(57)【要約】  本発明は、一般に、Ｔ細胞活性化及び特異的標的細胞への再指向のための新規な二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を産生する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。【選択図】図３Ａ−Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
ここで、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ、第２の抗原はＣＥＡであり、又は第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
第２の抗原結合部位が第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、請求項１−３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
第１の抗原がＣＥＡであり、かつ、第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原である、請求項１−４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
活性化Ｔ細胞抗原がＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンである、請求項１−５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１−６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１−７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ａ）の第１の抗原結合部分が第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）の第２の抗原結合部分が第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換され；
かつ、
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、
請求項１−８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９又は１０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９−１１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９−１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９−１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９又は１５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている、請求項９、１５、及び１６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９、及び１５−１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９、及び１５−１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分
を更に含む、請求項１−１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項２０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
第３の抗原結合部分が第１の抗原結合部分と同一である。請求項２０又は２１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
第１及び第３の抗原部分が標的細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合する、請求項２０−２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を更に含む、請求項１−２３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
第１及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１−２４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１−２５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１−２５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項２６又は２７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第１及び第２の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４、２９又は３０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
第１、第２、及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第２及び第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、かつ、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
第１、第２、及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、かつ、第１及び第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、かつ、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
第１及び第３の抗原結合部分及びＦｃドメインが、免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧクラスの免疫グロブリンの一部である、請求項３４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
ＦｃドメインがＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項２４−３５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２４−３６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
ＦｃドメインがＦｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項２４−３７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される、請求項３８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４０】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、かつ、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項３９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４１】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換され（Ｙ４０７Ｖ）、かつ任意選択的にＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換されている（Ｌ３６８Ａ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３９又は４０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４２】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置換され（Ｅ３５６Ｃ）、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換されている（Ｙ３４９Ｃ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３９−４１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項３９−４２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４４】
Ｆｃドメインが、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す、請求項２４−４３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４５】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項２４−４４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４６】
前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つ又は複数の位置においてである、請求項４５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４７】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）である、請求項２４−４６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４８】
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項４４−４７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４９】
エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項４４−４８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５０】
請求項１−４９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする、１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載ののポリヌクレオチド（１つ又は複数）を含む、１つ又は複数のベクター、具体的には発現ベクター。
【請求項５２】
請求項５０に記載のポリヌクレオチド（１つ又は複数）又は請求項５１に記載のベクター（１つ又は複数）を含む宿主細胞。
【請求項５３】
ａ）請求項５２の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）任意選択的にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む、ＣＥＡ及び活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法によって産生されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５５】
請求項１−４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５６】
医薬としての使用のための、請求項１−４９若しくは５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、請求項１−４９若しくは５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
疾患ががんである、請求項５７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
【請求項５９】
治療を必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１−４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項６０】
請求項１−４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容される形態で個体に投与することを含む、前記個体における疾患の治療方法。
【請求項６１】
前記疾患ががんである、請求項５９に記載の使用又は請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
標的細胞を、Ｔ細胞の存在下で、請求項１−４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導する方法。
【請求項６３】
上記の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を産生する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば様々な臨床設定において望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することががん治療の主要目的である。
【０００３】
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、従来の治療抗体のＦｃドメインにより媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
【０００４】
これに関し、標的細胞上の表面抗原に１つの「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、これは何れかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。従って、免疫応答は、標的細胞に再指向（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔ）され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、すなわち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
【０００５】
幾つかの二重特異性抗体フォーマットが開発され、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適合性が検討された。これらの中でも、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体）分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの有望さを示している（Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に掲載）ＢｉＴＥは、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されているタンデムｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞結合体について評価された更なる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びその誘導体、例えばタンデム型ダイアボディ（Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）が含まれる。更に最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定性のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)）。全体がハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であり、また現在臨床試験において評価されつつあるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）は大きなサイズのフォーマットを表している（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に総説される）。
【０００６】
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞の再指向（re-direction）及び活性化により大きな可能性を示すものである。しかしながら、そのために適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単ではなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴っている。
【０００７】
例えば、ＢｉＴＥ分子などの小さな構築物は、効果的にエフェクター細胞及び標的細胞を架橋することができるが、血清半減期が非常に短いため、連続注入によって患者に投与する必要がある。一方、ＩｇＧ−様フォーマットは、半減期が長いという大きな利点を有するが、ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのＩｇＧ様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体構築物を生産することで、これは、同時発現の際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とを誤って対にしてしまうことにより、正しく構築された構築物の収率が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副生成物が生じることに起因している。
【０００８】
二重特異性抗体における鎖会合の問題を克服するために、異なるアプローチがとられている（例えば、Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)参照）。例えば、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」戦略は、接触界面を改変するためにＣＨ３ドメインに突然変異を導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対形成を強制することを目的とする。１つの鎖において、嵩高いアミノ酸が短い側鎖を有するアミノ酸によって置換され、「ホール（ｈｏｌｅ）」を形成する。逆に、大きな側鎖を有するアミノ酸は、他のＣＨ３ドメインに導入されて「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する。これらの２つの重鎖（及び両方の重鎖に適切でなければならない２つの同一の軽鎖）を共発現することにより、ヘテロ二量体（「ノブ−ホール」）対ホモ二量体（「ホール−ホール」又は「ノブ−ノブ」）が観察されている（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及び国際公開第９６／０２７０１１号）。ヘテロ二量体の割合は、ファージディスプレイアプローチ及びヘテロ二量体を安定化させるためのジスルフィド架橋の導入を用いて２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を再構築することによって更に増加させることができた（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しいアプローチは、例えば欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号に記載されている。
【０００９】
しかしながら、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、異なる標的抗原への結合のための異なる軽鎖を含む二重特異性抗体において生じる重鎖−軽鎖の誤対合の問題を解決しない。
【００１０】
重鎖−軽鎖の誤対合を防止するための戦略は、二重特異性抗体の結合アームの一つの重鎖と軽鎖の間でドメインを交換することである（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191（ドメイン交差を有する二重特異性ＩｇＧ抗体に関連する）を参照）。
【００１１】
二重特異性抗体（国際公開第２００９／０８０２５２号、Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191もまた参照のこと）の結合アームの一つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬを交換することにより、第１の抗原に対する軽鎖の第２の抗原に対する誤った重鎖との誤対合により生ずる副生成物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）明らかに減少させる。それにもかかわらず、これらの抗体調製物は、副生成物を完全に含まないわけではない。主な副生成物は、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型の相互作用に基づいている（Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191；補足の図Ｓ１Ｉ）。従って、このような副生成物の更なる減少は、例えばこのような二重特異性抗体の収率を改善するのに所望される。
【００１２】
標的抗原並びにＴ細胞抗原及び標的細胞抗原の両方に対する適切な結合剤の選択は、治療適用のためのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の生成における更なる重要な側面である。がん胎児性抗原（ＣＥＡ）は、ＣＥＡ発現の有病率が一般に腫瘍では高いが、正常組織では低いので、魅力的な標的抗原である。従って、多数の抗体がこの標的に対して産生されており、その１つはマウス抗体Ｔ８４．６６である（Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)）。これもキメラ化されており（国際公開第１９９１／０１９９０号）及びヒト化されている（国際公開第２００５／０８６８７５号）。国際公開第２００７／０７１４２６又は国際公開第２０１４／１３１７１２号は、Ｔ細胞上のＣＤ３及び標的細胞上のがん胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗体を記載する。
【００１３】
本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、Ｔ細胞の活性化と再指向（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）、ＣＤ３とＣＥＡの標的化のために設計された、新規な改善された二重特異性抗原結合分子を提供する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、新規のヒト化抗ＣＥＡ抗体を使用して、予想外の改善された特性を有する新規Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を開発した。
従って、第１の態様において、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ、第２の抗原はＣＥＡであり、又は第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００１５】
一実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
特定の実施態様において、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。特定の実施態様において、第２の抗原結合部分は、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている（すなわち、このような実施態様によれば、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【００１７】
特定の実施態様において、第１の（そして、もしあれば第３の）Ｆａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。更なる特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができる１つを超えないＦａｂ分子が、Ｔ細胞を活性化する二重特異性抗原結合分子に存在する（すなわち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原に一価の結合を提供する）。
【００１８】
一実施態様において、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原である。より具体的な実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンである。
【００１９】
特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている第２のＦａｂ分子
を含み；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで、（ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００２０】
本発明の更なる態様によれば、望ましくない副生成物、特にそれらの結合アームの一つにおいてＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体に生じるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物と比較した所望の二重特異性抗体の比は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入（本明細書では「電荷修飾」と称することもある）によって改善することができる。
【００２１】
従って、幾つかの実施態様において、（ａ）の第１の抗原結合部分は第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）の第２の抗原結合部分は第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され；
かつ、
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２２】
一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２３】
更なる実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２４】
更に別の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２５】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２６】
別の特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２７】
別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２８】
更なる実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００２９】
更に別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００３０】
一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３１】
別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３２】
特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子
を含み；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで、（ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含み；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【００３３】
幾つかの実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分を更に含む。特定の実施態様において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分と同一である。一実施態様において、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
特定の実施態様において、第３及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である。これらの実施態様において、第３のＦａｂ分子は、もしあれば、第１のＦａｂ分子と同じアミノ酸置換を含む。第１のＦａｂ分子と同様に、第３のＦａｂ分子は特に従来のＦａｂ分子である。
【００３４】
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様において、第１及び第３の抗原部分はＣＥＡに特異的に結合し、第２の抗原結合部分は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合する。
【００３５】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかの実施態様において、ａ）の第１の抗原結合部分及びｂ）の第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される。特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２のＦａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１のＦａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているかのどちらかである実施態様において、更に、Ｆａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合させることができる。
【００３６】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
【００３７】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意選択的に第３）の抗原結合部分は、互いに、及び異なる方法でＦｃドメインに融合され得る。それらの成分は、直接的に、又は好ましくは、１つ又は複数の適切なペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。Ｆａｂ分子の融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対してである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介して行われる。
【００３８】
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施態様において、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、又はＦｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合され得る。
【００３９】
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に免疫グロブリン分子を含み、ここで、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載の電荷修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様における定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が互いに交換／置換されている（図１Ａ、Ｄ参照）。
【００４０】
別の実施態様において、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、かつ、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に免疫グロブリン分子を含み、ここで、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載の電荷修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様における定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が互いに交換／置換され、付加的な（従来の）Ｆａｂ分子が前記ＦａｂアームにＮ末端融合している（図１Ｂ、Ｅ参照）。別のそのような実施態様において、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリンＦａｂアームの１つにＮ末端融合された付加的Ｆａｂ分子を有する免疫グロブリン分子を本質的に含み、ここで、前記付加的Ｆａｂ分子において、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載の電荷修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様における定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が互いに交換／置換されている（図１Ｃ、Ｆ参照）。
【００４１】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。
【００４２】
特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ここで
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ここで
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００４４】
更なる実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている第２のＦａｂ分子；及び
ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで
第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；又は
第２の抗原はＣＥＡであり、かつ、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；かつ、
ＣＥＡに特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００４５】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる立体配置の全てにおいて、本明細書に記載のアミノ酸置換は、存在する場合、第１の及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインにおいて、又は第２のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインにおいてのどちらかに存在し得る。好ましくは、それらは、第１の及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念に従って、本明細書に記載のアミノ酸置換が第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第２のＦａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われない。Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されているＦａｂ分子を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において、アミノ酸置換はなされていない。
【００４６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の他の実施態様において、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子において行われる場合、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。幾つかの実施態様において、第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。
【００４７】
特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００４８】
更により特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００４９】
別の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００５０】
更なる実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで
第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；又は
第２の抗原はＣＥＡであり、かつ、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
ここで、ＣＥＡに特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００５１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。更に特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【００５２】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含む。このような特定の一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起を生成し、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞を生成する。
【００５３】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を有するように改変される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様において、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン内の１つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つ又は複数の位置においてである。特定の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる３つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）である。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。他の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる２つのアミノ酸置換を含んでおり、該アミノ酸残基はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇである（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）を含む。
【００５４】
一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００５５】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号５のＨＣＤＲ２、配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。更により特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合する抗原結合分子は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。幾つかの実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一つの特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、ＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、前記第２の抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の更に特定の実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一つの特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子はＣＥＡに特異的に結合し、かつ、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５７】
特定の態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで
（ｉ）第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原はＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
（ｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み；かつ、
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつ、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００５８】
一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換され、更に、（ｉｖ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００５９】
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）が提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）を含む１つ又は複数の発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）又は発現ベクター（１つ又は複数）を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００６０】
別の態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、ａ）本発明の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む。本発明は、本発明の方法によって産生されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も包含する。
【００６１】
本発明は更に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。本発明の一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
【００６２】
更に、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用と；本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容される形態で個体に投与することを含む、前記個体における疾患の治療方法とが提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様の何れにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００６３】
本発明は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する（「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｇ、Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する（「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂ並びに別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図。黒い点：ヘテロ二量体化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：ＣＨ及びＣＬドメインに任意選択的に導入された反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施態様では、代わりにＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。
【図２】Ｔ８４．６６  ＩｇＧの異なるヒト化変異体の細胞への結合。結合曲線に基づくＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算し、表１に示す。
【図３】実施例で調製されたＴＣＢの図（Ａ、Ｂ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中の電荷修飾、分子Ａ及びＢ）の図。（Ｃ）電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中の電荷修飾、分子Ｃ）の図。（Ｄ）電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中の電荷修飾、分子Ｄ）の図。（Ｅ）電荷修飾及びより長いリンカーを有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子（ＣＤ３バインダー中のＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、分子Ｅ）の図。（Ｆ）電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、分子Ｆ）の図。ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ。
【図４】実施例で調製されたＴＣＢ（最終精製調製物）のＣＥ−ＳＤＳ分析。（Ａ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、親マウスＣＥＡバインダー（Ｔ８４．６６）；分子Ａ）の電気泳動図。（Ｂ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー；分子Ｂ）の電気泳動図。（Ｃ）電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー；分子Ｃ）の電気泳動図。（Ｄ）電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー；分子Ｄ）の電気泳動図。（Ｅ）電荷修飾及びより長いリンカーを有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー；分子Ｅ）の電気泳動図。（Ｆ）電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ヒト化ＣＥＡバインダー；分子Ｆ）の電気泳動図。レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元。
【図５】高レベルのＣＥＡ（ＭＫＮ４５；Ａ）、中レベルのＣＥＡ（ＬＳ１７４Ｔ；Ｂ）又は低レベルのＣＥＡ（ＨＴ２９；Ｃ）、又はヒトＣＤ３（Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｄ）の何れかを発現する細胞への、異なるＣＥＡ  ＴＣＢフォーマットの結合。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）が示されている。エラーバーはトリプリケートのＳＤを示す。
【図６】２４時間後（Ａ−Ｃ）又は４８時間後（Ｄ−Ｆ）ＬＤＨ放出によって測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導された、腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＭＫＮ４５（Ａ、Ｄ）、ＢｘＰＣ−３（Ｂ、Ｅ）又はＨＴ２９（Ｃ、Ｆ）細胞を標的細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５によって計算し、表４及び５に示す。
【図７】異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されたＣＥＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解後のヒトＣＤ４＋（Ａ−Ｄ）及びＣＤ８＋（Ｅ−Ｈ）Ｔ細胞上のＣＤ２５のアップレギュレーション。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＭＫＮ４５（Ａ、Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（Ｂ、Ｆ）又はＨＴ２９（Ｃ、Ｇ）細胞を標的細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。標的細胞なしの結果を（Ｄ）及び（Ｈ）に示す。ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合を４８時間後にＦＡＣＳにより決定した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。
【図８】ＣＥＡ発現腫瘍又は初代上皮細胞と異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との同時インキュベーションに際してのヒトＣＤ４＋（Ａ−Ｅ）及びＣＤ８＋（Ｆ−Ｊ）Ｔ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーション。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＭＫＮ４５（Ａ、Ｆ）、ＬＳ１７４Ｔ（Ｂ、Ｇ）、ＨＴ２９（Ｃ、Ｈ）、ＣＣＤ８４１（Ｄ、Ｉ）細胞を標的細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。標的細胞なしの結果を（Ｅ）及び（Ｊ）に示す。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞の割合を４８時間後にＦＡＣＳにより決定した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。
【図９】４８時間後にＦＡＣＳ（ＣＤ６９陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）の割合）又はＬＤＨ（Ｃ、Ｄ）によって測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されたＴ細胞活性化及び腫瘍細胞溶解。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。標的細胞は、高ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５又は低ＣＥＡ発現初代上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮの何れかであった。更に、Ｔ細胞活性化は、標的の非存在下で評価された（「標的なし」）。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。Ａ、Ｃ：親キメラＴ８４．６６  ＣＥＡバインダーを有するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ａ）、Ｂ、Ｄ：ヒト化ＣＥＡバインダーを有するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（ヒト化変異体１；分子Ｂ）。
【図１０】異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の標的及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞への同時結合に際してのＪｕｒｋａｔｓの早期ＣＤ３媒介活性化を決定するための、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ。ＣＤ３媒介活性化及びシグナル伝達の強度を、相対発光シグナル（ＲＬＵ）を測定することにより検出した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。（Ａ）親キメラＴ８４．６６ ＣＥＡバインダーを有するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ａ）、（Ｂ）ヒト化ＣＥＡバインダーを有するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（ヒト化変異体１；分子Ｂ）。
【図１１】４８時間後にＦＡＣＳ（Ａ−Ｄ、ＣＤ６９陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合）、又はＬＤＨ（Ｅ−Ｈ）により測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されたＴ細胞活性化（Ａ−Ｄ）及び腫瘍細胞溶解（Ｅ−Ｈ）。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。標的細胞は、ＢｘＰＣ−３（Ａ、Ｅ）、低ＣＥＡ発現ＮＣＩ−Ｈ２１２２（Ｂ、Ｆ）細胞又は非常に低いＣＥＡ発現ＣＯＲ−Ｌ１０５（Ｃ、Ｇ）又は初代上皮細胞ＨＢＥｐｉＣ（Ｄ、Ｈ）の何れかであった。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。
【図１２】５日後にＦＡＣＳによって測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されたＣＤ８＋（Ａ−Ｄ）及びＣＤ４＋（Ｅ−Ｈ）Ｔ細胞の増殖。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。標的細胞は、高ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５（Ａ、Ｅ）、中程度のＣＥＡ発現ＬＳ１７４Ｔ（Ｂ、Ｆ）、低ＣＥＡ発現ＨＴ２９（Ｃ、Ｇ）細胞又は非常に低いＣＥＡ発現初代上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮ（Ｄ、Ｈ）の何れかであった。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。
【図１３】ＦＡＣＳによって測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ及び分子Ｅ）のＭＫＮ４５（Ａ）、ＬＳ１７４Ｔ（Ｂ）、ＨＴ２９（Ｃ）及びＪｕｒｋａｔ（Ｄ）細胞への結合。
【図１４】２４時間後（Ａ−Ｄ）又は４８時間後（Ｅ−Ｈ）ＬＤＨ放出によって測定された、異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ及び分子Ｅ）によって誘導された、腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＭＫＮ４５（Ａ、Ｅ）、ＬＳ１７４Ｔ（Ｂ、Ｆ）、ＨＴ２９（Ｃ、Ｇ）、ＨＢＥｐｉＣ（Ｄ、Ｈ）細胞を標的細胞として、最終のエフェクター対標的細胞比１０：１で使用した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５によって計算し、表６に示す。
【図１５】ＮＯＧマウスにおける単回静脈内ボーラス投与後の、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの薬物動態の比較。
【図１６】ＭＫＮ４５（Ａ）、ＬＳ１７４Ｔ（Ｂ）及びＨＴ２９（Ｃ）細胞上に発現されたヒトＣＥＡ、又はＪｕｒｋａｔ細胞（Ｄ）上に発現されたヒトＣＤ３への異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の結合。示されているのはトリプリケートとＳＤである。結合曲線に基づくＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算し、表６に示す。
【図１７】様々なＣＥＡ陽性腫瘍細胞の存在下で異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導された抗原依存性腫瘍細胞溶解の決定：（Ａ）ＨＣＣ１９５４、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ５９６、（Ｃ）ＮＣＩ−Ｈ２１２２、（Ｄ）Ｋａｔｏ ＩＩＩ、（Ｅ）ＣＸ−１。腫瘍細胞溶解は、アポトーシス／壊死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨの定量によって決定した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算し、表７に示す。
【図１８】抗原依存性Ｔ細胞活性化及び腫瘍溶解は、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞の存在下でＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって誘導されたが、低ＣＥＡ発現初代上皮細胞の存在下では誘導されなかった。腫瘍細胞溶解は、アポトーシス／壊死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨの定量によって決定した（Ａ）。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ４＋エフェクター細胞上の早期活性化マーカーＣＤ６９のアップレギュレーションのＦＡＣＳ測定によって決定した（Ｂ）。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算し、表９及び表１１に示す。
【図１９】抗原依存性Ｔ細胞活性化及び腫瘍溶解は、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞の存在下でＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって誘導されたが、低ＣＥＡ発現初代上皮細胞の存在下では誘導されなかった。腫瘍細胞溶解は、アポトーシス／壊死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨの定量によって決定した（Ａ）。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ４＋エフェクター細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５のアップレギュレーションのＦＡＣＳ測定によって決定した（Ｂ）。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算し、表１０に示す。
【図２０】（Ａ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ６の何れかを発現する、一時的なＨＥＫ２９３ＴトランスフェクタントへのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの結合。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。（Ｂ）一過性ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクタントへの抗ＣＤ６６抗体の結合は、３つのＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーのトランスフェクション効率、それぞれの発現量を示す。示されるのは、トリプリケートとＳＤに基づく、ＭＦＩ（蛍光シグナル中央値）である。
【図２１】完全ヒト化ＮＯＧマウスにおけるＭＫＮ４５モデルにおけるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ対ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの抗腫瘍活性。異なる投与量及び投与スケジュールを試験した：（Ａ）２．５ｍｇ／ｋｇ  ２回／週、（Ｂ）２．５ｍｇ／ｋｇ  １回／週、（Ｃ）０．５ｍｇ／ｋｇ  １回／週。黒い矢印は治療の開始を示す。治療は９週間施された。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  試験終了時（７０日目）の両側独立ｔ検定（８＜ｎ＜９）。
【図２２】用量範囲有効性試験に使用される異なる用量レベル及びスケジュールのシミュレートされたＰＫ（実施例１２）。２コンパートメントモデルが使用され、シミュレーションはＳＤＰＫデータに基づいていた。
【図２３】（Ａ）完全ヒト化ＮＳＧマウスのＭＫＮ４５モデルにおけるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ対ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの抗腫瘍活性。異なる投与量及び投与スケジュールが試験された。黒い矢印は治療の開始を示す。治療は４週間施された。（Ｂ）試験終了時（第３８日）の２元ＡＮＯＶＡ多重比較分析。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（９＜ｎ＜１４）．
【図２４】ｈｕＰＢＭＣ導入ＮＯＧマウスのＨＰＡＦ−ＩＩモデルにおけるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ対ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘ（２．５ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回）の抗腫瘍活性。灰色の矢印はヒトＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）注入を示し、黒色の矢印は治療の開始を示す。治療は３週間施された。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  試験終了時（３２日目）の両側独立ｔ検定（ｎ＝１０）。
【図２５】カニクイザルにおける静脈内ボーラス投与後の、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの薬物動態の比較。個々の代表的な動物の薬物動態が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
【００６６】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６７】
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。従って、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な１つの（かつ１つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
【００６８】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００６９】
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様において、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと直接方向付けることができる。別の実施態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様において、抗原結合部分は、本明細書において更に定義され、当該技術分野で周知の抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの何れかが含まれる。
【００７０】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的ストレッチ又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型形態とすることができる。特定の実施態様において、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理により得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号１；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）、又はがん胎児性抗原関連細胞接着分子５としても知られているがん胎児性抗原（ＣＥＡ）（ＣＥＡＣＡＭ５、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０６７３１（バージョン１１９）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４３５４．２）である。特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる種からのＣＤ３又はＣＥＡ抗原の間で保存されているＣＤ３又はＣＥＡのエピトープに結合する。
【００７１】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）の何れかによって測定することができる。一実施態様において、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００７２】
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表される。この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で周知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７３】
例えばＦｃ受容体への結合の減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定される、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する結合親和性の増大を指す。
【００７４】
本明細書で使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗原結合分子との相互作用の際にＴ細胞活性化を誘導することができるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指す。具体的には、活性化Ｔ細胞抗原と抗原結合分子との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様において、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３のイプシロンサブユニットである（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号１；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載の技術分野において周知である。
【００７６】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様において、標的細胞抗原はＣＤ２０、具体的にはヒトＣＤ２０である。
【００７７】
本明細書で使用されるように、Ｆａｂ分子などに関して「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、部分の各種類が２つ以上存在する場合、便宜上区別するために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
【００７８】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００７９】
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
【００８０】
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様において、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーにより連結されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様において、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に連結している。
【００８１】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置換されている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬと重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖定常ドメインＣＬ（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ−ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【００８２】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、すなわち重鎖可変ドメインと定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖、及び軽鎖可変ドメインと定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００８３】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【００８４】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
【００８５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作製することができ、このような技術には、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生が含まれる。
【００８６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に結合し、かつ抗原の一部又は全体に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供される。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００８７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００８８】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書中で交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 及びChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。本明細書に示されるＣＤＲ配列は、一般的にＫａｂａｔの定義に従う。
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【００８９】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超えた実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変領域配列に明白に割り当てることができる。可変領域配列に関連して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔの番号付け」とは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載の番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載され、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の６４７−６６０頁を参照）がκ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２及びＣＨ３）にはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けシステム（６６１−７２３頁を参照）が使用されており、この場合「ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け」を参照することにより本明細書において更に明確にされる。
【００９１】
配列リストのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされている。しかしながら、配列リストの番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは当業者の通常の技術の範囲内である。
【００９２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾されるか又は変更されているものである。
【００９４】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９５】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端からの１つ又は複数の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受け得る。従って、全長重鎖をコードする特異的核酸分子の発現によって宿主細胞によって生成される抗体は、全長重鎖を含み得るか、又は全長重鎖の切断型変異体（本明細書において「切断型変異体重鎖」とも称する）を含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である場合があり得る。従って、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを含まずに本明細書に示される。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載の薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子及び切断型変異体重鎖を有する分子を含み得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子及び切断型変異体重鎖を有する分子の混合物からなり得、ここではＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断型変異体重鎖を有する。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、そのような組成物は、本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子からなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う（上も参照）。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００９６】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合結合によるホモ二量体の形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一であり得る。幾つかの実施態様において、会合を促す修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００９７】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９８】
本明細書において使用される「改変する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」などの用語は、ペプチド骨格の何れかの操作、又は天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組み合わせが含まれる。
【００９９】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組み合わせは、最終的な構築物が所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的な構築物に到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを改変する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置換が含まれる。アミノ酸変異は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
【０１００】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合した単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すのではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために用いられる任意の他の用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の何れかの代わりに、又は何れかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図している。ポリペプチドは、天然の生物源に由来してもよく、組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む任意の方法で生成することができる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、規定の三次元構造を有さず、多数の異なるコンフォメーションをとることが可能なポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
【０１０１】
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組換えにより産生されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
【０１０２】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用する、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能である。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【０１０３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０４】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子を更に含む。更に、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、又はそれを含んでいてもよい。
【０１０５】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の１つ又は複数の連続する群において散在して生じ得る。特定の事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１０６】
用語「発現カセット」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え技術又は合成技術により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０７】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子を導入しその発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞性転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれず、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１０９】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【０１１０】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体で被覆された標的細胞の溶解を導く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「低減したＡＤＣＣ」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数の減少、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇の何れかと定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な産生、精製、製剤化、及び貯蔵方法（これらは当業者に周知である）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により産生される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低減させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低減は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
【０１１１】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１１２】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１３】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１４】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１１５】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１７】
用語「添付文書」は、適応、用法、用量、投与法、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含められるインストラクションを指すために使用される。
【０１１８】
実施態様の詳細な説明
本発明は、特に改善された有効性及び安全性（例えば、Ｔ細胞の非特異的活性化又は正常細胞よりも腫瘍細胞に対する選択性に関して）と、改善された生産性（例えば、純度、収率に関して）とを有する治療適用のための好ましい特性を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１１９】
本発明者らは、抗ＣＥＡ抗体Ｔ８４．６６（Wagener et al., J Immunol 130, 2308- (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)）の結合特異性を有する抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、Ｔ細胞によるＣＥＡ発現腫瘍細胞の死滅の媒介において予想外に高い効力を提供することを発見した。更に、抗体Ｔ８４．６６の新規なヒト化バージョンを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、驚くべきことに、親Ｔ８４．６６バインダーを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、正常細胞よりも腫瘍細胞に対する選択性が改善されていることが見出された。
【０１２０】
電荷修飾
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子にアミノ酸置換を含むことができ、該置換は、該分子の結合アームの１つ（又は２つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合にはそれ以上）においてＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生成において生じ得る、非適合重鎖（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ型副生成物）との軽鎖の誤対合を減少させるのに特に有効である（全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１５／１５０４４７、特にその中の実施例も参照のこと）。
【０１２１】
従って、特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている第２のＦａｂ分子
を含み；
ここで、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ、第２の抗原はＣＥＡであり、又は第１の抗原はＣＥＡであり、かつ、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１２２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載された両方の修飾を含まない。第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換されない（すなわち、未変化のままである）。
【０１２３】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【０１２４】
更なる実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【０１２５】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換されている。
【０１２６】
より特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１２７】
更により特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１２８】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
【０１２９】
あるいは、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常領域ＣＬ及び定常領域ＣＨ１において行うことができる。特定のそのような実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
【０１３０】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含み得る。特定の実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一である。これらの実施態様において、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子のそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われるであろう。あるいは、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われ得るが、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１においては行われ得ない。
【０１３１】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
【０１３２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な立体配置で互いに融合することができる。例示的な立体配置を図１に示す。
【０１３３】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。そのような実施態様において、第１、第２、第３などの抗原結合性部分は、それぞれ第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ぶことができる。更に、特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【０１３４】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１３５】
一つのそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｇ及び図１Ｋに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１３６】
別のそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ａ及び図１Ｄに模式的に示されている。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０１３７】
他の実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１３８】
一つのそのような実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｈ及び図１Ｌに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１３９】
Ｆａｂ分子は、直接、又は１つ若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインへ又はお互いに融合し得る。ペプチドリンカーは当該技術分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常は１〜１０、典型的には２〜４の数である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、一実施態様では５〜１００個の長さ、更なる実施態様では１０〜５０アミノ酸の長さを有する。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）、一実施態様において、ｘ＝４及びｎ＝２又は３、更なる実施態様において、ｘ＝４及びｎ＝２である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特に適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を連結するために適した例示的ペプチドリンカーは配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１及び１２）である。別の適切なそのようなリンカーは配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。更に、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特にＦａｂ分子がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、付加的なペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１４０】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示される）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる可能性がある。
【０１４１】
しかしながら、他の多くの場合、例えば、標的部位への標的化を最適化するために又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を有することが有利であろう（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示す例を参照）。
【０１４２】
従って、特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含む。第１の抗原は、好ましくは標的細胞抗原、すなわちＣＥＡである。一実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。一実施態様において、第３のＦａｂ分子は、第１のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第１及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置を有する（すなわち、従来型又はクロスオーバー型））。特定の実施態様において、第２のＦａｂ分子は、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に特異的に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子はＣＥＡに特異的に結合する。
【０１４３】
代替的な実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含む。これらの実施態様において、第２の抗原は、好ましくは標的細胞抗原、すなわちＣＥＡである。一つのそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子（Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子）である。一つのそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は、第２のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第２及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置を有する（すなわち、従来型又はクロスオーバー型））。一つのそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に特異的に結合し、第２及び第３のＦａｂ分子はＣＥＡに特異的に結合する。
【０１４４】
一実施態様において、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１４５】
特定の実施態様において、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は、図１Ｂ及び１Ｅ（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である）並びに図１Ｉ及び１Ｍ（代替的な実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１４６】
別の実施態様において、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は、図１Ｃ及び１Ｆ（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である）並びに図１Ｊ及び１Ｎ（代替的な実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１４７】
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合したＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の立体配置において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様において、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０１４８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の立体配置に依存して、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合し得る、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合し得る。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は更に、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を減少させ、また本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかの発現に必要なプラスミドの数を減少させる。
【０１４９】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合される。
【０１５０】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により共有結合している。
【０１５１】
幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）を含む。
【０１５２】
これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。これらの実施態様の他のものにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、又は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を必要に応じて含む。
【０１５３】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を含み得る。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により共有結合している。
【０１５４】
幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０１５５】
これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。これらの実施態様の他のものにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、又は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を必要に応じて含む。
【０１５６】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を含み得る。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により共有結合している。
【０１５７】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｏ及び図１Ｓに模式的に示されている。
【０１５８】
他の実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｐ及び図１Ｔに模式的に示されている。
【０１５９】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｑ及び図１Ｕに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１６０】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｗ及び図１Ｙに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同じである）。
【０１６１】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｒ及び図１Ｖに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１６２】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｘ及び図１Ｚに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１６３】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。
【０１６４】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。
【０１６５】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。
【０１６６】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１６７】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１６８】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１６９】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１７０】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））を含む。
【０１７１】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（３）−ＣＬ（３））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。
【０１７２】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））を含む。
【０１７３】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。
【０１７４】
上記実施態様の何れによっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）の成分は、直接融合するか、又は様々なリンカー、特に１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合する。このようなリンカーは本明細書に記載されているか、又は当該技術分野で既知である。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１〜１０、典型的には２〜４の整数である。
【０１７５】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各々のサブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、１つを超えないＦｃドメインを含む。
【０１７６】
本発明による一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でのアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ番号付け）、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアーム交換を減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更に特定の実施態様において、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な配列は配列番号１３に与えられる。
【０１７７】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なるＦａｂ分子を含み、従ってＦｃドメインの２つのサブユニットは、通常２つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体形成は、２つのポリペプチドの幾つかの可能な組み合わせをもたらす。従って、組換え産生におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０１７８】
従って、特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。従って、一実施態様において、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１７９】
ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための幾つかのアプローチが存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に記載される。典型的には、そのようなアプローチの全てにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、相補的な様式で両方とも改変され、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）はもはやそれ自身とホモ二量体化することができないが、相補的に改変された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するように強制される（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないように）。本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において、軽鎖の誤対合及びＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物を減少させる、改良された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、重鎖軽鎖修飾（１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬ交換／置換並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる選択肢として検討されている。
【０１８０】
特定の一実施態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾はいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含んでいる。
【０１８１】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での隆起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１８２】
このように、特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１８３】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【０１８４】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【０１８５】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変えることにより作り出すことができる。
【０１８６】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換されている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換されている（Ｌ３６８Ａ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８７】
更に別の実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置換され（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換されている（Ｙ３４９Ｃ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１８８】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１８９】
特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（任意選択的に標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子を介して）融合される。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子をＦｃドメインのノブ含有サブユニットに融合させることにより、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つのＦａｂ分子を含む抗原結合分子の生成を（更に）最小限に抑えることができる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
【０１９０】
ヘテロ二量体化を強制するためのＣＨ３修飾の他の技術は、本発明による代替案として考えられており、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１に記載される。
【０１９１】
一実施態様において、欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。このアプローチは、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の好ましい一実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である。
【０１９２】
別の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、更にＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９３】
別の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、又は前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、更にＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（全ての番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む。
【０１９４】
一実施態様において、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施態様において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）を更に含む。
【０１９５】
一実施態様において、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２の位置に、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）から選択される更なるアミノ酸変異を含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を更に含む。
【０１９６】
一実施態様において、例えば３６８及び４０９からなる群から選択される位置（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸修飾を有する、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。
【０１９７】
一実施態様において、上述したノブ・イントゥ・ホール技術を使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９８】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。
【０１９９】
別の実施態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ刊行物の国際公開第２００９／０８９００４号に記載される静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面における１つ又は複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置換を含む。そのような実施態様の１つにおいて、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）とのアミノ酸置換、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））とのアミノ酸置換、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））とのアミノ酸置換、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄを更に含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））とのアミノ酸置換を更に含む（全ての番号はＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２００】
更に別の実施態様において、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０１】
更に別の実施態様において、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。
【０２０２】
一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２０３】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかし、同時に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の所望されない標的化を導く。更には、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となる可能性があり、サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性を引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を更に低下させることすらある。
【０２０４】
従って、特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈する。このような一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈する。一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の一実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回る、具体的には約８０％を上回る、より具体的には約９０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するときに達成される。
【０２０５】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様において、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。一実施態様において、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる複数のアミノ酸変異が存在する一実施態様において、これらアミノ酸変異の組み合わせにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にまで低減する。一実施態様において、改変されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、更には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するときに達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、そのような親和性の約８０％を超える、更には約９０％を超える親和性を示し得る。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように改変される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。一実施態様において、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される１つ又は複数である。特定の一実施態様において、エフェクター機能の低減はＡＤＣＣの低減である。一実施態様において、低減したＡＤＣＣは、改変されていないＦｃドメイン（又は改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０２０６】
一実施態様において、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様において、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、更にＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様において、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。更に特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
【０２０７】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。よって、幾つかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様において、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低減させるために、一実施態様において、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｌ２３５の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様において、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様において、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０２０８】
特定の実施態様において、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０９】
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＮ２９７の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）により置き換えるアミノ酸置換を含む。
【０２１０】
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低減を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ突然変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２１１】
突然変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により確認することができる。
【０２１２】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的な計測手段を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０２１３】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【０２１４】
幾つかの実施態様において、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低減するように改変されている幾つかの実施態様において、前記エフェクター機能の低減はＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。
【０２１５】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、すなわち、それは２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（すなわち、各々が可変及び定常ドメインを含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン）である。一実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。更に別の実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
【０２１６】
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組換え生成において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬとＶＨ）が交換されている。しかし、このドメイン交換であっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合された重鎖と軽鎖との間のいわゆるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型相互作用のために、ある種の副生成物を含むことがある（Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191を参照）。異なるＦａｂ分子からの重鎖及び軽鎖の誤対合を更に減少させ、従って本発明による所望のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を増加させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸が、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子又は活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子の何れかのＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入され得る。電荷修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｊに示されるようなもの）、又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ−Ｆ、Ｋ−Ｎに示されているようなもの）の何れかで行われる（但し、両方ではない）。特定の実施態様において、電荷修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（特定の実施態様では標的細胞抗原に特異的に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子において行われる。
【０２１７】
本発明による特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に同時結合することができる。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原と活性化Ｔ細胞抗原に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。更に特定の実施態様において、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様において、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様において、このような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性化、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様において、標的細胞抗原への同時結合を伴わない、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
【０２１８】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害性活性を標的細胞へと再指向（re-directing）することができる。特定の一実施態様において、前記再指向（re-direction）は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
【０２１９】
特に、本発明の実施態様の何れかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０２２０】
活性化Ｔ細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合部分、又は活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分を最多で１つ含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に対する一価の結合を提供する。
【０２２１】
特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。そのような実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、標的細胞抗原に特異的に結合する二つ以上の抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子が存在する実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２２２】
別の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。
【０２２３】
特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、具体的にはヒトＣＤ３（配列番号１）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に対して交差反応性（すなわち、特異的に結合する）である。幾つかの実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
【０２２４】
幾つかの実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
【０２２５】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２６】
別の実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２７】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２２８】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２９】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号３の重鎖可変領域配列と、配列番号７の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３０】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号４８と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号４９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３１】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２３２】
一実施態様において、ＣＤ３結合抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号４８の重鎖可変領域配列と、配列番号４９の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３３】
標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部分、具体的にはＣＥＡ（標的細胞抗原）に特異的に結合するＦａｂ分子を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部分、具体的にはＣＥＡに特異的に結合するＦａｂ分子を含む。このような特定の実施態様において、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。更により特定の実施態様において、これらの抗原結合部分の全ては同一であり、すなわち、それらが本明細書に記載のＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換（存在する場合）を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡに特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、最多で２つの抗原結合部分、具体的にはＣＥＡに特異的に結合するＦａｂ分子を含む。
【０２３４】
特定の実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。
【０２３５】
別の実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。そのような実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分（１つ又は複数）は従来のＦａｂ分子である。
【０２３６】
ＣＥＡ結合部分は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えばＣＥＡを発現する特定のタイプの腫瘍細胞に方向づけすることができる。
【０２３７】
一実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。更なる実施態様において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。なお更なる実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号２２の重鎖可変領域配列及び配列番号２３の軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４のポリペプチド配列、配列番号３６のポリペプチド配列、配列番号３７のポリペプチド配列、及び配列番号３８のポリペプチド配列を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号３９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４のポリペプチド配列、配列番号３７のポリペプチド配列、配列番号３８のポリペプチド配列、及び配列番号３９のポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号４０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４のポリペプチド配列、配列番号３６のポリペプチド配列、配列番号３８のポリペプチド配列、及び配列番号４０のポリペプチド配列を含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号４１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４のポリペプチド配列、配列番号３６のポリペプチド配列、配列番号３８のポリペプチド配列、及び配列番号４１のポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号５２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３４のポリペプチド配列、配列番号５０のポリペプチド配列、配列番号５１のポリペプチド配列、及び配列番号５２のポリペプチド配列を含む。
【０２３８】
ＣＥＡ抗体
一態様において、本発明は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、具体的にはヒト化抗体を提供し、ここで前記抗体は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。更なる実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合する抗原結合部分、具体的にはＦａｂ分子は、配列番号２２の重鎖可変領域配列及び配列番号２３の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、抗体はＦａｂ分子である。
【０２３９】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を含む。幾つかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
【０２４０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、Ｆａｂ分子の軽鎖部分は、Ｆａｂ分子の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意選択的に別のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してＦａｂ分子を形成するであろう。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方及び任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
【０２４１】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるように、単離されたポリヌクレオチドは本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２４２】
特定の実施態様において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。
【０２４３】
組換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物の中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されているか又は融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、１つ又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片���、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２４４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様において、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２４５】
後の精製を容易にするため又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用され得る短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれ得る。
【０２４６】
更なる実施態様において、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様において、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で産生され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞��ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０２４７】
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０２４８】
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
【０２４９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、互いに遺伝的に融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０２５０】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つ又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に産生されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２５１】
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当該技術分野でよく知られている方法に従って調製され得る（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば���Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして、抗体断片を提示する。
【０２５２】
特定の実施態様において、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様において、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第１の標識された抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第１の標識された抗体を含むが第２の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が、抗原への結合において第１の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２５３】
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当該技術分野の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正しく会合していると示された（例えば図４を参照）。３つのバンドはおよそ分子量２５０００、分子量５００００及び分子量７５０００で分離され、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測された分子量に対応する。
【０２５４】
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０２５５】
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に記載される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
【０２５６】
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２５７】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付組換えＦｃ受容体が、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって捕捉され、二重特異性構築物は分析物として使用される。簡潔には、供給者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度論的な測定のため、二重特異性構築物の４倍の連続希釈物（５００ｎＭと４０００ｎＭの間の範囲）を、２５℃のＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
【０２５８】
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性構築物を、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化されたＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性構築物は、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原を、流速３０μｌ／分で２５０〜１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過させる。解離を１８０秒間モニターする。
【０２５９】
バルク屈折率の差は、基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正する。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照のこと。
【０２６０】
活性のアッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。
【０２６１】
組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかと、薬学的に許容可能な担体とを含む。別の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの追加的な治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０２６２】
更に提供されるのは、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をインビボ投与に適した形態で生成する方法であって、該方法は、（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含み、これにより、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物がインビボ投与用に製剤化される。
【０２６３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された１つ又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に付加的活性成分を含有する薬学的組成物の調製物は、本開示に照らして当業者に知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する官庁によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たさなければならないことが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的にされる担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びそれらの組み合わせを含む（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照。この文献は参照により本明細書に援用される）。何れかの従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、治療又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。
【０２６４】
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び任意の追加的治療剤）は、当業者に既知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所内、局部内に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浸す局所的かん流により、カテーテル経由で、洗浄により、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は他の方法、又は上記の何れかの組み合わせで投与することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990を参照。この文献は参照により本明細書に援用される）。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
【０２６５】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射のために、本発明の二重特異性抗原結合分子を活性化するＴ細胞は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液又は生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合した緩衝液中に製剤化することができる。この溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤のような処方剤を含有してもよい。あるいは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて、以下に列挙する種々の他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量で組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された液体媒質からの活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない内毒素汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有することができる。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが含まれる。
【０２６６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様において、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０２６７】
上記の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまた、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２６８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２６９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２７０】
治療的方法及び組成物
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかは、治療方法において使用することができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法剤として使用することができる。
【０２７１】
治療法での使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、良好な医療行為と一致した様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の要因が挙げられる。
【０２７２】
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様において、治療法において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様において、本発明は、治療を必要とする個体における疾患の治療に使用のための、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体の治療法において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様において、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患はがんである。特定の実施態様において、方法は更に、個体に対して少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様において、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様において、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するためにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２７３】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、治療を必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。更なる実施態様において、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様において、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患はがんである。一実施態様において、方法は更に、個体に対して少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様において、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施態様において、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２７４】
更なる態様において、本発明は、疾患を治療する方法を提供する。一実施態様において、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様において、薬学的に許容される形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様において、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患はがんである。特定の実施態様において、方法は更に、個体に対して少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２７５】
更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様において、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む。更なる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様において、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２７６】
特定の実施態様において、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様において、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、胃がん、膵臓がん、卵巣がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは固形腫瘍である。当業者は、多くの場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを容易に認識する。幾つかの実施態様において、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの実施態様において、生理学的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
【０２７７】
幾つかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量が細胞に投与される。他の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２７８】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な用量は（単独で使用されるか、あるいは１つ又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。何れの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２７９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、一般に持続されるであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的実施例では、用量は、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ又はそれ以上、及びそこから導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇの範囲、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム〜体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムの範囲などが投与され得る。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ又は複数の用量（又はそれらの任意の組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後に、１つ又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２８０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２８１】
全身投与の場合、治療的有効量は、細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイから最初に推定することができる。次いで、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２８２】
初期投与量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２８３】
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２８４】
局所投与又は選択的取り込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２８５】
本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供するであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示すＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２８６】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価することができるであろう。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０２８７】
その他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、治療法において１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの追加的治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与される任意の薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療されている特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含み得る。特定の実施態様において、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様において、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
【０２８８】
このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上記他の要因によって決まる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２８９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２９０】
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
【実施例】
【０２９１】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２９２】
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242。
【０２９３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２９４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２９５】
実施例１
Ｔ８４．６６  ＩｇＧの異なるヒト化変異体の細胞への結合
マウス抗体Ｔ８４．６６（Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)）の新規ヒト化変異体は、ＣＤＲをヒト生殖系列フレームワークアクセプター配列上に移植することによって開発された。
【０２９６】
この実施例では、Ｔ８４．６６ ＩｇＧの異なるヒト化変異体の結合を、ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞（ＭＫＮ４５、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）で試験した。
【０２９７】
簡潔には、細胞は採取され、計数され、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＣＥＡ  ＩｇＧ（４ｎｇ／ｍｌ−６０μｇ／ｍｌ）と共に丸底９６ウェルプレート中で３０分間４℃でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＰＥ  ＃１０９−１１６−１７０）と共に更に３０分間４℃で再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄し、直ちにＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて結合曲線及びＥＣ５０値が得られ、計算された（図２、ＭＫＮ４５細胞への結合）。
【０２９８】
図２は、ＭＫＮ４５細胞上に発現された、ヒトＣＥＡに対するＴ８４．６６ ＩｇＧの選択されたヒト化変異体の異なる結合パターンを示す。結合パターン及び計算されたＥＣ５０結合値（表１）に基づいて、ヒト化変異体１（配列番号２２及び２３）を更なる評価のために選択した。
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【０２９９】
実施例２
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子の調製
以下の分子がこの実施例で調製され、その模式図を図３に示す：
Ａ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、親マウスＣＥＡバインダー（Ｔ８４．６６））（図３Ａ、配列番号３２−３５）
Ｂ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー）（図３Ｂ、配列番号３４、３６−３８）
Ｃ．電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー）（図３Ｃ、配列番号３４、３７−３９）
Ｄ．電荷修飾を有する「１＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー）（図３Ｄ、配列番号３４、３６、３８、４０）
Ｅ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー中に電荷修飾、ヒト化ＣＥＡバインダー、より長いリンカー）（図３Ｅ、配列番号３４、３６、３８、４１）
Ｆ．電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３バインダー中にＶＨ／ＶＬ交換、ヒト化ＣＥＡバインダー）（図３Ｆ、配列番号３４、５０−５２）
【０３００】
ＣＤ３及びＣＥＡバインダーの可変重鎖及び軽鎖領域をコードするＤＮＡ配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。タンパク質発現は、ＭＰＳＶ又はＣＭＶプロモーターによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。加えて、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０３０１】
分子の産生のために、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてそれぞれの発現ベクターで同時トランスフェクトした。細胞は、対応する発現ベクターを１：２：１：１の比で（Ａ、Ｂ、Ｅ、及びＦ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」）又は１：１：１：１の比で（Ｃ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」、Ｄ：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」）
用いてトランスフェクトされた。
【０３０２】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む無血清のＥｘｃｅｌｌ培養液中で懸濁状態で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業容量４００ｍｌ）内での産生のために、６億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に４００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合する。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコに移し、加湿した５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ、１．０ｍＭのＶＰＡを含有するＥｘｃｅｌｌ培地を３６０ｍｌ加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、７％のＦｅｅｄ １を添加した。７日後、３６００×ｇで２０〜３０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離機）によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えた。溶液を４℃で維持した。
【０３０３】
培養培地中の分子の力価は、プロテインＡ−ＨＰＬＣによって決定した（表２）。力価の計算は、２段階のプロセスに基づいており、Ｆｃ含有分子のｐＨ８．０でのプロテインＡへの結合及びｐＨ２．５での段階（ｓｔｅｐ）溶出での放出を含む。分析に使用した両緩衝液はトリス（１０ｍＭ）、グリシン（５０ｍＭ）、及びＮａＣｌ（１００ｍＭ）を含み、それぞれのｐＨ（８及び２．５）に調整した。カラム本体は、ＰＯＲＯＳ  ２０Ａを充填した約６３μｌの内部容量を有するＵｐｃｈｕｒｃｈ  ２ｘ２０ｍｍプレカラムであった。最初の較正の後、１００μｌの各試料を０．５ｍｌ／分の流速で注入した。０．６７分後、試料をｐＨ２．５までのｐＨステップで溶出した。定量は、２８０ｎｍ吸光度の測定及び１６〜１６６ｍｇ／ｌのヒトＩｇＧ１の濃度範囲を有する標準曲線を用いた計算によって行った。
【０３０４】
分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いたアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製した。
【０３０５】
アフィニティークロマトグラフィーのために、２５ｍＭの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰ（分子Ａ、Ｂ及びＦ）カラム又はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（分子Ｃ、Ｄ及びＥ）カラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄することにより除去し、標的タンパク質を、６カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．０）を加えることにより中和させた。プロテインＡクロマトグラフィー後のインプロセス分析では、単一画分中の分子の純度及び分子量を、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅＴＭ、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した。標的タンパク質の選択された画分を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０３０６】
精製したタンパク質試料のタンパク質濃度が、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定された。
【０３０７】
分子の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０３０８】
最終精製工程後に分子の純度及び分子量が、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造業者の指示に従って使用した（図５及び表３）。
【０３０９】
分子の質量分析による解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）をＡｇｉｌｅｎｔ  ６２２４  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ装置に連結した。約５μｇの試料を４０℃で１ｍｌ／分の流速でＮＵＣＬＥＯＧＥＬ  ＲＰ１０００−８、２５０ｍｍ×４．６ｍｍカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注入した。移動相は以下の通りであった：Ａ：５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸、及びＢ：９５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸。溶出勾配を適用するために、１５％のＢを１０分以内に６０％のＢまで、次いで２．５分以内に１００％のＢまで上昇させた。
質量分析計は、高分解能モード４ＧＨｚポジティブで測定し、５００〜３２００ｍ／ｚの範囲を記録した。Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｌｔｄ）のＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒ  ２．４．１を用いてｍ／ｚスペクトルを手作業でデコンボリューションした。
【０３１０】
全ての分子は、本質的に同じ方法に従って製造され精製された。最終品質は、分子Ａ及びＢの両方ともＣＥ−ＳＤＳにおいてほぼ１００％の単量体含量及び１００％の純度であり、非常に良好であった（表２及び３、図４）。分子ＢについてＬＣ−ＭＳ分析が行われ、軽鎖の誤対合を示さなかった。対照的に、副産物を除去しなければならず、ＬＣ−ＭＳ測定値は依然として約１０％の誤対合を示したので、分子Ｆ（電荷修飾なし）は非常に低い回収率を示した。分子Ｃは、分子Ｄよりもわずかに良好な収率及び品質で精製することができた。最終品質は、ＣＥ−ＳＤＳでほぼ１００％の単量体含量及び９６％を超える純度を有する分子Ｃ及びＤの両方にとって良好であった（表２及び３、図４）。
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【０３１１】
実施例３
異なる抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性分子フォーマットの比較
実施例３Ａ
異なる抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）分子の細胞への結合
異なるフォーマットの抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）分子の結合をヒト胃腺癌細胞（ＭＫＮ４５、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９、〜５１３０００個のＣＥＡ結合部位）、結腸腺癌細胞（ＬＳ１７４Ｔ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＬ−１８８、〜４０７００個のＣＥＡ結合部位）、及び結腸腺癌細胞ＨＴ２９（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ２９９、〜１００００個のＣＥＡ結合部位）、並びにＣＤ３発現不死化Ｔリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ２８２）で試験した。
【０３１２】
簡潔には、細胞は採取され、計数され、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２×１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ  分子（３１０ｐＭ−５００ｎＭ）と共に丸底９６ウェルプレート中で３０分間４℃でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ ＃１０９−０９６−００８）と共に更に３０分間４℃で再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄した。
【０３１３】
暗所において４℃で３０分間、２％ＰＦＡを含むＦＡＣＳ緩衝液で細胞をインキュベートすることによって染色を固定した。測定のために、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔを用いて測定した。
【０３１４】
結果を図５に示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を用いて結合曲線を得た（上段、左から右、ＭＫＮ４５細胞；ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＨＴ２９細胞に対する結合、下段、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合）。
【０３１５】
図５は、中程度（ＬＳ１７４Ｔ）又は低いＣＥＡ発現レベル（ＨＴ２９）を有する細胞株において、高濃度での分子Ｄ及び分子Ｃのより高い蛍光強度を示す。これは、一価結合性構築物のより多くが、ヒトＣＥＡに二価的に結合する分子Ｂと比較して、これらの条件下で結合することができるという事実を指摘する。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のヒトＣＤ３への結合は分子Ｃ及び分子Ｂに匹敵するが、分子Ｄはより良好な結合を示す。これは、分子Ｄ中のＣＤ３標的化部分のより良好な接触性のためであろう。
【０３１６】
実施例３Ｂ
異なる抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）分子によって誘導された腫瘍細胞死滅
標的として、ＭＫＮ４５、ＢｘＰＣ−３（ＥＣＡＣＣ  ９３１２０８１６、ヒト初代膵臓腺癌細胞株）又はＨＴ−２９ヒト腫瘍細胞を、及びエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いて、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子による異なる腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を評価した。示されたＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子とのインキュベーションの２４時間及び４８時間で、腫瘍細胞の溶解が検出された。
【０３１７】
簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する相間上の血漿を廃棄し、新しいＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。腫瘍細胞溶解アッセイのために、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子を指示された濃度で添加した（１ｐＭ−２０ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間及び４８時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１６４４７９３００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクター細胞と共に同時にインキュベートした標的細胞を指す。
【０３１８】
図６は、分子Ｄが標的細胞株の最も強い死滅を誘導し、続いて分子Ｃ、最後に分子Ｂが続くことを示す。３つの異なるフォーマット間の最良の差別化は、低いＣＥＡ発現レベルを有する腫瘍細胞株において見ることができる（図６Ｃ及び６Ｆ）。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を用いて計算し、表４（２４時間）及び表５（４８時間）に示す。
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【０３１９】
実施例３Ｃ
異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導された、ＣＥＡ発現腫瘍細胞の死滅後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター細胞のＣＤ２５のアップレギュレーション
異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって媒介されるＣＥＡ発現ＭＫＮ４５、ＢｘＰＣ３又はＨＴ２９腫瘍細胞の死滅後のＣＤ４＋（図７Ａ−Ｄ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ｅ−Ｈ）の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）を認識する抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって評価した。更に、抗原非特異的Ｔ細胞活性化をチェックするために、標的細胞の非存在下におけるエフェクター細胞と異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との同時インキュベーションの際に、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔエフェクター細胞についてＣＤ２５を分析した。
【０３２０】
抗体及び死滅アッセイ条件は、同じ抗体濃度範囲（１ｐＭ−２０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１及び４８時間のインキュベーション時間を用いて、本質的に上記の通りであった（実施例３Ｂ）。
【０３２１】
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３４４７０４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３４４６１２）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０２６１０）の表面染色を供給者の指示に従って行った。細胞を０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡを含有するＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌ／ウェルを用いて４℃で３０分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
【０３２２】
図７は、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合によって測定した場合、分子Ｄが最も強いＴ細胞活性化を誘導することを示す。しかしながら、この分子はまた、最も高い２〜３の濃度で標的細胞の非存在下でＴ細胞の活性化を誘導したので、好ましいフォーマットとして選択されなかった。
【０３２３】
分子Ｃは、ＣＥＡを発現する標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘導する第２の最も強力な分子であり、これはかなり低レベルのＣＥＡを発現する標的細胞を用いた設定において特に明らかである（図７Ｃ）。また、分子Ｂは、ＣＥＡを発現する標的細胞の存在下で、強い濃度依存性Ｔ細胞活性化を誘導することができる。この実施例では、分子Ｂ及びＣの両方が、標的細胞の非存在下で有意なＴ細胞活性化を誘導しない。
この重要な安全点を更に詳しく説明するために、追加のアッセイを実施した。
【０３２４】
実施例３Ｄ
異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子及びＣＥＡ発現腫瘍又は初代上皮細胞との同時インキュベーションに際してのＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター細胞のＣＤ６９アップレギュレーション
ＣＤ４＋（図８Ａ−Ｅ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図８Ｆ−Ｊ）の活性化を、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５、ＬＳ１７４Ｔ（ＥＣＡＣＣ ８７０６０４０１、約４０７００個のＣＥＡ結合部位を有するヒト結腸腺癌細胞株）、ＨＴ２９又はＣＣＤ ８４１ ＣｏＮ（２０００個未満（＜２０００）のＣＥＡ結合部位を発現する、ヒト結腸由来の初代上皮細胞株であるＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１７９０ＴＭ）と、ヒトＰＢＭＣ及び異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との４８時間の同時インキュベーション後に評価した。抗原非特異的Ｔ細胞活性化を調べるために、ＣＤ６９を、エフェクター細胞と標的細胞の非存在下で異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との同時インキュベーションの際に、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔエフェクター細胞において分析した。
【０３２５】
抗体及びアッセイ条件は、同一の抗体濃度範囲（１ｐＭ−２０ｎＭ、３通り）及び１０：１のＥ：Ｔ比並びに上記のＦＡＣＳ染色プロトコルを使用して（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１０９０６）、本質的に上記の通りであった（実施例３Ｂ及び３Ｃ）。
【０３２６】
図８は、異なるＣＥＡ発現腫瘍細胞の存在下でのＣＤ６９陽性Ｔ細胞の割合によって測定した場合、再び分子Ｄが最も強いＴ細胞活性化を誘導することを示している。しかしながら、この分子は初代上皮細胞の存在下において（ＣＣＤ８４１、図８Ｄ及び８Ｉを参照）、並びに標的細胞の非存在下において（図８Ｅ及び図８Ｊ）、Ｔ細胞の活性化も誘導した。これらの知見は、Ｔ細胞の抗原非依存性活性化を確認し、更に、非常に低いＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞の存在下における潜在的な安全性の問題を指摘する。
【０３２７】
しかしながら、これらの反応性ＰＢＭＣエフェクター細胞では、抗原非依存性Ｔ細胞活性化が、２番目に強力な分子である分子Ｃでも同様に観察された。結果的に、種々のＣＥＡ発現腫瘍細胞の強力かつ濃度依存的な死滅を示したが、初代上皮細胞の顕著な死滅も、又は初代上皮細胞の存在下若しくは標的細胞の非存在下での抗原非依存性Ｔ細胞活性化も示さなかった唯一のフォーマットは分子Ｂである。従って、「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」フォーマットが好ましいフォーマットとして選択された。
【０３２８】
実施例４
親又はヒト化ＣＥＡバインダーを含む抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性分子の比較
実施例４Ａ
異なるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（キメラＴ８４．６６対ヒト化変異体１）によって誘導されたＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅
Ｔ細胞活性化又は腫瘍細胞溶解を誘導するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの最終効力に対するＣＥＡバインダーの影響を（親キメラＴ８４．６６対ヒト化変異体１）、上記のように古典的な腫瘍細胞溶解アッセイ、続いてＴ細胞活性化マーカーの染色により評価した（実施例３Ｂ及び実施例３Ｃ）。安全性ウインドウを更に評価するために、両方の分子をエフェクター細胞と一緒に同時インキュベートした。
【０３２９】
簡潔には、このアッセイに含まれる標的細胞は、ＭＫＮ４５及びＣＣＤ８４１  ＣｏＮ細胞であった。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ａ及びＢを、１ｐＭ−２０ｎＭの指示された濃度範囲（３通り）で添加した。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。示されたＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との４８時間のインキュベーションで、腫瘍又は初代上皮細胞の溶解が検出された。このアッセイのＰＢＭＣを採取し、上記のようにＣＤ８＋及び早期活性化マーカーＣＤ６９について染色した（実施例３Ｃ）。
【０３３０】
図９は、親キメラＴ８４．６６  ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ａ）が、ＣＥＡ高発現腫瘍細胞（ＭＫＮ４５）の存在下だけでなく、非常に低いＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞ＣＣＤ８４１の存在下においても、又は標的細胞の非存在下において、Ｔ細胞活性化（図９Ａ、Ｂ）及び細胞溶解（図９Ｃ、Ｄ）の両方を誘導したことを示す。
【０３３１】
対照的に、ヒト化バインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ）は、腫瘍細胞株ＭＫＮ４５の存在下でのみＴ細胞活性化を誘導したが、初代上皮細胞株の存在下では誘導しなかった。同じことが細胞溶解にも当てはまる。更に、標的細胞の非存在下では有意なＴ細胞活性化の兆候はなかった。
【０３３２】
実施例４Ｂ
親、キメラＴ８４．６６  ＣＥＡバインダー（分子Ａ）又はヒト化変異体１（分子Ｂ）の何れかを含む、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の安全性ウインドウを更に評価するために、感受性Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを行った。原理的には、抗原発現細胞上のヒトＣＥＡ及びＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーター調節ルシフェラーゼ発現を有するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ＃ＣＳ１７６５０１）上のヒトＣＤ３に対するＴＣＢ分子の同時結合で、ＮＦＡＴプロモーターは活性化され、活性なホタルルシフェラーゼの発現を導く。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加時に得られる）は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
【０３３３】
アッセイのために、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで採取し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を測定した。平底の白い壁の９６ウェルプレート（（＃６５５０９８，ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に２００００細胞／ウェルを播種し、指示された濃度範囲（０．４ｐＭ−１００ｎＭ）で希釈抗体又は培地（対照用）を添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を評価した。細胞を細胞培養培地に再懸濁し、腫瘍細胞に添加して、最終Ｅ：Ｔが２．５：１及び最終体積１００μｌ／ウェルを得た。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、１００μｌ／ウェルのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液（ウェルあたり１：１のＯＮＥ−Ｇｌｏ及びアッセイ培地容量）をウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベートした。発光は、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を用いて、検出時間として１秒／ウェルで検出した。
【０３３４】
図１０は、親キメラＴ８４．６６ ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ａ）が、ＣＥＡを高度に及び中程度に発現する腫瘍細胞（それぞれＭＫＮ４５及びＬＳ１７４Ｔ）の存在下でのみならず、非常に低いＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞ＣＣＤ８４１の存在下においても、又は標的細胞の非存在下において、ＪｕｒｋａｔＴ細胞活性化を誘導したことを示す（図１０Ａ）。
【０３３５】
対照的に、ヒト化バインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ）は、腫瘍細胞株ＭＫＮ４５及びＬＳ１７４Ｔの存在下でのみＪｕｒｋａｔＴ細胞活性化を誘導したが、初代上皮細胞株の存在下又は標的の非存在下では誘導しなかった（図１０Ｂ）。これらの結果は、驚くべきことに、ヒト化ＣＥＡバインダーを含有する分子が安全性の点でより良好であることを示している。
【０３３６】
実施例５
異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含む抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性分子の比較
実施例５Ａ
異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されるＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅
腫瘍細胞溶解を誘導するＣＥＡ  ＴＣＢの最終効力について、異なるヒト化ＣＥＡバインダー（配列番号３０及び３１、Ｔ８４．６６に基づくものではない）に対するＣＥＡバインダー（ヒト化変異体１（配列番号２２及び２３））の影響を、上記のように古典的腫瘍細胞溶解アッセイを用いて評価した（実施例３Ｂ）。
【０３３７】
簡潔には、このアッセイに含まれる標的細胞は、ＢｘＰＣ−３、ＮＣＩ−Ｈ２１２２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５９８５、ヒト非小細胞肺がん細胞株、〜１３３００個のＣＥＡ結合部位）、ＣＯＲ−Ｌ１０５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃９２０３１９１８、ヒト肺腺癌細胞株、〜１２００個のＣＥＡ結合部位）及びＨＢＥｐｉＣ（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ＃３２１０、ヒト気管支上皮細胞、５００個未満のＣＥＡ結合部位）であった。ヒト化変異体１  ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ）を、１ｐＭ−２０ｎＭの指示された濃度範囲（３通り）で添加し、異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（すなわち、分子Ｂと類似の構造のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子であるが、異なるＣＥＡバインダーを含む分子、配列番号４２−４５を参照）を６ｐＭ−１００ｎＭの指示された濃度範囲で加えた。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。示されたＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子との４７時間のインキュベーションで、腫瘍又は初代上皮細胞の溶解が検出された。
【０３３８】
続いて、このアッセイのＰＢＭＣを採取し、上記のようにヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞上の早期活性化マーカーＣＤ６９について染色した。
【０３３９】
図１１Ａ−Ｄは、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（実施例２の分子Ｂ）は、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＴＣＢ分子（以下、「分子Ｘ」、配列番号４２−４５と称する）と比較して、Ｔエフェクター及びＣＥＡ陽性標的細胞への同時結合の際に、より強いＴ細胞活性化を誘導したことを示す。
【０３４０】
このことは、ヒト化変異体１に基づく分子で、ＣＥＡ発現腫瘍細胞のより強い死滅が観察された図１１Ｅ−Ｈに示す腫瘍細胞溶解データと一致する。注目すべきことに、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の何れも、ＣＥＡが低い初代上皮ＨＢＥｐｉＣ細胞の溶解を誘導しなかった。
【０３４１】
まとめると、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ）は、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）と比較して、安全性ウインドウを維持しつつ、はるかに低いＣＥＡレベルを有する腫瘍細胞を死滅させることができる。
【０３４２】
実施例５Ｂ
異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導されるＴ細胞増殖
別の読み出しとして、実施例５Ａで使用したＴＣＢ分子を、それぞれの腫瘍標的細胞（ＭＫＮ４５、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＴ２９）の存在下における架橋の際のＴ細胞増殖を誘導する能力について分析した。対照として、非常に低いＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮを代替標的細胞として同様に含めた。
【０３４３】
簡潔には、新しく単離されたヒトＰＢＭＣを温ＰＢＳ中で１ｍｌ当たり１００万細胞に調整し、３７℃で１５分間加湿インキュベーター内で０．１μＭのＣＦＳＥで染色した。１／１０容量のＦＣＳを添加することにより染色を停止させ、これを室温で１分間インキュベートした。続いて細胞を遠心分離し、予熱した培地中に再懸濁し、３７℃の加湿インキュベーターで更に３０分間インキュベートして、残りのＣＦＳＥを除去した。インキュベーション後、細胞を暖培地で１回洗浄し、計数し、１ｍｌあたり２ｍｉｏの細胞で培地に再懸濁した。
【０３４４】
０．０２×百万個の標的細胞を平底９６ウェルプレートの１ウェルあたりに蒔き、異なるＴＣＢ分子を指示された濃度で添加した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを添加して最終Ｅ：Ｔ比を１０：１とし、アッセイプレートを加湿インキュベーター内で３７℃で５日間インキュベートした。
【０３４５】
５日目に、エフェクター細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現について染色した。ＰＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して、異なるＴ細胞亜集団の増殖を分析した。増殖曲線をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５により分析した。
【０３４６】
図１２は、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｂ）が、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）と比較して、ＣＥＡ陽性腫瘍標的細胞の存在下でより強いＴ細胞活性化及びその後のＴ細胞増殖を誘導したことを示す。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は図１２Ａ−Ｄに示され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖は図１２Ｅ−Ｈに示される。
【０３４７】
特に、５日間のインキュベーション後でさえ、有意なＴ細胞活性化及びそれに続くＴ細胞増殖の兆候は、初代上皮細胞の存在下において何れの分子でも観察されなかった（図１２、ＣＣＤ８４１  ＣｏＮ細胞）。
【０３４８】
これにより、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）と比較したとしても、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｂ）の好ましい効力及び安全性ウインドウが更に確認される。
【０３４９】
実施例５Ｃ
異なる抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）分子の細胞への結合
実施例５Ａ及びＢで使用したＴＣＢ分子の結合を、異なるＣＥＡ発現腫瘍細胞及びＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ２８２）細胞で試験した。
【０３５０】
簡潔には、細胞は採取され、計数され、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中で、ＣＥＡ  ＩｇＧの濃度を増加させながら（３１ｐＭ−５００ｎＭ）４℃で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的二次抗体（ＦＩＴＣ）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＦＩＴＣ ＃１０９−０９６−００８、ＰＢＳ０．１％ＢＳＡで１：４０に事前希釈したもの）、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、２％ＰＦＡを含む１５０μｌのＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡを用いて固定し、４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を４００ｘｇで４℃で８分間１回洗浄し、最後にＦＡＣＳ測定用の１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。蛍光をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔを用いて測定した。
【０３５１】
結合曲線及びＥＣ５０値がＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて得られ、計算された（図１６Ａ、ＭＫＮ４５細胞への結合、図１６Ｂ、ＬＳ−１７４Ｔ細胞への結合、図１６Ｃ、ＨＴ−２９細胞への結合、図１６Ｄ、表６）。
【０３５２】
図１６は、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３分子（分子Ｂ）が、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）よりもＣＥＡ発現腫瘍細胞へのより良好な結合を示したことを示す（特に中程度及び低いＣＥＡ発現標的細胞において、より良好なＥＣ５０値及び最大結合）。両方のＴＣＢ分子が、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のヒトＣＤ３に対する濃度依存的結合を示す。
2018533928.tif 000009
ＣＥＡ結合部位を、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＥＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２３９２８）を用いて、製造業者の指示に従って、ＦＡＣＳに基づくＱｉｆｉｋｉｔ分析によって決定した。
【０３５３】
実施例５Ｄ
異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導された腫瘍細胞溶解
実施例５Ａ−Ｃで使用したＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子による異なる腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解を、標的細胞としてヒト腫瘍細胞及びエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いて評価した。示されたＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子とのインキュベーションの４８時間で、腫瘍細胞の溶解が検出された。
【０３５４】
簡潔には、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００−３００００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する相間上の血漿を廃棄し、新しいＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２にて１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）保管した。腫瘍細胞溶解アッセイのために、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子を示された濃度で添加した（ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｂ）について０．２６ｐＭ−２０ｎＭの範囲、異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）についてそれぞれ１．２８ｐＭ−１００ｎＭ、３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。標的細胞の死滅を、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１６４４７９３００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクター細胞と共に同時にインキュベートした標的細胞を指す。
【０３５５】
図１７は、ヒト化変異体１に基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ）が、示された全ての腫瘍細胞株の有意な濃度依存性溶解を誘導したが、一方異なるヒト化ＣＥＡバインダーに基づくＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（分子Ｘ）は、ＫａｔｏＩＩＩの腫瘍溶解を誘導し、ＮＣＩ−Ｈ２１２２のみ比較的程度は低く誘導したことを示している。これは、分子Ｘと比較して、特にＣＥＡ発現レベルがかなり低い腫瘍細胞株について、分子Ｂの効力が高いことを明らかに示している。
【０３５６】
腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて計算し、表７（４８時間）に示す。
2018533928.tif 000010
ＣＥＡ結合部位を、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＥＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２３９２８）を用いて、製造業者の指示に従って、ＦＡＣＳに基づくＱｉｆｉｋｉｔ分析によって決定した。
【０３５７】
実施例６
ＣＥＡとＣＤ３バインダー間に異なるリンカーを含む抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性分子の比較
実施例６Ａ
ＣＥＡとＣＤ３バインダー間に異なるリンカーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の細胞への結合
ＣＤ３  ＦａｂとＣＥＡ  Ｆａｂとの間により長いリンカーを有する分子Ｂの変異体（分子Ｅ）の、細胞へのその結合について、分子Ｂと比較した。
【０３５８】
ヒトＣＥＡへの結合をＭＫＮ４５、ＬＳ１７４Ｔ又はＨＴ２９で試験し、ヒトＣＤ３への結合をＪｕｒｋａｔ細胞で試験した。アッセイの設定及び条件は上記の通りであった（実施例３Ａ）。
【０３５９】
結果を図１３に示す。結合曲線はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて得られた（Ａ、ＭＫＮ４５細胞への結合；Ｂ、ＬＳ１７４Ｔ細胞への結合、Ｃ、ＨＴ２９細胞への結合、Ｄ、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合）。
【０３６０】
図１３は、両方の分子の、細胞上のヒトＣＥＡ並びにヒトＣＤ３に対する同等の結合を示す。
【０３６１】
実施例６Ｂ
ＣＥＡとＣＤ３バインダー間に異なるリンカーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子による種々の腫瘍細胞の溶解
ＣＥＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解を誘導する分子の効力に対するリンカー長の影響を更に評価するために、上記のように（例えば実施例３Ｂにおいて）古典的腫瘍細胞溶解アッセイを行った。実施例６ＡのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子（分子Ｂ、及びＣＥＡとＣＤ３バインダーの間により長いリンカーを有する対応する分子、分子Ｅ）を指示濃度（１ｐＭ−２０ｐＭの範囲、３通り）で添加し、腫瘍細胞溶解を２４時間後（図１４Ａ−Ｄ）及び４８時間後（図１４Ｅ−Ｈ）に評価した。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５によって計算し、表８に示す。
【０３６２】
図１４は、高レベル（ＭＫＮ４５）又は中レベルのＣＥＡ（ＬＳ１７４Ｔ）を発現する腫瘍細胞の同等の溶解を示し、初代上皮細胞ＣＣＤ８４１の死滅は無い。
【０３６３】
しかしながら、低いＣＥＡ発現レベル（ＨＴ２９）を有する標的細胞は、より長いリンカーを含む分子でより高い全死滅を示した。
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【０３６４】
実施例７
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって誘導される腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性化
実施例７Ａ
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによる異なるＣＥＡ発現レベルを有する細胞株の溶解
別の実験において（図１８Ａ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、低ＣＥＡ発現初代上皮細胞株ＨＢＥｐｉＣの存在下で、異なる腫瘍細胞株に対して特徴づけられ、その安全性が評価された。アッセイ設定及び抗体範囲は、分子Ｂについて実施例５Ｄに記載した通りであった。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて計算し、表９（４８時間）に示す。
【０３６５】
図１８Ａ及び表９に示されるように、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって初代上皮細胞は死滅しなかったが、ＣＥＡ発現レベルが異なる腫瘍細胞株はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって濃度依存的に溶解された。
2018533928.tif 000012
【０３６６】
ＣＥＡ結合部位を、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＥＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２３９２８）を用いて、製造業者の指示に従って、ＦＡＣＳに基づくＱｉｆｉｋｉｔ分析によって決定した。
【０３６７】
別の実験において（図１９Ａ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、別のＰＢＭＣドナーを使用して、別の低ＣＥＡ発現初代上皮細胞株（ＣＣＤ８４１ＣｏＮ）の存在下で、異なる腫瘍細胞株に対して特徴づけられ、その安全性が評価された。アッセイ設定及び抗体範囲は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂについて実施例５Ｄに記載した通りであった。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて計算し、表１０（４８時間）に示す。
2018533928.tif 000013
【０３６８】
ＣＥＡ結合部位を、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＥＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２３９２８）を用いて、製造業者の指示に従って、ＦＡＣＳに基づくＱｉｆｉｋｉｔ分析によって決定した。
【０３６９】
図１９Ａ及び表１０に示されるように、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって初代上皮細胞は死滅しなかったが、ＣＥＡ発現レベルが異なる腫瘍細胞株はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子によって濃度依存的に溶解された。
【０３７０】
実施例７Ｂ
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって誘導された、ＣＥＡ発現腫瘍細胞の死滅後のＣＤ４＋エフェクター細胞のＣＤ６９のアップレギュレーション
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって媒介されるＣＥＡ発現腫瘍細胞の溶解後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０３７１】
抗体及び死滅アッセイ条件は、同じ抗体濃度範囲（０．２６ｐＭ−２０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１及び４８時間のインキュベーション時間を用いて、本質的に上記の通りであった（実施例５Ｄ）。
【０３７２】
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５６３４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５７８５２）及びＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１０９０６）の表面染色を供給者の指示に従って行った。細胞を０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡを含有するＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌ／ウェルを用いて４℃で３０分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
【０３７３】
図１８Ｂは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂが、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の割合によって測定されるように、異なるＣＥＡ発現腫瘍細胞株の存在下で濃度依存性Ｔ細胞活性化を誘導することを示す。対照的に、低ＣＥＡ発現初代上皮細胞の存在下ではＴ細胞活性化は起こらなかった。ＣＤ８＋細胞についても同様の結果が得られた（データ非表示）。このデータは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの治療的投与は、低ＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞に悪影響をもたらさないであろうことを示唆している。
【０３７４】
Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて計算し、表１１に示す。
2018533928.tif 000014
【０３７５】
ＣＥＡ結合部位を、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＥＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２３９２８）を用いて、製造業者の指示に従って、ＦＡＣＳに基づくＱｉｆｉｋｉｔ分析によって決定した。
【０３７６】
実施例７Ｃ
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって誘導された、ＣＥＡ発現腫瘍細胞の死滅後のＣＤ４＋エフェクター細胞のＣＤ２５のアップレギュレーション
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂによって媒介されるＣＥＡ発現腫瘍細胞の溶解後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）を認識する抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０３７７】
抗体及び死滅アッセイ条件は、同じ抗体濃度範囲（０．２６ｐＭ−２０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１及び４８時間のインキュベーション時間を用いて、本質的に上記の通りであった（実施例５Ｄ）。
【０３７８】
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３４４７０４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３４４６１２）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３０２６１０）の表面染色を供給者の指示に従って行った。細胞を０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡを含有するＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌ／ウェルを用いて４℃で３０分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
【０３７９】
図１９Ｂは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂが、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合によって測定されるように、ＣＥＡ発現腫瘍細胞株の存在下で濃度依存性Ｔ細胞活性化を誘導することを示す。対照的に、低ＣＥＡ発現初代上皮細胞の存在下ではＴ細胞活性化は起こらなかった。ＣＤ８＋細胞についても同様の結果が得られた（データ非表示）。このデータは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの治療的投与は、低ＣＥＡ発現レベルを有する初代上皮細胞に悪影響をもたらさないであろうことを示唆している。
【０３８０】
実施例８
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に対するＣＥＡ  ＣＤ３分子Ｂの特異的結合
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する（他の最も近いファミリーメンバーであるＣＥＡＣＡＭ１及びＣＥＡＣＡＭ６に対してではない）特異的結合を示すために、ヒトＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ６の何れかを発現する一過性ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞へのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの結合を評価した。
【０３８１】
簡潔には、細胞は採取され、計数され、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり１×１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．１ｘ１０６細胞含有）を丸底９６ウェルプレートに蒔き、１５０μｌの冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の固定可能な生存能力のある色素ｅＦｌｕｏｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃６５−０８６４−１４）の１：５０００に事前希釈された懸濁液を用いて、４℃で３０分間染色した。その後、細胞をＰＢＳで２回、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂの濃度を増加させながら４℃で３０分間染色した。抗体濃度範囲は３０．５ｐＭ−５００ｎＭであった。細胞を、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的二次抗体（ＦＩＴＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＦＩＴＣ ＃１０９−０９６−０９８、ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで１：５０に事前希釈したもの）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、２％ＰＦＡを含む１５０μｌのＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡを用いて固定し、４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を４００ｘｇで４℃で８分間１回洗浄し、最後にＦＡＣＳ測定用の１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。蛍光をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。結合曲線はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて得た（図２０Ａ）。
【０３８２】
トランスフェクション効率を決定するために、市販の抗ヒトＣＤ６６抗体（ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ６６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５１４７９、試料あたり２０μｌ）を用いて、全てのトランスフェクタントを４℃で３０分間染色した（図２０Ｂ）。図２０Ｂに示すように、最も高い発現レベルが、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、続いてＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６について検出された。図２０Ａは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する一過性トランスフェクタントに対する濃度依存的結合を示すが、ヒトＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ６を発現する他のトランスフェクタントの何れにも結合しないことを明らかに示しており、ＣＥＡへの結合の特異性を実証している。
【０３８３】
実施例９
健常なＮＯＧマウスにおける異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の単回投与ＰＫ
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの曝露を評価するために、健常ＮＯＧマウスで単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した（図１５）。０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注入をＮＯＧマウスに投与し、薬物動態評価のために選択した時点で血液試料を採取した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の総濃度を測定するために、一般的なイムノアッセイを使用した。両方のＴＣＢ分子の標準曲線の較正範囲は０．０７８〜５ｎｇ／ｍｌであった（ここでは１．５ｎｇ／ｍｌが定量下限（ＬＬＯＱ）である）。
【０３８４】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂについては１０日間の半減期（ノンコンパートメント分析）で、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘについては６．５日間の半減期で二相性低下が観察された。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂについては８．１ｍｌ／ｄ／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）が検出され、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘについては１９ｍｌ／ｄ／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）が検出された（表１２）。全体として、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘと比較して、ＮＯＧマウスにおいてより長い半減期及び低いＣＬを示した。
【０３８５】
Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  ＬｔｄのＰｈｏｅｎｉｘ ｖ６．４をＰＫ解析、モデリング、シミュレーションに使用した。
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【０３８６】
実施例１０
ＭＫＮ４５モデルにおける異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の抗腫瘍活性
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの抗腫瘍活性を、胃癌細胞株ＭＫＮ４５を有する完全ヒト化ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスで試験した。
【０３８７】
循環ヒトＢ細胞及びＴ細胞の生理学的レベルを有する、１４週齢の完全ヒト化ＮＯＧマウスに（Hayakawa et al., Stem Cells 27 (2009) 175-182）、１×１０６個のＭＫＮ４５細胞（元々はＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨから入手したもの）を皮下（ｓ．ｃ．）に注射した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂを、１週間に２回若しくは１回の投与又は１週間に１回の投与で２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に（ｉ．ｖ．）投与した（図２１）。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、試験した全ての用量及びスケジュールにおいて、有意により強力な抗腫瘍活性を示した。重要なことに、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂのみが腫瘍退縮を媒介することができ、腫瘍の無いマウスが２．５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの処置群で検出された（図２１、表１３）。
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【０３８８】
実施例１１
実施例９に示すＳＤＰＫデータに基づいて、ＮＯＧマウスにおけるＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子ＸのＰＫを説明するために、２−コンパートメントモデルを作成した（図２２）。次の実施例に記載される用量範囲有効性試験のために選択された異なる用量レベル及びスケジュールがシミュレートされた。図２２に示すように、ＣＥＡ５  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂのより低いクリアランスを補うために、研究の設計を適合させた。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの投与頻度を週２回のスケジュールへと増やし、また１２．５ｍｇ／ｋｇまでのより高い用量レベルが使用された。シミュレートされたプロファイルは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの１２．５ｍｇの隔週投与で、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂと比較して、曝露が実質的に高いことを示している。
【０３８９】
実施例１２
ＭＫＮ４５モデルにおける異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子を用いた用量範囲の有効性試験
２つの分子間の抗腫瘍活性のインビボ倍数差をより詳細に評価するために、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘを、胃癌細胞株ＭＫＮ４５を有する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおいてより広範囲の用量で試験した（図２３）。
【０３９０】
完全ヒト化ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。平均腫瘍体積が１８０ｍｍ３に達したとき、マウスにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘを、図２３に示されている異なる用量及びスケジュールで静脈内投与した。投与量及びスケジュールは、実施例１１に記載の分析に基づいて選択した。得られた有効性データは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘと比較して、少なくとも２５倍の顕著な倍数差でより強い抗腫瘍活性を媒介することができた（図２３のグラフの星印で強調されている）ことを明らかに示している。
【０３９１】
実施例１３
ＨＰＡＦ−ＩＩモデルにおける異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の抗腫瘍活性
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの抗腫瘍活性を、ヒト膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ−ＩＩを有し、ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスで試験した。簡潔に述べると、メスＮＯＧマウスに、１×１０６個のＨＰＡＦ−ＩＩ細胞（元々はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られたもの）を皮下（ｓ．ｃ．）に注射した。平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達したとき、マウスは、ヒトＴ細胞の供給源としてヒトＰＢＭＣ（マウスあたり１０×１０６細胞）の静脈内注射を受けた。３日後、マウスはＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘを２．５ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に１回静脈内に投与された。図２４に示すように、３週間の治療後、ＴＣＢ分子は両方とも強力な抗腫瘍活性を示し、分子Ｂのみが腫瘍退縮を媒介することができた（３２日目、試験終了日）（図２４）。
【０３９２】
実施例１４
カニクイザルにおける異なるヒト化ＣＥＡバインダーを含むＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子の単回投与ＰＫ
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘそれぞれの曝露を評価するために、カニクイザルで単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した（図２５）。０．０１ｍｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）ボーラス投与が投与され、薬物動態評価のために選択された時点で血液試料を採取した。特異的イムノアッセイを用いて、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘの結合コンピテント濃度を測定した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘでは、定量下限（ＬＬＯＱ）は０．１ｎｇ／ｍｌであり、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂでは０．４４ｎｇ／ｍｌであった。
【０３９３】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂについて１８４±４０時間の半減期（ノンコンパートメント分析）で、対して ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘでは３２±１１時間の半減期で二相性低下が観察された。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｂについて７±０．９ｍｌ／ｄ／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）が検出され、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘについては２５±６ｍｌ／ｄ／ｋｇが検出された。全体として、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子ＢはＩｇＧ様の特性を示し、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ分子Ｘと比較して、カニクイザルにおいてより長い半減期及びより遅いクリアランスを示した。
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Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  ＬｔｄのＰｈｏｅｎｉｘ  ｖ６．４をＰＫ評価に使用した。
＊  ＊  ＊
【０３９４】
前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｎ】
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【図１Ｏ−Ｖ】
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【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
2018533928.tif 000031
【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｆ】
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【図７Ａ−Ｂ】
2018533928.tif 000034
【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図７Ｇ−Ｈ】
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【図８Ａ−Ｃ】
2018533928.tif 000038
【図８Ｄ−Ｅ】
2018533928.tif 000039
【図８Ｆ−Ｈ】
2018533928.tif 000040
【図８Ｉ−Ｊ】
2018533928.tif 000041
【図９Ａ−Ｂ】
2018533928.tif 000042
【図９Ｃ−Ｄ】
2018533928.tif 000043
【図１０】
2018533928.tif 000044
【図１１Ａ−Ｄ】
2018533928.tif 000045
【図１１Ｅ−Ｈ】
2018533928.tif 000046
【図１２Ａ−Ｄ】
2018533928.tif 000047
【図１２Ｅ−Ｈ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｄ】
2018533928.tif 000050
【図１４Ｅ−Ｈ】
2018533928.tif 000051
【図１５】
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【図１６Ａ−Ｂ】
2018533928.tif 000053
【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１７Ｄ−Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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