(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞に由来する、多能性細胞由来の細胞、特に、膵臓内胚葉型細胞のための細胞表面マーカーを含む組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓内分泌細胞を濃縮するための方法であって、
（ａ）インビトロの膵臓内分泌細胞を含む細胞集合を、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４、ＣＤ５７、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するリガンドにさらし、
（ｂ）前記インビトロの細胞集合から、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４およびＣＤ５７からなる群から選択されるマーカーを発現する細胞を選択し、および／または前記インビトロの細胞集合から、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択されるマーカーを発現しない細胞を選択し、それによって、膵臓内分泌細胞を濃縮すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記リガンドが、抗体またはその結合フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記膵臓内分泌細胞がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記膵臓内分泌細胞が、膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ１）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記膵臓内分泌細胞がインスリンを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記膵臓内分泌細胞がＭＡＦＡを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが検出可能な標識と会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが磁性粒子と会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法に従って単離された、膵臓内分泌細胞の濃縮された集合。
【請求項１３】
請求項１２に記載の膵臓内分泌細胞の集合を、それを必要とするヒト被験体に移植することを含み、前記膵臓内分泌細胞の集合が、成熟した、機能的なインスリンを産生し、グルコースに応答するβ細胞を含む、糖尿病を治療する方法。
【請求項１４】
ヒト膵臓内分泌細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞に由来の培養物から単離される委任細胞系統から誘導される培養物から単離される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゼノフリー培養条件下で成長したヒト多能性細胞からＮＫＸ６−１＋、ＰＤＸ１＋、Ｃ−ペプチド＋、インスリン産生のβ細胞を調製する方法であって、
（ａ）ゼノフリー成長培地中、ゼノフリー基材上で多能性細胞を培養する工程と、
（ｂ）少なくとも３種類の分化剤存在下、前記ヒト多能性幹細胞を懸濁物中で、ＮＫＸ６−１＋、ＰＤＸ１＋、Ｃ−ペプチド＋、インスリン産生のβ細胞に分化させる工程と
を含む、方法。
【請求項１６】
前記ゼノフリー基材が、ビトロネクチン、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ、ＳｔｅｍＡｄｈｅｒｅ、Ｃｏｌｌａｇｅｎおよびラミニンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゼノフリー成長培地が、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍおよびＥ８培地からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト多能性細胞がＥＤＴＡによって解離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも３種類の分化剤が、アスコルビン酸、ＣＨＩＲ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＬＤＮ−１９３１８９、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）および重炭酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
アスコルビン酸が全ての分化プロセス中に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記インスリン産生β細胞を、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４、ＣＤ５７、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するリガンドにさらし、前記細胞集合から、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４およびＣＤ５７からなる群から選択されるマーカーを発現する細胞を選択し、および／または前記細胞集合から、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択されるマーカーを発現しない細胞を選択し、それによって、膵臓内分泌細胞を濃縮することとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法によって得られるインスリンを産生するβ細胞の集合を、それを必要とするヒト被験体に移植することを含む、糖尿病を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのある実施形態において、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞、およびこの細胞に分化させ、精製する方法に関する。本発明は、さらに、ヒト多能性幹細胞に由来する、ヒト多能性細胞由来の細胞、特に、膵臓内分泌型細胞のための細胞表面マーカーを含む組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病では、ランゲルハンス島のインスリン産生細胞、すなわち、ベータ（β）細胞が破壊される。ランゲルハンス島は、内分泌膵臓を構成する特殊な細胞凝集物であり、インスリンを産生するβ−細胞（ヒトの内分泌膵臓の約５５％）、グルカゴンを産生するα−細胞（ヒトにおいて約３５％）、ソマトスタチンを産生するδ−細胞（３〜１０％）、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞（３〜５％）、およびグレリンを産生するε−細胞（１％未満）を含んでいる。インスリンおよびグルカゴンは、血糖値の主要な調節因子である。高い血糖値に応答して、インスリンは、末梢組織（例えば、特に、脂肪、肝臓および筋肉細胞）によるグルコースの取り込みを刺激し、これがエネルギーに変換されるか、または脂肪およびグリコーゲンに蓄えられ、それにより血糖値が下がる。これとは逆に、グルカゴンは、低血糖症の状況において、脂肪およびグリコーゲンの備蓄からのグルコースの放出を刺激する。
【０００３】
Ｉ型糖尿病患者は、血糖値を下げるために、毎日のインスリン注射に依存する。しかし、長年にわたる、脈管構造に対する高血糖期間の累積的な損傷は、患者の健康の重度の悪化を引き起こす。このような患者の血中グルコースの生理学的調節および全身的な健康状態は、死亡ドナーからのヒト膵島の移植によって劇的に改善され得る。しかし、このような移植の必要性は、死亡ドナーからの膵島細胞の利用可能性よりもはるかに大きい。実際に、このような治療の恩恵を受ける可能性のある１億３，０００万人の患者のために、毎年世界中で数千の移植が行われるだけである。したがって、膵島細胞のさらなる供給源が必要とされる。
【０００４】
膵臓β細胞を単離する試みにおいて、これまでに様々な技術が用いられてきた。米国特許第９，０４５，７３６号は、クロモグラニンＡを発現する細胞を濃縮する方法を教示している。本発明者らの一部に対する米国特許出願第２０１５０１５７６６８号は、異種細胞集合から少なくとも１つの異なる型の膵臓細胞が濃縮された集合を単離する方法を教示している。
【０００５】
ヒト多能性幹細胞は、全てのヒト体細胞組織および器官を含む分化細胞型を産生する可能性を有する。インスリン依存性糖尿病の細胞治療処置は、ヒト膵島と同様に機能することが可能な膵臓細胞の制限のない数の産生によって促進されるであろう。したがって、多能性幹細胞に由来する膵島様細胞の作製、そのような細胞の移植前の分化および精製の信頼性高い方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第９，０４５，７３６号
【特許文献２】米国特許出願第２０１５０１５７６６８号
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新たに同定されたマーカーおよび選択手段を用い、膵臓内分泌型細胞を分化、単離および精製する方法を提供する。より具体的には、本発明は、特定の細胞表面マーカーを用いた膵臓内分泌型細胞の効率的な単離を提供する。
【０００８】
本発明は、さらに、膵臓内分泌型細胞を同定または濃縮するのに適した細胞マーカーの新規な組み合わせを提供する。糖尿病の治療におけるマーカーおよび単離された細胞の使用も提供される。
【０００９】
膵臓β細胞に特異的な表面マーカーは、移植に適した、成熟した、機能的なインスリンを産生するβ細胞の精製を容易にし得るため、特に関心が高い。
【００１０】
本発明の１つの態様によれば、膵臓内分泌細胞を濃縮するための方法であって、（ａ）インビトロの膵臓内分泌細胞を含む細胞集合を、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４、ＣＤ５７、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するリガンドにさらすことと、（ｂ）インビトロの細胞集合から、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４、ＣＤ５７からなる群から選択されるマーカーを発現する細胞を選択し、および／またはインビトロの細胞集合から、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択されるマーカーを発現しない細胞を選択し、それによって、膵臓内分泌細胞を濃縮することとを含む、方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４９ＡまたはＧ４６−２．６を用いた陽性選別または選択を用いるために濃縮される。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、細胞表面マーカーＣＤ４９ＡまたはＧ４６−２．６は、選択に使用される最初のマーカーである。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類のさらなる細胞表面マーカーを用いたさらなる選択が用いられる。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞に由来の培養物から単離される、培養物に由来する委任細胞系統から単離される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リガンドは、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施形態によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１を発現する。いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞は、膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ１）を発現する。いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞はインスリンを発現する。いくつかの実施形態によれば、膵臓内分泌細胞はＭＡＦＡを発現する。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、リガンドは検出可能な標識と会合している。いくつかの実施形態によれば、リガンドは磁性粒子と会合している。いくつかの実施形態によれば、細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって分離される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、ヒト膵臓内分泌細胞の濃縮された集合が提供され、本明細書に記載の方法によって単離される。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のヒト膵臓内分泌細胞の集合を、それを必要とするヒト被験体に移植することを含み、ヒト膵臓内分泌細胞の集合が、成熟した、機能的なインスリンを産生するβ細胞を含む、糖尿病を予防する方法または治療する方法が提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、ヒト膵臓内分泌細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞に由来の培養物から単離される委任細胞系統から誘導される培養物から単離される。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、ゼノフリー培養条件下で成長したヒト多能性細胞からＮＫＸ６−１＋、ＰＤＸ１＋、Ｃ−ペプチド＋、インスリンを産生するβ細胞を調製する方法であって、（ａ）ゼノフリー成長培地中、ゼノフリー基材上で多能性細胞を培養する工程と、（ｂ）少なくとも３種類の分化剤存在下、ヒト多能性幹細胞を懸濁物中で、ＮＫＸ６−１＋、ＰＤＸ１＋、Ｃ−ペプチド＋、インスリンを産生するβ細胞に分化させる工程とを含む、方法が提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、ゼノフリー基材は、ビトロネクチン、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ、ＳｔｅｍＡｄｈｅｒｅ、Ｃｏｌｌａｇｅｎおよびラミニンからなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、ゼノフリー成長培地は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍおよびＥ８培地からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、ヒト多能性細胞は、ＥＤＴＡによって解離される。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも３種類の分化剤は、アスコルビン酸、ＣＨＩＲ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＬＤＮ−１９３１８９、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）および重炭酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、アスコルビン酸は、全ての分化プロセス中に添加される。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、さらに、インスリンを産生するβ細胞を、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４、ＣＤ５７、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するリガンドにさらし、当該細胞集合から、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ２９、ＣＤ９９、ＣＤ１０、ＣＤ５９、ＣＤ１４１、ＣＤ１６５、Ｇ４６−２．６、ＣＤ４４およびＣＤ５７からなる群から選択されるマーカーを発現する細胞を選択し、および／または当該細胞集合から、ＣＤ２９４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３４０、ＣＤ２６、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７３からなる群から選択されるマーカーを発現しない細胞を選択し、それによって、膵臓内分泌細胞を濃縮することを含む。
【００２７】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先する。これに加え、材料、方法および例は、例示に過ぎず、必ずしも限定することを意図したものではない。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の画像を参照しつつ、単なる例として本明細書に記載される。図面を詳細に具体的に参照しつつ、示される詳細は、一例であり、本発明の実施形態の説明的な記載のためのものであることを強調しておく。この点に関し、図面を用いてなされる説明は、本発明の実施形態をどのように実施し得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】機能細胞捕捉スクリーニング（ＦＣＣＳ）を示す。ＥＳ由来の膵臓細胞を、機能細胞捕捉スクリーニングによって分析した。細胞表面抗体アレイ上で単一細胞を短時間インキュベートした後、細胞を固定し、インスリンについて染色した（緑色）。高含量スクリーニング分析を用い、各スポットに対して結合した細胞の総数を決定した。さらに、各スポットにおけるインスリン＋細胞の割合を計算した。インスリン＋細胞のための濃縮マーカー（陽性選択マーカー）としてＣＤ４９Ａ（平均３３％インスリン＋）およびＣＤ９９（平均１９％インスリン＋）、ならびにインスリン−細胞のための濃縮マーカー（陰性選択マーカー）としてＣＤ６６ＣおよびＣＤ７３の４種類のマーカーの出力シグナルの例を示す。
【図２】陽性選択マーカーの機能選別を示す。ＥＳ由来の膵臓細胞を解離させ、ＰＥが結合した抗ヒトＣＤ４９Ａ抗体と共にインキュベートした。インキュベートの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩを用い、ＣＤ４９Ａ＋集合およびＣＤ４９Ａ−集合について選別した。
【図３】ＣＤ４９Ａによって選別された集合の分子分析を示す。選別されたＥＳ由来の膵臓細胞集合からＲＮＡを精製した。ＱＰＣＲ分析は、ＣＤ４９Ａ＋集合において、ＣＤＡ４９−集合と比較して、インスリンｍＲＮＡの発現が５２％高いことを示した。さらに、ＣＤ４９Ａ＋集合は、グルカゴン発現の３４％の減少を示し、このことは、ＣＤ４９Ａ濃縮が主にインスリン産生細胞に対して起こり、グルカゴン産生細胞に対しては起こらないという事実を裏付けている。ＲＦＸ６およびＳｏｘ９などの初期膵臓発生マーカーの発現は、ＣＤ４９Ａ＋集合で顕著に低下し、このことは、これらの細胞が成熟表現型を有することを示唆している。高度に発現された遺伝子における最も顕著な変化は、ＭＡＦＡ発現にあり、すなわち、ＣＤ４９Ａ−集合と比較して、ＣＤ４９Ａ＋集合のほうが１７０倍高い。遺伝子発現は、２−ΔΔＣｔ法を用い、ＣＤ４９Ａ−集合に対する発現（ＲＱ＝１）と比較して、ＴＢＰ／ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに対して正規化される。
【図４Ａ】陰性選択マーカーの機能選別を示す。ＥＳ由来の膵臓細胞を解離させ、ＰＥが結合した抗ヒトＣＤ２６抗体と共に（Ａ）インキュベートした。
【図４Ｂ】陰性選択マーカーの機能選別を示す。ＥＳ由来の膵臓細胞を解離させ、ＰＥが結合した抗ヒトＣＤ７３抗体と共に（Ｂ）インキュベートした。
【図４Ｃ】陰性選択マーカーの機能選別を示す。ＣＤ２６−について選別した細胞（Ｃ）を、ＧＣＧについて内部染色した。インキュベート後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩを用い、ＣＤ＋集合およびＣＤ−集合について選別した。
【図４Ｄ】陰性選択マーカーの機能選別を示す。ＣＤ２６＋について選別した細胞（Ｄ）を、ＧＣＧについて内部染色した。インキュベート後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩを用い、ＣＤ＋集合およびＣＤ−集合について選別した。
【図５】ＣＤ２６／ＣＤ７３によって選別された集合の分子分析を示す。選別されたＥＳ由来の膵臓細胞集合からＲＮＡを精製した。ＱＰＣＲ分析は、ＣＤ２６＋集合およびＣＤ７３＋集合が、陰性集合と比較して、両方ともグルカゴンｍＲＮＡの高い発現を示すことを示した。さらに、陽性集合は、ＲＦＸ６およびＳｏｘ９などの初期膵臓発生マーカーのより高い発現を示し、このことは、ＣＤ２６−集合が、より成熟した発現型を有することを示唆している。高度に発現した遺伝子における最も顕著な変化は、膵臓ではなく肝臓系統マーカーであるＡＦＰ内にある。ＡＦＰは、ＣＤ２６＋集合において高度に発現し、ＣＤ７３＋集合において、それより少ない程度に発現する。遺伝子発現は、２−ΔΔＣｔ法を用い、ＣＤ２６−集合に対する発現（ＲＱ＝１）と比較して、ＴＢＰ／ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに対して正規化される。
【図６】ｓｃｉｄ−ｂｅｉｇｅマウスの腎被膜下でのＭＡＣＳ精製されたＣＤ４９Ａ＋を発現する細胞の移植の結果を示す。分化の最終段階でＨＥＳＣ由来の膵臓細胞を、それらのＣＤ４９Ａ発現に基づいて選別した。選別された細胞と、選別されていない細胞をマウスに移植した。移植後約２〜３週間で、ｈＰＳＣｓ由来のＣＤ４９Ａ＋を移植した細胞（３〜４×１０６細胞／マウス）は、選別されていない細胞と比較して、インビボで３倍高い機能を示した。
【図７】ＣＤ５７＋ＣＤ２６−ＣＤ４９Ｆ−集合が、以前選別した集合における２０．８％と比較して、４２．２％のｃ−ペプチドＮＫＸ６．１二重陽性細胞を与えることを示す（Ａ）。総ＮＫＸ６．１＋細胞も、以前選別した集合の６８．９％からＣＤ５７＋ＣＤ２６−ＣＤ４９Ｆ−集合の８５％に増加する。
【図８Ａ】グルカゴン（ＧＣＧ）（Ａ）について選別された集合のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図８Ｂ】グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）（Ｂ）について選別された集合のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図８Ｃ】ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）（Ｃ）について選別された集合のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図８Ｄ】ＭＡＦＡ（Ｄ）について選別された集合のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図９】ＦＡＣＳ分析によって分析した、実施例７に記載したプロトコルに従って分化した細胞集合の典型的な分布を表す。示されるように、膵臓前駆体の分布（ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１二重陽性細胞（６２．３％））であり、一方、ＰＤＸ１陽性細胞は、それぞれ全細胞の９８．９％を表し、ＮＫＸ６．１は６２．４％を表す。
【図１０】ＮＫＸ６．１／Ｃ−ペプチド二重陽性細胞（ベータ様細胞）の割合を、ウェルまたはスピナーフラスコのいずれかで行った分化および処理の時間の関数で図示し、時間およびアスコルビン酸の添加が収率に及ぼす影響を強調している。
【図１１】移植から２週間後のマウス血液中のヒトｃ−ペプチドの平均を示す。分化プロトコル全体にわたってアスコルビン酸を添加する利点が観察され得る。
【図１２】移植から２週間後の移植された細胞のクラスター内部組織化のような膵島を示す。示されるように、ｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋が検出され、グルカゴン陰性である。ソマトスタチンは、ごく少数の細胞で発現する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞、およびこの細胞を分化させ、精製する方法に関する。
【００３１】
ヒト多能性幹細胞から膵島様クラスターを産生する可能性は、分化プロセス終了時に機能的なβ細胞のかなり均質な集合を得る可能性に依存する。本発明のいくつかの実施形態によれば、機能的なβ細胞に結合する１セットの抗体を同定するために、抗体アレイを使用した。同定された１セットの抗体は、インスリン、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＡ遺伝子を高度に発現する細胞を、まだ機能的ではない他のインスリン発現細胞から精製することができる。この精製工程は、移植に最も適した均質な集合を製造するために重要である。本発明は、一部には、例えば、免疫染色の後、磁気ビーズによる細胞選別を行うことによって、抗体の組み合わせの系統的なスクリーニングと、これを使用する最良の様式を発見することに基づいている。本発明は、陰性選別を用い、関連のない細胞を除去する抗体も提供する。
【００３２】
細胞表面マーカーを同定し、インスリン産生のような機能的な細胞特異的な特性と関連付ける反復的ハイスループットスクリーニングも提供される。機能細胞捕捉スクリーニング（ＦＣＣＳ）と呼ばれる技術は、限定された異種サンプル中の複数の機能について多数の表面マーカーをスクリーニングすることと適合する。この手法の効率および特異性は、本明細書において、膵臓内分泌型細胞を濃縮する新規のマーカーを同定することによって示される。この戦略は、糖尿病の治療のための臨床的に関連する細胞の単離を可能にし得る。
【００３３】
Ｉ型糖尿病は、インスリンを産生するβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。インスリン投与は、脈管に対する高血糖期間の累積的な損傷のため、疾患の長期間にわたる合併症を予防しない。損傷した細胞を調節されたインスリン産生細胞に置き換えることは、１型糖尿病の究極の治癒であると考えられている。膵臓の移植は成功しているが、ドナーの不足により厳しく制限されている。
【００３４】
有糸分裂後のβ細胞を強制的に拡張するための代替法は、幹細胞（天然の自己拡張能を有する）からインスリン産生細胞への分化の誘発である。様々なグループが、子宮内発育の間に機能する典型的な分化経路に基づいて異なる分化プロトコルを示唆している（例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００６；Ｊｉａｎｇ、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、２００７；およびＫｒｏｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８を参照）。しかし、今日まで、胚性幹細胞の指向性分化は、β細胞と比較して、低量のインスリンしか産生しない細胞を生成している。
【００３５】
糖尿病の治療に有効であろう細胞集合を作製する試みにおいて、本願発明者らは、新規な精製プロトコルを考案し、精製された細胞が高レベルのインスリンを合成することを示した。
【００３６】
本明細書で使用する「多能性幹細胞」という句は、３種類の胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉へと分化することができる細胞を指す。
【００３７】
一実施形態によれば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞および／または人工多能性幹細胞を含む。
「胚性幹細胞」という句は、３種類の胚性生殖細胞層（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞へと分化することができるか、または未分化状態に留まることが可能な胚細胞を指す。適切には、胚細胞または部分的に分化した細胞前駆体は、胚の破壊を伴わない方法によってのみ得られるヒト細胞を含む。そのような方法は、例えばＣｈｕｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００８、２（２）、１１３−１１７に記載されている。商業的に入手可能な幹細胞も、本発明のこの態様で使用できることが理解されるだろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２である。
【００３８】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ、胚様幹細胞）は、成人体細胞における多能性の誘発によって得られる（すなわち、３種類の胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉へと分化することができる）細胞である。本発明のいくつかの実施形態によれば、このような細胞は、分化組織（例えば、皮膚などの体細胞）から得られ、胚性幹細胞の特徴を獲得するために細胞を再プログラミングする遺伝子操作によって多分化能の誘発を受ける。本発明のいくつかの実施形態によれば、人工多能性幹細胞は、体細胞幹細胞においてＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ−Ｍｙｃの発現を誘発することによって形成される。
【００３９】
ｉＰＳ細胞は、例えば、線維芽細胞、造血幹細胞、肝細胞、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４などの転写因子を有する胃上皮細胞などの体細胞のレトロウイルス形質導入による、体細胞の遺伝子操作によって体細胞から生成することができる［Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００７、１（１）：３９−４９；Ａｏｉ  Ｔら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８年２月１４日（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）；ＩＨ  Ｐａｒｋ、Ｚｈａｏ  Ｒ、Ｗｅｓｔ  ＪＡら、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５１：１４１−１４６；Ｋ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔａｎａｂｅ  Ｋ、Ｏｈｎｕｋｉ  Ｍら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  ２００７；１３１：８６１−８７２］。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、または受精細胞が有糸分裂で停止した場合には接合子への核移植によって作製することができる。
【００４０】
未分化幹細胞は、当業者によって胚または成人起源の分化細胞と明確に区別される明確な形態であることが理解されるだろう。典型的には、未分化幹細胞は、高い核／細胞質比を有し、顕著な核小体、およびほとんど認識できない細胞接合部を伴うコンパクトなコロニー形成を有する。未分化幹細胞のさらなる特徴については、本明細書で以下にさらに説明する。
【００４１】
現在実施されているＥＳ培養法は、主に、幹細胞増殖に必要な因子を分泌し、同時にそれらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用に基づいている。フィーダー細胞を含まないシステムもＥＳ細胞培養に使用されており、そのようなシステムは、フィーダー細胞層の代わりに血清または血清置換、サイトカインおよび成長因子のいずれかを追加したマトリックスを利用する。
フィーダーフリー培養
【００４２】
幹細胞は、培地存在下、細胞外マトリックス（例えば、ビトロネクチンまたはラミニン）などの固体表面上で成長することができる。
【００４３】
多能性幹細胞の拡張後、本発明は、多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させるために、分化培地中での培養を想定する。
【００４４】
本発明は、接着条件（細胞外マトリックスによってコーティングされたプレートに付着）または懸濁条件（組織培養物で処理されていないプレート中）で、多能性幹細胞を培養することを想定している。想定される細胞外マトリックスとしては、限定されないが、単独で、または種々の組み合わせで、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸、カルトレックス、Ｐｏｌｙ−ｌｙｚｉｎなどが挙げられる。
【００４５】
「接着培養物」とは、適切な成長培地と接触している細胞が存在し、基材に接着しつつ生存可能であるか、または増殖可能である培養物を指す。「非接着培養物」とは、細胞が典型的には適切な成長培地に懸濁しており、基材に接着せずに生存可能であるか、または増殖可能である培養物を指す。
【００４６】
多能性幹細胞から内胚葉細胞を生成する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｎｏｄａｌの使用（ＮＭ＿０１８０５５；ＮＰ＿０６０５２５．３）および低分子の使用（例えば、Ｂｏｒｏｗｉａｋら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ４、Ｉｓｓｕｅ４、３４８−３５８、２００９年４月３日を参照）を含む。あるいは、内胚葉細胞は、胚様体を介して生成されてもよい。具体的には、ｈＥＳ細胞をｂＦＧＦを含まない懸濁液中で培養し、胚様体を生成してもよい。内胚葉細胞は、ＥＢから選択されてもよい。例えば、（Ｓｅｇｅｖ、Ｆｉｓｃｈｍａｎ、Ｚｉｓｋｉｎｄら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、２００４；２２（３）：２６５−７４を参照。
【００４７】
「膵臓前駆細胞」という句は、膵臓細胞には完全に分化せず、いまだ少なくとも１種の膵臓細胞に向かって分化するようにコミットする細胞の集合（例えば、インスリンを産生するβ細胞、グルカゴンを産生するα細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞（またはＤ細胞）、および／または膵臓ポリペプチドを産生するＦ細胞（またはγ細胞））を指す。
【００４８】
典型的には、膵臓前駆細胞は、膵臓系統の特徴を有する表現型マーカー（例えば、ＧＬＵＴ２、ＰＤＸ−１  Ｈｎｆ３β、ＰＣ１／３、Ｂｅｔａ２、ＮＫＸ２．２およびＰＣ２）のいくつかを発現する。典型的には、膵臓前駆細胞は、脱分化または再プログラミングがされない限り、インビトロでそれ自体を培養する場合には、他の胚性胚葉の子孫を産生しない。集合内のそれぞれの細胞が、１種類より多い子孫を生成する能力を有するが、多能性膵臓前駆細胞である個々の細胞が存在してもよいことは暗示されていないことが理解されるだろう。
【００４９】
特定の実施形態では、「濃縮された」、「単離された」、「分離された」、「選別された」、「精製された」という用語、またはこれらの均等語は、特定の細胞表現型を有する、例えば、その細胞表現型の特徴的な特定の細胞マーカー遺伝子を発現するか、または特定の細胞マーカーを発現しない所望の細胞系統または所望の細胞を少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％含む細胞培養物または細胞集合または細胞サンプルを指す。
【００５０】
本発明の「単離する」および「単離」という用語は、特定の細胞型の純粋な集合を選択することだけではなく、特定の型の細胞が濃縮された細胞集合を選択することも包含する。
【００５１】
本発明の選択は、目的の細胞と、少なくとも１つの他の細胞型とを区別するプロセスを指す。したがって、選択プロセスは、目的の細胞の濃縮をもたらす。
【００５２】
本発明による幹細胞のコミットされた系統は、初期の多能性細胞が徐々に、機能的なインスリン産生細胞の最終的な細胞運命に向かってコミットするようになる分化工程を指す。最初に、多能性幹細胞は、中内胚葉を介し、胚体内胚葉へと分化する。胚体内胚葉は、その後、膵臓細胞の運命に向けてコミットし、これらの細胞は、内分泌膵臓細胞の運命に向かって分化し、その後、これらはβ細胞にコミットする。いくつかの実施形態によれば、ｈＥＳＣは、胚の破壊を伴わない方法によって得られる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「マーカー」、「エピトープ」、「標的」、またはこれらの均等語は、観察または検出することが可能な任意の分子を指すことができる。例えば、マーカーとしては、限定されないが、核酸、例えば、特定の遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド産物、例えば、膜タンパク質、非遺伝子産物であるポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または低分子（例えば、分子量が１０，０００未満の分子）を挙げることができる。「細胞表面マーカー」は、細胞表面上に存在するマーカーである。
【００５４】
「細胞に関連する細胞表面マーカー」という用語は、陽性選択（上述のマーカーを発現する細胞を選択する）によって、または陰性選択（このマーカーを発現する細胞を除外する）によって、細胞の異種集合から細胞集合を濃縮するために使用可能なマーカーを示す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「リガンド」は、細胞上のマーカーまたは標的または受容体または膜タンパク質に対し、またはサンプルまたは溶液中の可溶性検体に対して特異的に結合するか、または交差反応する部分または結合対を指す。細胞上の標的は、マーカーを含むが、これに限定されない。そのようなリガンドの例としては、限定されないが、細胞抗原に結合する抗体、可溶性抗原に結合する抗体、細胞抗原または可溶性抗原に既に結合した抗体に結合する抗原、可溶性炭水化物または糖タンパク質または糖脂質の一部である炭水化物部分に結合するレクチン、または結合することが可能な、このような抗体および抗原の機能性フラグメント、細胞標的または可溶性献体の標的核酸配列に十分に相補性であり、この標的または検体配列に結合する核酸配列、細胞マーカーまたは標的または可溶性検体に既に結合したリガンド核酸配列に十分に相補的な核酸配列、または化学化合物またはタンパク質化合物、例えば、ビオチンまたはアビジンが挙げられる。リガンドは、アッセイフォーマット、例えば抗体アフィニティクロマトグラフィーによって示されるように、可溶性であってもよく、または捕捉媒体上に固定されていてもよい（すなわち、ビーズに合成的に共有結合している）。本明細書で定義されるように、リガンドとしては、限定されないが、１つ以上の特異的な細胞マーカーまたは標的または可溶性検体を検出し、これらと反応する種々の薬剤が挙げられる。リガンドの例は、標的および／またはエピトープに選択的に結合する本明細書に記載されるものであり、限定されないが、ＣＤ４９Ａ、またはこれらの標的に選択的に結合するリガンドおよび／または薬剤および／または抗体のいずれかを含む。さらに、そのようなリガンドは全て、可溶性であるか、または細胞に結合しているかにかかわらず、特定のマーカーまたは標的または検体に結合する所望な能力によって特徴付けられる。１つの好ましい実施形態では、リガンドは、細胞表面受容体の全部または一部に優先的に結合する構成要素である。したがって、この実施形態において有用なリガンドは、ｈＥＳまたはｈＥＳに由来する細胞上の細胞表面受容体に結合することができる抗体またはそのフラグメントであってもよい。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「接触させる」または「さらす」、またはその均等語は、合わせること、または混合することを指す。例えば、上記の抗体のいずれかの推定ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはハイブリッド、誘導体またはフラグメントを、内胚葉系統細胞を含む集合を含むｈＥＳに由来する細胞集合と接触させることができる。いくつかの実施形態では、測定（すなわち、検出）または定量可能な安定な複合体を形成するための、ｈＥＳに由来の細胞と、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたは上述のいずれかの抗体分子のハイブリッド、誘導体またはフラグメントとの間の複合体の形成は、免疫グロブリン分子またはその結合部分に選択的に結合する標的、受容体または膜タンパク質の能力を指す。標的、受容体または膜タンパク質と、免疫グロブリン分子またはその結合フラグメントとの間の選択的な結合は、例えば、複合体を形成するのに適した条件下で行われ、このような条件（例えば、適切な濃度、バッファー、温度、反応時間）およびこのような条件を最適化するための方法は、当業者には公知であり、例が本明細書に開示される。複合体形成条件の例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９にも開示されており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の参考文献は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「複合体形成を検出する」という用語は、複合体が形成されているかどうかを決定すること、すなわち複合体の有無（すなわち存在）をアッセイすることを指す。複合体が形成されている場合、形成される複合体の量を決定することが可能であるが、決定する必要はない。組成物における、標的、受容体および／または膜タンパク質と、任意の免疫グロブリン分子との間の複合体形成または選択的な結合は、当該技術分野で標準的な種々の方法を用い（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照）、測定（すなわち、検出、決定）することができ、その例は本明細書に開示される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。このような抗体またはフラグメントとしては、任意の天然源からのポリクローナル抗体、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの天然または組換えのモノクローナル抗体、ハイブリッド誘導体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む抗体のフラグメント、ヒト化抗体またはヒト抗体、抗体の相補性決定領域を含む組換えまたは合成の構築物、そのＦｃ抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント、所望な細胞表面受容体に結合する抗体と機能的に等価な結合特徴を保持するのに十分なＣＤＲを共有する合成抗体またはキメラ抗体構築物、およびファージディスプレイによって作られる結合フラグメントが挙げられる。特定のクラスには、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスもある。さらに、ヒトにでは、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。本明細書中での抗体との言及は、ヒト抗体種のそのようなクラス、サブクラスおよび型の全てに対する言及を含む。本明細書中に記載される実施例で使用される抗体は、一般的に、従来のハイブリドーマ法によって得られ、硫酸アンモニウム（４５％）沈殿、遠心分離およびプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって、腹水から精製された。モノクローナル抗体を作製する標準的なプロセスは、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５  Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７に記載される。もちろん、モノクローナル抗体を作製する特定の方法および種類は、そのような技術に限定されず、そのような抗体を作製するための任意の技術は、本明細書中に記載される実施形態の範囲内にあることが想定される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「固体マトリックス」または「固相捕捉媒体」とは、細胞集合サンプル（例えば、生理学的に適合性のビーズ）から分離することができる任意のマトリックスまたは媒体を指す。このようなマトリックスまたは媒体の特徴としては、屈折指数、大きさ、光散乱強度、または固有の蛍光特色を与える蛍光検出色素を含むことが挙げられる。このようなビーズは、当技術分野では従来から利用可能である。例えば、固相捕捉媒体の１つのサブセットは、直径約０．２〜約５．０ミクロンの大きさ範囲（すなわち、コロイドの大きさ）のポリスチレンビーズなどの安定なコロイド粒子を含む。そのようなポリスチレン基材またはビーズは、アルデヒド官能基および／またはサルフェート官能基を含んでいてもよく、例えば、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポートランド、オレゴン州）から市販されるものであってもよい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「発現」は、物質または基質の産生、ならびに物質または基質の産生レベルまたは産生量を指す。出現するｈＥＳに由来する細胞集合を表現型マーカーによって評価し、発現パターンを分析し、どの因子が分化経路にプラスまたはマイナスの影響を及ぼすかだけでなく、特に、それらがどの細胞型を生成するかを決定する。したがって、特異的なマーカーの発現を決定することは、発現されるマーカーの相対量または絶対量のいずれかを検出すること、または単にマーカーの存在または非存在を検出することを指す。言い換えると、マーカーが、タンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは一部である場合、特定の細胞または組織における１つ以上のタンパク質の存在および存在量（レベル）についてタンパク質発現を測定し、定量する種々の方法が存在する。１つの方法は、関心のあるマーカー／タンパク質に対してウエスタンブロットを行い、それによって細胞溶解物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、目的のタンパク質に対する抗体でプローブすることである。抗体は、イメージングまたは定量化のために、フルオロフォアまたは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させることができる。細胞中の特定のタンパク質の量をアッセイするために一般的に使用される別の方法は、蛍光顕微鏡を用いて直接画像化することができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子にタンパク質の複写物を融合させることである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、「発現しない」との句、およびその均等語は、マーカーまたは基材の検出不可能な発現を指す。他の実施形態では、「発現しない」との句、およびその均等語は、検出可能であるが、有意ではないマーカー発現を指す。特定の実施形態では、有意でないマーカー発現とは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応のような感受性の高い技術によっては検出可能であるが、免疫細胞化学のような感受性の低い技術によってはほとんど検出されないマーカー発現を指す。
【００６２】
典型的には、選択は、この細胞表面タンパク質を特異的に認識することができる抗体を用いて行われる。しかし、本発明は、ポリヌクレオチドまたは低分子などのさらなる薬剤を想定する。
【００６３】
抗体アレイ：
Ｓｈａｒｖｉｋｉｎら（前出）に記載される手順を用い、抗体アレイスクリーニングを行った。２３１種類のモノクローナルマウス抗ヒト抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のパネルを用い、ヒドロゲルコーティングしたスライド（Ｆｕｌｌ  Ｍｏｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の固体ピン（Ｔｏｔａｌ  ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）を有するＭｉｃｒｏｇｒｉｄプリンターでアレイを印刷した。ヒト細胞表面マーカーの抗体を、濃度０．５ｍｇ／ｍｌで５つのスポットに印刷し、それぞれ、単一のスタンプを使用し、７５０μｍの間隔があけられた。印刷後、アレイを４℃の加湿器で４８時間水和し、次いで、室温で１０分間乾燥させた。
【００６４】
ＦＣＣＳの手順：
ＴｒｙｐＬＥ（商標）を用い、細胞を解離させた。Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２６０４）で４分間、その後、１０％ＦＢＳのＰＢＳ溶液を用いてクエンチした。次いで、これらを、２μｌのＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ  ２Ｕ／μｌ）を追加したヒト膵島媒体２５０〜５００μｌ中、合計濃度約０．５×１０６細胞／ｍｌでアレイに接種した。アレイ上で細胞をインキュベートする前に、印刷された領域を、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を用いて３分間ブロックした。ブロック溶液を細胞懸濁物と置き換え、アレイを３７℃で１時間インキュベートした。過剰な細胞を大量のＰＢＳで除去し、アレイを４％パラホルムアルデヒド溶液中で１０分間固定した。アレイ上の細胞を、０．２％トリトンＸ−１００溶液に２０分間に浸透させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ブロックバッファー（２％ＦＢＳ、２％ＢＳＡ、５０ｍＭグリシンのＰＢＳ溶液）で４５分間ブロックした。ブロック後、アレイをＰＢＳで２回洗浄し、一次抗体：モルモット抗−インスリン（ＤＡＫＯ、Ａ０５６４）およびウサギ抗−グルカゴン（ＤＡＫＯ、Ａ０５６５）抗体を含むワーキングバッファー（１：１０希釈したブロックバッファーに０．１％のトリトンを加えたもの）中、室温で２時間インキュベートした。一次抗体を除去し、アレイをワーキングバッファーを用いて３回洗浄した。次いで、室温で４５分間インキュベートするために、ワーキングバッファーに二次抗体であるｃｙ５ロバ抗−モルモット（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７０６−１７５−１４８）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ロバ抗−ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１１−５４５−１５２）を加えた。インキュベート期間の後、アレイをワーキングバッファーで３回洗浄し、自動化された高含量蛍光顕微鏡（ＩＸｍｉｃｒｏ、ＭＤＣ）を用いて画像化した。
【００６５】
統計学：遺伝子発現差のＰ値は、等分散を有する２標本の対応のあるｔ検定（片側）を用いて計算した。反復数（ｎ）は、異なるバッチに由来するサンプルを用いた生物学的な複製を表す。
【００６６】
分離方法：
種々の物理特性（例えば、蛍光特性）または他の光学特性、磁気特性、密度、電気特性などに従って、本発明の新規な分離方法に加え、またはこれと組み合わせて、細胞の分離を行ってもよい。細胞型は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、タンパク質が接合した磁気ビーズ分離、形態学的基準、特異的な遺伝子発現パターン（ＲＴ−ＰＣＲを用いる）、または特異的な抗体染色を含め、種々の手段によって単離することができる。
【００６７】
分離技術の使用としては、限定されないが、物理的な差に基づくもの（密度勾配遠心分離および向流遠心分離分級）、細胞表面に基づくもの（レクチンおよび抗体親和性）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色および生体染色特性に基づくもの（ミトコンドリアに結合する染料ｒｈｏ１２３およびＤＮＡに結合する染料Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）が挙げられる。
【００６８】
様々な技術を用い、細胞を分離することができる。モノクローナル抗体は、特に有用である。この抗体は、分離を可能にするために固体支持体に接続させることができる。使用される分離技術は、回収される画分の生存率の保持が最大になるようにすべきである。
【００６９】
有効性が異なる様々な技術を用いて、「比較的粗い」分離を得てもよい。そのような分離は、存在する全細胞の３０％まで、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下が、保持されるべき細胞集合と共に残っている望ましくない細胞である。使用される特定の技術は、分離の効率、関連する細胞傷害性、性能の容易さおよび速度、および高度な装置および／または技術的スキルの必要性に依存して変わる。
分離のための手順は、抗体コーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、モノクローナル抗体に接続しているか、またはモノクローナル抗体と組み合わせて使用される細胞毒性薬剤（例えば、相補体および細胞毒）、および固体マトリックス（例えば、プレート）に接続した抗体を用いた「パニング」、または他の従来技術を含んでいてもよい。
【００７０】
正確な分離を提供する技術としては、例えば、種々の精密度、例えば、複数の色チャンネル、低角度および鈍い光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することが可能な蛍光活性化細胞選別が挙げられる。アフィニティカラムなどの正確な分離を可能にする、陽性選択のための他の技術を用いることができる。
分離に使用される抗体は、特定の細胞型の分離を容易にするために、マーカー（例えば、直接的な分離が可能な磁気ビーズ、支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて除去化能なビオチン、蛍光活性化細胞選別と共に使用可能な蛍光色素など）と接続していてもよい。残った細胞の生存率に過度に有害ではない任意の技術を用いることができる。
【００７１】
細胞の濃縮は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの既知の細胞選別手順を用いて行われてもよい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「フローサイトメトリー」という用語は、サンプル中の材料の集合（例えば、特定のマーカーを含む腎細胞）が、その材料の標識化によって（例えば、標識化された抗体を材料に結合することによって）決定され、その材料を含む液体の流れに光ビームが通過し、サンプルから発せられた光を、一連のフィルタと鏡によって構成要素の波長に分離し、その光を検出するアッセイを指す。
【００７３】
例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウンテンビュー、ＣＡ）を含め、多数のフローサイトメーターが市販されている。ＦＡＣＳ分析に使用可能な抗体は、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ  Ｓ，Ｂｏｕｍｅｌｌ  Ｌら［Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９５］に教示されており、広く市販されている。
【００７４】
抗体が磁気部分に（直接的に、または間接的に同族の結合分子を介して）接続する場合、異種の細胞集合は、磁気活性化細胞分離によって、ＣＤ４９Ａ＋細胞が濃縮されてもよい。
【００７５】
ＣＤ４９Ａ抗体が親和性部分に接続する場合、異種の細胞集合は、同族の結合分子を用いたアフィニティ精製によって、ＣＤ４９Ａ＋細胞が濃縮されてもよい。したがって、例えば、ＣＤ４９Ａ抗体がビオチンに接続する場合、異種の細胞集合は、ストレプトアビジンビーズまたはカラムを用いた精製によってＣＤ４９Ａ＋が枯渇されてもよい。その後、ＣＤ４９Ａ＋細胞を回収することができる。例えば、ＣＤ４９Ａ抗体が抗体または抗体のＦｃに接続する場合、異種の細胞集合は、プロテインＡビーズまたはカラムを用いた精製によってＣＤ４９Ａ＋が枯渇されてもよい。その後、ＣＤ４９Ａ＋細胞を回収することができる。
【００７６】
本発明のこの態様の分化した細胞は、典型的にはクラスターとして成長するため、細胞選別の前に、異種の細胞集合は、好ましくは、分散剤を用いて分散されるべきであることが理解されるだろう。
【００７７】
分散剤の例としては、限定されないが、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、アキュターゼおよびトリプシンが挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、細胞の分散性を高めるために粉砕を行ってもよい。
【００７８】
ＣＤ４９Ａ＋細胞の濃縮の後、細胞は、典型的には、再凝集を可能にする条件下で、少なくとも２日間、好ましくは８日間以下（例えば、２〜６日間）培養される。典型的には、細胞は、カルシウム依存性の細胞−細胞相互作用を阻害する薬剤存在下で再凝集する。このような薬剤の例としては、ＥＤＴＡが挙げられる。
【００７９】
特定の実施形態によれば、再凝集は、低グルコース濃度（すなわち、初期分化段階のグルコース濃度よりも低い濃度）で効率的である。本願発明者らによって想定される例示的なグルコース範囲としては、１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜８ｍＭ、例えば、５．５ｍＭが挙げられる。
【００８０】
再凝集を起こさせるために、細胞を培養皿（例えば、低接着性結合プレート）中で培養してもよいし、固体支持体（すなわち、本明細書においてさらに記載するような足場材）の上に接種してもよい。
【００８１】
本発明によって想定される典型的な足場材としては、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、デンプン、ポリ（アミノ酸）、ポリ（プロピレンフマレート）、ゼラチン、アルギネート、ペクチン、フィブリン、酸化セルロース、キチン、キトサン、トロポエラスチン、ヒアルロン酸、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ（ビニルアルコール）から製造されるものが挙げられる。
【００８２】
一実施形態によれば、足場材は、生体適合性ポリマーから製造される。
【００８３】
「生体適合性ポリマー」との句は、生物の細胞、組織または体液と接触したときに、免疫学的反応および／または拒絶反応などの有害な影響を誘発しない任意のポリマー（合成または天然）を指す。生体適合性ポリマーは、生分解性ポリマーであってもよいことが理解されるだろう。
【００８４】
「生分解性ポリマー」という句は、プロテアーゼなどの生理学的環境において分解され得る（すなわち、破壊され得る）合成または天然のポリマーを指す。生分解性は、分解基材の利用可能性（すなわち、ポリマーの一部である、生体材料またはその一部）、生分解材料の存在（例えば、微生物、酵素、タンパク質）および酸素の利用可能性（好気性生物、微生物またはその一部のために）、二酸化炭素の利用可能性（嫌気性生物、微生物またはその一部のために）および／または他の栄養素に依存する。生分解性ポリマーの例としては、限定されないが、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩまたはＩＶ）、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、ＰＥＧ−ＤＭＡ、アルギネート、キトサンコポリマー、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００８５】
例示的な実施形態によれば、足場材は、多孔性のアルギネートスポンジを含む。
【００８６】
膵臓内分泌系統の細胞の特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系統のさらなる特徴的なマーカーが引き続き同定されている。これらのマーカーを使用し、本発明に従って処置された細胞が分化し、膵臓内分泌系統に特徴的な特性を獲得したことを確認することができる。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーには、Ｎｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤおよびＩｓｌｅｔ−１などの１つ以上の転写因子の発現が含まれる。
【００８７】
β細胞系統の細胞の特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、β細胞系統のさらなる特徴的なマーカーが引き続き同定されている。これらのマーカーを使用し、本発明に従って処置された細胞が分化し、β細胞系統に特徴的な特性を獲得したことを確認することができる。β細胞系統に特有の特徴としては、特に、例えばＰｄｘ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３βおよびＭａｆＡなどの１つ以上の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定のために当該分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：５２４−６３２（２００２））を参照。
【００８８】
分化の効率は、処置された細胞集合を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）にさらすことによって決定されてもよい。または、分化の効率は、処置された細胞集合を、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）にさらすことによって決定されてもよい。
【００８９】
培養された細胞または単離された細胞におけるタンパク質および核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当技術分野で標準的である。これらの方法には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、２００１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））および免疫アッセイ、例えば、切断した材料の免疫組織化学アッセイ、ウエスタンブロット、およびインタクトな細胞に接近可能なマーカーのために、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）が含まれる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）。
【００９０】
分化および成熟の後、最終産物は、例えば、島形態を有する領域を選択し、収穫するために、顕微鏡に連結したコンピュータ制御されたロボットアームを用いることによって、またはＦＡＣＳを用い、特定のマーカーを選択することによって、膵島細胞が濃縮されていてもよい。この手順は、多能性ＥＳ細胞による汚染の危険性およびインビボでの細胞移植後の奇形腫のリスクを回避する。
【００９１】
本発明の膵島細胞はインスリンを発現するため、糖尿病などのインスリン欠乏に関連する疾患を治療するために使用されてもよい。
【００９２】
Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦ−Ａを同時に発現する限り、まだ天然に存在する膵島と同様のインスリンレベルを発現しない膵臓内分泌系統にコミットした細胞を、移植に使用してもよい（未成熟膵島細胞）ことが理解されるだろう。これらの細胞は、正しいインビボ環境にあるとき、成熟するように刺激され、すなわち、高レベルのインスリンを発現するように刺激される。
【００９３】
したがって、本発明の別の態様によれば、治療に有効な量の本発明の膵島細胞を被験体に移植し、それによって糖尿病を治療することを含む、被験体において糖尿病を治療する方法が提供される。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「糖尿病」とは、生物において、インスリンの生合成または産生の欠陥に起因するインスリンの絶対的な欠乏（１型糖尿病）、またはインスリン抵抗性が存在する状態でのインスリンの相対的な欠乏（２型糖尿病）、すなわち、インスリン作用の障害のいずれかから生じる疾患を指す。したがって、糖尿病患者は、絶対的または相対的なインスリン欠乏を有し、他の症状および兆候の中でも、特に、血中グルコース濃度の上昇、尿中のグルコースの存在、および尿の過剰排出を示す。
【００９５】
「治療する」という句は、疾患、障害または状態の進行を阻害または阻止すること、および／または疾患、障害または状態に罹患しているか、またはそう診断された個体における疾患、障害または状態の軽減、緩解または回復を起こさせることを指す。当業者は、疾患、障害または状態の進行を評価するために使用可能な種々の方法論およびアッセイと、同様に、疾患、障害または状態の減少、寛解または退縮を評価するために使用可能な種々の方法論およびアッセイに気づくだろう。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「移植」とは、任意の適切な経路を使用して、本発明の膵島細胞を提供することを指す。典型的には、β細胞療法は、カテーテルを用いた肝臓の門脈への注射によって行われるが、他の投与方法も想定される（例えば、皮下または腹腔内または脂肪組織内）。
【００９７】
本発明の膵島細胞は、自己供給源、半自己供給源または同種供給源に由来していてもよい。非自己細胞は、身体に投与されたときに免疫反応を誘発する可能性が高いので、非自己細胞の拒絶反応の可能性を低減するためのいくつかの手法が開発されている。この手法には、移植前にレシピエントの免疫系を抑制するか、免疫分離する半透膜の中に非自己細胞をカプセル化するかのいずれかが含まれる。
【００９８】
カプセル化技術は、一般に、より大きな平らなシートおよび中空繊維膜を含む小さな球状ビヒクルおよびマクロカプセル化を含む、マイクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ら、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０００；４２：２９−６４）。
【００９９】
マイクロカプセルを調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｌｕ  ＭＺら、Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０００、７０：４７９−８３、Ｃｈａｎｇ  ＴＭ  ａｎｄ  Ｐｒａｋａｓｈ  Ｓ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１、１７：２４９−６０およびＬｕ  ＭＺら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２０００、１７：２４５−５１に開示される方法が挙げられる。
【０１００】
例えば、修飾したコラーゲンを、２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマーシェルで複合体化することによって、マイクロカプセルを調製し、厚み２〜５μｍのカプセルを得る。このようなマイクロカプセルは、負に帯電した平滑な表面を与え、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらに２〜５μｍのターポリマーシェルでカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２  ２３：８４９−５６）。
【０１０１】
他のマイクロカプセルは、海洋多糖類であるアルギネート（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３、５：６６５−８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウム存在下、多価アニオンであるアルギン酸ナトリウムおよびナトリウムセルロースサルフェートと、多価カチオンであるポリ（メチレン−コ−グアニジン）塩酸塩との高分子電解質の複合体化によって調製することができる。
【０１０２】
もっと小さなカプセルを用いれば、細胞のカプセル化が改善されることが理解されるだろう。したがって、カプセル化された細胞の品質の制御、機械的な安定性、拡散特性およびインビトロでの活性は、カプセルの大きさが１ｍｍ〜４００μｍまで小さくなったときに向上した（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．ら、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．２００２；１３：７８３−９６）。さらに、７ｎｍ程度の小ささの十分に制御された孔径を有し、表面化学および正確な微細構造が調節されたナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾よく免疫単離することがわかった（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９、１０：６−９；Ｄｅｓａｉ，  Ｔ．Ａ．Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２，  ２：６３３−４６）。
【０１０３】
免疫抑制剤の例としては、限定されないが、メトトレキセート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標登録））、エタネルセプト、ＴＮＦαブロッカー、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、限定されないが、アセチルサリチル酸、コリンマグネシウムサリチレート、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが挙げられる。
【０１０４】
適切な場合、患者を、移植された細胞の生存および機能を促進する医薬薬剤または生物活性物質を用いてさらに処置することができる。これらの薬剤としては、特に、例えば、インスリン、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（アクチビンＡ、ＴＧＦ−β１、２および３を含む）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２および−１３）、線維芽細胞増殖因子−１および−２、血小板由来成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ、血小板を豊富に含む血漿、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１５）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、β−セルリンが挙げられる。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびＩＩ、ＧＬＰ−１および２ミメティボディ、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモンが挙げられる。
【０１０５】
インドラクタムＶまたはＰＭＡまたはＭＡＰＫ阻害剤、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物。
【０１０６】
本発明の細胞は、それ自体をヒト被験体に移植してもよく、または適切な担体または賦形剤と混合した医薬組成物の状態で移植してもよい。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および賦形剤のような他の化学成分と共に、本明細書に記載される１つ以上の細胞集合の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１０８】
以下において、相互に置き換え可能に使用されてもよい「生理学的に許容される担体」および「医薬的に許容される担体」という句は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの句に含まれる。
【０１０９】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって、当技術分野で周知の方法によって製造されてもよい。
【０１１１】
したがって、本発明の使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む１種類以上の生理学的に許容される担体を用い、従来の様式で配合されてもよく、活性成分を調製物へと加工するのが容易になり、医薬的に使用することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１１２】
注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理的塩緩衝液のような生理学的に適合したバッファー中に配合されてもよい。
【０１１３】
本発明の観点で使用するのに適した医薬組成物には、意図された目的を達成するのに有効な量で活性成分を含む組成物が含まれる。より具体的には、治療に有効な量は、障害（例えば、糖尿病）の症状を予防し、緩和または軽減するのに有効であるか、または処置される被験体の生存を延ばすのに有効な活性成分（インスリン産生細胞）の量を意味する。
【０１１４】
治療に有効な量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１５】
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療に有効な量または用量は、動物モデル（例えば、ＳＴＺ糖尿病マウス）から推定して、所望の濃度または力価を達成することができる。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１１６】
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらの動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量の範囲を定式化する際に使用することができる。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。実際の製剤、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈ．１、ｐ．１を参照）。
【０１１７】
投薬量および投薬間隔は、正常血糖を誘発するのに十分な細胞数（最小有効濃度、ＭＥＣ）を与えるように個々に調節されてもよい。ＭＥＣは、各調製物で異なるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与経路に依存するだろう。検出アッセイを使用し、血漿濃度を決定することができる。
【０１１８】
投与される組成物の量は、もちろん、治療される被験体、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存するだろう。
【０１１９】
本発明の組成物は、所望な場合、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含有し得る、ＦＤＡによって承認されたキットなどの小袋またはディスペンサデバイスで提供されてもよい。小袋は、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックの箔を含んでいてもよい。小袋またはディスペンサデバイスには、投与のための指示書が付随していてもよい。小袋またはディスペンサには、医薬の製造、使用または販売を規制する政府機関によって記載された形態で容器に関連する注意書きが付随していてもよく、注意書きは、組成物の形態またはヒトまたは動物への投与の機関による承認を反映している。このような注意書きは、例えば、処方薬または承認された製品挿入物について、米国食品医薬品局によって承認されたラベルであってもよい。上にさらに詳細に記載したように、適合性のある医薬担体に配合される本発明の調製物を含む組成物が調製され、適切な容器に入れられ、適応状態の治療のためにラベルが付けられていてもよい。
【０１２０】
本発明は、細胞を三次元支持体に組み込むことも想定する。細胞は、患者に移植する前に、この支持体の上でインビトロで維持することができる。または、細胞を含有する支持体を、さらなるインビトロでの培養を行うことなく、患者に直接移植することができる。支持体は、場合により、移植された細胞の生存および機能を促進する少なくとも１つの医薬薬剤と共に組み込まれてもよい。
【０１２１】
本発明の目的に使用するのに適した支持材料には、組織修復に有用な組織テンプレート、導路、障壁およびリザーバが含まれる。特に、フォーム、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、布地および不織構造の形態の合成材料および天然材料は、生体組織を再構成または再生するためにインビトロまたはインビボで使用されており、また、組織の成長を誘発するための化学走性薬剤を送達するために使用されており、本発明の方法を実施するときに使用するのに適している。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号および米国特許第６，３３３，０２９号に開示される材料を参照のこと。
【０１２２】
薬剤と組み合わされた支持体を形成するために、支持体を形成する前に医薬薬剤をポリマー溶液と混合してもよい。または、製造された支持体の上に、好ましくは医薬担体存在下で、医薬薬剤をコーティングすることができる。医薬薬剤は、液体、細かく分割された固体、または任意の他の適切な物理的形態として存在してもよい。または、医薬薬剤の放出速度を変更するために、賦形剤を支持体に添加してもよい。代替的な実施形態では、支持体は、例えば、米国特許第６，５０９，３６９号に開示されている化合物などの抗炎症性化合物である少なくとも１つの医薬化合物と共に組み込むことができる。
【０１２３】
支持体は、例えば、米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物などの抗アポトーシス性化合物である少なくとも１つの医薬化合物と共に組み込むことができる。
【０１２４】
支持体は、例えば、米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物などの線維症の阻害剤である少なくとも１つの医薬化合物と共に組み込むことができる。
【０１２５】
支持体は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号および米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号に開示される化合物などの血管新生を向上させることが可能な少なくとも１つの医薬化合物と共に組み込むことができる。
【０１２６】
支持体は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物などの免疫抑制化合物である少なくとも１つの医薬化合物と共に組み込むことができる。
【０１２７】
支持体は、少なくとも１種類の医薬化合物、特に、成長因子、例えば、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（ＴＧＦ−β１、２および３を含む）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２および−１３）、線維芽細胞増殖因子−１および−２、血小板由来成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ、血小板を豊富に含む血漿、インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンと共に組み込まれてもよい。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導性因子１−α、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ミメティボディおよびＩＩ、エキセンディン−４、ノーダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞およびヘパリン結合ドメインを含む生物学的ペプチド、ＭＡＰＫ阻害剤、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物が挙げられるだろう。
【０１２８】
本発明の細胞を足場材に組み込むことは、細胞を足場材の上に単純に沈着させることによって達成することができる。細胞は、単純拡散によって足場材に入り込むことができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ  ２）：３−９（１９８８））。細胞接種の効率を高めるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、ポリグリコール酸足場材に軟骨細胞を接種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３−２０２（１９９８））。細胞を接種するための別の手法は、遠心分離の使用であり、接種した細胞に対するストレスを最小限にし、接種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、細胞接種法を開発し（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９−８６（２００１））、この方法は、遠心分離細胞固定化（ＣＣＩ）と呼ばれている。
【０１２９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、限定することを意図するものではない以下の実施例の実施により当業者には明らかになるだろう。さらに、本明細書で上に記載され、特許請求の範囲の章で請求される本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、以下の実施例における実験的な裏付けを見出す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０１３１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびこれらの組み合わせは、「〜を含むが、これに限定されない」を意味している。
【０１３２】
「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）という用語は、「〜を含み、これに限定される」を意味している。
【０１３３】
「〜から本質的になる」という用語は、さらなる成分、工程および／または部分が、請求される組成物、方法または構造の基本的で新規な特徴を実質的に変更しない場合にのみ、組成物、方法または構造が、さらなる成分、工程および／または部分を含んでいてもよいことを意味する。
【０１３４】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態を、ある範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記載は、単なる便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６のような下位範囲、およびその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示したものと考えるべきである。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１３５】
本明細書に数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定の数と第２の指定の数との間の「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅ）」および第１の指定の数「から」第２の指定の数「までの」範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅ）という句は、本明細書で相互に置き換え可能に使用され、第１の指定の数と第２の指定の数と、その間の全ての分数および整数を含むことを意味している。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術および手順を指し、限定されないが、化学、医薬品学、生物学、生化学および医薬の分野の当業者に知られている様式、手段、技術および手順、または既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含む。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、ある状態の進行を抑止し、実質的に阻害し、遅らせるか、または逆行させること、ある状態の臨床的または審美的な症状を実質的に緩和すること、またはある状態の臨床的または審美的な症状の外観を実質的に防ぐことを含む。
【０１３８】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。これとは逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔にするために、１つの実施形態の観点で記載されており、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載されている実施形態で適切なものとして与えられてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなすべきではない。
【０１３９】
本明細書で上に記載され、特許請求の範囲の章で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例における実験的な裏付けを見出す。
【実施例】
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で示す上の記載と共に、本発明のいくつかの実施形態を参照する。
【０１４１】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子生物学的、生化学的、微生物学的な技術および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．編集（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編集）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、Ｖｏｌｓ．１−４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に示される方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編集）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範囲に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編集（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒ��ｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編集（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編集（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編集（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．１−３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照（これら全ては、本明細書に完全に記載されているかのように参考として組み込まれる）。他の一般的な参考文献は、この文書を通して提供されている。その中の手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報は、参考として本明細書に組み込まれる。
[実施例１]
多能性幹細胞からインスリン産生細胞へと分化させるための手順
【０１４２】
多能性幹細胞を２Ｄで、Ｅ８培地およびビトロネクチンコーティングを用いて成長させた。コンフルエントな培養物（８０〜９０％）を、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）解離によって収穫した。ＥＤＴＡ除去の後、単一の細胞懸濁物にＲｏｃｋ阻害剤（１０ｕＭ）を追加した。細胞を、４８時間で均一な凝集物（４０〜８０ｕｍ）を形成するために、超低結合性６ウェルプレート、エレンマイヤーフラスコまたはスピナーフラスコに、動的懸濁状態で接種し（０．５〜１×１０６細胞／ｍｌ）、８０％の培地を凝集から１日後に交換した。４８時間凝集させた後、凝集物に対し、新規の分化プロトコルを行った。
【０１４３】
この分化プロトコルは、ＲＰＭＩ−１６４０  ＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ  ＧｌｕｃｏｓｅおよびＣＭＲＬ−１０６６の３種類の基本培地を利用する。分化の１日目（第０日）に、細胞をＰＢＳと、ＣＨＩＲ（３ｕＭ）、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＣＳ  ０．２％、ＩＴＳ  １：５０００、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。第１日に、８０％培地を、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＣＳ  ０．２％、ＩＴＳ  １：５０００、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地に交換した。第２日に、８０％培地を、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦｂ−ＲＩ（２．５ｕＭ）、ＦＣＳ  ０．２％、ＩＴＳ  １：１０００、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地に交換した。第３日に、８０％培地を、第２日と同じように、但し、ＴＧＦｂ−ＲＩを含めずに交換した。第５日および第６日に、８０％培地を、１％  Ｂ２７、ＲＡ  １ｕＭ、ＫＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＴＢＰ  ２００ｎＭ、ＬＤＮ  １００ｎＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に交換した。第７日、第９日、第１０日および第１２日に、８０％培地を、１％  Ｂ２７、ＲＡ  ０．１ｕＭ、ＫＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＡＡ  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に交換した。第１３日および第１５日に、８０％培地を、１％  Ｂ２７、ＲＡ  ０．１ｕＭ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、Ｔ３  １ｕＭ、ヘパリン１０ｕｇ／ｍｌ、ＧＳＩｘｘ  １ｕＭ、ＡＡ  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に交換した。第１７日および第１９日に、８０％培地を、１％  Ｂ２７、ＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、Ｔ３  １ｕＭ、ヘパリン１０ｕｇ／ｍｌ、ＧＳＩｘｘ  １ｕＭ、ＡＡ  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に交換した。第２０日から、８０％培地を、１０％  ＦＣＳ、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、Ｔ３  １ｕＭ、Ｎ−アセチル−システイン  ０．５ｍＭ、ＡＸＬｉ  １ｕＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＣＭＲＬ−１０６６培地に交換し、１日おきに交換した。
[実施例２]
インスリン＋細胞の割合を濃縮する細胞表面マーカーを同定するための機能細胞捕捉スクリーン（ＦＣＣＳ）の使用
【０１４４】
細胞型に特異的な機能に関連する細胞表面マーカーを同定する反復的ハイスループットスクリーニングが使用された。分析を３工程で行い、所望の細胞のためのマーカーの同定を改良するために、これを繰り返した。第１の工程では、異種サンプルを単細胞懸濁物に解離させ、細胞表面マーカー抗原に対する２３１種類の異なる抗体を用いて印刷したスライドグラス上に接種する（各抗体スポットは、５個ずつの繰り返しで表される）。アレイ上の細胞の捕捉は、印刷された抗体による抗原の認識に基づくため、密集したスポットは、異種サンプル中の細胞全体によって発現する細胞表面マーカーのリストを与える。各マーカーは、サンプル内の１つ以上の細胞型によって発現され得る。同定されたマーカーと所望の細胞型との間の関連性を決定するために、アレイ上の細胞を、細胞型に特異的な機能性を示す抗体で免疫染色した。分析は、自動化された高含量蛍光顕微鏡（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ）を用いてアレイを画像化し、各スポットについて関連する機能的な標識について陽性である細胞の割合を計算することによって行った。標識された細胞で濃縮されたスポットは、所望の機能性を有する細胞の濃縮のための候補表面マーカーを規定する。これらのマーカーを用いて細胞をＦＡＣＳによって選別し、関連する機能的遺伝子の発現レベルを測定することによって、細胞型に特異的な濃縮を確認した。濃縮をさらに洗練するために、検証したマーカーを用いて選別した細胞を用い、この手順を繰り返した。
【０１４５】
図１に示すように、ＥＳ由来の膵臓細胞を、機能細胞捕捉スクリーニングによって分析した。細胞表面抗体アレイ上で単一細胞を短時間インキュベートした後、細胞を固定し、インスリンについて染色した（緑色）。高含量スクリーニング分析を用い、各スポットに対して結合した細胞の総数を決定した。さらに、各スポットにおけるインスリン＋細胞の割合を計算した（表１）。インスリン＋細胞のための濃縮マーカー（陽性選択マーカー）としてＣＤ４９Ａ（平均３３％インスリン＋）およびＣＤ９９（平均１９％インスリン＋）の４種類のマーカーの出力シグナルの例を示した。インスリン＋細胞の割合は、関連する集合を定義する最初の工程であった。それでもなお、分析段階で、いくつかのマーカーがポリホルモンであるインスリン陽性細胞を表すことが見出された。これらのマーカーは、非常に少量のインスリンを発現する細胞ＣＤ７３およびＣＤ６６Ｃと共に、ＮＫＸ６．１発現、ＣＤ２６、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ２９４がないため、陰性選択マーカーともみなされる。
【０１４６】
【表１】
2018534949.tif 000002
[実施例３]
細胞表面抗体を用いた細胞選別
【０１４７】
アレイ内に出現した細胞表面抗体を用い、細胞選別を行った。蛍光共役した抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）：ＣＤ１０−ＦＩＴＣ、ＣＤ４９−ＰＥ、ＣＤ２９４−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ２６−ＰＥまたはＣＤ２６−ＰｅｒｃＰｃｙ５．５、ＣＤ２００−ＡＰＣ（ｎｏ．３２９２０７）、ＣＤ７３−ＰＥ−Ｃｙ７（ｎｏ．３４４００９）、ＣＤ５７−ＡＰＣ（ｎｏ．３２２３１３）、ＣＤ５９−ＦＩＴＣ（ｎｏ．３０４７０６）、ＣＤ３４０−ＰｅｒｃＰｃｙ５．５（ｎｏ．３２４４１５）およびＣＤ４９Ｆ−ＰＥ−ＣＹ７（ｎｏ．３１３６２２）を用い、細胞表面マーカー分析を行った。細胞凝集物をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＴｒｙｐｌＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、３７℃で単一の細胞懸濁物に対し、酵素的に解離させた。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡおよび１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）に入れた。細胞を４℃で３０分間、表面マーカーと共にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、３５０ｇで５分間遠心分離した。フローサイトメトリーを用いて細胞選別を行い、懸濁した細胞を４０ミクロンのナイロンストレナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過し、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ）によって分析／選別した。閾値は、染色されていないサンプルまたは単一に染色されたサンプルを用いて決定した。交差を回避するために、各集合の遠端で、ゲートを採取した。
【０１４８】
図２に示すように、ＥＳ由来の膵臓細胞を解離させ、ＰＥが結合した抗ヒトＣＤ４９Ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３２８３０４）と共にインキュベートした。インキュベートの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ）を用い、ＣＤ４９Ａ＋集合およびＣＤ４９−集合を選別した。
[実施例４]
リアルタイム定量ＰＣＲによる検証
【０１４９】
ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ  ７４００４）を用い、選別された細胞の集合からＲＮＡを単離した。ＲＮＡｓｅを含まないＤＮａｓｅキット（Ｑｉａｇｅｎ  ７９２５４）を用いてＤＮＡを除去し、高用量ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３６８８１４）を用い、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。転写物のレベルは、Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４４４４５５７）を用いたＳｔｅｐ−Ｏｎｅ−ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムでリアルタイムｑＰＣＲを用いて測定した。各遺伝子のレベルは、ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨまたはＴＢＰを内在性コントロールｍＲＮＡとして用いて正規化した。ｑＰＣＲに使用したプライマーのカタログ番号を表２に列挙する。
【０１５０】
【表２】
2018534949.tif 000003
【０１５１】
図３に示すように、ＣＤ４９Ａ＋によって選別されたＥＳ由来の膵臓細胞集合からＲＮＡを精製した。ＱＰＣＲ分析は、ＣＤ４９Ａ＋集合において、ＣＤＡ４９−集合と比較して、インスリンｍＲＮＡの発現が５２％高いことを示した。さらに、ＣＤ４９Ａ＋集合は、グルカゴン発現の３４％の減少を示し、このことは、ＣＤ４９Ａが主にインスリン産生細胞に濃縮し、グルカゴン産生細胞には濃縮しないという事実を裏付けている。ＲＦＸ６およびＳｏｘ９などの初期膵臓発生マーカーの発現は、ＣＤ４９Ａ＋集合で顕著に低下し、このことは、これらの細胞が成熟表現型を有することを示唆している。高度に発現された遺伝子における最も顕著な変化は、ＭＡＦＡ発現にあり、ＣＤ４９Ａ＋集合の場合には、ＣＤ４９Ａ−集合よりも約１７０倍多く発現する。遺伝子発現は、２−ΔΔＣｔ法を用い、ＣＤ４９Ａ−集合に対する発現（ＲＱ＝１）と比較して、ＴＢＰ／ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに対して正規化される。
[実施例５]
陰性選択マーカーの機能選別
【０１５２】
陰性選択マーカーの機能選別を図４Ａ〜図Ｄに示す。ＣＤ２６−について選別した細胞（Ｃ）またはＣＤ２６＋について選別した細胞（Ｄ）を、ＧＣＧについて内部染色した。インキュベート後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ）を用い、ＣＤ＋集合およびＣＤ−集合について選別した。
【０１５３】
図５に示すように、選別されたＥＳ由来の膵臓細胞集合からＲＮＡを精製した。ＱＰＣＲ分析は、ＣＤ２６＋集合およびＣＤ７３＋集合が、陰性集合と比較して、両方ともグルカゴンｍＲＮＡの高い発現を示すことを示した。さらに、陽性集合は、ＲＦＸ６およびＳｏｘ９などの初期膵臓発生マーカーのより高い発現を示し、このことは、ＣＤ２６−集合が、より成熟した発現型を有することを示唆している。高度に発現した遺伝子における最も顕著な変化は、非膵臓系統マーカーであるＡＦＰ内にある。ＡＦＰは、ＣＤ２６＋集合において高度に発現し、ＣＤ７３＋集合において、少ない程度に発現する。遺伝子発現は、２−ΔΔＣｔ法を用い、ＣＤ２６−集合に対する発現（ＲＱ＝１）と比較して、ＴＢＰ／ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに対して正規化される。
[実施例６]
インビボで選別された細胞集合の分泌能の評価
【０１５４】
選択された細胞集合をＭＡＣＳによって単離した。特定の細胞表面マーカーのための抗体を、磁気ビーズに付着させた。細胞を上述のビーズの中に流し、その細胞表面マーカーの発現に基づいて付着させた。単離された純粋な集合を、インビトロでＧＳＩＳ試験のために採取した。低グルコース（３．３ｍＭ）と比較して、高グルコース（２０ｍＭ）に応答して分泌されるインスリンの量を倍増させる集合を陽性とみなした。
【０１５５】
インビボで分泌能を評価するために、ＮＫＸ６．１／インスリンの高い発現、グルカゴンまたは非β細胞マーカーの低い発現を示し、ＧＳＩＳ陽性である細胞集合が、ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植された。
【０１５６】
インビボでの実験手順のために、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅ株の免疫不全マウス（７〜８週齢）を使用した。
【０１５７】
１０匹の未処置マウスのコントロール群を、移植マウスの群と比較した。５日間の馴化期間の後、マウスの体重を測定した。実験の第１日に、鎮痛薬を外科的処置の少なくとも３０分後に皮下投与し、その後、２〜３％のイソフルラン吸入による全身麻酔を行った。
【０１５８】
腎被膜下の移植：
皮膚は、胸郭の後ろの身体の左側方領域で斜めに切断され、続いて腹壁が切開された。
【０１５９】
腎被膜下への腎臓移植は、左の腎臓で行われ、腎臓を腹部と皮膚切開部を通って穏やかに引き出し、滅菌食塩水で洗浄し、その被膜を穿孔し、中空繊維またはカテーテル（長さ約１ｃｍ、直径０．６ｍｍ）を挿入し、これを通ってＩＬＣを被膜下に注射した。腎臓を、腹腔内の解剖学的位置に戻した。処置されたマウスあたりに移植／注射された細胞の数：約５×１０６。
腹壁をＶｉｃｒｙｌ  ５−０縫合糸で縫合し、皮膚を創傷クリップで閉じた。手術後少なくとも４８時間、疼痛緩和のために鎮痛薬を注射した。
【０１６０】
図６に示すように、選別されていない細胞を移植したマウスと比較して、ｈＰＳＣに由来するＣＤ４９Ａ＋細胞（３〜４×１０６細胞／マウス）を移植したマウスでは、３倍高いインビボ機能が測定された。
【０１６１】
皮下移植デバイスの移植：
皮膚は、脊椎に平行な胸郭の上の身体の左上の領域で切断される。皮下ポケットが作成され、デバイスが皮膚の下に挿入される。切開部を創傷クリップで閉じる。処置群におけるデバイスあたり移植された細胞の数：約５×１０６。手術後少なくとも４８時間、疼痛緩和のために鎮痛薬を注射される。
【０１６２】
動物は、毎日の臨床的なフォローアップ、毎週体重をチェックする、（種に特異的なＥＬＩＳＡキットを使用して）２週間ごとにそのｃ−ペプチド（ヒト）血中レベルをチェックすることにより、１０〜１２週間フォローアップされ、細胞機能（例えばインスリン分泌能）の評価が可能になる。試験手順：試験前１２時間は、マウスに食物を与えない。次いで、体重１グラムあたり２ｍｇの用量で、５０％デキストロースを注射する。この注射から４５分後に、軽い麻酔下で、眼窩後洞からＣ−ペプチドのレベルを評価するために血液サンプルを集める。採取する総血液量は、各マウスの総血液量の１０％を超えてはならない。
【０１６３】
実験終了時に、動物をＣＯ２吸入により安楽死させる。移植された腎臓またはデバイスは、その後の分析のために取り出され（死後）、ホルマリン溶液中で保存される。
[実施例７]
多能性幹細胞からインスリン産生細胞へと分化させるための代替的な手順
分化前の多能性幹細胞の成長
【０１６４】
多能性幹細胞を２Ｄで、Ｅ８培地およびビトロネクチンコーティングを用いて成長させた。コンフルエントな培養物（８０〜９０％）を、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）解離によって収穫した。遠心分離によるＥＤＴＡ除去の後、成長培地Ｅ８中の単一の細胞懸濁物にＲｏｃｋ阻害剤（１０ｕＭ）を追加した。細胞を、４８時間で均一な凝集物または細胞クラスター（４０〜８０ｕｍ）を形成するために、超低結合性６ウェルプレート、エレンマイヤーフラスコまたはスピナーフラスコに、動的懸濁状態で接種し（０．５〜１×１０６細胞／ｍｌ）、８０％の培地を接種から１日後に交換した。４８時間凝集させた後、凝集物に対し、既に定義した分化プロトコルを行った。分化プロトコル中、培地の交換は、古い培地の８０％を取り除き、同量の新しい培地または新しい組成物を戻すことを含んでいた。
【０１６５】
ＥＳ細胞は、９５％を超える段階特異的な胚抗原４（ＳＳＥＡ４）を発現し、９５％を超えるＴＲＡ１−６０、１００％のＥｐｃａｍを発現した。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）は０．２％未満の発現であった。純粋な多能性細胞から開始することは非常に重要であった。より多能性の低い細胞を使用した場合、懸濁物中のクラスター化および分化は得られなかった。
工程１  胚体内胚葉  ３日間
【０１６６】
第０日に、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｍｅｄｉｕｍ  Ａ（ＣＨＩＲ（３ｕＭ）、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２５ｍＭ  アスコルビン酸、２．４６ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）  ０．５％、ＩＴＳ  １：５０，０００、グルコース  ８ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に接種した。
【０１６７】
第１日に、培地の体積の８０％を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｂ（Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２５ｍＭ  アスコルビン酸、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ０．５％、ＩＴＳ  １：５００００、８ｍＭ  グルコース、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
工程２  原始腸管−２日間
【０１６８】
分化第２日に、細胞の９５％より多くがＣＸＣＲ４を発現し、９５％より多くがＳＯＸ１７を発現し、９５％より多くがＦＯＸＡ２を発現した。
【０１６９】
第３日に、培地の体積の８０％を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ（ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２５ｍＭ  アスコルビン酸、１．７５４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ０．５％、ＩＴＳ  １：５００００、８ｍＭ  グルコース、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
【０１７０】
第５日に、培地の体積の８０％を第３日と同様に更新した。
工程３  後部前腸−２日間
【０１７１】
第６日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（１．７５４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、  ＩＴＳ  １：２００、８ｍＭ  グルコース、ＲＡ  １ｕＭ、ＫＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＴＢＰ  ２００ｎＭ、ＬＤＮ  １００ｎＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１）に交換した。
【０１７２】
第７日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（１．２３ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、  ＩＴＳ  １：２００、８ｍＭ  グルコース、ＲＡ  １ｕＭ、ＫＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＴＢＰ  ２００ｎＭ、ＬＤＮ  １００ｎＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
工程４  膵臓前駆体−４日間
【０１７３】
第８日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ（１．２３ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、  ＩＴＳ  １：２００、８ｍＭ  グルコース、ＲＡ  ０．１ｕＭ、ＫＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＴＢＰ  １００ｎＭ、ＬＤＮ  ２００ｎＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
【０１７４】
分化第８日に、細胞の９０〜９５％がＰＤＸ１を発現し、１〜２％がＮＫＸ６．１を発現した。
【０１７５】
第１０日に、新しいＭｅｄｉｕｍ  Ｆを添加した。
工程５  膵臓内分泌前駆体−３日間
【０１７６】
第１２日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｇ（１．７５４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、  ＩＴＳ  １：２００、２０ｍＭ  グルコース、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、ＲＡ  ０．０５ｕＭ、ＳＡＮＴ１  ０．２５ｕＭ、ＬＤＮ  １００ｎＭ、Ｔ３  １ｕＭ、ヘパリン  １０ｕｇ／ｍｌ、ＺｎＳＯ４  １０ｕＭ  アスコルビン酸０．２５ｍＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１）に交換した。
【０１７７】
分化第１２日に、細胞の９０〜９５％がＰＤＸ１を発現し、細胞の６０〜７０％がＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時に発現した。
【０１７８】
第１４日に、新しいＭｅｄｉｕｍ  Ｇを添加した。
工程６  β細胞様集合（ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋／インスリン＋）の形成−８日間
【０１７９】
第１５日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｈ（１．７５４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、ＩＴＳ  １：２００、２０ｍＭ  グルコース、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、ＬＤＮ  １００ｎＭ、Ｔ３  １ｕＭ、ヘパリン  １０ｕｇ／ｍｌ、ＺｎＳＯ４  １０ｕＭ、ＧＳｉＸＸ  ０．１ｕＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
【０１８０】
分化第１５日に、細胞の分化６０％がＮＫＸ６．１を発現し、５〜１５％がＣ−ペプチドを発現した。細胞の３〜５％が、ＮＫＸ６．１とＣ−ペプチドを同時に発現した。
【０１８１】
第１７日、第１９日および第２１日に、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｈを更新した。
工程７  β細胞様細胞（ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋／Ｉｎｓ＋／ＭＡＦＡ＋）の成熟
【０１８２】
第２３日に、培地を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｉ（１．７５４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ＦＡＦ  ＢＳＡ  ２％、  ＩＴＳ  １：２００、２０ｍＭ  グルコース、ＡＬＫ５ｉ  １０ｕＭ、Ｔ３  １ｕＭ、ヘパリン  １０ｕｇ／ｍｌ、ＺｎＳＯ４  １０ｕＭ、Ｔｒｏｌｏｘ  １０ｕＭ、アスコルビン酸  ０．２５ｍＭ、Ｎ−アセチル−システイン  １ｍＭ、ＡＸＬｉ  ２ｕＭ、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびＧｌｕｔａｍａｘを追加したＭＣＤＢ  １３１培地）に交換した。
【０１８３】
第２４日に、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｉを更新した。
【０１８４】
第２６日、第２８日および第３０日に、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｉは移植前に更新された。
分化第２０〜３０日に、細胞の分化４０〜６０％がＮＫＸ６．１を発現し、４０〜４８％がＣ−ペプチドを発現した。細胞の１５〜３０％が、ＮＫＸ６．１とＣ−ペプチドを同時に発現した（表３）。
【０１８５】
分化のマーカーＣＸＣＲ４、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞の割合を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用い、以下の抗体（全て１：１００の希釈）を用い、フローサイトメトリーによって決定した。
ＣＸＣＲ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０６５０５
Ｃ−ペプチド；ＤＳＨＢ、ＧＮ−ＩＤ４
ＰＤＸ１；ＢＤ、５６３４３６
ＮＫＸ６．１，ＢＤ，５６３３３８
【０１８６】
測定は、各段階の終了時に、培地を交換する前に実施された。
【０１８７】
ＮＫＸ６．１／Ｃ−ペプチド二重陽性細胞の形成の動力学および分化プロトコルの最初から終了までのアスコルビン酸の添加の効果を図９〜図１１に示す。
【０１８８】
多能性幹細胞を懸濁物に接種し、６ウェルプレートに分配し（図９〜図１１）、またはスピナーフラスコにも接種し（図１０）、段階４の終了後（第１２日）、段階５の終了後（第１５日）、段階６の終了後（第２０日）および段階７の終了後（第３０日）に分化マーカーを測定した。レギュラー培地（標準）は、第０日から第８日までのアスコルビン酸を含有する。「処置」は、第０日から分化までの全段階のアスコルビン酸の添加（ＡＡ）から構成されていた。分化全体にわたってアスコルビン酸を添加する利点は、図１０〜図１１で観察され得る。ベータ様細胞の割合は、細胞をウェル中およびスピナー中で懸濁物の状態で培養した場合と似ている。しかし、スピナーは、必要な操作がウェルよりも少なく、回収される細胞数は、通常、ウェルよりも多い。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
上記のプロトコルに従って分化した５×１０６個の細胞を、免疫欠損マウスの腎被膜の下に移植した。移植から２週間後、動物を一晩絶食させた後、５０％グルコース溶液（２ｇ／Ｋｇ）を注射した（ＩＰ）。グルコース注入の３０分後に血液を採取した。血清中のヒトＣ−ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１９１】
図１１に示されるように、ＡＡ条件のない治療と比較して、アスコルビン酸（ＡＡ）処置において、ヒトインスリンＣ−ペプチドがさらに多かった。さらに、これらの細胞は、無傷なヒト膵島としての構造的構成を示した（図１２）。
【０１９２】
図１２に示すように、Ｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋が検出され、グルカゴン陰性であることが判明した。ソマトスタチンは、ごく少数の細胞で発現した。
[実施例８]
陰性選択マーカーおよび陽性選択マーカーの両方の機能選別
【０１９３】
実施例７に記載したように成長した分化第２１日の細胞を、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ５７およびＣＤ２６について外部染色した。５種類の集合を、その外部マーカーに従って選別した。選別された集合を、Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１について内部染色した。図７に示されるように、ＣＤ５７＋ＣＤ２６−ＣＤ４９Ｆ−集合が、以前選別した集合における２０．８％と比較して、４２．２％のｃ−ペプチドＮＫＸ６．１二重陽性細胞を与える（図７）。さらに、総ＮＫＸ６．１の割合の増加も検出され、このことは、ｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋細胞の真の濃縮を暗示している。図８Ａ〜図８Ｄに示されるように、選別された集合を、ＲＮＡ抽出のために採取し、グルカゴン（ＧＣＧ）（Ａ）、グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）（Ｂ）、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）（Ｃ）およびＭＡＦＡ（Ｄ）についてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０１９４】
本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されているが、当業者には多くの代替、変更および変形が明らかであることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内にあるそのような代替形態、改変形態および変形形態の全てを包含することが意図される。本明細書で述べられる全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が、本明細書に個々に組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。それに加え、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明の従来技術として利用可能であることを認めるものと解釈されてはならない。章の見出しが使用される場合において、それらが、必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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