(57)【要約】本発明は、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の二環式阻害剤に関する、ここで、（Ｘ１）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸であり；（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ４）は脂肪族Ｌ−アミノ酸または環状Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはＬ、Ｐまたは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり；（Ｘ５）はアミノ酸であり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ７）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり；（Ｘ１１）はアミノ酸であり、好ましくはＱであり；（Ｘ１２）は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、好ましくは脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくはＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり、（Ｘ１５）は側鎖を持つアミノ酸であり；および（Ｘ１６）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸である；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも三つの官能基を有しており、各官能基は（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖の内一つと共有結合を形成している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含む、またはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の二環式阻害剤であって、
（Ｘ１）は存在してもしなくてもよく、存在する場合はアミノ酸であり；
（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり；
（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；
（Ｘ４）は脂肪族Ｌ−アミノ酸または環状Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはＬ、Ｐまたは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり；
（Ｘ５）はアミノ酸であり；
（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；
（Ｘ７）は側鎖を持つアミノ酸であり；
（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；
（Ｘ１０）はアミノ酸であり；
（Ｘ１１）はアミノ酸であり、好ましくはＱであり；
（Ｘ１２）は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、好ましくは脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくはＬであり；
（Ｘ１３）はアミノ酸であり；
（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり、
（Ｘ１５）は側鎖を持つアミノ酸であり；および
（Ｘ１６）は存在してもしなくてもよく、存在する場合はアミノ酸であり；ならびに
ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖が連結分子を介して連結しており、前記連結分子が少なくとも三つの官能基を有し、各官能基が（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖の内一つと共有結合を形成している、二環式阻害剤。
【請求項２】
（Ｘ４）が、
Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される、
好ましくは、Ｆ、Ｗ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される、
さらに好ましくはＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される、ならびに
最も好ましくは２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される、
請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
（Ｘ５）が、疎水性Ｌ−アミノ酸または極性で非荷電のＬ−アミノ酸であり、好ましくは疎水性Ｌ−アミノ酸であり、さらに好ましくはＳ、Ａ、ＬまたはＰであり、最も好ましくはＬまたはＰである、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖が官能基を含み、好ましくは（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）が、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミド、好ましくは−ＮＨ２および−ＳＨ、最も好ましくは−ＳＨからそれぞれ独立に選択される、請求項１から３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）がそれぞれ独立に、Ｋ、オルニチン、チアリジン、２，３−ジアミノプロパン酸、ジアミノ酪酸、Ｄ、Ｅ、Ｃ、ホモシステイン、ペニシラミンまたはプロパルギルグリシンであり、好ましくはＣまたはホモシステインであり、最も好ましくは全てＣである、請求項１から３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
（Ｘ２）が、５−メルカプトノルバリン、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはホモシステインまたはＣであり、最も好ましくはＣであり；および／または、
（Ｘ７）が、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはＣであり；および／または、
（Ｘ１５）が、５−メルカプトノルバリン、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはホモシステインまたはＣである、
請求項１から３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項７】
（Ｘ１）が、Ｄ−Ａｒｇ、ホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＬ−Ａｒｇであり、好ましくはホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＬ−Ａｒｇであり、最も好ましくはホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＬ−Ａｒｇであり；および／または
（Ｘ１０）が、Ｇ、ＨまたはＲであり、好ましくはＨまたはＲであり；
（Ｘ１３）が、Ａ、Ｇ、（Ｓ）−β３−ホモアルギニンまたはＲであり、好ましくは（Ｓ）−β３−ホモアルギニンまたはＲであり、および／または、
（Ｘ１６）が、Ｒまたは存在しない、
請求項１から６のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項８】
連結分子が、１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）、１，３，５−トリス（クロロアセチル）−１，３，５−トリアジナン（ＴＣＡＴ）、１，３，５−トリス（ブロモアセチル）−１，３，５−トリアジナン（ＴＢＡＴ）、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）および２，４，６−トリス（ブロモメチル）−１，３，５−トリアジン（ＴＢＭＴ）から選択され、好ましくは１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である、請求項１から７のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項９】
下記の項目（ｉ）から（ｉｖ）の少なくとも一つを満たす：
（ｉ）（Ｘ１）がＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒである、
（ｉｉ）（Ｘ４）が４−フルオロフェニルアラニンである、
（ｉｉｉ）（Ｘ１０）がＨである、および／または
（ｉｖ）（Ｘ１３）が（Ｓ）−β３−ホモアルギニンである；
ここで（Ｘ１６）が場合により存在せず、連結分子が好ましくはＴＡＴＡである、
請求項１から８のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１０】
阻害剤がＦＸＩＩａに対して１００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）を有する、請求項１から９のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の阻害剤を、ＦＸＩＩａに接触させることを含む、ＦＸＩＩａの酵素活性を阻害するエクスビボの方法であって、ＦＸＩＩａが好ましくは、血液、血漿または血清試料中に存在する、方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
血栓症、好ましくは血栓、深部静脈血栓症、遺伝性血管浮腫および糖尿病性黄斑浮腫から選択される血栓症の、処置または予防における使用のための、請求項１から１０のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１４】
血管、チューブ、針、シリンジ、膜または医療機器を被覆するための、請求項１から１０のいずれかに記載の阻害剤の使用。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の阻害剤を含む、血液凝固を検定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の、二環式阻害剤に関する、ここで（Ｘ１）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸であり；（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ４）は脂肪族Ｌ−アミノ酸または環状Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはＬ、Ｐまたは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり；（Ｘ５）はアミノ酸であり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ７）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり；（Ｘ１１）はアミノ酸であり、好ましくはＱであり；（Ｘ１２）は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、好ましくは脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくはＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり、（Ｘ１５）は側鎖を持つアミノ酸であり；および（Ｘ１６）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸である；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも三つの官能基を有しており、各官能基は（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖の内一つと共有結合を形成している。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造者のマニュアルを含む多数の文書が引用されている。これらの文書の開示は、（本発明の特許性には関連しないと見なされるが、）その全体が参照によって本明細書に包含される。より具体的には、全ての参考文献は、個々の文書が参照によって包含されるために具体的および個別に示されるのと同じく、参照によって明細書中に包含される。
【０００３】
凝血検査は臨床検査室で日常的に行われ、患者の凝血効率を評価する。ほとんどの凝血検査において、血液凝固を強力なトリガーによって誘導し、凝血までの時間を凝血能の指標として用いる。これらの検査は診断上有用であるが、これらは患者の出血または血栓の危険性との関連を知るためには、制限された能力しかない。トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ）および較正され、自動化されたトロンボグラフィー（ＣＡＴ）などの、より新しい包括的な凝血検定は、凝血過程のより多くのパラメータを見出し、凝血能のより良い予測を約束する。全血の止血を検査するための粘弾性測定法(viscoelastometric method)である、ＴＥＧおよびＴＥＭの使用に向けて、多くの努力がなされてきた。これらは、模倣された静脈流における、凝固および続く溶解の段階の研究を可能とする。粘弾性測定法は、手術前後の出血管理のため、臨床においてすでに用いられている。ＴＥＧは病院内で分析法として用いられる。いくつかのＴＥＧおよびＣＡＴ検定において、患者の凝血能を最適に反映するため、凝血をトリガーする組織因子（ＴＦ）を低濃度で用いなければならない。しかしながらこのような検定では、ＦＸＩＩの試験管への接触は、内因性凝血経路を開始し、誤った結果となり得る。ＦＸＩＩａを２４ｎＭのＫｉで阻害し、トウモロコシの種子から単離される１３．６ｋＤａのタンパク質である、トウモロコシのトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）は、これらの効果を抑えるために従来用いられた１、２。したがって、これはＦＸＩＩａの天然の阻害剤である。しかしながら、ＣＴＩは通常使用する濃度（３０−１００μｇ／ｍＬ）では接触活性化を完全にはブロックしない。加えて最近の研究は、ＣＴＩがＦＸＩａなどの他の関連するプロテアーゼも阻害することを示した３。ＣＴＩの別の制限は高価なことである：一回の検定に通常用いる５０μｇの研究用グレードのＣＴＩは、提供者によるが５−１０ドルである。ＴＥＭは手術前後の出血管理のため、臨床において日常的に用いられる。最近、重度と軽度の出血性疾患を区別するためのＴＥＭの使用におけるコンソーシアムが創られてきた。このような分類には、低濃度のＴＦでトリガーするＥＸＴＥＭ検定（外因性経路の経由での凝血の特異的な誘導を伴うＴＥＭ）を行う必要がある。ＴＥＭおよび低濃度ＴＦ(low-TF)両方で誘導されるＴＧＡは、接触活性化の阻害剤の使用を必要とする。
【０００４】
いくつかの最近の研究は、内因性凝血が病的な凝血に関与し、治療標的として凝血因子ＦＸＩＩを特徴付けることを示唆した４−１０。ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質凝集体、ポリリン酸、およびコラーゲンなどの生理的な分子は、ＦＸＩＩを活性化し、血栓症をトリガーすることが報告された１１。ＦＸＩＩ欠損マウスは、通常の止血が生じるが、血栓形成から保護されることがわかった８。コホート研究によるデータは、血漿のＦＸＩＩレベルの上昇が、冠動脈イベントの危険性の増加と関連することを示唆した４、１２。同時に、内因性経路内の欠損は重大な病理学的な結果をもたらさない。ＦＸＩＩ欠損個体は通常の止血の能力を示す１３、１４。抗体を介してＦＸＩＩを阻害することによって、霊長類においてこの発見を確認した７。多様な起源および作用機序の様々なＦＸＩＩ阻害剤が開発されてきた。ＲＮＡアプタマーＲ４ｃＸＩＩ−１．９およびマウスｍＡｂ １５Ｈ８は、ＦＸＩＩの自己活性化を阻害する７。遺伝子組換えの吸血性昆虫タンパク質ドメインであるインフェスチン４（ｒＨＡ−インフェスチン−４；Ｋｉ＝０．３ｎＭ）１５、１６およびファージディスプレイ由来のヒト化抗体３Ｆ７は、ＦＸＩＩの活性型の直接的な阻害剤である（Ｋｉ＝１３ｎＭ）６。これら全ては、インビトロ(in vitro)での凝血検定において、凝血の内因性経路の選択的な阻害を示す。１５Ｈ８、ｒＨＡ−インフェスチン−４および３Ｆ７は、多様な血栓症モデルおよび種において、出血を伴わない、インビボ(in vivo)での血栓形成からの効率的な保護を示す４、６、７、９、１０。いくつかの小分子ＦＸＩＩａ阻害剤が開発されたが、それらは構造的に関連するトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害した１７。最近、関連するプロテアーゼに対して高い選択性（＞１００倍）を持つ合成ＦＸＩＩａ阻害剤が開発された１８。しかしながら、その効力（Ｋｉ＝１．２μＭ）では治療用化合物の生成に向けたさらなる開発はできなかった。内因性凝血のカスケードにおけるＦＸＩＩの重要な役割にもかかわらず、ナノモル濃度の範囲の結合定数を持つ合成ＦＸＩＩ阻害剤は現在存在しない。
【０００５】
したがって、現在利用可能なＦＸＩＩａの阻害剤に伴う不都合の少なくとも一つを克服する、さらなるＦＸＩＩａの阻害剤が、現在進行形で必要とされている。このような阻害剤は、診断上および治療上の応用において、とりわけ興味の対象となり、ＦＸＩＩａの阻害剤を本明細書で後述する。特に、ナノモル濃度の範囲でＦＸＩＩａの選択的な阻害を与える阻害剤が必要とされている。本発明はこの要求に応える。
【０００６】
したがって、第一態様において、本発明は、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ８）を含むまたはからなる、酵素で活性化された凝血第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）の環状阻害剤に関する、ここで（Ｘ１）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸であり；（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ４）は脂肪族Ｌ−アミノ酸または環状Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはＬ、Ｐまたは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり；（Ｘ５）はアミノ酸であり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ７）は側鎖を持つアミノ酸であり；および（Ｘ８）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸である；ここで、（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも二つの官能基を有し、各官能基は（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖の内一つと共有結合を形成している。
【０００７】
用語「含む／含んでいる(comprise/comprising)」は、含む／含んでいる(include/including)という意味で一般的に用いられ、一以上の特徴または構成要素の存在を許容することを表している。用語「含む」および「含んでいる」はまた、より制限される用語「からなる」および「からなっている」を包含する。
本明細書および特許請求の範囲において、単数形（ａ、ａｎおよびｔｈｅ）は、文中で明らかな他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【０００８】
本明細書において、「活性化された第ＸＩＩ因子」または「ＦＸＩＩａ」（ＥＣ３．４．２１．３８）は、負に帯電する表面との接触を通して（接触活性化として参照される）、内因性凝血経路を開始する、トリプシン様セリンプロテアーゼを指す。これは、ＦＸＩ、ＦＩＸ、ＦＸおよびトロンビンを含むプロテアーゼのカスケードを活性化する。トロンビンは、最終的に血餅を形成するフィブリノーゲンを活性化する。より詳細には、トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒し、フィブリンは重合し、血小板と共に血餅を形成する。外因性経路とは対照的に、障害後の血餅の形成は重要であり、内因性経路はホメオスタシスのために必要ではない。ＦＸＩＩ欠損個体は通常の止血の能力を示す９。いくつかの最近の研究は、内因性凝血が病的な凝血に関与し、したがって有害であることを示唆した３−７、１０、１１。ＦＸＩＩ欠損マウスは、通常の止血が起こっている間、血栓形成から保護されることがわかった３。抗体を媒介するＦＸＩＩの阻害は、霊長類においてこの発見を確認した４。したがって、この凝血因子を標的とする薬物は、止血を損なうことなく血栓性のイベントを防ぐ、抗血栓薬の開発を導き得る。本発明において、ＦＸＩＩａは好ましくはヒトまたはマウスＦＸＩＩａであり、最も好ましくはヒトα−ＦＸＩＩａまたはβ−ＦＸＩＩａである。
【０００９】
本明細書における用語「阻害剤」は、触媒反応において触媒の効力を弱める化合物を示す。本発明において、触媒は凝血酵素ＦＸＩＩａであり、ＦＸＩＩａに触媒される主要な反応は、第ＸＩ因子内のＡｒｇ−／−Ｉｌｅ結合を選択的に切断し、第ＸＩａ因子を形成する反応である。用語「環状阻害剤」は、阻害剤内の一以上の原子団が連結し、リングまたは環を形成していることを意味する。
【００１０】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合で結合する短鎖のアミノ酸を示す。可能な最も短いペプチドは、単一のペプチド結合で結合する二つのアミノ酸からなる。本発明の第一態様において、ペプチドは、ペプチド結合で結合する少なくとも六つのアミノ酸を含む。ペプチドは、サイズに基づいてタンパク質またはポリペプチドと区別され、一般に５０未満のアミノ酸を含む。
【００１１】
本明細書における用語「アミノ酸」は、アミン（−ＮＨ２）およびカルボン酸（−ＣＯＯＨ）の官能基で構成される有機化合物を指し、一般的に各アミノ酸に特異的な側鎖を伴う。最も単純なアミノ酸であるグリシンは側鎖を持たない（化学式Ｈ２ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）。α−炭素に結合する炭素鎖を持つアミノ酸（リジンなど）において、その炭素はα、β、γ、δなどの順番で標識される。いくつかのアミノ酸において、アミノ基は、例えばそのα−炭素、β−炭素またはγ−炭素と結合しても良く、これらはそれ故、それぞれα−アミノ酸、β−アミノ酸またはγ−アミノ酸として参照される。本発明において、全てのアミノ酸は好ましくは、一般的に一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨを持つα−アミノ酸（２−アミノ酸、またはアルファ−アミノ酸とも表される）であり、ここでＲは「側鎖」を示す有機的な置換基である。最も単純なα−アミノ酸であるアラニン（化学式：Ｈ２ＮＣＨＣＨ３ＣＯＯＨ）において、側鎖はメチル基である。さらに好ましくは、本発明において、アミノ酸はＬ−α−アミノ酸であり、ここでＬ−アミノ酸はＬ−立体異性体（または「左手型」の異性体）であることを指摘しておく。
【００１２】
上述のように、アミノ酸の側鎖は有機的な置換基であり、α−アミノ酸においてはα−炭素原子に結合する。したがって、側鎖はアミノ酸の親構造からの分枝である。アミノ酸は通常その側鎖の性質によって分類される。例えば、側鎖はアミノ酸を弱酸（例えば、アミノ酸ＤおよびＥ）または弱塩基（例えばアミノ酸ＫおよびＲ）にし、および側鎖が極性であれば親水性（例えばアミノ酸ＬおよびＩ）または側鎖が非極性であれば疎水性（例えばアミノ酸ＳおよびＣ）にする。脂肪族アミノ酸は脂肪族官能基の側鎖を持つ。脂肪族官能基はアミノ酸を非極性及び疎水性にする。脂肪族官能基は好ましくは未置換で分枝または直鎖のアルキルである。脂肪族アミノ酸の限定されない例は、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩである。環状アミノ酸においては、側鎖の一以上の原子団が結合し、リングを形成する。環状アミノ酸の限定されない例は、Ｐ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＨである。前記リングは、少なくとも二つの官能基を持つ連結分子によって形成するリングで、各官能基が（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖の内一つと共有結合を形成するリングとは別個のものでなければならないことが理解される。前者の環状アミノ酸のリングは単一のアミノ酸の側鎖の一部であるが、後者のリングは連結分子を介して二つのアミノ酸（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖間で形成される。連結分子を介して（Ｘ７）および（Ｘ１５）の間で形成されるリング（後述の好ましい実施態様において示す）もまた、二つのアミノ酸の側鎖間で形成される。芳香族アミノ酸は環状アミノ酸の好ましい形である。芳香族アミノ酸において、そのリングは芳香環である。分子の電子的な性質に関して、芳香族性は、不飽和結合、孤立電子対、または空の電子軌道が共役するリングが、単独の共役の安定化よりも強力な安定化を示す方法を説明する。芳香族性は、環状の非局在化および共鳴の発現とみなすことができる。環状アミノ酸の限定されない例は、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＨである。疎水性アミノ酸は、アミノ酸を疎水性にする非極性の側鎖を持つ。疎水性アミノ酸の限定されない例はＭ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩである。極性で、非荷電のアミノ酸は、電荷のない残基の非極性側鎖を有する。極性で、非荷電のアミノ酸の限定されない例は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、ＵおよびＹである。極性で荷電のアミノ酸は少なくとも一つの荷電残基を持つ非極性側鎖を有する。極性で荷電のアミノ酸の限定されない例は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲである。
【００１３】
本明細書における用語「連結分子」は、共有結合を介して少なくとも二つのアミノ酸の側鎖を連結でき、リングまたは環を形成する分子を指す。共有結合は原子間での電子対の共有を含む化学結合である。この目的のため、連結分子は少なくとも二つの官能基を含む。官能基は、少なくとも二つの前記アミノ酸のアミノ酸側鎖と連結分子とを連結する役割を担う、連結分子内の原子または結合の特定の基を示す。この目的のため、一般にこの官能基は、アミノ酸側鎖内の少なくとも一つの原子と化学反応を起こす。化学反応は結果として、官能基と側鎖との間の共有結合を生じる。官能基の限定されない例は、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ（フルオロまたはクロロなど）、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボン酸塩、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘテロ環、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、アミン（第一級、第二級および第三級アミンを含む）、イミン、アジド、アゾ化合物、（イソ）シアネート、硝酸塩、亜硝酸塩、スルフヒドリル、硫化物、ジスルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィン、スルホ、（イソ）チオシアナート、カルボノチオール(carbonothiol)、カルボノチオイル(carbonothioyl)、ホスフィノ（リン酸など）、ボロノ、ボロナート、ボロニアート(boroniate)およびボリノである。連結分子の少なくとも二つの官能基は同一または異なっても良く、好ましくは同一である。
【００１４】
後述の実施例からわかるように、配列番号１のペプチド（本明細書でＦＸＩＩ６１８と名付ける）を、大規模で構造的に多様な、二環式ペプチドのファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得た。ファージディスプレイによる大規模スクリーニングの試みは、既存の小分子ＦＸＩＩａ阻害剤よりも数桁強力で選択的なＦＸＩＩａ阻害剤をもたらした。より詳細には、ライブラリーから、最初にＦＸＩＩａに対する＞１０１０の異なる二環式ペプチドを単離した。さらに、ライブラリーのパンニングおよび単離したＦＸＩＩａに対する二環式ペプチドの親和性成熟の試みにより、２２ｎＭのＫｉのＦＸＩＩａの二環式ペプチド阻害剤（ＦＸＩＩ６１８）を得、エクスビボ(ex vivo)およびインビボの凝血の内因性経路の阻害によって証明されるように（後述の実施例参照）、本二環式ペプチドは効率的および選択的なＦＸＩＩａの阻害を示す。これは、中程度に選択的な小分子ＦＸＩＩａ阻害剤４４（クマリン誘導体；Ｋｉ＝４μＭ）よりも＞２００倍強力であり、非選択的な小分子ＦＸＩＩａ阻害剤ＰＣＫ（Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン；ＩＣ５０＝１８０ｎＭ）よりも約８倍強力である。さらに、本二環式ペプチドは、最近示された二環式ペプチドのＦＸＩＩａ阻害剤であり、ＦＸＩＩ６１８とはかなり異なるアミノ酸配列を持つＦＸＩＩ４０２よりも、６０倍強力で＞１０倍選択的である１５。ＦＸＩＩ６１８は、血漿および全血中の凝血の内因性経路の開始を阻害する。
【００１５】
臨床検査室における包括的な凝血検定の使用には多くの関心がある。全血または血漿の試料において低濃度の組織因子（ＴＦ）依存的なアッセイを行うことを試みる場合、凝血経路を開始する接触の抑制は重要である。上述のトロンビン生成検定（ＴＧＡ）およびトロンボエラストメトリー（ＴＥＭ）などの、診断上の凝血検査において、ＦＸＩＩ６１８は、続く試料処理の工程の間、接触で活性化した凝血を防ぐために容易に使用でき、インビトロでのアーティファクトを減らす。ＴＧＡは研究室内で使用され、診療所でもますます使用されている凝血検査である。臨床への転換に向けて主要な努力がなされ、トロンビノスコープ(thrombinoscope)装置は、数年後には（例えば、肝疾患の患者のために）研究室に一般的に導入されることが予想される。ＴＥＭおよび低濃度ＴＦで誘導されるＴＧＡは共に、接触活性化の阻害剤を必要とする。
【００１６】
トウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）は、凝血アッセイにおける現在の代表的な凝血阻害剤である。試料収集時のＣＴＩの添加は、続く試料処理の工程の間、凝血経路の接触活性化を防ぐ。シークエンス解析およびホモロジーモデリングにより、驚いたことに、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８の第一の大環状リングが、（ＣＴＩ）の結合ループ(combining loop)に構造的に類似であることが明らかになった。ここで前記ループはＦＸＩＩａに対するＣＴＩの阻害活性を媒介することを注記しておく（図３参照）。この点に関して、（結合状態における）ＣＴＩの結晶構造は先行技術から利用できなかったことを注記しておく（図４参照）。したがって、ＣＴＩがＦＸＩＩａにどのように結合しているかは完全には特徴付けられなかった。この予期しない構造上の類似を考慮して、ＦＸＩＩａの第一の大環状リングはＦＸＩＩａに対するＦＸＩＩ６１８の阻害能の大部分をもたらすと考えられ、一方ＦＸＩＩ６１８の第二の大環状リングには、ＦＸＩＩａの特異的なポケットとの相互作用は見出されなかった（図３においてＦＸＩＩａの活性部位内に第一のリングがぴったりとフィットすることも参照）。ＦＸＩＩ６１８の第一の大環状リング内のどのアミノ酸がＦＸＩＩａに対するＦＸＩＩ６１８の阻害能の大部分をもたらすのかをさらに決定するため、リング内にアミノ酸変化を導入し、その後変異した阻害剤のＫｉを決定した（図６参照）。第一の大環状リング内のジペプチドＲＬが重要であり、阻害能の大幅な減少なしには変更できないことがわかった。一方、第一の大環状リング内の他のアミノ酸は変更できることが立証された。したがって、本発明の第一態様を構成する実施態様に記述される一般的なペプチド配列は、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８の第一の大環状リングの構造に基づいている。（Ｘ３）ｎおよび（Ｘ６）ｍの位置におけるアミノ酸に関して、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８の第一のリング内のｎおよびｍは０であることを注記する。言い換えると、ＦＸＩＩ６１８にはこれらのアミノ酸は存在しない。さらなるアミノ酸を、ＦＸＩＩａに対する阻害活性をあまり制限することなく、第一のリング内に添加できると考えられるが、ＦＸＩＩ６１８のように、ｎおよびｍは０であることが最も好ましい。
【００１７】
本明細書で後述する例に示すように、ＦＸＩＩ６１８は、凝血の内因性経路の阻止において、ＣＴＩ（図４参照）よりも強力および選択的であり、より良い特異性プロファイルを持つ。加えて、ＦＸＩＩ６１８は、現在適用されている代表的なＣＴＩに対する、費用効率が高い代替物である。グラムスケールでは、ＣＴＩの生成費用は１グラムあたり約２０，０００ドルである。対照的に、１グラムの二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８は約２，０００ドルであり、したがって約１０倍安い。さらにＣＴＩはトウモロコシの種子からクロマトグラフィーで生成する必要がある。小さいペプチドであるＦＸＩＩ６１８はペプチド合成会社に有利に簡単に注文でき、市販の研究用試薬として利用可能である。それゆえ、ＦＸＩＩ６１８は、上述の診断検査における非常に魅力的なＣＴＩの代替物であり、凝血および血漿カリクレインに誘導される炎症疾患におけるＦＸＩＩ活性の対照としての有望な候補である。したがって、ＦＸＩＩ６１８は、研究および一般的な研究室の両方で広く用いられる高い将来性を有する。ＣＴＩに対するＦＸＩＩ６１８の有利な性質を考慮して、ＦＸＩＩ６１８が、いくつかの凝血検定において、ＣＴＩに取って代わることが予想される。
【００１８】
ＦＸＩＩ６１８の有利な性質を考慮して、発明の第一態様における環状阻害剤および本明細書で後述するそのあらゆる好ましい形態はまた、優先度の増加に伴って、三つ、二つおよび一つだけのアミノ酸変化により、配列番号１と異なるペプチドを含むまたはからなることが好ましい。アミノ酸変化はアミノ酸の置換、欠失または付加であってもよく、好ましい置換である。
【００１９】
本発明の第一態様の好ましい実施態様において、阻害剤は、５００ｎＭ未満、好ましくは２５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは５０ｎＭ未満および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数(inhibitory constant)（Ｋｉ）を持つ。
阻害定数（Ｋｉ）は酵素阻害の分野においてよく知られた尺度である。Ｋｉは阻害剤がいかに強力かの指標である；Ｋｉは５０％阻害を引き起こすために必要な濃度である。化合物のＩＣ５０値は実験間で変動し得るが、一方でＫｉは絶対的な値である。下記の実施例において、チェン＝プルソフ（Cheng-Prusoff）式に基づくＫｉの計算をさらに説明する。本明細書の上記で議論したように、ＦＸＩＩａに対するＦＸＩＩ６１８のＫｉは２２ｎＭであり、ＦＸＩＩａに対するＣＴＩのＫｉは２４ｎＭである。したがって、ＦＸＩＩａに対する２５ｎＭ未満の最も好ましいＫｉは、少なくともＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩと同等の阻害剤を指す。また、このＫｉ値に関して、ＦＸＩＩａは最も好ましくはヒトα−ＦＸＩＩａまたはβ−ＦＸＩＩａである。
【００２０】
本発明の第一態様のさらに好ましい実施態様において、阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
用語「阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する」は、その阻害剤が関連するプロテアーゼ、特にＦＸＩＩａ阻害剤のそれぞれの適用において阻害されないはずのプロテアーゼ（例えば、治療上の適用において、生理的に重要なプロテアーゼは実質的に阻害されない）を実質的に阻害しないことを意味する。この阻害剤は、優先度の増加に伴って、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭの高濃度において、これらのプロテアーゼを阻害しない。用語「関連するプロテアーゼ」は、トリプシンを含むまたはからなるプロテアーゼを好ましくは指し、より好ましくはトリプシン、トロンビン、プラスミン、ＦＸＩａ、ＰＫ（血漿カリクレイン）、ｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）、ｔＰＡ（組織型プラスミノーゲン活性化因子）、ＦＸａおよびＦＶＩＩａをさらに含むまたはからなるプロテアーゼを指す。下記の実施例で示すように、ＣＴＩは２０ｎＭの低い濃度において既にトリプシンの活性を有意に阻害するが、ＦＸＩＩ６１８では１０００ｎＭの高濃度において、トリプシンの阻害は観察されない（図４参照）。
【００２１】
本発明の第一態様のさらになお好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ４）は好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、ここで芳香族Ｌ−アミノ酸のアルファ−炭素は単一のＣＨ２基によって芳香環構造と結合しており、最も好ましくは、芳香族Ｌ−アミノ酸であり、ここで芳香族Ｌ−アミノ酸のアルファ−炭素は単一のＣＨ２基によって芳香環構造と結合しており、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸の環構造は他の置換基を持たない。
図６内の表からわかるように、ペプチドＦＸＩＩ６１８の３番目のアミノ酸Ｆを、このより好ましい実施態様に従って、構造的に特徴のあるアミノ酸に置換すると、ＦＸＩＩａ阻害能は概ね影響されないままであるか、または増加しさえする。
【００２２】
発明の第一態様のさらにその上好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ４）は、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、好ましくは、Ｆ、Ｗ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、さらに好ましくはＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、および最も好ましくは２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される。
【００２３】
ペプチドＦＸＩＩ６１８の３番目のアミノ酸Ｆは、アミノ酸（Ｘ４）に対応する。図６の表からわかるように、ペプチドＦＸＩＩ６１８の３番目のアミノ酸Ｆを、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニンまたは２−ニトロフェニルアラニンに置換すると、全ての場合において１００ｎＭ未満のＫｉが維持される。Ｆ、Ｗ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンへの置換において、５０ｎＭ未満のＫｉが維持される。Ｆ、Ｗ、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンへの置換は本質的に少なくともＦＸＩＩ６１８またはＣＴＩのＫｉと同等のＫｉを与える。Ｆを２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンに置換すると、全ての場合においてＫｉは１５ｎＭ未満に著しく改善さえされる。
【００２４】
本発明の第一態様のさらに好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ５）は、疎水性Ｌ−アミノ酸または極性で非荷電のＬ−アミノ酸であり、より好ましくは疎水性Ｌ−アミノ酸であり、さらにより好ましくはＳ、Ａ、ＬまたはＰであり、最も好ましくはＬまたはＰである。
ペプチドＦＸＩＩ６１８の６番目のアミノ酸Ｐはアミノ酸（Ｘ５）に対応する。図６の表からわかるように、６番目のアミノ酸Ｐを別の疎水性Ｌ−アミノ酸または極性で非荷電のＬ−アミノ酸に置換すると、阻害能はあまり減少しない。別の疎水性Ｌ−アミノ酸への置換は阻害能を概ね維持したが、一方Ｌへの置換はわずかに阻害能を改善した。例えば、ＰをＳ、ＡまたはＬに置換すると、ＦＸＩＩａに対するＫｉは、全ての場合において１００ｎＭ未満であることを図６に示す。
【００２５】
発明の第一態様の別の好ましい実施態様において、（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖は官能基を含み、好ましくは（Ｘ２）および（Ｘ７）はそれぞれ独立に、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミド、より好ましくは−ＮＨ２および−ＳＨ、ならびに最も好ましくは−ＳＨから選択される。
連結分子の少なくとも二つの官能基は同一または異なっても良く、好ましくは同一である。ペプチドＦＸＩＩ６１８において、２および７番目のアミノ酸は、アミノ酸（Ｘ２）および（Ｘ７）に対応する。アミノ酸側鎖内の官能基の正確な構造は、連結分子を介するリングの形成が可能である限り、特に重要ではないと考えられる。官能基−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミドにおいて、リング形成のために必要な化学反応が当分野で特に確立されているため、これらの官能基が好ましい。ＦＸＩＩ６１８において、２および７番目のアミノ酸が共にシステインであるように、−ＳＨが最も好ましい。
【００２６】
本発明の第一態様のより好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ２）および（Ｘ７）はそれぞれ独立に、Ｋ、オルニチン、チアリジン、２，３−ジアミノプロパン酸、ジアミノ酪酸、Ｄ、Ｅ、Ｃ、ホモシステイン、ペニシラミンおよびプロパルギルグリシンであり、好ましくはＣまたはホモシステインであり、最も好ましくは共にＣである。
二つのアミノ酸（Ｘ２）および（Ｘ７）は同一または異なっても良く、好ましくは同一である。このより好ましい実施態様に記載されたアミノ酸は、その側鎖に−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミドから選択される官能基を持つ。ＦＸＩＩ６１８において、２および７番目のアミノ酸は共にシステインであるように、システインが最も好ましい。
【００２７】
本発明の第一態様のさらになお好ましい実施態様において、（Ｘ２）は、５−メルカプトノルバリン、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはホモシステインまたはＣであり、最も好ましくはＣである；および／または、（Ｘ７）はホモシステインまたはＣであり、好ましくはＣである。
上述のように、ＦＸＩＩ６１８における２および７番目のアミノ酸は共にＣである。図６から明らかなように、２および／または７番目のアミノ酸におけるＣを、ＦＸＩＩａに対する阻害能をあまり減少させずに、別のアミノ酸に置換できる。例えば、（Ｘ２）のＣを５−メルカプトノルバリンまたはホモシステインに置換しても、ＦＸＩＩａに対するＫｉは未だ１００ｎＭ未満である。（Ｘ７）のＣをホモシステインに置換しても、ＦＸＩＩａに対するＫｉは未だ５０ｎＭ未満である。
【００２８】
本発明の第一態様の別の好ましい実施態様において、（Ｘ１）および（Ｘ８）は存在し、それぞれ独立に脂肪族Ｌ−アミノ酸または極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；好ましくは、アミン基を持つ極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；より好ましくは（Ｘ１）および（Ｘ８）は、それぞれ独立に、リジン、ホモリジン、アルギニン、ホモアルギニンから選択され、最も好ましくは共にアルギニンである。
アミノ酸（Ｘ１）および（Ｘ８）は同一でも異なっても良く、好ましくは同一である。ペプチドＦＸＩＩ６１８において、１および８番目のアミノ酸はアミノ酸（Ｘ１）および（Ｘ８）に対応する。（Ｘ１）および（Ｘ８）の位置のアミノ酸の正確な性質は特に重要でない。ペプチドＦＸＩＩ６１８において１および８番目のアミノ酸はＲであるため、上記好ましい実施態様において、（Ｘ１）および（Ｘ８）における好ましいアミノ酸は、Ｒに構造的に類似のアミノ酸および好ましくはＲである。
【００２９】
本発明の第一態様のさらに好ましい実施態様において、（Ｘ１）は、Ｄ−Ａｒｇ、ホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＬ−Ａｒｇであり、好ましくはホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＬ−Ａｒｇであり、最も好ましくはホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＲであり；および／または（Ｘ８）はＧ、ＨまたはＲであり、好ましくはＨまたはＲである。
上述のように、ＦＸＩＩ６１８において１および８番目のアミノ酸は共にＲである。図６から明らかなように、１および／または８番目のアミノ酸において、Ｒを、ＦＸＩＩａに対する阻害能をあまり減少させることなく、別のアミノ酸に置換できる。例えば、（Ｘ１）のＲをホモリジンまたはＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒに置換しても、ＦＸＩＩａに対するＫｉはＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉと少なくとも同等である。また、（Ｘ８）のＲをＨに置換しても、ＦＸＩＩａに対するＫｉはＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉと少なくとも同等である。
【００３０】
本発明の第一態様のさらにその上好ましい実施態様において、連結分子を、図７に示す三価および二価のリンカーから選択し、最も好ましくは１，３−ジアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＤＡＴＡ）、１，３−ジアクリロイル−１，３−ジアジナン（ＤＡＤＡ）、または１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である。
ペプチドＦＸＩＩ６１８において、連結分子はＴＡＴＡである。上記の好ましい実施態様はＦＸＩＩ６１８の第一のリングのみを含むため、ＴＡＴＡをＤＡＴＡまたはＤＡＤＡに置換できることは明らかである。二つの官能基は、リングを形成するためにアミノ酸（Ｘ２）および（Ｘ７）を連結するのに十分である。連結分子の正確な性質は特に重要ではないと考えられる。これは、環構造自身がＦＸＩＩａとの相互作用を形成するのではなく、環構造がペプチド内のアミノ酸を３Ｄ構造にするためであり、ここでペプチドはＦＸＩＩａと理想的に相互作用でき、前記相互作用はＦＸＩＩａの阻害をもたらす。したがって、アミノ酸を、ＴＡＴＡによって誘導される３Ｄ構造に少なくとも類似の３Ｄ構造にするあらゆるリンカーは、本発明に適した連結分子であると予期される。
【００３１】
本発明の第一態様のさらに好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ８）は存在せず、阻害剤はペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含む、またはからなる二環式阻害剤である、ここで（Ｘ１）から（Ｘ７）、ｎおよびｍは上記で定義されたものであり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり；（Ｘ１１）はアミノ酸であり、好ましくはＱであり；（Ｘ１２）は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、好ましくは脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくはＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり、（Ｘ１５）は側鎖を持つアミノ酸であり；および（Ｘ１６）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸である；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも三つの官能基を有し、各官能基は（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖の内一つと共有結合を形成している。
【００３２】
したがって、本発明は、第二態様において、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含み、またはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の二環式阻害剤に関する、ここで（Ｘ１）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸であり；（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ４）は脂肪族Ｌ−アミノ酸または環状Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはＬ、Ｐまたは芳香族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくは芳香族Ｌ−アミノ酸であり；（Ｘ５）はアミノ酸であり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ７）は側鎖を持つアミノ酸であり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり；（Ｘ１１）はアミノ酸であり、好ましくはＱであり；（Ｘ１２）は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、好ましくは脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、最も好ましくはＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０ないし３であり、好ましくは０または１であり、最も好ましくは０であり、（Ｘ１５）は側鎖を持つアミノ酸であり；および（Ｘ１６）は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはアミノ酸である；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも三つの官能基を有して、各官能基は（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖の内一つと共有結合を形成している。
【００３３】
本発明の第一態様に関連して、上記で説明する定義および好ましい実施態様を、適用可能なように、本発明の二環式阻害剤に同様に適用する。例えば、二環式阻害剤はまた、５００ｎＭ未満、好ましくは２５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは５０ｎＭ未満および最も好ましくは２５ｎＭ未満の、ＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有しても良い。同様に、この阻害剤は好ましくはＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
【００３４】
上述のように、ペプチドＦＸＩＩ６１８（配列番号１）はＦＸＩＩａの二環式阻害剤である。上記の本発明の第一態様の好ましい実施態様において説明される一般的なペプチド配列、および本発明の第二態様で説明されるペプチド配列は、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８の両方の大環状リングの構造に基づく。一般的なペプチド配列において、第一のリングは（Ｘ２）および（Ｘ７）の間で形成し、一方第二の環は（Ｘ７）および（Ｘ１５）の間で形成する。
【００３５】
（Ｘ３）ｎ、（Ｘ６）ｍ、（Ｘ９）ｌおよび（Ｘ１４）ｋの位置のアミノ酸に関して、ｎ、ｍ、ｌおよびｋは、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８のリングにおいて全て０であることを指摘しておく。言い換えると、これらのアミノ酸はＦＸＩＩ６１８に存在しない。さらなるアミノ酸を、ＦＸＩＩａに対する阻害活性をあまり制限することなく、第一のリング内に追加できると考えられるが、ＦＸＩＩ６１８のように、ｎ、ｍ、ｌおよびｋは全て０であることが最も好ましい。
【００３６】
下記の実施例で示すように、第二の環はおそらく、ＦＸＩＩａと特異的な相互作用を全く形成しない。このことから、上記の好ましい実施態様の最も広い意味において、第二の環におけるアミノ酸は固定されていない。ＦＸＩＩ６１８の９および１０番目のアミノ酸は、上記の好ましい実施態様の一般的なペプチド配列の（Ｘ１１）および（Ｘ１２）に対応する。図６に示すＧｌｎ９およびＬｅｕ１０のアミノ酸変化から明らかなように、一定の優先度が（Ｘ１１）および（Ｘ１２）の位置に対応する一定のアミノ酸に与えられ得る。このことから、（Ｘ１１）は好ましくはＱであり、（Ｘ１２）は脂肪族Ｌ−アミノ酸であり、好ましくはホモロイシン、ノルロイシン、３−エチルノルバリン、３−ターシャリー−ブチルアラニンまたはＬであり、より好ましくは３−ターシャリー−ブチルアラニンまたはＬであり、最も好ましくはＬである。第二の環におけるこれらのアミノ酸はおそらく、ペプチドＦＸＩＩ６１８がＦＸＩＩａの阻害に理想的な３Ｄ構造をとるのに貢献する。
【００３７】
本発明の第二態様の好ましい実施態様において、（Ｘ４）は、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、好ましくは、Ｆ、Ｗ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、さらに好ましくはＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群、および最も好ましくは２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、および２−ニトロフェニルアラニンからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の第二態様のさらに好ましい実施態様において、（Ｘ５）は、疎水性Ｌ−アミノ酸または極性で非荷電のＬ−アミノ酸であり、好ましくは疎水性Ｌ−アミノ酸であり、より好ましくはＳ、Ａ、ＬまたはＰであり、最も好ましくはＬまたはＰである。
本発明の第一態様のより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は官能基を含み、好ましくは（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）それぞれは、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミド、好ましくは−ＮＨ２および−ＳＨ、ならびに最も好ましくは−ＳＨから独立に選択される。
【００３９】
連結分子の少なくとも３つの官能基は同一または異なっても良く、好ましくは同一である。ペプチドＦＸＩＩ６１８において、２、７および１２番目のアミノ酸は、アミノ酸（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）に対応する。アミノ酸側鎖内の官能基の正確な構造は、連結分子を介するリングの形成が可能である限り、特に重要ではないと考えられる。官能基−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミドにおいて特に、必要とされる化学反応が当分野で確立されているため、これらの官能基が好ましい。ＦＸＩＩ６１８において、２、７および１２番目のアミノ酸が全て共にシステインであるように、−ＳＨが最も好ましい。
【００４０】
本発明の第一態様の別のより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）はそれぞれ独立に、Ｋ、オルニチン、チアリジン、２，３−ジアミノプロパン酸、ジアミノ酪酸、Ｄ、Ｅ、Ｃ、ホモシステイン、ペニシラミンおよびプロパルギルグリシンであり、好ましくはＣまたはホモシステインであり、最も好ましくは全てＣである。
【００４１】
３つのアミノ酸（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）は同一または異なっても良く、好ましくは同一である。このより好ましい実施態様に記載されたアミノ酸は、その側鎖に−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミドから選択される一つの官能基を持つ。ＦＸＩＩ６１８において、２、７および１２番目のアミノ酸が全てシステインであるように、アミノ酸（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）においては、システインが最も好ましい。
【００４２】
本発明の第一態様の別のより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、（Ｘ２）は、５−メルカプトノルバリン、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはホモシステインまたはＣであり、最も好ましくはＣであり；および／または、（Ｘ７）はホモシステインまたはＣであり、好ましくはＣであり；および／または（Ｘ１５）は、５−メルカプトノルバリン、ホモシステインまたはＣであり、好ましくはホモシステインまたはＣである。
【００４３】
ＦＸＩＩ６１８の２、７および１２番目のアミノ酸は全てＣである。上記のより好ましい実施態様における（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）は、それぞれＦＸＩＩ６１８の２、７、１２番目のアミノ酸に対応する。図６からさらに明らかなように、２、７および／または１５番目のアミノ酸におけるＣを、ＦＸＩＩａに対する阻害能をあまり減少させずに、別のアミノ酸に置換できる。例えば、（Ｘ１５）のＣをホモシステインに置換すると、ＦＸＩＩａに対するＫｉは１６ｎＭであり、したがってＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉよりもさらに良い。
【００４４】
本発明の第一態様のさらに好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ１）および（Ｘ１６）は存在し、それぞれ独立に、脂肪族Ｌ−アミノ酸または極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；好ましくは、アミン基を持つ極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；より好ましくは（Ｘ１）および（Ｘ１６）は、それぞれ独立に、リジン、ホモリジン、アルギニン、ホモアルギニンから選択され、最も好ましくは共にアルギニンである。
【００４５】
本発明の第一態様のより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、アミノ酸（Ｘ１０）および（Ｘ１３）は、それぞれ独立に、脂肪族Ｌ−アミノ酸または極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；好ましくは、アミン基を持つ極性で塩基性のＬ−アミノ酸であり；より好ましくは（Ｘ１０）および（Ｘ１３）は、それぞれ独立に、リジン、ホモリジン、アルギニン、ホモアルギニンから選択され、最も好ましくは共にアルギニンである。
【００４６】
ペプチドＦＸＩＩ６１８において、８および１１番目のアミノ酸は、アミノ酸（Ｘ１０）および（Ｘ１３）に対応する。（Ｘ１０）および（Ｘ１３）の位置のアミノ酸はＦＸＩＩａと相互作用しないため、それらの正確な性質は特に重要でない。ペプチドＦＸＩＩ６１８において、８および１１番目のアミノ酸はＲであるため、上記好ましい実施態様において、（Ｘ１０）および（Ｘ１３）における好ましいアミノ酸は、Ｒに構造的に類似のアミノ酸である。
【００４７】
本発明の第一態様のさらにより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、（Ｘ１）は、Ｄ−Ａｒｇ、ホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒもしくはＬ−Ａｒｇであり、好ましくはホモアルギニン、Ｌ、ノルアルギニン、４−グアニジノフェニルアラニン、ホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒもしくはＬ−Ａｒｇであり、最も好ましくはホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒもしくはＬ−Ａｒｇであり；および／または（Ｘ１０）はＧ、ＨもしくはＲであり、好ましくはＨもしくはＲであり；（Ｘ１３）は、Ａ、Ｇ、（Ｓ）−β３−ホモアルギニンもしくはＲであり、好ましくは（Ｓ）−β３−ホモアルギニンもしくはＲであり、および／または、（Ｘ１６）はＲもしくは存在しない。
【００４８】
ＦＸＩＩ６１８の１、８、１１および１３番目のアミノ酸は全てＲである。ＦＸＩＩ６１８の１、８、１１および１３番目のアミノ酸は、上記のより好ましい実施態様における（Ｘ１）、（Ｘ１０）、（Ｘ１３）および（Ｘ１６）にそれぞれ対応する。図６から明らかなように、１、８、１１および１３番目のアミノ酸の１以上におけるＲを、ＦＸＩＩａに対する阻害能をあまり減少させることなく、別のアミノ酸に置換できる。例えば、（Ｘ１３）のＲを（Ｓ）−β３−ホモアルギニンに置換すると、ＦＸＩＩａに対するＫｉは、ＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉと比較して、さらに改善する。また、（Ｘ１６）の位置のＲが存在しない（すなわち、ＲをＦＸＩＩ６１８から削除する）場合、ＦＸＩＩａに対するＫｉはＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉと基本的に同等である。
【００４９】
本発明の第二態様の好ましい実施態様と同様に、阻害剤が二環式阻害剤である、本発明の第一態様の別のより好ましい実施態様において、連結分子は、１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）、１，３，５−トリス（クロロアセチル）−１，３，５−トリアジナン（ＴＣＡＴ）、１，３，５−トリス（ブロモアセチル）−１，３，５−トリアジナン（ＴＢＡＴ）、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）および２，４，６−トリス（ブロモメチル）−１，３，５−トリアジン（ＴＢＭＴ）から選択され、好ましくは１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である。
【００５０】
第一態様のこのより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様に従って、全ての連結分子は、上述の二環式阻害剤の二つの環を形成できるように、３つの官能基を有する。言及されるように、二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８において、連結分子はＴＡＴＡである。このことから、ＴＡＴＡが最も好ましい。好ましい実施態様に列挙されるその他のリンカーは、ＴＡＴＡに構造的に似ており、したがってＴＡＴＡの適切な代替物の限定されない例である。これは、ＴＢＡＴおよびＴＢＭＴのための下記の実施例において、典型的に示される。ＦＸＩＩ６１８において、ＴＡＴＡをＴＢＡＴまたはＴＢＭＴに置換しても、ＦＸＩＩａに対する特異的な阻害能は維持された。
【００５１】
本発明の第一態様の別のより好ましい実施態様および本発明の第二態様の好ましい実施態様において、下記の項目（ｉ）から（ｉｖ）の少なくとも一つを満たす：（ｉ）（Ｘ１）はＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒである、（ｉｉ）（Ｘ４）は４−フルオロフェニルアラニンである、（ｉｉｉ）（Ｘ１０）はＨである、および／または（ｉｖ）（Ｘ１３）は（Ｓ）−β３−ホモアルギニンである；ここで（Ｘ１６）は場合により存在せず、連結分子は好ましくはＴＡＴＡである。
用語「少なくとも一つ」は、少なくとも二つ、少なくとも三つ、および四つ全てと、増加するにつれて好ましくなることを意味する。
【００５２】
下記の実施例において示され、上述されるように、ＦＸＩＩ６１８のアミノ酸配列におけるアミノ酸（４および５番目のアミノ酸におけるそれぞれＲおよびＬ以外）を置換することは、ＦＸＩＩ６１８のＦＸＩＩａに対するＫｉよりもさらに良いＦＸＩＩａに対するＫｉを有するＦＸＩＩ６１８の誘導体を一般的にもたらす。実施例は、（Ｘ１）におけるＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒ、（Ｘ４）における４−フルオロフェニルアラニン、（Ｘ１０）におけるＨ、および（Ｘ１３）における（Ｓ）−β３−ホモアルギニンへのアミノ酸置換であり、（Ｘ１）、（Ｘ４）、（Ｘ１０）および（Ｘ１３）の位置はそれぞれ、ＦＸＩＩ６１８の１、４、８および１１番目のアミノ酸に対応することを注記しておく。
【００５３】
特に、（Ｘ１）におけるＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒ、（Ｘ４）における４−フルオロフェニルアラニン、（Ｘ１０）におけるＨ、および（Ｘ１３）における（Ｓ）−β３−ホモアルギニンは、ＦＸＩＩ６１８における二以上の有利なアミノ酸置換の組合せの効果を説明するための、さらなる研究を行ったため、これらのアミノ酸置換は特に好ましい。任意の３つまたは４つ全てのアミノ酸置換をＦＸＩＩ６１８のアミノ酸配列に導入すると、各アミノ酸置換の有利な効果が合計され、これらのアミノ酸置換の一つのみを伴うＦＸＩＩ６１８誘導体よりも著しく強力なＦＸＩＩ６１８誘導体をもたらすことが下記の実施例において示される。任意の３つまたは４つ全てのアミノ酸置換をＦＸＩＩ６１８のアミノ酸配列に導入すると、得られるＦＸＩＩ６１８誘導体は、１ｎＭまたはさらにそれよりもさらに低いｐＭの範囲の、ＦＸＩＩａに対するＫｉを有する（実施例５．３の表参照）。
【００５４】
実施例５．３の表に示されるＦＸＩＩ６１８の誘導体は、本明細書で記述される最も効果的なＦＸＩＩａに対する阻害剤であり、したがって本発明の第一態様および第二態様の最も好ましい阻害剤である。これらの最も好ましい阻害剤は、ｒｓＣＦ４ＦＲＬＰＣＨＱＬＲｂＣＲ、ｒｓＣＦ４ＦＲＬＰＣＨＱＬＲＣＲ、ｒｓＣＦ４ＦＲＬＰＣＲＱＬＲｂＣＲ、ｒｓＣＦＲＬＰＣＨＱＬＲｂＣＲおよびｒｓＣＦ４ＦＲＬＰＣＨＱＬＲｂＣであり、ここで、ｒｓはＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒであり；Ｆ４Ｆは４−フルオロフェニルアラニンであり、Ｒｂは（Ｓ）−β３−ホモアルギニンである。
【００５５】
これらの組合せの実験との関連で、ＦＸＩＩ６１８誘導体の最後のアミノ酸におけるＲはなくてもよいことがさらにわかり、この不必要なアミノ酸は（Ｘ１６）に対応することを注記しておく。本明細書で開示されるほとんどのＦＸＩＩ６１８誘導体において、組合せのＦＸＩＩ６１８誘導体における連結分子はＦＸＩＩ６１８と同様にＴＡＴＡである。
【００５６】
要約すると、実施例５．３に例示される組合せのＦＸＩＩ６１８誘導体に基づいて、ＦＸＩＩ６１８の阻害能をさらに改善するために本発明に関連して見出されたアミノ酸変化は、組み合わせることができ、組み合わせによって、個々のアミノ酸変化における改善を超える改善を一般的にもたらすことが示される。
【００５７】
本発明の第一態様および第二態様を明示する実施態様ならびに上記の第一態様および第二態様の好ましい、およびより好ましい実施態様における好ましい選択肢（阻害剤のリングにおける各可変のアミノ酸の位置、存在するなら、阻害剤の第二の環における各可変のアミノ酸の位置、および連結分子における選択肢）は、構造を決め、その構造は、好ましくなるにつれて、ＦＸＩＩ６１８および、ＦＸＩＩ６１８の阻害能を保持もしくは基本的に保持し、または改善さえする、図６におけるその誘導体の構造にますます似てくる。したがって、当業者は、各可変のアミノ酸の位置におけるますます好ましいアミノ酸のあらゆる組合せおよび場合によっては、連結分子の好ましい構造を包含する実施態様は、本発明の一部を形成することをすぐに理解する。
【００５８】
そのような実施態様の限定されない例は、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ８）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の環状阻害剤であり、ここで（Ｘ１）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；（Ｘ２）はＣであり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０であり；（Ｘ４）はＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニンおよび３−ベンゾチエニルアラニンであり、ならびに好ましくは２−ナフチルアラニンであり；（Ｘ５）はＬまたはＰであり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０であり；（Ｘ７）はＣであり；および（Ｘ８）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；ここで、（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は１，３−ジアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＤＡＴＡ）、１，３−ジアクリロイル−１，３−ジアジナン（ＤＡＤＡ）および１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）から選択される。また、この実施態様に関連して、この阻害剤は好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有しており、および／またはこの阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
【００５９】
そのような実施態様のさらなる限定されない例は、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ８）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の環状阻害剤であり、ここで（Ｘ１）はアミノ酸であり、好ましくはＤ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ａｒｇであり；（Ｘ２）はＣであり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０であり；（Ｘ４）はＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニンおよび３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンであり；好ましくは、２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンであり、（Ｘ５）はＬまたはＰであり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０であり；（Ｘ７）はＣであり；および（Ｘ８）はアミノ酸であり、好ましくはＨまたはＲであり；ここで、（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は１，３−ジアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＤＡＴＡ）、１，３−ジアクリロイル−１，３−ジアジナン（ＤＡＤＡ）および１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）から選択される。また、この実施態様に関連して、この阻害剤は好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有しており、および／またはこの阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
【００６０】
そのような実施態様のさらになお限定されない例は、第二の環も存在する、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の二環式阻害剤であり、ここで（Ｘ１）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；（Ｘ２）はＣであり；（Ｘ３）は０であり；（Ｘ４）はＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニンおよび３−ベンゾチエニルアラニンであり、ならびに好ましくは２−ナフチルアラニンであり；（Ｘ５）はＬまたはＰであり；（Ｘ６）は０であり；（Ｘ７）はＣであり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；（Ｘ１１）はＱであり；（Ｘ１２）はＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０であり、（Ｘ１５）はＣであり；および（Ｘ１６）はアミノ酸であり、好ましくはＲであり；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である。同様に、この実施態様に関連して、この阻害剤は好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有しており、および／またはこの阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
【００６１】
そのような実施態様のさらにその上限定されない例は、第二の環も存在する、ペプチド（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）ｎ（Ｘ４）ＲＬ（Ｘ５）（Ｘ６）ｍ（Ｘ７）（Ｘ９）ｌ（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）（Ｘ１３）（Ｘ１４）ｋ（Ｘ１５）（Ｘ１６）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の二環式阻害剤であり、ここで（Ｘ１）はアミノ酸であり、好ましくはホモリジン、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ａｒｇであり；（Ｘ２）はＣであり；（Ｘ３）はアミノ酸であり、ｎは０であり；（Ｘ４）はＦ、Ｗ、２−ナフチルアラニンおよび３−ベンゾチエニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンであり；好ましくは、２−ナフチルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、２−アミノ−３−（ピリジン−３−イル）プロピオン酸、２−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、または２−ニトロフェニルアラニンであり、（Ｘ５）はＬまたはＰであり；（Ｘ６）はアミノ酸であり、ｍは０であり；（Ｘ７）はＣであり；（Ｘ９）はアミノ酸であり、ｌは０であり；（Ｘ１０）はアミノ酸であり、好ましくはＨまたはＲであり；（Ｘ１１）はＱであり；（Ｘ１２）はＬであり；（Ｘ１３）はアミノ酸であり、好ましくは（Ｓ）−β−ホモアルギニンまたはＲであり；（Ｘ１４）はアミノ酸であり、ｋは０であり、（Ｘ１５）はホモシステインまたはＣであり；および（Ｘ１６）はアミノ酸であり、好ましくは存在しない、またはＲであり；ここで、（Ｘ２）、（Ｘ７）および（Ｘ１５）の側鎖は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である。同様に、この実施態様に関連して、この阻害剤は好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有しており、および／またはこの阻害剤はＦＸＩＩａを特異的に阻害する。
【００６２】
本発明はさらに、ペプチド（Ｘ１）ＲＬ（Ｘ２）を含むまたはからなる、酵素で活性化された第ＸＩＩ凝固因子（ＦＸＩＩａ）の環状阻害剤に関し、ここで（Ｘ１）および（Ｘ２）はアミノ酸であり、好ましくはアルファ−アミノ酸であり、最も好ましくはそれぞれＦおよびＰであり、ペプチド結合によって連結しており；または（Ｘ１）および（Ｘ２）は側鎖を持つアミノ酸であり、（Ｘ１）および（Ｘ２）は連結分子を介して連結しており、前記連結分子は少なくとも二つの官能基を有し、各官能基は（Ｘ２）および（Ｘ７）の側鎖の一つと共有結合を形成する。
【００６３】
本発明の第一態様および／または第二態様に関連して、上記で説明する定義および好ましい実施態様を、適用可能なように、本発明のさらなる環状阻害剤に同様に適用する。また、この阻害剤は、５００ｎＭ未満、好ましくは２５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは５０ｎＭ未満、および最も好ましくは２５ｎＭ未満のＦＸＩＩａに対する阻害定数（Ｋｉ）を有し得る。同様に、この阻害剤は、好ましくはＦＸＩＩａを特異的に阻害する。ＦＸＩＩａの酵素活性を阻害するエクスビボの方法は、本発明の阻害剤をＦＸＩＩａと接触させることを含み、ここでＦＸＩＩａは好ましくは血液、血漿または血清試料中に存在する。（Ｘ１）および（Ｘ２）が側鎖を持つアミノ酸である場合、側鎖は官能基を含むことが好ましく、好ましくは、（Ｘ１）および（Ｘ２）は、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、アルケン、アルキン、アジドおよびクロロアセトアミド、好ましくは−ＮＨ２および−ＳＨ、ならびに最も好ましくは−ＳＨ、からそれぞれ独立に選択される。さらに、（Ｘ１）および（Ｘ２）が側鎖を持つアミノ酸である場合、アミノ酸（Ｘ１）および（Ｘ２）は、それぞれ独立に、Ｋ、オルニチン、チアリジン、２，３−ジアミノプロパン酸、ジアミノ酪酸、Ｄ、Ｅ、Ｃ、ホモシステイン、ペニシラミンまたはプロパルギルグリシンであり、好ましくはＣまたはホモシステインであり、最も好ましくは共にＣであることが好ましい。連結分子は、図７に示される三価および二価のリンカーから選択され得り、好ましくは１，３−ジアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＤＡＴＡ）、１，３−ジアクリロイル−１，３−ジアジナン（ＤＡＤＡ）および１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である。
【００６４】
本発明はさらに、少なくとも一つの大環状リングを含むことを特徴とする、凝血酵素ＦＸＩＩａの阻害剤に関する。通常、前記大環状リングは、ｉ）少なくとも１２原子および４２原子以下のリングサイズを有し、ｉｉ）二つの隣接するアミノ酸Ｘ１Ｘ２を含み、両アミノ酸はＬ体の立体配置であり、ペプチド結合によって連結しており、ここで１番目のアミノ酸Ｘ１は正電荷を含み、少なくとも四つの原子結合のアルファ−炭素原子から離れており、ここで前記阻害剤は、５００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）で凝血酵素ＦＸＩＩａと結合する。
【００６５】
好ましくは、アミノ酸Ｘ１は、その側鎖において、グアニジン、アミジン、ベンザミジンまたはアミノ基を含むアミノ酸の群から選択される。アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２は通常、各側にアミノ酸が隣接し、４つのアミノ酸がペプチド結合で連結する。大環状リングは、化学的なリンカーまたはジスルフィド架橋を介して連結する少なくとも２つのシステインを含むペプチドに基づく。
【００６６】
また好ましくは、前記阻害剤は４００ｎＭ未満、より好ましくは２００ｎＭ未満、さらにより好ましくは１００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）で、凝血酵素ＦＸＩＩａに結合する。あるいは、本発明の阻害剤は、側鎖を介して化学的なリンカーと連結する少なくとも３つのシステインを含むペプチドによって形成する、二つの大環状リングを含む。好ましくは、ペプチドは以下の配列を有し（配列番号１）：Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、化学的なリンカーは試薬１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）である、または、に基づく。
【００６７】
本発明の別の目的は、アミノ酸配列Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８（配列番号２）から基本的になる、凝血酵素ＦＸＩＩａの二環式ペプチド阻害剤に関し、ここで少なくとも３つのアミノ酸は以下に示されるものであり、または以下からなる群から独立に選択される：Ｘａａ２＝Ｔｒｐ；Ｘａａ３＝Ｇｌｙ；Ｘａａ４＝Ａｌａ；Ｘａａ５＝Ｌｅｕ；Ｘａａ６＝Ａｓｎ；Ｘａａ７＝Ｖａｌ、およびここで前記二環式ペプチド阻害剤は１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナンによって環化している。
【００６８】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸配列Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｃｙｓ−Ｘａａ８（配列番号３）から基本的になる、凝血酵素ＦＸＩＩａの二環式ペプチド阻害剤を提供することであり、ここでこのアミノ酸の少なくとも二つは以下に示すものである：Ｘａａ２＝Ｔｙｒ；Ｘａａ３＝Ｌｅｕ；Ｘａａ４＝Ａｒｇ、およびここで前記二環式ペプチド阻害剤は１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナンによって環化している。
【００６９】
さらに別の目的は、アミノ酸配列Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１４（配列番号４）から基本的になる、凝血酵素ＦＸＩＩａの二環式ペプチド阻害剤を提供することであり、ここでこのアミノ酸の少なくとも二つは以下に示すものである：Ｘａａ２＝Ｔｒｐ；Ｘａａ３＝Ｇｌｙ；Ｘａａ４＝Ａｌａ；Ｘａａ５＝Ａｌａ、およびここで前記二環式ペプチド阻害剤は１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナンによって環化している。
【００７０】
本発明はまた、配列番号１および５から８９（図９参照）のアミノ酸配列、ならびに前記アミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列からなる群から選択される、凝血酵素ＦＸＩＩａの阻害剤に関する。配列番号１および５から８９において、配列番号１が最も好ましい。
【００７１】
本発明は、同様に、配列番号１および５から８９のアミノ酸配列からなる群から選択される、凝血酵素ＦＸＩＩａの阻害剤に関し、ここで一個から数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加している。この点に関して、用語一個から数個は、好ましくなるにつれて、３個以下、２個、または１個のみのアミノ酸が欠失、置換、または付加していることを意味する。
【００７２】
また、本発明の阻害剤は、側鎖を介して化学的なリンカーと連結する少なくとも三つのシステインを含むペプチドによって形成する、二つの大環状リングを含んでもよい。好ましくは、ペプチドは以下の配列を有し（配列番号１）：Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、化学的なリンカーは試薬１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）に基づく。
【００７３】
本発明はさらに、抗体のＦｃドメイン、アルブミンバインダー、ＩｇＧバインダーまたは抗体と融合する、本発明の阻害剤を含む融合タンパク質に関する。
本明細書における用語「融合タンパク質」は、別々の（ポリ）ペプチドをコードする二以上の核酸分子を接合することによって生成する（ポリ）ペプチド構成物に関する一般的な用語に包含される。言い換えると、この融合核酸分子の翻訳は、それぞれの元の（ポリ）ペプチド由来の機能特性を有する単一の（ポリ）ペプチドをもたらす。（ポリ）ペプチドは直接融合するか、またはリンカー（すなわち、短いペプチド配列）を介して融合するかのいずれでも良い。一般的に、融合タンパク質は、当業者によく知られる組換えＤＮＡ技術によって人工的に生成される。しかしながら、本発明の融合タンパク質は、単純な有機合成戦略、固相支持の合成技術などの多くの従来、よく知られた技術のいずれか、または市販の自動化された合成装置によって調製できる。融合タンパク質を生物学的研究または治療学に用いてもよい。
【００７４】
好ましくは、Ｆｃドメインは、本発明の阻害剤のインビボでの半減期を延長することを可能にする、一以上のヒト機能性Ｆｃドメインである。本発明の阻害剤は、一以上の機能性ＦｃドメインのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかと融合してもよく、または一以上のＦｃドメインのＮ末端およびＣ末端の両方と融合してもよい。本発明の融合タンパク質は、一以上、好ましくは一つのＦｃドメインのＮ末端など、少なくとも片側と融合する本発明の阻害剤の四量体、三量体または二量体などの、多量体を含んでもよい。アルブミンバインダーおよびＩｇＧバインダーの実施例は、Gebauer and Skerra (2009), 13:245-255に記述される。したがって、アルブミンバインダーおよびＩｇＧバインダーの好ましい実施例は、ヒトの単一Ｉｇドメイン（二重(dubbled)のアルブミン Ｄａｂ）、ナノボディ、レンサ球菌のプロテインＧ由来の、天然に生じるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、およびＩｇＧに結合するドメインである。また例えば、そのような融合タンパク質は、特にインビボまたはエクスビボでの血液中において、本発明の阻害剤の半減期を改善する。
【００７５】
本発明はさらに、薬剤的に活性の化合物、診断上活性の化合物および／または血清の半減期を調節する構成要素と融合する、本発明の阻害剤を含む融合構成物に関する。
【００７６】
本明細書における「融合構成物」を、本発明の阻害剤と化合物との融合物と定義し、ここでこの化合物は、薬剤的に活性の化合物、診断上活性の化合物および／または血清の半減期を調節する構成要素からなる群から選択される。この化合物は、タンパク質性の化合物または非タンパク質性の化合物のいずれかであってよい。この化合物がタンパク質性の化合物（例えば、後述されるような抗体）である場合、融合構成物はまた、上記で定義される融合タンパク質である。言い換えると、用語「融合構成物」は融合タンパク質を含む。この化合物は本発明の阻害剤と直接融合するか、リンカーを介して融合するかのいずれかであってよい。本発明におけるリンカーは、好ましくは、１から３０個の炭素原子を含むアルキル、１から２０個のエチレン部分を持つポリエチレングリコール、１から２０残基を含むポリアラニン、１から２０残基を含むポリグリシン、１から２０残基を含むＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、カプロン酸、置換された、または未置換のポリパラフェニレンおよびトリアゾールからなる群から選択される。
【００７７】
さらなる好ましい実施態様において、前記リンカーは、アミノ−ｎ−アルキル、メルカプト−ｎ−アルキル、アミノ−ｎ−アルキル−Ｘ−アルキル、メルカプト−ｎ−アルキル−Ｘ−アルキル、ここでＸは、Ｏ、Ｓ−ＳおよびＳＯ２からなる群から選択され、アルキル基は互いに独立に１から３０個、好ましくは３、６または１２個の炭素原子を有し；またオリゴエチレングリコールは、１から約１０まで、好ましくは３つまたは４つのエチレングリコール部分を有する。これらおよびさらに適切なリンカーは当分野でよく知られており、市販されている（例えば、グレンリサーチ社のカタログ, 22825 Davis Drive, Sterling, Virginia, 20164 USA参照）。リンカーのさらなる実施例を以下に示す：５’−アミノ−モディファイヤー(5'-amino-modifier)（例えば、B.A. Connolly and P. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.S. Sproat, B.S. Beijer, P. Rider, and P. Neuner, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4837; R. Zuckerman, D. Corey, and P. Shultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; P. Li, et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5275; G.B. Dreyer and P.B. Dervan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 968.参照）；５’−チオール−モディファイヤー Ｃ６(5'-thiol-modifier C6)（例えば、B.A. Connolly and P. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.S. Sproat, B.S. Beijer, P. Rider, and P. Neuner, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4837; R. Zuckerman, D. Corey, and P. Shultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; P. Li, et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5275.参照）；５’−チオール−モディファイヤー Ｃ６ ３’末端のＳ−Ｓおよびチオール基(5'-thiol-modifier C6 S-S and thiol group at the 3'-terminus)（例えば、B.A. Connolly and R. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.A. Connolly, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3131-3139; N.D. Sinha and R.M. Cook, Nucleic Acids Res., 1988, 16, 2659; A. Kumar, S. Advani, H. Dawar, and G.P. Talwar, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4561; R. Zuckermann, D. Corey, and P. Schultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; K.C. Gupta, P. Sharma, S. Sathyanarayana, and P. Kumar, Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2471-2474; U. Asseline, E. Bonfils, R. Kurfurst, M. Chassignol, V. Roig, and N.T. Thuong, Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254; Gregg Morin, Geron Corporation, Personal Communication.参照）；スペーサーＣ３、スペーサーＣ１２およびdSpacerホスホロアミダイト（例えば、M. Durard, K. Chevrie, M. Chassignol, N.T. Thuong, and J.C. Maurizot, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 6353; M. Salunkhe, T.F. Wu, and R.L. Letsinger, J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 8768-8772; N.G. Dolinnaya, M. Blumenfeld, I.N. Merenkova, T.S. Oretskaya, N.F.Krynetskaya, M.G. Ivanovskaya, M. Vasseur, and Z.A. Shabarova, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5403-5407; M. Takeshita, C.N. Chang, F. Johnson, S. Will, and A.P. Grollman, J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171-10179; M.W. Kalnik, C.N. Chang, A.P. Grollman, and D.J. Patel, Biochemistry, 1988, 27, 924-931.参照）；３’−アミノ−モディファイヤーＣ７ ＣＰＧ（例えば、J.G. Zendegui, K.M. Vasquez, J.H. Tinsley, D.J. Kessler, and M.E. Hogan, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 307.参照）；３’−アミノ感光性Ｃ６ ＣＰＧ(3'-amino photolabile C6 CPG)（例えば、D.J. Yoo and M.M. Greenberg, J. Org. Chem., 1995, 60, 3358-3364.; H. Venkatesan and M.M. Greenberg, J. Org. Chem., 1996, 61, 525-529; D.L. McMinn and M.M. Greenberg, Tetrahedron, 1996, 52, 3827-3840.参照）。
血清の半減期を調節する構成要素は、好ましくはアルブミンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００７８】
薬剤的に活性の化合物または診断上活性の化合物は、好ましくは、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）医学画像のための造影剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子(pro-coagulant factor)、（ｉ）プロドラッグ活性化のための酵素、または（ｋ）ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤、ＡＤＨ阻害剤、アルドステロン阻害剤、もしくはアンジオテンシン受容体拮抗薬からなる群から選択される。
蛍光色素は、好ましくはAlexa FluorまたはCy色素から選択される構成要素である。
光増感剤は、好ましくは光毒性の赤色蛍光タンパク質であるKillerRedまたはヘマトポルフィリンである。
【００７９】
放射性核種は、好ましくは、ガンマ線放射同位体(gamma-emitting isotopes)、より好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎの群、および／またはポジトロン放射体、より好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉの群、および／またはベータ放射体、より好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕの群、またはアルファ放射体、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔの群のいずれかから選択される。
【００８０】
本明細書で用いる造影剤は、医学画像において、体内の構造または液体のコントラストを増強するために用いる物質である。一般的な造影剤は、Ｘ線減弱および磁気共鳴信号の増強に基づいて機能する。
【００８１】
サイトカインは、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦベータ、ＬＴ−ベータ、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータからなる群から選択される。
【００８２】
毒性化合物は、好ましくは小分子有機化合物またはポリペプチドであり、より好ましくはカリケアミシン、メイタンシノイド、ネオカルジノスタチン、エスペラミシン、ジネミシン、ケダルシジン、マズロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、オーリスタチン、リジンＡ鎖、モデッシン、短縮(truncated)シュードモナスエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンからなる群から選択される毒性化合物である
【００８３】
ケモカインは、好ましくはＩＬ−８、ＧＲＯアルファ、ＧＲＯベータ、ＧＲＯガンマ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１アルファ／ベータ、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３アルファ、ＭＩＰ−３ベータ、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインからなる群から選択される。
凝血促進因子は好ましくは組織因子である。
プロドラッグ活性化のための酵素は、好ましくはカルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される酵素である。
【００８４】
本発明は、第三態様において、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物をＦＸＩＩａと接触させることを含む、ＦＸＩＩａの酵素活性を阻害するエクスビボの方法に関し、ここでＦＸＩＩａは、好ましくは血液、血漿または血清試料中に存在する。
【００８５】
本方法は、原理上はインビボで同様に実施できる。上記で説明したように、ＦＸＩＩａの阻害剤は現在、研究所およびますます診療所において凝血検査に用いられている。上記エクスビボの方法をそのような凝血検査において用いても良い。血液、血漿または血清試料は、好ましくはヒトの血液、血漿または血清試料である。研究所において、血液、血漿または血清試料以外の試料もまた興味の対象となり得る；例えば、ＦＸＩＩａの組換え型の能力を検査するためなど。
【００８６】
本発明は、第四態様において、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物を含む医薬組成物に関する。
本発明において、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒトの患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも一つの本発明の阻害剤を含む。場合により、本発明の医薬組成物は、例えば本発明の化合物の機能を安定化し、調節し、および／または活性化することによって、本発明の化合物の特徴を変えることができるさらなる分子を含む。この組成物は、固体状、液体状または気体状でもよく、および特に、粉末状、錠剤状、溶液状またはエアロゾル状でもよい。
【００８７】
これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与できる。主治医および臨床因子によって投与計画を決定する。医学分野でよく知られるように、あらゆる患者の投与量は多くの因子に依存し、この因子は、患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および手段、全体的な健康および同時に投与される他の薬剤を含む。与えられた状況における治療上有効な量は、日常的な実験によって容易に決定され、通常の臨床医または医師の技能および判断の範囲内である。一般的に、医薬組成物の定期的な投与としての投与計画は、１日につき１μｇから５ｇの単位量の範囲であるべきである。しかしながら、より好ましい投与量は、１日につき０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲であり、さらにより好ましくは０．０１ｍｇから５０ｍｇであり、最も好ましくは０．０１ｍｇから１００ｍｇであり得る。
【００８８】
さらに、投与される医薬組成物の治療上有効な全量は典型的に、体重１ｋｇにつき約７５ｍｇ未満である（例えば、体重１ｋｇにつき約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満など）。より好ましくは、医薬組成物の治療上有効な量は、体重１ｋｇにつき２０００ナノモル未満の阻害剤である（例えば、体重１ｋｇにつき１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５または０．０００１５ナノモル未満の阻害剤）。
【００８９】
変化を観察するのに必要な処置の期間および発生に応答するための処置後の時間的な間隔は、所望の効果に依存して様々である。特定の量が、当業者によく知られた従来の検査によって決定される。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。「医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤」は、非毒性の固体、半固体または液体のフィルター、希釈剤、封入材またはあらゆるタイプの補助的な製剤（Handbook of Pharmaceutical Excipients 6ed. 2010, Published by the Pharmaceutical Pressも参照）を意味する。適切な薬剤のキャリアおよび賦形剤の例は、当分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、各種の湿潤剤、滅菌溶液、ＤＭＳＯなどを含む有機溶媒を含む。そのようなキャリアまたは賦形剤を含む組成物は、よく知られた従来法で処方できる。医薬組成物を、例えば、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、経皮、経粘膜、硬膜下、イオントフォレシス(iontopheresis)を介して局部または局所、吸入噴霧、エアロゾルによる舌下または直腸など）で、場合により従来の医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、単位用量の処方を施してもよい。
【００９１】
本発明は、第五態様において、血栓症、好ましくは血栓、深部静脈血栓症、遺伝性血管浮腫および糖尿病性黄斑浮腫から選択される血栓症の処置または予防において用いる、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物に関する。
【００９２】
ＦＸＩＩの特異的な阻害は、霊長類を含む様々な血栓形成の前臨床モデルにおいて、安全な抗血栓症の戦略を立証してきた。それゆえ、本発明の阻害剤、特にＦＸＩＩ６１８は、血栓症の処置または予防に適している。血栓症の限定されない例は、血栓、深部静脈血栓症、遺伝性血管浮腫および糖尿病性黄斑浮腫である。ＦＸＩＩ６１８はそれ自身が治療化合物であるだけでなく、さらなる治療化合物の開発のためのリード化合物として役立ち得る。ＦＸＩＩ６１８はＦＸＩＩａの直接の阻害剤であり、したがって凝血ＦＸＩＩの血栓性の機能と炎症性の機能の両方を妨げる、従前開発された阻害剤に対して、明確な利点を有する。本発明の阻害剤は、心臓手術中の体外循環または続発性脳卒中発症の予防などの急性の状況において特に有用であり得る。
【００９３】
本発明の別の目的は、血栓症、好ましくは血栓、深部静脈血栓症、遺伝性血管浮腫および糖尿病性黄斑浮腫から選択される血栓症の処置および／または予防の方法を提供することであって、この方法は、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物の治療上有効な量を、必要とする患者に投与することを含む。
【００９４】
本発明に適用する場合、投与は、本発明の阻害剤を処置される対象、好ましくはヒトに接触させることを指す。ヒトおよび動物への投与において、この阻害剤の治療上有効な量とは、凝血酵素ＦＸＩＩａの酵素活性を阻害する、検出可能な薬理学的効果および／または生理学的効果を誘導する、阻害剤の量である。
【００９５】
全身投与において、治療上有効な量または投与量をインビトロアッセイから最初に見積もってもよい。例えば、投与量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するように動物のモデルに処方してもよい。そのような情報を、ヒトにおける有用な処方量をより正確に決定するために用いてもよい。最初の投与量をまた、当業者によく知られた技術を用いて、インビボのデータ（例えば、動物のモデルなど）から見積もってもよい。当業者は、動物のデータに基づいてヒトへの投与を容易に最適化でき、それは当然、処置される対象、対象の体重、障害の重症度、投与の様式に依存する。
【００９６】
本発明は、第五態様において、血管、チューブ、針、シリンジ、膜または医療機器を被覆するための、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物の使用に関する。
抗凝血は、血餅が血液中に形成するのを防ぐことを助ける薬物療法である。本発明の阻害剤の抗凝血の効果を考慮して、それらはまた、血管、チューブ、針、シリンジ、膜または医療機器を適切に被覆する。被覆は、接触活性化で駆動する血栓症を予防するため、そのように被覆された物体は、対応する被覆されていない物体と比較して有利である。例えば、ＣＴＩは血液の適合性結果を向上する表面修飾因子として従前用いられてきた２７、２８。ＦＸＩＩ６１８の小さなサイズおよび合成の性質によって、この阻害剤は、心肺バイパス装置の冠動脈インターベンションまたはガス交換キャピラリーにおいて用いるカテーテルなどの、血液が接触する表面に接合するのに特に適合する。阻害剤を血管、チューブ、針、シリンジ、膜または医療機器の表面と共有結合的に連結することによって、被覆を達成してもよい。
【００９７】
本発明は、第七態様において、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物を含む、血液凝固を検査するためのキットに関する。
ＦＸＩＩａの阻害剤は現在、凝血検査において用いられているため、そのような検査を行うためのキットは本発明の範囲内である。キットは、好ましくはキットの使用方法の説明書を含む。キットの様々な構成要素は、一以上のバイアルなどの一以上の容器に包装されてもよい。このバイアルは、構成要素に加えて、貯蔵のための防腐剤または緩衝液を含んでもよい。
【００９８】
本発明はまた、本発明の阻害剤、融合タンパク質または融合構成物が、例えば血液、血漿または血清中において、第ＸＩＩａ因子を阻害し、または第ＸＩＩａ因子と特異的に結合するために用いられる診断上のアッセイを提供する。診断上のアッセイの限定されない例は、ＴＧＡおよびトロンボエラストメトリーを含む。
【００９９】
上述のように、ＦＸＩＩａの阻害剤は現在、凝血アッセイに用いられており、したがって本発明の新規なＦＸＩＩａ阻害剤もまた、そのようなアッセイに使用できる。そのようなアッセイの適切な形態は、ＴＧＡおよびトロンボエラストメトリーを含むアッセイである。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
図を下記に示す。
【図１】二環式ペプチドＦＸＩＩａ阻害剤のファージ選定(Phage selection)。（ａ）３つの選定の工程(round)後にβ−ＦＸＩＩａに対して単離されたペプチドの配列。灰色で強調された３つのシステインを、アフィニティーパンニング前にチオール反応性リンカーであるＴＡＴＡで環化した。ペプチド間の配列類似性を色付きで強調した。Ｋｉにおいて、少なくとも２回の測定での平均値を示した。（ｂ）ライブラリーから選択された最も良い２つのＦＸＩＩａ阻害剤の活性および特異性。標準偏差を示す。（ｃ）従前開発された二環式ペプチドＦＸＩＩａ阻害剤（ＦＸＩＩ４０２）ならびに２つの新たに開発された阻害剤ＦＸＩＩ５１２およびＦＸＩＩ５１６のａＰＴＴおよびＰＴ。標準偏差を示す。
【０１０１】
【図２】二環式ペプチドＦＸＩＩａ阻害剤の親和性成熟、特異性プロファイルおよび阻害活性。（ａ）ＦＸＩＩ５１６に基づいてセミランダム化された(semi-randomized)ペプチドライブラリーから単離されたペプチドの配列。ペプチド間の配列類似性を色付きで強調した。（ｂ）３回のアミノ酸置換の工程によって改善されたＦＸＩＩ５１６の結合親和性。示された標準偏差は３つのＫｉ値に基づいて計算した。（ｃ）ＦＸＩＩ６１８の標的選択性。標準偏差を３つ以上のＫｉ値に基づいて計算した。（ｄ）示されたＦＸＩＩ６１８の濃度における、凝血パラメータａＰＴＴおよびＰＴならびにＦＸＩＩ活性（ＦＸＩＩ：ｃ）。ａＰＴＴ、ＰＴおよびＦＸＩＩ：ｃの標準偏差を３回の測定に基づいて計算した。
【０１０２】
【図３】ＣＴＩおよび二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８の構造。（ａ）ＣＴＩ（左）およびＦＸＩＩ６１８（右）のポリペプチド配列。化学的リンカーＴＡＴＡは、二環式ペプチドの３つのシステインを、チオエーテル結合を介して連結する。ＦＸＩＩａの特異性ポケットＳ２、Ｓ１およびＳ１’に結合する残基を示す。（ｂ）ＦＸＩＩａと結合するＣＴＩ（上図）およびＦＸＩＩ６１８（下図）の構造モデル。二環式ペプチドのＴＡＴＡリンカーを緑色で示す。（ｃ）ＦＸＩＩａと結合するＣＴＩおよびＦＸＩＩ６１８の結合ループの重ね合わせ。（ｄ）ＦＸＩＩａに結合するＣＴＩ（オレンジ色）、遊離ＣＴＩ（赤色）およびＦＸＩＩａと結合するＦＸＩＩ６１８（青色）における結合ループのファイ（φ；実線）およびプサイ（ψ；点線）の二面角。（ｅ、ｆ）ＦＸＩＩａ活性部位領域に対する阻害剤の相補性を示す、ＣＴＩ（ｅ）およびＦＸＩＩ６１８（ｆ）の結合ループ。
【０１０３】
【図４】ＦＸＩＩ６１８とＣＴＩとの比較。（ａ）ＣＴＩ（上部パネル）およびＦＸＩＩ６１８（下部パネル）の特異性プロファイルおよび阻害活性。数種のトリプシン様セリンプロテアーゼの残効性(residual activity)を示す。標準偏差を示す。（ｂ）ＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩの同量存在下でのクエン酸乏血小板血漿(citrated platelet poor plasma)におけるａＰＴＴの比較。標準偏差を３回の測定に基づいて計算した。（ｃ）ＣＴＩ（上部パネル）およびＦＸＩＩ６１８（下部パネル）の種々の濃度存在下で、エラグ酸(elagic acid)（内因性経路活性化）によって駆動する、クエン酸乏血小板血漿におけるＣＡＴによるトロンビン生成。
【０１０４】
【図５】ＣＡＴによる血漿中での低濃度ＴＦで誘導されるＴＧＡにおける、ＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩの比較。クエン酸乏血小板血漿におけるトロンビンの生成は、１００μｇ／ｍＬの阻害剤ＣＴＩまたはＦＸＩＩ６１８の非存在下または存在下において０．１ｐＭおよび０．２５ｐＭのＴＦによって駆動した。
【０１０５】
【図６】ＦＸＩＩａ阻害剤の構造−活性相関（ＳＡＲ）。
【図７】連結分子の化学構造。
【図８】ＦＸＩＩ６１８の化学環構造。
【図９】本発明に関連して同定された、凝血酵素ＦＸＩＩａの阻害剤のアミノ酸配列。これら阻害剤のアミノ酸配列におけるシステインはＴＡＴＡと連結する。
【０１０６】
【図１０】（ａ）ヒト血漿中の二環式ペプチドの安定性。ペプチドをヒト血漿中、３７℃で、示される期間インキュベートした後、見かけ上のＩＣ５０を決定した。３回の測定の平均値を示す。（ｂ）二環式ペプチド７３（ＦＸＩＩ８０１）の特異性。少なくとも３回の測定の平均値。標準偏差を示す。
【図１１】二環式ペプチド１（ＦＸＩＩ６１８）、６１（ＦＸＩＩ８００）および７３（ＦＸＩＩ８０１）における凝血パラメータａＰＴＴ（ａ）およびＰＴ（ｂ）。ａＰＴＴ、ＰＴの標準偏差を３回の測定に基づいて計算した。
【０１０７】
【図１２】（ａ）ＦＸＩＩ６１８の化学構造（１）。（ｂ）親和性成熟戦略。α−アミノ酸をβ−アミノ酸に置換することによって、または環化リンカーに結合するシステインをより長い側鎖を持つシステインホモログに置換することによって、炭素原子をペプチド骨格に挿入する。
【図１３】ＦＸＩＩ６１８、ＦＸＩＩ７００およびＦＸＩＩ７０１における凝血パラメータａＰＴＴ（ａ）およびＰＴ（ｂ）。
【図１４】ＦＸＩＩ６１８−ＴＡＴＡ、ＦＸＩＩ６１８−ＴＢＡＴおよびＦＸＩＩ６１８−ＴＢＭＴの活性および特異性。標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０８】
実施例は本発明を説明する。
実施例１：ＦＸＩＩ６１８の生成および検査
実施例１．１：実験手順
活性化ヒトＦＸＩＩに対するファージ選定
二環式ペプチドのファージディスプレイライブラリー（ライブラリー３ｘ３、４ｘ４および６ｘ６）を作成し、以前に記述された手順２９に従って３回のファージ選定を行った。各選定において、ファージを、０．５Ｌの細菌培養液中で生成した。ファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって精製した。システイン残基を、８０％水溶性緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および２０％アセトニトリル中での、チオール反応性試薬１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ、１５０μＭ、３０℃、１時間）またはＮ，Ｎ’，Ｎ’’−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）−トリス（２−ブロモアセトアミド）（ＴＢＡＢ、４０μＭ、３０℃、１時間）との化学反応の前に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１ｍＭ、４２℃、１時間）で還元した。ヒトβ−ＦＸＩＩａ（ＨＦＸＩＩＡＢ; Molecular Innovations, Novi, MI, USA）をビオチン化し、５μｇをストレプトアビジンまたはニュートラアビジン磁性ビーズ上に固定化した。バインダーを酸性ｐＨにおいて溶出した。親和性成熟戦略において、あまりビオチン化されていないＦＸＩＩａを用いた：両方の選定において０．２μｇまたは１回目において２μｇおよび２回目において０．２、０．５、もしくは１μｇのいずれか。
【０１０９】
親和性成熟のライブラリーのクローニング
ＰＣＲ反応におけるファージｐ３の遺伝子、および２つのＳｆｉｌ制限部位において、ファージベクターｐＥＣＯ２中に挿入される生成物のために、ランダム化されたＤＮＡ配列に縮重プライマーを付加した２９。順方向プライマー：ＶＢｆＬｖｂ２１＿ｆｏｒ（ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＡＧＧＣＴＧＮＮＫＴＧＣＮＮＫＣＡＧＴＴＧＮＮＫＴＧＴＮＮＫＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ）（配列番号９１）、逆方向プライマー：ｓｆｉ２ｎｏｔｆｏ（ＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧ）（配列番号９２）。ＴＧ１細胞中に連結した４．４μｇのベクターのエレクトロポレーションは、大きな（直径１４０ｍｍ）クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）の２ＹＴ寒天プレート上に８．８ｘ１０６のコロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ）を生じた。コロニーを２ＹＴ培地含有プレートからこすり取り、１５％ ｖ／ｖグリセロールを添加し、−８０℃で保存した。
【０１１０】
ａＰＴＴ、ＰＴおよびＦＸＩＩ凝血活性（ＦＸＩＩ：ｃ）測定
ヒト血漿中の凝血時間（ａＰＴＴ、ＰＴ）およびＦＸＩＩａ活性を、自動化された凝血分析器(Sysmex CS-5100, Siemens, Eschborn, Germany)を用いて、製造者の説明書に従って(Siemens)、決定した。外因性凝血をInnovin（登録商標）（安定化したＨＥＰＥＳ緩衝液系中の組換えヒト組織因子、合成リン脂質およびカルシウム；Dade Behring / Simens）で駆動した。内因性凝血をPathromtin* SL(Siemens)で駆動した。本研究で用いたヒト血漿は、Service Regional Vaudois de Transfusion Sanguine, Switzerlandによって提供された新鮮な凍結した血漿単位のプール由来である。
【０１１１】
トロンビン生成検定：較正し、自動化されたトロンボグラフィー（ＣＡＴ）
トロンビン生成を、従前に記述されたものをいくつか改変して、行った３０。簡潔に述べると、６０μＬの乏血小板血漿（ＰＰＰ）、２０μＬのＦＸＩＩａ阻害剤／ＨＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）および２０μＬ ＰＰＰ試薬、ＰＰＰ ＬＯＷ試薬、ＭＰ試薬またはアクチンＦＳ（ＨＡ緩衝液中に１：１７０で希釈した）を９６−ウェルマイクロタイタープレート（Immulon 2HB; Thermo Fisher Scientific）中で混合し、３７℃で１５分インキュベートした。トロンビン生成を、３７℃で、２０μＬの基質／塩化カルシウム緩衝液（ＦＬＵＫＡ）を添加することで、駆動した。試料を各条件において３回検査した。蛍光性トロンビン基質の加水分解を、マイクロプレート蛍光光度計(Fluoroskan Ascent FL; Thermo Fisher Scientific)において、３９０／４６０ｎｍ（励起／蛍光）のフィルター設定で、２０秒毎に１２０分間測定した。データ解析を、Thrombinoscopeソフトウェア（Synapse BV）で行った。ＰＰＰ試薬（ＴＦ ５ｐＭ、ＰＬ ４μＭ）、ＰＰＰ ＬＯＷ試薬（ＴＦ １ｐＭ、ＰＬ ４μＭ）、ＭＰ試薬（ＰＬ ４μＭ）、トロンビン検量用試料(thrombin calibrator)およびＦＬＵＫＡをSynapse BVから購入した。
【０１１２】
全血への阻害剤添加後の、トロンビン生成測定のための血液収集
静脈血を、３．２％（ｗ／ｖ）クエン酸Monovetteプラスチックチューブにおける１９ゲージの針で、肘前の静脈穿刺によって、健康なボランティアから収集した。接触活性化を最小限にするため、ＥＤＴＡを含む最初のコレクションチューブを、標準の手順に従って、処分した。ＦＸＩＩ６１８を血液収集後すぐに（＜１分）チューブに添加し、終濃度１００μｇ／ｍＬとした。そして、血液をＰＰＰのために、２，０００ｇで５分間の第一の遠心の工程、次いで１０，０００ｇで１０分間の第二の遠心の工程で処理した。一定分量の血漿を分析まで−８０℃で保存した。
【０１１３】
二環式ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を用いる標準的な固相ペプチド合成によって、ペプチドを社内で合成した。アミノ酸を、カップリング試薬としてＨＢＴＵおよびＨＯＢｔを用いて、４倍モル過剰で２回カップリングした。合成したペプチドは全て、フリーなＮ末端とアミド化されたＣ末端を有する。ペプチドを、還元条件（９０％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％チオアニソール、２．５％フェノール、２．５％ １，２−エタンジチオール）下で樹脂から切断した。１ｍＭの未精製のペプチドを、７０％水溶性緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および３０％アセトニトリル中で、３０℃で１時間、１．５ｍＭ ＴＡＴＡまたはＴＢＡＢのいずれかと反応させた。環化したペプチドを、Ｃ１８カラムにおける逆相クロマトグラフィーによって精製した。純粋な二環式ペプチド（＞９５％の純度）を凍結乾燥し、水に溶かした。これらの質量をＥＳＩで確認した。
【０１１４】
プロテアーゼ阻害アッセイ
二環式ペプチドの阻害活性を、プロテアーゼとのインキュベーションおよび蛍光性の基質によるそれらの残効性の定量化によって、決定した。ヒトｂ−ＦＸＩＩａ（ＨＦＸＩＩＡＢ；Molecular Innovations）およびマウスａ−ＦＸＩＩａ（ＭＦＸＩＩＡ；Molecular Innovations）の終濃度は１０ｎＭであった。ペプチドの希釈を、０．２〜２００ｍＭの範囲で調製した。蛍光強度を、インフィニットＭ２００Ｐｒｏ蛍光プレートレーダー（３５５ｎｍの励起、４６０ｎｍの蛍光；Tecan, Mannedorf, Switzerland）で測定した。反応をＲＴで行った。シグモイド曲線を、下記の用量応答式を用いて、データにフィットし、ここでｘ＝ペプチド濃度、ｙ＝％ペプチドなしの反応の活性、Ａ１＝１００％、Ａ２＝０％、ｐ＝１である。ＩＣ５０の値はフィットした曲線に由来する。
【数１】
2018521960.tif 000002
阻害定数Ｋｉを、チェン＝プルソフ式２９ Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｓ］０／Ｋｍ））に従って計算し、ここでＩＣ５０は阻害剤の機能的強度であり、［Ｓ］０は基質の全濃度であり、Ｋｍはミカエリス・メンテン定数である。
【０１１５】
エクスビボでの凝血アッセイ
ヒト血漿中の凝血時間（ａＰＴＴ、ＰＴ）およびＦＸＩＩａ活性を、標準試薬を備える自動化された凝血分析器(Sysmex CA-7000)を用いて、製造者の説明書(Siemens Healthcare, Eschborn, Germany)に従って、少なくとも２回決定した。本研究で用いたヒト血漿は、Service Regional Vaudois de Transfusion Sanguine, Switzerlandによって提供された新鮮な凍結した血漿単位のプール由来である。
【０１１６】
ホモロジーモデリング
Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’およびＳ２’サブサイトに標準的な機構で結合するＣＴＩおよびＦＸＩＩ６１８のテトラペプチドを伴うβ−ＦＸＩＩａのホモロジーモデルを、鋳型としてＸ線共結晶構造データセット１ＰＰＥ、２ＸＴＴおよび４ＡＯＱを用いて、構築した。ＰＤＢファイル内の本質的でない水分子およびイオンを削除し、ペプチドリガンドをＰ２、Ｐ１、Ｐ１’およびＰ２’の残基のみを保持するように切り取った。β−ＦＸＩＩａならびにＣＴＩおよびＦＸＩＩ６１８のテトラペプチドを、ＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアからのアライメントスクリプト３０を用いて、ｂ−トリプシンおよび３つのリガンドのテトラペプチドと並べた。タンパク質およびペプチドを、保存されたアミノ酸に基づいて整列させた。ｂ−ＦＸＩＩａは、ｂ−トリプシン（アミノ酸１６−２４５、キモトリプシンナンバリング）と３５．７％の配列同一性および５４．４％の配列類似性を共有する。β−ＸＩＩａ内のＰ１アルギニンのｈアミノ基とアスパラギン酸１８９のｄ酸素との間の２．９＋／−０．１Åの距離の拘束が明らかとなった。ＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアを用いて、ペプチド結合するテトラペプチドのモデルを構築した。最低エネルギーでのモデルをさらに、Ａｍｂｅｒ １１ソフトウェア（R. Salomon-Ferrer, A. W. Gotz, 2013）での分子動力学シミュレーションに用いた。ＦＸＩＩ６１８の構造において、３つのシステインを手動でＴＡＴＡに連結した。ツリープ(treap)でのsanderインプットファイルを調製するために、ＡＭＢＥＲ力場を用いた。ＴＩＰ３Ｐの水を、その構造を溶媒和するために用いた。系を、第一に、ｂ−ＦＸＩＩａおよび結合するペプチドの構造を保ち、次いでＳ２、Ｓ１、Ｓ１’およびＳ２’ポケットにおいて残基を相互作用させることのみによって最小化した。最後に、系全体を最小化した。そして、系を、系全体の平衡化の前に、３００Ｋに加熱した。生成物の平衡化を、定圧および２０ｎｓの周期的な境界で、３００Ｋで実行した。ランジュバン動力学を用いて、１．０ｐｓ−１の衝突頻度で、温度を制御した。そして、最後の構造を分析した。全ての計算を、ＥＰＦＬのサイエンティフィックＩＴおよびアプリケーションサポート(scientific IT and application support；（ＳＣＩＴＡＳ）)によって提供された、ＧＰＵによって加速化されたクラスタＥＬＥＣＴＲＡ(GPU-accelerated cluster ELECTRA)において行った。
【０１１７】
インビボでのＦＸＩＩ活性の阻害
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを１２５ｍｇ／ｋｇペントバルビタールで麻酔した。５分後、マウスに、３．５ｍｇ／ｋｇのＰＫ１２８と併用して３．５ｍｇ／ｋｇのＦＸＩＩ６１８（Ｎ＝３）または対照としてのＰＢＳ（Ｎ＝２）のいずれかをｒ．ｏ．で注入した。５分後、血液を、血液とクエン酸塩との比が１：９となるように、大静脈から収集した。血漿をＲＴにおいて、２，４００ｇ、１０分の遠心によって、調製した。ＦＸＩＩａ活性を上述のように評価した。
【０１１８】
実施例１．２：構造的に多様な二環式ペプチドライブラリーのスクリーニング
１００億を超える異なる二環式ペプチドを同時に含む６回の組み合わせのファージディスプレイライブラリーを、新規なペプチド環化試薬およびより多様なペプチドフォーマットを用いて、開発した。そのライブラリーを、ヒトβ−ＦＸＩＩａ（触媒ドメインのみを含むＦＸＩＩａの天然に生じるタンパク質分解生成物）に対してパンニングした。ライブラリーを、チオール反応性試薬１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）またはＮ，Ｎ’，Ｎ’’−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）−トリス（２−ブロモアセトアミド）（ＴＢＡＢ）のいずれかと共にファージ上にディスプレイされる、フォーマットＣＸｎＣＸｎＣ（Ｃ＝システイン、Ｘ＝ランダムなアミノ酸；ｎ＝３、４、６）の直鎖ペプチドを環化することによって、生成した。これらの化学的なリンカーは、従前適用された試薬１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）と比較して、二環式ペプチドにおいて、異なるペプチド骨格構造を与える１９，２０。ＴＢＡＢによって環化したペプチドで行った親和性選択は、阻害剤ではなく、バインダーの単離をもたらした。対照的に、ＴＡＴＡによって環化したペプチドライブラリーから単離された二環式ペプチドは、β−ＦＸＩＩａに対して０．１６＋／−０．０７μＭから１０．２＋／−０．９μＭの範囲のＫｉを持つＦＸＩＩａ阻害剤をもたらした（図１ａ）。２つの最も強力なペプチド（ＦＸＩＩ５１２（０．１６＋／−０．０７μＭのＫｉ）およびＦＸＩＩ５１６（０．１６＋／−０．０８μＭ））のさらなる特徴付けは、それらがマウスのＦＸＩＩａ（β−ＦＸＩＩａ；それぞれ０．３２＋／−０．０７μＭおよび０．４５＋／−０．１６μＭのＫｉ）と交差反応することを示した（図１ｂ）。構造的および機能的に関連するセリンプロテアーゼのパネルでの特異性プロファイルは、ＦＸＩＩ５１２が、線維素溶解を含む凝血関連酵素であるヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ；Ｋｉ＝８．８μＭ）を阻害することを示した。ＦＸＩＩ５１６は、５０μＭに達する濃度で検査した全てのプロテアーゼを有意に阻害しなかった。
【０１１９】
ＦＸＩＩａ阻害に関して、ＦＸＩＩ５１２に対するＦＸＩＩ５１６のより高い選択性は、凝血アッセイにおいて、さらに観察された。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）を、３種の異なる濃度のＦＸＩＩ５１２またはＦＸＩＩ５１６存在下でのヒト血漿中で測定した。従前開発されたＦＸＩＩａ阻害剤であるＦＸＩＩ４０２（ＴＢＭＢで環化；Ｋｉ＝１．２μＭ）を比較のために用いた。ａＰＴＴおよびＰＴは、内因性経路（ａＰＴＴ）または外因性経路（ＰＴ）のいずれかを介する凝血の開始に際して、凝血までの時間を測定する。選択的なＦＸＩＩａ阻害では、ａＰＴＴは増加するが、ＰＴは増加しないことが予期される。完全なＦＸＩＩａ阻害では、ａＰＴＴおよびＰＴは、ＦＸＩＩ欠乏性血漿（ａＰＴＴ＞１７０秒および定常状態のＰＴ；Service and Central Laboratory of Hematology, Lausanne University Hospital, Switzerland）において測定されるａＰＴＴおよびＰＴと同等であるはずである。図１ｃで示すように、新規に開発された二環式ペプチドは、同濃度の阻害剤におけるより長いａＰＴＴによって観察されるように、凝血の内因性経路の阻害に関して、ＦＸＩＩ４０２よりも強力であった。ＦＸＩＩ５１２は最も強く内因性経路を阻害するが、５０μＭおよびそれ以上の濃度において、長い、非生理的なＰＴを示した。対照的にＦＸＩＩ５１６は、最も高濃度の阻害剤（１００μＭ）での検査においてさえ、外因性経路に影響を与えることなく、内因性経路を効率的に阻害し、有望な先例を与えた。したがって、新規に開発され、構造的により多様なライブライリーのスクリーニングは、ファージディスプレイによって従前開発された最良のペプチドよりもかなり強力な阻害剤をもたらした１８。
【０１２０】
実施例１．３：強力かつ選択的なＦＸＩＩａ阻害剤のエンジニアリング
ＦＸＩＩ５１６の効能を、共通する範囲(consensus region)外のアミノ酸を変えることによって、さらに改善した。ＸＣＸＲＬＸＣＸＱＬＸＣＸ（共通配列に下線を引いた、Ｘ＝ランダムなアミノ酸）の形のファージディスプレイライブラリーのスクリーニングは、改善されたバインダーをもたらさず、その配列は共通配列の拡大を示し、ＦＸＩＩ５１６における有益なアミノ酸置換のためのヒントを与えた（図２ａ）。最も注目すべきことは、１番目のアミノ酸の脂肪族アミノ酸およびアルギニンへの収束進化、３および６番目のアミノ酸のプロリンへの収束進化、８番目のアミノ酸のアラニンへの収束進化、および１１番目のアミノ酸のアルギニンへの収束進化である。単一アミノ酸置換によるＦＸＩＩ５１６変異体は、４倍以上に改善された阻害活性を示した（図２ｂ、１回目）。変異およびスクリーニングの周期の２回反復によるさらなる変異の蓄積は、ヒトβ−ＦＸＩＩａを２２＋／−４ｎＭのＫｉで阻害するペプチドＦＸＩＩ６１８（図２ｂ；２および３回目）をもたらした。α−ＦＸＩＩａは同程度阻害された（Ｋｉ＝１９＋／−１ｎＭ）。ＦＸＩＩ６１８はまた、マウスＦＸＩＩａを２５２＋／−２９ｎＭのＫｉで阻害したが、構造的に関連し、または機能的に重要なプロテアーゼを阻害しなかった（図２ｃ）。ＦＸＩＩ６１８は、その親であるＦＸＩＩ５１６および従前開発されたＴＢＭＢで環化された阻害剤ＦＸＩＩ４０２と比較して、ヒトＦＸＩＩａの阻害において、それぞれ８倍および６０倍の改善を示す。ＦＸＩＩ６１８の効能および特異性を、インビトロの凝血アッセイにおいてさらに評価した。４０μＭの低濃度において、その二環式ペプチドは、外因性経路に影響を与えることなく（定常状態のＰＴ）、内因性経路を介する凝血の開始を完全に阻害した（ａＰＴＴ＞１７０秒）。矛盾なく、５０μＭにおいて、ＦＸＩＩ凝血活性（ＦＸＩＩ：ｃ）は、＜５％に減少した（図２ｄ）。
【０１２１】
実施例１．４：ＦＸＩＩ６１８はトウモロコシトリプシン阻害剤の結合様式を模倣する
同定された共通配列と天然のＦＸＩＩａ阻害剤の結合ループとの比較は、最も強力な二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８（ＲＣＦＲＬＰＣＲＱＬＲＣＲ）の第一のリングとトウモロコシトリプシン阻害剤の結合ループ（ＣＴＩ；…ＩＧＰＲＬＰＷ…）（同一のアミノ酸に下線を引いた）との間に際だった類似性を示した。ホモロジーは、ＦＸＩＩ６１８（ＸＣＰＲＬＰＣＸＱＬＲ／ＫＣＸ；図２ａ）の開発をもたらす親和性成熟の手法で発見された共通配列において、さらにより明白となり、この二環式ペプチドはＣＴＩと同様の結合様式を有することを示唆した（図３ａ）。ＣＴＩはトウモロコシの種子由来の１３．６ｋＤａのタンパク質であり、ＦＸＩＩａおよびトリプシンを同等に阻害する。ＣＴＩは凝血アッセイにおける接触相の活性化を抑制するために、広く適用されている。５個のジスルフィド架橋を含む１２７個のアミノ酸のタンパク質（ＰＢＤ：１ＢＥＡ）は、阻害剤のペプチドループが酵素のポリペプチド基質として実質的に結合する、いわゆる阻害の「標準機構」２３に従う標準的な阻害剤である。ＣＴＩのＡｒｇ３４はＦＸＩＩａの特異的なポケットＳ１内に結合する２。
ＦＸＩＩ６１８が実際にＦＸＩＩａの活性部位に相補的な立体構造を採用できるかを、ホモロジーモデリングおよび分子動力学シミュレーションによって、検定した。ＣＴＩおよびＦＸＩＩａの共結晶構造は存在しないため、ＣＴＩ−ＦＸＩＩａ複合体もまたモデル化した。相同のセリンプロテアーゼウシβ−トリプシンとＣＭＴＩ−Ｉ（カボチャの種子由来のトリプシン阻害剤；ＰＤＢ：１ＰＰＥ）、ＳＧＰＩ−１−Ｐ０２（サバクトビバッタプロテアーゼ阻害剤１；ＰＤＢ：２ＸＴＴ）、およびＳＯＴＩ−ＩＩＩ（ホウレンソウトリプシン阻害剤ＩＩＩ；ＰＤＢ：４ＡＯＱ）の共結晶構造は、ホモロジーモデリングの構造の鋳型として役立った。ＦＸＩＩの触媒ドメイン（アミノ酸１６−２５４）とウシβ−トリプシンのアミノ酸の３６％が同一であった。ＣＭＴＩ−Ｉ、ＳＧＰＩ−１−Ｐ０２およびＳＯＴＩ−ＩＩＩは、標準機構に従ってトリプシンを結合する。ＣＴＩおよびＦＸＩＩ６１８の結合ループはＦＸＩＩａと相補的な構造を形成した（図３ｂ）。ＣＴＩの結合ループのアルギニン側鎖および骨格は、ＦＸＩＩ６１８の第一のリングのそれらと重なった（図３ｃ）。遊離ＣＴＩ（ＰＤＢ：１ＢＥＡ由来）の結合ループのラマチャンドラン角(Ramachandran angle)は、この阻害剤がプロテアーゼに結合した場合と、実質的に同一のままであった（図３ｄ）。ＦＸＩＩ６１８のリング１における４つのアミノ酸（ＦＲＬＰ）の二面角は、結合したＣＴＩのモデルにおける相当するアミノ酸の二面角と同様であった（図３ｄ）。酵素−阻害剤複合体の構造の表示は、プロテアーゼの活性部位を持つ二環式ペプチドのリング１の相補性を強調する（図３ｆ）。ＦＸＩＩ６１８の第２のリング（リング２）はまた、立体的な衝突を全く引き起こさずに、ＦＸＩＩａの表面に適合した。しかしながら、このペプチド領域とＦＸＩＩａの表面との特異的な接触は見つからなかったため、このモデルにおけるリング２の立体構造はあまり明確ではない。
【０１２２】
実施例１．５：ＦＸＩＩ６１８は、内因性凝血の開始の抑制において、ＣＴＩよりも優れている
ＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩの活性および標的特異性を、阻害アッセイにおいて対照比較した（図４）。ＦＸＩＩａ阻害は、両阻害剤において同等であった。対照的に、ＦＸＩＩと構造的および機能的な類似性を共有するトリプシン様セリンプロテアーゼのパネルを査定すると、ＦＸＩＩ６１８の標的選択性は、ＣＴＩよりも良かった。ＣＴＩは、トリプシン（Ｋｉ＝７＋／−０．５ｎＭ）、プラスミン（Ｋｉ＝５＋／−１．６μＭ）および第ＸＩａ因子（Ｋｉ＝１２．５＋／−１．４μＭ）の３つのプロテアーゼを実質的に阻害したが（図４上段のパネル）、この二環式ペプチドはトリプシン（Ｋｉ＝５＋／−０．５μＭ）のみを阻害する（図４下段のパネル）。ＣＴＩと比較すると、ＦＸＩＩ６１８は約１００倍弱くトリプシンを阻害した。
【０１２３】
ＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩをまた、インビトロの凝血アッセイにおいて、内因性経路の開始を阻害する能力について、対照比較した（図４ｂ）。導入部で示したように、商品の費用は、ＣＴＩの適用において主要な制限要因である２４。研究者は普通、主にＦＸＩＩａをブロックするために必要な最小量のＣＴＩ（３０〜１００μｇ／ｍＬ）を適用することによって、費用を抑える。したがって、この実験では、２つの阻害剤の質量当たりの活性を比べた。分子当たりの活性は、２つの阻害剤の異なる分子量（１３．６ｋＤａ［ＣＴＩ］：１９５６Ｄａ［ＦＸＩＩ６１８］＝７倍）を考慮することによって、示されたデータから導き出すことができる。実験の第一のセットでは、ａＰＴＴを、種々の阻害剤濃度存在下において測定した。ＦＸＩＩ６１８は１００μｇ／ｍＬにおいて、接触で駆動する凝血を完全にブロックした。（ａＰＴＴ＞１７０秒）。同量のＣＴＩは凝血を遅らせ、最終的なａＰＴＴ値はわずか６５．４＋／−０．５秒であった。より高いＣＴＩ濃度において、ａＰＴＴ値は、完全な阻害から遠く離れた値に、横ばいに収束するようであった。実験の第２のセットでは、２つの阻害剤による接触活性化の阻害を、ＣＡＴを用いて、エラグ酸（ＥＡ）によって駆動するリアルタイムトロンビン生成検定（ＴＧＡ）２５において、測定した（図４ｃ）。ＦＸＩＩ６１８は、ＥＡに誘導されたトロンビン生成を、用量依存的に減少させ、２０μｇ／ｍＬのＦＸＩＩ６１８で既にトロンビン生成の完全な阻害に達した（内在性トロンビンポテンシャル［ＥＴＰ］およびピークの＞９０％の減少）（図４ｃ、下段のパネル）。同等のＴＧＡの結果が、ＦＸＩＩ欠乏性血漿で得られた。トロンビン生成をバックグラウンドのレベルまで減らすためには、約５倍以上のＣＴＩ（１００μｇ／ｍＬ）を必要とした（ＥＴＰの約９０％の減少およびピークの＞９６％の減少；図４ｃ、上段のパネル）。これらの結果は、内因性経路の活性化の予防において、ＣＴＩに対するＦＸＩＩ６１８の効力の改善を示す。内因性経路におけるＦＸＩＩ６１８の特異性を評価するため、トロンビン生成を、高濃度のＴＦ（５ｐＭ）を用いて、外因性経路を介して誘導した。最も高濃度である１００μｇ／ｍＬのＦＸＩＩ６１８においてさえ、このペプチド阻害剤はＴＦで誘導されたトロンビン生成に影響を与えなかった。接触活性化は静脈穿刺中にも生じ得るため、収集後の全血にＦＸＩＩ６１８を直接添加することの効果を検定した。類似の結果が得られた。まとめると、これらのデータはＦＸＩＩ６１８の強力な効力および特異性を明確に示し、ＦＸＩＩ６１８は接触系およびそれによる内因性経路の開始を、外因性経路にいかなる影響も与えることなく、効率的に阻害する。
【０１２４】
実施例１．６：ＦＸＩＩ６１８は、低濃度ＴＦ診断検定において、接触活性化を効率的にブロックする
導入部で記述したように、低濃度ＴＦ（＜１ｐＭ）で駆動する凝血アッセイは、生理的条件下の凝血過程を最も良く模倣する。しかしながら、低濃度ＴＦの駆動では、接触活性化は実質的にトロンビン生成に寄与し、誤った結果となる。ＦＸＩＩ６１８およびＣＴＩを、血漿中の低濃度ＴＦトロンビン生成検定における接触活性化を阻害する能力について、比較した（図５）。トロンビン生成を１ｐＭのＴＦを用いて駆動すると、ＦＸＩＩ６１８またはＣＴＩの有意な効果は観察できなかった（図５上段のパネル）。代わりに、０．２５ｐＭのＴＦにおいて、ＦＸＩＩ６１８は内在性のトロンビンのポテンシャルをＣＴＩと同程度まで減少したが、遅延時間はより長かった（遅延時間：それぞれ１２．３±０．３および８．０±０．２）（図５中段のパネル）。外因性または内因性の特異的なトリガーなしで行ったトロンビン生成において、ＦＸＩＩ６１８は接触活性化をＣＴＩよりも有意に強く阻害した（遅延時間：それぞれ５５．８±３．７および３８．７±１．９ならびにピーク：それぞれ６０．３±０．８および７８．０±６．８；図５下段のパネル）。
【０１２５】
この二環式ペプチドを血液サンプリング後すぐに全血に添加すると、この二環式ペプチドはトロンビン生成をさらにより遅延できるかを、最後に検定した。トロンビン生成を血漿中で検定した。この阻害剤を血漿中に添加した実験と同様の結果が見られた。外因性または内因性の特異的なトリガーが存在しない場合において、ＦＸＩＩ６１８はトロンビンの活性化を未だ完全にブロックできた。この後者の発見は、この阻害剤を血液収集後すぐに添加することで、血液サンプリングチューブ中で起こるＦＸＩＩ活性化を抑制できることを示す。ＣＴＩと比較して改善したＦＸＩＩ６１８による接触活性化の阻害は、この合成阻害剤の潜在力を明らかにし、この合成阻害剤は低濃度ＴＦ診断検定においてＣＴＩに取って代わる。
【０１２６】
実施例１．７：マウスの内因性凝血の選択的阻害
ＦＸＩＩ６１８はマウスＦＸＩＩａと交差反応し、マウスにおいてその活性を検定することが可能である。マウスＦＸＩＩａにおけるＫｉ（２５２＋／−２９ｎＭ）はヒトＦＸＩＩａ（２２＋／−４ｎＭ）の１１倍高いため、ＦＸＩＩ６１８を、以前に記述された血漿カリクレイン（ＰＫ）の二環式ペプチド阻害剤ＰＫ１２８１９と組み合わせた。負に帯電した表面での少量のＦＸＩＩの活性化に際し、ＦＸＩＩａは、大量のＦＸＩＩと相互に活性化する血漿カリクレイン（ＰＫ）を活性化する。両方のプロテアーゼの阻害は、ＦＸＩＩの活性および活性化を阻害することによって、ＦＸＩＩａの相乗的な阻害をもたらす。３．５ｍｇ／ｋｇのＰＫ１２８と併用する３．５ｍｇ／ｋｇのＦＸＩＩ６１８の投与は、ＦＸＩＩの活性を４９．７＋／−１３．９％まで減らした。ヒト血漿中で得られたエクスビボのデータと一貫して、ＰＴ値は阻害剤処理（７．１＋／−０．２秒）とＰＢＳ対照マウス（６．７＋／−０．３秒）との間で同等であり、これは外因性経路が影響されないままであったことを示す。
【０１２７】
実施例２：ＦＸＩＩ６１８の天然および非天然アミノ酸置換
実施例２．１：試料と方法
二環式ペプチド合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸およびＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を用いる標準的な固相ペプチド合成によって、社内で合成した。アミノ酸を、カップリング試薬としてＨＢＴＵおよびＨＯＢｔを用いて、４倍モル過剰で２回カップリングした。非天然アミノ酸のカップリングを、２当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸、２当量のＨＡＴＵおよび４当量のＤＩＰＥＡを添加することによって、手動で行った。合成したペプチドは全て、フリーなＮ末端とアミド化されたＣ末端を有する。ペプチドを還元条件（９０％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％チオアニソール、２．５％フェノール、２．５％ １，２−エタンジチオール）下で樹脂から切断した。１ｍＭの未精製のペプチドを、７０％水溶性緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０）および３０％アセトニトリル中で、３０℃で１時間、１．５ｍＭ ＴＡＴＡと反応させた。環化したペプチドを、Ｃ１８カラムにおける逆相クロマトグラフィーによって精製した。純粋な二環式ペプチド（分析用ＨＰＬＣで確認した＞９５％の純度）を凍結乾燥し、水に溶かした。これらの質量をＥＳＩで確認した。
【０１２８】
プロテアーゼ阻害アッセイ
二環式ペプチドの阻害活性を、プロテアーゼとのインキュベーションおよび蛍光性の基質によるそれらの残効性の定量化によって、決定した。酵素の残効性を、１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖ トリトンＸ１００、および５％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯを含む緩衝液中で、１５０μＬの体積で測定した。第一の実験系列において、５０μＭの蛍光性の基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣおよび２．５ｎＭの酵素（ヒトβ−ＦＸＩＩａ、ＨＦＸＩＩＡＢ；Molecular Innovations）を用いた。後に、より感受性の高い基質Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用い、これは酵素濃度を０．５ｎＭに減らすことを可能にし、したがってより低いＫｉ値を測定できた。対照実験は、以下で言及する対応するＫＭ値を用いて、２つの異なる蛍光性の基質を比較することにより、非常によく似たＦＸＩＩａ阻害剤の阻害定数が得られたことを示した。
ペプチドの希釈を０．００００１〜４μＭの範囲で調製した。蛍光強度を、インフィニットＭ２００Ｐｒｏ蛍光プレートレーダー（３６８ｎｍの励起、４６７ｎｍの蛍光；Tecan, Mannedorf, Switzerland）で測定した。反応を２５℃で行った。シグモイド曲線を、下記の用量応答式を用いて、データにフィットし、ここでｘ＝ペプチド濃度、ｙ＝％ペプチドなしの反応の活性、Ａ１＝１００％、Ａ２＝０％、ｐ＝１であった。ＩＣ５０の値はフィットした曲線に由来する。
【数２】
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阻害定数Ｋｉを、チェン＝プルソフ式 Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｓ］０／Ｋｍ））に従って計算し、ここでＩＣ５０は阻害剤の機能的強度であり、［Ｓ］０は基質の全濃度であり、ＫＭはミカエリス・メンテン定数である。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣおよびＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの２つの基質におけるＫＭを、それぞれ１８０±３１および２５６±４２μＭと決定した（中間値±ＳＤ、ｎ＝４）。
【０１２９】
特異性の検定のために、下記の終濃度のヒトセリンプロテアーゼを用いた：ｔＰＡ(Molecular Innovations) ７．５ｎＭ、ｕＰＡ(Molecular Innovations) １．５ｎＭ、第ＸＩａ因子(Innovative Research, Novi, MI, U.S.) ６ｎＭ、ＰＫ(Innovative Research) ０．２５ｎＭ、トロンビン(Molecular Innovations) １ｎＭ、プラスミン(Molecular Innovations) ２．５ｎＭ、トリプシン(Molecular Innovations) ０．０５ｎＭ、第ＶＩＩａ因子(Haematologic Technologies Inc.) ５０ｎＭおよび第Ｘａ因子(Haematologic Technologies Inc.) ６ｎＭ。ペプチドの希釈を０．０４〜４０μＭの範囲で調製した。ＩＣ５０阻害定数の決定のため、下記の蛍光性の基質を終濃度５０μＭで用いた：Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（ＰＫにおいて；Bachem, Bubendorf, Switzerland）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（第ＸＩａ因子において；Bachem）、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（ｔＰＡ、ｕＰＡ、トロンビンおよびトリプシン；Bachem）、Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ（プラスミンにおいて；Bachem）およびＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＳＮＨ−Ｃ４Ｈ９（ＦＶＩＩａおよびＦＸａにおいて；Haematologic Technologies Inc.）。
【０１３０】
血漿安定性アッセイ
ペプチド（水中で２ｍＭ、２μＬ）を３９８μＬのヒト血漿（終体積４００μＬ中において、ペプチドの終濃度は１０μＭであった）に添加した。混合溶液を３７℃の水浴中でインキュベートした。８つの異なる時点（０時間、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間およびいくつかの場合において４８時間）において、３０μＬの試料を抜き取り、プロテアーゼ阻害アッセイ（上述）で用いたものと同じ緩衝液で２００μＬに希釈し、２０分間、６５℃で熱不活化した。この工程において、血漿中に存在するプロテアーゼは熱不活化され、さもなければこのプロテアーゼは続いて行われる酵素アッセイを妨害する。対照実験は、インキュベートしたペプチドが熱不活化の処置に完全な耐性を持ち、ペプチド阻害剤を持たない不活化された血漿が、酵素アッセイにおけるβＦＸＩＩａの活性にほんのわずかしか影響を与えないことを示した。血漿試料の熱不活化後、後者を、ＦＸＩＩａに対する阻害能をプロテアーゼ阻害アッセイで分析するまで、−２０℃で保持した。分析の前に、血漿試料を５分間、１６０００ｇで遠心し、上清を回収した。０．０００５〜０．５μＭの範囲の２倍の希釈系列を調製した。ＩＣ５０の値は、上記に示した式を用いてフィットした曲線に由来する。残余の阻害の百分率を、下記の式を用いて計算した：ＩＣ５０，０ｈ／ＩＣ５０，ｘｈ＊１００、ここでＩＣ５０，０ｈは、０の時点における阻害剤の機能的強度であり、ＩＣ５０，ｘｈは、上述の種々の血漿インキュベーション時間の一つの経過後における阻害剤の機能的強度である。
【０１３１】
ａＰＴＴおよびＰＴ凝血活性測定
ヒト血漿中の凝血時間（ａＰＴＴ、ＰＴ）を、凝血分析器(STart Hemostasis coagulation analyzer, Diagnostica Stago)を用いて決定した。外因性凝血をInnovin（安定化したＨＥＰＥＳ緩衝液系中の組換えヒト組織因子、合成リン脂質およびカルシウム；Dade Behring / Simens）で駆動した。内因性凝血をPathromtin* SL(Siemens)で駆動した。本研究で用いた、プールされた(pooled)標準ヒト血漿は、Innovative research (USA)によって提供された。
【０１３２】
実施例２．２：結果と考察
実施例２．２では、番号１から７３の、作製されたペプチドについて述べる。番号１のペプチドはＦＸＩＩ６１８である。番号３から７２のペプチドの構造的な特徴および阻害能をまた、図６に示す。番号７３のペプチドの構造的な特徴および阻害能を実施例において詳述する。
【０１３３】
阻害活性の改善
ＦＸＩＩａに対するファージ選定において単離されたペプチドの配列相同性に基づいて、ペプチド１の第一のリングの４つのアミノ酸（Ｐｈｅ３、Ａｒｇ４、Ｌｅｕ５、Ｐｒｏ６）および第二のリングの中間の２つのアミノ酸（Ｇｌｎ９、Ｌｅｕ１０）が結合に最も重要であると考えられる（図１）。ペプチド１の阻害能を改善する第一の試みにおいて、これらの位置のアミノ酸を、類似の側鎖を持つ天然アミノ酸へ置換することを選択した。別のアミノ酸による、アミノ酸の進化的置換可能性を示す、ＢＬＯＳＵＭ６２およびＰＡＭ２５０の２つのスコアマトリックス(scoring matrix) を用いて、適切なアミノ酸置換を選択した（図６）。吸収分光法による、合成されたペプチドの正確な定量化を可能にするため、トリプトファン残基を全てのペプチドのＣ末端に付加した。ペプチド２は２６±８ｎＭのＫｉ、つまりペプチド１と同等の活性を有する。６箇所の内の１つにおける単一のアミノ酸置換をそれぞれ有する、全２６種の二環式ペプチドを合成した。Ｋｉが改善したペプチドは無かったが、重要な構造−活性相関のデータが得られた。Ｐｈｅ３の位置において、フェニルアラニンのトリプトファンへの置換は活性を保存する（ペプチド３；Ｋｉ＝２６±２）。この位置における他の全てのアミノ酸置換は活性を２倍以上（チロシン、ロイシン、アラニン；ペプチド４−６）または１０倍以上（バリン、イソロイシン、プロリン；ペプチド７−９）減少させる。Ａｒｇ４の位置において、この残基は、ＦＸＩＩのＳ１結合ポケットの底部におけるアスパラギン酸とのイオン性相互作用を形成するための正電荷を有するべきであるため、リジンへの置換のみを検定した。この位置におけるリジンは阻害活性を１０倍減少させた（ペプチド１０；Ｋｉ＝２８３±２１）。Ｌｅｕ５の位置において、全ての置換（バリン（ペプチド１１）またはロイシン（ペプチド１２）などのロイシンに非常によく似たアミノ酸への置換でさえ）は、親和性を５０倍以上減少させた。この位置にメチオニン（ペプチド１３）またはアラニン（ペプチド１４）を含むペプチドは、最も高濃度（３μＭ）の検定においても、ＦＸＩＩａを全く阻害しなかった。Ｐｒｏ６の位置において、２つのアミノ酸置換（すなわちアラニン（ペプチド１５）およびロイシン（ペプチド１８））は活性の減少が２倍未満であった。第二の大環状リングにおいて、全ての置換は、ペプチド２の活性を大幅に減少させた。Ｇｌｎ９の位置では、アスパラギン酸（ペプチド２１；５４倍）において最小限の損失が確認され、Ｌｅｕ１０では、イソロイシン（ペプチド２６；８倍）において最小限の損失であることがわかった。
【０１３４】
ペプチド１の活性を改善する第二の試みでは、アミノ酸を、元のアミノ酸と構造的によりよく似ている非天然の残基に置換することを選択した（図６）。Ｐｈｅ３の位置において、フェニルアラニンおよびトリプトファンを有するペプチドの活性が最も高かった（ペプチド２および３）ため、フェニルアラニン（ペプチド２９−３２）およびトリプトファン（ペプチド３３−３７）に類似の非天然アミノ酸を検定した。２つのフェニルアラニン類似体（ペプチド２９および３０）は活性を約３０倍減少させ、残りの２つ（ペプチド３１および３２）は最も高濃度（１μＭ）での検定においてもＦＸＩＩａを阻害しなかった。トリプトファン類似体の５種のペプチドのうち１種は活性をわずかに改善させた：２−ナフチルアラニンを含むペプチド３３は、阻害活性を２倍に改善させた（Ｋｉ＝１２±４）。Ａｒｇ４の位置において、アミノ酸を１種のリジン類似体（ホモリジン；ペプチド３８）および３種のアルギニン類似体（ホモアルギニン、ノルアルギニンおよび４−グアニジノフェニルアラニン；ペプチド３９−４１）に置換した。これら全ての置換は、ペプチドの結合親和性を５倍またはそれ以上減少させた。Ｌｅｕ５およびＬｅｕ９の２つの位置において、ロイシンに構造的に似た数種の脂肪族アミノ酸を検定した。Ｌｅｕ５の位置において、これらの置換はペプチドの結合親和性を大きな倍数で減少させ、ここでノルバリンにおいて親和性の最も小さな減少が見られた（ペプチド４２）。Ｌｅｕ１０の位置において、５つの全ての非天然アミノ酸は親和性の減少を８倍未満とした。
【０１３５】
一度に一つのアミノ酸のみを置換し、挿入されたアミノ酸のほとんどは置換されたアミノ酸に構造的に類似していたという事実にもかかわらず、上述の４８種のペプチド変異体の多くは、活性を大幅に減少させた。ペプチド１は、ＦＸＩＩａの表面に相補的な形状に進化した可能性が高く、ほとんどのアミノ酸の位置において、より大きな構造変化を許容しない。リガンドと標的との間の構造形状の高い相補性は、Ｘ線結晶学によって研究された全ての二環式ペプチドにおいて、以前に見出された。ペプチド１の阻害活性を改善する第三の試みでは、側鎖においてさらに小さな構造変化をもたらすアミノ酸置換を検定することを目的とした。Ｐｈｅ３の位置は、２つの非天然アミノ酸への置換によってわずかに改善した阻害剤をもたらした唯一の部位であるため（図６）、Ｐｈｅ３の位置を改変することを選択した。Ｐｈｅ３のフェニル基のオルト位（ペプチド５１）およびパラ位（ペプチド５３）へのメチル基の付加は、活性を約５倍減少させた。対照的に、メタ位におけるメチル基は親和性を２．５倍向上させた（ペプチド５２；Ｋｉ＝１０．４±０．６）。これらの結果は、フェニルアラニン側鎖の周りには利用できる空間があるが、この空間は制限されていることを示した。次に、既存の原子を置換し、さらに小さい構造変化を調べた。フェニル環のメタ位における炭素原子の窒素原子への置換は、活性を約３倍改善した（ペプチド５４；Ｋｉ＝８．４±０．３）。パラ位における同様の置換は、阻害活性を約６倍減少させた（ペプチド５５）。フェニル環の水素原子のハロゲン原子への置換は、活性を両方向に劇的に変えた。メタ位におけるフッ素は活性を２．５倍減少させた（ペプチド５７）。対照的に、オルト位およびパラ位におけるフッ素は、活性をそれぞれ２倍および１１倍増強した（ペプチド５６：Ｋｉ＝１３．１±１．２；ペプチド５８：Ｋｉ＝２．３１±０．３６）。パラ位のフッ素に起因する大きな改善は、電子分布の変化に起因している可能性が最も高い。ペプチド１とＦＸＩＩａの相互作用の構造モデリングは、フェニルアラニンが芳香族のポケットに埋まり、Ｔｙｒ４３９およびＨｉｓ３９３と相互作用していることを示唆する。ペプチドのフェニル環におけるフッ素などの電子吸引基の存在は、プロテアーゼのチロシン残基とのπ−πスタッキング相互作用の強度を増大し、従ってより高い結合親和性をもたらす可能性がある。次に、フェニル環の電子分布に影響を与えるパラ位のより多くの置換基を検定した。ヨウ素の付加は、活性を１０倍を超えて減少させ（ペプチド５９）、ニトロ基は結合親和性を６倍改善した（ペプチド６０；Ｋｉ＝４．５±０．７）。最後に、ペプチド５８の変異体を、吸収に基づく濃度の正確な定量化を可能にする２８０ｎｍでの大きな吸光係数のためにのみ導入された、Ｃ−末端のトリプトファンを欠失させて、合成した。フェニルアラニン上のパラ−フルオロ原子のみがペプチド１と異なる、結果的に得られたペプチド６１は、２．０１±０．０７ｎＭのＫｉを有していた。この二環式ペプチド６１（ＦＸＩＩ８００とも呼ばれる）は、１桁のナノモル濃度の阻害定数を有する最初の合成ＦＸＩＩａ阻害剤である。
【０１３６】
タンパク質分解の安定性の改善
二環式ペプチド１は、３７℃で長時間（ｔ１／２＝３．９±１．９ｈ）ヒト血漿中でインキュベートすると、タンパク質分解によって不活化することがわかった。我々の先行研究で示すように、４時間の半減期は、インビトロの適用において用いた血漿試料中で接触活性化をブロックするのに十分であるが、ＦＸＩＩａをより長期間にわたって阻害する必要のある臨床適用においては不十分な長さであり得る。ヒト血漿中でインキュベートしたペプチド１の質量分光分析は、第一のタンパク質分解性の改変が、アルギニンの質量に対応する１５６Ｄａの断片の除去であることを示した。Ｎ末端およびＣ末端にアルギニンを持たない二環式ペプチドは、それぞれ９３２±８０ｎＭ（ペプチド６２）および２８．８±２．０ｎＭ（ペプチド６３）のＫｉを有した。この結果は、血漿のプロテアーゼはＮ末端のアルギニンを切り取ることを示唆する。安定性の改善に向けて、ｉ）結合親和性を大きく減少させず、ｉｉ）最初のアミノ酸のタンパク質分解性の切断を防ぐ、Ａｒｇ１の位置におけるアミノ酸置換を調べた（図６）。Ａｒｇ１を置換した二環式ペプチドを、Ｃ末端のトリプトファン残基なしで合成した。Ａｒｇ１の位置におけるイソロイシン、バリンおよびアラニンなどの天然アミノ酸は、親和性を＞５倍減少させた（ペプチド６４−６６）。リジンへの置換は結合親和性を保存し（ペプチド６７；２７．４±３．８）、これは側鎖の正電荷が重要であることを示唆する。Ｄ−アルギニンは結合親和性を３倍減少させた（ペプチド６８；Ｋｉ＝８９．４±２．３）。この構造−活性のデータに基づいて、正に帯電した側鎖を持つ多くの非天然アミノ酸を検定した（ペプチド６９−７２）。これらのアミノ酸を有するペプチドはわずかに低いまたは高い親和性を有し、１８．５ないし４３．１ｎＭのＫｉであった。
【０１３７】
次に、二環式ペプチド６９−７２の安定性を、１０μＭのそれらをヒト血漿中で３７℃、種々の期間インキュベートし、残余の阻害活性を測定することによって検定した。血漿のプロテアーゼの活性を、試料を６５℃で１０分間インキュベートすることにより、熱不活化した。熱処理は、二環式ペプチドの活性に影響を与えなかった。４つのペプチドの内２つは、ペプチド１と比較して安定性が改善した（図１０ａ）。最も長い半減期は、Ｎ末端にノルアルギニン残基を有するペプチド７１において見られた。ペプチド７１は２１．７±２．５時間の半減期、つまりペプチド１と比較して５．５倍改善された安定性を有していた。次に、ノルアルギニン置換を、ペプチド１の阻害活性を最も良く改善したアミノ酸置換（３番目における４−フルオロフェニルアラニン）と組み合わせた。得られたペプチド７３（ＦＸＩＩ８０１とも呼ばれる）は３．９０±０．４３ｎＭのＫｉおよび１５．５±３．９時間の血漿の半減期を有していた。
【０１３８】
標的選択性
ペプチド７３の標的選択性を、構造的に関連し、または機能的に重要なプロテアーゼの阻害を測定することによって評価し、ペプチド１の特異性プロファイルと比較した。１０種のプロテアーゼの内８種は、最も高濃度（４０μＭ）の検定において、２０％未満が阻害された。２種のパラロガスなプロテアーゼのみがペプチド７３によって阻害された（すなわち、トリプシン（１．３０±０．０１μＭ）および血漿カリクレイン（４５．１±１．５μＭ））。同じ２種のプロテアーゼは、ペプチド１によっても同程度阻害された。したがって、これらの結果は、ＦＸＩＩａに対する親和性は改善できたが、他のプロテアーゼに対する活性は実質的に変化しないままであったことを示した。それ故、この新規のＦＸＩＩａ阻害剤ペプチド７３はトリプシン（血中に存在しないプロテアーゼ）に対する３００倍高い選択性および他の血漿のプロテアーゼに対する少なくとも１１，０００倍の選択性を示す。
【０１３９】
内因性凝血経路の阻害
内因性凝血経路を選択的に抑制する能力を、インビトロの凝血アッセイにおいて評価した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）
は、内因性経路（ａＰＴＴ）または外因性経路（ＰＴ）のいずれかを介する凝血の開始に際して、凝血までの時間を測定する。これらの検定を、種々の濃度のＦＸＩＩａ阻害剤存在下において、ヒト血漿中で行った。選択的なＦＸＩＩａ阻害では、ａＰＴＴは増加するが、ＰＴは増加しないことが予期される。凝血検査を、優れた阻害活性を有するペプチド６１、およびわずかに活性が低いが、より安定な変異体であるペプチド７３について、従前開発されたＦＸＩＩａ阻害剤ペプチド１と比較して行った。ペプチド阻害剤の存在は、濃度依存的にａＰＴＴを延ばしたが（図１１ａ）、全てのペプチドの検定において、４０μＭの濃度においても、ＰＴはほとんど影響されないままであった（図１１ｂ）。５μＭのペプチド阻害剤において、内因性経路を介する凝血は１２０秒以内で起こらなかった。さらに、ＦＸＩＩａに対する阻害活性とａＰＴＴ延長の程度との間に相関があった。ペプチド６１および７３は、ペプチド１と比較して、有意にａＰＴＴの延長を増加させた。
【０１４０】
実施例３：ＦＸＩＩ６１８の大環状リング内の変化
実施例３．１：試料と方法
試料
Ｆｍｏｃ−Ｌ−α−アミノ酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）およびＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を、GL Biochem（China）から購入した。Ｆｍｏｃ−β−アミノ酸を、Chemimpex（USA）およびPolypeptide（France）から購入した。
【０１４１】
ペプチド合成
ペプチドを、Advanced ChemTech３４８オメガペプチド合成機(Aapptec, USA)で、標準的なＦｍｏｃの手順を用いる固相ペプチド合成（０．０３ミリモルスケール）によって、合成した。ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を固相担体に用い、ＤＭＦを溶媒に用いた。各アミノ酸（ＤＭＦ中で４当量、０．２Ｍ）を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（ＤＭＦ中で４当量、０．４５Ｍ）およびＤＩＰＥＡ（ＤＭＦ中で６当量、０．５Ｍ）を用いて、二回カップリングした。カップリング反応後、樹脂をＤＭＦで４回洗浄した。Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで除去した（ＲＴ、２ｘ５分、４００ｒｐｍ）。脱保護後、樹脂をＤＭＦで５回洗浄した。
【０１４２】
樹脂からのペプチド切断
５ｍＬ切断混合物（９０％ｖ／ｖ ＴＦＡ、２．５％ｖ／ｖ １，２−エタンジチオール、２．５％ｗ／ｖフェノール、２．５％ｖ／ｖチオアニソール、２．５％ｖ／ｖ Ｈ２Ｏ）と、振盪しながら２時間インキュベートすることにより、ペプチドの側鎖を脱保護し、ペプチドをＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂から切断した。樹脂を真空濾過によって除去し、ペプチドを氷冷したジエチルエーテル（５０ｍＬ）で沈殿させ、−２０℃で３０分インキュベートし、４０００ｒｐｍ（２７００ｇ）で５分間遠心することによりペレット状にした。ジエチルエーテルを捨て、次いで沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄した。残った溶媒をＲＴでエバポレートした。
【０１４３】
ＴＡＴＡによるペプチド環化
未精製のペプチド（典型的に、約５０ｍｇ）を６ｍＬの３３％ＭｅＣＮおよび６７％Ｈ２Ｏに溶解した（約３．５ｍＭの濃度となる）。この溶液に、ＭｅＣＮ中の１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）（１０ｍＭ、１．２当量）を添加した。脱気した水溶性ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（６０ｍＭ、ｐＨ＝８．０）を、ペプチドの終濃度が１ｍＭとなるまで添加することによって、反応を開始した。反応溶液を３０℃の水浴で１時間放置し、その後凍結乾燥した。
【０１４４】
逆相ＨＰＬＣによるペプチド精製
修飾したペプチド粉末を、１ｍＬ ＤＭＳＯ、０．１％ＴＦＡを含む２ｍＬ ＭｅＣＮおよび０．１％ＴＦＡを含む７ｍＬ Ｈ２Ｏ中に溶解し、調製用のＣ１８カラム(Vydac C18 TP1022 250, 22 mm, 10 mm)上で、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）に対する溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）の直線勾配（１３分、１５〜２８％、流速：２０ｍＬｍｉｎ−１）を用いて精製した。所望の生成物のピークを、ＥＳＩ−ＭＳ分析によって同定し、凍結乾燥した。
【０１４５】
プロテアーゼ阻害アッセイ
合成した二環式ペプチドの阻害活性を、プロテアーゼとのインキュベーションおよび蛍光性の基質を用いる種々のペプチド濃度での残効性の定量化によって決定した。Ｈ２Ｏ中の２ｍＭ（重量で）原液を各ペプチドにおいて作製した。アッセイにおいて、系列希釈を、ペプチド原液から、１０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ（６水和物）、１ｍＭ ＣａＣｌ２（２水和物）、０．０１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび７．４に調製したｐＨを含む水溶性の緩衝液を用いて作製した。ヒトβ−ＦＸＩＩａ（ＨＦＸＩＩＡＢ；Molecular Innovations）の終濃度は１ｎＭまたは０．５ｎＭであった。ペプチドの希釈液を、親和性に依存する３０００〜０．１ｎＭの範囲で作製した。蛍光性の基質Ｂｏｃ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−ＡＭＣ(Bachem)の終濃度は５０μＭであり、ＤＭＳＯの最終的な含量は５％であった。蛍光を、３６８ｎｍの励起および４６７ｎｍの蛍光において、フィルターを備えるインフィニットＭ２００Ｐｒｏプレートレーダー（Tecan）を用いて測定した。測定を、２５℃で、毎分の読み取りによって、６０分間行った。ＩＣ５０およびＫｉ値を、グラフパッドプリズム５ソフトウェアを用いて計算した。
【０１４６】
凝血アッセイ
凝血時間（ａＰＴＴおよびＰＴ）を、ヒト血漿中において、STAGO STart4 Coagulation analyzer (Diagnostica)を用いて、製造者の説明書に従って、決定した。外因性凝血をInnovin（安定化したＨＥＰＥＳ緩衝液系中の組換えヒト組織因子、合成リン脂質およびカルシウム；Dade Behring / Simens）で駆動した。内因性凝血をPathromtin* SL(Siemens)で駆動した。本研究で用いたヒト単一ドナー血漿は、Innovative research (USA)によって提供された。
【０１４７】
実施例３．２：結果と考察
実施例３．２では、番号１および７４から１０７のペプチドの作製について述べる。番号１のペプチドはＦＸＩＩ６１８である。番号７４から１０６のペプチドの構造的な特徴および阻害能をまた、図６に示す。番号１０７のペプチドの構造的な特徴および阻害能を実施例において詳述する。
【０１４８】
この実施例において、二環式ペプチドＦＸＩＩ阻害剤ＦＸＩＩ６１８を、側鎖では無く骨格を変えることにより、親和性成熟させた（１）。特に、大環状リングの種々の位置に炭素原子を挿入することが提案された。拡大したリングサイズを有するペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングにおいてサンプリングされなかったと考えられる。さらに、骨格のいくつかの部位に炭素原子を挿入することは、環状ペプチド内のいくつかの官能基のより良い配置を可能にし、次に既存の分子間相互作用の強度を潜在的に向上できることが推測された。ペプチドリガンドの大環状リング内の異なる位置における単一の炭素原子の挿入または欠失は、結合親和性を改善する体系的な手法として報告されたことはない。文献において記述されるいくつかの例では、ペプチドを環化する部位において、原子を挿入または欠失した。
【０１４９】
ペプチドの大環状リング内に炭素原子を挿入するための技術的に単純かつ速い戦略は、基準のα−アミノ酸をアミノ基とカルボキシ基との間に追加の炭素原子を含むβ−アミノ酸に置換することである（図１２ａ）。β−アミノ酸は、αヘリックス状のペプチドの安定性を改善するために広く用いられてきた３１−３４。いくつかの研究では、副甲状腺ホルモンレセプター１アゴニスト３５またはＺドメインに基づいて設計されたＶＥＧＦシグナル伝達阻害剤３６における例のように、β−アミノ酸は安定性に加えて結合親和性をも改善した。ＦＸＩＩ６１８（１）の親和性成熟に向けて、２つの大環状リングの種々の位置のα−アミノ酸をβ−アミノ酸に置換することを選択した。
【０１５０】
炭素原子の挿入がＦＸＩＩ６１８の結合親和性を潜在的に改善するようなアミノ酸の位置を同定するため３７、２系列のペプチド変異体を合成した：一方は個々のアミノ酸をβ−アラニンに置換し、他方は個々のアミノ酸をグリシンに置換した（図６）。特定の位置にβ−アラニンおよびグリシンを含むペプチドの比較は、アミノ酸側鎖に依存せずに、追加の炭素原子がＦＸＩＩへの結合を増強するかの理解を可能にする。Ｐｈｅ３、Ａｒｇ４およびＬｅｕ５のβ−アラニンへの置換（７４、７６、７８）は阻害剤を完全に不活化し、これらの位置にグリシンを有するペプチド（７５、７７、７９；２μＭにおいて阻害なし）との比較はできなかった。Ｐｒｏ６の、β−アラニン（８０）およびグリシン（８１）への置換は、それぞれ親和性を５．５倍および２２倍減少させた。β−アラニン変異体において見られた結合親和性のより小さな減少は、この位置への単一の炭素原子の挿入がＦＸＩＩへの結合を増強することを示唆する。おそらく、追加の柔軟性が、二環式ペプチドが一つまたはいくつかの既存の非共有相互作用を増強するような立体構造をとることを可能にした。Ａｒｇ８におけるアミノ酸置換は反対の効果となり、β−アラニンを有するペプチドにおいてより大きな親和性の減少をもたらした（８２，８３）。Ｇｌｎ９およびＬｅｕ１０の位置において、β−アラニンおよびグリシンへの置換は、親和性を同様に約２００倍減少させた（８４、８５、８６、８７）。最後に、Ａｒｇ１１の位置において、親和性の減少は小さく、β−アラニン変異体（８８）とグリシン変異体（８９）で類似していた（５倍）。親和性の損失が小さいため、アルギニン側鎖を持つβ−アミノ酸の挿入には、ＦＸＩＩ６１８の親和性を改善し得る現実的な可能性があった。
【０１５１】
β−アラニン／グリシンの選別の結果に基づいて、Ｐｒｏ６およびＡｒｇ１１を
適切な側鎖を持つβ−アミノ酸の挿入において最も有望な位置として考慮した。β−アミノ酸はα（Ｃ２）炭素またはβ（Ｃ３）炭素のいずれかに側鎖を有し得、それぞれβ２−残基およびβ３−残基と表記した。これらの炭素原子はＲ配置またはＳ配置をとり得るため、所定の側鎖において４つのジアステレオ異性体のβ−アミノ酸が存在する。Ｐｒｏ６を第一に、様々な環状β−アミノ酸に置換した（図６）。これら全ての置換は、阻害活性を少なくとも１００倍減少させ、または完全に不活化させた（９０−９４）。環状β−アミノ酸は、ＦＸＩＩ６１８に、効率的なＦＸＩＩへの結合を妨げる構造的な制約を明らかに課した。Ｐｒｏ６を炭素３、炭素２またはアミノ基のいずれかと結合するメチル基を有する非環状β−アミノ酸に置換したペプチドを、次に合成した（９５−９９；図６）。メチル基は、プロリンの側鎖における３つの炭素原子の内１つによって形成される相互作用を取って代わることができると考えられる。これらのペプチドの内３つ（９５、９８、９９）は、中程度のマイクロモル濃度範囲の阻害定数を有したが、これらは全て、この位置にβ−アラニンを持つペプチドよりも低いＫｉであった。β−アラニン置換を許容すると同定された第二の位置はＡｒｇ１１であった。このアミノ酸を、Ｌ−Ａｒｇに最も構造的に似ているβ３−アミノ酸に置換した（Ｃ３においてＳ配置；（Ｓ）−β３−ホモアルギニン）（１００）。この置換は、４倍改善されたＫｉを有するペプチドをもたらした（この二環式ペプチドをＦＸＩＩ７００と名付けた；５．４±０．１ｎＭ；図６）。この位置にβ−アラニンおよびグリシンを持つ２つのペプチドは同等の親和性を有していたため、（Ｓ）−β３−ホモアルギニンによって達成された大きな親和性の改善は、Ｌ−Ａｒｇよりもβ３−アミノ酸におけるより良いアルギニン側鎖の相互作用に由来している可能性がある。
【０１５２】
二環式ペプチドＦＸＩＩ６１８（１）のリング系内への炭素原子の挿入における別の効率的な合成戦略は、システインを、ホモシステインまたは５−メルカプトノルバリン（それぞれ１つおよび２つの追加の炭素原子を側鎖内に有する）に置換することである。ＦＸＩＩ６１８（１）の６種の変異体を合成し、それぞれは３つのシステインのうち１つを２つのシステインホモログのいずれかに置換した（図６）。Ｃｙｓ１２のホモシステインへの置換は結合を１．３倍改善した（番号１０５のＫｉ＝１６．３±３ｎＭ）。他の２つのシステインの置換は、結合性を減少させた。優れたＫｉを有する二環式ペプチド１０５をＦＸＩＩ７０１と名付けた。優れた親和性改善をもたらした２つの修飾（Ａｒｇ１１の（Ｓ）−β３−ホモアルギニンへの置換およびＣｙｓ１２のホモシステインへの置換）を次に組み合わせた。得られたペプチド（１０７）は１８±２ｎＭのＫｉを有し、これは２つの修飾がさらなる親和性の増強を提供しないことを示す。Ａｒｇ１１およびＣｙｓ１２は近接しているため、２つの修飾によって達成された親和性改善の分子基盤は関連しており、したがって相加的でなかった可能性がある。この２つの位置における炭素原子の挿入は、大環状リングのこの領域における小さな構造変化を可能にし、分子間相互作用の質を（アルギニン側鎖の相互作用の例のように）改善した可能性がある。
【０１５３】
まとめると、インビトロで進化した環状ペプチドリガンドの結合親和性を、１つまたは２つの炭素原子によって、大環状リングのサイズを変えることにより、改善できた。この化学的な余地は、遺伝的にコードされた環状ペプチドライブラリーのスクリーニングによってサンプリングされず、わずかに改善されるリガンドの豊富な供給源を潜在的に提供できると考えられる。実際、二環式ペプチドＦＸＩＩ阻害剤ＦＸＩＩ６１８の３４種のみの変異体の合成およびスクリーニングは、大幅に改善されたＫｉを有する２つの阻害剤をもたらした。
【０１５４】
実施例４：ＦＸＩＩ６１８の連結分子の置換
ペプチドＦＸＩＩ６１８（ＲＣＦＲＬＰＣＲＱＬＲＣＲ）を下記のリンカーで修飾した。
【化１】
2018521960.tif 000004
修飾プロトコル：
合成ペプチドを、水溶性緩衝液ＮＨ４ＨＣＯ３（６０ｍＭ）ｐＨ８．０に終濃度１ｍＭとなるように溶解した。アセトニトリルに溶解したリンカーをペプチドに添加し、１．５ｍＭの終濃度および２０％アセトニトリルとした。反応溶液を３０℃の水浴で１時間保持した。反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０１５５】
プロテアーゼ阻害アッセイ：
残効性を、１０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０１％ ｖ／ｖ トリトンＸ１００および５％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯを含む緩衝液（１５０μＬ）中で測定した。ヒトベータ第ＸＩＩ因子(Innovative Research)の終濃度は１０ｎＭであった。（７−アミノ−４−メチルクマリン）由来の蛍光性の基質であるＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ(Bachem)を終濃度５０μＭで用いた。蛍光強度を、インフィニットＭ２００Ｐｒｏプレートレーダー（３６８ｎｍの励起、４６８ｎｍの蛍光）で測定した。読み取りを３回測定した。
【０１５６】
阻害定数Ｋｉを、チェン＝プルソフ式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｓ］０／ＫＭ））に従って計算し、ここでＩＣ５０は阻害剤の機能的強度であり、［Ｓ］０は基質の全濃度であり、ＫＭはミカエリス・メンテン定数である。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣにおけるＫＭは１８０μＭである。
Ｋｉ値：
ＦＸＩＩ６１８−ＴＡＴＡ：２４．９±５．７ｎＭ
ＦＸＩＩ６１８−ＴＢＡＴ：３３８±３２ｎＭ
ＦＸＩＩ６１８−ＴＢＭＴ：１２１８±９４ｎＭ
ＦＸＩＩ６１８−ＴＡＴＡ、ＦＸＩＩ６１８−ＴＢＡＴおよびＦＸＩＩ６１８−ＴＢＭＴの活性および特異性をまた、図１４に示す。
【０１５７】
実施例５：ＦＸＩＩ６１８におけるアルギニンの変異およびＦＸＩＩ６１８における有利なアミノ酸置換の組み合わせ
実施例５．１：ＦＸＩＩ６１８のＡｒｇ８およびＡｒｇ１１の位置におけるアミノ酸の変異
これら２つの位置は、最初の親和性成熟の試みにおいて、徹底的に改変されてはいなかった。これら２つの位置における置換を伴うペプチドを合成し、ヒトＦＸＩＩａおよびマウスＦＸＩＩａの阻害ならびに安定性を検定した。下記のペプチドは、マウスＦＸＩＩａにおいて改善した活性を示し、大きく改善した安定性をもたらした。
【表１】
2018521960.tif 000005
【０１５８】
実施例５．２：タンパク質分解の安定性を改善するＦＸＩＩ６１８のアミノ酸Ａｒｇ１の変異
阻害剤のタンパク質分解の安定性をさらに改善するため、Ｎ末端へのアミノ酸の追加を検定した。具体的には、Ｄ−アミノ酸をスクリーニングし、１番目のＬ−Ａｒｇ（Ａｒｇ１）を２つのＤ−アミノ酸で置換した。Ａｒｇ１置換のうち、下記のペプチドが最も良い阻害活性を示した。
【表２】
2018521960.tif 000006
【０１５９】
実施例５．３：有利な変異の組み合わせ
実質的な改善を与えるＦＸＩＩ６１８のアミノ酸置換の全体像
Ａｒｇ１−＞Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｒｓ）：Ｋｉ（ヒトＦＸＩＩａ）＝１８±４ｎＭ
Ｐｈｅ３−＞４−フルオロフェニルアラニン（Ｆ４Ｆ）：Ｋｉ（ヒトＦＸＩＩａ）＝２．０±０．３ｎＭ
Ａｒｇ８−＞Ｈｉｓ（Ｈ）：Ｋｉ（ヒトＦＸＩＩａ）＝２１．６±４ｎＭ
Ａｒｇ１１−＞（Ｓ）−β３−ホモアルギニン（Ｒｂ）：Ｋｉ（ヒトＦＸＩＩａ）＝５．４±０．１ｎＭ
３つまたは４つの有利な変異の組み合わせ
【表３】
2018521960.tif 000007
Ｎ．Ｄ．＝未決定
【０１６０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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