(57)【要約】  本願は、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路における合成致死性および／または化学増感を利用するための材料および方法に関する。特に、当該出願は、ユビキチン加水分解酵素タンパク質であるユビキチン特異的プロテアーゼ４（ＵＳＰ４）およびそれとＤＤＲ経路との関連に関する。さらに、癌の治療およびスクリーニングの方法におけるＵＳＰ４阻害剤の使用、特に、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）に欠陥を有する腫瘍、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する腫瘍の処置における、あるいは、他の治療薬に対する腫瘍を増感する、すなわち、化学増感または放射線増感するためのＵＳＰ４の阻害剤の使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤であって、
ここで、前記癌が、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む、
ＵＳＰ４阻害剤。
【請求項２】
前記１若しくは複数のＤＤＲ経路が、相同的組み換え修復、非相同的末端結合修復、および二本鎖切断修復から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記１若しくは複数のＤＤＲ経路の欠損が、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、およびＡＴＲのうちの１つ以上から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、または欠陥性発現に起因する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記癌が、カルボプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチンまたはサトラプラチンに対して耐性を有する細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＵＳＰ４阻害剤が、ＵＳＰ４の機能的活性の低減を引き起こす、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＵＳＰ４阻害剤が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、小分子、ＲＮＡ系薬剤、またはその他の好適な化学物質から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＵＳＰ４阻害剤が、ＲＮＡ系薬剤または小分子化合物である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＵＳＰ４阻害剤が、ＵＳＰ４に対して選択的である、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
前記癌が、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸直腸、精巣、頭頚部、膵臓、脳、黒色腫、骨、食道、膀胱、子宮頚部、子宮内膜または他の組織臓器の癌、および血球細胞の癌、例えばリンパ腫および白血病から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＵＳＰ４阻害剤が、抗腫瘍性治療剤と組み合わせられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
癌の処置のための、ＵＳＰ４阻害剤および抗腫瘍性治療剤の使用。
【請求項１２】
前記抗腫瘍性治療剤が、白金系製剤、ＰＡＲＰ阻害剤、架橋剤、トポイソメラーゼＩ活性抑制剤、トポイソメラーゼＩＩ活性抑制剤、アルキル化剤および放射線類似作用薬のうちの１つ以上から選択される化学製剤、またはイオン化照射製剤である、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記化学製剤が、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、カンプトテシンおよび／またはオラパリブのうちの１つ以上から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
癌の処置において使用するために好適なＵＳＰ４製剤のスクリーニング方法であって、ここで、前記癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含み、以下のステップ：
ａ）精製されたまたは遺伝子組み換えのＵＳＰ４を得、
ｂ）単離したＵＳＰ４を、１若しくは複数の試験製剤と接触させ、そして、
ｃ）ＵＳＰ４活性の低減を実証する製剤を選択すること、
を含む、方法。
【請求項１５】
ＵＳＰ４阻害剤に対する癌に罹患している対象の応答性を決定する方法であって、
癌が１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含むか否かを決定すること
を含み、
ここで、前記欠損または耐性の存在は、対象がＵＳＰ４阻害剤に対して感受性であることを示す、
方法。
【請求項１６】
ＵＳＰ４阻害剤に対する対象の応答性が、
ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲタンパク質またはｍＲＮＡから選択される１若しくは複数のバイオマーカーの不存在または低減によって、あるいは、
ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４およびＡＴＲの配列の１若しくは複数のアミノ酸もしくは核酸の突然変異の存在によって、あるいは
白金系化学療法に対して耐性を有する細胞の存在によって
決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置のための、癌に罹患している対象を選択する方法であって、
癌が、欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを有する細胞を含むか否か、あるいは癌が、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含むか否かを決定し、そして、
欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを示すか、あるいは１若しくは複数の白金系化学療法に対する耐性を示す対象を選択すること
を含む、方法。
【請求項１８】
ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置に対する癌の感受性を決定するためのバイオマーカーとしての、癌細胞のサンプル中の突然変異ＢＲＣＡ２遺伝子、突然変異ＢＲＣＡ２タンパク質、突然変異ＸＲＣＣ４遺伝子、突然変異ＸＲＣＣ４タンパク質、突然変異ＬＩＧ４遺伝子、突然変異リガーゼＩＶタンパク質、突然変異ＡＴＲ遺伝子または突然変異ＡＴＲタンパク質の存在の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路における合成致死性および／または化学増感を利用するための材料および方法に関する。特に、当該出願は、ユビキチン加水分解酵素タンパク質であるユビキチン特異的プロテアーゼ４（ＵＳＰ４）およびそれとＤＤＲ経路との関連に関する。さらに、癌の治療およびスクリーニングの方法におけるＵＳＰ４阻害剤の使用、特に、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）に欠陥を有する腫瘍、および／または白金系化学療法(platinum-based chemotherapy)に対して耐性を有する腫瘍の処置における、あるいは、他の治療剤に対する腫瘍を増感する、すなわち、化学増感または放射線増感するためのＵＳＰ４の阻害剤の使用を記載する。彼らのＤＤＲ経路状態、特に彼らのＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲ状態に基づいた患者のスクリーニングまたは選択もまた記載する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＤＲとは、それによって細胞が遺伝子材料に対する損傷を感知し、シグナル伝達し、そして、修正するさまざまなプロセスを指す。ＤＮＡ損傷には、化学療法や、放射線治療法や、ＵＶ光や、複製エラーやアルキル化剤などの多数の原因があり、そして、毎日ヒトゲノムに対して何百万もの病巣をもたらしている。ＤＮＡ修復プロセスは、有害な因果関係を有する可能性がある病巣の遺伝の影響に対して絶えずゲノムを保護し続けている。腫瘍形成中には、遺伝的不安定性が、ＤＤＲ／ＤＮＡ修復に関与するものを含めた主要な調節タンパク質における変異に通じ、そして、細胞がＤＮＡ修復経路を維持することに依存するようになる原因となる。この依存は、腫瘍型の間で変動することが知られている。
【０００３】
合成致死性 (synthetic lethality)の概念は、特定の遺伝子の突然変異が、別の遺伝子の突然変異または欠損によってのみ致死がもたらされるモデル生物における遺伝研究から最初に導き出された。癌生物学への合成致死性の適用は、癌を治療するための新しい治療学的手段の発見につながった。例えば、腫瘍が依存するようになったＤＤＲ経路を標的化することは、正常細胞に対して少ない毒性で癌細胞を選択的に殺滅するための新しいアプローチにつながった。近年、正常細胞に対して癌において示差的な不良である経路のタイプに関する高められた理解によって支持されるより合理的なアプローチが保証された（Nijman SMB and Friends SH, Science, 809-811）。
【０００４】
癌治療への合成致死性アプローチは、細胞が生存のために排他的に依存する標的経路によって癌細胞を選択的に殺滅する可能性を提供する。このアプローチは、細胞毒性化学療法および放射線療法を越える有意な利点を提供し、そして、より安全で、かつ、より標的化された処置を潜在的に提示する。このアプローチに基づく特異的な依存関係の特徴づけを、標的化癌療法において有用な有効薬の開発を可能にするようにさらに理解することが求められた。
【０００５】
マウスＵＳＰ４相同分子種は、以前、Ｕｎｐ遺伝子と呼ばれた。ＵＳＰ４遺伝子は、ヒト染色体３ｐ２１．３１にマッピングされる。ユビキチン化は、タンパク質恒常性、転写、ＤＮＡ修復を含めた細胞プロセスの調整に関連しているので、発明者らは、細胞スクリーンを行って、ＵＳＰ４とＤＤＲタンパク質を欠損する細胞株との間の合成致死性を探した。彼らは、ＤＤＲ経路タンパク質、特にＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、およびリガーゼＩＶが減損した細胞株において、ＵＳＰ４のノックダウンが合成致死性をもたらしたことを同定した。加えて、彼らは、親対照と比較して、シスプラチン耐性などの処置に対する耐性を有する腫瘍細胞において、ＵＳＰ４の減少が合成致死性であることがわかった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第一の態様によれば、癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤が提供され、ここで、該癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む。
【０００７】
これにより、ＵＳＰ４阻害剤の使用は、さらなるまたは追加の抗癌剤を必要とすることなく関連癌細胞の処置を可能にする可能性がある。ＵＳＰ４阻害剤は、ＤＤＲ経路の欠損または白金系化学療法に対する耐性に関する合成致死性の組み合わせのため、癌細胞を選択的に殺滅する。かかる合成致死性の組み合わせでは、正常（非癌性）細胞は、ＵＳＰ４阻害剤の効果を受けない。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置において使用するために好適なＵＳＰ４製剤のスクリーニング方法を提供し、ここで、該癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む。
【０００９】
一実施形態において、細胞は、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを欠損する。
【００１０】
さらなる実施形態において、細胞は、推定される阻害剤に曝され、そして、細胞生存率が計測される。
【００１１】
本発明のさらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤としての製剤のスクリーニングにおける、欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを有する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞の使用を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤に対する癌に罹患している対象の応答性を決定する方法であって、該方法が、癌が１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含むか否かを判定することを含み、ここで、前記細胞における前記欠損または耐性の存在が、対象がＵＳＰ４阻害剤に感受性であることを示す、方法を提供する。
【００１３】
したがって、対象は、ＵＳＰ４阻害剤を用いた治療法が有効であるか否か、および／または適切であるか否か判定するためにスクリーニングされ得る。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤による処置のために癌に罹患している対象を選択する方法であって、該方法が、癌が欠陥性のＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを有する細胞を含むか否か、あるいは癌が白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含むか否かを判定し、そして、前記細胞において欠陥性のＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを示すか、または処置のための１若しくは複数の白金系化学療法に対する耐性を示す対象を選択することを含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、１若しくは複数の白金系化学療法に対する耐性を前記化学療法で処置された対象において克服する方法であって、前記対象における１若しくは複数の腫瘍の増殖または血液学的癌の再発を測定し、そして、ＵＳＰ４の阻害剤で対象をさらに処置することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、欠陥性のＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを有する細胞を含む癌、および／または１若しくは複数の白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む前記癌に罹患している対象を処置する方法であって、前記方法が、治療上有効な量のＵＳＰ４阻害剤を対象に投与することを含む方法、を提供する。
【００１７】
さらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置に対する癌の感受性を決定するためのバイオマーカーとして癌細胞のサンプル中の突然変異ＢＲＣＡ２遺伝子、突然変異ＢＲＣＡ２タンパク質、突然変異ＸＲＣＣ４遺伝子、突然変異ＸＲＣＣ４タンパク質、突然変異ＬＩＧ４遺伝子、突然変異リガーゼＩＶタンパク質、突然変異ＡＴＲ遺伝子または突然変異ＡＴＲタンパク質の存在の使用を提供する。
【００１８】
任意選択で、バイオマーカーは、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置に対する前記癌の感受性を決定できる。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む癌に罹患している対象を処置する方法であって、前記方法が、治療上有効な量のＵＳＰ４阻害剤を対象に投与することを含む方法、を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、癌に罹患している対象を処置する方法であって、前記方法は、１若しくは複数の他の抗腫瘍性治療剤と組み合わせて、治療上有効な量のＵＳＰ４阻害剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２１】
したがって、ＵＳＰ４阻害剤の使用は、別の抗腫瘍治療剤を用いた処置に対する腫瘍細胞を増感し得る。これは、化学的抗腫瘍性治療剤に関しても増感し得るし、または放射線系抗腫瘍性治療剤に関しても増感し得る。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置に使用するための製剤を含む医薬組成物を提供し、ここで、癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、および／または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含み、ここで、前記製剤は、ＵＳＰ４阻害剤である。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置に使用するための製剤およびＵＳＰ４阻害剤を含む医薬組成物を提供する。癌の処置に使用するための前記製剤は、任意の抗腫瘍性治療剤であってもよい。
【００２４】
付加の特性は、従属クレームで指定される。さらなる利点を以下に記載する。
【００２５】
本発明の特定の実施形態を、単なる例として、図面を参照してここに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】コロニー形成アッセイによって、同質遺伝子型ＤＤＲ野生型細胞と比較して、ＤＤＲ欠損細胞の選択的殺滅を示すグラフである。対照またはＤＤＲ欠損ＨｅＬａ子宮頚部癌細胞に、対照（ｓｉＬｕｃ）またはＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４−４）を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。細胞を１２日間インキュベートし、その後、コロニーをギムザ染色で固定し、そして、カウントした。３つの実験の平均を示し、エラーバーはＳＥＭを表す。このデータは、ｓｉＵＳＰ４がＤＤＲ欠損細胞にとって合成致死性であるという主張を支持する。
【図２】Cell Titer Gloアッセイによって、白金感受性癌細胞（Ａ２７８０）と比較して、特異的なｓｉＲＮＡを用いたＵＳＰ４のノックダウンが、インビトロ由来の白金耐性癌細胞（ＣＩＳ）を優先的に殺滅したことを示すグラフである。細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）または異なったＵＳＰ４領域を標的とするＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ＵＳＰ４−１、ＵＳＰ４−３、およびＵＳＰ４−４）を用いて１６時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。細胞を、さらに９６時間インキュベートし、そのご、Cell Titer Gloを添加した。Clariostarプレートリーダーにより発光を計測することによって、細胞生存率を決定した。このデータは、ＵＳＰ４ノックダウンが、白金耐性癌細胞を優先的に殺滅することを示す。
【図３】ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、放射線類似作用薬ブレオマイシンに対してＵ２ＯＳ骨肉腫細胞を増感することを示すグラフである。細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）または異なったＵＳＰ４領域を標的とするＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４−４またはｓｉＵＳＰ４（ＵＴＲ））を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞をブレオマイシンで処置した。細胞を９日間インキュベートし、次に、コロニーをギムザ染色により固定し、そして、カウントした。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図４】ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、トポイソメラーゼＩＩ化学療法薬（阻害剤）エトポシドに対してＵ２ＯＳ骨肉腫細胞を増感することを示すグラフである。細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）または異なったＵＳＰ４領域を標的とするＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４−４またはｓｉＵＳＰ４（ＵＴＲ））を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞をエトポシドで処置した。細胞を９日間インキュベートし、次に、コロニーをギムザ染色により固定し、カウントした。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図５】ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、白金製剤カルボプラチンに対してＵ２ＯＳ骨肉腫細胞を増感することを示すグラフである。細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）または異なったＵＳＰ４領域を標的とするＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４−４またはｓｉＵＳＰ４（ＵＴＲ））を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞をカルボプラチンで処置した。細胞を９日間インキュベートし、次に、コロニーを、ギムザ染色により固定し、カウントした。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図６】図６ａは、ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、トポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＰＴ）に対して癌細胞を増感することを示すグラフである。急性ＣＰＴ曝露による対照（ＬｕｃまたはＣｔｌＰ）またはＵＳＰ４減損（４−４または４ＵＴＲ）Ｕ２ＯＳ細胞のクローン形成生存率を示す（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。エラーバーはＳＥＭを表す。図６ｂは、ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、トポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＰＴ）に対して癌細胞を増感することを示すグラフである。Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）または異なったＵＳＰ４領域を標的とするＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４（ＵＴＲ）またはｓｉＵＳＰ４−４）を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞をＣＰＴで処置した。細胞を９日間インキュベートし、次に、コロニーを、ギムザ染色により固定し、カウントした。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図７】図７ａは、ＵＳＰ４がイオン化照射（ＩＲ）に対して細胞を増感することを示すグラフである。急性ＩＲ処置によるＵＳＰ４減損（４−４または４ＵＴＲ）Ｕ２ＯＳ細胞のクローン形成生存率。ｓｉＲＮＡ標的化ＬｕｃまたはＸＲＣＣ４が、それぞれ陰性または陽性の対照であった（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。図７ｂは、イオン化照射（ＩＲ）に対する触媒的不活性なＵＳＰ４増感細胞の過剰発現を示すグラフである。急性ＩＲ処置によりＧＦＰまたはＧＦＰ−ＵＳＰ４（ＷＴ−野性型またはＣＤ−触媒的に死滅）を安定して発現するＵ２ＯＳ細胞のクローン形成生存率（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。
【図８】ＵＳＰ４のｓｉＲＮＡノックダウンが、ＰＡＲＰ阻害剤オラパリブに対してＵ２ＯＳ骨肉腫細胞を増感すること示すグラフである。細胞を、対照（ｓｉＬｕｃ）またはが異なったＵＳＰ４領域を標的するＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＵＳＰ４−４またはｓｉＵＳＰ４（ＵＴＲ））を用いて２４時間トランスフェクションし、その後、マルチウェルプレートに再播種した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞をオラパリブで処置した。細胞を９日間インキュベートし、次に、コロニーを、ギムザ染色により固定し、カウントした。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図９】図９ａは、４種類のｓｉＲＮＡ（４種類のプール：ｓｉＵＳＰ４−１、４−２、４−３、および４−４）のプールによるＵ２ＯＳ細胞におけるＵＳＰ４のノックダウン効率を実証するタンパク質免疫ブロットの画像を示す。コード配列（４−３または４−４）を標的とする２種類の個々のｓｉＲＮＡまたは３’非翻訳領域標的化ｓｉＲＮＡ（４ＵＴＲ）を、指示した抗体を用いた免疫ブロッティング分析で評価した。ｓｉＲＮＡ標的化ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）は陰性対照である。α−チューブリンを添加対照として使用した。図９ｂは、フレオマイシン処置によるＵＳＰ４減損Ｕ２ＯＳ細胞（４種類のプール、４−３、４−４、または４ＵＴＲ）の中性単独細胞電気泳動（ＮＳＣＥ）アッセイを示すグラフである。Ｌｕｃ、ＣｔｌＰまたはリガーゼＩＶ（Ｌｉｇ ＩＶ）を標的とするｓｉＲＮＡが対照であり、後者の２種類が陽性対照である（ＣｔｌＰとＬｉｇ ＩＶは、二重鎖切断修復に関与するタンパク質である）、（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。図９ｃは、タンパク質免疫ブロットの画像を示す。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＵＳＰ４ ＷＴ発現Ｕ２ＯＳ細胞を、指示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、そして、指示した抗体を用いた免疫ブロッティング分析にかけた。棒線および角括弧は、それぞれ、外因的（ｅｘｏ．）または内因性（ｅｎｄｏ．）ＵＳＰ４を示す。α−チューブリンを添加対照として使用した。図９ｄは、指示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＧＦＰまたはＧＦＰ−ＵＳＰ４発現細胞株を用いて、図９ｂのように実施したＮＳＣＥ相補性アッセイを示すグラフである（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝２）。図９ｅは、タンパク質免疫ブロットの画像を示す。安定な細胞株の樹立：ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＵＳＰ４（ＷＴまたはＣＤ）を発現するＵ２ＯＳ細胞。細胞抽出物を、指示した抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。α−チューブリンを添加対照として使用した。図９ｆは、図９ｅに記載の細胞株を用いて実施したＮＳＣＥアッセイを示すグラフである（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。（**Ｐ＜０．０１）。
【図１０】ＧＦＰ−ＵＳＰ４ ＷＴまたはＣＤプラスミドによって一時的にトランスフェクションされ、そして、レーザーマイクロ波照射にかけた、ＲＦＰ−５３ＢＰ１を安定して発現するＵ２ＯＳ細胞の画像を示す。照射前および照射１０分後に、写真を撮影した。ＲＦＰ−５３ＢＰ１を、ＤＮＡ損傷部位を可視化するために使用した。ＵＳＰ４は、その触媒能の如何にかかわらずレーザーマイクロ波放射部分に動員される。
【図１１】図１１ａは、定量的ｓｓＤＮＡ形成アッセイを示すグラフである。ＣＰＴ（１μｍ）で処置した後の一本鎖ＤＮＡの形成を、対照（ＬｕｃまたはＣｔｌＰ）またはＵＳＰ４（４−４または４ＵＴＲ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＵ２ＯＳ細胞において評価した。ＢｒｄＵシグナル強度を、対照（ｓｉＬｕｃ）に対して正規化した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。図１１ｂは、対照（Ｌｕｃ）またはＵＳＰ４標的化（４−４または４ＵＴＲ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしてＧＦＰまたはＧＦＰ−ＵＳＰ４ ＷＴを安定して発現するＵ２ＯＳ細胞における定量的ｓｓＤＮＡ形成アッセイを示すグラフである。相対シグナルＢｒｄＵ強度を、１００％に設定されたそれらのそれぞれのＣＰＴおよび対照（ｓｉＬＵＣ）ＧＦＰ細胞に対する正規化によって評価した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。（**Ｐ＜０．０１）。図１１ｃは、ＥｄＵでパルスラベルした、対照（Ｌｕｃ）またはＵＳＰ４減損（４−４または４ＵＴＲ）Ｕ２ＯＳ細胞を示すグラフである。相対ＥｄＵシグナル強度を、計算し、そして、（１００％に設定した）Ｌｕｃに対して正規化した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝２）。これは、図１１ｂに見られる効果が一般的な細胞周期の影響によるものでないことを実証している。図１１ｄは、ＧＦＰ−ＵＳＰ４ ＷＴまたはＣＤ発現Ｕ２ＯＳ細胞における定量的ＤＮＡ末端切断アッセイを示すグラフである（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝５）。
【図１２】図１２ａは、ＵＳＰ４がＲＡＤ５１添加および相同的組み換えを促進することを示すグラフである。対照（ＬｕｃまたはＢＲＣＡ１）またはＵＳＰ４（４ＵＴＲ）減損細胞を、５ＧｙのＩＲに晒し、８時間回復させ、続いて、ＲＡＤ５１およびγΗ２ΑΧに対する抗体を用いて免疫蛍光染色した。３つより多くのＲＡＤ５１焦点を含むγΗ２ΑΧ陽性細胞を、プラスにスコア化した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。（**Ｐ＜０．０１）。図１２ｂは、ＵＳＰ４がＲＡＤ５１添加および相同的組み換えを促進することを示すグラフである。対照（ＬｕｃまたはＣｔｌＰ）またはＵＳＰ４（４−４、４ＵＴＲ）ｓｉＲＮＡで処置したＤＲ−ＧＦＰ Ｕ２ＯＳ細胞におけるｌ−Ｓｃｅｌ誘発ゲノムＤＳＢ修復アッセイ。相対ＨＲ修復効率を、Ｌｕｃ対照に対して正規化した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝４）。（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１）。
【図１３】ＵＳＰ４が非相同的末端結合を促進することを示すグラフである。ＮＨＥＪ修復効率を算定するための、対照（ＬｕｃまたはＬｉｇ ＩＶ）またはＵＳＰ４（４−４または４ＵＴＲ）減損Ｕ２ＯＳ細胞におけるランダムプラスミド組み込みアッセイ。相対ＮＨＥＪ修復効率を、１００％に設定した対照（Ｌｕｃ）に対して正規化した（平均±ｓ.ｅ.ｍ.、ｎ＝３）。（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１）。
【図１４】ＨＥＫ−２９３細胞で発現された精製ＦＬＡＧ−ＵＳＰ４の画像を提供する。ＦＬＡＧ精製タンパク質（５μｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして、Ｉｍｐｅｒｉａｌブルーで染色した（Pierce Biotechnology）。
【図１５】ＵＳＰ４の生物化学的アッセイ、特に蛍光分極アッセイを使用した、精製ＦＬＡＧ−ＵＳＰ４のタンパク分解活性の結果を示すグラフである。様々な濃度の指示したＵＳＰ４を、イソペプチド結合を介してユビキチンに連結されたＴＡＭＲＡ標識ペプチドと共にインキュベートし、そして、蛍光分極を使用してシグナルを検出した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
特定の実施形態の詳細な説明
実施例では、これまでＵＳＰ４機能に関連していなかったＤＤＲ経路が確定されることを示し、そして、結果は、ＵＳＰ４の阻害が、ＤＤＲ経路を欠損する腫瘍の処置に効果的な戦略であることを示す。特に、実施例に示されているように、ＵＳＰ４が、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、およびＡＴＲタンパク質の欠損 (deficiencies)または欠陥 (defects)を補うことが実証された。したがって、ＵＳＰ４は、これらのタンパク質及び関連するＤＤＲ経路の１以上の欠損を有する癌における細胞生存に不可欠である。これは、これらの経路の１以上における欠損を特徴とする腫瘍の処置において使用するＵＳＰ４阻害剤の開発において意義があり、かつ、ＵＳＰ４阻害剤処置の利益を得る患者を同定するための、患者のプレスクリーニングを提供する。
【００２８】
実施例は、ＵＳＰ４の阻害が、白金系化学療法処置に対して耐性である癌細胞を選択的に殺滅するのに有効であることを実証する。特に、結果は、ＵＳＰ４阻害が、白金系処置に耐性である癌細胞を優先的に殺滅することを実証する。これらの知見は、白金系化学療法に対する耐性を発症した患者のための新薬の開発と治療計画において意義があり、かつ、可能性を有する。
【００２９】
発明の態様によれば、癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤を提供し、ここで、該癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞を含む。
【００３０】
発明の態様によれば、癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤を提供し、ここで、該癌は、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む。
【００３１】
別の態様において、癌の治療剤の製造におけるＵＳＰ４阻害剤の使用を提供し、ここで、該癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞を含む。
【００３２】
別の態様において、癌の治療剤の製造におけるＵＳＰ４阻害剤の使用を提供し、ここで、該癌は、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む。
【００３３】
ＵＳＰ４は、ユビキチン特異的プロテアーゼ４ポリペプチドであり、そして、そのバリアント (variant)、突然変異体 (mutant)、および断片を含み得る。ＵＳＰ４は、ユビキチン特異的なプロセッシングプロテアーゼスーパーファミリーのメンバーであり、かつ、ユビキチン複合前駆体およびユビキチン化タンパク質からのユビキチン部分の除去による脱ユビキチン化酵素として機能する。ＵＳＰ４は、用語体系の標準化に先立ち、以前、ＵＮＰと命名された。
【００３４】
ＵＳＰ４ポリペプチドは、天然にみられるものに相当するアミノ酸配列を有するＵＳＰ４ポリペプチドを指すその天然または野生型形態であってもよい。あるいは、ＵＳＰ４ポリペプチドは、天然アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列アミノ酸同一性を有するバリアントであってもよい。ヒトＵＳＰ４のタンパク質配列は、配列番号１で提供され、およびヒトＵＳＰ４のｍＲＮＡ配列は、配列番号２として提供される。
【００３５】
ＵＳＰ４は、任意の起源、例えば、真核生物起源または原核生物起源に由来し得る。ある実施形態において、ＵＳＰ４は、哺乳類のものであり、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはヒト以外の霊長目動物由来である。ある実施形態において、ＵＳＰ４は、鳥類のものであり、ニワトリまたはシチメンチョウ由来である。ある実施形態において、ＵＳＰ４は、ヒトのものである。さらなる実施形態において、ＵＳＰ４は、人体組織由来であっても、または遺伝子組み換え合成法由来であってもよい。
【００３６】
ＵＳＰ４ポリペプチドは、ＵＳＰ４の野性型または天然型とは異なった遺伝子型を有する突然変異ポリペプチドであってもよい。かかる突然変異体はまた、異なった表現形の相違点をもたらし得る。ＵＳＰ４の突然変異体は、天然ＵＳＰ４タンパク質の各アミノ酸が異なったアミノ酸残基に独立に変更される任意の適切な方法によって作製され得る。
【００３７】
遺伝子およびｃＤＮＡをクローニングするおよび操作するため、ＤＮＡを突然変異させるため、ならびに宿主細胞でポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的技法は、「Molecular cloning, a laboratory manual」, third edition, Sambrook, J. & Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NYで例示されるとおり、当該技術分野で周知であり、該文献を参照により本明細書に援用する。
【００３８】
誤解を避けるために、「由来する」とは、初めは、規定した起源からｃＤＮＡまたは遺伝子を得、そして、任意の好適な宿主細胞でＵＳＰ４タンパク質を発現し得ることを意味する。例えば、真核生物起源由来のＵＳＰ４は、Ｅ．コリなどの原核生物の宿主細胞で発現されてもよい。
【００３９】
脱ユビキチン化活性は、ＵＳＰ４の触媒または酵素活性であり、ｋ６３連結ユビキチンコンジュゲートなどのタンパク質からの、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、およびＴＡＫ１からのユビキチンの除去である。ＵＳＰ４の他の既知の基質または相互作用パートナーとしては、ＴＲＩＭ２１、ＲＩＧ−１、ＲＩＰ１、ＰＤＫ１、ｐＲｂ（網膜芽細胞腫腫瘍抑制因子）、ポケットタンパク質ｐｌ０７およびｐｌ３０、ＡＲＦ−ＢＰ１、ＴＧＦβ受容体Ｉ、ＰＤＫ１キナーゼ、Ｒｏｓ５２、スプライセオソームタンパク質Ｐｒｐ１９、プロテアソームのＳ９／Ｒｐｎ６サブユニット、ならびにＡ２ａアデノシン受容体が挙げられる。
【００４０】
ＵＳＰ４阻害剤は、ＵＳＰ４と結合または相互作用し、そして、ＵＳＰ４の機能的活性の低減、例えば、部分的であってもまたは完全であってもよい触媒または酵素活性の低減を引き起こすことができる製剤であり得る。阻害剤は、ＵＳＰ４の活性部位と相互作用しても、またはＵＳＰ４の別の部位と相互作用してもよく、そして、アロステリク阻害剤として作用し得る。ＵＳＰ４の機能的活性の低減を引き起こすあらゆる製剤が、阻害剤と見なされる。
【００４１】
ＵＳＰ４の機能的活性における部分的または完全な低減は、１若しくは複数のＤＤＲ経路に欠陥があり、かつ、ＵＳＰ４媒介性修復に頼っているまたは高度に依存している癌細胞の細胞死またはアポトーシスを引き起こすことがあり、これにより、癌細胞の選択的標的化および殺滅を可能にすると同時に、正常な（非癌性）複製細胞の生き残りを可能にする。
【００４２】
ＵＳＰ４阻害剤は、既知のＵＳＰ４阻害剤、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド、小分子化合物、ＲＮＡ系薬剤（これだけに限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む）分子、あるいはその他の好適な化学物質であってもよい。一実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤は、抑制性ＲＮＡ分子または小分子化合物として機能するＲＮＡ分子である。また、ＲＮＡレベルは、ｍｉＲＮＡの導入によっても調節され得る。また、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、アプタマーを形成し得る。一実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤は、阻害性（ＲＮＡｉ）分子などのＲＮＡ系薬剤、または小分子化合物である。
【００４３】
ＵＳＰ４阻害剤は、ＵＳＰ４に関して特異的であっても、または選択的であってもよい。
【００４４】
「抗体」に対する言及は、これだけに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。抗体は、ＶＨまたはＶＬドメイン、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）または「第三世代」フラグメント（３Ｇ−必須でないと見なされたドメインを取り除くことによって完全な大きさの抗体から得られた小型化された抗体）を含めた抗体フラグメントまたはその誘導体であってもよい。一実施形態において、抗体はヒトの抗体であるが、もう一方の実施形態において、抗体は、動物由来の抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００４５】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」に対する言及は、細胞への二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の導入がＲＮＡｉ配列の一方に相補的なｍＲＮＡの阻害をもたらすことによって遺伝子機能を「ノックダウン」するために使用される技術を指す。これは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含めえたさまざまなＲＮＡ分子型によって実現できる。
【００４６】
（Okada K et al., Bioorg Med Chem Lett, 2013, Aug 1; 23(15) 4328-31に記載のように）シイタケ（Thelephora vialis）から単離された小分子化合物Ｖｉａｌｉｎｉｎ Ａなどの既知のＵＳＰ４阻害剤およびその誘導体が、本発明に従って使用されるものであって、それらを本明細書中に援用する。
【００４７】
患者／対象は、彼らのＵＳＰ４状態に基づいて、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置に関してスクリーニングまたは選抜され得る。例えば、ＵＳＰ４の発現レベル、またはＵＳＰ４が不完全か否か決定され得る。ＵＳＰ４の発現および性質を決定するために、例えば、他のＤＤＲ経路構成要素のための以下で記載した方法などの標準的な方法が使用され得る。
【００４８】
ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路は、それによって遺伝子材料に対する損傷を細胞が感知し、シグナル伝達し、そして、修正するさまざまなプロセスである。ＤＮＡ損傷は、例えば、化学療法、放射線治療法、ＵＶ光、複製エラー、およびアルキル化剤によって引き起こされる可能性がある。
【００４９】
１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞は、正常機能が部分的にまたは完全に損なわれるような、機能不全であるかまたは不完全である１若しくは複数のＤＤＲ経路を有している可能性がある。
【００５０】
ＤＤＲ経路は、塩基除去修復（ＢＥＲ）、一本鎖切断修復、ミスマッチ修復、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、転写共役修復、非相同的末端結合修復、損傷乗り越え合成、ならびに、相同的組み換え修復；二本鎖切断（ＤＳＢ）シグナル伝達およびＤＮＡ鎖間架橋修復（Fanconi Anaemia経路を含む）を含めた二本鎖切断修復プロセスのうちの１以上から選択され得る。
【００５１】
ＤＤＲ経路の欠損は、相同的組み換え修復、塩基除去修復、一本鎖切断修復、ミスマッチ修復、ヌクレオチド除去修復、転写共役修復、非相同的末端結合修復、損傷乗り越え合成またはＤＮＡ鎖間架橋修復に関与するタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、または欠陥性発現による可能性がある。
【００５２】
ある実施形態において、ＤＤＲ経路の欠損は、二重鎖切断の修復にかかわる。特に、細胞は、相同的組み換え（ＨＲ）修復または非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）修復から選択される１若しくは複数のＤＤＲ経路を欠損し得る。
【００５３】
特定の実施形態において、ＤＤＲ経路の欠損は、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４のうちの１以上から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、欠陥性発現に起因し得る。
【００５４】
特定の実施形態において、１若しくは複数のＤＤＲ経路を欠損する細胞は、化学療法薬などのＤＮＡ損傷薬に対して高い感受性を有する。
【００５５】
「ＡＴＲ」に対する言及は、一本鎖ＤＮＡ損傷、複製フォークの傷およびゲノムの脆弱部位のメインテナンスなどのＤＮＡ損傷を示す一本鎖ＤＮＡの永続的な存在によって動員および活性化されるキナーゼのＰＩ３ＫＫサブファミリー（ＰＩ３Ｋ関連キナーゼ）に属するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼであって毛細管拡張性運動失調およびＲａｄ３に関連したものを指す。一本鎖ＤＮＡは、これだけに限定されるものではないが、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、塩基除去修復、および相同的組み換えを含めた、いくつかのＤＤＲ経路の中間体である。このキナーゼは、チェックポイントキナーゼＣＨＫ１、チェックポイントタンパク質ＲＡＤ１７、ＲＡＤ９、ならびに腫瘍サプレッサタンパク質ＢＲＣＡ１をリン酸化することが示された。この遺伝子の突然変異は、ゼッケル症候群に関連している。
【００５６】
「ＢＲＣＡ２」は、乳癌２型感受性タンパク質を意味する。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子における異型接合生殖細胞変異のキャリアは、乳癌、卵巣癌、および他の臓器の癌に非常に罹患しやすい。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２タンパク質は、ゲノムの不安定性および突然変異の促進によって癌の進行を助長しそうな腫瘍の野生型ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２対立遺伝子の相同的組み換えおよび欠損による二本鎖切断の修復のために決定的に重要である。
【００５７】
「リガーゼＩＶ」または「Ｌｉｇ ＩＶ」は、ＤＮＡ二本鎖切断を修復するために非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）経路中に二本鎖切断をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼＩＶ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを意味する。このタンパク質は、エックス線修復交差相補タンパク質４（ＸＲＣＣ４）との複合体を形成し、さらに、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）と相互作用する。この遺伝子の欠陥は、急性放射線感受性、免疫不全および骨髄異常などの症状を伴うＬＩＧ４症候群の原因である。
【００５８】
「ＸＲＣＣ４」は、エックス線修復交差相補タンパク質４を意味する。これは、ＤＮＡ二本鎖切断を修復するためのＮＨＥＪ経路に関与するいくつかのコアタンパク質のうちの１つである。このタンパク質は、先に述べたように、リガーゼＩＶと複合体を形成する。非相同的末端結合経路は、正常な発生および腫瘍の抑制の両方に必要である。ＸＲＣＣ４多型性は、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌腫、リンパ腫、多発性骨髄腫などの癌への罹患のリスクにつながった。
【００５９】
１若しくは複数の白金系化学療法剤に対して効果的に応答しない腫瘍細胞は、白金系化学療法に耐性であると記述され得る。斯かる細胞は、白金系化学療法薬に対して感受性の腫瘍細胞と比較して、白金系化学療法薬の存在下で持続的に生存可能である固有のまたは獲得された細胞機構のいずれかをおそらく有しており、そのため、より多くの用量が細胞殺滅を達成するのに必要である。白金系処置に難治性である、すなわち、白金系化学療法に対して部分奏功さえ示さないか、または初めは白金系化学療法に反応するが、しかし、その後、処置の完了後の短期間の間に再発する腫瘍細胞もまた、耐性と規定され得る。斯かる細胞は、白金系化学療法薬の存在下で持続的に生存可能である固有のまたは獲得された細胞機構のいずれかをおそらく有しており、したがって、より多くの用量が細胞殺滅を達成するために必要である。処置後の癌細胞の再発は、即座であっても、または短期間の間での再発であってもよい。今回は、様々な腫瘍型について様々に規定され得るが、今回の卵巣癌では、６カ月の期間としてGynaecologic Oncology Groupによって測定された。これにより、６カ月以内に再発する癌は、白金系薬剤に耐性である傾向がある。
【００６０】
白金系化学療法に対する耐性は、これだけに限定されるものではないが、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頚部癌、精巣癌、乳癌、子宮頚癌、および胃癌を含めたさまざまな癌で起こる。
【００６１】
白金系化学療法剤／処置は、当業者に知られていて、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびサトラプラチンが挙げられる。
【００６２】
さらに、ＵＳＰ４の阻害が、これらの活性レベルをさらに低減することによって、二本鎖切断修復タンパク質の活性低下により腫瘍細胞を選択的に殺滅し得ることが認められる。
【００６３】
二本鎖切断修復プロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、または欠陥性発現を有する癌細胞は、ＵＳＰ４阻害の存在下で選択的に殺滅される。図９ａ〜９ｆ、１１ａ〜１１ｄ、１２ａ〜１２ｂ、および１３は、ＵＳＰ４が二本鎖切断の修復を促進することを明確に示す。
【００６４】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ゲノム材料の再配列または欠損をもたらす可能性があるＤＮＡ損傷の有害形態であり、最終的に細胞死または発癌に通じる。ＤＳＢは電離放射線（ＩＲ）によって引き起こされ得るが、それらはまた、ＤＮＡ複製、およびＶ（Ｄ）Ｊ組み換えを含めた正常な内因性プロセス中にも起こる。
【００６５】
実施例は、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４を欠損する癌細胞、または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞が、ＵＳＰ４阻害の存在下で選択的に殺滅されることを実証する。これにより、還元されたＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶおよびＸＲＣＣ４を有するか、または白金系化学療法に対して耐性を有する腫瘍が、ＵＳＰ４に高度に依存している。
【００６６】
さらなる実施形態において、癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤を提供し、ここで、該癌は、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞、または１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞を含み、ここで、斯かる欠損は、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４の１以上から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、または欠陥性発現に起因する。
【００６７】
ある実施形態において、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞、または１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞を含む癌の処置において使用するためのＵＳＰ４阻害剤を提供し、白金系化学療法に対して耐性を有する細胞、または１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞が、生存のためのＵＳＰ４関連経路に高度に依存する。
【００６８】
本発明の一態様において、ＵＳＰ４阻害剤は、１若しくは複数の追加の抗腫瘍性治療剤、例えば、放射線または化学療法薬、あるいは、他の調節タンパク質／他のＤＮＡ損傷応答タンパク質の阻害剤、に組み合わせられてもよい。この併用治療は、癌に罹患している対象に適用されてもよい。発明者らはまた、実施例および図面に示されているように、抗腫瘍性治療法を伴ったＵＳＰ４阻害剤の併用療法も同一視した。これにより、ＵＳＰ４阻害剤の使用は、別の抗腫瘍性治療法を用いた処置に対して癌細胞を増感する。これは、化学的抗腫瘍性製剤または放射線系抗腫瘍性製剤に関して増感されている可能性がある。この実施形態において、癌細胞は、ＤＤＲ経路に欠陥を有する必要はない。
【００６９】
組み合わせが物理的な組み合わせである必要はないが、ＵＳＰ４阻害剤と抗腫瘍性治療剤が別々にまたは連続して適用される併用療法であることは理解されるであろう。
【００７０】
任意の好適な組み合わせは、ＵＳＰ４阻害剤と追加の抗腫瘍性治療剤の使用であり得る。
【００７１】
本発明のこの態様において、ＵＳＰ４阻害剤は、１若しくは複数の追加のまたはさらなる抗腫瘍性治療剤の使用で殺滅するために癌細胞を準備する、増感剤、すなわち、化学増感剤または放射線増感剤として作用すると考えられる。
【００７２】
抗腫瘍性治療剤は、腫瘍または癌を処置するために好適な任意の製剤であってよい。
【００７３】
追加の抗腫瘍性治療剤は、ＡＴＲ阻害剤、ＢＲＣＡ２阻害剤、リガーゼＩＶ阻害剤、およびＸＲＣＣ４阻害剤から選択されてもよい。一実施形態において、ＡＴＲ阻害剤は、ＡＺＤ６７３８およびＶＥ−８２２のうちの１以上から選択されてもよい。ある実施形態において、ＸＲＣＣ４の阻害剤は、Ｓ−（ジメチルアルシン）システイン、ミリセチン、およびいくつかのキサントン系化合物のうちの１以上から選択されてもよい（Sun et a I, J Biomol Struct Dyn (2011) 29(2):325-37）。ある実施形態において、リガーゼＩＶ阻害剤は、ＳＣＲ７（Srivastava et al. Cell (2012) 151(7): 1474-87）またはＬ１８９（Chen et al, Cancer Res (2008) 68(9):3169-77）から選択されてもよい。
【００７４】
ＵＳＰ４阻害剤は、イオン化照射および／または以下の化学療法薬：白金、ＰＡＲＰ阻害剤、架橋剤、トポイソメラーゼＩ化学療法薬、トポイソメラーゼＩＩ化学療法薬、アルキル化剤、および放射線類似作用薬、に組み合わせられてもよい。よって、イオン化照射および化学療法剤は、本発明による追加の抗腫瘍性治療剤である。
【００７５】
ＵＳＰ４阻害剤は、ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）阻害剤に組み合わせられてもよく、そしてそれは、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子であってもよい（ＰＡＲＰｉ）。さらなる実施形態において、ＰＡＲＰ阻害剤は、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１）、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ−０１３６７３３８）およびベリパリブ（ＡＢＴ−８８８）、ＭＫ−４８２７、ＣＥＰ−９７２２、Ｅ７０１６（ＧＰＩ−２１０１６）、ＬＴ−６７３、ＭＰ−１２４、ＮＭＳ−Ｐ１１８のうちの１以上から選択されてもよい。ＰＡＲＰは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）破断の修復における役割を果たすポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ酵素を意味する。ＰＡＲＰファミリーは１７種類のメンバーを含み、すべてがＤＮＡ修復および細胞死における役割を有すると考えられた。ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２は共に、ＤＮＡの一本鎖の破断によって活性化される。
【００７６】
追加の抗腫瘍性治療剤は、白金系化学療法であってもよい。好適な白金系化学療法としては：カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびサトラプラチンが挙げられる。
【００７７】
追加の抗腫瘍性治療剤は、架橋剤であってもよい。好適な架橋剤としては、シスプラチン、マイトマイシンＣ、メルファラン、およびシクロホスファミドが挙げられる。
【００７８】
ＵＳＰ４阻害剤は、トポイソメラーゼＩ化学療法薬またはトポイソメラーゼＩＩ化学療法薬である追加の抗腫瘍性治療剤に組み合わせられてもよい。化学療法薬としては、トポイソメラーゼＩおよび／またはＩＩの活性抑制剤および阻害剤を挙げることもできる。活性抑制剤は、トポイソメラーゼを阻害するよりむしろトポイソメラーゼＤＮＡ複合体を標的とする化合物であってもよい。好適なトポイソメラーゼＩ化学療法薬としては、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、およびラメラリンＤが挙げられる。好適なトポイソメラーゼＩＩ化学療法薬としては、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサンチン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸およびＨＶ−３３１が挙げられる。
【００７９】
追加の抗腫瘍性治療剤は、アルキル化剤であってもよい。好適なアルキル化剤としては、ベンダモルフィン、ブスルファン、クロラムブシル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、イソファミド、テモゾロミド、およびシクロホスファミドが挙げられる。
【００８０】
追加の抗腫瘍性治療剤は、放射線類似作用薬であってもよい。好適な放射線類似作用薬としては、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、およびストレプトニグリンが挙げられる。
【００８１】
追加の抗腫瘍性治療剤は、紡錘体阻害剤または抗有糸分裂薬であってもよい。好適な紡錘体阻害剤としては、タキサン（パクリタキセルを含む）、メベンダゾール、コルヒチン、グリセオフルビン、およびビンカアルカロイドが挙げられる。
【００８２】
追加の抗腫瘍性治療剤は、代謝拮抗製剤であってもよい。好適な代謝拮抗製剤としては、フルロピリミジン、アザチオプリン、およびメルカプトプリンが挙げられる。
【００８３】
追加の抗腫瘍性治療剤は、ヌクレオシド類似物質または核酸塩基類似物質であってもよい。好適な類似物質としては、ビダラビン、シタラビン、およびゲムシタビンが挙げられる。
【００８４】
特定の実施形態において、追加の抗腫瘍性治療剤は、電離放射線（ＩＲ）、あるいは、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、カンプトテシン、オラパリブ、またはそれらの組み合わせから選択される化学療法薬を含むリストから選択される。
【００８５】
癌または腫瘍としては、これだけに限定されるものではないが、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頚部、膵臓、脳、黒色腫、食道、膀胱、子宮頚部、子宮内膜、骨または他の組織臓器の癌、および例えば、リンパ腫や白血病などの血球細胞の癌が挙げられる。
【００８６】
ＵＳＰ４が、本明細書中に記載の他の／追加の抗腫瘍性治療剤と組み合わせて使用される場合、組み合わせは、一緒に（at the same time）、同時に（simultaneously）、連続して、または別々に対象に適用されてもよいことが、当業者には理解される。ＵＳＰ４阻害剤および追加の抗腫瘍性治療剤はそれぞれ、例えば、異なった経路によって投与されてもよい。投与の経路は、以下でさらに考察され、ＵＳＰ４阻害剤と追加の抗腫瘍性治療剤に等しく適用される。
【００８７】
ＵＳＰ４阻害剤と追加の抗腫瘍性治療剤は、彼らの癌が１若しくは複数のＤＤＲ経路を欠損する細胞を含むか、または彼らの癌が白金系化学療法に耐性である細胞を含む対象で使用されてもよい。
【００８８】
実施例で実証されるように、併用療法は、ＵＳＰ４阻害剤に関してイオン化照射または以下の化学療法薬：白金、ＰＡＲＰ阻害剤、架橋剤、トポイソメラーゼＩ化学療法薬、トポイソメラーゼＩＩ化学療法薬、アルキル化剤、および放射線類似作用薬、と同定された。
【００８９】
追加の抗腫瘍性治療剤に関連したＵＳＰ４阻害剤の使用は、癌細胞の選択的標的化を可能にし、その結果、化学療法薬に関連する既知の副作用を低減する、従来の化学療法を超える治療利点を示す。
【００９０】
ある実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤は、癌の処置に有用であり、ここで、該癌は、抗癌剤を用いた処置に少なくとも部分的に感受性である。例えば、抗癌剤は、電離放射線（ＩＲ）であっても、またはＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブ）、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ化学療法薬（例えば、カンプトテシンまたはエトポシド）、白金系化学療法薬、例えば（例えば、シスプラチン）など、架橋剤（例えば、マイトマイシンＣ）アルキル化剤（例えば、イソファミド）および／または放射線類似製剤（例えば、ブレオマイシン）から選択される化学療法薬であってもよい。ＵＳＰ４阻害剤は、別の抗腫瘍性治療剤と組み合わせて斯かる癌を治療するために使用されるのが好ましい。
【００９１】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置において使用するために好適なＵＳＰ４の阻害剤のためのスクリーニング方法を提供し、ここで、該癌は、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含む。
【００９２】
ＵＳＰ４の阻害剤は、以前に考察され、そして、ＵＳＰ４の活性を低減する製剤であり得、ＵＳＰ４の拮抗薬または逆作動薬を含む。例としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、小分子化合物、ＲＮＡ系薬剤（これだけに限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる）分子またはその他の好適な化学物質が挙げられる。低減とは、部分的であっても、または完全であってもよい。ＵＳＰ４の固有活性が損なわれるが、その基質または補因子に結合するＵＳＰ４の能力には影響しないように機能する製剤もまた、本発明の任意の態様の範囲内に含まれる。
【００９３】
ＵＳＰ４は、「Short protocols in molecular biology」 Ausubel et al, Wiley, Fourth Edition, 1999に記載の方法を含めた、任意の従来の手段によってスクリーニングのために単離され得る。
【００９４】
スクリーニング方法は、以下のステップ：
ａ）哺乳動物細胞から精製されたまたは遺伝子組み換えＵＳＰ４複合体を得、
ｂ）単離されたＵＳＰ４を、１若しくは複数の試験製剤およびＵＳＰ４の適切な基質と接触させ、
ｃ）ＵＳＰ４活性の低減を実証する製剤を選択すること、
を含み得る。
【００９５】
一実施形態において、ステップｃ）で同定された製剤は、ナノモル濃度（ｎＭ）またはマイクロモル（μΜ）の範囲の結合親和力を有する。別の実施形態において、製剤は、他のタンパク質への結合が有意に減少するかまたは存在しないような、ＵＳＰ４への特異的な結合を実証する。
【００９６】
特に、ＵＳＰ４の適切な基質は、蛍光偏光基質としてイソペプチド結合を介してユビキチンに連結されたＴＡＭＲＡ標識ペプチドである。
【００９７】
精製したかまたは遺伝子組み換えのＵＳＰ４阻害剤を同定するために使用されるさらなる方法は、当業者によって理解される。特定の実施形態において、ＵＳＰ４の低減は、触媒能における低減である。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を成熟して有する、もしくは欠損する細胞株、または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞の同質遺伝子型対を使用する、ＵＳＰ４の阻害剤のスクリーニング方法を提供する。ＵＳＰ４阻害剤は、成熟または感受性細胞と比較して、欠損又は耐性の細胞においてより強力に作用する。
【００９９】
ＵＳＰ４の活性における低減は、少なくとも１つのＤＤＲ経路を欠損する細胞の細胞増殖における低減によってインビトロで計測され得る。特定の実施形態において、細胞増殖における低減は、細胞周期停止またはアポトーシスに起因する。特定の実施形態において、ＵＳＰ４の触媒能における低減は、ＵＳＰ４の脱ユビキチン化活性の低減によってインビトロで計測される。
【０１００】
ＵＳＰ４の触媒能の阻害は、Tirat et al, (Anal Biochem 343 (2005) 244-255)に記載の方法を含めたインビトロ法を使用して計測され得る。
【０１０１】
試験薬は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、先に記載したＲＮＡ分子、抗体またはそのライブラリであってもよい。
【０１０２】
本発明のさらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤に対する癌に罹患している対象の応答性を決定する方法を提供し、該方法は、癌が１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞、または白金系化学療法に対して耐性を有する細胞を含むか否かを決定することを含み、ここで、前記不安定性または前記耐性の存在が、対象がＵＳＰ４阻害剤に感受性であることを示す。一実施形態において、ＤＤＲ経路は、二本鎖切断修復、特に非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）および相同的組み換え（ＨＲ）に関与する。
【０１０３】
任意選択で、例えば、対象の応答性を決定するかまたは対象を選択するといった任意の本発明の方法が、対象の非発癌（正常）細胞が前記のＤＤＲ経路を欠損する細胞を含むか否かを決定することをさらに含んでもよい。対象の正常細胞および癌細胞は、癌細胞が正常細胞に対して１若しくは複数のＤＤＲ経路を欠損する場合に、比較して決定され得る。癌細胞が１若しくは複数のＤＤＲ経路を欠損しており、かつ、正常細胞が前記経路を欠損することが、場合によっては好ましい可能性もある。任意選択で、正常細胞は、多分、ＤＤＲ経路遺伝子の突然変異に関して異型接合であるか、またはＤＤＲ経路遺伝子に多型性を担持するのに対して、前記経路を欠損していない。
【０１０４】
実施例は、癌細胞においてＤＮＡ損傷応答タンパク質ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４のうちの１以上の欠損、または白金系化学治療法に対する耐性が、ＵＳＰ４がサイレンス化された細胞の選択的殺滅をもたらすことを実証した。そのため、癌細胞における機能的ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４タンパク質の不存在、または白金系化学療法に対する耐性は、ＵＳＰ４阻害剤処置の利益を得るであろう患者の選択またはスクリーニングに使用できる有用なバイオマーカーの典型である。ＵＳＰ４阻害剤処置に好適な癌患者のスクリーニングには、先に記載のＤＮＡ損傷応答タンパク質の欠損が存在しない患者の処置が避けられ、これにより、関連患者集団が標的とされるのを確実にするという利点がある。以前には有効であった白金系化学療法に対して耐性になった患者が、さらなる治療オプションを有することをさらに確実にする。
【０１０５】
特定の実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤に対する対象の応答性は、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４機能タンパク質から選択される１若しくは複数のバイオマーカーの癌細胞における不存在によって決定される。特定の実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤に対する対象の応答性は、癌細胞におけるＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４をコードする遺伝子配列の１若しくは複数のアミノ酸または核酸の突然変異の存在によって決定される。ＵＳＰ４阻害剤に対する対象の応答性は、癌細胞におけるＡＴＲ、ＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４のｍＲＮＡのレベルを計測することによって決定されてもよく、ここで、異常な低レベルは、対象がＵＳＰ４阻害剤に感受性であることを示す。
【０１０６】
さらなる態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置での前記癌の感受性を決定するためのバイオマーカーとしての突然変異ＢＲＣＡ２遺伝子、突然変異ＢＲＣＡ２タンパク質、突然変異ＡＴＲ遺伝子、突然変異ＡＴＲタンパク質、突然変異ＬＩＧ４遺伝子、突然変異リガーゼＩＶタンパク質、突然変異ＸＲＣＣ４遺伝子または突然変異ＸＲＣＣ４タンパク質の、癌細胞のサンプル中での存在の使用を提供する。
【０１０７】
癌細胞のサンプルは、生検検体を含めた任意の標準的手法に従って採取され得る。
【０１０８】
ある実施形態において、バイオマーカーは、ＵＳＰ４阻害剤を単独で、またはさらなる抗腫瘍性治療剤と組み合わせて用いた処置に対する前記癌の感受性を決定する。
【０１０９】
一実施形態において、前記方法は、ＵＳＰ４阻害剤に対する癌細胞の応答性を確認することをさらに含み、ここで、前記欠損の存在が、癌細胞がＵＳＰ４阻害剤に感受性であることを示す。
【０１１０】
特定の実施形態において、癌細胞は、欠陥性のＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶ、ＡＴＲまたはそれらの組み合わせを有する。欠陥は、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子中、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４、またはＡＴＲ遺伝子の発現、あるいは、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質、例えば翻訳後修飾などに存在し得る。
【０１１１】
よって、欠陥性のＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲは、これらのタンパク質をコードする遺伝子の突然変異、不存在、または、欠陥性発現に起因し得る。欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子、あるいはその発現は、突然変異であっても、不存在であっても、または欠損していてもよい。欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲが、ＵＳＰ４阻害剤による処置に対する癌細胞の感受性のそれぞれ個別的な前兆となる有用なバイオマーカーであることがわかった。特に、突然変異ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子、欠損性または存在しないＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質が、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置から生じる増強された細胞殺滅とよく相関することがわかった。
【０１１２】
本発明の一態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤に対する癌に罹患している対象の感受性を決定する方法を提供し、該方法は、癌が欠陥性ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲを有する細胞を含むか否かを決定することを含み、ここで、前記欠陥の存在は、対象がＵＳＰ４阻害剤に対して応答性であることを示す。欠陥が存在する場合、対象はＵＳＰ４阻害剤で処置され得る。
【０１１３】
欠陥は、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質、あるいは、後者の発現におけるあらゆる欠陥、例えば先に考察されたものなどであり得る。癌細胞が、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質をコードするヌクレオチドに突然変異を有するか否かを決定することは、任意の好適な方法で実施できる。
【０１１４】
任意選択で、対象からの正常細胞のサンプルもまた試験されてもよい。正常細胞が、先に考察されたものなどの、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４まＡＴＲ遺伝子、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質、あるいは後者の発現にいずれかの欠陥を有するか否かを決定するために、正常細胞は、先に記載したように分析され得る。正常細胞と癌細胞は、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶまたはＡＴＲタンパク質、または後者の発現におけるいずれかの欠陥が癌細胞だけに存在するか否かを決定するために比較され得る。正常細胞は、恐らく、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子内の突然変異に関して異型接合であるか、あるいは、ＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子内に多型性を担持するが、前記ＤＤＲ経路を欠損していない。
【０１１５】
ＢＲＣＡ２遺伝子は、２６個のコーディングエクソンを含み、長さが約１０,２００塩基対である。野生型遺伝子は、３４１８個のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。ＢＲＣＡ２の様々な突然変異は癌に関連している。これらとしては、コピー数の異常、欠失または重複突然変異、タンパク質が成熟前に短縮されるナンセンスおよびフレームシフト突然変異、ミスセンス突然変異および非コーディング介在配列（ＩＶＳ）突然変異、全体または複数のエクソンの欠失および重複突然変異、大規模なゲノム再配列、インフレーム欠失／重複および配列突然変異、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換などが挙げられる。癌リスクの増加に関連していることが知られている多型性、欠失、および挿入の例は、ｃ．５９４６ｄｅｌＴ、ｃ．８３６３Ｇ＞Ａ，ｃ．８７５４＋ｌＧ＞Ａ，ｃ．３８６０ｄｅｌＡ、ｃ．７８０６−２Ａ＞Ｇ、ｃ．８３５７＿８５３８ｄｅｌＡＧ、ｃ．３１７０＿３１７４ｄｅｌ５、ｃ．５８５７Ｇ＞Ｔ、ｃ２８０８＿２８１１ｄｅｌ４、ｃ．６６２９＿６６３０ｄｅｌＡＡ、ｃ．９０２６＿９０３０ｄｅｌ５、ｃ．９３１０＿９３１１ｄｅｌＡＡ、ｃ．５１４６＿５１４９ｄｅｌ４、ｃ．ｌ５６＿１５７ｉｎｓＡｌｕ、ｃ．５１６＋ｌＧ＞Ａ、ｃ．６２７５＿６２７６ｄｅｌＴＴ、ｃ８９０４ｄｅｌＣ、ｃ．５３５１ｄｕｐＡ、ｃ．６２７５＿６２７６ｄｅｌＴＴ、ｃ．１８１３ｄｕｐＡ、ｃ．４４７８ｄｅｌ４、ｃ．９０９８ｄｕｐＡ、ｃ．７９１３＿７９１７ｄｅｌ５、ｃ．８３５７＿８５３８ｄｅｌ２、ｃ．９０９８ｄｕｐＡ、ｃ．５９４６ｄｅｌＴ、ｃ．８７５５ｄｅｌＧ、ｃ．６３７３ｄｅｌＡ、Ｃ．１３１０＿１０１３ｄｅｌ４、ｃ．６４８６＿６４８９ｄｅｌ４、ｃ．３８４７＿３８４８ｄｅｌＧＴ、ｃ．４５２８ｄｅｌＧ、ｃ．２８０８ｄｅｌ４、ｃ．３８４７ｄｅｌＧＴ、ｃ．７４８０Ｃ＞Ｔ、ｃ．８３２７Ｔ＞Ｇ、ｃ．９１１８−２Ａ＞Ｇ、ｃ．９１１７＋ｌＧ＞Ａ、ｃ７７１＿７７５ｄｅｌ５、ｃ．６２７５＿６７２６ｄｅｌＴＴおよびｃ．ｌ９２９ｄｅｌＧである（ＢＲＣＡ２は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ４３７４６参照配列に従って付番）。これらのバリエーションのすべてが検出できる。
【０１１６】
すべての突然変異が、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙの推奨−http://www.hgvs.org/rec.htmlに従って命名される。
【０１１７】
ＡＴＲの突然変異は、遺伝子の非コードまたはコード部分を含めた、ＡＴＲのヌクレオチド配列のあらゆる部分に存在し得る。突然変異は、翻訳されるべきＡＴＲの不存在の原因となり得るか、または切断型もしくは短縮版のＡＴＲを許容し得る。あるいは、ＡＴＲの突然変異は、１若しくは複数のヌクレオチド、挿入、欠失または置換の突然変異であってもよい。置換されたアミノ酸残基ｃ．６４３１Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｇｌｎ２１４４Ａｒｇ）をもたらすミスセンス突然変異は、中咽頭癌病巣に関連し得る（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿００１１８４．３）。癌に関連している他の置換されたアミノ酸残基は、ｐ．Ｇｌｕ２５３７Ｇｌｎ、ｐ．Ｇｌｕ２４３８Ｌｙｓ、ｐ．Ａｌａｌ４８８Ｐｒｏおよびｐ．Ａｌａ２００２Ｇｌｙである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｕ７６３０８．１に従って付番）。
【０１１８】
ＸＲＣＣ４の多型性は、例えば膀胱癌、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌腫、リンパ腫、および複数の骨髄腫などの癌に罹患するリスクにつながった。そうしたものの例としては、ＸＲＣＣ４遺伝子の多型性ｒｓ２０７５６８６（Ｃ＞Ｔ）およびｒｓ６８６９３６６（Ｇ−１３９４Ｔ）は、乳癌の高いリスクに関連している。また、ミスセンス突然変異体ｒｓ３７３４０９１（ｃ．７３９Ｇ＞Ｔ、ｐ．Ａｌａ２４７Ｓｅｒ）も乳癌に関連している。イントロン３の欠失ｒｓ２８３６００７１は、口腔癌に関連している。６，０００を越えるＸＲＣＣ４の突然変異または多型性が報告され、それらのうちのいくつかが癌に罹患するリスクにつながる。
【０１１９】
ヒトＸＲＣＣ４遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＨ００８０５５．１として入手可能であり、そしてそれは、選択的スプライシング産物を示す。ＸＲＣＣ４タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＤ４７２９８．１として入手可能である。
【０１２０】
リガーゼＩＶ欠陥は、ＤＮＡリガーゼＩＶ ｃＤＮＡの８３３位におけるＧからＡへの突然変異変化を含む可能性があり、そしてそれは、白血病に関連することが示されている、２７８位のアミノ酸におけるアルギニンからヒスチジンへの置換をもたらす（Ｒ２７８Ｈ）。癌に関連していることが示された他の代表的な突然変異としては、ｒｓｌ０１３１、ｒｓｌ８０５３８８、ｒｓｌ８０５３８６およびｒｓ４９８７１８２（Ｔ１９７７Ｃ）が挙げられる。
【０１２１】
ＬＩＧ４遺伝子の約３００の突然変異または多型性が、現在知られている。
【０１２２】
ＤＮＡリガーゼＩＶ参照配列は、ＮＧ＿００７３９６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４７９２６４．１（核酸およびタンパク質の両方）で見つけられる。
【０１２３】
これらの遺伝子の単一ヌクレオチド多形または他の突然変異は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／（ＮＣＢＩ ｄｓＳＮＰ Ｓｈｏｒｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓデータベース）および／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｈｕｍｓａｖａｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｕｍａｎ多型性および疾患突然変異データベース）にて見つけることもできる。
【０１２４】
細胞が欠陥性ＤＤＲ経路構成要素を有するか否かの決定が、任意の技術的手段によって実施され得る。前記手段は、例えば、ＢＲＣＡ２、ＬＩＧ４、ＡＴＲまたはＸＲＣＣ４遺伝子のヌクレオチド突然変異、ヌクレオチド付加またはヌクレオチド欠失に関してＤＮＡを調べることによって、遺伝的変化についての分析に基づくものであり得る。さらに、ＤＮＡは、反転、翻訳、転座、ヘテロ接合の消失（ＬＯＨ）、欠失、および／または増幅を含めた、これらの遺伝子に影響するより大きい規模の変化について調査され得る。あるいは、細胞は、遺伝子の発現を変更する可能性がある、ＤＮＡメチル化またはクロマチン再構築などの後成的変化に関して調査され得る。癌細胞に不完全なＢＲＣＡ２、ＡＴＲ、リガーゼＩＶまたはＸＲＣＣ４があるか否かを決定するさらなる手段としては、それらのそれぞれの遺伝子からのＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に基づく決定が挙げられる。さらなる代替の手段は、野生型配列と比較したポリペプチド配列における突然変異か、または翻訳後修飾、すなわち、グリコシル化、リン酸化またはメチル化の存在または不存在などのタンパク質の修飾に基づく手段である。斯かる変化は、突然変異または翻訳後修飾に特異的な抗体の使用を含めた標準的な技術によって検出され得る。あるいは、欠陥タンパク質は、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶ、ＡＴＲまたはＢＲＣＡ２タンパク質発現に基づいて検出でき、そしてそれは、ウェスタンブロット法などの標準的な技術によって確立できる。本明細書中に概説した技術のいずれかを使用して不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを含む循環ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは細胞に関して、対象からの血液サンプルを観察することが可能である。異常な遺伝子産物を可視化するために、免疫組織化学が使用されてもよい。さらに、癌細胞は、任意の好適なアッセイを使用して、機能的なＤＮＡ修復活性について試験できる。例えば、相同的組み換え欠損スコア（ＨＲＤ）が決定できる（例えば、Myriad Genetics, Abkevich et a I, British Journal of Cancer (2012) 107, 1776-1782), Collins, A. R. (March 2004)などに記載の方法）。代替の機能的なＤＮＡ修復アッセイとしては、単細胞ゲル電気泳動アッセイ（ＳＣＧＥ、Ｃｏｍｅｔアッセイとしても知られている）（Collins, A. R. (March 2004). Mol Biotechnol. 26 (3): 249-61）およびＲａｄ５１焦点アッセイ（Mukhopadhyay et al, Clin Cancer Res April 15, 2010 16; 2344）が挙げられる。斯かるアッセイは、ＤＮＡ修復活性をアッセイするために臨床サンプルで使用され得る。
【０１２５】
例えば、ヌクレオチド突然変異は、任意のＤＮＡ配列決定、すなわち、リアルタイムＰＣＲに基づくアッセイ、プライマ伸長アッセイ、Ｓａｎｇｅｒ配列決定アッセイ、または定量的並列パイロシークエンシング法、によって検出され得る。
【０１２６】
本発明の態様によれば、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置のために癌に罹患している対象を選択する方法を提供し、該方法は、癌が不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを有する細胞を含むか否かを決定すること、あるいは、処置のための不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを示す前記対象を選択することを含む、方法を提供する。前記方法は、癌細胞が先に規定した不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを有するか否かの決定を伴ってもよい。選択に続いて、患者はＵＳＰ４阻害剤を用いて処置され得る。前記方法は、任意選択で、正常（非発癌）細胞が先に規定した不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを有するか否か決定することをさらに伴っても、あるいは、正常細胞がＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子の突然変異のための異型接合である場合、またはＢＲＣＡ２、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４またはＡＴＲ遺伝子の多型性を担持する。
【０１２７】
前記方法は、各対象に関する処置を最適化するために、ＵＳＰ４阻害剤の適切な用量の選択を支援するために使用されてもよい。前記方法は、ＵＳＰ４阻害剤を用いた処置の有効性を決定するために使用されてもよい。例えば、前記方法は、不完全なＢＲＣＡ２、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはＡＴＲを含む癌細胞のサンプル中の細胞の量または割合を定量化するために使用されてもよい。この量／割合の減少または増加が、ＵＳＰ４を用いた処置が有効であることを示し得る。
【０１２８】
別の実施形態において、ＵＳＰ４阻害剤に対する対象の応答性は、白金系化学療法に対して耐性を有する癌細胞の存在によって決定される。耐性は、白金系化学療法を用いた事前の処置に続く、腫瘍増殖の持続または再発、および／または転移の存在によって検出される。あるいは、対象の応答性は、白金系化学療法製剤に晒されたとき、腫瘍細胞の生存率を測定するインビトロアッセイによって決定される。斯かる方法は、当該技術分野の当業者に知られており、患者が白金系処置に対する耐性を有する癌を有するか否かの決定は、臨床医によって実施される所定の評価である。６カ月未満の白金系化学療法に応答する癌細胞を有する患者は、白金系処置に対して耐性を有する癌に罹患していると規定され得る。
【０１２９】
本発明のさらなる態様によれば、任意の医薬的に許容し得る担体、担体またはビヒクルと組み合わせた、癌の処置に使用するためのＵＳＰ４阻害剤を含む医薬組成物を提供し、ここで、該癌が１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路を欠損する細胞を含む。
【０１３０】
医薬組成物は、活性物質および１若しくは複数の医薬的に許容される賦形剤を含む組成物であってもよい。
【０１３１】
好適な医薬的に許容される賦形剤は、当業者に知られていて、そして、一般的に、動物に本発明のＵＳＰ４阻害剤を投与するために好適な、許容される組成物、材料、担体、希釈剤またはビヒクルを含む。
【０１３２】
動物は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
【０１３３】
医薬組成物は、癌細胞を標的化するのに好適な任意の有効な様式、例えば、経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内または局所的方法で投与され得る。医薬組成物は、例えば、外科的処置中に、腫瘍の部位に直接的に投与されても、または、点滴法によって投与されてもよい。
【０１３４】
投薬量は、患者の要件、処置される病状の重症度、および利用される有効成分の特徴によって変更されてもよい。有効量の決定は、不当な負担なしに、当業者の権限の範囲内である。ヒトを含めた哺乳動物への投与のための好適な剤形は、一般的に、最大１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、または、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１３５】
本発明のさらなる態様によれば、白金系化学療法に対して耐性に有する、および／または１若しくは複数のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路が不完全な細胞を含む癌に罹患している対象を処置する方法を提供し、該方法は、治療上有効な量のＵＳＰ４阻害剤を対象に投与することを含む。
ＵＳＰ４阻害剤は、小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、（これだけに限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含めた）ＲＮＡ系薬剤分子、および抗体から選択されてもよい。
【０１３６】
ＵＳＰ４阻害剤は、小分子化合物であってもよい。
【０１３７】
ＵＳＰ４阻害剤は、単独で投与されてもよい。
【０１３８】
ＵＳＰ４阻害剤は、追加の抗腫瘍性治療剤、例えば、化学療法薬、放射線、または他のＤＮＡ損傷応答タンパク質の阻害剤、の投与の前に、それらと組み合わせて、あるいは、その後に投与されてもよい。
【０１３９】
かかる抗腫瘍性治療剤は、当該出願のより初めの方に広範囲にわたって記載された。
【０１４０】
本発明の一態様に記載の実施形態もまた、本発明の他の態様で組み合わせられ得る。
【０１４１】
本発明は、以下の制限されることのない例でより詳細に記載される。
【実施例】
【０１４２】
材料と方法
細胞株と細胞培養
ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Gibco）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２９２μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Gibco）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma-Aldrich）中、加湿雰囲気および５％（ｖ／ｖ）のＣＯ2において３７℃にて培養した。ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＵＳＰ４ ＷＴ、ＣＤまたはＲＦＰ−５３ＢＰ１を安定して過剰発現するＵ２ＯＳ細胞（Galanty et al., Nature 462, 935-939, 2009）を、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Gibco）の存在下で培養した。重複配列（ＤＲ）−ＧＦＰを安定して発現するＵ２ＯＳ細胞を、１ｇ／ｍｌのピューロマイシン（Sigma-Aldrich）の存在下で培養し、そして、先に記載のように樹立した（Pierce et al., 1999）。ＤＤＲが不完全なＨｅＬａ同質遺伝子型Ｓｉｌｅｎｃｉｘ細胞株（ｓｈＡＴＲ、ｓｈＢＲＣＡ２、ｓｈＬｉｇａｓｅ ＩＶ、ｓｈＸＲＣＣ４、およびｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）（tebu-bio）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Gibco）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Invitrogen）を補ったＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０１４３】
実施例１：ＵＳＰ４の生化学的アッセイ
反応を、２０μｌの最終反応容量で、黒色３８４ウェルプレート（小容積、Greiner784076）内の５つで、二重反復試験で実施した。ＵＳＰ４を、反応バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で０、０．０１、０．００５、０．００２５μｌ／ウェルに相当するように希釈した。反応を、蛍光偏光基質としてのイソペプチド結合を介してユビキチンに連結したＴＡＭＲＡ標識ペプチド１００ｎＭの添加によって開始した。反応物を、室温にてインキュベートし、そして、２分毎に１２０分間読み出した。読み出しを、PHERAstar Plus（BMG Labtech）で実施した。λ励起５４０ｎｍ；λ放出５９０ｎｍ。結果を、図１５に示す。
【０１４４】
実施例２：コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）による合成致死性の計測
１．５μｌの２０μＭ 対照またはＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡを、３．５μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Life Technologies）を含む０．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ無血清培地で希釈し、次に、６ウェルプレートのウェル内で室温にて１０〜２０分間インキュベートした。２．５ｍｌの培地中の２×１０5細胞をトランスフェクション混合物に加え、次に、５％のＣＯ2、３７℃にて一晩インキュベートした。次に、対照および合致したＤＤＲ不完全細胞を、トリプシン処理し、カウントし、そして、１ｍｌあたり２０００細胞に希釈し、そして、１．５ｍｌの培地が入った６ウェル組織培養プレートのウェルに０．５ｍｌを加えた。コロニーが１コロニーあたり≧５０細胞を形成するまで、プレートを１〜２週間、インキュベータに戻した。次に、培地を、ウェルから取り除き、１ｍｌのＧｉｅｍｓａ染色液で室温にて１０〜２０分間、置換した。染色液を取り除き、そして、プレートを水道水で４回洗浄した。プレートを一晩乾燥させ、スキャンし、そして、コロニーをＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してカウントした。データを、対照ウェル内のコロニーの分数として表した。結果を、図１に示す。
【０１４５】
実施例３：コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）による化学増感および放射線増感の計測
実施例３ａ：
三日目に、（その２４時間前に６ウェルプレート、Nuncに１ウェルあたり２５０、５００または１，０００細胞で播種した）細胞を、適切なウェルに２０μｌの×１００薬液を加えることによって、様々な化学療法薬の段階希釈物、または様々な急性用量の電離放射線［ＩＲ；（Faxitron X-Ray Corporation, Illinois, USA）］で処理したことを除いて、実施例２のとおりであった。次に、プレートをインキュベータに戻し、１〜２週間静置し、そして、ＰＢＳで１回洗浄し、固定し、そして、クリスタルバイオレット溶液［１０％（ｖ／ｖ）エタノール中の２％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレット（Sigma-Aldrich）］で染色した。結果を、図６ａ、７ａ、および７ｂに示す。
【０１４６】
実施例３ｂ：コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）による化学増感の計測
三日目に、細胞を、適切なウェルに２０μｌの×１００薬液を加えることによって、様々な化学療法薬の段階希釈物で処理したことを除いて、実施例２のとおりであった。次に、プレートをインキュベータに戻し、１〜２週間静置し、そして前述のとおりＧｉｅｍｓａ染色した。結果を、図３、４、５、６ｂおよび８に示す。
【０１４７】
実施例４：CellTiter Gloを使用した白金耐性腫瘍細胞の選択的殺滅の計測
６μｌの１μＭ 対照またはＵＳＰ４特異的ｓｉＲＮＡを、０．４８μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを含有する８０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ無血清培地で希釈した。次に、トランスフェクション混合物を室温にて９０分間、インキュベートした。２０μｌのそれぞれのトランスフェクション複合体を、９６ウェルプレートの４つのウェル内にスポットした。次に、細胞を、トリプシン処理し、カウントし、そして、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ＋２ｍＭのピルビン酸ナトリウムで３４８００細胞／ｍｌ（Ａ２７８０）、５２２００細胞／ｍｌ（Ａ２７８０ＣＩＳ）に希釈した。１１５μｌのそれぞれの細胞懸濁液を、それぞれのトランスフェクション複合体の１ウェルに加えた。細胞を、通常の増殖条件（３７℃および５％のＣＯ2）下でさらに４日間インキュベートした。次に、５０μｌの再構成CellTiter Glo試薬（Promega）を各ウェルに加えた。プレートを、４分間プレート振盪機上に置き、そして、発光を、Clariostarプレートリーダーを使用してもう１０分間読み出した。結果を、図２に示す。
【０１４８】
実施例５：発現ベクター
ｐＥＧＦＰ−ＧＷ−ＪＪ−ＵＳＰ４（受入番号：ＮＭ＿００３３６３）発現強化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＵＳＰ４野生型（ＷＴ）が、Michael J. Clague and Sylvie Urbe（Institute of Translational Medicine, University of Liverpool）によって提供された。触媒的不活性（ＣＤ）ＧＦＰ−ＵＳＰ４突然変異（Ｃ３１１Ａ）を、QuikChange Lightning部位特異的突然変異誘発キット（Agilent Technologies）を使用してｐＥＧＦＰ−ＧＷ−ＪＪ−ＵＳＰ４プラスミドから作り出した。これらのベクターを使用した結果を、図７および９〜１１に示す。
【０１４９】
実施例６：ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｕ２ＯＳ細胞（４．８×１０5細胞／６ｃｍディッシュ）を、製造業者のプロトコールに従って、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Qiagen）トランスフェクション試薬を使用して３０ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、続いて、第二の同一のトランスフェクションを２４時間後に実施した。４種類のｓｉＲＮＡのＵＳＰ４プールをQiagenから入手し、そして、その他のすべてのｓｉＲＮＡをEurofins MWG Operonから入手した。サンプル処理および分析を、トランスフェクション開始から７２時間後に実施した。当該出願に使用したｓｉＲＮＡ配列を表１に記載する。ｓｉＲＮＡノックダウンを、いくつかの実験においてデータを得るために実施し、そしてそれを、図１〜９および１１〜１３のためのデータを得るために使用した。
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
実施例７：細胞抽出物の調製と免疫ブロッティング
細胞を、氷上で３０分間、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する、３００μｌ／６ｃｍディッシュのＣＳＫ−バッファー［３００ｍＭのスクロース、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ；ｐＨ６．８）、１ｍＭのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich）、および１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；Sigma-Aldrich］を用いて溶解した。可溶性画分とクロマチン画分を、遠心分離（４℃にて、２００,０００×ｇ１０分間）で分離した。クロマチン画分を、氷上で１５秒間超音波処置し（３０％の振幅；Sonics Vibra Cell、VHX500Watt）、そして、タンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質分析（Thermo Scientific）で測定した。１０マイクログラムの可溶性画分またはそれに対応する量のクロマチン画分を、添加バッファー［６７ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（MP Biomedicals）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール（Sigma）およびｍｉｌｌｉＱ水中に０．００２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー］中、９５℃にて５分間煮沸し、４〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓアクリルアミドゲル（Invitrogen）に乗せ、そして、NuPAGE（登録商標）MOPS SDS Running Buffer（Invitrogen）を用いて１２０Ｖで２時間分離した。タンパク質を、ニトロセルロース膜（Millipore）に移し、その後、膜を０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ；Sigma-Aldrich）および１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma Aldrich）を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水でブロックし、そして、補足の表２中にまとめた適切な一次および二次抗体と共にインキュベートした。製造業者のプロトコール（Amersham）に従って、所定の化学発光タンパク質検出を、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステムを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体処置によって実施した。定量的なウェスタンブロット分析を、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ結合二次抗体処置によって実施した。膜を、Odyssey Li-Corイメージングシステムを用いてスキャンし、そして、タンパク質定量を、Odyssey v1.2ソフトウェア（LI-COR Biosciences UK Ltd）を使用して達成した。これらの実験からのデータを、図９ａ、９ｃ、および９ｅに示す。
【０１５２】
実施例８：中性単独細胞電気泳動
細胞を、フレオマイシン（４０μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich）で２時間処理した。それに続いて、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして、通常の細胞培養条件下で２時間静置して、回復させた。次に、細胞を、ＰＢＳ（−／−）（Gibco）で１回洗浄し、そして、かき取り、その後、ペレットを、約５×１０6細胞／ｍｌの濃度にてＰＢＳ（−／−）中に再懸濁した。次に、１０μｌの細胞懸濁液を、９０μｌのLMAgarose（３７℃；Trevigen）と混合し、その後、７０μｌをGelBond Film（Lonza）上にスポットし、２２ｍｍのカバーガラス（ＶＷＲ）で覆い、そして、４℃にて１０分間インキュベートした。カバーガラスを取り外しのときに、サンプルを、溶解溶液（Trevigen）中で４℃にて１時間インキュベートした。溶解溶液を、ＴＢＥ［９０ｍＭのＴｒｉｓ−ボラート、ｐＨ８．３および２ｍＭの２，２’,２”,２”−（エタン−１,２−ジイルジニトリロ）テトラ−酢酸（ＥＤＴＡ）］で洗い落とし、そして、ＴＢＥ中、３５Ｖの電流で７分間、電気泳動にかけた。７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中で５分間の固定化後に、サンプルを、一晩乾燥させ、そして、ＳＹＢＲグリーン核酸染色溶液（Invitrogen）で染色した。載物台の前にLumen2000を接続したＯｌｙｍｐｕｓ１×７１顕微鏡、FViewソフト画像カメラ、およびCell^AF分析造影ソフトウェアを用いて、写真を撮影した。条件に従って、５０個の個別細胞のテールモーメントを、CometScoreソフトウェア（Tritek Corp.）で定量化した。結果を、図９ｂ、９ｄ、および９ｆに示す。
【０１５３】
実施例９：生細胞のレーザーラインマイクロ波照射
播種の２４時間後に、ＲＦＰ−５３ＢＰ１を安定して発現するＵ２ＯＳ細胞［１２×１０4細胞／３５ｍｍガラス底ディッシュ（Ted Pella, Inc）］を、製造業者のプロトコールに従って、TranslT-LTlトランスフェクション試薬（Mirus Biologicals）と共に１μｇのｐＥＧＦＰ−ＧＷ−ＪＪ−ＵＳＰ４ ＷＴまたはＣＤを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０μＭの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて２４時間、事前増感し、それに続いて、４０５ｎｍのＵＶ−Ａレーザービームを用いて４００μＷの限局性レーザーマイクロ波照射に晒した（Limoli and Ward, 1993）。細胞の写真を、図１０として示す。
【０１５４】
実施例１０：蛍光抗体法
対照（ＬｕｃもしくはＢＲＣＡ１）またはＵＳＰ４（４ＵＴＲ）減損細胞を、５ｇｙのＩＲに晒し、そして、８時間静置して回復させた。ポリ−Ｌ−リジン［０．０１％（ｗ／ｖ）；Sigma-Aldrich］被覆カバーガラス上で培養したＵ２ＯＳ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、２％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Sigma-Aldrich）を用いて室温にて２０分間固定した。次に、細胞を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ；Sigma-Aldrich）で２回洗浄し、そして、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ中）を用いて室温にて５分間透過処理した。ブロックバッファー［ＰＢＳ中に５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ］中で室温にて３０分間のインキュベーションに続いて、細胞を、抗ＲＡＤ５１および抗γＨ２ＡＸ一次抗体と共に室温にて２時間インキュベートし、そして、表２にまとめたそれらのそれぞれの二次抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。最後に、細胞を、１μのｇ／ｍｌの４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で室温にて１０分間染色し、VECTASHIELD封入剤（Vector Laboratories）を使用して顕微鏡用スライド（ＶＷＲ）上に封入し、そして、画像収集のためのソフトウェアを用いて共焦点顕微鏡（IX81 OLYMPUS）で分析した。結果を、図１２ａに示す。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
実施例１１：定量的ＤＮＡ末端切断アッセイ
最初のｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後、Ｕ２ＯＳ細胞を３０μＭのＢｒｄＵに２４時間晒し、次に、１μＭのカンプトテシンで１時間処理した。指摘した場合には、細胞をＰＢＳで２回洗浄することによって、カンプトテシンを取り除いた。次に、細胞を１時間静置して回復させた。処理後に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、掻き取り、そして、５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞懸濁液を、氷冷した７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで固定し、そして、２０℃にて一晩保存した。固定した細胞を、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ブロックバッファー（ＰＢＳ中の５％のＦＢＳ；３０分間、室温）中でインキュベートし、そして、ブロックバッファー中で、補足の表２にまとめた抗ＢｒｄＵと抗γＨ２ＡＸ一次抗体と、異なった組み合わせの二次抗体と共にインキュベートした。抗体処理後に、ＢｒｄＵおよびγΗ２ΑΧ強度を、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ存在下でBD LSRFortessa細胞分析装置（BD Biosciences）で計測した。Ｓ期ゲート細胞のＢｒｄＵ強度を、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc）を用いて定量化し、そして、処理サンプルから未処理サンプルを減じて、ＢｒｄＵ染色バックグラウンドに関して正規化した。γΗ２ΑΧ強度を、ＤＮＡ損傷の対照として使用した。結果を、図１１ａ、１１ｂ、および１１ｄに示す。
【０１５７】
実施例１２：フローサイトメトリーＤＮＡ複製分析
最初のｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、Ｕ２ＯＳ細胞を、１０μＭの５−エチニル−２”−デオキシウリジン（ＥｄＵ）に１５分間晒し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、２％のＰＦＡ（ｗ／ｖ）を用いて室温にて２０分間固定した。それに続いて、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を用いて透過処理し（室温にて５分間）、１回（ＰＢＳ）洗浄し、１００μｌ／サンプルの「クリック−イット」溶液［ＰＢＳ中、２０μｇ／ｍｌのClick-iT（登録商標）ＥｄＵバッファー、２０ｍＭのＣｕＳＯ4および１：５００希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７アジド（Molecular probes）］中で室温３０分間インキュベートし、遮光した。ＥｄＵシグナル強度を、BD LSRFortessa細胞分析装置で計測し、FlowJoソフトウェアで定量化した。結果を、図１１ｃに示す。
【０１５８】
実施例１３：ＤＲ−ＧＦＰ ＨＲレポーターアッセイ
ＤＲ−ＧＦＰレポーターを安定して発現するＵ２ＯＳ細胞を使用する相同的組み換え（ＨＲ）修復アッセイを、以前に確立した方法論に基づいて実施した（Pierce et al., 1999, Genes Dev., 13(20): 2633-8）。簡単に言えば、ｓｉＲＮＡ媒介性減少の７２時間後に、ＤＲ−ＧＦＰ細胞を、製造業者のプロトコールに従って、TranslT-LT1トランスフェクション試薬を使用して、以下で記載した異なったプラスミド組み合わせ４μｇを用いてトランスフェクトした。ＤＳＢを誘発するために、制限酵素ｌ−Ｓｃｅｌをコードする発現プラスミド（３．７５μｇ；サンプルｐＣＢＡ ｌ−Ｓｃｅｌあたり）を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ；０．２５μｇ；ｐＣＳ２−ｍＲＦＰ）の発現プラスミドと一緒にトランスフェクトして、トランスフェクション効率を観察した。陰性対照として、空のプラスミド［ｐＣＤＮＡ３．１（＋）］とｐＣＳ２−ｍＲＦＰの組み合わせをトランスフェクトした（それぞれ３．７５μｇと０．２５μｇ）。プラスミドトランスフェクションの４８時間後に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％のＥＤＴＡを使用して取り外し、そして、５％（ｗ／ｖ）のＦＢＳを用いてＰＢＳ中に採集した。死細胞を除くことができるように、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを加え、そして、ＨＲ効率を、BD LSRFortessa細胞分析装置を用いて、バックグラウンド−ＧＦＰ対照集団に対して正規化したＧＦＰおよびＲＦＰ二重陽性細胞の量として計測した。結果を、図１２ｂに示す。
【０１５９】
実施例１４：ランダムプラスミド組み込み
ジェネティシン選択マーカーを含んでいるｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミド（Clontech）を、製造業者のプロトコール（New England Biolabs）に従って、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌ制限消化によって線状にした。最初のｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、５μｇ／６ｃｍディッシュの線状プラスミドを、製造業者のプロトコールに従って、TranslT-LT1トランスフェクション試薬を用いてＵ２ＯＳ細胞内にトランスフェクトした。６時間後に、細胞を、４つの異なった濃度（１．０×１０3、２．５×１０3、１．０×１０4、および２．０×１０4細胞／ディッシュ）にて１５ｃｍディッシュに播種した。再播種の２４時間後に、１．０×１０4および２．０×１０4細胞を含むプレートを、１ｍｇ／ｍｌのジェネティシンの存在下で、および１．０×１０3および２．５×１０3細胞を含むプレートを、１ｍｇ／ｍｌのジェネティシンの不存在下で１０〜１４日間培養し、そして、２％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレット溶液で染色した。プラスミド組み込み効率を、プラスミドトランスフェクションの２４時間後にFACS Calibur（BD Biosciences）を備えたフローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして計算したトランスフェクション効率に対して正規化したジェネティシン耐性細胞のパーセンテージとして分析した。結果を、図１３に示す。ＬｕｃおよびＬｉｇｌＶはそれぞれ陰性および陽性対照細胞であり、そして、ＵＳＰ４（４−４または４ＵＴＲ）はＵＳＰ４減損細胞である。
【０１６０】
実施例１５：ＵＳＰ４の発現と精製
ＵＳＰ４構築物を、ＰＣＲ増幅し、Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有するｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−６ａベクター（Sigma-Aldrich）内にクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の取扱説明書に従って、TranslT-LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を使用して、ＦＬＡＧ−ＵＳＰ４を用いてトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４０時間後に採集した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ４０、１０％のグリセロール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤（complete mini、Roche）およびホスファターゼ阻害剤（PhosSTOP mini、Roche））中に掻き取った。溶解物を、氷上で３０分間インキュベートし、４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。可溶性上清を、低塩バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で平衡化したＦＬＡＧ親和性樹脂（EZview Rad ANTI-FLAG M2アフィニティーゲル、Sigma-Aldrich）に加え、そして、回転させながら４℃にて３時間インキュベートした。樹脂を２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、そして、上清を取り除いた。樹脂を、低塩バッファーで２回、および高塩バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤（complete mini、Roche）およびホスファターゼ阻害剤（PhosSTOP mini、Roche））で１回洗浄した。結合したＵＳＰ４を溶出するために、溶出バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ４０、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．１５ｍｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド（Sigma-Aldrich））を樹脂に加え、そして、回転させながら４℃にて２．５時間インキュベートした。樹脂を、４０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、精製ＦＬＡＧ−ＵＳＰ４を含んでいる上清を取り出し、そして、−８０℃にて保存した。結果を、図１４に示すが、それは、精製ＦＬＡＧ−ＵＳＰ４のゲル写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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