(57)【要約】  本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害を予防または治療する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害を予防または治療する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物。
【請求項２】
網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に関連する視力喪失を予防、進行を停止または改善するための方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物。
【請求項３】
網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に罹患している患者の光受容細胞の生存および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の生存を含む網膜細胞の生存を促進する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物。
【請求項４】
前記遺伝性網膜変性障害が網膜色素変性（ＲＰ）である、請求項１〜３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記遺伝性網膜変性障害がレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）である、請求項１〜４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記機能的遺伝子がＲＰＥ６５である、請求項１〜５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｒＡＡＶがＡＡＶ２／４血清型である、請求項１〜６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記機能的遺伝子を発現する前記網膜細胞がＲＰＥ細胞である、請求項１〜７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
疾患発症前に投与される、請求項１〜８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
光受容細胞の喪失開始後に投与される、請求項１〜８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
５０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに投与される、請求項１〜８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
１ミリリットル当たり１０９〜１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の濃度で投与される、請求項１〜１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
約５×１０１０ｖｇ／ｍＬの濃度で投与される、請求項１〜１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
４５０μＬの量で投与される、請求項１〜１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
７５０μＬまたは８００μＬの量で投与される、請求項１〜１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）による眼疾患、特に杆体錐体ジストロフィーなどの遺伝性網膜変性障害の治療のための改善された方法に関する。特に、本発明は、網膜の各象限への前記ｒＡＶＶの網膜下注射による遺伝性網膜変性障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
杆体錐体ジストロフィーを含む遺伝性網膜変性障害は、夜盲症および周辺視野拡大の喪失を引き起こす杆体の機能不全が主要な問題であるか、または錐体機能不全と少なくとも同等の重症度で起こる、進行性疾患ファミリーである。杆体錐体ジストロフィーは、網膜色素変性（ＲＰ）およびＲＰＥ６５関連レーバー先天黒内障（ＲＰＥ６５遺伝子の３０を超える変異がＬＣＡを引き起こすことがわかっているため）を含むレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）を包含する。
【０００３】
網膜色素上皮６５（ＲＰＥ６５）は、網膜色素上皮に発現されるイソメロヒドロラーゼであり、杆体および錐体の両方を介する視覚に必要な視物質の再生に極めて重要なものである。ＲＰＥ６５遺伝子には６０超の異なる変異が発見されており、劣性ＲＰの症例の約２％、ＬＣＡ患者の約１６％の原因である。天然のイヌ（ブリアード犬）モデルおよび遺伝子操作されたＲｐｅ６５−／−ノックアウトマウスを含むいくつかの動物モデルが、病理学、生化学、遺伝学、構造、機能および治療に関する研究に広く用いられている（［１］）。
【０００４】
最近、前臨床研究の結果を受け、遺伝子治療に関する有望な臨床試験が４件実施されており、この試験では、ＬＣＡに罹患している患者の網膜下にヒトＲＰＥ６５  ｃＤＮＡを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターｒＡＶＶ２／２を注射した［２〜６］。ＬＣＡ患者の網膜下（大部分は、下側の視野機能を促進するため上側の網膜）にヒトＲＰＥ６５  ｃＤＮＡを含むｒＡＡＶを１回または２回注射した。上記の初期研究の目的は単に遺伝子移入剤の安全性を試験するためであったが、３つグループ全てが、視覚機能の有意な改善を報告した。この画期的な肯定的報告を受け、５件の試験（ＮＣＴ００５１６４７７、ＮＣＴ００６４３７４７、ＮＣＴ００４８１５４６、ＮＣＴ００７４９９５７、ＮＣＴ０１４９６０４０  ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）が進行中であり、治療の安全性および有効性をさらに定期的に調べるために、その患者集団を拡大している。その結果、これまでのところ、ＬＣＡの遺伝子治療はベクター投与後数年から最大６年は安全かつ有効である［７］。
【０００５】
これらの肯定的結果から、視覚障害のある患者の視力が遺伝子移入によって改善されるという原理が証明された。しかし、疾患の進行を完全に停止させるには至っておらず（改善のピークは治療後１〜３年であり、その後視覚機能が低下することが、最近発表されている）［８］、このため、網膜機能のさらなる改善および／または安定化が得られなければならない。
【０００６】
この問題に促され、研究者らは遺伝子治療の転帰を改善する有望な戦略を多数提唱しており、このようなものとして、ＲＰＥ６５遺伝子の発現の改善をもたらす配列の最適化、特に網膜細胞のＲＰＥ細胞のみならず錐体細胞にもＲＰＥ６５を発現させるための最も効率的なベクターの特定、視覚サイクルの機能を改善するか、または網膜の細胞喪失を予防するよう設計された遺伝子治療と他の薬剤との併用使用の可能性、ＡＡＶベクターを最初に網膜下注射してから数か月もしくは数年後に２回目の遺伝子治療を実施するか、または疾患に罹患していない網膜の隣接領域を治療する可能性、ならびに治療前に疾患の進行期を分類し、十分に応答する機能的光受容細胞を含む網膜領域に治療を誘導できることが挙げられる。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様では、本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害である杆体錐体ジストロフィーを予防または治療する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【０００８】
第二の態様では、本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に関連する視力喪失を予防、進行を停止する、または改善する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【０００９】
第三の態様では、本発明は、網膜細胞内において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害である杆体錐体ジストロフィーに罹患している患者の光受容細胞の生存および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の生存を含む網膜細胞の生存を増強する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＬＣＡ患者の一方の眼球の複数の部位にＲＰＥ６５をコードするｒＡＡＶ２／４ベクターの網膜下注射を同じ手術時間中に複数回（最大５回）を実施することにより、ＬＣＡ患者の視覚に有意かつ安定な形態学的および機能的改善が得られるという知見に基づくものである。
【００１１】
特に、複数の部位（例えば、側頭側網膜、鼻側網膜、下側網膜および上側網膜）へのｒＡＡＶ２／４−ＲＰＥ６５の前記複数回の網膜下送達により、投与量を増加させることなく、前記患者に重度の網膜副作用を引き起こすことなく、または網膜剥離を来たすことなく、前記ＡＡＶによって治療される網膜表面が増加する。このような知見から、ＬＣＡ、ならびにＲＰなどの遺伝性網膜変性障害に関与する遺伝子の変異に関連する他の疾患に対する改善された治療法がもたらされる。
【００１２】
したがって、第一の態様では、本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害を予防または治療する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、目的とする遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害を予防または治療する方法であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって、網膜細胞において目的とする機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する段階を含み、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、方法に関する。
【００１４】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」という用語は、機能的遺伝子に有害な変異を有する患者の網膜細胞を遺伝的に形質転換するための、前記遺伝子（すなわち、目的とするポリヌクレオチド）をコードする核酸配列を保有するＡＡＶベクターを指す。ｒＡＡＶベクターは、５’および３’アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、標的細胞、本発明の文脈において、好ましくはまたは具体的には網膜細胞において、目的とするポリヌクレオチドの発現を調節する配列と作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドとを含む。さらに、「ｒＡＡＶベクター」という用語は、個々のｒＡＡＶベクターシステム、およびそのコード配列が個々のｒＡＡＶベクターのポリヌクレオチドパッケージング能を上回る完全長タンパク質の発現をもたらすｒＡＡＶベースのデュアルベクターシステムを包含する。実際、ｒＡＡＶベクターの遺伝子含有量はＤＮＡ約５ｋＢが限界であることがわかっている。眼疾患の遺伝子治療のためのこのようなｒＡＡＶデュアルベクターシステムについては、国際公開第２０１３／０７５００８号および同第２０１４／１７０４８０号に詳細に記載されている。  
【００１５】
一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにその混合物（すなわち、ｒＡＡＶハイブリッドベクター）を含む群で選択されるＡＡＶ血清型に属するものである。
【００１６】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶハイブリッドベクター」という用語は、本明細書では、ｒＡＡＶベクターゲノムとＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質とを含むネイティブのＡＡＶキャプシドを含み、ベクターゲノムのＣａｐ、ＲｅｐおよびＩＴＲが少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、ベクター粒子を指す。本発明のハイブリッドベクターは、例えば、ＡＡＶ４キャプシドと、ＡＡＶ２  ＩＴＲを有するｒＡＡＶゲノムとを含むｒＡＡＶ２／４ベクター、またはＡＡＶ５キャプシドと、ＡＡＶ２  ＩＴＲを有するｒＡＡＶゲノムとを含むｒＡＡＶ２／５ベクターであり得る。
【００１７】
一実施形態では、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４血清型またはＡＡＶ２／５血清型である。
【００１８】
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置いたとき、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子のことである。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって定められる。コード配列の３’側に転写終止配列が位置し得る。したがって、ベクターは、コードされるタンパク質を発現および分泌させる調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などを含む。この点に関して、ベクターは、目的とするポリヌクレオチドと作動可能に連結され、感染細胞内でのタンパク質の発現を生じさせる、または向上させるプロモーター領域を含む。このようなプロモーターは、感染細胞において効率的かつ適切（優先的）にタンパク質を発現させるユビキタスプロモーター、組織特異的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、調節プロモーター、キメラプロモーター、誘導型プロモーターなどであり得る。本発明で使用するのに好ましいプロモーターは、光受容細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞などの網膜細胞において機能的なものであるべきである。ユビキタスプロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶエンハンサー）、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、およびＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターなどの細胞プロモーターが挙げられる。網膜細胞に特異的なプロモーターの例としては、ＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターおよび光受容細胞に特異的なプロモーターが挙げられる。ＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターには、例えば、ＲＰＥ６５プロモーター、ＢＥＳＴ１プロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターまたは錐体アレスチンプロモーターがある。光受容細胞に特異的なプロモーターの例は、例えば、βホスホジエステラーゼ遺伝子、網膜色素上皮遺伝子プロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサーおよびＩＲＢＰ遺伝子プロモーターである。
【００１９】
本発明のｒＡＡＶ２／４ベクターなどのｒＡＡＶベクターは、当該技術分野で公知の方法を用いて作製される。簡潔に述べれば、方法は一般に、（ａ）ｒＡＡＶベクターを宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ｒＡＡＶベクターに欠けているウイルス機能を備えたＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞内に導入すること、（ｃ）ヘルパーウイルスを宿主細胞内に導入することを伴う。ｒＡＡＶベクターの複製およびｒＡＡＶビリオンへのパッケージングを得るためには、ｒＡＡＶのビリオン複製およびパッケージングのための全機能が存在する必要がある。宿主細胞内への導入は、標準的なウイルス学的技術を同時にまたは順次用いて実施することができる。最後に、宿主細胞を培養してｒＡＡＶビリオンを産生させ、ＣｓＣｌ勾配法などの標準的技術を用いて精製する。残存するヘルパーウイルス活性は、公知の方法、例えば熱不活化などを用いて不活化することができる。これにより、精製済みのｒＡＡＶビリオンは諸方法に使用できる状態となる。
【００２０】
本明細書で使用される「患者」という用語は、ヒトを対象とするものである。典型的に、患者は、遺伝性網膜変性障害、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または光受容細胞を冒す杆体錐体ジストロフィーに罹患しているか、それに罹患する可能性のある者である。例えば、患者は、治療法の候補となる者であり、ＬＣＡと診断された者がこれに含まれる。ＬＣＡの典型的な症状としては、生まれつきの重度の視覚障害；眼振（不随意の痙攣性の律動的眼球運動）；視覚検査時に正常な外観を呈する眼球（ただし、網膜に色素沈着が若干みられることもある）；極度の遠視；光に対する瞳孔反応が遅いこと；およびＥＲＧの著明な低下が挙げられる。ＬＣＡの診断は、例えばランベルトの診断基準（Ｌａｍｂｅｒｔら，Ｓｕｒｙ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８９；３４（３）：１７３−８６）に基づいて下すことができる。
【００２１】
本明細書に記載される方法は、患者、例えば、ＬＣＡを有するか、ＬＣＡを有する疑いのある（例えば、ＬＣＡの症状が認められ、ほかに明らかな原因がみられないことに基づく）小児、青年または若年成人の対象を特定し、その患者からゲノムＤＮＡを含む試料を採取すること、公知の分子生物学的方法を用いて、ＬＣＡの原因となることがわかっているＲＰＥ６５などの遺伝子に変異の存在を検出すること、およびＬＣＡを引き起こすそのような変異を有する患者を選択することを含み得る。ＲＰＥ６５などの目的とする遺伝子に変異を検出することは、特定の既知の変異を検出することを含み得る。
【００２２】
したがって、本明細書に提供される教示を考慮に入れると、治療され得る網膜疾患は多岐にわたるものであり、典型的に、遺伝性網膜変性、特に網膜色素変性（ＲＰ）および杆体錐体ジストロフィー、例えばレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）などが含まれる。
【００２３】
特定の実施形態では、前記杆体錐体ジストロフィーはレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）である。１８６９年、Ｌｅｂｅｒによって最初に記載されたＬＣＡは、他の網膜ジストロフィーとは異なる常染色体劣性疾患であり、先天性盲目の原因となる。レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）（ＭＩＭ２０４０００）は、乳児期早期に、視覚刺激を追うことができない、眼振がみられる、視線の動きが定まらないことを伴う重度のまたは完全な視覚機能喪失がみられることを特徴とする。罹患者は網膜電図が消失型となり、最終的には色素性網膜症を含む眼底異常を来たす。ＬＣＡは小児期に発症する重度の失明病であり、１０超の遺伝子の変異によって引き起こされ得る。変異の頻度が最も高い遺伝子は、ＣＥＰ２９０、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＣＲＢ１およびＲＰＥ６５である。その結果、下の表に記載するように、１０超のタイプのＬＣＡが認められている：
【表１】
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【００２４】
特定の実施形態では、ＬＣＡはＲＰＥ６５関連ＬＣＡである。
【００２５】
別の実施形態では、前記遺伝性網膜変性障害は、網膜色素変性、全脈絡膜萎縮症およびアッシャー病からなる群より選択される。
【００２６】
したがって、機能的遺伝子をコードする核酸配列は、光受容細胞およびＲＰＥ細胞などの網膜細胞の生存および／または機能を増強するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。目的とするポリヌクレオチドで、遺伝子置換療法に使用することができるものには、光受容細胞および／またはＲＰＥ細胞に優先的または特異的に発現される遺伝子、例えばＲＰＥ６５（ＬＣＡ、ｃｈｒ．１）、ＲＧＲ（網膜色素変性（ＲＰ）、ｃｈｒ．１０）、ＲＬＢＰ１（ＲＰ、ｃｈｒ．１５）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ、ｃｈｒ．２）、ＬＲＡＴ（ＲＰ、ｃｈｒ．４）、ＲＥＰ１（全脈絡膜萎縮症、Ｘｐ２１）、ＭＹＯ７Ａ（１型アッシャー症候群、ｃｈｒ．１１）およびＣＥＰ２９０（ＬＣＡ、ｃｈｒ．１２）などがある。
【００２７】
上で詳述した所望のトランスジーンを含む組換えＡＡＶベクターは、従来の方法によって混入物に関して評価した後、網膜下注射用の医薬組成物に製剤化するのが好ましい。このような製剤化は、薬学的および／または生理的に許容される媒体または担体、詳しくは、例えば網膜下注射によって眼に投与するのに適したもの、例えば、ｐＨを適切な生理的レベルに維持するための緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、ならびに任意選択で、その他の薬剤、医薬品、安定剤、緩衝剤、担体、補助剤、希釈剤などの使用を伴う。注射の場合、担体は典型的に、液体である。例示的な生理的に許容される担体としては、滅菌のパイロジェンフリー水および滅菌のパイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。担体または他の材料の正確な性質は、当業者が投与経路、すなわち、本明細書において網膜下注射に合わせて決定することができる。このような材料は、非毒性でなければならず、有効成分（すなわち、本発明のｒＡＡＶベクター）の有効性を妨害してはならない。
【００２８】
さらに、本発明のある特定の実施形態では治療の標的となる光受容細胞が保持された領域を特定するために、非侵襲性の網膜撮像および機能検査を実施することが望ましい。このような実施形態では、臨床診断検査法を用いて、網膜下注射を１回または複数回実施する正確な位置（１つまたは複数）を決定する。このような検査法としては、網膜電図検査法（ＥＲＧ）、周辺視野測定法、走査型共焦点レーザー眼底検査法（ｅＳＬＯ）および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による網膜各層の局所解剖学的マッピングおよび厚さの測定、補償光学法（ＡＯ）による錐体密度の局所解剖学的マッピング、眼機能検査などが挙げられる。
【００２９】
撮像検査および機能検査を考慮して、各注射の量およびウイルス力価は、以下に詳細に記載するように個別に決定され、同じ眼または反対側の眼に実施する他の注射と同じであっても異なってもよい。
【００３０】
「有効量」は、治療する疾患を予防、治療または遅延させることが可能なｒＡＡＶ組成物の濃度を達成するために十分な量を意味する。このような濃度は、当業者が日常的な方法で決定することができる。実際に投与されるｒＡＡＶ組成物の量は通常、治療する疾患、選択する投与経路、患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度を含む関連する状況を考慮に入れて医師が決定する。用量が、投与されるｒＡＡＶベクターの安定性に左右され得ることもまた、当業者に理解されよう。
【００３１】
一実施形態では、損傷した光受容細胞の領域のみが影響を受けるようにｒＡＡＶ組成物の量および濃度を選択する。別の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の量および／または濃度は、損傷していない光受容細胞を含む眼のより広い部分に達するように、さらに大きい値とする。
【００３２】
医薬組成物は、治療する領域の大きさ、ウイルス力価および方法の所望の効果に応じて、範囲内の全数値を含む約５０μＬ〜約１ｍＬの量で送達され得る。一実施形態では、量は約５０μＬである。別の実施形態では、量は約１００μＬである。別の実施形態では、量は約１５０μＬである。さらに別の実施形態では、量は約２００μＬである。別の実施形態では、量は約２５０μＬである。別の実施形態では、量は約３００μＬである。別の実施形態では、量は約４００μＬである。別の実施形態では、量は約４５０μＬである。別の実施形態では、量は約５００μＬである。別の実施形態では、量は約６００μＬである。別の実施形態では、量は約７５０μＬである。別の実施形態では、量は約８００μＬである。別の実施形態では、量は約９００μＬである。さらに別の実施形態では、量は約１０００μＬである。
【００３３】
ベクターの用量は、疾患の状態、患者、治療スケジュールなどに応じて調節することができる。本発明の文脈における好ましい有効量は、光受容細胞および／またはＲＰＥ細胞の最適な形質導入が可能になる用量である。典型的に、１用量当たり１０８〜１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）をマウスに投与する。典型的に、ヒトに投与するＡＡＶベクターの用量は、１０１０〜１０１２ｖｇの範囲であり得る。
【００３４】
したがって、所望のトランスジーンをコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効濃度は、１ミリリットル当たり約１０８〜１０１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の範囲であるのが望ましい。ｒＡＡＶの感染単位は、Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６２：１５＊６３に記載されている通りに測定する。好ましくは、濃度は約１×１０９ｖｇ／ｍＬ〜約１×１０１２ｖｇ／ｍＬ、より好ましくは約１×１０１０ｖｇ／ｍＬ〜約１×１０１１ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は約５×１０１０ｖｇ／ｍＬである。
【００３５】
主治医は、治療する患者の身体的状態、対象の年齢、特定の眼障害、および進行性の場合は障害が起こっている程度を考慮に入れて、上記の範囲内のなお別の用量を選択してもよい。
【００３６】
記載される方法のそれぞれに関して、治療は、網膜損傷の発生を予防する、または軽度もしくは進行疾患を有する眼を救出するために使用され得る。
【００３７】
本明細書で使用される「救出する」という用語は、疾患が全盲まで進行するのを防ぐこと、損傷していない光受容細胞および／もしくはＲＰＥ細胞まで損傷が広がるのを防ぐこと、または損傷を受けた光受容細胞および／もしくはＲＰＥ細胞の損傷を改善することを意味する。
【００３８】
したがって、一実施形態では、疾患発症前に医薬組成物を投与する。別の実施形態では、光受容細胞の喪失が始まる前に医薬組成物を投与する。別の実施形態では、光受容細胞の喪失が始まった後に医薬組成物を投与する。さらに別の実施形態では、非罹患の眼と比較して９０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。別の実施形態では、５０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。別の実施形態では、４０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。別の実施形態では、３０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。別の実施形態では、２０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。別の実施形態では、１０％未満の光受容細胞が機能または残存しているときに医薬組成物を投与する。
【００３９】
本明細書で使用される「同じ手術時間」という用語は、患者を手術室のベッドに移送したときに始まり、患者を麻酔後回復室（ＰＡＣＵ）に移送したときに終わる時間を指す。この時間、患者をモニターし、麻酔をかけ、準備し、覆布を掛け、手術を施行する。この時間の看護行動は、安全性、感染予防および麻酔に対する生理反応に重点を置く。したがって、「同じ手術時間」という用語は、複数回の注射を同時に、または（異なる時点かつ同じまたは異なる時間間隔で）逐次的に実施し得ることを意味する。
【００４０】
治療する各網膜は象限に分割される。それによって、網膜の表面を、中心窩の中心で交わる垂線と水平線によって細分する。垂線は網膜を鼻側の区画と側頭側の区画とに分割し、水平線は網膜を上側の区画と下側の区画とに分割する。視空間では、対応する垂線と水平線（経線とも呼ばれる）が固視点（視空間で中心窩が整列する点）で交わり、視野の象限を定義する。したがって、網膜は、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる４つの象限を含む。
【００４１】
一実施形態では、網膜の各象限に網膜下注射を少なくとも１回実施する。別の実施形態では、網膜の少なくとも１つの象限に網膜下注射を２回実施する。別の実施形態では、網膜の各象限に網膜下注射を２回実施する。別の実施形態では、網膜の少なくとも１つの象限に網膜下注射を３回実施する。別の実施形態では、網膜の各象限に網膜下注射を３回実施する。
【００４２】
したがって、医薬組成物を約７５０μＬ〜８００μＬなど大量に製剤化してよく、これを網膜の各象限に数回で送達する。あるいは、医薬組成物を少量で製剤化してもよく、これを網膜の１つの象限に１回で送達する。このような場合、複数個の単位が必要となる。
【００４３】
網膜下注射は、全身麻酔下で実施してもしなくてもよい。
【００４４】
さらに、国際公開第０３／０９４９９２号に記載されているように、眼などの閉じ込められた媒体中に液体を微量注射する装置によって網膜下注射を実施してもよい。このような液体を微量注射する装置は、直径の小さい注射カニューレを有する少なくとも１つのプランジャー型シリンジと、プランジャーを駆動させて注射する手段と、プランジャー駆動手段を制御する手段と、操作者が作動させることができる可動要素によって制御される空気圧式の駆動手段とを備える。駆動手段は、プランジャーに直接作用する加圧ガスと、プランジャーに接触したときにシリンジ内に加圧ガスを供給する手段とを備えている。制御手段は、操作者がシリンジプランジャーにガス圧を加えるように作動させて、前記圧を取り消すよう作動させることができる可動要素を備えている。
【００４５】
第二の態様では、本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に関連する視力喪失を予防、進行を停止、または改善させる方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限に少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【００４６】
本発明はまた、目的とする遺伝子の変異を有する遺伝性網膜変性障害に関連する視力喪失を予防、進行を停止または改善するための方法であって、同じ手術時間中に患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって、網膜細胞において目的とする機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与する段階を含み、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、方法に関する。
【００４７】
本明細書で使用される杆体錐体ジストロフィーに関連する「視力喪失」という用語は、周辺視力、中心（読字）視力、夜間視力、昼間視力のいずれかの低下、色覚の喪失、コントラスト感度の喪失または視力の低下を指す。
【００４８】
第三の態様では、本発明は、網膜細胞において機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含み、前記遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に罹患している患者の光受容細胞の生存および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の生存を含む網膜細胞の生存を増強する方法に使用する医薬組成物であって、同じ手術時間中に、それを必要とする患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって投与され、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、医薬組成物に関する。
【００４９】
本発明はまた、目的とする遺伝子の変異に関連する遺伝性網膜変性障害に罹患している患者の光受容細胞の生存およびＲＰＥの生存を含む網膜細胞の生存を増強する方法であって、同じ手術時間中に、患者の網膜の各象限への少なくとも１回の網膜下注射によって、網膜細胞において目的とする機能的遺伝子の産物を発現させる調節配列の制御下に前記遺伝子をコードする核酸配列を保有するｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物の有効量を、前記患者に投与する段階を含み、前記象限が、下側頭側網膜と、上側頭側網膜と、下鼻側網膜と、上鼻側網膜とからなる、方法に関する。
【００５０】
本明細書で使用される、光受容細胞の生存および網膜色素上皮の生存を含む「網膜細胞の生存の増強」という用語は、網膜細胞の変性を阻害または遅延させること、および網膜細胞の生存率を増加させて、それにより本明細書に記載される眼疾患もしくは眼障害または網膜損傷の進行が遅延または停止し得ることを意味する。
【００５１】
一実施形態では、網膜細胞は光受容細胞および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）である。
【００５２】
以下の図面および実施例により本発明をさらに説明する。ただし、これらの実施例および図面は、決して本発明の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｒＡＡＶ２／４．ｈｒｐｅ６５．ｒｐｅ６５の網膜下注射後の炎症評価を示す図である。（Ａ）Ｄ−９０、Ｄ−１、Ｄ＋４、Ｄ＋１４、Ｄ＋６０、Ｄ＋１８０、Ｄ＋３６０におけるレーザーフレアメータ測定のグラフ。（Ｂ）Ｄ＋４およびＤ＋１４においてＰｈ／ｍｓでの値に是正がみられる患者３例のレーザーフレアメータの値。
【図２】感覚および眼の運動力の評価を示す図である。（Ａ）注射を実施した眼および注射を実施していない眼に関する注射前および注射から１年後の最後の来院時のＥＴＤＲＳ視力検査の結果、眼振の有無、外斜視の有無。（Ｂ）患者９例の未治療眼および治療眼の術後の平均視力のばらつき。（Ｃ）眼振患者の未治療眼および治療眼の術後の平均視力のばらつき。ＬＰ：光覚；ＴＥ：治療眼；ＵＥ：未治療眼。
【図３】注射表面に基づく視野のフォローアップを示す図である。（Ａ）３つの列について：左側は、患者網膜の合成写真であり、ベクターに曝露された領域を破線で示し、右側は、ゴールドマン視野であり、注射前のＶ４表面を明るい色で示し、注射から１年後のＶ４表面を暗色で示す。（Ｂ）患者９例の術後の平均視野表面のばらつきについて、治療眼を暗色、未治療眼を明色でそれぞれ示したもの。（Ｃ）ベクターの注射量に基づく視野の平均値向上のばらつき。
【実施例】
【００５４】
実施例：ＲＰＥ６５レーバー先天黒内障に関するＡＡＶ４遺伝子移入の安全性および有効性。
材料および方法
臨床試験：この臨床試験（ＮＣＴ０１４９６０４０）は、２０１１年３月４日にＴｏｕｒｓ−Ｏｕｅｓｔ  １倫理委員会による承認を受け、２０１１年９月１日にＡｆｓｓａｐｓによる承認を受けた第１相／第２相試験である。患者または法定後見人に情報を提供した後、参加への同意を得た。注射するウイルスの用量および患者の年齢によって患者を３つのグループに分けた。第１グループの成人患者には最低用量のウイルスベクター（最大４００μｌ）を投与し、他の２つのグループ、すなわち、第２グループの成人および第３グループの小児には、これより高用量の最大８００μｌの溶液を投与した。ＡＡＶ２／４．ｒｐｅ６５．ｒｐｅ６５の安全性および耐容性を評価するため、患者１と２、患者３と４、患者４と５、患者６と７、患者７と８とを比較するために、この試験の監視を任命された独立安全性データ監視委員会が招集された。
【００５５】
患者：この試験に組み入れた患者は全員、ｒｐｅ６５遺伝子に変異を２つ保有していた（治療前に検査した）（表１）：
【表２】
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【００５６】
ベクター作製：ｐＡＡＶ−ｈＲＰＥ６５ベクタープラスミドは、ＡＡＶ血清型２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する導入遺伝子発現カセットを保有する。発現カセットは、ヒトＲＰＥ６５プロモーターフラグメント（転写開始部位に対して−１３５９〜＋２３の位置にある）の制御下にあるヒトＲＰＥ６５コード配列（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０００３２９）とウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含む。
【００５７】
ｒＡＡＶ−２／４．ｈＲＰＥ６５ベクターを作製するため、ｐＡＡＶ−ｈＲＰＥ６５プラスミドを、ＡＡＶ血清型４のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子とアデノウイルスヘルパー遺伝子（ＶＡ  ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４）の両方を供給するｐＤＰ４−ＫａｎａヘルパープラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。イオン交換クロマトグラフィーによってベクターを精製し、眼科手術のための特別な生理食塩水溶液を用いて製剤化した。
【００５８】
ｒＡＡＶ−２／４．ｈＲＰＥ６５ベクターを、０．５ｍＬアリコートで１．２ｍＬのクライオバイアルに入れた。最終的な製剤の濃度は、ドットブロットハイブリダイゼーションによる力価測定で１ｍＬ当たり６×１０１０ベクターゲノムであった。
【００５９】
外科手術および術中処置：全身麻酔下、視覚機能が最も不良な眼に網膜下注射を実施した。硝子体切除術（２０ゲージ、３チャンネル）を実施した後、４１Ｇのカニューレを用いて注射した。術後２０分間、患者を安静にさせて、ウイルスベクターとＥＰＲ細胞との間の接触を促進した。
【００６０】
患者によって網膜剥離に差がみられたため、患者ごとに１．２２×１０１０〜４．８×１０１０ベクターゲノムに相当する２００μｌ〜８００μｌの間で量を変えて注射した（表２）。手術ごとの網膜下注射部位の数は２〜４か所とし（表２）、周辺部の黄斑外網膜の治療に好ましい部位を選択した。
【表３】
2018522834.tif 000004
【００６１】
注射から１週間後、患者に、経口プレドニゾロン０．５ｍｇ／（ｋｇ・日）、次いで１ｍｇ／（ｋｇ・日）を術後の１週間投与した。この用量を次の１か月間にわたって段階的に減らした。局所術後処置は、デキサメタゾン−トブラマイシン点眼剤（１日３回、１か月間）および施術眼への１％アトロピン点眼剤（１日１回、７日間）からなった。
【００６２】
ウイルスベクターの播種の評価：外科手術後、Ｄ０からＤ＋３まで患者を隔離室で管理した。ウイルスベクターの注射前ならびに注射から１日後、２日後および３日後、血清、鼻汁および尿中でのＡＡＶ２／４．ＲＰＥ６５ベクターの生体内播種を分析した。ｑＰＣＲ  ＰＲＥＭＩＸ  ＥＸ  ＴＡＱ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）ＴＡＫＡＲＡ（Ｓｉｇｍａ社）、Ｆｌｕｏ：ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）によって試験を実施した。抽出には、Ｋｉｔ  ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を、９５℃で１０分×１サイクル、９５℃で１５秒×４５サイクル、６２℃で３０秒×４５サイクルで用いた。検出限界は２５コピーであり、定量限界は１００コピーであった。
【００６３】
安全性：前眼房および硝子体腔の顕微鏡検査によるルーチンの眼科検査を実施した。ナッセンブラットスケールを、レーザーフレアメータ（Ｋｏｗａ  ＦＭ７００）を用いる前眼房のチンダルタンパク質測定と組み合わせて、網膜炎症をスコア化した。散瞳させた（トロピカミド、Ｃｉｂａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｆａｕｒｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、アノネー、フランス）後、非散瞳網膜造影（ＴＯＰＣＯＮ  ＴＲＣ−ＮＷ６Ｓ）を用いたＥＴＤＲＳ法による網膜の写真に基づき脈絡網膜耐容性を評価した。黄斑の厚さ、網膜構造および神経線維の厚さをスペクトラルドメインＯＣＴ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ−ＯＣＴ）により分析した。２人の異なる観察者が、中心窩、次いで中心窩の側頭側および鼻側の３００μｍおよび１０００μｍの地点における外核層の厚さを手作業で測定した（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ−ＯＣＴ）。フルオレセイン（フルオレセインナトリウム５ｍＬ）およびインドシアニングリーン（ｉｎｆｒａｃｙａｎｉｎｅ（登録商標）、ＳＥＲＢ社）を用いた血管造影検査（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ−ＯＣＴ）を実施して、ベクター注射後の血管および網膜の変化を観察した。網膜下注射の前と後に身体検査、血液化学検査および血液学的検査を実施した。
【００６４】
患者は、外科手術後の眼球疼痛、眼部不快感および霧視に関する安全性アンケートに記入した。
【００６５】
免疫学的試験：
ＡＡＶ４ベクターに対する体液性応答：
ＩＮＳＥＲＭ１０８９研究所にて、ロイドレジスタークオリティアシュアランス（ＬＲＱＡ）により国際的な管理システム基準ＩＳＯ９００１：２００８の要件を満たすと認定された本発明者らの品質管理システムの制御下で分析を実施した。
【００６６】
ＩＣＨ（Ｑ２  Ｒ１）品質ガイドラインによって検証済みの方法で酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、患者血清中の抗ＡＡＶ４  ＩｇＧ抗体の検出を実施した。簡潔に述べれば、組換えＡＡＶ２／４ウイルス粒子で予めコートした９６ウェルプレート中、患者血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％緩衝液で連続希釈してインキュベートした。ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）およびＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と共にインキュベートした後、反応を顕色させた。マイクロプレート分光光度計リーダー（ＭｕｌｔＳｃａｎ  ＧＯ、Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて吸光度を読み取った（４５０ｎｍ〜５７０ｎｍ）。各希釈物に関して、陽性の閾値は、健常ドナーの陰性血清１９例を用いて別個に得た吸光度の平均値＋３ＳＤであると決定した。陽性試料に関して、ＩｇＧ力価は、吸光度が閾値曲線の上側にある最後の血清希釈率として定義した。
【００６７】
中和アッセイを用いてＡＡＶ４に対する中和因子を検出した。このアッセイは、連続血清希釈物の存在下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するＡＡＶ４ベクターを用いてＣｏｓ細胞系の形質導入を阻害することに基づくものである。細胞感染から７２時間後、フローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。中和力価は、血清不在下での形質導入対照に比してＡＡＶ形質導入を５０％以上阻害する最も高い血清希釈率として定義した。
【００６８】
ＡＡＶ４ベクターおよびＲＰＥ６５トランスジーン産物に対する細胞性免疫応答：ＡＡＶ４キャプシドおよびＲＰＥ６５遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価し、これらのアッセイは、ナント大学病院の免疫学プラットフォームで実施し、一部の試料については、必要に応じてＩＮＳＥＲＭ１０８９研究所にて２回目を実施した。簡潔に述べれば、予め抗ＩＮＦγをコートした９６ウェルＥＬＩｓｐｏｔプレート（ヒトＩＮＦγ  ＥＬＩＳｐｏｔプラスキット、Ｍａｂｔｅｃｈ社）に凍結ＰＢＭＣを播き、ＡＡＶ４  ＶＰ１キャプシドタンパク質の配列（３つのプールに分割）またはＲＰＥ６５タンパク質の配列（２つのプールに分割）のいずれかを範囲に含むオーバーラップペプチドライブラリー（Ｐｅｐｓｃｒｅｅｎ、Ｓｉｇｍａ社）の最終濃度２μｇ／ｍｌの存在下で刺激した。細胞刺激から２４時間後、製造業者の説明書（ヒトＩＮＦγ  ＥＬＩＳｐｏｔプラスキット、Ｍａｂｔｅｃｈ社）に従って反応を顕色させた。結果をスポット形成単位（ＳＦＣ）／１０６細胞で表した。任意のペプチドプールに対する陽性応答は、５０ＳＦＣ／１０６細胞を上回るＳＦＣ／１０６応答、および非活性化細胞（培地のみ）で記録したスポットより少なくとも３倍高いスポット数として任意に定義した。
【００６９】
有効性：ＥＴＤＲＳスケールにおいて遠見視力をスコア化し、パリノースケールにおいて近見視力をスコア化した。単眼飽和１５色相検査により色覚を評価した。視力が２０／２００より良好である場合、自動周辺視野測定法（Ｏｃｔｏｐｕｓ  １０１周辺視野計、Ｈａａｇ−ｓｔｒｅｉｔ社、ケーニンツ、スイス）をＶ４の半静止ゴールドマン解析とともに用いて視野の変化を評価した。Ａｌｌｐｌａｎ  ２０１５ソフトウェアをＲソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０、Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウィーン、オーストリア）による統計解析とともに用いて、視野面積を分析した。２００ｍｓの刺激ｕを用いて１２７ｃｄ／ｍ２の発光に１０分間暗順応させた後、４−２ストラテジーの微小視野測定を実施した（Ｎｉｄｅｋ  ＭＰ１微小視野測定計−ＮＡＶＩＳソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  １．７．１、Ｎｉｄｅｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、パドヴァ、イタリア）。映像モニター（Ｍｏｎｐａｃｋ３、Ｍｅｔｒｏｖｉｓｉｏｎ社、ペロンシ、フランス）でＩＳＣＥＶプロトコルによる広領域ＥＲＧを実施した。固視が十分に良好であれば、ＩＳＣＥＶの推奨に従い、ＲＥＴＩｓｃａｎシステム（Ｒｏｌａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｌｔ社、ヴィースバーデン、ドイツ）においてＲＥＴＩｓｃａｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１５）を用いて多焦点ＥＲＧを実施した。動的瞳孔測定を用いて瞳孔の大きさを測定し、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｐｕｐｉｌｌｏｍｅｔｒｙ装置（Ｍｅｔｒｏｖｉｓｉｏｎ社、ペロンシ、フランス）を用いて一連のフラッシュに応答した散大と収縮の速度を測定した。網膜下注射後の患者の移動能の変化を評価するため、移動試験を実施した。施術眼またはもう一方の眼を覆った患者の移動時間をミリ秒で測定した。この試験で患者は、２つの異なる光レベル（４ルクスおよび２４０ルクス）で進路を無作為に選択して迷路を歩き回らなければならなかった。試験は、各眼および各光条件について３回の反復実験で実施した。外科手術後に患者の視覚の印象に関するアンケートを実施した。
【００７０】
機能的ＭＲＩ：本発明者らは、１回の試行が交互に４回提示される３種類の３０秒間の条件からなるブロックデザイン試験を用いる：
−条件１：いかなる視覚刺激も与えずに暗所で安静にする。
−条件２：白色の均一なスクリーン点滅（５Ｈｚ）。３０秒の呈示の間は輝度を一定にするが、４回の反復の間に低レベルから高レベルに変化させる。
−条件３：黒と白のフルスクリーンのチェッカーボード点滅（５Ｈｚ）。いずれの呈示の間も輝度を一定にするが、チェッカーボードのコントラストは４回の反復の間に低レベルから高レベルに変化させる。
【００７１】
ｆＭＲＩセッションで各被験者は３回の試行を受ける。記録された活動を条件１と条件２との間で比較することにより、輝度の変化に対する皮質応答が示され、条件１と条件３との間の活動は、コントラストの変化に関連する。
【００７２】
画像の輝度およびコントラストを制御する特別なソフトウェアを用いて視覚刺激を発生させる。１．５  Ｔｅｓｌａ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅシステムおよび標準的なヘッドコイルを用いて機能収集を行う。Ｔ２＊強調勾配Ｅｃｈｏ  Ｐｌａｎａｒ  Ｉｍａｇｅ（ＥＰＩ）シーケンスを用いて機能データを収集する。セッション終了時にＴ１強調３次元解剖学的収集物（ＭＰ−ＲＡＧＥ）を記録する。ＳＰＭ５ソフトウェアパッケージ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、ロンドン、イギリス）を用いて個々のＭＲＩデータを解析する。
【００７３】
結果
手術時の患者の年齢は１５〜４２歳であった（表１）。患者は全員がｒｐｅ６５遺伝子の変異を有していた。患者によって網膜剥離に差がみられたため、患者ごとに１．２２×１０１０〜４．８×１０１０ベクターゲノムに相当する２００μｌ〜８００μｌの間で量を変えて注射した（表２）。手術ごとの網膜下注射部位の数は２〜４か所とし（表２）、術前の残存視野または術後の網膜剥離のいずれかに応じて部位を選択した。
【００７４】
フォローアップの間、治療した患者９例のいずれにも、ＡＡＶ２／４−Ｒｐｅ６５−Ｒｐｅ６５ベクターの網膜下注射による全身の有害作用は報告されなかった。レーザーフレアメータを用いて術前および術後の眼の炎症を測定した。Ｄ＋４に患者３例（ＨＴ０７、ＨＭ０９およびＬＣ１０）に炎症の増大が観察され、網膜下注射から１４日後に正常に戻った（図１Ａ）。患者ＨＴ０７では、Ｄ＋３から局所抗炎症治療を１日６回の点眼まで増やし、入院期間全体を通じて継続すると、炎症の急速な消退をみた。他の２例の患者にはより重度の炎症が観察され、Ｄ＋４のレーザーフレアの読取り値は、１２５．７±８．５ｐｈ／ｍｓおよび１５３．６±１３．９ｐｈ／ｍｓであったが、Ｄ＋１４までに正常に戻った（図１Ｂ）。この２例の患者には用量８００μＬおよび７７０μＬのウイルスベクター懸濁液を投与し、術中、網膜下注射によるバブルが特に硝子体内に観察され、バブルは表面にいくぶん拡散していた。患者ＬＣ１０では、バブルが消失するまでに４日を要したが、注射から４日後に実施したＯＣＴ検査ではベクター液のシートはなおも目に見えた。
【００７５】
眼科的モニタリングでは、フォローアップの年に有害作用、すなわち網膜剥離も白内障も検出されることはなかった。一連の異なる時点において、全身の有害作用は報告されず、血液学的パラメータにも血液化学検査の結果にも全く変化はみられなかった。安全性に関するアンケートでは、外科手術直後、縫合部分のそう痒および疼痛が複数認められ、数日間続いたことがわかった。血管造影検査では、術後炎症も血管異常も検出されなかった。唯一重大な事柄は、注射のためにカニューレを挿入した網膜の部分に遮蔽作用が生じて瘢痕が残ったことである。
【００７６】
分布解析では、ウイルスベクターの大部分が術後の鼻汁試料中に検出された。４例の患者（ＢＪ０３、ＨＭ０６、ＨＴ０７およびＬＣ１０）では、ウイルスベクターが４〜２０１コピー測定され、浸出ピークはＤ＋２前後であった。ウイルス負荷量の読取り値が検出限界を上回ったのはＢＪ０３とＬＣ１０のみであり、ＬＣ１０ではＤ＋２に、２０４コピーをピークとし定量限界を上回る値が涙中で測定された。Ｄ０〜Ｄ＋２の間、患者ＨＭ０６の１例にのみ血液中にウイルスが検出されたが、これは一時的で低レベル（２４コピーおよび１９コピー）のものであった。尿中にウイルスが検出されることはなかった。患者はＤ＋３に隔離室を出ることができた。
【００７７】
組み入れた患者９例のうち６例に眼振が認められ（図２Ａ）、そのうち４例に外斜視が認められた（図２Ａ）。患者ＨＭ０６は、外科手術後、治療眼での優先的な固視により利き目の変化を認めた。患者ＨＴ０７は、本来は近見視力が低い方の眼であった治療眼を好んで用い、距離に応じて交互に固視するようになったことを報告している。ＭＲ０５は、外科手術後、眼優位性の調整の感覚が変化したことを報告している。外科手術後の視力は、治療眼がＥＤＴＲＳで２．５文字、他方の眼がＥＤＴＲＳで１文字向上した（図２Ｂ）。眼振のある患者とそうでない患者との間に視力向上の差は認められなかった。眼振のある患者の視力向上は、治療眼がＥＤＴＲＳで＋７．６文字、他方の眼が＋１．６文字であった（図２Ｃ）。この差は有意水準に近い（ｐ＝０．０５８５５）。患者ＨＴ０７およびＨＭ０８の視力向上が最も大きかった（ＥＤＴＲＳで＋１５文字および＋１２文字）。
【００７８】
視野の変化は被験者により異なっていた。患者ＣＧ０１、ＢＪ０３、ＨＭ０６、ＨＴ０７、ＡＭ０８およびＬＣ０１では改善し、ＭＲ０５（最高齢患者）では変化せず、ＭＭ０４およびＨＭ０９では低下した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＨＭ０６およびＢＪ０３のような一部の患者では、視野面積がそれぞれ４．２倍および２．８倍に増加した（図３Ｃ）。これに対し、ＭＭ０４およびＨＭ０９では、視野がそれぞれ０．９倍および０．６５倍に縮小した（図３Ｃ）。視野の回復率は、最高用量を注射した患者で最も大きく、向上の平均値が１１．２９３１６７であったのに対し、最低用量を注射した患者は低下の平均値が５．３２６６７であった。この小規模の標本の結果は有意なものではない（ｐ＝０．３８１）が、回復率は注射したベクターの用量と相関するように思われる。
【００７９】
ＡＡＶ２／４．ｒｐｅ６５ベクターを網膜下注射した後、網膜電図のパターンに変化は認められなかった。
【００８０】
有効性に関するアンケートでは、患者９例のうち４例に細部認識の改善が認められ、３例に固視の改善が認められ、それぞれ１例に色覚の改善、羞明の軽減および眼精疲労の軽減が認められた。
【００８１】
考察
ｒｐｅ６５遺伝子の欠損によるレーバー先天黒内障を有する患者を対象に網膜上皮特異的ＡＡＶ２／４−Ｒｐｅ６５−Ｒｐｅ６５ベクターの網膜下注射の安全性を評価した。治療した患者９例のいずれにも有害な全身作用も眼科的作用も報告されなかった。
【００８２】
この試験の過程で２〜４回の網膜切開術を伴う網膜下注射を数回実施しても網膜に有害作用は起こらなかった。手術直後または１年間のフォローアップでも網膜剥離は観察されなかった。複数回注射は、術前の網膜の状態に合わせて、より広い網膜表面積を治療することが可能であることを意味する。
【００８３】
術後の眼球炎症のモニタリングにより、フレアメータを用いた測定で一部の患者に一過性で中等度の炎症が起こったことが示された。この増加は、最高用量のベクターを注射した３例の患者にＤ＋４の検査で観察されたが、Ｄ＋１４には観察されなかった。これらの患者では、手術中に網膜下注射によるバブルが主として硝子体内に観察され、（２４時間かけて）徐々に消失することが観察された。注射後ある程度経過してから硝子体内へのベクターの拡散が起こり、それにより４日後に本発明者らが炎症のピークを認めた可能性がある。とはいえ、例えば裂孔原性網膜剥離に対する硝子体切除術（Ｈｏｓｈｉ）のように、ウイルスベクター注射を実施せず硝子体切除術のみを実施しても、手術の１週間以内をピークとするレーザーフレアの読取り値の上昇が誘導され、血液網膜関門に変化を来たした色素性網膜症の患者（Ｍｕｒｉｋａｍｉ）であれば、なおさらのことである。
【００８４】
参考文献：
本願全体を通じて、様々な参考文献に本発明の属する分野の最新技術に関する記載がみられる。これらの参考文献の開示は参照により本開示に組み込まれる。
【００８５】
１．Ｃａｉ  Ｘ，Ｃｏｎｌｅｙ  ＳＭ，Ｎａａｓｈ  ＭＩ．ＲＰＥ６５：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｕａｌ  ｃｙｃｌｅ，ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔ．２００９；３０（２）：５７−６２．
２．Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ＪＷ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＪ，Ｂａｒｋｅｒ  ＳＳ，Ｒｏｂｂｉｅ  Ｓ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ，Ｂａｌａｇｇａｎ  Ｋ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ａ，Ｈｏｌｄｅｒ  ＧＥ，Ｓｔｏｃｋｍａｎ  Ａ，Ｔｙｌｅｒ  Ｎ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ＳＳ，Ｔｈｒａｓｈｅｒ  ＡＪ，Ｆｉｔｚｋｅ  ＦＷ，Ｃａｒｔｅｒ  ＢＪ，Ｒｕｂｉｎ  ＧＳ，Ｍｏｏｒｅ  ＡＴ，Ａｌｉ  ＲＲ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００８；３５８（２１）：２２３１−２２３９．
３．Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，Ａｌｅｍａｎ  ＴＳ，Ｂｏｙｅ  ＳＬ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＢ，Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ，Ｒｏｍａｎ  ＡＪ，Ｐａｎｇ  ＪＪ，Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，Ｗｉｎｄｓｏｒ  ＥＡ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭ，Ｆｌｏｔｔｅ  ＴＲ，Ｆｉｓｈｍａｎ  ＧＡ，Ｈｅｏｎ  Ｅ，Ｓｔｏｎｅ  ＥＭ，Ｂｙｒｎｅ  ＢＪ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ＷＷ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ＲＰＥ６５  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｂｕｔ  ｗｉｔｈ  ｓｌｏｗ  ｒｏｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．２００８；１０５（３９）：１５１１２−１５１１７．
４．Ｍａｇｕｉｒｅ  ＡＭ，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  Ｆ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ，Ｐｕｇｈ  ＥＮ  Ｊｒ，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ，Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ  Ｊ，Ｂａｎｆｉ  Ｓ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＡ，Ｔｅｓｔａ  Ｆ，Ｓｕｒａｃｅ  ＥＭ，Ｒｏｓｓｉ  Ｓ，Ｌｙｕｂａｒｓｋｙ  Ａ，Ａｒｒｕｄａ  ＶＲ，Ｋｏｎｋｌｅ  Ｂ，Ｓｔｏｎｅ  Ｅ，Ｓｕｎ  Ｊ，Ｊａｃｏｂｓ  Ｊ，Ｄｅｌｌ’Ｏｓｓｏ  Ｌ，Ｈｅｒｔｌｅ  Ｒ，Ｍａ  ＪＸ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＴＭ，Ｚｈｕ  Ｘ，Ｈａｕｃｋ  Ｂ，Ｚｅｌｅｎａｉａ  Ｏ，Ｓｈｉｎｄｌｅｒ  ＫＳ，Ｍａｇｕｉｒｅ  ＭＧ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＦ，Ｖｏｌｐｅ  ＮＪ，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ＪＷ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ，Ｈｉｇｈ  ＫＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００８；３５８（２１）：２２４０−２２４８．
５．Ｍａｇｕｉｒｅ  ＡＭ，Ｈｉｇｈ  ＫＡ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＦ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ，Ｔｅｓｔａ  Ｆ，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ，Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ  ＪＬ，Ｙｉｎｇ  ＧＳ，Ｒｏｓｓｉ  Ｓ，Ｆｕｌｔｏｎ  Ａ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＡ，Ｂａｎｆｉ  Ｓ，Ｃｈｕｎｇ  ＤＣ，Ｍｏｒｇａｎ  ＪＩ，Ｈａｕｃｋ  Ｂ，Ｚｅｌｅｎａｉａ  Ｏ，Ｚｈｕ  Ｘ，Ｒａｆｆｉｎｉ  Ｌ，Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓ  Ｆ，Ｄｅ  Ｂａｅｒｅ  Ｅ，Ｓｈｉｎｄｌｅｒ  ＫＳ，Ｖｏｌｐｅ  ＮＪ，Ｓｕｒａｃｅ  ＥＭ，Ａｃｅｒｒａ  Ｃ，Ｌｙｕｂａｒｓｋｙ  Ａ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＴＭ，Ｓｔｏｎｅ  Ｅ，Ｓｕｎ  Ｊ，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ＪＷ，Ｌｅｒｏｙ  ＢＰ，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  Ｆ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＰＥ６５  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ：ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９  Ｎｏｖ  ７；３７４（９７０１）：１５９７−６０５．
６．Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  Ｆ，Ｍａｇｕｉｒｅ  ＡＭ，Ｔｅｓｔａ  Ｆ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ，Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ  ＪＬ，Ｒｏｓｓｉ  Ｓ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｋ，Ｂａｎｆｉ  Ｓ，Ｓｕｒａｃｅ  ＥＭ，Ｓｕｎ  Ｊ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＴＭ，Ｚｈｕ  Ｘ，Ｓｈｉｎｄｌｅｒ  ＫＳ，Ｙｉｎｇ  ＧＳ，Ｚｉｖｉｅｌｌｏ  Ｃ，Ａｃｅｒｒａ  Ｃ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＦ，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ＪＷ，Ｈｉｇｈ  ＫＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｉｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  １．５  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｍａｒ；１８（３）：６４３−５０．
７．Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，Ｒａｔｎａｋａｒａｍ  Ｒ，Ｈｅｏｎ  Ｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＢ，Ｒｏｍａｎ  ＡＪ，Ｐｅｄｅｎ  ＭＣ，Ａｌｅｍａｎ  ＴＳ，Ｂｏｙｅ  ＳＬ，Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，Ｃｏｎｌｏｎ  ＴＪ，Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ，Ｐａｎｇ  ＪＪ，Ｅｒｇｅｒ  ＫＥ，Ｏｌｉｖａｒｅｓ  ＭＢ，Ｍｕｌｌｉｎｓ  ＣＬ，Ｓｗｉｄｅｒ  Ｍ，Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ，Ｆｅｕｅｒ  ＷＪ，Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ  Ａ，Ｆｉｓｈｍａｎ  ＧＡ，Ｓｔｏｎｅ  ＥＭ，Ｂｙｒｎｅ  ＢＪ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ＷＷ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ＲＰＥ６５  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  １５  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｕｐ  ｔｏ  ３  ｙｅａｒｓ．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１２  Ｊａｎ；１３０（１）：９−２４．
８．Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，Ｒｏｍａｎ  ＡＪ，Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＢ，Ｈｅｏｎ  Ｅ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ＷＷ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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