(57)【要約】  本発明は、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントあって、
配列番号１から選択されるＣＤＲ１、配列番号２から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに
配列番号４から選択されるＣＤＲ１、配列番号５から選択されるＣＤＲ２、及び／又は配列番号６から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２】
単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントあって、
配列番号１３を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１６を含む重鎖可変部
を含む、前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項３】
軽鎖可変部が、配列番号１１又は１２を含む、請求項２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項４】
重鎖可変部が、配列番号１４又は１５を含む、請求項２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項５】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号１１もしくは１２又はそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖、及び／あるいは
配列番号１４もしくは１５を含む重鎖
を含む、請求項２、３、あるいは４に記載の単離されたＴａｕ結合抗体あるいはその結合フラグメント。
【請求項６】
単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントであって、Ｔａｕへの結合について、請求項１、２、３、４、又は５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項７】
単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントであって、請求項１、２、３、４、又は５のいずれか一項に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じエピトープへ結合する、前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項８】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、モノクローナルヒト化抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、又は７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項９】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、請求項１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１０】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、可溶性形態のヒトＴａｕ、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）又は可溶性形態のヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、又は９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つ又は２つ以上の核酸配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の１つ又は２つ以上の核酸配列又は請求項１２に記載の１つ又は２つ以上のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
少なくとも
ｃ）請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
ｄ）前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを単離するステップ
を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを作製する方法。
【請求項１５】
治療活性のある薬剤としての使用のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１６】
タウオパチーを処置する上での使用のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１７】
タウオパチーがアルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項１６に記載の、使用のための単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１８】
診断薬としての使用のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載の、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項１９】
タウオパチーを診断する上での使用のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に記載の、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２０】
タウオパチーがアルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項１９に記載の、使用のための単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明はとりわけ、Ｔａｕ結合抗体及びこれらの結合フラグメント、このような抗体を作製する方法ならびにアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症−認知症合併症、好銀性粒子病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症、皮質基底核変性、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ＭＡＰＴ変異起因性１７番染色体連関型前頭側頭型認知症及びパーキンソン症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、グアドループ島型パーキンソン症、筋緊張性ジストロフィー、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化病併発性非グアマニアン型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン症、プリオンタンパク質性脳アミロイド血管症、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、変化のみの認知症（Ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、球状神経膠封入体を伴う白質タウオパチー（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２３  （２０１３）  ３４２−３４９）のようなタウオパチーを処置及び／又は診断するためのそれらの使用に関する。本発明は、先に説明したタウオパチー、特にアルツハイマー病及び進行性核上性麻痺のようなタウオパチーに罹患している又はであるヒト対象を処置する方法にも関する。
【０００２】
本発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）及び進行性核上性（ＰＳＰ）は、医学的な満たされていない高い需要、社会の健康系に対する高いコスト、及び影響を受ける家族に対する高い負荷を伴う神経変性疾患である。ＡＤの臨床徴候には、記憶、認知、推論、判断及び情動安定性の喪失、ならびに究極的には死亡が含まれる。ＰＳＰは、歩行制御及び平衡の重篤な及び進行性の問題、転倒、垂直方向の眼球運動の障害、認知上の問題、うつ、無感情、ならびに軽度認知症を包含する。後期の症状には、霧視、制御されていない眼球運動、不明瞭言語、嚥下困難及び死亡が含まれる。
【０００３】
１０年超の間、ＡＤ疾患改変プログラムは、種々の機序を通じてアミロイドベータペプチドを標的としてきた。対照的に、ＡＤについての第二の主要特徴である細胞内Ｔａｕ病理に取り組む上での進行ははるかに少なかった。凝集した高リン酸化型Ｔａｕを含有する神経原線維の封入体又は濃縮体は、ＡＤ病理及びＰＳＰを含むいくつかの他のタウオパチーの特徴を定義しつつある。
【０００４】
これらの疾患において、症候性進行と神経内Ｔａｕ凝集のレベル及び分布の間には強い相関がある。ＡＤにおいて、ニューロンのＴａｕ濃縮体はまず、経内側嗅皮質（ｔｒａｎｓｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）に現れ、そこから当該濃縮体は海馬及び新皮質へ拡散する。ＡＤニューロンにおいて観察される当該濃縮体は、高リン酸化型の凝集した不溶性Ｔａｕからなる。病理学的Ｔａｕ種の直接的な毒性効果及び／又は機能的Ｔａｕの隔離による高リン酸化型及び凝集型への軸索輸送の喪失（Ｉｏｓｓ）は、もはや軸索輸送を支援することができず、当該疾患に寄与すると提唱されてきた。
【０００５】
非病理学的状態において、Ｔａｕは、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）において、代替的スプライシングによる６個の主要アイソフォームにおいて生じる、非常に可溶性の高い細胞質微小管結合タンパク質であり、長さ３５２〜４４１アミノ酸に及ぶ。これらのアイソフォームは、０、１又は２個のＮ末端インサート（０Ｎ、１Ｎ、２Ｎ）、及び３個又は４個のいずれかのＣ末端「反復」配列（３Ｒ又は４Ｒ）を有することができる。これら３０〜３２個のアミノ酸からなるＣ末端反復配列Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はまとめて、Ｔａｕ微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を構成する。実際、Ｔａｕの主要な役割は、軸索微小管の集合及び安定化にあると考えられている。微小管は、軸索輸送のためのトラック、及び細胞増殖のための細胞骨格要素を形成する（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａら，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２３（２０１３）３４２〜３４９）。３種類のＴａｕアイソフォームは、３個の微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を含有することが実証されてきた。
・３Ｒ０Ｎとも呼ばれるアイソフォーム４型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０５８５２５．１（３５２アミノ酸）
・３Ｒ１Ｎとも呼ばれるアイソフォーム７型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９０１８０．１（３８１アミノ酸）
・３Ｒ２Ｎとも呼ばれるアイソフォーム８型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９０１８１．１（４１０アミノ酸）
これに対し、その他の３種のＴａｕアイソフォームは４個のＭＴＢＲを含有する。
・４Ｒ２Ｎとも呼ばれるアイソフォーム２型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５９０１．２（４４１アミノ酸）、
・４Ｒ０Ｎとも呼ばれるアイソフォーム３型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０５８５１８．１（３８３アミノ酸）、及び
・４Ｒ１Ｎとも呼ばれるアイソフォーム５型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１１６５３９．１（４１２アミノ酸）。
【０００６】
Ｔａｕは、８５個の潜在的なセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びチロシン（Ｙ）のリン酸化部位を含有する。Ｔａｕにおける当該リン酸化残基の多くは、微小管結合ドメインに隣接するＴａｕのプロリンに富むドメインにおいて認められる。６種類のＴａｕアイソフォームはすべて、正常成熟ヒト脳において存在し、この段階で、Ｔａｕンリン酸化は比較的低下している（Ｎｏｂｌｅら，２０１３  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３；  ４：  ８３）。種々のタウオパチーにおいて、病理学的病変において沈積したＴａｕは、常に高度にリン酸化されている。ホスホセリン２０２及びリン光体トレオニン２０５は、ＰＳＰ及びＡＤの患者由来の脳試料及び脳脊髄液に由来する凝集したＴａｕにおいて検出されてきた（Ｂｕｅｅら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３３（２０００）  ９５−１３０、Ｗｒａｙら  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８  ６月１日号；１０５（６）：２３４３−５２、Ｈａｎｇｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  ８月１０日号；２８２（３２）：２３６４５−５４、Ｍａｃｃｉｏｎｉら  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２００６年２月号；２７（２）：２３７−４４）。
【０００７】
他の症候性処置は、これらの疾患に対して得られるが、有効性は軽度であり又は全くない。当該疾患の発症を遅延させる又は理想的に停止させるための処置は現在、入手可能ではない。それゆえ、タウオパチーの処置において有用な新たな化合物及び組成物についての当該技術分野における需要があるままである。
【０００８】
本発明の目的及び概要
とりわけ、アルツハイマー病（ＡＤ）又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のようなタウオパチーを処置又は診断するための薬剤を提供することが、本発明の目的である。さらに、とりわけ、アルツハイマー病（ＡＤ）又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のようなタウオパチーを処置又は診断するための方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
以後の後続の説明から明らかとなるであろうこれらの及び他の目的は、独立請求項の対象によって達成される。本開示によって熟慮される具体的な態様及びその実施形態に関する一部は、従属請求項の対象を形成する。本開示によって熟慮されるさらに他の態様及びその実施形態は、後続の説明から得られ得る。
【００１０】
第一の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１１】
第二の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１２】
第三の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１３】
第四の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号１３もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１６もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１４】
第五の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６を含むリン酸化されたＴａｕフラグメントへ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１５】
第一及び第五の態様の実施形態として、本開示は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトの抗体又はその結合フラグメントであることができる、抗体又はその結合フラグメントを準備する。
【００１６】
第二又は第三の態様の実施形態として、本開示は、キメラ抗体又はその結合フラグメントであることができる、抗体又はその結合フラグメントを準備する。
【００１７】
第四の態様の実施形態として、本開示は、ヒト化抗体又はその結合フラグメントであることができる、抗体又はその結合フラグメントを準備する。
【００１８】
第六の態様において、本開示は、Ｔａｕへの結合について、第一〜第四の態様及びこれらの実施形態のうちのいずれかのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００１９】
第七の態様において、本開示は、第一〜第五の態様及びこれらの実施形態のうちのいずれかのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００２０】
第六及び第七の態様の実施形態として、本開示は、ヒト化抗体又はその結合フラグメントである、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントを準備する。
【００２１】
第一〜第七の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントは、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域を含む、可溶性形態のヒトＴａｕ、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）又は可溶性形態のヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合することができる。
【００２２】
第八の態様において、本開示は、第一〜第七の態様及びその実施形態の抗体又はその結合フラグメントの重鎖及び／又は軽鎖をコードするＤＮＡ配列のような核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００２３】
第九の態様において、本開示は、これらの上述の核酸分子を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。
【００２４】
第十の態様において、本開示は、これら上述の核酸分子、クローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
第十一の態様において、本開示は、第一〜第七の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントを作製する方法を提供する。
【００２６】
本開示の第十二の態様は、特にＡＤ及びＰＳＰのようなタウオパチーを処置するための、第一〜第七の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントの使用に関する。
【００２７】
本開示の別の態様は、特にＡＤ及びＰＳＰのようなタウオパチーを診断するための、第一〜第七の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実験２．３のＥＬＩＳＡアッセイにおける配列番号７のウサギＶＬ配列（ＶＬ＿ＡＢ１）及び配列番号８のウサギＶＨ配列（ＶＨ＿ＡＢ１）を有するＡＢ１の、ビオチン化Ｔ１９７ペプチドへの結合対ビオチン化ペプチドＴ１７４、Ｔ２１１、Ｔ２３０及びＴ３９６への結合。
【図２】実験３．１の細胞凝集アッセイを示す線図。
【図３】ヒトＰＳＰ患者（ＰＳＰ−ＰＨＦ８）から回収したヒトＴａｕ病理学的原線維をシーズとして用いた細胞内Ｔａｕ凝集アッセイにおける配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ａ）、ならびに配列番号１７の軽鎖及び配列番号２１の重鎖を有するＴａｕ結合抗体、又は陰性対照ＩｇＧ４抗体Ａ３３（Ｃ）の有効性。
【図４】ヒトＡＤ又はＰＳＰ由来のＴａｕ含有可溶化液に対する、配列番号９の軽鎖及び配列番号１０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体ＡＢ１の結合特性を示すウェスタンブロット。
【図５】Ａ）は、ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）及びＣＤＲ３（配列番号５３）が下線を付されている配列番号７のＡＢ１のドナーＶＬ（ＶＬ＿ＡＢ１）を示す。Ｂ）は、アクセプターＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が下線を付されている配列番号４４のヒトアクセプター領域ＩＧＫＶ１−３９のＶＬ配列を示す。Ｃ）は、ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）及びＣＤＲ３（配列番号３）が下線を付されている、配列番号１１のＣＤＲグラフト結合配列ｇＶＬ４＿ＡＢ１を示す。Ｄ）は、ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）及びＣＤＲ３（配列番号５４）が下線を付されている配列番号１２のＣＤＲグラフト結合配列ｇＶＬ９＿ＡＢ１を示し、ＣＤＲ３は、ＶＬ＿ＡＢ１と比較してＡ９１変異を含む。
【図６】Ａ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）及びＣＤＲ３（配列番号４８）が下線を付されている配列番号８のＡＢ１のドナーＶＨ（ＶＨ＿ＡＢ１）を示す。Ｂ）は、アクセプターＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が下線を付されている配列番号４５のヒトアクセプター領域のＶＨ配列ＩＧＨＶ４−３９を示す。Ｃ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）及びＣＤＲ３（配列番号４９）が下線を付されている配列番号１４のＣＤＲグラフト結合配列ｇＶＨ４１＿ＡＢ１を示す。ドナー残基は、斜体かつ太字で示されている（Ｋ７１及びＶ７８）。フレームワークにおける変異は、強調されている（Ｅ１）。ＣＤＲ３は、ＶＨ＿ＡＢ１と比較してＮ１００Ｑ置換を含む。Ｄ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）及びＣＤＲ３（配列番号５０）が下線を付されている配列番号１５のＣＤＲグラフト結合配列ｇＶＨ４９＿ＡＢ１を示す。ドナー残基は、斜字かつ太字で示されている（Ｋ７１及びＶ７８）。フレームワークにおける変異は強調されている（Ｅ１）。ＣＤＲ３は、ＶＨ＿ＡＢ１と比較してＮ１００Ａ置換を含む。
【図７】ヒトＡＤ患者からシードとして回収されたヒトＴａｕ病理学的原線維を用いた細胞内Ｔａｕ凝集アッセイにおける、配列番号９の軽鎖及び配列番号１０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体の、ならびに配列番号５５のリン酸化された残基２０２及び２０５を含むエピトープへ結合するような当該文献において説明されるＴａｕ結合抗体ＡＴ８、又は陰性対照抗体１０１．４の有効性。
【図８】ヒトＡＤ患者、又はヒトＰＳＰ患者もしくはヒトＦＴＤ患者からシードとして回収されたヒトＴａｕ病理学的原線維を用いた細胞内Ｔａｕ凝集アッセイにおける配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体の有効性。
【００２９】
発明の詳細な説明
以下において例証として説明される本開示は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の不在下でも適切に実施され得る。
【００３０】
本開示は、その特定の態様及びその実施形態に関して、ならびにある図面及び例に関して説明されるが、本発明はそれらによる制限を受けない。
【００３１】
技術用語は、別段の記載がない限り、当該用語の通常の意味によって使用される。具体的な意味がある特定の用語に付与される場合、用語の定義が当該用語が使用される状況に応じて以下に与えられる。
【００３２】
「を含んでいる」という用語が本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、当該用語は、他の要素を排除しない。本開示の目的のために、「からなる」という用語は、「から構成されている」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。以後、群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、このことはまた、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を開示するように理解されるものとする。
【００３３】
本開示の目的のために、「得られた」という用語は、「得ることができる」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。以後、例えば、抗体が具体的な源から得られることができると定義される場合、このことはまた、この源から得られる抗体を開示するよう理解されるものとする。
【００３４】
不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」が、単数名詞を指すときに使用される場合には、ほかに何らかの具体的な記載がない限り、当該名詞の複数形も包含される。「約」又は「およそ」という用語は、問題となっている特性の技術的な効果がなおも保証されると当業者が理解するであろう正確な間隔を示す。当該用語は典型的には、±１０％の、好ましくは±５％の、示される数値からの偏差を示す。
【００３５】
種々の態様の好ましい実施形態としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対するいかなる参照も、モノクローナルＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを熟慮することは理解されるものとする。
【００３６】
種々の態様について、本開示は、ＣＤＲならびに個々の軽鎖領域及び／又は重鎖領域の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントを示す。軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部のみを含む抗体又はその結合フラグメントは、例えば、対応する他の可変部と有効に結合することのできる可変部を製造する方法に対して、又は当該可変部をスクリーニングする方法に対して有用であり得る。しかしながら、ＣＤＲならびに個々の軽鎖領域及び／又は重鎖領域の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントに対する参照がなされる場合はどこでも、このことが常に、ＣＤＲならびに個々の軽鎖領域及び重鎖領域の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントを好ましい実施形態として熟慮することは理解されるものとする。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」という用語及びこれらに類するものは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。当該効果は、疾患及び／もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点で予防的であり得、ならびに／又は疾患及び／もしくは当該疾患に起因する有害作用に対する部分的な又は完全な治癒の点で治療的であり得る。したがって、処置は、哺乳類における、特にヒトにおける疾患の何らかの処置を網羅し、（ａ）当該疾患に易罹患性であり得るが、当該疾患に罹患しているとまだ診断されてはいない対象において、当該疾患が発症するのを予防すること、（ｂ）当該疾患を抑制すること、すなわち、当該疾患の発症を抑止すること、及び（ｃ）当該疾患を緩和すること、すなわち、当該疾患の退行を生じることがカバーされる。
【００３８】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを「治療活性のある薬剤」として参照する場合、疾患の処置におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用を指す。
【００３９】
「治療有効量」は、疾患を処置するために哺乳類又は他の対象へ投与される時、当該疾患のためのこのような処置をもたらすのに十分であるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの量を指す。治療有効量は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、治療されることになっている対象の疾患及びその重症度ならびに齢、体重などによって変化するであろう。
【００４０】
「診断活性のある薬剤」としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対する参照は、疾患の診断におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用を指す。
【００４１】
「診断有効量」は、生物試料に関する診断検査において使用される時に、疾患の識別、又は治療介入の有効性をモニターする手段として疾患組織の量をモニターすることを可能にするのに十分であるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの量を指す。
【００４２】
本出願は、ヒトＴａｕを結合するＡＢ１と呼ばれる抗体の識別に一部基づいている。当該技術分野において通例であるように、この状況におけるＴａｕ残基の番号付けは、配列番号５５のアイソフォーム２型を指す（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９０１．２）。免疫化ウサギから単離されたＡＢ１と以後割り付けられるであろうように、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域を認識する。
【００４３】
例は、ＡＢ１がヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合することができること（例２．４を参照されたい）、ならびにヒト試料の凍結切片においてニューロン内神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、ニューロン外ＮＦＴ、老人斑様構造及び神経柔毛糸（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ  ｔｈｒｅａｄ）を検出することができたこと（例３．２を参照されたい）を確立している。この挙動が、ＡＢ１の軽鎖可変部（ＶＬ）及び重鎖可変部（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって少なくとも一部仲介されていると想定することは妥当であるようである。
【００４４】
この背景に対して、本開示は、ＡＢ１（配列番号７）のＶＬ部のＣＤＲ若しくは特異性決定残基及び／又はＡＢ１（配列番号８）のＶＨ部のＣＤＲを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００４５】
抗体可変部における残基は慣習的に、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムによって番号付けされている。このシステムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ，米国におけるＫａｂａｔら，１９８７（以後、「Ｋａｂａｔら（上述）」）において発表されている。この番号付けシステムは、別段の記載がない限り、本明細書において使用される。
【００４６】
Ｋａｂａｔの残基命名法は必ずしも、アミノ酸残基の線形的な番号付けと直接対応してはいない。実際の線形アミノ酸配列は、フレームワークであろうと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと、塩基性可変部構造の短縮又は構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔの番号付けにおけるよりも少数の又は追加のアミノ酸を含有し得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列における相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列させることによって、付与された抗体に対して決定され得る。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ， Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１と等価のループは、残基２６から残基３２まで延びる。
【００４７】
ＡＢ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はしたがって、それぞれ配列番号１、２、及び５３に対応すると識別された。ＡＢ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はしたがって、それぞれ配列番号４、５、及び４８に対応すると識別された。ＣＤＲに対するアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失の効果は、当業者によって、例えば、例において説明される方法を用いることによって容易に検査することができる。ＶＨの元々識別されたＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）、すなわち配列番号４８において、例えば、潜在的なアスパラギン脱アミド化部位を識別し、グルタミン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンのいずれかによってアスパラギン残基を置き換えることによって修飾した。このことは、ＣＤＲＨ３に対してそれぞれ、配列番号４９、５０、５１及び５２の配列をもたらした。簡潔にする目的のため、ＣＤＲＨ３に対する３つの配列、すなわち、配列番号４８、４９、５０、５１及び５２を配列番号６として組み合わせた。同様に、ＶＬのＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）において、潜在的なグルタミン脱アミド化部位を識別し、連続的なグリシンをアラニンと置き換えることによって修飾した。簡潔にする目的のため、ＣＤＲＬ３に対する両配列、すなわち、配列番号５３及び５４を配列番号３として組み合わせた。
【００４８】
置換、付加及び／又は欠失のようなさらなる修飾が、例えばＡＢ１と比較して結合特性を実質的に変化させることなくＣＤＲに対してなされ得ることは認識されるであろう。このことは主として、例えば、ＣＤＲにおけるアミノ酸を類似のアミノ酸と置き換えることによって達成され得る。本明細書で使用される「類似性」は、整列した配列における何らかの特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンと置換され得る。しばしば互いに置換されることのできる他のアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
・リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
・アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
・アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、ならびに
・システイン及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）。
【００４９】
この背景に対して、本開示は、一態様において、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、もしくは配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを準備する。
【００５０】
さらなる態様において、本開示は、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３、ならびに
重鎖
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００５１】
さらなる態様において、本開示は、
軽鎖、ならびに
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、もしくは配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００５２】
本明細書で使用される「同一性」は、整列した配列における何らかの特定の位置において、アミノ酸残基が当該配列間で同一であることを示す。同一性の程度は、例えば、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェアを用いて容易に算出することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ｇｉｓｈ，Ｗ及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２。Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｋ．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。
【００５３】
それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６に対するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の同一性は、少なくとも９０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。
【００５４】
この状況において、本開示は具体的には、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。
本開示は、それぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびにそれぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびにそれぞれ配列番号１、２、５３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び４９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびにそれぞれ配列番号１、２、５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び５２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントも考慮する。
【００５５】
当該第一の態様によって熟慮されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、異なる起源のフレームワーク領域において埋め込まれたこれらのＣＤＲを含み得る。したがって、ＣＤＲは、ＡＢ１の元のフレームワーク領域、すなわち配列番号７のウサギＶＬ部内及び配列番号８のウサギＶＨ部内に含まれ得る。しかしながら、ＣＤＲは、このようなマウス又はヒトのフレームワーク領域のような異なる種起源のフレームワーク領域にも埋め込まれ得る。このようなフレーム枠領域と組み合わされることのできるフレームワーク領域の起源及び定常部に応じて、キメラ、ネズミ化又はヒト化のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを得られ得る。
【００５６】
キメラＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ネズミ又はヒト起源のような異なる種由来の定常部と組み合わされた非ヒト起源のフレーム領域内にＣＤＲを含むであろう。ネズミ化Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ネズミ起源の定常部と合わせて組み合わされたネズミ起源のフレームワーク領域内にＣＤＲを含むであろう。ヒト化Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ヒト起源の定常部と合わせて組み合わされたヒト起源のフレームワーク領域内にＣＤＲを含むであろう。
【００５７】
この背景に対して、本開示は、別の態様において、
配列番号７もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００５８】
配列番号７及び８のＶＬ及びＶＨの同一性はそれぞれ、少なくとも８０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得ることは認識されるであろう。
【００５９】
この文脈において、本開示は具体的には、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。
【００６０】
ヒト化Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、本開示によって特に熟慮される。
【００６１】
この目的のため、ＣＤＲは、ヒトフレームワーク領域へとグラフト結合され得る。このようなヒト化ＣＤＲをグラフト結合したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの識別は、当該技術分野の確立されたアプローチに従って達成され得ることは認識されるであろう。ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフト結合した時、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して、何らかの適切なアクセプターヒト可変部フレームワーク配列が使用され得る（例えば、Ｂｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓら，欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，ＷＯ  ８６／０１５３３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら，欧州特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１号を参照されたい）。
【００６２】
また、本発明のＣＤＲをグラフト結合した抗体可変部において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を実際に有している必要はない。したがって、ＣＤＲは、フレームワークの変化とともに又は当該変化を伴わずにグラフト結合し得る。ドナー可変部のフレームワーク領域とアクセプターフレームワーク領域の間の比較を基にしてフレームワーク変化を導入することは、例えば、さもなくばヒト化の結果として低下し得る抗体の親和性を保有することが可能となり得る。例えば、異常な残基は、アクセプター鎖のクラス又はタイプのためにより頻繁に発生する残基へと変化し得る。あるいは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基は、ドナー抗体における同じ位置において認められる残基に対応するよう変化し得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復させるのに必要な最低限まで維持されるべきである。変化のための残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体，ＷＯ９１／０９９６７）によって概略されるプロトコルを用いて選択され得る。本発明のＣＤＲをグラフト結合した抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、同じ抗体に由来する必要は必ずしもなく、所望の場合、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
【００６３】
本発明において使用することのできるヒトアクセプターフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔら，上述）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖に使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖に使用することができ、ならびにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖系列配列を使用し得、これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ＣＥ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいて入手可能である。本開示は具体的には、配列番号４４（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）のヒトＶ部ＩＧＫＶ１−３９プラスＪＫ４  Ｊ部を軽鎖ＣＤＲのアクセプターフレーム領域として、ならびに配列番号４５（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）のヒトＶ部ＩＧＨＶ４−３９プラスＪＨ４  Ｊ部を重鎖ＣＤＲについてのアクセプターフレームワーク領域として使用することを考慮する。配列番号４５において、位置１、７３及び８０は例えば、フレームワーク領域における残基変化のために考慮され得る。位置７３におけるバリン残基は、リジンへ変化し得る。位置８０におけるフェニルアラニンは、バリンへ変化し得る。フレームワーク領域における残基変化のための配列番号４５における他の位置は、位置３９及び／又は７５であり得る。例えば、配列番号４５の位置３９におけるイソロイシン残基は、バリンへ変化し得る。位置７５におけるトレオニン残基は、セリンへ変化し得る。フレームワーク領域における残基変化のための配列番号４４における位置は、位置２及び／又は６３であり得る。例えば、配列番号４４の位置２におけるイソロイシン残基は、バリンへ変化し得る。配列番号４４の位置６３におけるセリン残基は、リジンへ変化し得る。
【００６４】
この背景に対し、本開示は、別の態様において、
配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００６５】
本開示はさらに、別の態様において、
配列番号１３もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１６もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００６６】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１３もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１４、１５もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。
【００６７】
さらに、このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１１、１２もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１６もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。
【００６８】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１１もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１４、１５もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。
【００６９】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１２もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１４、１５もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。
【００７０】
配列番号１３及び１６のＶＬ及びＶＨの同一性はそれぞれ、少なくとも８０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得ることは認識されるであろう。
【００７１】
この状況において、本出願は具体的には、配列番号１１のＶＬ及び配列番号１４のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１１のＶＬ及び配列番号１５のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１２のＶＬ及び配列番号１４のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびに配列番号１２のＶＬ及び配列番号１５のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。
【００７２】
ヒト化ＣＤＲをグラフト結合したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ヒト起源の定常部を含み得る。当該重鎖の定常部のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスへと分けられ、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＧＡ１、及びＩｇＡ２へと分けられ得る。特にヒトＩｇＧ定常部ドメインは、抗体分子が治療用途に企図され及び抗体エフェクター機能が必要とされる時に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプが特に使用され得る。あるいは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプは、抗体分子が治療目的のために企図され及び抗体エフェクター機能が必要とされない時に使用され得る。本開示は具体的には、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体を考慮する。
【００７３】
これらの定常部ドメインの配列修正も使用され得ることは認識されるであろう。例えば、１つ又は２つのアミノ酸のような１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失は、Ｔａｕへ結合する抗体の能力を有意に変化させることなく抗体定常部に対してなされ得る。位置２４１におけるセリンがＡｎｇａｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（Ｉ），１０５−１０８において説明されるようにプロリンへ変化したＩｇＧ４分子は、同様に使用され得る。
【００７４】
抗体エフェクター機能には、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが含まれる。ＡＤＣＣは、抗体依存性細胞傷害を指す。抗体が原理上、ＡＤＣＣを仲介することができるかどうかを判定するために、ＡＤＣＣは、例えば、いわゆるＣｒ５１、Ｅｕ及びＳ３５放出アッセイによってインビトロで測定され得る。関心対象の抗原、すなわちＴａｕを含有する標的細胞は、これらの化合物で標識され得る。治療用抗体の結合後、細胞を洗浄し、ＦｃγＲＩＩＩのようなＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞を抗体標識標的細胞とともにインキュベートし、標的細胞の溶解を、標識の放出によってモニターすることができる。別のアプローチは、いわゆるａＣｅｌｌａ  ＴＯＸ（商標）アッセイを用いる。ＣＤＣは、補体依存性細胞傷害を指す。抗体が原理上、ＣＤＣを仲介することができるかどうかを判定するために、ＣＤＣは、例えば、Ｄｅｌｏｂｅｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  （２０１３）；  ９８８：１１５−４３又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＳＮ：  １９３４−３６７１）において説明されるように、インビトロで測定され得る。
【００７５】
この背景に対して、本開示は、別の態様において、
配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２２もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００７６】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２０、２１もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００７７】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１７、１８もしくはそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２２もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００７８】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１７、１８もしくはそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２０、２１もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００７９】
配列番号１９及び２２に対する軽鎖及び重鎖の同一性はそれぞれ、少なくとも７０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得、定常部についてはさらにより可撓性があり得ることは認識されるであろう。
【００８０】
この状況において、本出願は具体的には、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２１の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１８の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびに配列番号１８の軽鎖及び配列番号２１の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。
【００８１】
さらに、本開示は、別の態様において、
配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２５もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００８２】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／あるいは
配列番号２３もしくは配列番号２４又はそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００８３】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／あるいは
配列番号２３もしくは配列番号２４又はそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００８４】
このような単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１７、１８もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／あるいは
配列番号２３もしくは配列番号２４又はそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
【００８５】
この状況において、本出願は具体的には、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２３の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２４の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１８の軽鎖及び配列番号２３の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびに配列番号１８の軽鎖及び配列番号２４の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。
【００８６】
配列番号１９及び配列番号２３又は２４に対する軽鎖及び重鎖の同一性はそれぞれ、少なくとも７０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得、定常部についてはさらにより可撓性があり得ることは認識されるであろう。
【００８７】
本開示によって提供される抗体又はその結合フラグメント、特にＣＤＲ−Ｈ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２）又はＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３）のうちのいずれかを含む抗体又はその結合フラグメント、例えば、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＬを含む抗体によって結合するヒトＴａｕの特異的な領域又はエピトープも、本開示によって提供される。
【００８８】
本開示において提供される抗体又はその結合フラグメント、特に配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含む抗体又はその結合フラグメントによって結合するヒトＴａｕ、特に配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域の特異的な領域又はエピトープは、本開示によってさらに提供される。
【００８９】
配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のＴａｕ領域は、位置１９８（Ｓ１９８）、１９９（Ｓ１９９）、２０２（Ｓ２０２）におけるセリン残基及び位置２０５におけるトレオニン残基（Ｔ２０５）に対応する４つの起こり得るリン酸化部位を含む。
【００９０】
「配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域」という用語は、Ｓ１９８、Ｓ１９９、Ｓ２０２及びＴ２０５から選択される少なくとも１つのリン酸化された残基を含む配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のＴａｕ領域を指す。当業者が知っているであろうように、リン酸化された残基は例えば、Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）又はＴｈｒ（ＰＯ３Ｈ２）とも呼ばれ得る。
【００９１】
Ｔａｕのこの特異的な領域又はエピトープに対するＴａｕ結合抗体の結合は、本開示によって提供される抗体のうちのいずれか１つとの組み合わせで、当該技術分野で公知の何らかの適切なエピトープマッピング法によって識別することができる。このような方法の例としては、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントによって認識されるエピトープの配列を含有する抗体へ特異的に結合することのできる最小のフラグメントを用いて、本開示のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対する結合について、配列番号５５に由来する変動する長さのペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。中枢神経系における異なるＴａｕアイソフォームの存在を考慮すると、何らかのこのようなアイソフォームが本明細書で詳述される方法において使用され得ることは理解されることになっている。具体的な例において、Ｔａｕの最長のアイソフォーム、すなわち、配列番号５５に定義されるアイソフォーム２型が使用され得る。配列番号５５のＴａｕペプチドは、組換えで、合成で又はＴａｕポリペプチドのタンパク質分解性消化によって生成され得る。抗体を結合するペプチドは、例えば、ウェスタンブロット又は質量分析によって識別されることができる。別の例において、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学的手法は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントによって結合したエピトープを識別するために使用されることができる。いったん識別されると、本発明の抗体を結合するエピトープフラグメントは、必要な場合、同じエピトープを結合する追加の抗体を得るための免疫原として使用されることができる。さらに、本発明の抗体を結合するエピトープフラグメントは、同じエピトープへ結合して、必要な場合、例えば、当該技術分野において公知のリポカリン（「アンチカリン」）、フィブロネクチン（「アドネクチン」、トリネクチン）、クーニッツドメイン、Ｃ型レクチン、トランスフェリン、ガンマ−クリスタリン、システインノット、アンキリン反復配列（「ＤＡＲＰｉｎ」）又はプロテインＡ（「アフィボディ」）由来のタンパク質足場を基にした１０個を超えるアミノ酸を含むタンパク質又はポリペプチドの化合物のような、Ｔａｕの少なくとも凝集を阻害するタンパク質を得るために使用されることができる（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ, ２００４、Ｍｏｓａｖｉら, ２００４、Ｇｉｌｌ及びＤａｍｌｅ，２００６、Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＴｏｌｍａｃｈｅｖ，２００７、Ｂｉｎｚら，２００４）。さらに、同じエピトープを結合する分子には、１０個以下のアミノ酸を含むペプチド及び環状ペプチドならびにペプチド模倣薬を含むさらなる有機分子が含まれる。ペプチド模倣薬は、タンパク質間相互作用において認められるアミノ酸配列に基づいた、及び当該技術分野で公知の化合物である（Ｓｉｌｌｅｒｕｄ及びＬａｒｓｏｎ，２００５）。
【００９２】
この背景に対して、本開示は、別の態様において、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【００９３】
このような抗体は、キメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。
【００９４】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８、Ｓ１９９、Ｓ２０２及びＴ２０５から選択される少なくとも少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【００９５】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＳ１９９から選択される少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【００９６】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ２０２及びＴ２０５から選択される少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【００９７】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【００９８】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９９を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【００９９】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ２０２を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【０１００】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｔ２０５を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【０１０１】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８，Ｓ１９９、Ｓ２０２及びＴ２０５から選択される少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０２】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＳ１９９を含む少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０３】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９９及びＳ２０２を含む少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０４】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ２０２及びＴ２０５を含む少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０５】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＴ２０５を含む少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０６】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＳ２０２を含む少なくとも２つのリン酸化された残基を含む。
【０１０７】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９９及びＴ２０５を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【０１０８】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８、Ｓ１９９、Ｓ２０２及びＴ２０５から選択される少なくとも３つのリン酸化された残基を含む。
【０１０９】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＳ１９９を含む少なくとも３つのリン酸化された残基を含む。
【０１１０】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９９及びＳ２０２を含む少なくとも３つのリン酸化された残基を含む。
【０１１１】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ２０２及びＴ２０５を含む少なくとも３つのリン酸化された残基を含む。
【０１１２】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＴ２０５を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【０１１３】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９８及びＳ２０２を含む少なくとも１つのリン酸化された残基を含む。
【０１１４】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、Ｓ１９９及びＴ２０５を含む少なくとも３つのリン酸化された残基を含む。
【０１１５】
別の態様において、本開示は、配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供し、この中で、当該リン酸化されたＴａｕ領域は、以下の４つのリン酸化された残基、すなわちＳ１９８、Ｓ１９９，Ｓ２０２及びＴ２０５を含む。
【０１１６】
このような抗体は、キメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。
【０１１７】
別の態様において、本開示は、配列番号３５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化されたＴａｕ領域を結合する、単離された中和するＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１１８】
このような抗体は、キメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。
【０１１９】
別の態様において、本開示は、先に説明したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。エピトープへの結合は、例えば、参照としての配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを用いたエピトープマッピングについて説明されるように決定され得る。
【０１２０】
このような抗体は、キメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。
【０１２１】
別の態様において、本開示は、Ｔａｕへの結合について、先に説明したＴａｕ結合抗体と競合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【０１２２】
この状況において、本開示は具体的には、Ｔａｕへの結合について、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを熟慮する。
【０１２３】
このような抗体は、キメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ネズミ化、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。
【０１２４】
Ｔａｕへの結合についての競合は、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨ、又は配列番号９のＶＬ及び配列番号１０のＶＨを含み得る参照抗体又はその結合フラグメントの存在下でのＴａｕへの抗体又はその結合フラグメントの結合の少なくとも約５０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は約１００％ほどの低下によって判定することができる。結合は、ビアコア（登録商標）機器を用いた表面プラズモン共鳴法、種々の蛍光検出技術（例えば、蛍光相関分光法、蛍光交差相関、蛍光寿命測定など）又は種々のタイプのラジオイムノアッセイ又は標的分子に対する抗体結合を追うために使用される他のアッセイを用いて測定され得る。
【０１２５】
「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」という用語は、当該抗体又はその結合フラグメントが、Ｔａｕへその可変部を経由して特異的に結合する、すなわち、Ｔａｕ抗原を、Ｔａｕの類似体ではない他の抗原よりも大きな親和性で結合することを意味する。「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」は、Ｔａｕへその可変部を経由して、Ｔａｕの類似体ではない他の抗原よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０、２０、１００、１０３、１０４、１０５又は少なくとも１０６倍の親和性で結合する。Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントがそれにもかかわらず、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの可変部の外側にある配列との相互作用を通じて他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ又はＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用することは理解されるであろう。Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの可変部の外側にある配列によって、特にＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの定常部によって仲介されるこのような後者の結合特性は、「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」という用語によって包含されることを意味するものではない。抗体の結合特異性を判定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当該技術分野において通例で実施される。Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ナノモル濃度の範囲での抗体の抗原に対する当該抗体（又はその結合フラグメント）の結合の親和性に対して平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。したがって、ＫＤは、約１×１０−６未満、例えば、約２×１０−７以下のような、約５×１０−７未満であり得、例えば、例において説明される表面プラズモン共鳴法及びビアコア装置を用いて測定されることができる。
【０１２６】
先に記載されたように、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。全長の抗体には、定常部及び可変部が含まれる。定常部は、抗体の抗原結合フラグメントにおいてその全長で存在する必要はないことがある。しかしながら、適用がＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを仲介する抗体の使用を考慮する場合はどこでも、結合フラグメントが、なおもＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを仲介することができるのに十分な長さの定常部を含まなければならないことは理解されることになっている。
【０１２７】
先に記載されたように、本開示は、ヒト化に対する代替物質として生成することのできるヒトＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントにも言及する。例えば、免疫化の際に、内在性ネズミ抗体の産生の非存在下で、完全なレパートリーのヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）は、当該技術分野で公知である。例えば、キメラマウス及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接合部（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が内在性抗体産生の完全な阻害を結果的に生じることは説明されてきた。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、当該抗原を用いたヒト生殖系列免疫グロブリン胃炎死を保有するトランスジェニック動物の免疫化の際に、特定の抗原に対する特異性を有するヒト抗体の産生を結果的に生じるであろう。このようなトランスジェニック動物を作出するための技術、及びこのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び生成するための技術は、当該技術分野で公知である（Ｌｏｎｂｅｒｇ，２００５、Ｇｒｅｅｎ，１９９９、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＧｒｅｅｎ，２００２、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，１９９９）。あるいは、トランスジェニック動物、例えば、マウスにおいて、マウス抗体の可変部をコードする免疫グロブリン遺伝子のみが、対応するヒト可変部免疫グロブリン遺伝子配列と置き換えられる。抗体定常部をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は、未変化のままである。この方法で、抗体エフェクターは、トランスジェニックマウスの免疫系において機能し、結果的にＢ細胞の発達が本質的に変わらず、このことは、インビボでの抗原負荷に及ぼす改善された抗体応答をもたらし得る。関心対象の特定の抗体をコードする遺伝子がいったんこのようなトランスジェニック動物から単離された場合、定常部をコードする遺伝子は、完全ヒト抗体を得るためにヒト定常部遺伝子と置き換えられることができる。ヒト抗体抗体フラグメントをインビトロで得るための他の方法は、ファージディスプレイ技術又はリボソームディスプレイ技術のようなディスプレイ技術に基づいており、この中で、少なくとも一部人工的に、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）部遺伝子レパートリーからのいずれかで作製された組換えＤＮＡライブラリが使用される。ヒト抗体を作製するためのファージディスプレイ技術及びリボソームディスプレイ技術は、当該技術分野で周知である（Ｗｉｎｔｅｒら，１９９４、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００２、Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ，２００２、Ｇｒｏｖｅｓ及びＯｓｂｏｕｒｎ，２００５、Ｄｕｆｎｅｒら，２００６）。
【０１２８】
ヒト抗体は、関心対象の抗原でエクスビボで免疫化され、その後融合してハイブリドーマを作製し、次に当該ハイブリドーマを最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる、単離されたヒトＢ細胞からも作製され得る（Ｇｒａｓｓｏら，２００４、Ｌｉら，２００６）。
【０１２９】
本明細書で使用する「中和するＴａｕ結合抗体」という用語は、Ｔａｕへ結合してその少なくとも１つの生物活性を阻害する抗体を指す。特定の実施形態において、本明細書で使用する「中和するＴａｕ結合抗体」は、インビトロアッセイにおける、例えば、以下の実験３．１において説明されるような例えばインビトロアッセイにおけるような、Ｔａｕ凝集を結合及び阻害する抗体を指す。
【０１３０】
本明細書で使用する「抗体」という用語は概して、すなわち２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる要素を含む無処置（全、完全長）抗体に関する。抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５において開示される分子ＤＶＤ−Ｉｇ、又はＷＯ２０１１／０３０１０７において説明されるいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃにより、さらなる追加の結合ドメインを含み得る。したがって、本明細書で採用される抗体には、二価、三価又は四価の全長抗体が含まれる。
【０１３１】
抗体の結合フラグメントには、一本鎖抗体（すなわち、全長の重鎖及び軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｃ、ジスルフィド安定化したＦａｂ−ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、二価、三価もしくは四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トライボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨフラグメント及びＶＮＡＲフラグメントのようなドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ならびに上述のうちのいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６、Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを作製及び生成するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマット及びそのジスルフィド安定化版は、ＷＯ２００９／０４０５６２において最初に開示され、Ｆａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２において最初に開示された。Ｆａｂ−ｓｃＦｖのジスルフィド安定化形態は、ＷＯ２０１３／０６８５７１において説明された。ｓｃＦｃフォーマットを含む抗体フォーマットは、ＷＯ２００８／０１２５４３において最初に説明された。本発明における使用のための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１において説明されるＦａｂフラグメント及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。
【０１３２】
多価抗体は、多重特異性、例えば二重特異性を含み得、又は単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者の１つのこのような例は、ＷＯ９２／２２５８３において説明される三価Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【０１３３】
一実施形態において、Ｆａｂフラグメントが提供される。
【０１３４】
一実施形態において、Ｆａｂ’フラグメントが提供される。
【０１３５】
典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変部ＶＨ、定常部ＣＨ１及び天然の又は修飾されたヒンジ部を含み、ならびに軽鎖が可変部ＶＬ及び定常部ＣＬを含む、重鎖及び軽鎖の対を含む。
【０１３６】
一実施形態において、例えば、二量体化がヒンジを通じてであり得るＦ（ａｂ’）２を作製するために、本開示によるＦａｂ’の二量体が提供される。
【０１３７】
一実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、結合ドメインを含む。結合ドメインは概して、６個のＣＤＲを含み、３個は重鎖由来、及び３個は軽鎖由来であろう。一実施形態において、ＣＤＲは、フレームワークにあり、まとめて可変部を形成する。したがって、一実施形態において、抗体又は結合フラグメントは、軽鎖可変部及び重鎖可変部を含む、抗原に対して特異的な結合ドメインを含む。本開示によって提供されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの親和性が、当該技術分野で公知の適切な方法を用いて変化し得ることは認識されるであろう。本開示はそれゆえ、Ｔａｕに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。このようなバリアントは、ＣＤＲを変異させること（Ｙａｎｇら，Ｊ. Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖のシャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む、いくつかの親和性成熟化プロトコルによって得られることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、親和性成熟化に関するこれらの方法を考察している。
【０１３８】
したがって、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、例えば、１つ又は２つ以上の保存的置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の保存的置換）を有する軽鎖又は重鎖の、上述の具体的に記載されたアミノ酸配列のうちのいずれかも包含する。保存的置換についての候補であるアミノ酸配列の位置を決定することができ、何らかの特定のアミノ酸についての保存的置換をもたらす合成の及び天然のアミノ酸を選択することができる。保存的置換を選択することについての考慮には、何らかの特定のアミノ酸置換がなされる状況、側鎖の疎水性又は極性、側鎖の一般的な大きさ、及び生理学的条件下で酸性又は塩基性の特徴を有する側鎖のｐＫ値が含まれる。例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンはしばしば、互いに適切に置換される。当該技術分野で公知のように、このことは、３つのアミノ酸はすべて塩基性側鎖を有するからであるが、リジン及びアルギニンの側鎖についてのｐＫ値は、ヒスチジン（約６）よりも互いに非常に近い（約１０及び１２）。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンはしばしば、互いに適切に置換され、但し、グリシンがしばしば、当該群の他のメンバーと適切に置換されることがないことを条件とする。しばしば互いに適切に置換されるアミノ酸の他の群には、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群、ならびにセリン、トレオニン、及び任意にチロシンからなる群が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本発明についての文脈において記載されるようなＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、本明細書に開示される例示的な抗体、フラグメント及び配列の誘導体を包含し得る。「誘導体」には、化学的に修飾されたＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントが含まれる。化学修飾の例としては、水溶性ポリマー、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物、糖、リン酸塩のような１つ又は２つ以上のポリマーの、及び／又はフルオロフォアのような検出可能な標識のような他のこのような分子の共有結合が挙げられる。
【０１４０】
所望の場合、本発明における使用のためのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントはしたがって、１つ又は２つ以上のエフェクター分子（複数可）へ共役し得る。エフェクター分子が、本発明の抗体へ結合することのできる単一の部分を形成するよう連結された単一のエフェクター分子又はこのような２つ以上のエフェクター分子を含み得ることは認識されるであろう。エフェクター分子へ連結された抗体フラグメントを得ることが所望の場合、このことは、抗体フラグメントがエフェクター分子へ直接又はカップリング剤を介してのいずれかで連結される標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体へ共役させるための技術は、当該技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  第２版，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），１９８７，ｐｐ．６２３−５３、Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。エフェクター分子を共役させるためのこれらの技術には、部位特異的共役又は非部位特異的なもしくは無作為な共役が含まれ得る。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ  ９３／０６２３１、ＷＯ  ９２／２２５８３、ＷＯ  ８９／００１９５、ＷＯ  ８９／０１４７６及びＷＯ  ０３／０３１５８１において説明されるものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ  ８６／０１５３３及び欧州特許第３９２７４５号において説明される組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。あるいは、エフェクター分子に対する特定の付着部位は、例えば、ＷＯ  ２００８／０３８０２４において説明されるように、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントへと操作され得る。さらに、カップリング剤は、例えば、ＷＯ  ２００５／１１３６０５において説明されるように、エフェクター分子を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントへ連結するのに使用され得る。先に列挙した可能性が、それ自体で又は組み合わせで使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【０１４１】
本明細書で使用されるエフェクター分子という用語には、例えば、薬剤、毒素、生物活性のあるタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然のポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及び、蛍光化合物又はＮＭＭＲ分光法もしくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物のようなレポーター群が含まれる。
【０１４２】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８のようなキレート化放射性核種又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害薬、タキソイド及びスラミンのような、しかしこれらに限定されない薬剤が含まれ得る。
【０１４３】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。関心対象の酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。関心対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素のような毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子もしくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓薬もしくは血管新生抑制薬、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは他の成長因子及び免疫グロブリンのような生物応答修飾薬、又は当該技術分野において公知のリポカリン（「アンチカリン」）、フィブロネクチン（「アドネクチン」、トリネクチン）、クーニッツドメイン、Ｃ型レクチン、トランスフェリン、ガンマ−クリスタリン、システインノット、アンキリン反復配列「ＤＡＲＰｉｎ」）、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメイン（「フィノマー」）又はプロテインＡ（「アフィボディ」）由来のタンパク質足場を基にした１０個を超えるアミノ酸を含む他のタンパク質もしくはポリペプチドの化合物が含まれるが、これらに限定されない（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ, ２００４、Ｍｏｓａｖｉら, ２００４、Ｇｉｌｌ及びＤａｍｌｅ，２００６、Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＴｏｌｍａｃｈｅｖ，２００７、Ｂｉｎｚら，２００４、Ｓｉｌａｃｃｉら，２０１４）。
【０１４４】
他のエフェクター分子には、血液脳関門通過を亢進又は容易にするペプチド及びタンパク質が含まれる。例えば、ＷＯ２０１０／０４３０４７、ＷＯ２０１０／０６３１２２、ＷＯ２０１０／０６３１２３又はＷＯ２０１１／０４１８９７は、血液脳関門を通過して治療用分子を輸送することのできるベクターとして作用し得るペプチド又はポリペプチド、及びこれらを治療用分子へ共役させる方法を説明している。血液脳関門通過との関連ににおける関心対象のペプチド及びタンパク質には、トランスフェリン受容体、グルコース受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８型、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１型及びヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、エフェクター分子は、先の血液脳関門受容体のうちの１つへ特異的に結合するドメイン抗体のような抗体フラグメント、ラクダ抗体又はサメ由来抗体（ＶＮＡＲ）である。
【０１４５】
他のエフェクター分子には、例えば、診断において有用な検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補綴群（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放射断層撮影法もしくは単一光子放射断層撮影法において使用され得るようなポジトロン放射材料、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬としての使用のために抗体へ共役することのできる金属イオンについては概して、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補綴群には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが含まれ、適切な発光材料には、ルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、ならびに適切な放射性核種には、１２４Ｉ  １２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ及び１８Ｆが含まれる。診断に有用な検出可能な物質として適した特定のタイプのエフェクター分子には、Ｗｙｆｆｅｌｓら  ２０１４，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４１（２０１４）：５１３−５２３において説明される電子欠乏性テトラジン及びトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）が含まれ、ここで、テトラジンへ連結した本発明のＴａｕ結合抗体が投与され得、最大取り込み及び非標的部位からの十分な除去に到達することを許容し得、次いで、適切な放射性核種で標識されたＴＣＯ又は最適化されたＴＣＯ類似体のその後の投与があり、それにより、ＴＣＯは、本発明のＴａｕ結合抗体においてテトラジンを共有結合するであろうし、例えば、ポジトロン放射断層撮影法又は単一光子放射断層撮影法によるテトラジンの検出を許容するであろう。
【０１４６】
一実施形態において、放射性核種へ又はテトラジンへ連結されたＴａｕ結合型のＦａｂ、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖが提供される。放射性核種に対する又はテトラジンに対する連結は、抗体フラグメントに位置する何らかの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、何らかの遊離したアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を通じての付着を介してなされ得る。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて自然に生じ得、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントへと操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、修飾されたＦａｂフラグメントであり、この中で、当該修飾は、当該フラグメントの重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の付着を許容するための１つ又は２つ以上のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ又は２つ以上のシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ部を形成する。一実施形態において、放射性核種が１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、又は６８Ｇａのような金属である場合、このことは、例えば、Ｔｕｒｎｅｒら（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９４，７０：３５−４１；  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｕｍ−１１１−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｂ７２．３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ)によって説明される大環状キレーターによって結合し得、それにより後者は順に、当該抗体又は抗体フラグメントの上述のアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基（又は複数可）へ共有結合する。さらなる実施形態において、放射性核種の結合した大環状キレートは、２つ以上の抗Ｔａｕ抗体又はその結合フラグメントを連結するクロスリンカーの一部である、ＷＯ０５／１１３６０５において説明されるエフェクター分子であり得る。
【０１４７】
別の例において、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を延長し得、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ得、及び／又は上皮性関門を通過して免疫系に至る抗体の送達を亢進し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、及びアルブミン結合タンパク質又はＷＯ０５／１１７９８４において説明されるもののようなアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０１４８】
このようなエフェクター分子がポリマーである場合、概して、合成又は天然のポリマー、例えば、任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖のポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマーもしくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝鎖もしくは非分枝鎖の多糖、例えば、ホモ多糖もしくはヘテロ多糖であり得る。
【０１４９】
上述の合成ポリマーにおいて存在し得る具体的な任意置換には、１つ又は２つ以上のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が含まれる。
【０１５０】
合成ポリマーの具体例としては、任意に置換された直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体のような、任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
【０１５１】
具体的な天然ポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はこれらの誘導体が含まれる。
【０１５２】
一実施形態において、エフェクター分子は、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントのような、アルブミン又はそのフラグメントである。
【０１５３】
ポリマーの大きさは、所望の通り変化し得るが、概して、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａのような５０００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲にあるであろう。ポリマーの大きさは特に、生成物の企図される使用、例えば、脳のようなある特定の組織へ局在する又は循環半減期を延長する能力を基に選択され得る（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、当該生成物が、循環系を出て組織に浸透する場合である。
【０１５４】
適切なポリマーには、分子量が約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲にあるポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）もしくはその誘導体のような、ポリアルキレンポリマーが含まれる。
【０１５５】
一例において、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分へ付着する。１つの特定の例において、抗体は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント及びＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する何らかの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、何らかの遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を通じて付着し得る。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて自然に生じ得、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントへと操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、修飾されたＦａｂフラグメントであり、この中で、当該修飾は、その重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の付着を許容する１つ又は２つ以上のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ又は２つ以上のシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ部を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を使用することができる。
【０１５６】
適切に、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有結合する。修飾された抗体フラグメントへ付着した各ポリマー分子は、当該フラグメントに位置するシステイン残基の硫黄原子へ共有結合し得る。当該共有結合は概して、ジスルフィド結合又は、特に硫黄−炭素結合であろう。チオール基が適切に活性化されたエフェクター分子の付着点として使用される場合、例えば、マレイミドのようなチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、先に説明したポリマー修飾された抗体フラグメントの調製における出発材料として使用され得る。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステルのようなチオール反応基を含有する何らかのポリマー、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、スルホンビニル又はジスルフィドであり得る。このような出発材料は、商業的に得られ得（例えば、Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社，米国アラバマ州ハンツビル市）、又は従来の化学的手順を用いて市販の出発材料から調製され得る。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【０１５７】
別の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部をコードする核酸配列を含む核酸分子に対する、ならびにＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３をコードする核酸配列を含む核酸分子に対するＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【０１５８】
例として、ＡＢ１のＶＬ（配列番号７）は、配列番号２６によってコードされ得る。ＡＢ１のＶＨ（配列番号８）は、配列番号２７によってコードされ得る。
【０１５９】
配列番号１１のヒト化ＶＬは、配列番号３０によってコードされ得る。配列番号１２のヒト化ＶＬは、配列番号３１によってコードされ得る。配列番号１４のヒト化ＶＨは、配列番号３２によってコードされ得、配列番号１５のヒト化ＶＨは、配列番号３３によってコードされ得る。
【０１６０】
配列番号１７のヒト化軽鎖は、配列番号３４によってコードされ得る。配列番号１８のヒト化軽鎖は、配列番号３５によってコードされ得る。配列番号２０のヒト化重鎖は、配列番号３６によってコードされ得、配列番号２１のヒト化重鎖は、配列番号３７によってコードされ得る。配列番号２３のヒト化重鎖は、配列番号３８によってコードされ得、配列番号２４のヒト化重鎖は、配列番号３９によってコードされ得る。
【０１６１】
Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、単一の核酸（例えば、当該抗体の軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする塩基配列を含む単一の核酸）によって、又は２つ以上の別個の核酸によってコードされ得、これらの各々は、当該抗体又は抗体フラグメントの異なる一部をコードする。この点において、本開示は、上述の抗体のうちのいずれか又は結合フラグメントをコードする１つ又は２つ以上の核酸を提供する。当該核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらに類するものであり得る。
【０１６２】
例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列から所望の通り、又は対応するアミノ酸配列を基にして合成され得る。アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に対して広く入手可能であり、当業者が公知のアミノ酸配列を基にして容易に合成することができる。
【０１６３】
分子生物学の標準的な技術は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用され得る。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発技術及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、適宜使用され得る。
【０１６４】
好ましくは、コードする核酸配列は、原核細胞又は真核細胞における発現を許容する発言制御配列へ操作可能に連結される。当該ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。当該エレメントは通常、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに任意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。追加の調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサー、ならびに／又は天然に会合した若しくは異種性のプロモーター領域を含み得る。
【０１６５】
さらなる態様における本開示はしたがって、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントをコードするこのような核酸配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。
【０１６６】
「ベクター」とは、例えば、コードされたポリペプチドの合成が生じることのできる適切な宿主細胞へと核酸配列を運搬する能力を有する何らかの分子又は組成物である。典型的には及び好ましくは、ベクターとは、当該技術で公知である組換えＤＮＡ技術を用いて操作して所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込んだ核酸である。発現ベクターは典型的には、以下の構成要素（核酸分子によってまだ提供されていない場合）、すなわちプロモーター、１つ又は２つ以上のエンハンサー配列、複製起源、転写終結配列、ドナー及びアクセプターのスライス部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現することになっているポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカーエレメントのうちの１つ又は２つ以上を含有する。
【０１６７】
ベクターは典型的には、当該ベクターが使用されるであろう宿主細胞において機能的であるよう選択される（当該ベクターは、当該遺伝子及び／又は当該遺伝子の発現が生じることができるように宿主細胞機械と互換性がある）。
【０１６８】
さらなる態様における本開示はしたがって、先に説明したクローニングベクターもしくは発現ベクターならびに／又は先に説明したＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントをコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供する。
【０１６９】
宿主細胞は、核酸又はベクターによりコードされたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを生成するよう、当該核酸又はベクターを用いて形質転換することのできる何らかのタイプの細胞であることができる。当該核酸又はベクターを含む宿主細胞は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントあるいはその一部（例えば、当該核酸又はベクターによってコードされる重鎖配列又は軽鎖配列）を生成するために使用することができる。当該核酸又はベクターを細胞へ導入した後、細胞を、コードした配列の発現に適した条件下で培養する。次に、抗体、抗原結合フラグメント、又は抗体の一部は、細胞から単離されることができる。
【０１７０】
宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）又は真核宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞、又は脊椎動物細胞のような）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される時、その後、培地（宿主細胞が培地へ抗体又はその結合フラグメントを分泌する場合）から又は抗体もしくはその結合フラグメントを産生する宿主細胞から（宿盗細胞が分泌しない場合）直接収集されることのできる当該抗体又はその結合フラグメントを発現する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、グリコシル化又はリン酸化のような活性に対して望まれる又は必要なポリペプチド修飾、及び生物活性のある分子への折り畳みのしやすさのような種々の因子によるであろう。宿主細胞の選択は、抗体又はその結合フラグメントが転写後修飾される（例えば、グリコシル化される及び／又はリン酸化される）ことになっているかどうかに一部よるであろう。そうである場合、酵母、昆虫、又は哺乳類の宿主細胞が好ましい。
【０１７１】
適切な哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はハイブリドーマ細胞が含まれる。本発明における使用に適したタイプのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）には、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯＤＸＢ１１細胞のようなかつＤＨＦＲ選択可能マーカーと併用され得るｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、又はグルタミンシンテターゼ選択可能マーカーと併用され得るＣＨＯＫＩ−ＳＶ細胞を含む、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を含み得る。多くは、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），バージニア州マナサス市から入手可能である。例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ６１番）、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞もしくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５７３番）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ９２番）、又はＰＥＲ．Ｃ
６細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。抗体を発現する上での使用に関する他の細胞タイプには、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が含まれる。
【０１７２】
本開示の別の態様は、例えば、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントをコードするＤＮＡからのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの発現をもたらすのに適した条件下で、例えばベクターを含有する宿主細胞を培養すること、及び当該抗体分子を単離することを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの精製のための方法を提供する。
【０１７３】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのみを含み得、いずれの場合においても、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのみをコードする配列が宿主細胞をトランスフェクトするために使用されることが必要である。重鎖お及び軽鎖の両方を含む生成物の生成のために、当該細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターの２つのベクターがトランスフェクトされ得る。あるいは、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターが使用され得る。
【０１７４】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント本開示による抗体及びフラグメントは、良好なレベルで宿主細胞から発現する。したがって、当該抗体及び／又はフラグメントの特性は、商業的な加工をさせやすくする。
【０１７５】
したがって、宿主細胞を培養すること、及びＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを発現させること、後者を単離し、任意にこれを精製して、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供することのための方法が提供される。一実施形態において、当該方法はさらに、エフェクター分子を当該単離された抗体又はフラグメントへ共役させるステップ、例えば、特に本明細書で説明されるＰＥＧポリマーへ共役させるステップを含む。
【０１７６】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、組成物、特に医薬組成物又は診断用組成物において製剤化されることができる。医薬組成物は、治療有効量又は予防有効量のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを、適切な担体、例えば、診断上許容され得る薬剤との混合で含む。
【０１７７】
本医薬組成物における使用のための医薬として許容され得る薬剤には、担体、賦形剤、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、抗酸化物質、防腐剤、着色剤、香料及び希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、乳化剤、懸濁剤、溶剤、充填剤、増量剤、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗菌薬、ならびに界面活性剤が含まれる。
【０１７８】
当該組成物は、液状に又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）形態もしくは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）形態にあることができ、１つ又は２つ以上の凍結防止剤、賦形剤、界面活性剤、高分子量構造付加剤及び／又は増量剤を含み得る（例えば、米国特許第６，６８５，９４０号、第６，５６６，３２９号、及び第６，３７２，７１６号を参照されたい）。
【０１７９】
組成物は、非経口投与に適していることができる。例示的な組成物は、関節内経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、脳内（くも膜下内）経路、脳室内経路、筋肉内経路、眼内、動脈内、病変内経路のような、当業者に利用可能な何らかの経路による、動物への注射又は注入に適している。非経口製剤は典型的には、医薬として許容され得る防腐剤を任意に含有している、滅菌済みの、発熱物質非含有の、等張性水溶液であろう。
【０１８０】
非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、塩類溶液及び緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養物質の補液、リンガーデキストロースに基づいた補液のような電解質の補液、ならびにこれらに類するものが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化物質、キレート剤、不活性ガス及びこれらに類するもののような、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。概して、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１６版，Ｍａｃｋ編，１９８０を参照されたい。
【０１８１】
本明細書で説明される医薬組成物は、特定の局所環境における生成物の局所濃度（例えば、ボーラス、デポー作用）及び／又は安定性もしくは半減期の増大を提供する様式で徐放性送達又は持効性送達のために製剤化することができる。当該組成物には、後にデポー注射として送達することのできる作用薬の徐放性又は持効性を準備するポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の粒子状調製物、ならびに生分解性マトリックス、注射可能な微小球、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体分解可能な粒子ビーズ、リポソーム、及び植え込み可能な送達装置のような薬剤の粒子状調製物を用いた、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸又はベクターの製剤が含まれることができる。
【０１８２】
あるいは又は加えて、当該組成物は、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸、又はベクターが吸収又は封入されたメンブレン、スポンジ、又は他の適切な材料の、罹患した領域への植え込みを介して、局所的に投与することができる。植え込み装置を使用する場合、当該装置は、何らかの適切な組織又は器官へと植え込まれることができ、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸、又はベクターの送達は、ボーラスを介して直接、又は連続投与を介して、又は連続注入を用いるカテーテルを介して当該装置を通じて直接であることができる。
【０１８３】
Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物は、例えば、乾燥粉末としてのように吸入用に製剤化されることができる。吸入溶液は、エアゾール送達用液化高圧ガス中に製剤化することができる。さらに別の製剤において、溶液は、霧状化され得る。
【０１８４】
本開示の一態様は、疾患の治療における治療活性のある薬剤としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。
【０１８５】
本開示の別の態様は、タウオパチーの治療におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。Ｔａｕ封入体を含むことが説明されてきたタウオパチー（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａら．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３（２０１３）３４２−３４９）には、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症−認知症合併症、好銀性粒子病、慢性外傷性脳症、皮質基底核変性、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ＭＡＰＴ変異起因性１７番染色体連関型前頭側頭型認知症及びパーキンソン症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、グアドループ島型パーキンソン症、筋緊張性ジストロフィー、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化病併発性非グアマニアン型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン症、プリオンタンパク質性脳アミロイド血管症、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、変化のみの認知症、ならびに球状神経膠封入体を伴う白質タウオパチーが含まれる。
【０１８６】
本開示の別の態様はしたがって、アルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の処置におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。
【０１８７】
同様に、本開示は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺を処置することを必要とする対象へ、治療活性のある量のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを投与することによって、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺を処置する方法にも関する。
【０１８８】
本開示は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の処置のための薬剤の製造におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用にも関する。
【０１８９】
本開示の別の態様において、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、療法において単独で又は他の薬剤との組み合わせでのいずれかで使用され得る。例えば、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、少なくとも１つの追加の治療薬と併用投与され得る。ある特定の態様において、追加の治療薬は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが処置するために使用中であるのと同じ又は異なる障害を処置するのに情動的な治療薬である。例示的な追加の治療薬には、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、ロバスチグミン、及びタクリンのような）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（メマンチンのような）、アミロイドベータペプチド凝集阻害薬、抗酸化物質、ガンマ−セクレターゼ調節薬、神経成長因子（ＮＧＦ）模倣薬もしくはＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙアゴニスト、ＨＭＳ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（スタチン）、アンパキン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害薬、静脈内免疫グロブリン、ムスカリン性受容体アゴニスト、ニコチン性受容体調節薬、能動的又は受動的アミロイドベータペプチド免疫化、ホスホジエステラーゼ阻害薬、セロトニン受容体アンタゴニスト及び抗アミロイドベータペプチド抗体又はさらなる抗タウ抗体が含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的な神経学的薬剤は、成長ホルモン又は神経栄養因子から選択され得、例としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン４型／５型、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２型及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）３型、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞成長宇因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、ＴＧＦベータ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１型受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン類、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン１型、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン類、サポシン類、セマフォリン、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、当該少なくとも１つの追加の治療薬は、神経学的薬剤の１つ又は２つ以上の副作用を軽減する能力について選択される。先に記載されたこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）、及び個別投与を包含し、いずれの場合においても、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与後に生じることができる。Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、当該技術分野で公知の及び処置又は予防されることになっている神経学的障害に適切な、放射線療法、行動療法、又は他の療法のような、しかしこれらに限定されない他の介入療法と併用することもできる。
【０１９０】
本開示の別の態様は、診断活性のある薬剤としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。
【０１９１】
本開示の一態様は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の診断におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用にも関する。
【０１９２】
このような診断検査は好ましくは、生物試料に関して実施され得る。「生物試料」は、個体から得られた種々の試料タイプを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる。当該定義は、脳脊髄液、血液及び生物起源の他の液体試料、生検標品もしくは組織培養物又はそれらから得られる細胞及び当該細胞の後代のような固体組織試料を包含する。当該定義には、試薬を用いた処置、可溶化、又はポリヌクレオチドのようなある特定の成分についての濃縮などによる、当該試料の獲得後に何らかの方法で操作されたものも含まれる。「生物試料」という用語は、臨床試料を包含し、これには培養物、細胞上清、細胞可溶化液、血清、生物流体、及び組織試料における細胞も含まれる。「生物試料」という用語には、尿、唾液、脳脊髄液、血漿及び血清のような血液画分、ならびにこれらに類するものが含まれる。
【０１９３】
診断検査は好ましくは、ヒト又は動物の身体と接触していない生物試料に関して実施され得る。このような診断検査は、インビトロ検査とも呼ばれる。
【０１９４】
インビトロ診断検査は、ｉ）生物試料を本明細書に説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと接書させるステップ、ならびにｉｉ）Ｔａｕに対する本明細書で説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの結合を検出するステップを含む、個体から得られた生物試料におけるＴａｕを検出するインビトロ法に寄り得る。検出されたＴａｕレベルを適切な対照と比較することによって、次に、アルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーの存在又は発症見込みを診断することができる。このような検出方法はしたがって、対象がタウオパチーに罹患しているかどうか、又はタウオパチーを発症する危険にあるかどうかを、タウオパチーの病期（重症度）を判定することを含めて判定するために使用することができる。
【０１９５】
本開示はしたがって、ｉ）本明細書で説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを使用することによって、対象から得た生物試料におけるＴａｕのレベル又は状態を評価するステップ、及びｉｉ）Ｔａｕのレベル又は状態を、基準値、標準値、又は正常対照対象におけるＴａｕのレベルもしくは状態を示す正常対照値と比較するステップを含む、対象におけるアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーを診断するインビトロ法を提供する。Ｔａｕポリペプチドのレベル及び／又は状態の、生物試料と正常対照値の間の有意差は、個体がアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーに罹患していることを示す。
【０１９６】
本明細書で説明してきたこれらの種々の態様及び実施形態に関してい、本開示はとりわけ、以下を熟慮する。
【０１９７】
１．単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントであって、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号６もしくはそれと少なくとも０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０１９８】
２．配列番号１から選択されるＣＤＲ１、配列番号２から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに
配列番号４から選択されるＣＤＲ１、配列番号５から選択されるＣＤＲ２、及び／又は配列番号６から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、実施形態１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０１９９】
３．配列番号３のＸ１は、Ａである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２００】
４．配列番号３のＸ１は、Ｇである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０１】
５．配列番号６のＸ２は、Ａである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０２】
６．配列番号６のＸ２は、Ｑである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０３】
７．配列番号６のＸ２は、Ｎである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０４】
８．配列番号６のＸ２は、Ｄである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０５】
９．配列番号６のＸ２は、Ｓである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０６】
１０．モノクローナル抗体である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０７】
１１．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態10に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０８】
１２．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体である、実施形態１１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２０９】
１３．配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化Ｔａｕ領域へ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１０】
１４．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態又はヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１１】
１５．配列番号７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１２】
１６．配列番号７を含む軽鎖可変部、及び
配列番号８を含む重鎖可変部
を含む、実施形態１５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１３】
１７．配列番号７のＸ１は、Ａである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１４】
１８．配列番号７のＸ１は、Ｇである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１５】
１９．配列番号８のＸ２は、Ａである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１６】
２０．配列番号８のＸ２は、Ｑである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１７】
２１．配列番号８のＸ２は、Ｎである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１８】
２２．配列番号８のＸ２は、Ｄである、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２１９】
２３．配列番号ＳのＸ２である、実施形態１５又は１６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２０】
２４．モノクローナル抗体である、実施形態１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２１】
２５．キメラ抗体である、実施形態２４に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２２】
２６．配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化Ｔａｕ領域へ結合する、実施形態１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２３】
２７．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトｔａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態又はヒトＴａｕ及びヒトｔａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２４】
２８．配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２５】
２９．配列番号１３もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１６もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２６】
３０．配列番号１３を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１６を含む重鎖可変部
を含む、実施形態２９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２７】
３１．配列番号１３のＸ１は、Ａである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２８】
３２．配列番号１３のＸ１は、Ｇである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２２９】
３３．配列番号１６のＸ２は、Ａである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３０】
３４．配列番号１６のＸ２は、Ｑである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３１】
３５．配列番号１６のＸ２は、Ｎである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３２】
３６．配列番号１６のＸ２は、Ｄである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３３】
３７．配列番号１６のＸ２は、Ｓである、実施形態２９又は３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３４】
３８．当該重鎖可変部は、配列番号１４又は１５を含む、実施形態２９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３５】
３９．当該軽鎖可変部は、配列番号１１又は１２を含む、実施形態２９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３６】
４０．モノクローナル抗体である、実施形態２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３７】
４１．ヒト化抗体である、実施形態４０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３８】
４２．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである、実施形態４１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２３９】
４３．配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内のリン酸化Ｔａｕ領域へ結合する、実施形態２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１又は４２のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４０】
４４．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態、又はヒトＴａｕ及びヒトＴａｕのらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４１】
４５．配列番号１９もしくはそれと少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号２２もしくはそれと少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖
を含む、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４２】
４６．配列番号１９を含む軽鎖、及び
配列番号２２を含む重鎖
を含む、実施形態４５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４３】
４７．配列番号１９のＸ１は、Ａである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４４】
４８．配列番号１９のＸ１は、Ｇである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４５】
４９．配列番号２２のＸ２は、Ａである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４６】
５０．配列番号２２のＸ２は、Ｑである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４７】
５１．配列番号２２のＸ２は、Ｎである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４８】
５２．配列番号２２のＸ２は、Ｄである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２４９】
５３．配列番号２２のＸ２は、Ｓである、実施形態４５又は４６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５０】
５４．当該重鎖可変部は、配列番号１４又は１５を含む、実施形態４５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５１】
５５．当該軽鎖可変部は、配列番号１１又は１２を含む、実施形態４５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５２】
５６．モノクローナルヒト化抗体である、実施形態４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５３】
５７．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである、実施形態５６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５４】
５８．配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内に含むリン酸化Ｔａｕ領域へ結合する、実施形態４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５５】
５９．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態又はヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７又は５８のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５６】
６０．配列番号５５のアミノ酸１９７〜２０６内に含むリン酸化Ｔａｕ領域へ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５７】
６１．モノクローナル抗体である、実施形態６０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５８】
６２．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態６０又は６１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２５９】
６３．当該ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのモノクローナル抗体ヒト化抗体又はその結合フラグメントである、実施形態６２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６０】
６４．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態又はヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態６０、６１、６２、又は６３のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６１】
６５．Ｔａｕへの結合に対して、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６２】
６６．Ｔａｕへの結合に対して、
配列番号１１又は１２を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１４又は１５を含む重鎖可変部
を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、実施形態６５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６３】
６７．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６又は６７のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６４】
６８．配列番号１１又は１２を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１４又は１５を含む重鎖可変部
を含むＴａｕ結合抗体又は結合フラグメントＴａｕ結合抗体又は結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、実施形態６７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６５】
６９．モノクローナル抗体である、実施形態６５、６６、６７、又は６８のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６６】
７０．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態６９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６７】
７１．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体である、実施形態７０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６８】
７２．配列番号５５のリン酸化Ｔａｕ領域アミノ酸１９７〜２０６へ結合する、実施形態６５、６６、６７、６８、６９、７０、又は７１のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２６９】
７３．ヒトＴａｕの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の可溶性形態又はヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両可溶性形態へ結合する、実施形態６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、又は７２のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２７０】
７４．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｃ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ダイアボディ、トライアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ、線形抗体、又はＶＨＨ含有抗体である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２又は７３のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２７１】
７５．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードする、単離された核酸分子。
【０２７２】
７６．実施形態７５に記載の１つ又は２つ以上の核酸配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【０２７３】
７７．実施形態７６に記載の１つ又は２つ以上の核酸配列又は実施形態７６の１つ又は２つ以上のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【０２７４】
７８．ヒト胚性幹細胞ではない、実施形態７７に記載の宿主細胞。
【０２７５】
７９．少なくとも
ａ）実施形態７７又は７８に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
ｂ）当該Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを単離するステップ
を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを生成する方法。
【０２７６】
８０．治療活性のある薬剤としての使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２７７】
８１．タウオパチーを処置する上での使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２７８】
８２．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態８１に記載の使用のための、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２７９】
８３．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態８１に記載の使用のための、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２８０】
８４．タウオパチーを処置する必要のある対象へ、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを投与するステップを含む、タウオパチーを処置する方法。
【０２８１】
８５．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態８４に記載の方法。
【０２８２】
８６．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態８５に記載の方法。
【０２８３】
８７．診断薬としての使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２８４】
８８．タウオパチーを診断する上での使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３又は７４のいずれか１つに記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２８５】
８９．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態８８に記載の使用のための、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２８６】
９０．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態８８に記載の使用のための、単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
【０２８７】
さて、本発明は、制限するものとして解釈されることのない一部の例に関して説明される。
【０２８８】
実験
実験１−Ｔａｕ結合抗体の作製
１．１  Ｔａｕペプチドの設計及び生成
ペプチド及びイムノゲンをＰｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．，英国ビショップスウォルサム町によって供給し、Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐｐａｒｄの方法（参考文献：Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．英国オックスフォード市：  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）によるＦｍｏｃ固相ペプチド化学によって合成した。ホスホセリン含有ペプチド（ｐＳｅｒ）、ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）、３−ニトロチロシン（ｎＴｙｒ）及びＮ−ε−アセチルリジン（ａＬｙｓ）をＦｍｏｃ保護された前駆体Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＮＯ２）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨを用いて合成した。
【０２８９】
ホスホセリン（ｐＳｅｒ）、ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）及び／又はニトロソ−チロシン（ｎＴｙｒ）で翻訳後修飾したＴａｕアイソフォームをすべて認識するであろうＴａｕ結合抗体を作製するようペプチドを設計及び使用した。当該ペプチドは、Ｔａｕアイソフォーム２（配列番号５５、Ｕｎｉｐｒｏｔコード：Ｐ１０６３６−８、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９０１．２）に対して整列した残基１９７〜２０６：
Ｎ−アセチル−ｎＴｙｒ  ｐＳｅｒ  ｐＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ＊  ｐＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  ｐＴｈｒ  Ｐｒｏ−アミド
（Ｔ１９７と指定されかつ配列番号５６において定義されるペプチド）
を表す。
【０２９０】
Ｎペプチド末端及びＣペプチド末端をそれぞれアセチル基及びアミド基でキャッピングし、ｃｙｓ＊は、システイン側鎖チオール基が、以下に詳述するように、それぞれイムノゲン又はアッセイ試薬の調製のためのタンパク質又はビオチンを運搬するための連結のための共役地点であることを意味する。抗血清力価をモニターするためのアッセイ試薬を、等量のマレイイミド（ｍａｌｅｉｉｍｉｄｏ）−ＰＥＧ−ビオチン及びペプチドを反応させることによって調製した。３つの異なるイムノゲンを、当該ペプチドと、ε−アミノリジン側鎖上のマレイミド基で置換した以下の担体タンパク質、すなわちキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、先の血清アルブミン（ＢＳＡ）及び卵白アルブミン（ＯＶＡ）との反応によって調製した。
【０２９１】
１．２  免疫化
２匹の雌ニュージーランドホワイトウサギ（２ｋｇ以上）を等容積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中で注射器を用いて激しく混合することによって乳化した５００μｇの総ペプチド混合物（Ｔ１９７及びＴ２１１）で皮下的に免疫化した。ＫＬＨ、ＯＶＡ及びＢＳＡへ共役したペプチドを設計し、交互に免疫化した。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を用いてウサギに２回の追加抗原注射を２１日間隔で与えるとともに、免疫化１４日後に耳から採血した。最終追加の１４日後に終了するとともに、脾臓、骨髄及び末梢血単核細胞の単一細胞懸濁液を調製し、１０％ＤＭＳＯ／ＦＣＳ中で−８０℃で凍結させた。
【０２９２】
１．３  Ｂ細胞培養
Ｂ細胞培養物を、Ｚｕｂｌｅｒら（１９８５）によって説明された方法と類似の方法を用いて調製した。簡潔には、免疫化したウサギからのＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化型脾細胞培養上清及びガンマ照射済み変異ＥＬ４ネズミ胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いたバーコード入り９６穴組織培養プレート中に１ウェルあたりおよそ３０００個の密度で、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で７日間培養した。総じて、およそ１．２×１０７個のＢ細胞を採取した。
【０２９３】
１．４  一次スクリーニング
Ｂ細胞培養上清中のＴ１９７ペプチド特異的抗体の存在を、標的抗原の源としてのビオチン化Ｔ１９７ペプチドを用いてコーティングしたＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる均質蛍光系結合アッセイを用いて判定した。スクリーニングは、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅ液体取り扱い装置を用いて、バーコード入り９６穴組織培養プレートから、ビーズ上に免疫化したＴ１９７を含有するバーコード入りの３８４穴黒色壁アッセイプレート中へと１０ｕｌの上清を転移させることを包含した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて、結合を評価した。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム上で読み取った。
【０２９４】
１．５  二次スクリーニング
一次スクリーニング後、陽性上清を９６穴バーコード入りマスタープレートに、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘヒットピッキングロボットを用いてまとめ、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８００Ｃで凍結させた。次に、マスタープレートをＴ１９７ペプチドに関して、及びストレプトアビジンのみに関してもＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングした。このことは、各ウェルに対するペプチド特異性を判定するために、及びＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎビーズへ非特異的に結合することを示す擬陽性ウェルを除外するために実施した。当該ＥＬＩＳＡアッセイは、炭酸塩コーティング緩衝液（ｄＨ２Ｏ＋０．１６％Ｎａ２ＣＯ３＋０．３％ＮａＨＣＯ３）中のストレプトアビジンでコーティングした３８４穴Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上へのビオチン化Ｔ１９７の捕捉を包含した後、１０ｕｌ／ウェルのＢ細胞培養上清（ブロッキング緩衝液で１：１希釈）とともにインキュベートした。ＨＲＰ共役したヤギ抗ウサギＩｇＧｆｃ二次抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ／Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートへ添加した後、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、１０μｌ／ウェル）を用いた結合の可視化を行った。光学密度を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２μプレートリーダーを用いて６３０ｎＭで測定した。一次結合アッセイは、８８０のヒットを識別し、ＥＬＩＳＡスクリーニング後、当該ヒットのうちの４０６は、Ｔ１９７へ特異的に結合することが示された。Ｔ１９７に対する特異性を実証するＢ細胞上清をＢｉａｃｏｒｅによるさらなる分析のために選択して、当該細胞上清を最良の親和性で識別した。
【０２９５】
１．６  可変部の回収
関心対象のウェルの選択からの抗体可変部遺伝子の回収を可能にするために、逆重畳積分のステップは、Ｂ細胞の異種性集団を含有する付与されたウェルにおける抗原特異的Ｂ細胞の識別を可能にするために実施しなければならなかった。このことは、蛍光焦点法（Ｃｌａｒｇｏら，２０１４）を用いて達成された。簡潔には、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌細胞を、ビオチン化Ｔ１９７ペプチド及び１：１２００の最終希釈のヤギ抗ウサギＦｃγフラグメント特異的ＦＩＴＣ共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ）でコーティングしたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。３７℃で１時間の静的インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞を、当該Ｂ細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により識別することができた。次に、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて識別したこれらの個々のＢ細胞クローンのいくつかを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微小操作装置を用いて拾い、ＰＣＲチューブへと入れた。
【０２９６】
抗体可変部遺伝子を、重鎖及び軽鎖の可変部に特異的なプライマーを用いる逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって単一細胞から回収した。２回のＰＣＲをＡｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘ液体取り扱いロボット上で実施し、入れ子状態になった２回目のＰＣＲは、ウサギＩｇＧ（ＶＨ）又はウサギカッパ（ＶＬ）哺乳類発現ベクターへと可変部のクローニングを可能にする３’末端及び５’末端における制限部位を組み込んだ。３１の異なるウェル由来の抗Ｔ１９７抗体遺伝子を発現ベクター中へとうまくクローニングした。重鎖及び軽鎖のコンストラクトを、Ｆｅｃｔｉｎ  ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞中へと同時トランスフェクトし、組換え抗体を１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で３０ｍｌの容積で発現させた。５〜７日間の発現後、上清を収集し、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２９７】
実験２−識別した抗体のさらなるスクリーニング
２．１  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＴａｕ産生
異なるＴａｕアイソフォームをコードする遺伝子を合成で作製し、コドンを大腸菌における発現のために最適化した。標準的な分子生物学技術を用いて、Ｎ末端６Ｈｉｓ−ＴＥＶタグを有するＴａｕを生成するよう操作した改変ｐＥＴ３２ベクター中へとサブクローニングした。
【０２９８】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を上述のベクターで形質転換し、そのタンパク質を標準的な技術を用いて発現させた。
【０２９９】
次に、大腸菌を遠心分離によって回収し、溶解し、Ｔａｕタンパク質を、ＮｉＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性画分から捕捉した。６Ｈｉｓタグを、ＴＥＶプロテアーゼに続く第二のＮｉＮＴＡクロマトグラフィーステップを用いて除去した。精製したＴａｕを、適用に応じた適切な緩衝液中へと緩衝液交換した。免疫化に対して生じた試料は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ＮｏＥｎｄｏ（商標）カラム（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて取り出した内毒素を有していた。
【０３００】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）試験のための同位体標識したＴａｕの作製
タンパク質発現を、先に説明した通り実施したが、例外として、１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈの当該タンパク質への組み込みのために最少培地を使用した。大腸菌細胞ペレットを溶解し、Ｔａｕタンパク質をＮｉＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィーステップを用いて精製し、６ＨｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼにより除去した後、Ｔａｕタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００単位（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過によって精製した。
【０３０１】
２．２  ＨＥＫ２９３におけるＴａｕ産生
Ｔａｕアイソフォーム２型をコードする遺伝子を、野生型ＤＮＡ配列を用いて合成で作製した。標準的な分子生物学技術を用いて、当該遺伝子を、Ｎ末端１０Ｈｉｓ−ＴＥＶタグを有するＴａｕを産生するよう操作した発現ベクターｐＭＶ−１０ＨｉｓＴＥＶ（ＣＭＶプロモーター含有）中へとサブクローニングした。
【０３０２】
結果として生じるベクターを、製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３（商標）発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。このシステムは、ＨＥＫ２９３細胞株に由来するＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞を用いている。
【０３０３】
Ｔａｕタンパク質は、培地中に蓄積し、そこから当該Ｔａｕタンパク質を、免疫化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて回収した。次に、１０Ｈｉｓタグを、ＴＥＶプロテアーゼを用いて除去した後、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムへと再適用し、フロースルー中にある開裂したＴａｕを収集した。精製したＴａｕを適用に応じた適切な緩衝液中へと緩衝液交換した。
【０３０４】
２．３  ヒト脳試料からのＰＨＦ  Ｔａｕ原線維の調製
対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）−Ｔａｕタンパク質を、アルツハイマー病（ＡＤ）又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に罹患しているドナー由来の脳試料から、Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇ及びＷａｌｌ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  １５，１１−１９，１９９４）によって公開されたプロトコルにより精製した。ＰＨＦ−Ｔａｕが豊富であることがすでに説明されてきた画分８（この参照におけるスクロース勾配遠心分離前の粗ＰＨＦ−Ｔａｕと等価）及び画分１１（画分Ａ２と等価、この参照において説明されるＳＤＳ可溶性ＰＨＦ）を回収し、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ及び実験３の細胞アッセイに使用した。
【０３０５】
２．４  ＥＬＩＳＡスクリーニング
次に、精製した抗体をＥＬＩＳＡによる及びＢｉａｃｏｒｅによるさらなるスクリーニングへ供し、組換え抗体の活性を確認し、最高の親和性のかつ最も特異的である抗体を選択した。ＥＬＩＳＡアッセイはまた、ビオチン化したＴ１９７の、炭酸塩コーティング緩衝液（ｄＨ２Ｏ＋０．１６％Ｎａ２ＣＯ３＋０．３％ＮａＨＣＯ３）中のストレプトアビジンでコーティングした３８４穴Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上への捕捉を包含した。また、個別のプレートを、Ｔａｕ分子の代替的な領域へとマッピングする異なるＴａｕペプチドでコーティングして、Ｔ１９７配列の身に対する結合の特異性を点検した。プレートを１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳデブロッキングした後、精製済み一過性上清の数回希釈物ともにインキュベートした。ＨＲＰ共役型ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ｆｃ二次抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ／Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートへ添加した後、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、１０μｌ／ウェル）を用いて結合を可視化した。光学密度を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２マイクロプレートリーダーを用いて、６３０ｎＭで測定した。選択された抗体、すなわち、配列番号７のウサギＶＬ及び配列番号８のウサギＶＨを有するＡＢ１についてのデータを図１に示す。わかるように、ＡＢ１は、Ｔ１９７に対してのみ非常に選択的な結合を示し、Ｔａｕ分子の他の領域に対応する４つのペプチド、すなわち、
・Ｔ１７４  Ｎ−アセチル−Ｃ＊Ｋ  ｐＴ  Ｐ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｋ  ｐＴ  Ｐ  Ｐアミド（配列番号６２）、
・Ｔ２１１  Ｎ−アセチル−Ｒ  ｐＴ  Ｐ  ｐＳ  Ｌ  Ｐ  ｐＴ  Ｐ  Ｃ＊アミド（配列番号６３）、
・Ｔ２３０  Ｎ−アセチル−Ｒ  ｐＴ  Ｐ  Ｐ  Ｋ  ｐＳ  Ｐ  ｐＳ  ＳＣ＊アミド（配列番号５７）、及び
・Ｔ３９６  Ｎ−アセチル−Ｃ＊ｐＳ  Ｐ  Ｖ  Ｖ  ｐＳ  Ｇ  Ｄ  ｐＴ  ｐＳアミド（配列番号６４）
（＊ビオチン共役位置）
に対しては選択的結合を示さない。
【０３０６】
２．５  ＢＩＡｃｏｒｅスクリーニング
選択されたウサギ抗Ｔａｕ  ＩｇＧ抗体クローンを一過的に発現させ、精製し、ＳＰＲ  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００プラットフォームを用いて分析した。抗体をまず、固定化したヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＦｃガンマ試薬を用いてＣＭ５センサーチップへと捕捉した。浮遊細胞２、３及び４は、５６００〜６１００ＲＵの固定化レベルを示したのに対し、ブロッキングした浮遊細胞１（デキストランのみ）は、参照として機能した。精製したＩｇＧをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中で０．５μｇ／ｍｌへと希釈し、チップ上で１０μｌ／分の流量で捕捉した。各捕捉ステップの次に、ペプチド／ストレプトアビジン複合体、緩衝液対照及び脱リン酸化型ペプチド／ストレプトアビジン複合体による１８０秒間の分析物注入を行った。３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＤＭＳＯを含有するＨＢＳ−ＥＰ＋中の１０μｌの１００μＭペプチド溶液を用い、これを０．３ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＨＢＳ−Ｎ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で１：１０に希釈し、当該ＥＤＴＡを２μｌの０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２で飽和させることによって、ペプチドを脱リン酸化した。ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ，カタログ番号Ｍ０２９０Ｓ）の２μｌの１：１０の希釈物（ＨＢＳ−Ｎ溶液）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、４℃で保存した。ホスファターゼ反応を、１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを当該混合物へ添加することによって阻害した。この溶液を、脱リン酸化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の調製に使用した。配列番号７のＶＬ部及び配列番号８のＶＨを有するウサギ抗体のために、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＴａｕ領域２３０〜２３８由来のペプチドＴ２３０を陰性対照として使用した。データを二価の分析物モデルと適合させた。
【０３０７】
表１は、Ｔ１９７及びＴ２３０のリン酸化型及び脱リン酸化型ペプチド／ストレプトアビジン複合体へ結合した時のこの交代について測定された親和性の値を示す。
【表１】
2018519833.tif 000002
【０３０８】
選択されたモノクローナルＦａｂフラグメント（ｍＦａｂ）を、配列番号５８の軽鎖及び配列番号５９の重鎖を有するネズミ化ｍＡＢ１抗体から、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆｉｃｉｎ開裂キット（カタログ番号４４９８０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造元のプロトコルにより調製した。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ分析のためのＦａｂストック溶液の濃度を測定した。アルツハイマー病患者由来の不溶性Ｔａｕタンパク質調製物（ＡＤ−ＰＨＦ，画分１１）、ＨＥＫ由来のＴａｕアイソフォーム２型モノマー（アミノ酸１〜４４１）、及び大腸菌において発現したアイソフォーム２型モノマーをＣＭ５チップ上へとアミン固定し、抗Ｔａｕ  ｍＦａｂの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機を用いて測定した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の緩衝液ＨＢＳ−ＥＰを、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）を使用するＡＤ−ＰＨＦを除き、固定に使用した。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液に３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．２５％ＣＭ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を補充し、アッセイ緩衝液として使用した。浮遊細胞（Ｆｃ）１を参照として使用したのに対し、以下のＲＵ値、すなわち、５ｕｇ／ｍｌの大腸菌Ｔａｕによる４４ＲＵ、５ｕｇ／ｍのＨＥＫ  Ｔａｕによる５６ＲＵ、及びＡＤ−ＰＨＦ材料の１：２０希釈溶液による５００ＲＵをＦｃ２〜４について得た。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）の２回の６０秒間周期を再生に使用した。１０ｕｌ／分の流量を固定及び再生に使用したのに対し、３０ｕｌ／分の流量を分析物の結合に使用した。ＡＤ−ＰＨＦのために、複数回の手動注入を適用して、５００ＲＵに到達し、これにはＥＤＣ／ＮＨＳ及びＥからＡへのキャッピングを含んだ。５回の開始周期及びｍＦａｂ試料又は緩衝液対照あたり１２回の周期を適用し、解離については１８０秒間又は３００秒間のいずれかの９０ｕｌ分析物注入を用いた。６００ｎＭ溶液プラス緩衝液の１１１：３の希釈を各ｍＦａｂについて使用した。
【表２】
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【０３０９】
２．６  ＢＩＡｃｏｒｅによるエピトープマッピング
ＨＥＫ細胞から発現及び精製した組換えＴａｕアイソフォーム２型モノマー（アミノ酸１〜４４１）、及びアルツハイマー病患者脳から単離した対形成したらせん状フィラメント調製物（ＡＤ−ＰＨＦ）の形態にある不溶性Ｔａｕタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機及びランニングバッファーとしてのＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＣＭ５チップ上へアミン固定した。５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）及び２００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドからなる７０μｌの新鮮混合物の１０μｌ／分の流量での注入によるこれらの浮遊細胞及び参照浮遊細胞のカルボキシメチルデキストラン表面の活性化後に、前者を浮遊細胞２及び４へそれぞれアミンカップリングした。ｔａｕモノマーの固定化は、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）緩衝液中の５０μｌ／ｍｌにおける１６０μｌを注入することによって達成したのに対し、ＡＤ−ＰＨＦは、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）における２μｇ／ｍｌの２０個の一定分量１６０μｌの注入によって固定した。検査浮遊細胞表面及び対照浮遊細胞表面を１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．５）の５０μｌパルスを用いて非活性化した。
【０３１０】
エピトープマッピングは、それぞれ２００ｎＭ及び５０００ｎＭのランニングバッファー中で調製された配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合ヒト化抗体（Ｌ１７Ｈ２０）と検査ペプチド又は緩衝液対照とからなるプレインキュベーション溶液によって実施した。これらを個別に、一連のセンサグラム周期で、１０μｌ／分の定常流量で、５０μｌを参照、ｔａｕモノマー及びＡＤ−ＰＨＦの浮遊細胞に関して注入することによって検査した。抗体結合の応答単位を検査浮遊細胞値と参照浮遊細胞値の間の差として、各注入終了１５秒後に取った報告時点で記録した。リン酸緩衝塩類溶液中の１．５Ｍグアニジンの２回の２０μｌ注入によって、チップを各周期の終了時に再生した。
【０３１１】
【表３】
2018519833.tif 000004
【０３１２】
検査ペプチドを調製し、Ｔａｕタンパク質の残基１９６〜２０６を含有するペプチド（配列番号６５）を基に分析し、ホスホセリン、ホスホトレオニン及び／又はニトロソチロシンを用いた翻訳後修飾の役割を表３において定義するように解析した。
【０３１３】
この解析を基に、最小エピトープは、配列番号５５のアミノ酸（モチーフＧｌｙ  ｐＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  ｐＴｈｒ  Ｐｒｏに対応）によって定義されるリン酸化されたＴａｕ領域であり、ならびにこのエピトープは、配列番号５５の位置２０５におけるホスホトレオニン、及び配列番号５５の位置２０２におけるホスホセリンの存在についての絶対的な必要条件を有していると結論付けられる。
【０３１４】
実験３−識別した抗体のさらなる特徴づけ
３．１  細胞アッセイ
Ｔａｕ凝集を誘導するための、Ｔａｕトランスジェニックマウスからの粗可溶性画分及び粗不溶性画分の調製
これらの実験について、ヒトＴａｕＰ３０１Ｓ（Ａｌｌｅｎら，２００２  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２１）：９３４０−５１）及びＰ３０１Ｌ（Ｌｅｗｉｓら，２０００  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．（４）：４０２−５、Ｇｏｔｚ  Ｊら，２００１  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（１）：５２９−３４）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。
【０３１５】
粗可溶性画分及び粗不溶性画分を、Ｐ３０１Ｓ及びＰ３０１ＬのＴａｕトランスジェニックマウスの脳から、差次的遠心分離によって調製した。簡潔には、Ｐ３０１Ｓ（脊髄及び脳幹）及びＰ３０１Ｌ（中脳及び脳幹）のＴａｕトランスジェニックマウス由来の脳組織を氷冷ＴＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、把持型のホモジナイザーであるＰｅｌｌｅｔ  Ｐｅｓｔｌｅ  Ｍｏｔｏｒ（Ｋｏｎｔｅｓ）を用いて、氷上の１．５ｍｌ微量遠心分離チューブ中で均質化した。次に、均質液（Ｈ）を４℃、４，０００ｇで１０分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。結果として生じる上清（Ｓ０）を４℃、２０，０００ｇで２０分間遠心分離して、粗可溶性画分（Ｓ１）に対応する上清を提供した。残存するペレット（Ｐ１）を、ＴＢＳ中で調製した１ｍｌの１％サルコシル溶液中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした後、４℃、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。上清（Ｓ２）を廃棄した。ペレット（Ｐ２）を５ｍｌの氷冷ＴＢＳで洗浄した後、ＴＢＳ中に再懸濁して、粗不溶性画分（Ｐ２’）を提供した。
【０３１６】
Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕを発現するＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞の調製
ＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕアイソフォーム２型を発現するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを、２９３フェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造元の説明書によりトランスフェクトした。一定分量のトランスフェクトした細胞を液体窒素中で保存した。
【０３１７】
Ｔａｕ凝集の誘導
図２は、Ｔａｕ治療用抗体の活性を特徴づけるために使用される細胞凝集アッセイの異なるステップを示す。１日目に、Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕアイソフォーム２型を発現するＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞（Ｐ３０１Ｓ−ｔａｕ）を３７℃で解凍し、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＦＦＢＳ）を含有する２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に希釈した。細胞を自動細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて計数した後、ウェルあたり２５，０００個の生細胞密度で、ポリ−Ｄ−リジンでプレコーティングしておいた９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）の中に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。同日、アルツハイマー病患者（ＡＤ−ＰＨＦ、画分８）又は進行性核上性麻痺患者（ＰＳＰ−ＰＨＦ、画分８）又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ−ＰＨＦ）又はＰ３０１ＳもしくはＰ３０１Ｌのトランスジェニックマウス脳に由来する脳画分（Ｔａｕ凝集を誘導するためのシードとして使用）からの超音波処理されたヒト不溶性Ｔａｕを、４℃のＦＦＢＳ培地中で抗Ｔａｕ抗体ととともに又はそれなしで、緩徐に撹拌しながら一晩インキュベートした。ＡＤ−ＰＨＦ（画分８）をＡＤ試料及びＰＳＰ試料についてそれぞれ８０ｎｇ／μｌ及び６０ｎｇ／μｌで使用し、トランスジェニックマウスＰ３０１Ｓ及びＰ３０１Ｌ由来の可溶性能画分をそれぞれ０．１μｇ／μｌ、１．２μｇ／μｌで使用した。２日目に、シード又はシード／抗体混合物を細胞へ２４時間適用した。３日目に、培地を、抗体を含有する新鮮ＦＦＢＳ培地と交換し、細胞を培養物中でさらに２４時間維持した。４日目に、Ｔａｕ凝集を、均質時間分解性蛍光エネルギー転移（ＨＴＲＦ）を基にしたＴａｕ凝集アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて、製造元の説明書により測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｄａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて蛍光を測定した。凝集を、抗体の非存在下で外来性の原線維又は画分によって誘導される最大凝集応答に相当する、対照（−）に対する％凝集として報告した。誘導したＴａｕ凝集に及ぼすＡＢ１及び従来技術の他のＴａｕ結合抗体の効果を検査した。従来技術の抗体は、ＷＯ２０１４/０２８７７７Ａ２のＩＰＮ００２、ＷＯ２０１３／０９６３８０Ａ２のＰＴ３、ＷＯ２０１０／１４２４２３Ａ２のｍＡｂ２．１０．３、及びＷＯ  ２０１４／００８４０４のＨＪ８．５とした。
【０３１８】
本アッセイの結果を表３及び図３に要約する。
【０３１９】
表４は、配列番号９のネズミ化ＶＬ及び配列番号１０のネズミ化ＶＨを有するＡＢ１（ＶＬ９ＶＨ１０）、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２３の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２３）、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２４の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２４）、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２０）、配列番号１７の軽鎖及び配列番号２１の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２１）、ならびに種々の脳抽出物由来のある範囲のＴａｕシードに対する競合抗体に関する効力（ＩＣ５０）及び最大有効性（３００ｎＭにおけるＩｍａｘ）を要約する。図３は、ヒトＰＳＰ患者由来のヒトＴａｕ病理学的原線維を用いた細胞凝集アッセイにおける配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２０）の、ならびに配列番号１７の軽鎖及び配列番号２０の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１７Ｈ２１）の有効性を示す。
【表４】
2018519833.tif 000005
【０３２０】
さらなる実験を細胞アッセイにおいて実施して、配列番号９のネズミ化ＶＬ及び配列番号１０のネズミ化ＶＨを有するＡＢ１（ＶＬ９ＶＨ１０）の活性を、Ｐ３０１Ｌ（ｎ＝２）、ＡＤ（ｎ＝３）及びＰＳＰ（ｎ＝３）由来のＴａｕシードを用いて測定し、それぞれ１５ｎＭ、２７ｎＭ及び７０ｎＭの最終ＩＣ５０値、ならびにそれぞれ７９％、６８％及び５７％のＩｍａｘ値を提供した。
【０３２１】
３．２  組織学的分析
配列番号７のウサギＶＬ及び配列番号８のウサギＶＨを有するＡＢ１、配列番号１１のＶＬ及び配列番号１４のＶＨを有するヒト化ＡＢ１（ＶＬ１１ＶＨ１４）又は配列番号１１のＶＬ及び配列番号１５のＶＨを有するヒト化ＡＢ１（ＶＬ１１ＶＨ１５）ならびに従来技術の抗体ＩＰＮ００２、ＰＴ３及びＭａｂ２．１０．３をアッセイして、病理学的Ｔａｕ構造を含有することがＡＴ８免疫染色を用いて既に示されてきたアルツハイマー疾患に罹患しているドナー由来のヒト海馬の凍結切片を用いて至適濃度を判定した（Ｂｒａａｋ及びＢｒａａｋ，１９９５，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ；  １６（３）：２７１−８、ならびにＰｏｒｚｉｇら，２００７  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ；３５８（２）：６４４−９において説明されるように）。ＡＢ１抗体及び従来技術の抗体全部は、１０１．４（陰性対照抗体）を除き、特異的なかつ濃度依存的な免疫反応性を呈した。これらのデータから、抗体の単一の至適濃度を選択し、６個のヒト脳試料からなるパネルをスクリーニングするために使用した。３個の試料は、アルツハイマー病に罹患しているドナー又は高レベルのＴａｕ病理（ＡＴ８免疫染色を用いて検出された陽性Ｔａｕ病理）を呈する非常に高齢のドナーから得、３個はＴａｕ病理に罹患していない（ＡＴ８免疫染色を用いて検出された陰性Ｔａｕ病理）ドナーから得た。
【０３２２】
ＡＢ１、ＶＬ１１ＶＨ１４、ＶＬ１１ＶＨ１５、ＰＴ３及びＭａｂ２．１０．３は、ＡＴ８陽性試料における免疫染色の類似のパターンを示した。神経原線維変化（ニューロン内ＮＦＴ）、細胞質Ｔａｕ、老人斑様構造及び神経絨毛糸の特異的免疫染色を、陽性Ｔａｕ病理試料の海馬及び側頭皮質内で観察した。しかしながら、ＡＴ８陰性組織では非常により低い免疫染色が検出された。本結果は、これらの抗体が非病理学的Ｔａｕと比較して病理学的Ｔａｕを優先的に認識することを示唆する。ＩＰＮ００２は、陽性及び陰性の両病理学試料において類似のシグナルを提供した。
【０３２３】
３．３  ウェスタンブロット
化学発光読み出しを用いて実施したウェスタンブロット
ＡＤ、ＰＳＰヒトから調製した可溶化液を１０％ポリアクリルアミドゲルへと負荷した（レーン当たり２０μｇタンパク質）。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜上へと電気泳動で転写した。膜を４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（ＴＢＳＴ溶液：５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン２０、ＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ７．６に調整））中でブロッキングした。膜を４℃で一晩、一次抗体又は非免疫ＩｇＧ対照抗体とともにインキュベートし、ＴＢＳＴですすぎ、二次抗体とともに１時間インキュベートし（マウス抗ビオチン）、ＴＢＳＴですすぎ、三次抗体とともに１時間インキュベートし（抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ）、ＴＢＳＴですすぎ、ＥＣＬ（増強化学発光法）を用いて発光させた。
【０３２４】
配列番号９のネズミ化ＶＬ及び配列番号１０のネズミ化ＶＨを有するｍＡＢ１は、ヒトＡＤ試料由来の病理学的Ｔａｕへ結合するが、ＰＳＰに対しては弱い。図４を参照されたい。
【０３２５】
実験４−識別した抗体のヒト化
配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを有するＡＢ１を、ウサギ抗体Ｖ部由来のＣＤＲをヒト生殖系列抗体Ｖ部フレームワークへと移植することによってヒト化した。当該抗体の活性を回復させるために、ウサギＶ部由来のいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列において保有された。これらの残基を、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体，ＷＯ９１／０９９６７）によって概略されるプロトコルを用いて選択した。ウサギ抗体（ドナー）Ｖ部配列とヒト生殖系列（アクセプター）Ｖ部配列との整列を図５及び図６に、設計したヒト化配列とまとめて示す。ドナーからアクセプター配列へと移植したＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，１９８７）によって定義されるとおりであるが、例外はＣＤＲ−Ｈ１で、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義の組み合わせを使用する（Ａｄａｉｒら，１９９１  ヒト化抗体，ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。
【０３２６】
ヒトＶ部ＩＧＫＶ１−３９プラスＪＫ４  Ｊ部（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を抗体ＡＢ１軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。移植片ｇＬ４及びｇＬ９における軽鎖フレームワーク残基はすべて、ヒト生殖系列遺伝子に由来する。ＣＤＲＬ３を移植片ｇＬ９において変異させ、潜在的な脱アミド化部位を修飾した。ヒトＶ部ＩＧＨＶ４−３９プラスＪＨ４  Ｊ部（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体ＡＢ１の重鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。多くのウサギ抗体と共通して、抗体ＡＢ１のＶＨ遺伝子は、選択されたヒトアクセプターよりも短い。ヒトアクセプター配列と整列させる時、抗体ＡＢ１のＶＨ部のフレームワーク１はＮ末端残基を欠失しており、当該残基はヒト化抗体において保有されている（図６）。ＡＢ１ウサギＶＨ部のフレームワーク３はまた、ベータシート鎖ＤとＥの間のループにおいて２つの残基（７５及び７６）を欠失している。移植片ｇＨ４１及びｇＨ４９において、間隙は、選択されたヒトアクセプター配列由来の対応する残基（リジン７５（Ｋ７５）、アスパラギン７６（Ｎ７６））で満たされている（図６）。移植片ｇＨ４１及びｇＨ４９における重鎖フレームワーク残基はすべて、ヒト生殖系列遺伝子由来であるが、例外は、残基７１及び７８を含む群由来の１つ又は２つ以上の残基であり（Ｋａｂａｔの番号付け）、ここでは、ドナー残基であるリジン（Ｋ７１）及びバリン（Ｖ７８）をそれぞれ保有していた。残基Ｋ７１及びＶ７８の保持は、ヒト化抗体の完全な効力に必須であった。ヒトフレームワークの位置１におけるグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）と置き換えて、均質な生成物の発現及び精製を得た。抗体及び抗体フラグメントのＮ末端におけるグルタミンからピログルタミン酸への変換は、広く報告されている。ＣＤＲＨ３を移植片ｇＨ４１及びｇＨ４９において変異させ、潜在的な脱アミド化部位を修飾した。
【０３２７】
各抗体についていくつかのバリアントの重鎖及び軽鎖のＶ部配列をコードする遺伝子を、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．による自動化合成アプローチによって設計及び構築した。重鎖及び軽鎖のＶ部のさらなるバリアントを、潜在的な脱アミド化部位を修飾するためのＣＤＲ内での変異を一部の場合に含むオリゴヌクレオチド指定突然変異によってＶＨ遺伝子及びＶＫ遺伝子を修飾することによって作製した。一過性発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ部遺伝子を、ヒトカッパ鎖定常部（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒト軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫへとクローニングした。ヒト化重鎖Ｖ部遺伝子を、ヒンジが変異Ｓ２４１Ｐを安定化しているヒトガンマ４重鎖発現ベクターをコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトガンマ４重鎖発現ベクターｐＭｈγ４Ｐ  ＦＬへとクローニングした（Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，３０（１）：１０５−８）。あるいは、ヒト化ＶＨ遺伝子を、ヒトガンマ１定常部（Ｇ１ｍ１７、１アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢガンマ１重鎖発現ベクターｐＭｈγ１ＦＬへとクローニングした。ヒト化抗体の一価の結合動態を評価するために、ヒト化ＶＨ遺伝子を、１０個のヒスチジン残基からなるＣ末端タグを有するヒトガンマ１ＣＨ１−ヒンジドメインをコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトＦａｂ−ＨＩＳ発現ベクターｐＭｈＦａｂ１０ＨＩＳへもクローニングした。ヒスチジンタグは、発現したＦａｂのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする。結果として生じる重鎖ベクター及び軽鎖ベクターのＨＥＫ２９３懸濁細胞への同時トランスフェクションは、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（１２３４７−０１９  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて達成され、ヒトＩｇＧ４Ｐ、ＩｇＧ１又はＦａｂ−ＨＩＳフォーマットのいずれかにおけるヒト化組換え抗体の発現を与えた。
【０３２８】
複数のバリアントヒト化抗体鎖及びこれらの組み合わせを発現させ、親抗体に対するこれらの効力、これらの生物物理的特性及び下流プロセシングに対する適切性について評価した。
【０３２９】
哺乳類細胞におけるヒト化組換え抗体の安定した発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ部遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常部（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列へと接合させて、連続的な軽鎖遺伝子を作製した。ヒト化重鎖遺伝子を、ヒトガンマ−４Ｐ重鎖定常部、又はヒトガンマ−１重鎖定常部（Ｇｌｍｌ７、１アロタイプ）のいずれかをコードするＤＮＡへと接合させて、連続的な重鎖遺伝子を作製した。重鎖及び軽鎖の遺伝子を哺乳類発現ベクターへとクローニングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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