(57)【要約】  本発明は、代謝障害および／または肥満に起因しない望ましくない炎症活性、特に例えば喘息に見られるような気道炎症活性の治療のための、ヒト腸に見出される、ムチン分解細菌種であるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物であって、前記炎症活性が代謝障害および／または肥満に起因しない、組成物。
【請求項２】
前記炎症活性が非腸の炎症活性である、請求項１に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項３】
前記炎症活性が、例えば、喘息の増悪を含む喘息、ＣＯＰＤの増悪および好酸球性ＣＯＰＤを含むＣＯＰＤ、感染関連性炎症、アレルゲン誘導性炎症、アレルギー性鼻炎または慢性鼻副鼻腔炎の望ましくない気道炎症活性である、請求項１または２に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項４】
前記使用が、喘息の気道炎症の予防および／または治療である、請求項３に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項５】
腸内に正常レベルより低いアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を有すると同定された対象に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項６】
重症喘息を有する患者に投与される、請求項５に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項７】
前記使用が、関節リウマチなどの全身性炎症性疾患の予防および／または治療である、請求項１または請求項２に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項８】
前記使用が、自己免疫障害に関連する望ましくない炎症活性の予防および／または治療である、請求項１または請求項２に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項９】
前記使用が、例えば、アトピー性皮膚炎または乾癬に関連する望ましくない皮膚の炎症活性の予防および／または治療である、請求項１または請求項２に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１０】
前記使用が、感染症もしくはがんまたはそれらの免疫療法に関連する望ましくない炎症活性の予防および／または治療である、請求項１に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１１】
前記使用が、クローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、ポーチ嚢炎および感染後大腸炎から選択される状態に関連する胃腸炎の予防および／または治療である、請求項１に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の株が、ヒト腸における免疫調節効果を有する、ヒト糞便もしくは生検に由来する天然に存在する株またはそれらの天然に存在するバリアントから選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種のそのような株が、ヒトの腸における免疫調節効果を維持する、天然に存在するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の遺伝子組換え変異体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、ラクトバシラス属（Lactobacillus）およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）などの別の細菌種の１つまたは複数のプロバイオティクス株を追加で含むか、またはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）以外の細菌種の前記１つまたは複数のプロバイオティクス株が、異なる組成物中で、同時にまたは逐次的に投与される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１５】
経口投与に好適なプロバイオティクス組成物である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１６】
飲料または栄養組成物の他の形態である、請求項１５に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１７】
消化管への前記１つまたは複数の株の送達のための医薬組成物である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１８】
エアロゾル送達のために製剤化または包装されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、プレバイオティクス物質、好ましくは消化管におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の増殖を促進するプレバイオティクス物質を追加で含むか、または前記プレバイオティクス物質が、前記組成物と別個で、同時にまたは逐次的に投与される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物が消化されない株放出組成物であり、前記使用が、前記組成物を液体と接触させることによって、前記１つまたは複数の株が前記液体中に放出され、生じるプロバイオティクス液体組成物が消化されるプレステップをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物。
【請求項２１】
望ましくない炎症活性の予防および／または治療のための方法であって、消化管に１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を投与することを含み、炎症活性が代謝障害および／または肥満に起因しない、方法。
【請求項２２】
望ましくない炎症活性、例えば、望ましくない気道炎症活性の予防および／または治療における使用のための、消化管内においてアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の増殖を促進することができるプレバイオティクス物質、例えばオリゴフルクトースであって、前記炎症活性が代謝障害および／または肥満に起因しない、プレバイオティクス物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息の治療のための免疫調節性生物学的治療剤としてのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の使用に関する。より一般的に、任意の代謝障害および／または肥満と無関係である望ましくない炎症活性の治療のための、ヒト腸内に見出されるムチン分解細菌種である、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の使用に関する。この文脈において、「無関係である」は、「起因しない」ということを意味すると理解されよう。特に興味深いのは、健常人と比較してより低いレベルの腸内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を有すると同定された喘息患者における、気道炎症の予防および／または治療におけるその微生物の使用である。共通して、そのような喘息患者は、重篤であると分類できる喘息を有すると予測できる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのマイクロバイオーム（microbiome）は微生物のコミュニティであり、人体の特定の部位中またはその上に生息しているすべての微生物体の総体であると記述することができる。ＤＮＡ配列決定技術における近年の進歩は、腸、皮膚、尿生殖路および肺のマイクロバイオームのより徹底した解析を促し、宿主の粘膜表面に共生的に存在する微生物スーパー器官（super organ）を明らかにした。マイクロバイオームの組成および活性が、宿主に対して重要な、代謝の、栄養学的および免疫学的な影響を有することがよりよく理解されるようになってきている（１）。マイクロバイオームは、出生時から宿主内において、宿主の免疫系とのホメオスタシスの均衡を維持するよう常に微調整されつつ進化する。この進化は、適応免疫応答および自然免疫応答、食事、投薬および毒素曝露などの外部因子、ならびに病気などの、宿主の因子によって影響を受ける。
【０００３】
消化管は、最大の数および多様性の微生物を有し、腸内におよそ１００兆個（全身のヒト細胞の総数の２〜１０倍）の微生物が存在し、一方で、腸のマイクロバイオームの総体のゲノムは、ヒトゲノムのおよそ１００倍超の遺伝子を含有する。これらの微生物は、複雑なコミュニティ構造において生き延びるよう高度に適応し、他の微生物および／または宿主のプロセスからの栄養素を必要とする。興味深いことに、配列決定のアプローチを用いることで、１，０００を超える異なる細菌種が腸のマイクロバイオーム中において同定された。しかしながら、特定の個体のマイクロバイオームは、典型的には３００〜５００の異なる種のみを含有し、マイクロバイオームの組成における非常に大きな個体間の変動性をもたらす。この変動性は、例えば炎症性腸疾患などの疾患の患者が健康な個体と比較されるときにさらにより顕著となり、マイクロバイオーム中における特定の微生物の不均衡（すなわち腸内毒素症）が異常な炎症および代謝の応答の原因となり得るという概念を支持する（２）。同様に、肺のマイクロバイオームにおける変化が、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺関連障害と関連している（３）。
【０００４】
マイクロバイオームは、上皮の障壁機能および完全性の発達を支持し、一方で粘膜組織における強力な寛容および防御免疫機構を促進する（４）。微生物は、宿主の免疫応答に直接的に影響を及ぼし、そして腸内の栄養素の微生物発酵に由来する代謝産物は宿主のエネルギー摂取に寄与するだけでなく、宿主の免疫応答に著しく影響を与えもする（例えば短鎖脂肪酸およびヒスタミン）（５、６）。適切な細胞および分子のネットワークは、自然パターン認識受容体活性化、Ｔ細胞およびＢ細胞の極性化および増殖、広範囲のエフェクターサイトカインおよび調節性サイトカインならびに宿主の代謝産物の分泌に関与する。最終的に、腸内のマイクロバイオーム、免疫細胞および組織細胞間のこのトライアローグは、最適な消化能力、腸運動性、食物および特定の微生物抗原に対する免疫寛容、ならびに病原体に対する防御の確立をもたらす。
【０００５】
消化管における細菌のプロセスの免疫学的な結果は、腸それ自体から遠隔の器官に影響を及ぼしている（７）。例えば、呼吸器炎症は、マウスモデルにおいて、ラクトバシラス属（Lactobacillus）およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）などの特定のプロバイオティクス（probiotic）細菌の経口投与によって治療されている（８、９）。さらに、幼児期における、低減した腸の細菌の多様性は、その後の人生の喘息のリスクを増大させる（１０）。
【０００６】
アッカーマンシア属（Akkermansia）の種は共生微生物である。それらは、ヒトの消化管内の微生物フローラから単離された（１１）。消化管内の免疫系は、生じる炎症活性が宿主細胞および組織機能をも破壊するため、このフローラのメンバーに対して顕著な応答を示すことができない。したがって、それによって、免疫系が病原性生物とは異なる消化管フローラの共生非病原性のメンバーと認識することを可能にする、いくつかのメカニズムが存在する。このことは、宿主組織へのダメージが制限され、防御障壁が依然維持されていることを確かにする。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、マウスモデルにおいて、基礎代謝のホメオスタシスおよび共生微生物叢に対する免疫寛容の確立に関与する経路を調節することが示されている（１２）。
【０００７】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、肥満患者および炎症性腸疾患を有する患者の糞便試料において低減していると、これまでに報告されている（１３）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、過体重／肥満の成人におけるカロリー制限介入の後の、より健康な代謝状態およびより良好な臨床結果と関連する（１４）。実際、公開された国際特許出願、国際公開第２０１４／０７５７４５号パンフレットおよびその優先権を主張する公開された国際出願、国際公開第２０１４／０７６２４６号パンフレットは、肥満の個体におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の防御効果を対象とし、肥満および／または２型糖尿病などの代謝障害を呈する個体へのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の投与によりさまざまな有利な効果をもたらすことを提案する（１５）。肥満および２型糖尿病のマウスへのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の投与が改善された代謝プロファイルと相関すること、および高脂肪食に誘導される代謝障害を防御し得るが示されている。エンドカンナビノイドの腸内濃度の増加を含む、関連する腸炎に関する興味深い有利な効果が報告された（１６）。しかしながら、そのような研究は、異なる病因の腸炎を含む、他の形態の炎症を改善することに関連する情報を提供しない。
【０００８】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが、制御不能な症状を有する非肥満の喘息患者において減少し、そしてこの細菌が、呼吸器炎症の非肥満動物モデルにおいて防御的であることがここで見出された。同一の細菌が、マイクロバイオームによる腸ムチンの消化、および、後に続くＳＣＦＡ分泌に対する影響を通じて、おそらく直接的および間接的に、消化管内で免疫調節効果を発揮することが、これまでに記載されている（再び１２を参照）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のより低い保有率もまた、これまでに少数のアレルギー性の小児におけるＩｇＥ媒介性アトピー性疾患と相関していた（１７）。しかしながら、それらの研究は、単なる相関関係のみを提供し、消化（ＧＩ）管から遠隔の部位におけるその同様の微生物の経口投与の有利な効果の任意のものの推定の基礎も、これが達成される経路についての証拠も提供しない。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において報告される研究は、ヒトにおける、減少したアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の消化管レベルと、呼吸器疾患、より詳細には喘息の重篤度との間の連関を最初に示し、治療上関連する呼吸器炎症のマウスモデルにおける防御効果の実証を伴う。さらに、それは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）が、ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）においてＩＬＴ４（イムノグロブリン様転写体４）の発現を誘導できることを示した。ＩＬＴ４（しばしば、ＬＩＬＲＢ２とも呼ばれる）は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を分泌する調節性Ｔ細胞を誘導するのに重要であることが知られている。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を投与されたマウスは、肺組織リンパ球のうちで、ＩＬ−１０を分泌する調節性Ｔ細胞を増加させることが見出された。これらの所見は、以下により詳細に記載されるように、任意の代謝障害および／または肥満とは独立し、かつ無関係である、例えば喘息、特に重症喘息と関連するような、呼吸器炎症、および他の望ましくない炎症の予防および／または治療のためのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株のプロバイオティクスの使用の基礎を最初に提供する。
【００１０】
上に示される代謝障害は、エネルギーの利用および貯蔵の障害と関連することは理解されるであろう。代謝障害の共通の兆候は、特にウェストと胴の周りにおける脂肪組織蓄積を伴う中心性肥満または過体重である。代謝障害の他の兆候は、高血圧、空腹時血清ＨＤＬコレステロールの減少、空腹時血清トリグリセリドレベル（ＶＬＤＬ  トリグリセリド）の上昇、空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、または前糖尿病を含む。関連する状態は、高尿酸血症、非アルコール性脂肪肝疾患に進行する脂肪肝（特に同時肥満において）、多嚢胞性卵巣症候群（女性において）、勃起不全（男性において）、および黒色表皮腫を含む。
【００１１】
本明細書において言及される重症喘息は、次のように理解でき、そして定義できる。喘息の診断が確定し、そして共存症について取り組まれたとき、重症喘息は、「喘息が「制御不能」にならないようにするための高用量の吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）および第２のコントローラー（および／または全身性ＣＳ）による治療を必要とするか、またはこの治療にもかかわらず「制御不能」のままでいるような「喘息」」として定義される（１８）。
【００１２】
一態様において、本発明はこのように、望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物であって、炎症活性が代謝障害および／または肥満に起因しない、組成物を提供する。
【００１３】
そのような組成物は、好ましくは、経口投与のための、例えば、飲料の形態、または、経口摂取のための栄養組成物の他の形態である、ＧＩ管内の１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を送達するためのプロバイオティクス組成物であってもよい。組成物は、好ましくは、経口投与による、ＧＩ管内の１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を投与するための医薬組成物の形態であってよい。組成物は、消化されない株放出組成物（strain-release composition）であってよく、そのような場合、前記使用は、前記組成物を液体と接触させることによって、１つまたは複数のプロバイオティクス株が液体中に放出され、生じるプロバイオティクス液体組成物が消化されるプレステップをさらに含む。代替的に、使用されるプロバイオティクス組成物が、エアロゾル送達のために製剤化または包装されていることも想定される。
【００１４】
本発明の適用における使用のためのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株は、天然に存在する株およびさらなるバリアント（variant）、ならびに天然に存在するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株の遺伝子組換え変異体（mutant）を任意の形態で含み、ただし、腸において所望の免疫調節効果が維持されると理解されよう。
【００１５】
代替的に、本発明は、望ましくない炎症活性の予防および／または治療のための方法であって、ＧＩ管に１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を投与することを含み、前記炎症活性が、代謝障害および／または肥満に起因しない、方法を提供する。
【００１６】
本発明は次の図を参照することにより、以下にさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが、症状の重篤度が増加した制御不能な喘息患者において、減少していることを示す図であり、一方で図１Ｂは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルの減少が肥満と無関係であることを実証する図である。データは、糞便サンプルを用いる、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定に基づいた、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の相対存在量として表される。
【図１Ｂ】図１Ａは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが、症状の重篤度が増加した制御不能な喘息患者において、減少していることを示す図であり、一方で図１Ｂは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルの減少が肥満と無関係であることを実証する図である。データは、糞便サンプルを用いる、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定に基づいた、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の相対存在量として表される。
【図２】さまざまな重篤度の喘息を有する喘息患者の糞便サンプル中のＡ．ムシニフィラ（A. muciniphila）のゲノムＤＮＡを分析するための定量的ＰＣＲとアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）特異的なプライマーとに基づいて、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが肥満とは無関係の重症の疾患を有する喘息患者において減少することを示す図である。患者が、Ｃｈｕｎｇら（１８）によって定義されるように、１つまたは両方のメジャーな基準および少なくとも２つのマイナーな基準を満たす場合、患者は重症喘息の群に含められた。これらの基準を満たさない患者は、軽度または中程度の喘息の群に登録された。データは、定量的ＰＣＲを用いてアセスメントされ、ｎｇのＤＮＡ当たりのゲノムコピー数で表された。
【図３Ａ】図３Ａは、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）抽出物を急性負荷したマウスの肺への炎症細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示すグラフであり、図３Ｂは、炎症好中球の減少を強調するグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａは、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）抽出物を急性負荷したマウスの肺への炎症細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示すグラフであり、図３Ｂは、炎症好中球の減少を強調するグラフである。
【図４Ａ−１】図４Ａは、ハウスダストダニ抽出物によるマウスの慢性負荷に続く治癒／消散期間における、肺への炎症性自然細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図４Ｂは、リンパ球分画の減少を強調する図である。データは平均＋／−ＳＥＭで表される。データはＴｕｋｅｙ  ｐ値補正を用いた一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。分散を安定させるために必要なとき、データを対数変換した。０．０５未満のＰ値は有意であると考えた。
【図４Ａ−２】図４Ａは、ハウスダストダニ抽出物によるマウスの慢性負荷に続く治癒／消散期間における、肺への炎症性自然細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図４Ｂは、リンパ球分画の減少を強調する図である。データは平均＋／−ＳＥＭで表される。データはＴｕｋｅｙ  ｐ値補正を用いた一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。分散を安定させるために必要なとき、データを対数変換した。０．０５未満のＰ値は有意であると考えた。
【図４Ｂ−１】図４Ａは、ハウスダストダニ抽出物によるマウスの慢性負荷に続く治癒／消散期間における、肺への炎症性自然細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図４Ｂは、リンパ球分画の減少を強調する図である。データは平均＋／−ＳＥＭで表される。データはＴｕｋｅｙ  ｐ値補正を用いた一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。分散を安定させるために必要なとき、データを対数変換した。０．０５未満のＰ値は有意であると考えた。
【図４Ｂ−２】図４Ａは、ハウスダストダニ抽出物によるマウスの慢性負荷に続く治癒／消散期間における、肺への炎症性自然細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図４Ｂは、リンパ球分画の減少を強調する図である。データは平均＋／−ＳＥＭで表される。データはＴｕｋｅｙ  ｐ値補正を用いた一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。分散を安定させるために必要なとき、データを対数変換した。０．０５未満のＰ値は有意であると考えた。
【図５Ａ】図５Ａは、慢性ハウスダストダニ負荷モデルにおけるハウスダストダニ抽出物による再負荷に続く肺への好酸球の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図５Ｂおよび図５Ｃは、胚組織におけるＳｉｇｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈ好酸球の減少を強調する図である。
【図５Ｂ−１】図５Ａは、慢性ハウスダストダニ負荷モデルにおけるハウスダストダニ抽出物による再負荷に続く肺への好酸球の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図５Ｂおよび図５Ｃは、胚組織におけるＳｉｇｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈ好酸球の減少を強調する図である。
【図５Ｂ−２】図５Ａは、慢性ハウスダストダニ負荷モデルにおけるハウスダストダニ抽出物による再負荷に続く肺への好酸球の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図５Ｂおよび図５Ｃは、胚組織におけるＳｉｇｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈ好酸球の減少を強調する図である。
【図５Ｃ】図５Ａは、慢性ハウスダストダニ負荷モデルにおけるハウスダストダニ抽出物による再負荷に続く肺への好酸球の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図であり、図５Ｂおよび図５Ｃは、胚組織におけるＳｉｇｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈ好酸球の減少を強調する図である。
【図６】慢性ハウスダストダニ負荷モデルにおけるハウスダストダニ抽出物による再負荷に続くハウスダストマウス抽出物に特異的なＩｇＥ産生に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、オボアルブミン（ＯＶＡ）負荷マウスの肺への炎症細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示すグラフであり、図７Ｂは、炎症性好酸球の減少を強調する図である。
【図７Ｂ】図７Ａは、オボアルブミン（ＯＶＡ）負荷マウスの肺への炎症細胞の動員に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌の抑制的効果を示すグラフであり、図７Ｂは、炎症性好酸球の減少を強調する図である。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌動物の肺組織内の細胞が、エクスビボでＯＶＡによって再刺激されるときに、有意に少ないインターロイキン（ＩＬ）−４（図８Ａ）およびＩＬ−５（図８Ｂ）を分泌することを示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌動物の肺組織内の細胞が、エクスビボでＯＶＡによって再刺激されるときに、有意に少ないインターロイキン（ＩＬ）−４（図８Ａ）およびＩＬ−５（図８Ｂ）を分泌することを示す図である。
【図９】アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌動物の胚組織内に、より多くの調節性リンパ球が存在することを示す図である。
【図１０】ヒト樹上細胞によるＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４）発現を誘導するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の能力を示すグラフである。
【図１１】ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４に６日間曝露することによる樹状細胞の生成の後、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）と２４時間接触させたヒト末梢血単球の培養におけるＩＬ−１０分泌を誘導するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の能力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上述のように、本発明は、望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物であって、前記炎症活性が代謝障害および／または肥満に起因しない、組成物を提供する。
【００１９】
特に関心のあることは、本発明が、消化管から遠隔の望ましくない炎症活性に適用可能であることである。このような関心のある望ましくない炎症活性は、喘息増悪を含む喘息、ＣＯＰＤ増悪および好酸球性ＣＯＰＤを含むＣＯＰＤ、感染関連性炎症、アレルゲン誘導性炎症、アレルギー性鼻炎または慢性鼻副鼻腔炎などの場合に見られる気道炎症活性であってよい。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明は、喘息、特に腸内に正常より少ないレベルのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を有する喘息患者の気道炎症の予防および／または治療における使用のための１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を含む組成物を提供する。上述のように、そのようなアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の使用に関連して特に関心があることは、重症喘息である。以下にさらに説明するように、正常より少ない腸内レベルのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を有する喘息患者を、糞便サンプルに対するさまざまな定量的診断テストの適用によって簡便に予め同定してもよい。
【００２０】
例として、本発明はまた、関節リウマチなどの全身性炎症性疾患；自己免疫障害に関連する望ましくない炎症活性；例えば、アトピー性皮膚炎または乾癬に関連する望ましくない皮膚炎症活性、ならびに感染症もしくはがんまたはそれらの免疫療法に関連する炎症活性のいずれかの予防および／または治療における使用に応用することができることが想定される。例えば、細菌またはウイルスの感染に起因する呼吸器炎症活性の望ましくない増悪の予防および／または治療における使用のために適用してもよい。
【００２１】
望ましくない上部または下部の呼吸器炎症活性に関連した本発明の使用が、特に関心のある実施形態となるが、望ましくない消化管の炎症性疾患に関連したその使用、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、ポーチ嚢炎、感染後大腸炎または胃腸がんに関連する炎症などで認められる望ましくない消化管炎症活性の予防および／または治療における使用を排除するものではない。望ましくない炎症活性に起因する下痢性疾患、例えば大腸菌（E. coli）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）関連下痢症、ロタウイルス関連下痢症または感染後下痢症などの感染性細菌因子に起因する下痢性疾患の予防および／または治療に関連した使用を見出してもよい。
【００２２】
使用する１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株は、ヒト腸において、望ましい免疫調節効果を有する、ヒトの糞便または生検に由来する天然に存在する株、または天然に存在するそれらのバリアントであってもよい。天然に存在するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株の遺伝子組換え変異体もまた、それらが望ましい活性を保持する限り、使用してもよい。これは、例えば、インビトロでヒト樹状細胞にＩＬＴ４発現を誘導する能力と等しくてもよい。この目的のための好適なアッセイは、以下の例示で述べられる。
【００２３】
本発明による使用のための組成物は、ラクトバシラス属（Lactobacillus）およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）などの別の細菌種の１つまたは複数のプロバイオティクス株を追加で含んでもよく、例えば１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株を欧州特許第１１４１２３５号明細書に記載されるようなビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティス（Bifidobacterium longum infantis）３５６２４またはそのバリアントもしくは変異体と組み合わせてもよい。しかしながら、免疫学的効果を有する任意の他のプロバイオティクス細菌株も考慮できる。代替的に、異なる種の細胞を、異なる組成物中で、逐次的にまたは同時に投与し得る。
【００２４】
本発明による使用のための組成物は、１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株のＧＩ管への直接的な送達のためのものであってよい。好ましくは、本発明による使用のための組成物は、直接的な経口摂取に好適なプロバイオティクス組成物であろう。しかしながら、上述のように、消化されないが、液体と接触することによって前記１つまたは複数の株が前記液体中に放出され、次いで、生じるプロバイオティクス液体組成物が摂取されるような株放出組成物を提供できる。例えば、特に１つまたは複数のプロバイオティクス株が小児に送達されるべきものであるとき、最初に、飲用ストロー内の、例えば油懸濁液である組成物中に１つまたは複数のプロバイオティクス株を提供し、それによって１つまたは複数の株が、例えば飲料用紙パックからのジュースまたは牛乳などのストローを通じて引っ張られる液体へと移されることが有益であり得る。そのようなプロバイオティクス株を収納するストローは、例えば、欧州特許第１２２４１２８号明細書（Ｂｉｏｇａｉａ  ＡＢ）に記載される。
【００２５】
本発明による経口投与のためのプロバイオティクス組成物は、１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）株と摂取可能な担体とを含んでよい。組成物は、好ましくは、例えば飲用ヨーグルト、ジュースもしくは牛乳などの飲料の形態、または他の栄養組成物の形態であってよい。組成物は、ヒトおよび／または動物の摂取に好適であってよい。例えば、組成物は、ヨーグルト、チーズ、菓子、シリアルまたは栄養補給のスナックバーなどの食品の形態であってよい。組成物は栄養補助食品の形態であってよい。例えば、１つまたは複数のプロバイオティクス株は、プロバイオティクス株をＧＩ管内に放出する、例えばカプセル剤内の栄養補給の油懸濁液中に供給されてもよい。
【００２６】
本発明による使用のための組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、好ましくは、摂取可能な担体を含む経口投与のためのそのような製剤として製剤化されてもよい。そのような組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤または座剤などの固体の形態であってよい。組成物は、１つまたは複数のプロバイオティクス株をＧＩ管内に放出するための放出制御製剤であってよい。組成物は、リポソーム組成物または懸濁液、例えば、油懸濁液などの液体の形態であってよい。そのような液体組成物は、同様に１つまたは複数のプロバイオティクス株をＧＩ管内に放出するための、カプセル剤またはマイクロカプセル剤を提供するためのカプセル封入物質内に提供されてもよい。組成物はエアロゾル送達のための製剤であってよい。本発明による使用のための医薬組成物は、対象の望ましくない炎症活性または関連する状態の予防および／または治療に好適な非微生物性治療剤、例えば化学薬物または治療用生物製剤を追加で含んでもよい。
【００２７】
本発明による使用のための組成物は、適切な単位投薬量のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を提供するように製剤化されるであろう。これは投与形態に伴って変化し、例えば、治療すべき個体が子供か大人かによって変化してよい。例えば、少なくとも約１０４ｃｆｕ、より好ましくは少なくとも１０５ｃｆｕまたは少なくとも１０６ｃｆｕ、例えば、１０６〜１０１０ｃｆｕの投薬量が、１日当たり少なくとも１回で企図されてもよい。投与は、望ましくは、ＧＩ管内のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが、健常な個体に予測される正常レベル付近にまで少なくとも回復するまでか、またはそこで維持されるように継続するであろう。
【００２８】
例えばＤｅｒｒｉｅｎらによってヒトの糞便より単離され、凍結乾燥調製物としてＡＴＣＣより入手可能なアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＢＡＡ−８３５（商標））、またはヒトの糞便または生検から同様に単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）などのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、Ｄｅｒｒｉｅｎらによってこれまでに記載される（１１）ようにムチンベースの培地で嫌気的に増殖でき、次いで上述のような投与のための適切な組成物中に組み込まれ得る。例えば、そのように培養されたアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、洗浄され、そして少なくとも最初に、例えば、厳格な嫌気条件下で、２５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む嫌気性のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度まで懸濁され得る。これまでに記載されるように（１５、１６）、保管は−８０℃においてであってよく、その後の解凍、および例えば嫌気性のＰＢＳによるさらなる希釈の可能性がある。
【００２９】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の酸素感受性のため、本発明による使用前の保管は、空気との接触から保護すべきであろう。保管は、例えば脂質ゲルまたは脂質滴中であってよい。
【００３０】
本発明による使用のための組成物は、概して、空気との長時間の接触を回避するのを助けるために、使用前に密封の容器または包装中に保管されるであろう。保管は、ブリスターパックの密封された区画中で提供される、可消化固形組成物、例えば、丸剤の形態であってよい。
【００３１】
ＧＩ管への送達による本発明による使用のための組成物は、１つまたは複数のプレバイオティクス（prebiotic）物質を追加的に補充してもよい。そのような物質は、ＧＩ管内での１つまたは複数のプロバイオティクス株の増殖を促進するが、ヒトによって代謝される必要がないと認識される。用語「プレバイオティクス」は、常在菌によって結腸内で特異的に発酵することができ、かつ有益な価値であると考えられる任意の非生存の食物成分を指すと理解されるであろう。関心の対象であるプレバイオティクスの種類は、フルクトース、キシロース、ガラクトース、グルコースおよびマンノースの１つまたは複数を含有するものを含む、難消化性オリゴ糖を含む。大豆はプレバイオティクスとして使用できる。細菌株と１つまたは複数のプレバイオティクス物質との併用投与は、株のインビボでの増殖を増強し、より顕著な健康の利益をもたらし、シンバイオティクス（synbiotic）と呼ばれる。
【００３２】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のＧＩ管内における増殖を促進するプレバイオティクス物質を用いることは特に好ましくあり得る。例として、オリゴフルクトースがマウスＧＩ管内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の増殖を促進することが示されている（１６）。オリゴフルクトース（例として、例えばＢｅｎｅｏ  ＧｍｂＨより供給されるＯｒａｆｔｉ（登録商標）Ｐ９５などの、Ｏｒａｆｔｉ（登録商標）オリゴフルクトース調製物などの、市販のオリゴフルクトース調製物）が、本発明の適用における１つまたは複数のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）と共にプレバイオティクスとして投与されるのに有用な成分であり得ることが推定できる。プレバイオティクスは、同一の組成物または別個で、同時にまたは逐次的に投与できる。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、望ましくない炎症活性の予防および／または治療における使用のための、ＧＩ管内においてアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の増殖を促進することができるプレバイオティクス物質、例えば上述のオリゴフルクトースであって、前記炎症活性が、代謝障害および／または肥満に起因しない、プレバイオティクス物質を提供する。関心の対象であるそのような炎症活性は、ＧＩ管内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の正常なレベルを下回ることに伴うことが予測され、プレバイオティクスは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルを上げるためかまたは実質的に維持するために投与でき、好ましくは、健常な個体の正常レベルまたはその近辺にまで回復するか、またはそこで維持するようになる。望ましくない炎症活性は、上述のような任意の望ましくない炎症活性であってよく、特に例えば喘息、ＣＯＰＤ、好酸球性ＣＯＰＤ、感染関連性炎症、アレルゲン誘導性炎症、アレルギー性鼻炎または慢性鼻副鼻腔炎と関連するような望ましくない気道炎症活性であってよい。
【００３４】
本発明のさらなる態様において、好ましくはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を含有する組成物は、上述のように、同定されたアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の欠乏を治療することを目的として、個体におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の存在量を決定する診断テストと組み合わせて使用される。そのようなテストは糞便細菌マイクロバイオームの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＤＮＡのＰＣＲによる特異的検出または他の核酸ハイブリダイゼーションもしくは配列決定技術の適用、またはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の特異的検出のための選択培地における特異的培養の形態を取り得る。１６ｓ配列決定データを用いる、重症喘息患者におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の相対存在量の７５％パーセンタイルは、０．０１４２２であり、同定可能な配列の１．４２２％がアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）であることを意味する。これは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）治療が、約１．４％未満の相対存在量を有する喘息患者において最も効果的であり得ることを示唆する。ＰＣＲ法を用いる、重症喘息患者におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の７５％パーセンタイルは、６０．１コピー数／ｎｇ  ＤＮＡであり、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）治療が、総細菌ＤＮＡのｎｇ当たり約６０未満の検出されたコピー数を有する喘息患者において最も効果的であり得ることを示唆する。
【００３５】
本発明は、次の実施例からより明確に理解されるであろう。
［実施例］
【００３６】
最初に、部分的に制御されているかまたは制御不能の喘息症状を呈する喘息患者からの糞便サンプルにおいて、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが有意に低減していることを見出した。さらに、４つの異なる気道炎症のマウスモデルにおいて、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の摂取が疾患を引き起こす細胞の、肺への動員を有意に低減させることを見出した。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）が、免疫調節効果を有し、それは、インビトロでヒト樹状細胞のサイトカイン分泌を調節することができる。実際、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）による阻害分子ＬＩＲＢ２（ＩＬＴ４）の刺激が、驚くべきことに、プロバイオティクスとして典型的に使用される他の共生微生物において観察されるよりも有意に高い。
【００３７】
４つの気道炎症のマウスモデルを、主に好中球による応答と主に好酸球による応答の両方を見るために使用した。
【００３８】
好中球は食細胞の一種であり、通常血流中に見出される。炎症の初期（急性）の間、特に、細菌感染、環境曝露、およびいくつかのがんの結果として、好中球は、炎症細胞の最初の応答因子の１つであり炎症部位に向かって移動する。好中球は、化学遊走と呼ばれるプロセスにおいて化学シグナルを追って、血管、次いで間質組織を通って移動する。好中球は、膿における主要な細胞であり、膿の黄白色の外観の原因である。好中球は、病原体を破壊するのを助けるが、より高濃度おいて宿主細胞に有害な影響をも有する、広範囲のタンパク質を放出する。喘息および喘息憎悪は、肺内における高い好中球の数または高い好酸球の数と関連し得、その両方とも疾患の原因となる。
【００３９】
好酸球は白血球であり、寄生虫および特定の感染との戦いを担う免疫系の構成要素の１つである。マスト細胞と一緒に、それらはまたアレルギーおよび喘息に関連するメカニズムを制御する。肺または皮膚における好酸球の存在は疾患と関連する。好酸球は８〜１２時間、循環中に持続し、刺激物質の非存在において、さらなる８〜１２日間組織内で生存できる。好酸球は、アレルギー応答および喘息の病因の重要な仲介因子であり、疾患の重篤度に関連している。活性化に続いて、好酸球は、カチオン性顆粒タンパク質、活性酸素種、脂質メディエーター、酵素、増殖因子およびサイトカインを含む広範で強力な分子を放出する。好酸球によって放出される仲介因子の多くは、高レベルで宿主細胞に対して毒性である。
【００４０】
本明細書で呈示されるものおよび最近の文献からのマウスのハウスダストダニ（ＨＤＭ）再負荷モデル実験からの証拠は、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ発現に基づいて肺組織内の２種の異なる好酸球の集団を同定することができることを実証する。好酸球の肺に定住する集団は、Ｓｇｉｌｅｃ−Ｆｉｎｔとして同定され、一方、ＨＤＭ再負荷後に浸潤する炎症性集団は、Ｓｇｉｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈと同定される。炎症性好酸球は、ＩＬ−５依存性であり、Ｔｈ２応答に向かう傾きを促進することが見られ、一方で、定住集団は、ＩＬ−５非依存性であり、樹状細胞のアレルギー誘発性機能を阻害することを担う、より調節性の機能を有すると考えられる（１９、２０）。Ｍｅｓｎｉｌと同僚は、肺内における定住のおよび炎症性の好酸球集団の存在に基づいて、健常な個体から喘息患者を層別化することも可能であることを実証し、喘息患者がより大きい数の炎症性好酸球を有し、それゆえ、好酸球の表現型と疾患との間の関連性が示唆された。
【００４１】
後述されるアッセイは、ＩｇＥ、ＩＬＴ４、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ−１０、およびＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を測定した。
【００４２】
ＩＬ−４は、Ｔｈ２細胞、好塩基球、マスト細胞および好酸球によって産生される１５ｋｄのモノマー（１２９アミノ酸）である。２つの型のＩｌ−４受容体が存在する。Ｉ型ＩＬ−４Ｒは、ＩＬ−４にのみ結合し、２つの受容体鎖、ＩＬ−４Ｒα（ＣＤ１２４）と共通のγｃ（ＣＤ１３２）とからなる。ＩＩ型ＩＬ−４ＲはＩＬ−４およびＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１の鎖からなる。多機能性サイトカイン、ＩＬ−４は、アレルギー状態ならびに蠕虫および他の細胞外寄生虫に対する防御免疫応答を促進する。ＩＬ−４は、Ｔｈ２細胞発生の主要な刺激物質であり、それはまた、Ｔｈ１細胞の発生を抑制し、Ｂ細胞におけるＩｇＥクラススイッチを誘導する。ＩＬ−４は、Ｂ細胞上のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現を増加させ、Ｂ細胞受容体を上方制御し、ＣＤ２３の発現を増加させ、培養中のＴ細胞およびＢ細胞の寿命を伸ばし、組織接着および炎症を仲介する。ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαノックアウトマウスは、Ｔｈ２細胞分化が欠損し、ＩｇＧ１およびＩｇＥの血清レベルが低減する。
【００４３】
ＩＬ−５は、主に、パイエル板内のＣＤ４＋Ｔｈ２細胞、活性化好酸球、マスト細胞、ＣＤ８＋Ｔｈ２細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ４−ｃｋｉｔ−ＣＤ３ε−ＩＬ−２Ｒα＋細胞によって産生される。その受容体は、ＩＬ３およびＧＭ−ＣＳＦとβ鎖（ＣＤ１３１）を共有する。ＩＬ−５は、好酸球の増殖、活性化、分化、生存、および接着を促進する。ＩＬ−５を分泌するＴｈ２細胞は、好酸球を動員し、喘息を有する患者における気道過敏の誘導に寄与する。ＩＬ−５、Ｔｈ２細胞および好酸球のレベルは、気管支肺胞洗浄液検査において増加し、喘息の重篤度と相関する。ＩＬ−５欠損マウスは正常に発達するが、実験的喘息の誘導に耐性であり、低減したブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）の排除を示し、そして対照マウスと比較して粘膜固有層におけるより少ないＩｇＡ＋抗体細胞を有する。ＩＬ−５を標的とする臨床試験はさまざまな結果をもたらしたが、難治性好酸球性喘息を有する患者は、増悪ならびに喀痰および血液中の好酸球の低減数と生活の質の向上とを有することが報告された（２１）。
【００４４】
ｓｃｕｒｆｉｎとしても知られるＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、免疫系応答に関与するタンパク質である。ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーである、ＦＯＸＰ３は、調節性Ｔ細胞の発生および機能における主要調節因子（転写因子）である。調節性Ｔ細胞は、宿主組織に損傷を与える可能性のある過剰な免疫応答を防止する。自己免疫疾患において、調節性Ｔ細胞活性の欠乏は、他の自己免疫細胞が身体自身の組織を攻撃することを可能にする。調節性Ｔ細胞誘導および／または活性の欠乏は、複数のアレルギーおよび喘息のモデルにおいて実証されている。
【００４５】
イムノグロブリン様転写体４（ＩＬＴ４）は、樹状細胞上に発現でき、ＨＬＡ−Ｇと結合する。ＩＬＴ４とＨＬＡ−Ｇテトラマーの結合は、共刺激分子発現の上方制御を防ぎ、樹状細胞成熟を阻害し、アネルギー／サプレッサーＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を促進する。さらに、重要な免疫調節性ＩＬ−１０分泌Ｔ細胞サブセット、Ｔｒ１細胞の分化は、ＩＬ−１０依存性ＩＬＴ４／ＨＬＡ−Ｇ経路に依存する（２２）。これらのＴｒ１細胞は、寛容誘導において中心的な役割を果たし、例えば、喘息患者の炎症を起こした肺において観察されるような、異常な炎症活性の抑制に寄与する。
【００４６】
ＩＬ−１０は、免疫応答のいくつかの側面の重要な調節因子である抗炎症性サイトカインである（２３）。ＩＬ−１０遺伝子は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４およびＩＬ−２６の遺伝子を含む、染色体１ｑ３１−３２上のサイトカインクラスターに位置する。ＩＬ−１０は、単球、Ｔ細胞（主にＴｒ１細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および樹状細胞によって主に産生される。ＩＬ−１０は、それぞれ、およそ１８ｋｄの分子量の１７８アミノ酸の２つのサブユニットからなるホモダイマーとして分泌される。ＩＬ−１０は、マクロファージおよび単球の表面上のＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子の発現を下方制御することによって抗原提示細胞の機能に直接的に影響を与える。ＩＬ−１０は、多くの炎症性サイトカイン、ケモカインおよびケモカイン受容体の発現を阻害し、アレルゲン特異的免疫療法においておよび高用量のアレルゲンに対する曝露の後において、アレルゲン寛容を仲介する。これらの間接的な影響に加えて、ＩＬ−１０は、ＣＤ２８、ＣＤ２を抑制することによってＴ細胞活性化に、およびチロシンリン酸化酵素ＳＨＰ−１を介して誘導性Ｔ細胞共刺激分子のシグナル伝達に、直接的に影響を与える。Ｔ細胞に対する阻害効果と対照的に、ＩＬ−１０は、ヒトＢ細胞の生存、増殖および分化を促進し、ＩｇＧ４の産生を増加させる。いくつかのマウスモデルは、炎症応答の調節におけるＩＬ−１０の重要性を実証する。ＩＬ−１０ノックアウトマウスは正常なリンパ球および抗体応答を発生させるが、低減した成長を有し、貧血であり、慢性大腸炎を自発的に発症する。
【００４７】
血清中の上昇したイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）レベルの存在は、喘息などのアレルギー性疾患において観察される炎症カスケードの不可欠な部分とみなされる。アレルゲン特異的ＩｇＥの誘導は、アレルギー性肺炎症の動物モデルにおいてならびにヒト喘息患者において検出され、アレルギーの発症を駆動する関連する細胞性（ＴおよびＢ細胞系）および体液性メカニズムの開始の指標である。それゆえ、治療的介入によるアレルゲン特異的ＩｇＥ応答の調節は、アレルギーの発症を根本的に支えるメカニズムの調節を指向する。さらに、ＩｇＥの上昇したレベルの重要性は、抗ＩｇＥ抗体療法が、重症喘息憎悪の低減において重要であることが示されているという事実によって実証される（２４）。
【実施例１】
【００４８】
喘息患者由来の糞便中の細菌種の存在量
新しく排泄された糞便サンプルが、喘息患者から得られ、分析まで−８０℃で保管された。解凍時に、ＤＮＡを糞便サンプルから抽出し、１６ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ４領域をＰＣＲで増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ＭｉＳｅｑを用いて配列決定し、同一の配列をまとめて操作的分類単位（ＯＴＵ）に分類した。ＯＴＵを、公知の１６ｓ配列とアラインメントし、各ＯＴＵの相対存在量を計算した。
【００４９】
マイクロバイオーム分析に加えて、臨床データをすべての喘息患者から収集した。特に、症状制御のレベルを、次の設問を問う、国際的に検証されたアンケートを用いてアセスメントした。
次のいずれかを経験したか？
１．週に２回を超える昼間の喘息の症状があったか？
２．喘息の症状のために夜間に目が覚めたか？
３．前の週に２回を超えて救急薬を使用したか？
４．喘息の症状のために運動や身体活動が制限されたか？
４つの質問すべてに対する「いいえ」という回答は、喘息患者がよく制御されていると考えられることを意味する。１つまたは２つの質問に対する「はい」という回答は、患者が部分的に制御されていることを意味し、一方で３つまたは４つの質問に対する「はい」という回答は、患者が制御不能の喘息の症状を有することを意味する。
【００５０】
驚くべきことに、喘息患者からのマイクロバイオームデータを、制御された、部分的に制御された、および制御不能のカテゴリーに分けるとき、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルが、部分的に制御されるかまたは制御不能の喘息の症状を有する患者において有意に低いことを発見した（図１Ａ）。重要なことに、制御された喘息患者におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルは、健常なボランティアにおいて観察されるものと同様であり、これら個体から得られたすべての配列のおよそ８％を表した。このように、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、結腸内において、数値的に最も優勢な種の１つである。制御不能の喘息の症状を有する患者におけるマイクロバイオームのおよそ１〜２％に対する低減は、潜在的に重大な健康上の結果を伴う巨大な減少である。上述のように、これは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の減少した消化管のレベル間の関係が、肥満またはアトピーの存在に関係ない呼吸器疾患の重篤度とはじめて結びつけられた。
【００５１】
１６ｓ配列決定データを確認するために、糞便サンプル中のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のレベルもまたＰＣＲを用いて定量した。定量的ＰＣＲ解析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて実施し、使用したアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）特異的プライマー配列は、ＡＭ１  ５’ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ３’（配列番号１）およびＡＭ２  ５’ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ３’（配列番号２）であった。実験のサイクル条件は、５０℃２分間、９５℃１０分間、９５℃１５秒間、６０℃１分間を４０サイクルであった。定量的ＰＣＲの結果は、１６ｓ配列決定データと同一であった（図２）。
【実施例２】
【００５２】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、喘息のマウスモデルにおいて防御的である。
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）が肺炎症応答に直接的に影響を与ええる能力を有するかを解明するために、本発明者らは、マウスのハウスダストダニ呼吸器炎症研究を実施した。ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルゲンは、喘息患者がそれに対してアレルギー性である最も一般的な空中アレルゲンの１つである。マウスへのＨＤＭ抽出物の鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与は、肺の炎症応答を生じた。本発明者らは、ＨＤＭ抽出物を、０日目にｉ．ｎ．投与し（１μｇ）、次いで７日、８日、９日、１０日および１１日目により高い用量（各日に１０μｇ）でｉ．ｎ．投与した。このモデルは、急性負荷モデルとみなされた。動物は、１４日目に安楽死させ、炎症細胞の計数のために気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を得た。（本発明者らのストック培養からの）アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を、−５日目に開始して研究の最後まで、強制経口投与（oral gavage）によって毎日投与した（およそ１×１０８細胞）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を、３７℃の１０ｍｌアリコートの嫌気性ムチンｖ３培地（１０％播種）中で１６時間増殖した。ムチンｖ３培地から酸素の存在を除去するために窒素（および煮沸）を用いた。ムチンｖ３培地は、ペプトン、酵母抽出物、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＮａＨＣＯ３、グルコース、ＩＩ型ムチン、ヘミン、システインおよび水を含有する。陰性対照動物は、同一の日にＮａＣｌをｉ．ｎ．で受け、陽性対照動物は、ＨＤＭ抽出物をｉ．ｎ．で受けた。
【００５３】
驚くべきことに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の経口投与は、ＨＤＭ抽出物のみを受けた動物と比較して、ＨＤＭ抽出物に曝露された動物のＢＡＬへの炎症細胞動員を有意に防御した（図３Ａ）。顕微鏡的分類細胞計数（microscopic differential cell count）を実施するとき、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）処理動物における低減したＢＡＬの炎症細胞数は、このモデルにおける優勢な浸潤する炎症性細胞型である、好中球の低減した移動に主として起因するものであることは明らかであった（図３Ｂ）。
【００５４】
慢性および再負荷モデル
ハウスダストダニ（ＨＤＭ）抽出物などのタンパク質分解活性アレルゲンによる慢性鼻腔内負荷は、肺内のアレルギー性炎症変化を誘発することが示された（２５）。ＨＤＭ抽出物は、タンパク質分解性酵素（Ｄｅｒｐ）およびＬＰＳを含む多くの異なる物質からなり、それゆえ、組織細胞および免疫細胞（リンパ球性および骨髄性）と仲介因子との間の広範な相互作用を含む炎症応答を引き起こし得る（２６〜２８）。ここに示される実験において、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）を、３週の間（感作期間、１〜１９日）、週に５日間、滅菌生理食塩水または５０μｌの容量中２５μｇのＨＤＭ抽出物（Ｇｒｅｅｒ  ｌａｂｓ、ＵＳ、バッチ番号：２１８８６２）のいずれかで鼻腔内負荷した。このモデルは、上述のものと異なり、呼吸器炎症の慢性モデルとみなされる。
【００５５】
ＨＤＭ感作マウスにおいて生じる肺炎症は、２週間の期間（２０日目〜３３日目）、部分的に消散させた。消散期間の終了時（３４日目）において、マウスは、食塩水または全容量５０μｌ中のＨＤＭ（１００μｇ）による再負荷のいずれかにより鼻腔内負荷された。このモデルにおけるＨＤＭ再負荷は、７日の期間（３４〜４０日目）にわたって肺への顆粒球およびリンパ球の浸潤を生じることを示した。ＨＤＭ再負荷マウスにおける肺好酸球応答は、ＨＤＭ再負荷後２４時間（３５日目）から、および１６８時間（４０日目）のピークにおいて、生理食塩水負荷の動物のものとは有意に異なった。ここに示される実験において、マウスに、培地対照またはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）のいずれかを、２０日目から開始（ＨＤＭ感作の停止後）して１日１回、強制経口投与（０．２ｍｌ）によって投薬した。経口投薬は、消散期間全体にわたって、およびＨＤＭ再負荷の後継続し、最終的に３９日目に停止した。マウスの群を、実験の消散期中の所定の時点（２８日目）、ならびにＨＤＭ再負荷の後（４時間（３４日目）、２４時間（３５日目）および１６８時間（４０日目））に犠牲にした。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および肺組織中に存在する細胞を、多色フローサイトメトリーを用いて分析し、定量した。
【００５６】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌は、実験の消散期においてＢＡＬＦに存在する炎症性細胞（顆粒球およびリンパ球）の増強した排除をもたらした（図４Ａおよび４Ｂ）。ＨＤＭ再負荷の後の好酸球のＢＡＬＦへの浸潤は、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）給餌によって有意に抑制した（図５Ａ）。浸潤した炎症性好酸球（Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆｈｉｇｈ  ｅｏｓ）の数はまたアッカーマンシア属（Akkermansia）で給餌されたマウスの肺組織中において有意に阻害された（図５ＢおよびＣ）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）はまた、４０日目（ＨＤＭ再負荷の後１６８時間）における血清中のＨＤＭ特異的ＩｇＥの誘導を有意に阻害することもできる（図６）。
【００５７】
ＨＤＭマウスモデルは、アレルゲン抽出物に対する応答が試験され、本発明者らはまた、単一のアレルゲンによって駆動肺疾患の好酸球優勢モデルにおけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の影響を試験したいと希望した。マウスは、０日目、１４日目および２１日目において腹腔内注射（アジュバントａｌｕｍを用いて）によってタンパク質オボアルブミン（ＯＶＡ）に対して感作され、２６〜２８日目に繰り返されるＯＶＡエアロゾル負荷が後に続いた。動物は、肺疾患のパラメータの分析のために２９日目に安楽死させた。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、ＡＴＣＣ［アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）、Ｄｅｒｒｉｅｎら、（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＢＡＡ−８３５（商標））］より購入され、研究の間、強制経口投与（およそ１×１０８細胞）によって投与された。同様に、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を、３７℃で１０ｍｌアリコートの嫌気性ムチンｖ３培地（１０％播種）中で１６時間増殖した。
【００５８】
驚くべきことに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、ＯＶＡのみを受けた動物と比較して、ＯＶＡに曝露された動物のＢＡＬへの炎症細胞動員を有意に防御した（図７Ａ）。顕微鏡的分類細胞計数を実施するとき、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）処理動物における低減したＢＡＬの炎症細胞数は、このマウスモデルにおける優勢な浸潤する炎症性細胞型である、好酸球の低減した移動に主として起因するものであることは明らかであった（図７Ｂ）。
【００５９】
切除された肺組織より単離した細胞もまた、ＯＶＡに対するサイトカイン応答をアセスメントするためにインビトロにおいてＯＶＡで再刺激した。予測通り、ＯＶＡアレルギー動物由来のリンパ球は、非アレルギー動物由来のリンパ球と比較して、ＯＶＡに応答して、有意により多くのＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌した（図８Ａおよび８Ｂ）。しかしながら、このＩＬ−４およびＩＬ−５分泌における増加は、強制経口投与によってアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）で処理された動物由来の肺組織細胞では観察されなかった。
【００６０】
肺組織リンパ球の詳細な分析は、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）投与されたマウスの肺組織においてＩＬ−１０を分泌するＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞が有意により多く存在することを明らかにした（図９）。これらの細胞は、典型的には、異常な炎症応答の強力な抑制因子である。このように、肺におけるこれらの細胞の増加が、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の防御効果を説明し得る。
【実施例３】
【００６１】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、樹状細胞において免疫調節および抗炎症応答を誘導する。
消化管内に存在する細菌によって劇的で予想外の肺での抗炎症性肺効果がいかに誘導されるのかについて調査する観点で、さらなる研究を実施した。樹状細胞は、腸粘膜内の重要な細胞型の１種であり、これは、管腔内細菌をサンプリングし、下流のリンパ球応答に強力な極性化効果を誘導する（２９）。したがって、本発明者らは、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）が高レベルの免疫調節分子を発現するよう樹状細胞を刺激して、これが、肺において観察される下流の抗炎症効果を促進するという仮説を立てた。
【００６２】
ヒト単球由来の樹状細胞（ＭＤＤＣ）は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で６日間、ヒト末梢血単球を培養することによって生成した。ＭＤＤＣを、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）に２４時間暴露し、ＩＬＴ４の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって測定し、一方で、ＩＬ−１０サイトカイン分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、３７℃で１０ｍｌアリコートの嫌気性ムチンｖ３培地（１０％播種）中で１６時間増殖させることによって調製した。細菌細胞数を顕微鏡によって決定し、細菌細胞を５０：１の細菌細胞：ＭＤＤＣ細胞の比でＭＤＤＣに添加した。
【００６３】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、非常に多数のＭＤＤＣにおいてＩＬＴ４発現を誘導した（図１０）。驚くべきことに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）が誘導するＩＬＴ４発現は、他のプロバイオティクス微生物（例えば、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）またはラクトバシラス属（Lactobacillus））または黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）などの病原体によって観察される効果よりも有意に高かった（図１０）。ＩＬＴ４は、ＩＬ−１０を分泌できる、調節性Ｔ細胞の誘導を主に担う。上述のマウスモデルにおいて記載されるＩＬ−１０陽性の調節性Ｔ細胞の増加した数が、樹状細胞によるＩＬＴ４発現の誘導に起因する可能性がある。調節性細胞表面分子ＩＬＴ４の非常に高い発現の誘導に加えて、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、別の抗炎症分子である、ＩＬ−１０の非常に高レベルの分泌をもまた誘導する（図１１）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、３７℃で１０ｍｌアリコートの嫌気性ムチンｖ３培地（１０％播種）中で１６時間増殖させることによって調製した。細菌細胞数を顕微鏡によって決定し、細菌細胞を１０：１、２５：１または５０：１の細菌細胞：ＭＤＤＣ細胞の比でＭＤＤＣに添加した。
【００６４】
このデータは、肺におけるアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の防御効果が、腸内の調節性樹状細胞の誘導を部分的に介するものであり、それは調節性リンパ球の局所極性化を促進し、次いで、これらの調節性リンパ球は、例えば肺などの他の粘膜部位へと移動でき、炎症促進性応答を弱める。
【００６５】
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【図１Ａ】
2018534277.tif 000002
【図１Ｂ】
2018534277.tif 000003
【図２】
2018534277.tif 000004
【図３Ａ】
2018534277.tif 000005
【図３Ｂ】
2018534277.tif 000006
【図４Ａ−１】
2018534277.tif 000007
【図４Ａ−２】
2018534277.tif 000008
【図４Ｂ−１】
2018534277.tif 000009
【図４Ｂ−２】
2018534277.tif 000010
【図５Ａ】
2018534277.tif 000011
【図５Ｂ−１】
2018534277.tif 000012
【図５Ｂ−２】
2018534277.tif 000013
【図５Ｃ】
2018534277.tif 000014
【図６】
2018534277.tif 000015
【図７Ａ】
2018534277.tif 000016
【図７Ｂ】
2018534277.tif 000017
【図８Ａ】
2018534277.tif 000018
【図８Ｂ】
2018534277.tif 000019
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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