(57)【要約】  本出願は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）（ｃ）ペプチドリンカー（例えばＦｃドメイン）によって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバー、好ましくはＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬの３つの細胞外部分を含むポリペプチドを含むＴＮＦファミリーリガンド三量体に関する。またこれらの分子を製造する方法及びその使用方法も特許請求される。【選択図】３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）任意選択的にペプチドリンカーによって、互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、請求項１に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つのＮ末端又はＣ末端のアミノ酸に融合される、請求項１又は２に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項４】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがヒトＴ細胞活性化を共刺激する、請求項１から３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項５】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、請求項１から４の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項６】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬである、請求項１から５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項７】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項８】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号５又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項９】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、請求項１から５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１０】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１から５又は９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１１】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、請求項１から５又は９又は１０の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１２】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される、請求項１から１１の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１３】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合される、請求項１から１１の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１４】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１から１３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１５】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、請求項１から１４の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１６】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、請求項１から１５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１７】
標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から１６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１８】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１９】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２０】
標的細胞抗原がＣＥＡである、請求項１から１６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２１】
ＣＥＡに特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１６又は２０の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２２】
ＣＥＡに特異的に結合することができる部分が、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から１６又は２０又は２１の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２３】
標的細胞抗原がＣＤ１９である、請求項１から１６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２４】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分が、
（ａ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１６又は２３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２５】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分が、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から１６又は２３又は２４の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２６】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１から２５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２７】
Ｆｃドメインが、位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項２６に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２８】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分を含む、請求項１から２７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２９】
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項１から２８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３０】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項１から２９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項１から２９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３２】
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項１から２９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分を含む、請求項１から２７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３４】
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項１から２７又は３３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３５】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれ含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項３４に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３６】
（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項３４に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３７】
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、請求項３４に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３８】
請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項３９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で、請求項４０に記載の宿主細胞を培養する工程、及び
（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程
を含む、請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を製造するための方法。
【請求項４２】
請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項４３】
医薬として使用のための、請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
がんの治療における使用のための、請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は請求項４２に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用。
【請求項４６】
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の、請求項１から３７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記疾患ががんである、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む新規ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。本発明は更に、これらの分子を製造する方法及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の機構及び機能において重要な役割を果たしている。ＴＮＦファミリーのリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、免疫応答、造血及び形態形成などの正常な機能を調節する一方、腫瘍形成、移植拒絶、敗血症ショック、ウイルス複製、骨吸収、関節リウマチ、及び糖尿病において役割を果たしている（Aggarwal, 2003）。免疫におけるそれらの多様かつ重要な役割は、それらをがん免疫療法の開発にとって興味深いものにしている（Bremer, 2013）。ＴＮＦリガンドファミリーは、「ＴＮＦ相同ドメイン」（ＴＨＤ）を作りだす保存されたＣ末端ドメインの存在を特徴とする、１９型ＩＩ（すなわち、細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８の遺伝子を含む。このドメインは受容体結合に関与し、従ってＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物学的活性にとって重要である。ファミリー間の配列同一性は〜２０−３０％である（Bodmer, 2002）。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自己集合性の非共有結合三量体としてのその生物学的機能を発揮する（Banner et al, 1993）。従って、ＴＮＦファミリーのリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体に結合してこれを活性化することができる三量体を形成する。ＴＮＦリガンドファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞に対する共刺激効果を有しており、それらがＴ細胞の初期活性化後にＴ細胞応答を維持することを意味している（Watts, 2005）。４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴは、この共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのグループに属する。
【０００３】
幾つかの共刺激分子の中で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及び記憶Ｔ細胞の生存及び恒常性において重要な役割を果たしている（Croft et al., 2009）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、感染、腫瘍、及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞ならびに好中球の表面上でその発現が実証されており（Baumann et al., 2004）、種々の刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能であるか、又は強力に上方調節されることが示されている。Ｔ細胞受容体の誘発と組み合わせると、その天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞に対するＯＸ４０の関与は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらしている（Song et al., 2008）。次に、これは増殖の亢進、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生の増加、及び活性化Ｔ細胞のより良好な生存をもたらす。
【０００４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon and Weissman, 1989）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010）、ＮＫ細胞（Lin et al., 2008）、ＮＫＴ細胞（Kim et al., 2008）、単球（Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995）、好中球（Heinisch et al., 2000）、マスト細胞（Nishimoto et al., 2005）及び樹状細胞並びに非造血起源の細胞、例えば内皮及び平滑筋細胞（Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008）の発現を実証した。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体の誘発、並びに炎症誘発性サイトカインの共刺激分子又は受容体を介して誘導されるシグナル伝達などの様々な刺激シグナルによって駆動される（Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010）。
【０００５】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現はより制限され、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージなどのプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）で観察される。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδＴ細胞サブセット、及び内皮細胞の両方を含むＴ細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011に総説される）。
【０００６】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998）、それらの生存の増加並びにサイトカインの分泌及び共刺激分子の上方制御によって示されるＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲ誘発と組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011に総説される）。
【０００７】
インビトロでのＴ細胞に対する４−１ＢＢ抗体のこれらの共刺激効果に沿って、腫瘍担持マウスへのそれらの投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010）。しかしながら、４−１ＢＢは、通常、他の免疫調節化合物（Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013）、化学療法剤（Ju et al., 2008; Kim et al., 2009）、腫瘍特異的ワクチン接種（Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011）、又は放射線療法（Shi and Siemann, 2006）と組み合わせて投与された場合にのみ、抗腫瘍剤としての効力を示す。インビボ枯渇実験は、４−１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍効果において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことを実証した。しかし、腫瘍モデル又は抗４−１ＢＢを含む併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋  Ｔ細胞などの他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011）。
【０００８】
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的な効果に加えて、４−１ＢＢアゴニストはまた、腫瘍血管内皮上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４−１ＢＢ媒介性上方制御を介して腫瘍における活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することができる（Palazon et al., 2011）。
【０００９】
４−１ＢＢの誘発はまた、腫瘍微小環境又は慢性感染の際の免疫寛容の破壊に寄与し得る可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る（Wilcox et al., 2004）。
【００１０】
これは、ＴＮＦＲ−スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、インビボでの４−１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、そのような試薬の薬理学的活性に必要な重要な事象としてのＦｃ受容体結合を示唆していると思われる（Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体が存在しない場合に、減少されるか又は有意に改善される肝臓毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を誘導し得る。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，ＮＣＴ００３０９０２３）では、３週間に１回１２週間投与されたＦｃ−コンピテント４−１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ−６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣癌、又は腎細胞癌の患者の疾患の安定化を誘導した。しかし、別の試験（ＮＣＴ００６１２６６４）で与えられた同じ抗体は、試験の終了につながるグレード４の肝炎を引き起こした（Simeone and Ascierto, 2012）。
【００１１】
まとめると、利用可能な前臨床及び臨床データは、効果的な４−１ＢＢアゴニストに対する高い臨床的必要性があることを明確に示している。しかしながら、新世代の薬物候補は、４−１ＢＢを造血細胞及び内皮細胞の表面に効果的に結合するだけでなく、制御不能な副作用を避けるためにＦｃ受容体に結合する以外のメカニズムによっても達成できるはずである。後者は、腫瘍特異的又は腫瘍関連部分に対する優先的結合及びオリゴマー化によって達成され得る。
【００１２】
４−１ＢＢリガンドの１つの細胞外ドメイン（Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012, Kermer et al., 2014）と、重鎖のＣ末端に融合した単鎖抗体断片又は単一の４−１ＢＢリガンド（Zhang et al, 2007）とからなる融合タンパク質が作製されている。欧州特許第１７３６４８２号（Ａ１）は、天然の４−１ＢＢＬの全細胞外ドメイン及び架橋可能なペプチドドメインを含む組換え４−１ＢＢＬポリペプチドに関する。国際公開第２０１０／０１００５１号は、互いに連結され、抗体部分に融合された３つのＴＮＦリガンドエクトドメインからなる融合タンパク質の生成を開示している。
【００１３】
しかしながら、腫瘍特異的又は腫瘍関連標的に好ましい結合が可能な部分を、共刺激ＴＮＦファミリーリガンド三量体を形成することができる部分と組み合わせ、薬学的に有用であるために十分な安定性を有する新しい抗原結合分子が必要である。本発明の抗原結合分子は両方を含み、従ってＴＮＦ受容体を、効果的に誘発するだけでなく、所望の部位で非常に選択的に誘発することができ、それにより副作用を低減する。
【発明の概要】
【００１４】
発明の要旨
この発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）任意選択的にペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【００１６】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
ここで、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つのＮ末端又はＣ末端のアミノ酸に融合される。
【００１７】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。従って、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは共刺激ＴＮＦファミリーリガンドである。特に、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【００１８】
一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【００１９】
更なる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
更なる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号５又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。より具体的には、ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。
【００２３】
特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
更なる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。
【００２５】
一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される。特に、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、
ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、Ｆｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される。
【００２６】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合され、例えば、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメイン中のＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合される分子である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、
ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドに融合されない。
【００２８】
更なる態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。
【００２９】
一態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は抗体である。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は抗体断片である。特に、抗体断片は、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びａＶＨからなる群より選択される。
【００３１】
更なる態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は足場抗原結合タンパク質である。
【００３２】
従って、更なる態様では、本発明は、本明細書中で前に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。
【００３３】
特定の態様では、本発明は、上記に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。
【００３４】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【００３５】
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００３６】
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。別の特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００３７】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００３８】
別の態様では、標的細胞抗原はＣＥＡである。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる部分は、（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。特に、ＣＥＡに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００３９】
更に別の態様では、標的細胞抗原はＣＤ１９である。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、（ａ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。特に、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００４０】
更なる態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
特に、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【００４１】
別の態様では、本発明は、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低減させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００４２】
特に、Ｆｃドメインは、位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖中のアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。
【００４３】
特定の態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、かつＩｇＧ重鎖の位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。
【００４４】
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載した一価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００４５】
特に、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を更に含み、ここで、Ｆａｂ重鎖は、Ｆｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＮ末端にＣ末端で融合される。
【００４６】
更に、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【００４７】
別の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【００４８】
更なる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００４９】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。更なる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５０】
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分を含む、二価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００５１】
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５２】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。更に別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５３】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５４】
より具体的には、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【００５５】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５６】
より具体的には、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を含むベクター、特に発現ベクターを提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００５８】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を包含する。
【００５９】
本発明は更に、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００６０】
本発明にはまた、医薬として使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が包含される。一態様では、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００６１】
また、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特に、がんの治療のための医薬の製造のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様では、疾患はがんである。上記の実施態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いに連結された、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドを示す。図（１Ａ）は、ペプチドリンカーによって互いに連結された４−１ＢＢＬの３つのエクトドメインを含むポリペプチドを示し、図（１Ｂ）は、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＯＸ４０Ｌの３つのエクトドメインを含むポリペプチドを示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の一価ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の変異体（２Ａ）及び（２Ｂ）を模式的に示す。３つのＴＮＦリガンドは、白色点を有する灰色の領域によって象徴される。黒い点を有する白い部分はＦｃ部分を表し、太い黒い点はノブ・イントゥー・ホール修飾を象徴する。
【図３】本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の代表例は、図３Ａに示すようなＦＡＰ標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ融合抗原結合分子である。その調製は、実施例１．１及び１．３に記載されている。図３Ｂは、実施例２で調製したＤＰ４７  Ｆａｂ分子及び単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ融合抗原結合分子を含む「非標的化」変異体（対照１）を示す。図３Ｃは、実施例４で調製した単量体４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）構築物の図である。
【図４】本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の別の例は、図４Ａに示すようなＦＡＰ標的化三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ融合抗原結合分子である。その調製は、実施例６に記載されている。図４Ｂは、実施例７で調製したＤＰ４７  Ｆａｂ分子及び単鎖三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ融合分子を含む「非標的化」変異体を示す。図４Ｃは、実施例８で調製した単量体ＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）構築物の図である。
【図５】図５は、表面プラズモン共鳴によって評価したＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ１）の組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）受容体への結合を示す。図５Ａではアッセイの設定が示され、４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）はＳＡチップ上に固定される。図５Ｂはヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図５Ｃはカニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、及び図５Ｄはマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を示す。
【図６】ＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（対照１）の組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ ｋｉｈ受容体への結合を図６に示す。４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）はＳＡチップ上に固定される。図６Ａはヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図６Ｂはカニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、及び図６Ｃはマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を示す。
【図７】図７は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１）への組換えヒト４−１ＢＢの結合を示す。図７Ａでは、親和性測定の設定が示される。図７Ｂ及び７Ｃは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ）へのヒト４−１ＢＢ  ａｖｉ−Ｈｉｓタグの結合を示し、図７Ｄ及び７Ｅは、ＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子）へのヒト４−１ＢＢ  ａｖｉ−Ｈｉｓタグの結合を示す。
【図８】図８は、表面プラズモン共鳴によって評価したＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１０）の組換えＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）受容体への結合を示す。図８Ａではアッセイの設定が示され、ＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）はＳＡチップ上に固定される。図８ＢはヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図８ＣはカニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、及び図８ＤはマウスＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を示す。
【図９】図９では、ＤＰ４７含有ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（対照３）の組換えＯＸ４０  Ｆｃ ｋｉｈ受容体への結合を示す。ＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）はＳＡチップ上に固定される。図９ＡはヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図９ＢはカニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、及び図９ＣはマウスＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を示す。
【図１０】図１０は、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１０）への組換えヒトＯＸ４０の結合を示す。図１０Ａでは、親和性測定の設定が示される。図１０Ｂでは、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ標的化単鎖ＯＸ４０リガンド）へのヒトＯＸ４０  ａｖｉ−Ｈｉｓタグの結合が示され、図１０Ｃは、ＤＰ４７含有ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（ＤＰ４７含有単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ）へのヒト４−１ＢＢ  ａｖｉ−Ｈｉｓタグの結合を示す。
【図１１−１２】４−１ＢＢ及びＯＸ４０は、静止（ナイーブ）ヒトＰＢＭＣ上では発現されない（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ、及び１１Ｇ、図１２Ａ及び１２Ｃ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後、４−１ＢＢ及びＯＸ４０は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上で上方制御され、一方、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１１Ｂ、１１Ｆ、１１Ｋ、及び１１Ｍ、及び１２Ｂ）は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも１０倍高い４−１ＢＢの上方制御を示すが、４倍低いＯＸ４０の上方制御を示す（図１１Ｄ、１１Ｈ、１１Ｊ、及び１１Ｌ、及び１２Ｄ）。示されているように、ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（黒丸）及びＤＰ４７含有（「非標的化」）単鎖三量体４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌ（白丸、点線）は、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞と同様の結合を示すが、ナイーブなヒトＴ細胞との結合は示されない。従って、ＦＡＰ結合又はＤＰ４７結合とは無関係に、単鎖三量体４−１ＢＢＬ及び単鎖三量体ＯＸ４０Ｌの両方が、ヒト４−１ＢＢ又はＯＸ４０発現細胞に対して同様の結合を示す。ヒト４−１ＢＢ又はＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されない（静止、ナイーブ細胞）。示されるのは、二次検出抗体として使用されるｒｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈｙｔｉｃ藻類フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）−又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、ＦＡＰ又はＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の濃度を示す。
【図１１Ａ−Ｄ】図１１Ａから１１Ｄは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１、黒丸）又はＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（対照１、白丸）の静止（ナイーブ）ヒトＰＭＢＣ又は活性化ヒトＰＭＢＣへの結合に関する。具体的には、静止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合は、上の２つのグラフに示され、静止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は下の２つのグラフにそれぞれ示される。
【図１１Ｅ−Ｈ】図１１Ｅから１１Ｈは、一価標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の休止及び活性化ヒトＴ細胞への結合を示す。４−１ＢＢは、健常なドナーの血液から単離した休止（ナイーブ）ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞上には発現しない。活性化後、４−１ＢＢはＣＤ４＋  Ｔ細胞（下のグラフを参照）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（上のグラフを参照）上で上方制御されるが、一方、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも５〜１０倍高い４−１ＢＢ発現を示す（ドナーに依存する）。示されるように、全ての一価標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子は、それらの標的化とは無関係に、４−１ＢＢ＋ヒトＴ細胞に類似して結合する。ｙ軸上には、Ｒ−ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２ヤギＩｇＧ断片の蛍光強度の平均（ＭＦＩ）が示される。ｘ軸上には、異なる標的化の単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１、Ｓ３及びＳ５）の試験濃度が示される。値は、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図１１Ｊ−Ｍ】図１１Ｊから１１Ｍは、一価対二価の標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の活性化ヒトＴ細胞への結合を示す。活性化後、４−１ＢＢはＣＤ４＋  Ｔ細胞（左側）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（右側）上で上方制御される。示されるように、全ての一価及び二価の標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、それらの標的化とは無関係に、４−１ＢＢ＋ヒトＴ細胞に類似して結合する。ｙ軸上には、Ｒ−ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２ヤギＩｇＧ断片の蛍光強度の平均（ＭＦＩ）が示される。ｘ軸上には、異なる標的化の単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１、Ｓ３、Ｓ２及びＳ４）の試験濃度が示される。値は、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図１２Ａ−Ｄ】図１２Ａから１２Ｄは、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１０、黒丸）又はＤＰ４７含有ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（ＤＰ４７単鎖ＯＸ４０Ｌ三量体、対照３、白丸）の静止（ナイーブ）ヒトＰＭＢＣ又は活性化ヒトＰＭＢＣへの結合を示す。具体的には、静止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合は、図１２Ａ及び１２Ｂに示され、静止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は図１２Ｃ及び１２Ｄにそれぞれ示される。ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡの結合は、黒の菱形（陰性対照）によって象徴される。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３は、単鎖ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（それぞれ化合物Ｓ１及びＳ１０）のトランスジェニック改変マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９（図１３Ａ）又は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）発現ヒトＷＭ２６６−４細胞株（図１３Ｂ）への結合を示す。これらの細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。示されるのは、二次検出抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は、ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７標的化（「非標的化」）単鎖三量体４−１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌ抗原結合分子の濃度を示す。図１３Ａでは、ＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子（白丸、点線）ではなく、ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子（化合物Ｓ１、黒丸）のみがＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞に結合することを示している。図１３Ｂは、ＤＰ４７含有単鎖三量体ＯＸ４０抗原結合分子（白丸、点線）ではなく、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ抗原結合分子（化合物Ｓ１０、黒丸）のみがＷＭ２６６−４細胞に結合することを実証する。陰性対照として、黒い菱形によって象徴されるヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡもまた結合しなかった。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ｃから１３Ｄは、一価対二価のＦＡＰ（４Ｂ９又は２８Ｈ１）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合を示す。示されるように、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化分子は、より低いＥＣ５０値でＦＡＰに対する最も強い結合を示す。強力なＦＡＰ（４Ｂ９）結合剤では、一価及び二価を標的とした単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合抗原分子（それぞれ化合物Ｓ３及びＳ２）間のＭＦＩ又はＥＣ５０にはごくわずかな差異しか見られない。これは、より弱いＦＡＰ結合剤２８Ｈ１（化合物Ｓ１）とは異なる。ここで、二価の結合（二価結合ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡで示される）は、より低いＭＦＩを与える。ＤＰ４７非標的化分子は、ＦＡＰ＋腫瘍細胞に結合せず、従って真に標的化されていない。ｙ軸上には、Ｒ−ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２ヤギＩｇＧ断片の蛍光強度の平均（ＭＦＩ）が示される。ｘ軸上には、異なる標的化の単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の試験濃度が示される。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、一価対二価のＣＥＡ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のＣＥＡ発現腫瘍細胞株への結合を示す。二価ＣＥＡ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ４）の結合は、一価ＣＥＡ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ５）の結合よりも低いＭＦＩを与える。これは、腫瘍細胞の表面上の２つのＣＥＡ分子の同時の占有によって説明することができる。ＤＰ４７非標的化分子（それぞれ対照１及び２）は、ＣＥＡ＋  ＭＫＮ４５腫瘍細胞に結合せず、従って真に標的化されていない。ｙ軸上には、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２ヤギＩｇＧ断片の蛍光強度の平均（ＭＦＩ）が示される。ｘ軸上には、異なる標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の試験濃度が示される。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂでは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１、黒丸）又はＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（対照１；白丸）は、活性化マウス脾細胞を発現するマウス４−１ＢＢに結合しないことが示されている。抗マウスＣＤ１３７特異的ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体（クローンＬｏｂ１２．３）を陽性対照（三角）として用いた。結合は、試験された一次４−１ＢＢＬ三量体抗原結合分子のｎＭ濃度に対する二次検出抗体として使用されるＲ−ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片のＭＦＩをプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図１５】図１５のスキームは、レポーター細胞株を使用する実施例１１．１．２に記載されたＮＦκＢ活性アッセイの一般原則を示す。ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子に対する抗ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的抗体の比は１〜４であった。
【図１６】図１６では、二次抗体架橋ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子（化合物Ｓ１、黒丸）又は二次抗体架橋ＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子（対照１、白丸、点線）によるレポーター細胞株におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化が示されている。レポーター細胞を、示された濃度の単鎖４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と架橋二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片の１：４の比率での存在下で６時間培養した。ルシフェラーゼ活性を実施例１１．１．１に記載のように評価した。活性は、試験した一本鎖ヒト４−１ＢＢＬ三量体抗原結合分子のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。
【図１７】図１７のスキームは、レポーター細胞株としてＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃクローン２６を使用する実施例１１．１．３に記載されるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性アッセイの一般原則を示す。ヒト４−１ＢＢ発現レポーター細胞に対するＦＡＰ発現腫瘍細胞の使用された比率は５対１であった。
【図１８Ａ−Ｄ】図１８Ａから１８Ｄは、ＦＡＰ発現腫瘍細胞株架橋ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１、黒丸）を介したレポーター細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を示す。架橋されていないＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子のデータは陰性対照として示されている（対照１、白丸、点線）。レポーター細胞を、滴定したＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子及び架橋ＦＡＰ＋腫瘍細胞株の存在下で６時間培養した。レポーター細胞とＦＡＰ発現腫瘍細胞との比は１対５であった。ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランク対照のＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。図１８Ａは、標的細胞としてのＭＶ３細胞株による活性化を示し、細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ヒトＦＡＰクローン３９を図１８Ｂの標的細胞として使用した。図１８Ｃは、標的細胞としてのＷＭ−２６６−４細胞株による活性化を示し、図１８Ｄは、ＦＡＰ＋標的細胞が存在しない場合の測定データを示す。
【図１９】図１９は、単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のＦＡＰ標的化架橋によって媒介される４−１ＢＢ活性化によるＮＫκＢの活性化を示す。示されるのは、ＦＡＰ発現腫瘍細胞株架橋ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子を介した、ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃクローン２６レポーター細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化である。ＤＰ４７非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子は、ＮＫ−κＢ活性化を誘導しない（対照１及び２）。一価ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１及びＳ３）は、二価ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ２）より強いＮＦ−κＢ活性化を誘導する。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢレポーター細胞を、滴定したＦＡＰ標的化又はＤＰ４７−非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及び架橋ＦＡＰ＋腫瘍細胞株の存在下で６時間培養した。レポーター細胞とＦＡＰ発現腫瘍細胞との比は１：５であった。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した単鎖三量体４−１ＢＢリガンドのｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランク対照のＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。図１９Ａは、標的細胞としてのＭＶ３細胞株による活性化を示し、図１９Ｂは、標的細胞としてのＷＭ−２６６−４細胞株による活性化を示す。図１９Ｃは、ＦＡＰ＋標的細胞が存在しない場合の測定データを示す。
【図２０】図２０には、ＣＥＡ発現腫瘍細胞株架橋ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ４及びＳ５）を介した、ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃクローン２６レポーター細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化である。ＤＰ４７非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子は、ＮＫ−κＢ活性化を誘導しない（対照１及び２）。一価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原分子（化合物Ｓ５）は、二価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ４）より強いＮＦ−κＢ活性化を誘導する。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢレポーター細胞を、滴定したＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化又はＤＰ４７−非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子及び架橋ＣＥＡ＋ＭＫＮ４５腫瘍細胞株の存在下で６時間培養した。レポーター細胞とＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞との比は１：５であった。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した単鎖三量体４−１ＢＢリガンドのｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランク対照のＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。図２０Ａは、標的細胞としてのＭＫＮ４５細胞株による活性化を示し、図２０Ｂは、ＣＥＡ＋標的細胞が存在しない場合の測定データを示す。
【図２１】ＦＡＰ発現ＷＭ２６６−４腫瘍細胞株架橋ＦＡＰ標的化単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ分子（黒丸、化合物Ｓ１０）を介したＨｅＬａ−ｈｕＯＸ４０−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ１レポーター細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を図２１Ｂに示す。架橋されていないＤＰ４７含有単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ分子（白丸、点線、対照３）は陰性対照として示されている。レポーター細胞を、滴定したＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ分子及び架橋ＦＡＰ＋腫瘍細胞株の存在下で６時間培養した。レポーター細胞とＦＡＰ発現腫瘍細胞との比は１対２．５であった。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ抗原結合分子のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランク対照のＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。図２１Ａに示すように、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ分子（化合物Ｓ１０、黒丸）及びＤＰ４７含有単鎖三量体ＯＸ４０Ｌ抗原結合分子（対照３）は、ＦＡＰ＋標的細胞が存在せず、従って架橋が起こらない場合には、既に一定量のＮＦκＢ活性化を誘導する。
【図２２】図２２のスキームは、実施例１０．２．２に記載された抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイの一般原則を示す。
【図２３−２４】図２３及び２４は、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ１３７発現に対する（図２３）又はＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌に対する（図２４）単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子の効果を示す。ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の持続的ＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現は、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の認識によるＴ細胞の同時活性化（シグナル１、図Ａ及びＢ）及びＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子による４−１ＢＢ誘発（シグナル２、図Ｃ〜Ｆ）に厳密に依存する。黒丸：ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子（化合物Ｓ１）；白丸：ＤＰ４７含有単鎖三量体４−１ＢＢＬ分子（対照３）。４−１ＢＢの上方制御の効果を図２３Ａ〜２３Ｆに示し、一方ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＮＦγ発現の効果を図２４Ａ〜２４Ｆに示す。示されるのは常に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団全体における蛍光強度の中央値（左パネル）及び陽性細胞の頻度のパーセンテージ（右パネル）である。
【図２５−２６】図２５及び２６には、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の認識によるＴ細胞の同時活性化（シグナル１、図Ａ及びＢ）及びＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドによる４−１ＢＢ誘発（シグナル２、図Ｃ〜Ｆ）に厳密に依存するＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の持続的ＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が示される。４−１ＢＢの上方制御の効果を図２５Ａ〜２５Ｆに示し、一方ＩＮＦγ発現の効果を図２６Ａ〜２６Ｆに示す。示されるのは常に、一価若しくは二価のＦＡＰ（２８Ｈ１又は４Ｂ９）標的化又はＤＰ４７非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の使用濃度に対する、ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団全体における蛍光強度の中央値（左パネル）及び陽性細胞の頻度のパーセンテージ（右パネル）である。
【図２７Ａ−Ｆ】図２７Ａ〜図２７Ｆは、ＤＰ４７含有三量体単鎖ＯＸ４０Ｌ分子（白丸、点線、対照３）を用いた共刺激はほんのわずかに増殖を促進し、抗ヒトＣＤ３抗体で準最適に刺激されたヒトＣＤ４＋（左側）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（右側）において活性化表現型（ＣＤ２５発現）の増強を誘導した。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌ分子の過架橋は、この効果を強く増加させた（黒丸、化合物Ｓ１０）。示されるのは、事象数、増殖性（ＣＦＳＥ−低）細胞のパーセンテージ、又は生存ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＤ２５−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５のＭＦＩの何れかである。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有するブランク試料のベースライン値を試験化合物試料から差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０Ｌ共刺激の増強効果は示されるが、準最適の抗ＣＤ３刺激そのものの効果は示されていない。
【図２８】図２８Ａは、ペプチドリンカーによって互いに連結された４−１ＢＢＬの３つのエクトドメインを含むポリペプチドを示す。図２８Ｂは、図２８Ａのポリペプチドを含む本発明の二価ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の代表例を示す。３つのＴＮＦリガンドは、下部の灰色の領域によって象徴される。黒い点を有する白い部分はＦｃ部分を表し、太い黒い点はノブ・イントゥー・ホール修飾を象徴する。
【００６３】
発明の詳細な説明
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００６４】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００６５】
本明細書で使用される用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。
【００６６】
抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な部分は、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６７】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６９】
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００７０】
本出願において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。
【００７１】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００７２】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号（Ｂ１）を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、インタクトな抗体のタンパク質消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含む。
【００７３】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。本明細書で使用される場合、従って、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００７４】
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換され、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び計鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７５】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００７６】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００７７】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、約１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、又はその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96）に記載される。更に抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００７８】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で周知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されており、例えばGebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) 及び Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)を参照。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
【００７９】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、ＵＳ７１６６６９７Ｂ１）。エボビディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。
【００８０】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０〜１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。更なる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350(2000)、米国特許第７２５０２９７号（Ｂ１）及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。
【００８１】
アフィボディは、抗原に結合するように操作することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのらせん状の束からなる。ライブラリーは表面残基のランダム化によって作成されている。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及び欧州特許第１６４１８１８号（Ａ１）を参照。
【００８２】
アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然のバリエーションをシャッフルすることによって生成される。更なる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照。
【００８３】
トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディが含まれる。更なる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。
【００８４】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、第１のαヘリックス及び各リピートのβターンの残基をランダム化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号（Ａ１）を参照。
【００８５】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００８６】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが関心のある治療標的を特異的に認識することを可能にするように操作することができる。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号（Ｂ１）を参照。
【００８７】
ペプチドアプタマーは、定常性の足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照。
【００８８】
ミクロボディーは、３〜４個のシステイン架橋を含む長さが２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
【００８９】
参照分子と同じエピトープに結合する「抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００９０】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００９１】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００９２】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００９３】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００９４】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００９５】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２１）、又はＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号２２及び２３に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号２４）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号２５及び２６は、それぞれ、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号２７及び２８は、それぞれ、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２００２／２０００６号（Ａ２）号に記載されている。
【００９６】
特に断りのない限り、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号２９）に示されている。ＣＥＡは、腫瘍関連抗原として長い間同定されている（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。もともと、胎児組織においてのみ発現されるタンパク質として分類されたＣＥＡは、幾つかの正常な成体組織において同定されている。これらの組織は起源は上皮由来であり、胃腸管、呼吸器管及び泌尿生殖器管の細胞、並びに大腸、子宮頸部、汗腺及び前立腺の細胞を含む（Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992）。上皮起源の腫瘍及びそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含む。ＣＥＡ自体の存在はがん性細胞への形質転換を示さないが、ＣＥＡの分布は指標となる。正常組織では、ＣＥＡは一般に細胞の頂端表面上に発現され（Hammarstroem S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）、血流中の抗体に到達できなくなる。正常組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん細胞の表面全体にわたって発現される傾向にある（Hammarstroem S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。発現パターンのこの変化は、ＣＥＡをがん細胞における抗体結合に到達可能にする。更に、ＣＥＡ発現はがん性細胞において増加する。更に、ＣＥＡ発現の増加は、細胞間癒着の増加を促進し、これは転移をもたらし得る（Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003）。種々の腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は一般に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織試料で行われる独自の分析は、その高い有病率を確認し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）で約９５％、膵臓がんで約９０％、胃がんで約８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３と同時発現している）で約６０％、乳がんで約４０％であり；小細胞肺がん及び神経膠芽腫において低発現が見られた。ＣＥＡは細胞表面から容易に切断され、腫瘍からの血流に、直接的に又はリンパ管を介して流出する。この性質のために、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。
【００９７】
特に断りのない限り、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号３０）に示されている。特に断りのない限り、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１とも呼ばれる用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号３１）に示されている。
【００９８】
特に断りのない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号３２）に示されている。この用語は、「完全長」未処理のヒトＣＤ１９並びに本明細書中に報告される抗体がそれに結合する限り、細胞内でのプロセシングに起因する任意の形態のヒトＣＤ１９を含む。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞の表面上に発現される構造的に異なる細胞表面受容体であり、限定されないが、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（すなわち未成熟Ｂ細胞）形質細胞への最終分化を介した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞が含まれる。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、一部のＮｕｌｌ急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上でのＣＤ１９の発現は、多発性骨髄腫のような分化したＢ細胞腫瘍上で発現され得ることを更に示唆する。従って、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療における免疫療法の標的である。
【００９９】
特に断りのない限り、「ＣＤ２０」は、膜貫通型４ドメインサブファミリーメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号３３）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号３４）に示されている。
【０１００】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書中で交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記引用文献の各々によって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、以下の表Ａに比較として記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
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【０１０２】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって記載された番号付けシステムを指す。特に明記しない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【０１０３】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008）を参照）。特に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、抗原結合分子（例えば、抗体）の文脈における「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来し（例えば変異による）、参照抗体と同じ抗原に結合し、好ましくは同じエピトープに結合し；参照抗原結合分子のそれよりも抗原に対して高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【０１０５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【０１０６】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【０１０７】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【０１０８】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０１０９】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾されるか又は変更されているものである。
【０１１０】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１１１】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端の残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）のストレッチを含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖の対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するもの；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る．一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において他に特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【０１１２】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞（「ホール」）を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、かつホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、従って二量体を更に安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。残基番号付けは、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスに従う。
【０１１３】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むように意図されている。例えば、一又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対して最小の影響を有するように、当該技術分野で周知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照）。
【０１１４】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【０１１５】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１１６】
用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」は、炎症誘発性サイトカインを指す。一般的なサイトカイン、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び協調に重要な役割を果たす。現在、１９のサイトカインが、配列、機能的及び構造的類似性に基づいてＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドは全て、Ｃ末端細胞外ドメイン（外部ドメイン）、Ｎ末端細胞内ドメイン及び単一膜貫通ドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＡＴ）として知られるＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０〜３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結合を担う。ＴＮＦ外部ドメインはまた、それらの特異的受容体によって認識される三量体複合体を形成するＴＮＦリガンドに関与している。
【０１１７】
ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンパ毒素α（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られている）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られている）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られている）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られている）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られている）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られている）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られている）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られている）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られている）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られている）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られている）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られている）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られている）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られている）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られている）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られている）、ＥＤＡ−Ａ１（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ  Ａ１としても知られている）及びＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２としても知られている）からなる群から選択される。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。本発明の特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群から選択される。特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【０１１８】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの更なる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のような公的に入手可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトリンフォトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７４、配列番号３５）、ヒトＴＮＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７５、配列番号３６）、ヒトリンホトキシンβ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０６６４３、配列番号３７）、ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２３５１０、配列番号３８）、ヒトＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５、配列番号３９）、ヒトＦａｓＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４８０２３、配列番号４０）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７０、配列番号４１）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７１、配列番号４２）、４−１ＢＢＬ（ユニプロ受託番号Ｐ４１２７３、配列番号４３）、ＴＲＡＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ５０５９１、配列番号４４）、ＲＡＮＫＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ１４７８８、配列番号４５）、ＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５０８、配列番号４６）、ＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ７５８８８、配列番号４７）、ＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ２７５、配列番号４８）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５５７、配列番号４９）、ＴＬ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ９５１５０、配列番号５０）、ＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号５１）及びエクトジスプラシンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２８３８、配列番号５２）。
【０１１９】
「外部ドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に広がる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常、表面との接触を開始するタンパク質の一部であり、シグナル伝達につながる。従って、本明細書で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）に伸びるＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合の原因となるより短い部分又はその断片も含む。従って、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン、又は受容体に依然として結合することができるそれらの部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【０１２０】
「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体との相互作用時にＴＣＲシグナルを共刺激することができ、その受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員につながる。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【０１２１】
本明細書において前述されるように、４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１メンバーである。配列番号４３のアミノ酸配列を有する完全長又は全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬの外部ドメインの特定のモチーフ（ｍｏｔｉｖｅｓ）によって可能になる。前記モチーフは、本明細書では「三量化領域」と指定される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号５３）のアミノ酸５０−２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえも三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）、配列番号９９（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号１００（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）、配列番号１０１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号１０２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、また三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も指す。
【０１２２】
本明細書において前述されるように、ＯＸ４０Ｌは別のＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの更なるメンバーである。完全長又は全長ヒトＯＸ４０Ｌは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。ヒトＯＸ４０Ｌ配列（配列番号６）のアミノ酸５１−１８３は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえも三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「ＯＸ４０Ｌのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号６（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５１−１８３）又は配列番号７（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５２−１８３）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も本明細書に含まれる。
【０１２３】
用語「ペプチドリンカー」は、一又は複数のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、１〜４４個のアミノ酸、より具体的には２〜２０個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当該技術分野において周知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１〜１０の数、典型的には２〜４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドはＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５５）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５６）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号１３６），（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）であり、より具体的には（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）である。
【０１２４】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１２５】
本明細書で使用される「単鎖融合タンパク質」は、抗原結合部分又はＦｃ部分の一部に融合された前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つ又は２つの外部ドメインからなる単鎖ポリペプチドを指す。融合は、抗原結合部分のＮ又はＣ末端アミノ酸を、ペプチドリンカーを介して、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインのＣ末端又はＮ末端アミノ酸に直接的に連結することによって生じ得る。
【０１２６】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン）が、直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１２７】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて完全に一致するとされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【０１２８】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は表Ｂの「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して以下で更に説明する。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０１２９】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１３０】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うこととなる。
【０１３１】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作成することができる。簡潔には、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、一又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定するために使用される。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１３２】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１３３】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳類細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。幾つかの実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子におけるオリゴ糖の修飾が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の更なる変異体には、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有するものが含まれる。そのような変異体は、フコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体もまた提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１３４】
特定の実施態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のシステイン改変変異体（cysteine engineered variants）、例えば分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作ることが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちの何れか一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１３５】
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、当該技術分野において周知であり、容易に入手可能な更なる非タンパク質性部分を含有するように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝状又は非分枝状であってもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合する場合、それらは同一又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は型は、限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が定まった条件下で治療に使用されるかどうかを含む考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線に曝露することによって選択的に加熱することができる抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないものの、通常の細胞に害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度にまで加熱する波長を含む。
【０１３６】
別の態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１３７】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１３８】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に合成により製造されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１３９】
少なくとも、例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５つの点変異を含み得るということ以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％まで複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端位置の間のどこかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、何れか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１４０】
用語「発現カセット」は、組換えにより又は合成により、標的細胞内の一連の特定の核酸の転写を許可する特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１４１】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞性転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１４２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１４３】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１４４】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１４５】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１４６】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１４７】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定されなるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
【０１４８】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１５０】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病などの増殖性疾患を指し、任意の上記がんの難治性型、又は上記がんの一又は複数の組み合わせを含む。
【０１５１】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、及び低減された毒性などの特に有利な特性を有する新規なＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１５２】
従って、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）任意選択的にペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【０１５３】
一態様では、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１５４】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
ここで、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つのＮ末端又はＣ末端のアミノ酸に融合される。
【０１５５】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。従って、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは共刺激ＴＮＦファミリーリガンドである。特に、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【０１５６】
一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【０１５７】
更なる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
更なる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号５又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。より具体的には、ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。
【０１６１】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
更なる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。
【０１６３】
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片は、互いに直接的に、又はジスルフィド、エステル若しくはエーテル架橋などの適切な化学リンカーで連結される。
【０１６４】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
ここで、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片は、同一又は異なるものであって、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５５）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５６）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）をも含むペプチドリンカーによって互いに連結される。特に、ペプチドリンカーは同一であり、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号５４）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）からなる群から選択される。より詳細には、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片がｍ（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって互いに連結される、上で定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【０１６５】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される。更なる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸にペプチドリンカーによってＣ末端アミノ酸で連結される。
【０１６６】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ＦｃドメインのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合される。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合される。更なる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのＣ末端アミノ酸にペプチドリンカーによってＮ末端アミノ酸で連結される。
【０１６７】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドに融合されない。
【０１６８】
更なる態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。
【０１６９】
一態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は抗体である。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は抗体断片である。特に、抗体断片は、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びａＶＨからなる群より選択される。
【０１７１】
更なる態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は足場抗原結合タンパク質である。
【０１７２】
従って、更なる態様では、本発明は、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。従って特定の態様では、本発明は、（ａ）Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体断片、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。一態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される標的細胞抗原に特異的に結合することができる一つの抗体断片を含む。
【０１７３】
特定の態様では、本発明は、上記に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。従って、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂ分子、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１７４】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１７５】
更なる態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。特に、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
【０１７６】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各々のサブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１７７】
Ｆｃドメインは、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比を含む、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与する。従って、Ｆｃドメインは、クリアランス、分布の体積又は消失半減期（ｔ１／２）などの抗原結合分子の薬物動態パラメータ（ＰＫデータ）に有利に寄与する。しかし同時に、好ましい抗原担持細胞ではなくＦｃ受容体を発現する細胞への本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。従って、特定の態様において、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する減少した結合親和性及び／又は減少したエフェクター機能を示す。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【０１７８】
特定の態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１７９】
一態様では、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、本明細書中で先に定義したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低減させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。
【０１８０】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ一又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖中のアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合せは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に破壊し、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）に記載されており、これはそのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法も記載している。「ＥＵ番号付け」は、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスに従う番号付けを指す。
【０１８１】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１８２】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。更に特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。更に特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性はまた、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【０１８３】
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１８４】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０１８５】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【０１８６】
幾つかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されている幾つかの実施態様では、前記エフェクター機能の低減はＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及びCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
【０１８７】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
【０１８８】
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖（「重鎖」）に含まれるＦｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え同時発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。従って、組換え産生におけるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
【０１８９】
従って、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、前記修飾は、特にＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１９０】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。従って、特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ分子を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分は第２の二量化モジュールを含み、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量化を可能とし、かつノブ・イントゥー・ホール技術に従って、第１の二量化モジュールはノブを含み、第２の二量化モジュールはホールを含む。
【０１９１】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、かつホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１９２】
従って、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーのリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１９３】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
【０１９４】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらす。ジスルフィド架橋は二量体を更に安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１９５】
代わりの態様では、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０１９６】
特定のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載した一価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０１９７】
特に、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を更に含み、ここで、Ｆａｂ重鎖は、Ｆｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＮ末端にＣ末端で融合される。
【０１９８】
更に、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０１９９】
更なる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０２００】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。更なる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０２０１】
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分を含む、二価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２０２】
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン又はＶＬドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメイン又はＶＨドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン又はＶＬドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０２０３】
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０２０４】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれ含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。更に別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む２つの軽鎖、並びに（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０２０５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２０６】
更なる態様において、本発明は、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むＦＡＰに特異的に結合することができる部分、並びに（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２０７】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２０８】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２０９】
別の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２１０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２１１】
更なる態様において、本発明は、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで抗原結合分子は、
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むＦＡＰに特異的に結合することができる部分、並びに
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２１２】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２１３】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２１４】
標的細胞抗原がＦＡＰであるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０２１５】
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。別の特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０２１６】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１６のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
【０２１７】
更なる特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１９のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
【０２１８】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１０のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１１１のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
【０２１９】
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載した一価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２２０】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２２１】
更なる態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２２２】
別の特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２２３】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分を含む、本明細書中で前に記載した二価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２２４】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２２５】
標的細胞抗原がＣＥＡであるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
別の態様では、標的細胞抗原はＣＥＡである。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる部分は、（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０２２６】
更なる態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１８のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１１９のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
【０２２７】
一態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載した一価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２２８】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２２９】
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる２つの部分を含む、本明細書中で前に記載した二価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２３０】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２３１】
標的細胞抗原がＣＤ１９であるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
更に別の態様では、標的細胞抗原はＣＤ１９である。一態様では、本発明は、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、（ａ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、（ｖｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０２３２】
更なる態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１１８のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１１９のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。別の特定の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号１３４のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１３５のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
【０２３３】
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載した一価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２３４】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２３５】
更なる態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２３６】
別の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる２つの部分を含む、本明細書中で前に記載した二価ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２３７】
特定の態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２３８】
更なる態様では、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。
【０２３９】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２４０】
本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２４１】
幾つかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２４２】
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体を含む抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをコードする配列を含む。
【０２４３】
別の態様では、４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで該ポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結された４−１ＢＢＬの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをコードする配列を含む。
【０２４４】
更なる態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１及び配列番号１０２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む３つの４−１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを対象とする。一態様では、配列番号５又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０２４５】
別の態様では、ＯＸ４０リガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで該ポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＯＸ４０Ｌの３つの外部ドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをコードする配列を含む。
【０２４６】
更なる態様では、本発明は、配列番号６又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む３つのＯＸ４０Ｌ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを対象とする。一態様では、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０２４７】
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体を含む抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで該ポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結され、かつＦｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをコードする配列を含む。更なる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体を含む抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで該ポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結され、かつＦｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをコードする配列を含む。
【０２４８】
一態様では、本発明は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。特定の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、位置２３４、２３５及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を有するＦｃドメインをコードする配列を含む。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、配列番号６６に示される核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む単離されたポリヌクレオチドを対象とする。更なる態様では、配列番号８７に示される核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０２５０】
更なる態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、該ポリヌクレオチドは、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子と、配列番号６６の核酸配列との両方を含む、重鎖及び軽鎖をコードする配列を含む。更なる態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、該ポリヌクレオチドは、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子と、配列番号８７の核酸配列との両方を含む、重鎖及び軽鎖をコードする配列を含む。
【０２５１】
一態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５２】
別の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５３】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５４】
更に別の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５５】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５６】
更なる態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含むＦＡＰに特異的に結合することができる部分、並びに（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５７】
特定の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む。
【０２５８】
更なる態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１１０のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１１１のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含むＦＡＰに特異的に結合することができる部分、並びに（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２５９】
特定の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む。
【０２６０】
別の態様では、ＯＸ４０Ｌ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む重鎖、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２６１】
更なる態様では、本発明は、ＯＸ４０Ｌ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含むＦＡＰに特異的に結合することができる部分、並びに（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２６２】
特定の態様では、本発明は、ＯＸ４０Ｌ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここでポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む。
【０２６３】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２６４】
組換え法
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離し、配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともにＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物の中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、最終タンパク質中に翻訳後又は翻訳と同時に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２６５】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２６６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２６７】
後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は融合タンパク質を標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
【０２６８】
本発明の更なる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【０２６９】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０２７０】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供され、ここで方法は、本明細書で提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
【０２７１】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子において、構成要素（標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメインを含む１つのポリペプチド又はその断片、及びＦｃドメイン）が全て遺伝的に融合されているわけではない。ポリペプチドは、その構成要素（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つの外部ドメイン又はその断片、並びにＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３などの他の構成要素）が互いに直接又はリンカー配列を介して融合するように設計される。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。抗原結合分子の異なる構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合タンパク質の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むための付加的な配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を含めることができる。
【０２７２】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する標的細胞抗原（例えばＦａｂ断片）に特異的に結合することができる部分は、少なくとも抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に産生されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２７３】
免疫グロブリンの任意の動物種を本発明において使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図する場合、免疫グロブリンの定常領域がヒトに由来する免疫グロブリンのキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記述する）； Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述する）； Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述する）；並びにOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択（guided selection）」アプローチを記述する）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば��Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして、抗体断片を提示する。
【０２７４】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、例えばＰＣＴ公開国際公開第２００２／２０００６号（親和性成熟に関連する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示された方法に従って、結合親和性を増強させるように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、抗原に結合する第一の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合する能力について試験する第二の非標識抗原結合分子とを含む溶液中で固定化した抗原をインキュベートする。第二の抗原結合分子はハイブリドーマ上清に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第一の標識抗原結合分子を含むが第二の未標識抗原結合分子は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗原結合分子が、抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２７５】
本明細書で記載のように調製される本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、基本的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現されたＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０２７６】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子が、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。
【０２７７】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、その対応するＴＮＦ受容体に対する親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、その標的細胞抗原に対する親和性も、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例４で説明される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２７８】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を用いて、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。
【０２７９】
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰを発現するがん細胞株を用いて、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
【０２８０】
別の態様では、競合アッセイを使用して、標的又はＴＮＦ受容体にそれぞれ結合する特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、特異的抗標的抗体又は特異的抗ＴＮＦ受容体抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に詳細に示されている。
【０２８１】
３．活性のアッセイ
一態様では、特異的標的細胞抗原及び生物学的活性を有する特異的ＴＮＦ受容体に結合するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を介したアゴニストシグナル伝達を含み得る。インビトロでこのような生物学的活性を有するものとして本アッセイによって同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。
【０２８２】
特定の態様において、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、そのような生物学的活性について試験される。本発明の分子の生物学的活性を検出するためのアッセイは、実施例６に記載のアッセイである。更に、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いる）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０２８３】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの追加的治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０２８４】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に溶解又は分散された一又は複数のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示に照らして当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者には周知であるように、任意の及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
【０２８５】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒質及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された液体媒質からの活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。適切な薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
【０２８６】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０２８７】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の一又は複数の追加的グルコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２８８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２８９】
前に記載した組成物に加えて、融合タンパク質はデポー製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２９０】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【０２９１】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２９２】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２９３】
インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２９４】
治療的方法及び組成物
本明細書において提供される何れのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も、治療法に使用することができる。
【０２９５】
治療法における使用のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与され得る。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に既知の他の要因を含む。
【０２９６】
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療、特にがんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療の方法における使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、融合タンパク質の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のためのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。がんの例には、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。従って、がんの治療に使用のための本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２９７】
別の態様では、感染症の治療における使用のための、特にウイルス感染症の治療のための、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。更なる態様では、例えば、ループス疾患のような自己免疫疾患の治療における使用のための、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２９８】
一態様では、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん（ＰＡＣ）、胃がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び中皮腫の治療における使用のための、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここでその標的細胞抗原はＦＡＰである。
【０２９９】
更なる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製におけるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。一態様では、本医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。従って、一態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造又は調製における本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。がんの例には、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、場合によっては、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は治癒をもたらすことはできず、部分的な利益を提供し得るのみであることを認識し得る。幾つかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの態様では、生理的変化をもたらすＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０３００】
更なる態様では、本発明は、感染症の治療のための、特にウイルス感染症の治療のための、又は自己免疫疾患、例えばループス疾患の治療のための医薬の製造又は調製における本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。
【０３０１】
更なる態様では、本発明は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがんである。別の態様では、疾患は感染症又は自己免疫疾患である。特定の態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０３０２】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の適切な用量は（単独で使用されるか、又は１つ以上の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるとき）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。いずれの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、様々な時点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
【０３０３】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。融合タンパク質の一つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１μｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ、体重１ｋｇあたり約５０μｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ、体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり約３５０μｇ、体重１ｋｇあたり約５００μｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含み得る。本明細書に列挙した数値からの誘導可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇなどを投与することができる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が融合タンパク質の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０３０４】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療上有効な量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３０５】
全身投与の場合、治療的有効量は、細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイから最初に推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０３０６】
初期投与量はまた、当技術分野で周知の技術を用いて、インビボデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０３０７】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個々に調整されてもよい。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０３０８】
局所投与又は選択的取り込みの場合、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０３０９】
本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示すＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３１０】
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０３１１】
その他の薬剤及び治療
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、治療法において一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加的治療剤と組み合わせて投与され得る。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加的治療剤は別の抗がん剤である。
【０３１２】
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０３１３】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る個別投与を包含する。
【０３１４】
製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製造品は、容器、及び容器表面の若しくは容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性な薬剤は、本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子である。
【０３１５】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子を含有する組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物を特定の症状を治療するために使用することができることを示す添付文書を更に含み得る。
【０３１６】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
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【０３１７】
以下において、本発明の特定の実施態様が列挙される：
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）任意選択的にペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３１８】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３１９】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、ペプチドリンカーによって互いに連結されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つのＮ末端又はＣ末端のアミノ酸に融合される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２０】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがヒトＴ細胞活性化を共刺激する、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２１】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２２】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬである、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２３】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９９のアミノ酸配列を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２４】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１のアミノ酸配列を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２５】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号５又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２６】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２７】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２８】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号６のアミノ酸配列を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３２９】
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３０】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端アミノ酸にＣ末端アミノ酸で融合される、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３１】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドが、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＣ末端アミノ酸にＮ末端アミノ酸で融合される、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３２】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３４】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３５】
標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３６】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３７】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３８】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３３９】
標的細胞抗原がＣＥＡである、請求項１から１５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４０】
ＣＥＡに特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４１】
ＣＥＡに特異的に結合することができる部分が、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４２】
標的細胞抗原がＣＤ１９である、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４３】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分が、
（ａ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４４】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる部分が、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４５】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４６】
ＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、かつＩｇＧ重鎖の位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４７】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４８】
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３４９】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５０】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５１】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５２】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５３】
抗原結合分子が、
（ｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５４】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれ含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５５】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５６】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、
（ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む２つの軽鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５又は配列番号１０３又は配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、本明細書中で前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５７】
抗原結合分子が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）Ｆｃドメインと、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５８】
抗原結合分子が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３５９】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３６０】
抗原結合分子が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）Ｆｃドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３６１】
抗原結合分子が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を双方が含む、重鎖及び軽鎖、及び
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３６２】
抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０３６３】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０３６４】
前に記載した単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
【０３６５】
前に記載した単離されたポリヌクレオチド又は前に記載したベクターを含む宿主細胞。
【０３６６】
前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を製造するための方法であって、
（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で、前に記載した宿主細胞を培養する工程、及び
（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法。
【０３６７】
前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【０３６８】
医薬として使用のための、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は前に記載した薬学的組成物。
【０３６９】
がんの治療における使用のための、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は前に記載した薬学的組成物。
【０３７０】
がんの治療のための医薬の製造のための、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用。
【０３７１】
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の、前に記載したＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
【０３７２】
前記疾患ががんである、前記疾患を治療する方法。
【実施例】
【０３７３】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
【０３７４】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている：。
【０３７５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０３７６】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を用いたＰＣＲによって生成されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０３７７】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０３７８】
タンパク質の精製
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質をＰＢＳ又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し（必要に応じて）、−２０℃又は−８０℃で凍結保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
【０３７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０３８０】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄゲルろ過スタンダード１５１−１９０１が標準の役割を果たした。
【０３８１】
質量分析
この節では、正しい組み立てに重点を置いて、ＶＨ／ＶＬ交換（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）を用いた多重特異性抗体の特徴づけについて説明する。期待される一次構造は、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化ＣｒｏｓｓＭａｂ又は代わりに脱グリコシル化／限定されたＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析された。
【０３８２】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７℃で最大１７時間、リン酸又はトリス緩衝液中でＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン又は限定されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化は、脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂ１００μｇを用いて、トリス緩衝液ｐＨ８中で室温で１２０時間、３７℃で４０分間、それぞれ行った。質量分析に先立ち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳによって全質量を測定した。
【０３８３】
実施例１
標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製及び精製
１．１．一価ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１）
ヒト４−１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部（アミノ酸７１−２５４又は７１−２４８）をコードするＤＮＡ配列を、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４１２７３（配列番号４３）に従って合成した。
【０３８４】
それぞれ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号５４）によって分離された４−１ＢＢリガンドの３つの外部ドメインを含むポリペプチドを図１Ａ：ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンドに記載のようにクローニングした。
【０３８５】
単鎖三量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、配列番号５７のリンカー（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant, Zhu et al., 1998）。
【０３８６】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（クローン２８Ｈ１）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖（Ｃａｒｔｅｒ、２００１）又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。ＦＡＰ結合剤の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号（Ａ２）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８７】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入し、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止した。
【０３８８】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む単鎖リガンド−Ｆｃノブ鎖の、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的とされた抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖との組み合わせは、単鎖４−１ＢＢリガンド三量体及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３Ａ）。
【０３８９】
表１は、ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018512137.tif 000019
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【０３９０】
標的化単鎖ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子をコードする配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０３９１】
標的化単鎖４−１ＢＢＬ含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ鎖」：「ベクターホール鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。
【０３９２】
５００ｍＬ振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄをサプリメントとともに加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
【０３９３】
標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。結合したタンパク質を、１００％の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ２．５）までの２０カラム容量に対する直線的なｐＨ勾配を用いて溶出した。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄した。
【０３９４】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ／２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０３９５】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の純度及び分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）により染色して分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で、２５℃において平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０３９６】
表２は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終の単量体含有量をまとめたものである。
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【０３９７】
１．２．二価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ２）
図２８Ａに示されるように、（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離された４−１ＢＢリガンドの３つの外部ドメインを含有するポリペプチド（Ｐ４１２７３に従って合成された７１−２５４又は７１−２４８）を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端でフレーム内にサブクローニングした（Merchant, Zhu et al., 1998）：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンド。
【０３９８】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（クローン４Ｂ９）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。ＦＡＰ結合剤の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号（Ａ２）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９９】
国際公開第２０１２／１３０８３１号（Ａ１）に記載されるように、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０４００】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ホール鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ノブ三量体リガンド鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２８Ｂ）。
【０４０１】
表３は、二価ＦＡＰ標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４０２】
１．３．一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ３）
（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離された４−１ＢＢリガンドの３つの外部ドメイン（Ｐ４１２７３に従って合成された７１−２５４又は７１−２４８）を含むポリペプチドを図１Ａ：ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒト４−１ＢＢリガンドに記載のようにクローニングした。
【０４０３】
単鎖三量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、配列番号５７のリンカー（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant, Zhu et al, 1998）。
【０４０４】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（クローン４Ｂ９）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。ＦＡＰ結合剤の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号（Ａ２）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
国際公開第２０１２／１３０８３１号（Ａ１）に記載されるように、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０４０６】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む単鎖リガンド−Ｆｃノブ鎖の、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的とされた抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖との組み合わせは、単鎖４−１ＢＢリガンド三量体及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３Ａ）。
【０４０７】
表４は、一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018512137.tif 000028
【０４０８】
１．４．二価ＣＥＡ標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ４）
この分子は、二価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化構築物について１．２に記載されるように調製されており、その唯一の違いは抗ＦＡＰ結合剤が抗ＣＥＡ結合剤で置換されたことである。
【０４０９】
がん胎児性抗原（ＣＥＡ）（クローンｓｍ９ｂ）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。クローンｓｍ９ｂは、２００４年のＧｒａｆｆらの米国特許出願公開第２００５／０１４７６１４号及び国際公開第２０１４／００４４６号（Ａ１）に更に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１０】
国際公開第２０１２／１３０８３１号（Ａ１）に記載されるように、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０４１１】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１ホール鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１ノブ三量体リガンド鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２８Ｂ）。
【０４１２】
表５は、二価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018512137.tif 000029
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2018512137.tif 000031
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【０４１３】
１．５．一価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ５）
この分子は、一価ＦＡＰ標的化構築物について１．３に記載されるように調製されており、その唯一の違いは抗ＦＡＰ結合剤が抗ＣＥＡ結合剤で置換されたことである。
【０４１４】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＣＥＡ）（クローンｓｍ９ｂ）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖（Carter, 2001）又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。
【０４１５】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１ホール鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む単鎖リガンドｈｕＩｇＧ１ノブ鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び１つのＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２Ａ）。
【０４１６】
表６は、一価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018512137.tif 000033
【０４１７】
１．６．二価ＣＤ１９標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ６及びＳ７）
この分子は、二価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化構築物について１．２に記載されるように調製され、その唯一の違いは抗ＦＡＰ結合剤が抗ＣＤ１９結合剤で置換されることである。ＣＤ１９クローンの生成は実施例１．８に記載されている。
【０４１８】
ＣＤ１９、すなわちクローン８Ｂ８−０１８及び８Ｂ８−２Ｂ１１に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングする。
【０４１９】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕ  ＩｇＧ１ホール鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕ  ＩｇＧ１ノブ三量体リガンド鎖、及び抗ＣＤ１９  軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２８Ｂ）。国際公開第２０１２／１３０８３１号（Ａ１）に記載されるように、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入される。
【０４２０】
表７は、二価ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４２１】
表８は、二価ＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４２２】
１．７．一価ＣＤ１９標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ８及びＳ９）
この分子は、一価ＦＡＰ標的化構築物について１．３に記載されるように調製され、その唯一の違いは抗ＦＡＰ結合剤が抗ＣＤ１９結合剤で置換されることである。
【０４２３】
ＣＤ１９、すなわちクローン８Ｂ８−０１８又は８Ｂ８−２Ｂ１１に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール（Carter, 2001）の定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングする。
【０４２４】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕ  ＩｇＧ１ホール鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む単鎖リガンドｈｕ  ＩｇＧ１ノブ鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び１つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２Ａ）。
【０４２５】
表９は、一価ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４２６】
表１０は、一価ＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４２７】
１．８．抗ＣＤ１９結合剤８Ｂ８−０１８及び８Ｂ８−２Ｂ１１の生成
１．８．１  抗ＣＤ１９クローン８Ｂ８−０１８の生成
ａ）マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ハイブリドーマ）の免疫化及び生成
Ｂａｌｂ／ｃマウスを６回免疫化し、ＣＤ１９−トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（細胞あたり平均受容体密度３５，０００）で追加免疫した。免疫応答は、ヒトＣＤ１９−トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてＣＤ１９−細胞−ＥＬＩＳＡを用いて血清試料を試験することによってモニターした。十分な力価の抗ヒトＣＤ１９抗体を有するマウスからの脾臓細胞を、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３  Ａｇ８．６５３との融合による不死化に使用した。３回の融合を行い、ハイブリドーマ上清を、ヒトＣＤ１９−トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞上の細胞−ＥＬＩＳＡ及び抗ヒトＣＤ１９特異的抗体用のＤａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）及びＣＤ１９−細胞を用いたＦＡＣＳ結合アッセイによりスクリーニングした（国際公開第２０１１／１４７８３４号の実施例１を参照）。
ｂ）抗ＣＤ１９抗体のハイブリドーマスクリーニング及び細胞生物学的機能評価
ヒトＣＤ１９に対する抗体を分泌するハイブリドーマを同定するためのハイブリドーマのスクリーニングのために細胞ＥＬＩＳＡを適用した。ヒトＣＤ１９によりトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を陽性細胞として使用した。トランスフェクトされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞を陰性対照細胞として使用した。陽性ハイブリドーマの評価のために、トランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞とトランスフェクトされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞との間のＯＤ比を定量した。
−  培養培地：ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｍｇ／ｍｌ）、１０％ＦＣＳ、Ｎａ−ピルビン酸塩、ＮＥＡＡ、グルタミン
−  陽性対照抗体：抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃａｔ＃５５５４０９  ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ
−  検出抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰコンジュゲートＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｔ＃１７０−０６５１６
−  希釈  １ｘＥＬＩＳＡブロッキング試薬で１：２０００
−  他の試薬：フィブロネクチン  Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃８３８０３９  ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ
−  グルタルジアルデヒド：２５％原液／／Ｇｒａｄｅ  Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ｒ１０２  最終濃度：ＰＢＳ中０．０５％
−  ＥＬＩＳＡブロッキング試薬：１０ｘ原液／／Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃１１１２５８９
−  ＴＭＢ基質：Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃１１４３２５５９
−  停止液：１ＭのＨ２ＳＯ４
−  ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ＃１７０−６５１６  希釈  １ｘＥＬＩＳＡブロッキング試薬で１：２０００
１日目：
−  フィブロネクチンコーティング：ＰＢＳ中５μｇ／ｃｍ２；９６ウェルプレート＝３２ｃｍ２；６ｍｌ中１６０μｇ／プレート
−  ＰＢＳ、５０μｌ／ウェル
−  室温で４５分間インキュベートし、コーティング溶液を吸引する
−  ９６ウェルプレート中の５０μｌの培養培地中に１．２５×１０４細胞／ウェルで播種する
−  ３７℃で４０時間インキュベートする
−  プレートの上半分に加える：ＣＤ１９を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞
−  プレートの下半分に加える：トランスフェクトされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞
３日目：
−  ５０μｌの培養培地中に陽性対照抗体又は試料（上清又はマウス血清）の添加
−  ４℃で２時間インキュベートする
−  培地を除去し、１００μｌのグルタルジアルデヒド（ＰＢＳ中０．０５％）で細胞を固定する
−  ２００μｌのＰＢＳで２回洗浄する
−  検出抗体１：２０００、５０μｌ／ウェルの添加
−  室温で２時間インキュベートする
−  ２００μｌのＰＢＳで３回洗浄する
−  ５０μｌのＴＭＢを添加し、室温で３０分間インキュベートする
−  ２５μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止する；４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を読み取る
−  結果の計算：ＯＤ  ＮＩＨ３Ｔ３  ＣＤ１９：ＯＤ  ＮＩＨ３Ｔ３（トランスフェクトされていない）の比
選択された抗体は、トランスフェクトされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較して、ＣＤ１９トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞に特異的結合を示した（国際公開第２０１１／１４７８３４号の実施例２を参照）。
ｃ）抗ＣＤ１９抗体のヒト化
【０４２８】
マウス抗体のＣＤ１９結合特異性をヒトアクセプターフレームワークに移し、人体が異物と認識する配列伸長から生じる可能性のある免疫原性の問題を排除した。これは、マウス（ドナー）抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）全体をヒト（アクセプター）抗体フレームワークに移植することによって行われ、ＣＤＲ移植又は抗体ヒト化と呼ばれている。
【０４２９】
マウスのアミノ酸配列を、ヒト生殖系列抗体Ｖ遺伝子のコレクションと整列させ、配列同一性及び相同性に従って分類した。１つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆるカノニカルループ構造を決定しなければならない（Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279）。これらのカノニカルループ構造は、いわゆるカノニカル位置に存在する残基の種類によって決定される。これらの位置は、（部分的に）ＣＤＲ領域の外側にあり、親（ドナー）抗体のＣＤＲコンフォメーションを保持するために最終構築物において機能的に等価に保たれなければならない。ヒト生殖系列配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＨ１＿１を重鎖のためのアクセプターとして選択し、配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＫ２＿５を軽鎖のために選択した。
【０４３０】
野生型ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体８Ｂ８はＨＶＲ−Ｌ１：ＮＳＮＧＮＴ（配列番号１６１）に３つの脱アミノ化ホットスポットを有することが見出された。更に、ＨＶＲ−Ｈ２において、更なる脱アミノ化ホットスポットが存在することが見出された：ＫＦＮＧ（配列番号１６２）。ＨＶＲ−Ｈ２の脱アミド化ホットスポットに対処するために、位置６４のＮ（Ａｓｎ）からＱ（Ｇｌｎ）への点変異（Ｋａｂａｔによる番号づけ）が導入されている。軽鎖の脱アミド化ホットスポットに対処し、改善された脱アミド化安定性を有するヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を得るために、Ｓ（セリン）からＰ（プロリン）までの２７ｅ位での単一変異（Ｋａｂａｔによる番号づけ）を導入した。従って、以下の表１８に示すＣＤＲを有するクローン８Ｂ８−０１８が生成された。
2018512137.tif 000044
【０４３１】
更に、８Ｂ８−０１８は、以下の表１２に示すように、カニクイザルＣＤ１９に対する交差反応性を維持する。
2018512137.tif 000045
【０４３２】
１．８．２  ファージディスプレイキャンペーンのためのＣＤ１９抗原Ｆｃ融合体の調製、精製及び特徴づけ
単量体状態のヒト及びカニクイザルＣＤ１９外部ドメイン（ヒトＣＤ１９は配列番号３２参照）を発現及び精製するために、それぞれのＤＮＡ断片を「ノブ」変異を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子セグメントに融合させ（ヒト：配列番号１６３；カニクイザル：配列番号１６５）、「Ｆｃ−ホール」（配列番号７６）対応物によりトランスフェクトした（Merchant et al., 1998）。ＩｇＡ切断部位（ＰＴＰＰＴＰ）を抗原外部ドメインとＦｃノブ鎖との間に導入した。定方向のビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−Ｆｃノブ鎖のＣ末端に導入し、変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを精製目的のためにＦｃホールに導入した（Jendeberg L. et al, J. Immunological methods, 1997）。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異（ヒト：配列番号１６４；カニクイザル：配列番号１６６）を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異（配列番号８０）を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、ＣＤ１９外部ドメインの単一コピーを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合断片の生成を可能にする（図３Ｃの４−１ＢＢ構築物と同様に）。表１３は、抗原Ｆｃ融合構築物のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を列挙する。
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【０４３３】
単量体抗原／Ｆｃ融合分子の産生のために、指数関数的に増殖する懸濁ＣＨＯ細胞を、標準的な方法を用いて融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）をコードする２つのプラスミドで同時トランスフェクトした。
【０４３４】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム容量（ＣＶ）＝５〜１５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の樹脂にロードした。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。直線勾配を用いて結合したタンパク質を溶出した。工程１、０〜６０％溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５））から１０ＣＶ；工程２、６０〜１００％溶出緩衝液から２ＣＶ。直線勾配のために、１００％溶出緩衝液を用いて更なる２カラム容積の段階溶出を適用した。
【０４３５】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４３６】
表１４は、単量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１９抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合タンパク質の収率及び最終単量体含有量をまとめたものである。
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【０４３７】
精製された抗原の一部を、ＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼ標準反応キット（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｃａｔ．＃ＢｉｒＡ５００）を用いて製造業者の説明書に従ってインビトロでビオチン化した。ヒトＣＤ１９含有融合体のビオチン化の程度は９４％、それぞれのカニクイザルＣＤ１９構築物について１００％であった。次いで、ビオチン化タンパク質を、脱アミド化ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟８Ｂ８由来クローンの選択、スクリーニング及び特徴づけに使用した。ａ）２つのファージディスプレイライブラリーが作成され、ａ）位置２７ｄ及び２８のアスパラギン残基が両方とも除去され、ｂ）改善された親和性を有する８Ｂ８変異体を選択するために重鎖及び軽鎖の更なるＣＤＲが無作為化された。
【０４３８】
１．８．３  ＣＤＲ−Ｌ１ホットスポットを欠く８Ｂ８親和性成熟ライブラリーの作成
ＣＤＲ−Ｌ１に位置する脱アミド部位Ｎ２７ｄ及びＮ２８を持たない親和性成熟８Ｂ８由来抗体の生成は、標準的なプロトコール（Silacci et al, 2005）を用いてファージディスプレイによって行った。第１の工程では、ヒト化親クローン８Ｂ８（配列番号１６９及び配列番号１７０）のＶＬ及びＶＨ  ＤＮＡ配列をファージミドにクローニングし、次いで無作為化のための鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによる好ましいクローンの選択のための２つのライブラリーを作成した。上記のホットスポット位置を除去するために、位置２７ｄ及び２８のアミノ酸Ｓ  Ｔ  Ｑ  Ｅのみを許容したＬＣＤＲ１無作為化プライマー（配列番号１７１）を両方のライブラリーに使用した。成熟ライブラリー１は、軽鎖及び重鎖の両方のＣＤＲ１及び２において無作為化された一方、成熟ライブラリー２は、軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びに重鎖のＣＤＲ３において無作為化された。軽鎖及び重鎖の両方のＣＤＲ１及びＣＤＲ２において無作為化された成熟ライブラリー１の作成のために、３つの断片を「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって構築し、ファージベクターにクローニングした。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１７６）及びＣＤ１９  Ｌ１リバースランダム（配列番号１７１））、断片２（ＣＤ１９  Ｌ２フォワードランダム（配列番号１７２）及びＣＤ１９  Ｈ１リバースランダム（配列番号１７３））、及び断片３（ＣＤ１９  Ｈ２フォワードランダム（配列番号１７４）及びＣＤ１９  Ｈ３リバースコンスタント（配列番号１７５））（表１５）。十分な量の全長無作為化断片を集めた後、それを同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒にＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。３倍モル過剰のライブラリーインサートを１０μｇのファージミドベクターと連結した。精製されたライゲーションを２０回の形質転換に用い、２×１０ｅｘｐ９の形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリーを示すファージミド粒子を回収し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。
【０４３９】
軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びに重鎖のＣＤＲ３において無作為化された第２のライブラリーの作成も同様に行われた。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１７６）及びＣＤ１９  Ｌ１リバースランダム（配列番号１７１））、断片２（ＣＤ１９  Ｌ１フォワードコンスタント（配列番号１７７）及びＣＤ１９  Ｌ３リバースランダム（配列番号１７８））、及び断片３（ＣＤ１９  Ｌ３フォワードコンスタント（配列番号１７９）及びＣＤ１９  Ｈ３リバースランダム（配列番号１８０））（表１６）。十分な量の全長無作為化断片を集めた後、それを同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒にＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで消化した。３倍モル過剰のライブラリーインサートを２０ｕｇのファージミドベクターと連結した。精製されたライゲーションを４０回の形質転換に用い、２×１０ｅｘｐ９の形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリーを示すファージミド粒子を回収し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。
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【０４４０】
１．８．４  ＣＤＲ−Ｌ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠いている親和性成熟８Ｂ８由来クローンの選択
ＣＤＲ−Ｌ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟クローンの選択のために、ファージディスプレイによる２つの選択アプローチを実施した：
【０４４１】
第１のアプローチでは、両方のファージディスプレイライブラリーを用いて、ヒトＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質において選択を実施した。パニングラウンドは、次のパターンに従って溶液中で実施した：１．約１０１２個のファージミド粒子を、３０ｎＭのビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質に１ｍｌの総体積において０．５時間で結合させ、２．ビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁気ビーズを１０分間加えることにより捕捉し、３．ビーズを、５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄し、４．ファージ粒子を、１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡを加えることにより１０分間溶出し、５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えることにより中和し、５．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、６．ヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その後ファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降させて次の選択ラウンドに使用する。減少する抗原濃度（３０×１０−９Ｍ、１０×１０−９Ｍ、及び３×１０−９Ｍ）を用いて３ラウンドにわたって選択を行った。ラウンド２及び３において、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。ニュートラアビジンプレートを５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳにより洗浄した．ラウンド３では、ファージがプレートから溶出される前に、「オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）」選択のために、ニュートラアビジンプレートを２リットルのＰＢＳ中で一晩インキュベートした。更に、カニクイザルＣＤ１９−Ｆｃタンパク質を、交差反応性結合剤を濃縮するためにラウンド２で使用した。
【０４４２】
第２の選択アプローチでは、細胞表面上にヒト又はカニクイザルＣＤ１９  ＥＣＤの何れかを一過性に発現する細胞でファージパニングを実施した。ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションのために、以下のタンパク質セグメントについてＤＮＡ配列（５’→３’）を保有する発現プラスミドを生成した：Ｆｌａｇタグ、ＳＮＡＰタグ、ヒト又はカニクイザル起源のどちらかのＣＤ１９  ＥＣＤ、及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通領域（配列番号２２７及び２２８）。細胞表面上のそれぞれのタンパク質（配列番号２２９及び２３０）の発現は、検出のために抗Ｆｌａｇ抗体を用いたフローサイトメトリーによって確認した。両方のライブラリーを、ヒト又はカニクイザルＣＤ１９  ＥＣＤ含有タンパク質融合体を発現する細胞に最初の選択ラウンドで曝露した。その後のパニングラウンドでは、ＣＤ１９  ＥＣＤの種はそれに応じて交互にされた。無関係の膜タンパク質で一時的にトランスフェクトされた細胞を、前もってはっきりさせるために使用した。
【０４４３】
パニングラウンドは、次のパターンに従って実施した：
１．上記の標準的な手順に従って、ＣＤ１９  ＥＣＤ又は無関係の膜貫通タンパク質の何れかを発現する構築物によるＨＥＫ細胞のトランスフェクション、
２．５％ＣＯ２雰囲気を有するインキュベーター内で、３７℃で合計４８時間の細胞のインキュベーション、
３．遠心分離（２５０×ｇで３分間）による細胞の単離、並びにＰＢＳ／５％ＢＳＡ中の１×１０Ｅ７ ＣＤ１９  ＥＣＤ陽性細胞及び１×１０Ｅ７陰性細胞のそれぞれの再懸濁、
４．穏やかに回転するチューブローテーターを用いてファージライブラリーを４℃で６０分間、１×１０７ ＣＤ１９陰性細胞と共にインキュベートすることによる非特異的ファージの予備洗浄、
５．２５０ｘｇで３分間の細胞の遠心分離、新鮮なチューブへの上清の移入、１×１０Ｅ７ ＣＤ１９陽性細胞の添加、及びチューブローテーター上における穏やかな回転により４℃で６０分間のインキュベーション、
６．２５０×ｇで１分間の遠心分離による細胞の洗浄、上清の吸引、及び１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁（８回）、
７．１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡを用いたファージ溶出、室温で５分間のインキュベーション、及び５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６での溶出液の中和、
８．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の再感染、及び
９．ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染とその後の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。選択は３ラウンドにわたって行われた。
【０４４４】
両方の選択アプローチについて、特異的結合剤を以下のようにＥＬＩＳＡによって同定した：ウェルあたり３０ｎＭのビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質１００μｌをニュートラアビジンプレートにコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて，結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。
【０４４５】
組換えヒトＣＤ１９についてＥＬＩＳＡ陽性であったクローンを、ヒトＣＤ１９  ＥＣＤ含有発現プラスミド（配列番号２２７）で一過的にトランスフェクトした細胞を用いた細胞ベースのＥＬＩＳＡで更に試験した。この分析は以下のように実施した：トランスフェクションの４８時間後、ＨＥＫ細胞を回収し、２５０ｘｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ  ＢＳＡ  ２％に再懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとし、氷上で２０分間インキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。１００ｕｌ中４×１０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分配し、２５０ｘｇ及び４℃で３分間遠心分離した。上清を吸引除去し、可溶性Ｆａｂ断片を含む５０ｕｌの細菌上清を５０ｕｌの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ  ２％で希釈し、プレートに添加し、細胞と混合し、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳにより３回洗浄した後、抗Ｆａｂ−ＨＲＰ抗体の１：２０００希釈物を含む、ウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ  ＢＳＡ  ２％を添加した。１時間のインキュベーション時間の後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。現像のために、１ウェルあたり１００ｕｌの「１−ｓｔｅｐ  ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ」基質を添加した。１０分間のインキュベーション時間の後、ウェルあたり４０ｕｌのＨ２ＳＯ４（１Ｍ）を含有する新しい９６ウェルプレートに上清を移し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。バックグラウンドを超えて有意なシグナルを示すクローンを、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を用いたＳＰＲ分析によって動力学的スクリーニング実験に供した。
【０４４６】
１．８．５  ＳＰＲによる親和性成熟８Ｂ８由来変異体の同定
ＥＬＩＳＡ陽性クローンを更に特徴づけるために、オフ速度を表面プラズモン共鳴によって測定し、親のヒト化クローン８Ｂ８と比較した。
【０４４７】
この実験のために、７０００ＲＵのポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、アミンカップリングによって、ＧＬＭチップの６つのチャネル全てに固定化した（酢酸ナトリウムｐＨ４．５、２５μｌ／分、２４０ｓ）（垂直配向）。それぞれの抗体含有細菌上清を濾過し、ＰＢＳで２倍に希釈し、次に垂直配向で１００〜４００応答単位（ＲＵ）の固定レベルを達成するように２５μｌ／分で３６０秒間注入した。単量体ＣＤ１９−Ｆｃの注入：ワンショットキネティックス（ｏｎｅ−ｓｈｏｔ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）測定のために、注入方向を水平配向に変更し、精製単量体ＣＤ１９−Ｆｃの３倍希釈シリーズ（１５０〜６ｎＭで濃度範囲を可変させる）を、５０μｌ／分で別々のチャネル１−４に沿って１８０秒の会合時間及び３００秒の解離時間で同時に注入した。参照用に「インライン」ブランクを提供するために、第６チャネルにおけるＰＢＳ注入と共に、親和性成熟ＣＤ１９変異体への特異的結合のための陰性対照として、チャネル５にヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（１５０ｎＭ）を注入した。再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスにより３０秒間９０ｕｌ／分（水平配向）で行った。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアの単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて計算した。最も遅い解離速度定数を有するＦａｂを発現するクローンを同定した。対応するファージミドの可変ドメインを配列決定した。重要なことは、ＣＤＲ−Ｌ１中のアスパラギン残基（位置２７ｄ及び２８）の両方がセリン又はスレオニンにより置換され、両方の脱アミド化部位が除去されたことを示している。
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【０４４８】
表１８は、クローン８Ｂ８−０１８及び８Ｂ８−２Ｂ１１それぞれのＣＤＲ並びに可変領域ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
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【０４４９】
実施例２
「非標的化」単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製及び精製
単鎖三量体リガンドをコードするポリペプチド鎖（図１Ａ）を用いて、非標的化（生殖系列対照、ＤＰ４７）４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（例えば図３Ｂに示す一価対照）をＦＡＰ標的化構築物について上述したように調製した。
【０４５０】
ＦＡＰ結合剤の重鎖及び軽鎖の可変領域のＤＮＡ配列を、生殖系列コントロール（ＤＰ４７）のもと置換し、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。
【０４５１】
非標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、ＦＡＰ標的化構築物について上述したように産生した。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクター三量体リガンド−ノブ鎖」：「ベクターＤＰ４７  Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクターＤＰ４７軽鎖」）でトランスフェクトした。
【０４５２】
表１９は、一価ＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４５３】
表２０は、ＤＰ４７含有単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の収率及び最終の単量体含有量をまとめたものである。
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【０４５４】
表２１は、二価ＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（対照２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４５５】
実施例３
標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及びそれらの対照の産生
本明細書中に先に記載したような標的化及び非標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のコード配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０４５６】
標的化及び非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ鎖」：「ベクターホール鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。
【０４５７】
５００ｍＬ振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に３億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を２０ｍＬの予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）をＣＤ  ＣＨＯ培地２０ｍＬ中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭバルプロ酸を補充したＥｘｃｅｌｌ培地１６０ｍＬを加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１２％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、少なくとも４００×ｇで３０〜４０分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
【０４５８】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５〜１５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の樹脂にロードした。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いた直線勾配（２０ＣＶ）又は段階溶出（８ＣＶ）の何れかを用いて溶出させた。直線勾配のために、更なる４カラム容積の段階溶出を適用した。
【０４５９】
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４６０】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）により染色して、又はＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してＣＥ−ＳＤＳにより分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で、２５℃において平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０４６１】
表２２は、標的化及び非標的化鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終の単量体含有量をまとめたものである。
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【０４６２】
実施例４
４−１ＢＢの調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザル４−１ＢＢの外部ドメインをコードするＤＮＡ配列（表２３）を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原外部ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。定方向のビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、４−１ＢＢ外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図３Ｃ）表２４は、図３Ｃに示される単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を列挙する。
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【０４６３】
４−１ＢＢ−Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０４６４】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０４６５】
５００ｍｌの振盪フラスコ中でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
【０４６６】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０で洗浄した。
【０４６７】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４６８】
ヒト受容体に対する親和性決定のために、ヒト４−１ＢＢの外部ドメインも、ａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号８４）及びヘキサヒスチジンタグとともにフレーム内にサブクローニングした。タンパク質の産生を、Ｆｃ融合タンパク質について上記のように行った。分泌されたタンパク質は、キレートクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。最初のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で行った。溶出は、５％〜４５％の溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）からの１２カラム容量に対する勾配を適用することによって行った。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
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【０４６９】
実施例５
表面プラズモン共鳴によるＦＡＰ標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生化学的特徴づけ
ＦＡＰ標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の組換え４−１ＢＢへの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０４７０】
ＦＡＰ標的化又は「非標的化」４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子と組換え４−１ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用のアビディティーを図５Ａに示すように決定した。データは、４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の全ての変異体（例えば、図５のＦＡＰ（２８Ｈ１）単鎖４−１ＢＢＬ三量体（化合物Ｓ１）及び図６の「非標的化」ＤＰ４７単鎖４−１ＢＢＬ三量体（対照Ａ）の曲線を参照）は、ヒト及びカニクイザル４−１ＢＢに対して同程度のアビディティで結合するが、マウス相同体に対しては無視し得ることを実証した。
【０４７１】
組換えビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を、標準カップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳＡチップ上で直接カップリングさせた。固定化レベルは約３０共鳴単位（ＲＵ）であった。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１）又はＤＰ４７含有対照を、０．９〜５００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分の流速で、１８０秒にわたってフローセルを通過させた。解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準の空のフローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。
【０４７２】
親和性測定（図７）のために、抗ヒトＦｃ特異的抗体の約７２００共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で行った。５０ｎＭでのＦＡＰ標的化又は非標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子をフローセル２で６０秒間３０μｌ／分の流速で捕捉した。ｈｕ４−１ＢＢ  ａｖｉ  Ｈｉｓの希釈シリーズ（１．９５〜１０００ｎＭ）を両方のフローセルに３０μｌ／分で１２０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を１８０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り替えることによってトリガーした。６０秒間の３ＭのＭｇＣｌ２の二重注入を用いて、各サイクル後にチップ表面を再生した。バルク屈折率の差は、基準フローセル１で得られた応答を差し引くことによって補正した。標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子とｈｕ４−１ＢＢ  ａｖｉ  Ｈｉｓとの間の相互作用のために、親和定数は、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１ラングミュア結合に適合させることによって速度定数から誘導された。解離定数は表２６に見出すことができる。
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【０４７３】
実施例６
標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製及び精製
ヒトＯＸ４０リガンドの外部ドメインの一部（アミノ酸５１−１８３）をコードするＤＮＡ配列を、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２３５１０（配列番号３８）に従って合成した。２つのＡｓｎ−結合グリコシル化部位（Ｎ９０及びＮ１１４）を変異誘発によってアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した。
【０４７４】
（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離されたＯＸ４０リガンドの３つの外部ドメインを含むポリペプチドを図１Ｂ：ヒトＯＸ４０リガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒトＯＸ４０リガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ヒトＯＸ４０リガンドに記載のようにクローニングした。
【０４７５】
単鎖三量体Ｏｘ４０リガンドをコードするポリペプチドを、配列番号５７のリンカー（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【０４７６】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な結合剤をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖（Carter, 2001）又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。
【０４７７】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０４７８】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む単鎖リガンド−Ｆｃノブ鎖の、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的とされた抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖との組み合わせは、単鎖三量体ＯＸ４０リガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４Ａ）。
【０４７９】
表２７は、ＦＡＰ標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。単鎖三量体Ｏｘ４０リガンドをコードするポリペプチドを、配列番号５７のリンカー（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
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【０４８０】
標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子をコードする配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０４８１】
標的化単鎖三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ鎖」：「ベクターホール鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。
【０４８２】
５００ｍＬ振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄをサプリメントとともに加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
【０４８３】
標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。結合したタンパク質を、１００％の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ２．５）までの２０カラム容量に対する直線的なｐＨ勾配を用いて溶出した。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄した。
【０４８４】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ／２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４８５】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の純度及び分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）．により染色して分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で、２５℃において平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０４８６】
標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物ＳＣ−１０）を収率９．１ｍｇ／ｍｌ及び最終単量体含量８７％（ＳＥＣ）で得た。
【０４８７】
実施例７
「非標的化」単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製及び精製
「非標的化」構築物は、１：１：１の比率（「ベクターノブ鎖」：「ベクターホール鎖」：「ベクター軽鎖」）で同時トランスフェクトされた上記のＯｘ４０リガンド−Ｆｃノブ鎖、ＤＰ４７生殖系列コントロール−Ｆｃホール鎖及びＤＰ４７軽鎖によって構成された（図４Ｂ）。
【０４８８】
標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の産生及び精製は、上記のように行われた。ＦＡＰ結合剤の重鎖及び軽鎖の可変領域のＤＮＡ配列を、生殖系列コントロール（ＤＰ４７）のもと置換し、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとともにフレーム内にサブクローニングした。
【０４８９】
表２８は、ＤＰ４７含有４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
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【０４９０】
ＤＰ４７含有単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（対照３）を収率７ｍｇ／ｍｌ及び最終単量体含量１００％（ＳＥＣ）で得た。
【０４９１】
実施例８
ＯＸ４０の調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザルＯＸ４０の外部ドメインをコードするＤＮＡ配列（表１１）を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原外部ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。定方向のビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、ＯＸ４０外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図４Ｃ）表２９は、様々なＯＸ４０外部ドメインのアミノ酸配列を示す。表３０は、図４Ｃに示される単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
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【０４９２】
ＯＸ４０−Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０４９３】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０４９４】
５００ｍｌの振盪フラスコ中でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４°Ｃに保った。
【０４９５】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。結合したタンパク質を、１００％の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０含有緩衝液（ｐＨ２．５）までの１２カラム容量に対する直線的なｐＨ勾配を用いて溶出した。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄した。
【０４９６】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４９７】
ヒト受容体に対する親和性決定のために、ヒトＯＸ４０の外部ドメインも、ａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号８４）及びヘキサヒスチジンタグとともにフレーム内にサブクローニングした。配列を３１に示す。
【０４９８】
タンパク質の産生を、Ｆｃ融合タンパク質について上記のように行った。分泌されたタンパク質は、キレートクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。最初のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４の溶液で平衡化したＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で行った。溶出は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）を含有する５％〜４５％の溶出緩衝液からの１２カラム容量に対する勾配を適用することによって行った。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムの溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
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【０４９９】
実施例９
表面プラズモン共鳴によるＦＡＰ標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生化学的特徴づけ
ＦＡＰ標的化単鎖ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の組換えＯＸ４０への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０５００】
ＦＡＰ標的化又は非標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子と組換えＯＸ４０（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用のアビディティーを図８Ａに示すように決定した。データは、ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の両方の変異体（ＦＡＰ単鎖ＯＸ４０三量体（図８の化合物Ｓ１０）、及び図９のＤＰ４７含有単鎖ＯＸ４０三量体（対照３）は、ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対して同程度のアビディティで結合するが、マウス相同体に対しては無視し得ることを実証した。
【０５０１】
組換えビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を、標準カップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳＡチップ上で直接カップリングさせた。固定化レベルは約６００共鳴単位（ＲＵ）であった。ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子又はＤＰ４７含有対照を、０．２〜５００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分の流速で、１２０秒にわたってフローセルを通過させた。解離を２２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準の空のフローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。
【０５０２】
親和性測定（図１０）のために、抗ヒトＦｃ特異的抗体の約７２００共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で行った。２００ｎＭでのＦＡＰ標的化又は非標的化単鎖三量体Ｏｘ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子をフローセル２で６０秒間３０μｌ／分の流速で捕捉した。ｈｕＯＸ４０  ａｖｉ  Ｈｉｓの希釈シリーズ（３１〜２０００ｎＭ）を両方のフローセルに３０μｌ／分で１２０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を１８０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り替えることによってトリガーした。６０秒間の３ＭのＭｇＣｌ２の二重注入を用いて、各サイクル後にチップ表面を再生した。バルク屈折率の差は、基準フローセル１で得られた応答を差し引くことによって補正した。標的化単鎖三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子とｈｕＯｘ４０  ａｖｉ  Ｈｉｓとの間の相互作用のために、親和定数は、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１ラングミュア結合に適合させることによって速度定数から誘導された。解離定数は表３２に見出すことができる。
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【０５０３】
実施例１０
標的化４−１ＢＢリガンド又はＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴づけ
１０．１．ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド又はＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のナイーブ対活性化ヒトＰＭＢＣ上への結合
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重ねた。チューブを４５０×ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ−Ｐｙｒｕｖａｔ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０５０４】
ＰＢＭＣは単離直後に使用されたか（ナイーブで休止しているＰＢＭＣ）、又は以下のようにそれらを刺激してＴ細胞の細胞表面上における４−１ＢＢ及びＯＸ４０の発現を誘導した（活性化ＰＢＭＣ）：ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌを補充したＴ細胞培地で４日間培養した。再活性化のために、細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）で被覆した６ウェル組織培養プレート上で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを補充したＴ細胞培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で更に１日間活性化した。
【０５０５】
４−１ＢＢ結合の検出のために、９６ウェルプレート（グライナー・バイオ・ワン、セルスター、カタログ番号６５０１８５）の丸底懸濁細胞の各ウェルに、０．１×１０６個のナイーブＰＢＭＣ又は活性化ＰＢＭＣを加えた。ＯＸ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。ナイーブで活性化されたヒトＰＢＭＣの識別を可能にするために、ナイーブな細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を用いた結合アッセイの前に標識した。
【０５０６】
ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素標識のために、細胞を回収し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を最終濃度２．５ｍＭ及びＤＰＢＳ中の最終細胞密度０．５×１０７細胞／ｍＬでナイーブなヒトＰＢＭＣに添加した。次いで、細胞を暗所で室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、２ｍＬのＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（グライナー・バイオ・ワン、セルスター、カタログ番号６５０１８５）。
【０５０７】
プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を、４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）２００μＬで１回洗浄した。細胞を、４℃で１２０分間、滴定ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７非標的化単鎖４−１ＢＢ又はＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を含有する４℃の冷ＦＡＣＳの５０μＬ／ウェル中でインキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。
【０５０８】
４−１ＢＢ結合の検出のために、細胞を、０．１２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、２０μＬ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローンＳＫ７、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号３３２７７１）、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１４）、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ５６−ＡＦ４８８（クローンＨＣＤ５６、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３１８３１０）、２．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９８又は１０９−１１６−１７０）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。
【０５０９】
ＯＸ４０結合の検出のために、細胞を、０．２５５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、０．２５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＢＶ７１１（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、０．２５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５（クローンＨＩ３０、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０２８）、及び３０μｇ／ｍＬフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。
【０５１０】
次いでプレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に細胞を最終的に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０５１１】
場合によっては、細胞を固定して翌日取得した。この方法のために、細胞を更に染色し、ＵＶ励起用の１：１０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ−２３１０５）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳを用いて一次抗体と暗所で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体カクテルとのインキュベーション後、プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定し、４℃で一晩インキュベートした。フローサイトメトリー分析のために、細胞を８０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０５１２】
図１１Ａ〜１１Ｄ及び図１２Ａ〜１２Ｄに示されるように、ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のいずれも、休止中のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての構築物は活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に強く結合した。単鎖４−１ＢＢＬ三量体含有分子は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較してＣＤ４＋に対する結合が約１０倍低いことを示した。対照的に、単鎖Ｏｘ４０Ｌ三量体含有分子は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較してＣＤ４＋に結合すると特異的蛍光の約４倍高い強度を示した。これらの差異は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋ヒトＴ細胞上の４−１ＢＢ発現の１０−２０倍高いレベルと非常に良く一致するが、後者はＣＤ８＋サブセットと比較して約４倍高いレベルのＯＸ４０を発現する。図１１Ｅ〜１１Ｈに示すように、一価及び二価のＦＡＰ（２８Ｈ１又は４Ｂ９）標的化又はＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化又はＤＰ４７非標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子は休止中のヒトＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞には結合しなかったが活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞には強く結合し、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞には比較的低い程度で結合した。図１１Ｊ〜１１Ｍに見られるように、結合は標的化又は二価性とは無関係であって、例えば単鎖三量体４−１ＢＢリガンドの融合位置とは無関係である。
【０５１３】
１０．２．ＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
ＦＡＰ発現細胞に対する結合アッセイのために、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１６７６）を使用した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９は、マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１６５８）を発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクションし、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下でｈｕＦＡＰを発現させることによって生成された。
【０５１４】
ＤＰＢＳ中に０．１×１０６個のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９（４−１ＢＢＬ）又は５×１０４個のＷＭ２６６−４細胞（ＯＸ４０Ｌ）を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の結合分析のために、１：５０００希釈Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５０８６３１８）を含む４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液１００μＬ／ウェルを添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。示された範囲のコセンテートで、全ての試料を、ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖４−１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌ三量体含有分子を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに、示された範囲の濃度で再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で５回洗浄し、短時間のボルテックスで再懸濁した。細胞を、３０μｇ／ｍＬのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間更に染色した。細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＯＸ４０Ｌ三量体含有分子で染色した細胞を、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に最終的に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０５１５】
細胞を４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子で染色し、細胞を１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中での再懸濁により固定した。翌日、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０５１６】
図１３に示すように、単鎖三量体４−１ＢＢＬ（化合物Ｓ１、図１３Ａ）又はＯＸ４０Ｌ（化合物Ｓ１０、図１３Ｂ）の何れかを含むＦＡＰ標的化分子は、ヒトＦＡＰ−発現細胞に効率的に結合した。対照的に、ＤＰ４７抗体を含有するそれらの対応物（対照１及び３）は、そのような結合を示さなかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。従って、ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌ含有分子のみが腫瘍標的化特性を示した。図１３Ｃ及び１３Ｄに示されるように、ＤＰ４７非標的化でなく一価及び二価ＦＡＰ（２８Ｈ１又は４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３及びＷＭ−２６６−４に結合することができる。ＦＡＰ結合クローン４Ｂ９は最も強い結合を示すが、一方クローン２８Ｈ１はＦＡＰ発現腫瘍細胞に対してより低い親和性を示す。より低い親和性のために、一価ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ（ｋｉｈ）融合分子と二価結合ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ対照分子との間の差異がより明らかになる。二価結合ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ対照分子は、より低いＭＦＩ（ＦＡＰ分子の二価占有）及びより低いＥＣ５０値を示す。
【０５１７】
１０．３．ＣＥＡ発現腫瘍細胞への結合
ＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する結合アッセイのために、肝転移ＭＫＮ４５（ＤＭＳＺ、Ｎｏ．ＡＣＣ４０９）から得たヒト胃（gastric）がん（胃(stomach)）細胞株である以下のヒトＣＥＡ発現腫瘍細胞株を使用した。このアッセイは、実施例１０．２のＦＡＰ発現ＭＶ−３及びＷＭ−２６６−４腫瘍細胞株について記載したように実施した。
【０５１８】
図１３Ｅに示されるように、ＤＰ４７非標的化でなく一価及び二価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５に結合することができる。一価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ５）と二価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ４）との間の差異は、より低いＭＦＩ（ＣＥＡ分子の二価占有）に示されている。
【０５１９】
１０．４．マウス４−１ＢＢを発現する活性化マウス脾細胞への結合
マウス脾臓を３ｍＬのＰＢＳに集め、ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０９６−３３４）及びｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単一細胞懸濁液を生成した。その後、脾細胞を７０μｍの前分離（ｐｒｅ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）フィルター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  カタログ番号１３０−０４１−４０７）に通して濾過し、４℃、３５０ｘｇで７分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｐ４３３３）を供給したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。１０６細胞／ｍＬを、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３εアルメニアハムスターＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３３１）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８シリアンハムスターＩｇＧ（クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０２１０２）をコーティングした６ウェル組織培養プレート中で２日間培養した。活性化されたマウス脾細胞を回収し、ＤＰＢＳで洗浄し、計数し、０．１×１０６個の細胞を９６個のＵ底非組織培養処理ウェルプレートの各ウェルに移した。上清を除去し、細胞を４℃で３０分間、１：５０００希釈Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦ６６０（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で染色した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、異なる濃度のＦＡＰ標的化若しくはＤＰ４７標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ抗原結合分子又は抗マウスＣＤ１３７ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ｍＡｂ（クローンＬｏｂ．１２．３）を含む５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。細胞を４℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、１０μｇ／ｍＬ精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ラットＩｇＧ−Ｆｃ−Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３１４２クローン２．４Ｇ２）、５μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ８ｂラットＩｇＧ２ｂκ−ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１２６６０６、クローンＹＴＳ１５６．７．７）、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ３ラットＩｇＧ２ｂκ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００２２２、クローン１７Ａ２）、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ｂκ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２、クローンＧＫ１．５）、２μｇ／ｍＬ抗マウスＮＫ１．１マウス（Ｃ３ＨｘＢＡＬＢ／ｃ）ＩｇＧ２ａκ−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７２８、クローンＰＫ１３６）及び１０μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅポリクローナルＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的、ウシ、マウス及びウサギ血清タンパク質に対して最小交差反応性（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−���７０）を含有する５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定し、４℃で一晩保存した。翌日、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３レーザーＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０５２０】
図１４に示すように、ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ分子（化合物Ｓ１及び対照１）はマウス４−１ＢＢに結合しない。従って、それらの活性は、免疫コンピテントマウスにおいて試験することはできない。インビボ作用機序の研究のために、ヒト化マウスモデル又は単鎖三量体マウス４−１ＢＢＬを含む代理動物の何れかを使用しなければならない。
【０５２１】
実施例１１
標的化４−１ＢＢリガンド又はＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生物学的活性
１１．１．ヒト４−１ＢＢ又はＯＸ４０を発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
１１．１１ＮＦκＢエンハンサー領域の制御下でのヒト４−１ＢＢ及びルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
ヒトパピローマウイルス１８誘導子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−２）は、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下で、４−１ＢＢのヒト配列（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１、配列番号９９）を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９により形質導入された。細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ−Ｎｏ．ａｎｔ−ｐｒ）を供給したＤＭＥＭ培地で培養した。４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーによる４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプ対照（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲートマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号４００１５０）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩを含有する３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して取得した。単一のクローンが限界希釈によって生成された。この目的のために、生きたヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、これらの細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一のクローンを回収し、増やし、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。Ｒｏｃｈｅで作成されたＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢによる更なるトランスフェクションのために、４−１ＢＢ（クローン５）の最高発現を有するクローンを選択した。発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢは、ハイグロマイシンＢ耐性をＮＦ−κＢ（１）ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）に組み合わせる。ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％のコンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化した（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターＤＮＡを滅菌０．４ｃｍ Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。４００μｌの無添加ＤＭＥＭ中の２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を添加し、プラスミド溶液と注意深く混合した。キュベットをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５２６６０）に実装し、以下の設定でエレクトロポレーショントランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む組織培養フラ���コ７５ｃｍ２（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。播種の２４時間後、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む選択培地を添加した。その後、生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一のクローンを生成した。
【０５２２】
クローンを上記のように４−１ＢＢ発現及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地で回収し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を用いて計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、この細胞懸濁液１５０μＬを蓋付きの無菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（グライナー・バイオ・ワン、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、対照として、翌日の生存及び細胞密度を試験するために、従来の９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰカタログ番号９２０９６）に移した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含有する培地５０μＬを白色９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その後２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。３０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて以下の設定を用いてプレートを直ちに測定した：ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）については、５００ｍｓの積分時間、フィルターなし、全ての波長及びトップの読み取り値を集める。対照（ｒｈＴＮＦαを添加していない）より上の測定されたＵＲＬをルシフェラーゼ活性とした。最も高いルシフェラーゼ活性及び妥当な４−１ＢＢ発現を示す更なる使用のために、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ−４−１ＢＢ−ＨｅＬａクローン２６を選択した。
【０５２３】
１１．１２架橋抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片と共培養したヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａ細胞を回収し、１０％ウシ胎仔血清及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給されたＤＭＥＭ培地に０．８×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（８×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（グライナー・バイオ・ワン、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定ＦＡＰ又はＤＰ４７標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェルの培地を添加した。架橋のために、二次抗体抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−０９８）を含有する５０μｌ／ウェルの培地を１：４比（一次単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ抗原結合分子よりも４倍多くの二次抗体）で添加した。
【０５２４】
プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を実施例１１．１．１に記載されるように測定した。このアッセイの原理を図１５に図解する。
【０５２５】
図１６に示されるように、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ（黒丸）の二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片又はＤＰ４７含有単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ（白丸、点線）を介する架橋は、レポーター細胞株におけるルシフェラーゼ発現のレベルによって評価されるように、ＮＦκＢプロモーターの同様の活性化を導く。従って、人為的に誘発された非特異的オリゴマー化後、ＤＰ４７−コーティング及びＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ分子は、細胞表面で４−１ＢＢと作動的に関与する同等の能力を示す。
【０５２６】
１１．１３ＦＡＰ発現腫瘍細胞によるヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａ細胞を回収し、１０％ＦＢＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給されたＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（グライナー・バイオ・ワン、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定ＦＡＰ又はＤＰ４７標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ抗原結合分子を含有する５０μＬの培地を添加した。
【０５２７】
以下のヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給されたＤＭＥＭに２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した：
−  ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ３（最初にvan Muijen GN et al. 1991に公開）、
−  ヒトメスのメラノーマＷＭ−２６６−４細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６７６）、及び
−  ヒトＦＡＰ及びピューロマイシン耐性を発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクトしたマウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）：実施例１０．２に記載されるＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９。
【０５２８】
５０μＬのＦＡＰ発現腫瘍細胞懸濁液を各ウェルに添加した。架橋ＦＡＰ発現腫瘍細胞又は培地（架橋なし）を添加した後、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を実施例１１．１．１に記載されるように測定した。ＮＦκＢ−ルシフェラーゼヒトＣＤ１３７  ＨｅＬａ細胞と３Ｔ３−ヒトＦＡＰクローン３９細胞とのインキュベーション時間及び比を滴定し、時間及び比をルシフェラーゼ活性化プラトーに到達する値に設定した。このアッセイの原理を図１７に示す。
【０５２９】
図１８Ａ〜１８Ｄに示すように、ＦＡＰ標的化単鎖４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（化合物Ｓ１）（黒丸）は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞を介して架橋することができ、これはレポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を濃度依存的に引き起こす。対照的に、ＤＰ４７含有単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ（対照１）は、同じ実験条件下でレポーター細胞株を活性化することができない。架橋がない場合（ＦＡＰ発現腫瘍細胞を添加していない場合）、両分子はレポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導することができない。
【０５３０】
図１９Ａ〜１９Ｃに示されるように、一価又は二価のＦＡＰ（４Ｂ９又は２８Ｈ１）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ＦＡＰ発現腫瘍細胞を介して架橋することができ、従って、レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃにおいてＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を濃度依存的に誘導することができる。対照的に、一価又は二価ＤＰ４７−非標的単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（対照１及び２）は、架橋なしにレポーター細胞株を活性化することができない。架橋がない場合（ＦＡＰ発現腫瘍細胞を添加していない場合）、全ての分子はレポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導することができない。一価ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、二価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子よりも強力な活性化を誘導し、これはＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合も反映する。しかしながら、４Ｂ９と２８Ｈ１のＦＡＰ結合クローン間の違いは、ＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合アッセイにおけるほど強くはない。依然として、一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子は、わずかに低いＥＣ５０値を示し、これはＦＡＰに対するより高い親和性によって説明することができる。
【０５３１】
１１．１４ＣＥＡ発現腫瘍細胞によるヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ヒト４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポーター細胞とＣＥＡ発現腫瘍細胞株とを用いたＮＦ−κＢ活性化アッセイは、１１．１．３．に記載されているのと同じ方法で実施されたが、ＦＡＰ発現腫瘍細胞を、本出願の実施例１０．３に既に記載したＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞株と交換した。
【０５３２】
図２０Ａと２０Ｂに示されるように、一価又は二価のＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、ＣＥＡ発現腫瘍細胞を介して架橋することができ、従って、レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃにおいてＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を濃度依存的に誘導することができる。対照的に、一価又は二価ＤＰ４７−非標的単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（対照１及び２）は、架橋なしにレポーター細胞株を活性化することができない。架橋がない場合（ＣＥＡ発現腫瘍細胞株ＭＫＮ４５を添加していない場合）、全ての分子はレポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導することができない。一価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ５）は、二価ＣＥＡ（ｓｍ９ｂ）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子（化合物Ｓ４）よりも強い活性化を誘導し、これは図１３Ｅに示されるＣＥＡ発現ヒトＭＫＮ４５腫瘍細胞株への結合のＭＦＩも反映する。
【０５３３】
１１．１５ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
ＯＸ４０のそのリガンドへのアゴニスト結合は、ＮＦκＢの活性化を介した下流シグナル伝達を誘導する（Weinberg et al., 2004）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦＢ＿Ｌｕｃ１を作成し、その表面にヒトＯＸ４０を発現させた。更に、それはＮＦκＢ感受性エンハンサー領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを保持している。Ｏｘ４０の誘発は、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、ＮＦκＢは核に転座し、レポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼはルシフェリン酸化を触媒し、光を放出するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターで定量することができる。１つの実験の範囲は、単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ抗原結合分子が、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導する能力を試験することであった。
【０５３４】
Ｍｏｒｒｉｓらは、従来の抗Ｏｘ４０抗体によるアゴニスト共刺激が表面固定化に依存することを示した（Morris et al., 2007）。従って、ＯＸ４０のより高度な過架橋を達成するために、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ抗原結合分子を、ＦＡＰを天然に発現するＷＭ−２６６−４腫瘍細胞で過架橋させた。
【０５３５】
１１．１６ＦＡＰ発現腫瘍細胞によるヒトＯＸ４０を発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
全ての遠心分離は、４℃、３５０×ｇで５分間行った。細胞を洗浄するために、チューブ又はウェルを指示された緩衝液で満たした。遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを指示された緩衝液に再懸濁した。
【０５３６】
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞及びＷＭ−２６６−４細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間回収した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中で２×１０５細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（グライナー・バイオ・ワン、カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．３×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１を、滴定したＦＡＰ標的化又はＤＰ４７含有単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ抗原結合分子を含有するアッセイ培地を添加して６時間刺激した。超架橋のために、ヒトＦＡＰ発現ＷＭ２６６−４腫瘍細胞を、アッセイ培地中で３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に調整し、細胞を０．７５×１０５細胞／ウェルの最終密度まで添加した。
【０５３７】
インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａであり、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を製造業者の指示に従って使用して、発光の定量化を行った。
【０５３８】
放出された相対光単位（ＵＲＬ）を、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて対数一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、作り付けのシグモイド用量応答を使用してフィットさせた。
【０５３９】
図２１に示すように、ＦＡＰ標的化及びＤＰ４７含有単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（黒丸及び白丸）の両方が検出可能なＮＦκＢ活性化を誘導した。これは、二次抗体を介して過架橋することなくＮＦκＢ誘導活性を示さなかった単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ分子で観察されたものとは対照的である。ＦＡＰ発現腫瘍細胞ＷＭ−２６６−４による過架橋は、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子によって濃度依存的にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ発現の誘導を強く増加させた（化合物Ｓ１０、黒丸）。ＤＰ４７含有単鎖三量体ヒトＯＸ４０Ｌ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を使用した場合、そのような効果は見られなかった。
【０５４０】
１１．２  抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞に基づくアッセイ
１１．２．１．抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の単離及び培養
新鮮な血液をＨＬＡ−Ａ２＋  ＣＭＶ感染ボランティアから得た。ＰＢＭＣを、フィコール密度遠心分離によって実施例１０．１に記載のように単離した。ＣＤ８  Ｔ細胞は、製造業者の推奨に従ってネガティブ選択ヒトＣＤ８  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９４−１５６）を用いてＰＢＭＣから精製した。１０００万の単離されたＣＤ８  Ｔ細胞を、ＣＭＶ由来のＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドを含有する５０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ２−ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、カタログ番号Ｆ００８−２Ｂ、配列番号１８３）と共に、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充した１ｍＬの滅菌ＤＰＢＳ中に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした．細胞を、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを供給された３ｍＬの滅菌ＤＰＢＳで２回洗浄した。１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ（クローンＬＴ８、Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ２８０１０）を含む１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを供給された１ｍＬのＤＰＢＳに細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを供給されたＤＰＢＳ中に５×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、３０μｍの前分離ナイロン−ネットセルストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０４１−４０７）を通して濾過した。ＮＬＶペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、以下の設定でＡＲＩＡ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いたＦＡＣＳ選別によって単離した：１００μｍのノズルと純度ソートマスク。選別した細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び４００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給されたＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌを含む１５ｍｌのポリプロピレン製遠心チューブ（ＴＰＰ、カタログ番号９１０１５）に集めた。選別した細胞を室温で３５０×ｇで７分間遠心分離し、０．５３×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように同培地に再懸濁した。１００μＬ／ウェルのこの細胞懸濁液を、ＰＨＡ−Ｌ活性化照射同種異系支持細胞を用いて予め調製したプレートの各ウェルに添加した。支持細胞は、以前に記載されているように（Ｌｅｖｉｔｓｋｙら、１９９８）、ＰＢＭＣから調製し、１ウェル当たり２×１０５個の支持細胞を用いて９６ウェル培養プレートに分配した。
【０５４１】
培養の１日後、１００μＬの培地を各ウェルから取り出し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び４００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを補充した新しいＲＰＭＩ  １６４０培地で置き換えた。これは培養中に定期的に（２〜４日ごとに）繰り返した。ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞が増殖し始めるとすぐに、それらを２４ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ、９２０２４）に移した。細胞を増殖／分裂させ、定期的に新しい支持細胞調製物で再活性化した。
【０５４２】
１１．２．２．抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の単離及び培養
ヒトＦＡＰ発現メラノーマ細胞株ＭＶ３細胞株（実施例１１．１．３に記載）の細胞を回収し、ＤＰＢＳで洗浄し、２×１０７個の細胞を、ＰＫＨ−２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）の２５０μＬのＣ希釈液に再懸濁した。１μＬのＰＫＨ２６−赤色染色溶液を２５０μＬのＣ希釈液で希釈し、ＭＶ３細胞の懸濁液に添加し、次いでこれを暗所で室温で５分間インキュベートした。０．５ｍＬのＦＢＳを加え、細胞を１分間インキュベートし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地からなるＴ細胞培地で１回洗浄した。１×１０６個のＭＶ３細胞／ｍＬをＴ細胞培地に再懸濁し、３本のチューブに分けた。合成ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅ、配列番号１８１から得た）を１×１０−９Ｍ又は１×１０−８Ｍの最終濃度に加え、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２での回転下で９０分間インキュベートした。ＭＶ３細胞をＴ細胞培地で１回洗浄し、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェル丸底細胞懸濁プレート（グライナー・バイオ・ワン、セルスター、カタログ番号６５０１８５）に分配し（１００μＬ／ウェル）、３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。
【０５４３】
翌日、指示された最終濃度を達成するために、ＦＡＰ標的化及びＤＰ４７含有単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ分子を５０μＬのＴ細胞培地で添加した。ＮＬＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を回収し、洗浄し、５０μＬの培地で各ウェルに加えた（最終の腫瘍：ＣＤ８  Ｔ細胞比は０．１２５）。細胞を２４時間インキュベートし、２．６４μＬ／ｍＬのＧｏｌｇｉ  ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｓｉｎを含むタンパク質輸送阻害剤、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４７２４）を含有する５０μＬ／ウェルのＴ細胞培地を各ウェルに添加した。細胞を更に４時間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、４℃で３０分間、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ−ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４）を含有する１００μｌのＤＰＢＳで染色した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、以下の蛍光色素コンジュゲート抗体を含む４０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で染色した：抗ヒトＣＤ１３７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローン４Ｂ４−１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、抗ヒトＣＤ８−ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ  Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１２）及び抗ヒトＣＤ２５  ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＢＣ９６、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１２）。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号００−５１２３及び００−５２２３）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓ７９００）及び１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２００２）を供給されたＤＰＢＳ）で２回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬ抗ヒトＩＦＮγ−ＡＰＣ（クローンＢ２７、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５０６５１０）を含有する５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３−５６）で染色した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳを添加し、細胞を４℃で一晩保存した。翌日、細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。このアッセイの原理を図２２に示す。
【０５４４】
図２３Ａ〜２３Ｆに示されるように、抗原特異的刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞（刺激されていない対照ではない）は、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原の存在下で表面４−１ＢＢ発現レベルの増加を示した（化合物Ｓ１、黒丸）。この三量体ヒト４−１ＢＢＬのこの効果は用量依存性であり、非標的対照分子（対照１）の添加は４−１ＢＢ発現のレベルに影響しなかったので、ＦＡＰ標的化を必要とした。更に、より高いペプチド濃度（１×１０−８Ｍ）で活性化されたＴ細胞は、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬの存在下でＩＮＦγの持続的分泌を示した（図２４Ａ〜２４Ｆ）。特に、この効果は、４−１ＢＢの上方制御に対するＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬの効果と比較して、より強い一次ＴＣＲ誘発を必要とした。なぜなら、後者はペプチドの低濃度においても明確に観察されたからである。まとめると、これらのデータは、ＦＡＰ標的化単鎖三量体ヒト４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、標的特異的に抗原特異的Ｔ細胞の表面表現型及び応答性を調節することを実証する。
【０５４５】
図２５及び図２６に示すように、ＮＬＶペプチド（活性化シグナル１）及び架橋された一価又は二価のＦＡＰ（２８Ｈ１又は４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（活性化シグナル２）により共刺激された抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（刺激されていない対照ではない）は、増加したレベルの表面４−１ＢＢ発現及びＩＦＮγ分泌を示した。この効果は、ＮＬＶペプチド濃度並びにＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の濃度について用量依存的であった。まとめると、これらのデータは、ＦＡＰ標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、標的特異的に抗原特異的Ｔ細胞の表面表現型及び応答性を調節することを実証する。一価ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化とＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子との間の同じ差異は、ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＫ−κＢ−ｌｕｃレポーター細胞株を用いた活性化アッセイにおいて見られ、例えば一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子はより低いＥＣ５０値を示す。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＫ−κＢ−ｌｕｃレポーター細胞株活性化アッセイとは異なり、一価と二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢリガンド（ｋｉｈ）融合分子の間に大きな違いは見られない。高いＮＬＶペプチド濃度（１０−８Ｍ）では、二価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子は、一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化単鎖三量体４−１ＢＢＬ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子よりも優れた活性化を生じるようにさえ見える。
【０５４６】
１１．３．最適以下でのＴＣＲ誘発性休止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介共刺激
ヒトＰＢＭＣ調製物は、（１）休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びに（２）それらの細胞表面上に種々のＦｃγ受容体分子を有する抗原提示細胞、例えばＢ細胞及び単球を含む。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分とＦｃγ受容体分子に結合し、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上においてＴＣＲ誘発を媒介することができる。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナル伝達することができ、ＴＣＲ媒介刺激を支持し、より顕著な表現型変化（例えば、より高いＣＤ２５発現レベル）、生存ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の増強された増殖と数の増加とをもたらす。
【０５４７】
ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞株を用いた実験は、ＮＦκＢ発現を誘導するための三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌ分子の特定の固有の能力を示唆した（実施例１１．１．５を参照のこと）。アゴニスト効果は、ＦＡＰ発現腫瘍細胞を介したＦＡＰ標的化化合物の更なる過架橋によって大幅に増加した。従って、休止中のヒトＰＢＭＣの最適以下のＴＣＲ刺激を、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞とＤＰ４７含有（非標的化）及びＦＡＰ標的化三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌ分子との存在下で行い、更なる過架橋が有る場合と無い場合の共刺激活性を試験した。
【０５４８】
マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（実施例９．２参照）を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間回収した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞をＴ細胞培地中で１．６×１０５の細胞密度に調整し、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）中に０．２×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。プレートをインキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩保存した後、翌日、細胞株によるヒトＰＢＭＣのその後の過剰増殖を防ぐために、Ｘ線照射器で４５００ｒａｄの用量を用いて照射した。
【０５４９】
ヒトＰＢＭＣを、９．１に記載されているようにフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）密度遠心分離によって単離し、ＣＦＳＥで標識した。細胞を、最終濃度［５０ｎＭ］のＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８）を用いて１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度で３７℃で１０分間染色した。その後、細胞をＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を含む過剰のＤＰＢＳで２回洗浄した。標識された細胞を、３７℃で３０分間Ｔ細胞培地中で休ませた。その後、ＤＰＢＳを用いた２回の更なる洗浄工程によって、非変換ＣＦＤＡ−ＳＥを除去した。ＣＦＳＥ標識休止ヒトＰＢＭＣをＴ細胞培地中３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に調整し、各ウェルに０．７５×１０５細胞／ウェルの密度で添加した。ＦＡＰ標的化及びＤＰ４７含有単鎖三量体Ｏｘ４０Ｌ抗原結合分子を示された濃度で加え、抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）を最終濃度１０ｎＭで加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４日間保持した。４８時間後、半分の培地交換を行った。
【０５５０】
４日後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで蛍光色素コンジュゲート抗体：０．２５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、０．２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８−ＢＶ７１１（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１、０．２５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５（クローンＭ−Ａ２５１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）を含む２５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で染色した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５１２３及び００−５２２３）に再懸濁し、暗所で室温で４５分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｗａｓｈ−（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３−５６）で３回洗浄し、次いで０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトグランザイムＢ−ＰＥ（クローンＧＢ−１１、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６１１４２）及び０．６０μｇ／ｍＬの抗ヒトＥｏｍｅｓ−ｅＦｌｕｏｒ６７０（クローンＷＤ２９１８、マウスＩｇＧ１κ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０−４８７７−４２）を含有する２５μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３−５６）で染色した。プレートを室温で１時間暗所でインキュベートし、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。細胞を８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０５５１】
図２７に示すように、ＤＰ４７含有三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌ抗原結合分子による共刺激は、ほんのわずかに増殖を促進し、抗ヒトＣＤ３抗体で最適以下に刺激されたヒトＣＤ４＋（左側）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（右側）において活性化細胞表現型（ＣＤ２５発現）を増強した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌの過架橋は、この効果を強く増加させた。これは、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の所見とは対照的であり（図２１）、三量体単鎖Ｏｘ４０Ｌ分子それ自体はすでに強くアゴニスト的であった。これは、レポーター細胞株におけるＯＸ４０の非生理的な高発現に起因するかもしれず、これは低シグル伝達ＯＸ４０Ｒオリゴマーユニットの事前組み立てをもたらす可能性が最も高く、そのためそのＯＸ４０＋  Ｔ細胞と比較して、アゴニストシグナル伝達のための閾値を低下させるのはレポーター細胞株である。更に、ＯＸ４０関与の影響を観察するために、ＴＣＲを介した随伴性シグナル伝達がＴ細胞では必要であるが、レポーター細胞株では必要でないため、細胞の状況がＯＸ４０誘発の結果を決定する可能性が高い。
【０５５２】
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【図１】
2018512137.tif 000080
【図２】
2018512137.tif 000081
【図３Ａ】
2018512137.tif 000082
【図３Ｂ】
2018512137.tif 000083
【図３Ｃ】
2018512137.tif 000084
【図４Ａ】
2018512137.tif 000085
【図４Ｂ】
2018512137.tif 000086
【図４Ｃ】
2018512137.tif 000087
【図５】
2018512137.tif 000088
【図６】
2018512137.tif 000089
【図７Ａ−Ｃ】
2018512137.tif 000090
【図７Ｄ−Ｅ】
2018512137.tif 000091
【図８】
2018512137.tif 000092
【図９】
2018512137.tif 000093
【図１０】
2018512137.tif 000094
【図１１Ａ−Ｄ】
2018512137.tif 000095
【図１１Ｅ−Ｈ】
2018512137.tif 000096
【図１１Ｊ−Ｍ】
2018512137.tif 000097
【図１２】
2018512137.tif 000098
【図１３Ａ−Ｂ】
2018512137.tif 000099
【図１３Ｃ−Ｄ】
2018512137.tif 000100
【図１３Ｅ】
2018512137.tif 000101
【図１４】
2018512137.tif 000102
【図１５】
2018512137.tif 000103
【図１６】
2018512137.tif 000104
【図１７】
2018512137.tif 000105
【図１８】
2018512137.tif 000106
【図１９】
2018512137.tif 000107
【図２０】
2018512137.tif 000108
【図２１】
2018512137.tif 000109
【図２２】
2018512137.tif 000110
【図２３Ａ−Ｄ】
2018512137.tif 000111
【図２３Ｅ−Ｆ】
2018512137.tif 000112
【図２４Ａ−Ｄ】
2018512137.tif 000113
【図２４Ｅ−Ｆ】
2018512137.tif 000114
【図２５Ａ−Ｄ】
2018512137.tif 000115
【図２５Ｅ−Ｆ】
2018512137.tif 000116
【図２６Ａ−Ｄ】
2018512137.tif 000117
【図２６Ｅ−Ｆ】
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【図２７Ａ−Ｄ】
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【図２７Ｅ−Ｆ】
2018512137.tif 000120
【図２８】
2018512137.tif 000121
【配列表】
2018512137000001.app
【国際調査報告】
2018512137.tif 000122
2018512137.tif 000123
2018512137.tif 000124
2018512137.tif 000125
2018512137.tif 000126