(57)【要約】  一倍体ヒト胚性幹細胞と細胞株、一倍体多能性ヒト細胞、および分化した一倍体ヒト細胞が提供される。加えて、一倍体ヒト細胞を作製する方法、および使用する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製する方法であって、
ａ）ＥＳ細胞の集団からの試料中の一倍体中期細胞を識別することであって、前記ＥＳ細胞が人為的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する、一倍体中期細胞を識別すること、および
ｂ）一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製するために細胞倍数性に基づいて前記ＥＳ細胞の集団を選別すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＥＳ細胞の濃縮集団を培養中で少なくとも３継代の間維持することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の前記一倍体中期細胞が中期スプレッド解析またはサブ−２ｃ細胞選別によって識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料中の前記一倍体中期細胞がフローサイトメトリー、セントロメアタンパク質免疫蛍光染色またはＤＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによって識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選別ステップが蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を少なくとも１サイクル含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を作製する方法であって、
ａ）ＥＳ細胞の集団からの試料中の一倍体中期細胞を識別することであって、前記ＥＳ細胞が人為的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する、ＥＳ細胞の集団からの試料中の一倍体中期細胞を識別すること、および
ｂ）ＦＡＣＳを２〜５サイクル用いることにより細胞倍数性に基づいて前記ＥＳ細胞の集団を選別すること、
それによって一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を作製することを含む、方法。
【請求項７】
前記試料中の前記一倍体中期細胞が中期スプレッド解析またはサブ−２ｃ細胞選別によって識別される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一倍体ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の濃縮集団。
【請求項９】
一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を含む組成物。
【請求項１０】
前記濃縮集団が少なくとも５％の一倍体ヒトＥＳ細胞を含む、請求項８に記載の濃縮集団、請求項９に記載の組成物、または請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
培養中の一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１２】
一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を含む、組成物。
【請求項１３】
前記実質的に純粋な集団が少なくとも９５％の一倍体ヒトＥＳ細胞を含む、請求項１１に記載の実質的に純粋な集団、請求項１２に記載の組成物、または請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
分離された一倍体ヒトＥＳ細胞株。
【請求項１５】
一倍体ヒトＥＳ細胞株を作製する方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法によって一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製すること、
ｂ）培養中で一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を維持すること、および
ｃ）培養中の前記ＥＳ細胞を３〜４継代ごとに選別することであって、前記選別することが細胞倍数性に基づく、選別すること、
それによって、一倍体ヒトＥＳ細胞株を作製することを含む、方法。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一倍体多能性ヒト細胞の集団。
【請求項１７】
一倍体多能性ヒト細胞の集団を含む組成物。
【請求項１８】
一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製する方法であって、定方向分化の条件下で一倍体ヒト胚性幹細胞を培養すること、それによって一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む、方法。
【請求項１９】
一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）胚様体形成を誘導する条件下で、一倍体ヒトＥＳ細胞を培養すること、および
ｂ）胚様体を細胞に解離させること、
それによって、一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む、方法。
【請求項２０】
一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）テラトーマ形成を誘導する条件下で、一倍体ヒトＥＳ細胞を非ヒト哺乳動物に注入すること、および
ｂ）前記テラトーマを細胞に解離させること、
それによって、一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む、方法。
【請求項２１】
ｃ）細胞表面マーカーに基づいて解離細胞を選別することをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記選別することがＦＡＣＳを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記一倍体多能性ヒト細胞の集団が実質的に純粋な集団である、請求項１６に記載の集団、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８、１９もしくは２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記一倍体多能性ヒト細胞の集団が内胚葉前駆細胞を含む、請求項１６に記載の集団、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８、１９もしくは２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記一倍体多能性ヒト細胞の集団が中胚葉前駆細胞を含む、請求項１６に記載の集団、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８、１９もしくは２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記一倍体多能性ヒト細胞の集団が外胚葉前駆細胞を含む、請求項１６に記載の集団、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８、１９もしくは２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記一倍体多能性ヒト細胞の集団が神経前駆細胞を含む、請求項１６に記載の集団、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
培養中の分化した一倍体ヒト体細胞の集団。
【請求項２９】
分化した一倍体ヒト体細胞の集団を含む組成物。
【請求項３０】
分化した一倍体ヒト体細胞の集団を作製する方法であって、定方向分化の条件下で一倍体ヒトＥＳ細胞または一倍体多能性ヒト細胞を培養すること、それによって、分化した一倍体ヒト体細胞の集団を作製することを含む、方法。
【請求項３１】
前記分化した一倍体ヒト体細胞が神経細胞、心筋細胞、膵細胞、皮膚細胞、筋細胞、腎臓細胞、肝細胞、肺細胞および腸細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の集団、請求項２９に記載の組成物、または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝学的スクリーニングの方法であって、
ａ）細胞中で少なくとも１つの変異を誘導するためにヒト一倍体ＥＳ細胞の濃縮集団を変異原に曝すこと、
ｂ）前記変異を含有する前記濃縮集団においてヒト一倍体ＥＳ細胞を選択すること、および
ｃ）前記ヒト一倍体ＥＳ細胞において前記変異の遺伝子型効果および／または表現型効果を識別すること
を含む、方法。
【請求項３３】
前記遺伝学的スクリーニングが順遺伝学的スクリーニングである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記変異原が物理的変異原、化学的変異源および生物由来物質からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月２９日に出願の米国特許出願第６２／１９８，６１４号、２０１６年１月１５日に出願の同第６２／２７９，４９０号、および２０１６年２月８日に出願の同第６２／２９２，７５５号の関連出願であり、米国特許法第１１９（ｅ）の下でこれらの出願に基づく優先権を主張する。その全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
添付する配列表中の材料は、参照によって本出願に組み込まれている。添付の配列表のテキストファイル、ファイル名ＮＹＳＣ１２７０＿３ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇは、２０１６年７月２７日に作成され、２ｋｂである。同ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピュータでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用して評価することができる。
【背景技術】
【０００３】
二倍性は哺乳動物の基本的な遺伝的特徴であり、二倍性では一倍体細胞は通常、受精時に二倍体ゲノムを確実にするのに役立つ減数分裂後の生殖細胞としてのみ生じる。配偶子操作により、いくつかの哺乳動物種から一倍体胚性幹（ＥＳ）細胞が得られたが１〜６、本発明以前は、ヒトからは得られてない。
【０００４】
一倍体遺伝学はゲノム機能を詳細に描写するための有用なツールであり、単一対立遺伝子変異が表現型を誘発するのに十分であるので、一倍体哺乳動物細胞は、機能喪失遺伝学的スクリーニングを通して貴重であることが判明した７。一倍体ヒトＥＳ細胞株の誘導は、おそらくヒト卵母細胞の入手可能性が限定されていることによって妨げられている１０。したがって、ヒトにおいて、機能喪失スクリーニングは、これまでほぼ一倍体の慢性骨髄性白血病細胞株３０およびその誘導体細胞よって促進されてきた３１。有用であるが、これらは単一細胞型を表す染色体異常癌細胞である。その意味で、遺伝学的スクリーニングのために一倍体ヒトＥＳ細胞を利用する利点は、そのゲノム安定性、ヒト初期発生をモデル化するその能力、および実質的に任意の目的の細胞型を生じさせるその可能性を前提にしている。
【０００５】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９−媒介突然変異誘発の効率の増加により二倍体細胞での機能喪失スクリーニングを容易にすることができるが、各対立遺伝子は異なった影響を受けることがありえ、一倍体ゲノムにおける機能遺伝子破壊をより効率的にする３２、３３。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用は予め設計された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を必要とするが、遺伝子トラップ法などの偏りが少ない突然変異誘発手法は、機能喪失スクリーニングのために一倍体細胞に容易に用いることができるが、二倍体細胞には用いることができない７。
【０００６】
進化を通して、哺乳類ゲノムは、一倍体片親胚の発生を制限する親のインプリンティングなどの二倍性に依存する適応によって固定されてきた。それにもかかわらず、一倍体細胞は特定の動物種において発生を引き起こすことができる３４。一倍体ヒトゲノムの驚くべき分化能は、一倍性よりも二倍性に依存する適応がヒトにおける発生の主要な障壁をもたらし得ることを示唆する。したがって、本発明者らの一倍体ヒトＥＳ細胞の発見は、ヒト遺伝学および発生の基本的側面を描写する新規の手段を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
未受精細胞分裂中期ＩＩ（ＭＩＩ）ヒト卵母細胞の人為的活性化により、胚盤胞期と、それに続く単為発生ＥＳ（ｐＥＳ）細胞株の誘導へと効率的な発育がもたらされる１３〜１５。ＭＩＩでの第二極体放出により一倍体卵がもたらされるが、これらのＥＳ細胞は二倍体として繰り返し報告されてきた。本発明者らは、一倍体卵母細胞に由来するヒト単為発生ＥＳ細胞株の収集を作成して、解析し、正常な一倍体核型を有するヒトＥＳ細胞株の分離および維持に成功した。一倍体ヒトＥＳ細胞は、自己複製能および多能性特異的分子シグネチャーなどの多能性幹細胞特性を示した。さらに、本発明者らは、遺伝子トラップ型一倍体ヒトＥＳ細胞のライブラリーを使用して、機能喪失遺伝学的スクリーニングのためのプラットフォームとしてのこれらの細胞の有用性を示した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
しかし、一倍体ヒトＥＳ細胞は、その二倍対応体とは異なる特性、例えば、絶対遺伝子発現レベルと細胞サイズの低下と同時に、Ｘ染色体不活性化の差次的制御および酸化的リン酸化に関与する遺伝子の差次的制御も示した。驚くべきことに、常染色体とＸ染色体の間の遺伝子量が持続的に不均衡であるにもかかわらず、一倍体ヒトゲノムは、未分化多能性状態だけに適合するばかりでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、３つの胚性胚葉すべてを表す分化した体細胞運命にも適合する。一倍体ヒトＥＳ細胞は、ヒト機能ゲノミクスおよび発生を研究する新規の方法を提供する。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、培養中の、好ましくは培地中の一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団と、一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を含む組成物とを提供する。
【００１０】
本発明は、一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製する方法も提供し、該方法はＥＳ細胞の集団由来の試料において一倍体中期を識別すること、および一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製するために細胞の倍数性に基づいてＥＳ細胞の集団を選別することを含み、該ＥＳ細胞は人為的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する。一部の実施形態において、この方法は、少なくとも３継代間の培養においてＥＳ細胞の濃縮集団を維持することをさらに含む。好ましくは、試料中の一倍体細胞は２未満の染色体コピー数を有する細胞の中期スプレッド解析または選別によって識別される。一部の実施形態において、細胞倍数性に基づく選別ステップは、フローサイトメトリーを少なくとも１サイクル、好ましくは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。一倍体細胞は、フローサイトメトリー、セントロメアタンパク質免疫蛍光染色またはＤＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によっても識別されることができる。
【００１１】
好ましくは、濃縮集団は、少なくとも５％の一倍体ヒトＥＳ細胞を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、培養中に、好ましくは培地中に、一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団と、一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を含む組成物とを提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を作製する方法を提供し、該方法は、ＥＳ細胞の集団からの試料において一倍体中期を識別すること、およびＦＡＣＳを２〜５サイクル使用して、細胞倍数性に基づきＥＳ細胞の集団を選別すること、それによって、一倍体ヒトＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を作製することを含み、該ＥＳ細胞は人為的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する。好ましくは、試料中の一倍体細胞は、２未満の染色体コピー数を有する細胞の中期スプレッド解析または選別によって識別される。一倍体細胞は、フローサイトメトリー、セントロメアタンパク質免疫蛍光染色またはＤＮＡ  ＦＩＳＨによって識別されることもできる。
【００１４】
好ましくは、実質的に純粋な集団は、少なくとも９５％一倍体ヒトＥＳ細胞を含む。
【００１５】
本発明は、一倍体ヒトＥＳ細胞株を作製する方法を提供し、該方法は、本発明の方法によって一倍体ヒトＥＳ細胞の濃縮集団を作製すること、一倍体ヒトＥＳ砂防の濃縮集団を培養中に維持すること、および細胞倍数性に基づいて、３〜４継代ごとに培養中のＥＳ細胞を選別すること、それによって、一倍体ヒトＥＳ細胞株を作製することを含む。
【００１６】
本発明は、本発明の方法によって作製される一倍体ヒトＥＳ細胞株を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、培養中の一倍体多能性ヒト細胞の集団と、一倍体多能性ヒト細胞の集団を含む組成物とを含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製する方法であり、該方法は、定方向分化の条件下で、一倍体ヒト胚性幹細胞を培養すること、それによって一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製する方法であって、該方法は、胚様体形成を誘導する条件下で、一倍体ヒトＥＳ細胞を培養すること、および胚様体を細胞に解離させること、それによって一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む。一部の実施形態において、本方法は、解離細胞が細胞表面マーカーに基づいて解離細胞を選別することをさらに含む。一部の実施形態において、選別はＦＡＣＳを含む。
【００２０】
好ましくは、一倍体多能性ヒト細胞の集団は実質的に純粋な集団である。一実施形態において、一倍体多能性ヒト細胞の集団は、内胚葉前駆細胞を含む。一実施形態において、一倍体多能性ヒト細胞の集団は、中胚葉前駆細胞を含む。一実施形態において、一倍体多能性ヒト細胞の集団は、外胚葉前駆細胞を含む。一実施形態において、一倍体多能性ヒト細胞の集団は、神経前駆細胞を含む。
【００２１】
本発明は、培養中の一倍体分化ヒト体細胞の集団と、一倍体分化ヒト体細胞の集団を含む組成物とを提供する。本発明は、分化した一倍体ヒト体細胞の集団を作製する方法も提供し、該方法は、定方向分化の条件下で一倍体ヒトＥＳ細胞を培養すること、それによって分化した一倍体ヒト体細胞の集団を作製することを含む。本発明は、分化した一倍体ヒト体細胞の集団を作製する方法をさらに提供し、該方法は、テラトーマ形成を誘導する条件下で一倍体ヒトＥＳ細胞を非ヒト哺乳動物に注入すること、およびテラトーマを細胞に解離させること、それによって、一倍体多能性ヒト細胞の集団を作製することを含む。
【００２２】
好ましくは、分化した一倍体ヒト体細胞は、神経細胞、心筋細胞、膵細胞、皮膚細胞、筋細胞、腎臓細胞、肝細胞、肺細胞および腸管細胞からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、遺伝学的スクリーニングの方法であり、該方法は、細胞において少なくとも１つの変異を誘導するためにヒト一倍体ＥＳ細胞の濃縮集団を変異原に曝すこと、該変異を含む濃縮集団においてヒト一倍体ＥＳ細胞を選択すること、およびヒト一倍体ＥＳ細胞において変異の遺伝子型効果および／または表現型効果を識別することを含む。一実施形態において、遺伝学的スクリーニングは順遺伝学的スクリーニングである。一実施形態において、変異原は、物理的変異原、化学的変異源および生物由来物質からなる群から選択される。好ましくは、変異原は生物学的作用物質であり、より好ましくはベクターである。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子改変ヒト一倍体ＥＳ細胞の集団を提供する。同様に、別の態様において、本発明は、遺伝子改変ヒト一倍体多能性細胞の集団を提供する。さらに別の態様において、本発明は、遺伝子改変ヒト一倍体分化型体細胞の集団を提供する。そのような実施形態の各々において、遺伝子改変ヒト一倍体細胞（すなわち、ＥＳ細胞、多能性細胞または分化した体細胞）は、少なくとも１つの人為的に導入された変異を含有する。別の態様において、本発明は、例えば遺伝子トラップライブラリーなどのそのような遺伝子改変ヒト一倍体細胞のライブラリー（すなわち、遺伝子改変ＥＳ細胞、多能性細胞、または分化した体細胞のライブラリー）を提供し、該ライブラリーは複数の異なる人為的に導入された変異を含む。遺伝子改変ヒト一倍体細胞に関与する実施形態の各々において、変異は、物理的変異原、化学的変異源および生物由来物質からなる群から選択される変異原でヒト一倍体細胞を処理することによって導入されることができる。同様に、これらの実施形態の各々において、遺伝子改変一倍体細胞は任意選択で、例えば、人為的に導入される変異と関連した１または複数のマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子も含み得る。
【００２５】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。カラー図面が添付された本特許または特許出願公開のコピーは、要請により有料で米国特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１は一倍体ヒトＥＳ細胞株の誘導を示す。ＥＳ細胞株をもたらす単為発生卵母細胞の活性化および潜在的一倍性の模式的概略を示す。受精を行わずＭＩＩでの第２極体（ＰＢ）放出により、一倍体１−細胞期胚がもたらされ、一倍体細胞は二倍体化によって徐々に除去される。
【図１Ｂ】図１ｂは、指数関数的減衰フィットと重ねた（赤色の曲線）、１０％の理論的二倍体化確率による一倍体卵の二倍体化速度モデルを示す。異なるＥＳ細胞株の誘導段階の近似細胞周期数を示す。
【図１Ｃ】図１ｃは、１ｃ−細胞の繰り返し選別と濃縮後の一倍体濃縮ヒトＥＳ細胞株ｈ−ｐＥＳ１０の確立を示す。ｃ：染色体コピー数。上段から下段へ：未選別の二倍体細胞のＤＮＡ量プロファイル、選別４回目での部分的に精製した一倍体細胞、および選別６回目でほとんど精製した一倍体細胞。
【図１Ｄ】図１ｄは、４ラウンドの一倍体細胞濃縮と伸長の前後のｐＥＳ１０二倍体核型と一倍体核型を示す。
【図１Ｅ】図１ｅは、フローサイトメトリーによる７継代にわたるｈ−ｐＥＳ１０の二倍体化動態を、指数関数フィットをデータに重ねて（赤色の曲線）示す。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【図１Ｆ】図１ｆは、ＤＮＡ  ＦＩＳＨを示す。
【図１Ｇ】図１ｇは、一倍体濃縮および未選別の二倍体ｐＥＳ１０細胞中のセントロメア染色を示す。拡大挿入図は、単一ハイブリダイゼーションシグナルまたは二重ハイブリダイゼーションシグナルのいずれか（図１ｆ）、およびそれぞれ２３または４６セントロメア（図１ｇ）を有する代表的な一倍体核と二倍体核を示す。白い矢印は、２倍体核を示している。スケールバー＝１０μｍ。
【図２Ａ】図２は一倍体ヒトＥＳ細胞が多能性幹細胞の古典的特性を表し、機能喪失遺伝学的スクリーニングを可能にすることを示す。図２ａは、一倍体濃縮細胞株および適合する二倍体細胞株のコロニー形態を示す。スケールバーは、５０μｍである。
【図２Ｂ】図２ｂは、アルカリホスファターゼで染色したｈ−ｐＥＳ１０およびｈ−ｐＥＳ１２を示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図２Ｃ】図２ｃは、ｈ−ｐＥＳ１０中の多能性マーカー（一倍体ヒトＥＳ細胞が多能性幹細胞の古典的特性を表し、機能喪失遺伝学的スクリーニングを可能にすることを示す。赤色）、セントロメア（緑色）およびＤＮＡ（青色）の共染色をコロニー解像度（上段パネル、スケールバー＝５０μｍ）と単一細胞解像度（下段パネル、スケールバー＝１０μｍ）で示す。拡大挿入図は、２３のセントロメアを有する代表的な一倍体細胞を示す。
【図２Ｄ】図２ｄは、Ｇ１期で一倍体細胞をゲーティングした後、ＤＮＡマーカーおよび細胞表面マーカーのＴＲＡ−１−６０とＣＬＤＮ６を共染色することによるｈ−ｐＥＳ１０のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２Ｅ】図２ｅは、Ｇ１期のｐＥＳ１０細胞およびｐＥＳ１２細胞の一倍体（１ｎ）と二倍体（２ｎ）の多能性遺伝子の平均発現レベル±標準偏差を示す（各群につきｎ＝４、各細胞株に対して生物学的反復２回、対数スケール）。ＲＰＫＭ：マッッピングされる１００万フラグメント当たり１，０００塩基当たりのリード数。
【図２Ｆ】図２ｆは、多能性遺伝子のＤＮＡメチル化レベルをＧ１期のｐＥＳ１０細胞とｐＥＳ１２細胞の一倍体（１ｎ）と二倍体（２ｎ）ならびに対照の線維芽細胞（Ｆｉｂ）を２つ組で示す。
【図２Ｇ】図２ｇは、一倍体ヒトＥＳ細胞におけるゲノムワイドな遺伝子トラップおよび６−ＴＧ耐性遺伝子のスクリーニングについての図式的概要を示す。
【図２Ｈ】図２ｈは、３つの６−ＴＧ耐性コロニーで検出されたＮＵＤＴ５挿入物（赤色の矢印）を示す。上段パネルは、ゲノム構造を示す。下段パネルは、イントロン挿入部位（ＴＴＡＡで示した）のゲノム配列および上流のエキソン配列（四角枠内）を示す。
【図２Ｉ】図２ｉは、ＮＵＤＴ５媒介ＰＲＰＰ生成を介して６−ＴＧ毒性に至る代謝経路の模式図を示す。ＡＤＰ：アデノシン二リン酸；ＡＭＰ：アデノシン一リン酸。
【図３Ａ】一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞の分子および細胞比較を示す。図３ａは、比較解析のために一倍体ＥＳ細胞分離と二倍体ＥＳ細胞分離の実験スキームを示す。
【図３Ｂ】図３ｂは、２ｎ  ｐＥＳ１２由来の胚葉体（ＥＢ）試料と比較して、Ｇ１期における同質遺伝子の一倍体（１ｎ）細胞と二倍体（２ｎ）細胞のＲＮＡ配列に基づく階層的クラスタリング解析を示す（細胞株当たり２つの生物学的反復）。
【図３Ｃ】図３ｃは、常染色体とＸ染色体上の一倍体ＥＳ細胞対二倍体ＥＳ細胞において、相対的に下方制御された遺伝子と上方制御された遺伝子の円グラフを示す。
【図３Ｄ】図３ｄは、Ｘ染色体遺伝子による階層的クラスタリング解析を示す。
【図３Ｅ】図３ｅ〜３ｈは、一倍体ＥＳ細胞および二倍体ＥＳ細胞におけるＸ染色体不活性化（ＸＣＩ）の差次的状態を示す。図３ｅは、ゲノムワイド遺伝子発現の移動中央値プロットを示す（ＲＮＡ配列によってＧ１期における二倍体の平均値と比較して。ウィンドウサイズ＝１００遺伝子）。
【図３Ｆ】図３ｆは、ＸＩＳＴ発現レベルを示す。（１）および（２）は生物学的反復を示す。
【図３Ｇ】図３ｇは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図３Ｈ】図３ｈは、Ｘ染色体上でのＤＮＡメチル化レベルを示す。
【図３Ｉ】図３ｉは、Ｇ１期で選別した一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞の間の相対的全ＲＮＡ、細胞体積、およびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）対ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の比率を示す。反復数は、括弧内に示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ｊ】図３ｊは、二倍体ＥＳ細胞と比較して一倍体ＥＳ細胞において上方制御された（図２ｅのように、各群につきｎ＝４）、（上段パネル）核の平均発現レベル±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）および（下段パネル）ミトコンドリア酸化的リン酸化遺伝子、ならびにこの経路においてそれらの構造の略図を示す。ＩＭＳ：膜間腔。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（両側の不対のスチューデントｔ検定）。
【図４Ａ】図４は一倍体ヒト細胞の分化能を示す。図４ａは、一倍体濃縮ｐＥＳ１２細胞および二倍体ｐＥＳ１２細胞からの２１日目胚様体の代表的な画像を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｂ】図４ｂは、図４ａ（図１０ａに示すように、播種した細胞）の一倍体濃縮胚様体から解離した一倍体核型を示す。
【図４Ｃ】図４ｃは、ｈ−ｐＥＳ１０  ＥＢ細胞のＤＮＡ量プロファイルを示す。
【図４Ｄ】図４ｄは、Ｇ１期で選別されたＥＳ細胞およびＥＢ  ｐＥＳ１０細胞の一倍体（１ｎ）と二倍体（２ｎ）において組織特異的遺伝子および多能性特異的遺伝子の発現を示す。
【図４Ｅ】図４ｅは、ＮＣＡＭ１陽性ｈ−ｐＥＳ１０由来の神経前駆細胞（ＮＰＣ）のＤＮＡ量プロファイルを示す。
【図４Ｆ】図４ｆは、Ｇ１期で選別したｐＥＳ１０ＥＳ細胞およびＮＰＣにおける神経特異的遺伝子および多能性特異的遺伝子（それぞれ右側パネルと左側パネル）の発現を示す。色分けスケールは、ＮＰＣ試料とＥＳ細胞の二つ組にわたる平均と比較して発現を示す。
【図４Ｇ】図４ｇは、ゲノムワイド遺伝子発現の移動中央値プロット（ウィンドウシサイズ＝２００遺伝子）によって示すように、一倍体と二倍体ｐES10 ES由来のＥＢおよびＮＰＣにおける差次的ＸＣＩ状態を示す。
【図４Ｈ】図４ｈは、セントロメアと分化マーカーの共染色をｈ−ｐＥＳ１２由来のＴＵＪＩ陽性神経を示す。
【図４Ｉ】図４ｉは、セントロメアと分化マーカーの共染色をｈ−ｐＥＳ１２由来のＴＮＮＴ２陽性心筋細胞を示す。
【図４Ｋ】図４ｋは、セントロメアと分化マーカーの共染色をｈ−ｐＥＳ１２由来のＦＯＸＡ２−陽性成体型内胚葉細胞を示す。
【図４Ｌ】図４ｌは、セントロメアと分化マーカーの共染色をｈ−ｐＥＳ１２由来のＰＤＸ１陽性およびＮＫＸ６．１陽性ＰＰＣを示す。拡大挿入図は、代表的な一倍体核および二倍体核を示す。スケールバー＝１０μｍ。ＤＮＡ量プロファイルを、心筋細胞に分化したｈ−ｐＥＳ１２細胞について（図４ｊ）、およびＰＤＸ−１陽性ＰＰＣについて示す（図４ｍ）。
【図４Ｎ】図４ｎは、ｈ−ｐＥＳ１２由来のテラトーマを染色したＴＵＪ１（外胚葉）、α−ＳＭＡ（中胚葉）、ＡＦＰ（内胚葉）およびＯＣＴ４（多能性）を示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図４Ｏ】図４ｏは、ｈ−ｐＥＳ１０由来のテラトーマのＤＮＡ量プロファイルを示す。
【図４Ｐ】図４ｐは、ヘマトキシリンエオジン染色を用いた組織像（左側パネル：スケールバー＝２０μｍ）およびＤＮＡ  ＦＩＳＨ（右側パネル：スケールバー＝２０μｍ）によって解析したｈ−ｐＥＳ１２由来のテラトーマ連続切片を示す。拡大挿入図は、代表的な一倍体核（スケールバー＝５μｍ）を示す。
【図５Ａ】図５は一倍体ヒトＥＳ細胞株ｈ−ｐＥＳ１２の誘導を示す。図５ａは、反復選別およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色を用いる１ｃ−細胞の濃縮の後、ｐＥＳ１２細胞から一倍体濃縮ヒトＥＳ細胞株の確立を示す。上段から下段へ、選別していない二倍体細胞のＤＮＡ量プロファイル、３回目の選別で部分的に純化された一倍体細胞、および５回目の選別でほぼ純化された一倍体細胞を示す。ｃ：染色体数。
【図５Ｂ】図５ｂは、濃縮および継代の間の核型および一倍体中期パーセンテージを示す。
【図５Ｃ】図５ｃはＤＮＡ  ＦＩＳＨを示す。
【図５Ｄ】図５ｄはｈ−ｐＥＳ１２でのセントロメアタンパク質免疫蛍光染色を示す。拡大挿入図は、単一ハイブリダイゼーションシグナルを含む代表的な一倍体核（図５ｃ）と、２３のセントロメアを含む一倍体核（図５ｄ）をそれぞれ示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図５Ｅ】図５ｅは、一倍体（１ｎ）ｐＥＳ１０細胞およびｐＥＳ１２細胞をその選別していない二倍体（２ｎ）対応物と比較して一塩基多型（ＳＮＰ）アレイベースのコピー数多型（ＣＮＶ）を示す。
【図６Ａ】セントロメアフォーカスの定量化によって、単細胞レベルで倍数性の決定を示す。図６ａは、セントロメアの計数された数が倍数性と相関することを示す。１ｎ：４回目の選別後、４継代の間増殖した一倍体濃縮ｐＥＳ１０細胞（ｎ＝３３．このアッセイによる一倍体７６％）；２ｎ：未選別の二倍体ｐＥＳ１０細胞（ｎ＝３４）；３ｎ：ｓｏＰＳ２細胞３５（ｎ＝２７）；４ｎ：Ｈｙｂｒｉｄ１細胞３６（ｎ＝２７）。黒の水平線は、平均値±標準誤差を示し、破線マークは予想される染色体数を示す。
【図６Ｂ】図６ｂは、図６ａの一倍体濃縮細胞（ｎ＝１５２、このアッセイにより７３％一倍体）および二倍体細胞（ｎ＝１３５）においてＤＮＡ  ＦＩＳＨによる一倍体（１ｎ）細胞と二倍体（２ｎ）細胞の定量化を示す。
【図６Ｃ】図６ｃは、図６ａ（このアッセイにより７３％一倍体）の一倍体濃縮細胞のＤＮＡ量プロファイルを示す。ｃ：染色体コピー数。セントロメアと、ホスホ−ヒストン３（ｐＨ３、Ｓｅｒ１０）（図６ｄ）または５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）（図６ｅ）のいずれかとの共染色により、一倍体ｐＥＳ１２細胞において中間期の異なる段階を区別する。ＤＮＡ染色は、青色で示す。スケールバー＝５μｍ。
【図６Ｆ】図６ｆは、図６ｄと図６ｅに示した異なる細胞周期段階でのセントロメア数（括弧内に示す）の定量化を示す。黒の水平線は、平均値±標準誤差を示す。
【図７】一倍体ｐＥＳ１２細胞中の多能性幹細胞マーカーを示す。コロニー解像度（上部パネル；スケールバー＝５０μｍ）と１細胞解像度（下段パネル；スケールバー＝１０μｍ）でのｈ−ｐＥＳ１２における多能性標識ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４とＴＲＡ−１−６（赤色）、セントロメア（緑色）とＤＮＡ（青色）の共染色を示す。拡大挿入図は、２３のセントロメアを含む代表的な一倍体細胞を示す。
【図８】一倍体ヒト単為発生ＥＳ細胞での親インプリンティングと遺伝子トラップ突然変異誘発の解析を示す。図８ａおよび図８ｂは、インプリント遺伝子の発現レベル（ｎ＝７５、表６を参照されたい）（図８ａ）およびインプリントされた差次的メチル化領域でのＤＮＡメチル化レベル（ｉＤＭＲ、ｎ＝３５）３７（図８ｂ）による二倍体（２ｎ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）ＥＳ細胞およびＧ１−選別一倍体（１ｎ）と二倍体単為発生ＥＳ（ｐＥＳ）細胞の階層的クラスタリング解析を示す。（１）と（２）は生物学的反復を示す。
【図８Ｃ】図８ｃは、図８ａ（ＲＰＫＭ比）に示す試料中の７つの染色体にわたる代表的な父性発現インプリント遺伝子の相対的な平均発現レベル±標準誤差を示す。
【図８Ｄ】図８ｄは、図８ｂに示す試料中の代表的な父性メチル化と母性メチル化ｉＤＭＲ（一般的に両親性対照細胞では中程度のメチル化、および単為発生細胞においてそれぞれ、低メチル化および過剰メチル化）での平均ＤＮＡメチル化レベル±標準誤差を示す。β値は、完全な低メチル化（０）から完全な過剰メチル化（１）の範囲である。
【図８Ｅ】図８ｅは、ｐｉｇｇｙＢａｃ遺伝子トラップシステムの模式的概略図を表す。遺伝子トラップベクター５２は、ｐｉｇｇｙＢａｃ逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＦＲＴ部位と隣接し、５’スプライスアクセプター（ＳＡ）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、続いてプロモーターをもたないピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏΔｔｋ）と３’ポリ（Ａ）シグナル（ｐＡ）を保有する。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（別のプラスミド５３上でコードされる）の存在下で、遺伝子トラップベクターは、ゲノムへのランダムな転位を受ける。転写活性遺伝子への挿入により、内因性転写物がトランケーションされ、ピューロマイシンに対する抵抗性が導入される。ＩＴＲ：逆方向末端反復；ＦＲＴ：フロックス部位。
【図９Ａ】同質遺伝子的な一倍体と二倍体のヒトＥＳ細胞の遺伝子の比較解析を示す。図９ａは、Ｇ１期の一倍体（１ｎ）と二倍体（２ｎ）Ｅｓ細胞の選別純度を示す。
【図９Ｂ】図９ｂは、一倍体ヒトＥＳ細胞と二倍体ヒトＥＳ細胞の間の相対的な差次的遺伝子発現の対数スケールボルケーノプロットを、すべての遺伝子（上段）、常染色体遺伝子（中段）、Ｘ染色体遺伝子（下段）のパネルに分割して示す。Ｑ：偽陽性率（ＦＤＲ）。一倍体細胞中のかなり減少した遺伝子および増加した遺伝子（＞２倍の変化、Ｑ＜０．０５）をそれぞれ赤色と青色で示し、その総数を右側に示す。一倍体細胞においてＸＩＳＴが減少した転写物であることに留意されたい。
【図９Ｃ】図９ｃは、すべての発現遺伝子、すべての発現常染色体遺伝子およびすべての発現Ｘ染色体遺伝子（発現閾値、平均ＲＰＫＭ＞０．１）についての１ｎ／２ｎ遺伝子発現比率の平滑化分布を示す。
【図９Ｄ】図９ｄは、発現マイクロアレイ解析（ウィンドウサイズ＝１００遺伝子）による、Ｇ１期の一倍体ｐＥ１０細胞と二倍体ｐＥ１０細胞の間の遺伝子発現比率のゲノムワイドの移動中央値プロットを示す。
【図９Ｅ】図９ｅと図９ｆは、差次的ＸＣＩ状態によって推測されるように、一倍体ヒトＥＳ細胞中のゲノムワイドの常染色体遺伝子レベル減少のモデルを示す。図９ｅは、一倍体（Ｘａ）ヒトＥＳ細胞および二倍体（ＸａＸｉ）ヒトＥＳ細胞中のＤＮＡ量、全ＲＮＡと比較したＲＮＡ発現レベル、および絶対的なＸ染色体遺伝子量の推定等式が一倍体細胞当たりの全ＲＮＡレベルの推定を可能にすることを示す。それぞれ、ＸａおよびＸｉは活性Ｘ染色体（青色）と不活性Ｘ染色体（赤色）を示す。Ａ：常染色体；Ｘ：Ｘ染色体；Ｒ：全ＲＮＡ。
【図９Ｆ】図９ｆは、図９ｅに示す細胞の相対的および絶対的ＲＮＡレベルのゲノムワイドの略図である。
【図９Ｇ】図９ｇは、Ｇ１で選別した一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳさ細胞の平均直径、算出した表面積と体積を示す。エラーバーは、標準偏差ｎ＝４〜８）を表す。＊Ｐ＜０．０１（両側独立スチューデントｔ検定）。
【図９Ｈ】図９ｈおよび図９ｉは、二倍体ＥＳ細胞と比較して一倍体ＥＳ細胞において比較的減少した遺伝子と差次的メチル化領域（ＤＭＲ）（図９ｈ）、ならびに比較的増加した遺伝子（図９ｉ）についての機能アノテーションエンリッチメント解析を示す。
【図９Ｉ】図９ｈおよび図９ｉは、二倍体ＥＳ細胞と比較して一倍体ＥＳ細胞において比較的減少した遺伝子と差次的メチル化領域（ＤＭＲ）（図９ｈ）、ならびに比較的増加した遺伝子（図９ｉ）についての機能アノテーションエンリッチメント解析を示す。
【図１０Ａ】一倍体ヒトＥＳ細胞のＥＢ分化を示す。図１０ａは、ｈ−ｐＥＳ１２由来の２１日目のＥＢから解離した平板培養細胞の代表的な画像を示す。その核型は図４ｂに示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図１０Ｂ】図１０ｂは、一倍体濃縮ｐＥＳ１２細胞と二倍体ｐＥＳ１２細胞由来の解離したＥＢのＤＮＡ量プロファイルを示す。ｃ：染色体コピー数。
【図１０Ｃ】図１０ｃは、未分化の（ＥＳ）と分化した（ＥＢ）Ｇ１を選別した一倍体（１ｎ）ｐＥＳ１０細胞で組織と多能性に特異的な遺伝子の発現レベル（ＲＰＫＭ）を表す。
【図１１Ａ】一倍体ヒトＥＳ細胞の定方向分化を示す。図１１ａおよび図１１ｂは、神経分化の後、ｈ−ｐＥＳ１０細胞においてＤＮＡとＮＣＡＭ１の共染色によるフローサイトメトリー解析を示す。図１１ａは、陰性二次抗体で染色した対照試料（左側パネル）に基づくＮＣＡＭ１陽性細胞（右側パネル）のゲーティングを」示す。
【図１１Ｂ】図１１ｂは、全細胞集団（図４ｅに関連する）のＤＮＡ量プロファイルを示す。ｃ：染色体コピー数。
【図１１Ｃ】図１１ｃは、Ｇ１で選別された一倍体（１ｎ）ｐＥＳ１０細胞とＮＰＣにおける神経特異的遺伝子の発現レベル（ＲＰＫＭ）を示す。
【図１１Ｄ】図１１ｄは、一倍体と二倍体（２ｎ）のｐＥＳ１０由来のＥＢおよびＮＰＣにおけるＸＩＳＴ発現レベルを示す。
【図１１Ｅ】図１１ｅは、ｈ−ｐＥＳ１２由来の神経でのＴＵＪ１染色を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図１１Ｆ】図１１ｆは、図１１ｅに示す神経上でのＤＮＡ  ＦＩＳＨを示す。拡大挿入図は、それぞれ単一および二重ハイブリダイゼーションシグナルを有する代表的な一倍体核および二倍体核を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１１Ｇ】図１１ｇは、Ｇ１で選別した一倍体ｐＥＳ１２由来の心筋細胞でのＴＮＮＴ２染色を示す。スケ−ルバー＝１０μｍ。
【図１１Ｈ】図１１ｈと図１１ｉは、膵臓分化の後の、ｈ−ｐＥＳ１０細胞でのＤＮＡとＰＤＸ１の共染色によるフローサイトメトリー解析を表す。図１１ｈは、陰性二次抗体で染色した対照試料（左側パネル）に基づくＰＤＸ１陽性細胞（右側パネル）のゲーティングを示す。
【図１１Ｉ】図１１ｉは、全細胞集団（図４ｍに関連する）のＤＮＡ量プロファイルを示す。ｃ：染色体コピー数。
【図１２Ａ】一倍体ヒトＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの分化を示す。図１２ａは、ｈ−ｐＥＳ１０とｈ−ｐＥＳ１２に由来するテラトーマのヘマトキシリンエオジン組織切片を示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図１２Ｂ】図１２ｂは、ｈ−ｐＥＳ１０由来テラトーマ中のＴＵＪ１（外胚葉）、α−ＳＭＡ（中胚葉）、ＡＦＰ（内胚葉）およびＯＣＴ４（多能性）染色を示す。ＤＮＡ染色は、青色で示す。核ＯＣＴ４染色の欠如を留意されたい。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の多くの態様は、上記の本特許出願の発明が解決しようとする課題のセクション、ならびに図面の簡単な説明、および本特許出願の特許請求の範囲のセクションに記述されている。発明を実施するための形態の本セクションは、本発明に関するいくつかの追加の説明を提供し、本特許出願の他のすべてのセクションと組み合わせて読まれることを目的とする。
【００２８】
本発明は、一倍体ヒト卵母細胞の活性化に続く一倍体ヒト単為発生ＥＳ細胞株を提供する。マウス卵母細胞活性化に関する初期の試験は、生じる胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）において一倍性がおそらく少なくとも部分的に持続することを証明した８、９。それにもかかわらず、自然発生的および不可逆的二倍体化現象のため、二倍体細胞は、細胞周期の増加の間、徐々に優勢になる（図１ａ）９、１６、１７。二倍体化の動態モデルに基づいて、たとえ二倍体化が１０細胞周期のうち１に起こるとしても、ＥＳ細胞の１％は初期継代で一倍体のままであり得ることが推定された（図１ｂ）。培養中のＥＳ細胞または初期の胚細胞の細胞の二倍体化動力学をモデル化するために、定義と仮定を以下のように検討した。
【００２９】
（１）Ｈｎがｎ番目の細胞分裂周期での一倍体細胞の総数であり、ｐが単一細胞分裂周期で二倍体化する確率である場合、ｎ番目の細胞分裂周期で二倍体化現象（ｄ）の総数は：
【数１】
2018521692.tif 000002
【００３０】
（２）ｎ番目の細胞分裂周期での二倍体細胞（Ｄ）の総数は：
【数２】
2018521692.tif 000003
【００３１】
（３）ｎ番目の細胞分裂周期での細胞の総数（Ｔ）は：
【数３】
2018521692.tif 000004
【００３２】
および（４）ｎ番目の細胞分裂周期での一倍体割合（ｈ）はしたがって：
【数４】
2018521692.tif 000005
【００３３】
簡略化のために、さらに以下のように仮定した。
（１）二倍体化は細胞分裂周期の失敗に起因して一定の確率で起こり、２つの一倍体娘細胞よりむしろ１つの二倍体娘細胞になる。
（２）正常な細胞分裂周期は２つの娘細胞を産生し、平均的に同時に起こる。
（３）一倍体細胞または二倍体細胞のいずれかを支持するいかなる選択優位性もごくわずかであり、細胞死および異数性の場合は考慮しない。
【００３４】
１００の細胞分裂周期にわたるこのモデルのシミュレーションにより、図１ｂにプロットしたデータポイントを作成し、指数関数的減衰関数にフィッティングした。
【００３５】
時間とともに二倍体ゲノムが徐々に不可逆的に獲得されるために、一倍体細胞の頻度は低下するので、２，０００中期細胞および合計１４の４〜１０継代での総単為発生ＥＳ細胞株にわたる解析を必要とし、１４％の成功率で独立した２つの一倍体ＥＳ細胞株の確立を可能にした。全体として、４つの独立した方法、すなわち、中期スプレッド解析、フローサイトメトリー、ＦＩＳＨおよびとセントロメア定量化を利用して、未分化細胞および分化細胞の倍数性を決定した。
【００３６】
一倍体と二倍体のヒトＥＳ細胞は、多くの類似点、例えば、古典的な多能性幹細胞属性ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの多分化能を共有しており、その相対的な遺伝子発現プロファイル全般に基づいて区別されることができない。非ヒト一倍体ＥＳ細胞に関する他の研究は主にそれらの類似点を強調していたが、本発明者らは、これらの２つの倍数性状態を分離する推定上の転写特性、エピジェネティック特性および物理的特性を識別することを目標とした。二倍体ヒトＥＳ細胞19で容易に観察されるＸＣＩは、一倍体ＥＳ細胞では起こらない。特に、ＸＣＩの欠如も、最近二倍体化され、後に培養中でＸａＸｉになり得るＥＳ細胞に及んでいる。これらの調査結果により、一倍体ヒトＥＳ細胞における絶対的な遺伝子発現レベルの減少を推測することが可能になり、ＸＣＩが起こらない未分化マウスＥＳ細胞では引き出すことができない結論を推論することが可能になった２６。これは、常染色体の均衡が維持される限り、全体的な転写補償が細胞生存性の必要条件でないことを示唆する。対照的に、常染色体の不均衡は、ヒト常染色体が完全に一染色体性でないことに基づいて、耐えられないようである２７。さらに、一倍体と二倍体の間の物理的パラメータの比率の相違、例えば直径（約０．８）、表面積（約０．７）および体積（約０．６）は、制御のロバスト性が特定の補償機構を含むことを意味する。興味深いことに、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの間の協調クロストークを含む酸化的リン酸化に関与する遺伝子のわずかだが一貫した相対的な増加が観察された。これは一倍体細胞においてミトコンドリア量の相対的な増加を反映している可能性がある。このロバスト性は、初期胚において、特に、Ｘ染色体量および酸化的リン酸化活性の上昇の観点から、より許容的な制御段階を反映する可能性があり、これら両方とも初期の着床前の胚盤葉上層同一性と一致している２８。
【００３７】
一倍体ヒト核型がＥＳ細胞分化の障壁でないことを示す。特に、マウスでも観察されているように、一倍体ヒトＥＳ細胞が神経前駆細胞を生じさせることを示す２。しかし、さらに分化すると一倍体細胞が失われることをマウス試験が示したが２、１６、多能性状態から分化状態に存続した、Ｘ染色体と常染色体の間の量的不均衡にもかかわらず、ヒト一倍体細胞は３つの胚性胚葉すべての体細胞運命に特異化することが観察された。
【００３８】
本発明の一倍体ヒトＥＳ細胞は、人為的活性化ヒト卵母細胞由来のＥＳ細胞集団の中期スプレッド解析またはサブ−２ｃ（「ｃ」は染色体コピー数を表す）細胞選別によって識別される。一倍体ヒトＥＳ細胞は、フローサイトメトリー、好ましくはＦＡＣＳ、セントロメアタンパク質蛍光免疫染色またはＤＮＡ  ＦＩＳＨによって識別されることもできる。中期スプレッド解析およびサブ−２ｃ選別、セントロメアタンパク質免疫蛍光およびＤＮＡ  ＦＩＳＨを行う方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する。
【００３９】
人為的活性化方法は、当技術分野で周知であり、単為発生活性化および雄性発生活性化が挙げられるが、これに限定されるものではない。単為発生技術は、電気パルス、カルシウムイオノフォア、キナーゼ阻害剤、翻訳阻害剤またはこれらの組み合わせを用いる卵母活性を含む４１。雄性発生技術は、精子を用いる除核卵母細胞の受精、一般的に卵細胞質内精子注入法を含む。卵母細胞のゲノムを卵母細胞の受精の前または後に除去して、精子ゲノムだけを含有する細胞を生成する。卵母細胞は、単為発生に関しては活性化刺激にさらされ得る。
【００４０】
ＦＡＣＳを含むフローサイトメトリーを本発明の方法で用いて、倍数性、細胞表面マーカーまたは他の表現型特徴（複数可）に基づいて細胞の識別および／または選別を行うことができる。当技術分野で周知の他の細胞選別技術、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）も本発明の方法で用いることができる。
【００４１】
本発明の一倍体ヒトＥＳ細胞および細胞株は、非限定例によって標準ヒトＥＳ細胞増殖条件と呼ばれる「培養中」に保持することができる。すなわち、ゼラチン被覆プレート中の、１５％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、ペニシリンとストレプトマイシン（それぞれ、５０単位／ｍＬと５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および８ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培地で増殖停止マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上での培養。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター内に維持し、ＥＤＴＡを含まないトリプシン溶液Ａを用いて３〜５日間ごとに継代させることができる。好ましくは、一倍体ヒトＥＳ細胞は、少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも７継代、少なくとも１０継代、少なくとも２０継代、または少なくとも３０継代の間、培養で維持される。好ましくは、一倍体ヒトＥＳ細胞は、少なくとも約１０日、少なくとも約２０日、少なくとも約３０日、少なくとも約４５日、少なくとも約６０日、少なくとも約３ヵ月、少なくとも約４ヵ月または少なくとも約６ヵ月の間培養で維持される。
【００４２】
本発明の「多能性」一倍体ヒト細胞は、すべてではないが複数の細胞型に発達する可能性を有する前駆体または幹細胞である。神経幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞は、多能性細胞の非限定例である。本発明者らは、多能性一倍体ヒト細胞が一倍体ヒトＥＳ細胞から分化した胚葉体から、または特定の系統に向かう一倍体ヒトＥＳ細胞の定方向分化によって生成することができることを示した。
【００４３】
「細胞株」という用語は、多くの継代の間、培養で増殖することができ、細胞選別によって一倍体細胞を濃縮することができる細胞を指す。本発明の一例によれば、細胞株は、標準ヒトＥＳ細胞増殖条件下で培養され、３〜５継代ごとに選別されることによって一倍体割合が時々濃縮される。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「濃縮集団」という用語は、全細胞集団において１％を超える、好ましくは５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を超える一倍体細胞のパーセンテージを指す。一般的に、濃縮集団は、ＦＡＣＳなどの単一サイクルの選別後に得ることができる。
【００４５】
「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団において、９０％を超える、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える一倍体細胞のパーセンテージを指す。最も好ましくは、実質的に純粋な集団は、コンフルエントな一倍体細胞の集団である。
【００４６】
本発明の一倍体ヒト細胞を、例えば、発生生物学、遺伝学および細胞生物学の研究で用いて、一倍性対二倍性、Ｘ染色体不活性化、親のインプリンティングおよび雑種性などの基本的機構を調べることができる。一倍体ヒト細胞は、望ましいホモ接合性および免疫原性の特性によって操作されることができるので、再生医療などの治療目的でも有用である。一倍体単為発生ＥＳ細胞または一倍体分化ヒト細胞のゲノムをヒト生殖で用いて、卵母細胞のゲノムを置き換えることが場合によっては可能になり得る。
【００４７】
重要なことに、本発明の一倍体ヒト細胞は、遺伝学的スクリーニング、好ましくは順遺伝学に役立つ。一例は、さまざまな疾患の標的を識別するためのホモ接合体機能喪失スクリーニング、およびこれらの疾患を治療するための候補化合物を識別するための薬物スクリーニングである。遺伝学的スクリーニングは、１種または複数種の変異を一倍体ヒト細胞に導入するために変異原の使用を含むことができる。本発明の使用に好適な変異原としては、例えば、電離性放射線（Ｘ線、ガンマ線、紫外線など）の物理的変異原、アルキル化剤などの化学変異原、およびプラスミド、ファージまたはウイルスベクターなどの生物学的作用物質が挙げられる。生物学的作用物質の例としては、挿入ベクター、例えば遺伝子トラップベクター、および部位特異的突然変異誘発法、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター活性化物質様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの技術が挙げられる。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が特段に明示していない限り複数の指示対象を包含する。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）ならびに用語「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は同じ意味で使用し得る。
【００４９】
さらに、「および／または」は、他のものが存在しても存在しなくても２種の所定の特徴または構成要素の各々の特定の開示であるとみなすべきである。したがって、「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用されている場合、「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を包含するように意図されている。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句で使用されている場合、「および／または」という用語は、Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）を包含するように意図されている。
【００５０】
特段に規定していない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第５版．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ編集、２０１３），ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ    Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋら編集、２００８），およびＴｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ‐Ｓ．Ｊｕｏ，（第２版．２００２）は本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。
【００５１】
単位、接頭辞および記号は、その国際単位系（ＳＩ）に承認された形式で表示されている。数値範囲は範囲を規定する数値を包含する。本明細書で提供される見出しは、本発明の多様な態様または実施形態を限定するものではなく、全体として明細書を参照することにより包含され得る。したがって、下記に定義される用語は、本明細書をその全体を参照することによって、より完全に定義される。
【００５２】
実施形態が「含んでいる」という文言で記述される場合、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記述される他の類似の実施形態も包含される。
【００５３】
本開示に引用される参考文献のすべては、その全体を参照によって本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書に引用または記載のいずれの製品用のいずれのメーカーの説明書またはカタログでも、参照によって組み込まれる。参照によって本テキストに組み込まれる文書、またはそれに記載のいずれの教示も、本明細書を実施する際に使用することができる。参照によって本テキストに組み込まれる文書は、従来技術であると認めないものとする。
【００５４】
本発明をさらに、以下の非限定的な実施例で説明する。
【００５５】
実施例
実施例１．方法
ヒト卵母細胞操作および単為発生ＥＳ細胞株誘導
ヒト卵母細胞供与手法およびｐＥＳとｓｗａＰＳ細胞株誘導手法は、これまでに記述されている１５、３５。手短に言うと、成熟したＭＩＩ期卵母細胞をカルシウムイオノフォアおよび／または電気パルスを使用して活性化させ、続いてピューロマイシンとともに４時間培養した。極体放出と、一倍性を示す単一前核の存在とを確認し、卵母細胞を胚盤胞期まで発育させた。核ゲノムが別の卵母細胞の核ゲノムと交換されている卵母細胞を活性化させた後、ｓｗａＰＳ細胞を誘導した１５。栄養外胚葉３８にレーザーアブレーションを施し、次いで誘導培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を１０μＭ添加することによってＥＳ細胞株を誘導した３５。プレーティングから２〜３日後に、残りの栄養外胚葉細胞にレーザーアブレーションを施し、次いで増殖物の手動採取が可能になるまで、ＩＣＭ細胞を１０〜１４日間増殖させた。
【００５６】
細胞培養
特に明記しない限り、ヒトＥＳ細胞は、１５％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、および８ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地で構成された標準ヒトＥＳ細胞培地中で増殖停止マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で培養した。細胞はマイコプラズマがなく、加湿インキュベーター内に、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。継代培養は、ＥＤＴＡを含まないトリプシン溶液Ａ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いる穏やかなトリプシン処理による機械的な培養、または分離後ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ）を用い、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）１０μＭを加えて、１日もしくは最高２日間の酵素的な培養のいずれかで行った。一倍体ＥＳ細胞は、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地またはＳｔｅｍＦｉｔＮ．ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）培地中でマトリゲル被覆プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上でフィーダーを含まない状態で増殖することも可能である。増殖物が急速に伸長することにより、３継代の早い段階で一倍体ＥＳ細胞の分離が可能になる。
【００５７】
一倍体ヒトＥＳ細胞株の分離および維持
ヒト単為発生ＥＳ細胞株において６〜８継代で、中期スプレッド解析またはサブ−２ｃ細胞選別（表１および表２）のいずれかによって一倍体細胞を識別した後、一倍体ＥＳ細胞株を、二倍体細胞を基準として用いて、１ｃ細胞集団を選別することによって確立した。一倍体ＥＳ細胞培養物は、３〜４継代ごとに１ｃ細胞を選別する濃縮ラウンドによってさらに維持した。
【００５８】
【表１】
2018521692.tif 000006
【００５９】
細胞株ｐＥＳ１−６の誘導は、これまで報告されている１５、３５。
【００６０】
【表２】
2018521692.tif 000007
【００６１】
中期スプレッド解析
核分裂停止を誘導するために、コルセミド（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）１００ｎｇ／ｍＬを直接加えた培地中の増殖細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、４０分間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理し、室温、１０００ＲＰＭで遠心分離して、２０分で３７℃に温めた低張液（塩化カリウム２．８ｍｇ／ｍＬとクエン酸ナトリウム２．５ｍｇ／ｍＬ）に徐々に再懸濁した。細胞は、固定液（３：１のメタノール：酢酸）を加え、室温で５分間インキュベートして、固定した。遠心分離および固定液での再懸濁後、固定化を少なくとも３回繰り返した。中期スプレッドをスライド上で調製し、標準的なＧバンド染色技術を用いて染色した。核型の完全性は、解析した中期の少なくとも８０％に正常核型が観察された（一解析当たり最低２０中期細胞）ことに基づいて、人類染色体国際命名規約（ＩＳＣＮ）に従って決定した。
【００６２】
ＤＮＡ量による生ＥＳ細胞の選別。
細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ  ＳｅｌｅｃｔまたはＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）  のいずれかを使用して解離させ、次いでヒトＥＳ細胞培地中で、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０μｇ／ｍＬを用いて３７℃で３０分間染色した。遠心分離の後、細胞は、１５％のＫＳＲおよび１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含有するＰＢＳに再懸濁し、７０μｍのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩまたはＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれで４０５ｎｍレーザーを使用して選別した。連続増殖のために、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含有する新鮮培地で選別細胞を２４時間平地培養した。比較解析のために、Ｇ１期細胞は、同質遺伝子一倍体濃縮培養物と、選別していない二倍体培養物から選別した。培養中で比較的最近（一倍体細胞濃縮から３継代以内）二倍体化した細胞を、一倍体濃縮培養物中のＧ２／Ｍ期ピークを選別することによって分離し、選別していない二倍体培養物からのＧ２／Ｍ期二倍体細胞と比較した。一倍体濃縮培養物もＧ２／Ｍ期一倍体とＧ１期二倍体の混合集団からなることに留意されたい。選別純度は、少量の選別試料を装置に再度流すことによって確認した。
【００６３】
フローサイトメトリー
すべてのＤＮＡ量プロファイルは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色とともに、フローサイトメトリーに基づいて作成した。一倍体細胞比率は、１ｃ細胞のパーセンテージと、細胞周期の他の期に対するＧ１期細胞の相対的寄与とに基づいて推定した。メタノール固定細胞およびリボヌクレアーゼ処理細胞においてヨウ化プロピジウムとともにフローサイトメトリーを用いて各継代で２〜３反復のＤＮＡ量を解析することによる、連続濃縮ラウンド間の一倍体細胞の比率、ならびに７継代（３０日間）にわたるｈ−ｐＥＳ１０二倍体化動態の実験解析に基づいて、二倍体化率を推定した。二倍体化率は、データを指数関数的減衰曲線に適合させることによって推定した。ＤＮＡ量および細胞表面分子の同時フローサイトメトリー解析については、細胞を洗浄し、解離させ、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびコンジュゲート抗体、または一次抗体とともに６０分間インキュベートした後に１：２００に希釈した二次抗体のいずれかの存在下で、氷上で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ量および細胞内ＰＤＸ１の同時フローサイトメトリー解析については、解離細胞を免疫蛍光手法に記載のように、ＤＮＡ染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて処理した。一次抗体は、表３に詳述する。すべてのフローサイトメトリー手法において、試料は、７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通して濾過し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩまたはＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。
【００６４】
【表３】
2018521692.tif 000008
2018521692.tif 000009
【００６５】
ＤＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
他で記載されているように３９、ＤＮＡ  ＦＩＳＨをヒト２番および４番染色体用のプローブ、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によるＤＮＡ染色を用いて行った。一倍性と二倍性は、それぞれ、単一ハイブリダイゼーションシグナルまたは二重ハイブリダイゼーションシグナルに基づいて核ごとに判定した。ＦＩＳＨの対象となるＥＳ細胞は、解析に先立ち数継代にわたりマトリゲル被覆ＭＡＴＥＫガラスプレート上で増殖させた。
【００６６】
アルカリホスファターゼおよび免疫蛍光染色
アルカリホスファターゼ染色は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行った。免疫蛍光染色については、試料をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いでブロッキング溶液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％のロバ血清をＰＢＳに溶解）中で透過処理し、ブロックした。一次抗体（表３）と、ブロッキング溶液で１：５００に希釈した二次抗体とともに細胞をインキュベートし、ＤＡＰＩをＤＮＡ染色で用いた。固定化および各インキュベーションステップに続いて、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡を用いて画像を撮った。セントロメア定量化は、Ｚ軸に沿って個々の平面にわたるセントロメアフォーカスを手動で計数することによって行なった。ＥｄＵ染色は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｉｍａｇｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行なった。図１ｇおよび図５ｄのセントロメア染色の対象となるＥＳ細胞は、解析に先立ち、数継代にわたりマトリゲル被覆ＭＡＴＥＫガラスプレート上で増殖させた。
【００６７】
６−ＴＧ耐性スクリーニング
遺伝子トラップ変異体ライブラリーを作成するために、４〜５×１０６一倍体ｐＥＳ１０細胞の９反復（１ｃ−細胞濃縮後１継代以内）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（８００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、４−ｍｍキュベット、３２０Ｖ、２５０μＦ）を使用して２０μｇの５’−ＰＴＫ−３’遺伝子トラップベクター５２と、２０μｇのｐＣｙＬ４３  ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼプラスミド５３とともに同時遺伝子導入し、１００×２０ｍｍディッシュ上にＤＲ３  ＭＥＦとＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２とともに再播種した。発現遺伝子座への挿入の選択は、０．３μｇ／ｍＬピューロマイシンを用いて、遺伝子導入から４８時間後に開始し、続いて約１６，０００耐性コロニーによって代表される単一ライブラリーにプールした。５’−ＰＴＫ−３’だけによる遺伝子導入を陰性対照として用いた。６−ＴＧ−耐性変異体をスクリーニングするために、変異体ライブラリーをＤＲ４  ＭＥＦ上で６μＭの６−ＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で１８日間増殖させ、この間６つの耐性コロニーを独立して分離し、特性を明らかにした。ゲノムＤＮＡを抽出し（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  組織キット，  ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）、前述のように５４、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅＰＣＲを使用して、挿入部位を検出し、続いてＰＣＲ産物の精製とＳａｎｇｅｒ配列決定（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を行った。ＵＣＳＣ  ＢＬＡＴ検索ツールを使用して、配列をヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にマップした。
【００６８】
全ＤＮＡおよび全ＲＮＡの分離
全ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ組織キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を使用して分離した。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用し、メーカーのプロトコルに従って分離した。細胞当たりの全ＲＮＡレベルを判定するために、一倍体細胞および二倍体細胞を同じ培養物から、それぞれ１ｃ（一倍体Ｇ１）集団と４ｃ（二倍体Ｇ２／Ｍ）集団を選別することによって分離した。２継代にわたる増殖後、細胞を収取して、計数し、各細胞株および倍数性状態から４００，０００細胞を３つ組で分離した（ｐＥＳ１０とｐＥＳ１２、一倍体と二倍体；合計１２試料）。ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＲＮＡ量を定量化した。
【００６９】
ゲノム完全性の解析
コピー数多型解析（ＣＮＶ）をＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｏｍｎｉ２．５Ｅｘｏｍｅ−８  ＢｅａｄＣｈｉｐ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、メーカーのプロトコルに従って、Ｇ１期で選別した一倍体と二倍体のｐＥＳ１０細胞およびｐＥＳ１２細胞のＤＮＡ試料（表４）で行った。生データをＧｅｎｏｍｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して処理し、Ｒ統計プログラミング言語を使用する解析のためにｌｏｇＲ比率値を求めた。
【００７０】
【表４】
2018521692.tif 000010
【００７１】
ＲＮＡ配列決定
全ＲＮＡ試料（２００ｎｇ−１μｇ、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）＞９）をポリ（Ａ）＋ＲＮＡのプルダウンによってｍＲＮＡのために濃縮した。ＲＮＡーＳｅｑライブラリーをＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット第２版（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、メーカーのプロトコルに従って調製し、次いでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００を使用して  配列決定し、８５ｂｐの単一末端リードを作成した。
【００７２】
表５は、ＲＮＡ−Ｓｅｑで解析した試料の詳細なリストを示す。
【００７３】
【表５】
2018521692.tif 000011
【００７４】
トランスクリプトーム解析
ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを、ＴｏｐＨａｔ（第２．０．８ｂ版）を使用してヒト基準ゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に整列させ、５つのミスマッチを認めた。マップした１００万フラグメントごとのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値を、Ｃｕｆｆｑｕａｎｔを使用して定量化し、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（第２．１．１版）のＣｕｉｆｆｎｏｒｍを使用して正規化し、相対的な遺伝子発現レベルを作成した。ピアソン相関および平均連結を使用してＲＰＫＭ値を階層的クラスタリング解析した。一倍体と二倍体のヒトＥＳ細胞（各群につきｎ＝４）中の全ＲＮＡと比較して差次的遺伝子発現の解析を以下のように２つの相補的戦略によって行った。第１に、有意差としてＦＤＲ＜０．０５を用い、２倍未満の差異を考慮して、デフォルトパラメータでＣｕｆｆｄｉｆｆを使用した。第２に、おそらくわずかだが一貫した転写の相違を識別するために、特定の群のすべての反復にわたる最小発現レベルが他の群のすべての反復にわたる最大発現レベルより高かった遺伝子に対して検査をした。次いで、統計的有意性を両側独立スチューデントｔ検定によって判定した。機能アノテーション濃縮解析をＤＡＶＩＤ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ法を用いて統計的有意性を決定する）によって行った。インプリンティング解析には、表６に収載の７５のヒトインプリント遺伝子（Ｇｅｎｅｉｍｐｒｉｎｔウェブサイトを参照されたい）が含まれていた。対照ＥＳ細胞株ＮＹＳＣＦ１からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、他で３７発表されている（ＧＥＯ受入れ番号ＧＳＥ６１６５７）。最低基準を１にし、発現閾値を１より上に設定することによって平均化した基準二倍体試料中に発現しなかった遺伝子を除去した後、ゲノムワイド遺伝子発現の移動中央値プロットを、Ｒパッケージｚｏｏ（第１．７−１２版）を使用して作成した。異なる組織からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）ポータル４０から検索した。図４ｄの色分けスケールは、組織にわたる平均（左側スケール）およびＥＳ細胞二倍体とＥＢ試料の各セットにわたる平均（右側スケール）に対する遺伝子発現レベルに対応する。発現マイクロアレイ解析をこれまでのように４１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ１．０ＳＴアレイを用いて行った。
【００７５】
【表６】
2018521692.tif 000012
2018521692.tif 000013
【００７６】
ＤＮＡメチル化解析
これまでに記載のように３７、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨＤ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎプロトコルに従ってＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｃｈＣｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、表４に詳述した試料からのゲノムＤＮＡをＤＮＡメチル化解析した。対照ＥＳ細胞株ＮＹＳＣＦ１からのＤＮＡメチル化データは、以前に公表されている（ＧＥＯ受入れ番号ＧＳＥ６１６５７）３７。データは、アレイ正規化（ＳＷＡＮ）内のサブセット四分位点を用いて、処理し、正規化し、次いでＲパッケージＣｈＡＭＰ（第１．４．０版）を使用してバッチ効果を調整した。多能性特異的遺伝子およびｉＤＭＲに関連したＣｐＧ部位でのＤＮＡメチル化レベルは、前述のように解析した３７。Ｘ染色体上のＤＮＡメチル化レベルの解析のために、０．４未満の平均β値のプローブを除去した。ＤＭＲ解析は、デフォルト設定を用いてＣｈＡＭＰのラッソ機能によって容易になった。次いで、ＤＭＲを近似によって遺伝子に割り当て、機能アノテーション濃縮をＤＡＶＩＤ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ方法を用いて統計的有意性を決定する）によって解析した。
【００７７】
細胞サイズ解析
Ｇ１期の一倍体および２倍体の細胞集団の選別後、生存可能な単細胞の直径（２ｒ）をＣｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定し、その表面積と体積をそれぞれ４πｒ２と４／３πｒ３として算出した。解析は、１ｎ  ｐＥＳ１０、１ｎ  ｐＥＳ１２、２ｎ  ｐＥＳ１０および２ｎ  ｐＥＳ１２に対してそれぞれ、７、４、８および４回の技術的反復を包んだ。
【００７８】
ミトコンドリアＤＮＡ存在量解析。
他に記載されているように４２、ｍｔＤＮＡの相対的存在量を、ミトコンドリア遺伝子ＮＤ２のためのプライマー（順方向プライマー：５’−ＴＧＴＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＴＡＣＴＡ−３’（配列番号１）；逆方向プライマー：５’−ＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＡＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２））を用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって解析し、核遺伝子ＢＥＣＮ１のためのプライマー（順方向プライマー：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号３）；逆方向プライマー：５’−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴＡＴＧＣ−３’Ｅ（配列番号４））を用いて核遺伝子に対して正規化した。解析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍとともにＰｅｒｆｅＣＴａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＦａｓｔＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを使用して行なった。解析は、表４に詳述のすべてのＧ１期選別試料を包含した（各群につきｎ＝４、各細胞株対して生物学的反復２）。
【００７９】
すべての高スループットデータは、受入れ番号ＧＳＥ７１４５８の下でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に寄託した。
【００８０】
胚様体分化
ＥＢ分化は、ＥＤＴＡを含まないトリプシン溶液Ａ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）でＥＳ細胞コロニーを分離させ、続いて再懸濁させて、低接着プレート上のｂＦＧＦを含まないヒトＥＳ細胞培地中で細胞凝集体をさらに培養した。一倍体ＥＳ細胞の分化は、１ｃ−細胞濃縮後２継代以内に開始した。２１日後に、解離および１０μｇ／ｍＬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた３７℃で３０分間の染色後、Ｇ１期の選別していないおよび／または選別したＥＢ細胞からＥＢ ＲＮＡを抽出した。０．２％のゼラチン上に播種し、ｂＦＧＦを含まないヒトＥＳ細胞培地中で伸長した、解離ＥＢ細胞で中期スプレッド解析を行った。
【００８１】
神経前駆細胞への分化
ＮＣＡＭ１陽性ＥＳ細胞由来のＮＰＣを、わずかに改変した効率的な神経分化４３のための１０日間プロトコルを使用して得た４４。分化は、１ｃ−細胞濃縮後２継代以内に開始した。ＲＮＡは、Ｇ１期の一倍体ＮＣＡＭ１−陽性細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２および１：２００に希釈した抗ヒトＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６一次抗体とＣｙ３−コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とで同時染色することによって抽出した。
【００８２】
神経分化
神経への分化は、修正したＳＭＡＤシグナル伝達４６の相乗阻害に基づいて、公表されているプロトコル４５に従って以下のように行なった。分化は、マトリゲル被覆プレートでｍＴｅＳＲ１培地で培養された完全にコンフルエントなＥＳ細胞による１ｃ細胞濃縮から２継代以内に、該培地を、ｂＦＧＦを含まず、１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）と２．５μＭのＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）とを含有するヒトＥＳ細胞培地と交換して、開始し、４日間続けた。続いて、細胞を、１０μＭのＳＢ４３１５４２と２．５μＭのＬＤＮ−１９３１８９とを補充したＮ２培地４５にさらに４日間保持し、続いてＢ−２７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、１０μＥＭのＤＡＰＴ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）とを補充したＮ２培地に２日間保持した。次いで、細胞を解離させ、０．０１％のポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびラミニン被覆（４μｇ／ｍＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｉｃ）プレート上に、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の存在下で再播種し、さらにＹ−２７６３２を含まない同じ培地で続いて４日間培養した。神経培養物は、２０日目の免疫染色とＦＩＳＨによる解析まで、Ｂ−２７と２０ｎｇ−１  ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充したＮ２培地で維持した。
【００８３】
心筋細胞分化
マトリゲル被覆プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上のｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で増殖した８０〜９０％コンフルエントＥＳ細胞は、それぞれＣＨＩＲ９９０２１とＩＷＰ−２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を用いるＧＳＫ３とＷＮＴの連続阻害に基づく１１日間のレジメン４７を受けた。分化は、１ｃ−細胞濃縮後、２継代以内に開始した。分化の１１日目に、免疫染色のために１ｃ−細胞を選別し、播種した。
【００８４】
膵臓系統に向かう分化
ここで利用するプロトコルは、いくつかの最近の刊行物に基づいて開発した４８〜５０。フィーダーレス条件下で増殖したＥＳ細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３〜４日間胚体内胚葉に分化させた。組換え型ヒトＫＧＦ／ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびレチノイン酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）による処理を含む段階的プロトコルによって、以降の特異化を達成した。８〜１１日目、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｅｍ）を使用して、膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）を誘導した。分化は、１ｃ−細胞濃縮後、２継代以内に開始した。
【００８５】
テラトーマ形成アッセイ
動物におけるすべての実験手順は、ヘブライ大学の倫理委員会の承認を得た。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、約２×１０６細胞を１００μＬのヒトＥＳ細胞培地および１００μＬのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、続いてＮＯＤ−ＳＣＩＤＩＩ２ｒｇ−／−免疫不全マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に皮下注射した。注射から８〜１２週間後、腫瘍を切開し、さらなる解析にかけた。組織学的スライドは、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１０μｍ切片）を用いて、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）に凍結保存された腫瘍スライスから調製し、続いて免疫染色、ヘマトキシリンとエオシン染色、またはＦＩＳＨ解析を行なった。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によるフローサイトメトリーは、新たに切開した腫瘍からの解離細胞で行った。
【００８６】
実施例２．セントロメアフォーカスの定量化による単細胞レベルの倍数性の決定
本発明者らは、セントロメアタンパク質蛍光免疫染色に基づく一細胞解像度で倍数性を決定するための方法を考案した。各染色体は通常、セントロメアを１つ有するので、セントロメアを検出し、数え上げることができれば、個々の細胞での倍数性を可視化する手段がもたらされ、一方で識別のマーカーを共染色することによって細胞独自性を定義することが可能になると判断した。
【００８７】
まず、この方法を既知の倍数性の細胞株、例えば、一倍体濃縮と二倍体のｐＥＳ１０細胞、三倍体ｓｏＰＳ２細胞３５および四倍体Ｈｙｂｒｉｄ１細胞３６で試験し、倍数性と、セントロメアのカウント数との間の関連性を示した（図６ａ）。セントロメア数は、染色体数の予想範囲内であった。一倍体濃縮細胞の７６％が１５〜２５セントロメアフォーカスを示したが、残りの細胞は３０〜４８フォーカスを示し、二倍体細胞の記述されている範囲（３４〜５１）に類似していた。重要なことに、一倍体細胞のこのパーセンテージは、ＤＮＡ  ＦＩＳＨ（７３％、図６ｂ）およびＤＮＡ量フローサイトメトリー（７３％、図６ｃ）によって推定されたそれと一致しており、セントロメアフォーカス定量化が一倍体ＥＳ細胞を識別する信頼性の高い方法であることを示した。
【００８８】
セントロメアを計数する正確度は、個々のセントロメアの実際の数値の過小評価を引き起こすセントロメアクラスタリング、ならびに単一細胞で多数のセントロメアを計数する難しさに起因し、倍数性の増加とともに低下する。予想よりも多いフォーカスの数を観察することは、希少細胞での視覚的な人為的結果または異数性によって説明することができる。細胞周期進行がセントロメアフォーカス数を変えたか、またはその定量化に影響を及ぼしたかどうかに取り組むために、一倍体ＥＳ細胞をセントロメアタンパク質およびリン酸化ヒストン３（ｐＨ３、Ｓｅｒ１０）または５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）（それぞれ、有糸分裂に入る細胞、およびＤＮＡ複製を受ける細胞を標識する）のいずれかに対して共染色し、細胞周期の異なる期でのセントロメアの数を定量化した（図６ｄ、６ｆ）。明らかに、セントロメアフォーカス数はＤＮＡ複製の間、増加せず、一倍体細胞がセントロメア染色によって中間期の全体を通じて正確に検出され得ることを確認した。
【００８９】
実施例３．一倍体ヒトＥＳ細胞の誘導
一倍体細胞の持続のために、１４の初期継代（継代≦９）ヒトｐＥＳ細胞株の収集を作成し、解析した。すべての細胞株は、第二極体放出と単一前核を示している活性化卵母細胞に由来した。最初に、希少一倍体核の明白な定量的発見のための方法として中期スプッレッドおよびＧ−バンド法による染色体計数を利用した。個々の１０ｐＥＳ細胞株の中で、低比率の一倍体中期を単一細胞株、ｐＳＥ１０だけに見いだした（１．３％、表１）。染色体コピー数が２以下（２ｃ）に対応するＤＮＡ量を有する細胞を追加の４株から分離することを目標として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により生存可能なＦＡＣＳも利用し、第２の細胞株、ｐＥＳ１２（表２）からの一倍体細胞の濃縮に成功した。
【００９０】
２つの個々の一倍体濃縮ＥＳ細胞株を、１ｃ細胞ＦＡＣＳ濃縮および伸長の５〜６ラウンド以内で、ｐＥＳ１０とｐＥＳ１２（以下、ｈ−ｐＥＳ１０およびｈ−ｐＥＳ１２と呼ぶ）の両方から確立した（図１ｃ（ｐＥＳ１０）、図５ａ（ｐＥＳ１２））。正常な一倍体核型を有する細胞を組み入れながら、これらの細胞株を３０継代以上にわたり標準培養条件下で増殖させた（図１ｄ、図５ｂ）。しかし、二倍体化が一日当たり細胞の３〜９％の割合で生じたので（図１ｅ）、一倍体細胞の維持および解析のために３〜４継代ごとに細胞選別を必要とした。さらに、接着状態での倍数性の可視化は、ＤＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（図１ｆ、図５ｃ）およびセントロメアタンパク質フォーカスの定量化（図１ｇ、図５ｄ、図６）によって可能になった。それらの完全な核型に加えて、それらの未選別の二倍体対応物と比較して、一倍体ＥＳ細胞には重要なコピー数多型（ＣＮＶ）が内部になかった（図５ｅ）。重要なことに、偽二倍性になる２つの細胞株において、特定領域の共通の重複が観察されなかった。したがった、ゲノム完全性は、一倍体細胞胞分離および維持を通して保たれていた。予想されたように、一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ解析は、すべての染色体にわたり二倍体のｐＥＳ１０細胞およびｐＥＳ１２細胞の完全なホモ接合性を示した。
【００９１】
ｈ−ｐＥＳ１０およびｈ−ｐＥＳ１２は、両方とも、ヒト多能性幹細胞の古典的な特徴、例えば、典型的なコロニー形態およびアルカリホスファターゼ活性を示した（図２ａ、図２ｂ）。セントロメアフォーカスの定量化によって基本的に純粋な一倍体培養物（＞９５％一倍体）で確認されたように、単一一倍体ＥＳ細胞は、種々の特徴的な多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１−６０）を発現した（図２ｃ、図７）。特に、選択的なフローサイトメトリーにより、単一の一倍体細胞において、２つのヒトＥＳ細胞に特異的な細胞表面マーカー（ＴＲＡ−１−６０とＣＬＤＮ６１８）の発現を確認することができた（図２ｄ）。さらに、選別した一倍体と二倍体のＥＳ細胞は、多能性遺伝子の非常に類似した転写シグネチャーおよびエピジェネティックシグネチャーを示した（図２ｅ、図２ｆ）。一倍体ＥＳ細胞は単為生殖生物として誘導されたので、これらは、父性遺伝の対立遺伝子および父性エピジェネティックプロファイルが欠如しているために、母性インプリンティングの明白な転写およびエピジェネティックプロファイルを備えていた（図８）。
【００９２】
単一対立遺伝子の破壊後に表現型的に選択可能な変異体を識別することができるので、一倍体細胞は機能喪失遺伝子スクリーニングのために貴重である。一倍体ヒトＥＳ細胞におけるこの原理の適用性を示すために、転写的に活性な遺伝子座を標的にするｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン遺伝子トラップシステム（図２ｇ、図８ｅ）を使用して、ゲノムワイド変異体ライブラリーを作成し、プリン類似体６−チオグアニン（６−ＴＧ）に対する耐性のスクリーニングを行った。分離、解析した６−ＴＧ−耐性コロニー６個のうち３個がヌクレオシド二リン酸結合部分Ｘ型モチーフ５（ＮＵＤＴ５）常染色体遺伝子に局在する遺伝子トラップ挿入を内部に保持していた（図２ｈ）。ＮＵＤＴ５の破壊によって、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）媒介による６−ＴＧのチオグアノシンモノホスファート（ＴＧＭＰ）への変換において、ホスホリビシルのドナーとして働く５−ホスホ−ｄ−リボス−１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の産生に対して上流で作用することによりヒト細胞において６−ＴＧ耐性を付与する５１ことが最近確認された（図２ｉ）。常染色体の突然変異体による機能喪失表現型の検出により、遺伝学的スクリーニングが一倍体ヒトＥＳ細胞で実行できることが確証される。
【００９３】
実施例４：一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞の分子および細胞の比較
ヒトＥＳ細胞が一倍体および二倍体としての両方で存在する能力によって、本発明者らはこれらの２つの倍数性状態が遺伝子制御および細胞生物学のいくつかの側面において異なる可能性があるかどうかを調査することにした。細胞周期の同じ期で一倍体と二倍体のＥＳ細胞を解析するために、ＦＡＣＳを用いてＧ１期一倍体細胞（１ｃ）を分離し、次いでこれらの細胞を未選別の二倍体培養物からの同質遺伝子Ｇ１期二倍体細胞（２ｃ）と比較した（図３ａ、図９ａ）。観察される発現レベルの違いが絶対差を表わすよりもむしろ、各倍数性状態の全遺伝子発現に対して相対的であることを考慮して、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を用いて、一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞のトランスクリプトームを比較することによって、推定上の倍数性の関連する差異を明らかにすることを目標とした。ゲノムスケールで、未分化一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞は互いに密接に、および分化胚様体（ＥＢ）とは別々にクラスター形成し、遺伝的背景の影響を超えて広がる類似点を示している（図３ｂ）。それにもかかわらず、合計５６５の差次的に発現した遺伝子が識別され（＞２倍の変化、偽陽性率（ＦＤＲ）＜０．０５）、二倍体と比較して、一倍体において相対的に増加した遺伝子２７５および相対的に減少した遺伝子２９０に相当した（図９ｂ）。
【００９４】
特に、Ｘ染色体遺伝子は、相対的に増加した遺伝子セット（４０％、Ｐ＜０．００１、χ２適合度検定）の間でかなり大きな比率を占め（図３ｃ）、Ｘ染色体遺伝子単独の発現レベルは一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞を明確に区別し、後者は、それらの未分化一倍体対応物よりもそれらの分化誘導体とさらにより密接にクラスター形成した（図３ｄ）。これらのデータは、一倍体と二倍体のヒトＥＳ細胞においてＸ染色体不活性化（ＸＣＩ）の予想される差次的状態と一致しているが、一倍体の単一Ｘ染色体は転写的に活性（Ｘａ）であり、二倍体の２つのＸ染色体のうち１つは、雌性体細胞のようにＸＣＩ（ＸａＸｉ）１９を起こすことが多い。実際に、一倍体ヒトＥＳ細胞は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析と発現マイクロアレイ解析の両方により二倍体と比較して、Ｘ染色体遺伝子発現において相対的増加を示し、および二倍体ＸａＸａヒトＥＳ細胞２０で観察されるように、ＸＣＩに引き起こされる転写産物ＸＩＳＴの発現が欠如していた（図３ｅ、図３ｆ、図９ｂ〜９ｄ）。ＸＣＩはエピジェネティック現象であり、抑制性ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化によって調節される。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３フォーカスは、未選別の二倍体ＥＳ細胞で一貫して観察されたが、その一倍体濃縮対応物では観察されなかった（図３ｇ）。さらに、メチローム解析は、一倍体ＥＳ細胞のＸ染色体ＤＮＡメチル化シグネチャーが、二倍体雌性細胞における低メチル化Ｘａおよび過剰メチル化Ｘｉの複合パターンとは対照的に、単一コピーＸ染色体がほとんど低メチル化である二倍体雄性ＥＳ細胞（ＸａＹ）のそれと似ていることを示した（図３ｈ）。興味深いことに、上述のすべてのアッセイで、最近二倍体化されたＥＳ細胞は、二倍体化の直後（一倍体細胞濃縮後３継代以内）にＸａＸａのままであった（図３ａ、図３ｅ〜３ｈ）。
【００９５】
従来の相対的遺伝子発２１現解析につきものである全遺伝子発現への正規化は、外見上は類似した常染色体遺伝子の発現レベルになったが、二倍体ＥＳ細胞と比較すると、一倍体においてＸ連鎖遺伝子のレベルが高かった（図３ｅ、図９ｃ）。しかし、一倍体Ｘａ細胞および二倍体ＸａＸｉ細胞のＸ連鎖遺伝子の絶対発現が同じであると仮定すると、これらのデータは一倍体細胞においてゲノムワイドの常染色体遺伝子レベルの減少を示唆する（図９ｅ、図９ｆ）。この概念を支持して、我々は、一倍体ＥＳ細胞から分離した全ＲＮＡ量が同じ数の二倍体細胞から得られたものよりも有意に低いことを見いだした（図３ｉ）。全遺伝子発現の全体な減少は、これらの細胞の物理的寸法も変化し得ることを示した。実際に、Ｇ１期での選別一倍体ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞の間の平均直径比は、約０．８（それぞれ、９．６μｍと１１．５μｍ）であり、一倍体：二倍体が表面積で約０．７、体積で約０．６に対応する（図３ｉ、図９ｇ）。
【００９６】
続いて、常染色体内での一貫した差次的制御に注目した。転写およびＤＮＡメチル化解析に基づいて、一倍体ＥＳ細胞において相対的に減少するシグナルペプチドを含むタンパク質をコ−ドする遺伝子のかなりの濃縮を見いだした（図９ｈ）。注目すべきことに、一倍体細胞における酸化的リン酸化に関与する１１の遺伝子、例えばこの経路を含む５の複合体のうち４つのサブユニットをコードする代表的なもののわずかだが重要な相対的増加を検出した（図３ｊ、図９ｉ）。さらに、酸化的リン酸化に関与する１３のミトコンドリア遺伝子のすべては、同じように一倍体細胞において一貫して増加し（図３ｊ）、これらの核遺伝子とミトコンドリア遺伝子との間の協調制御を示した。これは、一倍体と二倍体との間のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）対核ＤＮＡの比率における３２％の増加と一致し（図３ｉ）、核ＤＮＡ量と比べて豊富なミトコンドリアが一倍体細胞においてかなり高いことを示唆している。
【００９７】
実施例５．ヒト一倍体ＥＳ細胞の分化
次に、単為発生由来の一倍体ヒトＥＳ細胞の分化能の評価を追求した。哺乳動物の単為発生が親ゲノムの非同等性のため制限されているが２２、２３、二倍体ヒト単為発生多能性幹細胞は、すべての胚系を生じさせるその能力によって明らかなように機能的に多能性である１３、２４、２５。ヒト単為発生ＥＳ細胞が一倍体として多系列分化ができるかどうかに取り組むために、いくつかの分化アッセイを行い、続いて得られた細胞の倍数性と分化状態の特徴づけを行った、一倍体濃縮ＥＳ細胞と二倍体ＥＳ細胞の同時分化によって作製したＥＢは、２１日目に外見から区別することができなく（図４ａ）、ＥＢ由来の解離一倍体細胞の形態は分化と一致していた（図１０ａ）。特に、中期スプレッド解析により、一倍体核型が明らかになり（図４ｂ、４／４中期）、および大部分のＤＮＡプロファイル（約７０％一倍体）は、ｈ−ｐＥＳ１０由来ＥＢ細胞とｈ−ｐＥＳ１２由来ＥＢ細胞の両方がフローサイトメトリーによって確認された（図４ｃ、図１０ｂ）。次いで、Ｇ１期選別一倍体ＥＳ細胞とＥＢ細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、８種類の組織と多能性幹細胞にわたり明確な特異性を示した１８の遺伝子に着目した。例えば、我々の遺伝子セットは、それぞれ脳、皮膚、筋肉、腎臓、肝臓、膵臓、肺および腸管で発現される、ＣＨＲＭ１（コリン受容体）、ＫＲＴ１７（ケラチン）、ＭＹＬ１（ミオシン）、ＲＥＮ（レニン）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＣＰＡ１（カルボキシペプチダーゼ）、ＳＦＴＰＤ（界面活性剤）およびＭＡＬＲＤ１（ＭＡＭおよびＬＤＬ受容体）を含んでいた（図４ｄ）。これらの系統特異的遺伝子の発現が未分化ＥＳ細胞でごくわずかだったのに対して、すべてが一倍体と二倍体のＥＢ細胞において発現された（図４ｄ、図６ｃ）。加えて、一倍体と二倍体のＥＢ細胞は、３つの胚性胚葉すべての効率的な分化および体細胞運命の獲得に一致する、多能性特異的遺伝子のわずかな発現を示した。
【００９８】
この解析をより特異的で、かつ潜在的により成熟した細胞型まで広げるために、一倍体ＥＳ細胞を定方向分化アッセイにかけた。神経運命に向かう定方向分化を受けている一倍体ＥＳ細胞は、１０日間、一倍体のままであったが、神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ１）−陽性遺伝子前駆細胞（ＮＰＣ、約９０％の効率）を効率的に生じさせた（図４ｅ、図１１ａ、図１１ｂ）。選別一倍体ＮＰＣは、複数の神経系統特異的遺伝子を発現させたが、多能性特的遺伝子は発現させることがなく（図４ｆ、図１１ｃ）、多能性状態からの強い退出を示した。ＸＣＩは二倍体の分化した雌性細胞において避けることができなく、Ｘ染色体と常染色体の間の遺伝子量補償および１：２の比率になる。一倍体ＥＳ細胞はその単一コピーＸ染色体を不活性化することができないので、１：１のＸ染色体：常染色体の量の不均衡は、分化状態まで持続しなければならない。実際に、一倍体ＮＰＣと一倍体ＥＢ細胞の両方は、全ゲノム発現解析およびＸＩＳＴレベルによって示されるように、二倍体ＥＢ細胞のＸａＸｉシグネチャーに反してＸａシグネチャーを示した（図４ｇ、図１１ｄ）。
【００９９】
セントロメアによる共染色（図４ｈ、４７％一倍体、ｎ＝１０４）およびＦＩＳＨ解析（図１１ｅ、１１ｆ、４６％一倍体、ｎ＝２００）の両方で示したように、一倍体細胞の注目すべき持続とともに２０日まで細胞も成熟ＴＵＪＩ（β−チューブリンＩＩＩとしても知られている）陽性神経に高効率（＞９０％）で分化するので、神経分化は前駆段階に制限されなかった。同様に、１１日間のプロトコル期間、一倍体細胞は心筋トロポニンＴタイプ２（ＴＮＮＴ２）を発現する心筋細胞に分化し（図４ｊ、３２％一倍体、ｎ＝９７）、自発的に拍動するクラスターになり、全培養（２５％  １ｃ細胞）から選別された一倍体細胞の３９％（ｎ＝３１）はＴＮＮＴ２−陽性と確認された（図４ｊ、図１１ｇ）。次に、一倍体濃縮培養物（約７０％一倍体）を膵臓系統に分化させ、セントロメアフォーカス解析によって分化の２段階、すなわち、胚体内胚葉およびさらに脾臓細胞への特異化を解析した。フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）−陽性胚体内胚葉細胞（図４ｋ、５６％一倍体、ｎ＝１１２）、および膵十二指腸ホメボックス１（ＰＤＸ１）−陽性膵細胞（図４ｌ、１３％の一倍体、ｎ＝１０３）への一倍体と二倍体の両方の強力な分化（＞９０％）が観察され、ＰＤＸ１陽性脾細胞の一部はＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）にも陽性であった。セントロメア解析に加えて、一倍体ＰＤＸ１−陽性細胞の持続は、フローサイトメトリーによっても確認された（図４ｍ、１０％のＰＤＸ１陽性１ｃ細胞、図１１ｈ、図１１ｉ）。
【０１００】
最終的に、ＴＵＪＩ、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（図４ｎ、図１２ａ、図１２ｂ）を用いる組織学的解析と免疫染色解析で示すように、両一倍体濃縮ヒトＥＳ細胞株は、外胚葉、中胚葉および内胚葉由来の細胞型を含むテラトーマを生じさせ、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト多能性に関する最もストリンジェントな基準を満たした。重要なことに、残留する未分化ＯＣＴ４−陽性細胞は、検出できなかった（図４ｎ、図１２ｂ）。精査後、ＤＮＡ量の解析により、ｈ−ｐＥＳ１０由来テラトーマ由来のかなりの集団が一倍体のままであることが明らかになった（図４ｏ）。別個のｈ−ｐＥＳ１２由来テラトーマからの連続切片についての組織学とＦＩＳＨによる複合解析は、発生のシグナルに応答する一方で、組織構造の組織化に寄与することができるｉｎ  ｖｉｖｏでの分化一倍体ヒト細胞の存在を確認した（図４ｐ）。一倍体細胞の初期量および／または分化の時間の長さによって影響を受けた可能性があり、様々な比率ではあるが、一倍体細胞が解析したすべてのテラトーマ（ｎ＝４）で識別されたことは注目に値する。
【０１０１】
参考文献
１．Ｌｅｅｂ，Ｍ．＆  Ｗｕｔｚ，Ａ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７９，１３１−４（２０１１）．
２．Ｅｌｌｉｎｇ，Ｕ．ら．Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，５６３−７４（２０１１）．
３．Ｙａｎｇ，Ｈ．ら．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｏｏｃｙｔｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  １４９，６０５−１７（２０１２）．
４．Ｌｉ，Ｗ．ら．Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｌｉｖｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．
Ｎａｔｕｒｅ  ４９０，４０７−１１（２０１２）．
５．Ｌｉ，Ｗ．ら．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔ  ｕｓｉｎｇ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，４０４−１４（２０１４）．
６．Ｙａｎｇ，Ｈ．ら．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｐａｒｔｈｅｎｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３，  １１８７−２００  （２０１３）．
７．Ｗｕｔｚ，Ａ  Ｈａｐｌｏｉｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０，  ７０５−２２（２０１４）．
８．Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ，Ａ  Ｋ．，Ｗｉｔｋｏｗｓｋａ，Ａ  ＆  Ｎｏｗｉｃｋａ，Ｊ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｒｔｈｅｏｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２２６，１６２−５（１９７０）．
９．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ，Ａ  Ｈ．＆  Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．７３，２４９−６１（１９８３）．
１０．Ｅｇｌｉ，Ｄ．ら．Ｉｍｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｇｇ  ｄｏｎｏｒ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，２９３−４（２０１１）．
１１．Ｌｅｅｂ，Ｍ．＆  Ｗｕｔｚ，Ａ  Ｈａｐｌｏｉｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ６，４１（２０１３）．
１２．Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．ら．Ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｂｌａｓｔ  ｓｈａｒｅ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，１９６−９（２００７）．
１３．Ｒｅｖａｚｏｖａ，Ｅ．Ｓ．ら．Ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ９，４３２−４９（２００７）．
１４．Ｋｉｍ，Ｋ．ら．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ  ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １，３４６−５２（２００７）．
１５．Ｐａｕｌｌ，Ｄ．ら．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９３，６３２−７（２０１３）．
１６．Ｌｅｅｂ，Ｍ．ら．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３９，３３０１−５（２０１２）．
１７．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．ら．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ２／Ｍ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１，３８４２−７（２０１４）．
１８．Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ，Ｕ．，Ｎｕｄｅｌ，Ｎ．＆  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｇｈｔ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌａｕｄｉｎ−６  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，１９９２（２０１３）．
１９．Ｓｉｌｖａ，Ｓ．Ｓ．，Ｒｏｗｎｔｒｅｅ，Ｒ．Ｋ．，Ｍｅｋｈｏｕｂａｄ，Ｓ．＆  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，４８２０−５（２００８）．
２０．Ｂｒｕｃｋ，Ｔ．，Ｙａｎｕｋａ，Ｏ．＆  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．Ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｘ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｓｈｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＥＬＫ−Ｉ  ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．４，２６２−７０（２０１３）．
２１．Ｌｏｖeｎ，Ｊ．ら．Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １５１，４７６−８２（２０１２）．
２２．ＭｃＧｒａｔｈ，Ｊ．＆  Ｓｏｌｔｅｒ，Ｄ．Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｅｒｎａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ  ３７，１７９−８３  （１９８４）．
２３．Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｕｒａｎｉ，Ｍ．Ａ  ＆  Ｎｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１１，３７４−６（１９８４）．
２４．Ｍａｉ，Ｑ．ら．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７，１００８−１９（２００７）．
２５．Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．，Ｙａｎｕｋａ，Ｏ．＆  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．Ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，７３５−４１（２０１１）．
２６．Ｍｉｎｋｏｖｓｋｙ，Ａ，Ｐａｔｅｌ，Ｓ．＆  Ｐｌａｔｈ，Ｋ．Ｃｏｎｃｉｓｅ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｍａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３０，４８−５４（２０１２）．
２７．Ｂｉａｎｃｏｔｔｉ，Ｊ．Ｃ．ら．Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｓｏｍｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｓｏｍｉｅｓ  ａｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．９，２１８−２４（２０１２）．
２８．Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら．ＨＩＦｌα  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｔｏ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ＥＳＣ−ｔｏ−ＥｐｉＳＣ／ｈＥＳＣ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ３１，２１０３−１６（２０１２）．
２９．Ｓｈｕａｉ，Ｌ．ら．Ｄｕｒａｂｌｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｉｄｙ  ｉｎ  ｅｐｉｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．      Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１−２９（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｍｃｂ／ｍｊｖ０４４
３０．Ｃａｒｅｔｔｅ，Ｊ．Ｅ．ら．Ｈａｐｌｏｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，  １２３１−５（２００９）．
３１．Ｃａｒｅｔｔｅ，Ｊ．Ｅ．ら．Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，３４０−３（２０１１）．
３２．Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．＆  Ｌａｎｄｅｒ，  Ｅ．Ｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，  ８０−４  （２０１４）．
３３．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．ら．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ    ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，８４−７（２０１４）．
３４．Ｏｔｔｏ，Ｓ．Ｐ．＆  Ｊａｍｅ，Ｐ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｈａｐｌｏｉｄｓ一ｈａｐｌｅｓｓ  ｏｒ  ｈａｐｐｅｎｉｎｇ？  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，２４４１−  ３（２００１）．
３５．Ｎｏｇｇｌｅ，Ｓ．ら．Ｈｕｍａｎ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔａｔｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７８，７０−５（２０１１）．
３６．Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．，Ａｔｉｅｎｚａ，Ｊ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．＆  Ｅｇｇａｎ，Ｋ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１３６９−７３（２００５）．
３７．Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎ，Ｂ．ら．Ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５，６３４−６４２（２０１４）．
３８．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｅ．ら．Ｏｐｔｉｍａｌ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｏｗｓ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｂｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４，１０３−６（２００９）．
３９．Ｒａｏ，Ｐ．Ｈ．，Ｎａｎｄｕｌａ，Ｓ．Ｖ  ＆  Ｍｕｒｔｙ，Ｖ．Ｖ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３８３，１６５−８５（２００７）．
４０．Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （ＧＴＥｘ）  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５，５８０−５（２０１３）．
４１．Ｙａｍａｄａ，Ｍ．ら．Ｈｕｍａｎ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍ  ａｄｕｌｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｔｏ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１０，５３３−６（２０１４）．
４２．Ｗａｎｅｔ，Ａ．ら．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５４，１７４−８５  （２０１４）．
４３．Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｓ．ら．Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．６，２７０−８１（２０１０）．
４４．Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．，Ｓａｇｉ，Ｉ．＆  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏ−ｍｉＲ−３７２−３７３．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，２７２４（２０１３）．
４５．Ｗａｎｇ，Ｌ．ら．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ−ｌｉｋｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，７９６−８０８（２０１５）．
４６．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．ら．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，２７５−８０（２００９）．
４７．Ｌｉａｎ，Ｘ．ら．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｕｎｄｅｒ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．８，１６２−７５（２０１３）．
４８．Ｈｕａ，Ｈ．ら．ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  β ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｅｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＪＣｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，３１４６−５３（２０１３）．
４９．Ｐａｇｌｉｕｃａ，Ｆ．Ｗ．ら．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ１５９，４２８−３９（２０１４）．
５０．Ｒｅｚａｎｉａ，Ａら．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，１１２１−３３（２０１４）．
５１．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ら．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｇＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）．ｄｏｉ：ｌ０．１０３８／ｎｂｔ．３４３７．
５２．Ｃａｄｉnａｎｏｓ，Ｊ．＆  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５，ｅ８７（２００７）．
５３．Ｗａｎｇ，Ｗ．ら．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，９２９０−５（２００８）．
５４．Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １３，９３（２０１３）．
【０１０２】
特定の実施形態についての前述の説明は本発明の全体的な特性を完全に明らかにしており、その結果、当業者は、過度の実験をせずに、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、種々の用途のためにこのような識別の実施形態を容易に修正および／または適合させるように当業者の範囲内にある知識を適用することができる。したがって、そのような適合および修正は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内であることが意図されている。本明細書の用語または語法が上記教示およびガイダンスを鑑みて当業者によって解釈されるように、本明細書の語法または用語は説明を目的としており、限定するものではないことを理解すべきである。本発明をさらに添付の特許請求項によって説明する。
【図１Ａ】
2018521692.tif 000014
【図１Ｂ】
2018521692.tif 000015
【図１Ｃ】
2018521692.tif 000016
【図１Ｄ】
2018521692.tif 000017
【図１Ｅ】
2018521692.tif 000018
【図１Ｆ】
2018521692.tif 000019
【図１Ｇ】
2018521692.tif 000020
【図２Ａ】
2018521692.tif 000021
【図２Ｂ】
2018521692.tif 000022
【図２Ｃ】
2018521692.tif 000023
【図２Ｄ】
2018521692.tif 000024
【図２Ｅ】
2018521692.tif 000025
【図２Ｆ】
2018521692.tif 000026
【図２Ｇ】
2018521692.tif 000027
【図２Ｈ】
2018521692.tif 000028
【図２Ｉ】
2018521692.tif 000029
【図３Ａ】
2018521692.tif 000030
【図３Ｂ】
2018521692.tif 000031
【図３Ｃ】
2018521692.tif 000032
【図３Ｄ】
2018521692.tif 000033
【図３Ｅ】
2018521692.tif 000034
【図３Ｆ】
2018521692.tif 000035
【図３Ｇ】
2018521692.tif 000036
【図３Ｈ】
2018521692.tif 000037
【図３Ｉ】
2018521692.tif 000038
【図３Ｊ】
2018521692.tif 000039
【図４Ａ】
2018521692.tif 000040
【図４Ｂ】
2018521692.tif 000041
【図４Ｃ】
2018521692.tif 000042
【図４Ｄ】
2018521692.tif 000043
【図４Ｅ】
2018521692.tif 000044
【図４Ｆ】
2018521692.tif 000045
【図４Ｇ】
2018521692.tif 000046
【図４Ｈ】
2018521692.tif 000047
【図４Ｉ】
2018521692.tif 000048
【図４Ｊ】
2018521692.tif 000049
【図４Ｋ】
2018521692.tif 000050
【図４Ｌ】
2018521692.tif 000051
【図４Ｍ】
2018521692.tif 000052
【図４Ｎ】
2018521692.tif 000053
【図４Ｏ】
2018521692.tif 000054
【図４Ｐ】
2018521692.tif 000055
【図５Ａ】
2018521692.tif 000056
【図５Ｂ】
2018521692.tif 000057
【図５Ｃ】
2018521692.tif 000058
【図５Ｄ】
2018521692.tif 000059
【図５Ｅ】
2018521692.tif 000060
【図６】
2018521692.tif 000061
【図７】
2018521692.tif 000062
【図８】
2018521692.tif 000063
【図９】
2018521692.tif 000064
【図９Ｅ】
2018521692.tif 000065
【図９Ｆ】
2018521692.tif 000066
【図９Ｇ】
2018521692.tif 000067
【図９Ｈ】
2018521692.tif 000068
【図９Ｉ】
2018521692.tif 000069
【図１０Ａ】
2018521692.tif 000070
【図１０Ｂ】
2018521692.tif 000071
【図１０Ｃ】
2018521692.tif 000072
【図１１Ａ】
2018521692.tif 000073
【図１１Ｂ】
2018521692.tif 000074
【図１１Ｃ】
2018521692.tif 000075
【図１１Ｄ】
2018521692.tif 000076
【図１１Ｅ】
2018521692.tif 000077
【図１１Ｆ】
2018521692.tif 000078
【図１１Ｇ】
2018521692.tif 000079
【図１１Ｈ】
2018521692.tif 000080
【図１１Ｉ】
2018521692.tif 000081
【図１２Ａ】
2018521692.tif 000082
【図１２Ｂ】
2018521692.tif 000083
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月28日(2018.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018521692000001.app
【国際調査報告】
2018521692.tif 000084
2018521692.tif 000085
2018521692.tif 000086
2018521692.tif 000087