(57)【要約】ＮＲＧ−１ペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与することによって、心臓の中もしくは心臓の周りに心臓前駆細胞を有すると決定された被験体において、筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法が本明細書で提供される。本明細書で開示される方法は、心臓傷害（例えば、心不全もしくは心筋梗塞）を処置、防止、またはその進行を遅らせるために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレグリンでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体を同定するための方法であって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）該被験体の細胞を、ニューレグリンペプチドまたは機能的改変体もしくはフラグメントに曝露する工程；
ｃ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への細胞の変換が抑制されるかどうか、ならびに／または該細胞が心筋細胞へと優先的に分化するかどうかを決定することによって、該細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；
を包含し、そしてここで線維芽細胞および筋線維芽細胞への該心臓前駆細胞の該変換の抑制または心筋細胞への優先的分化が見出される場合、該被験体は、該ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る、方法。
【請求項２】
心臓組織再生の必要性のある被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）該被験体から単離された心臓前駆細胞を、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに曝露する工程；
ｂ）該心臓前駆細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；ならびに
ｃ）該被験体の心臓前駆細胞が応答性である場合、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程
を包含する方法。
【請求項３】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、前記被験体において、心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体は、心臓傷害に罹患しているかまたは罹患していると予測される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する工程は、心臓傷害後に心臓組織再生を誘導する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する工程は、心臓傷害後に心臓組織の修復を生じる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する工程は、心臓傷害後に心臓線維症を低減する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
心臓傷害後に心臓線維症を低減することは、瘢痕形成を防止する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する工程は、心臓傷害の発症を防止する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心臓前駆細胞は、幹細胞抗原−１（ｓｃａ−１）細胞を発現する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｓｃａ−１細胞は、左室自由壁または心臓の血管もしくは血管周囲領域内に位置する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ニューレグリンに応答性の心臓前駆細胞を有すると以前に決定された被験体において、心臓傷害後に心臓組織再生を誘導するための方法であって、該方法は、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する方法。
【請求項１３】
ニューレグリンに応答性の心臓前駆細胞を有すると以前に決定された被験体において、心臓傷害後に心臓組織を修復するための方法であって、該方法は、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する方法。
【請求項１４】
ニューレグリンに応答性の心臓前駆細胞を有すると以前に決定された被験体において心臓傷害の発症を防止するための方法であって、該方法は、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する方法。
【請求項１５】
前記心臓傷害は、心臓血管疾患から生じる、請求項４または１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記心臓血管疾患は、冠動脈疾患；心不全；脳卒中；心筋梗塞；心筋症；高血圧症；虚血性心疾患；心房細動；先天性心疾患；心筋炎；心内膜炎；心膜炎；アテローム性動脈硬化症；血管疾患；左室収縮機能障害；冠動脈バイパス手術；心臓毒性化合物への曝露；甲状腺疾患；ウイルス感染；歯肉炎；薬物乱用；アルコール乱用、または高い血中コレステロールから生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体は、心筋梗塞に罹患したことがある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体は、心不全に罹患している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記心不全は、収縮性心不全である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体は、哺乳動物である、請求項２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、静脈内投与または皮下投与される、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、化学療法剤の治療上有効な量を投与する前、投与する間、もしくは投与した後に投与される、請求項２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法剤は、アザシチジンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、化学療法剤およびヒト心臓前駆細胞またはヒト胚性幹細胞とともに共投与される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
インビトロで、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法であって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を生物学的サンプルから単離する工程；
ｂ）該細胞を増殖培地中で懸濁する工程；
ｃ）該細胞を、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの有効量とともにインキュベートすることによって、心筋細胞分化を誘導する工程
を包含する方法。
【請求項２７】
心筋細胞が富化された細胞集団を生成するための方法であって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を被験体から単離する工程；
ｂ）該細胞を増殖培地中で培養する工程；
ｃ）該細胞を、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの有効量とともにインキュベートして、心筋細胞への分化を促進する工程；および
ｄ）該心筋細胞を単離する工程、
を包含する方法。
【請求項２８】
前記単離された心筋細胞は、前記被験体に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制することならびに／または心筋細胞への該心臓前駆細胞の分化を促進することによって、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答し得ることが見出された心臓前駆細胞を培養および拡大する工程；ならびに
ｂ）該拡大された心臓前駆細胞を、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量とともに、被験体に投与する工程
を包含する方法。
【請求項３０】
ニューレグリンでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体を同定するための方法であって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）該被験体の細胞を、ニューレグリンペプチドまたは機能的改変体もしくはフラグメントに曝露する工程；
ｃ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への細胞の変換が抑制されるかどうか、および／または該細胞が心筋細胞へと優先的に分化するかどうかを決定することによって、該細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；
を包含し、そしてここで線維芽細胞および筋線維芽細胞への該心臓前駆細胞の該変換の抑制または心筋細胞への優先的分化が見出される場合、該被験体は、該ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る、方法。
【請求項３１】
心臓傷害を処置または防止するための方法であって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制すること、ならびに／または心筋細胞への該心臓前駆細胞の分化を促進することによって、該被験体の心臓前駆細胞が、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答するかどうかを評価する工程；ならびに
ｃ）該心臓前駆細胞が応答性である場合、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与して、心臓傷害を処置または防止するかまたはその重篤度を低減する工程、
を包含する方法。
【請求項３２】
前記ヒト心臓前駆細胞は、心臓手術または心臓カテーテル検査の間に前記被験体から単離される、請求項１、２６、２７、３０、または３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、ヒト胚性幹細胞またはヒト心臓前駆細胞とともに共投与される、請求項２、１２〜１４、または３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記共投与される心臓前駆細胞は、処置されている前記被験体から元々採取された、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト胚性幹細胞またはヒト心臓前駆細胞は、前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントとともに同時に、逐次的に、連続して、または断続的に共投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ニューレグリンペプチドは、ＮＲＧ−１βペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮＲＧ−１βペプチドは、配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＲＧ−１βペプチドは、ＧＧＦ２またはその機能的改変体もしくはフラグメントである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ニューレグリンペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的改変体もしくはフラグメントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＧＧＦ２機能的改変体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、ＥＧＦ様ドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記上皮増殖因子様ドメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ニューレグリンペプチドは、ＮＲＧ−２またはその機能的改変体もしくはフラグメントである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ニューレグリンペプチドは、配列番号２１もしくは配列番号２２のアミノ酸配列またはその機能的改変体もしくはフラグメントを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ニューレグリンでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体を同定するための方法であって、該方法は、
ａ）心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体に由来するヒト心臓前駆細胞を、ニューレグリンペプチドまたは機能的改変体もしくはフラグメントにインビトロで曝露する工程；および
ｂ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への細胞の変換が抑制されるかどうか、ならびに／または該細胞が心筋細胞へと優先的に分化するかどうかを決定することによって、該細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；
を包含し、ここで線維芽細胞および筋線維芽細胞への該心臓前駆細胞の該変換の抑制、または心筋細胞への優先的分化が見出される場合、該被験体は、該ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る、方法。
【請求項４６】
請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法における使用のための、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント。
【請求項４７】
心臓組織再生の必要性のある被験体を処置するための方法での使用のためのニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントであって、該方法は、
ａ）該被験体から単離された心臓前駆細胞をニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに曝露する工程；
ｂ）該心臓前駆細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；を包含し、
該被験体の心臓前駆細胞が応答性である場合、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する、
ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント。
【請求項４８】
心臓組織再生の必要性のある被験体を処置するための方法における使用のためのニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントであって、ここで該被験体は、請求項１または４５に記載の方法によって、心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体であると同定されたことがある、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント。
【請求項４９】
心臓傷害を処置または防止するための方法における使用のためのニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントであって、該方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制すること、ならびに／または心筋細胞への該心臓前駆細胞の分化を促進することによって、該被験体の心臓前駆細胞が、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答するかどうかを評価する工程；ならびに
ｃ）該心臓前駆細胞が応答性である場合、ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与して、心臓傷害を処置または防止またはその重篤度を低減する工程、
を包含する、
ニューレグリンペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３，１４８号の優先権の利益を主張し、その内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
【０００２】
政府援助研究に関する陳述
この仕事は、援助金Ｕ０１  ＨＬ  １００３９８のもとの米国国立衛生研究所／米国国立心肺血液研究所によって部分的に援助された。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ニューレグリン（ＮＲＧ）ペプチドまたはその機能的フラグメントの治療上有効な量を投与することによる、筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
心臓血管疾患は、引き続いて世界中で死亡率および罹患率の主要な原因であり、１年に１７３０万人の死亡の原因である。例えば、虚血性心疾患、高血圧症、糖尿病、弁膜症、心筋炎、感染症、全身性の毒、および心臓毒製薬物による心臓組織への進行性の損傷は、最終的には、心不全をもたらし得る。いくつかの代償機構が、機能不全に陥った心臓が適切な機能を維持しようと試みるときに起こる。これらとしては、心拍出量を増大させること、心室容積を増大させること、および心室リモデリングを通じての壁の厚み、および神経ホルモン系の活性化を通じて平均動脈圧を増大させて組織灌流を維持することが挙げられる。心不全の初期段階において最初は有益であるものの、これらの代償機構のうちの全てが、最終的には、心不全を増悪させるという悪循環をもたらす。
【０００５】
さらに、心臓傷害は、筋線維の再配置、間質性線維症、細胞外マトリクスの蓄積、および血管新生が関わる複雑な構造リモデリングを必然的に伴う。心臓リモデリングの根底にあるプロセスのうちの多くは、慢性炎症プロセスと共通する特徴を有する。これらのプロセスの間に、心筋間質中にあるかまたは心筋間質へと浸潤する非筋細胞（例えば、内皮細胞、線維芽細胞、および免疫細胞）は、積極的役割を果たす。
【０００６】
新たな治療は、被験体の転帰を改善したものの、症候性心不全はなお、現行の治療で適切に処置されない慢性的に進行異性の疾患である。幹細胞治療は、重篤な心筋症を処置するための可能性のある新たな機構として浮かび上がってきた。しかし、ヒト胚性幹細胞の使用は、不十分な心筋生成分化（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に一部起因して、重大な制限を有する。増殖しかつ心筋細胞へと分化し得る内因性心臓幹細胞は、より近年になって、幹細胞マーカー（例えば、ｃ−Ｋｉｔおよび幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１））を使用して単離された。不運なことに、これらの心臓前駆細胞は、複数の系統（筋線維芽細胞を含む）へも分化し、筋線維芽細胞は、心不全をもたらし得る病的な心臓再構築と関連する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以前、動物研究および進行中の臨床試験は、心機能に対する可能性のある治療剤として組換えＮＲＧの有益な効果を示した（例えば、Ｓａｗｙｅｒら，  ２０１１；  Ｌｅｎｉｈａｎら，  ２０１３を参照のこと）。ＮＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達は、筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の分化を阻害し、筋細胞への分化を増大させることによって、心臓の構造的および機能的完全性において重要な役割を果たすことが見出された。従って、本発明は、心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターが、筋細胞の形成へと向かう心臓前駆細胞の分化を駆動しかつ線維芽細胞および筋線維芽細胞への分化を阻害するＮＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達を生じるＮＲＧの標的であるということを確立する研究に一部基づく。この知見は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害（心不全を含む）の処置から最も利益を得る患者を同定するために使用され得る。
【０００８】
従って、本発明の一局面は、ＮＲＧでの処置に応答性である心臓前駆細胞を有する被験体を同定するための方法を提供する。これは、例えば、心臓手術もしくは心臓カテーテル検査の間に得られる心臓組織の生検によって決定され得る。この方法は、被験体から細胞を単離する工程を含み得るか、または被験体に由来する細胞のサンプルを使用して、インビトロで完全に行われ得る。生検材料から単離される心臓前駆細胞は、次いで、線維芽細胞および筋線維芽細胞への低減した変換を示すことによって、ならびに／または心臓細胞へと優先的に分化することによって、上記細胞が応答するか否かを決定するために、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに曝露され得る。心臓前駆細胞がＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントへのこの応答を示す被験体は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは改変体での心臓傷害の処置または防止に十分応答すると予測され得る。
【０００９】
従って、本発明の別の局面は、線維芽細胞から離れるおよび／または心筋細胞に向かう優先的な分化によって、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答する心臓前駆細胞を有することが見出された被験体を処置するための方法を提供する。本発明はまた、このような被験体を処置するための方法において、例えば、心臓傷害を処置または防止するための方法、心臓組織再生を誘導するための方法あるいは心臓組織を修復するための方法において、使用するためのＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを提供する。上記方法は、本明細書で記載されるとおりの方法によって同定された任意の被験体において行われ得る。上記方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与して、心臓傷害を有する被験体において、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ）に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する工程を包含する。本発明の他の局面は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を、ＮＲＧに応答性の心臓前駆細胞を有すると同定された患者に投与することによって、心臓組織の形成を誘導する、心臓組織を強化する、および心臓傷害の発症を防止するための方法を提供する。ＮＲＧに応答性の心臓前駆細胞を有すると同定された患者に、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与することによって、心臓組織の形成を誘導する、心臓組織を強化する、または心臓傷害の発症を防止するための方法における使用のためのＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントもまた、提供される。ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与することによる、ＮＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達の活性化は、それらの被験体において心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進し、増強された心筋再生および改善された心機能をもたらす。本発明の方法は、ヒト胚性幹細胞またはヒト心臓前駆細胞の共投与を包含し得る。
【００１０】
ある特定の実施形態において、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制することは、筋細胞形成に向かう分化を駆動することによって、心臓組織再生を誘導する。他の実施形態において、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制することならびに／または心筋細胞への分化を誘導することは、心臓組織を修復および強化する。別の実施形態において、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制することは、心臓線維症を防止する。より具体的な実施形態において、心臓傷害後に心臓線維症を低減することは、瘢痕組織の形成を防止する。いくつかの実施形態において、瘢痕組織は、改善（ｒｅｖｅｒｓｅ）または修復され得る。ある特定の実施形態において、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制することは、心臓傷害の発症を防止する。
【００１１】
一局面において、ＮＲＧでの処置に応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体において、心臓傷害後に心臓組織再生を誘導するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する。
【００１２】
別の局面において、ＮＲＧでの処置に応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体において、心臓傷害後に心臓組織を修復するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する。
【００１３】
さらなる局面において、ＮＲＧでの処置に応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体において、心臓傷害の発症を防止するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を投与する工程を包含する。
【００１４】
ある特定の実施形態において、上記心臓傷害は、心臓血管疾患から生じる。いくつかの実施形態において、上記心臓血管疾患は、冠動脈疾患、脳卒中、心筋梗塞、心筋症、高血圧症、虚血性心疾患、心房細動、先天性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心膜炎、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、冠動脈バイパス手術、心臓毒性化合物への曝露、甲状腺疾患、ウイルス感染、歯肉炎、薬物乱用、アルコール乱用、または高い血中コレステロールから生じる。具体的な実施形態において、上記被験体は、左室収縮機能障害を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、心不全に罹患している。
【００１５】
ある特定の実施形態において、上記被験体は、心臓傷害を発生させるリスクがあるか、または心臓血管疾患の病歴を有する。他の実施形態において、上記被験体は、心臓組織を損傷することが公知の化学療法剤での化学療法を熟慮している可能性がある。上記被験体がＮＲＧでの処置に応答性である心臓前駆細胞を有するか否かを同定することは、上記被験体が、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの同時の治療から利益を得ることを示す。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与する前、投与する間、または投与した後に、抗がん剤（例えば、アザシチジン）の治療上有効な量を投与する工程をさらに包含し得る。
【００１６】
他の実施形態において、本明細書で提供される場合、上記被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態において、上記ヒトは、がんに罹患しており、心臓組織および心機能への損傷と関連したがん処置を既に受けている。いくつかの実施形態において、上記ヒトは、先天性の心臓傷害に罹患しているか、または心臓手術（特に、心臓のリモデルもしくは再設計部分に対する手術）から回復している小児または幼児である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、静脈内投与または皮下投与される。
【００１８】
ある特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドは、ＮＲＧ−１もしくはＮＲＧ−２ペプチド（詳細には、ＮＲＧ−１β、およびより詳細には、グリア増殖因子（ＧＧＦ）２ペプチド（例えば、Ｃｉｍａｇｌｅｒｍｉｎ  ａｌｐｈａ））またはその機能的改変体もしくはフラグメントである。いくつかの具体的な実施形態において、ＮＲＧペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の機能的改変体もしくはフラグメントを含む。他の具体的な実施形態において、上記ＮＲＧペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２の機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドは、配列番号２１もしくは配列番号２２のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、心臓前駆細胞上で発現されるＥｒｂＢ３レセプターに結合して、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化する。
【００２０】
ある特定の実施形態において、ＥｒｂＢ３レセプターへのＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの結合は、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化する。少なくともいくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、ＥｒｂＢ３レセプターに結合し、心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ２レセプターを動員することによって、ＥｒｂＢシグナル伝達をもたらす。その得られるＥｒｂＢシグナル伝達は、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を分化する、ならびに／または線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する。
【００２１】
本発明の別の局面は、ＮＲＧでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体を同定するための方法を提供し、上記方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）上記被験体の細胞を、ＮＲＧペプチドまたは機能的改変体もしくはフラグメントに曝露する工程；
ｃ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への細胞の変換が抑制されるかどうか、ならびに／または上記細胞が心筋細胞へと優先的に分化するかどうかを決定することによって、上記細胞がＮＲＧに応答性であるかどうかを評価する工程；
を包含し、ここで線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換の抑制または心筋細胞への優先的分化が見出される場合、上記被験体は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る。関連する局面において、上記方法は、上記被験体に由来する心臓前駆細胞に対して行われ、上記方法は、それら細胞を単離する工程を包含しない。例えば、ＮＲＧでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体を同定する方法が提供され、上記方法は、
ａ）心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体に由来するヒト心臓前駆細胞を、ＮＲＧペプチドその機能的改変体もしくはフラグメントにインビトロで曝露する工程；ならびに
ｂ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への細胞の変換が抑制されるかどうか、ならびに／または上記細胞が心筋細胞へと優先的に分化するかどうかを決定することによって、上記細胞がニューレグリンに応答性であるかどうかを評価する工程；
を包含し、ここで線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換の抑制または心筋細胞への優先的分化が見出される場合、上記被験体は、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントでの心臓傷害の処置または防止から利益を得る。
【００２２】
本発明の別の局面は、心臓傷害を処置または防止するための方法を提供し、上記方法は、
ａ）ヒト心臓前駆細胞を、心臓傷害を有するかまたは心臓傷害のリスクのある被験体から単離する工程；
ｂ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制すること、ならびに／または心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進することによって、上記被験体の心臓前駆細胞がＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答するかどうかを評価する工程；ならびに
ｃ）上記心臓前駆細胞が応答性である場合、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与して、心臓傷害を処置または防止するか、またはその重篤度を低減する工程
を包含する。
関連する局面において、本発明は、このような方法で使用するための、あるいは心臓傷害の処置または防止から利益を得る被験体であると本明細書で記載されるとおりの方法によって同定された被験体を処置するための方法において使用するための、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明の方法は、
ａ）線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制すること、ならびに／または心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進することによって、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに応答し得ることが見出された心臓前駆細胞を培養および拡大する工程；ならびに
ｂ）上記拡大した心臓前駆細胞を、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量とともに上記被験体に投与する工程
を包含する。このような方法において使用するための、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントもまた提供される。
【００２４】
本発明の別の局面は、心筋細胞が富化された細胞集団を生成するための方法を提供し、上記方法は、
ａ）被験体から得られる心臓前駆細胞を単離する工程；
ｂ）上記細胞を増殖培地中で培養する工程；
ｃ）上記細胞を、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの有効量とともにインキュベートして、心筋細胞の分化を促進する工程；および
ｄ）上記筋細胞を単離する工程
を包含する。
この方法に続いて、上記心筋細胞が上記被験体に投与され得る。上記細胞は、工程ａ）においてサンプル（例えば、本明細書で記載されるとおりの生検サンプル）からインビトロで単離され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターを発現するマウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞を示す。図１Ａは、磁性活性化前（左パネル）および後（右パネル）のセルソーティングの、心臓前駆細胞の単離された亜集団の純度を示す代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１Ｂは、心臓前駆細胞におけるＥｒｂＢレセプターのｍＲＮＡ発現のプロフィールを示す。図１Ｃは、Ｓｃａ−１ｐｏｓ／ＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーの代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【図１Ｂ】図１は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターを発現するマウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞を示す。図１Ａは、磁性活性化前（左パネル）および後（右パネル）のセルソーティングの、心臓前駆細胞の単離された亜集団の純度を示す代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１Ｂは、心臓前駆細胞におけるＥｒｂＢレセプターのｍＲＮＡ発現のプロフィールを示す。図１Ｃは、Ｓｃａ−１ｐｏｓ／ＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーの代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【図１Ｃ】図１は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターを発現するマウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞を示す。図１Ａは、磁性活性化前（左パネル）および後（右パネル）のセルソーティングの、心臓前駆細胞の単離された亜集団の純度を示す代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１Ｂは、心臓前駆細胞におけるＥｒｂＢレセプターのｍＲＮＡ発現のプロフィールを示す。図１Ｃは、Ｓｃａ−１ｐｏｓ／ＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーの代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【００２６】
【図２Ａ】図２は、マウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞が、インビトロで内皮細胞および心筋細胞に向かって分化することを示す。図２Ａは、増殖培地（左パネル）もしくは内皮細胞（ＥＣ）分化培地（中央パネル）中での心臓前駆細胞のインキュベーション後の、毛細管様構造の形成の例示的な顕微鏡視野心を示す。ＣＤ３１ｐｏｓ心臓内皮細胞を、陽性コントロールとして使用した（右パネル）。図２Ｂは、増殖培地（コントロール、左のバー）中で、または内皮細胞分化培地（ｄｉｆｆ、中央のバー）中でインキュベートした心臓前駆細胞、および心臓内皮細胞（ＥＣ、右のバー）の形態発生活性（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のグラフ表示を示す。毛細管形成を、それらの全長を測定することによって評価した。図２Ｃは、通常増殖培地（Ｃｏｎ）中でまたは心筋細胞分化培地（Ｄｉｆｆ）中で１週間または３週間（ｗ）にわたって培養した心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ細胞の心臓特異的遺伝子発現の例示的リアルタイムＰＣＲ分析を図示する。その値は、３回の実験の平均である。ｃＴｎＴ、心臓トロポニンＴ；−ＭＨＣ、−ミオシン重鎖。
【図２Ｂ】図２は、マウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞が、インビトロで内皮細胞および心筋細胞に向かって分化することを示す。図２Ａは、増殖培地（左パネル）もしくは内皮細胞（ＥＣ）分化培地（中央パネル）中での心臓前駆細胞のインキュベーション後の、毛細管様構造の形成の例示的な顕微鏡視野心を示す。ＣＤ３１ｐｏｓ心臓内皮細胞を、陽性コントロールとして使用した（右パネル）。図２Ｂは、増殖培地（コントロール、左のバー）中で、または内皮細胞分化培地（ｄｉｆｆ、中央のバー）中でインキュベートした心臓前駆細胞、および心臓内皮細胞（ＥＣ、右のバー）の形態発生活性（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のグラフ表示を示す。毛細管形成を、それらの全長を測定することによって評価した。図２Ｃは、通常増殖培地（Ｃｏｎ）中でまたは心筋細胞分化培地（Ｄｉｆｆ）中で１週間または３週間（ｗ）にわたって培養した心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ細胞の心臓特異的遺伝子発現の例示的リアルタイムＰＣＲ分析を図示する。その値は、３回の実験の平均である。ｃＴｎＴ、心臓トロポニンＴ；−ＭＨＣ、−ミオシン重鎖。
【図２Ｃ】図２は、マウスＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞が、インビトロで内皮細胞および心筋細胞に向かって分化することを示す。図２Ａは、増殖培地（左パネル）もしくは内皮細胞（ＥＣ）分化培地（中央パネル）中での心臓前駆細胞のインキュベーション後の、毛細管様構造の形成の例示的な顕微鏡視野心を示す。ＣＤ３１ｐｏｓ心臓内皮細胞を、陽性コントロールとして使用した（右パネル）。図２Ｂは、増殖培地（コントロール、左のバー）中で、または内皮細胞分化培地（ｄｉｆｆ、中央のバー）中でインキュベートした心臓前駆細胞、および心臓内皮細胞（ＥＣ、右のバー）の形態発生活性（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のグラフ表示を示す。毛細管形成を、それらの全長を測定することによって評価した。図２Ｃは、通常増殖培地（Ｃｏｎ）中でまたは心筋細胞分化培地（Ｄｉｆｆ）中で１週間または３週間（ｗ）にわたって培養した心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ細胞の心臓特異的遺伝子発現の例示的リアルタイムＰＣＲ分析を図示する。その値は、３回の実験の平均である。ｃＴｎＴ、心臓トロポニンＴ；−ＭＨＣ、−ミオシン重鎖。
【００２７】
【図３Ａ】図３は、ＮＲＧ−１が、筋線維芽細胞へのマウス心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図３Ａは、マウスにおける実験的心筋梗塞後７日目（Ｄ７、ＭＩ）に、インビボでαＳＭＡ陽性およびコラーゲン１生成筋線維芽細胞に向かう心臓前駆細胞の蓄積が存在することを示す、代表的なフローサイトメトリードットブロットを示す。図３Ｂは、αＳＭＡ陽性（左）およびコラーゲン１α陽性（右）のＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞のフローサイトメトリー分析からのデータのグラフ表示を示す。Ｐ値が示される（対応のないｔ検定）。図３Ｃは、ＴＧＦβ単独（ＴＧＦβ）とともに、または３０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ−１と組み合わせて（ＴＧＦβ＋ＮＲＧ−１）、４８時間インキュベートした心臓前駆細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現を示す、代表的な細胞蛍光グラフィックドットプロットを示す。図３Ｄは、フローサイトメトリーによって評価されるように、心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞におけるαＳＭＡ発現の平均蛍光強度を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、ｔ検定によって計算された有意レベルを示す。
【図３Ｂ】図３は、ＮＲＧ−１が、筋線維芽細胞へのマウス心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図３Ａは、マウスにおける実験的心筋梗塞後７日目（Ｄ７、ＭＩ）に、インビボでαＳＭＡ陽性およびコラーゲン１生成筋線維芽細胞に向かう心臓前駆細胞の蓄積が存在することを示す、代表的なフローサイトメトリードットブロットを示す。図３Ｂは、αＳＭＡ陽性（左）およびコラーゲン１α陽性（右）のＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞のフローサイトメトリー分析からのデータのグラフ表示を示す。Ｐ値が示される（対応のないｔ検定）。図３Ｃは、ＴＧＦβ単独（ＴＧＦβ）とともに、または３０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ−１と組み合わせて（ＴＧＦβ＋ＮＲＧ−１）、４８時間インキュベートした心臓前駆細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現を示す、代表的な細胞蛍光グラフィックドットプロットを示す。図３Ｄは、フローサイトメトリーによって評価されるように、心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞におけるαＳＭＡ発現の平均蛍光強度を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、ｔ検定によって計算された有意レベルを示す。
【図３Ｃ】図３は、ＮＲＧ−１が、筋線維芽細胞へのマウス心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図３Ａは、マウスにおける実験的心筋梗塞後７日目（Ｄ７、ＭＩ）に、インビボでαＳＭＡ陽性およびコラーゲン１生成筋線維芽細胞に向かう心臓前駆細胞の蓄積が存在することを示す、代表的なフローサイトメトリードットブロットを示す。図３Ｂは、αＳＭＡ陽性（左）およびコラーゲン１α陽性（右）のＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞のフローサイトメトリー分析からのデータのグラフ表示を示す。Ｐ値が示される（対応のないｔ検定）。図３Ｃは、ＴＧＦβ単独（ＴＧＦβ）とともに、または３０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ−１と組み合わせて（ＴＧＦβ＋ＮＲＧ−１）、４８時間インキュベートした心臓前駆細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現を示す、代表的な細胞蛍光グラフィックドットプロットを示す。図３Ｄは、フローサイトメトリーによって評価されるように、心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞におけるαＳＭＡ発現の平均蛍光強度を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、ｔ検定によって計算された有意レベルを示す。
【図３Ｄ】図３は、ＮＲＧ−１が、筋線維芽細胞へのマウス心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図３Ａは、マウスにおける実験的心筋梗塞後７日目（Ｄ７、ＭＩ）に、インビボでαＳＭＡ陽性およびコラーゲン１生成筋線維芽細胞に向かう心臓前駆細胞の蓄積が存在することを示す、代表的なフローサイトメトリードットブロットを示す。図３Ｂは、αＳＭＡ陽性（左）およびコラーゲン１α陽性（右）のＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞のフローサイトメトリー分析からのデータのグラフ表示を示す。Ｐ値が示される（対応のないｔ検定）。図３Ｃは、ＴＧＦβ単独（ＴＧＦβ）とともに、または３０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ−１と組み合わせて（ＴＧＦβ＋ＮＲＧ−１）、４８時間インキュベートした心臓前駆細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現を示す、代表的な細胞蛍光グラフィックドットプロットを示す。図３Ｄは、フローサイトメトリーによって評価されるように、心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞におけるαＳＭＡ発現の平均蛍光強度を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、ｔ検定によって計算された有意レベルを示す。
【００２８】
【図４】図４は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターが、ヒト心臓における血管／血管周囲領域に位置することを示す。緑：ＥｒｂＢ２（左パネル）およびＥｒｂＢ３（右パネル）に関する染色（それぞれ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈのＡｂ）；赤：ファロイジン；青：ＴＯ−ＰＲＯ−３（核染色）；黄色の矢印は、血管周囲染色を示す。
【００２９】
【図５Ａ】図５は、ＮＲＧ−１が筋線維芽細胞へのヒト心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図５Ａは、単一細胞由来クローンを再プレートした直後（ｄ０、上パネル）および３日後（ｄ３、下パネル）のヒト心臓前駆細胞の位相差顕微鏡写真を示す。スケールバー＝１００μｍ。図５Ｂは、１週間または２週間（ｗ）にわたって、分化培地中で培養する前（Ｃ）および後のヒト心臓前駆細胞における心臓特異的遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。値は、３回の実験の平均である（対応のないｔ検定）。図５Ｃは、ヒト心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【図５Ｂ】図５は、ＮＲＧ−１が筋線維芽細胞へのヒト心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図５Ａは、単一細胞由来クローンを再プレートした直後（ｄ０、上パネル）および３日後（ｄ３、下パネル）のヒト心臓前駆細胞の位相差顕微鏡写真を示す。スケールバー＝１００μｍ。図５Ｂは、１週間または２週間（ｗ）にわたって、分化培地中で培養する前（Ｃ）および後のヒト心臓前駆細胞における心臓特異的遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。値は、３回の実験の平均である（対応のないｔ検定）。図５Ｃは、ヒト心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【図５Ｃ】図５は、ＮＲＧ−１が筋線維芽細胞へのヒト心臓前駆細胞の移行を防止することを示す。図５Ａは、単一細胞由来クローンを再プレートした直後（ｄ０、上パネル）および３日後（ｄ３、下パネル）のヒト心臓前駆細胞の位相差顕微鏡写真を示す。スケールバー＝１００μｍ。図５Ｂは、１週間または２週間（ｗ）にわたって、分化培地中で培養する前（Ｃ）および後のヒト心臓前駆細胞における心臓特異的遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。値は、３回の実験の平均である（対応のないｔ検定）。図５Ｃは、ヒト心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
例示的実施形態
本開示がより容易に理解され得るために、ある特定の用語が、最初に定義される。これらの定義は、本開示の残りに鑑みて、および当業者によって理解されるものとして読まれるべきである。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて示される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「１つの、ある（ａ）」実体または「１つの、ある（ａｎ）」実体とは、その実体の１もしくはこれより多くに言及する。例えば、「１つのペプチド（ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２もしくはこれより多くのこのようなペプチドの混合物などを含む。よって、用語「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、「１もしくはこれより多くの」および「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され得る。例えば、「１つの用量（ａ  ｄｏｓｅ）」は、１もしくはこれより多くの用量を含む。さらに、状況によって別段要求されなければ、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、示された値±別の量である；それによって、ある範囲の値が確立される。ある特定の好ましい実施形態において、「約」は、基底の（またはコアのもしくは基準の）値に対する範囲、または１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％もしくは０．１％までの±の量を示す。
【００３３】
語句「および／または」は、リストの中の要素間で使用される場合、（１）列挙される要素のみが存在すること、または（２）そのリストのうちの１より多くの要素が存在すること、のいずれかを意味することが意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣであってもよいことを示す。語句「および／または」は、リストの中のエレメント「のうちの少なくとも１つ」またはリストの中のエレメント「のうちの１もしくはこれより多く」と交換可能に使用され得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「心臓毒性の」とは、心筋細胞を直接的または間接的に損なうかまたは死滅させることによって、心機能を低減する化合物に言及する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために、薬学的組成物へと添加される不活性物質をいう。例としては、炭酸水素カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物性オイル、ポリエチレングリコール、および界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「間欠的または不連続の投与」とは、その間隔／レジメンが少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長い限りにおいて、少なくとも（またはこれ以上）２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の間隔での投与のレジメンを含む。例えば、上記ペプチドは、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、もしくは４週間にわたる投与間隔で投与される。例えば、その投与間隔は、４ヶ月より長い。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ＮＲＧペプチド」とは、心臓前駆細胞上の少なくともＥｒｂＢ３に結合しかつＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するペプチドをいう。ＮＲＧペプチドとしては、ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、または少なくともＥｒｂＢ３レセプターに結合し、かつＥｒｂＢ２レセプターを動員して、ＥｒｂＢシグナル伝達をもたらす上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン含有ペプチドが挙げられる。「ＥＧＦ様ドメイン含有ペプチド」とは、例えば、Ｈｏｌｍｅｓら，  １９９２；米国特許第５，５３０，１０９号；米国特許第５，７１６，９３０号；米国特許第７，０３７，８８８号；Ｈｉｊａｚｉら，  １９９８；  Ｃｈａｎｇら，  １９９７；  Ｃａｒｒａｗａｙら，  １９９７；  Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら，  １９９７；およびＷＯ  ９７／０９４２５に開示されるように、ＥＧＦレセプター結合ドメインに対する構造類似性を有する。ＮＲＧ−１ペプチドは、米国特許第５，５３０，１０９号；米国特許第５，７１６，９３０号；および米国特許第７，０３７，８８８号（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。ＮＲＧ−２ペプチドは、米国特許第８，１１４，８３８号（その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧ−２ペプチドは、ＮＲＧ−２αである。いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧ−２ペプチドは、ＮＲＧ−２βである。ある特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるＮＲＧペプチドは、ＮＲＧ−１βペプチド、例えば、アイソフォームＧＧＦ２（配列番号１もしくは配列番号２）またはその機能的改変体もしくはフラグメントである。他の実施形態において、本発明の方法において使用されるＮＲＧペプチドは、ＮＲＧ−２ペプチド（例えば、ＮＲＧ−２α（配列番号２１）もしくはＮＲＧ−２β（配列番号２２）、またはその機能的改変体もしくはフラグメントのような）である。用語「ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント」とは、本明細書で記載されるとおりのＮＲＧペプチド、ＮＲＧペプチドの機能的改変体、ＮＲＧペプチドの機能的フラグメント、またはＮＲＧペプチドの機能的改変体の機能的フラグメントを含むことが意味される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語ＮＲＧペプチドの「機能的改変体」とは、ＥＧＦ様ドメインを有しかつＥｒｂＢ３に結合し、ＥｒｂＢ２を動員し、ＮＧＲ／ＥｒｂＢシグナル伝達を誘導し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の抑制された変換、ならびに／または心筋細胞への心臓前駆細胞の優先的分化をもたらすペプチドを意味する。ＮＲＧの機能的改変体は、ＧＧＦ２に対して実質的な配列類似性を有し得る。いくつかの実施形態において、ＮＲＧペプチドの機能的改変体は、配列番号１、配列番号２、配列番号２１、もしくは配列番号２２またはその機能的フラグメントと８０％、８２％，８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、もしくは９９％同一である。いくつかの実施形態において、上記改変体は、アミノ酸置換、欠失、もしくは挿入によって、配列番号１、配列番号２、配列番号２１、もしくは配列番号２２の相当する部分とは異なる。いくつかの実施形態において、改変体は、アミノ酸の保存的置換によってのみ、配列番号１、配列番号２、配列番号２１、もしくは配列番号２２とは異なる。いくつかの実施形態において、改変体は、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１２個未満、１０個未満、８個未満、５個未満、２個未満のアミノ酸置換（これは保存的置換であり得る）によって、配列番号１、配列番号２、配列番号２１、もしくは配列番号２２の相当する部分とは異なる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語ＮＲＧペプチドの「機能的フラグメント」とは、ＮＲＧペプチドの任意の短縮された部分であって、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号２１、もしくは配列番号２２のアミノ酸配列、またはその機能的改変体を有し、心臓前駆細胞上の少なくともＥｒｂＢ３に結合しかつＮＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化する能力を保持し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の抑制された変換ならびに／または心筋細胞への心臓前駆細胞の優先的分化を生じるものに言及する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ニューレグリンに応答性」および「ニューレグリンでの処置に応答性」とは、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントへの曝露の際、心臓細胞へと優先的に分化する、ならびに／または線維芽細胞もしくは筋線維芽細胞への低減した分化を示す心臓前駆細胞に言及する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、語句「生理学的に受容可能なキャリア」および「薬学的に受容可能なキャリア」とは、交換可能に使用され得、生物に顕著な刺激を引き起こさずかつ投与される細菌化合物の生物学的活性および特性を排除しない、キャリアまたは希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句の下で含まれる。
【００４２】
上記ペプチドならびにこれらの機能的改変体およびフラグメントは、精製および／または単離される。本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」ペプチド、改変体、またはフラグメントは、組換え技術によって生成される場合には、他の細胞物質も培養培地も、または化学合成される場合には、化学的前駆体も他の化学物質も、実質的に含まない。精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、その調製物は、目的の化合物の重量で、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％である。例えば、精製された化合物は、所望の化合物の重量で少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）であるものである。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって、測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、その天然に存在する状態において隣接している遺伝子または配列を含まない。精製または単離されたペプチドは、その天然に存在する状態において隣接しているアミノ酸または配列を含まない。精製された、はまた、ヒト被験体への投与にとって安全である程度の無菌性（例えば、感染性因子もしくは毒性因子がない）を規定する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「防止する」とは、心臓傷害から生じる線維症および瘢痕組織の発生を最小限にするか、または部分的にもしくは完全に阻害することを意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「再生」とは、機能が障害された場所である失われたもしくは損傷を受けた細胞、組織または器官に対する機能の回復に言及する。再生能力は、上記細胞、組織または器官の機能として測定され得る。このような機能は、タンパク質の発現、組織リモデリング、血管新生／脈管新生の誘導、肥大の低減、および組織もしくは器官としての調和した機能、収縮および弛緩であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記器官の機能のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％が、再生される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「定常状態レベル」とは、外因性の因子のレベル（例えば、投与と排出との間で平衡に（続いて起こる用量間の変動の範囲内で）達するために十分なペプチド）に言及する。「定常状態の治療剤レベルを維持する」とは、被験体に治療上の利益を与えるために十分なレベルで、外因性因子の濃度を持続させることをいう。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、薬物もしくは薬剤（例えば、本明細書で記載されるＮＲＧペプチド（例えば、ＮＲＧ−１β、特に、ＧＧＦ２、例えば、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、またはその機能的改変体もしくはフラグメント）のある量が、生成される筋線維芽細胞の数の低減を誘発するおよび／または内因性心臓前駆細胞もしくは共投与される心臓前駆細胞から生じる筋細胞の数を増大させることを意味することが意図される。「治療上有効な量」とは、心臓組織の健康状態および完全性を改善もしくは維持する、心臓傷害もしくは線維症と関連する症状の発生率を低減もしくは少なくするために、特定の身体機能の障害を生じる心臓傷害と関連する疾患もしくは傷害において身体機能を正常にするために、または心臓傷害が関わる疾患の臨床上測定されたパラメーターのうちの１もしくはこれより多くにおける改善を提供するために、十分な量である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」とは、本明細書で記載されるＮＲＧペプチド（例えば、ＮＲＧ−１β、特に、アイソフォームＧＧＦ２、例えば、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、またはその機能的改変体もしくはフラグメント）の投与が、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体において統計的に有意な様式で、処置の非存在下で起こる心臓傷害の進行を遅らせるかまたは阻害することを意味する。周知の徴候（例えば、左室駆出率、運動遂行、僧帽弁逆流、呼吸困難、末梢浮腫、および上記で列挙されるとおりの他の臨床検査）、ならびに生存率および入院率は、疾患進行を評価するために使用され得る。処置が心臓傷害進行を統計的に有意な様式で遅らせるかまたは阻害するか否かは、当該分野で周知の方法によって決定され得る（例えば、ＳＯＬＶＤ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，  １９９２およびＣｏｈｎら，  １９９８（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００４８】
心臓前駆細胞におけるＮＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達
通常は、心臓線維芽細胞の活性化に起因する線維症は、心臓傷害後に、心臓再生を妨げ、収縮機能の喪失、病的リモデリング、ならびに心不全および心筋梗塞への罹病性に寄与する。哺乳動物の心臓は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与することによって、心臓傷害後に天然の再生能力を最大化するように刺激され得ることがいまや見出された。いくつかの実施形態において、その患者は、天然の心臓前駆細胞の供給を有するとして以前の手順によって同定された。あるいは、この天然の再生可能性は、ヒト心臓前駆細胞またはヒト胚性幹細胞の共投与（同時または逐次的、連続してまたは間欠的に）によって補充され得る。理想的には、共投与される心臓前駆細胞は、処置されている被験体から元々得られた。
【００４９】
ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの投与は、被験体において、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する。
【００５０】
ある特定の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を被験体に投与する工程は、投与後少なくとも１２週間、少なくとも１０週間、少なくとも８週間、少なくとも６週間、少なくとも４週間、少なくとも２週間または少なくとも１週間の期間にわたって、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する。他の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を被験体に投与する工程は、投与後少なくとも１０日間、少なくとも９日間、少なくとも８日間、少なくとも７日間、少なくとも６日間、少なくとも５日間、少なくとも４日間、少なくとも３日間、少なくとも２日間または少なくとも１日間の期間にわたって、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する。別の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量を被験体に投与する工程は、投与後少なくとも７０時間、少なくとも６０時間、少なくとも５０時間、少なくとも４０時間、少なくとも３０時間、少なくとも２０時間、少なくとも１５時間、少なくとも１０時間、少なくとも５時間、少なくとも４時間、少なくとも３時間、少なくとも２時間、または少なくとも１時間にわたって、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制する。
【００５１】
別の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％促進する。
【００５２】
さらに他の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％程度抑制する。
【００５３】
ある特定の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％程度抑制する。
【００５４】
ある特定の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、線維芽細胞の低減した生成および機能的心筋細胞の増大した生成を生じる。他の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、抗線維症効果を有する。
【００５５】
ある特定の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、心筋線維症を抑制する。他の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、線維症促進遺伝子（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）の発現を低減する。具体的な実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、コラーゲン、フィブリリン、オステオネクチン、ペリオスチン、およびベルシカンの発現を低減する。
【００５６】
ある特定の実施形態において、被験体において、心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程、および心臓転写因子を発現するベクターを（同時に、逐次的に、連続して、または間欠的に）共投与する工程を包含する。ある特定の実施形態において、上記心臓転写因子は、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ２、ＭＥＦ２Ｃ、ＭｅｓＰ１、Ｎｋｘ２−５、もしくはＴｂｘ５である。
【００５７】
ある特定の実施形態において、心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを、がんに罹患している被験体に投与する工程を包含する。ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、化学療法剤の前、その後、または同時に投与され得る。それは、化学療法剤と同時にまたは逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、ハーセプチンである。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、以下から選択される：ベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、アスパラギナーゼ、カペシタビン、シタラビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アクチノマイシンＤ／ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン（ペグ化リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、カペシタビン、シタラビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アクチノマイシンＤ／ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン（ペグ化リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚａｍａｂ）、ＢＣＧ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、インターフェロン、イピリムマブ、ラパチニブ、パニツムマブ、リツキシマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、トラスツズマブ、クロドロネート、イバンドロン酸、パミドロネート、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アナストロゾール、アビラテロン、アミホスチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブセレリン、シプロテロン、デガレリクス、エキセメスタン、フルタミド、フォリン酸、フルベストラント、ゴセレリン、ランレオチド、レナリドミド、レトロゾール、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メスナ、オクトレオチド、スチルベストロール（ｓｔｉｌｂｏｅｓｔｒｏｌ）、タモキシフェン、サリドマイドもしくはトリプトレリン。
【００５８】
ある特定の実施形態において、被験体において、心筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するための方法は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程、およびＮＲＧに応答性であるヒト心臓前駆細胞を（同時に、逐次的に、連続して、または断続的に）共投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ヒト心臓前駆細胞は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを再投与する前に、処置を受けている被験体から元々単離され、インビトロで拡大される。ある特定の実施形態において、本発明の方法において投与される心臓前駆細胞は、幹細胞抗原、ｃ−ｋｉｔ、ｓｃａ−１、ｉｓｌ−１、ＳＳＥＡ−ＩまたはＡＢＣＧ２を発現する。他の実施形態において、本明細書で提供される場合、心臓前駆細胞は、心臓特異的マーカー；例えば、ＮＫｘ２．５、ＧＡＴＡ４、α−ＭＨＣを発現する。好ましい実施形態において、上記心臓前駆細胞は、ｓｃａ−１を発現する。他の実施形態において、上記心臓前駆細胞は、ｃ−ｋｉｔを発現しない。いくつかの実施形態において、上記心臓前駆細胞は、カルディオスフィア（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）であり得る。
【００５９】
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される心臓前駆細胞は、心房および／または心室から得られる、心房および／または心室に投与される。より具体的な実施形態において、上記心臓前駆細胞は、左室から得られる、および／または左室に投与される。さらにより具体的な実施形態において、心臓前駆細胞は、左室自由壁、心臓の血管もしくは血管周囲領域から得られる、および／または左室自由壁、心臓の血管もしくは血管周囲領域に投与される。ある特定の実施形態において、得られるおよび／または投与される心臓前駆細胞は、ｓｃａ−１を発現する。心臓前駆細胞は、当該分野で公知のまたは本明細書で開示される任意の手段によって単離され得る。
【００６０】
ある特定の実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを被験体に投与する工程は、ＴＧＦ−β活性化を制限し、線維芽細胞活性化を低減する。ＴＧＦ−βには、３種のアイソフォームが存在し（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３）、これらは、別個であるが、免疫、炎症、および組織修復において重なり合う機能を有し、ＴＧＦ−βはまた、線維芽細胞活性化および筋線維芽細胞への分化において中心的な役割を有する。
【００６１】
ニューレグリン
ＮＲＧは、ＥｒｂＢレセプターに結合する上皮増殖因子スーパーファミリーに関連する増殖因子である。それらは、心不全、心臓毒性および虚血の複数のモデルにおいて心機能を改善することが示されてきた。ＮＲＧはまた、脳卒中、脊髄損傷、神経因子曝露、末梢神経損傷および化学毒性のモデルにおいて神経系を保護することが示された（総説に関しては、Ｓａｗｙｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｇｇｉａｎｏ，  ２０１１を参照のこと）。
【００６２】
ＮＲＧのファミリーメンバーは、ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３およびＮＲＧ−４遺伝子を含み、ＥｒｂＢレセプターに結合しかつこれを活性化することを可能にするＥＧＦ様ドメインを有する。ＮＲＧ遺伝子のうちの各々は、オルタナティブスプライシング転写物に起因して、複数の別個のタンパク質アイソフォームとして発現され得る（Ｆａｌｌｓ，  ２００３）。ＮＲＧはまた、それらの生物学的活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を有する改変体または機能的ホモログを含む。アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、得られた分子の生物学的活性を変化させることなく作製され得る。
【００６３】
Ｈｏｌｍｅｓら（１９９２）は、ＥＧＦ様ドメインのみがＥｒｂＢシグナル伝達に結合しかつ活性化するために十分であることを示した。よって、ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、もしくはＮＲＧ−４の遺伝子によってコードされる任意のペプチド生成物、または任意のＮＲＧ様ペプチド（例えば、ＮＲＧ遺伝子もしくはｃＤＮＡによってコードされるＥＧＦ様ドメインを有するペプチド（例えば、米国特許第５，５３０，１０９号、米国特許第５，７１６，９３０号、および米国特許第７，０３７，８８８に記載されるとおりのＮＲＧ−１ペプチドサブドメインＣ−Ｃ／ＤもしくはＣ−Ｃ／Ｄ’を含むＥＧＦ様ドメイン；またはＷＯ  ９７／０９４２５に開示されるとおりのＥＧＦ様ドメイン）は、心臓血管疾患（例えば、心不全）を防止、処置またはその進行を遅らせるために、本開示の方法において使用され得る。米国特許第５，５３０，１０９号；米国特許第５，７１６，９３０号；米国特許第７，０３７，８８８号；およびＷＯ  ９７／０９４２５の各々の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【００６４】
ＮＲＧ−１は、およそ１５個の別個の構造的に関連するアイソフォームの群を含む（Ｌｅｍｋｅ，  １９９６；  Ｐｅｌｅｓ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，  １９９３）。いくつかの実施形態において、本開示の方法において使用されるペプチドまたはその機能的フラグメントは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、もしくは少なくとも１５個のＮＲＧ−１アイソフォームを含む。これらのアイソフォームは、それらのＮ末端配列に基づいて、３つの群（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ）に分けられ得る。本開示において、ＮＲＧ−１の任意のアイソフォームが使用され得る。ＮＲＧアイソフォームは、分泌されるリガンドを直接もたらす短い転写物から生成され得るか、または合成されたリガンドであるか、または膜貫通前駆体タンパク質として合成される。
【００６５】
ＮＲＧ−１
いくつかの実施形態において、ＮＲＧペプチドは、ＮＲＧ−１βまたはその機能的改変体もしくはフラグメントである。より具体的な実施形態において、ＮＲＧ−１ペプチドまたはその機能的フラグメントは、ＮＲＧ−１βアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４、アイソフォーム５、アイソフォーム６、アイソフォーム７、アイソフォーム８、アイソフォーム９、アイソフォーム１０、アイソフォーム１１、またはアイソフォーム１２である。特に好ましい実施形態において、そのアイソフォームは、ＧＧＦ２である。
【００６６】
ある特定の実施形態において、上記ＮＲＧ−１βペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、組換えタンパク質である。別の実施形態において、上記ＮＲＧ−１βペプチドまたはその組換えフラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である。別の実施形態において、上記ＮＲＧ−１βペプチドまたはその機能的フラグメントは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である。
【００６７】
グリア増殖因子２
いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドは、グリア増殖因子、ＧＧＦ２である。成熟ＧＧＦ２のアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＧＧＦ２の機能的改変体もしくはフラグメントを含む。心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ３レセプターに結合しかつ活性化し、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するＧＧＦ２の機能的フラグメントは、配列番号２の３７１アミノ酸もしくはこれより少ない、例えば、３７０アミノ酸、３６９アミノ酸、３６８アミノ酸、３６７アミノ酸、３６６アミノ酸、３６５アミノ酸、３６０アミノ酸、３５５アミノ酸、３５０アミノ酸、３４０アミノ酸、３３０アミノ酸、３２０アミノ酸、３１０アミノ酸、３００アミノ酸、２９０アミノ酸、２８０アミノ酸、２７０アミノ酸、２６０アミノ酸、２５０アミノ酸、２４０アミノ酸、２３０アミノ酸、２２０アミノ酸、２１０アミノ酸、２００アミノ酸、１９０アミノ酸、１８０アミノ酸、１７０アミノ酸、１６０アミノ酸、１５０アミノ酸、１４０アミノ酸、１３０アミノ酸、１２０アミノ酸、１１０アミノ酸、１００アミノ酸、９０アミノ酸、８０アミノ酸、７０アミノ酸、６０アミノ酸、５５アミノ酸、５０アミノ酸、４５アミノ酸、４０アミノ酸、３５アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸を含み得る。
【００６８】
ＧＧＦ２の機能的改変体は、心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ３レセプターに結合しかつこれを活性化し、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化する。本発明の方法において使用される改変体ＧＧＦ２は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態において、上記ＧＧＦ２ペプチドは、配列番号２またはその機能的フラグメントと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
ＮＲＧ−２
いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドは、ＮＲＧ−２ペプチド、例えば、ＮＲＧ−２αまたはＮＲＧ−２βである。ＮＲＧ−２αのアミノ酸配列は、配列番号２１に示され、ＮＲＧ−２βのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＮＲＧ−２αまたはＮＲＧ−２βの機能的改変体もしくはフラグメントを含む。心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ３レセプターに結合しかつこれを活性化し、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するＮＲＧ−２αの機能的フラグメントは、配列番号２１の３２９アミノ酸もしくはこれより少ない、例えば、３２５アミノ酸、３２０アミノ酸、３１０アミノ酸、３００アミノ酸、２９０アミノ酸、２８０アミノ酸、２７０アミノ酸、２６０アミノ酸、２５０アミノ酸、２４０アミノ酸、２３０アミノ酸、２２０アミノ酸、２１０アミノ酸、２００アミノ酸、１９０アミノ酸、１８０アミノ酸、１７０アミノ酸、１６０アミノ酸、１５０アミノ酸、１４０アミノ酸、１３０アミノ酸、１２０アミノ酸、１１０アミノ酸、１００アミノ酸、９０アミノ酸、８０アミノ酸、７０アミノ酸、６０アミノ酸、５５アミノ酸、５０アミノ酸、４５アミノ酸、４０アミノ酸、３５アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸を含み得る。心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ３レセプターに結合しかつこれを活性化し、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するＮＲＧ−２βの機能的フラグメントは、配列番号２２の２９７アミノ酸もしくはこれより少ない、例えば、２９５アミノ酸、２９０アミノ酸、２８０アミノ酸、２７０アミノ酸、２６０アミノ酸、２５０アミノ酸、２４０アミノ酸、２３０アミノ酸、２２０アミノ酸、２１０アミノ酸、２００アミノ酸、１９０アミノ酸、１８０アミノ酸、１７０アミノ酸、１６０アミノ酸、１５０アミノ酸、１４０アミノ酸、１３０アミノ酸、１２０アミノ酸、１１０アミノ酸、１００アミノ酸、９０アミノ酸、８０アミノ酸、７０アミノ酸、６０アミノ酸、５５アミノ酸、５０アミノ酸、４５アミノ酸、４０アミノ酸、３５アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸を含み得る。
【００７０】
ＮＲＧ−２αまたはＮＲＧ−２βの機能的改変体は、心臓前駆細胞上のＥｒｂＢ３レセプターに結合しかつこれを活性化し、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化する。本発明の方法において使用される改変体ＮＲＧ−２αまたはＮＲＧ−２βは、配列番号２１もしくは配列番号２２、またはその機能的フラグメントと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００７１】
ＥＧＦ様ドメイン
本開示の方法における使用に適したＮＲＧ改変体ペプチドまたはその機能的フラグメントは、ＥＧＦ様ドメイン含有ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記ＥＧＦ様ドメイン含有ペプチドは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、ＮＲＧ−１β、特にＧＧＦ２に由来するＥＧＦ様ドメインを含む。具体的な実施形態において、本発明の方法において使用されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、ＧＧＦ２に由来するＥＧＦ様ドメインを含む。他の具体的実施形態において、本開示の方法において使用されるペプチドまたはその機能的フラグメントは、ＮＲＧ−１β、特に、ＧＧＦ２に由来するＥＧＦ様ドメインを含む。本発明の方法における使用に適した例示的なＥＧＦ様ドメイン含有ペプチドは、配列番号１３（ＥＧＦＬ１）、配列番号１４（ＥＧＦＬ２）、配列番号１５（ＥＧＦＬ３）、配列番号１６（ＥＧＦＬ４）、配列番号１７（ＥＧＦＬ５）、または配列番号１８（ＥＧＦＬ６）に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００７２】
組成物、投与および投与量
ある特定の実施形態において、本発明の方法における使用に適したＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、精製された組換えペプチドもしくは化学合成されたペプチドである。
【００７３】
ある特定の実施形態において、本明細書で記載されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、被験体、例えば、ヒト、獣医学的被験体、または実験動物に、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアもしくは賦形剤とともに投与され得る。本開示の組成物は、単位剤形で提供され得る。治療製剤は、液体の液剤もしくは懸濁物の形態にあり得る；経口投与に関しては、製剤は、錠剤もしくはカプセル剤の形態にあり得る；そして鼻内製剤に関しては、散剤、点鼻剤もしくはエアロゾルの形態にあり得る。
【００７４】
製剤を作成するための方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に見出される。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、もしくは塩類溶液、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源のオイル、または水素化ナフタレンを含み得る。本開示の分子を投与するための他の潜在的に有用な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸入のための製剤は、賦形剤、例えば、ラクトースを含み得るか、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水性溶液であり得るか、または点鼻剤の形態において、もしくはゲルとしての、投与のための油性液剤であり得る。
【００７５】
ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、間欠的にもしくは不連続に投与される。
【００７６】
本開示によれば、本明細書で記載されるペプチドの間欠的もしくは不連続の投与は、投与レジメンを達成することに関し、ここでその投与されるペプチドの狭い定常状態濃度は維持されず、それによって、その哺乳動物が長い継続期間にわたって投与されるペプチドの超生理学的レベルを維持することから生じ得る都合の悪い副作用を経験する可能性は低減する。例えば、外因的に投与されるＮＲＧの超生理学低レベルと関連する副作用は、神経鞘過形成、乳腺過形成、腎障害、精液減少症、肝酵素上昇、心臓弁の変化、および注射部位の皮膚の変化が挙げられる。
【００７７】
好ましい実施形態において、本開示は、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの血清レベルにおける変動を誘発または許容し、従って、そのペプチドのより頻繁な投与と関連する有害副作用の可能性を低減する間欠的投与レジメンに関する。従って、本開示の間欠的投与レジメンは、哺乳動物に治療上の利点を与えるが、そのペプチドの定常状態治療レベルを維持しない。当業者によって理解されるように、間欠的投与を得るために、本開示の種々の実施形態がある；これら実施形態の利益は、種々の方法で述べられ得る。例えば、その投与する工程は、そのペプチドの定常状態治療レベルを維持しない、その投与する工程は、ＮＲＧペプチドをより頻繁に投与することに関連する有害副作用の可能性を低減するなど。
【００７８】
ある特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、その間隔／レジメンが、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長い限りにおいて、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔を提供する。ある特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチド、その機能的改変体もしくはフラグメントは、１ヶ月間あたりに少なくとも１回、２ヶ月間あたりに１回、３ヶ月間あたりに１回、または６ヶ月あたりに１回の投与間隔で投与される。例えば、上記ペプチドは、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、または４週間にわたる投与間隔で投与される。例えば、上記ペプチドは、４ヶ月間より長い投与間隔で投与される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量は、４８時間、７２時間、９６時間、もしくはこれより長い時間の投与間隔で哺乳動物に投与される。好ましくは、投与レジメンは、７２時間、９６時間、もしくはこれより長い時間の投与間隔で哺乳動物に上記ペプチドの治療上有効な量を投与する工程を包含する。よって、本発明の方法は、その哺乳動物へのＮＲＧペプチド、その機能的改変体もしくはフラグメントの間欠的または不連続の投与（７２〜９６時間、またはさらに長い間隔ごと）を要求する。ここで上記ペプチドの投与は、上記哺乳動物における心不全を処置、防止、またはその進行を遅らせるために有効な量にある。ＮＲＧ、例えば、ＧＧＦ２またはその機能的フラグメントの投与レジメン、定常状態濃度を維持しない投与は、より頻繁な投与レジメンと同程度に等しく有効であるが、より頻繁な投与から生じ得る不都合も、コストも副作用もない。
【００８０】
ある特定の実施形態において、本明細書において、用語間欠的または不連続の投与は、２週間ごとに少なくとも１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１ヶ月間あたりに１回、２ヶ月間あたりに１回、３ヶ月間あたりに１回、４ヶ月間あたりに１回、５ヶ月間あたりに１回、６ヶ月間あたりに１回、７ヶ月間あたりに１回、８ヶ月間あたりに１回、９ヶ月間あたりに１回、１０ヶ月間あたりに１回、１１ヶ月間あたりに１回、または１２ヶ月間あたりに１回投与するためのレジメンを含む。
【００８１】
本明細書で記載される投与レジメンのある特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、１ヶ月間ごとに１回、２ヶ月間ごとに１回、３ヶ月間ごとに１回、３．５ヶ月間ごとに１回、４ヶ月間ごとに１回、４．５ヶ月間ごとに１回、５ヶ月間ごとに１回、６ヶ月間ごとに１回、７ヶ月間ごとに１回、またはより頻度の少ない投与間隔で投与される。
【００８２】
本開示の投与レジメンは、種々の要因（駆出率、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、心臓容積、心臓重量、肝毒性、あるいは脳性ナトリウム利尿ペプチド、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド、および／もしくはトロポニン−Ｉの心臓組織または血液サンプルのいずれかにおける増大または低下したタンパク質発現レベルが挙げられるが、これらに限定されない）の評価に際して、開始され得るか、確立され得るか、またはその後改変され得る。本開示の投与レジメンはまた、心不全の１もしくはこれより多くの症状（例えば、息切れ、運動不耐性、入院、再入院、死亡率、および／もしくは罹患率）の評価、改良、または改善に際して、開始され得るか、確立され得るか、またはその後改変され得る。これらの要因のうちの１もしくはこれより多くの変化は、用量間の間隔が短すぎる、投与が頻繁すぎる、または投与経路が最適でない可能性があることを示し得る。他の場合には、これらの要因のうちの１もしくはこれより多くの変化は、最適用量および／または投与間隔が達成され、必要に応じて、維持され得ることを示し得る。
【００８３】
場合によっては、肝毒性は、例えば、規則的な間隔でモニターされる。例えば、肝毒性は、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間ごとに、もしくはこれより長い期間ごとに、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分ごとに評価される。
【００８４】
場合によっては、グルコースレベル（例えば、被験体の血漿中、血清中、もしくは血中）が、規則的な間隔でモニターされる。例えば、肝毒性は、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間ごとに、もしくはこれより長い期間ごとに、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分ごとに評価される。
【００８５】
例えば、肝毒性および／またはグルコースレベルは、本明細書で記載される任意の投与レジメンで、例えば、漸増投与レジメン、漸減投与レジメン、および／または治療上有効な用量が維持される（および例えば、変更されない）投与レジメンで、モニターされる。
【００８６】
従来の薬学実務は、適切な製剤もしくは組成物を提供するために、および被験体もしくは動物にこのような組成物を投与するために、使用される。任意の適切な投与経路が使用され得る（例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、心臓内投与、腹腔内投与、鼻内投与、エアロゾル投与、経口投与、もしくは局所投与（例えば、皮膚を横断して、血流に入ることができる製剤を有する接着性のパッチを適用することによって））。例えば、投与経路は、静脈内もしくは皮下の注射／注入である。例えば、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、本明細書で記載される経路（例えば、静脈内もしくは皮下の注射／注入）によって投与され得る。他の例では、上記組成物は、カテーテル、ポンプ送達システム、もしくはステントを介して送達される。
【００８７】
ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメント（例えば、静脈内注射もしくは皮下注射のように、注射を介して投与される）の用量レベルは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ  体重の範囲に及ぶ。例えば、上記ペプチドの用量レベルは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００７ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ。
【００８８】
場合によっては、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの用量レベルは、約１．５ｍｇ／ｋｇ  体重に等しいかもしくはこれより小さく、例えば、約０．８ｍｇ／ｋｇに等しいかもしくはこれより小さいか、または約０．７５６ｍｇ／ｋｇ  体重より小さい。
【００８９】
例えば、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの用量レベルは、約０．００７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．１９ｍｇ／ｋｇ、約０．３８ｍｇ／ｋｇ、約０．７６ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１．５ｍｇ／ｋｇ  体重、例えば、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．０２１ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ  ０．１８９ｍｇ／ｋｇ、０．３７８ｍｇ／ｋｇ、０．７５６ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．５１２ｍｇ／ｋｇ  体重を含む。
【００９０】
いくつかの例では、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔で、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ  体重の用量レベルで投与される。
【００９１】
他の例では、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔で、約０．００７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．１９ｍｇ／ｋｇ、約０．３８ｍｇ／ｋｇ、約０．７６ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１．５ｍｇ／ｋｇ  体重の用量レベルで投与される。
【００９２】
場合によっては、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔で、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．０２１ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ、０．１８９ｍｇ／ｋｇ、０．３７８ｍｇ／ｋｇ、０．７５６ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．５１２ｍｇ／ｋｇ  体重の用量レベルで投与される。
【００９３】
他の場合には、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔で、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇ  体重、例えば、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約１．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．８７５ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．３５ｍｇ／ｋｇ  体重の用量レベルで投与される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量は、約０．０６ｍｇ／ｋｇ  体重〜約０．３８ｍｇ／ｋｇ  体重であり、上記投与間隔は、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長い。例えば、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、約０．０６３ｍｇ／ｋｇ、約０．１８９ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．３７５ｍｇ／ｋｇである。例えば、約０．０６３ｍｇ／ｋｇ、約０．１８９ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．３７５ｍｇ／ｋｇという上記ペプチドの治療上有効な量は、例えば、心不全を防止、処置、またはその進行を遅らせるために、静脈内の注射もしくは注入を介して投与される。
【００９５】
場合によっては、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、またはこれらの任意の組み合わせもしくはその増分の投与間隔で、約０．０５６ｍｇ／ｋｇ〜約０．５７ｍｇ／ｋｇ  体重、例えば、約０．０５６ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．５７ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与される。
【００９６】
上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの用量レベルは、上記の経路（例えば、静脈内もしくは皮下の注射／注入）を介して投与される。
【００９７】
上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの用量レベルは、皮下経路によって投与される場合、静脈内経路によって投与される場合の同じペプチドの用量レベルに等しいかもしくはこれより高い可能性がある。さらに、用量間の間隔の長さは低減し得るか、または投与の頻度は、上記ペプチドが皮下経路によって投与される場合、静脈内経路と比較して増大し得る。ある特定の実施形態において、静脈内経路によって、およびその後肝毒性を示す肝酵素の増大を示す本開示のペプチドを受ける被験体は、皮下経路によって上記ペプチドの等しいもしくはより高い用量を使用して処置され得る。
【００９８】
経皮用量は一般に、注射用量を使用して達成されるものに類似のもしくはより低い血中レベルを提供するために選択される。
【００９９】
本開示のいくつかの投与レジメンにおいて、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの初期用量が上記被験体に投与され、そしてその後の用量（例えば、第２の用量、第３の用量、第４の用量など）が、本明細書で記載される投与間隔で上記被験体に投与される。場合によっては、上記初期用量は、その後の用量のうちの１もしくはこれより多くと同じである。例えば、上記初期用量は、全てのその後の用量と同じである。場合によっては、上記初期用量は、例えば、本明細書で記載される漸増投与レジメンによって提供されるように、その後の用量のうちの１もしくはこれより多くより低い。他の場合には、上記初期用量は、例えば、本明細書で記載される漸減投与レジメンによって提供されるように、その後の用量のうちの１もしくはこれより多くより高い。
【０１００】
併用処置
上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、単独の活性薬剤として投与され得るか、またはそれらは、ヒト心臓前駆細胞もしくはヒト胚性幹細胞と組み合わせて投与され得る。さらなる薬剤は、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントと、他の化合物（例えば、同じもしくは類似の治療活性を示し、このような組み合わされた投与に関して安全かつ効果的であることが決定されるペプチド）を含め、ヒト心臓前駆細胞とともにもしくはなしで投与され得る。ＣＨＦの処置のために使用される他のこのような化合物としては、以下が挙げられる：脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；スタチン（例えば、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、もしくはシンバスタチン）；特定の神経ホルモンの形成もしくは作用をブロックする薬物（例えば、アンギオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥインヒビター）、アンギオテンシンレセプターアンタゴニスト（ＡＲＢ）、アルドステロンアンタゴニストおよびβアドレナリン作動性レセプターブロッカー）；心収縮性を増強するための変力物質（例えば、ドブタミン、ジゴキシン）；血管拡張薬（例えば、ニトレート、ネシリチド）；うっ血を低減するための利尿薬（例えば、フロセミド）；１もしくはこれより多くの抗高血圧薬（例えば、βブロッカー、ＡＣＥインヒビターおよびＡＲＢ）；ニトレート（例えば、二硝酸イソソルビド）；ヒドラジン；ならびに／またはカルシウムチャネルブロッカー。
【０１０１】
特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは改変体は、ヒト心臓前駆細胞の共投与とともにもしくはなしで、アザシチジンと組み合わせて被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、アザシチジンは、本明細書で記載されるとおりのＮＲＧペプチド（例えば、ＮＲＧ−１β、特に、ＧＧＦ２、ＮＲＧ−２α、もしくはＮＲＧ−２β、またはその機能的改変体もしくはフラグメントのような）と同時に投与される。他の実施形態において、アザシチジンは、上記ＮＲＧペプチドもしくはその機能的フラグメントを投与する前に、投与する間に、または投与した後に、投与される。いくつかの実施形態において、アザシチジンは、心臓前駆細胞の分化を促進する。より具体的な実施形態において、アザシチジンは、筋細胞への心臓前駆細胞の分化を促進する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは改変体は、ヒト心臓前駆細胞の共投与とともにもしくはなしで、ベンゾジアゼピン薬物と組み合わせて投与され得る。上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントおよび上記ベンゾジアゼピン薬物は、同じ組成物の中に、または代わりに同じ処置の一部としておよび／もしくはＥＧＦ様ドメインを含むペプチドと同じ投与レジメンに従って、被験体に投与され得る。ベンゾジアゼピン薬物は、ベンゼン環およびジアゼピン環の縮合から生じる。ベンゾジアゼピン薬物は、短時間作用性、中間型作用性、もしくは長時間作用性として分類され得る。ベンゾジアゼピン薬物は、不安寛解特性、鎮静特性、催眠特性、筋弛緩特性、健忘特性、抗癲癇特性、および抗高血圧特性を共有する。本開示の例示的なベンゾジアゼピン薬物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルプラゾラム、ブレタゼニル、ブロマゼパム、ブロチゾラム、クロルジアゼポキシド（ｃｈｌｏｒｏｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、シノラゼパム、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸（ｃｌｏｒａｚｅｐａｔｅ）、クロチアゼパム、クロキサゾラム、デロラゼパム、ジアゼパム、エスタゾラム、エスゾピクロン、エチゾラム、ロフラゼプ酸エチル、フルマゼニル、フルニトラゼパム、５−（２−ブロモフェニル）−７−フルオロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン、フルラゼパム、フルトプラゼパム、ハラゼパム、ケタゾラム（ｋｅｔａｚｏｌａｍ）、ロプラゾラム、ロラゼパム、ロルメタゼパム、メダゼパム、ミダゾラム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、ノルダゼパム、オキサゼパム、フェナゼパム、ピナゼパム、プラゼパム、プレマゼパム、ピラゾラム（ｐｕｒａｚｏｌａｍ）、クアゼパム、テマゼパム、テトラゼパム、トリアゾラム、ザレプロン、ゾルピデム、およびゾピクロン。以下の例示的ベンゾジアゼピン薬物は、不安寛解特性を有し得る：アルプラゾラム、ブレタゼニル、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸、クロチアゼパム、クロキサゾラム、デロラゼパム、ジアゼパム、エチゾラム、ロフラゼプ酸エチル、ハラゼパム、ケタゾラム、ロラゼパム、メダゼパム、ノルダゼパム、オキサゼパム、フェナゼパム、ピナゼパム、プラゼパム、プレマゼパム、およびピラゾラム。以下の例示的ベンゾジアゼピン薬物は、抗癲癇特性を有し得る：ブレタゼニル、クロナゼパム、クロラゼプ酸、クロキサゾラム、ジアゼパム、フルトプラゼパム、ロラゼパム、ミダゾラム、ニトラゼパム、およびフェナゼパム。以下の例示的ベンゾジアゼピン薬物は、催眠特性を有し得る：ブロチゾラム、エスタゾラム、エスゾピクロン、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルトプラゼパム、ロプラゾラム、ロルメタゼパム、ミダゾラム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、クアゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、ザレプロン、ゾルピデム、およびゾピクロン。以下の例示的ベンゾジアゼピン薬物は、鎮静特性を有し得る：シノラゼパム。以下の例示的ベンゾジアゼピン薬物は、筋弛緩特性を有し得る：ジアゼパムおよびテトラゼパム。
【０１０３】
特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは改変体は、ヒト心臓前駆細胞の共投与とともにもしくはなしで、ミダゾラムと組み合わせて被験体に投与され得る。ミダゾラムは、同じ組成物の中に、または代わりに同じ処置の一部としておよび／もしくは上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントと同じ投与レジメンに従って、上記ＮＲＧペプチドまたは機能的改変体もしくはフラグメントとともに投与され得る。ベンゾジアゼピン薬物（例えば、ミダゾラム）は、本開示に記載される任意の投与レジメンに従って投与され得るが、特定の実施形態において、上記ベンゾジアゼピン薬物（例えば、ミダゾラム）は、経口用量を含め、１もしくはこれより多くの用量で投与され得る。ある特定の実施形態において、上記ベンゾジアゼピン薬物（例えば、ミダゾラム）が、経口用量を含め、１もしくはこれより多くの用量で投与される場合、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、単一用量、例えば、単一静脈内注入で投与される。上記ベンゾジアゼピン薬物（例えば、ミダゾラム）は、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの用量の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。特定の実施形態において、ベンゾジアゼピン薬物（例えば、ミダゾラム）は、５経口用量で投与され、そのうちの第２の用量の後に、上記ＮＲＧまたは機能的改変体もしくはフラグメントが、単一用量、単一静脈内注入で投与される。
【０１０４】
方法の有用性
心臓カテーテル検査もしくは心臓手術に関連して、被験体が、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞の集団を有するか否かが決定され得る。代表的には、この分析は、上記被験体の心臓組織から生検材料を採取し、心臓前駆細胞のマーカー（例えば、Ｓｃａ−１およびｃ−Ｋｉｔのような）に関して組織をスクリーニングすることによって、行われる。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターの存在はまた、心臓前駆細胞の存在を示す。上記被験体が、心臓前駆細胞の適切な集団を有すると一旦同定されたら、上記細胞は、上記細胞が線維芽細胞および筋線維芽細胞への低減した変換を示すこと、ならびに／または心臓細胞へと優先的に分化することによって応答するか否かを決定するために、ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに曝露される。心臓前駆細胞が上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントに対するこの応答を示す被験体は、次いで、ＮＲＧペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは改変体で処置される。これらの方法は、心不全を含め、任意の現在の心臓傷害、疑われる心臓傷害、または予期される心臓傷害と関連して使用され得る。
【０１０５】
低減した心筋収縮性を有するヒトにおける心不全は、低減した心拍出量をもたらす。本明細書で提供される方法は、心機能を増大させ、瘢痕組織を低減し、そして健康な心臓組織を再生するために使用され得る。例えば、本明細書で記載される方法は、被験体がＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有するという決定後に、損傷したかまたは虚血になった心臓の領域において、心筋細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を促進し、線維芽細胞および筋線維芽細胞への心臓前駆細胞の変換を抑制するために、使用され得る。
【０１０６】
一局面において、本明細書で開示されるとおりの方法は、心臓傷害の後に、心臓組織を再生するか、心臓組織を修復するか、または心臓線維症を低減するために、使用され得る。別の局面において、本明細書で記載される方法は、心臓傷害の発症を防止する。
【０１０７】
適切な被験体としては、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルもしくはブタが挙げられるが、これらに限定されない。本開示のいくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、ヒトである。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、心臓傷害は、心臓血管疾患から生じる。当業者は、多くの心臓血管疾患を認識する。具体的な実施形態において、上記心臓血管疾患は、以下から生じ得る；例えば、冠動脈疾患；心不全；脳卒中；心筋梗塞；心筋症；高血圧症；虚血性心疾患；心房細動；先天性心疾患；心筋炎；心内膜炎；心膜炎（periocarditis）；アテローム性動脈硬化症；血管疾患；左室収縮機能障害；冠動脈バイパス手術；心臓毒性化合物への曝露；甲状腺疾患；ウイルス感染；歯肉炎；薬物乱用；アルコール乱用、または高い血中コレステロール。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本開示で提供される方法の被験体は、慢性心不全を示し得る。好ましい実施形態において、上記被験体の状態は、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、または６ヶ月間安定なままであったことがある。安定もしくは慢性心不全は、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、もしくは６ヶ月間の期間にわたって、心機能の増大もしくは低下および／または損傷がないことによってさらに特徴付けられ得る。例えば、上記被験体は、本明細書で記載されるとおりのペプチドを投与する前に、少なくとも１ヶ月間、例えば、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、もしくはより長く、慢性心不全に罹患したことがある。
【０１１０】
例えば、上記被験体は、本明細書で記載されるとおりのペプチドの投与前に、クラス２、クラス３、もしくはクラス４の心不全に罹患する。ニューヨーク心臓協会機能分類システムは、被験体が、身体活動の間にどの程度制限されるかに基づいて、心不全のクラスを決定するために使用される。クラス１の心不全に入る被験体は、心疾患を有するが、身体活動の制限はない。通常の身体活動は、過度の疲労、動悸、呼吸困難もしくは狭心痛を引き起こさない。クラス２の心不全に入る被験体は、身体活動の僅かな制限を生じる心疾患を有する。これらの被験体は、安静時には無症状であるが、通常の身体活動で疲労、動悸、呼吸困難または狭心痛が引き起こされる。クラス３心不全の被験体は、身体活動の顕著な制限を生じる心疾患を有する。これらの被験体は、安静時は無症状であるが、通常の身体活動未満でも、疲労、動悸、呼吸困難もしくは狭心痛が生じる。クラスＩＶ心不全の被験体は、いかなる身体活動をも症状なしには行うことができない心疾患を有する。安静時には、これらの被験体は、心不全または狭心症症候群の症状を経験し得る。いかなる身体活動も、症状レベルを増大させる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上記被験体は、収縮性心不全に罹患している。例えば、上記被験体は、左室収縮機能障害に罹患している。例えば、上記被験体は、本明細書で提供されるペプチドの投与前に、４０％もしくはこれより低い、例えば、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくはこれより低い左室駆出率を有する。
【０１１２】
いくつかの例では、上記被験体は、少なくとも１８歳齢、例えば、少なくとも１８歳齢、２０歳齢、２５歳齢、３０歳齢、３５歳齢、４０歳齢、４５歳齢、５０歳齢、５５歳齢、６０歳齢、６５歳齢、７０歳齢、７５歳齢、８０歳齢、８５歳齢、９０歳齢、もしくは９５歳齢のヒトである。場合によっては、そのヒトは、１８〜７５歳齢の間である。いくつかの例では、上記被験体は、１３〜１８歳齢の間のヒトである。
【０１１３】
場合によっては、上記被験体は、本明細書で提供されるペプチドの投与前に、急性非代償性心不全（ＡＤＨＤ）に罹患し得る。例えば、急性非代償性心不全は、救急救命室受診、入院、および／もしくは予測外の医院受診を要する心不全の１もしくはこれより多くの症状または徴候が突然に、あるいは徐々に発現することによって特徴付けられる。場合によっては、ＡＤＨＤは、肺うっ血および／または全身性うっ血と関連し、これらは、左心充満圧および／もしくは右心充満圧の増大によって引き起こされ得る。例えば、Ｊｏｓｅｐｈら，  ２００９を参照のこと。例えば、ＡＤＨＤは、当該分野で一般に公知の方法を使用して、被験体における脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）もしくはＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）の血漿レベルを測定することによって診断され得る。例えば、１００ｐｇ／ｄＬより高い、例えば、少なくとも１００ｐｇ／ｄＬ、２００ｐｇ／ｄＬ、３００ｐｇ／ｄＬ、４００ｐｇ／ｄＬ、５００ｐｇ／ｄＬ、６００ｐｇ／ｄＬもしくはこれより高い、被験体に由来する生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、血清、もしくは尿）中のＢＮＰレベルは、被験体がＡＤＨＤを有することを示し得る。いくつかの例では、本明細書で提供されるペプチドの治療的投与レジメンは、ＡＤＨＤを防止、低減、またはその発生を遅らせるために十分である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、上記心不全は、高血圧症、虚血性心疾患、心臓毒性化合物（例えば、コカイン、アルコール、抗ＥｒｂＢ２抗体もしくは抗ＨＥＲ抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標））またはアントラサイクリン系抗生物質（例えば、ドキソルビシンもしくはダウノマイシン）への曝露、心筋炎、甲状腺疾患、ウイルス感染、歯肉炎、薬物乱用、アルコール乱用、心膜炎、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、肥大型心筋症、急性心筋梗塞もしくは以前の心筋梗塞、左室収縮機能障害、冠動脈バイパス手術、飢餓、放射線曝露、摂食障害、または遺伝的欠陥から生じ得る。
【０１１５】
本開示の別の実施形態において、抗ＥｒｂＢ２もしくは抗ＨＥＲ２抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標））は、アントラサイクリンを投与する前、投与する間、もしくは投与した後に哺乳動物に投与される。
【０１１６】
本開示の他の実施形態において、被験体の心臓前駆細胞は、ＮＲＧへの応答性に関して試験され、応答性であれば、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、心臓毒性化合物への曝露の前に、心臓毒性化合物への曝露の間に、または心臓毒性化合物の曝露の後に投与される；上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、哺乳動物におけるうっ血性心不全の診断の前もしくはその後に投与される。本開示の方法は、被験体である哺乳動物が代償性心肥大を受けた後に起こり得る。いくつかの例では、本明細書で記載される方法の転帰は、左室肥大を維持すること、心筋が薄くなることを防止／その進行を遅らせること、または心筋細胞アポトーシスを阻害することである。本開示の他の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、哺乳動物におけるうっ血性心不全の診断の前もしくはその後のいずれかに投与される。本開示のさらに別の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、代償性心肥大を受けた哺乳動物に投与される。本開示の他の特定の実施形態において、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの投与は、左室肥大を維持する、心筋が薄くなることを防止／その進行を遅らせる、および／または心筋細胞アポトーシスを阻害する。
【０１１７】
他の実施形態において、ニューレグリンおよび本明細書で記載される処置もしくは予防に応答性である心臓前駆細胞に関して試験する必要性のある被験体は、心不全（例えば、うっ血性心不全）のリスクがある。個体が心不全を発生させる可能性を増大させるリスク因子は、周知である。これらとしては、以下が挙げられ、これらに限定されない：喫煙、肥満、高血圧、虚血性心疾患、血管疾患、冠動脈バイパス手術、心筋梗塞、左室収縮機能障害、心臓毒性化合物（アルコール、コカインのような薬物、ならびにドキソルビシンおよびダウノルビシンのようなアントラサイクリン系抗生物質）への曝露、ウイルス感染、心膜炎、心筋炎、歯肉炎、甲状腺疾患、放射線曝露、心不全のリスクを増大させることが公知の遺伝的欠陥（例えば、Ｂａｃｈｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９８；  Ｓｉｕら，  １９９９；およびＡｒｂｕｓｔｉｎｉら，  １９９８に記載されるもの）、飢餓、摂食障害（例えば、拒食症および過食症）、心不全の家族歴、ならびに心筋肥大。このリスクは、上記被験体が、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有するか否かを決定すること、次いで、上記心臓前駆細胞が応答性であると決定されれば、本明細書で記載されるとおりのＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを投与することによって、低減され得る。あるいは、上記リスクは、心臓前駆細胞の集団を、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体に投与すること、および本明細書で記載されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントを同時にまたは逐次的に投与することによって、低減され得る。
【０１１８】
本開示によれば、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントは、リスクがあると同定された人々におけるうっ血性心疾患進行を防止するか、またはその速度を遅らせる／低下させることによるような予防を達成するために、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体に間欠的に投与され得る。例えば、初期の代償性肥大にある被験体への上記ペプチドの投与は、肥大状態の維持を可能にする、および心不全への進行を防止／遅らせる。さらに、リスクがあると同定された人々は、上記被験体がＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出される場合、代償性肥大の発生の前に、上記ペプチドでの心臓保護処置が与えられ得る。
【０１１９】
ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出されたがん被験体への、アントラサイクリン化学療法またはアントラサイクリン／抗ＥｒｂＢ２（抗ＨＥＲ２）抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標））の前、およびその間の本明細書で記載されるＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの投与、併用療法は、被験体の心筋細胞がアポトーシスを受けることを妨げ得／遅らせ得、それによって、心機能を保存し得る。心筋細胞喪失を既に罹患したことがある被験体はまた、ＮＲＧ処置から利益を得る。なぜならその残りの心筋組織は、肥大性増殖および増大した収縮性を示すことによって、ＮＲＧ曝露に応答するからである。
【０１２０】
心機能の例示的な評価基準（ｍｅｔｒｉｃｓ）としては、心室駆出率（ＥＦ）、例えば、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、収縮末期容積（ＥＳＶ）、拡張末期容積（ＥＤＶ）、短縮率（ＦＳ）、入院回数、運動耐容能、僧帽弁逆流、呼吸困難、末梢浮腫、およびＡＤＨＤの発生が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書で開示されるとおりのペプチドの投与の結果としての心機能の改善は、例えば、以下のうちの１もしくはこれより多くによって検出される：ＬＶＥＦの増大、ＥＳＶの減少、ＥＤＶの減少、ＦＳの増大、入院回数の減少、運動耐容能の増大、僧帽弁逆流発生の回数またはその重篤度の低減、呼吸困難の低減、末梢浮腫の低減、およびＡＤＨＤの防止またはその発生の低減。いくつかの例では、被験体が、ＬＶＥＦが保存された心不全に罹患する場合、心機能の評価基準としては、ＥＳＶ、ＥＤＶ、ＦＳ、入院回数、運動耐容能、僧帽弁逆流、呼吸困難、ＡＤＨＤの発生および末梢浮腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
いくつかの例では、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体またはＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を受けた被験体への上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量の投与は、上記ペプチドの投与前のＬＶＥＦと比較して、少なくとも１％、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくはこれより高い程度、上記被験体においてＬＶＥＦを増大させるために十分である。例えば、ＬＶＥＦの増大は、少なくとも１〜２０％である。場合によっては、本明細書で記載されるとおりのＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＬＶＥＦを、約１０〜４０％の駆出率へと増大させるために十分であり、例えば、上記被験体のＬＶＥＦは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、もしくは約４０％の駆出率へと増大される。他の場合には、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＬＶＥＦを、約４０〜６０％の駆出率へと増大させるために十分であり、例えば、上記被験体のＬＶＥＦは、約４０％、４５％、５０％、５５％、もしくは約６０％の駆出率へと増大される。さらに他の場合では、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＬＶＥＦを正常なＬＶＥＦ値へと完全に回復させるために十分である。例えば、上記被験体のＬＶＥＦは、上記被験体における上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの第１の投与、例えば、初期用量の９０日間もしくはこれより短い日数以内に、例えば、９０日間、８０日間、７０日間、６０日間、５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１０日間、もしくはこれより短い日数以内に増大する。場合によっては、上記被験体において増大したＬＶＥＦは、上記ペプチドの第１の投与の後に、例えば、上記ペプチドのその後の投与なしに、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く維持される。例えば、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、上記ペプチドの第１の投与の後に、例えば、上記ペプチドのその後の投与なしに、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く、上記被験体においてＬＶＥＦを維持するおよび／または安定化するために十分である。
【０１２２】
いくつかの例では、上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量の投与は、上記ペプチドの投与前の被験体のＥＤＶと比較して、少なくとも１ｍＬ、例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、もしくはこれより多く、例えば、少なくとも１〜６０ｍＬ程度、被験体においてＥＤＶを減少させるために十分である。例えば、上記被験体のＥＤＶは、上記被験体における上記ペプチドの第１の投与の、例えば、上記ペプチドの初期用量の９０日間もしくはこれより短い日数以内で、例えば、９０日間、８０日間、７０日間、６０日間、５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１０日間、もしくはこれより短い日数以内で減少する。場合によっては、上記被験体において減少したＥＤＶは、上記ペプチドの第１の投与後に、例えば、上記ペプチドのその後の投与なしに、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く維持される。
【０１２３】
他の例では、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体への上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量の投与は、上記ペプチドの投与前の上記被験体のＥＳＶと比較して、少なくとも１ｍＬ、例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、もしくはこれより多く、例えば、少なくとも１〜３０ｍＬ程度、上記被験体においてＥＳＶを減少するために十分である。例えば、上記被験体のＥＳＶは、上記被験体における上記ペプチドの第１の投与の、例えば、上記ペプチドの初期用量の９０日間もしくはこれより短い日数以内で、例えば、９０日間、８０日間、７０日間、６０日間、５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１０日間、もしくはこれより短い日数以内で減少する。場合によっては、上記被験体において減少したＥＳＶは、上記ペプチドの第１の投与後に、例えば、上記ペプチドのその後の投与なしに、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く維持される。
【０１２４】
場合によっては、ＮＲＧに応答性である心臓前駆細胞を有することが見出された被験体への上記ＮＲＧペプチドまたはその機能的改変体もしくはフラグメントの治療上有効な量の投与は、上記ペプチドの投与前のＦＳと比較して、少なくとも１％、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくはこれより多く、上記被験体においてＦＳを増大させるために十分である。例えば、ＦＳの増大は、少なくとも１〜１５％である。場合によっては、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＦＳを、約１５％、例えば、約１％、２％、３％、４％、６％、７％、８％、９％、１０％、もしくは約１５％のパーセント短縮率へと増大させるために十分である。他の場合では、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＦＳを、約１５〜２０％、例えば、約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは約２０％のパーセント短縮率へと増大させるために十分である。さらに他の場合には、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＦＳを、約２０〜２５％、例えば、約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは約２５％のパーセント短縮率へと増大させるために十分である。さらなる場合には、本明細書で提供されるペプチドの治療上有効な量は、必要性のある被験体のＦＳを、約２５〜４５％、例えば、約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、もしくは約４５％のパーセント短縮率へと増大させるために十分である。例えば、上記被験体のＦＳは、上記被験体において、上記ペプチドの第１の投与の、例えば、上記ペプチドの初期用量の９０日間もしくはこれより短い日数以内で、例えば、９０日間、８０日間、７０日間、６０日間、５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１０日間、もしくはこれより短い日数以内で増大する。場合によっては、上記被験体において増大したＦＳは、上記ペプチドの第１の投与後に、例えば、上記ペプチドのその後の投与なしに、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、９０日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月（年４回）、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、もしくはこれより長く維持される。
【０１２５】
本明細書で記載される心機能を評価するための評価基準は、当該分野で一般に公知の方法によって決定される。
参考文献：
１．Ａｒｂｕｓｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒｔ  ８０：５４８−５５８，１９９８
２．Ｂａｃｈｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．１６：６０３−６１０，１９９８
３．Ｃａｒｒａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６，１９９７
４．Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５０９−５１２，１９９７
５．Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．３３９：１８１０−１８１６，１９９８
６．Ｇａｌｉｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉｃａｔｉｏｎ  ３：ｅ０００７７３，２０１４
７．Ｆａｌｌｓ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２８４（１）：１４-３０，２００３．
８．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：６７５−６８０，１９９７
９．Ｈｉｊａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１０６１−１０６７，１９９８
１０．Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０，１９９２
１１．Ｊｏｓｅｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｘ．Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔ．Ｊ．３６（６）：５１０−２０，２００９
１２．Ｌｅｍｋｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７−２６２，１９９６
１３．Ｌｅｎｉｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ９−１１，２０１３
１４．Ｎｏ  ａｕｔｈｏｒｓ  ｌｉｓｔｅｄ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，８３（２Ａ）：１Ａ−３８−Ａ，１９９９
１５．Ｐｅｌｅｓ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １５：８１５−８２４，１９９３
１６．Ｓａｗｙｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｇｇｉａｎｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．５１（４）：５０１−５，２０１１
１７．Ｓｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８：１０２２−１０２６，１９９９
１８．ＳＯＬＶＤ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：６８５−６９１，１９９２
【０１２６】
本明細書で記載される実施形態は、例示であるに過ぎないことが意図され、当業者は、慣用的な実験法のみを使用して、本明細書で記載される具体的手順に対する多くの均等物を認識するか、または確認し得る。全てのこのような均等物は、本開示に範囲内であると見做され、以下の実施形態によって網羅される。本明細書で引用される全ての参考文献（特許出願、特許および刊行物を含む）は、各個々の刊行物もしくは特許もしくは特許出願が、全ての目的でその全体において参考として援用されていることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度まで、それらの全体においておよび全ての目的のために本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【０１２７】
実施例１．一般的方法
心臓の細胞の単離
マウスの心臓の細胞の単離を、１０ｍｇ／ｍｌ  コラゲナーゼＩＩ、２．５Ｕ／ｍｌ  ディスパーゼＩＩ、１μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ、および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を使用して、２０分間、３７℃において心室の消化後に行った。心臓のＣＤ３１ｐｏｓＣＤ４５ｎｅｇ内皮細胞およびＳｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞を、磁性活性化セルソーティングＭｉｃｒｏＢｅａｄ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ）を使用して単離した。
【０１２８】
単一細胞コロニー生成技術を使用して、ヒト心臓前駆細胞を単離した。ヒト心臓前駆細胞を、バイパス手術を受けている被験体から得た前方左室自由壁心外膜生検から単離した。単一細胞懸濁物を、コラゲナーゼＩＩ／ディスパーゼＩＩ／ＣａＣｌ２消化溶液を使用して調製し、１０３  細胞／ｃｍ２の濃度で４８培養ディッシュの中にプレートした。造血細胞を、ヒトＣＤ４５マイクロビーズを使用して、磁性分離によって除去した。ＣＤ４５枯渇細胞を、Ｍ１９９−ＥＧＭ−２培地中１０３  細胞／ｃｍ２の密度で、４８ウェルプレート上にプレートした。上記ウェルを、１週間に２回コロニー増殖に関して分析した。迅速に増殖するコロニー（２〜３コロニー／サンプル）を採取し、新鮮な増殖培地中に再懸濁し、０．１％  ゼラチン被覆組織培養ディッシュ上に５×１０３  細胞／ｃｍ２の密度でプレートした。ヒト心臓前駆細胞を、ＣＤ１０５の細胞表面発現、ならびにＣＤ３１内皮マーカー、ＣＤ４５、およびＣＤ１１７／ｃ−Ｋｉｔ造血マーカーの非存在によって特徴付けた。
【０１２９】
心筋生成分化の誘導
心筋生成分化を誘導するために、心臓前駆細胞を、１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ−ＬＧ培地中で７２時間、５μＭ  ５’−アザシチジンで予備処理し、２％  ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ、１００μＭ  アスコルビン酸、０．２％  ＤＭＳＯ、および１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ−ＬＧ培地中で培養し、３日ごとに交換した。
【０１３０】
内皮細胞に向かう心臓前駆細胞の分化を、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む１５％  ＦＢＳ  １９９培中で、細胞をインキュベートすることによって誘導した。
【０１３１】
心筋梗塞の誘導
マウスにおける心筋梗塞を、左冠動脈の恒久的な結紮によって誘導した。
【０１３２】
当業者に公知の任意の技術は、心筋梗塞を誘導するために使用され得る。例えば、心筋梗塞は、血管造影法によるガイド下での冠動脈内バルーン閉塞によって誘導され得る（例えば、Ｇａｌｉｎｄｏら，  ２０１４を参照のこと）。
【０１３３】
免疫組織化学
αＳＭＡおよびコラーゲンタイプＩに関する細胞内染色を、固定し、透過化した細胞（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、モノクローナルＦＩＴＣ結合体化抗αＳＭＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）およびビオチン結合体化抗コラーゲンタイプＩ抗体（６００−４０１−１０３；  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＰＡ）を使用して行った。マウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ結合体化（Ｓｉｇｍａ）およびビオチン結合体化ウサギ全ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）を、アイソタイプコントロールとして使用した。生細胞および非生細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｓｔａｉｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用して区別した。
【０１３４】
フローサイトメトリー分析を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して行い、そのデータを、ＷｉｎＬｉｓｔ  ５．０ソフトウェアで分析した。
【０１３５】
組換えＮＲＧタンパク質
国際公開番号ＷＯ２０１００３０３１７およびＷＯ２０１４１３８５０２に記載されるとおりの確立されたアプローチに従って、複数のＮＲＧスプライス改変体を、クローニングして生成した。
【０１３６】
実施例２．心臓におけるＮＲＧレセプターの発現
心臓前駆細胞の単離された亜集団の純度を決定するために、磁性活性化前および磁性活性化後のセルソーティングを行った（図１Ａ）。次に、ＮＲＧレセプター（すなわち、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、Ｅｒｂ４）のいずれがマウス心臓前駆細胞において発現されるのかを決定するために、ＥｒｂＢレセプターのｍＲＮＡを分析した。図１Ｂに示されるように、マウス心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ間質細胞は、機能的なＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターを発現した。ＮＲＧレセプターの発現を、Ｓｃａ−１ｐｏｓ／ＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞上での細胞表面マーカーのフローサイトメトリーヒストグラム（図１Ｃ）を分析することによって確認した。これらの研究から、マウス心臓前駆細胞は、高レベルのＥｒｂＢ２、中程度のレベルのＥｒｂ３、および非常に少ないＥｒｂＢ４を発現することが示された（図１Ｂ）。
【０１３７】
実施例３．インビトロで内皮細胞および心筋細胞に向かうマウス心臓前駆細胞の分化
図２Ａは、増殖培地または内皮細胞分化培地中での心臓前駆細胞のインキュベーション後の、毛細管様構造形成の顕微鏡写真を示す。ＣＤ３１ｐｏｓ心臓内皮細胞を、陽性コントロールとして使用した。図２Ｂは、増殖培地中または内皮細胞分化培地中でインキュベートした心臓前駆細胞、および心臓内皮細胞の形態発生活性のグラフ表示を示す。毛細管形成を、それらの全長を測定することによって評価した。通常の増殖培地中または心筋細胞分化培地中で、１週間または３週間培養した心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ細胞における心臓特異的遺伝子発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した（図２Ｃ）。この研究から、マウス心臓前駆細胞は、内皮細胞および心筋細胞に向かって分化することを示す。値は、３回の実験の平均である。
【０１３８】
実施例４．ＮＲＧ−１は、筋線維芽細胞へのマウス心臓前駆細胞の移行を防止する。
代表的なフローサイトメトリードットプロットは、心臓前駆細胞が、マウスでの実験的心筋梗塞後７日目に、インビボでαＳＭＡ陽性およびコラーゲン１生成筋線維芽細胞に向かって蓄積することを示す（図３Ａ）。図３Ｂは、αＳＭＡ陽性およびコラーゲン１α陽性Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ心臓前駆細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフによる代表的データを示す。Ｐ値が示される（対応のないｔ検定）。ＴＧＦβ単独とともに、または３０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ−１と組み合わせて、４８時間インキュベートした心臓前駆細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現は、図３Ｃにおいて代表的な細胞蛍光グラフィックドットプロットにおいて図示される。興味深いことに、この実験は、ＮＲＧ−１が筋線維芽細胞発現を低減することを示す。さらに、心臓Ｓｃａ−１ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞におけるαＳＭＡ発現の平均蛍光強度を、フローサイトメトリーによって評価した（図３Ｄ）。データは、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、ｔ検定によって計算された有意レベルを示す。
【０１３９】
実施例５．ヒト心臓の血管および血管周囲領域におけるＥｒｂ２およびＥｒｂＢ３レセプターの位置決定
この研究は、ヒト心臓におけるＮＲＧレセプターの位置決定を調べる。図４は、マウス心臓におけるＥｒｂＢレセプターの類似の発現が、ヒト心臓に由来する心臓ｐｏｓＣＤ３１ｎｅｇ前駆細胞に存在することを示す。具体的には、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターは、ヒト心臓の血管／血管周囲領域に位置する（図４）
【０１４０】
実施例６．ＮＲＧ−１は筋線維芽細胞へのヒト心臓前駆細胞の移行を防止する
この研究は、ＮＲＧ−１で心臓前駆細胞を刺激することの効果を調査した。図５Ａは、単一細胞由来クローンを再プレートした直後および３日後のヒト心臓前駆細胞の例示的な位相差顕微鏡写真を示す。スケールバー＝１００μｍ。次に、分化培地中で１週間または２週間培養する前および培養した後のヒト心臓前駆細胞における心臓特異的遺伝子発現を、リアルタイムＰＣＲを使用して分析した（図５Ｂ）。値は、３回の実験の平均である（対応のないｔ検定）。図５Ｃは、ヒト心臓前駆細胞上の細胞表面マーカーの代表的フローサイトメトリーヒストグラムを示す。影付きの領域は、相当するアイソタイプマッチ抗体コントロールで処理した細胞の蛍光を表す。これらの研究は、ＮＲＧ−１および内因性ＥｒｂＢレセプターリガンドでの細胞の刺激が、筋線維芽細胞へのそれらの移行を防止することを示した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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