(57)【要約】  ＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する物質を含む肥満診断用組成物及びキット、それを利用した肥満を診断する方法を利用すれば、肥満を効率的に診断することができ、またＴＭ４ＳＦ１９を阻害する肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法によって、肥満を治療することができる候補物質を効率的に選別することができる。
2018521332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質、あるいはその断片に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはポリペプチド、あるいは前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブ、プライマーセットまたはヌクレオチドを含む肥満診断用組成物。
【請求項２】
前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、配列番号５ないし８のうちいずれか一つの配列を含むものであり、前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１ないし４のうちいずれか一つの配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体、抗原結合断片またはポリペプチドは、ＴＭ４ＳＦ１９の膜貫通ドメインｄ及び／またはそのリンカー地域に結合することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の組成物、及びそれを検出するための試薬を含む肥満診断用キット。
【請求項５】
個体から分離された試料と、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質、あるいはその断片に特異的に結合する抗体、ペプチド、タンパク質、またはそれらの組み合わせ、あるいは前記ＴＭ４ＳＦ１９をコーディングするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブ、プライマー、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させて形成される複合体から、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する方法。
【請求項６】
前記発現量測定は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ）、ノーザンブロッティング、及びＤＮＡチップから選択された１以上の方法によることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現量測定は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）またはタンパク質チップから選択された１以上の方法によることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記試料は、個体の脂肪前駆細胞または脂肪細胞を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーターヌクレオチド配列を含む細胞に試験物質を接触させる段階と、
前記細胞において、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター活性を測定する段階と、
前記ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター活性が対照群に比べて低下する試験物質を選別する段階と、を含む肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
前記プローモーターヌクレオチド配列は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングする配列の５’末端から、−８０２配列ないし−１９６４配列であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列を含む細胞に試験物質を接触させる段階と、
前記試料において、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列と複合体を形成し、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の機能を阻害する、あるいはＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現を阻害する試験物質を選別する段階と、これらを含む肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
前記試験物質は、ＴＭ４ＳＦ１９の膜貫通ドメインｄ及び／またはそのリンカー地域に結合することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験物質は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質とＧｒｐ７８タンパク質との結合を阻害することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験物質は、脂肪前駆細胞の分化を阻害することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する物質を含む肥満診断用組成物及びキット、及びそれを利用した肥満を診断する方法、及びＴＭ４ＳＦ１９を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満（obesity）は、体脂肪が健康に有害な影響を及ぼすほどに過度に蓄積された医学的状態をいう。肥満は、各種成人病の発病と非常に深い関連性があり、肥満度が高くなるほど、糖尿病、胆石症、高血圧、心臓疾患及び脳卒中を含む多様な疾病の有病率が上昇する。
【０００３】
肥満は、遺伝的、文化的、環境的な要因など複合的原因によって発生する。特に、現代に入っては、過多な熱量摂取または高脂肪食餌による肥満の有病率が上昇している。
【０００４】
肥満は、体質量指数（ＢＭＩ：body mass index）、体脂肪率及び胴回りなど多様な尺度による診断が可能である。しかし、かような診断方法は、限定された身体的特性だけに依存する診断方法であるために、それらの尺度だけでは、肥満の正確な診断は困難である。従って、肥満を起こす生物学的メカニズムを基に、肥満診断に使用されるバイオマーカーを発掘し、それを利用して、高い正確度で肥満を診断することができる方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一様相は、ＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する物質を含む肥満診断用組成物及びキットを提供する。
【０００６】
他の様相は、個体の肥満を診断するためのＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する方法を提供する。
【０００７】
他の様相は、ＴＭ４ＳＦ１９を阻害する肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質、またはその断片に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはポリペプチド、あるいは前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブ、プライマーセットまたはヌクレオチドを含む肥満診断用組成物を提供する。
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、前記組成物、及びそれを検出するための試薬を含む肥満診断用キットを提供する。
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、個体から分離された試料と、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質、あるいはその断片に特異的に結合する抗体、ペプチド、タンパク質、またはそれらの組み合わせ、あるいは前記ＴＭ４ＳＦ１９をコーディングするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブ、プライマー、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体からＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する方法を提供する。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列を含む細胞に試験物質を接触させる段階と、前記試料において、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列と複合体を形成し、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の機能を阻害する、あるいはＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現を阻害する試験物質を選別する段階と、これらを含む肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
一様相によるＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する物質を含む肥満診断用組成物及びキットは、肥満診断に効率的に使用される。
【００１３】
他の様相による個体の肥満を診断するためのＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する方法は、肥満診断に効率的に使用される。
【００１４】
他の様相によるＴＭ４ＳＦ１９を阻害する肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法によれば、肥満を治療することができる候補物質を効率的に選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】食餌によるＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡ発現量を、ｍＲＮＡシーケンシング分析を介して測定した結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】食餌によるＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲで増幅して測定した結果を示す図面である。
【図２】脂肪前駆細胞の培養及び分化のモデルを示す模式図である。
【図３】脂肪細胞の分化時、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量増加を示す模式図である。
【図４Ａ】ＴＭ４ＳＦ１９過発現脂肪前駆細胞株と対照群との経時的脂肪蓄積を比較したところを示すイメージである。
【図４Ｂ】ＴＭ４ＳＦ１９過発現脂肪前駆細胞株と対照群との経時的脂肪蓄積を、ＯＤ４２０の光学密度を測定して定量したところを示すグラフである。
【図５Ａ】ＴＭ４ＳＦ１９の過発現が、脂肪分化マーカーであるＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡの発現を増加させたところを示すグラフである。
【図５Ｂ】ＴＭ４ＳＦ１９の過発現が、脂肪分化マーカーであるＰＰＡＲγｍＲＮＡの発現を増加させたところを示すグラフである。
【図６】ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株の脂肪細胞分化マーカーの発現量をタンパク質レベルで測定したところを示す図面である。
【図７】脂肪前駆細胞の分化前後において、ＴＭ４ＳＦ１９と結合するタンパク質を免疫沈降反応させたところを示す図面である。
【図８Ａ】食餌によるＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡの相対的な発現量を示すグラフである。
【図８Ｂ】食餌によるＧｒｐ７８ｍＲＮＡの相対的な発現量を示すグラフである。
【図９Ａ】脂肪細胞分化前後のＴＭ４ＳＦ１９及びＧｒｐ７８の細胞内結合を示す図面である。
【図９Ｂ】２９３Ｔ細胞で過発現されたＴＭ４ＳＦ１９及びＧｒｐ７８の結合を示す図面である。
【図１０】ＴＭ４ＳＦ１９の欠失コンストラクトを示す模式図である。
【図１１】ＴＭ４ＳＦ１９の欠失突然変異とＧｒｐ７８との結合有無を示す図面である。
【図１２】ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株において、Ｇｒｐ７８の発現を抑制した場合、脂肪細胞分化マーカーの発現が減少したところを示す図面である。
【図１３】ＴＭ４ＳＦ１９プローモーター部位の欠失コンストラクトを示す模式図である。
【図１４】ＴＭ４ＳＦ１９の欠失プローモーターコンストラクトを製造し、そのプローモーター活性を測定したところを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一様相は、膜貫通４Ｌ ６ファミリメンバー１９（ＴＭ４ＳＦ１９：transmembrane ４ Ｌ six family member）の発現量を測定することができる物質を含む肥満診断用組成物を提供する。
【００１７】
前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、ヒト由来またはマウス（Mus musculus）由来のタンパク質や、猿、牛、馬などの他の哺乳動物においても、同一タンパク質が発現され、ヒト由来のＴＭ４ＳＦ１９は、３種以上の異性体を有することができる。前記ＴＭ４ＳＦ１９は、それぞれGenBank Accession Ｎｏ．ＮＭ＿００１２０４８９７．１（配列番号１）、ＮＭ＿００１２０４８９８．１（配列番号２）、ＮＭ＿１３８４６１．３（配列番号３）、ＮＭ＿００１１６０４０２．１（配列番号４）を含むｍＲＮＡから、それぞれＮＰ＿００１１９１８２６．１（配列番号５）、ＮＰ＿００１１９１８２７．１（配列番号６）、ＮＰ＿６１２４７０．２（配列番号７）、ＮＰ＿００１１５３８７４．１（配列番号８）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に翻訳される。前記配列番号１ないし４のｍＲＮＡ、及び配列番号５ないし８のタンパク質と、一部ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が一致しないとしても、生物学的に同等な活性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、ＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡまたはＴＭ４ＳＦ１９タンパク質と見なされる。
【００１８】
前記ＴＭ４ＳＦ１９をコーディングするヌクレオチドは、配列番号１ないし４のうちいずれか一つと、６０％以上、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上あるいは１００％の配列同一性を有する塩基配列を有するものである。また、前記ＴＭ４ＳＦ１９をコーディングするヌクレオチドは、前記配列番号１ないし４のうちいずれか一つの塩基配列において、１個以上の塩基、２個以上の塩基、３個以上の塩基、４個以上の塩基、５個以上の塩基、６個以上の塩基または７個以上の塩基が異なる配列を有するヌクレオチドである。
【００１９】
前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、配列番号５ないし８のうちいずれか一つと、６０％以上、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上あるいは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。また、前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、前記配列番号５ないし８のうちいずれか一つの塩基配列において、１個以上の塩基、２個以上の塩基、３個以上の塩基、４個以上の塩基、５個以上の塩基、６個以上の塩基または７個以上の塩基が変化された配列を有するヌクレオチドである。
【００２０】
用語「肥満（obesity）」は、健康に悪影響を及ぼすほど体脂肪が過度に蓄積された状態を意味する。個体のＢＭＩ（body mass index）指数、胴回り、体脂肪率、または個体のＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定し、前記数値が対照群に比べて高い場合、肥満にかかったと判断することができる。肥満は、食べ過ぎまたは高脂肪食餌などの食習慣、遺伝的要因、他の疾病、感染、運動不足または社会的要素などの多様な要因によるものである。
【００２１】
前記ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定することができる物質は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質、あるいはその断片に特異的に結合する抗体、抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの組み合わせである。
【００２２】
用語「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味する。前記抗体は、肥満診断マーカーであるＴＭ４ＳＦ１９に対して特異的に結合する抗体を意味し、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子を発現ベクターにクローニングし、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子によってコーディングされるＴＭ４ＳＦ１９タンパク質を得て、得られたＴＭ４ＳＦ１９タンパク質から、当該技術分野の一般的な方法によって抗体を製造することができる。前記抗体の形態は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、全ての免疫グロブリン抗体が含まれる。前記抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する完全な形態だけではなく、２個の軽鎖及び２個の重鎖を有する完全な形態の完全な抗体の構造を有さないが、抗原性部位に対して指示される特異的な抗原結合部位（結合ドメイン）を有し、抗原結合機能を保有している、抗体分子の機能的断片も含む。
【００２３】
前記ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定することができる物質は、ＴＭ４ＳＦ１９をコーディングするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブ、プライマー、ヌクレオチド配列、またはそれらの組み合わせである。
【００２４】
ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のヌクレオチド配列が公知されているので、当業者は、前記配列を基に、それら遺伝子の配列に対して特異的に結合するプライマーまたはプローブに、当該技術分野の一般的な方法によってデザインすることができる。
【００２５】
用語「プローブ」とは、ｍＲＮＡなどのヌクレオチドと、特異的に結合をなすことができる、短くは、数塩基あるいは、長くは、数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどのヌクレオチド断片を意味し、放射性元素などに標識されており、特定ｍＲＮＡの存在有無、含量（発現量）を確認することができる。該プローブは、オリヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、単一鎖ＤＮＡ（single strand ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（double strand ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態に作製される。本発明の一具体例によれば、肥満マーカーであるＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡと相補的なプローブを利用して混成化を実施し、混成化程度を介して、ｍＲＮＡの発現量を測定することにより、肥満のいかん及び程度を測定することができる。適切なプローブの選択及び混成化条件は、当該技術分野に公知された技術によって、適切に選択することができる。
【００２６】
用語「プライマー」は、短い自由３末端水酸化基（free 3’ hydroxyl group）を有するヌクレオチド配列であり、相補的なテンプレート（template）と塩基対を形成することができ、テンプレート鎖コピーのための開始地点として作用する短いヌクレオチド配列をいう。該プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度において、重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ／重合酵素または逆転写酵素）、及び異なる４種のヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡ合成を開始することができる。本発明の一具体例によれば、マーカーＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡのプライマーセットを利用してＰＣＲ増幅を実施し、所望のＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量測定を介して、肥満を診断することができる。ＰＣＲ（polymerase chain reaction）条件及びプライマーセット長は、当業界に公知された技術によって適切に選択される。
【００２７】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを示し、特別に言及されていない限り、自然ヌクレオチドの類似体、及び糖部位または塩基部位が変形された類似体を含んでもよい。
【００２８】
前記プローブ、プライマーまたはヌクレオチドは、ホスホルアミジット（phosphoramidite）固体支持体合成法や、その他広く公知された方法を利用して、化学的に合成することができる。かようなヌクレオチド配列は、また当該技術分野に公知された多様な方法を介して変形させることができる。かような変形の例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド１以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されていない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、または荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。
【００２９】
前記プローブ、プライマーまたはヌクレオチドは、長さが１０ないし１００ヌクレオチド（以下、「ｎｔ」とする）、１０ないし９０ｎｔ、１０ないし８０ｎｔ、１０ないし７０ｎｔ、１０ないし６０ｎｔ、１０ないし５０ｎｔ、１０ないし４０ｎｔ、１０ないし３０ｎｔ、１０ないし２５ｎｔ、２０ないし１００ｎｔ、３０ないし９０ｎｔ、４０ないし８０ｎｔ、５０ないし７０ｎｔ、２０ないし６０ｎｔ、２０ないし５０ｎｔ、３０ないし４０ｎｔ、２０ないし３０ｎｔ、あるいは２０ないし２５ｎｔである。
【００３０】
前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、肥満マウスの脂肪組織及び脂肪前駆細胞において、特異的に増加するので、前記本発明による肥満診断用組成物は、肥満が疑われる患者の脂肪細胞または脂肪前駆細胞でのＴＭ４ＳＦ１９遺伝子発現量を測定し、肥満診断に利用される。
【００３１】
他の様相は、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定することができる物質を含む肥満診断用キットを提供する。
【００３２】
前記肥満診断用キットは、肥満診断マーカーであるＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量を、その遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の発現量測定を介して測定することにより、肥満を診断することができる。前記肥満診断用キットは、前述のＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量を測定することができる物質、すなわち、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に特異的に結合する抗体、抗原結合断片、ポリペプチドまたはタンパク質、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングする遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、ヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせを含むだけではなく、そのキットが利用するＴＭ４ＳＦ１９タンパク質発現量を測定する分析方法に適する１以上の他の構成成分組成物、溶液または装置を含んでもよい。
【００３３】
一具体例によれば、本発明の肥満診断用キットは、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定するためのキットである場合、ＲＴ−ＰＣＲ（real time polymerase chain reaction）を行うために必要な必須要素を含むキットでもある。ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対する特異的なそれぞれのプライマー対以外にも、テストチューブ、または他の適切なコンテイナ、反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（ｄＥＰＣ−water）、滅菌水などを含んでもよい。また、定量対照群で使用される遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。
【００３４】
他の具体例によれば、本発明の肥満診断用キットは、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に対して特異的に結合する抗体、抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質抗体の免疫学的検出のために、基質、適する緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質を含んでもよい。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラススライドグラスなどが利用され、該発色酵素は、ペルオキシダーゼ（peroxidase）、アルカリンホスファターゼ（alkaline phosphatase）が使用され、該蛍光物質は、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが使用され、該発色基質は、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）またはｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などが使用される。
【００３５】
さらに他の具体例によれば、本発明のキットは、タンパク質またはそのタンパク質をコーディングする遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することのできる、肥満診断用マイクロアレイでもある。前記肥満診断用マイクロアレイは、前記本発明のマーカーを利用して、当該技術分野に公知された方法によって、当業者が容易に製造することができ、一具体例によれば、前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質をコーディングする遺伝子のｍＲＮＡ、またはその断片に該当する配列のｃＤＮＡがプローブとして基板に付着しているマイクロアレイである。
【００３６】
前記キットで言及された用語または要素のうち、請求された組成物に係わる説明で言及されたようなことは、前に請求された組成物に係わる説明で言及されたようなものであると理解される。
【００３７】
他の様相は、個体の肥満を診断するためのＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する方法を提供する。
【００３８】
前記方法は、個体から分離された試料と、ＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する物質とを接触させて形成された複合体の量を測定し、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を測定する段階を含んでもよい。
【００３９】
前記診断の対象になる個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、マウス（mouse）、鼠（rat）、牛、山羊、豚、馬、羊、犬、猫、あるいはその組み合わせでもある。前記試料は、個体の細胞、脂肪前駆細胞、脂肪細胞、またはそれらに由来する細胞を含んでもよい。
【００４０】
前記ＴＭ４ＳＦ１９発現量測定は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量を測定するか、あるいはＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡの量を測定するものである。
【００４１】
前記ＴＭ４ＳＦ１９のタンパク質の発現量測定は、前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体、抗原結合断片、ポリペプチドまたはタンパク質を利用して、タンパク質の発現量を確認することができる。そのために、分析方法としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：radioimmunoassay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法（immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）及びタンパク質チップ（protein chip）などがある。かような分析方法は、当該技術分野において当業者であるならば、公知された技術を利用して適切に遂行することができる。
【００４２】
前記ＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡの発現量は、前記ｍＲＮＡに対して特異的に結合するプローブ、プライマーまたはヌクレオチドを利用して測定することができる。そのために、分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮａｓｅ protection assay）、ノーザンブロッティング（northern blotting）、あるいはＤＮＡチップなどがある。かような分析方法は、当該技術分野において当業者であるならば、公知された技術を利用して適切に遂行することができるであろう。
【００４３】
前記方法によれば、個体の試料、及び正常対照群のＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量を比較することにより、肥満を診断することができる。具体的には、肥満が疑われる患者の試料と、正常対照群のＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量とを測定して比較し、個体の試料において、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の発現量がさらに増加する程度によって、肥満いかん及びその程度を測定することができる。
【００４４】
前記方法で言及された用語または要素のうち、請求された組成物及びキットに係わる説明において言及されたようなことは、先に請求された組成物及びキットに係わる説明で言及されたようなところと理解される。
他の様相は、ＴＭ４ＳＦ１９を阻害する肥満治療用候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００４５】
本発明の実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質が肥満に関与すると公知されているＧｒｐ７８と結合し、それによって、脂肪前駆細胞の分化及び脂肪蓄積を促進することを確認したので、脂肪前駆細胞または脂肪細胞において、ＴＭ４ＳＦ１９の発現を阻害する物質、またはＴＭ４ＳＦ１９活性を阻害する物質は、肥満の治療に効果的な候補物質にもなる。
【００４６】
前記Ｇｒｐ７８は、マウス（Mus musculus）由来のタンパク質や、ヒト、猿、牛、馬などの他の哺乳動物においても、同一タンパク質が発現される。前記Ｇｒｐ７８は、uniprot参照番号Ｐ２００２９で示される配列を含むタンパク質である。前記配列と一部配列が一致しないとしても、生物学的に同等な活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｇｒｐ７８タンパク質と見なされる。
【００４７】
前記ＴＭ４ＳＦ１９の発現を阻害する物質は、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター配列に特異的に結合して転写を阻害する物質、またはＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡと結合して翻訳を阻害する抗体、ポリペプチド、タンパク質またはヌクレオチドなどの物質である。
【００４８】
前記スクリーニング方法は、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーターヌクレオチド配列を含む試料に、試験物質を接触させる段階を含んでもよい。前記試料は、哺乳類から分離された細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、またはそれらに由来する細胞を含んでもよい。
【００４９】
前記スクリーニング方法は、前記試験物質が添加された試料において、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーターの活性を測定する段階を含んでもよい。前記ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター配列は、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター３０００内にあるＳＲＥＢＰ転写因子またはＰＰＡＲγ転写因子の結合部位である。
【００５０】
前記スクリーニング方法は、前記試料において、ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター活性を測定する段階を含んでもよい。前記プローモーター活性測定は、当該技術分野において、当業者であるならば、公知された技術を利用して、ＴＭ４ＳＦ１９プローモーターに標識遺伝子を連結し、連結された標識遺伝子の発現を測定することにより、測定することができる。
【００５１】
前記ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター活性が、対照群に比べて低下している場合、試料に添加された試験物質は、肥満治療用候補物質と判断することができる。
【００５２】
前記スクリーニング方法は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列を含む試料に、試験物質を接触させる段階を含んでもよい。前記試料は、哺乳類から分離された細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、またはそれらに由来する細胞を含んでもよい。
【００５３】
前記スクリーニング方法は、前記試験物質が添加された試料において、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質またはその断片、あるいはそれをコーディングするヌクレオチド配列と複合体を形成する試験物質を選別する段階を含んでもよい。前記複合体の検出は、当該技術分野において、当業者であるならば、公知された技術を利用して適切に遂行することができる。
【００５４】
また、前記ＴＭ４ＳＦ１９の活性を阻害する物質は、ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合を阻害する物質でもある。前記ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合を阻害する物質は、抗体、ポリペプチド、タンパク質またはヌクレオチドなどの物質でもある。前記物質は、ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合部位、またはＴＭ４ＳＦ１９の膜貫通ドメインｄ、及び／またはそのリンカー部分に結合する物質でもある。
【００５５】
前記方法で言及された用語または要素のうち、請求された組成物、キット及び診断方法に係わる説明で言及されたようなことは、請求された組成物、キット及び診断方法に係わる説明で言及されたようなところであると理解される。
【００５６】
他の様相は、ＴＭ４ＳＦ１９を阻害する肥満治療用薬学的組成物、及びそれを利用して肥満を治療する方法を提供する。
【００５７】
また、本発明の実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質が、肥満に関与すると公知されているＧｒｐ７８と結合し、それによって、脂肪前駆細胞の分化及び脂肪蓄積を促進することを確認したので、脂肪前駆細胞または脂肪細胞において、ＴＭ４ＳＦ１９の発現を阻害する物質、またはＴＭ４ＳＦ１９の活性を阻害する物質は、肥満の予防及び治療に効果的であるということが分かる。
【００５８】
前記組成物及び方法で言及された用語または要素のうち、請求された組成物、キット、診断方法及びスクリーニング方法に係わる説明で言及されたようなことは、組成物、キット、診断方法及びスクリーニング方法に係わる説明で言及されたようなところであると理解される。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
（実施例１．肥満マーカーとしてのＴＭ４ＳＦ１９の確認）
〔１−１．伝統天産物を利用した肥満マーカーとしてのＴＭ４ＳＦ１９発掘〕
肥満に治療効果があると知られた伝統天然物を投与した食餌誘導肥満動物モデルの副睾丸白色脂肪の転写体ＲＮＡシーケンシング分析を介して、伝統天然物に特異的に反応する肥満マーカーを発掘した。
【００６０】
具体的には、正常食餌または高脂肪食餌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、太陰調胃湯、緑茶あるいは防風通聖散を添加した飼料を食べさせた動物モデルを考案した。前記マウスの副睾丸白色脂肪組織を得て、組織０．１ｇ当たり１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen，Grand Island，ＮＹ・米国）を添加して溶かした後、遠心分離して上澄み液を取った。得られた上澄み液に、クロロホルム２００μＬを添加し、２０分間遠心分離して上澄み液を取った。得られた上澄み液に、同量のイソプロパノールを添加した後、１０分間遠心分離し、ＲＮＡペレットを得た。前記ＲＮＡペレットを、７５％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、ＲＮＡペレットを乾燥させた後、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ：diethylpyrocarbonate）水に溶かして試料を準備した。準備された試料は、Theragen Co., Ltd.に依頼し、ｍＲＮＡシーケンシング分析を進めた。
【００６１】
図１Ａは、正常食餌（ＮＤ）、高脂肪食餌に高く反応する群（ＨＦ−ＯＰ）、高脂肪食餌に少なく反応する群（ＨＦ−ＯＲ）、高脂肪食餌＋太陰調胃湯（ＨＦＤ＋Ｔ）、高脂肪食餌＋防風通聖散（ＨＦＤ＋Ｂ）、あるいは高脂肪食餌＋緑茶（ＨＦＤ＋Ｇ）を食べさせたマウスの副睾丸白色脂肪でのＦＰＫＭ（fragment per kb exon model）によるＴＭ４ＳＦ１９の遺伝子発現を示している。ｍＲＮＡシーケンシング分析結果、ＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡは、正常食餌によっては、ほとんど発現されていないが、高脂肪食餌によってその発現量が非常に増加し、伝統天然物によって、その発現が抑制されるということが分かった。
〔１−２．食餌によるＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡの発現量確認〕
追加して、各個体別ＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡ量を、ＰＣＲで増幅して再検証した。図１Ｂから分かるように、ＲＮＡシーケンシング結果と同一に、ＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡ量が、高脂肪食餌によって増加し、太陰調胃湯によって減少するということを確認することができた。前記ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記表１の通りである。
【００６２】
【表１】
2018521332.tif 000003
【００６３】
（実施例２．脂肪細胞の分化によるＴＭ４ＳＦ１９の発現量確認）
脂肪前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１を利用して、ＴＭ４ＳＦ１９が脂肪細胞分化に及ぼす影響を確認した。
【００６４】
図２は、脂肪前駆細胞の培養及び分化のモデルの模式図を示している。脂肪前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１を、１０％牛胎児血清（ＢＣＳ：bovine calf serum）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞の分化を誘導するために、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培養液に、分化誘導剤ＤＭＩ（デキサメタゾン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びインシュリン）の存在下で２日間培養した。２日後、細胞培養液を、インシュリンだけ添加された培養液で交換した。さらに２日後、細胞培養液を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳだけ添加された培養液で２日ごとに培地を交換し、脂肪細胞を得た。その後、得られた脂肪細胞から、実施例１のような方法を利用してＲＮＡを得た。前記表１に示されたプライマーセットを利用して、ＲＴ−ＰＣＲ方法で、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を確認した。
【００６５】
ＤＭＩを添加した後、０日後、２日後、４日後及び８日後、ＴＭ４ＳＦ１９の発現量を確認して見た結果、図３のように、脂肪細胞分化が進むにつれ、ＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡ量が増加するということを確認することができた。
【００６６】
（実施例３．ＴＭ４ＳＦ１９過発現が脂肪細胞分化に及ぼす影響確認）
〔３−１．ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株の製造〕
ＴＭ４ＳＦ１９が脂肪細胞分化に及ぼす影響を確認するために、ＴＭ４ＳＦ１９過発現を誘導した３Ｔ３−Ｌ１細胞株を確立した。
【００６７】
ウイルスベクターであるＬＰＣＸ（Laboratory of Cell Regulation and Carcinogenesis，ＮＩＨ）に、Ｎ末端に３個のヘマグルチニン（ＨＡ：hemagglutinin）エピトープが付いている３ＨＡ−ＴＭ４ＳＦ１９をクローニングして入れた後、製造されたウイルスベクターを３Ｔ３−Ｌ１細胞に感染させ、ＴＭ４ＳＦ１９の過発現細胞株を確立した。ＴＭ４ＳＦ１９ｍＲＮＡの過発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲで確認した。前記ＰＣＲで使用されたプライマーは、下記表２に示されている。
【００６８】
【表２】
2018521332.tif 000004
【００６９】
〔３−２．脂肪細胞の脂肪蓄積確認〕
ＤＭＩで３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を誘導した後、オイルレッドＯ染色法で、脂肪細胞の脂肪滴形成程度及び脂肪蓄積程度を確認した。図４Ａは、オイルレッドＯ染色法によって染色された脂肪細胞の脂肪形成程度を示すイメージであり、図４Ｂは、脂肪細胞の脂肪蓄積程度を示すものであり、染色された脂肪細胞にイソプロパノールを添加した後、常温でインキュベーションした後、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレートに移した後、ＯＤ４２０で光学密度を測定して定量した値を示している。
【００７０】
図４Ａ及び図４Ｂのように、ＴＭ４ＳＦ１９過発現脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化が進むほど、対照群に比べ、細胞の脂肪蓄積が著しく増加したということを確認した。
【００７１】
〔３−３．脂肪細胞の脂肪分化マーカー発現量確認〕
次に、脂肪細胞分化を誘導した後、脂肪分化マーカーであるＣ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγとのｍＲＮＡ量をリアルタイム定量的重合酵素連鎖反応（real time quantitative ＰＣＲ）を介して確認した。このときに使用されたプライマーは、下記表３の通りである。
【００７２】
【表３】
2018521332.tif 000005
【００７３】
その結果、図５Ａ及び図５Ｂでのように、ＴＭ４ＳＦ１９過発現された細胞において、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγとのｍＲＮＡ量が、対照群のＣ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγとの発現量に比べ、著しく増加したということが観察された。
また、タンパク質レベルでの脂肪細胞分化マーカーの発現量を比較した。対照群ＬＰＣＸとＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株とに、ＲＩＰＡバッファを加えて遠心分離し、上澄み液を得た。得られた上澄み液からタンパク質を分離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ＰＶＤＦにタンパク質を移した後、脂肪細胞分化マーカーの抗体を付け、発現量を確認した。３ＨＡが標識されたＴＭ４ＳＦ１９は、ＨＡ（Ｙ−１１，Santa Cruz Biotech）であり、マーカー遺伝子は、脂肪細胞分化マーカー抗体サンプルキット（adipogenesis marker antibody sample kit，＃１２５８９，Cell Signaling）で確認した。図６は、ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株の脂肪細胞分化マーカーの発現量を、タンパク質レベルで測定したところを示している。
【００７４】
その結果、図６でのように、アジポネクチン（adiponectin）、Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγ、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、脂肪酸合成剤（fatty acid synthase）、アセチルコーエイカルボキシラーゼ、及び脂肪液滴膜の形成に作用するペリリピン（perilipin）の発現量が対照群に比べ、ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞株で著しく増加したということを確認することができた。かような結果から、ＴＭ４ＳＦ１９が、脂肪細胞分化に関与する主要シグナルに作用するということを確認することができる。
【００７５】
（実施例４．Ｔｍ４ｆ１９と結合するタンパク質Ｇｒｐ７８の発掘）
ＴＭ４ＳＦ１９の役割や作用メカニズムについて、既知の報告がないので、脂肪細胞の分化時、ＴＭ４ＳＦ１９と結合するタンパク質を発掘するために、分化前（preadipocyte）及び分化８日後（Ｄ８）に、それと結合するタンパク質を、免疫沈降反応で確認した。その結果、図７に示されているように、結合可能性を示すバンドが確認された。
【００７６】
その後、さらなる分析のために、ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞量を増やし、十分な量のタンパク質が、脂肪細胞分化８日後に得られるようにした。その後、ホルムアルデヒド交差結合（formaldehyde cross-linkng）を行わせ、免疫沈降反応を行った。免疫沈降されたタンパク質は、coomassieブルーで染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに下りて分離した。分離されタンパク質バンドを切り、質量分析法（mass-spectrometry）によるタンパク質分析を行った。分析されたさまざまな候補タンパク質において、肥満に関与すると知られたＧｒｐ７８（uniprot−MOUSE、Ｐ２００２９）を選定し、食餌によるＧｒｐ７８発現の差を確認する追加実験を進めた。
【００７７】
その結果、図８Ａ及び図８Ｂでのように、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子とＧｒｐ７８遺伝子との発現は、高脂肪食餌（ＨＦ）において、正常食餌（ＮＤ）より増加し、高脂肪食餌＋太陰調胃湯（ＨＦＤ−Ｔ）によって減少するということを確認することができた。
【００７８】
（実施例５．ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合確認）
脂肪細胞分化前（Ｄ０）と脂肪細胞分化後（Ｄ７）とのＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との細胞内（endogenous）結合を確認した。
【００７９】
具体的には、細胞内のＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合を確認するために、ＴＭ４ＳＦ１９過発現細胞のタンパク質を、分化前後に分けて分離した後、ＨＡで免疫沈降反応を行った。得られたタンパク質は、Ｇｒｐ７８抗体（Ｎ−２０，Santa Cruz Biotech）を使用して免疫ブロッティングした。ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８とのin vitro結合を確認するために、３ＨＡ−ＴＭ４ＳＦ１９とflag−Ｇｒｐ７８とに対して、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を送達体として利用して、形質注入（transfection）した。その後、抗flag抗体（Ｍ２、Sigma）を利用して免疫沈降し、その収得物を、抗ＨＡ抗体（Ｙ−１１，Santa Cruz Biotech）で確認した。
【００８０】
その結果、図９Ａから分かるように、細胞分化後、２つのタンパク質の結合が確認された。また、図９Ｂから分かるように、２つのタンパク質を２９３Ｔに過発現させた後、in vitro結合を確認した結果、２つのタンパク質が結合するということが分かった。
【００８１】
（実施例６．ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合部位確認）
ＴＭ４ＳＦ１９は、４個の膜貫通ドメイン（transmbrane domain）で構成されており、いまのところ、それ以外に知られたドメインはない。それを基準に、ＴＭ４ＳＦ１９とＧｒｐ７８との結合部位を確認するために、図１０のように、Ｎ末端にＧＳＴが標識された４種（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）のＴＭ４ＳＦ１９ドメイン欠失突然変異を製造した。
具体的には、３ＨＡ−ＴＭ４ＳＦ１９をテンプレートとして、下記表４のプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応を介して、所望のＴＭ４ＳＦ１９ドメイン欠失突然変異を製造した。Ｎ末端には、ＧＳＴが標識されたベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ，Smith and Johnson，Ｇｅｎｅ ６７：３１，（１９８８））に、適切な酵素で切って付けてクローニングした。
【００８２】
【表４】
2018521332.tif 000006
【００８３】
その結果、図１１にように、ＴＭ４ＳＦ１９野生型、ＴＭ４ＳＦ１９ Ｃ及びＤの突然変異がＧｒｐ７８と結合するところが観察された。従って、膜貫通ドメインｄ及びそのリンカー地域が、前記ＴＭ４ＳＦ１９及びＧｒｐ７８の２つのタンパク質の結合に必要な部分であるということを確認することができた。
【００８４】
（実施例７．Ｇｒｐ７８を介したＴＭ４ＳＦ１９の脂肪細胞分化確認）
ＴＭ４ＳＦ１９過発現が脂肪細胞分化を増加させるメカニズムを確認するために、ＴＭ４ＳＦ１９が過発現された細胞株に、下記表５に示されたマウスｓｉＲＮＡを添加し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ interference）を誘発させることにより、Ｇｒｐ７８の発現を抑制させた。
【００８５】
具体的には、ＧＲＰ７８ ｓｉＲＮＡと、形質注入を容易にする溶液であるInvitrogene社のLipofectamine ＲＮＡｉＭＡＸを、メーカーで提示する方式通り反応させて結合体を形成させ、それをＴＭ４ＳＦ１９過発現ＮＩＨ−３Ｔ３Ｌ１細胞株に処理し、ｓｉＲＮＡによるＧＲＰ７８の発現抑制を誘導した。Ｇｒｐ７８の発現抑制程度は、リアルタイムｑＰＣＲで確認した。
【００８６】
【表５】
2018521332.tif 000007
【００８７】
前記細胞株の脂肪細胞分化能を確認した結果、図１２にように、対照群に比べ、脂肪細胞分化能が低下するということが分かった。従って、ＴＭ４ＳＦ１９が、Ｇｒｐ７８を介して脂肪細胞分化を増加させるということが分かった。
【００８８】
（実施例８．ＴＭ４ＳＦ１９プローモーター転写因子結合部位の確認）
ＴＭ４ＳＦ１９のプローモーター１９６４には、脂肪細胞分化に重要な３個のＳＲＥＢＰ結合部位がある。図１３のようなＴＭ４ＳＦ１９の欠失プローモーターコンストラクトを製造するために、ＮＩＨ−３Ｔ３Ｌ１脂肪前駆細胞において、誘電体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をキットを利用して抽出した。下記表６に明記されたプライマーを利用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を介して、所望のＴＭ４ＳＦ１９の欠失プローモーター量を増幅させた。増幅させたＴＭ４ＳＦ１９欠失プローモーターの終端部位に、プローモーター分析に多く活用され、発光酵素（luciferease）を有したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Promega）を適切な制限酵素で切って付けてクローニングした。プローモーター分析のために、クローニングされたＴＭ４ＳＦ１９の欠失プロモーターコンストラクトを、ＮＩＨ−３Ｔ３Ｌ１細胞に、ＰＥＩを利用して注入し、ＮＩＨ−３Ｔ３Ｌ１細胞の脂肪分化を誘導した。脂肪分化が終わった後、細胞を溶解させ、発光酵素に反応する基質を入れ、発光酵素の活性を測定することにより、ＴＭ４ＳＦ１９欠失プローモーター活性を測定した。
【００８９】
【表６】
2018521332.tif 000008
【００９０】
その結果、図１４でのように、−１９６４と−８０２との部位の有無により、プローモーター活性度が大差を示すということを確認することにより、該プローモーター部位が、脂肪分化時、重要な役割を果たすということを確認した。また、前記部位に主に作用する転写因子を分析した結果、脂肪分化に重要な役割を果たすと知られたＳＲＥＢＰが結合する部位であるということを確認した。
【００９１】
従って、前記ＴＭ４ＳＦ１９プローモーター１９６４及びＴＭ４ＳＦ１９プロモータ８０２の間に結合する物質をスクリーニングし、肥満治療剤の候補物質を発掘することができるということを確認した。
【図１Ａ】
2018521332.tif 000009
【図１Ｂ】
2018521332.tif 000010
【図２】
2018521332.tif 000011
【図３】
2018521332.tif 000012
【図４Ａ】
2018521332.tif 000013
【図４Ｂ】
2018521332.tif 000014
【図５Ａ】
2018521332.tif 000015
【図５Ｂ】
2018521332.tif 000016
【図６】
2018521332.tif 000017
【図７】
2018521332.tif 000018
【図８Ａ】
2018521332.tif 000019
【図８Ｂ】
2018521332.tif 000020
【図９Ａ】
2018521332.tif 000021
【図９Ｂ】
2018521332.tif 000022
【図１０】
2018521332.tif 000023
【図１１】
2018521332.tif 000024
【図１２】
2018521332.tif 000025
【図１３】
2018521332.tif 000026
【図１４】
2018521332.tif 000027
【配列表】
2018521332000001.app
【国際調査報告】
2018521332.tif 000028
2018521332.tif 000029
2018521332.tif 000030
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