(57)【要約】本発明は、慢性閉塞性肺疾患の急性増悪の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪を処置する方法であって、治療有効量のフラジェリンポリペプチドを該対象に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のフラジェリンポリペプチドを該対象に投与することを含む、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪を処置する方法。
【請求項２】
ＣＯＰＤの急性増悪が、細菌感染によって、ウイルス感染によって又は大気汚染によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌感染が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）又はモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）によって引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象が、ＣＯＰＤの急性増悪を経験したか、又はＣＯＰＤの急性増悪を経験するリスクを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象が、頻回増悪者である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フラジェリンポリペプチドが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フラジェリンポリペプチドが、ａ）配列番号３の１位に位置するアミノ酸残基から開始して、配列番号３の９９位〜１７３位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＮ末端ペプチド；及びｂ）配列番号３の４０１位〜４０６位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基から開始して、配列番号３の４９４位に位置するアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＣ末端ペプチドを含み、前記Ｎ末端ペプチドが、前記Ｃ末端ペプチドに直接的に連結されているか、又は前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドが、スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｎ末端ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列１〜９９、１〜１３７、１〜１６０及び１〜１７３からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ末端ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列４０１〜４９４及び４０６〜４９４からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列１〜１７３及び４０１〜４９４からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列１〜１６０及び４０６〜４９４からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列１〜１３７及び４０６〜４９４からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドが、ＮＨ２−ＧＩｙ−ＡＩａ−ＡＩａ−ＧＩｙ−ＣＯＯＨ（配列番号４）ペプチド配列からなる中間スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号３の４８８位に位置するアスパラギンアミノ酸残基が、セリンで置換されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
フラジェリンポリペプチドを抗生物質と組み合わせて対象に投与する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の急性増悪の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、増加している深刻な世界的健康問題である。２０２０年までに、ＣＯＰＤは、世界で（現在の）６番目に多い死因から３番目に多い死因へと増加するであろう。米国では、ＣＯＰＤは、１年間に最大１２０，０００件の死亡理由であると考えられている。ＣＯＰＤの臨床経過は、病原体、吸入刺激物（例えば、タバコの煙）、アレルゲン又は汚染物質への曝露を含む様々な刺激によってトリガーされ得る断続的な急性増悪を伴う慢性障害を特徴とする。「急性増悪」は、対象のＣＯＰＤ症候の、彼又は彼女の通常状態からの悪化であって、日々の正常変動を超えるものであり、発症が急性である悪化を指す。ＣＯＰＤの急性増悪は、ＣＯＰＤを有する対象の健康及び生活の質に大きな影響を与える。ＣＯＰＤの急性増悪は、この疾患の関連する大きな社会経済的コストの主な作用因である。また、複数の研究により、過去の憎悪は、ＣＯＰＤによる将来の入院の独立リスク因子であることが示されている。結論として、対象に対する長期有害効果、疾患進行の加速、及び高い医療コストの観点から、ＣＯＰＤの憎悪は非常に重要である。しかしながら、現在までに、ＣＯＰＤの急性増悪のための処置はない。
【０００３】
生来のレセプターの活性による免疫のモデュレーションは、感染症に対する防御反応を誘発するための新たなコンセプトである。論理的根拠は、病原体それ自体によってトリガーされる先天性反応を規模、質及びダイナミクスにおいて大きく超える先天性反応を促進することである。感染性疾患の治療的処置のためのＴＬＲアゴニストの有効性は、気道感染症のモデルを含むいくつかの動物モデルにおいて実証されている。ＴＬＲ５は、鞭毛の主な構成要素である細菌フラジェリンを感知する。上皮細胞を含む様々な肺菅細胞がＴＬＲ５を発現するが、慢性閉塞性肺疾患の急性増悪の処置について、ＴＬＲ５シグナリング経路のモデュレーションはまだ研究されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の急性増悪の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪を処置する方法であって、治療有効量のフラジェリンポリペプチドを該対象に投与することを含む方法に関する。
【０００６】
本明細書で使用される「急性増悪」という用語は、当技術分野における一般的な意味を有し、対象のＣＯＰＤ症候の、彼又は彼女の通常状態からの悪化であって、日々の正常変動を超えるものであり、発症が急性である悪化を指す。典型的には、ＣＯＰＤの急性増悪は、呼吸困難の悪化、喀痰産生の増加、喀痰膿の増加、喀痰の色の変化、咳の増加、上気道症候（風邪及び咽頭痛を含む）、喘鳴の増加、胸部の圧迫、運動耐容能の減少、疲労、体液貯留及び急性錯乱から選択される１つ以上の症候によって現れ、前記方法は、前記症候の１つ以上の頻度、重症度又は継続期間を軽減することを含む。急性増悪は様々な病因を有し得るが、典型的には、ウイルス感染、細菌感染又は大気汚染によって引き起こされ得る。例えば、急性増悪の約５０％は、主に、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）及びモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）（これらは全て、肺炎を引き起こす）によるものである。ＣＯＰＤを有する患者における急性増悪に関連するウイルス病原体としては、ライノウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、コロナウイルス、アデノウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスが挙げられる。
【０００７】
いくつかの実施態様では、ＣＯＰＤの急性増悪は、細菌感染によって引き起こされる。いくつかの実施態様では、ＣＯＰＤの急性増悪は、ウイルス感染によって引き起こされる。いくつかの実施態様では、ＣＯＰＤの急性増悪は、大気汚染によって引き起こされる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、対象はＣＯＰＤの急性増悪を経験したか、又はＣＯＰＤの急性増悪を経験するリスクを有する。いくつかの実施態様では、対象は、過去２４カ月以内にＣＯＰＤの少なくとも１回の急性増悪を経験している。特定の一実施態様では、対象は、過去１２カ月以内にＣＯＰＤの少なくとも１回の急性増悪を経験している。いくつかの実施態様では、対象は、頻回増悪者である。本明細書で使用される「頻回増悪者」という用語は、ＣＯＰＤを患っているか、又はＣＯＰＤの処置を受けている対象であって、１２カ月間で少なくとも２回、より典型的には３回以上の急性増悪を経験する対象を指す。
【０００９】
いくつかの実施態様では、「処置すること」は、ヒトにおける、ＣＯＰＤの急性増悪の処置、ＣＯＰＤの急性増悪の頻度、継続期間若しくは重症度の軽減、ＣＯＰＤの急性増悪の１つ以上の症候の処置、ＣＯＰＤの急性増悪の１つ以上の症候の頻度、継続期間若しくは重症度の軽減、ＣＯＰＤの急性増悪の発生の予防、又はＣＯＰＤの急性増悪の１つ以上の症候の発生の予防を指す。頻度、継続期間又は重症度の軽減は、本発明の方法による処置を受けていない同じヒトにおける急性増悪又は症候の頻度、継続期間又は重症度に対するものである。急性増悪又は急性増悪の１つ以上の症候の頻度、継続期間又は重症度の軽減は、ＣＯＰＤ対象の処置経験を有する通常の熟練臨床医によって、又は処置を受けている対象による主観的な自己評価によって測定され得る。通常の熟練臨床医による臨床観察は、肺機能だけではなく、対象を彼又は彼女の最安定状態を維持するために必要な介入頻度、並びに対象を彼又は彼女の最安定状態を維持するために必要な入院頻度及び入院期間の客観的測定を含み得る。典型的には、対象による主観的な自己評価は、業界で承認されている及び／又はFDAが承認している対象報告結果（ＰＲＯ）ツールを使用して収集される。このようなツールは、対象が、特定の症候又は生活の質の他の主観的尺度を評価することを可能にし得る。対象報告結果ツールの例は、Exacerbations from Pulmonary Disease Tool (EXACT-PRO)であり、これは、United BioSource Corporationが、急性細菌性増悪の臨床応答を評価するために、FDAと協議して医薬業界スポンサーコンソーシアムと共に現在開発している。
【００１０】
いくつかの実施態様では、処置は、予防的処置である。本明細書で使用される「予防的処置」という用語は、その目的が疾患を予防することである任意の医療措置又は公衆衛生措置を指す。本明細書で使用される「予防する」、「予防」及び「予防すること」という用語は、所定の症状を獲得若しくは発症するリスクの減少、又は病気ではないが、罹患者であったか若しくは罹患者の近くにいる可能性がある対象における再発若しくは前記症状の軽減若しくは抑制を指す。
【００１１】
本明細書で使用される「フラジェリン」という用語は、様々なグラム陽性又はグラム陰性菌種に含まれるフラジェリンを意味することを意図する。フラジェリンの非限定的な供給源としては、限定されないが、Escherichia属、例えばE. coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えばSalmonella enterica serovar Typhimurium、Serratia、例えばSerratia marcescans及びShigella並びにBacilli属、例えばB. subtilis及びB. licheniformis、Pseudomonas、例えばP. aeruginosa及びStreptomycesが挙げられる。これらの例は、限定的ではなく例示的なものである。フラジェリンのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、NCBI Genbankで公的に入手可能であり、例えばアクセッションナンバーＡＡＬ２０８７１、ＮＰ＿３１０６８９、ＢＡＢ５８９８４、ＡＡＯ８５３８３、ＡＡＡ２７０９０、ＮＰ＿４６１６９８、ＡＡＫ５８５６０、ＹＰ＿００１２１７６６６、ＹＰ＿００２１５１３５１、ＹＰ＿００１２５００７９、ＡＡＡ９９８０７、ＣＡＬ３５４５０、ＡＡＮ７４９６９及びＢＡＣ４４９８６である。これらの及び他の種由来のフラジェリン配列は、本明細書で使用されるフラジェリンという用語によって包含されることを意図する。したがって、種間の配列の差異は、この用語の意味に含まれる。
【００１２】
「フラジェリンポリペプチド」という用語は、フラジェリン、又はＴＬＲ５に結合してそれを活性化する能力を保持するそのフラグメントを意味する。本明細書で使用される「ｔｏｌｌ様レセプター５」又は「ＴＬＲ５」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、任意のｔｏｌｌ様レセプター５、しかし好ましくはヒトｔｏｌｌ様レセプター５を意味することを意図する。ＴＬＲ５は、活性化すると、一連のシグナリング分子を介して伝搬される細胞内シグナルを細胞表面から核に伝達することによって、細胞性応答を誘導する。典型的には、ＴＬＲ５の細胞内ドメインは、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８をリクルートし、これが、セリン／トレオニンキナーゼＩＲＡＫ（ＩＲＡＫ−１及びＩＲＡＫ−４）をリクルートする。ＩＲＡＫはＴＲＡＦ６と複合体を形成し、これが次いで、ＴＬＲシグナルの伝達に関与する様々な分子と相互作用する。これらの分子及び他のＴＬＲ５シグナル伝達経路構成要素は、転写因子（例えば、ｆｏｓ、ｊｕｎ及びＮＦ−ｋＢ）の活性、並びにｆｏｓ、ｊｕｎ及びＮＦ−ｋＢによってアップレギュレーションされる遺伝子（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０など）の遺伝子産物の対応する誘導を刺激する。典型的には、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５シグナリングに関与するフラジェリンのドメインを含む。「フラジェリンのドメイン」という用語は、フラジェリンの天然に存在するドメイン及びその機能保存変異体を含む。「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能の変化を伴わずに、タンパク質又は酵素の所定のアミノ酸残基が変化（限定されないが、類似特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するものよるアミノ酸置換を含む）しているものである。保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、類似機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列同一性が変動し、例えば７０％〜９９％であり得るように、タンパク質の点で異なり得る。したがって、「機能保存変異体」はまた、フラジェリンのネイティブな配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はそのフラグメントを含む。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９又は１００％の同一性を有することを意味する。同様に、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９又は１００％の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、適切な配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータ、例えばBLAST P (Karlin and Altschul, 1990)を使用して決定される。ＴＬＲ５シグナリングに関与するフラジェリンのドメインは当技術分野で周知であり、例えば、Smith et al. (2003) Nat. Immunol. 4: 1247-1253を参照のこと（例えば、S. typhimuriumフラジェリンのアミノ酸７８〜１２９、１３５〜１７３及び３９４〜４４４又はそれらの相同体若しくは改変形態）。
【００１３】
フラジェリンポリペプチドの例としては、限定されないが、米国特許第６，５８５，９８０号；米国特許第６，１３０，０８２号；米国特許第５，８８８，８１０号；米国特許第５，６１８，５３３号；及び米国特許第４，８８６，７４８号；米国特許出願公開第２００３／００４４４２９Ａｌ号；並びに国際公開公報第２００８０９７０１６号及び国際公開公報第２００９１５６４０５号（これらは、参照により組み入れられる）に記載されているものが挙げられる。例示的なE. coIi  Ｏ１５７：Ｈ７フラジェリンは、配列番号１である。例示的なS. typhimuriumフラジェリンは、配列番号２又は配列番号３である。
【００１４】
いくつかの実施態様では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、本発明のフラジェリンポリペプチドとして使用され得る。いくつかの実施態様では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列は、本発明のフラジェリンポリペプチドとして使用され得る。いくつかの実施態様では、配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、残基８９〜９６（すなわち、ＴＬＲ５検出に関与する残基）が突然変異されていない（すなわち、置換又は欠失されていない）限り、本発明のフラジェリンポリペプチドとして使用され得る。いくつかの実施態様では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列は、残基８９〜９６（すなわち、ＴＬＲ５検出に関与する残基）が突然変異されていない（すなわち、置換又は欠失されていない）限り、本発明のフラジェリンポリペプチドとして使用され得る。
【００１５】
いくつかの実施態様では、本発明は、国際公開公報第２００９１５６４０５号（これは、その全体が参照により組み入れられる）に記載されているフラジェリンリコンビナントポリペプチドの使用を包含する。
【００１６】
いくつかの実施態様では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ａ）配列番号３の１位に位置するアミノ酸残基から開始して、配列番号３の９９位〜１７３位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＮ末端ペプチド；及びｂ）配列番号３の４０１位〜４０６位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基から開始して、配列番号３の４９４位に位置するアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＣ末端ペプチドを含み、前記Ｎ末端ペプチドは前記Ｃ末端ペプチドに直接的に連結されているか、又は前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドは、スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている。いくつかの実施態様では、前記Ｎ末端ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列１〜９９、１〜１３７、１〜１６０及び１〜１７３からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、前記Ｃ末端ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列４０１〜４９４及び４０６〜４９４からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１７３及び４０１〜４９４からなる。いくつかの実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１６０及び４０６〜４９４からなる。いくつかの実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１３７及び４０６〜４９４からなる。いくつかの実施態様では、前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドは、ＮＨ２−ＧＩｙ−ＡＩａ−ＡＩａ−ＧＩｙ−ＣＯＯＨ（配列番号４）ペプチド配列からなる中間スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている。いくつかの実施態様では、配列番号３の４８８位に位置するアスパラギンアミノ酸残基は、セリンに置換されている。いくつかの実施態様では、上記フラジェリンポリペプチドは、Ｎ末端にさらなるメチオニン残基を含む。
【００１７】
本発明のフラジェリンペプチドは、当技術分野で周知の任意の方法によって生産される。いくつかの実施態様では、本発明のフラジェリンペプチドは、典型的には、そのアミノ酸配列をコード核酸であって、トランスフェクション細胞内でその有効な産生を可能にする核酸でトランスフェクションされているリコンビナント細胞によって、リコンビナントに産生される。本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のための複製可能なベクターに挿入され得る。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であり得る。適切な核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当技術分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。一般に、ベクターの構成要素としては、限定されないが、配列が分泌される場合には１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列が挙げられる。これらの構成要素の１つ以上を含有する適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を用いる。発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有するであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリン）に対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠損を相補し、又は（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、BacilliのＤアラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸を取り込む能力を持つ細胞の同定を可能にするもの（例えば、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損しているＣＨＯ細胞株である。発現及びクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を指令するプロモーターであって、フラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーターを含有する。様々な潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核宿主と共に使用するために適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されているシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するであろう。宿主細胞は、フラジェリンポリペプチド生産のための本明細書に記載される発現又はクローニングベクターでトランスフェクション又はトランスフォーメーションされ、プロモーターの誘導、トランスフォーマントの選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、必要に応じて改変されている従来の栄養培地中で培養される。当業者であれば、過度の実験を伴わずに、培地、温度、ｐＨなどの培養条件を選択し得る。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール及び実践的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)に見られ得る。本明細書において、ベクターにおけるＤＮＡのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、限定されないが、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えばEnterobacteriaceae、例えばE. coliが挙げられる。E. coli  Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；E. coli  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；E. coli株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）；及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）などの様々なE. coli株が公的に入手可能である。他の適切な原核生物宿主細胞としては、Enterobacteriaceae、例えばEscherichia、例えばE. coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えばSalmonella typhimurium、Serratia、例えばSerratia marcescans及びShigella及びBacilli、例えばB. subtilis及びB. licheniformis(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されているB. licheniformis 41 P)、Pseudomonas、例えばP. aeruginosa及びStreptomycesが挙げられる。これらの例は、限定的ではなく例示的なものである。これらの原核生物宿主細胞はいかなるフラジェリンも分泌しないので、Salmonella typhimurium（ｆｌｉＣ  ｆｌｊＢ）のＳＩＮ４１株は、本発明のフラジェリンポリペプチドの生産のために特に興味深い（Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 ;98:13722-7）。しかしながら、フラジェリンは、特殊な分泌系（いわゆる「ＩＩＩ型分泌系」）を介して分泌される。興味深いことに、ＳＩＮ４１株は、最適なフラジェリン分泌に必要なＩＩＩ型分泌系の全ての構成要素を産生する。新たなフラジェリンペプチドをコードする配列をｆｌｉＣプロモーター下にクローニングすることにより、ＳＩＮ４１株における目的のフラジェリンポリペプチドの大量分泌が可能になる。Ｗ３１１０株もまた、リコンビナントＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるので興味深い。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、宿主に内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的突然変異をもたらすように改変され得、このような宿主の例としては、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有するE. coliＷ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有するE. coliＷ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎ．ｓｕｐ．ｒを有するE. coliＷ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎａ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎ．ｓｕｐ．ｒを有するE. coliＷ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する３７Ｄ６株である、E. coliＷ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号に開示されている突然変異体ペリプラズム性プロテアーゼを有するE. coli株が挙げられる。E. coli株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５  ＡｆｉｍＡ−Ｈ又はＭＫＳ１２、ｆｌｉＤ−及び−ｆ／ｍ＞Ａ−／−／−欠失ＭＧ１６５５株もまた、分泌タンパク質としてリコンビナントフラジェリンを生産するための興味深い候補である（Nat Biotechnol. 2005; (4):475-81）。あるいは、in vitroクローニング方法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適切である。本発明のフラジェリンポリペプチドは、培地又は宿主細胞溶解物から回収され得る。膜に結合している場合、それは、適切な界面活性剤溶液（例えば、TRITON- XTM. 100）を使用して、又は酵素的切断によって、膜から放出され得る。いくつかの実施態様では、フラジェリンポリペプチドは、Nempont et al. (Nempont, C. C., D.; Rumbo, M.; Bompard, C.; Villeret, V.; Sirard, J.C. 2008. Deletion of flagellin’s hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J Immunol 181:2036-2043.)に開示されているように、リコンビナントS. TyphimuriumＳＩＮ４１（ｆｌｉＣ  ｆｌｊＢ）の上清から精製される。特に、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス中でSalmonellaを３７℃で６〜１８時間成長させた。上清をろ過し、６０％硫酸アンモニア（Sigma Aldrich, USA）で飽和させた。遠心分離し、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５に溶解し、次いで透析することによって、沈殿した物質を回収した。連続した一連のハイドロキシアパタイト、陰イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー（Bio-Rad Laboratories, USA; GE Healthcare, Sweden）によって、タンパク質をさらに精製した。最後に、ポリミキシンＢカラム（Pierce, USA）を使用して、タンパク質からリポ多糖（ＬＰＳ）を除去した。リムルスアッセイ（Associates of Cape Cod Inc., USA）を使用して、残留ＬＰＳ濃度は、リコンビナントフラジェリン１μg当たり３０pg未満のＬＰＳであると決定した。フラジェリンをコードする構築物をＰＣＲによって作製し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ＋にクローニングし得る。該プラスミドをEscherichia coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し得、ＩＰＴＧ １mMを追加することによって、タンパク質産生を誘導し得る。フレンチプレスで破壊した後、Triton X-114抽出を使用して、可溶性画分からリポ多糖（ＬＰＳ）を除去した。フレンチプレス後の不溶性画分においてフラジェリンが見られる場合、尿素８Ｍの存在下で封入体を変性させ、続いて、透析及びTriton X-114抽出を行う。次いで、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過によって、タンパク質を精製し得る。最後に、ポリミキシンＢカラム（Pierce, USA）を使用して、タンパク質からＬＰＳを再び除去し得る。
【００１８】
いくつかの態様では、本発明はまた、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪を処置する方法であって、フラジェリンポリペプチドをコードする治療有効量の核酸を該対象に投与することを含む方法に関する。
【００１９】
「治療有効量」は、任意の医療処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でＣＯＰＤの急性増悪を処置するために十分なフラジェリンポリペプチド（又はそれをコードする核酸）の量を意味する。本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の対象の具体的な治療有効用量レベルは、対象の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置の継続時間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低レベルで化合物の投薬を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは当業者に周知である。しかしながら、生成物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。好ましくは、組成物は、処置すべき対象への投与量の症候調整のために、有効成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分１mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【００２０】
典型的には、本発明の有効成分（すなわち、フラジェリンポリペプチド又はそれをコードする核酸）を、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス（例えば、生体分解性ポリマー）と組み合わせて、医薬組成物を形成する。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」という用語は、哺乳動物、適切な場合には特にヒトに投与される場合に、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性で固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤化助剤を指す。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物における吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。本発明の医薬組成物では、本発明の有効成分は、従来の薬学的支持体との混合物として、単位投与形態で投与され得る。
【００２１】
適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液若しくは溶液、舌下及び頬内投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、局所投与される（すなわち、対象の気道に）。したがって、組成物は、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、又は当業者に周知の他の形態で製剤化され得る。本発明の方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト又は滴剤で製剤化され得る。特に、本発明の使用のための有効成分は、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）の使用によって、加圧容器又は噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で便利に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計測量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器又は吹送器で使用するための（例えば、ゼラチンから構成される）カプセル及びカートリッジは、化合物及び適切な粉末基剤（例えば、ラクトース又はデンプン）の粉末混合物を含有するように製剤化され得る。
【００２２】
いくつかの実施態様では、フラジェリンポリペプチドは、抗菌剤、例えば抗生物質又は抗ウイルス剤と組み合わせて対象に投与される。
【００２３】
いくつかの実施態様では、抗生物質は、アミノグリコシド、β−ラクタム、キノロン又はフルオロキノロン、マクロライド、スルホンアミド、スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド）、リファマイシン、糖ペプチド、ポリミキシン、リポペプチド抗生物質からなる群より選択される。
【００２４】
テトラサイクリンは、４つの縮合６員環（六員環）から構成される４員環構造を共有するクラスに属する。テトラサイクリンは、感受性細菌における３０ＳリボソームサブユニットへのアミノアシルｔＲＮＡの結合を阻害することによって、それらの活性を示す。本発明で使用するためのテトラサイクリンとしては、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、メタサイクリン、メコサイクリン、チゲサイクリン、リムサイクリン及びテトラサイクリンが挙げられる。テトラサイクリンは、ａ−溶血性連鎖球菌、非溶血性連鎖球菌、グラム陰性桿菌、リケッチア、スピロヘータ、Mycoplasma属及びChlamydia属を含む多くの公知の生物に対して有効である。
【００２５】
アミノグリコシドは、Streptomyces属又はMicomonospora属細菌の種に由来する化合物であり、グラム陰性菌によって主に引き起こされる感染症を処置するために使用される。このクラスに属する薬物は全て、同じ基本化学構造（すなわち、２つ以上のアミノ糖がグリコシド結合によって結合している中心的なヘキソース又はジアミノヘキソース分子）を有する。アミノグリコシドは、３０Ｓリボソームに結合して細菌タンパク質合成を阻害する殺菌性抗生物質である。それらは、好気性グラム陰性桿菌及びブドウ球菌に対して主に活性である。本発明で使用するためのアミノグリコシド抗生物質としては、アミカシン（Amikin（登録商標））、ゲンタマイシン（Garamycin（登録商標））、カナマイシン（Kantrex（登録商標））、ネオマイシン（Mycifradin（登録商標））、ネチルマイシン（Netromycin（登録商標））、パロモマイシン（Humatin（登録商標））、ストレプトマイシン及びトブラマイシン（TOBI Solution（登録商標）、TobraDex（登録商標））が挙げられる。
【００２６】
マクロライドは、その活性が、１つ以上のデオキシ糖（通常は、クラジノース及びデソサミン）が結合しているマクロライド環（大きな１４、１５又は１６員ラクトン環）の存在から生じるポリケチド抗生物質薬のグループである。マクロライドは主に静菌性であり、リボソームの５０Ｓサブユニットに結合し、それにより細菌合成を阻害する。マクロライドは、好気性及び嫌気性グラム陽性球菌（腸球菌を除く）に対して、並びにグラム陰性嫌気性菌に対して活性である。本発明で使用するためのマクロライドとしては、アジスロマイシン（Zithromax（登録商標））、クラリスロマイシン（Biaxin（登録商標））、ジリスロマイシン（Dynabac（登録商標））、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ジョサマイシン、ロキシスロマイシン及びリンコマイシンが挙げられる。
【００２７】
ケトライドは、エリスロマイシンマクロラクトン環構造及び５位に結合しているＤ−デソサミン糖が保持されているが、３位のＬ−クラジノース５部分及びヒドロキシル基の置換がａ３−ケト官能基である半合成１４員環マクロライドのクラスに属する。ケトライドは２３Ｓ  ｒＲＮＡに結合し、それらの作用機序はマクロライドのものに類似する（Zhanel, G. G.,et al.,Drugs, 2001; 61(4):443-98）。ケトライドは、グラム陽性好気性菌及びいくつかのグラム陰性好気性菌に対して良好な活性を示し、ｍｅｆＡ及びｅｒｍＢを産生するStreptococcus pneumoniae及びHaemophilus influenzaeを含むStreptococcus種に対して優れた活性を有する。本発明で使用するための代表的なケトライドとしては、テリスロマイシン（以前はＨＭＲ−３６４７として公知）、ＨＭＲ３００４、ＨＭＲ３６４７、セスロマイシン、ＥＤＰ−４２０及びＡＢＴ−７７３が挙げられる。
【００２８】
構造的には、キノロンは、３位に必須カルボキシル基を有する１，４ジヒドロ−４−オキソ−キノリニル部分を有する。機能的には、キノロンは、細菌染色体への直接的な結合を介して、原核生物ＩＩ型トポイソメラーゼ（すなわち、ＤＮＡジャイレース）及びいくつかの場合にはトポイソメラーゼＩＶを阻害する。本発明で使用するためのキノロンは、フルオロキノロンを含む第１世代、第２世代、第３世代及び第４世代のキノロンに及ぶ。このような化合物としては、ナリジクス酸、シノキサシン、オキソリン酸、フルメキン、ピペミド酸、ロソキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、オフロキサシン、エンロフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、クリナフロキサシン、シタフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン及びトロバフロキサシンが挙げられる。本発明で使用するために適切なさらなるキノロンとしては、Hooper, D., and Rubinstein, E., “Quinolone Antimicrobial Agents, Vd Edition”, American Society of Microbiology Press, Washington D.C. (2004)に記載されているものが挙げられる。
【００２９】
スルホンアミドクラスに属する薬物は全て、スルホンアミド部分（ＳＯ２ＮＨ２）、又は窒素上の水素の１１５個が有機置換基で置換されている置換スルホンアミド部分を有する。例示的なＮ置換基としては、置換又は非置換チアゾール、ピリミジン、イソキサゾール及び他の官能基が挙げられる。スルホンアミド抗生物質は全て、共通の構造的特徴を共有し（すなわち、それらは全てベンゼンスルホンアミドである）、これは、スルホンアミド官能基がベンゼン環に直接結合していることを意味する。スルホンアミド抗生物質の構造は、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）（細菌において、テトラヒドロ葉酸の合成のための酵素ジヒドロプテロイン酸シンターゼの基質として必要な化合物）に類似する。スルホンアミドは、ＰＡＢＡを必要とする細菌における代謝プロセスを妨害し、それにより細菌の成長及び活性を阻害することによって、抗生物質として機能する。本発明で使用するためのスルホンアミド抗生物質としては、以下のものが挙げられる：マフェニド、フタリルスルファチアゾール、スクシニルスルファチアゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファドキシン、スルファマゾン、スルファメタジン、スルファメトキサゾール、スルファメトピラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール、スルファモノメトキシン、スルファマイロン、スルファニルアミド、スルファキソキサリン、スルファサラジン、スルファチアゾール、スルフイソキサゾール、スルフイソキサゾールジオールアミン及びスルファグアニジン。
【００３０】
β−ラクタムのメンバーは全て、β−ラクタム環及びカルボキシル基を有し、その結果、それらの薬物動態及び作用機序は両方とも類似する。臨床的に有用なβ−ラクタムの大部分は、ペニシリングループ又はセファロスポリングループ（セファマイシン及びオキサセパムを含む）のいずれかに属する。β−ラクタムはまた、カルバペネム及びモノバクタムを含む。一般的に言えば、β−ラクタムは、細菌細胞壁合成を阻害する。より具体的には、これらの抗生物質は、細胞壁のペプチドグリカンネットにおいて「ニック」を引き起こし、細菌原形質がその保護ネットから周囲の低張性媒質に流入することが可能になる。次いで、流体がネイキッドなプロトプラスト（その壁を持たない細胞）内に蓄積し、それが最終的には破裂して、生物の死につながる。機構的には、β−ラクタムは、酵素ターゲット部位のヒドロキシル基に結合している開環ラクタム環のカルボキシルと安定なエステルを形成することによってＤ−アラニル−Ｄ−アラニントランスペプチダーゼ活性を阻害することによって作用する。β−ラクタムは極めて有効であり、典型的には低毒性である。グループとして、これらの薬物は、多くのグラム陽性、グラム陰性及び嫌気性生物に対して活性である。このカテゴリーに該当する薬物としては、２−（３−アラニル）クラバム、２−ヒドロキシメチルクラバム、７−メトキシセファロスポリン、エピチエナマイシン、アセチル−チエナマイシン、アモキシシリン、アパルシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、アズトレオナム、バカンピシリン、ビアペネム（blapenem）、カルベニシリン、カルフェシリン、カリンダシリン、カルペチマイシンＡ及びＢ、セファセリル、セファクロール、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファマンドール、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフブフェラゾン、セフカペン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフィネノキシム、セフィネタゾール、セフミノックス、セフモレキシン、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラミド、セフォセリス、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフォゾプラン、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシム、セフプロジル、セフキノム、セフラジン、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリンＣ、セファマイシンＡ、セファマイシンＣ、セファロチン、キチノボリンＡ、キチノボリンＢ、キチノボリンＣ、シクラシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクロセリン、デオキシプルラシドマイシンＢ及びＣ、ジクロキサシリン、ジヒドロプルラシドマイシンＣ、エピシリン、エピチエナマイシンＤ、Ｅ及びＦ、エルタペネム、ファロペネム、フロモキセフ、フルクロキサシリン、ヘタシリン、イミペネム、レナンピシリン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メタンピシリン、メチシリン（メチシリン（methicillin）とも称される）、メズロシリン、モキサラクタム、ナフシリン、ノルチエナマイシン、オキサシリン、パニペネム、ペナメシリン、ペニシリンＧ、Ｎ及びＶ、フェネチシリン、ピペラシリン、ポバンピシリン、ピブセファレキシン、ポブメシリナム、ピブメシリナム、プルラシドマイシンＢ、Ｃ及びＤ、プロピシリン、サルモキシシリン、スルバクタム、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、テルコナゾール、チエナマイシン並びにチカルシリンが挙げられる。
【００３１】
４００個超の天然抗菌性ペプチドが単離及び特性評価されている。化学構造に基づいて、これらのペプチドは、線状及び環状の２つの主なグループに分類され得る（R.E. Hancock et al, Adv. Microb. Physiol., 1995, 37: 135-137; H. Kleinkauf et al., Criti. Rev. Biotechnol., 198, 8: 1-32; D. Perlman and M. Bodansky, Annu. Rev. Biochem., 1971, 40: 449-464）。これらのペプチド（線状及び環状の両方）の大部分の作用様式は、細胞漏出をもたらす膜破壊を伴うと考えられている（A. Mor, Drug Develop. Res., 2000, 50: 440-447）。マガイニン及びメリチンなどの線状ペプチドは、（分離した疎水性部分及び親水性部分を含有する）ａ−ヘリックス両親媒性構造として、又はグラミシジンＡ（ＧＡ）に見られるβ−ヘリックスとして主に存在する。両親媒性β−シート構造を主に採る環状ペプチドは、ジスルフィド結合を含有するもの（例えば、タキプレシン）及びジスルフィド結合を含有しないもの（例えば、グラミシジンＳ）の２つのサブグループにさらに分類され得る（D. Audreu and L. Rivas, Biopolymers, 1998, 47: 415-433）。ペプチド抗生物質はまた、非リボソーム合成ペプチド（例えば、グラミシシン、ポリミキシン、バシトラシン、糖ペプチドなど）及びリボソーム合成（天然）ペプチドの２つのクラスに分かれる。前者は劇的に改変されることが多く、細菌によって主に産生されるのに対して、後者は、これらの種の天然の宿主防御分子の主要成分として全生物種（細菌を含む）によって産生される。特定の実施態様では、ペプチド抗生物質は、リポペプチド抗生物質、例えばコリスチン、ダプトマイシン、スルファクチン、フリウリミシン、アクレアシンＡ、イツリンＡ及びツシマイシンである。コリスチン（コリマイシンとも称される）は、５０年以上前に発見されたポリミキシン抗生物質である。それは環状リポペプチド抗生物質であり、二価イオンをキレートすることによる自己誘導性機構によって、グラム陰性菌の細胞壁を透過する。コリスチンは壁を不安定化し、それに入り込むことができる。基本的には、コリスチンは細胞壁を穿孔し、この構造の歪曲及び細胞内成分の放出を引き起こす。グラム陰性菌、特にPseudomonas aeruginosa、Acinetobacter baumannii及びKlebsiella pneumoniaeにおける多剤耐性の増加は、重大な問題を提起する。治療選択肢が限られているので、感染性疾患の臨床医及び微生物学者は、コリスチンの臨床適用を再評価しなければならない。コリスチンは、神経毒性及び腎毒性に関連する。投与量レジメン及び新規製剤が、毒性問題に対処するための答えであり得る。
【００３２】
併用処置はまた、呼吸刺激薬を含み得る。コルチコステロイドは、ＣＯＰＤの急性増悪において有益であり得る。本発明のアゴニストと組み合わせて使用され得るコルチコステロイドの例は、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ナフロコート、デフラザコート、ハロプロドンアセタート、ブデソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、クロコルトロンピバラート、メチルプレドニソロンアセポナート、デキサメタゾンパルミトアート、チプレダン、ヒドロコルチゾンアセトナート、プレドニカルバート、アルクロメタゾンジプロピオナート、ハロメタゾン、メチルプレドニゾロンシュレプタナート、モメタゾンフロアート、リメキソロン、プレドニゾロンファルネシラート、シクレソニド、デプロドンプロピオナート、フルチカゾンプロピオナート、ハロベタゾールプロピオナート、ロテプレドノールエタボナート、ベタメタゾンブチラートプロピオナート、フルニソリド、プレドニゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、トリアムシノロン、ベタメタゾン１７−バレラート、ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオナート、ヒドロコルチゾンアセタート、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、プレドニゾロンリン酸ナトリウム及びヒドロコルチゾンプロブタートである。本発明下で特に好ましいコルチコステロイドは、デキサメタゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、トリアムシノロン、モメタゾン、シクレソニド、フルチカゾン、フルニソリド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム及びそれらのエステル、並びに６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸（Ｓ）−フルオロメチルエステルである。本発明下でさらに特に好ましいコルチコステロイドは、ブデソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、モメタゾンフロアート、シクレソニド、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド及びフルチカゾンプロピオナートであり、場合によりそれらのラセミ体、それらのエナンチオマー、それらのジアステレオマー及びそれらの混合物であり、場合によりそれらの薬理学的に適合し得る酸付加塩である。特により好ましいのは、ブデソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、モメタゾンフロアート、シクレソニド及びフルチカゾンプロピオナートである。本発明の最も好ましいコルチコステロイドは、ブデソニド及びベクロメタゾンジプロピオナートである。
【００３３】
急性増悪中は、急性気管支痙攣を減少させるために、気管支拡張薬の投与量を増加させ得る。気管支拡張薬の例としては、限定されないが、β２−アゴニスト（例えば、サルブタモール、ビトルテロールメシラート、ホルモテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン及びフェノテロール）、抗コリン作用薬（例えば、チオトロピウム又はイプラトロピウム）、メチルキサンチン及びホスホジエステラーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ウイルス又は細菌に対する免疫応答を誘発することができる抗原又は抗原組成物を含有するワクチンと組み合わせて対象に投与される。典型的には、ワクチン組成物は、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、Burkholderis種、Streptococcus agalactiae、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Moraxella catarrhalis、Chlamydophila pneumoniae、Mycoplasma pneumoniae、Legionella pneumophila、Serratia marcescens、Mycobacterium tuberculosis、Bordetella pertussisからなる群より選択される少なくとも１つの細菌に対する免疫応答を誘発するために使用される。特に、ワクチン組成物は、Streptococcus pneumonia又はHaemophilus influenzaに対するものである。より具体的には、ワクチン組成物は、無莢膜型Haemophilus influenzae（ＮＴＨｉ）に対するものである。典型的には、ワクチン組成物は、典型的には、全死菌分離株又は全不活性化（例えば、弱毒化）細菌分離株を含有する。しかしながら、細胞外膜及び／又は表面抗原を含む又はからなる可溶性又は粒子状抗原は、全死菌生物と同様に、又は全死菌生物に代えて適切であり得る。１つ以上の実施態様では、選択分離株の細胞外膜画分又は膜タンパク質が使用される。例えば、ＮＴＨｉ  ＯＭＰ  Ｐ６は、高度に保存されている１６kDaのリポタンパク質（Nelson, 1988）であり、ヒト殺菌性抗体のターゲットであり、ヒト及び動物モデルの両方において防御を誘導する。慢性肺閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）では、ＯＭＰ  Ｐ６は、ＮＴＨｉ感染からの相対的防御に関連するリンパ球増殖応答を誘発することが示されている（Abe, 2002）。したがって、ＯＭＰ  Ｐ６又は任意の他の適切な外膜ＮＴＨｉタンパク質、ポリペプチド（例えば、Ｐ２、Ｐ４及びＰ２６）又はこのようなタンパク質若しくはポリペプチドの抗原性フラグメントは、ＮＴＨｉワクチンに適用され得る。可溶性及び／又は粒子状抗原は、選択した死菌分離株又は生菌分離株を破壊することによって調製され得る。次いで、遠心分離、ろ過及び／又は当技術分野で公知の他の適切な技術によって、ワクチンで使用するための画分を調製し得る。適切な界面活性剤及び撹拌を利用した超音波処理又は溶解、並びにこのような技術の組み合わせを含む、必要なレベルの細胞破壊を達成する任意の方法が用いられ得る。超音波処理が用いられる場合、特定のサイズ又はサイズ範囲の可溶性及び／又は粒子状物質の必要な程度の細胞破壊又は生成を達成するために、分離株は、いくつかの超音波処理工程に供され得る。いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、アジュバント、特にＴＬＲアゴニストを含む。一実施態様では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２又はＴＬＲ１３アゴニストからなる群より選択される。
【００３５】
特定の実施態様では、酸素需要量が増加し得、酸素補給が提供され得る。
【００３６】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに例証する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＯＰＤマウスにおける、S. pneumoniae及び分類不可能なheamophilus influenzae（ＮＴＨＩ）に対するＩＬ−１７及びＩＬ−２２産生の変化。マウスをタバコの煙に１２週間慢性曝露し、次いで、Streptococcus pneumoniae ５×１０４CFUで鼻腔内チャレンジし（Ｓｐ）、又はチャレンジしなかった（モック）。ＢＡＬにおいて、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７及びＩＬ−２２のレベルを評価した（Ａ）。Ｓｐチャレンジの２４時間後に、血清（Ｂ）及び再刺激肺細胞由来の上清（Ｃ）におけるＩｌ−２２の濃度を測定した。次いで、タバコの煙に１２週間慢性曝露したマウスを、ＮＴＨＩ ５×１０７CFUで鼻腔内チャレンジし、又はチャレンジしなかった（モック）。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＞１０／群）として表した。
【図２】フラジェリンの投与は、S. pneumoniae感染ＣＯＰＤマウスにおいて、細菌ロードを減少させた。streptococcus pneumoniae血清型１（ＳＰ１）５×１０４cfuを感染させた又は感染させなかったＣＯＰＤ（タバコの煙に慢性曝露）及び空気（コントロール）マウスの気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）（Ａ）、肺溶解物（Ｂ）及び血液（Ｃ）において、細菌ロードを測定した。腹腔内経路によって、フラジェリン（ＦＬＩＣ）５μgを一群のマウスに投与した。感染後１日目及び３日目に、細菌ロードを分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＞６／群）。
【図３】フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいて、S. pneumoniae感染後３日目のＩＬ−１７産生を増加させた。streptococcus pneumoniae血清型１（ＳＰ１）５×１０４cfuを感染させた又は感染させなかったＣＯＰＤ（タバコの煙に慢性曝露）及び空気（コントロール）マウスの気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）（Ａ）及び肺細胞の上清（Ｂ）において、ＩＬ１７のレベルを測定した。腹腔内経路によって、フラジェリン（ＦＬＩＣ）５μgを一群のマウスに投与した。感染後１日目及び３日目に、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−１７の濃度を分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＞６／群）。
【図４】フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいて、S. pneumoniae感染後３日目のＩＬ−２２産生を増加させた。streptococcus pneumoniae血清型１（ＳＰ１）５×１０４cfuを感染させた又は感染させなかったＣＯＰＤ（タバコの煙に慢性曝露）及び空気（コントロール）マウスの気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）（Ａ）及び肺細胞の上清（Ｂ）において、ＩＬ−２２のレベルを測定した。腹腔内経路によって、フラジェリン（ＦＬＩＣ）５μgを一群のマウスに投与した。完全培地のみで肺細胞を４８時間培養し（非刺激条件）、又は一定の抗ＣＤ３抗体によって刺激した（抗ＣＤ３条件）。感染後１日目及び３日目に、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２２の濃度を分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＞６／群）。
【図５】フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいて、ＮＴＨＩ感染後１日目の細菌ロードを減少させた。分類不可能なhaemophilus influenza（ＮＴＨＩ）５×１０７cfuを感染させた又は感染させなかったＣＯＰＤ（タバコの煙に慢性曝露）及び空気（コントロール）マウスの気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）（Ａ）、肺溶解物（Ｂ）及び血液（Ｃ）において、細菌ロードを測定した。腹腔内経路によって、フラジェリン（ＦＬＩＣ）５μgを一群のマウスに投与した。感染後１日目に、細菌ロードを分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＞６／群）。
【図６】フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいて、ＮＴＨＩ感染後１日目のＩＬ−２２産生を増加させた。分類不可能なhaemophilus influenza（ＮＴＨＩ）５×１０７cfuを感染させた又は感染させなかったＣＯＰＤ（タバコの煙に慢性曝露）及び空気（コントロール）マウスの気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）（Ａ）及び肺細胞の上清（Ｂ）において、ＩＬ−２２のレベルを測定した。腹腔内経路によって、フラジェリン（ＦＬＩＣ）５μgを一群のマウスに投与した。完全培地のみで肺細胞を４８時間培養し（非刺激条件）、又は熱殺菌ＮＴＨＩによって刺激した（ＨＫ−ＮＴＨＩ条件）。感染後１日目に採取した肺細胞において、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２２の濃度を分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＞６／群）。
【実施例】
【００３８】
イントロダクション：
細菌感染による憎悪エピソードは、ＣＯＰＤなどの多種多様の肺炎症障害の一般的な特徴である。ＣＯＰＤを有する患者では、急性増悪は、Haemophilus influenzae及びStreptococcus pneumoniaeに主に起因する細菌感染に主に関連する。病理学的には、ＣＯＰＤの憎悪は、浮腫（気道及び全身の炎症）の増強を特徴とし、より多くの気道狭窄及びガス交換不足をもたらす。ＣＯＰＤ中は、宿主の先天性免疫防御が広く抑制されていることを示す証拠が相次いでいる。本発明者らは、タバコの煙（ＣＳ）に１２週間慢性曝露したマウスを基礎として、ＣＯＰＤの憎悪中の細菌感受性に関与する機構をより明確に定義するための適切なモデルを開発した（Pichavant M et al., Mucosal Immunol, 2014）。このために、ＣＳに慢性曝露したＣ５７／ＢＬ６マウスに、局所投与によって、致死用量のH. influenzae及びS. pneumoniaeを感染させた。第１段落で報告されているように、これらのモデルにより、ＣＯＰＤマウスにおける細菌感染後のＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−２２）産生の強い欠損を確認することができた。ＴＬＲアゴニストは、強力な免疫刺激因子として、及び特にS. pneumoniae（ＪＣＳを参照のこと）に対する肺抗菌防御のプロモーターとして同定されているので、本発明者らは次いで、ＣＯＰＤマウスにおいて、細菌感染症の発症を制限するフラジェリン（ＴＬＲ５アゴニスト）の能力、及び肺炎症に対するそれらの影響を試験した。
【００３９】
材料及び方法
タバコの煙への曝露
スモークマシーン（Emka, Scireq, Canada）を使用して、１日当たりタバコ５本から生成したＣＳにＣ５７／ＢＬ６マウスを週５日及び最大１２週間曝露した。空気マウスを同様の条件で飼育したが、ろ過空気にのみ曝露した。
【００４０】
細菌感染
２つの細菌株を使用して、ＣＯＰＤを悪化させた：Streptococcus pneumoniae（Ｓｐ）血清型１及び分類不可能なHaemophilus influenza（ＮＴＨＩ）。細菌ストックを−８０℃で凍結維持した。感染直前に細菌を解凍し、チョコレートプレート上でcfuの数を決定した。鼻腔内経路（５０μl／マウス）によって、感染を実施した。１日目及び３日目に、S. pneumoniae感染マウスを屠殺した。１日目及び２日目に、ＮＴＨＩ感染マウスを屠殺した。
【００４１】
フラジェリンの投与
エンドトキシンフリー条件で、精製リコンビナントフラジェリンを調製した。全ての処置マウスにおいて感染の直前に、及びS. pneumoniae感染マウスでは感染の２日後に、腹腔内経路によって、フラジェリン５μgを注射した。同じ容量のＰＢＳ（１００μl）（モック）をコントロールに注射した。
【００４２】
サイトカインの定量
ＢＡＬ、肺溶解物及び肺細胞培養物の上清において、ＥＬＩＳＡ（R&D systems and e-Biosciences）によって、マウスＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２及びＩＦＮ−γの濃度を測定した。
【００４３】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施して、目的のｍＲＮＡを定量した（表１）。結果は、参照としてβ−アクチンを使用して遺伝子発現の倍率（２−ΔΔＣｔ）の平均±ＳＥＭとして表し、各実験について計算したコントロール（空気）と比較した。
【００４４】
結果
ＣＯＰＤマウスでは、細菌感染に対するＩＬ−１７及びＩＬ−２２応答が変化している。
【００４５】
感染ＣＯＰＤマウスは、（炎症反応の増加に関連する）ＳＰによる強い肺感染症を発症するのに対して、ナイーブマウスは、２４時間以内に細菌を除去することができる。この細菌除去障害は、ＢＡＬにおける（図１Ａ）、及び再刺激後の肺細胞における（図１Ｃ）ＩＬ−１７及びＩＬ−２２の両方の産生低下に関連する。感染ＣＯＰＤマウスの血液中では、空気マウスと比較して、ＩＬ−２２濃度も低下していた（図１Ｂ）。ＩＬ−１７及びＩＬ−２２の欠乏は、感染ＣＯＰＤマウスの肺では、感染空気曝露マウスと比較して、これらのサイトカインについて陽性のＮＫ、ＮＫＴ細胞、及び先天性リンパ球（ＩＬＣ）の割合が低下していることに関係する。また、リコンビナントＩＬ−２２の補充は、細菌の除去を促進して、ＣＯＰＤマウスにおけるS. pneumoniae感染の影響を制限することを可能にする。ＣＯＰＤマウスでは、ＮＴＨＩ感染は、ＢＡＬ液において示されているように、ＩＬ−２２産生の欠損に関連する（図１Ｄ）。この欠損もまた、ＳＰについて観察されたのと同じ細胞（ＩＬＣ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞）が関与していた。ＮＴＨＩ感染中のＩＬ−２２の役割は不明であるので、本発明者らは、ＩＬ−２２−／−マウスが、ＣＯＰＤマウスのものに近い表現型（感受性の増加、より高い炎症反応、及び肺のリモデリング）を再現することを観察した。これらのデータは、ＣＯＰＤマウスが、コントロールマウスよりも、H. influenzae及びS. pneumoniae感染に対して感受性であり、ＩＬ−１７及び／又はＩＬ−２２の産生不全が、細菌誘発性ＣＯＰＤ増悪の発症を促し得ることを示している。
【００４６】
フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいてS. pneumoniae感染の影響を制限する。
腹腔内経路によるフラジェリンの投与は、空気及びＣＯＰＤマウスにおいて、感染後１日目及び３日目の細菌ロードを顕著に減少させた。ＢＡＬ（図２Ａ）及び血液（図２Ｃ）では、肺（図２Ｂ）と比較して、効果が重大である。
【００４７】
感染動物由来の肺におけるサイトカインバーストの分析により、フラジェリンの投与は、感染空気マウス及び感染ＣＯＰＤマウスにおいて、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）の産生を顕著に増加させなかったことが明らかになった。対照的に、フラジェリンによる処置は、空気マウス及びＣＯＰＤマウスの両方由来のＢＡＬ液及び抗ＣＤ３刺激肺細胞の上清における３日目のＩＬ−１７の濃度を増強した（図３）。ＩＬ−２２の分泌について、同じプロファイルが観察されたが（図４）、この効果は、ＩＬ−１７よりもこのサイトカインが強いと思われる。サイトカイン産生の３日目のモデュレーションは、フラジェリンを投与した感染マウスの肺における好中球数の増加に関連していなかった。
【００４８】
これらのデータは、フラジェリンによる処置が、ＣＯＰＤマウスにおける細菌感受性を制限することを示している。この効果は、感染ＣＯＰＤマウスの肺におけるＩＬ−１７及びＩＬ−２２の産生の増加に関連していた（両サイトカインは、細菌に対する肺防御に関与する）。また、感染ＣＯＰＤマウスにおけるフラジェリンによる処置は、炎症性サイトカインのバースト及び好中球のリクルートの増幅（これは、肺機能に有害であり得る）に関連していなかった。
【００４９】
フラジェリンの投与は、ＣＯＰＤマウスにおいてＮＴＨＩ感染の影響を制限する。
ＮＴＨＩ感染空気マウス及びＮＴＨＩ感染ＣＯＰＤマウスにおいて、同様の実験を再現した。S. pneumoniaeで示したように、フラジェリンの投与は、ＢＡＬ、肺画分及び血液における細菌ロードを減少させた（図５）。それぞれＢＡＬ及び肺溶解物では、減少は５５及び６５％に達したのに対して、血液では、ほぼ全部であった。
【００５０】
ＮＴＥＬ感染ＣＯＰＤマウスのサイトカイン産生について、フラジェリンの効果を測定した。S. pneumoniaeで先に報告したように、フラジェリンによる処置は、感染空気マウス及び感染ＣＯＰＤマウスの肺における炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）の産生を増加させなかった。また、ＩＬ−１７の分泌は、この細菌でモデュレーションされなかった。対照的に、１日目において、ＣＯＰＤマウスでは、ＢＡＬ及び肺細胞培養物におけるＩＬ−２２の合成が顕著に増幅された（図６）。感染後２日目において、同様の所見が観察された。好中球のリクルートは、フラジェリンによる処置によってモデュレーションされなかった。
【００５１】
要するに、これらのデータは、フラジェリンの投与が、ＮＴＨＩ感染ＣＯＰＤマウスにおいて細菌ロードを減少させることができることを実証している。本発明者らは、ＩＬ−２２産生がこの感染のコントロールに重要であることを以前に報告したので、ＩＬ−２２産生の増加が、ＮＴＨＩ感染ＣＯＰＤマウスにおけるフラジェリンの有益な効果に関与し得ると推測することができる。この処置は、ＮＴＨＩ感染ＣＯＰＤマウスにおける肺炎を明らかに増幅しなかった。
【００５２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018502086.tif 000009
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