(57)【要約】  本発明は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のタンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法であって、発酵によって生成される微細藻類のバイオマスを提供する工程と；任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するためにバイオマスを洗浄する工程と；１０秒間〜５分間、好ましくは５秒間〜１分間にわたって、０℃〜１５０℃、好ましくは１００℃〜１５０℃の温度で、バイオマスを熱的に透過化する工程と；遠心分離技術、特に多段階遠心分離を用いて、可溶性画分からこのように透過化されたバイオマスを分離する工程と；任意選択的に、それから残留不溶物を除去するような精密ろ過によって、このように得られた可溶性画分を回収し、浄化する工程と；ペプチド単離物およびペプチド濃縮物を得るために、沈殿によって上記の可溶性画分を分離する工程とを含むことを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のタンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法であって、以下の工程：
−  発酵によって生成される微細藻類バイオマスを提供する工程と、
−  任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するように、前記バイオマスを洗浄する工程と、
−  約１０秒間〜５分間、好ましくは約５秒間〜約１分間にわたる、５０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１５０℃の温度での前記バイオマスの熱透過化、
−  遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離による、このように透過化された前記バイオマスと可溶性画分との分離、
−  任意選択的に、残留不溶性物質を除去するような精密ろ過による、このように得られた前記可溶性画分の回収および浄化、
−  ペプチド単離物およびペプチド濃縮物を得るような、沈殿による前の可溶性画分の精製
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質に富む微細藻類の前記バイオマスが、
−  窒素不足で、ｐＨ調節がＮＨ３／ＫＯＨ混合物を用いて行われる、第１の発酵工程、次に、
−  ＮＨ３単独で行われるｐＨ調節によるこの窒素不足の除去の第２の工程
を含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
約５秒間〜約５分間、好ましくは約１０秒間〜約１分間にわたって、約８０〜１５０℃の温度の前記熱処理を特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記熱処理が、約１分間にわたって約８５℃の温度で、または約１０秒間にわたって約１４０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記透過化されたバイオマスが、続いて、
−  粉砕、優先的に機械的粉砕、
−  ｐＨ７における安定化、
−  低温殺菌、
−  微粒子化
によって処理されることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性画分の精製が、
−  任意選択的に、２．５〜６．５、好ましくは３〜５の値へのｐＨの調整を伴う、１０℃未満、好ましくは４℃未満の冷却温度での沈殿、
−  前記ペプチド単離物に対応する重質相、および軽質相を得るような、遠心分離またはデカンテーション、
−  このように得られた前記ペプチド単離物の濃縮および乾燥
によって行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記残留ペプチドが、エタノールによる沈殿によって、前記軽質相から抽出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラは、タンパク質および他の必須栄養素が豊富であるため、潜在的な食物源であることが当業者に周知である。
【０００３】
クロレラは、４５％のタンパク質、２０％の脂肪、２０％の炭水化物、５％の繊維ならびに１０％のミネラルおよびビタミンを含有するものと記載されている。
【０００４】
したがって、それらの存在量およびそれらのアミノ酸プロファイルを考慮すると、微細藻類タンパク質は、食品中の大豆タンパクまたはエンドウマメタンパク質に対する代替的な供給源と考えられる。
【０００５】
タンパク質画分はまた、化粧品あるいは医薬品産業における機能性薬剤として利用され得る。
【０００６】
しかしながら、微細藻類タンパク質の食品用途における開発は、前記画分中の望ましくない化合物（クロロフィルなど）の存在が、それらを含有する食品組成物の色、風味および構造の望ましくない変化をもたらすため、わずかであった。
【０００７】
したがって、食品用途におけるそれらの可能性を高め、それらの商業的価値も高めるために、これらのタンパク質は、それらの分子構造に影響を与えずに微細藻類から抽出されなければならない。
【０００８】
したがって、「ソフトの」抽出技術が、高い溶解度ならびに良好な技術的および機能的特性を有するタンパク質を単離するのに必要であったが、特に、緑色微細藻類の微細藻類細胞壁の剛性は、細胞内タンパク質の抽出および完全性を妨げるため、基本的にこれと相反する。
【０００９】
したがって、逆に、従来、「ハードの」物理的または化学的条件が、微細藻類細胞壁を破壊するのに用いられる。
【００１０】
ここで、多くの研究が、アルカリ溶解タイプの技術、有機溶媒タイプまたは高圧均質化タイプによる抽出を提案している。
【００１１】
しかしながら、これらの技術的選択において、タンパク質の変性は、厄介であると考えられ、その理由は、これらの方法のほとんどが、分析のために開発され、またはタンパク質加水分解物を生成する酵素消化のための基質を提供することが意図されたためである。
【００１２】
しかしながら、細胞成分の完全性を保つ有効な分解方法は、収率だけでなく、抽出される生成物の品質も最大化すべきである。
【００１３】
言い換えると、細胞壁の最適化された分解のための方法は、例えば、
−  目標とする生成物の化学的汚染、
−  対象となる細胞内分子の不可逆的変性または分解をおそらく引き起こす；高過ぎる
破壊エネルギーの使用
を回避しなければならない。
【００１４】
さらに、大規模の生成の場合、選択される方法がこの規模に置き換え可能であることが重要である。
【００１５】
最後に、この細胞分解工程の導入は、容易でなければならず、その後の方法／処理工程に悪影響を与えてはならない。
【００１６】
全てのこれらの制限は、分解方法および同様にそのエネルギー消費の効率に影響を与える。
【００１７】
このような理由で、ビーズミル技術が好ましく、これは、ビーズミル技術が、細胞内タンパク質をそれらの天然形態で放出するのに効率的であると考えられるためである。
【００１８】
ビーズミルでは、細胞は、小さい球形粒子を含む懸濁液中で撹拌される。細胞の破壊は、せん断力、ビーズ間の粉砕、およびビーズによる衝突によって引き起こされる。
【００１９】
適切なビーズミルの説明は、例えば、米国特許第５３３０９１３号明細書に示されている。これらのビーズは、細胞含有物を細胞から放出するように細胞を破壊する。次に、元の細胞より小さいサイズの粒子の懸濁液が、「水中油型」エマルジョンの形態で得られる。
【００２０】
このエマルジョンは、一般に、微粒子化され、水が除去されて、しかしながら、細胞残屑、細胞間可溶性化合物、および油から構成される不均一混合物を含有する乾燥粉末が残される。
【００２１】
これらの細胞分解技術の使用において解決されるべき困難は、細胞内含有物（膜残屑、糖、繊維および脂肪を除外して）のみの単離および特に、タンパク質負荷の品質の保持である。
【００２２】
テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ）の微細藻類の場合、Ａｎｊａ  Ｓｃｈｗｅｎｚｆｅｉｅｒら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２，９１２１−９１２７）は、単離され、汚染物質（着色物質など）が除去されたタンパク質の溶解度およびアミノグラム（ａｍｉｎｏｇｒａｍ）の品質を保証する方法であって、以下の工程：
−  ビーズミルによる細胞分解、
−  粉砕された微細藻類懸濁液の遠心分離、
−  上清の透析、
−  イオン交換樹脂上の通過、
−  溶出液の透析、
−  脱色、次に
−  洗浄および再懸濁
を含む方法を提案した。
【００２３】
しかしながら、この（２４ｇのバイオマスを処理するための）実験室方法は、工業規模に拡大することができず、工業規模では、ビーズミル方法がむしろ完全なバイオマスを回収するのに使用される。
【００２４】
パルス電場電気的処理などの、微細藻類の細胞内含有物を放出するための技術を完全に
変更する代替的な解決策が提案されている。
【００２５】
これは、高強度パルス電場への生体細胞の曝露により、細胞膜の構造が変更され得るためである。
【００２６】
外部電場は、膜の変化を引き起こす。十分な膜透過電圧（０．５〜１Ｖ）で、リン脂質の分子配列が変化し、これにより、膜がその障壁の役割を失い、透過性になる。使用される条件に応じて、この膜透過化は、可逆性または不可逆性であり得る。
【００２７】
しかしながら、細胞内化合物の効率的な抽出のために、この技術を使用する当業者は、膜の不可逆的な透過化をもたらし、それによりその崩壊をもたらすことが推奨されている。
【００２８】
次に、膜のこの破壊は、細胞含有物の放出を促進し、補足的な溶媒抽出技術の使用の場合、細胞への溶媒の浸透も促進する。
【００２９】
この技術は、有望であるが、残念ながら、１〜２００ｍ３の反応器中で生成されるバイオマスを処理するための工業規模に当てはめることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
結果として、細胞を分解せず、またはその成分の品質を損なわずに、細胞内含有物を放出することが可能な微細藻類細胞壁を弱化するための技術を提供することに対する満たされていないニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本出願人は、培地の特性を変更することによって、微細藻類細胞の熱透過化のための方法を遠心分離および沈殿の工程と組み合わせることによって、このニーズを満たすことができることを見出した。
【００３２】
したがって、本出願人は、細胞破壊のための熱的方法が、機械的分解によって引き起こされるせん断力と同様に、微細藻類に由来する生成物を分解または変性するのに代わりに使用される技術であるという技術的な先入観に対抗している（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，１９８６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ−Ｍｏｌｉｎａ  Ｇｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０：４９１−５１５）。
【００３３】
さらに、本出願人によって開発された熱処理が細胞壁の分解を引き起こさないことを考慮すると、一旦細胞内区画から放出されると、ペプチド単離物の回収が容易に行われる。
【００３４】
最後に、本発明の方法は、とりわけ、残留バイオマス、さらにはペプチド単離物の副産物を回収し、改良することを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
したがって、本発明は、
−  細胞膜の熱透過化の方法、続いて、
−  このように透過化された残留バイオマスおよびその副産物の回収および改良を行うことによる、タンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法に関す
る。
【００３６】
より正確には、本発明に係る方法は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のタンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法であって、以下の工程：
−  発酵によって生成される微細藻類バイオマスを提供する工程と、
−  任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するように、バイオマスを洗浄する工程と、
−  約１０秒間〜約５分間の時間、好ましくは約５秒間〜約１分間の時間にわたる、５０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１５０℃の温度での、バイオマスの熱透過化、
−  遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離による、このように透過化されたバイオマスと可溶性画分との間の分離、
−  任意選択的に、残留不溶性物質を除去するような精密ろ過による、このように得られた可溶性画分の回収および浄化、
−  ペプチド単離物およびペプチド濃縮物を得るような、沈殿による前の可溶性画分の精製
を含むことを特徴とする方法である。
【００３７】
「約」という用語は、示される値の±１０％、好ましくはその±５％を含む値の範囲を意味することが意図される。例えば、「約１０」は、９〜１１、好ましくは９．５〜１０．５を意味する。
【００３８】
微細藻類の選択
好ましくは、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００３９】
特定の一実施形態において、菌株は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（菌株ＵＴＥＸ  ２５０−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡ）である。別の実施形態において、菌株は、菌株ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）である。
【００４０】
発酵条件の選択
従属栄養条件下で、光の非存在下における培養が、従来、乾燥細胞の４５重量％〜７０重量％のタンパク質含量（窒素含量Ｎ×６．２５を測定することによって評価される）を有するクロレラバイオマスの生成をもたらす。
【００４１】
例えば、Ｎ．６．２５として表される、６０％超のタンパク質含量を有するタンパク質が富化された微細藻類のバイオマスから開始するのが好ましい。この場合、本出願人は、
−  窒素が制限され、ｐＨ調節が、ＮＨ３／ＫＯＨ混合物を用いて行われる、第１の発酵工程、次に
−  ＮＨ３単独で行われるｐＨ調節によるこの窒素の制限の除去の第２の工程
を含む、開発された新規な方法を使用することを推奨している。
【００４２】
したがって、これらの動作条件は、Ｎ．６．２５の６０％超の、Ｎ．６．２５のおよそ６５％のタンパク質含量、および低着色を有するバイオマスを迅速に得ることを可能にする。収率は、４５〜５０重量％の固形分であり、バイオマスの最終濃度は、８０〜１２０
ｇ／ｌである。
【００４３】
バイオマスの処理
次に、バイオマスは、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過または当業者にさらに公知の任意の手段による固液分離によって収集される。
【００４４】
任意選択的に、本出願人は、次に、バイオマスの連続した濃縮（遠心分離による）／希釈によって細胞間可溶性化合物を除去するようにバイオマスを洗浄することを推奨している。
【００４５】
本発明の趣旨では、「細胞間可溶性化合物」という用語は、発酵培地の全ての可溶性有機汚染物質、例えば、塩、残留グルコース、２または３の重合度（またはＤＰ）を有するオリゴ糖、またはペプチドなどの水溶性化合物を意味する。
【００４６】
次に、その細胞間可溶性化合物のこのように精製されるこのバイオマスは、１５〜３０重量％の固形分に、好ましくは２０〜３０％の固形分に優先的に調整される。
【００４７】
バイオマスの熱透過化
熱処理は、約１０秒間〜約５分間の時間、好ましくは約５秒間〜約５分間の時間、好ましくは約１０秒間〜約１分間の時間にわたって、５０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１５０℃の温度で行われる。好ましい実施形態において、熱処理は、約１０秒間にわたって約１４０℃の温度で行われる。別の好ましい実施形態において、熱処理は、約１分間にわたって約８５℃の温度で行われる。
【００４８】
この処理は、細胞内成分が、反応媒体中に拡散するのを可能にする。
【００４９】
最後に、これらの工程の終了時に、バイオマスは、好ましくは４０℃未満の温度に冷却され、またはさらには約４℃で冷蔵される。
【００５０】
特定の理論によって制約されることを望むものではないが、本出願人は、これらの動作条件下で行われる熱処理が、細胞内区画、あるいは細胞外基質の可溶性成分の自然放出を可能にする膜弱化プロセスとしてこのように働き得ると考える。
【００５１】
イオン性物質に加えて、炭水化物（主に、ＤＰ１およびＤＰ２）、ペプチドおよびポリペプチドなどの有機物質が、細胞から排出される。
【００５２】
逆に、脂質および疎水性有機化合物は、細胞内に残り、それによって、細胞が透過化され、溶解または破壊されないことを明らかに示す。
【００５３】
したがって、本発明に係る方法は、エマルジョンの形成をもたらさず、実際に水性懸濁液の形成をもたらす。
【００５４】
透過化された膜を通した全てのこれらの可溶性物質の放出は、透析タイプの自由拡散のプロセスと類似している。
【００５５】
そのため、膜を透過化する熱処理後の十分な拡散を可能にするために、遅延時間が必要であり得る。
【００５６】
文献において、タンパク質を酵母膜から抽出するための酵母膜のパルス電場透過化のための方法は、４時間〜６時間を必要とする（Ｇａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１５，７７−８４）。
【００５７】
本発明によれば、約５秒間〜約５分間のはるかに短い反応時間が使用される。
【００５８】
透過化されたバイオマスおよび可溶性画分の分離
次に、遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離によって、このように透過化されたバイオマスと可溶性画分との間の分離が行われる。
【００５９】
必要であれば、このように得られた可溶性画分は、残留不溶物を取り除くような精密ろ過によって浄化されてもよく、その固形分に応じて、蒸発または当業者にさらに公知の任意の他の手段による濃縮が、後続の精製の前に行われてもよい。
【００６０】
得られた可溶性画分は、最終的に、タンパク質（５０〜８０％ｗ／ｗ）および炭水化物（５〜２５％ｗ／ｗ）から実質的に構成される。
【００６１】
残留バイオマスの改良
可溶物が分離された残留バイオマスは、栄養的側面が再調整された全体成分として改良され得る。
【００６２】
特に、タンパク質含量は、−可溶物中のペプチドの形態で部分的に取り込まれるため−減少され、これは、炭水化物および脂質画分に有利なバランスを再平衡させる。
【００６３】
遠心分離による分離後の残留バイオマスは、優先的には機械的粉砕によって、（所望の適用できる特性に応じて）「さらに粉砕され」てもよい。
【００６４】
従来、バイオマスは、安定化（ｐＨが再調整される（約７）、酸化防止剤などの添加）され、次に、微粒子化による乾燥の前に、熱処理（細菌管理のための低温殺菌）される。蒸発による濃縮の工程が、熱処理（乾燥と組み合わされた最適化）の前にあってもよい。
【００６５】
沈殿によるタンパク質単離物の精製
ここで、本発明の方法は、培地の特性を変更することによって、沈殿によって、対象となるペプチドの単離をもたらす。
【００６６】
ここで、本出願人は、以下のような手順を推奨している：
−  培地の物理化学的特性を変更することによって、ペプチド画分の全てまたは一部の沈殿を促進すること。
【００６７】
前の工程に記載されるように得られた粗可溶物の冷却は、可溶性ペプチドの一部の沈殿の現象を引き起こす。
【００６８】
沈殿が、より高い分子量に対してむしろ選択的であることが観察される。冷却温度は、１０℃未満、好ましくは４℃未満である。
【００６９】
特定の動作条件は、この現象を促進することを可能にする：温度に加えて、ｐＨは、２．５〜６．５でなければならず、好ましくはこのｐＨｉに近く、すなわち３〜５である。
【００７０】
同様に、培地のイオン強度は、沈殿を促進するように適合されてもよい。したがって、イオン強度を大幅に低下させることによって、「塩溶（ｓａｌｔｉｎｇ−ｉｎ）」の現象が軽減され得、ひいては（溶媒和層を減少させることによって）タンパク質の溶解度が減少され得る。
【００７１】
したがって、沈殿の前の脱塩操作が追加され得る。これは、カチオン性およびアニオン性樹脂、透析、ろ過または当業者にさらに公知の任意の手段によって行われる。
【００７２】
逆に、イオン強度を大幅に高めることによって、利用可能な水が、「塩析（ｓａｌｔｉｎｇ−ｏｕｔ）」の現象によって減少し、このように、タンパク質は、沈殿する傾向を有する。次に、このように抽出されたタンパク質単離物において著しい脱塩が必要であり得るため、この方法は好ましくない。
【００７３】
溶媒和層を変更するのと同じ観点で、培地の極性が、エタノールなどの溶媒を加えることによって（培地の脱水により）低下され得、これは、溶解度を大幅に低下させることによってタンパク質画分のより定量的な沈殿を生じることを可能にする。
【００７４】
−  次に、乾燥前に任意選択的に濃縮される沈殿された画分を回収する。
【００７５】
沈殿された画分の分離は、簡単なデカンテーションおよび重質相の回収によって、または任意選択的に、最適な温度条件下での遠心分離によって行われる。
【００７６】
ｐＨは、乾燥前に任意選択的に再調整され得る。
【００７７】
乾燥は、微粒子化、凍結乾燥によって、または当業者にさらに公知の任意の他の手段によって行われる。
【００７８】
乾燥の前に、蒸発による濃縮の工程の組み込みが、エネルギーの点で操作を最適化することを可能にし得る。エタノールなどの溶媒がその再循環を行うのに使用される場合、それは特に正当化され得る。
【００７９】
これらの手法を利用することにより、残留塩および糖からペプチドおよびポリペプチドの高含量を有する画分を精製することが可能になる。
【００８０】
次に、可溶性タンパク質単離物が、９０重量％超で得られる。
【００８１】
残渣の改良
単離物がこのように抽出された場合、可溶性相（分離後の軽質相）は、（その残留タンパク質含量に応じて）タンパク質濃縮物などとして改良されてもよく、または残留ペプチドをそれから抽出するための新たな精製プロセスを経てもよい。
【００８２】
これは、沈殿が部分的である場合（例えば水相中の部分的沈殿）、実験条件に応じて特に正当化され得る。この場合、一般により低い分子量（より可溶性）の残留ペプチドは、タンパク質単離物について記載されるのと同じように物理化学的環境を変更することによって抽出され得る。
【００８３】
例えば、エタノールなどの溶媒の組み込みが、その溶解度を大幅に低下させることによってこの残留タンパク質画分の沈殿を生じるために、この段階で行われ得る。
【００８４】
溶媒の作用は全て、残渣が予め脱水される場合、より効率的になる。これは、蒸発によってある固形分になるまで、または（例えば微粒子化によって）完全に乾燥するまで行われ得る。
【００８５】
沈殿後、この画分のｐＨが、任意選択的に再調整され、次に、蒸発による濃縮（溶媒の
再循環を可能にし得る）が、微粒子化、凍結乾燥または当業者にさらに公知の任意の手段による乾燥の前に任意選択的に行われる。
【００８６】
本発明は、例示的であり、非限定的であることが意図される以下の実施例からより明らかに理解されるであろう。
【実施例】
【００８７】
実施例１．：高いタンパク質含量を有するクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の生成
使用される菌株は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（菌株ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）である。
【００８８】
前培養：
−  ５００ｍＬの三角フラスコ中の１５０ｍＬの培地；
−  培地の組成：４０ｇ／Ｌのグルコース＋１０ｇ／Ｌの酵母エキス。
【００８９】
インキュベーションが、以下の条件下で行われる：
−  時間：７２時間；
−  温度：２８℃；
−  振とう：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）。
【００９０】
バッチおよび次に流加方式での培養
調製および初期バッチ培地
−  ２０％ｖ／ｖ（５９％）で、４００ｇ／ｌ（４１％）／ＮＨ３で、ＫＯＨの混合物を調製し、ろ過し；
−  １２１℃／２０分で、２０Ｌの発酵槽を滅菌し；
−  ２つの三角フラスコに、５００ｍＬの前培養物（１５のＯＤ６００ｎｍ）を接種し；
−  ２０％ｖ／ｖのＮＨ３を用いて、ｐＨ４．５にし、
−  ３００ｒｐｍの振とう速度を開始する；
−  通気量：２０Ｌ／分の空気；
−  ３０％におけるｐＯ２調節；
原料
−  グルコース：５００ｇ／Ｌ
−  硫酸アンモニウム：５ｇ／Ｌ
−  リン酸二アンモニウム：２０ｇ／Ｌ
−  リン酸：１６ｇ／Ｌ
−  硫酸マグネシウム七水和物：１２ｇ／Ｌ
−  硫酸鉄：１７０ｍｇ／Ｌ
−  硝酸カルシウム：６１０ｍｇ／Ｌ
−  微量元素の溶液：４５ｍＬ／Ｌ
−  ビタミンの溶液：４．５ｍＬ／Ｌ
【００９１】
アンモニウム塩、マグネシウム塩およびリン酸の原料が、発酵培地の塩含量を制限するように開発され、最終的な脱色されたバイオマスのＮ．６．２５含量を維持するように最適化されたことに留意するのが重要である。
【００９２】
【表１】
2018502592.tif 000002
【００９３】
【表２】
2018502592.tif 000003
【００９４】
発酵手順
−  接種前に、２０ｇ／Ｌの当量を提供し、
−  グルコース濃度が０ｇ／Ｌである場合、指数関数的プロファイル（μ＝０．０７時−１）で供給を開始し；
−  ４１％のＫＯＨ／５９％のＮＨ３混合物を用いて、ｐＨを５．２に調節、
−  ２ｋｇのグルコースが、微細藻類によって消費された場合、系を、ＮＨ３単独でのｐＨ調節に切り替える。
【００９５】
結果：
この発酵手順は、Ｎ．６．２５として表される、６５％超のタンパク質を含むバイオマスを得ることを可能にする。
【００９６】
実施例２．クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマスの熱透過化および沈殿による可溶性画分の回収
実施例１にしたがって生成されたバイオマスは、８０％の純度（全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度）で、１０５ｇ／Ｌの細胞固形分で採取される。
【００９７】
次に、それが、
−  洗浄され、インライン希釈［１：１］（ＶｗａｔｅｒＶｍｕｓｔ）によって濃縮され、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ  ５１０プレート遠心分離機において遠心分離され、２２０ｇ／Ｌの固形分および９３％の純度（全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度）にされ、次に、
−  ｐＨは、水酸化カリウムで７に調整され、
−  間接的な蒸気プレート熱交換器におけるＨＴＳＴによる熱処理により、バイオマス
が８５℃にされ、保持によって１分間維持され、その後、グリコール−水プレート熱交換器において４℃に冷却される。
【００９８】
熱処理は、バイオマスの部分溶解を制限するように中規模で行われ、その純度は６８％に減少する。
【００９９】
定義により、細胞外培地中の可溶物の塩析は、全固形分に対する細胞固形分の画分を減少させる。
【０１００】
この段階で、バイオマスの組成は、以下のとおりである：
−  全アミノ酸：４８．７３％
−  全糖：２７．０２％
−  全脂肪酸：１５．１０％
−  灰分およびその他：９．１５％
【０１０１】
粗可溶物の分離
バイオマスの熱透過化による塩析から得られる可溶物の分離は、遠心分離によって行われる。
【０１０２】
分離の収率および品質を最適化するために、わずかな希釈［０．５：１］（ＶｗａｔｅｒＶｍｕｓｔ）が、第２の段階から第１の段階への上清の再循環を伴い、第２の段階で（連続した２つのＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ  ５１０遠心分離機を用いた形態で）インラインで行われる。第１の段階からの上清が、ここで回収され、浄化された可溶物が濃縮される。
【０１０３】
この「粗」可溶物は、以下の組成を有する：
−  全アミノ酸：７７．３％
−  全糖：１７．６％
−  灰分およびその他：５．１％
【０１０４】
タンパク質単離物の精製
分離後に採取された可溶物の試料が、タンパク質単離物を得ることを目的とする精製に使用される。
【０１０５】
ペプチド画分を選択的に沈殿させるために、９．５％の固形分を有する７５０ｇの粗可溶物を、撹拌しながらジャケット型反応器に入れる。
【０１０６】
粗可溶物のｐＨは、リン酸で４．５に調整される。
【０１０７】
撹拌を停止した後、温度を４℃に下げる。
【０１０８】
これらの条件は、８時間維持される。
【０１０９】
ここで、より高い分子量のペプチドが富化された重質相のデカンテーションが行われる。
【０１１０】
次に、重質相は、分液漏斗における簡単な相分離によって抽出され、２８％の質量収率および３７．２％の固形分を有する。
【０１１１】
この抽出物は、９７％の固形分になるように凍結乾燥される。
【０１１２】
この単離物の組成を以下に詳述する：
−  全アミノ酸：９５．９％
−  全糖：２．４４％
−  灰分およびその他：１．６６％。
【０１１３】
タンパク質単離物のアミノ酸プロファイル分布は、以下のとおりである：
−  グルタミン酸：４９．９％
−  アルギニン：４７．２１％
−  その他：２．８９％。
【０１１４】
したがって、単離物は、（全アミノ酸の分布分析に基づいて）アルギニンおよびグルタミン酸によって実質的に形成されるアミノ酸のおよそ９５％の豊富さによって特徴付けられる。
【０１１５】
残渣の精製
単離物の沈殿および分離後の軽質相を、沈殿されない（より低い分子量の）タンパク質画分を濃縮するように精製してもよい。
【０１１６】
分離後（７２％の質量収率を有する）、最初に８．９％の固形分を有するこの相は、エタノールの作用を後に促進するために培地を部分的に脱水するように、蒸発（Ｂｕｃｈｉ
Ｒ−２１５実験室用ロータリーエバポレータ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）において１５ミリバール、−４３℃）によって、４５．４％の固形分になるように濃縮される。
【０１１７】
この段階で、濃縮物は、以下の組成を有する：
−  全アミノ酸：６８．５％
−  全糖：２３．４６％
−  灰分およびその他：８．０４％
【０１１８】
タンパク質画分を沈殿するために、エタノールの添加による脱水が行われる。
【０１１９】
（濃縮物の体積当たり）ある体積のエタノールが加えられ、培地中の溶解度の低下に起因するタンパク質凝集が、実質的に即座に起こる。
【０１２０】
ペレットは、１０分間にわたって４０００ｇで遠心分離によって回収される（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰ）。
【０１２１】
次に、ペレットは、２４時間にわたって真空オーブン中で、９２．３％の固形分になるまで乾燥される。
【０１２２】
このように得られた抽出物の組成が、以下に詳述される：
−  全アミノ酸：７３．１９％
−  全糖：２０．４５％
−  灰分およびその他：６．３６％
【０１２３】
次に、この抽出物は、タンパク質濃縮物として改良され得る。
【０１２４】
実施例３．溶解後の残留バイオマスの処理
実施例２で得られたタンパク質に富む粗不溶物は、残留バイオマスから分離され、残留バイオマスは、改良されるのを可能にするプロセスで処理され得る。
【０１２５】
抽出されたバイオマスは、２２％の細胞固形分で、水平ビーズミルモジュール（Ｎｅｔｚｓｃｈ  ＬＭＥ  ５００〜０．６ｍｍのケイ酸ジルコニウムビーズ）において８５％の粉砕度になるまで粉砕される。
【０１２６】
次に、粉砕された細胞物質は、５０％の水酸化カリウムでｐＨ７に調整される。
【０１２７】
ＳＰＸ強制循環蒸発器における濃縮が、ループの連続した供給によって行われ、このループにおいて、蒸発が起こる４０℃に温度が維持される減圧下でのフラッシュに入る前に、温度が７５℃に調整される。
【０１２８】
濃縮されたバイオマスは、７０℃での予熱を伴い、熱処理を行い、その後、１４０℃で約１０秒間の規模での蒸気の直接噴射および減圧下での４０℃へのフラッシュ冷却が続くように、フラッシュからＳＰＸ  ＵＨＴモジュールへと連続的に取り出される。
【０１２９】
次に、バイオマスは、ＧＥＡ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  ＦＭＤ  ２００アトマイザにおいて、９５％の固形分になるまで微粒子化される。
【０１３０】
このように得られたバイオマスは、以下の組成を有する：
−  全アミノ酸：２７．１％
−  全脂肪酸：２７．１％
−  全糖：３５．８％
−  灰分およびその他：１０％
【０１３１】
このように得られたバイオマスは、炭水化物、タンパク質および脂質画分の平衡した栄養的側面を有するという利点を有する。以下に示されるように、アミノ酸プロファイルは、アルギニンおよびグルタミン酸に富む可溶性画分の選択的な上流の除去によって、さらに再度平衡化される。
【０１３２】
バイオマス中のアミノ酸分布は、以下のとおりである：
−  アスパラギン酸：６．０５％
−  トレオニン：３．９１％
−  セリン：３．５６％
−  グルタミン酸：２３．８４％
−  グリシン：３．５６％
−  アラニン：５．６９％
−  バリン：４．２７％
−  イソロイシン：２．３１％
−  ロイシン：５．８７％
−  チロシン：２．４９％
−  フェニルアラニン：３．２０％
−  リジン：３．７４％
−  ヒスチジン：１．６０％
−  アルギニン：２５．９８％
−  プロリン：３．９１％
【国際調査報告】
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