(57)【要約】  ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合分子、抗ＩＬ−２抗体、及びＩＬ−２サイトカインに結合される抗ＩＬ−２抗体を含む複合体が、本明細書で提供され、これらは制御性Ｔ細胞を選択的に増殖させて活性化し、大規模生産に適している。バリアントヒトＩｇＧ１Ｆｃ分子もまた本明細書で提供され、これはエフェクター機能を欠いている、または大幅に減少したエフェクター機能を有し、Ｎ２９７のグリコシル化を欠いているにもかかわらず、高い安定性を有する。哺乳動物細胞中で発現される場合にグリコシル化されるリンカーペプチドもまた本明細書で提供される。本発明の組成物を作製する方法及び使用する方法もまた本明細書で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）変異タンパク質であって、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及びＥ９５Ｇから選択される少なくとも１つの変異を有し、インビトロアッセイ及びヒト化マウス（ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成されたＮＳＧマウス）の両方において、その他のＴ細胞またはＮＫ細胞と比較して制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する、ヒトＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９７％同一である、請求項１に記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項４】
前記変異タンパク質のアミノ酸配列が、Ｃ１２５ＡならびにＬ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及びＥ９５Ｇから選択される１つの位置においてのみ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列とは異なる、請求項１、請求項２、または請求項３に記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項５】
前記変異タンパク質の前記アミノ酸配列が、Ｃ１２５ＡならびにＤ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｓから選択される１つの位置においてのみ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項６】
Ｆｃ及び請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質を含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１Ｆｃである、請求項６に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項８】
前記ヒトＩｇＧ１Ｆｃが、前記Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヒトＩｇＧ１が、Ｎ２９７に置換を含む、請求項８に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ２９７の前記置換が、Ｎ２９７Ｇである、請求項９に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失を含む、請求項７〜１０のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃの前記Ｃ末端リジンが欠失される、請求項１１に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１３】
リンカーが、前記タンパク質の前記ＦｃとヒトＩＬ−２変異タンパク質部分とを接続する、請求項６〜１２のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１４】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ、または（配列番号６）、及びＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、請求項１３に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）である、請求項１４に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、哺乳動物細胞中で発現される場合、前記Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化を変化させるアミノ酸の付加、置換、または欠失をさらに含む、請求項６〜１５のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３置換を含む、請求項１６に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３ＮまたはＴ３Ａ置換を含む、請求項１７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３Ｎ置換を含む、請求項１８に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｓ５変異をさらに含む、請求項１９に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｓ５Ｔ変異をさらに含む、請求項２０に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ二量体を含む、請求項６〜２１のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２３】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、２つのＩＬ−２変異タンパク質を含む、請求項２２に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２４】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、単一のＩＬ−２変異タンパク質を含む、請求項２２に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする、単離核酸。
【請求項２６】
抗体のＦｃ部分及び請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする、単離核酸。
【請求項２７】
抗体の前記Ｆｃ部分及び前記ヒトＩＬ−２変異タンパク質が、単一のオープンリーディングフレーム内でコードされる、請求項２６に記載の単離核酸。
【請求項２８】
前記Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１Ｆｃである、請求項２６または２７に記載の単離核酸。
【請求項２９】
前記ヒトＩｇＧ１Ｆｃが、前記Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含む、請求項２８に記載の単離核酸。
【請求項３０】
前記ヒトＩｇＧ１が、Ｎ２９７に置換を含む、請求項２９に記載の単離核酸。
【請求項３１】
Ｎ２９７の前記置換が、Ｎ２９７Ｇである、請求項２８に記載の単離核酸。
【請求項３２】
前記ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失をコードする、請求項２８〜３１のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項３３】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃの前記Ｃ末端リジンが欠失される、請求項３２に記載の単離核酸。
【請求項３４】
抗体の前記Ｆｃ部分と前記ヒトＩＬ−２変異タンパク質とを接続するリンカーをさらにコードする、請求項２６〜３３のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項３５】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ、または（配列番号６）、及びＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、請求項３４に記載の単離核酸。
【請求項３６】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）である、請求項３５に記載の単離核酸。
【請求項３７】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、哺乳動物細胞中で発現される場合、前記ＩＬ−２変異タンパク質を含むタンパク質のグリコシル化を変化させるアミノ酸の付加、置換、または欠失をさらに含む、請求項２６〜３６のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項３８】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３置換を含む、請求項３７に記載の単離核酸。
【請求項３９】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３ＮまたはＴ３Ａ置換を含む、請求項３８に記載の単離核酸。
【請求項４０】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｔ３Ｎ置換を含む、請求項３９に記載の単離核酸。
【請求項４１】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｓ５変異をさらに含む、請求項４０に記載の単離核酸。
【請求項４２】
前記ＩＬ−２変異タンパク質が、Ｓ５Ｔ変異をさらに含む、請求項４１に記載の単離核酸。
【請求項４３】
プロモーターに作動可能に連結される請求項２５〜４２のいずれかに記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４４】
請求項２５〜４２のいずれかに記載の単離核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４５】
前記単離核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項４４または４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項４４または４５に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
ヒトＩＬ−２変異タンパク質の作製方法であって、前記プロモーターが発現される条件下で請求項４５〜５０のいずれかに記載の宿主細胞を培養することと、前記培養物から前記ヒトＩＬ−２変異タンパク質を採取することとを含む、前記方法。
【請求項５２】
Ｆｃ融合タンパク質の作製方法であって、前記プロモーターが発現される条件下で請求項４５〜５０のいずれかに記載の宿主細胞を培養することと、前記培養物から前記Ｆｃ融合タンパク質を採取することとを含む、方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞集団内における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、Ｔ細胞集団を有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質と接触させることを含む、方法。
【請求項５４】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞集団内における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、Ｔ細胞集団を有効量の請求項６〜２４のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
【請求項５７】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項６０】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象の前記末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、有効量の請求項６〜２４のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質を投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
対象の前記末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のヒトＩＬ−２変異タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項６６】
ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象の前記末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率の増加方法であって、有効量の請求項６〜２４のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項６９】
ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
炎症性疾患または自己免疫疾患を有する対象の処置方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−２変異タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項７２】
炎症性疾患または自己免疫疾患を有する対象の処置方法であって、前記対象に治療有効量の請求項６〜２１のいずれかに記載のＦｃ融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項７３】
投与により、前記疾患における少なくとも１つの症状の減少が引き起こされる、請求項７１または７２に記載の炎症性疾患または自己免疫疾患を有する対象の処置方法。
【請求項７４】
対象の前記末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が、前記投与後に増加する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
対象の前記末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が、前記投与後も本質的に同じままである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である、請求項７１〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドであって、前記Ｆｃ領域がＮ２９７Ｇ変異を含み、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を含む、ポリペプチド。
【請求項７８】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を含む、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、前記ポリペプチドを安定化させるための１つ以上の変異をさらに含む、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号３に記載される１つ以上のアミノ酸が、システインで置換される、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号３に記載される前記アミノ酸配列のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２が、システインで置換される、請求項８１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列内にＡ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列内にＶ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列内にＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ置換を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３に記載される前記アミノ酸配列内にＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含む、請求項８２に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
請求項７７〜８６のいずれかに記載のＦｃ領域を含む、抗体。
【請求項８８】
請求項７７〜８６のいずれかに記載のＦｃ領域を含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項８９】
リンカーを含むポリペプチドであって、前記リンカーが、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、前記ポリペプチド。
【請求項９０】
前記リンカーが、Ｎ−グリコシル化を含む、請求項８９に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
前記リンカーが、前記ポリペプチド構造内のループ中に挿入される、またはループに取って代わる、請求項８９に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子の作製方法であって、
ａ）哺乳動物細胞培養物中で請求項７７〜８６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
ｂ）前記培養物から前記非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子を採取することと
を含む、方法。
【請求項９３】
哺乳動物細胞中で発現される場合に非グリコシル化されるＩｇＧ１Ｆｃ含有分子の作製方法であって、前記Ｆｃ領域中のＮ２９７のコドンをグリシンコドンに変異させるステップを含む、方法。
【請求項９４】
Ｆｃ融合タンパク質であって、前記Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列が、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、前記Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項９５】
前記Ｆｃ融合タンパク質の前記アミノ酸配列が、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９６】
前記Ｆｃ融合タンパク質の前記アミノ酸配列が、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一である、請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９７】
前記Ｆｃ融合タンパク質の前記アミノ酸配列が、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９８】
前記Ｆｃ融合タンパク質の前記アミノ酸配列が、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である、請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９９】
請求項９４に記載のＦｃ融合体をコードする、核酸。
【請求項１００】
請求項９９に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項１０１】
Ｆｃ融合タンパク質の作製方法であって、請求項１００に記載の細胞が、前記Ｆｃ融合タンパク質を発現できる条件下で前記細胞をインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項１０２】
対象における炎症状態または自己免疫状態の処置方法であって、有効量の請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
前記炎症状態または自己免疫状態が、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１に記載のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）変異タンパク質、請求項６に記載のＦｃ融合タンパク質、または請求項９４に記載のＦｃ融合タンパク質を用いた処置に対する対象の応答のモニタリング方法であって、前記対象において変化を検出することを含み、前記変化が、
ａ）体温の上昇、
ｂ）前記対象の末梢血中におけるＣＲＰの上昇、
ｃ）前記対象の末梢血中における血小板の減少、
ｄ）前記対象の末梢血中における好中球の減少、または
ｅ）前記対象の末梢血中におけるアルブミンの減少であり、
前記変化が検出された後、前記処置を終了する、一時中断する、投薬頻度を減少させる、または投薬量を減少させる、方法。
【請求項１０５】
前記変化が、
ａ）少なくとも０．５℃の体温の上昇、
ｂ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬの前記対象の末梢血中におけるＣＲＰの上昇、
ｃ）少なくとも０．８倍の前記対象の末梢血中における血小板の減少、
ｄ）少なくとも０．８倍の前記対象の末梢血中における好中球の減少、または
ｅ）少なくとも０．４倍の前記対象の末梢血中におけるアルブミンの減少
を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
単離抗ヒトＩＬ−２抗体であって、
ａ）参照抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、前記参照抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、もしくは１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、それぞれ図２８及び図２６に示される通りであり；または
ｂ）参照抗体の前記重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、前記参照抗体の前記軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとを含み、前記重鎖ＣＤＲ及び前記軽鎖ＣＤＲが、それぞれ図２８及び図２６に示される通りであり；または
ｃ）野生型ヒトＩＬ−２サイトカインへの結合について参照抗体と交差競合し、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、もしくは１８Ｈ９である、
単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１０７】
参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、前記参照抗体の前記軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１０８】
参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、前記参照抗体の前記軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１０９】
参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９７％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、前記参照抗体の前記軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９７％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１０】
参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、前記参照抗体の前記軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１１】
参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、前記参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含み、前記参照抗体が、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、前記参照抗体の前記重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１２】
ａ）ヒト抗体；
ｂ）ヒト化抗体；
ｃ）キメラ抗体；
ｄ）モノクローナル抗体；
ｅ）ポリクローナル抗体；
ｆ）組換え抗体；
ｇ）抗原結合抗体断片；
ｈ）一本鎖抗体；
ｉ）ダイアボディ；
ｊ）トリアボディ；
ｋ）テトラボディ；
ｌ）Ｆａｂ断片；
ｍ）Ｆ（ａｂ’）２断片；
ｎ）ドメイン抗体；
ｏ）ＩｇＤ抗体；
ｐ）ＩｇＥ抗体；
ｑ）ＩｇＭ抗体；
ｒ）ＩｇＧ１抗体；
ｓ）ＩｇＧ２抗体；
ｔ）ＩｇＧ３抗体；
ｕ）ＩｇＧ４抗体；または
ｖ）Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するヒンジ領域内の少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体である、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１３】
ヒトＩＬ−２サイトカインに結合される請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体を含む、単離複合体。
【請求項１１４】
ヒトＩｇＧ１Ｆｃを含む、請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１５】
前記Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を有する、請求項１１４に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１６】
Ｎ２９７に置換を含む、請求項１１５に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１７】
Ｎ２９７の前記置換が、Ｎ２９７Ｇである、請求項１１６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１８】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃの前記Ｃ末端リジンの置換または欠失を含む、請求項１１４に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１１９】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃの前記Ｃ末端リジンが欠失される、請求項１１８に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体。
【請求項１２０】
請求項１０６に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体の軽鎖、重鎖、または軽鎖及び重鎖の両方をコードする、単離核酸。
【請求項１２１】
プロモーターに作動可能に連結される請求項１２０に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２２】
請求項１２０または１２１に記載の単離核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１２３】
前記単離核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項１２２に記載の宿主細胞。
【請求項１２４】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１２２に記載の宿主細胞。
【請求項１２５】
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１２４に記載の宿主細胞。
【請求項１２６】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１２２に記載の宿主細胞。
【請求項１２７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２６に記載の宿主細胞。
【請求項１２８】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である、請求項１２７に記載の宿主細胞。
【請求項１２９】
抗ヒトＩＬ−２抗体の作製方法であって、プロモーターが発現される条件下で請求項１２２〜１２８のいずれかに記載の宿主細胞を培養することと、前記培養物から前記ヒトＩＬ−２変異タンパク質を採取することとを含む、方法。
【請求項１３０】
対象における炎症状態または自己免疫状態の処置方法であって、有効量の請求項１０６に記載の抗ヒトＩＬ−２抗体または請求項１１３に記載の単離抗ヒトＩＬ−２抗体を含む前記単離複合体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３１】
前記炎症状態または自己免疫状態が、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である、請求項１３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１０日出願の米国特許仮出願第６２／１４６，１３６号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−２は、３つの膜貫通受容体サブユニット：すなわち、ＩＬ−２が結合すると、細胞内シグナル伝達事象を共に活性化するＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγ、ならびにＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβγとの間の相互作用を安定化させるように機能するＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）と結合する。ＩＬ−２Ｒβγにより送達されるシグナルvとしては、ＰＩ３−キナーゼ、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ、及びＳＴＡＴ５経路のシグナルが挙げられる。
【０００３】
Ｔ細胞は、典型的には組織中に存在する低濃度のＩＬ−２に応答するためにＣＤ２５の発現を必要とする。ＣＤ２５を発現するＴ細胞は、自己免疫性炎症の抑制に不可欠なＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、及びＣＤ２５を発現するように活性化されたＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の両方を含む。ＦＯＸＰ３−ＣＤ２５＋Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）は、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞のいずれかであってよく、これらは両方とも炎症、自己免疫、器官移植片拒絶、または移植片対宿主病の一因となる場合がある。ＩＬ−２刺激性ＳＴＡＴ５シグナル伝達は、正常なＴ−ｒｅｇ細胞の成長及び生存ならびに高いＦＯＸＰ３発現のために非常に重要である。
【０００４】
共同所有のＷＯ２０１０／０８５４９５では、発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞を選択的に増殖させる、または刺激するためのＩＬ−２変異タンパク質の使用について記載している。対象に投与される場合、Ｔｒｅｇ細胞に対する効果は、炎症性疾患及び自己免疫疾患を処置するのに有用である。その明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、インビボでＴｅｆｆ細胞よりも多くＴｒｅｇ細胞を増殖させるのに有用であるが、ヒト治療薬に最適な属性を有したＩＬ−２変異タンパク質を作製することが望ましかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０８５４９５号
【発明の概要】
【０００６】
高収率の製造性に適していて、かつ薬理活性を有するＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、及び抗ＩＬ−２抗体／ＩＬ−２複合体が、本明細書に記載される。ヒト治療薬として使用するためのこのような分子を作製する取り組みにおいて、多数の予想外かつ予測不能な観察が行われた。本明細書に記載される組成物及び方法は、その取り組みの結果であった。
【０００７】
本明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２変異タンパク質及び／または内因性ＩＬ−２に対する免疫応答が引き起こされる可能性が比較的低く、Ｔｒｅｇの選択的増殖及び活性化を提供する。さらに、特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、対象に投与される場合に血清半減期を増加させる分子、例えば、抗体Ｆｃに融合される。ＩＬ−２変異タンパク質は、短い血清半減期（皮下注射では３〜５時間）を有する。本明細書に記載される例示的なＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体は、ヒトにおいて少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、または少なくとも２５日の半減期を有する。ＩＬ−２変異タンパク質の薬物動態に対するこの効果は、ＩＬ−２変異タンパク質治療薬の投薬減少または低頻度の投薬を可能にする。
【０００８】
さらに、医薬大分子を作製する場合、分子の凝集を最小限に抑え、かつ分子の安定性を最大化しながら、大量の大分子を作製する能力について考慮しなければならない。ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合分子は、このような属性を実証する。
【０００９】
さらに、特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含有する。ＩｇＧ１のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を無効にすることが望ましい場合、２９７位のアスパラギンのグリシンへの変異（Ｎ２９７Ｇ；ＥＵ番号付けスキーム）が、非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃをもたらすその他の変異と比べて大幅に改善された精製効率及び生物物理学的特性を提供したことが見出された。好ましい実施形態では、システインをＦｃに導入してジスルフィド結合させて、これにより非グリコシル化Ｆｃ含有分子の安定性が増加した。非グリコシル化Ｆｃの有用性は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体の枠を超える。したがって、Ｎ２９７Ｇ置換及び場合により１つ以上のさらなる残基のシステインへの置換を含む、Ｆｃ含有分子、Ｆｃ融合体及び抗体が本明細書で提供される。
【００１０】
一態様では、本発明は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）変異タンパク質を提供し、このＩＬ−２変異タンパク質は、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及びＥ９５Ｇから選択される少なくとも１つの変異を有し、インビトロアッセイ及びヒト化マウス（ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成されたＮＳＧマウス）の両方において、その他のＴ細胞またはＮＫ細胞と比較して制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する。一実施形態では、変異タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、変異タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９７％同一である。別の実施形態では、変異タンパク質のアミノ酸配列は、Ｃ１２５ＡならびにＬ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及びＥ９５Ｇから選択される１つの位置においてのみ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列とは異なる。別の実施形態では、変異タンパク質のアミノ酸配列は、Ｃ１２５ＡならびにＤ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｓから選択される１つの位置においてのみ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列とは異なる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、Ｆｃ及び上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質を含むＦｃ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃである。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１は、Ｎ２９７に置換を含む。別の実施形態では、Ｎ２９７の置換は、Ｎ２９７Ｇである。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンが欠失される。別の実施形態では、リンカーが、タンパク質のＦｃとヒトＩＬ−２変異タンパク質部分とを接続する。別の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ、または（配列番号６）、及びＹＧＮＧＴ（配列番号７）である。別の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）である。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現される場合、Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化を変化させるアミノ酸の付加、置換、または欠失をさらに含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３ＮまたはＴ３Ａ置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３Ｎ置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５変異をさらに含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５Ｔ変異をさらに含む。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ二量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、２つのＩＬ−２変異タンパク質を含む。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、単一のＩＬ−２変異タンパク質を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする単離核酸を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、抗体のＦｃ部分及び上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする単離核酸を提供する。一実施形態では、抗体のＦｃ部分及びヒトＩＬ−２変異タンパク質は、単一のオープンリーディングフレーム内でコードされる。別の実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃである。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１は、Ｎ２９７に置換を含む。別の実施形態では、Ｎ２９７の置換は、Ｎ２９７Ｇである。別の実施形態では、核酸は、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失をコードする。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンが欠失される。別の実施形態では、核酸は、抗体のＦｃ部分とヒトＩＬ−２変異タンパク質とを接続するリンカーをさらにコードする。別の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ、または（配列番号６）、及びＹＧＮＧＴ（配列番号７）である。別の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）である。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現される場合、ＩＬ−２変異タンパク質を含むタンパク質のグリコシル化を変化させるアミノ酸の付加、置換、または欠失をさらに含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３ＮまたはＴ３Ａ置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３Ｎ置換を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５変異をさらに含む。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５Ｔ変異をさらに含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結される上記の単離核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上記の単離核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、単離核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、プロモーターが発現される条件下で上記のような宿主細胞を培養すること、及び培養物からヒトＩＬ−２変異タンパク質を採取することを含む、ヒトＩＬ−２変異タンパク質を作製する方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、プロモーターが発現される条件下で上記のような宿主細胞を培養すること、及び培養物からＦｃ融合タンパク質を採取することを含む、Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞集団を有効量の上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質と接触させることを含む、Ｔ細胞集団内における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞集団を有効量の上記のようなＦｃ融合タンパク質と接触させることを含む、Ｔ細胞集団内における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質を投与することを含む、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のようなＦｃ融合タンパク質を投与することを含む、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のようなヒトＩＬ−２変異タンパク質を投与することを含む、対象の末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のようなＦｃ融合タンパク質を投与することを含む、対象の末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増加する。別の実施形態では、ＣＤ５６及び／またはＣＤ１６を発現するＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が、少なくとも５０％増加する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する対象を処置する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の上記のようなＩＬ−２変異タンパク質または治療有効量の上記のようなＦｃ融合タンパク質を投与することを含む。一実施形態では、投与により、疾患における少なくとも１つの症状の減少が引き起こされる。別の実施形態では、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率は、投与後に増加する。別の実施形態では、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率は、投与後も本質的に同じままである。別の実施形態では、炎症性疾患または自己免疫疾患は、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域はＮ２９７Ｇ変異を含み、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、ポリペプチドを安定化させるための１つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態では、配列番号３に記載される１つ以上のアミノ酸が、システインで置換される。別の実施形態では、配列番号３に記載されるアミノ酸配列のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２が、システインで置換される。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列内にＡ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列内にＶ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列内にＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列内にＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、上記のようなＦｃ領域を含む抗体を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、上記のようなＦｃ領域を含むＦｃ融合タンパク質を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、リンカーを含むポリペプチドを提供し、リンカーは、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）である。一実施形態では、リンカーはＮ−グリコシル化を含む。別の実施形態では、リンカーは、ポリペプチド構造内のループ中に挿入される、またはループに取って代わる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子を作製する方法を提供し、本方法は、
ａ）哺乳動物細胞培養物中で上記のようなポリペプチドをコードする核酸を発現させること；及び
ｂ）培養物から非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子を採取すること
を含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞中で発現される場合に非グリコシル化されるＩｇＧ１Ｆｃ含有分子を作製する方法を提供し、本方法は、Ｆｃ領域中のＮ２９７のコドンをグリシンコドンに変異させるステップを含む。
【００３１】
別の態様では、本発明はＦｃ融合タンパク質を提供し、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。一実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一である。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、図２４に示されるヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、上記のようなＦｃ融合体をコードする核酸を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、上記のような核酸を含む細胞を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、上記のような細胞がＦｃ融合タンパク質を発現できる条件下でこの細胞をインキュベートすることを含む、Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のようなＦｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における炎症状態または自己免疫状態を処置する方法を提供する。一実施形態では、炎症状態または自己免疫状態は、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、上記のようなヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）変異タンパク質、上記のようなＦｃ融合タンパク質、または上記のようなＦｃ融合タンパク質を用いた処置に対する対象の応答をモニタリングする方法を提供し、本方法は対象の変化を検出することを含み、この変化は、体温の上昇、対象の末梢血中におけるＣＲＰの上昇、対象の末梢血中における血小板の減少、対象の末梢血中における好中球の減少、または対象の末梢血中におけるアルブミンの減少であり、変化が検出された後、処置を終了する、一時中断する、投薬頻度を減少させる、または投薬量を減少させる。一実施形態では、変化は、少なくとも０．５℃の体温の上昇、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬの対象の末梢血中におけるＣＲＰの上昇、少なくとも０．８倍の対象の末梢血中における血小板の減少、少なくとも０．８倍の対象の末梢血中における好中球の減少、または少なくとも０．４倍の対象の末梢血中におけるアルブミンの減少を含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は単離抗ヒトＩＬ−２抗体を提供し、この抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、もしくは１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、それぞれ図２８及び図２６に示される通りであり；または参照抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびに参照抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲは、それぞれ図２８及び図２６に示される通りであり；または野生型ヒトＩＬ−２サイトカインへの結合について参照抗体と交差競合し、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、もしくは１８Ｈ９である。一実施形態では、抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである。別の実施形態では、抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである。別の実施形態では、抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９７％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９７％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである。別の実施形態では、抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである。別の実施形態では、抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び参照抗体の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、この参照抗体は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９であり、参照抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ図２８及び図２６に示される通りである。別の実施形態では、単離抗体は、ヒト抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；組換え抗体；抗原結合抗体断片；一本鎖抗体；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片；ドメイン抗体；ＩｇＤ抗体；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；ＩｇＧ１抗体；ＩｇＧ２抗体；ＩｇＧ３抗体；ＩｇＧ４抗体；またはＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するヒンジ領域内の少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、単離抗体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を有する。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｎ２９７に置換を含む。別の実施形態では、Ｎ２９７の置換は、Ｎ２９７Ｇである。別の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンが欠失される。別の実施形態では、単離抗体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を有する。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、Ｎ２９７に置換を含む。別の実施形態では、Ｎ２９７の置換は、Ｎ２９７Ｇである。別の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンの置換または欠失を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ  ＦｃのＣ末端リジンが欠失される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−２サイトカインに結合される上記のような単離抗ヒトＩＬ−２抗体を含む単離複合体を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、上記のような単離抗ヒトＩＬ−２抗体の軽鎖、重鎖、または軽鎖及び重鎖の両方をコードする単離核酸を提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結される上記のような単離核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、上記のような単離核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、単離核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、プロモーターが発現される条件下で上記のような宿主細胞を培養すること、及び培養物からヒトＩＬ−２変異タンパク質を採取することを含む、抗ヒトＩＬ−２抗体を作製する方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、有効量の上記のような抗ヒトＩＬ−２抗体または単離抗ヒトＩＬ−２抗体を含む単離複合体を対象に投与することを含む、対象における炎症状態または自己免疫状態を処置する方法を提供する。一実施形態では、炎症状態または自己免疫状態は、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、器官移植片拒絶、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、または炎症性腸疾患である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】短期刺激アッセイにおいて、ＩｇＧ−ＦｃのＣ末端への融合によるホモ二量体化は、効力が低く、かつＣＤ２５に対する親和性が高いＩＬ−２変異タンパク質の活性を変化させない。
【図２Ａ】示される変異を有し、Ｆｃ−ヘテロ二量体の片側のＣ末端に融合されるＩＬ−２変異タンパク質を、Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するそれらの能力について試験した。これらの変異タンパク質はまた、ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する３つの変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）を含有していた。それらの活性を、Ｆｃ融合を含まないＩＬ−２の３つの形態（白抜きの記号）：すなわち、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対して高い親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、ならびにＨａＤ（ＣＤ２５に対して高い親和性及び低いシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。ホスホ−ＳＴＡＴ５応答を、ゲーティングしたＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋及びＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞について示す。
【図２Ｂ】示される変異を有し、Ｆｃ−ヘテロ二量体の片側のＣ末端に融合されるＩＬ−２変異タンパク質を、Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するそれらの能力について試験した。これらの変異タンパク質もまた、ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する３つの変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）を含有していた。それらの活性を、Ｆｃ融合を含まないＩＬ−２の３つの形態（白抜きの記号）：すなわち、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対して高い親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、ならびにＨａＤ（ＣＤ２５に対して高い親和性及び低いシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。ホスホ−ＳＴＡＴ５応答を、ゲーティングしたＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋及びＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞について示す。
【図３】Ｆｃ−ヘテロ二量体に融合されたＩＬ−２変異タンパク質の滴定に応じたＴ細胞サブセットの増殖。融合タンパク質の活性を、Ｆｃ融合を含まないＩＬ−２の３つの形態（白抜きの記号）：すなわち、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対して高い親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、ならびにＨａＤ（ＣＤ２５に対して高い親和性及び低いシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。
【図４】Ｆｃ−ヘテロ二量体に融合されたＩＬ−２変異タンパク質の滴定に応じたＮＫ細胞の増殖。融合タンパク質の活性を、Ｆｃ融合を含まないＩＬ−２の３つの形態（白抜きの記号）：すなわち、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対して高い親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、ならびにＨａＤ（ＣＤ２５に対して高い親和性及び低いシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。
【図５】Ｆｃ−ホモ二量体Ｎ２９７Ｇに融合されたＩＬ−２変異タンパク質の滴定に応じたＴ細胞サブセットの増殖。Ｆｃ．変異タンパク質の活性を、ＷＴ  ＩＬ−２（白抜きの丸）及びＦｃ．ＷＴ（黒塗りの丸）と比較した。ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する変異（ＨａＭｕｔ１）は、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐであった。
【図６】Ｆｃ−ホモ二量体Ｎ２９７Ｇに融合されたＩＬ−２変異タンパク質の滴定に応じたＮＫ細胞の増殖。Ｆｃ．変異タンパク質の活性を、ＷＴ  ＩＬ−２（白抜きの丸）及びＦｃ．ＷＴ（黒塗りの丸）と比較した。
【図７Ａ】ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する変異を含まないＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト化マウスにおいてＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３上方制御を促進する。
【図７Ｂ】ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する変異を含まないＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト化マウスにおいてＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３上方制御を促進する。
【図８】低週用量（動物１匹当たり０．５μｇ）のＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト化マウスにおいてＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３上方制御を促進し、Ｆｃ．Ｎ８８Ｄ及びＦｃ．ＷＴと比較してＦｃ．Ｖ９１Ｋでより良好な活性が観察された。
【図９Ａ】Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄは、ＣＤ２５との会合により活性化Ｔ細胞の表面上に残留する。
【図９Ｂ】Ｆｃ．ＷＴと比較した、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄを用いたＩＬ−２Ｒシグナル伝達の持続性。
【図１０Ａ】カニクイザルにおけるＦｃ．Ｖ９１Ｋの２週間及び４週間の投薬間隔の比較、ならびにＩＶ及びＳＣ投薬経路の比較。
【図１０Ｂ】カニクイザルにおけるＦｃ．Ｖ９１Ｋの２週間及び４週間の投薬間隔の比較、ならびにＩＶ及びＳＣ投薬経路の比較。
【図１１Ａ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１１Ｂ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１１Ｃ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１１Ｄ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１１Ｅ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１１Ｆ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、及びＦｃ．Ｎ８８Ｄの異なる投薬レジメンを用いて処置したシノルモガスザル（ｃｙｎｏｌｍｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態。
【図１２Ａ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、またはＦｃ．Ｎ８８Ｄの投与量増加が、カニクイザルにおけるＴｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞、及びＣＤ８＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞のレベルに及ぼす影響。各データポイントは、４匹の動物の平均ピーク応答を表す。
【図１２Ｂ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、またはＦｃ．Ｎ８８Ｄの投与量増加が、カニクイザルにおけるＴｒｅｇ細胞及び好酸球のレベルに及ぼす影響。各データポイントは、４匹の動物の平均ピーク応答を表す。
【図１２Ｃ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、またはＦｃ．Ｎ８８Ｄの投与量増加が、カニクイザルにおけるＴｒｅｇ細胞及びＣＲＰのレベルならびに体温に及ぼす影響。各データポイントは、４匹の動物の平均ピーク応答を表す。
【図１２Ｄ】ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ、またはＦｃ．Ｎ８８Ｄの投与量増加が、カニクイザルにおけるＴｒｅｇ細胞、血小板、好中球、及びアルブミンのレベルに及ぼす影響。各データポイントは、４匹の動物の平均ピーク応答を表す。右のｙ軸は、投薬前試料と比較して血小板、好中球、またはアルブミンにおける倍率変化の減少を示すために反転させている。
【図１３】Ｆｃ．Ｖ９１Ｋで処置したカニクイザルにおける抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生動態。
【図１４】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏは、様々なＩＬ−２変異タンパク質についてＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβ相互作用のΔΔＧ結合（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を予測した。ΔΔＧ結合の正値は、野生型ＩＬ−２と比較して変異タンパク質の結合が弱いことを示す。Ｎ８８及びＤ２０変異体のΔΔＧ結合値は、予測値に満たない可能性がある。ボックス中に示した変異タンパク質を選択した。
【図１５】Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒは、様々なＩＬ−２変異体についてＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβ相互作用のΔΔＧ結合（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を予測した。ΔΔＧ結合の正値は、ＷＴと比較して変異体の結合が弱いことを示す。ボックス中に示した変異タンパク質を選択した。
【図１６Ａ】初代ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で２日間、予備活性化した。次いで、細胞を、ＯＫＴ３抗体を除去するために３回洗浄した後に３日間静止させた。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の生物活性を、３７℃で１０分間、ＩＬ−２変異タンパク質の滴定（１ｎＭ、１００ｐＭ、３３ｐＭ、１１ｐＭ）を用いてこれらの静止予備活性化ＰＢＭＣを刺激することにより試験し、続いて標準的ＰＨＯＳＦＬＯＷ（商標）（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）アッセイを行ってホスホ−ＳＴＡＴ５レベルを検出した。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を、ゲーティングしたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるホスホ−ＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示する。変異タンパク質をトランスフェクト２９３−６Ｅ細胞の上清としてアッセイし、Ｆｃ．ＩＬ−２融合タンパク質の濃度を、プロテインＡ結合（ＯＣＴＥＴ  Ｑ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）、Ｐａｌｌ  ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｃｏ．、メンローパーク、カリフォルニア州）により決定した。「ｐＴＴ５」試料は、空のＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細胞からの上清画分を表す。Ａ）ホスホ−ＳＴＡＴ５は、１ドナーからのＴ細胞中で滴定Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質に応答する。
【図１６Ｂ】初代ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で２日間、予備活性化した。次いで、細胞を、ＯＫＴ３抗体を除去するために３回洗浄した後に３日間静止させた。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の生物活性を、３７℃で１０分間、ＩＬ−２変異タンパク質の滴定（１ｎＭ、１００ｐＭ、３３ｐＭ、１１ｐＭ）を用いてこれらの静止予備活性化ＰＢＭＣを刺激することにより試験し、続いて標準的ＰＨＯＳＦＬＯＷ（商標）（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）アッセイを行ってホスホ−ＳＴＡＴ５レベルを検出した。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を、ゲーティングしたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるホスホ−ＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示する。変異タンパク質をトランスフェクト２９３−６Ｅ細胞の上清としてアッセイし、Ｆｃ．ＩＬ−２融合タンパク質の濃度を、プロテインＡ結合（ＯＣＴＥＴ  Ｑ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）、Ｐａｌｌ  ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｃｏ．、メンローパーク、カリフォルニア州）により決定した。「ｐＴＴ５」試料は、空のＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細胞からの上清画分を表す。Ｂ）順位付けしたｐＳＴＡＴ５は、２ドナーについて３３ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質に応答する。
【図１７】初代ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で２日間、予備活性化した。次いで、細胞を、ＯＫＴ３抗体を除去するために３回洗浄した後に３日間静止させた。ＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を、３７℃で１０分間、ＩＬ−２変異タンパク質の滴定を用いてこれらの静止予備活性化ＰＢＭＣを刺激することにより試験し、続いて標準的ＰＨＯＳＦＬＯＷ（商標）（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）アッセイを行ってホスホ−ＳＴＡＴ５レベルを検出した。ＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を、ゲーティングしたＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞におけるホスホ−ＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示する。Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｗ、Ｃ１２５Ａ）は、ｐＳＴＡＴ５を活性化せず、この分子及びＦｃ．ＩＬ−２（ＷＴ、Ｃ１２５Ａ）を各プロットにおいて陽性対照及び陰性対照として示す。２つの異なるＰＢＭＣドナーについて、一致した結果を得た。
【図１８Ａ】全ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３００万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で５日間静止させた。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、２４ウェルプレート中において５０万／ウェルで、ＦＡＣＳ分析前に７日間ＩＬ−２含有培地中でさらに培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖を、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋細胞（Ａ）、ＦＯＸＰ３−ＣＤ８＋細胞（Ｂ）、及びＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋（Ｃ）のＣＦＳＥ希釈物（中央ＣＦＳＥ蛍光）として提示する。ＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋細胞中でＦＯＸＰ３を上方制御する変異タンパク質の能力も示す（Ｄ）。
【図１８Ｂ】全ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３００万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で５日間静止させた。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、２４ウェルプレート中において５０万／ウェルで、ＦＡＣＳ分析前に７日間ＩＬ−２含有培地中でさらに培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖を、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋細胞（Ａ）、ＦＯＸＰ３−ＣＤ８＋細胞（Ｂ）、及びＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋（Ｃ）のＣＦＳＥ希釈物（中央ＣＦＳＥ蛍光）として提示する。ＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋細胞中でＦＯＸＰ３を上方制御する変異タンパク質の能力も示す（Ｄ）。
【図１８Ｃ】全ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３００万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で５日間静止させた。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、２４ウェルプレート中において５０万／ウェルで、ＦＡＣＳ分析前に７日間ＩＬ−２含有培地中でさらに培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖を、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋細胞（Ａ）、ＦＯＸＰ３−ＣＤ８＋細胞（Ｂ）、及びＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋（Ｃ）のＣＦＳＥ希釈物（中央ＣＦＳＥ蛍光）として提示する。ＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋細胞中でＦＯＸＰ３を上方制御する変異タンパク質の能力も示す（Ｄ）。
【図１８Ｄ】全ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３００万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で５日間静止させた。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、２４ウェルプレート中において５０万／ウェルで、ＦＡＣＳ分析前に７日間ＩＬ−２含有培地中でさらに培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖を、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋細胞（Ａ）、ＦＯＸＰ３−ＣＤ８＋細胞（Ｂ）、及びＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋（Ｃ）のＣＦＳＥ希釈物（中央ＣＦＳＥ蛍光）として提示する。ＨＥＬＩＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋細胞中でＦＯＸＰ３を上方制御する変異タンパク質の能力も示す（Ｄ）。
【図１９】ＭＡＣＳ選別ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を、示したＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の滴定を用いて３日間、１０万／ウェルで９６ウェルプレート中において培養した。０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを、インキュベーションの最後の１８時間中に各ウェルに添加した。
【図２０Ａ】初代ヒトＰＢＭＣを、２日間１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で予備刺激した。細胞を採取し、４回洗浄して、培地中で一晩静止させた。次いで、細胞を４００ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２で３０分間、３７℃でパルスした。パルス後、細胞を１回洗浄後にＴ０で採取、または１２ｍｌの温培地中でさらに３回洗浄し、示した時間での培養のいずれかを行った。細胞会合Ｆｃ．ＩＬ−２を検出するために、細胞を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した（Ａ）。細胞表面保持について変異タンパク質を順位付けするために、ｈｕＩｇＧ  ＭＦＩ値の４時間、６時間、及び２４時間時点での合計を、２つのＰＢＭＣドナーについて平均化した（Ｂ）。
【図２０Ｂ】初代ヒトＰＢＭＣを、２日間１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で予備刺激した。細胞を採取し、４回洗浄して、培地中で一晩静止させた。次いで、細胞を４００ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２で３０分間、３７℃でパルスした。パルス後、細胞を１回洗浄後にＴ０で採取、または１２ｍｌの温培地中でさらに３回洗浄し、示した時間での培養のいずれかを行った。細胞会合Ｆｃ．ＩＬ−２を検出するために、細胞を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した（Ａ）。細胞表面保持について変異タンパク質を順位付けするために、ｈｕＩｇＧ  ＭＦＩ値の４時間、６時間、及び２４時間時点での合計を、２つのＰＢＭＣドナーについて平均化した（Ｂ）。
【図２１】１００ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２でパルスした細胞を除く、図２０におけるような、パルス洗浄後のｐＳＴＡＴ５シグナル保持。
【図２２】細胞表面保持及びＩＬ−２Ｒシグナル伝達保持の相関関係。増減した表面保持値及びｐＳＴＡＴ５シグナル保持値を、６時間及び２４時間時点のｈｕ−ＩｇＧ  ＭＦＩ（表面）またはｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩ（シグナル伝達）値を加えて、値を０から１に増減して、増減した値を２ドナーについて平均化することにより算出した。
【図２３Ａ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、０日目における１μｇのＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質皮下用量後、４日目のヒト化マウス（ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成したＮＳＧマウス）の血液中におけるＣＤ４Ｔ細胞のＴｒｅｇのパーセント。（Ｂ）Ｔｒｅｇ濃縮とｐＳＴＡＴ５シグナル保持との相関関係。増減したｐＳＴＡＴ５シグナル保持値を、６時間及び２４時間時点のｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを加えて、値を０から１に減じ、減じた値を２ドナーについて平均化することにより算出した。
【図２３Ｂ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、０日目における１μｇのＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質皮下用量後、４日目のヒト化マウス（ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成したＮＳＧマウス）の血液中におけるＣＤ４Ｔ細胞のＴｒｅｇのパーセント。（Ｂ）Ｔｒｅｇ濃縮とｐＳＴＡＴ５シグナル保持との相関関係。増減したｐＳＴＡＴ５シグナル保持値を、６時間及び２４時間時点のｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを加えて、値を０から１に減じ、減じた値を２ドナーについて平均化することにより算出した。
【図２４Ａ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｂ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｃ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｄ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｅ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｆ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｇ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｈ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｉ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｊ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｋ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｌ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｍ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｎ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｏ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２４Ｐ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質のアミノ酸配列。太字文＝リーダー配列；イタリック体＝Ｆｃドメイン（Ｎ２９７Ｇ及び欠失Ｋ変異を含む）；下線文＝リンカー配列；普通文＝ＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ及び示した変異を含む）。共に、Ｆｃドメイン、リンカー配列、及びＩＬ−２は、タンパク質の成熟型を含む。
【図２５Ａ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｂ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｃ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｄ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｅ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｆ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｇ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｈ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｉ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｊ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｋ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｌ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｍ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｎ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｏ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｐ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｑ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｒ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｓ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｔ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｕ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｖ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｗ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｘ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｙ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５Ｚ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＡＡ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＢＢ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＣＣ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＤＤ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＥＥ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＦＦ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＧＧ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＨＨ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＩＩ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＪＪ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＫＫ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２５ＬＬ】実施例１３及び実施例１４により作製かつ試験したヒトＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の核酸配列。
【図２６】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列。ＣＤＲ１、２、及び３（Ｋａｂａｔにより定義）を太字と下線で示し；フレームワーク領域１、２、３、及び４を普通文で示す。
【図２７Ａ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｂ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｃ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｄ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｅ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｆ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｇ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｈ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２７Ｉ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の軽鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２８−１】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列。ＣＤＲ１、２、及び３（Ｋａｂａｔにより定義）を太字と下線で示し；フレームワーク領域１、２、３、及び４を普通文で示す。
【図２８−２】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列。ＣＤＲ１、２、及び３（Ｋａｂａｔにより定義）を太字と下線で示し；フレームワーク領域１、２、３、及び４を普通文で示す。
【図２９Ａ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｂ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｃ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｄ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｅ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｆ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｇ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｈ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図２９Ｉ】実施例１５により単離かつ試験した抗体の重鎖可変ドメインの核酸配列。
【図３０】実施例１５に記載されているように、１．５μｇの野生型ヒトＩＬ−２）と複合化した８μｇの抗ＩＬ−２抗体の単回注射で処置したＮＳＧ  ＳＣＩＤ／Ｈｕマウスにおける、ＮＫ細胞増殖に対するＴｒｅｇ細胞増殖の活性化の比率。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で使用される節の見出しは、系統立てる目的のためだけのものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。本明細書の本文中に引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。
【００４６】
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換、タンパク質精製などに使用されてよい。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当該技術分野において一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように実施されてよい。以下の手順及び技術は、当該技術分野において周知の従来方法に従って、また本明細書全体を通して引用かつ議論される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように、一般に実施されてよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照し、これは、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、有機化学、ならびに医化学及び薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験室手順及び技術は、当該技術分野において周知であり、かつ一般に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、及び送達ならびに患者の処置に使用されてよい。
【００４７】
ＩＬ−２
本明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ヒトＩＬ−２のバリアントである。本明細書で使用される場合、「野生型ヒトＩＬ−２」、「野生型ＩＬ−２」、または「ＷＴ  ＩＬ−２」は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味することとする：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＸＱＳＩＩＳＴＬＴ
Ｘは、Ｃ、Ｓ、Ｖ、またはＡである（配列番号２）。
【００４８】
バリアントは、野生型ＩＬ−２アミノ酸配列中に１つ以上の置換、欠失、または挿入を含有してよい。残基は、本明細書において１文字アミノ酸コードに続いてＩＬ−２アミノ酸位置によって指定され、例えば、Ｋ３５は、配列番号２の３５位にあるリジン残基である。置換は、本明細書において１文字アミノ酸コードに続いてＩＬ−２アミノ酸位置、それに続いて置換する１文字アミノ酸コードによって指定され、例えば、Ｋ３５Ａは、配列番号２の３５位にあるリジン残基とアラニン残基との置換である。
【００４９】
ＩＬ−２変異タンパク質及び抗ＩＬ−２抗体
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を優先的に刺激するヒトＩＬ−２変異タンパク質及び抗ＩＬ−２抗体が、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する」とは、変異タンパク質または抗体が、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞よりもＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖、生存、活性化及び／または機能を促進することを意味する。Ｔｒｅｇを優先的に刺激する能力を測定する方法は、末梢血白血球のフローサイトメトリーによって測定され得、全ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の増加、全ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＦＯＸＰ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加、ＮＫ細胞と比較してＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の割合の増加、及び／またはその他のＴ細胞上におけるＣＤ２５発現の増加と比較してＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ２５発現レベルのより大きな増加が観察される。Ｔｒｅｇ細胞の選択的増殖はまた、重亜硫酸塩で処理したゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の配列決定により検出されるような、全血から抽出されたＤＮＡ中の脱メチル化ＣＤ３遺伝子と比較した脱メチル化ＦＯＸＰ３プロモーターＤＮＡ（すなわち、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域、またはＴＳＤＲ）の発現増加として検出され得る（Ｊ．Ｓｅｈｏｕｌｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２，２３６−２４６）。
【００５０】
Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激するＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体は、対象または末梢血試料中のＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞よりもＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の比率を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１０００％増加させる。
【００５１】
ＩＬ−２変異タンパク質の例としては、配列番号２に記載されるアミノ酸配列中にＨ１６Ｔ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｄ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及び／またはＶ９１Ｓ置換（複数可）を含むＩＬ−２変異タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＩＬ−２変異タンパク質は、図２４に記載される。本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、場合によりＣ１２５Ａ置換を含む。野生型ＩＬ−２配列に対するさらなる変異の数を減少させることが有利であってよいが、本発明は、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｄ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及び／またはＶ９１Ｓ置換に加えて、切断ならびに／またはさらなる挿入、欠失、及び／もしくは置換も含むＩＬ−２変異タンパク質を含むが、ただし、変異タンパク質がＴｒｅｇを優先的に刺激する活性を維持することを条件とする。したがって、実施形態は、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激し、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｄ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及び／またはＶ９１Ｓ置換を有し、配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ−２変異タンパク質を含む。特に好ましい実施形態では、このようなＩＬ−２変異タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
アミノ酸配列について、配列同一性及び／または配列類似性は、当該技術分野において既知の標準的技術、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、サイエンス通り５７５、マディソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを含むが、これらに限定されない技術を使用することにより、好ましくはデフォルト設定を使用して、または検査により決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢにより算出される：ミスマッチペナルティ＝１；ギャップペナルティ＝１；ギャップサイズペナルティ＝０．３３；及び結合ペナルティ＝３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
【００５３】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを使用して関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の単純化を使用し；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３によって記載される方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップ加重＝３．００、デフォルトギャップ長加重＝０．１０、及び加重末端ギャップを含む。
【００５４】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値で設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的な値であり、検索されている対象の配列に対して、特定のデータベースにおける特定の配列及び組成物の組成に応じてプログラム自体によって確立されるが；値は、感受性を高めるように調整されてよい。
【００５５】
さらに有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されているようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；ギャップなしの伸長を開始するための２ヒット法、ギャップ長ｋに１０＋ｋのコストを負荷；１６に設定されたＸｕ、ならびにデータベース検索段階で４０に、及びアルゴリズムの出力段階で６７に設定されたＸｇを使用する。ギャップアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによって開始される。
【００５６】
アミノ酸配列変化を導入する部位または領域は、あらかじめ決定されていてよいが、変異それ自体は、あらかじめ決定しておく必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を実施し、発現したＩＬ−２変異タンパク質を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてよい。既知の配列を有するＤＮＡにおいて所定の部位に置換変異を作製するための技術が周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発である。変異体のスクリーニングは、例えば、本明細書に記載されるアッセイを使用して行われてよい。
【００５７】
アミノ酸置換は、典型的には単一残基の置換であり；挿入は通常、約１〜約２０のアミノ酸残基程度であろうが、それよりも大幅に大きな挿入が許容されてよい。欠失は、約１〜約２０のアミノ酸残基の範囲であるが、いくつかの場合には、欠失がはるかに大きくともよい。
【００５８】
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せは、最終的な誘導体またはバリアントに到達するために使用されてよい。一般に、これらの変更は、分子の変化、特に抗原結合タンパク質の免疫原性及び特異性を最小限に抑えるために数個のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、特定の状況ではより大きな変更が許容されてよい。保存的置換は、表１として示される以下のチャートに従って一般に行われる。
【００５９】
【表１】
2018512151.tif 000002
【００６０】
機能または免疫学的同一性における実質的な変更は、表１に示されるものよりも保存性が低い置換を選択することにより行われる。例えば、置換は、変化の領域中におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、アルファへリックス構造もしくはベータシート構造；標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または側鎖の嵩高さにさらに有意な影響を及ぼすように行われてよい。一般にポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルと（もしくはそれにより）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意のその他の残基と（もしくはそれにより）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルと（もしくはそれにより）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンと（もしくはそれにより）置換されるようなものである。
【００６１】
バリアントは、典型的には天然に存在する類似体と同じ定性的生物活性を示し、同じ免疫応答を誘発するだろうが、バリアントは、必要に応じてＩＬ−２変異タンパク質の特徴を改変するようにも選択される。あるいは、バリアントは、ＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を変化させるように設計されてよい。例えば、グリコシル化部位は、本明細書で述べられるように変化させてよい、または除去されてよい。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、及び１８Ｈ９と称される抗体のうち１つの重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９の軽鎖可変ドメインの配列とは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの残基（複数可）においてのみ異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ＩＬ−２抗体を提供し、このような各配列の差異は、独立して１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９の軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、図２７のヌクレオチド配列の相補体に中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９の重鎖可変ドメインの配列とは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの残基（複数可）においてのみ異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗ＩＬ−２抗体を提供し、このような各配列の差異は、独立して１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９の重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、図２９のヌクレオチド配列の相補体に中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、抗体９Ｄ６、２Ｃ３、１４Ｃ９、８Ｂ１２、１６Ａ４、１６Ｅ１、１３Ａ１、８Ｆ１０、１２Ｃ４、９Ｂ１２、３Ｈ５、１８Ａ６、１０Ａ６、１０Ｈ７、１５Ａ１０、１２Ｄ２、９Ｂ１０、１７Ｄ３、１５Ｇ１１、１４Ｄ７、１８Ｆ３、１７Ｄ９、２１Ｆ８、２２Ｂ９、２１Ｄ１０、１４Ａ６、１１Ｄ６、１０Ａ９、１６Ｅ３、１４Ｇ７、５Ｈ３、２Ｂ１２、２６Ｈ７、２６Ｃ１２、２Ｈ１１、または１８Ｈ９の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列及び３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列を含む抗ＩＬ−２抗体を提供する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、実施例１５に記載されるようなＩＬ−２への結合について交差阻害する抗ＩＬ−２抗体を提供する。
【００６７】
延長された血清半減期を有するＩＬ−２変異タンパク質及び抗ＩＬ−２抗体
本明細書で提供されるＩＬ−２変異タンパク質は、例えば、ＴｅｆｆまたはＮＫ細胞よりもＴｒｅｇを選択的に増殖させるので、患者に投与される場合の安全性プロファイルが、野生型ＩＬ−２またはＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン；Ｎｏｖａｒｔｉｓ、バーゼル、スイス）のプロファイルとは異なるだろうと予想される。野生型ＩＬ−２またはＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）と関連する副作用としては、インフルエンザ様症状、寒気／悪寒、関節痛、発熱、発疹、掻痒、注射部位反応、低血圧、下痢、悪心、不安、錯乱、及びうつ病が挙げられる。本明細書で提供されるＩＬ−２変異タンパク質は、変異タンパク質の血清半減期を延長する分子を含むように変化されてよく、またはそれに融合されてよく、このような半減期の延長が、患者の副作用または有害事象の可能性または強度を高めるだろうリスクを増加させることはない。このように血清半減期が延長された変異タンパク質の皮下投薬は、より低い最大全身曝露量（Ｃｍａｘ）で標的範囲の長期化を可能にしてよい。血清半減期の延長は、より少ないまたはより頻度の低い変異タンパク質の投薬レジメンを可能にしてよい。
【００６８】
本明細書で提供されるＩＬ−２変異タンパク質の血清半減期は、当該技術分野において既知の本質的に任意の方法によって延長されてよい。このような方法は、ＩＬ−２変異タンパク質の配列を、新生児Ｆｃγ受容体に結合するペプチドを含むように、または延長された血清半減期を有するタンパク質、例えば、ＩｇＧもしくはヒト血清アルブミンに結合するように変化させることを含む。その他の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、融合分子に対して延長された半減期を付与するポリペプチドに融合される。このようなポリペプチドとしては、ＩｇＧ  Ｆｃもしくは新生児Ｆｃγ受容体に結合するその他のポリペプチド、ヒト血清アルブミン、または延長された血清半減期を有するタンパク質に結合するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃ分子に融合される。
【００６９】
ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に融合されてよい。実施例に示されるように、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣ末端への融合は、ＩｇＧ  ＦｃのＮ末端に融合される場合よりも大幅にＩＬ−２変異タンパク質活性を維持する。
【００７０】
本発明の一実施形態は、ＩＬ−２変異タンパク質を抗体のＦｃ領域に融合することにより作製される２つのＦｃ融合ポリペプチドを含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクター中に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞中で遺伝子融合体を発現させて、発現した融合タンパク質を抗体分子と非常に類似するように組み立てることにより作製され得、結果としてＦｃ部分間で鎖間結合が形成されて二量体を生じる。
【００７１】
「Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然形態及び変異タンパク質形態を含み、本発明のＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質または抗ＩＬ−２抗体のいずれかの一部であり得る。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態もまた含まれる。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。延長された血清半減期と共に、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（及びそれらから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。好ましいＦｃ領域はヒトＩｇＧに由来し、これはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。本明細書では、Ｆｃ中の特定の残基は位置により同定される。全てのＦｃ位置は、ＥＵ番号付けスキームに基づいている。
【００７２】
抗体のＦｃ部分における１つの機能は、抗体がその標的と結合する場合に免疫系に伝達することである。これは、「エフェクター機能」と考えられる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞表面上のＦｃ受容体にＦｃが結合することにより媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃと補体系のタンパク質、例えば、Ｃ１ｑとの結合により媒介される。
【００７３】
ＩｇＧサブクラスは、エフェクター機能を媒介するそれらの能力で異なる。例えば、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介することにおいて、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもはるかに優れている。したがって、エフェクター機能が望ましくない実施形態では、ＩｇＧ２Ｆｃが好ましいだろう。しかしながら、ＩｇＧ２Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子と比較した場合に、製造がより困難であって、より短い半減期などのあまり魅力的ではない生物物理学的特性を有することが知られている。
【００７４】
抗体のエフェクター機能は、Ｆｃに１つ以上の変異を導入することにより増加、または減少させることができる。本発明の実施形態は、エフェクター機能を高めるように操作されたＦｃを有するＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を含む（Ｕ．Ｓ．７，３１７，０９１及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５−６９１，２００９；両方ともその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。高いエフェクター機能を有する例示的なＩｇＧ１Ｆｃ分子としては、以下の置換を有する分子が挙げられる：
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ
Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
【００７５】
ＩｇＧ  Ｆｃ含有タンパク質のエフェクター機能を高める別の方法は、Ｆｃのフコシル化を減少させることによるものである。Ｆｃに結合された二分岐複合型オリゴ糖からコアフコースを除去することにより、抗原結合またはＣＤＣエフェクター機能を変化させることなく、ＡＤＣＣエフェクター機能が大幅に増大した。Ｆｃ含有分子、例えば、抗体のフコシル化を減少または無効にするためのいくつかの方法が知られている。これらとしては、特定の哺乳動物細胞系、例えば、ＦＵＴ８ノックアウト細胞系、バリアントＣＨＯ系Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞系ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞系、ならびにβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα−マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞系を含むものにおける組換え発現が挙げられる。あるいは、Ｆｃ含有分子は、非哺乳動物細胞、例えば、植物細胞、酵母、または原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどにおいて発現されてよい。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明のＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質または抗ＩＬ−２抗体は、エフェクター機能を減少させるように操作されたＦｃを含む。低いエフェクター機能を有する例示的なＦｃ分子としては、以下の置換を有する分子が挙げられる：
Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｑ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）
Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）
Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）
【００７７】
ヒトＩｇＧ１がＮ２９７（ＥＵ番号付けシステム）にグリコシル化部位を有すると、グリコシル化が、ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与することが知られている。例示的なＩｇＧ１配列が、配列番号３に提供される：
【００７８】
【化１】
2018512151.tif 000003
2018512151.tif 000004
【００７９】
群は、非グリコシル化抗体を作製するために変異したＮ２９７を有する。この変異は、Ｎ２９７を、生理化学的性質においてアスパラギンに類似しているアミノ酸、例えば、グルタミンなど（Ｎ２９７Ｑ）と、または極性基を有しないアスパラギンを模倣するアラニン（Ｎ２９７Ａ）と置換することに焦点を置いている。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「非グリコシル化抗体」または「非グリコシル化ｆｃ」は、Ｆｃの２９７位にある残基のグリコシル化状態を指す。抗体またはその他の分子は、１つ以上のその他の場所にグリコシル化を含有してよいが、依然として非グリコシル化抗体または非グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質であると見なされてよい。
【００８１】
エフェクター機能を有しないＩｇＧ１Ｆｃを作製する取り組みでは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｎ２９７のグリシンへの変異、すなわちＮ２９７Ｇが、その残基におけるその他のアミノ酸置換よりもはるかに優れた精製効率及び生物物理学的特性を提供することが発見された。実施例８を参照のこと。したがって、好ましい実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃを含む。Ｎ２９７Ｇ置換を含むＦｃは、分子がヒトＩｇＧ１Ｆｃを含むいずれの状況においても有用であり、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体との関連における使用に限定されない。特定の実施形態では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するＦｃを含む。
【００８２】
Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃを含むＦｃはまた、挿入、欠失、及び置換をさらに含んでよい。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ＦｃはＮ２９７Ｇ置換を含み、配列番号３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。特に好ましい実施形態では、Ｃ末端リジン残基が置換される、または欠失される。Ｎ２９７Ｇ置換及びＣ末端リジンの欠失を含むヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列は、配列番号４に記載される。
【００８３】
グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子は、グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ含有分子よりも安定ではないことが示された。Ｆｃ領域は、非グリコシル化分子の安定性を増加させるようにさらに操作されてよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸が、二量体状態でジスルフィド結合を形成するようにシステインに置換される。配列番号３に記載されるアミノ酸配列の残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２は、システインで置換されてよい。好ましい実施形態では、特定の残基対が互いにジスルフィド結合を選択的に形成し、それゆえジスルフィド結合のスクランブリングを制限または防止するような置換である。好ましい対としては、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、ならびにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
Ｆｃ含有分子が本明細書で提供され、残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２のうち１つ以上がシステインで置換されて、その例としては、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、またはＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含むものが挙げられる。
【００８５】
ＩｇＧ１Ｆｃに対して行われてよいさらなる変異は、Ｆｃ含有ポリペプチドの中でもヘテロ二量体形成を促進するものを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、細胞中で共発現される場合に２つの異なるＦｃ含有ポリペプチド鎖のヘテロ二量体形成を促進させる「ノブ」及び「ホール」を作製するように操作される。Ｕ．Ｓ．７，６９５，９６３。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、静電ステアリングを使用して、細胞中で共発現される場合に２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドのホモ二量体形成を妨げながら、ヘテロ二量体形成を促すように変化される。ＷＯ０９／０８９，００４は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。好ましいヘテロ二量体Ｆｃとしては、Ｆｃの一方の鎖がＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ置換を含み、Ｆｃの他方の鎖がＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ置換を含むものが挙げられる。その他の実施形態では、Ｆｃの一方の鎖が、Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及びＥ３５７Ｋ置換を含み、Ｆｃの他方の鎖が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ３７０Ｄ置換を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が単量体であること、すなわち、単一のＩＬ−２変異タンパク質分子のみを含有することが有利であってよい。同様に、１つ以上のさらなる標的と特異的に結合し得る二重、三重、または四重特異性抗体が望ましい場合もある。このような実施形態では、融合タンパク質または抗体のＦｃ領域は、ヘテロ二量体形成を促進する１つ以上の変異を含有してよい。融合タンパク質または抗体は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合ポリペプチド中のＦｃ領域に相互変異を有するが、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２重鎖可変ドメインを欠いているＦｃ領域と共発現される。２つのＦｃ含有ポリペプチドのヘテロ二量体が形成される場合、得られたタンパク質は、単一のＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２結合ドメインのみを含む。
【００８７】
単量体ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を作製する別の方法は、ＩＬ−２変異タンパク質を、単量体Ｆｃ、すなわち、二量体化しないＦｃ領域に融合することである。安定した単量体Ｆｃは、二量体化を妨げて、単量体形態の分子を安定化させる変異を含む。好ましい単量体Ｆｃは、ＷＯ２０１１／０６３３４８に開示され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｖ３９７、Ｌ３９８、Ｆ４０５、またはＹ４０７のトレオニン置換と共に、３９２位及び４０９位に負荷電アミノ酸を含むＦｃを含む。
【００８８】
特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃとＩＬ−２変異タンパク質との間にリンカーを含む。多くの異なるリンカーポリペプチドが、当該技術分野において既知であり、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質との関連において使用されてよい。好ましい実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃとＩＬ−２変異タンパク質との間にＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）からなるペプチドの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質領域との間のポリペプチド領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）の単一コピーを含む。本明細書に示されるように、リンカーのＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）は、適切な細胞中で発現される場合にグリコシル化され、このようなグリコシル化は、溶液中で、かつ／またはインビボで投与される場合にタンパク質を安定化させるのに役立つ場合がある。したがって、特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質は、Ｆｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質領域との間にグリコシル化リンカーを含む。
【００８９】
グリコシル化リンカーは、ポリペプチドとの関連において配置される場合に有用な場合があると考えられている。ポリペプチドのアミノ酸配列中に挿入される、またはポリペプチドのアミノ酸配列中における１つ以上のアミノ酸に取って代わるＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）を含むポリペプチドが、本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）は、ポリペプチド三次構造のループ中に挿入される。その他の実施形態では、ループの１つ以上のアミノ酸が、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）で置き換えられる。
【００９０】
ＦｃのＣ末端部分及び／またはＩＬ−２変異タンパク質のアミノ末端部分は、哺乳動物細胞中で発現される場合にＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化プロファイルを変化させる１つ以上の変異を含有してよい。特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔ３置換、例えば、Ｔ３ＮまたはＴ３Ａをさらに含む。ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５ＴなどのＳ５置換をさらに含んでよい。
【００９１】
ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質ならびに抗ＩＬ−２抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれて、一般に翻訳後に行われるが、必ずしもそうとは限らない。例えば、いくつかの種類の共有結合修飾は、そのアミノ酸残基のいくつかを、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。
【００９２】
最も一般的にはシステイニル残基を、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【００９３】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカーボネートとの反応により誘導化されるが、その理由とは、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり；反応は、好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。
【００９４】
リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応物が挙げられる。
【００９５】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ性条件で反応が実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジン基に加えてアルギニンイプシロンアミノ基と反応してよい。
【００９６】
チロシル残基の特異的修飾は、スペクトル標識をチロシル残基中に導入することに特に関心を払いながら、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により行われてよい。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、好適な上記ラジオイムノアッセイのクロラミンＴ法に使用するための標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化される。
【００９７】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中、Ｒ及びＲ’は、場合により異なるアルキル基である）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
【００９８】
二官能性剤を用いた誘導体化は、様々な方法に使用するために、抗原結合タンパク質を非水溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含み、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体をもたらす。あるいは、反応性非水溶性マトリックス、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；及び第４，３３０，４４０号に記載されている臭化シアン活性化炭水化物及び反応基質などが、タンパク質固定化に用いられる。
【００９９】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基へと頻繁に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内である。
【０１００】
その他の修飾としては、プロリン及びリジンの水酸化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１０１】
本発明の範囲内に含まれるＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体における別の種類の共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンを変化させることを含む。当該技術分野において既知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で述べられる特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系は以下で述べられる。
【０１０２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用されてもよい。
【０１０３】
ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が（Ｎ結合型グリコシル化部位の）上記トリペプチド配列のうち１つ以上を含有するようにその配列を変化させることにより簡便に行われてよい。この変化はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位の）開始配列に対する１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によって行われてもよい。容易にするために、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化により、特に所望のアミノ酸に翻訳されるだろうコドンを生成するように、あらかじめ選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより好ましくは変化される。
【０１０４】
ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとタンパク質との化学的カップリングまたは酵素カップリングによるものである。これらの手順は、それらがＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためにグリコシル化能を有する宿主細胞において、タンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング手法に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの基などの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの基などの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０に、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１０５】
出発ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にまたは酵素的に行われてよい。化学的脱グリコシル化は、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理により、ポリペプチドは無傷のままで、結合する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、ほとんどまたは全ての糖の切断がもたらされる。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２により、及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載されるように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるように、化合物ツニカマイシンの使用により防止されてよい。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。
【０１０６】
ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体における別の種類の共有結合修飾は、タンパク質を様々な非タンパク質性ポリマーに、例えば、これらに限定されないが、様々なポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどを含むポリマーに、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されている手法で結合することを含む。加えて、アミノ酸置換が、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体内の様々な位置で行われて、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促進してよい。したがって、本発明の実施形態は、ＰＥＧ化ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体を含む。このようなＰＥＧ化タンパク質は、それらの非ＰＥＧ化形態よりも増加した半減期及び／または減少した免疫原性を有する場合がある。
【０１０７】
ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体をコードする核酸が、本発明内に包含される。本発明の態様は、本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドバリアント（例えば、縮重による）を含む。
【０１０８】
核酸の単離のためのプローブもしくはプライマーとして、またはデータベース検索のためのクエリー配列として使用される、本明細書に記載されるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、アミノ酸配列からの「逆翻訳」により得られ得る。周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を用いて、ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離かつ増幅することができる。ＤＮＡ断片の組合せにおいて所望の末端を画定するオリゴヌクレオチドが、５’及び３’プライマーとして用いられる。オリゴヌクレオチドは、増幅したＤＮＡ断片の組合せの、発現ベクター中への挿入を促進するために、制限エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含有し得る。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９），ｐｐ．１８９−１９６；及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に記載されている。
【０１０９】
本発明の核酸分子は、一本鎖形態及び二本鎖形態の両方のＤＮＡ及びＲＮＡ、加えて対応する相補的配列を含む。「単離核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、その核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接した遺伝子配列から分離されている核酸である。鋳型から酵素的に、または化学的に合成される核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドなどの場合、このようなプロセスから得られる核酸が単離核酸であると理解される。単離核酸分子は、分離した断片の形態で、またはより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、汚染する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、実質的に純粋形態であり、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で概要が述べられているものなど）により、その成分であるヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに好ましくは由来している。このような配列は、典型的には真核生物遺伝子中に存在する内部非翻訳配列、またはイントロンによって中断されることなく、オープンリーディングフレームの形態で好ましくは提供かつ／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在し得、それらはコード領域の操作または発現に干渉しない。
【０１１０】
本発明によるＩＬ−２変異タンパク質は通常、カセットもしくはＰＣＲ変異誘発または当該技術分野において周知のその他の技術を使用した、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書で概要が述べられているような細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることにより調製される。しかしながら、ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体は、確立された技術を使用してインビトロ合成により調製されてよい。バリアントは、典型的には天然に存在する類似体と同じ定性的生物活性、例えば、Ｔｒｅｇ増殖を示すが、バリアントはまた、以下により詳細に概要が述べられるだろうように、改変された特徴を有するものも選択され得る。
【０１１１】
当業者には理解されるだろうように、遺伝子コードの縮重によって、本発明の各ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、及び抗ＩＬ−２抗体は、極めて多数の核酸によりコードされ、その各々が本発明の範囲内であり、標準的な技術を使用して作製され得る。したがって、特定のアミノ酸配列を同定すると、当業者は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単純に修飾することにより、任意の数の異なる核酸を作製することができる。
【０１１２】
本発明はまた、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態で発現系及び構築物を提供する。加えて、本発明は、このような発現系または構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１１３】
典型的には、宿主細胞のいずれにおいても使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有するだろう。このような配列は、特定の実施形態では「フランキング配列」と総称され、典型的には以下のヌクレオチド配列のうち１つ以上を含むだろう：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列の各々は、以下で述べられる。
【０１１４】
場合により、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してよく；オリゴヌクレオチド配列は、市販の抗体が存在するポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ（配列番号２１）など）、または別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどをコードする。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドのアフィニティー精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティー精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーにより行われ得る。場合により、タグはその後、様々な手段、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを使用することなどにより除去され得る。
【０１１５】
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／もしくは株に由来する）、異種（すなわち、宿主細胞種もしくは株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源からのフランキング配列の組合せ）、合成または天然であってよい。したがって、フランキング配列の供給源は、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、または任意の植物であってよいが、ただし、フランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、この機構により活性化され得ることを条件とする。
【０１１６】
本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかによって得られてよい。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングにより、かつ／または制限エンドヌクレアーゼ消化によりあらかじめ同定されているだろうし、それゆえ、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織源から単離され得る。いくつかの場合には、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が既知であってよい。本明細書では、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングについて本明細書に記載される方法を使用して合成されてよい。
【０１１７】
フランキング配列の全てまたは一部のみが既知であろうとなかろうと、この配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、かつ／または好適なプローブ、例えば、同じ種もしくは別の種からのオリゴヌクレオチド及び／もしくはフランキング配列断片などでゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られてよい。フランキング配列が未知である場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片は、例えば、コード配列または別の遺伝子（複数可）でさえ含有する場合があるより大きなＤＮＡ片から単離されてよい。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なＤＮＡ断片を産生し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（チャッツワース、カリフォルニア州）、または当業者に既知のその他の方法を使用して単離することにより行われてよい。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者には容易に明らかとなるだろう。
【０１１８】
複製起点は、典型的には市販購入されたこれらの原核生物発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。好適なベクターが複製起点部位を含有しない場合、部位は既知の配列に基づいて化学的に合成されて、ベクターに連結されてよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶもしくはＢＰＶなど）が、哺乳動物細胞中でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点が使用されることが多いのは、単に起点がウイルス初期プロモーターも含有するからである）。
【０１１９】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域末端の３’側に位置し、転写を終結させるように機能する。通常、原核細胞の転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片に続いてポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされる、あるいはベクターの一部として市販購入されるが、これはまた、本明細書に記載されるものなどの核酸合成の方法を使用して容易に合成され得る。
【０１２０】
選択可能マーカー遺伝子は、選択的培養培地中で成長した宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に抗生物質もしくはその他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求欠損を補完する；または（ｃ）複合培地もしくは合成培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。具体的な選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物及び真核生物宿主細胞の両方における選択に使用されてよい。
【０１２１】
その他の選択可能な遺伝子が、発現されるだろう遺伝子を増幅するために使用されてよい。増幅は、増殖または細胞生存のために重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続世代の染色体中でタンデムに反復するプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスのチルニジン（ｔｈｙｒｎｉｄｉｎｅ）キナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体は、形質転換体のみが、ベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように一意的に適合されるような選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換細胞を培養することにより課され、それによって、選択可能な遺伝子、ならびに結果として、所望のポリペプチド、例えば、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖などをコードする遺伝子の両方の増幅をもたらす。結果として、増加した量のポリペプチドが、増幅したＤＮＡから合成される。
【０１２２】
リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）を特徴とする。このエレメントは、典型的にはプロモーターの３’側及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。特定の実施形態では、１つ以上のコード領域が内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されてよく、単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
【０１２３】
いくつかの場合には、例えば、真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましいなどの場合、様々なプレ配列またはプロ配列を操作して、グリコシル化または収率を改善してよい。例えば、ある場合には特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させてよく、またはプロ配列を付加してよく、これはまたグリコシル化に影響を及ぼす場合がある。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸と比較して）に発現に伴う１つ以上のさらなるアミノ酸を有する場合があり、これは完全に除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合された、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つまたは２つのアミノ酸残基を有してよい。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用により、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、わずかに切断された形態の所望のポリペプチドが生じる場合がある。
【０１２４】
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、かつＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖をコードする分子に作動可能に連結されるプロモーターを典型的には含有するだろう。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５’側）（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する非転写配列である。従来、プロモーターは、２つのクラス：すなわち、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうち１つに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件における若干の変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化などに応答するそれらの制御下でＤＮＡから高レベルの転写を開始させる。他方では、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結された遺伝子を一様に転写する、すなわち、遺伝子発現をほとんどまたは全く制御しない。様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。
【０１２５】
酵母宿主との使用に好適なプロモーターもまた、当該技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に好適なプロモーターが周知であり、これらとしては、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。その他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１２６】
対象となってよいさらなるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター及び調節配列Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ならびにベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に対象となるのは、以下の動物転写制御領域であり、これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている：膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）；リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ細胞及び肥満細胞で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓で活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）；肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞で活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１２７】
エンハンサー配列は、高等真核生物による転写を増加させるためにベクター中に挿入されてよい。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較的、方向性及び位置に依存せず、転写単位の５’及び３’の両方の位置に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が、既知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的にはウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において既知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーター活性化のための例示的な促進エレメントである。エンハンサーは、コード配列の５’または３’のいずれかでベクター内に配置されてよいが、典型的にはプロモーターの部位５’に位置する。適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列が、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖の細胞外分泌を促進するために発現ベクター中に組み込まれ得る。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、タンパク質が産生されるだろう宿主細胞の種類に依存し、異種シグナル配列が、天然シグナル配列に取って代わり得る。哺乳動物宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例としては、以下のものが挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されているインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号に記載されているＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。一実施形態では、本発明のＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体は、図２４に示されるようなリーダー配列を含む。
【０１２８】
ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノム中に組み込まれる場合に発現を促進する１つ以上のエレメントを含有してよい。例としては、ＥＡＳＥエレメント（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）及びマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造的構成を媒介し、統合されたベクターを「位置」効果から遮断する場合がある。したがって、ＭＡＲは、ベクターが安定したトランスフェクタントを作製するために使用される場合に特に有用である。多数の天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が、当該技術分野、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号；第７，３２６，５６７号；第６，１７７，６１２号；第６，３８８，０６６号；第６，２４５，９７４号；第７，２５９，０１０号；第６，０３７，５２５号；第７，４２２，８７４号；第７，１２９，０６２号において既知である。
【０１２９】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築されてよい。このようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してよい、または含有していなくともよい。本明細書に記載されるフランキング配列のうち１つ以上がまだベクター中に存在していない場合、それらを個別に得てベクターに連結してよい。フランキング配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１３０】
ベクターが構築されて、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖をコードする核酸分子が、ベクターの適切な部位中に挿入された後、完全なベクターが、増幅及び／またはポリペプチド発現に好適な宿主細胞中に挿入されてよい。選択された宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、周知の方法、例えば、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはその他の既知の技術を含む方法により行われてよい。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の種類の関数であるだろう。これらの方法及びその他の好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されている。
【０１３１】
宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖を合成し、これらは、その後に培養培地から収集され得る（宿主細胞が培地中に変異タンパク質などを分泌する場合）、または変異タンパク質などを産生する宿主細胞から直接収集され得る（変異タンパク質などが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、様々な要因、例えば、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどに依存するだろう。宿主細胞は、真核生物または原核生物であってよい。
【０１３２】
発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞系は、当該技術分野において周知であり、これに限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系を含み、当該技術分野において既知の発現系に使用される任意の細胞系が、本発明の組換えポリペプチドを作製するために使用され得る。一般に、宿主細胞は、所望のＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体、または抗ＩＬ−２抗体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。用いられてよい宿主細胞の中には、原核生物、酵母または高等真核細胞がある。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバチルス属が挙げられる。高等真核細胞としては、昆虫細胞及び哺乳動物起源の確立された細胞系が挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯ及び関連細胞系など（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞系、及びＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１に記載されているようなアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶＩ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡもしくはＭＳＲ２９３など、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、その他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。場合により、哺乳動物細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ３Ｔ３またはＳ４９などが、様々なシグナル伝達アッセイまたはレポーターアッセイでポリペプチドを使用するのが望ましい場合に、ポリペプチドの発現に使用され得る。
【０１３３】
あるいは、酵母などの下等真核生物において、または細菌などの原核生物においてポリペプチドを産生することが可能である。好適な酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、クルイベロマイセス属株、カンジダ属、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母株が挙げられる。好適な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の細菌株が挙げられる。ポリペプチドが酵母または細菌中で作製される場合、機能的ポリペプチドを得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、酵母または細菌中で産生されるポリペプチドを修飾することが望ましい場合がある。このような共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を使用して行われ得る。
【０１３４】
ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を、１種以上の昆虫発現ベクター内の好適な制御配列に作動可能に連結させて、昆虫発現系を用いることにより産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国からキット形態で市販されていて（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）、このような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）、及びＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されているように、当該技術分野において周知である。無細胞翻訳系も、本明細書に開示される核酸構築物に由来するＲＮＡを使用して、ポリペプチドを産生させるために用いられ得る。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）により記載されている。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【０１３５】
特定の態様では、本発明は、制御性Ｔ細胞を優先的に刺激し、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及び／またはＶ９１Ｓ置換ならびに配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする単離核酸を含む。
【０１３６】
本明細書に記載される例示的なＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のいずれかをコードする単離核酸もまた含まれる。好ましい実施形態では、抗体のＦｃ部分及びヒトＩＬ−２変異タンパク質は、場合によりＦｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質との間にコードされるリンカーを用いて、単一のオープンリーディングフレーム内にコードされる。
【０１３７】
別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、上記ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターが、本明細書で提供される。
【０１３８】
別の態様では、上記ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質、または抗ＩＬ−２抗体をコードする単離核酸を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞であってよい、または哺乳動物細胞などの真核細胞であってよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【０１３９】
別の態様では、ヒトＩＬ−２変異タンパク質を作製する方法が、本明細書で提供される。方法は、ヒトＩＬ−２変異タンパク質に作動可能に連結されるプロモーターが発現される条件下で、宿主細胞を培養することを含む。その後、ヒトＩＬ−２変異タンパク質は、培養物から採取される。ＩＬ−２変異タンパク質は、培養培地及び／または宿主細胞溶解物から採取されてよい。
【０１４０】
別の態様では、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法が、本明細書で提供される。方法は、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質に作動可能に連結されるプロモーターが発現される条件下で、宿主細胞を培養することを含む。その後、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、培養物から採取される。ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、培養培地及び／または宿主細胞溶解物から採取されてよい。
【０１４１】
別の態様では、抗ＩＬ−２抗体を作製する方法が、本明細書で提供される。方法は、抗ＩＬ−２抗体の重鎖及び軽鎖に作動可能に連結されるプロモーターが発現される条件下で、宿主細胞を培養することを含む。その後、抗ＩＬ−２抗体は、培養物から採取される。抗ＩＬ−２抗体は、培養培地及び／または宿主細胞溶解物から採取されてよい。
【０１４２】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量のＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体を、薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／またはアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の枠内である。本発明の医薬組成物としては、液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
好ましくは、製剤材料は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性である。具体的な実施形態では、治療分子を含有する治療有効量のＩＬ−２変異タンパク質、例えば、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体を含む医薬組成物が提供される。
【０１４４】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透を変更、維持または保持するための製剤材料を含有してよい。このような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、もしくはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩もしくはその他の有機酸など）；増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及びその他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性増強剤（スクロースもしくはソルビトールなど）；張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤ならびに／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８’’  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【０１４５】
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、目的の投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて、当業者により決定されるだろう。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。特定の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼす場合がある。特定の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであってよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってよく、非経口投与用の組成物において一般的なその他の材料を補充する可能性がある。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる例示的なビヒクルである。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトールまたはそれに好適な代替物をさらに含んでよい。本発明の特定の実施形態では、Ｉｌ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤用薬剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存のために調製されてよい。さらに、特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体生成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化されてよい。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、組成物は、吸入のために、または消化管を通過する送達、例えば、経口送達などのために選択されてよい。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技能範囲内である。製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で好ましくは存在する。特定の実施形態では、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨで、またはそれよりもわずかに低いｐＨで、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【０１４７】
非経口投与が検討される場合、本発明に使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水溶液の形態で提供されてよい。非経口注射に特に好適なビヒクルは滅菌蒸留水であり、その中で変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物が、滅菌等張液として製剤化されて、適切に保持される。特定の実施形態では、調製は、所望の分子と、デポー注射により送達され得る生成物の制御放出または持続放出を提供する場合のある薬剤、例えば、注射用ミクロスフェア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどとの製剤化を含み得る。特定の実施形態では、循環中の持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸もまた使用されてよい。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスが、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物を導入するために使用されてよい。
【０１４８】
持続送達または制御送達製剤中にＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物を含む製剤を含む、さらなる医薬組成物が当業者には明らかだろう。様々なその他の持続送達または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性微粒子または多孔質ビーズ及びデポー注射などを製剤化するための技術もまた、当業者には既知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照し、これは参照によって組み込まれ、医薬組成物の送達のための、多孔質ポリマー微粒子の制御放出について記載している。持続放出調製物は、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態で半透性ポリマーマトリックスを含んでよい。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されるようなもので、その各々が参照によって組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（上記のＬａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を挙げてよい。持続放出組成物はまた、当該技術分野において既知のいくつかの方法のうちいずれかにより調製され得るリポソームを含んでよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号；第ＥＰ０８８，０４６号及び第ＥＰ１４３，９４９号を参照し、これらは参照によって組み込まれる。
【０１４９】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜に通して濾過することにより行われ得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかに実施されてよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存され得る。非経口組成物は、一般に滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により刺し通し可能な栓を有する静脈内輸液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０１５０】
本発明の態様は、自己緩衝ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体製剤を含み、これらは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ０６１３８１８１（Ａ２）号（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているような医薬組成物として使用され得る。
【０１５１】
上述のように、特定の実施形態は、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物、特にＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体組成物に加えて、本節及び本明細書内の他の箇所に例示的に記載されているものなどの１種以上の賦形剤を含む、医薬Ｉｌ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を提供する。賦形剤は、この点に関して多様な目的、例えば、製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的特性を調整すること、例えば、粘度の調整など、ならびにまたは本発明のプロセスを調整し、有効性を改善する、かつもしくはこのような製剤ならびに例えば、製造中、輸送中、保存中、使用前の調製中、投与中、及びその後に生じるストレスによる分解及び損傷に対してプロセスを安定化させることなどのために本発明で使用され得る。
【０１５２】
タンパク質安定化ならびにこの点に関して有用な製剤材料及び方法に関する様々な説明、例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，」Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，」ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２），及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）などが、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれて、特に本発明に従う自己緩衝タンパク質製剤のための賦形剤及びそのプロセスに関する部分において、特に獣医学的用途及び／またはヒト医学的用途のタンパク質医薬製品及びプロセスに関して利用可能である。
【０１５３】
塩は、本発明の特定の実施形態に従って、例えば、製剤のイオン強度及び／もしくは等張性を調整するために、かつ／または本発明に従う組成物のタンパク質もしくはその他の成分の溶解度及び／もしくは物理的安定性を改善するために使用されてよい。
【０１５４】
周知の通り、イオンは、タンパク質の表面上で荷電残基に結合することにより、ならびにタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽して、それらの静電相互作用、引力相互作用、及び反発相互作用の強度を減少させることによりタンパク質の天然状態を安定化し得る。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化し得る。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用もまた、分子間静電相互作用を減少させて、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防止または減少させることができる。
【０１５５】
イオン種は、タンパク質に対するそれらの効果の点で有意に異なる。イオン及びタンパク質に対するそれらの効果に関する多数のカテゴリー別順位が開発されていて、本発明に従って医薬組成物を製剤化する際に使用され得る。一例としてはホフマイスター系列であり、これはイオン性及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質のコンフォメーション安定性に対するそれらの効果により順位付けする。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、溶液からタンパク質を沈殿させる（「塩析」）ために高濃度（例えば、＞１モルの硫酸アンモニウム）で一般的に使用される。カオトロープは、タンパク質を変性かつ／または可溶化させる（「塩溶」）ために一般的に使用される。「塩溶」及び「塩析」するためのイオンの相対的有効性は、ホフマイスター系列におけるそれらの位置を規定する。
【０１５６】
遊離アミノ酸は、本発明の様々な実施形態に従ってＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体製剤に、増量剤、安定剤、及び抗酸化剤、加えてその他の標準的な用途として使用され得る。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用され得る。グリシンは、正確なケーキ構造及び特性を確保するために凍結乾燥において有用である。アルギニンは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方で、タンパク質凝集を阻害するために有用であってよい。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
【０１５７】
ポリオールとしては、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトールならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコールなど、ならびに本明細書における考察の目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質が挙げられる。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護するために、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方で有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の張度を調整するのに有用である。
【０１５８】
ポリオールの中でも、本発明の選択実施形態において有用なものはマンニトールであり、これは凍結乾燥製剤においてケーキの構造安定性を確保するために一般的に使用される。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保する。マンニトールは、一般にリオプロテクタント、例えば、スクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、好ましい薬剤の中でも、張度を調節するための薬剤、及び輸送中の凍結融解ストレスまたは製造プロセス中のバルクの調製から保護するための安定剤として好ましい薬剤である。還元糖（遊離アルデヒドまたはケトン基を含有する）、例えば、グルコース及びラクトースなどは、表面のリジン残基及びアルギニン残基を糖化し得る。したがって、それらは、一般に本発明に従った使用に好ましいポリオールの中には入らない。加えて、このような反応種を形成する糖、例えばスクロースなども、酸性条件下でフルクトース及びグルコースへと加水分解され、結果として糖化を引き起こし、この点に関して本発明の好ましいポリオールの中には入らない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化するために、及びクライオプロテクタントとして有用であり、この点に関して本発明で使用され得る。
【０１５９】
ＩＬ−２変異タンパク質及び／または抗ＩＬ−２抗体製剤の実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面上での吸着ならびに気−液、固−液、及び液−液界面における変性及び結果として生じる凝集の影響を受けやすい場合がある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例して増減する。これらの有害な相互作用は、一般にタンパク質濃度に反比例して増減し、典型的には物理的攪拌、例えば、製品の輸送及び取り扱い中に生じた攪拌などにより悪化する。
【０１６０】
界面活性剤は、表面吸着を防止する、最小限に抑える、または減少させるために日常的に使用される。この点に関して本発明で有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。
【０１６１】
界面活性剤はまた、タンパク質のコンフォメーション安定性を制御するためにも一般的に使用される。この点に関して界面活性剤の使用は、タンパク質特異的であり、その理由とは、任意の所与の界面活性剤が、典型的にはあるタンパク質を安定化し、その他のタンパク質を不安定化するだろうからである。
【０１６２】
ポリソルベートは酸化分解の影響を受けやすく、供給される場合、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な過酸化物量を多くの場合に含有する。結果として、ポリソルベートは慎重に使用されるべきであり、使用される場合、それらの最低有効濃度で用いられるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきであるという原則を例示している。
【０１６３】
ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体製剤の実施形態は、１種以上の抗酸化剤をさらに含む。タンパク質の有害な酸化は、医薬製剤において周囲酸素及び周囲温度の適切なレベルを維持することにより、かつ光への曝露を回避することにより、ある程度まで防止され得る。抗酸化賦形剤も同様に、タンパク質の酸化分解を防止するために使用され得る。この点に関して有用な抗酸化剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。本発明に従う治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の有効期限全体を通してそれらの活性を維持する。ＥＤＴＡが、この点に関して本発明に従った好ましい抗酸化剤である。
【０１６４】
抗酸化剤は、タンパク質を損傷し得る。例えば、特にグルタチオンなどの還元剤は、分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それら自体が製剤中のタンパク質を損傷する可能性を排除または十分に減少させるように選択される。
【０１６５】
本発明に従う製剤は、タンパク質補因子であり、かつタンパク質配位錯体を形成するのに必要な、例えば、特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要な亜鉛などの金属イオンを含んでよい。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスも触媒する。
【０１６６】
マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、イソアスパラギン酸へのアスパラギン酸の異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加し得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化し得、これはＭｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２ならびにＦｅ＋２により不安定化され得、その凝集はＡｌ＋３イオンにより増加され得る。
【０１６７】
ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体製剤の実施形態は、１種以上の防腐剤をさらに含む。防腐剤は、同じ容器からの２回以上の抽出を伴う、複数回用量の非経口製剤を開発する場合に必要である。それらの主な機能は、微生物の増殖を阻害し、医薬品の有効期限または使用期間全体を通して製品の無菌性を確保することである。一般的に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。防腐剤は、小分子非経口剤と共に使用されるという長い歴史を有するが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほぼ必ずタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これは複数回用量のタンパク質製剤におけるそれらの使用を制限する主な要因となっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬物は、単回使用のみのために製剤化されてきた。しかしながら、複数回用量製剤が可能な場合、それらは、患者の利便性、及び市場性の増加を可能にするというさらなる利点を有する。好例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例であり、保存製剤の開発により、より利便性の高い複数回使用注射ペンの提案が商品化につながった。ｈＧＨの保存製剤を含有する少なくとも４本のこのようなペンデバイスは、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）がフェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールを用いて製剤化される。
【０１６８】
一実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質のＦｃ融合体、例えば、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｔ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｋ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｒ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｌ１９Ｎ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｌ１９Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｅ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｇ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｔ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｓ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｇ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ）、またはＦｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｓ）などは、ｐＨ５．２で、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、３．０％（ｗ／ｖ）のＬ−プロリン中において１０ｍｇ／ｍＬに製剤化される。別の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質のＦｃ融合体、例えば、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｔ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｋ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｈ１６Ｒ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｌ１９Ｎ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｌ１９Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｅ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｇ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｄ２０Ｔ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｎ８８Ｓ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｄ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｇ）、Ｆｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ）、またはＦｃ．ＩＬ−２（Ｖ９１Ｓ）などは、ｐＨ７．６で、１０ｍＭのＫＰｉ、１６１ｍＭのＬ−アルギニン中で製剤化される。
【０１６９】
いくつかの態様は、保存剤形の製剤化及び開発中に考慮される必要がある。医薬品中の有効防腐剤濃度が最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なうことなく、抗菌有効性を付与する濃度範囲を有する剤形の所与の防腐剤を試験することを必要とする。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、ＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、またはＩＬ−２変異タンパク質のＦｃ融合体を凍結乾燥製剤で提供する。凍結乾燥製品は、防腐剤なしで凍結乾燥されて、使用時に防腐剤を含有する希釈剤で再構成され得る。これにより、防腐剤がタンパク質と接触している時間が短縮されて、付随する安定性リスクを有意に最小限に抑える。液体製剤では、防腐剤の有効性及び安定性が、製品の有効期限（約１８〜２４か月）全体にわたって維持されるべきである。留意すべき重要な点は、防腐剤の有効性が、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証されるべきであるということである。
【０１７１】
ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体製剤は一般に、特定の投与経路及び投与方法のために、特定の投与量及び投与頻度のために、特定の疾患における特定の治療のために、とりわけ、バイオアベイラビリティ及び持続性の範囲で設計されるだろう。したがって、製剤は、任意の好適な経路、例えば、これらに限定されないが、経口的、経耳的、経眼的、経直腸的、及び経膣的を含む経路による、ならびに非経口経路、例えば、静脈内及び動脈内注射、筋肉注射、ならびに皮下注射を含む経路による送達のために本発明に従って設計されてよい。
【０１７２】
医薬組成物が製剤化されると、それは溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として減菌バイアル中に保存されてよい。このような製剤は、すぐに使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存されてよい。本発明はまた、単回用量投与単位を作製するためのキットも提供する。本発明のキットは各々、乾燥タンパク質を有する第１容器及び水性製剤を有する第２容器の両方を含有してよい。本発明の特定の実施形態では、シングルチャンバー及びマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含有するキットが提供される。
【０１７３】
用いられるＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体を含有する医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療内容及び目的に依存するだろう。当業者は、処置に適切な投与量レベルが、送達される分子、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面もしくは器官サイズ）ならびに／または状態（年齢及び全身の健康状態）に部分的に応じて変動するだろうことを理解するだろう。特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために投与量を滴定し、投与経路を変更してよい。典型的な投与量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれを超えてもよい。具体的な実施形態では、投与量は、０．５μｇ／ｋｇ〜最大約１００μｇ／ｋｇ、場合により２．５μｇ／ｋｇ〜最大約５０μｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０１７４】
治療有効量のＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体は、好ましくは疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度もしくは期間の増加、または疾患の苦痛による損傷もしくは障害の予防をもたらす。
【０１７５】
医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号；第４，４３９，１９６号；第４，４４７，２２４号；第４，４４７，２３３号；第４，４８６，１９４号；第４，４８７，６０３号；第４，５９６，５５６号；第４，７９０，８２４号；第４，９４１，８８０号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；及び第５，３９９，１６３号に記載されていて、これらは全て参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
一実施形態では、医薬組成物は、を含むものが提供される。
【０１７７】
自己免疫障害または炎症性障害の処置方法
特定の実施形態では、本発明のＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体は、自己免疫障害または炎症性障害を処置するために使用される。好ましい実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が使用される。
【０１７８】
本明細書に開示されるＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体を用いた処置に特に適している障害としては、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身性発症若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸疾患性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清反応陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身性発症関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清反応陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、ミオリチス（ｍｙｏｌｉｔｉｓ）、多発性ミオリチス（ｐｏｌｙｍｙｏｌｉｔｉｓ）、皮膚ミオリチス（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｌｉｔｉｓ）、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性プロイ筋痛症（ｐｌｏｙｍｙａｌｇｉａ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギラン・バレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ＧＶＨＤ、移植拒絶、腎障害、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然流産などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
好ましい実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、自然流産、アトピー性疾患、及び炎症性腸疾患である。
【０１８０】
別の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害を有する、またはそれを発症するリスクのある患者は、ＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体（例えば、本明細書に開示されるＩＬ−２変異タンパク質、例えば、本明細書に開示されるようなＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体など、または当該技術分野において既知の別のＩＬ−２変異タンパク質もしくは野生型ＩＬ−２を、場合により本明細書に記載される種類のＦｃ融合分子の一部として）を用いて処置されて、その処置に対する患者の応答がモニターされる。モニターされる患者の応答は、処置に対するいずれの検出可能もしくは測定可能な患者の応答でも、またはこのような応答のいずれの組合せでもあり得る。例えば、応答は、患者の生理学的状態、例えば、体温または発熱、欲求、発汗、頭痛、悪心、疲労、空腹、口渇、精神的鋭敏さなどの変化であり得る。あるいは、応答は、例えば、患者から採取した末梢血試料中の細胞型または遺伝子産物（例えば、タンパク質、ペプチド、もしくは核酸）の量の変化であり得る。一実施形態では、患者の処置レジメンは、患者が処置に対する検出可能もしくは測定可能な応答を有する場合、またはこのような応答が特定の閾値を超える場合に変更される。この変更は、投薬頻度の減少もしくは増加、または１用量当たりに投与されるＩＬ−２変異タンパク質もしくは抗ＩＬ−２抗体の量の減少もしくは増加、または投薬の「休止」（すなわち、特定の期間、もしくは処置を行う医師が処置を継続すべきであると決定するまで、もしくはモニターされる患者の応答が処置を再開すべき、もしくは再開できると示すまでのいずれかにおける一時的な処置の中断）、または処置の終了であり得る。一実施形態では、応答は、患者の体温またはＣＲＰレベルの変化である。例えば、応答は、患者の体温上昇、もしくは末梢血試料中のＣＲＰレベルの上昇、またはその両方であり得る。特定の一実施形態では、患者の処置は、処置過程中に患者の体温が、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１、１．５、２、または２．５℃上昇する場合に減少される、一時中断される、または終了される。別の特定の実施形態では、患者の処置は、処置過程中に患者の末梢血試料中におけるＣＲＰの濃度が、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１、１．５、または２ｍｇ／ｍＬ上昇する場合に減少される、一時中断される、または終了される。処置を変更、減少、一時中断、または終了するか否かを決定する上でモニターかつ使用され得るその他の患者反応としては、毛細管漏出症候群（低血圧及び心血管不安定）の発症もしくは悪化、好中球機能障害（例えば、感染の発症もしくは悪化をもたらす、もしくは検出される）、血小板減少症、血栓性血管症、注射部位反応、血管炎（Ｃ型肝炎ウイルス血管炎など）、または炎症症状もしくは疾患が挙げられる。処置を変更、減少、増加、一時中断、または終了するか否かを決定する上でモニターかつ使用され得るさらなる患者反応としては、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＯＸＰ３−ＣＤ８Ｔ細胞、または好酸球の数の増加が挙げられる。これらの細胞型の増加は、例えば、末梢血の単位当たりのこのような細胞数の増加として（例えば、血液１ミリリットル当たりの細胞の増加として表される）、または血液試料中における別の細胞型（複数可）と比較したこのような細胞型の割合の増加として検出され得る。モニターされ得る別の患者反応は、患者の末梢血試料中のＣＤ２５＋細胞上に細胞表面結合したＩＬ−２変異タンパク質または抗ＩＬ−２抗体の量の増加である。
【０１８１】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖方法
ＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、対象または試料中のＴｒｅｇ細胞を増殖するために使用されてよい。非制御性Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの比率を増加させる方法が、本明細書で提供される。本方法は、Ｔ細胞集団を有効量のヒトＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合体と接触させることを含む。比率は、Ｔ細胞集団内のＣＤ３＋ＦＯＸＰ３−細胞に対するＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞の比率を決定することにより測定されてよい。ヒト血液中の典型的なＴｒｅｇ頻度は、全ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の５〜１０％であるが、上に列挙された疾患では、この割合がより低いまたはより高い場合がある。好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇの割合は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１０００％増加する。Ｔｒｅｇの最大増加倍率は、特定の疾患ごとに異なる場合があるが；ＩＬ−２変異タンパク質処置により得られる可能性のある最大Ｔｒｅｇ頻度は、全ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の５０％または６０％である。特定の実施形態では、ＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が対象に投与されると、対象の末梢血中の非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が増加する。
【０１８２】
ＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、その他の細胞型よりもＴｒｅｇを選択的に増殖させるため、それらは対象の末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増加させるためにも有用である。比率は、ＣＤ１９−及びＣＤ３−であるＣＤ１６＋及び／またはＣＤ５６＋リンパ球に対するＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞の比率を決定することにより測定されてよい。
【０１８３】
ＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、患者の末梢血中の非制御性Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対するＴｒｅｇの比率を有意に増加させることなく、患者内の疾患または障害に対して治療効果を有する場合があると考えられる。治療効果は、炎症部位または自己免疫部位におけるＩＬ−２変異タンパク質、抗ＩＬ−２抗体、またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の局所活性に起因する場合がある。
【実施例】
【０１８４】
実際の、かつ予測の両方である以下の実施例は、本発明の特定の実施形態または特徴を例証する目的で提供され、その範囲を限定することを意図するものではない。
【０１８５】
実施例１−ＣＤ２５に対して高い親和性を付与する変異数を減少させること
ＣＤ２５に対する親和性が高く、ＩＬ−２Ｒβγによるシグナル伝達強度が低いＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔｒｅｇの増殖及び機能を選択的に促進する。潜在的な免疫原性を減少させるために、ＣＤ２５に対して高い親和性を達成するのに必要な変異の最小数を求めた。その３つの受容体と複合したＩＬ−２（ＰＤＢコード−２Ｂ５Ｉ）の結晶構造は、Ｖ６９Ａ及びＱ７４ＰがＣＤ２５と相互作用するヘリックス構造内に位置していることを示す。このことは、なぜＶ６９Ａ及びＱ７４Ｐが、高いＣＤ２５結合親和性についての２つの独立したＩＬ−２変異誘発スクリーニングにおいて頻繁に単離されたのかを説明する可能性がある（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｔｈａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。本実施例では、Ｒａｏらのスクリーニングで同定されたＩＬ−２変異タンパク質「２−４」の他方の変異のうち、どれがＶ６９Ａ及びＱ７４Ｐ単独で観察された親和性を超えてそれを増加させるのに最も重要であるかを調査する。以下のタンパク質を、活性化Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ２５への結合についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。全ての構築物は、精製及び検出のためにＣ末端ＦＬＡＧ及びポリ−Ｈｉｓタグも含んだ。特定の変異を丸括弧内に提供する。
ＨａＭｕｔ１Ｄ（Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号８）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ２Ｄ（Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号９）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＳＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ３Ｄ（Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１０）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＲＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ４Ｄ（Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１１）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＡＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ５Ｄ（Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＥＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ６Ｄ（Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１３）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＤＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ７Ｄ（Ｎ７１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１４）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＲＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ８Ｄ（Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１２５Ａ）（配列番号１５）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＲＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＥＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＤＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
【０１８６】
ＨａＭｕｔ７Ｄが、元の分離物「２−４」（約２００ｐＭ）とほぼ同じ親和性でＣＤ２５に結合したため、変異Ｎ７１Ｒは、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ単独（ＨａＭｕｔ１Ｄ、約２ｎＭ）で観察された親和性を大きく超えて親和性を増加させることができたことを示している。他方の構築物は、ＨａＭｕｔ８Ｄの親和性がＷＴ  ＩＬ−２の親和性よりもわずかに高かったことだけを除けば、ＨａＭｕｔ１Ｄと同様の、またはそれよりもわずかに高い親和性を有していた。
【０１８７】
実施例２−半減期改善のためにＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−２変異タンパク質
ＩＬ−２変異タンパク質を用いたＴｒｅｇ濃縮を達成するのに必要な投薬頻度を減少させるために、ＩＬ−２とＩｇＧ１−Ｆｃドメインとの間の様々な融合体を評価した。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１により媒介されるエフェクター機能、例えば、標的細胞溶解などを無効にする点変異を含有していた。利用されたＦｃエフェクター機能変異は、Ａ３２７Ｑ、Ａｌａ  Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）またはＮ２９７Ｇのいずれかであった。Ｔｒｅｇ選択的ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２効力を一部減少させるため、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達に有意に影響を及ぼすことのないような方法でＩＬ−２をＦｃに融合することが重要であった。したがって、Ｆｃ融合を含む場合と含まない場合のＩＬ−２変異タンパク質をＩＬ−２Ｒ活性化について試験した。
【０１８８】
Ｆｃ融合によるＩＬ−２二量体化が、ＩＬ−２Ｒに対するアビディティ増加によってＩＬ−２Ｒシグナル伝達強度を増加させるかどうかを決定するために、より弱いＩＬ−２変異タンパク質（ｈａＤ５）（ＵＳ２０１１０２７４６５０）を、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカー配列により分離したＦｃのアミノ末端に融合した。この変異タンパク質は、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達に影響を及ぼす３つの変異（Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｎ８８Ｄ）、ＣＤ２５に対する高い親和性を付与する８つの変異（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、ならびにシステイン誤対合及び凝集を防止するＣ１２５Ｓを有していた。このような手法によるＦｃへの融合は、ｈａＤ５の生物活性を完全に無効にする一方で、細胞表面ＣＤ２５に対するその高親和性結合が増強されて、恐らくこれは二量体化によるアビディティ増加に起因していた。
【０１８９】
ＩＬ−２変異タンパク質をＦｃヘテロ二量体のＮ末端またはＣ末端のいずれかにも融合し、その結果、Ｆｃ二量体の一方の鎖のみがＩＬ−２ドメインを持つようにした。２つの非対称Ｆｃ鎖間のヘテロ二量体対合を、一方のＦｃ鎖上に導入したリジンと他方のＦｃ鎖上に導入したアスパラギン酸との間の静電相互作用により促進した。ＩＬ−２変異タンパク質ｈａＤ６を一方のＦｃ鎖または他方のＦｃ鎖のＮ末端に融合し、１つの配置が好ましかった場合に、ｈａＤ６．ＦｃＤＤ及びｈａＤ６．ＦｃＫＫと称される２つのタンパク質構築物を得た。変異タンパク質ｈａＭｕｔ７Ｄも、１つまたは２つのＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカーを用いてＦｃヘテロ二量体のＣ末端に融合した（ＦｃＫＫ（Ｇ４Ｓ）ｈａＭｕｔ７Ｄ、ＦｃＫＫ（Ｇ４Ｓ）２ｈａＭｕｔ７Ｄ）。ＩＬ−２変異タンパク質ｈａＤ６とＦｃヘテロ二量体のＮ末端との融合は、ｐＳＴＡＴ５及びＴ細胞増殖実験の両方において遊離ｈａＤ６と比較して活性の部分的な損失をもたらした。対照的に、１つまたは２つのいずれかのＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカーを用いたｈａＭｕｔ７ＤとＦｃヘテロ二量体のＣ末端との融合は、ｈａＭｕｔ７Ｄの効力を変化させなかった。
【０１９０】
ＩＬ−２変異タンパク質とＦｃホモ二量体のＣ末端との融合についても調査した。全ＰＢＭＣを、Ｔ７５組織培養フラスコ中において１００ｍｌ当たり３億個の細胞で、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を用いて活性化した。培養３日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で３日間静止させた。次いで、細胞を、ＩＬ−２バリアントを用いて５０μｌの最終体積において１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の１０×用量滴定で刺激した。ＳＴＡＴ５リン酸化のレベルを、ＢＤ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ緩衝液キットを使用して測定した。簡潔に述べると、１ｍｌのＢＤ溶解／固定ｐｈｏｓｆｌｏｗ緩衝液を添加して刺激を停止させた。細胞を３７℃で２０分間固定し、氷上で１×ＢＤ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ  ｐｅｒｍ緩衝液を用いて透過処理した後にＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３及びｐＳＴＡＴ５について染色した。
【０１９１】
図１に見ることができるように、変異タンパク質ｈａＭｕｔ１Ｄ及びｈａＭｕｔ７Ｄの生物活性は、Ｆｃホモ二量体のＣ末端への融合によって変化しなかった。したがって、ＩＬ−２のＮ末端とＦｃのＣ末端との間の融合は、Ｆｃ．ＩＬ−２ホモ二量体との関連であってもＩＬ−２変異タンパク質のアゴニスト活性を損なうことはなかった。これらの構築物では、製造性改善のためにＣ１２５Ｓの代わりにＣ１２５Ａ変異を使用した。
【０１９２】
実施例３−選択的Ｔｒｅｇ増殖を達成するようにＩＬ−２変異タンパク質効力を調整すること
ＩＬ−２変異タンパク質の最初のパネルは、Ｎ８８Ｄを単独で、またはＩＬ−２Ｒシグナル伝達に影響を及ぼす１つもしくは２つのさらなる変異と共に含有した。変異タンパク質の第２パネルは、Ｎ８８Ｄ系列のものと同様の、またはそれよりもわずかに強力なアゴニズムのいずれかを有する変異タンパク質を同定することを目標として、全て単一の点変異を有するように設計した。２４のシグナル伝達変異のパネルを、予測したＩＬ−２Ｒβと相互作用するアミノ酸（結晶構造、ＰＤＢコード−２Ｂ５Ｉ）に基づいて同定した。特定の置換を、変異タンパク質とＩＬ−２Ｒβとの間の結合自由エネルギーの予測した減少に基づいて選択した。結合自由エネルギーを、ＥＧＡＤ計算アルゴリズム（Ｈａｎｄｅｌ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、サンディエゴのカリフォルニア大学）を使用して算出した。変異体の結合自由エネルギーを、ΔΔＧｍｕｔ＝μ（ΔＧｍｕｔ−ΔＧｗｔ）と定義する。式中、μ（一般に＝０．１）は、実験的エネルギーと比較する場合、１の勾配を有するように結合親和性の予測した変化を正規化するために使用されるスケーリング係数である（Ｐｏｋａｌａ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｅｌ  ２００５）。解離の自由エネルギー（ΔＧ）を、複合状態（ΔＧ結合）と自由状態（ΔＧ自由）との間のエネルギー差として定義した。解離エネルギーΔＧｍｕｔを、各置換について算出した。
【０１９３】
以下の置換（Ｈ１６Ｅ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｋ、Ｄ２０Ｒ、Ｄ２０Ｋ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｙ、Ｍ２３Ｈ、Ｄ８４Ｋ、Ｄ８４Ｈ、Ｓ８７Ｙ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｋ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｙ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｒ、Ｉ９２Ｈ、Ｅ９５Ｋ、Ｅ９５Ｒ、またはＥ９５Ｉ）を有するＩＬ−２変異タンパク質のパネルを、Ｆｃヘテロ二量体へのＣ末端融合体として発現させた。これらの構築物はまた、高いＣＤ２５結合親和性のためのｈａＭｕｔ７変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）及び効率的なフォールディングのためのＣ１２５Ａも含有した。
【０１９４】
パネルを、実施例２のＴ細胞ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイで効力についてスクリーニングすると、Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒが、野生型ＩＬ−２よりも低く、Ｎ８８Ｄよりも高い活性を有することが見出された（図２）。
【０１９５】
Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒは、野生型ＩＬ−２よりも低く、Ｎ８８Ｄよりも高い活性を有していた。
【０１９６】
選択した変異タンパク質を、Ｔ細胞及びＮＫ増殖アッセイにおいても試験した。
【０１９７】
Ｔ細胞アッセイについては、全ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３００万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中で５日間静止させた。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、２４ウェルプレートにおいて５０万／ウェルで、ＦＡＣＳ分析前に７日間ＩＬ−２含有培地中でさらに培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖を、ＣＦＳＥ希釈物（中央ＣＦＳＥ蛍光）として図３に提示する。
【０１９８】
ＮＫ細胞アッセイについては、ＭＡＣＳ選別ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を、ＩＬ−２含有培地中で３日間、１０万／ウェルで９６ウェルプレート中において培養した。０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを、インキュベーションの最後の１８時間中に各ウェルに添加した。結果を図４に示す。
【０１９９】
変異体のＨ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒ変異体は、ＷＴ  ＩＬ−２と同様にＴｒｅｇ増殖を刺激することができたが、その他のＴ細胞に対する効力はおよそ１０×低く（図３）、ＮＫ細胞に対する効力はおよそ１００×低かった（図４）。
【０２００】
Ｆｃ．ＩＬ−２融合タンパク質の別個のパネルを設計し、この中で、Ｆｃヘテロ二量体と変異タンパク質ｈａＭｕｔ７（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｃ１２５Ａ）との間の距離を、一連の個々のアミノ酸切断により縮小した。
【０２０１】
【化２】
2018512151.tif 000005
【０２０２】
Ｔｒｕｎｃ１〜Ｔｒｕｎｃ４は、図２、図３、及び図４に記載されるように、ＳＴＡＴ５リン酸化により、ならびにＴ細胞及びＮＫ細胞増殖により測定した場合、全長親構築物Ｆｃ．ｈａＭｕｔ７と等しい効力を有していた。Ｔｒｕｎｃ５及びＴｒｕｎｃ６は、より弱い応答ではあったが、Ｎ８８Ｄ変異（ｈａＤ及びｈａＭｕｔ７Ｄ）により刺激されるものよりも強く、Ｖ９１Ｋにより刺激されるものと非常に類似した応答を刺激した。Ｔｒｕｎｃ７は、Ｎ８８Ｄ変異タンパク質よりも弱く、Ｔｒｕｎｃ８はごくわずかな活性を有した。しかしながら、ＮＫ細胞上で試験した場合、Ｔｒｕｎｃ５及びＴｒｕｎｃ６はＶ９１Ｋよりも強力なアゴニストであったため、Ｔｒｅｇ選択性が、近位Ｆｃドメインによる立体障害ではなく、シグナル伝達変異によってより容易に達成されたことを示している。
【０２０３】
実施例４−Ｆｃホモ二量体との関連におけるＣＤ２５高親和性変異
高いＣＤ２５結合親和性を付与した変異は、それらがＣＤ２５−ｈｉｇｈＴ細胞に対する向性を増加させたため、及びそれらが長期にわたるＣＤ２５：：ＩＬ−２変異タンパク質会合を促進し、シグナル伝達を延長したために有益であると考えられた。しかしながら、変異数を減少させることは、免疫原性の可能性を減少させる場合がある。ｈａＭｕｔ１高親和性変異のＶ６９Ａ及びＱ７４Ｐを含む場合と含まない場合のＮ８８ＤまたはＶ９１Ｋ変異タンパク質を、Ｆｃホモ二量体のＣ末端に対する融合体として発現させて生物活性について比較した。ｐＳＴＡＴ５刺激アッセイでは、ホモ二量体化は、単量体変異タンパク質と比較してシグナル強度に対して全く影響を及ぼさなかった。高親和性変異Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐの復帰変異も、ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達に影響を及ぼさなかった。Ｔ細胞増殖アッセイでは、高親和性変異は、従来のＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞に対する活性を減少させたが、制御性Ｔ細胞に対する活性は減少させなかった（図５）。高親和性変異はまた、ＮＫ細胞における増殖応答も変化させなかった（図６）。
【０２０４】
高親和性変異が、インビボでＴ細胞応答に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、ヒト化マウス（ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成したＮＯＤ．ＳＣＩＤ．Ｉｌ２ｒｇ−ヌルマウス）にＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質を投薬し、Ｔｒｅｇ増殖をモニターした。７週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤ．Ｉｌ２ｒｇ−ヌル（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、バーハーバー、メイン州）に放射線を照射し（１８０ｒａｄ）、９４，０００個のヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成した。２１週目に、マウスを、パーセントキメラ現象の均等分布（ＰＢＬのフローサイトメトリーにより決定した）に基づいて６つの群に分配し、０日目及び７日目に、１μｇの示したＦｃ．変異タンパク質融合タンパク質またはＰＢＳを皮下注射した。１１日目に、血液中のＴ細胞サブセット頻度をフローサイトメトリーにより決定した。動物１匹当たり１μｇの低用量では、高親和性変異は、Ｎ８８ＤまたはＶ９１Ｋ変異単独で観察した増殖を超えてＴｒｅｇ増殖を改善することはなかった（図７）。
【０２０５】
Ｔｒｅｇ増殖は、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヒトＢ細胞及びＴ細胞、ならびにマウス骨髄細胞の混合物を含む全末梢血白血球（ＰＢＬ）と比較して存在量を増加させなかったという点で選択的であった。さらに、より高い用量では、高親和性変異はＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の増加を促進し、それゆえＴｒｅｇ選択性を減少させた。したがって、Ｆｃホモ二量体との関連において、高親和性変異は、選択的Ｔｒｅｇ増殖を促進するのに必要であるとは見なされなかった。
【０２０６】
【化３】
2018512151.tif 000006
2018512151.tif 000007
【０２０７】
実施例５−Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の細胞表面ＣＤ２５長期会合
ヒト化マウス研究からの予期せぬ結果は、それらのシグナル伝達能の減少にもかかわらず、変異タンパク質が、Ｆｃ．ＷＴ  ＩＬ−２と比較してより強力なＴｒｅｇ濃縮を誘導したことであった。Ｆｃ．ＷＴで見られるものと比較してより高いＴｒｅｇ濃縮及びＦＯＸＰ３上方制御を、１μｇ／マウスの用量で（図７）、及びより低用量の０．５μｇ／マウスで（図８）観察した。このインビボでの効力増加は、Ｔ細胞による消費の減少に起因している場合があり、より多くのＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質を長期シグナル伝達のために利用可能にする。
【０２０８】
しかしながら、インビトロ及びインビボＰＫ研究では、活性化Ｔ細胞培養物からの上清中または投薬したマウスからの血清中において、Ｆｃ．ＷＴと比較してＦｃ．Ｖ９１ＫまたはＦｃ．Ｎ８８Ｄの持続性が有意に増加したことを実証できなかった。Ｆｃ融合体は２つのＩＬ−２変異タンパク質ドメインを持つため、エンドソームリサイクリングの増加が、ＣＤ２５に対するアビディティ増加による長期の細胞表面会合をもたらす場合がある。事実、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄが、融合タンパク質の短時間曝露後に、あらかじめ活性化したＴ細胞の表面上でＦｃ．ＷＴよりも効率的に残留したことを見出した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【０２０９】
初代ＰＢＭＣを、２日間１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３で予備刺激した。細胞を採取し、４回洗浄して、培地中で一晩静止させた。次いで、細胞を４００ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２で３０分間、３７℃でパルスした。パルス後、細胞を１回洗浄後にＴ０で採取、または１２ｍｌの温培地中でさらに３回洗浄し、４時間の培養のいずれかを行った。細胞会合Ｆｃ．ＩＬ−２を検出するために、細胞を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した（図９Ａ）。
【０２１０】
Ｆｃ．ＷＴと比較した、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄを用いたＩＬ−２Ｒシグナル伝達の持続性を、同時点におけるホスホ−ＳＴＡＴ５の細胞内免疫検出により観察した。ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のホスホ−ＳＴＡＴ５  ＭＦＩを示す（図９Ｂ）。
【０２１１】
実施例６−融合配列の最適化
マウスの前臨床研究では、Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質が、無傷の分子の血清濃度をヒトＦｃ部分のみの濃度と比較した場合に差次的曝露を示したことは、ヒトＦｃカタボライトの循環を表す。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のインビボ安定性及び薬物動態を最適化するために、融合配列修飾を、体循環中、及び細網内皮系によるリサイクリング中にＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のタンパク質分解に与えるそれらの影響について特徴付けた。以下の構築物を、インビトロ及びインビボでのタンパク質分解について評価した。
【０２１２】
【化４】
2018512151.tif 000008
【０２１３】
安定性を、全ヒトＦｃの経時的な濃度を無傷のＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の濃度と比較する定量的イムノアッセイにより測定した。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のタンパク質分解を、抗ＩＬ−２及び抗ヒトＦｃ抗体を利用したウェスタンブロット分析、続いてカタボライトの免疫捕獲及び質量分析による特徴付けにより検証した。インビトロ及びインビボ試料からの（Ａｌａ＿Ａｌａ）＿Ｇ４Ｓのカタボライトにおける質量分析による特徴付けは、ＦｃドメインのＣ末端Ｌｙｓをタンパク質分解切断部位として同定した。ＦｃドメインのＣ末端リジンの欠失または変異（（Ｎ２９７Ｇ＿欠失Ｋ）＿Ｇ４Ｓ及び（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴ）は、Ｃ末端リジンを含むＦｃ構築物（（Ａｌａ＿Ａｌａ）＿Ｇ４Ｓ）と比較して、３７℃でマウス血清中の長期インビトロ安定性をもたらした。この長期インビトロ血清安定性は、Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質血清濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定されるように、マウス中においてより高い曝露量となって現れた。Ｃ末端Ｆｃリジンを欠くＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のこの長期安定性は、カニクイザル及びヒトからの血清中においてインビトロでも観察された。ＩＬ−２のＴｈｒ−３からＡｌａへの変異（（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡ）は、マウス血清中で、ならびに組換えヒトカテプシンＤ及びＬを含む別個のインキュベーション中において、（（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴと比較して）３７℃でインビトロ安定性の減少をもたらした。このインビトロ血清安定性の減少は、（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴと比較して（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡで、マウス中におけるインビボでのより低い曝露量（ＡＵＣ）となって現れた。質量分析による、インビトロ及びインビボ試料からの（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡのカタボライトの特徴付けにより、ＩＬ−２変異タンパク質ドメインのＬｙｓ８及びＬｙｓ９を、（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴの同等の試料では観察されなかったタンパク質分解の影響を受けやすい残基として同定した。３７℃での（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴの安定性に対する（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡの安定性の減少は、カニクイザル及びヒトからの血清中においてインビトロでも観察された。
【０２１４】
この領域におけるグリコシル化の重要性ゆえに、また融合タンパク質の製造性を潜在的に改善するために、融合配列をＯ結合型グリコシル化ではなく、Ｎ結合型グリコシル化を促進するように以下の通りに変化させた。
【０２１５】
【化５】
2018512151.tif 000009
【０２１６】
実施例７−カニクイザルＰＫ／ＰＤの決定
標準的なＩＬ−２免疫刺激療法は、望ましくない副作用を回避するために投薬サイクルの間に休薬期間（曝露なし）を必要とする。対照的に、Ｔｒｅｇ増殖または刺激療法は、Ｔｒｅｇ刺激に十分な持続的トラフ薬物レベル（血清Ｃｍｉｎ）であるが、免疫活性化をもたらす薬物レベル未満の最大曝露量（血清Ｃｍａｘ）での長期曝露を必要とする場合がある。本実施例は、炎症性免疫活性化に必要であると思われる薬物レベル未満の最大曝露量（血清Ｃｍａｘ）を維持しながら、延長された標的範囲（血清Ｃｍｉｎ）についての、カニクイザルにおける半減期延長変異タンパク質の投薬戦略を実証する。
【０２１７】
カニクイザルに、４つの群（Ａ〜Ｄ）においてＦｃ．Ｖ９１Ｋ（ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿欠失Ｋ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ、Ｃ１２５Ａ）を投薬し、３つの群（Ａ〜Ｃ）には皮下投薬し、１つの群（Ｄ）には静脈内投薬する。各群では、４匹の生物学的にナイーブなオスのカニクイザルに、以下で概要を述べる投薬戦略により投薬する。半減期延長変異タンパク質の皮下投薬は、より多くのリンパ吸収を可能にし、より低い最大曝露量（血清Ｃｍａｘ）及び／またはより強力な薬理学的応答（Ｔｒｅｇ増殖）をもたらす場合がある。群Ａの投薬戦略は、サイクル１の０日目、２日目、及び４日目に１キログラム当たり１０マイクログラムの３連続用量ならびに１４日目に１キログラム当たり１０マイクログラムの用量からなり、より低い最大曝露量（Ｃｍａｘ）を維持しながら、１キログラム当たり５０マイクログラムのより高い初期用量と同様の長期標的範囲を可能にする。群Ｂの投薬戦略は、群Ａと比較するために０日目及び１４日目に投薬したのが１キログラム当たり５０マイクログラムである。群Ｃの投薬戦略は、０日目及び２８日目に投薬したのが１キログラム当たり５０マイクログラムである。Ｔｒｅｇ濃縮を持続させるためにトラフ範囲が必要であるか否か、または投薬サイクル間の休薬期間が有益であるか否かの決定を可能にする。静脈内投薬アーム群Ｄの投薬戦略は、０日目に投薬したのが１キログラム当たり５０マイクログラムであり、最大曝露量（Ｃｍａｘ）及びＴｒｅｇ濃縮の差と皮下投薬の場合とを比較することができる。
【０２１８】
薬物動態（無傷の分子及び全ヒトＦｃの定量的イムノアッセイ）、抗薬物抗体、放出された可溶性ＣＤ２５、ならびに血清サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、及びＩＬ−１３）を、指定した各用量群について以下の時点で測定する：
【０２１９】
群Ａ：投薬前（第１サイクル；用量１）、４８（投薬前第１サイクル；用量２）、９６（投薬前第１サイクル；用量３）、１００、１０４、１２０、１６８、２１６、２６４、３３６（投薬前第２サイクル）、３４０、３４４、３６０、４０８、４５６、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、及び１００８時間。
【０２２０】
群Ｂ：投薬前（第１サイクル）、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６（投薬前第２サイクル）、３４０、３４４、３６０、４０８、４５６、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、及び１００８時間。
【０２２１】
群Ｃ：投薬前（第１サイクル）、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、６７２（投薬前第２サイクル）、６７６、６８０、６９６、７４４、７９２、８４０、９１２、１００８、１０８０、及び１１７６時間。
【０２２２】
群Ｄ：投薬前（第１サイクル）、０．２５、１、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、及び６７２時間。
【０２２３】
薬力学（末梢血Ｔｒｅｇ、非制御性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞の免疫表現型検査及び計数）を、指定した各用量群について以下の時点で測定する：
【０２２４】
群Ａ：投薬前（第１サイクル；用量１）、９６（投薬前第１サイクル；用量３）、１６８、３３６（投薬前第２サイクル）、４５６、及び５７６時間。
【０２２５】
群Ｂ：投薬前（第１サイクル）、１２０、２４０、３３６（投薬前第２サイクル）、４５６、及び５７６時間。
【０２２６】
群Ｃ：投薬前（第１サイクル）、１２０、２４０、６７２（投薬前第２サイクル）、７９２、及び９１２時間。
【０２２７】
群Ｄ：投薬前（第１サイクル）、１２０及び２４０時間。
【０２２８】
血液学及び臨床化学を、全ての動物及び用量群について、用量群ごとに投薬前及び初期用量後２４時間で評価する。以下のパラメータを評価する。
血液学：
・白血球数（全微分及び絶対微分）
・赤血球数
・ヘモグロビン
・ヘマトクリット
・平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン濃度（算出値）
・絶対網状赤血球
・血小板数
・血球形態
・赤血球分布幅
・平均血小板容積
臨床化学：
・アルカリホスファターゼ
・総ビリルビン（総ビリルビンが１ｍｇ／ｄＬを超える場合は直接ビリルビンも）
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
・アラニンアミノトランスフェラーゼ
・ガンマグルタミルトランスフェラーゼ
・尿素窒素
・クレアチニン
・総タンパク質
・アルブミン
・グロブリン及びＡ／Ｇ（アルブミン／グロブリン）比（算出値）
・グルコース
・総コレステロール
・トリグリセリド
・電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物）
・カルシウム
・リン
【０２２９】
実施例８−非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ
天然に存在するＩｇＧ抗体は、重鎖の定常ドメイン２（ＣＨ２）にグリコシル化部位を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体は、Ａｓｎ２９７位（ＥＵ番号付け）に位置するグリコシル化部位を有する。今日まで、非グリコシル化抗体を作製するための戦略は、物理化学的特性に関してＡｓｎに類似しているアミノ酸（例えば、Ｇｌｎ）で、または極性基を有しないＡｓｎ側鎖を模倣するＡｌａ残基でＡｓｎ残基を置き換えることを含む。本実施例は、Ａｓｎをグリシンで置き換えること（Ｎ２９７Ｇ）の利益を実証する。Ｎ２９７Ｇ  Ｆｃは、より良好な生物物理学的特性及び製造性という特質（例えば、精製中の回収率）を有する非グリコシル化分子である。
【０２３０】
Ｆｃ断片及びＩｇＧ抗体における複数の既知の結晶構造に関する検査により、グリコシル化ループセグメントの周囲、特にグリコシル化されたＡｓｎ２９７位における大幅な構造的柔軟性が明らかとなった。既知の結晶構造の多くでは、Ａｓｎ２９７は、正の主鎖二面角に適合した。Ｇｌｙは、側鎖原子の欠如により、正の主鎖二面角に適合する強い傾向を有する。したがって、このコンフォメーション及び構造上の理由に基づいて、Ｇｌｙは、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａよりも良好なＡｓｎの代替物であってよい。
【０２３１】
Ａｓｎ２９７をＧｌｙで変異させることにより、精製プロセス中においてはるかに改善した回収率（または効率）及び生物物理学的特性を有する非グリコシル化分子がもたらされる。例えば、プロテインＡプールからの回収割合（最終収率）は、Ｎ２９７Ｑの４５．６％及びＮ２９７Ａの３９．６％と比較して、Ｎ２９７Ｇ変異では８２．６％であった。ＳＰＨＰカラム分析により、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａ変異体のより低い回収割合は、テーリングピークによるものであったことが明らかとなり、これは高分子量凝集及び／またはミスフォールド種を示している。この結果は、より大規模な２Ｌスケールの実験で再確認した。
【０２３２】
生物製剤産業では、大規模生産に対する潜在的必要性、例えば、薬物として販売される潜在性を有する分子は、この分子が大規模生産及び精製に適していないというリスクを緩和するための多数の属性について評価される。製造性評価では、Ｎ２９７Ｇは、ｐＨ変化に対するロバスト性を明らかにした。Ｎ２９７Ｇには凝集の問題はなかったが；それに対して、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａは、それぞれ２０％及び１０％の凝集増加を示した。Ｎ２９７Ｇはより良好な製造性という特質を有していたが、試験した全ての機能アッセイにおいてＮ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａと同様であった。例えば、ＡＤＣＣアッセイでは、Ｎ２９７Ｇは、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａと同様に細胞傷害性を欠いていた。
【０２３３】
実施例９−安定化した非グリコシル化ＩｇＧ１Ｆｃ
本実施例は、操作したジスルフィド結合（複数可）を導入することにより、ＩｇＧ抗体骨格の安定性を改善する方法について記載する。天然に存在するＩｇＧ抗体は、安定した分子である。しかしながら、一部の治療用途のために、変異を行うこと、または非グリコシル化分子を作製することが必要な場合がある。例えば、非グリコシル化ＩｇＧ分子は、ＡＤＣＣ及びＦｃガンマ受容体への結合を回避する必要がある治療適応症に使用されてよい。しかしながら、非グリコシル化ＩｇＧ１は、グリコシル化ＩｇＧ１よりもはるかに低い融解温度を有する（ＣＨ２ドメインの融解温度は、約１０℃；７０℃〜６０℃に減少する）。観察したより低い融解温度は、非グリコシル化ＩｇＧ１の様々な生物物理学的特性に悪影響を及ぼす。例えば、非グリコシル化ＩｇＧ１は、グリコシル化ＩｇＧ１と比較して低いｐＨで増加した凝集レベルを有する。
【０２３４】
ジスルフィド結合を操作するために、Ｃ−アルファ原子間の距離計算を含む構造に基づく方法を最初に使用して、Ｃｙｓへの変異のためにＦｃ領域中における５４の残基対を同定した。これらの５４の部位を、４つの残基対（Ｖ２５９Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃ）までさらに絞り込んだ。使用した基準は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン内の位置、（ｉｉ）ループ、ターン及び炭水化物からの距離、（ｉｉｉ）Ｆｃガンマ受容体及びＦｃＲｎ相互作用部位からの距離、（ｉｖ）溶媒露出度（好ましい埋没位置）などを含んだ。
【０２３５】
対合システイン置換を、非グリコシル化Ｎ２９７Ｇ  Ｆｃとの関連において作製した。非還元ペプチドマッピング分析により、４つの操作した部位のうち３つが、その関連において予想かつ設計した通りにジスルフィド結合を形成したことが明らかとなった。Ｖ２５９Ｃ−Ｌ３０６Ｃ変異は、ジスルフィド結合を正確に形成せず、ＣＨ２ドメイン中に既に存在する天然ジスルフィドとの誤対合を招いた。他方の３つの設計、すなわち、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃは、予測かつ設計した通りにジスルフィド結合を正確に形成した。Ｎ２９７Ｇ変異にジスルフィド結合を付加することは、Ｎ２９７Ｇ変異単独よりも約１５℃の熱安定性の改善をもたらした。Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃジスルフィドバリアントのうち、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ及びＡ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃが、ラットに投与した場合に良好な薬物動態を有した（それぞれ、１１日間及び９日間のｔ１／２）。これは、以前に公開されたＣＨ２ドメインジスルフィド結合（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９  ２８４：１４２０３−１４２１０）についてラット中で観察された薬物動態プロファイルとは対照的であり、これは５日間のｔ１／２を示していた。
【０２３６】
ＣＨ２ドメイン中のジスルフィド結合を操作することは、グリコシル化ＩｇＧ１分子と同等に非グリコシル化分子の安定性を改善する（示差走査熱量測定により決定されるような、融解温度の１０〜１５℃の改善）。本明細書に記載した操作部位は、ジスルフィドスクランブリングをもたらすことなく、集団のおよそ１００％において予測した通りにジスルフィドを形成する。より重要なことには、公開されているＣＨ２ドメインのジスルフィド結合部位とは異なり、本明細書に記載したジスルフィド結合は、ラットＰＫに影響を及ぼすことはない。
【０２３７】
実施例１０
カニクイザル及びヒトからのＴ細胞及びＮＫ細胞の応答に対するＶ９１Ｋ及びＮ８８Ｄ変異の効果をインビトロで比較した。ＣＤ２５の存在下（全血ｐＳＴＡＴ５応答におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ゲートＴ細胞）では、カニクイザルＩＬ−２Ｒシグナル伝達に対するＶ９１Ｋ変異の効果は、ヒトＩＬ−２Ｒに対するその減少した活性と比較してごくわずかであった。しかしながら、ＣＤ２５の不存在下（全血ｐＳＴＡＴ５応答及びＮＫ細胞増殖における両方のＣＤ２５−ゲートＴ細胞）では、Ｖ９１Ｋ変異は、カニクイザルＩＬ−２Ｒシグナル伝達をさらに著しく減少させた。対照的に、Ｆｃ．Ｎ８８Ｄは、カニクイザル全血中のＣＤ２５＋Ｔ細胞中でシグナル伝達の減少を示し、これはヒト全血中のＴ細胞におけるＦｃ．Ｖ９１Ｋのシグナル伝達効果により類似している。表２にまとめたインビトロデータは、カニクイザルにおいてより弱いアゴニストのＦｃ．Ｎ８８Ｄで観察した治療濃度域が、ヒト対象におけるＦｃ．Ｖ９１Ｋの効果を予測するであろうことを示唆している。
【０２３８】
【表２】
2018512151.tif 000010
【０２３９】
実施例１１
２つのインビボ研究をカニクイザルで実施した。最初のカニクイザル研究は、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋの２週間及び４週間の投薬間隔を比較して、完全なまたは部分的な薬物動態（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）トラフが、第２用量に対する応答の大きさを変化させたかどうかを決定するように設計した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。強力なＴｒｅｇ応答が得られると予測した第１用量（５０μｇ／ｋｇ）、及び治療濃度域の下限値を調査するための第２用量（１０μｇ／ｋｇ）を使用した。１０μｇ／ｋｇが少な過ぎるのか否か分からなかったため、用量を１日目、３日目、及び５日目に投与して応答の可能性を高めた。この投薬レジメンにより、５０μｇ／ｋｇの単回皮下（ＳＣ）用量で達成したのと同じ曝露量を５日目の後に得たが、Ｃ−ｍａｘはより低かった。５０μｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）群も、リンパ対血液区画におけるより高い薬物曝露量に応じたＰＤの生じ得る差を調査するために含んだ。この研究の結果は、用量レベルの各々が、有害事象（ＡＥ）またはＴｅｆｆもしくはＮＫ増殖なしに強力なＴｒｅｇ増殖応答を誘導し、かつ１４日目または２８日目のいずれかで第２用量に対する応答が同等であったことを立証した。
【０２４０】
【表３】
2018512151.tif 000011
【０２４１】
第２カニクイザル研究は、１、３、１００、２００μｇ／ｋｇ（ＳＣ）のＦｃ．Ｖ９１Ｋ用量で治療濃度域のマージンを調査して、これを３、１０、１００、２００μｇ／ｋｇ用量（ＳＣ）のより弱いアゴニストであるＦｃ．Ｎ８８Ｄ及び３、１０、３０、１００μｇ／ｋｇ（ＳＣ  ＱＤ×５）のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）と比較するように設計した。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）の用量を、公開されているヒト及び非ヒト霊長類研究（Ｈａｒｔｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｌａｎｃｅｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １：２９５−３０５；Ｓａａｄｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＮＥＪＭ  ３６５：２０６７−７７；Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １２：２５３２−３７）に基づいて選択し、ＨＣＶ血管炎及び１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）における低用量ＩＬ−２臨床試験を模倣するようにＱＤ×５で投与した。
【０２４２】
【表４】
2018512151.tif 000012
【０２４３】
図１１Ａ〜図１１Ｆでは、細胞応答、体温、及び血清ＣＲＰの動態を示す。ｘ軸の時系列は、第１用量の日として１日目ではなく０日目から始まる。
【０２４４】
組み合わせて、２つのカニクイザル研究は、ＩＬ−２変異タンパク質が、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）で達成したものよりも幅広い治療濃度域を有する、より高いＴｒｅｇ濃縮を誘導したことを実証した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）では、Ｔｒｅｇ濃縮は、ＮＫ及び好酸球の増殖と並行していた。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、好酸球増殖はＩＬ−２療法に対する周知の応答であり、ＣＤ２５＋自然リンパ細胞からのＩＬ−２誘導ＩＬ−５の結果である可能性が高い。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔｅｆｆ増殖は、ＴｒｅｇをＣＤ４Ｔ細胞の２５〜３５％に増加させた用量で生じた。対照的に、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄは、ＮＫ細胞及び好酸球を上回るより高い選択性でＴｒｅｇ増殖を誘導し、Ｔｅｆｆ増殖を促進した用量は、ＴｒｅｇをＣＤ４Ｔ細胞の＞４０％に濃縮した用量を上回った。
【０２４５】
文献で報告された低用量ＩＬ−２臨床試験では、最初に生じたＡＥはインフルエンザ様症状及び発熱であった。したがって、治療濃度域の比較に加えて、この研究の目的は、発熱に先行するバイオマーカーを発見することであった。図１２Ｃに示すように、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）のより高い２つの用量では、ＣＲＰレベルが体温と並行していることが見出された。Ｆｃ．Ｖ９１Ｋでは、中程度の体温上昇を最高用量で検出し、次により低い用量では、ＣＲＰのわずかな増加を観察した。したがって、ＣＲＰを使用して、本発明の分子を用いた処置に対する対象の応答をモニターすること、及び／または患者における用量漸増の上限値を定義することができる。
【０２４６】
ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）処置動物では、Ｆｃ．Ｖ９１ＫまたはＦｃ．Ｎ８８Ｄ処置動物にはあまり顕著ではなかった、または存在しなかったいずれかの特定の毒性も観察した（図１２Ｄ）。血小板、好中球、及びアルブミンのレベルが、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）を用いた処置により全て減少したことが見出されたのに対して、同様のまたはそれよりも高いＴｒｅｇ濃縮をもたらしたＦｃ．Ｖ９１ＫまたはＦｃ．Ｎ８８Ｄのいずれかの用量は、これらのパラメータをほとんどまたは全く減少させることはなかった。総合すると、これらのデータは、Ｆｃ．Ｖ９１ＫまたはＦｃ．Ｎ８８Ｄのいずれかを用いた患者の処置のための治療濃度域が、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）を用いた場合よりも有意に広いことが予想されることを示している。
【０２４７】
実施例１２
選択した時点において、実施例１１の第１カニクイザル試験からの血清を抗薬物抗体（ＡＤＡ）について試験した（図１３）。Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ特異性が競合によって確認された試料のＡＤＡシグナル／ノイズデータを示す。ＡＤＡを試験した時点を、ｘ軸の上の縦線で示す。群１では、１匹の動物が最終用量から少なくとも１５日後にＡＤＡを生成し、群２では試験結果がＡＤＡに陽性であった動物はおらず、群３では、第１用量から１５日後またはそれを超えて３匹の動物にＡＤＡが一貫して現れた。１６２日目に群１及び群２に５０μｇ／ｋｇを反復投薬したところ、４週間後（１９０日目）にさらに試験結果がＡＤＡに陽性であった動物はいなかった。最も強いＡＤＡシグナル（２１０、２１２）を生成した群３の２匹の動物がＰＤ応答の減少を示し、これは、これらの動物において第２用量後に観察したＣ−ｍａｘの減少と一致していた。群４（５０μｇ／ｋｇ  ＩＶ）では、試験結果がＡＤＡに陽性であった動物はいなかった。ＡＤＡは、ＩＬ−２及びＦｃドメインの両方に特異的であったことから、カニクイザルＩＬ−２とヒトＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ、Ｃ１２５Ａ）との間の８つのアミノ酸差異によるものであると予想できる。ＡＤＡの中和活性は試験しなかった。
【０２４８】
実施例１３
本実施例は、本発明の原理を使用して、所望のレベルまでＩＬ−２Ｒシグナル伝達を誘導するＩＬ−２変異タンパク質を設計かつ同定し得ることを示す。
【０２４９】
ＩＬ−２Ｒβ結合及びＩＬ−２Ｒシグナル伝達強度を部分的に減弱させるＩＬ−２変異を発見するために、計算アルゴリズムを適用して、ＩＬ−２変異がＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβとの間の会合エネルギーを減少させる程度を決定した。ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒα：ＩＬ−２Ｒβ：γｃ（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｂ５Ｉ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０（５７５１）：１１５９−６３））の構造を計算アルゴリズムへの入力値として使用し、構造に基づく計算エネルギー算出に基づいて６４のバリアントを推奨した。要約すると、ステップは、（ｉ）エネルギー算出のために、その受容体と複合したＩＬ−２の構造を調製すること、（ｉｉ）他方の１９の天然に存在するアミノ酸への変異のためにＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβ境界の界面残基を同定すること、（ｉｉｉ）２つの異なる計算アルゴリズムを使用して変異エネルギー算出を実行すること、ならびに（ｉｖ）算出したエネルギー値、アミノ酸のコンフォメーション、ならびにこれまでの経験及び知見を利用する基準を使用して変異タンパク質を選択することを含む。
【０２５０】
ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒα：ＩＬ−２Ｒβ：γｃ構造を、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用して陰（ＧＢＩＭ）溶媒モデル中において全ての水分子の欠失、欠損原子の座標生成、及び複合構造のエネルギー最小化により調製した。上記ステップを、ＡＣＣＥＬＲＹＳ（登録商標）からのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ＢＩＯＶＩＡ、サンディエゴ、カリフォルニア州）中で実施した。
【０２５１】
ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβ界面における以下のＩＬ−２残基を複合構造から同定し、インシリコ変異誘発算出のために選択した：Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｍ２３、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、及びＥ９５。インシリコ変異誘発を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアの「Ｃａｌｃｕｌａｔｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ（Ｂｉｎｄｉｎｇ）」プロトコールを使用して実施した。このプロトコールは、結合自由エネルギーの変化、すなわちΔΔＧ結合（すなわち、［ＩＬ−２Ｒβに対する変異体ＩＬ−２の結合自由エネルギー］−［ＩＬ−２Ｒβに対する野生型ＩＬ−２の結合自由エネルギー］）を計算する。ΔΔＧ結合値を陰溶媒モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｌｉｃｉｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）中で算出した。各変異タンパク質内の残基の番号付けは、野生型ヒトＩＬ−２の配列（配列番号１）に対応している：
【０２５２】
【化６】
2018512151.tif 000013
【０２５３】
全ての選択したＩＬ−２残基を、２９９の単一アミノ酸置換バリアントをもたらす１９の他方のアミノ酸に変異させた。これらのバリアントの各々に関するΔΔＧ結合を上記のように計算した。算出したΔΔＧ結合を図１４に報告する。バリアントを、選択した変異がΔΔＧ結合値＞１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌをもたらし、プロリン残基を導入しないように選択した。多様性を高めるために、変異がΔΔＧ結合＞１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌをもたらさない位置（例えば、Ｌ１２）については、変異をΔΔＧ結合＞１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌで選択した。
【０２５４】
ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒα：ＩＬ−２Ｒβ：γｃ構造を、ＯＰＬＳ２００５力場（Ｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ２６：１７５２）を使用して、構造から全ての水分子の欠失、欠損原子の座標を生成すること及び構造の最小化により調製した。上記ステップを、ＢＩＯＬＵＭＩＮＡＴＥ（登録商標）ソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ニューヨーク、ニューヨーク州）中で実施した。
【０２５５】
ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒβ界面における以下のＩＬ−２残基を複合構造から同定し、インシリコ変異誘発算出のために選択した：Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｍ２３、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５。インシリコ変異誘発を、ＢＩＯＬＵＭＩＮＡＴＥ（登録商標）の「Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ」機能を使用して実施した。算出したΔΔＧ結合を図１５に報告する。
【０２５６】
予測したΔΔＧ結合を使用して、バリアントを以下の基準により選択した：選択した変異がプロリン残基を導入しない；選択した変異が、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアによって既に推奨されたものではない；選択した変異が、ΔΔＧ結合値＞１０ｋｃａｌ／ｍｏｌをもたらす；選択した変異がヒスチジン残基を導入しない（ＢＩＯＬＵＭＩＮＡＴＥ（登録商標）によりヒスチジン残基への変異について計算されたΔΔＧ結合値は、信頼できないことが分かった）。
【０２５７】
変異Ｄ２０Ｅ、Ｖ９１Ｄ、及びＩ９２Ｗは、ＢＩＯＬＵＭＩＮＡＴＥ（登録商標）により提案された新規バリアントであって、これらをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアにより推奨された５７のバリアントの一覧に加えた。バリアントＬ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１９Ｒ及びＬ１９Ｎも最終分析に含めて、以下の一覧となった：Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｅ９５Ｇ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｍ２３Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｑ１３Ｇ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｓ。全てのＩＬ−２変異タンパク質が、製造性改善のためにＣ１２５Ａ変異も含有した。
【０２５８】
Ｇ４Ｓリンカーにより分離したＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ）のＣ末端に融合した６６のＩＬ−２変異タンパク質のパネルを、予備活性化及び静止ヒトＴ細胞上でＩＬ−２Ｒ刺激について試験した（図１６）。図１６Ａに示すように、３３ｐＭは全ての変異タンパク質について準最適濃度であり、それゆえ変異タンパク質の活性を、この濃度でのｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩに基づいて順位付けした。この順位付けを、２ＰＢＭＣドナーについて図１６Ｂに示す。上に示す通り、Ｔｒｅｇがこのような減弱ＩＬ−２変異タンパク質に対して選択的に応答するため、このパネルを使用して、最適なＴｒｅｇ選択性をもたらすＩＬ−２Ｒシグナル伝達の上限値及び下限値を規定することができる。
【０２５９】
実施例１４
上清画分で得られた初期ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達データから、構築物のより小さなパネルを発現、精製、及びさらなる評価のために選択した。これらの分子の各々は、Ｆｃ．ＩＬ−２−Ｇ４Ｓリンカー−ＩＬ−２変異タンパク質を含んでいて、各変異タンパク質は、Ｃ１２５Ａ及び次の変異：Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、Ｖ９１Ｓのうち１つを含み、または追加の変異はなかった（「ＷＴ」）。これらの精製分子を、予備刺激及び静止ヒトＴ細胞中においてＳＴＡＴ５リン酸化を活性化するそれらの能力について試験した（図１７）。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質もまた、Ｔ細胞サブセットの増殖を刺激し、ＦＯＸＰ３発現を増加させるそれらの能力について（図１８）、及びＮＫ細胞増殖を刺激するそれらの能力について（図１９）試験した。
【０２６０】
Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質を、Ｔ細胞の表面上でＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）と結合し、様々な時点において細胞表面ＣＤ２５に結合したままにするそれらの能力について試験した（図２０）。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質がＴ細胞中でＳＴＡＴ５リン酸化を刺激した程度（図１７）は、細胞表面保持と高い負の相関関係（ｒ＝−０．８７）にあり、これは、ＩＬ−２Ｒβγを介するシグナル伝達による内在化速度が受容体アゴニズム効力と密接に関連していたことを示している。
【０２６１】
並行して行った実験では、ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達の持続性を、異なる時点におけるホスホ−ＳＴＡＴＳの細胞内免疫検出により観察した。ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のホスホ−ＳＴＡＴＳ  ＭＦＩを図２１に示す。これらの結果は、中間のシグナル伝達強度を有する特定の変異タンパク質が、より遅い時点でのｐＳＴＡＴ５シグナル伝達の維持においてＦｃ．ＷＴ  ＩＬ−２よりも効果的であったことを実証した（例えば、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｄ、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、Ｖ９１Ｓ）。アンタゴニスト変異タンパク質（Ｄ２０Ｗ）を除いて、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達保持は、細胞表面保持と相関する傾向があったが；高い表面保持を示した特定の弱い変異タンパク質は、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達の維持において最も効果的ではなかった（例えば、Ｄ２０Ｇ及びＤ２０Ｔ）（図２２）。
【０２６２】
異なるＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質がインビボでＴｒｅｇ頻度をどのように増加させたのかを決定するために、ヒト化マウス（４か月前にＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成したＮＳＧマウス）に示した変異タンパク質を投薬し、Ｔｒｅｇ濃縮を血液中で４日目に測定した（図２３Ａ）。Ｔｒｅｇ濃縮の程度が、延長されたｐＳＴＡＴ５シグナルを送達する能力と最も密接に相関することが分かり（図２３Ｂ）、Ｖ９１位の置換はインビボでのＴｒｅｇ濃縮に特に効果的であって、インビトロでのＩＬ−２Ｒシグナル伝達保持を増加させた。
【０２６３】
実施例１５
一連のヒト抗ヒトＩＬ−２抗体を、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．、サウザンドオークス、カリフォルニア州）マウス中で生成し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒト及びカニクイザルＩＬ−２の両方と結合するそれらの能力に基づいて選択した。それらの軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸及び核酸配列を図２６〜図２９に示す。
【０２６４】
これらの抗体を、ＤＥＲＬ−２細胞（ＩＬ−２受容体α／β／γ陽性）による、及びＮＫＬ細胞（ＩＬ−２受容体α／β／γ陽性）によるＩＬ−２応答を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。ＤＥＲＬ２細胞に対しては高い阻害活性を、及びＮＫＬ細胞に対しては中程度から低い阻害活性を示した抗体を、さらなる分析のために選択した。クローンを配列決定し、満足のいく製造がより困難であろう姉妹クローン及びそれらのｍＡｂを排除した。結合交差阻害試験を実施して、抗体は８つのビンに分類されることが見出された。試験したＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）抗体の全てを、ビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＥ．１に分類した。ビンＢ、Ｃ、Ｅ及びＥ．１の抗体は、ヒトＩＬ２Ｒαに対するヒトＩＬ−２結合に干渉することが見出されたが、ビンＡ及びＤの抗体は干渉しなかった。ビンＦを、ヒトＩＬ−２に対するその結合により、サイトカインがＩＬ−２受容体αに結合するのを防止しない対照抗体によって定義し、ビンＧを、対照抗体５３４４．１１１（カタログ番号５５５０５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）によって定義した。試験したＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）抗体には、ビンＦまたはＧに分類されるものはなかった。
【０２６５】
動態パラメータのＫＤ、ｋｏｎ及びｋｄｉｓもまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）分析を使用して抗体の各々について定義した。３６の抗体のサブセットを選択し、全てのビンならびにＫＤ及びｋｄｉｓ値の範囲の代表例を含む、クローンの多様性を表した。これらのクローンの全てが、一般に非ＴｒｅｇＣＤ４Ｔ細胞（ｎＴｒ）、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中よりも制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）中においてより高いＩＣ５０値（より高いＩＣ５０が、効果の弱い阻害を示す）で、ヒト全血リンパ球中においてＩＬ−２シグナル伝達を阻害することが見出された。
【０２６６】
次いで、全ての３６の抗体を、ヒト幹細胞で再構成したＮＳＧ  ＳＣＩＤ／Ｈｕマウス中における抗ＩＬ−２抗体／ｈＩＬ−２免疫複合体（抗体：ｈＩＬ−２の１：２モル比で）の一部として、低用量野生型ＩＬ−２．Ｆｃ、モデルＩＬ−２変異タンパク質Ｎ８８Ｄ．Ｆｃ、５３４４．１１１マウス抗ヒトＩＬ−２／ｈＩＬ−２複合体及びＰＢＳ処置対照マウスと比較した場合に、ｎＴｒ、ＮＫ及びＣＤ８細胞に対してＴｒｅｇを増殖させるそれらの能力について試験した。Ｔｒｅｇ／ＮＫ及びＴｒ／ｎＴｒ比を使用して、エフェクター細胞に対してＴｒｅｇを選択的に増殖させるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）抗体の相対的能力を評価した（比は、ＰＢＳ処置マウスで観察した値を基準として正規化し、全ての抗体を分析するために必要ないくつかの実験間及び実験中において比較可能にした）。５３４４．１１１１／ＩＬ−２対照物と同様に、またはそれよりも良好に実施された抗体は１２あった。それらの特性を表５に列挙し、図３０に示す。
【０２６７】
【表５】
2018512151.tif 000014
【０２６８】
【表６】
2018512151.tif 000015
【図１】
2018512151.tif 000016
【図２Ａ】
2018512151.tif 000017
【図２Ｂ】
2018512151.tif 000018
【図３】
2018512151.tif 000019
【図４】
2018512151.tif 000020
【図５】
2018512151.tif 000021
【図６】
2018512151.tif 000022
【図７Ａ】
2018512151.tif 000023
【図７Ｂ】
2018512151.tif 000024
【図８】
2018512151.tif 000025
【図９Ａ】
2018512151.tif 000026
【図９Ｂ】
2018512151.tif 000027
【図１０Ａ】
2018512151.tif 000028
【図１０Ｂ】
2018512151.tif 000029
【図１１Ａ】
2018512151.tif 000030
【図１１Ｂ】
2018512151.tif 000031
【図１１Ｃ】
2018512151.tif 000032
【図１１Ｄ】
2018512151.tif 000033
【図１１Ｅ】
2018512151.tif 000034
【図１１Ｆ】
2018512151.tif 000035
【図１２Ａ】
2018512151.tif 000036
【図１２Ｂ】
2018512151.tif 000037
【図１２Ｃ】
2018512151.tif 000038
【図１２Ｄ】
2018512151.tif 000039
【図１３】
2018512151.tif 000040
【図１４】
2018512151.tif 000041
【図１５】
2018512151.tif 000042
【図１６Ａ】
2018512151.tif 000043
【図１６Ｂ】
2018512151.tif 000044
【図１７】
2018512151.tif 000045
【図１８Ａ】
2018512151.tif 000046
【図１８Ｂ】
2018512151.tif 000047
【図１８Ｃ】
2018512151.tif 000048
【図１８Ｄ】
2018512151.tif 000049
【図１９】
2018512151.tif 000050
【図２０Ａ】
2018512151.tif 000051
【図２０Ｂ】
2018512151.tif 000052
【図２１】
2018512151.tif 000053
【図２２】
2018512151.tif 000054
【図２３Ａ】
2018512151.tif 000055
【図２３Ｂ】
2018512151.tif 000056
【図２４Ａ】
2018512151.tif 000057
【図２４Ｂ】
2018512151.tif 000058
【図２４Ｃ】
2018512151.tif 000059
【図２４Ｄ】
2018512151.tif 000060
【図２４Ｅ】
2018512151.tif 000061
【図２４Ｆ】
2018512151.tif 000062
【図２４Ｇ】
2018512151.tif 000063
【図２４Ｈ】
2018512151.tif 000064
【図２４Ｉ】
2018512151.tif 000065
【図２４Ｊ】
2018512151.tif 000066
【図２４Ｋ】
2018512151.tif 000067
【図２４Ｌ】
2018512151.tif 000068
【図２４Ｍ】
2018512151.tif 000069
【図２４Ｎ】
2018512151.tif 000070
【図２４Ｏ】
2018512151.tif 000071
【図２４Ｐ】
2018512151.tif 000072
【図２５Ａ】
2018512151.tif 000073
【図２５Ｂ】
2018512151.tif 000074
【図２５Ｃ】
2018512151.tif 000075
【図２５Ｄ】
2018512151.tif 000076
【図２５Ｅ】
2018512151.tif 000077
【図２５Ｆ】
2018512151.tif 000078
【図２５Ｇ】
2018512151.tif 000079
【図２５Ｈ】
2018512151.tif 000080
【図２５Ｉ】
2018512151.tif 000081
【図２５Ｊ】
2018512151.tif 000082
【図２５Ｋ】
2018512151.tif 000083
【図２５Ｌ】
2018512151.tif 000084
【図２５Ｍ】
2018512151.tif 000085
【図２５Ｎ】
2018512151.tif 000086
【図２５Ｏ】
2018512151.tif 000087
【図２５Ｐ】
2018512151.tif 000088
【図２５Ｑ】
2018512151.tif 000089
【図２５Ｒ】
2018512151.tif 000090
【図２５Ｓ】
2018512151.tif 000091
【図２５Ｔ】
2018512151.tif 000092
【図２５Ｕ】
2018512151.tif 000093
【図２５Ｖ】
2018512151.tif 000094
【図２５Ｗ】
2018512151.tif 000095
【図２５Ｘ】
2018512151.tif 000096
【図２５Ｙ】
2018512151.tif 000097
【図２５Ｚ】
2018512151.tif 000098
【図２５ＡＡ】
2018512151.tif 000099
【図２５ＢＢ】
2018512151.tif 000100
【図２５ＣＣ】
2018512151.tif 000101
【図２５ＤＤ】
2018512151.tif 000102
【図２５ＥＥ】
2018512151.tif 000103
【図２５ＦＦ】
2018512151.tif 000104
【図２５ＧＧ】
2018512151.tif 000105
【図２５ＨＨ】
2018512151.tif 000106
【図２５ＩＩ】
2018512151.tif 000107
【図２５ＪＪ】
2018512151.tif 000108
【図２５ＫＫ】
2018512151.tif 000109
【図２５ＬＬ】
2018512151.tif 000110
【図２６】
2018512151.tif 000111
【図２７Ａ】
2018512151.tif 000112
【図２７Ｂ】
2018512151.tif 000113
【図２７Ｃ】
2018512151.tif 000114
【図２７Ｄ】
2018512151.tif 000115
【図２７Ｅ】
2018512151.tif 000116
【図２７Ｆ】
2018512151.tif 000117
【図２７Ｇ】
2018512151.tif 000118
【図２７Ｈ】
2018512151.tif 000119
【図２７Ｉ】
2018512151.tif 000120
【図２８−１】
2018512151.tif 000121
【図２８−２】
2018512151.tif 000122
【図２９Ａ】
2018512151.tif 000123
【図２９Ｂ】
2018512151.tif 000124
【図２９Ｃ】
2018512151.tif 000125
【図２９Ｄ】
2018512151.tif 000126
【図２９Ｅ】
2018512151.tif 000127
【図２９Ｆ】
2018512151.tif 000128
【図２９Ｇ】
2018512151.tif 000129
【図２９Ｈ】
2018512151.tif 000130
【図２９Ｉ】
2018512151.tif 000131
【図３０】
2018512151.tif 000132
【配列表】
2018512151000001.app
【国際調査報告】
2018512151.tif 000133
2018512151.tif 000134
2018512151.tif 000135
2018512151.tif 000136
2018512151.tif 000137
2018512151.tif 000138
2018512151.tif 000139
2018512151.tif 000140
2018512151.tif 000141
2018512151.tif 000142
2018512151.tif 000143