(57)【要約】改変型インターロイキン１２（ｎｓＩＬ−１２）およびその遺伝子、組換えベクター、ならびに腫瘍の治療のための医薬品の製造における使用が提供される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非分泌性である改変型ＩＬ−１２。
【請求項２】
ｐ４０−リンカー−ｐ３５またはｐ３５―リンカー−ｐ４０の構造を有し、
前記非分泌性ＩＬ−１２は分泌シグナルペプチドを含まず、好ましくは、前記構造中のｐ４０とｐ３５もシグナルペプチドを含まない、
請求項１に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項３】
ｐ３５およびｐ４０は天然のｐ３５およびｐ４０またはその活性型バリアントであり、好ましくは、ｐ３５およびｐ４０は天然のヒトｐ３５およびヒトｐ４０またはその活性型バリアントであり、より好ましくは、ｐ３５は配列番号５の配列を有するまたはそれから構成され、ｐ４０は配列番号６の配列を有するまたはそれから構成される、請求項２に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項４】
前記バリアントは、その親または天然のアミノ酸配列に対し約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％ ９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、その親または天然のアミノ酸配列の前記活性を有する、請求項３に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項５】
前記バリアントは、その天然のアミノ酸配列または親配列に基づいて１または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成され、前記置換、欠失、挿入または付加前の前記活性を保持する、請求項３に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項６】
前記リンカーは、配列番号７のアミノ酸を有するまたはそれから構成される、請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸またはそのバリアントを有するまたはそれから構成される、請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項８】
前記バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、その親または天然アミノ酸配列の前記活性を有する、請求項７に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項９】
前記バリアントは、前記配列番号２に基づいて１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、前記置換、欠失、挿入または付加前の前記活性を保持する、請求項７に記載の改変型ＩＬ−１２。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項９の何れか１項に記載の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１１】
以下の配列を含むか、またはそれから構成される請求項１０に記載のヌクレオチド配列：
ａ）配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
ｂ）配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能で、非分泌性ＩＬ−１２活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
ｃ）上記ａ）またはｂ）の相補的配列。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載のヌクレオチド配列を含む、または請求項１乃至請求項９の何れか１項に記載の改変型ＩＬ−１２を発現することができる組換えベクター。
【請求項１３】
プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１２に記載の組換えベクター。
【請求項１４】
腫瘍溶解性ウイルスであり、好ましくはアデノウイルス血清型５ベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはアデノウイルス血清型１１ベクターであって、より好ましくは受入番号ＣＣＴＣＣ  番号：Ｖ２０１５２０のウイルスベクターである請求項１２に記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１０または請求項１１に記載のヌクレオチド配列を含むか、請求項１乃至請求項９の何れか１項に記載の改変型ＩＬ−１２を発現することができる微生物または単離された細胞であって、前記単離された細胞は好ましくはヒト由来の細胞であり、例えば、ヒト肝臓、腎臓、膵臓、胃、大腸、小腸または幹細胞に由来する細胞であり、より好ましくは癌細胞または幹細胞である。
【請求項１６】
請求項１乃至請求項９の何れか１項に記載の非分泌性ＩＬ−１２、請求項１０または請求項１１に記載のヌクレオチド配列、または請求項１２乃至請求項１４の何れか１項に記載のベクターを含む薬物。
【請求項１７】
請求項１２乃至請求項１４の何れか１項に記載のベクターを対象に投与することを含むＩＬ−１２に関連する疾患の治療方法であって、好ましくは前記疾患は癌であり、より好ましくは膵臓癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌または胃癌であり、最も好ましくは腹腔内に播種する腫瘍である。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項９の何れか１項に記載の改変型非分泌性ＩＬ−１２、請求項１０または請求項１１に記載のヌクレオチド配列、または請求項１２乃至請求項１４の何れか１項に記載のベクターの、対象におけるＩＬ−１２に関連する疾患の治療のための医薬品の製造における使用であって、好ましくは前記疾患は癌であり、より好ましくは膵臓癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌または胃癌であり、最も好ましくは腹腔内に播種する腫瘍である。
【請求項１９】
非分泌性ＩＬ−１２を発現することができる組換えベクターを得るために、請求項１０または請求項１１に記載のヌクレオチド配列をベクターに挿入することを含む組換えベクターの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学バイオテクノロジーの分野に関し、特に、改変型インターロイキン１２（以下、ｎｓＩＬ−１２と称する）およびその遺伝子、組換えベクター、ならびに腫瘍の治療のための医薬品の製造における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、主に樹状細胞、単球、マクロファージおよびＢ細胞などの抗原提示細胞によって分泌される免疫調節サイトカインであり、ジスルフィド結合を介して連結する２つのサブユニットｐ３５およびｐ４０からなるヘテロ二量体である。ＩＬ−１２の主な機能はＴ細胞の分化に関与し、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を活性化し、インターフェロンγを分泌するようにＴ細胞およびＮＫ細胞を刺激し、ＮＫ細胞およびＣＤ8+細胞傷害性Ｔ細胞を媒介し、先天性免疫および適応免疫に関与するので多機能性の強い免疫調節因子であるＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１２Ｒ−β１およびβ２の発現を促進する。
【０００３】
現在、様々な方法でＩＬ−１２の抗腫瘍効果を研究する多くの研究室がある。例えば、ＩＬ−１２含有プラスミドを用いたエレクトロポレーションによる腫瘍細胞の形質転換、生分解性ミクロスフェアに封入されたＩＬ−１２プラスミドを用いて腫瘍細胞を形質転換、組換えＩＬ−１２タンパク質、抗体およびＩＬ−１２のキメラ、ＩＬ−１２を発現する免疫細胞、ＩＬ−１２を含有するアデノウイルス/レトロウイルスベクターなどを用いて癌治療を行うこと、化学療法、放射線療法および免疫療法と組み合わせてＩＬ−１２を使用することによって腫瘍療法を行うことを含む。これらの研究は、これらのＩＬ−１２が、ヒトおよびマウスの腫瘍細胞量の退縮および減少、ならびに腫瘍における血管新生の減少を引き起こし得ることを示した。しかしながら、上記の種々のＩＬ−１２のin vivo半減期は非常に短く、治療効果を達成するためにはこれらのＩＬ−１２に対する持続投与および比較的大量（１から１０μｇ／日）が通常必要であるのに対し、高用量のＩＬ−１２はしばしば重篤な全身性の副作用を招く。従って、in vivoでのＩＬ−１２の短い半減期および毒性副作用の問題に対処することが急務である。
【０００４】
ＩＬ−１２の全身投与は、潜在的に致死毒性を引き起こすかもしれないことから、これまで臨床的使用を妨げていた。ＩＬ−１２を臨床的に適用するために、ＩＬ−１２の毒性を低下させるための多くの開発戦略が研究のホットスポットであり、一連のＩＬ−１２の改変方法が開発されている。例えば、ＩＬ−１２の発現を制御するために経口リガンド薬物に依存するシステムは、ＩＬ−１２によって誘導される毒性を有意に減少させることができるが、腫瘍細胞に効果的に形質導入することができず、同時に誘発される炎症応答が欠如し、このためこの方法の抗腫瘍適用を制限する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＩＬ−１２の抗腫瘍効力を適用するために、本発明は、抗腫瘍能を保持または増強するが、その毒性は弱められまたは排除された新規再構成ＩＬ−１２を開示する。これに関連して、Ｎ末端シグナルペプチドの欠失を有する改変型ＩＬ−１２を新規の腫瘍標的化腫瘍溶解性ウイルスベクターに挿入して、非分泌性ＩＬ−１２を発現することができる腫瘍溶解性ウイルスを構築し、その治療効果およびＩＬ−１２機能も開示されている。これに基づいて、本発明は、改変型インターロイキン１２（ｎｓＩＬ−１２という）およびその遺伝子、組換えベクター、ならびに腫瘍の治療のための医薬品の製造における使用を提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態においては、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなる改変型インターロイキン１２をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【０００７】
改変型インターロイキン１２をコードするヌクレオチド配列は、ヒトインターロイキン１２ヌクレオチド配列に由来するが、配列番号1のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列であってもよく、それによってコードされるタンパク質は抗腫瘍効果を示すか、または腫瘍退縮を引き起こす可能性があり、既存のＩＬ−１２と比較してより低い毒性および副作用を有する。
【０００８】
本発明の他の実施形態において、上記ヌクレオチド配列にコードされる改変型インターロイキン１２が提供される。
【０００９】
好ましくは、改変型インターロイキン１２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１０】
改変型インターロイキン１２はまた、ヒトＩＬ−１２に由来するが配列番号２に示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなり、抗腫瘍効果を示すか、または腫瘍退縮を引き起こし、既存のＩＬ−１２と比較して低い毒性および副作用を有する。
【００１１】
本発明の他の実施形態では、改変型ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターが提供される。
【００１２】
好ましくは、組換えベクターは、腫瘍細胞を標的とすることができる。より好ましくは、組換えベクターは、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるベクターの構築によって得ることができる。
【００１３】
好ましい実施形態では、組換えベクターは、サブクラスＣのアデノウイルス血清型５であるが、Ｅ１Ａ−ＣＲ２、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＥ３ｇｐ１９Ｋの3つの遺伝子の欠失を有し、Ｅ３ｇｐ１９Ｋプロモーターを用いて改変型ＩＬ−１２遺伝子の発現を制御する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、中国、武漢市、Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、受入番号ＣＣＴＣＣ  番号：Ｖ２０１５２０、寄託日：２０１５年５月２１日、ヒトアデノウイルス血清型５変異体、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ１２としても知られている）である。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、改変型ＩＬ−１２または改変型ＩＬ−１２をコードする核酸配列またはベクターの、腫瘍の治療のための医薬の製造における使用が提供される。
【００１５】
好ましくは、腫瘍は固形腫瘍、腹腔内に播種する腫瘍、または転移性腫瘍である。
【００１６】
改変型インターロイキン１２をコードするヌクレオチド配列は、改変型ヒトＩＬ−１２  ｐ３５サブユニット（ｎｓ−ｐ３５、配列番号３に示すヌクレオチド配列）をコードする遺伝子を、短い配列（GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGG TGGGC）を介して改変型ヒトＩＬ−１２  ｐ４０サブユニット（ｎｓ−ｐ４０、配列番号４に示すヌクレオチド配列）をコードする遺伝子に連結することによって得られる。
【００１７】
腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２は、サブクラスＣのアデノウイルス血清型５であるが、Ｅ１Ａ−ＣＲ２、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＥ３ｇｐ１９Ｋの3つの遺伝子の欠失を有し、Ｅ３ｇｐ１９Ｋプロモーターを用いて改変型ＩＬ−１２遺伝子の発現を制御する。組換えアデノウイルスベクターは、腫瘍細胞で選択的に複製され、腫瘍への進入後に改変型ヒトＩＬ−１２を発現するため改変型ＩＬ−１２の発現が腫瘍細胞に限定される。腫瘍細胞の溶解により、発現されたＩＬ−１２が放出され、腫瘍関連抗原が同時に放出され、放出された腫瘍関連抗原およびＩＬ−１２は、ウイルスに感染していない転移性小腫瘍病変を含む遠隔腫瘍細胞をさらに死滅させるためのin vivoで効率的で特異的な抗腫瘍応答を誘導する相乗効果を示す。これらの腫瘍には、固形腫瘍、転移性腫瘍、および肉眼で観察することができるかまたは顕微鏡下で見ることができる浸潤性腫瘍が含まれる。組換えアデノウイルスベクターは、腹腔内に播種する腫瘍および同所性腫瘍に対してより強い腫瘍増殖抑制効果を有し、より低い毒性を有する。
【００１８】
ヒト腫瘍の標的治療のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を構築する方法は、以下の工程を含む：
（１）ｎｓＩＬ−１２融合遺伝子のクローニング：培養したＲＰＭＩ−８８６６細胞の全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写し、改変型ｐ３５サブユニット遺伝子（ｎｓ−ｐ３５、配列番号３にヌクレオチド配列を示す）および改変型ｐ４０サブユニット遺伝子（プライマー：ｐ４０−Ｆ：CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、ｐ４０−Ｒ：GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ｎｓ−ｐ４０、配列番号４にヌクレオチド配列を示す）をクロー二ングするために、ＳｎａＢＩ切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(p35-F: GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG, p35-R: GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてＰＣＲを行い、ｎｓ−ｐ４０サブユニット遺伝子断片およびｎｓ−ｐ３５サブユニット遺伝子断片をＰＣＲで連結してｎｓＩＬ−１２全遺伝子断片を形成し、ｎｓＩＬ−１２全遺伝子断片をクローニングベクターＴベクターに連結し、これをＴ−ｎｓＩＬ−１２とする。Ｔ−ｎｓＩＬ−１２プラスミドをＳｎａＢＩで消化してｎｓＩＬ−１２遺伝子断片（配列番号１）を得る。
（２）ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋシャトルベクターの構築：ｐＳＳ−ＣＨＬのＣＨＬ上流のマルチクローニングサイト（図1参照）をＳａｌ１およびＥｃｏＲＶで消化し、左腕として使用するＥ３  ６．７Ｋ遺伝子終止コドンの上流１０９１ｂｐ配列を両端にＳａｌ１およびＥｃｏＲＶ切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、ｐＳＳ−ＣＨＬに連結してｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−Ｌを形成する。ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ＬをＳｎａＢ１とＸｈｏ１で消化し、Ｅ３ｇｐ１９Ｋ遺伝子終止コドンの下流１１４６ｂｐ配列をその２つの末端にSnaB1とXho1切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋシャトルベクターを形成するために連結する。
（３）ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２ベクターの構築：ｐＳＳＥ３ｇｐ１９ＫベクターをＥｃｏＲＶで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、ｎｓＩＬ−１２遺伝子断片と連結してｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定する。
（４）Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬの構築：ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２をＰｍｅ１で線状化し、ｎｓＩＬ−１２を含む大きな断片を回収し、ＢＪ５１８３コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってｐＡｄ−ＴＤベクター（特許文献ＺＬ２００９１００６６１３０．４参照）との相同組換えを行い、陽性クローンｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬを選別する。
（５）ｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の構築：ポジティブベクターｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬをＳｗａ１で消化してＣＨＬ遺伝子を欠失させ、Ｓｗａ１及びＴ４リガーゼを失活させた後、それを用いてＴＯＰ１０コンピテント細胞を形質転換してｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ベクターを得る。及び
（６）Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ウイルスベクターの構築：組換えｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ベクターをＰａｃ１で線状化し、２９３細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を作製する。
【００１９】
本発明は、非分泌性の改変型ＩＬ−１２を提供する。本発明によって提供される改変型ＩＬ−１２は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠くので、発現されたときに細胞から分泌されることはできない。本発明の改変型ＩＬ−１２は、任意の天然のＩＬ−１２およびそのバリアント、例えば、遺伝子工学またはタンパク質工学によって得られた改変型ＩＬ−１２を含むが、そのような改変型ＩＬ−１２は、シグナルペプチドを含有しないが、抗腫瘍活性を保持する。本開示に基づいて、当業者は、本発明に記載されるような種々な改変型ＩＬ−１２を得ることができ、それらの活性を確認することができる（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５  Ｓｅｐ；  ２２（９）：６９６−７０６参照）。
【００２０】
従って、本発明は、具体的には、非分泌性の改変型ＩＬ−１２を提供する。
【００２１】
好ましくは、本発明の改変型ＩＬ−１２は、以下の構造を有する。
ｐ４０−リンカー−ｐ３５またはｐ３５―リンカー−ｐ４０
非分泌性ＩＬ−１２は分泌シグナルペプチドを含まない。好ましくは、上記構造中のｐ４０もｐ３５もシグナルペプチドを含まない。
「リンカー」については、当業者は、従来技術（例えば、Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65 (10): 1357-1369およびFront Immunol. 2015 Apr 7; 6: 136）に従って、種々の既知のリンカーに由来する適切なリンカーを設計または選択することができる。好ましくは、リンカーは（GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC）の配列を有する。当業者であれば、本開示に基づいて、当業者は様々な他の配列（J Biomed Nanotechnol. 2015 Aug; 11 (8): 1418-30）を有するリンカーを設計することができる。
【００２２】
もちろん、シグナルペプチドを含まないｐ３５およびシグナルペプチドを含まないｐ４０を腫瘍溶解性ウイルスを介して別々に発現させること、およびｐ３５およびｐ４０を細胞内で（例えばジスルフィド結合を介して）結合させ、分泌シグナルがないＩＬ−１２を産生することも可能である。
【００２３】
ｐ３５およびｐ４０には、天然のｐ３５およびｐ４０、ならびにそれらのバリアント、例えば、遺伝子工学またはタンパク質工学によって得られたバリアントが含まれ、バリアントが天然のｐ３５およびｐ４０の活性を保持していればよい。好ましくは、ｐ３５およびｐ４０は、天然のヒトｐ３５およびヒトｐ４０、ならびにそのバリアントである。より好ましくは、ｐ３５は配列番号５の配列を有するまたはそれから構成される。ｐ４０は配列番号６の配列を有するかまたはそれから構成される。
【００２４】
本発明のバリアントは、その天然のアミノ酸配列または親配列に基づいて１または複個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持してもよい。
【００２５】
一例として、ｐ３５は、その天然のアミノ酸配列または親配列に基づいて１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持してもよい。例えば、ｐ３５は、配列番号５に基づいて１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持していてもよい。
【００２６】
一例として、ｐ４０は、その天然のアミノ酸配列または親配列に基づいて1または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持してもよい。例えば、ｐ４０は、配列番号６に基づいて１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られるアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、置換、欠失、挿入または付加前の活性を保持していてもよい。
【００２７】
本発明において、アミノ酸配列における１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加とは、アミノ酸配列中の任意の１または複数の部位で１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸）の置換、欠失、挿入または付加を意味し、置換、欠失、挿入または付加のいずれか２以上が同時に起こってもよい。
【００２８】
アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加のための本発明における方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３」や、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」等に記載される部位特異的突然変異導入法によって行うことができる。
本発明に記載される置換において、アミノ酸残基の置換は、好ましくは以下の各群の中で行われる：
１：ロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン
２：アスパラギン酸、グルタミン酸;
３：アスパラギン、グルタミン;
４：リジン、アルギニン;
５：プロリン、ヒドロキシプロリン;
６：セリン、スレオニン; そして
７：フェニルアラニン、チロシン。
【００２９】
本明細書に記載の保守的置換、欠失、挿入または付加の前の活性に対して、置換、欠失、挿入または付加後のタンパク質またはアミノ酸配列の活性は、置換、欠失、挿入または付加前の活性の１０％超、２０％超、４０％超、６０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、または１００％以上、である。
【００３０】
上記の置換、欠失、挿入および/または付加のためのアミノ酸残基の数は、一般的には少ないことが好ましい。バリアントは、親またはその天然のアミノ酸配列に対し約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％ ９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、親または天然のアミノ酸配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
【００３１】
本発明の変異体はまた、その天然アミノ酸配列又は親配列に対して少なくとも約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、その天然アミノ酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
【００３２】
例として、ｐ３５はまた、その天然アミノ酸配列又は親配列（例えば、配列番号５）に対して少なくとも約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、その天然アミノ酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
【００３３】
例として、ｐ４０はまた、その天然アミノ酸配列又は親配列（例えば、配列番号６）に対して少なくとも約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、その天然アミノ酸配列又は親配列の活性を有する。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
【００３４】
好ましくは、本発明は、非分泌性であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するか、またはそれから構成される改変型ＩＬ−１２を提供する。
【００３５】
一例として、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２は、配列番号２に基づいて１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらから構成されてもよく、配列番号２の活性を保持していてもよい。
【００３６】
例として、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２は、配列番号２に対して少なくとも約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号２の活性を有してもよい。一般に、上記の同一性は、大きな値を有することが好ましい。
【００３７】
本発明において、「非分泌」とは、標的タンパク質をコードする遺伝子がシグナルペプチドをコードする断片を欠いているため、合成されたタンパク質を分泌関連小胞体−ゴルジ−原形質膜系に輸送することができず、従って、細胞外に分泌することができないことを意味する。
【００３８】
また、本発明は、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列をも提供する。好ましくは、それは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列またはその相補的配列を含むか、またはそれから構成される。
【００３９】
好ましくは、本発明による改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列は、以下の配列を含むか、またはそれから構成される：
ａ）配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
ｂ）配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能で、非分泌性ＩＬ−１２活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
ｃ）上記ａ）またはｂ）の相補的配列。
【００４０】
本明細書において、非分泌性ＩＬ−１２活性を有するとは、特定のタンパク質またはアミノ酸配列が、非分泌性ＩＬ−１２（配列番号２）に対して１０％以上、２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以上の活性を有することを意味する。
【００４１】
本発明による改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列は、以下の配列を含むか、またはそれから構成されることがさらに好ましい：
ａ）配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
ｂ）配列番号1のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能で、非分泌性ＩＬ−１２活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;または
ｃ）上記ａ）またはｂ）の相補的配列。
【００４２】
本明細書に記載の「ストリンジェント条件」とは、低度ストリンジェント条件、中度ストリンジェント条件、または高度ストリンジェント条件のいずれかであってもよく、好ましくは高度ストリンジェント条件であってもよい。具体的には、「低度ストリンジェント条件」は、３０℃、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件であってもよく、「中度ストリンジェント条件」とは、４０℃、５×ＳＳＣ、デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件であってもよく、「高度ストリンジェント条件」とは、５０℃、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件であってもよい。当業者であれば、温度が高いほど、得られるポリヌクレオチドの同一性が高いことを理解するであろう。さらに、当業者は、対応するストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間、塩濃度などの因子の組み合わせを選択することができる。
【００４３】
また、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアでデフォルトパラメーターを用いて同一性計算を行う場合、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列に対して約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％ ９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９.９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００４４】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性は、ＢＬＡＳＴのＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 5873, 1993）で決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくプログラムＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸが開発されている（Altschul SF, et al: J MoI Biol 215: 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを使用してアミノ酸配列を分析する場合、パラメーターはスコア＝１００、語長＝１２、さらにＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を分析する場合、パラメーターはスコア＝５０、語長＝３、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用する場合、各プログラムのパラメーターはそれらのデフォルトパラメーター値であってもよい。
【００４５】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むか、または本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２を発現し得る、組換えベクター、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターを提供する。また、本発明は、本発明の組換えベクターまたは本発明のヌクレオチド配列が導入された微生物（例えば、細菌）又は細胞、例えば大腸菌及び酵母を提供する。本発明の組換えベクターを導入する細胞としては、ヒト由来の細胞であることが好ましく、ヒト組織または器官に由来する細胞であって、ヒトの肝臓、腎臓、膵臓、胃、大腸、小腸、より好ましくは癌細胞または幹細胞に由来する細胞または幹細胞のような細胞である。
【００４６】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列を含む組換えベクターは、アデノウイルス血清型５ベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルス血清型１１ベクター、ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス 、ポリオウイルスなどが含まれる。
【００４７】
より好ましくは、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターは、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、中国、武漢市、Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、受入番号ＣＣＴＣＣ  番号：Ｖ２０１５２０、寄託日：２０１５年５月２１日、ヒトアデノウイルス血清型５変異体）である。
【００４８】
また、本発明は、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２を発現することができるベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを含むキットまたは薬剤を提供する。好ましくは、キットまたは薬剤は、ＩＬ−１２に関連する疾患の治療または予防のために使用される。
【００４９】
本発明はまた、対象におけるＩＬ−１２に関連する疾患（例えば、癌）の治療のためのキットまたは医薬品の製造における本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２を発現することができるベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターの使用を提供する。
【００５０】
本発明はまた、対象におけるＩＬ−１２に関連する疾患（例えば、癌）の治療のための方法であって、有効量の本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列、本発明の改変型非分泌性IL-12を発現することができるベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象に投与することを含む。
【００５１】
好ましくは、対象は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００５２】
本明細書で使用されているように、「ＩＬ−１２に関連する疾患」とは、好ましくは、ＩＬ−１２の使用によって治療または予防することができる癌などの疾患を指す。
【００５３】
本発明は、膵臓癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌および胃癌を例示するが、「癌」という用語は、原発性黒色腫、転移性黒色腫、腺癌、扁平上皮細胞癌、扁平上皮腺細胞癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、NPC（鼻咽頭癌）、膀胱癌、子宮頸癌、腎臓癌、脳腫瘍、骨肉腫、胃癌、食道癌、結腸直腸癌（直腸癌および十二指腸癌）、肝臓癌、肺癌、骨癌、膀胱癌、卵巣癌、リンパ腫、血液癌、乳癌、頭頚部癌、子宮癌、メラノーマおよび他の癌、ならびに癌の症状を含むが、これらに限定されない固形腫瘍、腹腔内に播種する腫瘍または転移性腫瘍であってもよい。好ましくは、本発明により治療される癌は、好ましくは、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌または胃癌およびそれらの関連症状である。
【００５４】
有効成分として作用する本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列、本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２を発現することができるベクター、または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを、薬学的に許容される担体と共に使用してもよい。有効成分に加えて、本発明の方法、使用および製品は、活性成分の製剤への加工を容易にする賦形剤およびアジュバントを含む適切な薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【００５５】
例えば、注射または注入に適した調製物は、水性および非水性の滅菌注射溶液および水性および非水性の滅菌懸濁液を含み、滅菌注射溶液は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および被験体の血液と調製物との間の圧力を平衡させることができる溶質を任意に含んでもよく、滅菌懸濁液は懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい。製剤は、密封アンプルなどの単位用量または複数用量容器中に存在してもよく、使用直前に注射用の水のような滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｎｇ）条件下で保存されてもよい。
【００５６】
本発明の活性成分は、固体賦形剤と任意に組み合わされてもよく、得られる混合物は任意に粉砕されてもよく、所望であれば、適切なアジュバントの添加後に、粒子の混合物を処理して所望の剤形を得る。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖、セルロースまたはデンプン調製物、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望であれば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。所望であれば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
【００５７】
本発明の有効成分の有効量は、癌を治療する、または癌症状を緩和するか、または癌細胞を阻害することができる任意の用量であればよく、活性成分の約０．１〜１５ｍｇ、好ましくは活性成分の０．２〜１２ｍｇに対応する投薬単位であってもよい。より好ましくは、投与単位は約２〜５ｍｇの活性成分を含む。最も好ましくは、投与単位は約３〜４ｍｇの活性成分を含む。有効量の決定は、特に本明細書で提供される開示に照らし合わせて、当業者の手腕の範囲内である。
【００５８】
本発明によれば、本発明の医薬品（薬剤またはキット）は有効量の用量を対象に投与することができる。好ましくは、本発明の医薬品（薬剤またはキット）は、複数回投与することができ、例えば約２〜１５回投与、より好ましくは約４〜１０回投与、最も好ましくは約６回投与することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の医薬品（薬剤またはキット）は、投与中に1日おきに約1回の頻度で、例えば注射、注入または経口投与によって対象に投与される。特に好ましい実施形態では、投与は、注射または注入、最も好ましくは腫瘍内注射によって行われる。
【００５９】
本発明の医薬品（薬剤またはキット）は、任意の適切な経路を介した投与のための任意の適切な方法で処方され得ることが理解されるべきである。
【００６０】
本発明の医薬品（薬剤またはキット）の投与単位は、対象の慣用の投与に基づく。例えば、投薬単位は、１日に１回、２日に１回、週に１回、月に１回などより多く投与することができる。投薬単位は、２回/週、すなわち週に２回、例えば３日に１回投与することができる。
【００６１】
また、本発明は、本発明の組換えベクターを調製する方法を提供し、それは非分泌性ＩＬ−１２を発現することができる組み換えベクターを得るため本発明の改変型非分泌性ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入すること、組換えベクターの細胞へのトランスフェクションを行って、本発明の組換えウイルスを産生すること、を含む。
【００６２】
本文中で使用されているように、「comprising」は、「including」、「containing」または「being characterized in」と類義語であり、包括的またはオープンであり、記載されていない追加の要素または方法ステップを排除するものではない。「含む」という用語が、本明細書中の任意の表現において、特に本発明の方法、使用または製品を記載する際に使用される場合、その方法、使用または製品は、実質的に構成成分または要素またはステップからまたはこれらによって構成される製品、方法および使用、および構成成分または要素またはステップからまたはこれらによって構成される製品、方法および使用、を包含することを理解されるべきである。本発明の例示的に記載された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない、1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限が存在しない場合に実行されてもよい。
【００６３】
本発明の医薬品において、医薬品に関する説明書には、適応症（癌、例えば膵臓癌）、投与量（例えば、上記に例示したもの）、副作用等の内容が含まれていてもよい。
【００６４】
本発明の組換えベクター（例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス）は、腫瘍細胞または癌細胞で選択的に複製され、腫瘍または癌細胞に入った後に改変型非分泌性ＩＬ−１２を発現し、改変型非分泌性ＩＬ−１２の発現は、シグナルペプチド配列の欠如のために腫瘍細胞または癌細胞に閉じ込められる。腫瘍細胞または癌細胞の溶解と共に、発現されたＩＬ−１２が放出され、同時に腫瘍関連抗原または癌関連抗原が放出されるため、このように放出された腫瘍関連抗原または癌細胞関連抗原は、ＩＬ−１２と相乗的に作用し、ウィルスに感染していない微小転移または癌性病変を含む遠隔腫瘍細胞または癌細胞をさらに死滅させるために、体内で効率的で特異的な抗腫瘍または抗癌応答を生成する。これらの腫瘍または癌には、肉眼で見ることができる、または顕微鏡下で見ることができる固形腫瘍、転移性腫瘍および拡散した腫瘍が含まれる。本発明者らは、驚くべきことに、シグナルペプチドを含まないＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター（例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス）が、ＩＬ−１２タンパク質を安定して持続的かつ低レベルで発現することができ、これにより、既存のIL-12タンパク質の短い半減期および高レベルの発現によって引き起こされる毒性および副作用のような欠点を克服することを見いだした。加えて、それはより強い腫瘍増殖阻害効果を有し、有意に毒性を有さない。さらに、シグナルペプチドを含まないＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター（例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス）は、腫瘍または癌（例えば、腹腔内に播種する腫瘍およびin situの腫瘍）に対してより強い腫瘍増殖阻害効果と弱い毒性を有する。
【００６５】
対照的に、組換えベクター（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）で発現されたＩＬ−１２がシグナルペプチドを含有する場合、シグナルペプチドを有する発現されたＩＬ−１２は腫瘍細胞または癌細胞から分泌され、身体は大容量のＩＬ−１２の投与に苦しみ、身体へのより強い毒性および副作用が生じるであろう。さらに、組み換えベクターによって発現されるＩＬ−１２は、腫瘍細胞または癌細胞から早期に分泌されるため、組換えベクター（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）が腫瘍細胞または癌細胞を溶解し、腫瘍関連抗原または癌細胞関連抗原を放出する場合に、身体は放出された腫瘍関連抗原または癌細胞関連抗原と相乗的に作用するための有効量のＩＬ−１２を体内に有効に補充することができない。したがって、シグナルペプチドを含まないＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター（例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルス）と比較して、シグナルペプチドを含むＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクター（例えば組換え腫瘍溶解性ウイルス）は、より強い毒性および副作用を引き起こし、身体に効率的で特異的な抗腫瘍または抗癌応答を生じさせることはできない。
【００６６】
本明細書に列挙された用語および表現は限定的ではなく説明的な用語として使用され、本明細書に記載された特徴およびその部分の等価物は除外されることを意図したものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能であることを理解されたい。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示された概念の変更および変形を採用することができ、そのような変更および変形は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内である。本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であり、本出願を限定するものと解釈されるべきではない。
【発明の効果】
【００６７】
本発明の有利な効果は以下の通りである：
１．既存のＩＬ−１２と比較して、本発明の改変型ＩＬ−１２は主に局所腫瘍組織に分布しており、腫瘍細胞に対する特異性を高め、ＩＬ−１２の全身性副作用を減少させる。
２．本発明の方法は、ＩＬ−１２タンパク質を安定で持続的かつ低レベルで発現させることができる改変型ＩＬ−１２を発現させるために腫瘍標的化ウイルスベクターを利用し、短い半減期および高レベルの発現によって引き起こされる毒性および副作用のような既存のＩＬ−１２タンパク質の欠点を克服する。
３．既存のIL-12と比較して、本発明の改変型IL-12は、腹腔内に播種した腫瘍およびin situの腫瘍に対してより強い腫瘍増殖阻害効果を有し、重大な毒性はない。
【００６８】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２は、腫瘍内注射のみならず、腹腔内および胸腔内注射に用いることができ、投与の困難性を低減し、治療可能な患者の範囲を広げる。異なる部位に腫瘍を有する全ての患者が、良好な治療効果を得ることができ、有意な副作用を被ることはない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ｐＳＳ−ＣＨＬプラスミドマップ
【図２】ｐＶＶ−ＴＫプラスミドマップ
【図３】ｐＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２プラスミドマップ
【図４】アデノウイルス血清型５ベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、ワクシニアウイルスベクターＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２及び１１型アデノウイルスベクターＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２の模式図。
【図５】細胞内におけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２のＩＬ−１２の発現。
【図６】細胞内におけるＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２のＩＬ−１２の発現。
【図７】異なるタイプの固形腫瘍に対するＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍効果。
【図８】異なるタイプの固形腫瘍に対するＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍効果。
【図９】様々なウイルスベクターを注射した腫瘍担持シリアンハムスターの末梢血におけるＩＬ−１２の発現。
【図１０】シリアンハムスターに皮下移植された膵臓癌腫瘍モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【図１１】シリアンハムスター皮下移植された膵臓癌腫瘍モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の腫瘍フリーレートの比較。
【図１２】シリアンハムスターの膵臓癌の同所性モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【図１３】シリアンハムスターの腹腔内播種性膵癌腫瘍モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【図１４】シリアンハムスターの腹腔内播種性膵癌腫瘍モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の肝毒性の比較。
【図１５】シリアンハムスターに皮下移植された頭頸部癌腫瘍モデルにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【図１６】シリアンハムスターの腹腔内播種性膵癌腫瘍モデルにおけるＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２と、ＶＶ−ＴＫ−ＲＦＰおよびＶＶ−ＴＫ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【図１７】シリアンハムスターの腹腔内播種性膵癌腫瘍モデルにおけるＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２と、Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ＧＦＰおよびＡｄ１１−Ｔｅｌ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本出願は、２０１５年９月９日に出願された中国特許出願第２０１５１０５６８７１８．５号「改変型インターロイキン１２および腫瘍の治療のための医薬品の製造におけるその使用」の優先権の利益を主張するものであり、その内容はここに参考文献として援用される。
【００７１】
発明を実施するための特定モデル：
本発明を実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似のまたは同じ結果を得るために、本発明の教示に照らしてこれらの実施形態を改変することができ、これらの改変はすべて本発明の範囲内にある。
【実施例】
【００７２】
実施例１：ヒト腫瘍の標的治療のための腫瘍溶解性アデノウイルス血清型５ベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法であって、以下のステップを含む。
（１）ｎｓＩＬ−１２融合遺伝子のクローニング：培養したＲＰＭＩ−８８６６細胞の全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、改変型ｐ３５サブユニット遺伝子（ｎｓ−ｐ３５、配列番号３にヌクレオチド配列を示す）および改変型ｐ４０サブユニット遺伝子（プライマー：ｐ４０−Ｆ：CCTACGTAATGATATGGGAACTGAAGAAAG、ｐ４０−Ｒ：GCCCACCCCAGGTACCCCTACTCCAGGAACACTGCAGGGCACAGATGC、ｎｓ−ｐ４０、配列番号５にヌクレオチド配列を示す）をクロー二ングするために、ＳｎａＢＩ切断部位とエラスチン配列(GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGC)を含むプライマー(ｐ３５−Ｆ：GTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTG、ｐ３５−Ｒ：GCTACGTATTAGGAAGCATTCAGATA)を用いてＰＣＲを行い、ｎｓ−ｐ４０サブユニット遺伝子断片およびｎｓ−ｐ３５サブユニット遺伝子断片をＰＣＲで連結してｎｓＩＬ−１２全遺伝子断片を形成し、ｎｓＩＬ−１２全遺伝子断片をクローニングベクターＴベクターに連結し、これをＴ−ｎｓＩＬ−１２とした。Ｔ−ｎｓＩＬ−１２プラスミドをＳｎａＢＩで消化して、ｎｓＩＬ−１２遺伝子断片（配列番号１）を得て使用のためにスタンバイした。
（２）ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋシャトルベクターの構築：ｐＳＳ−ＣＨＬのＣＨＬ上流のマルチクローニングサイト（図1参照）をＳａｌ１およびＥｃｏＲＶで消化し、左腕として使用するＥ３  ６．７Ｋ遺伝子終止コドンの上流１０９１ｂｐ配列を両端にＳａｌ１およびＥｃｏＲＶ切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、ｐＳＳ−ＣＨＬに連結してｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−Ｌを形成した。ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ＬをＳｎａＢ１とＸｈｏ１で消化し、Ｅ３ｇｐ１９Ｋ遺伝子終止コドンの下流１１４６ｂｐ配列をその２つの末端にＳｎａＢ１とＸｈｏ１切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋシャトルベクターを形成するために連結した。
（3）ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２ベクターの構築：ｐＳＳＥ３ｇｐ１９ＫベクターをＥｃｏＲＶで消化し、その末端リン酸基をホスファターゼで除去した後、ｎｓＩＬ−１２遺伝子断片と連結してｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２ベクターを作製し、その配列を配列解析によって決定した。
（４）Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬの構築：ｐＳＳＥ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２をＰｍｅ１で線状化し、ｎｓＩＬ−１２を含む大きな断片を回収し、ＢＪ５１８３コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってｐＡｄ−ＴＤベクター（特許文献ＺＬ２００９１００６６１３０．４参照）との相同組換えを行い、陽性クローンｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬを選別した。
（５）ｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の構築：ポジティブベクターｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２−ＣＨＬをＳｗａ１で消化してＣＨＬ遺伝子を欠失させ、Ｓｗａ１及びＴ４リガーゼを失活させた後、それを用いてＴＯＰ１０コンピテント細胞を形質転換してｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ベクターを得た。そして
（６）Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ウイルスベクターの構築：組換えｐＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ベクターをＰａｃ１で線状化し、２９３細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を作製した。
３．組換えＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２ベクターをＰａｃ１で線状化し、２９３細胞に導入して、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ１２としても知られている組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２（ヒトアデノウイルス血清型５変異体、Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、武漢市、中国、Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、受入番号ＣＣＴＣＣ  番号：Ｖ２０１５２０、寄託日：２０１５年５月２１日）を作製した。
【００７３】
実施例２：ヒト腫瘍の標的治療のための腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのベクターＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法であって、以下のステップを含む。
１．シャトルベクターｐＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２の構築
実施例1に記載したように、Ｓａｌ１およびＮｈｅＩ切断部位を含むプライマーでｎｓＩＬ−１２遺伝子をクローニングし、対応する酵素で消化して利用するためにスタンバイし、ｐＶＶ−ＴＫプラスミドをＳａｌ１およびＮｈｅＩで消化（図２参照、構築は本発明者らによって公開された方法によって行われた、Mol Ther Methods Clin Dev. 2015 Sep 16; 2:15035. doi: 10.1038/mtm. 2015.35. eCollection 2015）し、ｎｓＩＬ−１２遺伝子はｐＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２ベクターを構築するためにｐＶＶ−ＴＫと連結した（図３）。
【００７４】
２．ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２ウイルスベクターの組換え
ＣＶ１細胞を培養し、次いでＣＶ１を９６ウェルプレートに接種した。細胞が９０％コンフルエントになったら、ＣＲＩＳＰ−ｃａｓ９およびｇＲＮＡプラスミドでトランスフェクションし、２４時間後にワクシニアウイルスＶＶＬ１５に感染させ、２時間後にｐＶＶ−ＴＫでトランスフェクトした。２４時間後、それらを蛍光顕微鏡下で観察し、ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２ウイルスベクター（図４）がうまく組換えられたことを示す赤色蛍光細胞クローンを選別した。
【００７５】
３.ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２ウイルスベクターのスクリーニング
採取した赤色蛍光クローンを１度凍結および解凍した後、再びＣＶ１細胞に感染させ、赤色蛍光クローンを採取し、このスクリーニングプロセスを５回繰り返し、ＣＶ１細胞を感染させてウイルスを産生した。そのゲノムを配列決定のために抽出した。
【００７６】
実施例3：ヒト腫瘍の標的治療のための腫瘍溶解性アデノウイルス血清型１１のベクターＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法であって、以下のステップを含む。
１．ｎｓＩＬ−１２を含むシャトルベクターｐＳＳＥ３−１８．５Ｋ−ｎｓＩＬ−１２の構築
（1）ｐＳＳＥ３−１８．５Ｋの構築：ｐＳＳ−ＣＨＬ（ｐＢＲ３２２プラスミドに基づいて構築、図1参照）のマルチクローニングサイトをＳｎａＢ１およびＸｈｏ１で消化し、左腕として使用するＥ３  １６．１Ｋ遺伝子終止コドンの上流５３５ｂｐ配列を両端にＳｎａＢ１およびＸｈｏ１切断部位を含むプライマーを用いてクロー二ングし、ｐＳＳ−ＣＨＬに連結してｐＳＳＥ３−１８．５Ｋ−Ｌを形成した。ｐＳＳＥ３−１８．５Ｋ−ＬをＳａｌ１およびＥｃｏＲＶで消化し、２つの末端にＳａｌ１およびＥｃｏＲＶ切断部位を含むプライマーを用いてＥ３−１８．５Ｋ遺伝子終止コドンの下流５８４ｂｐ配列をその２つの末端にＳａｌ１およびＥｃｏＲＶ切断部位を含むプライマーを用いてクローニングし、その両方をｐＳＳＥ３−１８．５Ｋシャトルベクターを形成するために連結した。
（２）ｐＳＳＥ３−１８．５Ｋ−ｎｓＩＬ−１２ベクターの構築：ｐＳＳＥ３−１８．５ＫベクターをＳｎａＢ１で消化し、ホスファターゼを用いて末端リン酸基を除去した後、ｎｓＩＬ−１２遺伝子断片と連結してｐＳＳＥ３−１８．５Ｋ−ＮｓＩＬ−１２ベクターを作製し、その配列解析を行った。
（３）ｐＳＳ３ｇｐ１９Ｋ−ｎｓＩＬ−１２をＰｍｅ１で線状化し、ｎｓＩＬ−１２を含む大きな断片を回収し、ＢＪ５１８３コンピテント細胞にエレクトロポレーションすることによってＡｄ１１−Ｔｅｌ−ＧＦＰ（特許文献ＺＬ２０１１０１４３３８５．３の構築方法を参照）との相同組換えを行い、陽性クローンＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２（図４参照）を選別した。
【００７７】
２.組み換えＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２ベクターをＮｏｔ１で線状化し、２９３細胞に導入して組換えアデノウイルスベクターＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２を作製した。
【００７８】
実施例４：腫瘍細胞におけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２およびＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２のＩＬ−１２発現
培養ヒト膵癌Ｓｕｉｔ２およびＣａｐａｎ１、頭頸部腫瘍ＥＣ９７０６、肺癌Ａ５４９およびＨ１２９９、食道癌ＥＣ９７０６およびＺＺＢ、卵巣癌ＳＫＯＶ３、結腸直腸癌ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６ならびに胃癌ＡＧＳ細胞をトリプシンで消化し、計数し、６ウェルプレートに２×１０5細胞/ウェルで播種し、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２およびＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２で別々に感染させ、上清および細胞混合物をそれぞれ回収し、それらのＩＬ−１２発現レベルをＥＬＩＳＡによって検出した。図５および図６にその結果を示す。
【００７９】
図５は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２が腫瘍細胞においてＩＬ−１２を発現したことを示し、図６は、ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２が腫瘍細胞においてＩＬ−１２を発現したことを示す。
【００８０】
実施例５：種々な固形腫瘍に対するＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍効果
培養膵癌ＳＵＩＴ２およびＣａｐａｎ１、頭頸部腫瘍ＥＣ９７０６、肺癌Ａ５４９およびＨ１２９９、食道癌ＥＣ９７０６およびＺＺＢ、卵巣癌ＳＫＯＶ３、結腸直腸癌ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６ならびに胃癌ＡＧＳ細胞をトリプシンで消化し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで細胞懸濁液にし、Ｂ１〜Ｇ１が無細胞培地であり、他の３つがＰＢＳである９６ウェルプレートの中央に接種した。
【００８１】
１４時間〜１８時間後、ウイルスＶＶ−ＴＫ／Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２、ＶＶ−ＴＫ／Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２（全長ヒトＩＬ−１２）およびＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ（ＬＵＣ、ルシフェラーゼ）またはＶＶ−ＴＫ−ＲＦＰの複数の割合の希釈を行った。初期濃度１×１０4ｐｆｕ／細胞として、これらのウイルス溶液に１０倍希釈を適用して９段階の希釈勾配を形成し、最後の列の細胞にはウイルスを加えなかった。複数の割合の希釈の後、１０μl／ウェルずつ各列において同じウイルス勾配になるよう、バレーピペッターを用いてウイルスを９６ウェルプレートの中心に加えた。
【００８２】
ウイルス感染細胞を３７℃のインキュベーターに戻した。６日後、ＭＴＳとＰＭＳの混合溶液２０μl、２０：１（ＭＴＳ：ＰＭＳ）を、ＰＢＳを添加したウェル以外の各ウェルに添加した。１〜４時間後、溶液を取り出し、４９０ｎｍの波長における吸光度を決定するためマイクロプレートリーダーで測定した。それに応じてＥＣ５０を計算し、結果を図７および８に示した。
【００８３】
図７および８に、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２およびＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２が様々な固形腫瘍細胞を死滅させる能力を有することを示している。
【００８４】
実施例６：腫瘍を有するシリアンハムスターに一回腹腔内注射後のＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２と、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２のＩＬ−１２発現の変化の比較。
５〜６週齢シリアンハムスターの腹腔内に、１×１０7ＳＨＰＣ６細胞（セントルイス大学のＷＳＭ  Ｗｏｌｄ提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞）を接種し、そして動物は４日後にグループごとに９匹ずつ４つのグループに分けた。動物は、５００μlのＰＢＳ、１×１０9ＰＦＵのＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ（ＬＵＣは、実施例１でのＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構成されるｐＧＬ３ベクタールシフェラーゼに由来する）、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２（全長ヒトＩＬ−１２、実施例１に記載のＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構築）、またはＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を別々に1回腹腔内注射した。注射後１日目、３日目および５日目に、血清試料を採取し、末梢血中のＩＬ−１２発現の変化を分析し、その結果を図９に示した。
【００８５】
図９の結果は、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２グループの動物においてウイルスベクター注射後１日目のＩＬ−１２の発現が高く、３日目および５日目のＩＬ−１２の発現は有意に減少し、ＩＬ−１２発現レベルの有意な変化を示した。Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２グループの動物においては、それぞれの日でＩＬ−１２の発現が低レベルで一定であること、すなわちＩＬ−１２の発現が１日目から５日目まで有意な差を示さなかったことから、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２はｉｎ  ｖｉｖｏで毒性および副作用を引き起こすであろう大量のＩＬ−１２を産生する可能性が低いことを示している。
【００８６】
実施例７：腫瘍標的化アデノウイルスＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍適用、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２とのそれらの比較。
５〜６週齢の各シリアンハムスターの背中の右上に、１×１０7ＨＰＤ１−ＮＲ（セントルイス大学のＷＳＭ  Ｗｏｌｄ提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞）を接種した。各グループの動物の平均腫瘍体積は約３３０ｍｍ3であった。ＰＢＳ、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣ、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２およびＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を用いて、それぞれの腫瘍内注射を行った。ウイルスベクターを１×１０9ＰＦＵの用量で１日１回、合計６回注射し、腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察した。結果を図１０および図１１に示した。
【００８７】
図１０は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２およびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２がコントロールベクターＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＰＢＳよりも強い抗腫瘍効果を示したことを示す。図１１は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２およびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２処置したグループが最大１００％の非常に高い腫瘍フリーレートを有し、一方、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣのグループは４２．８％しか腫瘍フリーレートを有さないことを示す。
【００８８】
実施例８：シリアンハムスターにおける膵臓癌のｉｎ  ｓｉｔｕモデルに対するＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の治療効果、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２とのそれらの比較。
１０％抱水クロラールを用いて４〜５週齢のシリアンハムスターの麻酔を行い、シリアンハムスターの左腹部を開き、脾臓に接続する膵臓を見つけ、３×１０6個のＨａｐＴ１細胞（セントルイス大学のＷＳＭ  Ｗｏｌｄ提供、シリアンハムスター膵臓癌細胞）を膵臓実質に接種した。６日後、腫瘍を有する動物をグループごとに７匹ずつ４グループに分けた。１日おきに合計６回、５００μlのＰＢＳ、１×１０9ＰＦＵのＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２またはＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２をそれぞれ腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図１２に示した。
【００８９】
図１２の結果は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２がＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２よりも優れた治療効果を有し、腫瘍保有動物の生存時間を有意に延長することができることを示す。Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２グループの全ての動物の死亡率は、ＰＢＳのグループおよび他のグループの動物の死亡より有意に早く、全長ＩＬ−１２がその毒性のために動物に死を引き起こすことが示唆された。
【００９０】
実施例９：シリアンハムスターの腹膜播種ＰａＣａに対するＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２およびＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の治療効果。
４〜５週齢の各シリアンハムスターの腹腔に１×１０7個のＳＨＰＣ６細胞を接種した。４日後、動物はグループごとに１０匹ずつ４つのグループに分けた。治療のために１日おきに計３回、５００μlのＰＢＳ、１×１０9ＰＦＵのＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２またはＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２を別々に腹腔内注射した。 動物の生存時間を観察し、その結果を図１３に示した。
【００９１】
図１３の結果は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２処置したグループの動物は、観察期間中（最初の処置後から２００日）の生存率が１００％であったが、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣグループ、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２グループの動物の生存率はそれぞれ３０％および１０％であり、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２グループの動物の死亡率はＰＢＳのグループおよび他のグループの動物よりも早かった。全長ＩＬ−１２は、その毒性のために動物に死を引き起こすことが示唆された。
【００９２】
実施例１０：シリアンハムスターにおけるＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２とＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の腹腔内注射後の肝毒性の比較。
５〜６週齢の各シリアンハムスターの腹腔に１×１０7個のＳＨＰＣ６細胞を接種し、４日後、動物はグループごとに９匹ずつ分けた。５００μlのＰＢＳ、１×１０9ＰＦＵのＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣ、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２または５×１０8ＰＦＵのＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２の腹腔内注射を1回行い、注射後１日目、３日目および５日目に、血清試料を採取した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を検出し、その結果を図１４に示す。
【００９３】
図１４の結果は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２によって誘導されるＡＬＴ、ＡＳＴおよびＡＬＰの増加が、Ａｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２のそれより有意に低く、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の肝毒性がＡｄ−ＴＤ−ＩＬ−１２のそれより有意に低いことを示す。
【００９４】
実施例１１：頭頸部腫瘍の皮下ハムスター腫瘍モデルに対するＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
５〜６週齢の各シリアンハムスターの背部の右上部に１×１０7のＨＣＰＣ１細胞（シリアンハムスター頭頸部腫瘍細胞）を接種した。各グループの平均腫瘍体積が約３３０ｍｍ3であるとき、ＰＢＳ、Ａｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＡｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２をそれぞれ腫瘍内注射した。ウイルスベクターを５×１０7ＰＦＵの用量で１日１回、合計６回注射した。腫瘍増殖曲線および腫瘍フリーレートを観察し、その結果を図１５に示した。
【００９５】
図１５の結果は、Ａｄ−ＴＤ−ｎｓＩＬ−１２がコントロールウイルスベクターＡｄ−ＴＤ−ＬＵＣおよびＰＢＳよりも強い抗腫瘍効果を示したことを示す。
【００９６】
実施例１２：シリアンハムスターの腹膜播種ＰａＣａに対するＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２と、ＶＶ−ＴＫ−ＲＦＰおよびＶＶ−ＴＫ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
４〜５週齢の各シリアンハムスターの腹腔に１×１０7個のＳＨＰＣ６細胞を接種した。４日後、動物はグループごとに１０匹ずつ４つのグループに分けた。治療のために１日おきに計３回、５００μlのＰＢＳ、４×１０7ＰＦＵのＶＶ−ＴＫ−ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質を挿入。ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構築される。）、ＶＶ−ＴＫ−ＩＬ−１２（全長ヒトＩＬ−１２遺伝子を挿入。ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構築される。）またはＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図１６に示す。
【００９７】
図１６の結果は、ＶＶ−ＴＫ−ｎｓＩＬ−１２が、ＶＶ−ＴＫ−ＲＦＰおよびＶＶ−ＴＫ−ＩＬ−１２よりも優れた治療効果を有し、腫瘍を有する動物の生存時間を有意に延長することができたことを示す。
【００９８】
実施例１３：シリアンハムスターの腹膜播種ＰａＣａに対するＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２と、Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ＧＦＰおよびＡｄ１１−Ｔｅｌ−ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の比較。
４〜５週齢の各シリアンハムスターの腹腔に１×１０7個のＳＨＰＣ６細胞を接種した。４日後、動物はグループごとに１０匹ずつ４つのグループに分けた。治療のために１日おきに計３回、５００μlのＰＢＳ、１×１０9ＰＦＵのＡｄ１１−Ｔｅｌ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質を挿入。Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構築される。）、Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ＩＬ−１２（全長ヒトＩＬ−１２遺伝子を挿入。Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２の構築方法に従って構築される。）またはＡｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２を腹腔内注射した。動物の生存時間を観察し、その結果を図１７に示す。
【００９９】
図１７の結果は、Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ｎｓＩＬ−１２が、Ａｄ１１−Ｔｅｌ−ＧＦＰおよびＡｄ１１−Ｔｅｌ−ＩＬ−１２よりも優れた治療効果を有し、腫瘍を有する動物の生存期間を有意に延長することができたことを示す。
【０１００】
最後に、上記の実施形態は、本発明の技術的側面の単なる例示であり、限定するものではないことに留意すべきである。本発明を好ましい実施形態を参照して詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の技術的解決策は、技術的解決策の精神および範囲から逸脱することなく変更または同等に置き換えることができ、これらの変更の全ては、本発明の請求項の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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