(57)【要約】  本明細書は、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する遺伝子改変された家畜動物およびそれを提供する方法を開示する。本明細書において開示される動物は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子の切断型アレルを発現する。発現すると、家畜動物は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば１４８〜６９、が企図される、タンパク質の末端１４８アミノ酸（ａａ）残基まで欠損しているＰＲＬＲを産生する。ＳＬＩＣＫを発現する動物は、非ＳＬＩＣＫ動物と比較して優れた体温調節能力を有し、夏季の乳量にあまり劇的な低下を受けない。
2018531003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断型プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）を生じる遺伝子改変されたＰＲＬＲアレルを含む、家畜動物。
【請求項２】
前記ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるタンパク質の残基４３３のチロシンの後で切断される、請求項１に記載の家畜動物。
【請求項３】
前記ＰＲＬＲがＡＡ４６１のアラニン残基の後で切断される、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項４】
前記ＰＲＬＲが４９６のプロリン残基の後で切断される、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項５】
前記ＰＲＬＲが４６４のアラニン残基の後で切断される、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項６】
前記動物が暑さのストレスを受けにくい、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項７】
前記動物が偶蹄目である、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項８】
前記偶蹄目がウシである、請求項７に記載の家畜動物。
【請求項９】
前記遺伝子改変が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１０】
前記遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、請求項９のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１１】
前記遺伝子改変がヘテロ接合性である、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１２】
前記遺伝子改変がホモ接合性である、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１３】
前記ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される、請求項１のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１４】
前記ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるペプチドの残基Ｙ４３３とＹ５１２との間で切断されるように改変される、請求項１のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１５】
前記改変が前記遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１６】
前記動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、請求項１または２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１７】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物。
【請求項１８】
前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入によって行われる、請求項１７に記載の家畜動物。
【請求項１９】
前記遺伝子改変がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２０】
前記遺伝子改変が４３３アミノ酸以上を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２１】
前記遺伝子改変が４６１アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２２】
前記遺伝子改変が４６４アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２３】
前記遺伝子改変が４９６アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２４】
前記遺伝子改変が５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２５】
前記改変が体細胞に対して行われ、前記動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２６】
前記改変が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２７】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように改変された前記プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子改変方法。
【請求項２８】
前記改変が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計された前記ＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、前記合成の中断が導入される、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヌクレアーゼ制限部位が前記遺伝子改変の下流にある、請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子改変および前記ヌクレアーゼ制限部位の導入が、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される、請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子改変および前記ヌクレアーゼ制限部位の導入が、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される、請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子改変が体細胞に対して行われ、前記体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記除核卵が再核化され代理母へ移植される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、遺伝子改変された家畜動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１５年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２２１，４４４号明細書および２０１６年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２７，１１５号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ＳＬＩＣＫ表現型を発現することによって、より優れた耐暑性を有するように遺伝子改変された家畜動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
家畜動物は世界中で飼育されている。世界的に農業および畜産が行われているということは、数品種の家畜が、その望ましい品質のために世界中で大量に開発および飼育されていることを意味する。ウシは、牛乳および牛肉の生産の両方のために特に大規模な群れで飼育されている。しかしながら、ウシの中で最も人気のある品種は、元来ヨーロッパで開発されたものである。これらの品種には、数例を挙げると、アンガス（Ａｎｇｕｓ）、ホルスタインフリージアン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  Ｆｒｉｅｓｉａｎ）、ヘレフォード（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ）、ショートホーン（Ｓｈｏｒｔｈｏｒｎ）、シャロレー（Ｃｈａｒｏｌａｉｓ）、ジャージー（Ｊｅｒｓｅｙ）、ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）、ブラウンスイス（Ｂｒｏｗｎ  Ｓｗｉｓｓ）、キアニーナ（Ｃｈｉａｎｉｎａ）、およびベルジャンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）が含まれる。
【０００４】
家畜動物における耐暑性は、健康な動物を飼育することおよび生産能力においてそれらを維持することのために必須である。ウシにおいては、例えば、通常の体温を維持することができるということは、暑さのストレスに耐性を有しないウシよりも、動物が病気耐性で、より多くの牛乳を生産し、より大きく成長し、より健康な子牛を多産で繁殖することを意味する。これは、特に熱帯および亜熱帯気候で飼育される家畜に当てはまる。
【０００５】
「ＳＬＩＣＫ」は、セネポール（Ｓｅｎｅｐｏｌ）、カロラ（Ｃａｒｏｒａ）、クリオロ・リモネロ（Ｃｒｉｏｌｌｏ  Ｌｉｍｏｎｅｒｏ）、ロムシニャーノ（Ｒｏｍｏｓｉｎｕａｎｏ）などのニューワールドのウシで見出される突然変異である。「ＳＬＩＣＫ」という用語は、ウシの短い、光沢のある毛を指すように造られた。この表現型はまた、毛の密度、毛のタイプならびに汗腺の密度および体温調節効率を含む。ＳＬＩＣＫ表現型を有するウシは、熱帯環境において体温調節能力が大幅に向上し、その結果、高温環境下で受けるストレスが相当低くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
「ＳＬＩＣＫ」突然変異は、ウシゲノムの第２０染色体にマッピングされており、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）をコードしている。この遺伝子は、５８１アミノ酸のポリペプチドをコードする９つのエクソンを有する。セネポール牛におけるこれまでの研究は、この表現型が、未成熟終止コドン（ｐ．Ｌｅｕ４６２）を導入するエクソン１０（エクソン１がなく、認識されたエクソンは２〜１０である）における単一塩基欠失、および受容体からの末端１２０アミノ酸の喪失から生じることを示す。この表現型は本明細書においてＳＬＩＣＫ１と称する。セネポール牛は耐暑性が非常に高く、耐暑性の利点を提供するために他の多くのウシ品種と交配されてきた。特定の動物の品種が望まれる所以の形質を喪失させる有性交配を伴わず、他品種の動物に耐暑性を含む形質を付与することが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書は、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する、正確に交配され、遺伝子編集された家畜動物およびそれを提供する方法を開示する。本明細書において開示される動物は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子の切断型アレルを発現する。発現すると、家畜動物は、タンパク質の末端１４８アミノ酸（ａａ）残基まで欠損しているＰＲＬＲを産生する。一部の実施形態において、動物は、１４７または１４６ａａが切断されたタンパク質を発現する。一部の場合において、動物は、末端１２１ａａを欠損している。一部の実施形態において、家畜動物は、末端６９ａａを欠損しているＰＲＬＲを発現し、ＳＬＩＣＫ表現型を示す。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば１４８〜６９、が企図されることを直ちに認識するだろう。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有すると同定されたｍＲＮＡから翻訳された、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７を有するタンパク質の位置４３３の最後のアミノ酸であるチロシンとして発現する、任意のＰＲＬＲである。ＳＬＩＣＫを発現する動物は、非ＳＬＩＣＫ動物と比較して優れた体温調節能力を有し、夏季の乳量にあまり劇的な低下を受けない。
【０００８】
種々の例示的な実施形態において、本開示は、改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供し、その結果、切断型ＰＲＬＲが生じる。一部の実施形態において、ＰＲＬＲは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される残基である残基４３３のチロシンの後で切断される。種々の実施形態において、ＰＲＬＲは、ＡＡ４６１、４９６または４６４の残基の後で切断される。これらの例示的な実施形態において、家畜動物は暑さのストレスを受けにくい。種々の例示的な実施形態において、動物は偶蹄目である。一部の例示的な実施形態において、偶蹄目はウシである。種々の例示的な実施形態において、精密遺伝子編集によって行われる遺伝子改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入の遺伝子編集によって行われる。一部の例示的な実施形態において、遺伝子改変はヘテロ接合性である。他の例示的な実施形態において、遺伝子改変はホモ接合性である。一部の例示的な実施形態において、ＰＲＬＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される。種々の例示的な実施形態において、改変は、遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる。これらの例示的な実施形態において、動物はＳＬＩＣＫ表現型を発現する。
【０００９】
さらに他の例示的な実施形態において、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供する。種々の実施形態において、改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入の遺伝子編集によって行われる。一部の例示的な実施形態において、遺伝子改変はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる。これらの例示的な実施形態において、遺伝子改変は、４３３アミノ酸、４６１アミノ酸、４６４アミノ酸、４９６アミノ酸、５１１アミノ酸、または４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を終止する残基、を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる。種々の例示的な実施形態において、改変は体細胞に対して行われ、上記動物は体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される。一部の例示的な実施形態において、改変は、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む。
【００１０】
さらに他の例示的な実施形態において、本開示は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートを含む、精密遺伝子編集技術を使用することにより、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を破壊するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子改変方法を提供する。これらの例示的な実施形態において、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される。一部の実施形態において、本開示は、遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む。種々の実施形態において、ヌクレアーゼ制限部位は遺伝子改変の下流にある。他の実施形態において、ヌクレアーゼ制限部位の導入は、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される。種々の例示的な実施形態において、遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入は、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される。
【００１１】
これらのおよび他の本発明の特徴および利点は、以下に記載され、または以下の説明および添付の特許請求の範囲において、より完全に明らかになるであろう。特徴および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される機器および組合せの手段によって実現し、得ることができる。さらに、本発明の特徴および利点は、本発明の実施によって知ることができ、または以下に示すように、明細書から明らかになるであろう。
【００１２】
本発明による組成物および方法の種々の例示的な実施形態を、以下の図を参照して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ペプチドの様々なアイソフォームを示すプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の模式図である。ｗｔ受容体は、各単量体が５８１ａａの全長を有する二量体である。ペプチドの天然に存在するアイソフォームが示される。膜貫通領域は、図の中央を横切る水平の二重脂質構造によって表される。細胞外ドメインは、膜貫通領域の上の領域によって表され、細胞内ドメインは、細胞内ドメインの下の領域である。ＳＬＩＣＫ表現型は、それぞれＰＲＬＲの異なるアイソフォームを有する３品種の牛において見出される。セネポール品種によって発現されるＳＬＩＣＫＩは、ａａ４６１で切断された１つの単量体、例えば最終１２０ａａの喪失、を有する。カロラ／リモネロ品種によって発現されるＳＬＩＣＫ２は、ａａ４９６で切断された１つの単量体、最終８５ａａの喪失を有する。リモネロ品種によって発現されるＳＬＩＣＫ３は、ａａ４６４で切断され、最終１１５ａａの損失である。切断された単量体は遺伝子作用およびメンデル遺伝において優勢である。しかしながら、本発明による１つの例示的な実施形態において、Ｙ４３３の後の任意の場所におけるペプチドの中断は、ＳＬＩＣＫ表現型をもたらす。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂ。図２Ａは、エクソン１０のゲノム配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ９６６３５６．４参照）。下線が引かれた残基による上付きの数字は、次の配列のコンポーネントを特定する：１）エクソン１０の開始（第９エクソン）；２）チロシン４３３をコードする「ｔａｃ」；３）図３に示されるマップの最初の３残基；４）ＳＬＩＣＫ１のＲＦＬＰの同定のためのＸｂａｌ部位「ｔｃｔａｇａ」を導入するように改変された残基；５）フレームシフトにおける「ｃ」のＳＬＩＣＫ１欠失；６）「ｔ」から「ａ」がＳＬＩＣＫ３の同定のためのＮｓｉｌ部位「ａｔｇｃａｔ」を導入；７）ＳＬＩＣＫ３の「ｃ」から「ａ」が終止コドン「ｔａａ」を生じる；９）ＳＬＩＣＫ２のＲＦＬＰの同定のためのＸｂａｌ１部位「ｔｃｔａｇａ」を導入するように改変された残基；１０）図３の最後の３残基。図２Ｂは、全長ＰＲＬＲペプチドのアミノ酸配列である。このマップにおいて、下線が引かれ、上付き文字によって特定される残基は、以下のとおりである：１１）細胞外ドメイン（１〜２５１）；１２）膜貫通ドメイン；細胞内ドメイン（２９５〜５８１）；１３）Ｙ４３３；１４）タンパク質合成の中断を生じるＳＬＩＣＫ１突然変異；１５）生成したＳＬＩＣＫ３未成熟終止コドン；１６）生成したＳＬＩＣＫ２未熟終止コドン。
【図３】図３は、ＴＡＬＥＮを用いた突然変異計画を示す、エクソン１０におけるＰＲＬＲ遺伝子のマップである。
【図４】図４は、ＳＬＩＣＫ１について遺伝子移入されたウシ細胞の溶解物であり、Ｘｂａｌ消化物の制限酵素バンドパターンを示す。左パネルはクローン混合物、右パネルは個々のクローン。
【図５】Ｘｂａｌ制限酵素による切断を示す、ＳＬＩＣＫ２について遺伝子移入されたウシ細胞の細胞溶解物である。
【図６】図６は、ＳＬＩＣＫ２突然変異の成功した遺伝子移入を示すバンドパターンを示すゲルである。ＲＦＬＰ＝制限断片長多型。
【図７】ＴＡＬＥＮおよびＳＬＩＣＫ３のオリゴで形質移入したウシ細胞からの細胞溶解物を示すゲルである。左パネル、細胞溶解物；右パネル、ＮｓｉＩでの消化陽性を示すＴＡＬＥＮ計画９．１２の溶解物。
【図８】ＴＡＬＥＮおよびＳＬＩＣＫ３オリゴで形質移入した個々のクローンのＲＦＬＰ分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＳＬＩＣＫ表現型を発現する、精密編集された家畜動物およびそれを提供する方法が本明細書において開示される。本明細書において開示される動物は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子の切断型アレルを発現する。発現すると、家畜動物は、タンパク質の末端１４８アミノ酸（ａａ）残基まで欠損しているＰＲＬＲを産生する。一部の実施形態において、動物は、１４７または１４６ａａが切断されたタンパク質を発現する。一部の場合において、動物は、末端１２１ａａを欠損している。一部の実施形態において、家畜動物は、末端６９ａａを欠損しているＰＲＬＲを発現し、ＳＬＩＣＫ表現型を示す。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば１４８〜６９、が企図されることを直ちに認識するだろう。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有するｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の位置４３３における、最後のアミノ酸であるチロシンとして発現する任意のＰＲＬＲは、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する。ただし、チロシン５１２の後の切断がＳＬＩＣＫ表現型を発現しない可能性がある。
【００１５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物および特許は、本開示に関連して使用され得る刊行物に報告される化学物質、機器、統計分析および方法論の記載および開示を含む、全ての目的のために参照により組み込まれる。本明細書に引用される全ての参考文献は、当業者のレベルを示すものとして解釈されるべきである。本明細書中のいかなるものも、開示が先行発明によりそのような開示よりも先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「特徴付けられる」および「有する」は、交換可能に使用することができることにも留意されたい。
【００１７】
本明細書において使用される「相加的遺伝効果」は、親から子孫に伝達され得る平均的な個々の遺伝子効果を意味する。
【００１８】
本明細書において使用される「アレル」は、遺伝子の代替形態を指す。これは、ＤＮＡ配列の変異体としても考え得る。例えば、ある動物がＢｂという特定の遺伝子の遺伝子型を有する場合、Ｂおよびｂの両方がアレルである。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質合成の中断」は、タンパク質合成の未成熟終止を行う終止コドンまたはフレームシフトを生成する任意の欠失、挿入または突然変異を指す。
【００２０】
「ＤＮＡマーカー」は、物理的特性との関連について試験することができる特定のＤＮＡ変異体を指す。
【００２１】
「遺伝子型」は、動物の遺伝的構成を指す。
【００２２】
「遺伝子型決定（ＤＮＡマーカー試験）」は、動物を試験して、特定の遺伝子検査で保持する特定のアレルを決定するプロセスを指す。
【００２３】
「単純形質」は、毛色および角の状態、ならびに単一の遺伝子によって保有される一部の疾患などの形質を指す。
【００２４】
「複雑形質」は、多数の遺伝子によって制御される、生殖、成長および屠殺体などの形質を指す。
【００２５】
「複雑アレル」−中に１つ以上の突然変異を有するコード領域。これは、研究者がアレル内の突然変異がその効果を引き起こしているかどうかを確かめることができないため、所与の突然変異の影響を決定することをより困難にする。
【００２６】
構造変異の一形態である「コピー数多型」（ＣＮＶ）は、細胞が異常な変異、または特定の遺伝子に関して、１つ以上のＤＮＡのセクションのコピー数の正常な変異、を生じるゲノムのＤＮＡの変化である。ＣＮＶは、特定の染色体上で欠失している（正常数より少ない）または重複した（正常数より多い）ゲノムの比較的大きな領域に対応する。例えば、通常、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄのようなオーダーのセクションを有する染色体は、代わりにゲノム全体にわたる複数のコピーで生じる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のセクションＡ−Ｂ−Ｃ−「反復エレメント」パターンを有する可能性がある。反復ＤＮＡは、その迅速な会合速度により、最初に検出された。
【００２７】
「定量的変異」の変異は、個別の単位またはカテゴリーよりも、連続体（例えば、人間の身長）について測定される。連続変異を参照。明らかな定性的差異というよりも、程度で異なる、特定の特徴に関する表現型の範囲の存在。
【００２８】
「ホモ接合性」は、ＢＢなどの、単一の遺伝子に対して同じアレルの２つのコピーを有することを指す。
【００２９】
「ヘテロ接合性」は、Ｂｂなどの、単一の遺伝子に対して異なるアレルのコピーを有することを指す。
【００３０】
「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数の「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」）は、マーカーまたは遺伝子の特定の位置を指す。
【００３１】
「Ｃｅｎｔｉｍｏｒｇａｎ（Ｃｍ）」遺伝的連鎖を測定するための組換え頻度の単位。これは、単一の世代における介在染色体クロスオーバーの予想される平均数が０．０１である、染色体位置（遺伝子座またはマーカーとも呼ばれる）の間の距離として定義される。これはしばしば染色体に沿った距離を推測するために使用される。しかしながら、これは本当の物理的距離ではない。
【００３２】
「染色体クロスオーバー」（「クロシングオーバー」）は、母親と父親から個体が受け継いだ相同染色体間の遺伝物質の交換である。各個体は、母親および父親からそれぞれ継承された二倍体のセット（２つの相同染色体、例えば２ｎ）を有する。減数分裂Ｉ中に、染色体が複製され（４ｎ）、母親および父親から受け取った染色体の相同領域間のクロスオーバーが生じ、各染色体内に遺伝情報の新しいセットが生じ得る。減数分裂Ｉの後、それぞれ固有の遺伝情報セットを有する４つの一倍体（１ｎ）配偶子を生じる細胞分裂の２段階が続く。遺伝子組換えは新しい遺伝子配列または遺伝子の組合せを生じるため、多様性は増加する。クロスオーバーは、通常、相同染色体上の相同領域が破断し、他の染色体に再連結するときに発生する。
【００３３】
「マーカー補助選択（ＭＡＳ）」は、ＤＮＡマーカー情報を用いて管理決定を補助するプロセスを指す。
【００３４】
「マーカーパネル」は、特定の形質に関連する２つ以上のＤＮＡマーカーの組合せである。
【００３５】
「非相加的遺伝効果」とは、優位性および上位性などの効果を指す。共優性は同一遺伝子座におけるアレルの相互作用であり、上位性は異なる遺伝子座におけるアレルの相互作用である。
【００３６】
「ヌクレオチド」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の４つの塩基性化学物質のうちの１つを含むＤＮＡの構造成分を指す。
【００３７】
「表現型」は、測定可能な動物の外観を指す。表現型は、動物および環境の遺伝的構成に影響される。
【００３８】
「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」は、ＤＮＡ配列における単一のヌクレオチド変化である。
【００３９】
「ハプロイド遺伝子型」または「ハプロタイプ」は、減数分裂中に有意な割合で配偶子に再配座するように連結されたアレル、遺伝子座またはＤＮＡ多型の組合せを指す。ハプロタイプのアレルは、連鎖不平衡（ＬＤ）にある可能性がある。
【００４０】
「連鎖不平衡（ＬＤ）」は、異なる遺伝子座におけるアレルの非ランダムな会合、すなわち、仮にアレルが個別のアレル頻度に基づいて独立的かつランダムに採取された場合に期待されるものとは異なる、異なる遺伝子座におけるアレル間の統計的関連性の存在である。異なる座位のアレル間に連鎖不平衡がない場合、それらは連鎖平衡にあるという。
【００４１】
用語「制限断片長多型」または「ＲＦＬＰ」は、１つ以上のエンドヌクレアーゼ酵素によるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの制限消化によって生成される異なるＤＮＡ断片長のいずれか１つを指し、この断片長は集団中の個体間で異なる。
【００４２】
「移入性ハイブリダイゼーション」としても知られる「遺伝子移入」は、親種の１つと種間ハイブリッドの戻し交雑を繰り返すことによって、ある種から別の種の遺伝子プールへの遺伝子またはアレル（遺伝子流）の移動である。意図的な遺伝子移入は長期的なプロセスである。戻し交配が発生する前に多くのハイブリッド世代を要する可能性がある。
【００４３】
二倍体（非遺伝的）細胞における遺伝子またはアレルの導入による「非減数分裂性の遺伝子移入」の遺伝子移入。非減数分裂性の遺伝子移入は、有性生殖に依存せず、戻し交配を必要とせず、有意に、単一世代で実施される。非減数分裂性の遺伝子移入では、相同組換えによってアレルがハプロタイプに導入される。アレルは、ゲノムから編集されるべき既存のアレルの部位に導入されてもよく、または、アレルは、他の任意の所望の部位に導入され得る。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子改変」は、バイオテクノロジーを使用した生物のゲノムの直接操作を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、語句「精密遺伝子編集」という語句は、遺伝学者が、組換えＤＮＡを使用することなく、任意の品種に任意の自然形質を部位特異的に導入（遺伝子移入）させるプロセス遺伝子改変を意味する。
【００４６】
遺伝子編集のための「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」一技術は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。
【００４７】
本明細書において使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）」は、遺伝子編集に有用な別の技術であり、ユーザー指定の位置でＤＮＡに二本鎖切断を作成することによりゲノムの標的化編集を容易にする、操作されたＤＮＡ結合タンパク質のクラスである。
【００４８】
本明細書において使用される「メガヌクレアーゼ」は、遺伝子編集に有用な別の技術であり、大きな認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。結果として、この部位は、一般的に任意の所与のゲノムにおいて一度のみ発生する。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼによって認識される１８塩基対の配列は、平均でヒトゲノムのサイズの２０倍のゲノムを偶然に一度発見することを要するであろう（単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノムにつき約３回存在するが）。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられる。
【００４９】
本明細書において使用される「ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ」技術は、塩基配列の短い反復を含む原核生物ＤＮＡのセグメントである「ＣＲＩＳＰＲ」（規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム反復をクラスタ化したもの）を指す。各反復の後に、細菌ウイルスまたはプラスミドへの以前の曝露からの「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが続く。「ＣＡＳ」（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、ＣＲＩＳＰＲに関連するＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。Ｃａｓ９タンパク質および適切なガイドＲＮＡを細胞に送達することによって、生物のゲノムは任意の所望の位置で切断することができる。
【００５０】
本明細書で使用される「インデル」は、生物におけるＤＮＡの改変を指す「挿入」または「欠失」の略語である。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「再核化卵」は、体細胞の改変された核が導入された体細胞核移植に使用される除核卵を指す。
【００５２】
本明細書において使用される「遺伝子マーカー」は、染色体上で公知の位置を有する遺伝子／アレルまたは公知のＤＮＡ配列を指す。マーカーは、例えば、１つ以上のアレル、ハプロタイプ、ハプログループ、遺伝子座、定量的形質遺伝子座またはＤＮＡ多型［制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単一核多型（ＳＮＰ）、インデル、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、マイクロサテライトおよびミニサテライト］など、任意の遺伝子マーカーであってよい。便宜的には、マーカーは、マイクロサテライトなどのＳＮＰまたはＳＴＲであり、より好ましくはＳＮＰである。好ましくは、各染色体セグメント内のマーカーは連鎖不平衡にある。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「宿主動物」は、認識された種または動物の品種の天然の遺伝的相補体を有する動物を意味する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「天然ハプロタイプ」または「天然ゲノム」は、宿主動物に存在しない遺伝子またはアレルのレシピエントであるように選択された特定の種または動物の品種の天然ＤＮＡを意味する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「標的遺伝子座」は、染色体上の公知のアレルの特定の位置を意味する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「定量的形質」は、個別のカテゴリーに適合する形質を指す。定量的形質は、特定の品種が与え得る牛乳の量や尾の長さなど、連続的な範囲の変異として発生する。一般的に、より大きな遺伝子群が定量的形質を制御する。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「定性的形質」は、異なるカテゴリーに分類される形質を指すために用いられる。これらのカテゴリーは特定の順序を有するものではない。原則として、定性的形質は単遺伝子的であり、これは形質が単一遺伝子の影響を受けることを意味する。定性的形質の例としては、例えば、血液型および花の色が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」は、表現型（定量的形質）における差異と相関するＤＮＡの部分（遺伝子座）である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「クローニング」は、無性生殖的な遺伝子的に同一の生物の産生を意味する。
【００６０】
「体細胞核移植」（「ＳＣＮＴ」）は、体細胞および卵細胞から生存可能な胚をクローニングするための１つの方法である。この技術は、除核された卵母細胞（卵細胞）を採取し、体（ｓｏｍａｔｉｃ）（体（ｂｏｄｙ））細胞からドナー核を移植することからなる。
【００６１】
本明細書において使用される「オルソロガス」は、進化的に関連する種における遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を指す。オルソログの同定は、遺伝子機能予測に有用である。家畜の場合、オルソロガス遺伝子は動物界全体に見出され、他の哺乳動物に見出されるものはトランスジェニック置換に特に有用であり得る。これは、同じ種、品種または系統の動物に特に当てはまり、種は、有性生殖によって多産な子孫を産生することができることについて非常に密接に関連する２つの動物が定義され；品種は、均一な表現型、均一な挙動、およびその動物を他の同種の動物と区別する他の特性、を有する家畜動物の特定のグループとして定義され；および系統は、祖先／子孫関係によって結ばれる血統；一連の生物、集団、細胞、または遺伝子の連続線として定義される。例えば家畜牛はどちらも昔の原牛から生じる、２つの別個の系統のものである。一つの系統は中東における原牛の家畜化から血統を引き、第二の別個の系統はインド亜大陸の原牛の家畜化から血統を引くものである。
【００６２】
「遺伝子型決定」または「遺伝子検査」は、一般的に、目的の１つ以上のマーカー、例えば、試験される個体からの試料におけるＳＮＰ、を検出し、得られた結果を分析して対象のハプロタイプを決定することをいう。本明細書の開示から明らかなように、これは、直接的または間接的に結合した異なる配列の核酸から本質的になる、またはこれを有する、固体支持体を含む高スループットシステムを用いて目的の１つ以上のマーカーを検出する一つの例示的な実施形態であって、異なる配列の各核酸は現在の集団を表す祖先またはファウンダーに由来する多型遺伝子マーカーを含み、より好ましくは、上記の高スループットシステムは、現在の集団のゲノムを表すために十分なマーカーを含む。遺伝子型決定のための好ましい試料は、核酸、例えばＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを含む。家畜動物の品種は、その遺伝的マーカーを評価することによって容易に樹立することができる。
【００６３】
本明細書において使用される「ＳＬＩＣＫ」は、特に、短い毛の長さ、毛の密度、毛のタイプ、汗腺の密度および向上した体温調節効率を有する偶蹄目およびウシの表現型を指す。この表現型に影響を及ぼす遺伝子は、ウシの第２０染色体で見出されるプロラクチン受容体遺伝子として同定された。
【００６４】
本明細書において使用される用語「近接した」は、近いことを意味する。
【００６５】
家畜は、様々な遺伝子マーカーを同定するために遺伝子型決定をすることができる。遺伝子型決定は、生物学的アッセイを使用して個体のＤＮＡ配列を決定し、それを別の個体の配列または参照配列と比較することによって、個体の遺伝的構成（遺伝子型）における相違を決定するプロセスを指す用語である。遺伝的マーカーは既知のＤＮＡ配列であり、染色体上の公知の位置を有する。これらは繁殖によって一貫して受け継がれるため、血統または系統を通じて追跡することができる。遺伝子マーカーは、複数の塩基または公知の位置における一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列であり得る。家畜動物の品種は、その遺伝的マーカーを評価することによって容易に樹立することができる。多くのマーカーが知られており、マーカーを目的の形質に相関させ、または将来の繁殖のための動物の遺伝子的価値もしくは期待値を確立しようとする、多くの異なる測定技術が存在する。
【００６６】
相同組換え修復（ＨＤＲ）
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）病変を修復するための細胞内機序である。この修復機序は、病変部位と有意な相同性を有する配列を有するＨＤＲテンプレートが存在する場合、細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの非共有結合性相互作用を含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによりＤＮＡに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスを用いて内因性アレルの上に外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは、実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現行の理論は、そのプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子対であるため、それらの間には有意な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、または生物活性ＲＮＡ鎖をコードする機能もしくは調節タンパク質もしくはＲＮＡを受容するための部位を提供する機能などの他の機能を有し得る。
【００６７】
ＨＤＲテンプレートは、遺伝子移入されるアレルを含む核酸である。テンプレートは、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ｓｓＤＮＡテンプレートは、好ましくは約２０〜約５０００残基であるが、他の長さを使用することができる。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば５００〜１５００残基、２０〜１００残基などが企図されることを直ちに認識するだろう。テンプレートは、内因性アレルに隣接するＤＮＡまたは置き換えるべきＤＮＡとの相同性を提供する隣接配列をさらに含み得る。テンプレートは標的化ヌクレアーゼ系に結合される配列も含み得、したがって、その系のＤＮＡ結合メンバーについてのコグネート結合部位である。コグネートという用語は、典型的には、相互作用する２つの生体分子、例えば、受容体およびそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関して、生体分子の一方は目的の、すなわち、コグネートＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合する配列を用いて設計することができる。
【００６８】
標的化エンドヌクレアーゼ系
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集ツールは、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を及ぼしている。より最近では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に指向される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化ヌクレアーゼ系の例であり、これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、その部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合したヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上で互いを見出すコグネートである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中にコグネート配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位においても、その近傍においても核酸分解作用が生じないように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、例として限定されるものではないが、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されるアレルの配置に適用可能である。
【００６９】
ＴＡＬＥＮ
本明細書において使用されるＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを開裂し得る単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同一部位においてＤＮＡを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すために使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの掌性を参照して、左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称し得る。
【００７０】
それぞれのＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担うＴＡＬについての暗号が報告されている（ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するようにアセンブルされ得る。要するに、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位が決定され、ヌクレアーゼおよび標的部位を認識する一連のＲＶＤを含む融合分子が作出される。結合時、ヌクレアーゼがＤＮＡを開裂し、その結果、切断末端における遺伝子改変を作製するように細胞修復機序が作動し得る。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体機能的な単量体ＴＡＬＥＮおよび別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を要求する他のものを含む。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合にはホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらし得、または単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合にはヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらし得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復により不死化ヒト細胞における遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、ペアで用いられることが多いが、単量体ＴＡＬＥＮも公知である。ＴＡＬＥＮ（および他の遺伝子ツール）による処理のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態において、ＴＡＬエフェクターは、他のタンパク質ドメイン（例えば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特異的ヌクレオチド配列に標的化するために使用することができる。例えば、ＴＡＬエフェクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、またはリガーゼ）、転写活性化因子もしくはリプレッサー、またはヒストンなどの他のタンパク質と相互作用し、またはそれを改変するタンパク質からのタンパク質ドメインに連結され得る。このようなＴＡＬエフェクター融合物の適用としては、例えば、エピジェネティック調節因子の作出または改変、ＤＮＡ中の部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変が挙げられる。
【００７１】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒し得る任意の野生型または変異体酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼはまた、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは１４〜４５ｂｐ長のポリヌクレオチド認識部位を有する場合での希少切断（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼを含む。希少切断エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖分解（ＤＳＢ）を誘導する。希少切断エンドヌクレアーゼは、例えば、標的化エンドヌクレアーゼ、遺伝子操作されたジンクフィンガードメインと制限酵素、例えば、ＦｏｋＩまたは化学エンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合物から得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。化学エンドヌクレアーゼにおいて、化学またはペプチド性開裂因子は、核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより開裂活性を特異的配列に標的化する。化学エンドヌクレアーゼはまた、特異的ＤＮＡ配列に結合することが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ開裂分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートを包含する。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００７２】
ＴＡＬＥＮまたは他のツールにより作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択することができる。挿入という用語は、染色体中への文字どおりの挿入または修復のためのテンプレートとしての外因性配列の使用のいずれかを意味するために広義に使用される。一般に、標的ＤＮＡ部位が同定され、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアが作出される。ＴＡＬＥＮは、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより、細胞または胚に送達される。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを開裂して二本鎖分解を作製し、次いでそれを修復し、インデルの作出をもたらすことが多く、または染色体中に挿入され、もしくは改変配列による分解の修復のためのテンプレートとして機能する、同伴する外因性核酸中に含有される配列もしくは多型を取り込む。このテンプレート駆動型の修復は、染色体を変化させるための有用なプロセスであり、細胞染色体の有効な変化を提供する。
【００７３】
外因性核酸という用語は、細胞または胚に添加される核酸を意味し、核酸が天然に細胞中に存在する核酸配列と同一であるか異なるかとは無関係である。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、例えば、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、トリ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択することができる。
【００７４】
一部の実施形態は、ＴＡＬＥＮペアを家畜および／または偶蹄目細胞または胚中に導入し、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位における細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を作製し、細胞から家畜動物／偶蹄目を生産することを含む、遺伝子改変家畜動物および／または偶蹄目を作製する組成物または方法を含む。例えば、接合体、胚盤胞、または胚中への直接注射を細胞または胚に対して使用することができる。あるいは、ＴＡＬＥＮおよび／または他の因子は、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターを導入するための多くの公知の技術のいずれかを使用して細胞中に導入することができる。遺伝子改変動物は、公知の方法、例えば妊娠宿主中への胚の移植、または種々のクローニング法にしたがって胚または細胞から作製することができる。「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位における細胞のＤＮＡの遺伝子改変」などの語句は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合された場合にＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位において遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所を正確に切断するのではなく、２つの結合部位間の規定部位において切断する。
【００７５】
一部の実施形態は、動物のクローニングに使用される組成物または細胞の処理を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であり得る。例えば、実施形態は、培養下の複数の初代細胞をＴＡＬＥＮタンパク質または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露することを含む、遺伝子改変を作出する組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、例えば、ｍＲＮＡまたはベクター中のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質として、または核酸断片として導入することができる。
【００７６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能になる。内因性ＤＮＡ修復機序を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
【００７７】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定的構造にフォールドする。それぞれのフィンガーは主に、ＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。キー位置におけるアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸は、必要な構造を保存するために残留アミノ酸を維持しながら変化し得る。より長いＤＮＡ配列への結合は、いくつかのドメインをタンデムに連結することにより達成される。他の機能性、例えば、非特異的ＦｏｋＩ開裂ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）およびメチラーゼ（Ｍ）は、ＺＦＰに融合させて、それぞれのＺＦＮ、ジンクフィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ、およびジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子改変動物の作製のためにジンクフィンガーおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料および方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９８号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００２３１５９号明細書；および米国特許出願公開第２０１１／０２８１３０６号明細書に開示されている。
【００７８】
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のため、種々の核酸を細胞に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、および二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するため、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が６員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、４つの塩基が保持されるペプチド核酸を産生するように改変することができる。
【００７９】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結させることができる。調節領域は、ブタ調節領域であり得、または他種からのものであり得る。本明細書において使用される作動可能に連結させるとは、標的核酸の転写を可能にし、または容易にするような手法で核酸配列に対する調節領域を位置付けることを指す。
【００８０】
一般に、典型的なプロモーターは、標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または不応答性のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、顕著な組織特異性も時間的特異性もなく核酸分子の発現を容易にするプロモーターを使用することができる（すなわち構成的プロモーター）。ベータ−アクチンプロモーター、例えば、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用することができるとともに、ウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。一部の実施形態において、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２：５６３，２００１；およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：８２１，１９９６参照。
【００８１】
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、限定されるものではないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性因子、またはイントロンが挙げられる。このような調節領域は、必須でない場合があるが、それらはｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響することにより発現を増加させ得る。このような調節領域は、細胞中の核酸の最適な発現を得ることが望まれる核酸構築物中に含めることができる。しかしながら、そのような追加の因子を用いずに十分な発現を得ることができることもある。
【００８２】
シグナルペプチドまたは発現した選択マーカーをコードする核酸構築物を使用することができる。シグナルペプチドは、コードされるポリペプチドが特定の細胞位置（例えば細胞表面）に指向されるように使用することができる。選択マーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養下の安定的な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが挙げられる。
【００８３】
一部の実施形態において、選択マーカーをコードする配列は、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどの、リコンビナーゼについての認識配列に隣接させることができる。例えば、選択マーカーは、選択マーカーを構築物から切り出すことができるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位に隣接させることができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説については、Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：６８６１，１９９２、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，６：７，２００４参照。選択マーカー遺伝子により中断されるＣｒｅまたはＦｌｐを活性化できる導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して導入遺伝子の条件的発現を有するトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、ユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得、それはＦ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらす。導入遺伝子の組織特異的な活性化は、例えば、マーカーに中断された導入遺伝子をユビキタスに発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐを組織特異的に発現するブタとを交配することにより、またはマーカーに中断された導入遺伝子を組織特異的に発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタとを交配することにより達成することができる。導入遺伝子の発現の制御またはマーカーの切り出しの制御により、導入遺伝子の発現が可能になる。
【００８４】
一部の実施形態において、外因性核酸は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、後続のコードポリペプチドの操作を容易にするため（例えば、局在化または検出を容易にするため）に設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシルもしくはアミノ末端のいずれかに位置するようにポリペプチドをコードする核酸配列中に挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００８５】
核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児または成体偶蹄目／家畜細胞、例として、例えば、生殖細胞、例えば、卵母細胞または卵、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えば、ＰＫ−１５細胞、膵島細胞、ベータ細胞、肝細胞、または皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞中に種々の技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組換えウイルス、またはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿などの、リポソームまたは核酸を細胞に送達し得る他の非ウイルス的方法の使用が挙げられる。
【００８６】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち外因性核酸配列に作動可能に連結される調節領域は、トランスポゾンの逆方向リピートに隣接する。いくつかのトランスポゾン系、例として、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：６８７３，２００３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７，２００７）；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２，２００７）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２７：４５８９，２００７）；およびＰａｓｓｐｏｒｔが、核酸を細胞、例として、マウス、ヒト、およびブタ細胞中に導入するために開発されてきた。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポゼースは、外因性核酸と同一の核酸構築物上でコードされるタンパク質として送達することができ、別個の核酸構築物上で導入することができ、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供することができる。
【００８７】
核酸は、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の規定のＤＮＡセグメントを含む広義語である。ベクターは、発現ベクター、またはベクター系、と称され得る。ここでベクター系とは、ゲノム、またはエピソーム、プラスミド、もしくはさらにウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどの、他の標的化ＤＮＡ配列中へのＤＮＡ挿入を生じさせるために必要とされる構成要素のセットである。動物における遺伝子送達に使用されるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび統合ファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクターと、２）トランスポゼース、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入する他のインテグラーゼ酵素とを有する。ベクターは、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有することが最も多く、発現制御配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００８８】
多くの異なるタイプのベクターが公知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意選択のエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ因子、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００８９】
本明細書において使用される核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指し、例として、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然および化学修飾核酸、例えば合成塩基または代替骨格を含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンスの一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は、本明細書において広義に使用され、遺伝子材料が遺伝子操作技術を使用して変更された遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。したがって、ノックアウト偶蹄目は、外因性遺伝子または核酸が動物またはその子孫において発現されるか否かに無関係にトランスジェニックである。
【００９０】
遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮ、またはリコンビナーゼ融合タンパク質、もしくは公知の種々のベクターを含む、他の遺伝子操作ツールを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、その正常な（野生型）機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止し、遺伝子によりコードされる配列ならびに／または動物における遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーター中での１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するための遺伝子の変更、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５１８，７０１号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２５１３９５号明細書、および米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用性という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して（すなわち分子間で）作用するプロセスを指す。トランス作用性因子は、通常、遺伝子を含有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（またはマイクロＲＮＡもしくは他の拡散性分子）をコードする。トランス作用性遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするＲＮＡを介するものである。トランス作用性遺伝子の実施形態は、例えば標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般にトランス作用因子を含む。シス調節性またはシス作用性という用語は、タンパク質もＲＮＡもコードしない場合の作用を意味する一方、遺伝子不活性化に関して、これは、一般に遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／またはオペレーターの不活性化を意味する。
【００９１】
ノックアウト動物を作製するのに遺伝子を不活化するため、および／またはファウンダー動物を生産するのに核酸構築物を動物中に導入するため、およびノックアウトもしくは核酸構築物がゲノム中に組み込まれている動物系統を作製するため、当技術分野において公知の種々の技術を使用することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列中へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：６１４８−６１５２，１９８５）、胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１，１９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４，１９８３）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９（２２）：１４２３０−１４２３５，２００２；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３，２００６）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳腺細胞、または成体、胎児、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３，１９９７；およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−３７４，１９９８）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、その生殖系列細胞を含むその細胞の全てが遺伝子改変を有する動物である。遺伝子改変がモザイクである動物を生産する方法が使用される場合、動物を同系交配することができ、ゲノム改変されている子孫を選択することができる。例えば、モザイク動物を作製するため、その細胞が胚盤胞状態において改変される場合、クローニングを使用することができ、または単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が生じ得る。改変され、性的に成熟しない動物は、使用される具体的なアプローチに応じて、改変のためにホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。特定の遺伝子がノックアウト改変によって不活性化される場合、ホモ接合性が通常必要とされる。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ計画によって不活性化される場合、ヘテロ接合性は十分であることが多い。
【００９２】
典型的には、前核マイクロインジェクションにおいて、核酸構築物を受精卵中に導入し、精子頭部および卵からの遺伝子材料を含有する前核が原形質内で可視的であるため、１または２つの細胞受精卵を使用する。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）で得ることができる。体外受精卵は、以下のとおり生産することができる。例えば、ブタ卵巣を食肉処理場において回収し、輸送中、２２〜２８℃において維持することができる。卵巣を洗浄し、卵胞吸引のために単離することができ、５０ｍＬのコニカル遠心管中に１８ゲージ針を使用して真空下で４〜８ｍｍに及ぶ卵胞を吸引することができる。卵胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によりプレフィルターに通してリンスすることができる。コンパクトな卵丘塊により包囲される卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬずつの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が補給されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中に加湿空気下で３８．７℃および５％のＣＯ２において約２２時間配置することができる。続いて、卵母細胞を、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ、またはｈＣＧを含有しない新たなＴＣＭ−１９９成熟培地に移し、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞は、それらの卵丘細胞から、０．１％のヒアルロニダーゼ中での１分間のボルテックス処理により剥がすことができる。
【００９３】
ブタについては、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精用ディッシュ内、５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）の準備において、新たに採取したまたは凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地中に４×１０５個の精子になるように再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終的な体外授精は、雄ブタに応じて約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度において、１０μｌの量で実施することができる。全ての授精卵母細胞を３８．７℃、５．０％のＣＯ２雰囲気において６時間インキュベートする。授精から６時間後、推定される接合体をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同一培地に移すことができる。この系は、通常、ほとんどの雄ブタにおいて２０〜３０％の胚盤胞を定型的に生産し得、多精受精率は１０〜３０％である。
【００９４】
線状核酸構築物は、前核の１つに注射することができる。次いで、注射された卵を、レシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管中に）移植し、レシピエント雌中の発生を可能にしてトランスジェニック動物を生産することができる。特に、体外受精胚は、１５，０００×ｇにおいて５分間遠心分離して脂質を沈降させ、前核を可視化することができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注射器を使用して注射することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚の卵割および胚盤胞形成の率ならびに品質を記録することができる。
【００９５】
胚は、非同調性レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して、１００〜２００（例えば１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部接合部に堆積させることができる。術後に妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
【００９６】
体細胞核移植において、上記の核酸構築物を含む、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、または顆粒膜細胞などのトランスジェニック偶蹄目細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）を除核卵母細胞中に導入して複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍における透明帯部分切開を行い、次いで切開領域において細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭い斜角先端を有するインジェクションピペットを使用してトランスジェニック細胞を第２減数分裂時に停止した除核卵母細胞中に注射する。慣習として、第２減数分裂時に停止した卵母細胞は、卵と称される。ブタまたはウシ胚の生産後（例えば、卵母細胞の融合および活性化により）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の輸卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８，１９９８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書参照。ブタについては、胚の移植から約２０〜２１日後にレシピエント雌における妊娠を確認することができる。
【００９７】
標準的な育種技術を使用して初期のヘテロ接合性ファウンダー動物から外因性核酸についてホモ接合性である動物を作出することができる。しかしながら、ホモ接合性が要求されない場合がある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、他の目的のブタと交配することができる。
【００９８】
一部の実施形態において、目的の核酸および選択マーカーは、別個のトランスポゾン上に提供し、選択マーカーを有するトランスポゾンの量が目的の核酸を含有するトランスポゾンを大きく上回る（５〜１０倍過剰）不等量で胚または細胞のいずれかに提供することができる。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択マーカーの存在および発現に基づき単離することができる。トランスポゾンが正確かつ非連鎖的（独立した転位イベント）にゲノム中に組み込まれるため、目的の核酸および選択マーカーは遺伝的に連鎖しておらず、標準的な育種を介した遺伝的分離により容易に分離することができる。したがって、公共の安全の観点からいくぶん懸念される課題である、後続の世代において選択マーカーを保持することに制約されないトランスジェニック動物を生産することができる。
【００９９】
トランスジェニック動物が生成されたら、標準的な技術を使用して外因性核酸の発現をアッセイすることができる。初期スクリーニングは、構築物の組込みが生じたか否かを決定するためのサザンブロット分析により達成することができる。サザン分析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹ．，１９８９のセクション９．３７−９．５２参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術も初期スクリーニングにおいて使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅させる手順または技術を指す。一般に、目的の領域またはそれを超える領域の末端の配列情報を用いて、増幅させるべきテンプレートの逆鎖と配列が同一または類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用して全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの規定の配列を増幅させることができる。プライマーは、典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長〜数百ヌクレオチド長の範囲であり得る。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己保持配列複製、または核酸配列に基づく増幅により増幅させることができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，１２：１，１９９２；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：１８７４，１９９０；およびＷｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１２９２−１２９３，１９９１参照。胚は、胚盤胞期においてＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびスプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲによる分析用に個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９９：４４９５，２００２参照）。
【０１００】
トランスジェニックブタの組織中のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から得られる組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、免疫測定、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を使用して評価することができる。
【０１０１】
干渉ＲＮＡ
種々の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを低分子の２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮａｓｅ、例えばダイサー）およびｓｓＲＮＡｓｅ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝子改変動物における遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減するように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【０１０２】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し得る。例えば、標的ＤＮＡと相同性である二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してそのＤＮＡの発現を低減させることができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６，１９９８；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：３３４３，１９９２；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：３１５３，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：１６６，１９９９；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：１４５１，１９９９；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｃｅｌｌ，９５：１０１７，１９９８に記載のとおり産生することができる。ｓｈＲＮＡのための構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１により記載のとおりに産生することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールし、短鎖ヘアピンを形成し得る相補的領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【０１０３】
特異的遺伝子に指向される単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが見られる確率は高い。ｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は、例えば、約５０％であるが、多数の干渉ＲＮＡを、それらの少なくとも１つが有効である良好な信頼性で作製することができる。
【０１０４】
実施形態は、遺伝子、例えば、発生段階において選択的な遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現する、インビトロ細胞、インビボ細胞、および家畜動物などの遺伝子改変動物を含む。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【０１０５】
誘導性系
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能にする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能的であることが判明している。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現因子を含む。
【０１０６】
誘導性系の一例は、核酸の転写を制御するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系である。この系において、突然変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合させてテトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）を作出し、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節される。抗生物質の不存在下では転写が最小限である一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により産生が調節される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソンの類似体、例えば、ムリステロンＡによる処理により誘導される。誘導性系を誘発するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【０１０７】
より一般に使用される誘導性系の中には、テトラサイクリン誘導性系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）がある。テトラサイクリン誘導性系は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらの系をインビボで使用するための方法は、２系統の遺伝子改変動物を生成することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。トランスジェニック動物の別のセットは、目的の遺伝子（または改変すべき遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子についての標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列に隣接する）アクセプターを発現する。２つのマウス株を交配させることにより、遺伝子発現の制御が提供される。
【０１０８】
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわちテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに、テトラサイクリン依存的に依存する。テトラサイクリンまたは（ドキシサイクリンなどの）その誘導体の不存在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用し得ず、転写は生じない。ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方調節を可能にするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、インビボでの導入遺伝子発現の時間的制御が可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不存在下では機能的でないが、トランス活性化のためにリガンドの存在を要求するｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系はｔｅｔ−ＯＮと称される。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナリングカスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現のため、インビボで使用されている。
【０１０９】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、２つの区別されるＣｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位間のクロスオーバーによる部位特異的組換えを触媒するＣｒｅリコンビナーゼを使用する。２つのｌｏｘＰ配列間に導入されたＤＮＡ配列（ｆｌｏｘ化ＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的または細胞特異的プロモーターによる）または時間的制御（誘導性系による）のいずれかを使用するトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの切り出しの制御をもたらす。１つの適用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）を対象とする。別のアプローチは、ｆｌｏｘ化終止コドンがプロモーター配列および目的のＤＮＡ間に挿入されるタンパク質過剰発現を対象とする。遺伝子改変動物は、Ｃｒｅが発現されてｆｌｏｘ化終止コドンの切り出しがもたらされるまで導入遺伝子を発現しない。この系は、組織特異的腫瘍形成およびＢリンパ球におけるアンチジーン受容体発現の制御に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されてきた。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合し得る外部リガンドに依存的である。
【０１１０】
実施形態は、誘導性系の制御下にある遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、および家畜動物などの遺伝子改変動物を含む。動物の遺伝子改変は、ゲノミックまたはモザイクであり得る。誘導性系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１アルファからなる群から選択することができる。一実施形態は、本明細書に記載の遺伝子である。
【０１１１】
ドミナントネガティブ
したがって、遺伝子は、除去またはＲＮＡｉ抑制によってだけでなく、その遺伝子産物の通常の機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブ変異体の作出／発現によっても破壊することができる。ドミナントネガティブ（ＤＮ）遺伝子の発現は、表現型の変更をもたらし得、ａ）タイトレーション効果；（ＤＮは、内因性遺伝子の協調的因子または通常標的のいずれかについて内因性遺伝子産物と、その同一の活性を構成せずに受動的に競合する）、ｂ）ドミナントネガティブ遺伝子産物が通常の遺伝子機能に要求されるプロセスに能動的に干渉するポイズンピル（またはモンキーレンチ）効果、ｃ）ＤＮが遺伝子機能の負の制御因子を能動的に刺激するフィードバック効果により発揮される。
【０１１２】
ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物（Ｆ０世代）は、クローニングおよび本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性であるファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム改変することができ、これは、そのゲノムにおける細胞が改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターが典型的には胚盤胞段階において胚中の複数の細胞の１つに導入される場合に生じ得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム改変子孫を同定することができる。動物系統は、有性生殖させることができる、または生殖補助技術により生殖させることができる、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する、動物のプールが作出されている場合、樹立される。
【０１１３】
家畜では、多くのアレルが、産生形質、タイプ形質、作業性形質、および他の機能的形質のなどの様々な形質と関連していることが知られている。当業者は、これらの形質のモニタリングおよび定量化を一般的に実践している。例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１２３−１３７，１９９４；米国特許７，７０９，２０６号明細書；米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書；および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、産生形質、タイプ形質、作業性形質、多産性形質、母性形質、および病害抵抗性形質からなる群における形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質には、組換え遺伝子産物の発現が含まれる。
【０１１４】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、標的化ヌクレアーゼ系を、リコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質とともに投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲのためのテンプレートとして機能する核酸配列と複合し得る。次いで、リコンビナーゼはＨＤＲテンプレートと複合してフィラメントを形成し、細胞内に配置される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと複合するＨＤＲテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて配置することができる。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合には本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で２つの相対的に長いＤＮＡ鎖間での相対的に短いＤＮＡ片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージからのＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌中に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ開裂および組換えの開始を活性部位セリンに依存するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖分解の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同性である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位に隣接する規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【０１１５】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同一の機能、特に、（ｉ）後続のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをその相同な標的に適切に位置付けする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸をトポロジー的に調製する能力；および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が相補的配列を効率的に見出してそれに結合する能力、の本質的に全部または大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最も良く特徴付けされたＲｅｃＡタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものであり、そのタンパク質の元のアレル型に加えて、いくつかの突然変異体ＲｅｃＡ様タンパク質、例えば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、例として、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物、例として、ヒト、および植物は、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質としては、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２、およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源からのＲｅｃＡタンパク質、または別の生物からの相同組換えタンパク質であり得る。
【０１１６】
組成物およびキット
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮ、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合物をコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示されるアレルの遺伝子移入に有効なＨＤＲも提供することができる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
【０１１７】
ＳＬＩＣＫの表現型は、明らかに単遺伝子的な遺伝的形質を示す定性的形質であった。ＳＬＩＣＫ表現型を利用するためにウシを交配させることによっても、形質が優性であることが示され、ヘテロ接合性動物における発現が示された。最近、一部のグループが遺伝子を単離することを試みており、Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎら（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：５８６１（２０１４）は、セネポール牛のフレームシフトを生じるエクソン１０（エクソンをエクソン２から数えたため、９番目のエクソンがエクソン１０と呼ばれている）における単一塩基の欠失を同定し、未成熟終止コドンの導入は、ＷＴペプチドの末端１２０ａａの喪失に起因して、４６１ＡＡのペプチドを生じた。図１参照。
【０１１８】
プロラクチン受容体の遺伝子は、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の染色体２０に見出され、９個のエクソンを有し、５８１アミノ酸長のタンパク質をコードする。各単量体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有し、図１に示すように二量体化して機能的受容体を形成する。細胞内ドメインを有しないものを含むＰＲＬＲのいくつかのアイソフォームが存在する。しかしながら、２９４ＡＡショートフォームは、ウシ動物では発現されず、タンパク質のロングフォームで常に発現される組織特異的であり得る。
【０１１９】
他の牛の品種もＳＬＩＣＫ表現型を発現し、最近、研究者らは切断型ＰＲＬＲペプチドを生じるＰＲＬＲ遺伝子の２つの他のアイソフォームを単離した。ＳＬＩＣＫ２（本明細書において造られた語として）は、カロラ／リモネロ牛によって発現され、４９６ＡＡのペプチドを生じる未成熟終止コドンを生じる単一塩基変異である。ＳＬＩＣＫ３はリモネロ牛によって発現され、４６４ＡＡで切断されたタンパク質を生じる単一塩基変異である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されたＰＲＬＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す、図１および図２Ａを参照。残基９４０に示されるのは、エクソン１０の開始であり、チロシン４３３のコード部位は１３８１〜１３８３の残基「ｔａｃ」でコードされている。ＳＬＩＣＫ１を導く突然変異は１４６６の「ｃ」の欠失であり；ＳＬＩＣＫ３は１４７８の「ｃ」であり、ＳＬＩＣＫ２を生じる突然変異は１５７３の「ｃ」の突然変異である。ペプチド中のアミノ酸およびそれらの位置を図２Ｂに示す。
【０１２０】
ＰＲＬＲは、ＰＲＬによる刺激の後にチロシンリン酸化を受け、ＪＡＫ２は、ＰＲＬＲ細胞質ループおよびループ関連ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂにおいて複数のチロシン部位をリン酸化する。その後、チロシンリン酸化ＳＴＡＴ５はループから解離し、活性二量体を形成し、ＰＲＬに関連する遺伝子機能を調節する核へと翻訳される。したがって、チロシン残基はＰＲＬＲシグナル伝達に対して高度に機能的であると考えられる。したがって、本発明者らは、特定の理論にとらわれることなく、チロシンの機能に起因して、チロシンＹ２６１が毛の表現型とは無関係に存在すること、およびＳＬＩＣＫが少なくともＡＡ４６１の後のＰＲＬＲの切断によって明らかであることから、先行するチロシンＹ４３３までのＰＲＬＲの切断はＳＬＩＣＫ表現型をもたらすと仮定する。
【０１２１】
最大１４８個の末端アミノ酸を欠いたＰＲＬＲペプチドを生じる、挿入、欠失、未成熟終止コドンまたは他の改変をコードする突然変異に起因する、ＰＲＬＲペプチド合成の中断を有するＰＲＬＲ遺伝子を発現するように、遺伝的に改変されることにより、特にＳＬＩＣＫ表現型を発現する、所与の家畜動物、一実施形態においては偶蹄目およびウシを開示する。種々の例示的な実施形態において、ＰＲＬＲ遺伝子の改変は、右側および左側の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）構築物および適切な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートを用いたＰＲＬＲ遺伝子の非減数分裂性の遺伝子移入によって達成され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７を有するペプチド配列中で同定される位置４３３のチロシン残基の後のペプチドのある点において、ＰＲＬＲにおけるタンパク質合成の中断をもたらす突然変異を導入する。一部の実施形態において、タンパク質合成の中断は、ペプチドの５１２におけるチロシン残基の前である。非減数分裂性の遺伝子移入の使用は、当技術分野で公知であり、米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書および米国特許出願公開第２０１５／００６７８９８号明細書に記載され、全ての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
上で一般的に記載したような装置および化合物の種々の例示的な実施形態ならびに本発明による方法は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のために提供され、本発明をいかなる形においても限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２３】
実施例１
ＴＡＬＥＮの設計および生産
ＴＡＬＥＮの設計および生産。候補ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列およびＲＶＤ配列は、オンラインツール「ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ」（ｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔ）を使用して同定した。最終デスティネーションベクター（２）としてｐＣ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）およびＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）を用い、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙプロトコルにしたがって、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ形質移入またはインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写のためのプラスミドを構築した。最終的なｐＣ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮベクターは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調製し、使用前に配列決定した。ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した、アセンブルされたＲＣＩｓｃｒｉｐｔベクターをＳａｃＩにより線状化し、前に示されるように、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写のためのテンプレートとして使用した。改変されたｍＲＮＡは、前に記載したようにＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮベクターから合成され、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ  ＲＮＡキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、三リン酸５−メチルシチジン三リン酸プソイドウリジン（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）およびアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチドカクテルを置換した。最終的なヌクレオチド反応濃度は、キャップアナログについては６ｍＭ、グアノシン三リン酸については１．５ｍＭ、他のヌクレオチドについては７．５ｍＭである。得られたｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製する前にＤＮＡｓｅ処理した。表Ｉは、使用したＲＶＤ配列のリストを提供する。
【０１２４】
【表１】
2018531003.tif 000003
【０１２５】
オリゴヌクレオチドテンプレート
全てのオリゴヌクレオチドテンプレートは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１００ｎモル合成で合成し、標準的脱塩により精製し、４００μＭのＴＥに再懸濁させた。オリゴテンプレートのリストにつき表ＩＩを参照。
【０１２６】
【表２】
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【０１２７】
大文字は目的ＳＮＰを表し；太字はＲＦＬＰスクリーニングのための制限部位を生成するヌクレオチド変化を示し、二重下線部はＴＡＬＥＮ部位を示し；新規制限部位には下線が施されている。［ＤｅｌＣ］はこの位置でのシトシンヌクレオチドの欠失を示す。天然の表記は、他の塩基変化を伴わず天然ＳＬＩＣＫ１，２または３突然変異のみを導入するテンプレートを示す。
【０１２８】
実施例２
組織培養および形質移入
ウシ線維芽細胞は、３７℃または３０℃（示されるとおり）において、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２ｍＭのＬ−グルタミンが補給されたＤＭＥＭ中で５％のＣＯ２において維持した。トランスフェクションのために、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＨＤＲの全てのテンプレートは、特に明記しない限り、ネオントランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた形質移入により送達された。簡潔には、１００％のコンフルエンスに達する低継代のウシ線維芽細胞を１：２に分割し、翌日に７０〜８０％のコンフルエンスで回収した。各形質移入は、ｍＲＮＡおよびオリゴと混合した緩衝液「Ｒ」に再懸濁した５００，０００〜６００，０００個の細胞からなり、１００ｕｌのチップを用いて以下のパラメータによってエレクトロポレーションした：入力電圧；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；およびパルス数；１。典型的には、所望のＳＬＩＣＫ突然変異に特異的な０．１〜５μＭのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび２〜５μＭのオリゴを、ＲＦＬＰ分析に必要な制限部位に入るオリゴとともに各形質移入に含めた。形質移入後、細胞をそれぞれ３０℃または３７℃のいずれかで３日間培養するために６ウェルディッシュの２つの別々のウェルに６０：４０に分割した。３日後、細胞集団は増大し、少なくとも１０日目まで３７℃で編集の安定性を評価した。表ＩＩＩは、各処置群から陽性にトランスフェクトされた細胞の概要を提供する。
【０１２９】
希釈クローニング：
形質移入の３日後、５０〜２５０個の細胞を１０ｃｍディッシュ上に播種し、個々のコロニーが直径約５ｍｍに達するまで培養した。ここで、ＰＢＳ中に１：５（容量／容量）で希釈した６ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、コロニーを吸引し、２４ウェルディッシュウェルのウェル中に移し、同一条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを冷凍保存および遺伝子型決定のために回収し分割した。
【０１３０】
【表３】
2018531003.tif 000005
【０１３１】
実施例３
ＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出およびＲＦＬＰ分析
試料調製：３日目および１０日目における形質移入された細胞集団を６ウェルディッシュのウェルから回収し、１０〜３０％を、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫが新たに補給された５０μｌの１×ＰＣＲ適合性溶解緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４５％のＴｒｙｔｏｎ  Ｘ−１００（容量／容量）、０．４５％のＴｗｅｅｎ−２０（容量／容量）中で再懸濁させた。溶解物をサーマルサイクラー中で以下のプログラムを使用して処理した：５５℃で６０分間、９５℃で１５分間。２０〜３０μｌの溶解緩衝液を使用して希釈クローニングからのコロニー試料を上記のとおり処理した。
【０１３２】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉＦｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１μｌの細胞溶解物で、製造業者の推奨にしたがって使用して、目的部位に隣接するＰＣＲを実施した。それぞれの部位のためのプライマーを表ＩＶに列挙する。集団中の突然変異の頻度は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）により製造業者の推奨にしたがって上記のとおり１０ｕｌのＰＣＲ産物を使用して分析した。ＲＦＬＰ分析は、示される制限酵素を使用して１０μｌの上記ＰＣＲ反応物に対して実施した。ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰ反応物を１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分解し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドの密度測定はＩｍａｇｅＪを使用して実施し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ反応物の突然変異率はＧｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（４）に記載のとおり計算した。ＨＤＲパーセントは、ＲＦＬＰ断片の合計強度を、親バンド＋ＲＦＬＰ断片の合計強度で割ることにより計算した。制限部位の組込みの解析のために、標的部位に及ぶ小分子のＰＣＲ産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、編集されたアレル対野生型アレルをサイズによって区別し定量化することができた。コロニーのＲＦＬＰ分析は、ＰＣＲ産物を１×ＭｙＴａｑ  Ｒｅｄ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）で増幅し、２．５％アガロースゲル上で分離した以外は同様に処理した。図４は、ＳＬＩＣＫ１突然変異のＴＡＬＥＮ導入および特有のＸｂａＩ制限部位の導入のための計画を上部に示す。下部は、ＳＬＩＣＫ１形質移入細胞のＲＦＬＰ分析を示すゲルである。図５の上部は、ＳＬＩＣＫ２突然変異をウシ細胞に導入するため、および特有のＸｂａＩ部位の導入のための遺伝子導入計画、下部は、ＸｂａＩ制限部位の存在を示すコロニー混合物のアガロースゲル。図６は、ＳＬＩＣＫ２形質転換体の個々のクローンのＲＦＬＰ分析を示すアガロースゲルである。図７の上部は、ウシ細胞にＳＬＩＣＫ３突然変異を導入するための遺伝子移入計画を示す。左のゲルは、処理９．１１、９．１２、９．１３および９．１４（左から右）のコロニーの混合物であり、右のゲルはＮｓｉＩ活性によるエンドヌクレアーゼ活性を示す遺伝子移入の確認を示す。図８は、個々のクローンのＲＦＬＰ分析の結果を示すアガロースゲルである。ＴＡＬＥＮ  ＲＶＤの配列は、本開示に添付の配列表に提供される。
【０１３３】
レッドアンガス（Ｒｅｄ  Ａｎｇｕｓ）の遺伝的性質へのＳＬＩＣＫ表現型の遺伝子移入の目的のために、８つの成人線維芽細胞株をエリート雌生殖質（表Ｖ）から誘導した。ＳＬＩＣＫ１遺伝子移入の方法を用いて、（ｂｔＰＲＬＲ９．１＋ｓｓＯＤＮ、配列番号４４または配列番号４５）を、コロニー生成（表Ｖ）前の３日目にＮＨＥＪおよびＨＤＲについて分析した細胞に同時形質移入した。このプロセスは８系統のうち４系統で開始され、ＳＬＩＣＫ表現型を有するレッドアンガス動物を産生するため、改変された細胞をクローニングする前に、完了まで継続する。
【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
【表５】
2018531003.tif 000007
【０１３６】
実施例４
ＳＬＩＣＫ突然変異を発現する動物クローンの産生
ウシゲノムにおいて上記の安定したＳＬＩＣＫ突然変異が確認されると、体細胞核移植を用いて突然変異を発現するクローン動物を産生する。簡潔には、上記の核酸突然変異を含む、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体線維芽細胞、または顆粒膜細胞などのトランスジェニックウシ細胞（または所望により他の偶蹄目）を除核卵母細胞中に導入して複合細胞を樹立する。卵母細胞は、極体近傍における透明帯部分切開を行い、次いで切開領域において細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭い斜角先端を有するインジェクションピペットを使用してトランスジェニック細胞を第２減数分裂時に停止した除核卵母細胞中に注射する。慣習として、第２減数分裂時に停止した卵母細胞は「卵」と称される。ウシ（または他の偶蹄目）胚の生産後（例えば、卵母細胞の融合および活性化により）、活性化から約２０〜２４時間後に、またはウシにおける活性化から８日までに、胚をレシピエント雌の輸卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８，１９９０および米国特許第６，５４８，７４１号明細書参照。胚の移植後１７日から、レシピエント雌における妊娠を確認することができる。
【０１３７】
実施例５
胚マイクロインジェクションによりＳＬＩＣＫ突然変異を発現するウシの産生
ＳＬＩＣＫ突然変異は、特にＳＬＩＣＫ２およびＳＬＩＣＫ３部位について、直接ウシ胚に操作された（表ＶＩ）。手短に述べると、インビトロで成熟し、インビトロで受精したウシ接合体に、受精の１４〜２４時間後にＴＡＬＥＮおよび修復テンプレートの組合せを注射した。注射は接合体の細胞質に直接行った。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ（ＨＤＲテンプレート）濃度は表ＶＩに挙げられる。胚盤胞形成速度（受精後７日）は、緩衝液を注射した接合体とＴＡＬＥＮを注入した接合体との間に有意な差はなかった。各条件は、ＮＨＥＪによって媒介されるインデル突然変異を有する胚を産生するのに成功し、正確なＨＤＲが胚の５〜１９％で観察された。総突然変異率は、ＳＬＩＣＫ２注射胚において最も高かった（＞５０％ＮＨＥＪ＋ＨＤＲ）が、ＨＤＲによる正確な遺伝子移入の頻度は、ＳＬＩＣＫ３において、より高かった。高い突然変異率および健常な胚の発生を考慮すると、実施例４のように、同様に生産された胚を代理ダムに導入することにより、ＳＬＩＣＫ表現型を有するウシが高効率で生産される可能性がある。
【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
実施例６
ＳＬＩＣＫ表現型の遺伝子移入を確認するハプロタイプマーカーの同定
「ＳＬＩＣＫ」遺伝子座はウシゲノムの染色体２０にマッピングされており、熱耐性の表現型の基礎となる原因の突然変異は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）内に存在する。この遺伝子は、５８１アミノ酸のポリペプチドをコードする９つのエクソンを有する。セネポール牛におけるこれまでの研究は、この表現型が、未成熟終止コドン（ｐ．Ｌｅｕ４６２）を導入するエクソン１０（エクソン１がなく、認識されたエクソンは２〜１０である）における単一塩基欠失、および受容体からの末端１２０アミノ酸の喪失から生じることを示す。この表現型は本明細書においてＳＬＩＣＫ１と称する。セネポール牛は耐暑性が非常に高く、耐暑性の利点を提供するために他の多くのウシ品種と交配されてきた。
【０１４０】
以下の表ＶＩＩは、ＳＬＩＣＫ遺伝子座周辺のＳＮＰのマーカー分析を提供する。示されるように、マーカー１〜５は染色体２０上のＳＬＩＣＫ遺伝子座の上流にあり、マーカー６〜１０はＳＬＩＣＫ遺伝子座の下流にある。「ＳＮＰアレル」と標識された行は、マーカーがセネポール牛に天然に見出される染色体上の遺伝子座である（ＳＮＰ）。「他のアレル」と標識された行は、有毛のウシの中で、より高いマイナーアレル頻度のヌクレオチド残基であり、ＳＬＩＣＫを連結した、または含む、ハプロタイプには見出されない。ＭＡＦは、遺伝子型決定されたＤＮＡの実験的なセット内のＷＴと比較した、各ＳＮＰの頻度である。最後の列は、１０の隣接するマーカー中にＳＮＰアレルを有し、ＳＬＩＣＫ突然変異を有しない確率は、約８×１０−５であることを示す。しかしながら、この研究のための動物のサンプリングは、ＳＬＩＣＫ突然変異の天然源であるクリオロ遺伝子塩基の影響を受けた動物由来のウシＤＮＡサンプルに大きく偏っていたことに留意すべきである。したがって、各々のマーカーの頻度は、これらのマーカーが任意の全体／ランダム分布にある場合よりも、はるかに一般的である。非セネポール動物が連結したマーカーを有さずにＣｈｒ２０−３９１３６５５８で欠失を示す確率は８×１０−５であり、この値は、大きく影響したクリオロ集団のサンプリングに起因して、より高く歪んでいる。表ＶＩＩに示すように、検証領域の全長は、３９，０４７，５０１〜３９，３４３，５３４の、２９６，０３３ｂｐである。
【０１４１】
【表７−１】
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【０１４２】
【表７−２】
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【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
したがって、信頼できるマーカーが同定された後、標的配列（表ＶＩＩのＳＬＩＣＫ）の供給源をさらに同定することが可能となる。ＳＬＩＣＫの場合、ＳＬＩＣＫハプロタイプの全てのアレルをも共有しないシトシン塩基の欠失を有するハプロタイプは同定されていない。したがって、任意の集団からの動物がシトシン欠失を有し、同定された１０個の他のマーカーを持たない可能性は、不可能であるほど非常に低い。
【０１４５】
本発明は、上記に概説した種々の例示的な実施形態に関連して説明してきたが、公知であるか、現在予見されないか、予見されない可能性があるかに関わらず、様々な代替、改変、変形、改良、および／または実質的な均等物が、少なくとも当業者にとって明らかとなり得る。したがって、上記したような本開示による例示的な実施形態は、制限ではなく、例示することを意図するものである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができる。したがって、本発明は、全ての公知のまたは今後開発される、これらの例示的な実施形態の代替、改変、変形、改良、および／または実質的な均等物を包含することを意図する。
【０１４６】
１〜７３まで連続して列挙される以下の段落は、本発明の種々のさらなる態様を提供する。最初のパラグラフ１における一実施形態では：
１  本開示は、切断型ＰＲＬＲを生じるプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供する。
２．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される残基である残基４３３のチロシンの後で切断される、パラグラフ１の家畜動物。
３．ＰＲＬＲがＡＡ４６１の残基の後で切断される、パラグラフ１および２の家畜動物。
４．ＰＲＬＲがＡＡ４９６の残基の後で切断される、パラグラフ１〜３の家畜動物。
５．ＰＲＬＲがＡＡ４６４の残基の後で切断される、パラグラフ１〜４の家畜動物。
６．動物が暑さのストレスを受けにくい、パラグラフ１〜５の家畜動物。
７．動物が偶蹄目である、パラグラフ１〜６の家畜動物。
８．偶蹄目がウシである、パラグラフ１〜７の家畜動物。
９．遺伝子改変が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、パラグラフ１〜８の家畜動物。
１０．遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、パラグラフ１〜９の家畜動物。
１１．遺伝子改変がヘテロ接合性である、パラグラフ１〜１０の家畜動物。
１２．遺伝子改変がホモ接合性である、パラグラフ１〜１１の家畜動物。
１３．ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される、パラグラフ１〜１２の家畜動物。
１４．改変が遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、パラグラフ１〜１３の家畜動物。
１５．動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、パラグラフ１〜１４の家畜動物。
１６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物。
１７．改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる非減数分裂性の遺伝子移入である、パラグラフ１６の家畜動物。
１８．遺伝子改変がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６および１７の家畜動物。
１９．遺伝子改変が４３３アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ１６〜１８の家畜動物。
２０．遺伝子改変が４６１アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ１６〜１９の家畜動物。
２１．遺伝子改変が４６４アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２０の家畜動物。
２２．遺伝子改変が４９６アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２１の家畜動物。
２３．遺伝子改変が５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２２の家畜動物。
２４．改変が体細胞に対して行われ、動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、パラグラフ１６〜２３の家畜動物。
２５．改変が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、パラグラフ１６〜２４の家畜動物。
２６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子改変方法。
２７．改変が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、パラグラフ２６の方法。
２８．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される、パラグラフ２６および２７の方法。
２９．改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、パラグラフ２６〜２８の方法。
３０．遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む、パラグラフ２６〜２９の方法。
３１．ヌクレアーゼ制限部位が遺伝子改変の下流にある、パラグラフ２６〜３０の方法。
３２．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ２６〜３１の方法。
３３．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ２６〜３２の方法。
３４．遺伝子改変が体細胞に対して行われ、体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、パラグラフ２６〜３３の方法。
３５．再核化卵が代理母へ移植される、パラグラフ２６〜３４の方法。
３６．ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、前記のいずれかのパラグラフによる遺伝子改変された家畜動物。
３７．切断型ＰＲＬＲを生じる遺伝子改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）アレルを含む、家畜動物細胞。
３８．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるタンパク質の残基４３３のチロシンの後で切断される、パラグラフ３７の家畜動物細胞。
３９．ＰＲＬＲがＡＡ４６１のアラニン残基の後で切断される、パラグラフ３７または３８のいずれかの家畜動物細胞。
４０．ＰＲＬＲが４９６のプロリン残基の後で切断される、パラグラフ３７〜３９のいずれかの家畜動物細胞。
４１．ＰＲＬＲが４６４のアラニン残基の後で切断される、パラグラフ３７〜４０のいずれかの家畜動物細胞。
４２．動物が暑さのストレスを受けにくい、パラグラフ３７〜４１のいずれかの家畜動物細胞。
４３．動物が偶蹄目である、パラグラフ３７〜４２のいずれかの家畜動物細胞。
４４．偶蹄目がウシである、パラグラフ３７〜４３のいずれかの家畜動物細胞。
４５．遺伝子改変が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、パラグラフ３７〜４４のいずれかの家畜動物細胞。
４６．遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、パラグラフ３７〜４５のいずれかの家畜動物細胞。
４７．遺伝子改変がヘテロ接合性である、パラグラフ３７〜４６のいずれかの家畜動物細胞。
４８．遺伝子改変がホモ接合性である、パラグラフ３７〜４７のいずれかの家畜動物細胞。
４９．ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される、パラグラフ３７〜４８のいずれかの家畜動物細胞。
５０．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるペプチドの残基Ｙ４３３とＹ５１２との間で切断されるように改変される、パラグラフ３７〜４９のいずれかの家畜動物細胞。
５１．改変が遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、パラグラフ３７〜５０のいずれかの家畜動物細胞。
５２．動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、パラグラフ３７〜５１のいずれかの家畜動物細胞。
５３．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物細胞。
５４．改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入によって行われる、パラグラフ５３の家畜動物細胞。
５５．遺伝子改変がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３または５４のいずれかの家畜動物細胞。
５６．遺伝子改変が４３３アミノ酸以上を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ５３〜５５のいずれかの家畜動物細胞。
５７．遺伝子改変が４６１アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ５３〜５６のいずれかの家畜動物細胞。
５８．遺伝子改変が４６４アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５７のいずれかの家畜動物細胞。
５９．遺伝子改変が４９６アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５８のいずれかの家畜動物細胞。
６０．遺伝子改変が５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５９のいずれかの家畜動物細胞。
６１．改変が体細胞に対して行われ、動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、パラグラフ５３〜６０のいずれかの家畜動物細胞。
６２．改変が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、パラグラフ５３〜６１のいずれかの家畜動物細胞。
６３．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ遺伝子型を有する家畜動物細胞の遺伝子改変方法。
６４．改変が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、パラグラフ６３の方法。
６５．改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、パラグラフ６３または６４のいずれかの方法。
６６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される、パラグラフ６３〜６５のいずれかの方法。
６７．遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む、パラグラフ６３〜６６のいずれかの方法。
６８．ヌクレアーゼ制限部位が遺伝子改変の下流にある、パラグラフ６３〜６７のいずれかの方法。
６９．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ６３〜６８のいずれかの方法。
７０．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ６３〜６９のいずれかの方法。
７１．遺伝子改変が体細胞に対して行われ、体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、パラグラフ６３〜７０のいずれかの方法。
７２．除核卵が再核化され代理母へ移植される、パラグラフ６３〜７１のいずれかの方法。
７３．ＳＬＩＣＫ遺伝子型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、遺伝子改変された家畜動物細胞。
【０１４７】
本明細書に記載された全ての特許、刊行物、および雑誌記事は参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合には本明細書が優先する。
【０１４８】
本発明は、上記に概説した種々の例示的な実施形態に関連して説明してきたが、公知であるか、現在予見されないか、予見されない可能性があるかに関わらず、様々な代替、改変、変形、改良、および／または実質的な均等物が、少なくとも当業者にとって明らかとなるであろう。したがって、上記したような本発明による例示的な実施形態は、制限ではなく、例示することを意図するものである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができる。したがって、本発明は、全ての公知のまたは今後開発される、これらの例示的な実施形態の代替、改変、変形、改良、および／または実質的な均等物を包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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