(57)【要約】  試料中のインスリンの量を決定する方法を記載する。タンデム質量分析又は高分解能／高精度質量分析技術に加えて濃縮及び／又は精製法を利用して生物学的試料中のインスリン及びＣ−ペプチドを検出し、定量するための質量分析法が、本明細書で提供される。また、タンデム質量分析又は高分解能／高精度質量分析技術に加えて濃縮及び／又は精製法を利用して生物学的試料中のインスリン及びＢ鎖を検出し、定量するための質量分析法が、本明細書で提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、
（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、
（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的試料が血漿又は血清試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
質量分析の前に前記試料を酸性条件下におく、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料を酸性条件下におくステップが前記試料をギ酸にさらすステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
質量分析の前に前記試料を塩基性条件下におく、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料を塩基性条件下におくステップが、前記試料をトリズマ及び／又はエタノールにさらすステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又は複数のイオンが、９６８．９±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数のイオンが、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリンフラグメントイオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数のイオンが、１００７．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチド前駆イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数のイオンが、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のＣ−ペプチドフラグメントイオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
質量分析による定量の前に前記試料を脱脂する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
質量分析の前に前記試料を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製するステップが、前記試料を液体クロマトグラフィーにかけるステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製するステップが、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記質量分析がタンデム質量分析、高分解能質量分析又は高分解能／高精度質量分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
イオン化がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
イオン化がポジティブイオンモードである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
インスリン及びＣ−ペプチド用の内部標準を前記試料に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
インスリン用の内部標準がウシインスリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウシインスリンが、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する前駆イオン並びに１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるフラグメントイオンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｃ−ペプチド用の内部標準がＣ−ペプチドヘビー内部標準である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃ−ペプチドヘビー内部標準が、１００９．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する前駆イオン並びに５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるフラグメントイオンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
決定された前記１つ又は複数のイオンの量を用いて、前記試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、インスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
質量分析により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、
（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インスリン及びＣ−ペプチドが濃縮された画分を得るステップと、
（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、
（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
前記濃縮工程が、インスリン及びＣ−ペプチドの免疫捕捉を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫捕捉が、抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体を用いるステップを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体がＩｇＧである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体が磁気ビーズ上に固定化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びＣ−ペプチドを洗浄し、溶出する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的試料が血漿又は血清試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
質量分析の前に前記試料を酸性条件下におく、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料を酸性条件下におくステップが、前記試料をギ酸にさらすステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
質量分析の前に前記試料を塩基性条件下におく、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料を塩基性条件下におくステップが、前記試料をトリズマ及び／又はエタノールにさらすステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ又は複数のイオンが、９６８．９±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ又は複数のイオンが、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリンフラグメントイオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ又は複数のイオンが、１００７．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチド前駆イオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ又は複数のイオンが、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のＣ−ペプチドフラグメントイオンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
質量分析による定量の前に前記試料を脱脂する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
質量分析の前に前記試料を精製するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記精製するステップが、前記試料を液体クロマトグラフィーにかけるステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記精製するステップが、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記質量分析がタンデム質量分析、高分解能質量分析又は高分解能／高精度質量分析である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
イオン化がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５１】
イオン化がポジティブイオンモードである、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
インスリン及びＣ−ペプチド用の内部標準を前記試料に加える、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
インスリン用の内部標準がウシインスリンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウシインスリンが、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する前駆イオン並びに１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるフラグメントイオンを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｃ−ペプチド用の内部標準がＣ−ペプチドヘビー内部標準である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｃ−ペプチドヘビー内部標準が、１００９．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する前駆イオン並びに５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるフラグメントイオンを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
決定された前記１つ又は複数のイオンの量を用いて、前記試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５８】
前記試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、インスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項２７に記載の通りインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を診断する方法。
【請求項６０】
請求項２７に記載の通りインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するステップを含む、糖尿病を診断する方法。
【請求項６１】
請求項２７に記載の通りインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するステップを含む、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別する方法。
【請求項６２】
請求項２７に記載の通りインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するステップを含む、１型糖尿病と２型糖尿病を区別する方法。
【請求項６３】
請求項２７に記載の通りインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するステップを含む、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価する方法。
【請求項６４】
質量分析により試料中のインスリン類似体の量を決定する方法であって、
（ａ）インスリン類似体を免疫捕捉するステップと、
（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン類似体イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン類似体をイオン化源にかけるステップと、
（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン類似体イオンの量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
前記インスリン類似体がアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））、リスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、グルリシン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））、デテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））、デグルデク（ＴＲＥＳＩＢＡ（登録商標））、グラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））及びＮＰＨ（ＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）／ＮＯＶＯＬＩＮ  Ｎ（登録商標））から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記インスリン類似体が、１１６２．４±０．５、１０１１．２±０．５、９８７．２±０．５、９７１．５±０．５、９６８．７±０．５及び９５６．８±０．５から選択される質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する前駆イオンを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記インスリン類似体が、１３６．０±０．５、１１７９．０±０．５、１７５．０±０．５、４５４．４±０．５、３５７．２±０．５、２１９．０±０．５、２２６．０±０．５、６６０．８±０．５、１９９．０±０．５、３４６．２±０．５、３２８．２±０．５、２１７．３±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５から選択される質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する１つ又は複数のフラグメントイオンを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する方法であって、
（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、
（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６９】
前記１つ又は複数のイオンの量を用いて、前記試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つ又は複数のイオンが、９６８．９±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ又は複数のイオンが、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリンフラグメントイオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記インスリンＢ鎖がイオン化の前に化学的に修飾されていない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ又は複数のイオンが、１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンからなる群から選択されるインスリンＢ鎖前駆イオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ又は複数のイオンが、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記インスリンＢ鎖がイオン化の前に化学的に修飾される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記化学修飾が前記インスリンＢ鎖をアルキル化するステップを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
前記１つ又は複数のイオンが、１１８１．９±０．５、８８６．９±０．５及び７０９．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンからなる群から選択されるアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
前記１つ又は複数のイオンが、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
前記生物学的試料が血漿又は血清試料を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８１】
前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
質量分析の前に前記試料を酸性条件下におく、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
前記試料を酸性条件下におくステップが前記試料をギ酸にさらすステップを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
質量分析の前に前記試料を塩基性条件下におく、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
前記試料を塩基性条件下におくステップが、前記試料をトリズマ及び／又はエタノールにさらすステップを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
質量分析による定量の前に前記試料を脱脂する、請求項６８に記載の方法。
【請求項８７】
質量分析の前に前記試料を精製するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
前記精製するステップが、前記試料を液体クロマトグラフィーにかけるステップを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記精製するステップが、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記質量分析がタンデム質量分析、高分解能質量分析又は高分解能／高精度質量分析である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９２】
イオン化がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９３】
イオン化がポジティブイオンモードである、請求項６８に記載の方法。
【請求項９４】
インスリン及びインスリンＢ鎖用の内部標準を前記試料に加える、請求項６８に記載の方法。
【請求項９５】
前記試料中のインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、インスリン対インスリンＢ鎖の比を決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する方法であって、
（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖が濃縮された画分を得るステップと、
（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びインスリンＢ鎖を発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、
（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項９７】
前記濃縮工程が、インスリン及びインスリンＢ鎖の免疫捕捉を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記免疫捕捉が、抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体を用いるステップを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗体がＩｇＧである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体が磁気ビーズ上に固定化されている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びインスリンＢ鎖を洗浄し、溶出する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
生物学的試料が血漿又は血清試料を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０４】
前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０５】
質量分析の前に前記試料を酸性条件下におく、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０６】
前記試料を酸性条件下におくステップが、前記試料をギ酸にさらすステップを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
質量分析の前に前記試料を塩基性条件下におく、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記試料を塩基性条件下におくステップが、前記試料をトリズマ及び／又はエタノールにさらすステップを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
質量分析による定量の前に前記試料を脱脂する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１０】
質量分析の前に前記試料を精製するステップをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記精製するステップが、前記試料を液体クロマトグラフィーにかけるステップを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記精製するステップが、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
前記質量分析がタンデム質量分析、高分解能質量分析又は高分解能／高精度質量分析である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１５】
イオン化がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１６】
イオン化がポジティブイオンモードである、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１７】
インスリン及びインスリンＢ鎖用の内部標準を前記試料に加える、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１８】
決定された前記１つ又は複数のイオンの量を用いて、前記試料中のインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、インスリン対インスリンＢ鎖の比を決定する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項９６に記載の通りインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を診断する方法。
【請求項１２１】
請求項９６に記載の通りインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病を診断する方法。
【請求項１２２】
請求項９６に記載の通りインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別する方法。
【請求項１２３】
請求項９６に記載の通りインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、１型糖尿病と２型糖尿病を区別する方法。
【請求項１２４】
請求項９６に記載の通りインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価する方法。
【請求項１２５】
請求項９６に記載の通り質量分析によりインタクトなインスリン対インスリンＢ鎖の比を決定するステップを含む、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）活性を評価する方法。
【請求項１２６】
患者試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を比較するステップを含み、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の互いに対する異常な量が糖尿病を意味する、糖尿病を診断する方法。
【請求項１２７】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を質量分析により決定する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記質量分析がタンデム質量分析である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を免疫測定法により決定する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量の比較が、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比によって決定される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
患者試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を比較するステップを含み、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の互いに対する異常な量が糖尿病を意味する、糖尿病を診断する方法。
【請求項１３２】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を質量分析により決定する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記質量分析がタンデム質量分析である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を免疫測定法により決定する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量の比較が、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比によって決定される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高いレベルであると糖尿病を意味する、請求項１３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、それぞれがその全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年３月３日に出願の米国仮出願第６２／１２７，７７０号及び２０１５年３月４日に出願の米国仮出願第６２／１２８，２３６号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、体内の炭水化物及び脂肪代謝を調節する中心的なホルモンである。インスリンの異常なレベルは、糖尿病のような血糖障害及び／又はインスリン抵抗性症候群を意味する。糖尿病及びその合併症は、重大な公衆衛生上の問題である。したがって、糖尿病及び糖尿病前症患者におけるインスリンの定量は、診断ツールとしてもまた患者における治療をモニタリングするためにも重要である。
【０００３】
インスリンの定量には、最初には放射免疫測定法（ＲＩＡ）による、ごく最近では商業化可能な自動化プラットフォーム上免疫化学発光定量分析法（ＩＣＭＡ）による、免疫学的技術が広く用いられている。しかし、インスリンについての国際的な基準となる方法は、まだ確立されていない。そのような方法を確立するうえでの主要な障害は、用いられるアッセイ抗体の交差反応性が異なることによってもたらされ得る、異なる免疫測定法及びプラットフォームにわたって測定されるインスリン値の変動により生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インスリンレベルを測定する信頼できる正確な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析を用いて試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。
【０００６】
特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を同時に測定する多重アッセイを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インスリン及びＣ−ペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量に関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される濃縮工程は、抗体を用いるインスリン及びＣ−ペプチドの免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）インスリン及びＣ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉されたインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、マウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びＣ−ペプチドを洗浄し、溶出する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に血清を脱脂する。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の脱脂試薬を用いて、試料から脂質を除去する。いくつかの実施形態において、脱脂試薬は、ＣＬＥＡＮＡＳＣＩＴＥ（登録商標）である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析の前に試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、液体クロマトグラフィーを用いて試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による。いくつかの実施形態において、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）による。いくつかの実施形態において、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、試料に内部標準を添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、インスリン用の内部標準は、ウシインスリンである。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチド用の内部標準は、Ｃ−ペプチドヘビー内部標準である。いくつかの実施形態において、内部標準は、標識されている。いくつかの実施形態において、内部標準は、重水素化されている又は同位体標識されている。
【００１７】
いくつかの実施形態において、患者試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血液、唾液又は尿試料である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料を酸性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を酸性条件下におくステップは、濃縮インスリン及びＣ−ペプチドをギ酸にさらすステップを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、質量分析の前に試料を塩基性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマにさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマ及びエタノールにさらすステップを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、２２６．１±０．５のｍ／ｚを有するインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するウシインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１３６．０±０．５のｍ／ｚを有するウシインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１００７．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチド前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するＣ−ペプチドフラグメントイオンのいずれか又はそれらの合計の強度を定量に用いることができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１００９．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチドヘビー内部標準前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するＣ−ペプチドヘビー内部標準フラグメントイオンのいずれか又はそれらの合計の強度を定量に用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するために質量分析を利用することであり、方法は、（ａ）抽出技術により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドを濃縮するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からの精製インスリン及びＣ−ペプチドを液体クロマトグラフィーにかけて、試料からインスリン及びＣ−ペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｃ）質量分析により検出できるインスリン前駆イオンを発生させるのに適する条件下で濃縮インスリンをイオン化源にかけるステップと、（ｄ）質量分析により１つ又は複数のフラグメントイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抽出技術は、抗体を用いるインスリン及びＣ−ペプチドの免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抽出技術は、固相抽出（ＳＰＥ）を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、衝突エネルギーは、約４０〜６０Ｖの範囲内にある。いくつかの実施形態において、衝突エネルギーは、約４０〜５０Ｖの範囲内にある。
【００２５】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリン又はＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、（ａ）インスリン又はＣ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン又はＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン又はＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン又はＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンの量を決定する方法であって、（ａ）インスリンを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリンイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリンをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリンイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、（ａ）Ｃ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉Ｃ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体又は抗Ｃ−ペプチド抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体又は抗Ｃ−ペプチド抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン又はＣ−ペプチドを洗浄し、溶出する。
【００２６】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリン類似体の量を決定する方法であって、（ａ）インスリン類似体を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン類似体イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン類似体をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン類似体イオンの量を決定するステップとを含む方法である。
【００２７】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリン類似体及びＣ−ペプチドの量を同時に決定する方法であって、（ａ）インスリン類似体を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン類似体及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン類似体及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン類似体及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む方法である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、インスリン類似体は、アスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））、リスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、グルリシン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））、デテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））、デグルデク（ＴＲＥＳＩＢＡ（登録商標））、グラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））及びＮＰＨ（ＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）／ＮＯＶＯＬＩＮ  Ｎ（登録商標））から選択される。いくつかの実施形態において、インスリン類似体は、即効型又は長時間作用型インスリン類似体である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１０１１．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、１１７９．０±０．５及び１７５．０±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９８７．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、４５４．４±０．５及び３５７．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９７１．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１９．０±０．５、２２６．０±０．５及び６６０．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９７１．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１９９．０±０．５、３４６．２±０．５及び３２８．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１６２．４±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１７．３±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１７．３±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するウシインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に試料を脱脂する。いくつかの実施形態において、インスリン類似体を塩基抽出により抽出する。いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。
【００３１】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を糖尿病を診断するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。
【００３２】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００３９】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン対インスリンＢ鎖の比を決定するステップを含む、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）活性を評価する方法である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。
【００４１】
特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を同時に測定する多重アッセイを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖が濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される濃縮工程は、抗体を用いるインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉されたインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、マウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びインスリンＢ鎖を洗浄し、溶出する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるインスリンＢ鎖前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、８２４．９±０．５、７６８．４±０．５、７５２．８±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群、例えば、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群などから選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１４４．２±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン、８５８．３±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオンからなる群から選択される２つ以上のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、各前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群などの、８２４．９±０．５、７６８．４±０．５、７５２．８±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。
【００４８】
代替実施形態において、インスリンＢ鎖をイオン化の前に化学的に修飾する。いくつかの実施形態において、化学修飾は、前記インスリンＢ鎖をアルキル化するステップを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１８１．９±０．５、８８６．９±０．５及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１８１．９±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン、８８６．９±０．５のｍ／ｚを有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオンからなる群から選択される２つ以上のフラグメントイオンを含む。いくつかの関連実施形態において、各前駆イオンからのフラグメントイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるイオンを含む。
【００４９】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリンよりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインタクトなインスリンが高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００５６】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン対インスリンＡ鎖の比を決定するステップを含むインスリン分解酵素（ＩＤＥ）活性を評価する方法である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析を用いて試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。
【００５８】
特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を同時に測定する多重アッセイを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖が濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＡ鎖との比を決定する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される濃縮工程は、抗体を用いるインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖の免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）インタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉されたインタクトなインスリン及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体及び抗インスリンＡ鎖抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、マウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体及び抗インスリンＡ鎖抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びインスリンＡ鎖を洗浄し、溶出する。
【００６４】
インスリンＡ鎖をタンデム質量分析にかける実施形態において、Ｑ１は、約１１９２．０±０．５及び７９５．０±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のインスリンＡ鎖前駆イオンを選択し得る。これらのインスリンＡ鎖前駆イオンのいずれかのフラグメント化により、約５１３．０±０．５、３９９．０±０．５、２３６．０±０．５及び１３３．０±０．５のｍ／ｚを有するフラグメントイオンが生成し得る。したがって、Ｑ１が約１１９２．０±０．５及び７９５．０±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリンＡ鎖前駆イオンを選択する実施形態において、Ｑ３は、約５１３．０±０．５、３９９．０±０．５、２３６．０±０．５及び１３３．０±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを選択し得る。特定の実施形態において、単一前駆イオンからの単一フラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。或いは、単一前駆イオンからの２つ以上のフラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。これらの実施形態において、各フラグメントイオンの相対存在量を公知の数学的処理にかけて、試料中の最初のインスリンを定量的に評価することができる。他の実施形態において、２つ以上の前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンを測定し、上述のように利用して試料中の最初のインスリンを定性的に評価することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に血清を脱脂する。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の脱脂試薬を用いて、試料から脂質を除去する。いくつかの実施形態において、脱脂試薬は、ＣＬＥＡＮＡＳＣＩＴＥ（登録商標）である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析の前に試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、液体クロマトグラフィーを用いて試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による。いくつかの実施形態において、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）による。いくつかの実施形態において、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、試料に内部標準を添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、内部標準は、標識されている。いくつかの実施形態において、内部標準は、重水素化されている又は同位体標識されている。
【００７０】
いくつかの実施形態において、患者試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血液、唾液又は尿試料である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料を酸性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を酸性条件下におくステップは、濃縮インスリン及びインスリンＢ鎖をギ酸にさらすステップを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、の前に試料を塩基性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマにさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマ及びエタノールにさらすステップを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、２２６．１±０．５のｍ／ｚを有するインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。
【００７４】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インスリンＢ鎖とインスリンＡ鎖との相対量を比較するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後の方法である。別の態様において、本明細書で提供されるのは、インスリンＢ鎖とインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンＡ鎖とインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の相対的量を比較するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インスリンＢ鎖とインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含むヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンＢ鎖とインスリンＡ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインスリンＢ鎖及びインスリンＡ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖又はインスリンＡ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＢ鎖よりもインスリンＡ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。いくつかの実施形態において、インスリンＡ鎖よりもインスリンＢ鎖が高レベルであると、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【００７８】
別の態様において、本明細書に示す特定の方法は、試料中のインスリンの量を決定するために高分解能／高精度質量分析を利用する。高精度／高分解能質量分析を利用するいくつかの実施形態において、方法は、（ａ）多価インスリンイオンを発生させるのに適する条件下で試料からのインスリンをイオン化源にかけるステップ（インスリンイオンは質量分析により検出できる）と、（ｂ）高分解能／高精度質量分析により１つ又は複数の多価インスリンイオンの量を決定するステップとを含む。これらの実施形態において、ステップ（ｂ）で決定される１つ又は複数のイオンの量を前記試料中のインスリンの量に関連付ける。いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析を１０，０００のＦＷＨＭ及び５０ｐｐｍの質量精度で行う。いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析を高分解能／高精度飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計を用いて行う。いくつかの実施形態において、イオン化条件は、酸性条件下でのインスリンのイオン化を含む。いくつかの関連実施形態において、酸性条件は、イオン化の前のギ酸による前記試料の処理を含む。いくつかの実施形態において、多価インスリンイオンは、４＋、５＋及び６＋価インスリンイオンからなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、６＋荷電状態の１つ又は複数のインスリンイオンは、約９６８．８±１．５の範囲内のｍ／ｚを有する１つ又は複数のイオンを含む。いくつかの実施形態において、６＋荷電状態の１つ又は複数のインスリンイオンは、９６８．２８±０．１、９６８．４５±０．１、９６８．６２±０．１、９６８．７９±０．１、９６８．９５±０．１、９６９．１２±０．１、９６９．２８±０．１、９６９．４５±０．１、９６９．６１±０．１のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のイオン、例えば、９６８．９５±０．１のｍ／ｚを有するイオンなどを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、５＋荷電状態の１つ又は複数のインスリンイオンは、約１１６２．５±１．０の範囲内のｍ／ｚを有する１つ又は複数のイオンを含む。いくつかの実施形態において、５＋荷電状態の１つ又は複数のインスリンイオンは、１１６１．７２±０．１、１１６１．９２±０．１、１１６２．１２±０．１、１１６２．３２±０．１、１１６２．５２±０．１、１１６２．７２±０．１、１１６２．９２±０．１、１１６３．１２±０．１、１１６３．３２±０．１のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のイオン、例えば、１１６２．５４±０．１のｍ／ｚを有するイオンなどを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、４＋荷電状態の１つ又は複数のインスリンイオンは、約１４５２．９±０．８の範囲内のｍ／ｚを有する１つ又は複数のイオンを含む。
【００８２】
本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、試料は、生物学的試料を含み得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、尿、血漿又は血清などの生体液を含み得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、ヒト、例えば、成人男性若しくは女性、又は若年男性若しくは女性からの試料を含み得る。ここで、若年は、１８歳未満、１５歳未満、１２歳未満又は１０歳未満である。ヒト試料は、病状若しくは状態を診断若しくはモニターするために、又は病状若しくは状態の治療効力をモニターするために分析することができる。いくつかの関連実施形態において、本明細書で述べる方法は、ヒトから採取した場合の生物学的試料中のインスリンの量を決定するために用いることができる。
【００８３】
タンデム質量分析を利用する実施形態において、タンデム質量分析は、例えば、多重反応モニタリング、前駆イオンスキャニング又はプロダクトイオンスキャニングを含む、当技術分野で公知の方法により実施することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、タンデム質量分析は、前駆イオンを１つ又は複数のフラグメントイオンにフラグメント化するステップを含む。２つ以上のフラグメントイオンの量を決定する実施形態において、測定されたイオン量を試料中のインスリンの量に関連付けるために、該量を当技術分野で公知の数学的操作にかけることができる。例えば、試料中のインスリンの量を決定するステップの一部として、２つ以上のフラグメントイオンの量を合計することができる。
【００８５】
本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、対象の被分析物（例えば、インスリン、又は化学修飾若しくは非修飾インスリンＢ鎖）は、イオン化の前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により試料から精製することができる。本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、対象の被分析物は、例えば、試料を固相抽出（ＳＰＥ）カラムに加えることなどの抽出技術により試料から精製することができる。いくつかの実施形態において、抽出技術は、免疫精製技術でない。具体的には、いくつかの実施形態において、ＳＰＥカラムは、免疫アフィニティーカラムでない。いくつかの実施形態において、免疫精製は、方法のいずれの段階においても用いない。いくつかの実施形態において、抽出技術及びＨＰＬＣは、自動化された試料の処理及び分析を可能にするためにオンライン式で実施することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約１０，０００以上、例えば、約１５，０００以上など、例えば、約２０，０００以上など、例えば、約２５，０００以上などの分解能（ＦＷＨＭ）で実施する。いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約５０ｐｐｍ以下、例えば、約２０ｐｐｍ以下など、約１０ｐｐｍ以下など、約５ｐｐｍ以下など、約３ｐｐｍ以下などの精度で実施する。いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約１０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）及び約５０ｐｐｍ以下の精度で実施する。いくつかの実施形態において、分解能は、約１５，０００以上であり、精度は、約２０ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態において、分解能は、約２０，０００以上であり、精度は、約１０ｐｐｍ以下であり、好ましくは、分解能は、約２０，０００以上であり、精度は、約５ｐｐｍ以下、例えば、約３ｐｐｍ以下などである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、オービトラップ型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（時としてフーリエ変換質量分析計として公知である）を用いて実施することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリンイオンは、約１４５２．９±０．８、１１６２．５±１及び９６８．８±１．５の範囲内のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のイオンである。これらの範囲内のイオンは、それぞれ４＋、５＋及び６＋の電荷を有するインスリンイオンに相当する。これらの電荷を有する単一同位体イオンは、列挙した範囲内のｍ／ｚに主としておさまる。しかし、より低い存在度の天然に存在する同位元素変異体がこの範囲外に存在し得る。１１６２．５±１の範囲内のインスリンイオンは、好ましくは約１１６１．７２±０．１、１１６１．９２±０．１、１１６２．１２±０．１、１１６２．３２±０．１、１１６２．５２±０．１、１１６２．７２±０．１、１１６２．９２±０．１、１１６３．１２±０．１、１１６３．３２±０．１のｍ／ｚを有するインスリンイオン、例えば、１１６２．５４±０．１のｍ／ｚを有するイオンなどを含む。９６８．８±１．５の範囲内のインスリンイオンは、好ましくは約９６８．２８±０．１、９６８．４５±０．１、９６８．６２±０．１、９６８．７９±０．１、９６８．９５±０．１、９６９．１２±０．１、９６９．２８±０．１、９６９．４５±０．１、９６９．６１±０．１のｍ／ｚを有するインスリンイオン、例えば、９６８．９５±０．１のｍ／ｚを有するイオンなどを含む。いくつかの実施形態において、質量分析により検出される１つ又は複数のインスリンイオンの量を試料中のインスリンタンパク質の量に関連付けるステップは、ヒト又は非ヒトインスリンタンパク質などの内部標準との比較を含む。内部標準は、場合によって同位体標識することができる。
【００８９】
本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、試料は、生物学的試料、好ましくは、例えば、血漿又は血清を含む体液試料を含み得る。
【００９０】
質量分析（タンデム又は高分解能／高精度）は、ポジティブイオンモードで実施することができる。或いは、質量分析は、ネガティブイオンモードで実施することができる。例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む、様々なイオン化源を用いてインスリンをイオン化することができる。いくつかの実施形態において、インスリン及び／又は化学修飾若しくは非修飾インスリンＢ鎖は、ＥＳＩによりポジティブイオンモードでイオン化する。
【００９１】
本明細書で述べる方法のいずれかにおいて、単独で検出できる内部標準を試料に加えることができ、その量も試料中で決定される。単独で検出できる内部標準を利用する実施形態において、試料中に存在する対象の被分析物及び内部標準の両方のすべて又は一部がイオン化されて、質量分析計で検出できる複数のイオンを生成し、それぞれから生成した１つ又は複数のイオンが質量分析により検出される。これらの実施形態において、対象の被分析物から生成したイオンの存在又は量は、検出された内部標準イオンの量との比較により試料中の対象の被分析物の量の存在に関連付けることができる。
【００９２】
或いは、試料中のインスリンの量は、１つ又は複数の外部参照標準との比較により決定することができる。具体例としての外部参照標準は、ヒト若しくは非ヒトインスリン、合成インスリン類似体又はその同位体標識変異体を添加したブランク血漿又は血清などである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、方法は、約１０μＩＵ／ｍＬ〜５００μＩＵ／ｍＬの範囲内のレベルの試料中のインスリンの量を決定することができる。
【００９４】
上述の本発明の概要は、非限定的なものであり、本発明の他の特徴及び利点は、本発明の以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】インスリンの定量限界を示す図である。
【図１Ｂ】Ｃ−ペプチドの定量限界を示す図である。
【図２Ａ】インスリンの較正曲線の実例を示す図である。
【図２Ｂ】インスリンの較正曲線の低濃度領域の拡大図である。
【図２Ｃ】Ｃ−ペプチドの較正曲線の実例を示す図である。
【図２Ｄ】Ｃ−ペプチドの較正曲線の低濃度領域の拡大図である。
【図３Ａ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対Ｂｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による９４の患者試料に関するインスリン結果の比較を示す図である。
【図３Ｂ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対Ｂｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による９４の患者試料に関するインスリン結果の比較を示す図である。
【図３Ｃ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対基準方法としてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による９４の患者試料に関するインスリン結果の比較を示す図である。
【図３Ｄ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対基準方法としてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による９４の患者試料に関するインスリン結果の比較を示す図である。
【図３Ｅ】現在のアッセイにおける現在のインスリンキャリブレーターとＢｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡの比較を示す図である。
【図３Ｆ】現在のアッセイにおける現在のインスリンキャリブレーターとＢｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡの比較を示す図である。
【図４Ａ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対Ｉｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による１１５の患者試料に関するＣ−ペプチド結果の比較を示す図である。
【図４Ｂ】異なる試験方法：免疫捕捉（ＩＰＭＳ）対Ｉｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイを用いたＤｅｍｉｎｇ回帰分析による１１５の患者試料に関するＣ−ペプチド結果の比較を示す図である。
【図４Ｃ】現在のアッセイにおける現在のＣ−ペプチドキャリブレーターとＩｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイの比較を示す図である。
【図４Ｄ】現在のアッセイにおける現在のＣ−ペプチドキャリブレーターとＩｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイの比較を示す図である。
【図５Ａ】インスリンの凍結解凍試料安定性を示す図である。
【図５Ｂ】Ｃ−ペプチドの凍結解凍試料安定性を示す図である。
【図６Ａ】インスリンの冷蔵温度試料安定性を示す図である。
【図６Ｂ】Ｃ−ペプチドの冷蔵温度試料安定性を示す図である。
【図７Ａ】インスリンの室温試料安定性を示す図である。
【図７Ｂ】Ｃ−ペプチドの室温試料安定性を示す図である。
【図８Ａ】インスリンの凍結温度試料安定性を示す図である。
【図８Ｂ】Ｃ−ペプチドの凍結温度試料安定性を示す図である。
【図９Ａ】インスリンの超凍結温度試料安定性を示す図である。
【図９Ｂ】Ｃ−ペプチドの超凍結温度試料安定性を示す図である。
【図１０Ａ】塩基中のＨＵＭＡＬＩＮ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中ＨＵＭＡＬＩＮ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｃ】塩基抽出物中のＨＵＭＡＬＩＮ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＨＵＭＡＬＩＮ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１１】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物に対するＨＵＭＡＬＩＮ（登録商標）の結果を示す図である。
【図１２Ａ】塩基中のＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１２Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中のＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１２Ｃ】塩基抽出物中のＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１２Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１３】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物に対するＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の結果を示す図である。
【図１４Ａ】塩基中のＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１４Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中のＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１４Ｃ】塩基抽出物中のＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１４Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１５Ａ】塩基中のＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１５Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中のＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１５Ｃ】塩基抽出物中のＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１５Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１６】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物に対するＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の結果を示す図である。
【図１７Ａ】塩基中のＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１７Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中のＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１７Ｃ】塩基抽出物中のＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１７Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１８】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物に対するＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）の結果を示す図である。
【図１９Ａ】塩基中のＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１９Ｂ】０．１％ギ酸、３０％ＡＣＮ中のＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１９Ｃ】塩基抽出物中のＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図１９Ｄ】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物中のＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の質量スペクトルを示す図である。
【図２０】ＣＬＥＮＡＣＩＴＥ（登録商標）／塩基抽出物に対するＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の結果を示す図である。
【図２１】インスリン抗体を用いた免疫捕捉インスリン類似体のすべての種に関するＷ８キャリブレーター結果を示す図である。
【図２２】ｈｕｍａｌｉｎホモログに関するＩｇＧ比較結果を示す図である。
【図２３】ウシインスリンに対するＩｇＧの差がないことを示す図である。
【図２４】好ましい結果をもたらしたＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）：プロインスリンＩｇＧの有意な差を示す図である。
【図２５】より高い応答をもたらしたＡＰＩＤＲＡ（登録商標）：プロインスリンＩｇＧの有意な差を示す図である。
【図２６】ＬＡＮＴＵＳ（登録商標）について差がないことを示す図である。
【図２７】Ｌｅｖｅｍｉｒを捕捉するために延長したインスリン薬混合物グラディエントに関するＭＲＭを示す図である。
【図２８】図２７に示したＬｅｖｅｍｉｒを捕捉するために延長したインスリン薬混合物グラディエントに関するＭＲＭのグラフ表示である。
【図２９】Ｂ鎖抗体を用いたインスリンの免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３０】Ｂ鎖抗体を用いたＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３１】Ｂ鎖抗体を用いたＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）の免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３２】Ｂ鎖抗体を用いたＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３３】Ｂ鎖抗体を用いたＮＯＶＡＬＯＧ（登録商標）の免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３４】Ｂ鎖抗体を用いたＡＰＩＤＲＡ（登録商標）の免疫捕捉の結果を示す図である。
【図３５】ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の妨害の原因を示す図である。
【図３６】高分解能ＬＣ−ＭＳによる免疫捕捉種の調査及び定量を示す図である。
【図３７】患者試料中のプロインスリン／デス−３１，３２スプリットプロインスリンを示す図である。
【図３８】患者試料中のＮＯＶＡＬＯＧ（登録商標）の結果を示す図である。
【図３９】患者試料中のインスリン及びＣペプチドの同時定量を示す図である。
【図４０】患者試料中のインスリン及びＣペプチドの同時定量を示す図である。
【図４１】患者試料中の血小板因子による妨害を示す図である。
【図４２−１】インスリン及びＣペプチドの標準曲線を示す図である。
【図４２−２】図４２−１の続き。
【図４３Ａ】インスリンを測定する３つのアッセイの結果を示す図である。図２１ＡはＳｉｅｍｅｎｓ値３０μＩＵ／ｍＬ及びそれ以上の３つのアッセイの結果を示す。図２１Ｂは、Ｓｉｅｍｅｎｓ値１０〜３０μＩＵ／ｍＬの３つのアッセイの結果を示す。Ｙ軸は、測定インスリン値の方法／Ｂｅｃｋｍａｎの比を表す。
【図４３Ｂ】インスリンを測定する３つのアッセイの結果を示す図である。図２１ＡはＳｉｅｍｅｎｓ値３０μＩＵ／ｍＬ及びそれ以上の３つのアッセイの結果を示す。図２１Ｂは、Ｓｉｅｍｅｎｓ値１０〜３０μＩＵ／ｍＬの３つのアッセイの結果を示す。Ｙ軸は、測定インスリン値の方法／Ｂｅｃｋｍａｎの比を表す。
【図４４】免疫捕捉−質量分析対Ｂｅｃｈｍａｎ免疫測定法のインスリンの相関（ｎ＝９４）を示す図である。
【図４５】免疫捕捉−質量分析対Ｂ鎖ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのインスリンの相関（ｎ＝９４）を示す図である。
【図４６】キャリブレーター品質管理を示す図である。
【図４７】キャリブレーター品質管理を示す図である。
【図４８】５例の患者試料の３種のインスリンＢ鎖アッセイによる定量を示す図である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（左バー）、Ｂｅｃｈｍａｎ免疫測定法（中央バー）、免疫捕捉−質量分析（右バー）。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本明細書で用いる場合、特に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
【００９７】
本明細書で用いる場合、「精製」、「精製する」及び「濃縮する」という用語は、対象の被分析物（単数又は複数）以外のすべての物質を試料から除去することを意味しない。それよりも、これらの用語は、対象の被分析物の検出を妨害する可能性がある試料中の他の成分と比較して対象の１つ又は複数の被分析物の量を高くする手順を意味する。様々な手段による試料の精製は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択される親又は娘イオンの検出を妨害する可能性がある又は妨害しない可能性がある１つ又は複数の物質の相対的な減少を可能にする。この用語を用いるときの相対的な減少は、精製すべき材料中に対象の被分析物とともに存在する物質が精製により完全に除去されることを必要としない。
【００９８】
本明細書で用いる場合、「免疫精製」又は「免疫精製する」という用語は、対象の１つ又は複数の被分析物を濃縮するためにポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む抗体を利用する精製手順を意味する。免疫精製は、当技術分野で周知の免疫精製法のいずれかを用いて実施することができる。しばしば免疫精製手順は、固体担体、例えば、カラム、ウエル、チューブ、ゲル、カプセル、粒子又は同類のものに結合した、コンジュゲートした又は別の状態で結合した抗体を利用するものである。免疫精製は、本明細書で用いる場合、当技術分野でしばしば免疫沈降と呼ばれる手順、並びに当技術分野でしばしばアフィニティークロマトグラフィー又は免疫アフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる手順を制限なしに含む。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「免疫粒子」という用語は、その表面（粒子上及び／又は内）に結合した、コンジュゲートした又は別の状態で結合した抗体を有するカプセル、ビーズ、ゲル粒子又は同類のものを意味する。特定の好ましい実施形態において、免疫粒子は、セファロース又はアガロースビーズである。好ましい代替実施形態において、免疫粒子は、ガラス、プラスチック若しくはシリカビーズ又はシリカゲルを含む。
【０１００】
本明細書で用いる場合、「抗インスリン抗体」という用語は、インスリンに対する親和性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を意味する。種々の実施形態において、インスリン以外の化学種に対するインスリン抗体の特異性は、異なる可能性があり、例えば、特定の好ましい実施形態において、抗インスリン抗体は、インスリンに対して特異的であり、したがって、インスリン以外の化学種に対する親和性をほとんど又は全く有さないが、他の好ましい実施形態において、抗インスリン抗体は、非特異的であり、インスリン以外の特定の化学種に結合する。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、「試料」という用語は、対象の被分析物を含み得る試料を意味する。本明細書で用いる場合、「体液」という用語は、個人の身体から分離することができる流体を意味する。例えば、「体液」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙液、汗及び同類のものを含み得る。好ましい実施形態において、試料は、ヒトからの体液試料、好ましくは血漿又は血清を含む。
【０１０２】
本明細書で用いる場合、「固相抽出」又は「ＳＰＥ」という用語は、溶液が通過又は周りに流れる固体（すなわち、固相）に対する溶液（すなわち、移動相）中に溶解又は懸濁した成分の親和性の結果として化学物質の混合物を成分に分離する方法を意味する。場合によっては、移動相が固相を通過又はその周りに流れるとき、移動相の望ましくない成分が固相により保持されて、移動相中の被分析物の精製がもたらされる可能性がある。他の場合には、被分析物が固相により保持されて、移動相の望ましくない成分が固相を通過又はその周りに流れることが可能になり得る。これらの場合、さらなる処理又は分析のために次に第２の移動相を用いて、保持された被分析物を固相から溶出する。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一又は混合モード機構により機能し得る。混合モード機構は、同じカラムにおいてイオン交換と疎水性保持を利用するものであり、例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強い陰イオン交換及び疎水性保持を示し得る、又は強い陽イオン交換及び疎水性保持を示し得る。
【０１０３】
一般的に、被分析物に対するＳＰＥカラム充填物質の親和性は、１つ又は複数の化学的相互作用又は免疫親和性相互作用などの様々な機構のいずれかに起因し得る。いくつかの実施形態において、インスリンのＳＰＥは、免疫親和性カラム充填物質を用いずに行われる。すなわち、いくつかの実施形態において、インスリンは、免疫親和性カラムでないＳＰＥカラムにより試料から精製される。
【０１０４】
本明細書で用いる場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体又は気体により運ばれる化学物質の混合物が、静止液体又は固相の周り又は上に流れるときに化学物質の差別的分配の結果として成分に分離される方法を意味する。
【０１０５】
本明細書で用いる場合、「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」という用語は、流体が微細な物質のカラム又は毛細管通路に均一に浸透するときに流体溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延する方法を意味する。遅延は、１つ又は複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間のこの流体が固定相（単数又は複数）に対して移動するときの混合物の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例としては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（時に高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高処理液体クロマトグラフィーとして公知である）などがある。
【０１０６】
本明細書で用いる場合、「高速液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」（時に「高圧液体クロマトグラフィー」として公知である）という用語は、移動相を加圧下で固定相、一般的に密に充填されたカラムに強制的に通すことによって分離の程度を増大させる液体クロマトグラフィーを意味する。
【０１０７】
本明細書で用いる場合、「乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＴＦＬＣ」（時に高乱流液体クロマトグラフィー又は高処理液体クロマトグラフィーとして公知である）という用語は、カラム充填剤に通すアッセイされる物質の乱流を分離を行う基盤として利用するクロマトグラフィーの形態を意味する。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前に２つの無名の薬物を含む試料の調製に適用された。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、Ａ８５４巻、２３〜３５頁（１９９９年）を参照のこと。ＴＦＬＣをさらに説明している、米国特許第５，９６８，３６７号、第５，９１９，３６８号、第５，７９５，４６９号及び第５，７７２，８７４号も参照のこと。当業者は、「乱流」を理解している。流体がゆっくりと滑らかに流れている場合、その流れは、「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラム中を低流速で移動している流体は、層流である。層流において、流体の粒子の運動は規則的であり、粒子が一般的に実質的に直線的に移動する。より速い速度では、水の慣性が流体の摩擦力に打ち勝ち、乱流が生ずる。不規則な境界と接触していない流体は、それを「追い越し」、摩擦により遅くなるか、又は平坦でない表面により偏向させられる。流体が乱れて流れている場合、それは、流れが層流である場合より大きい「抵抗」により渦状に旋回して（又は渦巻き状で）流れる。流体の流れが層流又は乱流である場合を判断するうえで助けとするための多くの参考文献が入手可能である（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ  ＆  Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年）、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ  Ｍａｔｈｉｅｕ  ＆  Ｊｕｌｉａｎ  Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年））。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」という用語は、試料混合物を蒸発させ、液体又は粒子状固体からなる固定相を含むカラム中を移動するキャリヤーガス（窒素又はヘリウムとしての）の流れに注入し、固定相に対する化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離するクロマトグラフィーを意味する。
【０１０９】
本明細書で用いる場合、「大粒子カラム」又は「抽出カラム」という用語は、約５０μｍより大きい平均粒子直径を含むクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈において用いる場合、「約」という用語は、±１０％を意味する。
【０１１０】
本明細書で用いる場合、「分析カラム」という用語は、被分析物の存在又は量の決定を可能にするのに十分なカラムから溶出する試料中の物質の分離を達成するのに十分なクロマトグラフ段を有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラムは、さらなる分析のための精製試料を得るために保持されない物質から保持される物質を分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」としばしば区別される。この文脈において用いる場合、「約」という用語は、±１０％を意味する。好ましい実施形態において、分析カラムは、直径が約５μｍの粒子を含む。
【０１１１】
本明細書で用いる場合、「オンライン」及び「インライン」という用語は、例えば、「オンライン自動式（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）」又は「オンライン抽出」に用いられているように、操作者の介入の必要なしに実施される手順を意味する。対照的に、「オフライン」という用語は、本明細書で用いる場合、操作者の手作業による介入を必要とする手順を意味する。したがって、試料を沈殿に供し、次いで、上清を手作業でオートサンプラーに装填する場合、沈殿及び装填ステップは、その後のステップからオフラインである。方法の様々な実施形態において、１つ又は複数のステップをオンライン自動式で実施することができる。
【０１１２】
本明細書で用いる場合、「質量分析」又は「ＭＳ」という用語は、化合物をそれらの質量により同定するための分析技術を意味する。ＭＳは、イオンの質量電荷比又は「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタリングし、検出し、測定する方法を意味する。ＭＳ技術は、一般的に（１）化合物をイオン化して、荷電化合物を生成するステップと、（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を計算するステップとを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化し、検出することができる。「質量分析計」は、一般的にイオン化装置、質量分析計及びイオン検出器を含む。一般的に、対象の１つ又は複数の分子がイオン化され、その後イオンが質量分析装置に導入され、そこでは、磁界と電界の組み合わせにより、イオンが質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路をたどる。例えば、「表面からの質量分析（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆｒｏｍ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「タンデム質量分析の方法及び装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題する第６，１０７，６２３号、「質量分析に基づくＤＮＡ診断（ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題する第６，２６８，１４４号、「被分析物の脱離及び検出のための表面増強光感受性結合及び放出（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｏｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ）」と題する第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９９年、２巻、２６４〜７６頁並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０００年、２１巻、１１６４〜６７頁を参照のこと。
【０１１３】
本明細書で用いる場合、「高分解能／高精度質量分析」は、固有の化学イオン（ｕｎｉｑｕｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎ）を確認するのに十分な精度及び正確度で荷電種の質量電荷比を測定することができる質量分析計を用いて実施される質量分析を意味する。固有の化学イオンの確認は、当該イオンの個々の同位体ピークが容易に識別できる場合のイオンについて可能である。固有の化学イオンを確認するために必要な特定の分解能及び質量正確度は、イオンの質量及び電荷状態によって異なる。
【０１１４】
本明細書で用いる場合、「分解能」又は「分解能（ＦＷＨＭ）」（当技術分野で「ｍ／Δｍ５０％」としても公知である）は、最大高さの５０％における質量ピークの幅（半値全幅、「ＦＷＨＭ」）で割った観測質量電荷比を意味する。分解能の差の効果を、約１０９３のｍ／ｚを有するイオンの理論的な質量スペクトルを示す図１Ａ〜Ｃに示す。図１Ａに約３０００の分解能（通常の四重極型質量分析計の一般的な操作条件）を有する質量分析計による理論的質量スペクトルを示す。図１Ａにおいてわかるように、個々の同位体ピークは識別できない。比較すると、図１Ｂに約１０，０００の分解能を有する質量分析計による理論的質量スペクトルを示すが、個々の同位体ピークが明確に識別できる。図１Ｃに約１２，０００の分解能を有する質量分析計による理論的質量スペクトルを示す。この最高の分解能では、個々の同位体ピークは、ベースラインからの１％未満の寄与を含む。
【０１１５】
本明細書で用いる場合、質量分析に関する「固有の化学物質イオン」は、単一原子構成を有する単一イオンを意味する。単一イオンは、１価又は多価であり得る。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、質量分析に関する「正確度」（又は「質量正確度」）は、検討されるイオンの真のｍ／ｚからの機器の応答の生じ得る偏りを意味する。正確度は、一般的に百万分の１（ｐｐｍ）で表される。質量の正確度の差の効果を、１０９３．５２０９４のｍ／ｚの理論的ピークについて検出されるｍ／ｚと実際のｍ／ｚとの間で生じ得る差の境界を示す図２Ａ〜Ｄに示す。図２Ａに１２０ｐｐｍの正確度での検出されるｍ／ｚの生じ得る範囲を示す。対照的に図２Ｂに５０ｐｐｍの正確度での検出されるｍ／ｚの生じ得る範囲を示す。図２Ｃ及び２Ｄに２０ｐｐｍ及び１０ｐｐｍの正確度での検出されるｍ／ｚのより狭い生じ得る範囲を示す。
【０１１７】
本発明の高分解能／高精度質量分析法は、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００又はさらにより大きい値より大きいＦＷＨＭで質量分析を行うことができる機器で実施することができる。同様に、本発明の方法は、５０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、３ｐｐｍ未満又はさらにより小さい値の正確度で質量分析を行うことができる機器で実施することができる。これらの性能特性の能力がある機器は、特定のオービトラップ質量分析計、飛行時間（「ＴＯＦ」）型質量分析計又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を組み込み得る。好ましい実施形態において、方法は、オービトラップ質量分析計又はＴＯＦ型質量分析計を含む機器により実施される。
【０１１８】
「オービトラップ」という用語は、たる様の外側電極と同軸の内側電極からなるイオントラップを記述する。イオンは、電極間の電界に接線方向に注入され、イオンと電極との間の静電相互作用がイオンが同軸内側電極を周回するときの遠心力と釣り合うためにトラップされる。イオンが同軸内側電極を周回するとき、トラップされたイオンの軌道がイオンの質量電荷比に応じた調和振動数で中心電極の軸に沿って振動する。軌道振動数の検出により、オービトラップを高精度（１〜２ｐｐｍと低い）及び高分解能（ＦＷＨＭ）（最大約２００，０００）を有する質量分析計として用いることが可能になる。オービトラップに基づく質量分析計は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９９５，３６４号に詳細に記載されている。オービトラップ分析計の使用は、様々な被分析物の定性及び定量分析について報告されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１１８９３２号（２００７年１１月９日出願）、Ｂｒｅｄｅｈｏｅｆｔら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、２２巻、４７７〜４８５頁、Ｌｅ  Ｂｒｅｔｏｎら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、２２巻、３１３０〜３６頁、Ｔｈｅｖｉｓら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００８年、２７巻、３５〜５０頁、Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、４３巻、９０８〜１５頁、Ｓｃｈｅｎｋら、ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００８年、１巻、４１頁及びＯｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻、７０９〜１２頁を参照のこと。
【０１１９】
本明細書で用いる場合、「ネガティブイオンモードで動作する」という用語は、負イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する。「ポジティブイオンモードで動作する」という用語は、本明細書で用いる場合、正イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する。好ましい実施形態において、質量分析をポジティブイオンモードで行う。
【０１２０】
本明細書で用いる場合、「イオン化」又は「イオン化する」という用語は、１以上の電子単位に等しい正味の電荷を有する被分析物イオンを発生させる方法を意味する。負イオンは、１以上の電子単位の正味の負電荷を有するものであり、一方、正イオンは、１以上の電子単位の正味の正電荷を有するものである。
【０１２１】
本明細書で用いる場合、「電子イオン化」又は「ＥＩ」という用語は、気相又は蒸気相中の対象の被分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と被分析物との衝突が、次に質量分析技術にかけることができる被分析物イオンを生成する。
【０１２２】
本明細書で用いる場合、「化学イオン化」又は「ＣＩ」という用語は、試薬ガス（例えば、アンモニア）が電子衝撃にかけられ、試薬ガスイオンと被分析物分子との相互作用により被分析物イオンが生じる方法を意味する。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、「高速原子衝撃」又は「ＦＡＢ」という用語は、高エネルギー原子（しばしばＸｅ又はＡｒ）のビームが不揮発性試料に衝突し、試料に含まれている分子を脱離させ、イオン化する方法を意味する。試験試料をグリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンなどの粘性液体マトリックスに溶解する。化合物又は試料に対する適切なマトリックスの選択は、経験的プロセスである。
【０１２４】
本明細書で用いる場合、「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」又は「ＭＡＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路により試料中の被分析物を脱離させ、イオン化するレーザー照射にさらす方法を意味する。ＭＡＬＤＩのために、試料を、被分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合する。
【０１２５】
本明細書で用いる場合、「表面エンハンス型レーザー脱離イオン化」又は「ＳＥＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路により試料中の被分析物を脱離させ、イオン化するレーザー照射にさらす他の方法を意味する。ＳＥＬＤＩのために、試料を一般的に、対象の１つ又は複数の被分析物を優先的に保持する表面に結合させる。ＭＡＬＤＩと同様に、この方法は、イオン化を促進するエネルギー吸収物質も用いることができる。
【０１２６】
本明細書で用いる場合、「エレクトロスプレーイオン化」又は「ＥＳＩ」という用語は、末端に高い正又は負電位を印加した短い毛細管に溶液を通す方法を意味する。管の末端に到達した溶液は、蒸発して（霧化）、溶媒蒸気中溶液の非常に小さな液滴のジェット又は噴霧体になる。この液滴の噴霧体は、蒸発チャンバー中を流れる。液滴がより小さくなるとき、同符号電荷の間の自然反発力によってイオン並びに中性分子が放出されるような時点まで表面電荷密度が増加する。
【０１２７】
本明細書で用いる場合、「大気圧化学イオン化」又は「ＡＰＣＩ」という用語は、ＥＳＩと同様な質量分析法を意味するが、ＡＰＣＩは、大気圧のプラズマ内で起こるイオン−分子反応によりイオンを生成する。プラズマは、噴霧毛細管と対極との間の放電により維持される。次いで、イオンは、一般的に一組の差動排気スキマーステージを用いることにより質量分析計内に抽出される。向流の乾燥し、予熱されたＮ２ガスを用いて、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性がより低い種を分析するのにＥＳＩより有効であり得る。
【０１２８】
「大気圧光イオン化」又は「ＡＰＰＩ」という用語は、本明細書で用いる場合、分子Ｍのイオン化の機構が分子イオンＭ＋を生成する光子の吸収及び電子の放出である質量分析の形態を意味する。光子エネルギーが一般的にイオン化電位の直上であるため、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合に、クロマトグラフィーの必要なしに試料を分析することが可能であり、それによりかなりの時間と費用の節約となり得る。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンは、Ｈを引き抜いてＭＨ＋を形成し得る。Ｍが高いプロトン親和性を有する場合、これが起こる傾向がある。Ｍ＋とＭＨ＋の合計が一定であるため、これは、定量の正確度に影響を与えない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観測されるが、ナフタレン又はテストステロンなどの非極性化合物は、通常Ｍ＋を形成する。例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２巻（１５号）、３６５３〜３６５９頁を参照のこと。
【０１２９】
本明細書で用いる場合、「誘導結合プラズマ」又は「ＩＣＰ」という用語は、大部分の元素が原子化され、イオン化されるような十分に高い温度で試料が部分的にイオン化されたガスと相互作用する方法を意味する。
【０１３０】
本明細書で用いる場合、「電界脱離」という用語は、不揮発性試験試料をイオン化表面上にのせ、強い電界を用いて被分析物イオンを発生させる方法を意味する。
【０１３１】
本明細書で用いる場合、「脱離」という用語は、表面からの被分析物の除去及び／又は被分析物の気相への侵入を意味する。レーザー脱離熱脱離は、被分析物を含む試料をレーザーパルスにより気相中に熱的に脱離させる技術である。レーザーは、金属基部を備えた特製の９６ウエルプレートの裏面を照射する。レーザーパルスが底部を加熱し、熱が試料を気相に移行させる。気相試料が次に質量分析計に引き込まれる。
【０１３２】
本明細書で用いる場合、「選択イオンモニタリング」という用語は、比較的狭い質量範囲内、一般的に約１質量単位の範囲内のイオンのみが検出される質量分析機器の検出モードである。
【０１３３】
本明細書で用いる場合、「選択反応モニタリング」として時として公知である「多重反応モード」は、前駆イオン及び１つ又は複数のフラグメントイオンが選択的に検出される質量分析機器の検出モードである。
【０１３４】
本明細書で用いる場合、「定量化下限」、「定量下限」又は「ＬＬＯＱ」という用語は、測定が定量的に意味があるようになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける被分析物の応答は、特定可能であり、個別的であり、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）及び８５％〜１１５％の正確度で再現性がある。
【０１３５】
本明細書で用いる場合、「検出限界」又は「ＬＯＤ」という用語は、測定値がそれに関連する不確実さより大きいポイントである。ＬＯＤは、値がその測定に関連する不確実さを超えるポイントであり、ゼロ濃度における平均値のＲＳＤの３倍と定義される。
【０１３６】
本明細書で用いる場合、体液試料中の被分析物の「量」は、一般的に試料の体積において検出できる被分析物の質量を反映する絶対値を意味する。しかし、量は、他の被分析物の量と比較した相対量も意図する。例えば、試料中の被分析物の量は、試料中に通常存在する被分析物の対照又は正常レベルより大きい量であり得る。
【０１３７】
「約」という用語は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関して本明細書で用いる場合、表示値プラス又はマイナス１０％を意味する。質量分析機器は、所定の被分析物の質量を決定することについてわずかに異なり得る。イオンの質量又は質量／電荷比に関する「約」という用語は、＋／−０．５０原子質量単位を意味する。
【０１３８】
血清中のインスリンの定量は、インスリン抵抗性症候群の評価における糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害の診断に主として用いられる。Ｃ−ペプチドは、インスリンの２つのペプチド鎖を連結するペプチドであり、プロセシング中にプロインスリンから放出され、その後、膵ベータ細胞から共分泌される。半減期及び肝クレアランスが異なるため、Ｃ−ペプチド及びインスリンの末梢血レベルは、もはや当モルではないが、依然として高度に相関している。本実施形態において、本明細書で提供される方法は、（１）低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍を外因性インスリン投与と、（２）１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために内因性インスリン及びＣ−ペプチドを測定するものである。
【０１３９】
一態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析を用いて試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を同時に測定する多重アッセイを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インスリン及びＣ−ペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される濃縮工程は、抗体を用いるインスリン及びＣ−ペプチドの免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）インスリン及びＣ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉されたインスリン及びＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン及びＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、マウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体及び抗Ｃ−ペプチド抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びＣ−ペプチドを洗浄し、溶出する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に血清を脱脂する。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の脱脂試薬を用いて、試料から脂質を除去する。いくつかの実施形態において、脱脂試薬は、ＣＬＥＡＮＡＳＣＩＴＥ（登録商標）である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析の前に試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、液体クロマトグラフィーを用いて試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。いくつかの実施形態において、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による。いくつかの実施形態において、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）による。いくつかの実施形態において、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、試料に内部標準を添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、インスリン用の内部標準は、ウシインスリンである。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチド用の内部標準は、Ｃ−ペプチドヘビー内部標準である。いくつかの実施形態において、内部標準は、標識されている。いくつかの実施形態において、内部標準は、重水素化されている又は同位体標識されている。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、患者試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血液、唾液又は尿試料である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料を酸性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を酸性条件下におくステップは、濃縮インスリン及びＣ−ペプチドをギ酸にさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、の前に試料を塩基性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマにさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマ及びエタノールにさらすステップを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、２２６．１±０．５のｍ／ｚを有するインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するウシインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１３６．０±０．５のｍ／ｚを有するウシインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１００７．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチド前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、５３３．３±０．５、６４６．４±０．５及び９２７．５±０．５のｍ／ｚを有するＣ−ペプチドフラグメントイオンのいずれかをクオンティファイアイオンとして用いることができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１００９．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＣ−ペプチドヘビー内部標準前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、５４０．３±０．５、６５３．４±０．５及び９３４．５±０．５のｍ／ｚを有するＣ−ペプチドヘビー内部標準フラグメントイオンのいずれかをクオンティファイアイオンとして用いることができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定するために質量分析を利用することであり、方法は、（ａ）抽出技術により試料中のインスリン及びＣ−ペプチドを濃縮するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からの精製インスリン及びＣ−ペプチドを液体クロマトグラフィーにかけて、試料からインスリン及びＣ−ペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｃ）質量分析により検出できるインスリン前駆イオンを発生させるのに適する条件下で濃縮インスリンをイオン化源にかけるステップと、（ｄ）質量分析により１つ又は複数のフラグメントイオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの量を用いて、患者におけるインスリン対Ｃ−ペプチドの比を決定する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抽出技術は、抗体を用いるインスリン及びＣ−ペプチドの免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抽出技術は、固相抽出（ＳＰＥ）を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、衝突エネルギーは、約４０〜６０ｅＶの範囲内にある。いくつかの実施形態において、衝突エネルギーは、約４０〜５０ｅＶの範囲内にある。
【０１５０】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリン又はＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、（ａ）インスリン又はＣ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン又はＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン又はＣ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン又はＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリンの量を決定する方法であって、（ａ）インスリンを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリンイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリンをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリンイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のＣ−ペプチドの量を決定する方法であって、（ａ）Ｃ−ペプチドを免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のＣ−ペプチドイオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉Ｃ−ペプチドをイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のＣ−ペプチドイオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体又は抗Ｃ−ペプチド抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体又は抗Ｃ−ペプチド抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン又はＣ−ペプチドを洗浄し、溶出する。
【０１５１】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインスリン類似体の量を決定する方法であって、（ａ）インスリン類似体を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインスリン類似体イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉インスリン類似体をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインスリン類似体イオンの量を決定するステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、インスリン類似体は、アスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））、リスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、グルリシン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））、デテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））、デグルデク（ＴＲＥＳＩＢＡ（登録商標））、グラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））及びＮＰＨ（ＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）／ＮＯＶＯＬＩＮ  Ｎ（登録商標））から選択される。いくつかの実施形態において、インスリン類似体は、即効型又は長時間作用型インスリン類似体である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１０１１．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、１１７９．０±０．５及び１７５．０±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９８７．２±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、４５４．４±０．５及び３５７．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９７１．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１９．０±０．５、２２６．０±０．５及び６６０．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９７１．５±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１９９．０±０．５、３４６．２±０．５及び３２８．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１６２．４±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１７．３±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン類似体前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、２１７．３±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９５６．８±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するウシインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３１５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に試料を脱脂する。いくつかの実施形態において、インスリン類似体を塩基抽出により抽出する。いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。
【０１５４】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を糖尿病を診断するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性インスリン及びＣ−ペプチドの定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。
【０１５５】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を意味する。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の相対的な量を比較するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を単一アッセイにおいて同時に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を個別に決定する。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、免疫測定法により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定するステップを含む、ヒトにおける糖尿病の診断又は予後診断の方法である。いくつかの実施形態において、インタクトなインスリン又はインスリンＢ鎖の、互いに対する異常な又は正常でない量又は比は、糖尿病又は糖尿病前症を意味する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。
【０１６２】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、インタクトなインスリン対インスリンＢ鎖の比を決定するステップを含む、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）活性を評価する方法である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定することによって患者におけるインスリンレベルを測定する方法である。特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析により試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を同時に測定する多重アッセイを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、試料からのインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｂ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試料を濃縮工程にかけて、インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖が濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、濃縮されたインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定された１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を決定する。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を患者におけるインスリンの量と関連付ける。いくつかの実施形態において、試料中のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の量を用いて、患者におけるインタクトなインスリンとインスリンＢ鎖との比を決定する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される濃縮工程は、抗体を用いるインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の免疫捕捉を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）インタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖を免疫捕捉するステップと、（ｂ）質量分析により検出できる１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンを発生させるのに適する条件下で、免疫捕捉されたインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖をイオン化源にかけるステップと、（ｃ）質量分析により１つ又は複数のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖イオンの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される免疫捕捉するステップは、抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体を用いるステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、マウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗インスリン抗体及び抗インスリンＢ鎖抗体は磁気ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態において、磁気ビーズ上の免疫捕捉されたインスリン及びインスリンＢ鎖を洗浄し、溶出する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、質量分析による定量の前に血清を脱脂する。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の脱脂試薬を用いて、試料から脂質を除去する。いくつかの実施形態において、脱脂試薬は、ＣＬＥＡＮＡＳＣＩＴＥ（登録商標）である。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、質量分析の前に試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、液体クロマトグラフィーを用いて試料を精製するステップを含む。いくつかの実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高乱流液体クロマトグラフ（ＨＴＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料を固相抽出（ＳＰＥ）にかけるステップを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析を含む。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能質量分析である。いくつかの実施形態において、質量分析は、高分解能／高精度質量分析である。いくつかの実施形態において、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による。いくつかの実施形態において、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）による。いくつかの実施形態において、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、試料に内部標準を添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、内部標準は、標識されている。いくつかの実施形態において、内部標準は、重水素化されている又は同位体標識されている。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、患者試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、患者試料は、血液、唾液又は尿試料である。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料を酸性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を酸性条件下におくステップは、濃縮インスリン及びインスリンＢ鎖をギ酸にさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、の前に試料を塩基性条件下におく。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマにさらすステップを含む。いくつかの実施形態において、試料を塩基性条件下におくステップは、試料をトリズマ及びエタノールにさらすステップを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、９６８．７±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するインスリン前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１３６．０±０．５、２２６．１±０．５及び３４５．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、２２６．１±０．５のｍ／ｚを有するインスリンフラグメントイオンは、クオンティファイアイオンである。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるインスリンＢ鎖前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群などの、８２４．９±０．５、７６８．４±０．５、７５２．８±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１４４．２±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン、８５８．３±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するインスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオンからなる群から選択される２つ以上のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、各前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群などの、８２４．９±０．５、７６８．４±０．５、７５２．８±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。
【０１７２】
代替実施形態において、イオン化の前にインスリンＢ鎖を化学的に修飾する。いくつかの実施形態において、化学修飾は、前記インスリンＢ鎖をアルキル化することを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１８１．９±０．５、８８６．９±０．５及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイオンは、１１８１．９±０．５の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン、８８６．９±０．５のｍ／ｚを有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオン及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有するアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンからのフラグメントイオンからなる群から選択される２つ以上のフラグメントイオンを含む。いくつかの関連実施形態において、各前駆イオンからのフラグメントイオンは、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択されるイオンを含む。
【０１７３】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群の診断の方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を糖尿病を診断するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を糖尿病及び糖尿病前症患者における血糖障害又はインスリン抵抗性症候群を診断するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、低血糖の原因としてのインスリン分泌腫瘍と外因性インスリン投与を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、１型糖尿病と２型糖尿病を区別するために用いる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される内因性のインタクトなインスリン及びインスリンＢ鎖の定量の方法を、糖尿病前症患者における糖尿病のリスクを評価するために用いる。
【０１７４】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で述べた質量分析によりインタクトなインスリン対インスリンＢ鎖の比を決定するステップを含む、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）活性を評価する方法である。
【０１７５】
本発明の方法に用いる適切な試験試料は、対象の被分析物を含み得る試験試料である。いくつかの好ましい実施形態において、試料は、生物学的試料、すなわち、動物、細胞培養、器官培養等などの生物学的源から得られる試料である。特定の好ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等などの哺乳動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性ヒトである。好ましい試料は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液などの体液又は組織試料、好ましくは血漿及び血清を含む。そのような試料は、例えば、患者、すなわち、疾患又は状態の診断、予後診断又は治療のために臨床施設に出頭する男性又は女性の生者から得ることができる。試料が生物学的試料を含む実施形態において、方法は、試料が生物学的源から得られた場合の試料中のインスリンの量を決定するために用いることができる。
【０１７６】
インスリンは、５１個のアミノ酸からなる低分子ペプチドである。インスリンは、システイン残基間のジスルフィド架橋により連結された、Ａ鎖及びＢ鎖の２つの鎖から構成されている。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸を有し、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸を有する。
【０１７７】
本発明はまた、インスリンの定量アッセイ用のキットを企図する。インスリンの定量アッセイ用のキットは、本明細書で提供する組成物を含むキットを含み得る。例えば、キットは、包装材料及び少なくとも１回のアッセイに十分な量の一定量の同位体標識内部標準を含み得る。一般的に、インスリンの定量アッセイ用の包装済み試薬の使用についての有形の形式で記録された（例えば、紙又は電子媒体上に含まれた）取扱説明書も含む。
【０１７８】
本発明の実施形態に用いる較正及びＱＣプールは、好ましくは、インスリンが本質的に存在しないという条件で、対象とする試料マトリックスと同様なマトリックスを用いて調製する。
【０１７９】
質量分析用の試料の調製
質量分析のための調製において、例えば、免疫捕捉、液体クロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、毛細管電気泳動を含む電気泳動、免疫アフィニティー分離を含むアフィニティー分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のもの若しくは同類のもののいずれかの組み合わせを含む当技術分野で公知の様々な方法により、インスリンを試料中の１つ又は複数の他の成分と比べて濃縮することができる。
【０１８０】
質量分析の前に用いることができる試料の精製の１つの方法は、対象の被分析物はカラム充填剤に可逆的に保持されるが、１つ又は複数の他の物質は保持されない条件下で試料を固相抽出（ＳＰＥ）カラムに加えることである。この技術において、対象の被分析物がカラムにより保持される場合に、第１の移動相条件を用いることができ、保持されない物質が洗い流されたならば、保持された物質をカラムから除去するためにその後に第２の移動相条件を用いることができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、試料中のインスリンは、アルキル結合表面を含む充填剤を含むＳＰＥカラムに可逆的に保持させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃ−８オンラインＳＰＥカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．製のＯａｓｉｓ  ＨＬＢオンラインＳＰＥカラム／カートリッジ（２．１ｍｍｘ２０ｍｍ）又は同等物など）は、質量分析の前にインスリンを濃縮するために用いることができる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥカラムの使用は、洗浄溶液としてのＨＰＬＣ用０．２％水性ギ酸及び溶出溶液としてのアセトニトリル中０．２％ギ酸を用いて行われる。
【０１８２】
他の実施形態において、方法は、質量分析の前のインスリンを免疫精製するステップを含む。免疫精製ステップは、当技術分野で周知の免疫精製法のいずれかを用いて実施することができる。しばしば免疫精製手順は、固体担体、例えば、カラム、ウエル、チューブ、カプセル、粒子又は同類のものに結合した、コンジュゲートした、固定化された又は別の状態で結合した抗体を利用するものである。一般的に、免疫精製法は、（１）被分析物が抗体に結合するように対象の被分析物を含む試料を抗体とともにインキュベートするステップと、（２）１又は複数回の洗浄ステップを実施するステップと、（３）抗体から被分析物を溶出するステップとを含む。
【０１８３】
特定の実施形態において、免疫精製のインキュベーションステップは、溶液中の遊離の抗体を用いて実施し、抗体は、その後、洗浄ステップの前に固体表面に結合又は付着させる。特定の実施形態において、これは、抗インスリン抗体である一次抗体及び一次抗インスリン抗体に対する親和性を有する固体表面に結合させた二次抗体を用いて達成することができる。代替実施形態において、インキュベーションステップの前に一次抗体を固体表面に結合させる。
【０１８４】
適切な固体担体は、制限なしに、チューブ、スライド、カラム、ビーズ、カプセル、粒子、ゲル及び同類のものを含む。いくつかの好ましい実施形態において、固体担体は、例えば、９６ウエルプレート、３８４ウエルプレート及び同類のものなどの多ウエルプレートである。いくつかの実施形態において、固体担体は、セファロース若しくはアガロースビーズ又はゲルである。抗体（例えば、インスリン抗体又は二次抗体）を固体担体に結合、付着、固定化又は連結することができる当技術分野で周知の多くの方法、例えば、共有結合又は非共有結合吸着、親和性結合、イオン結合などがある。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＮＢｒを用いて連結させる。例えば、抗体は、ＣＮＢｒ活性化セファロースに連結させることができる。他の実施形態において、抗体は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ又はプロテインＬなどの抗体結合タンパク質を介して固体担体に付着させる。
【０１８５】
免疫精製法の洗浄ステップは、一般的に、インスリンが固体担体上の抗インスリン抗体に結合したままであるように固体担体を洗浄することを必要とする。免疫精製法の溶出ステップは、一般的に、抗インスリン抗体へのインスリンの結合を破壊する溶液の添加を必要とする。具体例としての溶出溶液は、有機溶液、塩溶液及び高又は低ｐＨ溶液を含む。
【０１８６】
質量分析の前に用いることができる試料の精製の他の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。液体クロマトグラフィー技術において、対象の被分析物が１つ又は複数の他の物質と比べて異なる速度で溶出する移動相条件下で試料をクロマトグラフ分析カラムに加えることによって、被分析物を精製することができる。そのような手順は、試料の１つ又は複数の他の成分と比べて対象の１つ又は複数の被分析物の量を高め得る。
【０１８７】
ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的に遅い層流技術に依拠している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム中を通る試料の層流が試料からの対象の被分析物の分離の基礎であるカラム充填に依拠している。当業者は、そのようなカラムにおける分離が分配過程であることを理解し、Ｃ−ペプチドとともに用いるのに適切であるＨＰＬＣを含むＬＣ、機器及びカラムを選択することができる。クロマトグラフ分析カラムは、一般的に化合物構成成分の分離（すなわち、分別）を促進するための媒体（すなわち、充填剤）を含む。媒体は、微細な粒子を含み得る。粒子は、一般的に、様々な化合物構成成分と相互作用して化合物構成成分の分離を促進する結合表面を含む。１つの適切な結合表面は、アルキル結合又はシアノ結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２又はＣ−１８結合アルキル基を含み得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフ分析カラムは、モノリスＣ−１８カラムである。クロマトグラフ分析カラムは、試料を受け入れる入口部及び分別試料を含む溶出物を排出するための出口部を含む。試料は、入口部に直接、又はオンラインＳＰＥカラムなどのＳＰＥカラム若しくはＴＦＬＣカラムから供給することができる。いくつかの実施形態において、試料がＳＰＥ及び／又はＴＦＬＣ及び／又はＨＰＬＣカラムに達する前に試料中の粒子及びリン脂質を除去するために、オンラインフィルターをＳＰＥカラム及び又はＨＰＬＣカラムの前に用いることができる。
【０１８８】
１つの実施形態において、試料は、入口部においてＬＣカラムに加え、溶媒又は溶媒混合物により溶出し、出口部において排出することができる。対象の被分析物（単数又は複数）を溶出するための各種溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、無勾配モード又は多型的（すなわち、混合）モードを用いて実施することができる。クロマトグラフィー中、物質の分離は、溶出液（「移動相」としても公知）、溶出モード、勾配条件、温度の選択等などの変数による影響を受ける。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、試料中のインスリンをＨＰＬＣにより濃縮する。このＨＰＬＣは、モノリスＣ−１８カラムクロマトグラフシステム、例えば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．製のＯｎｙｘモノリスＣ−１８カラム（５０ｘ２．０ｍｍ）又は同等物を用いて実施することができる。特定の実施形態において、ＨＰＬＣは、溶媒ＡとしてのＨＰＬＣ用０．２％水性ギ酸及び溶媒Ｂとしてのアセトニトリル中０．２％ギ酸を用いて実施する。
【０１９０】
弁及び継手配管の注意深い選択により、手作業によるステップの必要なく１つのクロマトグラフィーカラムから次のカラムに物質が通るように２つ以上のクロマトグラフィーカラムを必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態において、弁及び配管の選択は、必要なステップを実施するようにあらかじめプログラムされたコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムは、そのようなオンライン式で検出システム、例えば、ＭＳシステムにも接続されている。したがって、操作者が試料のトレーをオートサンプラーに取り付けることができ、残りの操作は、コンピュータ制御のもとに実施されて、選択されるすべての試料の精製及び分析が行われる結果となる。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、質量分析の前のインスリンの精製のためにＴＦＬＣを用いることができる。そのような実施形態において、被分析物を捕捉するＴＦＬＣカラムを用いて試料を抽出することができる。次いで、被分析物を溶出し、オンラインで分析ＨＰＬＣカラムに移す。例えば、試料の抽出は、大粒子径（５０μｍ）充填剤を含むＴＦＬＣ抽出カートリッジを用いて達成することができる。このカラムから溶出した試料は、質量分析の前のさらなる精製のためにオンラインで分析ＨＰＬＣカラムに移すことができる。これらのクロマトグラフィー手順に含まれるステップを自動式で連結することができるので、被分析物の精製中の操作者の関与の必要性を最小限にすることができる。この特徴により、時間と費用の節約がもたらされ、操作者の誤りの機会が排除される可能性がある。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の上述の精製技術は、複数の試料の同時処理を可能にするために、インスリンの精製のために並行して用いることができる。いくつかの実施形態において、用いられる精製技術は、免疫アフィニティークロマトグラフィーなどの免疫精製技術を除く。
【０１９３】
質量分析によるインスリンの検出及び定量
質量分析は、分別試料をイオン化し、さらなる分析のために荷電分子を生成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。様々な実施形態において、インスリンは、当業者に公知の方法によりイオン化することができる。例えば、インスリンのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）及び粒子ビームイオン化により行うことができる。当業者は、イオン化法の選択は、測定される被分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブ対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができることを理解し、インスリンはポジティブモードでイオン化されても、ネガティブモードでイオン化されてもよい。好ましい実施形態において、インスリンは、ＥＳＩによりポジティブイオンモードでイオン化される。
【０１９４】
質量分析技術において、一般的に、試料をイオン化した後、それにより生成した正又は負に荷電したイオンを分析して、質量電荷比（ｍ／ｚ）を決定することができる。ｍ／ｚを決定するための種々の分析計は、四重極型分析計、イオントラップ型分析計、飛行時間型分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計及びオービトラップ型分析計を含む。いくつかの具体例としてのイオントラップ方法は、Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２０００年、１４巻、９６７〜７３頁に記載されている。
【０１９５】
イオンは、数種の検出モードを用いて検出することができる。例えば、選択されるイオンは、すなわち、選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて検出することができ、又は代わりになるべきものとして、衝突誘起解離若しくはニュートラルロスに起因する質量遷移を例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）若しくは選択反応モニタリング（ＳＲＭ）によりモニターすることができる。いくつかの実施形態において、質量電荷比を四重極型分析計を用いて決定する。「四重極」又は「四重極型イオントラップ」機器において、振動高周波電界におけるイオンは、電極間に印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅及び質量／電荷比に比例する力を受ける。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷比を有するイオンのみが四重極を縦断するが、他のすべてのイオンは偏向させられるように選択できる。したがって、四重極機器は、機器に注入されるイオンの「マスフィルター」及び「質量検出器」の両方として機能し得る。
【０１９６】
イオンが検出器に衝突するとき、それらは、デジタル信号に変換される電子のパルスを生じる。取得されたデータは、コンピュータに転送され、コンピュータは、収集されたイオンの計数を時間に対してプロットする。得られる質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ−ＭＳ法で得られるクロマトグラムに類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積又はそのようなピークの振幅を測定し、対象の被分析物の量と関連させることができる。特定の実施形態において、フラグメントイオン（単数又は複数）及び／又は前駆イオンのピークの曲線下面積又は振幅を測定して、インスリンの量を決定する。所定のイオンの相対存在量は、内部又は外部分子標準の１つ又は複数のイオンのピークに基づく較正標準曲線を用いて最初の被分析物の絶対量に変換することができる。
【０１９７】
特定の質量分析計を用いるＭＳ技術の分解能を「タンデム質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」により向上させることができる。この技術において、対象の分子から得られる前駆イオン（親イオンとも呼ばれる）は、ＭＳ機器によりフィルターすることができ、前駆イオンは、その後フラグメント化されて、第２のＭＳ手順で分析される１つ又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）を生じる。前駆イオンの注意深い選択により、特定の被分析物により生成するイオンのみがフラグメント化チャンバーに通され、そこでの不活性ガスの原子との衝突により、フラグメントイオンが生成する。前駆及びフラグメントイオンの両方が一連の所定のイオン化／フラグメント化条件下で再現性よく生成するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分析ツールとなり得る。例えば、フィルトレーション／フラグメンテーションの組み合わせは、妨害物質を除去するために用いることができ、生物学的試料のような複雑な試料に特に有用であり得る。特定の実施形態において、マルチプル四重極型分析計を含む質量分析機器（トリプル四重極型機器など）を用いてタンデム質量分析を行う。
【０１９８】
ＭＳ／ＭＳ技術を用いる特定の実施形態において、前駆イオンをさらなるフラグメント化のために単離し、衝突活性化解離（ＣＡＤ）を用いて、後続の検出のために前駆イオンからフラグメントイオンを生成する。ＣＡＤにおいて、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突によりエネルギーを獲得し、その後「単分子分解」と呼ばれる過程によりフラグメントになる。振動エネルギーの増加によりイオン内の特定の結合を切断できるように、十分なエネルギーが前駆イオンに蓄積されなければならない。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、試料中のインスリンは、次のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出され、及び／又は定量される。最初に試料をＳＰＥに、次いで、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣにかけることにより、試料中のインスリンが濃縮され、クロマトグラフ分析カラムからの液体溶媒の流れがＭＳ／ＭＳ分析計の加熱ネブライザーインターフェースに入り、溶媒／被分析物混合物がインターフェースの加熱荷電チューブ中で蒸気に変換される。これらの過程において、被分析物（すなわち、インスリン）がイオン化される。イオン、例えば、前駆イオンは、機器の開口部を通過し、第１の四重極に入る。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンの選択（すなわち、Ｑ１及びＱ３におけるそれぞれ「前駆」及び「フラグメント」イオンの選択）を可能にするマスフィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンがフラグメント化されるコリジョンセルである。質量分析計の第１の四重極（Ｑ１）は、インスリンイオンのｍ／ｚを有する分子を選択する。正しいｍ／ｚを有する前駆イオンは、コリジョンチャンバー（Ｑ２）内に通されるが、他のｍ／ｚを有する不要なイオンは、四重極の側面に衝突し、除去される。Ｑ２に入った前駆イオンは、中性ガス分子（アルゴン分子など）と衝突し、フラグメントになる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に通され、ここでフラグメントイオンが検出のために選択される。
【０２００】
インスリンのイオン化は、多価前駆イオン（４＋、５＋、６＋等の前駆イオンのような）をもたらし得る。イオン化条件、特にエレクトロスプレー技術に用いられる緩衝液のｐＨは、生成したインスリン前駆イオンの同一性及び量に著しい影響を与える。例えば、酸性条件下では、ポジティブエレクトロスプレーイオン化は、主として、それぞれ１１６２．５±０．５及び９６８．５±０．５のｍ／ｚを有する５＋及び６＋価インスリン前駆イオンを発生させ得る。しかし、塩基性条件下では、ポジティブエレクトロスプレーイオン化は、主として、それぞれ１４５３．７５±０．５及び１１６２．９４±０．５のｍ／ｚを有する４＋及び５＋価インスリン前駆イオンを発生させ得る。本方法は、酸性又は塩基性条件、好ましくは酸性条件を利用し得る。
【０２０１】
本方法は、ポジティブ又はネガティブイオンモード、好ましくはポジティブイオンモードで実施されるＭＳ／ＭＳを含み得る。特定の実施形態において、エレクトロスプレー緩衝液は、酸性であり、Ｑ１は、約１１６２．５±０．５又は９６８．５±０．５のｍ／ｚを有するインスリン前駆イオンを選択する。これらのインスリン前駆イオンのいずれかのフラグメント化により、約２２６．２１±０．５及び／又は１３５．６±０．５のｍ／ｚを有するフラグメントイオンが生成する。したがって、Ｑ１が、約１１６２．５±０．５及び９６８．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリン前駆イオンを選択する実施形態において、Ｑ３は、約２２６．２１±０．５及び１３５．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを選択し得る。特定の実施形態において、単一前駆イオンからの単一フラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。或いは、単一前駆イオンからの２つ以上のフラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。これらの実施形態において、各フラグメントイオンの相対存在量を公知の数学的処理にかけて、試料中の最初のインスリンを定量的に評価することができる。他の実施形態において、２つ以上の前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンを測定し、上述のように利用して試料中の最初のインスリンを定性的に評価することができる。
【０２０２】
特定の実施形態において用いることができるタンデム質量分析機器を操作する代替モードは、プロダクトイオンスキャン法及び前駆イオンスキャン法を含む。これらの操作モードの説明については、例えば、Ｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８（Ａｍａｄｅｏ  Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｂａ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２００５）（３８７）を参照のこと。
【０２０３】
他の実施形態において、高分解能／高精度質量分析計は、本発明の方法によるインスリンの定量的分析に用いることができる。定量的結果の容認できる精度を達成するために、質量分析計は、対象のイオンについて約５０ｐｐｍ又はそれ以下の正確度で１０，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）を示すことができなければならない。好ましくは質量分析計は、約５ｐｐｍ又はそれ以下の正確度で１８，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）、例えば、２０，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）と約３ｐｐｍ又はそれ以下の正確度など、例えば、２５，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）と約３ｐｐｍ又はそれ以下の正確度などを示す。インスリンイオンについて必要なレベルの性能を示すことができる３つの具体例としての分析計は、オービトラップ質量分析計、特定のＴＯＦ質量分析計及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計である。
【０２０４】
炭素、酸素及び窒素などの生物学的活性分子に見いだされる元素は、多種の同位体で天然に存在する。例えば、ほとんどの炭素は、１２Ｃとして存在するが、すべての天然に存在する炭素の約１％は、１３Ｃとして存在する。したがって、少なくとも１つの炭素原子を含有する天然に存在する分子の一部分は、少なくとも１つの１３Ｃ原子を含有することになる。天然に存在する元素同位体が分子に含まれることにより、複数の分子同位体が生じる。分子同位体の質量の差は、少なくとも１原子質量単位（ａｍｕ）である。これは、元素同位体が少なくとも１つの中性子異なるからである（１つの中性子の質量≒１ａｍｕ）。分子同位体が多荷電状態にイオン化される場合、質量分析での検出が質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいているため、同位体の間の質量の差異は、識別することが困難になり得る。例えば、両方が５＋状態にイオン化される、質量が１ａｍｕ異なる２つの同位体は、わずか０．２のそれらのｍ／ｚの差を示す。高分解能／高精度質量分析は、高度に多荷電イオン（±２、±３、±４、±５又はより高度の電荷を有するイオンなど）の同位体を識別することができる。
【０２０５】
天然に存在する元素同位体のため、すべての分子イオン（十分に感度の高い質量分析機器により分析した場合、それぞれが個別に検出できるスペクトルピークを生じ得る）について複数の同位体が一般的に存在する。複数の同位体のｍ／ｚ比及び相対存在量は、分子イオンの同位体シグニチャを集合的に含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の分子同位体のｍ／ｚ比及び相対存在量は、検討中の分子イオンの同一性を確認するために利用することができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の同位体の質量分析ピークを用いて分子イオンを定量する。いくつかの関連実施形態において、１つの同位体の単一質量分析ピークを用いて分子イオンを定量する。他の関連実施形態において、複数の同位体ピークを用いて分子イオンを定量する。これらの後者の実施形態において、複数の同位体ピークは、適切な数学的処理にかけることができる。いくつかの数学的処理は、当技術分野で公知であり、多重ピーク下面積の合計又は多重ピークによる応答の平均を含むが、これらに限定されない。５＋及び６＋インスリンイオンの多重同位体を示す具体例としてのスペクトルは、図４〜６に見られる。図５Ａ〜Ｂに認められるように、５＋インスリンイオンの種々の同位体のピークは、約１１６１．７２、１１６１．９２、１１６２．１２、１１６２．３２、１１６２．５２、１１６２．７２、１１６２．９２、１１６３．１２及び１１６３．３２に認められる。図６Ａ〜Ｂに認められるように、６＋インスリンイオンの種々の同位体のピークは、約９６８．２８、９６８．４５、９６８．６２、９６８．７９、９６８．９５、９６９．１２、９６９．２８、９６８．４５及び９６９．６１に認められる。しかし、イオンの同位体の変異体について観測される正確な質量は、機器の変動のためにわずかに変化し得ることを注意すること。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、試料中のインスリンの量を定性的に評価するために１つ又は複数のイオンの相対存在量を高分解能／高精度質量分析計により測定する。いくつかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析により測定される１つ又は複数のイオンは多価インスリンイオンである。これらの多価イオンは、約１４５３±０．８（すなわち、４＋イオンの１つ又は複数の単一同位体ピーク）及び／又は１１６２±１（すなわち、５＋イオンの１つ又は複数の単一同位体ピーク）及び／又は９６８．８±１．５（すなわち、６＋イオンの１つ又は複数の単一同位体ピーク）の範囲内のｍ／ｚを有する１つ又は複数のイオンを含み得る。
【０２０７】
高分解能オービトラップ分析計の使用は、様々な被分析物の定性及び定量分析について報告された。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１１８９３２号（２００７年１１月９日出願）、Ｂｒｅｄｅｈｏｅｆｔら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、２２巻、４７７〜４８５頁、Ｌｅ  Ｂｒｅｔｏｎら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、２２巻、３１３０〜３６頁、Ｔｈｅｖｉｓら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００８年、２７巻、３５〜５０頁、Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８年、４３巻、９０８〜１５頁、Ｓｃｈｅｎｋら、ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００８年、１巻、４１頁及びＯｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻、７０９〜１２頁を参照のこと。
【０２０８】
被分析物アッセイの結果は、当技術分野で公知の多くの方法により最初の試料中の被分析物の量に関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが注意深く管理されているならば、所定のイオンの相対存在量は、当該相対存在量を最初の分子の絶対量に換算する表と比較することができる。或いは、外部標準を試料とともに実施することができ、標準曲線をそれらの標準から得たイオンに基づいて作成する。そのような標準曲線を用いて、所定のイオンの相対存在量を最初の分子の絶対量に換算することができる。特定の好ましい実施形態において、内部標準を用いてインスリンの量を計算するための標準曲線を作成する。そのような標準曲線を作成し、用いる方法は、当技術分野で周知であり、当業者は適切な内部標準を選択することができる。例えば、好ましい実施形態において、１つ又は複数の形の同位体標識インスリンを内部標準として用いることができる。イオンの量を最初の分子の量に関連させる多くの他の方法は、当業者に周知である。
【０２０９】
本明細書で用いる場合、「同位体標識」は、質量分析技術により分析するとき、非標識分子と比べて標識分子の質量シフトをもたらす。適切な標識の例としては、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ及び１５Ｎなどがある。１つ又は複数の同位体標識を分子における１つ又は複数の位置に組み込むことができ、１つ又は複数の種類の同位体標識を同じ同位体標識分子に用いることができる。
【０２１０】
他の実施形態において、質量分析の前にインスリンの成分鎖を得るために、インスリンを化学処理にかけることができる。インスリンのＢ鎖は、ジスルフィド還元を引き起こすことが当技術分野で公知である化学処理により分離することができる。例えば、インスリンをＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、インスリンのジスルフィド架橋を還元し、Ａ鎖とＢ鎖を分離することができる。
【０２１１】
Ｂ鎖は、次にインスリンの精製のための上述のいずれか１つ又は複数の精製ステップにかけることができる。好ましい実施形態において、Ｂ鎖を質量分析の前にＨＰＬＣによる精製にかける。
【０２１２】
精製されたならば、Ｂ鎖を次にイオン化源にかける。インスリンの場合と同様に、当業者は、イオン化法の選択は、測定される被分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブ対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができることを理解する。インスリンＢ鎖は、ポジティブ又はネガティブモードでイオン化され得る。好ましい実施形態において、インスリンＢ鎖は、ＥＳＩによりポジティブモードでイオン化される。
【０２１３】
インスリンＢ鎖のイオン化は、多価Ｂ鎖前駆イオン（３＋、４＋、５＋等の前駆イオンのような）をもたらし得る。例えば、インスリンＢ鎖分子のポジティブエレクトロスプレーイオン化は、それぞれ１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有する３＋、４＋及び５＋価Ｂ鎖前駆イオンを発生させ得る。インスリンと同様に、インスリンＢ鎖のイオン化により生成する多価種の同一性及び量は、用いられるイオン化条件による影響を受ける。好ましい実施形態において、インスリンＢ鎖を酸性条件下でイオン化する。
【０２１４】
インスリンＢ鎖をタンデム質量分析にかける実施形態において、Ｑ１は、約１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のインスリンＢ鎖前駆イオンを選択し得る。これらの３つのインスリンＢ鎖前駆イオンのフラグメント化により、約８２５．４±０．５、７６８．５±０．５、７５３．２±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するフラグメントイオンが生成し得る。したがって、Ｑ１が約１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のインスリンＢ鎖前駆イオンを選択する実施形態において、Ｑ３は、約８２５．４±０．５、７６８．５±０．５、７５３．２±０．５、３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される、好ましくは約３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを選択し得る。特定の実施形態において、単一前駆イオンからの単一フラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。或いは、単一前駆イオンからの２つ以上のフラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。これらの実施形態において、各フラグメントイオンの相対存在量を公知の数学的処理にかけて、試料中の最初のインスリンを定量的に評価することができる。他の実施形態において、２つ以上の前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンを測定し、上述のように利用して試料中の最初のインスリンを定性的に評価することができる。
【０２１５】
質量分析による化学修飾インスリンＢ鎖の定量によるインスリンの定量
代替実施形態において、インスリンＢ鎖を、イオン化及び／又は精製の前に１つ又は複数の化学修飾ステップにかけることができる。例えば、分離されたならば、インスリンＢ鎖分子は、構成要素であるシステインを完全にアルキル化するためのカルバミドメチル化を受け得る。例えば、カルバミドメチル化は、インスリンＢ鎖を、ＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール）による還元の後にヨードアセトアミドとの反応に供することによって達成することができる。インスリンＢ鎖のカルバミドメチル化は、約１１４．０４ａｍｕ（システイン当たり約５７．０２）の質量増加を引き起こす、２個のシステインのアルキル化をもたらす。
【０２１６】
精製されたならば、化学修飾（例えば、アルキル化）Ｂ鎖をイオン化源にかける。インスリンの場合と同様に、当業者は、イオン化法の選択は、測定される被分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブ対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができることを理解する。アルキル化インスリンＢ鎖は、ポジティブ又はネガティブモードでイオン化することができる。好ましい実施形態において、アルキル化インスリンＢ鎖は、ＥＳＩによりポジティブモードでイオン化される。
【０２１７】
アルキル化インスリンＢ鎖のイオン化は、多価アルキル化Ｂ鎖前駆イオン（３＋、４＋、５＋等の前駆イオンのような）をもたらし得る。例えば、アルキル化インスリンＢ鎖分子のポジティブエレクトロスプレーイオン化は、それぞれ１１８１．９±０．５、８８６．９±０．５及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有する３＋、４＋及び５＋価アルキル化Ｂ鎖前駆イオンを発生させ得る。インスリンと同様に、アルキル化インスリンＢ鎖のイオン化により生成する多価種の同一性及び量は、用いられるイオン化条件による影響を受ける。好ましい実施形態において、アルキル化インスリンＢ鎖を酸性条件下でイオン化する。
【０２１８】
アルキル化インスリンＢ鎖をタンデム質量分析にかける実施形態において、Ｑ１は、約１１８１．９±０．５、８８６．９±０．５及び７０９．８±０．５のｍ／ｚを有する１つ又は複数のインスリンＢ鎖前駆イオンを選択し得る。これらの３つのアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンのフラグメント化により、約３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するフラグメントイオンが生成し得る。したがって、Ｑ１が約１１４４．２±０．５、８５８．３±０．５及び６８６．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１つ又は複数のアルキル化インスリンＢ鎖前駆イオンを選択する実施形態において、Ｑ３は、約３４５．０±０．５及び２２６．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１つ又は複数のフラグメントイオンを選択し得る。特定の実施形態において、単一前駆イオンからの単一フラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。或いは、単一前駆イオンからの２つ以上のフラグメントイオンの相対存在量を測定することができる。これらの実施形態において、各フラグメントイオンの相対存在量を公知の数学的処理にかけて、試料中の最初のインスリンを定量的に評価することができる。他の実施形態において、２つ以上の前駆イオンからの１つ又は複数のフラグメントイオンを測定し、上述のように利用して試料中の最初のインスリンを定性的に評価することができる。
【０２１９】
上述の方法のいずれかの１つ又は複数のステップは、自動装置を用いて実施することができる。特定の実施形態において、１つ又は複数の精製ステップをオンラインで実施し、より好ましくは精製及び質量分析ステップのすべてをオンライン式で実施することができる。
【０２２０】
以下の実施例は、本発明を説明する役割を果たす。これらの実施例は、本方法の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：試料の調製
ヒトインスリンＵＳＰロットＪ０Ｊ２５０を０．１％ギ酸に溶解し、希釈したところ、定量アミノ酸分析により１．３ｍｇ／ｍＬ又は３５ＩＵ／ｍＬの濃度に相当する７５％のペプチド含量を有することが見いだされた。この溶液を０．１％ギ酸でさらに５分の１に希釈し、次いで直ちにＳＰ１０４０ストリップ血清で５０分の１に希釈し、間欠的に反転／ボルテックス混合して３０分間放置した。
【０２２２】
ヒトＣ−ペプチドＢａｃｈｅｍロット１０１２７６３を０．１％ギ酸に溶解し、希釈したところ、定量アミノ酸分析により０．２８ｍｇ／ｍＬの濃度に相当する５５％のペプチド含量を有することが見いだされた。この溶液を０．１％ギ酸でさらに１０分の１に希釈し、次いで直ちにＳＰ１０４０ストリップ血清で５０分の１に希釈し、間欠的に反転／ボルテックス混合して３０分間放置した。
【０２２３】
ＳＰ１０４０ストリップ血清中インスリン及びＣ−ペプチド保存液をＱＣ  Ｈｉｇｈ、ＱＣ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＱＣ  Ｌｏｗとラベル表示した３つの別個の５０ｍＬポリプロピレン管に加えた。十分な容積の各ペプチド溶液を各管に加えて、最終容積を５０ｍＬとし、最終計算濃度をＱＨ：インスリン１８８μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチド７．７０ｎｇ／ｍＬ；ＱＭ：インスリン４７μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチド２．０７ｎｇ／ｍＬ；ＱＬ：インスリン１４μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチド０．４８ｎｇ／ｍＬとした。
【０２２４】
緩やかな反転による十分な混合の後、ＱＣプールを１．５ｍＬアリコートとしてラベル表示１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に分配し、使用するまで−６０〜−９０℃で保存した。
【０２２５】
実施例１：免疫捕捉
このアッセイでは、血清を最初に脱脂し、次いで、磁気ビーズ上に固定化した抗体を用いてインスリン及びＣ−ペプチドを免疫捕捉した。ビーズを厳格な洗浄法にかけて、非特異的に結合した物質を除去し、その後、水中酸性化アセトニトリルを用いてペプチドをビーズから溶出した。トリズマ塩基のアリコートを加えて、溶出プレートにおけるペプチドの安定性を増大させた。インスリン及びＣ−ペプチドは、精製又は部分的に精製された状態では低濃度で不安定性であり、吸着損失を受け、溶液から「消失する」。したがって、調製したならば、溶出プレートは、感度を最大限にするために、調製後５時間以内に、好ましくは直ちに実験に供すべきである。溶出プレートは、凍結すべきではない。キャリブレーターの調製、内部標準の添加、脱脂、ビーズ堆積（bead deposition）、免疫捕捉、ビーズからのペプチドの洗浄及び溶出の工程は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＴＡＲ（登録商標）ロボット液体ハンドラーを用いて自動化した。用手ステップは、キャリブレーター保存液の最初の希釈、脱脂後の遠心分離機への移液及びビーズの準備を含んでいた。
【０２２６】
実施例２：液体クロマトグラフィー及び質量分析
溶出プレートをＨａｍｉｌｔｏｎロボットのデッキからＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＴｕｒｂｏＦｌｏｗ  Ａｒｉａ  ＴＸ４  ＨＴＬＣシステムのオートサンプラーに移し、直ちに実験に供した。試料を親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）捕捉カラム上に注入し、インスリン及びＣ−ペプチドをバックグラウンド混入物からさらに濃縮した。洗浄後、移動溶媒のプラグを用いて、抽出カートリッジからペプチドを放出させ、それらを逆相分析カラムに移した。アセトニトリル勾配クロマトグラフィーにより、インスリン及びＣ−ペプチドを残りのバックグラウンド混入物及び互いから分離した。
【０２２７】
ＨＰＬＣカラムからの溶媒の流れをＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０質量分析計の加熱エレクトロスプレー源に向けた。質量分析計において、所望の質量電荷比を有するイオンのみを四重極１（Ｑ１）領域を通過させて、衝突チャンバー（Ｑ２）内に流入させた。次いで、加速イオンが中性アルゴンガス分子と衝突して、小フラグメントになる。最後に、Ｑ３において、選択されるイオンのみが選択されて、検出器に到達した（以下の表１参照）。検出器におけるシグナルの強度は、質量分析計に入った分子の数に比例していた。次いでピーク面積比を一連の既知のキャリブレーターについて計算し、較正曲線を確立する。次いで、較正式を用いて、患者試料中のインスリン及びＣ−ペプチドの濃度を決定することができる。
【０２２８】
【表１】
2018511812.tif 000003
【０２２９】
実施例３：アッセイ内及びアッセイ間精度
アッセイ内精度は、アッセイ内の測定の再現性と定義され、ＱＣＬ、ＱＣＭ及びＱＣＨからの５つの複製物をアッセイすることにより得られた。試料の５つの複製物の変動係数（ＣＶ）を用いて、再現性が許容できる（≦１５％）かどうかを判断した。分析の結果について実施した統計処理により、ＱＣについての再現性（ＣＶ）がインスリンについて６．２〜１１．５％の範囲にあり、Ｃ−ペプチドについて５．１〜６．３％の範囲にあったことが確認された（表２）。アッセイ内精度もすべてのアッセイにわたって計算することができる（９３０ＴＰ５３１９：Ａｓｓａｙ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ参照）。インスリンについてはラン内ＣＶは、４．７〜９．６％の範囲にあり、Ｃ−ペプチドについてはラン内ＣＶは、４．７〜７．０％の範囲にあった。
【０２３０】
【表２ａ】
2018511812.tif 000004
【０２３１】
【表２ｂ】
2018511812.tif 000005
【０２３２】
アッセイ間変動は、アッセイの間の測定の再現性と定義される。ＱＣＬ、ＱＣＭ及びＱＣＨを５日にわたって評価した。プールのアッセイ間変動（％ＣＶ）は、インスリンについては７．３〜１１．３％、Ｃ−ペプチドについては６．２〜９．０％の範囲にあった。インスリン及びＣ−ペプチドのすべてのＱＣプールは、≦１５％ＣＶの許容できる再現性の要件を満たしていた（表３）。
【０２３３】
表３  アッセイ間精度
【０２３４】
【表３ａ】
2018511812.tif 000006
【０２３５】
【表３ｂ】
2018511812.tif 000007
【０２３６】
【表３ｃ】
2018511812.tif 000008
【０２３７】
【表３ｄ】
2018511812.tif 000009
【０２３８】
【表３ｅ】
2018511812.tif 000010
【０２３９】
【表３ｆ】
2018511812.tif 000011
【０２４０】
実施例４：分析感度（検出限界）
ブランク限界（ＬＯＢ）：  ＬＯＢは、測定値がそれに随伴する不確かさよりも大きい点であり、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）として任意に定義される。選択性は、試料中の他の成分の存在下で被分析物を識別し、定量する分析方法の能力である。選択性については、適切な生物学的マトリックス（ストリップ血清）のブランク試料の分析が得られ、妨害及び定量下限において保証される選択性について試験した。ブランクを２０回測定し、得られる面積比を逆算した（表４）。
【０２４１】
ＬＯＢは、インスリンについて０．９μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチドについて０．０６ｎｇ／ｍＬと決定された。
【０２４２】
検出限界（ＬＯＤ）：  ＬＯＤは、測定値がそれに随伴する不確かさよりも大きい点であり、ゼロ濃度から４標準偏差（ＳＤ）として任意に定義される。選択性は、試料中の他の成分の存在下で被分析物を識別し、定量する分析方法の能力である。選択性については、適切な生物学的マトリックス（ストリップ血清）のブランク試料の分析が得られ、妨害及び定量下限において保証される選択性について試験した。ブランクを２０回測定し、得られる面積比を逆算した（表４）。
【０２４３】
ＬＯＤは、インスリンについて１．５μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチドについて０．１０ｎｇ／ｍＬと決定された。
【０２４４】
表４  検出限界（ＬＯＤ）及びブランク限界（ＬＯＢ）
【０２４５】
【表４ａ】
2018511812.tif 000012
【０２４６】
【表４ｂ】
2018511812.tif 000013
【０２４７】
定量限界（ＬＯＱ）：  ＬＯＱは、測定が定量的に意味を持つようになる点である。インスリン及びＣ−ペプチドは、このＬＯＱにおいて応答し、識別でき、分離しており、２０％の精度及び８０％〜１２０％の正確度で再現性がある。ＬＯＱは、予測されるＬＯＱに近い濃度の５種の試料（インスリンについて１．２５、２．５、５、１０及び２０μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチドについて０．１１、０．２２、０．４４、０．８５、０．１７ｎｇ／ｍＬ）をアッセイし、次いで７ランにおけるアッセイ内再現性及びさらなる８ランにおけるアッセイ間再現性を評価することによって決定した（表５）。図１ａ及びｂにそれぞれインスリン及びＣ−ペプチドについてインスリンレベルと％ＣＶとの関係を示す。図１におけるグラフから推定すると、それぞれインスリン及びＣ−ペプチドの２．５μＩＵ／ｍＬ及び０．１１ｎｇ／ｍＬが、ＣＶの９５％信頼区間が２０％以下に留まっている、許容できる性能をもたらす最低濃度である。
【０２４８】
ＬＯＱは、インスリンについて２．５又は３μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチドについて０．１１ｎｇ／ｍＬと設定した。
【０２４９】
表５  定量限界（ＬＯＱ）
【０２５０】
【表５ａ】
2018511812.tif 000014
【０２５１】
【表５ｂ】
2018511812.tif 000015
【０２５２】
実施例５：被分析物測定範囲（ＡＭＲ）
較正検証：  １０個のスパイクしたストリップ血清試料プール（キャリブレーターの濃度は、インスリンについて１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、２４０及び３２０μＩＵ／ｍＬであり、０．１１、０．２１、０．４３、０．８５、１．７０、３．４０、６．８０、１３．６０、２０．４０及び２７．２０ｎｇ／ｍＬである）を調製し、別個の１３日に１８回分析した。
【０２５３】
１８の曲線からの重み付け（１／Ｘ）二次回帰（原点無視）により、±２０％の正確度を有する、インスリンについて０．９８９又はそれ以上、Ｃ−ペプチドについて０．９９２又はそれ以上の相関係数が得られ、インスリンについて５〜３２０μＩＵ／ｍＬ、Ｃ−ペプチドについて０．１１〜２７．２０ｎｇ／ｍＬの直線範囲を示した（表６）。較正曲線の例を図２に示す。
【０２５４】
表６  較正検証
【０２５５】
【表６ａ】
2018511812.tif 000016
【０２５６】
【表６ｂ】
2018511812.tif 000017
【０２５７】
実施例６：正確度
回収試験：  インスリンについてＴＥａを２５％又は５μＩＵ／ｍＬに設定した。Ｃ−ペプチドについてＴＥａを３０％又は０．２ｎｇ／ｍＬに設定した。ＴＥａ／３の許容できる正確度をこの検証のために両ペプチドについて設定した。
【０２５８】
既知標準の回収：  既知量のＵＳＰインスリン及びＢａｃｈｅｍ  Ｃ−ペプチドをストリップ血清にスパイクし、５日間にわたり５つの複製物で分析した。
【０２５９】
インスリンについては、結果は、それぞれ１４及び１８８μＩＵ／ｍＬのスパイクレベルで９２．９％及び９１．９％の総正確度であり、ＴＥａ／３以内であった（表７ａ）。
【０２６０】
表７  ストリップ血清にスパイクしたＵＳＰインスリン及びＢａｃｈｅｍ  Ｃ−ペプチドの回収
【０２６１】
【表７ａ】
2018511812.tif 000018
【０２６２】
Ｃ−ペプチドについては、結果は、それぞれ０．４８及び７．７０ｎｇ／ｍＬのスパイクレベルで９８．３％及び９４．２％の総正確度であり、ＴＥａ／３以内であった（表７ｂ）。
【０２６３】
【表７ｂ】
2018511812.tif 000019
【０２６４】
スパイク及び患者血清からの回収：  既知の低レベルのインスリン及びＣ−ペプチドを含む患者血清を採取し、１０、２０及び４０μＩＵ／ｍＬの既知レベルのインスリン並びに１．０２、１．７及び３．４ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドをスパイクすることによって回収試験を実施した。インスリン及びＣ−ペプチドのバックグラウンドレベルに対する補正が説明された。
【０２６５】
回収率を各レベルについて計算したところ、平均回収率は、インスリンについて９６〜１０６％、Ｃ−ペプチドについて９１〜１０４％であり、これらは、±１０％及びＴｅａ／４以内であった（表７ｃ及び７ｄ）。
【０２６６】
【表７ｃ】
2018511812.tif 000020
【０２６７】
【表７ｄ】
2018511812.tif 000021
【０２６８】
高インスリン及びＣ−ペプチド患者血清の希釈による回収：  高内因性レベルのインスリン及びＣ−ペプチドを含む患者血清をストリップ血清で希釈し、未希釈レベルを希釈倍率で割ることによって計算された値の百分率として回収率を測定した。患者＃１血清は、６９．３μＩＵ／ｍＬのインスリンレベル及び６．３７ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドレベルを有していたが、患者＃２血清は、７５３．５μＩＵ／ｍＬ（外挿による）のインスリンレベル及び２０．８４ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドレベルを有していた。表７ｅ及びｆに、患者＃１及び２のＣ−ペプチド及びインスリンの両方の±１０％（ＴＥａ／３）以内の回収率を示す。
【０２６９】
【表７ｅ】
2018511812.tif 000022
【０２７０】
【表７ｆ】
2018511812.tif 000023
【０２７１】
分割試料比較試験：  事前に検査した試料をＣ−ペプチドＩｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイ、インスリン用のＦＤＡ承認済みのＢｅｃｋｍａｎ  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＩＣＭＡプラットフォーム及びインタクトなインスリン濃度の代用としてのインスリンＢ鎖を測定する社内ＬＣ−ＭＳ／ＭＳから収集した。現在の提案されるアッセイをすべての試料について実施し、十分な試料の量が存在した場合、試料をインスリン及びＣ−ペプチドの他のアッセイに供した。
【０２７２】
９４例の患者からのインスリン結果を現在のアッセイ及びインスリンについて２つの確立されたアッセイによりＬＣ−ＭＳ／ＭＳ「Ｂ鎖」アッセイと比較したところ、良好な相関が得られた（Ｄｅｍｉｎｇ回帰、０．９４ｘ−２．３４）（図３ａ及び３ｂ）。商用Ｂｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡプラットフォームとの相関は、１．３３ｘ−９．０９のＤｅｍｉｎｇ回帰を有していた（図３ｃ及び３ｄ）。より高い値へのバイアスは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＩＣＭＡアッセイにおける現在のキャリブレーターの挙動に反映されていた（Ｄｅｍｉｎｇ回帰、１．２６ｘ＋０．７４）（図３ｅ及び３ｆ）。
【０２７３】
１１５例の患者からのＣ−ペプチド結果については、Ｃ−ペプチドＩｍｍｕｌｉｔｅ２０００アッセイに対する相関（Ｄｅｍｉｎｇ回帰、０．７８ｘ＋０．１９）は、インタクトなＣ−ペプチドのみを検出し、部分的にプロセシングされた型、短縮型又は修飾型を検出しないＬＣ−ＭＳ／ＭＳの特異性を反映して少なくとも２０％免疫測定法の方へ強くバイアスしていた（図４ａ及び４ｂ）。これは、Ｃ−ペプチドＩｍｍｕｌｉｔｅアッセイにおける現在の提案されるアッセイのＣ−ペプチドキャリブレーターの相関（Ｄｅｍｉｎｇ回帰、０．９３ｘ＋０．０８）（図４ｃ及び４ｄ）によって裏付けられる。
【０２７４】
実施例７：検体の安定性
合格基準：  ベースライン値と時間／温度試料値との平均差が当被分析物の≦ＴＥａ／４である限り、試料は、安定であるとみなされる。（ＳＴＡＥＦＡ温度範囲を用いて試験した安定性）。
【０２７５】
凍結／解凍試料安定性：  ６つの血清プールをヒト血清中のＣ−ペプチド及びインスリンの凍結／解凍安定性について評価した。６つの試料に既知濃度のペプチドをスパイクし、５凍結／解凍サイクルにかけた（表８及び図５）。試料を超低冷凍庫中で凍結し（−６０〜−９０℃）、室温に解凍した。データから、インスリン及びＣ−ペプチドの両方が少なくとも５凍結／解凍サイクルで安定であることがわかる。
【０２７６】
表８  凍結解凍安定性
【０２７７】
【表８ａ】
2018511812.tif 000024
【０２７８】
【表８ｂ】
2018511812.tif 000025
【０２７９】
冷蔵温度試料安定性（２〜８℃）：  ６つの血清プールをヒト血清中の２〜８℃の冷蔵温度におけるＣ−ペプチド及びインスリンの安定性について評価した。６つの試料に既知濃度のペプチドをスパイクし、冷蔵庫に保存し、割り当てられた日（０、１、３、５、７、１４、２１及び２８日目）に超低冷凍庫に移した。データから、インスリンは、冷蔵温度で少なくとも２８日間安定であるが、Ｃ−ペプチドは、これらの条件下で７日間まで安定であることがわかる（表９及び図６）。
【０２８０】
表９  冷蔵温度試料安定性
【０２８１】
【表９ａ】
2018511812.tif 000026
【０２８２】
【表９ｂ】
2018511812.tif 000027
【０２８３】
室温試料安定性（１８〜２６℃）：  ６つの血清プールをヒト血清中の１８〜２６℃の室温におけるＣ−ペプチド及びインスリンの安定性について評価した。６つの試料に既知濃度のペプチドをスパイクし、室温で放置し、割り当てられた日に１２０時間にわたって超低冷凍庫に移した。データから、両ペプチドは、室温で２４時間安定であることがわかる（表１０及び図７）。
【０２８４】
表１０  室温試料安定性
【０２８５】
【表１０ａ】
2018511812.tif 000028
【０２８６】
【表１０ｂ】
2018511812.tif 000029
【０２８７】
凍結温度試料安定性（−１０〜−３０℃）：  ６つの血清プールをヒト血清中の−１０〜−３０℃の凍結温度におけるＣ−ペプチド及びインスリンの安定性について評価した。６つの試料に既知濃度のペプチドをスパイクし、凍結保存し、割り当てられた日（０、７、１４、２１及び２８日目）に超低冷凍庫に移した。データから、両ペプチドは、少なくとも２８日間凍結した場合、安定であることがわかる（表１１及び図８）。
【０２８８】
表１１  凍結温度試料安定性
【０２８９】
【表１１ａ】
2018511812.tif 000030
【０２９０】
【表１１ｂ】
2018511812.tif 000031
【０２９１】
凍結温度試料安定性：超低（−６０〜−９０℃）：  ６つの血清プールをヒト血清中の−６０〜−９０℃の凍結温度におけるＣ−ペプチド及びインスリンの安定性について評価した。６つの試料に既知濃度のペプチドをスパイクし、直ちにドライアイス上で凍結し、超低冷凍庫に移した。管を８週間にわたって冷凍庫から取り出した。データから、両ペプチドは、少なくとも８週間超低温で凍結した場合、安定であることがわかる（表１２及び図９）。
【０２９２】
表１２  超低凍結温度試料安定性
【０２９３】
【表１２ａ】
2018511812.tif 000032
【０２９４】
【表１２ｂ】
2018511812.tif 000033
【０２９５】
実施例８：妨害試験
合格基準：  潜在的にな妨害物質に起因する差は、許容できるとみなされるためには≦ＴＥａ／４であるべきである（表１３）。
【０２９６】
溶血妨害：  アッセイにおける溶血の影響は、軽度から著明に溶血した血清試料を表す低、中及び高濃度の溶血ＲＢＣを含む低、中及び低ＱＣをスパイクすることによって評価した。
【０２９７】
インスリンについては、定量不能になるまでのインスリンピークの進行性の喪失により、すべてのレベルの溶血が許容できないことが見いだされた。
【０２９８】
Ｃ−ペプチドについては、すべてのＱＣレベルについての平均回収率は、軽度、中等度及び高度溶血赤血球についてそれぞれ９８％、９４％及び８５％であった。したがって、アッセイは、軽度から中等度の溶血に耐え得るが、著明に溶血した試料は、Ｃ−ペプチドの定量に許容できない。
【０２９９】
脂血症妨害：  アッセイにおける脂血症の影響は、中等度から著明な脂血症血清試料を表す低、中及び高濃度のイントラリピッド（intralipid）で低、中及び低ＱＣをスパイクすることによって評価した。
【０３００】
インスリンについては、すべてのＱＣレベルについての平均回収率は、９７％〜１００％であった。
【０３０１】
Ｃ−ペプチドについては、平均回収率は、９６〜９９％であり、いずれのペプチドの定量も脂血症妨害による影響を受けないことが示唆される。
【０３０２】
ビリルビン妨害：  アッセイにおける黄疸の影響は、中等度から著明な黄疸血清試料を表す低、中及び高濃度のビリルビンで低、中及び低ＱＣをスパイクすることによって評価した。
【０３０３】
インスリンについては、すべてのＱＣレベルについての平均回収率は、９６％〜９８％であった。
【０３０４】
Ｃ−ペプチドについては、平均回収率は、９７〜９９％であり、いずれのペプチドの定量も黄疸妨害による影響を受けないことが示唆される。
【０３０５】
表１３  妨害
【０３０６】
【表１３ａ】
2018511812.tif 000034
【０３０７】
【表１３ｂ】
2018511812.tif 000035
【０３０８】
インスリン類似体妨害：  いくつかの一般的なインスリン類似体をアッセイに対する妨害の可能性について試験した。インスリングラルギン(Insulin glargine)（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、用いた抗体により免疫捕捉されず、インスリンデテミル(Insulin detemir)（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、インスリンの後に十分に溶出した。これにより、インスリンアスパルト(Insulin aspart)（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））、インスリングルリシン(Insulin glulisine)（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））及びインスリンリスプロ(Insulin lispro)（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））の３つの類似体が妨害の可能性のある原因として残った。３つすべてが免疫捕捉され、ヒト及びウシインスリンＩＳを検出するために用いたウインドウ内で溶出された。したがって、３つすべてを妨害について試験した。
【０３０９】
ストリップ血清ブランク及び２０μＩＵ／ｍＬインスリン及び１．７０ｎｇ／ｍＬ  Ｃ−ペプチドを含むストリップ血清にそれぞれ７５又は１５０μＩＵ／ｍＬの３つの類似体のそれぞれを別個にスパイクした。次いで、これらの混合物のそれぞれにおけるインスリン及びＣ−ペプチドレベルを測定した（表１３ｃ）。インスリンリスプロのみがインスリンブランクにおけるＬＯＱを上回る有意な妨害を引き起こし、濃度の増加に伴って悪化した。インスリンアスパルトもインスリングルリシンもいかなるレベルの妨害も引き起こさなかった。予想通り、どの類似体もＣ−ペプチドの定量を妨害しなかった。
【０３１０】
【表１３ｃ】
2018511812.tif 000036
【０３１１】
実施例９：持ち越し
４つの高標準の直後に４つのマトリックスブランクを流し、Ａｒｉａ  ＬＣシステムにおける４チャンネルのそれぞれに対応する各ＬＣカラム上の持ち越しの証拠について評価した。３２０μＩＵ／ｍＬ（インスリン）及び２７．２ｎｇ／ｍＬ（Ｃ−ペプチド）高キャリブレーターの直後のブランクランの測定値は、ＬＯＱ又はそれ未満に対応する、インスリンについて０．３７〜０．７４％、Ｃ−ペプチドについて０．２５〜０．３９％の範囲の持ち越しを示した（表１６）。したがって、マトリックスブランクは、高キャリブレーターの後に流すべきである。ＬＯＱに近い患者試料は、３２０μＩＵ／ｍＬインスリン若しくは２７．２ｎｇ／ｍＬ  Ｃ−ペプチド又はそれ以上を含む患者試料に曝露したＬＣカラムの直後である場合、再度流すべきである。
【０３１２】
表１４  持ち越し
【０３１３】
【表１４ａ】
2018511812.tif 000037
【０３１４】
【表１４ｂ】
2018511812.tif 000038
【０３１５】
実施例１０：基準範囲
すべての対象は、空腹時に採血を受け、＜１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値及び健常範囲外（１８．５未満、２５超）のＢＭＩを有していた健常、歩行可能、非投薬の個人であることに同意した。
インスリン：１５．３μＩＵ／ｍＬ又はそれ未満（Ｎ＝５１）
Ｃ−ペプチド：０．６１〜２．４０ｎｇ／ｍＬ（Ｎ＝５２）
【０３１６】
表１５  基準範囲
【０３１７】
【表１５ａ】
2018511812.tif 000039
2018511812.tif 000040
【０３１８】
【表１５ｂ】
2018511812.tif 000041
2018511812.tif 000042
【０３１９】
実施例１０：検体
インスリン及びＣ−ペプチド多重アッセイをレッドトップ（無ゲル）チューブに採取したヒト血清について検証した。異なる種類の容器に採取した試料の間の差を評価するために、１７の患者プールを４種類のチューブ（レッドトップ血清、ＳＳＴ、ＥＤＴＡ血漿及びヘパリンナトリウム血漿）に採取し、インスリン及びＣ−ペプチドレベルを表１６に示すように定量した。データを対応のあるペアワイズｔ検定並びにＤｅｍｉｎｇ及び線形回帰により解析した。
【０３２０】
表１６  試料の種類の比較
【０３２１】
【表１６ａ】
2018511812.tif 000043
【０３２２】
【表１６ｂ】
2018511812.tif 000044
【０３２３】
データの解析により、試験したすべての種類のチューブがＣ−ペプチドについて許容できることが示唆される。
【０３２４】
インスリンについては、回帰分析により、ＥＤＴＡ血漿チューブは、他の種類のチューブと異なる結果をもたらし、用いるべきでないことが示唆された。さらに、レッドトップチューブと統計的に同じ結果をもたらした、ヘパリン血漿は、可能ならば、避けるべきであり、ヘパリン試料の多くは、ロボット液体ハンドリングに不適合の粘度を示し、チューブから試料プレートへの手作業による移液を必要とする。
【０３２５】
【表１７】
2018511812.tif 000045
【０３２６】
【表１８−１】
2018511812.tif 000046
【０３２７】
実施例１１：インスリン類似体免疫捕捉アッセイ
トリス塩基にスパイクした６種のインスリン類似体を用いて、応答（１６０μＩＵ／ｍＬ）を確認した。ギ酸（ＦＡ）緩衝液にスパイクした６種のインスリン類似体を用いて、応答（１６０μＩＵ／ｍＬ）を確認した。６種のインスリン類似体をストリップ血清ｓｐ１０４０にスパイクし、（ｗ０、ｗ１．．．ｗ８＝０、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０及び２４０μＩＵ／ｍＬ）の濃度を有するインスリン標準の調製を実施した。１５０μｌのストリップ血清を３５０μｌのＢＡＳＥ／ＥｔＯＨと混合した。１５０μｌのｃｌｅａｎａｃｉｔｅ処理ストリップ血清を３５０μｌのＢＡＳＥ／ＥｔＯＨと混合した。
【０３２８】
試料をＨＬＢ−Ｊｕｐｉｔｅｒ  ３μｍ液体クロマトグラフィーカラムを用いて流した。
【０３２９】
６種の類似体すべてが以下のｍ／ｚとして観測される。
【０３３０】
【表１８−２】
2018511812.tif 000047
【０３３１】
インスリン類似体のそれぞれの結果を図１０〜２０に示す。
【０３３２】
実施例１１：インスリンＢ鎖アッセイ
患者は、インスリンに関する異常な結果を示した（Ｓｉｅｍｅｎｓ免疫測定法で非常に高い、ＬＣ−ＭＳＭＳインスリンアッセイで非常に高い；フォローアップ試験で確認された）。その後の検査で、説明となるものは検出されなかった。第３のアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ免疫測定法）にかけたところ、正常結果が得られた。
【０３３３】
【表１９】
2018511812.tif 000048
【０３３４】
【表２０】
2018511812.tif 000049
【０３３５】
患者廃棄物（patient discards）の調査により、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｂｅｃｋｍａｎｎ及びＢ鎖ＬＣ−ＭＳ／ＭＳインスリンアッセイを用いて得られた結果の間にかなりの不一致が明らかにされた。Ｂｅｃｋｍａｎ及びＳｉｅｍｅｎｓへの問い合わせにより、ＢｅｃｋｍａｎアッセイがＢ鎖捕捉及びＡ鎖リードアウト（readout）抗体を用い、ＳｉｅｍｅｎｓがＢ鎖捕捉を用いるが、Ａ及びＢ鎖リードアウト抗体の混合物は用いないようにアッセイが構成されていたことが明らかになった。この情報により、過剰のＢ鎖が循環に存在し、少なくとも一部は、不一致の原因となっていると推測された。
【０３３６】
【表２１】
2018511812.tif 000050
【０３３７】
大規模な総合的試験により、これは、かなりの例数において、試料の３０％程度において約５０％の差として、変化が試料の約４％において５０〜＞１０倍の差として起こっていたことが明らかになった。全分子アッセイを創出するための研究を開始した。このアッセイを用いて得られた結果から、結果がＳｉｅｍｅｎｓ又はＢ鎖ＬＣ−ＭＳＭＳインスリンアッセイよりもＢｅｃｋｍａｎｎと一致しており、不一致が存在していたときには、循環におけるＢ鎖が過剰であることと一致していたことが明らかになった。最初の患者の同意（ＷＩＲＢ承認済みプロトコール）により、得られ、分析された試料は、最初の不一致が約１年後に維持されていたことを示していた。全分子インスリンアッセイを用いた結果は、正常結果を示したが、Ｓｉｅｍｅｎｓ及びＬＣ−ＭＳＭＳ  Ｂ鎖アッセイは、レベルの上昇を示した。
【０３３８】
【表２２】
2018511812.tif 000051
【０３３９】
５つの代表的な患者試料の比較により、図４８にグラフで示す、以下の結果が得られた。
【０３４０】
【表２３】
2018511812.tif 000052
【０３４１】
本明細書で言及又は引用した論文、特許及び特許出願、並びにその他の全文献及び電子的に入手できる情報の内容は、各個別の刊行物が参照により具体的及び個別に組み入れられるように示される場合と同程度に参照により本明細書に全体として組み入れられる。出願人らは、任意のこのような論文、特許、特許出願又はその他の物理的及び電子的文献からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を保持する。
【０３４２】
本明細書で例示的に記載した方法は、本明細書に具体的に開示していない任意の要素又は要素（複数）、限定又は限定（複数）の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」などは、広範に、限定されることなく読み取られるべきである。さらに、本明細書で使用した用語及び表現は、限定ではなく説明のために使用されており、このような用語及び表現の使用において、示された、及び説明された特徴の任意の同等物又はその一部を排除するものではない。請求した本発明の範囲内において様々な変更が可能であることは認識されている。したがって、本発明を好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書で開示しその中で実施される本発明の変更及び変形は当業者であれば用いることができ、このような変更及び変形は本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。
【０３４３】
本発明は、本明細書において広範及び一般的に記載してきた。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜種のそれぞれも本方法の一部を形成する。これには、部類から任意の対象物を削除する条件又は消極的限定を有する方法の一般的説明が、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かに関わらず、含まれる。
【０３４４】
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、方法の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合は、当業者であれば、本発明はまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群によって記載されることを理解するであろう。
【図１Ａ】
2018511812.tif 000053
【図１Ｂ】
2018511812.tif 000054
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2018511812.tif 000058
【図３Ａ】
2018511812.tif 000059
【図３Ｂ】
2018511812.tif 000060
【図３Ｃ】
2018511812.tif 000061
【図３Ｄ】
2018511812.tif 000062
【図３Ｅ】
2018511812.tif 000063
【図３Ｆ】
2018511812.tif 000064
【図４Ａ】
2018511812.tif 000065
【図４Ｂ】
2018511812.tif 000066
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2018511812.tif 000068
【図５Ａ】
2018511812.tif 000069
【図５Ｂ】
2018511812.tif 000070
【図６Ａ】
2018511812.tif 000071
【図６Ｂ】
2018511812.tif 000072
【図７Ａ】
2018511812.tif 000073
【図７Ｂ】
2018511812.tif 000074
【図８Ａ】
2018511812.tif 000075
【図８Ｂ】
2018511812.tif 000076
【図９Ａ】
2018511812.tif 000077
【図９Ｂ】
2018511812.tif 000078
【図１０Ａ】
2018511812.tif 000079
【図１０Ｂ】
2018511812.tif 000080
【図１０Ｃ】
2018511812.tif 000081
【図１０Ｄ】
2018511812.tif 000082
【図１１】
2018511812.tif 000083
【図１２Ａ】
2018511812.tif 000084
【図１２Ｂ】
2018511812.tif 000085
【図１２Ｃ】
2018511812.tif 000086
【図１２Ｄ】
2018511812.tif 000087
【図１３】
2018511812.tif 000088
【図１４Ａ】
2018511812.tif 000089
【図１４Ｂ】
2018511812.tif 000090
【図１４Ｃ】
2018511812.tif 000091
【図１４Ｄ】
2018511812.tif 000092
【図１５Ａ】
2018511812.tif 000093
【図１５Ｂ】
2018511812.tif 000094
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
2018511812.tif 000096
【図１６】
2018511812.tif 000097
【図１７Ａ】
2018511812.tif 000098
【図１７Ｂ】
2018511812.tif 000099
【図１７Ｃ】
2018511812.tif 000100
【図１７Ｄ】
2018511812.tif 000101
【図１８】
2018511812.tif 000102
【図１９Ａ】
2018511812.tif 000103
【図１９Ｂ】
2018511812.tif 000104
【図１９Ｃ】
2018511812.tif 000105
【図１９Ｄ】
2018511812.tif 000106
【図２０】
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【図２１】
2018511812.tif 000108
【図２２】
2018511812.tif 000109
【図２３】
2018511812.tif 000110
【図２４】
2018511812.tif 000111
【図２５】
2018511812.tif 000112
【図２６】
2018511812.tif 000113
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2018511812.tif 000116
【図３０】
2018511812.tif 000117
【図３１】
2018511812.tif 000118
【図３２】
2018511812.tif 000119
【図３３】
2018511812.tif 000120
【図３４】
2018511812.tif 000121
【図３５】
2018511812.tif 000122
【図３６】
2018511812.tif 000123
【図３７】
2018511812.tif 000124
【図３８】
2018511812.tif 000125
【図３９】
2018511812.tif 000126
【図４０】
2018511812.tif 000127
【図４１】
2018511812.tif 000128
【図４２−１】
2018511812.tif 000129
【図４２−２】
2018511812.tif 000130
【図４３Ａ】
2018511812.tif 000131
【図４３Ｂ】
2018511812.tif 000132
【図４４】
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【図４５】
2018511812.tif 000134
【図４６】
2018511812.tif 000135
【図４７】
2018511812.tif 000136
【図４８】
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【国際調査報告】
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2018511812.tif 000139
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