(57)【要約】本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、ＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度を決定するための、又は循環しているｍｉＲＮＡ及び他の血中を循環している肝損傷マーカー（例えばαマクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｍｉＲ−３４及びｍｉＲ−２００）を使用してＮＡＳＨの処置のレシーバー候補若しくは非レシーバー候補として被験者を分類するための方法に関する。本発明はまた本発明の方法を実施するためのキット、及びＮＡＳＨの処置法に使用するための化合物に関し、処置しようとする被験者は、本発明の方法に従って同定、評価、又は分類される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度を決定するための方法。
【請求項２】
前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から、以下の測定
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定
の実行を含み、対照試料と比較した該レベルの増加は、ＮＡＳＨの指標となる、及び／又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＳＨスコアが（ｉ）〜（ｖ）の測定で決定されたレベルから計算され、該ＮＡＳＨスコアに基づいてＮＡＳＨが診断される、及び／又はＮＡＳＨのステージ、若しくは活性、若しくは重症度が決定される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数８】
2018534542.tif 000026
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
０．１０２から０．６４６５の間に含まれる閾値よりも高いＮＡＳＨスコアが、重度のＮＡＳＨの指標となるか、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活性の指標となる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の処置のレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法。
【請求項８】
前記被験者の血液、血清、又は血漿試料の、以下の測定：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定
の実行を含み、ＮＡＳＨスコアは、（ｉ）〜（ｖ）の測定で決定されたレベルから計算され、被験者は、該スコアに基づいてＮＡＳＨの処置のレシーバー又は非レシーバーとして分類される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含み、ここでＮＡＳＨスコアは、以下の対数関数：
【数９】
2018534542.tif 000027
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記被験者は、Ｓが０．１０２〜０．６４６５の間に含まれる閾値よりも高い場合、処置のレシーバーとして分類される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の指標となるか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる、ＮＡＳＨスコアを計算するための方法であって、該スコアは、以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーの測定に基づく、該方法。
【請求項１２】
α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含み、ここでＮＡＳＨスコアは、以下の対数関数：
【数１０】
2018534542.tif 000028
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
（ｉ）α２マクログロブリン；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００
のレベルを決定するための手段を含むキット。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜６のいずれか一項の方法に従って被験者におけるＮＡＳＨを診断するか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度を決定するか、又は請求項７〜１２のいずれか一項の方法に従って該被験者を分類する工程；
ｂ）工程（ａ）に基づいて該被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置するための方法。
【請求項１５】
前記処置が、式（Ｉ）：
【化４】
2018534542.tif 000029
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２は、Ｇ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同一又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、非置換アルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基若しくはアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されているアルキル基を示し、ここでＲ３は水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか若しくは置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ環式基を示す）
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与する工程を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステル；又はその薬学的に許容される塩からなる群において選択される、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、ＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度を決定するための、又はＮＡＳＨの処置のレシーバー候補若しくは非レシーバー候補として被験者を分類するための方法に関する。本発明はまた本発明の方法を実施するためのキット、及びＮＡＳＨの処置法に使用するための化合物に関し、処置しようとする被験者は、本発明の方法に従って同定、評価、又は分類される。
【０００２】
発明の背景
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、脂肪酸の蓄積、肝細胞の損傷、及びアルコール性肝炎に似た炎症によって組織学的に特徴付けられる、進行性肝疾患である。ＮＡＳＨは、脂肪肝から肝硬変及び肝不全に至る過程において重要な段階である。相当な量のアルコールの摂取がないという慎重な病歴が、この診断を確立するのに必須である。ＮＡＳＨは、肝臓学者に評価のために照会された患者において上昇したアミノトランスフェラーゼの最も一般的な原因の１つである。肥満及び２型糖尿病はＮＡＳＨに関連している。これらの疾患の罹患率は上昇しつつあるので、ＮＡＳＨの罹患率も上昇することが予想され、それ故、この疾患は、米国並びに他の諸国において新興の大衆問題となりつつある。
【０００３】
ＮＡＳＨの活性、ステージ、又は重症度を診断及び決定するための非侵襲的な方法を提案するいくつかの試みが行なわれているが、今日現在でも肝生検材料の組織学的分析が依然として、初期ステージの脂肪肝からＮＡＳＨを区別するための最適なアプローチである。脂肪肝、小葉内炎症及び門脈炎症、風船様腫大及びアポトーシスの形態の肝細胞損傷、並びに線維症が、生検材料から評価されるＮＡＳＨの特色である。しかしながら、肝生検は、多くの明白な欠点を有する。第一に、肝生検材料で回収された材料は、診断された被験者の肝臓の非常に僅かな一部分しか示さず、これにより、回収された試料が、被験者の臓器の全体の状態を代表するかどうか疑問が生じる。さらに、肝生検は、患者にとって面倒で、心配で、痛みを伴うものである可能性がある非常に侵襲的な手順であり、罹患率及び死亡率に関する懸念も生じる。最後に、前記を鑑みて、母集団におけるヒト若しくはさらにはＮＡＳＨのリスクがある患者が、ＮＡＳＨに罹患しているかどうかを決定するための、及び／又は該ヒトにおけるＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度を決定するための日常的な手順として肝生検を提案することは合理的に考えてできない。
【０００４】
それ故、被験者におけるＮＡＳＨの活性、ステージ、又は重症度を診断及び決定するための正確で非侵襲的な手段を提供する強いニーズが存在する。
【０００５】
発明の要約
本発明は、患者の肝生検材料から得られた組織学的データを含む、出願人によって実施された臨床試験（ＧＦＴ５０５−２１２−７−ＮＣＴ０１６９４８４９）中にＮＡＳＨ患者から得られた３００を超える高品質の試料から決定された莫大な数の変数の非常に精密かつ完全な分析に基づく。この試験により、ＮＡＳＨ及びその重症度又はステージ又は活性の指標となる重要な循環中の因子（又はバイオマーカー）の発見がもたらされた。
【０００６】
したがって、本発明の第一の態様は、少なくとも１つの血中、血清中、又は血漿中に循環しているＮＡＳＨのマイクロＲＮＡマーカー、及び少なくとも１つの他の血中、血清中、又は血漿中に循環している肝損傷マーカーのレベルの測定を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度の決定のための方法に関する。
【０００７】
好ましくは、本発明のこの第一の態様は、以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度の決定のための方法に関する。
【０００８】
第一の態様の特定の実施態様では、前記方法は、前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から以下：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定
で示される測定の実行を含み、対照試料と比較した該レベルの増加は、ＮＡＳＨの指標となる、及び／又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる。
【０００９】
本発明の第一の態様のさらなる実施態様では：
−測定（ｉｉ）は、少なくともＨｂＡ１ｃのレベルの決定を含み；及び／又は
−測定（ｉｖ）は、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベルの決定を含む。
【００１０】
別の態様では、第一の態様の方法は、α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定を含む。
【００１１】
第一の態様のさらに別の実施態様では、ＮＡＳＨスコアは（ｉ）〜（ｖ）の測定から決定されたレベルから計算され、該ＮＡＳＨスコアに基づいて、ＮＡＳＨが診断される、及び／又はＮＡＳＨのステージ若しくは活性若しくは重症度が決定される。
【００１２】
第一の態様の別の実施態様では、ＮＡＳＨスコアは、以下の対数関数：
【数１】
2018534542.tif 000002
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される。
【００１３】
この実施態様の具体的な変法では：
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である。
【００１４】
第一の態様のさらなる実施態様では、０．１０２から０．６４６５の間に含まれる閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重度のＮＡＳＨの指標となるか、又は中程度若しくは高度のＮＡＳＨ活性の指標となる。
【００１５】
この実施態様の変法では：
ｋは２５．１３であり；
ａは０．６０であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５であり；
閾値は０．１０２から０．４６２の間に含まれ、より特定すると０．２３である。
【００１６】
この実施態様の代替的な変法では：
ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９であり；
閾値は０．２３１９〜０．６４６５の間に含まれ、より特定すると０．４３４３である。
【００１７】
本発明の第二の態様は、少なくとも１つの血中、血清中、又は血漿中に循環しているＮＡＳＨのマイクロＲＮＡマーカー、及び少なくとも１つの他の血中、血清中、又は血漿中に循環している肝損傷マーカーのレベルの測定を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の処置のためのレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明のこの第二の態様は、以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の処置のレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法に関する。
【００１９】
本発明の第二の態様の特定の実施態様では、前記方法は、前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から以下：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルの決定
で示される測定の実行を含み、ＮＡＳＨスコアは、（ｉ）から（ｖ）の測定で決定されたレベルから計算され、被験者は、該スコアに基づいてＮＡＳＨの処置のためのレシーバー又は非レシーバーとして分類される。
【００２０】
第二の態様のさらなる実施態様では：
−測定（ｉｉ）は、少なくともＨｂＡ１ｃのレベルの決定を含み；及び／又は
−測定（ｉｖ）は、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルの決定を含む。
【００２１】
第二の態様の別の実施態様では、前記方法は、α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルの決定を含む。
【００２２】
第二の態様のさらに別の実施態様では、ＮＡＳＨスコアは、以下の対数関数：
【数２】
2018534542.tif 000003
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される。
【００２３】
この実施態様の変法では：
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である。
【００２４】
第二の態様のさらに別の実施態様では、被験者は、Ｓが０．１０２から０．６４６５の間に含まれる閾値よりも高い場合、処置のレシーバーとして分類される。
【００２５】
この実施態様の変法では：
ｋは２５．１３であり；
ａは０．６であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５であり；
閾値は０．１０２〜０．４６２であり、より特定すると０．２３である。
【００２６】
この実施態様の代替的な変法では：
ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９であり；
閾値は０．２３１９〜０．６４６５の間に含まれ、より特定すると０．４３４３である。
【００２７】
本発明の第三の態様は、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の指標となるか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となるＮＡＳＨスコアを計算するための方法に関し、該スコアは、以下：
（ｉ）α２マクログロブリン、
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
に定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーの測定に基づく。
【００２８】
第三の態様の実施態様では、以下の（ｉ）から（ｖ）の測定は、前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から決定される：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベル；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベル；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベル；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル。
【００２９】
第三の態様の実施態様では、前記方法は、α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルを決定する工程を含み、ここでＮＡＳＨスコアは、以下の対数関数：
【数３】
2018534542.tif 000004
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンのレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される。
【００３０】
この実施態様の具体的な変法では：
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である。
【００３１】
この実施態様の別の具体的な変法では：
ｋは２５．１３であり；
ａは０．６であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５である。
【００３２】
この実施態様のさらに別の具体的な変法では：
ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９である。
【００３３】
第四の態様では、本発明は、
（ｉ）α２マクログロブリン；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のレベルの決定のための手段を含むキットに関する。
【００３４】
１つの実施態様では、第四の態様のキットは、α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルを決定するための手段を含む。
【００３５】
本発明の第五の態様では、本発明は、
（ａ）上記の方法に従って被験者におけるＮＡＳＨを診断するか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度を決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）に基づいて該被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置するための方法に関する。
【００３６】
第六の態様では、本発明は、
（ｃ）上記の方法に従って被験者を分類する工程；
（ｄ）該被験者が工程（ａ）に従って処置のレシーバーとして分類された場合、被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、該被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置するための方法に関する。
【００３７】
第五及び第六の態様の実施態様では、処置は、式（Ｉ）：
【化１】
2018534542.tif 000005
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２は、Ｇ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同一又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、非置換アルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基若しくはアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されているアルキル基を示し、ここでＲ３は水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか若しくは置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ環式基を示す）
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与する工程を含む。
【００３８】
第五及び第六の態様の別の特定の実施態様では、前記化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステル；又はその薬学的に許容される塩からなる群において選択される。
【００３９】
第五及び第六の態様の別の特定の実施態様では、前記化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン又はその薬学的に許容される塩である。
【００４０】
第五及び第六の態様の別の特定の実施態様では、処置は、以下に示されているような表１の化合物を被験者に投与する工程を含む。
【００４１】
他の態様及び実施態様は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１ａ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｂ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｃ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｄ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｅ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｆ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【図１ｇ】図１ａ〜１ｇは、既存のスコアを用いたブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨのスコア化の比較を示す。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の決定のための方法に関する。本発明はまた、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のための処置のレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法にも関する。この分類はまた、被験者が、肝生検を受けることによるなどの当技術分野において公知の方法によるＮＡＳＨのさらなる確認を受けるべきであるかどうかをさらに決定するための基礎であり得る。
【００４４】
本発明は、総合して判断した場合に、ＮＡＳＨについて又はその重症度若しくはステージ若しくは活性について試験される被験者において、ＮＡＳＨの指標となるか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる、規定のセットの循環マーカーの同定から派生する。本発明は特に、循環中のマイクロＲＮＡ（群）（ｍｉＲＮＡ（群））レベルの決定と他の循環中の肝損傷マーカーのレベルの決定とを組み合わせた、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の決定のための方法に関する。
【００４５】
さらに、本発明者らによって収集されたデータは、２つの異なる生物統計学的アプローチに従って処理され、これにより、疾患及び／又はその重症度若しくはステージ若しくは活性の指標となるスコアが決定され、これにより、医師が、被験者はＮＡＳＨを患っているかどうかを容易に決定するための、又は該疾患のステージ若しくは活性若しくは重症度を決定するための、強力で正確で高度に予測的なツールが提供される。以下の記載において別名「ＮＡＳＨスコア」と称されるこのスコアは、それを必要とする施術者及び被験者の両方にとって貴重なツールである。なぜなら、それは、非浸潤的な手順を使用して、すなわち肝生検に依拠することなく、ＮＡＳＨの重症度若しくはステージ若しくは活性の診断又は決定を可能とするからである。
【００４６】
本発明の方法は、マイクロＲＮＡマーカーである少なくとも１つのマーカー及び少なくとも１つの他の循環中の肝損傷マーカーの測定を含む。本発明の方法はより特定すると、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の群から選択された少なくとも１つのマーカー並びに（ｉｖ）及び（ｖ）の群から選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの測定を含む。
【００４７】
特定の実施態様では、本発明の方法は、
−（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の群において選択された少なくとも１つのマーカー、並びに（ｉｖ）及び（ｖ）の群からの少なくとも１つのマーカー、
−（ｉ）及び（ｉｉ）、又は（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉｉ）の各々の群から選択された少なくとも１つのマーカー、並びに（ｉｖ）及び（ｖ）の群から選択された少なくとも１つのマーカー；
−（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々の群から選択された少なくとも１つのマーカー、並びに（ｉｖ）及び（ｖ）の群から選択された少なくとも１つのマーカー；
−以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）の各々のマーカー群における少なくとも１つのマーカー、すなわち：
−（ｉ）に列挙されたマーカー；及び
−（ｉｉ）に列挙された少なくとも１つのマーカー；及び
−（ｉｉｉ）に列挙されたマーカー；及び
−（ｉｖ）に列挙された少なくとも１つのマーカー；
−（ｖ）に列挙されたマーカー
のレベルの測定を含む。
【００４８】
マーカー群は、以下に定義される：
（ｉ）α２マクログロブリン、
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）。
【００４９】
本発明によると、「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」すなわち「ＮＡＳＨ」は、脂肪肝、肝細胞の風船様腫大、及び肝炎症の存在として定義される。該疾患のこの基本的な定義に、ＮＡＳＨはさらに肝線維症を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明によると、被験者は哺乳動物であり、特にヒト被験者である。本発明は、その非侵襲性のお蔭で、ＮＡＳＨの素因が全く知られていないか又は全く疑われない被験者などのあらゆる被験者において実施され得る。しかしながら、特定の実施態様では、被験者は、肥満、糖尿病を有し、代謝症候群に患っているか、又は上昇した肝酵素を有しているか、又は以前に非アルコール性脂肪肝疾患（すなわち脂肪肝）と診断された被験者などの、ＮＡＳＨを有するリスクがあるか又は将来ＮＡＳＨを発症するリスクのある被験者である。被験者はまた、すでにＮＡＳＨと同定された被験者であってもよく、それにより本発明の方法が、該疾患が肝癌又は肝移植又は心血管疾患へと発展するリスクを決定することを可能とする。
【００５１】
本発明において測定されたマーカーのレベルは、被験者の体液から決定され、これは特に血液試料、より特定すると血清試料又は血漿試料であり得る。
【００５２】
本発明者らによって同定されたマーカーのレベルは、バイオマーカーの種類（例えばタンパク質レベル、マイクロＲＮＡレベル、血糖値など）に応じて、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、又は分子的及び生化学的アッセイ（定量ＰＣＲ、比色定量アッセイ）、又は分析法（例えば質量分析）などの当技術分野において周知の慣用的な方法によって決定され得る。試験されたマーカーがマイクロＲＮＡである場合、その測定は、以下の実施例に提示された方法などの、当技術分野において周知の多くの方法に従って実施され得る。簡潔に言えば、血漿試料、特に無細胞の血小板非含有の血漿試料から抽出された全ＲＮＡの測定が行なわれる。適切な内部対照（例えば、公知の配列及び量のマイクロＲＮＡ、例えば線虫のｍｉＲ−３９）を、ＲＮＡ抽出前に試料に加えることができる。Ｃｑ値が、定量ＰＣＲを使用して決定される。このようなアッセイを実施するために市販のキットを利用することができる。例えば、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ：ＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ２０Ｘ、及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスＩＩ（アプライドバイオシステムズ社）を製造業者の説明書に従って使用し得る。逆転写を、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社）などの容易に入手可能なＰＣＲシステムを、適切なサイクリングパラメーター（例えば１６℃で３０分間、その後、４２℃で３０分間及び８５℃で５分間、その後、４℃で保持など）と共に使用して実施され得る。逆転写はマルチプレックスフォーマットで実行され得る。次いで、定量ＰＣＴを、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー、バイオラッド社）などの定量ＰＣＲシステムを使用して実施する。サイクリング条件は以下であり得る：９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を計５０サイクル、並びに３０℃で３０秒間。定量ＰＣＲシステムにおけるＣｑの決定様式は、回帰設定であり得る。特定の実施態様では、本発明の方法に従って決定されたＣｑ値は、上記の特定のパラメーター及び材料を使用して得ることのできるＣｑ値である。試料のＣｑ値は、数値が各ｍｉＲＮＡの標準曲線の最大Ｃｑを上回る場合に、分析から除外され得る。標準曲線を使用して、反応の効率を評価し得る。連続希釈を、最も濃縮されたｃＤＮＡ試料から出発して８つの点にわたり実施することにより、標準曲線が、試験中に認められ得る全ての鋳型濃度候補を確実に網羅するようにすることができる。標準曲線は、得られたＣｑ値に対して出発時点の鋳型の量の対数をプロットすることによって構築され得る。
【００５３】
本発明によると、（ｉ）〜（ｖ）の各群において選択及び測定された全てのマーカーのレベルが、対照（又は基準）試料から得られた基準値と比較した場合に増加している場合、被験者は、ＮＡＳＨを有すると診断されるか、又はＮＡＳＨを有する可能性がある若しくはＮＡＳＨを有するようであると診断される。基準試料は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを有さない１人以上、例えば２人以上の被験者から得られた、体液試料、例えば血液、血清、又は血漿の試料に相当し得る。
【００５４】
本発明において、上記のように測定されたバイオマーカーのレベルを使用して、別名ＮＡＳＨスコアと命名された疾患スコアを決定することもできる。疾患スコアを、低いＮＡＳＨ活性と中程度のＮＡＳＨ活性と高いＮＡＳＨ活性とを、又は中程度のＮＡＳＨと重度のＮＡＳＨとを区別する閾値と比較し得る。本発明によると、この情報を、被験者がＮＡＳＨの治療的処置を受けるか否かを決定するために有利には使用し得る。中程度から高度のＮＡＳＨ活性又は重度のＮＡＳＨを有する被験者のみが処置されるだろう。したがって、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のための処置のレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法に関し、該方法は、上記に定義されているようなマーカーのレベルの決定、ＮＡＳＨスコアの計算、及び該ＮＡＳＨスコアに基づいた処置のレシーバー又は非レシーバーとしての被験者の分類を含む。さらに、被験者の分類を使用して、被験者における低いＮＡＳＨ活性又は中程度のＮＡＳＨを決定し、この分類に基づいて被験者にＮＡＳＨを元に戻す食事及び生活様式に関する忠告を提供し得る。
【００５５】
本発明によると、中程度から高度のＮＡＳＨ活性として、又は重度のＮＡＳＨ患者として分類された被験者は、ＮＡＳＨのための処置のレシーバー又はレシーバー候補であると判断される。本発明の脈絡において、中程度から高度のＮＡＳＨ活性又は重度のＮＡＳＨ患者は、以下の肝生検に由来する等級を提示している患者として定義されるか該患者と同等である：
−脂肪肝等級≧１
−肝細胞風船様腫大等級≧１
−小葉内炎症等級≧１
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪肝等級と肝細胞風船様腫大等級と小葉内炎症等級の合計として定義される）
−線維症ステージ≧２（例えば、線維症は２、３又は４、特に２又は３である）。
【００５６】
特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されているように測定された以下のマーカーレベルから計算される：
−α２マクログロブリン（ＬＶＢＰ＿Ａ２Ｍ＿ＧＬ）のレベル；及び
−ＨｂＡ１ｃ（ＬＢＢＣ＿ＨＢＡ１Ｃ＿ＰＥＲＣ）のレベル；及び
−ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＬＶＢ＿Ｐ３ＮＰ）のレベル；及び
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）（ＬＶＭＫ＿ＨＳＡ＿ＭＩＲ３４Ａ＿ＭＵＬＴＩ１＿ＣＱ）のレベル；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）（ＬＶＭＫ＿ＨＳＡ＿ＭＩＲ２００Ａ＿ＭＵＬＴＩ１＿ＣＱ）のレベル。
【００５７】
さらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数４】
2018534542.tif 000006
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃ％が１０％である場合、Ｂは１０である）；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
として定義される。
【００５８】
さらなる特定の実施態様では、スコアは、上記の対数関数：
（式中、
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である）
に従って計算される。
【００５９】
したがって、ＮＡＳＨスコアは、中程度から高度のＮＡＳＨ活性又は重度のＮＡＳＨを有する確率である。被験者について決定されたＳが、閾値より高いか又は等しい場合、被験者は、ＮＡＳＨについて処置される予定であるか、又はＮＡＳＨについて処置される可能性があると分類される。Ｓが閾値より低い場合、被験者は、処置される予定はないと分類される、並びに／あるいは、被験者は、その低いＮＡＳＨ活性又は中程度のＮＡＳＨを管理するための食事及び生活様式に関する忠告の受信者又は受信者候補として分類される。
【００６０】
特定の実施態様によると、Ｓが０．１０２〜０．６４６５の間に含まれる閾値より高い又は等しい場合、被験者は処置のレシーバー又はレシーバー候補として分類される。
【００６１】
本出願の実験部に記載されているようなメディアンモデルから導かれた、特定の実施態様では：
ｋは２５．１３であり；
ａは０．６であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５であり；
閾値は、０．１０２〜０．４６２の間に含まれ、より特定すると０．２３である。
【００６２】
本出願の実験部に記載されているようなブートストラップモデルから導かれた、特定の実施態様では、
ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；及び
ｆは−０．３９であり；
閾値は、０．２３１９〜０．６４６５の間に含まれ、より特定すると０．４３４３である。
【００６３】
本発明はまた、
（ｉ）α２マクログロブリン；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のレベルを決定するための手段を含むキットに関する。
【００６４】
本発明の特定の実施態様では、前記キットは、α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルを決定するための手段を含む。
【００６５】
本発明のキットは、上記の方法を実施するのに有用であり、さらに該方法を実施するための説明書を場合により含み得る。該キットは、上記に同定されたマーカーのレベルの測定を実施するのに適した試薬及び緩衝液を含み得る。特に、該キットは、定量しようとするタンパク質に特異的な抗体、及び／又は当技術分野において周知であるようなマイクロＲＮＡレベルを定量するのに有用なプライマーを含み得る。
【００６６】
本発明はさらに、
（ａ）上記に提供された方法に従って、被験者におけるＮＡＳＨを診断するか又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度を決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）に基づいて該被験者に、ＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者におけるＮＡＳＨを処置するための方法に関する。
【００６７】
本発明はさらに、
（ａ）上記に定義されているような分類法に従って前記被験者を分類する工程；
（ｂ）該被験者が工程（ａ）に従って処置のレシーバーとして分類された場合、被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者におけるＮＡＳＨを処置するための方法に関する。
【００６８】
本発明はさらに、
（ａ）上記に定義されているような分類法に従って前記被験者を分類する工程；
（ｂ）該被験者が工程（ａ）に従って処置の非レシーバーとして分類された場合、食事及び生活様式に関する忠告を提供する工程
を含む、被験者における低いＮＡＳＨ活性又は中程度のＮＡＳＨを管理するための方法に関する。
【００６９】
本発明に従ってＮＡＳＨを処置するための方法は、式（Ｉ）：
【化２】
2018534542.tif 000007
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２は、Ｇ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同一又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、非置換アルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基若しくはアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されているアルキル基を示し、ここでＲ３は水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか若しくは置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ環式基を示す）
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩などの１つ以上の化合物（群）の、それを必要とする被験者への投与を含む。
【００７０】
ＮＡＳＨの処置のためのこの方法の特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステル；又はその薬学的に許容される塩からなる群において選択される。本発明のさらなる特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン、又はその薬学的に許容される塩である。
【００７１】
本発明のＮＡＳＨの処置法に使用され得る他の化合物としては、以下の表１のクラス及び具体的な化合物から選択された化合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７２】
【表１】
2018534542.tif 000008
【００７３】
実施例
試料の収集及び分析
臨床試験
臨床試験（ＮＡＳＨの第２相ＧＯＬＤＥＮ−５０５試験（ＧＦＴ５０５−２１２−７−ＮＣＴ０１６９４８４９））は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者における脂肪肝に対する１日１回のエラフィブラノール（１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン）の有効性及び安全性を評価するための多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験である。
【００７４】
他の病因の肝疾患を適切に排除した後に、ＮＡＳＨの診断を確認するために肝生検を実施した。ＮＡＳＨは、無作為化の６か月前に肝生検によって評価され脂肪肝として診断された。脂肪肝の確認は、肝生検材料の中心部の解読に基づいた。ＮＡＳＨ患者は、脂肪肝等級≧１及び肝細胞の風船様腫大≧１及び小葉内炎症≧１を含む、ＮＡＳ≧３で定義された。
【００７５】
各々が参加している施設における試験は、適切な規制機関によって承認され、全ての患者が医学研究の参加に同意した。
【００７６】
血液試料採取及び臨床試験
血液試料を、セントラルラボのプロトコール及びマニュアル−ジェンフィ社−ＧＦＴ５０５−２１２−７に従って収集した。
【００７７】
試験プロトコールに従って、以下の分析を実施した。
【００７８】
血液学的検査は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、白血球、白血球百分率（好中球、リンパ球、好酸球、単球、塩基球の絶対数及び％値）、血小板及び網状赤血球を含む。
【００７９】
生化学的検査パネルＩは、血漿中のブドウ糖、トリグリセリド（ＴＧ）、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及びＨｂＡ１ｃを含む。
【００８０】
生化学的検査パネルＩＩは、血漿中のブドウ糖、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、総タンパク質、アルブミン、ナトリウム、カリウム、クロライド、カルシウム、尿酸、血中尿素窒素（ＢＵＮ）として表現される尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、総ビリルビン、抱合型ビリルビン、Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ比及びＨｂＡ１ｃを含む。
【００８１】
尿検査は、
−尿試験紙による分析（比重、ｐＨ、赤血球、白血球、ブドウ糖、タンパク質、ケトン、ビリルビン、ウロビリノーゲン、及び亜硝酸塩）、
−赤血球、白血球、円柱、結晶、細菌、上皮細胞、及び酵母を含む、顕微鏡による分析、
−化学分析（アルブミン及びクレアチニン）
を含む。
【００８２】
血清学的検査は、ＨＩＶ Ｉ／ＩＩ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＣＶ ＲＮＡ（来診のＨＣＶ ＲＮＡの試料を受け取った場合、及びＨＣＶ抗体について「反応性」又は「不確定」の結果の場合にのみ試験する）及びＨｂｓ抗原を含む。
【００８３】
脂質検査パネルは、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、ノンＨＤＬ−Ｃ（計算値）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）（計算値）、超低密度リポタンパク質コレステロール計算値（ＶＬＤＬ−Ｃ）（計算値）、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡ１）及びアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）を含む。
【００８４】
尿化学成分分析は、α−１−ミクログロブリン、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧ）、及び好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（Ｎ−Ｇａｌ）を含む。
【００８５】
安全性マーカーは、ホモシステイン、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、トロポニンＴ、シスタチンＣ、及びβ２−ミクログロブリンを含む。
【００８６】
血糖及び他の脂質パラメーターは、レプチン、インシュリン、恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、血清中ブドウ糖（ＨＯＭＡ−ＩＲの計算用）、フルクトサミン、Ｃ−ペプチド、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含む。
【００８７】
炎症マーカーは、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、及びプラスミノーゲン活性化抑制因子１（ＰＡＩ−１）抗原（クエン酸塩）を含む。
【００８８】
肝マーカーは、サイトケラチン−１８（ＣＫ１８）（Ｍ６５＆Ｍ３０）、アディポネクチン、フェリチン、α２マクログロブリン、ＦＧＦ１９＆ＦＧＦ２１、ヒアルロン酸（シーメンス・ベルギーが入手し、経由したジェンフィットに請求された試薬であるアドヴィア・ケンタウルス）、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）（シーメンス・ベルギーが入手した試薬であるアドヴィア・ケンタウルス）、及び組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤−１（ＴＩＭＰ−１）（シーメンスが入手した試薬であるアドヴィア・ケンタウルス）を含む。
【００８９】
試料の収集及び保存
このバイオマーカー試験に使用された血液試料は、処置期間前に５０５．２１２．７試験の患者から採取された。追加の試料の収集、保存及び使用に関する書面によるインフォームドコンセントが全ての患者から得られた。
【００９０】
クエン酸塩を含有しているチューブに収集された血液２．７mLを、収集から１５分以内に１，５００×ｇで１５分間の遠心分離によって血球から無細胞血漿を分離することによって処理した。上清の血漿を新たなチューブに移した。チューブを−７０℃に保持した。
【００９１】
次いで、ＲＮＡの抽出へと進めるために、血漿チューブを１３，０００×ｇで２分間遠心分離にかけ、血小板をペレット化し除去した。上清の血小板を含まない血漿を新たなチューブに移し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００９２】
全ＲＮＡの抽出及びｍｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮＡの保存された全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（製造番号２１７１８４））によって及び１：５の血漿／ＱＩＡｚｏｌ比を使用して４００μlの血小板非含有の血漿から抽出した。ＲＮＡ抽出前にＲＮＡ抽出過程の内部対照として、合成スパイクイン線虫ｍｉＲ−３９を試料［３，１２５フェムトモル］に加えた。溶出を１８μlの溶出緩衝液中で実施した。
【００９３】
成熟ｍｉＲＮＡの発現を、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ：ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（参照番号：４３６６５９６、アプライドバイオシステムズ社、カールズバッド、ＣＡ州）、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ２０Ｘ（参照番号：４４４０８８７、アプライドバイオシステムズ社）及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスＩＩ（参照番号：４４４００４０、アプライドバイオシステムズ社）を使用して製造業者の説明書に従って検出した。
【００９４】
逆転写を、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間、及び８５℃で５分間、その後、４℃で保持というサイクリング条件と共に、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００サーマルサイクラー（参照番号：２００００５、アプライドバイオシステムズ社）を使用して実施した。ＲＮＡ試料を保存するために４つのｍｉＲＮＡ特異的な逆プライマーを用いて逆転写を多重化した。
【００９５】
定量ＰＣＲは、９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を計５０サイクル、並びに３０℃で３０秒間というサイクリング条件と共に、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（Ｃ１０００タッチ（商標）サーマルサイクラー、バイオラッド社）を使用して実施した。
【００９６】
関心対象の候補であるｍｉＲＮＡの特異的プライマー配列は、以下の表２に従って選択された。
【００９７】
【表２】
2018534542.tif 000009
【００９８】
アルゴリズムの構築に使用されたデータは、Ｃｑフォーマットであった。Ｃｑの決定様式は回帰であった。
【００９９】
統計分析
目的及び定義
これらの分析の目的は、処置しようとするＮＡＳＨ患者の同定に関連する可能性のあるバイオマーカーを発見することであった。処置しようとする患者（ＴＢＴ）（patients to be treated）は以下のように定義された：
・線維症のステージ≧２、及び
・ＮＡＳ≧４、及び
・小葉内炎症等級≧１、及び
・脂肪肝の等級≧１、及び
・風船様腫大≧１。
【０１００】
他の患者は、処置する予定がない（ＮＴＢＴ）と記載された。分析のために、ＴＢＴ患者を１の反応変数、ＮＴＢＴを０の反応変数とカテゴリー化した。上記に示されるように、説明変数は、人口統計（年齢、性別、人種）、地域（試験施設、国、大陸）、又はカルテ（糖尿病）という条件で、血液試料（血液検査、生化学検査、凝固、肝マーカー、循環中ｍｉＲＮＡ）又は尿試料（尿試験紙、沈降）中で測定された多種多様なバイオマーカーを包含した。
【０１０１】
データセットの管理
本試験で使用されたデータセットはＧｏｌｄｅｎ−５０５試験に由来し、最初は２７４人の患者及び１２１個の変数から構成された。データセットの管理は、以下の工程を含んでいた：
１．ｍｉＲＮＡを測定していない２８人の患者の除去
２．１０個を超える欠損値を有する９つの変数の除去
３．極値を有する７人の患者及び欠損値が残っている２８人の患者の除去。
【０１０２】
それにより、説明変数間の共線性を試験するために使用された２１１人の患者及び１１２個の変数を有するデータセットが得られた。
【０１０３】
共線性の試験
量的変数間のピアソン相関を２つずつ計算した。２つの変数が０．７を上回る相関を提示した場合、患者のＴＢＴ（処置する予定）を定める反応変数に関連したその平均値の差の単変量検定を実施した。選択された変数はより有意であった。共線性及び選択された変数を表２に提示する。
【０１０４】
３５個の奇異な共線変数を除去し、分析に使用された最終データセットは、７７個の変数（患者のＩＤ、反応変数、５つの組織学的等級、及び７０個の説明変数）及び２１１人の患者（９５人のＴＢＴ（処置する予定）及び１１６人のＮＴＢＴ（処置しない予定））を含んでいた。
【０１０５】
【表３】
2018534542.tif 000010
【０１０６】
【表４】
2018534542.tif 000011
2018534542.tif 000012
【０１０７】
メディアンモデル
データセットを、ＴＢＴ（処置する予定）及びＮＴＢＴ（処置しない予定）の患者分布で層別化された、２/３の学習用セット及び１/３の検証用セットに１００万回分割した。これらの異なり得る分配において、２７，４７７個は、全ての説明変数及び組織学的等級において学習用セットと検証用セットとの間に有意差を全く示さず、これを分析のために使用した。
【０１０８】
反応変数と７０個の説明変数との間にロジスティック回帰分析を実施し、その後、２７，４７７個の学習用セットにおいて赤池情報量基準（ＡＩＣ）を使用して変数を選択した。それにより、７０個の変数に対して２７，４７７個の異なる係数が得られた。変数を、ゼロとは異なるメディアン係数と合わせることによってメディアンモデルを作成した（表４）。
【０１０９】
【表５】
2018534542.tif 000013
【０１１０】
次いで、モデルを、２７，４７７個の各セットに対するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって検証した。ＡＵＣは０．８２であった（９５％ＣＩ：０．７２〜０．９１）。ＡＵＣの中央値を使用して、３つの閾値が、ＴＢＴ又はＮＴＢＴとして患者を予測するために定義された：
【０１１１】
１．１−特異度＝０％及び感度＝１００％である点に最も近い閾値は０．２３であった。対応する分割表を表５ａに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：８０．２８％
・感度：８１．２５％
・特異度：７９．４９％
・ＰＰＶ（陽性適中率）：７６．４７％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：８３．７８％
【０１１２】
２．９０％を超える感度を与える閾値は０．１０２であった。対応する分割表を表５ｂに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：６３．３８％
・感度：９０．６３％
・特異度：４１．０３％
・ＰＰＶ（陽性適中率）：５５．７７％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：８４．２１％
【０１１３】
３．９０％を超える特異度を与える閾値は０．４６２であった。対応する分割表を表５ｃに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：７０．４２％
・感度：４３．７５％
・特異度：９２．３１％
・ＰＰＶ（陽性適中率）：８２．３５％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：６６．６７％
【０１１４】
【表６】
2018534542.tif 000014
【０１１５】
【表７】
2018534542.tif 000015
【０１１６】
【表８】
2018534542.tif 000016
【０１１７】
ブートストラップモデル
２１１人全ての患者を使用したロジスティック回帰を、７０個全ての説明変数を使用してフルモデルとして計算し、赤池情報量基準を用いて変数を選択することによって最適モデルを得る（表６）。次いで、変数係数の有意性を１０００個のブートストラップ試料を使用して試験した（表６）。
【０１１８】
【表９】
2018534542.tif 000017
【０１１９】
最も重要なことには、ブートストラップモデルを用いて同定された変数は、上記のメディアンモデルを用いて同定されたのと同じであることを注記することは非常に満足できる。この観察は、ＮＡＳＨ及びそのステージ又は重症度の予測因子としての、これらの変数の統計学的妥当性及び信頼性を強化する。
【０１２０】
最適なモデルは、１０００個のブートストラップ試料のＡＵＣを計算することによって検証される。ＡＵＣは０．８２であった（９５％ＣＩ：０．７６〜０．８７）。最適なモデルのＡＵＣを使用して、３つの閾値が、ＴＢＴ又はＮＴＢＴとして患者を予測するために定義された：
【０１２１】
１．１−特異度＝０％及び感度＝１００％である点に最も近い閾値は０．４３４３であった。対応する分割表を表７ａに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：７５．３６％
・感度：７４．７４％
・特異度：７５．８６％
・ＰＰＶ：７１．７２％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：７８．５７％
【０１２２】
２．９０％を超える感度を与える閾値は０．２３１９であった。対応する分割表を表７ｂに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：６５．８８％
・感度：９０．５３％
・特異度：４５．６９％
・ＰＰＶ（陽性適中率）：５７．７２％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：８５．４８％
【０１２３】
３．９０％を超える特異度を与える閾値は０．６４６５であった。対応する分割表を表７ｃに提示し、以下の指数を生じた：
・総合精度：７３．４６％
・感度：５２．６３％
・特異度：９０．５２％
・ＰＰＶ（陽性適中率）：８１．９７％
・ＮＰＶ（陰性適中率）：７０．００％
【０１２４】
【表１０】
2018534542.tif 000018
【０１２５】
【表１１】
2018534542.tif 000019
【０１２６】
【表１２】
2018534542.tif 000020
【０１２７】
他のＮＡＳＨスコア化法との比較
ＮＡＳＨスコアを確立するための方法は、文献に以前に記載されていた：
−Ａｎｇｕｌｏ指数（Angulo et al, 2007）、
−ＥＬＦ（Guha et al, 2008）（ＥＬＦの説明文http://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-availも参照）、
−フィブロテスト（Ratziu et al, 2006）、
−フィブロメーター（Cales et al, 2009）、
−ＦＬＩ（Bedogni et al, 2006）、
−脂肪肝等級又はステアトテスト（Poynard et al, 2005）。
【０１２８】
本発明者らは、このようにして、これらの多くの以前の方法により本発明のＮＡＳＨスコアを評価した。図１ａから１ｇは、既存のスコアを用いてブートストラップモデル（図１ａ）から導かれた本発明の方法によるＮＡＳＨスコア化の比較を示す。
【０１２９】
本明細書に提示されたデータは、ＮＡＳＨ患者又はＮＡＳＨ患者候補の同定、ＮＡＳＨ活性、ステージ又は重症度の決定の精度の目覚ましい改善を示す。この所見は最も重要であり、患者の管理の有効性を改善するための貴重なツールであろう。
【０１３０】
本明細書に開示されたさらなる目的
本開示は特に以下の目的に関する：
【０１３１】
１．少なくとも１つの血中、血清中、若しくは血漿中を循環しているＮＡＳＨのマイクロＲＮＡマーカー、及び少なくとも１つの血中、血清中、若しくは血漿中を循環している肝損傷マーカーのレベルの測定を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、又はＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度の決定のための方法。
【０１３２】
２．以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のように定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、目的１記載の方法。
【０１３３】
３．前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から、以下：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定
で示される測定（対照試料と比較した該レベルの増加は、ＮＡＳＨの指標となる、及び／又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる）
の実行を含む、目的１又は２記載の方法。
【０１３４】
４．−測定（ｉｉ）が少なくともＨｂＡ１ｃのレベルを決定する工程を含む；及び／又は
−測定（ｉｖ）が少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベルを決定する工程を含む、
目的２〜３記載の方法。
【０１３５】
５．α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含む、目的１又は４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
６．ＮＡＳＨスコアが、測定（ｉ）から（ｖ）に決定されたレベルから計算され、該ＮＡＳＨスコアに基づいてＮＡＳＨが診断される及び／又はＮＡＳＨのステージ若しくは活性若しくは重症度が決定される、目的２〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
７．ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数５】
2018534542.tif 000021
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、目的６記載の方法。
【０１３８】
８．ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である、目的７記載の方法。
【０１３９】
９．０．１０２〜０．６４６５の閾値よりも高いＮＡＳＨスコアは、重度のＮＡＳＨの指標となるか、又は中程度若しくは高度なＮＡＳＨ活性の指標となる、目的７又は８記載の方法。
【０１４０】
１０．ｋは２５．１３であり；
ａは０．６０であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５であり；
閾値は０．１０２から０．４６２であり、より特定すると０．２３である、目的９記載の方法。
【０１４１】
１１．ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９であり；
閾値は０．２３１９〜０．６４６５であり、より特定すると０．４３４３である、目的９記載の方法。
【０１４２】
１２．少なくとも１つの血中、血清中、若しくは血漿中を循環しているＮＡＳＨのマイクロＲＮＡマーカー、及び少なくとも１つの血中、血清中、若しくは血漿中を循環している肝損傷マーカーのレベルの測定を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の処置のレシーバー又は非レシーバーとして被験者を分類するための方法。
【０１４３】
１３．以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のように定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程を含む、目的１２記載の方法。
【０１４４】
１４．前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から、以下：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベルの決定；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベルの決定；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベルの決定；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルの決定
で示される測定の実行を含み、ＮＡＳＨスコアは、（ｉ）から（ｖ）の測定で決定されたレベルから計算され、被験者は、該スコアに基づいてＮＡＳＨの処置のためのレシーバー又は非レシーバーとして分類される、目的１２又は１３記載の方法。
【０１４５】
１５．−測定（ｉｉ）が少なくともＨｂＡ１ｃのレベルを決定する工程を含む；及び／又は
−測定（ｉｖ）が少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベルを決定する工程を含む、
目的１３又は１４記載の方法。
【０１４６】
１６．α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含む、目的１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
１７．ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数６】
2018534542.tif 000022
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、目的１６記載の方法。
【０１４８】
１８．ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である、目的１７記載の方法。
【０１４９】
１９．前記被験者は、Ｓが０．１０２〜０．６４６５の閾値よりも高い場合、処置のレシーバーとして分類される、目的１７又は１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
２０．ｋは２５．１３であり；
ａは０．６であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５であり；
閾値は０．１０２から０．４６２であり、より特定すると０．２３である、目的１９記載の方法。
【０１５１】
２１．ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９であり；
閾値は０．２３１９〜０．６４６５であり、より特定すると０．４３４３である、目的１９記載の方法。
【０１５２】
２２．被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の指標となるか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ若しくは重症度の指標となる、ＮＡＳＨスコアを計算するための方法であって、該スコアは、以下：
（ｉ）α２マクログロブリン
（ｉｉ）糖化ヘモグロブリン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）、
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のように定義された（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカー、及び（ｉｖ）又は（ｖ）の群のいずれかから選択された少なくとも１つのマーカーの測定に基づく。
【０１５３】
２３．前記被験者の血液、血清、又は血漿試料から、以下：
（ｉ）α２マクログロブリンのレベル；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベル；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカーのレベル；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル；
で示される（ｉ）から（ｖ）の測定値が決定される、目的２２記載の方法。
【０１５４】
２４．α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定する工程を含む、目的２３の方法。
【０１５５】
２５．ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数７】
2018534542.tif 000023
（式中、
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆであり、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａはα２マクログロブリンレベル（g/L）であり；
ＢはＨｂＡ１ｃレベル％であり；
ＣはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−３４のレベル（Cq）であり；
Ｆはｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベル（Cq）であり；
ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０から１．０２の数であり；
ｃは０から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から０の数であり；
ｆは−０．７８から０の数である）
に従って計算される、目的２４の方法。
【０１５６】
２６．ｋは５．２６から３６．７６の数であり；
ａは０．１１から１．０７の数であり；
ｂは０．００１から１．０２の数であり；
ｃは０．００１から０．２３の数であり；
ｄは−０．７７から−０．００１の数であり；
ｆは−０．７８から−０．０４の数である、目的２５記載の方法。
【０１５７】
２７．ｋは２５．１３であり；
ａは０．６であり；
ｂは０．４８であり；
ｃは０．１であり；
ｄは−０．４３であり；及び
ｆは−０．４５である、目的２５記載の方法。
【０１５８】
２８．ｋは２１．３５であり；
ａは０．６２であり；
ｂは０．５５であり；
ｃは０．１４であり；
ｄは−０．３８であり；及び
ｆは−０．３９である、目的２５記載の方法。
【０１５９】
２９．（ｉ）α２マクログロブリン；
（ｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド；
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２からなる群において選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００
のレベルを決定するための手段を含むキット。
【０１６０】
３０．α２マクログロブリン、ＨｂＡ１ｃ、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００のレベルを決定するための手段を含む、目的２９記載のキット。
【０１６１】
３１．（ａ）目的１〜１１のいずれか１つの方法に従って被験者におけるＮＡＳＨを診断するか、又はＮＡＳＨの活性、ステージ、若しくは重症度を決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）に基づいて該被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置するための方法。
【０１６２】
３２．（ｃ）目的１２〜２１のいずれか１つの方法に従って前記被験者を分類する工程；
（ｄ）該被験者が工程（ａ）に従って処置のレシーバーとして分類された場合、該被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程
を含む、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置するための方法。
【０１６３】
３３．処置は、式（Ｉ）：
【化３】
2018534542.tif 000024
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２は、Ｇ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同一又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、非置換アルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基若しくはアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されているアルキル基を示し、ここでＲ３は水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか若しくは置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ環式基を示す）
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を被験者に投与する工程を含む、目的３１又は３２記載の方法。
【０１６４】
３４．前記化合物が、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステル；又はその薬学的に許容される塩からなる群において選択される、目的３３記載の方法。
【０１６５】
３５．前記化合物が、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］−プロパ−２−エン−１−オン又はその薬学的に許容される塩である、目的３３又は３４記載の方法。
【０１６６】
３６．処置は、表１の化合物を被験者に投与する工程を含む、目的３１又は３２記載の方法。
【０１６７】
参考文献
【表１３】
2018534542.tif 000025
【図１ａ】
2018534542.tif 000030
【図１ｂ】
2018534542.tif 000031
【図１ｃ】
2018534542.tif 000032
【図１ｄ】
2018534542.tif 000033
【図１ｅ】
2018534542.tif 000034
【図１ｆ】
2018534542.tif 000035
【図１ｇ】
2018534542.tif 000036
【配列表】
2018534542000001.app
【国際調査報告】
2018534542.tif 000037
2018534542.tif 000038
2018534542.tif 000039