(57)【要約】  本発明は、１つの側面によれば、細菌細胞中に送達可能核酸を送達するための核酸送達ビークルを含む医薬組成物に関し、前記送達ビークルは、１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質にパッケージングされた送達可能核酸を含み、そして前記送達ビークルは、細菌細胞を感染でき、細胞中に送達可能核酸を導入でき、これに続いて、送達可能核酸は、細胞中にプラスミドを形成でき、そして感染によってではなく、接合により１又は２以上の異なる細菌細胞に伝達できる。送達ビークルを含む医薬組成物を含む組成物、及び送達ビークルの使用又は製造方法がまた、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞中に送達可能核酸を送達するための核酸送達ビークルを含む医薬組成物であって、前記送達ビークルが、１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質にパッケージングされた送達可能核酸を含み、そして前記送達可能核酸が、以下：
（ａ）栄養複製起点、及び送達可能核酸の栄養核酸複製を可能にする１又は２以上の核酸複製タンパク質をコードする１又は２以上の遺伝子；
（ｂ）トランスファーの起点、及び接合の間、プラスミド可動のために必要とされるリラキサソーム（relaxasome）機能をコードする１又は２以上のリラキサソーム核酸配列を含む伝達核酸配列；
（ｃ）前記１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質中への送達可能核酸のパッケージングを可能にする１又は２以上のバクテリオファージパッケージングシグナル配列；及び
（ｄ）選択された目的の核酸；
を含み、結果的に、前記送達ビークルは、細胞中に送達可能核酸を導入するために細菌細胞を感染することができ、これに続いて、送達可能核酸が細胞中でプラスミドを形成することができ、そして感染によってではなく、接合により１又は２以上の異なる細菌細胞に伝達され得る、
医薬組成物。
【請求項２】
部位特異的核酸組換えを用いて、送達可能核酸中への目的の選択された核酸の挿入を可能にする挿入部位をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記１又は２以上の異なる細菌細胞が、プラスミド接合のために必要とされる接合機能をコードする１又は２以上の接合核酸配列を含む、請求項１又は２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記伝達核酸配列が、プラスミド接合のために必要とされる接合機能をコードする１又は２以上の接合核酸配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記選択された核酸が、下記：
−１又は２以上の遺伝子を不活性化するか、又はダウンレギュレートできる（例えば、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム、遺伝子不活性化又はダウンレギュレーションのためのＴＡＬＥＮＳ又はジンクフィンガー（zinc finger）ヌクレアーゼを用いて）１又は２以上の遺伝子不活性化又はダウンレギュレート核酸配列；及び／又は
−細菌細胞及び／又は１又は２以上のさらなる細菌細胞に所望の形質を付与する１又は２以上のさらなる核酸配列、
から成る群の１又は２以上又はすべてである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記１又は２以上の遺伝子が、抗生物質体制遺伝子、病原性遺伝子、又は必須遺伝子である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記送達可能核酸が、細菌染色体への送達可能核酸の転位を可能にする遺伝子機能をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記送達可能核酸が、送達可能核酸を獲得する細菌細胞に選択的利点を提供する選択核酸配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記送達可能核酸が、選択可能マーカーをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
非経口、経口、局所又は吸入（例えば、エアロゾルを介して）方法による投与のために製剤化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記選択された核酸が、遺伝子不活性化のためのＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて１又は２以上の抗生物質耐性遺伝子を不活性化できる抗生物質耐性遺伝子不活性化核酸配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
薬剤としての使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗生物質耐性細菌により引起される感染の治療への使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性細菌細胞により引起される対象における感染を治療するための方法であって、治療的有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、前記細菌細胞中に導入し、それにより、抗生物質耐性遺伝子を不活性化し、そして前記細菌細胞を抗生物質に感作させる工程を含む方法。
【請求項１５】
前記組成物が、非経口、局所、経口的に又は吸入（例えば、エアロゾル送達を介して）により投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、魚、鳥、爬虫類又は哺乳類（例えば、ヒト）である、請求項１４又は１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記送達可能核酸が、プラスミド接合により抗生物質耐性細菌細胞から直接的に別の細菌細胞にトランスファーされる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細菌細胞が感作するようになった抗生物質を対象に同時に又は連続的に投与する工程をさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工業的細胞培養物中の細菌細胞を改変するための方法であって、請求項１〜１１の何れかに定義されるような核酸送達ビークルにより細菌細胞を感染させる工程を含む方法。
【請求項２０】
前記選択された核酸が、生合成遺伝子、又は医薬的活性タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項４、及び請求項４に従属する場合の請求項５〜１１のいずれか１項に記載される核酸送達ビークル。
【請求項２２】
請求項４、及び請求項４に従属する場合の請求項５〜１１のいずれか１項に記載される送達可能核酸。
【請求項２３】
抗生物質耐性細菌により引起される感染の治療又は予防のための薬剤の製造への使用のための請求項２１に記載の核酸送達ビークル。
【請求項２４】
抗生物質耐性細菌細胞における抗生物質耐性を不活性化するための方法であって、請求項２１に記載の核酸送達ビークル、又は請求項２２に記載の送達可能核酸を、細菌細胞中に挿入する工程を含む方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の核酸送達ビークルの製造方法であって、送達可能核酸を構築し、そして次に、送達可能核酸を、１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質中にパッケージングする工程を含む方法。
【請求項２６】
抗生物質耐性細菌細胞集団における抗生物質耐性を不活性化するためのプロバイオティック組成物の製造方法であって、請求項２１に記載の核酸送達ビークル、又は請求項２２に記載の送達可能核酸をプロバイオティック細菌中に導入し、それにより、抗生物質耐性を不活性化できる送達可能核酸を有するプロバイオティック細菌を含むプロバイオティック組成物を製造する工程を含む方法。
【請求項２７】
添付図面を参照して、本明細書に記載される、医薬組成物、使用のための組成物、核酸送達ビークル、送達可能核酸、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中でも核酸送達ビークル、送達ビークルを含む医薬組成物を含む組成物、及び送達ビークルの使用又は製造を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロバイオームにおける細菌間の遺伝子情報のトランスファー又は交換は、自然の中では広範囲に及んでおり、そして直接的ＤＮＡトランスファー、細菌接合、及びバクテリオファージ（ファージ）感染により起こり得る。
【０００３】
直接的ＤＮＡトランスファーは、１９２８年、Frederick Griffithにより実証されており、これは最初の遺伝子工学的実験であった。ストレプトコッカス・ニューモニエス・スムース（S）（Streptococcus pneumoniae smooth）形は毒性であり、ラフ（R）形は無毒である。Griffthは、マウスに注射された場合、熱殺害されたS及び生存Rの混合物が、生存している非病原性R形の毒性S形への変換をもたらし、肺炎及び死に至ったことを示している。この変換に関与する「形質転換原理」は、後で１９４４年、Avery, MacLeod and McCartyにより、ＤＮＡであると同定された。多くの細菌種は、これを可能にする特殊なＤＮＡ取り込み機構を有するそのようなＤＮＡ形質転換のために当然有能であり得る。実験的に、天然の能力を欠く細菌は、化学的又は物理的処理によりＤＮＡ形質転換のために有能にされ得（Sambrook and Russell, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, CSHL Press, 2001を参照のこと、これは引用によりその全体を本明細書に組込まれる）、そしてこれは、実験室の遺伝子クローニング実験において非常に使用されて来た。
【０００４】
細菌間の遺伝情報のトランスファーである細菌接合は、１９４６年、Lederberg及びTatumにより大腸菌（Escherichia coli）において記載された。１９５２年、Lederbergは、トランスファーされたＤＮＡ分子を記載するために用語「プラスミド」を作り出した。細菌において、プラスミドは通常、細菌染色体とは独立して複製する環状ＤＮＡ（時々、ストレプトマイセス（Streptomyces）においては、直鎖状）分子であり、そして細菌接合の間、細菌間で伝達され得る。それらは例えば、抗生物質耐性遺伝子及び病原性遺伝子をコードする遺伝子、及びそれらを受ける細菌に増大された代謝多様性を提供する遺伝子の普及のための剤である。そのような遺伝子のプラスミドドランスファーはまた、転移可能な遺伝子要素、及びＤＮＡ組換えにより、異なるプラスミド間で、及びプラスミドと細菌染色体との間で移動できるインテグロンを介して媒介され得る。プラスミドは、直接的ＤＮＡトランスファーによる組換えポリヌクレオチドの細菌細胞への導入のためのＤＮＡベクターとして使用される。
【０００５】
バクテリオファージ（「ファージ」又は「細菌ウィルス」とも呼ばれ、それらは本明細書においては、「バクテリオファージ」と同義語で及び交換可能的に使用される）は、ファージタンパク質コートに封入された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡウィルスである。タンパク質コートは、標的細菌細胞の認識を可能にする。これに続いて、ファージ核酸送達を介して感染が行われる。感染の後、溶菌ファージは複製し、ファージコートタンパク質を生成し、そして細胞溶解及び死滅に続いて、パッケージングされ、そして放出される。細胞に存在する他のＤＮＡ、例えば染色体及びプラスミドＤＮＡは代わりに、時々、ファージキャプシド中にパッケージングされ、そして次に、そのような遺伝子は新しい細胞の感染に続いて、広がることができ；これは一般的な形質導入として知られている。温存ファージは、溶菌サイクルに加えて、別の生活様式、すなわち溶原性の確立を有する。例えば、大腸菌ファージλは、感染に続いて、細菌染色体中に組込み、そして細菌染色体と共に受動的に複製し、休止状態のまま存続し、その後、切除し、溶解サイクルに入ることができる。誤った切除は、ファージ中にまたパッケージングされ、そして新しい細胞の感染に続いて、広がることができる隣接細菌遺伝子のパッケージングをもたらすことができ；これは特殊形質導入として知られている。非毒性ファージと呼ばれる他のファージは、感染し、複製し、そして細胞を殺すことなく新しいファージを放出するコートタンパク質にパッケージングされる。ファージはまた、ファージ感染による組換えポリヌクレオチドの細菌細胞への導入のためのＤＮＡベクターとして、例えばE．コリファージ（コリファージ）λ及びＭ１３に基づくそれらのＤＮＡベクターとして実験的にも使用される。
【０００６】
直接的ＤＮＡトランスファー、プラスミド及びファージ送達が、遺伝子クローニング、遺伝子機能の分析、及びＤＮＡ配列決定のために実験システムで使用される。それらはまた、生物学的治療への適用のための組換えタンパク質の発現のためにも使用される。溶解性ファージはまた、細菌感染の治療のための生物学的治療剤として長く使用されて来た（Nobrega et al., Trends in Microbiology, 23: 185-191, 2015による「ファージ治療」の概説を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組込まれる）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術のシステムに対して新規用途及び利点を有する新規核酸送達ビークルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の側面によれば、微生物、例えば細菌細胞中に送達可能核酸を送達するための核酸（例えば、ＤＮＡ）送達ビークル（また「トランスミド」として本明細書において言及される）を含む医薬組成物が提供され）、ここで前記送達ビークルが、１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質にパッケージングされた送達可能核酸を含み、そして前記送達可能核酸が、以下：
（ａ）栄養複製起点（例えば、ｏｒｉＶ）、及び送達可能核酸（例えば、広範 又は狭い範囲の細菌種）の栄養核酸複製を可能にする１又は２以上の核酸複製タンパク質をコードする１又は２以上の遺伝子（例えば、１又は２以上のｒｅｐ遺伝子）；
（ｂ）トランスファーの起点（例えば、ｏｒｉＴ）、及び接合の間、プラスミド可動のために必要とされるリラキサソーム（relaxasome）機能をコードする１又は２以上のリラキサソーム核酸配列を含む伝達核酸配列；
（ｃ）前記１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質中への送達可能核酸のパッケージングを可能にする１又は２以上のバクテリオファージパッケージングシグナル配列（例えば、インビトロ又はインビボ）；及び
（ｄ）選択された目的の核酸；
を含み、結果的に、前記送達ビークルは、細胞中に送達可能核酸を導入するために細菌細胞を感染することができ、これに続いて、送達可能核酸が細胞中でプラスミドを形成することができ、そして（感染によってではなく）、接合により１又は２以上の異なる細菌細胞に伝達され得る。
【０００９】
送達ビークルは好ましくは、非溶解性であり、結果的に、細菌細胞が感染されると、送達可能核酸は、さらなる感染ではなく、接合により１又は２以上の異なる細菌細胞に伝達され得る。従って、送達可能核酸は、溶解性ファージに見出される溶解挙動を可能にする機能を切除することができる。
【００１０】
医薬組成物は、部位特異的核酸組換え（例えば、Ｃｒｅ / ｌｏｘ媒介組換え）を用いて、送達可能核酸中への目的の選択された核酸の挿入を可能にする挿入部位をさらに含む。
【００１１】
プラスミドが接合により伝達される１又は２以上の異なる細菌細胞は、プラスミド接合（例えば、広い又は狭い宿主範囲で）のために必要とされる接合機能をコードする１又は２以上の接合核酸配列（例えば、ｔｒａ遺伝子）を含む。
【００１２】
さらに又は他方では、伝達核酸配列は、プラスミド接合（例えば、広範な又は狭い宿主範囲内、及び異なる細菌種の中及び間のいずれか）のために必要とされる接合機能をコードする１又は２以上の接合核酸配列（例えば、ｔｒａ遺伝子）をさらに含む。
【００１３】
以下に詳しく述べられるように、プラスミドが接合により伝達される１又は２以上の異なる細菌細胞がそれら自体の接合核酸配列を有する場合、送達可能核酸はそれ自体の接合核酸配列を必要としない。なぜならば、前記１又は２以上の異なる細菌細胞は接合・コンピテントであるからである。
【００１４】
しかしながら、１又は２以上の接合核酸配列をさらに含む送達可能核酸は、プラスミド自体を形成し、そして伝達することができ（すなわち、それは自己伝達可能である）、１又は２以上の異なる細菌細胞が内因性の１又は２以上の接合核酸配列、例えばｔｒａ遺伝子を有さない場合でさえ、プラスミド接合による１又は２以上の異なる細菌細胞への選択された核酸の伝達を可能にする。言い換えれば、ここでは、送達可能核酸は、それ自体の接合能力を提供する。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、細菌細胞は、接合性プラスミドにより形質転換され、そして本発明の核酸送達ビークルにより感染され得（何れかの順序で）、結果的に、送達可能核酸は１又は２以上の異なる細菌細胞への接合により伝達され得る。本発明のこの側面によれば、プラスミド接合のために必要とされる機能をコードする接合核酸配列は接合性プラスミドに提供されるので、それ自体の接合核酸配列を有さない送達可能核酸が使用され得る。
【００１６】
上述の発明は、種々の側面によれば、接合性成分の細菌細胞（例えば、プロバイオテック細菌）の製造方法、及びこのようにして形成された接合性成分の細菌細胞を包含する。
【００１７】
宿主特異的接合核酸配列及び／又は宿主特異的接合性プラスミドが、本発明に使用され得る。
【００１８】
医薬組成物中の選択された核酸は、下記：
−１又は２以上の遺伝子を不活性化するか、又はダウンレギュレートできる（例えば、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム、遺伝子不活性化又はダウンレギュレーションのためのＴＡＬＥＮＳ又はジンクフィンガー（zinc finger）ヌクレアーゼを用いて）１又は２以上の遺伝子不活性化又はダウンレギュレート核酸配列；及び／又は
−細菌細胞及び／又は１又は２以上のさらなる細菌細胞に所望の形質を付与する１又は２以上のさらなる核酸配列、
から成る群の１又は２以上又はすべてである。
【００１９】
例えば、不活性化されたか又はダウンレギュレートされた１又は２以上の遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子又は必須遺伝子（細菌細胞の死をもたらす不活性化又はダウンレギュレーション）であり得る。
【００２０】
医薬組成物中の送達可能核酸は、細菌染色体への送達可能核酸の転位（例えば、細菌性トランスポゾンＴｎ７の部位特異的ＤＮＡ転位システム）を可能にする遺伝子機能をさらに含む。
【００２１】
医薬組成物中の送達可能核酸は、送達可能核酸（例えば、毒素/抗毒素遺伝子、バクテリオシン、および細菌細胞分裂後の送達可能な核酸の継承を保証するＤＮＡ配列）を獲得する細菌細胞に選択的利点を提供する選択核酸配列をさらに含む。
【００２２】
医薬組成物中の送達可能核酸はさらに、選択可能マーカー（人工的選択のために適切な形質を付与する）を含むことができる。
【００２３】
医薬組成物は、非経口、経口、局所又は吸入（例えば、エアロゾルを介して）方法による投与のために製剤化される。
【００２４】
１つの側面におれば、医薬組成物中の選択された核酸は、遺伝子不活性化のためのＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて１又は２以上の抗生物質耐性遺伝子を不活性化できる抗生物質耐性遺伝子不活性化核酸配列である。
【００２５】
本発明の別の側面によれば、医薬として使用するための、本明細書に定義されるような医薬組成物が提供される。
【００２６】
医薬組成物は、抗生物質耐性細菌により引起される感染の治療への使用のためであり得る。
【００２７】
本発明のさらなる側面によれば、抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性細菌細胞により引起される対象における感染を治療するための方法が提供され、治療的有効量の医薬組成物（本明細書で定義されるような１又は２以上の抗生物質耐性遺伝子を不活性化することができる抗生物質耐性遺伝子不活性化核酸配列を有する）を、前記細菌細胞中に導入し、それにより、抗生物質耐性遺伝子を不活性化し、そして細胞を抗生物質に感作させる工程を含む。
【００２８】
治療方法においては、組成物は、非経口、局所、経口的に又は吸入（例えば、エアロゾル送達を介して）により投与される。
【００２９】
治療される対象は、魚、鳥、爬虫類又は哺乳類（例えば、ヒト）であり得る。
【００３０】
治療方法においては、送達可能核酸が、プラスミド接合により抗生物質耐性細菌細胞から直接的に別の細菌細胞（例えば、さらなる抗生物質耐性細菌細胞）にトランスファーされる。
【００３１】
治療方法は、細菌細胞が感作されるようになった抗生物質を対象に同時に又は連続的に投与する工程をさらに含む。
【００３２】
本発明の別の側面によれば、工業的細胞培養物中の細菌細胞を改変するための方法であって、本明細書で定義される本発明の核酸送達ビークルにより細菌細胞を感染させる工程が提供される。
【００３３】
上記の方法の選択された核酸は例えば、生合成遺伝子、又は医薬的活性タンパク質（例えば、抗体）をコードする遺伝子である。
【００３４】
また本発明によれば、本明細書に定義されるような核酸送達ビークルも提供される。
【００３５】
さらに、本明細書に定義されるような送達可能核酸も提供される。
【００３６】
別の側面によれば、本発明は、抗生物質耐性細菌により引起される感染の治療又は予防のための薬剤の製造への使用のための、本明細書に定義されるような核酸送達ビークルを提供する。
【００３７】
本発明はまた、抗生物質耐性細菌細胞における抗生物質耐性を不活性化するための方法を提供し、前記方法は、本明細書で定義されるような核酸送達ビークル、又は本明細書で定義されるような送達可能核酸を、細菌細胞中に挿入する工程を含む。
【００３８】
別の側面によれば、本発明は、本明細書で定義されるような核酸送達ビークルの製造方法を提供し、前記方法は、送達可能核酸を構築し、そして次に、送達可能核酸を、１又は２以上のバクテリオファージコートタンパク質中にパッケージングする工程を含む。
【００３９】
また、抗生物質耐性細菌細胞集団における抗生物質耐性を不活性化するためのプロバイオティック組成物の製造方法が提供され、前記方法は、本明細書に定義されるような核酸送達ビークル、又は本明細書に定義されるような送達可能核酸をプロバイオティック細菌中に接合により導入し、それにより、抗生物質耐性を不活性化できる送達可能核酸を有するプロバイオティック細菌を含むプロバイオティック組成物を製造する工程を含む。
【００４０】
上記方法により得られるか又は得ることができるプロバイオティック組成物もまた、本発明の１つの側面である。
【００４１】
本発明のさらなる側面、特徴及び非制限的実施形態が、以下の図面を参照して以下に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構造：この図は、６つの異なる領域を標的化する６つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を示す。各ｃｒＲＮＡは、Ｐで示される同じプロモーターモノシストロン的に転写され、各標的について同一の転写レベルが制御される。各ｃｒＲＮＡ転写体は、リーダー配列Ｌで始まり、そしてターミネーター配列Ｔで終結する。各プレ−ｃｒＲＮＡの転写体は矢印で示され、そして異なるスペーサー配列を含むボックスはユニーク陰影で示される。
【００４３】
【図２】改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド、Ｃａｓ９Ｒの地図。Ｃａｓ９とＴｎ３リゾルバーゼとの間の遺伝子融合。リゾルバーゼ及びＣａｓ９は、矢印により示される。矢頭の方向は、転写極性を示す。Ｃａｓ９の機能ドメイン名は、Ｃａｓ９オープン矢印下のボックスに示される。このＣａｓ９は、エンドヌクレアーゼ活性欠損変異体ｄＣａｓ９であり、ＲｕｖＣＩドメインにおけるアミノ酸置換Ｄ１０Ａ、ＨＮＨドメインにおけるアミノ酸置換Ｈ８４０Ａが存在する（Tsai et al. [2014, Nature Biotechnology 32: 569-576により、記載される；これはその全体が参照により穂明細書に組込まれる）。変異体Ｔｎ３リゾルバーゼ（Proudfoot et al. [2011 PloS ONE 6(4): e19537により記載される；これはその全体が参照により穂明細書に組込まれる）は、１２マーポリペプチドリンカーによりこのｄＣａｓ９のＮ端末に融合される。組換え部位の特異性を低めるそれらの置換アミノ酸残基のいくつかの位置が、リゾルバーゼのＮ末端ドメイン、残基１−１４８に短い縦のバーにより示される。これらの置換の完全なリストは次の通りである：Ｒ２Ａ、Ｅ５６Ｋ、Ｇ１０１Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、Ｍ１０３Ｉ、Ｑ１０５Ｌ、Ｖ１０７Ｆ、Ｅ１３２Ａ、Ｌ１３５Ｒ。融合体のＣａｓ９領域においては、ＲｕｖＣＩ、II、III、ＨＮＨ及びＰＩ（ＰＡＭ相互作用）ドメインはヌクレアーゼドメインであり、ＲＥＣ１及びＲＥＣ１ｂはそれぞれ、反復及び抗反復ＲＮＡの認識ドメインである。ＲＥＣ２ドメインは、プロトスペーサーｇＲＮＡへテロ二本鎖とのいかなる接触も有さない。４種のＣＲＩＳＰＲスペーサー配列Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４は、１つのＣＲＩＳＰＲリーダー配列の発現下に配列され、そして標的配列の欠失及び再連結を導く変異体Ｔｎ３リゾバーゼによるＣａｓ９Ｒ−介在組換え事象を引起すために必要とされる。Ｔｎ３Ｒ＝Ｔｎ３リゾルバーゼ、Ｒ＝直接的反復、Ｌ＝リーダー配列。
【００４４】
【図３】ｇＲＮＡ指図されたＣａｓ９によるリゾルバーゼの部位特異的配置を示す模式図。工程Ｉにおけるオープン矢印は、不活性化のためのプラスミド上の標的抗生物質耐性遺伝子である。各組換え部位Ａ（Ａ１、Ａ２）及びＢ（Ｂ１、Ｂ２）は、独立してｇＲＮＡにより認識され、そして正確に配置されたリゾルバーゼは、近接して二量体化される（工程II）。各組換え部位Ａ１＋Ａ２及びＢ１＋Ｂ２におけるダイマーは、四量体化され、シナプスが形成される（工程III）。シナプス複合体（III）は拡大され、ｇＲＮＡはＳ１、Ｓ２、Ｓ３と命名された点線の矢印として示される。大きな髄円はｄＣａｓ９を表し、縦の髄円はリンカーペプチドを介して連結されたリゾルバーゼである。白及び灰色の長楕円は、それぞれ組換え部位Ｂ及びＡ上で二量体化するリゾルバーゼ触媒ドメインである。垂直の矢印は、レゾルバーゼによる組換え部位上の切断位置を示す。薄い水平平行の矢印は、組換え部位Ａ１＋Ａ２を含むＤＮＡを表し、そして太い水平平行の矢印は、組換え部位Ｂ１＋Ｂ２を含むＤＮＡを表す。矢頭はＤＮＡ配列の３′末端を示す。黒の短い矢印は、各ＰＡＭ配列の位置である。
【００４５】
【図４】組換え部位Ａ１＋Ａ２及びＢ１＋Ｂ２の半分の部位を交換して、そして次ぐ鎖分解能及びシーリングブレークポイントを示す概略図。組換えＡ１及びＢ１の半分の部位が交換され、連結され、そして分解される。標的抗生物質遺伝子の領域は環状ＤＮＡとして分解されるが、染色体又はプラスミドレプリコンの残りは再環状化される（工程IV）。黒の短いブロック矢印は、分解後の各ＰＡＭ配列の位置である。
【００４６】
【図５】デザインｃ−トランスミド、Ｃ−ＴＮＢ００１に用いられる遺伝子。プラスミドＲＫ２、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１及びｐＧＲＧ３６からの機能的遺伝子要素は、以下を例示するために使用される：接合性トランスミド、ｃ−トランスミド：機能（F）トランスファー（ＴＲＡ）、起点（ＯＲＩ）、複製（ＲＥＰ）、可動（ＭＯＢ）、パーティショニング（ＰＡＲ）、プラスミド維持（ＰＭ）、遺伝子発現調節（ＲＧＥ）、組換え（ＲＥＣ）、パッケージング（ＰＫ）、抗生物質マーカー（ＡＭ）、塩基対（ＢＰ）、サイズ（Ｓ）、合計（Ｔ）。ボックス中の大文字のオペロン及び遺伝子は、対応するプラスミドから集められ、そしてアセンブリーされ、トランスミドが生成される。
【００４７】
【図６】ｃ−ＴＮＢ００１の構造。ｃ−トランスミドは環状であり、この図はトランスミドの線状地図を示す。このトランスミドの合計サイズは、４３，１３７ｂｐである。それはｏｒｉ２から複製し、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（ＢＡＣ）から取られ、そしてｐＢｅｌｏＢＡＣ１１のｓｏｐＡＢＣを用いて細胞分裂に続いて安定維持される。それは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１からのλパッケージングのためのｃｏｓ部位を含み；ａｐｈＡ、カナマイシン耐性（ＫｍＲ）をコードする抗生物質マーカー、Ｔｒａ１，Ｔｒａ２及びＣｔｌオペロンはＲＫ２から取られる。ｃ−トランスミドは、ｔｒａｌＪＫＡを用いてｏｒｉＴからトランスファーされる。トランスポゾンＴｎ７遺伝子は、ｐＧＲＧ３６から取られる逆位ｌｏｘ部位、ｌｏｘＮ及びｌｏｘ７１は、Ｔｎ７末端逆位反復体（ＴＩＲ）−左端（ＬＥ）右端（ＲＥ）の間に埋め込まれ；トランスポゼース複合体の左右の認識部位が、線状地図下で、２３６４５−２４７９２領域において拡大されたことが示されている。
【００４８】
【図７】ｃ−ＴＮＢ００１構築スキーム。ＰＣＲ鋳型Ａ：ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、Ｂ： ＲＫ２、 Ｃ： ｐＧＲＧ３６：：ｌｏｘ。２つの逆位ｌｏｘ部位ｌｏｘＮ及びｌｏｘ７１を含むＤＮＡカセットが、ｐＧＲ３６上のＰａｃＩ及びＥａｇＩ部位で挿入され、そしてｐＧＲ３６：：ｌｏｘと命名する。このｌｏｘカセットの上鎖及び下鎖の配列は、それぞれ以下の通りである：5’-ATAACTTCGTATAAgGTATcCTATACGAAGTTATgcggcgcaagcttaccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (配列番号1) 及び 5’-ggccATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAcggtaagcttgcgccgcATAACTTCGTATAGgATACcTTATACGAAGTTATat (配列番号２)。アンプリコン１、２及び３は、鋳型Ａからである。アンプリコン４，５，６，７，８，９，１０及び１１は、鋳型Ｂから別々に増幅され、アンプリコン１２及び１３は、鋳型Ｃから増幅される。各アンプリコンにおいて得られる遺伝子は、図８に示されている。アンプリコン１＋２及び３＋４＋５はアセンブルされ、コンストラクトＩが得られ、アンプリコン３及び７＋８、９＋１０＋１１、１２＋１３はアセンブルされ、それぞれコンストラクトII、III及びIVが得られる。文学ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは次の制限酵素認識部位を表す：ａ ＝ ＡｓｃＩ、 ｂ ＝ ＡｂｓＩ、 ｃ ＝ＡｖｒＩＩ、 ｄ ＝ ＰａｃＩ、ｅ ＝ ＭｌｕＩ、ｆ ＝ ＡｓｉＳＩ。４＋５＋６は、ｂとｃとの間でクローン化され、続いて１２＋１３はｄとｃとの間でクローン化され、９＋１０＋１１はｅとｄとの間でクローン化され、７＋８はｆとｅとの間でクローン化される。最終工程においては、コンストラクトはＡｓｃｌ（ａ）により切断され、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を含むｐＢｅｌｏＢａｃ１１の不必要な領域が除去される。
【００４９】
【図８】遺伝子地図及びｃ−ＴＮＢ００１のプライマーアニーリング部位。プライマーアニーリング領域の位置が、トランスミドの最終コンストラクトに沿ってマッピングされる。アセンブルされたフラグメントを連結するために使用されるユニーク制限酵素がまた、示される。線状地図上の番号は、図７に示されるアンプリコンに対応する。遺伝子組織が、線状地図の下に示される。
【００５０】
【図９】カーゴドッキング反応：切除反応による組換え経路１。カーゴドッキング反応は、以下の２つの工程を含む：（ｉ）トランスミドと、カーゴを供与するプラスミドとの間の組換え事象（Ｉ）、及びトランスミド中に組込まれるカーゴを含む細胞のための選択工程（II及びIII）。カーゴを含むプラスミド（Ｐ）を用いて、トランスミドを含むＥ．コリを形質転換する。カーゴは、一端にｌｏｘＰを、及び他端に、黒の四角により示されるｌｏｘ７１（左アーム変異体）を有する。Ｃｒｅ発現に続いて、カーゴが切除され、２つの環状分子が生成され、その１つは１つのｌｏｘ７１（Ａ）を有するカーゴを含み、他の１つは、カーゴを有さず、そして野生型ｌｏｘＰ（Ｂ）を有するベクター骨格を含む。トランスミド（Ｔｏ）は、Ａ又はＢの何れかと組換えすることができ、黒の三角で示される単一のｌｏｘ６６部位（右アーム変異体）を含む。Ａがトランスミド上でｌｏｘ６６と組換えする場合、一端は１つのアーム（Ｔ１＋）上に二重変異体ｌｏｘ部位を含み、従って逆切除反応が低められる（Ｉ）。Ｂがトランスミド上のｌｏｘ６６と組換えする場合、一端は右（Ｔ２＋）上に１つの変異体を含み、これは、逆切除反応をまだ可能にし、カーゴ（Ｉ）を含むトランスミドの量を低める。接合によりもたらされる選択工程においては、Ｔ０、Ｔ１＋、Ｔ２＋は、受容体（II）にトランスファーされ、次にカーゴを含むトランスミドが、抗生物質マーカー、及びカーゴ及び受容体細胞（III）により担持される陰性選択マーカーの組合せを用いて選択される得る。
【００５１】
【図１０】カーゴドッキング反応：交換反応による組合せ経路２。カーゴを含むプラスミド（Ｐ）を用いて、トランスミドを担持するＥ．コリを形質転換する。カーゴは、一端上のｌｏｘＮ（８ｂｐのコア領域中の突然変異）により、及び他端上のｌｏｘ７１（左アーム変異体）により切断される。組換えは、ｌoｘ部位間に同一の８ｂｐコア配列を必要とするので、カーゴは２つのｌｏｘ部位間で切除されない。Ｃｒｅ発現では、プラスミドとトランスミドとの間で交換され、このトランスミドはまた、逆位ｌｏｘＮ及びｌｏｘ７１も含む。ｌｏｘＮコア配列は、黒の四角で示され、これは、白の三角及び白の四角によりサンドイッチされている。ｌｏｘ７１左アームは、黒の四角により示される。０は空のトランスミドを示し、１は負荷されたトランスミドを示す。Ｐ０１及びＰ１０は、状態０から状態１への状態遷移確率であり、その逆も同様である。接合工程においては、カーゴを有するか又は有さないトランスミドは、受容体（II）にトランスファーされ、ここでカーゴを含むトランスミドのみが、抗生物質マーカー、及びカーゴ及び受容体細胞（III）により担持される陰性選択マーカーの組合せを用いて選択され得る。
【００５２】
【図１１】カーゴドッキング反応：交換及びロッキング反応による組換え経路３。  カーゴを含むプラスミドＰを用いて、トランスミドを担持するＥ．コリを形質転換する。カーゴが、一端で逆位ｌｏｘＮ＋７１（８ｂｐのコア領域及び左アームにおける突然変異）により、及び他端でｌｏｘ７１（左アーム変異体）により切断される。カーゴは、組換えがｌｏｘ部位間に同一の８ｂｐコア配列を必要とするので、２つのｌｏｘ部位間で切断されない。カーゴはまた、プラスミドとトランスミドとの間で交換され、これはまた、逆位ｌｏｘＮ＋６６（８ｂｐのコア領域及び右アームにおける変異体）及びｌｏｘ６６（右アーム変異体）も含む。ｌｏｘ７１左アームは、黒のチェックマークにより満たされた長方形により示されている。組換えは、それぞれ、ｌｏｘＮ＋７１とｌｏｘＮ＋６６との間で及びｌｏｘ６６とｌｏｘ７１との間で生じ、両端上に二重変異体アームを得、これは逆カーゴ非負荷反応を低める。ｌｏｘ６６右アームは、黒のチェックマークにより満たされた三角により示される。ｌｏｘＮ＋７１は、白の三角及び黒のチェックマーク付の長方形でサンドイッチされた黒の長方形により示される。０は空のトランスミドを示し、１は負荷されたトランスミドを示す。Ｐ０１及びＰ１０は、状態０から状態１への状態遷移確率であり、その逆も同様である。接合工程においては、カーゴを有するか又は有さないトランスミドは、受容体（II）にトランスファーされ、ここでカーゴを含むトランスミドのみが、抗生物質マーカー、及びカーゴ及び受容体細胞（III）により担持される陰性選択マーカーの組合せを用いて選択され得る。
【００５３】
【図１２】２つのｌｏｘ部位対間の組換えパターン。  ９種の組換え経路が示されている。三角は、ｌｏｘの方向、及び右アームを表す。三角はｌｏｘ左アームを表し、そしてａ及びｂは異なるＤＮＡを示し、太い実践及び点線は、それぞれａ及びｂ上のｌｏｘ部位により切断された領域を示す。（Ｉ、Ｉ）及び（II、II）及び（III、III）の組合せが交換反応を導く。
【００５４】
【図１３】トランスミドのカーゴ負荷された及び非負荷の状態の遷移確率グラフ。  Ｐ０１＝ドッキング確率は、所望の領域をｐＮＢ３００：：カーゴからトランスミドに統合する確率であり、Ｐ１０＝アンドッキング確率は、所望の統合された領域をトランスミドから崩壊させ、そして初期状態（すなわち、空のトランスミド）に戻る確率であり、１−Ｐ１０＝状態１維持確率、１−Ｐ０１＝状態０維持確率。状態１の定常状態確率＝Ｐ０１／（Ｐ１０＋Ｐ０１）、これは、Ｐ０１がより高められるにつれて、トランスミドの負荷状態がより高められるので、直感的に正しい。
【００５５】
【図１４】カーゴベクターｐＮＢ３００の構造。  カーゴベクターｐＮＢ３００は環状のプラスミドであり、この図は、そのベクターの線状地図を示す。このカーゴベクターの合計サイズは、４８５１ｂｐである。それは、ｐＡＣＹＣ１８４から使用されるｐ１５ＡｏｒｉＶから複製する。それは、カーゴドッキング反応組換え経路（図１０）を使用し、２つの逆位ｌｏｘ部位、ｌｏｘ７１及びｌｏｘＮを含み、この間にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が位置し、これはＣｒｅ−介在性組換え事象のための選択マーカーとして利用されるであろう。カーゴは、ユニーク制限部位ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩでクローン化され得る。Ｃｒｅはこのカーゴベクターから構成的に発現される。ｃｃｄＢ遺伝子はｌａｃオペレーターの制御下にあり、そして所望のカーゴのみだけではなく、ベクターバックボーンがトランスミドにトランスファーされるＣｒｅ介在組換え事象に対する負の選択として使用される。
【００５６】
【図１５】ｐＮＢ３００カーゴベクター構築スキーム。  ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、以下のユニーク制限酵素認識部位を示す：ａ ＝ ＸｂａＩ、ｂ ＝ ＥａｒＩ、ｃ ＝ ＡｓｉＳｉ、ｄ ＝ ＮｏｔＩ、ｅ ＝ ＸｈｏＩ。クローニング部位（ｌｏｘ７１−ｌｏｘＮと命名される）を有するスタッファー領域に隣接する逆位ｌｏｘ７１及びｌｏｘＮ部位（それぞれ、黒色及び白色）を含む合成二重鎖カセット１が、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のＸｂａＩ及びＥａｒＩ部位にクローン化され、ｐＡＣＹＣ１８４：：ｌｏｘ７１−ｌｏｘＮが得られる。フラグメント２は、Ｐ２．前方向及びＰ２．逆方向プライマーを用いてプラスミドｐＦＥ８７２から増幅されたジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子ｄｈｆｒを含むアンプリコンである。ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩ部位が、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩにより消化され、そしてｐＡＣＹＣ１８４：：ｌｏｘ７１−ｌｏｘＮのＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩにクローン化され、コンストラクトＡ（ｐＡＣＹＣ１８４：： ｌｏｘ７１−ｄｈｆｒ-ｌｏｘＮ）が得られる、アンプリコン２の末端に組込まれる。フラグメント３は、Ｐ３．前方向及びＰ３．逆方向プライマーを用いてコンストラクトＡから増幅される。ｃｒｅ遺伝子を含むフラグメント４は、Ｐ４．前方向及びＰ４．逆方法プライマーを用いてプラスミドｐＣＡＧ−Ｃｒｅ＿ＧＦＰから増幅される。フラグメント５及び６は、それぞれ、Ｐ５．前方向、Ｐ５．逆方法及びＰ６．前方向、Ｐ６．逆方向プライマーを用いて、プラスミドｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ (New England Biolabsから入手できる)から増幅される。フラグメント３，４，５及び６は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーによりアセンブルされ、カーゴベクターｐＮＢ３００が得られる。プライマー配列は、実施例１に示される。
【００５７】
【図１６】カーゴベクターｐＮＢ３００の遺伝子地図及びプライマーアニーリング部位。  プライマーアニーリング領域の位置が、カーゴベクターの最終コンストラクトに沿ってマッピングされる。カーゴフラグメントを連結するために使用されるユニーク制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩもまた示される。線状地図上の番号は、図１５に示されるアンプリコンに対応する。
【００５８】
【図１７】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びｐＮＢ１０８に由来するＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを有するカーゴを担持するｐＮＢ３００の線状遺伝子地図。  プラスミドｐＮＢ１０８からのｔｒａｃｒＲＮＡ  Ｃａｓ９及びＶＯＮＣＫＩＳＴ  ＣＲＩＳＰＲスペーサーをコードするアンプリコンがＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより消化され、そして５，３３５ｂｐのフラグメントを、ｐＮＢ３００上のＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ部位中にクローン化し、ｐＮＢ３０１が得られる。ｐＮＢ３０１の合計サイズは、１０、１７９ｂｐでアル。図２９−３１は、例示されたカーゴの構造を示している。
【００５９】
【図１８】Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えに続くｃ−トランスミド、ｃ−ＴＮＢ ００１、 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ ９システム及びｐＮＢ１０８由来の ＶＯＮＣＫＩＳＴ スペーサー。  カーゴｔｒａｃｒＲＮＡ Ｃａｓ９ 及び ＶＯＮＣＫＩＳＴ ＣＲＩＳＰＲスペーサー、及びｄｈｆｒ遺伝子が、インビボでのＣｒｅ−ｌｏｘ組換えによりｃＴＮＢ００１に特異的に組換えられる。この６，３０７ｂｐ領域が、Ｔｎ７左及び右ＴＩＲ部位間に挿入される。カーゴ領域が線状地図の下で拡大され、そして８種のＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを示す。合計サイズは、４９，３５８ｂｐである。
【００６０】
【図１９】カーゴにより負荷されたｃ−トランスミドの選択。  円形の点線により示されるカーゴプラスミド（Ｐ）は、図１４に示される遺伝子要素を担持する。ｃ：負の選択のためのｌａｃオペロンにより制御されるｃｃｄＢ遺伝子、Ａ：ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子ｄｈｆｒ。Ｐは、ｃ−トランスミドｃＴＮＢ００１（円形の実線で示されるＴ０）を有するＦ＋、ｌａｃｌｇ株に形質転換される。２種の組換え経路が、図１１に示される、交換よりドッキング組換え経路２を介して工程１に示される。１つの経路は、単一のｌｏｘ部位での組換えであり、全体のプラスミドＰがトランスミド（Ｔ２）に組換えされる事象が得られ；他の経路は、２つのｌｏｘ部位での組換えであり、所望する組換え体（Ｔ１）が得られる。接合工程（II）においては、Ｔｏ，Ｔ１又はＴ２のいずれかが、接合体のための選択と共に受容体細胞にトランスファーされる。工程３においては、ｃｃｄＢ遺伝子が、トリメトプリム（カーゴによりコードされるＴｐＲ）及びストレプトマイシン（細菌受容体によりコードされるＳｍＲ）の存在下でＴ２を有する細胞を死滅するために発現される。これは、所望のＴ１トランスミドのみを有する受容体細胞についての選択である。
【００６１】
【図２０】パッケージングＤＮＡ基質を調製するためのＴ１単離及びＲＣＡ増幅。  Ｔ１プラスミドが、大コンストラクトプラスミド調製キット、例えばＱＩＡＧＥＮ大コンストラクトキット（カタログ番号１２４６２号）を用いて、図１９において選択された細胞から単離される。Ｔ１は、プライマーｆ（５’−gacatgaggt*t*g*c）（配列番号３）からのｐｈｉ２１ＤＮＡポリメラーゼによるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のための鋳型であり、ここで米印は、ｃｏｓ部位でのホスホロチオエート結合を示す。重合ＤＮＡ上のｃｏｓ部位の下流にアニーリングするｒプライマー（５’−atgGCGAT*C*G*C（配列番号４）（米印は、ホスホロチオエート結合を示す））の存在下で、コンカテマー又は成熟二本鎖ＤＮＡがＲＣＡ反応において蓄積される。この反応は、膜透析、例えばゲノムチューブ−０−透析装置（G-Biosciences, カタログ番号７８６―１４２―４５ＭＣ）により洗浄され得る。この透析される二本鎖ＤＮＡは、パッケージングキット、例えばMaxPlax Lambda Packaging Extracts (カタログ番号ＭＰ５１０５)を用いて、インビトロパッケージングのための基質として利用され得、そしてトランスミドをλファージにパッケージングすることができる。
【００６２】
【図２１】宿主染色体上のａｔｔＴｎ７部位で統合されたカーゴの構造。  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及び８種の異なったβラクタマーゼ遺伝子を標的化するＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーが、ｃ−トランスミドベクターからのＴｎｓＡＢＣＤ−介在性転位に続いて、宿主染色体（Ｃｈ）上のａｔｔＴｎ７で統合される。
【００６３】
【図２２】実施例２で構築されたｐＮＢ１００のプラスミド地図。  プラスミド地図が、SnapGene viewer ver. 2.4.3 free version (http://www.snapgene.com)により描かれた。２つの直接的反復体（ＤＲ）は、リーダー配列の３′末端に隣接する狭い白の長方形ボックスとして示される。
【００６４】
【図２３】写真は、細菌細胞交配（実施例２を参照のこと）による本発明の実施形態に従っての「ネマシス共生活性」（ＮＳＡ）の結果を示す。左のプレートは、Ａｐ１００Ｃｍ３５におけるＪＡ２００ ｐＮＴ３ ｘ  ＤＨ５α ｐＮＢ１００を示し、右のプレートは、Ａｐ１００Ｃｍ３５におけるＪＡ２００ ｐＮＴ３ ｘ ＤＨ５α ｐＮＢ１０２を示し、両プレートは、５×１０７個の細胞／ｍｌでプレートされる。
【００６５】
【図２４】写真は、プラスミド形質転換（実施例２を参照のこと）による本発明の実施形態に従ってのＮＳＡの結果を示す。左：ＬＢ  Ｃｍ３５プレート、コロニー１−４０は、ｐＮＢ１０２により形質転換されたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２であり；コロニー４５−６０は、ｐＮＢ１００により形質転換されたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２である。すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２上に担持されるＣｍに対しての耐性を示し；右：ＬＢ  Ａｐ１００プレート。コロニー１−４０は、、ＮＢＥｃ００１株におけるプラスミドｐＢＲ３２２上に担持されるβ−ラクタマーゼ遺伝子に対して標的化されたスペーサー領域を担持するｐＮＢ１０２による形質転換に続いてＡｐＲを失い、それにより、ネメシス共生活性を実証することを注目すること。このスペーサー領域を欠いているが、しかしＣａｓ９遺伝子を担持するｐＮＢ１００は、β−ラクタマーゼ遺伝子を不活性化することができない。
【００６６】
【図２５】実施例２において構築されたｐＮＢ１０８のプラスミド地図。プラスミド地図が、SnapGene viewer ver. 2.4.3 free version (http://www.snapgene.com)により描かれた。オクタマースペーサーコンカテマー（図２６Ｂを参照のこと）が、制限部位がＡ１及びＡ２に位置するＢｓａＩにより消化され、そしてＮＢ１００上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結され、ｐＮＢ１０８が得られた。ｐＮＢ１０８上の単一のプロモーター及びスペーサー領域（６２２１−７２２５）が示されている。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接的反復体、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テール。連結されたスペーサー（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ及びＣＴＸ−Ｍに対して標的化された）は、単一のプロモーター下に位置する。
【００６７】
【図２６Ａ】実施例２におけるテトラマースペーサー連結。オリゴを会合する数字は、図１５に列挙されるプライマー番号に対応する。オリゴは、それぞれ、ａ、ｃ、ｅ及びｇユニークスペーサー領域（Ｉ）を介して、２６と２７との、２８と３４との、３５と３１との、３２と３６との間でペアワイズアニーリングされ、そして個々の管（II）において拡張される。２６及び２７からのダイマーコンカテマーは、スペーサーａ及びｂを連結する。２８及び３４からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｂ、ｃ及びｄを連結する。３５及び３１からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｅ及びｆを連結する。３２及び３６からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｆ、ｇ及びｈを連結する（II）。連結されたダイマーａ＋ｂ及びｂ＋ｃ＋ｄ、ｅ＋ｆ及びｆ＋ｇ＋ｈはさらに、それぞれｂ及びｆスペーサーを介してハイブリダイズされ、そして拡張され、スペーサーａ、ｂ、ｃ及びｄ、又はｅ、ｆ、ｇ及びｈが連結される（III）。テトラマースペーサーコンカテマーｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈが、制限部位がＢ１及びＢ２に位置するＳａｐＩにより消化され、そしてｐＮＢ２００上のＳａｐＩスペー鎖オークローニング部位に連結され、ｐｎＢ２０２が得られる。テトラスペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄが、制限部位がＡ１及びＡ２に位置するＢｓａＩにより消化され、そしてｐＮＢ２０２上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結され、ｐＮＢ２０３が得られる。ａ＝ＮＤＭのための２０マースペーサー、ｂ＝ＩＭＰのための２０マースペーサー、ｃ＝ＶＩＭのための２０マースペーサー、ｄ＝ＫＰＣのための２０マースペーサー、ｅ＝ＯＸＡ−４８のための２０マースペーサー、ｆ＝ＳＨＶのための２０マースペーサー、ｇ＝ＴＥＭのための２０マースペーサー、ｈ＝ＣＴＸ−Ｍのための２０マースペーサー。
【００６８】
【図２６Ｂ】実施例２におけるオクタマースペーサー連結。テトラマースペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ 及び ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈが、それぞれ、プライマー対ＮＢ０２６及びＮＢ０２９、ＮＢ０３０及び及びＮＢ０３３により増幅され（Ｖ）、そしてスペーサーｄ領域を介してテトラコンカテマーをハイブリダイズし、続いて伸長により、オクタマースペーサーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈを得る。このオクタマーが、ＢｓａＩにより消化され、そして制限部位がＡ１及びＡ２に位置するＢｓａＩに連結され、ｐＮＢ１００上のＢｓａＩスペーサークローニング部位にサンド連結され、ｐＮＢ１０８が得られる。ａ＝ＮＤＭのための２０マースペーサー、ｂ＝ＩＭＰのための２０マースペーサー、ｃ＝ＶＩＭのための２０マースペーサー、ｄ＝ＫＰＣのための２０マースペーサー、ｅ＝ＯＸＡ−４８のための２０マースペーサー、ｆ＝ＳＨＶのための２０マースペーサー、ｇ＝ＴＥＭのための２０マースペーサー、ｈ＝ＣＴＸ−Ｍのための２０マースペーサー。
【００６９】
【図２７Ａ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７０】
【図２７Ｂ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７１】
【図２７Ｃ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７２】
【図２７Ｄ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７３】
【図２７Ｅ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７４】
【図２７Ｆ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７５】
【図２７Ｇ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７６】
【図２７Ｈ】写真はプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ｂｌａＶＩＭ−１ （Ａ）; ｂｌａＯＸＡ−４８ （Ｂ）; ｂｌａＮＤＭ−１ （Ｃ）； ｂｌａＣＴＸ−Ｍ−１５ (Ｄ); ｂｌａＫＰＣ−３ （Ｅ）; ｂｌａＩＭＰ−１ （Ｆ）； ｂｌａＳＨＶ−１８ （Ｇ）;及び ｂｌａＴＥＭ−３ （Ｈ）を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ｐＮＢ１０８及びｐＮＢ１００により形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。（Ａ−Ｇ）においては、６つの単一コロニーが採取され、そしてＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上に画線した。予想通り、すべてのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０８上に担持されるＣｍに対する耐性を保持する。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれらは、ＡｐＲを失った初期の６つのコロニーの全て又はいくつかを示し、それにより、ネメシス共生活性を実証する。図２７Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおいては、矢印は、現在Ａｐ感染性である全てのコロニーを示す。図２７Ｃ、Ｄ及びＧにおいては、矢印は、低められたＡＰ耐性を示す。（Ｈ）においては、単一のコロニーが一次形質転換体から採取され、そしてＬＢＣｍ１６及びＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上にツースピック（toothpicked）された。ｐＮＢ１０８により形質転換されたそれら（３−６、８行目のコロニー、及び７行目の最後の３つのコロニー）は、ＡｐＲを失なっており（すなわち、それらは全て、現在Ａｐ感受性である）、それにより、ｐＮＢ１００（１、２列でのコロニー）、又はｂｌａＴＥＭスペーサー配列を欠いている別のプラスミド（７行目の最初の３つのコロニー）により形質転換されたそれらとは対照的に、ネシメス共生活性を実証する。
【００７７】
【図２８】トランスミドｃＴＮＢ００−Ｘの線状地図。地図は以下を示す：ｃｏｓ 部位（１）、ｏｒｉＶ （２）、ｔｒａｃｒＲＮＡ （３）、ｃａｓ９ （４）、リーダー （５）、直接的反復体 （６）、ＴＥＭ−３ノタメノスペーサー （７）、トレイラー配列 （８）、ｔｒａ２ オペロン（９）、Ｐｓｒ/Ｍｒｓ オペロン（１０）、ａｐｈＡ 遺伝子 （１１）, ｔｒａ１ オペロン （１２）、ｏｒｉＴ （１３)、制御領域（１４）。
【００７８】
【図２９Ａ】写真は、６つのｓｇＲＮＡカセットを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘプラスミド誘導体のプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例５を参照のこと）。βラクタマーゼ遺伝子を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ＶＫＯＮＴＣ１５を標的化するｓｇＲＮＡを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘ_ｓｇ０１７２１０３４Ｒにより形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。次の２６の単一コロニーが、左に示されるＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、右に示されるＬＢｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上にツースピックされた。図２９Ａは以下を示す：コロニー１−２６は、ＶＩＭ−１（ｈｅｘ１）をコードするＮＢＥｃ０３２であり、そしてすべてのＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＫＰＣ−３（ｈｅｘ２）をコードするＮＢＥｃ０３６であり、そして全てのＡｐＳである。図２９Ｂ（上部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＯＸＡ−４８（ｈｅｘ３）をコードするＮＢＥｃ０３３であり、そして２５／２５のコロニーがＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ０００１であり、そして３／２６コロニーがＡｐＳである。図２９Ｂ（低部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＮＤＭ−１（ｈｅｘ５）をコードするＮＢＥｃ０３であり、そしてすべてのコロニーはＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＣＴＸ−Ｍ−１５（ｈｅｘ６）をコードするＮＢＥｃ００３５であり、そしてすべてはＡｐＳである。図２９Ｃは、ＴＥＭ−３遺伝子の標的化の再試験を示す。ここで、一次形質転換体ＬＢＣｍプレートは、再び一晩増殖させ、そして次に、ツースピックされ；コロニー１−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ００１であり、そして４２／５２のコロニーがＡｐＳである。
【００７９】
【図２９Ｂ】写真は、６つのｓｇＲＮＡカセットを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘプラスミド誘導体のプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例５を参照のこと）。βラクタマーゼ遺伝子を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ＶＫＯＮＴＣ１５を標的化するｓｇＲＮＡを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘ_ｓｇ０１７２１０３４Ｒにより形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。次の２６の単一コロニーが、左に示されるＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、右に示されるＬＢｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上にツースピックされた。図２９Ａは以下を示す：コロニー１−２６は、ＶＩＭ−１（ｈｅｘ１）をコードするＮＢＥｃ０３２であり、そしてすべてのＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＫＰＣ−３（ｈｅｘ２）をコードするＮＢＥｃ０３６であり、そして全てのＡｐＳである。図２９Ｂ（上部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＯＸＡ−４８（ｈｅｘ３）をコードするＮＢＥｃ０３３であり、そして２５／２５のコロニーがＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ０００１であり、そして３／２６コロニーがＡｐＳである。図２９Ｂ（低部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＮＤＭ−１（ｈｅｘ５）をコードするＮＢＥｃ０３であり、そしてすべてのコロニーはＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＣＴＸ−Ｍ−１５（ｈｅｘ６）をコードするＮＢＥｃ００３５であり、そしてすべてはＡｐＳである。図２９Ｃは、ＴＥＭ−３遺伝子の標的化の再試験を示す。ここで、一次形質転換体ＬＢＣｍプレートは、再び一晩増殖させ、そして次に、ツースピックされ；コロニー１−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ００１であり、そして４２／５２のコロニーがＡｐＳである。
【００８０】
【図２９Ｃ】写真は、６つのｓｇＲＮＡカセットを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘプラスミド誘導体のプラスミド形質転換によるＮＳＡの結果を示す（実施例５を参照のこと）。βラクタマーゼ遺伝子を担持するプラスミドを有するＤＨ５αが、ＶＫＯＮＴＣ１５を標的化するｓｇＲＮＡを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘ_ｓｇ０１７２１０３４Ｒにより形質転換され、そしてクロラムフェニコール（Ｃｍ）１６μｇ／ｍｌを補充されたＬＢプレート上で選択される。次の２６の単一コロニーが、左に示されるＬＢＣｍ１６プレート、及びＣｍ及びアンピシリン（Ａｐ）の両者を担持するプレート、右に示されるＬＢｍ１６Ａｐ１００プレート（Ｃｍ、１６μｇ／ｍｌ、Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）上にツースピックされた。図２９Ａは以下を示す：コロニー１−２６は、ＶＩＭ−１（ｈｅｘ１）をコードするＮＢＥｃ０３２であり、そしてすべてのＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＫＰＣ−３（ｈｅｘ２）をコードするＮＢＥｃ０３６であり、そして全てのＡｐＳである。図２９Ｂ（上部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＯＸＡ−４８（ｈｅｘ３）をコードするＮＢＥｃ０３３であり、そして２５／２５のコロニーがＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ０００１であり、そして３／２６コロニーがＡｐＳである。図２９Ｂ（低部）は以下を示す：コロニー１−２６は、ＮＤＭ−１（ｈｅｘ５）をコードするＮＢＥｃ０３であり、そしてすべてのコロニーはＡｐＳであり；コロニー２７−５２は、ＣＴＸ−Ｍ−１５（ｈｅｘ６）をコードするＮＢＥｃ００３５であり、そしてすべてはＡｐＳである。図２９Ｃは、ＴＥＭ−３遺伝子の標的化の再試験を示す。ここで、一次形質転換体ＬＢＣｍプレートは、再び一晩増殖させ、そして次に、ツースピックされ；コロニー１−５２は、ＴＥＭ−３（ｈｅｘ４）をコードするＮＢＥｃ００１であり、そして４２／５２のコロニーがＡｐＳである。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本発明のさらなる側面及び特徴が下記に示される。
【００８２】
また「トランスミド」として本明細書において言及される、本発明の核酸送達ビークルは、目的の選択された核酸を、微生物、例えば細菌中に導入し、そしてマイクロバイオーム、例えば特定の環境、例えば人体又は人体の一部における他の微生物への選択された核酸の続く広がりを促進するために、細菌ウィルス及び細菌プラスミドの選択された特徴を組合せる。トランスミドの送達可能核酸成分は、感染による送達を可能にするために、バクテリオファージコートタンパク質中にパッケージングされる。感染は、感染された細菌細胞におけるトランスミドの送達可能核酸成分の放出及び複製、及び細菌接合によるほかの細菌へのその続く伝達を導く。
【００８３】
トランスミドは、例えば細菌病原体における抗生物質耐性及び病原性遺伝子の不活性化、又はマイクロバイオームの集団構造の改変、すなわちマイクロバイオーム工学のために使用され得る。マイクロバイオーム工学はまた、所望の又は有益な遺伝子の胃腸管における存在するマイクロバイオーム、例えばワクチン、治療薬及び栄養補助食品への現場トランスミド送達によってもたらされ得る。本発明のトランスミドは、例えば食品及び発酵技法、並びに生化学工学及びバイオ燃料生産において使用され得る。
【００８４】
本発明の種々の側面によれば、本明細書に記載される核酸送達ビークルは、バクテリオファージ（ファージ）キャプシド又はコード中にパッケージングされ、そして従って、送達可能核酸、例えばＤＮＡを、標的細菌細胞中に送達可能核酸の送達のために注入するファージ誘導体の能力を開発できる、接合性の又は可動可能なプラスミド誘導体を含む。標的細菌、例えば感染された個体における細菌病原体の感染に続いて、送達可能核酸は、ファージ粒子から放出され、そして細菌細胞に入り、そして複製する。
【００８５】
以下の２つの特定型のトランスミドが定義され得る：（ｉ）本明細書においては「ｃ−トランスミド」として言及される接合性トランスミド；及び（ii）本明細書においては「ｍ−トランスミド」として言及される可動可能トランスミド。
【００８６】
ｃ−トランスミドは、それが受容体細菌との接合を可能にする全ての遺伝子機能を担持する送達可能核酸を含むので、事故伝達性である。それらの機能は以下を含むことができる：（ｉ）ＤＮＡ可動機能−トランスファーｏｒｉＴの起点、及び／又はｏｒｉＴでニックを導入するためにリラクサゾームを形成するタンパク質又は複数のタンパク質をコードする遺伝子；及び（ii）例えば、線毛アセンブリー及び生成、内膜タンパク質、ペリプラズムタンパク質、表面排除タンパク質及び／又は交配対安定化を含む他のトランスファーｔｒａ機能（Thomas & Nielsen Nat. Rev. Microbiol. 3, 711-21, 2005によるレビューを参照のこと； その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
ｍ−トランスミドは、例えば核酸（例えば、ＤＮＡ）可動機能を含むドナーから受容体細胞への可動を可能にする遺伝子機能を担持する送達可能核酸を含む。ｍ−トランスミドは、ドナー細菌細胞にも存在する接合性プラスミドにより提供されるべき、他のｔｒａ機能からの機能的相補性を必要とする。
【００８８】
ファージ感染により最初に送達されるｃ−トランスミドからの送達可能核酸を有する細菌はまた、ドナーとしても機能し、そして細菌プラスミド接合により、送達可能核酸を他の細菌（例えば、マイクロバイオームにおける）に送達する。ｃ−トランスミドからの送達可能核酸を受ける各細菌細胞は、１又は２以上の続く３ラウンドの細菌接合において、それを他の新しい受容体（例えば、マイクロバイオームにおける）に伝達することができる。このようにして、目的の選択された核酸は、細胞集団内に広がる。
【００８９】
ファージ感染によりまた最初に送達されるｍ−トランスミドからの送達可能核酸を有する細菌はまた、ドナーとしても機能し、そして送達可能核酸を、細菌病原体（例えば、マイクロバイオームにおける）を含む他の細菌に伝達することができる。目的の選択された核酸はまた、細菌集団内に広がる。しかしながら、これは、共存する接合性プラスミドが細菌に存在し、必要とされる他のｔｒａ機能が提供されることを必要とする。
【００９０】
トランスミドはまた、治療される個体のマイクロバイオームに存在する非病原性共生細菌に、ファージ感染による送達可能核酸を最初に送達するために使用され得る。再び、送達可能核酸を現在担持する共生細菌は、ドナーとして作用する。細菌接合により、それらの細菌はトランスミドを伝達し、そして従って、目的の選択されたヌクレオチド配列を、さらなる受容体細菌に広げることができる。また、送達可能核酸を担持する共生細菌は、例えば、細菌接合により送達可能核酸の広がりを促進するために、プロバイオテックスとして直接的に投与され得る。
【００９１】
従って、最初にファージ感染又は共生細菌により送達され、そして細菌接合により広げられた、トランスミドからの送達可能核酸である単一の遺伝子コンストラクトは、治療用途及び予防用途の両者のために使用され得る。
【００９２】
種々の側面によれば、本発明のトランスミドは、以下の追加の利点の１又は２以上、又はすべてを提供することができる：
（ｉ）送達ビークルは好ましくは、病原性遺伝子を含む宿主遺伝子を形質導入することができる溶原性ファージの使用を含まない。医薬組成物又は生物工学への使用のためのトランスミドを商品化するために規制上のハードルが、より少なくなり；及び／又は
（ii）トランスミドは好ましくは、宿主細菌細胞を死滅できる溶解ファージではない。それらは、ファージ送達に対して耐性である標的細菌については、ほとんどか又はまったく選択されておらず；及び／又は
（iii）最初のファージ感染に続いて、送達可能核酸の続く広がりは、接合によってである。ファージ感染のさらなる必要性がないことは、トランスミドを含む医薬組成物に対する患者の免疫応答がほとんどか又はまったくないであろうことを意味する；及び／又は
（iv）トランスミドを含む医薬組成物は、好ましくは無細胞である。従って、組成物の送達は、非経口的に、及び例えば肺感染のためにはエアロゾル送達によってであり得；及び／又は
（ｖ）トランスミドは、ファージ感染段階及び／又は接合伝達段階のために、広範囲又は狭い範囲の細菌細胞に対して調整又は改変され得る。その調整又は改変は、ファージ感染及びプラスミド接合のための適切な遺伝子モジュールを使用でき；及び／又は
（ｖｉ）トランスミドは、臨床送達システム、例えば治療用及び予防用遺伝子モジュールの送達への使用のために理想的ではあるが、しかしまた、工学微生物学及び合成生物学における用途を提供する。
【００９３】
本発明のトランスミドは、以下の３つの成分を含むと思われても良く、そして以下の３つの成分から構成されても良い：（ｉ）「シップ（ｓｈｉｐ）」―複製、ファージパッケージング及び（ｃ−トランスミドについては）接合トランスファーのために必要とされる機能を担持するトランスミドベクターバックボーン；（ii）「カーゴ（Ｃａｒｇｏ）」―目的の選択された核酸の付加のための構築及び柔軟性を容易にするために、非可動性プラスミドクローニングベクター上の構築され得る、送達されるべき目的の選択された核酸；及び（iii）「ドッグ（Ｄｏｃｋ）」−カーゴ、すなわち目的の選択されたヌクレオチド配列を、クローニングベクターから、シップである接合性プラスミドベクターバックボーンにトランスファーするインビボ部位特異的組換えを可能にする機能。
【００９４】
本発明の特定の側面によれば、トランスミドは、以下に概説されるような特徴（又は「遺伝子モジュール」）を含むことができる。
【００９５】
ＯｒｉＶ及びｒｅｐ遺伝子及びコピー数調節−細菌細胞又は宿主へのファージ感染による送達の後、送達可能核酸の複製を可能にするための、栄養複製ｏｒｉＶのプラスミドＤＮＡ起点。典型的には、プラスミドは、ｏｒｉＶにおける認識配列からＤＮＡ複製を開始させるための細菌宿主複製機構をリクルートする。典型的には、１又は２以上のプラスミドコードの複製タンパク質ｒｅｐは、宿主複製機構のｏｒｉＶへのリクルートメントの助けを必要とされる。本発明への使用のためのいくつかのプラスミドｏｒｉＶ及びｒｅｐタンパク質は、広範囲の細菌種の宿主ＤＮＡ複製機能と相互作用することができ、そして広範な宿主範囲（ＢＨＲ）プラスミドとして知られている。
【００９６】
さらなるプラスミド機能は、プラスミドのコピー数及び細胞分裂における分配を通してのその安定性、並びに以下に記載される種々の他の機構、いわゆる「プラスミド依存性」システムを調節する。複製及びコピー数調節機能は、プラスミドを種々のいわゆる非互換性クラスに定義し、ここで非互換性であるものは、複製、コピー数の制御及び安定性のための共通する機構を共有する。そのような非互換性クラスは、ＩｎｃＣ、Ｊ．Ｎ、Ｐ、Ｑ及びＷを包含する。典型例は、ｉｎｃＰαタイプのプラスミドＲＫ２（ＲＰ４、Ｒ１８、Ｒ６８、ＲＰ１としても知られている）である。
【００９７】
他の接合性プラスミドは、細菌宿主中で複製するそれらの能力において、狭い宿主範囲を示す。典型例は、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇにより発見された最初のプラスミドである、受精率又はＦ因子として命名されているＥ．コリのＦプラスミドである。
【００９８】
従って、本発明に使用されるＯｒｉＶ及びｒｅｐ遺伝子の選択は、必要とされる用途に適合するよう調整され得る。例えば、広範な細菌腫、例えばグラム陰性ファミリーのメンバー、すなわち、多くの無害な共生生物と共に、病原体、例えばサルモネラ（Salmonella）、大腸菌（E. coli）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、グレブセラ（Klebsiella）、シゲラ（Shigella）、プロテウス（Proteus）、エンテロバクター（Enterobacter）、セｒａチア（Serratia）及びシトロバクター（Citrobacter）を包含するエンテロバクテリアシアエ（Enterobacteriaciae）において複製できるトランスミドが必要とされる場合、ＢＨＲプラスミドＲＫ２からの特徴を組込むトランスミドが適切な選択である。ＲＫ２は、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）−シュードモンド科（Rseudomondaceae）のメンバーにおいて最初に同定されており、そしてほとんどの属のグラム陰性細菌（Enterobacteriaciae）において複製することができる。他方では、狭い範囲の細菌腫のみにおいて複製できるトランスミドが必要とされる場合、狭い宿主範囲の接合性プラスミドからの特性を組込むトランスミドがより適切であり、例えばE.コリへの使用のためのＦ因子に基くプラスミドが適切である。
【００９９】
ｔｒａオペロン−線毛アセンブル及び生成、内膜タンパク質、ペリプラズムタンパク質、表面排除タンパク質及び／又は交配対安定化をコードする遺伝子もまた、送達可能核酸に含まれ得る。それらの遺伝子は、例えば広宿主範囲の接合性プラスミド、例えばＲＫ２、又は狭宿主範囲の接合性プラスミド、例えばＦ因子から得られる。
【０１００】
ｏｒｉＴ及びリラキシナーゼ遺伝子−トランスファーｏｒｉＴのプラスミド起点が、ドナーから受容体細菌細胞への伝達可能核酸の接合性トランスファーを可能にするために必要とされる。ｏｒｉＴは、二本鎖ＤＮＡにおいて部位−及び鎖特異的ニックを担当する一本鎖ＤＮＡトランスエステラーゼ酵素であるリラクサーゼのための認識配列として機能する。ｏｒｉＴでリラクサーゼにより生成されるニックは、細菌接合の間、ドナーから受容体にトランスファーされる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成するためにプラスミドローリングサークル複製を開始する。リラクサーゼは、それらが触媒する一本鎖ＤＮＡニックが螺旋状張力の緩和を導くので、そのような名称が付けられる。
【０１０１】
バクテリオファージパッケージングシグナル−ファージキャプシド又はタンパク質コートへの良好なパッケージングのために、送達可能核酸は、ファージパッケージングシグナル配列を含む。トランスミドを形成するための送達可能核酸のパッケージングは、ヘルパーファージを用いて、インビトロ又はインビボであり得る。インビボパッケージングのために、ファージアセンブリーのために必要とされる全ての成分を発現するが、しかしファージパッケージングシグナルをそれ自体、欠いており、そして従って、それ自体、パッケージングされ得ない、ヘルパーファージ誘導体を担持する細菌株が使用され得；従って、送達可能核酸を担持するファージ誘導体のみが生成されるであろう。
【０１０２】
トランスミドによる感染の宿主範囲は、異なる手段で操作され得る。１つの手段は、ファージパッケージングシグナル配列を担持する遺伝子モジュールの選択によるものであり、従って、インビボパッケージングに関しては、異なるタイプのヘルパーファージが、病原体を含む種々の異なる細菌種を感染するために使用され得る。
【０１０３】
宿主範囲を操作する別の手段は、感染についてのファージ特異性の変更によるものであり：そのような特異性は、ファージが広範囲の細菌を、テールフィバータンパク質と細胞表面受容体又は膜タンパク質との間の特的相互作用により感染するので、ファージテールファイバータンパク質上に担持される。いくつかのそのような受容体は、広範囲の細菌種に存在し、他は１種又は数種にのみ共通する。Ｅ．コリバクテリオファージλの場合、これは、糖マルトースを細菌細胞に輸送するマルトースペルメアーゼタンパク質である。別のバクテリオファージＭｕの場合、受容体はＬＰＳである。従って、テールファイバータンパク質をコードする遺伝子モジュールはまた、病原体を含む異なる細菌を感染できる広範囲の異なるファージを適合させるために交換され得る。
【０１０４】
インビトロパッケージングのためには、Collins and Hohn, 1978 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (9): 4242-4246、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)により開発されたような良く確立された方法が、ファージλシステムを利用してλＤＮＡをバクテリオファージコートタンパク質にパッケージングするために使用され得る。この方法は、パッケージングのために必要とされる約２００塩基対（ｂｐ）の長さのλＣｏｓ配列を担持するので、インビトロでバクテリオファージλヘッドにパッケージング可能であるプラスミド生成ベクターであるコスミドを用いる。Ｃｏｓ配列は、ｃｏｓＮ部位を含み、ここでＤＮＡは、ファージλコードのエンドヌクレアーゼであるターミナーゼにより、各鎖で１２ｂｐ離れてニッキングされる。これは、１２ｂｐの２つの「凝集性」又は「粘着性」末端を有する環状コスミドの線状化を導く。（そのＤＮＡは、ファージヘッドに適合させるためには、線状であり、且つ３７−５０ｋｂｐのサイズ範囲にあるべきである。）ｃｏｓＢ部位は、それが鎖をニッキングし、そして分離している間、ターミナーゼを保持する。次のコスミドのｃｏｓＱ部位（ローリングサークル複製がしばしば、線状コンカテマーをもたらすので）は、前のコスミドがパッケージングされた後、ターミナーゼにより保持され、細胞性ＤＮアーゼによる分離が防がれる。
【０１０５】
パッケージングは、パッケージングの前、インビトロで達成される複数のゲノム長のコンカテマーを含むことができる。広範囲の細菌宿主における複製を可能にする、開発されて来た、フォスミド（fosmids）として知られているコスミドの誘導体を使用することが可能である。これは、Ｅ．コリにおけるベクターへの多量のＤＮＡのクローニングを可能にし、機能的研究のための接合性による他の細菌への続く送達ノタメニ、バクテリオファージラムダインビトロパッケージングの優位性を取る（例えば、Aakvik et al., FEMS Microbiol. Lett. 296, 149-58, 2009, これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ここで、接合のための機能は、細菌細胞内の別のプラスミドにより、又は染色体に導入されるプラスミド機能から提供される。本質的には、それは、Ｅ．コリよりもあまり研究されていない細菌系へのＤＮＡの大部分の導入を可能にするシャトルシステムである。
【０１０６】
選択可能マーカー遺伝子−適切な選択可能マーカー遺伝子の送達可能核酸への包含は、好結果をもたらすファージ送達、及び細菌接合による好結果をもたらす送達についての試験を可能にする。適切な選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む。臨床用途のためには、トランスミドの開発の後、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去することが所望される。
【０１０７】
送達可能核酸の伝達のための選択的利点を提供する選択遺伝子−所望により、微生物病原体の集団を含む、マイクロバイオームを通しての送達可能核酸の伝達又は広がりの効率を高めるためには、本発明の種々の側面によれば、送達可能核酸は、送達可能核酸を獲得する微生物に増殖利点を付与する遺伝子をコードすることができる選択ヌクレオチド配列をさらに含み−例えば、それにより、非感染よりも選択的利点を与える。さらに又は他方では、選択ヌクレオチド配列は、他の細菌を死滅するか、又は増殖を阻害するために細菌により生成されるタンパク質性毒素であるバクテリオシンをコードするすることができ、そしてその対応する免疫性ポリペプチドは、伝達可能核酸を担持する細菌細胞を保護するために使用され得る（Cotter et al., Nature Reviews Microbiology 11: 95, 2013を参照のこと、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
細菌における送達可能核酸の維持を保証する遺伝子−送達可能核酸はまた、その細菌細胞宿主から失われないことを確実にする遺伝子機能を担持することができる。それらの遺伝的機能は、毒素／抗毒素（ＴＡ）対、例えばプラスミドを失った細胞の後分離殺害を導くプラスミド依存性システム（Goeders & Melderen, Toxins 6, 2014によりレビューされる、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むことができる。毒素又はキラー機能の効果を中和する抗毒素の発現の停止は、残っているプラスミドコードの毒素による細菌細胞の死滅を可能にする。そのようなＴＡシステムは、細菌に広く存在し、そしてプラスミド分離を確実にするためだけではない。従って、ＴＡ依存性システムを担持する送達可能核酸は、送達可能核酸を失った細胞の後分離死滅による細胞分裂後の娘細胞によるその遺伝を確実にするであろう。
【０１０９】
「ドック（Ｄｏｃｋ）」−トランスミドベクターバックボーン又は「ドッグ」は典型的には、バクテリオファージコートタンパク質（又はカスピド）にパッケージングされ、感染に続いて複製し、そして受容体細胞に接合できる。ドックは、他の遺伝子モジュール、例えば「カーゴ」の付加のための基礎として使用され得る。ドックは、主に真核生物系で実験的に使用されて来たバクテリオファージＰ１由来の部位特異的組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘシステムを用いることができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、何れの他のタンパク質も必要とせずに、ＬｏｘＰ配列と呼ばれる３４ｂｐの標的配列を組換える単一の酵素である。シップにおけるｌｏｘ部位の存在は、Ｃｒｅ介在性配列特異的組換え反応において、インビボでのクローニングベクターからのカーゴのトランスファーの選択を可能にする。従って、送達可能核酸は、ｌｏｘ部位に隣接する適切な非可動性クローニングベクター中に構築され得る。使用されるクローニングベクターはまた、この例においては、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするであろう。カーゴを担持するプラスミドコンストラクトを用いて、Ｅ．コリ、又はシップを担持する他の細菌宿主を形質転換することができた。カーゴが非可動性クローニングベクターからシップにトランスファーされる形質転換体における好結果をもたらす部位特異的組換え事象は、この形質転換体のカーゴのトランスファーのために適した細菌受容体との続く交配のために選択される。
【０１１０】
カーゴの転位をコードする遺伝子（目的の選択されたヌクレオチド配列）−トランスミド内に存在するカーゴはまた、トランスミドから細菌染色体へのその効果的転位を可能にする転位可能遺伝子要素内に配置され得る。例えば、トランスミドが、複製できないか、又は常在性不適合プラスミドがその安定した確率を妨げるか、又は内因性宿主防御機構、例えば制限エンドヌクレアーゼがそれを分解する、細菌細胞に導入される場合、目的の選択された核酸の送達は、それらがトランスミドを逃げ、そして染色体中に挿入すれば、まだ好結果をもたらす。
【０１１１】
ｍ−トランスミドの特徴−ｍ−トランスミドは、ｃ−トランスミドの遺伝子モジュールの多くを共有するが、しかしｃ−トランスミドに存在する比較的大きなＴｒａオペロンを必要としない。従って、ｍ−トランスミドは、ｃ−トランスミドよりも大きな選択された目的の核酸を収容することができ、一方、依然として、ファージコートタンパク質中にパッケージングされる。
【０１１２】
ｍ−トランスミドによる感染に続いて、感染された細菌細胞は、ドナーとして作用し、そして異なる細菌が必要とされるｔｒａ機能を提供するために存在する共存接合性プラスミドを有する場合、ｍ−トランスミドの送達可能核酸成分を異なる細胞に伝達することができる。異なる細菌から他の細菌に接合によりさらに伝達されるべき送達可能核酸については、それらの他の細菌は、接合のための必要とされるｔｒａ機能を提供するために存在する共存接合性プラスミドを、それら自体有すべきであるか、又は他方では、異なる細菌に存在する共存接合性プラスミドは、他の細菌中に送達可能核酸と共に同時トランスファーされ得る。
【０１１３】
共存接合性プラスミドの要件は、必要に応じて、ｍ−トランスミドからの送達可能核酸の広がり又は伝達を制限するか、又は制御するツールを提供する。例えば、ｍ−トランスミドが、他のＥ．コリ細胞とのみ接合できる接合性プラスミドを有するＥ。コリ株を感染する場合、接合によりｍ−トランスミドの送達可能核酸成分を伝達する能力は、Ｅ．コリに制限されるであろう。
【０１１４】
例証によると：プラスミドｐＲＫ２０１３（Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7347-7351, 1980, これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、非自己伝達可能プラスミド可動のためのｔｒａ及びｍｏｂ遺伝子を含むヘルパープラスミドである。ｐＲＫ２０１３がｍ−トランスミドにより感染された細菌細胞に存在する場合、ｍ−トランスミドの送達可能核酸成分は、広範囲の異なる細菌種に受容体として、接合により伝達され得る。しかしながら、送達可能核酸がそのような受容体に、いったん伝達されると、接合性プラスミドがそれらのさらなる細菌に既に存在しない限り、それはさらなる細菌に接合により伝達されないであろう。
【０１１５】
「カーゴ」−上記のように、本発明の送達可能核酸内の目的の選択された核酸についてのいくつかの選択肢が想定される。
【０１１６】
トランスミド送達システムの１つの用途は、微生物における抗生物質耐性を無効にするために、微生物、例えば細菌において、抗生物質耐性遺伝子、及び／又はそのような遺伝子を担持するレプリコンを干渉させる目的の選択された核酸の送達のためである。
【０１１７】
本来、微生物、例えばストレプトマイセスから単離された抗生物質は、感染症を治療するのに強力な手段である。しかしながら、非常に迅速な細菌は、選択圧に応答して抗生物質に対して抗菌耐性（ＡＭＲ）を獲得した。ＡＭＲへの１つの共通経路は、プラスミドベクター上での水平伝達を介して、元の抗生物質生成微生物において進化した耐性遺伝子の獲得であった。そのようなプラスミドは、場合によっては、転位可能な要素及びインテグロンにより担持される複数の抗生物質耐性遺伝子を獲得した。細菌タンパク質標的物を改変するか、又は抗生物質の侵入を妨げる宿主にコードされた突然変異もまた、生じた。
【０１１８】
微生物、例えば細菌病原体による抗生物質耐性は、最も重大な健康上の脅威の１つである。例えば、耐性菌からの感染は現在では、珍しくなく、そしていくつかの病原体は、複数のタイプ又はクラスの抗生物質に対して耐性になっている。効果的抗生物質の損失は、癌の化学療法、腎不全のための透析、及び手術、特に臓器移植を受けている脆弱な患者に一般的な感染症と戦い、そして感染合併症を管理する我々の能力を損ない、このために、二次感染を治療する能力は重要である。
【０１１９】
現代医学の多くの成果は、ＡＭＲにより危険にさらされている。感染の治癒及び予防のための効果的抗生物質なしでは、治療、例えば臓器移植、癌化学療法、及び大手術の成功は損なわれるであろう。
【０１２０】
耐性機構は以下の４つのクラスに分離される：
（１）抗生物質のペニシリンファミリーのβラクタム環を破壊するβ−ラクタマーゼを含む抗生物質を分解する酵素；
（２）抗生物質を改変する酵素は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシンをリン酸化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；クロラムフェニコールをアセチル化するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する；
（３）細胞から抗生物質を細胞質外に積極的にエクスポートする流出ポンプ、例えばテトラサイクリンの存在下で発現されるテトラサイクリン流出ポンプ、及び広範囲の抗生物質をエクスポートすることができる多剤耐性を付与する他のポンプ；及び
（４）抗生物質のタンパク質標的物を、それによりもはや不活性化されないように変化させる突然変異；例えば、β−ラクタムは、それらがペプチドグリカンを生合成及び細菌細胞壁の完全性のために必要とされるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）を阻害し、そしてβ―ラクタムへの低められた結合性を有するＰＢＰ変異体は、阻害されないので、殺菌性である。
【０１２１】
新規抗生物質、耐性酵素の直接的阻害、及び非抗生物質殺菌剤を含む抗生物質耐性の問題に対処するために、いくつかのアプローチが現在、使用され、又は開発されている。例えば、バクテリオファージによる感染は、１９２０年代に開発され、そして抗生物質の発現により主に中止されたが、特定の国々においては維持されて来た。現在のアプローチは、抗生物質耐性細菌を含む細菌を死滅する毒性の溶菌性バクテリオファージを使用しているが、しかしこれは、バクテリオファージ感染に耐性のある細菌変異体の選択のための手段を開いている。これを回避するために、バクテリオファージの異なる種の株の混合物を含む調製物が使用されている。敗血漿に罹患している患者におけるそのような溶解性バクテリオファージの使用の別の欠点は、溶菌性バクテリオファージによる細胞溶解及び死が、細胞からのエンドトキシンを血液中に放出し、そしてエンドトキシンショックを引起す可能性があることである（Nobrega et al., 2015によるレビューを参照のこと; 上記）。
【０１２２】
本発明は、種々の側面によれば、微生物、例えば細菌における抗生物質耐性に対処するための別の機構を提供する。
【０１２３】
１つの側面によれば、本発明の目的の選択された核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物又は改変されたバージョンの存在下で不活性化される抗生物質耐性遺伝子に関して、微生物（例えば、細菌）における抗生物質耐性遺伝子の標的配列に対して十分に相補的なスペーサー配列を有するＲＮＡガイド分子を有するか又はその分子を転写するクラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復体（ＣＲＩＳＰＲ）アレイ核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドであり得るか、又はそれを含むことができ、それにより、微生物を抗生物質に感作させる。
【０１２４】
本発明の種々の側面の目的は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子を担持するＤＮＡの不活性化である。本発明の利点は、微生物は抗生物質に対して再感作されるようになるか、又は抗生物質の獲得が妨げられるので、１又は２以上の既存の抗生物質が感染症を治療するために使用され得ることである。
【０１２５】
抗生物質耐性遺伝子の標的配列は、破壊される場合、抗生物質耐性遺伝子を不活性化する遺伝子自体に隣接する配列であり得る。例えば、抗生物質耐性遺伝子がプラスミド上に存在する場合、本発明はプラスミドに標的配列を含むことができる。
【０１２６】
抗生物質耐性酵素を不活性化する先行技術のアプローチとは対照的に、本発明のそれらの側面は、新薬の開発、及び各新薬のために必要とされる付随的な規制承認を必要としないであろう。むしろ、本発明は、遺伝子生成物ではなく、直接的に関連する抗生物質耐性遺伝子を標的化し、そして不活性化するために適用され得るツールを提供する。例えば、抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子、又は膜透過性及び排出ポンプ発現を変更することにより抗生物質の取り組み及び輸送を調節するタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ標的化され得る。
【０１２７】
本発明の種々の側面の背景によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物ＲＮＡｉ経路に類似する核酸侵入体に対する天然の細菌及び古細菌性免疫系の一部であるＲＮＡ介在性ゲノム防御経路である。天然のＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ遺伝子、及びＣＲ１ＳＰＲ介在性核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡ要素の組合せを含む。ＣＲＩＳＰＲシステム中の３つのタイプ（Ｉ−III）が広範囲の細菌及び古細菌宿主において同定されている。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、非反復性スペーサー配列により分離される一連の短いＤＮＡ直接反復体から構成される。スペーサー配列は、天然においては、典型的には外来性遺伝子要素、例えばバクテリオファージ及びプラスミドに由来する。本明細書において使用される場合、一連の反復体及び非反復性スペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲアレイとして知られている。ＣＲＩＳＰＲアレイは、反復体相補的ｔｒａｃｒＲＮＡにより転写され、そしてハイブリダイズされ、続いて直接的反復体内で切断され、そしてＣａｓヌクレアーゼを標的部位（「プロトスペーサー」として知られている）に向ける個々のスペーサー配列を含む短い成熟二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡに処理される。例えば、タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、４工程で、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を実施する。最初に、２つのＲＮＡ、プレ−ｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、そして個々の又はモノマースペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡ（また、「ＲＮＡガイド分子ｇＲＮＡ」として本明細書において言及される）へのプレ−ｃｒＲＮＡのプロセッシングを仲介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的ＤＮＡ上の標的部位との間の塩基対形成を介してリボヌクレオタンパク質の形でのＣａｓ９タンパク質を、標的ＤＮＡに向ける。最終的に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を介在し、そしてＤＳＢを創造する。
【０１２８】
本明細書に記載する本発明の側面によれば、改変されたＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、抗生物質耐性遺伝子を標的化するために使用され得る。そのようなコンストラクトを用いる本発明の送達可能核酸はまた、そのような遺伝子の不活性化をもたらすために使用される「暗殺コンストラクト（assassin construct）」として本明細書において言及される。
【０１２９】
今日までＣＲＩＳＰＲ技法を用いることの主要焦点は、主に真核生物における逆遺伝学のためのＤＮＡ編集ツールとしての使用のためであった。国際公開第ＷＯ２００７／０２５０９７号は、侵入する標的核酸、又はその転写生物、特に侵入するバクテリオファージに対する細胞における耐性を調節するためのＲＣＩＳＰＲ技法の使用を記載している。遺伝子により転写されたｍＲＮＡを標的化するためにＣＲＩＳＰＲ技法を用いて原核生物遺伝子発現をダウンレギュレートする方法は、国際公開第ＷＯ２０１０／０７５４２４号に示唆されている。国際公開第ＷＯ２０１２／１６４５６５号は、ラクトコッカス（Lactoccocus）からのＣＲＩＳＰＲシステム、及び侵入する標的核酸又はその転写生成物に対する細胞の耐性を調節するためのシステムの使用を記載する。先行技術システムのいずれも、本明細書に記載される核酸送達ビークル（本明細書においては、また「トランスミド」としても言及される）、又は微生物における抗生物質耐性を高めるためへのその使用を記載していない。
【０１３０】
本発明の側面によれば、ＲＮＡガイド分子は、抗生物質耐性遺伝子に対するＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又はその改変されたバージョンの結合を介在することができる。これは、上記の天然のシステムを反映している。
【０１３１】
Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は本発明の種々の側面のその改変されたバージョンはまた、ＲＮＡ又は他の核酸分子にも結合することができる。その改変されたバージョンの要件は、本発明のいくつかの側面によれば、ポリペプチド又はその機能的同等物、又はＲＮＡ又は他の核酸分子を結合できるその改変されたバージョンを排除するものではない。それらの側面によれば、Ｃａｓ  ＲＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又はその改変されたバージョンは、Ｃａｓ  核酸結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又はその改変されたバージョンとして言及され得る。
【０１３２】
特定の用途に関しては、微生物、例えば細菌は、天然の内因性、又は導入され改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は改変されたバージョンを有することができる。これは、本発明のそれらの側面の送達可能核酸又は組換えポリペプチドが、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は改変されたバージョンをコードするために必要とされないことを意味する。他方では、本発明のそれらの側面の送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドはさらに、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は改変されたバージョンをコードする核酸配列を含むことができる。別の側面によれば、本発明の送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドは、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は改変されたバージョンをコードしないが、しかしそうする別個のポリヌクレオチドと共に使用され得る。微生物中にＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物、又は改変されたバージョンを導入するための手段が使用され得る。
【０１３３】
典型的なＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓ９又はその機能的同等物、又はその改変されたバージョンである。
【０１３４】
本発明の種々の側面の送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドにおいては、ＣＲＩＳＰＲアレー核酸配列は、抗生物質耐性遺伝子又は１又は２以上の追加の抗生物質耐性遺伝子の標的配列に対して十分に相補的なスペーサー配列をそれぞれ含む追加のＲＮＡガイド分子を有するか又はそれを転写することができる。その又は各ＲＮＡガイド分子は、それ自体のプロモーター配列から転写され得る。他方では、１組のＲＮＡガイド分子は、１つのプロモーター配列から、及び任意には、１又は２以上の他のそのような組と組合して転写され得る。例えば、４つのＲＮＡガイド分子の組は、１つのプロモーター配列から、例えば１又は２以上の他のそのようなガイド分子組と組合して転写され得る。
【０１３５】
複数のＲＮＡガイド分子を有することにより、微生物中の異なる抗生物質耐性（又は他のタイプの）遺伝子を同時に標的化及び不活性化することが可能である。
【０１３６】
本発明の種々の側面の送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドは、さらに又は他方では、病原性又は微生物代謝の他の側面に関与する遺伝子を標的化するＲＮＡガイド分子（例えば、さらなるＲＮＡガイド分子）を含む企画され得る。例えば、特定の病原体は、抗生物質がそれらにアクセスすることを困難にするバイオフィルムを形成する。バイオフィルム生成のための細菌代謝に関与する１又は２位以上の遺伝子が標的化され得る。
【０１３７】
プロモーターからの遠位のスペーサー配列は、典型的にはそれほど効果的に転写されない。理想的には、異なる標的物に対する複数のＲＮＡガイド分子は、多かれ少なかれ、同等に表されるべきである。従って、各ＲＮＡガイド分子を転写する１つのプロモーター（例えば、図１を参照のこと）が使用され得る（長いポリシストロンＲＮＡガイド分子（又は、前駆体ｃｒＲＮＡ）転写に依存する代わりに）。
【０１３８】
例えば、大きな範囲の異なるβ−ラクタム抗生物質に耐性を与えるβ−ラクタマーゼをコードする多くの耐性遺伝子（ｂｌａ遺伝子）が存在する。それ自体のそのようなプロモーターから個々に転写され得る複数のＲＮＡガイド分子を発現するＤＮＡコンストラクトが、多くの異なるｂｌａ遺伝子を標的化するために使用され得る。
【０１３９】
従って、本発明の側面によれば、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、１又は２以上のβ−ラクタマーゼ遺伝子の標的配列に対して十分に相補的なスペーサー配列をそれぞれ含む１又は２以上のＲＮＡガイド分子を有するか、又は転写することができる。
【０１４０】
例えば、１又は２以上のＲＮＡガイド分子は、以下から成る群から選択された、１又は２以上の又は全ての遺伝子を標的化することができる：ＮＤＭ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＫＰＣ、ＯＸＡ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ、ＯＫＰ、ＬＥＮ、ＧＥＳ、ＭＩＲ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＣＭＹ、ＬＡＴ及びＦＯＸ。
【０１４１】
特に、１又は２以上のＲＮＡガイド分子は、１又は２以上の、又はすべての以下を含む抗生物質耐性遺伝子のβラクタムファミリーの標的配列に対して十分に相補的なスペーサー配列を含むことができる：ＮＤＭ−１、−２、−１０のための標的配列に対して十分に相補的な第１のスペーサー配列；ＶＩＭ−１、−２、−４、−１２、−１９、−２６、−２７− ３３、３４のための標的配列に対して十分に相補的な第２のスペーサー配列; ＩＭＰ−３２、−３８、−４８のための標的配列に対して十分に相補的な第３のスペーサー配列; ＫＰＣ− １、−２ 、−３ 、−４、 −６ 、−７ 、−８ 、 −１１ 、−１２ 、−１４、−１５ 、−１６、−１７のための標的配列に対して十分に相補的な第４のスペーサー配列; ＯＸＡ−４８のための標的配列に対して十分に相補的な第５のスペーサー配列; ＴＥＭ−１、−１Ｂ、−３、−１３９、 −１６２、 −１８３、−１９２、−１９７、 −１９８、 −２０９のための標的配列に対して十分に相補的な第６のスペーサー配列； ＳＨＶ及びその変異体のための標的配列に対して十分に相補的な第７のスペーサー配列; 及びＣＴＸ及びその変異体 のための標的配列に対して十分に相補的な第８のスペーサー配列
（下記表１及び２を参照のこと）。
【０１４２】
表１は、ＡＲＤＢデータベースに見出されるクレブシエラ・プラウモニアエ（Klebsiella pneumoniae）βラクタマーゼ遺伝子についてＮＣＢＩ  ＡＲＤＢデータベースにおいて同定された１１７の異なるｂｌａ遺伝子に対して標的化された２０のガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列組を示す。βラクタマーゼ遺伝子配列は、キーワードクレブシェラ・プネウモニアエを用いてＡＲＤＢデータベースから収集される。冗長配列が除去され、そしてユニーク配列が、ウェブプログラムClustal Omegaを用いて複数の配列アライメントのために使用された。１つの標準配列が、各クラスターから選択され、そしてウェブプログラムＪａｃｋ Ｌｉｎ‘ｓ ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ ｇＲＮＡファインダーにより予測される２０ｎｔスペーサー配列が収集された。スペーサー配列は、同じ枝に属する配列に見出されるプロト−スペーサー配列の比率を最大にするよう選択される。従って、第４カラムに示される例示的な各スペーサー配列は、第３カラムにおける遺伝子を破壊する能力を有する。この分析に使用されるβラクタマーゼ遺伝子は、以下である：ＳＨＶ−ａ ＝ １、２、 ２ａ、 ５、 ５ａ、１１、１２、１４、２６、２７、２８、３１、３３、３８、４３、４４、４８、５５、５６、６０、６１、６２、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、 ８１、８２、８５、 ８９、 ９２、 ９８、 ９９、 １０１、 １０３、 １０６、 １０７、 １０８、 １０９、 ＣＴＸＭ−ｂ ＝ １、 ３、 １０、 １２、 １５、 ２２、 ３２、 ５４、 ６０、 ６２、 ６８、 ＣＴＸＭ−ｃ ＝ １３、 １４、 １６、 １８、 １９、 ２４、 ２６、 ＣＴＸＭ−ｄ ＝ ２、 ３５、 ５９、 ＣＴＸＭ−ｅ ＝ ２６、 ６３、 ＴＥＭ−ｆ ＝ １、 １ｂ、 ３、 ＥＳＢＬ、 １３９、 ＫＰＣ−ｇ ＝ １、 ２、 ３、 ４、 ＯＫＰ−ｈ ＝ Ａ１１、 Ａ１２、 Ａ１６、 Ａ１７、 Ｂ１３、 Ｂ−ＳＢ６１３、 ６、 ＬＥＮ−ｉ ＝ ２、 １７、 １８、 １９、 ２０、 ２１、 ２２、 ２４、ＧＥＳ−ｊ ＝ １、 ３、 ４、 ５、 ＶＩＭ−ａ ＝ １、 ２、 ４、 １２、 １９、 ＩＭＰ−ｂ ＝ ４、 ８、 ＣＭＹ−ａ ＝ ２、 ４、 ２５、 ３１、 ３６、ＬＡＴ−ｂ＝１、 ２、ＣＭＹ−a ＝ １、 ８ｂ、 １０、 １９、 ＦＯＸ−ｄ＝１、 ５、 ７、 ＯＸＡ−ａ ＝ １、 ３０、 ４７、 ＯＸＡ−２、 ＯＸＡ−９、 ＯＸＡ−ｂ＝１０、 １７。βラクタム抗生物質は、ペナム、セフィム、カルバペネム及びモノバクタムの４種のクラスに分類される。１つの抗生物質名称が各クラス下に例として列挙されている。βラクタマーゼ環を開環できるβラクタマーゼは、Ｒにより示される。例えば、カルパペネムは、ＫＰＣにより不活性化される。細菌をカルバペネムに対して再感作することが所望される場合、配列番号１１のスペーサー配列（下記表１を参照のこと）が、ＫＰＣ遺伝子を不活性化するために、スペーサーアレイに使用されるべきである。ＣＭＹ−ａのためのスペーサー配列もまた、ＬＡＴ−ｂ切断のために使用され得る。スペーサー配列の例は、５′から３′の方向に示されている。
【０１４３】
【表１】
2018522935.tif 000002
【０１４４】
表１のキー
PAM    プロトスペーサー隣接モチーフ
Cl     ベータラクタマーゼクラス A, B, C又はD
P      ペナムス                             例えば、アモキシシリン
C-e    セフェムス:    e_セファロスポリン
C-n    セフェムス:    n_セファロスポリン
C-I    セフェムス     セファロスポリンI     例えば、セファゾリン
C-II   セフェムス     セファロスポリンII    例えば、セファマイシン
C-III  セフェムス     セファロスポリンIII   例えば、セフタジジム
Cb     カルバペネム                         例えば、エルタペネム
Mb     モノバクタム                         例えば、アズトレオナム
【０１４５】
表２は、クレブシェラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）についてのＣＡＲＤデータベースで同定される１５４の異なるｂｌａ遺伝子に対して標的化された１７のガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列組を示す。候補体スペーサー配列が同定され、ＣＡＲＤデータベースに見出されるクレブシェラ・ニューモニエβラクタマーゼ遺伝子がすべて破壊された。表２は、上記表１で説明された同じ方法により作製され、そして表１と同じキーが適用された。
【０１４６】
【表２】
2018522935.tif 000003
【０１４７】
不活性化されるべき抗生物質耐性遺伝子は、染色体上に、又はレプリコンとして知られ、そしてプラスミド及びバクテリオファージを含む染色体外複製ＤＮＡ分子上に位置し得る。
【０１４８】
本発明の種々の側面に従って使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的配列にＤＳＢを生成する。標的配列が染色体、又はレプリコン、例えば細菌染色体又はプラスミド上に位置する場合、ＤＳＢは、分解、及び従って、そのようなＤＳＢを有する染色体又はレプリコンの損失を導く可能性がある。標的配列が細菌染色体上に位置する場合、細胞はＤＳＢの結果として直接死滅する可能性がある。さらに、いくつかのプラスミド（天然プラスミドを含む）は、分裂細胞におけるプラスミドの忠実な継承を確実にする自然な機構である細胞がプラスミドを失う場合のみ毒性になる死滅機能を担持する。抗生物質耐性遺伝子の標的配列を担持するプラスミドがまた、そのような死滅機能を担持し、そしてプラスミドが生成されるＤＳＢの結果として失われる場合、細胞は死滅する可能性がある。
【０１４９】
そのようなＤＳＢにより引起される細胞死が、本発明の種々の側面による送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドに対する耐性のための選択圧を高める場合、これは、例えばＤＳＢを生成するよりもむしろ、抗生物質耐性遺伝子の標的配列を不活性化するために欠失を生成した後に標的部位を封鎖する就職されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを用いることにより緩和され得る。
【０１５０】
従って、本発明の種々の側面に従ってのＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、特定の側面によれば、リコンビナーゼ触媒ドメインを含む改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドにより置換されても良く、ここで前記改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＤＳＢを生成しないが、しかし欠失を創造し、そして標的配列中の部位を再封鎖する。
【０１５１】
改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、リコンビナーゼ触媒ドメインを含む改変されたＣａｓ９のタンパク質であり得る（例えば、図２、３及び４を参照のこと）。
【０１５２】
本発明の種々の側面に従っての送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドはさらに、微生物に選択利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、標的微生物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達効率を高める。例えば、その遺伝子は、非感染の兄弟、又はバクテリオシンをコードする遺伝子（それらは、他の細菌を死滅するか、又は増殖を阻害する、細菌により生成されるタンパク質毒素である）よりも増殖優位性を付与することができ、そして対応する免疫ポリペプチドが使用され得る。
【０１５３】
微生物に対する選択的利点は、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドにより引起されるＤＳＢのためにレプリコンの損失の効果を妨げるか又は減じるものを含むか、又はそのものであり得る。例えば、微生物に対する選択的利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、標的配列が位置するレプリコンにより担持される毒素又はキラー機能の効果を中和する抗毒素をコードすることができる。また、微生物に対する選択的利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドにより引起されるＤＳＢのために分解を受けるレプリコンによりコードされる１又は２以上のタンパク質をコードすることができる。
【０１５４】
抗生物質耐性遺伝子を不活性化するための核酸送達ビークル及び／又は送達可能核酸を含む本発明の組成物は、医薬組成物、非病原性微生物、例えばプロバイオテックス製剤のための共生細菌、又は栄養補助食品であり得る。
【０１５５】
微生物、例えば本発明の種々の側面により標的化される細菌は、体表面上に局在しても良く（例えば、器官内に、外科的創傷又は他の創傷の部位で、膿瘍内に含まれる）、又は全身性であり得る。本発明の核酸送達ビークルの局所適用による治療に適した細菌感染の治療が含まれる。
【０１５６】
本発明はまた、体表面以外の表面の、本発明の送達ビークル又は組成物、例えば創傷被覆材又は医療装置表面のコーティングも包含する。
【０１５７】
本発明においては、本発明の送達可能核酸又は組換えポリヌクレオチドを含むトランスミドを用いる利点は、それがファージ感染によるトランスミド送達に続いて、又はプラスミド接合に続いて、標的細菌又は他の微生物中への「暗殺コンストラクト」の挿入をもたらす「トロイの木馬」として作用できることである。
【０１５８】
次に、暗殺コンストラクトは、抗生物質耐性遺伝子の分解工程を開始する。本発明のＣａｓ  ＤＮＡ結合タンパク質により創造されるＤＳＢが、そのような抗生物質耐性遺伝子を担持するレプリコンを破壊する場合、抗生物質耐性遺伝子を有する微生物は、暗殺コンストラクトにより直接的に殺害され得る。微生物がＤＳＢに対して生存する場合、耐性遺伝子は不活性化され、そして次に、患者は、微生物が現在感作されている抗生物質により治療され得る。
【０１５９】
重要なことは、患者がその後、抗生物質により治療される場合及び治療されるまで、この事象に対して作用する直接的選択圧がないか、又は低められるべきである。従って、病原性細菌又は他の微生物におけるトランスミド送達に対して直接的選択がほとんどか、又はまったくなく、そして従って、「進化的兵器競争（evolutionary arm race）」（時々、バクテリオファージの殺菌剤としての公知の使用の有意な限定的特徴である）の確立はないか又はほとんどない。
【０１６０】
微生物のＤＳＢ誘発死滅がバクテリオファージ又は接合性プラスミド送達剤に対する耐性の選択圧を高める場合、この問題は、例えば、本明細書に定義されるような改変されたＣａｓ  ＤＮＡポリペプチドを用いることにより緩和され得る。
【０１６１】
本発明は、病原性細菌又は他の微生物における抗生物質耐性遺伝子を静かに不活性化するための疫学的ツールと同様に、経口、局所及びプロバイオテックス、栄養補助食品送達のための潜在的薬剤を提供する。外科手術又は病院での他の治療が予定されている患者は、病院に入院する前、予防的に抗生物質耐性遺伝子を標的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（又は他の）暗殺コンストラクトを担持するトランスミドにより治療される。このようにして、抗生物質による治療を必要とする術後感染を予測して、それらのマイクロバイオームに存在する病原体は、直接的に死滅されるか、又は抗生物質耐性遺伝子をパージされ得る。
【０１６２】
従って、本発明は、病原菌における抗生物質耐性遺伝子を静かに不活性化するための疫学的ツールを提供する。
【０１６３】
本発明の側面の例示をもたらすためには、選択された抗生物質に対して標的化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９「暗殺」コンストラクトのセットが構築され得る。
【０１６４】
定義
特にことわらない限り、本明細書に定義されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者により一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【０１６５】
さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、そして複数形の用語は単数形を含むであろう。
【０１６６】
一般的に、細胞及び組織培養、分子生物学、及び本明細書に記載されるタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関して利用される命名法及び技法は、当業者に知られており、そして当業界において一般的に使用される。
【０１６７】
標準技術は典型的には、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応及び精製方法は、製造業者の仕様書に従って、又は当技術分野で一般的に達成されているように、又は本明細書に記載されているように実施され得る。前述の技法及び手順は一般的に、当業界で十分に知られている従来の方法に従って、そして本明細書全体にわたって引用及び議論されている種々の一般的及び具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambook & Russell, 2015、前記を参照のこと。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び薬学及び医薬化学に関連して用いられる命名法及び技法は、当業界において良く知られており、そして一般的に使用されている。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、及び送達、及び患者の治療に使用される。
【０１６８】
本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特にことわらない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【０１６９】
本明細書に使用される用語「及び／又は」とは、２つの特定された特徴又は成分のそれぞれが他のものを有するか否かを具体的に開示するものとして解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ii）Ｂ及び（iii）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として、それぞれが個別に示されているように解釈されるべきである。
【０１７０】
用語「ａ」又は「ａｎ」は、要素のいずれか一方又は複数の要素の文脈上の明瞭なものでない限り、修飾する要素の１つ又は複数（例えば、「試薬」は１又は２以上の試薬を意味することができる）の構成要素が記載されている。
【０１７１】
本明細書において使用される用語「約」とは、数値範囲の下端及び上端を含む任意の及びすべての値は、±１０％までの許容できる偏差範囲（及びその間の値、例えば± ０．５％、± １ ％、 ± １ .５％、 ± ２％、 ± ２．５％、 ± ３％、 ± ３．５％、 ± ４％、 ± ４．５％、 ± ５％、 ± ５．５％、 ± ６％、 ± ６．５％、 ± ７％、 ± ７．５％、 ± ８％、 ± ８．５％、 ± ９％、 ± ９．５％）を有する任意の値を意味する。値の文字列の先頭での用語「約」の使用は、各値を変更する（すなわち、「約１、２及び３」とは、約１、約２及び約３を指す）。例えば、「約１００ｇ」の重量は、９０ｇと１１０ｇとの間の重量を含むことができる。さらに、本明細書での値の列挙が記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又は８６％）、その列挙はその中間値及び分数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。
【０１７２】
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」とは、他の化学成分、例えば生理学的に適切な担体及び賦形剤を有する、１又は２以上の活性剤（例えば、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド又は送達ビークル又は送達可能核酸）の調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物への活性剤の投与を容易にすることである。
【０１７３】
本発明の組成物は、必要に応じて、パック、ディスペンサー装置、又はキットで提供されても良く、その個々は、活性剤を含む１又は２以上の単位剤形を含むことができる。パック、ディスペンサー装置又はキットは、投与についての説明書を添付することができる。
【０１７４】
局所投与のための本発明の組成物は、局所使用に適した形、例えばエアロゾル、クリーム、軟膏、ローション又は散粉剤であり得る。
【０１７５】
本明細書で提供される組成物は、吸入による投与のために製剤化され得る。例えば、組成物は、エアロゾル、ミスト又は粉末の形で存在することができる。従って、本明細書に記載される組成物は、適切な噴射剤、例えばジクロロテトラフルオロエタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスの使用による、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提供の形で送達され得る。加圧エアロゾルを用いる場合、用量単位は、計算された量を送達するための弁を提供することにより決定され得る。
【０１７６】
本明細書において使用される場合、用語「抗生物質」は、他の微生物の増殖に対して拮抗する微生物により生成される古典的な抗生物質を言及し、そしてまた、より一般的には、微生物を死滅できるか、又はその増殖を阻害できる抗微生物剤、天然に存在する抗生物質の化学的に合成されたバージョン及び変異体も含む。
【０１７７】
用語「十分に相補的」とは、スペーサー配列を含むＲＮＡガイド分子が好ましくは、特異的且つ選択的に標的配列とハイブリダイズすることができるようなスペーサー配列及び標的配列の配列同一性を意味し、それにより、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介して、標的配列を含む抗生物質耐性遺伝子の不活性化を可能にする。例えば、スペーサー配列は、その全長にわたって標的配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有することができる。
【０１７８】
本明細書において使用される場合、用語「機能的同等物」とは、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド（又は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓ核酸結合ポリペプチド）と同じ活性を有することができるポリペプチドを言及する。その「機能的同等物」は、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドと同じ定性的生物学的性質を有することができる。「機能的同等物」は、その同等物が対応する天然の配列ポリペプチドと共通の活性を有するなら、天然のＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド及びその断片のフラグメント又は誘導体を含むが、但しそれらだけには限定されない。構造的同一性は、一般的生物学的活性のためには必ずしも必要ではないが、１つの側面によれば、機能的同等物は、その全長にわたって、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド、例えばＣａｓ９と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有することができる（Ferretti et al, 2001, PNAS, 98 No. 8: 4658-4663, Gene ID: 901176, Cas9 GI: 15675041）。
【０１７９】
用語「Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチド」は、完全長Ｃａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素的活性フラグメント、及びＣａｓポリペプチドの酵素的活性誘導体又はそのフラグメントを包含する。Ｃａｓポリペプチド又はそのフラグメントの適切な誘導体は、変異体、融合体、Ｃａｓタンパク質又はそのフラグメントの共有結合修飾体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１８０】
用語「改変された」Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、上記に定義されるようなＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを包含するが、但しポリペプチドのＤＳＢ触媒機能が例えばリコンビナーゼ触媒ドメインの存在によりＤＮＡ封鎖機能により置換されている。そのよう改変されたＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドのさらなる特徴が、本明細書に記載される。
【０１８１】
ヌクレオチドとアミノ酸配列との間の配列同一性は、配列のアライメントを比較することにより決定され得る。比較された配列中の同等の位置が同じ塩基又はアミノ酸により占有される場合、その分子はその位置で同一である。アライメントを同一性の％として採点することは、比較されるは配列により共有される位置で同一のアミノ酸又は塩の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアライメントは、配列中の可能な挿入及び欠失を考慮するために、１又は２以上の配列中にギャップを導入する必要がある。配列比較法は、比較される配列中の同一分子数の同一分子について、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映して、できるだけ少ないギャップでの配列アライメントが多くのギャップを有する１以上の高いスコアを達成するように、ギャップペナルティーを用いることができる。最大の％同一性の計算は、ギャップペナルティーを考慮して、最適なアライメントの生成を包含する。
【０１８２】
配列比較を行うための適切なコンピュータープログラムが、商業及び公共部門で広く入手可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ (Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29, その全体が参照により組み込まれる; http://bitincka.com/ledion/matgatから入手可能なプログラム)、ギャップ (Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453, その全体が参照により組み込まれる)、 ＦＡＳＴＡ (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, その全体が参照により組み込まれる; http://www.ebi.ac.uk/fastaから入手可能なプログラム)、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ２．０ 及び Ｘ ２．０ (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948、その全体が参照により組み込まれる; http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2から入手可能なプログラム) 及び ＥＭＢＯＳＳ ペアワイズアライメントアルゴリズム (Needleman & Wunsch, 1970, 前記; Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pp 1-44, Addison Wesley, その全体が参照により組み込まれる; http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/alignから入手可能なプログラム)を包含する。すべてのプログラムは、デフォルトパラメーターを用いて実行され得る。
【０１８３】
例えば、配列比較は、ＥＭＢＯＳＳ ペアワイズアライメントアルゴリズムの「ｎｅｅｄｌｅ」法を用いて行われ、全長にわたって考慮される場合、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を決定し、そして％同一性スコアを提供する。アミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーター（「タンパク質分子」オプション）は、以下であり得る：ギャップ拡張ペナルティー：０．５、ギャップオープンペナルティー：１０．０、Ｍａｔｒｉｘ：Blosum62。ヌクレオチド配列比較のためのデフォルトパラメーター（「ＤＮＡ分子」オプション）は、以下であり得る：ギャップ拡張ペナルティー：０．５、ギャップオープンペナルティー：１０．０、Ｍａｔｒｉｘ：ＤＮＡｆｕｌｌ。
【０１８４】
本発明の１つの側面によれば、配列比較は、参照配列の全長にわたって行われ得る。
【０１８５】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」又は「遺伝子モジュール」とは、ポリペプチドがコードされるＤＮＡ配列、又は非コードの機能的ＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列を言及する。
【０１８６】
用語「抗生物質耐性遺伝子」とは、生成物をコードするか、又は抗生物質耐性を付与する機能的ＲＮＡを転写する遺伝子又はそのコード部分を包含する。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、上記４つの耐性機構の何れかに寄与する遺伝子又はそのコード部分であり得る。抗生物質耐性遺伝子は、例えば以下をコードすることができる：（１）抗生物質を分解する酵素、（２）抗生物質を改変する酵素、（３）ポンプ、例えば流出ポンプ、又は（４）抗生物質の効果を抑制する変異した標的物。
【０１８７】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」はそれぞれ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又はＤＮＡを言及する。この用語はまた、特にオリゴヌクレオチドマーカー、公知のタイプの修飾、例えば当業界において知られている標識、メチル化、「キャップ」、１又は２以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無荷電結合、例えばリン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等を有し、及び荷電結合を有するそれらの修飾を包含する。
【０１８８】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーを言及する。その用語は、ポリマーの特定の長さを言及するものではなく、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。用語「ポリペプチド」は、後発現修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、等を含むことができる。「ポリペプチド」の定義内に含まれるものは以下である：アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸）の１又は２以上の類似体を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、及び天然に存在し、及び天然に存在しない当業界において知られている他の修飾体。
【０１８９】
用語「微生物」とは、原核生物、例えば細菌及び古細菌（ユリアーキオータ門（Euryarchaeota）及びクレンアーキオータ門（Crenarchaeota）に属する）を包含する。細菌は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む。臨床的に重要な病原性真菌のいくつかの種、例えばカンジダ（Candida）属、アスペルギラス（Aspergillus）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ヒストプラスマ（Histoplasma）属、ニューモシスチス（Pneumocystis）属、及びスタキポトリ（Stachybotrys）属のメンバーが、微生物の定義内に含まれる。
【実施例】
【０１９０】
本発明は、以下の非限定的な実施例により例示される。
【０１９１】
実施例１
選択された目的の核酸を細菌に送達するためのｃ−トランスミド介在性送達システムの構築の例示
実施例１は、目的の選択された核酸（以下、「カーゴ」と称す）のＥ．コリ及び他の細菌への送達のための概念実証として接合性トランスミド（ｃ−トランスミド）送達システムの構築を記載する。送達は、バクテリオファージλファージコートタンパク質における感染、及び／又は接合による他の細菌への送達によってである。カーゴの細菌染色体への転位の可能性がある。
【０１９２】
ｃ−トランスミド送達システムは、以下の２つの成分から構築される：（ｉ）複製、ファージパッケージング及び接合性トランスファーのために必要とされる機能を担持する「シップ」；及び（ii）カーゴをシップに送達する、カーゴ及び「ドッキング」機械（「ドック」）−Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを担持するプラスミドカーゴシャトルクローニングベクター。
【０１９３】
本明細書に例示される送達ビークルのｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１は、それを以下のようにできる種々のプラスミド源から単離された多くの遺伝子機能を担持する：（ｉ）接合、（ii）トランスミドＤＮＡの可動、（iii）複製、（iv）λファージ頭中へのパッケージング、（ｖ）Ｃｒｅ−ｌｏｘ介在性インビボ組換えによるカーゴのｃ−トランスミドへの導入−ｃ−ＴＢＮ００１：：カーゴの入手、及び（vi）Ｔｎ７トランスポザーゼ介在性インビボ転位による宿主染色体（Ｘｓｏｍｅ）中へのカーゴのトランスファー−Ｘｓｏｍｅ：カーゴの入手。
【０１９４】
ｃ−トランスミドシップコンストラクトに使用される機能的遺伝子が、図５に太字で示されている：
ａ．従って、ｃ−ＴＮＢ００１は、ｋｏｒＡ及びｋｏｒＢをコードするＲＫ２  ＣｔＩ領域の他に、接合性機能−Ｔｒａ１及びＴｒａ２オペロン、及び可動機能−トランスファーの起点ｏｒｉＴ、及び広宿主範囲（ＢＨＲ）の接合性プラスミドＲＫ２の可動タンパク質ｔｒａＩ、ｔｒａＪ、ｔｒａｋ、ｔｒａＡを含む（Bingle & Thomas, Current Opinion in Microbiology 2001, 4:194-200によりレビューされる、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。トランスミドはまた、ＲＫ２からのアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードし、そしてカナマイシン（Ｋｍ）耐性（ＫｍＲ）を付与するａｐｈＡ遺伝子を担持する。
ｂ．ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１は、Ｆプラスミドの狭い宿主範囲の栄養複製起点ｏｒｉ２（また、ｏｒｉＳとしても知られている）、及び複製タンパク質をコードする遺伝子ｒｅｐＥを担持し；それらの遺伝子モジュールは、ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（New England Biolabsから入手できる）から、バクテリオファージλｃｏｓ部位と共に単離される。ｃ−ＴＮＢ００１はまた、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１からの、活動的分割のためのＳｏｐＡ及びＳｏｐＢコード機能も担持する。それらの機能は、各娘細胞が細胞分裂でｃ−トランスミドのコピーを継承することを確実にするためにＳｏｐＣで作用する。
ｃ．ｃ−ＴＮＢ００１にはまた、Ｅ．コリ（Lichtenstein & Brenner Nature 297, 601-3, 1982、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる; Lichtenstein & Brenner Mol. Gen. Genet. 183, 380-7, 1981、 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及び腸内細菌科の多くの種（Crepin, Harel & Dozois, Appl. Environ. Microbiol. 78, 6001-8 (2012)にレビューされる、 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に存在する、染色体上に位置するＴｎ７結合部位ａｔｔＴｎ７に部位特異的転位をもたらす細菌トランスポゾンの４つの転位タンパク質をコードするｔｎｓＡ、ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ｔｎｓＤ遺伝子が存在する。
ｄ．さらに、ｃ−ＴＮＢ００１はまた、ＴｎｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄタンパク質との相互作用のために必要とされるＴｎ７の末端逆方向反復体（ＴＩＲ）を担持し、それらの間にあるＤＮＡ配列のａｔｔＴｎ７への転位をもたらす。
ｅ．それらのＴＩＲは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ介在性インビボ組換えのカーゴへの送達を可能にするためのｌｏｘ部位に隣接している。ｃ−ＴＮＢ００１の構造が図６に示される。
【０１９５】
この実施例におけるｃ−トランスミドシップは、大きく、そしてインビトロ遺伝子操作によりカーゴを直接クローニングすることは容易ではない。代わりに、そのような遺伝子操作は、小さな非可動性プラスミドクローニングベクター、例えばｐＡＣＹＣ１８４（New England BiolabsからのＥ．コリＫ１２株ＥＲ２４２０で入手できる）において容易に実施される。このプラスミドの誘導体ｐＮＢ３００は、以下の特徴を有する（図１８−２０）：
ａ．ｐＮＢ３００（ｐＡＣＹＣ１８４のような）は、可動性でなく、そして従って、プラスミド接合によりトランスファーされ得ない。
ｂ．このプラスミドは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードし、そして選択可能薬物マーカーとしてクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）を付与するｃａｔ遺伝子を保持する。
ｃ．Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするｃｒｅ遺伝子、及びｌｏｘ部位に隣接するクローニング部位。
ｄ．Ｆプラスミド由来のｃｃｄＢキラー遺伝子は、ｌａｃプロモーターにより調節される（Bernard, Gabant, Bahassi & Couturier Gene 148:71-4, 1994）。このマーカーは、全ｐＮＢ３００（ｃｃｄＢを含む）がｃ−トランスミドに組換えされる、所望しない単一相反的Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え事象に対する負の選択を提供する。
ｅ．ｌｏｘ部位はまた、抗生物質トリメトプリム（Ｔｐ）による阻害に耐性であるジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするＴｎ７（Fling & Richards Nucl. Acid. Res.11:5147, 1983、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）からのｄｈｆｒ遺伝子に隣接し；このマーカーは、二重相反的Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え事象によりｐＮＢ３００：：：カーゴからのｃＴＮＢ００１へのカーゴのトランスファーの選択を可能にする（図１を参照のこと）。続いて、それはまた、ｃ−トランスミドが複製できない受容体においてカーゴのａｔｔＴｎ７への転位の選択を可能にする。
【０１９６】
従って、目的の選択された核酸カーゴを担持するｃ−トランスミドの構築のための全体的スキーオムは次の通りである：
１．目的の選択された核酸であるカーゴを、インビトロ遺伝子操作により、ｌｏｘ部位とカーゴシャトルベクターｐＮＢ３００におけるｄｈｆｒ遺伝子に隣接する部位との間の部位にクローン化、続いて、ＣｍＲの選択を伴って、ＤＨ５α（F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ-）コンピテント細胞（New England Biolabsから入手できる）を形質転換し；そのような細胞から単離されたプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ配列分析により、所望の組換えプラスミドｐＮＢ３００：：カーゴの統合性を調べる。
２．次に、組換えプラスミドｐＮＢ３００：：カーゴを、ＣｍＲ (コードされるｐＮＢ３００：：カーゴ) 及び ＫｍＲ (コードされるｃ−ＴＮＢ００１)についての選択を伴って、ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１もまた担持するＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換する。
３．ＤＨ５α形質転換体は現在、ｐＮＢ３００：：カーゴ及びｃ−ＴＮＢ００１の両者を担持するので、カーゴに隣接するｌｏｘ部位と、トラレスミドにおけるｌｏｘ部位との間のＣｒｅ−ｌｏｘ組換えが起き、ｃ−トランスミド中へのカーゴの組換えが発生する。この事象について選択するために、ＤＨ５α (ｃ−ＴＮＢ００１) (ｐＮＢ３００：：カーゴ)ドナーを、ストレプトマイシンに対する耐性（ＳｍＲ）を担持する受容体Ｅ．コリ株と交配し、そしてカナマイシン５０μｇ/ ｍＬ（Ｋｍ５０）、ストレプトマイシン５０μｇ/ ｍＬ（Ｓｍ５０）及びトリメトプリム５０μｇ/ ｍＬ（Ｔｐ５０）及びＩＰＴＧを補充されたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）プレート上にプレートする。従って、
ａ．Ｓｍ５０は受容体株を選択し、そしてドナー株に関しては、Ｋｍ５０が、ｃ−トランスミドの受容体への接合性トランスファーを選択し；
ｂ．Ｔｐ５０は、二重相互組換えによりｐＮＢ３００：：カーゴからのカーゴのｃ−ＴＮＢ００１へのＣｒｅ−ｌｏｘ介在性トランスファーを選択し、ｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴが得られ；
ｃ．ＩＰＴＧの付加は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ介在性単一相互Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え事象に起因する所望しない組換え体のトランスファーを可能にし、ここで全体のｐＮＢ３００がｃ−トランスミド中に組換えする（ｃＴＮＢ００１：：ｐＮＢ３００：：カーゴ）。これは、ｐＮＢ３００プラスミドバックボーンがトランスファーされると、ＩＰＴＧが毒性ｃｃｄＢ遺伝子の発現を誘発するからである。
４．次に、ｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴのみを担持する、結果として得られるエクス−接合体（exconjugant）を、確認するために、予測されるＣｍＲの損失（ｐＮＢ３００上に存在する）についてスクリーニングする。
５．このようにして構築されたｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴは、現在、ファージ感染及び／又は細菌結合のいずれかによる標的細菌への送達のために準備が整っている。。ージ送達のために、ｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴＤＮＡを、エクス−接合体から調製し、そしてインビトロでパッケージングすることができる。
６．λパッケージングされたｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴによる標的細菌の感染に続いて、ｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴを担持する細胞を、ｋｍＲ又はＴｐＲのために選択できる。
７．そのような細胞を、所定のマイクロバイオームにおいて他の細菌と交配することができる。
８．ａｔｔＴｎ７へのカーゴの転位を、ｃ−ＴＮＢ００１：：カーゴを担持するドナーと、ｃ−トランスミドが複製できない受容体細菌種とを交配することにより試験することができる。
９．上記工程６−８のそれぞれについて、カーゴの機能性について、目的の選択された核酸を、適切なアッセイを用いて、新しい受容体において試験することができる。
【０１９７】
以下に２つの成分の構築について記載する：（ｉ）ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１及びカーゴシャトルベクターｐＮＢ３００。
【０１９８】
実施例１．１  ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１の構築
ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１の構築のためのスキームを、図７に示す：それを、コスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１からの配列要素（鋳型Ａ）、大接合性プラスミドＲＫ２（鋳型Ｂ）及びＴｎ７要素を担持するプラスミドｐＧＲＧ３６の誘導体を組合し、但しｐＧＲＧ３６：：ｌｏｘ（鋳型Ｃ）を与えるＴｎ７  ＴＩＲ間へのｌｏｘ部位の付加により構築する。構築のための全体的手段は、（ｉ）各セグメントが１３のＰＣＲアンプリコンとして生成される、１３のセグメントに全体のコンストラクトを分割することである。（ii）次に、そのような隣接するアンプリコンのオーバーラップする組を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（Gibson DG, et.al. Nature Methods 2009; 6: 343-345、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により一緒に組合し、そしてｐＢｅｌｏＢＡＣ１１の誘導体にクローン化し、Ｉ、II、III、IVと称する４種のプラスミドを生成する。（iii）ユニーク制限部位が、セグメントの増幅の間、適切なＰＣＲプライマーにより導入されるので、隣接するセグメントを含む４種のＧｉｂｓｏｎアセンブリーされたプラスミドコンストラクトＩ、II、III、IVを、適切なユニーク制限酵素により消化でき；（iv）これは、４つのプラスミドのそれぞれからの各Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーされた複合セグメントの組の連結を可能にし、全体のｃ−トランスミド構造体を生成する。
【０１９９】
第１工程は、次の通りにｐＧＲＧ３６からのプラスミド誘導体ｐＧＲＧ３６：：ｌｏｘの構築である：２つの逆さにされたｌｏｘ部位ｌｏｘＮ（８塩基コア配列変異体）及びｌｏｘ７１（左アーム変異体）を含むＤＮＡカセットを、ｐＧＲ３６上のＰａｃＩ及びＥａｇＩ部位に挿入し、ｐＧＲ３６：：ｌｏｘと命名する。このｌｏｘカセットの配列は、上記図７の凡例に提供されている通りである。
１．３種のプラスミド鋳型（Ａ、Ｂ、Ｃ）を、今、１３のアプリコンのＰＣＲ増幅のために使用する。表３は、鋳型プラスミド（ＴＰ）ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、 ＲＫ２、 及び ｐＧＲＧ３６：：ｌｏｘ（それぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ）上のプライマー及びそれらのアニーリング部位を要約する。Ｔｍは℃で与えられる。このｃ−トランスミド構築の設計に使用されるプライマー配列及び各プラスミド上のアニーリング部位が示される。最終トランスミドコンストラクトを得るためにアセンブリーされたコンストラクトを連結するのに後で使用される制限酵素認識部が、大文字で示され、そして下線で示される。ＢＡＣ３中のCCTCGAGGCGCGCC（配列番号３６）は、AbsI (CCTCGAGG) 及び AscI (GGCGCGCC)認識部位を含み、ＢＡＣ４中の ggcGCGCCはＡｃｓＩ認識部位であり、ｔｒａ２_１．前方向中のGCGATCGCACGCGTTTAATTAACCTAGG（配列番号３７）は、AsiSI (GCGATCGC), MluI (ACGCGT), PacI (TTAATTAA) and AvrII (CCTAGG)認識部位を含み、ｔｒａ２_３．逆方向中のGGCGCGCCTCGAGG（配列番号３８）は、AscI (GGCGCGCC) 及び AbsI (CCTCGAGG) 認識部位を含み、ｔｒａ１Ａ＿１．前方向中のＧＣＧＡＴＣＧＣはＡｓｉＳＩ認識部位であり、ｔｒａ１Ａ＿２．逆方向及びｔｒａ１Ｂ＿１．前方向中のＡＣＧＣＧＴはＭｌｕＩ認識部位であり、Ｔｒａ１Ｂ＿３．逆方向及びｔｎｓ＿１．前方向中のＴＴＡＡＴＴＡＡはＰａｃＩ認識部位であり、そしてｔｎｓ＿２．逆方向中のＣＣＴＡＧＧはＡｖｒII認識部位である。プライマーアニーリング位置、及びｃ−ＴＮＢ００１の遺伝子構成が、図８に示される。
【０２００】
【表３】
2018522935.tif 000004
【０２０１】
従って、アンプリコン１、２及び３は、鋳型Ａから別々に増幅され；アンプリコン４、５、６、７、８、９、１０及び１１は、鋳型Ｂから別々に増幅され；そしてアンプリコン１２及び１３は、鋳型Ｃから別々に増幅される。それらのアンプリコンのそれぞれに含まれる遺伝子が、図８に示される。
【０２０２】
２．プラスミドＩ−ＩＶを、次の通りにアセンブリーする：
ａ．アンプリコン１、２、４、５、６を、Ｇｉｂｓｏnアセンブリーし、プラスミドコンストラクトＩを得；
ｂ．アンプリコン３、７、８を、Ｇｉｂｓｏnアセンブリーし、プラスミドコンストラクトIIを得；
ｃ．アンプリコン３、９、１０、１１を、Ｇｉｂｓｏnアセンブリーし、プラスミドコンストラクトIIIを得；そして
ｄ．アンプリコン３、１２、１３を、Ｇｉｂｓｏnアセンブリーし、プラスミドコンストラクトIVを得る。
【０２０３】
３．プラスミドＩ−ＩＶは、ＣｍＲの複製及び選択を可能にするｐＢｅｌｏＢＡＣ１１からのベクターバックボーン配列を担持するので、ＧｉｂｓｏｎアセンブリーされたプラスミドＩ−ＩＶを用いて、ＤＨ５αを形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡ配列分析にゆだね、コンストラクトの統合性を確認する。
【０２０４】
４．次の工程は、プラスミドＩ−ＩＶの成分からのｃ−ＴＮＢ００１のアセンブリーである：
図７は、関連する制限酵素部位：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの位置を示し、ここで a ＝ ＡｓｃＩ、ｂ ＝ ＡｂｓＩ、ｃ ＝ＡｖｒＩＩ、ｄ ＝ ＰａｃＩ、ｅ ＝ ＭｌｕＩ、ｆ ＝ ＡｓｉＳＩ。関連する制限フラグメントを、プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターバックボーン１、２（１＋２＋４＋５＋６）のフラグメントを既に担持するプラスミドＩにクローニングする。
ａ．第１プラスミドIIIを、ＭｌｕＩ及びＰａｃＩ（ｅ＋ｄ）により消化し、そしてフラグメント９＋１０＋１１を、アガロースゲル電気泳動による分離に続いて、ゲルから単離し、そしてそのフラグメントを、プラスミドＩのＭｌｕＩ／ＰａｃＩ二重消化物中にクローン化し、プラスミド１＋２＋４＋５＋６＋９＋１０＋１１を得る。
ｂ．次に、プラスミドIIを、ＡｓｉＳＩ及びＭｌｕＩ（ｆ＋ｅ）により消化し、そしてフラグメント７＋８を、アガロースゲル電気泳動による分離に続いてゲルから単離し、そしてそのフラグメントを、１＋２＋４＋５＋６＋９＋１０＋１１を担持するプラスミドのＡｓｉＳＩ／ＭｌｕＩ二重消化物中にクローン化し、１＋２＋４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１を得る。
ｃ．次に、プラスミドＩＶを、ＡｖｒＩＩ及びＲａｃＩ（ｃ＋ｄ）により消化し、そしてフラグメント１２＋１３を、アガロースゲル電気泳動による分離に続いてゲルから単離し、そしてそのフラグメントを、１＋２＋４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１を担持するプラスミドのＡｖｒＩＩ／ＰａｃＩ二重消化物にクローン化し、１＋２＋４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１＋１２＋１３を得る。
ｄ．最終的に、１＋２＋４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１＋１２＋１３を、ＡｓｃＩ（ａ）により消化し、そして再環状化し、クロラムフェニルコール耐性遺伝子を含むｐＢｅｌｏＢａｃ１１の不必要な領域を除く。
ｅ．得られるプラスミド１＋２＋４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１＋１２＋１３−Ｄｅｌｔａ−ＡｓｃＩ −フラグメントは、ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１である。
【０２０５】
実施例１．２  ｐＮＢ３００、プラスミドカーゴシャトルクローニングベクターの構築
カーゴベクターｐＮＢ３００の合計サイズは、４８５１ｂｐである（図１４）。それは、ｐＡＣＹＣ１８４から使用されるｐ１５Ａから複製する。それは、２つの逆位ｌｏｘ部位、ｌｏｘ７１及びｌｏｘＮを含み、その間にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子ｄｈｆｒが位置し、これはＣｒｅ介在性組換え事象のための選択マーカーとして使用される。カーゴは、ユニーク制限部位ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩでクローン化され得る。Ｃｒｅは、このカーゴベクターから恒常的に発現される。ｃｃｄＢ遺伝子は、ｌｏｃオペレーターの制御下にあり、これは、Ｃｒｅ組換え体の負の選択であろう。より詳細な説明については、図１５及び１６を参照のこと。このカーゴプラスミドベクター構築に使用されるプライマー配列及び各プラスミド上のアニーリング部位が表４に示される。Ａで表される鋳型プラスミドは、図１５の図の凡例に記載される。Ｔｍは℃で与えられる。
【０２０６】
【表４】
2018522935.tif 000005
【０２０７】
実施例２
ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１の使用の例示：Ｅ．コリにおける抗生物質耐性遺伝子の不活性化をもたらすカーゴの送達
実施例２は、抗生物質耐性遺伝子の不活性化をもたらす、カーゴの送達のためのｃ−トランスミドの適用を実証する。カーゴは、以下の８種のβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）ファミリーからの抗生物質耐性遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする８種のスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９コンストラクトをコードする目的の選択されたヌクレオチドである：ｂｌａＶＩＭ （Ｖ）、ｂｌａＯＸＡ（Ｏ）、ｂｌａＮＤＭ（Ｎ）、ｂｌａＣＴＸ−Ｍ（Ｃ）、ｂｌａＫＰＣ（Ｋ）、ｂｌａＩＭＰ（Ｉ）、ｂｌａＳＨＸ（Ｓ）及びｂｌａＴＥＭ（Ｔ）ファミリー、この後、ＶＯＮＣＫＩＳＴ遺伝子ファミリーと称する。そのような抗生物質耐性遺伝子の不活性化は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びクレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）の病原性株を含む細菌株における抗生物質感受性の復活を可能にする。この例示に含まれる工程は、下記に要約される。
【０２０８】
実施例２．１
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを担持し、そして任意の選択された細菌遺伝子に対して標的化されたスペーサー配列を担持するプラスミド誘導体の構築を可能にする、プラスミドｐＮＢ１００上の一般的に適用可能なＤＮＡカセットを構築した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性を、最初に、プラスミドｐＮＢ１０２（ｐＮＢ１００：：ＴＥＭ）を生成するための単一β−ラクタマーゼスペーサー配列の付加により試験し、そしてプラスミド形質転換による送達、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９：：ＴＥＭカセットを担持するバクテリオファージＭ１３の誘導体Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２による送達の両者により、ＴＥＭファミリーからの例示的βラクタマーゼ遺伝子標的を不活性化することを示し、ここで前記Ｍ１３は、非病原性一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡファージである。
【０２０９】
実施例２．２
スペーサーを、ｐＮＢ１００に付加し、不活性化のためにＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーからの選択されたβラクタマーゼ耐性遺伝子を標的化できる誘導体プラスミドｐＮＢ１０８（ｐＮＢ１００：：ＮＩＶＫＯＳＴＣ、ここでＮＩＶＫＯＳＴＣはｂｌａＮＤＭ、ｂｌａＩＭＰ、ｂｌａＶＩＭ、ｂｌａＫＰＣ、ｂｌａＯＸＡ、ｂｌａＳＨＶ、 ｂｌａＴＥＭ、ｂｌａＣＴＸ−Ｍβラクタマーゼ遺伝子ファミリーを標的化するスペーサーの順序を示す）を生成した。
【０２１０】
実施例２．３
８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβ−ラクタマーゼ遺伝子ファミリーのそれぞれからの１つのβ−ラクタマーゼをコードする８種のプラスミドを構築し、ここで７つのそのようなβ−ラクタマーゼは、臨床分離株、Ｅ．コリ及びクレビシエラ・ニューモニアエの病原性株から単離され、そして1つのβラクタマーゼは、Ｅ．コリの非病原性実験室株からであった。
【０２１１】
実施例２．４
８種のＶＯＮＣＫＩＳＴβ−ラクタマーゼのそれぞれの１つをコードするプラスミドを担持するＥ．コリの非病原性実験室株を、βラクタマーゼ耐性遺伝子の選択されたファミリーを標的とすることができるスペーサー配列を担持する誘導体プラスミドにより形質転換し、そしてＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子を不活性化するそれらの能力について試験した。
【０２１２】
実験例２．５
すべての８種のスペーサーを担持するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣカセット、すなわちカーゴを、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在性組換え（ドッキング）により、ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１に付加し、そしてカーゴ、ｃ−ＴＮＢ００１：：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣを有する得られるｃ−トランスミドを、感染性バクテリオファージλ粒子中にパッケージングし、λ（ｃ−ＴＮＢ００１：：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣ）を得、そしてλ（ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴ）感染によるＥ．コリ細胞への送達について試験する。
【０２１３】
実施例２．６
ｃ−ＴＮＢ００１：：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣを、細菌受容体Ｅ．コリ及びＫ．ニューモニアエへの接合性トランスファーについて試験する。
【０２１４】
実施例２．７
ｃ−ＴＮＢ００１：：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣを、８種のＶＯＮＣＫＩＳＴβ―ラクタマーゼのそれぞれの１つをコードするプラスミドを担持するＥ．コリの非病原性実験株のλ（ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴ）感染に続いて、それらの８種のβラクタマーゼのそれぞれを不活性化する能力について試験する。
【０２１５】
実施例２．８
ｃ−ＴＮＢ００１：：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣを、８種のＶＯＮＣＫＩＳＴβ―ラクタマーゼのそれぞれの１つをコードするプラスミドを担持するＥ．コリの非病原性実験受容体株へのドナー株からの接合に続いて、それらの８種のβラクタマーゼｃ−Ｔｒａｎｓｍｉｄ：：ＶＯＮＣＫＩＳＴのそれぞれを不活性化する能力について試験する。
【０２１６】
上記で要約された工程を、下記にさらに詳細に説明する。
【０２１７】
実施例２．１  一般的に適用できるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドの構築
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを担持し、そして任意の選択された細菌遺伝子に対して標的化されるスペーサー配列を担持するプラスミド誘導体の構築を可能にする、一般的に適用できるＤＮＡカセットを構築した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性を、β−ラクタマーゼのＴＥＭファミリーメンバー、例えばＴＥＭ−３及びＴＥＭ−１（それぞれ、細菌トランスポゾンＴｎ３及びＴｎ1のβラクタマーゼ遺伝子）に対して標的化されるスペーサー配列を担持する、ｐＮＢ１００、ｐＮＢ１０２の誘導体を用いて、プラスミド形質転換による送達により、及びまたは、Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２（バクテリオファージＭ１３の誘導体は、非病原性一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡファージである）による送達により、確認した。
【０２１８】
実施例２．１．１  ｐＮＢ１００の構築
ｐＮＢ１００は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の２つの直接的反復体間の任意の所望するスペーサー配列をクローン化するために、適切なユニーク制限部位ＢｓａＩで、Ｅ．コリ及び他の細菌種においてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを発現させるためのベクターである。そのベクターのバックボーンは、ｐＡＣＹＣ１８４（New England Bialabsから購入されたＥ．コリＫ１２株ＥＲ２４２０から精製される）に由来し、そしてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座を、ベクターのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座の３つの領域を、ＡＴＣＣから購入されたストレプトコーカス・ピオゲネス株ＳＦＢ７０のゲノムＤＮＡからのＰＣＲに増幅し、そして反応において、ｐＡＣＹＣ１８４ベクターに沿って、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（Gibsonなど．，２００９、前記）によりアセンブリーした。最終コンストラクトの配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により確認した。
【０２１９】
３つの領域の増幅された配列及びゲル上のアンプリコン画像。
以下の配列は、ＰＣＲにより増幅された３つの領域である。下線を付けられた配列は、鋳型特異的プライマー配列であり、太字はＧｉｂｓｏｎアセンブリーに使用されるオーバーラッピング配列である。
【０２２０】
１．フラグメント１、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃａｓ９：アンプリコンの長さ＝４７５８ｂｐ。前方向プライマーは、８５４１７０〜８５４１９３であり、そしてＳ．ピオゲナス（Ｓ．Pgogenes）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡ上の８５８８６７〜８５８８４８である。
【化１−１】
2018522935.tif 000006
【化１−２】
2018522935.tif 000007
【０２２１】
２．フラグメント２、リーダー及び第１の直接的反復体：アンプリコンの長さ＝２７６ｂｐ。前方向プライマーは８６０６４８〜８６０６７１であり、そして逆方向プライマーは、Ｓ．ピオゲネスゲノムＤＮＡ上の８６０８６２〜８６０８０６である。
【化２】
2018522935.tif 000008
【０２２２】
３．フラグメント３、第２の直接的反復体：アンプリコンの長さ＝４５２ｂｐ．前方向プライマーは８６１２２１〜８６１２７６であり、そして逆方向プライマーは、Ｓ．ピオゲネスゲノムＤＮＡ上の８６１６１３〜８６１５９４である。ゲノムＤＮＡ上にＢｓａＩ認識配列を含む、８６１２４６〜８６１２５５GGTCTCCATTからのデカマー配列を、GGTCCCAAAAにより置換し、ＢｓａＩ認識配列を破壊し、そしてゲノム上のＣＲＩＳＰＲアレイの７番目の直接的反復体を、このベクター中の２番目の直接的反復体に変換する。
【化３】
2018522935.tif 000009
【０２２３】
３つのフラグメントを形成するためのＰＣＲ条件が、表５に提供される。
【０２２４】
【表５】
2018522935.tif 000010
【０２２５】
３つのＰＣＲアンプリコン、ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９、リーダー及び第１の直接的反復体、第２の直接的反復体からのｐＮＢ１００のアセンブリー；及びＥｃｏＲＶにより消化されたｐＡＣＹＣ１８４。
我々は、New England Biolabs（Ｅ５５１０）からのＧｉｂｓｏｎアセンブリーキットを使用し、そして上記の３つのＰＣＲアンプリコンを、ｐＡＣＹＣ１８４に従ってに沿って、アセンブリーするために、製造業者により提供されるプロトコルに従って。アセンブリー反応における各フラグメントの成分を、表６に示す。
【０２２６】
【表６】
2018522935.tif 000011
【０２２７】
２μｌのアセンブリー反応物を、ＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabsから購入された）に形質転換し、続いてクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）ＬＢプレート上で置換した。組換え体を、初期の３つのフラグメントを得るために使用される３つのプライマー組を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。３つの所望するアンプリコンを与えるプラスミド鋳型を、候補体クローンから単離し、そして配列分析にゆだねた。
【０２２８】
ＰＮＢ１００の最終コンストラクトの配列：
【化４−１】
2018522935.tif 000012
【化４−２】
2018522935.tif 000013
【化４−３】
2018522935.tif 000014
【０２２９】
ヌクレオチドの合計数は、９５７８ｂｐである。バックボーンベクターｐＡＣＹＣ１８４配列はイタリック体であり、配列位置は、ＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）のＧから下線を付して番号が付けられている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、太字で示されるヌクレオチド番号１８８９〜１９７４に位置し、Ｃａｓ９開始及び終結コドンは、太字の３文字により示され、ヌクレオチド番号２２７０で開始し、そして６３７６で終わり、続いてリーダー配列６４６２〜６５５６がイタリック体の太字で示され、第１及び第２直接的反復配列が下線を引かれ、この間にスペーサークローニング領域（３０マー）が位置する。このクローニング領域は、それぞれ、スペーサークローニング部位５‘−ＧＴＴＴ−３’及び５‘−ＴＴＴＴ−３’を突出する５′側の４個の塩基を創造するために、太字のイタリック体の文字５‘−ＧＡＧＡＣＣ−３’及び ５‘−ＧＧＴＣＴＣ−３’により示される２つの逆位ＢｓａＩ部位、及び不完全なＢｓａＩ消化の場合、自己連結を低めるために、太字イタリック体によってもまた示される１つのユニークＡａｔII（5’-GACGTC-3’）部位を含む。転位及び転換塩基は、それぞれ、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により検出されたＧ６５７３Ａ、Ａ６７７９Ｔを変更し、そして太文字で示されていることを注意すること。しかしながら、それらの点突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性に影響を与えず、これは後のセクションに示されるであろう。太字のイタリック体で強調された２つのユニーク部位ＳａｌＩ(ＧＴＣＧＡＣ) 及びＸｂａＩ(ＴＣＴＡＧＡ)が、Ｍ１３ｍｐ１８へのクローニングのためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９コンストラクトを単離するために利用される。
【０２３０】
ｐＮＢ１００のプラスミド地図が、図２２に示される。
【０２３１】
所望のためのスペーサー配列を、ＢｓａＩ部位間で時計周りの方向にクローン化することができる。このベクターは、１３９８−８４８でｐ１５Ａ起点、及び２１９−９１３７でｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）遺伝子を含む。括弧内に示される各制限酵素の切断位置は、認識配列内の上部鎖上の５′切断部位の位置を言及する。
実施例２．１．２  ｐＮＢ１０２の構築
【０２３２】
標的配列からスペーサー配列の選択
我々は、標的物からスペーサー配列を選択するために、BlueheronからのGuide RNA Target Design Tool (https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jspを参照のこと)を使用することができる。このプログラムは、３′末端に適切なＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列、及びＧＣ含有量を有する２０ｎｔスペーサー配列を単に戻す。それは、二次構造安定性及び配列特異性を考慮していない。二ｊ構造予測及び特異性の調査を、手動的に実施する。
【０２３３】
我々は、上記プログラムで得られた候補体配列から実際のスペーサー配列を選択し、これは以下の２つの基準を満たすべきである：１）ｃｒＲＮＡの安定した二次構造を形成する傾向が低く、２）宿主ゲノムＤＮＡ上に標的ＤＮＡが存在しない。基準２を満たすユニーク配列を見出すことは、非常に困難であるかも知れない。Jinek et al., Science 337, 816 (2012; 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)における図３Ｅからの不一致な標的データを考慮すると、基準２は標的配列における１２番目のヌクレオチド位置まで一致した配列を可能にするために緩和される（第１のヌクレオチド位置は、ＰＡＭ配列のすぐ次から数えられる）。言い換えれば、標的配列の最初の１２マープロトスペーサー配列が、３′末端におけるｃｒＲＮＡスペーサー配列の１２マー配列に完全に一致するが、しかし残りの配列は一致せず、標的ｄｓＤＮＡは切断されないと推定される。Ｅ．コリＫ１２ゲノム配列に沿ったプロトスペーサー配列の特性のチェックを、ＢＬＡＳＴにより実施する。ｂｌａ配列を、対象配列Ｅ．コリstr. substr. MG1655 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/556503834?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=JUYB76FX014)に対して調査し、そして任意の一致した染色体配列のそれぞれを、標準ＰＡＭ（ＮＧＧ）配列からのシード配列を計数するためにｂｌａ配列に対してマッピングする。二次構造は、デルタＧが可能な限り大きく、好ましくはｃｒＲＮＡスペーサー二次構造に対して陽性である配列を選択するために、ｍＦｏｌｄ（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）により予測することができる。表７は、ｂｌａ配列から適切なスペーサー配列を選択する手段を示す。
【０２３４】
【表７】
2018522935.tif 000015
【０２３５】
ｂｌａ遺伝子からのすべての標的配列を、BｌｕｅHｅｒｏｎからのGuide RNA Target Design Tool (https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp)を用いて得た。９８の標的候補体配列が戻される。細菌のオフターゲット染色体の短い類似配列を、ｂｌａ遺伝子に対してマッピングし、続いて、標準ＰＡＭ配列からシード配列を計数する。シード配列番号が８未満で、そしてＧｉｂｂｓ自由エネルギーが比較的大きい配列を選択する。選択された標的配列の性質の要約が、表7に示される。表７はまた、ｐＣａｓ９及びｐＢＲ３２２上のオフターゲット配列のシード配列のヌクレオチドを示す。
【０２３６】
スペーサー配列のためのオリゴカセット配列。
以下の４種のスペーサー配列は、上記の２つの基準を満たす、宿主株としてのＥ．コリにおけるｐＢＲ３２２上のβラクタマーゼを標的とするｃｒＲＮＡ生成カセットであるβラクタマーゼ遺伝子上で、ＣＲ０５は、７６２番目の塩基Ｃと７６３番目の塩基Ｃとの間のホスホジエステル結合を切断し、ＣＲ３０は、１９８番目の塩基Ｇと１９９番目の塩基Ａとの間ホスホジエステルを切断し、ＣＲ７０は、５７５番目の塩基Ｔと５７６番目の塩基Ａとの間ホスホジエステルを切断し、そしてＣＲ９０は、２２１番目の塩基Ｔと２２２番目の塩基Ａとの間ホスホジエステルを切断する。
【０２３７】
β−ラクタマーゼ遺伝子上の単一の標的のためのアダプター：
【化５】
2018522935.tif 000016
【０２３８】
β−ラクタマーゼ遺伝子上の二重標的のためのアダプター。
内部直接的反復配列は、イタリック体で下線が引かれている。
【０２３９】
【化６】
2018522935.tif 000017
【０２４０】
各オリゴの５′末端は、リン酸化され、そしてＢｓａＩ部位でのクローニングの準備ができている。６つの塩基カッター制限エンドヌクレアーゼの部位に下線が引かれ、これは組換え体をスクリーニングするために有用である。我々はまた、プラスミドベクターのための別のユニークプライマーと共に、ＰＣＲにより組換え体をスクリーニングするためのプライマーとしてカセットオリゴの１つを使用することができる。
【０２４１】
スペーサー配列ＣＲ３０を、以下のようにしてｐＮＢ１００に付加した：ｐＮＢ１００を、ＢｓａＩ及びＡａｔIIにより消化し、続いて、Agencourt  ampureビーズを用いて精製した。スペーサー配列ＣＲ３０を、２つのオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡカセットとして、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）、及び５０ｍＭのＮａＣｌにおいて、各オリゴの５′末端においてリン酸成分を付加するキナーゼ反応に続いて、９５℃での１分間の変性、及び３０℃まで１分ごとに−１度での再アニーリングにより、２つのオリゴヌクレオチドからの二本鎖ＤＮＡカセットとして調製した。アニーリングされたカセットは、ＢｓａＩ消化によりｐＮＢ１０２上で創造される部位の両端上に５′側の突出する４塩基適合性塩基を含む。このＣＲ３０カセットを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ１００に連結し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabsから購入された）に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、そして４０９ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成するために組換えプラスミド上の６２０９―６２２８領域でアニーリングする、逆方向プライマー及び前方向プライマーＣＦ1： ５’−ａｃｇｔｔｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｇａｇｃとしてＣＲ３０カセットの底部配列を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定し、ＣＲ３０スペーサー配列を確認し、そしてこの組換えクローンを、ｐＮＢ１０２として命名し、そしてＴＥＭβラクタマーゼ遺伝子不活性化実験のために使用した。ＣＲ３０スペーサーは、βラクタマーゼ遺伝子のセンス鎖にアニーリングし、そしてセンス及びアンチセンス鎖上の１８８番目と１８９番目のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断する。
【０２４２】
実験例２．１．３  Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２の構築。
ｐＮＢ１０２を、ユニーク制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩにより消化し、６０４４ｂｐ及び３５２４ｂｐの２つのフラグメントを生成した。フラグメントの長さを、制限認識部位内の上部鎖における制限部位の５′末端から計算した。ＣＲＩＳＰＲアレイに、ＣＲ３０スペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む６０４４ｂｐのフラグメントを、３５２４ｂｐのフラグメントから分離し、そして分取１％アガロースゲル上で精製した。Ｍ１３ｍｐ１８を、ＳａｌＩ−ＸｂａＩにより消化し、続いてAgencourt  ampure精製し、反応から６個の塩基のＳａｌＩ−ＸｂａＩフラグメントを除去した。それらの２つの精製されたフラグメントを組合し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結し、そしてＤＨ５αＦ′ｌｑコンピテント細胞（New England Biolabsから購入した）に形質転換した。形質転換された細胞を、ファージインジケーターとして新たに増殖されたＤＨＳαＦ′ｌｑ細胞、及び溶融されたトップアガロースを含む青一白色インジケーターとしてのＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌ溶液と共にＬＢプレートにプレートした。芝生から採取された白色プラークを、ＣＲ３０スペーサー配列の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。得られる正しいファージコンストラクトを、２回の単一プラーク単離により精製した。最終コンストラクトの全配列の長さは、１３２８８ｂｐである。このスペーサーＣＲ３０陽性組換え体を、Ｍ２３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２として命名し、そしてＭ１３ファージ送達により介在されるｂｌａ−遺伝子不活性化実験のために使用した。
【０２４３】
実施例２．１．４  「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）を試験するために細菌へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９コンストラクトの送達。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドｐＮＢ１００、及び細菌転位性要素Ｔｎ１及びＴｎ３によりコードされるβラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子に対して標的化されたスペーサー挿入を担持する誘導体プラスミドｐＮＢ１０２を構築した後、我々は、以下の３種の送達方法（ｉ）プラスミド接合、（ii）プラスミドＤＮＡ形質転換、（iii）バクテリオファージ感染を用いて、ｂｌａ−スペーサー挿入を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９コンストラクトのコピーを担持する細菌細胞が、β−ラクタム抗生物質アンピシリンの存在下で増殖できないことを実証しようとした。
【０２４４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを介して、抗生物質耐性遺伝子を含む標的遺伝子を不活性化することができ、そして本発明の側面の一部を形成できるコンストラクトをまた、本明細書においては、「ネメシス共生活性」として言及する。
【０２４５】
プラスミド接合によるＮＳＡアッセイ：予防実験。
我々はここで、ネメシス共生活性が、ネメシス共生活性を担持する受容体細胞の、ドナー細胞からの抗生物質耐性遺伝子を担持する接合性プラスミドの接合性トランスファーを阻害することにより、抗生物質耐性の広がりを妨げることができることを実証する。これをおこなうために、我々は、ネメシス共生活性を担持する受容体細胞と、接合性プラスミドを担持するドナー細胞と、及びアンピシリン耐性をコードするｂｌａ遺伝子を担持する複数コピー可動性プラスミドとを交配した。好結果をもたらす交配では、接合性プラスミドは、それ自体に加えて、アンピシリン耐性を担持する可動性プラスミドを受容体にトランスファーするであろう。エクソ接合体（exconjugant）は、受容体中の非可動性プラスミド上に存在するクロラムフェニコール、及びドナーから受け取ったアンピシリンの両方に対する耐性のために選択され得る。好結果をもたらすネメシス共生活性は、アンピシリン耐性のトランスファーの効果を低めるであろう。
【０２４６】
受容体細胞ＤＨ５α (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ-)を、New England Biolabsから購入し、そしてプラスミドｐＮＢ１００ 又はｐＮＢ１０２又はｐＡＣＹＣ１８４により形質転換し、ここで前記プラスミドは、クロラムフェニコール耐性をコードし、そしてｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２の両者は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を担持するが、しかしｐＮＢ１０２のみはβ―ラクタマーゼ遺伝子に対して標的化されたスペーサー配列を担持する。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４は、上記のように、ｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２の構築のために使用される非可動性親プラスミドである。
【０２４７】
プラスミドｐＮＴ３をまた担持するドナー株ＪＡ２００（F+ thr-1, leu-6, DE(trpE)5, recA, lacY, thi, gal, xyl, ara, mtl）は、Saka et al. DNA Research 12, 63-68 、2005; 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)により記載されている。プラスミドｐＮＴ３は、Ｔｎ１のＴＥＭ−１  ｂｌａ遺伝子を担持する可動性プラスミドである。
【０２４８】
ドナーＪＡ２００  ｐＮＴ３の単一のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）プレートから採取し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する１ｍｌのＬＢ培地において３７℃で一晩、振盪下で増殖した。受容体ＤＨ５α ｐＮＢ１００及び ＤＨ５α ｐＮＢ１０２の各単一コロニーを、３５μ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートから採取し、そして３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む、１ｍｌのＬＢにおいて３７℃で一晩、振盪下で増殖した。細胞を洗浄し、抗生物質を除去し、５０μｌの細胞を、エッペンドルフ管中の１ｍｌのＬＢに添加し、そして１２５００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離した。細胞を、５０μｌのＬＢに再懸濁した。交配を設定するために、ＪＡ２００  ｐＮＴ３をＬＢプレート上にスポットし、次にｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２を担持する各ＤＨ５α２μｌを、このスポットに添加した。ドナー及び受容体の別々の２μｌスポッティングをまた実施した（すなわち、交配しなかった）。プレートを、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を除去し、ＬＢに再懸濁し、そしてその１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの両方を含むＬＢプレート上にプレートした（ＬＢ  ＡｐＣｍ）。１００μｌの１０，０００倍（１０−４）希釈物をまた、ＬＢプレート上にプレートし、そして３７℃一晩インキュベートした。得られたコロニーを、表８に示されるように、計数した。
【０２４９】
【表８】
2018522935.tif 000018
【０２５０】
図２３中の写真は、以下の間の交配のプレートを示す：（Ａ） ＪＡ２００ ｐＮＴ３ ｘ  ＤＨ５α ｐＮＢ１００ （予想通り、ネメシス共生活性が欠如している）; 及び （Ｂ） ＪＡ２００ ｐＮＴ３ ｘ  ＤＨ５α ｐＮＢ１０２ (ネメシス共生活性を示す)。
【０２５１】
ＬＢプレート上にプレートされた１０−４倍希釈物は、交配された細胞懸濁液中１ｍｌ当たり５×１０７個の細胞の約５００コロニーを与え、そしてＪＡ２００ ｐＮＴ３ ｘ  ＤＨ５α ｐＮＢ１０２に関しては、わずか３．７×１０２個の細胞／ｍｌを、ＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５プレート上で増殖することができた。従って、半分の細胞が受容体／エクス−接合体であると仮定すると、２．５×１０７により割算された３．７×１０２個の細胞／ｍｌが、１．２×５×１０−５個のｐＮＢ１０２を担持する受容体の交配効率を与えた。
【０２５２】
この実験は、ｐＮＢ１０２ 対ｐＮＢ１００ ｘ ＪＡ２００ ｐＮＴ３を担持するＤＨ５αとの交配においてＣｍＲＡｐＲエクス接合体の有意な低下を実証した。
【０２５３】
相対的交配効率をより正確に測定するために、液体交配の後、細胞を、全ての細胞を力価するためにプレートし、ドナー及びエクス接合体を力価するためにＬＢＡｐ１００プレートに、受容体及びエクス接合体を力価するためにＬＢＣｍプレートに、及びエクス接合体のみを力価するためにＬＢＡｐ１００Ｃｍ３５にプレートした。
【０２５４】
液体交配のために、１０μｌのＪＡ２００ｐＮＴ３の一晩の培養物を、１０μｌの受容体ＤＨ５α ｐＮＢ１００又は ＤＨ５α ｐＮＢ１０２と混合し、２００μのＬＢを添加し、そして管を３７℃で一晩インキュベートした。交配混合物を、ＬＢで、１０−１、１０−３、１０−５倍に希釈し、そして５０μｌの希釈物を、ＬＢ、ＬＢ Ａｐ１００Ｃｍ３５、ＬＢ Ａｐ１００ 及び ＬＢ Ｃｍ３５プレート上にプレートし、そしてプレートを３７℃で一晩インキュベートした。表９は、得られる細胞力価を要約する。
【０２５５】
【表９】
2018522935.tif 000019
【０２５６】
ＬＢＣｍ及びＬＢＡｐプレート上の細胞の数は、ＬＢプレート上の細胞の数と等しくなければならない。ｐＮＢ１００ １．４０ ｘ １０＾８ (Ｃｍプレート) 及び ２．６４ ｘ １０＾８ (Ａｐプレート) ＝ ４．０４ ｘ １０＾８については、ＬＢプレート上での４．１４×１０８と非常によく一致する。ｐＮＢ１０２ １．７８ ｘ １０＾８ (Ｃｍ プレート) 及び ３．８２ １０＾８ (Ａｐ プレート) ＝ ５．６ ｘ １０＾８については、ＬＢプレート上での５．１６×１０８と非常に良く一致する。
【０２５７】
結論として、液体培養での一晩の交配の後、受容体当たり交配効率が、スペーサーを欠くｐＮＢ１００と、スペーサーを有するｐＮＢ１０２とを比較して、５，０００倍、低められることを示す。
【０２５８】
プラスミド形質転換によるＮＳＡアッセイ：
この実験においては、我々は、ＤＮＡ形質転換による受容体細胞へのネメシス共生生物の導入が形質転換体における抗生物質耐性を不活性化することを実証する。
【０２５９】
試験株を得るために、New England Biolabsから購入購入されたＤＨ５αコンピテント細胞をｐＢＲ３２２（Ｔｎ３に由来するｂｌａ遺伝子を担持する）により形質転換し、そしてＬＢ  Ａｐ１００プレート上で選択した。次に、前記誘導された株ＤＨ５０αｐＢＲ３２２のコンピテント細胞を、Sambrook and Russell in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)により記載されるように、ＣａＣＩ２プロトコル２５（１．１１６）を用いて調製し、そして続いて、プラスミドｐＮＢ１００、ｐＮＢ１０２ 及び ｐＡＣＹＣ１８４により形質転換し、ＣｍＲについて選択した。次に、形質転換体コロニーを、ＬＢ Ｃｍ３５ 及び ＬＢ Ａｐ１００プレート上に添加した。一次形質転換体を、ＬＢ Ｃｍ３５ 及び ＬＢ Ａｐ１００プレートの両者上に添加し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０２６０】
図２４に示される結果は、ｐＮＢ１００（ｂｌａ遺伝子標的スペーサー配列を欠いている）により形質転換されたＤＨ５αｐＢＲ３２２から採取された全てのコロニーがアンピシリンに対して耐性のまま存続することを示す。対照的に、ｐＮＢ１０２により形質転換されたＤＨ５αｐＢＲ３２２から採取された全てのコロニーはアンピシリン耐性を失っており、従って、ネメシス共生活性を実証する。
【０２６１】
上記実験は、ＮＳＡがｂｌａ遺伝子を不活性化している一次形質転換体の割合の値を与えない。これに対処するために、一次形質転換からの単一コロニーを、１ｍｌのＬＢ中に付加し、そしてＬＢ中で１０−３倍に希釈した。次の通りに、その１００μｌをプレート上にプレートし、そして結果を記録した。結果は、ｐＮＢ１０２を有するＤＨ５αｐＢＲ３２２の形質転換に続いて、１０−６未満の細胞がＡｐＲを保持することを示した。ネメシス共生活性は非常に効果的である。
【０２６２】
バクテリオファージＭ１３感染によるＮＳＡアッセイ。
この実験において、我々は、バクテリオファージ感染による受容体へのネメシス共生生物の導入が、形質転換体における抗生物質耐性を不活性化することを実証する。我々は、ネメシス共生生物コンストラクトのための送達剤として雄特異的繊維状ファージＭ１３を選択する。Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ、およびｐＮＢ１０２のｂｌａ遺伝子標的スペーサー領域を担持するＭ１３誘導体Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２を用いて、プラスミドｐＮＴ３上にアンピシリン耐性を担持するＦ＋株ＪＡ２００の感染によりネメシス共生生物を送達する。この株の新鮮な培養物０．２ｍｌを、３ｍｌのＬＰトップアガー（０．７％アガーを有するＬｕｒｉａブイヨン）に添加し、そしてＬＢプレート上に注いだ。次に、Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２（１０８ｐｆｕ/ ml）及び対照としてのＭ１３ｍｐ１８のファージストック２μｌを芝生にスポットし、そしてプレートを３７℃で８時間インキュベートした。プラークを１．５ｍｌのＬＢに添加し、そして３７℃で振盪培養した。１．５ｍｌのＬＢ中に付加された単一コロニーからの、アンピシリン耐性を欠いている対照株ＤＨ５αをまた、一晩、培養した。
【０２６３】
βラクタマーゼ活性についてのニトロセフィンアッセイを実施した：
１ｍｌの細胞培養物を、微量遠心気で１２，５００ｒｍｐで５０秒間、遠心分離し、次に２μｌのストックニトロセフィン（ＤＭＳＯ中、１０ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｌの細胞上清液に添加し、そしてニトロセフィンの分解生成物の吸光度を、ニトロセフィンの添加の後、数時点で、分光光度計で測定した。表１０は、その結果を要約する。
【０２６４】
【表１０】
2018522935.tif 000020
【０２６５】
上記に報告される実験は、モデル生物のＥ．コリにおいて、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ領域、及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域に対して向けられた配列を有するスペーサー領域を担持するＤＮＡコンストラクトが、裸ＤＮＡ形質転換及びバクテリオファージ感染により送達される場合、アンピシリン耐性を不活性化し、そしてプラスミド接合によりアンピシリン耐性のトランスファーを防止することができる概念実証を提供する。本発明のネメシス共生生物が病原性細菌及び他の抗生物質耐性遺伝子に適用され得ることは明らかである。
【０２６６】
実施例２．２  複数のβラクタマーゼ遺伝子ファミリーを標的にするプラスミドの構築。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが、微生物病原体の中で、及びマイクロバイオームの非病原性メンバーの中で見出され得る多数の異なるβラクタマーゼ遺伝子を不活性化するために、単一のコンストラクトで使用され得ることを実証するために行われるいくつかの概念実証実験を、以下の実験が記載する。
【０２６７】
それらの例示においては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、及びＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ 及び ＯＸＡの８つまでのＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼファミリーの耐性遺伝子を標的とする、直接的反復体に隣接するスペーサー配列を担持する誘導体を担持するプラスミドを構築した。
【０２６８】
それらの８つのファミリーのβ−ラクタマーゼ遺伝子のそれぞれについて、そのファミリーの多数の遺伝子メンバーを標的とする単一のスペーサーを企画した。それらは、以下の通りである：ＳＨＶ−ａ ＝ １、 １ａ、 ２、 ２ａ、 ５、 ５ａ、 １１、 １２、 １４、 １８、 ２０、 ２１、 ２２、 ２３、 ２６、 ２７、 ２８、 ３１、 ３２、 ３３、 ３８、 ４３、 ４４、 ４８、 ５２、 ５５、 ５６、 ６０、 ６１、 ６２、 ７１、 ７３、 ７４、 ７５、 ７６、 ７７、 ７８、 ７９、 ８０、 ８１、 ８２、 ８５、 ８９、 ９２、 ９８、 ９９、 １００、 １０１、 １０３、 １０６、 １０７、 １０８、 １０９、 １１０、 １１１、 １２１、 １３６、 １３４、 １３７、 １４０、 １４３、 １４４、 １４７、 １４８、 １４９、 １５０、 １５１、 １５２、 １５３、 １５４、 １５５、 １５７、 １５８、 １５９、 １６０、 １６１、 １６２、 １６３、 １６４、 １６５、 １６８、 １７２、 １７３、 １７８、 １７９； ＣＴＸＭ−ｂ＝ １、 ３、 １０、 １２、 １５、 １９、 ２２、 ３２、 ５２、 ５４、 ５９、 ６０、 ６２、 ６８、 ７１、 ８０、 ８１、 ９９、 １４１、 １４７; ＴＥＭ−ｃ＝ １、 １Ｂ、 ３、 １３９、 １６２、 １８３、 １９２、 １９７、 １９８、 ２０９; ＫＰＣ−ｄ ＝ １、 ２、 ３、 ４、 ６、 ７、 ８、 １１、 １２、 １４、 １５、 １６、 １７ ； ＶＩＭ−ｅ ＝ １、 ２、 ４、 １９、 ２６、 ２７、 ３３、 ３４； ＩＭＰ−ｆ ＝ ４、 ８、 ３２、 ３８; 及び ＮＤＭ−ｇ ＝ １、 ９、 １０。
【０２６９】
表１１は、ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ及びＯＸＡ−４８の８つのβ−ラクタマーゼファミリーの耐性遺伝子を標的とするよう企画された８つのスペーサー配列を示す：以下の遺伝子に対して標的化される８つのガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列組：クラスＡ遺伝子、ＳＨＶ−ａ、  ＣＴＸ−Ｍ−ｂ、 ＴＥＭ−ｃ、 ＫＰＣ−ｄ;クラスＢ 遺伝子 ＶＩＭ−ｅ、 ＩＭＰ−ｆ、 ＮＤＭ−ｇ 及び クラスＤ 遺伝子、 ＯＸＡ−４８ 、ここでＳＨＶ−ａ ＝ １、 １ａ、 ２、 ２ａ、 ５、 ５ａ、 １１、 １２、 １４、 １８、 ２０、 ２１、 ２２、 ２３、 ２６、 ２７、 ２８、 ３１、 ３２、 ３３、 ３８、 ４３、 ４４、 ４８、 ５２、 ５５、 ５６、 ６０、 ６１、 ６２、 ７１、 ７３、 ７４、 ７５、 ７６、 ７７、 ７８、 ７９、 ８０、 ８１、 ８２、 ８５、 ８９、 ９２、 ９８、 ９９、 １００、 １０１、 １０３、 １０６、 １０７、 １０８、 １０９、 １１０、 １１１、 １２１、 １３６、 １３４、 １３７、 １４０、 １４３、 １４４、 １４７、 １４８、 １４９、 １５０、 １５１、 １５２、 １５３、 １５４、 １５５、 １５７、 １５８、 １５９、 １６０、 １６１、 １６２、 １６３、 １６４、 １６５、 １６８、 １７２、 １７３、 １７８、 １７９； ＣＴＸＭ−ｂ ＝ １、 ３、 １０、 １２、 １５、 １９、 ２２、 ３２、 ５２、 ５４、 ５９、 ６０、 ６２、 ６８、 ７１、 ８０、 ８１、 ９９、 １４１、 １４７； ＴＥＭ−ｃ＝ １、 １Ｂ、 ３、 １３９、 １６２、 １８３、 １９２、 １９７、 １９８、 ２０９； ＫＰＣ−ｄ ＝ １、 ２、 ３、 ４、 ６、 ７、 ８、 １１、 １２、 １４、 １５、 １６、 １７ ; ＶＩＭ−ｅ ＝ １、 ２、 ４、 １９、 ２６、 ２７、 ３３、 ３４； ＩＭＰ−ｆ ＝ ４、 ８、 ３２、 ３８; 及びＮＤＭ−ｇ ＝ １、 ９、 １０（実証例２を参照のこと）。
【０２７０】
【表１１】
2018522935.tif 000021
【０２７１】
表のキー：
PAM    プロトスペーサー隣接モチーフ
Cl     ベータラクタマーゼクラス A, B, C又はD
P      ペナムス                             例えば、アモキシシリン
C-e    セフェムス:    e_セファロスポリン
C-n    セフェムス:    n_セファロスポリン
C-I    セフェムス     セファロスポリンI     例えば、セファゾリン
C-II   セフェムス     セファロスポリンII    例えば、セファマイシン
C-III  セフェムス     セファロスポリンIII   例えば、セフタジジム
Cb     カルバペネム                         例えば、エルタペネム
Mb     モノバクタム                         例えば、アズトレオナム
【０２７２】
プラスミドの構築に使用されるプライマー配列が、表１２に列挙される。
【０２７３】
【表１２】
2018522935.tif 000022
【０２７４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、及び細菌における８つのβ−ラクタマーゼファミリーの抗生物質耐性遺伝子に対して標的化され、そしてｂｌａＮＤＭ、ｂｌａＩＭＰ、ｂｌａＶＩＭ及びｂｌａＫＰＣ、ｂｌａＯＸＡ−４８、ｂｌａＳＨＶ、ｂｌａＴＥＭ 及びｂｌａＣＴＸ−Ｍ （ＮＩＶＫＯＳＴＣ)の１つのプロモーターから発現される、直接的反復体に隣接するスペーサー配列を担持する誘導体を担持する。一般的に適用できるＤＮＡカセットであるｐＮＢ１００、ＰＮＢ１０８（図２５）のプラスミド誘導体がこの実施例に記載される。
【０２７５】
ｐＮＢ１０８の構築
図２６Ａ二示されるテトラマースペーサーコンカテマーＡ （ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）及び Ｂ （ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ）を、ベクターｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯにサブクローンし、そしてそれぞれ、ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯスペーサーＡ 及びｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯ_スペーサーＢと命名した。次に、連結されたスペーサーアレイ配列Ａ及びＢを、それぞれプライマー組ＮＢ０２６及びＮＢ０２９、ＮＢ０３０及びＮＢ０３３により、サブクローン化されたベクターｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯ_スペーサーＡ 及び ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯ_スペーサーＢから増幅した。スペーサーＡのアンプリコンの３′末端及びスペーサーＢのアンプリコンの５′末端は、ＫＰＣスペーサー配列からのオーバーラップされた、２０塩基の配列である。それらの２つのアンプリコンをゲル精製し、そしてプライマーの不在下でのＰＣＲに基くペアワイズサイクル伸長反応に使用した。伸長された材料を、プライマー組ＮＢ０３７ (５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’; 配列番号 １１６) 及びＮＢ０３８ (５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’; 配列番号１１７)により再増幅し、完全な８つのスペーサーアレイコンテマーを生成した。この８つのスペーサーコンカテマーを、ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、そして配列分析により確かめた。
【０２７６】
このｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯサブクローンのＢｓａＩ消化は、ＢｓａＩによりｐＮＢ１００上に創造される部位の両端上で５′突出する４塩基適合塩基を含む、ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクターからのサブクローンとして完全８スペーサーアレイコンカテマーを除去する。次に、ｐＮＢ１００を、ＢｓａＩにより消化し、続いてアガロースゲル精製した。ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯから開放された８−スペーサーコンカテマーカセットを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ１００中に連結し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabsから購入される）に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、そして逆方向プライマーＮＢ０２１: ５’− ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＴ (配列番号１１８)及び前方向プライマーＮＢ０２０： ５’− ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣ (配列番号 １１９)によるＰＣＲによりスクリーニングし、組換えプラスミド上で、それぞれ、６３６８−６３８５領域及び７２０３−７２２５領域でアニーリングし、８５８ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成した。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定し、８スペーサーコンカテマー配列を確認し、そしてこの組換えクローンを、ｐＮＢ１０８と命名し、そしてそれを用いて、そのような遺伝子を担持する細菌株へのＤＮＡ送達に続いて、標的化されたβラクタマーゼ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９介在性不活性化を実証した。ｐＮＢ１０８のプラスミド地図は、図２５に示される。
【０２７７】
連結されたスペーサーアレイの構造の概略図
スペーサー配列を、標的β−ラクタマーゼ遺伝子ファミリーのカバレッジを最大にするよう決定した。各ユニットオリゴは、各端で適切なスペーサー配列に隣接する直接的反復体を含む。結合反応が対様オリゴ間で行われ、すなわち、最も近い隣接ユニットオリゴが最終に結合され、２つのユニット長オリゴが生成され、次に、２つのユニット長オリゴが連結され、４ユニット長のオリゴ等が生成される。
【０２７８】
テトラマー及びオクタマースペーサー構造の概略構造が図２６に示される。Ｓ：スペーサー、Ｒ：直接的反復体、Ａ及びＢは、ＢｓａＩ部位を含み、ｐＮＢ１００へのクローニングのための連結適合性部位を創造する。この例において、我々は、ＮＤＭを標的とするＳ１（スペーサー配列））、ＩＰＭを標的とするＳ２、ＶＩＭを標的とするＳ３、ＫＰＣを標的とするＳ４、ＯＸＡを標的とするＳ５、ＳＨＶを標的とするＳ６、ＴＥＭを標的とするＳ７及びＣＴＸ−Ｍを標的とするＳ８を用いた。
【０２７９】
スペーサー連結反応
各オリゴは、３′及び５′末端にオーバーラップした配列を有し、最初及び最後のオリゴを除く最も近い隣接オリゴにアニーリングする。最初及び最後のオリゴは、第２のオリゴにとオーバーラップする配列を有し、そして最後から２目のオリゴは、５′末端のみにある。４つのスペーサーを連結するために、４個のオリゴを合成する。言い換えれば、オリゴＮｏ．１は、５′及び３′末端にスペーサー１及び２を含む。オリゴＮｏ．２は、３′及び５′末端にスペーサー２及び３の逆相補体を含む。オリゴＮｏ．３は、５′及び３’末端にスペーサー３及び４を含む。オリゴＮｏ．４は、３′末端にスペーサー４の逆相補体を含む。従って、オリゴＮｏ．２は、オリゴＮｏ．１及びオリゴＮｏ．３を連結することができ、オリゴＮｏ．４は、オリゴＮｏ．３の３′末端二アニーリングする。オリゴＮｏ．１及びオリゴＮｏ．２、オリゴＮｏ．３及びオリゴＮｏ．４は、表１３及び１４に示されるＰＣＲ反応条件を用いて、別々の管で連結される。
【０２８０】
【表１３】
2018522935.tif 000023
【０２８１】
【表１４】
2018522935.tif 000024
【０２８２】
この例においては、ＮＢ０２６及び ＮＢ０２７、ＮＢ０２８ 及びＮＢ０３４、ＮＢ０３５ 及び ＮＢ０３１、ＮＢ０３２ 及びＮＢ０３６が連結される。各連結生成物Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２を、ゲル精製し、そして表１５及び１６に示されるＰＣＲ条件下で、精製されたＡ１及びＡ２、Ｂ１及びＢ２ダイマー生成物を用いて、第２の連結反応を設定した。
【０２８３】
【表１５】
2018522935.tif 000025
【０２８４】
【表１６】
2018522935.tif 000026
【０２８５】
それらの伸長生成物を、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＮＢ０３７及びＮＢ０３８により増幅した。最終アンプリコンを、ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII  ＴＯＰＯベクターにクローン化し、そしてコンカテマー配列を確認した。
【０２８６】
８つのスペーサー連結の場合、ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII  ＴＯＰＯベクター上のスペーサーコンカテマーＡ及びスペーサーコンカテマーＢを、それぞれプライマー対ＮＢ０２６ 及びＮＢ０２９、ＮＢ０３０ 及びＮＢ０３３により増幅し、そしてアンプリコンをゲル精製した。精製されたスペーサーＡ及びＢを、表１７及び１８に示されるサイクル伸長反応において、長いプライマーとして利用した。
【０２８７】
【表１７】
2018522935.tif 000027
【０２８８】
【表１８】
2018522935.tif 000028
【０２８９】
それらの伸長生成物を、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＮＢ０３７及びＮＢＯ３８により増幅した。最終アンプリコンを、ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII  ＴＯＰＯベクター中にクローン化し、そしてコンカテマー配列を確認した。
【０２９０】
実施例２．３  ８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβ−ラクタマーゼ遺伝子ファミリーのそれぞれからの１つのβ−ラクタマーゼをコードする８つのプラスミドの構築。
実施例２．１に記載されるＮＳＡアッセイは、プラスミドｐＮＢ１０２を有するプラスミドｐＢＲ３２２上のＴＥＭ−３βラクタマーゼ遺伝子をまた担持するＥ．コリ株ＤＨ５αのＤＮＡ形質転換が、その形質転換体を、アンピシリン感受性（ＡｐＳ）に変換することを示した。ここで、プラスミドｐＮＢ１０２は、クロラムフェニコールに対する耐性をコードし、そして現在、ｐＮＢ１０２を担持するＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）形質転換体を、ＬＢ  Ｃｍプレート上で選択し、そして次に、ＡｐＳについてスクリーニングした（図２８を参照のこと）。ＴＥＭ−３遺伝子を標的化するｇＲＮＡをコードするスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを発現する場合、プラスミドｐＮＢ１０２が、ＴＥＭ−３遺伝子を不活性化した。対照的に、陰性対照実験においては、ＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを発現するが、しかしＴＥＭ−３遺伝子を標的とするｇＲＮＡを欠いている親プラスミドｐＮＢ１００により形質転換される場合、ＡｐＳへの変換は生じなかった。
【０２９１】
例示目的のために、ＴＥＭ−３が他の７つの異なったファミリーのβ−ラクタマーゼ：ｂｌａＶＩＭ、ｂｌａＯＸＡ、ｂｌａＮＤＭ、ｂｌａＣＴＸ−Ｍ、ｂｌａＫＰＣ、ｂｌａＩＭＰ、ｂｌａＳＨＶ 及びｂｌａＣＴＸ−Ｍからの代表的遺伝子により置換されている、ｐＢＲ３２２又はｐＮＴ３ (ｂｌａＶＩＭ−１のための) 、又は ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ II−ＴＯＰＯ (ｂｌａＩＰＭ−１のための)が構築される同等の実験が記載されている。そのような遺伝子は、そのような遺伝子を担持する適切な細菌株から得られる。これは、同遺伝性の遺伝的背景において、実施例２．１に記載される概念実証実験との直接的比較を可能にする。
【０２９２】
それらの７つの異なるファミリーのβ−ラクタム抗生物質からの代表的遺伝子を担持するＥ．コリ及びＫ．ニューモニアエ株の組をCulture Collections, Public Health England, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UKから購入した。それらは以下である：ＳＨＶ−１８遺伝子を担持するＫ．ニューモニアエ株ＮＣＴＣ１３３６８；ＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子を担持するＥ．コリ株ＮＣＴＣ１３３５３；ＫＰＣ−３遺伝子を担持するＫ．ニューモニアエ株ＮＣＴＣ１３４３８；ＶＩＭ−１遺伝子を担持するＫ．ニューモニアエ株ＮＣＴＣ１３４４０；ＩＭＰ−１遺伝子を担持するＥ．コリ株ＮＣＴＣ１３４７６；ＮＤＭ−１遺伝子を担持するＫ．ニューモニアエ株ＮＣＴＣ１３４４３；及びＯＸＡ−４８遺伝子を担持するＫ．ニューモニアエ株ＮＣＴＣ１３４４２。７つの遺伝子全ては、また、ペナムクラスの抗生物質を分解し、そして不活性化できるβ−ラクタマーゼをコードする（図２及び３を参照のこと）。すべての株を試験し、そして予想通り、ペナムクラスの抗生物質アンピシリンに対して耐性であることを見出した。
【０２９３】
βラクタマーゼコード配列を、表１９に示される、適切な前方向及び逆方向プライマー組を用いて細胞から増幅した。
【０２９４】
【表１９】
2018522935.tif 000029
【０２９５】
以下のｂｌａ遺伝子について、各前方向プライマーは、ｐＢＲ３２２上のβ−ラクタマーゼプロモーターを復元するために１７個の塩基配列を含み、そして各逆方向プライマーは、４塩基の突出する５’末端（５’−ＡＣＣＧ）を創造するために、ＢｓａＩ部位（ＮＤＭ−１、ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ−１８、ＫＰＣ−３及びＣＴＸ−Ｍ１５のための）を含む。高性能ポリメラーゼ、例えばＱ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いて各βラクタマーゼ遺伝子を増幅した後、、アンプリコンを、上記逆方向プライマーに位置する適切な制限酵素により消化した。消化されたアンプリコンを、ＴＥＭ−３フラグメントの除去の後、プラスミドｐＢＲ３２２（New England Biolabsから購入された）上のＳｓｐＩ及びＢｓａＩ部位間のＴ４リガーゼを用いて連結した。ＳｓｐＩは平滑末端を創造し、そしてＢｓａＩは５’−ＣＧＧＴの突出する末端を創造する。制限消化の後、各アンプリコンのコード配列の逆相補体が下記に示される。５’突出末端は下線が引かれ、そしてプロモーター配列の３’末端は太字の小文字で示される。太字で示される、それらの７つの遺伝子のメチオニン開始コドンの逆相補性ＣＡＴは、ｐＢＲ３２２のＴＥＭ−３β−ラクタマーゼの翻訳シグナル配列への、７つの他のβ−ラクタマーゼのコード領域の正確な融合をもたらす。ＩＭＰ−１遺伝子を増幅し、そしてｐＣＲ  ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯにクローン化し、ｐＮＢ０１４を得た。ＶＩＭ−１遺伝子を、そのプロモーター領域により増幅し、そして以下のプライマー対により、ｐＮＴ３から増幅された２つのフラグメント用いて、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーキット（ＮＥＢ）によりアセンブリーし、ｐＮＢ０１３を得た：プライマー対5'-tcataacaagccGCTCTTCCactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagg (配列番号134) 及び 5'-acgggctgtctgattcaggttatttccgatgg (配列番号135)及びプライマー対5'-acctgaatcagacagcccgtaaggtgaacagcgggcag (配列番号136)及び5'-gtcgccgagtagGCTCTTCGctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgattt (配列番号137)。
【０２９６】
【化７】
2018522935.tif 000030
【０２９７】
【化８】
2018522935.tif 000031
【０２９８】
【化９】
2018522935.tif 000032
【０２９９】
【化１０】
2018522935.tif 000033
【０３００】
【化１１】
2018522935.tif 000034
【０３０１】
【化１２】
2018522935.tif 000035
【０３０２】
【化１３】
2018522935.tif 000036
【０３０３】
次に、New England Biolabsから購入されたＤＨ５αコンピテント細胞を、それらの連結により形質転換し、続いてＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレート上で所望の組換え体を選択した。
【０３０４】
プラスミドＤＮＡサンプルを、それらの形質転換体から単離し、そしてＤＮＡ配列分析に提供し、７つの異なるβラクタマーゼ遺伝子のそれぞれについての正しい配列がプラスミドを与える各コンストラクトに存在することを確認した。
【０３０５】
そのようにして誘導されたそれらのｐＢＲ３２２誘導体プラスミドを、以下のように命名した：
i. ＳＨＶ− １８遺伝子を担持するｐＮＢ０１０：
ii. ＣＴＸ−Ｍ−１５２を担持するｐＮＢ０１１；
iii. ＫＰＣ−３遺伝子を担持するｐＮＢ０１２；
iv. ＮＤＭ−１遺伝子を担持するｐＮＢ０１５；
v. ＯＸＡ−４８遺伝子を担持するｐＮＢ０１６；さらに；
vi. ＴＥＭ−３遺伝子を担持するｐＢＲ３２２。
そのようにして誘導されたｐＮＴ３誘導体を、以下のように命名した；
i. ＶＩＭ−１遺伝子を担持するｐＮＢ０１３；
そのようにして誘導されたそれらのｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  II−ＴＯＰＯ誘導体を、以下のように命名した：
i. ＩＭＰ−１遺伝子を担持するｐＮＢ０１４。
【０３０６】
実施例２．４  ８つのＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼに対するネメシス共生活性の試験。
プラスミド形質転換によるネメシス共生活性（ＮＳＡ）アッセイ：
ＴＥＭ−３をコードするプラスミドｐＮＢ０１０−０１６又はｐＢＲ３２２上のそれらの８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子の１つをそれぞれ担持する８つの受容体Ｅ．コリ株ＤＨ５αを続いて、８つのｂｌａ ＶＯＮＣＫＩＳＴ遺伝子を標的とするスペーサーを担持するプラスミドｐＮＢ１０８により形質転換し、そして陰性対照ｐＮＢ１００、並びに陽性対照としてのｐＮＢ１０２によるＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）の形質転換と共に、それらのネメシス共生プラスミドの獲得のために選択するクロラムフェニコール耐性について選択し、そして次に、本質的に実施例２．１に記載されるようなアンピシリン感受性への変換について試験した（図２７を参照のこと）。ＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子を担持する細菌株のＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサー配列を欠く、ｐＮＢ１０８又は陰性対照プラスミドｐＮＢ１００による形質転換に続いて、コロニーを採取し、そしてｐＮＢ１００ではなくｐＮＢ１０８に存在するネメシス共生活性指標としてアンピシリン耐性（ＡｐＲ）の喪失についてスクリーニングした。結果は、ｐＮＢ１０８に存在する単一の８つのスペーサーコンストラクトが８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子すべてのＡｐＲを不活性化することができることを示す。
【０３０７】
実施例２．５  λ（ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣ）の構築及びファージ感染による送達。
すべての８つのスペーサー、カーゴを担持するＣａｓ９/ＣＲＩＳＰＲ：：ＮＩＶＫＯＳＴＣカセットを、ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１中に、Ｃｒｅ/ｌｏｘ介在性組換え（ドッキング）により付加する。プラスミドｐＮＢ１０８からのｔｒａｃｒＲＮＡ Ｃａｓ９及び ＶＯＮＣＫＩＳＴ ＣＲＩＳＰＲスペーサーをコードするアンプリコンを、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより消化し、そして５，３３５ｂｐのフラグメントを、ｐＮＢ３００上のＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ部位中にクローン化し、ｐＮＢ３０１を得る（図１１）。ｐＮＢ３０１の合計サイズは、１０，１７９ｂｐである。次に、ＤＮＡ配列分析によるｐＮＢ３０１の検証の後、ｐＮＢ３０１を用いて、ＣｍＲ選択を有するｃ−ＴＮＢ００１を担持するＤＨ５αを形質転換し、そして次に、ストレプトマイシンに対して耐性（ＳｍＲ）を担持する受容体Ｅ．コリ株と交配させ、そして、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ（Ｋｍ５０）、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｇ（Ｓｍ５０）及びトリメトプリム５０μｇ／ｍｌ（Ｔｐ５０）、並びにＩＰＴＧ（０．１Ｍの５０μｌ）により補充されたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）プレート上にプレートし、上記のような正しいＣｒｅ−ｌｏｘドッキング反応を選択し、そして次に、ＣｍＲ５０の予想される損失についてスクリーニングし、カーゴｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣを有するｃ−トランスミドを得る（図２１及び２２）。次に、ｃ−ＴＮＢ００１：：ＮＩＶＫＯＳＴＣを、感染性バクテリオファージλ粒子中にパッケージングし、λ（ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣ）を得る（図１９）。これを行うために、ｃ−トランスミド、ｃ−ＴＮＢ００１：：ＮＩＶＫＯＳＴＣを、大きなコンストラクトプラスミド調製キット、例えばＱＩＡＧＥＮ大コンストラクトキット（カタログ番号１２４６２）を用いて、図２０において選択された細胞から単離する。トランスミドは、ｃｏｓ部位でアニーリングする、プライマーｆ（５’−ｇａｃａｔｇａｇｇｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ[配列番号 ３]、ここで星印は、ホスホロチオエート結合を示す）からのｐｈi２１  ＤＮＡポリメラーゼによるローリングサークル増幅（ＰＣＡ）のための鋳型である。重合されたＤＮＡ上のｃｏｓ部位の下流でアニーリングする、逆方向（ｒ）プライマー（５’−ａｔｇＧＣＧＡＴ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ [配列番号 ４]、ここで星印は、ホスホロチオエート結合を示す）の存在下で、コンカテマー又は成熟二本鎖ＤＮＡは、ＲＣＡ反応において蓄積する。反応を、膜透析、例えばGenomic  Tube−O−透析装置（Ｇ−Ｂｉｏｓｕｅｎｃｅｓ，カタログ番号７８６−１４２−４５ＭＣ）により洗浄することができる。この透析された二本鎖ＤＮＡは、パッケージングキット、例えばMaxPlax Lambda Packaging Extracts (epicentreカタログ番号MP5105)を用いて、ｃ−トランスミドをλファージ中にパッケージングするために、インビトロパッケージングのための基質として使用され得る。
【０３０８】
次に、得られるパッケージングされたλ（ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣ）を、Ｔｐ５０又はＫｍ５０選択で、Ｅ．コリ受容体に対する感染性について試験する。λパッケージングに続くｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣの好結果をもたらす送達の効率を、感染の多重度（ｍｏｉ）の範囲にわたって測定する。
【０３０９】
実施例２．６  （ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣ）の接合性トランスファー
ファージλ感染によるｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣの送達に続いて、この組換えｃ−トランスミドを、エクソ接合体の選択のためにＳｍＲを担持する受容体との交配の際、細菌受容体Ｅ．コリ及びＫ．ニューモニアエへの接合性トランスファーについて試験した。Ｅ．コリとの交配においては、ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣは、安定して複製することが予想され、そしてエクソン接合体が、ｃ−トランスミドによりコードされるＫｍＲのために選択され得る。Ｋ．ニューモニアエとの交配においては、ｃ−ＴＮＢ００１::ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣのｏｒｉ２／ｒｅｐＡシステムは、安定した複製を可能にせず、そしてエクソ接合体は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＩＶＫＯＳＴＣカーゴが染色体ａｔｔＴｎ７部位にシャープしている転位事象に続いて選択され得る（図２１）。ａｔｔＴｎ７部位へのそのような転位事象は、ＫｍＲマーカーはｃ−トランスミドで失われるので、カーゴコードのＴｐＲマーカーで選択され、そしてＬＢＫｍ５０プレート上でのｃ−トランスミドの欠失についてスクリーンされ得る。
【０３１０】
実施例２．７  バクテリオファージ送達に続いてのｃ−トランスミドにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９及びＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーの試験。
ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴを、８つのＶＯＮＣＫＩＳＴββ−ラクタマーゼのそれぞれ１つをコードするプラスミドを担持するＥ．コリの非病原性実験室株のλ（ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴ）感染に続いて、８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβ―ラクタマーゼのそれぞれを不活性化する能力について試験する。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを担持するｃ−トランスミドの送達の選択に続いて、それらを、上記のように、アンピシリンに対する感受性について試験する。ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴにより得られる結果を、Ｃａｓ９遺伝子及びトレーサーをまた担持するが、ＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを欠いている同等のｃ−トランスミドを用いての対照実験で得られ、そしてＣａｓ９−ＶＯＮＣＫＩＳＴ領域がｐＮＢ１０８から得られる同じ手段でｐＮＢ１００に由来する結果と比較する。
【０３１１】
実施例２．８  ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴを、８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβ−ラクタマーゼのそれぞれの１つをコードするプラスミドを担持するＥ．コリの非病原性実験室受容体株へのドナー株からの接合に続いて、８つのＶＯＮＣＫＩＳＴβ−ラクタマーゼｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＲＩＳＴのそれぞれを不活性化する能力について試験する。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９システム及びＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを担持するｃ−トランスミドの送達のための選択に続いて、それらを、上記のように、アンピシリンに対する感受性について試験する。この実験においては、ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴは、まずファージ送達によりＤＨＳαを感染するために使用され、次に、ｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＲＩＳＴ  ＤＮＡを都合よく担持する細胞についての選択に続いて、それらの細胞を、８つの異なるＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子の１つ又は他を担持する受容体と交配するドナーとして使用し、続いてＫｎＲ及びＡｐＲとのトランス接合体について選択する。ネメシス共生活性を、上記のように、Ｃａｓ９遺伝子及びtracrを担持するが、しかしＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを欠いている同等のｃ−トランスミドを用いる対照交配実験に比較して、この交配効率を比較することにより測定することができる。
【０３１２】
実施例３
ｃ−トランスミドｃ−ＴＮＢ００１：：ＶＯＮＣＫＩＳＴの使用の例示：多剤耐性Ｅ．コリＳＴ１３１クローンにおける抗生物質耐性遺伝子の不活性化をもたらすカーゴの送達
実施例３は、病原性菌株における抗生物質耐性遺伝子の不活性化をもたらすカーゴの送達のためへのｃ−トランスミドの適用を実証する。カーゴは、βラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９コンストラクトをコードする、目的の選択されたヌクレオチドである。そのような抗生物質耐性遺伝子の不活性化は、Ｅ．コリ及びクレブシエラ・ニューモニアエの病原性株を含む細菌株における抗生物質感受性の復活を可能にする。
【０３１３】
例示のために、多剤耐性（ＭＤＲ）尿路病原性Ｅ．コリ（ＵＰＥＣ）株、例えばＳＴ１３１株を選択することができる（Schembri et al., 2015, Pathogens 4:422-430, 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＵＰＥＣは、すべてのＵＴＩの８０％を引起し、そしてそのようなＭＤＲ  ＵＰＥＣは世界中に広がっている。ＳＴ１３１は最近出現し、そして世界的に広がっており、そして尿路感染症（ＵＴＩ）及び血流感染症は、院内及び地域社会の両方に関連している。
【０３１４】
この例示に含まれる工程を以下に示す：
・実施例２に記載されるようにして調製された組換えｃ−トランスミド：：ＶＯＮＣＫＩＳＴを担持する感染性ファージタンパク質コートを、実施例２に記載される方法と同じ方法を用いて、ＳＴ１３１のインビトロ感染に続いて、ネメシス共生活性について最初に試験する。従って、感染された細胞を、βラクタム抗生物質に対する耐性の喪失についてスクリーニングすることにより、それらが担持するβ−ラクタマーゼの不活性化について試験する。そのような感染は、細胞死をもたらすことができ、ここでＣａｓ９／ｔｒａｃｒＲＮＡ/ｇＲＮＡ複合体による二本鎖ＤＮＡ切断の生成が、βラクタマーゼ遺伝子標的物の他に、分離後死滅機構を担持するプラスミドの排除をもたらす。この実験は、ファージ感染によるネメシス共生活性を実証する。
・細菌接合によるネメシス共生活性も同様に、ドナーＥ．コリと受容体ＳＴ１３１とを交配し、エクソ接合体を選択し、そして再び、エクソ接合体におけるβラクタム抗体に対する耐性の消失についてスクリーニングすることにより実証される。再び、二本鎖ＤＮＡ切断が受容体の死をもたらし、これは、ＶＯＮＣＫＩＳＴスペーサーを欠いている対照株に比較してエクソ接合体を得ることができないと考えられる。
・インビトロでの好結果をもたらす実証は、適切な動物モデルシステムにおける前臨床製実証を導く。
【０３１５】
実施例４
バクテリオファージλキャプシドにパッケージングされ、そしてＥ．コリにおけるＴＥＭ−３抗生物質耐性遺伝子の不活性化をもたらすＣａｓ９遺伝子ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡ−ＴＥＭ３を発現するｃ−トランスミドの構築。
以下の概念実証実験は、インビボでバクテリオファージλ溶原ヘルパー株にパッケージングされ、感染によるＥ．コリへの送達を可能にし、続いて細菌接合により広がり、ＴＥＭ−３β−ラクタマーゼ遺伝子の続く不活性化、アンピシリン感受性に細菌の変換をもたらす、Ｃａｓ９遺伝子ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡ−ＴＥＭを発現する接合性トランスミドｃ−ＴＮＢ０００−Ｘの構築を記載する。
【０３１６】
この概念実証の目的のために、実証例１に記載されているように、「シップ」及び「カーゴ」を組合すためにｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムを使用する必要はなく、なぜならば、これは、標的細菌に送達されるべき新しいかカーゴ配列を担持する接合性トランスミド誘導体の構築を容易にするためにのみ必要とされるからである。下記接合性トランスミドはまた、Ｅ．コリに存在する、染色体上に位置するＴｎ７接合部位ａｔｔＴｎ７の部位特異的転位をもたらす細菌トランスポゾンＴｎ７の４つの転位タンパク質をコードする、ｔｎｓＡ、ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ｔｎｓＤ遺伝子を有さない。
【０３１７】
下記接合性トランスミドはまた、実施例１に記載されるＦプラスミドから単離される同等のそのような機能の代わりに、ＲＫ２  ｏｒｉＶ、及び栄養複製をコードする遺伝子、並びにプラスミド分割機能も保持する。
【０３１８】
実施例４．１  トランスミドをパッケージングできるバクテリオファージλ溶原を担持するＥ．コリヘルパー株の構築。
バクテリオファージλ溶原を担持するＥ．コリヘルパー株を、ＤＮＡ形質転換又は接合によりトランスミドのヘルパー株への導入に続いて、トランスミドＤＮＡの誘発性インビボパッケージングを実施するために、構築した。しかしながら、λファージ自体のパッケージングを回避するために、パッケージングシグナルを突然変異させるためにλＤＮＡに突然変異を生成することが必要であった。従って、開発されたλ溶原菌は、以下の３つの特徴を含む：（ｉ）ＣＩリプレーサー遺伝子、すなわちＣＩ８５７突然変異に温度感受性突然変異を担持する。制限温度＞３７℃でのヘルパー株の増殖は、λＰＬ及びＰＲプロモーターの転写を調節するオペレーター配列から解離するＣＩ８５７リプレッサータンパク質をもたらし、その結果、ファージの生成のために必要とされるすべてのタンパク質を発現する溶菌サイクルへの侵入をもたらし；（ii）それは、λＳ遺伝子におけるアンバーナンセンス突然変異Ｓａｍ７を担持する。Ｓ遺伝子は、細菌膜い穴を開ける小さな膜タンパク質ホリンをコードし、これにより、Ｓ穴を通して逃げ、そして細胞壁を切断し、パッケージングされたファージの溶解及び放出を導く、λＲ遺伝子エンドリシンの生成を可能にする。Ｓａｍ７アンバー突然変異は、このタンパク質の翻訳の早期終了をもたらし、非機能的遺伝子生成物をもたらし；（iii）それは、尾部が成熟ビリオンを生成するためにアセンブリーする前、アセンブリーされた頭部へのバクテリオファージλＤＮＡのパッケージングのために必要とされるｃｉｓ−必須配列のｃｏｓ配列における破壊的挿入突然変異を担持する。
【０３１９】
ＣＩ８５７及びＳａｍ７突然変異を担持するPromega（カタログ番号Ｄ１５０１）から購入されたファージＤＮＡを、ＮＥＢから購入されたＱｕｉｃｋ  Ｂｌｕｒｔｉｎｇキット（カタログ番号Ｅ１２０１）、続いて製造業者により提供されるプロトコルを用いて、末端を平滑によるためにフィルインされた付着末端を融解するために加熱した。平滑末端化されたＤＮＡ反応物を、Beckman  Coulterから購入されたAgencourt  ＡＭＰure ＸＰ（カタログ番号Ａ６３８８０）ビーズにより、製造業者により提供されるプロトコルを用いて精製した。ヌクレオチドフリーの得られる平滑末端化されたＤＮＡを、１２℃で３０分間、２．５ｍＭのｄＧＴＰの存在下でのNEBuffer２．１（５０ ｍＭ のＮａＣｌ、１０ ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ ｍＭ のＭｇＣｌ２、１００ μｇ/ｍＬ のＢＳＡ、ｐＨ ７．９、２５℃）中、１ユニットのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼにより処理し、続いて１０ｍＭのＥＤＴＡを添加し、そしてポリメラーゼを７５℃で２０分間、不活性化した。このＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ介在性チューバック（ｃｈｅｗ−ｂａｃｋ）反応は、以下のようなｃｏｓ部位において非対称の５’オーバーハングを創造した：
【化１４】
2018522935.tif 000037
【０３２０】
ｃｏｓ部位を不活性化するために、右及び左側のｃｏｓ部位端を、下記５’−３’に示されるプライマー対ＮＢ１８３及びＮＢ１８４を有する鋳型として、ｐＡＣＹＣ１８４からＰＣＲにより調製された、Ｃｍ耐性をコードするクロラムフェニコール（Ｃｍ）アセチルトランスフェラーゼＣａｔ遺伝子を挿入することにより分離した：
【化１５】
2018522935.tif 000038
【０３２１】
ＢＮ１８３プライマーは、下線を引かれたＢｓａＩ部位（ＧＧＴＣＴＣ）を含む。ＮＢ１８４プライマーは、下線を引かれたＳａｐＩ部位（ＧＣＴＣＴＴＣ）を含む。クロラムフェニコール遺伝子のアンプリコンを、チューバックｃｏｓ部位に対して相補的である創造された５’オーバーハンク、５’−ＡＣＣＴ及び５’−ＣＣＣを、両制限酵素により消化した。
【０３２２】
チューバックλＤＮＡ及びＢｓａＩ−ＳａｐＩ消化されたｃｏｔ遺伝子を、表２０に示される条件を用いて連結した。
【０３２３】
【表２０】
2018522935.tif 000039
【０３２４】
連結反応物を、１６℃で１２時間インキュベートした。この連結反応物を、Type_VS Millipore 膜 (平均孔径= 0.025 μM、カタログ番号VSWP02500)により、製造業者により提供されるプロトコルに従って滴下透析した。得られる連結混合物を用いて、下部ＤＨ１０Ｂ（MegaX DH10B T1R electrocomp cells カタログ番号C6400-03  遺伝子型: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG tonA）を、エレクトロポレーションにより形質転換し、そして２５μｇのカナマイシン／ｍｌに対して耐性の形質転換体を、３０℃で選択し、そして細胞が誘発されたλ溶解サイクルの最後で死滅すると予測される場合、４２℃で増殖することができないことをスクリーニングした。
【０３２５】
実施例４．２  バクテリオファージλキャプシドにおけるパッケージングのためのＣａｓ９遺伝子ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡ−ＴＥＭ３スペーサーを発現する接合性トランスミドｃＴＮＢ００１−Ｘの構築。
プロトタイプ接合性トランスミド（ｃ−トランスミド）ｃＴＮＢ０００−Ｘを、プラスミドＲＫ２及びＣａｓ９遺伝子ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｑＲＮＡ−ＴＥＭ３スペーサー及びバクテリオファージλｃｏｓ部位に基いて構築した。この構築は２段階で行われた。
【０３２６】
第１段階においては、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、ＲＫ２ 及びｐＮＢ１０２の選択された領域からのＰＣＲ生成物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーにより一緒に連結し、ｐＡＣＹＣ１８４に基く、及びＲＫ２のｏｒｉＶ、バクテリオファージλｃｏｓ部位、及びｐＮＢ１０２からの場合、ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＴＥＭ−３スペーサーを担持するプラスミドｃＴＮＢ０００−Ｘを生成した。
【０３２７】
第２段階においては、プラスミドｃＴＮＢ００１−Ｘを、ＲＫ２  ＤＮＡの４４，７８６ｂｐのＡｖｒII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメント中に、ｃＴＮＢ０００−Ｘの６，２２６ｂｐのＡｖｒII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントをクローニングすることにより構築した。
【０３２８】
次に、得られるプラスミドｃＴＮＢ００１−Ｘを、バクテリオファージλキャプシド中にパッケージングし、そしてＥ．コリの感染、及び接合による広がりの両方により、送達について、及びＴＥＭ−３βラクタマーゼ遺伝子の不活性化について試験した。
【０３２９】
実施例４．２．１  ＲＫ２のｏｒｉＶ、バクテリオファージλｃｏｓ部位、及びｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡを担持するｐＡＣＹ１８４に基くＴＮＢ０００−Ｘプラスミドの構築。
以下のオリゴヌクレオチドを、ｃＴＮＢ０００−Ｘのアセンブリーに使用されるＰＣＲ生成物の生成のためにＢｉｏｍｅｒにより合成した：
【化１６】
2018522935.tif 000040
【０３３０】
次に、以下のＤＮＡ鋳型及びプライマーの組合せを用いて、６つのＰＣＲ反応を、１×Ｑ５反応緩衝液及び０．５μｌのＱ５高性能ＤＮＡポリメラーゼ中、それぞれ０．５μＭの前方向及び逆方向プライマー、２００μＭのｄＮＴＰを含む５０μｌの反応体積において実施し、ここで前記Ｑ５緩衝液及び酵素はNew England Biolabsから購入された（カタログ番号Ｍ０１４９Ｓ）。ＰＣＲサイクルは次の通りであった：９８℃で３０秒、続いて９８℃で１０秒の３５サイクル、５４℃で１０秒、７２℃で６０秒、続いて７２℃で１０分、そして次に、４℃で一晩保持した。表２１は、予想される生成物を示す。
【０３３１】
【表２１】
2018522935.tif 000041
【０３３２】
次に、ＰＣＲ生成物を、アガロース（１．２％）ゲル電気泳動により分画し、そしてＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、そしてQiagen  Qiaquickゲル抽出キット（カタログ番号２８７０４）を用いて、製造業者の指示に従って精製した。
【０３３３】
New England Biolabs（カタログ番号Ｅ５５２０Ｓ）から購入されたGibsonアセンブリーキットを用いて、６つのゲル精製されたＰＣＲフラグメントを、それぞれ０．０５ｐモルの等モル比で、Gibsonアセンブリーキットにより提供される１０μｌのNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixを含むそれぞれ１０μｌの合計反応容量において、一緒に混合した。次に、二本鎖ＤＮＡフラグメントの各末端を、５’→３’エキソヌクレアーゼにより分解し、３’オーバーハングを創造した。各オーバーハング端を、適切な末端とアニーリングした。ニック及びキャップをフィルインした高性能ＤＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡリガーゼにより封止し、そして５０℃で６０分間インキュベートし、ＤＮＡフラグメントのアセンブリーを可能にした。
【０３３４】
次に、２μｌのアセンブリーを用いて、New England Biolabsから購入されたコンピテントＤＨ５αＥ．コリ細胞を、製造業者の指示に従って形質転換した。次に、細胞を、１６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢＣｍ１６）を含むＬＢプレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０３３５】
トランスミドの正しい構築を確証するために、３３のコロニーを、プライマーＮＢ１３７及びＮＢ１３８（下記表を参照のこと）を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、ｃａｓ９遺伝子のｃｏｓ、ｏｒｉＶ及び５’末端を増幅した。６個のプラスミドＤＮＡを、６つの独立したＰＣＲ陽性クローンから単離した。それらの精製されるプラスミド鋳型を用いて、さらなる８つの領域を、下記プライマー組を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０３３６】
【化１７】
2018522935.tif 000042
【０３３７】
プラスミド上の適切な領域にアニーリングするアンプリコンサイズ、及び前方向及び逆方向プライマーが、表２２に示される。
【０３３８】
【表２２】
2018522935.tif 000043
【０３３９】
６種のすべてのプラスミド鋳型からの各アンプリコンの長さを、１．２％アガロースゲル上でのサイズ画分により確認した。ｃｏｓ、ｏｒｉＶ、及び新たに創造されたＲｓｒII、ＡｖｒII部位を、Source Bioscience (William James House, Cowley Road, Cambridge CB4 0WU, United Kingdom)により行われたジデオキシ配列決定により確認した。
【０３４０】
配列分析は、所望の構築物を担持する４種のプラスミドＤＮＡを同定し、そしてそれらをｃＴＮＢ０００−Ｘと命名した。
【０３４１】
実施例４．２．２  接合のために必要とされるＲＫ２機能、及びＣａｓ９遺伝子ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡ−ＴＥＭ３スペーサーを担持する接合性プラスミドｃＴＮＢ０００１−Ｘの構築。
プラスミドｃＴＮＢ００１−Ｘを、ｃＴＮＢ０００−Ｘの６，２２６ｂｐのＡｖｒII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、ＲＫ２  ＤＮＡの４４，７８６ｂｐのＡｖｒII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメント中にクローン化することにより構築した。最初に、１μｇのＲＫ２プラスミドＤＮＡを、New England Biolabs (カタログ番号:それぞれ、 R0174及び R0101)から購入されたＡｖｒII及びＥｃｏＲＩにより消化し、続いてNew England Biolabs (カタログ番号 M0371)からのエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）により処理し、連結に続く挿入を伴わないプラスミドベクターの再環状化、及び欠失されるべきＲＫ２  ＤＮＡフラグメントの再連結を妨げる。同様に、２μｇのｃＴＮＢ０００−ＸプラスミドＤＮＡを、ＡｖｒII及びＥｃｏＲＩにより消化し、そして上記ように電気泳動による分画に続いて、０．７％アガロースゲルから６，２２６ｂｐのフラグメントを単離した。次に、ＤＮＡを、９０μｌの反応容積下で、４００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを有する６０ｎｇのｃＴＮＢ０００／ＥｃｏＲＩ−ＡｖｒIIの６，２２６ｂｐフラグメントを有する４３．２ｎｇのＲＫ２ベクターＤＮＡを用いて、１０：１の挿入体：ＲＫ２ベクターのモル比で、１６℃で一晩混合した。
【０３４２】
連結生成物を、滴下透析（Silhavy, T., Berman, M. and Enquist, L. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor, N.Y. Press (1984)）により透析し、塩を除去し、そしてエレクトロポレーションによるＥ．コリ株ＤＨ１０Ｂ（F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ ΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ - rpsL nupG tonA）の形質転換のために使用した。
【０３４３】
形質転換体を、カナマイシンプレート上で選択した。クロラムフェニコール及びアンピリシン感受性をまた、所望するコンストラクトは、唯一の抗生物質マーカーとしてカナマイシン耐性をコードするａｐｈＡ遺伝子を含むべきであるので、調べた。ＴＥＭ−３スペーサー領域を、ＰＣＲにより確認した。
【０３４４】
５１、０１２ｂｐのトランスミドｃＴＮＢ００１−ＸのＤＮＡ配列が以下に示され、そして図２８は、遺伝子地図を示す：
AATTCGACATGAGGTTGCCCCGTATTCAGTGTCGCTGATTTGTATTGTCTGAAGTTGTTTTTACGTTAAGTTGATGCAGATCAATTAATACGATACCTGCGTCATAATTGATTATTTGACGTGGTTTGATGGCCTCCACGCACGTTGTGATATGTAGATGATAATCATTATCACTTTACGGGTCCTTTCCGGTGATCCGACAGGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCTGAAAAGAAAGGAAACGACAGGTGCTGAAAGCGAGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTCTCTGTTTTTGTCCGTGGAATGAACAATGGAAGTCCGAGCTCATCGCTACTGCCATTTTTGGGGTGAGGCCGTTCGCGGCCGAGGGGCGCAGCCCCTGGGGGGATGGGAGGCCCGCGTTAGCGGGCCGGGAGGGTTCGAGAAGGGGGGGCACCCCCCTTCGGCGTGCGCGGTCACGCGCCAGGGCGCAGCCCTGGTTAAAAACAAGGTTTATAAATATTGGTTTAAAAGCAGGTTAAAAGACAGGTTAGCGGTGGCCGAAAAACGGGCGGAAACCCTTGCAAATGCTGGATTTTCTGCCTGTGGACAGCCCCTCAAATGTCAATAGGTGCGCCCCTCATCTGTCATCACTCTGCCCCTCAAGTGTCAAGGATCGCGCCCCTCATCTGTCAGTAGTCGCGCCCCTCAAGTGTCAATACCGCAGGGCACTTATCCCCAGGCTTGTCCACATCATCTGTGGGAAACTCGCGTAAAATCAGGCGTTTTCGCCGATTTGCGAGGCTGGCCAGCTCCACGTCGCCGGCCGAAATCGAGCCTGCCCCTCATCTGTCAACGCCGCGCCGGGTGAGTCGGCCCCTCAAGTGTCAACGTCCGCCCCTCATCTGTCAGTGAGGGCCAAGTTTTCCGCGTGGTATCCACAACGCCGGCGGCCGCGGTGTCTCGCACACGGCTTCGACGGCGTTTCTGGCGCGTTTGCAGGGCCATAGACGGCCGCCAGCCCAGCGGCGAGGGCAACCAGCCCGGTGAGCGTCGGAAAGGCGCTGGAAGCCCCGTAGCGACGCGGAGAGGGGCGAGACAAGCCAAGGGCGCAGGCTCGATGCGCAGCACGACATAGCCGGTTCTCGCAAGGACGAGAATTTCCCTGCGGTGCCCCTCAAGTGTCAATGAAAGTTTCCAACGCGAGCCATTCGCGAGAGCCTTGAGTCCACGCTAGATCTCAGAGTAGAATAGAAGTATCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTGAATGGTTCCAACAAGATTATTTTATAACTTTTATAACAAATAATCAAGGAGAAATTCAAAGAAATTTATCAGCCATAAAACAATACTTAATACTATAGAATGATAACAAAATAAACTACTTTTTAAAAGAATTTTGTGTTATAATCTATTTATTATTAAGTATTGGGTAATATTTTTTGAAGAGATATTTTGAAAAAGAAAAATTAAAGCATATTAAACTAATTTCGGAGGTCATTAAAACTATTATTGAAATCATCAAACTCATTATGGATTTAATTTAAACTTTTTATTTTAGGAGGCAAAAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATCCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAA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TGCCTCTTGCCGCGCTTCGTCACGCTCGGCTTGCACCGTCGTAAAGCGCTCGGCCTGCCTGGCCGCCTCTTGCGCCGCCAACTTCCTTTGCTCCTGGTGGGCCTCGGCGTCGGCCTGCGCCTTCGCTTTCACCGCTGCCAACTCCGTGCGCAAACTCTCCGCTTCGCGCCTGGTCGCGTCGCGCTCGCCGCGAAGCGCCTGCATTTCCTGGTTGGCCGCGTCCAGGGTCTTGCGGCTCTCTTCTTTGAATGCGCGGGCGTCCTGGTGAGCGTAGTCCAGCTCGGCGCGCAGCTCCTGCGCTCGACGCTCCACCTCGTCGGCCCGCTGCGTCGCCAGCGCGGCCCGCTGCTCGGCTCCTGCCAGGGCGGTGCGTGCTTCGGCCAGGGCTTGCCGCTGGCGTGCGGCCAGCTCGGCCGCCTCGGCGGCCTGCTGCTCTAGCAATGTAACGCGCGCCTGGGCTTCTTCCAGCTCGCGGGCCTGCGCCTCGAAGGCGTCGGCCAGCTCCCCGCGCACGGCTTCCAACTCGTTGCGCTCACGATCCCAGCCGGCTTGCGCTGCCTGCAACGATTCATTGGCAAGGGCCTGGGCGGCTTGCCAGAGGGCGGCCACGGCCTGGTTGCCGGCCTGCTGCACCGCGTCCGGCACCTGGACTGCCAGCGGGGCGGCCTGCGCCGTGCGCTGGCGTCGCCATTCGCGCATGCCGGCGCTGGCGTCGTTCATGTTGACGCGGGCGGCCTTACGCACTGCATCCACGGTCGGGAAGTTCTCCCGGTCGCCTTGCTCGAACAGCTCGTCCGCAGCCGCAAAAATGCGGTCGCGCGTCTCTTTGTTCAGTTCCATGTTGGCTCCGGTAATTGGTAAGAATAATAATACTCTTACCTACCTTATCAGCGCAAGAGTTTAGCTGAACAGTTCTCGACTTAACGGCAGGTTTTTTAGCGGCTGAAGGGCAGGCAAAAAAAGCCCCGCACGGTCGGCGGGGGCAAAGGGTCAGCGGGAAGGGGATTAGCGGGCGTCGGGCTTCTTCATGCGTCGGGGCCGCGCTTCTTGGGATGGAGCACGACGAAGCGCGCACGCGCATCGTCCTCGGCCCTATCGGCCCGCGTCGCGGTCAGGAACTTGTCGCGCGCTAGGTCCTCCCTGGTGGGCACCAGGGGCATGAACTCGGCCTGCTCGATGTAGGTCCACTCCATGACCGCATCGCAGTCGAGGCCGCGTTCCTTCACCGTCTCTTGCAGGTCGCGGTACGCCCGCTCGTTGAGCGGCTGGTAACGGGCCAATTGGTCGTAAATGGCTGTCGGCCATGAGCGGCCTTTCCTGTTGAGCCAGCAGCCGACGACGAAGCCGGCAATGCAGGCCCCTGGCACAACCAGGCCGACGCCGGGGGCAGGGGATGGCAGCAGCTCGCCAACCAGGAACCCCGCCGCGATGATGCCGATGCCGGTCAACCAGCCCTTGAAACTATCCGGCCCCGAAACACCCCTGCGCATTGCCTGGATGCTGCGCCGGATAGCTTGCAACATCAGGAGCCGTTTCTTTTGTTCGTCAGTCATGGTCCGCCCTCACCAGTTGTTCGTATCGGTGTCGGACGAACTGAAATCGCAAGAGCTGCCGGTATCGGTCCAGCCGCTGTCCGTGTCGCTGCTGCCGAAGCACGGCGAGGGGTCCGCGAACGCCGCAGACGGCGTATCCGGCCGCAGCGCATCGCCCAGCATGGCCCCGGTCAGCGAGCCGCCGGCCAGGTAGCCCAGCATGGTGCTGTTGGTCGCCGCCGGCCACCAGGGCCGACGTGACGAAATCGCCGTCATTCCCTCTGGATTGTTCGCTGCTCGGCGGGGCAGTGCGCCGCGCCGGCGGCGTCGTGGATGGCTCGGGTTGGCTGGCCTGCGACGGCCGGCGAAAGGTGCGCAGCAGCTCGTTATCGACCGGCTGCGGCGTCGGGGCCGCCGCCTTGCGCTGCGGTCGGTGTTCCTTCTTCGGCTCGCGCAGCTTGAACAGCATGATCGCGGAAACCAGCAGCAACGCCGCGCCTACGCCTCCCGCGATGTAGAACAGCATCGGATTCATTCTTCGGTCCTCCTTGTAGCGGAACCGTTGTCTGTGCGGCGCGGGTGGCCCGCGCCGCTGTCTTTGGGGATCAGCCCTCGATGAGCGCGACCAGTTTCACGTCGGCAAGGTTCGCCTCGAACTCCTGGCCGTCGTCCTCGTACTTCAACCAGGCATAGCCTTCCGCCGGCGGCCGACGGTTGAGGATAAGGCGGGCAGGGCGCTCGTCGTGCTCGACCTGGACGATGGCCTTTTTCAGCTTGTCCGGGTCCGGCTCCTTCGCGCCCTTTTCCTTGGCGTCCTTACCGTCCTGGTCGCCGTCCTCGCCGTCCTGGCCGTCGCCGGCCTCCGCGTCACGCTCGGCATCAGTCTGGCCGTTGAAGGCATCGACGGTGTTGGGATCGCGGCCCTTCTCGTCCAGGAACTCGCGCAGCAGCTTGACCGTGCCGCGCGTGATTTCCTGGGTGTCGTCGTCAAGCCACGCCTCGACTTCCTCCGGGCGCTTCTTGAAGGCCGTCACCAGCTCGTTCACCACGGTCACGTCGCGCACGCGGCCGGTGTTGAACGCATCGGCGATCTTCTCCGGCAGGTCCAGCAGCGTGACGTGCTGGGTGATGAACGCCGGCGACTTGCCGATTTCCTTGGCGATATCGCCTTTCTTCTTGCCCTTCGCCAGCTCGCGGCCAATGAAGTCGGCAATTTCGCGCGGGGTCAGCTCGTTGCGTTGCAGGTTCTCGATAACCTGGTCGGCTTCGTTGTAGTCGTTGTCGATGAACGCCGGGATGGACTTCTTGCCGGCCCACTTCGAGCCACGGTAGCGGCGGGCGCCGTGATTGATGATATAGCGGCCCGGCTGCTCCTGGTTCTCGCGCACCGAAATGGGTGACTTCACCCCGCGCTCTTTGATCGTGGCACCGATTTCCGCGATGCTCTCCGGGGAAAAGCCGGGGTTGTCGGCCGTCCGCGGCTGATGCGGATCTTCGTCGATCAGGTCCAGGTCCAGCTCGATAGGGCCGGAACCGCCCTGAGACGCCGCAGGAGCGTCCAGGAGGCTCGACAGGTCGCCGATGCTATCCAACCCCAGGCCGGACGGCTGCGCCGCGCCTGCGGCTTCCTGAGCGGCCGCAGCGGTGTTTTTCTTGGTGGTCTTGGCTTGAGCCGCAGTCATTGGGAAATCTCCATCTTCGTGAACACGTAATCAGCCAGGGCGCGAACCTCTTTCGATGCCTTGCGCGCGGCCGTTTTCTTGATCTTCCAGACCGGCACACCGGATGCGAGGGCATCGGCGATGCTGCTGCGCAGGCCAACGGTGGCCGGAATCATCATCTTGGGGTACGCGGCCAGCAGCTCGGCTTGGTGGCGCGCGTGGCGCGGATTCCGCGCATCGACCTTGCTGGGCACCATGCCAAGGAATTGCAGCTTGGCGTTCTTCTGGCGCACGTTCGCAATGGTCGTGACCATCTTCTTGATGCCCTGGATGCTGTACGCCTCAAGCTCGATGGGGGACAGCACATAGTCGGCCGCGAAGAGGGCGGCCGCCAGGCCGACGCCAAGGGTCGGGGCCGTGTCGATCAGGCACACGTCGAAGCCTTGGTTCGCCAGGGCCTTGATGTTCGCCCCGAACAGCTCGCGGGCGTCGTCCAGCGACAGCCGTTCGGCGTTCGCCAGTACCGGGTTGGACTCGATGAGGGCGAGGCGCGCGGCCTGGCCGTCGCCGGCTGCGGGTGCGGTTTCGGTCCAGCCGCCGGCAGGGACAGCGCCGAACAGCTTGCTTGCATGCAGGCCGGTAGCAAAGTCCTTGAGCGTGTAGGACGCATTGCCCTGGGGGTCCAGGTCGATCACGGCAACCCGCAAGCCGCGCTCGAAAAAGTCGAAGGCAAGATGCACAAGGGTCGAAGTCTTGCCGACGCCGCCTTTCTGGTTGGCCGTGACCAAAGTTTTCATCGTTTGGTTTCCTGTTTTTTCTTGGCGTCCGCTTCCCACTTCCGGACGATGTACGCCTGATGTTCCGGCAGAACCGCCGTTACCCGCGCGTACCCCTCGGGCAAGTTCTTGTCCTCGAACGCGGCCCACACGCGATGCACCGCTTGCGACACTGCGCCCCTGGTCAGTCCCAGCGACGTTGCGAACGTCGCCTGTGGCTTCCCATCGACTAAGACGCCCCGCGCTATCTCGATGGTCTGCTGCCCCACTTCCAGCCCCTGGATCGCCTCCTGGAACTGGCTTTCGGTAAGCCGTTTCTTCATGGATAACACCCATAATTTGCTCCGCGCCTTGGTTGAACATAGCGGTGACAGCCGCCAGCACATGAGAGAAGTTTAGCTAAACATTTCTCGCACGTCAACACCTTTAGCCGCTAAAACTCGTCCTTGGCGTAACAAAACAAAAGCCCGGAAACCGGGCTTTCGTCTCTTGCCGCTTATGGCTCTGCACCCGGCTCCATCACCAACAGGTCGCGCACGCGCTTCACTCGGTTGCGGATCGACACTGCCAGCCCAACAAAGCCGGTTGCCGCCGCCGCCAGGATCGCGCCGATGATGCCGGCCACACCGGCCATCGCCCACCAGGTCGCCGCCTTCCGGTTCCATTCCTGCTGGTACTGCTTCGCAATGCTGGACCTCGGCTCACCATAGGCTGACCGCTCGATGGCGTATGCCGCTTCTCCCCTTGGCGTAAAACCCAGCGCCGCAGGCGGCATTGCCATGCTGCCCGCCGCTTTCCCGACCACGACGCGCGCACCAGGCTTGCGGTCCAGACCTTCGGCCACGGCGAGCTGCGCAAGGACATAATCAGCCGCCGACTTGGCTCCACGCGCCTCGATCAGCTCTTGCACTCGCGCGAAATCCTTGGCCTCCACGGCCGCCATGAATCGCGCACGCGGCGAAGGCTCCGCAGGGCCGGCGTCGTGATCGCCGCCGAGAATGCCCTTCACCAAGTTCGACGACACGAAAATCATGCTGACGGCTATCACCATCATGCAGACGGATCGCACGAACCCGCTG (配列番号176)
【０３４５】
機能的接合能力を、ＴＥＭ−３  ｇＲＮＡを標的にするが、しかしアンピシリン（Ａｐ）耐性を付与するＫＰＣ−３遺伝子をコードするプラスミドｐＮＢ０１２を含む受容体ＮＢＥｃ０３６への、ドナーＮＢＥｃ０６３（ｃＴＮＢ００１−Ｘを担持し、そしてカナマイシン（Ｋｍ）耐性をコードするＤＨ１０Ｂ）の接合により確認した。ＮＢＥｃ０３６へのｃＴＮＢ００１のトランスファーを示すエクス−接合体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢＡｐ１００Ｃｍ１６）を含むＬＢプレート上での増殖のために選択した。ＴＥＭ−３スペーサー活性を、ＴＥＭ−３  ｇＲＮＡのための標的であるＴＥＭ−３をコードするｐＢＲ３２２を含む受容体ＮＢＥｃ００１への、ｃＴＮＢ００１−Ｘを担持するドナーＤＨ１０Ｂの接合により確認した。
【０３４６】
従って、一晩の培養物から、適切な場合、その１００μｌを、９００μｌのＬＢＡｐ１００又はＬＢＫｍ２０ブイヨン中に接種し、そして３７℃で２時間、振盪下で増殖した。次に、細胞を洗浄し、抗生物質をここで除去した：５００μｌの細胞を１３，０００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離し、そして８００μｌのＬＢブイヨンに再懸濁した。次に、４０μｌのドナー株（ＮＢＥｃ０６３）を、エッペンドルフ管において１６μｌの受容体（ＮＢＥｃ００１又はＮＢＥｃ０３６）と共に混合し、そして次に、７μｌの交配混合物（ＮＢＥｃ ００１ ｘ ＮＢＥｃ０６３ 及び ＮＢＥｃ０３６ ｘ ＮＢＥｃ０６３）を、ＬＢプレート上にスポットし、そして３７℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を、滅菌木製スティックによりプレートから取り出し、そして５００μｌのＬＢブイヨンに再懸濁し、十分に混合し、そして次に、ＬＢにおいて１０−１〜１０−６倍に希釈し、そしてその１００μｌを、ＬＢＡｐ１００、ＬＢＫｍ２０及びＬＢＡｐ１００Ｋｍ２０プレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０３４７】
表２３に示される結果は、ＴＥＭ−３  ｇＲＮＡのための標的ではないＫＰＣ−３を担持する受容体へのドナーからのＴＮＢ００１−Ｘの効果的接合を示している。対照的に、予測されるように、標的ＴＥＭ−３遺伝子を担持する受容体への交配効率は、１０００倍、低められる。
【０３４８】
【表２３】
2018522935.tif 000044
【０３４９】
表へのキー：
cfu    コロニー形成単位
ME     交配効率
D      ドナー
R      受容体
E      エクス−接合体
受容体株：
ＮＢＥｃ００１は、アンピシリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）のためのＴＥＭ−３をコードするｐＢＲ３２２を担持するＤＨ５αであり；
ＮＢＥｃ０３６は、アンピシリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）のためのＫＰＣ−３をコードするｐＮＢ０１２を担持するＤＨ５αであり；
ドナー株：
ＮＢＥｃ０６３は、カナマイシン耐性（２０μｇ／ｍｌ）のためのａｐｈＡをコードするｃＴＮＢ００１を担持するＤＨ１０Ｂである。
【０３５０】
実施例４．３  感染による接合トランスミドの送達及び接合による続く広がりに関する経時的研究。
トランスミドｃＴＮＢ００１−Ｘをインビボでパッケージングするために、トランスミドを担持するＮＢＥｃ０６３株を、３０℃でヘルパー株ＮＢＥｃ０６２ (ＤＨ１０Ｂ：：λ(CI８５７ Sam７、cos：：cat)（Ｃｍ耐性）と交配させ、そしてＬＢＣｍ１６Ｋｍ２０プレート上で選択されたエクス−接合体をまた、３０℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを、ＬＢＣｍ１６Ｋｍ２０プレートから採取し、そして１ｍｌのＬＢＣｍ１６Ｋｍ２０ブイヨンに接種し、そして３０℃で一晩、増殖した。次に、細胞を、５０ｍｌのＬＢＣｍ１６Ｋｍ２０において５０倍に希釈し、そしてＯＤ６００  ０．５まで３０℃で増殖した。次に、細胞を、４２℃で２５分間、熱誘導した。次に、細胞を、３７℃で３〜５時間、インキュベートした。次に、細胞を、６，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離により収穫し、そして５ｍｌのλ希釈緩衝液（２０  ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１００  ｍＭ のＮａＣｌ、１０ｍＭ のＭｇＣｌ２）に再懸濁した。細胞を、５０μｌのクロロホルムの添加、及び３７℃での１０〜１５分間の振盪により溶解した。次に、微量遠心分離機中、２ｍｌのアリコートにおける１３，０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、ペッケージングされたトランスミド粒子を４℃で貯蔵した。
【０３５１】
パッケージングされたトランスミド粒子により細菌を感染するために、ＮＢＥｃ０３６を、１．５ｍｌのＬＢＡｐ１００中に接種し、そして３７℃で振盪増殖した。次に、細胞を、２００μｌの一晩の培養物を１ｍｌのＬＢと共に混合し、続いて微量遠心分離機において１２，０００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離することにより洗浄し、そして１ｍｌのＬＢに再懸濁した。次に、５ｍｌの追加のＬＢを添加し、そして細胞を、ＯＤ  ０．５（６０ｎｍ）（２．５×１０８個のｃｆｕ／ｍｌ）まで３７℃で振盪増殖した。次に、４００μｌの５倍希釈された、パッケージングされたトランスミド（１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む新鮮なＬＢ３２０μｌ中、８０μｌのパッケージングされたトランスミド粒子）を、５０ｍｌのコニカル管において、ＬＢ中、４００μｌの新しく増殖された細胞と共に混合し、そして次に、３７℃で振盪下でインキュベートした。種々の時点で、混合物からのサンプルを、希釈し、そしてＬＢ、ＬＢＡｐ１００、ＬＢＫｍ２０及びＬＢＡｐ１００Ｋｍ２０プレート上にプレートした（５０μｌ）。
【０３５２】
表２４に示される結果は、４時間後、全ての細胞がトランスミドを受けていたことを示す。
【０３５３】
【表２４】
2018522935.tif 000045
【０３５４】
実施例５
ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼのメンバーを標的とするユニークプロモーター及びＣａｓ９由来の各単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する遺伝子カセットの実証。
ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーの８つのβ−ラクタマーゼ遺伝子を代表するＶＩＭ−１, ＯＸＡ−４８, ＮＤＭ−１,  ＣＴＸ−Ｍ−１５, ＫＰＣ−３, ＩＭＰ−１, ＳＨＶ−１８ 及びＴＥＭ−３遺伝子のネメシス共生生物による不活性は、上記実施例２に例示されており、そしてそれらのスペーサー配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするプラスミドｐＮＢ１０８（図２５）の構築に使用されたスペーサー配列のＤＮＡ配列を示す。ｐＮＢ１０８においては、それらのスペーサーＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを有する単一のプロモーター対から転写され、そして標的ＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼを不活性化するためにＣａｓ９エンドヌクレアーゼと複合体化する成熟ガイドＲＮＡを生成するために、インビボでプロセッシングされる。
【０３５５】
本明細書に記載される例示において、遺伝子カセットを、ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβラクタマーゼのメンバーを標的とするために、ユニークターミネーターによる転写の終結を伴って、それぞれ別々のユニークプロモーターからの単一がガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現するよう構築した。単一のガイドＲＮＡは、本質的に、ＤＮＡプロセッシングに続いて、成熟ガイドＲＮＡに見出されるスペーサーＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの要素の遺伝子融合である（Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentier,  E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive  bacterial immunity. Science 337, 816-821）。ｓｇＲＮＡの使用の利点は、インビボでのＲＮＡプロセッシングが少なくて済み、そしてスペーサー及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分が同時転写され、そして従って、等モルであり、そして分子内二次構造を形成できることである。ユニークプロモーターの使用が、各ｓｇＲＮＡの高レベルの転写を保証する。
【０３５６】
使用されるプロモーター及びターミネーターが表２５に示される。
【０３５７】
【表２５】
2018522935.tif 000046
【０３５８】
プロモーター＊は、ｉＧＥＭプロモーターカタログから使用される構成的Ｅ．コリシグマ７０プロモーターである。ターミネーター＊＊は、転写ターミネーターデータベース（Webgester  ＤＢ）から使用される。
【０３５９】
それらのｓｇＲＮＡコンストラクトのためのネメシス共生活性を、実施例２に例示されるようなプラスミド形質転換アッセイを用いて試験した。
【０３６０】
ｓｇＲＮＡ遺伝子を、BioCat GmbH  (Neuenheimer Feld 584 69120 Heidelberg, Germany)により合成し、そしてプラスミドベクターｐＵＣ５７（GenBank 受託番号 Y14837）上のＥｃｏＲＶ部位中にクローン化した。
【０３６１】
それらのｓｇＲＮＡ遺伝子カセットのＤＮＡ配列が以下に与えられる：
VIM-1を標的とするためのSG01
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATTTTCCGCAGTATTCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAGGGGTGCGAAAAACACAGCGGCACTTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCACGTCGAAAGACGGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGACTGGCATCCGTTGGGTGCTGGTCCGTATTCTTTAGAAAACTAATACTTTTCTACCGTTTGCGATTATTCCCCCGATACTGGCTTTTACGGCTACTTTTGCGCGATGTCAGACTGCGATTTCCGTTTGAACTAAGACAGCGATGACTAATGCCACGACGATAGCTACCAAAGTAACCACTGCAAAGTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号177)
【０３６２】
OXA-48を標的とするためのSG02
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGTCGCGCGTCTGTCCATCCCACTTAAAGACTGCCCCAGAGCTAGAAATAGCAAGTTGGGGTAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTAGCCGTGCTGTTTGCGCGGTTCTTCGGTCCATCCGTGACTGGGGCAATTTTGAATAATGGTCATGTGAGGACATAGTAGTTTTCGGTACATACTGCGAATGACCTTGCCATTTAAGTCTCTGACGCGAAAGGTAAGACCGAAATTACTCCTAAATAAACAAACACTTATAGTTCCGGTTAGTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号178)
【０３６３】
NDM-1を標的とするためのSG03
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATTGTAAGTTTATACATAGGCGAGTACTCTGTTATGGAGCTGGCGGAAAACCAGATCGCCAAACCGTGTTTTAGAGACAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTAGGCCGCCTGGCGCGGCCTGACATCTCCAGCCGGAACGATTACCATTACCACGATGACCACTAAAACGACCGAGATTAAGGGTTTACCGAGTTCAGCCACTGCCACTATTAAGTGGAAATTACTTATTAAAGGCAGTTATAAATGGAAGGGAGGGAGTTAGCCAACTTACAGCGGGAAATCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号179)
【０３６４】
CTX-M15を標的とするためのSG04
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGTACCGAGCCGACGTTAAACACCGCCATTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTAAGGGCTGGTATTCCAGCCCTTTTATCTGAGGAAATCGTTTTAGGGTATGTCTTTTAAGTAAATGATTGCAGACCTTTCTGCTGTTTTGAAATCTAGCAATGCGATTGATACTCCCGACAGACACCTTACGATGTCCGCAACATCAAACATGACCACTGCTTTGAGTCACAATGCCATGTACTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号180)
【０３６５】
CTX-M8を標的とするためのSG05
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAGCAAAAGCTGGCGGCGCTGGAGAAAAGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCACGCCGAAAGGCGGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTCCGGCGTTTCTCAACGCCGGAACAGTGCGCTTAGACGTAATCAACTTACACCATAAGGATTTAGAGTTGACTACTTAGAAAGATGGACATTATTACAACAAGGCAATCAAGCAAAATAATTGCATCTAAAAAGAAGGGTTGCAGGACTGACCATATTACTCGGTCAAGAATTTTAGCGTATTTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号181)
【０３６６】
CTX-M28を標的とするためのSG06
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAGAAATCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTAAATAAAGCCCTGAGTTTAACCGCTCGGGGCTTTTTGCGTTTTAGGTCAGATTTGTAAAATGATAATGGGGGAGAACGTTTTGAAGAAAACGTTTTCGGAGAGCGATAAAACCAAAAATAGCAGCAGACCATTTGCTCCCAATACTATCACAACGAGAATGATACGGAGCATTAAGGAAAACCGCAATACATTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号182)
【０３６７】
KPC-3を標的とするためのSG07
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATCCGTGACGGATCCTGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGCCGCCAATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAGCGGGAAACCGCGGCACCGAGTCGGTGCTTTTCTGACGATAATGCCCGCTGATGATCACCCGGCGGGCATTATTCAGGCTGCTTAAACCAGACTGGACGGAGTTGGAGGACAGTTACGACCGCCGCCGAGACTACCACCAAGACCACCGCCGAGACTCCCACCACCGAGACTCCCACCGCCAAGACTCCCACCGCCGAGACTCCCTCCGCCAAGGCCACCACCGAGACTAAGGCCACTTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号183)
【０３６８】
IMP-1を標的とするためのSG08
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGGGCTAGTTAAAAATAAAATTGAAGTTTTTTATCCGGGGGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTCCCCTAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTGGGCGGGCAAACAGCATAAACGCGTTTGCCCGCTTACTGATTATTACAGAAACCGCGACCATTTGGTATACTTAAAAGATAACTAACACTGTTTTATTTGAATAAGGCACCACAGAAACGCAAAGAAAATATACAACGGTGGAAATACATACATAAAAGATGCAAACGATTGTATGACGCATTATTCCTCAGAATTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号184)
【０３６９】
SHV-18を標的とするためのSG09
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATTATTAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGAAACAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTAAGGCGACTGATGAGTCGCCTTTTTTTTGTCTGCCGTGAATAGGCGGACCATGACTCGTTTTGGGGCGATTAGGATTAGGAAGAGAACTCCTCAGAGTCGGAGAATTATGAAAGTACAAAGTCTTATTATCCAAGGCTTTATCCGTCCCCCGTAATTGACAAATATGCCCGTGACAATGAGTTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号185)
【０３７０】
TEM-3を標的とするためのSG10
AGGAGGTGACTGATGGCCGGTCCGACTATATGATGAAGACCACGATAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCATGAAGAAATTCAGGCACCGAGTCGGTGCTTTCGCCGGATGAAAAGTCATCCGGCGTCATATTACTCCAAGGATAACCCGAACGATAGGGACTTTTACTCCCACCACCGAGACTCCCACCGCCAAGACTCCCACCGCCAAGACTCCCACCGCCATGATTTGGAGGACTCATGCCACTATGTGGATAAGGCCCGATATGAATATAGTTGGGAGAGCTTCGATCGAGACCCTTGAGAGCCTTCAACCCGGTCTCTACTGACGTCTTCCGGACCGATGGAAAAACGCCTGCTACG (配列番号186)
【０３７１】
IMP-1を標的とするためのSg08B
AGGAGGTGACTGATGGCCggTccgACTATATGATgaagacCAcgattgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaagaagttaacgggtggggcgttgttcctaaacaGggggAGAGCTAGAAATAGCAAGTTccccTAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTagtcaaaagcctccgaccggaggcttttgactacagaaaccgcgaccatttggtatacttaaaagataactaacactgttttatttgaataaggcaccacagaaacgcaaagaaaatatacaacggtggaaatacatacataaaagatgcaaacgattgtatgacgcattattcctcagaatcCGATCgagaccCTTGAGAGCCTTCAACCCggtctcTACTGACgtcttccggAccgatggaaaaacgcctgctacg (配列番号 187)
【０３７２】
SHV-18を標的とするためのSg09B
AGGAGGTGACTGATGGCCggTccgACTATATGATgaagacCAcgattgtaagtttatacataggcgagtactctgttatggGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGcgtgCGAGTCGcacgTTTtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatagccgtgaataggcggaccatgactcgttttggggcgattaggattaggaagagaactcctcagagtcggagaattatgaaagtacaaagtcttattatccaaggctttatccgtcccccgtaattgacaaatatgcccgtgacaatgagtTCGATCgagaccCTTGAGAGCCTTCAACCCggtctcTACTGACgtcttccggAccgatggaaaaacgcctgctacg (配列番号188)
【０３７３】
実施例５．１  ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼを標的とするｓｇＲＮＡを発現する遺伝子カセットの構築。
ｓｇＲＮＡカセットを、段階的に構築した。第１段階においては、単一のｓｇＲＮＡ遺伝子を、ベクターｐＮＧ０００−Ｘ中にクローン化した。そして次に、後の段階においては、２又は３、又は４又は６個のｓｇＲＮＡ遺伝子を、このベクター中にクローン化した。
【０３７４】
ＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨにより合成された各モノマーｓｇＲＮＡ配列を、適切なプライマー対により増幅し、続いて、ＲｓｒII消化し、ｓＴＮＢ０００−Ｘ上のｃａｓ９の下流に位置するＲｓｒII部位でクローン化した。ｓｇ０１の左及び右端での配列が、以下に示される。
【化１８】
2018522935.tif 000047
【０３７５】
左及び右端におけるＲｓｒII部位に下線を引き、そして左端での２つのＢｓａＩ部位は、太字の大文字により示される。ｓｇｘｘ（ここで、ｘｘ＝０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０８Ｂ、０９、０９Ｂ及び１０）の残りの左及び右アーム配列の部分が以下に示される。
【化１９】
2018522935.tif 000048
【０３７６】
ＲｓｒII部位が下線を引かれ、そしてＢｓａＩ部位は太字大文字により示される。ＢｂｓＩ部位は、太字小文字により示される。
【０３７７】
各ｓｇｘｘアンプリコン（ここで、ｘｘ＝０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０８Ｂ、０９、０９Ｂ及び１０）を、プライマー対ＮＢ１８５及びＮＢ１８６（５′−３′の下に示される）により増幅した。
【化２０】
2018522935.tif 000049
【０３７８】
アンプリコンを、Agencour AMPure XPビーズにより精製し、そしてＲｓｒIIにより消化した。消化されたフラグメントを、精製し、そしてＲｓｒII消化されたｃＴＮＢ０００−Ｘベクターに連結した。ベクター及び挿入体上のＲｓｒII消化により創造された一本鎖オーバーハングはそれぞれ、３′―ＧＡＣ−５’及び５′―ＧＴＣ−３′である。ベクター自己連結事象は存在しなかったが、挿入体のための２つの配向が可能であった。それらのモノマーｓｇｘｘ（ここで、ｘｘ＝０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０８Ｂ、０９、０９Ｂ及び１０）コンストラクトは、スペーサー連結のための出発材料であった。２つのＢｓａＩ部位が、ｓｇｘｘ挿入体の３′末端に創造される。以下は、１つのＳｇｘｘスペーサー配列のクローニングの後のベクター構造である。両端上のドット「．．．」は、円形である、ベクター配列の残り部分を表す。ＢｓａＩ部位は、小文字で示される。
【０３７９】
5’-…[Sgxx]1_CGATCgagaccCTTGAGAGCCTTCAACCCggtctcTACTG*1_[ベクター]…-3’
3’-…[Sgxx]1_GCTAGctctggGAACTCTCGGAAGTTGGGccagagATGAC*2_[ベクター]…-5’
*1 ＝配列番号195
*2 ＝配列番号196
【０３８０】
ＢｓａＩ消化は、非対称の４つの塩基の突出する５′末端を含むベクターを線状化する。
5’-…[Sgxx]1_ACTG_[ベクター]…-3’
3’-…[Sgxx]1_GCTA_[ベクター]…-5’
【０３８１】
各モノマー「Ｓｇｘｘ」２（ここで、ｘｘ＝０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０８Ｂ、０９、０９Ｂ及び１０）を、前のようにして、プライマー対ＮＢ１８５及びＮＢ１８６により増幅し、続いてAgencourtビーズを用いてアンプリコンを精製し、そしてＢｂｓＩにより消化した。ＢｂｓＩ消化されたフラグメントを、ゲル精製し、定量化し、そして等モルに比で混合し、そしてモノマー［Ｓｇｘｘ］１を担持する混合されたベクターに連結した。ＢｂｓＩにより消化された［Ｓｇｘｘ］２を含むフラグメントの構造は、次の通りである：
【０３８２】
5’-CGAT-[Sgxx]2-CGATCgagacc*1...ggtctcT -3’
3’-[Sgxx]2-GCTAGctctgg*2...ccagagA_TGAC-5’
*1 = 配列番号197
*2 =配列番号198
【０３８３】
［Ｓｇｘｘ］１を含むベクターに［Ｓｇｘｘ］２を連結した後、ダイマーコンストラクト［Ｓｇｘｘ］１＋［Ｓｇｘｘ］２を与え、そして２つのＢｓａＩ部位（小文字）を復元し、そして第３のスペーサー構造［Ｓｇｘｘ］３を連結し、トリマースペーサー構造を構築する準備ができている。
5’-…[Sgxx]1_CGAT-[Sgxx]2-CGATCgagacc*3...ggtctcT_ACTG_[ベクター]…-3’
3’-…[Sgxx]1_GCTA-[Sgxx]2-GCTAGctctgg*4...ccagagA_TGAC_[ベクター]…-5’
*3 = 配列番号197
*4 = 配列番号198
【０３８４】
他方では、いったんダイマーコンストラクトが構築されると、それらは２つのプライマー対ＮＢ１９４及びＮＢ１８９（以下の５′―３′で示される）により増幅され得る：
【化２１】
2018522935.tif 000050
【０３８５】
ダイマースペーサーコンストラクトを含むフラグメントを、ＢｂｓＩ消化により調製することができる。ＢｂｓＩにより消化されたダイマースペーサー［Ｓｇｘｘ］３−［Ｓｇｘｘ］４を含むフラグメントの構造は、以下通りである：
5’-CGAT-[Sgxx]3-[Sgxx]4-CGATCgagacc*1...ggtctcT -3’
3’-[Sgxx]3-[Sgxx]4-GCTAGctctgg*2...ccagagA_TGAC-5’
*1 = 配列番号197
*2 = 配列番号198
【０３８６】
［Ｓｇｘｘ］１−［Ｓｇｘｘ］２を含むベクターへの［Ｓｇｘｘ］３−［Ｓｇｘｘ］４の連結は、テトラマーコンストラクト［Ｓｇｘｘ］１−［Ｓｇｘｘ］２−［Ｓｇｘｘ］３−［Ｓｇｘｘ］４を与え、そして２つのＢｓａＩ部位（小文字）を復元し、そして次のスペーサーコンストラクトを連結する準備ができている。
【０３８７】
このようにして、ｓｇＲＮＡ遺伝子をコードするスペーサー配列を、スペーサークローン化ベクターについてのＢｓａＩ消化、及びＳｇｘｘモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー等のアンプリコンについてのＢｂｓＩ消化を用いて、組合せ手段で構築することができる。１０のスペーサーの１０！（１０階乗）＝３，６２８，８００の異なる種類を集めることが可能である。以下の実施例は、連結されたＳｇｘｘスペーサーコンストラクトのサブセットを創造する例である。
【０３８８】
実施例５．１．１  ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼを標的とする単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する遺伝子カセットの構築。
ＢｉｏＣａｔにより提供され、且つ１又は複数のｓｇＲＮＡ遺伝子、ｓｇ０１−ｓｇ１０、ｓｇ８Ｂ及びｓｇ９ＢをコードするｐＵＣ５７由来のプラスミドを鋳型として使用し、ＰＣＲによりアンプリコンを生成した。それらのアンプリコンを、ＲｓｒIIにより消化し、そしてＲｓｒIIにより前もって消化されたベクターｃＴＮＢ０００−Ｘ中にクローン化し、単一ｓｇＲＮＡ遺伝子のそれぞれを担持するプラスミドを生成した。
【０３８９】
ｓｇＲＮＡアンプリコンをコードするアンプリコンを生成するために、各ｐＵＣ５７プラスミド誘導体を、プライマーＮＢ１８５及びＮＢ１８６を有する鋳型として使用した。
【０３９０】
ＰＣＲ反応を、１×Ｑ５反応緩衝液及び０．５μｌのＱ５高性能ＤＮＡポリメラーゼ中、それぞれ０．５μＭの前方向及び逆方向プライマー、２００μＭのｄＮＴＰを含む５０μｌの反応容積下で実施した（Ｑ５緩衝液及び酵素は、New England Biolabsから購入された；カタログ番号Ｍ０１４９Ｓ）。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９８℃で６０秒、続いて（３５サイクル）９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で３０秒、続いて７２℃で２分、及び次に、４℃で一晩の維持。
【０３９１】
次に、アンプリコン精製を、Ampure Agencourtビーズを用いて、製造業者の指示に従って実施し、続いてNew England Biolabsから購入されたＲｓｒIIにより消化した。
【０３９２】
クロラムフェニコールに対する耐性をコードする、８６３６ｂｐのベクターｃＴＮＢ０００−Ｘをまた、ＲｓｒIIにより消化し、続いて、電気泳動による分画の後、０．８％アガロースゲルからＤＮＡを精製した。
【０３９３】
ＰＣＲフラグメントを、ＲｓｒII消化されたｃＴＮＢ０００−Ｘ中に連結し、そして連結生成物を用いて、ＤＨ５αコンピテント細胞を、上記のようにして形質転換し、続いて、ＬＢＣｍ１６プレート上で選択した。
【０３９４】
コロニーを、プライマーＮＢ１８９及びＮＢ１９０により、上記条件を用いて、挿入体の存在についてスクリーニングし、そしてＰＣ生成物を、１．２％アガロースゲル電気泳道により分析した。
【化２２】
2018522935.tif 000051
【０３９５】
プラスミドＤＮＡを、配列決定のためにSource Bioscienceに提出された、選択されたＰＣＲ−陽性クローンから調製した。ｓｇＲＮＡの正しい挿入体を担持するプラスミドを、表２６に提供する。挿入体は、前方向（Ｆ）及び逆方向（Ｒ）と命名されたベクターに対して２つの配向下で存在することが見出され、ここでｃａｓ９の同じ転写方向でのｓｇＲＮＡ転写方向＝前方向、及びｃａｓ９の逆方向でのｓｇＲＮＡ転写方向＝逆方向。
【０３９６】
【表２６】
2018522935.tif 000052
【０３９７】
それらのプラスミドを、下記実施例５．３に記載されるようなプラスミド形質転換アッセイを用いて、それらの同系β−ラクタマーゼ遺伝子に対するネメシス共生活性について試験した。
【０３９８】
実施例５．１．２  ダイマーｓｇＲＮＡ遺伝子連結：ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼを標的とする２つのｓｇＲＮＡを発現する遺伝子カセット。
プラスミドｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１Ｒ、０２Ｆ、０３Ｆを、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ キット（カタログ番号２７１０４）を用いて精製した。プラスミドを、ＢｓａＩにより消化し、そして０．８％アガロースゲル上で分画し、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡゲル 抽出キット（カタログ番号Ｔ１０２０）を用いて、前記消化されたフラグメントを精製した。実施例５．１．１で得られた、ＢｂｓＩ消化されたモノマーアンプリコンｓｇ０４、ｓｇ０７及びｓｇ１０を１．２％アガロースゲル上で分画し、所望するフラグメントを、ＮＥＢ  Ｍｏｎａｒｃｈ  ＤＮＡ抽出キットを用いて精製した。３種のフラグメントｓｇ０４、ｓｇ０７及びｓｇ１０を等モル比で混合し、そしてＮＥＢ（カタログ番号Ｍ２２００）から購入された１×Ｑｕｉｃｋ連結緩衝液において各ベクターｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１Ｒ、０２Ｆ 及び０３Ｆ (ベクター/挿入体 = 1/3 (モル比))に連結した。連結条件は、表２７に示される。
【０３９９】
【表２７】
2018522935.tif 000053
【０４００】
Ａは、ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿０１Ｒと、フラグメントｓｇ０４、ｓｇ０７及びｓｇ１０の混合物との間の連結混合物である。Ｂは、ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿０２Ｆと、フラグメントｓｇ０４、ｓｇ０７及びｓｇ１０の混合物との間の連結混合物である。Ｃは、ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿０３Ｆと、フラグメントｓｇ０４、ｓｇ０７及びｓｇ１０の混合物との間の連結混合物である。連結生成物を用いて、上記のようにして、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、続いてＬＢＣｍ１６プレート上で選択した。連結条件ＡについてはプライマーＮＢ１９Ｃ及びＮＢ１２９（５′−３′で下記に示される）、及び連結条件Ｂ及びＣについてはＮＢ１９５及びＮＢ１９４を用いて、上記ＰＣＲ条件を使用して、コロニーを、ダイマー挿入体の存在についてスクリーニングし、そしてＰＣＲ生成物を、１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０４０１】
【化２３】
2018522935.tif 000054
【０４０２】
プラスミドＤＮＡを、配列決定のためにSource Bioscienceに提供された、選択されたＰＣＲ−陽性クローンから調製した。ｓｇＲＮＡ遺伝子の正しいダイマー挿入体を担持するプラスミドを、表２８に示す。
【０４０３】
【表２８】
2018522935.tif 000055
【０４０４】
それらのプラスミドを、下記実施例５．３に記載のようにして、プラスミド形質転換アッセイを用いて、それらの同系β−ラクタマーゼ遺伝子に対するネメシス共生活性について試験した。
【０４０５】
実施例５．１．３  ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼを標的とする４つのｓｇＲＮＡを発現する遺伝子カセットの構築。
プラスミドｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７Ｒを、ＢｓａＩにより消化し、そして０．８％アガロースゲル上で分画し、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ ゲル 抽出キット (カタログ番号Ｔ１０２０)を用いて、消化されたフラグメントを精製した。ダイマーフラグメントｓｇ０２４, ｓｇ０２１０, ｓｇ０３４ 及びｓｇ０３１０を、上記で言及されたＱ５  ＰＣＲ反応において、プライマー対ＮＢ１９４及びＮＢ１９５を用いて、それぞれ、鋳型としてのプライマーｃＴＮＢ−Ｘ＿ｓｇ０２４Ｆ, ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０３４Ｆ及びｃＴＮＢ０００−Ｘ＿０３１０Ｆから増幅した。アンプリコンを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔビーズにより精製し、続いてＢｂｓＩにより消化した。消化されたダイマーフラグメントを、１．２％アガロースゲル上で分画し、そして所望するフラグメントを、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ ゲル 抽出キット（ カタログ番号 Ｔ１０２０)を用いて抽出した。４種のフラグメントｓｇ０２４、ｓｇ０１２０、ｓｇ０３４及びｓｇ０３１０を、等モルに比で混合し、そしてＮＥＢ（カタログ番号Ｍ２２００）から購入された１×Ｑｕｉｃｋ連結緩衝液中、ベクターｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７Ｒ (ベクター/挿入体 = １/３ (モル比))に連結した。連結条件は、表２９に示される。
【０４０６】
【表２９】
2018522935.tif 000056
【０４０７】
連結生成物を用いて、上記のようにして、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、続いてＬＢＣｍ１６プレート上で選択した。コロニーを、プライマーＮＢ１９０及びＮＢ１２９を用いて、上記ＰＣＲ条件下でテトラマー挿入体の存在についてスクリーニングし、そしてＰＣＲ生成物を、１．２％アガロース電気泳動により分析した。
【０４０８】
【化２４】
2018522935.tif 000057
【０４０９】
プラスミドＤＮＡを、配列決定のためにＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ (William James House, Cowley Road, Cambridge CB4 0WU, United Kingdom)  に提供された、選択されたＰＣＲ陽性クローンから調製した。ｓｇＲＮＡの正しいテトラマー挿入体を担持するプラスミドが、表３０に示される。
【０４１０】
【表３０】
2018522935.tif 000058
【０４１１】
それらのプラスミドを、下記実施例５．３に記載されるようなプラスミド形質転換アッセイを用いて、それらの同系β−ラクタマーゼ遺伝子に対するネメシス共生活性について試験した。
【０４１２】
実施例５．１．４  ＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼを標的とする６つのｓｇＲＮＡを発現する遺伝子カセット構築。
テトラマーコンストラクトｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７２４Ｒ、ｓｇ０１７２１０Ｒ、ｓｇ０１７３４Ｒ 及び ｓｇ０１７３１０を含むプラスミドを、ＢｓａＩにより消化し、そして０．５％アガロースゲル上で分画し、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ ゲル抽出キット(カタログ番号Ｔ１０２０)を用いて、消化されたフラグメントを精製した。
【０４１３】
実施例５．１．３で得られたＢｂｓＩにより消化された、増幅されたダイマーコンストラクトｓｇ０２４、ｓｇ０２１０、ｓｇ０３４ 及びｓｇ０３１０を、連結のために使用した。４つのフラグメントｓｇ０２４、ｓｇ０２１０、ｓｇ０３４ 及びｓｇ０３１０を、それぞれ、ベクターｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７３１０Ｒ、ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７３４Ｒ、ｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７２１０Ｒ及びｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７２４Ｒに、別々に連結した。連結条件は、表３１に示される。
【０４１４】
【表３１】
2018522935.tif 000059
【０４１５】
連結生成物を用いて、上記のようにして、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、続いてＬＢＣｍ１６プレート上で選択した。コロニーを、プライマーＮＢ１９０及びＮＢ１２９を用いて、上記ＰＣＲ条件下でヘキサマー挿入体の存在についてスクリーニングし、そしてＰＣＲ生成物を、１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０４１６】
プラスミドＤＮＡを、配列決定のためにＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに提供された、選択されたＰＣＲ陽性コロニーから調製した。ｓｇＲＮＡ遺伝子の正しいヘキサマー挿入体を担持するプラスミドが、表３２に示される。
【０４１７】
【表３２】
2018522935.tif 000060
【０４１８】
それらのプラスミドを、下記実施例５．３に記載されるようなプラスミド形質転換アッセイを用いて、それらの同系β−ラクタマーゼ遺伝子に対するネメシス共生活性について試験した。
【０４１９】
実施例５．２  ＣＴＸ−Ｍ８β−ラクタマーゼ遺伝子をコードするｐＵＣＫ５７Ｋａｎ−ＣＴＸ−Ｍ−８の構築。
ＣＴＸ−Ｍ−８遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡカセットによる分析を完結するために、この遺伝子を、ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ  (Neuenheimer Feld 584 69120 Heidelberg, Germany)により合成し、そしてこのプラスミドのＥｃｏＲ  Ｖ部位中への挿入により、それらのプラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎ (GenBank 受託番号: JF826242.2)上に提供し、プラスミドｐＮＢ０１8 (ｐＵＣ５７−Ｋａｎ：：ＣＴＸ−Ｍ−８)を得た。
【０４２０】
ＣＴＸ−Ｍ−８コード領域及び隣接するＴＥＭ−３  ５′プロモーター及び３′ターミネーターのＤＮＡ配列が下記に示される（５′―３′）。
【０４２１】
CTXM8, 986 nt.
TggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgatgagacatcgcgttaagcggatgatgctaatgacaacggcctgtatttcgctgttgctggggagtgcgccgctgtatgcgcaggcgaacgacgttcagcaaaagctggcggcgctggagaaaagcagcggggggcggttgggagtggcgctgattgacaccgccgataacgcacagacgctctaccgcgccgatgagcgctttgccatgtgcagcaccagtaaggtgatggcggcagcggctgtgctcaagcaaagtgaaacgcaaaagaaggtgttgagtcagaaggttgagattaaatcttcagacctgattaactacaatcccattactgaaaaacacgtcaacggcacgatgacgctggcggaattgagcgccgcggcgttgcagtacagcgacaatacggccatgaacaagctgattgcccatcttggggggccggataaagtgacggcgtttgcccgtgcgattggggataacaccttccggctcgatcgtactgagccgacgctcaacaccgcgatccccggcgacccgcgcgataccaccacgccattagcgatggcgcagacgcttcgcaatctgacgttgggcagtgccttaggtgaaactcagcgtgcgcaactggtaacgtggctgaaaggcaataccaccggcgctgccagcattcaggctgggctacccacatcgtgggttgtcggggataaaaccggcagcggtgattatggtacgacgaatgacatcgccgttatctggccggaagggcgtgcgccgcttattctggtcacttacttcacccagccagagcagaagTAAggtctcgcggtatcattgcag (配列番号２０３)
【０４２２】
プラスミドｐＮＢ０１８を用いて、ＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabsから購入された）を形質転換し、そして形質転換体を、ＬＢＣｍ１６プレート上で選択し、ＮＢＥｃ０６９株を得た。
【０４２３】
実施例５．３  Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現カセットによる、選択されたＶＯＮＣＫＩＳＴファミリーのβ−ラクタマーゼの不活性化を実証するためのプラスミドの形質転換アッセイ。
ｓｇＲＮＡ遺伝子及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼを発現する遺伝子カセットを、実施例２、又はＮＢＥｃ０６９については、上記実施例５．２に記載されるように、代表的なＶＯＮＣＫＩＳＴβラクタマーゼ遺伝子をコードするプラスミドを、それぞれ担持する、９個の受容体ＤＨ５α−由来のＥ．コリ株（表３３を参照のこと）を用いたプラスミド形質転換アッセイによりネメシス共生活性について試験した。
【０４２４】
【表３３】
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【０４２５】
ｓｇＲＮＡ発現カセットの挿入を担持するｃＴＮＢ０００−Ｘ誘導体を担持するプラスミドを導入するために、改良された迅速形質転換プロトコルを開発した。ＬＢ及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中、一晩の２ｍｌ培養物から、１００μｌを１ｍｌのＬＢに接種し、そして細胞を、６０−９０分間、振盪下で増殖した。次に、細胞を、微量遠心分離機（室温での）中、１．４ｍｌのエッペンドルフ管において、１２，５００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離した。上清液の除去の後、１ｍｌの氷冷却された、８０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＣａＣｌ２を添加し、そして管を、氷上で５分間インキュベートした。次に、再び細胞を、微量遠心分離機中、１．４ｍｌのエッペンドル管において、１２，５００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離した。上清液の除去の後、２００μｌの氷冷却された１００ｍＭのＣａＣｌ２を添加した。次に、それらを、２（又は４）つの冷却された１．４ｍｌのエッペンドルフ管に分割し、１００μｌ（又は５０μｌ）の細胞を、各管に添加し、続いて０．３μｌのプラスミドＤＮＡを添加した。それらを、氷上で２０−３０分間、次に、４２℃で９０秒間、続いて氷上で９０秒間インキュベートした。次に、４００μｌ（又は２００μｌ）のＬＢを添加し、そして管を、３７℃で６０分間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートし、次に、２００μｌの細胞を、ＬＢＣｍ１６プレートに上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。次の日、コロニーを、一次形質転換プレートから採取し、そして１６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍｇのアンピシリン（ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００）を含むＬＢプレート又は１６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｌＢＣｍ１６）を含むＬＢプレートにレプリカ−ツースピックし、そして３７℃で一晩インキュベートした。次の日、コロニーの増殖を記録した。
【０４２６】
すべてのツールピックされた細胞は、ＬＢＣｍ１６上で増殖するはずであり；ＬＢＣｍ１６Ａｐ１００プレート上で増殖しないことは、アンピシリン耐性遺伝子の成功した不活性化、及びネメシス共生活性の徴候を示唆する。
【０４２７】
プラスミド形質転換アッセイを用いて実施された、全てのネメシス共生活性（ＮＳＡ）アッセイの結果が、表３４に要約され、ここでＶ、Ｏ、Ｎ、Ｃ１５、Ｃ８、Ｃ２８、K、Ｉ、Ｓ、Ｔは、それぞれ以下のβラクタマーゼ遺伝子を言及する：ＶＩＭ−１、ＯＸＡ−４８、ＮＤＭ−１、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−２８、ＫＰＣ−３、ＩＭＰ−１、 ＳＨＶ−１８、ＴＥＭ−３。陽性の＋の印は、それぞれ、それらの遺伝子を担持する種々の株ＮＢＥｃ０３２、ＮＢＥｃ０３３、 ＮＢＥｃ０３４、 ＮＢＥｃ０３５、ＮＢＥｃ０６９、ＮＢＥｃ０３６、ＮＢＥｃ０３７、ＮＢＥｃ０３８、ＮＢＥｃ ００１の試験に続いて、試験されたすべてのコロニーにおける指定βラクタマーゼ遺伝子の好結果をもたらす不活性化を示す。括弧内の陽性符号（＋）は、すべてではないが、ほとんどのコロニーが指定されたβラクタマーゼ遺伝子の不活性化を示すことを示唆し、そして負の符号−は、指定されたβラクタマーゼ遺伝子が、そのｓｇＲＮＡ遺伝子により不活性化されなかったことを示唆する（他のｓｇＲＮＡ遺伝子配列が合成され、そしてそれらのβラクタマーゼ遺伝子の不活性化を実証するために試験されている）。図２９は、ＶＫＯＮＴＣ１５を標的とするｓｇＲＮＡを担持するｃＴＮＢ０００−Ｘ＿ｓｇ０１７２１０３４Ｒにより形質転換されたβラクタマーゼ遺伝子を担持するプラスミドを用いてのＤＨ５α誘導体のコロニーの試験の例を示す。
【０４２８】
【表３４】
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【０４２９】
上記実験は、モデル生物のＥ．コリにおいて、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ領域、及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域に対して向けられた配列を有するスペーサー領域を担持するＤＮＡコンストラクトは、裸ＤＮＡ形質転換及びバクテリオファージ感染により送達される場合、アンピシリン耐性を不活性化し、並びにプラスミド接合によるアンピシリン耐性のトランスファーを妨げることができる概念実証を提供する。本発明のネメシス共生物質が、病原性細菌及び他の抗生物質耐性遺伝子に適用され得ることは明らかである。
【０４３０】
本発明は、好ましい、又は例示的実施形態を参照して記載されて来たが、当業者は、本発明の種々の改変及び変更が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、達成され得、そしてそのような改変が本明細書において明らかに意図されていることを理解するであろう。本明細書に開示され、そして添付の特許請求の範囲に記載される特定の実施形態に関する制限は、意図も、推測もされるべきではない。
【０４３１】
本明細書に引用される全ての文献は、その全体が参照により組込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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