(57)【要約】  一般式（PC-L-Dr）を持つリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、その製造方法、及びレセプター制御による癌を治療するための薬物の製造におけるリガンド‐細胞傷害性薬物複合体及びそれを含有する医薬組成物の用途を提供する。2018512377.tif 000124【選択図】なし
2018512377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化１】
2018512377.tif 000099
式中：
R, R2-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りはそれぞれ水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
yは1-8、好ましくは2-5であり； 
PCはリガンドであり；Lはリンカーである。
【請求項２】
式（PC-L-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化２】
2018512377.tif 000100
（式中、R2-R14は請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項３】
式（PC-L’-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化３】
2018512377.tif 000101
（式中：
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
nは2-6、好ましくは2-5であり；
mは0-5、好ましくは1-3であり；
PC, y, n, R, R2-R14は、請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項４】
式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化４】
2018512377.tif 000102
（式中：
R15, R16, mは、請求項３で定義した通りであり；
PC, y, n, R2-R14は、請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項５】
式（PC-L’-D1）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化５】
2018512377.tif 000103
（式中、PC, y, n, m, R2-R16は、請求項２で定義した通りである。）
である、請求項２に記載の式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項６】
化合物が、
【化６】
2018512377.tif 000104
（式中、PC、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項７】
【化７】
2018512377.tif 000105
（式中、PC、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
PCが抗体、好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項９】
化合物が、
【化８】
2018512377.tif 000106
（式中、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１０】
【化９】
2018512377.tif 000107
（式中、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１１】
式（Dr）の化合物：
【化１０】
2018512377.tif 000108
（式中:
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択される。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
式（D）の化合物：
【化１１】
2018512377.tif 000109
（式中、R1-R14は、請求項１１で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１３】
式（D1）の化合物：
【化１２】
2018512377.tif 000110
（式中、R1-R14は、請求項１１で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１４】
化合物が、
【化１３】
2018512377.tif 000111
から成る群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１５】
【化１４】
2018512377.tif 000112
から成る群から選択される化合物。
【請求項１６】
式（L1-Dr）の化合物：
【化１５】
2018512377.tif 000113
式中:
nは2-6、好ましくは2-5であり；
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい。
【請求項１７】
式（L1-D）の化合物：
【化１６】
2018512377.tif 000114
（式中、n, R2-R14は、請求項１６で定義した通りである。）
である、請求項１６に記載の式（L1-Dr）の化合物。
【請求項１８】
化合物が、
【化１７】
2018512377.tif 000115
から成る群から選択される、請求項１６または１７に記載の式（L1-D）の化合物。
【請求項１９】
【化１８】
2018512377.tif 000116
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための中間体。
【請求項２０】
式（PC-L2）の化合物：
【化１９】
2018512377.tif 000117
式中、
PCは、リガンドであり、好ましくは抗体、より好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブであり；
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
mは、0-5、好ましくは1-3であり；
Xは、0-5、好ましくは1-3である。
【請求項２１】
化合物が、
【化２０】
2018512377.tif 000118
から成る群から選択される、請求項２０に記載の式（PC-L2）の化合物。
【請求項２２】
ステップ：
【化２１】
2018512377.tif 000119
１）PCと式（(PC-L2-A）の化合物を還元剤RAの存在下で反応させて式（PC-L2-B）の化合物を得る；ここでRAは、好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドである；
２）式（PC-L2-B）の化合物に脱保護剤を加えて、チオール基の保護基Tを除去し、式（PC-L2）の化合物を得る、
（ここで、Tは水素、tert-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル及び2-(トリメチルシリル)エトキシメチルから成る群から、好ましくは水素またはアセチルから選択され、
PC, R15, R16, m及びxは、請求項２０で定義した通りである。）
を含む、式（PC-L2）の化合物の製造方法。
【請求項２３】
ステップ：
【化２２】
2018512377.tif 000120
（式中、PC, m, n, y, R2〜R16は請求項３で定義した通りである。）
式（PC-L2）の化合物を式（L1-D1）の化合物と反応させて式（PC-L’-D）の化合物を得る；
を含む、請求項４に記載の式（PC-L’-D）の化合物の製造方法。
【請求項２４】
式（D-Aa）の化合物：
【化２３】
2018512377.tif 000121
（式中:
R8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つは水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され；
R12は、水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
Pは、水素原子または保護基であり、保護基は、好ましくはBoc, BnまたはCbz、最も好ましくはBocであり；
Raは、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、シクロアルコキシまたはアルキルアミノから成る群から選択される。）、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
式（D-A）の化合物；
【化２４】
2018512377.tif 000122
（式中、P、R8-R12は、請求項２４で定義した通りであり；
R’は、水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択される。）、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項２４に記載の式（D-A a）の化合物。
【請求項２６】
化合物が、
【化２５】
2018512377.tif 000123
から成る群から選択される、請求項２４に記載の式（D-A）の化合物。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療有効量、及び１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２８】
癌がHER2, HER3またはEGFRの発現と関連している、該癌の治療薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
哺乳動物がヒトであり、癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発未分化大細胞リンパ腫から成る群から、好ましくは乳癌、ホジキンリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫から、より好ましくは乳癌から選択される、該癌の治療薬の製造における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は。新しい種類のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体に関し、具体的にはリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、その製造方法、それを含有する医薬組成物及び該リガンド‐細胞傷害性薬物複合体または医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、依然として外科的手術、放射線療法、及び標的治療などの最も重要な抗癌手段の一つである。多くのタイプの高度に有効な細胞毒があるが、これらの薬剤による腫瘍細胞と健康な細胞の間の乏しい識別性が、有毒な副作用のために臨床におけるそれらの広範な使用を制限している。腫瘍関連抗原への特異的な結合能力のために重要なクラスの生物抗がん剤として抗体医薬が出現した。この重要なクラスの生物製剤は癌治療のための単剤として用いることができるが、それらの治療効果は、しばしば限定的である。
【０００３】
抗体薬物複合体（ADC）は、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを生物活性な細胞毒と化学的に安定なリンカーを介して結合させて、正常細胞と腫瘍細胞の表面抗原に結合する抗体の特異性と細胞毒の高い効率を十分に活用し、一方で抗体の効力の低下と細胞毒の有毒な副作用を回避する。それ故、伝統的な化学療法薬に比べ、抗体薬物複合体は腫瘍細胞を正確に認識して、正常細胞へのダメージを減少させることができる。
【０００４】
初期のADCは、マウスのモノクローナル抗体を主に用い、そのため幾つかの薬物はヒトの免疫応答のために標的に到達するのが困難であった。第２に、ドキソルビシンなどの早期の使用でエフェクター分子は低い生物活性を示し、第一世代の抗体薬物複合体の効率を制限している。更に、抗体の供給源、リンカー結合の方法や数が最適化されていなかった。
【０００５】
カドサイラ（アドトラスツズマブエムタンシン、T-DM1）が、トラスツズマブ（トラスツズマブ、商品名:ハーセプチン）及びパクリタキセルに抵抗性であるHER2陽性進行性または転移性乳がん患者の治療用に２０１３年２月に米国FDAにより承認された。マイロターグ及びアドセトリスが、組織構造が固形腫瘍に比べて比較的単純である血液腫瘍に対する標的治療に用いられている。カドサイラは、固形腫瘍の治療にFDAによって承認された最初のADC薬である。
【０００６】
カドサイラは、高活性の有糸分裂抑制剤DM1を、ImmunoGenの技術を用いて安定なチオエーテルリンカーでロシュ社のトラスツズマブに約3.5の平均薬物抗体比で結合させている。トラスツズマブは患者の乳癌細胞に特異的に結合する。エンドサイトーシス後、DM1が放出されて、細胞中のDM1濃度が分裂死による細胞の死滅に十分となる。T-DM1は、ハーセプチンの抗体依存性細胞増殖抑制効果を保持する一方で、細胞傷害性薬物の潜在的効力を増強する。その毒素が腫瘍細胞内部で放出されるため、その副作用は、治療効果が増加しても増加することはない。
【０００７】
ペルツズマブ（2C4としても知られる、商品名パージェタ）は、組換えヒト化モノクローン抗体であり、「HER二量化阻害剤」として知られる最初のモノクローナル抗体である。ペルツズマブは、HER2に結合することによりHER2の他のHERレセプターとの二量化をブロックする。ペルツズマブは、HER2過剰発現または低発現で前立腺癌における腫瘍増殖を阻害することを示した。
【０００８】
近位部IVサブドメインのHER2細胞外ドメインに位置する部位に結合することにより下流のシグナル経路を阻害するトラスツズマブ（商品名ハーセプチン）と違って、ペルツズマブはIIドメイン（二量化ドメイン）に結合することによりHER2ヘテロ二量化を効率的に阻害することができる。従って、トラスツズマブはHER2過剰発現の癌患者、特に乳癌患者に一定の効果を有するのみであるのに対し、ペルツズマブは二量化を阻害した後にErbBファミリーレセプターによって媒介されるシグナル経路を切断することができるため、ペルツズマブは、トラスツズマブと同じ標的とエンドサイトーシスを有し、作用機序が異なるものに対して、HER2シグナル経路をブロックするそれらの薬物よりも広い範囲の用途を有している。
現在、主として２つのADC薬物カップリング法がある：T-DM1で用いられる１つの方法は、細胞傷害性薬物と抗体のフリーアミノ基の間のランダム結合である；アドセトリスで用いられる他の方法は、細胞傷害性薬物と抗体のヒンジ領域の還元で得られるフリーチオールの間の結合である。両方のカップリング方法とも不定の薬物負荷を持った混合物が得られる。例えば、T-DM1の平均薬物負荷量は3.5であるが、薬物負荷量の分布は0〜8に亘る。低い薬物負荷量はADCの有効性に影響し、一方、高い薬物負荷量は組織のマクロファージ系により認識されて破壊されるADC薬物になる。これはADCの半減期を減少させるのみならず、標的でない組織における薬物の蓄積により有毒な副作用も増加させる。アドセトリスでは、還元剤が抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合を還元するために用いられ、抗体自身の安定性に影響を与えた。関連するADCは、特許文献１〜７に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2007008603
【特許文献２】WO2013173393
【特許文献３】WO2005081711
【特許文献４】WO2013173391
【特許文献５】WO2013173392
【特許文献６】WO2013173393
【特許文献７】WO2012010287
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は。新規のカップリング方法及び毒物と抗体の新規の組合せを有し、それ故より有益な効果を有する新規のADC化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
リガンド、具体的には抗体と薬物のカップリング効果を改善するために、本発明は改善されたリンカーを含む式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する：
【化１】
2018512377.tif 000003
式中:
R, R2-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリールまたはヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
yは1-8、好ましくは2-5であり；yは整数または十進数である正の実数であり；
PCはリガンド;Lはリンカーである。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様において、式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物は、式（PC-L-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である：
【化２】
2018512377.tif 000004
式中、R2-R14は式（PC-L-Dr）で定義した通りである。
【００１３】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物は、式（PC-L’-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である：
【化３】
2018512377.tif 000005
式中：
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
nは2-6、好ましくは2-5であり；
mは0-5、好ましくは1-3であり；
PC, y, n, R, R2-R14は、式（PC-L-Dr）で定義した通りである。
【００１４】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物は、式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である：
【化４】
2018512377.tif 000006
式中：
R15, R16, mは、式（PC-L’-Dr）で定義した通りであり；
PC, y, n, R2-R14は、式（PC-L-Dr）で定義した通りである。
【００１５】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物は、式（PC-L’-D1）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である：
【化５】
2018512377.tif 000007
式中、PC, y, n, m, R2-R16は、式（PC-L’-D）で定義した通りである。
【００１６】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体としては、これらに限定されないが、
2018512377.tif 000008
2018512377.tif 000009
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
【００１７】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（PC-L-Dr）の化合物で、PCは抗体であり、好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブ及びトラスツズマブから選択される。
【００１８】
本発明の代表的なリガンド‐細胞傷害性薬物複合体としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000010
2018512377.tif 000011
2018512377.tif 000012
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
【００１９】
本発明の他の態様は、式（Dr）の化合物：
【化６】
2018512377.tif 000013
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩に関し、式（PC-L-Dr）の化合物の製造における中間体として用いることができる：
式中:
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールはさらに水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（Dr）の化合物は、式（D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化７】
2018512377.tif 000014
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、式中、R1-R14は式（Dr）で定義した通りである。
【００２１】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（Dr）の化合物は、式（D1）の化合物：
【化８】
2018512377.tif 000015
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、式中、R1-R14は式（D）で定義した通りである。
【００２２】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための代表的化合物としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000016
2018512377.tif 000017
2018512377.tif 000018
2018512377.tif 000019
2018512377.tif 000020
が挙げられる。
【００２３】
本発明の他の態様は、式（PC-L’-D）の化合物の製造において中間体として使用することができる式（L1-Dr）の化合物に関する:
【化９】
2018512377.tif 000021
式中:
nは2-6、好ましくは2-5であり；
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールはさらに水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（L1-Dr）の化合物は、式（L1-D）の化合物である：
【化１０】
2018512377.tif 000022
式中、n, R2-R14は、式（L1-Dr）で定義した通りである。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（L1-D）の化合物は、式（L1-D1）の化合物である：
【化１１】
2018512377.tif 000023
式中、n, R1-R12は、式（L1-D）で定義した通りである。
【００２６】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための代表的なプロドラッグ（リンカーを有する）及び中間体としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000024
2018512377.tif 000025
2018512377.tif 000026
が挙げられる。
【００２７】
本発明の他の態様は、式（PC-L2）の化合物に関する:
【化１２】
2018512377.tif 000027
式中、
PCは、リガンドであり、好ましくは抗体、より好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブ及びトラスツズマブから選択され；
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
mは、0-5、好ましくは1-3であり；
Xは、0-5、好ましくは1-3であり；Xは十進数及び整数などのである正の実数である。
【００２８】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（PC-L2）の化合物は、
2018512377.tif 000028
から成る群から選択される。
【００２９】
本発明は、さらに:
【化１３】
2018512377.tif 000029
１）PCと式（PC-L2-A）の化合物を還元剤RAの存在下で反応させて式（PC-L2-B）の化合物を得る；RAは好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドであり、より好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムである；
２）式（PC-L2-B）の化合物に脱保護剤を加え、チオール基の保護基Tを除去して式（PC-L2）の化合物を得る、
ここで：Tは水素、t-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル及び2-(トリメチルシリル)エトキシメチルから成る群から、好ましくは水素またはアセチルから選択され；
式（PC-L2-A）の化合物は、好ましくはS-(3-カルボニルプロピル)チオアセテートであり；
PC, R15, R16, m及びxは、式（PC-L2）で定義した通りである：
のステップを含む、式（PC-L2）の化合物を製造する方法に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、
【化１４】
2018512377.tif 000030
式（PC-L2）の化合物を式（L1-D1）の化合物と反応させて式（PC-L’-D）の化合物を得る；式中、PC, m, n, y, R2〜R16は式（PC-L’-D）で定義した通りである：
のステップを含む、式（PC-L’-D）の化合物を製造する方法に関する。
【００３１】
本発明は、さらに、本発明のリガンド薬物複合体ADCの代表的中間体化合物の合成のための中間体として使用できる式（D-A a）の化合物：
【化１５】
2018512377.tif 000031
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩に関し、
式中:
R8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され；
R12は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
Pは、水素原子または保護基であり、保護基は、好ましくはBoc, Bn, Cbz、最も好ましくはBocであり；
Raは、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、シクロアルコキシ及びアルキルアミノから成る群から選択される。
【００３２】
本発明は、さらに、本発明のリガンド薬物複合体ADCの代表的プロドラッグ化合物の合成のための中間体として使用できる式（D-A ）の化合物：
【化１６】
2018512377.tif 000032
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である式（D-A a）の化合物に関し、
式中:
R8-R12のいずれか２つとPが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され；
R’は、水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択される。
【００３３】
本発明のリガンド薬物複合体ADCの代表的プロドラッグ化合物の中間体（D-A a）または（D-A）としては、これらに限定されないが、
2018512377.tif 000033
が挙げられる。
【００３４】
本発明は、さらに上述の式（PC-L-Dr）、式（PC-L’-D）のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または式（Dr）、式（L1-Dr）、式（D）、式（L1-D）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療有効量、及び薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
【００３５】
本発明は、さらに、癌がHER2, HER3またはEGFRの発現と関連している、該癌の治療薬の製造における、上述の式（PC-L-Dr）、式（PC-L’-D）のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または式（Dr）、式（L1-Dr）、式（D）、式（L1-D）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。
【００３６】
本発明は、さらに、癌がHER2, HER3またはEGFRの発現と関連していて、哺乳動物に上述の式（PC-L-Dr）、式（PC-L’-D）のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または式（Dr）、式（L1-Dr）、式（D）、式（L1-D）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、またはそれらを含有する医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、哺乳動物における癌の治療方法に関する。
【００３７】
本発明は、さらに、哺乳動物の癌の治療薬の製造における、上述の式（PC-L-Dr）、式（PC-L’-D）のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または式（Dr）、式（L1-Dr）、式（D）、式（L1-D）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関し、該哺乳動物はヒトであり、該癌は乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発未分化大細胞リンパ腫から成る群から、好ましくは乳癌、ホジキンリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫から、より好ましくはHER2の発現と関連する乳癌から選択される。
【００３８】
本発明は、さらに、哺乳動物における癌の治療方法に関し、該方法は哺乳動物に上述の式（PC-L-Dr）、式（PC-L’-D）のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または式（Dr）、式（L1-Dr）、式（D）、式（L1-D）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、またはそれらを含有する医薬組成物の治療有効量を投与することを含み；該哺乳動物はヒトであり、該癌は乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発未分化大細胞リンパ腫から成る群から、好ましくは乳癌、ホジキンリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫から、より好ましくは2+レベルまたはより高いレベルのHER2過剰発現乳癌から、最も好ましくはHER2発現と関連する乳癌から選択される。
【００３９】
本発明において、抗体のヒンジ領域を還元する必要はない。フリーのメルカプト基を含むユニットLは、抗体のN末端アミノ基及び/またはリジン残基のアミノ基に結合する。従って、抗体構造への影響を減らすことが減って、炭素―窒素結合構造は安定であり、体内循環で分解されにくい。薬物の負荷は、反応条件を更にコントロールすることによって０‐５の範囲に分布させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で用いた全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野における当業者の通常の理解と一致する。本発明は本明細書に記載したものと類似または同等の方法や物質を用いて実施または試験をすることができるが、本明細書には好ましい方法や物質を記載している。以下の用語は、以下の定義に従って本発明を記載し、保護するために用いられる。
本発明で商標名が用いられる場合、出願人は商標名の製品、ジェネリック医薬品及び製品の活性薬物部分の製造を含むことを意図している。
特に言及しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いた用語は以下に述べる意味を有する。
【００４１】
「アルキル」とは、Ｃ１−Ｃ２０の直鎖及び分岐鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素基をいう。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素原子を持つアルキル、より好ましくは、１〜１０個の炭素原子を持つアルキル、最も好ましくは、１〜６個の炭素原子を持つアルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル−2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、2,3-ジメチルブチル、n-ヘプチル、2-メチルヘキシル、3-メチルヘキシル、4-メチルヘキシル、5-メチルヘキシル、2,3-ジメチルペンチル、2,4-ジメチルペンチル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、2-エチルペンチル、3-エチルペンチル、n-オクチル、2,3-ジメチルヘキシル、2,4-ジメチルヘキシル、2,5-ジメチルヘキシル、2,2-ジメチルヘキシル、3,3-ジメチルヘキシル、4,4-ジメチルヘキシル、2-エチルヘキシル、3-エチルヘキシル、4-エチルヘキシル、2-メチル−2-エチルペンチル、2-メチル−3-エチルペンチル、n-ノニル、2-メチル−2-エチルヘキシル、2-メチル−3-エチルヘキシル、2,2-ジエチルペンチル、n-デシル、3,3-ジエチルヘキシル、2,2-ジエチルヘキシル、及びそれらの種々の分岐鎖異性体が挙げられる。より好ましくは、アルキル基は１〜６個の炭素原子を持つ低級アルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル―2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル及び2,3-ジメチルブチル等が挙げられる。該アルキル基は置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基はどの置換可能な位置で置換されていてもよく、好ましくは、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルホ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、複素環式アルキルチオ及びオキソ基から成る群から独立して選択される１以上の基である。
【００４２】
「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基で、３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、より好ましくは３〜１０個の炭素原子、最も好ましくは３〜８個の炭素原子を持つものをいう。単環式シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタトリエニル及びシクロオクチル等が挙げられる。多環式シクロアルキルとしては、スピロ環、縮合環または架橋環を持つシクロアルキルが挙げられる。
【００４３】
「ヘテロシクリル」とは、３〜２０員の飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基であって、環原子としてＮ、Ｏ、及びＳ(Ｏ)ｍ(式中、ｍは０〜２から選択される整数である)から成る群から選ばれる１以上のヘテロ原子を有するが、環内に−Ｏ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−はなく、残りの環原子が炭素原子であるものをいう。好ましくは、ヘテロシクリルは、１〜４個の原子がヘテロ原子である、３〜１２個の原子を有し；より好ましくは３〜１０個の原子を有する。単環式ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル及びホモピペラジニル等が挙げられる。。多環式ヘテロシクリルとしては、スピロ環、縮合環または架橋環を持つヘテロシクリルが挙げられる。
該ヘテロシクリルは、アリール、ヘテロアリールまたはシクロアルキルの環に縮合してもよく、ここでは親構造に結合する環がヘテロシクリルである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
2018512377.tif 000034
【００４４】
該ヘテロシクリル基は、置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ及びオキソから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４５】
「アリール」とは、６〜１４員の全て炭素の単環式環または多環式縮合環(即ち、系内の各環が隣り合った炭素原子対を系内の他の環と共有していることを意味する)をいい、完全に共役したπ電子系を持っている。好ましくは、アリールは６〜１０員であり、より好ましくはフェニル及びナフチル、最も好ましくはフェニルである。該アリールは、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合していてもよく、ここでは親構造に結合した環がアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
2018512377.tif 000035
アリールは置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ及びヘテロシクリルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４６】
「ヘテロアリール」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール系をいい、５〜１４個の環原子を持っている。好ましくは、ヘテロアリールは５〜１０員、より好ましくは５員または６員で、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル及びテトラゾリル等である。該ヘテロアリールは、アリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合してもよく、ここでは親構造に結合する環がヘテロアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
2018512377.tif 000036
該ヘテロアリール基は、置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルホ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ及び複素環式アルキルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４７】
「アルコキシ」とは、−Ｏ−(アルキル)または−Ｏ−(無置換シクロアルキル)基をいい、ここでアルキル及びシクロアルキルは上記で定義した通りである。代表例としては、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシ等が挙げられる。該アルコキシルは置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ及びヘテロシクリルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４８】
「アルキルアミノ」とは、−Ｎ−(アルキル)及び−Ｎ−(未置換シクロアルキル)をいい、ここでアルキル及びシクロアルキルは上記で定義した通りである。アルキルアミノ基の代表例としては、これらに限定されないが、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ及びシクロヘキシルアミノが挙げられる。該アルキルアミノ基は置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ及びヘテロシクロアルキルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４９】
用語「結合」とは、共有結合をいい、「―」で表す。
「ヒドロキシ」とは、−ＯＨ基をいう。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子をいう。
「アルコキシカルボニル」とは、−Ｃ(Ｏ)Ｏ(アルキル)または(シクロアルキル)基をいい、ここでアルキル及びシクロアルキルは上記で定義した通りである。
【００５０】
用語「任意の」または「任意に」は、続いて記載した出来事や状況が生じても、生じなくてもよいことを意味し、そのような記載は出来事や状況が生じても、生じなくてもよいことを含んでいる。例えば、「アルキルで任意に置換された複素環式基」は、アルキル基が存在しても、しなくてもよいことを意味し、その記載はアルキルで置換されている複素環式基とアルキルで置換されていない複素環式基の場合を含んでいる。
【００５１】
「置換された」は、基内の１以上の水素原子、好ましくは５まで、より好ましくは１〜３の水素原子が、対応する数の置換基で独立して置換されていることをいう。置換基はそれらの化学的に可能な位置にのみ存在することは言うまでもない。当業者は過剰な努力を払うことなく経験や理論により置換が可能かどうか判断することができる。例えば、フリーの水素を持つアミノまたはヒドロキシが不飽和結合を持つ炭素原子（例、オレフィン）に結合すると不安定である。
【００５２】
「医薬組成物」とは、本発明の１以上の化合物またはそれらの生理学的/薬学的に許容される塩またはプロドラッグ及び生理学的/薬学的に許容される担体及び賦形剤などの他の化学成分の混合物をいう。医薬組成物の目的は、生体への薬物投与、活性成分の吸収、そして生物活性の発現を容易にすることである。
【００５３】
用語「薬学的に許容される塩」とは、哺乳動物に安全かつ有効で、望ましい生物活性を有する本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の塩をいう。本発明の抗体‐抗体薬物複合化合物は、少なくとも１つのアミノ基を含有していて、酸と塩を形成することができる。薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。
【００５４】
「溶媒和物」とは、１以上の溶媒和分子と本発明のリガンド‐薬物カップリング化合物から得られた薬学的に許容される溶媒和物をいう。溶媒分子の例としては、限定されないが、水、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、DMSO、酢酸エチルが挙げられる。
【００５５】
「リガンド」とは、標的細胞に結合した抗原またはレセプターを認識し、それに結合できる巨大分子化合物をいう。リガンドの役割は、リガンドに結合した標的細胞群に薬物を届けることである。そのようなリガンドとしては、これらに限定されないが、タンパク質ホルモン、レクチン、増殖因子、抗体または細胞に結合する他の分子が挙げられる。本発明の実施態様において、リガンドはPCとして表され、好ましくは抗体であり、リガンドはリガンド上のヘテロ原子によりリンカーと結合を形成できる。
【００５６】
「リガンド薬物複合体」とは、化学的に安定なリンカー化合物によって生物活性細胞毒に結合したリガンドをいう。本発明の実施態様において、リガンドは、好ましくは抗体であり、「リガンド薬物複合体」は、好ましくは抗体薬物複合体（ADC）であって、化学的に安定なリンカー化合物によってモノクローナル抗体または抗体フラグメントを生物活性細胞毒に結合したものをいう。
【００５７】
「抗原またはレセプター」は、リガンドにより特定され、標的細胞に結合する。本発明における好ましいリガンドは、癌などの増殖性疾患の標的細胞及び/または組織に発現する細胞表面抗原またはレセプターである。細胞表面レセプターの例としては、これらに限定されないが、HER2、HER3、HER4、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、Lewis Y、CD56、CD105、VEGFRまたはGPNMBの細胞表面レセプターから選択され；最も好ましくは、HER2またはEGFRの細胞表面レセプターから選択される。具体的な好ましい例としては、これらに限られないが、HER2標的に特異的に結合するトラスツズマブ；またはHER2標的に特異的に結合するペルツズマブ; またはEGFR標的に特異的に結合するニモツズマブが挙げられる。
【００５８】
「抗体」とは、望ましい生物活性を示す抗体のいかなる形態をもいう。従って、それは最も広い意味で、特に、これらに限定されないが、全長の抗体、抗体結合フラグメントまたは誘導体などに用いられる。抗体のソースとしては、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（例、二重特異性抗体）が挙げられる。
【００５９】
「全長の抗体」とは、ジスルフィド結合で架橋した４つのポリペプチド鎖、即ち、ジスルフィド結合により架橋してポリマーを形成している２つの重鎖と２つの軽鎖から成る免疫グロブリン分子（IgMなど）をいう。各重鎖は重鎖可変領域（VH）と重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は３つのドメイン：CH1、CH2及びCH3から成っている。各軽鎖は軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域から成り、軽鎖定常領域は１つのドメイン（CL1）から成っている。VHとVL領域は、さらに相補性決定領域（CDR）と名付けられた超可変領域と、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、相補性決定領域の間に分散した、多くの保存ドメインに分けることができる。
【００６０】
「抗体結合フラグメントまたは誘導体」としては、抗原に特異的に結合して複合体を形成することができる、天然起源の、または酵素的に、合成的に、または遺伝子工学により得られる、いかなるポリペプチドまたは糖タンパクも含まれる。通常、それは少なくとも親抗体の抗原結合領域または可変領域（例、１以上のCDR）の部分を含み、そして少なくとも親抗体の何らかの結合特異性を保持している。「抗体結合フラグメントまたは誘導体」は、抗体から誘導してもよく、例えばタンパク分解や遺伝子組み換え技術（抗体の可変領域及び部分的に定常領域を発現するDNAの操作と発現を含む）などの適当な標準的手法により全長の抗体の転換から誘導してもよい。「抗体結合フラグメントまたは誘導体」としては、これらに限定されないが、(i) Fabフラグメント；(ii) F(ab')2フラグメント；(iii) Fdフラグメント；(iv) Fvフラグメント；(V)単鎖Fv (scFv)；(vi) dAbフラグメント；及び(vii)抗体の超可変領域のアミノ酸残基を模倣する最小認識単位（例、単離した相補性決定領域（CDR））が挙げられる。二価抗体、三価抗体、四価抗体及びマイクロ抗体などの他の改変分子も「抗体結合フラグメントまたは誘導体」の範囲内である。
【００６１】
「Fabフラグメント」は、軽鎖と重鎖の完全なVH及びCH1機能領域から成っている。Fab分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００６２】
「Fc」領域は、抗体のCH1及びCH2ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含んでいる。２つの重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合とCH3ドメインの疎水性効果によって一緒に保たれている。
【００６３】
「Fab'フラグメント」は、軽鎖と重鎖のVH及びCH1機能領域を含み、またCH1とCH2ドメインの間の領域も含んでおり、そのため鎖間のジスルフィド結合が２つのFab'フラグメントの２つの重鎖の間で形成されて、F(ab')2分子を形成することができる。
【００６４】
「F(ab')2フラグメント」は、２つの軽鎖とCH1とCH2ドメインの間の部分的な定常領域を含む２つの重鎖を含有しており、そのため鎖間のジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成できる。それ故、F(ab')2フラグメントは２つの重鎖間の鎖間ジスルフィド結合を介して２つのFab'フラグメントで形成される。
【００６５】
「Fvフラグメント」は、軽鎖または/及び重鎖の可変領域VH機能領域を含む。
【００６６】
「Fc領域」は、IgGのCH2とCH3機能領域に対応し、抗原結合活性は持たないが、抗体分子とエフェクター分子及び細胞の間の相互反応部位である。
【００６７】
「ヒンジ領域」は、抗体のFabとFcフラグメントを結合させるために用いられる。本発明においては、二重特異性融合タンパクをFcフラグメントに結合させるために用いられる。
【００６８】
本発明の抗体は、好ましくは標的細胞上の細胞表面抗原に対する特異的抗体である。具体例としては、限定されないが、次のものである。トラスツズマブ、乳癌の治療用ヒト化抗HER2抗体、はHER2を過剰発現する転移性乳癌の治療に適している。ペルツズマブ、2C4としても知られ、商品名パージェタ、は、組換えヒト化モノクローン抗体であり、HER2に結合することにより腫瘍増殖を減らしてHER2の他のHERレセプターとの二量化をブロックする、「HER二量化阻害剤」として知られる最初のモノクローナル抗体である。ペルツズマブは、HER2を過剰発現または低発現する前立腺癌患者における腫瘍増殖を阻害することを示した。ペルツズマブは、HER2陽性転移性乳癌の治療に米国FDAにより承認された。ニモツズマブは、上皮増殖因子レセプター（EGFR）を標的とするモノクローナル抗体であり、悪性腫瘍を治療するために用いることができるヒト化モノクローナル抗体である。EGFRは、頭部及び頚部癌、肺癌、結腸直腸癌などの種々の固形腫瘍で過剰発現する。
【００６９】
「細胞傷害性薬物」は、腫瘍細胞における正常の増殖を破壊する強力な能力を有する化学分子である。原則として、細胞傷害性薬物は全て十分に高い濃度で腫瘍細胞を死滅させることができるが、特異性が欠けるため、腫瘍細胞を死滅させる一方で、正常細胞のアポトーシスを起こし、重篤な副作用を生じる。本発明の実施態様において、細胞傷害性薬物はD/D1で表される。
【００７０】
本発明における「リンカー」は、Lで表される。それは、共有結合的に一端でリガンドに結合し、他端で細胞傷害性薬物に結合する化学構造フラグメントまたは結合手である。本発明におけるLの構造は、次の通りである:
【化１７】
2018512377.tif 000037
式中、R15, R16, m, nは、式（PC-L’-D）で定義した通りである。
【００７１】
「薬物負荷」とは、式（I）の各リガンドに負荷された細胞傷害性薬物の平均数をいい、抗体数に対する薬物数の比率としても表される。薬物負荷は、リガンド（Pc）当たり１〜８の細胞傷害性薬物（D）の範囲に亘る。本発明の実施態様において、薬物負荷はｙとして表され、カップリング反応後のADC分子当たりの薬物生成物の数は、UV /可視スペクトル、マススペクトル、ELISA法及びHPLC法などの慣用の方法により測定できる。
【００７２】
本発明において、ｙは結合部位の数によって限定してもよい。本発明の実施態様において、細胞傷害性薬物はリンカーを介してリガンドのN末端アミノ及び/またはリジン残基のe-アミノに結合する。典型的には、カップリング反応で抗体に結合した薬物分子の数は理論上の最大数より少ない。
【００７３】
限定されないが、次の方法はリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の負荷量をコントロールするために用いることができる：
（１）結合する試薬のモノクローナル抗体に対するモル比をコントロールする、
（２）反応時間と温度をコントロールする、
（３）異なる反応試薬を選択する。
【００７４】
慣用の医薬組成物の調製は中国薬局方で見ることができる。
【００７５】
本発明の薬物に用いられる「担体」とは、人体に入る薬物の様式と分布、薬物の放出速度を変え、薬物を標的器官へ送達するシステムをいう。薬物担体放出とターゲッティングシステムは、薬物の分解と損失を減らし、副作用を減らし、そしてバイオアベイラビリティを改善することができる。例えば、担体として用いられる高分子界面活性剤は、その特有の両親媒性構造のために自己集合して種々の形態で凝集物を形成する。好ましい例としては、ミセル、マイクロエマルション、ゲル、液晶、小胞などである。これらの凝集物は薬物分子を包み込む能力を有する一方で、膜に対して良い透過性を有し、優れた薬物担体として用いることができる。
【００７６】
「賦形剤」は、医薬製剤にとって主薬以外の補助剤であり、アジュバントとも呼ばれ、例えば、錠剤；準固形製剤の軟膏;クリームのマトリックス部分の粘着剤、賦形剤、崩壊剤または滑沢剤；液体製剤の保存剤、抗酸化剤、香味料、芳香剤、共溶媒、乳化剤、溶解剤、浸透圧調節剤、着色剤などである。
【００７７】
「希釈剤」は、フィラーとしても知られ、主に錠剤の重量と容積を増やすことを目的としている。希釈剤の添加は一定の容積を確実にするのみならず、主成分の用量逸脱を減らし、薬物の圧縮成形性を改善する。錠剤が油性成分を含んでいる場合、吸収剤を油性物質に添加して、「ドライ」状態を維持し、錠剤の成形を容易にする。デンプン、乳糖、カルシウムの無機塩、結晶セルロースなどである。
【００７８】
医薬組成物は無菌の注射用水溶液の形態であってもよい。用いることができる許容される溶剤及び溶媒としては、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。無菌の注射用製剤は、活性成分が油相に溶解している無菌の注射用水中油型マイクロエマルションでもよい。例えば、活性成分をまず大豆油とレシチンの混合物に溶解し、次いで、オイル溶液を水とグリセリン溶液の混合物に加え、マイクロエマルションを形成する。注射溶液またはマイクロエマルションは局所大量注射により患者の血流中に注入してもよい。または、注射溶液またはマイクロエマルションを本発明化合物の一定の循環濃度を維持する方法で投与するのも有利である。そのような一定の濃度を維持するために、継続的な静脈内輸送デバイスが用いられる。そのようなデバイスの例はDeltec CADD-PLUS. TM. 5400静脈注射ポンプである。
【００７９】
医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与用の無菌の注射用水またはオイル懸濁液の形態でもよい。そのような懸濁液は、公知技術に従い、上記の適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いて製剤化できる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒で調製した無菌注射用溶液または懸濁液、例えば1,3-ブタンジオール中で調製した溶液であってもよい。さらに、無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒体として用いることができる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどのブレンドした不揮発性オイルを用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸もまた注射剤の製造に用いることができる。
【００８０】
「還元剤」は、酸化還元反応において電子を失うまたは電子の偏向を有する物質である。広い意味で還元剤は還元特性を持ち酸化される抗酸化剤であり、その生成物は酸化生成物と呼ばれる。本発明の実施態様において、還元剤はRAとして表され、例としては、これらに限定されないが、H2、C、CO、Fe、Zn、アルカリ金属（一般にLi、Na、Kで用いられる）、他の活性金属（Mg、Al、Ca、Laなど）、SnCl2、シュウ酸、KBH4、NaBH4、NaCNBH3、 (CH3COO)3BHNa、LiAlH4、ジ亜リン酸、ジ亜リン酸ナトリウム、Na2S2O3が挙げられる。本発明の好ましい還元剤はNaCNBH3または(CH3COO)3BHNaである。
【００８１】
「メルカプト保護基」とは、メルカプト基を保護し、反応の最後に除去できる基をいい、従ってメルカプト基と他の基の両方を含む化学分子が関与する場合、反応は意図する位置でのみ起こり、メルカプト基は関与しない。本発明の実施態様において、メルカプト保護基はTとして表され、その例としては、これらに限定されないが、-tert-ブチル、-アセチル、-n-プロピオニル、-イソプロパノイル、-トリフェニルメチル、-メトキシメチル、-2-(トリメチルシリル)エトキシメチルが挙げられる。本発明の好ましいメルカプト保護基はアセチルである。
【００８２】
本発明の合成方法
本発明の合成の目的を達成するために、以下の合成スキームを採用した。
スキーム１
本発明による式（PC-L-DR）の化合物を製造するための方法は：
【化１８】
2018512377.tif 000038
を含む。
【００８３】
スキーム２
本発明による式（PC-L-DR1）の化合物を製造するための方法は：
【化１９】
2018512377.tif 000039
を含む。
式（PC-L2）の化合物をアセトニトリル溶液中で式（L1-D1）の化合物と反応させる。式（PC-L-DR）の化合物がSephadex G25ゲルカラムによる脱塩精製後に得られる；
式中、PC, m, n, y, R2〜R16は、式（PC-L-DR）で定義した通りである。
【００８４】
発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、実施例は発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
実施例で特定されていない条件は、当該技術分野における通常の条件または製品製造者による原料物質の推奨条件である。示されていない試薬については、市販の慣用試薬である。
【実施例】
【００８５】
化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び/またはマススペクトル（ＭＳ）によって同定した。ＮＭＲのケミカルシフト（δ）は１０−６（ｐｐｍ）で示した。ＮＭＲはBruker AVANCE-400で測定した。溶媒は重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）及び重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）で、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。
ＭＳは、FINNIGAN LCQAd (ESI)マススペクトロメータ（製造者：Thermo、型：Finnigan LCQ advantage MAX）で測定した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Agilent 1200DAD高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター（Sunfire C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム）及びWaters 2695-2996 高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター（Gimini C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム）で測定した。
キナーゼの平均阻害率及びIC50値は、NovoStar ELISA (BMG Co., Germany) で測定した。
薄層シリカゲルクロマトグラフィー（TLC）については、Yantai Huanghai HSGF254またはQingdao GF254シリカゲルプレートを用いた。ＴＬＣに用いたシリカゲルプレートの厚さは０．１５ｍｍ〜０．２ｍｍで、生成物の精製に用いたシリカゲルプレートの厚さは０．４ｍｍ〜０．５ｍｍである。
カラムクロマトグラフィーでは、担体としてYantai Huanghai 200〜300メッシュシリカゲルを用いた。
本発明の公知の原料物質は、技術分野で慣用の合成方法により調製するか、またはABCR GmbH & Co. KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、またはDari Chemical Companyなどから購入できる。
特に明示しない限り、全ての反応は、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下で行った。
用語「窒素雰囲気」または「アルゴン雰囲気」は、反応フラスコが１Ｌの窒素またはアルゴンの風船を備えていたことをいう。
特に明記しない限り、反応で用いた溶液は水溶液をいう。
特に明示しない限り、反応における反応温度は室温をいう。室温は、２０℃〜３０℃の範囲にある最適の。反応温度である。
反応におけるpH = 6.5のPBSバッファーの調製：KH2PO4 8.5g, K2HPO4.3H2O 8.56g, NaCl 5.85g, EDTA 1.5gを２Lのボトルにセットし、次いで超音波処理に付してバッファーを得た。
反応におけるpH = 4.5の酢酸/酢酸ナトリウムバッファーの調製：無水酢酸ナトリウム9gをボトルに入れ、精製水を加えて２Lにし、次いで無水酢酸ナトリウム4.9 mLを加えて撹拌し、バッファーを得た。
反応におけるpH = 7.0のリン酸バッファーの調製：0.2M NaH2PO4 39mLを0.2M  Na2HPO4 61mLに加えて撹拌し、pH = 7の0.2Mバッファーを得た。
反応過程は薄層クロマトグラフィー（TLC）でモニターし、そして溶出系としては：A：ジクロロメタンとメタノール、B：ｎ−ヘキサンと酢酸エチル、C：石油エーテルと酢酸エチル、D：アセトンが挙げられる。溶媒の容積比は化合物の極性に従って調節した。
カラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーによる化合物精製のため溶出系としては：Ａ：ジクロロメタンとメタノール、Ｂ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチル、Ｃ：ジクロロメタンとアセトン、Ｄ：酢酸エチルとジクロロメタン、Ｅ：酢酸エチルとジクロロメタンとｎ−ヘキサン，Ｆ：酢酸エチルとジクロロメタンとアセトンが挙げられる。溶媒の容積は化合物の極性により調節し、そしてときには、トリエチルアミンなどの少量のアルカリ試薬または酸性試薬も添加した。
本発明の化合物の構造の幾つかはQ-TOF LC/MSにより測定した。Q-TOF LC/MSには、Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole - Time of Flight Mass Spectrometer 及び Agilent 1290-Infinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5μm, 2.1 X 75mm Column)が用いられた。
本発明の公知の出発物質は、先行技術で公知の方法を採用または用いることにより合成されるが、特定の条件が示されていない以下の実施例における実験方法は慣用の条件または製品製造者が推奨する条件に従って実施する。特定の供給源が示されていない実験試薬は、一般に市場から購入される慣用の試薬である。
【００８６】
１．中間体としての抗体の調製
以下の抗体を慣用の方法：例えば、ベクター作成、HEK293細胞トランスフェクション(Life Technologies Cat. No. 11625019)、精製及び発現に従って調製した。
抗体の配列
（１）ペルツズマブ、特異的に標的HER2に結合できる：
軽鎖の配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC                      
配列番号1
重鎖の配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  
配列番号2
【００８７】
（２）ニモツズマブ、特異的に標的EGFRに結合できる：
軽鎖の配列：
Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqnivhsngntyldwyqqtpgkapklliykvsnrfsgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycfqyshvpwtfgqgtklqitrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
配列番号3
重鎖の配列：
Qvqlqqsgaevkkpgssvkvsckasgytftnyyiywvrqapgqglewigginptsggsnfnekfktrvtitadessttaymelsslrsedtafyfctrqglwfdsdgrgfdfwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
配列番号4
【００８８】
（３）トラスツズマブ、特異的に標的HER2に結合できる：
軽鎖の配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号5
重鎖の配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号6
【００８９】
２．薬物、薬物リンカー、リガンド薬物複合体（ADC）の調製
【実施例１】
【００９０】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000040
工程 1
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
アルゴン雰囲気下で(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(1.96 g, 9.26 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(50), 15512-15520”に従って調製)を25 mLのジクロロメタンに溶解し、0℃まで冷却した。この反応溶液にトリエチルアミン(1.49 mL, 10.93 mmol)を加え、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(9.7 mL, 9.72 mmol)を滴下した後、0℃で50分間撹拌した。得られた混合物をドライアイス-アセトン浴の中で-75℃まで冷却した後、(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-ホルミル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1a (2.16 g, 9.26 mmol, 既知の方法“US20100249190”に従って調製)のジクロロメタン溶液7 mLを加え、-75℃で1.5時間、そして0℃で2時間、更に室温で1時間それぞれ撹拌した。反応混合物にリン酸塩緩衝液(pH 7.0)及びメタノールの混合物(V/V=1:3)36 mLを加えた後、0℃でメタノール及び(30%)過酸化水素の混合液(V/V=2:1)36 mLを加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、有機層を除去した。残渣に少量の水を加え、エーテル(50 mL x 3)で抽出し、5%重炭酸ナトリウム溶液及び塩化ナトリウムの飽和溶液(150 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1c(2.4 g, 白色の泡沫状固体)を収率58.5%で得た。
MS m/z (ESI): 345.1 [M-100+1]
工程2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-(1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1c(1.4 g, 3.15 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、粉砕した分子篩1.4 gを加えた。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(1.75 g, 8.19 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボロン(1.16 g, 7.87 mmol)を加えた。反応混合物を暗所に置き、室温で40時間撹拌した。反応終了後、反応混合物をろ過し、ろ過ケーキを塩化メチレンで洗浄した。合わせたろ液を塩化アンモニウムの飽和溶液(50 mL x 4)で洗浄し、過剰の1,8-ビスジメチルアミノナフタレンを除去し、塩化ナトリウムの飽和溶液(120 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1d(400 mg, 白色固体)を収率27.8%で得た。
MS m/z (ESI): 459.4 [M+1]
工程3
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
アルゴン雰囲気下で(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1d(400 mg, 0.87 mmol)をテトラヒドロフラン24 mLに溶解し、0℃まで冷却した。30%過酸化水素(0.34 mL/0.38 g, 3.31 mmol)をゆっくり滴下した後、水酸化リチウム一水和物(62 mg, 1.48 mmol)を加えた。この反応混合物は室温で20時間反応した。反応溶液に亜硫酸ナトリウム固体(440 mg, 3.48 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。そして、水10 mLを加え、有機層を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン(40 mL x 2)で抽出した。氷浴中で分離した水層に2N塩酸を滴下し、溶液のpHを3〜4とした。そして、水層を酢酸エチル(25 mL x 3)で抽出し、合わせた酢酸エチル層を水(50 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(50 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下でろ液を濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(230 mg, 無色の液体)を収率88.0%で得た。
MS m/z (ESI): 200.1 [M-100+1]
工程4
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(100 mg, 0.334 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1) 6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(73.9 mg, 0.334 mmol, 既知の方法“Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17(4), 603-606”に従って調製)を加えた後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.29 mL, 67 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(152.3 mg, 0.40 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、攪拌しながら水10 mLを加えた。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1g(140 mg, 無色の粘稠性液体)を収率83.7%で得た。
MS m/z (ESI): 503.3 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1g(140 mg, 0.28 mmol)をジオキサン溶液2 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.15 mL, 0.835 mmol)を加えた。反応系を密封した後、室温で8時間撹拌し、0℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応後、ジクロロメタン3 mL、水3 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液3 mLを順次に加え、10分間撹拌した。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL × 2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1h(86 mg, 黄色固体)を収率76.7%で得た。
MS m/z (ESI): 403.4 [M+1]
工程6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1h (86 mg, 0.213 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(136 mg, 0.213 mmol, 既知の方法“WO 2013072813”に従って調製)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.19 mL, 1.065 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートヘキサフルオロリン酸塩(97.4 mg, 0.256 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、水20 mLを加えた。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液 (20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14−オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1j(120 mg, 白色の泡沫状固体)を収率54.9%で得た。
MS m/z (ESI): 1023.1 [M+1]
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1j(120 mg, 0.117 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応液を室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1kの粗製品(124 mg, 黄色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 801.5 [M+1].
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1kの粗製品(90 mg, 0.112 mmol)をジオキサン1 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(3 mL)を加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸1(19 mg, 白色固体)を収率22.7%で得た。
MS m/z (ESI): 744.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.34-7.21(m, 5H), 4.76-4.70(m, 2H), 4.26-4.19 (m, 1H), 4.14-4.06(m, 1H), 3.91-3.86(m, 1H), 3.85-3.77(m, 1H), 3.75-3.56(m, 2H), 3.44-3.10(m, 9H), 2.98-2.83(m, 1H), 2.71-2.57(m, 4H), 2.26-1.99(m, 4H), 1.92-1.77 (m, 1H), 1.75-1.58(m, 2H), 1.49-1.27(m,4H),1.21-0.95(m, 18H), 0.93-0.79(m, 4H), 0.76-0.61(m, 1H).
【実施例２】
【００９１】
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000041
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパン酸2a(400 mg, 2.0 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 1940, 62, 565-8”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解し、過塩素酸(428 mg (70%), 3.00 mmol)を加えて、室温で16時間撹拌した。得られた混合物に水6 mLを加え、有機層を重炭酸ナトリウムの飽和溶液(3 mL)で洗浄した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水(3 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2b(400 mg, 白色固体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(110 mg, 0.367 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2b(94 mg, 0.367 mmol), N,N-ジイソプロピルエチルアミンの粗製品(0.32 mL, 1.835 mmol)及び2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(168 mg, 0.44 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1.5時間攪拌し、攪拌しながら水10 mLを加えた。有機層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を洗浄し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート2c(112 mg, 白色の泡沫状固体)を収率56.8%で得た。
MS m/z (ESI): 537.3 [M+1]
工程3
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート2c(110 mg, 0.205 mmol)をジオキサン2 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.13 mL, 0.717 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、0℃の冷蔵庫に6時間放置した。その後、反応混合物に塩化メチレン5 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液10 mLを加え、10分間撹拌した。水層をジクロロメタン5 mLで抽出した。合わせた塩化メチレン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2d(99 mg, 黄色の液体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 437.2 [M+1]
工程4
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2dの粗製品(99 mg, 0.226 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (144.4 mg, 0.226 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.2 mL, 1.13 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(103.3 mg, 0.271 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、攪拌しながら水10 mLを加えた。塩化メチレン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2e(127mg, 白色の泡沫状固体)を収率53.1%で得た。
MS m/z (ESI): 1056.4 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2e(127 mg, 0.12 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解した後、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。その後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート2fの粗製品(130 mg, 黄色の粘稠性物質)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 834.5 [M+1]
工程 6
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート2fの粗製品(100 mg, 0.12 mmol)をジオキサン1 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で12時間攪拌した。そして、反応溶液を減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸2(35 mg, 白色固体)を収率35.7%で得た。
MS m/z (ESI): 778.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.41-7.32(m, 2H), 7.31-7.16(m, 2H), 4.80-4.65(m, 2H), 4.22-4.13 (m, 1H), 4.10-4.03(m, 1H), 3.98-3.91(m, 1H), 3.87-3.82(m, 1H), 3.73-3.63(m, 2H), 3.47-3.12(m, 9H), 3.09-3.01(m, 1H), 2.67-2.57(m, 4H), 2.24-2.11 (m, 3H), 2.09-1.98(m, 1H), 1.89-1.67(m, 3H), 1.51-1.25 (m, 4H), 1.20-0.93(m, 18H), 0.92-0.79(m, 4H), 0.75-0.66(m, 1H).
【実施例３】
【００９２】
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000042
工程1
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(0.992 g, 4.2 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。反応混合物にトリエチルアミン(0.69 mL, 4.96 mmol)を加えた後、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(4.4 mL, 4.4 mmol)を滴下した。この混合物を0℃で50分間攪拌した。反応溶液を-75℃まで冷却し、(2S,5S)-tert-ブチル2-ホルミル-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3a(900 mg, 4.2 mmol, 既知の方法“US 20120195857”に従って調製)の塩化メチレン溶液5 mLを加えた。そして、-75℃で1.5時間、0℃で1.5時間、更に室温で1時間それぞれ攪拌した。その後、室温で反応混合物にリン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3)36 mLを加えた。反応混合物を0℃まで冷却し、メタノール及び(30%)過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)36 mLを加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、合わせたエーテル層を5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液(150 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 白色固体)を収率33%で得た。
工程2
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 1.34 mmol)を塩化メチレン15 mLに溶解し、粉砕した分子篩1 gを加えた。アルゴン雰囲気下及び0oCでこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(740 mg, 3.45 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(500 mg, 3.38 mmol)を加えた。反応混合物を錫箔で包み、室温で38時間撹拌した。反応終了後、得られた混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL × 3)で洗浄し、過剰の1,8-ビス-ジメチルアミノナフタレンを除去した後、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 白色固体)を収率32%で得た。
工程3
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(2S、5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 0.43 mmol)をテトラヒドロフラン22 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。この混合物に過酸化水素(186 mg, 1.6 mmol)及び水酸化リチウム一水和物(58 mg, 1.37 mmol)をゆっくり滴下した。0℃で反応混合物を10分間攪拌した後、氷浴を除き、室温で更に44時間攪拌した。反応終了後、反応溶液に亜硫酸ナトリウム固体(220 mg, 1.74 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した後、水15 mLを加えた。有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン(20 mL × 2)で抽出した。水層に2N 塩酸を滴下し、pHを3〜4にした。その後、酢酸エチル(20 mL × 3)で抽出し、酢酸エチル層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(120 mg, 白色固体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(106 mg, 0.35 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(80 mg, 0.36 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.30 mL, 1.74 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(160 mg, 0.42 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水(5 mL × 2)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(138 mg, 無色の粘稠性液体)を収率78%で得た。
工程5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(150 mg, 0.267 mmol)をジオキサン2.2 mLに溶解した後、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.160 mL, 0.896 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で7時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に16時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣にジクロロメタン15 mLを加え、0℃まで冷却し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8に調整した。水層をジクロロメタン(8 mL × 2)で抽出し、有機層を合わせた。有機層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 無色の粘稠性固体)を収率74%で得た。
工程6
(S)-tert-ブチル2((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 0.198 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(136 mg, 0.213 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.170 mL, 0.98 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(100 mg, 0.263 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン15 mLを加え、水(6 mL × 2)で洗浄した。水層をジクロロメタン(5 mL)で抽出し、合わせたジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(168 mg, 白色の泡沫状固体)を収率81%で得た。
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(167 mg, 0.16 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(180 mg, 黄色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 802.6 [M+1]
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(130 mg, 0.16 mmol)をジオキサン1 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸3(28 mg, 白色固体)を収率23%で得た。
MS m/z (ESI): 746.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.14(m, 5H), 4.79-4.67(m, 2H), 4.25-4.13 (m, 1H), 4.10-3.97(m, 2H), 3.77-3.66(m, 1H), 3.60-3.52(m, 1H), 3.51-3.42(m, 1H), 3.41-3.12(m, 7H), 2.97-2.85(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.48-2.40(m, 2H), 2.30-2.02(m, 4H), 1.93-1.73(m, 2H), 1.70-1.55(m, 1H), 1.53-1.28(m, 5H),1.26-1.11(m, 7H), 1.10-0.99(m, 14H), 0.98-0.83(m, 4H).
【実施例４】
【００９３】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000043
工程1
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(1.5 g, 7.10 mmol, 既知の方法“Journal of Medcinal Chemistry, 2013, 56(24) 9955-9968”に従って調製)にN,N-ジメチルホルムアミド1滴を加え、これをドライアイス浴の中で冷却した後、アルゴン雰囲気下で激しく攪拌しながら塩化オキサリル15 mLを滴下した。そして、反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解し、減圧下で濃縮し、標記生成物6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bの粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程2
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸1(17 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(20 μL, 0.115 mmol)を加えた。そして、アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(7.9 mg, 0.034 mmol)を滴下し、室温で5時間攪拌した。反応終了後、メタノール10 mLを加え、反応混合物を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸4(9 mg, 白色固体)を収率42%で得た。
MS m/z (ESI): 937.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.37-7.17(m, 5H), 6.84-6.79(m, 2H), 4.80-4.71(m, 2H), 4.69-4.56(m, 2H), 4.26-4.19(m, 1H), 4.14-4.07(m, 1H), 3.92-3.86(m, 1H), 3.84-3.78(m, 1H), 3.77-3.60(m, 1H), 3.55-3.47(m, 2H), 3.42-3.23(m, 5H), 3.18-3.12 (m, 2H), 3.07-3.03(m, 2H), 3.02-2.82(m, 2H), 2.66-2.58(m, 2H), 2.54-2.46(m, 1H), 2.46-2.38(m, 2H), 2.30-2.14(m, 2H), 2.09-1.99(m, 1H), 1.90-1.78(m, 1H), 1.75-1.56 (m, 6H),1.48-1.28(m, 6H), 1.20-0.79(m, 22H), 0.77-0.69(m,1H).
【実施例５】
【００９４】
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000044
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸2(18 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.02 mL, 0.115 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(7.9 mg, 0.034 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した後、室温で4時間攪拌した。メタノール5 mLで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸5(6 mg, 白色固体)を収率26.6%で得た。
MS m/z (ESI): 971.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.42-7.34(m, 2H), 7.33-7.19(m, 2H), 6.83-6.78(m, 2H), 4.83-4.70(m, 2H), 4.68-4.56 (m, 2H), 4.24-4.16(m, 1H), 4.13-4.05(m, 1H), 4.03-3.95(m, 1H), 3.91-3.84(m, 1H), 3.76-3.65(m, 1H), 3.54-3.48(m, 2H), 3.47-3.18(m, 5H), 3.17-2.96(m, 6H), 2.67-2.58(m, 2H), 2.53-2.38(m, 3H), 2.28-2.18(m, 2H), 2.09-2.00(m, 1H), 1.92-1.57(m, 7H), 1.51-1.28(m, 6H), 1.21-0.82(m, 22H), 0.78-0.69(m, 1H).
【実施例６】
【００９５】
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000045
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸3(18 mg, 0.024 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.02 mL, 0.12 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(8.3 mg, 0.036 mmol)を滴下した。この反応混合物を室温で4時間攪拌した。メタノール5 mLで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-(5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸6(7 mg, 白色固体)を収率30.9%で得た。
MS m/z (ESI): 939.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.30-7.15(m, 5H), 6.83-6.78(m, 2H), 4.78-4.69(m, 2H), 4.69-4.56 (m, 2H), 4.24-4.12(m, 1H), 4.10-3.96(m, 2H), 3.60-3.44(m, 3H), 3.41-3.22(m, 4H), 3.16-3.10(m, 2H), 3.07-3.02(m, 2H), 3.01-2.86(m, 2H), 2.52-2.38(m, 4H), 2.31-2.15(m, 3H), 2.09-1.99(m, 1H), 1.91-1.77(m, 2H), 1.71-1.56(m, 5H), 1.52-1.28(m, 9H), 1.26-1.14(m, 6H), 1.11-0.77(m,18H).
【実施例７】
【００９６】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000046
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7a(400 mg, 2.18 mmol, 既知の方法“Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17) 3327-3332”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解し、過塩素酸(300 mg(70%), 3.3 mmol)を加えた。この混合物を室温で16時間攪拌した。反応後、水6 mLを加え、有機層を重炭酸ナトリウムの飽和溶液(3 mL)で洗浄した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水(3 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7bの粗製品(390 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程 2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(100 mg, 0.334 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7bの粗製品(80 mg, 0.334 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.29 mL, 1.67 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(152.3 mg, 0.40 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、攪拌しながら反応混合物に水10 mLを加え、ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液 (10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート7c(173 mg, 無色の液体)を収率99.5%で得た。
MS m/z (ESI): 521.2 [M+1] 
工程 3
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート7c(173 mg, 0.33 mmol)をジオキサン2 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.21 mL, 1.16 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を室温で1時間攪拌した後、0℃の冷蔵庫に12時間放置した。そして、反応溶液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン5 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液10 mLを加え、10分間撹拌した。水層をジクロロメタン(5 mL × 3)で抽出した。合わせたジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7d(77 mg, 黄色の液体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 421.2 [M+1]
工程 4
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S))-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7dの粗製品(77 mg, 0.183 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (116.8 mg, 0.183 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.16 mL, 0.915 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート (84 mg, 0.22 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。そして反応混合物に水6 mLを加え、ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S))-sec-ブチル）-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7e(190.5 mg, 黄色の粘稠性物質)を収率100%で得た。
MS m/z (ESI): 1040.6 [M+1]
工程 5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7e(190.5 mg, 0.183 mmol)をジクロロメタン1.5 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7fの粗製品(150 mg, 黄色の粘稠性物質)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 818.5 [M+1]
工程 6
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7fの粗製品(150 mg, 0.183 mmol)をジオキサン1 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で得られた混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、残留した溶媒を回転法によりエチルエーテルでコーティングした。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸7 (28 mg, 白色固体)を収率20%で得た。
MS m/z (ESI): 762.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.38-7.18(m, 2H), 7.13-7.01(m, 2H), 4.80-4.67(m, 2H), 4.30-4.15(m, 1H), 4.13-4.01(m, 1H), 3.96-3.83(m, 2H), 3.75-3.60(m, 2H), 3.42-3.11(m, 9H), 3.06-2.95(m, 1H), 2.70-2.58(m, 4H), 2.28-2.01 (m, 4H), 1.88-1.70(m, 3H), 1.57-1.25 (m, 4H), 1.22-0.95(m, 18H), 0.92-0.80(m, 4H), 0.78-0.65(m, 1H).
【実施例８】
【００９７】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000047
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸7(25 mg, 0.033 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.029 mL, 0.164 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴の中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(11.3 mg, 0.049 mmol)を滴下し、室温で3時間攪拌した。反応混合物に水5 mLを加え、20分間撹拌した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸8(7 mg, 黄色の粘稠性物質)を収率22.4%で得た。
MS m/z (ESI): 955.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.36-7.30(m, 1H), 7.29-7.21(m, 1H), 7.17-7.02(m, 2H), 6.83-6.79(m, 2H), 4.81-4.71(m, 2H), 4.69-4.55 (m, 2H), 4.25-4.15(m, 1H), 4.13-4.04(m, 1H), 3.96-3.85(m, 2H), 3.70-3.61(m, 1H), 3.55-3.46(m, 3H), 3.40-3.21 (m, 4H), 3.18-3.10(m, 2H), 3.07-2.96(m, 4H), 2.67-2.56(m, 2H), 2.54-2.34(m, 3H), 2.29-2.17(m, 2H), 2.10-1.99(m, 1H), 1.89-1.57(m, 7H), 1.52-1.28(m, 6H), 1.21-1.11 (m, 4H), 1.07-0.96(m, 6H), 0.95-0.81(m, 12H), 0.80-0.69(m, 1H).
【実施例９】
【００９８】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000048
工程1
(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-(ヒドロキシメチル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9a(1.32 g, 6.19 mmol, 既知の方法“From Journal of Organic Chemistry, 2003, 68(10), 3923-3931”に従って調製)をジクロロメタン15 mLに溶解し、0℃まで冷却した。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.38 mL, 30.9 mmol)、ジメチルスルホキシド(7.26 g, 92.9 mmol)及び三酸化硫黄-ピリジン複合体(7.26 g, 92.9 mmol)を加え、0℃で3時間撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7)で反応を急冷し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9b(1.1 g, 薄黄色の液体)を収率84.2%で得た。
工程2
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-(5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(1.43 g, 6.15 mmol)をジクロロメタン30 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。この溶液にトリエチルアミン(0.98 mL, 7.08 mmol)及びジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(6.65 mL, 6.65 Mmol)を滴下した後、0℃で50分間攪拌した。反応混合物を-78℃まで冷却し、用時調製された(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9b(1.43 g, 6.15 mmol)のジクロロメタン溶液を加えた。そして、この混合物を-78℃で2時間、0℃で1時間、更に室温で1時間それぞれ攪拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7)及びメタノールの混合物(V/V = 3: 1)36 mLで反応混合物を急冷した後、0℃でメタノール及び過酸化水素(V/V = 1: 2)の混合物を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、メタノール及び有機層を除去した。残留した水層を塩化メチレンで抽出し、有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-(5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9c(810 mg, 白色の泡沫状固体)を収率30%で得た。
MS m/z (ESI): 354.2 [M-100+1]
工程3
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9c(810 mg, 1.82 mmol)をジクロロメタン15 mLに溶解し、粉砕した分子篩、炭酸カリウム(1.25 g, 9.11 mmol)及びメチルトリフルオロメタンスルホネート(897.7 mg, 5.47 mmol)を加えた。そして、この混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9d(280 mg, 白色の泡沫状固体)を収率33.5%で得た。
MS m/z (ESI): 359.2 [M-100+1]
工程4
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9d(400 mg, 0.87 mmol)をテトラヒドロフラン20 mLに溶解し、水酸化リチウム一水和物(62.2 mg, 1.484 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を0℃まで冷却した後、30%過酸化水素(112.7 mg, 3.31 mmol)を滴下した。この混合物を室温で12時間反応させた。反応終了後、亜硫酸ナトリウム(416 mg, 3.3 mmol)を反応溶液に加えた。この混合物を室温で1時間攪拌した。テトラヒドロフランを減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出した。薄い塩酸で水層を希釈し、pHを3〜4に調整した後、ジクロロメタン(30 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸9eの粗製品(230 mg, 無色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 298.2 [M-1]
工程5
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸9e(220 mg, 0.735 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(178.8 mg, 0.809 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.51 mL, 2.94 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(363 mg, 0.956 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9f(271 mg, 白色固体)を収率66%で得た。
MS m/z (ESI): 503.3 [M+1]
工程 6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9f(270 mg, 0.537 mmol)を1,4-ジオキサン4 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.335 mL, 1.881 mmol)を加えた。室温でこの混合物を1時間撹拌し、0〜4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を加え、pHを8〜9に調整した。水層を塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9gの粗製品(210 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 403.4 [M+1]
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9gの粗製品(210 mg, 0.521 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (365.9 mg, 0.547 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.4537 mL, 2.609 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(257.8 mg, 0.678 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9h(345 mg, 白色の泡沫状固体)を収率64.7%で得た。
MS m/z (ESI): 1022.5 [M+1]
工程8
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9h(345 mg, 0.337 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9iの粗製品(375 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 800.5 [M+1]
工程9
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9iの粗製品(370 mg, 0.462mmol)に4M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。この反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸9(30 mg, 白色固体)を収率11.9%で得た。
MS m/z (ESI): 744.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 10.57(s, 1H), 10.00(s, 1H), 8.41-8.26(m, 2H), 7.52-6.99(m, 5H), 5.34(s, 1H), 5.02-4.95(m, 4H), 4.38-4.33(m, 2H), 4.16(m, 2H), 3.93-3.75(m, 3H), 3.49-3.07(m, 6H), 2.94-2.32(m, 16H), 2.30-2.01(m, 4H), 1.75-1.65(m, 2H), 1.32-0.83(m, 16H).
【実施例１０】
【００９９】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000049
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸9(22 mg, 0.0295 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(19 mg, 0.1479 mmol)を加えた。この混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(10.1 mg, 0.0443 mmol)を滴下した。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2.5時間攪拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸10(1.3 mg, 白色の粘着性物質)を収率4.6%で得た。
MS m/z (ESI): 937.9 [M+1]
【実施例１１】
【０１００】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000050
工程1
(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル6-(ヒドロキシメチル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11a(2.37 g, 10.4 mmol, 既知の方法“Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23(9), 2653-2658”に従って調製)をジクロロメタン40 mLに溶解し、0℃まで冷却した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10.8 mL, 62.5 mmol)、ジメチルスルホキシド(12.2 g, 156.4 mmol)及び三酸化硫黄-ピリジン複合体(6.63 g, 41.7 mmol)を加えた。反応混合物を0℃で3時間攪拌した。反応終了後、リン酸塩緩衝液(pH = 7)を加え、反応混合物を急冷し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11b(2 g, 黄色の液体)を収率88%で得た。
工程2
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(2 g, 8.88 mmol)をジクロロメタン35 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下でトリエチルアミン(1.42 mL, 10.2 mmol)を滴下した。この混合物を0℃まで冷却し、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(9.59 mL, 9.59 mmol)を滴下した後、0℃で50分間攪拌した。78℃で用時調製された(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11bのジクロロメタン溶液(2 g, 8.88 mmol)を加え、-78℃で2時間、0℃で1時間、更に室温で1時間それぞれ撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 3: 1)を加え、反応混合物を急冷した。0℃でメタノール及び過酸化水素の混合物(V/V = 1: 2)を加え、混合物を室温で1時間攪拌した。減圧下で濃縮した後、残渣を水に溶解し、塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11c(1.8g, 白色の泡沫状固体)を収率44.2%で得た。
MS m/z (ESI): 459.4 [M+1]
工程3
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11c(1.8 g, 3.92 mmol)をジクロロメタン30 mLに溶解し、粉砕した分子篩を加えた。アルゴン雰囲気下で炭酸カリウム(3.78 g, 27.48 mmol)及びメチルトリフルオロメタンスルホネート(3.22 g, 19.64 mmol)を加え、反応混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。溶出系Aを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11d(930 mg, 無色の油)を収率50.2%で得た。
MS m/z (ESI): 473.4 [M+1]
工程4
(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11d(1.03 g,  2.8 mmol)をテトラヒドロフラン20 mLに溶解し、水酸化リチウム一水和物(155 mg, 3.7 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で30% 過酸化水素(939 mg, 8.28 mmol)を滴下した。室温で反応混合物を12時間攪拌した。反応終了後、亜硫酸ナトリウム(1.04 g, 8.28 mmol)を反応溶液に加え、室温でこの混合物を1時間攪拌した。テトラヒドロフランを減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出した。水層を薄い塩酸で希釈し、pHを3〜4に調整した後、ジクロロメタン(30 mL x 5)で抽出した。合わせた有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11eの粗製品(700 mg, 無色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 314.4 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11eの粗製品(350 mg, 1.117 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7b(267 mg, 1.117 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(720 mg, 5.587 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(509.8 mg, 1.341 mmol)を加えた後、室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11f(570 mg, 無色の油)を収率95.3%で得た。
MS m/z (ESI): 535.3 [M+1]
工程 6
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11f(570 mg, 1.049 mmol)を1,4-ジオキサン8 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.749 mL, 4.196 mmol)を加えた。室温でこの混合物を1時間撹拌し、0〜4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整し、水層を塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート11gの粗製品(440 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 435.4 [M+1]
工程 7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート11gの粗製品(440 mg, 1.013 mmol)、(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(645.8 mg, 1.013 mmol)をジクロロメタン10 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.88 mL, 5.06 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(500.5 mg, 1.317 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11h(570 mg, 白色固体)を収率53.4%で得た。
MS m/z (ESI): 1054.9 [M+1]
工程 8
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11h(560 mg, 0.531 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン6 mLを加えた。この混合物を室温で2.5時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11i(550 mg, 白色の粘着性物質)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 832.5 [M+1]
工程9
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11iの粗製品(450 mg, 0.541 mmol)に4M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸11(403 mg, 白色固体)を収率96%で得た。
MS m/z (ESI): 776.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.30-7.22(m, 2H), 7.12-7.04(m, 2H), 4.72-4.68(m, 2H), 4.13-4.07(m, 2H), 3.96-3.94(m, 1H), 3.70-3.66(m, 2H), 3.50-3.47(m, 2H), 3.40-3.37(m, 3H), 3.34-3.28(m, 4H), 3.26-3.22(m, 2H), 3.11(s,1H), 3.05-2.91(m, 2H), 2.67-2.65(m, 3H), 2.57-2.43(m, 2H), 2.39-2.28(m, 2H), 2.25-2.16(m, 3H), 1.93-1.88 (m, 2H), 1.55-1.43(m, 2H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.08(m, 3H), 1.08-0.97 (m, 10H), 0.89-0.83(m, 3H), 0.66-0.53(m, 3H), 0.46-0.43(m, 2H).
【実施例１２】
【０１０１】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000051
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸11(150 mg, 0.193 mmol)をジクロロメタン7 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(87.3 mg, 0.677 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(57.6 mg, 0.251 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した後、室温で2時間撹拌した。この反応をメタノールで急冷し、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸12(14.7 mg, 白色固体)を収率7.8%で得た。
MS m/z (ESI): 969.9 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.23(m, 2H), 7.10-7.04(m, 2H), 6.79-6.78(m, 2H), 4.69-4.54(m, 3H), 4.18-4.07(m, 3H), 3.98-3.92(m, 1H), 3.75-3.71(m, 2H), 3.50-3.47(m, 3H), 3.42-3.39(m, 2H), 3.34-3.32(m, 5H), 3.27-3.19(m, 4H), 3.09-2.95(m, 5H), 2.49-2.47(m, 2H), 2.41-2.36(m, 2H), 2.29-2.18(m, 3H), 2.09-2.02(m, 2H), 1.90-1.87(m, 2H), 1.63-1.59(m, 4H), 1.49(s, 2H), 1.32-1.28(m, 3H), 1.21-1.12(m, 3H), 1.00-0.81(m, 12H), 0.62-0.55(m, 3H), 0.46-0.40(m, 2H).
【実施例１３】
【０１０２】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000052
本調製法は実施例11と類似するが、工程5の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1fを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸13(219 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 758.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.19(m, 5H), 4.70-4.68(m, 2H), 4.14-4.03(m, 2H), 3.95-3.93(m, 1H), 3.69-3.66(m, 2H), 3.48-3.45(m, 2H), 3.43-3.38(m, 3H), 3.34-3.29 (m, 4H), 3.23-3.21(m, 2H), 3.11(s, 1H), 2.97-2.89(m, 2H), 2.67-2.65(m, 3H), 2.51-2.43(m, 2H), 2.39-2.27(m, 2H), 2.21-2.06(m, 3H), 1.88-1.82(m, 2H), 1.41-1.39 (m, 2H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.10(m, 3H), 1.08-0.98(m, 10H), 0.89-0.84(m, 3H), 0.63-0.52(m, 3H), 0.46-0.43(m, 2H).
【実施例１４】
【０１０３】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000053
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸13(120 mg, 0.158 mmol)をジクロロメタン5 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(71.5 mg, 0.554 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(47.1 mg, 0.2059 mmol)を滴下した後、室温で2時間撹拌した。反応終了後、メタノール1 mLを加え、10分間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸14(5.1 mg, 白色固体)を収率3.39%で得た。
MS m/z (ESI): 951.9 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.18(m, 5H), 6.80-6.79(m, 2H), 4.75-4.61(m, 3H), 4.21-3.99(m, 3H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.74-3.70(m, 2H), 3.51-3.44(m, 3H), 3.42-3.37(m, 2H), 3.34-3.28(m, 5H), 3.23-3.21(m, 4H), 3.10-2.86(m, 5H), 2.49-2.36(m, 4H), 2.32-2.17(m, 3H), 2.12-2.03(m, 2H), 1.88-1.80(m, 2H), 1.67-1.58(m, 4H), 1.49(s, 2H), 1.37-1.26(m, 3H), 1.22-1.13(m, 3H), 1.00-0.83(m, 12H), 0.63-0.51(m, 3H), 0.43-0.40(m, 2H).
【実施例１５】
【０１０４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸
2018512377.tif 000054
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(p-トリル)プロパン酸15a(400 mg, 2.23 mmol, 既知の方法“Organic & Biomolecular Chemistry, 2004, 2(18), 2684-2691”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの混合物に過塩素酸(336.3 mg(70%), 3.34 mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応後、水10 mLを加えた。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15b(370 mg, 白色固体)を収率70%で得た。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸15(30 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 758.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.19-7.07(m, 4H), 4.82-4.68(m, 2H), 4.30-4.18 (m, 1H), 4.15-4.05(m, 1H), 3.89-3.84(m, 1H), 3.83-3.76(m, 1H), 3.74-3.62(m, 2H), 3.47-3.12(m, 9H), 2.89-2.79(m, 1H), 2.70-2.59(m, 4H), 2.34-2.03(m, 7H), 1.91-1.75 (m, 1H), 1.73-1.53(m, 2H), 1.50-1.24(m,4H),1.22-0.92(m, 18H), 0.90-0.79(m, 4H), 0.75-0.64(m,1H).
【実施例１６】
【０１０５】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸
2018512377.tif 000055
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸16a(400 mg, 2.33 mmol, 既知の方法“European Journal of Organic Chemistry, 2006, (5), 1113-1116”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却し、過塩素酸(352 mg(70%), 3.5 mmol)を滴下した。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、水を加え、重炭酸ナトリウムの飽和溶液でpHを8〜9に調整し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bの粗製品(370 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 228.3 [M+1].
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸16(18 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 527.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 11.00(s, 1H), 8.44(s, 1H), 7.17-7.15(d, 1H), 6.94-6.88 (d, 2H), 4.97-4.95(m, 2H), 4.10-4.08(m, 1H), 3.85-3.83(m, 2H), 3.71-3.69(m, 2H), 3.52-3.50(m, 2H), 3.37-3.34(m, 12H), 3.06-3.04(m, 2H), 2.80-2.78(m, 2H), 2.3-2.26 (m, 4H), 1.64-1.59(m, 3H), 1.48-1.46(m, 2H), 1.31-1.259(m, 12H), 1.08-0.98(m, 8H), 0.89-0.82(m, 4H).
【実施例１７】
【０１０６】
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000056
2018512377.tif 000057
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸17a(549 mg, 3 mmol, 既知の方法“Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17), 3327- 3332”に従って調製)を酢酸tert-ブチル15 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの混合物に過塩素酸(450 mg(70%), 4.5 mmol)を加えた後、室温で12時間撹拌した。反応後、水30 mLを加え、有機層を1N塩酸20 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄した。水層を合わせ、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で pHを8〜9に調整し、ジクロロメタン(100 mL ×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bの粗製品(600 mg, 油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e 及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸17(25 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 762.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.29-7.21(m, 1H), 7.08-6.87(m, 3H), 4.81-4.73(m, 1H), 4.72-4.67(m, 1H), 4.61-4.53(m, 1H), 4.29-4.22(m, 1H), 4.15-4.06(m, 1H), 3.99-3.93(m, 1H), 3.75-3.58(m, 2H), 3.43-3.12(m, 9H), 2.99-2.90(m, 1H), 2.69-2.60 (m, 4H), 2.30-1.97(m, 4H), 1.87-1.77(m, 1H), 1.63-1.53(m, 1H), 1.49-1.36(m, 1H), 1.18-0.92(m, 22H), 0.91-0.82(m, 4H), 0.81-0.71(m,1H).
【実施例１８】
【０１０７】
2018512377.tif 000058
工程1
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(0.35 mg, 2.65 mmol)をアセトニトリル0.45 mLに溶解した。ペルツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.85 mg/ml, 4.5 mL, 0.488 mmol)溶液pH 4.5にS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a のアセトニトリル溶液を加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液(7.06 mg, 112mmol) 1.0 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。反応終了後、残渣を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS 溶液, pH 6.5)で精製し、標記生成物18bの溶液を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
18bの溶液(15.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液0.45 mLを加え、25℃で30分間撹拌した。Sephadex G25 ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS 溶液, pH 6.5)を用いてこの反応溶液を脱塩し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(濃度：1.65 mg/ml, 22.6 mL)を得た。
工程 3
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)4(1.09 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。25℃で4時間撹拌した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05M PBS溶液、pH 6.5)を用いて反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物18のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148119.54(MAb+0D), 149331.45(MAb+1D), 150407.02 (MAb+2D, 151297.79(MAb+3D), 152448.85(MAb+4D), 153782.23(MAb+5D). 
平均値: y=2.0.
【実施例１９】
【０１０８】
2018512377.tif 000059
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸5(1.39 mg, 1.43 mmol)をアセトニトリル1.1mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物19のPBS緩衝液(0.78 mg/mL, 20.0 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148119.68(MAb+0D), 149308.79(MAb+1D), 150194.76 (MAb+ 2D), 151354.52(MAb+3D), 152410.57(MAb+4D), 153375.31(MAb+5D).
平均値：y=1.9.
【実施例２０】
【０１０９】
2018512377.tif 000060
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸6(1.08 mg, 1.15 mmol)をアセトニトリル1.25mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.50 mg/mL, 12.5 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS 溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物20のPBS緩衝液(0.74 mg/mL, 19.0 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: Q-TOF LC/MS: 148253.27(MAb+0D), 149263.59 (MAb+1D), 150315.25(MAb+2D), 151334.45(MAb+3D), 152383.92(MAb+4D), 153446.37 (MAb+5D).
平均値：y=2.2.
【実施例２１】
【０１１０】
2018512377.tif 000061
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸8(3.0 mg, 3.0 mmol)をアセトニトリル1.0 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.11 mg/mL, 10.0 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。そして、この反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物21のPBS緩衝液(1.31 mg/mL, 12.5 mL)を得た。これを4℃の冷蔵庫に保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148312.73(MAb+0D), 149515.61(MAb+1D), 150459.55 (MAb+ 2D), 151521.47(MAb+3D), 152580.02(MAb+4D).
平均値：y=1.7.
【実施例２２】
【０１１１】
2018512377.tif 000062
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸10(1.50 mg, 1.60 mmol)をアセトニトリル1.0 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.11 mg/mL, 10.0 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物22のPBS緩衝液(1.28 mg/mL, 13.0 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148411.82(MAb+0D), 149412.97(MAb+1D), 150468.08 (MAb+ 2D), 151496.41(MAb+3D), 152580.37(MAb+4D).
平均値: y=2.1.
【実施例２３】
【０１１２】
2018512377.tif 000063
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸12(0.86 mg, 0.89 mmol)をアセトニトリル0.6 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.06 mg/mL, 6.0 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物23のPBS緩衝液(0.70 mg/mL, 15 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148092.94(MAb+0D), 149296.82(MAb+1D), 150339.86 (MAb+ 2D), 151416.51(MAb+3D), 152516.25(MAb+4D), 153422.64(MAb+5D).
平均値: y=1.7.
【実施例２４】
【０１１３】
2018512377.tif 000064
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸14(0.73 mg, 0.78 mmol)をアセトニトリル0.6 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.06 mg/mL, 6.0 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物24のPBS緩衝液(0.68 mg/mL, 15.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148094.99(MAb+0D), 149277.83(MAb+1D), 150343.15 (MAb+ 2D), 151359.29(MAb+3D), 152478.14(MAb+4D), 153449.92(MAb+5D).
平均値: y=1.6.
【実施例２５】
【０１１４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000065
工程 1
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b (4.6 g, 20.1 mmol)をジクロロメタン80 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。0℃でこの反応溶液にトリエチルアミン(3.2 mL, 23.1 mmol)及びジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(20 mL, 20.7 mmol)を滴下し、0℃で50分間撹拌した後、-75℃で(S)-tert-ブチル2-ホルミルピロリジン-1-カルボキシレート25a(4 g, 20.1 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(42), 16901-16910”に従って調製)のジクロロメタン溶液5 mLを滴下し、-75℃で1時間撹拌した。その後、0℃で2時間、室温で1時間それぞれ撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3) 60 mLを反応溶液に加えた。0℃でメタノール及び30%過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)60 mLを加えた。室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、エーテル層を合わせ、5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2.26 g, 白色の泡沫状固体)を収率24.9%で得た。
MS m/z (ESI): 333.3 [M-100+1]
工程 2
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2 g, 4.62 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、粉砕した分子篩2 gを加えた。0oC及びアルゴン雰囲気下でこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(2.57 g, 12 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(1.71 g, 11.5 mmol) を加え、室温で17時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL x 3)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 白色の泡沫状固体)を収率63%で得た。
MS m/z (ESI): 447.3 [M+1]
工程 3
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 2.9 mmol)をテトラヒドロフラン80 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液を0℃まで冷却し、30%過酸化水素(1.25 g, 11 mmol)を滴下し、水酸化リチウム一水和物(207 mg, 4.95 mmol)を加えた。室温で反応混合物を12時間撹拌した。反応終了後、亜硫酸ナトリウム固体(1.47 g, 11.6 mmol)を反応溶液に加え、室温でこの混合物を1時間撹拌した。その後、少量の水を加え、有機層を減圧下で濃縮した。少量の水を加え、残渣を溶解し、ジクロロメタン(50 mL × 2)で抽出した。水層に塩酸を加え、pHを3とし、ジクロロメタン(40 mL × 3)で抽出した。有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25dの粗製品(870 mg, 無色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(S)-tert-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d(100 mg, 0.368 mmol)をジクロロメタン6 mL及びジメチルホルムアミド1.8 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7b(97 mg, 0.405mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(237.8 mg, 2.844 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(168.2 mg, 0.442 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。そして、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 無色の油)を収率83.9%で得た。
MS m/z (ESI): 509.3 [M+1]
工程 5
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 0.308 mmol)をジオキサン2 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.193 mL, 1.08 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で1時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25fの粗製品(100 mg, 淡黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 407.2 [M-1]
工程 6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25f(100 mg, 0.244 mmol)及び(5S、8S、11S、12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(156.1 mg, 0.244 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 4: 1)7.5 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(158 mg, 1.224 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物に2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(121 mg, 0.318 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。そして、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, pale 黄色の油)を収率96.5%で得た。
MS m/z (ESI): 1028.4 [M+1]
工程 7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, 0.235 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、ジエチルアミン3 mLを加えた。この混合物を室温で3時間撹拌した後、減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(250 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 806.7[M+1]
工程 8 
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ -(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(262 mg, 0.325mmol)を反応フラスコに入れ、4 M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した後、この反応溶液を減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(50 mg, 白色固体)を収率28.4%で得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.35-7.30(m, 1H), 7.20-7.15(m, 1H), 7.09-6.09(m, 2H), 4.81-4.75(m, 1H), 4.70-4.64(m, 1H), 4.15-4.13(m, 1H), 4.05-4.03(m, 1H), 3.84-3.81 (m, 1H), 3.69-3.64(m, 1H), 3.55-3.51(m, 1H), 3.48-3.13(m, 13H),  3.03-2.91(m, 2H), 2.66-2.53(m, 3H), 2.47-2.45(m, 1H), 2.40-2.33(m, 2H), 2.27-2.23 (m, 1H), 2.17-2.11 (m, 2H), 1.96-1.85(m, 3H), 1.63-1.40(m, 4H), 1.21-1.14(m, 3H), 1.09-0.94(m, 12H), 0.87-0.84(m, 3H).
【実施例２６】
【０１１５】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000066
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(20 mg, 0.026 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(13.7 mg, 0.106 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却した後、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(10.1 mg, 0.0443 mmol) のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(7 mg, 白色固体)を収率28.5%で得た。
MS m/z (ESI): 941.6 [M-1]
1HNMR (400 MHz, CD3OD) d 7.32-7.21(m, 2H), 7.10-7.00(m, 2H), 6.80-6.78(m, 2H), 4.75-4.55(m, 3H), 4.12-4.06(m, 2H), 3.93-3.89(m, 1H), 3.87-3.78(m, 2H), 3.69-3.63(m, 1H), 3.52-3.47(m, 3H), 3.44-3.28(m, 3H), 3.21-3.10(m, 4H), 3.04-2.96 (m, 4H), 2.53-2.40(m, 4H), 2.35-2.18(m, 2H), 2.13-2.00(m, 2H), 1.94-1.75(m, 4H), 1.68-1.56(m, 5H), 1.37-1.27(m, 4H), 1.20-1.13(m, 3H), 1.05-0.81(m, 18H).
【実施例２７】
【０１１６】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000067
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27a(250 mg, 1.28 mmol, 既知の方法“Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 2013, 49(70), 7744-766”に従って調製)を酢酸tert-ブチル7 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液に過塩素酸 (270 mg(70%), 1.88 mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。そして、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、重炭酸ナトリウムの飽和溶液でpHを8に調整した。水層を分離し、ジクロロメタン(10 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート27b(280 mg, 薄黄色の油)を収率87%で得た。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート27bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27(22 mg, 灰色かかった白色の固体)を得た。
MS m/z (ESI): 760.7[M-1].
【実施例２８】
【０１１７】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-(R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000068
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27(18 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン5 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(12.19 mg, 0.29 mmol)を加えた後、0℃で用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(6.5 mg, 0.028 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸28(4 mg, 白色固体)を収率18.2%で得た。
MS m/z (ESI): 955.5 [M+1]
【実施例２９】
【０１１８】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸
2018512377.tif 000069
本調製法は実施例25と類似するが、原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸 25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸29(20 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 746.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.17-7.05(m, 4H), 4.84-4.67(m, 2H), 4.27-4.15 (m, 1H), 4.12-4.05(m, 1H), 3.89-3.82(m, 1H), 3.78-3.63(m, 2H), 3.57-3.47(m, 1H), 3.43-3.11(m, 7H), 2.92-2.79(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.52-2.44(m, 1H), 2.40-2.15(m, 7H), 2.12-2.01(m, 1H), 1.95-1.69(m, 3H), 1.67-1.49(m, 2H), 1.48-1.27(m,4H),1.23-1.12(m, 5H), 1.11-0.95(m, 14H), 0.94-0.84(m, 3H).
【実施例３０】
【０１１９】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸
2018512377.tif 000070
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸29(12 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN, N-ジイソプロピルエチルアミン(0.014 mL, 0.08 mmol)を加えた後、0℃で用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(5.54 mg, 0.024 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で4時間撹拌した。メタノールで反応を急冷し、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸30(4 mg, 白色固体)を収率26.5%で得た。
MS m/z (ESI): 939.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.22-7.03(m, 4H), 6.85-6.78(m, 2H), 4.83-4.55(m, 3H), 4.27-3.97(m, 3H), 3.90-3.62(m, 3H), 3.59-2.95(m, 14H), 2.94-2.79(m, 1H), 2.54-2.35(m, 3H), 2.34-2.12(m, 5H), 2.08-1.99(m, 1H), 1.93-1.72(m, 3H), 1.71-1.51 (m,5H),1.48-1.24(m, 8H), 1.23-1.12(m, 3H), 1.11-0.78(m, 17H).
【実施例３１】
【０１２０】
(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000071
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸31a(600 mg, 3 mmol)を酢酸tert-ブチル15 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの溶液に過塩素酸(450 mg(70%), 4.5 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。そして、反応混合物に水10 mLを加え、有機層を1N 塩酸20 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄した。水層を合わせ、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整し、ジクロロメタン(100 mL ×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸ブチル31bの粗製品(500 mg, 油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート31bを用い、標記生成物(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸31(4 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 766.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.12(m, 4H), 4.73-4.51(m, 2H), 4.22-4.05(m, 1H), 3.92-3.83(m, 1H), 3.76-3.65(m, 1H), 3.62-3.51(m, 1H), 3.50-3.12(m, 9H), 3.09-2.98(m, 1H), 2.59-2.39(m, 4H), 2.38-2.24(m, 1H), 2.23-2.17(m, 1H), 2.16-2.01 (m, 3H), 2.00-1.85(m, 2H), 1.84-1.76(m, 1H), 1.73-1.57(m, 2H), 1.43-1.27(m, 5H), 1.25-1.14(m, 3H), 1.10-0.95(m, 13H), 0.94-0.83(m, 5H).
【実施例３２】
【０１２１】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000072
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸32(33.5 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.28(m, 1H), 7.08-6.95(m, 3H),4.77-4.69(m, 2H), 4.09-3.94(m,3H), 3.69-3.66(m,2H),3.48-3.44(m, 2H), 3.38-3.36(m, 3H), 3.34-3.28(m, 6H), 3.26-3.19(m, 2H), 3.13(m,1H), 3.01-2.91(m, 2H), 2.67-2.65(m, 2H),2.54-2.47(m, 2H), 2.34-2.28(m, 2H), 2.18-2.00(m, 2H),1.98-1.77(m, 2H), 1.55-1.42(m, 2H), 1.08-0.98(m, 18H),0.88-0.83 (m, 3H).
【実施例３３】
【０１２２】
(S)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000073
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパン酸33a(1.3 g, 5.57 mmol, 既知の方法“International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30(1), 13-21”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。0℃及びアルゴン雰囲気下でこの溶液に過塩素酸(1.2 g(70%), 8.36 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整した。水層を塩化メチレンで抽出した。 有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bの粗製品(3.4 g, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bを用い、標記生成物(S)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸33(23 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 800.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.43-7.42(m, 1H), 7.26-7.23(m,2H), 4.75-4.67(m, 2H), 4.14-4.04(m, 2H), 4.00-3.98(m, 1H), 3.91-3.89(m, 1H), 3.68-3.67(m, 3H), 3.39-3.26(m, 12H), 3.21-3.12(m, 3H), 2.67-2.64(m, 3H), 2.50-2.46(m, 3H), 2.31-2.28 (m, 2H), 2.17-2.15(m, 2H), 2.02-2.00(m, 4H), 1.90-1.88(m, 2H), 1.74-1.72(m, 2H), 1.39-1.37(m, 2H), 1.06-0.98(m, 12H).
【実施例３４】
【０１２３】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(o-トリル)プロパン酸
2018512377.tif 000074
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(o-トリル)プロパン酸34a(100 mg, 0.55 mmol, 既知の方法“International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30(1), 13-21”に従って調製)を酢酸tert-ブチル2.5 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で過塩素酸(107 mg(70%), 0.83 mmol)を滴下した。この混合物を室温で16時間撹拌した後、ジクロロメタン5 mLで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8に調整した。水層をジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート34bの粗製品(140 mg, 無色油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート34bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(o-トリル)プロパン酸34(40 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 746.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 8.41-8.39(d, 1H), 8.19-8.17(d, 1H), 7.18-7.05(m, 4H), 4.80-4.78(d, 1H), 4.71-4.69(d, 1H), 3.86-3.84(m, 1H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.69-3.63 (m, 2H), 3.48-3.42(d, 2H), 3.38-3.23(m, 5H), 3.20-3.12(m, 4H), 2.98-2.87 (m, 2H), 2.66-2.65(d, 3H), 2.53-2.50(d, 1H), 2.46-2.44(d, 1H), 2.41-2.26(m, 4H), 2.21-2.14(m, 2H), 2.10-2.04(m, 1H), 1.87-1.85(m, 2H), 1.77-1.74(m, 1H), 1.62-1.53 (m, 2H), 1.33-1.28(m, 3H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.14(d, 2H), 1.08-0.96(m, 14H), 0.90-0.84(m, 3H).
【実施例３５】
【０１２４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸
2018512377.tif 000075
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸35(2.6 mg, 白色固体)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.21-7.19(m, 1H), 6.91-6.90(m, 2H), 4.80-4.65(m, 2H), 4.16-4.08(m, 2H), 3.93-3.90(m, 1H), 3.70-3.66(m, 2H), 3.55-3.52(m, 1H), 3.48-3.45(m, 2H), 3.40-3.26(m, 6H), 3.25-3.13(m, 4H), 2.96-2.82(t, 1H), 2.69-2.65(d, 3H), 2.52-2.47(m, 2H), 2.39-2.29(m, 1H), 2.21-2.14(m, 2H), 1.92-(s, 3H), 1.63-1.61(m, 2H), 1.40-1.29(m, 3H), 1.23-1.14(m, 3H), 1.10-0.98(m, 13H), 0.88-0.85 (t, 3H).
【実施例３６】
【０１２５】
2018512377.tif 000076
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(5.45 mg, 5.78 mmol)をアセトニトリル1.2 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(7.56 mg/mL, 12 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。そして、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物36のPBS緩衝液(3.51 mg/mL, 27.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148094.39(MAb+0D), 149111.06(MAb+1D), 150167.12 (MAb+ 2D), 151188.93(MAb+3D), 152243.46(MAb+4D), 153272.96(MAb+5D).
平均値: y=1.9
【実施例３７】
【０１２６】
2018512377.tif 000077
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸28(1.75 mg, 1.83 mmol)をアセトニトリル0.9 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.31 mg/mL, 9.0 mL)を加え、25℃で6時間撹拌した。そして、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物37のPBS緩衝液(1.35 mg/mL, 13.0 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148093.25(MAb+0D), 149281.78(MAb+1D), 150474.33 (MAb+ 2D), 151372.72(MAb+3D), 152373.24(MAb+4D), 153469.40(MAb+5D).
平均値: y=2.3.
【実施例３８】
【０１２７】
2018512377.tif 000078
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸30(1.07 mg, 1.14 mmol)をアセトニトリル1.25 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.5 mg/mL, 12.5 mL)を加え、25℃で4.5時間撹拌した。反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物38のPBS緩衝液(0.74 mg/mL, 17.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148247.08(MAb+0D), 149265.32(MAb+1D), 150276.10 (MAb+ 2D), 151334.50(MAb+3D), 152392.21(MAb+4D), 153388.72(MAb+5D).
平均値: y=2.4.
【実施例３９】
【０１２８】
2018512377.tif 000079
工程1
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(2.44 mg, 18.5 mmol)をアセトニトリル3.0 mLに溶解した。ニモツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.22 mg/ml, 30 mL, 0.204 mmol)pH 4.3を、S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18aのアセトニトリル溶液とともに加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液(49.86 mg, 793 mmol)1.2 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。10% アセトニトリルを含有するPBS緩衝液(250 mL)を用いた30 KDa限外ろ過で反応溶液を精製した後、PBS緩衝液(200 mL)pH 6.5を用いた30 KDa限外ろ過パックで未反応のS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを除去し、標記生成物39bのPBS緩衝液(約75 mL)を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
39bのPBS緩衝液(75.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液2.0 mLを加え、25℃の水浴の中に設置された振動機に置き、30分間振動した。PBS緩衝液pH 6.5を用いた30 KDa 限外ろ過で反応溶液を精製し、標記生成物ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(濃度：5.38 mg/ml, 55 mL)を得た。
工程3
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)4(4.48 mg, 4.78 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオールのPBS緩衝液39c(5.38 mg/mL, 11 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、反応を止めた。
得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物39のPBS緩衝液の粗製品(2.96 mg/mL, 20.5 mL)を得た。これを遠心により約6 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物39のPBS緩衝液(4.25 mg/mL, 11.8 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.68(MAb+0D), 151234.76(MAb+1D), 152248.46 (MAb+ 2D), 153419.10(MAb+3D), 154312.17(MAb+4D), 155358.48 (MAb+5D).
平均値: y=2.2.
【実施例４０】
【０１２９】
2018512377.tif 000080
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フロロフェニル)プロパン酸8(4.32 mg, 4.52 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(5.38 mg/mL, 11 mL)を加えた。25℃の水浴の中で4時間振動した後、反応を止めた。
得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物40のPBS緩衝液の粗製品(2.92 mg/mL, 20 mL)を得た。これを更に約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物40のPBS緩衝液(4.25 mg/mL, 11.6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS:特徴ピーク: 150186.98(MAb+0D), 151374.09(MAb+1D), 152287.22 (MAb+ 2D), 153353.26(MAb+3D), 154501.80(MAb+4D), 155575.57(MAb+5D).
平均値: y=2.2.
【実施例４１】
【０１３０】
2018512377.tif 000081
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(4.45 mg, 4.72 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(5.38 mg/mL, 11 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、反応を止めた。得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物41のPBS緩衝液の粗製品(2.96 mg/mL, 20 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物41のPBS緩衝液(4.33 mg/mL, 11 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150186.05(MAb+0D), 151362.44(MAb+1D), 152261.90 (MAb+ 2D), 153438.29(MAb+3D), 154339.30(MAb+4D), 155511.23(MAb+5D).
平均値: y=2.3.
【実施例４２】
【０１３１】
2018512377.tif 000082
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸12(0.56 mg, 0.58 mmol)をアセトニトリル0.42 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール溶液39c(2.06 mg/mL, 4.2 mL)を加えた。25℃の水浴中で5時間振動した後、反応を止めた。
反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物42のPBS緩衝液の粗製品(0.74 mg/mL, 10 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物42のPBS緩衝液(1.15 mg/mL, 6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.42(MAb+0D), 151387.82(MAb+1D), 152472.27 (MAb+ 2D), 153528.33(MAb+3D).
平均値: y=1.0.
【実施例４３】
【０１３２】
2018512377.tif 000083
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸14(0.60 mg, 0.63 mmol)をアセトニトリル0.42 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール溶液39c(2.06 mg/mL, 4.2 mL)を加えた。25℃の水浴中で5時間振動した後、反応を止めた。
反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PB溶液, pH 6.5)でを脱塩し、標記生成物43のPBS緩衝液の粗製品(0.78 mg/mL, 9.5 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25 ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物43のPBS緩衝液(1.16 mg/mL, 6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.39(MAb+0D), 151251.46(MAb+1D), 152442.90 (MAb+ 2D), 153507.73(MAb+3D).
平均値: y=1.0.
【実施例４４】
【０１３３】
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000084
工程1
(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート
(R)-4-ベンジル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン44b(21 g, 90 mmol, 既知の方法“Tetrahedron Letters, 1999, 40(36), 6545-6547”に従って調製)をジクロロメタン300 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。0℃でこの反応溶液に四塩化チタン(9.8 mL, 1.1 mmol)を滴下し、この溶液は徐々に無色から黄色に変化し、黄色の固体が形成された。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(40 mL, 225 mmol)をゆっくり滴下し、白煙が生じた。この溶液は黄色から赤褐色に変化した。この混合物を0℃で1時間撹拌した後、-78℃まで冷却し、(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-ホルミルピロリジン-1-カルボキシレート44a(21.27 g, 98 mmol, 既知の方法“Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25(3), 212-218”に従って調製)のジクロロメタン溶液50 mLを加え、更に-78℃で1.5時間撹拌した。TLCにより反応の完了をモニターした。反応溶液に5%重炭酸ナトリウム溶液200 mLを加え、水層をジクロロメタン(300 mL × 2)で抽出した。有機層を合わせ、水(200 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(200 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート44c(19 g, 薄黄色の固体)を収率43.2%で得た。
MS m/z (ESI): 351.06 [M-100+1]
工程 2
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸
(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート44c(19 g, 42 mmol)をテトラヒドロフラン200 mL及び水50 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。30%過酸化水素(17.2 mL, 147 mmol)をゆっくり滴下し、水酸化リチウム一水和物(2.86 g, 68 mmol)80 mLを加えた。反応混合物を0℃で5時間撹拌した。亜硫酸ナトリウム溶液(21.2 g, 168 mmol)100 mLを反応溶液に加え、更に25℃で16時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン(200 mL × 3)で洗浄した。1N 塩酸で水層のpHを3に調整し、酢酸エチル(200 mL × 4)で抽出した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。残渣を350 mLの重炭酸ナトリウム 溶液(5%)に溶解し、ジクロロメタン(200 mL × 2)で洗浄した。2N塩酸で水層のpHを3に調整し、酢酸エチル(200 mL × 5)で抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸44dの粗製品(11.6 g, 薄黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 191.47 [M-100+1]
工程 3 
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸44d(11.6 g, 39.8 mmol)をテトラヒドロフラン200 mLに溶解し、窒素雰囲気下及び0℃でヨウ化メチル(91 g, 640 mmol)を加えた。その後、水素化ナトリウム(7.32 g (60%), 183 mmol)を数回に分けて加え、0℃で48時間撹拌した。氷水500 mLを加え、反応混合物を急冷し、酢酸エチル(150 mL)で抽出した。水層をエチルエーテル(150 mL x 2)で洗浄し、2N 塩酸でpHを3に調整し、酢酸エチル(250 mL x 3)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸44e(8.0 g, 薄黄色の粘稠性液体)を収率65.6%で得た。
MS m/z (ESI): 205.68 [M-100+1]
工程4
(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R、2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸44e(580 mg, 1.9 mmol)をアセトニトリル15 mLに溶解し、(S)-メチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート塩酸塩44f(480 mg, 2.2 mmol, 既知の方法“Journal of Heterocyclic Chemistry, 2013, 50(2), 320-325”に従って調製)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.42 mL, 8 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.07 g, 2.8 mmol)を加えた。反応混合物を室温で12 時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を40 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R、2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート44g(750 mg, 白色固体)を収率83.2%で得た。
MS m/z (ESI): 222.62 [M-100+1]
工程5
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート
(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R,2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート44g(738 mg, 1.58 mmol)をジクロロメタン15 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸(3 mL, 30 mmol)を滴下した後、室温で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート44hの粗製品(1.24 g, 黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 236.39 [M+1]
工程 6
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート44h(572 mg, 1.56 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸44i(868 mg, 1.56 mmol, 既知の方法“WO2007008848”に従って調製)をアセトニトリル15 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.0 mL, 12 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(890 mg, 2.34 mmol)を加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(30 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(30 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート44j(1.4 g, 白色の泡沫状固体)を収率99.9%で得た。
MS m/z (ESI): 898.99 [M+1]
工程 7
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート44j(180 mg, 0.2 mmol)をメタノール0.5 mL、テトラヒドロフラン0.5 mL及び水0.5 mLに溶解した後、0℃まで冷却し、水酸化リチウム一水和物(34 mg, 0.8 mmol)を加えた。この混合物を23℃で2時間撹拌した。TLC及びMSモニターで反応の完了を確認した後、反応混合物を2 mLの水で希釈し、1N塩酸を加え、pHを約4.5に調整し、酢酸エチル(5 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44k(160 mg, 薄黄色の泡沫状固体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 883.73 [M-1].
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44kの粗製品(160 mg, 0.2 mmol)を無水エタノールl10 mLに溶解し、10%Pd/Cを30 mg加えた。この反応系を水素で３回パージし、23℃で15時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物をセライトに通してろ過し、炭素上のパラジウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、120 mgの残渣を得た。高速液体クロマトグラフィーでこの残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44(29 mg, 白色固体)を収率21.5%で得た。
MS m/z (ESI): 749.94 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.14(m, 5H), 4.81-4.71(m, 2H), 4.18-4.13(m, 2H), 4.05-4.03(m, 2H), 3.84-3.81(m, 1H), 3.63-3.60(m, 1H), 3.58-3.52(m, 1H), 3.48-3.13(m, 14H), 3.00-2.91(m, 1H), 2.66-1.81(m, 11H), 1.63-1.38(m, 2H), 1.21-1.10(m, 5H), 1.09-0.94(m, 14H), 0.91-0.82(m, 3H).
【実施例４５】
【０１３４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000085
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44(1.0 g, 1.34 mmol)をアセトニトリル20 mLに溶解し、N, N-ジイソプロピルエチルアミン(0.53 mL, 3.0 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N'N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(560 mg, 1.48 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で30分間撹拌し、6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(300 mg, 1.41 mmol)を加えた。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物に50 mLの酢酸エチルを加え、減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物の粗製品1.0 gを得た。高速液体クロマトグラフィーでこれを更に精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(140 mg, 白色固体)を収率11%で得た。
MS m/z (ESI): 942.67 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.34-7.14(m, 5H), 6.83-6.80(m, 2H), 5.20-5.10(m, 1H), 5.01-4.96(m, 1H), 4.78-4.57(m, 2H), 4.18-4.01(m, 2H), 4.00-3.80(m, 1H), 3.56-3.41(m, 5H), 3.35-3.24(m, 10H), 3.19-2.90(m, 4H), 2.60-2.40(m, 4H), 2.39-2.00(m, 4H), 1.93-1.58(m, 6H), 1.50-1.10(m, 7H), 1.09-0.82(m, 21H).
【実施例４６】
【０１３５】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000086
工程1
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d(1.0 g, 3.5 mmol)をアセトニトリル15 mLに溶解し、(S)-メチル2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩46a (820 mg, 4 mmol, 既知の方法“Tetrahedron, 2003, 59(21), 3719-3727”に従って調製)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.7 mL, 15 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.9 g, 5.0 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(30 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(30 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル 2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート46b(1.35 g, 白色固体)を収率 82.6%で得た。
MS m/z (ESI): 366.46 [M-100-1].
工程2
(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート46b(1.34 g, 2.87 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸(3 mL, 30 mmol)を滴下し、23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R、3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩46cの粗製品(1.92 g, 黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 366.85 [M+1]
工程3
(S)-メチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩46c(367 mg, 1.0 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸44i(549 mg, 1.0 mmol)をアセトニトリル10 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.24 mL, 7 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(570 mg, 1.5 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を30 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート46d(760 mg, 白色の泡沫状固体)を収率84.6%で得た。
MS m/z (ESI): 898.10 [M+1]
工程 4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート46d(180 mg, 0.2 mmol)をメタノール0.5 mL、テトラヒドロフラン0.5 mL 及び水0.5 mLに溶解し、0℃まで冷却した後、水酸化リチウム一水和物(34 mg, 0.8 mmol)を加え、23℃で2時間撹拌した。TLC及びMSモニターで反応の完了を確認した後、反応混合物を2 mLの水で希釈し、1N塩酸を加え、pHを約4.5に調整し、酢酸エチル(5 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46eの粗製品(160 mg, 白色固体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 883.78 [M-1]
工程 5
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸 46eの粗製品(160 mg, 0.2 mmol)を無水エタノール10 mLに溶解し、10%Pd/C 30 mgを加えた。反応混合物を窒素で３回置換し、室温で15時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物をセライトに通してろ過し、炭素上のパラジウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、残渣130 mgを得た。この残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46(34 mg, 白色固体)を収率25.2%で得た。
MS m/z (ESI): 749.94 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.24(m, 2H), 7.02-6.92(m, 2H), 4.48-4.58(m, 2H), 4.22-4.11(m, 1H), 3.85-3.40(m, 4H), 3.39-3.04(m, 14H), 3.00-2.90(m, 1H), 2.66-2.40(m, 5H), 2.39-2.02(m, 4H), 1.99-1.75(m, 3H), 1.73-1.24(m, 3H), 1.20-1.10(m, 4H), 1.09-0.95(m, 16H), 0.94-0.80(m, 3H).
【実施例４７】
【０１３６】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000087
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(434 mg, 2.06 mmol)をアセトニトリル20 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(844 mL, 6.55 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(781 mg, 1.87 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で30分間撹拌し、(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46(1.4 g, 1.87 mmol)を加えた。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物の粗製品1.2 gを得た。これを高速液体クロマトグラフィーで更に精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸47(670 mg, 白色固体)を収率37.9%で得た。
MS m/z (ESI): 944.54 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 12.80(br.s, 1H), 8.56-8.52(m, 1H), 8.42-8.20(m, 1H), 8.18-8.10(m, 1H), 7.30-7.18(m, 2H), 7.07-6.75(m, 4H), 4.64-4.34(m, 3H), 4.08-3.94(m, 1H), 3.80-3.50(m, 2H), 3.46-2.70(m, 15H), 2.50-1.80(m, 6H), 1.73-1.38(m,7H), 1.30-1.10(m, 12H), 1.09-0.62(m, 20H).
【実施例４８】
【０１３７】
2018512377.tif 000088
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(1.1 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(1.63 mg/mL, 11.4 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物48のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.8 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150186.5(MAb+0D), 151364.1(MAb+1D), 152262.3 (MAb+2D), 153435.7(MAb+3D), 154499.6(MAb+4D), 155427.5(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【実施例４９】
【０１３８】
2018512377.tif 000089
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸47(1.1 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(1.63 mg/mL, 11.4 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物49のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.8 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150185.5(MAb+0D), 151364.7(MAb+1D), 152261.2 (MAb+2D), 153436.2(MAb+3D), 154499.9(MAb+4D), 155428.6(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【実施例５０】
【０１３９】
2018512377.tif 000090
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(1.09 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物50のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148095.6(MAb+0D), 149111.5(MAb+1D), 150165.3 (MAb+2D), 151184.7(MAb+3D), 152255.2MAb+4D), 153297.5(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【実施例５１】
【０１４０】
2018512377.tif 000091
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸47(1.09 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液47c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物51のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148096.2(MAb+0D), 149112.2(MAb+1D), 150165.4 (MAb+2D), 151184.8(MAb+3D), 152255.1(MAb+4D), 153297.6(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【実施例５２】
【０１４１】
2018512377.tif 000092
工程1
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(0.35 mg, 2.65 mmol)をアセトニトリル0.45 mLに溶解した。トラスツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.0 mg/ml, 4.5 mL, 0.304 mmol),pH 4.5をS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18aのアセトニトリル溶液とともに加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの水溶液(7.06 mg, 112mmol)1.0 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。反応終了後、反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物52b溶液を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
52bの溶液(約15.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液0.45 mLを加え、シェーカーを用いて反応混合物を25℃で30分間振動した。Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液)でこの反応溶液を脱塩し、標記生成物トラスツズマブ-プロパンチオール52cの溶液(濃度：1.65 mg/ml, 22.6 mL)を得た。
工程 3
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(1.1 mg, 1.2 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、トラスツズマブ-プロパンチオール溶液52c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。これをシェーカーに置き、25℃で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物52のPBS緩衝液(0.72 mg/mL, 20 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148062.9(MAb+0D), 149235.2(MAb+1D), 150259.8 (MAb+2D), 151268.2(MAb+3D), 152341.9(MAb+4D), 153356.4(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【実施例５３】
【０１４２】
2018512377.tif 000093
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸47(1.12 mg, 1.2 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、トラスツズマブ-プロパンチオール溶液52c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。これをシェーカーに置き、25℃で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物53のPBS緩衝液(0.70 mg/mL, 20.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148065.2(MAb+0D), 149244.6(MAb+1D), 150254.9 (MAb+2D), 151280.9(MAb+3D), 152301.6(MAb+4D), 153457.9(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
【０１４３】
生物試験
【試験例１】
【０１４４】
腫瘍細胞増殖に対する式（D）の化合物のin vitro阻害試験
１、試験目的
この試験の目的は、HepG2腫瘍細胞（ヒト肝細胞癌細胞、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu 72）及びA549腫瘍細胞（ヒト肺腺癌、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu150）の増殖に対する本発明による式（D）のin vitro阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬（Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04）によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
２．試験プロトコール
以下は、in vitroでの腫瘍細胞に対する増殖阻害活性に関する本発明による化合物の試験を例証する目的でHepG2細胞のin vitro増殖阻害試験の方法の例である。この方法はまた、限定されないが、他の腫瘍細胞に対するin vitro増殖阻害試験にも適用できる。
２．１細胞調製
対数増殖期のHepG2細胞をPBS（リン酸緩衝液、ThermoFisher）で一回洗浄し、2-3mlのトリプシン（0.25% トリプシン-EDTA (1x)、Gibico, Life Technologies）を加えて2-3分間消化した。細胞が完全に消化された後に、10-15mlの細胞培養液（DMEM/F12培地、Invitrogen；10% (v/v)）を加えた。消化HepG2細胞を溶出し、1000rpmで3分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、次いで10-20mlの細胞培養液を加えて細胞を再懸濁し、単細胞懸濁液を調製した。
２．２細胞の播種
HepG2単細胞懸濁液を混合して、細胞密度を細胞培養液で6×104 細胞/mlに調整した。密度調整細胞懸濁液を均一に混合して、96穴細胞培養プレートに100μl/ウェルで添加した。プレートは、5% CO2インキュベーター中で37 °Cで18-20時間培養した。
２．３化合物調製
化合物はDMSO（ジメチルスルホキシド、Shanghai Titan Technology Co., Ltd.）で溶解して、初期濃度10 mMを有する保存溶液を調製した。
10 mM化合物の10μlをU字型の底の96穴プレート（サンプルプレート１）の第1列のウェルに添加し、DMSO 90μlを第1列の各化合物サンプルウェルに添加した。即ち、保存溶液をスタート時点で10倍に希釈した。次いで、3倍グラジエント希釈を行い、各化合物濃度を10倍希釈した。希釈液はDMSO液であった。60μlの100% DMSを第12列に、20μlの1mM陽性薬物コントロールを第11列に添加した。
新しいU字底96穴プレート（サンプルプレート２）を取り、サンプルプレート１の各サンプルを完全培地で20倍希釈した。次いで、新しいU字底96穴プレート（サンプルプレート３）を取って、サンプルプレート２の各ウェルのサンプルを最終の10倍希釈に付した。
２．４サンプル負荷
細胞の前培養が完了した後、96穴細胞培養プレートを取り出し、上澄み液を廃棄した。96穴サンプルプレート３の各サンプル希釈液を続けて96穴細胞培養プレートに100μl/ウェルで添加した。各化合物サンプルは、各濃度で重複して試験を行った。負荷操作は30分を超えてはいけない。負荷操作の完了後、96穴培養プレートは37 °Cで約76時間、5% CO2インキュベーター中で培養した。
２．５発色操作
96穴細胞培養プレートを取り、各ウェルに100μl/ウェルでCCK-8を添加した。細胞培養プレートを10回以上穏やかにたたいて混合し、37 °Cで2時間5% CO2インキュベーター中で培養した。
２．６プレートの読み取り
96穴細胞培養プレートを取って、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer, VICTOR 3）中に置き、450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
上記の方法により、in vitroのA549腫瘍細胞の増殖に対する本発明による化合物の阻害活性を試験した。細胞培養液もDMEM/F12であった。
３．データ解析
データは、Microsoft Excel及びGraphpad Prism 5を用いて解析した。結果を表1に示す。
（表1）
2018512377.tif 000094
【試験例２】
【０１４５】
HER2標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体のin vitro腫瘍細胞増殖阻害試験
この試験の目的は、SK-BR-3腫瘍細胞（ヒト乳癌細胞、ATCC, HTB-30）についての本発明によるHER2標的に対する抗体‐薬物複合体のin vitro増殖阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬（Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04）によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
試験例１の試験方法に従い、試験細胞はSK-BR-3であり、細胞培養液は10% FBSを含むMcCoy's 5A 培地（Gibco, NO.16600-108）であった。適切な化合物を試験し、結果を表２に示した。
（表２）
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結論：HER2標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体は、SK-BR-3腫瘍細胞について顕著な増殖阻害効果を有している。
【試験例３】
【０１４６】
EGFR標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体のin vitro腫瘍細胞増殖阻害試験
この試験の目的は、HCC827腫瘍細胞（非小細胞肺癌細胞、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu153）についての本発明によるEGFR標的に対する抗体‐薬物複合体のin vitro増殖阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬（Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04）によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
試験例１の試験方法に従い、試験細胞はHCC827であり、細胞培養液は10% FBSを含むRPMI1640培地（Invitrogen）であった。適切な化合物を試験し、結果を表３に示した。
（表３）
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結論：EGFR標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体は、HCC827腫瘍細胞について顕著な増殖阻害効果を有している。
【試験例４】
【０１４７】
NCI-N87の腫瘍阻害率試験
１．試験目的
ヌードマウスにおけるNCI-N87細胞（HER2を過剰発現するヒト胃癌細胞、ATCC、CRL-5822）の移殖腫瘍についての本発明の抗体−細胞毒複合体の効力を評価し、比較すること。
２．試験薬物
サンプル：化合物１８、化合物２１、化合物３６
陽性コントロール：ペルツズマブ、トラスツズマブ
調製方法：全て生理食塩水で調製した。
３．試験動物
BALB/cA-ヌードマウス、６-７週令、雌、Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. Certificate number: SCXK (Shanghai) 2012-0002から購入。
居住環境：SPFレベル。
４．試験方法：
ヌードマウスにヒト胃癌NCI-N87細胞を皮下に接種し、腫瘍の増殖が100-200 mm3になった後、動物をランダムにグループに分けた（D0）。投与量と投与計画は表４に示した。マウスは腫瘍容積について週に２-３回測定し、体重を測定して、データを記録した。
腫瘍容積（V）の計算式は、次の通りである：
V＝1/2×a×b2
式中：ａ及びｂは、それぞれ長さと幅を表す。
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%
式中、ＴとＣは試験の終わりの腫瘍容積を表し、T0とC0は試験の最初の腫瘍容積を表す。
（表４）ヌードマウスにおけるヒト胃癌NCI-N87の移殖腫瘍に対する化合物（１８，２１，３６）の効果
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D0：最初の投与時；ペルツズマブ及びトラスツズマブ：最初の用量倍加；P値は溶媒コントロール群と比較した；Student’s tテストを用いた。試験開始時のマウスの数は次の通りであった：コントロール群n = 12、処置群n = 6。
５．結果
本発明化合物は、HER2を過剰発現するNCI-N87のヌードマウス皮下移植腫瘍の増殖を顕著に阻害し、腫瘍を持つマウスは上記薬物により耐性である。
【試験例５】
【０１４８】
ヌードマウスにおけるHCC827移植腫瘍についてのEGFRV3抗体とそのADCの有効性試験  
１．試験目的
この試験において、Nude-nudeマウスを試験動物として用い、多剤（multi-dose）腹腔内注射後のヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌HCC827の移植腫瘍に対する本発明のADC化合物３９及び４０の効力を評価した。
腫瘍抑制効果が、本発明のADC化合物３９及び４０の１回の多剤腹腔内注射後に観察され、試験は投与後３８日で終了した。試験結果はADC化合物３９（0.05 mg/マウス）の腫瘍抑制率は62.78%であり、差はコントロール群に比べて統計的に有意である（p<0.05）ことを示している。ADC化合物４０（0.025 mg/マウス）の腫瘍抑制率は49.20%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差ではない。ADC化合物４０（0.05 mg/マウス）の腫瘍抑制率は86.8%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差がある（p<0.01）。ADC化合物４０（0.1 mg/マウス）の腫瘍抑制率は93.41%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差がある。（p<0.05）。
２．試験薬物及び材料
２．１試験薬物
本発明のADC化合物：ADC化合物３９、ADC化合物４０
２．２薬剤処方
全て生理食塩水で調製した。
２．３試験動物
Nude-nudeマウス, SPF, 16-20 g, ♀, Shanghai Xi Puer Bikai Experimental Animal Co., Ltd.より購入、Certificate number: SCXK (Shanghai) 2008-0016。
３．試験プロトコール
ヌードマウスを３日間実験環境に順化した後、腫瘍細胞の移植を行った。HCC827細胞をヌードマウスの右肋骨の皮下に接種した（4×106 + 50%マトリゲル/マウス）。接種後２１日目、腫瘍が209.41 + 25.93 mm3 (d1)に増殖した時に、薬物を投与した。具体的な投与量と方法は表５に示した。
マウスは腫瘍容積について週に２回測定し、ヌードマウスの体重を測定して、データを記録した。
Excel統計ソフトウェア：平均値はavgとして計算する：SDはSTDEVとして計算する：SEMはSTDEV/SQRTとして計算する：異なる群間のP値はTTESTとして計算する。
式中、V0およびVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTVおよびTRTVは、それぞれブランクコントロール群（ブランク）と試験の終わりの試験群の相対的腫瘍容積を表す。
腫瘍容積 (V)は：V=1/2×Llength×Lshort2として計算する。
相対容積 (RTV) =VT/V0
腫瘍抑制率 (%) =(CRTV-TRTV)/CRTV (%)
式中、V0及びVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTV及びTRTVは、それぞれブランクコントロール群（ブランク）と試験の終わりの試験群の相対的腫瘍容積を表す。
（表５）ヌードマウスにおけるHCC827異種移植に対する試験抗体の効果
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４．結果
試験結果は、ADC化合物３９（0.5 mg/マウス）の腫瘍抑制率は３８日で62.78%であり、差はブランクコントロール群に比べて統計的に有意であった（p<0.05）ことを示している。ADC化合物４０（0.025 mg/マウス）の腫瘍抑制率は49.20%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差ではない（p<0.05）。ADC化合物４０（0.05 mg/マウス）とADC化合物４０（0.1 mg/マウス）の腫瘍抑制率は、それぞれ86.8%及び93.41%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差である（p<0.01）。さらに、３つの異なる用量群におけるADC化合物４０の抗腫瘍効果は、用量依存性である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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