(57)【要約】  本願は、ボルテテラ属（例えばB.pertussis）抗原および水中油ナノエマルションの混合物を含んでいる免疫原性組成物に関する。特に、本発明は、ナノエマルション、および異なる機能を有している複数のボルテテラ属（例えばB. pertussis）抗原の組み合わせ（例えば、B. pertussisの接着因子（アドヘシン）、B. pertussisの毒素、またはB. pertussisの病毒因子などの組み合わせ）を含んでいる免疫原性組成物を提供する。また、ワクチン、処置の方法、百日咳（pertussisまたはwhooping cough）ワクチンの使用および百日咳ワクチンを製造するための方法が、記載されている。本発明の粗および方法は、なかでも、臨床用途（例えば、治療薬および予防薬（例えばワクチン接種））および研究用途に役立つと分かっている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主において免疫学的応答を引き出すための方法であって、
上記宿主が、Bordetella pertussisのキャリッジに感受性であり、上記免疫学的応答が、当該宿主の上咽頭におけるB. pertussisの固着に対する免疫学的応答であり、
免疫する量の組成物を、上記宿主の鼻腔内に投与することを含んでおり、
上記組成物は、（ｉ）ナノエマルションまたはその希釈物、および（ｉｉ）複数のB. pertussis抗原を含んでおり、
上記ナノエマルションは、
ａ）ポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）有機溶媒；
ｃ）ハロゲン含有化合物；
ｄ）油；および
ｅ）水
を含んでおり、
上記B. pertussis抗原は、
ａ）単離された繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）またはその免疫原性断片；
ｂ）単離されたパータクチン（Ｐｔｎ）またはその免疫原性断片；および
ｃ）単離された百日咳毒素（Ｐｔｘ）または免疫原性断片
を含んでいる、方法。
【請求項２】
上記ナノエマルションは、
ａ）約３体積％〜約１５体積％のポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）約３体積％〜約１５体積％の有機溶媒；
ｃ）約０.５体積％〜約１体積％のハロゲン含有化合物；
ｄ）約３体積％〜約９０体積％の油；および
ｅ）約５体積％〜約６０体積％の水
を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記免疫学的応答が、Ｔｈ−１７型の免疫応答の誘導を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主において免疫応答を引き出すための方法であって、
上記宿主が、Bordetella pertussisのキャリッジに感受性であり、上記免疫応答が、B.pertussis特異的なＴｈ−１７免疫応答であり、
上記宿主におけるB. pertussis特異的なＴｈ−１７免疫応答を誘導するために、有効量の組成物を、上記宿主の粘膜に投与することを含んでおり、
上記組成物は、（ｉ）ナノエマルションまたはその希釈物、および（ｉｉ）複数のB. pertussis抗原を含んでおり、
上記ナノエマルションは、
ａ）約３体積％〜約１５体積％のポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）約３体積％〜１５体積％の有機溶媒；
ｃ）約０.５体積％〜約１体積％のハロゲン含有化合物；
ｄ）約３体積％〜約９０体積％の油；および
ｅ）約５体積％〜約６０体積％の水
を含んでおり、
上記B. pertussis抗原は、
ａ）単離された繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）またはその免疫原性断片；
ｂ）単離されたパータクチン（Ｐｔｎ）またはその免疫原性断片；および
ｃ）単離された百日咳毒素（Ｐｔｘ）または免疫原性断片
を含んでいる、方法。
【請求項５】
上記B. pertussis特異的なＴｈ−１７免疫応答が、宿主におけるBordetellapertussisのキャリッジを低減または消失させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
宿主におけるB. pertussisのキャリッジの低減または消失が、宿主におけるB. pertussis疾患を予防する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
宿主におけるB. pertussisのキャリッジの低減または消失が、上記宿主が他の宿主にB.pertussisをうつすことを防ぐ、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
鼻腔内投与可能なワクチン組成物であって、
上記ワクチン組成物が投与された宿主の上咽頭におけるB. pertussisによる固着に対する防御を与え、
（ｉ）有効量のナノエマルションまたはその希釈物、および（ｉｉ）有効量のB. pertussis抗原を含んでおり、
上記ナノエマルションは、
ａ）約３体積％〜約１５体積％のポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）約３体積％〜約１５体積％の有機溶媒；
ｃ）約０.５体積％〜約１体積％のハロゲン含有化合物；
ｄ）約３体積％〜約９０体積％の油；および
ｅ）約５体積％〜約６０体積％の水
を含んでおり、
上記B. pertussis抗原は、
ａ）単離された繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）またはその免疫原性断片；
ｂ）単離されたパータクチン（Ｐｔｎ）またはその免疫原性断片；および
ｃ）単離された単離された百日咳毒素（Ｐｔｘ）または免疫原性断片
を含んでいる、ワクチン組成物。
【請求項９】
タンパク質または免疫原性断片の少なくとも２つのグループから選択される少なくとも２つの異なるタンパク質またはその免疫原性断片、ならびにナノエマルションまたはその希釈物を含んでおり、
上記タンパク質または免疫原性断片は、以下のグループ：
グループａ）線維状赤血球凝集素アドヘシン（ＦＨＡ）および凝集原からなる群から選択される、B. pertussisの細胞外コンポネント結合タンパク質またはその免疫原性断片のうち少なくとも１つ；
グループｂ）パータクチン（ＰＲＮ）、Ｖａｇ８、ＢｒｋＡ、ＳｐｈＢ１および気管固着因子（ＴｃｆＡ）からなる群から選択されるB. pertussisのトランスポータタンパク質またはその免疫原性断片のうち少なくとも１つ、ならびに
グループｃ）百日咳毒素（ＰＴ）、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）、ＩＩＩ型分泌、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）および気管細胞毒素からなる群から選択されるB. pertussisの
病毒の制御因子、毒素またはその免疫原性断片のうち少なくとも１つ
から選択される、免疫原性組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つのタンパク質またはその免疫原性断片が、グループａ）、グループｂ）およびグループｃ）から選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
グループａ）の単離された繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）またはその断片；グループｂ）の単離されたパータクチン（Ｐｔｎ）またはその断片；ならびにグループｃ）の単離された百日咳毒素（Ｐｔｘ）またはその免疫断片を含んでいる、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
上記ナノエマルションは、
ａ）ポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）有機溶媒；
ｃ）ハロゲン含有化合物；
ｄ）油、および
ｅ）水
を含んでいる、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
上記ナノエマルションが、
ａ）約３体積％〜約１５体積％のポリオキサマー界面活性剤またはポリソルベート界面活性剤；
ｂ）約３体積％〜約１５体積％の有機溶媒；
ｃ）約０.５体積％〜約１体積％のハロゲン含有化合物；
ｄ）約３体積％〜約９０体積％の油；および
ｅ）約５体積％〜約６０体積％の水
を含んでいる、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の免疫原性組成物を含んでいる、ワクチン。
【請求項１５】
B. pertussis感染を予防または処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１４に記載のワクチンを投与するステップを含んでいる、方法。
【請求項１６】
B. pertussis感染の処置または予防のためのワクチンの製造における、請求項９に記載の免疫原性組成物の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造、ならびにそのような組成物の医薬における使用の分野に関する。より詳細には、本発明は、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）感染の処置または予防のために複数の抗原を含んでいるワクチン組成物に関する。また、そのようなワクチンを医薬に用いる方法およびそれらの調製のための方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
免疫化は、人々の健康を増進させるための主要な機能である。多くの一般的な病気に対して奏功する種々のワクチンを利用できるにもかかわらず、感染症は、健康上の問題および死亡の主な原因であり続けている。ワクチン接種の普及以前には、百日咳は、小児の全死亡原因の１３％に上った。百日咳感染および百日咳に関わる死亡は、１９５０年代には、全細胞ワクチンの導入後に劇的に減少した。全細胞ワクチン（ｗＰ）は、発熱および局所反応を含む所望されない副作用を有しており、一定の防御をもたらさなかった。無細胞百日咳ワクチン（ａＰ）が、１９８０年代に開発され、現在では、世界中の主だった先進工業国において（ｗＰ）にとって代わっている。無細胞百日咳ワクチン（ａＰ）は、重篤な百日咳の発症から幼児を守ることに、歴史的に見て、有効であるが、防御は、追加免疫なしでは、５〜１０年以内に劇的に低下する。しかし、無細胞ワクチンの広い利用にもかかわらず、百日咳は、１９９０年代以来、再浮上しており、現在、年に４０００万人に感染していると推定されており、全世界でおよそ１９５０００人の死者（主に子供）を出している。米国では、２０１２年に４８０００症例（５０年間で最高）が報告されており、２０人の死者を出している。
【０００３】
B. pertussisの経鼻キャリッジの持続と相関する、百日咳に特異的な粘膜免疫応答の欠如が、百日咳の再発を刺激する潜在的な要因であることを、いくつもの研究が示している。さらに、無細胞ワクチンが、集団におけるB. pertussisのキャリッジ（carriage）を有効に低下させず、より高い量の百日咳毒素（Ｐｔｘ）を産生し、かつパータクチン（Ｐｒｎ）を発現しない強毒株（Ｐ３と表される）の出現を導き得、無細胞ワクチンを、Ｐ３株および将来的に類似のあらゆる株に対して無効にするという報告が増えている。ＦＤＡにおけるCenter for Biologics EvaluationおよびResearchは、ヒヒにおける百日咳試験（ＴＨ１７および粘膜免疫が、キャリッジおよびB. pertussisによる再感染の予防に重要であることを示した）を実施した。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）抗原および水中油ナノエマルションの混合物を含んでいる、免疫原性組成物に関する。特に、本発明は、ナノエマルションおよび異なる機能を有しているボルデテラ属（例えばB. pertussis）抗原の組み合わせ（例えば、B. pertussisの複数の接着因子（アドヘシン）、B. pertussisの複数の毒素またはB. pertussisの複数の病毒因子を包含している組み合わせ）を含んでいる、免疫原性組成物を提供する。また、ワクチン、処置の方法、百日咳（pertussisまたはwhooping cough）ワクチンの利用および百日咳ワクチンを製造するための方法が、記載されている。本発明の組成物および方法は、なかでも、臨床用途（例えば、治療薬および予防薬（例えばワクチン接種））および研究用途に役立つと分かっている。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、１つ以上のB. pertussis免疫原性抗原（例えば、複数の接着因子、毒素および／または病毒因子）またはその断片を、送達および免疫を促進する水中油ナノエマルションと組み合わせることによって、B. pertussis感染に対する防御免疫を実現し、誘導する新規なアプローチを提供する。一実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる、免疫原性組成物は、粘膜免疫応答および全身性の免疫応答の両方を誘導する。一実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる、免疫原性組成物は、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答またはその任意の組み合わせを誘導する。好ましい実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる、（例えば粘膜に（例えば鼻腔粘膜を介して））対象に投与された、免疫原性組成物は、当該対象における強いＩＬ−１７および／またはＴｈ−１７型の免疫応答を誘導する。機序の理解は本発明の実施に必要ではないし、本発明は、任意の特定の機序によって限定されず、いくつかの実施形態において、対象におけるＴｈ−１７型の免疫応答の誘導は、当該対象におけるボルテテラ属（例えばB. pertussis）のキャリッジを抑え、および／または予防する一方で、注射された従来の無細胞百日咳ワクチンの使用が、Ｔｈ−１７免疫応答を誘導できないし、キャリッジも予防できない。他の実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる、（例えば粘膜に（例えば鼻腔粘膜を介して））対象に投与された、免疫原性組成物は、当該対象において強いＴｈ−１型の応答を誘導する。さらなる他の実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる、（例えば粘膜に（例えば鼻腔粘膜を介して））対象に投与された、免疫原性組成物は、B. pertussis特異的な中和抗体（例えば、従来の無細胞百日咳ワクチンの鼻腔内投与を介して産生される抗体の殺菌活性以上の、殺菌活性を示す）を当該対象において誘導する。
【０００６】
他の実施形態において、本発明は、本発明の免疫原性組成物をを用いて患者を処置（例えば予防的または治療的）して、B. pertussisによる感染に対して当該対象を防御する（例えば、それによってB.pertussisに基づく感染と関連する死亡率を低下させる）方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者を処置する方法は、B. pertussisの固着に対して当該対象を防御する（例えば、B.pertussisによって引き起こされる感染および疾患を、上記免疫原性組成物を投与された対象に回避させる、および／または上記免疫原性組成物を投与された対象におけるB. pertussisのキャリッジを排除する（例えば、それによって集団免疫をもたらす、および／または対象の集団からB. pertussisを排除する））。いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物の鼻腔内投与は、B. pertussisのキャリッジを減少させる。本発明は、本発明の免疫原性組成物を投与される対象のタイプによって限定されない。実際に、本発明の免疫原性組成物の有効量を投与され得る（例えば、対象におけるB. pertussisに特異的な免疫応答を誘導するために）任意の対象。いくつかの実施形態において、上記対象は成人（例えば、子を産む年齢の）である。一実施形態において、上記成人は、毎日のように、物理的に子供の周囲におり、かつ子供に接する、親、祖父母または他の成人（例えば、教師、保育提供者、保健専門家、または他の成人）である。
【０００７】
ナノエマルションおよび複数のB. pertussis免疫原性抗原の組み合わせを含んでいる、本発明の免疫原性組成物は、利用される複数のB. pertussis抗原によって限定されない。実際に、複数のB. pertussis免疫原性抗原の任意の組み合わせ（複数のB. pertussisの接着因子（アドヘシン）、複数のB. pertussisの毒素、複数のB. pertussisの病毒因子、複数のB. pertussisの外膜タンパク質、および／または上述のそれぞれの断片の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が、使用され得る。例示的な複数のB. pertussis免疫原性抗原は、本発明に記載されており、複数のB.pertussis免疫原性抗原としては、百日咳毒素（Ｐｔｘ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）、繊毛（例えば、fimbrial-2およびfimbrial-3）、吸着繊毛、気管細胞毒素（ＴＣＴ）または他の当該分野において知られているB. pertussis免疫原性抗原が挙げられるが、これらに限定されない。免疫原性の複数のB. pertussis抗原は、B. pertussisの任意の種、または呼吸器感染を引き起こす、ボルデテラ属の任意の株に基づき得る。本明細書に詳細に説明されているように、免疫原性のB. pertussis抗原は、少なくとも１つのヌクレオチド修飾（例えば、減弱された表現型またはより免疫原性の抗原を示す）を含み得る。他の実施形態において、免疫原性のB. pertussis抗原またはその抗原性断片は、融合タンパク質として存在する。また、本明細書の記載にしたがえば、免疫原性のB. pertussis抗原は、多価であるように構成され得る。
【０００８】
本発明は、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物に利用されるナノエマルションによって限定されない。実際に、本明細書に記載されている任意のナノエマルションが、利用され得る。１つの限定しない例において、上記ナノエマルションは、（ａ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤；（ｂ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（非イオン性界面活性剤である）；（ｃ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（ポリソルベート非イオン性界面活性剤、ポリオキサマー非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせである）；（ｄ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリオキサマー１８８、ポリオキサマー４０７またはその組み合わせである）；（ｅ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリオキサマー１８８、ポリオキサマー４０７またはその組み合わせである）（ここで、当該非イオン性界面活性剤は、約0.01%〜約5.0%または約0.1%〜約3%の濃度において存在する）；（ｆ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（非イオン性界面活性剤である）（ここで、当該非イオン性界面活性剤は、約0.05%〜約10%、約0.05%〜約7.0%、約0.1%〜約7%または約0.5%〜約4%の濃度において存在する）；（ｇ）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、および少なくとも１つの非カチオン性界面活性剤（ここで、カチオン性界面活性剤は、約0.05%〜約2%または約0.01%〜約2%の濃度において存在する）；または（ｈ）その任意の組み合わせを含んでいる。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明のナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有している液滴を含んでいる。一実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物に存在する上記ナノエマルションは、（ａ）水相、（ｂ）少なくとも１つの油、少なくとも１つの界面活性剤、（ｄ）少なくとも１つの有機溶媒、および（ｅ）任意に少なくとも１つのキレート剤を含んでいる。上記複数のB. pertussis抗原は、ナノエマルションの液滴内に存在する。他の実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、鼻腔内に投与される。本明細書に記載されているように、さらなる構成要素（本明細書に記載されているさらなる１つ以上のアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない）が、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物に加えられ得る。
【００１０】
一実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、薬学的に許容可能な任意の投与形態（例えば、液体分散剤、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、経鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、または固体用量）に製剤化されている。さらなる実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、対象に対して、全身性に有毒ではなく、投与による最少の炎症を生じるか、または炎症を生じない。他の実施形態において、対象は、免疫原性組成物の単回投与後に血清変換を生じる。さらなる実施形態において、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、液体分散剤、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、経鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、または固体用量として製剤化されている。さらに、ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物は、薬学的に許容可能な任意の方法を介して（例えば、非経口的、経口的、鼻腔内または直腸に）投与され得る。非経口投与は、皮内、皮下、腹腔内または筋肉内の注入により得る。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、B. pertussis特異的な免疫応答を、対象において生じさせる（例えば、それによって、患者におけるB. pertussisに対する免疫を向上させる）方法を提供し、ここで、当該方法は、本明細書に記載されているナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物を対象に投与することを含んでいる。本発明の他の実施形態は、対象におけるB. pertussis感染の徴候、症状および／または好ましくない健康状態、および／または疾患を抑制する方法に関し、当該方法は、本発明に係るナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。一実施形態において、上記対象は、上記免疫原性組成物の少なくとも単回投与後に血清防御性の免疫応答を生じる。一実施形態において、対象に対する鵜投与後に誘導される血清防御性の免疫応答（例えば、粘膜および全身のB. pertussis特異的な抗体の両方、および／またはB. pertussis特異的な細胞性免疫応答（例えば、Ｔｈ−１７免疫応答および／またはＴｈ−１免疫応答）を含んでいる）は、B. pertussisの１つ以上の株に対して有効である（例えば、他の株と交差反応する）。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、ボルデテラ属の種（例えばB. pertussis（例えば百日咳））によって引き起こされる感染および／または疾患を予防および／または処置する方法を提供し、当該方法は、本発明の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。他の実施形態において、本発明は、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）感染（例えば百日咳）の処置のための医薬の製造ための、本発明の免疫原性の組成物使用を提供する。さらなる他の実施形態において、本発明は、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）感染の処置における使用のための免疫原性組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物のいずれか１つ）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡによって評価されたときの、鼻腔内ＮＥ−ａＰワクチン接種または筋肉内ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチン接種のいずれかによる、（Ａ）百日咳毒素、（Ｂ）ＦＨＡ、および（Ｃ）パータクチンに対する抗体レベルを示している。
【図２】図２は、３回目の免疫化後の６週間の、ワクチン接種されたラットの血清における殺菌活性（血清コントロールサンプルと比べたＣＦＵ減少のパーセンテージとして示されている）を示している。
【図３】図３は、（Ａ）鼻腔内ＮＥ−ａＰワクチン接種、（Ｂ）筋肉内ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチン接種および（Ｃ）ＰＢＳコントロールに続く、各ワクチン抗原に対する再刺激後における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるサイトカインＩＬ−１７の分泌を示している。
【図４】図４は、鼻腔内ＮＥ−ａＰワクチン接種（ＩＮ）、筋肉内ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチン接種（ＩＭ）またはＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）に続く、各ワクチン抗原に対する再刺激後における、サイトカインＩＬ−５（図４Ａ）およびＩＦＮ−γ（図４Ｂ）の分泌を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現が、以下に定義づけられている。
【００１５】
本明細書に使用されるとき、用語「微生物」は、微視的な生物、ならびに藻類、細菌、真菌（地衣類が挙げられる）、原生動物、ウイルス、およびウイルス成分の媒介物のカテゴリ内にある分類学上の関連する巨視的な生物を指す。微生物という用語は、他の生物（例えば、動物（ヒトが挙げられる）および植物））に対してそれら自身が病原性である生物、および他の生物に対して病原性の作用物質を生成し、自身が他の生物に対して病原性または感染性でない生物の両方を包含する。本明細書に使用されるとき、用語「病原性」および文法的に等価な用語は、他の生物に直接に感染すること、または他の生物において疾患を引き起こす作用物質を産生すること（例えば、病原性毒素などを産生する細菌）によって他の生物（例えば、動物および植物）において疾患を引き起こす生物（微生物が挙げられる）を指す。
【００１６】
本明細書に使用されるとき、用語「疾患」は、種または集団の個体の大部分にとって有害でない条件のもとに、発症した個体にとって不利益な、種または集団の一部にとって正常または平均的とみなされる状態からの、逸脱（例えば、下痢、悪心、熱、痛みおよび炎症など）を指す。疾患は、微生物および／または病原体による接触によって引き起こされ得るか、当該接触から生じ得る。
【００１７】
本明細書に規定されているような、本発明の免疫原性組成物の、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）の固着に対して防御する能力は、当該免疫原性組成物の活性成分（例えば、ナノエマルション＋複数のボルデテラ属抗原）が、免疫された個体においてだけでなく、免疫された複数の個体の間におけるキャリッジを排除することによって、疾患に対して防御し得、病原体およびそれが引き起こす任意の疾患が集団から全体として排除され得る（例えば集団免疫）ことを意味する。
【００１８】
本明細書に使用されるとき、用語「宿主」または「対象」は、本発明の組成物および方法によって処置されるべき生物を指すために、交換可能に使用される。そのよな生物としては、１つ以上の病原体（例えばB. pertussis）にさらされている、またはさらされた疑いのある生物が挙げられる。また、そのような生物としては、病原体に対する所望されないばくろを防止するために処置される生物が挙げられる。生物としては、動物（例えば、ヒト、家畜の動物種、野生動物）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書に使用されるとき、用語「不活性化」および文法的に等価な用語は、宿主に感染するおよび／または宿主に病理的反応を引き起こす、病原体の能力を消失、排除または低下させる能力を有していることを意味する。
【００２０】
本明細書に使用されるとき、用語「融合性（fusigenic）」は、微生物媒介物（例えば、細菌または細菌胞子）の膜と融合可能なエマルションを指すと意図されている。融合性エマルションの特定の例としては、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,618,840号；米国特許第5,547,677号；米国特許第5,549,901号に記載されているW808Pならびに米国特許第5,700,679号に記載されているNP9が挙げられるが、これらに限定されない。NP9は、分枝鎖状のポリ(オキシ−1,2  エタノイル),アルファ−(4−ノニルフェナル)−オメガ−ヒドロキシ界面活性剤である。本発明に有用であり得るNP9および他の界面活性剤は、以下に限定されないが、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,662,957号の表１に記載されている。
【００２１】
本明細書に使用されるとき、用語「溶原性」は、微生物媒介物（例えば、細菌または細菌胞子）の膜を崩壊官能なエマルションを指す。本発明の好ましい実施形態において、同じ組成物における、融合性剤および溶原性剤の両方の存在は、いずれか単独より向上された不活性化作用を生じる。改良された殺菌性のこの組成物を用いる方法および組成物が、本明細書に詳細に説明されている。
【００２２】
本明細書に使用されるとき、
用語「ナノエマルション」は、水と混和しない油相が水相と混合されたときに、無極性残基（すなわち長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向かわせる疎水性力の結果として形成し得る、水中油の小さな、分散物、液滴および他の液体構造を包含する。これらの他の液体構造としては、単層、少層および多層の脂質小胞、ミセルおよび層状相が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、本明細書に開示されている特定の実施形態を理解する必要のあるときに、当業者がこの区別を明確に理解することを期待する。用語「エマルション」および「ナノエマルション」は、本発明のナノエマルションを指して、交換可能に、本明細書にしばしば用いられている。
【００２３】
用語「界面活性剤」は、水による溶媒和をエネルギー的に好む極性頭部基、および水によって十分に溶媒和されない疎水性尾部の両方を有している分子を指す。用語「カチオン性界面活性剤」は、カチオン性の頭部基を有している界面活性剤を指す。用語「アニオン性界面活性剤」は、アニオン性の頭部基を有している界面活性剤を指す。
【００２４】
用語「親水性−親油性バランス指数」および「HLB指数」は、界面活性剤の化学構造をそれらの表面活性と相関させる指数を指す。HLB指数は、Meyers（参照によって本明細書に組み込まれるMeyers, SurfactantScienceおよびTechnology, VCH Publishers Inc., New York, pp.231-245 [1992]）によって説明されているような種々の実験式によって算出され得る。本明細書に使用されるとき、界面活性剤のHLB指数は、McCutcheon’s Volume 1:  EmulsifiersおよびDetergents North AmericanEdition, 1996（参照によって本明細書に組み込まれる）における界面活性剤に指定されているHLB指数である。HLB指数は、市販の界面活性剤について０〜約７０以上の範囲である。水における高い可溶性、および可溶化特性を有している新水性界面活性剤は、範囲の高い側にあり、水における水における低い可溶性を有している、油における水の良好な可溶化剤である界面活性剤は、範囲の低い側にある。
【００２５】
本明細書に使用されるとき、用語「発芽促進剤」は、例えば特定種の細菌の発芽を促進するために、作用する化合物（例えば、アミノ酸（例えばＬ−アミノ酸（Ｌ−アラニン）、ＣａＣｌ２、イノシン、窒素性塩基）を指す。
【００２６】
本明細書に使用されるとき、用語「相互作用促進剤」は、細菌（例えばグラム陰性菌）の細胞壁との、エマルションの相互作用を促進するために作用する化合物を指す。考慮されている相互作用促進剤としては、キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）酢酸（ＥＧＴＡ）など）および特定の生物学的な作用物質（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
用語「バッファー」または「緩衝化剤」は、溶液に加えられたときに、ｐＨ変化に対する抵抗を当該溶液に起こさせる物質を指す。
【００２８】
用語「還元剤」および「電子供与体」は、第２の物質の原子の１つ以上の酸化状態を低下させるために、第２の物質に電子を供する物質を指す。
【００２９】
用語「１価塩」は、金属（Ｎａ、ＫまたはＬｉ）が、正味１＋の電荷（すなわち電子ではなく１つ以上のプロトン）を溶液において有している任意の酸を指す。
【００３０】
用語「２価塩」は、金属（例えば、Ｍｇ、ＣａまたはＳｒ）が正味２＋の電荷を溶液において有している任意の塩を指す。
【００３１】
用語「キレータ」または「キレート剤」は、金属イオンに対する結合に利用可能な孤立電子対を有している２つ以上の原子を有している任意の物質を指す。
【００３２】
用語「溶液」は、水性または非水性の混合物を指す。
【００３３】
本明細書に使用されるとき、用語「治療剤」は、病原性微生物に接触された個体における感染性、罹患率または死亡の発生を低下させる、または病原性微生物に接触された個体における感染性、罹患率または死亡の発生を抑える組成物を指す。そのような剤は、薬学的に許容可能な化合物（例えば、アジュバント、賦形剤、安定化剤、希釈剤またはワクチン）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療剤（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）は、局所的エマルション、注入可能な組成物、および経口摂取可能な溶液などの形態において投与され得る。経路が局所であるとき、上記形態は例えば噴霧剤（例えば経鼻噴霧剤）であり得る。
【００３４】
本明細書に使用されるとき、用語「局所的に活性な剤」は、宿主に対する使用（接触）の部位において薬学的な応答を認められない（illicit）本発明の組成物を指す。
【００３５】
本明細書に使用されるとき、用語「全身的に活性な薬物」は、対象への使用または進入の点から離れた部位における薬学的な反応を生じる物質または組成物を広く示すために使用される。
【００３６】
本明細書に使用されるとき、用語「免疫応答を誘導するための組成物」、「免疫原性組成物」または文法的に等価な用語は、いったん対象に投与（例えば、１回、２回または３回以上（例えば、数週間、数か月または数年を置いて））されると、対象における免疫応答を刺激、生成および／または惹起する（例えば、疾患を引き起こし得る微生物に対する全体的または部分的な免疫を生じる）組成物を指す。本発明の好ましい実施形態において、上記組成物は、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる。さらに好ましい実施形態において、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる上記組成物は、１つ以上の他の化合物または剤（治療剤、生理学的に許容可能な液体、ゲル、担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗体、サイトカイン、抗生剤、結合剤、充填剤、保存剤、安定化剤、乳化剤および／またはバッファーが挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる。免疫応答を誘導するための組成物（例えば本発明の免疫原性組成物）は、（例えば、疾患を予防または減弱させるために（例えば、疾患に対する全体的もしくは部分的な免疫、または疾患の徴候、症状もしくは好ましくない状態の全体的もしくは部分的な減弱（例えば抑制）を対象にもたらすことによって、）ワクチンとして対象に投与され得る。
【００３７】
本明細書に使用されるとき、用語「アジュバント」は、免疫応答（例えば粘膜免疫応答）を刺激し得る任意の物質を指す。一部のアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こし得る（例えば、アジュバントは、サイトカインの産生および分泌を細胞に起こさ得る）。免疫系の細胞の活性化を引き起こし得るアジュバントの例としては、Q. saponariaの木の樹皮から精製されたサポニン（例えば、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ画分によって２１番目のピークにおいて溶出する糖脂質；Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.））；ポリ（ジ（カルボキラートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ重合体；Virus Research Institute, USA）；リポ多糖の誘導体（例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ribi）およびスレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ribi））；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミンジサッカリド；OM Pharma SA, Meyrin, Switzerlおよび）；およびリーシュマニアの伸張因子（精製されたリーシュマニアのタンパク質；Corixa Corporation, Seattle, Wash.）が挙げられるが、これらに限定されない。従来のアジュバントは、当業者によく知られており、当該アジュバントとしては、例えば、アルミニウムのリン酸塩または水酸化物塩（「ａｌｕｍ」）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物（例えば、ナノエマルション不活性化ＲＳＶを含んでいる）は、１つ以上のアジュバント（例えば、免疫応答をＴｈ１型またはＴｈ２型の応答に向けて進めるための）とともに投与される。
【００３８】
本明細書に使用されるとき、用語「免疫応答を誘導するために有効な量」（例えば、免疫応答を誘導するための組成物の）は、対象における免疫応答を刺激、精製および／または惹起するために必要（例えば、対象に投与されるときに）とされる投与レベルを指す。有効量は、１回以上の投与（例えば、同じ経路または異なる経路を介する）、使用または投与量において、投与され得る、特定の剤形または投与経路に制限されない。
【００３９】
本明細書に使用されるとき、用語「対象が免疫応答を生じるような条件のもと」は、免疫応答（例えば、自然または獲得）の定性的または定量的な任意の誘導、生成および／または惹起を指す。
【００４０】
本明細書に使用されるとき、用語「免疫応答」は、対象の免疫系による応答を指す。例えば、免疫応答としては、トル受容体の活性化、リンフォカイン（例えば、サイトカイン（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ１７またはＴｈ２型サイトカイン）またはケモカイン）の発現および／または分泌、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、および／またはＢ細胞の活性化（例えば、抗体の産生および／または分泌）の検出可能な変化（例えば向上）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例としては、ＭＨＣ分子に対する免疫原（例えば免疫原性ポリペプチド）の結合および細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答の誘導、免疫原性ポリペプチドが由来する抗原に対するＢ細胞応答（例えば抗体産生）、および／またはＴヘルパーリンパ球応答、および／または遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答の誘導、免疫系の細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞（例えば、発達の任意の段階（例えば形質細胞）の）の増殖（例えば、細胞集団の増殖）、ならびに抗原提示細胞による抗原の向上したプロセシングおよび提示が挙げられる。免疫応答は、対象の免疫系が異物（例えば、微生物（例えば病原体）からの非自己抗原、または異物と認識される自己抗原）と認識する免疫原に対し得る。したがって、本明細書に使用されるとき、「免疫応答」は、任意の種類の免疫応答（自然免疫応答（例えばトル受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介性免疫応答（例えば、Ｔ細胞（例えば抗原特異的なＴ細胞）および免疫系の非特異的な細胞によって媒介される応答）、液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介（例えば、抗体の産生および血漿、リンパおよび／または組織液への分泌を介して）される応答）が挙げられるが、これらに限定されない）を指すと、理解される。用語「免疫応答」は、抗原および／または免疫原に反応する、対象の免疫系の能力の、すべての側面（例えば、免疫原（例えば病原体）に対する初期応答、および適応免疫の結果である獲得（例えば記憶）応答の両方）を包含すると意図される。
【００４１】
本明細書に使用されるとき、用語「免疫」は、疾患を引き起こし得る微生物（例えば病原体）に対するばくろによる、疾患からの防御（例えば、疾患の徴候、症状または好ましくない状態の予防または減弱）を指す。免疫は、自然免疫（例えば、抗原に対する予めのばくろなしに存在する非適応（例えば非獲得）免疫応答）および／または獲得免疫（例えば、抗原に対する予めのばくろに続いてＢ細胞およびＴ細胞（例えば、抗原に対する向上した特異性および反応性を示す）によって媒介される免疫応答）であり得る。
【００４２】
本明細書に使用されるとき、用語「抗原」および「免疫原」は、免疫応答を惹起し得る１つ以上のエピトープ（直鎖状、立体配置、連続、Ｔ細胞）を含み得るタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、または誘導体もしくは断片を指して、交換可能に使用される。好ましい実施形態において、免疫原／抗原は、本発明のナノエマルションとの組合せにおいて投与されたときに、免疫原／抗原（例えば、病原体または病原生成物）に対する免疫を惹起する。
【００４３】
用語「抗原断片」（例えば百日咳毒素の抗原断片）は、天然に存在する百日咳毒素タンパク質または変異体百日咳毒素タンパク質のうち、少なくとも約５つの連続するアミノ酸を有しているペプチド、または異なる抗原の抗原性ペプチドを説明するために使用される場合、当該抗原の天然に存在する型または変異体型のうち、少なくとも約５つの連続するアミノ酸を有しているペプチドを指す。抗原断片は、好適な任意の長さ（例えば、約５アミノ酸長〜全長タンパク質）であり得る。例えば、抗原断片は、天然タンパク質の全長の、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%または約100%であり得る。
【００４４】
本明細書に使用されるとき、用語「病原生成物」は、病原体に由来する任意の成分または生成物（ポリペプチド、タンパク質、核酸、膜タンパク質および多糖が挙げられるが、これらに限定されない）を指す。
【００４５】
本明細書に使用されるとき、用語「向上した免疫」は、本発明のワクチンが投与されていないときの獲得免疫レベルに対する、本発明のワクチンの投与に続く所定の病原体に対する獲得免疫レベルの向上を指す。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、「精製された」または「精製」は、夾雑物または所望されない化合物の、サンプルまたは組成物からの除去を指す。本明細書に使用されるとき、用語「実質的に精製された」は、夾雑物または所望されない化合物の、サンプルまたは組成物からの、約70〜90 %、100%以下の除去を指す。
【００４７】
本明細書に使用されるとき、「単離された」は、その天然の位置から独立しているタンパク質、糖タンパク質、ペプチド誘導体もしくは断片またはポリヌクレオチドを指す。遺伝学的な組換え手段を介して得られているは、細菌（例えばB. pertussis）性の成分は、相対的に精製された生成物を一般にもたらす。
【００４８】
本明細書に使用されるとき、用語「表面」は、最も広い意味において使用される。１つの意味において、当該用語は、本発明の組成物によって接触可能な、生物または無生物（例えば、車両、建築物および食品加工機器）の最外部にある境界（例えば、動物；皮膚、毛髪および毛皮など、植物；葉、幹、花部および果実体など）を指す。他の意味において、当該用語はまた、経皮送達経路（例えば、注入、経口摂取、経皮送達および吸入など）のいずれかによって、組成物によって接触可能な、動物および植物の内膜および内面（例えば、動物；消化管および管状組織など、植物；管状組織など）を指す。
【００４９】
本明細書に使用されるとき、用語「サンプル」は、その最も広い意味において使用される。１つの意味において、それは、動物細胞ま動物組織を指す。他の意味において、それは、任意の源から得られた試料または培養物（例えば、生物学的サンプルまたは環境サンプル）を包含していると意図される。生物学的なサンプルは、植物または動物（例えばヒト）から入手され得、液体、固体または気体を包含している。環境サンプルとしては、環境材料（例えば表面物質、土壌、水および工業サンプル）が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルの種類を限定するとは解釈されない。
【００５０】
本明細書に使用されるとき、用語「投与」および「投与すること」は、本発明の組成物（例えば、免疫応答を誘導するための組成物（例えば、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる組成物））を対象に与える行為を指す。ヒトの身体に対する投与の、例示的な経路としては、眼（眼の）、口（経口）、皮膚（経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入）、口腔粘膜（舌下）、耳、直腸、注入による（例えば、血管内、皮下、腹腔内など）および局所などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書に使用されるとき「共投与」および「共投与すること」は、少なくとも２つの剤（例えば、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる組成物、ならびに１つ以上の他の剤（例えばアジュバント））または治療薬の、対象に対する投与を指す。いくつかの実施形態において、第１の剤／治療薬は、第２の剤／治療薬の前に投与される。いくつかの実施形態において、共投与は、投与の同じ経路または異なる経路を介し得る。当業者は、理解する。共投与にとって適切な用量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態において、複数の剤または治療薬が投与されるとき、それぞれの剤または治療薬は、それらの単独投与にとって適切な用量より少ない用量において投与される。したがって、複数の剤または治療薬の共投与が潜在的に有害な（例えば有毒な）（複数の）剤の必要な用量を低下させる場合、および／または２つ以上の剤の共投与が、他の剤の共投与を介して、複数の剤のうち１つ有益な作用に対する対象における感作を好ましく惹起するときの実施形態において、共投与は、特に所望される。他の実施形態において、共投与は、２つ以上の異なる免疫原（例えば、微生物（例えば病原体））に対する対象における免疫応答を、同時またはほぼ同時に惹起するために（例えば、対象が、免疫応答を誘導するための第２、第３またはそれ以上の、組成物の連続投与を利用できないときに）好ましい。
【００５２】
本明細書に使用されるとき、用語「局所的」は、皮膚および／または粘膜の細胞および組織（例えば、歯槽、舌下、舌、咀嚼器官、膣または鼻腔粘膜、ならびに線状の中空器官または体腔の他の組織および細胞）の表面に対する本発明の組成物（例えば、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる組成物）の使用を指す。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、局所エマルション、注入可能な組成物、および経口摂取可能な溶液などの形態において投与される。経路が局所であるとき、形態は、例えば、噴霧剤（例えば経鼻噴霧剤）、クリーム剤、または他の粘性溶液剤（例えば、ポリエチレングリコールにナノエマルションおよび免疫原を含んでいる組成物）であり得る。
【００５４】
本明細書に使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、標準的な担体（リン酸緩衝化生理食塩水、水および種々の湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、ラウリル硫酸ナトリウム、等張性の吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ポテトスターチまたはスターチグルコール酸ナトリウム）、およびポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかを指す。また、上記組成物は、安定化剤および保存剤を含み得る。担体、安定化剤およびアジュバントの例は、当該分野において知られている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co.,Easton, Pa. (1975)を参照）。
【００５５】
本明細書に使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な塩」は、標的の対象において生理学的に許容される、本発明の組成物の任意の塩（例えば、酸または塩基との反応によって得られる）を指す。本発明の組成物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基に由来し得る。酸の例としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−硫酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。それ自身が薬学的に許容可能でない他の酸（例えばシュウ酸）は、本発明の組成物およびそれらの薬学的に許容可能な酸付加塩の入手における中間体として有用な塩の調製において採用され得る。塩基の例としては、アルカリ金属（例えばナトリウム）の水酸化物、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）の水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋の化合物（ここで、ＷはＣ１−４アルキルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコペンタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、クロリド、ブロミド、ヨウ化物、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモイン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルスルホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートおよびウンデカン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、好適なカチオン（例えば、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（ここで、ＷはＣ１−４アルキル基である）など）と化合されている、本発明の化合物のアニオンが挙げられる。治療用途のために、本発明の化合物の塩が、薬学的に許容可能とみなされる。しかし、薬学的に許容可能でない酸および塩基の塩も、例えば薬学的に許容可能な化合物の調製または精製における、用途を見出され得る。治療用途のために、本発明の化合物の塩が、薬学的に許容可能とみなされる。しかし、薬学的に許容可能でない酸および塩基の塩も、例えば薬学的に許容可能な化合物の調製または精製における、用途を見出され得る。
【００５６】
本明細書に使用されるとき、用語「疾患の危険性にある」は、特定の疾患にかかる素因のある対象を指す。この素因は、遺伝的（例えば、疾患（例えば、遺伝性の障害）にかかる遺伝的な特定の傾向）であり得る、または他の要因（例えば、年齢、環境条件、環境に存在する有害化合物へのばくろなど）に起因し得る。したがって、意図されない。
本発明が任意の特定の危険性に限定されると意図されない（例えば、対象が、他人にばくろされること、および他人との交流することによって単に「疾患の危険性にあり」得る）し、本発明が任意の特性の疾患に限定されるとも、意図されない。
【００５７】
本明細書に使用されるとき、「鼻腔使用」は、鼻道、副鼻腔またはその両方に、鼻を通って使用されるを意味する。上記使用は、例えば、鼻道または副鼻腔に使用される、液滴剤、噴霧剤、ミスト剤、コーティング剤またはその混合物によってなされ得る。
【００５８】
本明細書に使用されるとき、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。免疫原性剤（例えば、ナノエマルションおよび免疫原を含んでいる組成物）の関連において、そのような送達システムとしては、１点から他の点までの、免疫原性剤および／または補助材料（例えば、材料を使用するために記載された指示書など）の貯蔵、輸送または送達を可能にするシステムが挙げられる。例えば、キットは、関連する免疫原性剤（例えばエマルション）および／または補助材料を収納している１つ以上の包装物（例えば箱）を含んでいる。本明細書に使用されるとき、用語「小部分化キット」は、全体のキット構成要素の小集団をそれぞれ収納している２つ以上の別々の容器を備えている送達システムを指す。複数の容器は、目的の受容者にいっしょにまたは別に送達され得る。例えば、第１の容器は、特定の用途のためのナノエマルションおよび免疫原を収納し得、第２の容器は、第２の剤（例えば、抗生剤または噴霧器）を収納し得る。実際に、全体のキット構成要素の小集団をそれぞれ収納している２つ以上の別々の容器を備えている任意の送達システムは、用語「小部分化キット」に包含されている。一方で、「複合化キット」は、特定の用途に必要とされる免疫原性剤の構成要素のすべてを、単一の容器（例えば、所望の構成要素のそれぞれを格納している単一の箱）に収納している送達システムを指す。
【００５９】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ボルデテラ属百日咳抗原および水中油ナノエマルションの混合物を含んでいる免疫原性組成物に関する。特に、本発明は、ナノエマルション、および異なる機能を有している複数のボルデテラ属抗原の組み合わせ（例えば、B. pertussis接着因子（アドヘシン）、B. pertussis毒素またはB. pertussis発病因子お含んでいる組み合わせ）を含んでいる免疫原性組成物を提供する。また、ワクチン、処置の方法、百日咳ワクチンの使用、百日咳ワクチンを製造する方法が、説明されている。本発明の組成物および方法は、なかでも、臨床用途（例えば、治療薬および予防薬（例えばワクチン接種））および研究用途に役立つと分かっている。
【００６０】
Bordetella pertussisは、１９５０年代における全細胞ワクチンの導入まで、小児の死亡の主要な原因の１つであった。全細胞ワクチンは、百日咳感染および関連する死亡の頻度を劇的に低下させたが、相反して、安全性についての懸念を起こさせた。無細胞百日咳ワクチンは、１９９０年代に導入され、先進国のほとんどにそれを採用させる一貫性および有効性を示した。しかし、百日咳は、無細胞ワクチンの採用からまもなく再興し、毎年、４０００万人に感染しており、全世界で１９５０００人の死亡（主に子供）に達すると推定されている。研究は、百日咳の再興の有望な原因に達し、ＦＤＡの研究所において、ヒト疾患と非常に類似するヒヒの動物モデルの開発を介して大きく進展した。無細胞ワクチンが、百日咳疾患を防御し、強い免疫応答を惹起するが、B. pertussisのキャリッジを抑えることができないことを、Warfel etal.は証明した。無細胞ワクチンによってワクチン接種されたヒヒは、３５日にわたる細菌の排除を、非ワクチン接種のヒヒと同様に果たした。対照的に、全細胞ワクチンは、百日咳疾患を予防し、１８日以内に生物を排除した。回復期にある動物は、あらゆる鼻腔キャリッジを示さなかった。しかし、疾患の徴候を示さなかった無細胞ワクチン接種された動物は、未処置の動物にB. pertussisをうつしており、これらの動物は、顕性感染していないが、B.pertussisをうつす働き（例えば、無細胞ワクチン接種された対象に生じたB. pertussisのキャリッジ）をしていた。Warfel et al.は、異なるワクチンを介して誘導される異なるＴ細胞記憶応答：Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７を、Ｔｈ１応答の指標としてのＩＦＮγ、Ｔｈ２応答の指標としてのＩＬ−５、Ｔｈ１７応答の指標としてのＩＬ−１７を用いて、さらに同定した。無細胞ワクチンは、より弱いＴｈ１応答をともなったＴｈ２応答（強いＩＬ−５および弱いＩＦＮγ）を誘導するが、全細胞ワクチンは強いＴｈ１およびＴｈ１７応答（ＩＦＮγおよびＩＬ−１７）を誘導した（したがって、疾患および経鼻キャリッジに対して防御されている回復期の動物にみられる自然免疫と類似していた）。Ｔｈ１７は、ウイルス性および細菌性の多く病原体に対する上皮表面および粘膜表面における宿主防御にその防御的な役割について同定された。
【００６１】
百日咳感染は、いくつかの異なる臨床段階を経て進行する。百日咳の潜伏期は、４〜１２日の範囲にあり、一般に７〜１０日であり、まれに４２日になり得る。疾患の臨床経過は３段階に分かれる。第１段階のカタル性段階は、一般的な風邪と似た、鼻感冒（鼻水）、くしゃみ、程度の低い発熱、およびまばらな軽い咳によって特徴づけられる。咳は、徐々にひどくなり、１〜２週間後に、第２の発作性段階が始まる。発熱は、疾患の経過全体を通して一般的に最小である。百日咳の診断がおおく下されるのは、発作性段階の間である。特徴的に、患者は、気管支管系からの濃い粘液の排除が明らかに困難なために、急激な頻回の咳の突発（すなわち発作）を起こす。発作の終期には、長い吸気の困難は、特徴的な甲高いぜいぜい言うことをたいてい伴う。そのような発作の間、患者は、チアノーゼ（青く）なり得る。子供および幼児は特に、非常な苦しみおよび苦痛を表わす。おう吐および疲弊が、この症状に続く。その人は、発作の間に苦しみを表わさない。発作の作用は、夜間により頻度高く（２４時間に平均１５回の発作）起こる。この段階の最初の１または２週間では、発作の頻度が高まり、２〜３週間では同程度を維持し、それから徐々に減少する。発作段階は、たいてい１〜６週間、継続するが、１０週間まで持続し得る。６か月未満の幼児は、ぜいぜい言う力がなく、咳の発作を示す。回復期において、回復は緩やかである。咳は、２〜３週間において、発作的でなくなり、収まる。しかし、発作は、百日咳の発症後から数か月にわたる、後の呼吸器感染をしばしば再発する。
【００６２】
部分的にワクチンによって防御されている青年、成人および子供は、B. pertussisに感染し得るが、幼児および幼い子供より穏やかな症状を示し得る。これらの人における百日咳感染は、無症候性であり得る、または軽い咳から、持続する咳（例えば７日を超えて継続する）をともなう典型的な百日咳までの疾患として現れ得る。
【００６３】
疾患は、より高い年齢の人において穏やかであり得るが、感染者は、感染しやすい他の人（例えば、免疫低下している幼児もしくは免疫をされていない幼児、または不完全に免疫されている幼児）に疾患をうつし得る。より高い年齢の人は、しばしば、子供にとっての感染源である。
【００６４】
本明細書に記載されているように、ナノエマルションおよび１つ以上のボルデテラ属抗原を含んでいる新たな免疫原性組成物が、生成され、B. pertussis特異的な免疫応答を対象において誘導し得るか否かの実験を、本発明の実施形態の開発中に実施した。実施例１に説明されているように、ラットの鼻腔内に本発明の免疫原性組成物を投与し、免疫原性および殺菌活性を評価する実験を実施した。本発明の免疫原性組成物を、ポジティブコントロールとして筋肉内に投与された従来の無細胞百日咳ワクチンと比較した。本発明の免疫原性組成物を用いた鼻腔内ワクチン接種は、ワクチンの３つの成分すべてに対して、高レベルの抗体（ＥＬＩＳＡによって測定された）を惹起した（実施例１を参照）。さらに、ワクチン接種された動物からの血清を、ワクチン防御の免疫学的相関として、３回目の投与から６週間後に殺菌活性について試験した。本発明の免疫原性組成物を用いて鼻腔内にワクチン接種された動物は、ポジティブコントロールの筋肉内ワクチンと比べていくぶん低いレベルの抗体に関わらず、顕著に高レベルの殺菌活性を示した（実施例１を参照）。NEアジュバントは、筋肉内に投与された従来の無細胞百日咳ワクチン以上に強い、高レベルの殺菌活性（ワクチン防御の免疫学的相関および予測子として役立つ）をともなって、鼻腔内免疫および免疫応答の惹起が可能であった。さらに、LUMINEX複合分析を、本発明の免疫原性組成物によってラットに惹起される粘膜免疫を評価するために使用し、その結果は、ＦＨＡ、百日咳毒素に対して強いＩＬ−１７応答を、パータクチンに対していくぶん弱いＩＬ−１７応答を示した。明らかに対照的に、筋肉内に投与された従来のワクチンは、無視できる程度に低いＩＬ−１７応答を惹起した（実施例１を参照）。
【００６５】
したがって、一実施形態において、本発明は、全身性の百日咳特異的な免疫応答（例えば、全身性免疫）を誘導するためおよび百日咳特異的なＩＬ−１７応答を惹起するための、免疫原性組成物およびそれを用いた方法を提供する。そのような方法は、本発明の免疫原性組成物の鼻腔内送達を利用することを実現可能にする。機序の理解は、本発明の実施に必要ではなく、本発明は、作用のあらゆる特定の機序に限定されず、一実施形態において、固着の部位（またはその近傍）における本発明の免疫原性組成物の投与は、全身性免疫ならびにB. pertussisの固着および伝播に対する防御を付与する。したがって、一実施形態において、本明細書に開示されている組成物および方法の使用は、鼻腔内投与のため、B. pertussisに対する粘膜免疫を付与するため、固着および伝播を防止するため、百日咳に対する集団免疫を回復させるために、利用される。
【００６６】
B. pertussis感染の生活環は、共生の固着（細菌が繊毛のある気道上皮に付着する）、接合組織または血流との接触による感染の開始、血中における嫌気性増殖、B. pertussis発病因子／有害因子および宿主防御の間における相互作用、およびB.pertussis感染と関連する合併症の誘導（例えば、咳、発熱、呼吸困難、気管支肺炎、嘔吐、疲弊および／またはB.pertussisに関連する病的状態）を含んでいる。
【００６７】
感染の全体に関与するボルデテラ属抗原が本明細書に記載されている。B. pertussisの表面上の異なる分子が、感染サイクルの異なる段階に関与する。B.pertussis感染の異なる過程に関与する有効量の特定抗原の組み合わせに対して免疫応答を標的化することによって、ナノエマルションおよび複数のボルデテラ属抗原の組み合わせを含んでいる免疫原性組成物が、実現されている。
【００６８】
特に、異なる分類に基づく一部の抗原（一部は宿主の接着に関与し、一部はトランスポータ機能に関与し、一部は毒素または発病の制御因子である）、および主要抗原の組み合わせは、感染の多段階に対して防御する免疫応答を惹起し得る。
【００６９】
免疫応答の有効性は、研究および臨床（例えば、動物モデルアッセイおよび／またはオプソニン作用の食菌アッセイを用いて）の両方において測定され得る。
【００７０】
本発明のさらなる利点は、免疫原性組成物における、異なるファミリーに属する複数の抗原の組み合わせ種々の株に対する防御を可能にすることである。
【００７１】
一実施形態において、本発明は、B. pertussis内において異なる機能を有している少なくとも２つのカテゴリのタンパク質から選択される複数のタンパク質を含んでいる免疫原性組成物に関する。そのようなカテゴリのタンパク質の例は、細胞外結合タンパク質、トランスポータタンパク質、代謝タンパク質、毒素もしくは発病性の制御因子、および他の主要免疫タンパク質である。本発明の組み合わせワクチンは、同種のB. pertussis株（上記抗原が由来する株）に有効であり、好ましくは異種のB.pertussis株にも有効である。
【００７２】
本発明の免疫原性組成物は、以下のグループ：
グループａ）繊維状血球凝集素アドヘシン（ＦＨＡ）および／または繊毛から選択されるB. pertussis細胞外コンポネント結合タンパク質またはその免疫原性断片の少なくとも１つ；
グループｂ）パータクチン（ＰＲＮ）、Ｖａｇ８、ＢｒｋＡ、ＳｐｈＢ１および／または気管固着因子（ＴｃｆＡ）から選択されるB. pertussisトランスポータタンパク質（自己トランスポータタンパク質）またはその免疫原性断片の少なくとも１つ；
グループｃ）百日咳毒素（ＰＴ）、アデニルシクラーゼ（ＣｙａＡ）、タイプＩＩＩ分泌、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）、気管細胞毒素（ＴＣＴ）および／またはＬＰＳ（例えば、wlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）から選択されるB. pertussisの発病調節因子、毒素またはその免疫原性断片の少なくとも１つ
のうち２つまたは３つから選択される２、３、４、５または６以上の数のタンパク質を含んでいる。
【００７３】
例えば、第１のタンパク質は、グループａ）、ｂ）およびｃ）から選択され、第２のタンパク質は、第２のタンパク質を含んでいないグループａ）、ｂ）およびｃ）から選択される。
【００７４】
さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、グループａ）から選択されるタンパク質の少なくとも１つおよびグループｂ）および／またはグループｃ）から選択されるさらなるタンパク質を含んでいる。
【００７５】
さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、グループｂ）から選択される抗原の少なくとも１つおよびグループｃ）および／またはグループａ）から選択されるさらなるタンパク質を含んでいる。
【００７６】
さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、グループｃ）から選択される抗原の少なくとも１つおよびグループａおよび／またはグループｂ）から選択されるさらなるタンパク質を含んでいる。
【００７７】
本発明の免疫原性組成物は、B. pertussis、B. bronchiseptica、B. parapertussisおよび／またはB. holmesiiから得られたタンパク質を含み得る。
【００７８】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、鞭毛、タイプＩＩＩ繊毛、カプセル、アルガリジンおよび／またはVrg遺伝子座から選択される他のB. pertussisタンパク質またはその免疫原性断片の１つ以上を含んでいる。
【００７９】
タンパク質が本明細書に詳細に述べられている場合、好ましくは、それは、天然もしくは組換えタンパク質、全長タンパク質または必要に応じて任意のシグナル配列が排除されている成熟タンパク質に対する言及である。
タンパク質は、ボルデテラ属の株から直接に単離され得るか、または組換えＤＮＡ手法によって生成され得る。タンパク質の免疫原性断片は、本発明の免疫原性組成物に組み込まれ得る。タンパク質のアミノ酸配列から、近接して得られている、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸、より好ましくは４０アミノ酸または５０アミノ酸、最も好ましくは１００アミノ酸を含んでいる断片がある。さらに、そのような免疫原性断片は、ボルデテラ属のタンパク質に対して産生された抗体またはボルデテラ属による哺乳類宿主の感染によって産生された抗体と、免疫学的に反応性である。また、免疫原性断片は、有効量において投与されたとき（単独または担体に結合されたハプテンとして）、ボルデテラ属感染に対する防御免疫応答（より好ましくはBordetella pertussis感染に対する防御である）を惹起する断片を包含している。そのような免疫原性断片は、例えば、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインおよび／またはＣ末端アンカードメインを欠いているタンパク質を包含し得る。一実施形態において、本発明に係る免疫原性断片は、タンパク質の細胞外ドメインのすべてを実質的に（当該タンパク質の細胞外ドメインの全長の、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９７〜９９％）含んでいる。
【００８０】
本発明の免疫原性組成物にはまた、複数のボルデテラ属タンパク質または複数のボルデテラ属タンパク質の免疫原性断片によって構成されている融合タンパク質が含まれている。そのような融合タンパク質は、組換え的に産生され得、少なくとも２、３、４、５または６つのボルデテラ属タンパク質の一部を含み得る。代替的に、融合タンパク質は、少なくとも２、３、４または５つのボルデテラ属タンパク質の複数の部分を含み得る。これらは、同じタンパク質において、異なるボルデテラ属タンパク質またはその免疫原性断片を組み合わせ得る。代替的に、本発明はまた、複数のボルデテラ属タンパク質またはその免疫原性断片の個々の融合タンパク質を、複数の異種配列（例えば、Ｔ細胞エピトープの提示物または精製タグ（例えば、ベータガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジン、ウイルス表面タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン）、細菌タンパク質（例えば、破傷風毒素、ジフテリア毒素、CRM197））））を有している１つの融合タンパク質として、含んでいる。細胞外コンポネント結合タンパク質は、宿主の細胞外コンポネントに結合するタンパク質である。当該用語としては、アドヘシンが挙げられるが、これらに限定されない。細胞外コンポネント結合タンパク質の例としては、繊維状血球凝集素アドヘシン(FHA)、パータクチン(PRN)、finbrial-2およびfimbrail-3が挙げられる。FHAは、宿主の繊毛のある気道細胞（気道上皮と呼ばれる）に対する付着にとって主要な付着因子として機能する、巨大な繊維状のタンパク質である。それは、生物膜形成と関連し、上皮細胞の表面上の異なる細胞受容体に結合し得る少なくとも４つの結合ドメインを有している。
【００８１】
FHAは、動物モデル系におけるボルデテラ属にとっての主要な付着因子として機能する、非常に免疫原性の高いヘアピン状の分子である。タンパク質の構造分析および免疫学的分析は、B. pertussisおよびB. bronchisepticaから得られたFHAタンパク質が、それらの分子量、構造容積および血球凝集特性において類似すること、ならびに共通する１組の免疫原性エピトープを有していることを示唆している。
【００８２】
FHAは、大規模なＮ末端およびＣ末端修飾を受けて成熟な220-kDaのFHAタンパク質を形成する367kDaの前駆体FhaBとして合成される。それは、Secシグナルペプチド依存性経路によって細胞膜を通って、排出される。外膜を通るその転移および分泌は、特定の補助タンパク質FhaCを必要とする。FhaCは、外膜におけるFHA特異的な細孔として機能することによって分泌を容易にする膜貫通βバレルに折りたたむ。おそらく、FHAは、細長いにおいて立体配置外膜を通過し、細胞表面においてその三次構造を、大規模なＮ末端およびＣ末端のタンパク質分解性修飾に必要とする。細胞膜を通過する転移によって、FhaBのＮ末端は、Lepシグナルペプチダーゼ認識配列に対応する部位においてさらなる８〜９kDaの切断を受ける。Ｎ末端のこの部分は、FhaCとの相互作用に重要と予想されている。細胞表面において、FhaBの約130kDaのＣ末端が、サブチリチン様自己トランスポータ／プロテアーゼSphB1によってタンパク質分解的に除去される。FHA放出は、SphB1によって媒介される成熟に依存する。FhaB前駆体のＣ末端は、タンパク質の未成熟なフォールディングを防ぐ分子内シャペロンとして機能すると予想されている。FHAおよびFhaCはともに、two-partner分泌(TPS)系のメンバー（種々のグラム陰性細菌からの同種の補助タンパク質とともに分泌されるタンパク質を典型的に含んでいる）である。この過程を介して効率的に分泌されるが、かなりの量のFHAは、未知の機序によって細胞表面と会合して留まっている。
【００８３】
FHAは、付着に関与する４つの分かれた結合ドメインを含んでいる。FHAの中央に配置されており、提唱されているヘアピン構造の一端に局在しているArg-Gly-Asp (RGD) トリプレットは、リンパ球応答インテグリン／インテグリン関連タンパク質 (LRI/IAP) 複合体および補体受容体タイプ３(CR3)を介して、単球／マクロファージおよびおそらく他のリンパ球に対する接着を促進する。特に、FHA のRGDモチーフは、気管支上皮細胞の最晩期抗原５（VLA-5；α５β１-インテグリン）に対する結合に関与している。FHA RGDドメインによるVLA-5の連結は、ＮＦ−κＢの活性化を誘導し、それから、上皮細胞内接着分子１（ICAM-1）の上方制御を引き起こす。ICAM-1の上方制御は、細菌感染の部位における白血球の集積および活性化に関与する。また、FHAは、繊毛のある呼吸器上皮細胞およびマクロファージに対するインビトロにおける付着を媒介する糖認識ドメイン（CRD）を有している。さらに、FHAは、繊毛のない細胞株に対する付着を媒介し得る、ヘパリンおよび他の硫酸化糖炭化水素に対するレクチン様活性を示す。このヘパリン結合部位は、CRD部位およびRGD部位と異なっており、FHAによって媒介される背血球凝集に必要とされる。FHAはまた、B. bronchisepticaにおける生物膜形成に必要とされる。
【００８４】
ボルデテラ属の株は、自己トランスポータ分泌系に属する、多くの関連する表面会合タンパク質を発現する。自己トランスポータファミリーは、外膜にそれら自身を直接に指向させる、機能的に多様なタンパク質（例えば、プロテアーゼ、アドヘシン、毒素、インベイシン、およびリパーゼ）を含んでいる。自己トランスポータは、エフェクタ機能を与えるパッセンジャドメインと呼ばれるＮ末端領域、およびパッセンジャタンパク質の膜を通過する分泌に必要とされるβバレルと呼ばれるＣ末端領域を一般に含んでいる。Ｎ末端シグナル配列は、Sec経路を介した内膜を通るプレプロタンパク質の転移を容易にする。周辺質におけるＮ末端シグナルの切断によって、Ｃ末端は、外膜においてβバレルに折りたたみ、水性チャネルを形成する。Ｎ末端およびＣ末端の間におけるリンカー領域は、βバレルのチャネルを通るパッセンジャの転移に関連する。その表面において、パッセンジャードメインは、転移ユニットから切断され、かつ細菌表面と非共有結合的に会合して残り得るか、または自己タンパク質分解処理もしくは内因性の外膜プロテアーゼによる切断に続いて細胞外環境に放出され得る。
【００８５】
パータクチン(PRN)は、ボルデテラ属の自己トランスポータファミリーのメンバーである。成熟PRNは、B. bronchisepticaにおいて68-kDaのタンパク質であり、B. pertussisにおいて69-kDaのタンパク質であり、B. parapertussis (ヒト)において70-kDaのタンパク質である。３つのPRNタンパク質のすべてが、Arg-Gly-Asp (RGD)トリプレットモチーフ、ならびに真核細胞結合に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を形成する分子に共通して存在するいくつかのプロリンリッチ領域およびロイシンリッチリピートを含んでいるので、付着において役割を果たすことが、提唱されている。B. pertussis、B. bronchisepticaおよびB. parapertussisのPRNは、それらが含んでいるプロリンリッチ領域の数において主に異なる。B. pertussis PRNのＸ線結晶構造は、それが、Ｖ型の断面を有している１６鎖の平行なβへリックスを含んでおり、現在、知られている最大のβへリックスであること示唆している。prnBpの３’領域の欠失は、その分子の表面露出を妨げる。
【００８６】
自己トランスポート能を有しているさらなるボルデテラ属タンパク質としては、TcfA (もとは気管支固着因子と分類されていた)、BrkA、SphB1およびVag8が挙げられる。これらのタンパク質はすべて、Ｃ末端に顕著なアミノ酸配列類似性を示し、１つ以上のRGDトリプレットモチーフを含んでいる。
【００８７】
SphB1は、FHAの切断およびＣ末端成熟に必須な、サブチリシン様Serプロテアーゼ／リポタンパク質として性質決定されている。SphB1は、同じ生物によって分泌される他のタンパク質にとっての成熟因子としてパッセンジャタンパク質が機能する、最初に報告された自己トランスポータである。BrkAは、プロセシングされて、73-kDaのα (パッセンジャ)-ドメインおよび30-kDaのβ-ドメインを生じる、103-kDaのプレプロタンパク質として発現される。β-ドメインは、分泌孔および分子内シャペロン（外膜を通る転移と同時にか、それに続いてパッセンジャのフォールディングをもたらす）として二重に機能することによってトランスポートを容易にする。PRNおよびSphB1と同様に、BrkAは、細菌表面と強く会合して残る。Vag8は、B. pertussis、B.bronchisepticaおよびB. parapertussishuにおいて発現される、95-kDaの外膜タンパク質である。B. pertussisおよびB. bronchisepticaの Vag8相同物は、高度に類似しており、それらのＣ末端は、PRN、BrkAおよびTcfAのＣ末端と顕著な相同性（Vag8が自己トランスポータとしてとして機能することを示す）を示す。TcfAは、プロセシングされて60-kDaの成熟タンパク質を放出する90-kDaの細胞会合前駆体として産生される。
【００８８】
繊毛。グラム陰性の病原性細菌と同様に、ボルデテラ属は、繊毛(FIM)と呼ばれる線維状の重合体タンパク質細胞表面構造を発現する。２つの主要な、ボルデテラ属の繊毛血清型Fim2およびFim3 (AGG2およびAGG3)を形成する繊毛の主要なサブユニットは、連結されていない染色体座fim2およびfim3にそれぞれコードされている。
第３の連結されていない遺伝子座fimXは、あっても極めて低いレベルにおいて発現されており、第４の繊毛遺伝子座fimNは、B. bronchisepticaにおいて同定された。B. bronchisepticaおよびB. parapertussisは、繊毛生合成オペロンfimBCDおよびfhaBの３’のすぐ上流に配置されている第５の遺伝子fimA（発現され、繊毛サブユニットFimAをコード可能な）を含んでいる。
【００８９】
アデニル酸シクラーゼ(CyaA)。哺乳類に感染するボルデテラ属の種はすべて、CyaA（二機能性のカルモジュリン感受性アデニル酸シクラーゼ／ヘモリシン）を分泌する。CyaAは、１７０６アミノ酸のプロ毒素として合成される。アデニル酸シクラーゼの触媒活性は、Ｎ末端の４００アミノ酸の範囲に位置している。１３００アミノ酸のＣ末端ドメインは、真核細胞の細胞質への、触媒作用ドメインの輸送を媒介し、ヒツジ赤血球にとっての検出可能な低い溶血活性を有している。Ｃ末端ドメイン、E. coliのヘモリシン (HlyA)、Actinobacillus pleuropneumoniaeのヘモリシン (HppA)、leukotoxins of Pasteurella hemolyticaの白血球毒素(LktA)およびActinobacillus actinomycetemcomitansの白血球毒素(AaLtA)の間におけるアミノ酸配列類似性は、カルシウム依存性の、細孔形成する、細胞毒素（RTX (repeats-in-toxin) toxinsとして知られている）のファミリーに、CyaAを入れている。これらの毒素のそれぞれは、カルシウム結合に関与すると考えられている９アミノ酸の繰り返し（LXGGXG(N/D)DX）の直列を含んでいる。CyaAプロ毒素は、宿主細胞を中毒し得る前に、cyaABDEオペロンに隣接し、cyaABDEオペロンとは別に転写されるcyaC遺伝子の産物によって活性化される必要がある。CyaCは、内部のリジン残基（Lys-983）のパルミトイル化を触媒することによって、CyaAプロ毒素を活性化する。また、E. coli HlyAプロ毒素は、脂肪族アシル基修飾によって活性化される。E.coliヘモリシンは 細胞外培地に放出され、ボルデテラ属CyaAの大部分は、会合して表面に残り、残りが上澄に放出される。近年、FHAが細菌細胞表面にCyaAを保持する役割を果たし得ると、示唆されている：FHAを欠いているB. pertussis変異株は、非常に多くCyaAを培地に放出し、細菌表面とのCyaA毒素の会合は、プラスミドからトランスにFHAを発現することによって回復できた。また、CyaAは、おそらくFHAとの相互作用および続くsubsequent interference withFHA機能の妨害を介して、B. bronchisepticaにおける生物膜形成を阻害する。真核細胞の表面糖タンパク質ＣＤ１１ｂは、成熟CyaA毒素にとっての受容体として機能する。
【００９０】
皮膚毒素(DNT)。内毒素としてはじめは誤って同定されたが、最初のB. pertussis発病因子の１つであった。B. pertussis、B. bronchisepticaおよびB. parapertussishuのDNTは、ほぼ同一な、単一の約160 kDaの細胞質ポリペプチド鎖である。ボルデテラ属DNTは、５４アミノ酸のＮ末端受容体結合ドメインおよび３００アミノ酸のＣ末端酵素ドメインによって構成されている典型的なＡ−Ｂ毒素である。
【００９１】
リポ多糖。他のグラム陰性細菌からの内毒素と同様に、ボルデテラ属の種のLPSは、発熱性、分裂促進性かつ毒性であり、マクロファージにおける腫瘍壊死因子を活性化および誘導し得る。ボルデテラ属のLPS分子は、腸内細菌科のメンバーによって発現される、よく知られているスムースLPSと化学構造において異なる。特に、B. pertussisのLPSは、反復性のO-抗原性構造を欠いており、したがって、ラフLPSとより類似している。それは、銀染色されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおいて、２つの異なるバンド（ＡおよびＢ）として、分離される。より早い移動度の部分バンドＢは、ヘプトース、グルコース、グルクロン酸、グルコサミン、およびガラクトサミヌロン酸（GalNAcA）を含んでいる分枝鎖状のオリゴ糖に、単一のケトデオキシオクツロソン酸残基を介して連結されている脂質Ａ分子からなる。荷電糖（GalNAcA、グルクロン酸およびグルコサミン）は、他のLPS分子におけるコア構成要素として一般には見られない。より遅い移動度の部分（バンドＡ）は、バンドＢ＋N-アセチル-N-メチルフルコサミン(FucNAcMe)、2,3-デオキシ-ジ-N-アセチルマンノサミヌロン酸(2,3-diNAcManA)およびN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)からなる三糖からなる。B. bronchisepticaのLPSは、バンドＡおよびバンドＢ＋2,3-ジデオキシ-ジ-N-アセチルガラクトサミヌロン酸の単一の糖重合体からなるO-抗原によって構成されている。B. parapertussishu単離物は、バンドＡを欠いているLPSを含んでおり、トランケートされたバンドＢを有しており、B.bronchisepticaと同様に、2,3-ジデオキシ-ジ-N-アセチルガラクトサミヌロン酸からなるO抗原を含んでいる。B. parapertussisov単離物は、O抗原を欠いており、ボルデテラ属の他の種のそれらと異なると思われるバンドＡ−バンドＢ様部分を含んでいる。
【００９２】
タイプＩＩＩ分泌装置(TTSS)。TTSSはボルデテラ属の亜種において同定されている。TTSSは、グラム陰性細菌がエフェクタータンパク質を、真核細胞の形質膜または細胞質に針様注射組織を通して直接に転移させることを可能にする。これらの細菌エフェクタータンパク質は、それから細菌の病原性ストラテジーを促進するために、正常な宿主細胞シグナル伝達カスケードおよび他の過程を変更させる。タイプＩＩＩ分泌は、種々の病原体（ヒトに感染する病原体（例えば、Yersinia、Shigella、Salmonellaおよび腸管病原性E. coli、ならびに植物病原体Pseudomonas syringaeおよびErwinia）が挙げられる）において同定されている。B. bronchisepticaのTTSSは、呼吸器感染のラットモデルおよびマウスモデルの両方において、気管の持続的な固着に寄与する。
【００９３】
気管細胞毒素(TCT)。TCTは、それらが成長の間におけるそれらの細胞壁を壊し、再構築するように、すべてのグラム陰性細菌によって産生されるペプチドグリカンのジサッカリド−テトラペプチド単量体に対応する。その構造は、N-アセチルグルコサミニル-1,6-アンヒドロ-N-アセチルムラミル-(l)-アラニル-γ-(d)-グルタミル-モソジアミノピメリル-(d)-アラニンである。他の細菌（例えばE. coli）は、Integral細胞膜タンパク質（AmpGと呼ばれる）介してそれを細胞質に輸送することによって、このペプチドグリカン断片を再利用し、ボルデテラ属 spp.は機能的なAmpGの欠乏によってAmpGを環境に放出する。
したがって、TCTは、構造的に発現されており、BvgAS制御に依存している。
【００９４】
TCTは、ハムスターの気管支ring培養物において、繊毛のない細胞にはわずかな損傷を与えるか、損傷をあたえず、ミトコンドリアbloating、タイトジャンクションの崩壊、および繊毛のある細胞のextrusionを、THE細胞においてDNA合成の用量依存的阻害を引き起こす。また、TCTは、ヒトの上皮生検試料において明らかな通り、繊毛のある細胞の低下、細胞blebbing、およびミトコンドリア損傷を引き起こす。TCTは、単独で、Explanted気管支組織における、B. pertussis感染の、繊毛のある細胞に特異的な細胞病原特性を再現するために、必須かつ十分である。TCT依存的な一酸化窒素(NO)の増加は、繊毛のある細胞のこの重篤な崩壊を媒介すると提唱されている。TCTは、THE細胞におけるＩＬ−１αの産生を引き起こし、TCTおよびＩＬ−１αの両方は、THE細胞に加えられたとき、増加したNO生成を生じさせる。TCTは、繊毛のない粘液分泌細胞におけるＩＬ−１α産生を刺激する（高レベルのNO生成を導く誘導可能な一酸化窒素合成酵素の発現を正に制御する）ことが仮定されている。NOは、それから、その損傷作用に対してはるかに影響されやすい近傍の繊毛のある細胞に分散する。また、TCTは、気道上皮内におけるNOの生成を誘導するために、ボルデテラ属 LPSと相乗的に機能する。
【００９５】
百日咳毒素(PT)。PTは、B. pertussisによって多く合成され、分泌されるADPリボシル化毒素である。それは、ptxA〜ptxE遺伝子によってそれぞれコードされている６つのポリペプチド（designated S1〜S5）によって構成されているA-B毒素である。S1ポリペプチドは、毒素のAサブユニットを含んでおり、五量体B サブユニットは、1:1:2:1の比において集められているポリペプチドS2、S3、S4およびS5からなる。各サブユニットは、N末端シグナル配列を有して合成され、かつ細胞質周辺領域への輸送が、E. coliのsecシステムと同様の一般的な輸送経路を介して生じさせると示唆されている。外膜を通過する分泌は、９つのPtl(for “百日咳毒素 liberation”)タンパク質によって構成されている特殊化された輸送装置を必要とする。Ptl遺伝子座は、Agrobacterium tumefaciensのvirBオペロンによってコードされている短鎖「T-DNA」の輸送に関与するプロトタイプ型IV分泌に対する大きな類似性を有しており、かつこれらのシステムの両方が巨大タンパク質複合体を輸送するための共通する機序によって機能すると示唆されている。さらに、完全に集合したPTホロ毒素のみが効率的に分泌されるという証拠がある。
【００９６】
酵素的に活性なS1サブユニットからなるPTのAコンポネントは、残りのS2〜S5サブユニットによって形成されているリング様構造であるBオリゴマーの先頭にある。複数のサブユニットはともに、非共有的な相互作用によって保持されている。Bオリゴマーは、真核細胞の細胞膜に結合し、S1サブユニットが宿主細胞に侵入する効率を劇的に向上させる。それが真核細胞への侵入に酸性環境を必要としないので、PTは、エンドサイトーシスを必要とせずに直接に膜をtraversesと提唱されている。しかし、それに続く報告は、PTが細胞表面受容体に結合し、サイトカラシンD依存的な経路を介してエンドサイトーシスを受けると、提唱している。初期および後期のエンドソームならびにゴルジ装置は、PTトラフィッキング過程を有している。宿主細胞細胞質に入ると、Bオリゴマーは、細胞膜にintercalatesし、ATPを結合し、ジスルフィド結合の還元によって活性になるS1サブユニットの放出を引き起こす。
【００９７】
還元体におけるS1サブユニットは、真核細胞におけるグアニンヌクレオチド結合タンパク質（G タンパク質）のαサブユニットへのNADからの、ADPリボースの転移を触媒すると示されている。PTは、リボシル化ADPを結合し、それから不活性なGタンパク質（例えばGi、Gt (トランスダクチン)およびGo）を結合し得る。活性なとき、Giは、アデニルシクラーゼを阻害し、K+チャネルを活性化し、Gtは、特定の光受容体におけるサイクリックGMホスホジエステラーゼを活性化し、Goは、K+チャネルを活性化し、Ca2+チャネルを不活性化し、ホスホリパーゼC-βを活性化する。これらのシグナル伝達経路の崩壊に寄与する生物学的な作用としては、ヒスタミン感作、制御シグナルにおけるインスリン分泌の向上、および両方の抑制性および刺激性の免疫学的作用が挙げられる。
【００９８】
PTは、種々の動物およびヒトの免疫系における強力なアジュバントである。実験動物におけるこのアジュバント性は、他の抗原に対する血清抗体反応の向上、種々のタンパク質抗原に対する向上した細胞性免疫応答、hyperacute experimental autoallergic encephalomyelitisへの寄与、および向上したアナフィラキシー感受性と関連している。動物モデル系において証明されているこれらのアジュバント活性のうち、他のワクチン抗原に対する血清抗体反応の向上のみが、ワクチン接種された子供において生じると証明されている。
【００９９】
一方で、PTはアジュバント特性を示すが、それはまた、好中球およびマクロファージにおける化学走性、酸化応答、およびリソソーム酵素放出を阻害すると示されている。この表現型は、PTが好中球、単球/マクロファージ、およびリンパ球の化学走性および移動を阻害すると示されたマウスおよびラットのモデルを用いて確認されている。最近、PT変異体に感染したマウスが、野生型B. pertussisに感染したマウスよりはるかに高い力価の抗ボルデテラ属血清抗体を誘導したので、PTは、免疫抑制活性を示すと、示されている。また、PTは、ヒトのマクロファージおよび繊毛のある呼吸器上皮細胞に対するB. pertussisのアドヘシンに関与するアドヘシンとして機能すると示唆されている。
【０１００】
他の抗原。
【０１０１】
一実施形態において、特定の遺伝子座のタンパク質または産物の１つ以上は、本発明の免疫原性組成物に含まれている。
【０１０２】
Flagella.ボルデテラ属のflagellaは、are peritrichous 細胞表面 appendages required for motility.
タイプIV繊毛。ボルデテラ属は、Ｎ末端残基としてＮメチル化フェニルアラニンを一般的に有している極性の繊毛を含んでいる。それらは、接着、twitching motilityおよびDNA取り込みにおいて機能し得る。
【０１０３】
カプセル。ボルデテラ属のカプセルは、Nアセチルガラクトサミヌロン酸のVi抗原様重合体によって構成されていると考えられているタイプII多糖のコートである。
それらは、宿主防御機序または環境における生存に機能し得る。
【０１０４】
アルカリギン。ボルデテラ属は、複数の外膜受容体（B.bronchisepticaは16のそのような受容体をコードしており、B. pertussisは１２の受容体をコードしている）を介して内在化される鉄を錯化するためのsiderophoreである、アルカリギンを含んでいる。.
鉄の取り込みは、哺乳類宿主内の生存にとって重要であり得る。
【０１０５】
本発明の一実施形態において、免疫原性組成物は、約0.1μg(または0.1μg未満)〜約100μgの本明細書に記載されている１つ以上の抗原を含んでおり、１つ以上のそれぞれの抗原（例えばFHA、百日咳毒素および／またはパータクチン）を任意の量（例えば、約0.1μg、約0.2μg、約0.3μg、約0.4μg、約0.5μg、約0.6μg、約0.7μg、約0.8μg、約0.9μg、約1.0μg、約1.1μg、約1.2μg、約1.3μg、約1.4μg、約1.5μg、約1.6μg、約1.7μg、約1.8μg、約1.9μg、約2.0μg、約2.1μg、約2.2μg、約2.3μg、約2.4μg、約2.5μg、約2.6μg、約2.7μg、約2.8μg、約2.9μg、約3.0μg、約3.1μg、約3.2μg、約3.3μg、約3.4μg、約3.5μg、約3.6μg、約3.7μg、約3.8μg、約3.9μg、約4.0μg、約4.1μg、約4.2μg、約4.3μg、約4.4μg、約4.5μg、約4.6μg、約4.7μg、約4.8μg、約4.9μg、約5.0μg、約5.1μg、約5.2μg、約5.3μg、約5.4μg、約5.5μg、約5.6μg、約5.7μg、約5.8μg、約5.9μg、約6.0μg、約6.1μg、約6.2μg、約6.3μg、約6.4μg、約6.5μg、約6.6μg、約6.7μg、約6.8μg、約6.9 mg, 約7.0mg, 約7.5 mg, 約8.0 mg, 約8.5 mg, 約9.0 mg, 約9.5μg、約10.0μg、約10.5μg、約11.0μg、約11.5μg、約12.0μg、約12.5μg、約13.0μg、約13.5μg、約14.0μg、約14.5μg、約15.0μg、約15.5μg、約16.0μg、約16.5μg、約17.0μg、約17.5μg、約18.0μg、約18.5μg、約19.0μg、約19.5μg、約20.0μg、約21.0μg、約22.0μg、約23.0μg、約24.0μg、約25.0μg、約26.0μg、約27.0μg、約28.0μg、約29.0μg、約30.0μg、約35.0μg、約40.0μg、約45.0μg、約50.0μg、約55.0μg、約60.0μg、約65.0μg、約70.0μg、約75.0μg、約80.0μg、約85.0μg、約90.0μg、約95.0μgまたは約100.0μgまたはそれ以上）において含んでいる。 
【０１０６】
好ましい組み合わせ。本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質の好ましい組み合わせは、百日咳毒素 (Pt)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、繊毛、パータクチン (PRN)、Vag8、BrkA、SphB1、気管固着因子(TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)、およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１０７】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊毛、パータクチン (PRN)、Vag8、BrkA、SphB1、気管固着因子 (TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１０８】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質の他の好ましい組み合わせは、
パータクチン (PRN)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊毛、繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、Vag8、BrkA、SphB1、気管固着因子 (TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１０９】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、繊毛ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、Vag8、BrkA、SphB1、気管固着因子(TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ(CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１０】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、Vag8ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、BrkA、SphB1、気管固着因子(TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ(CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１１】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、BrkAならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、SphB1、気管固着因子(TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ(CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１２】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、SphB1ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、気管固着因子(TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ(CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagPからなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１３】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、気管固着因子 (TcfA)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP)からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、アデニルシクラーゼ (CyaA)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、気管固着因子 (TcfA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１５】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、タイプIII分泌ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、気管固着因子 (TcfA)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１６】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、皮膚壊死毒素 (DNT) ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、気管固着因子 (TcfA)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、気管細胞毒素 (TCT)およびLPS （例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１７】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、気管細胞毒素 (TCT)ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、気管固着因子 (TcfA)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)およびLPS（例えばwlb遺伝子座、wbm遺伝子座、PagP）からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる好ましい組み合わせは、ボルデテラ属LPSならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのさらなる抗原（繊維状血球凝集素アドヘシン (FHA)、パータクチン (PRN)、繊毛、Vag8、BrkA、SphB1、百日咳毒素 (PT)、気管固着因子 (TcfA)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)からなる群から選択される）を含んでいる。
【０１１９】
後述の実施例に記載の通り、本発明は、特定の抗原が、抗原の混合物の内容量において特に有効な免疫応答を生じることをもたらす。
したがって、本発明の一実施形態は、ボルデテラ属毒素（例えば百日咳毒素）)およびボルデテラ属細胞外結合タンパク質（例えばアドヘシン（例えばFHA））、またはボルデテラ属毒素（例えば百日咳毒素）)およびボルデテラ属トランスポータタンパク質（例えばパータクチン））、またはボルデテラ属トランスポータタンパク質（例えばパータクチン）)およびボルデテラ属細胞外結合タンパク質（例えばアドヘシン（例えばFHA））、または百日咳毒素およびFHA、またはパータクチンおよびFHA、またはパータクチンおよび百日咳毒素を含んでいる免疫原性組成物である。
これらの組み合わせのそれぞれについて、タンパク質は、全長または全長配列（例えば野生型または変異体配列）の少なくとも85%、90%、95%、98%または100%を有している断片であり得る。
【０１２０】
以上および以下の組み合わせにおいて、特定されているタンパク質は、断片または融合タンパク質として本発明の免疫原性組成物に存在し得る。
【０１２１】
好ましい本発明の免疫原性組成物は、組み合わせにおいて３つのタンパク質構成要素（例えば、細胞外コンポネント結合タンパク質 (FHA)；トランスポータタンパク質パータクチン)；および制御因子または発病（例えば百日咳毒素））を含んでいる。例えば、一実施形態において、免疫原性組成物は、ナノエマルションならびに百日咳毒素、FHAおよびパータクチンの組み合わせを含んでいる。毒素ば、化学的に無毒化され得るか、または（複数の）点変異を導入することによって遺伝学的に無毒化され得る。また、毒素は、遊離タンパク質として存在し得るか、または代替的に多糖もしくは他の種の炭化水素（例えば免疫原性の炭化水素部分）に結合され得る。
【０１２２】
多糖および／または炭化水素部分は、本来のサイズであり得るか、または例えばmicrofluidisation、超音波照射または化学切断によって大きさが変えれ得る。本発明はまた、B. pertussis株から抽出されたオリゴ糖を網羅している。多糖および／または炭化水素部分は、複合化され得るか、複合化され得ない。
【０１２３】
多糖および／または炭化水素部分の複合化
ワクチン接種における多糖および／または炭化水素部分の使用に関連する問題が、存在しており、それらが独立して乏しい免疫原であるという事実に関連する。
この免疫原性の乏しさを克服するために設計されている戦略としては、bystanderT-細胞の補助をもたらす巨大タンパク質担体に対する多糖の連結が挙げられる。本発明に利用される多糖がbystanderT-細胞の補助をもたらすタンパク質担体に連結されていることが好ましい。多糖免疫原に複合化されているそのような担体の例としては、DiphtheriaおよびTetanus toxoids (DT、それぞれDT crm197およびTTである)、Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)、およびTuberculinの精製タンパク質誘導体(PPD)、Pseudomonas aeruginosa exoタンパク質 A (rEPA)、Haemophilus influenzaのタンパク質D、ニューモリシン、または上述のいずれかの断片が挙げられる。使用に好適な断片としては、Tヘルパエピトープを含んでいる断片が挙げられる。特に、タンパク質 D 断片は、当該タンパク質のＮ末端の1/3を好ましく含んでいる。タンパク質 Dは、Haemophilus influenzaに由来するIgD結合タンパク質であり（EP 0 594 610 B1）、潜在的な免疫原である。
【０１２４】
さらに、ボルデテラ属タンパク質は、本発明の多糖複合化物における担体タンパク質として使用され得る。以下に記載されているボルデテラ属タンパク質は、担体タンパク質（例えば、繊維状血球凝集素アドヘシン(FHA)、繊毛、パータクチン (PRN)、Vag8、BrkA、SphB1、気管固着因子 (TcfA)、百日咳毒素 (PT)、アデニルシクラーゼ (CyaA)、タイプIII分泌、皮膚壊死毒素 (DNT)、気管細胞毒素 (TCT)、またはその断片）として使用され得る。
【０１２５】
多糖は、周知の方法(例えば、byLikhite（Armor et al.による米国特許第4,372,945号、米国特許第4,474,757号、および、米国特許第4,356,170号（Jennings et al.）によって担体タンパク質に連結され得る。好ましくは、CDAP複合化化学が、実施される（WO95/08348を参照)。
【０１２６】
ICDAPにおいて、シアニル化剤1-シアノ-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)は is preferably used for the synthesisof 多糖-タンパク質複合化物の合成に好ましく使用される。シアニル化反応は、アルカリ感受性の多糖の加水分解を回避する相対的に穏やかな条件において実施され得る。この合成は、担体タンパク質に対する直接的な結合を可能にする。
【０１２７】
多糖は水または生理食塩水に可溶化される。CDAPは、アセトニトリルに溶解され、多糖溶液に速やかに加えられる。CDAPは、シアン酸エステルを形成するために多糖の水酸基と反応させられる。活性化ステップのあとに担体タンパク質が加えられる。リジンのアミノ基は、活性化多糖と反応してイソウレア共有結合を形成する。カップリング反応の後に、大過剰のグリシンが加えられ、残余の活性化官能基をクエンチする。生成物はそれから、ゲル浸透カラムに通されて、未反応の担体タンパク質および残余の試薬を除去する。
【０１２８】
複合化は、担体タンパク質および多糖の間の直接結合を好ましく含んでいる。任意にスペーサ（例えば、アジピン酸二水和物(ADH)）が担体タンパク質および多糖の間導入され得る。
【０１２９】
ボルデテラ属感染に対する防御
ナノエマルション。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、単離された抗原（例えば、単離された抗体および／または組換え産生された抗体）および水中油ナノエマルションを用いて構成されている。
【０１３０】
液滴サイズ。
本発明のナノエマルションおよびボルデテラ属抗原の組み合わせを含んでいる、免疫原性組成物は、平均粒径（約1,000 nm未満、約950 nm未満、約900 nm未満、約850 nm未満、約800nm未満、約750 nm未満、約700 nm未満、約650 nm未満、約600 nm未満、約550nm未満、約500 nm未満、約450 nm未満、約400 nm未満、約350 nm未満、約300nm未満、約250 nm未満、約220 nm未満、約210 nm未満、約205 nm未満、約200nm未満、約195 nm未満、約190 nm未満、約175 nm未満、約150 nm未満、約100nmを超える、約50 nmを超える、約70 nmを超える、約125 nm、またはその任意の組み合わせ）を有している液滴を含んでいる。一実施形態において、液滴は、約125 nmを超え、約600 nm以下の平均粒径を有している。異なる実施形態において、液滴は、約50 nmを超えるか、または約70 nmを超え、かつ約125 nm以下の平均粒径を有している。他の実施形態において、液滴は、約200 nm〜約400 nmの平均粒径を有している。
【０１３１】
水相。水相は、任意の種類の水相（水（例えばH2O、蒸留水、精製水、注射用の水、脱イオン水、水道水）および溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液）が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。一部の実施形態において、水相は、約4〜10、好ましくは約6〜8のｐＨにおける水を含んでいる。水は、脱イオン化され得る（以下、DiH2O）。いくつかの実施形態において、水相は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでいる。水相はさらに、滅菌であり、病原体なしであり得る。
【０１３２】
有機溶媒。本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにおける有機溶媒としては、C1-C12アルコール、ジオール、トリオール、リン酸ジアルキル、リン酸トリアルキル（例えばリン酸トリ-n-ブチル）、半合成誘導体、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一側面において、有機相は、非極性溶媒、極性溶媒、プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒から選択されるアルコールである。 
【０１３３】
本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにとって好適な溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、プロパノール、オクタノール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、酢酸、n-ブタノール、ブチレングリコール、蒸気アルコール、イソプロパノール、n-プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、ソルビトール、鉱業メチル化スピリッツ、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、ポリエチレングリコール、有機リン酸に基づく溶媒、半合成誘導体、および任意のその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
油相。本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにおける油は、化粧用または薬学的に許容可能な、任意の油であり得る。油は、揮発性または不揮発性であり得、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、半合成誘導体、およびその組み合わせから選択され得る。
【０１３５】
好適な油としては、鉱油、スクアレン油、香油、シリコン油、精油w、非水溶性ビタミン、イソプロピルステアラート、ブチルステアラート、オクチルパルミテート、セチルパルミテート、トリデシルベヘネート、ジイソプロピルアジピン酸、ジオクチルセバシン酸、メンチルアントラニル酸、セチルオクタン酸、オクチルサリチル酸、イソプロピルミリステート、ネオペンチルグリコールジカプリル酸セトール、CERAPHYLS、デシルオレイン酸、ジイソプロピルアジピン酸、C12-15 アルキルラクテート、セチルラクテート、ラウリルラクテート、イソステアリルネオペンタン酸、ミリスチルラクテート、イソセチルステアロイルステアラート、オクチルドデシルステアロイルステアラート、炭化水素油、イソパラフィン、液体パラフィン、イソドデカン、Petrolatum、アルガン油、キャノール油、チリ油、ココナツ油、コーン油、綿実油、麻実油、グレープ実油、マスタード油、ｐリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ピーナツ油、松実油、けし実油、かぼちゃ実油、米ぬか油、サフラワー油、茶油、トリュフ油、植物油、杏子(核)油、ホホバ(simmondsiachinensis実油)、ブドウ実油、マカダミア油、麦芽油、アーモンド油、菜種油、へちま油、ダイズ油、ゴマ油、ヘーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、材木油、Kukiナッツ油、アボカド油、ウォールナッツ油、魚油、ベリー油、オールスパイス油、ネズ油、種油、アーモンド油、アニス油、セロリ種子油、クミン種油、ナツメグ油、葉油、バジル葉油、月桂樹油、シナモン油、セージ油、ユーカリ油、レモングラス油、コバノブラッシノキ油、オレガノ油、パチョリ油、ペパーミント油、松葉油、ロ０ズマリー油、スペアミント油、ティーツリー油、タイム油、ウインターグリーン油、フラワー油、カモミール油、半合成誘導体、およびその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
油は、シリコーン成分（例えば、シリコーン成分における単独の油であり得るか、または揮発性および不揮発性の他のシリコーン油および非シリコーン油と混合され得る不揮発性シリコーン成分）をさらに含んでいる。好適なシリコーン成分としては、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチコン、フェニルトリメチコン（またはそれらの有機修飾体）、重合体シリコーンのアルキル化誘導体（例えば、セチルジメチコン、ラウリルトリメチコン）、、重合体シリコーンのヒドロキシル化誘導体（例えば、ジメチコノール）、揮発性シリコーン油、環状シリコーン、直鎖状シリコーン、シクロメチコン、シクロメチコンの誘導体、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、揮発性の直鎖ジメチルポリシロキサン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソテトラコサン、ポリイソブテン、イソオクタン、イソデカン、半合成誘導体、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
揮発性油は、有機溶媒であり得るか、揮発性油は、有機溶媒の他にさらに存在し得る。好適な揮発性油としては、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、a terpene、monoterpene、sesquiterpene、カーミナティブ、アズレン、メントール、カンフル、チモール、ネロール、リナロール、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロリドール、フラネゾール、イルアンゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、ケノポジ油、シトロネラル、シトラル、シトロネロール、カマズレン、ノコギリソウ、グアイアズレン、カモミール、半合成誘導体、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の一側面において、シリコン成分における揮発性油は油相と異なる。
【０１３９】
界面活性剤。本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにおける界面活性剤は、薬学的に許容可能なイオン性界面活性剤、薬学的に許容可能な非イオン性界面活性剤、薬学的に許容可能なカチオン性界面活性剤、薬学的に許容可能なアニオン性界面活性剤、または薬学的に許容可能な双生イオン性界面活性剤であり得る。
【０１４０】
例示的な有用な界面活性剤は、Applied Surfactants:Principles and Applications. Tharwat F. Tadros, Copyright 8 2005 WILEY-VCHVerlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 3-527-30629-3)に記載されている。
【０１４１】
さらに、界面活性剤は、薬学的に許容可能な重合体のイオン性界面活性剤、薬学的に許容可能な重合体の非イオン性界面活性剤、薬学的に許容可能な重合体のカチオン性界面活性剤、薬学的に許容可能な重合体のアニオン性界面活性剤、または薬学的に許容可能な重合体の双生イオン界面活性剤であり得る。重合体の界面活性剤の例としては、複数の（少なくとも１つの）ポリエチレンオキシド(PEO)側鎖、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化アルキルフェノールホルムアルデヒド縮合体、脂肪酸疎水性物を有しているポリアルキレングリコール修飾ポリエステル、ポリエステル、その半合成誘導体、またはその組み合わせを有している、ポリ(メチルメタクリレート)骨格のグラフト重合体のグラフト共重合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
表面活性剤または界面活性剤は、非極性疎水性部分（一般的に極性またはイオン性の親水性部分に結合されている、8-18の炭素原子を含んでいる直鎖状または分枝鎖状の炭化水素鎖またはフルオロカーボン鎖）からなる両親媒性分子である。親水性部分は、非イオン性、イオン性または双生イオン性であり得る。炭化水素鎖は、水性環境において水分子と弱く相互作用し、極性またはイオン性の頭部基は、双極性またはイオン双極性相互作用を介して水と強く相互作用する。親水性基の性質に基づいて、界面活性剤は、双生イオン性、非イオン性および重合体の界面活性剤に分類される。
【０１４３】
好適な界面活性剤としては、9〜10ユニットのエチレングリコールを含んでいるエトキシル化ノニルフェノール、8ユニットのエチレングリコールを含んでいるエトキシル化ウンデカノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリル酸塩、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノパルミチン酸塩、ポリオキシエチレン(20) ソルビタンモノステアリン酸塩、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノオレイン酸塩、ソルビタンモノラウリル酸塩、ソルビタンモノパルミチン酸塩、ソルビタンモノステアリン酸塩、ソルビタンモノオレイン酸塩、エトキシル化水素化リシン油、ナトリウムラウリル硫酸塩、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのジブロックコポリマー、エチレンオキシド-プロピレンオキシドブロックコポリマー、およびエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づく四官能化ブロックコポリマー、グリセリルモノエステル、グリセリルカプレート、グリセリルカプリル酸塩、グリセリルコケート、グリセリルエルカエート、グリセリルヒドロキシステアラート、グリセリルイソステアレート、グリセリルラノリン酸塩、グリセリルラウレート、グリセリルリノレート、グリセリルミリステート、グリセリルオレエート、グリセリルPABA、グリセリルパルミテート、グリセリルリコノレアート、グリセリルステアラート、グリセリルチオグリコレート、グリセリルジラウレート、グリセリルジオレエート、グリセリルジミリステート、グリセリルジステアレート、グリセリルセスイオレアート、グリセリルステアラートラクテート、ポリオキシエチレンセチル／ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ポリオキシエチレンラウレートまたはジラウレート、ポリオキシエチレンステアラートまたはジステアレート、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、ベータシトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、イソプロピルミリステート、脂肪族イソプロピルｎ−ブチレート、イソプロピルｎ−ヘキサノエート、イソプロピルｎ−デカノエート、イソプロピルパルミテート、オクチルドデシルミリステート、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖誘導体、天然油のアルコキシル化誘導体およびワックス、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、nonoxynol-14、PEG-8ラウレート、PEG-6 ココアミド、PEG-20 メチルグルコースセスキステアレート、PEG40ラノリン、PEG-40 キャスター油、PEG-40 水素化キャスター油、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル、グリセリル diエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、およびポリオキシエチレンラウリルエーテル、グリセリルジラウレート、グリセリルジミリステート、グリセリルジステアレート、その半合成誘導体、またはその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
付加的な好適な界面活性剤としては、非イオン性脂質（例えば、グリセリルラウレート、グリセリルミリステート、グリセリルジラウレート、グリセリルジミリステート、半合成誘導体、およびその混合物）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
さらなる実施形態において、界面活性剤は、約2〜約100の範囲の数のポリオキシエチレン頭部基または構造R5--(OCH2CH2)y--OH（R5は約6〜約22の炭素原子を有している分枝鎖または分枝なしのアルキル基であり、yは約4および約100（好ましくは約10〜約100）である）を有しているアルコキシル化アルコールを有しているポリオキシエチレン脂肪族エーテルである。好ましくは、アルコキシル化アルコールは、R5がラウリル基であり、yが23の平均値を有している種である。
【０１４６】
異なる実施形態において、界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体であるアルコキシル化アルコールである。好ましくは、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体は、１０の平均のエトキシル化値を有しているラノリンアルコールのポリエチレングルコールである。
【０１４７】
非イオン性界面活性剤としては、エトキシル化界面活性剤、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化モノアルカノールアミド、エトキシル化ソルビタンエステル、エトキシル化脂肪族アミノ、エチレンオキシド-プロピレンオキシドコポリマー、ビス(ポリエチレングリコールビス(イミダゾールカルボニル))、ノンオキシノール-9、ビス(ポリエチレングリコール ビス[イミダゾールカルボニル])、BRIJ 35、BRIJ 56、BRIJ 72、BRIJ 76、BRIJ92V、BRIJ 97、BRIJ 58P、CREMOPHOR、EL、デカエチレングリコールモノデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルアルファ-D-グルコピラノシド、デシルベータ-D-マルトピラノシド、n-ドデカノイル-N-メチルグウｒカミド、n-ドデシルアルファ-D-マルトシド、n-ドデシルベータ-D-マルトシド、n-ドデシルベータ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルベータ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル-6-O--(N-ヘプチルカルバモイル)-アルファ-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-ベータ-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテル W-1、ポリオキシエチレン 10 トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン 100ステアラート、ポリオキシエチレン 20 イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン 20 オレイルエーテル、ポリオキシエチレン 40ステアラート、ポリオキシエチレン 50ステアラート、ポリオキシエチレン 8ステアラート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン 25 プロピレン グリコールステアラート、Saponin（Quillaja bark）、SPAN 20、SPAN 40、SPAN 60、SPAN65、SPAN 80、SPAN 85、Tergitol、Type 15-S-12、Tergitol、Type 15-S-30、Tergitol、Type 15-S-5、Tergitol、Type 15-S-7、Tergitol、Type 15-S-9、Tergitol、Type NP-10、Tergitol、Type NP-4、Tergitol、TypeNP-40、Tergitol、Type NP-7、Tergitol、Type NP-9、Tergitol、Tergitol、Type TMN-10、Tergitol、Type TMN-6、テトラデシル-ベータ-D-マルトシド、Tetraエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、TRITON X-100、TRITON X-114、TRITON X-165、TRITON X-305、TRITON X-405、TRITON X-45、TRITON X-705-70、TWEEN 20、TWEEN 21、TWEEN40、TWEEN 60、TWEEN 61、TWEEN 65、TWEEN 80、TWEEN81、TWEEN 85、Tyloxapol、n-ウンデシルベータ-D-グルコピラノシド、半合成誘導体、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
さらに、非イオン性界面活性剤はポリオキサマーであり得る。ポリオキサマーは、ポリオキシエチレンのブロック、ポリオキシプロピレンのブロック、およびポリオキシエチレンのブロックから作製されているポリマーである。ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンの平均ユニット数は、ポリマーと会合する数に基づいて変化する。例えば、最小のポリマー、Poloxamer 101は、平均2ユニットを有しているポリオキシエチレンのブロック、平均16 ユニットのポリオキシプロピレンを有しているブロック、および平均2ユニットのポリオキシエチレンを有しているブロックからなる。ポリオキサマーは、無色の液体およびペースト、から白色の固体までがある。ポリオキサマーの例としては、Poloxamer 101、Poloxamer 105、Poloxamer 108、Poloxamer 122、Poloxamer 123、Poloxamer 124、Poloxamer 181、Poloxamer 182、Poloxamer 183、Poloxamer 184、Poloxamer 185、Poloxamer 188、Poloxamer 212、Poloxamer 215、Poloxamer 217、Poloxamer 231、Poloxamer 234、Poloxamer 235、Poloxamer 237、Poloxamer 238、Poloxamer 282、Poloxamer 284、Poloxamer 288、Poloxamer 331、Poloxamer 333、Poloxamer 334、Poloxamer 335、Poloxamer 338、Poloxamer 401、Poloxamer 402、Poloxamer 403、Poloxamer 407、Poloxamer 105 Benzoate、およびPoloxamer 182Dibenzoateが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
好適なカチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム化合物、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド化合物、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド化合物、カチオン性ハロゲン含有化合物（例えば、セチルピリジニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロイオダイト、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド、グリニャール試薬T、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパン、トンゾニウムブロミド、トリメチル(テトラデシル)アンモニウムブロミド、1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール、1-デカナミニウム、N-デシル-N,N-ジメチル-,クロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、2-(2-(p-(ジイソブチル)クレソスキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、2-(2-(p-(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキル1または3ベンジル-1-(2-ヒロキシエチル)-2-イミダゾリニウムクロリド、アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)ベンジルアンモニウムクロリド、アルキルデメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロリド (100% O12)、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロリド (50% O14、40% C12、10% O16)、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロリド (55% C14、23% C12、20% O16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (100% O14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (100%C16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (41% C14、28% C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (47% C12、18% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (55% C16、20% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (58% C14、28% C16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (60% C14、25% C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (61% C11、23% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (61% C12、23% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (65% C12、25% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (67% C12、24% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (67% C12、25% C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (90% C14、5% C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (93% C14、4% C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (95% C16、5% C18)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジデシルジメチルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド (C12-16)、アルキルジメチル���ンジルアンモニウムクロリド (C12-18)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ジアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルエチルアンモニウムブロミド (90% C14、5% C16、5%C12)、アルキルジメチルエチルアンモニウムブロミド(ダイズ油のような混合されたアルキルおよびアルキレン基)、アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムクロリド (60% C14)、アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウムクロリド (50%C12、30% C14、17% C16、3% C18)、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド (58% C18、40% C16、1% C14、1%C12)、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド (90% C18、10% C16)、アルキルジメチル-(エチルベンジル) アンモニウムクロリド (C12-18)、ジ-(C8-10)-アルキルジメチルアンモニウムクロリド、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、ジアルキルメチルベンジルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジイソデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、ドデシルビス(2-ヒドロキシエチル)オクチル水素アンモニウムクロリド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ドデシルカルバモイルメチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウムクロリド、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、ミリスタルコニウムクロリド（および）Quat RNIUM 14、N,N-ジメチル-2-ヒドロキシプロピルアンモニウムクロリドポリマー、n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド一水和物、オクチルデシルジメチルアンモニウムクロリド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリド、オクチフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、オキシジエチレンビス(アルキルジメチルアンモニウムクロリド)、四級アンモニウム化合物s、ジココアルキルジメチル、クロリド、トリムエトキシシリルプロピルジメチルオクタデシルアンモニウムクロリド、トリムエトキシシリルquat、トリメチルドデシルベンジルアンモニウムクロリド、半合成誘導体、およびその組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。 
【０１５０】
好適なアニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコリンさん酸、ケノデオキシコリン酸ナトリウム塩、コリン酸、デヒドロコリン酸、デオキシコリン酸、デオキシコリン酸、デオキシコリン酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンN-オキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコ件デオキシコリン酸ナトリウム塩、グリココリン酸水和物、合成グリココリン酸ナトリウム塩水和物、合成グルコデオキシコリン酸一水和物、グリコデオキシコリン酸ナトリウム塩、グリコデオキシコリン酸ナトリウム塩、グリコールイトコリン酸3-硫酸二ナトリウム塩、グリコールイトコリン酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン溶液、N-ラウロイルサルコシン溶液、リチウムドデシル硫酸、リチウムドデシル硫酸、ルゴール溶液、Niaproof 4、Type 4、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、ナトリウム1-ブタンスルホン酸、ナトリウム1-デカンスルホン酸、ナトリウム1-デカンスルホン酸、ナトリウム1-ドデカスルホン酸、無水ナトリウム1-ヘプタンスルホン酸、無水ナトリウム 1-ヘプタンスルホン酸、ナトリウム 1-ノナンスルホン酸、ナトリウム 1-プロパンスルホン酸 一水和物、ナトリウム 2-bromoethaneスルホン酸、ナトリウムコール酸水和物、ナトリウムコール酸、ナトリウムデオキシコール酸、ナトリウムデオキシコール酸一水和物、ナトリウムドデシル硫酸、無水ナトリウムヘキサンスルホン酸、ナトリウムオクチル硫酸、無水ナトリウムペンタンスルホン酸、ナトリウムタウロコール酸、タウロケノデオキシコリン酸ナトリウム塩、タウロデオキシコリン酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、TRIZMAドデシル硫酸、TWEEN 80、ウルソデオキシコール酸、半合成誘導体、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
好適な双生イオン性界面活性剤としては、N-アルキルベータイン、ラウリルアミンドプロピルジメチルベータイン、アルキルジメチルグリシンさん塩、N-アルキルアミノプロピオン酸塩、CHAPS（最少98% (TLC)）、CHAPS（SigmaUltra、最少98% (TLC)）、CHAPS（電気泳動用、最少98% (TLC)）、CHAPSO（最少98%）、CHAPSO（SigmaUltra）、CHAPSO（電気泳動用）、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸の内部塩、3-ドデシルジメチル-アンモニオ)プロパンスルホン酸の内部塩（SigmaUltra）、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)-プロパンスルホン酸の内部塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホン酸、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホン酸、3-(N,N-ジメチルオクチル-アンモニオ)プロパンスルホン酸の内部塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)-プロパンスルホン酸、半合成誘導体、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物のナノエマルションは、セチルピリジニウムクロリドであり得るカチオン性界面活性剤を含んでいる。本発明の他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物のナノエマルションは、カチオン性界面活性剤を含んでおり、当該カチオン性界面活性剤の濃度は、カチオン性界面活性剤、および濃度のカチオン性界面活性剤は、約5.0%未満および0.001%を超える。さらなる他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物のナノエマルションは、カチオン性界面活性剤を含んでおり、カチオン性界面活性剤の濃度は、約5%未満、約4.5%未満、約4.0%未満、約3.5%未満、約3.0%未満、約2.5%未満、約2.0%未満、約1.5%未満、約1.0%未満、約0.90%未満、約0.80%未満、約0.70%未満、約0.60%未満、約0.50%未満、約0.40%未満、約0.30%未満、約0.20%、または約0.10%未満からなる群から選択される。さらに、本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにおけるカチオン性剤の濃度は、約0.002%を超える、約0.003%を超える、約0.004%を超える、約0.005%を超える、約0.006%を超える、約0.007%を超える、約0.008%を超える、約0.009%を超える、約0.010%、または約0.001%を超える。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物のナノエマルションにおけるカチオン性剤の濃度は、約5.0%未満であり、約0.001%を超える。
【０１５３】
免疫原性組成物は、緩衝化剤（例えば薬学的に許容可能な緩衝化剤）を含み得る。緩衝化剤の例としては、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、≧99.5% (NT)、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、≧99.0% (GC)、L-(+)-酒石酸、≧99.5% (T)、ACES、≧99.5% (T)、ADA、≧99.0% (T)、酢酸、≧99.5% (GC/T)、酢酸、発光用、≧99.5% (GC/T)、酢酸アンモニウム溶液、分子生物学用、約5M in H2O、酢酸アンモニウム、発光用、≧99.0% (calc. on 乾燥物質、T)、ジカルボン酸アンモニウム、≧99.5% (T)、クエン酸アンモニウム、≧99.0% (T)、ギ酸アンモニウム、10 M in H2O、ギ酸アンモニウム、≧99.0% (calc. 乾燥物質に基づく、NT)、シュウ酸アンモニウム一水和物、≧99.5% (RT)、リン酸アンモニウム溶液、2.5 M in H2O、リン酸アンモニウム、≧99.0% (T)、リン酸アンモニウム溶液、2.5 M in H2O、リン酸アンモニウム、≧99.5% (T)、リン酸アンモニウムナトリウム四水和物、≧99.5% (NT)、硫酸アンモニウム溶液、分子生物学用、3.2 M in H2O、アンモニウム四塩基性溶液、2 M in H2O (２０℃において無色溶液)、二塩基性酒石酸アンモニウム、≧99.5% (T)、BES緩衝化食塩水、分子生物学用、２倍濃度、BES、≧99.5% (T)、BES、分子生物学用、≧99.5% (T)、BICINE緩衝溶液、分子生物学用、1 M in H2O、BICINE、≧99.5%(T)、BIS-TRIS、≧99.0% (NT)、二カルボン酸緩衝溶液、>0.1 M Na2CO3、>0.2 M NaHCO3、ホウ酸、≧99.5% (T)、ホウ酸、分子生物学用、≧99.5% (T)、CAPS、≧99.0% (TLC)、CHES、≧99.5% (T)、酢酸カルシウム水和物、≧99.0% (calc. 乾燥材料、KT)、炭酸カルシウム、沈殿、≧99.0% (KT)、三塩基性のクエン酸カルシウム四水和物、≧98.0% (calc. 乾燥物質、KT)、クエン酸塩濃縮溶液、分子生物学用、1 M in H2O、クエン酸、無水、≧99.5% (T)、クエン酸、発光用、無水、≧99.5% (T)、ジエタノールアミン、≧99.5% (GC)、EPPS、≧99.0% (T)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、分子生物学用、≧99.0% (T)、ギ酸溶液、1.0 M in H2O、Gly-Gly-Gly、≧99.0% (NT)、Gly-Gly、≧99.5% (NT)、グリシン、≧99.0% (NT)、グリシン、発光用、≧99.0% (NT)、グリシン、分子生物学用、≧99.0% (NT)、HEPES緩衝食塩水、分子生物学用、２倍濃度、HEPES、≧99.5% (T)、HEPES、分子生物学用、≧99.5% (T)、イミダゾール緩衝溶液、1 M in H2O、イミダゾール、≧99.5% (GC)、イミダゾール、発光用、≧99.5% (GC)、イミダゾール、分子生物学用、≧99.5% (GC)、リポタンパク質リフォールディング緩衝液、酢酸リチウム二水和物、≧99.0%(NT)、三塩基性クエン酸リチウム水和物、≧99.5% (NT)、MES 水和物、≧99.5% (T)、MES一水和物、発光用、≧99.5% (T)、MES溶液、分子生物学用、0.5 M in H2O、MOPS、≧99.5%(T)、MOPS、発光用、≧99.5% (T)、MOPS、分子生物学用、≧99.5% (T)、酢酸マグネシウム溶液、分子生物学用、約1 M in H2O、酢酸マグネシウム四水和物、≧99.0% (KT)、三塩基性クエン酸マグネシウム九水和物、≧98.0% (calc. 乾燥物質、KT)、ギ酸マグネシウム溶液、0.5 M in H2O、二塩基性リン酸マグネシウム三水和物、≧98.0% (KT)、インシチュハイブリダイゼーション用の中和溶液、分子生物学用、シュウ酸二水和物、≧99.5% (RT)、PIPES、≧99.5%(T)、PIPES、分子生物学用、≧99.5% (T)、リン酸緩衝化食塩水、溶液(オートクレーブした)、リン酸緩衝食塩水、エスタンブロッティングにおけるペルオキダーゼ複合物用の洗浄緩衝液、10倍濃度、ピペラジン、無水、≧99.0% (T)、一塩基性酒石酸カリウム、≧99.0% (T)、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、酢酸��リウム溶液、分子生物学用、5M in H2O、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、約1 M in H2O、酢酸カリウム、≧99.0% (NT)、酢酸カリウム、発光用、99.0% (NT)、酢酸カリウム、分子生物学用、≧99.0% (NT)、ビカルボン酸カリウム、≧99.5% (T)、炭酸カリウム、無水、≧99.0% (T)、カリウムクロリド、≧99.5% (AT)、一塩基性クエン酸カリウム、≧99.0% (乾燥材料、NT)、三塩基性クエン酸カリウム溶液、1 M in H2O、ギ酸カリウム溶液、14 M in H2O、ギ酸カリウム、≧99.5% (NT)、シュウ酸カリウム一水和物、≧99.0% (RT)、二塩基性リン酸カリウム、無水、≧99.0% (T)、二塩基性リン酸カリウム、発光用、無水、≧99.0% (T)、二塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧99.0% (T)、一塩基性リン酸カリウム、無水、≧99.5% (T)、一塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧99.5% (T)、三塩基性リン酸カリウム一水和物、≧95% (T)、一塩基性リン酸カリウム、≧99.5% (T)、酒石酸カリウムナトリウム溶液、1.5 M in H2O、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、≧99.5% (NT)、ホウ酸カリウム四水和物、≧99.0% (T)、テトラシュウ酸カリウム二水和物、≧99.5% (RT)、プロピオン酸溶液、1.0 M in H2O、STE緩衝溶液、分子生物学用、pH 7.8、STET緩衝溶液、分子生物学用、pH 8.0、ナトリウム 5,5-ジエチルバルビツレート、≧99.5% (NT)、酢酸ナトリウム溶液、分子生物学用、〜3 M in H2O、酢酸ナトリウム三水和物、99.5% (NT)、酢酸ナトリウム、無水、≧99.0% (NT)、酢酸ナトリウム、発光用、無水、≧99.0% (NT)、酢酸ナトリウム、分子生物学用、無水、≧99.0% (NT)、重炭酸ナトリウム、≧99.5% (T)、重酒石酸ナトリウム一水和物、≧99.0% (T)、Tris-EDTA緩衝溶液、分子生物学用、pH 7.4、Tris-EDTA緩衝溶液、分子生物学用、pH 8.0、TRIZMA酢酸、≧99.0%(NT)、TRIZMA塩基、≧99.8% (T)、TRIZMA塩基、≧99.8% (T)、TRIZMA塩基、発光用、≧99.8% (T)、TRIZMA塩基、分子生物学用、≧99.8% (T)、TRIZMA炭酸、≧98.5%(T)、TRIZMAヒドロクロリド緩衝溶液、分子生物学用、pH7.2、TRIZMAヒドロクロリド緩衝溶液、分子生物学用、pH7.4、TRIZMAヒドロクロリド緩衝溶液、分子生物学用、pH7.6、TRIZMAヒドロクロリド緩衝溶液、分子生物学用、pH8.0、TRIZMAヒドロクロリド、≧99.0% (AT)、TRIZMAヒドロクロリド、発光用、≧99.0% (AT)、TRIZMAヒドロクロリド、分子生物学用、≧99.0% (AT)、およびTRIZMAマレイン酸、≧99.5% (NT)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
免疫原性組成物は、エマルションの形成を補助する１つ以上の乳化剤を含み得る。乳化剤としては、２つの隣接する液滴の間における直接の接触を妨げるある種の連続播くを形成するために油／水界面に凝集する化合物が挙げられる。本発明特徴的な免疫原性組成物の一部の実施形態は、その所望の特性を損なわずに、所望の濃度にまで、水または他の水性相を用いて容易に希釈され得る。
【０１５５】
免疫調節剤。本発明の免疫原性組成物は、１つ以上の免疫調節剤をさらに含んでいる。免疫調節剤の例としては、キトサンおよびグルカンが挙げられるが、これらに限定されない。免疫調節剤は、薬学的に許容可能な任意の量（約0.001%〜約10%が挙げられるが、これらに限定されない）、および約0.01%、約0.02%、約0.03%、約0.04%、約0.05%、約0.06%、約0.07%、約0.08%、約0.09%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、または約10%の任意の量において免疫原性組成物に存在し得る。
【０１５６】
薬学的組成物。本発明の免疫原性組成物は、治療有効量における免疫原性組成物および薬学的に許容可能な送達に好適な、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいる薬学的組成物に調合され得る。そのような賦形剤は当該分野においてよく知られている。用語「薬学的有効量」によって、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）によって引き起こされる疾患の予防、処置または寛解に有効な、免疫原性組成物の任意の量が意図される。「防御免疫応答」によって、疾患の予防、処置または寛解に関する免疫応答が意図される。完全な予防は必要でないが、本発明に包含されている。免疫応答は、本明細書に述べられている方法を用いて、または当業者に知られている任意の方法によって評価され得る。
【０１５７】
鼻腔内投与は、投与の間に付随する吸入ありまたはなしの、鼻を介した投与を含んでいる。そのような投与は、免疫原性組成物を含んでいる組成物による、鼻粘膜、鼻甲介または副鼻腔との接触を典型的に介する。吸入による投与は、鼻腔内投与を含んでいるか、または経口吸入を含み得る。そのような投与はまた、口腔粘膜、気管支粘膜および他の上皮との接触を含み得る。
【０１５８】
薬学的な投与ためまの例示的な投与形態は、本明細書に記載されている。例としては、液体、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲル、生体接着ゲル、噴霧剤、
エアロゾル、ペースト、発泡体、日焼け止め剤、カプセル、マイクロカプセル、懸濁剤、ペッサリー、粉末、半固体投与形態などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
薬学的な免疫原性組成物は、上皮または真皮への、即時放出、徐放性、制御放出、遅延放出およびその任意の組み合わせのために調合され得る。いくつかの実施形態において、調合物は、浸透促進剤（アルコール（例えば、エタノール）、トリグリセリドおよびアロエ組成物が挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる。浸透促進剤の量は、調合物の約0.5重量%〜約40重量%であり得る。
【０１６０】
本発明の免疫原性組成物は、電気泳動送達／電気泳動を利用して、使用および／または送達され得る。さらに、組成物は、経皮送達系（例えばパッチ）であり得るか、または圧縮装置（例えば遺伝子銃）によって投与され得る。電流を加えるそのような方法は、当業者によく知られている。
【０１６１】
投与のための免疫原性組成物は、単回または複数回投与において使用され得る。
【０１６２】
局所に用いられるとき、免疫原性組成物は、閉塞または半閉塞にされ得る。閉塞または半閉塞は、局所調製物にバンド、ポリオレフィンフィルム、織物、不浸透性バリアまたは半浸透性バリアをかぶせることによって実施され得る。
【０１６３】
本発明に係る例示的なナノエマルションは、「W805EC」と表される。W805ECの組成は表１に示されている。W805ECアジュバントにとっての平均液滴サイズは約400 nmである。ナノエマルションの成分のすべては、Approved DrugProductsとっての、FDAの不活性成分リストに含められている。
【０１６４】
【表１】
2018511655.tif 000002
【０１６５】
一実施形態において、ナノエマルションは、油、精製水、非イオン性界面活性剤、有機溶媒および界面活性剤（例えばカチオン性界面活性剤）のエマルション化によって形成される。本発明の免疫原性組成物の、例示的な特定のナノエマルションは、「60% W805EC」と表される。60% W805EC製剤は、表２に示されている成分によって構成されている。精製水、USP；ダイズ油 USP；脱水されたアルコール、USP [無水エタノール；ポリソルベート 80、NFおよびセチルピリジニウムクロリド、USP（この例示的なエマルションのCPCAII成分は、Approved Drug Productsとっての、FDAの不活性成分リストに含められている）。 
【０１６６】
【表２】
2018511655.tif 000003
【０１６７】
製造方法。本発明の免疫原性組成物のナノエマルションは、標準的なエマルション形成手法を用いて形成され得る（米国特許出願公開第2004/0043041号を参照）。例示的な方法において、油が相対的に高い剪断力（例えば、水圧および機械力）のもとに水性相と混合されて、約1000nm未満の直径を有している油滴を含んでいるナノエマルションを得る。本発明のいくつかの実施形態は、アルコール（例えばエタノール）を含んでいる油相を有しているナノエマルションを採用する。
【０１６８】
例示的な実施形態において、本発明の方法に使用される免疫原性組成物のナノエマルションは、水性の連続相（水またはＰＢＳ）に分散されている油性の不連続相の液滴を含んでいる。本発明のナノエマルションは、長期の保存後にも、安定であり、劣化しない。本発明の一部のナノエマルションは、嚥下、吸入または対象の皮膚に接触させたとき、無毒である。
【０１６９】
本発明の免疫原性組成物のナノエマルションは、大量に生成され得、広い温度範囲において数か月にわたって安定であり得る。ナノエマルションは、半固体のクリームから薄いローション、液体までの範囲の構造を有し、上述の薬学的に許容可能な方法によって局所に使用され得る。
【０１７０】
上述の通り、エマルションの少なくとも一部は、脂質構造（単層および多層の脂質小胞、ミセルおよび層状相が挙げられるが、これらに限定されない）の形態であり得る。
【０１７１】
そのような薬学的組成物は、本発明の抗原に対する特異性を有している、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）の免疫グロブリンの全体であり得るモノクローナル抗体、キメラ抗体、またはハイブリッド抗体を含んでいる。それらはまた、ハイブリッド断片を含んでいる断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖなど）であり得る。
【０１７２】
モノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野においてよく知られており、当該方法としては、脾細胞およびミエローマ細胞の融合（Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies--a laboratorymanual Harlow and Lane 1988）が挙げられる。代替的に、モノクローナルＦｖ断片は、好適なファージディスプレイライブラリ（Vaughan T J et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535）によって入手され得る。モノクローナル抗体は、周知の方法によってヒト化され得るか、または部分的にヒト化され得る。
【０１７３】
治療の方法
本明細書に記載された本発明の免疫原性組成物は、全身性の又は粘膜を介した経路によって本免疫原性組成物を投与することにより、感染可能性のある哺乳類（例えばヒト）を保護又は治療するために用いられてもよいこれらの投与には、筋内、腹膜内、皮内又は皮下経路の注射；又は、経口／消化管、呼吸器管、尿生殖路へ、粘膜を介してが含まれる。
【０１７４】
本発明はまたボルデテラ属(B. pertussis)感染を治療する方法も対象とする。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、特に、共同体における百日咳の大発生の場合に際して用いることに特に利点がある。
【０１７５】
ここに記載の通り、本発明は、対象に対して本発明の免疫原性組成物の有効量を投与する工程を含む、ボルデテラ属の種（例えば、B. pertussis （例えば百日咳））の感染及び／又は病気を予防する及び／又は治療する方法を提供する。例えば、本発明は、ボルデテラ属（例えば、B. pertussis）感染（例えば、百日咳）を治療するための医薬品（例えばワクチン）の製造のための、本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。本発明はまた、ボルデテラ属（例えば、B. pertussis）感染の治療に使用するための、免疫原性組成物（例えば、本発明の如何なる免疫原性組成物の何れか）を提供する。例えば、幾つかの実施形態において、対象を治療する方法は、当該対象をB. pertussis のコロニー形成から保護する（例えば、この免疫原性組成物が投与された対象が.pertussisによって引き起こされる感染及び病気にかかるのを防ぐ、及び／又は、この免疫原性組成物が投与された対象においてB. pertussisのキャリッジを排除する（例えば、これによって、集団に免疫性を提供する、及び／又は、対象の集団からB. pertussisを排除する））。本発明の実施のために作用メカニズムの理解は要せず、かつ、本発明は特定の作用メカニズムに限定されないが、ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物の投与は、全身性及び粘膜性の免疫を与え、B. pertussisのコロニー化及び転移に対して保護をする(例えば、ワクチン投与された対象においてTh17型の免疫応答を誘導し、対象及び／又は対象が属する対象の集団においてB.pertussisの固着、キャリッジ及び／又は転移をブロックする）。従って、好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物の経鼻的な投与は、B. pertussisのキャリッジ（例えば、本免疫原性組成物が投与された対象において、及び／又は、この組成物が投与されていない、集団内の他者に対して（例えば免疫性の提供））、を減少させる及び／又は排除する。本発明は、本発明の免疫原性組成物が投与された対象のタイプによって限定はされない。実際、本発明の免疫原性組成物(例えば、対象におけるB. pertussis 特有の免疫応答を誘導する)の有効量を投与されうる如何なる対象も、本発明の免疫原性組成物からの利益を享受できる。ある実施形態では、対象は成人（例えば子を産みうる成人）である。ある実施形態では、成人は、日々、子達の周りに物理的におりかつ曝されている親であり、祖父母であり、又は他の成人である(例えば、教師、デイケア提供者、ヘルスケア専門家、又は他の成人）。ある実施形態では、対象は成人ではない（例えば子）が、日々、他の非成人／子達の周りに物理的におりかつ曝されているものである。
【０１７６】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫化は、ボルデテラ属（B.pertussis）のキャリッジを低減し、及び／又は、防ぎ、百日咳の転移を低減する、及び／又は、防ぐ。理論によって拘束はされないが、本発明の免疫原性組成物中に存在する抗原に特異的な抗体が、ボルデテラ属が潜在的な宿主細胞に侵入することを防ぎ、従って、この感染ルートをブロックする。これは特に、ボルデテラ属の体への侵入ルートが、口又は粘膜の表皮細胞(例えば、呼吸器系の表皮細胞）を通しての場合に、利点がある。この転移のルートをブロックする能力は、本発明の免疫原性組成物／ワクチンが投与された個体の中でボルデテラ属感染が発達することを妨げ又は遅くし、その結果、個体間でのボルデテラ属の転移をまた遅くし又は妨げる。「中和抗体」によって、宿主における感染の開始及び／又は感染の永続化をするという病原体の能力を中和する（排除する、低減する、又は減弱する）ことができる抗体を指す。理論によって拘束はされないが、ここに記載の中和抗体は、ボルデテラ属が細胞（例えば呼吸器系の表皮細胞）に侵入する能力を妨げる（例えば、排除する、又は少なくとも低減する又は減弱する）ことによって、かかる事を達成すると信じられている。
【０１７７】
従って、他の実施形態では、免疫化されていない対象でさえ他者から百日咳を獲得するが、キャリッジを低減する本発明の免疫原性組成物／ワクチンは、免疫化されていない患者の他、免疫的に危険にさらされた（immunocompromised）対象、免疫不全の対象における感染を低減する。実際のところ、積極的な免疫化プログラムを遂行するある実施形態では、実施されるキャリッジに対する抗生物質による治療と任意に組合せて、本発明は、この生物を保有するヒトを排除する又は大部分を排除する能力を提供する（例えば、１９９０年代の中〜後半に行われていたように、細胞ワクチンによる筋肉内免疫化を用いて）。従って、ボルデテラ属(B. pertussis)、固着に対する防御における本発明の免疫原性組成物／ワクチンの能力は、ここに供されるように、免疫化された対象においてのみ病気に対する防御を可能な方法とするだけではなく、免疫化された個体の間でキャリッジを排除することによって、ボルデテラ属の病原体及びそれを原因とする如何なる病気も集団全体から排除しうる。本発明の実施形態の進展の間に生成されたデータは、本発明の免疫原性組成物を用いた経鼻的な免疫化は、Th1型免疫応答と同時にTh17免疫応答を生じさせ、これはボルデテラ属の固着及びキャリッジの防止に重要である（実施例１参照）ことを記載する。本発明の実施のために作用メカニズムの理解は要せず、かつ、本発明は特定の作用メカニズムに限定されないが、ある実施形態において、キャリッジは、免疫化（例えば、粘膜での免疫化（例えば、ボルデテラ属の抗原（例えば固着に必要なもの）に特異的な抗体（例えば、IgA 抗体) の生成）によって干渉される。再度、本発明の実施のために作用メカニズムの理解は要せず、かつ、本発明は特定の作用メカニズムに限定されないが、ある実施形態において、抗ボルデテラ属抗体は、ボルデテラ属の種にオプソニンを作用させることによって粘膜の表面で機能し、その付着や表面侵入を妨げる；及び／又はオプソノファゴサイトーシスを介して作用し殺することを含むがこれに限定されない様々な方法で、キャリッジに対して効果がある。ここに供された、経鼻的に投与されるワクチン組成物は、その投与の形態及び防御応答の誘導に応じた、如何なる方法によっても及び投薬量の処方によっても調剤される。投与される抗原の量は、免疫される対象および抗原の形態に依存する。投与される免疫原性組成物（例えば、抗原）の厳密な量および形態は、医師の判断に依存する。しかし、好適な投与量の範囲は、当業者によって容易に決定可能であり、マイクログラム〜ミリグラムのオーダーであり得る。また、初回投与および追加投与のための好適な投薬計画は、変更可能であるが、初回投与、これに続く複数回の投与を含み得る。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Bordetella（例えば、B. pertussis）ばくろを受ける危険がある（または危険があるらしい）か、またはまだ感染症（例えば、百日咳）を起こしていないがばくろされた（らしい）対象に投与される。しかし、他の実施形態において、組成物は、個体における感染の程度を抑え、回復を早めるため、および／または他者にうつすことを防ぐために、感染症をすでに起こしている個体に投与される。
【０１７９】
本明細書に述べられているように、各ワクチン用量における抗原の量は、標準的なワクチンにおける顕著な副作用なしに、免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、採用される免疫原およびそれがどのように存在するかに、依存して変化する。ワクチンのタンパク質含有量は、典型的に、1-100μg、好ましくは5-50μg、最も代表的には10-25μgの範囲にある。一般的に、多糖が使用されるとき、各用量は0.1-100μの多糖を含んでおり、存在する場合に、好ましくは0.1-50μg、好ましくは0.1-10μg、このうち1-5μgが最も好ましい範囲であると予測される。
【０１８０】
本発明のワクチンは任意の経路によって投与され得るが、述べられているワクチンの経鼻における投与は、本発明の好ましい実施形態を形成している。
【０１８１】
本発明の好ましい他の実施形態は、Bordetella (B. pertussis)感染または疾患を予防または処置する方法である。当該方法は、それを必要とする患者に、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含んでいる。
【０１８２】
本発明の好ましい他の実施形態は、Bordetella (B. pertussis)感染または疾患を予防または処置する方法である。当該方法は、それを必要とする（例えば、集団内におけるBordetella (B. pertussis)の伝染および／またはキャリッジを防止するために）集団（例えば、家族、学生、保健医療労働者、保育従事者など）に、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与するステップを含んでいる。
【０１８３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、Bordetella (B.pertussis)感染または疾患の処置または予防のためのワクチンの製造における、本発明の免疫原性組成物の使用である。
【０１８４】
用語「ボルデテラ属感染」は、Bordetella pertussis、および哺乳類（好ましくはヒト宿主）に感染可能な他のボルデテラ属株によって引き起こされる感染を包含している。
【０１８５】
本明細書において、用語「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（comprise）」および「含んでいる（comprises）」は、すべての例において、用語「からなる（consisting of）」、「からなる（consist of）」および「からなる（consists of）」のそれぞれと、任意に置き換えられると、本発明者らによって意図されている。
【０１８６】
本発明は、例証のみを目的とする以下の実施例を参照することによってさらに説明されている。本発明は、実施例に限定されず、その教示から明らかなすべての変更を包含している。本明細書に引用されているすべての刊行物（米国特許が挙げられるが、これらに限定されない）は、参照によって特に組み込まれている。
【０１８７】
用語「ボルデテラ属感染」は、Bordetella pertussis、および哺乳類（好ましくはヒト宿主）に感染可能な他のボルデテラ属株によって引き起こされる感染を包含している。
【０１８８】
本明細書において、用語「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（comprise）」および「含んでいる（comprises）」は、すべての例において、用語「からなる（consisting of）」、「からなる（consist of）」および「からなる（consists of）」のそれぞれと、任意に置き換えられると、本発明者らによって意図されている。
【０１８９】
本発明は、例証のみを目的とする以下の実施例を参照することによってさらに説明されている。本発明は、実施例に限定されず、その教示から明らかなすべての変更を包含している。本明細書に引用されているすべての刊行物（米国特許が挙げられるが、これらに限定されない）は、参照によって特に組み込まれている。
【実施例】
【０１９０】
以下の実施例は、本発明の、好ましい特定の実施形態および側面を例示する役割を果たし、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１９１】
以下の実験に基づく開示において、以下の略語が適用されている。
ｅｑ（等量）；μ（ミクロン）；Ｍ（モーラー）；μＭ（マイクロモーラー）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎＭ（ナノモーラー）；℃（摂氏度）；およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。
【０１９２】
（実施例１）
ナノエマルションおよび複数のB. pertussis抗原を含んでいるの免疫原性組成物の生成および性質決定
Ｗ８０５ＥＣナノエマルション。ここに記載されているＷ８０５ＥＣは、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）複数の成分から、カチオン性界面活性剤セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）を用いた、高速エマルション化によって製造された。
【０１９３】
ワクチン調製。鼻腔内（ＩＮ）免疫用のａＰ／ＮＥワクチンを、百日咳毒素（Ｐｔｘ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）およびパータクチン（Ｐｔｎ）を、ＮＥと混合する（２０％のＮＥの終濃度）ことによって調製した。従来の筋肉内（ＩＭ）ワクチンを、３つすべての抗原を、２％の水酸化アルミニウムを含んでいる水酸化アルミニウムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）と混合することによって調製した。無細胞鼻腔内（ＩＮ）ワクチンおよび従来の無細胞筋肉内ワクチンはいずれも、４μｇの百日咳毒素（Ｐｔｘ）、４μｇの繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）および２μｇのパータクチン（Ｐｔｎ）を含んでいた。
【０１９４】
ＥＬＩＳＡ。Ｐｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎに対する特異抗体の生成を、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。プレートを、２〜８℃において夜通し、上述の複数のタンパク質によってコートした。動物の血清を、希釈し、９６ウェルプレートにおいてインキュベートし、それから、洗浄した後にＨＲＰ結合二次抗体を加えた。高感度化K-blue TMB基質を、着色に用いた。吸光度（ＯＤ）値を、希釈率に対してプロットし、直線回帰曲線を生成させた。２.５９９を超えるすべてのＯＤ値を除外した。曲線の下にある面積を測定し、ＩｇＧを、基準コントロールに対する比較によって算出した。基準コントロールに、単位の値を割り当て、結果を、その値と比較し、ＥＬＩＳＡユニット（ＥＵ）として表した。一部の試験において、基準血清の、特定のＩｇＧのμｇ／ｍｌ量を見積もるために、Zollinger法を用いた。試験血清を、基準血清と比較し、その免疫グロブリン含有量を、μｇ／ｍｌを用いて算出した。
【０１９５】
殺菌活性。殺菌活性を評価するために、試験血清を、４５分にわたって５６℃において熱失活させ、段階希釈物を、Stainer-Scholteブロスにおいて調製した。試験血清の混合物を、２０％のテンジクネズミ血清に加えて補体成分を準備し、１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍＬにおけるB. pertussis接種物と混合した。混合物を、１時間にわたって３７℃においてインキュベートし、段階希釈物を、Burdett Gangue寒天に播いた。プレートを、４日にわたって３７℃においてインキュベートした。ポジティブコントロール（補体なし）におけるＣＦＵ数に対して比較された、試験サンプルにおけるＣＦＵの減少を、殺菌活性を決定するために使用した。
【０１９６】
B. pertussisワクチン。計２４匹のSprague-Dawleyラットを使用した。ワクチン接種経路は、鼻腔内（ＩＮ）および筋肉内（ＩＭ）を含んでいた（Ｎ＝８動物／群）。免疫しないコントロール（Ｎ＝８）を、免疫原性およびサイトカイン産生を比較するために用いた。ＩＮワクチン接種動物は、Ｐｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎを２０％ナノエマルションに含んでいる免疫原性組成物を受けた。動物に、ケタミン／キシラジン麻酔のもとにワクチン接種した。動物に、３週間をおいて３回にわたってワクチン接種した。
【０１９７】
サイトカインアッセイ。脾臓およびリンパ節を、実験の終了時に屠殺したあとのSprague-Dawleyラットから採取した。培養培地における単一細胞懸濁物のみ（コントロール）または異なる抗原を用いて活性化された細胞懸濁物を、試験した。無細胞上澄を、４８時間にわたる３７℃におけるインキュベーションの後に回収した。Ｔ細胞サイトカイン分泌プロファイルを、LUMINEXによって決定して、サイトカイン／ケモカインMilliplex MAPkit（Millipore Corp.）を用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７を評価した。データを、各サイトカインについてｐｇ／ｍｌによって表し、コントロール細胞および各抗原活性化細胞の間において検出された濃度間の差異として得た。
【０１９８】
動物使用委員会。あらゆる動物実験は、試験を実施した場所における適切な、動物の使用および取扱いに関する委員会にしたがって、実施され、承認された。
【０１９９】
統計学。統計分析を、GraphPad Prismソフトウェアを用いて実施した。分析を、Mann-Whitneyノンパラメトリック試験を用いて実施した。
【０２００】
ALHYDROGELに対するワクチンにおけるＰｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎに対する２０％ナノエマルションワクチンにおけるＰｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎの免疫原性。
【０２０１】
動物は、３週間の休止をおきながら、２０％ナノエマルションワクチンにおけるＰｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎ（ＮＥ−ａＰワクチン）の、計３回のワクチン接種を受けた。免疫原性および血清殺菌活性を、各追加免疫の前および最終投与後の６週間後に評価した。ALHYDROGEL筋肉内ワクチンにおけるＰｔｘ、ＦＨＡおよびＰｔｎ（ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチン）を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０２０２】
ＮＥ−ａＰワクチンを用いた鼻腔内ワクチン接種は、図１に示されているように、ワクチンの３つすべての構成要素に対する高レベル（ＥＬＩＳＡによって測定された）の抗体を誘導した。
【０２０３】
ワクチン接種された動物からの血清を、３回目の投与から６週間後における殺菌活性（ワクチン防御の免疫学的な相関事象として）について試験した。図２に示されているように、ＮＥ−ａＰワクチンを用いて鼻腔内にワクチン接種された動物は、やや低いレベルの抗体にもかかわらず、ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチンに匹敵する殺菌活性を示した（図１を参照）。
【０２０４】
粘膜免疫およびサイトカイン分泌。LUMINEXマルチプレックス分析キットを、鼻腔内ＮＥ−ａＰワクチンによって惹起された粘膜免疫を評価するために使用した。図３に示されているように、強いＩＬ−１７応答がＰｔｘ、ＦＨＡに対して、より小さい程度にＰｔｎに対して、ＮＥ−ａＰワクチンによって惹起された（図３Ａ）。これと際立って対照的に、低いか、無視できるＩＬ−１７応答が、ａｌｕｍ−ａＰ  ＩＭワクチンおよびＰＢＳコントロールを用いて観察された（図３Ｂおよび３Ｃを参照）。
【０２０５】
明細書の以上において述べられているすべての刊行物および特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の説明されている方法およびシステムの、種々の変更および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかである。本発明が好ましい特定の実施形態に関して説明されているが、請求されている発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解される。実際に、本発明を実施するために説明されている様式の、関連する技術分野における当業者に自明な種々の変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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