(57)【要約】本開示は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する抗体と同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合するＡＰＲＩＬ結合抗体に関する。本開示の抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク配列の選択された特定のものを含み、かつｈＡＰＲＩＬ．０１Ａに比較して予想外の特色を有する。本開示はさらに、本発明の抗体を含む組成物、ならびに該抗体および組成物の医学的および診断的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する抗体断片などの抗体類似体を含む抗体と同じヒトＡＰＲＩＬエピトープへの結合に関して競合する、抗体断片などの抗体類似体を含むＡＰＲＩＬ結合抗体であって、前記ＡＰＲＩＬ結合抗体が、ＶＨおよびＶＬドメインを含む複数の抗原結合部位を含み、抗原結合部位において、前記ＶＨドメインのフレームワーク配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６、１８、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１８から選択されるＶＨアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有し、かつ前記ＶＬドメインのフレームワーク配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のフレームワークアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する、ＡＰＲＩＬ結合抗体。
【請求項２】
−  前記ＶＨドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つ、好ましくは３つ全てが、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、もしくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選択され；かつ／または
−  前記ＶＬドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つ、好ましくは３つ全てが、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９および１０、もしくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選択される、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４４、４６、４８、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４または４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する重鎖アミノ酸配列内にあり、かつ前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する軽鎖アミノ酸配列内にある、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＶＨアミノ酸配列において、７２位のアミノ酸がＳであり、前記ＶＨアミノ酸配列が、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、３４、３６、３８または４０から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
少なくとも７０％の配列類似性が、少なくとも８５％の配列類似性である、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
少なくとも７０％の配列類似性が、少なくとも９０％の配列類似性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
少なくとも７０％の配列類似性が、少なくとも９５％の配列類似性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
少なくとも７０％の配列類似性が、少なくとも９９％の配列類似性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＶＨアミノ酸配列において、６７位のアミノ酸がＫであり、かつ６８位のアミノ酸がＡであり、前記ＶＨアミノ酸配列が、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
以下の特色の１つまたは複数を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体：
−  ヒトＡＰＲＩＬと約１００ｎＭ以下のＫＤで結合する；
−  ヒトＢＣＭＡおよびヒトＴＡＣＩへのヒトＡＰＲＩＬの結合を約１００ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断する；
−  ヒトＡＰＲＩＬへのｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの結合を約１００ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断する。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１３、１５、１７、より好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１７から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列であり、かつ前記ＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の複数のポリヌクレオチドを適切な調節配列の制御下に含む、複数の発現ベクターを含む発現単位であって、複数の前記ポリヌクレオチドが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードし、かつ前記ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、前記ＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列と同じまたは異なる発現ベクター上にあり得る、発現単位。
【請求項１３】
請求項１１に記載の複数のポリヌクレオチド、ならびに／または請求項１２に記載の発現単位、好ましくは前記ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列および前記ＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列の両方を含む発現ベクターを含む発現単位を含む、宿主細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１３に記載の宿主細胞を、複数の前記ポリヌクレオチドが発現される条件下の培地中で培養し、それにより軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生成すること；ならびに
ｂ）前記宿主細胞または培地から前記ポリペプチドを回収すること
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を生成する方法。
【請求項１５】
担体または希釈剤、好ましくは医薬的に許容し得る担体または希釈剤との、および場合により複数の他の活性化合物、特に、メルファラン；ビンクリスチン；フルダラビン；クロラムブシル；ベンダムスチン；エトポシド；ドキソルビシン；シクロホスファミド；シスプラチン；例えばデキサメタゾン、プレドニゾロンといったコルチコステロイド、例えばサリドマイド、レナリドミド、ポマリドミドといったサリドマイド類似体などの免疫調整剤；例えばイブルチニブ、イデラリシブといったキナーゼ阻害剤；リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）などのＣＤ２０を標的とする抗体治療薬；アレムツズマブなどのＣＤ５２を標的とする抗体治療薬；ダラツムマブなどのＣＤ３８を標的とする抗体治療薬；サリルマブ、トシリズマブなどのＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体を標的とする抗体治療薬；エロツズマブなどのＣＳ−１を標的とする抗体治療薬；ＧＳＫ２８５７９１６などのＢＣＭＡを標的とする抗体治療薬；タバルムマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）などのＢＡＦＦもしくはＢＬｙｓｓを標的とする抗体治療薬；パミドロナートもしくはゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）などのビスホスホナート；またはボルテゾミブから選択されるような複数の治療活性化合物との組み合わせで請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１６】
治療、好ましくは
ａ．免疫細胞の増殖および／もしくは生存の阻害；
ｂ．癌の処置；
ｃ．自己免疫疾患の処置；
ｄ．炎症性疾患の処置；または
ｅ．免疫グロブリンレベルの低下が有益となる状態の処置
から選択される１つまたは複数を目的とする治療
における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む、対象、好ましくはヒト対象を処置するための方法。
【請求項１８】
前記処置が、
ａ．免疫細胞の増殖および／もしくは生存の阻害；
ｂ．癌の処置；
ｃ．自己免疫疾患の処置；
ｄ．炎症性疾患の処置；または
ｅ．免疫グロブリンレベルの低下が有益となる状態の処置
から選択される１つまたは複数を目的とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
診断方法、好ましくはフローサイトメトリー、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学的検査から選択される診断方法などのエクスビボまたはインビトロ診断方法における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
ＶＨ１１．ＶＬ１５、ＶＨ１２．ＶＬ１５、ＶＨ１３．ＶＬ１５、ＶＨ１４．ＶＬ１５、ＶＨ１４＿１．ＶＬ１５、ＶＨ１４＿１Ｃ．ＶＬ１５、ＶＨ１４＿１Ｄ．ＶＬ１５、ＶＨ１４＿１Ｅ．ＶＬ１５、およびＶＨ１４＿１Ｇ．ＶＬ１５からなる群から選択される重鎖可変領域・軽鎖可変領域対を含む、ヒト化抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２０に記載のヒト化抗体の発現をもたらすように構成された調節配列に機能的に連結された前記ヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトＡＰＲＩＬに結合する、抗体断片を含む単離された抗体、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、および前記抗体を産生する宿主細胞に関する。該抗体は、癌を処置するのに、免疫細胞増殖を阻害するのに、そして自己免疫疾患、炎症性疾患または免疫グロブリンの過剰産生に関連する疾患などの免疫細胞増殖のそのような阻害により利益を受け得る状態を阻害するのに用いることができる。加えて、該抗体は、免疫細胞増殖および／または生存の阻害のための診断ツールおよびインビトロ薬として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＡＰＲＩＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質として発現されるが、他のほとんどのＴＮＦファミリーメンバーと異なり、それは主に分泌タンパク質として処理されてゴルジ体内で切断され、そこでフューリン転換酵素（ｆｕｒｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）によって切断されて、可溶性活性形態を放出する（Ｌｏｐｅｚ−Ｆｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ２：９４５−５１）。ＡＰＲＩＬは、タンパク質フォールドにおいて複数の他のＴＮＦファミリーリガンドと類似の構造的相同性を有する非共有結合でつながったホモトリマーとして構成される（Ｗａｌｌｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４３，  ２８３−９０）。ＡＰＲＩＬは、２つのＴＮＦ受容体：Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ならびに、膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１８（１）  ：１−８において論評）。加えて、ＡＰＲＩＬは近年になり、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することが示された（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １２，  ６３７−４８）。ＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞シグナル伝達における役割を担い、インビトロでヒトおよびマウスＢ細胞の増殖および生存の両方を引き起こすことが示された（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１８（１）  ：１−８において論評）。
【０００３】
ＡＰＲＩＬは主に、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞およびＴ細胞などの免疫細胞サブセットによって発現され、それらの多くは、ＢＡＦＦも発現する。加えて、ＡＰＲＩＬは、破骨細胞、上皮細胞および様々な腫瘍組織などの非免疫細胞によって発現され得る（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１８（１）：１−８において論評）。事実、ＡＰＲＩＬは元々、癌細胞内での発現に基づいて同定された（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８，  １１８５−９０）。ＡＰＲＩＬ  ｍＲＮＡの高レベルの発現が、一連の腫瘍細胞株およびヒト原発腫瘍、例えば結腸およびリンパ球の癌腫において見出された。
【０００４】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者９５名での後向き研究で、血清中のＡＰＲＩＬレベル上昇が示され、それは疾患進行および全患者生存率に相関し、ＡＰＲＩＬ血清レベルの高い患者で予後不良であった（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９２，  １２８４−５）。同様にＡＰＲＩＬ（のレベル上昇）が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）において発現されることが示された（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１８（１）：１−８において論評）  。ＤＬＢＣＬ患者（ＮＨＬ）における後向き研究から、癌病変における高発現のＡＰＲＩＬが、生存率低下に相関することが示された（Ｓｃｈｗａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｂｌｏｏｄ  １０９，  ３３１−８）。近年になり、大腸癌に罹患した患者の血清中ＡＰＲＩＬレベルが、正の診断値を有することが示された（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ  ．ｃｌｉｎｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３．０６．００８）。
【０００５】
Ｂ細胞の生物学における役割によって、ＡＰＲＩＬは、多くの自己免疫疾患における役割も担う。血清中高レベルのＡＰＲＩＬが、多くのＳＬＥ患者において報告された（Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６４，  １０６５−７）。後向き分析から、血清中ＡＰＲＩＬレベルが抗ｄｓＤＮＡ抗体力価と相関する傾向があることが明らかとなった。同じく炎症性関節炎患者の滑液において、骨関節炎などの非炎症性関節炎に罹患した患者の滑液に比較して有意なＡＰＲＩＬレベル上昇が検出された（Ｓｔｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６，  ３５１−８；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４８，  ９８２−９２）。
【０００６】
複数の研究が、より広範囲の全身免疫性リウマチ疾患（現在は、シェーグレン症候群、ライター症候群、乾癬性関節炎、多発性筋炎、および強直性脊椎炎も含む）に罹患した患者の血清中ＡＰＲＩＬの存在に焦点をあてており、これらの患者において有意に上昇したＡＰＲＩＬレベルを見出しており、これらの疾患におけるＡＰＲＩＬの重要な役割も示唆される（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ６１，  １６６−９；  Ｒｏｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，  ４３１４−２１）。加えて、血清中ＡＰＲＩＬレベルの上昇が、アトピー性皮膚炎に罹患した患者の血清中で検出された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １７，  １９７−２０２）。同じく、血清中ＡＰＲＩＬレベルは、敗血症において上昇しており、重篤疾患患者の死亡率を予測させる（Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，  ２０１３，  ｈｔｔｐ：  ／／ｄｘ．ｄｏｉ．  ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ  ．  ｊｃｒｃ．２０１２．１１．００７）。さらに血清中ＡＰＲＩＬレベルは、ＩｇＡ腎症に罹患した患者において上昇することが見出された（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２１  （１０）：  ３９９１−４００２）。
【０００７】
最後に、ＡＰＲＩＬ発現の増加は、多発性硬化症（ＭＳ）にも関連づけられている。ＡＰＲＩＬ発現は、正常対照に比較して、ＭＳ罹患者の星状細胞で増加することが見出された。これは、グリオブラストーマ中、およびグリオブラストーマ患者の血清中での記載されたＡＰＲＩＬ発現と一致する（Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，  ３００５−１２；  Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ８，  ４０３−１０）。
【０００８】
ＡＰＲＩＬは、複数のＢ細胞悪性腫瘍、そして潜在的に一部の固形腫瘍においても、生存および増殖能において重要な役割を担う。ＡＰＲＩＬはまた、炎症性疾患または自己免疫性におけるキープレイヤーとして浮上してきた。したがってＡＰＲＩＬをアンタゴナイズする方策が、複数のこれらの疾患にとっての治療目標である。実際、ＴＡＣＩ−Ｆｃ（アタシセプト）でＡＰＲＩＬを標的にする臨床試験が、複数の自己免疫疾患の処置について現在続行中である。しかしＴＡＣＩ−Ｆｃは、正常なＢ細胞の維持に関与する因子ＢＡＦＦも標的にする。ＡＰＲＩＬに対する抗体が、ＷＯ９６１４３２８、ＷＯ２００１／６０３９７、ＷＯ２００２／９４１９２、ＷＯ９９１２９６５、ＷＯ２００１／１９６５２８、ＷＯ９９００５１８およびＷＯ２０１０／１０００５６に記載されている。ＷＯ２０１０／１０００５６には、ＡＰＲＩＬを特異的に標的にする抗体が記載されている。ＷＯ２０１０／１０００５６の抗体は、ＴＡＣＩへのＡＰＲＩＬの結合を完全に遮断し、ＢＣＭＡへの結合は少なくとも部分的に遮断する。抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方への結合を完全に遮断する。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗体は、インビトロおよびインビボでのＢ細胞の増殖、生存および抗原特異性免疫グロブリン分泌を阻害した（Ｇｕａｄａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｂｌｏｏｄ  １１７  （２５）：  ６８５６−６５）。加えて、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、ヒトのＣＬＬおよびＭＭ疾患を表すインビトロおよびインビボでの悪性腫瘍細胞の増殖および生存を阻害した（Ｇｕａｄａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｂｌｏｏｄ  １１７  （２５）：  ６８５６−６５；  Ｌａｓｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｂｌｏｏｄ  １２２（２４）：  ３９６０−３；  Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  ＡＳＨ  ｐｏｓｔｅｒ  ２０９８）。最後に、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、抗原特異性ＩｇＡの分泌を阻害した（Ｇｕａｄａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｂｌｏｏｄ  １１７  （２５）：  ６８５６−６５）。これらの独特の結合特性を鑑みれば、このマウス抗体は、独特の医薬的効用を有する。しかし、マウス起源であるゆえ、ヒトの医薬におけるこの抗体の医薬的効用には特定の欠点も存在する。それゆえ本発明は、ヒト医薬における使用により適する改変ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗体を提供することを対象とする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域の特定の置換を含むｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体を提供する。驚くべきことに、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位において、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＨドメインのフレームワーク領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６または１８から選択されるＶＨアミノ酸配列由来のフレームワーク領域で置換され、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＬドメインのフレームワーク領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０から選択されるＶＬアミノ酸配列のフレームワーク領域で置換された場合に、機能的ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体が得られることが見出された。ヒト起源である代替的ＶＨおよびＶＬフレームワーク配列の限定的組み合わせのみが、ヒトＡＰＲＩＬへのｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＣＤＲの適当な結合を補助し得ること、つまり機能的なｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体をもたらし得ることが、本発明の発明者らによる研究で示されたという事実を鑑みて、これは驚くべきことである。加えて、本発明の発明者らは、ｈＡＰＲＩＬ．０１類似体のさらなる改善が特定の特異的アミノ酸置換を導入することによって得られる可能性を示した。特に、選択されたＶＨアミノ酸配列における、Ｒ７２Ｓのアミノ酸置換および／またはＶ６８Ａと組み合わせたＲ６７Ｋの二重置換である。
【００１０】
したがって第一の態様による本発明は、ＷＯ２０１０／１０００５６に開示されたモノクローナル抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡなどのｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する抗体と同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合するＡＰＲＩＬ結合抗体に関し、前記ヒトＡＰＲＩＬ結合抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインを含む複数の抗原結合部位を含み、抗原結合部位において、ＶＨドメインのフレームワーク配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６または１８から選択されるＶＨアミノ酸配列のフレームワーク配列と、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１８の該フレームワーク配列と、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の該フレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有し、ＶＬドメインのフレームワーク配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０から選択されるＶＬアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする、単離された形態のポリヌクレオチド、複数の該ポリヌクレオチドを含む発現単位、ならびに該発現単位および／または複数の該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体を生成する方法であって、
ａ）本発明の宿主細胞を、該複数のポリヌクレオチドが発現される条件下の培地中で培養し、それにより該軽鎖および重鎖可変領域を含むポリヌクレオチドを生成すること；ならびに
ｂ）該宿主細胞または培地から該ポリヌクレオチドを回収すること
を含む方法に関する。
【００１３】
医薬的に許容し得る担体または希釈剤との、および場合により複数の他の活性化合物との組み合わせで本発明の抗体を含む組成物が、本発明のさらなる態様の主題である。
【００１４】
本発明の抗体の治療的および診断的使用が、本発明のさらに別の態様である。
【００１５】
配列の簡単な説明
配列表に表された配列は、フレームワーク配列が本発明による抗体内で用いられ得るＶＨおよびＶＬドメインの、そして重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列に関する。加えて、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＨドメインおよびＶＬドメイン両方のＣＤＲのアミノ酸配列と、該重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が、表される。本発明の特定の実施形態によれば、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＣＤＲが、本発明の抗体内で用いられる。以下の表１では、配列ＩＤをそれらの各配列に対応させている。
【００１６】
（表１）配列表
2018502918.tif 000002
2018502918.tif 000003
2018502918.tif 000004
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜５２は、示されたような改変免疫グロブリンＶＨ、ＶＬ、重鎖または軽鎖配列に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】Ｔ細胞非依存性Ｂ細胞応答に関するインビボテストにおいてｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは類似体１４＿１Ｇ．１５でＡＰＲＩＬを標的とした結果を示す。トランスジェニックマウス（ＡＰＲＩＬ−Ｔｇ）にＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ  ２５０μｇをチャレンジし（０日目）、−１日目および３日目にｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは１４＿１Ｇ．１５で処置した。ＰＢＳおよび野生型マウス（ＷＴ）を、陰性対照として用いた。免疫グロブリン力価（ＩｇＡ１）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。１４＿１Ｇ．１５は、ＮＰ−ＦｉｃｏｌｌへのＴ細胞非依存性免疫応答をｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体よりも有効に阻害した。
【図１Ｂ】Ｔ細胞非依存性Ｂ細胞応答に関するインビボテストにおいてｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは類似体１４＿１Ｇ．１５でＡＰＲＩＬを標的とした結果を示す。トランスジェニックマウス（ＡＰＲＩＬ−Ｔｇ）にＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ  ２５０μｇをチャレンジし（０日目）、−１日目および３日目にｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは１４＿１Ｇ．１５で処置した。ＰＢＳおよび野生型マウス（ＷＴ）を、陰性対照として用いた。免疫グロブリン力価（ＩｇＡ２）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。１４＿１Ｇ．１５は、ＮＰ−ＦｉｃｏｌｌへのＴ細胞非依存性免疫応答をｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体よりも有効に阻害した。
【図１Ｃ】Ｔ細胞非依存性Ｂ細胞応答に関するインビボテストにおいてｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは類似体１４＿１Ｇ．１５でＡＰＲＩＬを標的とした結果を示す。トランスジェニックマウス（ＡＰＲＩＬ−Ｔｇ）にＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ  ２５０μｇをチャレンジし（０日目）、−１日目および３日目にｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは１４＿１Ｇ．１５で処置した。ＰＢＳおよび野生型マウス（ＷＴ）を、陰性対照として用いた。免疫グロブリン力価（ＩｇＧ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。１４＿１Ｇ．１５は、ＮＰ−ＦｉｃｏｌｌへのＴ細胞非依存性免疫応答をｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体よりも有効に阻害した。
【図１Ｄ】Ｔ細胞非依存性Ｂ細胞応答に関するインビボテストにおいてｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは類似体１４＿１Ｇ．１５でＡＰＲＩＬを標的とした結果を示す。トランスジェニックマウス（ＡＰＲＩＬ−Ｔｇ）にＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ  ２５０μｇをチャレンジし（０日目）、−１日目および３日目にｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたは１４＿１Ｇ．１５で処置した。ＰＢＳおよび野生型マウス（ＷＴ）を、陰性対照として用いた。免疫グロブリン力価（ＩｇＭ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。１４＿１Ｇ．１５は、ＮＰ−ＦｉｃｏｌｌへのＴ細胞非依存性免疫応答をｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体よりも有効に阻害した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な記載
したがって本発明は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する抗体断片などの抗体類似体を含む抗体と同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合する抗体に関する。抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの配列と共にＷＯ２０１０／１０００５６に開示されている。本発明の発明者らは、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＨおよびＶＬドメインのマウスフレームワーク領域をヒト代替物によって置換する限定的可能性が存在することを見出した。加えて、選択された代替的フレームワーク配列が、予想外の特色を有する代替的抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体をもたらす。選択されたフレームワーク配列が、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合することに関連する特別な特色を明らかにし、それによりこの状況において広い効用を有すると考えられる。それゆえ本発明は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じエピトープに結合し、ＶＨおよびＶＬドメインにおいて選択されたフレームワーク配列を含む、任意の抗体（断片および／または誘導体および／または類似体を含む）を対象とする。特定の実施形態において、そのような抗体は、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＣＤＲと異なる代替的ＣＤＲを含む。しかし他の実施形態によれば、該抗体は、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＣＤＲと類似または同一のＣＤＲを含む。特定の実施形態によれば、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または前記配列のいずれかの変異体を含む抗体は、モノクローナル抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合する抗体と見なされなければならない。これは、該抗体がヒトＡＰＲＩＬと約１００ｎＭ以下のＫＤで結合する場合、ならびに／またはヒトＢＣＭＡおよびＴＡＣＩへのヒトＡＰＲＩＬの結合を約１００ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断する場合に、特にあてはまる。本発明において、好ましい抗体は、ヒトＡＰＲＩＬと約１００ｎＭ以下のＫＤ値、例えば１００〜０．００１ｎＭから選択される範囲、例えば１００〜０．０１０、１００〜０．０５０、１００〜０．１００、１００〜０．１５０、１００〜０．２００、１００〜０．２５０、１００〜０．３００、１００〜０．３５０、１００〜０．４００、１００〜０．４５０、９０〜０．５００、８０〜０．５５０、７０〜０．６００、６０〜０．６５０、５０〜０．７００、４０〜０．７５０、３０〜０．８００、２０〜０．８５０、１０〜０．９００または１．０〜０．９５０ｎＭのＫＤ値で結合する。当業者に理解される通り、５０、２０、１０、１．００ｎＭ未満の値など、より低い値がＫＤに好ましい。そのような範囲のＫＤ値を有する抗体は、臨床用途に適している（例えば、Ｐｒｅｓｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８５：３７９−３８９；  Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３８：１７−２３；  Ｃａｒｎａｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ  ．，  ２００３，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （Ｓｕｐｐｌ．）  ９：  ３９８２ｓ−３９９０ｓ参照）。抗体親和性は、例えば実施例の節に例示された通り、当業者に知られる標準的な分��を利用して決定することができる。
【００２０】
本発明の抗体が、ヒトＢＣＭＡおよびＴＡＣＩへのヒトＡＰＲＩＬの結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０値、例えば１００〜０．００１ｎＭから選択される範囲、例えば１００〜０．０１０、１００〜０．０５０、１００〜０．１００、１００〜０．１５０、１００〜０．２００、１００〜０．２５０、１００〜０．３００、１００〜０．３５０、１００〜０．４００、１００〜０．４５０、９０〜０．５００、８０〜０．５５０、７０〜０．６００、６０〜０．６５０、５０〜０．７００、４０〜０．７５０、３０〜０．８００、２０〜０．８５０、１０〜０．９００または１．０〜０．９５０ｎＭのＩＣ５０値で遮断する場合が、さらに好ましい。当業者に理解される通り、５０、２０、１０、１．００ｎＭ未満の値など、より低い値がＩＣ５０に好ましい。
【００２１】
ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じエピトープへの該抗体の結合は、ＷＯ２０１０／１０００５６の実施例２もしくは５に表された方法、または以下に議論されるような当業者に知られる他のクロスブロッキングもしくはエピトープマッピング技術に従い、ヒトＡＰＲＩＬに関する、本発明の抗体と、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する参照抗体との結合競合を評定することによって、評価することができる。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４に表された通りＶＨおよびＶＬドメインによって定義される。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４に表されたようなＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片などの抗体類似体を含む任意の抗体を、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じヒトＡＰＲＩＬエピトープへの結合を評価するための参照抗体として用いることができる。ＷＯ２０１０／１０００５６に開示された抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの抗原結合部位を有する抗体の一例であり、本発明の状況において適した参照抗体である。しかし、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａに由来するＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２またはＦｖ断片などの抗体断片もまた、参照抗体として用いることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２のＤＮＡ配列ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４のアミノ酸配列に基づけば、当業者はそのようなｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ由来の抗体断片を構築および生成することができよう。提供された配列に基づけば、当業者は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によりコードされる）の重鎖可変領域アミノ酸配列をＩｇＧ１定常領域（マウスまたは異なる種由来、好ましくはマウス由来）に連結すること、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によりコードされる）の軽鎖可変領域アミノ酸配列をκ定常領域（マウスまたは異なる種由来、好ましくはマウス由来）に連結することによって、参照抗体として使用するためのｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体を生成することもできる。
【００２２】
そのような方法で評価される場合、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合する抗体は、ヒトＡＰＲＩＬへの、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗原結合部位を有する参照抗体の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０値、例えば１００〜０．００１ｎＭから選択される範囲、例えば１００〜０．０１０、１００〜０．０５０、１００〜０．１００、１００〜０．１５０、１００〜０．２００、１００〜０．２５０、１００〜０．３００、１００〜０．３５０、１００〜０．４００、１００〜０．４５０、９０〜０．５００、８０〜０．５５０、７０〜０．６００、６０〜０．６５０、５０〜０．７００、４０〜０．７５０、３０〜０．８００、２０〜０．８５０、１０〜０．９００または１．０〜０．９５０ｎＭのＩＣ５０値で遮断することができる。当業者には理解されるであろうが、５０、２０、１０、１．００ｎＭ未満の値など、より低い値がＩＣ５０に好ましい。
【００２３】
したがって本発明の抗体は、以下の特色の１つまたは複数を有し得る：
（ｉ）約１００ｎＭ以下のＫＤでヒトＡＰＲＩＬに結合する；
（ｉｉ）約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＢＣＭＡおよびヒトＴＡＣＩへのヒトＡＰＲＩＬの結合を遮断する；
（ｉｉｉ）約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＡＰＲＩＬへのｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの結合を遮断する。
【００２４】
これらの特色は、以下の組み合わせで組み合わせることができる：（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）。
【００２５】
本発明によれば、抗体の抗原結合部位のＶＨドメインのフレームワーク配列は、それらがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、１４、１６または１８から選択されるＶＨアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するように選択される。好ましい実施形態によれば、該抗体のＶＨドメインのフレームワーク配列は、それらがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４または１８、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８から選択されるＶＨアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するように選択される。該抗体の前記抗原結合部位におけるＶＬドメインのフレームワーク配列は、それらがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０から選択されるＶＬアミノ酸配列のフレームワーク配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するように選択される。
【００２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、１４、１６または１８から選択されるＶＨアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０から選択されるＶＬアミノ酸配列は、フレームワーク配列とＣＤＲ配列の両方を含む。これらのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列に組み込まれたＣＤＲ配列は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａのものであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ１）、６（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ２）、７（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ３）、８（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ１）、９（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ２）、１０（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ３）に対応する。しかし、先に既に言及した通り、本発明の中で選択された通りのＶＨおよびＶＬフレームワーク配列の使用は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの特定のＣＤＲとの組み合わせに制限されない。したがって、特定の実施形態による少なくとも７０％の配列類似性は、フレームワーク配列のみに対して考慮されるべきであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６、１８から選択される完全なＶＨアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０から選択される完全なＶＬアミノ酸配列に対して考慮されるべきではない。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６、または１８で表されるＶＨアミノ酸配列のフレームワーク配列は、ＶＨ  ＣＤＲ以外のこれらの配列の一部、即ちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ１）、６（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ２）、７（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ３）と同一の配列部分以外の部分である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０で表されるＶＬアミノ酸配列のフレームワーク配列は、ＶＬ  ＣＤＲ以外のこの配列の一部、即ちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ１）、９（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ２）、１０（ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲ３）と同一の配列部分以外の部分である。
【００２７】
代わりの実施形態によれば、少なくとも７０％の配列類似性は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４、１６、または１８から選択される完全なＶＨアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０から選択される完全なＶＬアミノ酸配列に対して考慮されなければならない。
【００２８】
本発明の記載において、少なくとも７０％の配列類似性は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列類似性を意味すると理解されなければならない。
【００２９】
当業者は、「配列類似性」が個々のヌクレオチド配列またはペプチド配列が類似する度合いを指すことを、理解するであろう。２つの配列間の類似性の度合いは、保存的変化の度合いを組み合わせた同一性の度合いに基づく。「配列類似性」のパーセント値は、同一であるか、または保存的に変化しているアミノ酸またはヌクレオチドのパーセント値、すなわち「配列類似性」＝（％配列同一性）＋（％保存的変化）である。
【００３０】
本発明の目的では、「保存的変化」および「同一性」は、より広範囲の用語「類似性」の一種であると見なされる。したがって、配列「類似性」という用語が用いられる場合は必ず、それは配列の「同一性」および「保存的変化」を包含する。特定の実施形態によれば、保存的変化は無視され、％配列類似性は％配列同一性を指す。
【００３１】
用語「配列同一性」は、当業者に知られている。２つのアミノ酸配列によって、または２つの核酸配列によって共有された配列同一性の度合いを決定するために、該配列は、最適比較の目的でアライメントされる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのために、ギャップを第一のアミノ酸配列または核酸配列の中に導入し得る）。そのようなアライメントは、比較される配列の全長にわたって実施され得る。あるいは該アライメントは、より短い比較長、例えば約２０、約５０、約１００またはそれよりも長い核酸／塩基またはアミノ酸にわたって実施され得る。
【００３２】
その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第一の配列の位置が、第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。配列間で共有される同一性の度合いは、典型的には２つの配列間の％同一性に関して表現され、配列内の同一残基によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝対応する位置での同一残基の数／位置の総数×１００）。好ましくは比較される２つの配列は、同一の長さ、または実質的に同一の長さのものである。
【００３３】
「保存的変化」のパーセント値は、配列同一性のパーセント値と似たように決定され得る。しかしこの場合、元の残基の機能的性質を保存する可能性があるアミノ酸またはヌクレオチド配列の特定の位置での変化が、変化が全く起こっていないかのごとくスコア付けされる。
【００３４】
アミノ酸配列の場合、関連の機能的性質は、アミノ酸の物理化学的性質である。本発明のポリペプチド内のアミノ酸の保存的置換は、そのアミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択され得る。例えば、特定のサイズまたは特徴（電荷、疎水性および親水性など）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸が、特に生物活性に直接関連しないタンパク質の領域において、タンパク質の活性を実質的に改変せずに別のアミノ酸と置換され得ることは、タンパク質生化学の技術分野で周知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  ｐ．２２４  （４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８７）参照）。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。保存的置換としては、例えば正電荷を維持するためのＬｙｓの代わりのＡｒｇおよびその逆；負電荷を維持するためのＧｌｕの代わりのＡｓｐおよびその逆；遊離−ＯＨが維持されるようなＳｅｒの代わりのＴｈｒおよびその逆；ならびに遊離−ＮＨ２が維持されるようなＧｌｕの代わりのＡｓｎ、が挙げられる。
【００３５】
本発明のＣＤ７０結合ペプチドのアミノ酸配列内の例示的な保存的置換は、以下に示されるものに従って行われ得る。
【００３６】
（表２）例示的な保存的アミノ酸置換
2018502918.tif 000005
【００３７】
ヌクレオチド配列の場合、関連の機能的性質は、主に転写および／または翻訳機構に関連する配列のオープンリーディングフレーム内で特定のヌクレオチドが担う生物学的情報である。遺伝暗号が縮重（または冗長性）を有すること、および複数のコドンが、それらがコードするアミノ酸に関して同じ情報を担い得ることは、一般に認知されている。例えば特定の種において、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧコドン（またはＤＮＡではＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ）によってコードされ、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、ＡＧＣ（またはＤＮＡではＴＣＡ、ＴＣＧ、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）によって特定される。翻訳された情報を改変しないヌクレオチド変化は、保存的変化と見なされる。
【００３８】
当業者は、異なる数学的アルゴリズムを用いる複数の異なるコンピュータプログラムが、２配列間の同一性を決定するのに利用可能であることを認識するであろう。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７０））を用いたコンピュータプログラムを使用することができる。実施形態によれば、該コンピュータプログラムは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，米国サンディアゴ所在）内のＧＡＰプログラムである。用いられ得る置換行列は、例えばＢＬＯＳＵＭ６２行列またはＰＡＭ２５０行列であり、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）である。当業者は、これらの異なるパラメータの全てが、わずかに異なる結果を生じるが、２配列の全体的な％同一性が、異なるアルゴリズムを用いた場合に有意に変化しないことを認識するであろう。
【００３９】
実施形態によれば、２ヌクレオチド配列間の％同一性は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，米国サンディアゴ所在）内のＧＡＰプログラムを用いて決定される。ＮＷＳｇａｐｄｎａ  ＣＭＰ行列および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトが用いられる。
【００４０】
別の実施形態において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の％同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を利用し、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（フランス、モンペリエ、ＩＧＨのＧｅｎｅｓｔｒｅａｍサーバー：ｈｔｔｐ：／／ｘｙｌｉａｎ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉの配列データを用いてＡＬＩＧＮ  Ｑｕｅｒｙで入手）に組み込まれたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））を用いて決定される。
【００４１】
本発明の場合、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ）を利用してヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の％同一性および／または類似性を決定することが、最も好ましい。
【００４２】
Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎおよびｔＢＬＡＳＴｘプログラムを用いたクエリーは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを通して入手可能なＢＬＡＳＴのオンラインバージョンを介して知ることができる。あるいは、ＮＣＢＩインターネットサイトを介してダウンロード可能なＢＬＡＳＴのスタンドアローンバージョン（例えば、バージョン２．２．２９（２０１４年１月３日公開））を用いることができる。好ましくはＢＬＡＳＴクエリーを、以下のパラメータを用いて実施する。アミノ酸配列間の％同一性および／または類似を決定するために、ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ｂｌａｓｔｐ；ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３；ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１；ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ；ｆｉｌｔｅｒ：ｏｆｆ；ｍａｓｋ：ｏｆｆ。ヌクレオチド配列間の％同一性および／または類似性を決定するために、ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：  ｂｌａｓｔｎ；  ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：  １１；  ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅ：  ０；  ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｓｃｏｒｅｓ：  ２，  −３；  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：  ５，  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：  ２；ｆｉｌｔｅｒ：  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ；  ｍａｓｋ：  ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ。
【００４３】
「保存的変化」のパーセント値は、示されたアルゴリズムおよびコンピュータプログラムの助けを借りて配列同一性のパーセント値と似たように決定され得る。幾つかのコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴｐは、陽性（＝類似性）の数／パーセント値および同一性の数／パーセント値を表す。保存的変化のパーセント値は、陽性／類似性のパーセント値から同一性のパーセント値を減算することによって、それから得ることができる（％保存的変化＝％類似性−％同一性）。
【００４４】
当業者に理解される通り、本発明の抗体は、複数の抗原結合部位を含む。ＣＤＲ配列と共に選択されたＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列のフレームワーク配列が、抗原結合部位内で組み合わせられる。本発明で予期されるＶＨおよびＶＬドメイン由来のフレームワーク配列の具体的な組み合わせは、以下の表３に表された通りであるが、ここで「Ｘ」は、予期されるＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせの位置に表されている。
【００４５】
（表３）フレームワーク配列のＶＨおよびＶＬの組み合わせ
2018502918.tif 000006
【００４６】
これらのＶＨおよびＶＬドメイン由来のフレームワーク配列の組み合わせは、ヒトＡＰＲＩＬへの機能的結合を有する抗体をもたらす。実験の節でさらに示される通り、本発明の発明者らによって実施されたテストにおいて、本発明のＶＨ配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ＶＬ１５）のＶＬ配列とを組み合わせた場合だけ、ＡＰＲＩＬ結合機能性を有する抗体が得られたことに留意すべきである。選択されたＶＨ配列と他のＶＬ配列（ＶＬ１０〜ＶＬ１４）とのテストされた組み合わせにおいて、得られた抗体は、機能的なＡＰＲＩＬ結合特性を有さなかった。本発明に従って用いられたＶＨ配列とＶＬ配列の組み合わせのさらに驚くべき効果は、実験の節に示される通り、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨおよびＶＬ配列を有する抗体と比較した場合の改善された（熱）安定性である。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のＶＬフレームワーク配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のＶＨフレームワーク配列からのＶＨフレームワーク配列またはそれから得られた配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、３４、３６、３８、４０との組み合わせが好ましい。これらの好ましい組み合わせは、表３では下線のひかれた「Ｘ」で表されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０由来のＶＬフレームワーク配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０由来のＶＨフレームワーク配列との最も好ましい組み合わせは、表３では太字（および下線付き）の「Ｘ」で表されている。驚くべきことに、ＶＬフレームワーク配列とＶＨフレームワーク配列のこれらの組み合わせが、有益な安定性および／またはヒトＡＰＲＩＬターゲットへの改善された結合をはじめとする追加的な有益な特色を有する抗体をもたらすことが見出された。
【００４８】
特定の実施形態によれば、ＶＨドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７または前記配列のいずれかの変異体からなる群から選択される。好ましくはＶＨドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７または前記配列のいずれかの変異体から選択される。これらのＶＨドメインＣＤＲ配列は、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＨドメインＣＤＲに対応する。
【００４９】
特定の実施形態によれば、ＶＬドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、１０または前記配列のいずれかの変異体からなる群から選択される。好ましくはＶＬドメインにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、１０または前記配列のいずれかの変異体から選択される。これらのＶＬドメインＣＤＲ配列は、ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＶＬドメインＣＤＲに対応する。
【００５０】
特定の実施形態によれば、該抗体の抗原結合部位において、ＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７または前記配列のいずれかの変異体から選択され、ＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、１０または前記配列のいずれかの変異体から選択される。
【００５１】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明で用いられるＶＨフレームワーク配列とＶＬフレームワーク配列とを組み合わせた抗体において、さらなる改善が行われ得ることを見出した。特にＶＨアミノ酸配列における置換Ｒ７２Ｓは、ヒトＡＰＲＩＬへの結合の改善をもたらす。
【００５２】
加えて、ＶＨアミノ酸配列における置換の組み合わせＲ６７Ｋ−Ｖ６８Ａもまた、ヒトＡＰＲＩＬへの結合の改善をもたらす。それゆえ本発明は、特定の実施形態によれば、ＶＨアミノ酸配列において７２位のアミノ酸がＳである抗体に関する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３２、３４、３６、３８、４０のＶＨアミノ酸配列は、７２位にＳ残基を有するそのようなＶＨアミノ酸配列の例である。他の実施形態によれば、ＶＨアミノ酸配列において６７位のアミノ酸がＫであり、６８位のアミノ酸がＡである抗体に関する。３つのアミノ酸置換Ｒ７２Ｓ、Ｒ６７ＫおよびＶ６８Ａの全ての組み合わせもまた、本発明において予期される。したがって他の実施形態によれば、本発明は、ＶＨアミノ酸配列において７２位のアミノ酸がＳであり、６７位のアミノ酸がＫであり、６８位のアミノ酸がＡである抗体に関する。
【００５３】
ＶＨおよびＶＬドメインとは別に、該抗体は、適切な数のＣＨドメインおよび適切な数のＣＬドメインなどのさらなるドメインを含み得る。ＣＨドメインおよびＣＬドメインは、ヒト起源のものであり得る。そのようなドメインはまた、修飾された（または遮断された）Ｆｃ領域を有する抗体を提供して、エフェクター機能の改変を提供するドメインを包含する。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２；  Ｐｒｅｓｔａ，  ２００６，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５８：６４０−６５６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｚｕｒｉｎｉ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ．  Ｊ．，  ２０１２，７：１４４４−５０；Ｋａｎｅｋｏ  ａｎｄ  Ｎｉｗａ，  Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，  ２０１１，  ２５：  １−１１を参照されたい。そのような修飾は、免疫系の様々な反応を増進または抑制するために用いることができ、診断および治療における有益な作用を有する可能性がある。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化、または脱グリコシル、および複数のＦｃの付加がある。特定の実施形態によれば、Ｆｃエフェクター機能の低下を示すＦｃ領域を使用することが、好ましい。特定の実施形態による本発明の抗体はまた、ヒトＩｇＧ４から出発したＦｃ領域および／またはＮ２９７Ｑグリコシル化欠損突然変異体を含むＦｃ領域を有し得る。ＣＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ定常ドメインから選択され得る。好ましくは、ヒトカッパＣＬドメインが用いられる。
【００５４】
本発明の特定の実施形態によれば、ＦｃおよびＣＬドメインを含む抗体が提供され、ＶＨドメインアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４４、４６、４８、５２、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８または５２、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する重鎖アミノ酸配列内にあり、ＶＬドメインアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する軽鎖アミノ酸配列内にある。
【００５５】
本発明により予期されるこれらの重鎖および軽鎖の特定の組み合わせを、以下の表４に表すが、ここで「Ｘ」は、予期される重鎖および軽鎖の組み合わせの位置に表されている。
【００５６】
（表４）
2018502918.tif 000007
【００５７】
好ましい組み合わせは、下線のひかれた「Ｘ」で示されている。より好ましい組み合わせは、太字（および下線付き）の「Ｘ」で示されている。
【００５８】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明による抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１３、１５、１７、３１、３９、４１、４３、４５、４７、５１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、３１、３９、４７または５１、より好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列である。ＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９または４９、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するポリヌクレオチド配列である。
【００５９】
本発明はさらに、本発明による複数のポリヌクレオチドを適切な調節配列の制御下に含む、複数の発現ベクターを含む発現単位に関し、該複数のポリヌクレオチドは、本発明による抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする。ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列とＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、同じ発現ベクター上にあり得るように、発現単位が設計され得る。したがって該発現単位は、１つのベクターを含み得る。あるいはＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列とＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、異なる発現ベクター上にあり得る。そのような実施形態において、該発現単位は、複数の、例えば２つの、発現ベクターを含む。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、本発明の複数のポリヌクレオチドおよび／または本発明の発現単位を含む宿主細胞に関する。該発現単位は、好ましくはＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド配列と、ＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド配列との両方を含む発現ベクターを含む発現単位である。
【００６１】
本発明の抗体は、以下のうちの任意の１つであり得る：
−  キメラ抗体もしくはその断片；
−  ヒト化抗体もしくはその断片；または
−  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性ｍＡｂおよびジアボディからなる群から選択される抗体断片。ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡのＣＤＲに基づく複数の抗原結合部位を含むヒト化抗体が、好ましい。本発明により選択されたフレームワーク領域がヒト起源のものであり、したがって、特にヒト起源の定常領域と組み合わされた場合に、ヒト化抗体を得るために適切に使用され得ることが、留意されるであろう。
【００６２】
そのさらなる態様によれば、本発明は、
ａ）本発明の複数のポリヌクレオチドおよび／または本発明の発現単位を含む宿主細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下の培地中で培養し、それにより軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生成すること；ならびに
ｂ）該宿主細胞または培地からポリペプチドを回収すること
を含む、本発明の抗体を生成する方法に関する。
【００６３】
本発明はさらに、医薬的に許容し得る担体または希釈剤と組み合わせて本発明の抗体を含む組成物に関する。一実施形態におけるそのような組成物は、１種を超える抗体を含み得る。一実施形態において、該組成物は、本発明の１種または複数の抗体に加えて１種または複数の他の活性化合物を含む。そのような併用組成物は、例えば癌の処置の際に、併用療法で用いられ得る。その場合、該抗体は、通常の抗癌剤の１種または複数と組み合わせられ得る。他の併用療法では、他の追加的活性化合物が、用いられ得る。併用療法では、同じ組成物中に２種以上の活性化合物を有することが必須ではない。したがって本発明の一部は、抗体と他の活性化合物の併用または逐次的使用であり、ここで抗体および他の活性化合物は、同時または逐次投与される。
【００６４】
上記から明白な通り、本発明の抗体は、治療および診断における使用のため、ならびに他の非治療的目的のものであり得る。したがって本発明はさらに、治療および診断における、そして他の非治療目的での該抗体の使用方法に関する。
【００６５】
一実施形態において、該治療は、免疫細胞増殖および／または免疫細胞生存の阻害を含む。別の実施形態において、該処置は、癌を処置することを対象とする。一実施形態において、該治療は、自己免疫疾患の処置を含む。一実施形態において、該治療は、炎症性疾患の処置を含む。一実施形態において、該治療は、Ｉｇ分泌介在性疾患、特にＩｇＡ分泌介在性疾患の処置を含む。本発明の抗体の治療的使用を、以下により詳細に議論する。
【００６６】
非治療的用途に用いられる場合の本発明の抗体は、例えばフローサイトメトリー、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および免疫組織化学的検査などのインビトロまたはエクスビボ技術において適用され得る。
【００６７】
治療
本発明の抗体がｈＡＰＲＩＬ．０１Ａに類似してヒトＡＰＲＩＬに結合するという事実を鑑みると、本発明の抗体は、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと類似した治療における使用に適しており、先に議論され、そして実験の節で議論される改善を伴う。それゆえ本発明の抗体は、ヒトＡＰＲＩＬとＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩとの相互作用を遮断することによって改善されることが知られている、またはそれが予測される状態の処置に適する。当該技術分野で既に知られる通り、ヒトＡＰＲＩＬとＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩとの相互作用を遮断することで、免疫細胞の増殖および／または生存が阻害されるので、遮断はそのような免疫細胞の増殖および／または生存の遮断が有益となる状態、例えば炎症性疾患、Ｉｇ分泌が介在する疾患および／または自己免疫疾患の処置にとって価値を有し得る。ヒトＡＰＲＩＬとＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩとの相互作用を遮断することは、癌の処置においても有益になり得る。
【００６８】
本発明の抗体が有益になり得る自己免疫状態は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、クローン病および他の炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎（ｐｏｌｙｐｙｏｓｉｔｉｓ）、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連性不妊症、糸球体腎炎、半月形糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、インスリン抵抗性、自己免疫性糖尿病、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性網膜ブドウ膜炎、ギランバレー症候群、動脈硬化およびアルツハイマー病から選択され得る。
【００６９】
加えて、本発明の抗体は、移植片（移植）拒絶またはアレルギー状態などの免疫応答の低下が有益となる他の関連状態の処置においても有益となり得る。
【００７０】
同じく本発明の抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭレベルなどの免疫グロブリンレベルの低下が有益となる他の状態、例えばＩｇ分泌、特にＩｇＡ分泌、Ｉｇ過剰産生、例えばＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの過剰産生、特にＩｇＡ過剰産生、またはＩｇ沈着、特にＩｇＡ沈着に関連する状態の処置において有益となり得る。そのような状態の例としては、ＩｇＡ腎症、および他の形態の糸球体腎症、セリアック病、類天疱瘡、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ならびにＩｇ沈着に関連する他の自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明において、「状態」の処置は、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体の予防的および治癒的使用を含む任意の治療的使用を包含する。それゆえ用語「状態」は、疾患状況だけでなく、生理機能が有害な状況に変化しないような防御的設定における生理学的状況も指し得る。
【００７２】
本発明における癌としては、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球・前骨髄球（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｅ）、骨髄単球性単球性赤白血病（ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性多血症性リンパ腫（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｖｅｒａ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌、子宮頸癌、繊毛癌、大腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、腹腔内新生物、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌（小細胞、大細胞）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口および咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、および泌尿器系の癌が挙げられるが、これらに限定されない。特に該当する癌は、Ｂ細胞由来の悪性腫瘍、リンパ球もしくは結腸もしくは肺の癌、または多発性骨髄腫（ＭＭ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）Ｂ細胞など、ＡＰＲＩＬを発現する細胞を有する癌である。
【００７３】
上述の状態のいずれかの処置を目的とすれば、本発明の抗体は、単独で、または他の治療薬と併用で、対象に直接投薬され得る。それゆえ本発明の特定の実施形態によれば、使用および／または組成物における本発明の抗体は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、Ｂ−ＣＬＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびウェゲナー肉芽腫を処置するのに用いられる化学療法剤、例えばメルファラン、ビンクリスチン、フルダラビン、クロラムブシル、ベンダムスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、シスプラチンの複数と併用され得る。加えて、使用および／または組成物における本発明の抗体は、コルチコステロイド（デキサメタゾン、プレドニゾロン）、サリドマイド類似体（サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）などの免疫調整剤の複数と併用され得る。同じく、使用および／または組成物における本発明の抗体は、イブルチニブ、イデラリシブなどの標的指向性キナーゼ阻害剤の複数と併用され得る。さらに、使用および／または組成物における本発明の抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）などのＣＤ２０を標的とする抗体治療薬；またはアレムツズマブなどのＣＤ５２を標的とする抗体治療薬；またはダラツムマブなどのＣＤ３８を標的とする抗体治療薬；またはＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体を標的とする抗体治療薬（サリルマブ、トシリズマブなど）；またはＣＳ−１を標的とする抗体治療薬（エロツズマブなど）；またはＢＣＭＡを標的とする抗体治療薬（ＧＳＫ２８５７９１６など）；またはＢＡＦＦもしくはＢＬｙｓｓを標的とする抗体治療薬（タバルムマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）など）の複数と併用され得る。加えて、使用および／または組成物における本発明の抗体は、ビスホスホナート（パミドロナート、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）の複数と併用され得る。ＡＰＲＩＬがＭＭ細胞をＩＬ−６欠乏、デキサメタゾンおよびボルテゾミブ処置から防御することが、過去に記載されている（Ｍｏｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  Ｂｌｏｏｄ  １０３（８）：３１４８−５７；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ．  ２７：４３９−４５）。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、レナリドミドおよびデキサメタゾン処置におけるＭＭ細胞のＡＰＲＩＬ介在生存を逆転させることが示されている（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  ＡＳＨ  ｐｏｓｔｅｒ  ２０９８）。当該技術分野におけるこれらの知見を考慮すると、本発明の抗体は、特に、使用および／または組成物において、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン、プレドニゾロン、好ましくはデキサメタゾン、またはサリドマイド類似体、例えばサリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、特にレナリドミド、またはボルテゾミブから選択されるさらなる治療薬と併用され得る。
【００７４】
診断
ＡＰＲＩＬが非限定的に自己免疫疾患、炎症性疾患、および悪性腫瘍などの重要な疾患マーカを代表することから、ヒト対象の血清および／または組織中のＡＰＲＩＬの検出が重要になる。診断用途では、該抗体は典型的には、検出可能な部分で標識される（直接的または間接的のいずれか）。数多くの標識が、入手可能であり、それらは概ね以下の分類に群分けされ得る：ビオチン、蛍光色素、放射性核種、酵素、ヨウ素、および生合成標識。
【００７５】
様々な異なる患者の血清および他の体液および／または組織中に存在する可溶性ＡＰＲＩＬが、患者の疾患重症度と相関することが示された。例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）、ＤＬＢＣＬ患者（ＮＨＬ）、大腸癌、ＳＬＥ、より広範囲の全身免疫性リウマチ疾患（現在は、シェーグレン症候群、ライター症候群、乾癬性関節炎、多発性筋炎、および強直性脊椎炎も含む）およびアトピー性皮膚炎に罹患した患者は、可溶性ＡＰＲＩＬの血清レベル増加を示した。加えて、ＩｇＡ腎炎に罹患した患者の血清ＡＰＲＩＬレベルは、上昇している（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｊ．Ｃｌｉｎ  ．  Ｉｎｖｅｓｔ  ．  １２１  （１０）：  ３９９１−４００２）。同じく血清ＡＰＲＩＬレベルは、敗血症において上昇し、重篤疾病患者における死亡率を予測させる（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ６１，  １６６−９；  Ｒｏｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，  ４３１４−２１）。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの実証された結合特性に基づけば、本発明による抗体は、体液および／または組織中の可溶性ＡＰＲＩＬを検出するための診断ツールとして用いることができる。
【００７６】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、間接的および直接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知アッセイ法で用いられ得る。Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．１４７−１５８  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７）。
【００７７】
本発明の抗体はまた、インビボ診断アッセイに用いられ得る。一般に抗原または該抗体を発現する細胞が、イムノシンチグラフィーまたは陽電子放射断層撮影を用いて位置決めされ得るように、該抗体が放射性核種で標識される。
【００７８】
非治療的用途
本発明の別の態様によれば、該抗体は、他の非治療的用途を有する。本発明の抗体の非治療的用途としては、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および免疫組織化学的検査が挙げられる。
【００７９】
本発明の抗体は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムへの固定を通し、アフィニティー精製試薬として用いられ得る。
【００８０】
一般的定義
用語「抗体」は、受容体へのリガンドの結合を阻害すること、または受容体のリガンド誘導性シグナル伝達を阻害することなど、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体を指す。本発明の例では、生物活性は、受容体ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩへのＡＰＲＩＬの結合を遮断することを含む。したがって「抗体」は、最も広範囲の意味で用いられ、具体的にはＤｕｏｂｏｄｙ（登録商標）技術（Ｇｅｎｍａｂ）またはＨｅｘａｂｏｄｙ（登録商標）技術（Ｇｅｎｍａｂ）または抗体断片に基づくようなモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
「抗体断片」および「抗体結合断片」は、典型的には親抗体の抗原結合領域または可変領域（例えば、１つまたは複数のＣＤＲ）の少なくとも一部を含む、抗体の抗原結合断片および類似体を意味する。抗体断片は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。典型的には抗体断片は、親の結合活性がモル基準で表現される場合、該活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは抗体断片は、標的への親抗体結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％、またはそれ以上を保持する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ、ユニボディ（Ｇｅｎｍａｂの技術）；ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘの技術）；ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓの技術）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。改変抗体変異体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，  ２００５，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１１２６−１１３６において論評されている。
【００８２】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１および可変領域と、で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００８３】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。該２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合と、ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用と、によってまとめられている。
【００８４】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、そしてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域を含む１つの重鎖の一部と、を含み、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるようになっている。
【００８５】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖と、を含むことで、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成される。したがってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によってまとめられた２つのＦａｂ’断片で構成される。
【００８６】
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００８７】
「一本鎖Ｆｖ抗体」（または「ｓｃＦｖ抗体」）は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインが一本のポリペプチド鎖の中に存在する、抗体断片を指す。一般にＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、抗原結合に望ましい構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの論評については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  １９９４，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ  ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。同じく国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９、ならびに米国特許第  ４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００８８】
「ジアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。該断片は、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。短すぎるために同じ鎖上の２つのドメイン間で対合することができないリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補性ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作製するように促される。ジアボディは、例えば欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８により完全に記載されている。
【００８９】
「Ｄｕｏｂｏｄｙ」は、通常のＩｇＧ構造を有する二重特異性抗体である（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１０  （１３）：  ５１４５−５１５０）。
【００９０】
「Ｈｅｘａｂｏｄｙ」は、規則的構造および特異性を保持しながら高い殺傷能力を有する抗体である（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３  （６１７６）：  １２６０−３）。
【００９１】
「ドメイン抗体断片」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的機能のある免疫グロブリン断片である。幾つかの例において、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合で連結して、二価ドメイン抗体断片を生成する。二価ドメイン抗体断片の２つのＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的とし得る。
【００９２】
本明細書で用いられる抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のアミノ酸配列を有し、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のアミノ酸配列を有するマウス抗体である。
【００９３】
本発明の抗体断片は、例えば通常は重鎖間ジスルフィド結合に関与するヒンジシステインの少なくとも１つが、本明細書に記載された通り改変されている、低いジスルフィド結合能力を有する重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にするのに十分な部分の定常領域を含み得る。別の実施形態において、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、インタクト抗体中に存在する場合にはＦｃ領域に通常関連する生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調整、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）機能、および／または補体結合（例えば抗体がＡＤＣＣ機能または補体結合に必要なグリコシル化プロファイルを有する場合）のうちの少なくとも１つを保持する。
【００９４】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一または相同的であり、同時に鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一または相同的であるような抗体、および所望の生物活性を呈する限りはそのような抗体の断片を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５参照）。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体およびヒト抗体に由来する配列を含む抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、その超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部も含む。げっ歯類抗体のヒト化形態は、本質的に親げっ歯類抗体の同じＣＤＲ配列を含むが、親和性を上昇させるため、ヒト化抗体の安定性を上昇させるため、または他の理由で、特定のアミノ酸置換が含まれる場合がある。
【００９６】
本発明の抗体はまた、改変されたエフェクター機能を提供するように修飾された（または遮断された）Ｆｃ領域を有する抗体を包含する。例えば米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２；  Ｐｒｅｓｔａ，  ２００６，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８：６４０−６５６を参照されたい。そのような修飾を利用して、免疫系の様々な反応を増進または抑制し、同時に診断および治療における有益作用を可能にする。Ｆｃ領域の改変としては、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル、および複数のＦｃの付加が挙げられる。Ｆｃの変化はまた、治療抗体の抗体半減期を改変することができ、半減期が長いほど、投与頻度は低くなり、利便性上昇と材料使用減少が同時に適う。Ｐｒｅｓｔａ，  ２００５，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ．１１６  ：  ７３１  ａｔ  ７３４−３５を参照されたい。
【００９７】
本発明の抗体はまた、標的細胞において補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する完全なエフェクター機能を提供するインタクトＦｃを備えた抗体、例えばアイソタイプＩｇＧ１の抗体を包含する。
【００９８】
該抗体はまた、貯蔵の間の抗体安定性を改善する分子、またはインビボで抗体の半減期を増加させる分子にコンジュゲートされ得る（例えば、共有結合での連結）。半減期を増加させる分子の例は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。抗体のアルブミン連結誘導体およびＰＥＧ化誘導体は、当該技術分野で周知の技術を利用して調製され得る。例えばＣｈａｐｍａｎ，  ２００２，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４：５３１−５４５；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｍａｓｉ，  １９８８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０９：３７−４２；  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ７８８：２４８−２５５；およびＢｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｌｉｅ，  ２００３，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  ２：５２−６２を参照されたい。
【００９９】
本明細書で用いられる用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、配列アライメントによって定義される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、例えば軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．参照）、ならびに／または構造的に定義された通り「超可変ループ」（ＨＶＬ）由来のそれらの残基、例えば軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、重鎖可変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋｌ，  １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７参照）を含む。
【０１００】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基または配列は、本明細書に定義されたＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基または配列である。
【０１０１】
特定の実施形態による本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。「単離された」抗体は、自然環境の成分から同定され、分離および／または回収されたものである。自然環境の混入成分は、抗体の診断的および治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。幾つかの実施形態において、該抗体は、（１）ローリー法による測定で抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によって、Ｎ−末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な度合いまで、または、（３）クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を利用して、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかし通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０１０２】
「単離された」核酸分子は、通常は抗体核酸の天然供給源の中で会合している少なくとも１種の混入核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態または配置以外である。それゆえ単離された核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子と区別される。しかし単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞のものと異なる染色体位置にあるような抗体を通常、発現する細胞に含まれる核酸分子を包含する。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、該集団を含む個々の抗体は、わずかに存在し得る可能な天然由来の突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対して高特異性である。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特別な方法による抗体生成を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に初めて記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。該「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７に記載された技術を利用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には「キメラ抗体」を包含する。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「免疫細胞」は、造血性起源の細胞、および免疫応答における役割を担う細胞を包含する。免疫細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞などのリンパ球、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄細胞が挙げられる。
【０１０５】
本明細書で用いられる「イムノコンジュゲート」は、細菌毒素、細胞傷害性剤、または放射性毒素などの治療部分にコンジュゲートされた抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体またはその断片を指す。毒素部分は、当該技術分野で利用可能な方法を利用して本発明の抗体にコンジュゲートされ得る。
【０１０６】
本明細書で用いられる配列の「変異体」または「変異体配列」は、１個または複数個のアミノ酸残基が開示の配列と異なるが親分子の生物活性を保持する配列を指す。本発明は、様々な配列によって明白に開示された抗体の変異体を包含する。ＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列では、幾つかの実施形態によれば、変異体配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列全体で６個までのアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５または６個のアミノ酸置換を含み得る。同様にＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列では、幾つかの実施形態によれば、変異体配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列全体で６個までのアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５または６個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１０７】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者に知られるアミノ酸置換を指し、一般には得られた分子の生物活性を改変させずに作製され得る。一般に、ポリペプチドの非本質的領域における単一アミノ酸置換が、生物活性を実質的に改変しないことを、当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  ｐ．２２４  （４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８７）参照）。そのような例示的置換は、好ましくは先の表２に示されたものに従って作製される。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「約」は、当業者によって決定される特定の値の許容し得る誤差範囲内の値を指し、一部として値が測定または決定される方法、即ち測定システムの限界に依存する。例えば「約」は、当該技術分野での実践あたり１以内または１よりも大きい標準偏差を意味し得る。あるいは「約」または「本質的に〜で構成される」は、２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的系または工程に関して、該用語は、値の桁まで、または５倍までを意味し得る。特定の値が、本出願および特許明細書において提供されている場合、他に断りがなければ、「約」または「本質的に〜で構成される」の意味は、特定の値の許容し得る誤差範囲内であると推測されなければならない。
【０１０９】
用語「複数の」は、１つまたは複数を意味すると理解されなければならない。「複数の」は、その用途の状況に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される任意の適切な数を指し得る。特定の実施形態によれば、「複数の」は、「多数の」の意味を有し得る。「多数の」は、その用途の状況に応じて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される任意の適切な数を指し得る。
【０１１０】
「特異的に」結合するとは、リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対を参照する場合には、異種タンパク質集団および／または他の生物体における当該タンパク質、例えばＡＰＲＩＬ、の存在を決定する結合反応を示す。したがって設定された条件下では、明記されたリガンド／抗原は、特定の受容体／抗体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質へ顕著な量では結合しない。
【０１１１】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生体液へ適用される「投与」、「治療」および「処置」は、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または生体液への外因性の医薬用、治療用、診断用の薬剤または組成物の接触を指す。「投与」、「治療」および「処置」は、例えば治療法、薬物動態法、診断法、研究法および実験法を指し得る。細胞の処置は、細胞への試薬の接触、および細胞に接触している液体への試薬の接触を包含する。「投与」、「治療」および「処置」はまた、例えば細胞の、試薬による、診断薬による、結合組成物による、または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボ処置を意味する。本発明の本明細書において、用語「インビトロ」および「エクスビボ」は、類似の意味を有し、互換的に用いられ得る。
【０１１２】
抗体ＤＮＡは、例えば相同性マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによっても（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１）、または非免疫グロブリン材料（例えば、タンパク質ドメイン）のコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結することによっても、修飾され得る。典型的にはそのような非免疫グロブリン材料は、抗体の定常ドメインに取って代わり、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに取って代わり、抗原への特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原への特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１１３】
本発明の抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような変異体としては、例えば抗ＡＰＲＩＬ抗体に関して示されたアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または該残基への挿入、および／または該残基の置換が挙げられる。最終的な構築物が所望の特性を有することを条件に、最終的構築物に到達するのに、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗ＡＰＲＩＬ抗体の翻訳後工程を改変することもできる。
【０１１４】
突然変異誘発のための好ましい位置である抗ＡＰＲＩＬ抗体ペプチドの特定の残基または領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １０８１−１０８５に記載される通り、「アラニンスキャニング突然変異導入」と呼ばれる。この場合、１つの残基または標的残基群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの電荷残基）、中性または負電荷アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられ、該アミノ酸とＡＰＲＩＬ抗原との相互作用に影響を及ぼす。その後、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸残基が、さらなる変異体または別の変異体を置換部位においてまたは置換部位に対して導入することによって、純化される。したがってアミノ酸変異を導入する部位は、予め決めるが、突然変異の性質自体は、予め決める必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、Ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を、標的コドンまたは領域で実施し、発現した抗ＡＰＲＩＬ抗体の変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
【０１１５】
通常、抗ＡＰＲＩＬ抗体のアミノ酸配列変異体は、重鎖または軽鎖いずれかの元の抗体アミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する類似性または相同性は、先に定義された通りである。
【０１１６】
本明細書において望ましいとして同定された特性を有する抗体は、インビトロでの生物活性または適切な結合親和性の上昇についてスクリーニングされ得る。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じヒトＡＰＲＩＬエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されたものなどの所定のクロスブロッキングアッセイを実施し得る。同じエピトープに結合する抗体は、そのようなアッセイにおいてクロスブロッキングする可能性があるが、クロスブロッキングは、オーバーラッピングエピトープまたは付近の非オーバーラッピングエピトープに結合する抗体の立体障害により生じ得るため、全てのクロスブロッキング抗体が、必ずしも正確に同じエピトープで結合するわけではない。
【０１１７】
あるいは、抗体が該当するエピトープに結合するか否かを決定するために、例えばＣｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１３８８−１３９４に記載された、エピトープマッピングが実施され得る。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １０８１−１０８５に記載された「アラニンスキャニング突然変異導入」または他の形態の、ヒトＡＰＲＩＬ中アミノ酸残基の点突然変異誘発を用いて、本発明の抗ＡＰＲＩＬ抗体の機能的エピトープを決定することもできる。
【０１１８】
抗体エピトープをマッピングする他の方法は、Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｍｏｌ．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：  ８７−９６）およびＴｉｍｍｅｒｍａｎら（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２０：  ２８３−２９９）によって記載された通り、クレジットカード形式のミニＰＥＰＳＣＡＮカードを用いてスクリーニングされ得る合成直鎖状およびＣＬＩＰＳペプチドへの抗体の結合を試験することである。各ペプチドへの抗体の結合は、ＰＥＰＳＣＡＮに基づく酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定される。
【０１１９】
ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａと同じエピトープに結合するさらなる抗体は、例えばエピトープへの結合についてＡＰＲＩＬに対して生じた抗体をスクリーニングすることによって、またはエピトープ配列を含むヒトＡＰＲＩＬの断片を含むペプチドで動物を免疫処理することによって、得ることができる。同じ機能的エピトープに結合する抗体は、類似のＡＰＲＩＬ結合、ならびにＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ遮断活性などの類似の生物活性を呈すると予測され得、そのような活性は、抗体の機能的アッセイによって確認され得る。
【０１２０】
該抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラスから選択され得る。好ましくは該抗体は、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧの任意のアイソタイプを、用いることができる。ＩｇＧアイソタイプの変異体もまた、企図される。該抗体は、１つよりも多くのクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含み得る。所望の生物活性を生成するのに必要となる定常ドメイン配列の最適化は、実施例に記載された生物アッセイにおいて抗体をスクリーニングすることよって即座に実現される。
【０１２１】
同様に、軽鎖のいずれかのクラスを、本明細書の組成物および方法で用いることができる。具体的には、カッパ、ラムダ、またはその変異体が、本発明の組成物および方法において有用である。
【０１２２】
本発明の抗体および抗体断片はまた、細胞傷害性剤などの細胞傷害性ペイロードまたは９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、および４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅなどの放射性核種とコンジュゲートされ得る。そのような抗体コンジュゲートは、表面にターゲット（抗体の場合には抗原）を発現する細胞を選択的に標的にして、それを殺傷する免疫療法で用いられ得る。例示的な細胞傷害性剤としては、リシン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、シュードモナス・エキソトキシン、サポリン、ジフテリア毒素、シスプラチン、ドキソルビシン、アブリン毒素、ゲロニン、およびヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０１２３】
本発明の抗体および抗体断片はまた、希土類キレートなどのフルオロフォア、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、および安定したフリーラジカルを含む蛍光または化学発光標識とコンジュゲートされ得る。
【０１２４】
Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６２，  Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；  Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；  Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ４０：２１９；および  Ｎｙｇｒｅｎ，  Ｊ．，  １９８２，  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３０：４０７に記載された方法を含む、本発明の抗体分子またはタンパク質分子を様々な部分にコンジュゲートするための当該技術分野で知られる任意の方法を用いることができる。抗体およびタンパク質をコンジュゲートする方法は、当該技術分野では従来通りで、周知である。
【０１２５】
抗体精製
組換え技術を利用する場合、該抗体は、細胞内のペリプラズム空間内で産生され得、または直接培地に分泌され得る。抗体が、最初のステップとして細胞内で産生される場合、宿主細胞断片または溶解した断片である微粒子片が、例えば遠心分離または限外濾過によって、除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７には、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順が記載される。手短に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下、約３０分間にわたって解凍する。細胞残屑は、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般には最初、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを利用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれかにおいて含ませて、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を含ませて、偶発的混入物の増殖を予防することができる。
【０１２６】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適切さは、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトＩｇガンマ１、Ｉｇガンマ２、またはＩｇガンマ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトガンマ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ５：１５６７−１５７５）。アフィニティーリガンドが付着したマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。
【０１２７】
コントロールド・ポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで実行され得るよりも急速な流速および短い処理時間を可能にする。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ所在）が、精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿法などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１２８】
一実施形態において、レクチン基質（例えば、レクチンアフィニティーカラム）へ吸着させ、調製物からフコース含有糖タンパク質を除去し、それによりフコース不含糖タンパク質を濃縮することを利用して、糖タンパク質を精製することができる。
【０１２９】
医薬配合剤
本発明は、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体の医薬配合剤を含む。医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体、詳細には抗体またはその断片を医薬的に許容し得る担体または賦形剤と混和するが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （１９８４）を参照されたい。治療薬および診断薬の配合剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の、生理学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ２０００，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  １９９３，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  １９９０，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  １９９０，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ，  ２０００，  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ参照）。
【０１３０】
単独で投与される、または通常の抗癌剤などの別の薬剤と併用で投与される、抗体組成物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致命的となる用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に治療有効性となる用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的医薬手順によって決定され得る。毒性作用と治療効果との用量比が、治療指数であり、それはＬＤ５０とＥＤ５０の比率として表すことができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を配合する際に用いられ得る。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。該投与量は、用いられる投与剤型および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。
【０１３１】
適切な投与経路としては、筋肉内、静脈内または皮下投与などの非経口投与、および経口投与が挙げられる。本発明の医薬組成物中で用いられる、または本発明の方法を実践するために用いられる抗体の投与は、様々な従来法、例えば経口摂取、吸入、局所適用または皮膚、皮下、腹腔内、非経口、動脈内、または静脈内注射で実施され得る。一実施形態において、本発明の抗体は、静脈内に投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、皮下に投与される。
【０１３２】
あるいは全身的手法というよりむしろ局所において、例えば、多くの場合はデポまたは持続放出配合剤中で、作用部位への直接の抗体注射を介して、投与され得る。さらに、標的指向性薬物送達システム中で抗体を投与することができる。
【０１３３】
抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択することにおけるガイダンスは、入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，  １９９６，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，  ＵＫ；  Ｋｒｅｓｉｎａ  （ｅｄ．），  １９９１，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｂａｃｈ  （ｅｄ．），  １９９３，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｂａｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：６０１−６０８；  Ｍｉｌｇｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１：１９６６−１９７３；  Ｓｌａｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４：７８３−７９２；  Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２：６１３−６１９；  Ｇｈｏｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：２４−３２；  Ｌｉｐｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３：１５９４−１６０２参照）。
【０１３４】
適切な用量の決定は、例えば処置に影響を及ぼすことが当該技術分野で知られている、もしくは疑われる、または処置に影響を及ぼすことが予測されるパラメータまたは因子を利用して、臨床医によって行われる。一般に該用量は、最適容量よりも若干低い量で開始され、所望の、または最適な効果が任意の負の副作用と相対的に実現されるまで、その後、用量を少量の増分で増加させる。重要な診断尺度としては、例えば炎症の症状の尺度、または産生された炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
【０１３５】
好ましい投与プロトコルは、顕著で望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。１週あたりの総用量は一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、最も一般には少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、典型的には少なくとも１μｇ／ｋｇ、より典型的には少なくとも１０μｇ／ｋｇ、最も典型的には少なくとも１００μｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、最適には少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、より最適には少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、最も最適には少なくとも５０ｍｇ／ｋｇである（例えば、Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４９：４２７−４３４；  Ｈｅｒｏｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６：１６９２−１６９８；  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈ．  ６７：４５１−４５６；  Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２：１３３−１４４参照）。小分子治療薬、例えばペプチド模倣薬、天然生成物、または有機化学物質の所望の用量は、モル／ｋｇ基準で抗体またはポリペプチドの場合とほぼ同量である。
【０１３６】
本明細書で用いられる「阻害する」または「処置する」または「処置」は、疾患に関連する症状の発症の延期、および／または前記疾患によって発症する、もしくは発症すると予測されるそのような症状の重症度の軽減を包含する。該用語はさらに、既存の症状の改善、さらなる症状の予防、およびそのような症状の根底にある原因の改善または予防を包含する。したがって該用語は、有益な結果が、疾患を有する脊椎動物対象に付与されたことを示す。
【０１３７】
治療目的での本発明の抗体は、治療有効量で投与される。本明細書で用いられる用語「治療有効量」または「有効量」は、細胞、組織もしくは対象に単独で投与された場合、またはさらなる治療薬と併用で投与された場合に処置される疾患または状態を予防または改善するのに有効となる、抗ＡＰＲＩＬ抗体またはその断片の量を指す。治療有効用量はさらに、症状の改善、例えば関連する医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度上昇をもたらすのに十分な化合物量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療有効用量は、該成分のみを指す。併用物に適用される場合、治療有効用量は、併用で投与されるか、連続で投与されるか、または同時に投与されるにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の合わせた量を指す。治療薬の有効量は、症状を、典型的には少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、および最も好ましくは少なくとも５０％軽減する。
【０１３８】
第二の治療薬との共投与または処置の方法は、当該技術分野で周知であり、例えばＨａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ２００１，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １０ｔｈ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  （ｅｄｓ．），  ２００１，  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  ＰＡ；  Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ  （ｅｄｓ．），  ２００１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  ＰＡを参照されたい。
【０１３９】
本発明の医薬組成物はまた、非限定的に細胞傷害性剤、化学療法剤、細胞分裂阻害剤、血管新生抑制剤、代謝拮抗剤、腫瘍標的指向剤、免疫刺激剤、免疫調整剤、または細胞傷害性剤に、細胞分裂阻害剤にもしくは他の毒性剤にコンジュゲートされた抗体を含む他の薬剤を含有し得る。該医薬組成物はまた、手術、化学療法および放射線照射などの他の治療モダリティーと共に用いられ得る。
【０１４０】
ここに、以下の非限定的実験を参照しながら、本発明をさらに例示および裏づけする。
【実施例】
【０１４１】
実験
実験１
抗ＡＰＲＩＬヒト化抗体の設計
ＣＤＲの移植
ヒトＡＰＲＩＬに結合する独特の抗体ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ（ＷＯ２０１０／１０００５６）は、過去に同定されている。マウスｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗体を、ＣＤＲ移植技術によってヒト化した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号およびＷｉｌｌｉａｍｓ，  Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１参照）。最初、ＩｇＢＬＡＳＴを用いてヒト生殖系列配列を同定する方策を設計した（Ｙｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１：Ｗ３４−４０）。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨでは、ヒト生殖系列配列ＩＧＨＶ１−３＊０１（７０．４％同一性）を、そしてｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬでは、ヒト生殖系列配列ＩＧＫＶ１−１６＊０１（６５．３％同一性）を同定した。
【０１４２】
次に、ＩＭＧＴデータベース（公開２０１２２２−４：１６１９０５エントリー、２０１２年６月４日索引付け）において利用可能な全てのヒト成熟配列を含むデータベースを構築し（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２７：２０９−２１２）、９０，４０１の個々の配列を同定した。これらの配列は、ＴＢＬＡＳＴＮ（２．２．２６＋）を用いて問合せて、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ．３および４）に対する同一性が最も高かったテンプレート配列を同定した。８０％以上の類似性スコアを示し、それぞれｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ．５〜７）およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ．８〜１０）のものと類似のＣＤＲ長、好ましくは同一ＣＤＲ長を示した３つのＶＨおよび７つのＶＬ配列を選択した。
【０１４３】
重鎖では、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ，  Ｄ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１（Ｄ１）：Ｄ３６−４２）アクセション番号ＡＦ０２２０００、ＡＢ３６３１４９、およびＡＢ０６３８２７によってコードされたフレームワークが、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨ  ＣＤＲの線状移植（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）に選択され、それぞれ以下のｃＤＮＡ構築物：ＳＥＱ  ＩＤ．１１、１３、および１５をもたらした。軽鎖では、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＸ３７５９１７、ＤＤ２７２０２３、ＡＢ３６３２６７、ＡＪ２４１３９６、ＤＩ１５２５２７、およびＤＱ８４０９７５によってコードされたフレームワークが、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＬ  ＣＤＲの線状移植に選択され、それぞれ以下のｃＤＮＡ構築物：ＳＥＱ  ＩＤ．１９、２１、２３、２５、２７および２９をもたらした。
【０１４４】
さらなる重鎖配列を、ＴＢＬＡＳＴＮの結果から得られた２５の最良にマッチした配列（Ｅ値５ｅ−４６〜９ｅ−４３）のアライメントからのコンセンサス配列に基づいて設計し、以下のｃＤＮＡ構築物：ＳＥＱ  ＩＤ  １７をもたらした。
【０１４５】
フレームワーク残基のヒト化の構造的影響を測定するために、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗体の相同性モデルを、ＷＨＡＴＩＦを用いて作製した（Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ．  ４４：５０９−２３）。それぞれＶＨおよびＶＬ鎖のテンプレート：２ＧＫＩ（Ｋｉｍ  Ｙ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８１：  １５２８７−１５２９５）および２ＡＥＱ（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３５６：  ６５１−６６３）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，  ｒｅｌｅａｓｅ  Ｊｕｎｅ  ２０１２；  Ｂｅｒｍａｎ  Ｈ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２３５−２４２）を用い、ＢＬＡＳＴＰサーチ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）によって同定した。ＶＨおよびＶＬ鎖を、ＭＵＳＴＡＮＧアライメント（Ｋｏｎａｇｕｒｔｈｕ  Ａ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６４：５５９−５７４）を用いてＦａｂ断片として組み合わせ、２ＡＥＱテンプレートによって誘導した。ヒト化の影響を受け、ヒト化構築物の機能性に影響を及ぼし得る残基を選択するのに、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａの構築された相同性モデルを用い、選択された残基を置換すべきか否かを評価し、６番目のＶＬテンプレート（ＶＬ１５）では、ＶＬ残基Ｙ４９およびＹ８７をより小さなＳ４９およびＦ８７と置換することを決定した。
【０１４６】
シグナルペプチドの同定
ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔ（ＢＬＡＳＴＮ）（Ｙｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０）を用いて、マウスｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ  ＶＨおよびＶＬとマッチするヒト生殖系列レパトアを同定し、ＶＨおよびＶＬに関する分泌リーダー：生殖系列ＩＧＨＶ１−３＊０１（ＮＣＢＩアクセション番号Ｘ６２１０７）に基づくＶＨ、および生殖系列ＩＧＫＶ１６＊０１（ＮＣＢＩアクセション番号Ｘ６２１０９）に基づくＶＬを選択するために用いた。以下の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７によってコードされるＶＨ分泌リーダー配列
2018502918.tif 000008
およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９によってコードされるＶＬ分泌リーダー配列
2018502918.tif 000009
が、全てのヒト化ＶＨおよびＶＬ構築物を発現するのに用いられた。
【０１４７】
セリン２４１（Ｋａｂａｔ番号付け）がプロリンに変換されている、安定化Ａｄａｉｒ突然変異（Ａｎｇａｌ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：  １０５−１０８）を含むヒト化抗体のＩｇＧ４バージョンを、産生した。
【０１４８】
実験２
合成、サブクローニング、発現、結合
合成
ヒト化ＶＨおよびＶＬ構築物をコードするｃＤＮＡ：ＳＥＱ  ＩＤ  １１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、２９を、ＯｐｔＧｅｎｅソフトウエア（バージョン２．０．６．０）を用いてコドン最適化し、  Ｂａｓｅｃｌｅａｒによって化学合成した。次に、５’−  ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’−ＡｐａＩ（ＶＨ）または３’−ＢｓｉＷＩ（ＶＬ）  制限エンドヌクレアーゼ切断部位を利用して、配列をｐＵＣ５７ベクター（ＢａｃｅＣｌｅａｒ）にクローニングした。
【０１４９】
サブクローニング
ヒト化ＶＨ構築物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を利用して、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングされたヒトＩｇＧ４定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｋ０１３１６）を含有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ヒト化ＶＬ構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を利用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングされたヒトＣＬ（カッパ）ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ００２４１）を含有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。構築物を、Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＨ５αコンピーテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で、製造業者の使用説明書に従って形質転換させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って単離した。該構築物の完全性を、ＤＮＡシーケンシング（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）  によって確認した。
【０１５０】
発現および結合
ＶＨおよびＶＬ構築物をコードするプラスミドを、１：３比（総量４μｇ）で混合して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の使用説明書に従ってＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）内へのトランスフェクションによって一過性に発現させた。細胞上清を５日後に回収し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して抗体の発現およびＡＰＲＩＬへの結合についてテストした。これらのＥＬＩＳＡにおいて、全てのインキュベーションステップの後、ＰＢＳＴ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）での洗浄ステップを行った。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を０．５μｇ／ｍｌ抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）または抗ＩｇＧ４（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。次に、抗ＦＬＡＧコーティングされた９６ウェルプレートを、ＦＬＡＧ標識ヒトＡＰＲＩＬと共に室温で１時間インキュベートした。次に、上清およびその希釈物を１時間インキュベートし、次にマウス抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に１時間インキュベートした。
【０１５１】
免疫反応をＴＭＢ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌで視覚化した。反応を０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌで停止して、吸光度を４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで測定した。
【０１５２】
実験３
精製および安定性
精製
先に記載されたヒト化抗体のサブセットを、さらなる分析のために選択した。再度、ＶＨおよびＶＬ構築物をコードするプラスミドを、１：３比（３２μｇ）で混合して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）（８×１０６）内へのトランスフェクションによって一過性に発現させた。上清を回収して（１０ｍｌ）、抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂を用い、製造業者の使用説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って精製した。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、緩衝液でＰＢＳを交換した。精製抗体の濃度を、ＯＤ２８０（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）に基づいて測定した。ＡＰＲＩＬへの精製抗体の結合を、上記のＡＰＲＩＬ  ＥＬＩＳＡを利用して確定した。ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ受容体によるヒト化抗体の遮断能力を、競合ＥＬＩＳＡでテストした。これらのＥＬＩＳＡにおいて、全てのインキュベーションステップの後、ＰＢＳＴ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）での洗浄ステップを行った。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を０．５μｇ／ｍｌ  Ｆｃ−ＢＣＭＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＦｃ−ＴＡＣＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。次に、ヒト化抗体およびその希釈物をインキュベートし、ＦＬＡＧ標識ＡＰＲＩＬと１時間プレミックスして、抗ＦＬＡＧ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）と共に１時間インキュベートした。免疫反応をＴＭＢ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌで視覚化した。反応を０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌで停止して、吸光度を４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで測定した。全ての結合シグナルまたは遮断の５０％が観察された濃度を表す計算されたＥＣ５０およびＩＣ５０を、表５に表す。
【０１５３】
（表５）ＥＣ５０値（ＡＰＲＩＬへの結合）。ＩＣ５０（ＢＣＭＡ−Ｆｃに対するＡＰＲＩＬ結合の遮断）。Ｃ４−ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａを各ＥＬＩＳＡにおける実験参照として用いた。ｎ．ｃ．は、阻害を示すが、ＩＣ５０は、フィッティングが不適切であったため、計算することができなかった。
2018502918.tif 000010
【０１５４】
ＴＡＣＩ−Ｆｃに対するＡＰＲＩＬ結合の遮断について、類似の遮断効果が観察された。
【０１５５】
驚くべきことに、ＶＨ１１〜ＶＨ１４とＶＬ１０〜ＶＬ１４の組み合わせは、ナノモルまたはマイクロモルのＥＣ５０値を示さず、選択されたＶＨフレームワーク配列とＶＬ１５のフレームワーク配列との組み合わせのみが、機能的ＡＰＲＩＬ結合特性を有する抗体をもたらした。
【０１５６】
安定性
抗体の安定性に及ぼすヒト化の影響を測定するために、ヒト化抗体を一定範囲の温度に１０分間暴露した。精製抗体をＰＢＳで３．１６μｇ／ｍｌおよびその希釈物に希釈した。次に、これらの溶液を６５℃または７０℃に暴露し、抗体の加熱処理後の残存する結合を、先に記載された通りＦＬＡＧ標識ＡＰＲＩＬ  ＥＬＩＳＡアッセイを利用して測定した（表６参照）。
【０１５７】
（表６）ＥＬＩＳＡによって測定された、ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬへの抗体（ヒト化）の残存結合。結合を、３種の濃度：３．１６、１および０．３１６μｇ／ｍｌで測定する。６５℃または７０℃での％結合率を、室温でのそれぞれの抗体（＝１００％）に対して、観察された％結合率として表す。
2018502918.tif 000011
【０１５８】
実験４
復帰突然変異およびバーニア残基による結合、遮断および安定性の改善
復帰突然変異による結合および遮断の改善
配列および構造レベルの分析を、異なるＶＨ／ＶＬ組の結合および遮断における違いに関して分子基準で理解するために実施した。ヒト化抗体の相同性モデルを、先に記載された通り作製した。ＶＨおよびＶＬの両方について選択されたテンプレートが、３ＨＣ４であった（Ｊｏｒｄａｎ  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７７：  ８３２−８４１）。作製されたモデルの注意深い分析に基づいて、本発明の発明者らは、選択されたＶＨ鎖中の残基Ｓ７２が、ＣＤＲ２ループの方向づけに重要であると推測した。この推測を検討するために、突然変異Ｒ７２ＳをＶＨ１４に導入して、ＳＥＱ  ＩＤ  ３１のヌクレオチド配列によってコードされる  ＶＨ  １４＿１（ＳＥＱ  ＩＤ  ３２）を得た。抗体１４＿１．１５を、先に記載された通り結合および遮断についてテストした。表７に表される通り、抗体１４＿１．１５の結合および遮断が、表５に示された抗体１４．１５の結合に比較して改善されている。
【０１５９】
（表７）抗体１４＿１．１５による、ＡＰＲＩＬへの結合およびＢＣＭＡ−Ｆｃに対するＡＰＲＩＬ結合の遮断。ｈＡＰＲＩＬ．０１ＡおよびＣ４−ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａを、各ＥＬＩＳＡにおける実験参照として用いた。
2018502918.tif 000012
【０１６０】
ＴＡＣＩ−Ｆｃに対するＡＰＲＩＬ結合の遮断については、類似したＩＣ５０値が得られた。
【０１６１】
バーニア残基
配列および構造レベルについての分析を実施して、抗体１４＿１．１５の結合および遮断をさらに改善した。このｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ類似体の相同性モデルを、先に記載された通り作製した。ＶＨ鎖に選択されたテンプレートは、２ＧＫＩであり、ＶＬ鎖では４ＧＭＴであり（Ｌｅｅ  Ｐ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  ＰＮＡＳ  １０９：  １７０４０−１７０４５）、それをテンプレート２ＡＥＱにより誘導されたＦａｂ断片として組み合わせた。
【０１６２】
ＣＤＲに近接した残基は、ループコンフォメーションに影響を及ぼし得るため、詳細に試験した。この分析において、本発明者らは、複数の潜在的に関連するバーニア残基を同定した（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４：４８７−４９９）。関連性を評価するために、それらをマウスアミノ酸で置換した。
【０１６３】
突然変異Ｍ７０Ｉの導入によりＶＨ１４＿１Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ３３、３４）が得られ、突然変異Ｔ７４ＫはＶＨ１４＿１Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ３５、３６）内に存在し、突然変異Ｑ１ＥはＶＨ１４＿１Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ３７、３８）をもたらした。Ｒ６７ＫとＶ６８Ａの突然変異の組み合わせは、ＶＨ１４＿１Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ３９、４０）をもたらした。抗体を、先に記載された通り、結合、遮断および安定性についてテストした。表８に表された通り、意外にも結合および遮断は、因子２〜３で改善される。特に抗体ＶＨ１４＿１Ｇ．ＶＬ１５内に導入された突然変異は、驚くべきことに相当な改善を示す。
【０１６４】
（表８）抗体１４＿１．１５およびバーニアゾーン突然変異体の結合および遮断。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａを各ＥＬＩＳＡにおける実験参照として用いた。
2018502918.tif 000013
【０１６５】
加えて、置換されたヒト化抗体の安定性は、実施例３に記載された熱安定性試験を利用して測定すると、改善されていた（表９参照）。
【０１６６】
（表９）ＥＬＩＳＡによって測定された、ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬへの抗体（ヒト化）の残存結合。結合を、３種の濃度：３．１６、１および０．３１６μｇ／ｍｌで測定する。６５℃または７０℃での％結合率を、室温でのそれぞれの抗体（＝１００％）に対して、観察された％結合率として表す。
2018502918.tif 000014
【０１６７】
実験５
１４＿１Ｇ．１５はインビボ阻害により有効であることを示す
ＡＰＲＩＬ機能に及ぼすＡＰＲＩＬ類似抗体のインビボ遮断効果を実証するために、本発明者らは、マウスにおけるＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ誘導性体液性応答を遮断する該抗体の能力を検査した。用いられたマウスは、８〜１０週齢ＡＰＲＩＬトランスジェニック（ＴＧ）マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹仔で、両者ともＣ５７ＢＬ／６バックグランドであった。ＡＰＲＩＬトランスジェニックマウスは、トランスジーン発現を成熟胸腺細胞および末梢Ｔリンパ球に指示するＬｃｋ遠位プロモーターの下で、ヒトＡＰＲＩＬを発現する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９，  １５８７−９８）。マウスは、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの動物施設で飼育され、実験は、施設内倫理委員会によって認可された。マウスを複数の群に分け、以下の通り処置した：ＷＴマウスをＰＢＳ（２００μｌ）で処置し、ＡＰＲＩＬトランスジェニックマウスの３群を以下の分子で処置した：ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａもしくは１４＿１Ｇ．１５（−１日目および３日目に２００μｌ  ＰＢＳ中で２００μｇ／マウス）またはＰＢＳ。０日目にマウスをＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌで免疫処理した（０日目に免疫原２５０μｇを１００μｌ  ｉ．ｐ．）。−１、３、７、１０日目に、血液を尾静脈から採取した。抗（４−ヒドロキシニトロフェナセチル）（ＮＰ）特異性抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡａ／２）を、過去に記載された通り希釈された血清を用いてＥＬＩＳＡによりアッセイした（Ｈａｒｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ８６（６）：  ５３０−４，  （２００８）；  Ｇｕａｄａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｂｌｏｏｄ  １１７  （２５）：  ６８５６−６５）。手短に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌ  ＮＰ−ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４℃で一晩コーティングした。ウェルを１％ＢＳＡにより３７℃で１時間遮断し、希釈された血清と共に室温で２時間インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートアイソタイプ特異性抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）を、顕在化抗体（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）として用いた。希釈物は全て、ＰＢＳ／ＢＳＡ  １％／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％中で作製した。図１から明白な通り、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａおよび１４＿１Ｇ．１５は両者とも、インビボでＴ細胞非依存性のＢ細胞応答を阻害した。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａは、この応答を、１４＿１Ｇ．１５より低い有効性で阻害した。ＰＢＳ、およびアイソタイプ適合対照としてのマウスＩｇＧ１は、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗ＮＰ応答に影響を及ぼさなかった。
【図１Ａ】
2018502918.tif 000015
【図１Ｂ】
2018502918.tif 000016
【図１Ｃ】
2018502918.tif 000017
【図１Ｄ】
2018502918.tif 000018
【配列表】
2018502918000001.app
【国際調査報告】
2018502918.tif 000019
2018502918.tif 000020
2018502918.tif 000021
2018502918.tif 000022
2018502918.tif 000023
2018502918.tif 000024