(57)【要約】カプセル周辺での線維性過剰増殖が減少した埋め込み用生体医療デバイスを開示する。デバイスは、生体適合性材料を含み、特定の特徴を有し、これらの特徴は、デバイスに存在するこれらの特徴の１つまたは複数を欠く同じデバイスより埋め込み後の線維化反応の誘発を少なくすることができる。哺乳動物細胞を封入し、１ｍｍ超の直径、および任意選択で細胞を含まないコアを有し、対象への埋め込み後の線維性過剰増殖を低減した、生体適合性ヒドロゲルカプセルを開示する。開示された封入された細胞の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における疾患を処置する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体医療デバイスの調製物であって、
該調製物の該デバイスの少なくとも６０％が、（ｉ）球様形状または回転楕円体様形状を有し、（ｉｉ）少なくともＸ  ｍｍであるがＹ  ｍｍ以下の直径を有し、但しＹはＸより大きく、Ｘが１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０であり、Ｙが２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０であり、
（ａ）該調製物の該デバイスの２０％以下が、球様形状または回転楕円体様形状以外を有し、
（ｂ）該調製物の該デバイスの少なくとも５０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞／デバイスを含み、
（ｃ）球様形状または回転楕円体様形状を有する該調製物の該デバイスの少なくとも５０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞を含み、
（ｄ）該調製物の該デバイスの２０％以下が、エッジを有し、
（ｅ）該調製物の該デバイスの少なくとも５０％中の該細胞が、該デバイス全体にわたって本質的に均一に分布し、
（ｆ）球様形状または回転楕円体様形状を有する該調製物の該デバイスの少なくとも５０％中の該細胞が、該デバイス全体にわたって本質的に均一に分布し、
（ｇ）該調製物の該デバイスの少なくとも５０％中の該細胞が、該デバイス全体にわたって本質的に均一に分布しておらず、
（ｈ）該調製物の該球様形状または回転楕円体様形状のデバイスの少なくとも５０％中の該細胞が、該デバイス全体にわたって本質的に均一に分布していない、調製物。
【請求項２】
前記生体医療デバイスは、生体適合性材料を含み、該生体適合性材料が、アルギナートまたはアルギナート誘導体である、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
Ｘ＝１．２およびＹ＝１０．０である、請求項１から２のいずれかに記載の調製物。
【請求項４】
Ｘ＝１．２およびＹ＝８．０である、請求項１から２のいずれかに記載の調製物。
【請求項５】
Ｘ＝１．３およびＹ＝１０．０である、請求項１から２のいずれかに記載の調製物。
【請求項６】
Ｘ＝１．３およびＹ＝８．０である、請求項１から２のいずれかに記載の調製物。
【請求項７】
前記調製物の前記デバイスの少なくとも６０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
前記調製物の前記デバイスの少なくとも７０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項９】
前記調製物の前記デバイスの少なくとも８０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１０】
前記調製物の前記デバイスの少なくとも８０％が、サブコンパートメント化されていない、請求項１から９のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１１】
前記調製物の前記デバイスの少なくとも８０％が、サブコンパートメント化されており、少なくとも１つのサブコンパートメントが、細胞を本質的に含まない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１２】
被験体を処置する方法であって、
（ａ）該被験体に、治療効果を少なくともＺ日間提供する、有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の調製物の最初の投与を施す工程、および
（ｂ）該被験体に、有効な量の該調製物の、その後の投与を施す工程
を含み、
該最初の投与と該その後の投与とが少なくともＺ−１０、Ｚ−５またはＺ日離れており、中間の投与が提供されない、方法。
【請求項１３】
Ｚが少なくとも１４日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｚが少なくとも３０日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
被験体を処置する方法であって、
被験体への有効な量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の調製物の前記最初の投与の少なくともＺ日後に、有効な量の該調製物の、その後の投与を施す工程
を含み、
該最初の投与と該その後の投与とが少なくともＺ−１０、Ｚ−５またはＺ日離れている、方法。
【請求項１６】
Ｚが少なくとも１４日である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｚが少なくとも３０日である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルであって、
該カプセルは、
内側の無細胞コア層、
哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有する、ヒドロゲル層、ならびに
外側の無細胞バリアまたは構造層
の３層からなる、ヒドロゲルカプセル。
【請求項１９】
平均直径が１ｍｍ超８ｍｍ未満である、請求項１８に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２０】
前記コア層が、治療剤、予防剤または診断剤を含む、請求項１８または１９に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２１】
前記コア層が、抗炎症剤、フェノール系酸化防止剤および抗増殖薬からなる群から選択される治療剤を含む、請求項２０に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２２】
前記コア層が、埋め込み部位で放出される治療剤を含む、請求項２０または２１に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２３】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルであって、
該カプセルは、哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有する、ヒドロゲル層、ならびに
外側の無細胞バリアまたは構造層
の２つまたはそれ超の層からなり、
該カプセルは、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満であり、直径１ｍｍ未満の同じカプセルより埋め込み後の線維化反応の誘発が少ない、ヒドロゲルカプセル。
【請求項２４】
直径が少なくとも１．２ｍｍである、請求項２３に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２５】
直径が少なくとも１．５ｍｍである、請求項２３に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２６】
内側の無細胞コア層、
前記哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有する、ヒドロゲル層、ならびに
前記外側の無細胞バリアまたは構造層
の３層からなる、請求項２４から２５のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２７】
前記ヒドロゲルが、多糖、コラーゲン、アガロース、ポリホスファゼン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ならびにそれらのコポリマーおよびブレンドからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２８】
前記ヒドロゲルが、アルギナート、キトサン、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択される多糖である、請求項１８から２７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項２９】
前記カプセルの表面が親水性である、請求項１８から２８のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項３０】
前記細胞が、膵島細胞または未分化のもしくは部分的に分化したそれらの前駆体である、請求項１８から２９のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞が、同種異系または自家性である、請求項１８から３０のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞が膵島細胞である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項３３】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルの集団であって、該カプセルが、哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有し、カプセルの前記集団中の全てのカプセルは、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満であり、前記ヒドロゲルカプセルは、直径１ｍｍ未満の同じカプセルより埋め込み後の線維化反応の誘発が少ない、集団。
【請求項３４】
前記集団中の前記カプセルが、直径が１ｍｍ未満であるカプセルおよび直径が少なくとも８ｍｍであるカプセルから、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満であるカプセルを分離することによって選択されたものである、請求項３３に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項３５】
前記集団中の全ての前記カプセルは、直径が少なくとも１．２ｍｍである、請求項３３または３４に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項３６】
前記集団中の全ての前記カプセルは、直径が少なくとも１．５ｍｍである、請求項３３または３４に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項３７】
前記ヒドロゲルが、多糖、コラーゲン、アガロース、ポリホスファゼン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ならびにそれらのコポリマーおよびブレンドからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項３３から３６のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項３８】
前記ヒドロゲルが、アルギナート、キトサン、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択される多糖である、請求項３３から３７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項３９】
前記カプセルの表面が親水性である、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
【請求項４０】
前記細胞が、膵島細胞または未分化のもしくは部分的に分化したそれらの前駆体である、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項４１】
前記哺乳動物細胞が、同種異系または自家性である、請求項３３から４０のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項４２】
前記哺乳動物細胞が膵島細胞である、請求項３３から４３のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの集団。
【請求項４３】
機能細胞を、それを必要とする個体に提供する方法であって、請求項１８から４２のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルの有効量を前記個体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４４】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルを作製する方法であって、
該カプセルは、
内側の無細胞コア層
哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有する、ヒドロゲル層、ならびに
外側の無細胞バリアまたは構造層
の３層からなり、
該方法は、３つの別個の同心チューブからなるノズルを出口に有する電気スプレー装置を準備する工程、
１種または複数種の抗炎症薬または撮像試薬を任意選択で含む、ヒドロゲル形成性材料を、該ノズルの最も内側のチューブ内へポンプ注入する工程、
ヒドロゲル形成性材料および封入される細胞を含有する第２の流れを、該ノズルの中間のチューブ内へポンプ注入する工程、
ヒドロゲル形成性材料を含有する第３の流れを、最も外側のチューブ内へポンプ注入し、３つの流れが該ノズルの該出口で合流し、ヒドロゲル溶液の粘度によって該３つの流れの間の顕著な混じり合いが防止され、それによって、電界下で３つの明瞭な同心層を有する液滴が形成される工程、ならびに
該液滴を、ヒドロゲルを架橋するための二価イオンを含有するゲル浴に落下させ、３層カプセルを形成させる工程
を含む、方法。
【請求項４５】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルを作製する方法であって、
該カプセルは、
哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される移植される細胞を含有する、ヒドロゲル層、ならびに
外側の無細胞バリアまたは構造層
の２つまたはそれ超の層からなり、
該カプセルは、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満であり、直径１ｍｍ未満の同じカプセルより埋め込み後の線維化反応の誘発が少なく、
第１のヒドロゲル流体（その中に懸濁された細胞を有する）および第２のヒドロゲル流体を、二流体同軸電気噴射に提供し、該２つの流体の比較的高い粘度およびそれらの間の短い相互作用時間によって、該流体が静電気力下で混じり合うことを防止する工程、
コア−シェル構造を有するミクロ液滴を形成する工程、ならびに
二価架橋イオンを含有するゲル化浴中で該ミクロ液滴を架橋して、ヒドロゲルカプセルを形成する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
生体適合性材料を含む埋め込み用生体医療デバイスであって、該デバイスは、直径が少なくとも１ｍｍかつ１０ｍｍ未満であり、該デバイスの表面孔は、０ｎｍ超１０μｍ未満であり、該デバイスの表面は、中性または親水性であり、該デバイスは、回転楕円体様形状を有し、該デバイスの表面の曲率は、該表面の全ての点において、少なくとも０．２かつ２以下であり、該デバイスの表面は、平面、鋭角、溝または峰を有さず、該デバイスは、直径１ｍｍ未満の同じデバイスより埋め込み後の線維化反応の誘発が少ない、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年５月１７日に出願した米国仮出願第６２／１６２，８０３号の利益を主張する。２０１６年５月１７日に出願した出願第６２／１６２，８０３号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
連邦支援研究開発に関する申立て
この発明は、米国国立衛生研究所により与えられた政府支援助成番号Ｒ０１  ＤＥ０１６５１６によってなされた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、治療剤を含有し細胞を封入した構造的デバイスを含めた生体医療デバイスの製作および使用の分野に関する。より詳細には、本発明の一部の態様は、哺乳動物細胞を封入した生体適合性ヒドロゲルおよび抗炎症薬を搭載したポリマー粒子を含む、埋め込みされる生体医療デバイスの生体適合性の改善を確実にするための改善された物理的パラメータに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
体内に移植される生体材料およびデバイスは、細胞移植、制御された薬物放出、生理学的状態の連続的感知およびモニタリング、電子的ペーシングならびに組織再生などの幅広い領域の臨床的応用に用いられている。これらの応用において、デバイスの寿命および忠実度は、デバイスが宿主免疫系による認識を避ける能力に高く依存する。持続性の炎症、線維形成（仕切り（walling-off））および周囲の組織への損傷を含めた異物反応を導く、宿主が編成する細胞プロセスのカスケードが、免疫認識によって引き起こされる。これらの不要な効果は、デバイスの機能に有害であり、患者の疼痛および不快感の重大な原因でもある。
【０００５】
１９８０年、LimおよびSunは、膵臓膵島の封入のためのアルギナート／ポリリシン複合体でコーティングされたアルギナートミクロカプセルを紹介した。それまで、組織工学および再生医療用の生細胞または細胞集合体の封入のためには、ヒドロゲルミクロカプセルが広く調査されていた（Oriveら、Nat.  Medicine、９巻：１０４頁（２００３年）；Paulら、Regen.  Med.、４巻：７３３頁（２００９年）；Readら、Biotechnol.、１９巻：２９頁（２００１年））。一般的に、カプセルは、細胞によって分泌される治療用タンパク質を放出しながら、封入された細胞への酸素および栄養素の容易な拡散が可能となるように、かつ免疫系による攻撃から細胞が防御されるように設計される。これらは、Ｉ型糖尿病、がん、およびパーキンソン病などの神経変性障害を含めた一連の疾患に有望な治療剤として開発されてきた（Wilsonら、Adv.  Drug.  Deliv.  Rev.、６０巻：１２４頁（２００８年）；Jokiら、Nat.  Biotech.、１９巻：３５頁（２００１年）；Kishimaら、Neurobiol.  Dis.、１６巻：４２８頁（２００４年））。最も普及しているカプセル製剤の１つは、イオン架橋を通じて形成され得るアルギナートヒドロゲルをベースとしたものである。典型的なプロセスにおいて、まず、細胞が粘性のアルギナート溶液とブレンドされる。その後、細胞懸濁液は、空気剪断、音響振動または静電液滴形成などの種々の方法を使用して、ミクロ液滴へと加工される（Rabaneletら、Biotechnol.  Prog.、２５巻：９４６頁（２００９年））。アルギナート液滴は、Ｃａ２＋またはＢａ２＋などの二価イオンの溶液と接触するとゲル化する。
【０００６】
しかしながら、細胞封入用のアルギナートミクロカプセルにまつわる課題の１つは、カプセル内での細胞の相対的位置の制御に欠くということである。細胞は、カプセル表面上に捕捉され曝露されることがあり、これは不適切な免疫防御につながる（Wongら、Biomat.  Artific.  Cells  Immobiol.  Biotechnol.、１９巻：６７５頁（１９９１年））。不完全な被覆は、曝露された細胞の拒絶を引き起こすばかりでなく、曝露されたエリアを通ってのマクロファージおよび線維芽細胞のカプセル中への侵入を可能にする場合もあるということが分かった（Chang、Nat,  Rev.  Drug  Discovery、４巻：２２１頁（２００５年））。アルギナートヒドロゲルミクロカプセルは、Ｉ型糖尿病の処置のための膵臓膵島と共に用いたその有用性について広く調査されてきた（Calafiore、Expert  Opin.  Biol.  Ther.、３巻：２０１頁（２００３年））。げっ歯動物（Lim、Science、２１０巻：９０８頁（１９８０年）；Qiら、Artifi.  Cells,  Blood  Substitutes,  Biotechnol.、３６巻：４０３頁（２００８年））、イヌ（Soon-Shiongら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：５８４３頁（１９９３年））、および非ヒト霊長類（El,  X.  Ma、D.  Zhou、I.  Vacek、A.  M.  Sun.、J.  Clin.  Invest.、９８巻：４１７頁（１９９６年））を含めたいくつかの動物モデルにおける多くの有望な結果が報告されている。Soon-Shiongら、Lancet、３４３巻：９５０頁（１９９４年）；Elliottら、Xenotransplantation、１４巻：１５７頁（２００７年）；Calafioreら、Diabetes  Care、２９巻：１３７頁（２００６年）、Bastaら、Diabetes  Care、３４巻：２４０６頁（２０１１年）、およびTuchら、Diabetes  Care、３２巻：１８８７頁（２００９年）によって、臨床試験も行われている。概して、これらの臨床試験は、インスリン分泌について報告しているが、長期の血糖制御の矯正についての報告はなく、これらの系を前進させるには、さらなる課題が残っている（Tamら、J.  Biomed.  Mater.  Res.  Part  A、９８Ａ巻：４０頁（２０１１年）；deVosら、Biomaterials、２７巻：５６０３頁（２００６年））。
【０００７】
１つの課題は、カプセルの生体適合性である。移植時に、異物応答が、カプセル上での線維性細胞の過剰増殖を引き起こし、この過剰増殖は、酸素および栄養素の拡散を遮り、封入された膵島の壊死につながる。このため、研究グループは、線維化反応を低減するためのポリマーを開発してきた（Maら、Adv.  Mater.、２３巻：Ｈ１８９頁（２０１１年））。別の課題は、カプセル内での膵島の不完全な被覆である（deVosら、Transplantation、６２巻：８８８頁（１９９６年）；deVosら、Transplantation、６２巻：８９３頁（１９９６年））。カプセルの外側へ突出した膵島は、アルギナート溶液中での膵島数密度が増加する場合またはカプセルサイズが小さい場合に、より頻繁に観察されるが、これらの場合のいずれも、移植体積を最小化するためには望ましい（Leungら、Biochem.  Eng.  J.、４８巻：３３７頁（２０１０年））。たとえ小さくとも膵島の断片が曝露していると、免疫エフェクター細胞は、膵島全体を破壊する場合があるという仮説が立てられてきた（Kingら、Graft、４巻：４９１頁（２００１年）；Weberら、Ann.  NY  Acad.  Sci.、８７５巻：２３３頁（１９９９年））。さらに、少数の膵島の曝露によって、増強された抗体特異的細胞免疫および移植の失敗につながる、事象のカスケードが始まる場合がある。
【０００８】
二重封入法（Elliot、２００７年；Wongら、Biomat.  Artific.  Cells  Immobiol.  Biotechnol.、１９巻：６８７頁（１９９１年））は、細胞を含有する非常に小さいカプセルをまず形成し、次いでいくつかの小さなカプセルを大きなカプセルそれぞれの中に入れるものであり、封入および異種移植片生存の改善のために使用されてきた。このアプローチは、２つのプロセス工程、ならびに細胞の生存能力および機能性に不可欠な物質輸送を必然的に限定する大きなサイズの最終カプセルを必要とする。Schneiderら（Biomaterials、２２巻（１４号）：１９６１〜１９７０頁（２００１年））によって報告されているように、これらの問題のいくつかに対処するため、膵島含有アルギナートビーズが、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸またはカルボキシメチルセルロースとアルギナートとの交互の層でコーティングされた。膵島の薄いコンフォーマルコーティングは、拡散距離および総移植体積を低減する（Teramuraら、Adv.  Drug  Deliv.  Rev.、６２巻：８２７号（２０１０年）；Wilsonら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３１巻：１８２２８頁（２００９年））。しかしながら、この方法は、膵島に損傷を引き起こす複数の工程を伴うことが多く、コーティングが臨床での使用にとって十分に強固であるかどうか明らかではない（Califiore、２００３年；Bastaら、Curr.  Diab.  Rep.、１１巻：３８４頁（２０１１年））。Bastaら（Transpl.  Immunol.、１３巻：２８９頁（２００４年））によるこれまでのデータは、コンフォーマルコーティングは、ヒドロゲルカプセルと比較して免疫防御能力を低減している可能性があるということを示唆している。
【０００９】
要するに、長年にわたる様々な動物モデルにおける有望な研究にもかかわらず、封入されたヒト膵島はこれまで、臨床的な環境においてインパクトを与えてこなかった。生体適合性、低減された免疫防御、低酸素、カプセル周辺での線維性過剰増殖、封入プロセスの影響、および移植後の炎症などの多くの非免疫学的および免疫学的因子が、この有望な技術の応用の成功を阻んでいる（Vaithilingaら、Diabet  Stud、８巻（１号）：５１〜６７頁（２０１１年））。近年使用されているアルギナートミクロカプセルは、カプセルの外側に突出した膵島を有していることが多く、これは不適切な免疫防御につながる。カプセルのコア領域中に膵島を閉じ込めるための二流体同軸電気噴射法を用いた改善された封入が、Maら、Adv.  Healthcare  Materials、２巻（５号）：６６７〜６７２頁（２０１３年）によって報告されている。
【００１０】
封入された細胞および他の生体材料ならびに医療デバイスの臨床的応用への大きな課題の１つは、それらが非特異的な宿主応答を誘発する可能性である（Williams、Biomaterials、２９巻（２０号）：２９４１〜５３頁（２００８年）；Parkら、Pharm  Res、１３巻（１２号）：１７７０〜６頁（１９９６年）；Kvistら、Diabetes  Technol、８巻（４号）：４６３〜７５頁（２００６年）；Wisniewskiら、J  Anal  Chem、３６６巻（６号）：６１１〜２１頁（２０００年）；Van  der  Giessenら、Circulation、９４巻（７号）：１６９０〜７頁（１９９６年）；Granchiら、J  Biomed  Mater  Res、２９巻（２号）：１９７〜２０２頁（１９９５年）；Wardら、Obstet  Gynecol、８６巻（５号）：８４８〜５０頁（１９９５年）；Remesら、Biomaterials、１３巻（１１号）：７３１〜４３頁（１９９２年））。この反応は、初期には好中球およびマクロファージなどの先天的免疫細胞、続いて、コラーゲンを堆積する線維芽細胞の補充を伴って、埋め込まれた対象物を囲む線維性カプセルを形成する（Williams、Biomaterials、２９巻（２０号）：２９４１〜５３頁（２００８年）；Remesら、Biomaterials、１３巻（１１号）：７３１〜４３頁（１９９２年）；Andersonら、Semin  Immunol、２０巻（２号）：８６〜１００頁（２００８年）；Andersonら、Adv  Drug  Deliver  Rev、２８巻（１号）：５〜２４頁（１９９７年）；Abbasら、Pathologic  Basis  of  Disease.第７版、Philadelphia：W.B  Saunders（２００９年））。線維性細胞層は、電気的伝達（Singarayarら、PACE、２８巻（４号）：３１１〜５頁（２００５年））または化学的伝達を妨害し、分析物（Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、３７巻（３号）：４０１〜１２頁（１９９７年）；Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、４０巻（４号）：５９８〜６０５頁（１９９８年）；Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、４０巻（４号）：５８６〜９７頁（１９９８年））および栄養素の輸送を妨げる可能性があり、そうして、免疫隔離した膵臓膵島など多くの埋め込み可能な医療デバイスの最終的な失敗につながる（De  Grootら、J  Surg  Res、１２１巻（１号）：１４１〜５０頁（２００４年）；De  Vosら、Diabetologia、４０巻（３号）：２６２〜７０頁（１９９７年）；Van  Schilfgaardeら、J  Mol  Med、７７巻（１号）：１９９〜２０５頁（１９９９年））。
【００１１】
移植の際のカプセルに対する線維化反応は、膵島の移植に対する大きな課題を提起する。線維形成は、最終的に膵島の壊死および移植の失敗へとつながる。
【００１２】
ヒト膵島細胞の移植のための改善された封入方法およびデバイスが、依然として実質的に必要とされている。
【００１３】
本発明の目的は、カプセル周辺での線維性過剰増殖が低減された、細胞移植のための細胞封入系を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、カプセル周辺での線維性過剰増殖が低減された、細胞移植方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、封入された膵島細胞を使用して糖尿病を処置する、改善された方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、線維性隔離ならびに機能および長期間治療効率の妨げを防止する一般的なデバイス製作のための方法およびデバイスを提供することにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Oriveら、Nat.  Medicine、９巻：１０４頁（２００３年）
【非特許文献２】Paulら、Regen.  Med.、４巻：７３３頁（２００９年）
【非特許文献３】Readら、Biotechnol.、１９巻：２９頁（２００１年）
【非特許文献４】Wilsonら、Adv.  Drug.  Deliv.  Rev.、６０巻：１２４頁（２００８年）
【非特許文献５】Jokiら、Nat.  Biotech.、１９巻：３５頁（２００１年）
【非特許文献６】Kishimaら、Neurobiol.  Dis.、１６巻：４２８頁（２００４年）
【非特許文献７】Rabaneletら、Biotechnol.  Prog.、２５巻：９４６頁（２００９年）
【非特許文献８】Wongら、Biomat.  Artific.  Cells  Immobiol.  Biotechnol.、１９巻：６７５頁（１９９１年）
【非特許文献９】Chang、Nat,  Rev.  Drug  Discovery、４巻：２２１頁（２００５年）
【非特許文献１０】Calafiore、Expert  Opin.  Biol.  Ther.、３巻：２０１頁（２００３年）
【非特許文献１１】Lim、Science、２１０巻：９０８頁（１９８０年）
【非特許文献１２】Qiら、Artifi.  Cells,  Blood  Substitutes,  Biotechnol.、３６巻：４０３頁（２００８年）
【非特許文献１３】Soon-Shiongら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：５８４３頁（１９９３年）
【非特許文献１４】El,  X.  Ma、D.  Zhou、I.  Vacek、A.  M.  Sun.、J.  Clin.  Invest.、９８巻：４１７頁（１９９６年）
【非特許文献１５】Soon-Shiongら、Lancet、３４３巻：９５０頁（１９９４年）
【非特許文献１６】Elliottら、Xenotransplantation、１４巻：１５７頁（２００７年）
【非特許文献１７】Calafioreら、Diabetes  Care、２９巻：１３７頁（２００６年）
【非特許文献１８】Bastaら、Diabetes  Care、３４巻：２４０６頁（２０１１年）
【非特許文献１９】Tuchら、Diabetes  Care、３２巻：１８８７頁（２００９年）
【非特許文献２０】Tamら、J.  Biomed.  Mater.  Res.  Part  A、９８Ａ巻：４０頁（２０１１年）
【非特許文献２１】deVosら、Biomaterials、２７巻：５６０３頁（２００６年）
【非特許文献２２】Maら、Adv.  Mater.、２３巻：Ｈ１８９頁（２０１１年）
【非特許文献２３】deVosら、Transplantation、６２巻：８８８頁（１９９６年）
【非特許文献２４】deVosら、Transplantation、６２巻：８９３頁（１９９６年）
【非特許文献２５】Leungら、Biochem.  Eng.  J.、４８巻：３３７頁（２０１０年）
【非特許文献２６】Kingら、Graft、４巻：４９１頁（２００１年）
【非特許文献２７】Weberら、Ann.  NY  Acad.  Sci.、８７５巻：２３３頁（１９９９年）
【非特許文献２８】Wongら、Biomat.  Artific.  Cells  Immobiol.  Biotechnol.、１９巻：６８７頁（１９９１年）
【非特許文献２９】Schneiderら、Biomaterials、２２巻（１４号）：１９６１〜１９７０頁（２００１年）
【非特許文献３０】Teramuraら、Adv.  Drug  Deliv.  Rev.、６２巻：８２７号（２０１０年）
【非特許文献３１】Wilsonら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３１巻：１８２２８頁（２００９年）
【非特許文献３２】Bastaら、Curr.  Diab.  Rep.、１１巻：３８４頁（２０１１年）
【非特許文献３３】Bastaら、Transpl.  Immunol.、１３巻：２８９頁（２００４年）
【非特許文献３４】Vaithilingaら、Diabet  Stud、８巻（１号）：５１〜６７頁（２０１１年）
【非特許文献３５】Maら、Adv.  Healthcare  Materials、２巻（５号）：６６７〜６７２頁（２０１３年）
【非特許文献３６】Williams、Biomaterials、２９巻（２０号）：２９４１〜５３頁（２００８年）
【非特許文献３７】Parkら、Pharm  Res、１３巻（１２号）：１７７０〜６頁（１９９６年）
【非特許文献３８】Kvistら、Diabetes  Technol、８巻（４号）：４６３〜７５頁（２００６年）
【非特許文献３９】Wisniewskiら、J  Anal  Chem、３６６巻（６号）：６１１〜２１頁（２０００年）
【非特許文献４０】Van  der  Giessenら、Circulation、９４巻（７号）：１６９０〜７頁（１９９６年）
【非特許文献４１】Granchiら、J  Biomed  Mater  Res、２９巻（２号）：１９７〜２０２頁（１９９５年）
【非特許文献４２】Wardら、Obstet  Gynecol、８６巻（５号）：８４８〜５０頁（１９９５年）
【非特許文献４３】Remesら、Biomaterials、１３巻（１１号）：７３１〜４３頁（１９９２年）
【非特許文献４４】Andersonら、Semin  Immunol、２０巻（２号）：８６〜１００頁（２００８年）
【非特許文献４５】Andersonら、Adv  Drug  Deliver  Rev、２８巻（１号）：５〜２４頁（１９９７年）
【非特許文献４６】Abbasら、Pathologic  Basis  of  Disease.第７版、Philadelphia：W.B  Saunders（２００９年）
【非特許文献４７】Singarayarら、PACE、２８巻（４号）：３１１〜５頁（２００５年）
【非特許文献４８】Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、３７巻（３号）：４０１〜１２頁（１９９７年）
【非特許文献４９】Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、４０巻（４号）：５９８〜６０５頁（１９９８年）
【非特許文献５０】Sharkawyら、J  Biomed  Mater  Res、４０巻（４号）：５８６〜９７頁（１９９８年）
【非特許文献５１】De  Grootら、J  Surg  Res、１２１巻（１号）：１４１〜５０頁（２００４年）
【非特許文献５２】De  Vosら、Diabetologia、４０巻（３号）：２６２〜７０頁（１９９７年）
【非特許文献５３】Van  Schilfgaardeら、J  Mol  Med、７７巻（１号）：１９９〜２０５頁（１９９９年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
ある特定の物理的特徴を有するように設計された生体医療デバイスは、宿主の拒絶ならびに生体材料および生体医療デバイスの線維性過剰増殖の低減を呈することを発見した。
【００１９】
生体医療デバイスの調製物、例えばヒドロゲルカプセルの調製物であって、調製物のデバイスの少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９８％が、（ｉ）球様形状または回転楕円体様形状を有し、（ｉｉ）少なくともＸ  ｍｍであるがＹ  ｍｍ以下の直径を有し、但しＹはＸより大きく、Ｘが１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０であり、Ｙが２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０である、調製物を開示する。
【００２０】
いくつかの形態において、調製物のデバイスの２０％以下が、球様形状または回転楕円体様形状以外を有する。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞／デバイスを含む。いくつかの形態において、球様形状または回転楕円体様形状を有する調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞を含む。いくつかの形態において、調製物のデバイスの１、２、３、４、５、１０、１５または２０％以下が、エッジを有する。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布している。いくつかの形態において、球様形状または回転楕円体様形状を有する調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布している。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布していない。いくつかの形態において、調製物の球様形状または回転楕円体様形状のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布していない。これらの特色のあらゆる組合せが、生体医療デバイスの調製において使用され得る。
【００２１】
いくつかの形態において、生体医療デバイスは、アルギナートまたはアルギナート誘導体などの生体適合性材料を含むことができる。いくつかの形態において、Ｘ＝１．２およびＹ＝１０．０である。いくつかの形態において、Ｘ＝１．２およびＹ＝８．０である。いくつかの形態において、Ｘ＝１．３およびＹ＝１０．０である。いくつかの形態において、Ｘ＝１．３およびＹ＝８．０である。
【００２２】
いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも６０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも７０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも８０％が、球様形状または回転楕円体様形状を有する。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも８０％が、サブコンパートメント化されていない。いくつかの形態において、調製物のデバイスの少なくとも８０％が、例えば膜又は界面によって、サブコンパートメント化されており、少なくとも１つのサブコンパートメントが、細胞を本質的に含まない。
【００２３】
また、被験体を処置する方法であって、（ａ）被験体に、治療効果を少なくともＺ日間提供する、有効量の（an  effect  of  amount  of）本明細書に開示する調製物の最初の投与を施す工程、および（ｂ）被験体に、有効な量の（an  effective  of  amount  of）調製物の、その後の投与を施す工程を含み、最初の投与とその後の投与とが少なくともＺ−１０、Ｚ−５またはＺ日離れており、中間の投与が提供されない、方法を開示する。
【００２４】
また、被験体を処置する方法であって、（ａ）被験体への有効な量の本明細書に開示する調製物の最初の投与の少なくともＺ日後に、有効な量の調製物の、その後の投与を施す工程を含み、最初の投与とその後の投与とが少なくともＺ−１０、Ｚ−５またはＺ日離れている、方法を開示する。
【００２５】
いくつかの形態において、Ｚは少なくとも１４日である。いくつかの形態において、Ｚは少なくとも３０日である。
【００２６】
カプセル周辺での線維性過剰増殖が減じられた埋め込み用生体医療デバイスを開発した。デバイスは、生体適合性材料を含み、直径が少なくとも１ｍｍかつ１０ｍｍ未満であり、回転楕円体様形状を有し、以下の追加の特徴の１つまたは複数を有する：デバイスの表面孔は、０ｎｍ超１０μｍ未満である；デバイスの表面は、中性または親水性である；デバイスの表面の曲率は、表面の全ての点において、少なくとも０．２であり２以下である；およびデバイスの表面は、平面、鋭角、溝または峰を有さない。デバイスは、デバイス上に存在するこれらの特徴の１つまたは複数を欠く同じデバイスより、埋め込み後の線維化反応の誘発が少ない。一部の実施形態において、デバイスは、例えば、生物学的細胞もしくは組織、合成電気リード線またはセンサーを封入した、生体適合性の球様（回転楕円体）の外側シェルであり得る。
【００２７】
生体医療デバイスは、ヒドロゲル、化学的に精製されたアルギナートおよび食品グレードのエンドトキシン含有アルギナートの両方、ガラスのような二酸化ケイ素系セラミックスなどの半導体材料、ならびにＰＣＬおよびポリスチレンなどの分解性および非分解性ポリマーおよびプラスチックを含めた、様々な材料から作製することができる。特色の特定の組合せは、デバイスの生体適合性という結果をもたらしまたは生体適合性を改善する（特に、デバイスへの免疫反応およびデバイスのカプセル様の線維形成を低減しまたはなくすことによって）。
【００２８】
生体医療デバイスは、例えば、長期埋め込み可能なセンサーおよびアクチュエーター、制御された薬物放出デバイス、プロステーシスおよび組織再生生体材料、ならびに移植に関する技術を含めた、任意の生体医療用途に使用することができる。
【００２９】
哺乳動物細胞を封入し、任意選択で抗炎症薬を含み、カプセル周辺での線維性過剰増殖が減少した、移植用生体適合性カプセルを開発した。カプセルは、その中に封入された哺乳動物細胞を有している。哺乳動物細胞は、カプセルのコア中には位置していない。好ましくは、カプセルは、２つまたは３つの層を含有する。無細胞コア、ヒドロゲル層および外側のバリア層を有する３層カプセルにおいて、細胞は中間層中に位置している。コアおよびシェルを含有する２層カプセルについては、細胞はシェル中に位置している。あるいはまた、細胞は、２層カプセルのコア中にあってもよい。任意選択で、カプセルは、その中に封入された、抗炎症薬または放射線不透過性イメージング剤などの１種または複数種の治療剤、診断剤または予防剤も含有する。
【００３０】
一般的に、コア−シェルカプセルは、２つまたはそれ超のまとまった層を有するカプセルおよびミクロカプセルを形成するためのミクロ流体または針システムを用いて膜層なしで製作される。例えば、２つの同時液体流を用いて、２層の液滴を形成してもよい。３層カプセルは、膜層なしで製作することができる。例えば、３つの同時流を用いて、硬化してカプセルおよびミクロカプセルを形成する３層の液滴を形成してもよい。
【００３１】
封入および移植に適した細胞は、一般的に、分泌もしくは代謝細胞（すなわち、それらは、治療因子を分泌するもしくは毒素を代謝する、もしくは両方）、または構造細胞（例えば、皮膚、筋肉、血管）、または代謝細胞（すなわち、それらは毒性物質を代謝する）である。一部の実施形態において、細胞は、自然にインスリンを分泌する膵島細胞など、自然分泌性であり、または、自然に解毒し分泌する肝細胞など、自然代謝性である。一部の実施形態において、細胞は、分泌タンパク質または代謝酵素などの組み換えタンパク質を発現するように生体工学によって作られたものである。細胞のタイプに応じて、細胞は、単一の細胞、細胞集合体、回転楕円体、または天然のもしくは生体工学によって作られた組織として組織され得る。
【００３２】
カプセルは、好ましくはヒドロゲルカプセルである。一部の実施形態において、カプセルのコアは、非ヒドロゲルポリマーである。好ましくは、カプセルは１ｍｍ超の直径を有し、より好ましくは、直径は１．５ｍｍまたはそれ超のサイズであるが８ｍｍ未満である。より大きなカプセルは、ヒドロゲル中にわたる拡散によって細胞が適切な栄養素および気体交換を受けることができることを確実にするため、無細胞コアを必要とする。
【００３３】
細胞を封入したヒドロゲルカプセルの集団を開発した。集団中のカプセルは、哺乳動物分泌細胞、哺乳動物代謝細胞、哺乳動物構造細胞およびそれらの集合体からなる群から選択される、移植される細胞を含有する。カプセルの集団中の全てのカプセルは、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満である。集団中のカプセルは、直径１ｍｍ未満の同じカプセルより、埋め込み後の線維化反応の誘発が少ない。集団中のカプセルは、直径が１ｍｍ未満であるカプセルおよび直径が少なくとも８ｍｍであるカプセルから、直径が少なくとも１ｍｍかつ８ｍｍ未満であるカプセルを分離することによって選択することができる。
【００３４】
封入された膵島細胞を含有する人工膵臓などの人工臓器を、組成物から製作してもよい。これらの実施形態の一部において、細胞は、単一のヒドロゲル区画中へ封入される。他の実施形態において、組成物は、生体適合性構造中に分散または封入された複数の封入された細胞を含有する。
【００３５】
疾患を処置する方法は概して、対象に、哺乳動物細胞および抗炎症薬を封入した生体適合性ヒドロゲルを投与することを伴う。一部の実施形態において、抗炎症薬は、制御放出ポリマー中に封入される。これらの実施形態の一部において、封入された細胞は、疾患を処置するための治療有効量の物質を、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、より好ましくは少なくとも９０日間、好ましくは分泌する。特に好ましい実施形態において、細胞は、対象において糖尿病を処置するための治療有効量のインスリンを、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、より好ましくは少なくとも９０日間分泌する膵島細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、コアヒドロゲル中に細胞が封入されており、かつ外側の（包膜）ヒドロゲル中に薬物搭載粒子を含有する、３層カプセルの図である。コアと包膜ヒドロゲルとを分離する任意選択の膜材料が示されている。
【図２】図２は、三流体同軸電気スプレーにより３層カプセルを形成するためのノズルの図である。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、外側の架橋シェルを有するヒドロゲルマトリックス内に細胞を分散させる従来の細胞封入方法（図３Ａ）、および、細胞を含有し、任意の細胞がカプセルの外壁に接触することを防ぐためにシェルによって囲まれており、カプセルが埋め込まれる宿主において、免疫細胞に曝露され得る、ヒドロゲルコアを形成するための二流体同軸電気噴射デバイスの模式図である。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｉ型糖尿病の処置における対照、標準カプセルおよびコア−シェルカプセルを比較したグラフである。図４Ａは、封入された５００ラット膵島当量を移植した後のＳＴＺ誘発糖尿病マウスの血糖データを示す。エラーバーは、標準誤差を表す。図４Ｂは、正常血糖のマウスの数を時間の関数として示したものである。両方のタイプのカプセルについて、８回の反復を使用した。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｉ型糖尿病の処置における対照、標準カプセルおよびコア−シェルカプセルを比較したグラフである。図４Ａは、封入された５００ラット膵島当量を移植した後のＳＴＺ誘発糖尿病マウスの血糖データを示す。エラーバーは、標準誤差を表す。図４Ｂは、正常血糖のマウスの数を時間の関数として示したものである。両方のタイプのカプセルについて、８回の反復を使用した。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、膵島細胞を含有する５００μｍヒドロゲルカプセル（図５Ａ）およびラット膵島（５００ＩＥ）を封入した１．５ｍｍアルギナートカプセル（図５Ｂ）を埋め込まれたＳＴＺ誘発Ｃ５７ＢＬ／６糖尿病マウスにおける血糖レベルを比較したグラフである。
【図６】図６は、種々のサイズの空のカプセルにおける免疫応答（マクロファージまたは好中球から構成される細胞集団のパーセント）のグラフである。３００μｍ、５００μｍ、９００μｍおよび１５００μｍのカプセルについて評定した。
【図７】図７は、ウエスタンブロットによって決定した０．３ｍｍ、０．５ｍｍ、１ｍｍおよび１．５ｍｍのカプセルに関連する平滑筋アクチンおよびβ−アクチンの正規化シグナル強度のグラフである。
【図８】図８は、カプセルの表面積（図８上部）またはカプセルの体積（図８下部）について正規化した、３００μｍ、５００μｍおよび８００μｍのカプセルについての線維形成レベルのグラフである。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、ＳＬＧ２０アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）、ポリスチレン、ガラス、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびＬＦ１０／６０アルギナート（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）から作製された５００μｍおよび１５００μｍのカプセルにおける線維形成マーカーの相対的発現のグラフである。線維形成は、ＣＤ６８（マクロファージマーカー；図９Ａ）、Ｌｙ６ｇ（好中球マーカー；図９Ｂ）、ＣＤ１１ｂ（骨髄性細胞マーカー；図９Ｃ）、およびＣｏｌ１ａ１（線維形成マーカー；図９Ｄ）を用いて測定した。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＳＬＧ２０アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）、ポリスチレン、ガラス、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびＬＦ１０／６０アルギナート（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）から作製された５００μｍおよび１５００μｍのカプセルにおける線維形成マーカーの相対的発現のグラフである。線維形成は、ＣＤ６８（マクロファージマーカー；図９Ａ）、Ｌｙ６ｇ（好中球マーカー；図９Ｂ）、ＣＤ１１ｂ（骨髄性細胞マーカー；図９Ｃ）、およびＣｏｌ１ａ１（線維形成マーカー；図９Ｄ）を用いて測定した。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、種々の材料から作製された５００μｍおよび１５００μｍのカプセルにおける免疫応答（マクロファージ（図１０Ａ）または好中球（図１０Ｂ）から構成される細胞集団のパーセント）のグラフである。カプセルは、ＳＬＧ２０アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）、ポリスチレン、ガラス、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびＬＦ１０／６０アルギナート（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）から作製された。
【図１１】図１１は、測定されたカプセル直径（μｍ）対カプセルサイズ（μｍ）の線グラフである。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、それぞれアルファ−ＳＭＡ、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ１ａ２に関する遺伝子発現対直径（ｍｍ）の線グラフである。  図１２Ｄは、球における細胞の過剰増殖内のアルファ−ＳＭＡ発現のウエスタンブロット解析の棒グラフである。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、それぞれアルファ−ＳＭＡ、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ１ａ２に関する遺伝子発現対直径（ｍｍ）の線グラフである。  図１２Ｄは、球における細胞の過剰増殖内のアルファ−ＳＭＡ発現のウエスタンブロット解析の棒グラフである。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、応答する宿主マクロファージ（Ａ）および好中球（Ｂ）についての特異的マーカーを使用したフロー（flow）解析から得た、それぞれマクロファージ細胞および好中球細胞の細胞集団の棒グラフである。中間のサイズ（０．５ｍｍ）および大きなサイズ（１．５〜２ｍｍ）バージョンのＳＬＧ２０アルギナート、ＬＦ１０／６０アルギナート（エンドトキシン含有）、ガラスおよびポリスチレンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に埋め込んでから１４日後。モック（Mock）、手術およびＰＢＳのみ注射；ＳＬＧ、ＳＬＧ２０アルギナート；ＬＦ、ＬＦ１０／６０アルギナート（エンドトキシン含有）；ＰＣＬ、ポリカプロラクトン；ＰＳ、ポリスチレン。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、種々の球に関する、それぞれＣＤ６８（マクロファージマーカー）、Ｌｙ６ｇ／Ｇｒ１（好中球マーカー）、ＣＤ１１ｂ（骨髄性細胞マーカー）およびＣｏｌ１ａ１（コラーゲンマーカー）のｑＰＣＲによって決定された相対的発現の棒グラフである。中間の（ＭＥＤ、０．４〜０．６ｍｍ）球または大きなサイズの（ＬＧ、１．５〜２．５ｍｍ）球を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込んだ。次に、埋め込み１４日後に全ての材料を回収し、異なる自然免疫および線維症マーカーのレベルを遺伝子発現によってアッセイした。ＣＤ６８、マクロファージマーカー；Ｌｙ６ｇ／Ｇｒ１、好中球マーカー；ＣＤ１１ｂ、骨髄性細胞マーカー；およびＣｏｌ１ａ１、コラーゲンマーカー。材料：ＳＬＧ２０（化学的に精製されたアルギナート）、ＬＦ１０／６０（非精製、エンドトキシン含有アルギナート）、ポリマーのポリスチレン（ＰＳ）およびＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、シリカベースのセラミックガラス、ならびにステンレス鋼（ＳＳ）。結果は、異物応答の低下におけるサイズ増加の効果が、ヒドロゲル、プラスチック、金属およびセラミックスを含む、ある範囲の材料にわたって拡大することを示す。プロットにおける注記、ＮＴ＝処置なし、およびＭＴ＝モック処置（すなわち、ＰＢＳ注射単独）。エラーバー、平均±ＳＥＭ。処置当たりＮ＝５匹のマウス。ｑＰＣＲ統計解析：ボンフェローニ多重比較補正による一元配置ＡＮＯＶＡ、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００１および＊＊＊：ｐ＜０．０００１、ＭＥＤ対ＬＧを比較。実験を２回繰り返した。
【図１４Ｃ−Ｄ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、種々の球に関する、それぞれＣＤ６８（マクロファージマーカー）、Ｌｙ６ｇ／Ｇｒ１（好中球マーカー）、ＣＤ１１ｂ（骨髄性細胞マーカー）およびＣｏｌ１ａ１（コラーゲンマーカー）のｑＰＣＲによって決定された相対的発現の棒グラフである。中間の（ＭＥＤ、０．４〜０．６ｍｍ）球または大きなサイズの（ＬＧ、１．５〜２．５ｍｍ）球を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込んだ。次に、埋め込み１４日後に全ての材料を回収し、異なる自然免疫および線維症マーカーのレベルを遺伝子発現によってアッセイした。ＣＤ６８、マクロファージマーカー；Ｌｙ６ｇ／Ｇｒ１、好中球マーカー；ＣＤ１１ｂ、骨髄性細胞マーカー；およびＣｏｌ１ａ１、コラーゲンマーカー。材料：ＳＬＧ２０（化学的に精製されたアルギナート）、ＬＦ１０／６０（非精製、エンドトキシン含有アルギナート）、ポリマーのポリスチレン（ＰＳ）およびＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、シリカベースのセラミックガラス、ならびにステンレス鋼（ＳＳ）。結果は、異物応答の低下におけるサイズ増加の効果が、ヒドロゲル、プラスチック、金属およびセラミックスを含む、ある範囲の材料にわたって拡大することを示す。プロットにおける注記、ＮＴ＝処置なし、およびＭＴ＝モック処置（すなわち、ＰＢＳ注射単独）。エラーバー、平均±ＳＥＭ。処置当たりＮ＝５匹のマウス。ｑＰＣＲ統計解析：ボンフェローニ多重比較補正による一元配置ＡＮＯＶＡ、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００１および＊＊＊：ｐ＜０．０００１、ＭＥＤ対ＬＧを比較。実験を２回繰り返した。
【図１５】図１５は、中間のサイズの球における相対的発現レベルに対し正規化されてプロットされた、中間の（０．５ｍｍ）および大きなサイズの（０．５ｍｍ）ガラスミクロスフェアにおける直接的な、線維症マーカーのα−ＳＭＡ、コラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）およびコラーゲン１ａ２（Ｃｏｌ１ａ２）の遺伝子発現の棒グラフである。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腹膜腔に埋め込まれ、２週間後（after  two  2  weeks）に回収された、ガラスミクロスフェア。エラーバー、平均±ＳＥＭ。処置当たりＮ＝３匹のラット。ｑＰＣＲ統計解析：ボンフェローニ多重比較補正による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊：ｐ＜０．００１、中間（Med）対Largeを比較。
【図１６Ａ−Ｃ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ラット膵島（５００ＩＥ）を封入する０．５ｍｍおよび１．５ｍｍアルギナートカプセルを移植されたＳＴＺ誘発Ｃ５７ＢＬ／６糖尿病マウスにおける何日にもわたる（Ａ）および何分間にもわたる血糖の線グラフである。大きな（１．５ｍｍ）ヒドロゲルアルギナートカプセルにより長期にわたる正常血糖を示すが、標準（０．５ｍｍ）カプセルでは短期の成功しか示さない血糖曲線（Ａ）。標準（０．５ｍｍ）または大きな（１．５ｍｍ）カプセルに封入されたラット膵島移植７日後の、健康なマウスおよび糖尿病マウスのｉｎ  ｖｉｖｏグルコース負荷試験（ｉｖ  ＧＴＴ）は、カプセル形状の関数として、ＢＧ補正における有意な遅延を示さない（Ｂ）。全ての実験を少なくとも２または３回行った。  図１６Ｃは、経時的に回復したマウスのパーセンテージを示すカプラン・マイヤープロットである。ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５００ＩＥの初代ラット膵島を含有する０．５ｍｍまたは１．５ｍｍカプセルのいずれかを移植した。全ての実験を少なくとも２または３回行った。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、インスリン分泌促進物質に応答した細胞内カルシウム流入を示す、経時的なＣａ２＋濃度のそれぞれ線グラフおよび棒グラフである。２０ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌ（塩化カリウム）刺激に応答した、単一のラット膵島の細胞内カルシウムの代表的トレース（Ａ）。２０ｍＭまたは２ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌに応答したカルシウム流入の平均ＡＵＣ［Ｃａ２＋］ｉ％。左から右に：裸の（naked）、ｎ＝５９；０．５ｍｍ、ｎ＝４９；１．５ｍｍ、ｎ＝４３。平均±ＳＥＭ（Ｂ）。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ〜図１８Ｄは、インスリン分泌促進物質に応答した細胞内カルシウム流入を示す、経時的なＣａ２＋濃度の線グラフ（Ａ、Ｂ）および棒グラフ（Ｃ、Ｄ）である。２０ｍＭグルコースに応答した平均インスリン分泌動態（Ａ）。３０ｍＭ  ＫＣｌ（塩化カリウム）に応答した平均インスリン分泌動態（Ｂ）。２０ｍＭグルコースに応答して分泌された平均ＡＵＣ［インスリン／１０膵島］（Ｃ）。３０ｍＭ  ＫＣｌに応答して分泌された平均ＡＵＣ［インスリン／１０膵島］。（ｎ＝３匹の群、各群５０膵島、平均±ＳＤ）（Ｄ）。
【図１８Ｃ−Ｄ】図１８Ａ〜図１８Ｄは、インスリン分泌促進物質に応答した細胞内カルシウム流入を示す、経時的なＣａ２＋濃度の線グラフ（Ａ、Ｂ）および棒グラフ（Ｃ、Ｄ）である。２０ｍＭグルコースに応答した平均インスリン分泌動態（Ａ）。３０ｍＭ  ＫＣｌ（塩化カリウム）に応答した平均インスリン分泌動態（Ｂ）。２０ｍＭグルコースに応答して分泌された平均ＡＵＣ［インスリン／１０膵島］（Ｃ）。３０ｍＭ  ＫＣｌに応答して分泌された平均ＡＵＣ［インスリン／１０膵島］。（ｎ＝３匹の群、各群５０膵島、平均±ＳＤ）（Ｄ）。
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＳＴＺ誘発Ｃ５７ＢＬ／６糖尿病マウスにおける、ラット膵島（５００ＩＥ）を封入する０．５ｍｍ（Ａ）および１．５ｍｍ（Ｂ）アルギナートカプセルの個々のＢＧ補正を示す、経時的な（数日間）血糖の線グラフである。中間の０．５ｍｍ直径カプセルによる短期の成功のみ（Ａ）、対、大きな１．５ｍｍ直径ヒドロゲルアルギナートカプセルによる長期にわたる正常血糖（Ｂ）を示す、個々の血糖曲線。ｎ＝５〜７；２回繰り返し。
【図２０Ａ−Ｃ】図２０Ａ〜図２０Ｃは、応答する宿主自然免疫骨髄性細胞（Ａ）、好中球細胞（Ｂ）およびマクロファージ細胞（Ｃ）についての特異的マーカーを使用した、直径０．５および１．５ｍｍのＳＬＧ２０アルギナートミクロスフェアに対する、埋め込まれた球における経時的な細胞のフロー解析の棒グラフである。ＦＡＣＳ解析のため、処置当たりＮ＝５匹のマウス。ＦＡＣＳ実験を２回行った。ＦＡＣＳサイズ比較を対応のない両側ｔ検定によって行った。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図２１Ａ−Ｃ】図２１Ａ〜図２１Ｆは、直径０．５（Ａ〜Ｃ）および１．５ｍｍ（Ｄ〜Ｆ）のＳＬＧ２０アルギナートミクロスフェアに関する、２を底とする対数目盛りで示す、埋め込み１、４および７日後に（それぞれＡ＆Ｄ、Ｂ＆ＥおよびＣ＆Ｆ）沈着細胞ＲＮＡ抽出物から解析された、マクロファージ表現型マーカーの発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析である。エラーバー、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；生体イメージングのため、処置当たりＮ＝３匹のマウス；ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析のため、処置当たりＮ＝４。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析を１回行った。
【図２１Ｄ−Ｆ】図２１Ａ〜図２１Ｆは、直径０．５（Ａ〜Ｃ）および１．５ｍｍ（Ｄ〜Ｆ）のＳＬＧ２０アルギナートミクロスフェアに関する、２を底とする対数目盛りで示す、埋め込み１、４および７日後に（それぞれＡ＆Ｄ、Ｂ＆ＥおよびＣ＆Ｆ）沈着細胞ＲＮＡ抽出物から解析された、マクロファージ表現型マーカーの発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析である。エラーバー、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；生体イメージングのため、処置当たりＮ＝３匹のマウス；ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析のため、処置当たりＮ＝４。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析を１回行った。
【図２２】図２２は、埋め込み１、４、７、１４および２８日後に、応答する宿主自然免疫骨髄性細胞（ａ）、好中球細胞（ｂ）およびマクロファージ細胞（ｃ）についての特異的マーカーを使用した、直径０．５および１．５ｍｍのＳＬＧ２０アルギナートミクロスフェアに対する宿主応答のフロー解析の棒グラフである。エラーバー、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。ＦＡＣＳ解析のため、処置当たりＮ＝５匹のマウス。ＦＡＣＳ実験を２回行った。ＦＡＣＳサイズ比較を対応のない両側ｔ検定によって行った。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図２３】図２３は、生体イメージングのためのマウスの調製を示す。埋め込まれた球の周りおよびその上におけるマクロファージ動員のｉｎ  ｖｉｖｏ生体蛍光イメージングのための、量子ドットを搭載したアルギナートヒドロゲル球による埋め込みのためのマウスの調製に関与するプロセスの流れ図。
【図２４Ａ−Ｃ】図２４Ａ〜図２４Ｆは、腹腔内空間の細胞における、マクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された（腹腔内洗浄された）、腹腔内空間における細胞からのマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射された）マウスから収集された腹腔内細胞に対し正規化されており、２を底とする対数目盛りで示す。処置当たりＮ＝４匹のマウス。解析の詳細については、補足的方法の記載を参照されたい。
【図２４Ｄ−Ｆ】図２４Ａ〜図２４Ｆは、腹腔内空間の細胞における、マクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された（腹腔内洗浄された）、腹腔内空間における細胞からのマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射された）マウスから収集された腹腔内細胞に対し正規化されており、２を底とする対数目盛りで示す。処置当たりＮ＝４匹のマウス。解析の詳細については、補足的方法の記載を参照されたい。
【図２５Ａ−Ｃ】図２５Ａ〜図２５Ｆは、末梢網脂肪組織の細胞における、マクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された末梢脂肪組織における細胞からのマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射された）マウスから収集された脂肪組織に対し正規化されており、２を底とする対数目盛りで示す。処置当たりＮ＝４匹のマウス。
【図２５Ｄ−Ｆ】図２５Ａ〜図２５Ｆは、末梢網脂肪組織の細胞における、マクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された末梢脂肪組織における細胞からのマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射された）マウスから収集された脂肪組織に対し正規化されており、２を底とする対数目盛りで示す。処置当たりＮ＝４匹のマウス。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「ヒドロゲル」は、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋し、水分子を捕捉してゲルを形成する３次元開放格子構造を作り出すときに形成される物質を指す。生体適合性ヒドロゲルは、生細胞に対して毒性がなく、かつ捕捉された細胞への、生存能力を維持するための酸素および栄養素の十分な拡散を可能にするゲルを形成するポリマーを指す。
【００３８】
「アルギナート」は、任意のＭ／Ｇ比のβ−Ｄ−マンヌロン酸（β-D-mannuronate）およびα−Ｌ−グルロン酸（α-L-guluronate）から形成された直鎖多糖ならびにそれらの塩および誘導体を指すのに使用される総称である。用語「アルギナート」は、本明細書で使用する場合、以下に示す構造を有する任意のポリマーおよびその塩を包含する。
【化１】
2018521717.tif 000002
【００３９】
「生体適合性」は、受容者に対し一般的に非毒性であり、対象に対しいかなる重大な有害効果も引き起こさない、材料およびその任意の代謝生成物または分解生成物を一般的に指す。
【００４０】
「生分解性」は、生理的条件下で加水分解または酵素作用によって、対象により代謝、排出または排泄することが可能な小さい単位または化学種へと分解または腐食する材料を一般的に指す。分解時間は、ポリマーの組成および形態と相関関係にある。
【００４１】
「薬物搭載粒子」は、そこへ溶解、分散、捕捉、封入または結合された薬物を有するポリマー粒子を指す。
【００４２】
「ミクロ粒子」および「ナノ粒子」は、それぞれ、そこへ溶解、分散、捕捉、封入または結合された薬物を任意選択で含有する、ミクロスケールおよびナノスケールのサイズのポリマー粒子を指す。
【００４３】
「抗炎症薬」は、組織における炎症を直接的にまたは間接的に低減する薬物を指す。この用語は、限定されるものではないが、免疫を抑制する薬物を含む。この用語は、リンパ球の増殖を阻害する薬物など、抗増殖免疫抑制薬を含む。
【００４４】
「免疫抑制薬」は、対象内での異物への免疫応答を阻害するまたは防止する薬物を指す。免疫抑制薬は、Ｔ細胞の活性化を阻害すること、増殖を妨害すること、または炎症を抑制することによって、一般的に作用する。免疫抑制が起きている人は、免疫不全であると言われる。
【００４５】
「哺乳動物細胞」は、同じまたは異なる対象への移植に適した哺乳動物対象に由来する任意の細胞を指す。細胞は、異種、自家性または同種異系であってよい。細胞は、哺乳動物対象から直接得られる１次細胞であり得る。細胞は、対象から得た細胞の培養および増大に由来する細胞であってもよい。例えば、細胞は、幹細胞であってよい。不死化細胞もまた、この定義に含まれる。一部の実施形態において、細胞は、組み換えタンパク質および／または核酸を発現するように遺伝子操作されたものである。
【００４６】
「自家性」は、同一個体から取られて移植された生物学的物質を指す。
【００４７】
「同種異系」は、同一種の異なる個体から取られて移植された生物学的物質を指す。
【００４８】
「異種」は、異なる種から取られて移植された生物学的物質を指す。
【００４９】
「膵島細胞」は、哺乳動物の膵臓に由来する内分泌細胞を指す。膵島細胞は、グルカゴンを分泌するアルファ細胞、インスリンおよびアミリンを分泌するベータ細胞、ソマトスタチンを分泌するデルタ細胞、膵臓ポリペプチドを分泌するＰＰ細胞、またはグレリンを分泌するイプシロン細胞を含む。この用語は、これらの細胞の均一な集団および不均一な集団を含む。好ましい実施形態において、膵島細胞の集団は、少なくともベータ細胞を含有する。
【００５０】
「移植」は、細胞、組織または臓器を、対象へ別の供給源から移植することを指す。この用語は、特定の様式の移植に限定されるものではない。封入された細胞は、注入または外科的な埋め込みなどの任意の適切な方法によって移植されてよい。
【００５１】
「球様形状」は、球を概ね形成する表面を有する物体を指す。完全なまたは模範的な球形状以外に、球様形状は、波および起伏を有し得る。一般的に、球様形状は、準主軸が互いに１０％以内である楕円体（その平均された表面について）である。球様形状の直径は、平均直径、例えば準主軸の平均である。
【００５２】
「回転楕円体様形状」は、回転楕円体を概ね形成する表面を有する物体を指す。完全なまたは模範的な球、扁平回転楕円体または扁長回転楕円体形状以外に、回転楕円体様形状は、波および起伏を有し得る。一般的に、回転楕円体様形状は、準主軸が互いに１００％以内である楕円体（その平均された表面について）である。回転楕円体様形状の直径は、平均直径、例えば準主軸の平均である。
【００５３】
「平面」は、曲率が０の表面が５％超である連続エリアを指す。
【００５４】
「鋭角」は、表面に対する正接が、表面の円周の２％またはそれ未満の距離にわたって１０％超変化する表面上の場所を指す。表面内の端、角、溝および峰は、全て鋭角の形態である。
【００５５】
ＩＩ．生体医療デバイスおよびカプセル
Ａ．線維形成が低減された生体医療デバイス
対象への埋め込みのための生体医療デバイスを開示する。デバイスは、生体適合性ポリマー、生分解性および非生分解性ポリマー、半導体材料、セラミックスならびにガラスなどの生体適合性材料から形成される。線維形成を低減または防止するため、デバイスは、一組の特徴のうちの一部または全部を含むべきである。
【００５６】
（１）サイズ：デバイスは、最小直径１ｍｍ（好ましくは１．５ｍｍ）を有するべきである。直径は、８から１０ｍｍまで増加し得る。
【００５７】
（２）形状：デバイス全体は、球、球様、回転楕円体または回転楕円体様であるべきである。デバイスの表面上の任意の点における曲率は、０．２以上２以下であるべきである。デバイスの表面の曲率を計算する目的において、表面孔は無視される。
【００５８】
（３）疎水性：デバイスの表面は、中性またはより好水性（親水性）のいずれかであるべきであり、テフロン（登録商標）のように疎水性の化学的性質を有するべきではない。
【００５９】
（４）表面孔サイズ：デバイスの表面上の孔は、０ｎｍ超であるべきであるが、１０μｍを超えるべきではない。
【００６０】
（５）表面トポグラフィー：デバイスは、いかなる平面、鋭角、溝または峰も有するべきではない。
【００６１】
これらの特徴は埋め込まれたデバイスの線維形成へ影響するということが発見された。はじめの２つの特徴と他の特徴のうちの少なくとも１つとを有するデバイスは、低減された線維形成を呈することが分かった。これらの特徴のいずれか１つまたは組合せを有するデバイスを作製することができる。これらの特徴の全てを有するデバイスが好ましい。一般的に、開示されるデバイスは、これらの特徴のいずれか１つまたは複数を有する同じデバイスより、埋め込み後の線維化反応の誘発が少なくなる。一部の実施形態において、デバイスは、はじめの２つの特徴と他の特徴のうちの少なくとも１つとを有する同じデバイスより、埋め込み後の線維化反応の誘発が少なくなる。一部の実施形態において、デバイスは、全ての特徴を有する同じデバイスより、埋め込み後の線維化反応の誘発が少なくなる。一部の実施形態において、生体医療デバイスは、本明細書に記載するカプセルまたはヒドロゲルカプセルである。本明細書におけるカプセルまたはヒドロゲルカプセルへの言及は、言及されるカプセルと同じ説明の生体医療デバイスへの言及も意図している。
【００６２】
開示されるデバイスは、既存のデバイスおよび材料を超える利点および改良点を有する。例えば、円柱などの平らな表面（曲率ゼロ）を有する物体は、たとえ全体のサイズが大きい（１ｍｍを超える）場合でも線維化するということが発見された。これとは対極的に、高い曲率（したがって、とても直径が小さい、すなわち１ｍｍ未満である）を有する物体は、他の埋め込み材料および／または周辺組織と共に高充填密度が可能であり、このことは、免疫細胞の付着および線維性沈着を容易にする。特色の特定の組合せは、一緒になって、ヒドロゲル（化学的に精製されたアルギナートおよびエンドトキシン含有食品グレードアルギナートの両方）、半導体材料（ガラスのような二酸化ケイ素系セラミックスなど）、ならびに分解性および非分解性ポリマーおよびプラスチック（ＰＣＬおよびポリスチレンなど）を含めた多くの種別の材料の線維形成を低減または防止することが確立された。したがって、開示されるデバイスは、これらおよび多様な他の材料から作製することができる。
【００６３】
特定した特徴を有するヒドロゲルアルギナートの球が産生され、ヒドロゲルアルギナートの球は、線維形成を防止し、かつ、疾患（１型糖尿病）の処置について、移植された様々な起源の哺乳動物細胞（すなわち、ラット、マウス、ブタ、ヒト）の長期生存能力および機能性を確実にすることが実証された。任意選択で、デバイスのシェルは、１種または複数種の治療剤（抗炎症剤など）または診断剤（酸素検知もしくは撮像化学物質など）も含有してもよい。
【００６４】
生体医療デバイスは、例えば、長期埋め込み可能なセンサーおよびアクチュエーター、制御された薬物放出デバイス、プロステーシスおよび組織再生生体材料、ならびに埋め込みおよび移植に関する技術を含めた、任意の生体医療用途に使用することができる。多くの生体医療デバイスおよび目的が公知であり、開示されるデバイスは、そのような目的に適合させることができる。
【００６５】
一実施形態は、生体医療デバイスの調製物、例えばヒドロゲルカプセルの調製物であって、調製物のデバイスの少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９８％が、球様形状または回転楕円体様形状を有し、少なくともＸ  ｍｍであるがＹ  ｍｍ以下の直径を有し、但しＹはＸより大きく、Ｘ＝１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０であり、Ｙ＝２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０であり、ａ）調製物のデバイスの１、２、３、４、５、１０、１５または２０％以下が、球様形状または回転楕円体様形状以外を有し、ｂ）調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞／デバイスを含み、ｃ）調製物の球様形状または回転楕円体様形状のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％が、1個の生細胞もしくは複数の生細胞、または少なくとも１０００、２０００もしくは５０００個の生細胞を含み、ｄ）調製物のデバイスの１、２、３、４、５、１０、１５または２０％以下が、エッジを有し、
ｅ）調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布し、ｆ）調製物の球様形状または回転楕円体様形状のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布し、ｇ）調製物のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布しておらず、ｈ）調製物の球様形状または回転楕円体様形状のデバイスの少なくとも５０、６０、７０、８０または９０％中の細胞が、デバイス全体にわたって本質的に均一に分布していない、調製物を提供する。
【００６６】
Ｂ．線維形成が低減された、封入された細胞
哺乳動物細胞を対象へ移植するためのカプセルを開示する。カプセルは、移植される細胞を封入した、ヒドロゲル形成性の生体適合性ポリマーから形成される。カプセル様の過剰増殖（線維形成）を阻害するため、細胞材料がカプセル表面上に位置することを、カプセルの構造によって防止する。加えて、細胞に適切な気体交換が起こること、およびそこに封入されている細胞によって栄養素が受け取られることが、カプセルの構造によって確実になる。任意選択で、カプセルは、制御放出のためにその中に封入された１種または複数種の抗炎症薬も含有する。
【００６７】
Ｃ．生体適合性ポリマー
開示される組成物は、移植される細胞を封入した、ヒドロゲル形成性の生体適合性ポリマーから形成される。適したヒドロゲルを形成するのに使用することができる材料の例には、アルギナートなどの多糖、コラーゲン、キトサン、硫酸セルロースナトリウム、ゼラチンおよびアガロース、水溶性ポリアクリレート、ポリホスファジン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ならびにそれぞれのコポリマーおよびブレンドが含まれる。例えば、米国特許第５，７０９，８５４号、同６，１２９，７６１号および同６，８５８，２２９号を参照されたい。
【００６８】
一般的に、荷電側基またはその一価イオン塩を有するこれらのポリマーは、水、緩衝塩溶液またはアルコール水溶液などの水溶液中に、少なくとも部分的に可溶である。カチオンと反応することができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ビニルアセテート）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーも使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基およびスルホン酸基である。
【００６９】
アニオンと反応することができる塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、および一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまたは第四級塩も、主鎖の窒素またはペンダントイミノ基から形成することができる。塩基性側基の例は、アミノ基およびイミノ基である。
【００７０】
ヒドロゲル形成性の生体適合性ポリマーは、好ましくは水溶性ゲル化剤である。好ましい実施形態において、水溶性ゲル化剤は、多糖ガム、より好ましくはポリアニオン性ポリマーである。
【００７１】
細胞は、ヒドロゲル層（例えばコア）を提供するアルギナートなどのアニオン性ポリマーを使用して封入されることが好ましく、ここでは、ヒドロゲル層は、引き続いてポリカチオン性ポリマー（例えば、ポリリシンなどのアミノ酸ポリマー）で架橋されて、シェルを形成する。例えば、Goosenらに対する米国特許第４，８０６，３５５号、同４，６８９，２９３号および同４，６７３，５６６号；Limらに対する米国特許第４，４０９，３３１号、同４，４０７，９５７号、同４，３９１，９０９号および同４，３５２，８８３号；Rhaらに対する米国特許第４，７４９，６２０号および同４，７４４，９３３号；ならびにWangらに対する米国特許第５，４２７，９３５号を参照されたい。アルギナートなどのヒドロゲル形成性ポリマーを架橋するために使用してもよいアミノ酸ポリマーには、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルチニンならびにそれらのコポリマーおよびブレンドなどのカチオン性ポリ（アミノ酸）が含まれる。
【００７２】
１．多糖
細胞の封入に関し、いくつかの哺乳動物性および非哺乳動物性多糖について調査した。細胞の封入に適した例示的な多糖には、アルギナート、キトサン、ヒアルロナン（ＨＡ）およびコンドロイチン硫酸が含まれる。アルギナートおよびキトサンは、ある特定の溶液条件下で架橋ヒドロゲルを形成するのに対し、ＨＡおよびコンドロイチン硫酸は、ヒドロゲルを形成するための架橋性基を含有するように好ましくは修飾される。
【００７３】
好ましい実施形態において、細胞を封入するヒドロゲル形成性の生体適合性ポリマーは、アルギナートである。アルギナートは、主として褐藻に由来し、乾燥重量にておよそ２０％から４０％で細胞外および細胞内に存在する、非分岐アニオン性多糖のファミリーである。１，４−結合したα−１−グルロン酸（Ｇ）およびβ−ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）が、ホモポリマーブロック構造（ＧＧＧブロックおよびＭＭＭブロック）またはヘテロポリマーブロック構造（ＭＧＭブロック）で配列する。褐藻の細胞壁は、主な構成成分として１−フコース四硫酸ブロックを有する分岐多糖硫酸エステルであるフコイダンも５％から２０％含有する。市販のアルギナートは、海岸で洗われた藻類から抽出されることが多く、それらの特性は、収集および抽出プロセスに依存する。
【００７４】
アルギナートは、二価カチオンの存在下で、イオン架橋を介してゲルを形成する。ヒドロゲルの特性は、アルギナート前駆体における変化を通じてある程度制御することができる（分子量、組成およびマクロマー濃度）が、アルギナートは分解せず、むしろ、二価カチオンが一価イオンによって置き換えられると溶解する。加えて、アルギナートは、細胞の相互作用を促進しない。
【００７５】
特に好ましい組成物は、ポリリシンシェルを有するアルギナートのコア中に固定された細胞を含有するカプセルまたはミクロカプセルである。好ましいカプセルまたはミクロカプセルは、追加の外部アルギナート層（例えば包膜）を含有して、アルギナート／ポリリシン−アルギナート／アルギナート−細胞の多層カプセルまたはミクロカプセルを形成してもよい。ポリリシンで架橋されたアルギナートヒドロゲルの説明については、Limらに対する米国特許第４，３９１，９０９号を参照されたい。ポリリシンに代えて架橋剤として使用するのに適した他のカチオン性ポリマーには、ポリ（βアミノアルコール）（ＰＢＡＡ）が含まれる（Ma  Mら、Adv.  Mater.、２３巻：Ｈ１８９−９４（２０１１年））。
【００７６】
キトサンは、天然の非哺乳動物性多糖であるキチンの部分脱アセチル化によって作製され、キチンは哺乳動物性多糖に近い類似性を呈し、このことが、キトサンを細胞封入にとって魅力的なものにしている。キトサンは、主にリゾチームによって、アセチル化残基の加水分解を通じて分解される。脱アセチル化度が高いと、分解時間が遅くなるが、疎水性が増すことにより細胞接着がより良好になる。希釈酸条件下（ｐＨ＜６）では、キトサンはプラスに荷電し水溶性であるのに対し、生理学的なｐＨでは、キトサンは中性で疎水性であり、このことは、物理的に架橋した固体のヒドロゲルの形成につながる。ポリオール塩の添加によって、中性ｐＨでの細胞の封入が可能となり、ここでは、ゲル化は温度依存性になる。
【００７７】
キトサンは、修飾され得る多くのアミン基およびヒドロキシ基を有する。例えば、キトサンは、架橋性マクロマーを作り出すためにメタクリル酸をグラフトし、同時に生理学的なｐＨにおける水溶性を高めるために乳酸もグラフトすることによって、修飾されてきた。この架橋したキトサンヒドロゲルは、リゾチームおよび軟骨細胞の存在下で分解する。光重合性キトサンマクロマーは、光反応性アジド安息香酸基でキトサンを修飾することによって合成することができる。開始剤の不存在下でＵＶへ曝露すると、反応性ニトレン基が形成され、これは互いにまたはキトサン上の他のアミン基と反応して、アゾ架橋を形成する。
【００７８】
ヒアルロナン（ＨＡ）は、体中の多くの組織中に存在するグリコサミノグリカンであり、胚発生、傷の治癒および血管新生において重要な役割を果たす。加えて、ＨＡは、細胞表面のレセプターを介して細胞と相互作用して、細胞内シグナル経路に影響する。これらの性質が一緒になって、ＨＡを、組織工学の足場にとって魅力的なものにしている。ＨＡは、細胞封入のために、メタクリレートおよびチオールなどの架橋性部分で修飾され得る。架橋ＨＡゲルは、ＨＡを様々な分子量のオリゴ糖断片に分けるヒアルロニダーゼによって依然として分解されやすいままである。細胞は、ゲル構造がマクロマー濃度およびマクロマー分子量によって制御された、光重合したＨＡヒドロゲル中に封入することができる。加えて、光重合したＨＡおよびデキストランヒドロゲルは、未分化ヒト胚性幹細胞の長期培養を維持する。ＨＡヒドロゲルは、アクリル化ＨＡをＰＥＧテトラチオールと反応させること、またはチオール修飾ＨＡをＰＥＧジアクリレートと反応させることのいずれかのマイケル型付加反応メカニズムを通じて製作された。
【００７９】
コンドロイチン硫酸は、皮膚、軟骨、腱および心臓弁を含めた多くの組織において見出だされる構造プロテオグリカンの多くのパーセンテージを占め、このことは、コンドロイチン硫酸を、一連の組織工学用途にとって魅力的なバイオポリマーにしている。光架橋コンドロイチン硫酸ヒドロゲルは、コンドロイチン硫酸をメタクリレート基で修飾することによって調製することができる。ヒドロゲルの特性は、メタクリレート置換度および重合前の溶液中のマクロマー濃度によって容易に制御された。さらに、マイナスに荷電したポリマーは、ゲルがその機械的特性を犠牲にすることなくより多くの水を吸収することを可能にする、増加した膨潤圧を生み出す。コンドロイチン硫酸とＰＥＧまたはＰＶＡなどの不活性ポリマーとのコポリマーヒドロゲルも使用してもよい。
【００８０】
２．合成ポリマー
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、細胞封入のためのマクロマーを作り出すために最も広く使用されてきた合成ポリマーである。いくつかの研究では、様々な細胞を封入するために、ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートが使用されてきた。生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、架橋を可能にするため（メタ）アクリレート官能基で末端封鎖されたポリ（α−ヒドロキシエステル）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（α−ヒドロキシエステル）のトリブロックコポリマーから調製することができる。ＰＬＡおよびポリ（８−カプロラクトン）（ＰＣＬ）は、細胞封入のための生分解性ＰＥＧマクロマーを作り出す際に、最も一般的に使用されてきたポリ（α−ヒドロキシエステル）である。分解プロファイルおよび速度は、分解性ブロックの長さおよび化学的性質を通じて制御される。エステル結合は、分解を加速する、血清中に存在するエステラーゼによって分解される場合もある。生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、ＰＥＧ−ビス−［２−アクリロイルオキシプロパノエート］の前駆体から製作することもできる。直鎖ＰＥＧマクロマーの代替として、ＰＥＧ１分子当たり複数の反応性ビニル基を含有するポリ（グリセロール−コハク酸）−ＰＥＧのＰＥＧ系デンドリマーを使用することができる。これらの材料の魅力的な特色は、分岐度を制御する能力であり、これは、ヒドロゲルの全体的な構造特性およびその分解へ結果として影響する。分解は、デンドリマー主鎖中に存在するエステル結合を通じて起こる。
【００８１】
ヒドロゲル形成性の生体適合性ポリマーは、ポリホスホエステルまたはポリホスフェートを含有することができ、ここで、ホスホエステル結合は、結果としてホスフェートを放出する加水分解を起こしやすい。例えば、ホスホエステルは、架橋性ＰＥＧマクロマーの主鎖ポリ（エチレングリコール）−ジ−［エチルホスファチジル（エチレングリコール）メタクリレート］（ＰｈｏｓＰＥＧ−ｄＭＡ）へ組み込まれて、生分解性ヒドロゲルを形成することができる。骨細胞によって合成されるＥＣＭ構成成分であるアルカリホスファターゼを添加すると、分解が強まる。分解生成物であるリン酸は、媒体中でカルシウムイオンと反応して、ヒドロゲル内での自己石灰化を誘発する不溶性リン酸カルシウムを生成する。ポリホスホエステルであるポリ（６−アミノエチルプロピレンホスフェート）は、メタクリレートで修飾して、マルチビニルマクロマーを作り出すことができ、ここで、分解速度は、ポリホスホエステルポリマーの誘導体化度によって制御された。
【００８２】
ポリホスファゼンは、交互になった単結合および二重結合によって分けられた窒素およびリン（phosphorous）からなる主鎖を有するポリマーである。それぞれのリン原子は、２つの側鎖へ共有結合している。架橋に適したポリホスファゼンは、酸性であり二または三価カチオンと塩橋を形成することができる、大部分の側鎖基を有する。好ましい酸性側基の例は、カルボン酸基およびスルホン酸基である。加水分解に安定なポリホスファゼンは、Ｃａ２＋またはＡｌ３＋などの二価または三価カチオンによって架橋するカルボン酸側基を有するモノマーから形成される。加水分解によって分解するポリマーは、イミダゾール、アミノ酸エステルまたはグリセロール側基を有するモノマーを組み込むことによって合成することができる。生体侵食性ポリホスファゼン（polyphosphazine）は、多価カチオンと塩橋を形成することができる酸性側基、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で加水分解する側基、例えば、イミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロールおよびグリコシルという、少なくとも２つの異なるタイプの側鎖を有する。側鎖の加水分解は、ポリマーの侵食という結果をもたらす。加水分解性側鎖の例は、基がアミノ結合を介してリン原子へ結合している、未置換または置換イミダゾール（imidizole）、およびアミノ酸エステルである（両方のＲ基がこの様式で結合したポリホスファゼンポリマーは、ポリアミノホスファゼンとして公知である）。ポリイミダゾールホスファゼンについては、ポリホスファゼン主鎖上の「Ｒ」基のいくつかは、環窒素原子を介して主鎖中のリンに結合したイミダゾール環である。
【００８３】
Ｄ．薬物とヒドロゲル形成性ポリマーとのコンジュゲート
一部の実施形態において、１種または複数種の抗炎症薬が、ヒドロゲル形成性ポリマーに共有結合する。これらの場合、抗炎症薬は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されるように設計された結合部分を介してヒドロゲル形成性ポリマーに結合する。結合部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗炎症薬の持続放出をもたらすように、加水分解的、酵素的またはそれらの組合せで切断されるように設計され得る。結合部分の組成および抗炎症剤へのその結合点の両方は、結合部分の切断によって抗炎症剤または適したそのプロドラッグのいずれかが放出されるように選択される。結合部分の組成も、抗炎症剤の所望の放出速度の観点から選択することができる。
【００８４】
結合部分は、１つまたは複数の有機官能基を一般的に含む。適した有機官能基の例には、第２級アミド（−ＣＯＮＨ−）、第３級アミド（−ＣＯＮＲ−）、第２級カルバメート（−ＯＣＯＮＨ−；−ＮＨＣＯＯ−）、第３級カルバメート（−ＯＣＯＮＲ−；−ＮＲＣＯＯ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−；−ＮＲＣＯＮＨ−；−ＮＨＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯＮＲ−）、カルビノール（−ＣＨＯＨ−、−ＣＲＯＨ−）、ジスルフィド基、ヒドラゾン、ヒドラジド、エーテル（−Ｏ−）およびエステル（−ＣＯＯ−、−ＣＨ２Ｏ２Ｃ−、ＣＨＲＯ２Ｃ−）が含まれ、式中、Ｒは、アルキル基、アリール基またはヘテロ環基である。一般的に、結合部分内の１つまたは複数の有機官能基の実体は、抗炎症剤の所望の放出速度の観点から選択することができる。加えて、１つまたは複数の有機官能基は、ヒドロゲル形成性ポリマーへの抗炎症剤の共有結合を容易にするように選択することができる。好ましい実施形態において、結合部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単純な加水分解によって切断されて抗炎症剤を放出することができる、１つまたは複数のエステル結合を含有する。
【００８５】
ある特定の実施形態において、結合部分は、上に記載した１つまたは複数の有機官能基を、スペーサー基と組み合わせて含む。スペーサー基は、オリゴマー鎖およびポリマー鎖を含めた、原子の任意の集まりから構成することができるが、スペーサー基中の原子の総数は、好ましくは３から２００原子の間、より好ましくは３から１５０原子の間、より好ましくは３から１００原子の間、最も好ましくは３から５０原子の間である。適したスペーサー基の例には、アルキル基、ヘテロアルキル基、アルキルアリール基、オリゴおよびポリエチレングリコール鎖、ならびにオリゴおよびポリ（アミノ酸）鎖が含まれる。スペーサー基の変動は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症剤の放出に対する追加的な制御をもたらす。結合部分がスペーサー基を含む実施形態において、１つまたは複数の有機官能基は、スペーサー基を抗炎症剤およびヒドロゲル形成性ポリマーの両方につなげるために一般的に使用される。
【００８６】
ある特定の実施形態において、１種または複数種の抗炎症剤は、アルキル基、エステル基およびヒドラジド基を含有する結合部分を介して、ヒドロゲル形成性ポリマーへ共有結合する。例えば、抗炎症剤デキサメタゾンのアルギナートへのコンジュゲートは、アルキル基と、アルキル基を抗炎症剤へつなげるエステル基と、アルキル基をアルギナート上に位置するカルボン酸基へつなげるヒドラジド基とを含有する結合部分を介してなすことができる。この実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏでのエステル基の加水分解は、長期間にわたって低用量でデキサメタゾンを放出する。
【００８７】
抗炎症剤をヒドロゲル形成性ポリマーへ共有結合するのに有用な反応および方策は、当技術分野において公知である。例えば、March、「Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、２００１年、Wiley-Interscience  Publication、ニューヨーク、およびHermanson、「Bioconjugate  Techniques」、１９９６年、Elsevier  Academic  Press、米国を参照されたい。所与の抗炎症剤の共有結合の適切な方法は、所望の結合部分ならびに抗炎症剤およびヒドロゲル形成性ポリマー全体の構造の観点から選択することができ、なぜならば、それは、官能基の適合性、保護基の方策および不安定な結合の存在に関係するからである。
【００８８】
Ｅ．抗炎症薬および抗増殖薬
開示する組成物において使用するのに適した薬物について説明する。薬物は、開示する方法を使用して特定することができる。代表的な薬物には、グルココルチコイド、フェノール系酸化防止剤、抗増殖薬またはそれらの組合せが含まれる。本明細書において、別段断らない限り、これらをまとめて「抗炎症薬」という。
【００８９】
非限定的な例には、ステロイド系抗炎症剤が含まれる。特に好ましいステロイド系抗炎症薬には、デキサメタゾン、５−ＦＵ、ダウノマイシンおよびマイトマイシンが含まれる。抗血管新生薬または抗増殖薬も有用である。例には、モノエステルおよびテトラヒドロクルクミンを含めたクルクミン、ならびにシロリムス（ラパマイシン）、シクロスポリン、タクロリムス、ドキソルビシン、ミコフェノール酸およびパクリタキセルならびにそれらの誘導体などの薬物が含まれる。一部の実施形態において、抗炎症薬は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムスおよびエベロリムス）である。新規な抗増殖薬は、４２−Ｏ位の水素原子をアルコキシ−アルキル基で置き換えた高親油性の半合成シロリムスアナログであるバイオリムスＡ９である。リソフィリンは、抗炎症特性を有する合成小分子である。一部の実施形態において、抗炎症薬は、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、ピメクロリムスおよびタクロリムス）である。
【００９０】
一部の実施形態において、抗炎症薬は、合成または天然の抗炎症性タンパク質である。免疫抑制療法には、選択する免疫構成成分に特異的な抗体を加えることができる。一部の実施形態において、抗炎症薬は、抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリンもしくは抗リンパ球グロブリン）、抗ＩＬ−２Ｒαレセプター抗体（例えば、バシリキシマブもしくはダクリズマブ）または抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ）である。
【００９１】
好ましい実施形態において、１種または複数種の抗炎症薬は、組成物の線維形成を阻害するのに有効な量で哺乳動物対象に投与された後に、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、より好ましくは少なくとも９０日間にわたって、カプセルから放出される。一部の実施形態において、抗炎症薬は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１４日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、全身的な免疫抑制なしで、対象中で空間的に局部化された炎症阻害をもたらす。一部の実施形態において、空間的に局部化された炎症は、対象における注入部位でカテプシン活性を測定することによって、検出される。他の実施形態において、空間的に局部化された炎症は、対象における注入部位で反応性酸素種（ＲＯＳ）を測定することによって、検出される。一部の実施形態において、全身的な免疫抑制は、対象における対照部位、例えば、薬物なしのポリマー粒子またはヒドロゲルを注入した部位において、カテプシン活性またはＲＯＳがないということを測定することによって、検出される。開示する組成物中で使用する抗炎症薬の特定、選択および最適化の方法について、以下に説明する。
【００９２】
放出速度および量は、ポリマー粒子の薬物搭載を加減することによって、ある程度選択することができる。本明細書に開示するように、高い薬物搭載は、顕著な初期バースト放出を引き起こし得る。これは、空間的に局部化された炎症阻害よりむしろ全身的な免疫抑制という結果にもなり得る。これとは対照的に、薬物搭載レベルが低すぎると、治療有効量の抗炎症薬が放出されない。
【００９３】
最適な薬物搭載は、薬物、ポリマー、ヒドロゲル、細胞および埋め込み部位の選択を含めた多くの因子に必然的に依存する。一部の実施形態において、１種または複数種の抗炎症薬は、約０．０１重量％から約１５重量％、好ましくは約０．１重量％から約５重量％、より好ましくは約１重量％から約３重量％の濃度で、ポリマー粒子に搭載される。一部の実施形態において、１種または複数種の抗炎症薬は、０．０１から１０．０ｍｇ／ｍｌヒドロゲル、好ましくは０．１から４．０ｍｇ／ｍｌヒドロゲル、より好ましくは０．３から２．０ｍｇ／ｍｌヒドロゲルの濃度で、ヒドロゲル中に封入される。しかしながら、任意の所与の薬物、ポリマー、ヒドロゲル、細胞および移植部位に最適な薬物搭載は、本明細書に記載されるものなどの常法によって特定され得る。
【００９４】
Ｆ．薬物送達のための生分解性ポリマー
抗炎症薬を含有する薬物搭載粒子は、薬物送達に適した生体適合性の生分解性ポリマーから好ましくは形成される。一般的に合成ポリマーが好ましいが、天然ポリマー、とりわけ、一部のポリヒドロキシアルカノエートなど、加水分解によって分解する天然のバイオポリマーの一部も使用することができ、同等のまたはより良好な特性を有することがある。
【００９５】
代表的な合成ポリマーには、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）などのポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンオキサイド）などのポリアルキレンオキサイド、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリ塩化ビニルなどのポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリスチレン、ポリウレタン、ならびにこれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテートおよびセルロース硫酸ナトリウム塩などの誘導体化セルロース（本明細書において、まとめて「合成セルロース」という）、エステル、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含めた、アクリル酸、メタクリル酸のポリマーまたはそれらのコポリマーもしくは誘導体（本明細書において、まとめて「ポリアクリル酸」という）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、それらのコポリマーおよびブレンドが含まれる。本明細書において使用する場合、「誘導体」には、置換、化学基の付加および当業者によって慣例的になされる他の修飾を有するポリマーが含まれる。
【００９６】
好ましい生分解性ポリマーの例には、乳酸およびグリコール酸などのヒドロキシ酸のポリマーおよびＰＥＧとのコポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、それらのブレンドおよびコポリマーが含まれる。
【００９７】
好ましい天然ポリマーの例には、アルブミン、コラーゲン、ゼラチンおよびプロラミン（例えばゼイン）などのタンパク質、ならびにアルギナートなどの多糖、セルロース誘導体およびポリヒドロキシアルカノエート（例えばポリヒドロキシブチレート）が含まれる。粒子およびミクロ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性は、ＰＥＧと共重合したポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）などのポリマーを使用することによって、製造中に調整することができる。
【００９８】
最も好ましい実施形態において、生分解性ポリマーとしてＰＬＧＡが使用される。ＰＬＧＡ粒子およびミクロ粒子は、封入または結合される分子を数日から数週間の期間にわたって放出するように設計される。放出期間に影響する因子には、周囲の媒体のｐＨ（ｐＨ５およびそれ未満では、ＰＬＧＡの酸触媒加水分解のため、放出速度が速い）、およびポリマー組成が含まれる。脂肪族ポリエステルは、疎水性が異なり、それが今度は分解速度に影響する。例えば、疎水性のポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、より親水性のポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、およびそれらのコポリマーであるポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）は、様々な放出速度を有する。これらのポリマーの分解速度は、また対応する薬物放出速度もしばしば、数日（ＰＧＡ）から数ヶ月（ＰＬＡ）まで変動することがあり、ＰＬＡとＰＧＡとの比を変動させることによって容易に操作される。
【００９９】
薬物搭載粒子の直径および多孔度は、送達される薬物ならびに所望の投与量および放出速度に基づいて最適化することができる。好ましい実施形態において、薬物搭載粒子は、ミクロ粒子またはナノ粒子である。より好ましい実施形態において、薬物搭載粒子は粒子である。粒子の平均直径は、必要とされる個々の薬物、投薬量および放出速度に基づいて、選択および最適化してもよい。好ましい実施形態において、薬物搭載ポリマー粒子は、約１μｍから約１００μｍ、好ましくは約１μｍから約５０μｍ、より好ましくは約１μｍから約１０μｍの平均直径を有するミクロ粒子である。他の実施形態において、薬物搭載ポリマー粒子は、少なくとも約５０ｎｍ、好ましくは少なくとも約１００ｎｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｎｍを含め、約１０ｎｍから約９９９ｎｍの平均直径を有するナノ粒子である。より好ましい実施形態において、薬物搭載ポリマー粒子は、１ｍｍ超、好ましくは１．５ｍｍまたはそれ超の平均直径を有する。一部の実施形態において、薬物搭載ポリマー粒子は、直径８ｍｍの大きさであり得る。
【０１００】
Ｇ．カプセル
カプセルは、２または３層カプセルである。好ましくは、カプセルは、１ｍｍ超、好ましくは１．５ｍｍまたはそれ超の平均直径を有する。一部の実施形態において、カプセルは、直径８ｍｍの大きさであり得る。例えば、カプセルは、１ｍｍから８ｍｍ、１ｍｍから６ｍｍ、１ｍｍから５ｍｍ、１ｍｍから４ｍｍ、１ｍｍから３ｍｍ、１ｍｍから２ｍｍ、１ｍｍから１．５ｍｍ、１．５ｍｍから８ｍｍ、１．５ｍｍから６ｍｍ、１．５ｍｍから５ｍｍ、１．５ｍｍから４ｍｍ、１．５ｍｍから３ｍｍ、または１．５ｍｍから２ｍｍのサイズ範囲であり得る。
【０１０１】
細胞の生存能力のために必要な分子がカプセルへ入る速度、ならびに治療用生成物および廃棄物がカプセル膜から出る速度は、マクロカプセルの透過性をモジュレートすることによって選択される。マクロカプセルの透過性は、免疫細胞、抗体およびサイトカインがカプセルまたはミクロカプセル中へ入ることを制限するためにも改変される。
【０１０２】
異なるタイプの細胞は異なる代謝要件を有するため、膜の透過性は、ヒドロゲル中に封入される細胞のタイプに基づいて最適化されるべきであるということが示された。カプセルまたはミクロカプセルの直径は、細胞カプセルに対する免疫応答およびカプセル膜を横断する物質輸送の両方に影響する重要な因子である。
【０１０３】
Ｈ．細胞
開示する組成物に封入するために選択する細胞のタイプは、所望の治療効果に依存する。細胞は、患者から（自家細胞）であっても、同一種の別の提供者から（同種異系細胞）であっても、または別の種から（異種）であってもよい。異種細胞は、入手し易いが、拒絶の可能性、および患者へのウイルス伝染の可能性という危険によって、それらの臨床的応用が制限されている。抗炎症薬は、そのような細胞の存在によって誘発される免疫応答と戦う。自家細胞の場合、抗炎症薬は、異物であるヒドロゲル材料の存在によってまたは移植手術の外傷によって引き起こされる免疫応答を低減する。細胞は、患者もしくは提供者のバイオプシーまたは切除、細胞培養物または死体から得ることができる。
【０１０４】
一部の実施形態において、細胞は、タンパク質または核酸などの治療に効果的な物質を分泌する。一部の実施形態において、細胞は毒性物質を代謝する。一部の実施形態において、細胞は、皮膚、骨、軟骨、血管または筋肉などの構造組織を形成する。一部の実施形態において、細胞は、インスリンを自然に分泌する膵島細胞または自然に解毒する肝細胞など、天然のものである。一部の実施形態において、細胞は、異種のタンパク質もしくは核酸を発現するように、および／または内因性のタンパク質もしくは核酸を過剰発現するように、遺伝子操作される。
【０１０５】
封入のための細胞の例には、肝細胞、膵島細胞、副甲状腺細胞、腸を起源とする細胞、腎臓に由来する細胞、ならびに材料を主として合成および分泌または代謝するために作用する他の細胞を含む。好ましい細胞のタイプは、膵臓膵島細胞である。遺伝子操作された細胞もまた、開示される方法に従って封入するのに適している。一部の実施形態において、細胞は、例えば血友病の処置のために、血液凝固因子を分泌するように、または遺伝子欠損のある個人の処置のための成長ホルモンを分泌するように、操作される。あるいはまた、細胞は、がんまたは他の有害な物質を標的とする物質を生成するように操作されてもよい。一部の実施形態において、細胞は、天然のまたは生体工学的に操作された組織中に含有される。一部の実施形態において、細胞は、神経変性疾患の処置のために中枢神経系中へ移植するのに適している。
【０１０６】
カプセルおよびミクロカプセルなどの開示される組成物中に封入される細胞の量および密度は、細胞、ヒドロゲルおよび埋め込み部位の選択に応じて変動する。一部の実施形態において、単一種の細胞が、０．１×１０６から４×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは０．５×１０６から２×１０６細胞／ｍｌの濃度でヒドロゲル中に存在する。他の実施形態において、細胞は細胞集合体として存在する。例えば、膵島細胞集合体（または膵島全体）は、１５０μｍ直径の各集合体について約１５００〜２０００細胞を好ましくは含有し、これは、１膵島当量（ＩＥ）として定義される。したがって、一部の実施形態において、膵島細胞は、１００〜１００００ＩＥ／ｍｌ、好ましくは２００〜３，０００ＩＥ／ｍｌ、より好ましくは５００〜１５００ＩＥ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１０７】
１．膵島細胞
好ましい実施形態において、開示する組成物は、インスリンを生成する膵島細胞を含有する。膵臓膵島細胞を単離する方法は、当技術分野において公知である。Fieldら、Transplantation、６１巻：１５５４頁（１９９６年）；Linetskyら、Diabetes、４６巻：１１２０頁（１９９７年）。新鮮な膵臓組織は、刻むこと、ほぐすこと（teasing）、粉砕、および／またはコラゲナーゼ消化によって、分割することができる。その後、膵島は、洗浄、ろ過、遠心分離または採集手順によって、コンタミネーションしている細胞および材料から単離され得る。膵島細胞を単離および精製する方法および装置は、Langleyに対する米国特許第５，４４７，８６３号、Scharpらに対する同５，３２２，７９０号、Langleyに対する同５，２７３，９０４号、およびScharpらに対する同４，８６８，１２１号に記載されている。単離された膵臓細胞は、当技術分野において公知の任意の適した膵島細胞培養方法を使用して、封入またはミクロ封入前に、任意選択で培養してもよい。例えば、Brothersに対する米国特許第５，８２１，１２１号を参照されたい。単離された細胞は、抗原性の構成成分を排除する助けとなる条件下にて培地中で培養してもよい。
【０１０８】
２．遺伝子操作細胞
一部の実施形態において、開示する組成物は、治療用タンパク質または核酸を生成するように遺伝子操作された細胞を含有する。これらの実施形態において、細胞は、幹細胞（例えば多能性）、前駆細胞（例えば、多分化能性もしくは寡能性）、または最終分化細胞（すなわち単能性）であり得る。細胞は、ｍｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉなどの治療用のポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドをコードする核酸を含有するように操作され得る。核酸は、安定した発現のために細胞ゲノムＤＮＡ中へ組み入れることができ、または発現ベクター（例えばプラスミドＤＮＡ）中へ組み入れることができる。治療用のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、処置される疾患および移植部位に基づいて選択することができる。一部の実施形態において、治療用のポリヌクレオチドまたはタンパク質は抗腫瘍剤である。他の実施形態において、治療用のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、ホルモン、増殖因子、または酵素である。
【０１０９】
ＩＩＩ．カプセルを作製する方法
Ａ．  ２および３層カプセルを作製する方法
３層カプセルは、三流体同軸電気スプレー法によって作製することができる。
【０１１０】
好ましくは、３層カプセルは、３つの別個の同心チューブからなるノズルを出口に有する電気スプレー装置中で形成される。ノズル（１００）の例を図２に例証する。ヒドロゲル形成性材料を含有し、１種または複数種の抗炎症薬または撮像試薬を任意選択で含む第１の流れが、ノズルの最も内側のチューブ（１１０）中へポンプ注入される。ヒドロゲル形成性材料および膵島を含有する第２の流れが、ノズルの中間のチューブ（１１２）内へポンプ注入される。ヒドロゲル形成材料を含有する第３の流れが、最も外側のチューブ（１１４）へ送達される。
【０１１１】
３つの流れが、ノズルの出口で合流する。アルギナート溶液の比較的高い粘度によって、３つの流れの間のいかなる顕著な混じり合いも防止され、３つの明瞭な同心層を有する液滴が、電界下で形成される。カルシウムイオンまたはバリウムイオンなどの二価イオンを含有するゲル浴中へ液滴が落下した後、瞬時に架橋が起こり、３層カプセルが形成される。３層カプセルは、三流体同軸電気スプレーによって作製することができる。
【０１１２】
例えば、抗炎症薬または撮像試薬を含有する流れは、最も内側のチューブ中へポンプ注入され、膵島を含有する第２の流れは、中間のチューブ内へポンプ注入され、別の流れが、最も外側のチューブへ送達される。３つの流れが、ノズルの出口で合流する。アルギナート溶液の比較的高い粘度によって、３つの流れの間のいかなる顕著な混じり合いも防止され、３つの明瞭な同心層を有する液滴が、電界下で形成される。カルシウムイオンまたはバリウムイオンなどの二価イオンを含有するゲル浴中へ液滴が落下した後、瞬時に架橋が起こり、３層カプセルが形成される。
【０１１３】
Ｂ．  ２層カプセルを作製する方法
二流体同軸電気噴射が、コア−シェルカプセルの製作および細胞または細胞集合体の封入に使用される。好ましい実施形態において、シェル流体は、細胞を含まないアルギナート溶液からなるのに対し、コア流体は、膵島または他の治療用細胞を含有する。２つの流体の比較的高い粘度およびそれらの間の短い相互作用時間によって、それらの混じり合いが防止される。静電気力下において、コア−シェル構造を有するミクロ液滴が形成され、二価架橋イオンを含有するゲル化浴中でヒドロゲルカプセルに転換される。
【０１１４】
Ｃ．多糖ヒドロゲルを用いた細胞封入
ヒドロゲル中に細胞を封入する方法は公知である。好ましい実施形態において、ヒドロゲルは多糖である。例えば、哺乳動物細胞をアルギナートポリマーに封入する方法は、周知であり、以下に簡単に説明する。例えばLimに対する米国特許第４，３５２，８８３号を参照されたい。
【０１１５】
アルギナートは、水中において室温にて二価カチオンでイオン的に架橋され、ヒドロゲルマトリックスを形成することができる。封入される生物学的材料を含有する水溶液は、水溶性ポリマー溶液中に懸濁され、懸濁液は、多価カチオンと接触することによって個別のカプセルまたはミクロカプセルへと構成される液滴に形成され、次いで、カプセルまたはミクロカプセルの表面が、ポリアミノ酸で架橋されて、封入された材料の周囲に半透過性膜を形成する。
【０１１６】
荷電した側基を有する水溶性ポリマーは、ポリマーが反対の電荷の多価イオンを含有する水溶液と反応することによって架橋し、反対の電荷の多価イオンは、ポリマーが酸性側基を有する場合には多価カチオンまたはポリマーが塩基性側基を有する場合には多価アニオンのいずれかである。アルキルアンモニウム塩などの２、３または４官能有機カチオン、例えばＲ３Ｎ＋−−＼／＼／＼／−−＋ＮＲ３も使用することができるが、酸性側基を有するポリマーと架橋してヒドロゲルを形成するのに好ましいカチオンは、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムおよびスズなどの二価および三価カチオンである。これらのカチオンの塩の水溶液がポリマーに添加されて、軟質の高膨潤ヒドロゲルおよび膜を形成する。カチオンの濃度が高いほどまたは価数が高いほど、ポリマーの架橋度が大きい。０．００５Ｍという低い濃度から、ポリマーの架橋が実証された。より高い濃度は、塩の溶解性によって限定される。
【０１１７】
塩基性側鎖を含有するポリマーと架橋してヒドロゲルを形成するのに好ましいアニオンは、低分子量二価カルボン酸、例えばテレフタル酸、硫酸イオン、および炭酸イオンなどの、二価および三価アニオンである。カチオンについて説明したのと同様に、これらのアニオンの塩の水溶液がポリマーに添加されて、軟質の高膨潤ヒドロゲルおよび膜を形成する。
【０１１８】
様々なポリカチオンが、ポリマーヒドロゲルを半透過性表面膜へと複合体化させ、それによって安定化するために、使用され得る。使用することができる材料の例には、アミン基またはイミン基などの塩基性反応基を有し、３，０００から１００，０００の間の好ましい分子量を有するポリマー、例えばポリエチレンイミンおよびポリリシンが含まれる。これらは市販されている。ポリカチオンの１つはポリ（Ｌ−リシン）であり、合成ポリアミンの例は、ポチエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（アリルアミン）である。多糖であるキトサンなどの天然ポリカチオンもある。
【０１１９】
ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基との反応によって半透過性膜を形成するために使用することができるポリアニオンには、アクリル酸、メタクリル酸およびアクリル酸の他の誘導体のポリマーおよびコポリマー、スルホン化ポリスチレンなどのペンダントＳＯ３Ｈ基を有するポリマー、ならびにカルボン酸基を有するポリスチレンが含まれる。
【０１２０】
好ましい実施形態において、アルギナートカプセルは、懸濁した細胞を含有するアルギナート溶液から、封入機（Ｉｎｏｔｅｃｈ封入機など）を使用して製作される。一部の実施形態において、アルギナートは、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋またはＳｒ２＋などの多価カチオンとイオン的に架橋する。特に好ましい実施形態において、アルギナートは、ＢａＣｌ２を使用して架橋される。一部の実施形態において、カプセルは、形成後にさらに精製される。好ましい実施形態において、カプセルは、例えば、ＨＥＰＥＳ溶液、Ｋｒｅｂｓ溶液および／またはＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄される。
【０１２１】
細胞は、提供者から直接、提供者からの細胞の細胞培養物から、または確立された細胞培養系から、得ることができる。好ましい実施形態において、細胞は、提供者から直接得て、洗浄され、ポリマー材料と組み合わせて直接埋め込まれる。細胞は、組織培養の分野における当業者に公知の技術を使用して培養される。
【０１２２】
細胞の付着および生存能力は、組織学および蛍光顕微鏡検査法などの標準的な技術を使用して評定することができる。埋め込まれた細胞の機能は、上記の技術と機能的アッセイとの組合せを使用して決定することができる。例えば、肝細胞の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝臓機能研究は、受容者の総胆管中へカニューレを配置することによって行うことができる。胆汁は、その後漸増して採取することができる。胆汁色素は、未誘導体化テトラピロールを探索する高圧液体クロマトグラフィーによって、またはＰ−グルクロニダーゼによる処置有りまたは無しのいずれかで、ジアゾ化されたアゾジピロールエチルアントラニレートとの反応によってアゾジピロールへ転換した後に薄層クロマトグラフィーによって、分析することができる。二抱合型ビルビリンおよび一抱合型ビルビリンは、抱合胆汁色素のアルカリメタノリシス後に薄層クロマトグラフィーによって決定することもできる。一般的に、機能する移植された肝細胞の数が増加すると、抱合ビルビリンのレベルが増加する。アルブミン産生などの簡便な肝臓機能テストは、血液試料で行うこともできる。埋め込み後の細胞機能の程度を決定するために必要であれば、類似の臓器機能研究を、当業者に公知の技術を使用して実行することができる。例えば、膵臓の膵島細胞を、肝細胞を埋め込むために特に使用されるのと同じ様式で送達して、インスリンの適切な分泌によってグルコース調節を達成して、糖尿病を回復させてもよい。他の内分泌性組織も埋め込むことができる。
【０１２３】
細胞が埋め込まれる１つの部位または複数の部位は、個人の必要性に基づいて決定され、必要な細胞の数もまた同様である。臓器機能を有する細胞、例えば肝細胞または膵島細胞については、混合物を、腸間膜、皮下組織、後腹膜腔、腹膜前空間および筋肉内空間の中へ注入することができる。
【０１２４】
所望であれば、カプセルまたはミクロカプセル中に含有される細胞の生理学的応答性を保持しながらまたは過度に損なわずにカプセルまたはミクロカプセルの耐久性を増加するために、カプセルまたはミクロカプセルは、硫酸ナトリウムなどの生理学的に許容される塩または類似の剤で処理またはそれらと共にインキュベートしてもよい。「生理学的に許容される塩」は、カプセルまたはミクロカプセル中に封入された細胞の生理学的応答性に対して過度に有害ではない塩を意味する。一般的に、そのような塩は、カプセルの中に含有される細胞の機能および／または生存能力を実質的に損なうことなく、カルシウムイオンに結合するアニオンを有してカプセルを十分に安定化する塩である。硫酸ナトリウムおよび硫酸カリウムなどの硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウムが最も好ましい。インキュベーション工程は、上記のようにカプセルの中に含有される細胞の機能および／または生存能力を実質的に損なうことなく、カプセルを安定化するのに有効な量の生理的塩類を含有する水溶液中で実施される。一般的に、塩は、約０．１または１ミリモル濃度から、約２０または１００ミリモル濃度まで、最も好ましくは約２から１０ミリモル濃度の量で含まれる。インキュベーション工程の期間は重要ではなく、約１または１０分から、約１もしくは２時間またはそれ超（例えば一晩）であってよい。インキュベーション工程が実施される温度も同様に重要ではなく、典型的には約４℃から約３７℃までであり、室温（約２１℃）が好ましい。
【０１２５】
ＩＶ．疾患または障害の処置
封入された細胞は、それを必要とする患者に、疾患または障害の処置のために投与する、例えば注入するまたは埋め込むことができる。一部の実施形態において、疾患または障害は、患者におけるホルモンまたはタンパク質分泌細胞の機能不全によって引き起こされ、またはそのような機能不全を伴う。これらの実施形態において、ホルモンまたはタンパク質分泌細胞が封入され、患者に投与される。例えば、封入された膵島細胞は、糖尿病を有する患者に投与され得る。別の実施形態において、細胞は、対象における組織を修復するために使用される。これらの実施形態において、細胞は、皮膚、骨、軟骨、筋肉または血管などの構造組織を形成する。これらの実施形態において、細胞は、好ましくは幹細胞または前駆細胞である。
【０１２６】
また、（ａ）治療効果を少なくともＺ日間提供するのに有効量の本明細書に開示する調製物の最初の投与を提供すること、および（ｂ）有効量の請求項１に記載の調製物の、その後の投与を施すことによって被験体を処置する方法であって、但し、最初の投与とその後の投与とが少なくともＺ−１０、Ｚ−５、Ｚ日離れており、中間の投与が提供されない、方法を開示する。いくつかの形態において、Ｚは、少なくとも１４、３０、６０または９０日である。
【０１２７】
また、有効量の本明細書に開示する調製物の最初の投与がなされた被験体に、有効量の請求項１に記載の調製物の、その後の投与を提供することによって、被験体を処置する方法であって、但し、その後の投与が、最初の投与の少なくともＺ−１０、Ｚ−５、Ｚ日後に行われる、方法を開示する。いくつかの形態において、Ｚは、少なくとも１４、３０、６０または９０日である。
【０１２８】
１．糖尿病
半透過性膜中に膵島細胞を封入することに基づく糖尿病処置用バイオ人工膵臓の使用の可能性は、科学者らによって広く研究されている。ミクロ封入は、膵島細胞を免疫拒絶から防御し、動物細胞または遺伝子修飾されたインスリン産生細胞の使用を可能にする。
【０１２９】
エドモントンプロトコルは、死亡している提供者から抜き取ったヒト膵島の埋め込みを伴い、無自覚の低血糖に陥りやすい１型糖尿病患者の処置に向けた改良点を示した。しかしながら、この技術において直面している２つの大きなハードルは、提供者臓器の利用可能性が限られていること、および患者の体内における免疫応答を防止するための免疫抑制剤が必要であることである。
【０１３０】
いくつかの研究は、ポリマーカプセル内部での膵島細胞の固定を伴うバイオ人工膵臓の開発に向けて専念されてきた。この目的に向けた最初の試みは、１９８０年にLimらによって実証され、そこでは、異種移植膵島細胞が、アルギナートポリリシンミクロカプセル内部に封入され、これは、数週間、有意なｉｎ  ｖｉｖｏ結果をもたらした。
【０１３１】
膵島ミクロ封入に典型的に使用されるポリマーは、アルギナート、キトサン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アガロース、硫酸セルロールナトリウムおよび水不溶性ポリアクリレートである。
【０１３２】
２．がん
いくつかの形態のがんの処置に向けた細胞封入ミクロカプセルの使用は、大きな可能性を示してきた。研究者らによってなされてきた１つのアプローチは、遺伝子修飾されたサイトカイン分泌細胞を含有するミクロカプセルの埋め込みを通じたものである。マウスに埋め込まれた、遺伝子修飾されたＩＬ−２サイトカイン分泌非自家マウス筋芽細胞は、腫瘍の増殖を遅らせ、動物の生存率を増加させた。しかしながら、この処置の効率は、植え込まれたミクロカプセルへの免疫応答のために小さかった。がん抑制への別のアプローチは、腫瘍の広がりにつながる増殖因子の放出を防止するための血管新生阻害剤の使用を通じたものである。硫酸セルロールポリマー中に封入された、遺伝子修飾されたチトクロームＰ４５０発現細胞が、固形腫瘍の処置のために有用である場合もある。
【０１３３】
３．心臓疾患
虚血性心臓疾患後の患者における心臓組織再生を可能にするための細胞投与についての多くの方法が研究されてきたが、埋め込み後の拍動している心臓において保持される細胞数の効率は、今も非常に低い。この問題を克服するための有望なアプローチは、細胞ミクロ封入療法の使用を通じたものであり、これは、遊離の幹細胞の心臓中への注入と比較して高い細胞保持を可能にすることが示された。
【０１３４】
心臓再生用途向けの細胞ベースの封入技術の影響を改善するための別の方策は、新生血管形成を刺激し損傷を受けた虚血性心臓における灌流を回復する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生因子を分泌することが可能な、遺伝子修飾された幹細胞の使用を通じたものである。
【０１３５】
４．肝臓疾患
ミクロ封入された肝細胞は、バイオ人工肝臓補助デバイス（ＢＬＡＤ）において使用することができる。急性肝臓不全（ＡＬＦ）は、現代の集中治療において改善されてはいるものの今も相当な致死率をもたらす医学的な非常事態である。最も深刻な場合、緊急の同所性肝臓移植（ＯＬＴ）が、目下のところ唯一の生存の機会を提示する。しかしながら、提供者臓器の供給は限られており、臓器は、時間に間に合うように利用可能にならない場合がある。効果的な一時的な肝臓サポートシステムは、提供者肝臓が利用可能になるまで患者を維持することによって、この状況において生存の機会を改善する。さらに、ＡＬＦからの快癒に続く本来の肝臓の既知の再生能力は、十分な時間にわたって一時的な肝臓サポートを使用すると少なくとも一部の場合においてＯＬＴの必要性がなくなりさえするという可能性を、上昇させる。
【０１３６】
一部の実施形態において、肝細胞は、修飾されたコラーゲンの内部コアならびにメチルメタクリレート（ＭＭＡ）、メタクリレート（ＭＡＡ）およびヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）のターポリマーの外側シェルを有するカプセルまたはミクロカプセル中に封入される（Yin  Cら、Biomaterials、２４巻：１７７１〜１７８０頁（２００３年））。
【０１３７】
バイオ人工肝臓サポートシステムにおいて使用するために採用されてきたまたは現在調査中の細胞系には、ヒトまたは動物の肝臓から単離された初代肝細胞ならびに肝細胞癌、肝芽細胞腫および不死化肝細胞株などの様々に形質転換したヒト細胞が含まれる。
【０１３８】
以下の非限定的な実施例を参照することによって本発明はさらに理解される。
【０１３９】
実施例は、コア−シェルアルギナート系カプセルおよびミクロカプセルの形成を実証するものであり、これらは、ヒドロゲルカプセル内に細胞を隔離し、体内の免疫細胞によって細胞が検出されることを防止することが可能であること（実施例１）、直径が１ｍｍ超のより大きなヒドロゲルカプセルは、より小さな直径を有する同じヒドロゲルカプセルより、引き起こす繊維化反応が少ないということ（実施例２）を実証している。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）コア−シェルアルギナート系ミクロカプセルの調製
材料および方法
コア−シェルノズルの設計およびコア−シェルカプセルの形成
【０１４１】
現在のアルギナート系細胞封入プロトコルと互換性のある二流体同軸電気噴射を使用した、コア−シェル構造を有するタイプのアルギナート系ヒドロゲルミクロカプセルを開発した。コアおよびシェルの組成および厚さは、生体医療用途の多くのタイプのために、独立して設計および制御することができる。図３Ａおよび３Ｂは、従来の細胞封入アプローチ（図３Ａ）ならびにコア−シェルカプセルおよび細胞封入のための二流体同軸電気噴射（図３Ｂ）の模式図である。図３Ｂは、コア−シェルカプセルの製作および細胞または細胞集合体の封入のための二流体同軸電気噴射の概略を示している。この二流体構成は、コア−シェルヒドロゲルカプセルを作製し生細胞を封入するために使用された。
【０１４２】
シェル流体は、細胞を含まないアルギナート溶液からなるのに対し、コア流体は、膵島または他の治療用細胞を含有する。２つの流体の比較的高い粘度およびそれらの間の短い相互作用時間によって、それらの混じり合いが防止される。静電気力下において、コア−シェル構造を有するミクロ液滴が形成され、ゲル化浴中でヒドロゲルカプセルに転換される。
【０１４３】
まず、コア−シェルヒドロゲルカプセルの形成を実証するため、蛍光標識されたアルギナートを使用してシェルを形成し、標識されていないアルギナートを使用してコアを形成した。コアおよびシェルの厚さは、単純にそれらそれぞれの流速を調和させることによって制御することができる。次に、細胞封入のため、カプセル当たりの所望の細胞質量に基づいて、コアのサイズを設計することができるのに対し、機械強度および物質輸送の要求に従って、シェルのサイズを調整することができる。コアおよびシェルの組成も調整可能である。これは、封入する細胞と直接接触する材料と、移植したときに宿主免疫系と隣接する材料との独立した最適化を可能にする。例えば、抗炎症薬または撮像コントラスト試薬（例えば、酸化鉄ナノ粒子）を、コア中の細胞に接触させることなく、シェル中に搭載することができる。アルギナートシェルの内側のコアとしてＭａｔｒｉｇｅｌなどの異なる材料を置くことも可能である。コア材料は、単独では機械的に強固なカプセルを形成することはできない場合があるが、それゆえ、封入された細胞にとって好ましい局所的環境を提供することができる。
【０１４４】
同軸ノズルの設計は、カプセルの均一なコア−シェル構造の安定した形成および膵島の完全な封入にとって重要であった。第一に、ノズルは同心でなければならず、何らかの偏心は、コア流体を囲むシェル流体の不均一流を引き起こし、コア−シェル構造を乱す場合がある。第二に、ノズルは、ノズルの内側のシェル流体流がコアチューブの周りに均一であるように設計されなければならない。第三に、コアチューブの内径は、膵島のサイズに適応しなければならない。同軸ノズルは、内径０．０１４インチおよび外径０．０２２インチのコアチューブ、ならびに内径０．０４インチおよび外径０．０６２５インチのシェルチューブを有する。ノズル本体から突出するシェルチューブの長さは０．５インチであり、出口端において先細になっていた。コアチューブは、出口において、シェルチューブに対して１００ミクロン内側に置かれていた。コアおよびシェル流体の流速は、別個のシリンジポンプによって、独立して調整された。電圧は６．２ｋＶであり、ノズル先端とゲル化溶液の表面との間の距離は１．８ｃｍであった。
【０１４５】
封入を最適化するため、所与の分子量のアルギナートの溶液濃度を最適化する必要がある。コアおよびシェル溶液の濃度の両方が低すぎると、コアおよびシェル溶液の間で顕著な混じり合いが生じ、不均一なコア−シェル構造につながる。ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ２０アルギナート（Ｍｗおよそ７５〜２２０，０００、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）について、最適な濃度範囲は、０．８％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）であることが見出された。全てのアルギナート溶液は１．４％（ｗ／ｖ）であり、封入前のゲル化を避けるためＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は４℃の冷室内において４ｍｇ／ｍＬにて使用した。コアおよびシェル溶液の特性のほかに、操作パラメータの最適化も、理想的な封入を得るために重要であった。典型的な流速は、コア流については０．００５ｍＬ／分から０．１ｍＬ／分、シェル流については０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分であった。
【０１４６】
ラット膵島の単離および精製：
膵島を収集するために、およそ３００グラムの重さのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。全てのラットは、１：２０のキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって麻酔し、各注入の総体積は、ラットの体重に応じて０．４〜０．５ｍＬであった。単離手術を行った。簡単に説明すると、胆管にカニューレを挿入し、ＲＰＭＩ１６４０培地中の０．１５％リベラーゼ（研究用グレード、Ｒｏｃｈｅ）の溶液のｉｎ  ｖｉｖｏ注入によって膵臓を膨張させた。ラットは、下行大動脈を切ることによって屠殺し、膨張した膵臓臓器を取り出し、全ての手術が完了するまで氷上の５０ｍＬコニカルチューブ中に保った。全てのチューブを３７℃の水浴中に置いて３０分間消化し、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清を含む冷Ｍ１９９培地を１０〜１５ｍＬ添加し軽く振とうすることによって、消化を停止した。消化された膵臓を、上述の同じＭ１９９培地で２回洗浄し、４５０μｍの篩を通してろ過し、その後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）／Ｍ１９９培地勾配中に懸濁し、１，７００ＲＣＦで４℃にて遠心分離した。勾配中で形成された膵島層の厚さに応じて、高純度の膵島のためにこの工程を繰り返した。最後に、膵島を勾配から採取し、一連の６つの重力沈降によってさらに単離し、ここで、それぞれの上澄みは４分の沈降の後に廃棄した。精製された膵島は、光学顕微鏡下でアリコートによって手で数え、その後、無菌の１Ｘリン酸塩緩衝食塩水中で３回洗浄した。その後、膵島を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１回洗浄し、さらなる使用のためにこの培地中で一晩培養した。
【０１４７】
肝臓組織の均質化および封入
肝臓は、肝門脈系の血管および結合組織から肝臓を切り離すことによって、屠殺したラットから得た。それを０．９％ＮａＣｌ溶液中に入れ、シャーレ中で外科用鉗子およびハサミを使用して刻んだ。これらの切片を、０．９％食塩水で２回洗浄して血液を取り除き、その後、簡易のＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して解離した。解離後、組織試料を１００μｍ細胞ストレーナー、続いて４０μｍ細胞ストレーナーを通してろ過した。このろ過をもう１回繰り返して、封入用肝臓組織細胞を得た。単流体封入のため、解離した肝臓組織細胞０．０６ｍＬを、１．４％ＳＬＧ２０アルギナート溶液４．５ｍＬに分散させた。二流体同軸封入のため、解離した肝臓細胞０．０６ｍＬを、１．４％ＳＬＧ２０アルギナート溶液０．５ｍＬに分散させ、コア流体として使用した。別個の１．４％アルギナート溶液４ｍＬをシェルとして使用した。
【０１４８】
膵島の封入および移植
封入の直前に、培養した膵島を１４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、Ｃａを含有しないＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液（４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨおよそ７．４、浸透圧およそ２９０ｍＯｓｍ）で洗浄した。洗浄後、膵島を再度遠心分離し、全ての上澄みを吸引した。その後、膵島沈渣を、所望の膵島数密度で、０．８％ＮａＣｌ溶液中に溶解した１．４％ＳＬＧ２０アルギナート溶液中に再懸濁した。標準カプセルの場合、１０００膵島毎にアルギナート溶液０．２７ｍＬを使用した。コア−シェルカプセルには、１０００膵島毎に溶液０．０３ｍＬをコア流体として使用した。別の膵島なしの１．４％アルギナート溶液０．２４ｍＬをシェル流体として使用した。シェルの流速は０．２ｍＬ／分であり、コアの流速は０．０２５ｍＬ／分であった。したがって、同じ数の膵島について、通常の封入およびコア−シェル封入の両方において使用したアルギナート溶液の総体積は同じであった。カプセルをＢａＣｌ２ゲル化溶液（２０ｍＭ  ＢａＣｌ２、２５０ｍＭ  Ｄ−マンニトール、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ約７．４、浸透圧およそ２９０ｍＯｓｍ）を使用して架橋した。架橋の直後に、封入した膵島をＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、ＲＰＭＩ培地１６４０で２回洗浄し、移植のため３７℃にて一晩培養した。膵島は多様なサイズであり（５０〜４００μｍ）、封入プロセス中に膵島の不可避な損失があったため、封入された膵島の総数を再度数え、移植前に膵島当量（ＩＥ、１５０μｍサイズに正規化）に変換した。
【０１４９】
免疫適格性の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを移植に利用した。インスリン依存性糖尿病マウスを作り出すため、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＩＴへの出荷前にストレプトゾシン（ＳＴＺ）を用いて販売者（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）が処置した。全てのマウスの血糖レベルを、移植前に再テストした。２日続けて非絶食時血糖レベルが３００ｍｇ／ｄＬ超であったマウスのみが糖尿病とみなされ、移植を受けた。酸素中３％イソフルオランを使用してマウスを麻酔し、手順全体を通じて同じ割合を維持した。手術前に、全てのマウスが、脱水症状を防止するための皮下の０．９％食塩水０．３ｍＬと共に、手術前の鎮痛剤として０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のブプレノルフィンを皮下に受けた。手術野へ移す前に、マウスの腹部の毛を剃り、ベタジンおよびイソプロピルアルコールで交互に擦って、無菌野を作り出した。腹部の正中線に沿って０．５ｍｍ切開し、鈍的切開を用いて腹膜を曝露した。その後、腹膜を鉗子で掴み、白線に沿って０．５〜１ｍｍ切開した。その後、所定数の膵島当量を有する所望の体積のカプセルを無菌ピペット中へ採り、切開部を通して腹腔中へ移植した。その後、切開部を５−０先端テーパーポリジオキサノン（ＰＤＳ  ＩＩ）吸収性縫合糸を使用して閉じた。その後、創傷クリップおよび組織グルーを使用して、切開部にかけて皮膚を閉じた。
【０１５０】
全ての動物プロトコルは、ＭＩＴ動物飼育委員会によって承認され、全ての外科的手順および術後ケアは、ＭＩＴ比較医学部の獣医スタッフによって監督された。
【０１５１】
封入された膵島の共焦点画像化
膵臓膵島をＨｏｅｃｈｓｔ染料（２μｇ／ｍＬ）で染色し、蛍光の標準カプセル、またはシェルが蛍光標識されたコア−シェルカプセルに封入した。チャンバーのあるカバーガラス（ＬａｂＴｅｋ）上にカプセルを置き沈降させた。その後、レーザー走査型共焦点顕微鏡７１０（ＬＳＭ７１０）を使用して、１０倍対物レンズ下で、封入された膵島を画像化した。試料の底部から頂部までの複数の共焦点スライスを画像化し、Ｚスタックを作成した。ＬＳＭブラウザソフトウェアを使用して直交画像化および３Ｄ描画を行い、膵島含有カプセルを可視化した。
【０１５２】
血糖モニタリング
移植手術に続いて、血糖レベルを１週間に３回モニタリングした。ランセットを使用して尾静脈から血液の小滴を採取し、市販のグルコースメーター（Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｏｎｅ、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、ボカラトン、フロリダ州）を使用してテストした。非絶食時血糖レベルが２００ｍｇ／ｄＬ未満のマウスを正常血糖とみなした。実験群の全てのマウスが高血糖状態に戻るまでモニタリングを継続し、その時点でマウスは安楽死させた。
【０１５３】
結果
コア−シェルカプセルを使用した良好な細胞封入が、均質化したラット肝臓組織細胞およびラット膵臓膵島の両方を使用して実証された。膵島を含有する標準カプセルおよびコア−シェルカプセルの両方についての顕微鏡画像は、膵島当たり比較的少ない体積のアルギナート溶液（すなわち、１０００膵島毎に溶液０．２７ｍＬ）が使用されて、移植されるカプセルの総体積が最小化されたことを示す。これは、典型的に使用される体積のおよそ３分の１である（deVosら、Transplantation、１９９６年、６２巻、８８８頁）。架橋のため、ＢａＣｌ２溶液（deVosら、Transplantation、１９９６年、６２巻、８８８頁）を使用し、平均カプセルサイズは、両方とも５００μｍ近辺であった。標準カプセルについては、膵島はカプセル内でランダムに位置し、外部へ突出した膵島が頻繁に観察された。これとは対照的に、コア−シェルカプセル中の膵島は完全に封入されていた。カプセルのコア−シェル構造は、シェルにおいて蛍光アルギナートを使用し、コアにおいて非蛍光アルギナートを使用することによって実証された。膵島が青色に染色される（すなわち核染色）蛍光画像は、一部の場合において、膵島はコア−シェル界面に近いが、追加のシェル層のために、なお完全に封入されていることを示した。共焦点顕微鏡技術は完全な封入を確認するために使用されたということに留意することが重要である。従来の顕微鏡検査では、比較的密集した膵島塊がカプセルの底に落ちて対物レンズと一列になり得るときに、誤って理解されることがある。旧来のようにして形成されたアルギナートカプセルでは、従来の光学顕微鏡下で、膵島が完全に封入されたように見えた。しかしながら、共焦点顕微鏡法を使用したｚシリーズおよび直交視野は、膵島がカプセルの外側へ部分的に曝露していることを明らかにした。これとは対照的に、コア−シェルカプセルは、３方向全てから見たときに、膵島を完全に入れていた。量的には、共焦点顕微鏡法を使用した複数の膵島含有カプセルの試験に基づくと、標準カプセルは約３０％で膵島が突出していたのに対し、コア−シェルカプセルでは膵島の突出はなかった。コア−シェル構造を有するヒドロゲルミクロカプセルは、ＦＩＴＣで部分的に修飾されたアルギナートのシェルで形成されたのに対し、コアは標識されていないアルギナートまたはＭａｔｒｉｇｅｌである。シェルおよびコアの厚さは、それらのそれぞれの流速を調和させることによって制御される：（ａ）０．１ｍＬ／分および０．１ｍＬ／分；（ｂ）０．１５ｍＬ／分および０．０５ｍＬ／分；（ｃ）０．２ｍＬ／分および０．０２ｍＬ／分。コアおよびシェルの組成も、独立して制御することができる。（ｄ）シェルアルギナートは、抗炎症薬であるクルクミンの粒子を含有する。薬物粒子は、自己蛍光性である。シェルは蛍光アルギナートであり、コアは非蛍光Ｍａｔｒｉｇｅｌである。
【０１５４】
ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病マウスモデル（Brodskyら、Diabetes、１９６９年、１８巻、６０６頁）を使用して、同軸封入された膵島の機能性を評価し、標準カプセルと効能を比較した。比較は、標準カプセルおよびコア−シェルカプセルに封入された膵島で実行した。コア−シェルカプセルに封入された膵島の３Ｄ再構築共焦点蛍光画像では、膵島が青色に染色されているのに対し、シェルは緑色に標識されていることが示された。
【０１５５】
封入されたラットの膵島を糖尿病マウスの腹腔中へ移植し、それらの血糖を測定した。図４Ａは、コア−シェルカプセル（ダイアモンド）および標準カプセル（丸）の両方についての移植後の日数の関数としてのマウスの血糖レベルを示している。両方のタイプのカプセルについて、アルギナート溶液０．２７ｍＬあたり１０００の膵島密度を使用し、各マウスに５００膵島当量（１５０μｍサイズに正規化）を移植した。血糖が２００ｍｇ／ｄＬ未満のマウスを正常血糖とみなす（Kimら、Lab  Chip、２０１１年、１１巻、２４６頁）。移植から数日後、全ての糖尿病マウスが、予測通り正常血糖となった。しかしながら、図４Ｂに実証されているように、２つのタイプのカプセルの間の差が、約２週間後に明らかになり始めた。標準カプセルを受けたマウスの平均血糖レベルは、１５日で２００ｍｇ／ｄＬ超に戻り、コア−シェルカプセルを受けたマウスの平均血糖レベルは、５０日まで２００ｍｇ／ｄＬ未満を維持した。図４Ｂは、移植後の日数に対する正常血糖マウスのパーセントを示す。標準カプセルは、全てのマウスにおいて、糖尿病を２０日まで制御することができなかったのに対し、コア−シェルカプセルは、一部のマウスにおいて、移植後約８０日まで制御することができ、コア−シェルカプセルは、標準カプセルと比較して顕著に処置を改善したことが示された。
【０１５６】
要するに、コア−シェル構造を有するヒドロゲルミクロカプセルが作製され、改善された細胞封入および免疫防御のためのそれらの使用がなされた。膵島当たりの材料体積が低減したコア−シェルカプセルを使用した、より良好な膵島封入が実証された。カプセルのコア領域中に細胞または細胞集合体を単純に閉じ込めることによって、単一の工程で、改善された免疫防御が達成された。コア−シェル構造およびより良好な封入の両方が、共焦点顕微鏡法によって確認された。１型糖尿病マウスモデルを使用して、ラット膵島を封入したコア−シェルカプセルが、現在使用されている標準カプセルより顕著に良好な処置を提供することが示された。
【０１５７】
膵島ミクロ封入は、１型糖尿病の処置のための有望なアプローチを提示し、数十年にわたり熱心な研究の主題となってきた（Bratlieら、Adv.  Healthcare  Mater.、２０１２年、１巻、２６７頁）。異なる研究グループからの結果は、たびたび相反していた。膵島の品質、および生体適合性などの材料特性は、処置の成果に影響を与える実に重要な因子である。封入の品質も、結果に影響し不一致を生じ得た。コア−シェルカプセルは、標準カプセルを作製するために使用されてきたのと同じ封入プロトコルを使用する単一工程で作製することができ、膵島を傷付けることがない。シェルおよびコアの組成を制御する機会は、より良好な免疫防御を提供することに加えて、ミクロ封入における追加の機会を提供する。その例には、コア中のアルギナートを、膵島の長期生存を増強し得る異なる材料で置き換えることが含まれる。加えて、幹細胞に由来するインスリン生成細胞（Calneら、Nature  Reviews  Endocrinology、２０１０年、６巻、１７３頁）または成人細胞（Zhouら、Nature、２００８年、４５５巻、６２７頁）は、膵島に大きな選択肢を提供する。コア−シェルカプセルは、改善された封入のみならず、シェル中に封入する材料およびコア中の細胞に直接接触する材料の設計における、より大きな自由度も可能にする。
【０１５８】
（実施例２）治療用細胞および細胞集合体の封入のための大きな２層ヒドロゲルカプセル（＞１ｍｍ）の調製
材料および方法
封入方法は、（ａ）膵島を含有するアルギナート溶液の液滴の形成、および（ｂ）液滴のヒドロゲルカプセルのへ転換という２つの大まかな工程を含む。機械力または静電気力を使用して、液滴またはカプセルサイズを制御することができる。膵島は、カプセル内にランダムに分布し得る。物質輸送を容易にするため、膵島をカプセルのシェル領域中に導入することもできる。これは、二流体封入アプローチを使用することによって達成することができ、このアプローチでは、膵島を含有するアルギナート溶液の１つの流れがシェル流体として働き、かつ細胞を含有しないアルギナート溶液の別個の流れがコアに流れる。抗炎症薬などの追加の構成成分もコアに組み込むことができる。
【０１５９】
膵島を封入するための２つのタイプの大きな（Ｄ＞１ｍｍ）アルギナートヒドロゲルカプセルを調製した。１つ目では、膵島をカプセル内にランダムに分散させた。２つ目では、膵島をカプセルのシェル領域中に意図的に置いた。
【０１６０】
ラット膵島を封入した１．５ｍｍカプセルを、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへ注入した。５００μｍカプセルを対照として使用し、両方のカプセルサイズについて５００ＩＥを使用した。
【０１６１】
結果
大きいサイズ（Ｄ＞１ｍｍ）のカプセルは、従来の（０〜５００μｍ）カプセルより、線維形成がはるかに少なく、はるかに長い回復をもたらした。５００μｍカプセルは対照として使用し、５００ＩＥが両方のサイズのカプセルに使用された。５００μｍカプセル群の５匹のマウス全てが、４３日までに失敗した（３つの連続した測定で血糖が２００ｍｇ／ｄｌ超）のに対し、大きなカプセルははるかに長く持続した。５匹のマウスのうちの１匹は４３日で失敗し、１匹は７５日で失敗し、別の１匹は１４６日で失敗し、残りの２匹は、実験を止めた１９６日で回復状態を維持した。５００μｍカプセル群の５匹のマウス全てが、４３日までに失敗した（すなわち、３つの連続した測定で血糖が２００ｍｇ／ｄｌ超）のに対し、大きなカプセルははるかに長く持続した。５匹のマウスのうちの１匹は４３日で失敗し、１匹は７５日で失敗し、別の１匹は１４６日で失敗し、残りの２匹は、実験を止めた１９６日で回復状態を維持した。
【０１６２】
再び５００ＩＥを用いた別個の追跡研究において、５００μｍカプセル群における８匹全てのマウスは３５日までに失敗したのに対し、１．５ｍｍカプセル群においては、６匹のうちの１匹が２８日で失敗し、１匹は１０５日で失敗し、１匹は１３４日で失敗し、別の１匹は１３７日で失敗し、残りの２匹は、実験を止めた１７５日で回復状態に留まっていた。
【０１６３】
５００ミクロンカプセルについては図５Ａ、１．５ｍｍカプセルについては図５Ｂを参照されたい。
【０１６４】
回収したカプセルの分析によって、５００μｍカプセルは、全て線維形成して塊になっていたが、１．５ｍｍカプセルは、はるかに線維化が少なかったことが明らかになった。
【０１６５】
要するに、アルギナートヒドロゲルなどの材料を使用して膵島などの細胞または細胞集合体を封入することによって、直径１ｍｍ超の大きなヒドロゲルカプセルを作製した。アルギナートヒドロゲルカプセル中に封入された膵島は、免疫抑制薬を使用することなく、１型糖尿病の処置のために移植することができた。１つの大きな課題は、最終的に膵島の壊死および移植の失敗につながる、移植時のカプセルに対する線維化反応である。現在使用されているカプセルの典型的な直径は、１ｍｍ未満と比較的小さい。より大きなカプセルは、線維形成が少なく、したがって臨床的使用にとってより良好な疾患の転帰を有することが発見された。
【０１６６】
（実施例３）大きい（＞１ｍｍ）および小さい（＜１ｍｍ）ヒドロゲルカプセルに対する線維化の影響の比較
開示した２または３層ヒドロゲルカプセルは、センサーまたは薬物放出制御用途に有用である。一部の実施形態において、カプセルは、異物応答に抵抗するように設計される。好ましいカプセルの大まかな特徴には、１ｍｍ超のサイズおよび球形状、直線端のない滑らかな表面、親水性材料から作製されること、およびカプセルは多孔性であってよく孔は１μｍ未満のサイズが好ましいことが含まれる。１ｍｍより大きいカプセルは、マクロファージ細胞の接着に効果的に抵抗する。例えば、マクロファージ被覆は、カプセルの総表面積の３０％未満であり得る。この実施例は、１ｍｍ超のカプセルへの低減した線維化の影響を示す。１ｍｍ超のカプセルは、マクロファージおよび好中球の接着に効果的に抵抗し、マクロファージおよび好中球の動員を減少させる（図６）。例えば、マクロファージおよび好中球のレベルは、カプセルと会合した線維化組織においてＦＡＣＳによってアッセイされ、より小さい３００μｍのカプセルで観察されたレベルの３０％未満まで低減した（図６）。より大きなコア−シェル（複層アルギナートカプセル）を、二重ノズル電気スプレー法（図１に例証されている）を使用して生産したところ、それらも、マクロファージ／好中球の動員および接着の同様の低減を示した。これは、移植後の多くの時点を通して（例えば、７、１４および２８日、ならびに１、６ヶ月ならびに１年）、完全に健康なおよびＳＴＺ誘発糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスから取られたカプセルについて当てはまる。さらに、線維形成を、位相差／明視野画像上での細胞接着および線維性過剰増殖の目視検査によって、ならびにＦ−アクチン（細胞過剰増殖マーカー）およびアルファ平滑筋アクチン（線維形成マーカー）についての共焦点画像化およびウエスタンブロットによって測定した。ｑＰＣＲを使用してコラーゲン（１Ａ１）沈着の相対レベルも決定した。これらの実施例は、１ｍｍ超のカプセルへの線維化の影響の低減を示す。
【０１６７】
種々のサイズの空のカプセル（封入された細胞がないカプセル）をＳＬＧ１００アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）を使用して生産した。カプセルをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植し、回収、ならびにＦＡＣＳ分析、ｑＰＣＲ、共焦点画像化および／またはウエスタンブロットによって決定する宿主拒絶応答（すなわち、免疫炎症および線維形成）の分析の前に、２週間インキュベートした。位相差画像を使用して、処置群（すなわち、カプセルサイズ）当たりｎ＝５の個体で、細胞の過剰増殖および線維形成の相対的レベルを評定した。３００μｍおよび５００μｍのカプセルは、１１００μｍのカプセルより、２８日後に有意に多く線維化していた。
【０１６８】
小さい（３００μｍ）、中間（５００μｍ）および大きい（１５００μｍ）均一なサイズのカプセルを、電気スプレー技術を使用して生産し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内でインキュベートし、分析のため１４日後に回収した。線維形成のいくつかの尺度（ＦＡＣＳ分析、ｑＰＣＲ、共焦点画像化および／またはウエスタンブロット）を使用して、カプセルを試験した。３００μｍおよび５００μｍのカプセルは、明視野および共焦点画像化において、１５００μｍのカプセルより有意に多い線維形成を示した。
【０１６９】
種々のサイズのカプセルへの免疫応答を、マクロファージまたは好中球のいずれかにより構成される免疫細胞集団のパーセントを測定することによって評定した（図６）。３００μｍ、５００μｍ、９００μｍおよび１５００μｍのカプセルを、ＦＡＣＳによる分析のため試料を回収する前に、免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内で１４日間インキュベートした。マクロファージのパーセントは、３００μｍのカプセルで高く、カプセルサイズが大きくなるにつれて着実に低減した。好中球のパーセントは、３００μｍ、５００μｍおよび９００μｍのカプセルで高く、１５００μｍのカプセルでは対照レベル近くまで下がった。０．３ｍｍ、０．５ｍｍ、１ｍｍおよび１．５ｍｍのカプセルの回収されたカプセルからのタンパク質も、ウエスタンブロットによって分析した。平滑筋アクチン（ＳＭＡ）およびβ−アクチンのウエスタンブロットによって、カプセルサイズが大きくなると線維形成が低減するという同じ傾向が確認された。種々のカプセルサイズに会合した平滑筋アクチンおよびβ−アクチンの量を、ウエスタンブロットによって決定した。平滑筋アクチンについてのシグナルを、β−アクチンについてのシグナルに対して正規化した。平滑筋アクチンのレベルは、１．５ｍｍおよび１ｍｍのカプセルで低かったが、１．５ｍｍおよび１．０ｍｍのカプセルでははるかに高かった（図７）。
【０１７０】
線維形成の低減効果は、カプセルの表面積または体積を正規化したときも依然として明白である。３００μｍ、５００μｍおよび８００μｍのカプセルをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内で１４日間インキュベートし、１４日後に回収し、位相差顕微鏡法を使用して画像化した。観察された線維形成量を、カプセルの表面積（図８上）またはカプセルの体積（図８下）について正規化した。両方の場合において、線維形成の尺度は、３００μｍのカプセルで最も大きく、８００μｍのカプセルで最も低かった。小さいカプセルに対する大きいカプセルの線維形成の低減は、小さいカプセル（３００μｍ）の体積の９倍大きいカプセル（１０００μｍ）をテストしたときでも明らかであった。
【０１７１】
大きいカプセルの線維形成の低減効果は、様々な材料にわたって依然として明白である。５００μｍおよび１５００μｍのカプセルを、ＳＬＧ２０アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）、ポリスチレン、ガラス、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ＬＦ１０／６０アルギナート（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）から作製し、また、大きな２０００μｍテフロン（登録商標）球を作製した。カプセルをＣ５７ＢＬ／６マウス中で１４日間インキュベートし、様々な技術（すなわち、ｑＰＣＲおよびＦＡＣＳ）によって分析した。線維形成は、ＣＤ６８（マクロファージマーカー）、Ｌｙ６ｇ（好中球マーカー）、ＣＤ１１ｂ（骨髄性細胞マーカー）およびＣｏｌ１ａ１（線維形成マーカー）を使用して測定し、ｑＰＣＲによってアッセイした。１組のみの例外があったが、マーカーは１５００μｍのカプセルの全てにおいて対照レベルまたはその近傍で発現し、５００μｍのカプセルの全てについて対照レベルを有意に超えた（図９）。例外は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）カプセルおよびＬＦ１０／６０アルギナートカプセルについてのＬｙ６ｇ発現ならびにＬＦ１０／６０アルギナートカプセルについてのＣＤ１１ｂ発現であった。これらの場合それぞれにおいて、マーカーの発現は、１５００μｍのカプセルについては対照より高かったが、５００μｍのカプセルについての発現レベルよりなお有意に低かった。
【０１７２】
これらの異なる材料から作製された５００μｍおよび１５００μｍのカプセルへの免疫応答も、マクロファージおよび好中球から構成される細胞集団のパーセントをＦＡＣＳによって測定することにより、細胞レベルで評定した（図１０）。ＳＬＧ２０アルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ）、ポリスチレン、ガラス、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびＬＦ１０／６０アルギナート（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）からカプセルを作製した。カプセルをＣ５７ＢＬ／６マウス中で１４日間インキュベートし、様々な技術（すなわち、ｑＰＣＲおよびＦＡＣＳ）によって分析した。各場合において、マクロファージのパーセントおよび好中球のパーセントは、１５００μｍのカプセルより５００μｍのカプセルで有意に高かった（図１０）。
【０１７３】
（実施例４）生体適合性における球直径の効果
材料および方法
試薬
他に断りがなければ、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、細胞培養試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から得た。抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗マウスＣＤ６８（カタログ番号１３７０１２、クローンＦＡ−１１）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗マウスＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１）（カタログ番号１３７０１２、クローンＲＢ６−８Ｃ５）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗マウスＴＧＦベータ１（カタログ番号ｂｓ−０１０３Ｒ−Ａ６４７）は、Ｂｉｏｓｓ抗体から購入した。Ｃｙ３コンジュゲート抗マウスアルファ平滑筋アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）から購入した。繊維状アクチン（Ｆａｃｔｉｎ）特異的Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートファロイジンおよびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。中間のサイズ（５００μｍ）および大きなサイズ（２ｍｍ）のガラス球は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。中間のサイズ（５００μｍ）および大きなサイズ（２．５ｍｍ）のステンレス鋼球は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）から購入した。中間のサイズ（４００〜５００μｍ）および大きなサイズ（２ｍｍ）のポリスチレン球は、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｘ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。研究で使用する球のサンプリングを、商業的販売者（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）によるエンドトキシンテストのために提出したところ、結果は、球が、＜０．０５ＥＵ／ｍｌのエンドトキシンレベルを含有したことを示した。
【０１７４】
アルギナートヒドロゲル球の製作
電圧発生器、垂直シリンジポンプおよび接地オートクレーブ可能ガラスコレクタ（grounded  autoclavable  glass  collector）からなる特注のエレクトロジェッティング（electro-jetting）デバイスを使用して、アルギナートヒドロゲル球を作製した。電圧が、アルギナート溶液を含有するシリンジおよび針にカップルしている一方、ゲル化浴を接地して回路を完成した。０．９％食塩水（ｐＨほぼ７．４、浸透圧ほぼ２９０ｍＯｓｍ）中に溶解し、ＢａＣｌ２ゲル化溶液（２０ｍＭ  ＢａＣｌ２、２５０ｍＭ  Ｄ−マンニトール、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨほぼ７．４、浸透圧ほぼ２９０ｍＯｓｍ）を使用して架橋した市販のアルギナート（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ２０（エンドトキシンレベルまたはＬＦ１０／６０  ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）の１．４％溶液を使用して、球を生成した１。
【０１７５】
異なる針ゲージ、電圧および流速を利用することにより、様々なサイズのアルギナートヒドロゲルミクロスフェアを生成した；３０Ｇの尖っていない針、電圧５ｋＶおよび２００μｌ／分の流速を使用して０．３ｍｍ球を生成し、２５Ｇの尖っていない針、電圧７ｋＶおよび２００μｌ／分の流速により０．４ｍｍ球を生成し、２５Ｇの尖っていない針、電圧５ｋＶおよび２００μｌ／分の流速により０．５ｍｍ球を生成し、２５Ｇの尖っていない針、電圧４ｋＶおよび１８０μｌ／分の流速により０．７ｍｍ球を生成し、１８Ｇの尖っていない針、電圧７ｋＶおよび２００μｌ／分の流速により０．９ｍｍ球を生成し、１８Ｇの尖っていない針、電圧６ｋＶおよび２００μｌ／分の流速により１ｍｍ球を生成し、１８Ｇの尖っていない針、電圧５ｋＶおよび１８０μｌ／分の流速により１．５ｍｍ球を生成し、１８Ｇの尖っていない針と電圧５ｋＶおよび１５０μｌ／分の流速により１．９ｍｍ球を生成した。全てのミクロスフェアは、無菌ガラス容器内で２５０ｍＬのＢａＣｌ２ゲル化溶液において架橋した。架橋の直後に、球をＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３２ｍＭ  ＮａＣｌ２、ｐＨほぼ７．４、ほぼ２９０ｍＯｓｍ）で４回洗浄し、４℃で一晩貯蔵した。マウスの腹膜腔への埋め込みの直前に、球を０．９％食塩水でさらに２回洗浄した。製作されたヒドロゲルのサンプリングを、商業的販売者（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）によるエンドトキシンテストのために提出したところ、結果は、ＬＦ１０／６０球が、３１．６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを含有した一方、ＳＬＧ２０ヒドロゲルが、＜０．０５ＥＵ／ｍｌのエンドトキシンレベルを含有したことを示した。
【０１７６】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）球合成
溶媒蒸発によって、中間の（０．３〜０．５ｍｍ）および大きな（１．５〜２．０ｍｍ）直径を有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｎ７０，０００〜９０，０００、Ｓｉｇｍａ）ミクロスフェアを調製した。６．５％濃度でジクロロメタン（Ｆｉｓｈｅｒ）にＰＣＬを溶解することにより、小さい直径のミクロスフェアを製作した。この溶液を、２００ｒｐｍのステンレス鋼４ブレードオーバーヘッドインペラを使用して撹拌した１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、８８ｍｏｌ％加水分解（hydrolyzed）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）溶液に滴下して導入した。７５分後に、この分散物を４００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、溶媒が全て蒸発するまでさらに１０５分間撹拌した。次に、このミクロスフェアを篩にかけ、水で数回洗浄し、液体窒素中で即時凍結し、一晩凍結乾燥させた。９％ポリマー濃度、０．５％ＰＶＡ溶液、および１５０ｒｐｍで撹拌する３ブレードオーバーヘッドインペラを使用して、大きなミクロスフェアを同様に調製した。
【０１７７】
埋め込み／移植手術
全ての動物プロトコルは、ＭＩＴ実験動物委員会（Committee  on  Animal  Care）によって承認され、全ての外科手技および術後ケアは、ＭＩＴ比較医学部門（Division  of  Comparative  Medicine）の獣医スタッフによって管理された。免疫適格性の（immune-competent）雄の非糖尿病またはＳＴＺ誘発糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）または雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を酸素中の３％イソフルランで麻酔し、その腹部の毛を剃り、ベタジン（betadine）およびイソプロパノールを使用して滅菌した。術前に、全てのマウスに、０．３ｍＬの０．９％食塩水を皮下に与えて脱水を予防すると共に、手術前鎮痛薬として０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のブプレノルフィンも皮下に与えた。腹部の正中線に沿って０．５ｍｍ切開し、鈍的解剖を使用して腹膜層を露出させた。その後、腹膜壁を鉗子で掴み、白線に沿って０．５〜１ｍｍ切開した。次に、所望の体積の球（膵島を含まない全ての材料並びにラット膵島を封入しているＳＬＧ２０球）を無菌ピペットに装填し、切開部を通して腹膜腔に埋め込んだ。その後、切開部を５−０先端テーパーポリジオキサノン（ＰＤＳ  ＩＩ）吸収性縫合糸を使用して閉じた。その後、創傷クリップおよび組織グルーを使用して、切開部にわたって皮膚を閉じた。
【０１７８】
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）手技に関して、術前鎮痛薬としてブプレノルフィン（０．０１〜０．０３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。次に、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内（ＩＭ）注射を使用してＮＨＰを鎮静させ、必要であればさらなる鎮静のためにＤＣＭ  ｖｅｔスタッフによって指示される通りにミダゾラムを追加した。体温を維持するために手技の最中は循環温水ブランケットの上に動物を維持し、タオルで覆った。注射による本発明者らの生体材料の剪断を予防するために、１８および１２ゲージのカスタム製造された（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）無菌ステンレス鋼針とスリップチップシリンジを使用して、０．５または１．５ｍｍの直径のＳＬＧ２０球いずれかを、４匹の非ヒト霊長類（カニクイザル）の背側（背中）領域に注射した。針をＮＨＰの背中に対して接線方向に挿入して、初回注射点からおよそ１〜２ｃｍ離して滑り込ませ（貫通させ（tunneled））、それにより最終的材料応答の部位の注射部位から注射部位を分けるようにした。球（０．５および１．５ｍｍ直径）を、本発明者らの非ヒト霊長類のうち４匹の側腹部の合計４つのスポットに注射した：それぞれ０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ直径球の埋め込みのため、左側腹部に２つのスポットおよび右側腹部に２つのスポット。食塩水を注射し、３匹の追加の霊長類のそれぞれ背中の左および右側に最小１ｃｍ切開して、４ｍｍ直径のＳＬＧ２０アルギナート円柱状ディスクを埋め込んだ。３−０ナイロンによる単一結節縫合またはＶｅｔＢｏｎｄ（組織グルー）のいずれかにより、切開部を閉じた。
【０１７９】
細胞、組織および材料の回収
所望の時点において、埋め込みまたは移植（封入された膵島による）後に、図に指定される通り、ＣＯ２投与と続く頸部脱臼によって、マウスを安楽死させた。ある特定の実例では、腹腔内洗浄を行って、自由に浮遊している腹腔内免疫細胞をすすぎ出して採取するために、５ｍｌの氷冷ＰＢＳを先ず注射した。次に、鉗子およびハサミを使用して、腹部の皮膚および腹膜壁に沿って切開し、腹腔内洗浄液容量をピペットで吸い出して、新しい１５ｍｌファルコンチューブ（それぞれ、５ｍｌのＲＰＭＩ細胞培養培地で準備した）に入れた。次に、洗浄ボトルの先端を腹腔に挿入した。次に、クレブス緩衝液を使用して、腹部から材料の球を全て洗い流し、採取のためにペトリ皿に入れた。全ての球が、洗い流されたまたは手動で回収された（腹腔内組織に直接的に線維を形成する場合）ことを確実にした後に、これを下流の処理およびイメージングのために５０ｍＬコニカルチューブに移した。腹腔内洗浄および球回収後に、残っている線維を形成した腹腔内組織も、下流のＦＡＣＳおよび発現解析のために切除した。
【０１８０】
非ヒト霊長類皮下回収に関して、材料を埋め込んだ場合と同様に、ＮＨＰに術前鎮痛薬としてもう一度ブプレノルフィン（０．０１〜０．０３ｍｇ／ｋｇ）を与え、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＭ注射を使用して鎮静させ、さらなる鎮静に必要であればＤＣＭ  ｖｅｔスタッフによって指示される通りにミダゾラムを用いた。体温を維持するために手技の最中は循環温水ブランケットの上に動物をもう一度維持し、タオルで覆った。次に、８ｍｍ直径の生検パンチを使用して、埋め込み２週間後およびその後に４週間後に、皮膚全体および皮下空間をサンプリングした。生検パンチ後に、単純結節パターンの３−０ナイロンおよびＶｅｔＢｏｎｄ（組織グルー）により、回収部位を閉じた。
【０１８１】
ＥＬＩＳｐｏｔマルチプレックスサイトカイン解析
プロテオームプロファイラーマウスサイトカインアレイパネルＡキット（カタログ番号ＡＲＹ００６、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、サイトカインアレイ解析を行った。この解析のため、ウエスタンブロッティングセクションにおいて、上述の通り、材料から直接的にタンパク質を抽出した。膜毎に、２００μｌのタンパク質溶液を、１００μｌの試料緩衝液（アレイ緩衝液４）および１．２ｍｌのブロッキング緩衝液（アレイ緩衝液６）と混合し、続いて１５μｌの再構成されたマウスサイトカインアレイパネルＡ検出抗体カクテルを添加し、室温で１時間インキュベートした。アレイ膜をブロッキング緩衝液（アレイ緩衝液６）と共に２時間、ロッキングプラットフォームシェーカー上でインキュベートした。次に、ブロッキング緩衝液を吸引し、調製された試料／抗体混合物を膜に添加し、一晩４℃で、ロッキングプラットフォームシェーカー上でインキュベートした。膜を２０ｍｌの１×洗浄緩衝液で１０分間、ロッキングプラットフォームシェーカー上で３回洗浄し、脱イオン水で１回リンスし、続いてフルオロフォアコンジュゲートストレプトアビジン（１：５，０００希釈、カタログ番号９２６−３２２３０、Ｌｉ−Ｃｏｒ）により室温で３０分間、ロッキングプラットフォームシェーカー上でプローブし、次に上述の通り、洗浄緩衝液でさらに３回、脱イオン水でもう一度洗浄した。８００ｎｍ波長におけるＯｄｙｓｓｅｙ検出（Ｌｉ−Ｃｏｒ、通し番号ＯＤＹ−２３２９）を使用して、抗体−抗原複合体を可視化させた。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、スポットの密度を解析した。
【０１８２】
統計解析
データは、平均±ＳＥＭとして表現し、時点当たりおよび処置群当たりＮ＝５匹のマウスを用いた。ラット研究については、処置当たりＮ＝３。これらの試料サイズは、以前の文献に基づき選択した。予期せぬ病気または罹患の場合を除いて、全ての動物を解析に含めた。動物コホートはランダムに選択した。治験責任医師は、盲検化せずに実験を行った。ｑＰＣＲまたはＦＡＣＳに関して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５において実行される通り、他に指示がなければ、対応のない両側ｔ検定またはボンフェローニ多重比較補正による一元配置ＡＮＯＶＡのいずれかにより、統計的有意性についてデータを解析した；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００１および＊＊＊：ｐ＜０．０００１。ハイスループットＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく遺伝子発現解析データを、マクロファージサブタイプおよび区画に基づきセットに分けた。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ陽性対照の幾何平均を使用してデータを正規化し、陰性対照の平均を使用してバックグラウンドレベルを確立した。ハウスキーピング遺伝子のＴｕｂｂ５、Ｈｐｒｔ１、ＢａｃｔおよびＣｌｔｃを使用して、試料間を正規化した。次に、データを対数変換した。サブタイプ、時間および区画群毎に、遺伝子におけるサイズ遮断の効果の二元配置ＡＮＯＶＡを行った。テューキーのＨＳＤ（Honest  Significant  Difference）検定を使用して行ったペアワイズ比較からＰ値を算出し、ボンフェローニ補正を使用して、全体的な誤り率を制御した。
【０１８３】
結果
生体適合性における球直径の効果を調査するために、本発明者らは、非常に狭いサイズ分布で、８種の異なるサイズ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．７ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．５および１．９ｍｍのＢａＣ架橋ＳＬＧ２０アルギナートヒドロゲル球を製作した（図１１）。次に、これらの球（３５０μｌ／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込み、そこで１４日間保持した。この期間の後に、安楽死させたマウスから球を収集し、細胞沈着および線維症に関して研究した（図１２Ａ〜図１２Ｄ）。回収された球の暗視野位相差像は、そのサイズが増加するにつれて、球上への細胞沈着が著明に低下することを示す。球における細胞沈着は、ＤＡＰＩ（核マーカー）、Ｆ−アクチン（細胞の細胞骨格マーカー）およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、筋線維芽細胞マーカー）を使用したＺスタック共焦点イメージングを使用して試験した。興味深いことに、より大きな球は、有意に低下した線維性沈着を有した。宿主免疫細胞マーカーのＣＤ６８（マクロファージ）、Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ−ＧＲ１（好中球）およびＴＧＦ−β（炎症マーカー）に対する追加の免疫染色も、より大きな球における免疫細胞沈着低下を示した。追加の線維症マーカー、すなわち、コラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）、コラーゲン１ａ２（Ｃｏｌ１ａ２）およびα−ＳＭＡのｑＰＣＲ発現解析は、球サイズが増加するにつれて低下した細胞沈着をさらに示した（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。球における細胞の過剰増殖内のα−ＳＭＡ発現のウエスタンブロット解析は、球サイズが増加するにつれて有意な減少を示した（図１２Ｄ）。
【０１８４】
サイズモジュレートされた線維化応答効果が、単純に表面積の関数ではないことを確実にするために、２種のサイズの０．５ｍｍおよび１．５ｍｍの球を埋め込み、総表面積において正規化した。換言すれば、１００μｌ／マウスの中間のサイズの球および３００μｌ／マウスの大きなサイズの球をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込み、次いで１４日後に回収した。回収された球の暗視野位相差像は、１．５ｍｍ球におけるごく限られた細胞沈着および０．５ｍｍ球における有意な細胞沈着を明らかにした。これらの知見は、この現象が、サイズ媒介性であり、埋め込まれた材料の総表面積に依存しないことを示す。
【０１８５】
線維症における埋め込みサイズの効果が、より大きなサイズの球における細胞沈着の動態における遅延に関係するかについて調査した。この仮説を研究するために、０．３ｍｍおよび１．５ｍｍ  ＳＬＧ２０アルギナートヒドロゲル球を、有意により長い期間である６ヶ月間、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込んだ。６ヶ月後に、埋め込まれたヒドロゲル球を回収し、細胞沈着に関して試験した。回収されたカプセルの暗視野位相差像は、１．５ｍｍ球が、細胞沈着を大部分は欠く一方で、０．３ｍｍ球が、沈着細胞で覆われており、一体に集塊していることを示す。
【０１８６】
このようなサイズモジュレートされる線維性沈着現象が、埋め込みにおいてより高レベルの線維化反応（fibrotic  reaction）を生じることが公知の他の材料に拡張されるか否かについて評価した。この目的のために、ＳＬＧ２０アルギナート（無菌グレードアルギナート）、ＬＦ１０／６０アルギナート（医薬品グレードアルギナート）、ステンレス鋼、ガラス、ポリカプロラクトンおよびポリスチレンで構成された中間のサイズ（０．４〜０．６ｍｍ）およびより大きなサイズ（１．５〜２．５ｍｍ）の球を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内空間に埋め込んだ。ここで評価した材料球の表面の粗さは、相対的に滑らかな表面の材料（＜１μｍ粗さ）のみを含んだ。埋め込み１４日後に回収された材料の明視野像は、テストした全ての材料の中間サイズバージョンにおける有意な細胞沈着を明らかにした。興味深いことに、サイズ増加におけるテストした全ての材料は、細胞の過剰増殖沈着の厚さの著明な低下をもたらした。回収した材料の免疫蛍光染色したｚスタック共焦点像は、テストした全ての材料に及ぶマクロファージ（ＣＤ６８）および筋線維芽細胞（アルファ−ＳＭＡ）沈着の有意な減少を示す；有意には、大きなＳＬＧ２０アルギナート、ＬＦ１０／６０（エンドトキシン含有アルギナート）、ガラスおよびステンレス鋼の球は、無視できる細胞沈着を有した。
【０１８７】
（実施例５）異なるサイズの球に対する自然免疫応答の評価
材料および方法
ｑＰＣＲ解析
製造業者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、切除直後に液体窒素で手早く凍結（snapfrozen）した組織（末梢組織単独、球単独、および／または存在するのであれば接着細胞および線維性過剰増殖と共に、ならびにｉｐ洗浄液単独）から全ＲＮＡを単離した。加えて、完全な組織破壊を確実にできるようにするために、ポリトロンホモジナイザーによる強い機械的破壊も用いた。よって、全体を通して示された遺伝子発現サインは、回収された材料の上および／またはその周りに存在する細胞集団全体に比例的かつ代表的である。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（カタログ番号４３６８８１４；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した逆転写の前に、試料毎に容量２０μｌに同じインプット１μｇ全ＲＮＡをロードすることにより、比較のために全ての試料を先ず正規化した。総容量１６μｌ（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎおよびＰＣＲプライマーを含む）におけるｃＤＮＡ（４．８μｌ；１：２０希釈）を、次のプライマーを用いたｑＰＣＲによって増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してプライマー（表２）を設計し、ＬａｓｅｒＧｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して評価して、マウスまたはラット（宿主）特異性のいずれかを確実にした。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、試料を９５℃で１０分間インキュベートし、続いて４０サイクルの９５℃１５秒間および６０℃１分間を行った。製造業者によって記載される通りに比較ＣＴ（ＤＤＣＴ）方法を使用して、結果を解析した。比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）方法を使用して結果を解析し、各試料のβ−アクチンＲＮＡ含量に対する正規化後に、モック埋め込み対照細胞試料（末梢腹腔内脂肪組織または自由に浮遊している腹腔内洗浄細胞）のいずれかにおけるＲＮＡ発現と比較した相対的ＲＮＡレベルとして提示する。材料球単独に関して、０．３または０．５ｍｍアルギナートＳＬＧ２０球のいずれかと比べて全てを比較した。加えて、複数の回収時点にわたる適切な正規化および試料取扱いをさらに確実にするために、収集条件（すなわち、記載されている通り、ｉｐ洗浄液、接着細胞および線維症ありまたはなしの球、ならびに侵入による末梢組織）毎の全ての試料のＲＮＡを並行して定量し、逆転写し、ｑＰＣＲによって解析した。マウス特異的（宿主）またはラット（膵島）特異的フォワードおよびリバースプライマーセットを本研究に利用した（表２）。
【０１８８】
【表２】
2018521717.tif 000003
【０１８９】
結果
自然免疫細胞侵入に関して、埋め込みに対し末梢の網および精巣上体脂肪パッド組織を、フローサイトメトリー（図１３Ａおよび図１３Ｂ）およびｑＰＣＲ解析（図１４Ａ〜図１４Ｄ）の組合せを使用して評価した。これらの解析は、テストした全ての材料にわたって（ＳＬＧ２０アルギナート、ＬＦ１０／６０アルギナート、ステンレス鋼、ガラス、ポリカプロラクトンおよびポリスチレン）、増加する球サイズが、末梢組織における自然免疫細胞蓄積の有意な低下をもたらしたことを明らかにした。これらの知見は、マルチプレックス炎症性マウスサイトカインプロファイルによりさらに検証された。注目すべきことに、軟（アルギナートヒドロゲル、＜１００ｋＰａ；Papajovaら、Carbohydrate  polymers  ９０巻（１号）：４７２〜４８２頁（２０１２年））から硬（ステンレス鋼、１００の台のＧＰａ）まで変動する、ある範囲の機械的剛性特性を有するある範囲の材料の本発明者らによる評価は、剛性以外のサイズおよび形（shaper）が、生体適合性において決定的な役割を果たすことを実証する。
【０１９０】
（実施例６）より大型の動物における研究
材料および方法
回収された材料球のイメージング
位相差イメージングのため、クレブス緩衝液を使用して、回収された材料を穏やかに洗浄し、Ｅｖｏｓ  Ｘｌ顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｇｒｏｕｐ）を使用した位相差顕微鏡検査のために３５ｍｍペトリ皿に移した。回収された材料の明視野イメージングのため、クレブス緩衝液を使用して試料を穏やかに洗浄し、Ｌｅｉｃａ実体顕微鏡を使用した明視野イメージングのために３５ｍｍペトリ皿に移した。
【０１９１】
共焦点免疫蛍光
免疫蛍光イメージングを使用して、球に付着した免疫集団を決定した。マウスから材料を回収し、４℃で４％パラホルムアルデヒドを使用して一晩固定した。次に、試料をクレブス緩衝液で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００溶液を使用して３０分間透過処理し、その後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用して１時間ブロッキングした。次に、ＢＳＡ中のＤＡＰＩ（５００ｎＭ）、特異的マーカープローブ（１：２００希釈）からなる免疫染色カクテル溶液中で球を１時間インキュベートした。染色後に、球を０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で３回洗浄し、５０％グリセロール溶液中に維持した。次に、ガラス底ディッシュに球を移し、５および１０×対物レンズを備えたＬＳＭ  ７００ポイント走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｊｅｎａ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して画像化した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して、得られた像を提示のために直線的に調整した。
【０１９２】
結果
この観察されたサイズモジュレートされる線維化効果を、より大型のげっ歯動物モデルに置き換えることができるかについて試験した。これを試験するため、０．５ｍｍおよび２．０ｍｍガラス球を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腹腔内空間に埋め込み、次いで１４日後に材料を回収した。回収されたガラスミクロスフェアから得られた明視野およびＺスタック共焦点像は、大きな球が、いかなる細胞沈着も欠く一方、より小さい球が、有意に一体に集塊し、厚い線維性カプセル内に包埋されたことを示す。線維症マーカーのコラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）、コラーゲン１ａ２（Ｃｏｌ１ａ２）およびαＳＭＡのｑＰＣＲ発現解析は、球３サイズの増加が、球における直接的な線維症形成の有意な低下をもたらしたことを確かめた（図１５）。これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける本発明者らのサイズ依存性線維化応答の観察が、他のより大型のげっ歯動物種にも置き換えられることを示唆する。
【０１９３】
（実施例７）非ヒト霊長類における研究
材料および方法
Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色のための組織学的処理
４℃で４％パラホルムアルデヒドを使用して、回収された材料を一晩固定した。固定後に、７０％アルコールを使用して、アルギナート球または回収された組織試料を洗浄した。次に、材料を摂氏（calcium）４度に冷却されたＨｉｓｔｏｇｅｌ（ＶＷＲ、カタログ番号６０８７２−４８６）と混合した。モールド硬化後に、標準組織学的方法に従って、パラフィン包埋、切片作製および染色のためにブロックを処理した。
【０１９４】
結果
これらの知見をより高等な種に、また、他の埋め込み部位に置き換えることができるかを評価するために、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ球（Ｎ＝４）ならびに円柱（４ｍｍ直径×１ｍｍ高さ；Ｎ＝２）として調製されたＳＬＧ２０アルギナートヒドロゲルを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の背側領域の皮下に１４または２８日間埋め込んだ。埋め込み１４および２８日後の両方の回収時点において、１．５ｍｍ  ＳＬＧ２０アルギナート球は、宿主組織に包埋されておらず、生検パンチでの切開における埋め込み部位から自由に分離された。回収された１．５ｍｍ過剰増殖。回収された大きな球のＨ＆Ｅ染色された切片は、無視できる細胞沈着および線維症の欠如を確認した。逆に、１４および２８日目両方の回収時点で、埋め込まれた０．５ｍｍ球および円柱は、宿主組織に大量に包埋されていた。ＳＬＧ２０アルギナート１．５ｍｍ球、０．５ｍｍ球、円柱の埋め込み部位から得た切除された組織、および食塩水を注射された対照組織を、Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色の組合せを使用した組織学的解析により試験した。得られた像は、大きな球の包埋または線維症の欠如を確認する。しかし、埋め込まれた円柱および中間のサイズの球を包む、広範な包埋および線維症構築（最大１００μｍ厚）が目に見える。
【０１９５】
皮下背側ＮＨＰ観察を、ＮＨＰの腹腔内部位に置き換えることができることを確認するために、より小さい方のＳＬＧ２０アルギナートヒドロゲルを、最小に侵襲的な腹腔鏡手技を使用して、非ヒト霊長類（処置当たりｎ＝１）に別々に埋め込んだ。腹腔鏡カメラを使用して、埋め込み直後に、および埋め込み１４日後に再度球の像およびビデオを記録した。得られたｉｎ  ｓｉｔｕ像は、１４日後に１．５ｍｍ球が半透明のままであり、宿主網／脂肪組織に包埋されていないことを明らかにする；逆に、０．５ｍｍ球は、網／脂肪組織に妨害される（impeded）。埋め込み１４日後の食塩水によるＩＰ洗浄は、ＳＬＧ２０  １．５ｍｍ球の回収を可能にした；しかし、ＩＰ宿主組織（網）内への強い接着および包埋のため、０．５ｍｍ球は、回収することができなかった。暗視野イメージングを使用して、回収された１．５ｍｍ球を試験したところ、無視できる細胞の過剰増殖で透明に見える。回収された１．５ｍｍ球のＺスタック共焦点イメージングは、最小の細胞沈着、免疫マクロファージ、および線維症関連の活性化された筋線維芽細胞被覆の欠如を確認する。ＮＨＰ網内の０．５ｍｍ球の包埋を検証するために、生検パンチを使用して、組織学的解析のためにこの組織の試料を切除したところ、その包埋および中間のサイズの球を包む有意な線維化組織構築が観察されたことを確認した。
【０１９６】
（実施例８）埋め込まれたデバイスによる研究
材料および方法
ラット膵島単離、精製および封入
膵島を収集するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）からの、およそ３００グラムの重さの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。全てのラットは、１：２０のキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔し、各注射の総体積は、ラットの体重に応じて０．４ｍｌ〜０．５ｍｌであった。LacyおよびKostianovskyによって記載されている通りに単離手術を行った２。簡潔に説明すると、胆管にカニューレを挿入し、ＲＰＭＩ  １６４０培地中の０．１５％リベラーゼ（Liberase）（研究グレード、Ｒｏｃｈｅ）の溶液のｉｎ  ｖｉｖｏ注射によって膵臓を膨張させた。ラットは、下行大動脈を切ることによって屠殺し、膨張した膵臓臓器を取り出し、全ての手術が完了するまで、氷上の５０ｍｌコニカルチューブ内に保った。全てのチューブを３７℃の水浴中に置いて３０分間消化し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩＦＢＳ）を含有する冷Ｍ１９９培地を１０〜１５ｍｌ添加し、軽く振とうすることによって、消化を停止した。消化された膵臓を、上述の同じＭ１９９培地で２回洗浄し、４５０μｍの篩を通してろ過し、その後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ）／Ｍ１９９培地勾配中に懸濁し、１，７００ＲＣＦで４℃にて遠心分離した。勾配内で形成された膵島層の厚さに応じて、高純度の膵島のためにこの工程を繰り返した。最後に、膵島を勾配から採取し、一連の６つの重力沈降によってさらに単離し、ここで、それぞれの上清は４分間の沈下の後に廃棄した。精製された膵島は、光学顕微鏡下で、一定分量ずつ手で数え、その後、無菌の１×リン酸緩衝食塩水において３回洗浄した。その後、膵島を、１０％ＨＩＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で１回洗浄し、さらなる使用のためにこの培地中で一晩培養した。
【０１９７】
封入の直前に、培養された膵島を１，４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、Ｃａを含有しないＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液（４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨほぼ７．４、ほぼ２９０ｍＯｓｍ）で洗浄した。洗浄後に、膵島を再度遠心分離し、全ての上清を吸引した。次に、膵島沈渣を、０．９％ＮａＣｌ溶液中に溶解した１．４％ＳＬＧ２０アルギナート溶液に、０．７５ｍｌアルギナート溶液当たり１，０００個の膵島の膵島密度で再懸濁した。ＢａＣｌ２ゲル化溶液を使用して球を架橋し、空の球と同様の手技を使用してそのサイズを制御した（上述）。架橋の直後に、封入された膵島をＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、１０％ＨＩＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地１６４０で２回洗浄し、移植のために３７℃で一晩培養した。膵島は、不定サイズ（５０〜４００μｍ）を有し、封入プロセス中に膵島の不可避な損失があったため、封入された膵島の総数を再度数え、移植前に、以前に発表された方法３に基づき膵島当量（ＩＥ、１５０μｍサイズに正規化）に換算した。
【０１９８】
血糖モニタリング
インスリン依存性糖尿病マウスを作り出すために、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＩＴへの出荷前にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いて販売者（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）が処理した。全てのマウスの血糖レベルを、移植前に再テストした。２日続けて非絶食時血糖レベルが３００ｍｇ／ｄＬ超であったマウスのみが、糖尿病とみなされ、移植を受けた。
【０１９９】
膵島含有アルギナートカプセルの移植後に、血糖レベルを１週間に３回モニタリングした。ランセットを使用して尾静脈から血液の小液滴を採取し、市販のグルコメーター（glucometer）（Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｏｎｅ、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を使用してテストした。非絶食時血糖レベルが２００ｍｇ／ｄＬ未満のマウスを正常血糖とみなした。全てのマウスが高血糖状態に戻るまでモニタリングを継続し、その時点でマウスを安楽死させ、球を回収した。
【０２００】
ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロット解析のために、材料から直接的にタンパク質を抽出した。タンパク質解析のため、プロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤単回使用カクテル、カタログ番号７８４３０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＰｉｅｒｃｅ  ＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号８９９０１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に氷上で材料を浸漬することにより、回収された材料を調製し、続いて超音波処理（３０秒間オン、３０秒間オフ、７０％振幅で２回）によって溶解した。次に、試料を２時間４℃で一定の撹拌に付した。次に、ライセートを２０分間１２，０００ｒｐｍで４℃にて遠心分離し、タンパク質含有上清を新たなチューブ内に採取し、氷上に維持した。脂肪組織由来の試料では、上清を移す前に、過剰な脂肪（上清上の上層）を先ず除去した。レーン毎に２０μｇタンパク質（ＢＣＡアッセイによって定量、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット、カタログ番号２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を９５℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ａｎｙ  ｋＤ  １５ウェルコームミニゲル、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号４５６−９０３６）で電気泳動し、次いでニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６２−０２１３）にブロットした。抗α平滑筋アクチン抗体（１：４００希釈、アルファ平滑筋アクチンに対するウサギポリクローナル；カタログ番号ａｂ５６９４、ＡｂＣａｍ）、抗ＰＤＸ１抗体（１：１０００希釈、膵臓＆十二指腸ホメオボックス１に対するウサギポリクローナル；カタログ番号０６−１３７９、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびローディング対照としての抗β−アクチン抗体（１：４０００希釈、マウスにおいて産生されたモノクローナル抗β−アクチン抗体；カタログ番号Ａ１９７８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と、続くロバ抗ウサギ（１：１５，０００希釈、カタログ番号９２６−３２２１３、Ｌｉ−Ｃｏｒ）およびヤギ抗マウス（１：１５，０００希釈、カタログ番号９２６−６８０７０、Ｌｉ−Ｃｏｒ）フルオロフォアコンジュゲート二次抗体により、ブロットをプローブした。７００および８００ｎｍ波長でＯｄｙｓｓｅｙ検出（Ｌｉ−Ｃｏｒ、通し番号ＯＤＹ−２３２９）を使用して、抗体−抗原複合体を可視化した。
【０２０１】
Ｎｅｗｐｏｒｔ  ＧｒｅｅｎおよびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ膵島染色
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞傷害性キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ；カタログ番号Ｌ−３２２４）を製造業者の指示に従って使用して、封入後の膵島の生存率を評定した。ＤＡＰＩと組み合わせた細胞浸透性色素であるＮｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎ（商標）ＤＣＦジアセテート（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ；カタログ番号Ｎ−７９９１）を使用して、回収後に封入された膵島細胞を染色した。
【０２０２】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析
モック埋め込み／モック処置された（ＭＴ）対照、または０．５もしくは１．５ｍｍアルギナート球保有マウス（ｎ＝４／群）のＲＮＡを、記載されている通りに、埋め込み後の種々の時点で採取された組織試料から単離した。それぞれのＲＮＡを定量し、適切な濃度（１００ｎｇ／μｌ）に希釈し、次いで本発明者らのカスタマイズされたマルチプレックス遺伝子マウスマクロファージサブタイプ決定パネルによる発現解析のためにＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ製造業者プロトコルに従って、各試料の５００ｎｇを処理した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）定量後にＲＮＡレベル（絶対的コピー数）を得て、ｎＳｏｌｖｅｒ解析ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して群試料を解析した。
【０２０３】
結果
材料形状を調査して、これが、埋め込まれた生体医療デバイスの改善された／長期の機能を生じ得るかについて確かめた。この効果を研究するために、従来のサイズの０．５ｍｍアルギナートミクロカプセル内に免疫単離（immunoisolated）／封入されたランゲルハンス（膵島）の膵島の生存を、１．５ｍｍカプセル内に保護された膵島と比較して評価した。以前に、移植された０．５ｍｍアルギナートミクロカプセルの表面における細胞およびコラーゲン沈着による宿主認識および線維症が、ＳＴＺ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける封入された膵島グラフト細胞死および糖尿病補正の失敗をもたらすことが示された。注目すべきことに、膵島封入の文脈において、ヒドロゲルカプセルの直径は、大部分で見落とされるパラメータであり、本発明者らの観察に基づき、これは、移植されたグラフトの有効性の改善において重要な役割を果たし得る。さらに、小さいカプセル（＜３５０μｍ）が、中間の（３５０〜７００μｍ）およびより大きなカプセル（＞７００μｍ；ｒｅｆ．４０）よりも、封入された膵島への栄養素および酸素の優れた拡散および輸送を可能にすることが伝統的に仮定されてきた。よって、本発明者らの知る限りでは、より大きな１．５ｍｍ球状カプセルは、膵島細胞封入について以前に評価されていない。
【０２０４】
ＳＴＺ誘発糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのラット膵臓膵島の移植の異種間処置モデルを使用して、細胞生存におけるカプセルサイズの役割を調査した。ラット膵島（マウス当たり５００ＩＥ）を、１．５ｍｍまたは０．５ｍｍ球として調製されたＳＬＧ２０アルギナートヒドロゲルに別々に封入した。これらの研究のため、０．３２５ｍｌアルギナート溶液当たり５００ＩＥの膵島密度調製を使用したが、その理由として、この密度では、カプセルの外側における膵島の突出がほとんど観察されなかったことが挙げられる。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を使用して、封入後の膵島の生存率を確認した（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。より大きなサイズの１．５ｍｍカプセルの使用による潜在的拡散障壁を調査するために、移植前に、膵島を搭載した１．５ｍｍおよび０．５ｍｍカプセル内におけるグルコースおよびインスリン拡散の両方の動態を評価した。カプセル形状の関数として、グルコース（図１７Ａおよび図１７Ｂ）またはインスリン（図１８Ａ〜図１８Ｄ）の拡散動態における有意差は観察されなかった。移植後に、経時的に細胞グラフト機能を非侵襲的にモニタリングするための指標として血糖（ＢＧ）補正を使用し、１週間に少なくとも３回測定を行った。０．５ｍｍカプセル群における全てのマウス（ｎ＝５）が、平均して移植３０日後までに失敗した（すなわち、３回続けての測定で２ｍｇ  ｍｌ−１を上回るＢＧ）一方、１．５ｍｍカプセル群（ｎ＝５）において、平均して、実験が停止される移植１７５日後まで（５倍を超える増加）回復を維持した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。実験の残りを通して０．５ｍｍ群によるＢＧ調節における初期失敗後に（２５日目前後）、ＢＧ正常化（図１６Ａ）および回復した割合（fraction  cured）（図１６Ｃ）の両方における差は、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍカプセル群の間で有意に異なった（ｐ＜０．０００１）。移植７日後に、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を使用して、血糖補正の動態を評価したところ、カプセル形状の関数として有意な遅延は測定されなかった（図１６Ｂ）。
【０２０５】
本研究の終了時に、移植６ヶ月後に、カプセルを回収し、線維症および生存可能な膵島の存在について解析した。暗視野イメージングは、０．５ｍｍカプセルが、細胞沈着に覆われ集塊した一方、１．５ｍｍカプセルが、大部分はきれいで、細胞沈着を欠くことを明らかにした。回収された０．５ｍｍおよび１．５ｍｍから取得した共焦点像は、１．５ｍｍカプセル群のみにおける染色を示す。各群における回収されたカプセルから抽出されたタンパク質においてウエスタンブロットアッセイも行って、ＰＤＸ−１（膵島生存能マーカー）およびα−ＳＭＡ（線維症マーカー）の相対的発現をモニタリングした。このアッセイのため、各マウスから回収されたカプセルのおよそ５０％を消化し、総タンパク質抽出のために処理した。０．５ｍｍカプセル群における５匹のマウスのうち４匹は、比較的縮小したＰＤＸ−１発現を有し、全５匹のマウスは、高レベルのα平滑筋発現を示した；逆に、高レベルのＰＤＸ−１および最小のα−ＳＭＡが、１．５ｍｍカプセル群における全５匹のマウスから回収されたカプセルにおいて検出された。回収されたカプセルから単離されたＲＮＡのｑＰＣＲ解析を使用して、ＰＤＸ−１発現結果をさらに検証したところ、０．５ｍｍカプセル群と比較して、１．５ｍｍカプセルにおいておよそ８倍高いレベルのラットＰＤＸ−１が検出可能であった。組み合わせると、整えられた形状のヒドロゲルは、より長い持続時間線維症に抵抗することができたため、本発明者らの結果は、１．５ｍｍカプセルにおけるグラフトが、従来のサイズの０．５ｍｍカプセルで調製されたものよりもおよそ６倍長く生存したことを示唆する。興味深いことに、カプセルにおける有意な線維症構築は、１８０日後の回収時に観察されなかったが、この処置群におけるマウスは、およそ１４０日後に血糖制御を失った。これはおそらく、この処置モデルにおいて使用されるラット膵島の長期耐久性に関係する可能性がある、移植後のある程度の膵島生存能損失を示唆する。
【０２０６】
（実施例９）埋め込み後の宿主媒介性自然免疫認識の動態プロファイリング解析
材料および方法
インスリン分泌動態
５０個のラット膵島を裸でまたは０．５ｍｍおよび１．５ｍｍアルギナートカプセルに封入して、カルシウム測定に使用される同じミクロ流体デバイスに搭載することにより、膵島インスリン応答を評定した。自動フラクションコレクタ（Ｇｉｌｓｏｎ、モデル２０３Ｂ、ＷＩ、ＵＳＡ）により、灌流液（perifusate）試料を１分間毎に採取した（５００μＬ／分）。げっ歯動物化学発光インスリンＥＬＩＳＡ（Ａｌｐｃｏ、ＮＨ、ＵＳＡ）を使用して、インスリン濃度を１分間おきに定量した。次の灌流（perifusion）プロトコルを使用した：１）ＫＲＢ２（０〜２０分間）；２）２０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭ  ＫＣｌ（２０〜５５分間）；３）ＫＲＢ２（５５〜１００分間）。一元配置ＡＮＯＶＡ（有意としてｐ＜０．０５）を使用して群を統計的に比較するために、インスリン曲線（裸の、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍはｎ＝３）毎の曲線下面積を計算した。
【０２０７】
ＦＡＣＳ解析
製造業者のプロトコルに従ってｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して、新鮮に切除された組織の単一細胞懸濁液を調製した。受動的ＰＥＢ解離緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ）において単一細胞懸濁液を調製し、懸濁液を７０μｍフィルター（カタログ番号２２３６３５４８、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に通した。このプロセスは、表面に接着する大部分の細胞を除去した（＞９０％）。次に、全ての組織および材料試料に由来する、単一細胞集団を、５ｍｌの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（カタログ番号００−４３３３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）による赤血球溶解に５分間４℃で付した。２０ｍｌの無菌１×ＰＢＳの添加により反応を終結させた。残っている細胞を３００〜４００ｇで４℃にて遠心分離し、抗体インキュベーションのために最小容量（ほぼ５０μｌ）のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２）に再懸濁した。次に、暗所で２５分間４℃にて、細胞マーカーであるＣＤ６８（試料当たり１μｌ（０．５μｇ）；ＣＤ６８−Ａｌｅｘａ６４７、クローンＦＡ−１１、カタログ番号１１−５９３１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｇ（Ｇｒ−１）（試料当たり１μｌ（０．５μｇ）；Ｌｙ−６Ｇ−Ａｌｅｘａ−６４７、クローンＲＢ６−８Ｃ５、カタログ番号１０８４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（試料当たり１μｌ（０．２μｇ）；またはＣＤ１１ｂ−Ａｌｅｘａ−４８８、クローンＭ１／７０、カタログ番号１０１２１７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に特異的な蛍光タグ付けされたモノクローナル抗体のうち２種により、全ての試料を共染色した。次に、２ｍｌのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅフローサイトメトリー染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加し、試料を４００〜５００ｇで５分間４℃にて遠心分離した。上清を吸引により除去し、この洗浄工程を染色緩衝液でさらに２回繰り返した。３回目の洗浄後に、各試料を５００μｌのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カタログ番号３４２９７５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した最終的なＦＡＣＳ解析のために４０μｍフィルター（カタログ番号２２３６３５４７、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通した。適切なバックグラウンドおよびレーザー強度設定のため、染色されていない単一の抗体およびＩｇＧ（Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−６４７のいずれかで標識、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）対照も実行した。
【０２０８】
結果
埋め込みサイズの関数としての自然免疫応答についてより良く理解するために、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ  ＳＬＧ２０アルギナート球の埋め込み後に、２８日間の期間にわたり（図２０Ａ〜図２０Ｃ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、宿主媒介性自然免疫認識の動態プロファイリング解析を行った。フローサイトメトリーを使用して、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍサイズの球において直接的に、埋め込み１、４、７、１４および２８日後に、骨髄性細胞１（図２０Ａ）、好中球（図２０Ｂ）およびマクロファージ（図２０Ｃ）の蓄積を定量した。評価した全ての時点において、１．５ｍｍ球と比較して、０．５ｍｍ球における骨髄性細胞の蓄積の有意な増加が観察された（図２０Ａ）。マクロファージ細胞および好中球細胞の探索において、埋め込み４日後までに、０．５ｍｍ球における有意に増加した蓄積が観察され、これは、７日目までにプラトーであるようである（図２０Ｃおよび図２０Ｃ）。注目すべきことに、１．５ｍｍ球において、無視できる数の好中球細胞ならびに限られた数の骨髄性細胞およびマクロファージ細胞が全ての時点で観察された。
【０２０９】
（実施例１０）埋め込まれた材料に対する異物反応の重要な駆動体
材料および方法
インスリン分泌動態
５０個のラット膵島を裸で、または０．５ｍｍおよび１．５ｍｍアルギナートカプセルに封入して、カルシウム測定に使用される同じミクロ流体デバイスに搭載することにより、膵島インスリン応答を評定した。自動フラクションコレクタ（Ｇｉｌｓｏｎ、モデル２０３Ｂ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって、灌流液試料を１分間毎に（５００μＬ／分）採取した。げっ歯動物化学発光インスリンＥＬＩＳＡ（Ａｌｐｃｏ、ＮＨ、ＵＳＡ）を使用して、インスリン濃度を１分間おきに定量した。次の灌流プロトコルを使用した：１）ＫＲＢ２（０〜２０分間）；２）２０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭ  ＫＣｌ（２０〜５５分間）；３）ＫＲＢ２（５５〜１００分間）。一元配置ＡＮＯＶＡ（有意としてｐ＜０．０５）を使用して群を統計的に比較するために、インスリン曲線（裸の、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍはｎ＝３）毎の曲線下面積を計算した。
【０２１０】
膵島細胞内カルシウムのリアルタイム蛍光イメージング
封入された膵島のために修飾されたミクロ流体デバイスにおいて、膵島細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉのリアルタイム蛍光イメージングを行った４。簡潔にまとめると、５０個のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット膵島を裸でまたはアルギナートカプセル（０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ直径）に封入して、２ｍＭグルコース（ＫＲＢ２）および０．５％ＢＳＡを補充したクレブス・リンゲル緩衝液（ＫＲＢ）において３７℃で５μＭ  Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（カルシウム指標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に３５分間インキュベートした。次に、倒立落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ４００Ｂ、ＩＬ、ＵＳＡ）に備え付けられたミクロ流体デバイスに、膵島を搭載した。過剰な色素をＫＲＢ２で３５分間、５００μＬ／分にて洗い流した。二重波長Ｆｕｒａ−２／ＡＭ色素を、３４０および３８０ｎｍでレシオメトリックに励起し、［Ｃａ２＋］ｉレベルの変化をＦ３４０／Ｆ３８０（基底２ｍＭグルコースからの％増加）として表現する。Ｌａｍｂｄａ  ＤＧ−４波長スイッチャに備え付けられた励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＶＴ、ＵＳＡ）によって、励起波長を制御した。Ｆｕｒａ２／ＦＩＴＣ多色性（polychroic）ビームスプリッターおよびダブルバンド発光フィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒ：７３．１００ｂｓ）を使用して、Ｆｕｒａ−２／ＡＭの発光にフィルターをかけた。ＳｉｍｐｌｅＰＣＩソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｏｒｐ、ＩＬ、ＵＳＡ）をイメージング取得および解析に使用した。高速高分解能電荷結合（charge  coupled）カメラ（ＣＣＤ、Ｒｅｔｉｇａ−ＳＲＶ、Ｆａｓｔ  １３９４、ＱＩｍａｇｉｎｇ）により、これらの像を収集した。
【０２１１】
次の灌流プロトコルにより、個々の膵島細胞内カルシウム応答を評定した：１）ＫＲＢ２（０〜５分間）；２）２０ｍＭグルコース（５〜２５分間）；３）ＫＲＢ２（２５〜４５分間）；４）３０ｍＭ  ＫＣｌ（４５〜６０分間）；５）ＫＲＢ２（６０〜７０分間）。一元配置ＡＮＯＶＡ（有意としてｐ＜０．０５）を使用して群を統計的に比較するために、期間毎の曲線下面積を個々の膵島毎に計算した。げっ歯動物単離物の３個の別々のバッチを評定に使用し、そこでは、同じバッチの膵島（裸の膵島、ｎ＝５９；０．５ｍｍ、ｎ＝４９；１．５ｍｍ、ｎ＝４３）から各条件をテストした。
【０２１２】
生体イメージングおよびＭＡＦＩＡ枯渇
生体イメージングのため、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍサイズのＳＬＧ２０ヒドロゲルに、Ｑｄｏｔ  ６０５（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を搭載し、上述の通りＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰ−ＮＧＦＲ／ＦＫＢＰ１Ａ／ＴＮＦＲＳＦ６）２Ｂｃｋ／Ｊマウスへと外科的に埋め込んだ。埋め込み１、４または７日後に、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、元の手術の部位に小さな切開を施し、ビーズを露出させた。マウスを倒立顕微鏡に置き、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶＢ−１０００  ＭＰ多光子顕微鏡における２５×のＮ．Ａ．１．０５対物レンズを使用して、励起波長８６０ｎｍで画像化した。像に応じて２０〜４５分間の時系列において２分間間隔で、２００μｍ（１０μｍ刻み）のＺスタックを取得した。マウスを一定のイソフルラン麻酔下に維持し、イメージングセッションを通してモニタリングした。Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ３Ｄ画像解析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、得られた像を解析した。
【０２１３】
加えて、対照（非枯渇）または誘導されたマクロファージ枯渇ＭＡＦＩＡマウスにおける線維症またはその欠如を調査するために、０．５ｍｍ  ＳＬＧ２０球を上述の通り移植した。標的化マクロファージ枯渇の場合、ｎ＝５匹のマウスの追加の群に、Ｂ／Ｂホモ二量体化物質（homodimerizer）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を静脈内（尾静脈）注射した。本発明者らによる１０ｍｇ／ｋｇのホモ二量体化物質ＡＰ２０１８７の静脈内注射のこれらのマウスにおける投与後に、有意なマクロファージ枯渇が達成された（ほぼ８０〜９０％、平均群減少＝８４．３６％、図２２）。３日前に、続いてアルギナート球埋め込み３日後に開始して回収まで３日毎に１回の、ＭＡＦＩＡモデルにおける反復枯渇は、移植された非枯渇対照ＭＡＦＩＡマウスのＩＰ空間に観察される腹膜レベルをはるかに下回ってマクロファージ数をノックダウンすることができた（ほぼ６５．２６％対ほぼ１０．２％；図２２）。
【０２１４】
結果
マクロファージは、埋め込まれた材料に対する異物反応の重要な駆動体として意味づけられている４１。埋め込まれた材料に対する線維化応答に向けたその役割を探索するために、ＳＬＧ２０アルギナート球を、マクロファージ細胞枯渇の誘導を可能にするトランスジェニックマウスモデル、ＭＡＦＩＡのＩＰ空間に移植した一連の実験を行った。このモデルにおいて、マクロファージＦａｓ誘導性アポトーシス導入遺伝子は、変異体ヒトＦＫ５０６結合タンパク質１Ａ、１２ｋＤａ（ｒｅｆ．４２）の発現を駆動するための、マウスコロニー刺激因子１受容体プロモーター（ＣＳＦ１Ｒ）を使用したマクロファージの誘導性／可逆性アポトーシスを可能にする。さらに、このモデルに含まれるＥＧＦＰ導入遺伝子は、マクロファージ細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ蛍光モニタリングを可能にする。
【０２１５】
第一に、線維化応答の駆動におけるマクロファージの重要性を確認するために、０．５ｍｍ  ＳＬＧ２０球を、マクロファージの枯渇を誘導するように処置したＭＡＦＩＡマウスおよび同様に対照として、枯渇なしのＭＡＦＩＡマウスのＩＰ空間に１４日間移植した。回収された球の暗視野顕微鏡像は、マクロファージが枯渇されたマウスに埋め込まれた球におけるごく限られた細胞沈着と、逆に、マクロファージを有するマウスから受け取った球における有意な細胞沈着を明らかにした（図２２）。これらの結果は、マクロファージが実際に、本発明者らの移植材料に応答して観察される線維化応答の重要な駆動体であることを確認する。
【０２１６】
第二に、リアルタイムでマクロファージ挙動をモニタリングするために、蛍光標識された、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍサイズの埋め込まれたアルギナート球におけるｉｎ  ｖｉｖｏ生体イメージングを行った。ＭＡＦＩＡマウスのＩＰ空間における球状埋め込みを研究した（図２３）。埋め込み１、４および７日後の、埋め込まれた中間のおよび大きなサイズの球から得たｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｚスタック生体内像は、マクロファージ細胞が、末梢脂肪パッド組織から溢出し、この１週間の期間にわたって０．５ｍｍ球に蓄積する一方、マクロファージが、１．５ｍｍ球付近にほとんど観察できないことを示す。埋め込み１、４および７日後の０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ球におけるマクロファージ蓄積のＺスタックおよびタイムラプス生体内像は、１．５ｍｍ球を囲むマクロファージの活性および数の欠如、ならびに０．５ｍｍ球周囲の有意なマクロファージの活性および数の両方を確認する。１．５ｍｍ球が、ごく僅かなマクロファージ細胞に囲まれているため、大きな球周囲のマクロファージは、活性化されるようになってはおらず、さらなるマクロファージの動員および血管外遊出の低下をもたらすことが仮定された。
【０２１７】
マクロファージ細胞は、環境シグナルに対するその効率的な応答および関係する刺激に取り組むためのその表現型の変化を可能にする、顕著な柔軟性を有する。３つの状態：すなわち、古典的活性化（炎症誘発性、Ｍ古典的）、代替的活性化（治癒促進性、Ｍ創傷）および調節性活性化（ＭＲｅｇ）にカテゴリー化することができる、広範囲のマクロファージ活性化が存在する。これらの表現型は、各活性化状態と相関する、特異的マーカーの遺伝子発現解析により特徴付けることができる。炎症誘発性マクロファージ表現型は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ１）およびインターフェロン調節因子５（ＩＲＦ５；マクロファージの創傷治癒促進性表現型は、樹状細胞免疫受容体（Ｄｃｉｒ）、スタビリン（stabilin）１（Ｓｔａｂ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、キチナーゼ様３（ＹＭ１）およびアルギナーゼ１（Ａｒｇ）の発現における上方調節と相関する）の発現上昇と相関する。一方、調節性マクロファージ表現型は、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（Ｌｉｇｈｔ）およびスフィンゴシンキナーゼ１（Ｓｐｈｋ１）の発現上昇と相関すると特徴付けされた。マクロファージの変化する活性化／分化状態を解明するために、Ｍ古典的、Ｍ創傷およびＭＲｅｇ表現型を反映する一連のマーカーを使用して、ある範囲の埋め込まれた構築物を試験した。埋め込み１、４および７日後に、遺伝子発現解析を使用して、腹腔内空間、網脂肪パッド組織から単離されたおよび直接的に球における細胞の表現型マーカー発現を探索した。全体的に見て、有意に異なる遺伝子発現パターンが、１．５ｍｍ球と比較して、０．５ｍｍ球の埋め込み後のこれらの組織に関連する細胞に観察された。
【０２１８】
【表１】
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【０２１９】
０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ球の両方の埋め込みは、腹腔内および末梢網脂肪区画における創傷治癒表現型に関連するマーカーの発現増加をもたらした（表１）。この表現型は、マウスに埋め込まれた両方の球サイズに関して４日目に上昇し、１．５ｍｍ球に関して７日目までに減少した。これらのデータが、これらの区画におけるマクロファージ活性化と一致している、すなわち、埋め込まれた材料が１．５ｍｍ球からなる場合は低下することが考えられる。０．５ｍｍ球から直接的に得られる線維化組織は、全３種のマクロファージ表現型に関連するマーカーの増加する発現を示した。対照的に、古典的および創傷治癒表現型のみに関連するマクロファージマーカーの発現は、１．５ｍｍ球において富化された（表１＊＊）。調節性マクロファージマーカーは、１．５ｍｍ球の埋め込み後に、テストしたいずれの時点においてもまたはいずれの区画においても有意に上方調節されなかった。しかし、このマクロファージ表現型に関連するマーカーの発現増加は、０．５ｍｍ球に関連する細胞において４および７日目に観察された。組み合わせた本発明者らの観察は、大きなサイズの球における調節性マクロファージ細胞蓄積の欠如が、トランケートされた線維化応答と相関することを示唆する。
【０２２０】
要約すると、データは、埋め込まれた材料の形状を調整することにより、その宿主認識および異物反応の伝播に影響を与えることができることを実証した。１．５ｍｍの直径またはそれを超える球状材料が、そのより小さいサイズのまたは異なって形づくられた対応物よりも有意に生体適合性であることを証明した。この効果は、埋め込まれた総表面積に依存しないこと、また、テストした全ての材料で明らかであることが実証された。さらに、本発明者らの知見は、埋め込みサイズを単純に増加させることが、異物応答に抵抗するのに不十分であり、宿主線維症／拒絶に抵抗するには球状の形も不可欠であることを示唆する。有意には、１．５ｍｍの直径のアルギナートミクロスフェアは、細胞沈着を少なくとも６ヶ月間避ける能力を実証した。ヒドロゲル、セラミックス、金属およびプラスチックを包含する広範囲の材料の球状寸法のモジュレートも、１．５ｍｍまたはそれを超える直径の球が、異物性反応および線維症を有意に軽減したことを示した。これらの知見は、ある範囲の適用、トロールされた薬物放出（trolled  drug  release）、組織工学のための埋め込み可能なプロテーゼのためのｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込まれた生体医療デバイスの設計に重要な意義を有する。
【０２２１】
（実施例１１）マクロファージ表現型シフトのプロファイリング
図２４Ａ〜図２４Ｆは、腹腔内空間の細胞におけるマクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された（腹腔内洗浄された）、腹腔内空間における細胞由来のマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射）マウスから収集された腹腔内細胞に対し正規化され、２を底とする対数目盛りで示される。処置当たりＮ＝４匹のマウス。解析の詳細については、補足方法の記載を参照されたい。
【０２２２】
図２５Ａ〜図２５Ｆは、末梢網脂肪組織の細胞におけるマクロファージ表現型シフトのプロファイリングを示す。埋め込み１、４および７日後に抽出された、末梢脂肪組織における細胞由来のマクロファージ表現型マーカーのＲＮＡ発現のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに基づく解析。発現は、モック手術（ＰＢＳ注射）マウスから収集された脂肪組織に対し正規化され、２を底とする対数目盛りで示す。処置当たりＮ＝４匹のマウス。
【０２２３】
０．５ｍｍおよび１．５ｍｍサイズの球の両方の埋め込みは、腹腔内および末梢網脂肪区画における創傷治癒表現型に関連するマーカーの発現増加をもたらした。この表現型は、マウスに埋め込まれた両方の球サイズに関して４日目に上昇し、１．５ｍｍサイズの球に関して７日目までに減少した。本発明者らは、これらのデータが、これらの区画におけるマクロファージ活性化と一致している、すなわち、埋め込まれた材料が１．５ｍｍ球である場合は低下すると考える。０．５ｍｍサイズから直接的に得られる線維化組織は、全３種のマクロファージ表現型に関連するマーカーの増加する発現を示した。対照的に、古典的および創傷治癒表現型のみに関連するマクロファージマーカーの発現は、１．５ｍｍ球において富化された。調節性マクロファージマーカーは、１．５ｍｍサイズの球の埋め込み後に、テストしたいずれの時点においてもまたはいずれの区画においても有意に上方調節されなかった。しかし、このマクロファージ表現型に関連するマーカーの発現増加は、０．５ｍｍ球に関連する細胞において４および７日目に観察された。組み合わせると、観察は、大きなサイズの球における調節性マクロファージ細胞蓄積の欠如が、トランケートされた線維症応答と相関することを示唆する。
【０２２４】
（実施例１２）カプセル形状の関数としてのインスリンおよびグルコースの拡散
ベータ細胞において、グルコース誘導性インスリン分泌は、グルコース代謝、ミトコンドリアエネルギー産生、カリウム依存性ＡＴＰチャネル（ＫＡＴＰチャネル）、電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）、カルシウム流入およびインスリン分泌が関与する複雑なプロセスであり、二相性および振動性動態パターンを有する５。本研究では、本発明者らは、インスリン分泌共役因子およびインスリン分泌における封入およびカプセルサイズの影響を特徴付けるために、ミクロ流体灌流デバイスを適用して、灌流液試料における細胞内カルシウム流入（細胞膜へのインスリン顆粒の融合およびエキソサイトーシスのための下流および直ぐ近位のトリガー）およびインスリン濃度を動的に測定した。図１８Ａ〜図１８Ｄに示す通り、グルコース誘導性細胞内カルシウムシグナルは、３群の間で同様であり、全３群で典型的な位相応答を有した。２０ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌ（塩化カリウム）負荷の両方に応答して、カルシウム流入の開始時から最大カルシウムピークまで、有意差は観察されなかった。その上、両方の刺激因子下におけるカルシウム濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）は、有意に異ならなかった（図１８Ｃおよび図１８Ｄ）。しかし、裸の膵島および０．５ｍｍカプセルと比較して、１．５ｍｍカプセルの最大カルシウムレベルに達する時間は、グルコースに応答して統計的に遅延した（ｐ＝０．０３）が、ＫＣｌ刺激に応答して統計的に遅延しなかった。
【０２２５】
結果は、グルコース（１８０．２ダルトン）およびＫＣｌ（７４．６ダルトン）等、小分子は、アルギナートカプセル中に非常に急速に拡散し、裸の膵島と同様の速度でカルシウム流入を効率的に誘導することを示唆する。これは、封入プロセスおよびアルギナート材料が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ機能に重要な、ミトコンドリアエネルギー産生およびイオンチャネル等のグルコース代謝、またはインスリン刺激因子分泌共役因子（insulin  stimulator-secretion  coupling  factor）を激しく妨害しないことを示唆する。さらに、グルコース（１８０．２ダルトン）に応答して１．５ｍｍカプセルにおいて最大カルシウムレベルに達するのに遅延した時間が存在したが、ＫＣｌ（７４．６ダルトン）にはないため、カプセルにおける拡散効率は、分析物の分子量に依存し得る。
【０２２６】
次に、裸のおよび封入された膵島のインスリン分泌動態を調査した。図１９Ａに示す通り、裸の膵島は、グルコースに応答して典型的な二相性インスリン分泌パターンを示すが、両方の封入膵島群は、二相性パターンの損失を示し、インスリン分泌が、定義されたＩ相分泌なしに、グルコース刺激の期間にわたって徐々に増加することを示す。２０ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌ負荷の両方に応答して、インスリン分泌の開始時から最大ピークインスリン分泌まで、有意差は観察されなかった。しかし、２０ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌから最大インスリン分泌に達する時間は、裸の膵島と比較して、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ封入膵島では有意に遅延した（ｐ＝０．０００２（２０ｍＭグルコース）、０．０４（３０ｍＭ  ＫＣｌ））。インスリン分泌動態曲線のさらなる解析は、刺激の最初の１０分間で裸の膵島によって分泌される総インスリンが、グルコースおよびＫＣｌ（それぞれｐ＝０．０２および０．０４）の両方に応答した０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ封入膵島の両方よりも有意に高かったが、刺激におけるより後の時間区域では有意に異ならなかったことを示した。このデータは、より大きな分子量のインスリン（５，８０８Ｄａ）が、裸の膵島と比較して両方の封入群にとって、アルギナートゲルを通って灌流液チャンバーに入るより長い拡散時間をもたらす決定因子であることをさらに示唆する。
【０２２７】
刺激において（２０〜５５分間）および刺激後の洗い流し期間において（５５〜１００分間）全群によって分泌される総インスリンも、両方の刺激因子に応答して有意に異ならないことが判明した。これは、全体的大量のインスリン分泌が、封入またはカプセルサイズによって影響されないことを示唆する。より重要なことに、封入膵島は、裸の膵島と同様の基底インスリン分泌レベルに戻ったが、刺激後に長期にわたるインスリン分泌は、危険な低血糖を引き起こし得るため、これは、将来の臨床適用を考慮する場合、決定的な因子である。
【０２２８】
正常グルコース誘導性カルシウム流入と共に、本発明者らの結果は、より大きなＭＷのインスリンのカプセルから灌流液への増加する拡散時間のため、封入膵島のインスリン分泌プロファイルの変更が、アルギナートゲルの存在によって大部分は影響されるようであることを示す。これは、グルコースに応答した封入膵島のＩ相インスリン分泌の観察される損失を説明することができる。しかし、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍ封入膵島の間でインスリン分泌動態に有意差はなく、カプセルサイズが、インスリン分泌に効果がほとんどないことを示唆する。
【０２２９】
要約すると、小分子量分泌促進物質による膵島刺激動態は、封入またはカプセルサイズによって影響されない；しかし、初期インスリン分泌動態は、両方のカプセルサイズにおける封入膵島で同様に遅延される。にもかかわらず、両方のカプセルサイズの全体的大量のインスリン動態（overall  bulk  insulin  kinetics）は、十分に保存されており、裸の膵島と同様である。
【０２３０】
本発明の改変および変形形態は、以下の請求項を参照することによってさらに理解される。本明細書において引用した全ての参考文献は、参照により明確に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ−Ｃ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０Ａ−Ｃ】
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【図２１Ａ−Ｃ】
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【図２１Ｄ−Ｆ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｃ】
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【図２４Ｄ−Ｆ】
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【図２５Ａ−Ｃ】
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【図２５Ｄ−Ｆ】
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【国際調査報告】
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