(57)【要約】ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質懸濁液を調製する方法は、ブロックコポリマーのある量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程と、結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と、機能性タンパク質の溶液のアリコートをＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程と、生成するポリマーソームが機能性タンパク質で逐次飽和される少なくとも３回の希釈ステップを行う工程とを含むことができる。添加した、機能性タンパク質の溶液のアリコートは、ＰＥＧ／ポリマー試料に対する比が容積でおよそ０．５：１〜１．５：１であり得、熱ブレンドは９０〜１００℃で行うことができる。
2018521128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；  
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、順次的な様式で、第１、第２、および第３の希釈ステップを行う工程を含み、
前記第１のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第１の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ１：１であるように、前記第１の量を添加することを含み；
前記第２のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第２の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ２：１であるように、前記第２の量を添加することを含み；
前記第３のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第３の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第３の量を添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、第４の希釈ステップを行う工程をさらに含み、前記第４のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第４の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第４の量を添加することを含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも３回の希釈ステップの後、タンパク質分解を使用して、前記ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の前記懸濁液中のポリマーソームから表面会合タンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質分解を使用することが：
ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で室温で少なくとも１８時間処理すること；および
混合した前記ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を４℃で少なくとも１２時間透析する  こと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記機能性タンパク質の前記溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビン１５０ｍｇ／ｍＬ溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リン酸緩衝食塩水中の１５０ｍｇ／ｍＬメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液を１ｗｔ％亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の十分量と合わせて、前記ｍｅｔＭｂをオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）に還元することにより、前記機能性タンパク質の前記溶液を調製する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ジブロックコポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記両親媒性ジブロックコポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブロックコポリマーの前記ある分量を前記低分子量ＰＥＧの前記ある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）５〜１５ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）５〜１５ｍｇと少なくとも１時間熱ブレンドする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記両親媒性ジブロックコポリマーを前記低分子量ＰＥＧと少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドする工程を含み；
前記機能性タンパク質の前記溶液の前記アリコートを添加する工程が、オキシミオグロビン溶液１０μＬを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物の前記試料に添加する工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記熱ブレンドが、およそ９５℃で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を含む組成物であって、前記懸濁液が、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
によって調製される、組成物。
【請求項１４】
被験体を処置する方法であって、前記方法が：
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する工程を含み、前記懸濁液を調製する工程が：
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが、
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と；
前記被験体にポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を投与する工程であって、前記懸濁液が：によって調製される、工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と熱ブレンドする工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行う工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年７月２日に出願された米国仮特許出願第62/187,942号および２０１６年６月３０日に出願された米国通常特許出願第15/198,836号に対する優先権の利益を主張し、これらの両方の出願はその全体が本明細書により参照として援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する陳述
本発明に関する研究は、the  National  Institute  of  Healthからの基金(研究ID#  1R43CA159527-01A1および研究ID#  1R43AI096605-01)によって支援された。したがって、米国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
天然および合成タンパク質は、ヒトの治療用途に利用できる、独特な生物学的機能の比類ないアレイを与えてくれる。しかし、その臨床的有用性は、生化学的不安定性、貧弱な薬理学的特性、および有害な免疫原性を誘発する可能性によって、制限されることが多い。結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖を有する長循環媒体（すなわち、ペグ化された媒体）、例えばナノ粒子中に、生体分子、例えば、タンパク質を組み込むことによって、そのような問題が軽減され得る。しかし、多量の機能性タンパク質をペグ化された媒体に安定してカプセル化することは難題であることが判明している。従来のカプセル化技法は、これは元来小分子薬物の送達のために開発されたが、粒子を形成するために高エネルギーの入力および／または有機溶媒の使用を必要とし、それゆえ、生物学的に複雑でより不安定な巨大分子で使用するには不向きである。
【０００４】
特に、従来のカプセル化技法の例としては、薄膜再水和、直接水和、およびエレクトロフォーメーションが挙げられ得、これらを使用して、独特な生物学的機能を有する小分子およびタンパク質を、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）から生成したポリマーソームにカプセル化することができる。例えば、メチレンブルー（ｍＢｌｕｅ；Ｍｗ＝３１９．８５ｇ／ｍｏｌ）をモデル小分子として使用することができ、ミオグロビン（Ｍｂ；Ｍｗ＝１７，６００Ｄａ）を独特の生物学的機能（すなわち、酸素貯蔵）を有するモデルタンパク質として使用することができる。薄膜再水和技法および直接水和技法を使用して、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤへのメチレンブルーおよびミオグロビンのカプセル化の効率について比較した。特には、完全に機能的なミオグロビンの最大カプセル化の定量化は、これらの確立された技法を使用し、いくつかの特徴に基づいた。例えば、ミオグロビンのヘム基における鉄の濃度および還元酸化反応（「酸化還元（redox）」）状態は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）およびＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法（分光光度法ともいう）を使用して、それぞれ測定した。ポリマーソームカプセル化ミオグロビン（ＰＥＭ）の形態および安定性は、極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）によっておよび動的光散乱（ＤＬＳ）によってそれぞれ確認した。種々の酸素の分圧での平衡酸素結合および放出は、Ｈｅｍｅｏｘアナライザーを使用して測定した。薄膜再水和技法および直接水和技法によって首尾よくメチレンブルーをカプセル化すことは可能であったが、ミオグロビンのカプセル化は一様に不十分であった。したがって、ＰＥＭを生成するための方法を改善すれば、ヒトの治療用途にとって有益である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
種々の実施形態は、ブロックコポリマーのある量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程と、結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と、機能性タンパク質の溶液のアリコートをＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程と、生成するポリマーソームが機能性タンパク質で逐次飽和される（progressively  saturated）少なくとも３回の希釈ステップを行う工程とによって、ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質懸濁液を調製する方法を含む。一部の実施形態では、添加したアリコートとＰＥＧ／ポリマー試料との比は容積でおよそ０．５：１〜１．５：１である。一部の実施形態では、熱ブレンドは９０〜１００℃で行われる。一部の実施形態では、各希釈ステップは、試料に機能性タンパク質の溶液の追加量を添加することと、ＰＥＧ／ポリマー配合物中の機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと、結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、少なくとも３回の希釈ステップを行う工程は、順次的な様式で第１、第２、および第３の希釈ステップを行う工程を含む。
一部の実施形態では、第１のステップにおいて溶液の追加量を添加することは、機能性タンパク質の溶液の第１の量とＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ１：１であるように、第１の量を添加することを含む。一部の実施形態では、第２のステップにおいて溶液の追加量を添加することは、機能性タンパク質の溶液の第２の量とＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ２：１であるように、第２の量を添加することを含む。一部の実施形態では、第３のステップにおいて溶液の追加量を添加することは、機能性タンパク質の溶液の第３の量とＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、第３の量を添加することを含む。実施形態の方法はまた、第４の希釈ステップを行う工程も含むことができ、この場合、第４のステップにおいて溶液の追加量を添加することは、機能性タンパク質の溶液の第４の量とＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、第４の量を添加することを含む。実施形態の方法はまた、少なくとも３回の希釈ステップ後タンパク質分解を使用して、ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液中のポリマーソームから表面会合タンパク質を除去する工程もさらに含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質分解を使用することは、混合したＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で室温で少なくとも１８時間処理することと、ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を４℃で少なくとも１２時間透析することを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、機能性タンパク質の溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）１５０ｍｇ／ｍＬ溶液とすることができる。実施形態の方法はまた、リン酸緩衝食塩水中の１５０ｍｇ／ｍＬメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液を１ｗｔ％亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の十分量と合わせて、ｍｅｔＭｂをｏｘｙＭｂに還元することにより、機能性タンパク質の溶液を調製する工程も含むことができる。一部の実施形態では、ブロックコポリマーは両親媒性ジブロックコポリマーとすることができる。一部の実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーはポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）とすることができる。一部の実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーのある量を低分子量ＰＥＧのある量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程は、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）５〜１５ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）５〜１５ｍｇと少なくとも１時間熱ブレンドする工程を含む。一部の実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーのある量を低分子量ＰＥＧのある量と少なくとも５０分間熱ブレンドする工程は、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドする工程を含む。一部の実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーのある量を低分子量ＰＥＧのある量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程は、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドする工程を含むことができる。一部の実施形態では、機能性タンパク質の溶液のアリコートを添加する工程は、ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料にｏｘｙＭｂ溶液１０μＬを添加する工程を含むことができる。一部の実施形態では、熱ブレンドはおよそ９５℃で行うことができる。
【０００８】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、例示的な実施形態を例証するものであり、種々の実施形態の記述とともに、本明細書における特色を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、既存の技法を使用した様々なタンパク質のカプセル化による結果の表である。
【００１０】
【図２】図２は、２種のポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（すなわち、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）ジブロックコポリマーならびに小分子およびタンパク質カプセル化に使用したそれらのポリマーソーム配合物に関する特性の表である。
【００１１】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物のポリマーソームにおけるミオグロビンのカプセル化を改善するために、直接水和プロトコールの種々のステップを最適化することによる結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物のポリマーソームにおけるミオグロビンのカプセル化を改善するために、直接水和プロトコールの種々のステップを最適化することによる結果を示すグラフである。
【００１２】
【図３Ｃ】図３Ｃおよび図３Ｄは、時間の関数として、ミオグロビン酸化率およびタンパク質分解による表面会合ミオグロビンの消失を示すグラフである。
【図３Ｄ】図３Ｃおよび図３Ｄは、時間の関数として、ミオグロビン酸化率およびタンパク質分解による表面会合ミオグロビンの消失を示すグラフである。
【００１３】
【図３Ｅ】図３Ｅは、ミオグロビンとリン酸緩衝食塩水溶液との種々の比を使用して、ミオグロビンのカプセル化効率と比較した最終重量百分率を示すグラフである。
【００１４】
【図４】図４は、種々の実施形態に従って、逐次飽和（progressive  saturation）プロトコールおよびＯＢ２９ポリマーソームを使用して、ある範囲のタンパク質をカプセル化したことによるカプセル化の結果を示す表である。
【００１５】
【図５Ａ】図５Ａは、種々の実施形態に従って調製されたポリマーソームの構成成分の略図である。
【００１６】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ポリマーソームカプセル化ミオグロビンを形成するための既存の薄膜再水和プロトコールの略図である。
【００１７】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ポリマーソームカプセル化ミオグロビンを形成するための既存の直接水和プロトコールの略図である。
【００１８】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、既存のプロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのメチレンブルーのカプセル化による結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、既存のプロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのメチレンブルーのカプセル化による結果を示すグラフである。
【００１９】
【図６Ｃ】図６Ｃおよび図６Ｄは、既存のプロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのミオグロビンのカプセル化による結果を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｃおよび図６Ｄは、既存のプロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのミオグロビンのカプセル化による結果を示すグラフである。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａは、種々の実施形態においてポリマーソームカプセル化ミオグロビンを形成するための逐次飽和プロトコールの略図である。
【００２１】
【図７Ｂ】図７Ｂおよび図７Ｃは、図７Ａの逐次飽和プロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのミオグロビンのカプセル化による結果を例証するグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｂおよび図７Ｃは、図７Ａの逐次飽和プロトコールを使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのミオグロビンのカプセル化による結果を例証するグラフである。
【００２２】
【図７Ｄ】図７Ｄは、図７Ｂおよび図７Ｃに示す結果をまとめる表である。
【００２３】
【図７Ｅ】図７Ｅは、遊離ミオグロビンについて、ならびに、逐次飽和によって調製された、タンパク質分解の前のおよびプロナーゼ処理後の、ポリマーソームカプセル化ミオグロビンについて、Ｏ２平衡曲線から得られた５０％飽和（Ｐ５０）を達成するのに必要な酸素の分圧を示す表である。
【００２４】
【図８Ａ】図８Ａは、種々の実施形態の逐次飽和技法を使用して２種の特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームへのミオグロビンのカプセル化による結果を示すグラフである。
【００２５】
【図８Ｂ】図８Ｂおよび図８Ｃは、種々の実施形態の逐次飽和技法を使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物のそれぞれから形成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液中のベシクルのｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像である。
【図８Ｃ】図８Ｂおよび図８Ｃは、種々の実施形態の逐次飽和技法を使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物のそれぞれから形成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液中のベシクルのｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像である。
【００２６】
【図８Ｄ】図８Ｄは、種々の実施形態の逐次飽和技法を使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液の平均流体力学的直径を示すグラフである。
【００２７】
【図８Ｅ】図８Ｅは、遊離オキシミオグロビンについて、ならびに、種々の実施形態の逐次飽和技法を使用して特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成された、酸素化されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液について、酸素平衡曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
種々の実施形態について添付の図面を参照して詳細に説明する。可能な限り、同一参照番号を、同一または同じ部分を示すために図面全体にわたって使用する。特定の例および実装になされる言及は、例証のためのものであり、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２９】
種々の実施形態には、ＰＥＭを生成するための改善方法が含まれ、これには、効率的な取込みを妨害しかつ／またはタンパク質機能を損なう、薄膜再水和プロトコールおよび直接水和プロトコールの重要なパラメーターを同定すること、ならびにそのような重要なパラメーターの反復最適化を行うことが含まれる。結果として、種々の実施形態により、中性に帯電しかつ完全にペグ化されたポリマーベシクル内で増大量の機能性タンパク質のカプセル化を可能とする一般化可能な技法が提供される。すなわち、種々の実施形態には、ミオグロビンをポリマーソームにカプセル化するための新しい「逐次飽和」方法が含まれる。
【００３０】
ナノ粒子媒体によって、機能性タンパク質の送達に関連する多くの課題を解決することができ、多様な巨大分子医薬品の臨床開発が可能になる。ナノ粒子媒体としては、例えば、リポソーム（すなわち、天然リン脂質の自己集合ベシクル）およびポリマーソーム（すなわち、ブロックコポリマーの自己集合ポリマーベシクル）、ならびにミセル、ペルフルオロカーボンエマルジョンなどが挙げられ得る。その目的のため、リポソームは通常は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い膜透過性および低い安定性を有するので、ポリマーソームは従来のリポソームと比較して有利な特性を有する。しかし、中性に帯電しおよび／またはペグ化されたポリマーソームに大量のタンパク質をカプセル化するための単一の、大規模対応が可能で、一般化された戦略を確立および確認した比較研究はほとんどなかった。リポソームベースの種々のカプセル化方法からの様々なステップを最適化しかつ組み合わせることによって、種々の実施形態は、ナノスケールポリマーベシクルにおいて機能性タンパク質のカプセル化を改善することができる新しい逐次飽和技法を提供する。種々の実施形態は、ポリマーソーム負荷の程度（すなわち、タンパク質対ポリマーの重量百分率）と達成が可能なタンパク質のカプセル化効率（ポリマーソーム形成に用いられた最初の分量に対する）との間の、トレードオフを実証する。さらに、種々の実施形態では、タンパク質分解ステップによって、逐次飽和プロトコールにより形成されたポリマーソーム懸濁液中に得ることのできる、カプセル化タンパク質（すなわち、所望の成果）ならびに表面会合（すなわち、非特異的に結合した）生成物の双方の量が正確に定量化される。既存のリポソームカプセル化技法を使用した、高効率でのポリマーソーム内の大量のタンパク質負荷に関する一部の報告があるが、そのような報告にはカプセル化タンパク質と表面会合タンパク質との間を区別することが含まれていない。したがって、種々の実施形態での逐次飽和技法によって、さらなる橋渡し的な開発を可能とし得る量および効率で、完全にペグ化されかつ中性に帯電したポリマーソーム中にタンパク質をカプセル化する、より確固とした、大規模対応が可能で、一般化可能な戦略を提供することができる。
【００３１】
哺乳動物細胞においてタンパク質機能を選択的におよび強力に調節することは、ほとんどの分子治療薬の主たる作業であるが、この場合、大多数の利用可能な薬剤が有機小分子（サイズが８００Ｄａ未満またはそれに等しい）である。しかし、最近の研究では、ほんのわずかの割合のヒトプロテオームが小分子をベースとした治療に感受性であることが示唆されている。さらに、小分子により首尾よく標的化されるタンパク質の機能的多様性は依然として非常に低いままである。すなわち、全ての処方薬のおよそ４０％が単一のクラスのタンパク質、すなわちＧタンパク質共役型受容体を標的とする。しかし、小薬物分子は、生物学的に重要な多くの境界面にみられる拡張した接触表面に対処することが本質的にできないので、小分子治療の使用は限られている。
【００３２】
タンパク質などの生体巨大分子は、相当程度、従来の小分子治療に伴うこれらの重要な限界を解決するその能力により、重要な臨床的実用性を最近示している。小分子とその生物学的標的との相互作用を比較した場合、巨大分子治療薬は、より大きくより正確な三次元構成の適用を可能にするより高い折り畳みエネルギー（通常はおよそ７〜２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するが、これは、効率的な結合および／または複雑な生物学的機能の制御にとって必要であることが多い。したがって、巨大分子は、卓越した結合選択性およびより強力な標的に対する活性を達成することができる。現在、世界中で利用可能な約２００のタンパク質薬物を含めて、使用状態にある少数の巨大分子治療は、薬物開発の新たなリードとして可能性が高いことを実証している。それにもかかわらず、いくつかの障壁がヒト治療薬としての巨大分子の迅速な開発の妨げとなってきており、（ｉ）商業的規模の生産の困難および／または費用、（ｉｉ）病態生理学的環境においてまたは長期貯蔵によって生じる生化学的不安定性、（ｉｉｉ）短い循環半減期および効果的な組織浸透を妨害する大きい立体障害、ならびに（ｉｖ）抗イディオタイプ抗体および／または免疫複合体形成の誘発などの重度の有害効果を促進する巨大分子の可能性に関連したリスクが挙げられる。これらの制限のいくつかを解決するために、ほとんどの医薬化合物は、タンパク質複合体形成およびｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために生体適合性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒアルロン酸）またはリポソーム（すなわち、脂質ベースのベシクル）のいずれかを用いる。
【００３３】
合成ナノ粒子は、より従来の配合物と比較した場合、薬物送達を高める卓越した特性を呈することができる。特に、ナノ粒子のクラスの内で、ポリマーソーム（すなわち、両親媒性ブロックコポリマーで構成される自己集合ポリマーベシクル）は、有益なナノスケール送達プラットフォームを提供することができる。脂質ベースのベシクル（すなわち、リポソーム）は生物医学研究に広く利用されてきたが、懸濁安定性が損なわれること、早すぎる薬物放出、および限られた製品有効期間を含めて、これらのリン脂質ベースの薬物送達媒体に付随する物質的な制限がある。対照的に、ポリマーソームは、広範で整調可能な範囲の担体特性を付与する、高分子量の両親媒性ブロックコポリマーから形成される。例えば、ポリマーソームは、（ｉ）非共有結合相互作用を介する多様な治療有効搭載量の容易で安定した負荷、（ｉｉ）類似した分子量のコポリマーから構築されたリポソームまたはミセル構造のそれより５〜５０倍大きい機械的安定性、（ｉｉｉ）コストのかかる製造後精製の必要性を除去する経済的で大規模な生産、および（ｉｖ）様々なコポリマー組成物からのポリマーソームの構築によって付与される生化学的特性の多様性、を可能とする。そのような特性として、完全にペグ化された表面および整調可能なｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間、部位特異的標的化、環境応答性、および完全な生分解を挙げることができる。
【００３４】
ナノ粒子へタンパク質を組み込むことで、それらの薬理学的性能を高め、それらの標的に対する活性を改善することができる。タンパク質をナノ粒子にカプセル化するために開発された方法では、静電相互作用を利用して、効率的で再現性のあるナノ粒子形成のために、一握りの高度にアニオン性のタンパク質、または当初のタンパク質の化学的もしくは遺伝的改変物を組み込んだ。そのような方法の例としては、薄膜再水和（すなわち、乾燥ポリマーの再水和）が挙げられ、これはポリマーソームカプセル化タンパク質の収率を低くする。別の例の方法は直接水和であるが、この使用は一般に小規模調製（例えば、１ｍＬ未満）に限定される。別の例の方法はエレクトロフォーメーションであるが、これは限られた数のタンパク質（すなわち、高度に荷電したタンパク質）に対してのみ有用な結果を提供する。別の例の方法は中空繊維の押出であるが、これはタンパク質溶液の存在下で予め形成されたベシクルの押出を必要とする。中空繊維押出技法は、リポソームカプセル化タンパク質の大規模調製に使用されてきたが、ポリマーソーム形成には温度および圧力の上昇が必要であり、これによってその広範な適用性が制限されてきた。
【００３５】
既存の技法は、粒子形成のための熱、電気、超音波、もしくは機械エネルギーの入力、または代替的にタンパク質の構造および／もしくは機能を損なうおそれがある有機共溶媒の使用を必要とし、カプセル化をいっそう難題とし、利用性において限定的とする。したがって、種々のカプセル化技法では、中性に帯電しかつ／またはペグ化されたナノ粒子に大量の天然タンパク質を組み込むことを可能にする一般化された方法に対する必要性が存在する。
【００３６】
種々のリポソームカプセル化技法の適用により、ポリマーソーム内に小分子を容易に組み込むことが可能になったが、これらの方法は、機能性タンパク質の大規模対応が可能なカプセル化に直接適用することはできない。多くの場合、カプセル化することができる水性タンパク質の最大濃度（すなわちｍｇタンパク質／ｍＬ溶液）、ポリマーソーム構造を構成するタンパク質対ポリマーの最終的な負荷率（すなわち、ｗ／ｗ％のタンパク質／ポリマー）、および／またはタンパク質カプセル化効率（すなわち、保持される、最初のタンパク質懸濁液の百分率）には、トレードオフが存在する。さらに、これらのパラメーターのそれぞれの値は、タンパク質の性質、厳密なブロックコポリマー配合物、および利用されるカプセル化方法に大きく依存する。例えば、図１の表には、種々のタンパク質のポリマーソームへのカプセル化による既存の結果が示されている。種々の実施形態は、ポリマーソーム中に増大量の機能性タンパク質を効率的にカプセル化するための代替の、最適化された再現性のある方法を提供する。種々の実施形態の新たに開発された「逐次飽和」技法は、新しく多様な生物医学的用途を可能にし得る増大量のポリマーソームカプセル化タンパク質を生産するのに、容易に大規模対応が可能であり、高度に再現性があり、一般化可能である。
【００３７】
種々の実施形態では、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤコポリマーを使用して、完全にＰＥＧ化された表面を有するポリマーソームを形成する。非荷電および非分解性であるそのような表面によって、ベシクルの完全性を保証し、かつ望ましくないタンパク質相互作用または改変を最小限にする理想的なシステムが提供される。異なる分子量の２種のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマー、「ＯＢ１８」ジブロックコポリマーおよび「ＯＢ２９」ジブロックコポリマーは、最小サイズ、ＰＥＧの長さ、および膜コアの厚さが異なっているポリマーソームに係るので、これらを用いて結果の一般化可能性について決定する。図２は、ＯＢ１８およびＯＢ２９の種々の特性の比較を示す表を提供する。メチレンブルー（ｍＢｌｕｅ；Ｍｗ＝３１９．８５ｇ／ｍｏｌ）を、これは水性懸濁液中で非常に安定であり、容易な分光光度検出を可能とする強い近赤外吸光度を有するが、モデル小分子として使用して、既存の方法を使用してカプセル化のための種々のベースラインパラメーターを確立する。そのようなベースラインパラメーターには、水性懸濁液の濃度、最終重量百分率、およびカプセル化効率が含まれる。ミオグロビン（Ｍｂ；Ｍｗ＝１７，６００Ｄａ）を、これは治療的可能性を有する他の小タンパク質に匹敵するサイズと熱安定性（すなわち、６０℃超での変性）を有するが、モデルタンパク質として使用した。ミオグロビンはまた、その鉄含有ヘム基の酸化還元状態によって決定される、その機能的状況の容易な同定を可能にし得る強い紫外線（ＵＶ）吸光度を有する。ミオグロビンはさらに、図１に関連して上で論議したように、他の研究で用いられており、既存の技法を使用する他のカプセル化との結果の比較が可能となる。メチレンブルーは、高温での薄膜再水和によって形成されたＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマーソーム中に容易にカプセル化され、４０および６０℃で形成された場合、それぞれ、４．１および５．０ｗ／ｗ％のｍＢｌｕｅ対ポリマーの最終重量比が得られる。しかし、類似の条件ではミオグロビンの分解をもたらすだけであった。
【００３８】
薄膜再水和によってベシクルを形成する場合、乾燥コポリマーのフィルムが水和されるときに、膜の膨潤部に親水性ブロックとしてラメラ（別名スポンジ様構造）が最初に形成される。さらに膨潤させると、六角形にパックされたベシクルへの、最終的に完全に分散したポリマーソームへの形質転換をもたらす。可溶性小分子（またはタンパク質）の溶液中で薄膜再水和を試みると、これらの水溶性種は突起を形成している（budding）ラメラの表面に吸着し、これはその後自発性の（または好ましい）湾曲する形をとる。形成の間、これらの膜は、より高濃度の吸着種を含有する水性区画から離れるように優先的に曲がり、それによって水溶性薬剤はベシクルカプセル化から除外される。最終的に、エネルギーを入力することで、ベシクルのカプセル化を促進するために、この自発性の表面張力を解決することができる。必要とされるエネルギーの量は、吸着した分子のサイズおよびベシクルの膜厚により増減する。したがって、熱（および／または音波）エネルギーの入力によって、リポソームを崩壊させることならびに薄膜再水和による小分子およびタンパク質の効果的負荷を可能とすることは容易である一方で、そのような入力は、小分子のポリマーソーム懸濁液への効果的なカプセル化を可能とするだけである。溶媒分散とホモポリマー添加とのハイブリッドとして開発された直接水和方法では、親水性ポリマーＰＥＧ５００ジメチルエーテル（ＤＭＥ）を使用して、形成するポリマーラメラの疎水性鎖の相互作用を崩壊させる。続いて水溶液を添加すると、分散したタンパク質を有する突起を形成しているラメラからのベシクルの自己集合が促進され、水性カプセル化の改善がもたらされる。３７％という高いカプセル化効率が観察された。２３℃での直接水和を使用して、ポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液は、カプセル化されたミオグロビン種が良好な懸濁特性および未変成タンパク質の特徴的な吸収スペクトルを呈する状態で、１０％を超えるカプセル化効率を有することができる。しかし、これらのポリマーソームカプセル化懸濁液中のミオグロビンの最終負荷は、わずかおよそ０．３ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーであることが判明した。全ての表面会合（すなわち、非特異的に結合した）タンパク質のタンパク質分解を誘発するプロテアーゼ溶液を添加すると、ＰＥＭ懸濁液の最終的なＭｂ組成はさらに低く、すなわち０．１ｗ／ｗ％未満のＭｂ／ポリマーであると判明した。橋渡し的な治療用途の場合、ポリマーソーム媒体の水性キャビティ内への治療用タンパク質の負荷は、被験体に導入される関連担体の量を最小限にするために最大化する必要がある、最終的な評価指標（metric）である。したがって、標準的な直接水和を使用するそのようなカプセル化は不十分である。
【００３９】
種々の実施形態では、逐次飽和プロトコールによって、ＰＥＭ懸濁液の効率的な生成が提供される。タンパク質カプセル化のための逐次飽和の一般化可能性は、１７〜４５０ｋＤａの範囲の様々な異なるタンパク質を利用することによってさらに確立され、新規の多数の治療組成物に関する前臨床研究を可能とし得る量でナノスケールポリマーソームが得られる。特に、逐次飽和方法と直接水和との間の差異は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）での追加の希釈の代わりに、後続する５容積の機能性タンパク質溶液を添加してＰＥＧ／ポリマー混合物を希釈することが関与し得る。
【００４０】
具体的には、種々の実施形態の逐次飽和方法は、ポリマー１０ｍｇおよびＰＥＧ１０ｍｇをおよそ９５℃で約１時間加熱することを含む。試料混合物を遠心分離し、室温に冷却することができる。メトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液（例えば、ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｍＬ）は、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）（例えば、１ｗｔ％）でオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）に還元することができる。結果として生成するｏｘｙＭｂ溶液から、一部（すなわち、アリコート）を１：１の容積比で試料混合物に添加し、十分に混合し、続いて室温でおよそ３０分間超音波処理することができる。特に、アリコートは、ｏｘｙＭｂ溶液１０μＬとすることができる。試料混合物は、いくつかの希釈ステップでさらに希釈することができる。具体的には、各希釈ステップは、ｏｘｙＭｂ溶液のある容積（例えば、ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて十分に混合して、室温でおよそ３０分間超音波処理することを含み得る。希釈ステップで使用されるｏｘｙＭｂ溶液の容積は、ｏｘｙＭｂ溶液と当初の試料混合物との比が、容積１０μＬで、続いて２０、５０および１００μＬで、１：１、２：１、５：１および５：１である量とすることができる。希釈ステップの後、結果として生成する試料を室温でさらに３０分間超音波処理し、続いて１０００ｋＤａの分子量カットオフ膜を用いておよそ４℃で少なくとも３０時間透析することができる。表面会合ミオグロビンは、０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液での処理を介するタンパク質分解によって、続いておよそ４℃で少なくとも１２時間の透析（例えば、分子量カットオフ１０００ｋＤａ）によって、除去することができる。種々の実施形態では、結果として生成するポリマーソーム懸濁液のミオグロビンカプセル化は、タンパク質分解の前後で測定することができる。具体的には、ミオグロビンの濃度は誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用して測定することができ、一方、ミオグロビンのヘム基の鉄の酸化還元状態はＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法を使用して定量化することができる。
【００４１】
これらの逐次飽和ステップによって、図３Ａ〜図３Ｅに示すように、ＯＢ１８ポリマーソーム中のミオグロビンのカプセル化について好ましい結果が提供された。例えば、図３Ａには、超音波処理を使用しなかった場合（従来技法におけるように）、および逐次飽和プロトコールに従って、超音波処理を使用することによって（すなわち、各希釈ステップの後、室温でおよそ３０分間）得られた、ポリマーソームカプセル化ミオグロビン中のＭｂ対ポリマー（すなわち、ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）の最終重量百分率が示されている。図３Ａに示すように、およそ６のＭｂ対ポリマーの最終重量百分率（すなわちｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）が、そのような超音波処理を含むプロトコールによって作製されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンにより達成された結果であり得る。したがって、各希釈ステップの後に室温でおよそ３０分間試料を超音波処理することにより、直接水和を介して生成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンから得られる最終重量百分率に基づいて、カプセル化効率を３０倍超で向上させることができる。
【００４２】
図３Ｂには、メトミオグロビン溶液を使用して（従来技法におけるように）、および逐次飽和技法におけるようにｏｘｙＭｂを使用することによって得られた、ポリマーソームカプセル化ミオグロビン中のＭｂ対ポリマー（すなわちｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）の最終重量百分率が示されている。図３Ｃには、様々な溶液条件に対するミオグロビンの曝露の関数として、ミオグロビン酸化率（経時的に形成されるｍｅｔＭｂの百分率として表されている）が示されている。図３Ｄには、様々なｏｘｙＭｂ容積に対するタンパク質分解時間の関数として除去された表面会合Ｍｂの量（％Ｍｂ消失）が示されている。図３Ｅには、ｏｘｙＭｂ溶液の容積と希釈ステップで使用されたＰＢＳの容積との種々の比を使用して生成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンにおいて、カプセル化効率（％Ｍｂ  ＥＥ）と比較した、Ｍｂ対ポリマーの最終重量百分率（すなわちｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）が示されている。特に、図３Ｅの試料を１８時間タンパク質分解して表面会合ミオグロビンを除去し、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法を使用して定量化した。
【００４３】
したがって、種々の実施形態による逐次飽和を使用してポリマーソームカプセル化ミオグロビンを生成する際に得られた最終的なＭｂ対ポリマー重量比（すなわち、４〜６ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）は、直接水和プロトコールを使用して生成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン（すなわち０．１〜０．３ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）と比較して、有意に改善され得る。特定の理論に縛られることを望むものではないが、逐次飽和ステップを使用して達成される負荷容量は、最初の希釈ステップ中の不完全なポリマーソーム形成に起因し得、さらなるカプセル化はタンパク質溶液の後続する各添加によって実現される。
【００４４】
逐次飽和プロトコールの開発には、複数のリポソーム形成法からの種々のステップを最適化することおよび組み合わせることが含まれた。ミオグロビンの最終濃度、ＯＢ１８ポリマーソーム担体内で達成できた相対負荷レベル（すなわち、ｗ／ｗ％のタンパク質／ポリマー）、およびミオグロビンカプセル化の効率に影響する要因を体系的に評価した。ポリマーの分子量、タンパク質の酸化状態および濃度、緩衝溶液のｐＨおよび性質、厳密なポリマー水和条件（すなわち、時間、温度およびブレンド技法）、超音波処理ステップの回数および持続時間、ならびに凍結−融解サイクルの追加または回避などの要因全てが最終ポリマーソームカプセル化タンパク質生成物の濃度および忠実度に効果を有した。
【００４５】
さらに、既存の技法を使用して作製されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンと比較して、逐次飽和によって作製されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンはまた、Ｍｂの最終濃度の向上を呈する。例えば、直接水和を介して生成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン中のＭｂの最終濃度は、溶液中でおよそ０．５ｍｇ／ＭＬ未満であるが、種々の実施形態において逐次飽和を介して生成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンの最終濃度は溶液中でおよそ２．０ｍｇ／ｍＬ超であり得る。
【００４６】
ベシクル形態を確認するためにｃｒｙｏ−ＴＥＭを使用すると、逐次飽和を使用して開発されたポリマーソームカプセル化ミオグロビンの懸濁液は、４℃、２３℃および３７℃で１ヶ月より長い間維持した場合に凝集体形成に関してなんら兆候を示さなかった。逐次飽和技法は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマーソーム内で１７〜４５０ｋＤａのサイズの範囲の様々な他のタンパク質を首尾よくカプセル化するために、さらに利用することができる。
【００４７】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、各添加ステップに使用された遊離Ｍｂの濃度に基づいて達成され得たＭｂカプセル化効率とＭｂ対ポリマーの最終重量比との間に直接的なトレードオフが存在する可能性がある。最終生成物はポリマーソーム送達媒体を利用するという目的を満たしていることを保証するために、すなわち、生化学的安定性を改善し、循環半減期を向上させ、有害な副作用を最小限にし、会合タンパク質の放出制御を達成するために、表面会合タンパク質よりもタンパク質の水性カプセル化が好ましい。種々の実施形態の技法は、治療上適切な抗体および酵素に関連するものを含めて、広い範囲の分子量およびサイズにわたって変化する様々なタンパク質を使用して用いることができる。例えば、逐次飽和技法を利用して、ＯＢ２９ジブロックコポリマーで構成されるＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤベースのポリマーソームシステムにミオグロビンをカプセル化することができる。種々の実施形態では、逐次飽和技法を利用して、限定されないが、抗体（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））および機能性酵素（例えば、カタラーゼ）を含めて、いくつかの他のタンパク質のいずれかをカプセル化することができる。
【００４８】
図２に関連して上記のように、ＯＢ１８ジブロックコポリマーと比較した場合、ＯＢ２９ジブロックコポリマーは、より小さい分子量を有し、より短いＰＥＧ刷子縁（１．３対３．９ｋＤａ）、より薄い二分子膜（９．６ｎｍ対１４．８ｎｍ）、およびより小さい平均流体力学的直径（１３０対２００ｎｍ）を有するポリマーソームを生成する。種々の実施形態では、逐次飽和を使用してＯＢ２９ポリマーソームにミオグロビンをカプセル化すると、ＯＢ１８ポリマーソームからのものと同様の結果が得られる。種々の実施形態では、逐次飽和技法は、ＰＥＧおよび生分解性ポリマー（例えば、生分解性のポリエステル、ポリ（アミド）、ポリ（ペプチド）、ポリ（核酸）等）である、疎水性ブロックで構成される任意の両親媒性ポリマーを含めて、任意のＰＥＧベースポリマーソーム形成性ブロックコポリマーを使用して、適用することができる。疎水性ブロックを形成し得る生分解性ポリエステルの例としては、限定されないが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（メチルカプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリ（ヒドロキシヘキサノエート（hdyroxyhexanoate））、ポリ（ヒドロキシオクタノエート（hydroxyoxtanoate））およびポリ（トリメチレンカーボネート）が挙げられる。
【００４９】
逐次飽和技法の一般化可能性は、ＯＢ２９ポリマーソームを使用するより大きいいくつかのタンパク質のカプセル化による類似の結果によってさらに実証される。図４には、逐次飽和プロトコールおよびＯＢ２９ポリマーソームを使用して、ミオグロビン、ヘモグロビン（Ｈｂ）（６４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６６ｋＤａ）、ＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、カタラーゼ（２５０ｋＤａ）、フィブリノーゲン（３４０ｋＤａ）、およびアポフェリチン（４５０ｋＤａ）をカプセル化することによるカプセル化の結果が示されている。
【００５０】
本発明を、以下の実施例によって説明するが、限定されることを意図するものではない。
【実施例】
【００５１】
実験
機能性タンパク質をカプセル化する大規模対応が可能な量の中性に帯電しかつ完全にペグ化されたポリマーソームを生産するための一般化可能な方法を確立するために、比較および定量研究を行った。小分子およびタンパク質カプセル化の差異について、ＯＢ１８ジブロックコポリマーおよびＯＢ２９ジブロックコポリマーで構成されるポリマーソーム配合物を用いることにより調べた。図２に関連して上記のように、これら２つのＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマーおよびこれらから形成されたポリマーソームは、分子量および最終的にはベシクルの膜厚に関して異なっている。メチレンブルー（ｍＢｌｕｅ；Ｍｗ＝３１９．８５ｇ／ｍｏｌ）をモデル小分子として、ミオグロビン（Ｍｂ；Ｍｗ＝１７，６００Ｄａ）を独特の生物学的機能（すなわち、酸素貯蔵および放出）を有するモデルタンパク質として使用した。図５Ａには、両親媒性ジブロックコポリマーでできているポリマーソーム、ならびにポリマーソーム中にカプセル化され得るかまたはそれに結合され得る水不溶性薬剤および水溶性種の表現が示されている。例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマーソーム内に水溶性薬剤を組み込むために用いられた従来のベシクル形成技法には、薄膜再水和および直接水和が含まれ、これらのプロトコールは、図５Ｂおよび図５Ｃにそれぞれ示されている。薄膜再水和方法および直接水和方法のそれぞれによって生成されたＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤポリマーソームにおけるメチレンブルーおよびミオグロビンのカプセル化を比較した。酸素結合が可能な完全機能性タンパク質のカプセル化量を定量化するために、ポリマーソームカプセル化ミオグロビンの鉄濃度をＩＣＰ−ＯＥＳにより測定し、ミオグロビンのヘム基における鉄の酸化還元状態をＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法により測定した。
【００５２】
既存の技法を使用して作製されたＰＥＭと比較して、逐次飽和によって作製されたＰＥＭは、Ｍｂの最終濃度の向上（例えば、溶液中およそ０．５ｍｇ／ｍＬ未満から溶液中およそ２．０ｍｇ／ｍＬ超へ）および再現可能に得ることができたＭｂとポリマーとの最終重量比における向上（１ｗ／ｗ％未満のＭｂ／ポリマーからおよそ３〜４ｗ／ｗ％超のＭｂ／ポリマーへ）を呈する。さらに、逐次飽和によって作製されたＰＥＭは、ＰＥＭ懸濁液中のタンパク質カプセル化の全体的効率の向上（およそ５％未満からおよそ９０％超へ）を示している。ベシクル形態を確認するためにｃｒｙｏ−ＴＥＭを使用すると、逐次飽和を使用して開発したＰＥＭの懸濁液は、４℃、２３℃、および３７℃で１ヶ月より長い間、凝集体形成に関してなんら兆候を示さない。
【００５３】
材料
【００５４】
ＰＥＯ（３９００）−ｂ−ＰＢＤ（６５００）（ＯＢ１８）およびＰＥＯ（１３００）−ｂ−ＰＢＤ（２５００）（ＯＢ２９）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｏｒｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）から購入した。ウマの骨格筋Ｍｂ、ウシ血液ヘモグロビン（Ｈｂ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カタラーゼ（Ｃ）、フィブリノーゲン（Ｆ）、次亜硫酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）ジメチルエーテル（ＰＥＧ；Ｍｎ＝約５００）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ（「プロナーゼ」）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）から購入した。ウマ脾臓アポフェリチン（ａＦｒ）はＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、米国）から購入した。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はＬＥＥ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）から購入した。透析チューブおよびバイアルは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、米国）から購入した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸カリウム、ｍＢｌｕｅおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｗａｎｅｅ、米国）から購入した。全ての化学物質は、別段の記載がない限り試薬グレードであった。
【００５５】
粒子サイズは、Ｄｅｌｓａ（商標）Ｎａｎｏ、動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、米国）を使用して測定した。ＭｂおよびｍＢｌｕｅ濃度は、Ｇｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｕｗａｎｅｅ、米国）を使用する吸収分光法によって決定した。ポリマーソーム懸濁液中の全タンパク質の濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法を利用し、製造者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）に従って、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用してさらに測定した。ポリマーソームカプセル化Ｍｂ懸濁液中の鉄濃度は、Ｖｉｓｔａ−ＰＲＯ  ＣＣＤ  ＩＣＰ−ＯＥＳ（Ｖａｒｉａｎ、米国）を使用して決定した。酸素平衡結合は、Ｈｅｍｏｘ（商標）−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ、ＰＡ、米国）を使用して調べた。エレクトロフォーメーションは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｔｅｓ、ＣＡ、米国）を使用して行った。
【００５６】
方法
【００５７】
薄膜再水和方法
【００５８】
ＯＢ１８ポリマー１０ｍｇをＤＣＭ  ２００μＬに溶解させた。ポリマー溶液をテフロン（登録商標）ウェハー（１５ｍｍ×１５ｍｍ）上に堆積させ、続いて室温（ＲＴ）で３０分間乾燥させた。フィルムを真空下ＲＴで一晩さらに維持してＤＣＭの蒸発を確実とした。メチレンブルーのカプセル化については、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭ、ｐＨ７．４）のメチレンブルー溶液（２１ｍｇ／ｍＬ）で２３、４０または６０℃で２４〜４８時間、ポリマーフィルムを水和させた。試料を、室温で３０分間超音波処理し、続いて液体窒素を使用して凍結−解凍サイクル（×１０）を行った。試料をＲＴで３０時間透析した（ＭＷカットオフ＝１００ｋＤａ）。ミオグロビンカプセル化については、ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のミオグロビン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）で２３、４０、および６０℃で６０時間、ポリマーフィルムを水和させた。次いで、試料をＲＴで３０分間超音波処理し、続いて４℃で３０時間透析した（ＭＷカットオフ＝１０００ｋＤａ）。
【００５９】
直接水和方法
【００６０】
ＯＢ１８  １０ｍｇおよびＰＥＧ  １０ｍｇを、１．５ｍＬ遠心分離管中で９５℃で２０分間加熱した。試料を混合し、室温に冷却し、続いてＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のメチレンブルー溶液（２１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬまたはミオグロビン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加した。次いで、試料をＰＢＳ  ２０、７０および９００μＬで希釈し、各添加／希釈の後に（ボルテックスにより）十分に混合した。次いで、試料を室温でまたは４℃で３０時間透析して（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）、カプセル化されていないメチレンブルーまたはミオグロビンをそれぞれ除去した。
【００６１】
ｍＢｌｕｅ／Ｍｂの定量化
【００６２】
精製されたポリマーソーム懸濁液中のカプセル化されたメチレンブルーまたはミオグロビンの量は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、６６５ｎｍ（ｍＢｌｕｅ）でのまたは４１０ｎｍ（Ｍｂ）での溶液の吸光度を測定することによって決定した。メチレンブルーおよびミオグロビンの検量線は、既知濃度の段階希釈を使用して作成した。ポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液中の鉄含量を測定するために（その試料中のミオグロビン濃度の確証として）、５〜１０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、混合物を王水中で９８℃で３時間加熱することにより消化し、続いて脱イオン水で希釈した。ＩＣＰ−ＯＥＳを実験試料に対して行い、その鉄含量をこの標準検量線と比較して決定した。ミオグロビンの濃度（ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度分光法によって算出される）を、各懸濁液について、ＩＣＰ−ＯＥＳを介してまたはＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ（二次ＵＶ−Ｖｉｓ法）を介して得られたものと比較した。ポリマーソーム中の水性カプセル化材の負荷を定量化し、懸濁液中のベシクルを構成するカプセル化材対ポリマーの最終重量百分率として表した（例えば、ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）。
【００６３】
ｍｅｔＭｂの定量化
【００６４】
ポリマーソーム懸濁液中のメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ、すなわち、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ヘム基を有する酸化Ｍｂ）の量を、シアノメトヘモグロビンレベルの測定のために以前に確立された改変ＵＶ−Ｖｉｓ吸収プロトコールを使用して定量化した。手短に言えば、ミオグロビンの吸光度を、ブランク基準（脱イオン水）に対して６３０ｎｍ（Ｌ１）で測定した。ＫＣＮ溶液（１０％ＫＣＮ  １部および５０ｍＭホスフェート  １部、ｐＨ７．６）１滴を添加し、処理済みミオグロビン試料と混合した。この反応ステップは、ｍｅｔＭｂを６３０ｎｍでは吸収しないシアノメトミオグロビン（ｃｙａｎｏＭｂ）に変換するのに必要であった。２分後、ブランク基準として働く脱イオン水に対して吸光度を６３０ｎｍ（Ｌ２）で測定した。式１を使用してｍｅｔＭｂの濃度を決定した：
【数１】
2018521128.tif 000003
式中、Ｅ＝３．７（ｃｍ×ｍＭ）−１であり、６３０ｎｍでのｍｅｔＭｂの消衰係数であり、Ｄ１はこの実験における希釈倍率である（キュベット長＝１ｃｍ）。
【００６５】
ミオグロビンの濃度を決定するために、２０％Ｋ３（Ｆｅ（ＣＮ）６）１滴を添加し、処理済みミオグロビン試料と混合した。溶液を２分間反応させ、１０％ＫＣＮの追加の１滴を添加し、混合した。次いで、試料の吸光度を５４０ｎｍ（Ｌ３）で測定した。式２を使用して総Ｍｂの濃度を決定した：
【数２】
2018521128.tif 000004
式中、Ｅ＝１１．３（ｃｍ×ｍＭ）−１であり、５４０ｎｍでのｃｙａｎｏｍｅｔＭｂの消衰係数であり、Ｄ２は希釈倍率である（キュベット長＝１ｃｍ）。
【００６６】
式３を使用して当初の溶液におけるｍｅｔＭｂの百分率を決定した：
【数３】
2018521128.tif 000005
【００６７】
ポリマーソームの構造的特徴付け
【００６８】
ポリマーソーム懸濁液をＰＢＳ溶液で希釈し、それらの流体力学的直径を標準１．５ｍＬセミミクロのＰｌａｓｔｉｂｒａｎｄポリスチレンキュベット（ＶＷＲ、Ａｔｌａｎｔａ、米国）を使用してＤＬＳにより測定した。ブランクポリマーソームおよびポリマーソームカプセル化ミオグロビンの形態を、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ２１００Ｆ、米国）によって可視化した。手短に言えば、ポリマーソーム試料をマイクロ穿孔グリッド中で懸濁させ、液体エタン（−１８３℃）を使用して急速にガラス化し、２００ｋＶでのｃｒｙｏ−ＴＥＭイメージング用の低温試料ホルダーに載せた。
【００６９】
従来の方法を使用するポリマーソーム懸濁液でのｍＢｌｕｅおよびＭｂのカプセル化
【００７０】
ポリマーソーム懸濁液中の小分子およびタンパク質カプセル化の比較のベースラインを確立するために、最終濃度、重量百分率（すなわち、ナノ粒子を構成するポリマーの重量と比較したカプセル化剤の重量）、およびメチレンブルーのカプセル化の効率を、薄膜再水和技法によって形成されたＯＢ１８ポリマーソームで決定した。図６Ａには、４０℃（すなわち、４．１ｗ／ｗ％のｍＢｌｕｅ／ポリマー）および６０℃（すなわち、５．０ｗ／ｗ％のｍＢｌｕｅ／ポリマー）でメチレンブルーをカプセル化するための最終ポリマーソーム組成物の重量百分率結果が示されている。室温（すなわち、２３℃）で薄膜再水和を試みた場合、おそらく、水和の４８〜７２時間後にポリマーフィルムは膨潤しなかったという観察から、メチレンブルーのカプセル化は無視できると判明した（結果は示さず）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤベースのポリマーソームはベシクル形成のためのエネルギーの入力を必要とするが、これは高温（例えば、４５℃超）を使用することによって通常支援される。
【００７１】
不安定なタンパク質を用いる場合に必要となるより低温でのカプセル化の効率を改善するために、ｍＢｌｕｅのカプセル化も直接水和方法によって調べた。図６Ｂには、２３℃での直接水和を使用して作製されたポリマーソーム懸濁液中のｍＢｌｕｅ対ポリマーの最終重量百分率が示されている（すなわち、１．２ｗ／ｗ％のｍＢｌｕｅ／ポリマー）。
【００７２】
次に、薄膜再水和によって２３℃で形成されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液はおよそ２．７ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーで構成されていることが、最初に判明した。タンパク質分解ステップを追加して任意の表面会合Ｍｂ（すなわち、非特異的に結合した遊離タンパク質）を除去した後、ポリマーソームの最終組成はわずか０．５ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーであることが判明し、これは非常に少量のタンパク質がポリマーソーム内にカプセル化されていたことを示している。図６Ｃには、追加したタンパク質分解ステップの前後両方での、２３℃での薄膜再水和を使用して作製されたポリマーソーム懸濁液中のＭｂ対ポリマーの最終重量百分率が示されている。
【００７３】
ポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液中のミオグロビンの濃度および最終重量百分率を改善するために、４０および６０℃での薄膜再水和を利用して、より高温でのポリマーソーム生成を再度試みた。しかし、そのような試験では、タンパク質は変性し凝集するだけであった。対照的に、２３℃での直接水和によって調製されたポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液は、良好なコロイド特性および未変成ミオグロビンの特徴的な吸収スペクトルを示したが、これらのポリマーソームカプセル化ミオグロビン懸濁液中のＭｂ対ポリマーの最終負荷率は依然として低かった。図６Ｄには、タンパク質分解前（すなわち、０．３ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーを示す）およびタンパク質分解後（すなわち、０．１ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーを示す）両方の、２３℃での直接水和を使用して作製したポリマーソーム懸濁液中のＭｂ対ポリマーの最終重量百分率が示されている。
従来プロセスに対する改変
【００７４】
機能性タンパク質のポリマーソームカプセル化を改善するために、直接水和および薄膜再水和技法の両方の特色を実験条件下で繰り返して評価した。
【００７５】
超音波処理の効果
【００７６】
直接水和プロトコールに続き、ＯＢ１８ポリマーおよびＰＥＧの添加の際に、試料を混合し、ＲＴに冷却し、ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＭｂ溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加した。次いで、試料をＭｂ溶液１０、２０、５０および１００μＬでさらに希釈し、続いて、追加の各希釈ステップの後にＡ）０分間またはＢ）３０分間のいずれかで混合および超音波処理した。次いで、全ての試料を４℃で３０時間透析した（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）。結果として得られたポリマーソーム懸濁液中の最終Ｍｂ濃度、Ｍｂ対ポリマーの重量百分率、およびＭｂカプセル化の効率を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法、ＩＣＰ−ＯＥＳによって測定し、比較した。
【００７７】
ＯＢ１８ポリマーソーム中のＭｂのカプセル化を試みる上で、およびベシクル形成に直接水和プロトコールを用いることにより、最終的なＰＥＭ懸濁液中で再現可能に得られたＭｂ対ポリマーの重量比は、ここでも非常に低いことが判明した（例えば、およそ０．２ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）。しかし、カプセル化効率は、各希釈ステップの後に、試料を室温で３０分間超音波処理した場合（すなわち、水溶液の追加容積を導入して懸濁液中のポリマーの濃度を希釈した後に超音波処理する）、３０倍超で向上することができた。図３Ａに関連して上で論議したように、ＰＥＭ懸濁液中のＭｂの相対量は、およそ６．０ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーまで増量させることができ、この超音波処理ステップを当初の直接水和プロトコールに追加することが裏付けられている。
【００７８】
ブレンド技法の効果（有機溶媒へのポリマーの溶解対加熱の追加）
【００７９】
直接水和プロトコールの第１のステップ中のポリマーの溶解を改善するために、有機溶媒を利用する効果を、加熱してＯＢ１８をＰＥＧ５００ホモポリマーとブレンドすることと比較した。これらの戦略を、ポリマーソーム形成の最終収率、ならびに最終的には、各方法によって得ることができたタンパク質カプセル化の濃度および効率について比較した。２種のポリマーをＤＣＭに溶解させることによって最初に混合した場合（続いて、有機溶媒蒸発後にポリマーソームを形成させる）、ＰＥＭ懸濁液中のＭｂ対ポリマーの最終重量比はおよそ２ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーであった。これと比較して、乾燥ＯＢ１８およびＰＥＧ５００を９５℃に１時間最初に加熱すると、混合が改善され、より効率的なポリマーソームの生成が促進され、最終的なＰＥＭ懸濁液中の、Ｍｂ対ポリマーの著しく高い最終重量比が得られ（すなわち、およそ５ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）、これは、より多量のカプセル化されたタンパク質に相当する。
【００８０】
直接水和プロトコールに続き、ＯＢ１８  １０ｍｇおよびＰＥＧ  １０ｍｇを、９５℃で１時間加熱することによってブレンドするか、またはＤＣＭ（５０μＬ）に溶解することによって混合した後、室温で一晩真空下で乾燥した。さらなるカプセル化は、各希釈ステップの後に３０分間の超音波処理を追加して同一プロトコールを使用して行った。最終懸濁液中のＭｂ濃度を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法およびＩＣＰ−ＯＥＳによって決定し、比較した。
【００８１】
Ｍｂ酸化状態の効果（すなわち、ポリマーソームカプセル化のためのｏｘｙＭｂ対ｍｅｔＭｂの利用）
【００８２】
出発Ｍｂ原液を亜ジチオン酸ナトリウムで最初に還元して全てのメトミオグロビン（すなわちｍｅｔＭｂ）をオキシミオグロビン（すなわちｏｘｙＭｂ）型に変換すると、ミオグロビンカプセル化はさらに増強されることが判明した。ｏｘｙＭｂは、第一鉄の状態（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ））の鉄を有する中心ヘム基を含有するが、これによって、Ｆｅ（ＩＩＩ）を含有するそのｍｅｔＭｂ型と溶解性を比較した場合、タンパク質の溶解度が改善される。このｏｘｙＭｂ溶液は、直接水和プロトコールにおける後続の希釈ステップの全てにおいてそれを利用する前に透析によりさらに脱塩したが、これは、ＰＥＭ懸濁液中のＭｂの負荷（すなわち、Ｍｂ対ポリマーの最終重量比）を向上させるのに必要であることが判明した。図３Ｂに関連して上で論議したように、ｏｘｙＭｂを最初のプロトコールステップで使用すると、６ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーで構成されたＰＥＭ懸濁液が形成され、これはｍｅｔＭｂを利用した場合に得られる４ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーよりも統計的に有意な改善であった。
【００８３】
直接水和プロトコールを改変して、ポリマーとＰＥＧとの最初の混合物を９５℃で１時間（２０分の代わりに）の加熱に曝露した。ポリマーソームカプセル化の効率に対するＭｂのヘム基の鉄酸化状態の効果を、各希釈ステップに対してｏｘｙＭｂ（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）Ｍｂ）対ｍｅｔＭｂを使用することによって調べた。ｍｅｔＭｂ溶液を、凍結乾燥したＭｂをＰＢＳで溶解することによって調製した。同一溶液を１ｗｔ％Ｎａ２Ｓ２Ｏ４で処理して、還元されたＭｂ型（ｏｘｙＭｂ）を得た。ポリマーソームにおけるＭｂカプセル化を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法およびＩＣＰ−ＯＥＳによって測定し、比較した。
【００８４】
Ｍｂ酸化に対する超音波処理および温度の効果
【００８５】
ポリマーソームのカプセル化の最初のステップで使用されたｏｘｙＭｂの４０％超が、５０℃で２時間以内にｍｅｔＭｂに再酸化されることが判明した。対照的に、ポリマーソーム形成により低い温度を用いた場合（例えば、４０℃で２時間の加熱）、およそ１５％のｍｅｔＭｂのみが最初のｏｘｙＭｂ溶液から生成した。５０℃でのＭｂ酸化率はまた、図３Ｃに関連して上で論議したように、超音波処理の追加または利用された電力にかかわらず、４０℃でのＭｂ酸化率よりも有意に大きかった。このように、超音波処理はＭｂ酸化に効果を有さないこと、したがってこれを優先的に用いて、ポリマー混合を促進するとともに、界面エネルギーを提供してポリマーソーム形成を増強することが決定された。
【００８６】
最初のＭｂ溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）をＮａ２Ｓ２Ｏ４で還元し、４０℃（超音波処理有りでまたはなしで）または５０℃で２〜５時間加熱することを含めて、種々の条件に供した。Ｍｂ酸化を、シアノメトヘモグロビン法を使用して、総ポリマーソームカプセル化Ｍｂ懸濁液中のｍｅｔＭｂの百分率を測定することによって決定した。
【００８７】
タンパク質分解の効果
【００８８】
形成時に、任意の表面会合（すなわち、非特異的に結合した）Ｍｂの完全消化に要する期間を調べるために、ＰＥＭ懸濁液を室温で最長１８時間０．４％プロナーゼ溶液で処理した。全ての表面会合Ｍｂは２時間で消化されること、プロナーゼ曝露時間を長くしても濃度を高めてもＭｂ消失をさらに増強させないことが観察され、したがって、図３Ｄに関連して上で論議したように、カプセル化されたＭｂのみが保持されていたことが示された。
【００８９】
タンパク質の様々な初期溶液濃度（すなわち、５０、７５、１５０ｍｇ／ｍＬ）を使用してＯＢ１８ポリマーソームにＭｂをカプセル化し、その後４℃で少なくとも３０時間透析した（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）。続いて試料を室温で１８時間０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で処理し、４℃で一晩再度透析した。ポリマーソームにおけるＭｂカプセル化（タンパク質分解前後）をＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法およびＩＣＰ−ＯＥＳで測定し、比較した。
【００９０】
Ｍｂカプセル化効率の改善（すなわち、％Ｍｂ  ＥＥ）
【００９１】
最適なＭｂ濃度を確立して、当初の「直接水和」プロトコールに関する本発明者らの改変における後続の各希釈ステップで使用するために、種々のＭｂ対ＰＢＳの容積比（すなわち、「Ｍｂ：ＰＢＳ」）を用いて５セットの実験を行った。特に、Ｍｂ：ＰＢＳが上昇すると、ＰＥＭ懸濁液中の最終ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーも上昇したが、結果として、Ｍｂカプセル化効率（すなわち、％Ｍｂ  ＥＥ）は低下した。換言すれば、Ｍｂ対ポリマーの最終的な質量比は、全ての希釈ステップが最大濃縮Ｍｂ溶液（すなわち、Ｍｂ：ＰＢＳ＝１９０：０および１５０ｍｇ／ｍＬ  ｏｘｙＭｂ）を使用して行われたときに最大化された。図３Ｅに関連して上で論議したように、％Ｍｂ  ＥＥは、Ｍｂ：ＰＢＳが最小であった場合に（すなわち、１０：１８０）最も大きかった。最終ポリマーソーム懸濁液中のタンパク質の量は、治療投与のために最適化する必要がある最終的な評価指標なので（被験体に導入される関連担体ポリマーの量を最小限にするために）、純粋なＭｂ溶液（１５０ｍｇ  ｏｘｙＭｂ／ｍＬ）が、究極的なカプセル化プロトコールにおいて各希釈ステップに使用され、ＰＥＭ懸濁液中の最終ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーが最大化されると決定された。
【００９２】
基本的な直接水和プロトコールに続き、ポリマー１０ｍｇおよびＰＥＧ  １０ｍｇを１．５ｍＬ微量遠心分離管中で９５℃で１時間最初に加熱し、その後ＲＴに冷却した。次いで、希釈剤１０、１０、２０、５０および１００μＬを添加することにより混合物を希釈した。２つの異なる溶液、ＰＢＳおよび／またはＭｂ懸濁液（すなわち、ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｍＬのＭｂ）を使用し、５つの希釈ステップのそれぞれについて比較した。ステップ１、２、３、４および５において、Ｍｂと希釈剤として使用したＰＢＳとの最終（ｖ／ｖ）比（すなわち「Ｍｂ：ＰＢＳ」）は、それぞれ、１０：１８０、２０：１７０、４０：１５０、９０：１００、および１９０：０であった。次いで、試料を０．４ｗｔ％プロナーゼを使用してタンパク質分解し、４℃で一晩再度透析した（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）。Ｍｂカプセル化をＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法を使用して測定した。Ｍｂカプセル化効率を式４を使用して算出した。
【数４】
2018521128.tif 000006
式中、ｖ１＝未カプセル化Ｍｂの最初の容積（ｍＬ）、ｃ１＝未カプセル化Ｍｂの最初の濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ｖ２＝透析およびタンパク質分解後に得られたポリマーソームカプセル化Ｍｂの容積（ｍＬ）、ならびにｃ２＝透析およびタンパク質分解後に得られたカプセル化Ｍｂの濃度（ｍｇ／ｍＬ）。
【００９３】
ポリマーソームカプセル化タンパク質懸濁液を生成するための逐次飽和の使用。
【００９４】
種々の実施形態でのステップのそれぞれを組み込むことによって逐次飽和技法が確立され、図７Ａに表されているが、これによって、図５Ｃに関連して上で論議した当初の直接水和プロトコールの結果に大幅に改良が加えられた。逐次飽和プロトコールを使用すると、ＯＢ１８ベースのＰＥＭ懸濁液中のＭｂの最終含量は、タンパク質分解の前後でそれぞれ、６．１および３．２ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーであると判明した。ＩＣＰ−ＯＥＳによるポリマーソーム懸濁液それぞれにおける鉄含量（未変成のヘム基の数）の定量化によってＵＶ−Ｖｉｓ測定のタンパク質濃度が確証された。図７Ｂに示すように、ポリマーソーム中のＭｂの最終負荷率は、タンパク質分解の前後でそれぞれ、７．９および５．１ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマーであると判明した。図７Ｃに示すように、ｍｅｔＭｂの百分率（これらの懸濁液中の総Ｍｂ含量に対する）をＵＶ−Ｖｉｓ吸光度分光法により決定し、非タンパク質分解（ＰＥＭ−ＳＥ）試料およびタンパク質分解（ＰＥＭ−Ｅ）試料において、それぞれ、およそ８％および６％であると判明した。図７Ｄは、図７Ｂおよび図７Ｃに関連して論議したように、ＯＢ１８ベースのＰＥＭ懸濁液に関して測定された特性（すなわち、結果）の表である。
【００９５】
ポリマーソームカプセル化タンパク質懸濁液の安定性
【００９６】
最適化された逐次飽和技法を使用してＯＢ１８カプセル化Ｍｂ懸濁液を調製した。試料を４、２３および３７℃で３週間保存した。所定の時点で、試料をＰＢＳで希釈し、平均粒子サイズおよび分布をＤＬＳによって決定した。
【００９７】
ポリマーソームカプセル化Ｍｂ懸濁液中の酸素の平衡結合
【００９８】
遊離のおよびポリマーソームカプセル化Ｍｂの懸濁液中の酸素に対する平衡結合曲線および解離曲線を、Ｈｅｍｏｘ（商標）−Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して３７℃で得た。試料を１４７ｍｍＨｇのｐＯ２に飽和させ（圧縮空気を使用して）、次いで脱酸素化した（圧縮窒素流を使用して）。酸素化されたおよび脱酸素化された遊離Ｍｂ懸濁液ならびに酸素化されたおよび脱酸素化されたポリマーソームカプセル化Ｍｂ懸濁液の吸光度を、二重波長分光法によるｐＯ２の関数として記録した。酸素平衡曲線は、４パラメーター（Ａ０、Ａ∞、Ｐ５０、ｎ）ヒルモデル（式５）に適合させた。このモデルでは、Ａ０およびＡ∞は、それぞれ０ｍｍＨｇおよび１４７ｍｍＨｇにおける吸光度を表す。ｐＯ２は酸素の分圧を表す。Ｐ５０は、試料が酸素で５０％飽和しているＯ２の分圧を表す。最後に、ｎは試料の協同性係数を表す。
【数５】
2018521128.tif 000007
【００９９】
図７Ｅには、遊離ミオグロビン（Ｍｂ）試料、逐次飽和技法を使用して調製された、タンパク質分解前のポリマーソームカプセル化ミオグロビン試料（ＰＥＭ−ＳＥ）、および逐次飽和技法を使用して調製された、プロナーゼ処理後のポリマーソームカプセル化ミオグロビン試料（ＰＥＭ−Ｅ）について得られた、Ｐ５０値（ｍｍＨｇ単位）が示されている。
【０１００】
最終ＰＥＭ懸濁液の特徴付け
【０１０１】
最終的なＯＢ１８ベースおよびＯＢ２９ベースのＰＥＭ懸濁液のサイズ分布を、ＤＬＳおよびｃｒｙｏ−ＴＥＭの両方によって測定した。図８Ａには、ＤＬＳによって評価された、逐次飽和を使用して調製されたＯＢ１８ベースのおよびＯＢ２９ベースのＰＥＭ懸濁液中の粒子の平均流体力学的直径が提供されている。ＯＢ１８ベースのおよびＯＢ２９ベースのＰＥＭ懸濁液中のベシクルのｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を、それぞれ図８Ｂおよび図８Ｃに示す。これらの結果により、ＯＢ１８ポリマーソームについては約２００ｎｍの、ＯＢ２９ポリマーソームについては１３０ｎｍの平均粒径が確認された。ＯＢ１８ベースのＰＥＭ懸濁液の安定性は、３週間にわたり、種々の温度でさらに調べ、ポリマーソームによって、懸濁液中の一定した粒子数および安定なサイズ分布に基づいて凝集はないことが実証された。図８Ｄには、種々の温度（すなわち、４℃、２３℃および３７℃）で逐次飽和により調製されたＯＢ１８ベースのＰＥＭ懸濁液中の、ＤＬＳにより決定された、粒子の平均流体力学的直径が、時間の関数として示されている。最後に、ＰＥＭ懸濁液中のカプセル化Ｍｂの機能的状況（すなわち、酸素を結合および放出するＭｂの能力の保持）を、二重波長分光法によって確認した。図８Ｅには、遊離のｏｘｙＭｂ懸濁液および酸素化されたＯＢ１８ベースのＰＥＭ懸濁液の酸素平衡曲線が示されている。エラーバーは、１条件当たりｎ≧３回の実験の繰り返しで、平均の標準偏差を示している。酸素平衡曲線、ＰＥＭのＰ５０（すなわち、Ｍｂが酸素で５０％飽和しているＯ２の分圧）は、溶液中の遊離Ｍｂの酸素平衡曲線と非常に類似していた。
【０１０２】
ブロックコポリマーおよび種々の分子量のタンパク質を使用するポリマーソームカプセル化
【０１０３】
逐次飽和技法の一般化可能性は、種々のサイズのタンパク質、すなわち、Ｍｂ（１７ｋＤａ）、ヘモグロビン（Ｈｂ；６４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；６６ｋＤａ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ：１５０ｋＤａ）、カタラーゼ（２５０ｋＤａ）、フィブリノーゲン（３４０ｋＤａ）、およびアポフェリチン（４５０ｋＤａ）を使用して試験した。各タンパク質を、１５０、１５０、４０、２０、５０、５０および２５ｍｇ／ｍＬの最終懸濁液濃度にそれぞれ相当するその最大溶解度で、ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶解させた。逐次飽和プロトコールの後、ＯＢ２９ポリマーソームにこれらのタンパク質をカプセル化した。遊離タンパク質を４℃で少なくとも３０時間透析することにより分離した（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）。０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液での処理を介するタンパク質分解によって表面会合タンパク質を除去した後、４℃で一晩透析した（分子量カットオフ１０００ｋＤａ）。ポリマーソーム懸濁液中のタンパク質カプセル化（タンパク質分解前後）を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法を利用し、製造者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）に従い、ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイを介して定量化した。タンパク質の最終濃度は、ポリマーの最終濃度で除し、懸濁液中のポリマーソームを構成するタンパク質対ポリマーの最終重量比（例えば、ｗ／ｗ％のＭｂ／ポリマー）として表した。
【０１０４】
統計学的解析
【０１０５】
平均±平均の標準偏差（ＳＤ）としてデータが提示されている。各条件に対して、最低でも３回の実験の繰り返しを使用した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用して一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。＜０．０５のｐ値は統計的に有意であるとした。
【図１】
2018521128.tif 000008
【図２】
2018521128.tif 000009
【図３Ａ】
2018521128.tif 000010
【図３Ｂ】
2018521128.tif 000011
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2018521128.tif 000014
【図４】
2018521128.tif 000015
【図５Ａ】
2018521128.tif 000016
【図５Ｂ】
2018521128.tif 000017
【図５Ｃ】
2018521128.tif 000018
【図６Ａ】
2018521128.tif 000019
【図６Ｂ】
2018521128.tif 000020
【図６Ｃ】
2018521128.tif 000021
【図６Ｄ】
2018521128.tif 000022
【図７Ａ】
2018521128.tif 000023
【図７Ｂ】
2018521128.tif 000024
【図７Ｃ】
2018521128.tif 000025
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【国際調査報告】
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