（配列番号９３）を有する。本明細書において示されるように、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４によって認識されるエピトープを構成する、すなわちＰＤ−Ｌ１に結合したｍＡｂが接触するアミノ酸残基Ｙ５６、Ｋ６２、およびＫ７５を、下線で示す。本明細書において、ＰＤ−Ｌ１への結合に関してＳＴＭ００４  ＭＡｂと競合する、および／またはＳＴＭ００４と同じエピトープに結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。
【０００９】
ＳＴＭ００４  ＭＡｂの重鎖および軽鎖可変（Ｖ）ドメインの核酸（ＤＮＡ）および対応するアミノ酸配列を以下の表３に示す。配列番号２、３、１０、および１１は、重鎖および軽鎖可変ドメインの成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを有しない）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。表３はまた、重鎖および軽鎖可変ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号８５〜８８として提供し、この中でシグナル配列をイタリック体で表す。同様に、ＳＴＭ００４のＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの重鎖および軽鎖ＶドメインＣＤＲも表３に示す。
【００１０】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号３のＶＨドメインと配列番号１１のＶＬドメインとを含む抗体と競合する。他の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＶＨドメイン、および／または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＶＬドメインを含む。これらの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、キメラ抗体であってもよく、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのヒト定常ドメインを含んでもよい。
【００１１】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲを含むＶＬドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメインと、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインとを含む抗体を含むか、またはそれらを含む抗体への結合に関して競合する。
【００１２】
他の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲの１、２、または３個において１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶＨドメインを有する。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶＬドメインを有しうる。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインの両方のＣＤＲにアミノ酸置換を有してもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は保存的置換である。
【００１３】
好ましくは、前述の抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、すなわちＳＴＭ００４のヒト化形態であり、任意選択で、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのヒト定常ドメインを含む。
【００１４】
結合親和性または他のパラメータを改善するために、ヒト化抗体のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよいことは、当業者に認識されると予想される。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、上記のＶＨおよびＶＬドメインならびにそのＣＤＲを含む抗体と競合する。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体の結合によって示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質への抗体の結合によって示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、実施例５に記載する細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいＭＦＩとして表される、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合を示す。一実施形態において、抗体は、蛍光標識またはマーカーによって直接または間接的に検出可能である。一実施形態において、抗体は、ＦＩＴＣなどの蛍光標識またはマーカーによって直接標識される。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対するＳＴＭ００４  ＭＡｂ、またはそのキメラもしくはヒト化形態の結合親和性は、その下限および上限値を含む、５〜２０ｎＭまたは５〜１０ｎＭである。一実施形態において、抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害し、特にエフェクターＴ細胞によって発現したＰＤ−１と、腫瘍細胞によって発現したＰＤ−Ｌ１、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する。
【００１５】
別の特定の態様において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、配列番号１９および２７のアミノ酸配列（成熟ＶＨおよびＶＬ領域アミノ酸配列）をそれぞれ有する、またはシグナルペプチド配列を含む配列番号９０および９２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＳＴＭ１１５、ならびにその抗原結合部分、およびそのヒト化およびキメラ形態が提供される。ＳＴＭ１１５  ＭＡｂの重鎖および軽鎖可変（Ｖ）ドメインの核酸（ＤＮＡ）および対応するアミノ酸配列を以下の表３に示す。配列番号１８、１９、２６、および２７は、重鎖および軽鎖可変ドメインの成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを有しない）をコードするヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列である。表３はまた、配列番号８９〜９２として、イタリック体で表されるシグナル配列を含む、重鎖および軽鎖可変ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列も提供する。同様に、ＳＴＭ１１５のＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの重鎖および軽鎖ＶドメインＣＤＲも表３に示す。同様に、ＰＤ−Ｌ１への結合に関してＳＴＭ１１５  ＭＡｂと競合する、および／またはＳＴＭ１１５と同じエピトープに結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体も提供する。
【００１６】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および／または配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号１９のＶＨドメインと配列番号２７のＶＬドメインとを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＨドメイン、および／または配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＬドメインを含む。これらの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、キメラ抗体であってもよく、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのヒト定常ドメインを含んでもよい。
【００１７】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＬドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメインと、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ  １〜３を含むＶＬドメインとを含む抗体を含むか、またはそれらを含む抗体と結合に関して競合する。
【００１８】
ある特定の実施形態において、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有する、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶＨドメインを有する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体はまた、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有する１、２、または３個のＣＤＲにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶＬドメインを有しうる。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインの両方のＣＤＲにおいてアミノ酸置換を有しうる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。
【００１９】
実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、上記のＶＨおよびＶＬドメインならびにそのＣＤＲを含む抗体と競合する。好ましくは、これらの抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、すなわちＳＴＭ１１５のヒト化形態であり、任意選択で、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのヒト定常ドメインを含む。結合親和性または他のパラメータを改善するために、ヒト化抗体のＣＤＲまたはフレームワーク領域に、１つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよいことは当業者に認識されると予想される。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体の結合によって示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質への抗体の結合によって示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、実施例５に記載する細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいＭＦＩとして表される、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合を示す。一実施形態において、抗体は、蛍光標識またはマーカーによって直接または間接的に検出可能である。一実施形態において、抗体は、ＦＩＴＣなどの蛍光標識またはマーカーによって直接標識される。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対するＳＴＭ１１５  ＭＡｂ、または結合ドメイン、またはそのヒト化もしくはキメラ形態の結合親和性は、その下限および上限値を含む、５〜２０ｎＭまたは５〜１０ｎＭである。一実施形態において、抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害し、特にエフェクターＴ細胞によって発現したＰＤ−１と、腫瘍細胞によって発現したＰＤ−Ｌ１、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する。
【００２０】
一態様において、従来の競合法によってアッセイするとき、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合して、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、本明細書において記述されるＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５と競合するまたは交叉競合する、単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。一態様において、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４、ＭＡｂ  ＳＴＭ１１５と同じエピトープに結合する単離抗体、または本明細書において記述される単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１  ＭＡｂが提供される。
【００２１】
別の態様において、ＰＤ−Ｌ１配列（ＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨ）（配列番号９３）内のエピトープに特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。
【００２２】
ある特定の実施形態において、配列番号１のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ５６、Ｋ６２、およびＫ７５を含むエピトープに結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。一態様において、抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、以下のアミノ酸残基：配列番号１のＹ５６、Ｋ６２、またはＫ７５の少なくとも１つに結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体であって、ヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１の結合を阻害する抗体が提供される。
【００２３】
別の実施形態において、配列番号１のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｋ６２、Ｈ６９、およびＫ７５を含むエピトープに結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。一態様において、抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、以下のアミノ酸残基：配列番号１のＫ６２、Ｈ６９、またはＫ７５の少なくとも１つに結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体であって、ヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１の結合を阻害する抗体が提供される。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１のエピトープ領域を構成するアミノ酸残基の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つに接触する。
【００２４】
別の態様において、抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、配列番号１のＬ４８からＨ７８のアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸に結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗体が提供される。一態様において、モノクローナル抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、配列番号１のＬ４８〜Ｈ７８のアミノ酸領域内の以下の群のアミノ酸残基：Ｙ５６、Ｋ６２、Ｋ７５に結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗体であって、モノクローナル抗体が、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１の結合、特にヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１の結合を阻害する単離抗体が提供される。別の態様において、抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、配列番号１のＤ６１〜Ｈ７８のアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸に結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗体が提供される。一態様において、モノクローナル抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、配列番号１のＤ６１〜Ｈ７８のアミノ酸領域内の以下の群のアミノ酸残基：Ｋ６２、Ｈ６９、およびＫ７５に結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗体であって、モノクローナル抗体が、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１の結合、特にヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１の結合を阻害する単離抗体が提供される。
【００２５】
別の態様において、抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するとき、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質（配列番号１）のＬ４８〜Ｈ７８アミノ酸領域内またはＤ６１〜Ｈ７８アミノ酸領域内に結合するように、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。
【００２６】
別の態様において、非グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する単離抗体またはその結合断片が提供され、抗体は、（ａ）配列番号５もしくは配列番号２１のアミノ酸配列を有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１、または配列番号４もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１；配列番号７もしくは配列番号２３のアミノ酸配列を有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ２、または配列番号６もしくは配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ２；および配列番号９もしくは配列番号２５のアミノ酸配列を有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ３、または配列番号８もしくは配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ３を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）配列番号１２または配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号１４または配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および配列番号１６または配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含み、抗体はヒトＰＤ−１とヒトＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害する。好ましい実施形態において、抗体は、ヒト抗体フレームワークと、任意選択でヒト抗体定常ドメインとを有するヒト化抗体である。
【００２７】
別の態様において、配列番号２もしくは１８から選択されるヌクレオチド配列、および／または配列番号１０もしくは２６からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド分子が提供される。一実施形態は、ヌクレオチド配列が、配列番号２または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０〜９８％同一である、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１  ＶＨドメインをコードする単離ヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態は、ヌクレオチド配列が、配列番号１９または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９０〜９８％同一である、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１  ＶＬドメインをコードする単離ヌクレオチド配列を提供する。実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２もしくは１８、または配列番号１０もしくは２６とそれぞれ、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である。これらのヌクレオチド配列は、少なくとも二価の抗体の文脈において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする。
【００２８】
ある特定の態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、そのアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ４、またはその抗原結合断片である。他の態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。一態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は組み換えによって産生される。さらなる態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種にコンジュゲートされる。
【００２９】
一態様において、薬学的に許容される担体または培地中で、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に選択的かつ優先的に結合する抗体）を含む組成物が提供される。
【００３０】
さらなる態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）連続アミノ酸のペプチドを含む単離ポリペプチドが提供される。一実施形態において、単離ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の）連続したアミノ酸のペプチドを含み、ここでＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応するアミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されている。一実施形態において、単離ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチド（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨ）に融合またはコンジュゲートされている。ある特定の態様において、ポリペプチドは、そのアミノ（Ｎ）またはカルボキシ（Ｃ）末端でシステイン（Ｃｙｓ）残基をさらに含む。例えば、ポリペプチドは、Ｃｙｓ残基でジスルフィド結合によって免疫原性ポリペプチドにコンジュゲートされてもよい。特定の実施形態において、ヒトＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する位置でグリコシル化されている少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＰＤ−Ｌ１ペプチドを免疫原として使用して、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を産生する。
【００３１】
さらなる態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１のＥＣＤ内のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の）連続したアミノ酸のポリペプチドを含む組成物であって、ＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する前記アミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されており、ポリペプチドが、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクル中で製剤化される組成物が提供される。
【００３２】
なおさらなる態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＥＣＤ内のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの連続したアミノ酸のポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＥＣＤ内のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応するアミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されており、ポリペプチドが、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクル中で製剤化される、免疫原性組成物が提供される。いくつかの態様において、免疫原性組成物はさらに、ミョウバンまたはフロイントアジュバントなどのアジュバントを含む。
【００３３】
さらなる態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の有効量を対象に投与することを含む、がんを有する対象などの、それを必要とする対象を処置するための方法が提供される。特異的実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４もしくはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５のヒト化形態もしくはキメラ形態、または本明細書において記述される別の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への結合に関して、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４もしくはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５、または本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と競合する抗体である。一実施形態において、本明細書において記述される抗体の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与は、ＰＤ−１の免疫阻害活性を遮断し、このように、Ｔ細胞における抗がん活性を促進して、腫瘍細胞の殺滅をもたらす。
【００３４】
非限定的な実施形態において、対象において処置されるがん、疾患、または病態は、乳がん、肺がん、頭頚部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、皮膚がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。ある特定の実施形態において、処置されるがんは、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、男性の乳がん、思春期のがん、小児のがん、青少年のがん、原因不明の原発性がん、キャッスルマン病、子宮頚がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼のがん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭または上咽頭がん、白血病（例えば、成人急性リンパ球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、小児白血病）、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、成人の軟部組織がん）、皮膚がん（例えば、基底細胞扁平上皮がん、黒色腫、メルケル細胞がん）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍である。
【００３５】
ある特定の実施形態において、がんは、ＰＤ−Ｌ１陽性、および第２のがんマーカー、例えばＥＧＦＲ陽性である。そのようながんは、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と、がんのマーカーを標的とする抗がん剤、例えば受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤との併用によって処置されうる。
【００３６】
ある特定の態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、薬学的に許容される組成物中に存在する。さらなる態様において、抗体は全身投与される。特定の態様において、抗体は、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、髄腔内、または局所投与される。他の態様において、１つまたは１つ以上の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を、それを必要とする対象に同時投与してもよい。抗体の同時投与は、１つの抗体を、別の抗体の前、後、または同時に投与することを伴いうる。
【００３７】
一態様において、がんまたは腫瘍を有する、特にがんまたは腫瘍細胞表面にＰＤ−Ｌ１を発現するまたはＰＤ−Ｌ１を高度に発現するがんまたは腫瘍を有する対象を処置する方法が提供される。そのような方法は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を阻害または遮断するために、および免疫抑制を防止して、対象のエフェクターＴリンパ球によるがんまたは腫瘍細胞の殺滅を促進するために、本実施形態に従う抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＳＴＭ００４またはＳＴＭ１１５のヒト化形態もしくはキメラ形態、または非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してＰＤ−Ｌ１の選択的結合に関してこれらの抗体の１つもしくは両方と競合する抗体である。
【００３８】
ある特定の実施形態は、少なくとも２つの異なる抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を投与して、好ましくは１つの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体より大きい治療効果が得られることを含む、対象におけるがんを処置する方法を提供する。
【００３９】
いくつかの態様において、方法はさらに、実施形態に従う抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体による処置を受けている対象に、少なくとも第２の抗がん治療または薬物を投与することを含む。第２の抗がん治療は、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法を構成しうるが、これらに限定されるわけではない。第２の抗がん剤はまた、限定されないと意図され、医師、当技術分野における通常の知識を有する医学の専門家（例えば、腫瘍学者）が実践的にまたは経験的に決定することができる。当業者によって認識されるように、少なくとも第２の抗がん治療または薬物の投与は、実施形態の抗体の投与の前、後、または同時に行われ得る。
【００４０】
別の態様において、がんを有する患者が、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合を遮断する薬剤による処置によって利益が得られる可能性があるか否かを決定する方法であって、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に優先的に結合する抗体を使用して、患者のがん細胞の試料に由来する細胞におけるグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在に関して試験することと、対象のがん細胞がグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現に関して陽性であることが見出された場合、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を防止する薬剤の有効量を患者に投与することとを含む、方法が提供される。一実施形態において、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を防止する薬剤は、本明細書において記述される抗体などの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、またはその組み合わせである。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＰＤ−１抗体は、別の抗がん剤または治療薬と併用して投与される。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において記述される抗体などのも別の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と併用して投与される。一実施形態において、方法はさらに、患者からがん細胞試料を得ることを伴う。
【００４１】
なお別の態様において、生物試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化、Ｎ−連結グリコシル化、またはＮ−グリコシル化を評価するための方法であって、試料に、本明細書において記述される抗体（例えば、本明細書におけるＳＴＭ００４またはＳＴＭ１１５などの、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に優先的に結合する抗体）を接触させることを含む、方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法またはアッセイである。ある特定の態様において、生物試料は、細胞試料、組織試料、体液（例えば、血漿、血清、血液、尿、喀痰、リンパ、腹水、腹腔内液、脳脊髄液、およびその他）である。特定の実施形態において、試料は、細胞試料、またはがんもしくは腫瘍を有する対象から得た腫瘍もしくはがんの細胞試料である。そのようながんまたは腫瘍細胞試料は、特に、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１が対象のがんまたは腫瘍細胞上に存在すれば、細胞が記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体による処置に関して適切な標的である可能性があることを決定するために、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を使用してがんまたは腫瘍細胞表面上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に関してアッセイしてもよい。
【００４２】
別の態様において、抗体を作製する方法であって、実施形態に従うポリペプチド（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの連続したアミノ酸の断片を含むポリペプチドであって、ＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する前記アミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されているポリペプチド）を対象（例えば、動物）に投与することと、対象から抗体を単離することとを含む方法が提供される。例として、動物は、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、またはヒトでありうる。ある特定の態様において、方法はさらに、抗体のＣＤＲを同定することと、当技術分野で公知の方法および技法を使用して、ＣＤＲ周囲の配列（すなわち、フレームワーク配列）をヒト化して、ヒト化抗体を産生することとを含む。なおさらなる態様において、方法は、ヒト化抗体を組み換え発現させることを含む。このため、さらなる実施形態において、前述の方法によって産生された単離抗体が提供される。このため、いくつかの実施形態において、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して、実施形態のポリペプチド（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＰＤ−Ｌ１の少なくとも７つの連続したアミノ酸の断片を含むポリペプチドであって、ＰＤ−Ｌ１のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位に対応する前記アミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されているポリペプチド）のコンフォメーションエピトープなどのエピトープに選択的に結合する単離抗体が提供される。一実施形態において、免疫原性の抗原として実施形態のポリペプチド（例えば、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド）の有効量を対象に投与することを含む、対象を免疫して免疫応答、例えば抗原に対する抗体応答を生じさせる方法が提供される。
【００４３】
記述の実施形態の他の態様、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および例証される実施例から明らかになると予想される。
【００４４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書において記述される実施形態の特定の態様を限定することなくさらに証明するために含める。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−１】ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞においてグリコシル化されている。１Ａ．原発性乳がん患者試料におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現。代表的な乳がん患者試料中のＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。１Ｂ．４種の代表的な乳がん細胞株、４種の黒色腫細胞株、３種の肺がん細胞株、および３種の結腸がん細胞株におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。１Ｃ．Ａ４３１細胞のｓｈＣＴＲＬおよび独立した２つのｓｈＰＤ−Ｌ１安定クローンにおけるＰＤ−Ｌ１発現のウェスタンブロット分析。ＰＤ−Ｌ１を、ｓｈＰＤ−Ｌ１＃５クローンに一過性にトランスフェクトした。１Ｄ．ＰＮＧアーゼＦ処置の存在下または非存在下での、精製ＰＤ−Ｌ１タンパク質の糖タンパク質染色。クーマシーブルー染色パネルは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の全量を表す。レーン４および５に現れる上のバンドは、ＰＮＧアーゼＦのローディングに由来する。（−）対照、非糖タンパク質の対照；（＋）対照、糖タンパク質の対照。
【図１−２】ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞においてグリコシル化されている。１Ｅ．ＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ、ＨＡ−ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ１−Ｆｌａｇタンパク質のグリコシル化パターン。細胞溶解物をＰＮＧアーゼＦおよびＥｎｄｏＨによって処置して、ウェスタンブロットによって分析した。１Ｆ．ＧＦＰタグＰＤ−Ｌ１完全長（ＷＴ）、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を、２９３Ｔ細胞において一過性に発現させた。次に細胞を、５μｇ／ｍｌツニカマイシン（ＴＭ）の存在下または非存在下で終夜処置した。ＰＤ−Ｌ１のタンパク質発現を、ウェスタンブロットを使用して調べた。１Ｇ．本明細書において記述される実験的試験において使用される代表的なＰＤ−Ｌ１タンパク質発現構築物の概略図であり、完全長のＰＤ−Ｌ１タンパク質およびその成分である細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）を示す。概略図において、ＰＤ−Ｌ１のＥＣＤドメインにおける４つのＮ−グリコシル化部位（ＮＸＴモチーフ）を赤色で示す。数字は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置を示す。１Ｈ．ＰＤ−Ｌ１  ＷＴおよびＰＤ−Ｌ１のグリコシル化変異体（ＮＱ変異体）のタンパク質発現パターンのウェスタンブロット分析。レーン１４は、ツニカマイシン（ＴＭ）によって終夜処置した非グリコシル化、野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１を示す。図において、黒丸は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を示し、黒の矢印は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を示す。
【図２】がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現。Ａ．肺がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。Ｂ．結腸がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。Ｃ．乳がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。Ｄ．卵巣がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。黒丸＝グリコシル化ＰＤ−Ｌ１；矢印＝非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１。
【図３】ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞においてグリコシル化されている。Ａ．異なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用した、がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。異なる抗体を使用してＰＤ−Ｌ１の発現を分析するために、４種のＢＬＢＣ細胞株、ＨＣＣ１９３７、ＳＵＭ１４９、ＭＢ−２３１、およびＢＴ２０、ならびに２種の非ＢＬＢＣ細胞株、ＭＢ−４８３およびＭＢ−４７４を選択した。Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ４３１細胞のｓｈＣＴＲＬおよび独立した２つのｓｈＰＤ−Ｌ１安定クローンにおけるＰＤ−Ｌ１のウェスタンブロット分析。Ｃ．Ｆｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ１のｓｈＲＮＡに対する二重発現構築物の概略図。Ｄ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ４３１細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のグリコシル化パターン。細胞溶解物を、ＰＮＧアーゼＦによって処置して、ウェスタンブロットによって分析した。黒丸＝グリコシル化ＰＤ−Ｌ１；矢印＝非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１。
【図４−１】グリコシル化および非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現。Ａ．ツニカマイシン（ＴＭ）処置細胞におけるＰＤ−Ｌ１−Ｍｙｃ、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｌａｇ、およびＨＡ−ＰＤ−Ｌ１タンパク質のウェスタンブロット分析。Ｂ．ツニカマイシン（ＴＭ）処置または無処置細胞におけるＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＷＴ、ＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＥＣＤ、およびＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＩＣＤタンパク質のウェスタンブロット分析。Ｃ．ツニカマイシン（ＴＭ）処置細胞におけるＰＤ−Ｌ１−Ｍｙｃ、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｌａｇ、ＨＡ−ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＷＴ、ＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＥＣＤ、およびＰＤ−Ｌ１−ＧＦＰ−ＩＣＤタンパク質のウェスタンブロット分析。グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（黒色の棒）または非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（赤色の棒）の強度を、濃度定量（ウェスタンブロット分析の下の棒グラフ）によって決定した。
【図４−２】グリコシル化および非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現。Ｄ．上記の（ｃ）で示した棒グラフから得たグリコシル化ＰＤ−Ｌ１（黒色の棒）または非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（赤色の棒）の強度の平均値。エラーバーは、ＳＤを表す。Ｅ．ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化パターン。細胞溶解物を、ＰＮＧアーゼＦまたはＯ−グリコシダーゼの存在下または非存在下で処置して、ウェスタンブロットによって分析した。黒丸＝グリコシル化ＰＤ−Ｌ１；矢印＝非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１。当業者によって認識されるように、ツニカマイシンは、タンパク質のＮ−連結グリコシル化を阻害するヌクレオシド抗生物質である（Heifetz, A. et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192）。
【図５】ＰＤ−Ｌ１タンパク質のＮ−グリコシル化部位。異なる種からのＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列の配列アライメント。４つのＮＸＴモチーフ、Ｎ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、およびＮ２１９を四角で囲んで赤色で示し、２つの非ＮＸＴモチーフ、Ｎ６３およびＮ２０４を緑色で示す。赤色の四角＝保存されたＮＸＴモチーフ。図５Ａ：コンセンサス配列（配列番号７４）；Ｑ９ＮＺＱ７＿ヒト（配列番号７５）；Ｑ９ＥＰ７３＿マウス（配列番号７６）；Ｄ４ＡＥ２５＿ラット（配列番号７７）；Ｃ５ＮＵ１１＿ウシ（配列番号７８）；Ｑ４ＱＴＫ１＿ブタ（配列番号７９）；およびＦ７ＤＺ７６＿ウマ（配列番号８０）。図５Ｂ：コンセンサス配列（配列番号９４）；Ｑ９ＮＺＱ７＿ヒト（配列番号９５）；Ｑ９ＥＰ７３＿マウス（配列番号９６）；Ｄ４ＡＥ２５＿ラット（配列番号９７）；Ｃ５ＮＵ１１＿ウシ（配列番号９８）；Ｑ４ＱＴＫ１＿ブタ（配列番号９９）；およびＦ７ＤＺ７６＿ウマ（配列番号１００）。
【図６−１】Ｎ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＨＥＫ２９３細胞からのＰＤ−Ｌ１の４つのＮ−グリコシル化部位、Ｎ３５（ＡおよびＥ）、Ｎ１９２（ＢおよびＦ）、Ｎ２００（ＣおよびＧ）、ならびにＮ２１９（ＤおよびＨ）のそれぞれに対応するＮ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＬＣ−ＭＳプロファイル（Ａ〜Ｄ）は、糖形態の代表的なサブセットが検出されるときの、溶出時間（図に表示）の期間に平均したスペクトルとして示す。それぞれのＮ−グリコシル化部位に関して、そのペプチド配列を定義するｂおよびｙイオンと共に、ｙ１イオン（Ｎ−グリコシル化Ａｓｎに付着したＧｌｃＮＡｃを有するトリプシンペプチド骨格）の検出に基づくその同定を例示するために、１つの代表的なＨＣＤ  ＭＳ２スペクトル（Ｅ〜Ｈ）を示す。グリカン（挿入図を参照されたい）に関して使用される略図の記号は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓによって推奨される標準的な表示に従う：追加のＨｅｘおよびＨｅｘＮＡは、フコシル化されているかまたはされていないいずれかのコアでありうる、トリマンノシルコア（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２）からのｌａｃＮＡｃ（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）またはｌａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）伸長部のいずれかとして暫定的に割付した。図６Ｅ〜６Ｈに示される配列をそれぞれ、配列番号８１〜８４に記載する。
【図６−２】Ｎ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＨＥＫ２９３細胞からのＰＤ−Ｌ１の４つのＮ−グリコシル化部位、Ｎ３５（ＡおよびＥ）、Ｎ１９２（ＢおよびＦ）、Ｎ２００（ＣおよびＧ）、ならびにＮ２１９（ＤおよびＨ）のそれぞれに対応するＮ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＬＣ−ＭＳプロファイル（Ａ〜Ｄ）は、糖形態の代表的なサブセットが検出されるときの、溶出時間（図に表示）の期間に平均したスペクトルとして示す。それぞれのＮ−グリコシル化部位に関して、そのペプチド配列を定義するｂおよびｙイオンと共に、ｙ１イオン（Ｎ−グリコシル化Ａｓｎに付着したＧｌｃＮＡｃを有するトリプシンペプチド骨格）の検出に基づくその同定を例示するために、１つの代表的なＨＣＤ  ＭＳ２スペクトル（Ｅ〜Ｈ）を示す。グリカン（挿入図を参照されたい）に関して使用される略図の記号は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓによって推奨される標準的な表示に従う：追加のＨｅｘおよびＨｅｘＮＡは、フコシル化されているかまたはされていないいずれかのコアでありうる、トリマンノシルコア（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２）からのｌａｃＮＡｃ（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）またはｌａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）伸長部のいずれかとして暫定的に割付した。図６Ｅ〜６Ｈに示される配列をそれぞれ、配列番号８１〜８４に記載する。
【図６−３】Ｎ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＨＥＫ２９３細胞からのＰＤ−Ｌ１の４つのＮ−グリコシル化部位、Ｎ３５（ＡおよびＥ）、Ｎ１９２（ＢおよびＦ）、Ｎ２００（ＣおよびＧ）、ならびにＮ２１９（ＤおよびＨ）のそれぞれに対応するＮ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＬＣ−ＭＳプロファイル（Ａ〜Ｄ）は、糖形態の代表的なサブセットが検出されるときの、溶出時間（図に表示）の期間に平均したスペクトルとして示す。それぞれのＮ−グリコシル化部位に関して、そのペプチド配列を定義するｂおよびｙイオンと共に、ｙ１イオン（Ｎ−グリコシル化Ａｓｎに付着したＧｌｃＮＡｃを有するトリプシンペプチド骨格）の検出に基づくその同定を例示するために、１つの代表的なＨＣＤ  ＭＳ２スペクトル（Ｅ〜Ｈ）を示す。グリカン（挿入図を参照されたい）に関して使用される略図の記号は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓによって推奨される標準的な表示に従う：追加のＨｅｘおよびＨｅｘＮＡは、フコシル化されているかまたはされていないいずれかのコアでありうる、トリマンノシルコア（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２）からのｌａｃＮＡｃ（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）またはｌａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）伸長部のいずれかとして暫定的に割付した。図６Ｅ〜６Ｈに示される配列をそれぞれ、配列番号８１〜８４に記載する。
【図６−４】Ｎ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＨＥＫ２９３細胞からのＰＤ−Ｌ１の４つのＮ−グリコシル化部位、Ｎ３５（ＡおよびＥ）、Ｎ１９２（ＢおよびＦ）、Ｎ２００（ＣおよびＧ）、ならびにＮ２１９（ＤおよびＨ）のそれぞれに対応するＮ−グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく同定。ＬＣ−ＭＳプロファイル（Ａ〜Ｄ）は、糖形態の代表的なサブセットが検出されるときの、溶出時間（図に表示）の期間に平均したスペクトルとして示す。それぞれのＮ−グリコシル化部位に関して、そのペプチド配列を定義するｂおよびｙイオンと共に、ｙ１イオン（Ｎ−グリコシル化Ａｓｎに付着したＧｌｃＮＡｃを有するトリプシンペプチド骨格）の検出に基づくその同定を例示するために、１つの代表的なＨＣＤ  ＭＳ２スペクトル（Ｅ〜Ｈ）を示す。グリカン（挿入図を参照されたい）に関して使用される略図の記号は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓによって推奨される標準的な表示に従う：追加のＨｅｘおよびＨｅｘＮＡは、フコシル化されているかまたはされていないいずれかのコアでありうる、トリマンノシルコア（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２）からのｌａｃＮＡｃ（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）またはｌａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）伸長部のいずれかとして暫定的に割付した。図６Ｅ〜６Ｈに示される配列をそれぞれ、配列番号８１〜８４に記載する。
【図７−１】ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化は、がん細胞関連免疫抑制にとって必要である。Ａ．ＢＴ５４９細胞上で発現した膜結合ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ変異体タンパク質の相互作用を測定するフローサイトメトリー。細胞を実験前にＭＧ１３２によって前処置した。Ｂ．最後の時点でのＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間の動的相互作用を示す低速度撮影顕微鏡画像。ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたは４ＮＱ発現細胞の赤色蛍光（核限定ＲＦＰ）および緑色蛍光（緑色蛍光標識ＰＤ−１／Ｆｃタンパク質）融合画像（２０倍）。Ｂの右に示す動力学グラフは、毎時間の時点でＢＴ５４９細胞上で発現したＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱタンパク質へのＰＤ−１／Ｆｃタンパク質の定量的結合を示す。Ｃ．ＢＴ５４９細胞上で発現したＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたは４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１タンパク質を伴うＴ細胞媒介腫瘍細胞殺滅（ＴＴＫ）アッセイ。カスパーゼ３／７基質の存在下で９６時間での、ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたは４ＮＱ発現細胞、およびＰＤ−１発現Ｔ細胞同時培養物の、代表的な赤色蛍光（核限定ＲＦＰ）および／または緑色蛍光（ＮｕｃＶｉｅｗ（商標）４８８カスパーゼ３／７基質）位相融合画像（１０倍）。Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）によって活性化した。緑色蛍光細胞は死細胞として計数した。ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱタンパク質に関連する死細胞の総細胞に対する定量比を、画像の右側の棒グラフで示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって有意性を決定し、＊ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１；１群あたりマウスｎ＝７であった。＊は、スチューデントのｔ検定によって統計学的に有意であることを示す。エラーバーは全て、独立した３回の実験の平均値±ＳＤとして表記する。
【図７−２】ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化は、がん細胞関連免疫抑制にとって必要である。Ｄ．ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ変異体タンパク質のいずれかを発現する４Ｔ１細胞の注入に由来する腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍の増殖。４Ｔ１−ｌｕｃ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ１００（Ｄの左側）を使用する生物発光イメージングによって示した。Ｄの右側：ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱタンパク質と比較して、ＰＤ−Ｌ１  ＷＴを発現する４Ｔ１細胞に由来する腫瘍を有するマウスにおける、腫瘍体積を示すボックスプロットおよび腫瘍の大きさを示す写真。腫瘍をエンドポイントで測定して解剖した。１群あたりマウスｎ＝８（右）。Ｅ．ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞集団におけるＩＦＮγの細胞内サイトカイン染色。二元配置ＡＮＯＶＡによって有意性を決定し、＊ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１；１群あたりマウスｎ＝７であった。＊は、スチューデントのｔ検定によって統計学的に有意であることを示す。エラーバーは全て、独立した３回の実験の平均値±ＳＤとして表記する。
【図８】ＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化および非グリコシル化形態の概略図およびウェスタンブロット分析。Ａ．野生型のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ）、およびそれぞれがＰＤ−Ｌ１タンパク質の４つのＮ−グリコシル化部位のうち１つのグリコシル化アミノ酸残基と３つの非グリコシル化アミノ酸残基とを有する、４つのＰＤ−Ｌ１タンパク質変種（Ｎ３５／３ＮＱ；Ｎ１９２／３ＮＱ；Ｎ２００／３ＮＱ；およびＮ２１９／３ＮＱ）の概略図。黒色で示したアミノ酸は、グリコシル化残基を表し、赤色で示したアミノ酸部位は、変種ＰＤ−Ｌ１タンパク質においてグリコシル化されない。Ｂ．ＰＤ−Ｌ１タンパク質のＮ３５／３ＮＱ、Ｎ１９２／３ＮＱ、Ｎ２００／３ＮＱ、およびＮ２１９／３ＮＱ形態を発現するＢＴ５４９の安定なクローンを作製した。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体のいくつかは、ウェスタンブロット分析によって決定した場合に、他と比較してある特定のＰＤ−Ｌ１グリコシル化変種により大きいレベルの結合を示し、それらのＭＡｂが部位特異的であることを証明した。例えば、Ｂに示すように、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４は、Ｎ３５／３ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１変種を認識して結合し、このモノクローナル抗体がグリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＮ３５領域に結合することを示した。Ｃ．肝臓がん細胞株の溶解物へのＳＴＭ００４  ＭＡｂ結合のウェスタンブロットの結果を示す。
【図９】抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体はＴ細胞による腫瘍細胞殺滅を増強する。ＳＴＭ００４  ＭＡｂを、実施例８に記述する細胞傷害アッセイにおいて異なる量で使用して、腫瘍細胞（ＢＴ５４９）に対するＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。図９は、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４によって処置したＢＴ５４９（ＲＦＰ  ＰＤ−Ｌ１（ＷＴ））細胞のリアルタイムでの細胞死を示す。図９において、下のグラフ（塗りつぶした青色の四角）は、対照（ＰＢＭＣからのＴ細胞なし）を表す；塗りつぶした赤色の丸は、抗体なしの対照を表し；塗りつぶした黒色の四角は、アッセイに使用した２０μｇ／ｍｌのＳＴＭ００４  ＭＡｂを表し；および塗りつぶした茶色の丸は、アッセイに使用した４０μｇ／ｍｌのＳＴＭ００４  ＭＡｂを表す。図９からわかるように、ＰＤ−Ｌ１を有する腫瘍細胞の用量に比例した経時的な細胞殺滅が証明される。
【図１０】結合アッセイ。図１０Ａおよび１０Ｂは、実施例９に記載の結合アッセイの結果を示し、ＳＴＭ００４  ＭＡｂ（図１０Ａ）が、アッセイ対照のＰＤ−１／Ｆｃなし、Ａｂなし、ｍＩｇＧ  Ａｂ対照（図１０Ｂ）と比較して、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現するＢＴ５４９標的細胞へのＰＤ−１の結合を用量依存的に遮断することが認められる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
記載の実施形態の他の態様、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および例としての実施例から明らかになると予想される。
【００４７】
腫瘍細胞で発現したプログラム死リガンド−１タンパク質（ＰＤ−Ｌ１）と、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞上で発現したプログラム死−１タンパク質（ＰＤ−１）との間の細胞外相互作用は、腫瘍関連免疫逃避において顕著な影響を有する。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用する免疫チェックポイント遮断の臨床での成功にもかかわらず、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用の基礎となる調節メカニズムおよび構造特徴は依然として不明のままである。本明細書において記述される知見によれば、ＰＤ−Ｌ１のＮ−連結グリコシル化はＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を促進および増強し、これがＴ細胞媒介免疫応答の抑制を促進することが証明されている。逆に、異常なグリコシル化、またはＮ−連結グリコシル化の欠如、例えば腫瘍細胞上で発現したＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの部分的または完全な脱グリコシル化は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に有害な影響を及ぼし、例えば弱めるまたは妨害し、それによって免疫抑制を阻害して、エフェクターＴ細胞の細胞傷害活性および腫瘍細胞の殺滅を促進することが新たに見出されている。加えて、その腫瘍が高度グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する患者の生存は不良であることから、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１は、本明細書における知見に基づいて、がんの処置に関する有効な治療標的として認識される。本明細書において、がんを処置するために、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を妨害するため、免疫抑制を阻害するため、およびＴ細胞エフェクター機能を促進するために、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合して相互作用するがんの治療薬、例えば抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供および記述される。本明細書において記述される抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体による腫瘍の処置は、ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化形態に対して特異的ではない抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較して増強された免疫抑制阻害効果を提供する。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体であり、本明細書において「ＭＡｂ」として示される。
【００４８】
本明細書において記述される実施例は、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体による、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較したグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の結合における有意な差、例えば２〜３倍の差を示す実験結果を提供する。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対して、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して、ナノモル濃度範囲、例えば約５〜２０ｎＭ、または約１０〜２０ｎＭの結合親和性を示す。
【００４９】
定義
本明細書において使用される用語「１つの（a）」または「１つの（an）」は、１つまたは複数を意味しうる。
【００５０】
本明細書において使用される用語「または」は、代替物のみを指すことが明白に示されている場合、または代替物が相互に排他的である場合を除き「および／または」を意味するが、本開示は、代替物のみと「および／または」を指す定義を支持する。
【００５１】
本明細書において使用される用語「別の」は、少なくとも２番目以上を意味する。
【００５２】
本明細書において使用される用語「約」は、方法が、値または試験対象間に存在する変動を決定するために使用される、値が装置の固有の誤差の変動を含むことを示すために使用される。
【００５３】
本明細書において使用される用語「プログラム死リガンド−１」または「ＰＤ−Ｌ１」は、特に示していなければ、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ））、イヌ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む任意の脊椎動物源由来のポリペプチド（用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書において互換的に使用される）または任意のネイティブＰＤ−Ｌ１を指し、ある特定の実施形態において、様々なＰＤ−Ｌ１アイソフォーム、そのＳＮＰ変種を含む関連するＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを含む。
【００５４】
ヒトＰＤ−Ｌ１の例示的なアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＺＱ７．１；ＧＩ：８３２８７８８４）を以下に提供する：
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭ  ＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴ  ＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶ  ＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣ  ＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬ  ＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥ  ＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ  ＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳ  ＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤ  ＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱ  ＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧ  ＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧ  ＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶ  ＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲ  ＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥ  ＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹ  ＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳ  ＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴ  ＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬ  ＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮ  ＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴ  ＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨ  ＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰ  ＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨ  ＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣ  ＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲ  ＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫ  ＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫ  ＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号１）配列番号１において、アミノ末端のアミノ酸１〜１８は、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のシグナル配列を構成する。したがって、成熟ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸１９〜２９０からなる。
【００５５】
本明細書において記述されるポリペプチドおよびペプチドを構成するアミノ酸残基の略語、ならびにこれらのアミノ酸残基対する保存的置換を、以下の表１に示す。１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド、または本明細書において記述されるポリペプチドの保存的に改変された変種は、当初のまたは天然に存在するアミノ酸が、類似の特徴、例えば類似の電荷、疎水性／親水性、側鎖の大きさ、骨格のコンフォメーション、構造、および剛性などを有する他のアミノ酸に置換されているポリペプチドを指す。このため、これらのアミノ酸変化は、典型的に、ポリペプチドの生物活性、機能、または他の所望の特性、例えば抗原に対するその親和性またはその特異性を変更することなく行われうる。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における１つのアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しない。さらに、構造または機能が類似であるアミノ酸の置換は、ポリペプチドの生物活性を妨害する可能性がより低い。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
用語「抗体」、「免疫グロブリン」、および「Ｉｇ」は、本明細書において広い意味で互換的に使用され、具体的に、以下に記述されるように、例えば個々の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば本明細書において記述されるモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長またはインタクトモノクローナル抗体、抗原結合活性を維持している抗体のペプチド断片を含む）、抗非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体組成物、ポリクローナル抗体または一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体）、一本鎖抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の断片が範囲に含まれる。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、および／または親和性成熟抗体でありうる。抗体は、他の種、例えばマウス、ラット、ウサギなど由来であってもよい。用語「抗体」は、特異的分子抗原に結合することができるポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むと意図される。抗体は典型的に、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、それぞれの対は、１つの重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）と１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、重鎖および軽鎖のアミノ末端部分は、約１００〜約１３０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は定常領域を含む（Borrebaeck (ed.), 1995, Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby, 1997 Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New Yorkを参照されたい）。特異的実施形態において、本明細書において提供される抗体が結合する特異的分子抗原は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、またはＰＤ−Ｌ１エピトープを含む。ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、またはＰＤ−Ｌ１エピトープは、非グリコシル化またはグリコシル化されうる。特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、またはＰＤ−Ｌ１エピトープは、グリコシル化される。ＰＤ−Ｌ１抗原に結合する抗体またはそのペプチド断片は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡコア、または当業者に公知の他の技術によって同定することができる。抗体またはその断片は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を使用して決定した場合に、いかなる交叉反応抗原よりも高い親和性でＰＤ−Ｌ１抗原に結合するとき、ＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する。典型的に、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より典型的に、バックグラウンドシグナルまたはノイズの５〜１０倍以上である。例えば、抗体特異性に関する考察に関しては、Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336を参照されたい。
【００５８】
本明細書において提供される抗体には、合成抗体、モノクローナル抗体、組み換えによって産生された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、および上記のいずれかの機能的断片（例えば、ＰＤ−Ｌ１結合断片などの抗原結合断片）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。結合断片は、抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの一部、例えば断片が由来する抗体の結合活性のいくつかまたは全てを保持するペプチド部分を指す。機能的断片（例えば、ＰＤ−Ｌ１結合断片などの抗原結合断片）の非限定的な例には、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単特異性、二重特異性など）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えばＰＤ−Ｌ１抗原、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む抗原結合ドメインまたは分子を含む。そのような抗体断片の説明は、例えば、Harlow and Lane, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.；Huston et al., 1993, Cell Biophysics, 22:189-224；Pluckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol., 178:497-515 and in Day, E.D., 1990, Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NYに見出されうる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）の抗体でありうる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体でありうる。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、完全ヒト、例えば完全ヒトモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト化されており、例えば、ヒト化モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ＩｇＧ抗体、またはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）もしくはサブクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
【００５９】
４本鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ４量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４本鎖（非還元）抗体単位の分子量は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて、２つのＨ鎖が１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。それぞれのＨおよびＬ鎖はまた、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。Ｎ末端において、それぞれのＨ鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）の後に、αおよびγ鎖のそれぞれにつき３つの定常ドメイン（ＣＨ）を有し、μおよびεアイソタイプにつき４つのＣＨドメインを有する。それぞれのＬ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後にそのカルボキシ末端において定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬドメインは、ＶＨドメインと整列し、ＣＬドメインは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬは対形成によって、共に１つの抗原結合部位を形成するが、ある特定のＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ、ＶＬまたはＶＨドメインと対を形成しなくとも抗原に結合することができる。免疫グロブリン分子の基本構造は、当業者によって理解される。例えば、異なるクラスの抗体の構造および特性は、Terr, Abba I. et al., 1994, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Appleton & Lange, Norwalk, CT, page 71 and Chapter 6に見出されうる。
【００６０】
本明細書において使用される用語「抗原」または「標的抗原」は、抗体が選択的に結合することができる既定の分子である。標的抗原は、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物でありうる。実施形態において、標的抗原は低分子である。ある特定の実施形態において、標的抗原は、ポリペプチドまたはペプチドであり、好ましくはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドである。
【００６１】
本明細書において使用される用語「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、および類似の用語は、抗原と相互作用して、結合剤としての抗体に、抗原に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の部分を指す（例えば、抗体のＣＤＲは、抗原結合領域である）。抗原結合領域は、任意の動物種、例えば齧歯類（例えば、ウサギ、ラット、またはハムスター）およびヒトに由来しうる。特異的実施形態において、抗原結合領域は、ヒト起源の領域でありうる。
【００６２】
「単離」抗体は、細胞材料または細胞もしくは組織起源の他の混入タンパク質、および／または抗体が由来する他の混入成分を実質的に含まず、または化学合成されるときの化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。語句「細胞材料を実質的に含まない」には、単離されたまたは組み換えによって産生された細胞の細胞成分から分離されている抗体の調製物を含む。このため、細胞材料を実質的に含まない抗体は、異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる）の約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）を有する抗体の調製物を含む。ある特定の実施形態において、抗体が組み換えによって産生されるとき、抗体は培養培地を実質的に含まず、例えば、培養培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満を表す。ある特定の実施形態において、抗体が化学合成によって産生されるとき、抗体は、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、例えば抗体は、タンパク質の合成に関係する化学前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、抗体のそのような調製物は、目的の抗体以外の化学前駆体または化合物の約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）を有する。混入成分はまた、抗体に対する治療的使用を妨げる材料を含みうるがこれらに限定されるわけではなく、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含みうる。ある特定の実施形態において、抗体は、（１）ローリー法（Lowry et al., 1951, J. Bio. Chem., 193: 265-275）によって決定した場合に、抗体の９５重量％より大きいもしくはそれに等しい、例えば９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、もしくは９９重量％まで、（２）スピニングカップシーケネーターを使用することによって、Ｎ−末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるまで、精製される。単離抗体はまた、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組み換え細胞内のその場の抗体を含む。単離抗体は、典型的に少なくとも１つの精製ステップによって調製される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体は単離されている。
【００６３】
本明細書において使用される用語「結合する」または「結合している」は、例えば複合体の形成を含む分子間の相互作用を指す。実例として、そのような相互作用は、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、およびファンデルワールス相互作用を含む非共有結合的相互作用を包含する。複合体はまた、共有もしくは非共有結合、相互作用、または力によって共に保持される２つまたはそれ以上の分子の結合を含みうる。抗体の１つの抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１などの標的（抗原）分子上のそのエピトープの間の全体的な非共有結合的相互作用の強度は、そのエピトープに関する抗体または機能的断片の親和性である。一価の抗原への抗体の結合（ｋｏｎ）と解離（ｋｏｆｆ）との比率（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、結合定数Ｋａであり、これは親和性の測定値である。Ｋの値は、抗体および抗原の異なる複合体ごとに異なり、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書において提供される抗体に対する結合定数Ｋａは、本明細書において提供される任意の方法、または当業者に公知の他の任意の方法を使用して決定されうる。１つの結合部位での親和性は、抗体と抗原の間の相互作用の真の強度を必ずしも反映しない。多数の反復抗原性決定基を含む複合抗原が、多数の結合部位を含む抗体と接触するとき、１つの部位で抗体と抗原とが相互作用すると、第２の結合部位での相互作用の確率が増加する。多価抗体と抗原の間のそのような多数の相互作用の強度は、アビディティと呼ばれる。抗体のアビディティは、その個々の結合部位の親和性よりもその結合能のよりよい尺度でありうる。例えば、高いアビディティは、時に、ＩｇＧより低い親和性を有しうる５量体のＩｇＭ抗体において見出されるように低い親和性を補うことができるが、ＩｇＭのアビディティがその多価性に起因して高い場合、ＩｇＭは抗原に有効に結合することができる。
【００６４】
「結合親和性」は、一般的に、ある分子（例えば、抗体などの結合タンパク質）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。特に示していなければ、本明細書において使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。結合分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）によって表されうる。親和性は、本明細書において記述される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、抗原への結合が遅く、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般的に、抗原への結合が速く、抗原により長い時間結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する多様な方法が当技術分野で公知であり、そのいずれも、本開示の目的のために使用されうる。特異的な例示的実施形態は、以下を含む：一実施形態において、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば結合アッセイによって測定される。Ｋｄは、例えば目的の抗体のＦａｂ部分とその抗原に関して実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）において測定することができる（Chen, et al., 1999, J. Mol. Biol., 293:865-881）。ＫｄまたはＫｄ値はまた、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用することによって、または例えばＯｃｔｅｔＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって、または水晶振動子微量天秤（ＱＣＭ）技術によっても測定することができる。「オンレート」または「結合の速度」または「結合速度」または「ｋｏｎ」はまた、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００もしくはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、またはＯｃｔｅｔＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用する、上記の同じ表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって決定することもできる。
【００６５】
用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」、「ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」、または「ＰＤ−Ｌ１に特異的である抗体」、「ＰＤ−Ｌ１エピトープに特異的に結合する抗体」、「ＰＤ−Ｌ１に選択的に結合する抗体」、「ＰＤ−Ｌ１エピトープに選択的に結合する抗体」、「ＰＤ−Ｌ１に優先的に結合する抗体」、および類似の用語は、本明細書において互換的に使用され、特に非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１のグリコシル化変異体と比較して十分な親和性および特異性で、ＰＤ−Ｌ１、すなわちグリコシル化またはＷＴ  ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗体を指す。本明細書において提供される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の「優先的結合」は、適当な対照、例えば非グリコシル化もしくは変種ＰＤ−Ｌ１（例えば、４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１）への結合と比較した、細胞上で発現したＰＤ−Ｌ１、すなわちグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドもしくはＰＤ−Ｌ１  ＷＴもしくはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体の結合、またはＰＤ−Ｌ１の非グリコシル化もしくは変種形態（例えば、４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１）を発現する細胞、例えば分子的に改変された細胞、細胞株、もしくは腫瘍細胞単離体、例えば本明細書において例えば実施例５に記述されるものなどへの抗体の結合の蛍光強度の定量に基づいて決定または定義されうる。記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ）発現細胞への優先的結合は、細胞フローサイトメトリーによって評価した場合に、非グリコシル化もしくは変異体グリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは非グリコシル化もしくは変異体グリコシル化ＰＤ−Ｌ１発現細胞への抗体の結合と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれ以上の測定された蛍光結合強度（ＭＦＩ）によって示され、アッセイされる抗体は、ＦＩＴＣなどの蛍光標識またはマーカーによって直接または間接的に検出可能である。一実施形態において、アッセイされる抗体は、ＦＩＴＣなどの蛍光マーカーで直接標識される。実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に優先的または選択的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において記述される非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１グリコシル化変種、例えばグリコシル化されていない４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１の結合に関して、同じ抗体のＭＦＩ値より１．５倍〜２５倍、または２倍〜２０倍、または３倍〜１５倍、または４倍〜８倍、または２倍〜１０倍、または２倍〜５倍、またはそれ以上大きいＭＦＩ値を示す。前述の全ての間のおよび全てに等しい倍率の蛍光強度の値が含まれると意図される。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、例えばグリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗原、ペプチド断片、またはエピトープ（例えば、ヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、抗原、またはエピトープなどのヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１）に特異的かつ優先的に結合する。ＰＤ−Ｌ１（例えば、グリコシル化または野生型ヒトＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗体は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＥＣＤに由来するペプチドに結合することができる。ＰＤ−Ｌ１抗原（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗体は、近縁の抗原（例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＰＤ−Ｌ１）と交叉反応しうる。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体は、他の抗原と交叉反応しない。ＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体は、例えば免疫蛍光結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ法、イムノアッセイ法、Ｂｉａｃｏｒｅ、または当業者に公知の他の技術によって同定されうる。
【００６６】
ある特定の他の実施形態において、本明細書において記述されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ未満であるかまたはそれに等しい、および／または０．１ｎＭ以上であるかまたはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、異なる種（ヒトとｃｙｎｏ  ＰＤ−Ｌ１の間）のＰＤ−Ｌ１タンパク質において保存されているＰＤ−Ｌ１のエピトープに結合する。抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を使用して決定した場合に、いかなる交叉反応抗原よりも高い親和性でＰＤ−Ｌ１抗原に結合するとき、ＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する。典型的に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍以上でありうる。例えば、抗体の特異性に関する考察に関しては、Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336を参照されたい。そのような実施形態において、「非標的」タンパク質への抗体の結合の程度は、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射免疫沈殿（ＲＩＡ）によって決定した場合に、その特定の標的タンパク質への抗体の結合の約１０％未満と予想される。
【００６７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体または抗野生型ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ）抗体を含み、野生型ＰＤ−Ｌ１タンパク質はグリコシル化されており、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対して特異的である。好ましい実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１の線形グリコシル化モチーフに結合する。いくつかの実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体は、３次元でグリコシル化モチーフの１つまたは複数の近傍に位置するペプチド配列に結合する。いくつかの実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して、ＰＤ−Ｌ１の１つもしくは複数のグリコシル化モチーフまたはＰＤ−Ｌ１のグリコシル化モチーフを有するＰＤ−Ｌ１ペプチドに選択的に結合する。他の実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体）は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸を含む線形エピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１の１つまたは複数のグリコシル化モチーフに選択的に結合し、グリコシル化モチーフは、配列番号１のＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、および／またはＮ２１９を含む。なお他の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸を含むコンフォメーション（非線形）エピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。ある特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより５０％より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。さらなる態様において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの少なくとも５〜１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。ある特定の実施形態において、抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への結合によって示されるＫｄの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、または２０％以下であるＫｄでグ���コシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６８】
一実施形態において、実施例５に記述される細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に対して、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩの少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍であるか、またはそれより大きい、およびある特定の実施形態において、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍以下大きいＭＦＩとして表される結合を示す。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合部分は、ナノモル濃度の親和性で、例えば下限および上限の値を含む５〜２０ｎＭまたは１０〜２０ｎＭの親和性で、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６９】
本明細書において抗体を参照して使用される用語「重（Ｈ）鎖」は、アミノ末端部分が約１１５〜１３０またはそれ以上のアミノ酸の可変（Ｖ）領域（Ｖドメインとも呼ばれる）を含み、カルボキシ末端部分が定常（Ｃ）領域を含む、約５０〜７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。定常領域（または定常ドメイン）は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる異なる５つのタイプ（例えば、アイソタイプ）の１つでありうる。異なる重鎖は、大きさが異なる：α、δ、およびγは、およそ４５０アミノ酸を含むが、μおよびεは、およそ５５０アミノ酸を含む。軽鎖と併せると、これらの異なるタイプの重鎖はそれぞれ、５つの周知のクラス（例えば、アイソタイプ）の抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを生じ、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。抗体重鎖は、ヒト抗体重鎖でありうる。
【００７０】
本明細書において抗体を参照して使用される用語「軽（Ｌ）鎖」は、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約１００〜約１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖（ＶおよびＣドメインの両方）のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。軽鎖には２つの異なるタイプが存在し、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野で周知である。抗体軽鎖は、ヒト抗体軽鎖でありうる。
【００７１】
本明細書において使用される用語「可変（Ｖ）領域」または「可変（Ｖ）ドメイン」は、軽（Ｌ）または重（Ｈ）鎖のアミノ末端に一般的に位置する抗体ポリペプチドのＬ鎖またはＨ鎖の部分を指す。Ｈ鎖Ｖドメインは、約１１５〜１３０アミノ酸長を有するが、Ｌ鎖Ｖドメインは、約１００〜１１０アミノ酸長である。ＨおよびＬ鎖Ｖドメインは、その特定の抗原に対するそれぞれの特定の抗体の結合および特異性において使用される。Ｈ鎖のＶドメインは、「ＶＨ」と呼ばれうる。Ｌ鎖のＶ領域は、「ＶＬ」と呼ばれうる。用語「可変」は、Ｖドメインのある特定の区分が、異なる抗体の間で配列が大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原の結合を媒介して、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義するが、可変性は抗体Ｖドメインの１１０アミノ酸の全長にわたって均一に分布しているわけではない。その代わりに、Ｖドメインは、それぞれが約９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれるより大きい可変性（例えば、極度の可変性）のより短い領域によって隔てられた約１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより可変性の低い（例えば、比較的不変である）鎖からなる。抗体ＨおよびＬ鎖のＶドメインはそれぞれ、４つのＦＲを含み、これらは大部分がβシート立体配座を採用し、３つの超可変領域で接続され、βシート構造を接続するループを形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する。それぞれの鎖における超可変領域は、ＦＲによって共に近位に保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に関与する（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照されたい）。Ｃドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの様々なエフェクター機能を示す。Ｖドメインは、異なる抗体クラスまたはタイプでは配列が大きく異なる。配列の多様性は、ＣＤＲに集中し、これは主に抗体と抗原との相互作用の原因である。特異的実施形態において、抗体の可変ドメインはヒトまたはヒト化可変ドメインである。
【００７２】
本明細書において使用される用語「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、および「ＨＶ」は、互換的に使用される。「ＣＤＲ」は、抗体ＶＨβシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２、もしくはＨ３）の１つ、または抗体ＶＬβシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）の１つを指す。この用語は、本明細書において使用されるとき、配列が高度に可変でありおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体Ｖドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６つの超可変領域：ＶＨドメインにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬドメインにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。したがって、ＣＤＲは、典型的に、Ｖドメインのフレームワーク領域配列内に介在する高度に可変の配列である。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲに隣接するそれらの可変領域残基である。ＦＲ残基は、例えばキメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、線形抗体、および二重特異性抗体に存在する。
【００７３】
多数の高度可変領域の描写が使用されており、本明細書において包含される。ＣＤＲ領域は当業者に周知であり、例えば、抗体Ｖドメイン内の最も超可変性の領域としてＫａｂａｔによって定義されている（Kabat et al., 1977, J. Biol. Chem., 252:6609-6616; Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem., 32:1-75）。ＫａｂａｔのＣＤＲは、配列多様性に基づいており、最も一般的に使用される（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照されたい）。ＣＤＲ領域配列はまた、保存されたβシートフレームワークの一部ではなく、このため異なる立体構造を採用することができる残基としてＣｈｏｔｈｉａによって構造的に定義されている（Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917）。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置を指す。Ｋａｂａｔ付番の慣例を使用して付番したときのＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４の間で変化する（これは、Ｋａｂａｔの付番スキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂで挿入を配置するために起こり；３５Ａも３５Ｂのいずれも存在しなければ、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合ループは３３で終了し、３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。いずれの付番システムおよび専門用語も当技術分野で十分に認識されている。
【００７４】
最近、普遍的な付番システム、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）情報システム（登録商標）（Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol., 27(1):55-77）が開発されて、広く使用されている。ＩＭＧＴは、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｔ細胞受容体（ＴＲ）、ならびにヒトおよび他の脊椎動物の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を専門とする総合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、軽鎖または重鎖内の位置の両方に関して参照される。免疫グロブリンＶドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、構造特徴に従って可変ドメイン配列を整列させる付番システムを使用することによって、種の間で保存されており、ループと呼ばれる構造で存在することから、ＣＤＲおよびフレームワーク残基は容易に同定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンからのＣＤＲ残基を典型的にヒト抗体からのアクセプターフレームワークに移植および置換するために使用することができる。追加の付番システム（ＡＨｏｎ）が、Honegger et al., 2001, J. Mol. Biol., 309: 657-670によって開発されている。例えばＫａｂａｔ付番を含む付番システムとＩＭＧＴ独自の付番システムとの対応は、当業者に周知である（例えば、Kabat, Id; Chothia et al., Id.; Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag；およびLefranc et al., 1999, Nuc. Acids Res., 27:209-212を参照されたい）。
【００７５】
ＣＤＲ領域配列はまた、ＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＩＭＧＴによって定義されている。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（例えば、Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlagを参照されたい）によって使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」の超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域またはＣＤＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
【００７６】
ＣＤＲ領域配列の例示的な描写を、以下の表２に例示する。標準的な抗体可変領域内のＣＤＲの位置は、多数の構造との比較によって決定されている（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948)；Morea et al., 2000, Methods, 20:267-279）。超可変領域内の残基数は、異なる抗体において変化することから、標準的な可変領域付番スキーム（Al-Lazikani et al., 同上）では、標準的な位置と比較した追加の残基を、慣例によって残基番号の次にａ、ｂ、ｃなどと付番する。そのような命名法は同様に当業者に周知である。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
「親和性成熟」抗体は、それらの変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善が起こる、１つまたは複数のそのＨＶＲにおける１つまたは複数の変更（例えば、変化、付加、および／または欠失を含むアミノ酸配列の変動）を有する抗体である。ある特定の実施形態において、親和性成熟抗体は、標的抗原、例えばグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性さえ有すると予想される。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の技法によって産生される。総説に関しては、Hudson and Souriau, 2003, Nature Medicine, 9:129-134；Hoogenboom, 2005, Nature Bioethanol., 23:1105-1116；Quiroz and Sinclair, 2010, Revitas Ingeneria Biomedia, 4 : 39-51を参照されたい。
【００７９】
「キメラ」抗体は、所望の生物活性を示す限り、Ｈおよび／またはＬ鎖の一部、例えばＶドメインが、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応するアミノ酸配列と同一または相同であるが、鎖の残り、例えばＣドメインは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である抗体、ならびにそのような抗体の断片である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855を参照されたい）。
【００８０】
「ヒト化」された非ヒト（例えば、マウス）抗体は、本来のＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性、ならびに抗原結合および相互作用能を有する非ヒト種（例えば、ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類の対応するＣＤＲの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン配列を指す抗体（例えば、レシピエント抗体）のキメラ形態である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの１つまたは複数のＦＲ領域残基を同様に、対応する非ヒト残基で置き換えてもよい。加えて、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含みうる。これらの改変は、ヒト化抗体の性能をさらに精密化するために行われる。ヒト化抗体のＨまたはＬ鎖は、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つまたは複数の可変領域の実質的に全てを含みうる。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、典型的に、ヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）を含む。当業者に公知であるが、さらなる詳細は、望ましければ、例えばJones et al., 1986, Nature, 321:522-525；Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329；およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596；Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289；ならびに米国特許第６，８００，７３８号明細書（２００４年１０月５日発行）、同第６，７１９，９７１号明細書（２００５年９月２７日発行）、同第６，６３９，０５５号明細書（２００３年１０月２８日発行）、同第６，４０７，２１３号明細書（２００２年６月１８日発行）、および同第６，０５４，２９７号明細書（２０００年４月２５日発行）において見出されうる。
【００８１】
用語「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」は、本明細書において互換的に使用され、ヒトによって産生された、および／または当業者によって実践されるようにヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製されている抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ（Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol., 227:381；Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581）、および酵母ディスプレイライブラリ（Chao et al., 2006, Nature Protocols, 1:755-768）を含む、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。Cole et al., 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77；Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147(1):86-95に記述される方法も同様に、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。同様にvan Dijk et al., 2001, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74も参照されたい。ヒト抗体は、その内因性のＩｇ座が無能力化されていて、抗原チャレンジに応答してヒト抗体が生成されるように、ヒト抗体をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子を有するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物、例えばマウスに抗原を投与することによって調製することができる（例えば、Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-566；Bruggemann et al,, 1997 Curr. Opin. Biotechnol., 8(4):455-8；ならびにＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関して米国特許第６，０７５，１８１号明細書および同第６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）。同様に、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関して、Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562も参照されたい。特異的実施形態において、ヒト抗体は、ヒト起源の可変領域と定常領域とを含む。「完全ヒト」抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに結合し、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変種である核酸配列によってコードされる抗体も包含することができる。特異的実施形態において、本明細書において提供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、完全ヒト抗体である。用語「完全ヒト抗体」は、Ｋａｂａｔら（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）によって記述されるヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変および定常領域を有する抗体を含む。語句「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたヒト抗体、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体；組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックおよび／またはトランスクロモゾームである動物（例えば、マウスまたはウシ）から単離された抗体（例えば、Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照されたい）；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の任意の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常��域を有しうる（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）。しかし、ある特定の実施形態において、そのような組み換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を使用するときは、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）を受け、このため、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来して関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない配列である。
【００８２】
本明細書において使用される用語「エピトープ」は、１つの抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位または領域、例えば抗原、例えば抗ＰＤ−Ｌ１または抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の１つまたは複数の抗原結合領域が結合することができるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの表面上の局所領域である。エピトープは、免疫原性でありえて、動物において免疫応答を誘発することができる。エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。エピトープはしばしば、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学活性表面基からなり、特異的三次元構造特徴および特異的電荷特徴を有する。エピトープは、線形エピトープおよびコンフォメーションエピトープでありうる。エピトープに関与するポリペプチドの領域は、線形エピトープを形成するポリペプチドの連続するアミノ酸でありうるか、またはエピトープは、典型的にコンフォメーションエピトープと呼ばれるポリペプチドの２つもしくはそれ以上の不連続なアミノ酸もしくは領域から形成されうる。エピトープは、抗原の三次元表面特徴であってもなくてもよい。ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１エピトープは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの三次元表面特徴である。他の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１エピトープは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの線形特徴である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１エピトープは、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１エピトープは、１つまたは複数の部位でグリコシル化される。一般的に、抗原は、いくつかのまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応することができる。特定の実施形態において、記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、コンフォメーションエピトープであるＰＤ−Ｌ１のエピトープ、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１のエピトープに結合する。
【００８３】
抗体は、２つの抗体が、三次元空間において、同一の、重なり合う、または隣接するエピトープを認識するとき、「１つのエピトープ」、または参照抗体と「本質的に同じエピトープ」もしくは「同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が、三次元空間において、同一、重なり合う、または隣接するエピトープに結合するか否かを決定するために最も広く使用される迅速な方法は、競合アッセイであり、これは例えば標識抗原または標識抗体のいずれかを使用する多数の異なるフォーマットで構成することができる。いくつかのアッセイにおいて、抗原を９６ウェルプレートに固定するか、または細胞表面上で発現させて、非標識抗体が、標識抗体の抗原への結合を遮断する能力を、検出可能なシグナル、例えば放射活性、蛍光、または酵素標識を使用して測定する。
【００８４】
ＰＤ−Ｌ１標的タンパク質またはそのペプチド上の同じエピトープまたは結合部位に関して競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の文脈において使用するときの用語「競合する」は、試験中の抗体またはその結合断片が、共通の抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはその断片）への参照分子（例えば、参照リガンド、または参照抗原結合タンパク質、例えば参照抗体）の特異的結合を防止、遮断、または阻害する、アッセイにおいて決定した場合の競合を意味する。多数のタイプの競合結合アッセイを使用して、試験抗体が、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトグリコシル化ＰＤ−Ｌ１）への結合に関して参照抗体と競合するか否かを決定することができる。使用することができるアッセイの例には、固相の直接または間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；固相の直接または間接的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253を参照されたい）；固相の直接のビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619を参照されたい）；固相の直接標識アッセイ；固相の直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）；標識ヨウ素（Ｉ１２５標識）を使用する固相の直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15を参照されたい）；固相の直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552を参照されたい）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82）が挙げられる。典型的に、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製抗原（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１などのＰＤ−Ｌ１）、または非標識試験抗原結合タンパク質（例えば、試験抗ＰＤ−Ｌ１抗体）もしくは標識参照抗原結合タンパク質（例えば、参照抗ＰＤ−Ｌ１抗体）のいずれかを有する細胞の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の公知の量の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定することができる。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および／または参照抗体が結合するエピトープに十分に近位の隣接するエピトープに結合して立体妨害を引き起こす抗体を含む。競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細を本明細書に記述する。通常、競合抗体タンパク質が過剰に存在するとき、競合抗体は、共通の抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも１５％、または少なくとも２３％、例えば４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％またはそれ以上、および記載の量の間のパーセント量で阻害するが、これらに限定されない。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％、９８％、９９％、またはそれ以上阻害される。
【００８５】
本明細書において使用される用語「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性または機能的活性を防止、阻害、遮断、または低減させる抗体を指す。遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性または機能を、実質的または完全に防止、阻害、遮断、または低減させることができる。例えば、遮断抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の結合相互作用を防止、阻害、遮断、または低減させて、このようにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に関連する免疫抑制機能を防止、遮断、阻害、または低減させることができる。遮断する、阻害する、および中和するという用語は、本明細書において互換的に使用され、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を防止またはそうでなければ妨害もしくは低減させる能力を指す。
【００８６】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された一続きの３またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質アナログ、オリゴペプチドなどでありうる。ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然由来または合成でありうる。ポリペプチドは、生物試料から精製してもよい。例えば、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたはペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したアミノ酸で構成されうる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、または２８５個の連続したアミノ酸を有する。ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００８７】
本明細書において使用される用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと類似もしくは同一の機能を保有するが、必ずしも参照ポリペプチドと類似もしくは同一のアミノ酸配列を含まないか、または参照ポリペプチドと類似もしくは同一の構造を保有しないポリペプチドを指す。参照ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの断片、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体でありうる。参照ポリペプチドと類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本明細書において記述されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体でありうる参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。参照ポリペプチドと類似の構造を有するポリペプチドは、本明細書において記述されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体でありうる参照ポリペプチドの構造と類似の二次、三次、または四次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造は、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、および結晶電子顕微鏡を含むがこれらに限定されるわけではない、当業者に公知の方法によって決定することができる。
【００８８】
本明細書において使用される用語「変種」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体に関連して使用するとき、ネイティブまたは非改変のＰＤ−Ｌ１配列または抗ＰＤ−Ｌ１抗体配列と比較して１つまたは複数（例えば、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５個など）のアミノ酸配列の置換、欠失、および／または付加を有するポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を指す。例えば、ＰＤ−Ｌ１変種は、ネイティブＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列に対する１つまたは複数（例えば、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５個など）の変化に起因しうる。同様に、例として、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の変種は、ネイティブまたはこれまで未改変の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のアミノ酸配列に対する１つまたは複数（例えば、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５個など）の変化に起因しうる。変種は、対立遺伝子変種もしくはスプライス変種などの天然に存在しうるか、または人為的に構築することができる。ポリペプチド変種は、変種をコードする対応する核酸分子から調製することができる。
【００８９】
用語「同一性」は、配列を整列させて比較することによって決定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または２つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子におけるアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基の百分率を意味し、比較される分子の最小の大きさに基づいて計算される。これらの計算に関して、アライメントにおけるギャップ（もしあれば）は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって特定されなければならない。整列させた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用されうる方法には、Lesk, A. M., ed., 1988, Computational Molecular Biology, New York: Oxford University Press；Smith, D. W., ed., 1993, Biocomputing Informatics and Genome Projects , New York: Academic Press；Griffin, A. M., et al., 1994, Computer Analysis of Sequence Data, Part I , New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press；Gribskov, M. et al., 1991, Sequence Analysis Primer, New York: M. Stockton Press；およびCarillo et al., 1988, Applied Math., 48:1073に記述される方法が挙げられる。
【００９０】
パーセント同一性の計算において、比較される配列を、配列間で最大のマッチを生じるように整列させることができる。％同一性を決定するために使用することができるコンピュータープログラムの例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res., 12:387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）であり、これはその％同一性を決定するために２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために使用されるコンピューターアルゴリズムである。配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチド配列の最適なマッチングが得られるように整列させることができる（アルゴリズムによって決定された「マッチさせる範囲」）。ギャップオープンペナルティ（平均対角線の３倍として計算され、「平均対角線（average diagonal）」は、使用される比較行列の対角線の平均値であり、「対角化」は、特定の比較行列によるそれぞれの完全なアミノ酸マッチに割り付けされるスコアまたは数である）、およびギャップ伸長ペナルティ（これは通常、ギャップオープンペナルティの１／１０である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムと共に使用される。ある特定の実施形態において、標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列に関して、Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関して、Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）も同様にアルゴリズムによって使用される。ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための例示的なパラメータは、以下を含む：（ｉ）アルゴリズム：Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453；（ｉｉ）比較行列：Henikoff et al., 同上のＢＬＯＳＵＭ６２;（ｉｉｉ）ギャップペナルティ：１２（しかし、末端ギャップにはペナルティなし）；（ｉｖ）ギャップ長ペナルティ：４；および（ｖ）類似性の閾値：０。
【００９１】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのある特定のアライメントスキームによって、２つの配列の短い領域のみのマッチが起こりえて、この小さい整列した領域は、２つの完全長の配列間にたとえ有意な関係がない場合であっても非常に高い配列同一性を有しうる。したがって、選択されたアライメント方法（例えばＧＡＰプログラム）を、望ましければ、標的ポリペプチドの代表的な数のアミノ酸、例えば少なくとも５０個の連続したアミノ酸に及ぶアライメントが得られるように調節することができる。
【００９２】
参照ポリペプチド配列に関連するパーセント（％）アミノ酸配列同一性は、必要であれば、最大のパーセント配列同一性が達成されるように配列を整列させてギャップを導入した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなく、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例として一般に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当技術分野の専門家の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適当なパラメータを決定することができる。
【００９３】
本明細書において使用される用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変更されている参照ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。参照ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体でありうる。本明細書において使用される用語「誘導体」はまた、例えば任意のタイプの分子をポリペプチドに共有結合により付着させることによって化学的に改変されているＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を指す。例えば、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解、細胞リガンドへの連結、ペプチドもしくはタンパク質タグ分子への連結、または他のタンパク質などによって化学改変することができる。誘導体は、付着した分子のタイプまたは位置のいずれかで、天然に存在するまたは開始ペプチドもしくはポリペプチドとは異なるように改変される。誘導体はさらに、ペプチドまたはポリペプチド上に本来存在する１つまたは複数の化学基の欠失を含みうる。ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体の誘導体は、特異的化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンによる代謝合成などを含むがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の技術を使用する化学的改変によって化学的に改変されうる。さらに、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体の誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含みうる。ポリペプチド誘導体は、本明細書において記述されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体、特に抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体でありうる参照ポリペプチドと類似または同一の機能を保有する。
【００９４】
本明細書において使用される用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体に関連して使用するときの用語「融合」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変種および／または誘導体を、異種ペプチドまたはポリペプチドに接続、融合、またはカップリングさせることを指す。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体の生物活性を保持する。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、異種ペプチドまたはポリペプチドにカップリング、融合、または接続したＰＤ−Ｌ１抗体ＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨＣＤＲ（１、２、または３個のＶＨＣＤＲ）、および／またはＶＬＣＤＲ（１、２、または３個のＶＬＣＤＲ）を含み、融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはペプチド上のエピトープに結合する。融合タンパク質は、当技術分野で実践される化学カップリング反応を介して、または分子組み換え技術を介して調製されうる。
【００９５】
本明細書において使用される用語「組成物」は、明記された構成成分（例えば、本明細書において提供されるポリペプチドまたは抗体）を、任意選択で明記された量または有効量で含む産物、および任意選択で明記された量または有効量の、特異的構成成分の併用または相互作用に直接または間接的に起因する任意の所望の産物を指す。
【００９６】
本明細書において使用される用語「担体」は、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して使用される投与量および濃度で非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または安定化剤を含む。しばしば、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝液である。生理的に許容される担体の例には、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、および他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（例えば、約１０アミノ酸残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。用語「担体」はまた、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント、完全または不完全）、賦形剤、または治療薬がそれと共に投与されるビヒクルも指しうる。薬学的担体を含むそのような担体は、滅菌の液体、例えば石油、動物、植物、または合成起源の水および油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む水および油でありうる。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与されるときの例示的な担体である。食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液の液体担体として使用することができる。適した賦形剤（例えば、薬学的賦形剤）には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。望ましければ、組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含みうる。組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。製剤を含む経口組成物は、標準的な担体、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含みうる。適した薬学的担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAに記述される。薬学的化合物を含む組成物は、対象（例えば、患者）にとって適切な投与形態を提供するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の治療有効量を単離または精製形態で、適量の担体と共に含みうる。組成物または製剤は、投与様式に適合しなければならない。
【００９７】
本明細書において使用される用語「賦形剤」は、希釈剤、ビヒクル、保存剤、結合剤、または安定化剤として一般的に使用される不活性物質を指し、これには、タンパク質（例えば、血清アルブミンなど）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど）、脂肪酸、およびリン脂質（例えば、スルホン酸アルキル、カプリル酸など）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤など）、糖類（例えば、スクロース、マルトース、トレハロースなど）およびポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。同様に参照として、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。
【００９８】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、必要に応じて、動物、例えばヒトに投与されるときに、有害な、アレルギー、または他の予想外のもしくは望ましくない反応を生じない分子実体、製剤および組成物を指す。抗体または追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして、Remington's Pharmaceutical Science、同上によって例示されるように当業者に公知である。その上、動物（例えば、ヒト）の投与に関して、調製物は、連邦政府または州政府の規制当局、例えばＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓが必要とする、または動物、より詳しくはヒトにおいて使用するために、米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般的に認識される薬局方に記載される無菌性、発熱性、全身安全性および純度の基準を満たさなければならないと理解される。
【００９９】
用語「医薬製剤」は、活性成分の生物活性を有効にすることができる形態（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体）で存在し、製剤が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌製剤でありえて、すなわち、無菌的であるかまたは全ての生きている微生物およびその胞子などを含まない。
【０１００】
用語「添付文書」は、そのような治療製品の使用に関する指示、用途、用量、投与、禁忌、および／または警告に関する情報を含む、市販の治療製品のパッケージに慣例的に含まれる説明書を指すために使用される。
【０１０１】
本明細書において使用される用語「処置する」、「処置」、または「処置している」は、少なくとも１つの陽性の治療効果または利益を得る目的、例えば疾患または健康関連状態を処置する目的で、それを必要とする対象に治療剤を投与もしくは適用すること、または対象に技法もしくはモダリティを行うことを指す。例えば、処置は、様々なタイプのがんを処置する目的での、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその組成物もしくは製剤の薬学的有効量の投与を含みうる。用語「処置レジメン」、「投与レジメン」、または「投与プロトコール」は、互換的に使用され、治療剤、例えば本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与時期および用量を指す。本明細書において使用される用語「対象」は、がんを有するまたはがんを有すると診断されたヒトまたは非ヒト動物、例えば霊長類、哺乳動物および脊椎動物のいずれかを指す。好ましい実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象はがん患者である。一実施形態において、それを必要とする対象は、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体処置から利益を得ることが予想または予測される。
【０１０２】
本明細書において使用される用語「治療上有益な」または「治療上有効な」は、それを必要とする対象（例えば、がんを有する、またはがんを有すると診断された対象）の、特に抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の使用および記述の方法の実施の結果としての、状態の医学的処置、治療、用量の投与に関する幸福度の促進または増強を指す。これには、疾患の兆候または症状の頻度または重症度の低減が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例えば、がんの処置は、例えば腫瘍の大きさの低減、腫瘍の浸潤性もしくは重症度の低減、末梢組織もしくは臓器へのがん細胞の浸潤の低減、腫瘍もしくはがんの増殖速度の低減、または転移の予防もしくは低減を伴いうる。がんの処置はまた、対象において持続的な応答を達成すること、またはがんを有する対象の生存を延長させることも指しうる。
【０１０３】
本明細書において使用される用語「投与する」、または「投与」は、例えば、注射または経口経路を介して、体外に存在する物質を、例えば経口、皮下、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、および／または本明細書において記述されるもしくは当技術分野で公知の他の任意の物理的送達法によって、患者に物理的に送達する行為を指す。疾患、障害、もしくは状態、またはその症状が治療的に処置されるとき、物質の投与は典型的に、疾患、障害、もしくは状態、またはその症状の発症後に起こる。予防的処置は、疾患、障害、もしくは状態、またはその症状の発症前の時点での物質の投与を伴う。
【０１０４】
本明細書において使用される用語「有効量」は、がんの重症度および／もしくは持続、またはそれに関連する症状を低減、減少、軽減、および／または改善するために十分である治療薬（例えば、本明細書において提供される抗体または医薬組成物）の分量または量を指す。この用語はまた、がんの進展または進行の低減または改善、がんの再発、発生、または発症の低減または改善；および／または別のがん治療（例えば、本明細書において提供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与以外の治療）の予防または治療効果の改善または増強にとって必要な量を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇに等しい値（対象の体重１ｋｇあたりの抗体のｍｇ）から約１００ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇに等しい値までである。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇに等しい、約０．５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇに等しい、約１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇに等しい、約３ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇに等しい、約５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇに等しい、約１０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇに等しい、約１５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇに等しい、約２０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇに等しい、約２５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇに等しい、約３０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇに等しい、約３５ｍｇ／ｋｇまたは３５ｍｇ／ｋｇに等しい、約４０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇに等しい、約４５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇに等しい、約５０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇに等しい、約６０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇに等しい、約７０ｍｇ／ｋｇまたは７０ｍｇ／ｋｇに等しい、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇである。これらの量は、その中の量および範囲を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、「有効量」はまた、特定の結果（例えば、細胞表面ＰＤ−Ｌ１への細胞表面ＰＤ−１の結合を防止、遮断、もしくは阻害すること；またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１媒介免疫抑制を防止、遮断、もしくは阻害すること）を得るための、本明細書において提供される抗体の量も指す。
【０１０５】
他の治療（例えば、他の薬剤、がんの薬物、がんの治療）の投与の文脈における用語「併用」は、１つ以上の治療（例えば、薬物治療および／またはがんの治療）の使用を含む。１つまたは複数のさらなる治療剤との「併用」投与は、同時（例えば、並行）投与および任意の順序での連続投与を含む。用語「併用」の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。非限定的な例として、第１の治療（例えば、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体などの薬剤）を、がんを有するまたはがんを有すると診断された対象への、第２の治療（例えば、薬剤）の投与の（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間）前、同時、または（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間もしくはそれ以上）後に投与してもよい。
【０１０６】
治療の併用（例えば、治療剤を含む薬剤の使用）は、任意の２つまたはそれ以上の単剤治療の相加効果より有効でありうる（例えば、相乗効果を有する）。相乗効果は典型的に予想外で、予測することができない。例えば、治療剤の併用の相乗効果によってしばしば、１つもしくは複数の薬剤のより低用量を使用することができ、および／または薬剤をがん患者により少ない回数で投与することができる。治療薬およびがん治療のより低用量を利用できること、ならびに／または治療の投与回数がより少ないことは、治療の有効性を低減させることなく、対象への治療の投与に関連する毒性の可能性を低減させる。加えて、相乗効果によって、処置における治療の有効性の改善またはがんの軽減が起こりうる。同様に、治療（例えば、治療剤）の併用によって証明される相乗効果により、任意の単剤治療の使用に関連する有害なまたは望ましくない副作用を回避または低減することができる。
【０１０７】
抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体）
実施形態において、好ましくは非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１より高い親和性で（すなわち、優先的に結合する）グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（例えば、特異的Ｎ−グリカン構造を有するＰＤ−Ｌ１タンパク質；ＰＤ−Ｌ１の特異的グリコペプチド）またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ペプチドに結合して、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の免疫抑制機能を阻害する抗体またはその結合断片、および疾患、特にがんの処置におけるそのような抗体の使用が提供される。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ  Ｉｇクラスの抗体、ならびに抗原結合活性を保持する１つまたは複数の抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドでありうる。実例として、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、キメラ、親和性成熟、ヒト化、またはヒト抗体でありうる。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、モノクローナル抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＳＴＭ００４もしくはＳＴＭ１１５、またはそのヒト化もしくはキメラ形態である。別の好ましい実施形態において、モノクローナル抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト化抗体である。公知の手段によって、および本明細書において記述されるように、そのような抗原またはエピトープが、天然起源から単離されるか、または天然のタンパク質の合成誘導体もしくは変種であるかによらず、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗原、そのそれぞれのエピトープの１つもしくは複数、または前述の任意のコンジュゲートに対して特異的な、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体断片、結合ドメイン、およびＣＤＲ（前述のいずれかの改変形態を含む）を作製してもよい。
【０１０８】
一実施形態において、抗体はキメラ抗体、例えば異種の非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワークおよび／または定常ドメイン配列）に移植された非ヒトドナー由来の抗原結合配列（例えば、Ｖドメインおよび／またはＣＤＲ）を含む抗体である。一実施形態において、非ヒトドナー配列は、マウスまたはラットに由来する。一実施形態において、抗原結合配列は、合成、例えば変異誘発（例えば、ヒトファージライブラリのファージディスプレイスクリーニングなど）によって得られる。一実施形態において、キメラ抗体はマウスＶ領域とヒトＶ領域とを有する。一実施形態において、マウス軽鎖Ｖ領域はヒトκ軽鎖Ｃ領域に融合される。一実施形態において、マウス重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｃ領域に融合される。
【０１０９】
一実施形態において、抗体は、ラクダ抗体に由来し、好ましくはＶＨＨドメイン配列またはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）として知られる、軽鎖を欠如する重鎖ラクダ抗体に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインである。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）（Ｎｂ）は、天然に存在する一本鎖抗体の最小の機能的断片または単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であり、当業者に公知である。それらは、ラクダに見られる重鎖のみの抗体に由来する（Hamers-Casterman et al., 1993, Nature, 363, p. 446-448；Desmyter et al., 1996, Nat. Struct. Biol., p. 803-811）。「ラクダ」科では、軽鎖ポリペプチドを欠如する免疫グロブリンが見出される。「ラクダ」は、旧大陸ラクダ（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Camelus dromedarius））、ならびに新大陸ラクダ（例えば、アルパカ（Lama paccos）、リャマ（Lama glama）、グアナコ（Lama guanicoe）、およびビクーニャ（Lama vicugna））を含む。単一可変ドメイン重鎖抗体は、本明細書において、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）またはＶＨＨ抗体として示される。Ｎｂの大きさが小さいことおよび独自の生物物理学的特性は、一般的でないまたは隠れたエピトープの認識に関して、およびタンパク質標的の腔または活性部位への結合に関して通常の抗体断片より優れている。さらに、Ｎｂは、レポーター分子に付着したまたはヒト化された、多重特異性および多価抗体として設計することができる。Ｎｂは、安定で、消化管系で分解されることなく、容易に製造することができる。
【０１１０】
別の実施形態において、抗体は二重特異性抗体である。異なる特異性の２つの抗原結合部位を１つの構築物に統合すると、二重特異性抗体は、優れた特異性を有する２つの異なる抗原を一つにする能力を有し、したがって、治療剤として非常に有望である。二重特異性抗体は、それぞれが異なる免疫グロブリンを産生することができる、２つのハイブリドーマを融合することによって当初作製された。二重特異性抗体はまた、完全な免疫グロブリンに存在するＦｃ部分を除外しながら２つのｓｃＦｖ抗体断片を接続させることによっても産生される。そのような構築物におけるそれぞれのｓｃＦｖ単位は、合成ペプチドリンカーによって互いに接続した、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）抗体鎖のそれぞれからの１つの可変ドメインを含み、後者はしばしば、タンパク質分解に対して最大限の抵抗性を残しながら最小の免疫原性となるように遺伝子改変されている。それぞれのｓｃＦｖ単位を、２つのｓｃＦｖ単位を架橋する短い（通常、１０アミノ酸未満）ポリペプチドスペーサーを組み込むことを含む、多数の公知の技術によって接続して、それによって二重特異性一本鎖抗体を作製してもよい。したがって、得られた二重特異性一本鎖抗体は、それぞれのｓｃＦｖ単位におけるＶＨおよびＶＬドメインが、これらの２つのドメイン間の分子内会合を可能にするために十分に長いポリペプチドリンカーによって隔てられており、そのように形成されたｓｃＦｖ単位が、例えば１つのｓｃＦｖ単位のＶＨドメインと他のｓｃＦｖ単位のＶＬドメインとの間での望ましくない会合を防止するために十分に短く維持されるポリペプチドスペーサーを通して互いに連続してつながれている、１つのポリペプチド鎖上で異なる特異性の２つのＶＨ／ＶＬ対を含む種である。
【０１１１】
使用するために適した抗体断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片；（ｉｉｉ）１つの抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなる「Ｆｖ断片」；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインが、２つのドメインを会合させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号明細書を参照されたい）；および（ｉｘ）ダイアボディ、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号明細書）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を取り込むことによって安定化されうる。ＣＨ３ドメインに接続したｓｃＦｖを含むミニボディ（Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055-3061）も同様に、有用でありうる。加えて、抗体様結合ペプチド模倣体も同様に、実施形態において企図される。「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）は、小さい抗体として作用し、より長い血清中半減期およびより面倒でない合成方法という特定の利点を有するペプチドであり、Liu et al., 2003, Cell Mol. Biol., 49:209-216によって報告されている。
【０１１２】
動物に、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたはペプチドなどの抗原を接種して、免疫応答を生成させて、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに対して特異的な抗体を産生してもよい。免疫応答を増強するために、しばしば、抗原を別の分子に結合またはコンジュゲートさせる。本明細書において使用されるように、コンジュゲートは、動物において免疫応答を誘発するために使用される、抗原に結合する任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質様物質である。抗原の接種に応答して動物において産生される抗体は、多様な個々の抗体産生Ｂリンパ球によって作製される多様な非同一の分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体は、そのそれぞれが、同じ抗原上の異なるエピトープを認識しうる抗体種の混合集団である。動物におけるポリクローナル抗体産生に対する正確な条件を考慮すると、動物の血清中の抗体のほとんどは、動物が免疫されている抗原性化合物上の集合的エピトープを認識する。この特異性を親和性精製によってさらに増強して、目的の抗原またはエピトープを認識するそれらの抗体のみを選択する。
【０１１３】
モノクローナル抗体は、全ての抗体産生細胞が、１つの抗体産生Ｂリンパ球（または他のクローン細胞、例えば抗体分子を組み換え発現する細胞）に由来することから、あらゆる抗体分子が同じエピトープを認識する抗体の１つのクローン種である。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製する方法は、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ方向に沿って始まる。いくつかの実施形態において、マウスおよびラットなどの齧歯類を、モノクローナル抗体の生成に使用する。いくつかの実施形態において、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞がモノクローナル抗体の生成に使用される。ラットの使用は周知であり、特定の利点を提供しうる。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は日常的に使用され、一般的に、安定な融合体を高い割合で生じる。モノクローナル抗体産生に使用されるハイブリドーマ技術は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはペプチドによって予め免疫したマウスから単離した１つの抗体産生Ｂリンパ球と、不死化骨髄腫細胞、例えばマウス骨髄腫細胞株との融合を伴う。この技術は、１つの抗体産生細胞を、無限の世代にわたって繁殖させる方法を提供し、それによって同じ抗原またはエピトープ特異性を有する構造的に同一の抗体、すなわちモノクローナル抗体の無限の量が産生されうる。
【０１１４】
モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖定常ドメインを、外来抗体の可変領域をインタクトにしたままで、ヒト起源の類似のドメインで置き換える方法が開発されている。あるいは、「完全ヒト」モノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるマウスまたはラットにおいて産生する。齧歯類とヒトの両方のアミノ酸配列を有する抗体可変ドメインを組み換えにより構築することによって、モノクローナル抗体の可変ドメインを、よりヒト形態に変換する方法も同様に開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変ＣＤＲのみが非ヒト（例えば、マウス、ラット、ニワトリ、ラマなど）モノクローナル抗体に由来して、フレームワーク領域は、ヒト抗体アミノ酸配列に由来する。齧歯類の特徴である抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置で見出されるアミノ酸配列に置き換えると、ヒトにおいて治療的に使用する際の外来タンパク質に対する有害な免疫反応の可能性を低減させる。ハイブリドーマまたは他の抗体産生細胞を同様に、ハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を変更しうるまたは変更しない遺伝子変異または他の変化に供してもよい。
【０１１５】
モノクローナル抗体および他の抗体および組み換えＤＮＡ技術を使用して改変抗体を作製して、当初の抗体の抗原またはエピトープ結合特異性を保持する他の抗体またはキメラ抗体を産生してもよく、すなわち分子は、特異的結合ドメインを有する。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる抗体のフレームワーク領域、定常領域、または定常領域プラスフレームワーク領域に対する遺伝子材料に導入することを伴い得る。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０９１，５１３号明細書および同第６，８８１，５５７号明細書を参照されたい。
【０１１６】
本明細書において記述される公知の手段によって、そのような抗原またはエピトープが天然起源から単離されたか、または天然化合物の合成誘導体もしくは変種であるか否かによらず、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質、１つもしくは複数のそのそれぞれのエピトープ、または前述のいずれかのコンジュゲートに特異的に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、結合活性、結合ドメイン、およびＣＤＲを有する抗体断片（前述の任意の改変形態を含む）を作製してもよい。
【０１１７】
抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源から産生してもよい。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。加えて、より新しい技術によって、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリによりヒト抗体の開発およびスクリーニングが可能である。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９４６，５４６号明細書に記述されるように、動物の免疫を行うことなく、バクテリオファージ抗体発現技術によって、特異的抗体を産生することができる。これらの技術は、Marks et al., 1992, Bio/Technol., 10:779-783；Stemmer, 1994, Nature, 370:389-391；Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580；Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813；およびSchier et al., 1996, Gene, 169(2):147-155に詳しく記述されている。
【０１１８】
様々な動物種においてポリクローナル抗体を産生する方法、ならびにヒト化、キメラ、および完全ヒトを含む様々なタイプのモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知であり、非常に再現性が高い。例えば、以下の米国特許は、そのような方法の説明を提供するものであり、参照により全体が本明細書に組み込まれる：米国特許第３，８１７，８３７号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９３９，３５０号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，１９６，２６５号明細書；同第４，２７５，１４９号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，３６６，２４１号明細書；同第４，４６９，７９７号明細書；同第４，４７２，５０９号明細書；同第４，６０６，８５５号明細書；同第４，７０３，００３号明細書；同第４，７４２，１５９号明細書；同第４，７６７，７２０号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第４，８６７，９７３号明細書；同第４，９３８，９４８号明細書；同第４，９４６，７７８号明細書；同第５，０２１，２３６号明細書；同第５，１６４，２９６号明細書；同第５，１９６，０６６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，４２０，２５３号明細書；同第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，６２７，０５２号明細書；同第５，６５６，４３４号明細書；同第５，７７０，３７６号明細書；同第５，７８９，２０８号明細書；同第５，８２１，３３７号明細書；同第５，８４４，０９１号明細書；同第５，８５８，６５７号明細書；同第５，８６１，１５５号明細書；同第５，８７１，９０７号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第６，０５４，２９７号明細書；同第６，１６５，４６４号明細書；同第６，３６５，１５７号明細書；同第６，４０６，８６７号明細書；同第６，７０９，６５９号明細書；同第６，７０９，８７３号明細書；同第６，７５３，４０７号；同第６，８１４，９６５号明細書；同第６，８４９，２５９号明細書；同第６，８６１，５７２号明細書；同第６，８７５，４３４号明細書；同第６，８９１，０２４号明細書；同第７，４０７，６５９号明細書；および同第８，１７８，０９８号明細書。
【０１１９】
本明細書において記述されるグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、動物種、モノクローナル細胞株、または他の抗体起源によらず、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１の効果を中和、遮断、阻害、または拮抗する能力を有すると予想される。ある特定の動物種は、それらが、抗体の「Ｆｃ」部分を通して補体系の活性化により免疫応答またはアレルギー応答を引き起こす可能性がありうることから、治療抗体を作製するためにはあまり好ましくない。しかし、抗体全体を、「Ｆｃ」（補体結合）断片および結合ドメインまたはＣＤＲを有するペプチド断片へと酵素的に消化してもよい。Ｆｃ部分の除去は、この抗体断片が望ましくない免疫応答を誘発する可能性を低減させ、このように、Ｆｃ部分を有しない抗体は、予防的または治療的処置にとって好ましくなりうる。上記のように、抗体はまた、キメラ、ヒト化、または部分的もしくは完全なヒトとなるように、別の種において産生されているまたは別の種からのアミノ酸配列を有する抗体を動物に投与することに起因する、潜在的に有害な免疫学的効果を低減または消失させるように構築されうる。
【０１２０】
置換変種は典型的に、タンパク質内の１つまたは複数の部位で１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み、他の機能もしくは特性の喪失を伴うまたは伴うことなく、ポリペプチドの１つまたは複数の特性を調節するように設計されうる。置換は保存的、すなわち１つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸に置き換えられる置換でありうる。保存的置換は、上記の表１に記述される通りである。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受ける非保存的であってもよい。非保存的変化は典型的に、ある残基を化学的に異なる残基に置換すること、例えば極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸に置換することおよびその逆を伴う。
【０１２１】
抗体タンパク質は、組み換えであってもよく、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されてもよい。本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体含有組成物において、全抗体ポリペプチドが１ｍｌあたり約０．００１ｍｇから１０ｍｇの間で存在すると企図される。このため、組成物中の抗体タンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くて約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上（またはそれらから誘導可能な任意の範囲）でありうるかまたはそれらに等しい。この中で、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、約、少なくとも約、多くて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％でありうるか、またはそれらに等しい。
【０１２２】
抗体または結合活性を保持する抗体の免疫学的部分を、他のタンパク質に化学的にコンジュゲートさせることができ、または他のタンパク質との融合タンパク質として組み換え発現させることができる。本明細書において記述される目的として、そのような全ての融合タンパク質が、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。いくつかの実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対して作製された抗体および抗体様分子、または少なくとも１つの薬剤と連結して抗体コンジュゲートもしくはペイロードを形成するポリペプチドが包含される。診断または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、慣例的に少なくとも１つの所望の分子または部分を抗体に連結または共有結合または複合体形成させる。そのような連結された分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子でありうるがこれらに限定されるわけではない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に付着されうるエフェクター分子の非限定的な例には、毒素、治療的酵素、抗体、放射標識ヌクレオチドなどが挙げられる。これに対し、レポーター分子は、アッセイを使用して検出されうる任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされうるレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンなどが挙げられる。抗体をコンジュゲート分子または部分に付着またはコンジュゲートさせるいくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの付着方法は、非限定的な例として有機キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／または抗体に付着させたテトラクロロ−３−６α−ジフェニルグリクリル−３を使用する、金属キレート錯体を使用することを伴う。抗体、特に本明細書において記述されるモノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応しうる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、慣例的に、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。別の実施形態において、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体、特にその結合断片を、投与後の血漿、血清、または血液中のそのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させるために、化合物または物質、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングまたは連結させてもよい。
【０１２３】
特定の実施形態において、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的かつ優先的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体が提供される。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば配列番号１に記載されるＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列のＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、および／またはＮ２１９位でグリコシル化されているＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的または優先的に結合する。あるいは、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、３次元空間においてＮ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、またはＮ２１９位の１つまたは複数の近位に結合し、例えば、グリコシル化残基または複数の残基を隠すまたは遮断しうる。例えば、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の特異的または選択的結合は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの半分より小さいＫｄでＰＤ−Ｌ１抗原への抗体の結合を伴う。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、実施例５に記述される細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いＭＦＩとして表される結合を示す。
【０１２４】
特定の実施形態は、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＳＴＭ００４である、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対して特異的な抗体、またはその結合断片を提供する。他の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において配列番号１に記載されるヒトＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列のＹ５６、Ｋ６２、およびＫ７５位のアミノ酸残基に対応するＰＤ−Ｌ１上のエピトープに特異的に結合する。ＳＴＭ００４は、ＰＤ−Ｌ１内の非連続のアミノ酸に結合し、エピトープはコンフォメーションエピトープである。ＳＴＭ００４  ＭＡｂエピトープを包含するヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの部分は、配列ＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨ（配列番号９３）を有する。本明細書において示されるように、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４によって認識されるエピトープを構成するアミノ酸残基Ｙ５６、Ｋ６２、およびＫ７５を下線で示す。
【０１２５】
別の特定の実施形態は、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＳＴＭ１１５である、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対して特異的な抗体、またはその結合断片を提供する。他の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において配列番号１に記載されるヒトＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列のＫ６２、Ｈ６９、およびＫ７５位のアミノ酸残基に対応するＰＤ−Ｌ１上のエピトープに特異的に結合する。ＳＴＭ１１５  ＭＡｂエピトープを包含するヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの部分は、配列番号１内の配列ＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨを有する。本明細書において示されるように、ＭＡｂ  ＳＴＭ１１５によって認識されるエピトープを構成するアミノ酸残基Ｋ６２、Ｈ６９、およびＫ７５を下線で示す。
【０１２６】
ＳＴＭ００４  ＭＡｂの重鎖および軽鎖可変（Ｖ）ドメインの核酸（ＤＮＡ）および対応するアミノ酸配列を、以下の表３に示す。表３は、ＳＴＭ００４の成熟（すなわち、シグナルペプチドを含まない）ＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれ、配列番号２、３、１０、および１１）、ならびにシグナルペプチドを含むＶＨおよびＶＬドメイン配列（それぞれ、配列番号８５、８６、８７、および８８）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方を提供する。表３に示される重鎖および軽鎖ドメインを含むシグナル配列の重鎖ＤＮＡおよびタンパク質Ｖドメイン配列において、アミノ末端シグナル配列（それぞれ、ＶＨドメインのヌクレオチド１〜５７およびアミノ酸１〜１９、ならびにＶＬドメインのヌクレオチド１〜６０およびアミノ酸１〜２０）をイタリック体で表す。同様に、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方の付番定義を使用する、ＳＴＭ００４  ＭＡｂ重鎖および軽鎖ＶドメインＣＤＲを表３に示す。
【０１２７】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のＶＨドメインおよび配列番号１１のＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号３のＶＨドメインと配列番号１１のＶＬドメインとを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインとを含む。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、上記のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにそのＣＤＲを含む抗体と競合する。
【０１２８】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のアミノ酸配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＨドメイン、および／または配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＬドメインを含み、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害または遮断する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列それぞれに関して、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメインを含み、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、（ａ）少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列それぞれに関して、または配列番号５、配列番号７、および配列番号９のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメインと、（ｂ）少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインとを含み、抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する。同様に、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、またはＩＭＧＴ定義ＣＤＲを使用して、ヒトフレームワーク領域、および任意選択でヒト定常ドメインを有するＳＴＭ００４のヒト化形態が提供される。
【０１２９】
前述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質と比較して示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の結合親和性は、下限および上限値を含む、５〜２０ｎＭまたは５〜１０ｎＭである。一実施形態において、実施例５に記述される細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいＭＦＩとして表される結合を示す。
【０１３０】
一実施形態において、抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害し、特にエフェクターＴ細胞によって発現されるＰＤ−１と、腫瘍細胞によって発現されるＰＤ−Ｌ１、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する。
【０１３１】
別の特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＳＴＭ１１５である、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗体またはその結合断片が提供される。ＳＴＭ１１５  ＭＡｂの成熟重鎖および軽鎖可変（Ｖ）ドメイン（配列番号１８、１９、２６、および２７）の核酸（ＤＮＡ）および対応するアミノ酸配列を以下の表３に示す。プロセシングされていない重鎖および軽鎖Ｖドメイン配列（すなわち、Ｎ−末端のシグナル配列を含む配列）のＤＮＡおよびアミノ酸配列も同様に、表３（配列番号８９、９０、９１、および９２）に示し、アミノ末端シグナル配列をイタリック体（ＶＨドメインのヌクレオチド１〜５７およびアミノ酸１〜１９、ならびにＶＬドメインのヌクレオチド１〜６６およびアミノ酸１〜２２）で表す。同様に、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方の定義に従う、ＳＴＭ１１５  ＭＡｂ重鎖および軽鎖ＶドメインＣＤＲも表３に示す。
【０１３２】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列のＶＨドメインと、配列番号２７のアミノ酸配列のＶＬドメインとを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号１９のアミノ酸配列のＶＨドメインと、配列番号２７のアミノ酸配列のＶＬドメインとを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む抗体と競合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＫａｂａｔ  ＣＤＲ１〜３、またはその組み合わせを含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインとを含む。実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、上記のＶＨおよびＶＬドメインならびにそのＣＤＲを含む抗体と競合する。
【０１３３】
一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＨドメインと、配列番号２７のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＬドメインとを含む。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列それぞれ、またはその組み合わせを有するＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメインを含む。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、（ａ）少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４のアミノ酸配列それぞれに関して、または配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列それぞれ、またはその組合せに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＨドメイン、および／または（ｂ）少なくとも１、２または３個全てのＣＤＲが配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２のアミノ酸配列それぞれに関して少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有するＣＤＲ１〜３を含むＶＬドメインを含む。同様に、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、またはＩＭＧＴ定義ＣＤＲを使用して、ヒトフレームワーク領域、および任意選択でヒト定常ドメインを有するＳＴＭ１１５のヒト化形態が提供される。
【０１３４】
実施形態において、前述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄの半分より小さいＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較して示されるＫｄより少なくとも５分の１のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質と比較して示されるＫｄの少なくとも１０分の１未満のＫｄでグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する。一実施形態において、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対するＳＴＭ１１５の結合親和性は、下限および上限値を含む、５〜２０ｎＭまたは５〜１０ｎＭである。一実施形態において、実施例５に記述される細胞フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、抗体は、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合に対するＭＦＩより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいＭＦＩとして表される結合を示す。これらの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害し、特にエフェクターＴ細胞によって発現されるＰＤ−１と、腫瘍細胞によって発現されるＰＤ−Ｌ１、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する。
【０１３５】
別の実施形態は、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合して、通常の競合法によってアッセイするときに、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１への特異的結合に関して、本明細書において記述されるＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５と競合または交叉競合する、単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を提供する。一態様において、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４またはＭＡｂ  ＳＴＭ１１５と同じエピトープに結合する単離抗体、例えばモノクローナル抗体またはその結合断片が提供される。
【０１３６】
別の実施形態は、配列番号１の成熟ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列内に位置する、ＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨ（配列番号９３）から選択されるアミノ酸配列内のエピトープに特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。
【０１３７】
別の実施形態は、配列番号１のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ５６、Ｋ６２、およびＫ７５を含むエピトープに結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一態様において、以下のアミノ酸残基、配列番号１のＹ５６、Ｋ６２、またはＫ７５の少なくとも１つを含むエピトープでグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１ｌ抗体が提供される。別の実施形態は、配列番号１のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｋ６２、Ｈ６９、およびＫ７５を含むエピトープに結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一態様において、以下のアミノ酸残基、配列番号１のＫ６２、Ｈ６９、またはＫ７５の少なくとも１つを含むエピトープでグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１、すなわちグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１のエピトープ領域を含むアミノ酸残基の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つに接触する。
【０１３８】
なお別の実施形態は、配列番号１のＬ４８〜Ｈ７８のアミノ酸領域内、またはＤ６１〜Ｈ７８のアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープでグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。一実施形態において、配列番号１のＬ４８〜Ｈ７８のアミノ酸領域内で以下の群のアミノ酸残基：Ｙ５６、Ｋ６２、Ｋ７５を含むエピトープでグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。別の実施形態において、配列番号１のＬ４８〜Ｈ７８のアミノ酸領域内で、またはＤ６１〜Ｈ７８のアミノ酸領域内で以下の群のアミノ酸残基：Ｋ６２、Ｈ６９、Ｋ７５を含むエピトープでグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が提供される。
【０１３９】
なお別の実施形態は、配列番号２もしくは１８と少なくとも９０〜９８％同一であるヌクレオチド配列を含む抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１  ＶＨドメインをコードする、および／または配列番号１０もしくは２６と少なくとも９０〜９８％同一であるヌクレオチド配列を含む抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体ＶＬドメインをコードする単離核酸分子を提供する。実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２もしくは１８、または配列番号１０もしくは２６とそれぞれ、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である。
【０１４０】
【表３−１】
2018512175.tif 000004
【０１４１】
【表３−２】
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【０１４２】
【表３−３】
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【０１４３】
【表３−４】
2018512175.tif 000007
【０１４４】
疾患の処置
ある特定の態様において、本明細書における実施形態に記述される抗体またはその抗原結合断片（例えば、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的かつ優先的に結合して、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断または阻害する抗体）は、がんを処置するための処置方法において使用され、投与されうる。したがって、本明細書において、がんを処置するために、本明細書において記述される少なくとも１つの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによって、がんを処置する方法を提供する。対象は、好ましくはヒト患者である。本明細書において述べたように、処置または治療的処置は、患者におけるがん細胞の成長、増殖、遊走などを低減させる、防止する、阻害する、または遮断する、特に、がん細胞の細胞殺滅またはアポトーシスを促進することを伴う。記述の方法は、特に免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、特にキラーまたは細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表面で発現するＰＤ−１に結合／相互作用することができるＰＤ−Ｌ１細胞表面タンパク質を発現する対象の腫瘍細胞に関して、処置を受けている対象、好ましくはヒト対象に利益を提供する。
【０１４５】
これらの対象を、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つの有効量によって処置すると、腫瘍細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１への抗体の結合が起こり、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞とＰＤ−１発現Ｔ細胞との相互作用を防止、遮断、または阻害して、それによってＴ細胞活性の免疫抑制を防止または回避して、Ｔ細胞を活性化させてＰＤ−Ｌ１を有する腫瘍細胞を殺滅させることができると予想される。したがって、提供される方法は、本発明の方法の実践によって得られる抗がん結果を必要とする、抗がん結果から利益を得ることができる、または抗がん結果の利益を受けることを望む対象にとって有利である。対象が、少なくとも１つの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の治療有効量の投与を伴う方法の治療上の利益を求めること、またはそのような治療上の利益を受けることは、当技術分野に利点をもたらす。加えて、本発明の方法は、副作用、有害な転帰、禁忌などを消失もしくは回避させる利点、または他の処置および処置モダリティと比較してそのような問題が起こるリスクもしくは可能性を低減させるさらなる利点を提供する。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、方法は、本明細書において記述される２つまたはそれ以上の異なる抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与を含む。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の同時投与は、いずれかの抗体単独の投与より治療上もしくは予防上有効でありうる、および／またはいずれかの抗体単独より低用量もしくは少ない回数での投与が可能となりうる。
【０１４７】
本発明の処置方法が有用であるがんは、任意の悪性細胞タイプ、例えば固形腫瘍または血液腫瘍において見出されるがんを含む。一般的に、腫瘍は、任意の大きさの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊を指し、原発腫瘍および二次腫瘍を含む。固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体を含まない異常な組織塊または成長である。例示的な固形腫瘍には、膵臓、胆嚢、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、精巣、腎臓、咽頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、および乳房からなる群より選択される臓器の腫瘍が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例示的な血液腫瘍には、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書において提供される方法を使用して処置されうるがんのさらなる例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん（gastric cancer）または胃がん（stomach cancer）（消化管がん、および消化管間質がんを含む）、膵臓がん、胆嚢がん、神経膠芽腫、子宮頚がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん（kidney cancer）または腎臓がん（renal cancer）、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、肢端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中間悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中間悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み型細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるがこれらに限定されるわけではない
【０１４８】
がんは、具体的に以下の組織学タイプのがんでありうるが、これらに限定される必要はない：悪性新生物；癌腫；未分化癌；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺癌、腺腫様ポリープ；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；膠様腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を有する腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫瘍；悪性男性胚細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣型横紋筋肉腫；間質性肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；原線維性星細胞腫；星芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経芽細胞腫；原始神経外胚葉腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の明記された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球腫；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ球性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核球性白血病；骨髄肉腫；およびヘアリーセル白血病。
【０１４９】
処置されるがんは、好ましくはＰＤ−Ｌ１陽性、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１陽性である。ある特定の実施形態において、腫瘍細胞はまた、例えば乳がんに対する腫瘍細胞マーカー、例えばＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ発現に関して陽性である。これらのマーカーの存在または非存在は、ＥＧＦＲ陽性がんに対する標的化治療薬、例えばゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、またはＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性がんに対するハーセプチンとの併用治療が、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と二重に機能することを示しうる。このように、ある特定の実施形態は、記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を、第２のがんマーカーを標的とするがんの治療薬、例えばゲフィチニブなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤と併用して投与することを含む、がんに罹患している対象における、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に関して陽性である、およびＥＧＦＲなどの第２のがんマーカーに関して陽性であるがんの処置方法を提供する。そのような併用によって、副作用、毒性の低減などを含む、治療有効性の改善が得られうる。ある特定の実施形態において、がんはＢＬＢＣである。
【０１５０】
治療の選択を誘導するためにがんを特徴付けするためまたは治療をモニターするために使用されうる他のマーカーには、非小細胞肺がんおよび異型性大細胞リンパ腫におけるＡＬＫ遺伝子の再配列および過剰発現；肝臓がんおよび胚細胞腫瘍に関するα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）；多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、およびいくつかのリンパ腫に関するβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；絨毛がんおよび胚細胞腫瘍に関するβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−ｈＣＧ）；卵巣がんおよび乳がんに関するＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子変異；慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄性白血病に関するＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子（フィラデルフィア染色体）；皮膚黒色腫および結腸直腸がんに関するＢＲＡＦ  Ｖ６００変異；消化管間質腫瘍および粘膜黒色腫に関するＣ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７；乳がんに関するＣＡ１５−３／ＣＡ２７．２９；膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、および胃がんに関するＣＡ１９−９；卵巣がんに関するＣＡ−１２５；甲状腺髄様がんに関するカルシトニン；結腸直腸がんおよびいくつかの他のがんに関する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；非ホジキンリンパ腫に関するＣＤ２０；神経内分泌腫瘍に関するクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）；膀胱がんに関する第３、７、１７および９ｐ２１染色体；肺がんに関するサイトケラチン断片２１−１；非小細胞肺がんに関するＥＧＦＲ遺伝子変異分析；乳がんに関するエストロゲン受容体（ＥＲ）／プロゲステロン受容体（ＰＲ）；膀胱がんに関するフィブリン／フィブリノーゲン；卵巣がんに関するＨＥ４；乳がん、胃がん、および胃食道接合部腺癌に関するＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子増幅またはタンパク質過剰発現；多発性骨髄腫およびワルデンストレームマクログロブリン血症に関する免疫グロブリン；結腸直腸癌および非小細胞肺がんに関するＫＲＡＳ遺伝子変異分析；胚細胞腫瘍、リンパ腫、白血病、黒色腫、および神経芽細胞腫に関する乳酸デヒドロゲナーゼ；小細胞肺がんおよび神経芽腫に関するニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）；膀胱がんに関する核マトリクスタンパク質２２；前立腺がんに関する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；甲状腺がんに関するサイログロブリン；ならびに乳がんに関するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）が挙げられる。
【０１５１】
抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体、例えばモノクローナル抗体は、多様なモダリティにおいて抗腫瘍剤として使用されうる。特定の実施形態は、抗腫瘍剤として抗体を使用する方法に関し、したがって、抗体または抗体を含む組成物の治療有効量を腫瘍細胞集団に、腫瘍細胞の成長を遮断または阻害するために十分な期間、接触させることを含む。一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞に接触させることは、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を含む生理学的に忍容可能な組成物の治療有効量を、例えば静脈内、皮下、腹腔内、または腫瘍内注射によって、それを必要とする患者に投与することによって達成される。抗体は、注射または経時的な徐々の注入によって非経口投与されてもよい。有用な投与および送達レジメンには、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、皮内、蠕動ポンプ手段、または腫瘍細胞を含む組織への直接注射が挙げられる。
【０１５２】
抗体を含む治療組成物は、慣例的に静脈内に、例えば単位用量の注射によって投与される。治療組成物を参照して使用される用語「単位用量」は、それぞれの単位が、必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の既定量を含む、対象の単位投与量として適した物理的に個別の単位を指す。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物は、投与製剤と適合性である方法で、治療有効量で投与される。投与される量は、処置される対象、対象の系が活性成分を利用する能力、所望の治療効果の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存して、個々の個体に特異的である。しかし、全身適用に関して適した投与量範囲が本明細書において開示され、投与経路に依存する。初回および追加投与にとって適したレジメンも同様に企図され、典型的に初回投与後に１つまたは複数の間隔（時間）で皮下注射または他の投与による繰り返し投与を伴いうる。例示的な複数回投与は、抗体の高い血清中および組織レベルを持続的に維持するために適している。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療に関して明記された範囲で血液中の濃度を維持するために十分な持続的な静脈内注入が企図される。
【０１５３】
本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、局所進行または転移性がんを有するがん患者において、疾患を処置するために、例えば腫瘍細胞の成長を阻害するために、またはがん細胞を殺滅させるために全身または局所投与されうると企図される。抗体は、単独で、または抗増殖薬もしくは抗がん薬と併用して投与されうる。一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、手術または他の技法前に患者におけるがんの負荷を低減させるために投与される。あるいは、残っているいかなるがん（例えば、手術によって除去できなかったがん）も大きさまたは成長能が確実に低減されるように、および／または確実に生存しないように、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を、術後、定期的な間隔で投与することができる。上記で注目したように、抗体の治療有効量は、所望の効果を達成するように計算された既定量である。このため、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与のための投与量範囲は、腫瘍細胞分裂および細胞周期進行の兆候が低減される所望の効果を生じるために十分に大きい範囲である。最適には、投与量は、有害な副作用、例えば過粘稠度症候群、肺浮腫、うっ血性心不全、神経学的効果などを引き起こすほど多量であってはならない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、体格、および性別、ならびに疾患の程度によって変化し、内科医または臨床医などの当業者が決定することができる。当然、いずれかの合併症が起こった場合には、個々の医師が投与量を調節することができる。
【０１５４】
処置方法
ある特定の実施形態において、記述の組成物および方法は、本明細書に記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の単独投与、または第２のもしくは追加の薬物もしくは治療との併用投与を伴う。そのような薬物または治療は、ＰＤ−Ｌ１またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１、好ましくはヒトＰＤ−Ｌ１もしくはグリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１との相互作用に関連する任意の疾患の処置に適用されうる。例えば、疾患はがんでありうる。非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１または変種グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質に優先的に結合する少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物および方法は、がんまたは他の疾患の処置において、特にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を防止、低減、遮断、または阻害して、それによって治療効果および処置を提供することによって、治療効果または保護効果を有する。
【０１５５】
併用治療を含む組成物および方法は、治療効果もしくは保護効果を有し、治療効果もしくは保護効果を増強し、および／または別の抗がん治療もしくは抗増殖剤治療の治療効果を増加させうる。治療および予防の方法ならびに組成物は、所望の効果、例えばがん細胞の殺滅および／または細胞の過増殖の阻害を達成するために有効な併用量で提供されうる。このプロセスは、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片と、第２の治療とを投与することを伴いうる。第２の治療は、直接の細胞傷害効果を有しても有しなくてもよい。例えば、第２の治療は、直接の細胞傷害作用を有することなく免疫系をアップレギュレートする薬剤でありうる。組織、腫瘍および／または細胞に、１つもしくは複数の薬剤（例えば、抗体もしくは抗がん剤）を含む１つもしくは複数の組成物もしくは薬理学的製剤を曝露するか、または組織、腫瘍、および／もしくは細胞に、２つもしくはそれ以上の異なる組成物もしくは製剤を曝露することができ、１つの組成物は、例えば、１）抗体、２）抗がん剤、３）抗体と抗がん剤の両方、または４）２つもしくはそれ以上の抗体を提供する。いくつかの実施形態において、第２の治療もまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、好ましくは非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体であるか、または他の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体である。限定されないが、例示的な抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブおよびニボルマブを含み、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体はアテゾリズマブを含む。同様に、そのような併用治療は、化学療法、放射線療法、外科療法、または免疫療法と共に使用されうると企図される。
【０１５６】
例として、用語「接触した」および「曝露した」は、細胞に適用されるとき、本明細書において、特に腫瘍またはがん細胞の表面で発現または高度に発現した標的抗原、例えばＰＤ−Ｌ１、特にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するように、治療ポリペプチド、好ましくは本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を標的細胞に送達するかまたは標的細胞の直接近位に配置するプロセスを記述するために使用される。治療的抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片によるそのような結合は、腫瘍またはがん細胞が発現するＰＤ−Ｌ１とエフェクターＴ細胞上のＰＤ−１との相互作用を防止、遮断、阻害、または低減させて、それによって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に関連する免疫抑制を防止する。実施形態において、化学療法剤または放射線療法剤はまた、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片と共に対象に投与または送達される。細胞の殺滅を達成するために、例えば１つまたは複数の薬剤は、細胞を殺滅させるためにまたは細胞が分裂するのを防止するために有効な併用量で細胞に送達される。
【０１５７】
抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、別の抗がん処置に対してその前に、間に、後に、または様々な組み合わせで投与されうる。投与は、互いを前後として、同時から数分まで、数日まで、数週間までの範囲の間隔でありうる。抗体が抗がん剤とは別に患者に提供される実施形態において、投与された化合物が患者に対して有利な併用効果をなおも発揮することができるように、一般的に、それぞれの送達時間の間に有意な時間が経過しないように確保される。実例として、そのような例において、患者に抗体と抗がん治療とを互いに約１２〜２４時間または７２時間以内に、より詳しくは互いに約６〜１２時間以内に提供してもよいと企図される。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する、処置期間の有意な延長が望ましいと予想される。
【０１５８】
ある特定の実施形態において、一連の処置または処置サイクルは、１〜９０日またはそれ以上持続すると予想される（この範囲はその間の日および最後の日を含む）。１つの薬剤を、１日〜９０日のいずれかの日（このような範囲はその間の日および最後の日を含む）にまたはその任意の組み合わせで投与してもよく、別の薬剤が１日〜９０日（このそのような範囲は、その間の日および最後の日を含む）またはその任意の組み合わせのいずれかの日に投与されると企図される。１日の間（２４時間の期間）に、患者に、薬剤を１回または複数回投与してもよい。その上、一連の処置の後、抗がん処置が投与されない期間が存在してもよいと企図される。この期間は、患者の状態、例えば予後、体力、健康などに応じて、例えば１〜７日間、および／または１〜５週間、および／または１〜１２ヶ月またはそれ以上持続してもよい（このそのような範囲は、その間の日および上限の時点を含む）。処置のサイクルは必要に応じて繰り返される。様々な処置の組み合わせを使用してもよい。以下に示す併用処置レジメンの代表的な例において、抗体、例えば抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を「Ａ」で表し、抗がん治療を「Ｂ」で表す。
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１５９】
本実施形態の任意の抗体または治療の患者への投与は、もしあるとすれば、薬剤の毒性を考慮に入れて、そのような化合物を投与するための一般的プロトコールに従う。したがって、いくつかの実施形態において、有害事象および毒性、特に併用治療に帰することができる有害事象および毒性をモニターするステップが存在する。
【０１６０】
一実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を単独または別の抗がん剤と併用して、それを必要とする患者、すなわちがんまたは腫瘍を有する患者に投与することを伴う方法が提供される。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与前に、患者の腫瘍またはがんの試料をＰＤ−Ｌ１の存在に関して評価してもよい。そのような評価の結果によって、患者の腫瘍またはがんがグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に関して陽性であることが判明すれば、患者のｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１＋腫瘍またはがんが抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体による処置により感受性がある可能性、および処置を進めて有益な転帰が得られる可能性がより高いことに基づいて、患者を処置に関して選択する。医療の専門家または医師は、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体処置方法を進めるように患者に助言を与えてもよく、患者は医療の専門家または医師の助言に基づいて処置を進めることを決定してもよい。加えて、一連の処置において、患者の腫瘍またはがん細胞を、処置の進行または有効性をモニターする方法として、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在に関してアッセイしてもよい。アッセイによって、例えば、患者の腫瘍またはがん細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の変化、喪失、または減少が示される場合、医療の専門家は患者と共に、処置を継続すべきか否か、または何らかの方法で変更すべきか、例えばより高い投薬量に、別の抗がん剤もしくは治療を追加するか否かなどを決定してもよい。
【０１６１】
化学療法
広く多様な化学療法剤が、本実施形態の処置または治療方法に従って使用されうる。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を意味する。そのような薬剤または薬物は、細胞内でのその活性様式、例えばそれらが細胞周期、細胞成長、および増殖のどの段階に影響を及ぼすかによって分類される。あるいは、化学療法剤は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡにインターカレートする、または細胞における核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および分裂異常を導入するその能力に基づいて特徴付けされうる。
【０１６２】
化学療法剤の非限定的な例には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル類、例えばブスルファン、イムプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンアミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールアミンを含むエチレンイミン類およびメチルアメラミン類；アセトゲニン類（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン類（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトジェンマスタード類、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロフォスフェミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エネジイン系抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシン・ガンマ１Ｉ、カリケアミシン・オメガＩ１；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート類、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質、エンジイン系抗生物質発色団、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎皮質剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補給剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド類、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；ジゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’−２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド類、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えば、レチン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス型白金製剤、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１６３】
放射線療法
放射線療法は、ＤＮＡの損傷を引き起こす薬剤による処置を含む。放射線療法は、がんおよび疾患の処置において広く使用されており、一般的にγ線、Ｘ線として知られるもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達を包含する。他の形態のＤＮＡ損傷因子、例えばマイクロ波、光子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号明細書および同第４，８７０，２８７号明細書）、およびＵＶ照射も同様に企図される。これらの要因は全て、ＤＮＡそのもの、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の例示的な線量範囲は、５０〜２００レントゲンの長期間（３〜４週間）毎日照射から２０００〜６０００レントゲンの１回照射の範囲である。放射性同位元素の線量範囲は広く異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、新生物細胞による取り込み、ならびに処置を受ける対象の忍容性に依存する。
【０１６４】
免疫療法
方法のいくつかの実施形態において、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の投与と併用して、または投与と共に、免疫療法を使用してもよい。がんの処置の文脈において、免疫療法は一般的に、がん細胞を標的として破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、そのような一例である。イピリムマブを含む他のチェックポイント阻害剤もまた、併用して投与することができる。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体はまた、他の抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えばアテゾリズマブ、デュルバルマブ、もしくはアベルマブを含むＰＤ−Ｌ１に対する抗体、またはニボルマブ、ペムブロリズマブ、もしくはピディリズマブを含むＰＤ−１に対する抗体と併用して投与されうる。加えて、実施形態の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の１つまたは複数を、互いに併用して投与してもよい。抗体単独は、治療のエフェクターとしての役割を果たしてもよく、または細胞殺滅を実際に行うために他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートしてもよく、単に標的化剤としての役割を果たしてもよい。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子、例えばＴ細胞上のＰＤ−１／腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１相互作用を有するリンパ球でありうる。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。
【０１６５】
免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に感受性があるいくつかのマーカー（タンパク質／受容体）を有しなければならない。最適には、腫瘍マーカータンパク質／受容体は、大部分の他の細胞、例えば非がん細胞または正常細胞には存在しない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも本実施形態の文脈において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と共に投与される別の薬物または治療による標的化にとって適しうる。一般的な腫瘍マーカーには、例えばＣＤ２０、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗がん作用と免疫刺激作用とを組み合わせることである。免疫刺激分子も同様に存在し、これにはサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ；ケモカイン、例えばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８；および増殖因子、例えばＦＬＴ３リガンドが挙げられる。
【０１６６】
現在治験中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号明細書および同第５，７３９，１６９号明細書；Hui et al., 1998, Infection Immun., 66(11):5329-5336；Christodoulides et al., 1998, Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037）；サイトカイン療法、例えばα、β、およびγインターフェロン；ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Bukowski et al., 1998, Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347；Davidson et al., 1998, J. Immunother., 21(5):389-398；Hellstrand et al., 1998, Acta Oncologica, 37(4):347-353）；遺伝子治療、例えばＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24):14411-14416；Austin-Ward and Villaseca, 1998, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845；米国特許第５，８３０，８８０号明細書および同第５，８４６，９４５号明細書）；ならびにモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Hollander, 2012, Front. Immun., 3:3；Hanibuchi et al., 1998, Int. J. Cancer, 78(4):480-485；米国特許第５，８２４，３１１号明細書）である。１つまたは複数の抗がん治療を、本明細書において記述される抗体治療と共に使用してもよいと企図される。
【０１６７】
手術
がんを有するおよそ６０％の個体が、予防的、診断的、または進行期分類、根治的、および姑息的手術を含む何らかのタイプの手術を受ける。根治的手術は、がん様組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、および／または破壊される切除を含み、他の治療、例えば本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および／または代替治療、ならびにその組み合わせと共に使用されうる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍の切除に加えて、手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気的手術、および顕微鏡下の手術（モース顕微鏡手術）を含む。がん様細胞、組織、または腫瘍の一部または全ての切除後、体に腔が形成されることがある。追加の抗がん治療によってその領域の灌流、直接注射、または局所適用による処置を行ってもよい。そのような処置を、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日ごと、または１、２、３、４、もしくは５週間ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月ごとに繰り返してもよい。これらの処置も同様に、多様な用量の処置でありうる。
【０１６８】
タンパク質の精製
抗体および特に抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を含むタンパク質の精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルで細胞、組織、または臓器のホモジナイゼーション、ならびにポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への簡易分画を伴う。目的のタンパク質またはポリペプチドを、特に示していなければ部分精製または十分な精製（または均一になるまで精製）を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用してさらに精製してもよい。純粋なタンパク質またはペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。ペプチドの特に効率的な精製方法は、中圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。一般的に当技術分野で公知であるように、様々な精製ステップを実施する順序を変化させてもよく、および／またはある特定のステップを省略してもよく、それでもなお実質的に精製されたポリペプチドの適した調製方法が得られうる。
【０１６９】
精製ポリペプチド、例えば本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、他の成分から単離可能なまたは単離されて、その天然に得ることができる状態と比較して任意の程度に精製されるポリペプチドを指す。したがって、単離または精製ポリペプチドはまた、それが天然に存在しうる環境、例えば、細胞、組織、臓器、生物試料などを含まないポリペプチドを指す。一般的に、「精製」は、様々な他の成分を除去するために分画に供されているが、組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているポリペプチド組成物を指す。「実質的に精製された」組成物は、ポリペプチドが組成物の主成分を形成し、そのため、ポリペプチドが、組成物のタンパク質成分の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成する組成物を指す。
【０１７０】
ポリペプチド、例えば抗体タンパク質の精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に公知である。これらは、例えば、活性分画の特異的活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画内のポリペプチドの量を評価することを含む。分画の純度を評価する好ましい方法は、分画の特異的活性を計算すること、それを最初の抽出物の特異的活性と比較すること、およびこのようにして「精製倍率」によって評価したその純度の程度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、精製後に行うように選択される特定のアッセイ技術、および発現されたポリペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存する。
【０１７１】
一般的に、ポリペプチドが常にその最も精製された状態で提供される必要はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、ある特定の実施形態において有用性を有しうると企図される。部分精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて使用することによって、または同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することによって達成されうる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施する陽イオン交換カラムクロマトグラフィーでは、一般的に、低圧のクロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術より大きい精製「倍率」が得られると認識される。低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収において、または発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有しうる。
【０１７２】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質（タンパク質）とそれが特異的に結合することができる分子との間の特異的親和性、すなわち、受容体−リガンド型相互作用に依存するクロマトグラフィー技法である。結合パートナーの１つを不溶性マトリクスに共有結合的にカップリングさせることによって、カラム材料（樹脂）を合成する。次いで、カラム材料は、カラム樹脂の上を通過する溶液から物質を特異的に吸着することができる。条件を、結合が妨害される／起こらない条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度の変更など）に変化させることによって、溶出が起こる。マトリクスは、いかなる有意な程度にも分子を吸着せず、広範囲の化学的、物理的、および温度安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングすべきである。リガンドはまた、比較的堅固な結合を提供すべきであるが、結合した物質の溶出は、望ましい試料タンパク質またはリガンドを破壊することなく起こるべきである。
【０１７３】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がその大きさに基づいて、またはより技術的な用語ではその流体力学的体積に基づいて分離されるクロマトグラフィー方法である。これは通常、大きい分子または高分子複合体、例えばタンパク質および工業用ポリマーに適用される。典型的に、水溶液を使用して試料をカラムの中に通過させるとき、この技術は、ゲル濾過クロマトグラフィーとして知られるが、これに対し、ゲル透過性クロマトグラフィーという名称は、移動相として有機溶媒を使用するときに使用される。ＳＥＣの基礎となる原理は、異なる大きさの粒子が、異なる速度で静止相の中を溶出（濾過）して、それによって、大きさに基づいて粒子の溶液が分離されることである。粒子の全てが同時またはほぼ同時にロードされると仮定すれば、同じ大きさの粒子は共に溶出するはずである。
【０１７４】
高速（すなわち、高圧）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、同定、および定量するために生化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの１つの形態である。ＨＰＬＣは、クロマトグラフィー充填材料（静止相）、移動相をカラムの中に移動させるポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、静止相、分析される分子、および使用する溶媒の間の相互作用に応じて変化する。
【０１７５】
医薬調製物
抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを含む医薬組成物の臨床応用を行う場合、一般的に、意図される適用にとって適当な医薬または治療組成物を調製することが有益である。一般的に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散した１つまたは複数のポリペプチドの有効量または追加の薬剤を含みうる。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％のポリペプチドまたは抗体を含みうる。他の実施形態において、ポリペプチドまたは抗体は、単位重量の約２％から約７５％の間、または約２５％から約６０％の間、例えば、その上限および下限値を含むその間で誘導可能な任意の範囲を含みうる。それぞれの治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適した投与量が任意の所定の単位用量において得られるように調製されうる。溶解度、生物学的利用率、生物学的半減期、投与経路、産物の貯蔵寿命、および他の薬理学的検討などの要因は、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、そのため、多様な投与量および処置レジメンが望ましいと予想される。
【０１７６】
さらに、ある特定の態様に従って、投与に適した組成物は、不活性希釈剤の存在下または非存在下で薬学的に許容される担体中で提供されうる。担体は、同化可能でなければならず、液体、半固体、例えばゲルもしくはペースト、または固体担体を含むべきである。担体または希釈剤の例には、脂肪、油、水、食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、増量剤など、またはその組み合わせが挙げられる。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知である、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、エタノール、食塩水溶液、非経口用ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル）、分散培地、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル）、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）、塩、薬物、薬物安定化剤（例えば、緩衝剤、アミノ酸、例えばグリシンおよびリジン、炭水化物、例えばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなど）、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香味料、色素、血液体液用薬、そのような類似の材料および組み合わせを含む。任意の通常の培地、薬剤、希釈剤、または担体がレシピエントまたはその中に含まれる組成物の治療上の有効性にとって有害である場合を除き、方法の実践のために投与可能な組成物におけるその使用が適切である。医薬組成物中の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。ある特定の態様に従って、組成物を、任意の通常のおよび実践的方法で、すなわち、溶液、懸濁液、乳液、混合物、カプセル化、吸収、粉砕などによって担体と結合させる。そのような技法は当業者にとって日常的である。
【０１７７】
ある特定の実施形態において、組成物は、それらが固体、液体、エアロゾル剤形のいずれで投与されるかに応じて、およびそれが注射などの投与経路に関して無菌的である必要があるか否かに応じて、異なるタイプの担体を含みうる。組成物は、当業者に公知であるように、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜内、経口、局所表面、局所、または吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浴する局所灌流、カテーテル、洗浄、脂質組成物（例えば、リポソーム）、または他の方法、または前述の任意の組み合わせによる投与のために製剤化されうる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990を参照されたい。典型的に、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射前に液体の添加による溶液または懸濁液の調製に使用するために適した固体または再構成可能な形態も同様に調製することができ、調製物はまた乳化させることもできる。
【０１７８】
抗体は、遊離の塩基、中性、または塩形態として組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質様組成物の遊離のアミノ基によって形成される塩、または無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸によって形成される塩が挙げられる。遊離のカルボキシル基によって形成される塩もまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄など、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基から誘導してもよい。
【０１７９】
さらなる実施形態において、ポリペプチド、１つまたは複数の脂質、および水性溶媒を含む薬学的脂質ビヒクル組成物を使用してもよい。本明細書において使用される用語「脂質」は、特徴的に水に不溶性であり、有機溶媒によって抽出可能である広範囲の物質のいずれかを指す。この広いクラスの化合物は当業者に周知であり、用語「脂質」が本明細書において使用される場合、これは任意の特定の構造に限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するかまたは合成でありうる（すなわち、ヒトによって設計または生成される）。しかし、脂質は通常、生体物質である。生体脂質は、当技術分野で周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴリピッド、糖脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル結合した脂肪酸を有する脂質、重合化可能な脂質、およびその組み合わせを含む。当然、当業者によって脂質として理解される、本明細書において具体的に記述される化合物以外の化合物も同様に、組成物および方法に包含される。当業者は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために使用することができる技術範囲を周知していると予想される。例えば、抗体を、脂質を含む溶液中に分散させる、脂質と共に溶解する、脂質によって乳化する、脂質と混合する、脂質と組み合わせる、脂質に共有結合させる、脂質中に懸濁剤として含める、ミセルもしくはリポソームに含めるもしくはそれらと複合体を形成する、または当業者に公知の任意の手段によって脂質もしくは脂質構造に会合させてもよい。分散によって、リポソームが形成してもしなくてもよい。
【０１８０】
用語「単位用量」または「投与量」は、それぞれの単位が、その投与に関連して、すなわち適切な経路および処置レジメンに関連して、上記の所望の応答を生じるように計算された、治療抗体または治療抗体を含む組成物の既定量を含む、対象において使用するために適した物理的に個別の単位を指す。処置の回数および単位用量の両方に従って投与される量は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、身体的および生理学的要因、例えば対象の体重、年齢、健康、および性別、処置される疾患のタイプ、疾患浸透の程度、過去のまたは同時の治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。他の非限定的な例において、用量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、およびそこから誘導可能な任意の範囲を含みうる。本明細書において記載した数値から誘導可能な範囲の非限定的な例において、上記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。前述の用量は、記載の用量の間の量を含み、同様に、範囲の下限および上限値を含むと意図される。投与の責任者である医師は、いずれにせよ、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に関して適切な用量を決定すると予想される。
【０１８１】
治療組成物または調製物の特定の性質は、限定的であると意図されない。例えば、適した組成物は、生理的に忍容可能な液体、ゲル、または固体担体、希釈剤、および賦形剤と共に製剤中で提供されうる。いくつかの実施形態において、治療調製物は、他の治療剤と類似の方法で、家畜動物などの獣医学での使用のために、およびヒトでの臨床での使用のために哺乳動物に投与されうる。一般的に、治療有効性のために必要な投与量は、使用のタイプおよび投与様式、ならびに上記のように個々の対象の特定の必要条件に従って変化する。
【０１８２】
バイオマーカーとしてのグリコシル化ＰＤ−Ｌ１
実施形態に記述される少なくとも１つの抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の使用を伴う方法が提供される。そのような方法は、がんまたは腫瘍を有する対象から得た腫瘍またはがん細胞のバイオマーカー評価において有用でありうる。がんを有する対象が、ＰＤ−Ｌ１を有する腫瘍またはがん細胞のバイオマーカーとしてグリコシル化ＰＤ−Ｌ１、特にそのような細胞の細胞表面上にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の検出可能なレベルを発現するがんまたは腫瘍を有するか否かを決定する方法が提供される。例えば、対象のがんまたは腫瘍細胞を試験して、細胞表面上にグリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現すると決定されれば、対象は、記述の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の単独、または例えば別の抗がん剤との併用による処置の候補であり、処置によって利益が得られると予想される。そのような方法は、がんまたは腫瘍を有する対象から試料を得ること、当技術分野において公知で使用される、および本明細書において記述される結合方法を使用して、例えば、実施形態の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を使用して対象のがんまたは腫瘍に由来する細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在に関して試料を試験すること、ならびに対象のがんまたは腫瘍がグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞表面発現に関して陽性であることが見出されれば、対象に、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の有効量を単独でまたは別の抗がん剤と併用して投与することを含む。処置前に対象が、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１を発現するがんまたは腫瘍を有すると診断されれば、投与された抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体が、対象のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１発現がんまたは腫瘍細胞と、対象のＰＤ−１発現Ｔ細胞との相互作用を遮断または阻害する可能性がより高く、それによってＴ細胞活性の免疫抑制を防止して、活性化Ｔ細胞殺滅により腫瘍またはがん細胞の殺滅を促進することから、より有効な処置が得られ、対象にとって利益が得られる。一実施形態において、方法は、そのがんまたは腫瘍が、発現されたグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在に対する試験に感受性がありうる対象を最初に選択することを伴いうる。
【０１８３】
類似の方法を使用して、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と別の抗がん薬または処置との併用処置を含む、一連のがんの処置または治療の間に、ならびに処置の終了後に、患者の腫瘍細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の存在を経時的にモニターしてもよい。そのような方法はまた、処置前に、および一連の処置の間に、抗がん処置レジメンまたは併用処置が、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍またはがん細胞に関して患者の腫瘍またはがん試料を試験またはアッセイすること、例えば成功の転帰またはその可能性を決定するためにモニターすることを伴うコンパニオン診断法において使用されうる。
【０１８４】
他の薬剤
他の薬剤を、処置の治療有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と共に使用してもよいと企図される。これらの追加の薬剤は、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合部のアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞抑制および分化剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過増殖細胞の感受性を増加させる薬剤、または他の生物薬剤を含む。ＧＡＰ接合部の数を増加させることによる細胞内シグナル伝達の増加は、隣接する過増殖細胞集団に対して抗過増殖作用を増加させうる。他の実施形態において、細胞抑制または分化剤は、処置の抗過増殖有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と併用して使用されうる。細胞接着阻害剤は、本実施形態の有効性を改善すると企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、処置の有効性を改善するために、アポトーシスに対する過増殖細胞の感受性を増加させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５を、本実施形態のある特定の態様において併用して使用することができると企図される。
【０１８５】
キットおよび診断
別の実施形態において、治療剤および／または他の治療剤および送達剤を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を伴う治療を準備および／または投与するために使用される。キットは、本明細書において記述される医薬組成物のいずれかを含む１つまたは複数の密封されたバイアルを含みうる。キットは、例えば少なくとも１つの抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体、ならびに１つまたは複数の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を調製、製剤化、および／もしくは投与するための、または記述の方法の１つもしくは複数のステップを実施するための試薬を含みうる。いくつかの実施形態において、キットはまた、キットの成分と反応しない容器である適した容器手段、例えばエッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブを含みうる。容器は、滅菌可能な材料、例えばプラスチックまたはガラス製でありうる。
【０１８６】
キットはさらに、本明細書において記載される方法の技法ステップを概要する説明書を含んでもよく、本明細書において記述されるまたは当業者に公知である技法と実質的に同じ技法に従う。説明書の情報は、コンピューターを使用して実行するとき、ディスプレイに、治療剤の薬学的有効量を送達する実際のまたはバーチャル技法を表示させる、機械読み取り可能な説明書を含むコンピューター読み取り可能な媒体であってもよい。
【０１８７】
融合体およびコンジュゲート
本明細書において提供される抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはまた、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させるか、または別の部分と化学的にコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アイソタイプまたはサブクラスによって変化しうるＦｃ部分を有し、キメラもしくはハイブリッドであってよく、および／または例えばエフェクター機能を改善するために、半減期もしくは組織アクセシビリティを制御するために、生物物理学的特徴、例えば安定性を強化するために、および産物の有効性を改善するために、改変することができ、これらはコスト低減に関連しうる。融合タンパク質の構築において有用な多くの改変、およびそれらを作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Mueller, J.P. et al., 1997, Mol. Immun. 34(6):441-452；Swann, P.G., 2008, Curr. Opin. Immunol., 20:493-499；およびPresta, L.G., 2008, Curr. Opin. Immunol., 20:460-470に記述されている。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体のネイティブＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域はハイブリッド、例えばＩｇＧ２／ＩｇＧ４  Ｆｃ定常領域を含むキメラである。Ｆｃ領域の改変には、Ｆｃγ受容体および補体への結合を防止するために改変されるＩｇＧ４；１つまたは複数のＦｃγ受容体への結合を改善するために改変されるＩｇＧ１；エフェクター機能を最小限にするように改変されるＩｇＧ１（アミノ酸の変化）；変更されたグリカンを有する／グリカンを有しない（典型的に、発現宿主を変化させることによって）ＩｇＧ１；ならびにＦｃＲｎへのｐＨ依存的結合が変更されたＩｇＧ１が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。Ｆｃ領域は、全ヒンジ領域、または抗体の全ヒンジ領域より少ない部分を含みうる。
【０１８８】
別の実施形態は、その半減期を増加させるＦｃＲへの結合が低減したＩｇＧ２−４ハイブリッドおよびＩｇＧ４変異体を含む。代表的なＩｇＧ２−４ハイブリッドおよびＩｇＧ４変異体は、例えば、Angal et al., 1993, Molec. Immunol., 30(1):105-108；Mueller et al., 1997, Mol. Immun., 34(6):441-452；および米国特許第６，９８２，３２３号明細書に記載され、その参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ドメインは欠失している。例えば、Ａｎｇａｌら、同上は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ドメインのセリン２４１位がプロリンで置換されているタンパク質を記述している。いくつかの実施形態において、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を有する融合タンパク質またはポリペプチドが企図される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを、連結または共有結合させる、または少なくとも１つの部分と複合体を形成させる。そのような部分は、診断剤または治療剤として抗体の有効性を増加させる部分でありうるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、部分は、造影剤、毒素、治療酵素、抗生物質、放射標識ヌクレオチド、化学療法剤などでありうる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体もしくはグリコシル化ポリペプチドまたはその一部にコンジュゲートまたは融合される部分は、酵素、ホルモン、細胞表面受容体、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエンテロトキシン（すなわちＰＥ−４０）、ジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、またはヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質）、タンパク質（腫瘍壊死因子、インターフェロン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン）、神経生長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、またはアポトーシス剤（例えば、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β）、生物応答修飾剤（例えば、リンフォカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、またはマクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、または増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））、細胞毒素（例えば、細胞抑制または細胞障害剤、例えばパクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、例えばベドチン）、ならびにピューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログ）、抗代謝薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、ＢｉＣＮＵ（登録商標）（カルムスチン、ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ））、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（これまでダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（これまでのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、またはその組み合わせであってもよい。
【０１９１】
特定の実施形態において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は、典型的に不安定な結合を有する化学リンカーによって、生物活性薬もしくは薬剤、例えば細胞障害剤もしくは化学療法剤、または放射性核種にコンジュゲートさせて、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生してもよい。したがって、そのようなＡＤＣが細胞に内在化されるとき、それらは、細胞を直接殺滅するか、または細胞内の分子を標的とするように作用して、それによってアポトーシスまたは細胞死が起こる。本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体、特にモノクローナル、ヒト化、キメラ、またはヒト抗体を含むそのようなＡＤＣは、腫瘍およびがん細胞上のグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に対する抗体の特異的標的化を、細胞障害薬のがんの細胞殺滅能と組み合わせて、それによって抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体による処置および治療に関するさらなる利点を提供する。ＡＤＣを調製および使用する技術は当技術分野で公知であり、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体に限定されないと意図される。（例えば、Valliere Douglass, J.F., et al., 2015, Mol. Pharm., 12(6):1774-1783；Leal, M. et al., 2014, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1321:41-54；Panowski, S. et al., 2014, mAbs, 6(1):34-45；Beck, A. 2014, mAbs, 6(1):30-33；Behrens, C.R. et al., 2014, mAbs, 6(1):46-53；およびFlygare, J.A. et al., 2013, Chem. Biol. Drug Des., 81(1):113-121を参照されたい）。実施形態において、上記の部分のいくつかまたは全て、特に毒素および細胞毒素を、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体にコンジュゲートさせて、がんを処置するために有効なＡＤＣを産生してもよい。
【０１９２】
治療的または細胞傷害性部分を抗体にコンジュゲートさせる方法は周知である。例えば、Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press；Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-158 (1982)；Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169 (2008)；Alley et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4):529-537 (2010)；Carter et al., Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book. 2005(1):147-154 (2005)；Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169(2008)；Chari, Acc. Chem Res. 41(1):98-107 (2008)；Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21(7):778-784(2003)；Ducry et al., Bioconjug Chem. 21(1):5-13(2010)；Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244 (2009)；およびTeicher, Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004 (2009)を参照されたい。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述される抗体およびポリペプチドは、精製を容易にするために、マーカー、例えばペプチドにコンジュゲートさせてもよい。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヘキサヒスチジンペプチド、すなわちインフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する血液凝集素「ＨＡ」タグ（Wilson, I. A. et al., Cell, 37:767-778 (1984)）、または「ｆｌａｇ」タグ（Knappik, A. et al., Biotechniques 17(4):754-761 (1994)）である。
【０１９４】
他の実施形態において、本明細書において記述される抗体およびポリペプチドにコンジュゲートされる部分は、アッセイにおいて検出することができる造影剤でありうる。そのような造影剤は、酵素、補欠分子団、放射標識、非放射活性常磁性金属イオン、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、生物発光分子、光親和性分子、または色素粒子もしくはリガンド、例えばビオチンでありうる。実施形態において、適した酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられるがこれらに限定されるわけではない；補欠分子団には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない；蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない；発光材料には、ルミノールが挙げられるがこれらに限定されるわけではない；生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない；放射活性材料には、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、イオウ（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）；様々な陽電子射出トモグラフィーを使用して陽子を放出する金属；および非放射活性常磁性金属イオンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１９５】
造影剤は、当技術分野で公知の技術を使用して、本明細書において記述される抗体またはポリペプチドに、直接、または中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を通して間接的にコンジュゲートさせてもよい。例えば、診断薬として使用するために、本明細書において記述される抗体および他の分子にコンジュゲートすることができる金属イオンに関して報告する米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。いくつかのコンジュゲーション方法は、例えば抗体に付着した有機キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−クロローｐ−トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ−３−６α−ジフェニルグリクリル−３を使用する金属キレート錯体の使用を伴う。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応することができる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体またはｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを、例えば米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記述されるように、二次抗体にコンジュゲートして、抗体ヘテロコンジュゲートを形成してもよい。そのようなヘテロコンジュゲート抗体はさらにハプテン（例えば、フルオレセイン）または細胞マーカー（例えば、限定されないが４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、ＯＸ４０、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＴＬＲ２、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ７、Ｂ７−Ｈ７ＣＲ、ＣＤ７０、ＣＤ４７）、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ））、またはケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１）に結合させることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述される抗グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗体またはグリコシル化ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、固相支持体に付着させることができ、これは、本明細書において記述される抗体もしくは抗原結合断片との結合を通して支持体に固定されている標的抗原もしくは標的抗原に結合することができる他の分子のイムノアッセイまたは精製を行うために有用でありうる。そのような固相支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【実施例】
【０１９８】
以下の実施例は、非グリコシル化ＰＤ−Ｋ１および／またはＰＤ−Ｌ１グリコシル化変異体と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１に優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体に関連する実施形態および本明細書において記述される使用方法を実証するために含まれる。代表的な抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体を例示する。開示の抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体は例であり、限定でないと意図されることは当業者によって認識されるべきである。
【実施例１】
【０１９９】
材料および方法
細胞培養、安定なトランスフェクタント、およびトランスフェクション。細胞は全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。これらの細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＲＰＭＩ  １６４０培地で成長させた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ５４９、および２９３Ｔ細胞におけるＰＤ−Ｌ１安定トランスフェクタントを、ピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して選択した。一過性のトランスフェクションに関して、細胞に、ＳＮリポソーム（Hu, M. C. et al., 2004, Cell, 117:225-237）およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＤＮＡ、例えばＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトした。
【０２００】
レンチウイルス感染を使用する安定な細胞の生成。細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現をノックダウンするために使用されるレンチウイルスに基づくｓｈＲＮＡ（ｐＧＩＰＺプラスミド）（Shen, J. et al., 2013, Nature, 497:383-387）を、sｈＲＮＡ／ＯＲＦコア施設（ＵＴ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＡ４３１細胞におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質発現のノックダウン効率に基づいて、本発明者らは、この試験に関して２つのＰＤ−Ｌ１クローンを選択した。成熟アンチセンス配列は以下の通りである：ＴＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＧＣＴＡＣ（ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃１、配列番号３４）、ＴＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡ（ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃５、配列番号３５）。内因性のＰＤ−Ｌ１をノックダウンして同時にＦｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１を再構成するために、ｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１二重発現構築物を使用して、本発明者らは、内因性のＰＤ−Ｌ１ノックダウンおよびＦｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたは４ＮＱ変異体発現細胞株を確立した。ＰＤ−Ｌ１およびＦｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１に関するレンチウイルス発現ｓｈＲＮＡを生成するために、本発明者らは、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬によって、２９３Ｔ細胞にｐＧＩＰＺ非サイレンス（ベクター対照ウイルスに関して）、ｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１、またはｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ、またはｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ変異体をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を交換した後、培地を２４時間間隔で収集した。収集したレンチウイルスを含む培地を遠心分離して、細胞破片を除去し、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。細胞を、注射の１２時間前に５０％コンフルエンスで播種して、培地を、レンチウイルスを含む培地に交換した。２４時間感染後、培地を新しい培地に交換して、感染した細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）によって選択した。
【０２０１】
プラスミド。ヒトＰＤ−Ｌ１クローンをｓｈＲＮＡ／ＯＲＦコア施設（ＵＴ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）から得て、ｐＣＤＨレンチウイルス発現ベクターにクローニングして、公知の分子生物学技術を使用してＰＤ−Ｌ１−ＦｌａｇまたはＰＤ−Ｌ１−Ｍｙｃ発現細胞株を確立した。加えてヒトＰＤ−Ｌ１核酸を、一過性のトランスフェクションのためにｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＣＭＶ−ＨＡ哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。ｐＣＤＨ／ＰＤ−Ｌ１−Ｆｌａｇ発現ベクターを鋳型として使用して、以下の表４に示されるプライマーを使用して部位特異的変異誘発を実施することによって、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｌａｇ  ＮＱ変異体Ｎ３５Ｑ、Ｎ１９２Ｑ、Ｎ２００Ｑ、Ｎ２１９Ｑ、および４ＮＱ（Ｎ３５Ｑ／Ｎ１９２Ｑ／Ｎ２００Ｑ／Ｎ２１９Ｑ）を生成した。内因性のＰＤ−Ｌ１をノックダウンして同時にＦｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１を再構成するために、ｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１二重発現構築物を作製するために、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡの３−ＵＴＲ領域を標的とするｓｈＰＤ−Ｌ１構築物（ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃５）を選択した。Ｆｌａｇ−ＰＤ−Ｌ１野生型（ＷＴ）または４ＮＱ変異体ＤＮＡを、内因性のＰＤ−Ｌ１に対して特異的なｓｈＲＮＡを発現するｐＧＩＰＺ−ｓｈＰＤ−Ｌ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）にクローニングした。全ての構築物を酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを使用して確認した。
【０２０２】
【表４】
2018512175.tif 000008
【０２０３】
ｍＲＮＡの発現を測定するためにｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した（Shen et al., 2013, Nature, 497:383-7；およびChang et al., 2011, Nature cell biology, 13:317-23）（以下の表５を参照されたい）。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、ＱＩＡｚｏｌ中で直ちに溶解した。溶解した試料を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して総ＲＮＡ抽出に供した。ｍＲＮＡの発現を測定するために、ランダムヘキサマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成システムによって、製造元の説明書に従って精製総ＲＮＡ  １μｇからｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲ機器（ｉＱ５，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｑＰＣＲを実施した。データ分析は全て、比較Ｃｔ法を使用して実施した。結果を最初に、内部対照β−アクチンｍＲＮＡに対して標準化した。
【０２０４】
【表５】
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【０２０５】
抗体および化学物質。以下の抗体を実施例に記述される実験に使用した：Ｆｌａｇ（Ｆ３１６５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；Ｍｙｃ（１１６６７２０３００１；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）；ＨＡ（１１６６６６０６００１；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；ＰＤ−Ｌ１（１３６８４；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）；ＰＤ−Ｌ１（３２９７０２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，）；ＰＤ−Ｌ１（ＧＴＸ１１７４４６；ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ＰＤ−Ｌ１（ＡＦ１５６；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）；ＰＤ−１（ａｂ５２５８７；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）；α−チューブリン（Ｂ−５−１−２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；およびβ−アクチン（Ａ２２２８；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２０６】
イムノブロット分析、免疫組織化学、および免疫沈降。イムノブロット分析は既に記述されるように実施した（Lim et al., 2008, Gastroenterology, 135:2128-2140；およびLee et al., 2007, Cell, 130:440-455）。画像獲得およびバンド強度の定量を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）を使用して実施した。免疫沈降に関して、細胞を緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０））中で溶解して、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、破片を除去した。きれいにした溶解物を、抗体による免疫沈降に供した。免疫細胞化学に関して、細胞を４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定して５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で５分間透過性にした後、一次抗体を使用して染色した。使用した二次抗体は、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８または５９４色素コンジュゲートおよび／または抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または５９４色素コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩｂｌｕｅ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって染色した。封入後、多光子共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を可視化した。
【０２０７】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１）相互作用アッセイ。ＰＤ−１タンパク質とＰＤ−Ｌ１タンパク質の相互作用を測定するために、細胞を４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した後、組み換えヒトＰＤ−Ｌ１  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。使用した二次抗体は抗ヒトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８色素コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩｂｌｕｅ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって染色した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８色素の蛍光強度を、マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ（ＢｉｏＴｅＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して測定して、総タンパク質の量によって強度に対して標準化した。封入後、画像を得るために、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して、細胞を可視化した。
【０２０８】
ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化分析。ＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化を確認するために、細胞溶解物を、酵素ＰＮＧアーゼＦ、ＥｎｄｏＨ、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって製造元によって記述されるように処置した。グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質を染色するために、精製ＰＤ−Ｌ１タンパク質を、製造元によって説明されるように糖タンパク質染色キット（Ｐｅｉｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して染色した。
【０２０９】
Ｎ−グリコペプチドの同定。精製ＨｉｓタグＰＤ−Ｌ１タンパク質を、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって３７℃で１時間還元し、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液中で５０ｍＭヨードアセトアミドによって、室温の暗所で１時間アルキル化した後、シークエンシング等級のトリプシンによって、酵素対基質比１：５０で、３７℃で終夜処置した。消化された産物をギ酸で希釈して、最終濃度０．１％を得て、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってさらに洗浄した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを、ＩＢＣのＡｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで得た。ペプチド混合物を、トラップカラムＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００（内径２ｃｍ×１００μｍ）（Ｄｉｏｎｅｘ）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ３０００  ＲＳＬＣナノシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）にカップリングされたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてナノスプレーＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチド混合物を、カラム内径２５ｃｍ×７５μｍのＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣにロードして、５％〜３５％溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル）の勾配を使用して流速５００ｎＬ／分で６０分間分離した。溶媒Ａは０．１％ギ酸水溶液であった。ＣＩＤモードに対応するＨＣＤ下でＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータ獲得に使用したパラメータは：サイクル時間３秒のトップスピードモード；ＦＴＭＳ：スキャン範囲（ｍ／ｚ）＝４００〜２０００；解像度＝１２０Ｋ；ＡＧＣ標的＝２×１０５；経過時間（ｍｓ）＝５０；ＦＴＭＳｎ（ＨＣＤ）：単離モード＝四重極；単離ウィンドウ＝１．６；衝突エネルギー（％）＝段階的衝突エネルギー５％で３０；解像度＝３０Ｋ；ＡＧＣターゲット＝５×１０４；経過時間（ｍｓ）＝６０；ＩＴＭＳｎ（ＣＩＤ）；単離モード：四重極；単離ウィンドウ＝１．６；衝突エネルギー（％）＝３０；ＡＧＣターゲット＝１×１０４であった。生データをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．４によってマスコット汎用フォーマット（ＭＧＦ）に変換した。グリコペプチドの同定に関して、ＨＣＤ  ＭＳ２データを、Ｂｙｏｎｉｃ（バージョン２．０−２５）を使用して、以下の検索パラメータによって検索した：ペプチド公差＝２ｐｐｍ；断片公差＝６ｐｐｍ；切れ残り＝１；修飾：カルバミドメチルシステイン（ｆｉｘｅｄ）、メチオニン酸化（ｃｏｍｍｏｎ２）、Ｎでの脱アミノ化（ｒａｒｅ１）。Ｂｙｏｎｉｃによって示唆されるグリコペプチドのヒットを、ＨＣＤおよびＣＩＤ  ＭＳ２結果を組み合わせることによって手動でさらにチェックした。
【０２１０】
統計分析。棒グラフのデータは、３回の独立した実験の標準偏差と共に無処置または対照群と比較した倍率変化を意味する。統計分析は、ＳＰＳＳ（バージョン、２０  ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して実施した。タンパク質発現と、ＢＬＢＣサブセットの間の相関を、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関およびＭａｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して分析した。実験データに関してスチューデントのｔ検定を実施した。Ｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられた。
【実施例２】
【０２１１】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現分析
ＰＤ−Ｌ１の基礎となるメカニズムを明らかにして解明するために、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質発現を、ヒト腫瘍組織およびがん細胞株において調べた。図１Ａおよび１Ｂ、ならびに図２Ａ〜２Ｄは、ウェスタンブロット分析による肺がん、乳がん、結腸がん、および卵巣がん細胞系におけるタンパク質発現を示す。図３Ａは、異なるＰＤ−Ｌ１抗体による細胞中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を示す。大部分のＰＤ−Ｌ１タンパク質が約４５ｋＤａ（黒丸）で検出されたが、より小さい分画が３３ｋＤａ（黒色の矢印の先）にも出現することが観察された。コード配列（ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃１）または３’ＵＴＲ（ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃５）のいずれかを標的とするレンチウイルスの低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＰＤ−Ｌ１のノックダウンにより、ＰＤ−Ｌ１の３３ｋＤａおよび４５ｋＤａの両方の形態の発現がダウンレギュレートされた。ＰＤ−Ｌ１を再構成すると、ｓｈＰＤ−Ｌ１  ＃５クローンでは両方の形態の発現が回復した（図１Ｃ、図３Ｃはベクターの設計を示す）。これらの結果は、ウェスタンブロットにおける両方のバンドがＰＤ−Ｌ１タンパク質であり、ＰＤ−Ｌ１のより高分子量形態が翻訳後修飾を示すことを示した。
【０２１２】
グリコシル化タンパク質は、しばしば、ＰＤ−Ｌ１の高分子量（約４５ｋＤａ）に関して観察されるように、ウェスタンブロットにおいて不均一なパターンを生じる。ＰＤ−Ｌ１に関して観察されたグリコシル化パターンがグリコシル化形態に対応するか否かを試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅＬａ細胞を、組み換えグリコシダーゼ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ；ＰＮＧアーゼＦ）によって処置してＮ−グリカン構造を除去した後、ウェスタンブロット分析に供した。図３Ｄに示されるように、ＰＮＧアーゼＦ処置によって、４５ｋＤａ  ＰＤ−Ｌ１の有意な部分がＰＤ−Ｌ１の３３ｋＤａ形態に還元された。精製ＨｉｓタグＰＤ−Ｌ１では、一貫してグリカン構造の陽性染色が観察されたが、ＰＮＧアーゼＦの存在下では観察されなかった（図１Ｄ）。これらの結果は、より高分子量のＰＤ−Ｌ１が、実際にＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化形態であることを実証している。
【０２１３】
細胞におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を要約するために、タンパク質の内因性の発現を模倣するために、様々な過剰発現構築物を作製した。Ｎ−末端シグナリングペプチドでの起こりうる切断を回避するために、様々なタグ配列をＮ−またはＣ−末端のいずれかに融合させた（図４Ａおよび４Ｂ、ブロットの上）。内因性のＰＤ−Ｌ１発現分析からの結果と同様に、全てのＧＦＰ−、ＨＡ−、Ｆｌａｇ−、またはＭｙｃ−タグＰＤ−Ｌ１の一過性のトランスフェクションにより、ウェスタンブロット上で分子量がその実際の大きさから約１５ｋＤａシフトした（図１Ｅおよび４Ａおよび４Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１タンパク質上のＮ−グリカン構造の全てを除去するＰＮＧアーゼＦ処置とは対照的に、組み換えグリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）の添加は、ＰＤ−Ｌ１グリコシル化を部分的に低減させたに過ぎず、ＰＤ−Ｌ１には主にＮ−連結グリカン構造の複合体型（高いマンノースおよびハイブリッド形態の両方を含む）が存在することを示唆している（Stanley, P., 2011, Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3）。さらに、Ｎ−連結グリコシル化阻害剤であるツニカマイシン（ＴＭ）によって細胞を処置したとき、ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化は完全に阻害された（図１Ｆおよび４Ａ〜４Ｄ）が、Ｏ−グリコシダーゼ（図４Ｅ）では阻害されなかった。併せると、これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１が、試験した細胞において広範囲にＮ−連結グリコシル化されることを示している（Heifetz, A., et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192）。
【実施例３】
【０２１４】
グリコシル化分析
２つのＰＤ−Ｌ１特異的抗体（抗ＰＤ−Ｌ１および抗ｈＢ７−Ｈ１）を使用するウェスタンブロット分析により、ＰＤ−Ｌ１グリコシル化がその細胞外ドメイン（ＥＣＤ、抗ｈＢ７−Ｈ１によって認識される）で起こるが、その細胞内ドメイン（ＩＣＤ、抗ＰＤ−Ｌ１によって認識される）では起こらないことが示された（図１Ｆおよび４Ｃ）。グリコシル化部位を正確に示すために、異なる種のＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列の配列アライメントを実施して、進化的に保存されたＮＸＴモチーフ、コンセンサスＮ−グリコシル化認識配列に関して検索した（Schwarz, F. et al., 2011, Current opinion in structural biology, 21, 576-582）。初期の予測と一貫して（Cheng et al., 2013, The Journal of biological chemistry, 288:11771-85；およびVigdorovich et al., 2013, Structure, 21:707-17）、４つのＮＸＴモチーフが同定された（図１Ｇおよび図５Ａおよび５Ｂ）。これらの配列が実際にグリコシル化されたか否かを確認するために、精製ヒトＰＤ−Ｌ１のトリプシンペプチドをナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。複合体型のＮ−グリカンを有するグリコペプチドを、４つのＮ−グリコシル化部位のそれぞれに関して同定し（図６Ａ〜６Ｈ）、ＥｎｄｏＨ処置に対する見かけの抵抗性と一貫した（図１Ｅ）。一連のアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を作製して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質上の特異的グリコシル化部位を決定した。４つ全ての変異体Ｎ３５Ｑ、Ｎ１９２Ｑ、Ｎ２００Ｑ、およびＮ２１９Ｑが、ＷＴ  ＰＤ−Ｌ１と比較してある程度のグリコシル化の低減を示した（図１Ｈ、レーン２、３、４、および５）。グリコシル化の検出可能な差は、３つの非ＮＸＴ  ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１変異体に関して観察されなかった（図１Ｈ、レーン１１、１２、および１３）。加えて、ＰＤ−Ｌ１グリコシル化は、４つ全てのアスパラギンがグルタミンに変異したＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ変種において、４５ｋＤａでのグリコシル化形態に対応するシグナルが存在しないことによって示されるように完全に消失した（図１Ｈ、レーン１０（４ＮＱ）およびレーン１４（ＷＴ））。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の結晶構造（Lin, D.Y. et al., 2008, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 3011-3016）に基づくと、ＰＤ−Ｌ１のこれら４つのグリコシル化部位（Ｎ３５、Ｎ１９２、Ｎ２００、およびＮ２１９）は、タンパク質の表面に露出する。ＰＤ−Ｌ１グリコシル化部位の変異（ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ）は、予測に基づいて全体的な構造に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１が細胞においてもっぱらＮ−グリコシル化糖タンパク質として存在し、４つ全てのＮＸＴモチーフがグリコシル化されていることを示唆している。
【実施例４】
【０２１５】
ＰＤ−Ｌ１糖表現型の機能性
ＰＤ−Ｌ１  ＷＴおよび４ＮＱ変異体は、内因性のＰＤ−Ｌ１欠失ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＢＴ５４９細胞において安定に発現された。これらの細胞株を使用して、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１結合親和性を分析した。示されるように、グリコシル化変種ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱとＰＤ−１との会合は減少した（図７Ａ）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合実験によりさらに、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との会合にとってグリコシル化が必要であることが証明された（図７Ｂ）。Ｔ細胞媒介腫瘍細胞殺滅を、ＢＴ５４９  ＰＤ−Ｌ１  ＷＴおよびＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ発現安定細胞株をヒト初代培養Ｔ細胞と同時培養することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した（低速度撮影顕微鏡）。ＰＤ−１結合の喪失と一貫して、ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ安定細胞株は、より多くのがん細胞のＴ細胞媒介殺滅を示した（図７Ｃ）。加えて、ＰＤ−Ｌ１の免疫抑制機能を、ＰＤ−Ｌ１  ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ発現４Ｔ１細胞のいずれかを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腫瘍の成長を測定する、同系の４Ｔ１マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。ＰＤ−Ｌ１  ＷＴを発現する細胞を有するマウスと比較して、ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱを発現する細胞を有するマウスは、低減された腫瘍の大きさおよびより活性化された細胞傷害性Ｔ細胞を示した（図７Ｄおよび７Ｅ）。併せると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１グリコシル化の喪失が、ＰＤ−１とのその相互作用を障害し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用による腫瘍細胞のＴ細胞による免疫監視逃避能を障害することを証明している。したがって、ＰＤ−Ｌ１がグリコシル化されていない、または異常にグリコシル化されている腫瘍細胞は、機能的なエフェクターＴ細胞による殺滅に対して感受性がある標的を提供する。その膜発現ＰＤ−Ｌ１のグリコシル化障害により、腫瘍細胞によるＴ細胞免疫監視の逃避を防止または遮断するこのメカニズムは、ＰＤ−Ｌ１糖表現型の完全性が、その免疫抑制機能にとって必要であることをさらに裏付ける。
【実施例５】
【０２１６】
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１結合モノクローナル抗体の産生およびスクリーニング
グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１に対して作製されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準化プロトコールに従って、ＳＰ２／０マウス黒色腫細胞と、ヒトＰＤ−Ｌ１免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）から単離した脾細胞との融合によって得た（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ）。融合前に、免疫したマウスの血清を、ＦＡＣＳ分析を使用してＰＤ−Ｌ１免疫原への結合に関して確認した。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）産生ハイブリドーマを作製した。ＭＡｂの全てのアイソタイプはＩｇＧ１であった。抗体を産生するハイブリドーマを、特異性に関して再度試験した。
【０２１７】
非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗原に対して特異的であり、優先的に結合する抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１  ＭＡｂ（すなわち、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１特異的ＭＡｂ）を同定するために、異なるタイプのアッセイを実施した。グリコシル化ＰＤ−Ｌ１へのＭＡｂの優先的結合を検出するスクリーニングアッセイにおいて、ＦＡＣＳ分析による蛍光強度の測定に基づいて（細胞膜結合タンパク質を使用する）、抗体の結合を決定した。例として、ＢＴ５４９ヒト乳がん細胞株を使用して、アッセイを実施した。実例として、ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ（完全にグリコシル化）を過剰発現するＢＴ５４９細胞を、通常の技法に従ってビオチンによって標識した後、ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ（完全な非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１変種）を過剰発現するＢＴ５４９細胞と混合した。混合した細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体と共にインキュベートして、検出剤としてのＦＩＴＣにコンジュゲートした二次抗体と共にさらにインキュベートした。洗浄後、蛍光強度（測定蛍光強度、ＭＦＩ）をＦＡＣＳ／フローサイトメトリー分析によって測定して、膜結合ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ（細胞上）または４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１（細胞上）への抗ＰＤ−Ｌ１抗体の相対的結合を評価した。４ＮＱ  ＰＤ−Ｌ１と比較してＷＴ  ＰＤ−Ｌ１において有意により高いＭＦＩを示した抗体を、さらなる評価のために選択した。ＳＴＭ００４およびＳＴＭ１１５  ＭＡｂの蛍光結合分析の結果を、以下の表６に示し、これは、野生型（グリコシル化）ＰＤ−Ｌ１を発現するＢＴ５４９細胞（ＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１ＷＴ細胞）への抗体結合に対するＭＦＩ値を、変種（非グリコシル化４ＮＱ）ＰＤ−Ｌ１を発現するＢＴ５４９細胞（ＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ細胞）への抗体結合に対するＭＦＩ値と比較して示す。表６に示す実験結果は、ＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ細胞（非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１発現細胞）と比較してＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ細胞（グリコシル化ＰＤ−Ｌ１発現細胞）に対するＳＴＭ００４  ＭＡｂの結合のＭＦＩ値がおよそ５倍高いことを示す。ＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１  ４ＮＱ細胞と比較して、ＢＴ５４９ＰＤ−Ｌ１  ＷＴへのＳＴＭ１１５の結合に対するＭＦＩ値は、２倍より高いと決定された。
【０２１８】
【表６】
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結合分析に基づき、４２個の候補ＭＡｂ産生ハイブリドーマを選択して、ＡＤＣＦ培地中で成長させ、モノクローナル抗体を含むその上清を濃縮して精製した。
【０２１９】
いくつかの例において、精製ＭＡｂをさらに、生細胞イメージングアッセイＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標）（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、そのＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用（ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用）の中和または阻害能に関して試験した。このアッセイに関して、ＰＤ−Ｌ１を発現するＢＴ−５４９細胞を、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体および蛍光標識ＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。リガンドおよび受容体結合を、製造元の説明書に従ってＩｎｃｙｃｙｔｅ（商標）Ｚｏｏｍによって毎時間定量した。このアッセイに基づいて、試験した４２個のＭＡｂのうち、１５個のＭＡｂは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を完全に遮断した。強い遮断有効性を示す１５個のＭＡｂのいくつかは、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１にもある程度結合することを示した。
【０２２０】
別のアッセイにおいて、グリコシル化ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質および非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１、すなわちＰＮＧアーゼＦによって処置したＰＤ−Ｌ１タンパク質の両方を、固相表面にコーティングして、ＰＤ−Ｌ１抗原に対するＭＡｂの結合親和性に関して試験した。「ＰＤ−Ｌ１抗原」は、「ＰＤ−Ｌ１タンパク質」と同義であると理解される。１２個のＭＡｂが、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質（ＰＮＧアーゼＦ処置タンパク質）と比較してグリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質と高親和性の相互作用を示した。さらなる特異性分析に関して、選択されたＭＡｂをウェスタンブロットおよびＦＡＣＳフローサイトメトリー分析によって分析した。様々な分析から、ＳＴＭ００４およびＳＴＭ１１５などのＭＡｂが、ＰＤ−Ｌ１の非グリコシル化形態と比較してＰＤ−Ｌ１のグリコシル化形態に特異的に結合することが見出され、このことは、グリコシル化ＰＤ−Ｌ１抗原に関するこれらのＭＡｂの特異性をさらに確認した。
【実施例６】
【０２２１】
特異的グリコシル化ＰＤ−Ｌ１結合抗体の結合領域の同定
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体の領域を同定するために、野生型（グリコシル化）ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ）およびグリコシル化変種タンパク質Ｎ３５／３ＮＱ、Ｎ１９２／３ＮＱ、Ｎ２００／３ＮＱ、およびＮ２１９／３ＮＱ（３５、１９２、２００、または２１９位でのグリコシル化部位の１つが、その位置での野生型アスパラギン（Ｎ）であるが、他の３つの位置がグルタミン（Ｑ）に変異しており、そのためグリコシル化されていない）（図８Ａ）を、ＰＤ−Ｌ１ノックダウンＢＴ５４９細胞において過剰発現させた。ウェスタンブロットによって決定されるように、いくつかのＭＡｂは他のＰＤ−Ｌ１変異体と比較してより高い結合レベルを有する特定のＰＤ−Ｌ１変異体を認識し、そのようなＭＡｂが部位特異的であることを証明した。例えば、ＭＡｂ  ＳＴＭ００４は、Ｎ３５／３ＮＱ変異体を認識して結合したが、Ｎ１９２／３ＮＱ、Ｎ２００／３ＮＱ、またはＮ２１９／３Ｑ変異体には結合せず、この抗体がＰＤ−Ｌ１のＮ３５領域に結合することを証明した（図８Ｂ）。さらに、肝臓がん細胞溶解物を使用するウェスタンブロット分析により、ＳＴＭ００４などの代表的な抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体に関してＰＤ−Ｌ１グリコシル化の差別的パターンが明らかとなった（図８Ｃ）。
【０２２２】
これらのＭＡｂの組織病理学的関連性を、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によってさらに証明した。サイトスピン染色分析において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、一貫してＰＤ−Ｌ１タンパク質のグリコシル化タンパク質を認識して結合したが、非グリコシル化ＰＤ−Ｌ１タンパク質には結合しなかった。ヒトトリプルネガティブ乳がん患者の試料において、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体はまた、膜および細胞質染色を１：３０の比率で示した。これらのデータは、抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が、バイオマーカー分析において、バイオマーカーとしてグリコシル化ＰＤ−Ｌ１の検出のために使用することができることを証明した。
【実施例７】
【０２２３】
グリコシル化ＰＤ−Ｌ１結合抗体のエピトープマッピング
マウスモノクローナル抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体ＳＴＭ００４のエピトープマッピングを、ＣｏｖａｌＸ  ＡＧ社（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が実施した。抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体全般、特にＳＴＭ００４  ＭＡｂによって認識されるエピトープの性質、例えば線形またはコンフォメーションであるかを決定するために、試験を実施して、標的抗原としてのＰＤ−Ｌ１タンパク質と抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１抗体との相互作用が、ＰＤ−Ｌ１抗原のタンパク質分解によって生成される非構造化ペプチドによって阻害されうるか否かを評価した。ＰＤ−Ｌ１抗原の十分なタンパク質分解によって生成されるペプチドが、抗体による抗原の結合を阻害することができれば、相互作用はコンフォメーションに基づいておらず、エピトープは線形である。エピトープの配列を決定するためには、抗原の配列から生成された重なり合うペプチドのバンクによる単純な競合アッセイで十分である。あるいは、ＰＤ−Ｌ１抗原の十分なタンパク質分解によって生成されたペプチドが抗体による抗原の結合を阻害することができなければ、標的のコンフォメーションは、相互作用にとって必要であると決定され、エピトープはコンフォメーションであり、例えば連続（ループなどの空間的コンフォメーションで）または不連続（三次元構造により）である。コンフォメーションエピトープへの結合をさらに解明するために、共有結合標識、ペプチドマッピング、および高解像度質量分析も同様に使用した。
【０２２４】
競合アッセイは、ＰＤ−Ｌ１抗原から生成されたペプチドが本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、例えば代表的なＭＡｂ  ＳＴＭ００４のＰＤ−Ｌ１抗原への結合を阻害しなかったことを示し、これらの抗体および代表的なＳＴＭ００４  ＭＡｂによって認識されるＰＤ−Ｌ１のエピトープ領域が、コンフォメーションであって、線形ではないことを確認した。化学的クロスリンク、高質量のＭＡＬＤＩ質量分析およびｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析を使用して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質と抗体との相互作用表面を特徴付けした。ＰＤ−Ｌ１のペプシンタンパク質分解、得られたペプシン生成ＰＤ−Ｌ１ペプチドと抗体およびインタクトＰＤ−Ｌ１との混合物を使用する競合アッセイ、ならびに公知の方法による抗原／抗体相互作用の分析により、ＰＤ−Ｌ１ペプチドによる、ＳＴＭ００４モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１抗原への結合の検出可能な阻害は示されなかった。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１  ＭＡｂ  ＳＴＭ００４によって認識されるＰＤ−Ｌ１のエピトープは、コンフォメーションであって、線形ではないと決定された。
【０２２５】
ＳＴＭ００４は、配列番号１の残基４８〜７８位内のＹ５６、Ｋ６２、およびＫ７５位（配列番号１の付番）でアミノ酸残基に接触するＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合することが決定された。
【０２２６】
ＳＴＭ１１５は、配列番号１の残基６１〜７８位内のＫ６２、Ｈ６９、およびＫ７５位（配列番号１の付番）のアミノ酸残基に接触するＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合することが決定された。
【実施例８】
【０２２７】
Ｔ細胞殺滅アッセイ
Ｔ細胞殺滅活性を利用して、本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が腫瘍細胞に及ぼす細胞傷害活性を決定した。従ったプロトコールは以下のとおりである；０日目、グリコシル化野生型ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１  ＷＴ）発現ＢＴ５４９  ＲＦＰ標的細胞培養物から血清含有培地を除去して、ＰＢＳで丁寧に２回すすいだ。細胞を回収して計数した。細胞浮遊液を遠心分離（１０００ＲＰＭ、４分間）して、細胞沈降物を培養培地に細胞５０，０００個／ｍｌで浮遊させた。手動のマルチチャンネルピペットを使用して、細胞を平底マイクロプレートのあらゆるウェルに播種した（１００μＬ／ウェル、すなわち、細胞５０００個／ウェル）。プレートを室温で３０分間放置した後、ＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ（登録商標）生細胞イメージング装置の中に入れて、２０分間平衡にした後、初回スキャンを計画した。初回スキャンの開始直後から３時間ごとに、２４時間の繰り返しスキャン（１０倍対物レンズ）を計画した。細胞のコンフルエンスを、所望のコンフルエンス（例えば２０％）が達成されるまで、続く１８時間で（終夜）モニターした。
【０２２８】
翌朝、アッセイの日（すなわち、１日目）、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｃａｓｐａｓｅ３／７アポトーシス緑色蛍光検出試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４４４０）の１０μＭ溶液を、アッセイ培地（４×最終アッセイ濃度２．５μＭ）中で調製して、インキュベータにおいて３７℃に加温した。抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）Ｔ細胞活性化剤処置を、アッセイ培地中で４×最終アッセイ濃度で調製して、３７℃に加温した。試験ＭＡｂも同様に調製した。標的細胞プレートをインキュベータから取り出して、細胞層を傷つけないように注意して培地を吸引した。マルチチャンネルピペットを使用して、加温したカスパーゼ３／７溶液２５μＬを各ウェルに移した。その後、加温した抗ＣＤ３抗体＋ＩＬ−２  ２５μＬおよび抗体を、細胞プレートの適切なウェルの中に入れた。エフェクター細胞（ＰＢＭＣまたは総Ｔ細胞）を含む追加の培地５０μＬを添加して、総アッセイ容積を１００μＬにした。脱気した細胞プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ（登録商標）機器の中に入れて、２０分間平衡にして、初回スキャンを行った。２４時間の繰り返しスキャンを２〜３時間毎に５日まで計画した。（対物レンズ１０倍；容器のタイプ：Ｃｏｒｎｉｎｇ３５９６；スキャンモード：標準；スキャンパターン：ウェルあたり画像２個；チャンネル：フェーズ＋「緑色」（＋ＮｕｃＬｉｇｈｔ（商標）赤色標的細胞を使用する場合は＋「赤色」）。
【０２２９】
分析に関して、標的細胞アポトーシスを、視野における「大きい」緑色蛍光オブジェクト（核）の総数を経時的に計数することによってＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ソフトウェアにおいて定量した。標的細胞の増殖は、赤色細胞核の数に対応する、赤色オブジェクトの数から測定した。データは１ｍｍ２あたりの蛍光オブジェクト数として表記した。データは、本明細書において記述した抗体、具体的にＳＴＭ００４の添加が腫瘍細胞殺滅を増強することを示した（図９）。
【実施例９】
【０２３０】
結合アッセイ
本明細書において記述される抗ｇｌｙｃＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体がＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を特異的に阻害するか否かを決定するために、以下の結合アッセイを実施した。アッセイの０日目に、血清含有培地をＰＤ−Ｌ１発現ＢＴ５４９標的細胞培養物から採取して、Ｄ−ＰＢＳによって丁寧に２回すすいだ。細胞を採取して計数した。細胞浮遊液を遠心分離（１０００ＲＰＭ、５分間）して、細胞沈降物を細胞５０，０００個／ｍｌで培養培地に浮遊させた。手動でのマルチチャンネルピペットを使用して、細胞（１００μＬ／ウェル、すなわち、細胞５０００個／ウェル）を平底マイクロプレートのあらゆるウェルに播種した。プレートを室温で３０分間放置した。その後、細胞を含むプレートを、５％ＣＯ２インキュベータにおいて終夜インキュベートした。
【０２３１】
アッセイの１日目に（すなわち翌朝）、１μｇ／ｍＬ  ＰＤ−１／Ｆｃおよび１：４００倍希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧを含む培養培地を調製して、インキュベータ内で３７℃に加温した。細胞プレートをインキュベータから取り出して、細胞層を傷つけないように注意して培地を吸引した。試験抗体５０μＬを、用量依存的に各ウェルに添加した。ＰＤ−１／ＦｃおよびＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧを含む培養培地５０μＬをあらゆるウェルに添加した。細胞プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ（登録商標）機器の中に入れて、２０分間平衡にして、初回スキャンを行った。２４時間の自動繰り返しスキャンを１〜２時間毎に２４時間まで計画した。対物レンズ１０倍；容器のタイプ：Ｃｏｒｎｉｎｇ３５９６；スキャンモード：標準；スキャンパターン：ウェルあたり画像４個；チャンネル：フェーズ＋「緑色」。
【０２３２】
図１０Ａは、代表的なＭＡｂ  ＳＴＭ００４が、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞へのＰＤ−Ｌ１／Ｆｃの結合を用量依存的に阻害したことを示している。対照アッセイの結果を図１０Ｂに示す。
【０２３３】
本明細書において開示され特許請求される方法の全ては、本開示に照らして不当な実験を行うことなく、作製および実行することができる。組成物および方法は、実施形態および好ましい実施形態に関して記述してきたが、記述の本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において記述される方法およびステップに、または方法のステップの順序に変更を適用してもよいことは、当業者に明白である。より具体的に、化学的および物理的に関連する特定の薬剤を、本明細書において記述される薬剤の代わりに置換してもよく、それでも同じまたは類似の結果が得られることは明白である。当業者に明白であるそのような全ての類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される記述の実施形態の精神、範囲、および概念に含まれると考えられる。
【０２３４】
本明細書において引用した全ての特許、刊行された特許出願、およびその他の刊行物は、参照により全体が本出願に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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