(57)【要約】  口腔ケア用の自己フィルム形成性組成物。粉末形態の自己フィルム形成性組成物、再構成済製剤、および経口用のキットが提供されている。これらは、口腔内でプロバイオティクスの十分なコロニー形成を可能にすると共に、十分な滞留時間によって、口腔状態に関連する病原体に対して有益な効果をもたらす。ゆえに、提供されたアイテムは、口腔微生物叢の変性に関連する病態、特にインプラント周囲炎を予防し且つ／あるいは治療するのに有用である。粉末形態の自己フィルム形成性組成物は、少なくともゲル化剤および／または少なくとも生体接着剤、ならびに少なくとも１種の乳酸細菌株を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地の存在下、攪拌下にて自己フィルム形成性である粉末形態の自己フィルム形成性組成物であって、前記組成物が、
（ｉ）少なくとも１種の粉末形態のゲル化剤と、
（ｉｉ）少なくとも１種の粉末形態の生体接着剤と、
（ｉｉｉ）少なくとも１種の粉末形態の乳酸細菌株と、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が単一容器、または別個の容器に収容され、前記自己フィルム形成性組成物が局所的に投与され、
（ｉ）前記少なくとも１種のゲル化剤が前記組成物に粘度を付与する量であり、且つ（ａ）デンプン、（ｂ）ガム、（ｃ）藻類多糖類、（ｄ）ペクチンおよび麦芽デキストリンからなる群から選択されるポリサッカライド、（ｅ）セルロース誘導体、（ｆ）ゼラチン、コラーゲンおよびカゼインからなる群から選択されるポリペプチドからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記少なくとも１種の生体接着剤が前記組成物に粘度を付与する量であり、且つ（ａ）ガム、（ｂ）藻類多糖類、（ｃ）セルロース誘導体、（ｄ）ペクチンおよび麦芽デキストリンからなる群から選択されるポリサッカライド、ならびに（ｅ）アクリレート系ポリマー、ビニル系ポリマーおよびカチオン性ポリサッカライドからなる群から選択されるポリマー、
からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
前記ゲル化剤および前記生体接着剤が前記少なくとも１種の乳酸細菌に対して殺菌効果を有さない、請求項１に記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物。
【請求項３】
前記ゲル化剤および前記生体接着剤が前記少なくとも１種の乳酸細菌に対して静菌効果を有さない、請求項２に記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物。
【請求項４】
前記ゲル化剤または前記生体接着剤が、前記少なくとも１種の乳酸細菌に対してプレバイオティクス効果を有する、請求項３に記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物。
【請求項５】
前記ゲル化剤がガムおよび藻類ポリサッカライドからなる群から選択され、前記生体接着剤がセルロース誘導体およびビニル系ポリマーからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の自己フィルム形成性組成物。
【請求項６】
前記乳酸細菌株が、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する、請求項１〜５のいずれかに記載の自己フィルム形成性組成物。
【請求項７】
前記ペディオコッカス（Pediococcus）菌株が、受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５、ＣＥＣＴ８９０６の菌株として受託された菌株からなる群から選択される、請求項６に記載の自己フィルム形成性組成物。
【請求項８】
液体培地の存在下、攪拌下にて自己フィルム形成性である粉末形態の自己フィルム形成性組成物であって、前記組成物が、
（ｉ）ゲル化剤、および生体接着剤からなる群から選択される少なくとも１種の粉末形態の薬剤と、
（ｉｉ）少なくとも１種の粉末形態のペディオコッカス（Pediococcus）菌株と、を含み、（ｉ）および（ｉｉ）が、単一容器または別個の容器に収容される、組成物。
【請求項９】
前記ペディオコッカス（Pediococcus）菌株が、受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５、ＣＥＣＴ８９０６の菌株として受託された菌株からなる群から選択される、請求項８に記載の自己フィルム形成性組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物を攪拌しながら液体培地と混合する工程を含む、再構成済製剤の調製工程。
【請求項１１】
請求項１０に記載の工程により得られる再構成済製剤。
【請求項１２】
各薬剤に対する、前記最終再構成済製剤中のゲル化剤および生体接着剤の量が０．０５〜２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１１に記載の再構成済製剤。
【請求項１３】
前記最終再構成済製剤中のゲル化剤の量が１〜５％（ｗ／ｖ）で、生体接着剤の量が４〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１２に記載の再構成済製剤。
【請求項１４】
薬品として使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または請求項１１〜１３のいずれかに記載の再構成済製剤。
【請求項１５】
インプラント周囲炎、粘膜炎、歯周病、歯肉病、齲蝕、口腔カンジダ症、口辺ヘルペスおよび水疱からなる群から選択される病態を予防し且つ／あるいは治療する目的に使用される、請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または請求項１１〜１３のいずれかに記載の再構成済製剤。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または請求項１１〜１３のいずれかに記載の再構成済製剤の、口腔ケアを目的とした使用。
【請求項１７】
経口用のキットであって、
１）請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物または請求項１１〜１３のいずれかに記載の再構成済製剤と、
２）請求項１〜９のいずれかに記載の粉末形態の自己フィルム形成性組成物もしくは請求項１１〜１３のいずれかに記載の再構成済製剤を頬側口腔に塗布する手段と、を具備したキット。
【請求項１８】
インプラント周囲炎および粘膜炎からなる群から選択される病態を予防し且つ／あるいは治療することを目的に使用される、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する単離菌株。
【請求項１９】
受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５、およびＣＥＣＴ８９０６の菌株として受託された菌株からなる群から選択される、スペイン基準株コレクション（Spanish Type Culture Collection）に受託されたペディオコッカス（Pediococcus）属に属する単離菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野および微生物学に関し、特に、歯科衛生および療法に使用するための組成物に関する。特に、本発明は、インプラント周囲炎、および微生物ディスバイオシス（dysbiosis）に関連する他の口腔状態を治療し且つ／あるいは予防するのに用いられる組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
インプラントを囲繞する組織内に発症する炎症性病変は、インプラント周囲疾患として一まとまりに認識され、粘膜炎およびインプラント周囲炎の、２つの疾患エンティティを含む。インプラント周囲炎とインプラント周囲粘膜炎とでは徴候が類似しているが、インプラント周囲粘膜炎の場合にはいっさい歯槽骨粗鬆が存在しない。粘膜炎は、骨粗鬆のないインプラント周囲軟組織の可逆性修飾として定義される。代わりに、インプラント周囲炎は、深い軟組織および骨インプラント周囲に影響を及ぼすことから、オッセオインテグレーテッド・インプラントに近い組織に影響を及ぼして、支持骨量の減少だけでなく粘膜の炎症をも引き起こす炎症過程として定義されてきた。インプラント周囲炎の罹患率は、その罹患率を定義するために使用された臨床閾値に依存する。最近の結果は６．６％〜４７％の間で変動している［Albertini, M.ら、2014］。
【０００３】
インプラントが失敗する主因の１つは、インプラント周囲炎であり、歯垢の堆積および細菌のアンバランスも、主因の１つであると提議されてきた。これは、歯垢の堆積と歯槽骨粗鬆との間には正の相関が存在するためである。インプラント周囲炎におけるインプラント周囲の骨粗鬆は、細菌、ストレス、または両方の組み合わせによって促進される場合がある。いったん骨粗鬆が増進して深いポケットが形成されると、嫌気性細菌の優勢を強化する嫌気性環境が確立される。その後、これらは引き続き骨量が減少する主要な原因となる。インプラント周囲炎の周りのバイオフィルムの微生物組成は、健全なインプラント内に存在するものとは異なるものであることが明らかにされてきた。全般的には、不健全なインプラントでは、健全なインプラントと比較して、有益な細菌種の比率が低めである一方で、推定の病原体の比率が高めであることが提示されている。インプラント周囲炎部位では、多くの場合、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）またはプレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）などの橙色の複合体に由来するいくつかの歯周病原体が認められており、その比率の高さが提示されている。これらの部位には、赤色の複合体に由来するポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、およびタンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）などの他の偏好性病原体が存在する［Da Silva, E.S.C.ら、2013］。更なる議論の余地もあるが、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）のような他の平均レベルの数種の歯周病原体は一般に、インプラント周囲炎に関連すると考えられている［Persson, G.R.ら、2013］。
【０００４】
歯科インプラント表面におけるバイオフィルムの生成は、インプラント周囲炎の出現に重要な役割を果たすことから、治療は主として、インプラントの表面上における細菌コロニー形成の減少、または細菌微生物叢の機械的排除に基礎を置いたものとなる。この趣旨に則って、外科的技法および非外科的技法の両方が、開発されてきた。
【０００５】
外科的手技は、ポケット深度を減じて軟組織モルホロジーを確保するための切除技術、および骨の配置を利用した骨誘導手術に基づく再生技術を基盤とする。概して、これらの手技は、患者にとってコスト高であったり、疼痛を伴ったり、あるいは不快なものであることから、初期の予防的治療を施したにもかかわらず骨粗鬆が進行または持続している場合には、治療の選択肢として制約を受ける。［Ata-Ali, J.ら、2011］。
【０００６】
したがって、一次治療の選択肢としては、非外科的技法の方が好ましい。これらの技法は、一般的に、０．１２％クロルヘキシジンリンス剤（例えば、１５日間にわたって１２時間）および／または抗生物質形態の化学的プラークコントロールによる、歯垢除去を伴う。しかしながら、クロルヘキシジンの副作用は、疾っくの昔から周知である。クロルヘキシジンは、口腔粘膜を刺激して損傷させ、歯および他の口腔面の退色ならびに染色を引き起こし、結石の形成を増やし、且つ味覚を変えてしまう可能性がある。また、口腔刺激および局所アレルギー型の症状が報告されてきたほかに、口内炎、歯肉炎および潰瘍粘膜をはじめとする副作用も報告されてきた。これらの作用のいくつかは、クロルヘキシジンが防腐効果を発揮した結果、口腔微生物叢が変性したことに起因するものであった［Flotra, L.ら、1971］。
【０００７】
抗生物質療法は、さまざまな副作用、および薬物相互作用を引き起こす可能性がある。例えば、広範囲に使用される体系的な抗生物質は時として、市販の微生物叢を変性させ、それによってクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）に関連する大腸炎、下痢、腟疾患、腟炎などをはじめとする抗生物質関連の疾患を招来しうるといった問題を生ずる可能性がある。抗生物質の使用はまた、細菌耐性の増強を支援し、治療における障害を生じさせる場合もあれば以降の治療を悪化させる可能性さえある［Slots, J.ら、1990］。
【０００８】
最近の調査が照準を当てるようになってきたのは、プロバイオティクス、すなわち「十分量を投与された場合に宿主に健康効果をもたらす微生物の生体」である。プロバイオティクスが口腔の健康に及ぼす影響は、これまで比較的知られていなかったものであり、多くの研究が継続して実施されてきた。
【０００９】
Ｌ．ロイテリ・プロデンティス（L. reuteri Prodentis）は、市場投入されている公知の口腔プロバイオティクスである。最近の研究によれば、プロバイオティクス菌株Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）を含有する錠剤の経口治療によって、炎症反応を促進するサイトカイン反応の有意な低減が誘発され、且つ慢性歯周炎を患うほとんどの患者における臨床パラメータが改善されることが示唆されている［Szkaradkiewicz, A.K.ら、2014］。もう１つの研究は、慢性歯周炎患者におけるスケーリング・アンド・ルートプレーニング（ＳＲＰ）の補助としてＬ．ロイテリ（L. reuteri）含有のプロバイオティクス口内錠の効果を評価することを目指したものであった。プロバイオティクスで治療されたＳＲＰ群においてはポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の減少が観察されたが、研究対象となったその他の病原性細菌においては変化が見られなかった［Teughels, W.ら、2013］。しかしながら、並行研究において、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）（ＡＴＣＣ５５７３０およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ５２８９）を含有するプロバイオティクス口内錠を毎日摂取しても、実験的な歯肉炎において、歯垢の堆積、炎症状態、またはバイオフィルムの微生物組成に対して有意な影響が及んだとは見られなかったことから、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）が口腔微生物叢に及ぼす効果には、依然として疑問の余地がある［Hallstroem, H.ら、2013］。
【００１０】
最近の公報（Flichy-Fernandez, A. J.ら、2015）には、菌株Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ５２８９とＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８とを含有するＬ．ロイテリ・プロデンティス（L. reuteri Prodentis）プロバイオティクス錠剤が、インプラント周囲粘膜炎に及ぼす効果が記載されている。インプラント周囲粘膜炎を患う患者１２例が、本研究に登録して、プロバイオティクス錠剤を３０日間服薬した。患者が歯肉炎指数の低下を示した主因と考えられるのは、炎症性サイトカインがプラセボと比較して減少したことである。本文書では、インプラント周囲炎に対するＬ．ロイテリ（L. reuteri）の効果に関しては触れない。粘膜炎とは比較対照的に、インプラント周囲炎は、病原性細菌の影響に主に起因する骨構造の損傷によって特徴づけられる。本文書中には、インプラント周囲炎または関連する病原体に対するプロバイオティクス錠剤の効果は記述されていないので、プロバイオティクスがインプラント周囲炎を治療するのに有用でありうるかどうかは、依然として疑わしい。
【００１１】
別の例としては、Ｌ．ラムノサス（L. rhamnosus）ＧＧおよびＢ．アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２含有の口内錠を経口投与したことにより、健康な若年成人における歯垢、歯肉炎、および口腔微生物叢の量に対して及ぶ効果について説明した最近の研究が挙げられる。プロバイオティクス口内錠によって歯垢および歯肉炎指数の両方が減少したが、いずれの群においても、唾液の微生物組成プロバイオティクスによって誘発された変化は、見られなかった。結論を言えば、プロバイオティクス口内錠が、口腔微生物叢に影響を与えることなしに歯肉炎に関して歯周状態を改善したことである［Toiviainen, A.ら、2015］。
歯周炎におけるラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＣＤ２などの他のプロバイオティクスの効果を研究したが、インプラント周囲炎および粘膜炎における効果は何も実証されなかった［Maekawa, T.ら、2014］。
【００１２】
特開２０１０−００５３０６２号公報には、歯周疾患および齲歯をはじめとする口腔疾患を予防し且つ／あるいは治療するのに有用な乳酸細菌を含有する経口組成物が、開示されている。特に、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）種に属する細菌の菌株は、良好な共凝集および接着能力を有するため、粘膜に付着して病原体バイオフィルムを阻害できることが明らかである。経口組成物は、菌株および賦形剤、ならびに従来の方法に準じて調合された結合剤、潤滑剤および可溶化剤を含む場合がある。
【００１３】
当該分野における最近の考察［Yanine, N.ら、2013］は、歯周疾患の予防および治療に対するプロバイオティクスの有効性には疑問の余地があると結論づけている。一次転帰では、プロービングポケット深度に対して、プロバイオティクスによる有益な臨床効果は認められていない。二次転帰では、歯垢指数および歯肉炎にプロバイオティクスがなんらかの利益をもたらすことが明らかにされている。要約すれば、先行技術において見受けられてきたように、プロバイオティクスは、歯周および歯肉プロセスの炎症の改善に寄与しうるが、プロバイオティクスが、そのようなプロセスにおいて存在する、インプラント周囲炎における骨粗鬆の主因であるディスバイオシス（dysbiosis）において効果を有しうるかどうかは、依然として疑わしい。
【００１４】
現行の療法の有効性に関連して、更なる問題が浮上する。それは、食物、錠剤、チューインガム、ジェルまたは練り歯磨きへの練り込みをはじめとするプロバイオティクスの口腔送達に使用される技法および方法には、大きな制限が伴うことである。これらの制限としては、プロバイオティクスの安定性に悪影響が及ぶこと、および口腔内での滞留時間が短いせいで、有益な効果を誘発する能力が低下することが挙げられる。この口腔送達は、送達インプラント周囲炎の予防または治療の目的で、歯科インプラント周囲の部位のような到達しづらい口腔内にプロバイオティクスを送達する必要がある場合に、至難の業となる。口腔病原体に対する拮抗活性を損なう可能性があるためである。
【００１５】
しかも、骨に連続しているインプラント区域は、多くの場合、インプラント接着およびオステオインテグレーションを補助する未加工面を有し、依然として汚染されたままの状態になり、抗微生物治療が施された後も同様に、引き続き更に骨粗鬆が進行すると共に、インプラント周囲ポケットが形成される可能性がある。これらの区域の病原体コロニー形成の処置に努めたにもかかわらず、大した成果は得られなかった。これらの区域は、到達しづらく、たいていのブラシおよび他のデバイスよりも小さいことから、歯科衛生の効果のないことが実証されてきた。細菌が迅速に凝集して保護されたクラスタを生ずる傾向があり、抗生物質耐性細菌の生成される確率が高まりつつあることから、体系的な予防薬の効果は限られていた。
【００１６】
口腔微生物叢を効率的に変調するには、口腔の特定の所望される部位内にプロバイオティクス細菌を送達できる送達システムが必要とされる。生存可能且つ代謝的に活性なプロバイオティクス細菌の口腔内への徐放と、所望される部位におけるプロバイオティクスの十分なコロニー形成と、有益な効果を得るための十分な滞留時間とを、送達システムによって可能にする必要がある。
【発明の概要】
【００１７】
口腔の特定の所望される部位内にプロバイオティクス細菌を送達できる送達システムは、そのような部位における病理学的状態に関与する口腔微生物叢を効率的に変調するのに必要とされるものであり、本発明によって解決する必要のある１つの課題は、この送達システムの提供に関連すると見なすことができる。
【００１８】
この解決策は、粉末形態の組成物、再構成済製剤、および経口用のキットを提供することに基づくものである。これらを提供することにより、所望される部位においてプロバイオティクスの十分なコロニー形成が可能になると共に、十分な滞留時間によって、口腔状態に関連する病原体に対して有益な効果をもたらすことも可能となる。
【００１９】
したがって、本発明の第１の態様は、液体培地の存在下、攪拌下にて自己フィルム形成性であり、本組成物が（ｉ）少なくとも１種の粉末形態のゲル化剤と、（ｉｉ）少なくとも１種の粉末形態の生体接着剤と、
【００２０】
（ｉｉｉ）少なくとも１種の粉末形態の乳酸細菌株とを含み、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、単一容器または別個の容器に収容され、且つ自己フィルム形成性組成物が局所的に投与される、粉末形態の自己フィルム形成性組成物に関する。
【００２１】
ゆえに、本発明は、液体培地の存在下、攪拌下にて自己フィルム形成性である、粉末形態の自己フィルム形成性組成物を提供するものである。
【００２２】
「フィルム形成性」という用語は、固体表面への塗布によって即座にフィルムを形成する（すなわち、しなり易く密着して表面を被覆し続ける）能力を意味する。「自己フィルム形成性（sef-film-forming）」という用語は、他の成分または条件、更には指定成分または条件を必要とすることなしに、フィルムを形成することを意味する。本明細書において「攪拌下（under agitation）」は、手動攪拌または電動ミキサーを用いた攪拌；継続的または断続的攪拌、および好ましくは５秒〜６０分、より好ましくは１０秒〜３０分、または３０秒〜１０分を含む好適な時間内での攪拌などと、広義に理解される。
【００２３】
本フィルムは、本組成物の粘度をゲル化剤で増強することによって、あるいは本組成物の接着性を生体接着剤で強化することによって表面上に形成される。本明細書において「ゲル化剤」という用語は、ジェルを形成する液体の粘度を増強する物質に関連する。これらは、弱い粘着性内部構造を形成するコロイド混合物として液相中に溶解することができ、また、当該技術分野において、増粘剤、安定剤、または乳化剤とも呼ばれることもある。「生体接着剤」という用語は、接着剤（すなわち、材料の表面に塗布され、それらの表面を決結着し、且つ分離に抵抗するもの）として作用する天然起源のポリマー類を指す。好ましいゲル化剤および生体接着剤の更なる詳細については、後述する。
【００２４】
理論に縛られるものではないが、本明細書中で提案されている溶液は、一方では、乳酸細菌（好ましくは、プロバイオティクス特性を有するもの）を到達しづらい口腔、例えば、歯科インプラントを囲繞する腔中、ならびにインプラント自体の間隙および未加工面（通常は、病原性細菌で汚染される）に送達することを可能にするものであると考えられる。第２の有利な点として、本明細書によって提案されている本溶液は、所望される部位においてプロバイオティクスの十分なコロニー形成を可能にすると共に、十分な滞留時間によって、口腔状態に関連する病原体に対して有益な効果をもたらすことも可能にするものである。より具体的には、本組成物中に含まれているゲル化剤および生体接着剤によって、所望される部位にて乳酸細菌の増殖が可能となり増強され、結果として、問題含みの腔を密閉する有益なバイオフィルムが形成される（すなわち、更なる病原体汚染に対する物理的バリヤが形成される）。注目すべきことに、ゲル化剤および生体接着剤のプレバイオティクス効果は病原性細菌の事例では無視してよいほど僅かであるが、望ましくない病原体の増殖を回避するうえでは有益である。ゆえに、有益なプロバイオティクスバイオフィルムの生成量を増やす一方、病原体バイオフィルムの生成量を少なめに抑えられる。したがって、プロバイオティクスバイオフィルムの形成は、口腔病原体に対する乳酸細菌の拮抗活性と相まって、病原性細菌の作用から生じた悪循環（すなわち、インプラント周囲区域における骨粗鬆）を中断する。
【００２５】
本発明の第２および第３の態様は、第１の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物を攪拌しながら液体培地と混合する工程を含む、再構成済製剤の調製プロセス、ならびに得られたその再構成済製剤に関する。
【００２６】
本発明の第４の態様は、（１）第１の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または第３の態様の再構成済製剤と、（２）粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤を頬側口腔に塗布する手段と、を備える、経口用のキットに関する。
【００２７】
本発明の第５の態様は、薬品として使用するための、粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤に関する。
【００２８】
本発明の第６の態様は、インプラント周囲炎、粘膜炎、歯周病、歯肉病、齲蝕、口腔カンジダ症、口辺ヘルペスおよび水疱からなる群から選択される病態を予防し且つ／あるいは治療することを目的に使用される、第１の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、あるいは第３の態様の再構成済製剤に関する。
【００２９】
第７の態様は、粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または再構成済製剤の、口腔ケアを目的とした非薬品の使用に関する。
【００３０】
本発明の第８の態様は、インプラント周囲炎および粘膜炎からなる群から選択される病態を予防し且つ／あるいは治療することを目的に使用される、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する単離菌株に関する。
【００３１】
本発明の第９の態様は、受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５、ＣＥＣＴ８９０６の菌株として受託された菌株からなる群から選択される、スペイン基準株コレクション（Spanish Type Culture Collection）に受託されたペディオコッカス（Pediococcus）属に属する単離菌株に関する。
【００３２】
本発明の第１０の態様は、液体培地の存在下、攪拌下にて自己フィルム形成性である粉末形態の自己フィルム形成性組成物であって、（ｉ）ゲル化剤および生体接着剤からなる群から選択される少なくとも１種の粉末形態の薬剤と、（ｉｉ）少なくとも１種の粉末形態のペディオコッカス（Pediococcus）菌株と、を含み、（ｉ）および（ｉｉ）が、単一容器または別個の容器に収容される、組成物に関する。
【００３３】
本発明の第１１および第１２の態様は、第１０の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物を攪拌しながら液体培地と混合する工程を含む、再構成済製剤の調製プロセス、ならびに得られたその再構成済製剤に関する。
【００３４】
本発明の第１３の態様は、（１）第１０の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または第１２の態様の再構成済製剤と、（２）粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤を頬側口腔に塗布する手段と、を備える、経口用のキットに関する。
【００３５】
本発明の第１４の態様は、インプラント周囲炎、粘膜炎、歯周病、歯肉病、齲蝕、口腔カンジダ症、口辺ヘルペスおよび水疱からなる群から選択される病態を予防し且つ／あるいは治療することを目的に使用される、第１０の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、あるいは第１２の態様の再構成済製剤に関する。
【００３６】
本明細書の前のセクションに提示されているように、下記の詳細な説明および実施例は、当業者に対し、本発明を十分に明白且つ完全に説明することを目的に提示されたものであるが、本明細書中で想到される必須の態様を制限するものと見なすべきではない。
［発明の詳細な説明］
【００３７】
本発明は、乳酸細菌を含む粉末形態の自己フィルム形成性組成物、および液体培地を混合する工程を含む、本組成物の調製プロセスを提供するものである。
【００３８】
一態様において、自己フィルム形成性組成物は、少なくとも１種のゲル化剤と、少なくとも１種の生体接着剤と、少なくとも１種の乳酸細菌株とを含む。別の態様において、自己フィルム形成性組成物は、少なくとも１種のゲル化剤または少なくとも１種の生体接着剤と、少なくとも１種のペディオコッカス（Pediococcus）菌株とを含む。
【００３９】
粉末形態の自己フィルム形成性組成物
本発明の粉末形態の自己フィルム形成性組成物中に含まれる乳酸細菌は、生菌体または非生菌体の形態とすることができる。菌株は生菌体の形態で使用されるのがごく一般的である。一方、菌株はまた、非生菌体、例えば、死菌培養液、または菌体溶解物（例えば、ｐＨ変化、超音波処理、放射線、温度、圧力への曝露、またはとりわけ他の殺菌もしくは溶菌手段によって得られるもの）、あるいは任意の菌株（例えば、バクテリオシン、および抗炎症性物質）によって以前に生成された有益な因子を含有する組成物にまで敷衍される。
【００４０】
特定の実施形態において、粉末組成物中に含まれる少なくとも１種の乳酸細菌株は、生菌体を含む形態である。つまり、本組成物は、実質的に生菌体から構成されるか、または部分的に生菌体によって構成される。
【００４１】
特定の実施形態において、ゲル化剤および生体接着剤からなる群から選択される少なくとも１種の粉末形態の薬剤は、少なくとも乳酸細菌に対して殺菌効果を有さない。用語「殺菌性（bactericidal）」（「殺菌（bacteriocidal）」とも呼ばれる）は、本組成物中の生菌体の数を減少させる細菌を死滅させることを意味する。ゆえに、本組成物中に含まれる薬剤は、乳酸細菌を死滅させない薬剤である。細菌を含有する製品中の生菌体数が、温度、雰囲気、および抗結防御剤などの保護剤または他のキャリアの使用を含めた貯蔵条件に経時的に依存して、自然に減少することは、当業者に公知である。本明細書において、「殺菌効果を有さない」という表現は、ゲル化剤および／または生体接着剤の存在下における生菌体の濃度が、これらの薬剤の存在下、同じ条件下で貯蔵またはインキュベートされたときの生菌体の濃度と比較して低くならないことを意味する。
【００４２】
粉末組成物中の生菌体の濃度は、ゲル化剤および／または生体接着剤の存在下では、これらの薬剤が存在しない同じ組成物と比較して、１／１００００（すなわち、常用対数値＝４）以下に減少することが好ましい。これは、例えば、ゲル化剤および生体接着剤を含有しない粉末中の生菌体の濃度が、１Ｅ＋０９ｃｆｕｓ／ｇである場合、薬剤の存在下で、生菌体の濃度は、１Ｅ＋０５ｃｆｕｓ／ｇ以上になることを意味する。
【００４３】
粉末組成物中の生菌体の濃度は、これらの薬剤の存在下で、これらの薬剤が存在しない同じ組成物と比較して、１／１０００（常用対数値＝３）以下、１／１００（常用対数値＝２）以下、または１／１０（常用対数値＝１）以下に減少することがより好ましい。
【００４４】
特定の実施形態において、ゲル化剤および生体接着剤は、乳酸細菌に対して殺菌効果を有さないだけでなく、静菌効果も有さない。つまり、これらの薬剤は、細菌を死滅させることもないし細菌の増殖を阻害することもない（細菌の増殖および分裂を中断しない）。ゆえに、本組成物中に含まれている薬剤は、細菌が正常に増殖するのを阻止しない薬剤である。
【００４５】
より具体的な実施形態において薬剤は、プレバイオティクス効果を有する薬剤である。つまり、これらの薬剤によって、細菌の増殖が改善または増強される。この特徴は、下記実施例５〜７に示すとおりである。
【００４６】
更により具体的な実施形態では、有益薬剤のプレバイオティクス効果を、その薬剤の存在下で有益な乳酸細菌をインキュベートすることによって研究した。１ｇ／Ｌの「ラブレムコ」粉末（Oxoid製、本拠：英国のベイジングストーク）と、２ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid製）と、５ｇ／Ｌのプロテオースペプトン（Oxoid製）と、２．５ｇ／Ｌのブタ胃粘素（Sigma Chemical Co.製、本拠：英国のプール）と、３５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（BDH Chemicals Ltd製、本拠：英国のプール）と、０．２ｇ／Ｌの塩化カルシウム（ＢＤＨ）と、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム（ＢＤＨ）とを蒸留水に溶解したものを含有する人工唾液に、有益薬剤を終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）に達するまで補給した。また、ジェル配合剤なしの人工唾液を調製し、有益薬剤の細菌増殖効果を、無添加培地と比較した。オートクレーブ処理後に、人工唾液培地１リットル当たり４０％尿素水溶液（ｗ／ｖ）１．２５ｍＬを加える。異なる調製済培地をそれぞれ９６ウェルプレートに２００マイクロリットルずつピペットで加える。その直後に、ＰＢＳ中１Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｍＬに標準化された有益な乳酸細菌の懸濁液２０マイクロリットルを加える。同量の細菌接種源不含ＰＢＳを、陰性対照として使用する。プレートを嫌気条件で、３７℃にて２４時間インキュベートし、６２５ｎｍでの光学密度を定量して細菌増殖をモニターする。プロバイオティクス候補が増殖用の有益薬剤を利用する能力は、次式に従って算出される。
【００４７】
【数１】
2018521136.tif 000002
【００４８】
式中、ΔＤＯｇｐは、有益薬剤を補給し、且つ有益な乳酸細菌（ＬＡＢ）候補を接種したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間後とで比較した差分である。
ΔＤＯｇ０は、有益薬剤を補給し、但しＬＡＢの代わりにＰＢＳを含有したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間目とで比較した差分である。
ΔＤＯｓｐは、有益薬剤を補給せず、且つＬＡＢを接種したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間目とで比較した差分である。
ΔＤＯｓ０は、有益薬剤を補給せず、且つＬＡＢの代わりにＰＢＳを含有したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間目とで比較した差分である。
【００４９】
実施例５〜７に記載されている詳細なアッセイに基づいて、当業者は、日常的にアッセイを繰り返し実施して、特定の有益薬剤がプレバイオティクス効果を有するかどうかを客観的に定量することができる。実施例５〜７に開示されているアッセイの説明および条件は、本発明の範囲を制限するものではないという点に留意することが適切である。これらのアッセイは、有益薬剤のプレバイオティクス効果を検定する能力を試験する用途に適したアッセイである。
【００５０】
特定の実施形態において、上記式で算出された
【００５１】
【数２】
2018521136.tif 000003
が０．００５を上回る場合、薬剤はプレバイオティクス効果を有するものと見なされる。より具体的な実施形態において、
【００５２】
【数３】
2018521136.tif 000004
は０．０１を上回る。更により具体的な実施形態において、
【００５３】
【数４】
2018521136.tif 000005
は０．０２を上回る。
【００５４】
上述したように、粉末形態の本組成物は、ゲル化剤でありうる少なくとも１種の薬剤を含む。特定の実施形態において、少なくともゲル化剤は、本組成物に粘度を付与する量であり、且つ以下からなる群から選択される。
（ａ）好ましくは、コメ、トウモロコシもしくはジャガイモのデンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウムであるデンプン、
（ｂ）好ましくは、トラガカントガム、アカシアガム、キサンタンガム、ガティガム、ゲランガム、カラヤガム、コニャックガム、またはガラクトマンナンガム（具体的にはグアーガム、ローカストビーンガム、およびターガム）であるガム、
（ｃ）好ましくはアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、寒天、デキストラン、またはカラギーナンである藻類多糖類、
（ｄ）ペクチンおよび麦芽デキストリンからなる群から選択されるポリサッカライド、
（ｅ）好ましくは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、または微結晶性セルロースであるセルロース誘導体、
（ｆ）ゼラチン、コラーゲンおよびカゼインからなる群から選択されるポリペプチド、ならびに
（ｇ）アクリレート系ポリマー、ビニル系ポリマー（好ましくは、ポリビニルピロリドン、別称：ポリビドン、またはポビドン）、カチオン性ポリサッカライド（例えば、カチオン性アセチルグルコサミンは、好ましくはキトサン、カチオン性シクロデキストリン、およびカチオン性デキストラン）、およびポリアルキレングリコール（好ましくは、ポリエチレングリコール）からなる群から選択されるポリマー。
【００５５】
また、少なくとも１種の薬剤を、生体接着剤としてもよい。特に、生体接着剤は、本組成物に接着性を付与する量であり、且つ以下からなる群から選択される。
（ａ）好ましくはハケアガム、キサンタンガム、アカシアガム、コニャックガム、ゲランガム、またはガラクトマンナンガム（具体的にはグアーガム）であるガム、
（ｂ）好ましくはアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、寒天、デキストラン、またはカラギーナンである藻類多糖類、
（ｃ）好ましくは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースであるセルロース誘導体、
（ｄ）ペクチンおよび麦芽デキストリンからなる群から選択されるポリサッカライド、ならびに
（ｅ）アクリレート系ポリマー、ビニル系ポリマー（好ましくは、ポリビニルピロリドン、またはポビドン）、カチオン性ポリサッカライド（好ましくは、キトサン）、およびポリアルキレングリコール（好ましくは、ポリエチレングリコール）からなる群から選択されるポリマー。
【００５６】
上述したように、ゲル化剤は、本組成物に粘度を付与する量であり、且つ生体接着剤は、本組成物に接着性を付与する量である。ゲル化剤および生体接着剤として使用される化合物は、当該技術分野において周知であり、当業者によって薬剤の量が定量される。特定の実施形態において、ゲル化剤はガムである。ガムは、例えば、キサンタンガム、アラビアガム、グアーガム、トラガカントガム、カラヤガム、ローカストビーンガム、カロブビーンガム、アカシアガム、ガティガム、ゲランガム、カラヤガム、コニャックガム、ハケアガム、およびターガムでありうる。そのようなガムは、概して、全体的に負の電荷を有する炭水化物ガムとして分類できる。ゲル化剤は、当該技術分野においてグアーガム、グアー粉、およびグアランとしても知られているグアーガムとすることがより好ましい。グアーガム類は、マメ科植物系統の或る植物の種子の胚乳から抽出される。これらのグアーガムは、（１〜４）位に結合したＤ−マンノース単位の直鎖形成と、（１〜６）位に結合した単一のＤ−ガラクトースによって形成された分岐とから生ずる、ガラクトマンナンである。グアーガムは、改質または誘導が可能である。グアーガム誘導体の例には、ヒドロキシプロピレート化誘導体、またはカルボキシヒドロキシプロピレート化誘導体、カチオン性誘導体（Ｅｃｏｐｏｌ）、およびグアーガムの脱重合によって得られる生成物が挙げられる。  
【００５７】
特定の実施形態において、生体接着剤は、セルロース誘導体である。主な誘導体はセルロースエーテル類（すなわち、無水グルコース単位のヒドロキシル基の水素原子の一部分がアルキル基で置換された結果として、セルロースがアルキル修飾されたもの）である。セルロースエーテル類の非限定例には、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣＮａ）、ヒドロキシエチルセルロースにトリメチルアンモニウム置換基（ポリクオタニウム１０）を付加して得られる第四級アンモニウム塩、および塩化ジメチルジアリルアンモニウムコポリマー類（ポリクオタニウムＡ）が挙げられる。より好ましい実施形態において、生体接着剤は、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。
【００５８】
デンプン類の非限定例としては、アルファ化デンプン（トウモロコシ、小麦、タピオカ）、アルファ化高アミロース含有デンプン、アルファ化加水分解デンプン（麦芽デキストリン、トウモロコシシロップ固形物）、または化工デンプン、例えば、α化置換デンプン（例えば、オクテニルコハク酸改質デンプン）が挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態において、粉末形態の自己フィルム形成性組成物は、少なくとも１種のゲル化剤と、少なくとも１種の生体接着剤とを含む。より具体的な実施形態において、ゲル化剤は、生体接着剤とは異なった化合物である。
【００６０】
特定の実施形態において、ゲル化剤はガムおよび藻類ポリサッカライドからなる群から選択され、生体接着剤はセルロース誘導体およびビニル系ポリマーからなる群から選択される。
【００６１】
より具体的には、ゲル化剤はグアーガムまたはアルギン酸塩であり、生体接着剤はヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）またはポリビニルピロリドンである。
【００６２】
ゆえに、特定の実施形態において、ゲル化剤はグアーガムおよびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択され、生体接着剤はＨＥＣである。
【００６３】
本発明による自己フィルム形成性組成物は、粉末形態である。特に、組成物の含水率が１０％未満、より好ましくは５％未満であることを意味する。
【００６４】
当業者であれば、再構成済製剤の容量に応じて適切な粘度および接着度をもたらす再構成済製剤を得るため、粉末形態のゲル化剤および生体接着剤の所要量を、日常的に選択するであろう。
【００６５】
特定の実施形態において、自己フィルム形成性組成物中のゲル化剤および生体接着剤の量は、最終の再構成済製剤中の各薬剤の濃度を０．０５〜２０％（ｗ／ｖ）とするのに必要な量である。より具体的には、最終再構成済製剤中の粉末形態のゲル化剤は、濃度を１〜５％（ｗ／ｖ）、より具体的には、２％、３％または４％（ｗ／ｖ）にするための量であり、最終再構成済製剤中の粉末形態の生体接着剤は、濃度を４〜１０％（ｗ／ｖ）、より具体的には、６％（ｗ／ｖ）にするための量である。
【００６６】
インプラント周囲炎の用途に対応した特定の実施形態において、自己形成性組成物は、４％（ｗ／ｖ）のグアーガムと６％（ｗ／ｖ）のＨＥＣとを含む最終の再構成済製剤を得るための、必要量のグアーガムとＨＥＣとを含む。歯科用途に対応した特定の実施形態において、自己形成性組成物は、２％（ｗ／ｖ）のグアーガムと６％（ｗ／ｖ）のＨＥＣとを含む最終の再構成済製剤を得るための、必要量のグアーガムとＨＥＣとを含む。
【００６７】
特定の実施形態において、本組成物は粉末形態にて、ゲル化剤を０．０５〜９０％（ｗ／ｗ）、より具体的には１％〜６０％（ｗ／ｗ）含む。より具体的な実施形態において、ゲル化剤の量は、５０％、２０％、１５％、および１０％（ｗ／ｗ）である。別の特定の実施形態において、粉末形態の組成物中の生体接着剤は、０．０５〜９０％（ｗ／ｗ）、具体的には３０〜８５％（ｗ／ｗ）の量を占める。より具体的な実施形態において、生体接着剤量は、６８％、５０％、および４０％（ｗ／ｗ）である。
【００６８】
当業者は、処理対象面および条件に応じて適切な容積の液体培地を選択することになる。特定の実施形態において、製剤の再構成に使用される容積は、５００ｍＬ以下である。特定の実施形態において、使用容積は、２００ｍＬ以下、１５０ｍＬ以下、１００ｍＬ以下、５０ｍＬ以下、または２０ｍＬ以下である。より具体的な実施形態において、製剤の再構成に使用される容積は、６ｍＬである。より具体的な実施形態において、製剤の再構成に使用される容積は、２〜３ｍＬの範囲である。
【００６９】
当業者であれば、以降（再構成済製剤、およびそれを得る工程のセクション）に、粉末形態のゲル化剤および生体接着剤の適切な量、最終の再構成済製剤、および液体培地の容積の非限定例を見出すことであろう。
【００７０】
本発明において用いられているゲル化剤および生体接着剤ならびにそれらの量は、単なるキャリア、賦形剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、可溶化剤または湿潤剤としては使用されないが、乳酸細菌の投与を改善するための適切な粘度および接着特性を最終の再構成済組成物に付与するために選択される。適切な組み合わせによって、臨床診療に便宜的な期間、有効性および安定性を低下させずに、あるいは更に強化して、乳酸細菌を投与することができる。
【００７１】
上述したように、本発明の粉末形態の自己フィルム形成性組成物はまた、少なくとも１種の乳酸細菌株を含む。特定の実施形態において、乳酸細菌株は、ポルフィロモナス（Porphyromonas）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、プレボテラ（Prevotella）、およびアグリゲイティバクター（Aggregatibacter）属の細菌からなる群から選択される少なくとも１種の口腔病原体に拮抗することができる。より具体的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、およびアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitants）からなる群から選択される少なくとも１種の口腔病原体を拮抗しうる。乳酸細菌株が口腔病原体に拮抗する能力を、例えば、実施例８〜９のアッセイで試験した。
【００７２】
特定の実施形態において、乳酸細菌株は、ペディオコッカス（Pediococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、乳酸桿菌（Lactococcus）、腸球菌（Enterococcus）、バチルス（Bacillus）、バクテロイド（Bacteroides）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、およびロイコノストック（Leuconostoc）属の細菌からなる群から選択される。特に、乳酸細菌は、ラクトバチルス（Lactobacillus）、（例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）もしくはラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum））、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、またはストレプトコッカス（Streptococcus）である。より具体的には、乳酸細菌株は、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する。より具体的には、菌株は、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、またはペディオコッカス・ペントサス（Pediococcus pentosaceus）である。より具体的には、乳酸細菌株は、菌株ＣＥＣＴ８９０３、菌株ＣＥＣＴ８９０４、菌株ＣＥＣＴ８９０５、および菌株ＣＥＣＴ８９０６からなる群から選択される。
【００７３】
上記に示したように、少なくともゲル化剤、少なくとも生体接着剤、および少なくとも乳酸細菌株は、粉末形態の組成物を形成するものである場合、単一容器または別個の容器に収容される。以前の態様の組成物を得る方法は、乳酸細菌株を好適な培地内で培養して得る工程と、それを（例えば、凍結乾燥によって）粉末形態に加工する工程と、（本組成物が単一容器中に提供されている場合）乳酸細菌株をゲル化剤および生体接着剤（両方とも粉末形態）と混合する工程と、を含む。乳酸細菌の培養方法および後処理方法については後述する。本組成物はまた、本組成物の要素を含む３つまたは２つのそれぞれ異なる容器で提供される場合があり、これらは使用前にユーザーが混合できる。
【００７４】
自己形成性組成物は、局所投与に特に好適である。本明細書中で用いられている「局所的（topical）」という用語は、体表面（例えば、外側かそれとも内側のいずれであるかを問わない皮膚または粘膜）への塗布を意味する。局所経路による投与の非限定例としては、経皮投与（皮膚への直接的な塗布）、眼の結膜への塗布、もしくは耳への塗布、口腔面（例えば、歯および歯肉）への投与、または腟内投与が挙げられる。
【００７５】
再構成済製剤、およびそれを得る工程
上述したように、本発明の或る態様は、以前の態様の粉末形態の自己フィルム形成性組成物を攪拌しながら液体培地と混合する工程を含む、再構成済製剤の調製プロセスに関する。再構成済製剤が得られ、手動攪拌または電動ミキサーを用いた攪拌；継続的または断続的攪拌、および好適な時間内での攪拌などで、攪拌を実行できる。混合時間には、好ましくは、５秒〜６０分、より好ましくは１０秒〜３０分、または３０秒〜１０分が含まれる。より好ましい実施形態では、攪拌を１分間、２分間、３分間、４分間、または５分間実行する。製剤は、使用直前に再構成し、その投与に先立ってゲル状になるまで静置させることが好ましい。特定の実施形態では、混合後に、本組成物を少なくとも１０秒間静置させる。より具体的には、再構成済製剤は、使用前に少なくとも３０秒間、より具体的には、少なくとも１分間静置させる。また、ジェルが塗布前に濃厚になりすぎて治療対象面上に分散させるのが困難になる可能性があるので、これを回避するため、長時間にわたってジェルを静置させるのを回避するのが便宜的である。したがって、特定の実施形態では、いったん再構成された製剤を、治療対象面上に１２０分以内の時間内で塗布する。より具体的には、再構成済製剤は、６０分以下、より具体的には３０分以下、より具体的には１０分以下の時間内で塗布される。
【００７６】
液体培地は、ヒトまたは動物の飲用水として許容されるものであることが好ましいが、液体培地はまた、例えば、水、油、グリセリンまたはワセリンに溶解した任意の懸濁液ともされる。
【００７７】
再構成済製剤は、所望される口腔に塗布し易い好適な粘度および／もしくは接着性を有するジェルの形態、ニスの形態（例えば、製剤を歯科表面に塗布する必要がある場合）、またはスプレーの形態を採用できることが好ましい。
【００７８】
各薬剤に対する、最終再構成済製剤中のゲル化剤および生体接着剤の量は、０．０５〜２０％（ｗ／ｖ）である。好ましくは、再構成済製剤は、再構成済製剤の総量の１〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２％、３％または４％（ｗ／ｖ）のゲル化剤と、再構成済製剤の総量の１〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは４〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは６％（ｗ／ｖ）の生体接着剤と、を含む。
【００７９】
インプラント周囲炎の用途に対応した特定の実施形態において、再構成済製剤は特に、グアーガム４％ｗ／ｖと、ＨＥＣ６％と、を含む。特定の実施形態において、歯科用途向けに再構成された製剤は、グアーガム２％ｗ／ｖと、ＨＥＣ６％と、を含む。
【００８０】
好ましい粉末形態の組成物は、グアーガム２０％（ｗ／ｗ）と、ＨＥＣ３０％とを含み、乳酸細菌の量は５０％となる。粉末ブレンド０．５ｇを水２．５ｍｌで再構成した場合、ジェル中の終濃度は、グアーガム４％（ｗ／ｖ）、且つＨＥＣ６％となる。
【００８１】
好ましい粉末形態の組成物は、グアーガム１０％（ｗ／ｗ）と、ＨＥＣ３０％とを含み、乳酸細菌の量は６０％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水２．５ｍｌで再構成した場合、ジェル中の終濃度はグアーガム２％（ｗ／ｖ）、且つＨＥＣ６％となる。
【００８２】
別の実施形態において、本組成物は粉末形態は、アルギン酸ナトリウム１５％（ｗ／ｗ）と、ＨＥＣ３０％と、酢酸カルシウム１．５％とを含み、乳酸細菌の量は５３．５％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水２．５ｍｌで再構成した場合、ジェル中の終濃度はアルギン酸塩３％（ｗ／ｖ）、且つＨＥＣ６％となる。
【００８３】
別の実施形態において、本組成物は粉末形態は、アルギン酸ナトリウム１０％（ｗ／ｗ）と、ＨＥＣ３０％と、酢酸カルシウム１％とを含み、乳酸細菌の量は５９％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水２．５ｍｌで再構成した場合、ジェル中の終濃度はアルギン酸塩２％（ｗ／ｖ）、且つＨＥＣ６％となる。
【００８４】
別の実施形態において、本組成物は粉末形態は、グアーガム２０％（ｗ／ｗ）と、ポリビニルピロリドン１０％とを含み、乳酸細菌の量は７０％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水２．５ｍｌで再構成した場合、ジェル中の終濃度はグアーガム４％（ｗ／ｖ）、且つポリビニルピロリドン２％となる。
【００８５】
別の実施形態において、本組成物は粉末形態は、グアーガムを５０％（ｗ／ｗ）含み、乳酸細菌の量は５０％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水６ｍｌで再構成した場合、ジェル中のグアーガムの終濃度は４％となる。
【００８６】
別の実施形態において、本組成物は粉末形態は、ＨＥＣを７２％（ｗ／ｗ）含み、乳酸細菌の量は２８％（ｗ／ｗ）となる。粉末ブレンド０．５ｇを水６ｍｌで再構成した場合、ジェル中のＨＥＣの終濃度は６％となる。
【００８７】
経口用のキット
本発明の特定の実施形態において、製造品は、本明細書中に提供されている粉末組成物を封入した密閉容器を含み、この粉末組成物は、単位投与量、且つ滅菌状態であることが好ましい。容器は、本組成物をその場で再構成するための十分な容量のものであることが好ましい。概して、容量は約１ｍｌ〜約２０ｍｌ、好ましくは約５ｍｌ〜約１０ｍＬが便宜的であることが見出される。
【００８８】
ゆえに、一部の事例において、自己フィルム形成性組成物を使用して患者に塗布するための他の要素（例えば、液体培地、シリンジおよびニードル、ならびに塗布手段）は、専門家の自由裁量に任されているので、製造品は、容器に粉末形態の自己フィルム形成性組成物を入れたものにすぎない。
【００８９】
別の製造品として、使用時まで短期間冷蔵することの可能な再構成済製剤も挙げられる。
【００９０】
一方、一部の例において製造品は、使用および塗布を容易にする他の要素を備えるキットである。したがって、本発明の別の態様は、（１）上記に定義された粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤と、（２）粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤を頬側口腔に塗布する手段と、を含む経口用のキットに関する。
【００９１】
粉末形態の自己フィルム形成性組成物は、口腔に直接に塗布することも、また、例えば唾液を用いてその場で（in situ）再構成することも可能であった。にもかかわらず、好ましい実施形態は、本組成物を使用の直前に再構成するものである。
【００９２】
特定の実施形態において、頬側口腔に塗布するための手段は、ブラシ、注射針を備えるシリンジ、鈍先ニードル備えるシリンジ、およびマウスガードからなる群から選択される。
【００９３】
より具体的な実施形態において、塗布手段は、シリンジ、および歯周探針と類似の鈍先を有するニードルである。シリンジおよび鈍先ニードルを用いて、罹患部位（すなわち、インプラント周囲ポケット）に、再構成済溶液を塗布する。
【００９４】
塗布手段は、マウスガード（別称：咬合床副子）、マウスプロテクター、マウスピース、歯肉シールド、ガムガード、ナイトガード、バイト、または口内床副子、または咬合平面である。この取り外し可能な歯科器具は、上歯列弓または下歯列弓に嵌着する。マウスガードまたは口内床副子は、粉末形態の組成物、または再構成済製剤で充填され、歯に嵌着される。
【００９５】
別の実施形態では、使用し易いように、粉末形態の自己フィルム形成性組成物を再構成するための、液体培地の入った容器が、キットに更に具備される。
【００９６】
別の実施形態ではまた、使用し易いように、粉末形態の自己フィルム形成性組成物の入った容器に、液体を入れるための手段が、キットに更に具備される。この手段は、液体をその容器から引き込んで、粉末形態の自己フィルム形成性組成物の入った容器に入れるために使用される、使い捨て式穿孔ニードルを備えるシリンジであることが好ましい。
【００９７】
本明細書において「容器」という用語は、好ましくは滅菌状態の再構成可能な粉末を単位投薬量だけパッケージングするのに好適な閉鎖部を有する、任意の小型の入れ物を示す。本発明のこの実施形態には、等価形態の包装（例えばバイアル、アンプル、使い捨て式シリンジ、シリンジカートリッジ、または予備充填式シリンジ）が包含されることが、理解されるであろう。バイアルは、任意選択的に、例えば、２つの隔室を具備し、１つの隔室には再構成可能な粉末が含有されていて、もう１つの隔室には粉末を溶解するのに十分な量の液体が含有されている、多隔室のバイアルとしてもよい。そのようなバイアルでは、２つの隔室を開口部によって相互接続し、バイアルの使用準備が整うまで、栓を嵌め込んでおくことで、粉末および液体溶媒への接触を防止できる。使用時には、任意の好適な手段、例えば、圧力をかけるかまたはニードルを栓に貫通させるプランジャーなどのデバイスで、栓を取り外すかあるいは穿刺して、液体を粉末に接触させる。そのような多隔室のバイアルの例としては、シリンジ用の複室カートリッジ、および複室バイアル、または送達キャップ、ならびにこのキャップで閉鎖されたバイアルが挙げられる。
【００９８】
本発明の特定の実装態様は、本発明の粉末形態の自己フィルム形成性組成物を或る量だけ、アルミニウムカプセルを入れたセプタム付きガラス製バイアル中に導入する工程からなる。シリンジで水、脱イオン水または蒸留水を加えて即座に、手動で振盪して、極めて短い時間で再構成済ジェルが形成されることが、好ましい。このジェルは、粘度がさほど高くないためシリンジを用いて塗布することが可能であり、且つ歯科インプラント用途に好適な接着性を有する。次いで、再構成済製剤を、例えば、シリンジ、およびニードル、ブラシもしくは圧力アプリケータを使って歯周ポケット、または外科手術部位に投与する。歯科専門家は、治療部位に対して最適な適合が得られるようにシステムを操作することによって、他のシステムに生来的な配置の問題を克服することができる。投与時に、フィルムシステムは所望される部位に少し留まり、ゆえに、所望されるインプラントの内部空間を本発明の製剤で密閉できる。
【００９９】
医療用途
上述したように、本発明の別の態様は、薬品として使用するための、粉末形態の自己フィルム形成性組成物または再構成済製剤に関する。特に、本発明は、口腔微生物叢の変性に関連する病態を予防し且つ／あるいは治療することを目的に使用される、粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または再構成済製剤を提供するものである。より具体的には、この病態は、インプラント周囲炎、粘膜炎、歯周病、歯肉病、齲蝕、口腔カンジダ症、口辺ヘルペスおよび水疱からなる群から選択される。特定の実施形態において、病態は、インプラント周囲炎である。
【０１００】
これらの態様は、口腔微生物叢の変性に関連する病態（好ましくは、インプラント周囲炎、粘膜炎、歯周炎、歯肉疾患、齲歯 口腔カンジダ症、口辺ヘルペスおよび水疱）を予防し且つ／あるいは治療するための医薬製品、獣医学的製品、薬品、食料品、保健食品、医療食、または口腔ケア製品を製造することを目的に、本発明の組成物のいずれかを使用する場合に代替的に調合されうる。これはまた、代替的に、本発明の任意の組成物を有効量にてそれを必要とする被験者に投与することを含む、口腔微生物叢の変性に関連する病態を予防し且つ／あるいは治療するための方法として、調合してもよい。
【０１０１】
インプラント周囲炎の治療および予防における用途
歯科補綴物が具備するコンポーネントには、概して２とおりがある。インプラントコンポーネント（別称：骨内インプラント、または固定具）は、骨切り（osteotomy）に埋め込まれたネジである。それは歯肉線の下部に位置する部分であり、人工歯根と見なすことができる。他のコンポーネントとしては、インプラントコンポーネントに固定される歯冠、ブリッジまたは義歯が挙げられ、歯冠の事例では、歯の見える部分がこれらのコンポーネントで置き換えられる。第３のコンポーネントは、歯科インプラントと歯冠との間に嵌着して固定される、セラミック成分またはチタン成分である当接体（abutment）として具備されうる。この当接体部分は、歯肉線におよび歯肉線の上部に位置する部分である。これらの構造の間には、細菌が口腔から貫通する可能性のある間隙および腔が存在する。その後に、これらの細菌は、隣接する組織に戻って、インプラント周囲炎を引き起こすおそれがある。
【０１０２】
インプラント周囲炎の予防および治療における本発明の特定の実装態様は、粉末形態の自己フィルム形成性組成物が入った容器にシリンジで水を加えて即座に、手動で振盪すれば、再構成済ジェルが極めて短い時間で形成される。再構成済ジェルは、例えば、シリンジ、および鈍先を備えるニードルで、インプラントの隙間、微小隙間および窩に投与される。特に、歯科インプラントは、口腔流体に曝露される未加工面を備えることから、縦骨粗鬆が起こったり、局所炎症過程が原因でインプラント周囲ポケットが生じたために、上記の組成物が、そのようなポケットの中に塗布され、インプラントの未加工面および同じポケットの粘液表面に接着されることにもなる。したがって、鈍先ニードルを曲げ、歯肉消息子に模し、この鈍先ニードルをポケット基部の近くに配置し、本溶液が歯肉の上縁に達するまで本製品を注入して、本溶液をインプラント周囲ポケット内に塗布するのが、好都合でありうる。
【０１０３】
好都合にも、上述の自己フィルム形成性組成物は、炎症過程の影響を受ける歯科インプラントに近いインプラント周囲領域に投与するための手段に関連する。特に、本組成物は、可撓性の鈍先ニードルを具備する歯科キットに関連する。
【０１０４】
特に、インプラント周囲炎の治療における本発明の特定の実装態様は、歯冠を取り除く工程と、局所麻酔を患者に投与する工程と、治療対象ゾーンを清潔にする工程と、歯肉下の歯垢をこすり落として機械的に除去する工程と、クロルヘキシジンのような抗生物質を塗布する工程と、食塩溶液を塗布する工程と、本発明の再構成済製剤をインプラントの周囲および窩に、更にはインプラントの内側にも塗布する工程と、からなる。ポケットからニードルを引き抜いた後、食塩溶液で洗浄し、治療ゾーン上にエアジェット（約１０秒間）を当てる。その直後、歯冠を所定位置に配置した。患者は、治療後６時間以内に歯磨きをしないように指示される。
【０１０５】
予防的治療の事例において、この実装態様は、特に、歯冠を取り除く工程と、任意選択的に、治療対象ゾーンを清潔にする工程と、歯肉下の歯垢をこすり落として機械的に除去する工程と、本発明の再構成済製剤を塗布する工程と、からなる。
【０１０６】
他の口腔用途：歯肉炎および歯科齲歯
本発明はまた、健康な被験者の歯科衛生において疾患の可能性を予防する目的、ならびに口腔のディスバイオシス（dysbiosis）だけでなくインプラント周囲炎にも関連する口腔内の病態を治療または予防する目的にも使用できる。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明の溶液は、歯周炎および歯肉炎を予防し且つ治療する目的に使用される。歯肉炎および歯周炎ならびに歯周疾患の発症は、通常、縦溝内の微生物バランスのシフト（すなわち、歯面と歯肉との間の歯腔周辺）に関連する。その結果、細菌歯垢（バイオフィルム）が形成され、これらの付着物内に存在するグラム陰性病原体種が増える。これらの細菌によって生成された外毒素および代謝産物が蓄積し、周囲の歯肉組織の炎症を引き起こし、ひいては膨潤および出血にもつながる。炎症の過程では、歯に対する付着上皮の易接合性（liability）が弱まって、細菌が歯肉下区域を貫通するおそれがある。歯周疾患はまた、ほとんどの哺乳類、特にウマ、ネコ、齧歯類、家畜、およびイヌに対して起こる。例えば、３歳を超える年齢の全てのイヌの８０％は、歯周疾患に罹患している。
【０１０８】
歯周療法では、典型的に、最初に、歯肉下の歯垢をこすり落とすかまたは超音波で機械的に除去してから、バイオフィルム内の細菌を剥離させて洗浄する。この治療の過程では、抗生物質、およびグラム陰性細菌による再コロニー形成を防止するように設計された他の殺菌組成物が、昨今では使用されている。しかしながら、抗生物質を含有する組成物を定期的に且つ広範に使用した場合、抗生物質の耐性を助長してしまう危険性を伴うという不利益を招く。また、これらの製品によって副作用が誘発されることもばしばある。
インプラント周囲炎の事例において、本発明の再構成済製剤は、例えば、シリンジ（特に鈍先ニードルを備えるもの）を用いて塗布できる。
【０１０９】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、齲歯の予防および治療に使用される。そのような事例において、本発明の再構成済製剤は、歯科医、歯科衛生士または他のヘルスケア専門家がブラシを使って歯の表面に塗布し易いニスの形態とすることもできる。ニス類は、他の治療形態の補助として、歯のエナメル質、象牙質またはセメント質に塗布される場合がある。これらのニス類は永続性がないが、その接着一貫性によって数時間にわたって歯面に接触したままの状態を維持し、プロバイオティクス細菌のコロニー形成を可能にし、且つ本発明の組成物による有益な効果を提供するものである。
【０１１０】
本明細書では以下、好ましい塗布手技について説明する。専門家が予防処置を施す必要はないが、本発明の溶液を塗布する前に、必要に応じて、歯を歯ブラシで清潔にし、大量の歯垢または懐死組織片を綺麗に落とすことが推奨される。空気またはコットンガーゼで、歯をやや乾燥させる必要がある。（例えば、コットンロールまたは吸収性材料で）歯同士を隔離することによって、唾液による再汚染を防げる。少量のニス（例えば、０．５ｍｌ）を分取する。０．３〜０．６ｍｌ程度の少ない量で、歯列全体を治療できる。歯が湿っているときでさえも、ニスはくっ付く。続いて、小型のブラシまたはアプリケータを使って、ニスを塗布する。患者に対し、本日は終日歯磨きしないように指示する。翌日には、再び通常の口腔衛生手技を開始することができる。
【０１１１】
歯周病、歯肉炎または齲蝕などでの用途において、本発明の組成物はまた、患者自身で塗布することができる。市販製品は、容易に実装できるよう、上記されているようなブラシを具備する歯科キットとしてもよい。
【０１１２】
他の実施形態では、緊急の治療において歯科専門家が本発明の本組成物およびキットを使用し、患者はチューインガム、練り歯磨き、洗口剤、口腔スプレー、口内錠、または口腔分散性錠剤などの口腔ケア製品を用いたメンテナンス治療に従って治療を進めることができる。これらの口腔ケア製品には、本発明の粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または乳酸細菌を用いた一般の賦形剤が含まれる。
他の用途および製品形態
【０１１３】
本発明はまた、口腔ケア用途（すなわち、非医薬用途）に使用するための、粉末形態の自己フィルム形成性組成物、または再構成済製剤を提供するものである。したがって、本発明の組成物は、洗口剤、スプレー、口腔用ジェル、および練り歯磨きの形態で調合できる。調合の際には、当業者に周知されている、これらの経口剤型に用いられる従来の配合剤が利用される。
【０１１４】
当業者に公知であるように、洗口剤は、周知の従来の調合物を有する、口内洗浄用の水性アルコール溶液またはアルコール水溶液である。水、グリセリンまたはグリコールなどのポリヒドロキシル化化合物（例えば、プロピレングリコール、非イオン性界面活性剤など）だけでなく、外観、香味および防腐性を向上させるための他の添加剤を配合することもできる。
【０１１５】
スプレーは、洗口剤と同等または類似の組成物であるが、スプレーボトルに分注してあるので、以後ゆすぐ必要なしに口内を湿らせ且つ保護するのに必要な１回用量を、好都合に塗布できる。
【０１１６】
口腔用ジェルには、口腔に直接安定して塗布することを可能にするポリマー類が含まれる。これらのポリマー類に関しては、本発明の目的に合うように、ポリカルボフィルおよびカルボマーとして一般的に知られるポリマー類を組み合わせて使用するのが好ましい。これらのポリマー類によって、かなりの長時間にわたって、極端な温度条件下で安定なジェル構造が保持されるからである。ジェルはまた、ソルビトールなどの非齲蝕性天然甘味料をいくらかの量含みうる。
【０１１７】
練り歯磨きの調合は、当業者に周知である。練り歯磨き組成物中には、非イオン性（例えば、糖類を用いた脂肪酸エステル）または両性（例えば、ココ由来のベタイン）界面活性剤を使用することが好ましい。なぜなら、イオン性界面活性剤は、歯肉の繊細な上皮組織に対してマイナスの効果を有するからである。練り歯磨きの事例で、口腔酸度を中性化する目的で重炭酸ナトリウムを使用することもまた、特に好ましい。そのほか、キサンタンガムのような増粘剤、研磨剤シリカフィラー、および練り歯磨き産業において通常使用されるもの以外の他の補助剤を、練り歯磨きに配合することもできる。乳酸細菌は、他の形態でカプセル化または保護して、練り歯磨き中に導入するのが好ましい。
乳酸細菌株
【０１１８】
本発明の他の態様は、ペディオコッカス（Pediococcus）属の新たな菌株、特に、インプラント周囲炎、および口腔のディスバイオシスに関連する他の口腔内病態を予防し且つ治療するのに有益な該菌株に関する。これらの新たな菌株は、健康なヒトから単離されたさまざまな乳酸細菌株を広範に研究した成果である。ペディオコッカス・ペントサス（Pediococcus pentosaceus）ＰＥＲＩ１、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＰＥＲＩ２、ペディオコッカス・ペントサス／アシディラクティシ（Pediococcus pentosaceus/acidilactici）ＰＥＲＩ３、ペディオコッカス・ペントサス／アシディラクティシ（Pediococcus pentosaceus/acidilactici）ＰＥＲＩ４は、２０１５年６月１６日に、Parc de Recerca UAB, Campus UAB, s/n Edifici Eureka, 08193 Cerdanyola del Valles（スペインのバルセロナ）に拠点を置く受託業者AB-Biotics, S.A.によって、スペイン基準株コレクション（Coleccion Espanola de Cultivos Tipo、ＣＥＣＴ, Edificio 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, Catedratico Agustin Escardino, 9, 46980-Paterna、於：スペインのバレンシア）に受託された。これらの菌株は、国際寄託機関（International Authority of Deposit）に生存可能な菌株であると宣告された後、それぞれ受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５およびＣＥＣＴ８９０６を受け取った。
【０１１９】
これらの菌株が選択されたのは、以下の特徴的な特性/能力に適合するという理由からであった。
・  口腔内によく存在する２とおりの殺菌剤（リゾチームおよび過酸化水素）の存在下で、忍容性が良好な菌株として口腔内で旺盛に生存する能力。
・  忍容性が十分で、ゲル化剤および／または生体接着剤の存在下で増殖する能力。例えば、選択された菌株の、唾液中での増殖は、グアーガムのようなゲル化剤、および／またはヒドロキシエチルセルロースのような生体接着剤の存在下で増強される。
・  口腔病原体の増殖を阻害する能力。例えば、菌株は、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）および／またはアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）をはじめとするインプラント周囲炎に関連する細菌に拮抗しうる。
・  凝集能力。これは、他の病原体のコロニー形成に対して天然バリヤを形成することによって防御する効果を有しうるバイオフィルムを形成するための要件である。
・  多種多様な乳酸細菌種が、これまで明らかに安全に使用されてきた長い歴史を有すること。「安全適格性推定（Qualified Presumption of Safety）」（ＱＰＳ）ステータスを分類単位に付与するシステムが、欧州食品安全機関（European Food Safety Authority）によって開発されており、現在に至るまでの長期にわたって明らかに安全に使用されてきたことは実証済みである。本発明の菌株は、ＱＰＳステータスを有する細菌種に属する［Andreoletti, O.ら、2008］。
【０１２０】
要約すれば、ペディオコッカス（Pediococcus）菌株、特に、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、およびペディオコッカス・ペントサス（Pediococcus pentosaceus）菌株で上述の特徴を備えるもの、ならびにインプラント周囲炎の予防および／または治療における使用に対応したものは、これまで先行技術によって記載されたことがなかったと考えられている。菌株ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０３、ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４、ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５、ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６は共に、上述した全ての特性に適合するため、インプラント周囲炎の治療に好適であることは、注目に値する。
【０１２１】
特定の実施形態では、単離菌株を人工培地内で発酵させて、発酵後に後処理を施すことによって細菌菌体を得ることから、結果として得られる細菌菌体は、液体培地形態または固体形態のものとなる。後処理は特に、乾燥、凍結、凍結乾燥、流動床乾燥、スプレー乾燥、および液体培地中での凍結からなる群から選択され、より具体的には、凍結乾燥である。
【０１２２】
本発明の菌株は、好適な条件下、好適な人工培地中で細菌の培養（または発酵）によって生成される。微生物に関して「人工培地（artificial medium）」という表現は、天然物質、任意選択的に、ポリマーであるポリビニルアルコールなどの合成化学物質を含有させることによって、血清の機能のいくつかを再現できるようにした培地であると理解すべきである。一般の好適な人工培地は、細菌増殖に必要な炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アミノ酸およびタンパク質）、水、ならびに塩をはじめとする要素を含有する、栄養ブロスである。増殖培地は、液体形態である場合もあれば、あるいは、多くの場合、寒天または他のゲル化剤との混合によって固体培地を得る。菌株は、単独で培養して純粋培養物を形成することもできるし、あるいは他の微生物と一緒に混合培養物として培養することもできるし、あるいはそれぞれ異なる種類の培養細菌を別個に培養してから、所望される比率で結合することもできる。培養後、最終調合物によっても異なるが、菌株を、精製済細菌として使用する場合もあれば、あるいは代わりに、細菌培養液または菌体懸濁液を、そのままの状態でもしくは適切な後処理後に使用する場合もある。本明細書において「バイオマス」という用語は、培養後に得られる細菌株培養（または培養と同義の用語としての発酵）として理解される。
【０１２３】
「後処理」という用語は、本発明との関連において、貯蔵可能な細菌菌体を得ることを目的にバイオマスに対して施される任意の処理として理解すべきである。後処理は、バイオマス内の菌体の代謝活性を減弱させ、それにより、菌体有害反応の速度を低下させることを目標とするものである。後処理の結果として、細菌菌体は、固形または液体の形態になりうる。固体形態の場合、貯蔵された細菌菌体は、粉末または顆粒でありうる。いずれにしても、細菌菌体を含有する固体および液体形態は両方とも、人為的な後処理工程の成果であって、天然には存在しないため、天然起源のものではない。特定の実施形態において、後処理工程では、いわゆる後処理剤を１種以上使用する必要のある場合もある。本発明との関連において、「後処理剤」という表現は、本明細書中に記載されている後処理工程を実施するために使用される化合物を指す。後処理剤としては、限定されないが、脱水剤、静菌剤、凍結保護剤（凍結防御剤）、不活性フィラー（別称：凍結乾燥保護剤）、キャリア材料（別称：コア材料）などを挙げることができ、これらは、単独で使用されることもあれば、あるいは組み合わせて使用されることもある。
【０１２４】
細菌菌体の代謝活性を減弱させるための基本的手法には２とおりがあるので、後処理を遂行するための手法にも２とおりがある。第１の手法は全ての化学反応の速度を低下させることであり、この化学反応速度の低下は、冷蔵庫、機械的フリーザーおよび液体窒素フリーザーを使用した冷凍または凍結によって、温度を下降させれば遂行できる。代替的に、全ての化学反応速度の低下は、細菌菌体の増殖を阻害する物質、つまり、静菌剤（略称：Ｂｓｔａｔｉｃ）を添加することによっても達成できる。
【０１２５】
後処理を遂行するための第２の手法は、水をバイオマスから除去すること、すなわち、凍結乾燥機を用いた水の昇華を含みうる工程である。水をバイオマスから除去するための好適な技法は、乾燥、凍結乾燥、スプレー乾燥、または流動床乾燥である。結果として固体形態を生ずる後処理は、乾燥、凍結、凍結乾燥、流動床乾燥、またはスプレー乾燥でありうる。
【０１２６】
後処理は、減圧下で昇華によって凍結細菌懸濁液から水を除去することを含む、凍結乾燥であることが好ましい。この工程は、生成物を予備凍結して凍結構造物を形成する工程と、一次乾燥にてほとんどの水を除去する工程と、二次乾燥にて結合水を除去する工程の、３つの工程からなる。凍結乾燥された細菌培養を製造し且つ単離するにあたって、工業工程の目標および予期されるばらつきに対応するため、後者には、或る量の不活性フィラー（別称：凍結乾燥保護剤）が共通に含有されている。その役割は、生成物中のプロバイオティクス細菌の含有率を標準化することにある。市販の凍結乾燥した培養液中に、不活性フィラーとして、スクロース、サッカロース、乳糖、トレハロース、グルコース、麦芽糖、麦芽デキストリン、トウモロコシデンプン、インスリン、および他の医薬的に許容可能な非吸湿性フィラーを使用した。また、任意選択的に、他の安定化剤またはアスコルビン酸のような凍結保護剤を使用して粘性ペーストを形成し、これを凍結乾燥した。いずれにしても、そのようにして得られた材料を、適切なサイズになるまで、例えば、粉末になるまで粉砕することができる。
【０１２７】
当業者であれば、受託済菌株を出発材料として使用して、日常的に、従来の突然変異誘発または再単離技術によって、本明細書中に記載されている該当の特徴、および本発明の組成物を形成する菌株の利点を保持または強化する、その更なる変異体を得ることが可能であるのは明らかである。特定の一実施形態において変異体は、組み換えＤＮＡテクノロジーを利用して得られる。別の実施形態において変異体は、ランダム突然変異誘発によって得られる。ゆえに、本発明の別の態様は、菌株が菌株ＣＥＣＴ８９０３、菌株ＣＥＣＴ８９０４、菌株ＣＥＣＴ８９０５および菌株ＣＥＣＴ８９０６からなる群から選択される、ペディオコッカス（Pediococcus）の少なくとも１種の菌株の変異体を得る方法に関する。
本方法は、受託済菌株を出発材料として使用して変異誘発を加える工程を含み、得られた変異体を更に保持するか、あるいはポルフィロモナス（Porphyromonas）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、プレボテラ（Prevotella）、およびアグリゲイティバクター（Aggregatibacter）属の細菌からなる群から選択される少なくとも１種の口腔病原体に拮抗する受託済菌株の能力を少なくとも強化する。
【０１２８】
本発明の追加的な態様は、医薬製品、獣医学的製品、医療食、食料品、保健食品および口腔ケア製品であり、これらは、上記に定義された有効量の少なくとも１種の菌株と、適切な量の許容可能な賦形剤とを共に含む。
【０１２９】
本組成物の特定の目的を鑑みた場合、賦形剤、および最も適切な調合方法の選択は、製薬技術の当業者の範囲内に含まれる。本発明の菌株は、活性剤単独の形態で、または１種以上の他の活性剤と混合された形態で調合できる。
【０１３０】
本明細書において「賦形剤」という用語は、医薬製品、獣医学的製品、薬品、保健食品、医療食、および口腔ケア製品の活性配合剤と共に調合された、任意の天然物質または合成物質を包含する、その広義の意味にて理解される。賦形剤は、フィラー／希釈剤／増容剤、結合剤、付着防止剤、崩壊剤、コーティング、抗固化剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、またはタルク）、抗酸化剤、潤滑剤、甘味料、着香料、着色剤、界面活性剤、および他の部類の医薬的に且つ獣医学的に許容可能な賦形剤を含む群から選択されるが、それらに限定されない。
【０１３１】
本組成物中の菌株の有効量のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、当業者によって定量され、最終調合物に依存する。例えば、他の任意の活性剤なしで経口投与された場合、本発明の菌株の総量は、現行の法律制定に準じて、有効な一日用量１０７〜１０１２ｃｆｕ、好ましくは１０９〜１０１１ｃｆｕを供給する量にて、単回投与の本組成物中に存在する。「コロニー形成単位（colony forming unit）」（「ｃｆｕ」）という用語は、寒天プレート上に微生物学的計数にて曝露される細菌菌体数として定義される。保健食品は通常、プロバイオティクス菌株を１０７〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で含有する。
【０１３２】
本明細書において、「医薬製品」という用語は、その広範な意味に理解される。例えば、活性配合剤を含む任意の組成物であり、この事例において本発明の菌株は、好ましくは、組成物の形態であると共に、医薬的に許容可能な賦形剤の形態である。この用語は、薬品だけに限定されるものではない。本明細書中で用いられている「医薬的に許容される（pharmaceutically acceptable）」という用語は、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題、あるいは合理的な利益／リスク比率に相応した合併症を起こすことなしに、被験者（例えば、ヒト）の組織に接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態に関する。各キャリア、賦形剤などはまた、調合物の他の配合剤と相容するという意味で、「許容される」ものでなければならない。好適なキャリア、賦形剤などは、医薬の標準テキスト中に見出すことができる。
【０１３３】
医薬製品は、製品承認経路に応じて、また国によっても、それぞれ異なる形態または名称のものが採用される場合がある。例えば、具体的な医薬製品としては薬品が挙げられ、もう１つの具体的な医薬製品として医療食が挙げられる。「医療食」または「特別医療目的用食品」という用語は、一部の諸国において典型的な栄養所要量が規定されていてそれを通常の食事だけでは満たすことができない疾患における食事管理の目的に対応するよう特別に調合され且つ意図された食品を指すのに用いられる。これらは、米国における食品薬品局（ＦＤＡ）による１９８８オーファンドラッグ法の改正、および欧州における委員会指令（Commission Directive）１９９９／２１／ＥＣなどの規制にて定められている。医療食は、より広範な範疇の保健食品および栄養機能表示を有する従来食品とは区別される。ゆえに、特定の実施形態において、本発明の菌株は、医療食として調合される。
【０１３４】
プロバイオティクス細菌組成物、例えば、本明細書中に開示されているものは、多くの場合、保健食品と見なされる。保健食品（別称：栄養補助食品、または栄養補給剤）は、別の特定の医薬製品であると考えられる。これは、食事を補うための調製物または製品であって、食品中に通常用いられる化合物から製造され、通常の食事では通常消化されないか、または十分な量で摂取されない可能性のある栄養素もしくは有益な成分を供給することを意図したものである。たいてい、保健食品は食料品と見なされるが、これらは時には、薬物、ナチュラル・ヘルス製品、またはニュートラ・スーティカル（nutraceutical）製品として定義されることもある。本発明の意味において、保健食品はまた、ニュートラ・スーティカルを含む。保健食品は通常、「店頭で（over the counter）」すなわち処方箋なしで、販売される。丸剤、カプセル、錠剤、または粉末の形態が採用されている保健食品には、薬品中に使用されている賦形剤と同じ賦形剤が含まれる。しかしながら、保健食品には、いくつかの栄養源（例えば、バーまたはヨーグルト）で強化される食料品の形態が採用される場合もある。ゆえに、特定の実施形態において、本発明の菌株は、保健食品として調合される。保健食品は、そのまま投与される場合もあれば、水、ヨーグルト、牛乳、または果汁などの飲用に適した好適な液体と混合して、あるいは固形または液状の食物と混合して、投与される場合もある。これに関連して、保健食品は、錠剤または口内錠の形態、丸剤、カプセル、顆粒剤、粉末、懸濁液、サッシェ、スイーツ、バー、シロップ剤、ならびに対応する投与形態（通常は１回服用分分包）の形態でありうる。
【０１３５】
本発明の菌株はまた、各種の食料品、例えば、乳製品（ヨーグルト、チーズ、発酵乳、粉乳、発酵乳製品、アイスクリーム、発酵穀物製品、牛乳を主成分とする粉末）、パン、バー、スプレッド、ビスケット、およびシリアル、飲料、さまざまな種類の油脂、またはドレッシング中にも配合できる。本明細書において「食料品」という用語は、動物が消化できる任意の提示形態の任意の型式の製品を含み、但し製薬、および獣医学的製品を除く、広義の意味で使用されている。他の食料品の例には、肉製品、チョコレートスプレッド、フィリングおよび糖衣、チョコレート、コンフェクショナリ、焼き菓子、ソースおよびスープ、果汁、ならびにコーヒー・ホワイトナーがある。特に興味深い食料品には、保健食品および乳児用調製粉乳がある。食料品は、オートミール粥、乳酸発酵食品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質などの担体物質を含むことが好ましい。特定の実施形態において、本発明の菌株は、カプセル化またはコーティングされている。
【０１３６】
本発明の組成物は、口腔衛生用途に使用されるように意図されている。したがって、本発明の別の態様は、上述の組成物と、医薬的にもしくは化粧料的に許容可能な賦形剤または他の食用配合剤と、を含んでなる口腔ケア製品を提供するものである。この意味で、本組成物は、特定の治療薬が全身投与されるように意図的に嚥下するのではなく、寧ろ、口腔活性の目的に合わせて、実質的に全ての歯科表面および／または口腔組織に接触するのに十分な時間にわたって口腔内に保持される、口腔用製品である。そのような製品の非限定例としては、練り歯磨き、歯磨剤、歯磨き粉、局所口腔用ジェル、マウスリンス、義歯製品、口腔スプレー、チューインガム、デンタルフロスデンタルテープ、黒色火薬、ポリシングペースト、歯科用樹脂、裂溝封鎖材、充填物、口腔用クリーム、またはジェル、キャンディ、口内錠、経口分散錠、あるいは口腔内に直接散布できる粉末もしくはストリップが挙げられる。口腔ケア製品は、メントールなどの着香用化合物を追加的に含む場合がある。
【０１３７】
上記の実施形態は、治療、療法および予防処置の分野、更には、特に、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サル、ヒツジ、ヤギにおける獣医学的薬品に当てはまる。動物が咀嚼したりかじったりしゃぶったりするための具体的な物品としては、スティック、動物用スナック、ペットフード、ペレット、またはペット玩具がある。
【０１３８】
ゆえに、本発明の菌株は、組成物の形態に関係なく、すなわち、医薬製品、薬品、食料品、保健食品、医療食、または口腔ケア製品のいずれであるかに関係なく、口腔のディスバイオシスの処置に有用であることを理解すべきである。
【０１３９】
本発明の別の態様は、凍結防止剤と、少なくとも１種の乳酸細菌を含む凍結乾燥バイオマスと、医薬的に許容可能なキャリアとを含む、固体組成物に関する。医薬的に許容可能なキャリアは、好ましくは、エマルジョン、ジェル、ペースト、顆粒、粉末およびガムから選択される。本発明の追加的な態様は、口腔ケア製品、医薬組成物および食用製品、ならびに以前の態様において規定された有効量の本組成物を含む栄養補助食品および化粧料組成物を提供するものである。特定の実施形態において、口腔ケア製品は、チューインガム、練り歯磨き、口腔スプレー、口内錠、または口腔分散性錠剤である。特定の実施形態において、医薬組成物、食用製品、または栄養補助食品は、口内錠もしくは口腔分散性錠剤である。
【０１４０】
明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」という単語およびそのバリエーションは、他の技術的特徴、添加物、成分または工程を除外することを意図するものではない。本発明の追加的な目標、利点、および特徴は、本明細書を考察することによって当業者に明らかになるであろうし、あるいは本発明を実践することによって習得することができる。そのうえ、本発明は、本明細書中に記載されている特定の実施形態および好ましい実施形態に関して考えられる全ての組み合わせを網羅している。以下の実施例および図面は、例証の目的で本明細書中に提供されているものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】グアーガム（ＧＧ）を補給した人工唾液中でのプロバイオティクス菌株の増殖（Ｇ）を、無添加の人工唾液と比較した図である。
【図２】ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）を補給した人工唾液中でのプロバイオティクス菌株の増殖（Ｇ）を、無添加の人工唾液と比較した図である。
【図３】アルギン酸ナトリウム（ＳＡ）を補給した人工唾液中でのプロバイオティクス菌株の増殖（Ｇ）を、無添加の人工唾液と比較した図である。
【図４】メチルセルロース（ＭＣ）を補給した人工唾液中でのプロバイオティクス菌株の増殖（Ｇ）を、無添加の人工唾液と比較した図である。
【図５】アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）に対するプロバイオティクス候補の阻害活性（Ｉｎ）
【図６】ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤによる、菌株の遺伝子型判定。１＝ＰＥＲＩ１；２＝ＰＥＲＩ２；３＝ＰＥＲＩ３；４＝ＰＥＲＩ４の、ランダム増幅後に得られたパターン。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：微生物の単離
乳酸細菌候補を、０〜９歳の小児由来の新鮮な便、および経口ヒソップから単離した。試料をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解し、分取して、さまざまな組み合わせの抗生物質を補給したＭＲＳ上に播種した。菌株を微好気条件（ＣＯ２５％）下、３７℃または３０℃で培養した。インキュベーション時間は、増殖速度によっても異なったが、通常は２４時間ないし３日間にわたって継続された。個々の菌株の単離によって、同じ選択培地の処理を進めてから、第１の識別を得るためグラム染色を遂行した。いったん増殖した単離菌株は、１５％脱脂粉乳含有ＰＢＳ０．１ｘ溶液中で凍結乾燥によって貯蔵された。
【０１４３】
実施例２：属および種の同定
種レベルの同定を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって実行した。概略説明すると、Bio-Rad Laboratories（本拠：スペインのバルセロナ）製Chelex（登録商標）100樹脂から、菌株のＤＮＡを抽出した。上述したように、真正細菌２７Ｆ用および１４９２Ｒに対してユニバーサルプライマーを使用して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の完全な配列を増幅した［Weisburg, W.G.ら、１９９１；Muyzer, G.ら、１９９８］。ＰＣＲ製品の完全性は、アガロースゲル中にＳＹＢＲ緑色染料（Invitrogen, Life Technologies製、本拠：スペインのマドリード）を使用して、検査した。２７Ｆ、３５７Ｆ、９０７Ｒ、および１４９２プライマー［上掲のWeisburg, W.G.ら；上掲のMuyzer, G.ら］、v３.１サイクルシーケンシングキット、および３１３０ XLジェネティックアナライザ（塗布され、Biosystems, Life Technologies製、本拠：スペインのマドリード）を使用して、ＰＣＲ製品の配列決定を行った。結果として得られた配列をアラインして、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）およびＲＤＰ（リボソームデータベースプロジェクト）に存在するものと比較した。菌株は、最高のヒットスコアに基づいて同定される。
【０１４４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、ペディオコッカス（Pediococcus）属に対応していた。ＮＣＢＩデータベースおよびＲＤＰデータベースと比較した場合、ＰＥＲＩ１の配列はＰ．ペントサセウス（P. pentosaceus）に対して１００％の相同性で対応していた。ＰＥＲＩ２の配列はＰ．アシディラクティシィ（P. acidilactici）（１００％）に対応していた。ＰＥＲＩ３の配列はＰ．ペントサセウス（P. pentosaceus）またはＰ．アシディラクティシィ（P. acidilactici）のいずれかに対して１００％の相同性で対応していた。ＰＥＲＩ４の配列はＰ．ペントサセウス（P. pentosaceus）またはＰ．アシディラクティシィ（P. acidilactici）のいずれかに対して９９％の相同性で対応していた。これらは、スペイン基準株コレクション（ＣＥＣＴ）にてそれぞれ受託番号ＣＥＣＴ８９０３、ＣＥＣＴ８９０４、ＣＥＣＴ８９０５、およびＣＥＣＴ８９０６で受託された。
【０１４５】
実施例３：菌株の遺伝子型判定
受託されたペディオコッカス（Pediococcus）種の４とおりの菌株が互いに異なることを確認するため、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）で菌株の遺伝子型判定を実施した。ＲＡＰＤを、［Nigatu.ら、1998］によって記載されている方法で実施した。菌株のＲＡＰＤパターンは、図６に図示してあるように、４とおりの菌株がそれぞれ異種であることを実証している。
【０１４６】
実施例４：口腔状態に対する生存率
細菌の生存を危険にさらすものとして既知の数とおりの濃度の薬剤（例えば、過酸化水素（ＨＰ）およびリゾチーム）に対する忍容性を評価することによって、口腔内の菌株の生存率を研究した。総数５０の乳酸細菌候補を評価し、対照として使用された市販のプロバイオティクス菌株、つまり、ストレプトコッカス（Streptococcus）、Ｓ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２（Blis Technologies製、本拠：ニュージーランド）およびラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＤＳＭ１７９３８（Biogaia製、本拠：スウェーデン）と比較した。
【０１４７】
プロバイオティクス候補、およびＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８を、Man Rogosa Sharpe寒天培地（MRSa）中で ３７°Ｃ、微好気条件（ＣＯ２５％）にて１８〜２４時間増殖させた。Ｓ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２を、同じ条件下で、但しＭＲＳの代わりにレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）を使用して、増殖させた。単離されたコロニーを使用して、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した細菌懸濁液（光学密度が、０．５番のマクファーランド標準液（およそ１Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｍＬ）に対応するもの）を調製した。細菌の懸濁液を、引き続きＭＲＳ、またはＢＨＩ液体培地で２倍希釈した。９６ウェルのマイクロプレートに、結果として得られた希釈液２００マイクロリットルを接種し、リゾチームまたはＨＰのいずれかを含有するＰＢＳ溶液５０μｌを加える。試験対象となったリゾチームの濃度は、１×１０６および５×１０６Ｕ／ｍＬ（ウェル内の終濃度はそれぞれ２×１０５および１×１０６Ｕ／ｍＬ）、ＨＰの濃度は、５ｍＭおよび２５ｍＭ（ウェル内の終濃度はそれぞれ１ｍＭおよび５ｍＭ）であった。マイクロウェルプレートを、微好気条件（ＣＯ２５％）、３７°Ｃにて６時間インキュベートした。細菌の増殖を、吸光度６２５ｎｍで定量してモニターした。リゾチームまたはＨＰの存在下で観察された増分を比較し、これらの薬剤（陽性対照）の存在下での細菌の増殖菌株と比較して、次式を使用して増殖率を計算した。
【０１４８】
【数５】
2018521136.tif 000006
式中、ＯＤＬＨは、微生物とリゾチームまたはＨＰのいずれかとを含有する、ウェルの光学密度であった。
ＯＤＣ-は、同量のリゾチームを含有し、且つ微生物を含有しない３つのウェルの平均光学密度であった。
ＯＤＣ＋は、リゾチームまたはＨＰ（陽性対照）のどちらでもない細菌を接種した、３つのウェルの平均光学密度であった。
【０１４９】
結果：
プロバイオティクス候補５０個中７個は、（栄養補給なしの）対照ＭＲＳ培地中でさえも増殖しなかった。ゆえに、これらの菌株は、潜在的候補として破棄された。残りの４３個は、その能力に従ってランク付けされ、試験対象となった最高濃度のリゾチームおよびＨＰの存在下で、増殖した。結果は、表１に示すとおりである。リゾチームまたはＨＰのいずれも補給されない培地中での同じ菌株の増殖と比較して、生存率の平均としてパーセンテージで表される。
【０１５０】
表１  リゾチームおよび過酸化水素濃度に対する細菌の忍容性。
【０１５１】
【表１】
2018521136.tif 000007
【０１５２】
第１の細菌２５個がリゾチームに対して最高の忍容性を示し、ＨＰが最良の候補と考えられ、プロバイオティクス特性評価のための以後のインビトロ検査用に選択された。観察できるように、全ての菌株が、高濃度のリゾチームに対して、生存率８６％以上と良好な忍容性を示し、これは市販の対照を用いた場合とほぼ同じであった。ＬＡＢ候補はまた、ＨＰに対して良好な忍容性（濃度５ｍＭのＨＰで８４％超の値）を示した。これらの結果を、市販の対照Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８、およびＬ．サリバリウス（L. salivarius）Ｋ１２の生存率（それぞれ５３．４、および８０．５％）とよく比較した。
【０１５３】
実施例５：プレバイオティクス効果を有するゲル化剤としてのグアーガムの使用
菌株がグアーガムを利用して増殖を増強する能力を、インビトロで研究した。この目的を達成するため、グアーガムを補給した人工唾液中でのプロバイオティクス候補の増殖を、補給しない人工唾液中で各プロバイオティクス候補を増殖した場合と比較した。人工唾液は、１ｇ／Ｌの「ラブレムコ」粉末（Oxoid製、本拠：英国のベイジングストーク）と、２ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid製）と、５ｇ／Ｌのプロテオースペプトン（Oxoid製）と、２．５ｇ／Ｌのブタ胃粘素（Sigma Chemical Co.製、本拠：英国のプール）と、３５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（BDH Chemicals Ltd製、本拠：英国のプール）と、０．２ｇ／Ｌの塩化カルシウム（ＢＤＨ）と、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム（ＢＤＨ）を蒸留水に溶解したものを含有していた。人工唾液に、グアーガム（Genox Pharma製、本拠：スペインのバルセロナ）を終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）に達するまで補給した。また、ジェル配合剤なしの人工唾液を調製し、細菌増殖におけるグアーガムの効果を、無添加培地と比較した。オートクレーブ処理後に、人工唾液培地１リットル当たり４０％尿素溶液１．２５ｍＬを加える。異なる調製済培地をそれぞれ９６ウェルプレートに２００マイクロリットルずつピペットで加えた。その直後に、ＰＢＳ中１Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｍＬに標準化されたプロバイオティクス候補の懸濁液２０マイクロリットルを加えた。同量の細菌接種源不含ＰＢＳを陰性対照として使用した。プレートを嫌気条件で、３７℃にて２４時間インキュベートし、６２５ｎｍでの光学密度を定量して細菌増殖をモニターした。プロバイオティクス候補が増殖用グアーガムを利用する能力を、次式に従って算出した。
【０１５４】
【数６】
2018521136.tif 000008
式中、ΔＤＯｇｐは、グアーガムを補給し、且つプロバイオティクス候補を接種されたウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間後とで比較した差分である。ΔＤＯｇ０は、グアーガムを補給し、但しＬＡＢの代わりにＰＢＳを含有したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間目とで比較した差分である。ΔＤＯｓｐは、グアーガムを補給し、且つプロバイオティクス候補を接種されたウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間後とで比較した差分である。ΔＤＯｓ０は、グアーガムを補給し、且つＬＡＢの代わりにＰＢＳを含有したウェルにおける、６２５ｎｍでの光学密度を０時間の時点と２４時間目とで比較した差分である。
【０１５５】
市販のプロバイオティクスＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８、Ｌ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２およびストレプトコッカス（Streptococcus salivarius）Ｋ１２を用いて得られた結果と、病原体フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）およびポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）を用いて得られた結果とを比較した。実験を二重に反復して行った。
【０１５６】
結果
栄養素としてのグアーガムを利用し且つ増殖を強化する能力を、図１に図示された無添加の人工唾液と比較した。グアーガムがＬＡＢの増殖に及ぼす影響は、試験対象となった菌株にかなり依存した。グアーガムは一部の菌株の増殖を強化したが、それ以外の菌株の増殖には、無添加の唾液と比較して有害な影響が及んだ。菌株ＰＥＲＩ１；ＰＥＲＩ２；ＰＥＲＩ３；ＰＥＲＩ４；Ｆ３１６３；Ｉ１００３；Ｉ１００５；Ｉ３０２８；Ｉ３０３０；Ｉ３１４０；Ｉ３１４２Ａ；Ｉ３１４５、およびＩ３１５３は、グアーガムの添加よる恩恵を受けた。最高のパフォーマンスを示した菌株は、ＰＥＲＩ１であった。試験対象となった対照菌株のうち、Ｌ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２、およびＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２は、グアーガムを添加したことによる恩恵を受けたが、グアーガムがこれらの菌株の増殖に及ぼす効果は、ＰＥＲＩ１、ＰＥＲＩ２、ＰＥＲＩ３、Ｆ３１６３；Ｉ１００３、および３１４２Ａなどの他のＬＡＢ候補に及ぼす効果よりも低かった。とりわけ、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、およびポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の事例においてグアーガムの効果は取るに足らないほど僅かであるが、望ましくない病原体の増殖を回避するうえでは有益である。
【０１５７】
実施例６：プレバイオティクス効果を有する接着剤としてのヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）の使用
実施例５でグアーガムに関して上述したように、菌株がＨＥＣを利用して増殖を強化する能力を検定した。
【０１５８】
結果
プロバイオティクスによる増殖に対してＨＥＣが与える効果を、非人工唾液と比較した。図２に示すとおりである。ＨＥＣを加えたことによって、２〜３の菌株の増殖が強化された。菌株、つまり、ＰＥＲＩ４、Ｉ１００５、およびＩ３１４２Ａは、ジェル中にＨＥＣを利用することによって、有意な恩恵を受けた。市販の菌株を含めた他の菌株は、この配合剤を利用する能力が劣っていた。
【０１５９】
実施例７：プレバイオティクス効果を有する配合剤としての他のゲル化剤の使用
また、他のゲル化剤を利用してプロバイオティクスにより増殖を増強できる可能性も、先に説明したのと同じ方法論を用いて研究した。特に、アルギン酸ナトリウム（ＳＡ）およびメチルセルロース（ＭＣ）を、プレバイオティクス効果を有する有能なゲル化剤として使用した。
【０１６０】
結果
ＳＡを補給したことによる細菌増殖に対する影響を、図３に図示された無添加の人工唾液と比較した。ＰＥＲＩ；ＰＥＲＩ２；ＰＥＲＩ３；ＰＥＲＩ４；Ｉ１００３；Ｉ１００５；Ｉ３０２８；Ｉ３０３０；Ｉ３１３０；Ｉ３１４２Ａ；Ｉ３１４５、およびＩ３１５３をはじめとする数種の菌株は、菌株増殖を強化するための栄養素として、ＳＡを利用することができた。対照的に、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、およびポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）は、増殖用ＳＡを利用する能力に乏しい。ＭＣの結果を図４に示す。病原体および対照菌株はいずれも、増殖強化用のＭＣを利用できなかった。対照的に、Ｆ２００８Ａ；ＰＥＲＩ２；Ｆ２０４３；ＰＥＲＩ４；Ｉ１００３；Ｉ１００５；Ｉ３０２８；Ｉ３０６１；Ｉ３１１８；Ｉ３１４０、およびＩ３１４２Ａをはじめとする数種のプロバイオティクス菌株は、ＭＣの補給による恩恵を得た。
【０１６１】
実施例８：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、およびプレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）に対する拮抗作用
【０１６２】
インプラント周囲炎を呈する患者において異常なほど大量の細菌に対するプロバイオティクス候補の拮抗活性を評価した。特に、病原体菌株は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）ＤＳＭ−２０７０９、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）ＤＳＭ ２０４８２、およびプレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）ＤＳＭ−２０７０６ＤＳＭ ８３２４であった。Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ １７９３８（Biogaia、スウェーデン）、Ｌ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２（Inersan（登録商標）、VSL Pharmaceuticals, Inc.製、本拠：米国）およびストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）Ｋ１２（BLIS Technologies製、本拠：ニュージーランド）を、市販の対照として使用した。ＬＡＢ候補が病原体増殖を阻害する能力は、キャンベルプロトコルを使用して定量した。概略説明すると、プロバイオティクス候補およびラクトバチルス（Lactobacillus）対照をＭＲＳ寒天プレート上に均一に播種し、３７°Ｃ、ＣＯ２５％で２４時間、コンフルエントに達するまで増殖させた。同じ条件下で、但しＢＨＩ培地を使用して、ストレプトコッカス（Streptococcus）、Ｓ．サリバリウス（s salivarius）Ｋ１２を増殖させた。
【０１６３】
病原体菌株を一晩培養した。これらの病原体の単離されたコロニーを使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）培地に溶解した懸濁液を調製し、増殖に適した固体培地中に均一にスワブ（swab）した。Ｆ．ヌクレアタム（F. nucleatum）およびＰ．インテルメディア（P. intermedia）を血液寒天中に播種し、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）をSchaeder嫌気性菌用ヒツジ血液寒天中に播種した。試験対象となったＬＡＢ候補のコンフルエントの寒天プレートの直径６ｍｍの円筒状セクションは、病原体を播種したプレート上にレーン・ツー・レーン（lane-to-lane）にて直ちに配置され、病原体を播種したプレートは、いくつかあるシリンダーセクションのうちの１つの増殖寒天側、および他のシリンダーセクションの非増殖側と直面した。プレートを嫌気条件にて３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、フラットルール上に寒天プレートを置いて阻害ゾーンを測定し、ハロー（halos）を測定して、（部分的にまたは完全に）病原体の増殖を阻害した。続いて、ミリメートル単位で測定された阻害ゾーン直径（ＩＺＤ）からシリンダー直径（ＣＤ）を減算して、増殖阻害活性（ＧＩ）を計算した。最終的な阻害活性を、プロバイオティクス菌株毎の２つの上記シリンダーセクションのＧＩ値の平均値として（すなわち、複製を平均して）計算した。全ての実験を二重に反復して行った。
【０１６４】
結果
数種のプロバイオティクス候補の拮抗活性を、表２に詳述する。菌株ＰＥＲＩ３、ＰＥＲＩ４およびＦ３１６６は、Ｆ．ヌクレアタム（F. nucleatum）に対して最大の活性を示し、これら３種の菌株はＬ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８およびＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２よりも高い活性を示した。候補Ｆ１０３１およびＰＥＲＩ２は、Ｐ．インテルメディア（P. intermedia）に対して最大の活性を示す候補である。数種の菌株はまた、Ｐ．ジンジバリス（P. gingivalis）の阻害に有効であった。それらのうち、ＰＥＲＩ１、Ｆ２００６、ＰＥＲＩ２、Ｆ３１６３、Ｉ１００３、Ｉ３１４３、Ｉ３１４５、およびＩ３１５３は、比較用に用いた市販の対照を使用した場合よりも高い活性を示した。
表２  Ｆ．ヌクレアタム（F. nucleatum）、Ｐ．インテルメディア（P. intermedia）、およびＰ．ジンジバリス（P. gingivalis）に対する阻害活性（結果を平均±ＳＤのｍｍ数で表す）。
【０１６５】
【表２】
2018521136.tif 000009
【０１６６】
実施例９：アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス
（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）に対する拮抗作用
アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）に拮抗するプロバイオティクス候補の活性を、液体培地にて研究した。プロバイオティクス候補、および乳酸桿菌（Lactobacillus）種対照を、ＭＲＳ液体培地中、微好気条件（ＣＯ２５％）にて３７℃で一晩増殖させた。同じ状態で、但しＢＨＩ培地を使用して、ストレプトコッカス・サリバリウス（Staphylococcus salivarius）Ｋ１２を増殖させた。培養液を遠心分離にかけ、上清０．２２マイクロリットルを濾過した。２０マイクロリットルを濾過し、ＢＨＩ培地１６０ｍｌを含有する９６ウェルマイクロプレートに上清を加えた。最後に、ＰＢＳ中に溶解したＡ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）懸濁液２０ｍｌを１Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｍＬに標準化したものを、ウェルに添加して、微好気条件（ＣＯ２５％）にて３７℃で２４時間インキュベートした。Ａ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）は、吸光度６２５ｎｍでの定量によってモニターされた。プロバイオティクスの上清を補給されたＡ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）の増殖を、補給されなかったもの（陰性対照）の増殖と比較し、次式を使用して、プロバイオティクスの上清阻害能力を定量した。
【０１６７】
【数７】
2018521136.tif 000010
式中、ＤＯｃは陰性対照に対応し、ＢＨＩ培地１６０μｌ＋Ａ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）懸濁液２０μl＋ＭＲＳ２０μl、またはＢＨＩを含有するウェルの６２５ｎｍでの光学密度であった。
ＤＯＢは、ブランクに対応し、ＢＨＩ培地１６０μｌ＋ＭＲＳ４０μｌ、またはＢＨＩを含有するウェルの６２５ｎｍでの光学密度であった。且つ
ＤＯＰは、プロバイオティクス候補に対応し、ＢＨＩ培地１６０μｌ＋Ａ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）懸濁液２０μｌ＋プロバイオティクスの上清２０μｌを含有するウェルの６２５ｎｍでの光学密度であった。
【０１６８】
全ての実験を、二重に反復して行った。
【０１６９】
結果
Ａ．アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）に対するプロバイオティクス候補の阻害活性は、図５に図示してある。数種の菌株のうち、ＰＥＲＩ３は、最大の活性を示した。アクチノミセテムコミタンス（A. actinomycetemcomitans）の増殖を７７．９％低減できる。この活性は、市販の対照、例えば、Ｌ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ１７９３８、および特にＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２（それぞれ４５．６％、３８．８％および２．４２％）よりも有意に高かった。
【０１７０】
実施例１０：凝集体を形成する能力
細菌の自己凝集能力は、バイオフィルムを形成するのに必要な第１の工程と考えられ、菌株の潜在的バイオフィルム形成能力を評価するための特徴として使用できるバイオフィルムの形成によって、口腔面への病原体の付着を低減することの可能な、保護バリヤが作成される。プロバイオティクス候補ＰＥＲＩ、ＰＥＲＩ２、ＰＥＲＩ３、ＰＥＲＩ４、Ｉ３１４２Ａ、Ｉ１００５、Ｉ３０３０、およびＩ３１４５が凝集体を形成する能力を評価した。Ｌ．ブレビス（L. brevis）ＣＤ２およびＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２を、対照として使用した。菌株を、ＭＲＳ培地（またはＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２の場合はＢＨＩ）中、微好気条件（ＣＯ２５％）で３７℃にて一晩増殖させた。この期間を経て、培養液を１０００ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を棄て、ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。最後に、光学密度が１番のマクファーランド標準液（およそ３Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｍＬ）に等しいプロバイオティクス懸濁液が得られるまで、ＰＢＳを加えた。懸濁液３ｍＬを分光光度計のキュベットに移し、６２０ｎｍでの光学密度を、３時間および６時間モニターした。この時間間隔における自動凝集能力を、次式を使用して算出した。
【０１７１】
【数８】
2018521136.tif 000011
式中、ＤＯ０は、試験開始（０時間）時点における細菌懸濁液の６２０ｎｍでの正味吸光度であった。
ＤＯｔは、３時間目または６時間目の細菌懸濁液の、６２０ｎｍでの正味吸光度である。
【０１７２】
結果
３時間目および６時間目の凝集率を、表３に要約する。プロバイオティクス候補ＰＥＲＩ４が、最高の自動凝集能力を示した菌株であったのに対して、最も低い活性を示したのは候補Ｉ３０３０およびＳ．サリバリウス（S. salivarius）Ｋ１２であった。
表３  プロバイオティクス候補の凝集率
【０１７３】
【表３】
2018521136.tif 000012
【０１７４】
実施例１１：インプラント用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）とを含有する凍結乾燥粉末５００ｇ、グアーガム２００ｇおよびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍｌを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕｓ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は４％、およびヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１７５】
実施例１２：インプラント用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５（３．７５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）とを含有する凍結乾燥粉末５３５ｇ、アルギン酸ナトリウム１５０ｇ、酢酸カルシウム１５ｇおよびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、アルミニウムカプセルを入れたセプタム付きガラス製バイアル中に導入した。シリンジに入れた水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍＬを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ＣＦＵ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のアルギン酸塩の濃度は３％、ヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１７６】
実施例１３：インプラント用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（２．９Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）とを含有する凍結乾燥粉末７００ｇ、グアーガム２００ｇおよびポリビニルピロリドン１００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、アルミニウムカプセルを入れたセプタム付きガラス製バイアル中に導入した。シリンジに入れた水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍＬを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は４％、ポリビニルピロリドンの濃度は２％になった。
【０１７７】
実施例１４：インプラント用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）とを含有する凍結乾燥粉末５００ｇおよびグアーガム５００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）６ｍｌを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕｓ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は４％になった。
【０１７８】
実施例１５：歯の用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０３（３．３５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末６００ｇ、グアーガム１００ｇ、およびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍｌを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は２％、ヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１７９】
実施例１６：歯の用途に対応した粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０３（３．４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末５９０ｇ、アルギン酸ナトリウム１００ｇ、酢酸カルシウム１０ｇ、およびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍＬを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のアルギン酸塩の濃度は２％、ヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１８０】
実施例１７：歯に塗布するための粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（７Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末２８０ｇと、ヒドロキシエチルセルロース７２０ｇとを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）６ｍｌを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕｓ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１８１】
実施例１８：歯に塗布するための粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＣＤ２（４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末６００ｇ、グアーガム１００ｇ、およびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍｌを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は２％、ヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１８２】
実施例１９：歯に塗布するための粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＣＤ２（４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末５９０ｇ、アルギン酸ナトリウム１００ｇ、酢酸カルシウム１０ｇ、およびヒドロキシエチルセルロース３００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、スクリューキャップ付きのガラス製バイアル中に導入した。水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍＬを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のアルギン酸塩の濃度は２％、ヒドロキシエチルセルロースの濃度は６％になった。
【０１８３】
実施例２０：歯に塗布するための粉末形態の再構成可能プロバイオティクスゲルの調製
ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）Ｋ１２（２．９Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）を含有する凍結乾燥粉末７００ｇ、グアーガム２００ｇ、およびポリビニルピロリドン１００ｇを、混合して均質にした。この粉末ブレンド０．５ｇを、アルミニウムカプセルを入れたセプタム付きガラス製バイアル中に導入した。シリンジに入れた水（好ましくは、脱イオン水または蒸留水）２．５ｍＬを加えて即座に手動で振盪して、再構成済ジェルを形成した。プロバイオティクスの最終用量は１Ｅ＋１０ｃｆｕ／バイアルであった。ジェルの再構成後、ジェル中のグアーガムの濃度は４％、ポリビニルピロリドンの濃度は２％になった。
【０１８４】
実施例２１：インプラント周囲炎に罹患する患者における再構成可能プロバイオティクスゲルの塗布
歯冠を除去して患者に局所麻酔を投与した。ゾーンを清潔にし、歯肉下の歯垢を機械的に除去した。クロルヘキシジン０．１２％を投与し、その後、食塩溶液を投与した。ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５とペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（４Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ）とを含有する凍結乾燥粉末、グアーガム２００ｇおよびヒドロキシエチルセルロース３００ｇに、滅菌水２．５ｍＬを加え、力強く１分間混合して、実施例１１の再構成済ジェルを得た。混合物を室温で１〜１０分間静置させ、シリンジおよび鈍先を備えるニードルでインプラント周囲ポケットに投与し、鈍先ニードルの先端をポケット基部の近くに位置決めしてから、本溶液が歯肉の上縁に達するまで本製品を注入した。次いで、ポケットからニードルを引き抜いた後、食塩溶液で洗浄し、治療ゾーン上にエアジェット（約１０秒間）を当てた。その直後、歯冠を所定位置に配置した。患者は、治療後６時間以内に歯磨きをしないように指示された。
【０１８５】
実施例２２：齲歯の予防を目的とした、患者における再構成可能プロバイオティクスゲルの塗布
歯ブラシで歯を磨き、多量の歯垢または懐死組織片（debris）を除去した。治療対象の歯を送風で軽く乾燥させて、唾液による再汚染を防ぐため、歯同士をコットンロールで隔離した。実施例１５に従って作製された少量のジェル（０．５ ｍｌ）をブラシで分取して、歯に塗った。患者に、本日は終日歯磨きしないように指示した。
【０１８６】
実施例２３：齲歯の予防を目的とした、患者における再構成可能プロバイオティクスゲルの塗布
歯ブラシで歯を磨き、多量の歯垢または懐死組織片（debris）を除去した。プロバイオティクス菌株５０ｍｇとグアーガム１２０ｍｇとヒドロキシエチルセルロース３６０ｍｇとを含む自己フィルム形成性組成物を、水６ｍＬで再構成し、直ちにシリンジでアスパイア（aspire）した。シリンジ中にジェルを１分間静置してから、口内床副子に均一に分散させた。その後、直ちに床副子を口内に当てがい、５分後に取り除いた。患者は、自己フィルム形成性組成物を含有するバイアルを更に提供され、４８時間毎に、好ましくは夜間に歯磨きしてから就寝直前までに、同じ手技に従って再構成済ジェルを自己投与するように指示された。患者に対し、ジェルの塗布後は歯磨きまたは飲食しないよう指示した。
【０１８７】
実施例２４：動物モデルにおける再構成可能プロバイオティクスゲルの有効性研究
動物モデルとしてのビーグル犬において、粘膜炎およびインプラント周囲炎の予防に対するプロバイオティクスゲルの有効性を研究した。全ての手技を、獣医の監督下で実施した。動物の大腿四頭筋中に、アセプロマジン（０．１２〜０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（３５ｌｇ／ｋｇ）を筋肉内注射することによって予め麻酔をかけた。
【０１８８】
静脈内カテーテル（直径２２または２０ゲージ）を橈側皮静脈内に挿入し、プロポフォールを一定の遅い注入速度（０．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度）で注入した。外科手術部位に従来の歯科浸潤麻酔（アルチカイン４０ｍｇ、エピネフリン１％）を投与した。下顎の両方の象限、第二小臼歯（ＰＭ２）および第一小臼歯（Ｍ１）を、実験部位として使用した。歯をカーバイドタングステンドリルで切断し、残りの骨壁に損傷を与えることなしに歯根を取り除いた。前庭および歯槽に隣接する舌区域に沿って溝周縁を切開し、稜部の硬質組織壁が視認できるように組織を分離させた。部位治療の２か月後、８個のインプラントを稜部に（crestally）配置し、更に２か月間にわたってヒーリングカップ（healing cup）で治療した。治療の２か月後、各当接体の周辺に絹結紮を配置した。また、インプラントの周りにも、口腔用ジェルを投与した。イヌ５匹を、グアーガム４％とヒドロキシエチルセルロース６％と１ｍＬ当たり４ＣＦＵのプロバイオティクス混合物とを含有する再構成済液体ジェルで、治療した。このプロバイオティクス混合物は、ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０４、ペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０５およびペディオコッカス（Pediococcus）ＣＥＣＴ８９０６（１：１：１）で構成されたものである。これらの動物のうちの１匹は、プロバイオティクスを含有しない同じ種類のジェルで治療された。その後、動物に軟食を与えて、歯垢の蓄積を誘発し、インプラント周囲炎症、および骨粗鬆を起こさせた。２週間毎に、以前の結紮の上およびインプラントの周りに、追加的な結紮を配置した。
【０１８９】
いずれの外科手術後も癒合に問題はなく、曝露または二次的な創傷の治癒はまったく観察されなかった。実験的なインプラント周囲炎は、炎症および骨粗鬆の徴候に帰結した。概して、プロバイオティクスジェルで治療された動物は、プロバイオティクスを含有しないジェルで治療された動物と比較して、組織破壊、炎症反応、プロービング深度、粘膜後退、およびプロービング上の出血が、さほど顕著でないことが明らかであった。したがって、インプラント周囲炎に関連する臨床的徴候は、プロバイオティクス治療によって改善されたことになる。
【０１９０】
実施例２５：ゲル化剤および生体接着剤のレオロジー特性の研究
さまざまな薬剤の粘度および接着性を研究した。研究の対象となった組成物は、以下のとおりである。
・  酢酸カルシウム（濃度０．０２〜０．２％）含有または不含のアルギン酸ナトリウム（濃度範囲：２〜８％水溶液（ｗ／ｖ））。
・  グアーガム（濃度範囲：１〜５％水溶液（ｗ／ｖ））。
・  メチルセルロース（濃度範囲：１〜５％水溶液（ｗ／ｖ））。
・  ヒドロキシエチルセルロース（濃度範囲：１〜６％水溶液（ｗ／ｖ））。
・  カルボキシメチルセルロースナトリウム（濃度範囲：１〜３％水溶液（ｗ／ｖ））。
表４  粘度および接着能力
【０１９１】
【表４】
2018521136.tif 000013
【０１９２】
本フィルム形成性組成物に与えられた粘度、および接着性は、ジェルの臨床的塗布に応じて異なる可能性をもたらすために使用される薬剤に依存する。アルギン酸ナトリウムとの組み合わせ、特に、グアーガムとヒドロキシエチルセルロースとの組み合わせは、高粘度および高接着性などの特性を兼備するジェルを形成する格好の候補と見なされる。
書誌参照
【０１９３】
特許文献
特開２０１０００５３０６２号（Sunstar Inc.，2010. 3. 11）。
非特許文献
Albertini, M.ら「Assessment of periodontal and opportunistic flora in patients with peri-implantitis」Clinical Oral Implants Research, 2014, vol. 00, p. 1〜4。
Da Silva, E.S.C.ら「Microbial diversity of peri-implantitis biofilm by Sanger Sequencing」Clin Oral Implants Research, 2013, vol. 0, p. 1〜8。
Persson, G.R.ら「Cluster of Bacteria Associated with Peri-Implantitis」Clinical Implant Dentistry and related research, 2013, vol. 0, p. 1〜11。
Ata-Ali, J.ら「Peri-implantitis: Associated microbiota and treatment」Med Oral Patol Oral Cir Bucal.2011, vol. 16, p. 937〜43。
Flotra, L.ら「Side effects of chlorhexidine mouth washes」Scand J Dent Res 1971, vol. 73, p. 119〜125。
Slots, J.ら「Antibiotics in periodontal therapy: advantages and disadvantages」J Clin Periodontol 1990, vol. 17, p. 479〜493。
Szkaradkiewicz, A.K.ら「Effect of Oral Administration Involving a Probiotic Strain of Lactobacillus reuteri on Pro-Inflammatory Cytokine Response in Patients with Chronic Periodontitis」Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2014, vol. 62, p. 495〜500。
Teughels, W.ら「Clinical and microbiological effects of Lactobacillus reuteri probiotics in the treatment of chronic periodontitis: a randomized placebo-controlled study」J of clinical periodontology, 2013, vol. 40, p. 1025〜35。
Hallstroem, H.ら「Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis」Acta Odontologica Scandinavica, 2013, vol. 71, p. 828〜833。
Flichy-Fernandez, A.J.ら「The effect of orally administered probiotic Lactobacillus reuteri-containing tablets in peri-implant mucositis: a double-blind randomized controlled trial」J Periodont Res, 2015, Epub ahead of print
Toiviainen, Aら「Impact of orally administered lozenges with Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 on the number of salivary mutans streptococci, amount of plaque, gingival inflammation and the oral microbiome in healthy adults」Clin Oral Investig, 2015, vol. 19, p. 77〜83。
Maekawa, T.ら「Topical treatment with probiotic Lactobacillus brevis CD2 inhibits experimental periodontal inflammation and bone loss」J Periodont Res, 2014, vol. 44, p. 785〜791。
Yanine, N.ら「Effects of probiotics in periodontal diseases: a systematic review」Clinical oral investigations, 2013, vol. 17, p. 1627〜34。
Andreoletti, O.ら「The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed.Question no: EFSA-Q-2008-006」The EFSA Journal, 2008, vol. 923, p. 1〜48。
Weisburg, W.G.ら「16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study」J Bacteriology, 1991, vol. 173, p. 697〜703。
Muyzer, G.ら「Application of denaturing gradient gel electophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology」Antonie van Leeuwenhoeck, 1998, vol. 73, p. 127〜141。
Nigatu, A.ら「Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for discrimination of Pediococcus pentosaceus and Pediococcus acidilactici and rapid grouping of Pediococcus isolates」Letters in Applied Microbiology 1998, vol. 26, p. 412〜6。
【図１】
2018521136.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2018521136.tif 000021
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