(57)【要約】  異なる励起波長を有する複数の共線励起ビームとの複合光源、1つ又はそれ以上の励起ビームによる励起の際に異なるそれぞれの発光波長でそれぞれのエミッション光を放出するように構成されたDNA鋳型及び核酸塩基標識を有するシーケンシング表面、各核酸塩基標識のエミッション光を検出するように構成されたカラーカメラ、共線励起ビームを複合光源からシーケンシング表面に方向付けるように構成された第1の光路、及びシーケンシング表面からカラーカメラに方向付けるように構成された第2の光路、を有するシーケンシング機器光学システム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シーケンシング機器光学システムであって、
各励起ビームがそれぞれ異なる励起波長を有する複数の共線励起ビームを含む複合光源;
前記励起ビームのうち1つ又はそれ以上により励起されるとそれぞれ異なる励起波長のエミッション光を放出するように構成された、複数のDNA鋳型及び複数の核酸塩基標識を含むシーケンシング表面;
各核酸塩基標識のエミッション光を検出するように構成されたカラーカメラ;
共線励起ビームを複合光源からシーケンシング表面に方向付けるように構成された第1の光路; 及び
シーケンシング表面からのエミッション光をカラーカメラに方向付けるように構成された第2の光路、
を含むシーケンシング機器光学システム。
【請求項２】
該複合光源が、4つの共線励起ビームを含む、請求項1に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項３】
該カラーカメラが、
複数の感光画素を有するセンサ; 及び
複数のカラーフィルタを有するフィルタアレイ、
を含み、
各カラーフィルタはそれぞれ別の感光画素に関連付けられている、請求項1に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項４】
該複数のカラーフィルタが、赤色カラーフィルタ、緑色カラーフィルタ及び青色カラーフィルタを含む、請求項3に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項５】
該フィルタアレイが、ハイパースペクトルフィルタを含む、請求項3に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項６】
該ハイパースペクトルフィルタが、複数のファブリペロースペクトルフィルタを含む、請求項5に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項７】
該ハイパースペクトルフィルタが、
第1の核酸塩基標識エミッション光に関連する第1の波長を有する光を透過させるように構成された第1のフィルタ群;
第2の核酸塩基標識エミッション光に関連する第2の波長を有する光を透過させるように構成された第2のフィルタ群;
第3の核酸塩基標識エミッション光に関連する第3の波長を有する光を透過させるように構成された第3のフィルタ群; 及び
第4の核酸塩基標識エミッション光に関連する第4の波長を有する光を透過させるように構成された第4のフィルタ群、
を含む、請求項5に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項８】
第1の核酸塩基標識エミッション光に関連する第1の波長が、第1の核酸塩基標識の第1のピーク発光波長に対応する波長を含み;
第2の核酸塩基標識エミッション光に関連する第2の波長が、第2の核酸塩基標識の第2のピーク発光波長に対応する波長を含み;
第3の核酸塩基標識エミッション光に関連する第3の波長が、第3の核酸塩基標識の第3のピーク発光波長に対応する波長を含み;
第4の核酸塩基標識エミッション光に関連する第4の波長が、第4の核酸塩基標識の第4のピーク発光波長に対応する波長を含む、
請求項7に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項９】
第1のピーク発光波長が、約525nm、第2のピーク発光波長が、約565nm、第3のピーク発光波長が、約630nm、及び第4のピーク発光波長が、約680nmである、
請求項8に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１０】
第1の波長は、電磁スペクトルの第1の帯域内に位置する半値全幅を有する波長の第1の分布を含み;
第2の波長は、電磁スペクトルの第2の帯域内に位置する半値全幅を有する波長の第2の分布を含み;
第3の波長は、電磁スペクトルの第3の帯域内に位置する半値全幅を有する波長の第3の分布を含み; 及び
第4の波長は、電磁スペクトルの第4の帯域内に位置する半値全幅を有する波長の第4の分布を含む、
請求項7に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１１】
第1の帯域、第2の帯域、第3の帯域及び第4の帯域は、重なり合う波長を含まない、請求項10に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１２】
第1の帯域、第2の帯域、第3の帯域及び第4の帯域は各々、電磁スペクトルのそれぞれ別の20nmの幅の部分を含む、請求項10に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１３】
第1の群のフィルタ、第2の群のフィルタ、第3の群のフィルタ及び第4の群のフィルタがモザイク状に配置される、請求項7に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１４】
第1の群のフィルタ、第2の群のフィルタ、第3の群のフィルタ及び第4の群のフィルタが、走査パターンで配置され、各群のフィルタは、連続した列に配置される、請求項7に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１５】
該シーケンシング表面が、カラーカメラに対して第1の方向に移動可能であり、及び第1の経路が、共線励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面に投影するように構成されたレンズアセンブリを含む、請求項14に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１６】
該カラーカメラが、複数のセンサを有するマルチセンサカメラを含む、請求項1に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１７】
該複数のセンサが、3つ又は4つのセンサを含み、各センサが、異なる波長を有するエミッション光を受け取るように構成されている、
請求項16に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１８】
該カラーカメラが、ハイパースペクトルカメラを含み、複数のセンサが、第1の発光波長を検出するように構成された第1のセンサ、第2の発光波長を検出するように構成された第2のセンサ、第3の発光波長を検出するように構成された第3のセンサ、第4の発光波長を検出するように構成された第4のセンサを含む、
請求項17に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項１９】
該マルチセンサカメラが、複数のプリズムを含み、各プリズムが、それぞれ別のエミッション光をそれぞれ別のセンサに方向付けるように構成されている、
請求項16に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２０】
第1の光路及び第2の光路が、共有されたマルチバンドダイクロイックミラーを含み、前記共有されたマルチバンドダイクロイックミラーは、エミッション光を透過させると共に、複数の共線励起ビームをシーケンシング表面に向けて反射するように構成されている、
請求項1に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２１】
少なくとも1つの第1の光路及び第2の光路が、シーケンシング表面に対して斜めに配置される、
請求項1に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２２】
シーケンシング機器光学システムであって、
第1の励起波長を有する第1の励起ビーム;
第1の励起波長とは異なる第2の励起波長を有する第2の励起ビーム;
複数のDNA鋳型を含むシーケンシング表面、第1の励起ビームによる励起時に第1の発光波長で第1のエミッション光を放出するように構成された第1の核酸塩基標識、及び第2の励起ビームによる励起時に第2の発光波長で第2のエミッション光を放出するように構成された第2の核酸塩基標識;
第1の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面の第1の位置に投影するように構成されたレンズアセンブリ;
第2の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面の第1の位置とは異なる第2の位置に投影するように構成された第2のレンズアセンブリ;
該核酸塩基標識のそれぞれのエミッション光を検出するように構成されたセンサであり、シーケンシング表面に対して第1の方向に移動可能であるセンサ; 
シーケンシング表面の第1の位置とセンサの第1の部分との間に位置する第1の発光波長を透過するように構成された第1のカラーフィルタ; 及び
シーケンシング表面の第2の位置とセンサの第2の部分との間に位置する第2の発光波長を透過するように構成された第2のカラーフィルタ、
を含むシーケンシング機器光学システム。
【請求項２３】
第3の励起波長を有する第3の励起ビーム;
第3の励起ビームによる励起時に第3の発光波長で第3のエミッション光を放出するように構成された第3の核酸塩基標識;
第3の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面の第3の位置に投影するように構成され、第3の位置は、第1の位置及び第2の位置とは異なる第3のレンズアセンブリ; 及び
シーケンシング表面の第3の位置とセンサの第3の部分との間に位置する第3の発光波長を透過するように構成された第3のカラーフィルタ、
をさらに含む、請求項22に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２４】
第4の励起波長を有する第4の励起ビーム;
第4の励起ビームによる励起時に第4の発光波長で第4のエミッション光を放出するように構成された第4の核酸塩基標識;
第4の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面の第4の位置に投影するように構成され、第4の位置は、第1の位置、第2の位置及び第3の位置とは異なる第4のレンズアセンブリ; 及び
シーケンシング表面の第4の位置とセンサの第4の部分との間に位置する第4の発光波長を透過するように構成された第4のカラーフィルタ、
をさらに含む、請求項23に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２５】
シーケンシング表面が、可動ステージ上に搭載され、それによりセンサがシーケンシング表面に対して第1の方向に移動可能に構成される、
請求項22に記載のシーケンシング機器光学システム。
【請求項２６】
該センサの第1の部分で第1の離散線に沿って第1の発光波長を投影し、且つ、センサの第2の部分で第2の離散線に沿って第2の発光波長を投影するように構成された1つ又はそれ以上のレンズをさらに含む、請求項22に記載のシーケンシング機器光学システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、2015年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/212,820号の利益を主張し、その内容は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、シーケンシング-バイ-シンテシス(sequencing-by-syntheses)又は他のシーケンシングプロセス中に用いられる核酸塩基に関連する蛍光色素又は他の発光標識を検出するための機器に関する。
【背景技術】
【０００３】
DNAシーケンシングプロセスは、DNA分子内の塩基対の順序を決定するために使用される。この技術は、DNA分子の同一性の決定、又はDNA分子が特定の特徴（例えば、先天的状態を示す特徴）を含むかどうかの決定等、様々な用途を有する。DNA配列を決定する多くの技術が利用可能である。例えば、典型的なシーケンシング・バイ・シンセシス(SBS)プロセスでは、特別に設計されたヌクレオチド及びDNAポリメラーゼを用いることで、表面に結合された一本鎖DNA鋳型の配列を制御下で読み取ることができる。このプロセスは、DNA分子を構成する特定の核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン及びチミン）を同定するために標識（プローブ又はタグとしても知られる）を用いる。他のシーケンシング技術は、核酸配列を決定するために天然のヌクレオチド及び/又はポリメラーゼ又は標識されたオリゴヌクレオチド及びライゲーション酵素を使用し得る。
【０００４】
その最も基本的な意味において、SBSプロセスは、DNA鋳型分子の長さを一度に1核酸塩基ずつ延長し、加えられた核酸塩基の配列を記録することによって進行する。より具体的に、このプロセスは、DNA鋳型を1核酸塩基分伸長し、標識がDNA鋳型の位置に存在するか否か(又はどのような種類か)を決定するため、得られた分子を光学的に検査(「読み取る」)する。標識の存在は、その特定の標識に付随する核酸塩基がDNA鋳型に付加されていることを示す。次いで、このプロセスを複数回反復して、DNA鋳型を構成する塩基対の配列を決定する。処理速度を上げ、このプロセスをより実用的にするために、典型的には、それぞれがより大きなDNA分子の断片を含み得る数百万のDNA鋳型を処理することが望ましい。例えば、数百万のDNA鋳型を、シーケンシング表面上の規則的又はランダムな位置（「鋳型スポット」）に配置し、一緒に処理することができる。各DNA鋳型は、それ自体が単一分子又は複数の本質的に同一の分子を含み得る。DNA鋳型をそれらの配列を決定するために処理した後、個々の配列を、互いに比較することができ、元の完全DNA分子の性質を同定するために照合することができる。
【０００５】
核酸塩基標識の光学的解析に基づく従来のSBS法及び他の方法は、非常に小さいスケールのDNA鋳型及び低い照度の核酸塩基標識を用いて実施できなければならない。典型的な核酸塩基標識は、外部「励起」光源によって励起されたときに光を発する蛍光性化合物を有する蛍光分子を含む。放出される光の波長は、特定のフルオロフォア(fluorophore)に依存する。放出された光の平均波長は、一般に、光子のエネルギー損失（ストークスシフトとして知られている現象）に起因して、励起光の平均波長よりわずかに大きい。光の強度は非常に低いが、各鋳型スポットで複数の同一の核酸塩基標識を凝集させるために各DNA鋳型をその場で増幅することによって、ある程度対応することができる。しかしながら、このような増幅を行ったとしても、ヌクレオチド標識によって生成されたシグナルを、バックグラウンドノイズ及び近くに存在し得る他の標識から注意深く区別する措置を講じる必要がある。
【０００６】
いくつかの場合において、伸長及び読み取りプロセスは、各伸長プロセスにおいてDNA鋳型を結合するために単一種類の核酸塩基(例えば、アデニン)のみを提示すること、どのDNA分子が伸長されたかの検出を実行すること、及びその後、それぞれの残りの核酸塩基(グアニン、シトシン及びチミン)について独立して同じプロセスを繰り返すこと、によって連続的に行われる。この一連のプロセスは、各伸長及び読取りサイクルの間に1種類の核酸塩基のみを加えることができるため、1つの核酸塩基が読み込み段階中に別の核酸塩基と誤認される可能性を最小にする。しかしながら、このプロセスは、単一の塩基対によってすべてのDNA鋳型を伸長させるために、4つの完全伸長サイクルおよび4つの完全な読み取りサイクル、という多数の処理段階を必要とするため、時間がかかる。
【０００７】
他の場合において、伸長段階は、各伸長サイクルの間に一部又は全ての核酸塩基をDNA鋳型に提示することによって、並行して行うことができる。この方法は、各DNA鋳型が理論的に各伸長サイクルの間に伸長され得るため、プロセスを高速化する。しかしながら、このプロセスは、核酸塩基の各タイプに関連する標識を正確に同定するために、依然として4つの異なる読み取り段階を連続して行う必要がある。このプロセスはまた、いくつかの核酸標識が、類似の照射波長(例えば、緑と黄色、又は赤色と暗赤色)を有し、これらの標識間の区別をより困難にする可能性があるため、連続のプロセスよりもより厳しい光学性能が求められ得る。
【０００８】
典型的なSBS機器は、複数の別々の処理プロセスの間に4種類の核酸塩基標識のそれぞれを読み取るように構成される。そのような装置は、図1の従来技術の例に示すような移動光学系を使用することができる。この例において、機器100は、DNA鋳型がその上に配置されるシーケンシング表面102を含む。シーケンシング表面102は、DNA鋳型が、例えばチップ、ビーズ、フローセル又はDNA鋳型が伸長するために必要な種々の化学的段階を行うために試薬を通過させる他の構造、又はそれらの組み合わせ等に設置される何れかの適切な表面を含み得る。シーケンシング表面102は、対物レンズ106を介して固定CCD(電荷結合素子)カメラ104によって検査される。CCDカメラセンサは、典型的にはローカルカラーフィルタを含まないので、光強度のみを決定し、波長は決定しない。これは、光フィルタが放射される光の強度を減少させ、典型的にはセンサの空間分解能を低下させるので好ましい。したがって、カメラ104自体は、異なる核酸塩基標識を区別することができず、機器100は、別個のそれぞれの読み取り操作中に、4つの核酸塩基標識のそれぞれを読み取らなければならない。これを行うために、機器100は、それぞれが光源110（例えば、LED光又は同様のもの等）、励起フィルタ112、ダイクロイックミラー114、及びエミッションフィルタ116を有する4つの別個の照明モジュール108を含む。種々の光ガイド120及び同様のものは、光学部品間の光路を遮断するために、システム全体にわたって使用され得る。線Aは、光源110からカメラ104への光の移動経路を示す。
【０００９】
照明モジュール108は、典型的には、それぞれの特定の核酸塩基標識についてエミッション光の強度を最大にするように構成される。例えば、特定の核酸塩基標識が、495ナノメートル(nm)の波長を有する励起光を吸収し、520nmの波長で発光する場合、光源110は、約495nmの波長で高強度の光を放出するために選択されてもよく、励起フィルタ112は、励起光を495nmの狭い周波数帯域周囲にフィルタリングするために選択されてもよく、ダイクロイックミラー114は、約495nmの光を反射し、約520nmの光を透過するように選択されてもよく、及びエミッションフィルタ116は、放出された光を520nmの狭い周波数帯域にフィルタリングするために選択されてもよい。このようなフィルタ及びダイクロイックミラーの使用は、光源108が他の核酸塩基標識を不注意に励起し、誤った読み取りを与えること、又はそうでなければカメラ104の操作を飽和又は影響することを防ぐことができる。
【００１０】
伸長段階の後、シーケンシング表面102は、4つのステップで読み取られる。各読み取り段階の間に、機器100は、異なる照明モジュール108を機械的に移動させて、新しいモジュールのダイクロイックミラー114及びエミッションフィルタ116を対物レンズ106とカメラ104との間に配置する。非常に小さなミスアライメントでさえ、1つの読み取りから次の読み取りまでのDNA鋳型の位置を相関させることが不可能になる可能性があるため、個々の標識を検出するために使用される光学系は、その後の伸長及び/又は読み取り中に個々のDNA鋳型スポットでの読み取りを正確に比較するために、正確かつ反復的にアラインされなければならない。このような光学系は、典型的には高価であり、厳重で頻繁な較正及びサービスを必要とすることがある。
【００１１】
いくつかの機器はまた、可動シーケンシング表面ステージ118及び/又は移動対物レンズ106を使用する。このような運動性は、例えば、カメラ104の視野より大きいシーケンシング表面を検査するため、シーケンシング表面102を他の処理段階中に光学システムから除去することを可能にするため、又はシーケンシング表面102を画像センサと適切に位置合わせするように移動するため、望ましいことがある。このような装置において、種々の光学部品間の高精度で再現可能なアライメントを得るために必要性(demand)が増加する。個々のDNA鋳型を調べて区別するために必要とされる倍率では、表面のわずかなミスアライメントは、光学系の視野に劇的なシフトを引き起こす可能性がある。そのため、固定されたシーケンシング表面102を有さないシステムは、個々のDNA鋳型について正しい塩基対配列を提供するために、各読み取り段階からのデータを計算的に整列させる精巧なソフトウェア技術を必要とすることがある。
【００１２】
装置及び類似の技術の例は、米国特許出願公開第2014/0267669号および第2009/0298131号、及び米国特許第8,940,481号および第8,481,259号に示されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
先行技術はある種の有用な手段および進歩を提供するが、本発明者達は、シーケンシング機器の技術水準を進歩させる必要性が引き続き存在すると判断した。
【発明の概要】
【００１４】
例示的な一実施形態では、多数の共線励起ビームを有する複合光源を有するシーケンシング機器光学システム、それぞれ異なる励起波長を有する各励起ビーム、1つ又はそれ以上の励起ビームによる励起時にそれぞれ異なるエミッション波長でそれぞれのエミッション光を放出するように構成された複数のDNA鋳型及び核酸塩基標識を有するシーケンシング表面、各核酸塩基標識のエミッション光を検出するように構成されたカラーカメラ、共線励起ビームを複合光源からシーケンシング表面に方向付けるように構成された第1の光路、及びシーケンシング表面からの放射光をカラーカメラに方向付けるように構成された第2の光路が提供される。
【００１５】
第一の代表的な実施形態において、複合光源は、4つの共線励起ビームを有し得、複合光源は、第1の光源と、ダイクロイックミラーによって第1の光源と同一線上に導かれた少なくとも1つの追加光源を有し得る。
【００１６】
第一の代表的な実施形態において、該カラーカメラは、複数の感光画素を有するセンサ、及び各カラーフィルタがそれぞれの感光画素に関連付けられている複数のカラーフィルタを有するフィルタアレイを有し得る。カラーフィルタは、赤色カラーフィルタ、緑色カラーフィルタ及び青色カラーフィルタを含み得る。
【００１７】
第一の代表的な実施形態のフィルタアレイは、ハイパースペクトルフィルタであり得る。この実施形態では、カラーフィルタは、いくつかのファブリペロー(Fabry-Perot)スペクトルフィルタであり得る。カラーフィルタは、第1の核酸塩基標識エミッション光に関連する第1の波長を有する光を透過させるように構成された第1の群のフィルタ、第2の核酸塩基標識エミッション光に関連する第2の波長を有する光を透過させるように構成された第2の群のフィルタ、第3の核酸塩基標識エミッション光に関連する第3の波長を有する光を透過させるように構成された第3の群のフィルタ、第4の核酸塩基標識エミッションライトに関連する第4の波長を有する光を透過させるように構成された第4の群のフィルタ、を含み得る。第1、第2、第3及び第4の核酸塩基標識エミッション光に関連する第1、第2、第3及び第4の波長は、それぞれの核酸塩基標識のそれぞれ第1、第2、第3及び第4のピークエミッション波長に対応する波長をそれぞれ含み得る。第1のピークエミッション波長は約525nmであり、第2のピークエミッション波長は約565nmであり、第3のピークエミッション波長は約630nmであり、第4のピークエミッション波長は約680nmであり得る。第1、第2、第3及び第4の波長はまた、それぞれのピークエミッション波長周囲の波長のそれぞれの範囲を含み得る。いくつかの実施例において、それぞれの波長範囲は、20nmの範囲、又は5nmの範囲を超えない可能性がある。波長の範囲は、重なり合う波長を含まなくてもよい。
【００１８】
一実施形態において、フィルタアレイは、モザイクパターンで配置された第1の群のフィルタ、第2の群のフィルタ、第3の群のフィルタ及び第4の群のフィルタを含み得る。別の実施形態において、フィルタの群は、フィルタの各群が連続した行に配置された走査パターンで配置されてもよい。
【００１９】
シーケンシング表面は、カラーカメラに対して第1の方向に移動可能であり、第1の光路は、第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面に共線励起ビームを投影するように構成されたレンズアセンブリを含み得る。
【００２０】
カラーカメラは、複数のセンサを有するマルチセンサカメラであり得る。それらは、異なる波長を有するエミッションライトを受光するように構成された3つ又は4つのセンサであり得る。カラーカメラは、ハイパースペクトルカメラであり得、センサの数は、第1のエミッション波長を検出するように構成された第1のセンサ、第2のエミッション波長を検出するように構成された第2のセンサ、第3のエミッション波長を検出するように構成された第3のセンサ、第4のエミッション波長を検出するように構成された第4のセンサ、を含む。第1、第2、第3及び第4のエミッション波長は、それぞれ第1、第2、第3及び第4核酸塩基標識のそれぞれ第1、第2、第3及び第4ピークエミッション波長を含み得る。第1、第2、第3及び第4の光波長はまた、それぞれ、20nmを超えない又は5nmを超えない波長の範囲を含み得る。第1、第2、第3及び第4の光波長はまた、重なり合う波長を含まなくてもよい。マルチセンサカラーカメラは、それぞれのエミッション光をそれぞれのセンサに方向付けるように構成された複数のプリズムを含み得る。
【００２１】
第1の光路及び第2の光路は、エミッション光を透過するように構成された共用マルチバンドダイクロイックミラーを含み得、シーケンシング表面へ複数の共線励起ビームを反射する。第1の光路及び第2の光路の少なくとも一方は、シーケンシング表面に対して斜めであり得る。
【００２２】
他の例示的な実施形態において、第1の励起波長を有する第1の励起ビーム、第1の励起波長とは異なる第2の励起波長を有する第2の励起ビーム、及びシーケンシング表面を有するシーケンシング機器光学システムを提供する。該シーケンシング表面は、複数のDNA鋳型、第1の励起ビームによる励起時に第1のエミッション波長で第1のエミッション光を放出するように構成された第1の核酸塩基標識、及び第2の励起ビームによる励起時に第2のエミッション波長で第2のエミッション光を放出するように構成された第2の核酸塩基標識を有する。該機器はまた、第1の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面上の第1の位置に投影するように構成された第1のレンズアセンブリ、第2の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面上の第2の位置に投影するように構成された第2のレンズアセンブリ、該第2の位置は該第1の位置とは異なり、及び各核酸塩基標識のエミッション光を検出するように構成され、シーケンシング表面に対して第1の方向に移動可能な状態で構成されたセンサを含む。第1のエミッション波長を透過するように構成された第1のカラーフィルタは、シーケンシング表面上の第1の位置とセンサの第1の部分との間に配置され、及び第2のエミッション波長を透過するように構成された第1のカラーフィルタは、シーケンシング表面上の第2の位置とセンサの第2の部分との間に配置される。
【００２３】
第2の例示的な実施形態において、第3の励起波長を有する第3の励起ビーム、第3の励起ビームによる励起時に第3のエミッション波長で第3のエミッションライトを放出するように構成された第3の核酸塩基標識、第3の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面上の第3の位置に投影するように構成された第3のレンズアセンブリ、第3の位置は、第1の位置及び第2の位置とは異なり、及び第3のエミッション波長を透過するように構成され、シーケンシング表面の第3の位置とセンサの第3の部分との間に位置する第3のカラーフィルタを含み得る。該実施形態はまた、第4の励起波長を有する第4の励起ビーム、第4の励起ビームによる励起時に第4のエミッション波長で第4のエミッションライトを放出するように構成された第4の核酸塩基標識、第4の励起ビームを第1の方向に垂直な線でシーケンシング表面上の第4の位置に投影するように構成された第4のレンズアセンブリ、第4の位置は、第1の位置、第2の位置、及び第3の位置とは異なり、及び第4のエミッション波長を透過するように構成され、シーケンシング表面の第4の位置とセンサの第4の部分との間に位置する第4のカラーフィルタを含み得る。
【００２４】
第2の例示的な実施形態において、1つ又はそれ以上のレンズは、センサの第1の部分で第1の別々の線に沿って第1のエミッション波長を投影するため、及びセンサの第2の部分で第2の別々の線に沿って第2のエミッション波長を投影するために提供され得る。
【００２５】
第1又は第2の例示的な実施形態において、シーケンシング表面を、可動ステージ上に搭載して、シーケンシング表面に対して第1の方向にセンサを移動可能にすることができる。
【００２６】
他の代替案は、本開示を考慮することで当業者に明らかになり得る。
【００２７】
本発明の要約の列挙は、本明細書又は関連する若しくは関連しない何れかの請求項を限定することを意図するものではない。他の態様、実施形態、変更及び請求項の特徴は、本発明の開示を考慮して当業者に明らかになり得る。
【００２８】
例示的な実施形態の良き理解は、添付の図面を参照することによって理解することができ、同様の参照番号は同様の部品を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、従来のシーケンシング機器光学システムの概略図である。
【図２】図2は、機器光学システムの第1の実施形態の概略図である。
【図３】図3は、従来のカラーデジタル画像センサの一部の概略図である。
【図４】図4は、第1のハイパースペクトルデジタル画像センサの一部の概略図である。
【図５】図5は、ファブリペロースペクトルフィルタの概略図である。
【図６】図6は、シーケンシング機器光学システムの第2の実施形態の概略図である。
【図７】図7は、シーケンシング機器光学システムの第3の実施形態の概略図である。
【図８】図8は、シーケンシング機器光学システムの第4の実施形態の概略図である。
【図９】図9は、シーケンシング機器光学システムの第5の実施形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
標識された核酸塩基又は他の化学標識を光学的に読み取るSBS機器及び他の機器は、種々の方法、特に連続した核酸塩基標識読み取りの間に機器の光学的構成要素を機械的に移動させる必要性を低減又は排除することによって有益に改変し得ることを決定してきた。この説明は、スピードの向上、信頼性の向上、精度の向上、低コスト化又は同様のもの等、既存のシステムと比較して1つまたはそれ以上の利点を提供し得る機器光学システムのいくつかの例を提供する。
【００３１】
シーケンシング機器200のための光学システムの第1の例示的な実施形態を、図2に概略的に示す。機器200は、シーケンシングプロセス中に使用される核酸塩基標識の2つ、3つ、又は4つすべてを励起するために選択された1つ又はそれ以上の波長で光を生成する複合光源202を用いる。図示の例において、結合された抗原202は、第1、第2、第3及び第4の光源204を含む。各光源204は、青色（例えば470nm）、緑色（例えば520nm）、黄色（例えば570nm）及び赤色（例えば、615nm）等の核酸塩基標識の1つを励起するために選択された励起波長で光を発するために選択される。核酸塩基標識は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,481,259号に記載されるような蛍光色素（例えば、Alexa488、Cy3、Texas Red及びCy5）又は特定のヌクレオチドに関連する他の組成物を含み得る。これらの又は他の実施形態において、異なる励起及びエミッション波長を有する、当技術分野で知られている又は後で開発される他の組成物、標識及びフルオロフォアを使用し得る。
【００３２】
核塩基標識に用いられるフルオロフォアは、多くの場合、様々な入射波長の範囲によって励起され得る。このように、1種類の核酸塩基標識を励起するために選択された光源はまた、ある程度他の核酸塩基標識を励起する可能性がある。場合によっては、1つのソースを、2つ又はそれ以上の標識を効果的に励起するために用いることが出来る。しかしながら、各個々の核酸塩基標識を励起するために最も効率的な波長で又はその付近で操作される単一の光源を有することがより好ましい。適切な光源204の例は、レーザー、LEDライト、ダイオード、及び所望の波長を放出するように構成又はフィルタされた他の光源を含む。そのような装置は、当該技術分野において公知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。
【００３３】
光源204は、矢印Aによって示されるように、単一の軸に沿った共線である（すなわち、同じ直線に沿ってアラインされた）ビームを放出するように構成される。これは、所望の軸に沿って1つの光源204を向けること、及びミラー206を用いて残りの光源204を同じ軸に沿って方向転換することによって達成され得る。ミラー206は、上流光源の波長が背面を通過するが、リダイレクトされている特定の光源206の波長を反射するダイクロイックミラー又は同様のもの等を含み得る。あるいは、ビームは、それらを1つ又はそれ以上のプリズムに通すことによって、又は当技術分野で知られているような他の方法及び装置によって、共通軸に沿って方向付けられ得る。
【００３４】
各光源204は、好ましくは、単一波長又は非常に狭い範囲の波長（例えば、約20~30nmの範囲内の光）を有する光を生成するように構成される。本明細書で使用する「波長の範囲」は、波長値の差にまたがるスペクトル範囲の連続部分を指す。例えば、20nmを超えない波長の範囲は、波長の組み合わせ強度プロファイルの半値全幅で測定するように、電磁スペクトルの20nm幅の部分（例えば520nmから540nmまで）を含み得る。この測定技術を使用すると、光は依然として定義された範囲外の波長を含み得るが、比較的少量である。これは、狭い範囲の波長（例えば、レーザーダイオード）のみを自然に放出する光源を使用することによって、又は望ましくない波長を取り除くために追加の光学要素を用いることによって達成され得る。例えば、バンドパスフィルタは、光源204とその関連ミラー206との間に配置され得、又はミラー206は、狭い範囲の所望の波長のみを反射するダイクロイックミラーを含み得る。光学フィルタ、ダイクロイックミラー及び同様のもの等は、ニュージャージー州バーリントンのエドモンド・オプティクス社（Edmund Optics Inc.）等の様々な供給元から入手可能である。
【００３５】
共線結合されたビームAは、ビームを対物レンズ106及びシーケンシング表面102に向け直すミラー208で反射される。チップ、ビーズ、フローセル又は他の適切な基材若しくは基材タイプの組み合わせであり得るシーケンシング表面102は、核酸塩基標識が前の伸長段階によって結合された複数のDNA鋳型を含むが、伸長段階中のシーケンシングプロセスを観察するために実施形態を容易に使用し得ることも考慮される。シーケンシング表面102は、任意で、ビームAがシーケンシング表面102に突き当たる点で共線結合ビームAの軸から直交して延びる平坦な平面を含み得る。各核酸塩基標識は、共線結合ビームAによって提供される励起波長の少なくとも1つによって励起され得る。共線結合されたビームAは、入射ビーム波長に感受性の高い核酸塩基標識のすべてを同時に励起し、核酸塩基標識がそれぞれのエミッション波長で蛍光を発する。放出された光は、対物レンズ106を通り、ミラー208を通り、カメラ212に戻る。ミラー208は、好ましくは、共線結合された励起ビームを反射するが、放出された光を核酸塩基標識から透過させる。この目的を達成するために、ミラーは、好ましくは、核酸塩基標識エミッション波長の各々に一致する透過波長を有するマルチバンドダイクロイックミラーを含む。マルチバンド及びクワッドバンドのダイクロイックミラーは、ニューヨーク州バッファローの「Iridian Spectral Technologies of Ottawa、Ontario、Semrock、Inc.」及び他の供給源から入手可能である。1つ又はそれ以上の励起フィルタ(図示しない)は、結合された光源202とミラー208との間の光路において、所望の範囲外の波長を除去するために提供され得る。
【００３６】
ミラー208とカメラ212との間の光路には、1つ又はそれ以上のエミッションフィルタ（図1参照）が設けられ得る。典型的な核酸塩基標識は、広範囲の波長にわたって光を放出するが、光の大部分は、典型的には、特定の波長又は狭い波長帯（「エミッション波長」）で放出される。エミッションフィルタは、エミッション光の範囲をエミッション波長又はエミッション波長周囲の小さい範囲(例えば、20~30nm)に狭めるために用いられ得る。これは、複数の異なる核酸塩基標識によって産生される波長の強度を読み取ることによって生じる可能性がある不明確さを低減するために、4つの核酸塩基標識のそれぞれについてピーク発光値のみにカメラ212に透過される光を制限するのに特に有用であり得る。
【００３７】
4つの波長すべてを通過させる単一のマルチバンドダイクロイックミラーがすべての実施形態で使用され得ないことも想定される。このような実施形態において、複数の異なるミラーを可動ユニット210として提供し、及び連続的な読み取り操作中に核酸塩基標識を読み取るために機械的に所定位置に移動され得る。例えば、1つの代替実施形態は、それぞれが単一のエミッション波長を透過する4つのミラーユニット210を使用し得る。別の代替の実施形態は、それぞれが、２つのエミッション波長を透過する２つのミラーユニット210も使用し得る。複数のミラーが使用される場合、読み取りプロセスは逐次的に操作する。それにもかかわらず、移動部品をミラーのみに限定することは、依然としてコスト、効率、及び正確さの利益を得ることが期待される。他の代替案は、この開示を考慮して当業者には容易に明らかになり得る。
【００３８】
この例におけるカメラ212は、機器内で使用される核酸塩基標識のエミッション波長（例えば、約525nm、約565nm、約630nm、及び約680nm）の全てを同時に検出して区別することができるカラーカメラを含み得る。これにより、単一のダイクロイックミラー208が使用される場合、読み取りプロセスが1ステップで実行されることが可能になる。この目的のために、従来のカラーCCD及びCMOS（相補型金属酸化膜半導体）センサを使用することができる。従来のカラーデジタルカメラは、入射フォトンを検出するフォトサイトのアレイのすぐ上に配置されたカラーフィルタアレイを使用する。カラーフィルタアレイは、赤色スペクトル、緑色スペクトル及び青色スペクトルのフィルタを含む。典型的なカラーカメラセンサでは、センサ画像がヒトの目の光感度の分布をより正確に反映するように、フィルタは、他の色と比較して約2倍の緑色光がセンサに到達するように構成されている。
【００３９】
図3は、典型的な従来のカラーCCDセンサ300の一部を簡略化した概略図である。センサ300は、個々の光受容体である感光性「画素」の層302を含む。画素層302の上には、赤（「R」）、緑（「G」）及び青（「B」）フィルタ（示されたパターンは一般に「バイヤー」フィルタと呼ばれる）のパターンを含むフィルタ層304がある。フィルタ層304は、明瞭化のために画素層302から間隔を空けて示されているが、典型的には層の間に殆ど又は全くギャップがなく、個々の画素はそれぞれ、1つのフィルタを通過する光のみを受光する。各フィルタは、3つの色のうちの1つにピーク透過値を有し、各フィルタは、その下の画素が、フィルタの特定の色の周囲の選択された波長範囲のみを受け取ることを可能にする。このタイプのセンサでは、フィルタ色の位置は、フィルタを通過する波長を有する光の位置と必ずしも一致しないので、サンプリング誤差が生じる可能性がある。例えば、非常に小さい（「ピンポイント」）着色光源は、異なる色のフィルタで覆われた画素に直接衝突し、同じ色のフィルタに部分的にしか衝突せず、光源の小さな強度の測定値に誤ってつながる可能性がある。さらに、フィルタは物理的にお互いオフセットされているので、画像内の光源の物理的位置および強度を表す「フルカラー」画像を生成するために、赤色光、緑色光及び青色光を受光する画素から得られたデータの物理的位置及び強度を補間する必要がある。当技術分野で知られているように、いわゆるデモザイク及びデバイディングアルゴリズムがこの目的のために一般に使用される。このようなアルゴリズムは、元の画像の特徴位置を再構成するのに非常に優れていると考えられるが、元の画像の完全な再構成を提供することはできない。
【００４０】
核酸塩基標識間の色の区別が有意である場合、従来のカラーデジタルセンサを用いて、シーケンシング表面102の視野に存在する核酸塩基標識の全てを同時に読み取ることができる。例示的なプロセスは、以下の段階を含む: 第1、4つの核酸塩基標識のうちの1つを各DNA鋳型に加えるため、４つの標識核酸塩基の全ての存在下でDNA鋳型を伸長する段階; 第2、シーケンシング表面102を4つの光源204の全てで励起する段階; 第3、4つ全ての核酸塩基標識からの放出光を示すシーケンシング表面102の画像を取り込むため、カメラ212を操作する段階; 第4; どの核酸塩基標識が各DNA鋳型と結合しているかを決定するため、画像データを処理する段階; その後、上記段階を繰り返す段階。シーケンシング表面102が対物レンズ106の視野よりも大きい場合、励起及び捕捉の段階は、対物レンズ106又はシーケンシング表面102を動かすことによってシーケンシング表面102に沿った複数の位置で繰り返し得る。あるいは、シーケンシング表面102は、シーケンシング表面102が、稼働ステージ118を用いて移動されるか、又は表面102上の光学系を横断することによって時間依存性の画像配列を取り込むことによって走査され得る。典型的なSBS機器で使用される他の段階は、明確にするために省略されているが、当業者には理解されるように、プロセスに含められ得る。
【００４１】
場合によっては、従来のカラーデジタルセンサは、特定の核酸塩基標識によって放出される異なる波長を正確に区別することができないことが予想される。この理由の1つは、従来のカラーデジタルカメラの赤色、緑色及び青色のフィルタが、典型的にスペクトル範囲内に著しい量の重なりを有する広いスペクトル範囲（例えば、「赤」、「緑」、および「青」フィルタの全ては、約540nmの中央の緑色範囲内のいくつかの光を透過し得る）を有するためであると予想する。これにより、色彩値間のクロストークが生じ、最終的な色彩決定において不確実性が生じる。したがって、従来のカラーセンサは、黄色スペクトル及び緑色スペクトルの特定のエミッション波長間で所望の精度で区別することができないことがある。そのような場合、上記のプロセスは、第1、第2、第3及び第4光源204のそれぞれを順次選択的に作動さることによって、及び4つの光源活性化サイクルのそれぞれの間に1回、シーケンシング表面102の画像を取り込むためにカメラ212を操作することによって改変され得る。この技術を使用すると、4つの核酸塩基ラベルすべてを、部品の動きを必要とせずに素早く読み取ることが可能である。あるいは、従来のカラーセンサでは、いくつかのエミッション波長を区別することが出来るが、他は出来ない場合、光源204は、識別問題を示さない群(例えば、第1のサイクルにおいて、「青」、「黄」及び「赤」、並びに第2のサイクルにおいて「緑」を活性化し、又は第1のサイクルにおいて「青」及び「黄」、並びに第2のサイクルで「緑」及び「赤」を活性化する)で活性化され得、及びカメラ212は、一度に2種類の核酸塩基標識を読み取るために、活性化サイクルごとに核酸塩基標識を1回読み取るように操作され得る。さらに、光源204が群で操作される場合、実施形態はまた、各光活性化サイクルの間に光路に選択的に移動される複数の適切な2パスダイクロイックミラー208を使用することが出来る。他の代替案は、本開示を考慮すれば当業者には明らかになり得る。
【００４２】
あるいは、カメラ212は、機器で使用される核酸塩基標識のエミッション波長を直接好ましくはそれらのエミッション波長のみを検出するように構成されたハイパースペクトルカメラを含み得る。従来のカラーカメラとは異なり、ハイパースペクトルカメラは、赤、緑及び青のフィルタを通過した色情報を補間することなく、特定の波長を直接検出することが可能である。例えば、図4に示すように、ハイパースペクトルカメラセンサ400は、一般に従来のセンサ層402を使用することができるが、従来のフィルタ層304を、核酸塩基標識によって放出された波長λ1、λ2、λ3、λ4を通過させるために調整されたフィルタアレイ404で置換し、センサ層402上の画素を分離する。各波長λ1、λ2、λ3、λ4は、各核酸塩基標識についてのエミッション光のピーク値に対応するように選択することができるが、他の値を選択し得ることは理解されよう。一例では、これらの波長は、約525nmを含む第1の範囲、約565nmを含む第2の範囲、約630nmを含む第3の範囲、および約680nmを含む第4の範囲を含むが、他の実施形態は異なる波長を使用することが出来る。
【００４３】
各波長λ1、λ2、λ3、λ4は、波長の範囲を含み得ることも理解されよう。例えば、各波長λ1、λ2、λ3、λ4は、核酸塩基標識のうちの1つについてのピークエミッション値と、ピーク値周囲の約20nmを超えない範囲とを含み得る。これは、光強度を過度に低下させることなく、異なる核酸塩基標識のより大きな差異をもたらすことが期待される。より大きな識別が望まれる場合、ピーク値周囲の範囲は、約5nmを超えない範囲に縮小され得るが、この実施形態では、シグナル対ノイズ比が低減され得る。1つ又はそれ以上の波長λ1、λ2、λ3、λ4が、特定の核酸塩基標識についてピークエミッション波長を含まない波長の範囲を含むことも想定される。これは、第1の核酸塩基標識のピークエミッション波長が第2の核酸塩基標識の顕著なエミッション強度に近い場合に有用であり得るが、そうでなければ、第1の核酸塩基標識エミッション範囲は、第2の核酸塩基標識エミッション範囲からより明確な、比較的強くて読み取り可能な領域を含む。他の代替案は、本開示を考慮すれば当業者に明らかになるであろう。波長λ1、λ2、λ3、λ4が重なり合う波長を含まないことも、厳密には要求されないが、好ましい。本明細書で使用されるように、「重なり合う波長」は、特定の波長の何れかにおける有意な量の光強度の重なりを含む（例えば、透過された波長範囲の半値全幅で重なり合う）。わずかな重なりは、所望の範囲外の波長を反射又は阻止する際に100％の効率を提供しないミラー又はフィルタが原因となり生じる可能性があり、そのような非効率性が分析された画像データに相当な変化をもたらさない場合、そのような非効率性は「重なり合う波長」をもたらすとは考慮され得ない。
【００４４】
ハイパースペクトルフィルタアレイ404は、例えば、狭い範囲の波長のみをそれぞれ透過する複数のファブリペロースペクトルフィルタを含み得る（例えば、5〜20nmFWHM（半値全幅））。ファブリペローフィルタの一例を図5に示す。この例において、フィルタ500は、間隔Lを隔ててギャップ506を形成する平行な第1及び第2の鏡面502、504を備える。光は、表面502の1つを通過し、ギャップ506に入る。ギャップ506の内部では、多重干渉がフィルタ出力スペクトル特性を狭い波長帯域にわたり急激にピークすることを引き起こす。透過波長は、既知の方程式にしたがって、入射角θ及び表面502、504間の距離Lに依存する。ファブリペロースペクトルフィルタを介して透過される波長の範囲は、狭い透過帯域を生じるより反射性の面を有する表面502、504の反射率を調節することによって調整することができる(ハイヤー「フィネス」とも呼ばれる)。そのようなファブリペローフィルタ及び他の適切な装置は、当技術分野で知られており、本明細書では、これ以上説明する必要はない。適切なハイパースペクトルフィルタは、「IMEC International of Heverlee、Belgium」から入手可能である。他の実施形態では、ハイパースペクトルフィルタアレイ404は、さらに多くの波長を検出するように構成され得る。
【００４５】
ハイパースペクトルセンサは、画像によって生成される光源の波長を決定するために赤色、緑色及び青色のデータを補間する必要がなく、色精度を改善し、入力信号を解釈するのに必要な処理パワーを低減できるという利点を有する。比較的に近い間隔のエミッション波長を有する核酸塩基標識を用いるシーケンシングシステムにおいて、エミッション波長に調整されたセンサ画素を有するハイパースペクトルセンサは、エミッション波長間を区別することが出来、どの塩基標識が各DNA鋳型と結合したかを正確に決定するのに適した出力を提供することが期待される。個々のエミッション波長の別個の検出はまた、スペクトルクロストーク分析のために色「チャネル」間のスペクトル情報を使用することの可能性、例えば、異なる核酸塩基標識の全ての強度に対する各個々の励起ビーム波長の影響を決定するための分析等を提供する。この種の分析は、クロストークパラメータ及び関係を確立し、リアルタイムでエミッション信号強度を再計算するために使用することができる。さらに、ハイパースペクトルカメラは、波長がヒトの目に見えるか否かにかかわらず、実質的に任意の波長で放出する核酸塩基標識を読み取るために調整され得る。
【００４６】
図4の実施例において、ハイパースペクトルフィルタアレイ404は、フィルタのモザイクパターンを使用する。したがって、検出された光源の位置をより正確に決定するために、生データに対してデモザイクアルゴリズムを実行することが必要な場合がある。
【００４７】
図6に示すさらなる実施形態は、図2の実施形態と概して同じであるが、機器600は、単一センサカメラ212ではなく複数のセンサカメラ602を使用する。例示された複数センサカメラ602は、放射光を、シーケンシングプロセスで使用される核酸塩基標識によって放射される4つの異なる波長λ1、λ2、λ3、λ4に分離するプリズム604の配置を有するハイパースペクトルカメラである。前述のとおり、波長λ1、λ2、λ3、λ4のそれぞれは、核酸塩基標識のそれぞれ1つのピーク発光波長を含むことができ、又は波長範囲（例えば、約20nm以下、又は約5nm以下）であり得、波長範囲は重ならないことが好ましい。ダイクロイックリフレクター606は、ノッチフィルタ（すなわち、特定の狭い範囲の波長を反射するフィルタ）、ローパスフィルタ、ハイパスフィルタ、又はそれらの組み合わせを含み得る。4つのセンサ608は、各センサ608上の各画素が他のセンサ608上の同じ画素と相関するように光学的にアラインさせることができるので、1つのセンサ608から他のセンサ608への画像を比較する際に核酸塩基標識位置を再マップする必要はない。しかしながら、センサ608が光学的にアラインされていなくても、画像を数学的に再マップするのは常套手段である。ダイクロイックプリズムセパレータを使用する複数のセンサカメラ及び複数のセンサ（4センサカメラを含む）は、「JAI A/S of Copenhagen, Denmark」及び「Hamamatsu Photonics K.K. of Hamamatsu, Japan」等の会社から購入可能である。
【００４８】
マルチセンサカメラ602は、多くの利点を提供することが期待される。例えば、各センサ608の各画素は、センサ608に送信される光の全てを検出するので、核酸塩基標識の正確な位置を再構成するための何れかのデモザイク処理を行う必要はない。他のすべてが等しい場合、これは、モザイクフィルタを使用するシステムより幾分高い解像度の画像及び大きな幾何精度を提供し、ピンポイントカラーの光のみが（又はほとんどが）その波長を遮断するフィルタに当たるときに起こり得る忠実性の損失を回避することができる。別個のセンサは、近くの画素が異なる波長の色によって照明されるときに生じる可能性のある照射画素の周囲の画素間クロストーク及びノイズ生成の影響を受けにくいと予想される。別個のセンサは、それぞれの波長の異なる光強度を説明(account)するために個別に較正（例えば、ゲインコントロール等）することが出来、リアルタイムで信号強度を調節することが出来る。他の特徴及び利点は、本開示を考慮して当業者には明らかであろう。
【００４９】
別個のセンサ608の使用はまた、色収差等の波長依存現象の比較的簡単な較正及び補正を可能にする。色収差は、レンズが異なる波長の光を正確に同じ点でフォーカスしない場合に生じる。フルカラー画像においてこれは、典型的に、光がレンズによってより大きな角度に曲げられる画像フレームの外周に向かって色のフリンジとして現れる。典型的なSBS操作のスケールでは、色収差は非常に重要であり得る。例えば、青色スペクトルで発光する核酸塩基標識は、赤色スペクトルで発光する近くの核酸塩基標識と同じ位置に現れることがあり、誤った読み取りを引き起こす可能性がある。色ごとに異なるセンサを用いる場合、色収差による光学的歪みを比較的簡単に補正することができる。例えば、核酸塩基標識位置を同定するためにデータが組み合わされる前に、センサは、収差を除去するために別々に合わせることが出来、又は従来のアルゴリズムを用いて各センサからのデータを別々に調節して、収差を低減又は削除することが出来る。
【００５０】
複数のセンサカメラ602を使用する他の実施形態は、1つ又はそれ以上の三角プリズム、又は同様のもの等を使用して成分光波長を分離し得る。また、複数のセンサカメラ602が、ハイパースペクトルカメラである必要はない。複数センサカメラ602の他の実施形態は、赤色、緑色及び青色波長を収集するために3つのセンサを有し、このデータを用いてフルカラー合成画像を生成して核酸塩基標識を読み取ることができる。この実施形態は、色分けの問題の対象になる可能性があり、このような問題は、図2に関連して上述したように光源を連続的に操作することによって克服され得る。核酸塩基標識のすべてについて同時に読み取りを行う能力は、ダイクロイックミラー208が4つの波長全てを一度に透過できるかどうかに依存することも理解されよう。もしそうでなければ、上述のように少なくとも部分的に一連でプロセスを実行し、読み取り間でミラー208を変更する必要があり得る。
【００５１】
図2の実施形態は、励起ビームをシーケンシング表面102に方向付けるために第1の経路、エミッション光をカメラ212に方向付けるために使用する。第1及び第2の光路は共に、励起ビームを対物レンズの方向に、かつエミッションビーム経路の少なくとも一部と平行に方向付けるために用いられる共有ダイクロイックミラー208を含む。別の実施形態では、共有ダイクロイックミラー208を省略することができる。例えば、機器の別の実施形態を図7に示す。機器700は、従来のシーケンシング面102及び対物レンズ106を含み、ビームを方向付けるため光ガイド120又は他の特徴を含み得る。この実施形態において、結合された励起ビームAは、ダイクロイックミラーによって反射されて放出されたビーム経路に平行に進むのではなく、シーケンシング表面102に直接読み取る第1の光路に沿って透過される。集束光学系、マルチバンドフィルタ及び同様のもの等（図示せず）は、第1の光路に沿って設けられ得る。この実施形態において、第1の光路は、好ましくは、放出された光をカメラ702に向ける第2の光路から完全に分離される。ここでは、複合光源202は、励起ビームAをシーケンシング表面102に向かって斜めに方向付けるために回転させられ（光源自体を回転させることによって、またはレンズ、プリズム、ミラーなどの光学素子を使用してビームを方向転換することによって）、及び対物レンズは、シーケンシング表面102に対して垂直に進む放出ビームを読み取るために向けられる。他の実施形態において、励起ビームAはシーケンシング表面102に垂直に方向付けられ、放出されたビーム経路はシーケンシング表面102に対して斜めに傾けられてもよく、又は励起ビームA及び放出ビーム経路の両方が斜めに方向付けられてもよい。他の軸外アレンジメント及び代替例は、本開示を考慮して当業者によって理解されるであろう。
【００５２】
機器700はまた、カメラ702を含み、カメラ702は、従来のカラーデジタルセンサカメラ、ハイパースペクトルセンサカメラ、従来のマルチセンサカメラ、またはハイパースペクトルマルチセンサカメラであってもよい。機器700は、本明細書で以前に説明したのと同様に動作することができるが、ダイクロイックミラーを取り外すことは、コストを削減し、機器設計を単純化することが期待される。必要に応じて、1つ又はそれ以上の励起フィルタ、エミッションフィルタ、又は他の光学的構成要素をまた、光源202からシーケンシング表面102まで、及びシーケンシング表面102からカメラ702までの光路に設けてもよい。他の代替案は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【００５３】
軸外機器のさらなる例を図8に示す。機器800は、移動するシーケンシング表面102の連続走査の間に2つの異なる核酸塩基標識色を同時に読み取るように構成される。シーケンシング表面102は、可動ステージ118上に取り付けられているが、あるいは、シーケンシング表面102は静止していてもよく、光学システム構成要素は動かされてもよい。機器800は、励起光を曲げて進行方向に垂直に延びる線を形成する線形光学系804(例えば、円柱レンズ)を介してシーケンシング表面102に向けられ、シーケンシング表面102の幅全体又は部分的に横断する2つの光源802を有する。必要に応じて又は必要であれば、集光レンズ806、励起フィルタ808又は他の光学部品を、光源802とシーケンシング表面102との間のビーム経路に設けることも出来る。
【００５４】
シーケンシング表面102からの放出光は、対物レンズ810によって投影レンズ812に向けて集束され、次にカメラセンサ814(例えば、CCD又はCMOSセンサ)に集束される。エミッションフィルタ818及びビーム集束又は整形レンズ等の追加の光学的特徴もまた、シーケンシング表面102からカメラセンサ814までの光路に含まれ得る。投影レンズ812とセンサ814との間には、2つのエミッションビームフィルタ816が設けられている。各エミッションビームフィルタ816は、光源802のうちの1つの活性化によって生成されるエミッション光を透過するために選択される。例えば、左側の光源802は、第1の励起波長で、第1の核酸塩基標識が第1のエミッション波長で光を放出することを引き起こす光を放出し得、及び右側の光源802は、第2の励起波長で、第2の核酸塩基標識が第1のエミッション波長と異なる第2のエミッション波長で、光を放出することを引き起こす光を放出し得る。
【００５５】
使用において、各光源802は、シーケンシング表面102に沿った別個の位置で線状ビームをシーケンシング表面102に投射して、その位置で核酸塩基標識を励起する。対物レンズ810及び投射レンズ812は、核酸塩基標識によって放出された光を、エミッションフィルタ816を介してセンサ814に透過する。右側のエミッションビームフィルタ816は、第1の発光波長をセンサ814の第1の部分に通すように構成され、左側のエミッションビームフィルタ816は、第2の発光波長をセンサ814の第2部分に通すように構成される。レンズ810、812は、放出された光がシーケンシング面102の第1及び第2部分に当たる別々の線状ビームを生成するように構成される。分離された励起ビーム及び分離されたエミッションビームのこの配置は、いくつかの利点を提供する。例えば、励起ビームが4つの異なる核酸塩基標識のうちの1つ以上を励起する場合に起こり得る誤った読み取りを防止することに役立つ。また、センサのノイズや関連する問題を防ぐために、センサの画像を分離するのにも役立つ。しかしながら、すべての実施形態において、励起ビームの位置を分離することが厳密に要求されるわけではないことは理解されよう。
【００５６】
シーケンシング面102が対物レンズ810に対して移動されると、センサ814は、一連の画像を生成するためにシーケンシング表面102の全幅又は部分幅にわたって連続的に走査する。この時間依存性の画像セットは、回線走査で知られているアルゴリズムを使用して核酸塩基標識の位置の2次元マップに容易に一緒に対照され得る。センサ814は、これらの2次元画像を2つの異なる核酸塩基標識について同時に読み取り、各ラベルのエミッション波長は、センサ814上の異なる位置で検出される。
【００５７】
図8の実施形態は、4つの核酸塩基標識波長全てを読み取るように改変され得る。例えば、各光源802は、2つの励起波長を放出するために変更され得、1つの光源802は、４つの波長全てを放出するために提供され得、又は1つの光源802は、3つ励起波長を提供し得並びに他の光源は、1つの励起波長を含み得る。それら実施形態において、センサは、上述したような従来のカラーセンサ又はハイパースペクトルセンサと置き換えられ得る。他の実施例として、2つ以上の光源セットを、シーケンシング表面102上の2つ以上の異なる位置で別々の励起ビームを投影するために設けてもよく、放出光を、適切なエミッションフィルタを通過した後に、センサ814上の2つ以上の異なる位置で読み取ることが出来る。
【００５８】
図8の実施形態はまた、ハイパースペクトル又は通常カラーセンサを使用するために改変され得る。カラーセンサは、モザイクセンサ（例えば、図3及び図4参照）として、または走査センサとして構成され得る。例えば、図9は、走査センサとして配置されたハイパースペクトルフィルタ902を使用する走査機器900を示す。この実施例において、組み合わされた光源202は、ライン形状の光学レンズ804を介してシーケンシング表面102に4つの励起波長を投射する。核酸塩基標識は、対物レンズ810、放射フィルタ818、及び投射レンズ812を介してセンサ814にエミッション光を放出する。走査ハイパースペクトルフィルタ902は、センサ814に隣接して配置される。走査ハイパースペクトルフィルタ902は、図4に関連して説明したフィルタと同様であるが、異なるファブリペロースペクトルフィルタをモザイクパターンで配置する代わりに、可動ステージ118に対して垂直に延びる4列に配置される。シーケンシングシップ(sequencing ship)102が走査されると、走査ハイパースペクトルフィルタ902の各行は、4つの核酸塩基発色団のうちの1つを隣接するセンサ画素に連続的に透過して、それぞれの波長を放出する核酸塩基標識の位置の時間依存性の画像セットを生成する。次いで、各波長の時間依存性の画像セットを、回線走査技術で知られているアルゴリズムを使用して、核酸塩基標識の各タイプに関しての2次元マップに対照することが出来た。この実施例において、投影レンズ812は、放出された光ビームを、焦点をずらし、4つの列のスペクトルフィルタを横切ってそれらを分配するライン形状(例えば、円柱形)レンズを含み得る。他の光学系及び配置は、本開示を考慮して当業者によって容易に理解されるであろう。
【００５９】
図8及び図9に関連して提供され説明される例示的な実施形態は、結果として得られる画像をデモザイク処理する必要がないため、モザイク状のパターン化フィルタを使用する従来のカラーセンサ及びハイパースペクトルセンサに優る利点を提供することが期待される。これらの実施形態はまた、画像データを、ダイクロイックプリズム及び複数のセンサを用いることなく異なる波長を分離及び読み取るために対照され得るため、マルチセンサカメラシステムに優る利点を提供し得る（ただし、このような装置は、図8及び図9の実施形態では依然として使用可能である）。しかしながら、より堅牢で能動的なフォーカシングコントロールを提供して、核酸塩基標識が走査操作中に焦点を維持することを保証することが必要な場合がある。また、連続的な伸長プロセスの後に生成された走査画像をアラインするためにより機械的で計算的に含まれ得る。これら及び他の考慮事項は、本開示を考慮して当業者には理解されるであろう。
【００６０】
本開示は、単独で又は一緒に使用され得る複数の新規、有用並びに非自明な複数の特徴及び/又は特徴の組み合わせを記載する。実施形態は、ハイスループットシーケンシングシステムの状況で処理速度を増加させるために特に有用であると予想されるが、他の利点が提供されてもよく、全ての実施形態において増加した処理速度が必ずしも要求されないことを理解されたい。本明細書に記載された実施形態は、合成プロセスによるシーケンシングの状況において一般的に説明されてきたが、実施形態が、化学標識の視覚的観察を用いる他のシーケンシングプロセスでの使用のように構成され得ることが理解されよう。本明細書に記載の実施形態は全て例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本明細書に記載された発明は、様々な等価な方法で修正され、適合され得、そのような改変及び適合は全て、本開示の範囲及び添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されることが理解される。
【図１】
2018533969.tif 000002
【図２】
2018533969.tif 000003
【図３】
2018533969.tif 000004
【図４】
2018533969.tif 000005
【図５】
2018533969.tif 000006
【図６】
2018533969.tif 000007
【図７】
2018533969.tif 000008
【図８】
2018533969.tif 000009
【図９】
2018533969.tif 000010
【国際調査報告】
2018533969.tif 000011
2018533969.tif 000012
2018533969.tif 000013
2018533969.tif 000014
2018533969.tif 000015