(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含むタンパク質を提供する。本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含むタンパク質も提供する。本発明は、該タンパク質から形成される粒子、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を製造するための方法、該タンパク質を含有する医薬組成物、及び被験体における免疫応答を誘導するための、該タンパク質の使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、タンパク質。
【請求項２】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、タンパク質。
【請求項４】
ＨＢｃＡｇの一方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、ＨＢｃＡｇの他方のコピーが、別の免疫原性ポリペプチドを含む、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
タンパク質が、以下の構成要素：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［他の免疫原性ポリペプチド］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］
を含む、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
タンパク質が、以下の構成要素：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［第４のリンカー］−［他の免疫原性ポリペプチド］−［第５のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］
を含む、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
他の免疫原性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスポリペプチド又はその免疫原性断片である、請求項４〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
インフルエンザウイルスポリペプチド又はその免疫原性断片が、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片であり、ＨＡの断片が場合によりＨＡストーク領域である、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＨＢｃＡｇの一方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、且つＨＢｃＡｇの他方のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、グリシン残基及びセリン残基を含むリンカー配列が両側に隣接するリジン（Ｋ）残基を含む、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
タンパク質が、以下の構成要素：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［第４のリンカー］−［リジン（Ｋ）残基］−［第５のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］
を含む、請求項９又は１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、配列ＧＳＧＳＧＧＧＫＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１）を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位の代替アミノ酸がセリンである、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
該又は各ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１超のコピーが存在する、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
該又は各ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片が２〜５コピー存在する、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
該又は各ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片が３コピー存在する、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１７】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の各コピー間にリンカーが存在する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の免疫原性断片が、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）である、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
該又は各ｅ１ループ中のＭ２ｅの該又は各コピーが、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列又は最大６個のアミノ酸置換、付加又は欠失を伴う、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列である、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
該又は各ｅ１ループ中にＭ２ｅが３コピー存在し、第１のコピーがユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列であり、第２のコピーが、Ｈ３Ｎ２又はＨ７Ｈ７に見られる共通の変異体であり、第３のコピーが、Ｈ５Ｎ１に見られる共通の変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＨＢｃＡｇのタンデムコピーがリンカーによって連結されている、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
（ａ）該又は各リンカーが、長さが少なくとも１．５ｎｍであり；及び／又は
（ｂ）該又は各リンカーが、配列ＧｌｙｎＳｅｒ（ＧｎＳ）（式中、ｎは２〜８である）のコピーを１以上含む、上記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
該又は各リンカーがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）である、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡ断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質。
【請求項２５】
（ａ）ＨＡの断片が、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメイン由来であり；及び／又は
（ｂ）ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、グリシン残基及びセリン残基を含むリンカー配列が両側に隣接するリジン（Ｋ）残基を含む、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
タンパク質が、以下の構成要素：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［第２のリンカー］−［リジン（Ｋ）残基］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］
を含む、請求項２４又は２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、配列ＧＳＧＳＧＧＧＫＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１）を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
上記請求項のいずれか１項に記載の１以上のタンパク質を複数コピー含む粒子。
【請求項２９】
請求項９〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を複数コピー含む、請求項２８の粒子。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３１】
発現ベクターである、請求項３０に記載の核酸分子。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の１以上の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３３】
タンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を、タンパク質が発現する条件下で培養すること、及びタンパク質を回収することを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を製造するための方法。
【請求項３４】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２８若しくは２９に記載の粒子又は請求項３０若しくは３１に記載の核酸分子、及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子；又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２８若しくは２９に記載の粒子又は請求項３０若しくは３１に記載の核酸分子、及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含むワクチン。
【請求項３７】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子；又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、ワクチン。
【請求項３８】
アジュバントを更に含む、請求項３４若しくは３５に記載の医薬組成物又は請求項３６若しくは３７に記載のワクチン。
【請求項３９】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２８若しくは２９に記載の粒子、又は請求項３０若しくは３１に記載の核酸分子を被験体に投与することを含む、被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項４０】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子；又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子を被験体に投与することを含む、被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項４１】
投与がアジュバントと組み合わされる、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２８若しくは２９に記載の粒子、又は請求項３０若しくは３１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子；又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項４４】
インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２８若しくは２９に記載の粒子、又は請求項３０若しくは３１に記載の核酸分子の使用。
【請求項４５】
インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む粒子；又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子及び請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含むタンパク質に関する。本発明は、該タンパク質から形成された粒子、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を製造するための方法、該タンパク質を含有する医薬組成物、及び被験体における免疫応答を誘導するための、該タンパク質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）タンパク質は、特徴的な「スパイク」構造を形成する２本の逆平行αへリックスから成る、やや独特の構造を有する。次いで、２つのＨＢｃ分子が、自然に二量体化してスパイク対の束状構造（ｔｗｉｎ  ｓｐｉｋｅ  ｂｕｎｄｌｅ）を形成する。この束状構造は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組み立てブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）である。ＶＬＰの高頻度反復性（ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｕｓ  ｎａｔｕｒｅ）が抗原の多数のコピーを送達するので、ＶＬＰは魅力的なワクチンシステムである。更に、ウイルス核酸がないことにより、それらは特に安全なベクターとなる。ＨＢｃは、いくつかの、抗原配列が挿入され得る部位を有するので、ＨＢｃは、ワクチン担体として特に興味深い。その結果、ＨＢｃの極度の免疫原性は、挿入配列にも与えられ、従って、該配列が過度に免疫原性になる。最適な挿入部位は、主要挿入領域（Ｍａｊｏｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎ，  ＭＩＲ）である。しかしながら、以前に、長大な又は疎水性の配列がＭＩＲに挿入される場合、単量体のＨＢｃは、二量体になることができず、ＶＬＰは生じず（Ｐｕｍｐｅｎ  ＆  Ｇｒｅｎｓ  ２００１）、従ってワクチンが非効果的となることが示された。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のメンバーである。Ａ型、Ｂ型、Ｃ型と呼ばれる、ヒトに感染するインフルエンザウイルスの３サブタイプが存在する。インフルエンザビリオンは、セグメント化したネガティブセンスＲＮＡゲノムを含有する。エンベロープに包まれたＡ型インフルエンザのビリオンは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）及びプロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）の３つの膜タンパク質；脂質二重層の直下のマトリックスタンパク質（Ｍ１）；８つのウイルスＲＮＡセグメント及び３つのタンパク質（ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）及びポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２））から成るリボ核タンパク質コア；及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）を有する。Ｂ型インフルエンザのビリオンは、エンベロープ中に４つのタンパク質：ＨＡ、ＮＡ、ＮＢ、及びＢＭ２を有する。ＢＭ２タンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質と同様に、脱外皮の過程に不可欠なプロトンチャネルである。ＮＢタンパク質はイオンチャネルであると考えられているが、細胞培養におけるウイルス複製にとっては必要ではない。
【０００４】
Ｃ型インフルエンザウイルスはやや異なる。Ｃ型インフルエンザウイルスの核は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスと同様に、ウイルスＲＮＡ及び４つのタンパク質で構成されるリボ核タンパク質から成る。Ｍ１タンパク質は、Ａ型及びＢ型インフルエンザのビリオンのように、膜の直下に位置する。ＣＭ２は、イオンチャネルとして機能する少量のウイルスエンベロープタンパク質である。Ｃ型インフルエンザウイルスの、量の多いエンベロープ糖タンパク質は、それがＨＡ及びＮＡの両方の機能を有するので、ＨＥＦ（ヘマグルチニンエステラーゼフュージョン）と呼ばれる。
【０００５】
ＨＡ及びＮＡタンパク質は、細胞へのウイルス付着及びウイルス粒子の透過に関与する、エンベロープの糖タンパク質であり、ウイルス中和及び防御免疫のための免疫優勢エピトープである。しかし、これらのタンパク質は、株から株へと変化し得、頻繁に変化する。これらの２つのタンパク質の可変性のために、スペクトラムが広域で長期持続性のインフルエンザワクチンはこれまで開発されていない。一般に用いられているインフルエンザワクチンは、ウイルスの抗原連続変異に対応するために、ほぼ毎年適合させなければならない。ウイルスにおけるより劇的な変化（抗原不連続変異として知られる）が起こると、ワクチンはもはや防御的ではなくなる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）コアタンパク質ベースのワクチン送達システムに関する。インフルエンザウイルスに対する現在のワクチンは、前年のワクチンに含有されていないエスケープ変異体の出現を引き起こす、ウイルスの急速な突然変異速度（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）のために、毎年再設計する必要がある。それらは、優勢な循環型インフルエンザ株の予測に頼っているが、ワクチンと循環株との間に不一致がある場合、それらが最適なわけではなくなる（ｒｅｎｄｅｒｅｄ  ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）。更に、それらは、以前は見られなかった新しいウイルス株に対しては、防御することができない。１つの解決策は、毎年ほとんど変わらずに残っていて、新たに出現する変異体に保存されている、インフルエンザの保存タンパク質ドメインに基づいてワクチンを設計することである。保存ドメインを標的とする、以前の多くの試みは、これらの領域が、自体で有する免疫原性が低いか、又は、野生型ウイルス外では、それらの天然の立体構造で提示され得ないため、失敗した。本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２（インフルエンザマトリックスタンパク質２）由来の保存領域をタンデムコンストラクトに挿入することに成功した。該保存領域は、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）であった。得られるＶＬＰは、関連するＭ２ペプチドへの血清変換を生じさせ、致死量のＨ１Ｎ１インフルエンザ感染からの防御をもたらすことができる（実施例１参照）。本発明者らは、タンデムコンストラクトに、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）由来の保存領域を挿入することにも成功した。得られるＶＬＰは、ＨＡタンパク質への血清変換を生じさせ、致死量の相同なＨ１Ｎ１インフルエンザ感染からの防御をもたらすことができる（実施例２参照）。更に、本発明者らは、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）及びマトリックス２タンパク質外部ドメイン（Ｍ２ｅ）由来の保存領域の両方を、タンデムコンストラクトに、同時に挿入することにも成功した。得られるＶＬＰは、ＨＡタンパク質及びＭ２ｅペプチドへの血清変換を生じさせ、致死量の相同なＨ１Ｎ１インフルエンザ感染からの防御をもたらすことができる（実施例３）。本発明者らは、異なる２つのＶＬＰ：インフルエンザＨＡ及びＭ２ｅに由来する保存領域の両方を含む第１のＶＬＰのためのタンデムコンストラクト；及びインフルエンザの異なるサブタイプからのインフルエンザＨＡ由来の保存領域を含む第２のＶＬＰのためのタンデムコンストラクトを含むワクチンも製造した。まとめると、２つのＶＬＰは、インフルエンザ由来の、保存された異なる５抗原を含み、単一のワクチンとして同時に送達され得る。混合ワクチンは、グループ１及びグループ２のＨＡタンパク質及びＭ２ｅペプチドへの血清変換を生じさせ、致死量のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２インフルエンザ感染からの防御をもたらすことができる（実施例４）。
【０００７】
本発明者らは、ネイティブのＭ２ｅをｅ１ループに挿入すると、ＶＬＰが、タンパク質ミスフォールディングがあるために、適切に形成されないことを見出した。驚くべきことに、本発明者らは、Ｍ２ｅインサートに隣接するリンカー配列を付加することによって、及び／又は、Ｍ２ｅの１７位及び１９位の２つのシステイン残基の一方又は両方を代替アミノ酸で置換することによって、この問題が克服され得ることを見出した。リンカーにより、血清変換を誘導し、病原体の攻撃からの防御をもたらすことができるＶＬＰの形成が可能になる。例えば、実施例１の表２の行１及び４は、Ｍ２ｅとｅ１ループとの間にリンカーを導入すると、血清変換を誘導し得るＶＬＰが生じることを示す。従って、リンカーは、リンカーなしではミスフォールディングを引き起こし、それ故に免疫応答を誘導するのに有効なＶＬＰを産生することができないタンデムコンストラクトに、Ｍ２ｅを挿入する手段を提供する。
【０００８】
更に、タンデムコンストラクトに組み込まれ得る免疫原性ポリペプチドの例を、以下に検討する。特に、本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２外部ドメイン及び／又はヘマグルチニン（ＨＡ）のストーク（ｓｔａｌｋ）ドメインを含むタンデムコンストラクトが、血清変換の誘導及びインフルエンザによる攻撃からの防御をもたらすのに特に有効なＶＬＰを産生することを見出した（実施例参照）。
【０００９】
Ｍ２ｅの１７位及び／又は１９位での、システインの、セリンとの置換により、血清変換を誘導し、病原体の攻撃からの防御をもたらすことができるＶＬＰの形成が可能になる。一方又は両方のシステインの置換がなければ、ＶＬＰは、上記の通り、Ｍ２ｅインサートとｅ１ループとの間にリンカーが挿入されない限り、適切に形成しない。例えば、実施例１の表２の行１〜３は、１７位及び１９位にネイティブのシステインを有するＶＬＰを用いると血清変換が生じない場合に、１７位及び／又は１９位で、システインをセリンで置換すると、血清変換を誘導し得るＶＬＰをもたらし得ることを実証する。システイン残基の置換の存在により、ＶＬＰの形成を妨害し得るジスルフィド結合の形成が阻止されると考えられる。
【００１０】
従って、本発明は、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含む、タンパク質を提供する。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片には、片側又は両側に、該ポリペプチド又は断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが隣接する。
【００１１】
本発明は、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、タンパク質も提供する。
【００１２】
本発明のタンパク質は、ＨＢｃＡｇの他のコピーに、別の免疫原性ポリペプチドも含み得る。この免疫原性ポリペプチドは、インフルエンザに由来し得る。しかしながら、それは、異なる病原体又はアレルゲンにも由来し得る。従って、本発明のタンパク質は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するのに有用であり、他にいかなる免疫原性ポリペプチドが存在するのかに依存して、異なる病原体又はアレルゲンに対する免疫応答を同時に誘導するためにも有用であり得る。
【００１３】
本発明者らは、挿入された抗原ペプチドのミスフォールディングの潜在的な問題は、抗原ペプチドをＨＢｃＡｇのコピーの一方のｅ１ループ中に提示すること、及びＨＢｃＡｇの第２のコピーのｅ１ループ中に「ヌル」インサートを有することによって解決し得ることも見出した。特に、本発明者らは、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメイン（ＬＡＨ３）由来の保存領域を、タンデムコンストラクト中のＨＢｃＡｇの一方のコピーに挿入することにより、さらなるタイプのＶＬＰ（ＶＬＰ２）を開発した。彼らは、２０アミノ酸未満の短い配列のみをＨＢｃＡｇの第２のコピーに挿入することにより、第１のインサート（ＬＡＨ３）の立体配置を適切にすることが可能となり、ＶＬＰ全体へより高い溶解性が付与されることを見出した（実施例４）。具体的には、彼らは、グリシン及びセリン残基からなる、短い可撓性リンカー領域が隣接する単一のリジン（Ｋ）残基を挿入したが、これは事実上、「ヌル」インサートである。
【００１４】
従って、本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質も提供する。ＨＡの断片は、場合により、インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメインに由来し、更に場合により、インフルエンザウイルスサブタイプＨ３Ｎ２に由来する。ＨＢｃＡｇの第２のコピーは、ｅ１ループ中に、グリシン及びセリン残基を含むリンカー配列が両側に隣接するリジン（Ｋ）残基を含み得る。
【００１５】
本発明は、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含む、本発明によるタンパク質であって、ＨＢｃＡｇのコピーの一方又は両方が、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質を更に提供する。ＨＢｃＡｇの第２のコピーは、ｅ１ループ中に、グリシン及びセリン残基を含むリンカー配列が両側に隣接するリジン（Ｋ）残基を含み得る。
【００１６】
本発明は：
−  本発明の１以上のタンパク質を多数コピー含む粒子；
−  本発明のタンパク質をコードする核酸分子；
−  本発明の１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞；
−  本発明のタンパク質を製造する方法であって、タンパク質が発現する条件下で、該タンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養すること、及び該タンパク質を回収することを含む、方法；
−  本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物；
−  本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含むワクチン；
−  被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子を被験体に投与することを含む、方法；
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子；
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子の使用も提供する。
【００１７】
本発明のタンパク質、粒子、核酸、医薬組成物及びワクチンは、インフルエンザを防御するために、単独で用いられてもよいし、又は、それらは組み合わせて用いられてもよい。異なるインフルエンザ抗原を含む異なるＶＬＰを組み合わせて使用することにより、例えば、より広いレベルの、異なる亜型のインフルエンザからの防御が、同時に可能となる。これを念頭において、本発明者らは、インフルエンザＨＡ由来の、保存された５抗原及びＭ２ｅを共に含有する、単一のワクチンとして、同時に送達され得る２つのＶＬＰの混合物を含む、混合ワクチンを開発した（実施例４）。
【００１８】
従って、本発明は：
−  （ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物；
（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質がＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物；
−  （ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、ワクチン；
−  （ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；並びに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、ワクチン；
−  被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法であって：（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸を被験体に投与することを含む、方法；
−  被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法であって：（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸を被験体に投与することを含む、方法；
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であり、（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸と組み合わされた、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であり、（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸と組み合わされた、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であり、（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸と組み合わされた、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸の使用；並びに 
−  インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であり、（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸と組み合わされた、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】インフルエンザ３×Ｍ２ｅ配列を含有するタンデムコアによる免疫で、組換えＭ２ｅペプチドを認識する抗体を生成した。初回免疫の３週間後に、タンデムコア＋インフルエンザ３×Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（丸）、アジュバントのみ（三角）又はＭ２ｅペプチドに対する１４Ｃ２モノクローナル抗体（四角）で免疫した５匹のマウスから血清を採取した。Ｍ２ｅに対するＥＬＩＳＡにより、５匹のマウスからの血清プールを、異なる３通りの血清希釈物で、デュプリケートで試験した。
【図２】３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のインフルエンザ接種の際に体重減少を緩和する。３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。体重のパーセンテージは次の通り算出した：％体重＝１００−（１００×（０日目での体重−ｎ日目での体重／０日目での体重）。１群当たりマウス５匹、個別の２実験の代表。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させた（ｐｅｒｉｓｈｅｄ）か、又は処分した。
【図３】３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のインフルエンザ接種の際に臨床的疾患を軽減する。ＨＡ  ３×Ｍ２ｅを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。群の臨床スコアは、群（１群あたりマウス５匹）内の各マウスについての、個々の臨床スコアの和として算出した。個々の臨床スコアは、表３に示す尺度によって決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図４】３×Ｍ２ｅを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のＰＲ８インフルエンザ接種後の死亡率を無くする（ａｂｒｏｇａｔｅｓ）。３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。生存率は：生存率＝１００−（１００＊（０日のマウス数−（ｎ）日の生存マウス数／０日目でのマウス数）の通り決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図５】インフルエンザウイルスの表界面（ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を示す模式図。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒｃｈ  １９９８  ｖｏｌ．７２  ｎｏ．３  ２４４９−２４５５から改変。
【図６】インフルエンザストーク配列を含有するタンデムコアによる免疫で、組換えヘマグルチニンタンパク質を認識する抗体を生成した。初回免疫の３週後に、５匹の、タンデムコア＋インフルエンザストークＶＬＰ（丸）、アジュバントのみ（三角）で免疫したマウスか、又はＰＲ８感染マウス（四角）から血清を採取した。Ａ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１由来のｒＨＡに対するＥＬＩＳＡにより、血清プールを、異なる３通りの血清希釈物で、デュプリケートで試験した。
【図７】ＨＡストークインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のインフルエンザ接種の際に体重減少を緩和する。ＨＡストークインサートを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。体重パーセンテージは：％体重＝１００−（１００×（０日目での体重−ｎ日目での体重／０日目での体重）の通り算出した。１群当たりマウス５匹、個別の２実験の代表。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図８】ＨＡストークインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のインフルエンザ接種の際に臨床的疾患を軽減する。ＨＡストークインサートを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。群の臨床スコアは、群（１群あたりマウス５匹）内の各マウスについての、個々の臨床スコアの和として算出した。個々の臨床スコアは、表３に示す尺度によって決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図９】ＨＡストークインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のＰＲ８インフルエンザ接種後の死亡率を無くする。ＨＡストークインサートを含有するタンデムコア（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後に、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。生存率は：生存率＝１００−（１００＊（０日のマウス数−（ｎ）日の生存マウス数／０日目でのマウス数）の通り決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図１０】ＨＡタンパク質のストーク領域を示す模式図。Ｋａｍｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；２：７６．２０１１年１２月１６日にオンラインで公開。２０１１年９月１２日にオンラインで予備公開。ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１１．０００７６から改変。
【図１１】インフルエンザＨＡストーク及び３×Ｍ２ｅ配列を含有するタンデムコアによる免疫で、組換えヘマグルチニンタンパク質及びＭ２ｅペプチドを認識する抗体を生成した。初回免疫の３週後に、５匹の、タンデムコアＶＬＰ（丸）、アジュバントのみ（三角）で免疫したマウスか、又はＰＲ８感染マウス（四角）から、血清を採取した。Ｍ２ｅ  ＥＬＩＳＡ（バツ印）では、Ｍ２ｅ（Ｃ１４）に対するモノクローナル抗体をポジティブコントロールとして用いた。Ａ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１又はＭ２ｅペプチド由来のｒＨＡに対するＥＬＩＳＡにより、血清プールを、異なる３通りの血清希釈物で、デュプリケートで試験した。
【図１２】インフルエンザストーク及び３×Ｍ２ｅ配列を含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、インフルエンザ接種の際に体重減少を緩和する。タンデムコアＶＬＰ（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。体重のパーセンテージは：％体重＝１００−（１００×（０日目での体重−ｎ日目での体重／０日目での体重）の通り算出した。１群当たりマウス５匹、個別の２実験の代表。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図１３】インフルエンザストーク及び３×Ｍ２ｅ配列を含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、インフルエンザ接種の際に臨床的疾患を軽減する。タンデムコアＶＬＰ（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。群の臨床スコアは、群（１群あたりマウス５匹）内の各マウスについての、個別の臨床スコアの和として算出した。個々の臨床スコアは、表３に示す尺度によって決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図１４】インフルエンザストーク及び３×Ｍ２ｅ配列を含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のＰＲ８インフルエンザ接種後の死亡率を無くする。タンデムコアＶＬＰ（丸）又はアジュバントのみ（三角）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルスで感染させた。生存率は：生存率＝１００−（１００＊（０日のマウス数−（ｎ）日の生存マウス数／０日目でのマウス数）の通り決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図１５】インフルエンザ由来のインサートを、両方のＭＩＲに含有するタンデムコアＶＬＰの模式図。コア１は、交差線模様（ＭＩＲにＨＡストークインサートを含有する）で示す。コア２は、黒色（３連のＭ２ｅインサートを含有する）で示す。表示した二量体（Ａ）は、コア１及び２の両方を、それらのインサートと共に外部（Ｂ）に提示する、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に会合した。
【図１６】ＭＩＲの一方又は両方にインフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰ１及びＶＬＰ２の模式図。ＭＩＲにＨＡストークインサートを含有するコア１を、交差線模様で示す。３連のＭ２ｅインサート又はリジン残基を含有する「ヌル」インサートを含有するコア２を黒色で示す。ウイルス様粒子（ＶＬＰ１）に会合した二量体（Ａ）、同様のＶＬＰ２の構築ブロック（Ｂ）を示す。会合したＶＬＰは、コア１とコア２の両方を、それらのインサートと共に外部（Ｃ）に提示する。
【図１７】ＶＬＰ１（ＨＡ２．３）及びＶＬＰ２（ＬＡＨ３）の内部の、インフルエンザウイルスＨＡストークインサートの二次構造を示すモデル。
【図１８】インフルエンザストーク及びＭ２ｅの配列を含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、組換えのヘマグルチニンタンパク質及びＭ２ｅペプチドを認識する抗体を生成した。グラフ上の点は、１群当たり５匹のマウスの、プールされた血清からの２つのＥＬＩＳＡ吸光度値の平均を表す。Ｈ３Ｎ２由来のヘマグルチニンへの血清変換は、三角で、Ｈ１Ｎ１へは四角で、Ｍ２外部ドメインへは菱形で示す。ネガティブコントロールは、アジュバントのみのプールされた血清（丸）由来の３つのタンパク質すべてに対する反応性のうちの代表である。この実験を３回、別々に繰り返した。
【図１９】インフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、インフルエンザ接種の際に体重減少を緩和する。タンデムコアＶＬＰ（四角）又はアジュバントのみ（丸）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルス（２ａ）又はＸ３１  Ｈ３Ｎ２（２ｂ）で感染させた。体重のパーセンテージは：％体重＝１００−（１００×（０日目での体重−ｎ日目での体重／０日目での体重）の通り算出した。１群当たりマウス５匹、個別の２実験の代表。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図２０】インフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、インフルエンザの接種の際に臨床的疾患を軽減する。タンデムコアＶＬＰ（四角）又はアジュバントのみ（丸）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８ウイルス（３ａ）又はＸ３１  Ｈ３Ｎ２（３ｂ）で感染させた。群の臨床スコアは、群（１群あたりマウス５匹）内の各マウスについての、個々の臨床スコアの和として算出した。個々の臨床スコアは、表３に示す尺度によって決定した。２０％の体重減少か、又は個別スコア１５に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【図２１】インフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰによる免疫は、致死量のインフルエンザ接種後の死亡率を無くする。タンデムコアＶＬＰ（四角）又はアジュバントのみ（丸）による免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０のＰＲ８  Ｈ１Ｎ１（４ａ）又は３×ｍＬＤ５０のＸ３１  Ｈ３Ｎ２（４ｂ）ウイルスで感染させた。生存率は：生存率＝１００−（１００＊（０日のマウス数−（ｎ）日の生存マウス数／０日目でのマウス数）の通り決定した。２０％の体重減少に達したマウスは、英国内務省の指針に従って死滅させたか、又は処分した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ａｙｗサブタイプの１８３アミノ酸タンパク質とＨＢｃＡｇの２９アミノ酸プレ配列、及び対応するヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ａｙｗサブタイプの１８３アミノ酸タンパク質とＨＢｃＡｇの２９アミノ酸プレ配列である。
配列番号３は、Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／３４／ＰＲ８由来のＭ２アミノ酸配列である。
配列番号４は、ｅ１ループ中の免疫原性ポリペプチドインサートに隣接するため、又はｅ１ループ中の複数の免疫原性ポリペプチドを一体的に連結するために、隣接するＨＢｃＡｇユニットを結合させるためのリンカー配列の候補である。
配列番号５は、ｅ１ループ中の免疫原性ポリペプチドインサートに隣接するため、又はｅ１ループ中の複数の免疫原性ポリペプチドを一体的に連結するために、隣接するＨＢｃＡｇユニットを結合させるためのリンカー配列の候補である。配列番号５は、配列番号４の配列の、３回の繰り返しである。
配列番号６は、野生型Ｍ２ｅ配列である。
配列番号７は、１７位のシステインがセリンに置換されている以外は、配列番号６の配列と同一である。
配列番号８は、１７位及び１９位のシステインが両方ともセリンで置換されている以外は、配列番号６の配列と同一である。
配列番号９は、１７位及び１９位の各システインがセリンで置換されている以外は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列である。
配列番号１０は変異Ｍ２ｅ配列である。
配列番号１１は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーに３つのＭ２ｅ配列が挿入されたタンデムコアのアミノ酸配列である。挿入された３つのＭ２ｅ配列は、リンカー配列が両側に隣接している。一方のリンカーは、配列番号１１のアミノ酸８０〜９４の範囲であり（ｓｐａｎ）、他方は、配列番号１１のアミノ酸１６７〜１８１の範囲である（実施例１の斜体で示したアミノ酸）。リンカー配列は、配列番号５の配列と同一である。３つのＭ２ｅ配列は、配列番号１１のアミノ酸９５〜１６６（実施例１において下線で示すアミノ酸）の範囲である。配列番号１１のアミノ酸９５〜１１８の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号９の配列と同一である。配列番号１１のアミノ酸１１９〜１４２の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号８の配列と同一である。配列番号１１のアミノ酸１４３〜１６６の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号１０の配列と同一である。
配列番号１２は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを含むタンデムコアのアミノ酸配列である。ＨＡストークインサートは、配列番号１２のアミノ酸８０〜１５１（実施例２において下線で示すアミノ酸）の範囲である。ＨＡストークインサートは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４０３〜４７４の範囲である。
配列番号１３は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを含み、ＨＢｃＡｇのコピーの他方に３つのＭ２ｅ配列が挿入されたタンデムコアのアミノ酸配列である。ＨＡストークインサートは、配列番号１３のアミノ酸８０〜１５１（実施例３において二重下線で示したアミノ酸）の範囲である。ＨＡストークインサートは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４０３〜４７４の範囲である。挿入された３つのＭ２ｅ配列は、リンカー配列が両側に隣接している。一方のリンカーは、配列番号１３のアミノ酸３２８〜３４２の範囲であり、他方は、配列番号１３のアミノ酸４１５〜４２９の範囲である（実施例３の斜体で示されているアミノ酸）。リンカー配列は、配列番号５の配列と同一である。３つのＭ２ｅ配列は、配列番号１３のアミノ酸３４３〜４１４（実施例３において下線で示すアミノ酸）の範囲である。配列番号１３のアミノ酸３４３〜３６６の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号９の配列と同一である。配列番号１３のアミノ酸３６７〜３９０の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号８の配列と同一である。配列番号１３のアミノ酸３９１〜４１４の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号１０の配列と同一である。
配列番号１４は、Ｃ末端に−ＯＨ基を付加した配列番号６と同一の配列である。
配列番号１５は、αヘリックスのバランスをとるためにＨＢｃＡｇが含み得る配列である。
配列番号１６は、ｅ１ループ中の免疫原性ポリペプチドインサートに隣接するため、又はｅ１ループ中の複数の免疫原性ポリペプチドを一体的に連結するために、隣接するＨＢｃＡｇユニットを結合させるためのリンカー配列の候補である。実施例４におけるＶＬＰ１の、Ｍ２ｅインサートに隣接するリンカーとして用いた。
配列番号１７は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを、ＨＢｃＡｇのコピーの他方に、挿入された３つのＭ２ｅ配列を含む、タンデムコアのＤＮＡ配列である（実施例４におけるＶＬＰ１）。
配列番号１８は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを含み、ＨＢｃＡｇのコピーの他方に、挿入された３つのＭ２ｅ配列を含み、タンデムコアのアミノ酸配列である（実施例４におけるＶＬＰ１）。ＨＡストークインサートは、配列番号１８のアミノ酸８０〜１５１（実施例４において下線で示すアミノ酸）の範囲である。ＨＡストークインサートは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４０３〜４７４の範囲である。挿入された３つのＭ２ｅ配列は、リンカー配列が両側に隣接している。一方のリンカーは、配列番号１８のアミノ酸３２８〜３４２の範囲であり、他方は、配列番号１８のアミノ酸４１５〜４２８の範囲である（実施例４の斜体で示されているアミノ酸）。リンカー配列は、それぞれ配列番号５及び配列番号１６の配列である。３つのＭ２ｅ配列は、配列番号１８のアミノ酸３４３〜４１４（実施例４において下線で示したアミノ酸）の範囲である。配列番号１８のアミノ酸３４３〜３６６の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号９の配列と同一である。配列番号１８のアミノ酸３６７〜３９０の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号８の配列と同一である。配列番号１８のアミノ酸３９１〜４１４の範囲であるＭ２ｅ配列は、配列番号１０の配列と同一である。
配列番号１９は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを含み、ＨＢｃＡｇのコピーの他方に「ヌル」インサートを含む、タンデムコアのＤＮＡ配列である（実施例４におけるＶＬＰ２）。
配列番号２０は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにＨＡストークインサートを含み、ＨＢｃＡｇのコピーの他方に「ヌル」インサートを含む、タンデムコアのアミノ酸配列である（実施例４におけるＶＬＰ２）。ＨＡストークインサートは、配列番号２０のアミノ酸８０〜１３４（実施例４において下線で示すアミノ酸）の範囲である。ＨＡストークインサートは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２／ＨＫ／６８から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４２１〜４７５の範囲である。「ヌル」インサートは、配列番号２０のアミノ酸３１１〜３２４の範囲であり、配列番号２１に対応する。
配列番号２１は、実施例４におけるＶＬＰ２のＨＢｃＡｇの第２のコピーに挿入された「ヌル」インサートのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４０３〜４７４の範囲であるＨＡストークのアミノ酸配列である。これは、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１８のアミノ酸８０〜１５１に対応する。
配列番号２３は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４２０〜４７４の範囲であるＨＡロングアルファヘリックスのアミノ酸配列である。これは、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１８のアミノ酸９７〜１５１に対応する。
配列番号２４は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２／ＨＫ／６８から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４２１〜４７５の範囲であるＨＡストーク領域のアミノ酸配列である。これは、配列番号２０のアミノ酸８０〜１３４に対応する。
【００２１】
発明の詳細な説明
加えて、本明細書及び添付された請求の範囲において用いられる場合、内容に明確な別段の指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「免疫原性ポリペプチド」への言及は、２以上のかかるポリペプチドを含む。
【００２２】
本明細書中に引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記のものか下記のものかにかかわらず、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２を含む免疫原性ポリペプチドをＨＢｃＡｇコアに導入することに伴う困難を克服したタンデムコアコンストラクトを開発した。
【００２４】
タンデムコンストラクトは、２つのＨＢｃＡｇ遺伝子の遺伝学的融合物であり、結果として生じる組換えタンパク質は、自然に二量体化する野生型コアタンパク質と変わらない、２つの平行「スパイク」を形成する。タンデムコアタンパク質は、単量体コアタンパク質と同様の様態でＶＬＰを形成する。「タンデムコア」、「タンデムコンストラクト」及び「タンデムコアコンストラクト」は、本明細書では交換可能に用いられる。該用語は、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループ中に免疫原性ポリペプチドを有するか、又は有さないタンデムＨＢｃＡｇコアを記述するために用いられ得る。
【００２５】
ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループ中に挿入される、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の、一方又は両方の側にリンカーを含む、タンデムコアコンストラクトが提供される。ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されている、タンデムコアコンストラクトも提供される。ＨＢｃＡｇの一方のコピーのｅ１ループ中に挿入されたヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片と、場合により、ＨＢｃＡｇの他方のコピーに挿入された、グリシン及びセリン残基が隣接するリジン（Ｋ）残基を含む２０アミノ酸未満の配列を含むタンデムコアコンストラクトも提供される。
【００２６】
本明細書に記載される特徴は、上記のタンデムコンストラクトのいずれにもあてはまり得る。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２ポリペプチド又はその免疫原性断片の一方又は両方の側にリンカーを含む、上記のタンデムコアコンストラクト中のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２ポリペプチド又はその免疫原性断片は、１７位及び／又は１９位にシステイン置換を有し得る。
【００２７】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）
タンデムコアは、高度に免疫原性であることが知られており、その構造内のタンパク質インサートに免疫原性特性を付与する能力を有する、ＨＢコアタンパク質ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。更に、タンデムコアのウイルス様特性により、多量体の提示プラットフォーム上の構造エピトープを維持しながら、外来抗原を提示できる。加えて、タンデムコアは、その二連挿入部位のために、複数のインサートを担持することができる。
【００２８】
ＨＢｃＡｇは、ＨＢＶのサブタイプに応じて、１８３又は１８５アミノ酸（ａａ）を有する。ａｙｗサブタイプと２９アミノ酸のプレ配列の、１８３アミノ酸のタンパク質の配列を配列番号２に示す。成熟ＨＢｃＡｇは、プレ配列である、１〜２９位の配列を伴い、３０位のＭｅｔ残基から最もＣ末端のＣｙｓ残基まで続いている。
【００２９】
タンパク質は、二量体を形成する、２コピーのＨＢｃＡｇ（「第１のコピー」及び「第２のコピー」）を含む。ＨＢｃＡｇの「コピー」及び「ユニット」は、本明細書においては交換可能に用いられる。ＨＢｃＡｇの二量体は、ＶＬＰの構造的な組み立てブロックを形成する。ＨＢｃＡｇユニットは、通常、頭とつま先の様式（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔｏｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）で一体的に連結する、即ち、１のユニットのＣ末端が、隣接するユニットのＮ末端に連結する。「第１のコピー」は、Ｎ末側コピー又はＣ末側コピーのいずれであってもよい。ユニットは、直接的に共有結合（例、ペプチド結合）により連結され得るが、好ましくは、それらは隣接するユニットの間隔を空けるリンカーにより連結され、それによって隣接するユニットの詰め込み（ｐａｃｋｉｎｇ）の乱れ（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関する任意の問題を回避する。リンカーの性質は、以下に検討する。連結した二量体は、免疫原性ポリペプチドを一方又は両方のｅ１ループに挿入させ得る「タンデムコンストラクト」、「タンデムコア」又は「タンデムコアコンストラクト」を形成する。
【００３０】
タンパク質中のＨＢｃＡｇは、ネイティブの全長ＨＢｃＡｇであり得る。しかしながら、本発明の一態様によれば、ユニットの少なくとも一方は、ｅ１ループ中にＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を有する改変型のＨＢｃＡｇである。ＨＢｃＡｇの他方のコピーは、ネイティブのＨＢｃＡｇであってもよく、又は本明細書に記載のＨＢｃＡｇの改変型であってもよい。ＨＢｃＡｇの改変型は、ｅ１ループ中に、別の免疫原性ポリペプチドを有し得る。タンデムコンストラクトは、ＨＢｃＡｇの両方のコピーのｅ１ループ中に挿入された、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を有し得る。ＨＢｃＡｇの一方のコピーに１超の型の免疫原性ポリペプチドが存在し得る。免疫原性ポリペプチドの候補の例を、本明細書で検討する。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、ユニットの一方は、ｅ１ループ中に、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド又はその免疫原性断片を有する改変型のＨＢｃＡｇである。ＨＢｃＡｇの他方のコピーは、ネイティブのＨＢｃＡｇであってもよく、又は本明細書に更に記載される通りの、ＨＢｃＡｇの改変型であってもよい。
【００３２】
免疫原性ポリペプチドは、片側又は両側にリンカーが隣接していてもよい。従って、タンデムコンストラクトは、ＨＢｃＡｇの一方のコピー又はＨＢｃＡｇの両方のコピーに、免疫原性ポリペプチドに隣接する１つ以上のリンカーを含有し得る。ｅ１ループの１つ又はそれぞれに、１超の免疫原性ポリペプチドが存在する場合、又は１つの又は各ｅ１ループ中に同一の免疫原性ポリペプチドのコピーが１超存在する場合、１つ又はそれぞれの免疫原性ポリペプチドに、該免疫原性ポリペプチドの片側又は両側で隣接するリンカーが存在し得る。免疫原性ポリペプチドの各々は、リンカーが、両側の一方に隣接していてもよいし、隣接していなくてもよい。隣接する免疫原性ポリペプチドを連結する隣接リンカー及び／又は免疫原性ポリペプチドをｅ１ループに連結する隣接リンカーが存在し得る。タンデムコンストラクトは、ＨＢｃＡｇユニットを連結するリンカーも有し得る。リンカーの性質は以下で検討する。
【００３３】
原則として、任意の改変が、ＨＢｃＡｇの立体構造及び粒子に会合するその能力を妨害しないように選ばれる。かかる改変は、その立体構造を維持するために重要ではない、タンパク質中の部位、例えば、ｅ１ループ、Ｃ末端及び／又はＮ末端においてなされる。ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、タンパク質の粒子形成能力を損なうことなく、１〜６００アミノ酸（例）の挿入を許容し得る。
【００３４】
ＨＢｃＡｇ配列は、置換、挿入、欠失又は伸長によって改変され得る。挿入、欠失又は伸長の程度は、例えば、１〜６００アミノ酸、１〜５００アミノ酸、１〜４００アミノ酸、１〜３００アミノ酸、１〜２００アミノ酸、３〜１００アミノ酸又は６〜５０アミノ酸であり得る。置換には、ＨＢｃＡｇ配列全長の至る所で、最大で、例えば１、２、５、１０、２０又は５０アミノ酸といった数のアミノ酸が関与し得る。伸長は、ＨＢｃＡｇのＮ末端又はＣ末端のものであり得る。欠失は、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又は内部部位におけるものであり得る。置換は、タンパク質配列中における任意の位置においてなされ得る。挿入も、タンパク質配列中における任意の位置においてなされ得るが、典型的には、ｅ１ループ等の、タンパク質の、表面に露出した領域においてなされる。挿入配列は、免疫原性ポリペプチドを有し得る。各ＨＢｃＡｇユニットに対して、１超の改変がなされ得る。このようにして、末端の伸長又は欠失、また内部挿入もなすことができる。例えば、Ｃ末端において切断がなされ得、ｅ１ループ中に挿入がなされ得る。
【００３５】
本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇ配列の各部分は、配列番号２に示す配列を有するタンパク質等の、天然のＨＢｃＡｇタンパク質の対応する配列に対し、好ましくは、少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、同一性は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。タンパク質の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書の文脈において、相同性が、アミノ酸の同一性に基づいて計算される（時に「ハードホモロジー（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と呼ばれる）ということは、当業者により理解される。
【００３６】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７−３９５）は、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、その初期設定で使用される）を提供する。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載の通り、（典型的にはそれらの初期設定で）相同性を計算し、又は配列を整列する（ｌｉｎｅ  ｕｐ）ために使用され得る。
【００３７】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントされた場合に、ある正の値の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ）閾値スコアＴに一致するか、又はこれを満たすかのいずれかの、クエリ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の長さＷの短いワードを同定することにより、最初に、スコアの高い配列ペア（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ，ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして機能する。累積アライメントスコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ）が増加し得る限り、該ワードヒットが、各配列に沿って両方向に伸長される。ワードヒットの各方向への伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｖａｌｕｅ）から量Ｘだけ低下するとき；１以上の負のスコアの残基アライメント（ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の累積に起因して累積スコアがゼロ以下になるとき；又はいずれかの配列の端部に到達するとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ，Ｔ及びＸは、アラインメントの感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００３８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）の統計解析を行う（例、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１基準（ｍｅａｓｕｒｅ）は、ヌクレオチド又はアミノ酸の２配列間の一致が偶然に起こる確率の目安を提供する、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ，Ｐ（Ｎ））である。ある配列が、別の配列と類似であるとみなされるのは、例えば、第１の配列と第２の配列との比較において、最小合計確率が約１未満である場合、好ましくは約０．１未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合である。
【００３９】
ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、成熟配列の６８〜９０位にあり、免疫原性ポリぺプチドは、これらの位置の間のどこにでも挿入され得る。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、６９〜９０、７１〜９０又は７５〜８５位の領域に挿入される。最も好ましいのは、免疫原性ポリペプチドを、アミノ酸残基７９と８０の間又は残基８０と８１の間に挿入することである。免疫原性ポリペプチドが挿入される場合、ＨＢｃＡｇの配列全体が維持されてもよく、又はその代わりに、ｅ１ループ配列の全体又は一部が、欠失され、タンパク質配列によって置換されてもよい。従って、アミノ酸残基６９〜９０、７１〜９０又は７５〜８５が、免疫原性ポリペプチドによって置換され得る。免疫原性ポリペプチドが、ｅ１ループ配列を置換する場合、置換配列は、通常、それが置換する配列よりも短くはない。
【００４０】
ＨＢｃＡｇの、Ｃ末側での切断は、通常、アミノ酸１４４を越えない。任意のそれ以上の切断がなされた場合、粒子が形成され得ないからである。従って、欠失されたアミノ酸は、例えば、アミノ酸１４４〜Ｃ末端のアミノ酸（アミノ酸１８３又はアミノ酸１８５）、アミノ酸１５０〜Ｃ末端のアミノ酸、アミノ酸１６４〜Ｃ末端のアミノ酸又はアミノ酸１７２〜Ｃ末端のアミノ酸を含み得る。ＨＢｃＡｇのＣ末端は、ＤＮＡを結合させるので、Ｃ末端の切断は、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇハイブリッドタンパク質（ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の調製物から、ＤＮＡを減少させ、又は完全に除去する。
【００４１】
本発明のタンパク質は、好ましくは、ネイティブのＨＢｃＡｇにより形成された粒子に類似する粒子を形成する。本発明の粒子は、本発明の１以上のタンパク質を多数コピー含む。粒子は、ＶＬＰの形態であり得る。本発明の粒子は、典型的には、少なくとも直径１０ｎｍ、例えば、直径１０〜５０ｎｍ又は２０〜４０ｎｍであるが、好ましくは、それらは（ネイティブのＨＢｃＡｇ粒子の大きさである）直径約２７ｎｍである。それらは、多数のＨＢｃＡｇユニット、例えば１５０〜３００のユニットを含むが、通常、それらは（ネイティブのＨＢｃＡｇ粒子におけるユニットの数である）約１８０又は約２４０ユニットに固定される。本発明のタンパク質は二量体であり得るので、このことは、粒子中のタンパク質単量体の数が７５〜１５０であり得るが、通常は約９０又は約１２０であることを意味する。
【００４２】
ＨＢｃスパイク領域を含む２本のαへリックスは対称でなく、それで結果として生じるＭＩＲは、ＶＬＰから完全に垂直な向きではなく、わずかにずれている（ｏｆｆｓｅｔ）。従って、分子モデリングは、挿入されたいかなる抗原もＶＬＰに対し直角ではなくむしろ平行に位置し得ることを示唆する。このことは、場合により立体障害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）及び免疫原性の減少の原因となり得る。ＨＢｃＡｇは、第１のへリックス（成熟配列の５０〜７３位に位置する）に、追加のターン（ｅｘｔｒａ  ｔｕｒｎ）（単数）又はターン（複数）を加えることにより、αへリックスと「つり合いをとる」ように機能する、挿入配列を含み得る。このことが、挿入された免疫原性タンパク質の、ＶＬＰに対して垂直な方向への提示をもたらす。これは、ＨＢｃＡｇへの３〜１２アミノ酸（例、３、５又は７アミノ酸）の挿入により達成され得る。これらのアミノ酸は、好ましくはアラニン、ロイシン、セリン及びスレオニン等の非荷電性アミノ酸である。挿入配列は、好ましくはＡＡＡＬＡＡＡ（配列番号１５）である。挿入は、成熟配列のアミノ酸５０と７５との間の部位、例えば、残基６０と７５との間、又は残基７０と７３との間の部位にあり得る。
【００４３】
本発明の粒子は、本発明の１超のタンパク質を含み得る（即ち混合粒子）。本発明者らは、タンデムコンストラクト中のＨＢｃＡｇの一方のコピーに、長さが２０アミノ酸未満であり、本明細書に更に記載される通りの、「ヌル」インサートを挿入することにより、ＨＢｃＡｇの他方のコピーにおける挿入抗原（複数可）の折り畳み、及び／又は正しい提示が可能になることを見出した。ＨＢｃＡｇの一方のコピーに、あるタイプの挿入抗原（複数可）を含み、ＨＢｃＡｇの他方のコピーに「ヌル」インサートを含むタンパク質は、ＨＢｃＡｇの一方のコピーに、異なるタイプの挿入抗原（複数可）を含み、ＨＢｃＡｇの他方のコピーに、「ヌル」インサートを含むタンパク質と、組み合わされ、同一の粒子にされ得る。これにより、粒子は、間隔を十分に空けて安定した形態で、両方のタイプの挿入抗原（複数可）を複数コピー含むことが可能になる。挿入抗原は、実質的に、互いの間に「スペーサー」を伴って配置され、従って、正確に折り畳む余地を提供する。単量体のＨＢｃＡｇは、これを実現することができない。
【００４４】
リンカー
隣接するＨＢｃＡｇユニット間のリンカーは、ｅ１ループ中のインサートに隣接し、及び／又はｅ１ループ中の隣接するインサートを連結し、通常、少なくとも長さが１．５ｎｍ（１５Å）、例えば１．５〜１０ｎｍ、１．５〜５ｎｍ又は１．５〜３ｎｍのアミノ酸の鎖である。それは、例えば、４〜４０アミノ酸又は１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５〜２１アミノ酸を含み得る。リンカーは、通常、可撓性である（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）。リンカー中のアミノ酸は、例えば、グリシン、セリン及び／若しくはプロリンを含むか、又は完全にそれらで構成される。例えば、リンカーは、配列ＧｌｙｎＳｅｒ（ＧｎＳ）（式中、ｎは、２、３、４、５、６、７又は８である）の１以上のリピートを含む。好ましいリンカーは、配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号４）の１つ、２つ又はそれ以上のリピートを含む。例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）。或いは、リンカーは、１以上のＧｌｙＰｒｏ（ＧＰ）ジペプチドリピートを含み得る。リピート数は、例えば、１〜１８、好ましくは３〜１２であり得る。Ｇ２Ｓリピートの場合、５、６又は７リピートの使用により、粒子の形成が可能になることが見出されている。隣接するＨＢｃＡｇユニット間の好ましいリンカーは、７リピートのＧ２Ｓである。リンカーは、抗体のヒンジ領域に相当し得；このヒンジ領域は、抗体の、抗原結合ドメインと尾部ドメインとの間の、可撓性の連結部を提供すると考えられている。
【００４５】
リンカーを含有するタンデムコンストラクトの構造の一例は、以下を含む：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］−［場合により、ＨＡストーク等の免疫原性ポリペプチド］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］。
【００４６】
タンデムコンストラクト中に１以上のリンカーが存在する場合、それらは互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、それらはすべて同一であってもよく、それらはすべて互いに異なっていてもよく、２つ以上のリンカーが同一であってもよいが、１以上の他のリンカーとは異なっていてもよい、という具合である。免疫原性ポリペプチドが「第２のコピー」に存在する場合、ｅ１ループの各々における挿入配列は、一方又は両方の側にリンカーを有し得る。両方のインサートの両側にリンカーがある場合、タンデムコンストラクトの構造の例は、以下を含む：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側であるＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］−［第４のリンカー］−［場合により、ＨＡストーク等の免疫原性ポリペプチド］−［第５のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側であるＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］
【００４７】
本発明の一態様のタンデムコアコンストラクトは、ＨＢｃＡｇの一方のコピーのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、場合により、ＨＢｃＡｇの他方のコピーのｅ１ループ中に、別の免疫原性ポリペプチドを含む。ＨＢｃＡｇの他方のコピーにおける免疫原性ポリペプチド（上記の配置順において「場合により免疫原性ポリペプチド（ｏｐｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」と記載される）は、本明細書に記載の任意の免疫原性ポリペプチドであり得る。従って、免疫原性ポリペプチドは、別のインフルエンザポリペプチド又はその免疫原性断片であり得る。それは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片であり得る。従って、ＨＢｃＡｇの両方のコピーのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片が存在し得る。各ｅ１ループ中のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片は、同一であっても異なっていてもよい。免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ由来であってもよい。例えば、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡストーク又はその免疫原性断片であり得る。従って、ＨＢｃＡｇの一方のコピーのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片が、そしてＨＢｃＡｇの他方のコピーのｅ１ループ中に、ＨＡストーク又はその免疫原性断片が存在し得る。
【００４８】
本発明の別の態様のタンデムコアコンストラクトは、ＨＢｃＡｇの一方のコピーのｅ１ループ中に、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド又はその免疫原性断片を含む。ＨＢｃＡｇの他方のコピーのｅ１ループは、２０アミノ酸未満の配列を含む。
【００４９】
本明細書に記載の通り、免疫原性ポリペプチドの１以上のコピーが、ＨＢｃＡｇの一方のコピーのｅ１ループ中に存在し得る。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１以上のコピーが、一方のｅ１ループ中に存在し得る。ＨＡストーク又はその免疫原性断片の、１以上のコピーが、一方のｅ１ループ中に存在し得る。免疫原性ポリペプチドの、最大２、３、４、６又は８コピーが、一方のｅ１ループ中に存在し得る。各ｅ１ループ中には、免疫原性ポリペプチドが複数コピー存在し得る。例えば、タンデムコンストラクトは、一方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１、２、３、４又は５コピーを、且つ他方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、ＨＡストーク又はその免疫原断片の１、２又は３コピーを含み得る。従って、タンデムコンストラクトは、一方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の３コピーを、且つ他方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、ＨＡストーク又はその免疫原性断片の１コピーを含み得る。更に、タンデムコンストラクトは、一方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の３コピーを、且つ他方のＨＢｃＡｇのｅ１ループ中に、ＨＡストーク又はその免疫原性断片の２又は３コピーを含み得る。一方のｅ１ループ中の各コピーは同一であっても異なっていてもよい。例えば、一方のｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチド又はその免疫原性断片の、異なる２、３、４又は５（好ましくは３）配列が存在し得る。一方のｅ１ループに挿入された免疫原性ポリペプチドのコピー間には、リンカーが存在し得る。従って、１以上の免疫原性ポリペプチドをｅ１ループに連結するリンカー、並びに、一方のｅ１ループに挿入された複数の免疫原性ポリペプチドを一体的に連結するリンカーが存在し得る。例えば、タンデムコンストラクトの配置順は、以下の通りであり得る：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］  ［第３のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第４のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの「第１のコピー」の一部］−［第５のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］−［場合によりＨＡストーク等の免疫原性ポリペプチド］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの「第２のコピー」の一部］。
【００５０】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２（Ｍ２）
本発明のタンパク質の目的は、それが、インフルエンザ、特にＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために用いられ得、従ってインフルエンザワクチンとして用いられ得ることである。本発明の一態様のタンパク質は、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループに挿入された、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を有する。本発明のタンパク質は、ＨＢｃＡｇの両方のコピーのｅ１ループに挿入されたＭ２又はその免疫原性断片を有し得る。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２は、インフルエンザウイルスのウイルスエンベロープ中に必須のプロトン選択性イオンチャネルタンパク質である。チャネル自体はホモ四量体（４つの同一のＭ２ユニットからなる）であり、ユニットは２つのジスルフィド結合によって安定化されたヘリックスである。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２ユニットは、３つのタンパク質ドメイン：外部環境に露出した、Ｎ末端の２４アミノ酸、膜貫通領域の疎水性の１９アミノ酸、及びウイルス粒子の内部へと配向している、Ｃ末端の５４アミノ酸から成る。Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／３４／ＰＲ８由来のＭ２タンパク質の全長配列を配列番号３に示す。
【００５１】
ＨＢｃＡｇのｅ１ループに挿入されるＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２は、Ａ型インフルエンザウイルスに由来する。それは配列番号３中の配列に由来し得る。全長のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２、即ち、完全な９７アミノ酸の配列が、ＨＢｃＡｇのｅ１ループに挿入され得る。例えば、配列番号３の全長配列が挿入され得る。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２は、天然に存在するＭ２タンパク質であっても、天然に存在するＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の変異体であってもよい。
【００５２】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１超のコピーが、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループに挿入され得る。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の２、３、４、５、６、７又は８コピーが、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループ中に挿入され得る。例えば、１、２又は３コピーが、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーのｅ１ループ中に挿入され得る。従って、１、２又は３コピーのＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片が、両方のｅ１ループ中又は一方のｅ１ループ中に挿入され得る。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１超のコピーが、ｅ１ループ中に存在する場合、各コピーの配列は同一であっても異なっていてもよい。配列が異なる場合、それらは任意の順序で挿入され得る。例えば、「第１のコピー」、「第２のコピー」、「第３のコピー」等は、ｅ１ループにおけるＮ末端からＣ末端までで任意の順序であり得る。例えば、「第３のコピー」は、「第１のコピー」のＮ末端側であってもよい。
【００５３】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２配列を、配列番号３に示す。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の配列は、配列番号３又は天然に存在する任意のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２と、例えば、全配列にわたって、又は少なくとも２０、例えば少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性等の相同性を有し得る。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ＨＢＶコアタンパク質に関して上記に検討されている。
【００５４】
相同なタンパク質は、典型的には、置換、挿入又は欠失、例えば、１、２、３、４、５〜８以上の置換、欠失又は挿入によって、天然に存在するＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２配列とは異なる。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、表１に従ってなされ得る。第２列における同一ブロック中、好ましくは第３列における同一行中のアミノ酸が互いに置換され得る。
【００５５】
【表１】
2018502562.tif 000002
【００５６】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片のインサート配列は、インフルエンザＡ型の任意のサブタイプに由来し得る（例、Ｓｈａｒｐ  ２００２  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１０８，３０５−３１２，“Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ”  ａｎｄ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，ＰＬＯＳＯＮＥ，５（１２）“Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＡ  ａｎｄ  ＮＡ  Ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”を参照）。例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５若しくはＨ１６等のＨＡサブタイプのいずれかから、及び／又はＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９等のＨＡサブタイプ由来のいずれかから。好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片のインサートは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２又はＨ１０Ｎ７に由来し得る。更により好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片のインサートは、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１又はＨ７Ｎ７に由来し得る。
【００５７】
インサートとして用いられるＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の免疫原性断片は、免疫応答を誘導する能力を保持する、全長Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の短縮型である。いくつかの例においては、断片は、天然に存在するＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２配列又は配列番号３の配列の長さの、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％等の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％であり得る。例えば、断片は、長さが６〜９６アミノ酸、６〜５０アミノ酸又は６〜２５アミノ酸であり得る。
【００５８】
好ましくは、免疫原性断片は、ビリオンの表面上に露出する、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の領域由来である。免疫原性断片は、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２タンパク質の外部のドメインである、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）であることが好ましい。Ｍ２ｅの配列は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列であり得る。配列番号９は、１７位及び１９位のシステインがセリンで置換された、ユニバーサル配列を示す。Ｍ２ｅの配列は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列の変異体であり得る。Ｍ２ｅの配列は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列、又は天然に存在する任意のＭ２ｅと、例えば、全配列にわたって、又は少なくとも８、例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性等の相同性を有し得る。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ＨＢＶコアタンパク質に関して上記に検討されている。配列は、１以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって変化し得る。例えば、最大１８、最大１５、最大１２、最大１０又は最大５の置換、欠失又は付加が存在し得る。配列は、欠失のみ、付加のみ、又は置換のみによって変化し得る。配列は、欠失及び付加、欠失及び置換、付加及び置換、又は欠失、付加及び置換の組合せによって変化し得る。好ましくは、１、２、３、４、５又は６個の欠失、付加及び置換が存在する。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、上記の表１に従ってなされ得る。Ｍ２ｅ配列の置換形態の例が、実施例１及び３において用いられる。Ｍ２ｅの配列は、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２に関連して上に列挙されたもの等、Ａ型インフルエンザウイルスの任意のサブタイプに由来し得る。最も一般的なＭ２ｅの変異体が用いられることが好ましい。例えば、実施例１及び３において用いられるＭ２ｅの配列を参照。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の免疫原性断片は、これらの配列のいずれかであり得る。これらの配列のいくつかでは、１７位及び／又は１９位のシステインをセリンで置換した。Ｍ２ｅ等の、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の配列のいずれもが、以下に更に検討されるように改変され得る。Ａ型インフルエンザウイルスＡ／３４／ＰＲ８株由来のＭ２ｅ配列は、配列番号３の最初の２４アミノ酸である。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の断片は、配列番号３のアミノ酸１〜２４を含み得るか、又は、であり得る。 
【００５９】
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２におけるシステインの置換又は欠失
Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位のシステインアミノ酸、１９位のシステインアミノ酸又は１７位及び１９位の両方のシステインアミノ酸は、欠失され得、又は代替アミノ酸で置換され得る。欠失と置換との組み合わせはあり得る。例えば、１７位のシステインが欠失され、１９位のシステインが置換されるか、又は１７位のシステインが置換され、１９位のシステインが欠失される。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び１９位は、Ａ型インフルエンザウイルス成熟表面ポリペプチドＭ２のＮ末端からの１７位及び１９位である。例えば、配列番号３の１７位及び１９位。上記の通り、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の断片はＭ２ｅであり得る。従って、Ｍ２ｅの１７位のシステイン、１９位のシステイン、又は１７及び１９位の両方のシステインは、欠失され得、又は代替アミノ酸で置換され得る。
【００６０】
「代替アミノ酸」は、ＶＬＰの形成を可能にし、ひいては被験体における免疫応答を誘導し得る、システインではない任意のアミノ酸であり得る。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、上記の表１に従ってなされ得る。システインは、好ましくはセリン、スレオニン又はメチオニンで置換される。セリンが最も好ましい。置換された一方又は両方のシステインを有するＭ２ｅ配列の例を、実施例１の表２に示す。
【００６１】
免疫原性ポリペプチド
タンデムコアシステムの柔軟性は、Ｍ２又はその免疫原性断片を含むことに加えて、本発明のタンパク質が１つ以上のさらなる免疫原性ポリペプチドを含み得ることを意味する。例えば、本発明のタンパク質は、インフルエンザウイルスに対し優れた免疫応答を誘導するために、１以上のさらなるインフルエンザウイルス由来免疫原性ポリペプチドを含み得る。或いは、本発明のタンパク質は、インフルエンザウイルス及び異なる病原体又はアレルゲンに対する免疫応答を同時に誘導するために、異なる病原体又はアレルゲン等の、異なるソースに由来する１以上の免疫原性ポリペプチドを含み得る。従って、本発明のタンパク質は、ＨＢｃＡｇの少なくとも一方のコピーのｅ１ループに挿入されたＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を有しなければならないが、タンパク質中のＨＢｃＡｇの他方のコピーのｅ１ループは、他の任意のタイプの免疫原性ポリペプチド（複数可）を含み得る。
【００６２】
免疫原性ポリペプチドは、免疫反応を誘導できる、アミノ酸の配列を含む。免疫原性ポリペプチドは、立体構造をとるか又は線状であり得る。それは、例えば、６〜６００アミノ酸、６〜３００アミノ酸、６〜２００アミノ酸、５０〜２００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、６〜１２０アミノ酸、２０〜９０アミノ酸、４０〜９０アミノ酸又は６０〜９０アミノ酸の配列であり得る。
【００６３】
長大且つ／又は疎水性の挿入物（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）が、ＶＬＰを破壊することなく収容され得る。インサートとして用いられる免疫原性ポリペプチドは、ＶＬＰ形成を妨害しない任意の好適な大きさであり得る。それは、好ましくは１００ｋＤａ未満、例えば８０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満又は５ｋＤａ未満である。それは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、又は３０ｋＤａ超であってもよい。
【００６４】
本発明のタンパク質は、１超の免疫原性ポリペプチド、例えば最大２、３、４、６又は８の免疫原性ポリペプチドを含有し得る。免疫原性ポリペプチドの１超のコピーは、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピー中に挿入され得、例えば、２〜８コピーが挿入され得る（例、２、３、４、５、６、７又は８コピーが挿入され得る）。本発明のタンパク質中に、２以上の免疫原性ポリペプチドがある場合、それらは同一の又は異なる生物由来のもの、また、同一の又は異なるタンパク質由来のものであり得る。
【００６５】
免疫原性ポリペプチドは、１以上の、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープを含み得る。それがＴ細胞エピトープを含む場合、それは細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ又はＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（例、Ｔｈ１エピトープ又はＴｈ２エピトープ）であり得る。本発明の好ましい実施形態においては、免疫原性ポリペプチドは、Ｔヘルパー細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープ又はＣＴＬエピトープを含む。Ｔヘルパー細胞エピトープが存在することが、Ｂ細胞エピトープ又はＣＴＬエピトープに対する免疫反応を増強する。
【００６６】
免疫原性ポリペプチドの選択は、ワクチン接種をすること又は治療が望まれる疾患によって決まる。免疫原性ポリペプチドは、例えば、病原性生物、がん関連抗原又はアレルゲンに由来し得る。病原性生物は、例えば、ウイルス、細菌又は原生動物であり得る。
【００６７】
免疫原性ポリペプチドは、限定されないが、（例えばＡ型、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスを含む）オルトミクソウイルス科、（例えばヒトアデノウイルスを含む）アデノウイルス科、（ノーウォークウイルス群等の）カリシウイルス科、（例えばＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＥＢＶ、ＣＭＶ及びＶＺＶを含む）ヘルペスウイルス科、（例えばヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓｅ）-ＨＰＶを含む）パポバウイルス科、（例えば天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ）及びワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）を含む）ポックスウイルス科、（例えばパルボウイルスＢ１９を含む）パルボウイルス科、（例えばロタウイルスを含む）レオウイルス科、（例えばＳＡＲＳを含む）コロナウイルス科、（例えば黄熱（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ）、ウエストナイルウイルス、デング熱、Ｃ型肝炎及びダニ媒介脳炎を含む）フラビウイルス科、（エンテロウイルス、ポリオ、ライノウイルス、及びＡ型肝炎を含む）ピコルナウイルス科、（例えば風疹ウイルスを含む）トガウイルス科、（例えばマールブルグ及びエボラを含む）フィロウイルス科、（パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｉｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）、おたふく風邪（ｍｕｍｐｓ）及び麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）を含む）パラミクソウイルス科、（例えば狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）を含む）ラブドウイルス科、（例えばハンタウイルスを含む）ブニヤウイルス科、（例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ−ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスを含む）レトロウイルス科及び（例えばＢ型肝炎を含む）ヘパドナウイルス科のメンバーを含むウイルス等、任意の病原体に由来し得る。
【００６８】
免疫原性ポリペプチドは、バークホリデリア属、Ｍ．ツベルクローシス、クラミジア属、Ｎ．ゴノレエ、シゲラ属、サルモネラ属、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕａ）、シュードモナス属、ボルデテラ・ペルツッシス、ブルセラ属、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｔｕｌｏｒｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｒｉａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｕｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・ペスティス、ストレプトコッカス属（Ａ型及びＢ型）、ニューモコッカス属、メニンゴコッカス属（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（ｂ型）、カンピロバクター感染症（Ｃｏｍｐｌｙｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓ）、モラクセラ・カタラーリス、ドノヴァン症（Ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ）、及び放線菌症（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｏｓｉｓ）を含む細菌病原体、カンジダ症（Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）及びアスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）を含む菌類病原体、並びにトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、テニア属（Ｔａｅｎｉａ）、吸虫（Ｆｌｕｋｅ）、回虫（Ｒｏｕｎｄｗｏｒｍ）、扁虫（Ｆｌａｔｗｏｒｍ）、アメーバ症（Ａｍｅｂｉａｓｉｓ）、ランブル鞭毛虫症（Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｔｏｓｏｍａ）、ニューモシス・ティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トリコモナス症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）及び旋毛虫病（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）を含む寄生性病原体に由来し得る。
【００６９】
免疫原性ポリペプチドは、ａ）気道、ｂ）尿生殖器系又はｃ）消化管を経由して感染する病原体に由来し得る。かかる病原体の例としては、ａ）アデノウイルス科、パラミクソウイルス科及びポックスウイルス科のメンバー、ライノウイルス、インフルエンザ、及びハンタウイルス、ｂ）ウレアプラズマ・ウレアリチカム、ナイセリア・ゴノレエ、ガードネレラ・バギナリス、トリコモナス・バギナリス、トレポネーマ・パリダム、クラミジア・トラコマチス、ヘモフィルス・デュクレイ、単純ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、カンジダ・アルビカンス、トレポネーマ・パリダム、及びカリマトバクテリウム・グラヌロマティス（Ｃａｌｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、並びにｃ）シゲラ属、サルモネラ属、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ）、Ｅ．コリ、エントアメーバ・ヒストリティカ、カンピロバクター属、クロストリジウム属、エルシニア属、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、回虫、扁虫、ランブル鞭毛虫症、及びクリプトスポリジウム属が挙げられる。
【００７０】
本発明において用られる免疫原性ポリペプチドは、限定されないが、肺、膵臓、腸、結腸、胸部、子宮、頸部、卵巣、精巣、前立腺、黒色腫、カポジ肉腫、リンパ腫（例、ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫）及び白血病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ）のがん等のがんに由来し得る。腫瘍関連抗原の具体的な例としては、限定されないが、ＭＡＧＥ  ファミリーのメンバー（ＭＡＧＥ  １、２、３等）、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２等のがん精巣抗原（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２及びＣＥＡ等の分化抗原（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）、突然変異した自己抗原及び発がん性ＨＰＶ型由来のＥ６及び／又はＥ７等のウイルス腫瘍抗原（ｖｉｒａｌ  ｔｕｍｏｕｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）が挙げられる。特定の腫瘍抗原の更なる例としては、ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ９７、ベータ−ＨＣＧ、ＧａＩＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、Ｐ１Ａ、ＥｐＣａｍ、メラノーマ抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ  ８、高分子量メラノーマ抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒｌ、Ｔｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭ（前立腺ムチン抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、前立腺分泌タンパク質、アルファ−フェトプロテイン、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＴＡＧ−７２、ＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２抗原が挙げられる。
【００７１】
本発明における使用のための他の免疫原性ポリペプチド候補の例としては、以下の抗原が挙げられる：インフルエンザ抗原ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）、ＮＰ（核タンパク質／ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１及びＮＳ２；ＨＩＶ抗原ｇｐ  １２０、ｇｐ  １６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ及びＲｅｆ；マラリア抗原ＣＳタンパク質及びスポロゾイト表面タンパク質２；ヘルペスウイルス抗原ＥＢＶ  ｇｐ３４０、ＥＢＶ  ｇｐ８５、ＨＳＶ  ｇＢ、ＨＳＶ  ｇＤ、ＨＳＶ  ｇＨ、ＨＳＶ初期タンパク質産物（ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、サイトメガロウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＨ、及びＩＥタンパク質ｇＰ７２；ヒトパピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６及びＥ７；呼吸器合胞体ウイルス抗原Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、及びＮタンパク質；百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のペルタクチン抗原；腫瘍抗原ＣＥＡ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＣＥＡ）、がん関連ムチン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｕｃｉｎ）、がん腫Ｐ５３（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｐ５３）、メラノーマＭＰＧ、メラノーマＰ９７、ＭＡＧＥ抗原、がん腫のＮｅｕがん遺伝子産物（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原、ｒａｓタンパク質、及びｍｙｃ；並びにハウスダストダニアレルゲン（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ）。
【００７２】
好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスに由来する。免疫原性ポリペプチドは、Ａ型、Ｂ型又はＣ型インフルエンザウイルスに由来し得る。好ましくは、それはＡ型インフルエンザウイルスに由来する。免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）、ＮＰ（核タンパク質／ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ１、Ｍ２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１及びＮＳ２抗原、特にＭ２、ＨＡ及びＮＡ及び抗原等の任意のインフルエンザ抗原に由来し得る。免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、本明細書に記載のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片である。
【００７３】
免疫原性ポリペプチドは、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片である。Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２及びその免疫原性断片に関連する上記検討は、ＨＡにも関連する。ＨＡの配列は、天然に存在する任意のＨＡと、例えば、全配列にわたって、又は少なくとも２０、例えば少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性等の相同性を有し得る。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ＨＢＶコアタンパク質に関して上記に検討されている。
【００７４】
免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、ＨＡ又はその免疫原性断片である。ＨＡの断片は、ＨＡ１又はＨＡ２に由来し得る。断片は、長さが６〜５６５アミノ酸、６〜３００アミノ酸、６〜２００、又は６〜１００アミノ酸であり得る。ＨＡの断片は、ＨＡのストーク領域としても知られている、ＨＡ２であり得る。図１０は、ＨＡストーク領域の構造を示す。断片は、ＨＡ２単量体の既知のドメイン、ループＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＣＤ及びヘリックスＤを含み得る（図１０参照）。ｅ１ループ中に挿入するためのＨＡの断片の例を表４に示す。挿入されたＨＡストーク配列は、配列番号１２のアミノ酸８０〜１５１であり得る。ＨＡストークの配列は、例えば、全配列にわたって、又は少なくとも８個、例えば少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、天然に存在する任意のＨＡストークと、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％等の同一性を有し得る。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ＨＢＶコアタンパク質に関して上記に検討されている。配列は、１以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって変化し得る。例えば、最大１８、最大１５、最大１２、最大１０又は最大５の置換、欠失又は付加が存在し得る。配列は、欠失のみ、付加のみ、又は置換のみによって変化し得る。配列は、欠失及び付加、欠失及び置換、付加及び置換、又は欠失、付加及び置換の組合せによって変化し得る。好ましくは、１、２、３、４、５又は６個の欠失、付加及び置換が存在する。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、上記の表１に従ってなされ得る。
【００７５】
ＨＡ又はその免疫原性断片の１超のコピーが、ｅ１ループに挿入され得る。例えば、ＨＡ又はその免疫原性断片の２、３、４、５、６、７又は８コピーが、ｅ１ループ中に挿入され得る。例えば、１、２又は３コピーが、ｅ１ループ中に挿入され得る。従って、ＨＡ又はその免疫原性断片の１、２又は３コピーが、ｅ１ループに挿入（ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｔｈｅ  ｅ１  ｌｏｏｐ）され得る。ｅ１ループ中に１超のＨＡ又はその免疫原性断片のコピーが存在する場合、各コピーの配列は、同一であっても、異なっていてもよい。配列が異なる場合、それらは、任意の順序で挿入され得る。例えば、「第１のコピー」、「第２のコピー」、「第３のコピー」等は、ｅ１ループのＮ末端からＣ末端までで任意の順序であり得る。例えば、「第３のコピー」は、「第１のコピー」のＮ末端側であり得る。
【００７６】
本発明の１つの態様によれば、タンデムコンストラクトは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇの「第１のコピー」中に、ＨＡ又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇの「第２のコピー」中に含む。本明細書に記載される通り、「第１のコピー」は、Ｎ末側又はＣ末側のコピーのいずれかであり得る。
【００７７】
ＨＢｃＡｇの一方のコピーにおける「ヌル」インサート
本発明の別の態様によれば、タンデムコンストラクトは、ＨＢｃＡｇの一方のコピー中に「ヌル」インサートを含む。本発明者らは、これにより、ＨＢｃＡｇの他方のコピー中で抗原が折りたたまれ、及び／又は正しく提示されることが可能となることを見出した。「ヌル」インサートは、典型的には、長さが２０アミノ酸未満の短い配列であり、ＨＢｃＡｇの他方のコピー中で抗原が折り畳まれ、及び／又は正しく提示されることを可能にする。
【００７８】
より詳細には、本発明者らは、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスＨＡ２タンパク質ドメイン（ＬＡＨ３）由来の保存領域を、タンデムコンストラクト中のＨＢｃＡｇの一方のコピーに挿入した。彼らは、２０アミノ酸未満の短い配列をＨＢｃＡｇの第２のコピーに挿入することにより、単量体のコア中でＬＡＨ３を発現させるのと比較して、第１のインサート（ＬＡＨ３）の立体配置を適切にすることが可能になり、ＶＬＰ全体により高い溶解性が付与されることを見出した（実施例４）。具体的には、彼らは、グリシン及びセリン残基からなる短い可撓性リンカー領域が隣接する単一のリジン（Ｋ）残基を含む配列（「ヌル」インサート）をＨＢｃＡｇの第２のコピーに挿入した。かかるインサートは、タンデムコンストラクト（ＨＢｃＡｇの第２のコピー中に任意の抗原を含む）中の、ＨＢｃＡｇの一方のコピーにおいて用いられ、該抗原を折り畳むこと及び／又は正しく提示することを促進し得る。
【００７９】
従って、本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含み、ＨＢｃＡｇの他方のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質を提供する。
【００８０】
本発明は、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換されており、ＨＢｃＡｇの他方のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質も提供する。
【００８１】
本発明のこれらの態様のいずれかによるＭ２又はその断片は、上記のＭ２又はその断片であり得る。
【００８２】
本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ＨＡ又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、タンパク質も提供する。
【００８３】
本発明のこの態様によるＨＡ又はその断片は、上記のＨＡ又はその断片であり得る。ＨＡの断片は、例えば、タンパク質が、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルス感染に対して免疫するために用いられ得るように、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルス由来のもの等のＨＡ２タンパク質ドメイン由来であり得る。例えば、断片は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸４２１〜４７５を含み得る。断片は、配列番号２４又は該配列と相同性を有する配列を含み得る。天然に存在するＨＡ配列と相同性を有する配列は上記されている。やはり上記の通り、ＨＡ又はその断片の１超のコピーが存在し得る。
【００８４】
ＨＢｃＡｇの第２のコピーは、ｅ１ループ中に、短い配列、すなわち「ヌル」インサートを含む。該配列により、単量体のＨＢｃＡｇコア中のＨＢｃＡｇの第１のコピー中でインサートを発現させるのと比較して、ＨＢｃＡｇの第１のコピー中のインサートの立体配置を適切にすることが可能となり、及び／又は、ＶＬＰ全体に、より高い溶解性が付与される。配列は、長さが２０アミノ酸未満、例えば長さが１８アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、１２アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、５アミノ酸以下、又は３アミノ酸以下である。例えば、配列は、長さが１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１又は０アミノ酸であり得る。配列は、配列番号２１の通り、長さが１４アミノ酸であり得る。配列は、リンカー配列（以下の構造における「第２の」及び「第３の」リンカー）が両側に隣接するリジン（Ｋ）残基を含み得る。一般的に、リンカーは可撓性である。リンカー中のアミノ酸は、例えば、グリシン及びセリン残基を含み得るか、又は完全にそれらで構成され得る。リジン残基は、例えば、２〜８個、又は３〜７個のグリシン又はセリン残基等の、１〜１０個のグリシン又はセリン残基を含むリンカー配列に隣接し得る。
【００８５】
Ｍ２又はその免疫原性断片を含むタンデムコンストラクトの構造の一例は、以下を含む：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片］−［第２リンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［第４のリンカー］−［リジン（Ｋ）残基］−［第５のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］
【００８６】
ＨＡ又はその免疫原性断片を含むタンデムコンストラクトの構造の一例は、以下を含む：
［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第１のコピーの一部］−［第１のリンカー］−［ｅ１ループのＮ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］−［第２のリンカー］−［リジン（Ｋ）残基］−［第３のリンカー］−［ｅ１ループのＣ末側である、ＨＢｃＡｇの第２のコピーの一部］。
【００８７】
ＨＢｃＡｇの第２のコピーは、ｅ１ループ中に、配列番号２１の配列、又は相同な配列を含み得る。配列は、例えば、全配列にわたって、又は少なくとも６、例えば少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、配列番号２１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性等の相同性を有し得る。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ＨＢＶコアタンパク質に関して上記に検討されている。配列は、１以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって変化し得る。例えば、最大８、最大６、最大４、又は最大２の置換、欠失又は付加が存在し得る。配列は、欠失のみ、付加のみ、又は置換のみによって変化し得る。配列は、欠失及び付加、欠失及び置換、付加及び置換、又は欠失、付加及び置換の組合せによって変化し得る。好ましくは、１、２、３、４、５又は６個の欠失、付加及び置換が存在する。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、上記の表１に従ってなされ得る。
【００８８】
ＨＢｃＡｇの一方のコピーに抗原（複数可）を含み、ＨＢｃＡｇの第２のコピーにヌルインサートを含むタンパク質は、タンパク質の複数コピーを含む粒子において発現し得る。或いは、ＨＢｃＡｇの一方のコピー中に抗原（Ｍ２又はその免疫原性断片等）を、ＨＢｃＡｇの第２のコピー中にヌルインサートを含むタンパク質は、ＨＢｃＡｇの一方のコピー中に第２の抗原（ＨＡ又はその免疫原性断片等）を、ＨＢｃＡｇの第２のコピー中にヌルインサートを含むタンパク質と組合せて、混合粒子を作製するために用いられ得る。ヌルインサートにより、２つの抗原を、間隔を十分に空けて提示することが可能となり、安定した粒子が得られる。
【００８９】
本発明のタンパク質の作製
本発明のタンパク質は、一般に、組換えＤＮＡ技術によって作製される。本発明は、発現ベクター等の、本発明のタンパク質をコードする核酸分子（例、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。核酸分子は、核酸を操作するための公知の技術を用いて作製され得る。典型的には、２つのＨＢｃＡｇユニットをコードする２つの別個のＤＮＡコンストラクトが作製され、次いでオーバーラップＰＣＲによって一体的に連結される。
【００９０】
本発明のタンパク質は、タンパク質が発現する条件下で、タンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養すること、及びタンパク質を回収することによって製造され得る。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞及び他の真核細胞、例えば昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【００９１】
宿主細胞を、本発明のタンパク質をコードする１超の核酸分子で形質転換することにより、本発明の１超のタンパク質が同時に産生され得る。例えば、宿主細胞は、ＨＢｃＡｇの一方のコピー中に抗原（Ｍ２又はその免疫原性断片等）を、及びＨＢｃＡｇの第２のコピー中にヌルインサートを含むタンパク質をコードする核酸分子、並びにＨＢｃＡｇの一方のコピー中に第２の抗原（ＨＡ又はその免疫原性断片等）を、ＨＢｃＡｇの第２のコピー中にヌルインサートを含むタンパク質をコードする核酸分子で形質転換され得る。２つのタンパク質は、同一又は別個の核酸分子にコードされ得る。
【００９２】
本発明による核酸分子を構成するベクターは、例えば、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。それらは、複製起点、タンパク質をコードする配列の発現のためのプロモーター、エンハンサー等の、プロモーターのレギュレーター、転写停止シグナル、翻訳開始シグナル及び／又は翻訳停止シグナルを含有し得る。ベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、又は哺乳動物ベクターの場合にはネオマイシン耐性遺伝子も含有し得る。ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生のためにインビトロで用いられ得、又は宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いられ得る。ベクターはまた、例えば、遺伝子治療又はＤＮＡワクチン接種の方法において、インビボで用いられるように適合され得る。
【００９３】
プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択され得る。例えば、原核生物プロモーター、特に大腸菌株（大腸菌ＨＢ１０１等）での使用に好適なものが用いられ得る。嫌気的条件等の周囲環境における変化に反応して活性が誘導されるプロモーターが用いられ得る。好ましくは、ｈｔｒＡ又はｎｉｒＢプロモーターが用いられ得る。これらのプロモーターは、特に、例えばワクチンとしての使用のために、弱毒化細菌中でタンパク質を発現させるために用いられ得る。哺乳動物細胞において、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明のタンパク質の発現が行われる場合、哺乳動物プロモーターが用いられ得る。組織特異的プロモーター、例えば肝細胞特異的プロモーターも用いられ得る。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター及びアデノウイルスプロモーターも用いられ得る。これらのプロモーターは、全て当該技術分野で容易に入手可能である。
【００９４】
本発明によるタンパク質は、タンパク質を精製するための従来の技術を用いて精製され得る。タンパク質は、例えば、精製された、純粋な又は単離された形態で提供され得る。ワクチンにおける使用のためには、タンパク質は、一般に、高レベルの純度で、例えば標品中のタンパク質の８０％超、９０％超、９５％超又は９８％超を構成するレベルで提供されなければならない。しかし、最終ワクチン製剤中で、タンパク質を他のタンパク質と混合することが望ましい場合がある。
【００９５】
免疫誘導の応答
本発明のタンパク質、粒子又は核酸は、特にＡ型インフルエンザウイルス等のインフルエンザに対する免疫応答を誘導するために用いられ得る。タンパク質、粒子又は核酸は、ワクチンとして用いられ得る。本発明のタンパク質、粒子又は核酸を被験体に投与することを含む、被験体における免疫応答を誘導する方法が提供される。アジュバントは、タンパク質、粒子又は核酸と組み合わせて投与され得る。タンパク質、粒子又は核酸は、すべての成分（ＨＢｃＡｇ、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２、又はＨＡ及び場合により１以上の他の免疫原性ポリペプチド）に対する、複数の同時免疫応答を生じさせるために用いられ得る。免疫原性ポリペプチドがインフルエンザにも由来する場合、それは、インフルエンザに対する免疫応答の増強を誘導し得る。免疫原性ポリペプチドがインフルエンザに由来しない場合、それは、免疫原性ポリペプチドのソース及びインフルエンザに対する同時免疫応答を誘導し得る。１超の免疫原性ポリペプチド及びＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２が存在する場合、１超の免疫原性ポリペプチドは、病原体若しくはアレルゲン等の１つのソース由来、又は１超の病原体若しくはアレルゲン等の異なるソース由来であり得る。すべての免疫原性ポリペプチドが１超のソースに由来する場合、これは異なるソース、例えば１超の病原体又はアレルゲンに対する同時免疫応答を誘導し得る。本発明の利点の１つは、ワクチンにおいて、それにより、送達される異なる免疫原性ポリペプチドの比に対し正確な制御が可能となることである。例えば、ＨＢｃＡｇの第２のコピーにおける免疫原性ポリペプチドに対するＨＢｃＡｇの第１のコピーにおけるＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２の比は、正確に１：１であり得る。
【００９６】
タンパク質、粒子又は核酸は、単独で用いられ得、又は、限定されないが、医薬組成物、ワクチン組成物若しくは免疫療法組成物を含む、組成物の一部として用いられ得る。従って、本発明は、本発明のタンパク質、本発明のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は本発明のタンパク質をコードする核酸分子及び、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物（例、ワクチン組成物）を提供する。また、上記説明の通り、本発明は、本発明の１超のタイプのタンパク質を含む「混合」粒子を提供する。従って、本発明は、かかる混合粒子を含有する医薬組成物、ワクチン組成物又は免疫療法組成物も提供する。組成物は、アジュバントを更に含み得る。組成物は、ヒト又は動物の身体の治療のために用いられ得る。組成物は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用に用いられ得る。組成物を被験体に投与することを含む、ヒト又は動物被験体の治療方法が提供される。該組成物は、本明細書に記載の病原体のいずれかに対してワクチン接種するために用いられ得る。特に、組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス等のインフルエンザに対してワクチン接種するために用いられ得る。
【００９７】
本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸は、ヒト又は動物の身体の治療方法において用いられ得る。本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸を被験体に投与することを含む、ヒト又は動物被験体の治療方法が提供される。アジュバントは、タンパク質、粒子又は核酸と組み合わせて投与され得る。本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸の、ヒト又は動物の身体の治療のための医薬の製造のための使用も提供される。タンパク質、粒子又は核酸は、本明細書に記載の病原体を処理するために用いられ得る。特に、タンパク質、粒子又は核酸は、インフルエンザウイルスＡ型等のインフルエンザの治療のために用いられ得る。
【００９８】
本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いられ得る。本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸を被験体に投与することを含む、ヒト又は動物被験体のワクチン接種方法が提供される。本発明は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬の製造のための、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸の使用を提供する。タンパク質、粒子又は核酸は、本明細書に記載されたいずれかの病原体に対するワクチン接種のために用いられ得る。特に、タンパク質、粒子又は核酸は、Ａ型インフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルスに対するワクチン接種に用いられ得る。
【００９９】
ワクチン接種の背景にある原理は、宿主において免疫記憶をもたらすように、宿主における免疫反応を誘導することである。このことは、宿主が病原性の強い（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）病原体に曝露される場合に、それが、有効な（防御）免疫反応、すなわち、病原体を不活性化し及び／又は死滅させる免疫反応を開始することを意味する。本発明は、インフルエンザに対するワクチンの基礎を形成し、タンパク質中に、他のいかなる免疫原性ポリペプチドが含められるかに依存して、ＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＣＶ、口蹄疫、ポリオ、ヘルペス、狂犬病、ＡＩＤＳ、デング熱、黄熱、マラリア、結核、百日咳、腸チフス、食中毒、下痢、髄膜炎及び淋病等の他の広範な疾患及び状態のいずれかに対して、個体を、同時にワクチン接種し得る。本発明のタンパク質中の免疫原性ポリペプチドは、ワクチンが防御をもたらすことが意図される疾患に適切であるように選ばれる。
【０１００】
本発明のタンパク質、粒子又は核酸は、Ａ型インフルエンザウイルスのいずれかの、又は全てのサブタイプに対する免疫応答を誘導する能力を有する。従って、本発明のタンパク質、粒子又は核酸は、Ａ型インフルエンザウイルスのいずれかの、又は全てのサブタイプに対してワクチン接種する能力を有する（例、Ｓｈａｒｐ  ２００２  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１０８，３０５−３１２，“Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ”及びＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，ＰＬＯＳＯＮＥ，５（１２）“Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＡ  ａｎｄ  ＮＡ  Ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”を参照））。例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５若しくはＨ１６等のＨＡサブタイプのいずれか及び／又はＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９等のＮＡサブタイプのいずれか由来。好ましくは、サブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２及び／又はＨ１０Ｎ７。更により好ましくは、サブタイプＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及び／又はＨ７Ｎ７。例えば、タンデムコンストラクトは、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプ由来のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み得、従って、免疫応答を誘導し、よってＡ型インフルエンザウイルスのサブセット又はすべてのサブタイプに対して防御をもたらす万能なワクチンとして用いら得る。例えば、ユニバーサルなＭ２ｅ配列及び１つ、２つ又はそれ以上の、（本明細書に記載されるような）ユニバーサルなＭ２ｅ配列の変異体を含むタンデムコンストラクトは、Ａ型インフルエンザウイルスのサブセット又はすべてのサブタイプに対する免疫応答を誘導し得る。例えば、実施例１及び３における、３連のＭｅ２を含有するタンデムコンストラクトを参照。１つ、２つ又はそれ以上の、ユニバーサルなＭ２ｅ配列の変異体は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５若しくはＨ１６等のＨＡサブタイプに見られる、及び／又はＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９等のＮＡサブタイプのいずれか由来の、最も一般的な変異体の１つ以上（例えば１，２又は３つ）であり得る。好ましくは、サブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２及び／又はＨ１０Ｎ７。更により好ましくは、サブタイプＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及び／又はＨ７Ｎ７。
【０１０１】
また、一例として、タンデムコンストラクトは、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片、及びＡ型インフルエンザウイルスの１以上のサブタイプに由来する１以上の更なる免疫原性ポリペプチドを含み得、従って、免疫応答を誘導する万能なワクチンとして用いられ得るので、Ａ型インフルエンザウイルスのサブセット又はすべてのサブタイプに対する防御をもたらす。例えば、（本明細書に記載される）ユニバーサルなＭ２ｅ配列及び１つ、２つ又はそれ以上の、ユニバーサルなＭ２ｅ配列の変異体並びに１つ以上（例、１、２又は３）のＨＡ又はその免疫原性断片（例、ＨＡストーク）のコピーを含むタンデムコンストラクトは、Ａ型インフルエンザウイルスのサブセット又はすべてのサブタイプに対して免疫応答を誘導し得る。例えば、実施例３のタンデムコンストラクトを参照。１つ、２つ又はそれ以上の、ユニバーサルなＭ２ｅ配列の変異体は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５若しくはＨ１６等のＨＡサブタイプに見られる、及び／又はＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９等のＮＡサブタイプのいずれか由来の、最も一般的な変異体の１つ以上（例、１，２又は３つ）であり得る。好ましくは、サブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２及び／又はＨ１０Ｎ７。更により好ましくは、サブタイプＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及び／又はＨ７Ｎ７。免疫原性ポリペプチド（例、ＨＡ又はその、ＨＡストーク等の免疫原性断片）はまた、上記に列挙されたもののいずれか等の任意のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプに由来し得る。
【０１０２】
また、一例として、タンデムコンストラクトは、インフルエンザウイルスＨＡ又はその免疫原性断片（例、ＨＡストーク）の領域を含み得、これも上記のいずれか等の任意のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプに由来し得る。
【０１０３】
それぞれが、インフルエンザの同一又は異なるサブタイプ由来の、異なるインフルエンザウイルス抗原を含有する、複数の異なるタンデムコンストラクトが、インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において同時に使用するために調製され得る。例えば、本発明のＡ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含むタンデムコンストラクトは、本発明のＨＡ又はその免疫原性断片を含むタンデムコンストラクトと組み合わせて用いられ得る。特に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ７及び／又はＨ５Ｎ１インフルエンザ感染からの防御をもたらす、本発明の、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含むタンデムコンストラクトは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザからの防御（Ｈ３Ｎ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）をもたらす、本発明の、ＨＡを含むタンデムコンストラクト又は免疫原性コンストラクトと組み合わせて用いられ得る。例えば、実施例４のタンデムコンストラクトを参照。
【０１０４】
従って、本発明は、本発明の１超の異なるタンパク質、粒子又は核酸を含む医薬組成物及びワクチンも提供する。例えば、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸であって、第１のタンパク質がＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片をＨＢｃＡｇ配列に連結するリンカーが片側又は両側に隣接した、該ポリペプチド又は該断片を含み、且つ場合によりＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、別の免疫原性ポリペプチド又は２０アミノ酸未満の配列を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が、場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物及びワクチンが提供される。
【０１０５】
また、（ｉ）第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又はタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーが、ｅ１ループ中に、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルス表面ポリペプチドＭ２又はその免疫原性断片の１７位及び／又は１９位のシステインアミノ酸が、欠失され、又は代替アミノ酸で置換され、且つ場合によりＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、別の免疫原性ポリペプチド若しくは２０アミノ酸未満の配列を含む、第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又はタンパク質をコードする核酸；及び
（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の第１及び第２のコピーをタンデムに含み、ＨＢｃＡｇの第１のコピーが、ｅ１ループ中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性断片を含み、ＨＡの断片が場合によりＨＡストーク領域であり、ＨＢｃＡｇの第２のコピーが、ｅ１ループ中に、２０アミノ酸未満の配列を含む、第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸；及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物及びワクチンも提供される。
【０１０６】
医薬組成物又はワクチン中の第１及び第２のタンパク質は、上記のインフルエンザのサブタイプのいずれかに対する防御をもたらし得るが、好ましくは、異なるサブタイプに対する防御をもたらす。例えば、（実施例４における例示的なタンデムコンストラクトに関して、）第１のタンパク質は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ７及び／又はＨ５Ｎ１に対する防御をもたらし得、第２のタンパク質は、Ｈ３Ｎ２インフルエンザ感染に対する防御をもたらし得る。
【０１０７】
従って、本発明の第１及び第２のタンパク質は、被験体における、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する方法において共に用いられ得る。該方法は、（ｉ）本発明の第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸、及び（ｉｉ）本発明の第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸を被験体に投与することを含み得る。該２つのもの（ｅｎｔｉｔｙ）は、同一又は異なる組成物、好ましくは同一組成物、で投与され得る。
【０１０８】
インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種方法において用いるための、（ｉ）本発明の第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸、及び（ｉｉ）本発明の第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸も提供される。インフルエンザに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬を製造するための、（ｉ）本発明の第１のタンパク質、第１のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第１のタンパク質をコードする核酸、及び（ｉｉ）第２のタンパク質、第２のタンパク質を複数コピー含む粒子、又は第２のタンパク質をコードする核酸の使用も提供される。用語「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」及び「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、限定するものではないが、ヒト並びに、チンパンジー及び他の類人猿等の非ヒト霊長類を含む他の霊長類並びにサルの種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等の家畜；イヌ及びネコ等の家畜哺乳類；マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類並びにブタを含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽（ｇａｌｌｉｎａｃｅｏｕｓ  ｂｉｒｄ）、アヒル（ｄｕｃｋ）、及びガチョウ（ｇｏｏｓｅ）など等の飼育（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）鳥、野鳥並びに狩猟鳥を含む鳥類を含む、脊索動物亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを指すために、本明細書中において交換可能に用いられる。用語は、特定の年齢を表していない。従って、成人及び新生児の個体の両方がカバーされることが意図される。上述の脊椎動物の全ての免疫系は同じように働くことから、本明細書中に記載された方法は、これらの脊椎動物種のいずれかにおける使用が意図される。
【０１０９】
いくつかの例においては、本発明は、任意の好適な被験体及び特に所与の種の任意の好適な被験体、好ましくは好適なヒト被験体に投与され得る。従って、可能な限り多くの被験体が、例えば、被験体のうちの任意の特定の群に重点を置くことなく、投与に供され得る。例えば、被験体の集団の全体又は可能な限り多くが、投与に供され得る。
【０１１０】
本発明のタンパク質、粒子又は核酸は、被験体への投与用である。それは、アジュバントと同時に投与され、又はアジュバントに続いて（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｗｉｔｈ）投与され得る。従って、タンパク質、粒子又は核酸を含む本発明の組成物は、アジュバントも含み得る。本発明の組成物は、（皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、及び腹腔内等の）注射、経皮粒子送達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、吸入により、局所に、経口で又は（鼻、舌下、膣又は直腸等の）経粘膜的に送達されるものであり得る。
【０１１１】
組成物は、従来の医薬調製物として製剤化され得る。このことは、当業者に利用可能な標準の医薬製剤化学及び方法論を用いてなされ得る。例えば、アジュバントとともに又はアジュバントを伴わずに、タンパク質、粒子又は核酸を含有する組成物が、液体製剤を提供するために１以上の医薬的に許容可能な賦形剤又はビヒクルと組み合わされ得る。従って、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と共にタンパク質、粒子又は核酸を含む医薬組成物も提供される。組成物は、場合によりアジュバントを含む。
【０１１２】
湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）等の補助物質が存在し得る。これらの担体、希釈剤及び補助物質は、通常、過度の毒性を伴わずに投与され得、且つ、抗原性組成物（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の場合には、それ自体は、組成物を受容する個体中の免疫反応を誘導しない医薬品である。医薬的に許容可能な担体としては、限定されないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール及びエタノール等の液体が挙げられる。医薬的に許容可能な塩、例えば、鉱酸塩（ｍｉｎｅｒａｌ  ａｃｉｄ  ｓａｌｔ）（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など等）及び有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など等）も、これらに含まれ得る。また、必要ではないが、ペプチド、タンパク質又は他の類似分子（ｏｔｈｅｒ  ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を組成物中に含めるつもりであれば、調製物が、特にそれらのための安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）として働く医薬的に許容可能な担体を含有することも好ましい。ペプチドのための安定剤としても作用する好適な担体の例としては、限定されないが、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が挙げられる。他の好適な担体としては、やはり限定されないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル及び補助物質の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能であり、該文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１１３】
核酸取り込み及び／又は発現の、ある種の促進剤（「トランスフェクション促進剤」）例えばブピバカイン、カルジオトキシン及びスクロース等の促進剤、並びに、核酸分子を送達するために日常的に用いられる、リポソーム調製物又は脂質調製物等の、トランスフェクション促進ビヒクルも、組成物に含められ得る。アニオン性及び中性のリポソームは広く入手可能であり、核酸分子を送達することに関して周知である（例、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９０）ＲＰＣ  Ｎｅｗ  Ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ参照）。カチオン性脂質調製物も、核酸分子の送達において使用するための周知のビヒクルである。好適な脂質調製物としては、商品名Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）で入手可能なＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）及びＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）（例、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６；Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７−６０８１；米国特許第５，２８３，１８５号及び第５，５２７，９２８号、並びに国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号、第ＷＯ９１／１５５０１号及び第ＷＯ９５／２６３５６号を参照）が挙げられる。これらのカチオン性脂質は、好ましくは中性脂質、例えばＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と組み合わせて用いられ得る。上記の脂質又はリポソーム調製物に加えられ得る、なお更なるトランスフェクション促進組成物としては、スペルミン誘導体（例、国際公開第ＷＯ９３／１８７５９号を参照）及びＧＡＬＡ、グラミシジンＳ及びカチオン性胆汁酸塩等の膜透過化化合物（例、国際公開第ＷＯ９３／１９７６８号を参照）が挙げられる。
【０１１４】
或いは、タンパク質、粒子若しくは核酸、及び／又はアジュバントは、粒状担体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）に封入され（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、吸着され（ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｔｏ）、又は結合され得る（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）。適切な粒状担体としては、ポリメチルメタクリレート重合体から得られるもの、及びポリ乳酸（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅｓ））及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から得られるＰＬＧ微小粒子が挙げられる。例、Ｊｅｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：３６２−３６８を参照。他の粒子系及び重合体、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、及びこれらの分子のコンジュゲート等の重合体も用いられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド凝縮剤及び金属イオンキレート剤の存在下で担体上に沈殿させられ得る。好ましい縮合剤としては、カチオン性重合体、特にポリアミン、特にポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）又はポリリジンが挙げられる。好ましい例においては、ポリアミンは（Ａｒｇ）４又は（Ａｒｇ）６である。用いられ得る、ＷＯ２００４／２０８５６０に記載の技術が参照され得る。
【０１１５】
一旦製剤化された組成物は、様々な既知の経路及び手法を用いて、インビボで被験体に送達され得る。例えば、液体製剤は、注射液、懸濁剤又は乳剤として提供され得、従来の注射針及び注射器を用いて、又は液体ジェット注入系（ｌｉｑｕｉｄ  ｊｅｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内  骨内及び腹腔内注射によって投与され得る。液体製剤も、皮膚又は（例、鼻、舌下、膣又は直腸の）粘膜組織へ局所投与され得、又は呼吸投与又は経肺投与に好適な微粉化されたスプレー剤（ｆｉｎｅｌｙ  ｄｉｖｉｄｅｄ  ｓｐｒａｙ）として提供され得る。投与の他の方法としては、経口投与、坐薬、及び能動的又は受動的経皮送達手法が挙げられる。
【０１１６】
本発明のタンパク質、粒子又は核酸は、被験体に、免疫反応の調節において有効な量で投与される。適切な有効量は、比較的広い範囲に収まるであろうが、当業者によりごく普通の取り組み（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｔｒｉａｌ）によって容易に決定され得る。“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”及び“Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”が、必要量を決定するために有用である。典型的には、タンパク質又は粒子は、０．１〜２００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは１０〜５０ｍｇ体重の用量で投与される。本発明の核酸は、当該分野で公知の技術を用いるか、又は当該分野で公知のベクターを用いて、むき出しの核酸コンストラクトとして直接投与され得る。投与される核酸の量は、典型的には１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１ｍｇの範囲である。ワクチンは、単回投与計画（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）又は複数回投与計画、例えば２〜３２回又は４〜１６回の投与で与えられ得る。上述した投与経路及び用量は、単に指針としての意図であり、経路及び用量は、最終的に医師の裁量であり得る。
【０１１７】
いくつかの事例では、本発明の組成物の投与が、初回投与後に、引き続き行われ得る。特に、初回投与後に、被験体が、「追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）」を与えられ得る。追加免疫は、例えば、本明細書中に言及されたもののいずれかから選ばれた用量であり得る。追加免疫投与は、例えば、初回投与後、少なくとも１週間、２週間、４週間、６週間、１ヶ月、２ヶ月又は６ヶ月であり得る。
【０１１８】
本発明のタンパク質、粒子又は核酸、及びアジュバントは、連続して又は同時に、好ましくは同時に、投与され得る。該２つのものは、同一の又は異なる組成物で、好ましくは同一の組成物で投与され得る。アジュバント効果がみられるように、すなわち、みられた免疫反応が、アジュバントが抗原とともに投与されなかった場合の免疫反応と異なるように、アジュバントが送達される。該２つのものは、同一の又は異なる部位、好ましくは同一の部位に投与され得る。好ましくは、該２つのものが、同一組成物で同一部位に同時に、好ましくは注射により投与される。
【０１１９】
任意の好適なアジュバントが用いられ得る。現在用いられるワクチンアジュバントとしては：
−    アルミニウム塩（例、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム）又はリン酸カルシウム等の無機化合物。アルミニウム塩は、別名ミョウバンとして知られている。
−    油乳剤及び界面活性剤ベースの製剤、例、ＭＦ５９（ミクロ流動化界面活性剤によって安定化した（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ）水中油型乳剤）、ＱＳ２１（精製サポニン、ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］  （水中油型乳剤＋ＭＰＬ＋ＱＳ−２１）、モンタニドＩＳＡ−５１及びＩＳＡ−７２０（安定化油中水型乳剤）。
−    粒子状アジュバント、例、ビロソーム（例、インフルエンザヘマグルニチンを取り込んだ単層リポソームビヒクル、ＡＳ０４（［ＳＢＡＳ４］Ａｌ塩とＭＰＬ）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニン及び脂質の構造化複合体（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ））、及びポリラクチドコ−グリコリド（ＰＬＧ）。
−    （天然及び合成の）微生物派生物（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、例、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋Ｍ．フレイ細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化単糖）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（自己組織化によりリポソームを形成可能な類脂質免疫刺激物質（ｌｉｐｏｉｄａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ））、ＯＭ−１７４（脂質Ａ派生物）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、及び改変されたＬＴ及びＣＴ（非毒性アジュバント効果をもたらすための、遺伝学的に改変された細菌毒素）。
−    内因性のヒト免疫刺激物質、例、ｈＧＭ−ＣＳＦ又はｈＩＬ−１２（タンパク質又はコードしたプラスミドのいずれかとして投与され得るサイトカイン）、及びイミュダプチン（Ｉｍｍｕｄａｐｔｉｎ）（Ｃ３ｄタンデム配列）。
−    金粒子等の不活性のビヒクル。
が挙げられる。
好ましくは、用いられるアジュバントはミョウバンである。最も好ましくは、アジュバントは、ヒトにおける使用には好適でない、水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウムの混合物、例えばＩｎｊｅｃｔ  ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。
【０１２０】
本発明は、以下の実施例により説明される：
【実施例】
【０１２１】
実施例１
材料及び方法：
ＶＬＰ配列：
ＭＩＲ中にインフルエンザウイルス保存タンパク質由来のインサートを含有するタンデムコアを、大腸菌ＢＬ２１で産生した。インサートに対応する配列は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）の領域に属する。それはＭ２タンパク質の既知のＮ末端外部配列をコードする２４アミノ酸；ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ（配列番号６）の範囲である（図５）。この野生型配列を、１７位及び１９位（上記下線で示す）でのシステイン残基（ＶＬＰ形成に影響を及ぼす）をセリンで置換するように改変した。最後のインサートは、この配列の３つのバリエーションを含有する。第１バージョンは、１７位及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列である（配列番号９）。第２（配列番号８）及び第３（配列番号１０）は、１７及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに見られる最も一般的な変異体に対応するユニバーサル配列の突然変異型である。Ｍ２ｅ配列には、１５個のアミノ酸からなる、可撓性のスペーサーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）が隣接している。Ｍ２ｅ配列同一性、コピー数及び隣接配列の変異を含有する他のコンストラクトも産生した；これらを、以下の表２に記載する。
【０１２２】
【表２】
2018502562.tif 000003
【０１２３】
３×Ｍ２ｅインサートを含むタンデムコアのアミノ酸配列（アミノ酸の一文字コード）を以下に示す。タンデムコア由来のアミノ酸は太字であり、インフルエンザＭ２由来のアミノ酸は下線で示し、可撓性の連結領域は斜体である：
【０１２４】
【化１】
2018502562.tif 000004
【０１２５】
理論等電点（ｐＩ）／分子量（Ｍｗ）：６．２９／５１４３８．３４
【０１２６】
動物：
６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Ｗｙｔｏｎ、ＵＫ）から購入し、個別換気式飼育装置（ＩＶＣ）カテゴリー２の封じ込め設備に収容した。すべての動物の管理及び処置は、実験目的のための動物の使用に関する英国内務省規則に従って行った。
【０１２７】
免疫：
初回免疫のために、個々のマウスに、１５μｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＳＡＳ（ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び滅菌生理食塩水（総体積１００μｌ）を含有する腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液を与えた。初回の７日後及び１４日後に施されるブースター免疫のために、個々のマウスに、５ｕｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＭＬＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのムラミルジペプチド（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有し、滅菌生理食塩水で最終体積を１００μｌとした皮下（ｓ．ｃ．）注射液を受容させた。最終ブースターの１日後、マウスを顔面静脈抽出により採血し、血清変換を確認した。コントロール群は、ＶＬＰ材料を含有しないアジュバントのみで免疫した。
【０１２８】
血清変換：
ＥＬＩＳＡにより、抗Ｍ２ｅ抗体の検出を行った。９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中の６．２５μｇ／ｍｌ  Ｍ２ｅペプチド配列ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ−ＯＨ（配列番号１４）（Ａｃｔｉｖｏｔｅｃ）でコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で３回洗浄し、１０％ミルク溶液により３７℃で１時間ブロッキングした。２．５％ミルク中に希釈した血清を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）を２０分間添加し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍ補正を伴う４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）ソフトウェアにより解析した。ウェルは、全体で、少なくとも３ずつ同じ希釈物を含み、デュプリケートでランした。
【０１２９】
接種：
初回免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０用量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスで感染させた。生理食塩水中のケタミン／キシラジン２：１混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によりマウスを麻酔した後、ウイルスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。マウスを、感染の時点（０日目）で体重測定し、その後完全に回復するまで、半日毎に体重測定した。また、表３に見られる病気の尺度を用いて、マウスをスコア化した。
【０１３０】
結果
免疫したマウスは、インフルエンザウイルス由来のＭ２ｅペプチドに血清変換した。
初回免疫の３週後、マウスからの抗血清を回収し、プールし、ＥＬＩＳＡによりインフルエンザウイルス由来の合成Ｍ２ｅペプチドに対する反応性について試験した。３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコアＶＬＰで免疫したマウスは、インフルエンザウイルス由来のＭ２ｅペプチドを結合させ得る抗体を生成したが、アジュバントのみで免疫したマウスはしなかった（図１）。
【０１３１】
免疫したマウスは、致死量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染から防御された。
初回免疫の４週後、マウスに、５×ｍＬＤ５０のＰＲ８インフルエンザウイルスを接種した。アジュバントのみの群のマウスは、急速に体重を減少させ、高臨床スコア（図２及び３）を提示し、感染後８日目までに死亡率１００％に達した（図４）。逆に、インフルエンザ３×Ｍ２ｅインサートを含むタンデムコアで免疫したマウスでは、はるかに軽度の臨床スコアに関連した、８％の体重減少のピークに達し、７日目までに回復を開始し、感染後１２日目までに完全に回復した（図２及び３）。免疫群における生存率は１００％であった（図４）。まとめると、これらの結果は、インフルエンザ３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコアを受容したマウスが、ＰＲ８インフルエンザウイルスの致死量接種後に、より軽度の体重減少、より低い罹患率を示し、且つ死亡率を示さなかったことを示す。抗Ｍ２ｅ抗体力価が、防御を完全にするほど十分高くないか、又は抗Ｍ２ｅが非中和機構を介して防御するかのいずれのため、タンデムコアによってもたらされる防御は滅ウイルス的（ｓｔｅｒｉｌｅ）ではなかった。或いは、防御は、非抗体依存的（ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）メカニズムを介して調節されるのかもしれない。しかし、防御は、抗Ｍ２ｅ産生レベルと良好に相関している。免疫されていないマウスがはるかに重篤な症状及び高死亡率を示すので、防御は、タンデムコアＶＬＰを含むワクチンの接種により、個別のメカニズムにとらわれることなくもたらされる。
【０１３２】
【表３】
2018502562.tif 000005
【０１３３】
実施例２
材料及び方法：
ＶＬＰ配列：
ＭＩＲ中にインフルエンザウイルス保存タンパク質由来のインサートを含有するタンデムコアを、大腸菌ＢＬ２１で産生した。インサートに対応する配列は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメインのストーク領域に属する。それは既知のドメイン：ＨＡ２単量体のループＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＣＤ及びヘリックスＤをコードするアミノ酸の範囲である（図１０）。この配列は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸（ａａ）４０３〜４７４の範囲である。ＨＡストークインサート配列の変異体を含有する他のコンストラクトを以下の表４に記載する。
【０１３４】
【表４】
2018502562.tif 000006
【０１３５】
ＨＡストークインフルエンザインサートを含むタンデムコアのアミノ酸配列（アミノ酸の一文字コード）を以下に示す。タンデムコア由来のアミノ酸は太字であり、インフルエンザＨＡ由来のアミノ酸は下線で示す：
【０１３６】
【化２】
2018502562.tif 000007
【０１３７】
理論等電点／分子量：６．９８／５０２９３．８５
【０１３８】
動物：
６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Ｗｙｔｏｎ、ＵＫ）から購入し、個別換気式飼育装置（ＩＶＣ）カテゴリー２の封じ込め設備に収容した。すべての動物の管理及び処置は、実験目的のための動物の使用に関する英国内務省規則に従って行った。
【０１３９】
免疫：
初回免疫のために、個々のマウスに、１５μｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＳＡＳ（ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び滅菌生理食塩水（総体積１００μｌ）を含有する腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液を与えた。初回の７日後及び１４日後に施されるブースター免疫のために、個々のマウスに、５ｕｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＭＬＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのムラミルジペプチド（Ｓｉｇｍａ）、２０μのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有し、滅菌生理食塩水溶液で最終体積を１００μｌとした皮下（ｓ．ｃ．）注射液を受容させた。最終ブースターの１日後、マウスを顔面静脈抽出により採血し、血清変換を確認した。コントロール群は、ＶＬＰ材料を含有しないアジュバントのみで免疫した。
【０１４０】
血清変換：
ＥＬＩＳＡにより、抗ＨＡ抗体の検出を行った。９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸−重炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌ  Ａ／ＰＲ８インフルエンザウイルス由来ｒＨＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で３回洗浄し、１０％ミルク溶液により３７℃で１時間ブロッキングした。２．５％ミルク中に希釈した血清を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）を２０分間添加し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍ補正を伴う４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）ソフトウェアにより解析した。ウェルは、全体で、少なくとも３ずつ同じ希釈物を含み、デュプリケートでランした。
【０１４１】
接種：
初回免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０用量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスで感染させた。生理食塩水中のケタミン／キシラジン２：１混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によりマウスを麻酔した後、ウイルスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。マウスを、感染の時点（０日目）で体重測定し、その後完全に回復するまで、半日毎に体重測定した。また、上記表３に見られる病気の尺度を用いて、マウスをスコア化した。
【０１４２】
結果：
免疫したマウスは、Ａ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質に血清変換した。
初回免疫の３週後、マウスからの抗血清を回収し、プールし、ＥＬＩＳＡによりＰＲ８インフルエンザウイルス由来の組換えヘマグルチニンタンパク質に対する反応性について試験した。ＨＡストークインサートを含有するタンデムコアＶＬＰで免疫したマウスは、インフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質を結合させ得る抗体を生成したが、アジュバントのみで免疫したマウスはしなかった（図６）。
【０１４３】
免疫したマウスは、致死量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染から防御された。
初回免疫の４週後、マウスに、５×ｍＬＤ５０のＰＲ８インフルエンザウイルスを接種した。アジュバントのみの群のマウスは、急速に体重を減少させ、高臨床スコア（図７及び８）を提示し、感染後８日目までに死亡率１００％に達した（図９）。逆に、インフルエンザストークインサートを含むタンデムコアで免疫したマウスでは、はるかに軽度の臨床スコアに関連した、１５％の体重減少のピークに達し、８日目までに回復を開始し、感染後１６日目までに完全に回復した（図７及び８）。免疫群における生存率は１００％であった（図９）。まとめると、これらの結果は、インフルエンザストークインサートを含有するタンデムコアを受容したマウスが、ＰＲ８インフルエンザウイルスの致死量接種後に、より軽度の体重減少、より低い罹患率を示し、死亡率を示さなかったことを示す。抗ＨＡ抗体力価が、防御を完全にするほど十分高くないか、又は抗ＨＡが非中和機構を介して防御するかのいずれかのため、タンデムコアによってもたらされる防御は滅ウイルス的ではなかった。或いは、防御は、非抗体依存的メカニズムを介して調節されるのかもしれない。しかし、防御は、抗ＨＡ産生レベルと良好に相関している。免疫されていないマウスがはるかに重篤な症状及び高死亡率を示すので、防御は、タンデムコアＶＬＰを含むワクチンの接種により、個別のメカニズムにとらわれることなくもたらされる。
【０１４４】
実施例３
材料及び方法：
ＶＬＰ配列：
２つの主要挿入領域（ＭＩＲ）内にインフルエンザウイルス保存タンパク質由来のインサートを含有するタンデムコアを、大腸菌ＢＬ２１で産生した（図１５）。第１のインサートに対応する配列は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメインのストーク領域に属する。それは、既知のドメイン：ＨＡ２単量体のループＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＣＤ及びヘリックスＤ（図１０）をコードするアミノ酸の範囲である。この配列は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸（ａａ）４０３〜４７４の範囲である。第２のインサートに対応する配列は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）の領域に属する。それはＭ２タンパク質の既知のＮ末端外部配列をコードする２４アミノ酸；ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ（配列番号６）の範囲である（図５）。この野生型配列を、１７位及び１９位（上記下線で示す）のシステイン残基（ＶＬＰ形成に影響を及ぼす）をセリン残基で置換するように改変した。最後のインサートは、この配列の３つのバリエーションを含有する。第１バージョンは、１７位及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列である（配列番号９）。第２（配列番号８）及び第３（配列番号１０）は、１７位及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、Ｈ７Ｎ７及びＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに見られる最も一般的な変異体に対応するユニバーサル配列の突然変異型である。ＨＡストークスインフルエンザインサート及びＭ２ｅ×３を含むタンデムコアのアミノ酸配列（アミノ酸の一文字コード）を以下に示す。タンデムコア由来のアミノ酸は太字であり、インフルエンザ由来のアミノ酸は下線で示す：
【０１４５】
【化３】
2018502562.tif 000008
【０１４６】
理論等電点／分子量：６．１７／５９８３４．７８
【０１４７】
動物：
６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Ｗｙｔｏｎ、ＵＫ）から購入し、個別換気式飼育装置（ＩＶＣ）カテゴリー２の封じ込め設備に収容した。すべての動物の管理及び処置は、実験目的のための動物の使用に関する英国内務省規則に従って行った。
【０１４８】
免疫：
初回免疫のために、個々のマウスに、１５μｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＳＡＳ（ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び滅菌生理食塩水（総体積１００μｌ）を含有する腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液を与えた。初回の７日後及び１４日後に施されるブースター免疫のために、個々のマウスに、５ｕｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＭＬＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのムラミルジペプチド（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有し、滅菌生理食塩水で最終体積を１００μｌにした皮下（ｓ．ｃ．）注射液を受容させた。最終ブースターの１日後、マウスを顔面静脈抽出により採血し、血清変換を確認した。コントロール群は、ＶＬＰ材料を含有しないアジュバントのみで免疫した。
【０１４９】
血清変換：
ＥＬＩＳＡにより、抗ＨＡ抗体又は抗Ｍ２ｅ抗体の検出を行った。９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸−重炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌ  Ａ／ＰＲ８インフルエンザウイルス由来ｒＨＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中の６．２５μｇ／ｍｌ  Ｍ２ｅペプチド配列ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ−ＯＨ（配列番号１４）（Ａｃｔｉｖｏｔｅｃ）でコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で３回洗浄し、１０％ミルク溶液により３７℃で１時間ブロッキングした。２．５％ミルク中に希釈した血清を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。抗マウスヤギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ二次抗体を１／２５００希釈（Ｓｉｇｍａ）で加え、３７℃で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）を２０分間加え、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍ補正を伴う４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）ソフトウェアにより解析した。ウェルは、全体で、少なくとも３ずつ同じ希釈物を含み、デュプリケートでランした。
【０１５０】
接種：
初回免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０用量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスで感染させた。生理食塩水中のケタミン／キシラジン２：１混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によりマウスを麻酔した後、ウイルスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。マウスを、感染の時点（０日目）で体重測定し、その後完全に回復するまで、半日毎に体重測定した。また、表３に見られる病気の尺度を用いて、マウスをスコア化した。
【０１５１】
結果：
免疫したマウスは、Ａ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質及びＭ２ｅペプチドに血清変換した。
初回免疫の３週後、マウスからの抗血清を回収し、プールし、ＥＬＩＳＡによりＰＲ８インフルエンザウイルス由来の組換えヘマグルチニンタンパク質及びＭ２ｅペプチドに対する反応性について試験した。ＨＡストーク及び３×Ｍ２ｅインサートを含有するタンデムコアＶＬＰで免疫したマウスは、インフルエンザウイルス由来の、ｒＨＡタンパク質及びＭ２ｅペプチドを結合させ得る抗体を生成したが、アジュバントのみで免疫したマウスはしなかった（図１１）。
【０１５２】
免疫したマウスは、Ａ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染から防御された。
初回免疫の４週後、マウスに、５×ｍＬＤ５０  ＰＲ８インフルエンザウイルスを接種した。アジュバントのみの群のマウスは、急速に体重を減少させ、高臨床スコア（図１２及び１３）を提示し、感染後１０日目までに死亡率５０％に達した（図１４）。逆に、タンデムコアＶＬＰで免疫したマウスでは、はるかに軽度の臨床スコアに関連した、５％の体重減少のピークに達し、６日目までに回復を開始し、感染後１０日目までに完全に回復した（図１２及び１３）。免疫群における生存率は１００％であった（図１４）。まとめると、これらの結果は、インフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアを受容したマウスが、ＰＲ８インフルエンザウイルスの致死量接種後に、より軽度の体重減少、より低い罹患率を示し、死亡率を示さなかったことを示す。抗インフルエンザ抗体力価が、防御を完全にするほど十分高くないか、又はＶＬＰワクチン接種が非中和機構を介して防御するかのいずれのため、タンデムコアによってもたらされる防御は滅ウイルス的ではなかった。免疫されていないマウスがはるかに重篤な症状及び高死亡率を示すので、防御は、タンデムコアＶＬＰによるワクチンの接種により、個別のメカニズムにとらわれることなくもたらされる。
【０１５３】
実施例４
材料及び方法：
ＶＬＰ配列：
２つの主要挿入領域（ＭＩＲ）内にインフルエンザウイルス保存タンパク質ドメイン由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰを、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母で産生した（図１６）。第１のＶＬＰ（ＶＬＰ１）は２つのインフルエンザインサート（各ＭＩＲに１つ）を含有する。第１のインサートは、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメインのストーク領域に対応する配列である。それは既知のドメイン：ＨＡ２単量体のループＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＣＤ及びヘリックスＤをコードするアミノ酸の範囲である（図１０）。この配列は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｌｕｘ／０９から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸（ａａ）４０３〜４７４を含む。このＶＬＰ１のインサートを、以後ＨＡ２．３と呼ぶ（図１７）。
【０１５４】
ＶＬＰ１の第２のインサートに対応する配列は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）の領域に属する。それはＭ２タンパク質の既知のＮ末端外部配列をコードする２４アミノ酸；ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ（配列番号６）の範囲である（図５）。この野生型配列を、１７位及び１９位（上記下線で示す）のシステイン残基（ＶＬＰ形成に影響を及ぼす）をセリン残基で置換するように改変した。最後のインサートは、この配列の３つのバリエーションを含有する。第１バージョンは、１７位及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、ユニバーサルなＭ２ｅコンセンサス配列である（配列番号９）。第２（配列番号８）及び第３（配列番号１０）は、１７位及び１９位のシステイン残基がセリンで置換されている以外は、Ｈ７Ｎ７及びＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに見られる最も一般的な変異体に対応するユニバーサル配列の突然変異型である。このＶＬＰ１の３連インサートを、以後Ｍ２ｅ×３と呼ぶ。Ｍ２ｅ配列には、可撓性のスペーサー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１６）が隣接している。
【０１５５】
ＶＬＰ１についての全ＤＮＡ配列は配列番号１７であり、以下にＶＬＰ１のアミノ酸配列（アミノ酸の一文字コード）を示す。タンデムコア由来のアミノ酸は太字であり、インフルエンザ由来のアミノ酸は下線で示し、可撓性の連結領域は斜体である：
【０１５６】
【化４】
2018502562.tif 000009
【０１５７】
理論等電点／分子量：６．０１／５８７６９．６６
【０１５８】
第２のＶＬＰ（ＶＬＰ２）は、その第１のＭＩＲ中に、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスヘマグルチニンＨＡ２タンパク質ドメインのストーク領域に対応する配列を含有する。それは既知のドメイン  ＨｅｌｉｘヘリックスＣ、ヘリックスＣＤ及びヘリックスＤ（時に集合的に「ロングアルファヘリックス」又は「ＬＡＨ」と呼ばれる）をコードするアミノ酸の範囲である（図１０）。この配列は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２／ＨＫ／６８から単離されたＨＡタンパク質のアミノ酸（ａａ）４２１〜４７５を含む。以降、このインサートをＬＡＨ３と呼ぶ（図１７）。
【０１５９】
ＶＬＰ２の第２のインサートは、グリシン及びセリン残基で構成される可撓性のリンカー領域が隣接する単一のリジン（Ｋ）残基である。用いられたインサートの配列はＧＳＧＳＧＧＧＫＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１）である。これは事実上、ヌルインサートであり、第１のインサート（ＬＡＨ３）の立体配置を適切にすることを可能にし、ＶＬＰ２全体に、より高い溶解性を付与する。
【０１６０】
ＶＬＰ２についての完全なＤＮＡ配列は配列番号１９であり、以下にＶＬＰ２のアミノ酸配列（アミノ酸の一文字コード）を示す。タンデムコア由来のアミノ酸は太字であり、インフルエンザ由来のアミノ酸は下線で示し、リンカー配列は斜体である：
【０１６１】
【化５】
2018502562.tif 000010
【０１６２】
理論等電点／分子量：６．７７／４８１８６．４０
【０１６３】
動物：
６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Ｗｙｔｏｎ、ＵＫ）から購入し、個別換気式飼育装置（ＩＶＣ）カテゴリーIIの封じ込め設備に収容した。すべての動物の管理及び処置は、実験目的のための動物使用に関する英国内務省規則に従って行った。
【０１６４】
免疫：
初回免疫のために、個々のマウスに、３０μｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＳＡＳ（ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び滅菌生理食塩水（総体積１００μｌ）を含有する腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液を与えた。初回の７日後及び１４日後に施されるブースター免疫のために、個々のマウスに、１５ｕｇのＶＬＰ材料、２０μｇのＭＬＰＡ（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのムラミルジペプチド（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇのＰｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有し、滅菌生理食塩水で最終体積を１００μｌにした皮下注射液を受容させた。最終ブースターの１日後、マウスを採血し、血清変換を確認した。コントロール群は、ＶＬＰ材料を含有しないアジュバントのみで免疫した。
【０１６５】
血清変換：
ＥＬＩＳＡにより、抗ＨＡ抗体又は抗Ｍ２ｅ抗体の検出を行った。９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸−重炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌ  Ａ／ＰＲ８若しくはＸ３１インフルエンザウイルス由来ｒＨＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中の６．２５μｇ／ｍｌ  Ｍ２ｅペプチド配列ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ−ＯＨ（配列番号１４）（Ａｃｔｉｖｏｔｅｃ）でコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で３回洗浄し、１０％ミルク溶液により３７℃で１時間ブロッキングした。２．５％ミルク中に希釈した血清を加え、３７℃（３７Ｃ）で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。抗マウスヤギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ二次抗体を１／２５００希釈（Ｓｉｇｍａ）で加え、３７℃で１時間インキュベーションし、次いで以前と同様に３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）を２０分間加え、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍ補正を伴う４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）ソフトウェアにより解析した。ウェルは、全体で、少なくとも３ずつ同じ希釈物を含み、デュプリケートでランした。
【０１６６】
接種：
初回免疫の４週後、マウスを５×ｍＬＤ５０用量のＡ／ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス又は３×ｍＬＤ５０  Ｘ３１  Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスで感染させた。マウスを、酸素拡散チャンバーを介して送達されたイソフルランで麻酔した後、ウイルスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。マウスを、感染の時点（０日目）及びその後完全に回復するまで、毎日、体重測定した。表３に示す病気の尺度を用いて、マウスのスコア化も行った。
【０１６７】
結果：
免疫したマウスは、Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）、Ｈ３Ｎ２（Ｘ３１）インフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質、及びＭ２ｅペプチドに血清変換した。
初回免疫の３週後、５匹のマウスからの抗血清を採取し、プールし、ＥＬＩＳＡにより、ＰＲ８（Ｈ１）又はＸ３１（Ｈ３）インフルエンザウイルス由来の組換えヘマグルチニンタンパク質、及びＭ２ｅペプチドに対する反応性について試験した。ＨＡストーク及びＭ２ｅのインサートを含有するタンデムコアＶＬＰ１及びＶＬＰ２で免疫したマウスは、インフルエンザウイルス由来のｒＨＡタンパク質、及びＭ２ｅペプチドを結合し得る抗体を生成した。アジュバントのみで免疫したマウス（ｎｅｇ−）は、いずれのインフルエンザ抗原に対しても陽性反応を示さなかった（図１８）。
【０１６８】
タンデムコアＶＬＰで免疫したマウスは、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス感染から防御された。
初回免疫の４週後、マウスに、５×ｍＬＤ５０のＰＲ８  Ｈ１Ｎ１（ａ）又は３×ｍＬＤ５０のＸ３１  Ｈ３Ｎ２（ｂ）インフルエンザウイルスを接種した。アジュバントのみの群のマウスは、急速な体重減少（図１９ａ及び１９ｂ）及び高臨床スコア（図２０ａ及び２０ｂ）を提示し、感染後８日目までに死亡率の程度が高まった（図２１ａ及び２１ｂ）。逆に、タンデムコアＶＬＰで免疫したマウスでは、はるかに軽度の臨床スコアに関連した、１０％の体重減少のピークに達し、５〜７日目までに回復を開始し、感染後１５日目までに完全に回復した（図１９及び２０）。免疫群における生存率は１００％であった（図２１）。まとめると、これらの結果は、インフルエンザ由来のインサートを含有するタンデムコアＶＬＰ１及びＶＬＰ２を受容したマウスが、ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１又はＸ３１  Ｈ３Ｎ２のいずれかのインフルエンザウイルスの致死量接種後に、より軽度の体重減少、より低い罹患率を示し、且つ死亡率を示さなかったことを示す。抗インフルエンザ抗体力価が、滅ウイルス的な免疫に比べて十分高くないか、又はＶＬＰワクチン接種が非中和機構を介して防御するかのいずれのため、タンデムコアによって付与された防御は感染に対する許容性があった。ネガティブコントロール群のマウスがはるかに重篤な症状及び高死亡率を示すので、タンデムコアＶＬＰによるワクチンの接種により、個別のメカニズムにとらわれることなく、明らかな利益がもたらされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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