(57)【要約】  (a)CD99の細胞外ドメインに結合し、(b)骨髄系またはリンパ系悪性細胞表面に発現するCD99を連結し、(c)骨髄系またはリンパ系悪性細胞表面に発現するCD99のキャッピング/クラスタリング/凝集を促進し、(d)抗体が連結されたCD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞においてアポトーシスを誘導し、結果として細胞傷害を生じる1以上の抗体を含む、血液疾患、特に、CD99+急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)およびT細胞新生物を含む造血器腫瘍およびリンパ腫を治療するための組成物および方法が提供される。開示された方法は、患者由来の組織試料または骨髄系もしくはリンパ系悪性細胞におけるCD99の発現増加を検出することによる、抗CD99抗体を用いる治療に感受性を示す造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者を確認する方法および、抗CD99抗体を、単独で、あるいは動員剤、トランスマイグレーションブロッキング剤ならびにダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、5-アザシチジンおよびデシタビンなどの化学療法剤などの1以上のさらなる成分と組み合わせて含む組成物を投与することによる、CD99遺伝子およびまたは細胞表面タンパク質発現増加を示す、造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者を治療する方法を含む。
2018511311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血器腫瘍またはリンパ腫を有する患者において、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性を同定する方法であって、
a.前記患者由来の細胞において、CD99遺伝子配列に特異的なプライマー対を用いて前記細胞のRNAを増幅することによってCD99 mRNAレベルを定量すること、
b.健常人被験者由来の対照細胞において、CD99遺伝子配列に特異的なプライマー対を用いて前記細胞のRNAを増幅することによってCD99 mRNAレベルを定量すること、および、
c.前記患者由来の前記細胞の前記CD99 mRNAレベルと、前記健常人被験者由来の前記細胞の前記CD99 mRNAレベルとを比較すること、
を含み、
前記健常人被験者細胞の前記CD99 mRNAレベルと比較したときの前記患者細胞の前記CD99 mRNAレベルが、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性の指標となり；
前記抗CD99抗体は、
(i)CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99の細胞外ドメインに結合し；
(ii)前記抗体が結合したCD99の、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上の凝集、クラスタリングおよびキャッピングの1以上を促進し；
前記抗体は、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合したとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項２】
プライマー対が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーはCD99 mRNAの5’末端にハイブリダイズし、前記リバースプライマーは前記CD99 mRNAの3’末端にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
CD99 mRNAが、配列番号1、配列番号3および配列番号5からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、初代AML芽球細胞、白血病幹細胞(LSC)、初代MDS芽球細胞およびMDS造血幹細胞(HSC)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、DGEN(配列番号7)、DAVVDGEND(配列番号10)、AVVDGEN(配列番号11)およびDDPRPPNPPK(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、CD99のエピトープに結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
抗体がIgGモノクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
IgGモノクローナル抗体が、12E7およびO13からなる群から選択されるマウス抗体である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
抗体がIgMである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
抗体がIgMモノクローナル抗体H036-1.1である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が第２の抗体に結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
第２の抗体が、CD99の細胞外ドメインに結合する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
第２の抗体が、DGEN(配列番号7)、DAVVDGEND(配列番号10)、AVVDGEN(配列番号11)およびDDPRPPNPPK(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、CD99の細胞外ドメインのエピトープに結合する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
第２の抗体が、DGEN(配列番号7)、DAVVDGEND(配列番号10)、AVVDGEN(配列番号11)およびDDPRPPNPPK(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含まないCD99の細胞外ドメインのエピトープに結合する、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞と抗CD99抗体とを接触させることを含む、造血器腫瘍またはリンパ腫に関連するCD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する方法であって、前記抗体は前記CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99の細胞外ドメインに結合し、前記抗体は、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合するとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項１５】
抗体が、前記抗体が結合したCD99の、骨髄系またはリンパ系悪性表面上の凝集、クラスタリングおよびキャッピングの1以上を促進する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
抗CD99抗体を含む組成物を患者に投与することを含む、CD99レベルの上昇を示す骨髄系またはリンパ系悪性細胞に関連する造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者を治療する方法であって、抗CD99抗体を含む組成物を前記患者に投与することを含み、
前記抗体が、
a.前記CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上のCD99の細胞外ドメインに結合し；
b.前記抗体が、前記抗体の結合したCD99の、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを促進し；
前記抗体が、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合したとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項１７】
CD99レベルの上昇を示す細胞に関連する造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者を治療するための組成物であって、
a.第１の抗CD99抗体であって、
i.前記CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99の細胞外ドメインに結合し；
ii.前記抗体の結合したCD99の、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを促進し；および、
iii.前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合したとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する、
前記第１の抗CD99抗体、および、
b.前記CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の経内皮遊走を阻害する第２の抗CD99抗体、
含む前記組成物。
【請求項１８】
第２の抗体が、12E7、HEC2、DN16およびH036からなる群から選択される、請求項16に記載の組成物。
【請求項１９】
CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞と抗CD99抗体とを接触させることを含む、CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の増殖を阻害する方法であって、
前記抗体は、
a.前記CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上のCD99の細胞外ドメインに結合し；
b.前記抗体が、前記抗体の結合したCD99、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上のCD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを促進し；
前記抗体は、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面上のCD99に結合したとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項２０】
抗CD99抗体が、約100nM〜約10μMまたは約250nM〜約5μMまたは約500nM〜約1μMのKdでCD99細胞外ドメインに結合する、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞と、ダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、アザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される化合物とを接触させることをさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、抗CD99抗体と同時に投与される、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
化合物と抗CD99抗体が逐次的に投与される、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
骨髄系またはリンパ系悪性細胞の細胞傷害を誘導するのに有効な量で抗CD99抗体を患者に投与することを含む、患者の造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法であって、前記患者が、対照骨髄系またはリンパ系非悪性細胞におけるCD99発現レベルと比較してCD99発現レベルの上昇を示す造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている前記方法。
【請求項２５】
ダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、アザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される化合物の化学療法的有効量を患者に投与することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が、抗CD99抗体と同時に投与される、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
化合物が、抗CD99抗体に続いて投与される、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
AMLおよび／またはMDS患者に動員剤を投与することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
動員剤が、プレリキサホルもしくはG-CSFまたはそれらの組み合わせである、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
動員剤が、抗CD99抗体を投与する前にAMLおよび／またはMDS患者に投与される、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
以前に骨髄系またはリンパ系悪性細胞に冒されていることが確認された患者において、CD99遺伝子発現レベルの上昇を示す造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法であって、骨髄系またはリンパ系悪性細胞に細胞傷害を誘導するのに有効な量で前記患者に抗CD99抗体を投与する前記方法。
【請求項３２】
ダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、アザシチジンおよびデシタビンからなる群から選択される化合物を前記AMLおよび／またはMDS患者に投与することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
化合物が、抗CD99抗体と同時に投与される、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
化合物が、抗CD99抗体に続いて投与される、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
患者に動員剤を投与することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３６】
動員剤が、プルリキセフォル（plurixefore）もしくはG-CSFまたはそれらの組み合わせである、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
動員剤が、抗CD99抗体を投与する前に患者に投与される、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
a.造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者由来の骨髄系またはリンパ系悪性細胞においてCD99遺伝子発現レベルを測定すること；
b.非悪性ドナーの対照骨髄系またはリンパ系細胞由来の細胞において、前記CD99遺伝子発現レベルを測定すること；
c.患者細胞におけるCD99遺伝子レベルと、対応する対照細胞における遺伝子発現レベルとを比較すること；
を含む、前記患者の、抗CD99抗体を用いる治療への感受性を測定する方法であって、
対応する前記対照細胞における遺伝子発現レベルの少なくとも約2倍を超える前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞におけるCD99遺伝子発現レベルによって、抗CD99抗体の治療効果が予測され、
前記抗CD99抗体は、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合したとき、前記CD99の凝集、クラスタリングまたはキャッピングの少なくとも1つを促進することができる、前記方法。
【請求項３９】
造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞をCD99の発現増加について試験することを含む、前記患者の、抗CD99抗体を用いる治療への感受性を予測する方法であって、CD99の発現増加によって、骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面の前記CD99に結合するときにCD99の凝集、クラスタリングまたはキャッピングの少なくとも1つを促進する抗CD99抗体の治療効果が予測される、前記方法。
【請求項４０】
c-kit遺伝子発現について前記患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞を試験することをさらに含み、c-kit遺伝子発現の非存在または低レベルのc-kit遺伝子発現によって、抗CD99抗体を用いる治療への患者の感受性が予測される、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
BCR-ABL転座の存在について患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞を試験することをさらに含み、BCR-ABLの存在によって、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性が予測される、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
JAK2変異体の存在について患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞を試験することをさらに含み、構成的活性化JAK2変異の存在によって、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性が予測される、請求項38に記載の方法。
【請求項４３】
CD99の発現増加について造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞を試験することを含む、前記患者の、抗CD99抗体を用いる治療への感受性を予測する方法であって、CD99の前記発現増加によって、骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面の前記CD99に結合するとき細胞傷害性を示す抗CD99抗体の治療効果が予測される前記方法。
【請求項４４】
造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者の、抗CD99抗体を用いる治療への感受性を予測する方法であって、骨髄系またはリンパ系悪性患者細胞をCD99の発現増加について試験することを含み、CD99の記発現増加によって、骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面の前記CD99に結合するとき細胞死を誘導する抗CD99抗体の治療効果が予測される前記方法。
【請求項４５】
患者における造血器腫瘍またはリンパ腫の治療のための候補抗CD99抗体を作製する方法であって、
a.CD99の細胞外ドメインに結合する抗体を作製すること、
b.前記抗CD99抗体を、
i.骨髄系またはリンパ系悪性細胞表面に発現するCD99の抗体媒介性凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピング、および
ii.骨髄系またはリンパ系悪性細胞表面に発現するCD99の細胞死の抗体媒介性誘導、
について試験すること、
を含み、CD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを媒介し、細胞死を誘導する抗CD99抗体は、患者における造血器腫瘍またはリンパ腫の治療のための候補抗CD99抗体であるとする、前記方法。
【請求項４６】
AmlまたはMDs細胞が、それぞれCD99発現レベルの上昇を示す患者において、抗CD99抗体が造血器腫瘍またはリンパ腫の治療に使用するための候補であるかどうかを決定する方法であって、
a.抗CD99抗体を提供すること；
b.前記抗CD99抗体を、骨髄系またはリンパ系悪性細胞表面に発現するCD99の抗体媒介性凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングをもたらすかどうかを決定するための1以上の試験に供すること、
を含み、前記凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングが生じる場合、前記抗体はCD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞に細胞傷害性を示し、それ自体、造血器腫瘍またはリンパ腫の治療のための候補であると結論し、前記凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングが生じない場合、前記抗体は前記治療薬の候補ではないと結論する、前記方法。
【請求項４７】
骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99レベルの上昇を示す患者において造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法であって、1以上の抗CD99抗体、1以上の抗CD99抗体を含む組成物もしくは製剤および／または、AMLおよび／またはMDSの治療に有効な1以上の他の薬剤と組み合わせた1以上の抗CD99抗体を含む組成物もしくは製剤を前記患者に投与することを含み、抗CD99抗体が、前記細胞の表面に結合するとき細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項４８】
造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者において、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性を同定する方法であって、
a.前記患者由来の細胞におけるCD99 mRNAレベルを定量すること、
b.前記患者由来の細胞における非CD99対照RNAのレベルを定量すること、
c.前記細胞におけるCD99 mRNAのレベルと、前記細胞における前記対照RNAのレベルとを比較し、それによって、CD99遺伝子と対照遺伝子の遺伝子発現の比を得ることを含み、CD99遺伝子と、非AMLおよび／または非MDS細胞における対照遺伝子のあらかじめ定められた閾値比を超えるCD99遺伝子と対照遺伝子の遺伝子発現の比が、骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合したときアポトーシスを誘導する抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性の指標となる、前記方法。
【請求項４９】
対照mRNAが、β-アクチン、GAPDHおよびシクロフィリンからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者において、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性を同定する方法であって、
a.前記患者由来の骨髄系またはリンパ系悪性細胞におけるCD99 mRNAレベルを、CD99遺伝子配列に特異的なプライマー対を用いて前記細胞のRNAを増幅することによって定量すること、
b.健常人被験者由来の対照細胞におけるCD99 mRNAレベルを、CD99遺伝子配列に特異的なプライマー対を用いて前記細胞のRNAを増幅することによって定量すること、
c.前記患者由来の前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞における前記CD99 mRNAレベルと、前記健常人被験者由来の前記対照細胞における前記CD99 mRNAのレベルとを比較すること；
を含み、
前記健常人被験者の対照細胞における前記CD99 mRNAと比較したときの、前記患者の骨髄系またはリンパ系悪性細胞における前記CD99 mRNAのレベルが、抗CD99抗体を用いる治療への前記患者の感受性の指標となり；
前記抗CD99抗体は、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞の表面のCD99に結合するとき、前記骨髄系またはリンパ系悪性細胞における細胞死を誘導する、
前記方法。
【請求項５１】
細胞が、成熟T細胞リンパ腫細胞、T急性リンパ性白血病(T-LL)、T急性リンパ性白血病(T-ALL)細胞および未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞からなる群から選択される、請求項1、14、16、19、24、31、38、39、43、44、45、46、47、48または50のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)およびT細胞悪性新生物などの造血器腫瘍およびリンパ腫の治療に関する。より具体的には、本開示は、(i)急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群およびT細胞新生物などの造血器腫瘍およびリンパ腫の治療のための、抗CD99抗体および、1以上の抗CD99抗体を含む組成物；(ii)造血器腫瘍およびリンパ腫の治療に適した抗CD99抗体を作製し、同定する方法；(iii)抗CD99抗体および／または1以上の抗CD99抗体を含む組成物を用いる治療に感受性を示す、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および／またはT細胞リンパ腫などの造血器腫瘍およびリンパ腫を有する患者を確認する方法；(iv)CD99+白血病幹細胞および／または造血幹細胞などの、急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群および／またはT細胞リンパ腫などの造血器腫瘍およびリンパ腫に関連するCD99+細胞においてアポトーシスを誘導する方法；ならびに(v)CD99+急性骨髄性白血病、CD99+骨髄異形成症候群および／またはCD99+T細胞リンパ腫を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
CD99は、T細胞成熟および白血球の経内皮遊走を制御する32kDaの膜貫通タンパク質である。CD99はまた、急性T細胞リンパ芽球性リンパ腫/白血病(T-ALL)、ユーイング肉腫および神経内分泌腫瘍の診断に役立つバイオマーカーとしても用いられる。しかしながら、種々の造血器腫瘍およびリンパ腫において、CD99が、実現性のある治療標的であるかどうかはいまだに不明である。
T急性リンパ芽球性白血病(T-LL)/リンパ性白血病(T-ALL)および未分化大細胞リンパ腫(ALCL)を含むT細胞新生物は、T細胞系列の血球の癌である。T-LLおよびT-ALLは、骨髄に集積し、正常な血球の産生を妨げる異常な未熟T前駆細胞(芽球)の急速な増殖を特徴とし、骨髄における芽球のカットオフ値20〜25%によって任意に分類される。T-ALLは、小児コホートおよび成人コホートにおけるALLのおよそ15%および25%の割合を占め、T-LLは、成人における非ホジキンリンパ腫(NHL)患者のおよそ2%に相当する。対照的に、ALCLは、NHLではまれなタイプ(患者のおよそ3%)であるが、より一般的なT細胞リンパ腫のタイプの1つである。
T-LL/T-ALLの臨床徴候および症状は、正常骨髄が白血病細胞によって置き換えられることによって引き起こされ、これによって赤血球、血小板および正常白血球の減少（血球減少)が引き起こされる。これらの徴候および症状には、疲労、息切れ、あざのできやすさおよび出血が含まれ、感染症リスクの増加、脾腫もしくは肝腫大および、組織の白血病性浸潤によって引き起こされる他の症状もまた見られる場合がある。いくつかの危険因子、染色体異常および他の体細胞変異が同定されているが、特定の原因は明らかではない。T-ALLは、急性白血病として急速に進行し、治療せずに放っておいた場合、一般的には数週間または数か月以内に死をもたらす。
【０００３】
急性骨髄性白血病(AML)は、急性骨髄白血病または急性非リンパ性白血病(ANLL)としても知られ、骨髄に集積し、正常血球の産生を妨げる異常白血球の急速な増殖を特徴とする骨髄系血液細胞の癌である。AMLは、成人が罹患する最も一般的な急性白血病であり、その罹患率は加齢とともに増加する。AMLは、アメリカ合衆国における癌死のおおよそ1.2%を占める比較的希な疾患であるが、その罹患率は、その集団の年齢につれて増加すると予想される。
AMLの臨床徴候および症状は、正常骨髄が白血病細胞によって置き換えられることによって引き起こされ、これによって赤血球、血小板および正常白血球の減少（血球減少)が生じる。これらの徴候および症状には、疲労、息切れ、あざのできやすさおよび出血が含まれ、感染症リスクの増加、脾腫もしくは肝腫大および、組織の白血病性浸潤によって引き起こされる他の症状も見られる場合がある。いくつかの危険因子、染色体異常および他の体細胞変異が同定されているが、特定の原因は明らかではない。T-ALLは、急性白血病として急速に進行し、治療せずに放っておいた場合、一般的には数週間または数か月以内に死をもたらす。
AMLにはいくつかのサブタイプがある。治療法および予後はサブタイプ間で異なる。サブタイプに応じて、5年生存率は15〜70%であり、再発率は33〜78%である。AMLは、寛解の導入を目標として、初めに化学療法で治療される。患者は、さらなる化学療法を受けることを継続するか、または同種造血幹細胞移植を受けることができる。
急性骨髄白血病(AML)患者の治療法は、20年以上変化しておらず、AMLの生存率は、成人では50%を大きく下回り、小児ではおよそ60〜70%である。たとえ患者の疾患が治癒するとしても、多くの場合、従来の化学療法レジメンおよび骨髄移植に由来する顕著な病状が存在する。明らかに、より有効で毒性の低い治療法が求められている。
【０００４】
骨髄異形成症候群(MDS、以前は前白血病として知られていた)は、骨髄球系の血球の無効産生(および異形成)を含む血液(血液関連)病状の多様な寄せ集めである。MDS患者は、重篤な貧血を発症して輸血を必要とする場合がある。該疾患が悪化し、その患者が、進行性骨髄不全症によって引き起こされる血球減少症(低血球数)を発症する場合がある。
MDSの予後は、その種類および重症度によって異なる。多くの人々は、MDSとともに正常寿命を生きる。多くの場合、人々は無症候性であり、ルーチン血液検査でその正体が明らかになるまでMDSを有していることさえ気づかない。
骨髄異形成症候群は、骨髄の造血幹細胞に生じるすべての疾患をいう。MDSにおいて、造血(血液産生)は障害を生じており、無効である。造血細胞の数および特性は不可逆的に減退しており、それによってさらに血液産生が損なわれる。
骨髄異形成症候群(MDS)は、無効造血による末梢血球減少症を特徴とするクローン性血液疾患の関連群である。この症候群は、新たに（de novo)発生する場合と、他の疾患に対する化学療法および／または放射線治療を用いる治療後に二次的に発生する場合とがある。二次的な骨髄異形成(myelodysplasia)は、通例、デノボでの骨髄異形成よりも予後不良である。診断後、様々な間隔で、MDSは、患者の約30%において急性骨髄性白血病(AML)に変化する。
MDSは主に年配患者に生じるが、2歳の患者も報告されている。貧血、出血、あざのできやすさおよび疲労が、共通した初期の所見である。共通性を有する脊髄増殖性疾患と関連して、脾腫または肝脾腫大が認められる場合がある。患者のおおよそ50%は検出可能な細胞遺伝学的異常を有しており、通常それは、第5染色体もしくは第7染色体の全部もしくは一部の欠失または第8トリソミーである。該骨髄は、診断時に通例細胞増多であるが、患者の15%〜20%は骨髄低形成を呈する。低形成性骨髄異形成患者は顕著な血球減少を示す傾向があり、しばしば免疫抑制療法に反応する可能性がある。
【０００５】
AMLおよびMDSは、ともに、自己再生する幹細胞によって開始され維持される。Lapidot et al., Nature 367:645-648 (1994); Bonnet and Dick, Nat. Med. 3:730-737 (1997); Nilsson et al., Blood 100:259-267 (2002); Nilsson et al., Blood 110:3005-3014 (2007); Tehranchi et al., New Engl. J. Med. 363:1025-1037 (2010); Nilsson et al., Blood 96:2012-2021 (2000);およびPang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:3011-3016 (2013)。これらの疾患開始細胞は、正常な造血幹細胞および造血前駆細胞(HSPC)の免疫表現型特性を共有するが、細胞表面タンパク質の発現異常は、疾患幹細胞の予期的分離を可能にし、魅力的な治療標的である。AML白血病幹細胞(LSC)およびMDS造血幹細胞(HSC)において強く発現されている細胞表面タンパク質としてのCD99の同定が記載されている。CD99の強い発現は、AML異種移植片における疾患悪性度に関連している。対照的に、高いCD99転写産物発現を有する患者は予後改善を示す。それは、白血病細胞の経内皮遊走および末梢血(PB)への動員の促進によって付与される化学療法感受性の増加による可能性がある。最後に、モノクローナル抗体(mAb)に基づくCD99のターゲッティングによって、免疫エフェクター細胞または補体の非存在下で、正常HSCおよび内皮細胞を相対的に温存したまま直接細胞傷害が誘導される。総合すれば、これらのデータは、AMLおよびMDS幹細胞において優先的に発現される細胞表面タンパク質としてのCD99を、白血病芽球の経内皮遊走および動員のメディエーターとして、かつmAbの直接標的化のための有望な治療標的として確立している。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、血液疾患、特に急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)およびT細胞リンパ腫などの造血器腫瘍およびリンパ腫を治療するための組成物および方法を提供する。本明細書に詳細に記載されるように、AML、MDSおよびT細胞悪性腫瘍などの造血器腫瘍およびリンパ腫は、細胞CD99の凝集を促進する1以上の化合物で効果的に治療することができる。特に、本開示は、1以上の抗CD99抗体を含む組成物であって、各抗CD99抗体が、(i)CD99の細胞外ドメインに結合し；(ii)CD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを促進し；(iii)前記抗CD99抗体が結合したAMLおよび／またはMDSおよび／またはT細胞悪性新生物細胞の細胞死を誘導する、前記組成物、を提供する。さらに、本明細書によって明らかなように、細胞死の誘導は、結合と、凝集、クラスタリングまたはキャッピングの1以上との組み合わせと密接な相関関係があり、後者は細胞死の発生を予測するのに役立つことができる。
いくつかの実施形態において、(i)T細胞新生物の治療のための、抗CD99抗体および、1以上の抗CD99抗体を含む組成物;(ii)T細胞新生物の治療に適した抗CD99抗体を作製し、同定する方法；(iii)抗CD99抗体および／または1以上の抗CD99抗体を含む組成物を用いる治療に感受性を示す、T細胞新生物を有する患者を確認する方法；(iv)CD99+白血病幹細胞および／または造血幹細胞などのT細胞新生物に関連するCD99+細胞において、アポトーシスを誘導する方法；ならびに(v)CD99+T細胞新生物を治療する方法、の提供を含む、T細胞新生物を治療する方法が開示される。
【０００７】
一実施形態において、それを必要とする患者において、CD99の細胞外ドメインを認識するかまたはそれに特異的に結合することができる抗体の治療的有効量をその患者に投与することを含む、造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法が提供される。一実施形態において、造血器腫瘍またはリンパ腫に冒されている患者には、CD99+骨髄系またはリンパ系悪性細胞が認められる。いくつかの実施形態において、悪性細胞は、成熟T細胞リンパ腫細胞、T急性リンパ性白血病(T-LL)、T急性リンパ性白血病(T-ALL)細胞または未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞から選択される。他の実施形態において、悪性細胞は、初代AML芽球細胞、白血病幹細胞(LSC)、初代MDS芽球細胞およびMDS造血幹細胞(HSC)からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、悪性細胞は、Tリンパ芽球性リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫または未分化大細胞リンパ腫(ALCL)に冒されている患者由来の細胞である。
一実施形態において、それを必要とする患者において、造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法であって、前記悪性腫瘍が、Tリンパ芽球性リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、NK/T細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群から選択される前記方法が提供される。一実施形態において、ALCLは、退形成性リンパ腫キナーゼ(ALK)陽性未分化大細胞リンパ腫(ALCL)またはALK陰性未分化大細胞リンパ腫である。一実施形態において、悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫である。一実施形態において、前記悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群から選択される。
一実施形態において、本開示は、急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群の治療のための、抗CD99抗体および、1以上の抗CD99抗体を含む組成物を提供する。
他の実施形態において、本開示は、急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群の治療に適した抗CD99抗体を作製し、同定する方法を提供する。
さらなる実施形態において、本開示は、抗CD99抗体および／または1以上の抗CD99抗体を含む組成物を用いる治療に感受性を示す、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群またはT細胞悪性腫瘍を含む造血器腫瘍またはリンパ腫を有する患者を確認する方法を提供する。
【０００８】
他の実施形態において、本開示は、CD99+白血病幹細胞および／または造血幹細胞などの急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群を含む造血器腫瘍またはリンパ腫に関連するCD99+細胞における細胞死を誘導する方法を提供する。
さらに他の実施形態において、本開示は、CD99レベルの上昇を示す急性骨髄性白血病および／またはCD99+骨髄異形成症候群などのCD99+造血器腫瘍またはリンパ腫を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】MDS細胞株MDS92(Tohyama et al., Br. J. Haematol. 91:795 (1995))上のCD99と、12E7と呼ばれる抗CD99抗体(Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:6552 (1979))20μg/mlとの連結（ライゲーション）は、72時間後でのMDS92細胞数(p<0.001)の128倍の減少によって証明されるように、20μg/mlのアイソタイプコントロール抗体の存在下でのMDS92細胞数と比較して、これらのMDS92細胞に対する細胞傷害性を示すことを示す棒グラフである。
【図１Ｂ】エフェクター細胞非依存性アポトーシスの証拠となる7-AAD対アネキシンVの蛍光値のプロットである（20μg/mlのアイソタイプコントロール抗体の存在下、72時間のインキュベーション後においてMDS92細胞のアポトーシスが認められなかったことと比較して、10μg/mlの12E7とCD99との連結（ライゲーション）後72時間においてMDS92細胞のアネキシンV陽性(p<0.001)が77%増加したことによって証明された）。
【図２Ａ】12E7媒介性細胞傷害を示す棒グラフであり、アイソタイプコントロール抗体の存在下でのMDS92細胞数と比較して、抗CD99抗体12E7とCD99との連結（ライゲーション）後22時間におけるMDS92細胞数が時間に依存して128倍減少すること(p<0.001)によって証明される。
【図２Ｂ−２Ｃ】図２Bは抗CD99抗体12E7とCD99との連結（ライゲーション）後の、MDS92細胞上でのCD99の細胞表面発現の、時間に依存した減少を示すログプロットである。  図２Cは骨髄系分化マーカーCD11b対CD14の蛍光値のプロットである。このプロットは、抗CD99抗体12E7とCD99との連結（ライゲーション）後の、時間に依存した両マーカーの細胞表面発現の減少を示す。
【図３】初代CD34+MDS細胞上のCD99と12E7抗CD99抗体との連結（ライゲーション）が、初代MDS細胞に対する細胞傷害性を示すことを示す棒グラフであり、48時間後における抗体なしに対する細胞数の10倍の減少およびアイソタイプ(IgG)対照抗体に対する細胞数の8倍の減少によって証明された。
【図４Ａ】高発現CD99+AML細胞株HL60およびMOLM13上のCD99との12E7抗CD99抗体との連結（ライゲーション）が、細胞傷害性を示すことを示す棒グラフであり、72時間後におけるアイソタイプコントロール抗体に対する細胞数の49倍の減少(HL60;p<0.001)および70倍の減少(MOLM13;p<0.001)によって証明される。
【図４Ｂ】アイソタイプコントロール抗体と比較した、MOLM13およびHL60細胞上のCD99発現レベルの上昇を示すログプロットである。
【図５Ａ】48時間後における細胞数の57倍の減少(p<0.001)によって証明されるように、CD99を発現している初代AML1520芽球細胞上のCD99との12E7抗CD99抗体との連結（ライゲーション）が細胞傷害性を示すことを示す棒グラフである。
【図５Ｂ】48時間後における細胞数の48倍の減少(p<0.001)によって証明されるように、CD99を発現している初代AML890芽球細胞上のCD99と12E7抗CD99抗体との連結（ライゲーション）が細胞傷害性を示すことを示す棒グラフである。
【図５Ｃ】80時間後におけるHSC細胞数の1.4倍の減少によって証明されるように、12E7抗CD99抗体が正常脊髄血液HSCに対してわずかな細胞傷害を示すに過ぎないことを示す棒グラフである。
【図６Ａ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Aは、CD99の発現に関して、治療関連骨髄異形成症候群(MDS)患者(n=26)および正常脊髄血液(CB)対照(n=27)からの造血幹細胞(HSC、系統陰性(LN)CD34+CD38-CD90+CD45RA-)のフローサイトメトリー(FC)による解析結果を示す図である。
【図６Ｂ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Bは、CD99発現に関してFCによって解析した、未分画のAML芽球(CD19-CD3-CD45lowSSClow)(n=63)および正常CB対照のプロットである。エラーバーは±SDを表す。星印は、p<0.0001を表す(対応のないt検定)。
【図６Ｃ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Cは、AML検体UPenn 1956からのCD3-CD19-CD34+CD38-細胞においてフローサイトメトリーによって評価したCD99発現の結果を示す図である。免疫表現型によって、“低CD99”細胞は、主にHSCおよび多能性前駆細胞(MPP、LN CD34+CD38-CD90-CD45RA-)に類似し、“高CD99”細胞は、リンパ球系MPP(LMPP、LN CD34+CD38-CD90-CD45RA+)に類似していた。
【図６Ｄ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Dは、“低CD99”および“高CD99”細胞集団がFACSにより95%以上の純度に二重選別（double-sorted）され、メチルセルロースアッセイ(1600細胞)にプレーティングしたとき、“低CD99”フラクションから14日目において多数の正常骨髄系コロニーが形成されたが、“高CD99”集団からは形成されなかったことを示す棒グラフである。
【図６Ｅ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Eは、コロニー由来の“低CD99”細胞は、UPenn 1956AML検体(B-バルクAML芽球、1-7-低CD99コロニー)に存在するFLT3-ITD分子異常を欠いていたことを示すアガロースゲルを示す図である。
【図６Ｆ】図6A〜6Fは、CD99がMDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に過剰発現されていることを示す図である。図6Fは、CD34+発現AML(n=54)において、LSC濃縮CD34+CD38-フラクションにおいてCD99発現が高かったことを示すグラフである。エラーバーは±SDを表す。*は、p<0.0001を表す(対応の有るt-検定)。
【図７Ａ】図7A〜7Eは、CD99が、in vivoでは疾患悪性度を促進するが、化学療法との関係において患者アウトカムを改善することを示す図である。図7Aは、2種類のshRNAによるHL60細胞におけるCD99のノックダウン(それぞれ、#61および#59により2.3倍および8.3倍）は、in vitroでの増殖動態を有意には変えなかったことを示すグラフである。エラーバーは±SDを表す。
【図７Ｂ】図7A〜7Eは、CD99が、in vivoでは疾患悪性度を促進するが、化学療法との関係において患者アウトカムを改善することを示す図である。図7Bは、shRNA#59が形質導入されたMOLM13細胞が移植された、準致死量で放射線照射されたNSGマウスの生存期間(OS)は、ベクター対照と比較して有意な改善を示した（それぞれ、58日および34日、p=0.0033、1群あたりn=5、3種類の移植片の独立したセット）ことを示す生存曲線である。
【図７Ｃ】図7A〜7Eは、CD99が、in vivoでは疾患悪性度を促進するが、化学療法との関係において患者アウトカムを改善することを示す図である。図7Cは、CD99の表面発現が、AML患者の末梢血における%芽球によって測定した場合(n=31、R2=0.2476、p=0.0051、Pearson相関)、疾患負荷に関連性を示すことを示すグラフである。
【図７Ｄ】図7A〜7Eは、CD99が、in vivoでは疾患悪性度を促進するが、化学療法との関係において患者アウトカムを改善することを示す図である。図7Dは、Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)1900臨床試験において標準用量または高用量のダウノルビシン(DNR)に無作為化した358名のAML患者において、CD99転写産物の高発現は、標準用量DNR群における改善されたOSに関連性を示したことを示す生存曲線である（高CD99および低CD99に関して、それぞれ25.0ヶ月および10.4ヶ月、p=0.000585、左上部パネル)。DNRの増強によって、CD99低発現を有する患者の悪い予後が緩和された(高CD99の23.3ヶ月間に対して21.3ヶ月間、p=0.755、左下部パネル)。
【図７Ｅ】図7A〜7Eは、CD99が、in vivoでは疾患悪性度を促進するが、化学療法との関係において患者アウトカムを改善することを示す図である。図7Eは、DNR増強によって特別な利益が記載されているDNMT3aまたはNPM1変異またはMLL再構成サブグループにおいて、DNR増強が低CD99群におけるOSを改善したが(12.3〜20.2ヶ月間、p=0.007、右上部パネル)、高CD99群では改善しなかった(18.1〜17.5ヶ月間、p=0.701、右下部パネル)ことを示す生存曲線である。すべての生存率比較にはログランク検定を用いた。
【図８Ａ】図8A〜8Dは、CD99が、白血病芽球の経内皮遊走および動員を促進することを示す。図8Aは、テトラサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを用いてCD99を過剰発現する(7倍)ように形質導入し、トランスウェルインサート(孔径8μM)上にコンフルエンスまで増殖させたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)上にそれを播種したHL60細胞の棒グラフである。CD99の過剰発現は、4時間目および28時間目において測定したとき、遊走の効率における有意な増加を導いたことをこれらのデータは示している。
【図８Ｂ】図8A〜8Dは、CD99が、白血病芽球の経内皮遊走および動員を促進することを示す。図8Bは、72時間後、残存した非遊走細胞が、遊走した細胞と比較して有意に低いレベルのCD99発現を示したことを示す棒グラフである。
【図８Ｃ】図8A〜8Dは、CD99が、白血病芽球の経内皮遊走および動員を促進することを示す。図8Cは、末梢血から採取された初代AML検体(n=9)は、骨髄(n=31)と比較して有意に高いCD99発現レベルを示すことを示す棒グラフである。
【図８Ｄ】図8A〜8Dは、CD99が、白血病芽球の経内皮遊走および動員を促進することを示す。図8Dは、10匹の準致死量で放射線照射したNSGマウスへのヒトAML試料UPenn 2741の異種移植後10週間における移植した細胞上のCD99発現を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。これらのデータは、対分析において、CD99発現が、骨髄と比較して、末梢血中を循環している移植した腫瘍細胞上で有意に高かったことを示している。エラーバーは、±SDを表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(パネルdに関しては対応の有るt-検定、他のすべてに関しては対応のないt検定）。
【図９Ａ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9A(左パネル)は、AML検体AU 5.1からの白血病芽球を10μg/mlまたは20μg/mlの用量で72時間抗CD99 mAbクローン12E7とインキュベーションした後の相対細胞数の棒グラフを示す。これらのデータは、IgG1アイソタイプコントロール抗体とのインキュベーションと比較して、12E7抗体とのインキュベーション後の細胞数の有意な減少を示す。図9A(右パネル)は、初代MDS患者試料からの系統陰性CD34+CD38-細胞を抗CD99 mAbクローン12E7と72時間のインキュベーションした後の相対細胞数の棒グラフを示す。これらのデータは、IgG1アイソタイプコントロール抗体とのインキュベーションと比較して、12E7抗体とのインキュベーション後の細胞数の有意な減少を示す。
【図９Ｂ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Bは、MOLM13細胞の、抗CD99 mAb H036-1.1(Abcam社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)による72時間のインキュベーション後の相対細胞数のグラフである。これらのデータは、IC50=186ng/mlでの細胞数の用量依存的減少を示す。
【図９Ｃ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Cは、MOLM13細胞の、H036-1.1による5μg/mL(マイクログラム／mL)でのインキュベーション後の活性化カスパーゼ3(aCaspase3)の棒グラフである。これらのデータは、aCaspase3の増加を示し、それは、アポトーシスによる細胞死のH036-1.1媒介性誘導を示す。
【図９Ｄ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Dは、抗CD99mAb H036-1.1での72時間のインキュベーション後のMOLM13細胞、脊髄血液(CB)HSCおよびHUVECの相対細胞数のグラフである。これらのデータは、IC50がMOLM13細胞については186ng/mlであり、CB HSCについては5201ng/mlであることを示しており、これが実質的の治療濃度域の根拠である。HUVECでは、20,000ng/mlまでの投与で、IC50に達しなかった。図12に示すように、抗CD99 mAb H036-1.1への暴露後のMSK MDS-001 CD34+CD38-細胞を用いてこの実験を繰り返し、非ML成人骨髄CD34+CD38-細胞およびHUVEC細胞と比較した。同様に、相対細胞数が劇的に減少したので、MSK MDS-001 CD34+CD38-に対する広い治療濃度域が示されたが、成人BM CD34+CD38-およびHUVEC細胞への影響はずっと少なかった。
【図９Ｅ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Eは、準致死量で放射線照射したNSGマウスへの移植の前の、H036-1.1によるAML検体UPenn 2741の45分間のex vivo処置後の末梢血(PB)におけるヒトキメリズムのグラフである。8週間において、PBにおけるヒトキメリズムによって測定するとき、これらのデータは腫瘍生着の有意な減少を示す。
【図９Ｆ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9F(左パネル)は、抗CD99 mAb(12E7)を用いた処置後のHL60細胞の免疫蛍光法分析(CD99-green、DAPI-blue)の結果を示す。105分において、CD99の顕著な細胞表面キャッピングが明らかになった。図9F(右パネル)は、架橋用抗IgG二次mAbの存在下でのMOLM13細胞の72時間のインキュベーション後の相対細胞数の棒グラフである。このグラフは、抗CD99 mAb(IgG-アイソタイプ)の細胞傷害の顕著な増強を示し、細胞表面CD99の抗CD99媒介性凝集におけるIgG媒介性促進と、それに続くMOLM13細胞死の促進と整合する。
【図９Ｇ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Gは、抗CD99 mAb H036-1.1によるMOLM13細胞のインキュベーション後の、Srcファミリーキナーゼ(SFKs、pSrc[Y416])の活性化を示すオートラジオグラフである。
【図９Ｈ】図9A〜9Hは、抗CD99モノクローナル抗体(mAb)が、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示し、このような抗体媒介性細胞傷害が、エフェクターおよび補体非依存性であることを示す。図9Hは、SFK抗CD99抗体PP2(20μM)でMOLM13細胞を3時間プレインキュベーションし、次いでH036-1.1で48時間インキュベーションした後の相対数のグラフである。これらのデータは、PP2の非存在下で細胞傷害における有意な減少(48時間においてIC50  476ng/ml)を示す。PP2の存在下でIC50は得られなかった。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(対応のないスチューデントのt検定))。これは、H036-1.1媒介性CD99凝集および細胞死の減少をもたらすプレインキュベーション工程中の細胞表面CD99のダウンレギュレーションと矛盾しない。
【図１０Ａ】抗CD99抗体12E7との48時間のインキュベーション後の15株のAML細胞株についての相対細胞数を示す棒グラフである。試験した15株のAML細胞株のうち、AML5Q、NB4、KCL22、MOLM13、HL60、MOLM14、NOMO1、U937、MonoMac1、KG1aおよびAML14は、12E7抗体とCD99との連結（ライゲーション）後の増殖抑制に感受性を示すことが見いだされた。試験した4株の細胞株、KBM5、SET2、KU812およびK562は、12E7抗体とのCD99連結（ライゲーション）に非感受性であることが見いだされた。
【図１０Ｂ】AML細胞株であるHL60、K562、KBM5、SET2およびKU812細胞におけるc-kitおよびCD99の相対的発現を示すフローサイトメトリープロット(上部パネル)ならびにIgG1κまたは抗CD9912E7抗体との48時間のインキュベーション後の相対細胞数を示す棒グラフ(下部パネル)である。HL60は、CD99の高発現およびc-kitの低発現を示す典型的な“感受性”細胞株である。“抵抗性”細胞株はCD99を発現しない(K562およびKBM5)か、または高レベルのc-kitを発現し(SEM2およびKU812)、Bcr-abl陽性(K562/KBM5/KU812)であるか、またはJAK2陽性(SEM2)である。CD99の低発現またはc-kitの高発現が、抗CD99抗体12E7に媒介される細胞傷害に抵抗性であることを予測することをこれらのデータは示している。
【図１０Ｃ】抗CD99抗体12E7、HEC2、DN16およびH036の存在下でのCD99+AML細胞の経内皮遊走動態のグラフである。このグラフは、二次抗体の非存在下では、CD99によって媒介されることが知られているAML細胞の経内皮遊走を特定の抗CD99抗体が抑制しないことを示している。
【図１１】上パネルは、UPenn 2522を異種移植したAMLマウスの抗CD99 mAb H036-1.1を用いるex vivo前治療およびin vivo治療の併用の概略図を示す。下パネルは、AML芽球UPenn 2522を異種移植したマウスの骨髄における5ヶ月後のヒトキメリズムの評価を示す。異種移植の前に抗CD99 mAbでプレコートしたAML芽球または抗CD99 mAbによる異種移植したマウスのin vivo処置ではAML異種移植片が除去されたが、一方、対照動物の4/5が白血病を受け継いだ。
【図１２】抗CD99 mAb H036-1.1での72時間のインキュベーション後のMSK MDS-001 CD34+CD38-細胞、成人BM CD34+CD38-細胞およびHUVECの相対細胞数のグラフである。抗CD99 mAbは、MDS-001CD34+CD38-細胞に対して有意に高い毒性を示したが、これは、白血病細胞の治療のための良好な治療濃度域を示す。
【図１３】免疫組織化学により組織マイクロアレイを染色することによって、CD99発現に関して264名のNHL患者をスクリーニングした結果を示す表4である。5%カットオフを用いたとき、4/13(31%)ALCL、11/20(55%)Tリンパ芽球性リンパ腫、7/16(44%)血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、10/63(16%)末梢性T細胞リンパ腫(非特異型)、0/3(0%)NK/T細胞リンパ腫、2/17(11.7%)濾胞性リンパ腫、2/24(8%)マントル細胞リンパ腫、4/22(18%)慢性リンパ性白血病、3/16(18.8%)辺縁帯リンパ腫および1/70(1.4%)びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)が、CD99発現に関して陽性であった。試料に関して、%陽性細胞および染色強度もまた記録した。弱〜中程度染色を示す場合は、主に細胞質パターンを示したが、強の場合は、膜染色を示した。
【図１４Ａ】免疫組織化学によるCD99の典型的な染色パターンを示す図である。A)Tリンパ芽球性リンパ腫(膜、強)、B)マントル細胞リンパ腫(細胞質、中程度)、C)辺縁帯リンパ腫(細胞質、弱)、D)未分化大細胞リンパ腫(細胞質、中程度)。
【図１４Ｂ】正常骨髄(n=7)および小児T-ALL患者の骨髄(n=117)におけるCD99(mRNA)の発現を示す図である。結果は、正常BM(p<.0001)に対してT-ALLにおいてCD99がアップレギュレートされていることを示している。この解析に用いた生データは、BioGPSにおける公表されている転写プロフィールから得た。この研究における患者は、German Co-operative study group for childhood ALL (COALL)および Dutch Childhood Oncology Group (DCOG)プロトコルに登録された。
【図１４Ｃ】T-ALL患者のマッチした診断-再発対間の、(フローサイトメトリーによる）CD99の発現を示す図である。CD99は、診断時および再発時に同等なレベルで発現されていることが示されている。総合すれば、これらのデータは、診断時および再発時に、T-ALLにおけるCD99を標的としうることを示唆している。この解析に用いた生データは、BioGPSにおける公表されている転写プロフィールから得た。この研究における患者はDutch Childhood Oncology Groupプロトコルに登録された。
【図１４Ｄ】正常末梢血BおよびT細胞に対するリンパ系新生物(細胞株)上のCD99の発現レベルを示す図である。陽性対照として、AML細胞株であるHL60を用いた。CD99発現を、293T細胞ならびに個々の細胞株のアイソタイプ対照に対して正規化した。この実験により、CD99は、正常T細胞に対してKarpas-299(ALCL細胞株)およびKoptK1(T-ALL細胞株)上でアップレギュレートされており、Granta-519(白血病形質転換[B系統]細胞株を有するマントル細胞リンパ腫）は、正常B細胞より高いレベルでCD99を発現していることが明らかとなる。対照的に、Mac2A(ALCL)、Hut78(セザリー症候群)、Hut102(菌状息肉症)、Ly8(びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、DLBCL)、WSU(DLBCL)、Daudi(バーキットリンパ腫)、DOHH2(免疫芽球性B細胞リンパ腫)、SKO-007(多発性骨髄腫)、SKMM1(多発性骨髄腫)、SKMM2(多発性骨髄腫)、LICR2(形質細胞性白血病)およびRPMI8226(形質細胞腫/多発性骨髄腫)上のCD99の発現は、それらの正常なBおよびT細胞カウンターパートよりも低下している。これにもかかわらず、4/4皮膚T細胞リンパ腫、3/3DLBCL、0/1バーキットリンパ腫および1/1白血病マントル細胞リンパ腫は、FCによってCD99陽性であった（データは示さず）。
【図１５Ａ】4KOPTK1細胞株におけるDN16媒介性細胞傷害を示すグラフであり、0ug/ml IgGおよび50〜100ug/ml抗IgG対照に対して40ug/ml DN16および50〜100ug/ml抗IgGによる72時間のインキュベーション後の細胞数の70〜81%の減少によって証明される(p≦.0002)。
【図１５Ｂ】Karpas-299細胞株におけるDN16媒介性細胞傷害を示すグラフであり、40ug/ml IgGおよび50〜100ug/ml抗IgG対照(p≦.0021)に対して40ug/ml DN16および50〜100ug/ml抗IgGによる72時間のインキュベーション後の細胞数の38〜43%の減少によって証明される。
【図１５Ｃ】40ug/ml DN16および50〜100ug/ml抗IgGによる72時間のインキュベーションがMac2A（低レベルののCD99を発現するALCL細胞株）における細胞傷害を誘導できず、それゆえに、適切な陰性対照として役に立つことを示すグラフである。
【図１５Ｄ】KOPTK1細胞株における12E7媒介性細胞傷害を示すグラフであり、40ug/ml IgGおよび50〜100ug/ml抗IgG対照に対して40ug/ml12E7および50〜100ug/ml抗IgGによる72時間のインキュベーション後の細胞数の42〜78%の減少によって証明される(p≦.0003)。
【図１５Ｅ】Karpas-299細胞株におけるO13媒介性細胞傷害を示すグラフであり、40ug/ml IgGおよび75ug/ml抗IgG対照に対して40ug/ml O13および75ug/ml抗IgGによる72時間のインキュベーション後の細胞数の25%の減少によって証明される(p<.0001)。
【図１６】抗IgGの存在下で72時間、CD99mAb(F8、O13、12E7、DN16)の処置による、Karpas-299、KOPTK1およびMac2A細胞株において同定された細胞数の最大変化を要約す表5を示す図である。これらの発見は、CD99のmAb媒介性細胞傷害は、エピトープ特異的であることを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本開示は、一部分において、低リスク骨髄異形成症候群(MDS)患者由来の造血幹細胞(HSC)および正常成人ドナー由来の正常骨髄(BM)細胞のトランスクリプトーム解析の結果に基づく。該トランスクリプトーム解析において同定された発現量の異なる3,258の転写産物の中から、弁別的に発現している25の細胞表面転写産物が検出された。37名のデノボMDS患者のフローサイトメトリー解析によって、患者試料の73%において、CD99の細胞表面タンパク質発現の制御不全が確認された。26名の治療関連MDS患者試料においても、同じ25の細胞表面タンパク質のフローサイトメトリー解析を行い、患者試料の85%において、CD99が過剰発現されていることが明らかとなった。
特定の細胞表面タンパク質、特に細胞表面マーカーCD99の発現が、低リスク骨髄異形成症候群(MDS)患者由来の造血幹細胞(HSC)だけでなく治療関連MDS患者試料においても上昇しているというこれらの予備的観察に基づいて、CD99の細胞外ドメインに結合特異性を有する抗体の潜在的治療効果を、MDS細胞株および初代細胞だけでなく、AML細胞株および初代AML芽球においても評価した。本発明者らの実験において、MDSおよびAMLの両方において、CD99が本質的に最も頻繁に過剰発現されていたマーカーであり、かつ、かなり過剰発現されていた（対照に対して平均約7倍）。
本明細書に記載されるように、特定の抗CD99抗体、例えば抗CD99抗体12E7とMDS細胞上のCD99との連結（ライゲーション）によって、(i)細胞数が時間に依存して減少し、(ii)抗CD99抗体が連結（ライゲーション）したMDS細胞の細胞死が誘導され（アネキシンV陽性の増加によって証明される）；(iii)CD99の細胞表面発現レベルが減少し；(iv)CD14およびCD11bなどの、特定の骨髄球特異的分化マーカーのレベルが低下した。同様に、抗CD99抗体12E7などの特定の抗CD99抗体と初代CD34+MDS細胞上のCD99との連結（ライゲーション）は、初代MDS細胞に細胞傷害性を示したが、これは、抗体の非存在下またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で増殖させた培養物中の細胞数に対する、抗CD99抗体の存在下で増殖させた培養物中の細胞数の時間に依存した減少によって証明された。
【００１１】
抗CD99抗体12E7などの特定の抗CD99抗体と、高レベルのCD99を発現しているAML細胞上のCD99とのライゲーションは、AML細胞に対しても細胞傷害性を示すことも観察されたが、これは、抗体の非存在下またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で増殖させた培養物中の細胞数に対する、抗CD99抗体の存在下で増殖させた培養物中の細胞数の時間に依存した減少によって証明された。同様に、抗CD99抗体12E7などの特定の抗CD99抗体とCD99を発現している初代AML芽球上のCD99とのライゲーションは、初代AML芽球に対して細胞傷害性を示し、これは、細胞数の時間に依存した減少によって証明されたが、正常脊髄血液HSC細胞数に対しては、時間に依存した中等度の効果のみが見られた。
そのうえ、本明細書に記載されているように、CD99を発現しているMDS細胞株、MDS初代細胞、AML細胞株および初代AML芽球上のCD99の抗CD99抗体ライゲーションによる細胞傷害は、補体依存性細胞傷害(CDC)および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)の非存在下を含む、抗体のエフェクター機能の非存在下で生じることがさらに明らかにされた。
これらの研究により、試験された抗CD99抗体のサブセットは、CD99+細胞増殖に対して細胞傷害性を示すことが見いだされたが、これはアポトーシスなどの細胞死の誘導による抗CD99媒介性細胞傷害に起因するものであった。これらの細胞傷害性抗CD99抗体は、細胞表面CD99に連結する特性を共有し、それによって、抗体が結合したCD99の細胞表面の凝集が促進され、それによって細胞表面の限局性領域内のそのクラスタリングまたはキャッピングが生じる。さらに、特定の抗CD99抗体の細胞傷害およびそれによって誘導されるアポトーシスは、CD99凝集、クラスタリングおよびキャッピングを促進する各抗体の能力に直接的に関連していた。これらの結果により、CD99+AMLおよびCD99+MDSを抑制するのに有効な抗CD99抗体は、望ましくは、(i)CD99凝集を誘導する;(ii)CD99クラスタリングを誘導する;ならびに(iii)CD99+MDSおよびAML細胞の表面上のCD99キャッピングを誘導する、特性の1以上を有するべきであることが示された。
【００１２】
これらおよび他の発見（本明細書においてさらに詳細に説明される）に基づいて、本開示は、
（1）急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群の治療のための、抗CD99抗体および、1以上の抗CD99抗体を含む組成物であって、適切な抗CD99抗体が、表面に発現しているCD99に連結する（すなわち結合する）；CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の増殖を抑制する；ライゲートしたCD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを容易にする；および、アポトーシス、壊死/ネクロプトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレス関連細胞傷害または分裂死、パラトーシス、パイロトーシス、ピロネクローシスエントーシスなどの他の細胞死機構などによる細胞死の直接誘導によってAMLおよび／またはMDS細胞の細胞傷害を促進する、前記抗CD99抗体および、1以上の抗CD99抗体を含む組成物；
（2）急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群の治療に適した抗CD99抗体を作製し、同定する方法；
（3）抗CD99抗体および／または1以上の抗CD99抗体を含む組成物を用いる治療に感受性を示す急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群を有する患者を同定する方法；
（4）CD99+白血病幹細胞および／または造血幹細胞などの、急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群に関連するCD99+細胞においてアポトーシスを誘導する方法；ならびに
（5）CD99レベルの上昇を示すCD99+急性骨髄性白血病および／またはCD99+骨髄異形成症候群を治療する方法
を提供する。
【００１３】
本明細書にさらに詳細に説明するように、これらの抗体、組成物ならびに急性骨髄性白血病および／または骨髄異形成症候群の治療方法は、(1)急性骨髄性白血病(初代AML細胞、芽球および白血病幹細胞(LSC)を含む)に関連し、および／またはデノボもしくは治療関連骨髄異形成症候群(初代MDS細胞、芽球および／または造血幹細胞(HSC)を含む)に関連する組織および／または細胞におけるCD99の発現増加；(2)特定の抗CD99抗体とのライゲーションおよび、このような抗CD99抗体とライゲーションしたときに結果として生じる細胞CD99の凝集、クラスタリングおよびキャッピングに対するこのようなCD99+AMLおよびMDSの組織および細胞の感受性；ならびに(3)抗CD99ライゲーションおよび、結果として生じる凝集、クラスタリングおよびキャッピング（細胞表面に発現しているCD99に対する抗CD99結合によって媒介される）および、そのCD99凝集の結果として誘導される細胞死(すなわちアポトーシス)によって生じる細胞傷害、の間に新たに見いだされた本開示の関係に由来する。
CD99+AMLおよびMDS細胞上のCD99のライゲーション媒介性クラスタリングのための抗CD99抗体
本開示は、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の増殖を阻害するかまたはそのアポトーシスを誘導する本開示の方法に適切に用いることができる細胞傷害性抗CD99抗体であって、CD99発現レベルの上昇を示す細胞で構成されるAMLおよび／またはMDSに冒されている患者の治療に適した前記細胞傷害性抗CD99抗体を提供する。
【００１４】
本明細書に開示された細胞傷害性抗CD99抗体は、以下の特性：
1．CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現されている場合のCD99の細胞外ドメインに対する結合親和性；
2．CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面の、抗体結合CD99の凝集、クラスタリングおよびキャッピングの促進またはさらなる促進；ならびに
3．CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面のCD99に結合した場合の、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞における細胞死の誘導、
を示す。CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面のCD99に結合した抗体による凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングの促進は、その抗体による細胞傷害ならびに、アポトーシス、壊死/ネクロプトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレス関連細胞傷害または分裂死、パラトーシス、パイロトーシス、ピロネクローシスおよびトーシスなどの細胞死機構によるか否かにかかわらず細胞死を誘導するという能力を予測することは理解されるであろう。Kroemer et al., Cell Death Differ. 16(1):3-11 (2009)を参照のこと。いずれにしても、凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングの中間評価の有り無しで細胞死を直接的に観察することができる。
【００１５】
これらの方法に適切に用いることができる例示的な抗体には、マウスIgG1抗体12E7(Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76:6552 (1979))およびO13(Dracopoli et al., Am. J. Hum. Genet. 37:199 (1985))（これらはともに、CD99の細胞外ドメインのエピトープ“DGEN”(配列番号7)（これは配列番号2のアミノ酸61〜64、配列番号4のアミノ酸45〜48および配列番号6のアミノ酸61〜64によって定義される）に結合する）ならびにマウスIgM H036-1.1抗体（CD99の細胞外ドメインのエピトープDDPRPPNPPK(配列番号12)に結合する）が含まれる。
対照的に、いくつかの実施形態において、マウスIgG1抗体DN16(Hahn et al., J. Immunol. 159:2250 (1997)(参照により本願に組み込まれる)（CD99の細胞外ドメインのエピトープ“LPDNENKK”(配列番号8)(配列番号2および6のアミノ酸32〜39によって定義される）に結合するが、配列番号4(式中、アミノ酸32〜39はアミノ酸配列“LPGDDFDL”(配列番号9)を含む）のアミノ酸配列には存在しない）は、本開示の方法には不適当である。なぜなら、CD99の細胞外ドメインへの結合は、抗体が結合したCD99の凝集および相応じて低レベルの細胞傷害を促進する限定された能力しか示さず、その抗体媒介性凝集、細胞傷害およびアポトーシスは、抗CD99抗体関連CD99と第2抗IgG抗体とを結合させることによって増強されることができるが、これは、その二価性のために、2つの抗CD99抗体が結合したCD99分子を近接近させるからである。
【００１６】
抗CD99 mAb細胞傷害に必要とする潜在的エピトープをさらに同定するために、CD99細胞外ドメインにおけるオーバーラップする15マーペプチドのペプチドスキャニング実験を用いた。結果を表1に示す。mAb 12E7およびF8は、ともにエピトープDAVVDGEND(配列番号10)を含むオーバーラップペプチドを認識した。mAb O13は、エピトープAVVDGEN(配列番号11)を含むオーバーラップペプチドを認識した。mAb H036-1.1は、エピトープDDPRPPNPPK(配列番号12)を含むオーバーラップペプチドを認識した。MAb 3B2は、エピトープLPD(配列番号13)を含むオーバーラップペプチドを認識した。mAbは、エピトープDALPDN(配列番号14)を含むオーバーラップペプチドを認識した。この15merペプチドをフラグメントとする細胞外ドメインの配列は、配列番号15である。
同様に、いくつかの実施形態において、マウスIgG抗体3B2およびF8は、本開示の方法には適さない。なぜなら、CD99の細胞外ドメインには結合するものの、抗体が結合したCD99の凝集は促進せず、かつ凝集を媒介できず、細胞死を誘導できない結果として、抗体が結合したAMLおよび／またはMDS細胞に対して細胞傷害性を示さないからである。そのうえ、3B2およびF8抗体が結合したCD99に対する第2抗IgG抗体の結合は、抗CD99抗体媒介性凝集または細胞傷害の促進には無効である。
【００１７】
表1に、12E7、O13およびH036-1.1抗CD99抗体のそれぞれの特性を示す。それぞれは、(1)AMLおよび／またはMDS細胞に発現されたときのCD99の細胞外ドメインに結合する；(2)AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現しているCD99の凝集、クラスタリングおよびキャッピングの少なくとも1つを促進する、という所望の特性を示す。これらの抗体は、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞に細胞傷害性を示し、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞における細胞死を誘導することが明らかにされている。
表1に、DN16、3B2およびF8抗CD99抗体の特性も示してある。これらの抗体は、AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現されたときのCD99の細胞外ドメインに結合するという所望の特性を示すが、AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現しているCD99の凝集、クラスタリングおよびキャッピングは促進しない。これらの抗体は、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞には細胞傷害性を示さず、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞における細胞死を誘導する能力を欠く。
従って、12E7、O13およびH036-1.1抗CD99抗体と、凝集/クラスタリング/キャッピングを促進する能力を共有し、その結果として、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞における細胞死を誘導する能力を共有する細胞傷害性抗体は本開示の範囲内であり、CD99+AMLおよび／もしくはMDS細胞における細胞傷害を誘導するための、またはCD99発現レベルの上昇を示すAMLおよび／またはMDS関連細胞を示すAMLおよび／もしくはMDS患者を治療するための本開示の方法に適切に用いることができることは理解されるであろう。
【００１８】
対照的に、DN16、3B2およびF8抗CD99抗体と、凝集/クラスタリング/キャッピングを促進するかまたはCD99+AMLおよび／もしくはMDS細胞における細胞死を誘導するための限定された能力しか有さないかまたは能力を有さないことを共有する非細胞傷害抗体は、本開示の範囲および本方法の範囲外であることもまた理解されるであろう。
【００１９】
表1  抗CD99抗体の特性
2018511311.tif 000003
【００２０】
本明細書に開示された方法に用いるのが適切であることができる抗CD99抗体は、約100ng/ml〜約10μg/mlまたは約250ng/ml〜約5μg/mlまたは約500ng/ml〜約1μg/mlのIC50でヒトCD99の細胞外ドメインに結合する。
本開示の方法を実施するのに適した抗CD99抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、従前に記載されたものであれ、新規に開発されたものであれ、これらの抗CD99抗体が12E7、O13およびH036-1.1抗CD99抗体と、(1)CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現されるときの、CD99の細胞外ドメインに対する結合親和性；(2)CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面の、抗体が結合したCD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングの促進；ならびに(3)CD99+AMLおよび／またはMDS細胞の表面のCD99に結合するときの、CD99+AMLおよび／またはMDS細胞における細胞死の誘導、を共有する限りは、本明細書に記載の12E7、O13およびH036-1.1抗CD99抗体もしくは他の抗体のいずれかの一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’）フラグメント、Fab発現ライブラリーによって作製されるフラグメントおよび／または結合フラグメントを含むヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体であることができる。凝集、クラスタリングおよびキャッピングの1以上と細胞傷害の密接な相関により、凝集、クラスタリングおよびキャッピングは細胞傷害、より具体的には細胞死のマーカーとして役立つことができる。従って、凝集、クラスタリングおよびキャッピングを引き起こすことが以前に同定されている抗体は、細胞死の誘導による細胞傷害を促進するために用いることができる。
【００２１】
本開示の抗CD99抗体は、従来の手段によっても作製することができるし、組換え技術によっても作製することができる。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、少量存在しうる、天然に存在する起こりうる変異を除けば同一である集団を含む個々の抗体から得られる。従って、修飾語句"モノクローナル"は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
本開示の抗CD99モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリードーマ法を用いて製造することもできるし、組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって製造することもできる。
ハイブリードーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターが、免疫化されて、免疫化に利用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、またはそれを産生することができるリンパ球を誘発する。CD99に対する抗体は、CD99およびアジュバントの皮下(sc)または腹腔内(ip)注射を複数回行うことによって動物において産生されることができる。当該分野で公知の方法を用いてCD99を調製することができるが、その一部を本明細書にさらに記載する。例えば、ヒトおよびマウスCD99の組換え産生を以下に記す。一実施形態において、免疫グロブリンH鎖のFc部分に融合されたCD99を用いて動物が免疫される。他の実施形態において、CD99-IgG1融合タンパク質を用いて動物が免疫される。通常、動物はCD99の免疫原性複合体またはその誘導体とモノホスホリル脂質A(MPL)/トレハロースジクリノミコレート(TDM)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.)に対して免疫され、この溶液は複数の部位で皮内に注入される。2週間後にこの動物はブーストされる。7〜14日後、動物は採血され、抗CD99力価について血清がアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまでブーストされる。
【００２２】
あるいは、リンパ球は、in vitroで免疫することができる。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞に融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種し、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する1以上の物質を含有する適切な培地中で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用培地は、一般的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(HAT培地)を含むが、これらの物質は、HGPRT欠乏細胞の増殖を抑制する。
骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を維持し、HAT培地などの培地に対して感受性が高いものであることができる。骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手できるSP-2またはX63-Ag8-653細胞由来のマウス骨髄腫株であることができる。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載がある(Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００２３】
CD99に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が増殖している培地がアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはin vitro結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定することができる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスカッチャード分析によって測定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によってそのクローンをサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培地は、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において、腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、適切には、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水または血清から分離される。
【００２４】
本開示の抗CD99抗体は、所望の活性（単数または複数）を有する合成抗体クローンをスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーを用いて製造することができる。原理的には、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域(Fv)の種々のフラグメントを提示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合することができるFvフラグメントを発現するクローンは、その抗原に吸着され、従って、そのライブラリー中の非結合クローンから選別される。次いで、結合クローンは抗原から溶離され、抗原吸着/溶離のさらなるサイクルによってさらに濃縮されることができる。本開示の抗CD99抗体は、いずれも、注目するファージクローンを選択するための適切な抗原スクリーニング法を設計し、次いで、注目するファージクローンからのFv配列および、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3 に記載されている適切な定常領域(Fc)配列を用いて完全長抗CD99抗体クローンを構築することによって得ることができる。
抗体の抗原結合性ドメインは、共に3つの超可変ループまたは相補性決定領域(CDR)が存在する、L(VL)鎖およびH(VH)鎖からそれぞれ1つずつの、約110アミノ酸の2つの可変(V)領域から形成される。可変ドメインは、Winter et al.、Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)に記載されているように、VHおよびVLが、短い可動性ペプチドを介して共有結合した一本鎖Fv(scFv)フラグメントとして、またはそれぞれ定常ドメインに融合して非共有結合的に相互作用しているFabフラグメントとして機能的に提示されることができる。本明細書において、ファージクローンをコードするscFvおよびファージクローンをコードするFabは、一まとめにして、"Fvファージクローン"または"Fvクローン"と呼ばれる。
【００２５】
VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994)に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組替えることができ、次いで抗原結合性クローンを探索することができる。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要としないで、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) に記載されているように、ナイーブレパートリーをクローニングして、免疫化をすることなく、広範囲の非自己および自己抗原に対するヒト抗体の単一源を提供することができる。最後に、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992) に記載されているように、ナイーブライブラリーは、また、幹細胞からの組換えされていないV遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むPCRプライマーを用いて合成的に製造して、高度に可変のCDR3領域をコードし、in vitroでの再編成を達成することができる。
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質pIIIに融合させることによって抗体フラグメントを提示するために用いられる。抗体フラグメントは、例えばMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) に記載されているように、可動性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖にVHおよびVLドメインが連結されている一本鎖Fvフラグメントとして提示することもできるし、あるいはHoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19:4133-4137 (1991)に記載されているように、1つの鎖がpIIIに融合され、もう一つの鎖が、細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、ペリプラズムにおいて、Fabコートタンパク質構造の会合型が野生型コートタンパク質の一部が置き換わることによってファージ表面に提示されるFabフラグメントとして提示することもできる。
【００２６】
一般に、抗体遺伝子フラグメントをコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取される免疫細胞から得られる。抗CD99クローンに偏ったライブラリーが所望される場合、個体をCD99で免疫化して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞および／または循環B細胞である他の末梢血リンパ球(PBL)が、ライブラリー構築のために回収される。CD99免疫化によって、CD99に対するヒト抗体を産生するB細胞が生じるように、機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(かつ機能性内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおいて抗CD99抗体応答を生じさせることによって、抗CD99クローンに偏ったヒト抗体遺伝子フラグメントライブラリーが得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下で述べる。
抗CD99反応性細胞集団のさらなる濃縮は、CD99特異的膜結合抗体を発現するB細胞を分離するための適切なスクリーニング法を用いて、例えば、CD99アフィニティークロマトグラフィーによる細胞分離によって、または、蛍光色素標識CD99への細胞の吸着と、それに続くフロー活性化細胞ソーティング(FACS)によって得ることができる。
あるいは、非免疫ドナーからの脾臓細胞および／またはB細胞もしくは他のPBLの使用によって、可能な抗体レパートリーのよりよい提示がなされ、また、CD99が抗原性でない任意の動物(ヒトまたは非ヒト)種を用いる抗体ライブラリーの構築が可能となる。in vitro抗体遺伝子構築を組み込むライブラリーのために、個体から幹細胞を採取して、組換えされていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸が得られる。対象となる免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン(luprine)、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマおよびトリなどから得ることができる。
【００２７】
抗体可変遺伝子セグメント(VHおよびVLセグメントを含む)をコードする核酸は、注目する細胞から回収され、増幅される。再構成されたVHおよびVL遺伝子ライブラリーの場合は、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837 (1989)に記載されているように、ゲノムDNAまたはmRNAをリンパ球から単離し、次いで、再構成されたVHおよびVL遺伝子の5'および3'末端でマッチングするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって所望のDNAを得ることができ、それによって、発現のための多様なV遺伝子レパートリーが作製される。V遺伝子は、Orlandi et al. (1989)およびWard et al., Nature 341:544-546 (1989)に記載されるように、成熟Vドメインをコードするエクソンの5’末端におけるバックプライマー(back primer)およびJセグメント内に基づくフォワードプライマーを用いてcDNAおよびゲノムDNAから増幅することができる。しかしながら、cDNAから増幅するためには、バックプライマーは、Jones et al., Biotechnol. 9:88-89 (1991)に記載されているように、リーダーエクソンに基づくことができ、フォワードプライマーは、Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5728-5732 (1989)に記載されているように、定常領域内に基づくことができる。Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)に記載されているように、相補性を最大化するために、プライマーに縮重を組み入れることができる。例えば、Marks et al.、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)の方法に記載されているように、またはOrum et al., Nucleic Acids Res. 21:4491-4498 (1993)の方法に記載されているように、ライブラリーの多様性は、免疫細胞の核酸試料中に存在するすべての入手可能なVHおよびVL配列を増幅するために、各V遺伝子ファミリーを標的にするPCRプライマーを用いることによって最大化することができる。増幅DNAの発現ベクターへのクローニングのために、Orlandi et al. (1989)に記載されているように、一末端のタグとして、あるいは、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)に記載されているように、タグ付きプライマーを用いるさらなるPCR増幅を行うことによって、PCRプライマー内にまれな制限部位を導入することができる。
【００２８】
合成的に再構成されたV遺伝子のレパートリーは、V遺伝子セグメントからin vitroで誘導することができる。ヒトVH遺伝子セグメントの大部分はクローニングされ、配列決定され(Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992)に報告されている)、マッピングされている(Matsuda et al., Nature Genet. 3:88-94 (1993)に報告されている）。Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)に記載されているように、これらのクローニングされたセグメント(H1およびH2ループの主な配座のすべてを含む)を、多様な配列および長さのH3ループをコードするPCRプライマーを用いて、多様なVH遺伝子レパートリーを作製するのに用いることができる。Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4457-4461 (1992)に記載されているように、VHレパートリーを、単一長さの長いH3ループにすべての配列多様性の焦点を合わせて作製することもできる。ヒトVκおよびVλセグメントは、クローニングされ、配列決定されており(Williams and Winter, Eur. J. Immunol. 23:1456-1461 (1993)に報告されている)、合成L鎖レパートリーを製造するために用いることができる。合成V遺伝子レパートリーは、一連のVHおよびVLフォールドならびにL3およびH3の長さに基づき、かなりの構造多様性の抗体をコードする。DNAをコードするV遺伝子の増幅に続いて、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)の方法に従って、in vitroで生殖系列V遺伝子セグメントを再構成することができる。
【００２９】
いくつかの方法で、VHおよびVL遺伝子レパートリーを組み合わせることによって抗体フラグメントのレパートリーを構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、それらのベクターを、in vitroで、例えばHogrefeet al, Gene, 128: 119-126(1993)に記載されているように、またはコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse et al.、Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993) に記載されているloxP系によるin vivoで作製することができる。このin vivo組換えアプローチは、大腸菌の形質転換効率によって課されるライブラリーサイズの限界を克服するために、二本鎖種のFabフラグメントを利用する。ナイーブVHおよびVLレパートリーは、1つはファージミドへ、もう1つはファージベクターへ、別々にクローニングされる。次いで、この2つのライブラリーは、各細胞が異なる組み合わせを含み、そのライブラリーサイズが、存在する細胞数(約1012クローン)によってのみ限定される、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わされる。双方のベクターは、VHおよびVL遺伝子が単一のレプリコンへ組替えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、in vivoでの組換えシグナルを含む。これらの巨大ライブラリーは、優れた親和性(約10-8MのKd-1)を有する多数の多様な抗体を提供する。
【００３０】
あるいは、該レパートリーは、例えば、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:7978-7982 (1991)に記載されているように、同じベクターに順次にクローニングされることもできるし、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)に記載されているように、PCRによってアセンブルした後、クローニングすることもできる。PCRアセンブリは、また、可動性ペプチドスペーサーをコードするDNAとVHおよびVL DNAとを結合させて一本鎖Fv(scFv)レパートリーを形成するのに用いることができる。さらに他の技術において、Embleton et al., Nucl. Acids Res. 20:3831-3837 (1992)に記載されているように、"細胞内でのPCRアセンブリ"が、PCRによってリンパ球内のVHおよびVL遺伝子を連結し、次いで連結された遺伝子のレパートリーをクローニングするために用いられる。
【００３１】
ナイーブライブラリー(天然または合成のいずれか)によって産生される抗体は、中等度の親和性(約106〜107M-1のKd-1)のものであることができるが、Winter et al. (1994)（前出）に記載されているように、第2ライブラリーから構築して再選択することによって、in vitroで親和性成熟を模倣することができる。例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)の方法またはGram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3576-3580 (1992)の方法において、エラープローンポリメラーゼ (Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)に報告されている)を用いることによって、in vitroでランダムに変異を導入することができる。さらに、1以上のCDRをランダムに変異させることによって、例えば選択された個々のFvクローンにおいて、注目するCDRにまたがるランダム配列を含むプライマーによるPCRを用いてより高い親和性のクローンをスクリーニングすることによって親和性成熟を行うことができる。PCT特許公開WO1996/07754(1996年3月14日に公開)には、免疫グロブリンL鎖の相補性決定領域に変異誘発を誘導して、L鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法が記載されている。もう1つの有効なアプローチは、Marks et al.. Biotechnol. 10:779-783 (1992)に記載されているように、非免疫ドナーから得られた天然に存在するVドメイン変異体のレパートリーを用いるファージディスプレイによって選択されたVHまたはVLドメインを組換え、数ラウンドの鎖リシャッフリングでより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、10-9M域の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。CD99の核酸およびアミノ酸配列は当該技術分野で公知であり、本明細書において表2Aに示されている。CD99をコードする核酸配列は、CD99の所望の領域のアミノ酸配列を用いて設計することができる。
【００３２】
CD99をコードする核酸は、当該技術分野で公知の種々の方法で調製することができる。これらの方法は、限定するものではないが、トリエステル法、亜リン酸エステル法、ホスホロアミダイト法およびH−ホスホネート法などの、Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:716-734 (1989)に記載されている方法のいずれかによる化学合成を含む。一実施形態において、CD99をコードするDNAの設計に、発現宿主細胞に好ましいコドンが用いられる。あるいは、CD99をコードするDNAは、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから単離されることもできる。
CD99をコードするDNA分子の構築に続いて、このDNA分子は、プラスミドなどの、発現ベクターにおける発現制御配列に作動可能に連結されるが、この調節配列は、ベクターによって形質転換された宿主細胞によって認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種由来の複製配列および調節配列を含む。このベクターは、通常は、形質転換細胞における表現型選択を与えることができるタンパク質をコードする配列だけでなく、複製部位を含む。原核および真核宿主細胞における発現に適切なベクターは当該技術分野で公知であり、その一部は本明細書にさらに記載されている。酵母などの真核生物または、哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞を用いることができる。
場合により、CD99をコードするDNAは、分泌リーダー配列に作動可能に連結され、宿主細胞による発現産物の培地への分泌が行われる。分泌リーダー配列の例は、stII、ecotin、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼおよびα因子を含む。本明細書において、プロテインAの36アミノ酸リーダー配列もまた使用に適している(Abrahmsen et al., EMBO J. 4: 3901 (1985))。
【００３３】
宿主細胞は、本開示の上記の発現またはクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、必要に応じて、誘導性プロモーターを改変し、形質転換細胞を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅して、通常の栄養培地中で培養する。
トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みのことをいう。トランスフェクションの多くの方法、例えば、CaPO4沈殿およびエレクトロポレーションが当業者に公知である。一般に、宿主細胞内にこのベクターの作動の任意の徴候が見られたとき、トランスフェクションの成功が認識される。トランスフェクションの方法は当該分野で公知であり、その一部は本明細書にさらに記載されている。
形質転換は、生物体にDNAを導入し、それによって、染色体外因子または染色体組込み体のいずれかでDNAが複製可能になることを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、このような細胞に適した標準法を用いて形質転換が行われる。形質転換の方法は当該分野で公知であり、その一部は本明細書にさらに記載されている。
CD99の産生に用いる原核宿主細胞は、Sambrookら（前出）に一般的に記載されているように培養されることができる。CD99の産生に用いる哺乳動物宿主細胞は、種々の培地中で培養することができるが、これらは当該分野で公知であり、その一部は本明細書に記載されている。本開示で言及した宿主細胞は、in vitro培養における細胞だけでなく、宿主動物内の細胞も含む。
【００３４】
CD99の精製は、当業者には明らかな方法を用いて達成することができるが、その一部は本明細書に記載されている。精製されたCD99は、ファージディスプレイクローンのアフィニティクロマトグラフィー分離に使用するための、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリル酸共重合体、ヒドロキシメタクリレートゲル、ポリアクリル酸共重合体、ポリメタクリル酸共重合体、ナイロン、中性担体、イオン性担体などの適切なマトリックスに吸着されることができる。マトリックスへのCD99タンパク質の吸着は、Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)に記載されている方法で達成されることができる。多糖マトリックス、例えばアガロース、デキストランまたはセルロースにタンパク質リガンドを吸着させるために一般に用いられる技術は、ハロゲン化シアンによる担体の活性化と、その後の、活性化マトリックスへのペプチドリガンドの一級脂肪族アミンまたは芳香族アミンのカップリングを含む。
あるいは、吸着プレートに張り付けられた宿主細胞上に発現されたCD99は、吸着プレートのウェルをコートするために用いることができ、細胞ソーティングに用いることができ、ストレプトアビジンコーティングされたビーズでの捕捉のためにビオチンに結合させることができ、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための、当該分野で公知の任意の他の方法に用いることができる。
【００３５】
ファージライブラリー試料は、吸着剤とファージ粒子の少なくとも一部との結合に適した条件下で、固定されたCD99と接触される。通常、pH、イオン強度、温度などを含む条件は、生理的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージは洗浄され、次いで、例えばBarbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:7978-7982 (1991)に記載されているように、酸によって溶出されるか、または例えば、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載されているように、アルカリによって溶出されるか、または例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)の抗原競合法に類似した手順でのCD99抗原競合によって溶出される。ファージは、1ラウンドの選択で20〜1,000倍に濃縮することができる。そのうえ、濃縮したファージは、細菌培養で増殖させ、さらなるラウンドの選択に供することができる。
選択の効率は、洗浄中の解離動態および、単一ファージ上の複数の抗体フラグメントが同時に抗原とかみ合うことができるかどうかを含む多くの要素に依存している。速い解離動態(および弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイおよび固相における抗原の高いコーティング密度によって保持されることができる。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合を応援する。遅い解離動態(および優れた結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass et al., Proteins, 8: 309-314(1990 およびWO 92/09690に記載されているような長い洗浄および一価のファージディスプレイの使用によって、さらに、Marks et al., Biotechnol. 10:779-783 (1992)に記載されているような抗原の低いコーティング密度の使用によって促進することができる。
【００３６】
親和性の差異がわずかだとしても、CD99に対する異なる親和性を有するファージ抗体間で選択は可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム変異(例えば前述の親和性成熟技術のいくつかで用いられているような）は、多くの変異体を生じやすく、大部分は抗原と結合するが、より高い親和性を有するものは少ない。CD99を制限すれば、まれな高親和性ファージは競合しえない可能性がある。すべてのより高い親和性変異体を保持するために、ファージは、過剰のビオチン化CD99であるが、CD99の標的モル親和定数よりも低いモル濃度である濃度のビオチン化CD99とともにインキュベートすることができる。次いで、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズに捕捉されることができる。このような"平衡捕捉"によって、親和性の低い大過剰のファージから、2倍しか高くない親和性を有する変異体クローンの単離を可能にする感受性で、それらの結合の親和性に従って抗体を選択することが可能になる。固相に結合しているファージの洗浄に用いる条件もまた、解離動態に基づいて識別するために操作することができる。
【００３７】
CD99抗体に対応するFvクローンは、(1)前述のようにファージライブラリーからCD99クローンから単離し、場合により、適切な細菌宿主中でその集団を増殖させることによって、ファージクローンの単離された集団を増幅し；(2)それぞれに対するブロッキング活性および非ブロッキング活性が望ましいCD99および第2タンパク質を選択し；(3)固定されたCD99に抗CD99ファージクローンを吸着させ；(4)過剰の第2タンパク質を用いて、オーバーラップするCD99結合決定基を認識するか、または第2タンパク質の結合決定基と共通の任意の望ましくないクローンを溶出し；(5)工程(4)に続いて、吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって選択することができる。場合により、所望のブロッキング/非ブロッキング特性を有するクローンは、ここに記載された選択手順を1回以上繰り返すことによってさらに濃縮することができる。
本開示のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイFvクローンをコードするDNAは、慣用法を用いて(例えば、ハイブリドーマまたはファージDNA鋳型から注目するH鎖およびL鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて）、容易に単離され、配列決定される。ひとたび単離されれば、そのDNAは発現ベクターに挿入することができ、次いでそれは、普通なら免疫グロブリンタンパク質を産生しないはずの大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内で所望のモノクローナル抗体の合成体が得られる。抗体をコードするDNAの細菌での組換え発現についての概説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs. 130:151 (1992)が含まれる。
【００３８】
本開示のFvクローンをコードするDNAを、H鎖および／またはL鎖定常領域(例えば、適切なDNA配列はKabatら（前出)から得ることができる）をコードする公知のDNA配列と結合させて、完全長もしくは部分長のH鎖および／またはL鎖をコードするクローンを形成させることができる。この目的のために、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を使用することができ、かつ、このような定常領域が、任意のヒトまたは動物種から得ることができることは明らかであろう。動物(ヒトなどの)種の1つの可変ドメインDNAから誘導され、次いで、もう1つの動物種の定常領域DNAに融合されて、"ハイブリッド"完全長H鎖および／またはL鎖のコード配列(単数または複数)を形成するFvクローンは、本明細書において、"キメラ"および"ハイブリッド"抗体の定義に含まれる。好ましい実施形態において、ヒト可変DNA由来のFvクローンが、ヒト定常領域DNAに融合されて、すべてのヒト完全長若しくは部分長のH鎖および／またはL鎖のコード配列(単数または複数)が形成される。
【００３９】
本開示のハイブリドーマ由来の抗CD99抗体をコードするDNAはまた、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同なマウス配列の代わりに、ヒトH鎖およびL鎖定常ドメインコード配列を置換することによって改変することもできる(例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984)の方法で)。ハイブリドーマまたはFvクローン由来の抗体またはフラグメントをコードするDNAは、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによってさらに改変することができる。このようにして、本開示のFvクローンまたはハイブリドーマクローン由来抗体の結合特異性を有する"キメラ"または"ハイブリッド"抗体が調製される。
本開示は、さらに、抗CD99抗体のキメラ誘導体であって、非ヒト動物可変領域およびヒト定常領域を含む前記抗体を考える。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域を含む、マウス、ラット、ラクダまたは他の種の抗体からの抗原結合性ドメインを含むことができる。キメラ抗体を調製するための種々のアプローチについては記載があり、AMLおよび／またはMDS細胞の表面のCD99の細胞外ドメインを認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を調製するために用いることができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985); Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Bossら、米国特許第4,816,397号;Tanaguchiら、ヨーロッパ特許出願EP171496、ヨーロッパ特許出願100173494、英国特許GB2177096BおよびPCT特許公開WO2013/064700を参照のこと（それぞれは、参照により本願に組み込まれる）。
【００４０】
特定の側面において、本開示の範囲の抗CD99抗体は、Fab、Fab'およびF(ab')2'、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Fv(sdFv)ならびにVLまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメントなどのヒト抗原結合性抗体フラグメントを含む。一本鎖抗体を含むCD99結合抗体フラグメントは、単独で、あるいは、以下：ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメインの全部または一部、と組み合わせて可変領域(単数または複数)を含むことができる。ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメインと可変領域(単数または複数)との任意の組み合わせを含むCD99結合フラグメントもまた含まれる。該抗体はヒト、マウス、ラット、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリの抗体であることができる。本明細書において、"ヒト"抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、ヒトB細胞から単離された抗体または、1以上のヒト免疫グロブリンを発現する、トランスジェニックである動物から単離された抗体を含む。ラクダ抗体の作製は、例えば、PCT特許公開WO2013/064700に記載されている。
【００４１】
本明細書に記載されているように、本方法に適切に用いることができる抗CD99抗体は、AMLおよび／またはMDS細胞の表面の、抗体が結合したCD99の、凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを促進する特性の少なくとも1つを確認することができる抗CD99抗体である。したがって、抗体が結合したCD99の凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングなどの特性は、二重特異性または多重特異性抗CD99抗体を用いることによって促進されることは明らかであろう。
本明細書において、用語“二重特異性抗体”および“二機能性抗体"のそれぞれは、第1エピトープ、抗原またはハプテンに特異的な少なくとも1つの第1抗原結合部位および、第2エピトープ、抗原またはハプテンに特異的な少なくとも1つの第2抗原結合部位を有することによって、CD99細胞外ドメインの2つの異なる抗原エピトープを認識する抗体のことをいう。
【００４２】
このような抗体は、組換えDNA法によっても調製することができるし、限定するものではないが、当該技術分野で公知の方法によって化学的に作製された抗体を含むこともできる。二重特異性抗体は、2つの異なるCD99エピトープを認識することができるすべての抗体または抗体の複合体または抗体の重合体を含む。二重特異性抗体は、それらの二価性を保持するように還元され、改変された抗体および、CD99の複数の抗原認識部位を有することができるように化学的に結合された抗体を含む。
【００４３】
限定するものではない例として、本方法に使用する二重特異性抗体は、本明細書に記載のCD99エピトープの少なくとも1つと結合でき、かつ、このようなCD99エピトープの2以上に結合することもできる。いくつかの実施形態において、該抗体の特異性の1つは、例えば約10-9未満の結合定数、通例約10-8未満の結合定数の低い親和性を有し、約10-7を超える結合定数であることができる。
本開示の方法を実施するのに適した抗体は、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性であることができる。さらにまた、本開示の抗体は、バイスタンダー細胞としての顆粒球(好中球)、NK細胞およびCD4+細胞に対して低リスクの毒性を有することができる。
二重特異性抗体の製造方法は当該技術分野で公知である。従来の完全長二重特異性抗体の製造法は、2本鎖が異なる特異性を有する、2つの免疫グロブリンH鎖-L鎖対の同時発現に基づく。Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)。これらの鎖は、以下で説明するようなリンカーによって連結されることができる。一般的に用いられる適切なリンカーは(GGGGS)3である。
【００４４】
免疫グロブリンのH鎖およびL鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、種々の抗体分子の混合物を産生する。抗CD99エピトープ結合特異性の所望の組み合わせを有する抗体の精製は、アフィニティークロマトグラフィー行程によって行うことができる。関連する分離法は、国際公開番号WO1993/08829および、EMBO J. 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
二重特異性抗体は、AMLおよび／またはMDS細胞表面に発現されたCD99を凝集させるために、2つの可変領域（第1CD99エピトープに特異的な第1可変領域および第2CD99エピトープに特異的な第2可変領域）を結合させることによって作製することができる。このような二重特異性抗体は、Bassan, Blood 120(26):5094-5095 (2012)に記載されている一本鎖二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE（登録商標）)抗体に類似しているということができ、Topp et al., Blood 120(26):5185-5187 (2012)および Loffler et al., Blood 95(6):2098-2103 (2000)に記載されている画期的医薬品CD19x CD3 BiTE抗体ブリナツモマブによって典型的に示されている。
【００４５】
BiTE（登録商標）抗体は、単一のペプチド鎖上に構造VL1-VH1-VH2-VL2を有する2つの異なる一本鎖Fvフラグメントからなり、グリシン-セリンリンカーによって連結されている。BiTE抗体構築物は、一般に、サイズが60kDaのオーダーであり、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞内で発現され、復元を必要とすることなく完全活性型で高収量で分泌され、C末端ヒスチジンタグによって精製されることができる。BiTE（登録商標）抗体は、10〜100pg/mlという大変低い濃度で、かつエフェクター対標的細胞比が2:1という濃度で高レベルの細胞傷害性活性を示すように設計することができる。
抗体V L鎖(VL)およびV H鎖(VH)ドメインは、標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によってクローニングすることができる。cDNAは、Dubel et al., J. Immunol. Methods 175:89-95 (1994)に記載されているように、オリゴdTプライマーおよび逆転写酵素によって合成することができ、Vドメインは、VLドメインに隣接するプライマー5’L1および3’Kと、H鎖に基づくプライマー5’H1および3’GとによるPCRによって増幅することができる。
【００４６】
VLおよびVH領域は、VL特異的およびVH特異的PCRの鋳型としての別々のプラスミドベクターに、オリゴヌクレオチドプライマー対5’VLB5RRV(AGGTGTACAC TCCGATATCC AGCTGACCCA GTCTCCA)/3’VLGS15(GGAGCCGCCG CCGCCAGAAC CACCACCACC TTTGATCTCG AGCTTGGTCC C)および5’VHGS15(GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGT(GC)(AC)A(AG)C TGCAG(GC)AGTC(AT)GG)/3’VHBspE1(AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCT TGGCCCCAG)を用いてクローニングすることができる。その後の融合PCRに際して、結合して15アミノ酸(G4S1)3リンカーのコード配列を形成するために、PCR産物にオーバーラップする相補配列を導入することができる。この増幅工程は、プライマー対5’VLB5RRV/3’VHBspEaを用いて行うことができ、得られる融合産物(scFvフラグメント)は、制限酵素(例えばEcoRVおよびBspE1)で切断し、二重特異性一本鎖抗体のコード配列を含むプラスミドベクター(例えば、bluescript KSベクター;Stratagene社、ラホヤ、カリフォルニア州)にクローニングすることができる。得られた二重特異性一本鎖抗体は、発現ベクター(例えばpEF-DHFR)にサブクローニングされ、例えばエレクトロポレーションおよび選択によってトランスフェクトされることができる。二重特異性抗体は、Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7021-7025 (1995)に記載されているように、ニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)カラム(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ)によるアフィニティークロマトグラフィーを用い、そのC末端Hテールによって精製することができる。
【００４７】
国際公開番号WO1996/27011に記載されている他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にすることができる。このような界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含むことができる。この方法によって、第１の抗体分子の界面からの1以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)によって置き換えられる。より小さいアミノ酸側鎖(例えばアラニンまたはトレオニン)を、大きなアミノ酸側鎖に置き換えることによって、第２の抗体分子の界面に、大きな側鎖(単数または複数)に対する同一または小さいサイズの代償性"空洞"が作られる。これによって、ホモ二量体などの他の好ましくない最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させる機構が提供される。代替法は、2つの異なる一本鎖可変領域を熱安定抗原(HSA)に結合させる。リンカーとしてHSAを用いることによって血清半減期が増大するため、低い免疫原性というメリットを有している。
【００４８】
二重特異性抗体は、架橋抗体または"ヘテロコンジュゲート"抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方がアビジンに連結され、他はビオチンに連結されることができる。このような抗体は、例えば、不必要な細胞を免疫系細胞の標的とすること(米国特許第4,676,980号)および、HIV感染症の治療用にすること(国際公開番号WO1991/100360およびWO1992/200373ならびにヨーロッパ特許EP03089)が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて製造することができる。適切な架橋剤は当該分野で公知であり、多くの架橋技術と併せて、米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Breunanet et al., Science 229:81 (1985)は、無傷の抗体をタンパク質分解により切断してF(ab')2フラグメントを生成させる手順を記載している。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド生成を妨げる。生成されたFab'フラグメントは、次いで、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換される。次いで、Fab'-TNB誘導体の1つは、メルカプトエチルアミンによる還元によってFab'-チオールに変換され、等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合されて、二重特異性抗体を生成する。
【００４９】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体フラグメントを製造し単離する種々の技術もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて製造されている。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。FosおよびJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって2つの異なる抗体のFab'部分に結合された。抗体ホモ二量体がヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも用いることができる。
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448 (1993)によって記載された"ダイアボディ"技術は、二重特異性抗体フラグメントを製造するための代替機構を提供する。該フラグメントは、同じ鎖上で2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによってL鎖可変ドメイン(VL)に連結されるH鎖可変ドメイン(VH)を含む。したがって、1つのフラグメントのVHおよびVLドメインは、もう1つのフラグメントの相補的VLおよびVHドメインと対合することを強いられ、それによって2つの抗原結合部位を形成する。
一本鎖Fv(sFv)二量体を使用する二重特異性抗体フラグメントの製造のための他の戦略もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。あるいは、抗体は、Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されているように、"直鎖抗体"であることができる。簡潔に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメント(VH"CH1-VH"CH1)を含む。直鎖抗体は、二重特異性であることもできるし、単一特異性であることもできる。
【００５０】
本開示の文脈内で、抗CD99抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体フラグメント(例えばFabおよびF(ab')2)、キメラ抗体、二機能性または二重特異性抗体ならびに四量体抗体複合体を含むことが知られている。
抗体は、適切な親和性(会合定数)で、例えば107M-1以上の会合定数で結合する場合、細胞の表面のCD99に対して反応性であると考えられる。さらに、本開示の方法に用いることができる抗体は、また、5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15Mおよび10-15M未満の解離定数またはKdを有する結合親和性を含むそれらの結合親和性によって説明または特定することができる。
抗体は、慣用法を用いて断片化し、そのフラグメントは、全長抗体について前述したのと同様に結合活性についてスクリーニングすることができる。例えば、ペプシンで抗体を処理することによってF(ab')2フラグメントを作製することができる。ジスルフィド架橋を還元するために得られたF(ab')2フラグメントを処理してFab'フラグメントを生成させることができる。
化学結合は、E-アミノ基またはヒンジ領域チオール基とホモおよびヘテロ二機能性試薬の使用に基づく。5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DNTB)などのホモ二官能性試薬は、2つのFab間にジスルフィド結合を生成し、O-フェニレンジマレイミド(O-PDM)は、2つのFab間にチオエーテル結合を生成する。Breuner et al., (1985) and Glennie et al., (1987)。N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などのヘテロ二官能性試薬は、クラスまたはアイソタイプにかかわらず、抗体の露出アミノ基とFabフラグメントとを結合させる。Van Dijk et al., (1989)。
【００５１】
特に、限定するものではないが、抗体のFcドメインのヒンジ領域を模倣するペプチドまたはポリペプチドリンカーもまた使用することができる。例えば、米国特許第7,928,072号を参照のこと（リンカーの適切なクラスの開示に関して、その全体が参照により組み込まれる）。本開示の抗CD99抗体、すなわち、CD99を発現している、白血病幹細胞および造血幹細胞などのAMLおよび／またはMDS幹細胞だけでなくAMLおよび／またはMDSを治療するのに有用な抗体は、共有結合が、CD99の細胞外ドメイン上のそのコグネイトエピトープ(単数または複数)への結合をその抗体が妨げない限り、その抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって改変された誘導体を含む。例えば、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって改変された抗体を含むことができる。限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、処方、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって、多くの化学修飾のいずれも実施することができる。さらに、該誘導体は、1以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。
本開示に記載の抗CD99抗体は、抗体の細胞傷害をさらに促進するために、1以上の細胞傷害性化合物に結合されることができる。例えば、抗体薬物複合体(ADC)は、細胞傷害性ペイロードまたは薬物への不安定な結合を有する化学的に安定なリンカーによって連結された抗体(全mAbまたは一本鎖抗体[scFv]などの抗体フラグメント)で構成されるバイオコンジュゲート/イムノコンジュゲートの1種である。抗体-薬物複合体は、抗CD99抗体のCD99との結合および細胞傷害活性と、細胞毒の癌殺傷能力とを組み合わせることによって、全般的な細胞傷害活性および細胞毒の標的特異性が促進される。このターゲッティングにより、このサイトトキシンは、副作用の低下を示し、この抗体は、治療濃度域のさらなる改善を示す。
【００５２】
サイトトキシンは、抗CD99抗体とサイトトキシンとの安定な結合によって該抗体に連結されることができる。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンまたはペプチド(切断可能)またはチオエーテル(切断不可能)を含む化学モチーフに基づくことができ、これは標的細胞への細胞毒の分布および送達を調節する。切断可能および切断不可能なタイプのリンカーは、前臨床試験および臨床試験において安全であることが証明されている。例えば、ブレンツキシマブベドチンは、ヒト特異的CD30陽性悪性細胞に対する合成抗新生物剤である強力で毒性の高い微小管阻害薬モノメチルオーリスタチンE（MMAE）を送達するための酵素感受性で切断可能なリンカーを含む。チューブリンの重合を阻害することによって細胞分裂を阻害するその高い毒性のために、MMAEは、単剤の化学療法薬としては用いることができない。抗CD30モノクローナル抗体に結合したMMAEの組み合わせは細胞外液中で安定であり、in vivoでカテプシンによって切断可能であり、したがって治療に安全である。トラスツズマブエムタンシンは、認可された他のADCであり、安定で切断不可能なリンカーによって結合された微小管形成阻害薬メルタンシン(DM-1)（メイタンシンの誘導体）と抗体トラスツズマブ(ハーセプチン（登録商標）/Genentech/Roche社)との組み合わせである。
リンカーのタイプは、切断可能であれ切断不可能であれ、そのサイトトキシンに特定の特性を付与する。例えば、切断不可能なリンカーは細胞内に薬物を保持する。その結果、全抗体、リンカーおよびサイトトキシンは標的細胞に侵入することができ、そこでその抗体はその構成アミノ酸に分解される。得られたアミノ酸、リンカーおよびサイトトキシンは、それによって活性化される。対照的に、切断可能なリンカーはin vivoで酵素的に切断されてサイトトキシンを放出する。このサイトトキシンは、標的細胞から出て、隣接細胞を殺傷することができる。
【００５３】
AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現されたCD99の抗CD99媒介性凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングの検出
特定の側面において、本開示は、AMLおよび／またはMDS細胞の表面に発現されたCD99の抗CD99媒介性凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングを検出するイメージング法を提供する。
例えば、免疫蛍光法は、細胞表面のCD99を検出し場所を特定するための使用に適合させることができる。AMLまたはMDS細胞を抗CD99モノクローナル抗体とともに3〜6時間インキュベートし、次いでパラホルムアルデヒドで固定し、そのアイソタイプよる抗CD99抗体の定常ドメインに結合する蛍光色素で標識された二次抗体を添加する。次いで、細胞をスライドにのせ、共焦点顕微鏡検査または広視野顕微鏡検査によって像を得る。この技術を用いて、種々の抗CD99抗体の添加による凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングについて、細胞表面のCD99分子を評価することができる。
抗体結合CD99の抗CD99媒介性凝集、クラスタリングおよび／またはキャッピングの検出での使用に適合させることができる他の方法も当該技術分野で容易に入手でき、例えばフローサイトメトリー法は、抗体が結合したCD99の共焦点型イメージングに使用することができる。例えば、Amnis社(シアトル、ワシントン州)は、同時に明視野、暗視野を生む12の標準検出チャネルと個々の細胞の蛍光画像の10チャネルを含む高性能システム(FlowSight（登録商標）)を提供している。
【００５４】
CD99の発現増加を示すAMLおよび／またはMDS細胞の抗CD99媒介性細胞傷害およびアポトーシスの検出
他の側面において、本開示は、抗CD99媒介性アポトーシスAMLおよび／またはMDS細胞を検出することによる、AMLおよび／またはMDS細胞における抗CD99抗体の細胞傷害を評価する方法を提供する。例として、in vitroで、AMLもしくはMDS細胞株または初代患者試料に対する抗CD99抗体の細胞傷害を試験するために、無血清培地(初代患者試料用)または補体を不活性化した血清を含む培地中で抗CD99抗体とともに細胞をインキュベートすることができる。初代患者試料用には、幹細胞因子、トロンボポエチン、IL-3およびIL-6を含むサイトカインを培地に補充することができる。抗体量は、100ng/ml〜20μg/mlの範囲で滴定することができる。72時間後、生存細胞の絶対数は、生存率排除色素としてトリパンブルーを用いる血球計での手による細胞計数か、または生存率排除色素としてヨウ化プロピジウムまたはDAPIを用いる単一ビーズ増強（single bead-enhanced)細胞蛍光測定法(Montes et al., J. Immunol. Methods 317:45 (2006))によって数えることができる。
【００５５】
in vitroアポトーシスを評価するために、より短い時間的経過(8〜24時間)を除いて、前述と同様な実験条件を用いることができる。この時間枠の間、抗CD99抗体によるアポトーシスの誘導は、フローサイトメトリーによって評価する場合、アネキシンV/7-AAD染色によって評価することができるが、アネキシンV+7-AAD-細胞は初期アポトーシス細胞であり、アネキシンV+7-AAD+細胞は後期アポトーシス細胞である。アポトーシス細胞はまた、細胞の固定および透過処理と、それに続く、活性化カスパーゼ3を検出する蛍光色素標識抗体を用いる細胞内標識によって検出することもできる。
【００５６】
抗CD99抗体を含む組成物および製剤
本開示は、CD99遺伝子発現レベルの上昇に関連するAMLおよび／またはMDSの治療のための1以上の抗CD99抗体を含む治療用組成物を含む組成物を提供する。1以上の抗CD99抗体は、本明細書に記載のAMLおよび／またはMDSを治療または緩和するための用量で各抗体が適切な担体または賦形剤と混合された医薬組成物としてヒト患者に投与されることができる。医薬組成物として、抗CD99抗体の混合物もまた患者に投与することができる。
本開示の範囲の組成物は、治療薬が、(1)AMLおよび／またはMDSに関連する、細胞表面に提示されたCD99の細胞外ドメインにライゲーションし、(2)AMLおよび／またはMDS細胞上のライゲーションしたCD99のクラスタリングおよび凝集を媒介し、(3)例えば、抗体がライゲーションした細胞のアポトーシスを誘導することによって、AMLおよび／またはMDS細胞上の抗体がライゲーションしたCD99の細胞傷害を促進する、のに有効な量の抗CD99抗体である組成物を含む。
各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の技術の範囲内である。有効量は、用いられる特定の抗CD99抗体だけでなく、患者の年齢および臨床状態を含むいくつかの要素の関数である。投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用治療の種類（もしあれば）、治療の頻度ならびに所望される効果の性質によって決まる。
【００５７】
抗CD99抗体を含む組成物は、非経口投与されることができる。本明細書において、用語"非経口投与"とは、通例は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与方法をいい、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、髄腔内および胸骨内の注射および注入を含む。
抗CD99抗体を含む組成物は、例えば、静脈内プッシュまたはボーラスによって静脈内に投与することができる。あるいは、抗CD99抗体を含む組成物は、静脈内注入によって投与することができる。
抗CD99抗体を含む組成物の静脈内注入のための適切な用量は、少なくとも約2mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約10mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約20mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約50mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約100mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約200mg抗CD99抗体/m2/日または少なくとも約500mg抗CD99抗体/m2/日の用量を含む。
【００５８】
1以上の抗CD99抗体を含む組成物は、例えば、AMLおよび／またはMDSの治療のための化学療法化合物などの1以上の追加の化合物をさらに含むことができる。例えば、AMLの導入化学療法は、シタラビン(ara-C)および、ダウノルビシンまたはイダルビシンなどのアントラサイクリンを含むことができる。シタラビンは、連続で7日間、連続静脈内注入で投与することができるが、アントラサイクリンは、一般に、IVプッシュとして3日間連続で投与される。AMLサブタイプである急性前骨髄球性白血病は、多くの場合、アントラサイクリンおよび／または三酸化ヒ素との併用でオールトランスレチノイン酸(ATRA)を用いて治療される。本開示の組成物はまた、ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ)に類似した細胞毒に架橋された抗CD99抗体イムノコンジュゲートを含むこともできる。
MDSについては、1以上の抗CD99抗体は、造血因子(エリスロポエチンなど)または、特に、染色体5qが欠失したMDSのサブタイプだけでなく、MDSの他の低リスクサブタイプの患者において赤血球輸血必要性を減じるのに有効である、MDSの治療のために米国食品医薬品局(FDA)に承認されている3つの薬剤（5-アザシチジン、デシタビン(単独で、あるいはバルプロ酸と組み合わせて)およびレナリドミド）の1つを組み合わせて用いることができる。
【００５９】
抗CD99抗体を含む組成物は、一般に、治療的有効量の抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において、用語"薬学的に許容される"は、動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用が、連邦政府または州政府の監督官庁に承認されているか、または、米国薬局方もしくは他の一般に知られている薬局方に記載されていることを意味する。用語"担体"とは、それとともに治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのことをいう。このような医薬担体は、水および、石油、動物、野菜または合成起源のオイル、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含むオイルなどの滅菌液であることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、液体担体、特に注射液として用いることもできる。適切な医薬品賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸エステル、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝化剤を含むこともできる。
これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、粉末剤などの形態をとることができる。これらの組成物は、トリグリセリドなどの従来のバインダーおよび担体を用いて座剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。このような組成物は、患者への投与に適した形態を提供するために、適切な量の担体とともに抗CD99抗体、好ましくは精製物としての抗CD99抗体の治療的有効量を含む。該製剤は、投与方法に適していなければならない。
【００６０】
組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合された医薬組成物として、常法に従って製剤化することができる。一般的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液または他の生理学的に許容される緩衝液の溶液である。必要ならば、該組成物はまた、可溶化剤および、注射部位の痛みを軽減するためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般に、該成分は、例えば、活性薬の量が表示されているアンプルまたはサシェなどの密封容器中に凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として別々にまたは混合されて単位剤形で供給される。該組成物が注入によって投与される場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルにそれを分注することができる。該組成物が注射によって投与される場合、該成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本明細書に開示された抗CD99抗体は、中性形または塩形で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンで形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンで形成される塩を含む。
【００６１】
本開示の抗CD99抗体の多くは、薬学的に適合する対イオンによる塩(すなわち薬学的に許容される塩)で提供することができる。"薬学的に許容される塩"とは、レシピエントへの投与時に、直接的または間接的に本開示の抗体または組成物を提供することができる任意の無毒の塩を意味する。
"薬学的に許容される対イオン"とは、被験者への投与時に塩から放出されるとき無毒である塩のイオン部分である。薬学的に適合する塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸およびコハク酸を含むがこれに限定されない多くの酸によって形成されることができる。塩は、それらの対応する遊離塩基型よりも水または他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向がある。本開示の組成物はこのような塩を含むことができる。
本開示に記載の組成物は、公知の方法に従って、例えば自家骨髄のCD99+腫瘍細胞(およびCD99+腫瘍幹細胞)を除去するためにex vivoで用いることができる。例えば、Robertson et al., 79:2229-2236 (1992)を参照のこと。
【００６２】
AMLおよびMDS細胞におけるCD99発現の上昇を検出する方法
本開示は、抗体およびその組成物だけでなく、上昇したCD99細胞表面発現を示すAMLおよび／またはMDSの組織または細胞に対して細胞傷害促進活性および／またはアポトーシス誘導活性を示す1以上の抗体または抗体組成物を用いる方法を提供する。従って、本開示は、AMLおよび／またはMDSの組織または細胞の表面に露出されるCD99タンパク質分子の相対数だけでなく、CD99遺伝子転写の相対活性およびCD99転写産物レベルを含む、CD99遺伝子発現の程度の定量にも基づくCD99発現の上昇を評価する方法を提供する。CD99発現の上昇を評価する例示的な方法が、本セクションに提示されている。
【００６３】
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【００６４】
CD99遺伝子発現の上昇を示すAMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞を同定するために、AMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞ならびに非AMLおよび／またはMDS対照の組織試料または細胞からmRNAを単離することができ、所定のmRNAの発現レベルを測定することができ、AMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞ならびに非AMLおよび／またはMDS対照の組織試料または細胞について測定されたmRNAレベルを比較することによって、遺伝子発現の上昇の評価を行うことができる。
あるいは、CD99遺伝子発現の上昇を示すAMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞は、AMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞からmRNAを単離し、CD99 mRNAおよび対照mRNAのレベルを測定し、白血病組織試料または細胞内のCD99 mRNAレベルと対照mRNAレベルとを比較することによって遺伝子発現の上昇を評価して、mRNA発現の比を決定することによって同定することができ、対照mRNAレベルに対するCD99 mRNAレベルの比の上昇は、CD99遺伝子発現レベルの上昇を示す。この文脈において用いられるとき、対照mRNAとは、AMLおよび／またはMDSの組織または細胞における発現レベルの上昇を示さない遺伝子からのmRNAのことをいう。適切な対照mRNAは、例えば、β-アクチン、GAPDHおよびシクロフィリンを含む。
【００６５】
適切なAMLおよび／またはMDS組織試料は、例えば、AMLおよび／またはMDS患者からの血液、リンパ節、骨髄および／または腫瘍生検試料を含む。適切な非AMLおよび／またはMDS対照組織試料は、例えば、無病健常ドナーなどの非AMLおよび／またはMDSドナーからの血液、リンパ節および／または骨髄試料を含む。非AMLおよび／またはMDSドナーからのこのような血液、リンパ節および／または骨髄試料は、一般的にはCD34+細胞を含む。ドナーの組織試料または細胞の正確な性質または起源にかかわらず、そのドナーの組織または細胞が、CD99遺伝子発現の増加を示さないことが知られていることが本質的であることは理解されよう。
適切なAMLおよび／またはMDS細胞は、例えば骨髄系前駆細胞を含む。適切な非AMLおよび／またはMDS対照細胞、特に非AMLおよび／またはMDS CD34+対照細胞は、例えば非AMLおよび／またはMDSドナー（無病健常ドナーなど）からの骨髄系前駆細胞あるいは、例えばKasumi-1細胞株を含むCD34+細胞株などの1以上の細胞株を含む。その起源または同一性にかかわらず、適切な非AMLおよび／またはMDS対照の組織試料または細胞は、CD99遺伝子レベルの上昇を示さないことを特徴とすることは理解されるであろう。
【００６６】
AML細胞株
試験されたほぼすべてのAML細胞株は抗CD99 mAbに感受性を示した。いくつかの実施形態において、1以上のAML細胞株が本開示の方法に用いられるが、前記1以上の細胞株は、Kg1a、SET2、Meg1a、THP-1、NB4、AML14、KBM5、AML5Q、KCL22、MOLM14、HL60、K562、U937、KU812、MOLM13、MonomacおよびNOMO1からなる群から選択される。
図10Aは、抗CD99抗体12E7との48時間のインキュベーション後の細胞増殖抑制を試験した15株のAML細胞株についての相対細胞数を示す棒グラフである。試験した15株のAML細胞株のうちの11株、AML5Q、NB4、KCL22、MOLM13、HL60、MOLM14、NOMO1、U937、MonoMac1、KG1aおよびAML14は、12E7抗体とのCD99ライゲーション後の増殖抑制に感受性を示すことが見いだされた。試験した4株の細胞株、KBM5、SET2、KU812およびK562は、12E7抗体とのCD99ライゲーションに非感受性であることが特徴づけられた。
【００６７】
図10Bは、AML細胞株であるHL60、K562、KBM5、SET2およびKU812細胞におけるc-kitおよびCD99の相対的発現を示すフローサイトメトリープロット(上部パネル)ならびにIgG1κまたは抗CD9912E7抗体との48時間のインキュベーション後の相対細胞数を示す棒グラフ(下部パネル)を示す。HL60は、CD99の高発現およびc-kitの低発現を示す典型的な“感受性”細胞株である。CD99を発現しない(K562およびKBM5)か、または高レベルのc-kitを発現する(SEM2およびKU812)“抵抗性”細胞株は、Bcr-abl陽性(K562/KBM5/KU812)であるか、またはJAK2陽性(SEM2)である。CD99の低発現またはc-kitの高発現が、抗CD99抗体12E7に媒介される細胞傷害に抵抗性であることが予測されることをこれらのデータは示している。
図10Cは、抗CD99抗体12E7、HEC2、DN16およびH036の存在下でのCD99+AML細胞の経内皮遊走動態のグラフである。このグラフは、二次抗体の非存在下では、CD99によって媒介されることが知られているAML細胞の経内皮遊走を特定の抗CD99抗体が抑制しないことを示している。
別の実験において、17株のAML細胞株を抗CD99 mAb H036-1.1に暴露した。17株のAML細胞株すべてが、抗CD99モノクローナル抗体H036-1.1に反応を示し、その大部分(11/17)について、試験した用量で反応は完全であった。抗体暴露後の細胞数の減少は、表2Bに示すように、2.74倍〜370.5倍の範囲であった。
【００６８】
表2B    抗CD99 mAb H036-1.1に感受性のあるAML 細胞株
2018511311.tif 000008
【００６９】
本実験において、試験した17株の AML 細胞株（Kg1a、SET2、Meg1a、THP-1、NB4、AML14、KBM5、AML5Q、KCL22、MOLM14、HL60、K562、U937、KU812、MOLM13、MonomacおよびNOMO1）は、すべて、抗CD99H036-1.1抗体(Abcam社)とのCD99ライゲーション後の増殖抑制に感受性を示すことが見いだされた。試験した4株の細胞株（Kg1a、SET2、KCL22およびK562）は、H036-1.1抗体とのCD99ライゲーションによる増殖抑制にある程度感受性のあることが見いだされた。
次に、CD99遺伝子の発現増加の検出に容易に適合させることができる遺伝子発現レベルの定量方法をさらに詳細に説明する。
【００７０】
マイクロアレイ解析
CD99遺伝子発現の上昇は、AMLおよび／またはMDSの患者および／または対照ドナーの組織試料または細胞から単離されたRNAのマイクロアレイ解析によって検出し、定量することができる。しかしながら、その感度に限界があることから、マイクロアレイ法は、低存在量遺伝子の絶対的な組織分布を正確に測定することはできないし、また信号飽和により、CD99遺伝子発現の上昇の程度を過小評価する恐れもある。マイクロアレイ発現プロファイリングによってCD99発現の上昇を示す細胞については、感受性のより大きなダイナミックレンジを提供する、例えば、Taqman（登録商標）プローブ検出(Invitrogen Life Sciences社、カールズバッド、カリフォルニア州)に基づくRT-PCRなどの1以上の定量的PCR法を用いてさらなる解析を行うことができる。
簡潔に言えば、マイクロアレイ解析は、発現が検出および／または定量されるCD99遺伝子内のコード配列および／または非CD99遺伝子内のコード配列にハイブリダイズするプライマー対による、AMLおよび／またはMDS患者または対照ドナーの組織試料または細胞から抽出されたRNAのPCR増幅を含む。PCR産物はアレイフォーマットスライド上に点在し、各PCR産物は、アレイにおける特定の位置を占める。次いでRNAが逆転写され、蛍光標識cDNAプローブが作製される。マイクロアレイは蛍光標識cDNAプローブでプローブされ、スライドがスキャンされ、蛍光強度が測定される。蛍光強度のレベルは、ハイブリダイゼーション強度と相関し、これは遺伝子発現の相対レベルと相関する。
【００７１】
CD99遺伝子発現の解析は、市販のマイクロアレイ(例えばU133Aチップ;Affymetrix社、サンタクララ、カリフォルニア州)またはカスタムマイクロアレイを用いて行うことができる。あるいは、CD99遺伝子発現の上昇は、製造業者の使用説明書に従って、Synteniマイクロアレイ(Palo Alto社、カリフォルニア州)を用い、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10614-10619 (1996)およびHeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:2150-2155 (1997) に記載されているようにして検出することができる。マイクロアレイハイブリダイゼーションは、Abraham et al., Blood 105:794-803 (2005)に記載されている方法に従って行うことができる。
プローブレベルデータは、市販のアルゴリズム(例えばAffymetrix社マイクロアレイスイート5.0アルゴリズム)またはカスタムアルゴリズムを用いて正規化されることができる。CD99遺伝子発現強度値および非CD99遺伝子発現強度値は、市販のプログラム(例えば、GeneSpring 7.3.1 GX; Agilent Technologies社、サンタクララ、カリフォルニア州)またはカスタムアルゴリズムを用いて、log変換し、中心を中央値に置きおよび／または解析することができる。
【００７２】
CD99遺伝子発現解析の質を評価するために、例えばGAPDHの3':5'比およびアクチンの3':5'比などのいくつかの因子を用いることができる。質の低い結果を示す試料は、約1.25を超えるGAPDHの3':5'比を有し、および／または約3.0を超えるアクチンの3':5'比を有すると定義することができる。
CD99遺伝子発現の上昇は、GeneSpring内で利用可能な1からの偏差に基づくクロスジーンエラーモデル(cross-gene error model)を適用することによって計算される分散値を用いるウェルチのANOVAを用いて決定することができる。これによって、個々の試料に関連する反復不足および分散を克服することができ、これは、原理的には分散フィルタリングに類似しているとみなすことができる。教師なしクラスタリングは、階層的凝集型アルゴリズムを用いて行うことができる。ピアソンの相関係数および重心連結は、それぞれ、類似度法および連結法として用いることができる。
生じうる試料間の差異を検出するために、個々の試料間で1.5倍の発現差を有する遺伝子および／またはBenjamini-Hochberg多重検定補正を用いてスチューデントのt検定により0.05の補正P値で統計的に有意な遺伝子をデータセットから抽出することができる。発現量の異なる遺伝子は、遺伝子オントロジー(GO)濃縮について評価することができる(例えばGeneSpringを用いて)。
【００７３】
定量的PCR
AMLおよび／またはMDS組織試料中に存在するAMLおよび／またはMDS細胞の相対数ならびに／または組織試料内の各AMLおよび／またはMDS細胞内のCD99遺伝子発現のレベルなどの因子に基づいて、CD99遺伝子発現のレベルを検出および／または定量する定量的PCR分析を行うのが好ましい場合がある。
例えば、CD99遺伝子mRNAおよび／または非HOXクラスター/非CD99遺伝子mRNAあるいはAMLおよび／またはMDSの組織試料または細胞ならびに／または非AMLおよび／またはMDSの対照ドナーの組織試料または細胞に由来する対応するcDNAの少なくとも一部を増幅するためのPCRベースのアッセイに、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つは、CD99遺伝子によってコードされるmRNAに特異的であり、それにハイブリダイズする。増幅されたcDNAは、場合により、検出前に、例えばゲル電気泳動などの分画工程に供することができる。
RT-PCRは、逆転写と組み合わせてPCR増幅が行われる定量的PCR法である。血液、リンパ節、骨髄および／または腫瘍生検試料などの組織試料または細胞からRNAが抽出され、それがcDNA分子を生成するために逆転写される。少なくとも1つの特異的プライマーPCR増幅によってcDNA分子を増幅し、これを、例えばゲル電気泳動を用いて分離し、可視化することができる。患者および、癌に冒されていない対照から採取した組織試料または細胞について増幅を行うことができる。2桁にわたるcDNAのいくつかの希釈液について増幅反応を行うことができる。非AMLおよび／またはMDS対照ドナー試料の同じ希釈液と比較して、AMLおよび／またはMDS患者試料のいくつかの試験希釈液において、少なくとも約3倍以上、少なくとも約5倍以上、少なくとも約10倍以上、少なくとも約15倍以上、少なくとも約20倍以上または少なくとも約25倍以上の発現の増加は、一般的に陽性とみなされる。
【００７４】
本明細書において、用語"増幅"とは、所期の特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む、標的核酸の複数のコピーの産生のことをいう。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と同義で用いられる。本開示の特定の側面において、増幅される標的は、完全な標的mRNA配列(すなわち、エクソンおよび隣接非翻訳配列のスプライスされた転写産物)および／または標的ゲノム配列(イントロンおよび／またはエクソンを含む)よりも小さい部分を含む。例えば、特定のアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドの内部の位置にハイブリダイズし、そこから重合を開始する増幅プライマーを用いて標的ポリヌクレオチドの一部を増幅することによって調製することができる。増幅される部分は、種々の公知の方法のいずれかを用いて検出することができる検出可能な標的配列を含む。
公知の核酸増幅法の多くは、二本鎖核酸の変性とプライマーのハイブリダイズを交互に行う熱サイクルを必要とする。しかしながら、核酸増幅の他の公知の方法は、等温性である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;米国特許第4,683,195号;第4,683,202号;第4,800,159号;第4,965,188号に記載されている)は、変性、逆鎖へのプライマー対のアニーリングおよび標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長法の複数のサイクルを用いる。RT-PCRと呼ばれる変法において、mRNAから相補的DNA(cDNA)を製造するために逆転写酵素(RT)が用いられ、次いでcDNAがPCRによって増幅されてDNAの複数のコピーを生じる。
【００７５】
CD99遺伝子発現は、さらに特性分析されるか、または定量的リアルタイムPCR法を用いて独自に検出および／または定量することができる。Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996)およびHeid et al., Genome Research 6:986-994 (1996)。リアルタイムPCRは、増幅の過程においてPCR産物の蓄積レベルを評価するための技術である。この技術は、複数の試料におけるmRNAレベルの定量的評価を可能にする。この方法によって、AMLおよび／またはMDSの組織試料または細胞を、対応する非AMLおよび／またはMDSの対照ドナー試料または細胞ならびに／または類縁性のない正常非AMLおよび／またはMDSの組織試料または細胞のパネルと共に試験することができる。
リアルタイムPCRは、例えば、ABI 7700 PrismまたはGeneAmp（登録商標）5700配列検出システム(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)のいずれかによって行うことができる。7700システムは、一方の末端に5'蛍光性レポーター色素を有し、他方の末端に3'クエンチャー色素を有する特異的プローブ(Taqman（登録商標）)と組み合わせてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いる。5'-3'ヌクレアーゼ活性を有するTaq DNAポリメラーゼを用いてリアルタイムPCRを行うとき、プローブが切断されて蛍光を発し始めるため、蛍光の増加によって反応をモニターすることが可能となる(リアルタイム)。5700システムは、二本鎖DNAにのみ結合する蛍光色素であるSYBR（登録商標）greenと、7700装置と同じフォワードプライマーおよびリバースプライマーとを用いる、プライマー発現プログラム(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)に従って、マッチングプライマーおよび蛍光性プローブを設計することができる。プライマーおよびプローブの最適濃度は、最初に当業者によって決定される。対照(例えばβ-アクチン特異的)プライマーおよびプローブは、例えば、Perkin Elmer/Applied Biosystems社(フォスターシティ、カリフォルニア州)から商業的に入手することができる。
【００７６】
試料中のCD99遺伝子発現の量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドを用いて検量線を作成する。検量線は、アッセイに用いる初期cDNA濃度に関連する、リアルタイムPCRで測定されるCt値を用いて作成される。10〜106コピーの目的の遺伝子の範囲の標準希釈液であれば、一般に十分である。加えて、対照試料配列に対して検量線が作成される。これによって、比較目的の対照の組織試料または細胞の量に、AMLおよび／またはMDSの組織試料または細胞の初期RNA含有量を標準化することが可能である。
本明細書に記載されるように、Trizol試薬を用いて、AMLおよび／またはMDSの組織試料または細胞ならびに非AMLおよび／またはMDS対照の組織試料または細胞から全RNAを抽出することができる。第1鎖合成は、全RNA1〜2μgを用い、42℃で1時間、SuperScript II逆転写酵素(Life Technologies社、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いることによって実施することができる。次いで、表2Aに提示したCD99 mRNAもしくは他の配列に基づいて設計されるCD99遺伝子特異的プライマーまたは当業者に容易に入手できる他の公知のCD99遺伝子特異的プライマーを用いるPCRによってcDNAを増幅することができる。
【００７７】
RT-PCRの定量性を確保するために、検査されるAMLおよび／またはMDS患者ならびに非AMLおよび／またはMDS対照ドナーの組織試料および／または細胞のそれぞれに対する内部対照として、β-アクチンなどのハウスキーピング遺伝子を用いることができる。第1鎖cDNAの連続希釈液を調製し、β-アクチン特異的プライマーを用いてRT-PCRアッセイを行う。次いで、β-アクチン鋳型の直線範囲増幅を可能にし、初期コピー数の違いを十分に反映する感度を示す希釈液が選択される。これらの条件を用いて、各組織に由来する逆転写反応について、β-アクチンレベルが測定される。DNA汚染は、DNアーゼ処理によって、そして、逆転写酵素を添加せずに調製した第1鎖cDNAを用いる陰性PCR結果を確かめることによって最小限にされる。
Dynabeads mRNA direct microkit (Invitrogen, Life Sciences Technologies社、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いる例示的なRT-PCR反応において、H2O14.25μl;BSA1.5μl;第1鎖緩衝液6μl;10mM dNTPミックス0.75mL;Rnasin3μl;0.1M dTT3μl;およびSuperscript II1.5μlを含む30μlの総反応容量中で、105以下の細胞を含む試料を試験する。得られた溶液を42℃で1時間インキュベートし、H2Oで1:5に希釈し、80℃で2分間加熱して、ビーズからcDNAを分離し、直ちにMPS上に置く。cDNAを含む上清を新しいチューブに移し、-20℃で保存する。
【００７８】
RNA配列決定
CD99遺伝子の発現増加は、AMLおよび／またはMDS患者の組織試料または細胞ならびに／または非AMLおよび／またはMDSドナー対照の組織試料または細胞におけるmRNAの直接配列決定によって測定することができる。あるいは、CD99遺伝子の発現増加は、逆転写によるmRNAのcDNAへの変換後に測定することができる。
True Single Molecule Sequencing(tSMS（登録商標）)および／またはDirect RNA Sequencing(DRS（登録商標）)は、CD99遺伝子の発現を検出し定量するのに容易に適合させることができる、遺伝子発現を定量するための有用な技術である。これらの合成による配列決定技術は、事前の逆転写またはPCR増幅を必要とすることなく組織試料または細胞由来のmRNAに実施することができる。
直接RNA配列決定技術(Helicos BioSciences Corporation社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)および単分子直接RNA配列決定を用いるトランスクリプトームプロファイリングは、Ozsolak et al., Nature 461(7265):814-818 (2009)およびOzsolak and Milos, Methods Mol Biol 733:51-61 (2011)に記載されている。True Single Molecule SequencingおよびDirect RNA Sequencingの技術は、さらに、米国特許公開第2008/0081330号、第2009/0163366号、第2008/0213770号、第2010/0184045号、第2010/0173363号、第2010/0227321号、第2008/0213770号および第2008/0103058号ならびに米国特許第7,666,593号;第7,767,400号;第7,501,245号;および第7,593,109号に記載されており、それらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
mRNAによってコードされるa CD99遺伝子は、CD99 mRNA配列（例えば、表2Aに提示した排列または他に公知であり当業者が容易に入手可能である配列）に基づいて設計される特異的配列決定プライマーを用い、True Single MoleculeおよびDirect RNA Sequencingの技術を用いることによって、直接的に配列決定することができる。
AMLおよび／またはMDSに関連するCD99+細胞の増殖および／または生存を阻害する方法ならびにCD99+発現の上昇を示すAMLおよびまたはMDSに冒されている患者を治療する方法
本開示は、さらに、AMLおよび／またはMDSがCD99の発現増加を示すAMLおよび／またはMDSを治療するための、ヒト患者に対する1以上の抗CD99抗体を含む組成物を投与することを含む治療法を提供する。
CD99発現の上昇を特徴とするAMLおよび／またはMDSの治療に有効な抗CD99抗体の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。場合により、最適の投与量範囲を特定するのに役立つin vitroアッセイを用いることができる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路および、疾患または障害の重篤度に左右される。有効量は、in vitroまたは動物モデル試験系で導かれる用量反応曲線から外挿することができる。
【００８０】
本発明の化合物または医薬組成物は、ヒトに使用する前に、所望の治療または予防効果について、in vitroで試験し、次いでin vivoで試験することができる。例えば、化合物または医薬組成物の治療または予防効果を明らかにするためのin vitroアッセイは、細胞株または患者組織試料に対する化合物の効果を含む。細胞株および／または組織試料に対する化合物または組成物の効果は、限定するものではないが、増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイを含む、当業者に公知の技術を用いて決定することができる。本開示によれば、特定の化合物の投与が必要とされるかどうかを決定するために用いることができるin vitroアッセイは、患者組織試料が培養下で増殖され、化合物に暴露するかまたは他の方法で化合物が投与され、組織試料に対する前記化合物の効果が観察されるin vitro細胞培養アッセイを含む。
【００８１】
本開示は、本明細書に記載されるように、被験者に抗CD99抗体または医薬組成物の有効量を投与することによる治療法および抑制法を提供する。一側面において、化合物は、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を引き起こす物質をその化合物が実質的に含まないように実質的に精製される。
1以上の抗CD99抗体を用いる治療法および抑制法は、例えば、さらに、AMLおよび／またはMDSの治療のための化学療法化合物などの1以上のさらなる化合物の投与を含むことができる。AMLのための導入化学療法は、シタラビン(ara-C)および、ダウノルビシンなどのアントラサイクリンもまた含むことができる。シタラビンは、連続で7日間、連続静脈内注入で投与することができるが、アントラサイクリンは、一般に、IVプッシュとして3日間連続で投与される。AMLサブタイプである急性前骨髄球性白血病は、多くの場合、アントラサイクリンおよび／または三酸化ヒ素との併用でオールトランスレチノイン酸(ATRA)を用いて治療される。
再発のリスクが高い患者(例えば、ハイリスク細胞遺伝学、MDSの前歴または治療関連MDS/AMLを有する患者）の場合は、その患者が移植片に耐えられ、適切なドナーを有する場合、通例、同種幹細胞移植が推奨される。予後良好な白血病(すなわちinv(16)、t(8;21)およびt(15;17))については、患者は、一般的には、地固め化学療法として知られる強化化学療法をさらに3〜4コース行う。再発AML患者には、移植前の細胞減少または移植後の予防として抗CD99抗体が、造血幹細胞移植片と併用投与されることができる。
【００８２】
種々のデリバリーシステム、例えばリポソームへのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、受容体介在性エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照のこと)などが公知であり、本開示の組成物を投与するために用いることができる。これらは当業者に公知であろう。
投与方法は、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含む。抗CD99抗体または組成物は、任意の都合のよい経路、例えば注入もしくはボーラス注射によって、または上皮もしくは皮膚粘膜被覆細胞(例えば、口腔粘膜、直腸内および腸粘膜など)からの吸収によって投与することができ、これらは、他の生物活性剤とともに投与することができる。投与は、全身または局所に行うことができる。さらに、脳室内および髄腔内注入を含む任意の適切な経路によって、抗CD99抗体または組成物を中枢神経系に導入することが好ましい場合がある。脳室内注射は、例えば、オンマヤリザーバーなどのリザーバーに装着された脳室内カテーテルによって支援されることができる。経肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブライザーおよびエアゾール噴霧剤を含む製剤の使用により行うことができる。
治療を必要とする部位に局所的に抗CD99抗体または組成物を投与することが好ましい場合がある。これは、例えば、外科手術中の局所注入、注射、カテーテル、座剤またはインプラントによる局所投与によって達成することができ、前記インプラントは、膜、シアラスティック膜または繊維などを含む多孔質、非多孔質またはゼラチン様物質からなる。
【００８３】
抗CD99抗体は、リポソーム(Langer, Science 249:1527-1533 (1990))などの小胞または徐放性システムで送達することができる。徐放性システムは、治療標的の近くに配置することができ、従って、全身投与量の一部のみを必要とする(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照のこと)。
抗CD99抗体を含む組成物の静脈内注入は、少なくとも約1日間、または少なくとも約3日間、または少なくとも約7日間、または少なくとも約14日間、または少なくとも約21日間、または少なくとも約28日間、または少なくとも約42日間、または少なくとも約56日間、または少なくとも約84日間、または少なくとも約112日間の期間継続することができる。
抗CD99抗体を含む組成物の持続静脈内注入は、特定の期間継続し、それに続いて別の期間の休止期を設けることができる。例えば、持続注入期間は、約1日間から約7日間、約14日間、約21日間、約28日間、約42日間、約56日間、約84日間または約112日間であり得る。持続注入は、それに続いて、約1日間から約2日間、約3日間、約7日間、約14日間または約28日間の休止期間を設けることができる。次いで、上記のような持続注入を繰り返えし、それに続いて別の休止期間を設けらることができる。
採用される正確な持続注入プロトコルにかかわらず、抗CD99抗体を含む組成物の持続注入は、所望の有効性が達成されるか、または許容できないレベルの毒性が顕在化するまで継続されることは理解されるであろう。
【００８４】
本開示の一部の側面において、AMLおよび／またはMDSに関連するCD99+細胞の増殖および／または生存を抑制する方法ならびにCD99+発現の上昇を示すAMLおよび／またはMDSに冒されている患者を治療する方法は、さらに、AMLおよび／またはMDS細胞ならびに関連造血幹細胞および／または白血病幹細胞の骨髄から末梢血への動員をそれぞれ促進する化合物で細胞を処理するか、またはそれを患者に投与することを含むことができる。このような動員を達成するための例示的な薬剤については当該技術分野で記載があり、G-CSF(Pabst et al., Blood 119(23):5367-5373 (2012))および Plerixafor(Uy et al., Blood 119(17):3917-3924 (2012)を含む。
【００８５】
当然のことながら、特記しない限り、用語は"オープン(open)"であるものとする（例えば、用語"含む(including)"は、"〜を含むがこれに限定されない"と解釈されるべきであるし、用語"有する(having)"は、"少なくとも〜を有する"と解釈されるべきであるし、用語"含む(includes)"は、"限定するものではないが〜を含む"と解釈されるべきである）。"少なくとも1つの"および"1以上の"などの語句ならびに"1つの（a）"または"1つの（an）"などの用語は、単数形および複数形の両方を含む。
さらに、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群によって記載される場合、その開示は、そのマーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されるものとすることもまた理解されるであろう。同様に、本明細書に開示された範囲のすべては、すべての可能な部分範囲および部分範囲の組み合わせもまた含み、たとえば、"〜の間"、"〜まで"、"少なくとも〜"、"〜超"、"〜未満"などの用語は、その範囲に記載された数を含み、かつ個々のメンバーも含む。
上記下記にかかわらず、限定するものではないが、米国、PCT、非米国であるかどうかにかかわらず、特許、特許出願、および特許公開ならびにすべての技術および／または科学出版物を含む本明細書に引用したすべての参考文献は、すべて参照により本願に組み込まれる。
【００８６】
種々の実施形態を本明細書に開示してきたが、当業者には他の実施形態が明らかであろう。本明細書に開示された種々の実施形態は、例示のためのものであって、限定するものではなく、真の範囲および趣旨は、特許請求の範囲によって示される。
限定するものではない以下の実施例を参照して、本開示をさらに説明する。本明細書で引用されたすべての特許、特許出願およびすべての他の刊行物の教示は、すべて、参照により本願に組み込まれる。
以下の実験で用いた抗体は、すべて市販されている（例えばAbcam社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州から）。
【実施例１】
【００８７】
抗CD9912E7抗体は、CD99+MDS細胞株、MDS初代細胞、AML細胞株および初代AML芽球に対して細胞傷害性を示し、それらにおけるアポトーシスを誘導する
本実施例では、CD99を発現しているMDS細胞株、MDS初代細胞、AML細胞株および初代AML芽球上のCD99の抗CD99抗体12E7媒介性ライゲーションが、これらの細胞に細胞傷害性を示し、これらの細胞におけるアポトーシスを誘導することを明らかにする。そのうえ、抗体のエフェクター機能の非存在下でCD99のライゲーションによる細胞傷害が生じる。したがって、12E7媒介性細胞傷害およびアポトーシスは、補体依存性細胞傷害(CDC)および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)に無関係である。
【００８８】
MDS細胞株MDS92(Tohyama et al., Br. J. Haematol. 91:795 (1995))上のCD99と、12E7と呼ばれる抗CD99抗体(Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:6552 (1979))20μg/mlとのライゲーションは、20μg/mlのアイソタイプコントロール抗体の存在下でのMDS92細胞数と比較して、72時間後でのMDS92細胞数(p<0.001)が128倍減少することによって証明されるように、これらのMDS92細胞に対する細胞傷害性を示す（図1A）。AAD対アネキシンVの蛍光値の解析によって、エフェクター非依存性アポトーシスが明らかになった（20μg/mlのアイソタイプコントロール抗体の存在下、72時間後においてMDS92細胞のアポトーシスが認められなかったことと比較して、10μg/mlの12E7とCD99とのライゲーション後72時間において、MDS92細胞のアネキシンV陽性(p<0.001)が77%増加したことによって証明された）（図1B）。
CD99+MDS92細胞に対する12E7媒介性細胞傷害は、アイソタイプコントロール抗体の存在下でのMDS92細胞数と比較して、抗CD99抗体12E7とCD99とのライゲーション後22時間におけるMDS92細胞数の時間に依存した128倍の減少(p<0.001)によってさらに確認された（図2A)。MDS92細胞上でのCD99の細胞表面発現は、抗CD99抗体12E7とCD99とのライゲーション後に時間に依存して減少を示した（図2B）。骨髄系分化マーカーCD11bおよびCD14の細胞表面発現は、抗CD99抗体12EとCD99とのライゲーション後に時間に依存して減少を示した（図2C）。
【００８９】
48時間後における抗体対照なしに対する細胞数の10倍の減少およびアイソタイプ(IgG)対照抗体に対する細胞数の8倍の減少によって証明されたように、初代CD34+MDS細胞上のCD99と12E7抗CD99抗体とのライゲーションは初代MDS細胞に対する細胞傷害性を示す（図3）。
HL60およびMOLM13などの、高レベルのCD99を発現しているAML細胞株上のCD99と12E7抗CD99抗体とのライゲーションは、72時間後におけるアイソタイプコントロール抗体に対する細胞数の49倍の減少(HL60;p<0.001)および70倍の減少(MOLM13;p<0.001)によって証明されるように、AML細胞株に対する細胞傷害性を示す（図4A）。アイソタイプ対照と比較して、CD99は、MOLM13およびHL60細胞上に高レベルで発現している。
48時間後における細胞数の57倍の減少(p<0.001)によって証明されるように、CD99を発現している初代AML1520芽球細胞上のCD99と12E7抗CD99抗体とのライゲーションは、初代AML芽球細胞に対する細胞傷害性を示す（図5A）。48時間後における細胞数の48倍の減少(p<0.001)によって証明されるように、CD99を発現している初代AML890芽球細胞上のCD99と12E7抗CD99抗体とのライゲーションは、初代AML芽球細胞に対する細胞傷害性を示す（図5B）。80時間後におけるHSC細胞数の1.4倍の減少によって証明されるように、12E7抗CD99抗体は正常脊髄血液HSCに対するわずかな細胞傷害を示すに過ぎない（図5C）。このことは、抗CD99が実質的な治療濃度域(therapeutic window)を有していることを示している。
【実施例２】
【００９０】
高度に精製した系統マーカー陰性[Lin-]CD38+CD34-CD90+CD45RA-造血幹細胞の比較トランスクリプトーム解析
本実施例は、CD99が、MDSおよびAMLにおける疾患開始幹細胞上に発現されていることを明らかにする。AMLにおいて、LSCは自己複製を行い、疾患細胞の大部分を含む自己複製しない子孫に分化する能力を有することが明らかにされているが(Lapidot et al., Nature 367:645-648 (1994) およびBonnet and Dick, Nat. Med. 3:730-737 (1997))、これは、癌幹細胞仮説によって案出された基準を満たした最初の悪性腫瘍である。従って、抗CD99抗体によってLSCを標的とすることによって、AMLにおける疾患開始幹細胞が攻撃されることが期待される。
MDSはHSCにおいて開始されることが明らかになっているが、これはMDSのHSCが、疾患関連細胞遺伝学異常を含み、免疫不全動物に疾患を生着させることができることを示している。Nilsson et al., Blood 100:259-267 (2002); Nilsson et al., Blood 110:3005-3014 (2007); Tehranchi et al., New Engl. J. Med. 363:1025-1037 (2010); Nilsson et al., Blood 96:2012-2021 (2000); Pang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:3011-3016 (2013);およびWill et al., Blood 120:2076-2086 (2012)。従って、抗CD99抗体によってMDSのHSCを標的とすることによって、MDSにおける疾患開始幹細胞が攻撃されることが期待される。
【００９１】
正常HSCと比較して、AMLのLSC上で細胞表面タンパク質が優先的に発現されていることを多くの研究者が明らかにしている(Jin et al., Nat. Med. 12:1167-1174 (2006); Majeti et al., Cell 138:286-299 (2009); Jan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:5009-5014 (2011); Jin et al., Cell Stem Cell 5:31-42 (2009); van Rhenen et al., Blood 110:2659-2666 (2007); Saito et al., Sci. Transl. Med. 2:17ra19 (2010)）。これらは、HSCを助けながら、AMLのLSCを選択的に標的とする治療のための有望な標的である。今日まで、MDSのHSCにおける細胞表面タンパク質発現は、注意深く特性分析されてはおらず、この疾患において、幹細胞を標的とする治療法は評価されていない。
骨髄異形成症候群(MDS)患者8名、低リスク患者7名および中間リスク患者1名(Greenberg et al., Blood 89:2079-2088 (1997))ならびに年齢をマッチした 正常対照(McGowan et al., Blood 118:3622-3633 (2011))からの高度に精製したHSC(系統陰性[Lin-]CD38+CD34-CD90+CD45RA-)の比較トランスクリプトーム解析を行い、25の制御不全細胞表面タンパク質転写産物(FDR<0.1)を同定した。MDSのHSCに特異的な細胞表面マーカーを同定するために、フローサイトメトリー(FC)を用いて、26の治療関連MDS検体および37のデノボMDS検体の検証コホートにおける脊髄血液(CB)HSC対照と比較して、これらのマーカーの細胞表面発現を確認し、最も頻繁に過剰発現されているものとしてCD99を同定した（それぞれ、患者の85%および73%、図6A)。これらのランダムに選択されたMDS患者間での高頻度のCD99発現は、抗CD99抗体が、広範囲のMDSサブタイプに対して有効であることを示唆している。
【００９２】
他の骨髄系悪性腫瘍のマーカーとしてのCD99の妥当性を調べるために、78対の診断および再発AML試料からの白血病芽球について、FCによってCD99の発現を評価し、診断試料の81%および再発試料の83%においてCD99の発現レベルの上昇(平均9.2倍増、p<0.0001、図6B)が観察され、AMLだけでなくMDSにおいてもCD99が過剰発現されていることが明らかとなった。診断と再発との間でCD99の発現が安定していたので、抗CD99抗体が多くの疾患状態(初期診断および再発の両方)において有効であることが示唆された。実験の1つにおいては、診断と比較して、再発においてCD99の表面発現が有意に増加していた(p=0.047)。
CD99の発現によって、正常造血幹細胞および造血前駆細胞(HSPC)から白血病細胞を区別することができるかどうかを試験するために、幹細胞を濃縮したAMLのCD34+CD38-フラクションにおいてCD99の細胞表面発現を評価した。このフラクション内で、“高CD99(CD99 high)”細胞は、大部分のヒトAMLで見られる免疫表現型と一致するリンパ球系多能性前駆細胞(LMPP、CD34+CD38-CD90-CD45RA+)に類似し(Goardon et al., Cancer Cell 19:138-152 (2011))、一方、“低CD99（CD99 low）”細胞は、正常造血において優勢であるHSC/多能性前駆細胞(MPP)に類似していた(図6C)。Majeti et al., Cell Stem Cell 1:635-645 (2007)。FACSを用いて“低CD99”細胞をメチルセルロース培地中に精製したとき、それらは正常HSCに特徴的なロバストな骨髄系コロニーを形成したが、LSCは見られなかった(図6D)。これらのコロニーを採取し、アレル特異的PCRを行うことによって、それらは対応するAMLに関連する分子マーカー(例えばFLT3-ITD)が欠如していることが明らかとなり、そのことは、残りの正常または前白血病HSCからのそれらの誘導と矛盾しなかった(図6E)。Jan et al., Sci. Transl. Med. 4:149ra118 (2012)。このことは、同じ患者内の残りの正常造血幹細胞(HSC)と比較して白血病幹細胞(LSC)のCD99発現の特異性を明らかにしており、抗CD99抗体が広い治療濃度域を有することを示唆した。
【００９３】
AMLのCD34+CD38-フラクションは、LSCが濃縮されていることが示されており(Bonnet and Dick, Nat. Med. 3:730-737 (1997)およびGoardon et al., Cancer Cell 19:138-152 (2011))、このフラクションは、より分化したAML芽球と比較して、一貫してAMLにおけるより高レベルのCD99発現を示すことが見いだされた(図6F)。機能性LSCについて、CD99発現が増加しているかどうかを試験するため、初代AMLのLSC濃縮CD34+CD38-CD90-CD45RA-フラクション内のCD99発現体の上位および下位10%を、限界希釈で、準致死量で放射線照射(185cGy)したNSGマウスに移植し、白血病開始能力(LIC)は、高CD99細胞に限定されていることが見いだされた（上位10%に関して24,401細胞に1細胞、下位10%からの生着は見られない(表3A参照)）。AML検体UPenn 2741の“LMPP様”LSC濃縮フラクションからCD99発現体の上位および下位10%を精製し、準致死量で放射線照射したNSGマウス(185cGy)に限界希釈で移植した。白血病性生着(カットオフ値>0.1%ヒトCD45+細胞)は、“上位10%”の細胞を移植したマウスにおいてのみ認められた。これによって、機能的に関連する白血病開始細胞の特異的マーカーとしてのCD99発現が検証され、抗CD99抗体が、この疾患開始細胞集団を優先的に殺傷することが示唆される。
【００９４】
表3A  白血病開始能力(LIC)は、高CD99細胞に限定されている
2018511311.tif 000009
【００９５】
他の独立したAML試料UPenn 2522を用いて、同様な希釈分析実験を行った。表3Bは、高または低CD99発現を示すCD19-CD3-CD45(dim)SSC(low)白血病芽球であるUPenn 2522の移植の限界希釈分析を示す。表3Bにおいて、AML検体UPenn 2522からのCD99を発現する“LMPP様”LSC濃縮芽球の上位および下位15%もまた同様に精製され、NSGマウスに限界希釈で移植された。“上位15%”のCD99発現芽球を移植されたマウスにおいてのみ白血病性生着が観察された。
【００９６】
表3B  高または低CD99発現を示すCD19-CD3-CD45(dim)SSC(low)白血病芽球であるUPenn 2522の移植の限界希釈分析
2018511311.tif 000010
【００９７】
このように、CD99はAMLにおいて強くは発現されていないだけでなく、機能性LSCにおいて濃縮されていると考えられる。これは、この特徴を有することが報告された最初のLSCマーカーである。他のLSCマーカーは、LSCおよびより分化したAML芽球上にほぼ同等のレベルで発現されていることが見いだされた(例えば、CD44、CD47およびTIM3;データは示さず)。Jin et al., Nat. Med. 12:1167-1174 (2006); Majeti et al., Cell 138:286-299 (2009);およびJan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:5009-5014 (2011)。
【００９８】
さらに研究するために、患者AML芽球におけるCD99の多様な発現を評価した。患者AML芽球を分画した。未分画の細胞を分画したCD34+CD38-AML細胞と比較し、CD99、CD44、CD123、CD47およびTIM3を含む選択された可能なLSCマーカーの発現レベルを評価した。患者AML芽球において、試験したいくつかのAMLマーカーの中で、CD99のみが分画した白血病幹細胞(CD34+、CD38-)に有意に濃縮されていることが認められ、統計的に関連性が認められた。CD44、CD123、CD47またはTIM3に関しては、このような統計的に関連性のある発現増加は認められなかった。
白血病細胞上のCD99の分布は、正常HSPCのそれよりもはるかに高い。この観察に基づき、白血病細胞からの残りの正常HSCの予期的分離を行った。AML患者試料(MSK AML 003)を得た。AML検体MSK AML-003からのCD3-CD19-CD34+CD38-細胞におけるCD99発現をFCによって評価した。細胞集団を95%以上の純度で“低CD99群”および“高CD99群”にFACSで選別した。2つの群を、サイトカインを補充したメチルセルロースにプレーティングした(750細胞、3連で)。正常骨髄系/赤血球系コロニーは、“低CD99”フラクションからのみ形成され、種類の異なる造血器細胞(CFU-E、BFU-E、GEMM、CFU-MおよびCFU-G)の予想される分布を有していた。さらに、“低CD99”由来コロニーは、MSK AML-003に存在するホモ接合型FLT3-ITD異常を欠いていた。
別の実験において、AML試料(MSK-003)からのフラクションを、“高CD99”(Lin-CD34+CD38-CD99+)および“低CD99”(Lin-CD34+CD38-CD99-)フラクションに分離し、これらをNSGマウスに異種移植した。12週間後に生着を評価した。表3Cに示すように、“低CD99”細胞は、正常なリンパ骨髄系の生着を示し、これは残りの正常造血幹細胞(HSC)の活性と一致した。対照的に、表3Cに示すように、“高CD99”細胞は、マウス4匹中4匹において、高細胞量で白血病性生着を生じた。
【００９９】
表3C  高CD99細胞および低CD99細胞のNSGマウスへの異種移植後12週間における生着
2018511311.tif 000011
【０１００】
AMLにおけるCD99の機能を特徴づけるために、CD99を標的とするshRNAをMOLM13 AML細胞に安定的に形質導入した(8.0倍ノックダウン)。2種類のshRNAによるHL60細胞におけるCD99のノックダウン(それぞれ、#61および#59により2.3倍および8.3倍）は、in vitroでの増殖動態を有意には変えなかった。エラーバーは±SDを表す。このことは、in vitroでの増殖に有意差をもたらさなかったが(図7A)、これらの細胞が移植された、準致死量で放射線照射されたNSGマウスは、ベクター対照と比較して有意に改善された生存を示したことから(58日対34日、p=0.02、図7B)、CD99は、微小環境との相互作用を調節することによって、より侵襲性が高い疾患を促進することができることが示唆された。したがって、ヒトAML試料における高いCD99表面タンパク質発現は、BM疾患負荷の増加に有意に関連していた(図7C)。CD99高発現は、マウスおよびヒトの両方において、AMLのより侵襲性の高い増殖に関連している。
【０１０１】
LSCが濃縮されている遺伝子発現特性は、悪い臨床結果の前兆となるとされており(Majeti,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:3396-3401 (2009)およびEppert, et al. Nature Medicine 17:1086-1093 (2011))、CD123およびCD47などのLSCマーカーの過剰発現は、それぞれ、白血病負荷の増加およびOS悪化と相関している。従って、AMLにおけるCD99 mRNA発現は、“幹細胞らしさ（stemness）”を増加させ、より悪い予後が予測されることが想定された。Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 臨床試験  (E1900)に登録した358名のAML患者から入手できるトランスクリプトームデータを、初期疾患治療のための2種類の用量のダウノルビシン(DNR)と比較することによって解析した。驚くべきことに、CD99低発現は、より悪い予後と関連性を示したが、これは、高投与量のDNRの処方によって緩和されると考えられた(図7D)。
そのうえ、DNR強化によって利益が予測されるAMLの分子サブタイプ(NPM1変異、DNMT3a変異またはMLL再構成; Patel et al., New Engl. J. Med. 366:1079-1089 (2012))内で、利益は、CD99低発現体に限定されていた(図7E)。炎症に応答した単球および好中球の経内皮遊走におけるCD99の確定された役割を考慮すれば(Schenkel et al., Nat. Immunol. 3:143-150 (2002)およびLou et al., J. Immunol. 178:1136-1143 (2007))、化学療法との関係において、高レベルのCD99 mRNA発現は、内皮を通してPB（PB中では、より化学療法に感受性を示すことが示されている）への白血病芽球の動員を促進することによって改善された臨床結果もたらすことが想定されるUy et al., Blood 119:3917-3924 (2012)。
【実施例３】
【０１０２】
CD99は白血病芽球の経内皮遊走および動員を促進する
白血病芽球の経内皮遊走に対するCD99発現の影響を試験するために、CD99を過剰発現(6.7倍)するようにAML細胞株HL60に安定的に形質導入し、トランスウェル膜上にコンフルエンスまで増殖させたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)上にそれを播種し、化学誘引物質SDF-1に向けてHUVECを通してHL60を遊走させた(データは示さず)。CD99の過剰発現は、経内皮遊走の効率における有意な増加を導いた(4時間において3.72倍増加（p<0.0009）、28時間において2.93倍増加（p=0.0065）、図8A)。この遊走の効率は、種々の抗CD99 mAbの添加によって、さまざまに促進または抑制することができた(データは示さず)。経内皮遊走を遮断する抗CD99抗体は、末梢血（本明細書に記載されるように、末梢血中で腫瘍細胞は細胞傷害性抗CD99抗体に対する感受性だけでなく、促進された化学療法感受性を示すことがある）中に動員された白血病細胞を“捕まえる”ために、G-CSFまたはプレリキサホル（Plerixafor）などの動員剤と組み合わせて用いることができる。
72時間後、残存した非遊走細胞は、遊走した細胞と比較して有意に低レベルのCD99発現を示した(3.65倍低下、p=0.028、図8B)。CD99発現とSDF-1受容体CXCR4の発現の間に相関は認められなかった(データは示さず)。CD99の表面発現は、BMと比較して、末梢血から採取されたAML検体上で有意に高いことが見いだされ(1.65倍高い、p=0.028、図8C)、初代AML異種移植片から同時に採取されたBMおよびPBの対分析において、CD99の表面発現は、BMと比較して、PB中を循環している白血病芽球上で有意に高かった(2.32倍増加、p<0.0001、図8D)。最後に、AML細胞株におけるCD99の過剰発現によって、フィブロネクチンおよびコラーゲンなどの基質成分でコーティングされた組織培養プレートへの接着の増加が導かれた(図8E)。
総合すれば、これらの発見は、CD99が、経内皮遊走を促進し、BM中の基質成分への接着を減少させることによって、白血病芽球の動員を促進することを示唆している。
【実施例４】
【０１０３】
抗CD99モノクローナル抗体(mAb)は、AMLおよびMDS細胞に対して直接的な細胞傷害性を示す
AMLおよびMDSにおいて、細胞死を誘導する抗CD99 mAbの能力を試験した。いくつかの抗CD99 mAbクローン(12E7、O13、H036-1.1)は、in vitroで、初代AML芽球およびMDS CD34+細胞(図9A)ならびにAML細胞株15株中11株(図9B)に対して細胞傷害性を示すことが見いだされた。抗CD99 mAb5μg/mLとともにインキュベートしたMOLM13細胞におけるアポトーシスの誘導(図9C)は、経時的な活性化カスパーゼ増加を示し、免疫エフェクター細胞または補体の非存在下で生じたことから、これは直接細胞傷害であることが示唆された。アポトーシスは、細胞周期状態に依存しないで誘導され(データは示さず)、汎カスパーゼ抗CD99抗体QVDによって抑制することができた(データは示さず)。
【０１０４】
CD99は、正常HSC(図6A)および内皮細胞上で、それぞれ低レベルおよび中間レベルで発現されているが(データは示さず)、抗CD99 mAbは、in vitroでこれらの細胞型に大変わずかな効果しか示さず、これは潜在的に広い治療濃度域を示している(図9D)。準致死量で放射線照射したNSGマウスへの異種移植の前に抗CD99 mAb(H036-1.1、20μg/ml)によって初代AML細胞をex vivo治療することによって、PBにおいて8週間で測定するとき、生着の有意な減少が導かれた(20.5%対67.4%、p=0.006、図9E)。これらの実験は、AML患者からの自家骨髄移植片の抗CD99抗体によるex vivo治療が、移植片の疾患開始細胞の枯渇に役立ち、移植後の再発のリスクを軽減させるという点で有益であることを示唆している。
【０１０５】
細胞傷害性抗CD99 mAbによって誘導される顕著な細胞表面のCD99のキャッピングおよびIgGアイソタイプ抗CD99 mAbに対する第2架橋抗体(例えば、クローンO13)の添加によってこのキャッピング効果が反復され、細胞傷害が促進されることから、細胞表面のCD99の多量体化が、細胞死を誘導する鍵であることが示唆される(図9F)。細胞傷害性抗CD99抗体(例えば12E7)はまた、CD99の細胞表面凝集およびクラスタリングを誘導したが、非細胞傷害性抗CD99抗体(例えば3B2)は、CD99の表面発現の再分布を明白には誘導しなかった。
CD99は、骨肉腫細胞において、Srcファミリーキナーゼ(SFK)と物理的に結合し、その活性を抑えることが記載されている。Scotlandi et al., Oncogene 26:6604-6618 (2007)。CD99は、AMLにおいて、SFKと共免疫沈降し(データは示さず)、細胞傷害性抗CD99 mAbは、ロバストなSFK活性化を誘導することが確認された(図9G)。小分子抗CD99抗体PP2によるSFKの薬理学的阻害は、抗CD99 mAbによって誘導される細胞傷害を有意に低下させる(図9H)。従って、抗CD99 mAbは、制御不全SFKの活性化を促進することによって、癌遺伝子によって誘導されるアポトーシスによって細胞死を促進することができる。
【実施例５】
【０１０６】
抗CD99モノクローナル抗体(mAb)は、AML異種移植片を除去する
AML異種移植片を除去する抗CD99 mAbの能力を試験した。NSGマウスにおける異種移植AML検体UPenn 2522の、ex vivoおよびin vivoでのH036-1.1による併用治療を行った。実験プロトコルの概略図を、図11の上パネルに示す。450,000個のAML芽球(UPenn 2522)を、H036-1.1抗CD99 mAb(20マイクログラム/mL)またはアイソタイプ(20マイクログラム/mL)で45分間プレコートした。準致死量で放射線照射したNSGマウスにこの芽球を異種移植した。2週間後、マウスをH036-1.1またはアイソタイプ(15マイクログラム)で治療した。5ヶ月後、マウスを犠牲にし、骨髄(BM)を評価した。図11の下パネルに示すように、5ヶ月後におけるヒトキメリズムに対するマウス骨髄(BM)の評価において、H036-1.1でプレコートした芽球を投与した動物の0/6、in vivoでH036-1.1で処置した動物の0/5、がBMへの0.1%以下のヒト生着を示し(閾値の境界は灰色の点線で示す)、一方、移植した対照動物の4/5がヒト生着を示した。エラーバーは±SDを表す。図11に示すように、異種移植の前にAML芽球を抗CD99 mAbでプレコートするか、または異種移植したマウスを抗CD99 mAbでin vivo治療することによってAML異種移植片は除去されたが、対照動物の4/5では白血病性生着を示した。H036-1.1抗CD99 mAbによる、芽球のex vivo前処理または移植した移植片のin vivo処置によって、NSGマウスにおけるAML異種移植片の除去がもたらされることをこれらのデータは示している。
【実施例６】
【０１０７】
デノボ抗体生成、ヒト化および検証
標準手段によってデノボ抗CD99 mAb生成を行った。慣用法を用い、ベンダー(Thermo Fisher社)によって精製された組換えCD99を用いてマウスを免疫した。in vitro効力および有効性に基づいて、85の候補リード抗CD99 mAbのスクリーニングを行った。Abを含むハイブリドーマ上清を、IgGアイソタイプ陰性対照と比較して評価した。ハイブリドーマ上清との72時間のインキュベーション後にMOLM13相対細胞数を測定した。顕著に相対細胞数が減少した3つの上清が同定された。候補の1つである上清13が、相対細胞数を減少させるのに特に有効であった。上清13に暴露したMOLM13細胞はまた、IgGアイソタイプで処置されたMOLM13細胞と比較して、PI染色による生存率の減少およびSSCの減少を示した(データは示さず)。候補の将来評価は、12E7/H036-1.1/O13 mAbと比較して同等以上の効力を示す基準を含む。これらのリード化合物のさらなる特性づけは、そのアポトーシス促進活性が、ヒト内皮細胞株およびHSCにおける殺傷を誘発しないことを保証するために行われるであろう。アポトーシス促進性リードAbは、ヒトAML細胞株、初代AML細胞およびLSCを用いて、ADCC/CDC活性についてin vitroで評価されるであろう。効力および有効性を増すためのリード候補Abの親和性最適化およびリードヒト化mAb候補のin vivo検証が行われるであろう。
【実施例７】
【０１０８】
T細胞悪性新生物におけるCD99の標的化
CD99は、T細胞成熟および白血球の経内皮遊走を制御する32kDaの膜貫通タンパク質である。CD99はまた、急性T細胞リンパ芽球性リンパ腫/白血病(T-ALL)、ユーイング肉腫および神経内分泌腫瘍の診断に役立つバイオマーカーとしても用いられる。本明細書において、我々は、CD99に対するモノクローナル抗体(mAb)が、急性骨髄性白血病(AML)および骨髄異形成症候群(MDS)における細胞傷害を効果的に誘導することを示す。CD99が、T細胞新生物における実現性のある治療標的であるかどうかを決定するためにさらなる実験を行った。
本実験において、組織マイクロアレイを用い、免疫組織化学(IHC)によって115のリンパ腫患者試料についてCD99タンパク質発現を評価した。CD99発現はまた、成熟T細胞リンパ腫細胞株、T-ALL細胞株および末梢血(PB)T細胞についてのフローサイトメトリーによっても評価した。最高レベルのCD99発現を示す細胞株をin vitro細胞傷害アッセイに用い、漸増濃度の抗IgG架橋抗体(Ab)(50〜100μg/ml)の存在下で、抗CD99 mAb(DN16、O13または12E7)40μg/mlとともにインキュベートした。抗CD99 mAbとのインキュベーション後72時間で、フローサイトメトリーおよび光学顕微鏡法によって細胞生存および形態について評価した。結果を図13〜16に示す。
【０１０９】
IHCにより、5%カットオフ値に基づき、種々のT細胞新生物がCD99発現を示した：11/20(55%)Tリンパ芽球性リンパ腫、7/16(44%)血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、4/13(31%)未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、10/63(16%)末梢性T細胞リンパ腫および0/3(0%)NK/T細胞リンパ腫。フローサイトメトリー解析によって、CD99は、PB T細胞に対してKarpas-299(ALCL)およびKopt-K1(T-ALL)細胞株上でアップレギュレートされていることが明らかとなったが(正規化MFI値：56.1、39.5、20.5)、Mac2A(ALCL)、Hut78(セザリー症候群)およびHut102(菌状息肉症)細胞株上には、低レベルのCD99が発現されていた(それぞれ、正規化MFI値:0.19、10.9、0.5)。
DN16または12E7とKopt-K1細胞とのインキュベーションによって、IgGアイソタイプ対照に対して、漸増濃度の抗IgG Abの存在下で顕著な細胞死が誘導された(DN16:70〜81%の細胞死、p≦.0002;12E7:42〜78%細胞死、p≦.0003)。DN16またはO13とKarpas-299とのインキュベーションもまた、抗IgG Abの存在下で細胞数の著しい減少をもたらした(O13:75μg/mlの抗IgG Abで25%の細胞死、p<.0001;DN16:50〜100μg/mlの抗IgG Abで38〜43%の細胞死、p≦.0021)。B-ALLにおける以前の発見と矛盾せず、細胞死は、顕著な細胞凝集と関連していた。
【０１１０】
本実験は、CD99が、T-ALL芽球および、T細胞リンパ腫、特にALCLにおけるかなりの割合の細胞上で強く発現されていることを示している。理論にとらわれるわけではないが、抗CD99 mAbは、抗IgG Abの存在下でT-ALLおよびALCL細胞株に対して細胞傷害性であり、これは、細胞死を誘導するためにはCD99の架橋または多量体化が必要であることを示唆している。まとめれば、一般原則として、治療mAbを用いるCD99の標的化は複数のT細胞新生物の治療における実行可能な新規戦略であることをこれらの研究は示唆している。
【０１１１】
個々に見て、あるいは総合して、これらの研究は、CD99が、AML、MDSおよびT細胞新生物における疾患開始細胞上に濃縮されている有望な予後マーカーおよび治療標的であることを確立した。そのうえ、抗CD99 mAbによるSFK活性の調節障害は、この経路の他のモジュレーターを用いて開発することができるAMLおよびMDSにおける新規治療脆弱性である。直接的にアポトーシスを誘導し、および／または化学療法感受性を増強することによって、CD99指向性治療は、AMLおよびMDSにおける長期寛解に導く、疾患幹細胞の根絶を可能にすることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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