(57)【要約】  本発明は、脂肪由来幹細胞(ＡＳＣ)および組成物ならびに治療のためのそのようなＡＳＣおよび組成物を製造および使用する方法に関する。
2018531269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度でプロテインフリークリオ保護剤中に実質的に均質かつ免疫抑制性の成人脂肪組織由来幹細胞(ＡＳＣ)集団の懸濁液を含む、組成物。
【請求項２】
ＡＳＣ集団の少なくとも約８０％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、ＡＳＣ集団の多くて約１５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、ＣＤ３１およびＣＤ３６を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＡＳＣ集団において、
少なくとも９０％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現し、多くて５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ３１を発現し、多くて１０％がＣＤ１０６を発現し、２〜１５％がＣＤ３６を発現し、少なくとも１０％がＣＤ１４６を発現し、少なくとも８０％がＣＤ１０５を発現し、多くて４０％がＣＤ３４を発現する；および／または
少なくとも９０％がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現し、少なくとも６０％がＣＤ２５８およびＣＤ２７０を発現し、少なくとも５％がＣＤ２００を発現し、多くて１５％がＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ２７４、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現し、多くて３０％がＣＸＣＲ４を発現する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
インターフェロン−ガンマ刺激により、ＣＤ２７４を発現するＡＳＣ集団のパーセンテージが少なくとも８０％に増加し、ＣＤ５４陽性細胞におけるＣＤ５４の発現レベルが少なくとも２５倍増加する、請求項１〜３の何れかに記載の組成物。
【請求項５】
解凍直後、幹細胞集団の少なくとも８０％が生存可能細胞であり、幹細胞集団が４８時間培養したとき少なくとも１の集団倍加を有する、請求項１〜４の何れかに記載の組成物。
【請求項６】
クリオ保護剤がTrolox(６−ヒドロキシ−２,５,７,８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸)、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋１Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシンおよびグルタチオンおよび約５％〜約１５％ＤＭＳＯを含む、請求項１〜５の何れかに記載の組成物。
【請求項７】
医薬組成物である、請求項１〜６の何れかに記載の組成物。
【請求項８】
凍結される、請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
【請求項９】
凍結条件下に保存される複数のバイアルを含み、各バイアルが約５mLの請求項７に記載の組成物を含み、ここで、細胞濃度が約２.０×１０７〜約２.５×１０７細胞／mL範囲である、細胞バンク。
【請求項１０】
(ｉ)ドナーから採取した吸引脂肪組織の間質血管細胞群(ＳＶＦ)を、少なくとも一表面が成人幹細胞の接着が促進されるように前処理されているバイオリアクターに添加し；
(ii)バイオリアクターにおいて、接着細胞をヒト血小板ライセートを添加した無血清培養培地においてコンフルエントまで培養し；
(iii)接着細胞を剥離し；
(iv)剥離した細胞を、クリオ保護剤中少なくとも１×１０６細胞／mLの濃度で凍結させ；
(ｖ)凍結細胞を解凍し、工程(ii)および(iii)および所望により(iv)を少なくとも１回繰り返し、
(vi)剥離した細胞を少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度で凍結させ；そして
(vii)所望により、凍結組成物を解凍する
工程を含む、実質的に均質な成人幹細胞集団を含む組成物を製造する方法。
【請求項１１】
ａ)バイオリアクターの少なくとも一表面タンパク質を、クリオ沈降物を含むまたはそれからなる組成物で前処理し；
ｂ)培養培地が約２％〜約１５％ヒト血小板ライセートを含み；
ｃ)クリオ保護剤が約５％〜約１５％ＤＭＳＯおよびTrolox(６−ヒドロキシ−２,５,７,８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸)、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋１Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシンおよびグルタチオンを含み；
ｄ)工程(ｖ)において、凍結細胞を解凍し、工程(ii)および(iii)を１回実施するか；または
ｅ)(ａ)〜(ｄ)の任意の２以上の組み合わせである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法により得たまたは得られる、クリオ保護剤中に実質的に均質な成人幹細胞集団の懸濁液を含む、組成物。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項１〜８および１２の何れかに記載の組成物。
【請求項１４】
組織再生、免疫抑制におよび／または抗炎症剤として使用する、請求項１〜８および１２の何れかに記載の組成物。
【請求項１５】
対象における虚血性組織障害、組織機能不全または破壊障害、自己免疫性障害、移植片拒絶および炎症性疾患または障害から選択される疾患または障害の処置または予防に使用するための、請求項１〜８および１２の何れかに記載の組成物。
【請求項１６】
疾患または障害が虚血性心疾患、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、重症虚血肢、虚血性創傷、虚血再灌流障害／原発臓器移植機能不全、椎間板修復、非虚血性拡張型心筋症、関節軟骨障害、クローン病、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、腎疾患、リウマチ性関節炎、移植臓器の拒絶、II型糖尿病、肺動脈性高血圧および敗血症からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
疾患または障害が虚血性心疾患であり、多くて約５mL中約５×１０７〜約５×１０８細胞が心筋内注射により対象に投与される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
対象が脂肪組織のドナーではない、請求項１５〜１７の何れかに使用するための組成物。
【請求項１９】
患者への投与を少なくとも１回繰り返し、所望により脂肪組織が異なるドナーからである、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、脂肪由来幹細胞(ＡＳＣ)および組成物ならびに治療のためのそのようなＡＳＣおよび組成物を製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多数の前臨床試験において、骨髄(ＭＳＣ)ならびに脂肪組織からの間葉性間質細胞が強い再生能を有することが確立されている。両組織起源の間葉性間質細胞は、マトリクスリモデリング、血行再建および免疫調節を含む天然内在性修復機構を促進する細胞外物質を放出する、傍分泌機構を介して再生を改善する。
【０００３】
ＭＳＣは、重篤な安定型冠動脈疾患および難治性アンギナおよび慢性虚血性心不全の処置に安全かつ効率的であることが証明されている(例えば、Mathiasen et al., 2012; Mathiasen et al., 2013)。ＡＳＣでの慢性心筋虚血の処置の臨床的安全性も、同様に実証されている(Qayyum et al., 2012; Ekblond, 2015)。ＭＳＣはまた、樹状細胞成熟ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞増殖を阻害または停止させる能力に由来する免疫抑制性質を有し、多種多様な自己免疫性または他の炎症性障害の処置について探索されている(Gebler et al., 2012; Wang et al., 2014)。
【０００４】
しかしながら、現在のＡＳＣ産生方法および臨床現場への配送は最適にはほど遠く、このタイプの処置の広い普及が妨げられている。従って、広範な治療適用に適する高品質同種異系間ＡＳＣ製剤を製造および保存する安全かつ効率的方法が必要とされている。
【０００５】
ＷＯ２０１４／２０３２６７号(Kaziak Research PVT Ltd.)は、ヒト脂肪組織由来ＭＳＣの単離、精製および産業規模増殖のための方法およびＩ型糖尿病、重症虚血肢および他の障害の処置におけるそれらの使用に関する。
【０００６】
ＷＯ２００６／０３７６４９号(Cellerix S.L.およびUniversidad Autonoma de Madrid)は、あるマーカーにより特徴付けられる、非骨軟骨間葉性組織からの多能性細胞の同定および単離に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この分野におけるこれらおよび他の進歩にもかかわらず、ＡＳＣのための新規製造および製剤テクノロジーがなお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明者らにより、ＡＳＣの高品質“即納可”製剤が効率的に、高濃度で、プロテインフリーのクリオ保護剤(cryoprotectant)中で生産され、凍結できることが発見された。凍結ＡＳＣ製剤は、解凍されたとき、即時臨床使用可である。さらに、ＡＳＣ製剤は免疫抑制性質を有し、例えば、免疫抑制性治療における自己および同種使用の両方に適するものとなる。
【０００９】
従って、第一の態様において、本発明は、次の
(ｉ)ドナーから採取した吸引脂肪組織の間質血管細胞群(ＳＶＦ)を、所望によりＡＳＣ接着が促進するように表面が前処理されているバイオリアクターに添加し；
(ii)バイオリアクターにおいて、接着細胞をヒト血小板ライセートを添加した無血清培養培地においてコンフルエントまで培養し；
(iii)接着細胞を剥離し；
(iv)剥離した細胞を、クリオ保護剤中少なくとも１×１０６細胞／mLの濃度で凍結させ；
(ｖ)凍結細胞を解凍し、工程(ii)および(iii)および所望により(iv)を少なくとも１回繰り返し、
(vi)剥離した細胞を少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度で凍結させ；そして
(vii)所望により、凍結組成物を解凍する
工程の１以上を含む、実質的に均質な成人幹細胞集団を含む組成物を製造する方法に関する。
【００１０】
第二の態様において、本発明は、プロテインフリーのクリオ保護剤中、ドナーから採取した脂肪組織から単離した実質的に均質な成人幹細胞集団の懸濁液を含む医薬組成物などの組成物に関し、ここで、細胞濃度は少なくとも１×１０７細胞／mLである。組成物は所望により凍結される。ある実施態様において、組成物は、第一の態様の方法を使用して製造される。
【００１１】
第三の態様において、本発明は、例えば、自己免疫性または他の炎症性障害の処置のための、免疫抑制のためのおよび虚血性障害または組織破壊により特徴付けられる他の障害の処置のための、医薬としてのこのような組成物の使用に関する。ある実施態様において、組成物を、虚血性心疾患の処置方法において使用し、一般に組成物を直接心筋内注射により投与する。特に企図されるのは、同種治療、すなわち、ＡＳＣのドナーが組成物を投与する患者ではない場合である。
【００１２】
第四の態様において、本発明は、ドナーから採取した脂肪組織から単離した、実質的に均質なヒト幹細胞集団に関し、ここで、ＡＳＣ集団の少なくとも約８０％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、ＡＳＣ集団の多くて約１５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、ＣＤ３１およびＣＤ３６を発現する。ある実施態様において、幹細胞集団は、第一の態様の方法を使用して製造される。
【００１３】
これらおよび他の態様および実施態様を下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のある実施態様によるＡＳＣ産生方法を記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明は、細胞バンクでの凍結保存に適する組成物であって、一般にＡＳＣのバイオリアクター中での凍結保存工程により分離される２ラウンドの増殖による、健常ドナーから単離したＡＳＣに基づく幹細胞生成物に関する。生成物は、例えば、心不全を伴うまたは伴わない心疾患などの虚血または他の組織破壊により特徴付けられる障害または疾患の再生治療、自己免疫性反応または移植片拒絶の免疫抑制または炎症性疾患の抗炎症性治療のための、同種治療薬物として有用である。特に、ＡＳＣ組成物は、例えば、液体窒素中で保存される即納可凍結保存製品として使用でき、解凍後直ぐに使用できる。次いで、ＡＳＣ組成物を静脈内、動脈内または組織、例えば、心筋への直接注射または点滴により投与できる。
【００１６】
さらに、本発明による異なるドナーからの多くのＡＳＣ製剤を保有する細胞バンクは、例えば、レシピエントの処置前にドナーとレシピエントの組織マッチングを可能にすることにより個別化処置を提供でき、レシピエントが数処置を必要とするならば、ＡＳＣをあるドナーから他のドナーにスイッチする可能性もある。後者は、レシピエントが初期に投与したＡＳＣ製剤からのＡＳＣに同種抗体応答を獲得したとき、特に有用である。
【００１７】
定義
“ＡＳＣ”、“脂肪組織由来幹細胞”、“脂肪組織由来間質細胞”などは、脂肪組織由来である、間葉性幹細胞、多能性間質細胞、多能性幹細胞および間葉性間質／幹細胞としても知られる多能性間質幹細胞をいう。ＡＳＣを同定するある基準が当分野で知られ、例えば、Bourin et al. (2013)に記載され、これは全体として引用により本明細書に包含させる。ある実施態様において、ＡＳＣは、適切な条件下、脂肪細胞、軟骨芽細胞および造骨細胞分化系列に添って分化する能力により特徴付けられる。培養物におけるＡＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５の１以上の細胞表面マーカーを発現し、ＣＤ４５およびＣＤ３１の発現を欠くことにより特徴付けられ得る。ある実施態様において、それらは骨髄由来ＭＳＣと、ＣＤ３６陽性およびＣＤ１０６陰性により区別できる。
【００１８】
ここに記載する本発明の方法により製造した幹細胞集団は、“実質的に均質”であり、細胞の大部分がＡＳＣ標準に合うことを意味する。一般に、本発明による実質的に均質なＡＳＣ集団は、ＡＳＣ集団の少なくとも約８０％がＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、および場合により、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、ＡＳＣ集団の多くて約１５％がＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ１４およびＣＤ１９を発現することにより特徴付けられる。本発明のあるＡＳＣ集団において、１以上のＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲが、ＡＳＣ集団の少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９７％またはそれ以上で発現され得る。同様に、本発明のあるＡＳＣ集団において、１以上のＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、ＣＤ３１およびＣＤ３６は、ＡＳＣ集団の多くて約１５％、例えば多くて約１２％、例えば多くて約１０％、例えば多くて約７％、例えば多くて約５％、例えば多くて約３％またはそれ以下で発現され得る。これらおよび他のマーカーについて企図される特定の範囲は、表１５および２０に示すとおり、ＡＳＣ集団の最小および最大発現パーセンテージにより規定されるものである。
【００１９】
“脂肪”は、あらゆる脂肪組織を意味する。脂肪組織は、腹部領域または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色脂肪組織であり得る。ある実施態様において、脂肪は皮下白色脂肪組織または内臓脂肪組織または脂肪細胞を含む任意の他の組織であり得る。脂肪組織は如何なる哺乳動物にも由来し得る。好ましくは、脂肪組織はヒト、最も好ましくは成人由来である。好都合な脂肪組織供給源は脂肪吸引手技由来である。
【００２０】
ここで使用する“吸引脂肪組織”は、アスピレーター、すなわち、吸引デバイスによる脂肪吸引で取り出された物質をいう。吸引脂肪組織は、脂肪細胞、脂肪、結合組織、血管および間質血管細胞群を含む。当分野で知られるあらゆるタイプの脂肪吸引方法を使用でき、陰圧式、超音波式、パワーアシスト式、双カニューレ式、レーザー式および水流式脂肪吸引(ＷＡＬ)を含むが、これらに限定されない。しかしながら、ＷＡＬは、この中で好ましい選択肢に入る。次いで、“間質血管細胞群”または“ＳＶＦ”を、当分野で知られ、下に例示する方法を使用して、吸引脂肪組織から単離できる。
【００２１】
ここで使用する用語“バイオリアクター”は、生物学的および／または生化学的プロセスが、監視および制御された環境および操作条件、例えば、ｐＨ、温度、ガス／空気および栄養素供給および廃棄物除去の下に展開される、あらゆるデバイスをいう。
【００２２】
ここで使用する用語“凍結保存”またはその文法上異なる形態は、氷点下温度でのクリオ保護剤中での保存のための細胞の保存をいう。長期保存のため、細胞およびクリオ保護剤を含むクリオバイアルを、通常液体窒素中に保持する。
【００２３】
ここで使用する用語“クリオ保護剤”は、クリオ保護剤非含有下に冷却したときの影響と比較して、細胞または組織を氷点下温度に冷却したとき、細胞または組織における氷晶形成を最小化し、温めた後、細胞または組織への損傷を実質的に減らす薬剤をいう。
【００２４】
ここで使用する“生存能”は、細胞が膜不透過色素(例えば、トリパンブルー、ＦＶＳ−７８０、SYTOXブルー、ヨウ化プロピジウム)を取り込まず、それ故に、細胞膜完全性が示される性質をいう。
【００２５】
ここで使用する“増殖能”は、細胞が適当な培養培地で増殖する能力をいう。増殖能は、例えば、最初に播種した細胞と比較した２４時間、４８時間または７２時間培養時間後の相対的細胞数により表され得る。これはまた一定時間中の“集団倍加”によっても表され得る。例えば、細胞培養４８時間中の少なくとも１の集団倍加は、播種した細胞数が、その期間中に少なくとも１回倍加していることを意味する。
【００２６】
ここで使用する用語‘ドナー’は、一般に脂肪吸引により、脂肪組織を取り出したヒトまたは哺乳動物をいう。好ましくは、ヒトは成人である。
【００２７】
用語“処置”、“治療”などは、ここで、一般に所望の薬理的および／または生理的効果を得ることをいう。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは一部予防する点で予防的であってよくおよび／または疾患および／または疾患に起因し得る有害作用の部分的なまたは完全な安定化または治癒の点で治療的であり得る。ここで使用する“処置”は、哺乳動物、特にヒトまたは動物対象の疾患のあらゆる処置を包含し、(ａ)疾患または症状に罹患し易い傾向を有するが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患または症状が生じるのを予防する、(ｂ)疾患症状を阻止する、すなわち、その進展を阻止するまたは(ｃ)疾患症状を軽減する、すなわち、疾患または症状を退行させることを含む。
【００２８】
開示する医薬組成物の治療使用において、‘同種’治療においては、ドナーおよびレシピエントは、同じ種の遺伝的に異なる個体であり、‘自己’治療においては、ドナーおよびレシピエントは同じ個体である。
【００２９】
用語“レシピエント”、“対象”および“患者”はここでは相互交換可能に使用し、処置または治療が望まれる哺乳動物対象、特にヒトをいう。
【００３０】
本発明の特定の実施態様
方法：
本発明の方法は、例えば、ＡＳＣの増殖添加剤としてのヒト血小板ライセート、密閉バイオリアクターシステムでの増殖および高品質ＡＳＣを用いる同種凍結保存即使用可組成成物としてのＡＳＣの最終製剤の組み合わせに基づく、安全かつ効率的な製造テクノロジーを提供する。
【００３１】
いくつかの異なる実施態様による本発明の方法の一般的概要を図１に示す。
一般に、本発明の方法を使用する、ＳＶＦからＡＳＣ生成物の製造は、凍結保存時間を除き、わずか約１５〜約１８日を要するのみである。増殖効率は、バイオリアクターＳＶＦ１回操作から、１１±５中間生成物バイアルの平均収量を得ることができ(ＳＶＦ３回操作の平均)、最終生成物の平均バッチ当たり収量５±２アンプルを与える(バイオリアクターＡＳＣ８回操作の平均)ことを考慮すると、特に驚くべきである。従って、各約１億１０００万ＡＳＣを含む５５クリオバイアルの平均収量が、ＳＶＦ中の約１億単核細胞(ＭＮＣ)から得られ得る。さらに、実施例に記載するとおり、ＡＳＣ生成物は、継代２代ＡＳＣ生成物の解凍直後に評価して、高生存能(平均９０±２％)であることにより特徴付けられる。
【００３２】
ある実施態様において、実質的に均質な成人幹細胞集団を含む組成物を製造する方法は、
(ｉ)ドナーから採取した吸引脂肪組織のＳＶＦを、少なくとも一表面が成人幹細胞の接着が促進されるように前処理されているバイオリアクターに添加し；
(ii)バイオリアクター中、接着細胞をヒト血小板ライセートを添加した無血清培養培地においてコンフルエントまで培養し；
(iii)接着細胞を剥離し；
(iv)剥離した細胞を、クリオ保護剤中少なくとも１×１０６細胞／mLの濃度で凍結させ；
(ｖ)凍結細胞を解凍し、工程(ii)〜(iii)を少なくとも１回繰り返し、
(vi)剥離した細胞を少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度で凍結させ；そして
(vii)所望により、凍結組成物を解凍する
工程を含む。
【００３３】
ある実施態様において、実質的に均質な成人幹細胞集団を含む組成物を製造する方法は、
(ｉ)ドナーから採取した吸引脂肪組織のＳＶＦを、少なくとも一表面が成人幹細胞の接着が促進されるように前処理されているバイオリアクターに添加し；
(ii)バイオリアクターにおいて、接着細胞をヒト血小板ライセートを添加した無血清培養培地においてコンフルエントまで培養し；
(iii)接着細胞を剥離し；
(iv)工程(ii)および(iii)を少なくとも１回繰り返し；
(ｖ)剥離した細胞を少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度で凍結させ；そして、所望により、
(vi)凍結組成物を解凍する
工程を含む。
【００３４】
ある実施態様において、実質的に均質な成人幹細胞集団を含む組成物を製造する方法は、
(ｉ)ドナーから採取した吸引脂肪組織の間質血管細胞群(ＳＶＦ)を、少なくとも一表面が成人幹細胞の接着が促進されるように前処理されているバイオリアクターに添加し；
(ii)ヒト血小板ライセートを添加した無血清培養培地においてＳＶＦの接着細胞をコンフルエントまで培養し；
(iii)接着細胞を剥離し；
(iv)剥離した細胞を、クリオ保護剤中少なくとも１×１０６１００万細胞／mLの濃度で凍結させ；
(ｖ)凍結細胞を解凍し、工程(ii)〜(iv)を繰り返し、剥離した細胞を少なくとも１×１０７細胞／mLの濃度で凍結させ；そして、所望により、
(vi)凍結組成物を解凍する
工程を含む。
【００３５】
ＳＶＦを、健常ドナーから得た吸引脂肪組織、例えば、５０mL、１００mL、２００mL、３００mLまたは５００mL、例えば１００〜３００mLの吸引脂肪組織から単離する。一般に、脂肪組織を、先ず、物質分離のために傾斜法、沈降または遠心分離技術を利用する組織収集容器を使用して、非脂肪組織から分離する。次いで、脂肪組織を機械力(細分または剪断力)、コラゲナーゼ、トリプシン、TrypLe Select、リパーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシンなど１以上のタンパク質分解酵素での酵素消化または機械的および酵素的方法の組み合わせなどの方法を使用して、解離させ得る。その後、残った細胞を濾過、遠心分離などにより取得できる。吸引脂肪組織からＳＶＦを取得する方法の例は、Godthardt, et al. (2008) MACS Miltenyi Biotec Information PamphletおよびＷＯ２０１４／１３８３８３号に記載されている。
【００３６】
ある実施態様において、約１００mlの吸引脂肪組織を、局所麻酔下、腹部からの脂肪吸引により１ドナーから得る。吸引脂肪組織を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.４で２回洗浄し、残存血液を除去する。次いで、脂肪組織を、３７℃、４５分、平衡塩溶液に溶解したコラゲナーゼと定速回転下、インキュベートすることにより消化させる。コラゲナーゼを５％ヒト血小板ライセートおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有培地で中和し、１００μmフィルターで濾過する。残った細胞を１２００×ｇで１０分、室温で遠心分離し、再懸濁し、製造業者の指示に従い、セルカウンターで計数する。
【００３７】
一般に、バイオリアクターの少なくとも一表面を、バイオリアクターの製造業者の指示に従ってまたは製法開始前のある選択した時点で、ＡＳＣの接着を容易にしまたは促進するように前処理する。細胞接着を促進するための種々のタイプの処理は当分野で知られており、例えば、合成荷電ポリマー、ナノファイバー、グリコサミノグリカンおよび種々のタンパク質組成物での組織培養処理およびコーティングを含む。組織培養処理のために、バイオリアクター中のポリスチレンベースの表面をプラズマガスで修飾し、疎水性可塑性表面をより親水性とし、細胞接着を促進する正味負電荷とする。表面のプレコーティングについて、この目的で有用なタンパク質組成物は、例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子および第XIII因子などの、１以上の血漿タンパク質、例えば、コラーゲンおよびラミニンなどの、１以上の細胞外マトリクスタンパク質および／または１以上のプロテオグリカンを含み得る。ある実施態様において、タンパク質組成物は、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの一方または両方を含むまたはこれらからなる。ある実施態様において、タンパク質組成物はクリオ沈降物を含むかまたはそれからなる。クリオ沈降物は、例えば、新鮮血漿を凍結および解凍し、沈殿の採取により、血漿から調製される周知の血液製剤である。製剤は、一般にフィブリノーゲンおよび第VIII因子、ならびに例えばフォン・ウィルブランド因子、第XIII因子およびフィブロネクチンを含む。ある実施態様において、クリオ沈降物は、所望によりＡＢ型または低力価Ａ型血液ドナーから調製した、７０IUの第VIII因子あたり少なくとも１４０mg以上のフィブリノーゲンを含む。他の実施態様において、タンパク質組成物は、下記ヒト血小板ライセートを含む、またはそれからなる。
【００３８】
本発明での使用に適するバイオリアクターの基本的クラスは、足場依存性細胞増殖に適する、マイクロキャリアーまたはディスクを伴うまたは伴わない中空糸バイオリアクターおよび揺動、高速回転または回転潅流システムを含む。好ましくは、バイオリアクターは、機能的に閉鎖されたシステムまたは滅菌バリアフィルターで保護され、細胞培養中の培養培地の連続的供給および廃棄物の連続的除去が可能である。最も好ましいのは、細胞接着のために少なくとも０.５ｍ２、例えば少なくとも１ｍ２、例えば少なくとも１.５ｍ２、例えば少なくとも２ｍ２、例えば１〜３ｍ２の表面積を提供するインキュベーターに封入された使い捨て中空糸バイオリアクターである。好ましくは、表面は、少なくとも２ｍ２、例えば約２.１ｍ２である。このようなバイオリアクターの一例は、培地および試薬または細胞用の導入口を備えた双循環ループにより供給され、廃棄物が廃棄物バッグに除去される、Quantum Cell Expansion System(ここでは“Quantumバイオリアクター”とも称する)である。実施例７に示すとおり、バイオリアクターでのＡＳＣ増殖は、標準組織培養フラスコにおける手動方法と比較して、顕著に増殖速度および収量を増加させる。
【００３９】
ＳＶＦ(または第一継代ＡＳＣ)のバイオリアクターへの導入前に、システムを、緩衝液、例えば、リン酸緩衝化食塩水でプライムし、その後コーティングのためのタンパク質または他の組成物を負荷し得る。細胞負荷前に、次いで緩衝液をシステムから洗い出し、完全培地に置き換え得る。
【００４０】
次いで、細胞をバイオリアクターに添加できる。例えば、ＳＶＦ製剤からの約１０００万、２０００万、５０００万、１億、２億または５億単核細胞(ＭＮＣ)または約５００万、１０００万、２０００万、５０００万または１億第一継代ＡＳＣを、プライムおよびコートしたバイオリアクターに、導入口から、所望によりフィルターを通して導入できる。好ましくは、ＭＮＣについて、ＳＶＦからの約１億細胞を負荷する。第二継代について、好ましくは、第一継代ＡＳＣからの約５００万〜５０００万細胞、例えば５００万〜３０００万、５００万〜２５００万、１０００万〜３０００万または１５００万〜２５００万細胞を導入できる。細胞の高度継代(すなわち、第三継代、第四継代など)について、細胞を、第二継代に準ずる量で添加できる。次いで、細胞を少なくとも５時間および／または最大約２４時間のような十分な時間接着させ、その後培地での連続的供給を始動させる。例えば、培地供給速度を約０.１mL／分で開始し、その後グルコースおよび／または乳酸測定値および／または細胞増殖に基づき調節され得る。
【００４１】
例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)、アルファ最小必須培地(α−ＭＥＭ)などのあらゆる標準細胞培養培地が使用され得る。実施例６に示すとおり、しかしながら、ヒト血漿ライセート(ＨＬＰ)生成物の使用は、ゲノム安定性を損なうことなく、ＦＢＳの使用よりも増殖能の点で、明らかにより有効な増殖添加剤であった。ＨＰＬは、１回、２回、３回またはそれ以上の凍結／解凍サイクル後のヒト血液血小板から得る一般に濁った、淡黄色液体である。これらのサイクルは、血小板を溶解させ、増殖因子などを含むその細胞内内容物を周辺培地に放出させる。あるＨＰＬ製剤は、凝血因子を含み、この場合、凝血を防止するためのヘパリンなどの抗凝血剤の添加が有利であり得る。他のＨＰＬ製剤を、凝固因子を除くかまたは他に影響を阻止するために処理できる。ＨＰＬ製剤は、そのいくつかはＧＭＰグレードで、例えば、Compass Biomedical, Inc.、Cook General BIotechnologyl、Macopharma SA, Cook Regentech、Mill Creek、iBiologicsおよびTrinova Biochem GmbHから、商品分野PLUS、Stemulate、Human Platelet Lysate、PLTMax、XcytePlusおよびCRUX RUFA Media Supplementsの下、商業的に入手可能である。好ましくは、ＡＳＣのための培養培地は、約１％〜約２０％、例えば約２％〜約１５％、例えば約３％〜約１２％、例えば約５％〜約１０％、例えば約５％、８％または１０％ＨＰＬを含む。好ましくは、培養培地は、約２％〜約１５％ＨＰＬを、例えば、ＭＥＭ中に含む。好ましいＨＰＬ製剤は、ヘパリン添加を必要としないStemulateである(ＷＯ２０１５０３１４６５Ａ１号)。
【００４２】
細胞成長が、例えば、グルコース消費および／または乳酸産生停滞を追跡して、その静止期に達するかまたはほぼ達したら、ＡＳＣを、一般にTrypLe Selectをシステムに負荷することにより採取する。次いで、採取細胞を洗浄し、遠心管に入れ、ペレット化し、計数できる。
【００４３】
次いで、第一継代(“中間”)ＡＳＣを凍結保存するか、あるいは、第二(または第三、第四など)ラウンドの増殖のために、直接プレコートしたバイオリアクターに導入してよい。凍結保存のために、中間ＡＳＣを、少なくとも約１×１０６細胞／mL、例えば少なくとも約２×１０６細胞／mL、少なくとも約５×１０６細胞／mL、少なくとも約１０×１０６細胞／mL、少なくとも約１５×１０６細胞／mL、少なくとも約２０×１０６細胞／mLまたは少なくとも約５０×１０６細胞／mL、例えば１×１０６〜５０×１０６細胞／mL、例えば１×１０６細胞〜２０×１０６細胞／mLの濃度でクリオ保護剤に懸濁する。
【００４４】
第二(または第三、第四など高度)継代ＡＳＣを凍結保存できる。凍結保存のために、第二(または高度)継代ＡＳＣを、少なくとも約１×１０７細胞／mL、例えば少なくとも約１.５×１０７細胞／mL、少なくとも約２×１０７細胞／mL、少なくとも約２.５×１０７細胞／mL、少なくとも約３×１０７細胞／mL、少なくとも約５×１０７細胞／mLまたは少なくとも約１０×１０７細胞／mL、例えば１×１０７〜５×１０７細胞／mL、例えば２×１０７細胞〜３×１０７細胞／mLの濃度でクリオ保護剤に懸濁する。ある実施態様において、第二(または高度、例えば第三、第四など)継代ＡＳＣを、約２×１０７細胞／mLクリオ保護剤、例えば約２.２×１０７細胞／mLクリオ保護剤の濃度でクリオ保護剤に懸濁する。文脈に反しない限り、ここで使用する２×１０７細胞／mLは、１.６×１０７〜２.４×１０７細胞／mLを含むかまたはこれに対応し、約２.２×１０７細胞／mLは２.０〜２.４細胞／mLを含むかまたはこれに対応する。
【００４５】
クリオ保護剤は好ましくはプロテインフリー、エンドトキシンフリーで、かつ無菌である。いくつかの適当なクリオ保護剤が入手可能であるが、本発明のＡＳＣ組成物のために企図されるクリオ保護剤の非限定的例は、CryoStor CS2、CryoStor CS5およびCryoStor CS10を含むCryoStor(登録商標)(BioLife Solutions)およびProFreeze(Lonza)を含む。CryoStor凍結培地は、無菌無血清、プロテインフリーおよび動物成分フリーで、ｐＨ７.５〜７.７および１EU／mL未満のエンドトキシンレベルを有する。ある実施態様において、クリオ保護剤はHypothermosol(登録商標)(CMS, Rockville, Md.)＋１０％ＤＭＳＯである(ＷＯ２０００／００２５７２Ａ１号)。Hypothermosol(登録商標)は、Trolox(６−ヒドロキシ−２,５,７,８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸)、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋１Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０(すなわち、平均ＭＷ４０,０００Daのデキストラン)、アデノシンおよびグルタチオンを含む(ＷＯ２０１０／０６４０５４Ａ１号)。製造業者によると、ProFreezeは、使用時１０％ＤＭＳＯを添加しなければならない。ＷＯ２０００／００２５７２Ａ１号およびＷＯ２０１０／０６４０５４Ａ１号は、引用によりそれらを全体として本明細書に包含させる。
【００４６】
ＤＭＳＯを使用するここでのあらゆる実施態様において、ＤＭＳＯを、例えば、デキストラン−４０などの、例えば３５０００〜４５０００Daの範囲の平均分子量を有するデキストランなどのグルカンに置き換え得る。
【００４７】
ある実施態様において、クリオ保護剤は５％〜１５％ＤＭＳＯ、例えば約５％、約６％、約８％、約１０％、約１２％または約１５％ＤＭＳＯおよびTrolox、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋１Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシンおよびグルタチオンを含む。好ましくは、クリオ保護剤は約１０％ＤＭＳＯを含む。
【００４８】
ある実施態様において、クリオ保護剤は、ＤＭＳＯおよび水溶液の１：１０〜約１：２０混合物を含み、水溶液は、
(ａ)約３５〜４５mM範囲の濃度のカリウムイオン、約８０〜１２０mM範囲の濃度のナトリウムイオン、約２〜１０mM範囲の濃度のマグネシウムイオンおよび約０.０１〜０.１mM範囲の濃度のカルシウムイオンからなる群から選択される１以上の電解質；
(ｂ)循環系からの漏出を制限するのに十分に大きなサイズであり、血液血漿と同等の膠質浸透圧の維持に有効であり、ヒト血清アルブミン、多糖およびコロイド状デンプンからなる群から選択される巨大分子膠質浸透圧性物質；
(ｃ)生理学的および低温条件で有効な生物学的ｐＨ緩衝液；
(ｄ)栄養有効量の少なくとも１つの単糖；
(ｅ)非透過性およびヒドロキシル基除去有効量のマンニトール；
(ｆ)細胞膜に不浸透性であり、寒冷暴露中の細胞膨張を中和するのに有効な非透過性アニオンであって、該非透過性イオンがラクトビオン酸、グルコン酸、クエン酸およびグリセロリン酸からなる群から選択される少なくとも一つのメンバーであるもの；
(ｇ)ＡＴＰの再生に有効な基質であって、該基質がアデノシン、フルクトース、リボースおよびアデニンからなる群から選択される少なくとも一つのメンバーであるもの；および
(ｈ)グルタチオン
を含む。
【００４９】
ある実施態様において、クリオ保護剤はＤＭＳＯおよび水溶液の１：１０〜約１：２０混合物を含み、水溶液は
ａ)３５〜４５mM範囲の濃度のカリウムイオン、８０〜１２０mM範囲の濃度のナトリウムイオン、２〜１０mM範囲の濃度のマグネシウムイオンおよび０.０１〜０.１mM範囲の濃度のカルシウムイオンからなる群から選択される１以上の電解質；
ｂ)循環系からの漏出を制限するのに十分に大きなサイズであり、血液血漿と同等の膠質浸透圧の維持に有効であり、ヒト血清アルブミン、多糖およびコロイド状デンプンからなる群から選択される巨大分子膠質浸透圧性物質；
ｃ)生理学的および低温条件で有効な生物学的ｐＨ緩衝液；
ｄ)栄養有効量の少なくとも１つの単糖；
ｅ)非透過性およびヒドロキシル基除去有効量のマンニトール；
ｆ)細胞膜に不浸透性であり、寒冷暴露中の細胞膨張を中和するのに有効な非透過性アニオンであって、該非透過性イオンがラクトビオン酸、グルコン酸、クエン酸およびグリセロリン酸からなる群から選択される少なくとも一つのメンバーであるもの；
ｇ)ＡＴＰの再生に有効な基質であって、該基質がアデノシン、フルクトース、リボースおよびアデニンからなる群から選択される少なくとも一つのメンバーであるものおよび
ｈ)アポトーシス誘発細胞死を制御する少なくとも一つの薬剤
を含む。
【００５０】
次に、クリオ保護剤中の第一、第二(またはさらに高度)継代ＡＳＣの懸濁液をクリオバイアルに添加する。第一継代(中間)ＡＳＣについて、各クリオバイアルは、例えば、約２０００万、約３０００万、約４０００万、約５０００万、約６０００万、約８０００万または約１億細胞などの、５００万細胞〜２億５０００万細胞の範囲のＡＳＣ数に対応する、約１mL、約２mL、約３mL、約４mL、約５mL、約６mL、約７mL、約８mL、約９mL、約１０mL、約１５mLまたは約２０mL  ＡＳＣ懸濁液を含み得る。好ましくは、第一継代ＡＳＣのクリオバイアルは、５mLあたり約５０００万細胞含む。
【００５１】
最終継代ＡＳＣ、すなわち、第二または高度継代ＡＳＣについて、各クリオバイアルは、例えば、約４０００万、約６０００万、約８０００万、約１億、約１億１０００万、約１億２０００万、約１億６０００万または約２億細胞、１０００万細胞〜５億細胞の範囲のＡＳＣ数に対応する、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５または約２０mL  ＡＳＣ懸濁液を含み得る。好ましくは、第二継代ＡＳＣのクリオバイアルは、約５mLに約１億〜約１億２０００万細胞、例えば約５mLに約１億１０００万細胞含む。本発明の組成物において、文脈に反しない限り、約１億１０００万細胞は、１億〜１億２０００万細胞を含む。
【００５２】
凍結は、有利に制御された速度の冷凍器を使用して、自動凍結により実施できる。その後、凍結バイアルを−７０℃〜−１９６℃、例えば−１５０℃〜−１９０℃、例えば−１８０℃−範囲の温度に移し、保存できる。バイアルの凍結およびこのような凍結条件に維持する種々の手段が知られ、その多くは液体窒素を使用する。それらは、例えば、バイアルの液体窒素への浸漬、バイアルの液体窒素の気相への保存およびバイアルのいわゆる乾式貯蔵に置くことを含む。後者のタイプの保存において、バイアルは、窒素が容器のシェルに含まれるため、液体または気相が窒素に直接接触せず、−１８０℃−範囲での保存温度をもたらす。
【００５３】
ある態様において、第一継代バイオリアクター増殖からの中間ＡＳＣを保持する作業細胞バンクおよび最終的に製剤および包装されたＡＳＣ組成物を保持する細胞バンクからなる、二重構造細胞バンキングシステムがバイアルについて確立されている。細胞バンクにおいて、第一継代中間ＡＳＣは、一般に第二バイオリアクター増殖のために負荷されるまで、クリオバイアルで、約５ml  CryoStor 10中約５０００万細胞で凍結保存する。最終ＡＳＣ組成物は、一般に使用直前まで、クリオバイアルで、約５ml  CryoStor 10で約１億１０００万細胞で凍結保存される。この組成物はまた“ＣＳＣＣ＿ＡＳＣ”とも称され得る。ある実施態様において、細胞バンクは、凍結条件下に保存された複数のバイアルを含み、各バイアルは約５mLの第二継代ＡＳＣを含み、ここで細胞濃度は２×１０７細胞／mL、例えば、１.６×１０７〜２.４×１０７細胞／mL範囲または約２.２×１０７細胞／mL、例えば、２.０×１０７〜２.４×１０７細胞／mL範囲である。
【００５４】
ＡＳＣ：
本発明のＡＳＣは、凍結保存後でさえ多能性能、マーカープロファイルおよび／またはおよび増殖能、生存能、回収率および免疫抑制能などのＡＳＣの機能的特徴により特徴付けられる。これらのＡＳＣ特徴は、下に詳述するが、本発明の方法により得られたＡＳＣに各々等しく適用される。マーカープロファイルは、例えば、実施例２、１０、１１または１４に記載するように、例えば、各マーカーに対する蛍光標識抗体を使用するフローサイトメトリーにより好都合に決定され得る。
【００５５】
ＡＳＣは、特に、適切な条件下脂肪細胞、軟骨芽細胞および造骨細胞分化系列に沿って分化できるその能力により特徴付けられる。実施例４に示すとおり、実施例１に記載の製造方法により調製されたＡＳＣは、分化培地で培養したとき、脂肪細胞、軟骨細胞および骨芽細胞に分化する。
【００５６】
ＡＳＣはこれに加えてまたはこれとは別に、他の間葉性間質／幹細胞と同様にＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４を含むマーカーの発現および低いまたは無視できる発現レベルのＣＤ４５およびＣＤ３１の維持に基づく、その表現型、すなわち、マーカープロファイルにより特徴付けられる(Bourin et al., 2013)。
【００５７】
ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、幹細胞集団の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％がＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２９およびＣＤ１３を発現し、多くて１０％、例えば多くて５％、例えば多くて３％、例えば多くて２％がＣＤ４５、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９およびＣＤ１４を発現するものである。好ましくは、少なくとも９５％がＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１３を発現し、多くて５％がＣＤ４５、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９およびＣＤ１４を発現する。
【００５８】
ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、少なくとも９０％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現し、多くて５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ３１を発現し、多くて１０％がＣＤ１０６を発現し、２〜１５％がＣＤ３６を発現し、少なくとも１０％がＣＤ１４６を発現し、少なくとも８０％がＣＤ１０５を発現し、多くて４０％がＣＤ３４を発現するものである。ある実施態様において、少なくとも９５％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現する。さらに、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％がＣＤ４４を発現し得る。
【００５９】
ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％がＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現し、多くて約１５％、例えば多くて約１０％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、ＣＤ３１およびＣＤ３６を発現し、例えば多くて約７％、例えば多くて約５％、例えば多くて約３％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６およびＣＤ３１を発現し、少なくとも約２％、例えば少なくとも約５％、例えば約１％〜約２０％、例えば約２％〜約１５％または約５％〜約１５％がＣＤ３６を発現し、多くて約５０％、例えば多くて約４０％、例えば多くて約２０％、例えば多くて約１０％がＣＤ３４を発現し、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１２％がＣＤ１４６を発現するものである。ある実施態様において、少なくとも９５％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現し、少なくとも８５％がＣＤ１０５、多くて２％がＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ３１を発現し、２％〜１５％がＣＤ３６を発現し、１０％〜６０％がＣＤ１４６を発現する。ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、マーカーの最小および最大発現パーセンテージの範囲が表２０に示すものである。
【００６０】
凍結保存第二継代細胞の解凍直後の評価では、色素排除(例えば、実施例３参照)によれば、細胞の少なくとも約８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％が、生存可能である。好ましくは、細胞の少なくとも９０％が生存可能である。
【００６１】
増殖能について、解凍直後に培養したとき、ＡＳＣは、組織培養フラスコで４８時間培養したとき(例えば、実施例３における方法による)、少なくとも１、例えば少なくとも１.３、例えば少なくとも１.５、例えば少なくとも１.７、例えば少なくとも２の集団倍加(ＰＤ)により特徴付けられる。好ましくは、ＡＳＣは、少なくとも１、例えば少なくとも１.５のＰＤを有する。ＰＤは、Ｌｎ(Ｎ)／Ｌｎ２として計算し、ここでＮ＝採取細胞／播種細胞である。
【００６２】
実施例に示すとおり、本発明のＡＳＣはさらにその免疫抑制性質により特徴付けられる。例えば、ＡＳＣは、次の樹状細胞(ＤＣ)活性化抑制、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)増殖抑制、免疫調節、特に免疫抑制の指標である細胞表面マーカーまたはインターフェロン−ガンマなどのサイトカインに応答する１以上の細胞表面マーカーの変化の１以上のまたは全てにより特徴付けられ得る。
【００６３】
ある実施態様において、本発明のＡＳＣは、ＤＣの活性化を抑制し、例えば、ＤＣと混合していないＡＳＣ(すなわち、陽性対照)と比較して、ＤＣと混合したＡＳＣにより、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現が低減される。具体的実施態様において、実施例９のアッセイを使用し、ここで、ＡＳＣおよびＤＣを約１：１比となるように播種し、ＤＣは１μg／mL  リポ多糖(ＬＰＳ)および２０ng／mL  インターフェロン−ガンマで刺激されており、２４時間インキュベートされ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの各発現レベルは、平均して、陽性対照のそれぞれ多くて８０％、６５％、７０％および８０％に低減される。
【００６４】
ある実施態様において、本発明のＡＳＣは、例えば、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)で決定して、ＰＢＭＣの増殖を抑制する。このタイプのアッセイは当分野で周知であり、例えば、１：２０〜１：１の範囲の種々の比で、ＡＳＣと同種ドナーからの刺激ＰＢＭＣを混合し、陽性対照としてＡＳＣ不含ＰＢＭＣを使用し、４日共培養期間後測定して、１８〜２０時間インキュベーション時間中の３Ｈ−チミジン(２５μSi／ml)のＰＢＭＣ取り込みを測定することを含み得る。のタイプのアッセイを使用して、陽性対照と比較して、１：２０、１：１０、１：５および１：１比のＡＳＣ対ＰＢＭＣが、それぞれ、陽性対照の多くて約８０％、７５％、５５％および２５％の平均３Ｈ−チミジン取り込みをもたらし得る。
【００６５】
ある実施態様において、ＡＳＣはこれに加えてまたはこれとは別にＣＤ１０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２５８、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−Ｇ、ＬＴβＲおよびこれらの組み合わせなどの免疫調節、特に免疫抑制の指標である特異的マーカーにより特徴付けられる。理論に拘束されないが、これらのマーカーは免疫シグナル伝達、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ接着、ホーミング、パターン認識、Ｔ細胞阻害、増殖因子受容体の上方制御および炎症誘発性タンパク質の不活性化と関連する。
【００６６】
特に、ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−Ｇおよび／またはＬＴβＲ、場合により、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、例えば少なくとも約９０％またはある場合少なくとも約９５％またはそれ以上がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現するものである。ある実施態様において、ＡＳＣは、さらに、ＣＤ１５２、ＣＤ２７４および／またはＣＤ８６を約２０％以下、例えば約１５％以下またはある場合には約１０％以下しか発現せず、そして／また場合により、少なくとも約７０％がＣＤ２５８、少なくとも約５５％がＣＤ２７０、少なくとも約８０％がＣＤ４９ａ、最大約３０％がＣＸＣＲ４および／または約５％〜約３５％がＣＤ２００を発現することにより特徴付けられ得る。ある実施態様において、ＡＳＣ集団はまたＡＳＣの多くて約１５％がＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ２７４、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６および場合によりＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、−ＤＰを発現するものであり得る。
【００６７】
ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、少なくとも９０％がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現し、少なくとも６０％がＣＤ２５８およびＣＤ２７０を発現し、少なくとも５％がＣＤ２００を発現し、多くて１５％がＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ２７４、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現し、多くて３０％がＣＸＣＲ４を発現するものである。
【００６８】
ある実施態様において、実質的に均質なＡＳＣ集団は、ＡＳＣ集団の少なくとも９５％がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、少なくとも８５％がＣＤ４９ａを発現し、少なくとも６５％がＣＤ２５８およびＣＤ２７０を発現し、集団の少なくとも１０％がＣＤ２００を発現し、集団の多くて１５％がＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ２７４、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱおよび−ＤＰを発現し、多くて２５％がＣＸＣＲ４を発現するものである。
【００６９】
ある実施態様において、ＡＳＣはまたさらにＡＳＣの２０％未満、例えば約１５％未満、例えば約１０％未満のＣＤ２７４発現によっても特徴付けられる。場合により、ＡＳＣはまたＡＳＣの少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９８％のＣＤ５４発現により特徴付けられる。他の具体的実施態様において、ＡＳＣは、実施例１０の表１５における各マーカーの表１５に示す最小値から最大値の範囲の集団のパーセンテージにより特徴付けられる。
【００７０】
ＡＳＣはまたここでのある実施態様による間質／幹細胞マーカーの発現パーセンテージおよびここでのある実施態様による免疫調節マーカーの発現パーセンテージにより特徴付けられ得る。非限定的例として、実質的に均質なＡＳＣ集団は、
−  少なくとも９０％がＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ２９およびＣＤ１６６を発現し、多くて５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ３１を発現し、多くて１０％がＣＤ１０６を発現し、２〜１５％がＣＤ３６を発現し、少なくとも１０％がＣＤ１４６を発現し、少なくとも８０％がＣＤ１０５を発現し、多くて４０％がＣＤ３４を発現する；および
−  少なくとも９０％がＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３、ガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲを発現し、少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現し、少なくとも６０％がＣＤ２５８およびＣＤ２７０を発現し、少なくとも５％がＣＤ２００を発現し、多くて１５％がＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ２７４、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現し、多くて３０％がＣＸＣＲ４を発現する
ものである。
【００７１】
さらなる実施態様において、本発明のＡＳＣはこれに加えてまたはこれとは別にインターフェロン−ガンマなどの炎症誘発性サイトカインに応答する１以上の細胞表面マーカーの変化により特徴付けられる。これは、有利に実施例１１のアッセイにより試験でき、一般に表１６および１７における１以上のＡＳＣマーカーは、
ＩＦＮ−ガンマで刺激していない同じＡＳＣからの細胞などの対照と比較して、５０ng／ml  ＩＦＮ−ガンマ存在下で３日培養したとき
−  マーカーを発現するＡＳＣ集団のパーセンテージのＡＳＣ集団の少なくとも５％における陽性または陰性変化または
−  マーカーを発現する細胞の部分におけるマーカーの発現レベルの少なくとも０.５倍の陽性または陰性変化
を示す。
【００７２】
例えば、ある実施態様において、ＩＮＦ−ガンマ刺激により、ＣＤ２００、ＣＤ２７０、ＣＤ９、ＣＸＣＲ４を発現するＡＳＣ集団のパーセンテージは減少し、ＣＤ２７４およびＣＤ４９ａを発現するＡＳＣ集団のパーセンテージは増加し、ＣＤ５４陽性細胞におけるＣＤ５４の発現レベルは増加する。
【００７３】
ある実施態様において、変化は、次の１以上または全てである。
−  ＣＤ２７４、ＣＤ１０６および／またはＣＤ４９ａを発現するＡＳＣ集団のパーセンテージの少なくとも５％の増加、例えばＣＤ２７４のパーセンテージの少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％の増加；
−  ＣＤ２００、ＣＤ２７０、ＣＤ９および／またはＣＸＣＲ４を発現するＡＳＣ集団のパーセンテージの少なくとも５％減少、例えば発現ＡＳＣ集団のパーセンテージの少なくとも１０％減少；
−  マーカー陽性細胞でのＣＤ１０、ＣＤ５４、ＨＬＡ−ＡＢＣおよび／またはＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ／ＤＰ発現レベル増加、例えばＣＤ５４発現細胞でのＣＤ５４の発現レベルの少なくとも２０倍、例えば少なくとも３５倍、例えば少なくとも３０倍増加；および／または
−  ＬＴβＲ発現レベルの、例えば、少なくとも２倍の減少。
【００７４】
具体的実施態様において、ＡＳＣ集団の多くて約３０％、例えば多くて約２０％、例えば多くて約１５％、例えば多くて約１０％がＣＤ２７４を発現し、例えば、それぞれ５０ng／ml  ＩＦＮ−ガンマ非存在下または存在下でＡＳＣを３日培養したとき、インターフェロン−ガンマ刺激により、ＡＳＣ集団の少なくとも７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％がＣＤ２７４を発現する。
【００７５】
また注目されるのは、マーカーＣＤ５４(ＩＣＡＭ−１)についてのＭＦＩの３から９７への増加であり、これは、ＡＳＣ−白血球相互作用の安定化およびシグナル伝達に必要な細胞間接着分子の可動化を説明する。ＩＣＡＭ−１は、白血球に見られる受容体であるＬＦＡ−１(インテグリン)のリガンドである。従って、ある実施態様において、ＡＳＣ集団の少なくとも９５％がＣＤ５４を発現し、インターフェロン−ガンマ刺激により、ＣＤ５４発現細胞におけるＣＤ５４の発現レベルは少なくとも２０倍、例えば少なくとも３０倍増加する。
【００７６】
特定の実施態様において、インターフェロン−ガンマ刺激により、ＣＤ２７４を発現するＡＳＣ集団のパーセンテージは少なくとも８０％増加し、ＣＤ５４陽性細胞におけるＣＤ５４の発現レベルは少なくとも２５倍増加する。
【００７７】
組成物：
本発明によりまた提供されるのは、先の“ＡＳＣ”セクションおよび“方法”セクションにおける各方法により得られるものを含む、ここでの態様および実施態様において詳述する各ＡＳＣ集団の組成物である。このようなＡＳＣ集団の各々はまた本発明の組成物の形式で提供される。
【００７８】
特に、ＡＳＣ、特に本発明の方法により得られたＡＳＣを、生存能、増殖能、免疫抑制性質または回収率を損なうことなく、プロテインフリークリオ保護剤で、少なくとも約１×１０７細胞／mLで凍結保存され得ることが判明した。またCryoStorベースのクリオ保護剤が、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)ベースのクリオ保護剤より高い増殖能を提供し得ることも判明した。
【００７９】
特に、本発明の組成物は、プロテインフリークリオ保護剤中の、ドナーから採取した脂肪組織から単離した実質的に均質な成人幹細胞集団の懸濁液を含み得て、ここで、細胞濃度は、添加クリオ保護剤mLあたり、少なくとも１×１０７細胞、例えば少なくとも１.５×１０７細胞、例えば少なくとも２×１０７細胞、例えば少なくとも３×１０７細胞、例えば少なくとも５×１０７細胞である。好ましくは、細胞濃度は、添加クリオ保護剤mLあたり、少なくとも２×１０７細胞、例えば約２.２×１０７細胞である。
【００８０】
上記のとおり、プロテインフリークリオ保護剤は、一般に約５％〜約１５％ＤＭＳＯおよびTrolox、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋１Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシンおよびグルタチオンを含む。好ましくは、クリオ保護剤は、約１０％ＤＭＳＯを含む。当分野で知られる他のプロテインフリークリオ保護剤も使用し得る。“方法”セクションですでに記載しているものが、特に企図される。
【００８１】
また提供されるのは、凍結ＡＳＣ組成物解凍時に得られる組成物である。凍結ＡＳＣ組成物は、例えば、３７℃水浴で解凍されまたは手術室で室温で解凍／保存され得る。好ましいのは、解凍直後
(ａ)ＡＳＣ集団の少なくとも８５％が生存可能細胞であり、２時間室温で保存後の生存能が少なくとも８０％である；
(ｂ)ＡＳＣ集団が、４８時間培養したとき少なくとも１のＰＤを提供する増殖能を有する；
(ｃ)ＡＳＣ集団が樹状細胞成熟および活性化を抑制できる；
(ｄ)解凍後の回収率が９５％を超え、解凍後室温で２時間保存後の細胞の回収率が少なくとも８５％である；
(ｅ)ＡＳＣ集団が、総細胞数の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％が５時間培養後接着性であるインビトロ細胞接着を有する
組成物である。
【００８２】
また好ましいのは、解凍後室温で２時間保存後、
(ａ)幹細胞集団の少なくとも８０％が生存可能細胞である；
(ｂ)幹細胞集団が、４８時間培養したとき、少なくとも１のＰＤを有する；
(ｃ)幹細胞集団が樹状細胞成熟および活性化を抑制できる；
(ｄ)回収率が少なくとも８５％である；および
(ｅ)ＡＳＣ集団が、総細胞数の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％が５時間培養後接着性であるようなインビトロ細胞接着を有する
組成物である。
【００８３】
本発明によりまた提供されるのは、医薬組成物である。本発明の組成物は無菌であり、エンドトキシンおよびマイコプラズマを含まず、エンドトキシンレベルは、一般に、１０IE／mlの最小検出レベルを提供する分析法で決定する。本発明の組成物が即時臨床使用できるため、医薬組成物は、一般にＡＳＣおよびプロテインフリークリオ保護剤のみを含む。しかしながら、付加的成分もまた企図される。特に、医薬組成物はさらに細胞外マトリクスタンパク質、ペプチドまたはグリコサミノグリカンおよび／またはアルギネートなどの天然または合成バイオポリマーを含む可溶性生体材料またはヒドロゲルを含み得る。例えば、医薬組成物は、無菌およびエンドトキシンフリーアルギネート(Sodium alginate VLVG, Novamatrix, FMC Biopolymers, Norway)、Ｄ−グルコン酸と部分的に架橋したカルシウムおよびヘミカルシウム塩を含み得る(Follin et al., 2015)。ある実施態様において、最終凍結保存工程前に、最終濃度１％(ｗ／ｖ)の部分的に架橋したアルギネートまで、アルギネートをＡＳＣおよびクリオ保護剤と混合する。他の実施態様において、部分的に架橋したアルギネートをＲＴで保存し、最終生成物と１％(ｗ／ｖ)アルギネートの最終濃度まで、例えば、ＡＳＣ製剤をアルギネート容器に注入することにより混合し、その後最終懸濁液を吸引し、注射カテーテルに接続する。
【００８４】
また提供されるのは、シリンジまたはＡＳＣ組成物の注射または点滴のための他の手段であり、これは、ＡＳＣ組成物を含む。一般に、ＡＳＣ組成物を受容するアンプルをアルコール綿棒(８２％エタノールおよび０.５％クロルヘキシジン、Mediq, Denmark)で滅菌し、細胞懸濁液を無菌シリンジに注射針で吸引する。次いで、シリンジを注射のために、注射カテーテル、例えば、MYOSTAR注射カテーテル(Biological Delivery System, Cordis, Johnson & Johnson, USA)に接続する。注射は、解凍３時間以内が推奨される。好ましくは、シリンジまたは注射または点滴のための他の手段は、約１億〜約１億２０００万細胞、例えば約１億１０００万ＡＳＣを含む、約５mLの組成物を含む。
【００８５】
治療用途：
ある実施態様において、医薬、例えば、組織再生、免疫抑制のためおよび／または抗炎症剤として使用するためのＡＳＣ組成物が提供される。
【００８６】
実際、本発明は、ＡＳＣおよびＡＳＣ本発明の組成物の種々の治療用途を提供し、これは、“即納可”かつ即臨床使用可である。高濃度のＡＳＣ、一般に少なくとも１×１０７細胞、好ましくは少なくとも２×１０７細胞、例えば約２.２×１０７細胞、／mLクリオ保護剤のため、組成物を、小容量注射が必要である適用および高濃度組成物を投与前に希釈し、例えば、点滴により投与する適用に使用できる。さらに、いくつかの異なるドナーからのＡＳＣを細胞バンクに保存でき、反復投与を可能としおよび／または多用途への処置選択肢を可能とする。
【００８７】
理論に拘束されないが、投与後、ＡＳＣはマトリクスリモデリング、血行再建および免疫調節を含む自然内在性修復機構を促進する細胞外物質を放出する傍分泌機構により、再生を刺激および改善する。ＡＳＣ免疫調節の他の固有の部分は、免疫原性、それにより同種ＡＳＣ移植の拒絶を抑制する、能動的免疫抑制である。これは、他の体細胞とこれらの細胞を区別する、本来的なＡＳＣの特徴である。
【００８８】
従って、ある実施態様において、例えば、虚血性組織障害または他の組織機能不全または破壊障害の処置または予防における、組織再生に使用するための同種異系間治療用生成物が提供される。虚血性組織障害の非限定的例は、虚血性心疾患(心不全を伴うまたは伴わない)、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、重症虚血肢、虚血性創傷および虚血再灌流障害／原発臓器移植機能不全を含む。組織機能不全または破壊障害の非限定的例は、椎間板修復、非虚血性拡張型心筋症および関節軟骨障害を含む。ある実施態様において、多くて約５mLの本発明の組成物中、約５×１０７〜約５×１０８細胞が虚血性組織に直接投与される。具体的実施態様において、多くて約５mLの本発明の組成物中、約５×１０７〜約５×１０８細胞が、左室駆出率(ＥＦ)低下および心不全を有する患者への心筋内注射により投与される。例えば、５mLクリオ保護剤中、約１億１０００万細胞を含むＣＳＣＣ＿ＡＳＣ生成物を、解凍し、最大１時間、最大２時間または最大３時間以内に左室ＥＦ低下および心不全を有する患者への直接心筋内注射により投与できる。他の具体的実施態様において、多くて約１〜約５mLの本発明の組成物中、約５×１０７〜約５×１０８細胞が、例えば、関節軟骨障害を有する患者の関節への直接注射により投与される。
【００８９】
ある実施態様において、提供されるのは、例えば、自己免疫性疾患または障害または移植片拒絶の処置または予防のための免疫抑制剤として使用するための、同種異系間治療用生成物である。自己免疫性疾患および障害の非限定的例は、クローン病、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、腎疾患、リウマチ性関節炎および骨髄、心臓、肺および腎臓移植を含む、移植臓器の拒絶を含む。具体的実施態様において、本発明の組成物の約２００ml無菌点滴液体中の約１０×１０６〜約０.５×１０６細胞／mLを、患者、例えば、クローン病を有する患者への静脈内または動脈内注射または点滴により投与できる。
【００９０】
ある実施態様において、提供されるのは、炎症の処置または予防、すなわち、抗炎症剤として使用するための同種異系間治療用生成物である。炎症性障害の非限定的例は、II型糖尿病、腎疾患、非虚血性拡張型心筋症、肺動脈性高血圧および敗血症を含む。具体的実施態様において、本発明の組成物の約２００ml無菌点滴液体中の約１０×１０６〜約０.５×１０６細胞／mlを、患者、例えば、肺動脈性高血圧を有する患者に、静脈内または動脈内注射または点滴により投与できる。
【００９１】
例えば、ＣＳＣＣ＿ＡＳＣ生成物を解凍し、所望により５〜約２００ml無菌点滴用溶液で、約１０×１０６〜約０.５×１０６細胞／mL、例えば、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万または１０００万細胞／mLの濃度に希釈し、自己免疫性または炎症性障害または移植片拒絶を有するまたはその
リスクのある患者に、最大１時間、最大２時間または最大３時間以内に注射または点滴により投与し得る。あるいは、ＣＳＣＣ＿ＡＳＣ生成物を解凍し、無菌点滴用溶液で約１２００万、１３００万、１４００万、１５００万、１６００万、１７００万、１８００万、１９００万または２０００万細胞／mLの濃度に希釈し、静脈内または動脈内注射または点滴により投与するか、または直接疾患組織に投与することができる。
【００９２】
ある実施態様において、多数の本発明のＡＳＣ製剤を、例えば、レシピエントの処置のために、数処置前にドナーとレシピエントの組織マッチングを可能にすることにより個別化処置を提供でき、レシピエントが数処置を必要とするならば、ＡＳＣをあるドナーから他のドナーにスイッチすることもあり得る。後者は、レシピエントが初期に投与したＡＳＣ製剤からのＡＳＣに同種抗体応答を獲得したとき、特に有用であり、この場合同じドナーからのＡＳＣの使用を継続することが可能でないかもしれない。特に、多数のドナーからのＡＳＣを伴う細胞バンクはレシピエント−ドナー組織マッチングを可能とし、これは臨床効果を改善し得る。
【００９３】
本発明を次の実施例により説明し、これは限定を意図しない。
【００９４】
実施例１
ＡＳＣ生成物の製造
次の方法が使用されている。
間質血管細胞群の単離
吸引脂肪組織を健常ドナーから得る。ドナー適格性は、ドナー問診、質問表および感染性疾患マーカーＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎、梅毒およびＨＴＬＶの試験に基づき決定する。皮下腹部脂肪の脂肪吸引を局所麻酔下に実施し、各ドナーから約１００ml〜３００mL吸引脂肪組織を得る。局所麻酔を、その後の脂肪吸引のための２〜４箇所の腹部皮膚に実施する。これらの孔を通して、点滴カニューレ(細針)を、注入液、例えば、麻酔剤および加乳酸緩衝液、重炭酸ナトリウム、アドレナリンおよびリドカインなどの脂肪組織をほぐすための薬剤を維持しながら、導入する。Bodyjet EVO(水流式脂肪吸引)(Human med, Germany)を使用する。吸引脂肪組織をBodyjet吸引カニューレから、無菌採取チャンバーに取り出す。吸引脂肪組織を無菌シリンジで無菌フラスコ／ビンに移す。
【００９５】
バイオリアクターでの培養増殖前に、脂肪組織の酵素消化によって間質血管細胞群を吸引脂肪組織から単離する。吸引脂肪組織をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)ｐＨ７.４で２回洗浄し、残存血液を除去する。脂肪組織を、２mM  Ｃａ２＋濃度まで希釈したＨＢＳＳ(＋ＣａＣｌ２＋ＭｇＣｌ２)(Gibco, Life Technologies)に溶解した０.６ＰＺＵ／ml  コラゲナーゼＮＢ６(Serva GmbH, Germany)と、３７℃、４５分、定回転下インキュベートすることにより消化させる。コラゲナーゼを５％ヒト血小板ライセートおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有培地で中和し、１００μmフィルターで濾過する(Steriflip , Millipore)。残った細胞を１２００ｇで１０分、室温で遠心分離し、再懸濁し、製造業者の指示に従い、NucleoCounter(登録商標)NC-100TMで計数する。
【００９６】
第一継代増殖：
約１億ＳＶＦ細胞を、ＡＳＣ増殖のためにバイオリアクター(Quantum Cell Expansion System, Terumo, Belgium)に負荷する。Quantumバイオリアクターは、独立型インキュベーターに封入された使い捨て中空糸バイオリアクターからなる機能的に閉鎖されたシステムである。培地および試薬または細胞のための導入口を有する双循環ループから供給する。廃棄物を廃棄物バッグに除去する。
【００９７】
方法全体はコンピューター制御され、タッチスクリーンインターフェイスにより制御され、培地灌流量、収集時間、培地ウォッシュアウトおよびＡＳＣの成長と関連する他の作業の制御を可能とする。導入口バッグのクリオ沈降物での負荷、細胞剥離のための酵素添加または収集バッグから細胞導入口バッグへの採取細胞輸送以外(この全ては、バイオリアクターへの負荷前に行われる)、バイオリアクターと関連する全ての操作は、密閉されるかまたは０.２mm無菌バリアフィルターにより保護される。
【００９８】
ＳＶＦのバイオリアクターへの負荷４〜２４時間前、システムをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)でプライムし、その後イオリアクターコーティングのために、約３０ml  クリオ沈降物(Blood Bank, Rigshospitalet, Denmark)を負荷する。クリオ沈降物をそのまま使用するかまたは、例えば、１００mlの総量まで、ＰＢＳで１：３または１：４希釈する。細胞負荷前、ＰＢＳおよびクリオ沈降物をシステムから洗い出し、完全培地(リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド(Gibco, Life Technologies)、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco, Life Technologies)、５％ヒト血小板ライセート(Stemulate、Cook General Biotechnology)を含まない最小必須培地、ＭＥＭアルファ(αＭＥＭ))で置き換える。システムに、ガスを２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および残りがＮ２の混合物(Strandmollen, Denmark)として提供する。
【００９９】
１００ml  完全培地で希釈した１億ＳＶＦを、６０ml  シリンジを使用して細胞導入口バッグに移し、Quantumバイオリアクターに負荷する。細胞を２４時間接着させ、その後培地の連続的供給を始動させる。培地供給速度を０.１mL／分で開始する。グルコースおよび乳酸測定値に基づき、供給速度を調節し、細胞の増殖を検定する。Quantumバイオリアクターサンプルポートからサンプルを除去して、グルコースおよび乳酸レベルを、血液ガス分析装置ABL 835 FLEX(Radiometer, Denmark)での測定値を取ることによりモニターする。細胞負荷約９日後、ＡＳＣを、システムにTrypLE(登録商標)Select(Gibco, Life Technologies)を負荷することにより採取する。収集方法は、ＰＢＳでのシステムのウォッシュアウト、１８０mL  TrypLE(登録商標)Select添加および２０分インキュベーションを含む。採取細胞を細胞収集バッグに洗い入れる。収集バッグからの細胞を、層流空気流中の遠心管に移し、洗浄し、ペレット化し、計数し、NucleoCounterで生存能を試験する。
【０１００】
第一継代中間ＡＳＣをペレット化し、１０００万細胞／ml濃度でCryoStor 10(BioLifeSolutions)に再懸濁する。この溶液をCellSealクリオバイアル(Cook General Biotechnology)に、バイアルあたり５mlの総容積で移す。
【０１０１】
次いでクリオバイアルを制御された速度の冷凍器(Kryo 560-16, Planer)で−８０℃を達成するように凍結し、ドライアイス上で液体窒素乾式貯蔵である、サンプル保存空間に液体窒素がない−１８０℃−範囲の均一温度を提供する、等温液体窒素冷凍器(V1500−AB, CBS)に移す。このシステムは、交差汚染のリスクを最小化する。
【０１０２】
凍結保存第一継代中間生成物は作業細胞バンクを構成し、第二バイオリアクター増殖のために負荷するまで保存する。
【０１０３】
第二継代増殖
第一継代中間ＡＳＣの第二継代増殖への負荷４〜２４時間前、新規バイオリアクターを第一継代増殖について記載のとおりプライムおよびコートする。システムに完全培地を負荷し、ガスをシステムに２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および残りがＮ２の予備混合物サプライとして提供する。５０００万第一継代ＡＳＣを保持する１個のCellSealバイアルを窒素タンクから取り出す。細胞のアンプルを“ジップバッグ”に移し、３７℃水浴で解凍する。バイアルの底からのシールを取り出し、アルコールで除菌する。配管の断片を通気孔から切断し、細胞に圧がかかりすぎるのを避ける。１０ml  シリンジおよび１６Ｇ注射針で、予め決定した量の細胞(例えば、アンプルの１／４、アンプルの１／２またはアンプル全体)を吸引し、１０ml  遠心管に移す。細胞を計数し、生存能をNucleoCounterで決定する。細胞を１００ml  完全培地で希釈し、６０ml  シリンジを使用して細胞入口に移す。増殖および収集を第一継代増殖について記載のとおり実施する。
【０１０４】
第二継代増殖約７日後、ＡＳＣを採取し、細胞をペレット化し、CryoStor 10に約２２００万細胞／mlの濃度で、一般に約２０００万〜約２４００万細胞／mL範囲で再懸濁する。この溶液を、バイアルあたり５mlの総容積でCellSealクリオバイアルに等分し、バイアルあたり約１億１０００万細胞、一般にバイアルあたり約１億〜約１億２０００万細胞範囲を保持する。
【０１０５】
次いで、クリオバイアルを制御速度冷凍器で凍結し、−８０℃を達成し、サンプル保存空間に液体窒素なく、−１８０℃−範囲の均一温度を提供する液体窒素乾式貯蔵容器にドライアイス上で移す。凍結保存第二継代ＡＳＣは、治験薬生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣからなり、臨床使用のための輸送まで生成物細胞バンクで保存される。
【０１０６】
組成物は直ぐに使用でき、臨床現場で最小の取扱のみを必要とする。凍結バイアルを、手術室内／近傍で３７℃水浴で解凍する。バイアルを滅菌し(一般にアルコール綿棒で)、細胞懸濁液を注射針で無菌シリンジに吸引する。次いでシリンジを注射カテーテルに接続し、患者に投与する。
【０１０７】
実施例２
ＡＳＣ生成物特徴付け  −  細胞表面マーカー
免疫表現型検査を使用して、細胞品質を同定し、第一継代中間生成物および第二継代最終生成物で、実施例１に従い製造したＡＳＣ生成物の凍結保存前後に実施した。
【０１０８】
採取細胞を洗浄し、濾過し、抗体含有または非含有チューブに分配した。細胞を、表１に示す抗体と、３０分、室温でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、遠心分離し、六色プロトコルを使用するフローサイトメトリーのためにＰＢＳに再懸濁した。
【０１０９】
欧州薬局方によると、フローサイトメトリーは細胞表面マーカー同定のための適当な方法である。ＡＳＣの同定のために、ＩＳＣＴ／ＩＦＡＴＳ(International Federation for Adipose Therapeutics and Science and the International Society for Cellular Therapy)により推奨される表面マーカーに対する蛍光標識抗体をＡＳＣに添加し、細胞関連蛍光をフローサイトメーターを使用して測定した。ある生成物の特徴付けのために、フルオロフォアフィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン−テキサスレッド、フィコエリトリン−シアニンおよびアロフィコシアニンでの補償型６色プロトコル標識細胞を使用して測定した。生存能をSYTOXブルー染色により決定した。プロトコルを、手動補償、アイソタイプ対照およびFluorescence Minus One対照を用いて開発した。死滅細胞およびダブレットを最終分析から除外した。データをＧＭＰ遵守Navios(Beckman Coulter, Germany)を使用して所得および分析した。データを、NaviosソフトウェアおよびKaluza(Beckman Coulter, Germany)を使用して分析した。
【０１１０】
【表１】
2018531269.tif 000003
【０１１１】
【表２】
2018531269.tif 000004
【０１１２】
【表３】
2018531269.tif 000005
【０１１３】
実施例３
ＡＳＣ生成物の特徴付け  −  細胞生存能
生成物品質および最終生成物の効果は、ＡＳＣの生存能の対象である。従って、生存能は製造方法をとおして重要である。
生存能を、実施例１の製造過程中に数回決定し、ＳＶＦの生存能を、最初の増殖のためにバイオリアクターに負荷する前に決定し、第一継代増殖ＡＳＣの生存能を収集後ならびに第二継代のために解凍および負荷後に決定し、最終生成物の生存能を収集後ならびに凍結保存および解凍後に決定した。パーセンテージ生存能をNucleoCounter(登録商標)NC-100TMで決定した。NucleoCounterは、ＤＮＡ結合蛍光色素であるヨウ化プロピジウム(ＰＩ)からの蛍光検出を利用するイメージサイトメーターである。
【０１１４】
【表４】
2018531269.tif 000006
【０１１５】
実施例４
分化アッセイ
増殖添加剤としてStemulateを用い、Quantumバイオリアクターで増殖させた第二継代ＡＳＣの骨分化、脂肪細胞分化および軟骨分化能を、製造業者のプロトコルに従い、StemPro分化キット(Gibco, Life Technologies)を使用して決定した。
骨分化について、１２ウェルプレート中１０,０００  ＡＳＣ／ウェルを骨分化誘導培地(StemPro Adipocyte Differentiation Basal Medium, StemPro Adipocyte Supplement、ペニシリン／ストレプトマイシン)でインキュベートした。脂肪細胞分化について、１２ウェルプレート中２０,０００  ＡＳＣ／ウェルを、脂肪細胞分化誘導培地(StemPro Adipocyte Differentiation Basal Medium、ペニシリン／ストレプトマイシン)でインキュベートした。軟骨分化について、多数の５μl滴の８０,０００  ＡＳＣを軟骨形成誘導培地(StemPro Osteocyte/Chondrocyte Differentiation Basal Medium, StemPro Chondrogenesis Supplement、ペニシリン／ストレプトマイシン)でインキュベートした。細胞を２１日、培地を３〜４日毎に交換しながら誘導した。対照細胞を、サプリメント無添加完全培地でコンフルエントまで培養した。
【０１１６】
骨分化は、Alizarin Red S染色(Sigma-Aldrich)でカルシウム沈着を示す細胞として記録した。脂肪細胞分化は、Oil Red O(Sigma-Aldrich)で染色された脂肪滴の形態的外観から記録した。軟骨形成分化は、細胞がAlcian Blue 8GX(Sigma-Aldrich)で染色されたとして記録した。完全培地に維持した対照細胞は全て陰性であった。
【０１１７】
実施例５
クリオ保護剤製剤の比較
臨床での解凍時の最終凍結保存生成物におけるＡＳＣの生存能および機能は、生成物有効性のために一番重要である。生存能および機能を、種々のクリオ保護剤製剤を用いる凍結保存ＡＳＣで決定した。
【０１１８】
第一継代中間ＡＳＣおよび第二継代最終ＡＳＣ生成物を、実施例１に記載のとおり製造した。中間ＡＳＣを、クリオバイアルで、種々のクリオ保護剤製剤中、５mLあたり５０×１０６細胞で凍結させた。
【０１１９】
第二継代最終ＡＳＣを、クリオバイアルで、種々のクリオ保護剤製剤中、５mLあたり１００×１０６細胞で凍結させた。細胞を自動冷凍器で−８０℃に凍結し、液体窒素乾式貯蔵で保存し、３７℃水浴で解凍し、生存能および回収率を、解凍直後および解凍後３時間まで室温においた凍結製剤で決定した。
【０１２０】
解凍直後および、凍結製剤を室温に維持しながら、解凍後３時間まで、最終ＡＳＣ細胞生成物を洗浄し、インビトロ形態学、接着および増殖により決定される細胞機能の同定のために培養した。培養物を、２０ml完全培地含有Ｔ７５フラスコあたり、１×１０６細胞で、３７℃、５％ＣＯ２で確立した。
【０１２１】
生存能および回収率をNucleoCounterで決定した。形態学および接着を、細胞を培養して２４時間後の顕微鏡法により決定した。増殖を、細胞を培養して４８時間後、剥離およびNucleoCounterでの細胞計数により決定した。
【０１２２】
等張食塩水、CryoStor 10およびCryoStor 5中５％または１０％ＨＰＬまたはヒトアルブミン(ＨＡ)およびＤＭＳＯを含む凍結製剤を試験した。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
細胞の機能および効力は、臨床効果の最良の予測因子である。現在利用可能なインビトロ法で、形態学、接着および増殖は、細胞機能の最良の全体的指標である。顕微鏡的試験は、細胞機能(形態学、接着および増殖)がCryoStor 10中の細胞製剤で優れていることを明らかにした。
【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
【表１０】
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【０１３０】
実施例６
増殖添加剤の比較
ＳＶＦを、３名の健常女性ドナー(年齢３２〜４７歳；平均年齢４０歳)から得た吸引脂肪組織から、実施例１に記載のように得た。ＳＶＦを、５％ｈＰＬまたは１０％ＦＢＳを含む４つの異なるＧＭＰ遵守培地で培養した。ＡＳＣ  Ｐ０、Ｐ１およびＰ５を特徴付けし、分析に使用した。
【０１３１】
ＡＳＣの初代細胞培養物を、最小必須培地、ＭＥＭアルファ(αＭＥＭ)、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび次の４種の異なる増殖添加剤を含む完全培地中、４.５×１０６  ＳＶＦ／Ｔ７５フラスコで確立した：
１. ５％ヒト血小板ライセート(PLTMax, Mill Creek Life Sciences)、１０IU  ヘパリン
２. ５％ヒト血小板ライセート(Stemulate、hPL-S、Cook General Biotechnology)、１０IU  ヘパリン
３. ５％ヒト血小板ライセート(Stemulate、hPL-SP、Cook General Biotechnology)
４. １０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ、Gibco, Life Technologies)
【０１３２】
ＨＰＬは、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子を伴う血漿からなり、それ故に、ヘパリンをゼラチン化防止のために添加しなければならない。Cook General Biotechnologyは、StemulateTM貯蔵ヒト血小板ライセートの二つの異なるバージョン、ヘパリン要求性ＰＬ−Ｓおよび、凝固因子のいくぶんかは除去され、ヘパリン添加を必要としない非ヘパリン要求性ＰＬ−ＳＰを産生する。
【０１３３】
細胞を、３７℃で５％ＣＯ２の加湿空気の標準条件下、インキュベートした。ＡＳＣの培地を、非接着細胞を除去するため２日後に、そして、その後３〜４日毎に交換した。培養物が約９０％コンフルエンスのレベルに達したとき、細胞をＰＢＳで洗浄し、剥離し、実験群について継代した。増殖を、Buerker-Tuerkチャンバーでの手動計数により、１日、２日、３日、５日および７日に決定した。集団倍加(ＰＤ)をＰＤ＝ｌｎ(Ｎ／Ｎ０)／ｌｎ２として計算し、ここで、Ｎは７日目の採取細胞数であり、Ｎ０は播種細胞数である。ＡＳＣの骨分化、脂肪細胞分化および軟骨分化能を、StemPro分化キットを使用して決定した。免疫表現型検査を、実施例２に記載のとおり決定した。ゲノム安定性を、比較ゲノムハイブリダイゼーションにより決定した。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
表１１似示すとおり、ＨＰＬ生成物の使用は、何れも、ＦＢＳの使用よりも、増殖能の点で明らかにより有効な増殖添加剤である。
【０１３６】
継代第一で試験した全増殖添加剤と共に培養したＡＳＣは、同等なおよびＡＳＣ特徴免疫表現型プロファイルを有し、その三分化系列分化能を維持することが証明された。比較ゲノムハイブリダイゼーション(ＣＧＨ)により同定したゲノム安定性は、PLTMax、StemulateおよびＦＢＳ存在下インビトロで増殖したＡＳＣは、第五継代まで培養したとき、何ら不均衡染色体再編を示さなかった。従って、PLTMaxまたはStemulateで培養したＡＳＣの高い増殖能はゲノム安定性を損なわなかった。
【０１３７】
実施例７
バイオリアクターでの手動および自動化増殖の比較
ＳＶＦを腹部脂肪から単離し、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび血清含有増殖添加剤添加基底培地に懸濁し、Ｔ７５フラスコ上またはクリオ沈降物で被覆されているQuantumバイオリアクター内に播種した。ＳＶＦから継代したＡＳＣの培養物を、フラスコからフラスコ、フラスコからバイオリアクターおよびバイオリアクターからバイオリアクターの３段階で実施した。全例で、フローサイトメトリーにより決定する細胞数、生存能および免疫表現型決定に加えて、品質管理を、無菌性、マイコプラズマおよびエンドトキシンを試験することにより実施した。
【０１３８】
一次フラスコ培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の標準条件下培養するＴ７５フラスコあたり４.５×１０６  ＳＶＦ細胞で確立した。培養培地を、非接着細胞除去のため３日後に代えた。その後、培地を、培養の残り期間にわたり３〜４日毎に交換した。９０％細胞のコンフルエンスレベル到達を採取した。細胞を３.５×１０５細胞／Ｔ７５フラスコで再播種した。継代０(Ｐ０)および継代１(Ｐ１)でのＡＳＣの生存能および収率をNucleoCounter(登録商標)NC-100ＴＭで決定し、３個のＴ７５フラスコの平均として計算した。
【０１３９】
Quantumバイオリアクター中のＳＶＦの一次増殖について、システムを、実施例１に記載のとおりクリオ沈降物でプライムし、そしてコートした。ＳＶＦからの１００×１０６細胞を負荷し、２４時間接着させ、その後自動で開始する０.１mL／分で供給した。３日培養後、ウォッシュアウト作業を非接着細胞除去のために実施した。前培養したＡＳＣ(すなわち、一次増殖由来のもの)の第二継代増殖のために、Quantumバイオリアクターを３０×１０６  ＡＳＣで播種した。Quantumバイオリアクターで実施するＳＶＦおよびＡＳＣの増殖で使用する培地および試薬は、フラスコ培養で使用したものと同一であった。
【０１４０】
【表１２】
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【０１４１】
ＡＳＣ  Ｐ０およびＰ１の生存能は、培養がフラスコであるかバイオリアクターであるかに係わらず、９６％を超えた。全条件下のＡＳＣ増殖は、同等なおよびＡＳＣ特徴免疫表現型プロファイルを有することが明らかとなった。無菌性、マイコプラズマおよびエンドトキシン試験は一貫して陰性であった。
【０１４２】
しかしながら、バイオリアクターに負荷した平均５５×１０６  ＳＶＦ細胞は８９×１０６  ＡＳＣ  Ｐ０をもたらし(播種したＳＶＦ細胞数に対してＡＳＣ数は１.６倍高い)、一方Ｔ７５フラスコあたり４.５×１０６播種ＳＶＦは、平均１.７５×１０６  ＡＳＣをもたらした(播種したＳＶＦ細胞数に対してＡＳＣ数は０.４倍)。QuantumバイオリアクターにおけるＡＳＣ  Ｐ１増殖は、Ｐ０の培養がフラスコであるかQuantumバイオリアクターであるかに係わらず、約２.１の集団倍加(ＰＤ)を示し、一方フラスコでのＡＳＣ  Ｐ１は、１.０のＰＤにしか到達しなかった。
【０１４３】
結論として、バイオリアクターでのＡＳＣ製造はＡＳＣ増殖速度および収率を、Ｔフラスコにおける手動方法と比較して有意に増加させ、同時に安全かつ強固な細胞産生に必須の純度および品質を維持する。
【０１４４】
実施例８
Quantumバイオリアクターにおける増殖添加剤比較
QuantumバイオリアクターでのＡＳＣ増殖のための増殖添加剤としてのＨＰＬ(Stemulate、hPL-SP、無ヘパリン、Cook General Biotechnology)およびウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Gibco, Life Technologies)の使用を比較した。
【０１４５】
３ドナー脂肪吸引から、腹部脂肪からのＳＶＦ単離および第一継代増殖を実施例１に従い実施した。これらの継代から、３０×１０６  ＡＳＣを、新規Quantumバイオリアクターに第二増殖のために負荷した。全ての継代において、代謝モニタリング(グルコースおよび乳酸)が供給速度および収集時期を導いた。ＡＳＣの生存能、無菌性、純度、分化能およびゲノム安定性を決定した。比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイアッセイにより決定する微生物品質管理、フローサイトメトリー、三重分化およびゲノム安定性を実施した。
【０１４６】
この二つの継代方法の各継代は、ＦＢＳより大きな程度へのＡＳＣのＨＰＬ支持増殖を示した。３ドナーの平均として、９(７〜１１)日のＨＰＬ培地でのＳＶＦ培養物は、平均５４６×１０６  ＡＳＣを生じた。ＦＢＳ培地でのＳＶＦ培養物は、１１１×１０６  ＡＳＣを得るために、８日多く必要とした。第二継代ＡＳＣは、ｈＰＬ培地で６日後平均８００×１０６細胞(ＰＤ５.２)を生じ、それに対し、ＦＢＳ培地で２１日後１００×１０６  (ＰＤ：２.２)細胞であった。ＡＳＣは、両方の培地タイプでＩＳＣＴ基準を満たした(免疫表現型および三重分化)。比較ゲノムハイブリダイゼーションはゲノム安定性を示した。無菌性、マイコプラズマおよびエンドトキシン試験は全て陰性であった。
【０１４７】
QuantumバイオリアクターおよびｈＰＬの使用の組み合わせは、QuantumバイオリアクターおよびＦＢＳの使用と比較して、第一継代ＡＳＣで５倍多くおよび第二継代ＡＳＣで８倍多く採取した。
【０１４８】
実施例９
最終ＡＳＣ生成物の免疫抑制性活性
本来虚血性、外傷性または自己免疫性である、何らかの原因の組織損傷中の顕在化は、炎症性細胞の迅速な出現であり、これは再生方法成功の間にゆっくり減少するが、慢性虚血性／外傷性創傷治癒および自己免疫反応中持続する。この浸潤は、単球／マクロファージの最初の、続くリンパ球の蓄積からなる。従って、特に単球／マクロファージ集団に対しＡＳＣ生成物により発揮される免疫抑制が、再生に有利となるバランスを変えることが予測される。ＡＳＣ免疫抑制性活性は、同様に同種移植生存およびそれにより多数の再生機構に必須である。
【０１４９】
免疫抑制が同種使用および有効性の両方について目的の固有のＡＳＣ特徴であるため、ヒト樹状細胞アッセイおよびヒト混合リンパ球反応などの自然免疫および細胞性免疫に取り組むインビトロ細胞モデルを、免疫抑制性活性の試験に使用した。
【０１５０】
循環単球由来ＡＳＣおよび樹状細胞(ＤＣ)の共培養を、Jensen and Gad (2010)の方法により確立した。末梢血単核細胞を５０歳未満の健常ドナーのバフィーコートから、Ficoll-Paque勾配(GE Healthcare)での遠心分離および細胞接触面の分離により単離した。細胞を、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ添加ＲＰＭＩ  １６４０(Roswell Park Memorial Institute)培地(Sigma)で洗浄し、ＣＤ１４＋単球をＭＡＣＳ分離カラムおよび磁気ビーズ(CD14 MACSマイクロビーズ、ヒト、Miltenyi Biotec)を使用する陽性選択により単離した。細胞懸濁液適用前後に、カラムを脱気ＰＢＳＥ緩衝液(ＰＢＳ、０.５mol／Ｌ  ＥＤＴＡ、２％ＦＢＳ)で洗浄した。ＣＤ１４＋単球を、６ウェルプレートに、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、２％ヒトＡＢ血清、ヒト組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(２０ng／mL)およびヒトインターロイキン(ＩＬ)−４(２０ng／mL；PeproTech)添加ＲＰＭＩ  １６４０培地中２×１０６細胞／mL密度で播種した。培地を２〜３日毎に交換した。分化６日後、細胞を採取し、ＤＣ：ＡＳＣ共培養のために調製した。細胞生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣ；第二継代凍結保存ＡＳＣ(CryoStor 10中)を解凍し、細胞をフラスコ培養(ａＭＥＭ、５％Stemulate、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ)に１週間入れ、その後ＤＣ：ＡＳＣ共培養を開始した(培養復帰ＡＳＣ)。ＤＣ：ＡＳＣ共培養の日、細胞生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣ；第二継代凍結保存ＡＳＣ(CryoStor 10中)のバイアルを、共培養への直接使用のために解凍した。ＡＳＣを、１×１０６／ウェル濃度で４８ウェルプレートに播種し、ＤＣ対ＡＳＣ比１：１とした。ＤＣを１μg／mL  リポ多糖(ＬＰＳ；Sigma)および２０ng／mL  インターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−ｇ；PeproTech)での刺激により活性化した。ＤＣ活性化の陽性対照として、ＤＣのみを含む１ウェルを１μg／mL  リポ多糖(ＬＰＳ；Sigma)および２０ng／mL  インターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−ｇ；PeproTech)で等しく刺激し、２４時間インキュベートした。
【０１５１】
樹状細胞成熟マーカーのフローサイトメトリー
共培養物を、再懸濁し、上清を除去し、ウェルの底を曲がったピペットチップで擦り取ることにより採取した。採取細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液(１.５％ＮａＮ３および１％熱不活性化ＦＢＳ添加ＰＢＳ)で２回洗浄した。サンプルをヒトＩｇＧ(Sigma)と氷上で１５分インキュベートして、Ｆｃ受容体を遮断した。使用した一次抗体は、ＩｇＧ−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、ＩｇＧ１ｋ−ＰＥ、ＣＤ４０−ＰＥ、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ８６−ＰＥ(BD Bioscience)およびＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ(Beckman Coulter)であった。サンプルを抗体と３０分氷上でインキュベートし、洗浄し、データをFACS Accuri(BD Bioscience)に収集した。データを、ＣＤ１１ｃ陽性およびサイズによるＤＣ集団のゲート事象で獲得し、Flowlogicで分析した。平均蛍光強度(ＭＦＩ)を測定し、陽性対照ＤＣのＭＦＩと比較した。
【０１５２】
【表１３】
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【０１５３】
ヒト樹状細胞アッセイは、第二継代最終および凍結製剤ＡＳＣ生成物がヒト樹状細胞成熟／活性化を抑制したことを示した。これは、細胞生成物が能動的に免疫抑制性であり、インビボ注射後拒絶を回避することを指摘する。解凍後直接最終生成物でおよび復帰のために培養されている最終かつ解凍生成物からのＡＳＣで実験を実施した。樹状細胞の活性化に関するＡＳＣ製剤および凍結貯蔵保存の影響が、これにより取り組まれている。
【０１５４】
継代２代最終ＡＳＣ生成物の免疫抑制性活性を、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)に基づくインビトロ細胞モデルでさらに試験した。このモデルにおいて、循環末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を同種ドナーからの照射ＰＢＭＣにより刺激し、種々の比の最終ＡＳＣ生成物を添加した。簡単にいうと、ＡＳＣを、９６ウェルプレートで次のレスポンダーＰＢＭＣの１：２０〜１：１に対応する比で培養した。ＡＳＣ不含ウェル(培地のみ)を陽性対照として使用した。翌日、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をLymphoprepを使用する密度勾配遠心分離の手段によりバフィーコートから精製した。各ＰＢＭＣプールの半分をガンマ放射線源(３０００RAD)で照射した。ＰＢＭＣを９６ウェルプレートで合わせ(ウェルあたり１００μl＋１００μl)固有のＭＬＲ数とし、増殖性ＰＢＭＣプールを他のドナーからの照射プールで攻撃した。４日共培養期間後、３Ｈ−チミジン(２５μSi／ml)を添加し、１８〜２０時間インキュベートした。自動化ハーベスターを使用して、細胞をフィルタープレートに採取し、シンチレーション液に入れ、ＰＢＭＣ増殖応答を可視化して、カウント毎分を、シンチレーションカウンター(Topcount)で決定した。
【０１５５】
第二継代最終ＡＳＣ生成物のＭＬＲへの添加は、ＡＳＣが通常生じる迅速なリンパ球増殖に対し、抑制効果を発揮することを示した。
【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
実施例１０
最終生成物／第二継代ＡＳＣの免疫調節性表現型検査
実施例１に従い製造した最終生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣの免疫調節性表面マーカーに基づく表現型特徴付けをフローサイトメトリーにより実施した。ＡＳＣをTrypleSelectで採取し、洗浄し、濾過し、抗体含有または非含有チューブに分配した。細胞を、表１５に示す抗体と、３０分、室温でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、遠心分離し、フローサイトメトリーのためにＰＢＳに再懸濁した。
【０１５８】
フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン−テキサスレッド、フィコエリトリン−シアニン、アロフィコシアニンおよびBrilliant Violet(伝導ポリマー)などのフルオロフォアにコンジュゲートした抗体を用いる単色プロトコル標識細胞を使用した。生存能をＦＶＳ−７８０染色(Becton Dickinson)により決定した。死滅細胞およびダブレットを最終分析から除外した。データをＧＭＰ遵守Navios(Beckman Coulter, Germany)を使用して所得および分析した。データをNaviosソフトウェアおよびKaluza(Beckman Coulter, Germany)を使用して分析した。
【０１５９】
【表１５】
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ＣＸＣＲ４：Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４
ＬＴβＲ：リンホトキシンベータ受容体
【０１６０】
表１５に示すＣＤマーカーは、全て、免疫調節性および特に免疫抑制性機能におけるその関連性のために選択されている。表１５に示すＡＳＣ特徴付けは、相当な免疫抑制性能力に一致する(Krampera et al., 2013)。特に最強陽性マーカーＣＤ１０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ２０４、ＣＤ２５８、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ９、ガレクチン３およびガレクチン９、ＨＬＡ−ＧおよびＬＴβＲは、免疫シグナル伝達、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ接着、ホーミング、パターン認識、Ｔ細胞阻害、増殖因子受容体上方制御および炎症誘発性タンパク質の不活性化などの機構を経るＡＳＣ免疫調節能を反映する。
【０１６１】
実施例１１
免疫調節性機能的能力；炎症誘発環境への表現型的適応
実施例１０に記載する免疫調節性および免疫抑制性表現型が、実際の免疫抑制応答性に合致するか否かを試験すために、実施例１に従い製造した生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣからのＡＳＣを炎症誘発性サイトカインでインビトロで攻撃し、表現型的変化を試験した。
【０１６２】
種々のドナーからの最終生成物ＡＳＣを、標準培地(αＭＥＭ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％ｈＰＬ)でインビトロで培養した。約８０％コンフルエンスで、各ドナーからの培養物の半分を培養物あたり２５ml培地で、５０ng／ml  ＩＦＮ−ガンマで刺激した。３日後、実施例１０に記載のとおり培養物をTrypleSelectで採取し、フローサイトメトリーのために調製した。
【０１６３】
【表１６】
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【０１６４】
【表１７】
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【０１６５】
表１６および１７に示すとおり、最終生成物ＡＳＣは炎症性環境に応答できる。応答は集団レベルならびに個々の細胞レベルで見られる。
【０１６６】
集団のパーセンテージは、集団全体において表面マーカーを発現する細胞のパーセンテージを意味する。平均蛍光強度数は、各個々の細胞のマーカー数の上方または下方制御に対応する。
【０１６７】
特に重要なのは、集団ベースでのＣＤ２７４(ＰＤ−Ｌ１)の８７％上方制御が、免疫抑制性作用を開始する能力を説明することである。マクロファージでの発現が知られるＣＤ２７４は、組織同種移植および自己免疫性疾患などの特定の事象中の免疫系の抑制に主要な役割を有する(Camillieri et al, 2016; Krampera et al., 2013)。ＰＤ−Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞に見られるその受容体であるＰＤ−１に結合し、Ｔ細胞増殖の活性化または抑制を制御する。ＰＤ−Ｌ１は、少なくとも一部、アポトーシス誘発により作用する。第二継代ＡＳＣに対するＣＤ２７４の厳密な役割はなお未定であるが、ＦＢＳを用いて手動で増殖させた、ＣＤ２７４陽性骨髄ＭＳＣはＴ細胞増殖およびＴｈ１７極性化を制御し、ＩＮＦガンマライセンシング後に同等な効果が示されている。
【０１６８】
また注目されるのは、マーカーＣＤ５４(ＩＣＡＭ−１)についてのＭＦＩの３から９７への増加であり、これは、ＡＳＣ−白血球相互作用の安定化およびシグナル伝達に必要な細胞間接着分子の可動化を説明する。ＩＣＡＭ−１は、白血球に見られる受容体であるＬＦＡ−１(インテグリン)のリガンドである。
【０１６９】
ＨＬＡ  ＤＲ／ＤＰ／ＤＱの顕著な上方制御が予測されるが、既知共刺激性マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の上方制御がない状況で、抗原提示表現型は得られない。むしろ、同時のＣＤ２７４の顕著な上方制御および他の免疫抑制性マーカーの永続性発現は、抗炎症性である正味の結果と一致する(Krampera et al., 2013; Galipeau et al., 2016)。
【０１７０】
環境に表現型的におよび機能的に応答する能力は、処置の際に細胞が注入されるインビボ環境と相互作用する生成物の能力にとって重要である。生成物のこの固有の相互作用的性質は、その特徴およびその臨床効果に重要である。免疫抑制性表現型を呈する能力は、同種使用を可能とし、説明する。
【０１７１】
実施例１２
臨床試験
血行再建選択肢および最大耐容性医薬治療がない慢性虚血性心疾患および心不全、左室ＥＦ低下(≦４５％)、ニューヨーク心不全(ＮＹＨＡ)クラスII〜IIIを有する、６２.５±６.６歳(平均±ＳＤ)の１０患者を、最終生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣで処置している。NOGA MYOSTAR(登録商標)カテーテル(Biological Delivery System, Cordis, Johnson & Johnson, USA)で、実施例１に従い製造した０.３mL  ＣＳＣＣ＿ＡＳＣの約１５注射を、梗塞領域境界部において生存可能心筋に注入した。
【０１７２】
患者は、ベースラインおよび６ヶ月後、心エコーおよび造影剤使用ＣＴ走査を受けた。
３２０多検出器ＣＴスキャナー(Aquilion One, 東芝メディカルシステムズ株式会社, 大田原、日本)を心臓ＣＴ走査実施のために使用した。Ｒ−Ｒ間隔およびマルチセグメント画像再構築をスキャナーソフトウェアで実施した。画像を前向きウィンドウで０.５mmスライス厚および２％間隔で０.２５mm漸増で再構築した。
エコーは、胸骨傍断面および心尖部像で心機能および体積を測定した。
【０１７３】
全画像データをｃｖｉポスト・プロセッシング・ツール(Circle Cardiovascular Imaging, Calgary, Alberta, Canada)で分析した。心内膜および心外膜境界を拡張終期および収縮末期に手動でトレースし、僧帽弁面をＬＶの基底境界規定のために設定した。
【０１７４】
ニューヨーク心臓病学会(ＮＹＨＡ)機能分類を使用した。それは、患者を、身体活動中、息切れに関連して、どの程度制限されるかに基づき４カテゴリーの一つに分類する。
【０１７５】
６分歩行試験(６ＭＷＴ)を、３０ｍ長(１００ft)廊下または通廊を使用する、米国胸部学会ガイドライン２００２年３月により標準化した。Borg CR10スケールを、実験強度の測定に使用した。
【０１７６】
【表１８】
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ａ：対応のあるＴ検定
ｂ：ウィルコクソンの符号順位検定
【０１７７】
処置６ヶ月後、左室駆出率(ＬＶＥＦ)および６ＭＷＴは改善し、同時に左室収縮末期容積(ＬＶＥＳＶ)およびＮＹＨＡスコアは減少していた。測定は、心臓ポンプ機能改善、作業能力増加および息切れの発作減少を明らかにする。処置は、安全かつ有効であった。
【０１７８】
実施例１３
ＡＳＣの表面接着
ＡＳＣ集団を規定する固有の特徴は、ＡＳＣが接着する能力である。加えて、接着する能力は、ＡＳＣが正常細胞機能を維持することを示す多くの性質の第一である。本実施例において、実施例１に記載のとおり製造した生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣからのＡＳＣが、乾式貯蔵液体窒素容器で−１８０℃、最大１２ヶ月保存された後に接着する能力を試験した。簡単にいうと、実施例１に従い製造した３ドナーからのＡＳＣを１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月および１２ヶ月保存し、解凍し、計数し、５％ＨＰＬ添加ａＭＥＭで１００万生存可能細胞／フラスコで５時間、インビトロ培養した。５後、培養物を洗浄し、接着性集団をTrypleSelectで剥離し、計数した。
【０１７９】
表１９Ａ、ＢおよびＣ
【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【０１８０】
表面に接着する能力は、重要なＡＳＣ特徴である。生成物ＣＳＣＣ＿ＡＳＣは、凍結、保存および解凍後、ＡＳＣ接着性の高い程度の維持を示す。
【０１８１】
Ｎ２乾式貯蔵容器中、−１８０℃で、最大１２ヶ月保存したならば、７１〜８９％(平均：７６％)の細胞が、接着する機能的能力を維持する。
【０１８２】
実施例１４
表面マーカー
実施例１に記載のとおり産生した細胞を、単色フローサイトメトリープロトコルを使用する以外実施例２に記載のとおり特徴付けし、第一継代ＡＳＣ(８バッチ)および第二継代ＡＳＣ(１４バッチ)について下の表２０に示す結果を得た。
【０１８３】
簡潔には、細胞を収集後、凍結保存前に直接分析した。フローサイトメトリーのために、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００万細胞／mlに調節し、生存能染色ＦＶＳ−７８０(Becton Dickinson)で、１０分、ＲＴで暗所で標識した。ＦＶＳ−７８０をＦＢＳ含有ＰＢＳで洗い出し、細胞懸濁液を濾過し、抗体を、先のタイトレーションに従う容積で３０分、ＲＴで暗所で、添加した。使用した全抗体はBecton Dickinsonからであり、蛍光色素ＰＥ(フィコエリトリン)、Brilliant Violet５１０、ＦＩＴＣ(フルオレセインイソチオシアネート)、ＡＰＣ(アロフィコシアニン)およびＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５.５(ペリジニン−クロロフィルタンデム)とコンジュゲートさせた。死滅細胞およびダブレットを最終分析から除外した。データをＧＭＰ遵守Navios(Beckman Coulter, Germany)を使用して所得および分析した。データを、NaviosソフトウェアおよびKaluza(Beckman Coulter, Germany)を使用して分析した。
【０１８４】
【表２２】
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【０１８５】
表２０は、第一および第二継代後、ＡＳＣ特徴付けに使用した列記した表面マーカーを発現する、ＡＳＣのパーセンテージを示す。平均発現値は、第一継代および第二継代それぞれ８および１４バッチに基づく。最小および最大発現レベルも示す。
【０１８６】
参考文献一覧
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【図１】
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【国際調査報告】
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