(57)【要約】本発明は、アミノ酸残基：α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つを含み、該少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する生殖系列ＴＣＲアミノ酸配列中には存在しない、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
のうちの少なくとも１つを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
該少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する生殖系列ＴＣＲアミノ酸配列中には存在しない、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；または
β鎖のＲ４３
から選択される、請求項１に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項３】
α鎖のＬ９６を含む、請求項１に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項４】
β鎖のＲ９を含む、請求項１に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項５】
β鎖のＹ１０を含む、請求項１に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項６】
α鎖のＴ２４を含む、請求項に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載の複数のアミノ酸残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項８】
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９およびβ鎖のＹ１０を含む、請求項７に記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項９】
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
の各々を含む、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴＣＲ。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれかに記載のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖をコードする核酸配列。
【請求項１１】
内部自己切断性配列または内部リボソーム進入部位によって連結された、α鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸配列。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項１４】
請求項１０もしくは１１に記載の核酸配列または請求項１２もしくは１３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１５】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞または幹細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
被験体から単離されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞または幹細胞に由来する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲを発現する細胞を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれかに記載のＴＣＲを発現する細胞を含む医薬組成物。
【請求項１９】
疾患を処置および／または予防する際の使用のための、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における使用のための、請求項１２もしくは１３に記載のベクターまたは請求項１４から１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１４から１６のいずれかに記載の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置するための方法。
【請求項２２】
細胞を、請求項１２または１３に記載のベクターでｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップを含む、請求項１４から１６のいずれかに記載の細胞を産生するための方法。
【請求項２３】
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；
（ｉｉ）α鎖の９６位；β鎖の９位；β鎖の１０位；α鎖の２４位；α鎖の１９位；α鎖の２０位；α鎖の５０位；α鎖の５位；α鎖の８位；α鎖の８６位；α鎖の３９位；α鎖の５５位；β鎖の４３位；α鎖の６６位；β鎖の１９位；β鎖の２１位；β鎖の１０３位；α鎖の３位；α鎖の７位；α鎖の９位；α鎖の１１位；α鎖の１６位；α鎖の１８位；α鎖の２１位；α鎖の２２位；α鎖の２６位；α鎖の４０位；α鎖の４７位；α鎖の４８位；α鎖の４９位；α鎖の５１位；α鎖の５２位；α鎖の５３位；α鎖の６７位；α鎖の６８位；α鎖の７４位；α鎖の７６位；α鎖の７９位；α鎖の８１位；α鎖の８３位；α鎖の９０位；α鎖の９２位；α鎖の９３位；およびα鎖の１０１位から選択される１または複数の位置において、該ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸残基を決定するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に列挙した位置のうちの１または複数におけるアミノ酸残基を、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択されるアミノ酸残基に変更するステップ
を含む、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の複数のアミノ酸残基を含むようにＴＣＲアミノ酸配列を変更するステップを含む、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法。
【請求項２５】
前記ＴＣＲアミノ酸が、請求項１から９のいずれかに記載の１または複数のアミノ酸残基を含むように変更される、請求項２３または２４に記載のＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法。
【請求項２６】
前記ＴＣＲアミノ酸配列が、前記ＴＣＲをコードする核酸配列の変異誘発によって変更される、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）一群のＴＣＲアミノ酸配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＴＣＲアミノ酸配列を選択するステップ
を含む、高発現ＴＣＲを選択するための方法。
【請求項２８】
（ｉ）一群のＴＣＲアミノ酸配列を提供するステップ；および
（ｉｉ）請求項２７に記載の複数のアミノ酸残基を含むＴＣＲアミノ酸配列を選択するステップ
を含む、高発現ＴＣＲを選択するための方法。
【請求項２９】
ステップ（ｉｉ）において選択された前記ＴＣＲアミノ酸配列が、請求項１から９のいずれかに記載の１または複数のアミノ酸残基を含む、請求項２７または２８に記載のＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法。
【請求項３０】
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）該ＴＣＲ配列が、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むかどうかを決定するステップ
を含み；
列挙されたアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含む配列が、高発現ＴＣＲであると決定され、列挙されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含まない配列が、低発現ＴＣＲであると決定される、ＴＣＲの強度を決定するための方法。
【請求項３１】
コンピュータープログラムが非一時的様式で記憶され、該プログラムが処理デバイス上で実行された場合に、請求項２７から３０のいずれかに記載の方法を該処理デバイスに実施させる、コンピュータープログラム製品。
【請求項３２】
請求項１から９のいずれかに記載の操作されたＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための、該ＴＣＲ；請求項１０もしくは１１に記載の核酸配列または請求項１２もしくは１３に記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。特に、本発明は、対応する生殖系列ＴＣＲ配列と比較して、外因性ＴＣＲとして発現された場合に高レベルの細胞表面発現を有する操作されたＴＣＲに関する。本発明は、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子治療は、レシピエントＴ細胞中への抗原特異的ＴＣＲ鎖の移入であり、こうすることでＴリンパ球の特異性を目的の標的抗原へと再指向化させる。
【０００３】
導入されたＴＣＲは、細胞表面上で発現されるそれらの能力が大きく異なる。導入された強く発現されるＴＣＲは、内因性ＴＣＲと共発現される、または細胞表面発現について内因性ＴＣＲを打ち負かしさえし得る。導入された弱く発現されるＴＣＲは、内因性の強いＴＣＲと共発現される場合、細胞表面には存在しない（図１）。
【０００４】
Ｔ細胞表面上の抗原特異的ＴＣＲの高レベルの発現は、治療的ＴＣＲ治療の効力にとって有益な、Ｔ細胞のより高いアビディティを生じる。
【０００５】
したがって、弱く発現されるＴＣＲの細胞表面発現を増加させる方法およびアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要の局面
本発明者らは、ＴＣＲ細胞表面発現を増強するＴＣＲフレームワーク領域内のいくつかの重要なアミノ酸位置および残基を決定した。
【０００７】
したがって、第１の態様では、本発明は、以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
のうちの少なくとも１つを含む操作されたＴＣＲであって、
該少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する生殖系列ＴＣＲアミノ酸配列中には存在しない、操作されたＴＣＲを提供する。
【０００８】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；および
β鎖のＲ４３
のリストから選択され得る。
【０００９】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６を含み得る。
【００１０】
操作されたＴＣＲは、β鎖のＲ９を含み得る。
【００１１】
操作されたＴＣＲは、β鎖のＹ１０を含み得る。
【００１２】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ２４を含み得る。
【００１３】
操作されたＴＣＲは、本発明の第１の態様に規定される複数のアミノ酸残基を含み得る。
【００１４】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９およびβ鎖のＹ１０を含み得る。
【００１５】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１の各々を含み得る。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によって規定されるＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖をコードする核酸配列を提供する。
【００１７】
核酸配列は、内部自己切断性配列または内部リボソーム進入部位によって連結された、α鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列を含み得る。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列を含むベクターを提供する。
【００１９】
ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００２０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列または本発明の第３の態様によるベクターを含む細胞を提供する。
【００２１】
細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞または幹細胞であり得る。
【００２２】
細胞は、被験体から単離されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞または幹細胞に由来し得る。
【００２３】
第５の態様では、本発明は、以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲを発現する細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
細胞は、本発明の第１の態様で規定される複数のアミノ酸残基を含むＴＣＲを発現し得る。
【００２５】
細胞は、本発明の第１の態様によって規定される操作されたＴＣＲを発現し得る。
【００２６】
第６の態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の第５の態様に従う医薬組成物に関する。
【００２７】
第７の態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における使用のための、本発明の第３の態様に従うベクターまたは本発明の第４の態様に従う細胞を提供する。
【００２８】
第８の態様では、本発明は、本発明の第４の態様に従う細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置するための方法に関する。
【００２９】
第９の態様では、本発明は、細胞を、本発明の第３の態様に従うベクターでｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップを含む、本発明の第４の態様に従う細胞を産生するための方法に関する。
【００３０】
第１０の態様では、本発明は、
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；
（ｉｉ）α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される１または複数の位置において、ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列のアミノ酸残基を決定するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に列挙した１または複数の位置におけるアミノ酸残基を、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択されるアミノ酸残基に変更するステップ
を含む、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法を提供する。
【００３１】
この方法は、本発明の第１の態様で規定される複数のアミノ酸残基を含むようにＴＣＲアミノ酸配列を変更するステップを含み得る。
【００３２】
ＴＣＲアミノ酸配列は、前記ＴＣＲをコードする核酸配列の変異誘発によって変更され得る。
【００３３】
第１１の態様では、本発明は、
（ｉ）一群のＴＣＲアミノ酸配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＴＣＲアミノ酸配列を選択するステップ
を含む、高発現ＴＣＲを選択するための方法に関する。
【００３４】
この方法は、本発明の第１１の態様で規定される複数のアミノ酸残基を含むＴＣＲアミノ酸配列を選択するステップを含み得る。
【００３５】
第１２の態様では、本発明は、
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）該ＴＣＲ配列が、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むかどうかを決定するステップ
を含み；
列挙されたアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含む配列が、高発現ＴＣＲであると決定され、列挙されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含まない配列が、低発現ＴＣＲであると決定される、ＴＣＲの強度を決定するための方法を提供する。
【００３６】
第１３の態様では、本発明は、コンピュータープログラムが非一時的様式で記憶され、該プログラムが処理デバイス上で実行された場合に、本発明の第１２の態様の方法を該処理デバイスに実施させる、コンピュータープログラム製品を提供する。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための、本発明の操作されたＴＣＲ；核酸配列またはベクターの使用を提供する。
【００３８】
弱く発現されるＴＣＲにおける、重要なアミノ酸残基による置換は、大きく改善された発現を生じることが実証された。「弱い」残基を本発明によって規定される「強い」アミノ酸残基で置き換えるための、個々の重要な残基の単一のアミノ酸置換、ならびにある範囲のアミノ酸置換組合せは、ＴＣＲ発現を増加させたこともまた実証された。
【００３９】
アミノ酸の変化は、変異誘発、例えばＰＣＲ変異誘発によって、経済的に、迅速にかつ効率的に達成され得る。ＴＣＲ細胞表面発現を増加させるこの方法は、ＴＣＲによるペプチド／ＭＨＣ認識を妨害せず、ＴＣＲの折り畳みにも構造にも影響を与えない。したがって、ＴＣＲ発現は、ＴＣＲ構造に対する最小限の影響を伴って増加される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ａ）内因性ＴＣＲもまた発現する細胞における弱い外因性ＴＣＲおよび強い外因性ＴＣＲの描写。Ｂ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の模式図  −  ＳＰ：シグナルペプチド；ＦＲ：フレームワーク領域；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＩＧ：Ｃ領域の免疫グロブリン様ドメイン；ＣＰ：接続ペプチド；ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＩＣ：細胞内ドメイン。
【００４１】
【図２】ＴＣＲ優位を示す改変されたＷＴ１  ＴＣＲで形質導入された初代Ｔ細胞。
【００４２】
【図３】強い内因性ＴＣＲおよび弱い内因性ＴＣＲのＴＣＲクロノタイピング。  表中には、（ｉ）配列決定した強いおよび弱いアルファおよびベータ可変セグメントの総数、ならびに（ｉｉ）各集団内の可変セグメントの各々の総数と共に、強い内因性ＴＣＲ集団または弱い内因性ＴＣＲ集団のいずれかにおいて優位を示すアルファ可変セグメントおよびベータ可変セグメントが示される。アルファセグメントおよびベータセグメントは、ＩＭＧＴ命名法を使用して分類されている。
【００４３】
【図４】一般的な強発現ＴＣＲおよび弱発現ＴＣＲの特徴を評価するために使用した構築物の図。
【００４４】
【図５】非競合的環境（ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞）における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現。
【００４５】
【図６】競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現。
【００４６】
【図７−１】低、中間および高発現の改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現。
【図７−２】低、中間および高発現の改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現。
【００４７】
【図８】強発現ＴＣＲおよび弱発現ＴＣＲのバイオインフォマティクス分析。Ａ）クロノタイピングからの配列決定情報を使用して、配列決定した全ての強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲについて、各位置における全ての残基を比較した。ＴＣＲアラインメント後、弱いＴＣＲと比較して、強いＴＣＲ中の特定の位置における高い出現率を有した残基が、一例としてＴＲＡＶ３８−１を使用して図中に示される（＊）。Ｂ）強いＴＣＲ可変セグメントおよび弱いＴＣＲ可変セグメントの予測された３Ｄ構造の分析。
【００４８】
【図９】非競合的環境（ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞）および競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）の両方において強発現ＴＣＲおよび弱発現ＴＣＲを逆転させる、全ての同定された重要な残基の変異。
【００４９】
【図１０−１】個々の重要な残基の変更は、非競合的環境（ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１０−２】個々の重要な残基の変更は、非競合的環境（ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１０−３】個々の重要な残基の変更は、非競合的環境（ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１０−４】個々の重要な残基の変更は、非競合的環境（ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【００５０】
【図１１−１】個々の重要な残基の変更は、競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１１−２】個々の重要な残基の変更は、競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１１−３】個々の重要な残基の変更は、競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【図１１−４】個々の重要な残基の変更は、競合的環境（ＷＴ１ハイブリッドＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞）における外因性ＴＣＲの発現レベルに影響を与える。
【００５１】
【図１２】一部の実施形態を提供またはサポートするために使用される汎用計算デバイス。
【００５２】
【図１３−１】ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞（Ａ）および改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）を、示されたＴＣＲをコードするｐＭＰ７１レトロウイルスで形質導入した。形質導入の７２時間後、細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗Ｍｙｃタグ抗体および抗マウス定常ベータＴＣＲ抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現を決定した。Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現のＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した。（Ｃ）ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩ。（Ｄ）改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲのＭＦＩ。
【図１３−２】ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞（Ａ）および改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）を、示されたＴＣＲをコードするｐＭＰ７１レトロウイルスで形質導入した。形質導入の７２時間後、細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗Ｍｙｃタグ抗体および抗マウス定常ベータＴＣＲ抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現を決定した。Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現のＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した。（Ｃ）ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩ。（Ｄ）改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲのＭＦＩ。
【００５３】
【図１４】Ｌ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βへの可変ドメイン残基の変化は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＭＶおよびＷＴ１  ＴＣＲ発現を改善する。
【００５４】
【図１５】Ｌ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βへの可変ドメイン残基の変化は、抗原特異的サイトカイン産生を改善する。
【００５５】
【図１６】Ｌ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βへの可変ドメイン残基の変化は、抗原特異的サイトカイン産生を改善する。
【００５６】
【図１７−１】良好に発現されるＴＣＲおよび不十分に発現されるＴＣＲで形質導入された細胞は、類似の量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを含有する。
【図１７−２】良好に発現されるＴＣＲおよび不十分に発現されるＴＣＲで形質導入された細胞は、類似の量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを含有する。
【図１７−３】良好に発現されるＴＣＲおよび不十分に発現されるＴＣＲで形質導入された細胞は、類似の量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを含有する。
【００５７】
【図１８】ＴＣＲ発現へのＴＣＲアルファ対ＴＣＲベータの寄与。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
Ｔ細胞受容体
抗原プロセシングの間に、抗原は、細胞の内側で分解され、次いで、主要組織適合複合体（major  histocompatability  complex）（ＭＨＣ）分子によって細胞表面に運搬される。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面におけるこのペプチド：ＭＨＣ複合体を認識することができる。異なる細胞区画から細胞表面にペプチドを送達する、２つの異なるクラスのＭＨＣ分子、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩが存在する。
【００５９】
Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、ＭＨＣ分子に結合した抗原の認識を担う、Ｔ細胞の表面上に見出される分子である。ＴＣＲヘテロダイマーは、Ｔ細胞の９５％ではα鎖およびβ鎖からなり、Ｔ細胞の５％は、γ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有する。
【００６０】
ＴＣＲが抗原およびＭＨＣと結合すると、関連する酵素、共受容体および固有アクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的事象を介して、そのＴリンパ球の活性化を生じる。
【００６１】
ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、１つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、１つの膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端における１つの短い細胞質テイルを有する（図１Ｂ）。
【００６２】
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＣＤＲ３は、処理された抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１もまた、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に位置する。これらの領域は、ＴＣＲ可変領域の構造を提供する。
【００６３】
ＴＣＲ可変領域のレパートリーは、可変（Ｖ）遺伝子、連結（joining）（Ｊ）遺伝子および多様性（Ｄ）遺伝子のコンビナトリアル連結によって；ならびにＮ領域多様化（酵素デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって挿入されたヌクレオチド）によって生成される。
【００６４】
α鎖およびγ鎖は、ＶセグメントとＪセグメントとの間の組換え事象から形成される。β鎖およびδ鎖は、Ｖ、ＤおよびＪセグメントが関与する組換え事象から形成される。
【００６５】
ＴＣＲδ遺伝子座もまた含むヒトＴＣＲα遺伝子座は、第１４染色体上に位置する（１４ｑ１１．２）。ＴＣＲβ遺伝子座は、第７染色体上に位置する（７ｑ３４）。ＴＣＲα鎖の可変領域は、４６の異なるＶα（可変）セグメントのうちの１つと５８のＪα（連結）セグメントのうちの１つとの間での組換えによって形成される（Koopら；１９９４年；Genomics；１９巻：４７８〜４９３頁）。ＴＣＲβ鎖の可変領域は、５４のＶβセグメントと、１４のＪβセグメントと、２つのＤβ（多様性）セグメントとの間での組換えから形成される（Rowenら；１９９６年；Science；２７２巻：１７５５〜１７６２頁）。
【００６６】
各ＴＣＲ鎖遺伝子座についてのＶおよびＪ（および適宜Ｄ）遺伝子セグメントが同定されており、各遺伝子の生殖系列配列が公知であり、アノテーションされている（例えば、ScavinerおよびLefranc；２０００年；Exp  Clin  Immunogenet；１７巻：８３〜９６頁ならびにFolchおよびLefranc；２０００年；Exp  Clin  Immunogenet；１７巻：４２〜５４頁を参照のこと）。
【００６７】
α鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３は、Ｖα遺伝子によってコードされる。ＦＲ４は、Ｊα遺伝子によってコードされる（図１Ｂ）。
【００６８】
β鎖のＦＲ１、ＣＲＤ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２およびＦＲ３は、Ｖβ遺伝子によってコードされる。ＣＤＲ３はＤβ遺伝子によってコードされ、ＦＲ４はＪβ遺伝子によってコードされる（図１Ｂ）。
【００６９】
各可変遺伝子の生殖系列配列は当該分野で公知である（ScavinerおよびLefranc；上記ならびにFolchおよびLefranc；上記を参照のこと）ので、特定のＴＣＲのＶαおよび／またはＶβが配列決定され得、ＴＣＲにおいて利用される生殖系列Ｖセグメントが同定され得る（例えば、Hodgesら；２００３年；J  Clin  Pathol；５６巻：１〜１１頁、Zhouら；２００６年；Laboratory  Investigation；８６巻；３１４〜３２１頁を参照のこと）。
【００７０】
ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して２つの鎖間の連結（link）を形成する、短い連結配列（connecting  sequence）からなる。本発明のＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメイン中に２つのジスルフィド結合を含むように、α鎖およびβ鎖の各々中に追加のシステイン残基を有し得る（以下を参照のこと）。
【００７１】
この構造により、ＴＣＲが、哺乳動物における３つの別個の鎖（γ、δおよびε）を有するＣＤ３、およびζ鎖などの他の分子と会合することが可能になる。これらのアクセサリー分子は、負に荷電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲからのシグナルを細胞中に伝播するために重要である。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと一緒になって、Ｔ細胞受容体複合体として公知の構造を形成する。
【００７２】
Ｔ細胞複合体からのシグナルは、特異的共受容体によるＭＨＣ分子の同時結合によって増強される。ヘルパーＴ細胞上では、この共受容体はＣＤ４（クラスＩＩ  ＭＨＣに対して特異的）であり；細胞傷害性Ｔ細胞上では、この共受容体はＣＤ８（クラスＩ  ＭＨＣに対して特異的）である。共受容体は、抗原に対するＴＣＲの特異性を保証するだけでなく、抗原提示細胞とＴ細胞との間の長期にわたる結合を可能にし、活性化されたＴリンパ球のシグナル伝達に関与する細胞の内側の重要な分子（例えば、ＬＣＫ）を動員する。
【００７３】
したがって、用語「Ｔ細胞受容体」は、従来の意味において、ＭＨＣ分子によって提示された場合にペプチドを認識することが可能な分子を意味するために使用される。この分子は、２つの鎖αおよびβ（または任意選択でγおよびδ）のヘテロダイマーであり得、または単鎖ＴＣＲ構築物であり得る。
【００７４】
本発明は、かかるＴ細胞受容体由来のα鎖またはβ鎖もまた提供する。
【００７５】
本発明のＴＣＲは、１つよりも多い種に由来する配列を含むハイブリッドＴＣＲであり得る。例えば、マウスＴＣＲは、ヒトＴＣＲよりも、ヒトＴ細胞において効率的に発現されることが見出されたことが、驚くべきことに見出された。したがって、ＴＣＲは、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含み得る。このアプローチの短所は、マウス定常配列が免疫応答を引き起こして、移入されたＴ細胞の拒絶をもたらし得ることである。しかし、養子Ｔ細胞治療のために患者を準備するために使用されるコンディショニングレジメンは、マウス配列を発現するＴ細胞の生着を可能にするのに十分な免疫抑制を生じ得る。
【００７６】
本発明の第１の態様に従う操作されたＴＣＲは、生殖系列Ｖα遺伝子またはＶβ遺伝子によってはコードされない、本明細書で規定される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。言い換えると、本発明の操作されたＴＣＲは、本明細書に記載される位置のうちの１または複数において変更されたアミノ酸残基を含むα鎖および／またはβ鎖を含み、変更されたアミノ酸残基アミノ酸は、変更されていない生殖系列Ｖα遺伝子またはＶβ遺伝子によってコードされる対応するα鎖および／またはβ鎖と比較して、本明細書で規定される残基である。
【００７７】
本明細書で同定されたアミノ酸残基は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）に従って番号付けされる。この系は、当該分野で周知であり（Lefranceら；２００３年；Dev  Comp  Immunol；２７巻：５５〜７７頁）、可変領域の構造の高い保存に基づいている。この番号付けは、ＦＲおよびＣＤＲの定義、Ｘ線回折研究からの構造データならびに超可変ループの特徴付けを考慮に入れ、これらを組み合わせる。
【００７８】
ＦＲ領域およびＣＤＲ領域の限界は、ＩＧＭＴ番号付け系内で定義される。ＦＲ１領域は、２３位における第１のＣＹＳを伴って、１〜２６位（Ｖ−ＧＥＮＥ群または下位群に依存して２５〜２６アミノ酸）を含む。ＦＲ２領域は、４１位における保存されたＴＲＰを伴って、３９〜５５位（１６〜１７アミノ酸）を含む。ＦＲ３領域は、８９位における保存された疎水性アミノ酸および１０４位における第２のＣＹＳを伴って、６６〜１０４位（ＶＧＥＮＥ群または下位群に依存して３６〜３９アミノ酸）を含む。ＩＧＭＴ番号付け系の残基１は、ＦＲ１中の最初の残基である。ＩＧＭＴ番号付け系の残基１０４は、ＦＲ３中の最後の残基である。
【００７９】
このように、本明細書で使用される番号付け系は、適宜、α鎖全体またはβ鎖全体内のアミノ酸の位置を指す。
【００８０】
したがって、ＩＧＭＴ番号付けは、ＴＣＲ可変領域内のアミノ酸位置の標準化された記載、および生殖系列コードされた配列との比較の実施を可能にする。
【００８１】
本発明の第１の態様に従う操作されたＴＣＲを生成するために適切な方法は、当該分野で公知である。
【００８２】
例えば、変異誘発が、ＴＣＲをコードする核酸配列中の特定のヌクレオチドを変更するために実施され得る。かかる変異誘発は、ＴＣＲが本発明に従うアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含むように、ＴＣＲのアミノ酸配列を変更する。
【００８３】
変異誘発法の一例は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法である（Papworthら；１９９６年；Strategies；９巻（３号）；３〜４頁）。この方法は、高忠実度非鎖置換（high-fidelity  non-strand-displacing）ＤＮＡポリメラーゼ、例えばｐｆｕポリメラーゼを使用するサーモサイクリング反応において鋳型核酸配列を増幅するための相補的変異原性プライマー対の使用を伴う。
【００８４】
本発明者らは、ＴＣＲフレームワーク領域の特定の位置における特定のアミノ酸残基の存在が、ＴＣＲの細胞表面発現を変更することを決定している。
【００８５】
本明細書で使用する場合、細胞表面発現は、発現の強度と同義である。このように、「強い」または「高い」発現は、ＴＣＲの高レベルの細胞表面発現と等価である。「弱い」または「低い」発現は、ＴＣＲの低レベルの細胞表面発現と等価である。
【００８６】
ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるとは、本発明に従う少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＴＣＲが、生殖系列配列によってコードされるアミノ酸配列を含む等価なＴＣＲと比較して、より高いレベルの細胞表面発現を有することを意味する。生殖系列配列によってコードされるアミノ酸配列を含む等価なＴＣＲとは、本発明に従うアミノ酸残基を含むように改変されていないＴＣＲを指す、即ち、変更されていないＴＣＲは、特定の位置において野生型アミノ酸残基を有する。
【００８７】
一実施形態では、本発明の操作されたＴＣＲは、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲよりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍大きい細胞表面発現を有し得る。
【００８８】
ＴＣＲの細胞表面発現は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、ＴＣＲの細胞表面発現は、当該分野で公知の従来のフローサイトメトリー法を使用して決定され得る（例えば、Shapiro；Practical  Flow  Cytometry；John  ２００５年；Scienceを参照のこと）。
【００８９】
例えば、ＴＣＲの細胞表面発現は、細胞の集団におけるＴＣＲ発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表され得る（Shapiro；上記を参照のこと）。一実施形態では、本発明の操作されたＴＣＲを発現する細胞の集団のＭＦＩは、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲを発現する細胞の対応する集団のＭＦＩよりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍大きくてよい。
【００９０】
ＴＣＲの細胞表面発現は、細胞表面においてＴＣＲを発現する集団内の細胞の百分率として表され得る。かかる百分率は、当該分野で周知のように、従来のフローサイトメトリー法を使用して決定され得る（例えば、Shapiro；上記およびHenelら；２００７年；Lab  Medicine；３８巻；７号；４２８〜４３６頁を参照のこと）。
【００９１】
一実施形態では、本発明の操作されたＴＣＲは、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲと比較して、集団中の少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％より多い細胞によって発現され得る。
【００９２】
一実施形態では、操作されたＴＣＲの細胞表面発現は、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲと比較して増加されるが、操作されたＴＣＲまたは改変されていない生殖系列ＴＣＲをコードするｍＲＮＡの相対的レベルは、本質的に同じである。本明細書で使用する場合、「本質的に同じ」は、ｍＲＮＡレベルが、例えば１．５倍未満異なることを意味し得る。相対的ｍＲＮＡレベルは、当該分野で公知の方法；例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノザンブロッティングおよびフローサイトメトリーＲＮＡアッセイ（例えば、図１７中に示される）を使用して決定され得る。
【００９３】
したがって、第１の態様では、本発明は、以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
のうちの少なくとも１つを含む操作されたＴＣＲであって、
該少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する生殖系列ＴＣＲアミノ酸配列中には存在しない、操作されたＴＣＲを提供する。
【００９４】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；および
β鎖のＲ４３
のリストから選択され得る。
【００９５】
一実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；および
α鎖のＳ８６
のリストから選択され得る。
【００９６】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６と、β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【００９７】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９およびβ鎖のＹ１０を含み得る。
【００９８】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＶ１９；β鎖のＲ９およびβ鎖のＹ１０を含み得る。
【００９９】
操作されたＴＣＲは、β鎖のＲ９を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、β鎖のＲ９と、α鎖のＬ９６；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１００】
操作されたＴＣＲは、β鎖のＹ１０を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、β鎖のＹ１０と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０１】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ２４を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ２４と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０２】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＶ１９を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＶ１９と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０３】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ２０を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ２０と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０４】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＭ５０を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＭ５０と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０５】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ５を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＴ５と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０６】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＱ８を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＱ８と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０７】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＳ８６を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＳ８６と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０８】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＦ３９を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＦ３９と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１０９】
操作されたＴＣＲは、α鎖のＤ５５を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＤ５５と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１１０】
操作されたＴＣＲは、β鎖のＲ４３を含み得る。一実施形態では、操作されたＴＣＲは、β鎖のＲ４３と、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１のうちの少なくとも１つとを含み得る。
【０１１１】
用語「少なくとも１つ」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超のアミノ酸残基を含み得る。
【０１１２】
操作されたＴＣＲは、上に列挙された複数のアミノ酸残基を含み得る。言い換えると、ＴＣＲは、上に列挙されたアミノ酸残基のうち、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０を含み得る。
【０１１３】
操作されたＴＣＲは、β鎖中のＲ９およびＹ１０を含み得る。
【０１１４】
一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１の各々を含み得る；
一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；およびβ鎖のＲ４３の各々を含み得る。
【０１１５】
一実施形態では、操作されたＴＣＲは、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；およびα鎖のＳ８６の各々を含み得る。
【０１１６】
保存的置換
本発明はまた、以下のアミノ酸残基：
α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１
から選択されるアミノ酸残基の保存的置換を含む操作されたＴＣＲを包含する。
【０１１７】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；または
β鎖のＲ４３
から選択され得る。
【０１１８】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、本明細書に記載される任意のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基であり得る。
【０１１９】
高発現のＴＣＲが保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質における類似性に基づいて保存的アミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【０１２０】
保存的置換を、例えば、以下の表に従って行うことができる。２番目の列の同じブロック中のアミノ酸、および好ましくは３番目の列の同じ並びのアミノ酸は、互いに置換され得る：
【表１】
2018512867.tif 000002
【０１２１】
本発明は、相同置換（置換および置き換えは共に、代替的残基による既存のアミノ酸残基の交換を意味するために本明細書で使用される）、即ち、同じ条件の下での置換（like-for-like  substitution）、例えば、塩基性を塩基性に、酸性を酸性に、極性を極性に置換することなどもまた包含する。
【０１２２】
核酸配列
本発明は、本発明の第１の態様に従う操作されたＴＣＲ受容体またはその一部、例えば、α鎖またはβ鎖の可変配列；α鎖および／またはβ鎖をコードするヌクレオチド配列をさらに提供する。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義であることとする。
【０１２４】
遺伝コードの縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが、当業者によって理解される。さらに、当業者が、慣用的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度（codon  usage）を反映するように、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ることを、理解すべきである。
【０１２５】
本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。これらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる型の改変が、当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリシン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載される使用を目的として、ポリヌクレオチドが当該分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることを理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施され得る。
【０１２６】
ヌクレオチド配列は、二本鎖または一本鎖であり得、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【０１２７】
ヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するようにそれらが調整されるように、配列中のコドンを変更させることによって、発現を増加させることが可能である。
【０１２８】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀なコドンを使用し、一般に使用される哺乳動物コドンに対応するようにこれらを変化させることによって、哺乳動物産生細胞におけるパッケージング成分の発現の増加が達成され得る。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞について、ならびに種々の他の生物について、当該分野で公知である。
【０１２９】
コドン最適化は、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび潜在性スプライス部位の除去も伴い得る。
【０１３０】
核酸配列は、α鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列（a  nucleic  acid  sequence  a  β  chain）の両方が同じｍＲＮＡ転写物から発現されるのを可能にする核酸配列を含み得る。
【０１３１】
例えば、核酸配列は、α鎖をコードする核酸配列とβ鎖をコードする核酸配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列の中央部における翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。
【０１３２】
核酸配列は、内部自己切断性配列によって連結されたα鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列を含み得る。
【０１３３】
内部自己切断性配列は、α鎖を含むポリペプチドとβ鎖を含むポリペプチドとが分離されるのを可能にする任意の配列であり得る。
【０１３４】
切断部位は、ポリペプチドが産生されたときに、任意の外部切断活性を必要とせずに個々のペプチドへと即座に切断されるように、自己切断性であり得る。
【０１３５】
用語「切断」は、便宜のために本明細書で使用されるが、切断部位は、古典的切断以外の機構によってペプチドを個々の実体へと分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断性ペプチド（以下を参照のこと）について、種々のモデルが「切断」活性を説明するために提唱されてきた：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）（Donnellyら（２００１年）J.  Gen.  Virol.  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列間に位置する場合にそれらのタンパク質を別々の実体として発現させる限り、かかる「切断」の正確な機構は、本発明の目的のためには重要ではない。
【０１３６】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。
【０１３７】
ベクター
本発明は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含むベクターもまた提供する。
【０１３８】
用語「ベクター」には、発現ベクター、即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ発現が可能な構築物が含まれる。
【０１３９】
ウイルス送達系には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４０】
レトロウイルスは、溶解性ウイルス（ｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）のものとは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。これに関して、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染性実体である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは、逆転写酵素によってＤＮＡ形態に変換される。このＤＮＡコピーは、感染性ウイルス粒子のアセンブリに必要な、新たなＲＮＡゲノムおよびウイルスによりコードされたタンパク質の産生のための鋳型として機能する。
【０１４１】
多くのレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）−２９（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ならびにレンチウイルスを含む全ての他のレトロウイルス科（retroviridiae）が存在する。。
【０１４２】
レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら（「Retroviruses」１９９７年Cold  Spring  Harbour  Laboratory  Press編：JM  Coffin、SM  Hughes、HE  Varmus  ７５８〜７６３頁）中に見出され得る。
【０１４３】
レンチウイルスもまたレトロウイルス科に属するが、これらは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染できる（Lewisら（１９９２年）EMBO  J.  ３０５３〜３０５８頁）。
【０１４４】
ベクターは、本発明の第２の態様に従うヌクレオチドを、Ｔ細胞などの細胞に移入させることが可能であり得る。ベクターは、理想的には、導入されたＴＣＲが、ＣＤ３分子の限定されたプールをめぐって内因性ＴＣＲと首尾よく競合し得るように、Ｔ細胞において持続的な高レベル発現が可能であるべきである。
【０１４５】
ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。ベクターは、ＭＰ７１ベクター骨格に基づき得、またはＭＰ７１ベクター骨格から誘導可能であり得る。ベクターは、全長または短縮型バージョンのウッドチャック肝炎応答エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）を欠き得る。
【０１４６】
ヒト細胞の効率的感染のために、ウイルス粒子は、両種指向性エンベロープまたはテナガザル白血病ウイルスエンベロープを用いてパッケージングされ得る。
【０１４７】
ＣＤ３分子の供給を増加させることは、遺伝子改変された細胞においてＴＣＲ発現を増加させ得る。したがって、ベクターは、ＣＤ３−ガンマ、ＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−イプシロンおよび／またはＣＤ３−ゼータの遺伝子もまた含み得る。ベクターは、ＣＤ３−ゼータの遺伝子だけを含み得る。これらの遺伝子は、自己切断性配列、例えば、２Ａ自己切断性配列によって連結され得る。あるいは、ＣＤ３遺伝子をコードする、１または複数の別々のベクターが、ＴＣＲコードベクター（複数可）との共移入のために提供され得る。
【０１４８】
細胞
本発明はさらに、本発明に従うヌクレオチド配列を含む細胞に関する。細胞は、本発明の第１の態様のＴ細胞受容体を発現し得る。
【０１４９】
細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、例えば、αβ  Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞を含む任意のＴ細胞サブセットであり得る。
【０１５０】
細胞は、ナチュラルキラー細胞であり得る。
【０１５１】
細胞は、被験体から単離された細胞に由来し得る。細胞は、被験体から単離された混合細胞集団、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の集団の一部であり得る。
【０１５２】
ＰＢＬ集団内のＴ細胞は、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用して、当該分野で公知の方法によって活性化され得る。
【０１５３】
Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。細胞は、ＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の混合集団中にあり得る。例えば、任意選択で抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて抗ＣＤ３抗体を使用するポリクローナル活性化は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を誘発するが、ＣＤ４＋２５＋  調節性Ｔ細胞の増殖もまた誘発し得る。
【０１５４】
一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１５５】
一実施形態では、本発明に従う操作されたＴＣＲを発現する細胞は、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲを発現する細胞と比較して、増加した機能的活性を有し得る。
【０１５６】
増加した機能的活性は、例えば、ＴＣＲへの抗原の結合後の細胞による増加したサイトカイン産生を指し得る。サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３から選択され得る。
【０１５７】
サイトカインは、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２であり得る。
【０１５８】
本明細書で使用する場合、「増加したサイトカイン産生」とは、ＴＣＲへの抗原の結合の際に、本発明に従う操作されたＴＣＲを発現する細胞によって産生されるサイトカインの量が、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲを発現する等価な細胞によって産生される量よりも大きい（in  greater  than  the  amount  produced  by  an  equivalent  cell）ことを意味する。
【０１５９】
本発明に従う操作されたＴＣＲを発現する細胞によって産生されるサイトカインの量は、改変されていない生殖系列ＴＣＲ配列を含む対応するＴＣＲを発現する等価な細胞によって産生される量よりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍大きい場合がある。
【０１６０】
細胞によって産生されるサイトカインの量は、当該分野で公知の方法、例えば、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。
【０１６１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞に本発明に従うベクターをトランスフェクトし、または細胞を本発明に従うベクターで形質導入するステップを含む、本発明に従う細胞を産生する方法もまた提供する。
【０１６２】
細胞は、遺伝子改変された細胞が養子移入される被験体から単離され得る。この点において、細胞は、Ｔ細胞を被験体から単離すること、そのＴ細胞を任意選択で活性化すること、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ遺伝子移入することによって作製され得、該ＴＣＲ形質導入された細胞の養子移入による被験体の引き続く免疫療法がなされる。
【０１６３】
あるいは、細胞は、同種異系であるように、異なる被験体から単離され得る。細胞は、ドナー被験体から単離され得る。例えば、被験体が同種異系造血幹細胞移植（Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ）を受けている場合、この細胞は、ＨＳＣが由来するドナーに由来し得る。被験体が固形臓器移植を受けている場合またはそれを受けた場合、この細胞は、固形臓器が由来した被験体に由来し得る。
【０１６４】
あるいは、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞であり得、またはそれに由来し得る。幹細胞はＣＤ３分子を発現しないので、ＨＳＣ中への遺伝子移入は、細胞表面におけるＴＣＲ発現をもたらさない。しかし、幹細胞が、胸腺へと遊走するリンパ系前駆体へと分化する場合、ＣＤ３発現の開始は、胸腺細胞における導入されたＴＣＲの表面発現をもたらす。
【０１６５】
このアプローチの利点は、導入されたＴＣＲ鎖の発現が、機能的なＴＣＲアルファおよびベータ遺伝子を形成するための内因性ＴＣＲ遺伝子セグメントの再構成を抑制するので、成熟Ｔ細胞が、一旦産生されると、導入されたＴＣＲのみを発現し、内因性ＴＣＲ鎖はほとんどまたは全く発現しないことである。
【０１６６】
さらなる利点は、遺伝子改変された幹細胞が、所望の抗原特異性を有する成熟Ｔ細胞の継続的な供給源であることである。したがって、細胞は、分化の際に、本発明の第１の態様のＴＣＲを発現するＴ細胞を産生する遺伝子改変された幹細胞であり得る。本発明は、本発明に従うヌクレオチド配列を含む幹細胞の分化を誘導することによって、本発明の第１の態様のＴＣＲを発現するＴ細胞を産生する方法もまた提供する。
【０１６７】
幹細胞アプローチの短所は、所望の特異性を有するＴＣＲが、胸腺におけるＴ細胞発生の間に欠失され得、または末梢Ｔ細胞において発現される場合に寛容を誘導し得ることである。別のあり得る問題は、幹細胞における挿入変異誘発のリスクである。
【０１６８】
医薬組成物
本発明は、本発明に従うベクターまたは細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１６９】
医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を追加的で含み得る。医薬組成物は、１または複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を任意選択で含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０１７０】
使用
本発明はさらに、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明に従う細胞を含む医薬組成物に関する。
【０１７１】
「処置する」は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、細胞を、既存の疾患または状態を有する被験体に投与して、疾患と関連する少なくとも１つの症状を低下、低減もしくは改善し、かつ／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断し得る。
【０１７２】
「予防する」は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書では、かかる細胞は、疾患の原因を予防もしくは減じるため、または疾患と関連する少なくとも１つの症状の発症を低減もしくは予防するために、疾患にいまだ罹患していない被験体および／または疾患のいずれの症状も示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患の素因を有し得、または疾患を発症するリスクにあると考えられ得る。
【０１７３】
本発明は、本発明に従う操作されたＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための、本発明に従う操作されたＴＣＲ；核酸配列またはベクターの使用も提供する。
【０１７４】
本発明は、細胞の機能的活性を増加させるための、本発明に従う操作されたＴＣＲ；核酸配列またはベクターの使用もまた提供する。機能的活性は、本明細書に記載される任意の機能的活性であり得る。
【０１７５】
処置の方法
本発明は、本発明の細胞（例えば、上記医薬組成物中の）を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【０１７６】
この方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離する（isolated）ステップ；
（ｉｉ）かかる細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターで形質導入する、またはかかる細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターをトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ
を伴い得る。
【０１７７】
本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の細胞もまた提供する。
【０１７８】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの被験体は、哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットであるが、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【０１７９】
本明細書に記載される細胞の投与のために、当該分野で一般的または標準的な任意の様式の細胞集団の投与、例えば、適切な経路による注射または注入が使用され得る。一態様では、１ｋｇ当たり最大で５×１０８細胞が、ヒトにおいて投与される。したがって、例えば、１００ｋｇの体重を有するヒトは、処置当たり最大で５×１０１０細胞の用量を受け得る。この用量は、必要に応じて、後の時点で反復され得る。
【０１８０】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明に従うベクターまたは細胞の使用にも関する。
【０１８１】
疾患
本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する任意の疾患であり得る。
【０１８２】
例えば、本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、がん性疾患、例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がんおよび甲状腺がんであり得る。
【０１８３】
本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、感染、例えば、細菌感染またはウイルス感染であり得る。
【０１８４】
方法
本発明は、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法であって、
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；
（ｉｉ）α鎖の９６位；β鎖の９位；β鎖の１０位；α鎖の２４位；α鎖の１９位；α鎖の２０位；α鎖の５０位；α鎖の５位；α鎖の８位；α鎖の８６位；α鎖の３９位；α鎖の５５位；β鎖の４３位；α鎖の６６位；β鎖の１９位；β鎖の２１位；β鎖の１０３位；α鎖の３位；α鎖の７位；α鎖の９位；α鎖の１１位；α鎖の１６位；α鎖の１８位；α鎖の２１位；α鎖の２２位；α鎖の２６位；α鎖の４０位；α鎖の４７位；α鎖の４８位；α鎖の４９位；α鎖の５１位；α鎖の５２位；α鎖の５３位；α鎖の６７位；α鎖の６８位；α鎖の７４位；α鎖の７６位；α鎖の７９位；α鎖の８１位；α鎖の８３位；α鎖の９０位；α鎖の９２位；α鎖の９３位；およびα鎖の１０１位から選択される１または複数の位置において、該ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸残基を決定するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に列挙した位置のうちの１または複数におけるアミノ酸残基を、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択されるアミノ酸残基に変更するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
【０１８５】
本明細書に記載されるように、各可変遺伝子の生殖系列配列は、当該分野で公知であり（ScavinerおよびLefranc；上記ならびにFolchおよびLefranc；上記を参照のこと）、したがって、ＴＣＲにおいて利用されるＶαおよび／またはＶβ生殖系列Ｖセグメントは、配列決定し、公知の生殖系列配列と比較することによって決定され得る（例えば、Hodgesら；上記、Zhouら；２００６年；上記を参照のこと）。したがって、１または複数の位置においてＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸残基を決定する本発明のステップは、具体的には、本明細書に記載される特定の位置のうちの１または複数に存在するアミノ酸残基を決定することに関する。
【０１８６】
この方法は、本明細書に記載される任意の位置または複数の位置に存在するアミノ酸残基を決定するステップを含み得る（may  comprise  may  comprise）。
【０１８７】
ＴＣＲのアミノ酸配列は、本明細書に記載される任意のアミノ酸残基または任意の複数のアミノ酸残基を含むように変更され得る。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つの残基を含むようにＴＣＲアミノ酸配列を変更するステップを含む、ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるための方法を提供する。
【０１８９】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；または
β鎖のＲ４３
から選択され得る。
【０１９０】
ＴＣＲのアミノ酸配列は、上で規定される複数のアミノ酸残基を含むように変更され得る。
【０１９１】
ＴＣＲのアミノ酸配列は、当該分野で周知の方法を使用して変更され得る。例えば、ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＴＣＲをコードする核酸配列の変異誘発によって変更され得る（may  be  altered  mutagenesis  of）。
【０１９２】
ＴＣＲの細胞表面発現を増加させるとは、本発明に従う少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＴＣＲが、生殖系列配列によってコードされるアミノ酸配列を含む等価なＴＣＲと比較して、より高いレベルの細胞表面発現を有することを意味する。生殖系列配列によってコードされるアミノ酸配列を含む等価なＴＣＲとは、本発明に従うアミノ酸残基を含むように変更されていないＴＣＲを指す、即ち、変更されていないＴＣＲは、特定の位置において野生型アミノ酸残基を有する。
【０１９３】
ＴＣＲの細胞表面発現は、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して決定され得る。
【０１９４】
本発明はさらに、高発現ＴＣＲを選択するための方法であって、
（ｉ）一群のＴＣＲアミノ酸配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むＴＣＲアミノ酸配列を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０１９５】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；または
β鎖のＲ４３
から選択され得る。
【０１９６】
この方法は、上で規定される任意のアミノ酸残基または任意の複数のアミノ酸残基を含むＴＣＲを選択するステップを含み得る。
【０１９７】
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲの強度を決定するための方法であって、
（ｉ）ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の配列を提供するステップ；ならびに
（ｉｉ）該ＴＣＲ配列が、α鎖のＬ９６；β鎖のＲ９；β鎖のＹ１０；α鎖のＴ２４；α鎖のＶ１９；α鎖のＴ２０；α鎖のＭ５０；α鎖のＴ５；α鎖のＱ８；α鎖のＳ８６；α鎖のＦ３９；α鎖のＤ５５；β鎖のＲ４３；α鎖のＡ６６；β鎖のＶ１９；β鎖のＬ２１；β鎖のＬ１０３；α鎖のＴ３；α鎖のＳ７；α鎖のＰ９；α鎖のＭ１１；α鎖のＡ１６；α鎖のＴ１８；α鎖のＬ２１；α鎖のＳ２２；α鎖のＤ２６；α鎖のＦ４０；α鎖のＳ４７；α鎖のＲ４８；α鎖のＱ４９；α鎖のＩ５１；α鎖のＬ５２；α鎖のＶ５３；α鎖のＴ６７；α鎖のＥ６８；α鎖のＮ７４；α鎖のＦ７６；α鎖のＮ７９；α鎖のＱ８１；α鎖のＡ８３；α鎖のＫ９０；α鎖のＳ９２；α鎖のＤ９３；およびα鎖のＭ１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むかどうかを決定するステップ
を含み；
列挙されたアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含む配列が、高発現ＴＣＲであると決定され、列挙されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含まない配列が、低発現ＴＣＲであると決定される方法を提供する。
【０１９８】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、
α鎖のＬ９６；
β鎖のＲ９；
β鎖のＹ１０；
α鎖のＴ２４；
α鎖のＶ１９；
α鎖のＴ２０；
α鎖のＭ５０；
α鎖のＴ５；
α鎖のＱ８；
α鎖のＳ８６；
α鎖のＦ３９；
α鎖のＤ５５；または
β鎖のＲ４３
から選択され得る。
【０１９９】
α鎖および／またはβ鎖の配列は、アミノ酸配列、またはα鎖および／もしくはβ鎖をコードする核酸配列であり得る。
【０２００】
この方法は、本明細書に記載される任意の位置または複数の位置に存在するアミノ酸残基を決定するステップを含み得る（may  comprise  may  comprise）。
【０２０１】
かかる方法は、細胞、例えばＴ細胞において外因性ＴＣＲとして発現される場合に、ＴＣＲ、例えば治療的ＴＣＲの表面発現のレベルを予測するために有用である。
【０２０２】
コンピュータープログラム製品
図１２は、上記技術を実装するために使用され得る型の汎用計算デバイス１００を模式的に示す。本発明の文脈では、これは、例えば、より大きいシステムの一部を形成する組み込み型プロセッサであり得る。汎用計算デバイス１００は、バス１２２を介して一緒に接続された中央処理装置１０２、ランダムアクセスメモリ１０４およびリードオンリーメモリ１０６を含む。汎用計算デバイス１００は、全て共通のバス１２２を介して接続されたネットワークインターフェースカード１０８、ハードディスクドライブ１１０、ディスプレイドライバー１１２およびモニタ１１４ならびにキーボード１１８およびマウス１２０を備えたユーザー入力／出力回路１１６もまたさらに含む。動作中に、例えば、より大きいシステムの一部を形成する場合、中央処理装置１０２は、例えば、ランダムアクセスメモリ１０４および／またはリードオンリーメモリ１０６中に保存され得るコンピュータープログラム命令を実行する。プログラム命令は、ハードディスクドライブ１１０から追加で検索され得、またはネットワークインターフェースカード１０８を介して動的にダウンロードされ得る。実施された処理の結果は、接続されたディスプレイドライバー１１２およびモニタ１１４を介して、ユーザーまたはエンジニアにディスプレイされ得る。汎用計算デバイス１００の動作を制御するためのユーザー入力は、キーボード１１８またはマウス１２０から、接続されたユーザー入力出力回路１１６を介して受け取られ得る。コンピュータープログラムは、種々の異なるコンピューター言語で書かれ得ることが理解される。コンピュータープログラムは、記録媒体上にローカルに保存され得、または汎用計算デバイス１００に動的にダウンロードされ得る。適切なコンピュータープログラムの制御下で動作する場合、汎用計算デバイス１００は、上記技術を実施でき、上記技術のいずれかを実施するための装置を形成すると考えることができる。汎用計算デバイス１００の構造は、かなり異なってもよく、図１３は一例にすぎない。汎用計算デバイス１００はまた、命令実行環境（即ち、バーチャルマシン）を提供するのを可能にする構成を有し得る。
【０２０３】
本発明は、本発明を実施するにあたり当業者を補助するように機能することを意味し、本発明の範囲を決して限定しない意図である実施例によって、ここでさらに記載される。
【実施例】
【０２０４】
（実施例１）
強いＴＣＲ発現または弱いＴＣＲ発現と相関するＴＣＲ可変セグメントの決定
ＴＣＲによるＴ細胞の形質導入後に、導入されたＴＣＲは、内因性ＴＣＲと比較して、細胞表面上に発現されるそれらの能力が大きく異なる。強く発現される外因性ＴＣＲは、内因性ＴＣＲと共発現される、または細胞表面発現について内因性ＴＣＲを打ち負かしさえし得る。弱く発現される外因性ＴＣＲは、強いＴＣＲと共発現（co−express）される場合、細胞表面には存在しないまたは不十分に発現される（図１Ａ）。
【０２０５】
活性化された初代Ｔ細胞を、マウス化定常ドメイン、および定常ドメイン中に追加のシステインを含有するＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）ＴＣＲをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した（ＴＣＲ全体をコドン最適化した）。
【０２０６】
この改変されたＷＴ１  ＴＣＲは、ＴＣＲ優位を示す（図２）。形質導入の７２時間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体ならびに抗ヒトＴＣＲ定常ドメイン抗体および抗マウスＴＣＲ定常ドメイン抗体で染色した。Ｔ細胞を、ＣＤ３＋かつＣＤ８＋  Ｔ細胞集団に対してゲーティングを行った。強い内因性ＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗マウスＴＣＲ定常ドメイン抗体および抗ヒトＴＣＲ定常ドメイン抗体で共染色される。弱い内因性ＴＣＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗マウスＴＣＲ定常ドメイン抗体でのみ染色される。
【０２０７】
強い内因性ＴＣＲおよび弱い内因性ＴＣＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞集団を、ＦＡＣｓ選別し、クロノタイピングして、それらの可変アルファ鎖および可変ベータ鎖の使用頻度を決定した。図３に示される表中には、（ｉ）配列決定した強いおよび弱いアルファおよびベータ可変セグメントの総数、ならびに（ｉｉ）各集団内の可変セグメントの各々の総数と共に、強い内因性ＴＣＲ集団または弱い内因性ＴＣＲ集団のいずれかにおいて優位を示すアルファ可変セグメントおよびベータ可変セグメントが示される。アルファセグメントおよびベータセグメントは、ＩＭＧＴ命名法を使用して分類されている。
【０２０８】
（実施例２）
非競合的環境および競合的環境における一般的な強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現
クロノタイピングデータを使用して、強いＴＣＲ集団および弱いＴＣＲ集団において最も広く使用されるアルファ可変セグメントおよびベータ可変セグメントを決定した。一般的な強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲを、この情報を使用して操作した。
【０２０９】
強いＴＣＲは、可変アルファ３８．２および可変ベータ７．８である。弱いＴＣＲは、可変アルファ１３．２および可変ベータ７．３である。上記アルファ可変セグメントおよびベータ可変セグメントに対する市販のモノクローナル抗体は存在しないので、形質導入されたＴ細胞におけるＴＣＲ発現の決定のために、Ｖ５タグが、アルファ鎖の開始部に存在し、Ｍｙｃタグが、ベータ鎖の開始部に存在する。さらに、形質導入効率を正常化（normalize）できるようにするために、短縮型マウスＣＤ１９が、構築物の末端部に存在する（図４）。
【０２１０】
これら２つの構築物は、同じアルファ定常ドメインおよびベータ定常ドメインを含有し、構築物全体はコドン最適化しなかった。さらに、独自の制限部位が、アルファセグメントおよびベータセグメントの容易な交換が可能となるように、アルファセグメントおよびベータセグメントに隣接する。ＴＣＲを、形質導入実験のためにｐＭＰ７１レトロウイルス中にクローニングする。
【０２１１】
非競合的環境における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現
内因性ＴＣＲアルファ鎖またはベータ鎖を含有しないＪｕｒｋａｔ細胞を、一般的な強いＴＣＲまたは弱いＴＣＲをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した（図５）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、これらのＣＤ１９＋高発現細胞上のＶ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。さらに、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した。
【０２１２】
競合的環境における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現
改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、一般的な強いＴＣＲまたは弱いＴＣＲをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した（図６）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。Ｖ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した。
【０２１３】
低、中間および高発現の改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞における強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲの発現
改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、一般的な強いＴＣＲまたは弱いＴＣＲをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗マウスＴＣＲ定常ドメイン抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した（図７）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、最初に高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、次いで、マウスＴＣＲ定常ドメインの高、中間および低発現に対してゲーティングを行った。別々のＷＴ１  ＴＣＲ集団の３つ全て、およびＷＴ１発現細胞についてはまとめて、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。Ｖ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩもまた決定した。
【０２１４】
（実施例３）
ＴＣＲ発現の強度と相関する重要な特色を同定するためのバイオインフォマティクス分析
クロノタイピングからの配列決定情報を使用して、配列決定した全ての強いＴＣＲおよび弱いＴＣＲについて、各位置における全ての残基を比較した。ＴＣＲアラインメント後、弱いＴＣＲと比較して、強いＴＣＲ中の特定の位置における高い出現率を有した残基が、一例としてＴＲＡＶ３８−１を使用して図中に示される（＊）（図８Ａ）。
【０２１５】
強いＴＣＲにおいて広がりを示した残基をさらに分析し、ＴＣＲ鎖の構造およびペアリングを安定化することにおいて意味を有するフレームワーク領域中の残基だけを含むまで精緻化した。これらの残基は、骨格としてＴＲＡＶ３８−２およびＴＲＢＶ７−８を使用して強調される（＊）（図８Ｂ）。上の並びは、強いＴＣＲ中の残基である。下の並びは、弱いＴＣＲ中の等価な残基である。
【０２１６】
（実施例４）
強発現ＴＣＲおよび弱発現ＴＣＲの操作
弱い残基を有する強発現ＴＣＲを、操作により得るために、強いＴＣＲを骨格として使用し、ＴＣＲ強度において重要であると予測された全ての強い残基を、関連する位置において弱いＴＣＲ残基で置き換えた。
【０２１７】
強い残基を有する弱いＴＣＲを、操作により得るために、弱いＴＣＲを骨格として使用し、ＴＣＲ強度において重要であると予測された全ての強い残基で、関連する位置において弱いＴＣＲ残基を置き換えた（replaced  with  weak  TCR  residues  in  the  relevant  position）。
【０２１８】
ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞（上の行）、およびＷＴ１マウス化ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（下の行）を、示したＴＣＲで形質導入し、７２時間後、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。Ｖ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した（図９）。
【０２１９】
（実施例５）
ＴＣＲ発現に対する個々の残基の変異の影響
ＴＣＲ発現に対する強い残基の個々の影響
【０２２０】
一般的な弱いＴＣＲを骨格として使用し、ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲ変異誘発技術を使用して、弱いＴＣＲ骨格の残部を保持しつつ、関連する位置において弱いＴＣＲ残基を置き換える予測された強い残基のうちの１つだけを有した一連のＴＣＲを作製した。
【０２２１】
変異したＴＣＲは、文字がアミノ酸を示し、数がＴＣＲフレームワーク中の位置であり、αまたはβが、残基がアルファ鎖中にあるかベータ鎖中にあるかを示すように表示される。最後のプロット、下の行、右側は、３残基の変化、アルファ鎖上のＶ１９およびベータ鎖上のＲ９、Ｙ１０を有する（図１０および１１）。
【０２２２】
ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞（図１０）および改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（図１１）を、示されたＴＣＲをコードするｐＭＰ７１レトロウイルスで形質導入した（where  transduced  with  the  pMP71  retrovirus）。形質導入の７２時間後、形質導入された細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。
【０２２３】
図１３は、ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞（Ａ）および改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）を、示されたＴＣＲをコードするｐＭＰ７１レトロウイルスで形質導入した（where  transduced  with  the  pMP71  retrovirus）実験の結果を示す。形質導入の７２時間後、細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗Ｍｙｃタグ抗体および抗マウス定常ベータＴＣＲ抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現を決定した。Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲの発現のＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高発現細胞について決定した。（Ｃ）ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩ。（Ｄ）改変されたＷＴ１  ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞についてのＶ５タグ、Ｍｙｃタグおよびマウス定常ベータＴＣＲのＭＦＩ。
【０２２４】
これらの結果は、α鎖のＦ３９、α鎖のＤ５５およびβ鎖のＲ４３が、ＴＣＲの表面発現を増加させることを示している。さらに、上記３つの残基の変異は、Ｊｕｒｋａｔ細胞競合実験において、細胞表面上に発現されたＷＴ１  ＴＣＲの量を減少させることもまた示された。
【０２２５】
（実施例６）
抗原特異的ＴＣＲにおいてＬ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βへと可変ドメイン残基を変異させることの影響
Ｊｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現
Ｊｕｒｋａｔ細胞（内因性ＴＣＲのアルファ鎖またはベータ鎖を含有しない）を、改変されていない野生型ＣＭＶもしくはＷＴ１  ＴＣＲ、またはＬ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βを含有するように変異させた同じＴＣＲのいずれかをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９  Ａｂ、およびＣＭＶテトラマー  ＡｂまたはＶβ２．１  Ａｂ（ＷＴ１可変ベータ発現を決定するため）のいずれかで染色した。
【０２２６】
細胞を、最初に高ＣＤ１９発現に対してゲーティングを行い、次いで、ＣＭＶテトラマーおよびまたはＶβ２．１の発現を決定した（図１４）。
【０２２７】
初代Ｔ細胞における細胞表面発現
活性化された初代Ｔ細胞を、改変されていない野生型ＣＭＶ  ＴＣＲもしくは野生型ＷＴ１  ＴＣＲ、またはＬ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βを含有するように変異させた同じＴＣＲのいずれかをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３  Ａｂ、抗ＣＤ８  Ａｂおよび抗ＣＤ１９  ＡｂならびにＣＭＶテトラマー  ＡｂまたはＶβ２．１  Ａｂのいずれかで染色した。細胞を、ＣＤ３＋およびＣＤ１９高Ｔ細胞に対してゲーティングを行い、次いで、ＴＣＲ発現を、テトラマーまたは抗ｖβ２．１抗体を使用して決定して、それぞれ、ＣＭＶ−ＴＣＲおよびＷＴ１−ＴＣＲを検出した（図１５）。
【０２２８】
活性化された初代Ｔ細胞を、改変されていない野生型ＣＭＶ、またはＬ９６α、Ｒ９βおよびＹ１０βを含有するように変異させた同じＴＣＲのいずれかをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の５日後、Ｔ細胞を、ｐＣＭＶペプチドまたは無関係のペプチドｐＷＴ２３５を発現するＡＰＣ（APCs  expression  the  pCMV  peptide  or  the  irrelevant  peptide  pWT235）と共に共培養した。１８時間の共培養後、上清を収集し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡによって決定した（図１６）。
【０２２９】
良好に発現されるＴＣＲおよび不十分に発現されるＴＣＲで形質導入された細胞は、類似の量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを含有する
内因性ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞を、一般的な強いＴＣＲ、または一般的な弱いＴＣＲ、または予測された弱い残基を含有する一般的な強いＴＣＲ、または予測された強い残基を含有する一般的な弱いＴＣＲのいずれかをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｐｒｉｍｅｆｌｏｗ  ＲＮＡアッセイを使用して、定常アルファｍＲＮＡおよび定常ベータｍＲＮＡを発現するＣＤ１９＋高細胞の百分率を決定した。定常アルファｍＲＮＡおよび定常ベータｍＲＮＡのＭＦＩを、４つの集団について決定した。さらに、Ｖ５タグを発現するＣＤ１９＋高Ｊｕｒｋａｔ細胞の百分率もまた決定した（図１７）。
【０２３０】
（実施例７）
ＴＣＲ細胞表面発現へのＴＣＲα対ＴＣＲβの寄与
内因性ＴＣＲなしのＪｕｒｋａｔ細胞を、強いＴＣＲ、または弱いＴＣＲ、または強いアルファ可変鎖および弱いベータ可変鎖を含有するように操作されたＴＣＲ、または弱いアルファ可変鎖および強いベータ可変鎖を含有するように操作されたＴＣＲのいずれかをコードするｐＭＰ７１ベクターで形質導入した。形質導入の７２時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｖ５タグ抗体および抗Ｍｙｃタグ抗体で染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、高ＣＤ１９に対してゲーティングを行い、Ｖ５タグおよびＭｙｃタグの発現を決定した。Ｖ５タグおよびＭｙｃタグのＭＦＩもまた、ＣＤ１９＋高細胞において決定した（図１８）。
【０２３１】
上記明細書中で言及される全ての刊行物が、本明細書で参照によって組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、当業者に明らかである。本発明を、具体的な好ましい実施形態との関連で記載してきたが、特許請求された本発明は、かかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないと理解すべきである。実際、分子生物学、細胞免疫学または関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
2018512867.tif 000003
【図２】
2018512867.tif 000004
【図３】
2018512867.tif 000005
【図４】
2018512867.tif 000006
【図５】
2018512867.tif 000007
【図６】
2018512867.tif 000008
【図７−１】
2018512867.tif 000009
【図７−２】
2018512867.tif 000010
【図８】
2018512867.tif 000011
【図９】
2018512867.tif 000012
【図１０−１】
2018512867.tif 000013
【図１０−２】
2018512867.tif 000014
【図１０−３】
2018512867.tif 000015
【図１０−４】
2018512867.tif 000016
【図１１−１】
2018512867.tif 000017
【図１１−２】
2018512867.tif 000018
【図１１−３】
2018512867.tif 000019
【図１１−４】
2018512867.tif 000020
【図１２】
2018512867.tif 000021
【図１３−１】
2018512867.tif 000022
【図１３−２】
2018512867.tif 000023
【図１４】
2018512867.tif 000024
【図１５】
2018512867.tif 000025
【図１６】
2018512867.tif 000026
【図１７−１】
2018512867.tif 000027
【図１７−２】
2018512867.tif 000028
【図１７−３】
2018512867.tif 000029
【図１８】
2018512867.tif 000030
【国際調査報告】
2018512867.tif 000031
2018512867.tif 000032
2018512867.tif 000033