(57)【要約】本発明は、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体、またはＴプロスタノイド受容体（ＴＰ）アンタゴニストとして作用する新規な化学的実体、ならびにトロンボキサン（ＴＸ）Ａ、およびエンドペルオキシドプロスタグランジン（ＰＧ）Ｇ２／ＰＧＨ２、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）およびフリーラジカル由来のイソプロスタン（例えば、８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α）ｉを含めた、ＴＰの偶発的リガンドとして作用するあらゆる他の作用物質が役割を果たすヒトの疾患の処置におけるそれらの使用に関する。本発明の化合物は、好ましくは、ベンゼンが、置換ビフェニリルオキシ基によって置換されており（例えば２位で）、ニトリル基によって置換されている（例えば５位で）、ベンゼンスルホニル尿素を含み、その化合物は、ＴＰ−イソ型選択的ＴＰアンタゴニストとして有望な結果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンゼンスルホニル尿素を含む化合物であって、前記ベンゼンが、２位で置換ビフェニリルオキシ基によって置換されており、５位でニトリル基によって置換されており、
前記ビフェニリルオキシ基が、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化メトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択される１つによって置換されており、
前記尿素が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される１つによって置換されている、化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化４４】
2018519281.tif 000050
によって表される化合物または薬学的に許容されるその塩であって、式中、
Ｒ１は、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、ＯＨ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、メチルケトン、ニトリル基、メチルエステル基、エチルエステル基、イソプロピルエステル基、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基、ハロゲン化メチルエステル基、ハロゲン化エチルエステル基、ハロゲン化イソプロピルエステル基、およびハロゲン化ｔｅｒｔ−ブチルエステル基からなる群より選択され、
Ｒ２は、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される、化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｒ１が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、
Ｒ２が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される、
請求項２に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
Ｒ１が、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化メトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、
Ｒ２が、３〜６個の炭素を有するアルキル基、および３〜６個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、
請求項２に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
Ｒ１が、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、
Ｒ２が、６個またはそれ未満の炭素を有するアルキル基、および６個またはそれ未満の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、
請求項２に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
式（ＩＩ）：
【化４５】
2018519281.tif 000051
によって表される、請求項２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
Ｒ１が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、
Ｒ２が、２〜６個の炭素を有するアルキル基、および２〜６個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、
請求項６に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
Ｒ１が、ハロゲン化メトキシ基および第三級アミドからなる群より選択され、
Ｒ２が、３〜５個の炭素を有するアルキル基である、
請求項６に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項９】
Ｒ１が、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、
Ｒ２が、３〜５個の炭素を有するアルキル基、および３〜５個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、
請求項６に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）：
【化４６】
2018519281.tif 000052
によって表され、式中、Ｒ１は、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１１】
（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、および（ＸＩ）：
【化４７】
2018519281.tif 000053
【化４８】
2018519281.tif 000054
【化４９】
2018519281.tif 000055
【化５０】
2018519281.tif 000056
からなる群より選択される式によって表される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１２】
（ＩＶ）、（Ｖ）、および（Ｘ）：
【化５１】
2018519281.tif 000057
【化５２】
2018519281.tif 000058
からなる群より選択される式によって表される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１３】
式（ＩＶ）：
【化５３】
2018519281.tif 000059
によって表される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１４】
式（Ｖ）：
【化５４】
2018519281.tif 000060
によって表される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１５】
式（Ｘ）：
【化５５】
2018519281.tif 000061
によって表される、請求項６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１６】
ヒトトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体／Ｔプロスタノイド受容体／ＴＰが役割を果たすヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
ヒトＴＰのレベルの発現が変わるヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
ＴＸＡ２のレベルが上昇するヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
ヒトＴＰを介して作用する他の生化学的実体／リガンド（例えば、ＰＧＧ２／ＰＧＨ２、２０−ＨＥＴＥまたは８−イソＰＧＦ２αを含むイソプロスタン）のレベルが上昇するヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
８−イソ−ＰＧＦ２αなどの、ヒトＴＰを介してシグナル伝達する非酵素的なフリーラジカル由来のイソプロスタンのレベルが上昇するヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の処置において使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の処置に承認されている他の１種または複数種の薬物と併用される、ＰＡＨの処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物が、肺動脈圧を測定するための埋込式センサーと併用するためのものであり、このような化合物の治療的な投与または治療的な投薬が、測定されたこのような肺動脈圧の変化に対して最適化または調整される、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
血栓症の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
微小血管血栓症の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
心血管疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
１型または２型真性糖尿病と関連する心血管疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２８】
過度の血小板凝集と関連するアテローム血栓症の防止に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２９】
虚血性脳卒中の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３０】
一過性虚血発作（ＴＩＡ）の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３１】
急性冠症候群の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３２】
肺疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３３】
喘息の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３４】
腎疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３５】
前立腺疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３６】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３７】
炎症性疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３８】
新生物疾患の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項３９】
がんの処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４０】
脳卒中の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４１】
がんを処置するための免疫調節薬と併用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４２】
平滑筋細胞機能の調節不全の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４３】
高血圧の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４４】
外科ステント留置後の再狭窄の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４５】
内皮細胞機能の調節不全の処置に使用するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を含む埋込式医療デバイス。
【請求項４７】
ステント、バルーン、ステントグラフト、人工弁、シャント（ｓｈｕｔ）、および腹部大動脈弁からなる群より選択される１つを含む、請求項４６に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／１８０，３１７号（この内容は、参考として本明細書に援用される）の利益および優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｔプロスタノイド受容体（ＴＰ）アンタゴニストおよびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロスタノイドであるトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２は、血小板凝集の強力なメディエーター、ならびに血管、腎臓（ｒｅｎａｌ）／腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、肺／気管支および前立腺の平滑筋を含めた様々なタイプの平滑筋（ＳＭ）の収縮物質である。またＴＸＡ２は、血小板、様々なタイプのＳＭ、内皮細胞、および炎症性単球由来マクロファージによって豊富に生成される、強力な炎症促進性メディエーターおよび免疫調節作用物質である。したがって、ＴＸＡ２は、心血管（ＣＶ）、腎臓、肺および前立腺系において、ならびに免疫および炎症において必須の役割を果たす。ＴＸＡ２、またはＴプロスタノイド受容体、もしくは略してＴＰとも呼ばれる、そのＴＸＡ２受容体のシグナル伝達の不均衡および／またはレベルの変化は、様々な心血管（例えば血栓症、アテローム血栓症、末梢動脈疾患、心筋梗塞、脳卒中および一過性脳虚血発作／ＴＩＡ、急性冠症候群／ＡＣＳ、全身性高血圧および妊娠誘発性高血圧）、腎臓（糸球体腎炎および腎性高血圧を含む）、肺（喘息および肺動脈高血圧／ＰＡＨを含む）および前立腺（例えば良性前立腺肥大／ＢＰＨ）疾患、ならびにそれらの系および状態と関連するいくつかの炎症性疾患に関与するとされてきた。より最近では、他にも腫瘍促進作用はあるが、腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤、血管新生、炎症および免疫をＴＸＡ２が促進し得る、膀胱、前立腺、乳房および肺のがんを含めた新生物疾患における、ＴＸＡ２、ＴＸＡ２シンターゼ（ＴＸＡＳ）およびその受容体であるＴＰの役割が、十分に確立されてきた。ヒトでは、ＴＸＡ２は、実際、ＴＰαおよびＴＰβと呼ばれる２種の別個の受容体（イソ）型を介してシグナル伝達し、これらは、同じ遺伝子によってコードされ、それらの細胞内カルボキシル末端（Ｃ）尾部ドメインが排他的に異なっている。ＴＰ（ＴＰαおよびＴＰβ）は、例えば血小板、様々なタイプのＳＭ、内皮細胞およびマクロファージを含めた、全身の様々な細胞において発現する。
【０００４】
ＣＶ、腎臓、肺および前立腺系におけるＴＸＡ２の役割に起因して、とりわけアテローム血栓症ならびに他のＣＶ、腎臓および肺の障害の処置のためのＴＰアンタゴニストの開発への臨床的な関心は、著しく高い。またＴＰアンタゴニストには、様々な炎症促進性（炎症性ＣＶＤ、１型および２型真性糖尿病と関連するＣＶＤ、腎疾患および肺疾患、ウイルス／微生物感染後の感染症を含むが、これらに限定されない）、新生物および前立腺（例えば、良性前立腺肥大／ＢＰＨ）疾患の処置において潜在的な適用がある。現在、ＴＰアンタゴニストの代替として使用されている他の従来の治療手法は、ＴＸＡ２の生合成を阻害することを目標としている。これらの中でも、アスピリンならびに関連するＣＯＸ１および／またはＣＯＸ２阻害剤を含めた、非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）と呼ばれるクラスのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤が挙げられる。これらのＣＯＸ阻害剤は、ＴＸＡ２、ならびにＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αおよびＰＧＩ２／プロスタサイクリンを含めた関連のプロスタノイドの合成における最初の酵素的ステップである、アラキドン酸からエンドペルオキシドプロスタグランジン（ＰＧ）Ｇ２／ＰＧＨ２への変換を阻害することによって作用する。ＴＸＡ２合成の主な部位の１つは、ＣＯＸ２とは対照的に、主にＣＯＸ１を発現する無核血小板であるため、血小板内でのＴＸＡ２の合成を低減／阻害するが、他の有核細胞におけるＣＯＸ１またはＣＯＸ２によるその他のプロスタノイドの合成には実質的に影響を及ぼさないように、低用量アスピリンが広く使用されている。したがって、低用量アスピリンは、無核血小板におけるＴＸＡ２の産生を阻害することによって、ＣＶエピソードの危険性がある患者における過度の血栓症を防止するために、広く使用されている。
【０００５】
主に、低用量アスピリンの使用を伴うこのような従来の手法は、例えば危険性がある患者における血栓症を低減するのに十分に有効ではない事実に起因して、および／またはその他のプロスタノイド（ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αおよびＰＧＩ２／プロスタサイクリン）の合成の無差別阻害による関連の副作用に起因して、ＴＰアンタゴニストを開発する必要があるという認識が、近年高まりつつある。また、比較的高い百分率の母集団が、アスピリン治療に応答してＴＸＡ２レベルを低下させることができない「アスピリン抵抗性」を呈する事実に起因して、有効性の欠如が生じるおそれがある。さらに、有害なＣＶエピソードの発生率の上昇が、ＣＯＸＩＢ（ＣＯＸ２選択的阻害剤）治療を受けている患者において生じる場合があるが、このことは、ＣＯＸ１／２の阻害ではなく、より標的化されたＴＰ受容体拮抗作用が、ＴＸＡ２の有害効果を阻害するのにより臨床的に有益な方法となり得ることを示唆している。さらに、アスピリンでも他のＮＳＡＩＤでもＣＯＸＩＢではなく、ＴＰアンタゴニストが、ＴＸＡ２、およびフリーラジカル由来のイソプロスタンである８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α、およびＴＰの完全または部分アゴニストとしても作用するすべての他の偶発的ＴＰリガンド（例えば、エンドペルオキシドＰＧＧ２／ＰＧＨ２、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸／２０−ＨＥＴＥ）の作用を阻害する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体（ＴＰ）に結合し、それに限定されるものではないが、血小板、様々なタイプの平滑筋（ＳＭ）細胞、内皮細胞、単球／マクロファージおよびある特定の免疫系細胞を含めた、ＴＰを発現する心血管、腎臓、肺、または他の系内の血栓症および他の事象を阻害する化合物を提供する。本発明の化合物は、ＴＸＡ２、ならびにＴＰに結合し、血小板の活性化および凝集を刺激するエンドペルオキシドＰＧＧ２／Ｈ２、２０−ＨＥＴＥおよびイソプロスタン（例えば、８−イソ−ＰＧＦ２α）を含めた他の偶発的ＴＰリガンドに拮抗し、それによって、臨床的に著しい血栓もしくは塞栓の危険性を低減するか、または心血管、腎臓、肺もしくは他の系の細胞に発現したＴＰαおよび／もしくはＴＰβイソ型に拮抗する。したがって、本発明のＴＰアンタゴニストは、ＴＰを発現し、および／またはそのリガンドが調節不全となる、心血管、腎臓、肺または他の系内の血栓症および他の事象を処置するのに有益な薬学的特性を提供する。
【０００７】
ＴＰアンタゴニストとしての本発明の化合物は、過度の血管収縮を阻害するだけでなく、微小血栓症（ｍｉｃｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）も防止する、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）のための治療薬物として作用し、潜在的に、ＰＡＨに見出される肺動脈再構築、右室（ＲＶ）肥大、内皮細胞機能不全および局所炎症を制限するはずである。また本発明の化合物は、ＰＡＨに関与する炎症経路または増殖経路を直接的に抑制することができる。これに加えて、ＴＰは、ＰＡＨの臨床状況、および酸化ストレスまたは傷害を伴う他の疾患において豊富に産生されたフリーラジカル由来のイソプロスタンであり、ＴＸＡ２と類似の作用を媒介する８−イソ−ＰＧＦ２αの作用を媒介するので、本発明の化合物は、ＰＡＨにおけるこれらの効果にも拮抗する。さらに、ＴＸＡ２は、血管再構築、再狭窄および／または肥大を促進する強力な炎症促進性かつ分裂促進性の作用物質であり、肺内のシクロ−オキシゲナーゼ（ＣＯＸ）由来の主な収縮物質であるプロスタノイドなので、本発明の化合物は、これらの効果に拮抗する。
【０００８】
したがって、本発明の化合物は、このような化合物が、ＴＸＡ２、肺内で生成された主な血管収縮性プロスタグランジンを阻害するだけでなく、ＴＸＡ２自体の有害作用に加えて、酸化ストレス由来のイソプロスタンである８−イソ−ＰＧＦ２αの有害作用も阻害するという点で、使用されている他のＰＡＨ治療剤を上回るさらなる利点を有するであろう。本発明の化合物は、（ｉ）ＴＸＡ２、ＰＧＧ２／ＰＧＨ２および２０−ＨＥＴＥの作用を遮断するだけでなく、アスピリン非感受性ＴＰアゴニスト（例えば、酸化傷害中にフリーラジカルによって豊富に産生された８−イソ−ＰＧＦ２α）の作用も遮断し、（ｉｉ）また（アスピリンとは異なり）、炎症性アテローム血栓症中に存在する血管床の細胞および循環マクロファージ／単球において発現したＴＰを阻害し、（ｉｉｉ）集団の約３３％に生じると推定されるアスピリン抵抗性を克服するので、ＰＡＨに加えて、アテローム血栓症などの他の疾患において、標準治療のアスピリンを本発明の化合物で置き換えることによって、いくつかの利点が得られる。
【０００９】
本発明の化合物は、好ましくは、ベンゼンが、置換ビフェニリルオキシ基によって置換されており（例えば２位で）、ニトリル基によって置換されている（例えば５位で）、ベンゼンスルホニル尿素を含み、その化合物は、ＴＰ−イソ型選択的ＴＰアンタゴニストとして有望な結果を示す。
【００１０】
ある特定の態様では、本発明は、ベンゼンが置換ビフェニリルオキシ基によって２位で置換されており、ニトリル基によって５位で置換されており、尿素が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基またはハロゲン化アリール基によって置換されている、ベンゼンスルホニル尿素を含む化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。一部の実施形態では、ビフェニリルオキシ基は、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化メトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、またはニトリル基によって置換されている。
【００１１】
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉ）
【化１】
2018519281.tif 000002
［式中、Ｒ１は、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、ＯＨ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、メチルケトン、ニトリル基、メチルエステル基、エチルエステル基、イソプロピルエステル基、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基、ハロゲン化メチルエステル基、ハロゲン化エチルエステル基、ハロゲン化イソプロピルエステル基、およびハロゲン化ｔｅｒｔ−ブチルエステル基からなる群より選択され、Ｒ２は、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される］によって表されるか、または薬学的に許容されるその塩である。好ましい一実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。別段記載されない限り、アルキル基は、分岐または非分岐のいずれかを意味する（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルは、アルキル基である）。
【００１２】
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化メトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、３〜６個の炭素を有するアルキル基、および３〜６個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ（ｄｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｏｘｙ）基、トリフルオロメトキシ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｏｘｙ）基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、６個またはそれ未満の炭素を有するアルキル基、および６個またはそれ未満の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物
【化２】
2018519281.tif 000003
［式中、Ｒ１は、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、ＯＨ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、メチルケトン、ニトリル基、メチルエステル基、エチルエステル基、イソプロピルエステル基、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基、ハロゲン化メチルエステル基、ハロゲン化エチルエステル基、ハロゲン化イソプロピルエステル基、およびハロゲン化ｔｅｒｔ−ブチルエステル基からなる群より選択され、Ｒ２は、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、およびハロゲン化アリール基からなる群より選択される］、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、２〜６個の炭素を有するアルキル基、および２〜６個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、式（ＩＩ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化メトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、３〜６個の炭素を有するアルキル基である、式（ＩＩ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１７】
非常に好ましい一実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択され、Ｒ２が、３〜５個の炭素を有するアルキル基、および３〜５個の炭素を有するハロゲン化アルキル基からなる群より選択される、式（ＩＩ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１８】
好ましい実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物
【化３】
2018519281.tif 000004
［式中、Ｒ１は、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、およびニトリル基からなる群より選択される］、または薬学的に許容されるその塩を提供する。例えば、化合物は、式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、または（ＸＩ）
【化４】
2018519281.tif 000005
【化５】
2018519281.tif 000006
【化６】
2018519281.tif 000007
【化７】
2018519281.tif 000008
【化８】
2018519281.tif 000009
によって表されるか、または薬学的に許容されるその塩であり得る。
【００１９】
非常に好ましい一実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物、より具体的には式（ＩＶ）、（Ｖ）または（Ｘ）
【化９】
2018519281.tif 000010
【化１０】
2018519281.tif 000011
によって示される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２０】
特定の一実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）
【化１１】
2018519281.tif 000012
によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２１】
第２の特定の実施形態では、本発明は、式（Ｖ）
【化１２】
2018519281.tif 000013
によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２２】
第３の特定の実施形態では、本発明は、式（Ｘ）
【化１３】
2018519281.tif 000014
によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２３】
本発明の化合物は、ヒトトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体／Ｔプロスタノイド受容体／ＴＰが役割を果たすヒトの疾患を処置するために使用することができる。
【００２４】
本発明の化合物は、ヒトＴＰのレベルの発現が変わるヒトの疾患を処置するために使用することができる。
【００２５】
本発明の化合物は、ＴＸＡ２のレベルが上昇するヒトの疾患を処置するために使用することができる。
【００２６】
本発明の化合物は、ヒトＴＰを介して作用する他の生化学的実体／リガンド（例えば、ＰＧＧ２／ＰＧＨ２、２０−ＨＥＴＥまたは８−イソＰＧＦ２αを含むイソプロスタン）のレベルが上昇するヒトの疾患を処置するために使用することができる。
【００２７】
本発明の化合物は、８−イソ−ＰＧＦ２αなどの、ヒトＴＰを介してシグナル伝達する非酵素的なフリーラジカル由来のイソプロスタンのレベルが上昇するヒトの疾患を処置するために使用することができる。
【００２８】
本発明の化合物は、経口、吸入、噴霧、経皮、静脈内、皮下、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｓｏｓａｌ）、埋込式のデポー製剤を含む異なる投与経路によって投与することができる。
【００２９】
本発明の化合物は、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の処置において使用するために使用して、ＴＰに拮抗することができる。
【００３０】
本発明の化合物は、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の処置に承認されている他の薬物と併用される場合、この疾患を処置するために使用することができる。
【００３１】
本発明の化合物は、肺動脈圧を測定するための埋込式センサーと併用することができ、このような化合物の治療的な投与または治療的な投薬は、測定されたこのような肺動脈圧の変化に対して最適化または調整される。
【００３２】
本発明の化合物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて、血栓症を処置するために使用することができる。
【００３３】
本発明の化合物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて、微小血管血栓症を処置するために使用することができる。
【００３４】
本発明の化合物は、１型または２型真性糖尿病と関連するＣＶＤを含めた他の心血管疾患を処置するために使用することができる。本願の分野の例として、過度の血小板凝集と関連するアテローム血栓症、虚血性脳卒中、一過性虚血発作（ａｔｔａｃｈ）（ＴＩＡ）、急性冠症候群の防止を含めた、様々な心血管疾患の処置が挙げられるが、これらに限定されない。これらの状態のために、本発明の化合物は、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３５】
本発明の化合物は、それに限定されるものではないが、喘息を含めた他の肺疾患を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３６】
本発明の化合物は、腎疾患を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３７】
本発明の化合物は、それに限定されるものではないが、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）を含めた前立腺疾患を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３８】
本発明の化合物は、炎症性疾患を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３９】
本発明の化合物は、がんを含めた新生物疾患を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００４０】
本発明の化合物は、脳卒中および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を処置するために使用することができ、単独でまたは他の治療薬物と組み合わせて使用することができる。
【００４１】
本発明の化合物は、がんを処置するための免疫調節薬と併用することができる。
【００４２】
本発明の化合物は、それに限定されるものではないが、様々なタイプの高血圧および外科ステント留置後の再狭窄などの平滑筋細胞機能の調節不全を処置するために使用することができる。
【００４３】
本発明の化合物は、内皮細胞機能の調節不全を処置するために使用することができる。
【００４４】
本発明の化合物は、ステント、バルーン、ステントグラフト、人工弁、シャント、腹部大動脈弁を含む埋込式医療デバイスの移植部位で制御送達または局所送達するために、このような医療デバイス上にコーティングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＨＥＫ  ＴＰα細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００４６】
【図２】図２は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００４７】
【図３】図３は、ＨＥＫ  ＴＰα細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００４８】
【図４】図４は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００４９】
【図５】図５は、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５０】
【図６】図６は、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５１】
【図７】図７は、ＨＥＫ．ｈＩＰ細胞におけるシカプロスト媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５２】
【図８】図８は、ＨＥＬ９２．１．７細胞におけるＥＰ３／ＰＧＥ２媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５３】
【図９】図９は、ＨＥＫ  ＴＰα細胞における８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５４】
【図１０】図１０は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞における８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員に対する本発明の化合物の効果を示す。
【００５５】
【図１１】図１１は、本発明の化合物が、ＤＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００５６】
【図１２】図１２は、本発明の化合物が、ＥＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００５７】
【図１３】図１３は、本発明の化合物が、ＥＰ２受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００５８】
【図１４】図１４は、本発明の化合物が、ＥＰ３受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００５９】
【図１５】図１５は、本発明の化合物が、ＥＰ４受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００６０】
【図１６】図１６は、本発明の化合物が、ＦＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００６１】
【図１７】図１７は、本発明の化合物が、ＩＰ受容体に対して効果を示さないことを示す。
【００６２】
【図１８】図１８は、ＴＰ媒介性またはＵ４４０６９媒介性シグナル伝達に対する化合物の効果を示す。
【００６３】
【図１９】図１９は、拡張期肺動脈圧（ｄＰＡＰ）に対する化合物の効果を示す。
【００６４】
【図２０】図２０は、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）に対する化合物の効果を示す。
【００６５】
【図２１】図２１は、平均全身動脈圧（ｍＡＰ）に対する化合物の効果を示す。
【００６６】
【図２２】図２２は、Ｆｕｌｔｏｎ指数に対する化合物の効果を示す。
【００６７】
【図２３】図２３は、肺組織切片を示す。
【００６８】
【図２４】図２４は、全細動脈の平均内腔：全血管径の比に対する化合物の効果を示す。
【００６９】
【図２５】図２５は、小細動脈（ｓｍａｌｌ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）（＜５０μｍ）の平均内腔：全血管径の比に対する化合物の効果を示す。
【００７０】
【図２６】図２６は、中細動脈（ｍｅｄｉｕｍ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）（５０〜１００μｍ）の平均内腔：全血管径の比に対する化合物の効果を示す。
【００７１】
【図２７】図２７は、大細動脈（ｌａｒｇｅ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）（＞１００μｍ）の平均内腔：全血管径の比に対する化合物の効果を示す。
【００７２】
【図２８】図２８は、ＦＦＰＥ肺組織切片を示す。
【００７３】
【図２９】図２９は、血管再構築に対する化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、Ｔプロスタノイド受容体（ＴＰ）アンタゴニストとして作用する新規な化学的実体、ならびにトロンボキサン（ＴＸ）Ａおよびエンドペルオキシドプロスタグランジン（ＰＧ）Ｇ２／ＰＧＨ２、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）およびフリーラジカル由来のイソプロスタン（例えば、８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α）を含めた、ＴＰの偶発的リガンドとして作用するあらゆる他の作用物質が役割を果たす、ヒトの疾患の処置におけるそれらの使用に関する。
【００７５】
本発明は、一般に、ＴＰのアンタゴニストとして作用して、ＴＸＡ２、ＰＧＧ２／Ｈ２、２０−ＨＥＴＥ、８−イソ−ＰＧＦ２αを含めたイソプロスタン、またはヒトにおいて発現するＴＰに結合する任意の他の偶発的ＴＰリガンドを防止する、新規な化学的実体／化合物に関する。本発明の化合物は、ＴＰαおよび／またはＴＰβ受容体サブタイプのいずれかに対して優先的な結合を示す化合物を含む。本明細書で論じる通り、本発明は、例えばそれに限定されるものではないが、ヒト血小板の凝集を阻害し、前臨床ＰＡＨモデルにおける肺動脈高血圧（ＰＡＨ）を防止し、魅力的なＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、および排出）特性を示す、小分子化合物を提供する。本発明はさらに、あらゆる合成経路の、包括的ではないが、例えば新規なＴＰアンタゴニスト化合物のための例示的な合成経路を提供する。本発明の例示的な化合物が開示される。
【００７６】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、ヒト血小板においてｅｘ  ｖｉｖｏで著しいＴＰの選択性および拮抗活性を呈し、ＰＡＨの前臨床的疾患モデルにおける肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の防止に有用である。
【００７７】
本発明の化合物は、好ましくは、１００ｎＭ未満の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＴＸＡ２誘導性の血小板凝集を阻害する。本発明の化合物は、好ましくは、５０ｎＭ未満の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＴＸＡ２誘導性の血小板凝集を阻害する。本発明の化合物は、好ましくは、２０ｎＭ未満の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＴＸＡ２誘導性の血小板凝集を阻害する。本発明の化合物は、好ましくは、５ｎＭ未満の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＴＸＡ２誘導性の血小板凝集を阻害する。本発明の化合物は、５ｍｇ／ｋｇ／日未満で使用される場合、ＰＡＨの前臨床的モデルにおけるＰＡＨを防止する。ある特定の実施形態では、本発明の化合物はさらに、他の血小板アゴニスト、例えばトロンビンまたはアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）などによって誘導された凝集ではなく、ＴＸＡ２誘導性の血小板凝集を阻害する。さらに、本発明の化合物は、好ましくは、いくつかの他のＧタンパク質共役受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、またはヒトＥｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）を含めたイオンチャネルによるシグナル伝達を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）ことも、拮抗することもない。
【００７８】
本発明の化合物は、魅力的なＡＤＭＥ特性を示す。本発明の化合物は、ＴＰアゴニスト誘導性細胞内カルシウム動員を阻害し、ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイで血小板凝集を阻害する能力を示し得る。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ＴＰイソ型と同様に血小板活性化にも関与する他のプロスタノイド受容体（プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２受容体、ＤＰ；ＰＧＥ２受容体ＥＰ１〜ＥＰ４；ＰＧＦ２α受容体、ＦＰ；ＰＧＩ２／プロスタサイクリン受容体、ＩＰ）、ならびにプリン（ＡＤＰ）受容体およびトロンビン（ＰＡＲ１）受容体を含めた非プロスタノイド受容体を介するシグナル伝達には、効果を示し得ない。さらに化合物は、最小限の毒性および好ましい細胞透過性を示す。
【００７９】
以下に、本発明の化合物の例示的な合成方法を示す。化合物の合成については、ＳＭ８を参照されたい。
【化１４】
2018519281.tif 000015
【００８０】
中間体ｉ−１、ｉ−２、ｉ−３、ｉ−４、ｉ−５、ｉ−６、およびｉ−７も参照されたい。
【化１５】
2018519281.tif 000016
式中、Ｒ＝ＣＨＦ２（ｉ−１）、Ｒ＝ＣＦ３（ｉ−２）、Ｒ＝ＣＯＮＨ２（ｉ−３）、Ｒ＝ＣＯＮＨＭｅ（ｉ−４）、Ｒ＝ＣＯＮＭｅ２（ｉ−５）、Ｒ＝ＣＮ（ｉ−６）である。
【００８１】
合成経路は、経路１で概説される。
【化１６】
2018519281.tif 000017
【００８２】
ある範囲の臭化アリール（ＳＭ１〜ＳＭ６）を、３−ヒドロキシフェニルボロン酸（ＳＭ７）とのパラジウム媒介性カップリングに付して、中間体ｉ−１〜ｉ−６を産生する。フェノール中間体ｉ−１〜ｉ−６を、ｉ−７（ＳＭ８から形成される）中で塩素のｉｐｓｏ置換に付して、ｉ−８〜ｉ−１４を得、それらがｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートと反応すると、本発明の化合物が得られる。
【００８３】
スキーム経路２に示されている通り、その範囲の臭化アリール（ＳＭ１〜ＳＭ６）を、３−ヒドロキシフェニルボロン酸（ＳＭ７）とのパラジウム媒介性カップリングに付して、中間体ｉ−１〜ｉ−６を産生する一方、ｉ−７はＳＭ８から生成する。
【化１７】
2018519281.tif 000018
【００８４】
ＳＭ８．１を購入し、経路３を使用して対応するスルホンアミドｉ−７．１に変換する。
【化１８】
2018519281.tif 000019
【００８５】
フルオロ中間体ｉ−７．１を、経路４に示されている通り、６種のフェノールｉ−１〜ｉ−６と反応させると、優れた変換が生じる。
【化１９】
2018519281.tif 000020
【００８６】
中間体ｉ−８、ｉ−９およびｉ−１１〜ｉ−１３を、経路５でｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートを用いて副生成物が少ない（ｃｌｅａｎ）変換に付して（ＬＣＭＳによって＞７０％）、粗製物１、２、４〜６を得、それを逆相分取ＨＰＬＣによって精製して、標的を収率４０〜６０％、純度９６％超で得る。経路５によって、式（ＩＩＩ）の化合物が得られる。
【化２０】
2018519281.tif 000021
【００８７】
４−（３−ヒドロキシフェニル）ベンゾニトリル（ｉ−６）の調製は、経路６を含み得る。
【化２１】
2018519281.tif 000022
【００８８】
窒素を、アセトン（６５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１２０ｍＬ）中、３−ヒドロキシベンゼンボロン酸（ＳＭ７、２．００ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）、４−ブロモベンゾニトリル（ＳＭ６、２．９０ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２．２０ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）の混合物に５分間発泡させる。Ｐｄ（ＯＡｃ）２（３２５ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、窒素雰囲気下で室温において３０分間撹拌し、その後、ＬＣ−ＭＳ分析によって反応の完了が示される。反応混合物を、真空下で濃縮し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５０ｍｌ）で酸性にし、ＤＣＭ（２００ｍｌ、次に２×７５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を、相分離器に通過させ、真空下で濃縮乾固させる。粗製生成物を、シリカ上に吸収させ、ＭＰＬＣクロマトグラフィーによって１００ｇのＢｉｏｔａｇｅシリカカートリッジ上で精製する（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ勾配０〜４０％で溶出する）。標的化合物４−（３−ヒドロキシフェニル）ベンゾニトリル（ｉ−６）を、白色固体として単離する。
【００８９】
化合物ｉ−１〜ｉ−５を、同様に調製する。
【００９０】
本発明において使用するための３−［４−（ジフルオロメチル）フェニル］フェノール（ｉ−１）を得るために、ＳＭ（１，１−ブロモ−４−（ジフルオロメチル）−ベンゼン）を使用することができる。（イソ−ヘキサン／ＤＣＭ勾配０〜１００％で溶出する）。標的化合物３−［４−（ジフルオロメチル）フェニル］フェノール（ｉ−１）を、白色固体として単離する。
【化２２】
2018519281.tif 000023
【００９１】
本発明において使用するための３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］フェノール（ｉ−２）のために、ＳＭ２（４−ブロモベンゾトリフルオリド）を使用することができる。（イソ−ヘキサン／ＤＣＭ勾配０〜１００％で溶出する）。標的化合物３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］フェノール（ｉ−２）を、白色固体として単離する。
【化２３】
2018519281.tif 000024
【００９２】
本発明において使用するための４−（３−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド（ｉ−３）を作製するために、ＳＭ−３（４−ブロモベンズアミド）を使用することができる。一般手順を改変し、粗製反応混合物を、ＥｔＯＡｃから再結晶化させる。標的化合物４−（３−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド（ｉ−３）を、白色固体として単離する。
【化２４】
2018519281.tif 000025
【００９３】
本発明において使用するための４−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−メチル−ベンズアミド（ｉ−４）を作製するために、ＳＭ−４（Ｎ−メチル−４−ブロモベンズアミド）を使用することができる。
【００９４】
標的化合物４−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−メチルベンズアミド（ｉ−４）を、白色固体として単離する。
【化２５】
2018519281.tif 000026
【００９５】
本発明において使用するための４−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（ｉ−５）を作製するために、ＳＭ−５（Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−ブロモベンズアミド）を使用することができる。一般手順を改変し、粗製反応混合物を、ＥｔＯＡｃから再結晶化させる。標的化合物４−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（ｉ−５）を、白色固体として単離する。
【化２６】
2018519281.tif 000027
【００９６】
５−シアノ−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミド（ｉ−７．１）の調製は、経路７を含み得る。
【化２７】
2018519281.tif 000028
【００９７】
アンモニア溶液（ＭｅＯＨ中７Ｍ、４．５ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ）を氷水に冷却し、５−シアノ−２−フルオロベンゼンスルホニル塩化物（ＳＭ８．１、０．９９ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を滴下添加する。反応混合物を３０分間撹拌し、その後、ＬＣ−ＭＳ分析によって反応の完了が示される。反応混合物を真空下で濃縮し、水（４０ｍｌ）を添加し、次にＤＣＭ（１００ｍｌ、次に２×５０ｍＬ）で抽出する。有機相を、相分離器に通過させ、合わせ、真空下で濃縮乾固させて、５−シアノ−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミド（ｉ−７．１）を白色固体として得、それをさらなる精製なしに使用する。
【００９８】
４−［３−（４−シアノ−２−スルファモイル−フェノキシ）フェニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（ｉ−１２）の調製は、経路８を含み得る。
【化２８】
2018519281.tif 000029
【００９９】
ここで、２．１ＭのＮａＯＨ（０．５５ｍＬ、１．１５ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（７ｍＬ）に懸濁させた４−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（２５３ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）に添加し、５分間撹拌する。混合物を、真空下で濃縮乾固させ、乾燥アセトニトリル（７ｍＬ）を添加し、その後５−シアノ−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミド（１２６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（６０９ｍｇ、４．４１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８５℃で終夜撹拌する。ＬＣ−ＭＳは、スルホンアミドが残存していないことを示す。反応混合物を、２ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）に添加し、水（４０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ、２×１５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を、水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮乾固させる。粗製反応物を、ＭＰＬＣクロマトグラフィーによって、１０ｇのＢｉｏｔａｇｅシリカカートリッジ上で精製する（イソ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配４０〜１００％で溶出する）。標的化合物４−［３−（４−シアノ−２−スルファモイル−フェノキシ）フェニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（ｉ−１２）を単離する。
【０１００】
同様に、フェノールｉ−１、ｉ−２、ｉ−４およびｉ−６から、化合物ｉ−８、ｉ−９、ｉ−１１およびｉ−１３をそれぞれ調製した。
【０１０１】
５−シアノ−２−［３−［４−（ジフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−８）のために、ｉ−１（２３１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を使用する。（イソ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配５〜４５  １００％で溶出する）。化合物５−シアノ−２−［３−［４−（ジフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−８）を単離する。
【化２９】
2018519281.tif 000030
【０１０２】
５−シアノ−２−［３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−９）のために、ｉ−２（２５０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を使用する。（イソ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配０〜３５％で溶出する）。化合物５−シアノ−２−［３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−９）を単離する。
【化３０】
2018519281.tif 000031
【０１０３】
４−［３−（４−シアノ−２−スルファモイル−フェノキシ）フェニル］−Ｎ−メチル−ベンズアミド（ｉ−１１）のために、ｉ−４（２３８ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を使用する。（イソ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配４０〜１００％で溶出する）。化合物４−［３−（４−シアノ−２−スルファモイルフェノキシ）フェニル］−Ｎ−メチル−ベンズアミド（ｉ−１１）を単離する。
【化３１】
2018519281.tif 000032
【０１０４】
５−シアノ−２−［３−（４−シアノフェニル）フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−１３）のために、ｉ−６（２０５ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を使用する。（イソ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配１０〜５５％で溶出する）。化合物５−シアノ−２−［３−（４−シアノフェニル）フェノキシ］ベンゼンスルホンアミド（ｉ−１３）を単離する。
【化３２】
2018519281.tif 000033
【０１０５】
本明細書に開示の化合物は、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル）−５−シアノ−２−（（４’−（置換）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）オキシ）ベンゼンスルホンアミド（１〜６）を一般的に調製するための経路９を使用して合成することができる。
【化３３】
2018519281.tif 000034
【０１０６】
５−シアノ−２−（（４’−（置換）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）オキシ）ベンゼンスルホンアミド（ｉ−８〜ｉ−１３）を、ジオキサン（１ｍｍｏｌ当たり１０ｍＬ）中で撹拌し、３．１ＭのＫＯＨ（１．１当量）を添加する。混合物を１０分間撹拌し、次に真空下で濃縮乾固させる。乾燥ＤＭＦ（１ｍｍｏｌ当たり７ｍＬ）を添加し、その後ｔｅｒｔ−ブチルイソシアネート（２．５当量）を添加し、反応混合物を、室温で１８時間撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、２ＭのＨＣｌ（１ｍｍｏｌ当たり１．７ｍＬ）を添加する。次に、これをＥｔＯＡｃ（１ｍｍｏｌ当たり３×７ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、真空下で濃縮乾固させる。残渣をＤＭＳＯに溶解させ、逆相分取ＨＰＬＣによって精製する。標的化合物を、白色固体として約３５〜６０％の収率で単離する。
【０１０７】
本発明の方法は、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［５−シアノ−２−［３−［４−（ジフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］フェニル］スルホニル−尿素（ＶＩ）を生成するために使用することができる。
【化３４】
2018519281.tif 000035
【０１０８】
本発明の方法は、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［５−シアノ−２−［３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］フェノキシ］フェニル］スルホニル−尿素（ＶＩＩ）を生成するために使用することができる。
【化３５】
2018519281.tif 000036
【０１０９】
本発明の方法は、４−［３−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイルスルファモイル）−４−シアノ−フェノキシ］フェニル］−Ｎ−メチル−ベンズアミド（ＩＸ）を生成するために使用することができる。
【化３６】
2018519281.tif 000037
【０１１０】
本発明の方法は、４−［３−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイルスルファモイル）−４−シアノ−フェノキシ］フェニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンズアミド（Ｘ）を生成するために使用することができる。
【化３７】
2018519281.tif 000038
【０１１１】
本発明の方法は、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［５−シアノ−２−［３−（４−シアノフェニル）フェノキシ］フェニル］スルホニル−尿素（ＸＩ）を生成するために使用することができる。
【化３８】
2018519281.tif 000039
【０１１２】
本発明の方法は、式（ＩＶ）の化合物の生成に使用することができる。
【化３９】
2018519281.tif 000040
【０１１３】
本発明の方法は、式（Ｖ）の化合物の生成に使用することができる。
【化４０】
2018519281.tif 000041
【０１１４】
本発明の方法は、式（ＶＩＩＩ）の化合物の生成に使用することができる。
【化４１】
2018519281.tif 000042
【０１１５】
こうして、本発明の方法は、式（ＩＩ）の化合物
【化４２】
2018519281.tif 000043
［式中、Ｒ１は、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化シクロアルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン化メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ハロゲン化エトキシ基、ハロゲン化イソプロポキシ基、ハロゲン化ｔｅｒｔ−ブトキシ基、第一級アミド、第二級アミド、第三級アミド、ＯＨ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、メチルケトン、ニトリル基、メチルエステル基、エチルエステル基、イソプロピルエステル基、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基、ハロゲン化メチルエステル基、ハロゲン化エチルエステル基、ハロゲン化イソプロピルエステル基、またはハロゲン化ｔｅｒｔ−ブチルエステル基であり、Ｒ２は、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、またはハロゲン化アリール基である］、または薬学的に許容されるその塩の生成に使用できることがわかる。
【０１１６】
ハロゲン化とは、Ｆ、ＣＬ、ＢＲ、Ｉ、およびＡｔの１つまたは複数、好ましくはＦおよびＣｌの１つまたは複数で置換されることを意味すると解釈することができる。
【０１１７】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩形態で、または遊離塩基として存在し得る。適切な投与経路には、経口、口腔、局所（経皮を含む）、注射、静脈内、鼻、肺、および埋込式医療デバイス（例えば、ステントまたは薬物溶出ステントまたはバルーン等価物）を用いるか、またはその上による投与経路が含まれる。
【０１１８】
各薬剤の有効な投与量は、患者の年齢、体重、性別および臨床的な病歴などの典型的な要因を考慮して、当業者によって容易に決定され得る。典型的な投与量は、例えば、１日１回、２日毎、数日毎、週１回、２週間毎に１回もしくは１カ月１回、または限られた回数、例えば１回だけ、２回もしくは３回もしくはそれ超の回数で投与される、例えば１日当たり１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ未満であり得る。
【０１１９】
各活性成分を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態で、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、急速溶融剤（ｆａｓｔ  ｍｅｌｔ）、水性もしくは油性懸濁物、分散性散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として存在し得る。経口使用を企図された組成物は、医薬組成物の製造分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、医薬として優れた、口当たりの良い調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤から選択される１種または複数種の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤を製造するのに適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、またはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア、および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または胃内での崩壊を遅延させ、胃腸管のより下の部分で吸収させ、それによって持続作用を長期間にわたってもたらすための公知の技術によって、コーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。それらの材料は、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６６，４５２号および同第４，２６５，８７４号に記載の技術によってコーティングして、制御放出のための浸透圧性の治療錠剤を形成することもできる。化合物の調製および投与は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，８４１号および米国特許出願第２００３／０２３２８７７号に論じられている。
【０１２０】
また、経口使用のための製剤は、活性成分が不活性な固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水もしくは油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセル剤として提示することができる。
【０１２１】
化合物の胃腸管での加水分解の制御が求められる代替の経口製剤は、制御放出製剤を使用して達成することができ、この場合、本発明の化合物は、腸溶コーティングで被包される。
【０１２２】
水性懸濁物は、水性懸濁物を製造するのに適した賦形剤と混合した活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；分散剤または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルおよびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンと脂肪酸由来の部分エステルおよびヘキシトール無水物の縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである。また水性懸濁物は、１種または複数種の保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１種または複数種の着色剤、１種または複数種の矯味矯臭剤、ならびに１種または複数種の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンを含有することができる。
【０１２３】
油性懸濁物は、活性成分を、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、または鉱油、例えば流動パラフィンに懸濁させることによって製剤化することができる。油性懸濁物は、増粘剤、例えば蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。前述のものなどの甘味剤、および矯味矯臭剤を添加して、口当たりの良い経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を添加することによって保存することができる。
【０１２４】
水を添加することによって水性懸濁物を調製するのに適した分散性散剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および１種または複数種の保存剤と混合した活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤が例示され、例えば甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤が存在することもできる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、水中油エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば流動パラフィン、またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えばアカシアガムもしくはトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズ、レシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、ならびに前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。エマルジョンは、甘味剤および矯味矯臭剤を含有することもできる。
【０１２６】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースを用いて製剤化することができる。このような製剤は、粘滑薬、保存剤および矯味矯臭剤および着色剤を含有することもできる。医薬組成物は、注入可能な滅菌水性または油性懸濁物の形態であってよい。この懸濁物は、前述の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。注入可能な滅菌調製物は、非毒性の非経口で許容される希釈剤または溶媒の注入可能な滅菌溶液または懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンガー溶液および等張食塩溶液が挙げられる。さらに、滅菌固定油は、従来、溶媒または懸濁化媒体として用いられている。この目的では、合成モノ−またはジ−グリセリドを含めた任意の無刺激性の固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製に使用される。
【０１２７】
本発明の化合物を含めた各活性剤は、薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、常温で固体であるが直腸温度で液体となり、したがって直腸内で溶融して薬物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料の例は、カカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１２８】
局所使用のために、クリーム、軟膏剤、ゼリー、急速溶融錠剤、溶液または懸濁物が適しており、肺への送達のための噴霧形態も適している。局所適用には、洗口剤および含嗽剤の使用が含まれる。
【０１２９】
また本発明はさらに、一般に抗血栓性化合物を含む埋込式医療デバイスなどのデバイスに関する。ある特定の態様では、本発明は、本発明の化合物を含むか、または本発明の化合物を他の補完的な薬物、例えばシロリムス、パクリタキセル、ｔＰＡ、ウロキナーゼなどと一緒に含むステント（例えば、薬物溶出ステント）またはバルーンを提供する。本発明のデバイスは、薬物溶出大動脈弁人工装具または薬物溶出僧帽弁人工装具であり得る。したがって、本発明は、ステント、大動脈弁、または僧帽弁からの送達を介する本発明の化合物の投与を提供する。一部の実施形態では、本発明は、薬物溶出大動脈弁または薬物溶出僧帽弁を提供する。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本発明は、経皮的心血管介入（ＰＣＩ）で使用するための、本発明の化合物を含む埋込式医療デバイスまたはバルーンを提供する。本発明のデバイスは、ステントまたはバルーンであり得る。本発明はまた、抗血栓性化合物を含むデバイスを使用する方法を提供する。本発明のデバイスおよび方法は、ＴＰアンタゴニスト化合物を、ステント（例えば、ＤＥＳ）、バルーン、埋込式デバイスもしくは外科デバイスにより、または本発明の化合物を、例えばｔＰＡ、ウロキナーゼなどの他の補完的な薬物と共に提供することができる。デバイスおよび抗血栓性化合物は、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４７，３０２号、米国特許第７，６１８，９４９号、および米国特許出願第２００６／０１２２１４３号に論じられている。
【０１３１】
本発明によるステントは、例えば、血管形成術と併用して、血管内の狭小部位の動脈を永久的に開放したままにして血流を制限しないようにするか、または血管動脈壁の弱化もしくは「動脈瘤」を支持するための、メッシュ管様の構造を含むことができる。ステントは、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７９６，９９８号、米国特許第６，３５２，５５２号、米国特許出願第２００５／００１５１３６号、米国特許出願第２００５／００１０２７９号、および米国特許出願第２００７／０１６８０１５号に論じられている。
【０１３２】
本発明の化合物は、例えば脳卒中または他の血栓事象を処置するために使用される、ステント、薬物溶出ステント（ＤＥＳ）、分枝ステント、バイパスグラフト血管ステント、バルーン、医療デバイス、または外科デバイスのためのコーティング剤を提供することができる。これらの化合物は、血小板およびマクロファージ上のＴＰ受容体に拮抗することによって、局所的血管損傷部位における血小板の凝集および分泌を防止し、局所的血管損傷部位におけるＴＸＡ２のレベル上昇による炎症効果を相殺する。化合物は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）上のＴＰに拮抗することによって、ＴＸＡ２誘導性のＳＭＣ増殖、新生内膜肥厚および再狭窄を防止する。さらに、ＴＰは、虚血を含めた酸化ストレス／傷害の状況において、フリーラジカルに非酵素的に由来するアラキドン酸から豊富に産生されたイソプロスタンである８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２αの有害作用も媒介するので、本発明の化合物は、損傷を受けた血管内の８−イソ−ＰＧＦ２αの望ましくない作用を阻害することもできる。これらの化合物と非常に低レベルのシロリムスおよび／またはパクリタキセルの組合せは、相乗的に、再狭窄をさらに防止すると同時に、局所的な高レベルのシロリムスまたはパクリタキセル（ｐａｘｌｉｔａｘｏｌ）と関連する有害効果を排除または低減することができる。これらの化合物と血餅溶解薬物、例えばｔＰＡ、ウロキナーゼまたは関連のタイプの薬物の組合せは、アテローム血栓症、虚血または脳卒中などの処置などにおいて、閉塞部位の血餅を溶解し、新しい血栓形成を防止することができる。ＤＥＳは、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１３５，０３８号、米国特許第５，６９７，９６７号、米国特許出願第２０１１／００９９７８５号、米国特許出願第２０１０／００２３１１５号、および米国特許出願第２００５／００４３７８８号に論じられている。ステントのコーティングは、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８３３，５４４号および米国特許出願第２００９／００６２９０４号に論じられている。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本発明は、単独で使用されるか、または非常に低レベルのシロリムスおよび／もしくはパクリタキセルと併用される、デバイスのコーティングまたは構成成分としての新規な適用を有するＴＰアンタゴニストを提供する。シロリムスおよび／またはパクリタキセルのいずれかを伴う本発明の化合物の両方の放出プロファイルおよび放出プロファイルのタイミングは、抗血栓効果および抗再狭窄効果を最大限にするように最適化することができる。これによって、血管形成術およびステント留置後に損傷を受けた血管の近傍に見出される、ＴＸＡ２およびイソプロスタンである８−イソ−ＰＧＦ２αのレベル上昇によるシグナル伝達を防止することができる。このシグナル伝達の防止によって、血管形成術およびステント留置後に損傷を受けた血管の近傍の、ＴＸＡ２およびイソプロスタンである８−イソ−ＰＧＦ２αのレベル上昇に起因して上昇する宿主免疫応答の機能障害が、防止または低減される。本発明の化合物は、さらに、例えば平滑筋細胞上のＴＰに拮抗することによって、再狭窄を防止することができる。本発明の化合物は、大動脈弁狭窄を処置するためにＴＡＶＩ（経カテーテル大動脈弁介入）で使用される大動脈弁または僧帽弁上にコーティングすることもできる。大動脈弁または僧帽弁上への化合物によるこのようなコーティングは、ＴＡＶＩ外科手術後の血栓または脳卒中の発生を防止することができる。
【０１３４】
本発明は、ベアメタルステント、織り合わされたステント、薬物溶出ステントおよびバルーン、分枝ステントおよびバイパスグラフトステント上のコーティングとして使用することができる、すなわち（ａ）抗再狭窄剤、（ｂ）抗血栓剤および（ｃ）再内皮化促進剤として使用するための化合物を提供する。本発明の化合物は、規定された期間（例えば、１２カ月）にわたる、ゼロ次放出、一次放出および／または初期バースト放出とその後の制御放出の組合せを含めた予め規定された方式で、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含めた脈管構造の様々な疾患の処置に使用される、コーティングされたこのような医療デバイスから放出され得る。本発明の化合物は、急性冠状動脈ステント血栓症に対してさらにより脆弱であり、ステント留置後にＴＸＡ２などのプロスタノイドのレベルが上昇しているアスピリン抵抗性患者（母集団の約３０％）において、特に有用となり得る（Ｒｕｅｆ  ＆  Ｋｒａｎｚｈｏｆｅｒ、２００６年、Ｊ  Ｉｎｔｅｒ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．第１９巻、５０７〜５０９頁）。医療デバイス上のコーティングとしての新しい小分子薬物の他の適用には、様々な外科的介入、例えば肥満外科手術、整形外科手術を受ける被験体、外傷患者、および外科手術介入を受ける糖尿病患者を含めた様々なタイプの患者における、（ａ）分枝ステントまたはバイパスグラフト病変ステント、（ｂ）脳卒中を処置し、神経学的適用のための医療デバイス上の血餅の形成をさらに防止するために使用される、医療デバイス上の血餅溶解薬（ｃｌｏｔ  ｄｉｓｓｏｌｖｅｒ）、（ｃ）ならびに重症の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または肺塞栓症（ＰＥ）を処置するために使用される下大静脈フィルター（ＩＶＣＦ）上のコーティングへの適用が含まれる。デバイスからの薬物送達は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７１３，５３８号、米国特許出願第２００４／０２１３８１８号および米国特許出願第２００９／０３１１２９９号に論じられている。
【０１３５】
ＴＰアンタゴニストとしての本発明の化合物は、過度の血管収縮を阻害するだけでなく、微小血栓症も防止する、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）のための治療薬物として作用し、潜在的に、ＰＡＨに見出される肺動脈再構築、右室（ＲＶ）肥大、内皮細胞機能不全および局所炎症を制限するはずである。また本発明の化合物は、ＰＡＨに関与する炎症経路または増殖経路を直接的に抑制することができる。これに加えて、ＴＰは、ＰＡＨの臨床状況、ならびに酸化ストレスまたは傷害を伴う他の疾患において豊富に産生されたフリーラジカル由来のイソプロスタンであり、ＴＸＡ２と類似の作用を媒介する８−イソ−ＰＧＦ２αの作用を媒介するので、本発明の化合物は、ＰＡＨにおけるこれらの効果にも拮抗する。さらに、ＴＸＡ２は、血管再構築、再狭窄および／または肥大を促進する強力な炎症促進性かつ分裂促進性の作用物質であり、肺内のシクロ−オキシゲナーゼ（ＣＯＸ）由来の主な収縮物質であるプロスタノイドなので、本発明の化合物は、これらの効果に拮抗する。
【０１３６】
したがって、本発明の化合物は、このような化合物が、ＴＸＡ２、肺内で生成された主な血管収縮性プロスタグランジンを阻害するだけでなく、例えば、ＴＸＡ２自体、そのエンドペルオキシド前駆体ＰＧＧ２／ＰＧＨ２および２０−ＨＥＴＥの有害作用に加えて、酸化ストレス由来のイソプロスタンである８−イソ−ＰＧＦ２αの有害作用も阻害するという点で、使用されている他のＰＡＨ治療剤を上回るさらなる利点を追加するであろう。本発明の化合物は、（ｉ）ＴＸＡ２の作用を遮断するだけでなく、アスピリン非感受性ＴＰアゴニスト（例えば、酸化傷害中にフリーラジカルによって豊富に産生された８−イソ−ＰＧＦ２α）の作用も遮断し、（ｉｉ）また（アスピリンとは異なり）、炎症性アテローム血栓症中に存在する血管床の細胞および循環マクロファージ／単球において発現したＴＰを阻害し、（ｉｉｉ）集団の約３３％に生じると推定されるアスピリン抵抗性を克服するので、ＰＡＨに加えて、アテローム血栓症などの他の疾患において、標準治療のアスピリンを本発明の化合物で置き換えることによって、いくつかの利点が得られる。
【０１３７】
本発明の様々な化合物は、活性な治療形態を達成するために肝臓での代謝を必要としないので、脈管構造内のコーティングされた医療デバイスの放出部位または即時局所環境に、即時治療効果をもたらすという利益を提供する。医療デバイス上へのこの薬物コーティングは、予防的および／または治療的処置として適用される。
参考文献の援用
【０１３８】
本開示を通して、他の文書、例えば特許文書、特許出願、特許刊行物、学術誌、本、論文、ウェブコンテンツが参照され、引用されている。このようなあらゆる文書は、それらの全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる。
均等物
【０１３９】
本明細書に示され、記載されている実施形態に加えて、本発明の様々な改変およびそれらの多くのさらなる実施形態は、本明細書に引用されている科学文献および特許文献への参照を含むこの文書の完全な内容から、当業者に明らかとなろう。本明細書の主題は、本発明の様々な実施形態およびそれらの均等物における本発明の実施に適合され得る重要な情報、例証および指針を含有する。
【実施例】
【０１４０】
本発明は、Ｔプロスタノイド受容体、または略してＴＰとも呼ばれるヒトトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体のＴＰαおよび／またはＴＰβ（イソ）型のアンタゴニストとして作用する様々な化合物（ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９と呼ばれる新しい化学的実体）の合成および生物学的評価を提供する。これらのＴＰアンタゴニストは、ＴＰを活性化する（ＴＰのアゴニストまたは部分アゴニストとして作用する）、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２、およびフリーラジカル由来のイソプロスタンである８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α、およびすべての他の偶発的作用物質（例えば、エンドペルオキシドＰＧＧ２／ＰＧＨ２および２０−ＨＥＴＥ）の作用を阻害する（拮抗する）。ＴＰは、体中の様々な細胞型において発現し、本明細書に記載の化合物（ＴＰアンタゴニスト）は、それらの細胞型のすべてにおいて発現したＴＰ（ＴＰαおよび／またはＴＰβを含む）を標的とする。さらに、ＴＰの発現の変化は、様々な疾患状況において生じ、本明細書に記載の化合物（ＴＰアンタゴニスト）は、それらの細胞型のすべて、ならびに炎症およびがんを含めた異なる疾患状況において発現したＴＰ（ＴＰαおよび／またはＴＰβを含む）を標的とする。さらに、化合物は、任意の薬物型式（例えば、それに限定されるものではないが、経口、ｉ．ｖ、ｉ．ｐ、皮膚、経皮送達系、または医療デバイス上、例えば薬物溶出ステント上のステント上）に使用することができる。式ＮＴＰ４およびＴＰ２０を有する化合物を参照し、巻末の表５も参照されたい。
【化４３】
2018519281.tif 000044
【０１４１】
ここで本発明者らは、メトキシ基を、ジフルオロメトキシ（ＮＴＰ４２において）、トリフルオロメトキシ（ＮＴＰ４３において）、ジフルオロ（ＮＴＰ４４）、トリフルオロ（ＮＴＰ４５）、第二級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＭｅ；ＮＴＰ４７）、第三級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）２；ＮＴＰ４８）またはニトリル（ＮＴＰ４９）基で置き換えることによって、ＮＴＰ４の有効性を増大することに成功し、それらから、３つの新しく非常に強力で有効な望ましいリードであるＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８を同定した。これらの例は、合成され、生物活性についてスクリーニングされた化合物（例えば、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９）を示しており、化合物ＮＴＰ４およびＴＰ２０は、参照または対照化合物として働いた。本発明者らは、追加の高度に集中的な医薬品化学を行って、ＮＴＰ４の有効性を、選択的ＴＰアンタゴニストとしてのその特異性を保持しながら、さらに改善した。ＴＰ特異的アンタゴニストとしてのリード化合物の特異性は、アゴニスト誘導性細胞内カルシウム動員を阻害するそれらの能力を介して、ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイにおいて血小板凝集を阻害するそれらの能力を介する有効性アッセイにより確認されている。より具体的には、その結果によって、ＴＰ２０およびＮＴＰ４と同様に、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３、およびＮＴＰ４８のいずれも、ＴＰイソ型と同様に血小板活性化にも関与する他のプロスタノイド（プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２受容体、ＤＰ；ＰＧＥ２受容体ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４；ＰＧＦ２α受容体、ＦＰ；ＰＧＩ２／プロスタサイクリン受容体、ＩＰ）、ならびにプリン（ＡＤＰ）受容体およびトロンビン（ＰＡＲ１）受容体を含めた非プロスタノイド受容体を介するシグナル伝達に対して、いかなる効果も示さなかったことが確立された。ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、それぞれ、ＤＰ−、ＥＰ１−ＥＰ４−、ＦＰ−またはＩＰ−媒介性シグナル伝達に対していかなる効果も示さないことが確認された。データによって、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８が、最小限の毒性および好ましい細胞透過性を示すことが確認された。
【０１４２】
本発明者らは、新規な一連の高度に特異的なＴＰ（ＴＰα−およびＴＰβ−選択的）アンタゴニストであるＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９を開発し、それらを生物学的に評価した。式ＩＩＩは、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９化合物の一般構造を示しており、式中、Ｒ１は、７種の新しく非常に強力で有効な望ましいリードを産生するための、ジフルオロメトキシ（ＮＴＰ４２において）、トリフルオロメトキシ（ＮＴＰ４３において）、ジフルオロ（ＮＴＰ４４において）、トリフルオロ（ＮＴＰ４５において）、第二級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＭｅ；ＮＴＰ４７において）、第三級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）２；ＮＴＰ４８において）またはニトリル（ＮＴＰ４９において）基のいずれかであり得る。
【０１４３】
様々なＣＶ疾患の処置のためのＴＰアンタゴニストの主要な適用に加えて、本発明者らのＴＰアンタゴニスト技術を使用および商業開発するための、奇病名を有する疾患を含めた数々の他の疾患の適応が存在する。例えば、これらのＴＰアンタゴニストは、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２、およびフリーラジカル由来のイソプロスタンである８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α、およびＴＰを活性化する（ＴＰのアゴニストまたは部分アゴニストとして作用する）すべての他の偶発的作用物質（例えばエンドペルオキシドＰＧＧ２／ＰＧＨ２、２０−ＨＥＴＥ）の作用を阻害する。前述の通り、ＴＰは、体中の様々な細胞型において発現し、本明細書に記載の化合物（ＴＰアンタゴニスト）は、それらの細胞型のすべてにおいて発現したＴＰ（ＴＰαおよび／またはＴＰβを含む）を標的とする。さらに、ＴＰの発現の変化は、様々な疾患状況において生じ、本明細書に記載の化合物（ＴＰアンタゴニスト）は、それらの細胞型のすべて、ならびに炎症およびがんを含めた異なる疾患状況において発現したＴＰ（ＴＰαおよび／またはＴＰβを含む）を標的とする。さらに、化合物は、任意の薬物型式（例えば、それに限定されるものではないが、経口、ｉ．ｖ、ｉ．ｐ、皮膚、経皮送達系、または医療デバイス上、例えば薬物溶出ステント上のステント上）に使用することができる。
【０１４４】
（実施例１：ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９の評価）
ＮＴＰ４のノーザン群改変体であるＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９を、それぞれＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞と呼ばれる、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体、α（ＴＰα）およびβ（ＴＰβ）イソ型を過剰発現する専売のＨＥＫ２９３細胞を使用して、カルシウム動員アッセイによって評価した。初期スクリーニングには、ＩＣ５０値を決定するための、用量応答アッセイ（使用濃度０．０００１μＭ（ＴＰβだけ）、０．００１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ（ＴＰαおよびＴＰβ））、その後、より集中的な総用量応答アッセイ（濃度範囲：０．００００１〜１０μＭ）が含まれており、ＴＸＡ２模倣薬Ｕ４６６１９（１μＭ）に応答して動員されたカルシウムに対する化合物の効果を、非常に重要なリード化合物ＴＰ２０およびＮＴＰ４と並行比較した。結果を、図１〜４および表１（ｎ≧４）に示す。
【０１４５】
結論：
（Ａ）初期試験：カルシウム動員アッセイ：用量応答カルシウム動員アッセイで決定される通り、新しい化合物ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９は、ＴＰαおよびＴＰβ媒介性カルシウム動員を強力に阻害し、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８は、ＴＰ２０よりも高い効力を示す。さらなる詳細については、図１〜４、および表１を参照されたい。２種の細胞株における効力の序列を、以下に示す。
ＴＰα：ＮＴＰ４８＞ＮＴＰ４２＞ＮＴＰ４３＞ＴＰ２０＞＞ＮＴＰ４
ＴＰβ：ＮＴＰ４８＞ＮＴＰ４２＞ＴＰ２０≧ＮＴＰ４３＞ＮＴＰ４  。
（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集アッセイ：ＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集計を使用して実施した予備的な血小板凝集アッセイにおいて、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、Ｕ４６６１９媒介性の血小板凝集の阻害に効力を有することが実証され、その序列は、
血小板：ＮＴＰ４８＞ＮＴＰ４２＞ＴＰ２０＞ＮＴＰ４３≧ＮＴＰ４
となる。さらなる詳細については、図５および６、ならびに表２を参照されたい。
（Ｃ）特異性（さらなる詳細については、図７、８および１１〜１７を参照されたい）：新しい化合物の特異性を決定するための予備的なアッセイでは、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９は、ＩＰ／シカプロストまたはＥＰ／ＰＧＥ２媒介性カルシウム動員に対する効果を示さなかった。具体的には、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９は、ｈＩＰ／シカプロスト媒介性またはＥＰ／ＰＧＥ２媒介性カルシウム応答に対して効果がないことが見出された。現在まで、ＮＴＰ４６を除き、化合物ＮＴＰ４４〜ＮＴＰ４９を、ＰＧＩ２受容体、ＩＰおよびＰＧＥ２受容体／ＥＰによるシグナル伝達に対するそれらの効果について試験したが、新しい化合物ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、ＴＰ２０およびＮＴＰ４と同様に、ＩＰ媒介性、ＥＰ媒介性シグナル伝達に対して効果を示さないことが確認された。データによって、新しいリード化合物ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８が、最小限の毒性および好ましい細胞透過性を示すことが確認された。
【０１４６】
さらに、さらなる特異性試験は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８のいずれも、ＴＰイソ型と同様に血小板活性化にも関与する他のプロスタノイド受容体（プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２受容体、ＤＰ；ＰＧＥ２受容体ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４；ＰＧＦ２α受容体、ＦＰ；ＰＧＩ２／プロスタサイクリン受容体、ＩＰ）、ならびにプリン（ＡＤＰ）受容体およびトロンビン（ＰＡＲ１）受容体を含めた非プロスタノイド受容体を介するシグナル伝達に対して、いかなる効果も示さなかったことが確立された。ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、それぞれ、ＤＰ−、ＥＰ１−ＥＰ４−、ＦＰ−またはＩＰ−媒介性シグナル伝達に対していかなる効果も示さないことが確認された。データによって、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８が、最小限の毒性および好ましい細胞透過性を示すことが確認された。
（Ａ）初期試験：Ｕ４６６１９媒介性カルシウム動員に対するＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９の効果
【０１４７】
前述の通り、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９を、それぞれトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２受容体、α（ＴＰα）およびβ（ＴＰβ）イソ型を過剰発現するＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞を使用して、カルシウム動員アッセイによってスクリーニングした。初期スクリーニングには、用量応答アッセイが含まれており、化合物を、０．０００１μＭ（ＴＰβだけ）、０．００１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ（ＴＰαおよびＴＰβ）で使用して、ＴＸＡ２模倣薬Ｕ４６６１９（１μＭ）を阻害するそれらの能力について評価した。化合物を、既に同定された非常に重要なリード化合物ＴＰ２０およびＮＴＰ４との並行アッセイで試験した。結果を以下に示す。
【０１４８】
図１は、ＨＥＫ  ＴＰα細胞（単離株ＨＲ番号４）におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰα（ＨＲ番号４）細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３、ＮＴＰ４４、ＮＴＰ４５、ＮＴＰ４７、ＮＴＰ４８およびＮＴＰ４９と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．００１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭで使用した）、その後、１μＭのＵ４６６１９で刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を二連で処理した少なくとも４回の独立した実験から得られたデータを表す。
【０１４９】
図２は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰβ（ＥＭ番号８）細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３、ＮＴＰ４４、ＮＴＰ４５、ＮＴＰ４７、ＮＴＰ４８およびＮＴＰ４９と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．０００１μＭ、０．００１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭで使用した）、その後、１μＭのＵ４６６１９で刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を二連で処理した少なくとも４回の独立した実験から得られたデータを表す。
【０１５０】
コメント：
先のデータと一致して、参照化合物／リードＴＰ２０およびＮＴＰ４は、ＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞においてＵ４６６１９媒介性カルシウム動員を阻害する。同様に、新しいノーザン群の改変体（ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９）は、様々な度合いだが、両方の細胞株においてＵ４６６１９媒介性応答を阻害する。さらにほとんどの場合、阻害レベルは、ＮＴＰ４について観測されたレベルを超える。先のデータから、最も活性な新しい化合物には、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８が含まれる。これらの化合物を、総用量応答アッセイによってさらに調査して、阻害に関するＩＣ５０値を決定した。
【０１５１】
図３は、ＨＥＫ  ＴＰα細胞（単離株ＨＲ番号４）におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。
【０１５２】
Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰα（ＨＲ番号４）細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．００００１〜１０μＭで使用した）、その後、１μＭのＵ４６６１９で刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を二連で処理した少なくとも３回の独立した実験から得られたデータを表す。
【０１５３】
図４は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰβ（ＥＭ番号８）細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．００００１〜１０μＭで使用した）、その後、１μＭのＵ４６６１９で刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を二連で処理した少なくとも４回の独立した実験から得られたデータを表す。
【表１】
2018519281.tif 000045
【０１５４】
コメント：
先のＳＡＲ研究から、ＴＰ２０およびＮＴＰ４は、非常に重要なリード化合物として同定された。このことと一致して、ＴＰ２０およびＮＴＰ４は、共に、ＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞におけるＵ４６６１９媒介性カルシウム動員を強力に阻害し、ＴＰβ媒介性応答の阻害に関するＩＣ５０値は、ナノモル濃度範囲内にあることが決定付けられた（各細胞株における化合物毎の具体的な図については、表１を参照されたい）。同様に、化合物ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９は、両方の細胞株において、Ｕ４６６１９媒介性応答を強力に阻害した。特に、化合物ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、最も有効であり、これらを、より詳細な分析およびＩＣ５０値の決定のために選択した。ＩＣ５０値は、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８が、ＮＴＰ４よりも有効にＴＰαおよびＴＰβの応答に拮抗し、すなわち、メトキシ基を、ジ−、トリ−フルオロメトキシまたは第三級アミドで置き換えることによって、有効性が改善されたことを示している。３種の化合物、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８を、カルシウムおよび血小板凝集アッセイの両方によって、さらに特徴付けた。
（Ｂ）Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対するＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９の効果：
【０１５５】
第２の独立したアッセイにおいてＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９を評価するために、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集アッセイに対する化合物の効果を調査した。有効性の観点から、このアッセイは明らかに重要なアッセイであり、生理的に治療標的に関してより関連性が高い。
【０１５６】
初期スクリーニングには、用量応答アッセイが含まれており、化合物を、７．８１２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭおよび１２５ｎＭで使用して、ＴＸＡ２模倣薬Ｕ４６６１９（１μＭ）によって誘導された血小板凝集を阻害するそれらの能力について評価した。化合物を、ＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集計を使用して、既に同定された非常に重要なリード化合物ＴＰ２０との並行アッセイで試験した。結果を以下に示す。
【０１５７】
図５は、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対するＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９の効果を示す。健康なボランティアから採血した血液を、３．８％クエン酸ナトリウムおよび１０μＭインドメタシンを含有するシリンジに、抗凝固剤と血液の最終的な比が１：９になるように入れて、ＰＲＰを調製した。ＰＲＰのアリコート（３００μｌ）を、ＴＰアンタゴニスト、ＴＰ２０、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３、ＮＴＰ４４、ＮＴＰ４５、ＮＴＰ４７、ＮＴＰ４８およびＮＴＰ４９と共に１０分間プレインキュベートし、０．２５μＭからの２倍連続希釈物を、それぞれについて調製した後、血小板を１μＭのＵ４６６１９で刺激し、３７℃で撹拌しながらインキュベートした。結果は、ＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集プロファイラーを使用して光透過の経時的変化によって決定される通り、凝集百分率（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として提示され、４回の独立した実験から得られたデータを表す（ｎ＝４）。
【０１５８】
コメント：
参照化合物ＴＰ２０と同様に、新しいＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９化学的実体は、ｅｘ  ｖｉｖｏでヒト血小板のＵ４６６１９媒介性凝集を強力に阻害し、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、最も有効である。したがって、その後のアッセイでは、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対するＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８、ならびに参照化合物としてのＴＰ２０およびＮＴＰ４の効果を、ＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集計を使用して並行比較した。
【０１５９】
図６は、Ｕ４６６１９媒介性血小板凝集に対するＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８の効果を示す。健康なボランティアから採血した血液を、３．８％クエン酸ナトリウムおよび１０μＭインドメタシンを含有するシリンジに、抗凝固剤と血液の最終的な比が１：９になるように入れて、ＰＲＰを調製した。ＰＲＰのアリコート（３００μｌ）を、ＴＰアンタゴニスト、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８と共に１０分間プレインキュベートし、１μＭからの２倍連続希釈物を、それぞれについて調製した後、血小板を１μＭのＵ４６６１９で刺激し、３７℃で撹拌しながらインキュベートした。結果は、ＰＡＰ−８Ｅ血小板凝集プロファイラーを使用して光透過の経時的変化によって決定される通り、凝集百分率（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として提示され、少なくとも３回の独立した実験から得られたデータを表す（ｎ≧３）。
【表２】
2018519281.tif 000046
【０１６０】
コメント：
化合物ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、Ｕ４６６１９媒介性応答を阻害し、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８は、共に、ＴＰ２０またはＮＴＰ４のいずれかよりも強力であった。ＮＴＰ４３は、Ｕ４６６１９媒介性応答を阻害するのにＮＴＰ４と等しい効力を示した。
（Ｃ）特異性試験：ｈＩＰ媒介性およびＥＰ３媒介性カルシウム動員に対するＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９の効果
【０１６１】
新しいＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９化合物の特異性を確認するために、ｈＩＰ（シカプロスト）媒介性およびＥＰ（ＰＧＥ２）媒介性応答に対するそれらの効果を、それぞれＨＥＫ．ｈＩＰおよびＨＥＬ９２．１．７細胞で調査した。化合物を１０μＭで試験し、結果を以下に示す。
【０１６２】
図７は、ＨＥＫ．ｈＩＰ細胞におけるシカプロスト媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ｈＩＰ細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３、ＮＴＰ４５、ＮＴＰ４７、ＮＴＰ４８およびＮＴＰ４９と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り１０μＭで使用した）、その後、１μＭのシカプロストで刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を三連で処理した少なくとも３回の独立した実験から得られたデータを表す。ＨＥＫ．ｈＩＰ細胞。
【０１６３】
図８は、ＨＥＬ９２．１．７細胞におけるＥＰ／ＰＧＥ２媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＬ９２．１．７細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４３と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り１０μＭで使用した）、その後、１μＭのシカプロストで刺激した。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、細胞を三連で処理した３回の独立した実験から得られたデータを表す。１μＭのＰＧＥ２。
【０１６４】
コメント：本明細書で、データは、ＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４９が、特異性に関して全く問題がなく、ＴＰ／Ｕ４６６１９媒介性応答の拮抗作用に対して高度に特異的であることが実証されたことを示す。
【０１６５】
（実施例２：（ＰＧ）Ｆ２α拮抗作用）
イソプロスタンである８−イソ−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２αの作用に拮抗するＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８、ならびに参照としてのＮＴＰ４およびＴＰ２０の能力の実証。
８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員に対するＮＴＰ４２〜ＮＴＰ４８の効果
【０１６６】
さらに、Ｕ４６６１９媒介性応答に拮抗する化合物を評価するために、部分ＴＰアゴニストである８−イソ−ＰＧＦ２αを阻害するＮＴＰ４２およびＮＴＰ４３の能力を、ＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞におけるカルシウム動員アッセイを介して調査した。
【０１６７】
図９および１０は、ＨＥＫ  ＴＰβ細胞における８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員に対するＴＰアンタゴニストの効果を示す。
【０１６８】
図９は、Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰα細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．００００１〜１０μＭで使用した）、その後、１０μＭの８−イソ−ＰＧＦ２αで刺激した後の結果を示す。
【０１６９】
図１０は、Ｆｌｕｏ−４を予め負荷したＨＥＫ．ＴＰβ細胞を、ＴＰ２０、ＮＴＰ４、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８と共にインキュベートし（各アンタゴニストを、示されている通り０．００００１〜１０μＭで使用した）、その後、１０μＭの８−イソ−ＰＧＦ２αで刺激した後の結果を示す。データは、ビヒクル処理細胞におけるアゴニスト誘導性応答の平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）百分率（対照に対する百分率；％）として提示され、ＮＴＰ４８を除き、細胞を二連で処理した少なくとも３回の独立した実験から得られたデータを表す。
【０１７０】
表３は、ＨＥＫ．ＴＰαおよびＨＥＫ．ＴＰβ細胞における８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員の阻害に関する推定ＩＣ５０値を表し、ＴＰアンタゴニストがない状態の部分アゴニストは、１１２±３．２６（ｎ＝１２）および９６．１±２．５２（ｎ＝８）の応答をそれぞれ媒介した。
【表３】
2018519281.tif 000047
【０１７１】
結論：
データによって、新しい非常に重要なリード化合物、すなわちＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム応答の強力な阻害剤であることが確認された。さらに、データ（先に提示）によって、ＮＴＰ４２、ＮＴＰ４３およびＮＴＰ４８は、ＴＰ２０およびＮＴＰ４よりも強力であることが確認される。各細胞株におけるＴＰアンタゴニストによる８−イソ−ＰＧＦ２α媒介性カルシウム動員の阻害に関する序列は、以下の通りである。
ＴＰα：ＮＴＰ４２＞ＮＴＰ４８≧ＮＴＰ４３＞ＴＰ２０＞ＮＴＰ４
ＴＰβ：ＮＴＰ４２≧ＮＴＰ４３＞ＮＴＰ４８＞ＴＰ２０＞ＮＴＰ４  。
【０１７２】
（実施例３：特異性）
図１１〜１７は、さらなる特異性試験の例であり、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８のいずれも、その他のプロスタノイド受容体（すなわち、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２受容体、ＤＰ；ＰＧＥ２受容体ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４；ＰＧＦ２α受容体、ＦＰ；ＰＧＩ２／プロスタサイクリン受容体、ＩＰ）を介するシグナル伝達に対していかなる効果も示さなかったことを示している。
【０１７３】
図１１は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＤＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７４】
図１２は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＥＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７５】
図１３は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＥＰ２受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７６】
図１４は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＥＰ３受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７７】
図１５は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＥＰ４受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７８】
図１６は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＦＰ１受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１７９】
図１７は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、ＩＰ受容体に対して効果を示さないことを示す。
【０１８０】
ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８は、それぞれ、ＤＰ−、ＥＰ１−ＥＰ４−、ＦＰ−またはＩＰ媒介性シグナル伝達に対していかなる効果も示さなかったことが確認された。
【０１８１】
ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８のいずれかの存在下で観測された非ＴＰ媒介性シグナル伝達の大部分は、阻害されないか、または最小限にしか阻害されない。シグナル伝達の阻害が存在している場合、１０μＭ濃度のみで観測される。例えば、ＮＴＰ４２は、ほんの１０μＭでＤＰ１、ＥＰ１、ＥＰ４およびＩＰを最大限阻害し、応答における百分率の低下は、それぞれ＜３０％、約５５％、４０％および５０％である。ＮＴＰ４８は、ＮＴＰ４２と比較して、非ＴＰプロスタノイド受容体のシグナル伝達に対する効果が少なく、したがって、この文脈ではより好ましいとみなすことができる。
【０１８２】
図１８は、ＴＰ媒介性またはＵ４４０６９媒介性シグナル伝達に対する、阻害に関するＩＣ５０値を含めたＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８の効果を示す（ＣＥＲＥＰは、Ｕ４６６１９ではなく関連のＵ４４０６９を使用する）（表４も参照されたい）。それらの効果は、ＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８が、Ｕ４６６０９またはＴＰの強力なアンタゴニストであることを示す。ＩＣ５０値の差異は、細胞型、アゴニスト、カルシウム指示薬などの差異を含めた、アッセイの特定条件の差異に起因し得る。
【０１８３】
表４は、代替ＴＰアゴニストＵ４６６０９による細胞の刺激後の、ＴＰ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ動員に拮抗するＮＴＰ４２およびＮＴＰ４８のＩＣ５０値の一例である。
【表４】
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【０１８４】
（実施例４：有効性）
図１９〜２３は、ラットの肺動脈高血圧（ＰＡＨ）のモノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔｏｌｉｎｅ）（ＭＣＴ）誘導性モデルにおけるＮＴＰ４２の有効性を示す。手短には、雄性Ｗｉｓｔａｒ／Ｋｙｏｔｏラットに、単回用量のＭＣＴ（６０ｍｇ／ｋｇ、皮下）を与え、次に薬物ビヒクル、試験物質ＮＴＰ４２（０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）または参照化合物であるシルデナフィル（５０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）またはＴＰ２０（０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）のいずれかで１日２回の用量（経口投薬）で２８日間処置した。対照として、一群のラットを、未処置のままにし、すなわちＭＣＴも治療薬物も与えなかった。ＭＣＴ誘導後の２８日目に、ラットを、心臓外科手術のために麻酔し、血行動態パラメータを記録した。その後、気管、心臓および肺をひとまとめに取り出し、心臓および肺の湿重量を記録し、次に肺を組織病理学のために回収し、固定し、処理した。
【０１８５】
図１９は、拡張期肺動脈圧（ｄＰＡＰ）に対する試験物質の効果を示す。
【０１８６】
図２０は、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）に対する試験物質の効果を示す。
【０１８７】
図２１は、平均全身動脈圧（ｍＡＰ）に対する試験物質の効果を示す。
【０１８８】
図２２は、Ｆｕｌｔｏｎ指数に対する試験物質の効果を示す。
【０１８９】
図１９〜２２では、対照（Ｃｔｒ）は、ＭＣＴでも試験／参照化合物でも処置しなかった動物を指し、陰性対照（Ｎ．Ｃ．）は、ＰＡＨを誘導するためにＭＣＴで処置したが、試験／参照化合物では処置しなかった動物を指す。
【０１９０】
図２３は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ａｐｅｒｉｏ画像取込みシステムを使用して走査した後のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織切片を示す。代表的な画像は、肺血管再構築（上パネル、白色矢印）および肺胞気腔（下パネル）の程度を示す。各画像の横スケールバーは、１００μＭに相当し、すべての画像を、２０倍の拡大率で取り込んだ。
【０１９１】
Ａｐｅｒｉｏ製ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して、Ｈ＆Ｅ染色し、デジタル的に走査した肺切片を分析し、下部、中間部および上部の肺組織切片１つ当たり１０の無作為な正方形（およそのサイズまたは各正方形＝１×１０６μｍ２）を、分析のために選択した。各正方形内の、すべての血液細動脈（各正方形内の完全な細動脈、ならびに右および下に接触するものを評価したが、正方形の左または上は評価しなかった）を、管腔および全血管径についてＩｍａｇｅＳｃｏｐｅで測定し、内腔  対  全血管径の比を、細動脈毎に決定した。
【０１９２】
図２４〜２７は、すべての細動脈（全体）、ならびにサイズ：小、＜５０μｍの全直径、中、５０〜１００μｍおよび大、＞１００μｍによって分類された細動脈の、平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）内腔：全血管径の比に対する試験物質の効果を示す。
【０１９３】
図２４〜２７は、ＭＣＴ誘導性ＰＡＨにおける血管再構築に対するＮＴＰ４２の効果の形態計測分析を示す。
【０１９４】
図２４は、全細動脈の平均（±ＳＥＭ）内腔：全血管径の比を表すデータを示す。
【０１９５】
図２５は、小細動脈（＜５０μｍ）の平均（±ＳＥＭ）内腔：全血管径の比を表すデータを示す。
【０１９６】
図２６は、中細動脈（５０〜１００μｍ）の平均（±ＳＥＭ）内腔：全血管径の比を表すデータを示す。
【０１９７】
図２７は、大細動脈（＞１００μｍ）の平均（±ＳＥＭ）内腔：全血管径の比を表すデータを示す。図２４〜２７では、アスタリスクは、ＭＣＴで処置した群の内腔：全血管径の比が、偽対照／非ＭＣＴ群から統計的に低下していることを示し、ハッシュマークは、シルデナフィル、ＴＰ２０およびＮＴＰ４２で処置した動物の内腔：全血管径の比が、ＭＣＴだけで処置した動物から著しく増大していることを示し、＊／＃、ｐ＜０．０５、＊＊／＃＃、ｐ＜０．０１および＊＊＊／＃＃＃、ｐ＜０．０００１である。
【０１９８】
図２８では、ＦＦＰＥ肺組織切片を、Ｈ＆Ｅで染色し、デジタル的に走査した（Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ）。代表的画像は、小、中および大細動脈における肺血管再構築の程度を示す。横スケールバーは、５０μｍ（小および中細動脈）および１００μｍ（大細動脈）に相当し、画像を、４０倍の拡大率で取り込んだ。図２８の代表的画像は、小、中および大血管における肺血管再構築の程度を示す。各画像の横スケールバーは、５０μｍ（小および中血管）または１００μｍ（大血管）に相当し、すべての画像を、４０倍の拡大率で取り込んだ。
【０１９９】
図２８は、血管再構築または筋性動脈化（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を評価する独立した尺度としての、血管壁における平滑筋細胞を検出するために抗アルファ平滑筋アクチン抗体を使用する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）後のＦＦＰＥ肺組織切片を示す。染色されたスライドを、Ａｐｅｒｉｏ画像取込みシステムを使用して走査し、上パネルの代表的画像は、中細動脈（直径５０〜１００μｍ）における肺血管再構築の程度を示す。各画像の横スケールバーは、５０μｍに相当し、すべての画像を、２０倍の拡大率で取り込んだ。下パネルは、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅのＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｉｘｅｌアルゴリズムｖ９．０によって決定された通り、陽性（黄色から赤色）および陰性（青色）染色の強度を示す。
【０２００】
結論として、図１９〜２８のＮＴＰ４２によって例示される本発明の化合物は、ＭＣＴ−ＰＡＨに対する動物被験体の血行動態特徴および組織学的特徴の測定によって示される通り、ＭＣＴ誘導性ＰＡＨモデルにおいて有効である。
【０２０１】
（実施例５：血管再構築）
図２９は、α−ＳＭＡのＩＨＣによって評価したＭＣＴ誘導性ＰＡＨにおける血管再構築に対するＮＴＰ４２の効果を示す。ＦＦＰＥ肺組織切片を、抗α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ；上の図、褐色染色）抗体で免疫染色し、ヘマトキシリン（上の図、青色の核）で核対比染色し、その後、デジタル走査（Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ）を行った。上の代表的画像は、細動脈の周りの平滑筋層のα−ＳＭＡ（褐色）免疫染色を示し、中（直径５０〜１００μｍ）細動脈における肺血管再構築の程度を示す。下の図は、Ａｐｅｒｉｏ製のＩｍａｇｅＳｃｏｐｅのＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｉｘｅｌアルゴリズムｖ９．０を使用して評価した通り、陰性（青色）または陽性染色（黄色／赤色）の強度を示す。横スケールバーは、５０μｍに相当し、画像を、２０倍の拡大率で取り込んだ。
【０２０２】
付録
表５は、ＮＴＰ参照名と式の番号の対応である。左欄の任意の項目は、右欄の式と定義され、その逆も同様である。
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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