(57)【要約】【課題】試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法並びに試料容器を提供する。【解決手段】  試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、（ａ）第１段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程と、（ｂ）第１段階の増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、（ｃ）試料の一部が第２段階の増幅ウェルのそれぞれに移動されるように、試料を第２段階の増幅ウェルのアレイに移動させる工程と、（ｄ）第２段階の増幅ウェルにおいて第２段階の増幅を実施して、個々の核酸が試料中に存在する場合に、第２段階の増幅ウェルのそれぞにおいてアンプリコンを生成させる工程と、（ｅ）少なくとも１つの第２段階の増幅ウェルの内容物を配列決定条件下にする工程と、を含む方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
（ａ）第１段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、前記第１段階の増幅チャンバーが、前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、
（ｂ）前記第１段階の増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、
（ｃ）前記試料の一部が第２段階の増幅ウェルのそれぞれに移動されるように、前記試料を前記第２段階の増幅ウェルのアレイに移動させる工程であって、前記第２段階の増幅ウェルのそれぞれが前記試料中に存在し得る１つの個々の核酸をさらに増幅するように構成されている、工程と、
（ｄ）前記第２段階の増幅ウェルにおいて第２段階の増幅を実施して、前記個々の核酸が前記試料中に存在する場合に、前記第２段階の増幅ウェルのそれぞれにおいてアンプリコンを生成させる工程と、
（ｅ）少なくとも１つの前記第２段階の増幅ウェルの内容物を配列決定条件下にする工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記さらなる第２段階の増幅ウェルのそれぞれが、そこに係留されたプライマーを有し、配列決定が、前記第２段階の増幅ウェルで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）から工程（ｅ）が、単一の容器中で実施され、工程（ｄ）及び工程（ｅ）が、前記ウェル中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記容器が、１つ又は複数の密封可能なポートを備えており、ここで１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記密封可能なポートは、前記容器の外面から前記第１段階の増幅チャンバー及び前記第２段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）が、別の試料容器中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）から工程（ｅ）が、約５時間又はそれ未満で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
全ての第２段階の増幅ウェルが配列決定条件下にされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アンプリコンが前記第２段階の増幅ウェルのそれぞれにおいて生成され、前記アンプリコンが生成された前記第２段階の増幅ウェルのそれぞれについて陽性判定が生成したかどうかを検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｅ）が、前記陽性判定が存在する第２段階の増幅ウェルに関してのみ実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１段階の増幅チャンバーが、それぞれが前記試料中に存在し得る複数の前記個々の核酸の１つを増幅するように構成された複数の第１段階のプライマー対を含み、前記第２段階の増幅ウェルのそれぞれが前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸の１つを増幅するように構成された第２段階のプライマーの対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２段階のプライマーの対のそれぞれの少なくとも１つが、その対応する第１段階のプライマー内で入れ子状である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
（ａ）増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、前記増幅チャンバーが、前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、
（ｂ）前記増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、
（ｃ）前記試料をスポットのアレイに移動させる工程であって、それぞれのスポットが、それらに係留された第２段階の増幅プライマーの組を含み、前記第２段階の増幅プライマーの組のそれぞれが、前記個々の核酸の１つのさらなる増幅のために構成されている、工程と、
（ｄ）前記アレイで第２段階の増幅を実施して、その個々の核酸が前記試料中に存在する場合に、前記スポットそれぞれでアンプリコンを生成させる工程と、
（ｅ）前記スポットの少なくとも１つを配列決定条件下にする工程と
を含む方法。
【請求項１３】
工程（ａ）から工程（ｅ）が、単一の容器中で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記容器が、１つ又は複数の密封可能なポートを備えており、前記１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記密封可能なポートは、前記容器の外面から前記増幅チャンバー及び前記第２段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレイが、入口チャネル及び出口チャネルを有し、前記入口チャネル及び前記出口チャネルの開放及び閉鎖が、前記アレイを通る流体の流量を制御する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
流体を前記入口チャネルに進入させながら前記出口チャネルを閉鎖することにより、前記アレイ上に流体の泡を生じさせ、前記泡を攪拌することにより前記流体を均質化させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンプリコンがスポットのそれぞれで生成され、前記アンプリコンが生成されたウェルのそれぞれについて陽性判定を生成させたかどうかを検出する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記スポットの数が、合計で５１２個以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記スポットの数が、合計で２５６個以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記組が、前記第２段階のプライマー対の両方を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）が、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記組が、前記第２段階のプライマー対の一方を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）が、前記第２段階のプライマー対のそれぞれの第２のものを含む溶液の存在下で実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、工程（ｂ）に続いて、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで処理される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２段階のプライマー対の前記第２のものの全てが、ユニバーサルプライマーに相当する５’配列を備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液が、前記ユニバーサルプライマーをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２段階のプライマー対の前記第２のものの全てが、前記ユニバーサルプライマーの約１０分の１以下の濃度で供給される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が、工程（ｂ）と工程（ｄ）との間で希釈されない、請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２段階のプライマー対の少なくとも１つが、ユニバーサルプライマーに相当するさらなる配列を有し、工程（ｅ）が、前記ユニバーサルプライマーを使用した合成によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
試料中に存在し得る核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
それぞれが核酸の１つを増幅するように構成された複数の外側プライマー対の存在下で、及び前記核酸のそれぞれのための少なくとも１つの内側プライマーの存在下で増幅を行い、前記試料中に存在する前記核酸のそれぞれのアンプリコンを生成させる工程と、
前記アンプリコンを配列決定条件下にする工程と
を含む方法。
【請求項３１】
前記複数の外側プライマー対が、１つの反応チャンバー中に位置しており、前記内側プライマーが、別の反応チャンバーに位置している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
複数の外側プライマー対及び内側プライマーが、単一の反応チャンバー中に位置している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
試料中の核酸を増幅する方法であって、
（ａ）第１段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが、試料中に存在し得る核酸を増幅するように構成された第１のプライマー対を含む、工程と、
（ｂ）増幅チャンバーを増幅条件下にして、アンプリコンを生成させる工程と、
（ｃ）試料の第１の部分を、第１の複数の第２段階の増幅プライマーの組を含む第１の第２段階の増幅ゾーンに移動させる工程であって、第２段階の増幅プライマーのそれぞれの組が、アンプリコンの異なる非重複領域を増幅するように構成されている、工程と、
（ｄ）試料の第２の部分を、第２の複数の第２段階の増幅プライマーの組を含む第２の第２段階の増幅ゾーンに移動させる工程であって、第２段階の増幅プライマーのそれぞれの組が、アンプリコンの異なる非重複領域を増幅するように構成されている、工程と、
（ｅ）第２段階の増幅を、第１の第２段階の増幅ゾーンで実施して、第１の第２段階のアンプリコンを生成させ、第２の第２段階の増幅ゾーンで実施して、第２の第２段階のアンプリコンを生成させる工程と
を含み、第１の第２段階のアンプリコンの少なくとも一部が、第２の第２段階のアンプリコンの少なくとも一部と重複している、方法。
【請求項３４】
（ｆ）アンプリコンの少なくとも１つを配列決定条件下にする工程
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが、第１のフォワードプライマー、第１のフォワードプライマー内で入れ子状の第２のフォワードプライマー、及びリバースプライマーを含み、第２の増幅チャンバーが構造に係留されている、工程と、
増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と
を含む方法。
【請求項３６】
増幅チャンバーを配列決定条件下にする工程
をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
複数の核酸の増幅及び配列決定のための容器であって、
複数の第１段階のプライマー対を含む第１段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第１段階のプライマー対が、第１段階のアンプリコンを生成させるための複数の核酸の１つの増幅用に構成されている、増幅チャンバーと、
複数の第２段階のプライマー対を含む第２段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第２段階のプライマー対が、第２段階のアンプリコンを生成させるための前記第１段階のアンプリコンの１つの配列の少なくとも一部の増幅用に構成されている、増幅チャンバーと
を含み、
前記第２段階の増幅チャンバーが、前記第２段階のアンプリコンを配列決定するようにさらに構成されている、容器。
【請求項３８】
前記第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つのメンバーが、相当する第１段階のプライマー内で入れ子状である、請求項３７に記載の容器。
【請求項３９】
前記第２段階のプライマー対それぞれの少なくとも１つのメンバーが、支持体に係留されている、請求項３７に記載の容器。
【請求項４０】
前記第２段階のプライマー対それぞれの少なくとも１つのメンバーが、５’末端によって前記支持体に係留されている、請求項３９に記載の容器。
【請求項４１】
前記第２段階のアンプリコンが、単一の分子種を含む、請求項３７に記載の容器。
【請求項４２】
１つ又は複数の密封可能なポートをさらに備えており、前記１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記１つ又は複数の密封可能なポートは、前記容器の外面から前記増幅チャンバー及び前記第２段階の増幅チャンバーへの唯一の経路を提供する、請求項３７に記載の容器。
【請求項４３】
前記第２段階の増幅チャンバーが、入口チャネル及び出口チャネルを含み、前記入口チャネル及び前記出口チャネルの開放及び閉鎖が、前記第２段階の増幅チャンバーを通る流体の流量を制御する、請求項３７に記載の容器。
【請求項４４】
試料を受け取り、溶解した試料を調製するように構成されている溶解チャンバーをさらに含む、請求項３７に記載の容器。
【請求項４５】
前記溶解した試料を受け取り、前記溶解した試料から核酸を抽出するように構成されている核酸抽出チャンバーをさらに含む、請求項４４に記載の容器。
【請求項４６】
前記第２段階の増幅チャンバーが、それぞれが第２段階の増幅反応を実行するように構成されているウェルのアレイを含む、請求項３７に記載の容器。
【請求項４７】
前記第２段階の増幅チャンバーが、それぞれが第２段階のプライマー対を含み、それぞれが第２段階の増幅反応を実行するように構成されているスポットのアレイを含む、請求項３７に記載の容器。
【請求項４８】
前記第２段階のプライマーの少なくとも１つが、前記スポットに係留されている、請求項４７に記載の容器。
【請求項４９】
前記スポットの数が、合計で５１２個以下である、請求項４７に記載の容器。
【請求項５０】
前記スポットの数が、合計で２５６個以下である、請求項４７に記載の容器。
【請求項５１】
試料中に存在し得る複数の核酸の２ステップ増幅及び配列決定のための方法であって、
（ａ）それぞれが複数の核酸の１つの増幅用に構成される複数の第１段階のプライマー対を含む第１の混合物において核酸を増幅して、前記試料中に存在する前記核酸それぞれについて第１段階のアンプリコンを生成させる工程と、
（ｂ）それぞれが前記第１段階のアンプリコンの１つの増幅用に構成される複数の第２段階のプライマー対を使用して、前記第１段階のアンプリコンを増幅する工程であって、第２段階のプライマー対それぞれの少なくとも１つが、その対応する第１段階のプライマー対内で入れ子状であり、前記試料中に存在する前記核酸のそれぞれについて単一の分子種を生成させる、工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で生成される前記単一の分子種を配列決定する工程と
を含む方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）が、単一の反応チャンバー中で実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つが、固体支持体に係留されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）が、異なる反応容器中で実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
正確なアンプリコンを同定するために、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間で、フィルターが使用されない、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]  短期間でのサンプルからのシーケンス（sample-to-sequence）の結果が大きな有用性を有すると予想される様々な用途が存在する。これらの用途として、例えば、迅速な、ポイントオブケアに近い、又は研究室での、抗生物質耐性を付与する突然変異の同定、ウイルス遺伝子の配列決定、法医学的目的での組織の同定、臓器移植のための組織タイピング及び薬物代謝の速度に関する対立遺伝子の同定が挙げられ得る。
【０００２】
[0002]  例えば、敗血症に関与する細菌病原体に関して、細菌が、それらを広域スペクトルセファロスポリンに対して耐性にさせる広域スペクトル・ベータ−ラクタマーゼ（ESBL）を保有するかどうかを知ることが有用である。これらのＥＳＢＬは、ＴＥＭ−１、ＴＥＭ−２、ＳＨＶ及び他のベータラクタマーゼ遺伝子における突然変異に起因する。抗生物質耐性表現型を付与することができる多数の他の遺伝子が存在し、その発現又は活性は、これらの遺伝子のコード領域又は調節領域における点突然変異によって調節される。単一の公知の点突然変異は、標準的なＰＣＲ技法を使用してアッセイしやすいのに対して、多重対立遺伝子を有する遺伝子における突然変異は、同定することがより困難であり得る。
【０００３】
[0003]  同様に、ウイルス遺伝子の配列が、ヒト試料中のそのウイルスの存在と、そのウイルスが抗ウイルス化合物に耐性であるかどうかの両方を示すことができる。したがってどのような処理が開始、継続又は停止されるべきであるかを示す多数の場合が存在する。これは、Ｃ形肝炎、Ｂ型肝炎及びＨＩＶに当てはまる。これらの慢性ウイルス感染にとって結果に至る時間はそれほど緊急性がないのに対して、インフルエンザなどの他のウイルス感染にとって時間は最も重要である。インフルエンザ及び他の急性ウイルス感染では、ＦＤＡに認可されているノイラミニダーゼ阻害剤に対して耐性を与える十分に特徴付けられた点突然変異のますますの増加が見られる。理想的には、ノイラミニダーゼ阻害剤による処理は、ウイルスが検出された後に可能な限り素早く開始すべきであるが、正確な阻害剤を使用することが重要である。
【０００４】
[0004]  病原体検出及び同定の他に、ヒト遺伝子（単数又は複数）の配列を迅速に決定することが重要である場合が幾つか存在する。これらには、例として縦列型反復配列（STR）の長さをマッピングすることによる法医学目的でのヒト組織の同定が含まれる。この同定は現在のところ、ＰＣＲアンプリコンをサイズ分けすることによって実施されているが、同様に配列決定によっても行うことができる。迅速なサンプルからのシーケンス方法は、多くのかかる事例で役立つ。
【０００５】
[0005]  別の例は、移植用の臓器をＨＬＡタイピングすることである。供与されるべき臓器は、亡くなったばかりの個体に由来する。ドナーに対して最良のＭＨＣ適合を有する移植レシピエントへ素早く臓器を送達させることが重要である。これを行うのに最も的確な方法は、移植拒絶を支配するＭＨＣ遺伝子を配列決定し、続いてこれらの配列をレシピエントＭＨＣ型の国家登録に適合させることである。迅速なサンプルからのシーケンス方法は、多くの臓器提供の事例で役立つ。
【０００６】
[0006]  さらに別の例は、薬物代謝の速度を決定するチトクロムＰ４５０対立遺伝子の同定である。肝臓におけるチトクロムＰ４５０酵素は、排泄のために外来化合物を代謝することが知られている。このファミリーの多重タンパク質が公知であり、それぞれの異なる対立遺伝子が、異なる集団及び個体中に存在する。例えば、非常に速くワルファリンを代謝する酵素に関する対立遺伝子を保有する人々もいれば、またワルファリンをはるかにゆっくりと代謝する人々もいる。患者の遺伝子型を知ることによって、血流中で薬物のある特定の濃度を達成するように、ワルファリン又は他のかかる薬をどれくらい投与するかを医師は決定することが可能となる。
【０００７】
[0007]  配列決定が有用であり得る他の非限定的な例として、癌遺伝子並びに結核などの他の感染病原体が挙げられる。臨床診断及び他の分野の両方で使用されるように、多くの他の例が可能である。
【０００８】
[0008]  ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、分子生物学において広く使用されている技法である。その重要な構成成分の１つである、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的複製によってＤＮＡ片を増幅するのに使用されるＤＮＡポリメラーゼに、その名称は由来している。ＰＣＲが進行するにつれ、生成されたＤＮＡ（アンプリコン）自体が、複製用の鋳型として使用される。これが、ＤＮＡ鋳型が指数関数的に増幅される連鎖反応を引き起こす。ＰＣＲを用いれば、ＤＮＡ片の単一又は数個のコピーを桁違いに多く増幅させることが可能であり、ＤＮＡ片の数百万個又はそれを超えるコピーを生成させる。ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）及びプライマー（オリゴヌクレオチド）対を用いる。既存のＰＣＲ技法及び他の増幅方法は、次世代の配列決定（NGS）と組み合わせて、迅速なサンプルからのシーケンスの結果を提供し得る。
【０００９】
[0009]  伝統的な核酸配列決定技法は、特異的な塩基での化学的切断（マクサムギルバート法）又はジデオキシヌクレオチドを使用した鎖終結（サンガー配列決定）のいずれかを用いる。次世代の配列決定は、ハイスループット配列決定技術を含み、それらの幾つかが、配列決定プロセスを並列化して、何千個から何百万個の配列を同時に生じて、多くの場合、ヌクレオチドのそれぞれが、個々の鎖のそれぞれに付加される場合に検出する。様々な次世代システムが、現在利用可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]  本開示の一態様は、試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法である。例としての方法は、増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、核酸の一部がさらなる第２の増幅ウェルのそれぞれに移動されるように、試料を第２段階の増幅ウェルのアレイに移動させる工程であって、それぞれの第２段階の増幅ウェルが試料中に存在し得る１つの個々の核酸をさらに増幅するように構成されている、工程と、さらなる第２段階の増幅ウェルにおいて第２段階の増幅を実施して、個々の核酸が試料中に存在する場合に第２段階の増幅ウェルのそれぞれでアンプリコンを生成させる工程と、少なくとも複数のウェルを配列決定条件下にする工程とを含み得る。
【００１１】
[0011]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、第１段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、第１段階の増幅チャンバーが、試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、第１段階の増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、試料の一部が、第２の増幅ウェルのそれぞれに移動されるように、試料を、それぞれが試料中に存在し得る１つの個々の核酸をさらに増幅するように構成されている第２の増幅ウェルのアレイに移動させる工程と、第２段階の増幅ウェルにおいて第２段階の増幅を実施して、その個々の核酸が試料中に存在する場合に第２段階の増幅ウェルのそれぞれにおいてアンプリコンを生成させる工程と、少なくとも１つの第２段階の増幅ウェルの内容物を配列決定条件下にする工程とを含む方法を含む。幾つかの場合において、さらなる第２段階の増幅ウェルのそれぞれが、そこに係留されたプライマーを有し、配列決定が、第２段階の増幅ウェルで行われ得る。他の場合において、工程が全て、単一の容器中で実施され、最後の２工程が、前記ウェル中で実施される。さらに他の場合において、容器は、１つ又は複数の密封可能なポートを備えており、ここで１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると容器が完全に閉鎖されるように、密封可能なポートは、容器の外面から第１段階の増幅チャンバー及び第２段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する。幾つかの場合において、配列決定が、別の試料容器中で実施され得る。他の場合において、工程が全て、約５時間又はそれ未満で実施される。さらに他の場合において、全ての第２段階の増幅ウェルが配列決定条件下にされる。さらに他の場合において、本方法は、アンプリコンが第２段階の増幅ウェルのそれぞれにおいて生成され、アンプリコンが生成された第２段階の増幅ウェルのそれぞれについて陽性判定が生成したかどうかを検出する工程をさらに含み得る。幾つかの場合において、配列決定が、陽性判定が存在する第２段階の増幅ウェルに関してのみ実施される。他の場合において、第１段階のアンプリコンチャンバーが、それぞれが試料中に存在し得る複数の個々の核酸の１つを増幅するように構成された複数の第１段階のプライマー対を含み、第２段階の増幅ウェルのそれぞれが試料中に存在し得る複数の個々の核酸の１つを増幅するように構成された第２段階のプライマーの対を含む。さらに他の場合において、第２段階のプライマーの対のそれぞれの少なくとも１つが、その対応する第１段階のプライマー内で入れ子状である。
【００１２】
[0012]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが、試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、試料を、スポットのアレイに移動させる工程であって、それぞれのスポットが、それらに係留された第２段階の増幅プライマーの組を含み、第２段階の増幅プライマーのそれぞれの組が、個々の核酸の１つのさらなる増幅用に構成されている、工程と、アレイに第２段階の増幅を実施して、その個々の核酸が試料中に存在する場合にスポットのそれぞれでアンプリコンを生成させる工程と、スポットの少なくとも１つを配列決定条件下にする工程とを含む方法を含む。幾つかの場合において、工程が全て、単一の容器中で実施される。他の場合において、容器は、１つ又は複数の密封可能なポートを備えており、１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると容器が完全に閉鎖されるように、密封可能なポートは、容器の外面から増幅チャンバー及び第２段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する。さらに他の場合において、アレイが、入口チャネル及び出口チャネルを有し、入口チャネル及び出口チャネルの開放及び閉鎖が、アレイを通る流体の流量を制御する。幾つかの場合において、流体を入口チャネルに進入させながら出口チャネルを閉鎖することにより、アレイ上に流体の泡を生じさせ、泡を攪拌させることにより流体を均質化させる。他の場合において、本方法は、アンプリコンがスポットのそれぞれで生成され、アンプリコンが生成されたウェルのそれぞれについて陽性判定を生成させたかどうかを検出する工程をさらに含む。さらに他の場合において、スポットの数が、合計で５１２個以下である。幾つかの場合において、スポットの数が、合計で２５６個以下である。他の場合において、前記組が、第２段階のプライマー対の両方を含む。さらに他の場合において、第２段階の増幅が、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で実施される。幾つかの場合において、前記組が、第２段階のプライマー対の一方を含む。他の場合において、第２段階の増幅が、第２段階のプライマー対のそれぞれの第２のものを含む溶液の存在下で実施される。さらに他の場合において、試料が、増幅チャンバーを、増幅にする工程に続いて、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで処理される。幾つかの場合において、第２段階のプライマー対の第２のものの全てが、ユニバーサルプライマーに相当する５’配列を備える。他の場合において、溶液が、ユニバーサルプライマーをさらに含む。さらに他の場合において、第２段階のプライマー対の第２のものの全てが、ユニバーサルプライマーの約１０分の１以下の濃度で供給される。幾つかの場合において、試料が、増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と第２段階の増幅を実施する工程との間で希釈されない。他の場合において、第２段階のプライマー対の少なくとも１つが、ユニバーサルプライマーに相当するさらなる配列を有し、配列決定が、ユニバーサルプライ���ーを使用した合成によって実施される。
【００１３】
[0013]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中に存在し得る核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、それぞれが核酸の１つを増幅するように構成された複数の外側プライマー対の存在下で、及び核酸のそれぞれに対する少なくとも１つの内側プライマーの存在下で増幅を行い、試料中に存在する核酸のそれぞれのアンプリコンを生成させる工程と、アンプリコンを配列決定条件下にする工程とを含む方法を含む。他の実施形態において、複数の外側プライマー対が、１つの反応チャンバー中に位置しており、内側プライマーが、別の反応チャンバーに位置している。さらに他の実施形態において、複数の外側プライマー対及び内側プライマーが、単一の反応チャンバー中に位置している。
【００１４】
[0014]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中の核酸を増幅する方法であって、第１段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが、試料中に存在し得る核酸を増幅するように構成された第１のプライマー対を含む、工程と、増幅チャンバーを増幅条件下にして、アンプリコンを生成させる工程と、試料の第１の部分を、第１の複数の第２段階の増幅プライマーの組を含む第１の第２段階の増幅ゾーンに移動させる工程であって、第２段階の増幅プライマーのそれぞれの組が、アンプリコンの異なる非重複領域を増幅するように構成されている、工程と、試料の第２の部分を、第２の複数の第２段階の増幅プライマーの組を含む第２の第２段階の増幅ゾーンに移動させる工程であって、第２段階の増幅プライマーのそれぞれの組が、アンプリコンの異なる非重複領域を増幅するように構成されている、工程と、第２段階の増幅を、第１の第２段階の増幅ゾーンで実施して、第１の第２段階のアンプリコンを生成させ、第２の第２段階の増幅ゾーンで実施して、第２の第２段階のアンプリコンを生成させる工程とを含み、第１の第２段階のアンプリコンの少なくとも一部が、第２の第２段階のアンプリコンの少なくとも一部と重複している、方法を含む。他の実施形態において、本方法は、アンプリコンの少なくとも１つを配列決定条件下にする工程をさらに含む。
【００１５】
[0015]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、増幅チャンバーが、第１のフォワードプライマー、第１のフォワードプライマー内で入れ子状の第２のフォワードプライマー、及びリバースプライマーを含み、第２のフォワードプライマーが構造に係留されている、工程と、増幅チャンバーを増幅条件下にする工程とを含む方法を含む。他の実施形態において、本方法は、増幅チャンバーを配列決定条件下にする工程をさらに含む。
【００１６】
[0016]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、複数の核酸の増幅及び配列決定のための容器であって、複数の第１段階のプライマー対を含む第１段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第１段階のプライマー対が、第１段階のアンプリコンを生成させるための複数の核酸の１つの増幅用に構成されている、増幅チャンバーと、複数の第２段階のプライマー対を含む第２段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第２段階のプライマー対が、第２段階のアンプリコンを生成させるための第１段階のアンプリコンの１つの配列の少なくとも一部の増幅用に構成されている、増幅チャンバーとを含み、第２段階の増幅チャンバーが、第２段階のアンプリコンを配列決定するようにさらに構成されている、容器を含む。幾つかの場合において、第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つのメンバーが、相当する第１段階のプライマー内で入れ子状である。他の場合において、第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つのメンバーが、支持体に係留されている。さらに別の場合において、第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つのメンバーが、５’末端によって支持体に係留されている。幾つかの場合において、第２段階のアンプリコンが、単一の分子種を含む。他の場合において、容器は、１つ又は複数の密封可能なポートをさらに備えており、１つ又は複数の密封可能なポートが密封されると容器が完全に閉鎖されるように、１つ又は複数の密封可能なポートは、容器の外面から第１の増幅チャンバー及び第２段階の増幅チャンバーへの唯一の経路を提供する。さらに他の場合において、第２段階の増幅チャンバーが、入口チャネル及び出口チャネルを含み、入口チャネル及び出口チャネルの開放及び閉鎖が、第２段階の増幅チャンバーを通る流体の流量を制御する。幾つかの場合において、容器が、試料を受け取り、溶解した試料を調製するように構成されている溶解チャンバーをさらに含む。他の場合において、容器が、溶解した試料を受け取り、溶解した試料から核酸を抽出するように構成されている核酸抽出チャンバーをさらに含む。幾つかの場合において、第２段階の増幅チャンバーが、それぞれが第２段階の増幅反応を実行するように構成されているウェルのアレイを含む。他の場合において、第２段階の増幅チャンバーが、それぞれが第２段階のプライマー対を含み、それぞれが第２段階の増幅反応を実行するように構成されているスポットのアレイを含む。さらに別の場合において、第２段階のプライマーの少なくとも１つが、スポットに係留されている。幾つかの場合において、スポットの数が、合計で５１２個以下である。他の場合において、スポットの数が、合計で２５６個以下である。
【００１７】
[0017]  幾つかの実施形態において、本明細書中に記載するシステム及び方法は、試料中に存在し得る複数の核酸の２ステップ増幅及び配列決定のための方法であって、それぞれが複数の核酸の１つの増幅用に構成される複数の第１段階のプライマー対を含む第１の混合物において核酸を増幅して、試料中に存在する核酸のそれぞれの第１段階のアンプリコンを生成させる工程と、それぞれが第１段階のアンプリコンの１つの増幅用に構成される複数の第２段階のプライマー対を使用して、第１段階のアンプリコンを増幅する工程であって、第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つが、その対応する第１段階のプライマー対内で入れ子状であり、試料中に存在する核酸のそれぞれについて単一の分子種を生成させる、工程と、生成される単一の分子種を配列決定する工程とを含む方法を含む。他の実施形態において、増幅及び配列決定の工程が、単一の反応チャンバー中で実施される。さらに他の実施形態において、第２段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも１つが、固体支持体に係留されている。幾つかの実施形態において、増幅及び配列決定の工程が、異なる反応容器中で実施される。他の実施形態において、正確なアンプリコンを同定するために、フィルターが増幅工程と配列決定工程との間で使用されない。
【００１８】
[0018]  本発明の実施形態のさらなる特色及び利点は、下記の説明に記載されるか、又はかかる実施形態の実施によって習得され得る。かかる実施形態の特色及び利点は、併記の特許請求の範囲において特に注目する手段及び組合せを用いて実現並びに獲得され得る。これらの特色及び他の特色は、下記説明及び併記の特許請求の範囲から十分に明らかとなるか、又はこれ以降で記載するようなかかる実施形態の実施によって習得され得る。
【００１９】
[0019]  本発明の上述の及び他の利点並びに特色が獲得され得る方法について記載するために、簡潔に上述した本発明のより詳細な説明を、添付の図面に示されるそれらの特定の実施形態を参照することによって示す。これらの図面は、本発明の典型的な実施形態のみを表し、したがってその範囲の限定であるとみなされるべきではないという理解の下、本発明は、下記の添付の図面の使用によって、さらに具体的に且つ詳細に、記載及び説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0020] 図１は、本開示における１つの実施形態における使用のための例としてのポーチを示す。
【図２Ａ】[0021] 図２Ａは、単一の試料ウェル中での増幅及び配列決定に使用される工程を示す。
【図２Ｂ】[0021] 図２Ｂは、単一の試料ウェル中での増幅及び配列決定に使用される工程を示す。
【図３】[0022] 図３は、増幅に続く配列決定用に構成される図１のポーチの例としての第２段階の部分的分解組立図である。
【図４】[0023] 図４は、図１に類似しているが、第２段階のアレイに関する異なる実施形態を示す。
【図５】[0024] ブリッジ増幅を示すことを除いて、図５Ａから図５Ｃは、図２Ａ〜図２Ｂと同様である。
【図６】[0025] 本明細書中に記載するデバイスを用いた使用に関する異なる実施形態を示すことを除いて、図６Ａから図６Ｅは、図５Ａ〜図５Ｃと同様である。
【図７】[0026] 図７Ａから図７Ｃは、単一の第１段階のアンプリコンから生成される多重増幅産物を配列決定するための実施形態を示す。図７Ａは、重複する第２段階のアンプリコンを示すのに対して、図７Ａ〜図７Ｂは、第２段階の増幅を、第２段階の増幅反応へ進ませる１つの方法を示す。
【図８】[0027] 代替的なプライマー実施形態を示すことを除いて、図８Ａから図８Ｃは、図５Ａ〜図５Ｃと同様である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0028]  実施例遂行を詳細に記載する前に、本開示は、特定の例示されるシステム、方法、装置、製品、プロセス、組成物及び／又はキットのパラメーターに限定されず、それらは当然のことながら多様であることが理解されよう。同様に、本明細書中で使用する専門用語は、単に本開示の特定の遂行について記載する目的のためであり、いかなる方法でも本開示及び／又は本発明の範囲を限定するとは必ずしも意図されないことが理解されよう。したがって、本開示は、特定の形態を参照することによって詳細に説明される一方で、説明は、単なる例であり、特許請求される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。例えば、ある特定の遂行は、添付の図面に示され、及び／又は書面による説明で記載される少数の又はさらなる構成要素を含んでもよい。さらに、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、示した形態に対して、様々な修飾を成すことができる。したがって、本発明の様々な態様、実施形態及び／又は遂行は、本明細書中に記載及び／又は開示される一方で、他の態様、遂行及び実施形態もまた意図される。
【００２２】
[0029]  別記しない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同義を有する。本明細書中に記載するものに類似するか、又は等価な多数の方法及び材料は、本開示の実施において使用することができる一方で、ある特定の例示的な材料及び方法のみが、本明細書中で記載される。
【００２３】
[0030]  デバイス、システム、方法等を含む本開示の様々な態様は、１つ又は複数の例示的な遂行を参照することによって示され得る。本明細書中で使用する場合、「例示的な」及び「例としての」という用語は、「例、場合又は説明として機能すること」を意味し、本明細書中に開示する他の遂行よりも好ましいか、又は有利であると必ずしも解釈されるべきではない。さらに、本開示若しくは本発明の「遂行」又は「実施形態」に対する言及は、その１つ又は複数の実施形態に対する特定の言及を含み、逆も同じであり、下記の説明によってではなく、併記の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定することなく、例としての実施例を提供すると意図される。
【００２４】
[0031]  本明細書及び併記の特許請求の範囲で使用される場合、内容が明らかに他を指示しない限りは、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「タイル（a tile）」に対する言及は、１つ、２つ又はそれ以上のタイルを含む。同様に、複数の指示対象に対する言及は、内容及び／又は文脈が明らかに他を指示しない限りは、単一の指示対象及び／又は複数の指示対象を含むと解釈されるべきである。したがって、「タイル」に対する言及は、複数のかかるタイルを必ずしも必要としない。代わりに、活用とは無関係に、１つ又は複数のタイルが本明細書中で意図されることが理解されよう。
【００２５】
[0032]  本出願全体にわたって使用する場合、「することができる」及び「してもよい」という単語は、命令的な意味（即ち、しなくてはならないと意味すること）よりも、許容的意味（即ち、する可能性を有すると意味すること）で使用される。さらに、「を含んでいる」、「を有している」、「を包含している」、「を含有している」、「を特徴とする」という用語、それらの変形（例えば、「を含んでいる（includes）」、「を有している（has）」、及び「を包含している（involves）」、「を含有している（contains）」など）及び類義語は、特許請求の範囲を含む本明細書中で使用する場合、包括的であり、及び／又は制約がないものとされ、「を含んでいる」という単語及びその変形（例えば、「を含む（comprise）」及び「を含む（comprises）」）と同じ意味を有するものであり、例としてさらなる記載されていない要素又は方法工程を排除しない。
【００２６】
[0033]  本明細書中で使用する場合、「最上部」、「底部」、「左側」、「右側」、「上方」、「下方」、「上部」、「下部」、「内側」、「外側」、「内部」、「外部」、「内面」、「外面」、「近位」、「遠位」、「フォワード」、「リバース」等などの方向性及び／又は任意の用語は、相対的な方向及び／又は配向を単に示すのに使用することができ、他の場合では、明細書、本発明及び特許請求の範囲を含む本開示の範囲を限定するように意図され得ない。
【００２７】
[0034]  また、本明細書中に記載する様々な遂行は、本開示の範囲を逸脱することなく、記載又は開示される任意の他の遂行と組み合わせて利用することができることが理解される。したがって、本開示のある特定の遂行に従う製品、メンバー、要素、デバイス、装置、システム、方法、プロセス、組成物及び／又はキットは、本開示の範囲を逸脱することなく、本明細書中に開示する他の遂行において記載される特性、フィーチャ、構成要素、メンバー、要素、工程等（システム、方法、装置等を含む）を包含する、組み込む、又はそれ以外の方法で含む。したがって、１つの遂行に関する特定の特色に対する言及は、前記遂行内のみでの適用に限定されると解釈されるべきではない。
【００２８】
[0035]  本明細書中で使用する見出しは、単に構成の目的のためであり、説明又は特許請求の範囲を限定するのに使用すると意図されない。理解を促進するために、可能であれば、同様の参照数字が使用されて、図面に共通する同様の要素を指定する。さらに、可能であれば、要素の同様の番号付与は、様々な図面で使用されている。さらに、特定の要素の代替的な形態はそれぞれ、要素番号に付加される別の文字を含んでもよい。
【００２９】
[0036]  「約」という用語は、およそ、その辺りで、概略で、又はおおよそを意味するのに本明細書中で使用される。「約」という用語が、数値と併用される場合、それは、記載する数値の上下の境界を延長させることによって範囲を修飾する。概して、「約」という用語は、５％の分散で記載した値の上下の数値を修飾するのに本明細書中で使用される。かかる範囲を表す場合、別の実施形態は、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲のそれぞれの終点が、他の終点に関連して、及び他の終点とは無関係に有意であることがさらに理解される。
【００３０】
[0037]  「又は」という単語は本明細書中で使用する場合、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、また当該リストのメンバーの任意の組合せを含む。
【００３１】
[0038]  「試料」とは、本明細書中で記載するようにアッセイされる動物；動物由来の組織又は臓器；細胞（対象内、対象から直接採取した、又は培養物中に維持されるか、又は培養細胞株由来の細胞）；細胞溶解物（又は溶解物分画）又は細胞抽出物；細胞、細胞材料又はウイルス材料に由来する１つ又は複数の分子（例えば、ポリペプチド又は核酸）を含有する溶液；ウイルス、ウイルスに由来する１つ又は複数の分子を含有する溶液；寄生虫；寄生虫に由来する１つ又は複数の分子を含有する溶液；細菌；細菌に由来する１つ又は複数の分子を含有する溶液；真菌；真菌に由来する１つ又は複数の分子を含有する溶液；植物；植物に由来する１つ又は複数の分子を含有する溶液；又は核酸を含有する溶液を意味する。試料はまた、細胞、細胞構成要素又は核酸を含有する任意の体液又は排泄物（例えば、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁、脳脊髄液、粘液、膿、汗、しかし、これらに限定されない）であってもよい。
【００３２】
[0039]  「核酸」という語句は本明細書中で使用する場合、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれかの、単鎖又は二重鎖の、センス又はアンチセンスの、ワトソンクリック塩基対形成によって相補核酸へのハイブリダイゼーションが可能である、天然に存在するか、若しくは合成のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、BrdU）、及び非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（PNA）又はチオジエステル結合）、又は例えばＢｅｎｎｅｒ、米国特許第８，３５４，２２５号、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ」及び米国特許第８，８７１，４６９号  「Ｓｅｌｆ−ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｐｒｉｍｉｎｇ」によって記載される伸長遺伝子アルファベットを含むことができる。特に、核酸として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ又はそれらの任意の組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３３】
[0040]  「プローブ」、「プライマー」又は「オリゴヌクレオチド」とは、相補配列（「標的」）を含有する第２の核酸分子と塩基対形成することができる規定の配列の単鎖核酸分子を意味する。生じたハイブリッドの安定性は、長さ、ＧＣ含有量、及び行われた塩基対形成の程度に依存する。塩基対形成の程度は、プローブと標的分子との間の相補性の程度、及びハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの度合いなどのパラメーターによって影響される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの度合いは、温度、塩濃度及びホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメーターによって影響され、当業者に公知の方法によって決定される。プローブ、プライマー及びオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法によって、放射能で、蛍光的に、又は非放射能で、検出可能に標識され得る。ｄｓＤＮＡ結合色素を使用して、ｄｓＤＮＡを検出し得る。「プライマー」は、ポリメラーゼによって伸長されるように特異的に構成されるのに対して、「プローブ」又は「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されてもよく、又はされなくてもよいことが理解される。
【００３４】
[0041]  「ｄｓＤＮＡ結合色素」とは、通常、より強力に蛍光を発することによって、単鎖ＤＮＡに結合されるか、又は溶液中で遊離している場合よりも、二重鎖ＤＮＡに結合されている場合に、差次的に蛍光を発する色素を意味する。ｄｓＤＮＡ結合色素について言及する一方で、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７,３８７,８８７号に記載される幾つかの非限定的な例としての色素を用いて、任意の適切な色素が本明細書中で使用され得ることが理解される。他のシグナル産生物質もまた、当該技術分野で公知であるように、核酸増幅を検出して、例として酵素、抗体等を融解させるのに使用され得る。
【００３５】
[0042]  「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシー条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、試料核酸）を認識して、物理的に相互作用し（即ち、塩基対）、他の核酸とは実質的に塩基対形成しないことを意味する。
【００３６】
[0043]  「高ストリンジェンシー条件」とは、標的核酸配列の同定を可能にするように設定されている条件を意味する。かかる条件は通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃未満）で行われる。機能的に、高ストリンジェンシー条件は、少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列を同定するのに使用される。
【００３７】
[0044]  ＰＣＲは、本明細書中の実施例で使用される増幅方法である一方で、プライマーを使用する任意の増幅方法が適切であり得ることが理解される。かかる適切な手順として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；鎖置換増幅（SDA）；核酸配列ベースの増幅（NASBA）；カスケードローリングサークル増幅（CRCA）、ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（LAMP）；核酸の等温及びキメラプライマー開始増幅（ICAN）；標的ベースのヘリカーゼ依存性増幅（HDA）；転写媒介性増幅（TMA）等が挙げられる。したがって、ＰＣＲという用語が使用される場合、他の代替的な増幅方法を含むことが理解されるべきである。別個のサイクルを用いない増幅方法に関して、測定がサイクル又はＣｐで行われる反応時間が使用されてもよく、さらなるＰＣＲサイクルが本明細書中に記載する実施形態で付加されるさらなる反応時間が付加されてもよい。プロトコールは、状況に応じで調節する必要があり得ることは理解される。
【００３８】
[0045]  幾つかの実施形態では、ＰＣＲは、任意の適切なＰＣＲ方法を含む。例えば、ＰＣＲは、マルチプレックスＰＣＲを含むことができ、ここではポリメラーゼ連鎖反応を使用して、幾つかの異なる核酸配列を同時に増幅させる。マルチプレックスＰＣＲは、多重プライマー組を使用することができ、幾つかの異なる核酸配列を同時に増幅することができる。幾つかの場合において、マルチプレックスＰＣＲは、単一のＰＣＲ反応内で多重プライマー組を用いて、異なる核酸標的配列に特異的である異なる核酸配列のアンプリコンを産生することができる。マルチプレックスＰＣＲは、多重の個々のＰＣＲ反応に代わって、単一のＰＣＲ反応を用いて、異なる核酸標的配列のアンプリコンを生成させる有益な特色を有し得る。
【００３９】
[0046]  本明細書中で使用する場合、「配列決定」は、個々の塩基の順番を決定するために核酸の一方又は両方の鎖の配列を同定することを含む、核酸の配列を同定することを意味する。「次世代配列決定」は、複数の同時併発反応で実施される配列決定である。
【００４０】
[0047]  オリゴヌクレオチドに関する下記命名法を本明細書中で使用する：
Ｕ＝ユニバーサルプライマー−特定の反応において全てのプライマーによって共有される共通配列
Ｓ＝特異的なプライマー−所定の標的アッセイに特有
添字：
ｏ＝外側−外側アンプリコンを生成させるための第１段階の増幅で使用するプライマー
ｉ＝内側−第２段階のアンプリコン反応で使用するネステッドプライマー。このプライマーは、外側アンプリコンを生成させるのに使用された外側プライマーと部分的に重複することができるが、外側アンプリコンの部分的に又は完全に内部に存在する
ｉｉ＝内側−内側−入れ子状の内側プライマーの内部で入れ子状になるプライマー。このプライマーは、この内側プライマーと部分的に重複することができるか、又は内側プライマーの完全に内部に位置していてもよい
Ｆ＝フォワード及びＲ＝リバースは、ＰＣＲアンプリコンを規定する２つのプライマーである。配向性は任意であることが理解される
ｘ＝マルチプレックスにおける特定の特異的なオリゴヌクレオチドの指数（１≦ｘ≦ｎ）
例えば：ＵＲＳｉＲ４は、アンプリコン数４のための特異的な内側リバースの５’末端上のユニバーサルリバースプライマーである。
【００４１】
[0048]  本明細書中に記載する様々な実施例は、ヒト標的及びヒト病原体について言及する一方で、これらの実施例は、単なる例である。本明細書中に記載する方法、キット及びデバイスを使用して、ヒト試料、動物試料、獣医学試料、植物試料、藻類試料、食品試料、工業試料、ウイルス試料、真菌試料、細菌試料、寄生虫試料及び環境試料を含むが、これらに限定されない多種多様な試料由来の多種多様な核酸配列を、検出及び配列決定し得る。本明細書中に記載する方法、キット及びデバイスを使用して、抗生物質耐性を検出すること、ウイルス遺伝子を検出すること、法医学、組織タイピング、臓器移植、薬物代謝、バイオテロリズム、食品安全、環境安全、農業、生態学を含むが、これらに限定されない多種多様な用途由来の多種多様な核酸配列を、検出及び配列決定し得る。
【００４２】
[0049]  本明細書中に開示する様々な実施形態は、例として単一の閉鎖系において、様々な生物学的物質、例として抗原及び核酸配列の存在及び／又は同定に関して試料をアッセイするための内蔵型核酸分析ポーチを使用する。ポーチ及びポーチとともに使用するための機器を含むかかるシステムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８,３９４,６０８号及び第８，８９５，２９５号並びに米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号において、より詳細に開示されている。しかしながら、かかるポーチは、単に例示的であり、本明細書中に論述するＰＣＲ反応は、当該技術分野で公知であるように様々な増幅システムを使用して、９６ウェルプレート、他の形態のプレート、アレイ、カルーセル等を含む、当該技術分野で公知であるような様々な開放又は閉鎖系の試料容器のいずれかにおいて実施され得ることが理解される。「試料ウェル」、「増幅ウェル」、「増幅容器」等の用語が本明細書中で使用される一方で、これらの用語は、これらの増幅システムにおいて使用されるように、ウェル、チューブ、ＤＮＡチップ及び様々な他の反応容器を包含すると意図される。一実施形態において、ポーチは、多重標的核酸に関してアッセイするのに使用される。ポーチは、例示的な閉鎖系において、試料ウェルとして使用される１つ又は複数のブリスターを含んでもよい。例として、核酸調製、一次大容量マルチプレックスＰＣＲ、一次増幅産物の希釈及び二次ＰＣＲを含む様々な工程が、任意選択により使い捨てのポーチにおいて実施されてもよく、融解曲線分析及び核酸配列決定などの任意のリアルタイム検出又は増幅後分析に終わる。さらに、様々な工程が、本発明のポーチにおいて実施され得る一方で、工程の１つ又は複数が、ある特定の使用に関して省略されてもよく、ポーチ形態は、状況に応じて変更されてもよいことが理解される。
【００４３】
[0050]  図１は、様々な実施形態で使用され得るか、又は様々な実施形態用に再構成され得る例としてのポーチ５１０を示す。ポーチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５に類似しており、同じ項目は、同じ番号付けをした。備品５９０は、進入チャネル５１５ａから５１５ｌまで備えており、進入チャネルはまた、試薬リザーバ又は廃棄物リザーバとして機能する。例として、試薬は、備品５９０中で凍結乾燥されて、使用前に再水和され得る。各々のチャネル５３８、５４３、５５２、５５３、５６２及び５６５を有するブリスター５２２、５４４、５４６、５４８、５６４及び５６６は、米国特許第８,８９５,２９５号の図１５の同じ数のブリスターに類似している。図１の第２段階の反応ゾーン５８０は、米国特許出願番号第８,８９５,２９５号の反応ゾーンに類似しているが、高密度アレイ５８１の第２段階のウェル５８２は、いくらか異なるパターンで配置される。図１の高密度アレイ５８１のより円形なパターンは、角にあるウェルを排除して、第２段階ウェル５８２のより均一な充填をもたらし得る。図示するように、高密度アレイ５８１は、１０２個の第２段階のウェル５８２を備えている。ポーチ５１０は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器（Biofire Diagnostics、ソルトレイクシティ、UT）における使用に適している。しかしながら、ポーチの実施形態は、単に例示的であることが理解される。
【００４４】
[0051]  ポーチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号に記載される方法で使用され得る。ある例としての実施形態では、試験されるべき試料（１００μｌ）及び溶解緩衝液（２００μｌ）を含む混合物３００μｌを、チャネル５１５ａ付近にある備品５９０における注入ポート（図示せず）に注入し、試料混合物を、進入チャネル５１５ａに引き入れる。水もまた、進入チャネル５１５ｌに隣接した備品５９０の第２の注入ポート（図示せず）に注入して、備品５９０に備えられたチャネル（図示せず）を介して分配され、それにより最大１１個の異なる試薬を水和させ、試薬はそれぞれ、進入チャネル５１５ｂから５１５ｌにて乾燥形態で予め供給された。これらの試薬は例として、凍結乾燥させたＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄試薬、イムノアッセイ試薬、又は他の化学物を含んでもよい。例として、試薬は、核酸抽出、第１段階のマルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックス反応の希釈、及び第２段階のＰＣＲ試薬の調製、並びに対象反応用である。図１に示す実施形態において、注入する必要のあるもの全ては、一方の注入ポートでは試料溶液であり、他方の注入ポートでは水である。注入後、２つの注入ポートを密封してもよい。ポーチ５１０及び備品５９０の様々な形態に関するより多くの情報については、すでに参照により組み込まれる米国特許第８，８９５，２９５号を参照されたい。
【００４５】
[0052]  注入後、試料を、チャネル５１４を介して注入チャネル５１５ａから溶解ブリスター５２２に移動させる。溶解ブリスター５２２は、セラミックビーズ５３４を備え、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器内に備えられた回転ブレード又はパドルを使用した嵌入を介してボルテックスするように構成されている。細胞が適切に溶解されたら、試料を、チャネル５３８、ブリスター５４４、及びチャネル５４３から、ブリスター５４６まで移動させて、ブリスター５４６で、試料を、シリカでコーティングした磁気ビーズ５３３などの核酸結合磁気ビーズと混合する。混合物を、適切な時間、例としてはおよそ１０秒〜１０分間インキュベートする。ブリスター５４６に隣接するＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器内に位置する格納式マグネットにより、溶液から磁気ビーズが捕捉されて、ブリスター５４６の内面表面に対してペレットを形成する。次に、液体をブリスター５４６から、ブリスター５５４４を戻って通って、ブリスター５２２へ移動させ、ブリスター５２２はここでは、廃棄物容器として使用される。注入チャネル５１５ｃから５１５ｅまでの１つ又は複数からの１つ又は複数の洗浄緩衝液は、ブリスター５４４及びチャネル５４３を介して、ブリスター５４６へ供給される。任意選択により、マグネットが格納されて、磁気ビーズは、ビーズをブリスター５４４及びブリスター５４６からチャネル５４３を介して前後に移動させることによって洗浄される。磁気ビーズが洗浄されたら、磁気ビーズは、マグネットの活性化によってブリスター５４６中に格納され、続いて洗浄溶液を、ブリスター５２２に移動させる。このプロセスは、溶解緩衝液及び試料残骸を核酸結合磁気ビーズから洗浄するために必要に応じて繰り返してもよい。
【００４６】
[0053]  洗浄後、注入チャネル５１５ｆで保管される溶出緩衝液を、ブリスター５４８に移動させて、マグネットを格納する。溶液は、チャネル５５２を介して、ブリスター５４６とブリスター５４８との間で循環させて、ブリスター５４６中で磁気ビーズのペレットを崩壊させて、捕捉された核酸をビーズから解離させて、溶液に放出させる。マグネットを再度活性化させて、ブリスター５４６中に磁気ビーズを捕捉して、溶出した核酸溶液をブリスター５４８へ移動させる。
【００４７】
[0054]  注入チャネル５１５ｇからの第１段階のＰＣＲマスターミックスを、ブリスター５４８中で核酸試料と混合させる。任意選択により、混合物は、チャネル５５３を介して、５４８と５６４との間に混合物を通すことによって混合させる。混合の数サイクル後、溶液をブリスター５６４中に含有させて、ブリスター５６４で、第１段階のＰＣＲプライマーのペレットが供給され、プライマーの少なくとも１つの組が、各標的核酸配列用であり、第１段階のマルチプレックスＰＣＲが実施される。ＲＮＡ標的が存在する場合、ＲＴ（逆転写）工程は、第１段階のマルチプレックスＰＣＲに先立って、又はそれと同時に実施され得る。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器における第１段階のマルチプレックスＰＣＲ温度循環は、例として、１５〜３０サイクルで実施されるが、特異的な用途の要件に応じて、他のレベルの増幅が望ましい場合がある。第１段階のＰＣＲマスターミックスは、当該技術分野で公知であるように、様々なマスターミックスのいずれかであり得る。１つの例において、第１段階のＰＣＲマスターミックスは、１サイクルにつき２０秒未満かかるＰＣＲプロトコールを用いた使用のための、すでに参照により組み込まれる米国特許第１４／４０３，３６９号及び国際公開第２０１３／１７７４２９号で開示される化学のいずれかであり得る。
【００４８】
[0055]  第１段階のＰＣＲが、所望のサイクル数を継続した後、試料は、例として、試料の大部分をブリスター５４８に戻して通して、ブリスター５６４中にほんの少量を残して、注入チャネル５１５ｉからの第２段階のＰＣＲマスターミックスを添加することによって希釈され得る。或いは、５１５ｉからの希釈緩衝液を、ブリスター５６６に移動させた後、流体をブリスター５６４とブリスター５６６との間で前後に移動させることによってブリスター５６４中で増幅試料と混合されてもよい。望ましければ、希釈は、注入チャネル５１５ｊ及びチャネル５１５ｋからの希釈溶液を使用して、数回繰り返してもよく、又は注入チャネル５１５ｋは、以下で論述するように配列決定した後に、注入チャネル５１５ｈからの第２段階のＰＣＲマスターミックスを、希釈した増幅試料の幾つか又は全てに添加するために貯蔵されてもよい。希釈のレベルは、希釈工程の数を変更することによって、又は増幅用の構成成分、例として、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含む希釈緩衝液若しくは第２段階のＰＣＲマスターミックスと混合する前に廃棄される試料のパーセントを変更させることによって調節され得るが、他の構成成分もまた、非ＰＣＲ増幅方法に特に適切であり得ることが理解される。望ましければ、試料及び第２段階のＰＣＲマスターミックスのこの混合物は、第２段階の増幅のための第２段階のウェル５８２への移動に先立って、ブリスター５６４中で予熱され得る。かかる予熱は、第２段階のＰＣＲ混合物においてホットスタート構成成分（抗体、化学物質又はそれ以外）の必要性を除去し得る。
【００４９】
[0056]  例としての第２段階のＰＣＲマスターミックスは不完全であり、プライマー対を欠如しており、１０２個の第２段階のウェル５８２のそれぞれは、特異的なＰＣＲプライマー対を個々に予め供給される。望ましければ、第２段階のＰＣＲマスターミックスは、他の反応構成成分を欠如してもよく、これらの構成成分は、同様に第２段階のウェル５８２において予め供給されてもよい。プライマー対はそれぞれ、第１段階のＰＣＲプライマー対に類似し得るか、若しくはそれと同一であってもよく、又は第１段階プライマー対内で入れ子状であり得る。ネステッドプライマーは、第１段階のプライマーのハイブリダイゼーション位置に対して内部である位置で、第１段階のアンプリコンにハイブリダイズするプライマーであることが理解される。ネステッドプライマーは、第１段階のプライマーと部分的に重複してもよいが、３’末端は、第１段階のプライマーの３’末端に対して内部に位置する。ブリスター５６４から第２段階のウェル５８２までの試料の移動は、ＰＣＲ反応混合物を完成させる。高密度アレイ５８１が充填されると、個々の第２段階の反応は、当該技術分野で公知であるように、任意数の手段によって、各々の第２段階のブリスター中で密封される。相互汚染を伴わない高密度アレイ５８１を充填及び密封する例としての方法は、すでに参照により組み込まれる米国特許第８，８９５，２９５号で論述される。例として、高密度アレイ５８１のウェル５８２における様々な反応が、例として１つ又は複数のペルチェデバイスを用いて、同時に熱循環されて、第２段階のＰＣＲ反応を実行するが、熱循環に関する他の手段は、当該技術分野で公知である。
【００５０】
[0057]  ある特定の実施形態において、第２段階のＰＣＲマスターミックスは、ｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓを含有して、増幅を示すシグナルを生成する。しかしながら、この色素は、単なる例であり、当該技術分野で公知であるように、他のｄｓＤＮＡ結合色素、及び蛍光的に、放射能で、化学発光的に、酵素的に、又は他で標識されるプローブを含む他のシグナルを使用してもよいことが理解される。或いは、アレイ５８１のウェル５８２は、シグナルを伴わずに、続く配列決定から報告される結果を提供してもよい。
【００５１】
[0058]  例としてのＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器は、ＰＣＲ後融解に基づいて第２段階の反応のそれぞれに関する陽性又は陰性判定を行うようにプログラムすることができる。陽性判定は、相当するウェル５８２に関して、成功した第２段階のＰＣＲ反応を示し得る。陽性判定はまた、第２段階のＰＣＲ反応で生成されるアンプリコンの量が、配列決定を可能にするのに十分であることを示し得る。陽性判定はまた、第２段階のＰＣＲ反応が、実質的に均質な分子種であるアンプリコンを産生したことを示し得る。陰性判定は、相当するウェル５８２に関して、失敗した第２段階のＰＣＲ反応を示し得る。陰性判定はまた、第２段階のＰＣＲ反応で生成されるアンプリコンの量が、配列決定を可能にするのに十分ではないことを示し得る。陰性判定はまた、第２段階のＰＣＲ反応が、実質的に均質な分子種であるアンプリコンを産生しなかったことを示し得る。一実施形態において、融解曲線は、陽性であるべき判定に関して、予め規定される温度範囲内に融解ピーク（例えば、一次導関数最大値又は負の一次導関数最大値）を生じなくてはならない。第２段階の反応のそれぞれを判定するこの方法は、単なる例であり、判定は、当該技術分野公知であるように、リアルタイム増幅データを使用して、若しくは他の手段によって行うことでき、又は判定は、続く配列決定が実施されるまで先送りされてもよいことが理解される。
【００５２】
[0059]  例として、機器が、陽性又は陰性判定を行うように構成される場合、機器は、続く配列決定に関して陽性の結果を生じるウェルのみに印を付すようにプログラムされ得る。幾つかの実施形態において、陽性判定と、配列決定用に印を付されたウェルとの間に１対１の一致が見られ得る。他の実施形態において、配列決定用に印を付されたウェルは、陽性判定を生じるウェルと１対１の一致を有し得ない。例えば、ＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチ５１０の第２段階５８０は、反復ウェル、例として二重反復又は三重反復ウェルでスポットされ得る。それらのウェルの１つ又は複数が、陽性で現れる場合、当該標的配列の複製物全てが、配列決定用に印を付されることが望ましい場合がある。他の実施形態において、複製物のそれぞれに関して唯一のウェルを、配列決定に関して印を付すことが望ましい場合がある。さらに他の実施形態において、対照として使用されるウェルは、続く配列決定用に印を付されてもよく、又は印を付されなくてもよい。さらに他の実施形態において、ウェルは全て、陽性若しくは陰性の増幅判定を伴って、又は伴わずに配列決定され得る。
【００５３】
[0060]  ＦｉｌｍＡｒｒａｙが、未精製の生物学的試料由来のＰＣＲに基づいて、陽性又は陰性の結果を提供するのに有用である一方で、未精製の生物学的試料から、特異的なＲＮＡ及びＤＮＡ標的の配列へと進む方法もまた有用である。１つの例としての実施形態において、手順は自動化されてもよく、８時間未満、さらに例としては５時間未満、さらに例としては３時間又はそれ未満かかってもよく、配列の２５個以上の塩基、例として多重アンプリコン、例として最大１０００個のアンプリコンに関する配列の最大２００個の塩基を提供し得る。例として、未精製の試料（サンプル）からシーケンスまでのプロセスは、アンプリコン混入の機会を最低限に抑えるように閉鎖系で行われる。
【００５４】
[0061]  ＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチ５１０の第２段階の５８０は、所望の標的に対するアンプリコンを生成させるのに使用される。２工程ＰＣＲのため、本質的に均質なアンプリコンが、第２段階のウェル５８２のそれぞれにおいて生成される。その各々のウェル５８２におけるアンプリコンのバッチのそれぞれが独立して、当該技術分野で公知の配列決定方法によって配列決定され得る。例えば、アンプリコンのバッチのそれぞれが、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Life Technologies）、４５４（Roche）、ＳＯＬｉＤ（ABI）、ＨｉＳｅｑ又はＭｉＳｅｑ（Illumina）及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどの次世代配列決定（NGS）に関して、当該技術分野で公知の幾つかの技法のいずれか１つによって配列決定することができる。
【００５５】
[0062]  多くの成功したＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチの実行において、第２段階のアレイ５８１におけるウェル５８２中の陽性シグナルは、アンプリコンの実質的に純粋な単一種を表す。アンプリコンのこの単一種は、必ずしも分子クローンであるとは限らない。例えば、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、又はプラスミドへの分子クローニングは、元の核酸分子の空間的に分離された分子クローンを生成させる全ての方法である。対比して、第２段階のアンプリコンは、多くの同一の又は密接に関連した鋳型分子によって生じる。しかしながら、第１段階の濃縮及び希釈のため、第２段階のＰＣＲの最終結果は、主に「単一の分子種」と本明細書中で称されるアンプリコンの単一種である。本明細書中で使用する場合、単一の分子種は、必ずしも分子クローンであるとは限らず、配列決定を可能にするのに十分な１つの優勢種であることが理解される。
【００５６】
[0063]  幾つかの実施形態において、第２段階のＰＣＲにおいて発生するアンプリコンの融解曲線は、これらのアンプリコンが、本質的に均質であることを示す。融解曲線分析が、非特異的な二重鎖ＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓを用いてＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器で実施することにより、単一のピークが生じ、第２段階のＰＣＲ産物が、単一の意図されるアンプリコンに支配されて、相当量のプライマー−二量体種又は非特異的なアンプリコンを含まないことを示し、２工程ネステッドマルチプレックス増幅が、単一の分子種を生成させることを実証している。
【００５７】
[0064]  幾つかの実施形態において、標的核酸配列は、試料において非常に低コピー数で存在する。標的核酸は、試料全体の非常に少量の部分を構成することができ、及び／又は他の核酸が存在し得る。例えば、ＰＣＲベースの病原体検出用途において、目的の病原体は、試料において非常に低コピー数で存在してもよく、試料は、大過剰の他の核酸、例としてヒト核酸（例えば、血液）又は他の微生物学的ゲノム（例えば、便）が混入されてもよく、複雑な核酸混合物をもたらし得る。従来の単一段階のＰＣＲ検出システムにおいて、この複雑な核酸混合物由来の単一段階のＰＣＲ増幅は多くの場合、所望の特異的なアンプリコンに加えて、多重の非特異的な産物をもたらす。したがって、従来の単一段階のＰＣＲ検出システムは多くの場合、正確なアンプリコンを単離して、及び／又は正確なアンプリコンの同定を確認するのに、基礎的な単一段階のＰＣＲに加えて、第２の検出メカニズム又は「フィルター」を必要とする。このフィルターは、標的アンプリコンを同定するためのサイズ排除工程（例えば、アガロース又はアクリルアミドゲル）、プローブベースの検出方法（例えば、加水分解プローブ又は２つのハイブリダイゼーションプローブを使用した）又は表面（GenMark Diagnostics, Inc.、カールスバッド、カリフォルニア）への、又は保管することができるビーズ（Luminex Corporation、オースティン、テキサス）への配列捕捉を使用した配列捕捉方法を含むことができる。
【００５８】
[0065]  幾つかの実施形態において、２工程ＰＣＲは、本質的に均質であるアンプリコンを生成させるため、第２の検出メカニズム又は「フィルター」を省略することができ、第２段階のＰＣＲにおいて発生するアンプリコンを直接配列決定することができる。したがって、第２段階のＰＣＲによって生成されるアンプリコンは、当該技術分野で公知の任意の手段によって直接配列決定することができる。
例として、アンプリコンの一部をウェルに係留させることによって、例としては、当該技術分野で公知であるように、第２段階のプライマー又はアンプリコンをウェルの底部に共有結合させて、続いてＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＡＢＩ（SoLiD）のＮＧＳ技術、又は他の配列決定方法に基づき得る次世代配列決定方法を使用することによって、集団を配列決定することが可能であるはずである。他のシステムとは異なり、この続く配列決定は、第２の段階のウェルの１つ又は複数内で自動的に遂行されてもよい。
【実施例】
【００５９】
[0066]  実施例１
[0067]  この実施例において、アンプリコンの１つの鎖は、配列決定に先立って、ウェルの底部に係留されている（図２Ａ）。１つの例では、係留されたアンプリコンを供給する方法の１つは、一方が正常な５’ＯＨを有し、且つ他方が、ウェル表面に架橋させることが可能である５’末端に供給される化学部分を有する５’伸長を有する、２つの形態のオリゴヌクレオチドの１つ（例として、フォワードプライマー）を合成することである。この目的で、当該技術分野で公知である様々な化学が存在する。これは、反応ウェルに係留されたフォワードプライマーの幾つか及び溶液中で遊離したフォワードプライマーの幾つかを供給する。溶液中で遊離したフォワードプライマーは、増幅反応の動態を改善するのに供給されることが理解される。第２段階のアレイ５８１に供給するための１つの例としての方法は、例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５８７４０号及び米国特許第１４／３９５，００２号に記載されるデバイスなどを使用して、二度アレイをスポットすることである。例として、第１回のアレイ５８１をスポットして、化学的に修飾されたプライマー２４を、アレイ５８１のウェル５８２のそれぞれに付加させる。続いて、化学的に修飾されたプライマー２４をウェル５８２に架橋して、続いてカップリング反応をクエンチして、アレイへの分子のさらなる架橋を防止し得る。アレイ５８１を乾燥させて、次に、リバースプライマー３２、及び任意選択により他のＰＣＲ構成成分で再びスポットし得る。任意選択により、未修飾のフォワードプライマー２６をスポットして、プライマー濃度の増加を提供して、ＰＣＲ増幅の動態を改善し得る。しかしながら、アレイ５８１をスポットするこの方法は、単なる例であり、化学的に修飾されたプライマー２４（図２Ａに示すような）、未修飾のフォワードプライマー２６、及びリバースプライマー３２に、一度に、又は任意の順序でスポットしてもよいことが理解される。他の実施形態において、化学的に修飾されたプライマー２４は、リバースプライマー３２をスポットするのと一緒に、又はそれに先立ってスポットしてもよく、未修飾のフォワードプライマー２６を省略し得る。例として、リバースプライマー３２は、アレイ５８１における全てのリバースプライマーに関して同じである５’伸長配列２０を有し得る。この「ユニバーサルプライマー」は、後に配列決定反応中に使用されるように供給される。溶液中で遊離した幾つかのフォワードプライマーが供給される例としての実施形態において、ＰＣＲ反応の大部分が溶液中で行われるが、アンプリコン２８の一部は、アレイ５８１におけるウェル５８２に係留されている係留されたアンプリコン２９の形態で存在する（図２Ａを参照）。
本明細書中の実施例の多くは、１つ又は複数のプライマーをアレイ上の試料ウェル又はスポットに係留させることについて記載している。しかしながら、係留が論述される場合、これは、配列決定位置へ移動させることができるビーズを含む任意の固体表面へ係留させることを含み得ることが理解される。
【００６０】
[0068]  実施例２
[0069]  この実施例において、配列決定チップとしての第２段階のＰＣＲアレイ５８０の幾何学の例について記載する。図３は、例としてのアレイ５８１の部分的分解組立図を示す。この例としての実施形態において、ケイ素層５８９は、アレイ５８１の底部上に構築されて、例として、米国特許第８，８９５，２９５号で論述されるように第２の層５８７（図示せず）を置き換えて、ウェル５８２のそれぞれにおいて底部表面を形成する。
【００６１】
[0070]  上述するように、相互汚染を伴わずに高密度アレイ５８１を充填及び密封する例としての方法は、すでに参照により組み込まれる米国特許第８，８９５，２９５号で論述されている。図３に示す１つの例としての実施形態において、米国特許第８，８９５，２９５号の穿孔層５８５に類似した穿孔層５８５が提供される。穿孔層５８５は、力の存在下で流体がウェル５８２のそれぞれを通過するのを可能にするが、穿孔は、力の非存在下では、流体が通過するのを実質的に防ぐように十分小さい。しかしながら、再水和中にプライマーを適所に保つ化学的メカニズムは、続く配列決定工程においてほとんど妨害を提供しないように、本実施形態において、穿孔層として存在してもよく、又は穿孔層よりも望ましい場合もあることが理解される。化学的メカニズムを用いる一実施形態において、「溶液相」フォワードプライマー２６及びリバースプライマー３２を、溶融した低融解アガロースの溶液、例えばＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）Ｌｏｗ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ  Ａｇａｒｏｓｅ（Life Technologies）と組み合わせてもよく、その後、それらが最初に溢れた場合にそれらがアレイから流れ出ないようにスポットするが、化学的メカニズムに関する他の材料が、当該技術分野で公知であり、それらの幾つかは、米国特許第８，８９５，２９５号で論述されている。第２段階のアレイ５８１を溢れた後は、アレイ５８１におけるウェル５８２は、米国特許第８，８９５，２９５号で論述される機器においてブラダーを膨らませること、及び米国特許第８，８９５，２９５号に記載されるように、層５１８と同じか、又は類似した薄膜５１８に対して押し込むことによって密封して塞ぐ。低融解アガロースを使用した実施形態において、ウェル５８２が密封されると、アレイの加熱により、溶液中にフォワードプライマー２６及びリバースプライマー２２が放出される。アレイ５８１は、主にケイ素で作製されてもよく、又はケイ素層５８９を備えてもよく、米国特許第８，８９５，２９５号で論述されるように、材料の残部は、アレイ５８１に類似しており、又は他の材料で作製されてもよく、且つアレイ５８１を横切って流れる液体が、ウェル５８２に進入することが可能であり、また新しい化学物質を導入するか、若しくはこれまでの化学物質を洗い流すように構成される。深さ約５０μｍ〜約５００μｍを有するアレイ５８１を提供することが望ましい場合があるが、配列方法及び形態に応じて、他のサイズが適切である場合もある。
【００６２】
[0071]  図１を参照すると、第２段階の反応ゾーン５８０は、２つのポート、チャネル５６５及びチャネル５６７を備えており、それらはそれぞれ、圧力又は他の手段によって密封され得る。チャネル５６５は、ブリスター５６６から液体を受け取るために提供され、ブリスター５６６は、多重進入チャネルに接続して図示される。注入チャネル５１５ｋは、配列決定用の材料を含有し得るか、又は配列決定に必要とされる材料に関する外部供給源への接続を可能にするバルブ又は密封可能なポートを有し得る。同様に、注入チャネル５１５ｌは、配列決定から廃棄物材料を受け取ってもよく、又は別の廃棄物容器への接続のためのバルブ又は密封可能なポートを備えてもよい。したがって、この例としての実施形態において、液体は、注入チャネル５１５ｋから、チャネル５６５を通って、アレイ５８１のウェル５８２全て及び出口チャネル５６７を横切って、廃棄物リザーバ５１５ｌまで流れる。流体が、第２段階の増幅ゾーン５８０へ移動すると、出口チャネルは密封されたままであり得ることが理解される。これが、アレイ５８１上に流体の泡を形成して、攪拌によりアレイ上に均質化された流体が創出され得る。チャネル５６５及びチャネル５６７の同調した開放及び閉鎖は、アレイ５８１を通る流体の量を制御することができる。
【００６３】
[0072]  第１段階のアンプリコン２１（図２Ａ（ｉ）及び図２Ａ（ｉｉ））の増幅に続いて、例として、配列決定が、下記工程によって実施され得る：
１）例として加熱することによって、係留されたアンプリコン２９を変性させること、及びアレイから未結合の鎖３０を洗浄すること（図２Ａ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ））。これもまた、未結合のアンプリコン２８全てを洗い流すことが理解される。
２）配列決定プライマー３２をユニバーサルテイル２０へアニーリングさせること、及び開始複合体を形成するためにＤＮＡポリメラーゼ３４を供給すること。未結合の配列決定プライマー及び未結合のＤＮＡポリメラーゼを洗い流すこと（図２Ｂ（ｉｖ）及び図２Ｂ（ｖ））。
３）配列決定。ＤＮＡポリメラーゼが、結合鎖２９に沿って移動して、結合鎖２９の配列を増幅する合成によって、配列決定が実施され得る。ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧはそれぞれ個々に供給され、個々のｄＮＴＰの組込みが測定されて、それにより結合鎖２９のヌクレオチド配列が明らかとなる。個々のｄＮＴＰの組込みは、当該技術分野で公知の方法（例えば、プロトン生成（Ion Torrentと同様）、蛍光又は化学発光（Roche 454と同様）、又は配列決定方法に適切であるような任意の他のシグナル）によって測定することができる。アレイ５８１を洗浄して、配列が生成されるまで、これを繰り返す（図２Ｂ（ｖｉ）及び図２Ｂ（ｖｉｉ））。
【００６４】
[0073]  代替的な実施形態において、ＰＣＲは、リアルタイム曲線及び／又は融解物を用いてポーチ５１０において実施されてもよく、続いてウェル５８２のそれぞれが密封されて、ポーチ５１０の第２段階の増幅ゾーン５８０は、配列決定用の第２の機器へ移動される。上記で論述するようにフォワードプライマーを係留することは、ウェルからウェルへの混入を防止する方法の１つであり得るが、例としてウェル５８２を密封することによって、他の方法が可能であり得る。したがって、係留することは、使用する配列決定方法に応じて、任意選択的であり得る。
【００６５】
[0074]  他の配列決定方法が、かかるシステムで使用され得ることは理解される。かかる例としての方法の１つは、アンプリコンをウェルに連結させることを必要とせず、むしろ単一の分子配列決定方法を使用する（Oxford Nanopore、Wolna AH等を参照、Electrical Current Signatures of DNA Base Modifications in Single Molecules Immobilized in the α-Hemolysin Ion Channel. Isr J Chem. 2013 Jun 1; 53（6-7）:417-430. PubMed PMID:24052667; PubMed Central PMCID: PMC3773884）。かかる代替的な実施形態において、アレイウェル５８２は、単一のチャネルを有するチャンバーに接続されてもよく、又はそれと統合されてもよく、ウェル５８２における第２段階のアンプリコンの集団は、アンプリコンがチャネルを通じて位置を変える際に、１塩基読み取られる。このチャンバーへの接続が、ポーチ５１０へと構築させることができ、又はそれが、第２段階のＰＣＲ実行が完了した後に行われ得る（アンプリコンが、それら個々のウェルへ分離された状態である限り）。例として、増幅後に、アレイ５８１の片側が、ウェルのそれぞれ上に配置される単一のタンパク質ナノポアチャネルを有する薄膜の層上へ密封される。チャネルの他方の側にはさらなる流体が存在し、その結果ウェル５８２とさらなる流体との間に、タンパク質ナノポアチャネルを通って電流が印加され得る。次に、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅのように、又は類似した方法によって、タンパク質ナノポアチャネルを通って移動すると、配列決定はアンプリコンに関して実施することができる。例として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅは、タンパク質ナノポアチャネルとしてタンパク質α−ヘモリジンを使用する。タンパク質ナノポアは、脂質二重層中に配置されて、開放を通じて単鎖ＤＮＡ分子の位置を変えるのに十分なサイズの開放を有する。単鎖ＤＮＡ分子がナノポアを通ると、他の場合ではナノポアを横切って流れるプロトン及び他のイオンが妨害されて、その結果としてナノポアを通る電流が変更される。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシステムでは、単鎖ＤＮＡ分子の個々の塩基の独自性（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）は、電流におけるこの変さらによって個々に識別することができる。したがって、個々の塩基対に相当する電流変さらによって引き起こされる電位の変化を測定することによって、単鎖ＤＮＡ分子内の個々のヌクレオチドの配列を確認することができる（Maglia, Giovanni, et al. "Analysis of single nucleic acid molecules with protein nanopores." Methods in enzymology 475（2010）: 591-623及びClarke, James, et al. "Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing." Nature Nanotechnology 4.4（2009）: 265-270を参照）。しかしながら、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシステムは例であり、他の配列決定形態が意図されることが理解される。別のバージョンでは、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニアによって開発された方法に類似して、配列決定ウェルは、小さな光検出容量を創出する底部表面上にゼロモードの導波管を含む。ゼロモードの導波管のそれぞれが、励起ビームによって下から照射されて、ゼロモードの導波管は、光の波長が、導波管を効率的に通過するのを防ぎ、それにより、励起ビームからの衰弱した光を、ゼロモードの導波管のそれぞれの２０〜３０ｎｍ下を透過するのを可能にする。続いて、アンプリコン及びＤＮＡポリメラーゼ複合体の複合体は、ゼロモードの導波管の底部に係留されている。次に、ホスホ連結されたヌクレオチドをウェルに添加する。４つのヌクレオチドはそれぞれ、異なる有色のフルオロフォアで標識することができる。ＤＮＡポリメラーゼ複合体がアンプリコンを増幅すると、個々のホスホ連結されたヌクレオチドは、新生鎖に組み込まれ、個々のホスホ連結されたヌクレオチドのそれぞれの蛍光色が、順番に検出されて、アンプリコンのヌクレオチド配列を決定することができる。元のウェル１つにつき多重のポリメラーゼが存在するため、ポリメラーゼのそれぞれによって維持される鎖のそれぞれへのヌクレオチドの組込みは、最良の結果に同調されるべきである。
【００６６】
[0075]  単一の分子種が２工程ネステッドマルチプレックスＰＣＲに起因することを実証するための１つの例において、ＦｉｌｍＡｒｒａｙの第２段階のアンプリコンが配列決定されている。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ  ＢＣＩＤ  Ｐａｎｅｌ（BioFore Diagnostics）における偽陽性の試験結果の研究の一部として、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、大腸菌（Escherichia coli）、及びストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）を含む生物の混合物は、市販のＦｉｌｍＡｒｒａｙ  ＢＣＩＤ  Ｐａｎｅｌ及び実験ソフトウェアを使用して試験した。乏しい増幅を示す、非常に遅いＣｐｓ弱偽陽性の結果は、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）の第２段階のウェルにおいて検出された。
【００６７】
[0076]  これらの陽性の第２段階のウェルのそれぞれからのアンプリコンを、インスリンシリンジを用いて、第２段階のアレイ上のウェルのそれぞれを穿孔すること、及びアンプリコンを含有する溶液を引き抜くことによってポーチから抽出した。次に、ＢＣＩＤパネルの第２段階で使用するのと同じカンジダ・クルセイ（Candida krusei）内側プライマーを使用して、ＣＦＸ機器（Bio-Rad）においてアンプリコンをさらに２０サイクル増幅させた。続いて、このさらに増幅した材料を、ＡＢＩ機器でサンガー配列決定によって配列決定した。５１個のヌクレオチド（フォワードプライマー）及び７５個のヌクレオチド（リバースプライマー）に関して、２０を超えるＰｈｒｅｄ品質スコアを有するフォワード及びリバースプライマーの両方を使用して、読取り可能な配列を得ることができる。表１は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（National Center for Biotechnology Information）に対する近接配列（フォワード及びリバース配列の重複領域から作製される）のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用した配列比較の結果を示す。
【００６８】
[0077]
【表１】
2018519808.tif 000003
【００６９】
[0078]  これらのデータにより、ＢＣＩＤパネルの第２段階におけるＣ．クルセイ（C. krusei）アッセイが、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）ゲノムの領域を特異的に増幅していることが示される。これにより、配列を産生するＰＣＲが、アンプリコンが豊富でなかったことを示す非常に遅いＣｐを有する場合でさえ、ＢＣＩＤパネルにおいて２工程ネステッドマルチプレックスＰＣＲから、良好な配列データを得ることができることが実証される。
【００７０】
[0079]  実施例３
[0080]  この実施例では、２工程ＰＣＲシステムにおけるヌクレオチド配列決定の例としての実施形態について記載する。ここで図４を参照すると、図４は、図１に類似しており、同様の参照数字は、類似した構成要素を示す。この実施形態において、ウェル５８２を有するアレイ５８０が、スポット６８２（多くの場合、フィーチャと称される）を有するマイクロアレイ６８０で置き換えられる。スポット６８２は、それらの上に堆積される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有するアレイの領域である。スポット６８２の１個当たりに１つの均質な群のオリゴヌクレオチドでスポットしたことが、本明細書中で例として使用されるのに対して、スポット６８２のそれぞれが、プライマー対の両方のメンバーを有してもよく、又はその上にスポットされた１組のネステッドオリゴヌクレオチドを有してもよく、また他の形態が可能であることが理解される。したがって、各組が、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド種であり、組が、標的に特異的である場合に、スポット６８２のそれぞれが、その上にスポットされた１組のオリゴヌクレオチドを有することが理解される。
【００７１】
[0081]  １つの例としての実施形態において、１つのオリゴヌクレオチド種が、スポット６８２のそれぞれにおいてスポットされ、それを使用して、アンプリコンの一方の末端を伸長させて、複数のスポット６８２のそれぞれが、その上にスポットされた異なるオリゴヌクレオチド種を有する。アレイ６８０のスポット６８２のそれぞれが、異なる種を有してもよく、又は反復（例として、二重反復又は三重反復）スポット、又はそれらの任意の組合せが存在し得ることが理解される。
【００７２】
[0082]  以下でより詳細に論述する別の例としての実施形態において、プライマー対の２つのメンバーが、アレイ上の同じスポット６８２でスポットされ、当該スポットでブリッジＰＣＲが可能となり、その結果、スポット６８２全体が、一方又は他方の末端によって留められるアンプリコンを覆うようになる。ブリッジＰＣＲを無作為に使用する従来技術の次世代シーケンサーは、プライマーを、フローセル全体を横切って堆積させ、アレイ上に堆積されたライブラリーの任意の単一のメンバーの増幅を可能にする。単一のスポット６８２においてプライマー対の両方のメンバーをスポットすることによって、標的配列が存在する場合のみ、当該スポット６８２から配列が得られる。したがって、当該スポットから配列を得ることにより、配列が提供されるだけでなく、当該標的に関する陽性判定が提供され得る。
【００７３】
[0083]  例として、アレイ６８０の基板材料はガラスであり得る。例として、（１）高い負荷密度でオリゴヌクレオチドをガラスにカップリングするための化学が十分に理解されているため、（２）平坦性及び伸びの欠如は、アレイプリンターが小さなスポットを互いに非常に近くに配置することができることを意味するため、及び（３）ガラスは、比較的低い自己蛍光を有し、その結果、アレイ上の蛍光色素に関するシグナルノイズ比がより検出しやすいため、多くのマイクロアレイはガラス表面上で作製される。ガラスアレイの、ポーチ６１０への組込みは、ガラスアレイ６８０の破損を低減するために、アレイ６８０周辺又はポート６１０周辺に硬質なフレームを置く必要がある場合がある。
【００７４】
[0084]  しかしながら、他の材料をアレイ６８０に使用してもよいことが理解される。オリゴヌクレオチドをプラスチックに結合する方法は、当該技術分野で公知である。幾つかの実施形態において、プラスチックアレイは、下記：（１）プラスチックが、他のプラスチック構成要素に容易に結合すること、及びポーチ６１０へより容易に組み込ませることができること、（２）可撓性プラスチックを使用してもよく、その結果、ポーチ６１０にストレスがかかった場合に、アレイ６８１はあまり脆弱性ではないことのうちの１つ又は複数を有し得る。プラスチックマイクロアレイは、（ａ）比較的大きなスポットを作製することができ、そのため、シグナルが比較的大きく、スポッティングの精度は重要でない（アレイ面積１平方ｃｍ上に２５６個のスポット＝０．３９ｍｍ２の平方スポット）ため、プラスチックマイクロアレイは、ポーチ６１０において良好に機能する。このサイズのスポットは、マイクロアレイ基準で非常に大きい。比較により、市販のＦｉｌｍＡｒｒａｙウェルは、１．９８ｍｍ２面積の円である（ウェルは、直径１．５９ｍｍである）。より大きなスポットは、より大きなシグナルを発生し、これは、蛍光ヌクレオチド組込みを画像化するためのカメラが、より少数の感知要素を必要とすることを意味し、又はｐＨ変化を感知するのに使用されるシリコンチップは、より少数のトランジスターしか必要とせず、これにより、どちらのデバイスも製造するのにより安価となり、また（ｂ）プラスチックは、低い自己蛍光を有し、さらに比較的高密度でオリゴヌクレオチドと結合できることもある。５１２個のスポット若しくはそれ未満、又は２５６個のスポット又はそれ未満、又は任意数のスポットが意図されることが理解される。
【００７５】
[0085]  本明細書中に記載する例としてのアレイは、５’末端でウェル６８２に係留されたオリゴヌクレオチドを有し得ることが理解される。その意味で、それらは基板（例えば、ウェル）の３’末端によって結合されるオリゴヌクレオチドを有する当該技術分野で多くの公知の他のアレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイとは異なる。したがって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイは、ハイブリダイゼーションにのみ使用することができ、例としてのアレイのような増幅反応におけるプライマーとして伸長に使用することができない。
【００７６】
[0086]  ３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ又はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡポリメラーゼとして作用することに加えて、下記のさらなる活性を実施することができる（ｄＮＴＰの存在下で）：（１）二重鎖ＤＮＡの３’オーバーハングから塩基を除去すること、及び（２）一本鎖ＤＮＡをヌクレオチドへ分解すること。（New England BioLabs, New England. "New England BioLabs catalog and technical reference." Beverly, MA: New England Biolabs（2014）and BEBENEK, K. et al.（1989）Nucl. Acids Res. 17, 5408を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。幾つかの実施形態において、これらのさらなる活性を有するこれらの３’から５’へのエキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼは、２工程ネステッドマルチプレックスＰＣＲで有用である。ある特定の商業的な実施形態において、第１段階のＰＣＲの最後に、ネステッド第２段階反応に先立って、反応混合物を、例として１００〜２５０倍に希釈して、新たな内側ネステッドプライマーが使用される（第１段階のプライマー内で入れ子状であるプライマー）。これは、第１段階のＰＣＲプライマーが、任意のプライマー二量体を増幅し続けるのを防ぐために行われ、増幅曲線における非特異的な上昇するベースライン、及び第２段階のＰＣＲにおける大きく、幅広い融解ピークを回避する。ｄＮＴＰの存在下での３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、エキソ+DNAポリメラーゼ）の例としての処理により、二重鎖アンプリコンへ組み込まれなかった第１段階のプライマーが分解される。正確なアンプリコン、非特異的なアンプリコン及びプライマー二量体は全て二重鎖であり、そのためそれらは、無傷のままであるはずである。第１段階のＰＣＲプライマーを用いない場合、第１段階のＰＣＲから提示されるプライマー二量体は、第２段階のＰＣＲにおいて増幅しないはずであり、したがって、第１段階のＰＣＲと第２段階のＰＣＲとの間でより小さな希釈（又は希釈なし）が可能であり、それは、第２段階のアンプリコンが、バックグラウンド上に現れる（第２段階の反応において、より早期のＣｐを有する）のにより少ないサイクルが必要とされることを意味する。
【００７７】
[0087]  さらに、エキソ＋ＤＮＡポリメラーゼ処理は、低コピー数で存在する非常に複雑なゲノムのセグメント（ヒトゲノムDNA、cDNAに変換されるヒトmRNA（RT-CR工程が使用される場合）、並びに非増幅病原体、及び存在し得る混入など）を分解する。これは、標準的なＰＣＲ循環条件（特に、アニーリング工程）が、低コピーの非常に複雑なＤＮＡが再アニーリングするのを防ぐのに十分速い可能性があり、したがってエキソ＋活性によって分解されるので起こり得るが、より高いコピー数で存在する幾つかの配列は、再アニーリングし得る。この工程でエキソヌクレアーゼを使用する利点は、それが第２段階のＰＣＲ反応に進入するＤＮＡの配列複雑性を低減することである。これは、ＬＣＧｒｅｅｎなどの二重鎖ＤＮＡ結合色素によって検出することができる第２段階のＰＣＲにおける非特異的な増幅をあまり生じ得ない。したがって、誤った増幅からのシグナル妨害をあまり伴わずに、さらなるサイクルを第２段階のＰＣＲに付加することが可能であり得る。
【００７８】
[0088]  １つの例において、ポーチ６１０において、１００〜２２５倍の総希釈に等しいそれぞれ約１０〜１５倍の２回の連続希釈は、注入チャネル６１６ｈ、６１５ｉ及び／又は６１５ｊからの構成成分を使用して行われる。このレベルの希釈を実施することの代わりとして、１つの例としての実施形態において、少量のエキソ＋ポリメラーゼは、循環の最後に、例として注入チャネル６１５ｈから第１段階のＰＣＲに直接添加することができる。これは、高度に多重化される第１段階のＰＣＲ中に存在する多数のプライマーのため、より長い消化を必要とし得る。ほんのわずかな標的が、通常任意の単回の実行で増幅するため、これらのプライマーの大部分が、依然として一本鎖のままであることが理解される。しかしながら、第２段階のＰＣＲにおける速度の低減の任意の利点は、この大きな消化を実施するのにかかる時間によって損失され得る。したがって、エキソ＋消化に先立って、又はそれと同時に、例として１０〜１５倍の単回の希釈を実施することが望ましい場合がある。例として、エキソ＋酵素がＴ４又はＴ７である場合、混合物は、各々第１段階のＰＣＲプライマーを分解させるのに十分な時間、３７〜４２℃でインキュベートされ得る。この工程の最後に、混合物を、エキソ＋酵素を不活性化させるのに十分長い時間、８０〜９０℃に加熱し得る。続いて、この混合物は、第２段階のアレイ６８１を横切って溢れ得る。
【００７９】
[0089]  幾つかの実施形態において、３’から５’へのエキソヌクレアーゼを有するＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼが使用され、Ｖｅｎｔポリメラーゼによる第２段階のＰＣＲプライマーの不活性化を防止する工程を行わなくてならない。Ｖｅｎｔポリメラーゼは、熱不安定性ではなく、そのためそれは、第２段階のＰＣＲ増幅を実行する前に熱によって不活性化することはできない。Ｖｅｎｔポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による第２段階のＰＣＲプライマーの不活性化を防止するために、Ｖｅｎｔポリメラーゼの濃度は、それが第２段階のプライマーを分解しない程度に十分低いレベルに滴定され得る（Barnes WM. PNAS USA. 1994 Mar 15; 91（6）:2216-20. PMID: 8134376を参照、これは、KlenTaqポリメラーゼ及びVent DNAポリメラーゼの混合物の使用について記載しており、ここで、KlenTaqは、混合物の主要な構成成分を構成し、Vent DNAポリメラーゼは、混合物の微量構成成分である）。また、オリゴヌクレオチドの３’末端でホスホロチオエート結合を伴って少数の塩基を含有する第２段階のプライマーを、これらの塩基が３’から５’へのエキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼのエキソ＋活性による消化に耐性であるため使用することが可能である（Chrisey, L.A.（1991）Antisense, Research and Development 1（1）, 65-113; Spitzer, S.; Eckstein, F.（1988）Nucl. Acids. Res. 16（24）, 11691-11704. Connolly, B.A.; Potter, B.V.L.; Eckstein, F.; Pingoud, A.; Grotjahn, L.（1984）Biochemistry 23, 3443-3453; Stein, C.A.; Pal, R.; Devico, A.L.; Hoke, G.; Mumbauer, S.; Kinstler, O.; Sarngadharan, M.G.; Letsinger, R.L.（1991）Biochemistry 30（9）, 2439-2444. Sayers, J.R.; Olsen, D.B.; Eckstein, F.（1989）Nucl. Acids Res. 17（22）9495. Manson, J.; Brown, T.; Duff, G.（1990）Lymphokine Research 9（1）, 35-42. Woolf, T.M.; Jennings, C.B.G.; Rebagliati, M.; Melton, D.A.（1990）Nucl. Acids Res. 18（7）, 1763-1769. Leiter, J. M.E.; Agrawal, S.; Palese, P.; Zamecnik, P.C.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87（9）, 3430-3434. Reed, J.C.; Stein, C.; Subasinghe, C.; Haldar, S.; Croce, C.M.; Yum, S.; Cohen, J.（1990）Cancer Research 50（20）, 6565-6570; Iyer, R.P.; Egan, W.; Regan, J.B.; Beaucage, S.L.（1990）J. Am. Chem Soc. 112, 1254-1255. Iyer, R.P.; Phillips, L.R.; Egan, W.; Regan, J.B.; Beaucage, S.L.（1990）J. Org. Chem. 55, 4693-4699; Dagle, J.M.; Weeks, D.L.; Walder, J.A.（1991）Antisense, Research and Development 1（1）, 11-20. Maher, L.J.; Dolnick, B.J.（1988）Nucl. Acids Res. 16, 3341-3358. Walkder, R.Y.; Walkder, J.A.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5011-5015を参照、それらの全体が参照により組み込まれる）。
【００８０】
[0090]  第２段階のＰＣＲ反応の複雑性を低減することに加えて、エキソ＋ＤＮＡポリメラーゼはまた、より長い第１段階のＰＣＲアンプリコンを、それらの３’末端で、配列決定に使用されるユニバーサルプライマー配列の相補体を含有するより短い第２段階のＰＣＲアンプリコンへ変換するのに使用することができる。
【００８１】
[0091]  幾つかの実施形態において、ある特定の配列決定方法（例えば、Illumina SBS又はIon Torrent）は、単一のクローン集団からの配列決定読みよりを決定する。一塩基多型（SNP）並びに挿入及び欠失（In/Del）は、単一のクローン集団から決定されるこれらの配列において曖昧さを引き起こさないことが理解される。したがって、多重配列読取りにわたって配列を比較することによって、ＳＮＰ及び／又はＩｎ／Ｄｅｌは、配列決定される分子の集団に位置することができ、続いてＳＮＰ及びＩｎ／Ｄｅｌにおける特異的な変化を決定することができる。他の実施形態において、配列が、単一のクローン集団から決定されない場合、分子の多重集団が配列シグナルに寄与し得るため、ＳＮＰ及びＩｎ／Ｄｅｌは、配列において曖昧さを引き起こし得る。幾つかの場合において、配列におけるこれらの曖昧さは、同じ理由で従来のサンガー配列決定において生じ得る。当該技法と同様に、ＳＮＰが、１つの特定の位置で２つの異なる塩基として現れる点で、多型の性質を決定することが可能であり得る。同様に、一塩基挿入は、当該塩基位置まで単一の配列として、その後、互いの一塩基フレームシフトである２つの配列の混合物として現れる。この情報を解いて、それがサンガー配列決定に関して行われた通りに、ＳＮＰ及びＩｎ／Ｄｅｌを決定することが可能であり得る。
【００８２】
[0092]  図４を参照すると、例としてのアレイ６８１は、１００個〜１０００個のスポットを有し得るが、より多くの、又はより少ないスポットが可能であり、幾つかの場合において、例として２５ｍｍ×２５ｍｍのアレイ全体を用いた場合に、スポットは例として直径２ｍｍであり得る。しかしながら、このサイズは、単なる例であり、任意数のスポット及び任意のサイズのアレイが意図される。一実施形態において、このアレイ上のスポットは、例としてブリスター６６４において、第１段階の増幅で生成される所定のアンプリコンに関して、１対の内側プライマーの両方を含有する。内側プライマーのそれぞれが例として、ユニバーサルフォワード又はユニバーサルリバースプライマー（例えば、幾つかの異なるNGS法においてライブラリー産生中に導入される共通配列決定プライマーに類似している）のいずれかに相補的であるさらなる配列を、それらの５’末端に有する。一実施形態において、スポットの位置が、当該スポット中に存在するアンプリコンに関する情報、したがって、当該スポットで生成される配列の独自性をコードするため、次世代配列決定で一般的に使用されるようなバーコードプライマー配列を省略してもよい。
【００８３】
[0093]  多数のサイクル（特異的なアッセイに応じて、約１０〜約２６回のサイクル、ここで、１０回のサイクルは、大量の病原体が、また２６回のサイクルは、あまり大量でない標的が、第１段階のPCRにおいて産物形成の飽和に達するのに十分であり得る）後、この第１段階のＰＣＲ材料は、上述するようにアレイ６８１へ溢れる。一例において、試料は、熱いうちにアレイ６８１に移行されて（その結果、PCR産物は変性される）、冷却されて、アレイ６８１上でプライマーにハイブリダイズする。第２段階の増幅ゾーン６８０に進入するＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰは、ハイブリダイズされる係留されたオリゴヌクレオチドを伸長することができる。例として、配列決定が、アレイ上の係留されたオリゴヌクレオチドの単回の伸長切り離し後に実施され得る場合、第１段階の増幅産物は、希釈されてもよく、又は希釈なしで使用されてもよい。伸長後、余分な材料は、チャネル６６５を通って戻って、又はチャネル６６７から押し出すことができ、新たなＰＣＲ緩衝液、酵素及びｄＮＴＰは、進入ウェル６１５ｉ、６１５ｊ及び６１５ｋのいずれか又は全てから導入され得る。これは、全ての溶液アンプリコン及び第１段階のプライマーを除去する。
【００８４】
[0094]  上記のように、ブリスター６６４における増幅に続いて、増幅は、アンプリコン２２１をゾーン６８０へ移動することによって、第２段階の増幅ゾーン６８０で実施され得る。アレイ６８１上での増幅は、係留されたプライマー２２４及び任意選択により上述するようなユニバーサルプライマーに相補的な配列を有するリバースプライマーを使用する。図５Ａ〜図５Ｃは、ブリッジＰＣＲを使用する例を示す。第１段階のアンプリコン２２１の増幅はまず、フォワードプライマー２２４のＳｉＦｘ部分を使用して行われ（図５Ａ（ｉ）〜図５Ａ（ｉｉｉ））、第２段階のアンプリコン２２９を生成する。リバース鎖２３０は、リバースプライマーＳｉＲｘを使用して生成され得る（図５Ｂ（ｉｖ）〜図５Ｂ（ｖ））。エキソ＋ＤＮＡポリメラーゼを使用して、長い第１段階のアンプリコンの末端２３４を修復することができ、その結果、それは、その３’末端でＵＲプライマー配列を有して（図５Ｃ（ｖｉ）及び図５Ｃ（ｖｉｉ））、ＵＲプライマーを使用する配列決定に利用可能になる。鎖２３０は、その３’末端に、ユニバーサルプライマーＵＦの相補体を含み、その結果、鎖２３０は任意選択により、ＭｉＳｅｑ又はＨｉＳｅｑ（Illumina）で使用されるものに類似した方法を使用して、ユニバーサルプライマーＵＦを使用して配列決定され得る。任意選択により、一方又は両方の鎖２２９、２３０は、この実施形態において配列決定され得る。
【００８５】
[0095]  ブリッジＰＣＲは、ＬＬＧｒｅｅｎ（登録商標）（BioFire Diagnostics、LLC）などのｄｓＤＮＡ結合色素の存在下で、又はプローブ若しくは当該技術分野で公知であるような他の検出方法の存在下で行われ得る。１つの例としての実施形態において、ブリッジＰＣＲに続いて、アレイを融解させて、ｄｓＤＮＡ結合色素からの蛍光を使用して、特異的に増幅される産物の存在を示し得る融解曲線を作成する。反応が完全に失敗した場合、融解曲線は存在せず、プロセスは、配列決定反応に進み得ない。
【００８６】
[0096]  アレイ上にアンプリコンが存在する場合、チャネル６６５及びチャネル６６７は、配列決定用の溶液を導入及び除去するのに使用され得る。続いて、配列決定は、本出願に記載するものを含む任意の従来方法によって、例えばＩｌｌｕｍｉｎａによって記載されるものなどの方法によって実施することができる（例えば、特許第７，５４４，７９４号及び第８，９４６，３９７号を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
[0097]  また、他の配列決定メカニズムを使用してもよいことが理解される。例えば、４５４ピロシーケンシング技術に類似した実施形態を用いてもよく、ここで、特定のスポット６８２で組み込まれたｄＮＴＰがピロリン酸を生成して、さらなる酵素は、これをＡＴＰへ、続いて光へ変換する。この光を検出して、ヌクレオチド配列が明らかとなる。同様に、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ型技術を使用することが可能である場合があり、ここで、発生するシグナルはプロトンであり、検出は、アレイ下にあるｐＨ感受性トランジスター要素である。
【００８８】
[0098]  配列決定はまた、アレイ６８１において組み込まれるＮａｎｏｐｏｒｅスタイルのチャネルを通って流れる分子の電流変化を測定することによって実施することができ、又はアレイ６８１を、Ｎａｎｏｐｏｒｅ機器へ移動されてもよい。他の配列決定方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書中で意図される。
【００８９】
[0099]  代替的な実施形態において、上記で論述するのと同じポーチ６１０を使用してもよく、又は２工程ＰＣＲ用の他の容器を用いてもよい。しかしながら、この実施形態において、プライマー対のそれぞれの唯一の内側プライマーは、アレイに係留され、内側プライマー全てが、第２段階の増幅ゾーン６８０における増幅溶液中に存在する。この遂行は、アレイ上での増幅を伴う溶液中での増幅が、迅速で且つ効率的であるという利点を有するが、それはまた、内側プライマー全てが、混合物中に存在し、そのため、より非特異的な産物が作製され、これは、単一の分子種ではないスポットのそれぞれに結合された産物をもたらし得るという欠点を有する。この遂行において、増幅及び融解分析後に、アレイは、リバース鎖を洗い流してもよく、アレイは、配列決定ライブラリーのようになり、適切な一連の配列決定化学物質は、上述するようにアレイ及び検出の乏しい容量から溢れる。この実施形態は、アレイ６８２上の増幅が、単一の反応混合物において実施されることを除いて、図１に関して記載するものに類似している。
【００９０】
[00100]  例として、類似した実施形態において、特異的な内側フォワードプライマー（ＳｉＦｘは３２４である）のみが、アレイ６８１に係留され、リバースプライマー３３２のみが、第１段階のアンプリコン３２１のさらなる増幅のために溶液中に存在する（図６Ａ）。利点は、マルチプレックスの第２段階の反応が、存在するプライマーの数のおよそ半分を有し、それが、非特異的な増幅を低減するはずであることである。しかしながら、同様に、それは、一方の鎖が、アレイ上でのみ作製され、他方の鎖が溶液中でのみ作製されるため、増幅の動態がよりゆっくりであることを意味する（図６Ａ〜図６Ｂ（ｉ）〜（ｉｖ））。この実施形態において、増幅及び任意選択の融解分析（図６Ａ〜図６Ｂ（ｉ）〜（ｉｖ））後に、アレイは、リバース鎖を洗い流して（変性に続いて、図６Ｂ（ｉｉｉ）〜（ｉｖ））、アレイは、配列決定ライブラリーとして機能し、適切な一連の配列決定化学物質は、上述するようにアレイ及び検出の乏しい容量から溢れる。
【００９１】
[00101]  さらに、アレイ６８１についての溶液中の第２段階のリバースプライマーを用いた非特異的な増幅は、この第２段階の反応に進む材料の配列複雑性が、第１段階のＰＣＲからの濃縮によって低減されたため、アレイ６８１上のスポット６８２のそれぞれで、第２段階のアンプリコンの単一の分子種の生成を妨害しないはずである。しかしながら、単一の分子種を保証するさらなる工程を、一緒に又は別に行うことができることが理解される。１つのかかる工程において、３’から５’へのエキソ＋ＤＮＡポリメラーゼを上述するように使用して、入力材料の配列複雑性をさらに低減することができる。
【００９２】
[00102]  別の例において、ＰＣＲの特異性は、Ｇｅｎａｃｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．のＴｅｍｐｌｅｘ方法（Han J. et al. JCM. 2006 Nov; 44（11）:4157-62. PMID: 17005760）などの方法を使用して、増大させることができる。この例としての実施形態において、アレイ６８１にわたって溶液中に存在するプライマー３３２は、特異的な内側プライマーの５’側上に結合するユニバーサルリバース配列３３０を含む（図６Ｃ〜図６Ｄにおいて最良に見られる）。例として、これらのプライマーは、標準的なＰＣＲ中に存在する正常濃度の１０分の１〜１００分の１で存在する（標準物質は、０．４〜０．８μＭである）。プライマー二量体の創出は、２つのプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの三分子複合体を必要とし、この複合体の形成速度は、プライマーの濃度の関数である。したがって、プライマーがそれぞれ、標準的なＰＣＲにおける濃度の１０分の１で存在する場合、プライマー二量体形成の速度は、１００分の１に低減されるはずである。低濃度で存在するＵＲＳｉＲプライマー３２２の他に、標準的なプライマー濃度で存在するさらなるプライマー−ＵＲ配列−が存在する。低濃度ＵＲＳｉＲプライマーがそれらの標的にハイブリダイズする時間を有するように長い伸長時間で実施されるＰＣＲの数回のサイクル（例として、３〜１０回のサイクル）（図６Ｃ〜図６Ｄ（ｖ）〜（ｖiii））後に、新生アンプリコン３２９においてＵＲ配列の十分な相補体が存在する。この時点で、ＵＲＳｉＲプライマーは任意選択により、洗い流すことができ、エキソ＋ＤＮＡポリメラーゼを導入して、アンプリコン３２９を修復して、アンプリコン３２９ａを生成することができ、その結果、それは、ユニバーサルプライマー３２０に相補的な配列を含有する（図６Ｄ〜図６Ｅ（ｖｉｉｉ）〜（ｉｘ））。続いて、高濃度での単一のＵＲプライマーを導入して、この鋳型へアニーリングすることができ（図６Ｅ（ｘｉ））、ＰＣＲ循環は、標準的なアニーリング及び伸長回数で進行し得る。最終的な結果は、第２段階のＰＣＲの特異性が増大され、したがってアレイ上のフィーチャのそれぞれが、単一の分子種である可能性がより高いことである。したがって、特異性の増大は、ＰＣＲの初期部分において、少しゆっくりしたサイクルとの交換で得られる。
【００９３】
[00103]  第３の例において、Ｔｅｍｐｌｅｘ方法のさらなる伸長は、参照により本明細書に組み込まれるＢｅｎｎｅｒの「自己回避分子認識システム」（SAMRS）及び「人工的に増殖される遺伝情報システム」（AEGIS）（Glushakova et al. J. Virol. Methods. 2015 Mar; 214:60-74. PMID: 25680538）を使用する。これにより、ネステッドＰＣＲ方式で、きれいな高レベルのマルチプレックスＰＣＲ増幅が可能となる。これは、第２段階の反応ゾーン６８０における第２段階のマルチプレックス反応で記載するように、直接遂行することができる。
【００９４】
[00104]  実施例４
[00105]  ここでは、第１段階のＰＣＲアンプリコン内で入れ子状の配列決定多重領域について記載する。幾つかの状況において、例として第１段階のＰＣＲ標的内で入れ子状の異なる第２段階のアンプリコンに由来する第１段階のＰＣＲアンプリコンの多くの領域の配列を決定することは有利である。例えば、ＥＳＢＬ表現型を付与するＴＥＭベータラクタマーゼにおける突然変異は、遺伝子にわたって散在し得る。第１段階の増幅反応において遺伝子の大部分を増幅することができ、続いて、第２段階のＰＣＲにおいて、様々なより小さな領域を増幅することができる。
【００９５】
[00106]  １つの例において、重複アンプリコンが、第２段階のＰＣＲで生成される。図１のデバイスのウェル５８２においてなどの別個の反応で実施される場合、これらの重複アンプリコンは、容易に生成され得る。図４のアレイ６８１において、増幅の特異性は、アレイスポット６８２に結合されたプライマーに由来する。しかしながら、溶液中のプライマー及びスポット６８２上のプライマーは、別個の組の重複する第２段階のアンプリコンを作製すること（図７Ａ（ｉ）におけるＩ１〜Ｉ５）に代わって、重複せず且つ配列を完全に網羅しないより一層短いアンプリコンが生成され得る（例えば、ＳｉＦｂ１とＳｉＲａ１との間、それは、重複するＩ１及びＩ２の部分のみであるアンプリコンを生成する）ような様式で重複し得る（図７Ａ（ｉ）〜図７Ａ（ｉｉ）を参照）。
この問題は、２組の反応を用いて、第２段階のＰＣＲを、ともに第２段階の増幅ゾーン６８０に類似した２つの区画へ分けることによって回避され得る（図７Ｂ及び図７Ｃ）。この遂行において、第１段階のＡで生成されるアンプリコン（図７Ｂ（ｉｖ））は重複せず、その結果、望ましくない短いアンプリコンは最低限に抑えられるか、又は排除される。介在アンプリコンは、第２段階Ｂで生成され（図７Ｂ（ｖ））、それらは同様に重複せず、その結果、望ましくない短いアンプリコンは同様に最低限に抑えられるか、又は排除される。
【００９６】
[00107]  実施例５
この遂行は、内側プライマーが全て、混合物中に存在することを除いて、上記実施例３に類似している（図８Ａ）。これは、アレイ上での増幅を伴う溶液中での増幅が、迅速で且つ効率的であるという利点を有する（図８Ｂ）。アレイ６８１上で合成される単一の分子種の特異性に関する任意選択のフィルターを付加するために、捕捉プライマーは、「内側−内側」であり得る。内側−内側ＳｉｉＦｘは、外側プライマーＳｏＦｘに対して内部にある溶液ベースの内側プライマーＳｉＦｘに対して内部にある配列にハイブリダイズする（図８Ａ（ｉ）を参照）。数個の塩基（例として、少なくとも４個の塩基）が、ＳｉＦｘ配列に対して（又はその３’に対して）内部にある限りは、内側−内側プライマーＳｉｉＦｘは、当該方向で内側プライマーＳｉＦｘ配列と部分的に重複することができる。溶液ベースのＰＣＲは、図８Ｂ（ｉｖ）に示すように、内側プライマーＳｉＦｎ及びＵＲＳｉＲｎを使用して、また図８Ｂ（ｉｉｉ）に示すようにアレイ６８２上で同時に行われ、図８Ｃ（ｖ）に示すように、適切なユニバーサルプライマーを有する係留されたアンプリコンを生じる。この実施形態において、付加された特異性が、２組のネステッドプライマーＳｉＦｘ及びＳｉｉＦｘを使用して提供されるため、ＳｏＦｘを用いた第１段階の増幅は任意選択的であり、増幅は全て、単一の増幅チャンバーにおいて行われ得ることが理解される。配列決定用のアレイ６８１を調製することは、上記で論述する本方法のいずれかに従うものであり得る。
【００９７】
[00108]  本発明は、その趣旨又は本質的特質を逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。記載する実施形態は、あらゆる点で、単なる例として、また限定的ではないとして考慮されるべきである。したがって、本発明の範囲は、先述の説明によってではなく、併記の特許請求の範囲によって示される。ある特定の実施形態及び詳細は、本発明を示す目的で、本明細書中に、及び添付の本開示に含まれてきたが、併記の特許請求の範囲で規定される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中に開示する方法及び装置における様々な変更が成され得ることは、当業者には明らかである。特許請求の範囲の等価性の意義及び範囲内に収まる変更は全て、それらの範囲内に包含されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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