(57)【要約】本発明は、ウイルス転写の制御に使用することができる組成物および方法を提供する。非活性化Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９等、触媒的に不活性なヌクレアーゼを使用して、ウイルス核酸内の制御エレメントを認識するガイドＲＮＡを設計することができる。ｄＣａｓ９は、ウイルスプロモーターに結合し転写を上方制御または下方制御する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ結合タンパク質として機能することができる。例えば、ウイルスプロモーター特異的ｇＲＮＡを有するｄＣａｓ９は、宿主細胞内のウイルスゲノム内のプロモーターにハイブリダイズし、例えば、転写機構のリクルートメントを立体的に遮断することにより、転写を阻害することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を処置するための組成物であって、
プログラム可能なヌクレアーゼの非切断型バリアントを含むポリペプチドと、
ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列を含む標的化オリゴと
をコードする核酸を含む、組成物。
【請求項２】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、Ｃａｓ９であり、前記標的化オリゴが、ガイドＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が前記ウイルスに感染した細胞に導入されると、
前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡが発現され、
該ポリペプチドが、該ガイドＲＮＡに結合して複合体を形成し、
該複合体が、前記標的化配列を介して前記ウイルスゲノムにおける前記標的にハイブリダイズする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複合体が、前記ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与える、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記複合体が、前記ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的化配列が、所定の判定基準に従って前記標的にマッチし、該所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記宿主ゲノムが、ヒトゲノムであり、前記標的化配列が、前記所定の判定基準に従って該ヒトゲノムのいかなる部分にもマッチしない、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ウイルスゲノムにおける前記標的が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；および該ＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；該ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーターからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、転写的抑制ドメインをさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記転写的抑制ドメインが、Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン；ＨＰ１αのクロモシャドウドメイン；およびＨｅｓ１のＷＲＰＷドメインからなる群から選択される１種を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記複合体が、宿主細胞内の転写を上方制御する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスゲノムが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルス、Ｂ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスおよびバンナウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ウイルス感染を処置するための組成物であって、
Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチドと、
ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化オリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
【請求項１４】
前記組成物が前記ウイルスに感染した細胞に導入されると、
前記ポリペプチドが、前記標的化オリゴヌクレオチドと複合体を形成し、
該複合体が、該標的化オリゴヌクレオチドを介して前記ウイルスゲノムにおける前記標的にハイブリダイズする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的化オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含み、リボ核タンパク質における前記ポリペプチドと複合体化される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記複合体が、前記ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与える、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスゲノムにおける前記標的が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；および該ＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；該ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーターからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ウイルス感染を処置するための組成物であって、
プログラム可能なヌクレアーゼの非切断型バリアントを含むポリペプチドをコードする５’キャップを含むｍＲＮＡと、
ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列を含む標的化オリゴと
を含む、組成物。
【請求項１９】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、Ｃａｓ９であり、前記標的化オリゴが、ガイドＲＮＡである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、ＮｇＡｇｏ、Ｃａｓ９、アルゴノート、Ｃａｓ９ホモログおよびＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が前記ウイルスに感染した細胞に導入されると、
前記ポリペプチドが発現され、
該ポリペプチドが、前記ＲＮＡに結合して複合体を形成し、
該複合体が、前記標的化配列を介して前記ウイルスゲノムにおける前記標的にハイブリダイズする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
複合体が、前記ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与える、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ウイルスゲノムにおける前記標的が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；該ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；および該ＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；該ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーターからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照によって組み込まれる、２０１５年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／２３４，３４５号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヌクレアーゼの非切断型（non-cutting）バリアントを含む組成物を使用したウイルス感染の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス感染症は、深刻な医学的問題である。例えば、ヘルペスは、広範なヒト病原体であり、９０％超の成人が感染している。ひとたび感染すると、潜伏により、症状を発現しない場合であっても、宿主はヘルペスウイルスを無期限に保有する。同様に、ヒトパピローマウイルスまたはＨＰＶは、ヒト集団における一般的なウイルスであり、７５％超の人々が感染する。特に大きい問題は、ウイルス感染症ががんを引き起こす場合があることである。例えば、宿主ＤＮＡへのＨＰＶの組み込みは、がん、具体的には、子宮頸がんをもたらすことが公知である。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、伝染性単核球症（腺熱（glandular  fever））の原因となるのみならず、ホジキンリンパ腫およびバーキットリンパ腫等、がんとも関連する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ウイルスタンパク質を標的とする薬物を開発する試みがなされているが、このような試みは全面的に成功したとは言えない。例えば、ウイルスが、そのタンパク質を活発に発現しない潜伏状態にある場合、標的とするものが存在しない。その上、ウイルス感染が宿主細胞機能に干渉する場合、ウイルス感染を根絶するいかなる試みも最善ではない。例えば、ウイルス複製が宿主全身の細胞におけるゲノム複製に干渉する場合、ウイルス複製を防止する酵素は役に立たない。
【０００５】
本発明は、ウイルス感染症を処置するための組成物および方法を提供する。本発明は、ウイルス核酸に結合し、ウイルス制御機能に干渉する非切断型エンドヌクレアーゼを提供する。本発明の好ましい組成物は、Ｃａｓ９等、プログラム可能なヌクレアーゼの非切断型バリアントを含む。Ｃａｓ９は、触媒的に非活性化されたＣａｓ９またはｄＣａｓ９と呼ばれることもあり、ウイルスプロモーターまたは転写もしくは翻訳に関与する他の制御エレメントを特異的に標的とする。標的化は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）等、標的化オリゴヌクレオチドの使用により達成される。標的化オリゴヌクレオチドは、ウイルス核酸内の制御エレメントを認識し、標的化されたウイルスエレメントへとｄＣａｓ９をガイドするように設計することができる。
【０００６】
ｇＲＮＡにより、プログラム可能なヌクレアーゼは、配列特異的様式で標的に結合し、転写を上方制御または下方制御する。例えば、ウイルスプロモーター特異的ｇＲＮＡを有するｄＣａｓ９は、宿主細胞におけるウイルスゲノム内のプロモーターにハイブリダイズし、例えば、転写機構のリクルートメントを立体的に遮断することにより、転写を阻害することができる。その上またはそれに代えて、ｄＣａｓ９は、別の転写的抑制（transcriptionally-repressive）タンパク質またはドメインに連結されてよい。ウイルスゲノム内において、複数の標的がそれぞれ独立して、転写抑制のために標的とされてよい。
【０００７】
本発明の組成物の好ましい使用は、転写を阻害し、これにより、ウイルスタンパク質の発現を防止することである。これは、感染の拡散を防止することができる、または拡散を遅くすることができる一方、他のウイルス処置は、ウイルスを根絶するように働く。本発明の組成物は、触媒的に不活性化され、ウイルス標的を特異的に標的とする、プログラム可能なヌクレアーゼを含む。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくは修飾されたＣａｓ９またはＣｐｆ１もしくは修飾されたＣｐｆ１、Ｃａｓ９ホモログまたはｈｉ−ｆｉ  Ｃａｓ９等、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ）であってよい。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮまたは修飾されたＴＡＬＥＮであってよい。ある特定の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）またはＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ））であってよい。
【０００８】
特異的ｇＲＮＡの提供により、ｄＣａｓ９を使用して、独立してまたは同時に種々の標的の転写を抑制することができる。よって、本発明の組成物は、ｄＣａｓ９（またはｄＣａｓ９をコードする核酸）と共に、それぞれウイルスゲノム内の特異的プロモーターを標的とする１つまたは複数種のｇＲＮＡを含むことができる。
【０００９】
その上またはそれに代えて、本発明の組成物を使用して、転写を上方制御することができる。例えば、ｄＣａｓ９は、転写の上方制御に役立つ転写活性化ドメイン（例えば、転写因子をリクルートする）に連結されてよい。本発明の組成物は、抗ウイルス剤の発現に寄与し得るため、転写の上方制御は、抗ウイルス剤がプラスミド内にコードされて提供される場合に有用となり得る。プラスミドにおける遺伝子が、処置されているウイルスのプロモーターの制御下にある場合、本発明に係るタンパク質を含むことにより、ウイルス活性が抗ウイルス治療薬の発現を刺激する傾向がある、正のフィードバックサイクルを増大し得る。ウイルス遺伝子の転写を抑制することにより、または抗ウイルス治療薬の転写を上方制御することにより、本発明の組成物は、ウイルス感染症を処置するための価値があり有効な方法を提供することができる。
【００１０】
ある特定の態様では、本発明は、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアント（ｄＣａｓ９）と、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列とをコードする核酸を含むベクターを含む。２。ある特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含むことができる。ｄＣａｓ９は、標的化配列を介してウイルスゲノムにおける標的に結合し、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与える。一部の実施形態では、複合体は、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する。
【００１１】
所定の判定基準に従って標的にマッチし、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない標的化配列を使用することができる。所定の判定基準は、２０ヌクレオチドストレッチ内で少なくとも６０％相補的であることと、２０ヌクレオチドストレッチに隣接した（ａｄｊａｃｅｎｔ）プロトスペーサー隣接モチーフの存在とを含むことができる。一部の実施形態では、宿主ゲノムは、ヒトゲノムであり、標的化配列は、所定の判定基準に従ってヒトゲノムのいかなる部分にもマッチしない。
【００１２】
好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒト宿主に潜伏感染することができる。適した標的は、次のものを含む：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；およびＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーター。
【００１３】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、転写的抑制ドメインをさらに含む。転写的抑制ドメインは、例えば、次のうち１つまたは複数を含むことができる：Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン；ＨＰ１αのクロモシャドウドメイン；およびＨｅｓ１のＷＲＰＷドメイン。
【００１４】
組成物は、ヒト皮膚への局所適用に適するように、キャリア内に提供されてよい。一部の実施形態では、核酸は、キャリアによってヒト皮膚へと運搬および送達されるプラスミド内に存在する。
【００１５】
例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルス、Ｂ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症（sever）急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリト（guanarito）ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモ（metapnemo）ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスまたはバンナ（banna）ウイルス等、任意の適したウイルスが標的とされてよい。
【００１６】
一部の態様では、本発明は、ウイルス感染を処置するための方法を提供する。本方法は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチドと、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な部分を含むＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物を宿主細胞に導入するステップを含む。ある特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含むことができる。ポリペプチドは、ＲＮＡに結合して複合体を形成し、複合体は、ＲＮＡ内の標的化配列を介してウイルスゲノムにおける標的にハイブリダイズする。複合体は、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する。好ましくは、ウイルス感染は、潜伏感染である。宿主細胞への組成物の導入は、ヒト患者内の潜伏感染の局部リザーバーへの組成物の送達を含むことができる。ウイルスゲノムにおける標的は、次のいずれかを含むことができる：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；およびＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；またはＨＰＶ後期プロモーター。ポリペプチドは、Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン；ＨＰ１αのクロモシャドウドメイン；またはＨｅｓ１のＷＲＰＷドメイン等、転写的抑制ドメインをさらに含むことができる。
【００１７】
一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞内で転写の上方制御を引き起こすための複合体を使用するステップを含む。例えば、ポリペプチド／ｇＲＮＡ複合体は、これらの構成成分のいずれか一方または両方をコードする核酸のコピーに結合し、それら自身のさらなる発現を上方制御することができる。よって、核酸がプラスミドの一部であり、ポリペプチドがＲＮＡに結合して複合体を形成する一部の実施形態では、複合体は、プラスミドにハイブリダイズして、プラスミドの少なくとも一部分の上方制御された転写を引き起こす。ある特定の実施形態では、宿主細胞内のプラスミドの初期転写は、上方制御された転写が続いて上方制御された転写を増加させる、正のフィードバックサイクルをもたらす。
【００１８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主内のｉｎ  ｓｉｔｕにあり、宿主は、ウイルス感染を有するヒト患者等、哺乳動物である。好ましくは、組成物は、宿主における組織への送達によってｉｎ  ｓｉｔｕで細胞に導入される。宿主細胞へ組成物を導入することは、宿主におけるウイルス感染の局部リザーバーへ非全身的に組成物を送達することを含むことができる。
【００１９】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルス、Ｂ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症（sever）急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモ（metapnemo）ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスまたはバンナウイルスのゲノム等、任意のウイルスゲノムが標的とされてもよい。
【００２０】
他の態様では、本発明は、ウイルスによる感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、次のものをコードする核酸を含む：Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチド；および核酸の一部分に相補的な標的化配列を含むＲＮＡ。核酸は、５’キャップを含むｍＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含むことができる。組成物が、ウイルスに感染した細胞に導入されると：ポリペプチドおよびＲＮＡが発現され；ポリペプチドが、ＲＮＡに結合して複合体を形成し；複合体が、核酸における標的にハイブリダイズし、核酸の転写に影響を与える。核酸は、プラスミドの一部となることができ、プラスミドへの複合体のハイブリダイゼーションは、プラスミドの少なくとも一部分の上方制御された転写を引き起こす。感染細胞内の核酸の初期転写は、上方制御された転写が続いて上方制御された転写を増加させる、正のフィードバックサイクルをもたらすことができる。好ましくは、標的化配列は、所定の判定基準に従って標的にマッチし、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない。核酸は、ウイルスのゲノム由来のプロモーターをさらにコードすることができる。一部の実施形態では、複合体は、ウイルスに感染した宿主細胞内の転写を上方制御する。
【００２１】
ある特定の態様では、本発明は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチドと、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化オリゴヌクレオチドとを含む、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。ウイルスに感染した細胞に導入されると、ポリペプチドは、標的化オリゴヌクレオチドと複合体を形成し、複合体は、標的化オリゴヌクレオチドを介してウイルスゲノムにおける標的にハイブリダイズし、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与える。ある特定の実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを含み、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）におけるポリペプチドと複合体化する。好ましくは、複合体は、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する。一部の実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、所定の判定基準に従って標的にマッチし、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない部分を有するＲＮＡを含む（例えば、所定の判定基準は、２０ヌクレオチドストレッチ内で少なくとも６０％相補的であることと、２０ヌクレオチドストレッチに隣接したプロトスペーサー隣接モチーフの存在とを含むことができる）。ウイルスゲノムにおける適した標的は、次のうち１つまたは複数を含むことができる：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；およびＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーター。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン、ＨＰ１αのクロモシャドウドメインまたはＨｅｓ１のＷＲＰＷドメイン等、転写的抑制ドメインをさらに含む。組成物は、ヒト皮膚への局所適用に適するように、キャリア内に提供されてよい。
【００２２】
ある特定の態様では、本発明は、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアント（ｄＣａｓ９）を含むポリペプチドをコードする５’キャップを含むｍＲＮＡと、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列を含むＲＮＡとを含む。ある特定の実施形態では、組成物が、ウイルスに感染した細胞に導入されると、ポリペプチドが発現され；ポリペプチドが、ＲＮＡに結合して複合体を形成し；複合体が、標的化配列を介してウイルスゲノムにおける標的にハイブリダイズする。
【００２３】
ｄＣａｓ９は、標的化配列を介してウイルスゲノムにおける標的に結合し、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写に影響を与えることができる。一部の実施形態では、複合体は、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する。
【００２４】
所定の判定基準に従って標的にマッチし、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない標的化配列を使用することができる。所定の判定基準は、２０ヌクレオチドストレッチ内で少なくとも６０％相補的であることと、２０ヌクレオチドストレッチに隣接したプロトスペーサー隣接モチーフの存在とを含むことができる。一部の実施形態では、宿主ゲノムは、ヒトゲノムであり、標的化配列は、所定の判定基準に従ってヒトゲノムのいかなる部分にもマッチしない。
【００２５】
好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒト宿主に潜伏感染することができる。適した標的は、次のものを含む：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；およびＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーター。
【００２６】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、転写的抑制ドメインをさらに含む。転写的抑制ドメインは、例えば、次のうち１つまたは複数を含むことができる：Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン；ＨＰ１αのクロモシャドウドメイン；およびＨｅｓ１のＷＲＰＷドメイン。
【００２７】
組成物は、ヒト皮膚への局所適用に適するように、キャリア内に提供されてよい。一部の実施形態では、核酸は、キャリアによってヒト皮膚へと運搬および送達されるプラスミド内に存在する。
【００２８】
例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルス、Ｂ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症（sever）急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモ（metapnemo）ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスまたはバンナウイルス等、任意の適したウイルスが標的とされてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ウイルス感染を処置するための組成物を例示する図である。
【図２】図２は、ウイルスによる感染を処置するための組成物を示す。
【図３】図３は、本発明のある特定の実施形態に係るプラスミドを例示する図である。
【図４】図４は、ウイルス感染を処置するための方法を図示する。
【図５】図５は、ＥＢＶ参照ゲノムを図示する。
【図６】図６は、ＨＢＶゲノムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ウイルス遺伝子の転写を制御するための組成物および方法を提供し、このシステムおよび方法は、例えば、ウイルス感染の処置として、宿主細胞内で適用可能であり得る。本発明は、ウイルス核酸に特異的に結合し、ウイルス核酸の転写を制御し、宿主核酸の転写に影響を与えない部分を使用する。本発明の実施形態は、Ｃａｓ９等、触媒的に不活性なヌクレアーゼまたは触媒的に不活性なヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物を使用する。
【００３１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９をコードする遺伝子の触媒残基に点変異を導入することにより（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）、触媒的に不活性になるように操作することができる。このような変異は、Ｃａｓ９が、ｄｓＤＮＡを切断することができないようにするが、ＤＮＡを標的とする能力を保持する。この形態のタンパク質は、非活性化Ｃａｓ９の代わりに、ｄＣａｓ９と称されることがある。ｄＣａｓ９は、ウイルスゲノム内の標的に特異的なガイドＲＮＡと共に提供することができる。ｄＣａｓ９およびウイルスｇＲＮＡを含むシステムは、宿主内でのウイルス転写の制御をもたらす。触媒的に不活性なｄＣａｓ９の考察は、参照により組み込まれる、Gilbertら、２０１３年、CRISPR-mediated  modular  RNA-guided  regulation  of  transcription  in  eukaryotes、Cell  １５４巻（２号）：４４２〜５１頁に見出すことができる。本発明のシステムは、ウイルス遺伝物質の転写の抑制または活性化に使用することができる。
【００３２】
いずれか適した触媒的に不活性なヌクレアーゼを使用することができる。本発明の組成物および方法は、触媒的に不活性なＣａｓ９ホモログまたは触媒的に不活性化された別のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、ｎｇＡｇｏ、Ｃｐｆ１もしくはｈｉ−ｆｉ  Ｃａｓ９を使用することができる。ヌクレアーゼは、例えば、触媒的に不活性なバージョンのＣａｓ９、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃｐｆ１、ＮｇＡｇｏ、または無修飾バージョンに実質的に類似したアミノ酸配列を有する修飾されたプログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃｐｆ１もしくはＮｇＡｇｏの１つに少なくとも９０％類似したアミノ酸配列を有するプログラム可能なヌクレアーゼ、または他のいずれかのプログラム可能なヌクレアーゼであってよい。プログラム可能なヌクレアーゼは、細菌性の規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１等、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＰｆＡｇｏおよびＮｇＡｇｏも含む。プログラム可能なヌクレアーゼは一般に、酵素が、配列特異的様式で核酸を標的とするまたは核酸を切断するように、ヒトの寄与によって設計または操作され得るまたは設計または操作された核酸を切断する酵素を指す。
【００３３】
本発明のシステムを使用して、転写開始または伸長の遮断等の方法によりウイルス転写を抑制することができる。これは、それぞれプロモーター配列またはエクソン配列に相補的なｓｇＲＮＡを設計することにより達成される。エクソン配列についての転写抑制のレベルは、鎖特異的である。非鋳型鎖に相補的なｓｇＲＮＡは、鋳型鎖に相補的なｓｇＲＮＡと比較して転写をより強く抑制する。この効果を説明する仮説の１つは、ｓｇＲＮＡが、鋳型鎖のエクソンに相補的である場合に、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩの前にＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を巻き戻すヘリカーゼの活性に由来する。本発明のシステムは、エフェクタードメインを介して転写を抑制することもできる。ｄＣａｓ９へのリプレッサードメインの融合は、クロマチン凝縮を誘導することにより、転写がさらに抑制されることを可能にする。例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインをｄＣａｓ９に融合して、標的遺伝子の転写を抑制することができる。
【００３４】
本発明のシステムは、例えば、転写活性化因子をｄＣａｓ９に融合することにより、ウイルス転写またはベクター転写の活性化に使用することができる。例えば、転写活性化因子ＶＰ１６は、遺伝子発現を有意に増加させることができる。
【００３５】
本発明の組成物および方法を使用して、最大９９．９９％または１００％抑制によって標的遺伝子をサイレンシングすることが可能となる場合がある。制御は、ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡおよびＮＧＧ  ＰＡＭモチーフのワトソンクリック塩基対形成に基づくため、ゲノム内の標的化可能部位の選択は、簡単かつ柔軟である。ガイドＲＮＡのための慎重に定義されたプロトコールは、本明細書に提示されている。複数のガイドＲＮＡは、同時に複数の異なる遺伝子の調節に使用されてよいだけでなく（遺伝子標的化のマルチプレックス化）、同じ遺伝子標的の制御の効率の増強に使用されてもよい。外因的システムとして、ＣＲＩＳＰＲｉは、マイクロＲＮＡ発現または機能等の内因的機構と競合しない。さらに、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＤＮＡレベルで作用するため、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンス転写物、核局在化ＲＮＡおよびポリメラーゼＩＩＩ転写物等、転写物を標的とすることができる。最後に、ＣＲＩＳＰＲｉは、はるかに大きい標的化可能配列スペースを保有する；プロモーターおよび理論上はイントロンが標的とされ得る。背景については、参照により組み込まれる、Larsonら、２０１３年、CRISPR  interference  (CRISPRi)  for  sequence-specific  control  of  gene  expression、Nature  Protocols  ８巻（１１号）：２１８０〜９６頁を参照されたい。本明細書において使用する場合、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を有するｇＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の使用を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡとの使用のための単離されたｇＲＮＡが、ガイドＲＮＡの１種であるのと同様に、ｔｒａｃｒＲＮＡを有するｇＲＮＡや、ｓｇＲＮＡもそうである。標的にハイブリダイズするガイドＲＮＡの部分は、ガイドＲＮＡの標的化配列の一部である。
【００３６】
図１は、ウイルス感染を処置するための組成物１０１を例示する図である。組成物１０１は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチドと、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列を含むＲＮＡとをコードする核酸１０５を含む。
【００３７】
図２は、ここでは標的２２１とともに描写される、ウイルスによる感染を処置するための組成物２０１を示す。組成物２０１は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチド２２５と、核酸２２１の一部分に相補的な標的化配列２０９を含むＲＮＡ２０５とを含む。組成物２０１が、ウイルスに感染した細胞に導入されると、ポリペプチド２２５は最終的に、ＲＮＡ２０５に結合され、核酸における標的にハイブリダイズし、核酸２２１の転写に影響を与える。
【００３８】
図２は、組成物１０１がウイルスに感染した細胞に導入されたときの、組成物１０１の作用を例示する図である。細胞内で、ポリペプチド２２５およびＲＮＡ２０５が発現される。ポリペプチド２２５は、ＲＮＡ２０５に結合して複合体２０１を形成し、複合体２０１は、標的化配列２０９を介してウイルスゲノム２２１における標的にハイブリダイズする。複合体２０１は、ウイルスゲノム２２１の少なくとも一部分の転写に影響を与える。一部の実施形態では、複合体２０１は、ウイルスゲノム２２１の少なくとも一部分の転写を阻害する。
【００３９】
本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、いずれか適したウイルス核酸の転写を制御することが可能となり得る。本発明の組成物は、好ましくは、潜伏ウイルス感染症の処置に用いられる。潜伏ウイルス感染症は、抗ウイルス薬によって標的化され得るタンパク質を発現しない傾向があるため、一部の抗ウイルス薬は、有効でない場合がある。しかし、本発明の組成物および方法を使用すると、標的は実際に核酸配列であり、よって、潜伏ウイルス感染が標的とされ得る。例えば、ウイルス複製起点（original）に結合するｇＲＮＡを設計し、ｄＣａｓ９（またはｄＣａｓ９の遺伝子）を細胞に配置することができる。ｇＲＮＡによって、ｄＣａｓ９は、ウイルス起点（origin）に結合し、いかなる転写または複製も阻害する。よって、潜伏感染は、再活性化する機会がない。ｄＣａｓ９による転写抑止は、ウイルス遺伝物質の消化に使用されるＣａｓ９等、他の抗ウイルス処置と組み合わせると非常に有効となり得る。ｄＣａｓ９は、ウイルスが転写されることを防止することができ、Ｃａｓ９に、ウイルスゲノムを完全に消化するための時間および機会を与える。
【００４０】
ガイドＲＮＡ２０５は、所定の判定基準に従って標的にマッチし、好ましくは、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない、標的化配列２０９を含む。よって、標的化配列２０９は、その設計により、ウイルス核酸の一部分に特異的である。この同じ配列は、好ましくは、宿主ゲノムに出現しない。したがって、宿主遺伝物質に干渉することなく、ウイルス核酸転写を制御することができる。本発明に従った他のシステムが使用される場合、システムが、宿主ゲノムに干渉することなく、ウイルス配列における指定のフィーチャ（feature）または標的に結合し、その転写を制御するように、配列を選ぶことが好ましい。好ましくは、標的化ポリペプチドは、ウイルス配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、ＮＧＧ（式中、Ｎはいずれかのヌクレオチドである））の隣のヌクレオチドストリングに対応する。好ましくは、宿主ゲノムは、（１）所定の類似性判定基準に従ってヌクレオチドストリングにマッチし、（２）また、ＰＡＭに隣接する、いかなる領域も欠く。所定の類似性判定基準は、例えば、ＰＡＭに対し５’の２０ヌクレオチド内の少なくとも１２個のマッチするヌクレオチドの要件を含むことができ、ＰＡＭに対し５’の１０ヌクレオチド内の少なくとも７個のマッチするヌクレオチドの要件を含むこともできる。アノテートされたウイルスゲノム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ由来）を使用して、ウイルス配列のフィーチャを同定し、ウイルス配列の選択されたフィーチャ（例えば、ウイルス複製起点、末端反復配列、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列または反復性領域）内で、ウイルス配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にヌクレオチドストリングを見出すことができる。ウイルス配列およびアノテーションは、ゲノムデータベースから得ることができる。
【００４１】
複数の候補標的が、ウイルスゲノムに見出される場合、標的化ポリペプチドの鋳型となるべき配列の選択は、ガイド配列として標的化されるフィーチャに最も近いまたはその５’最末端における候補標的を好む場合がある。選択は、中間（例えば、４０％〜６０％）ＧＣ含量を有する配列を優先的に好む場合がある。エンドヌクレアーゼによるＲＮＡ指向性標的化に関する追加的な背景は、これらそれぞれの内容をあらゆる目的のため参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／００５０６９９号；米国特許出願公開第２０１４０３５６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３４２４５７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；および米国特許出願公開第２０１４／０２７３０３７号に考察されている。好ましい実施形態では、所定の類似性判定基準は、２０ヌクレオチドストレッチ内で少なくとも６０％相補的であることと、２０ヌクレオチドストレッチに隣接したプロトスペーサー隣接モチーフの存在とを含む。また、好ましくは、標的化配列２０９は、所定の判定基準に従ってヒトゲノムのいかなる部分にもマッチしない。標的化配列２０９を介して標的に適することができるウイルス配列２２１内の標的は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；およびＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーター；エプスタイン・バーウイルスゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域；ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＨＰＶ初期プロモーター；およびＨＰＶ後期プロモーターを含む。
【００４２】
組成物および方法を使用して、いずれか所望の様式で転写を制御することができる。例えば、第１の実施形態では、ｄＣａｓ９は、標的化配列２０９によってウイルス核酸を認識しこれに結合し、立体障害により転写を下方制御する。すなわち、ｄＣａｓ９ポリペプチド２２５は、転写機構のアセンブリーまたは操作の成功の防止に十分なほど大型でかさ高い。さらに、ポリペプチド２２５は、転写抑制に寄与する１つまたは複数の追加的なドメインまたは部分を含むことができる。
【００４３】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド２２５は、転写的抑制ドメインを含むまたはこれに連結される。例えば、転写的抑制ドメインは、Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン、ＨＰ１αのクロモシャドウドメインまたはＨｅｓ１のＷＲＰＷドメインのうち１つまたは複数を含むことができる。
【００４４】
Ｋｏｘ１のクルッペル関連ボックスドメイン（ＫＲＡＢ）は、およそ４００種のヒトジンクフィンガータンパク質に基づく転写因子（ＫＲＡＢジンクフィンガータンパク質）に存在する転写抑制ドメインのカテゴリーである。ＫＲＡＢドメインは典型的に、約７５アミノ酸残基からなる一方、最小抑制モジュールは、およそ４５アミノ酸残基である。参照により組み込まれる、Margolinら、１９９４年、Kruppel-associated  boxes  are  potent  transcriptional  repression  domains、PNAS  ９１巻（１０号）：４５０９〜１３頁を参照されたい。これは、２個の両親媒性ヘリックスを介したタンパク質−タンパク質相互作用により機能することが予測される。最も顕著な相互作用タンパク質は、ＴＲＩＭ２８と呼ばれており、ＳＭＰ１として初期に可視化され、ＫＡＰ１およびＴＩＦ１−ベータとしてクローニングされている。１０種を超える独立してコードされたＫＲＡＢドメインが、転写の有効なリプレッサーであると示され、この活性が、ドメインの共通の特性であることを示唆する。ＫＲＡＢドメインは、ＫＯＸ１／ＺＮＦ１０のジンクフィンガー領域に対し５’の６アミノ酸によって分けられたロイシン残基の周期的配置、ロイシンのコインドヘプタッド反復（coined  heptad  repeat）（ロイシンジッパーとしても公知）として初期に同定された。その後、このドメインは、Ｃ２Ｈ２−ジンクフィンガータンパク質クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）に関連して命名された。ＫＲＡＢドメインは、四足類生物由来のゲノムに限局される。ＫＲＡＢを含有するＣ２Ｈ２−ＺＮＦ遺伝子は、ジンクフィンガー遺伝子の最大サブファミリーを構成する。Ｃ２Ｈ２−ＺＮＦ遺伝子の半分超は、ヒトゲノムにおけるＫＲＡＢドメインに関連する。これらは、クラスター形成する傾向が高く、ヒトゲノムにおける大型のクラスターに見出される。ＫＲＡＢドメインは、ヒトゲノムにおける最も強いリプレッサーの１種を示す。ＫＲＡＢドメインが、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）に融合されると、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ融合タンパク質は、哺乳動物細胞において働く最初の操作された薬物誘導性リプレッサーとなった。ＫＲＡＢ−ＺＦＰをコードするヒト遺伝子は、ＫＯＸ１／ＺＮＦ１０、ＫＯＸ８／ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ９１、ＨＰＦ４、ＨＴＦ１０およびＨＴＦ３４を含む。
【００４５】
クロモシャドウドメインは、自己凝集するタンパク質ドメインであり、転写を抑制するクロマチン凝縮を引き起こす。宿主ゲノムに組み込まれたレトロウイルスを処置するときに、ポリペプチド２２５にクロモシャドウドメインを含むことが特に有益であり得る。よって、一部の実施形態では、本発明の組成物は、レトロウイルスゲノム（ＨＩＶ等）内の標的にマッチする標的化配列２０９と、ｄＣａｓ９および１つまたは複数のクロモシャドウドメインの配列を含むポリペプチド２２５とを含む。標的化配列２０９およびポリペプチド２２５は、宿主内で複合体２０１を形成し、標的化配列２０９を介して、組み込まれたレトロウイルス配列に結合する。クロモシャドウドメイン（複数可）は、凝集し、クロマチンを凝縮し、レトロウイルスの転写を抑制する。本実施形態のため、好ましくは、ポリペプチド２２５は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含むことが好ましい場合がある。よって、一部の実施形態では、本発明は、いずれか適した順序で、少なくとも１つのｄＣａｓ９、少なくとも１つのクロモシャドウドメインおよび少なくとも１つのＮＬＳを含むポリペプチドをコードするプラスミド等のベクターを提供する。ｇＲＮＡは、このベクターまたは別のベクターによってコードされてよい。
【００４６】
Ｈｅｓ１のＷＲＰＷドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘアリーおよびエンハンサーオブスプリット（Hairy  and  Enhancer  of  Split）タンパク質ならびに哺乳動物Ｈｅｓタンパク質を含む、ヘアリー（hairy）関連タンパク質のＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐモチーフを指す。これらのタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよび哺乳動物の両方における細胞運命決定を調節する塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写リプレッサーである。ヘアリー関連タンパク質は、リプレッサー特異的ｂＨＬＨ  ＤＮＡ結合ドメインおよびカルボキシル末端ＷＲＰＷ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ）モチーフの両方の存在によって定義される部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。このようなタンパク質は、標的遺伝子プロモーターにおけるＤＮＡ部位に結合することにより、また、活性化因子タンパク質に干渉しないことにより、リプレッサーとして作用し、このようなタンパク質が、したがって特異的抑制ドメインを有するべき活性リプレッサーであることを示す。参照により組み込まれる、Fisherら、１９９６年、Mol  Cell  Biol.１６巻：２６７０頁を参照されたい。
【００４７】
転写的抑制ドメインを有するｄＣａｓ９を増強することにより、本発明の組成物の転写制御を強化することができる。
【００４８】
本方法の組成物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含む、適したベクターを含むことができる（例えば、その内にパッケージングすることができる）。好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物は、プラスミドにおいてコードされたｄＣａｓ９および／またはｇＲＮＡを提供する。
【００４９】
図３は、核酸１０１を含有するプラスミド３０１を例示する図である。一部の実施形態では、核酸１０１は、プラスミド３０１内に存在し、上に記載または考察されているもののいずれか等、適したキャリアによってヒト皮膚に運搬および送達される。
【００５０】
その上またはそれに代えて、本発明の材料は、ウイルスベクター等のベクターを使用して提供することができる。一部の実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の使用を含む。ＡＡＶは、その低い免疫原性およびある特定の組織の優先的感染を可能にする範囲の血清型であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達に使用することができる。ＡＡＶベクターへのｄＣａｓ９の遺伝子およびｇＲＮＡの一体的なパッケージング（約４．２ｋｂ）が、ＡＡＶの低いパッケージング容量のため（約４．５ｋｂ）困難である可能性がある場合、そのｄＣａｓ９および１つまたは複数のｇＲＮＡは、別々のＡＡＶベクターにパッケージングし、全体的パッケージング容量を増加させることができる。ｄＣａｓ９遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＳｔ１Ｃａｓ９に基づく本来のタンパク質の「収縮した」バージョンおよび合理的に設計されたトランケート型Ｃａｓ９を含むことができる。
【００５１】
本発明の組成物は、皮下、経皮、水力学的遺伝子送達、局所または他のいずれか適した方法を含む、いずれか適した方法によって送達することができる。一部の実施形態では、組成物１０１は、キャリア内に提供され（is  provided  a  carrier）、ヒト皮膚への局所適用に適する。組成物は、宿主における組織への送達によって、ｉｎ  ｓｉｔｕで細胞に導入することができる。宿主細胞への組成物の導入は、例えば局所的に、宿主におけるウイルス感染の局部リザーバーへの非全身的な組成物の送達を含むことができる。
【００５２】
本発明の組成物は、医薬の局所、真皮、真皮内または経皮送達のために皮膚表面に適用され得るいずれか許容できる製剤等、許容できる局所キャリア中で、皮膚の患部に送達することができる。許容できる局所キャリアおよび本明細書に記載されている組成物の組合せは、本発明の局所製剤と名付けられる。本発明の局所製剤は、本技術分野の周知方法、例えば、REMINGTON:  THE  SCIENCE  AND  PRACTCE  OF  PHARMACY  １５７７〜１５９１、１６７２〜１６７３、８６６〜８８５頁（Alfonso  R.  Gennaro編）；Ghosh,  T.  K.；ら、TRANSDERMAL  AND  TOPICAL  DRUG  DELIVERY  SYSTEMS（１９９７年）等の標準的な文献によって提供されている方法に従って、局所キャリアと組成物とを混合することにより調製される。
【００５３】
本明細書に記載されている化合物の局所送達に有用な局所キャリアは、医薬品を局所に投与するための本技術分野で公知のいずれかのキャリアであってよく、例えば、多価アルコールまたは水等、許容できる溶媒；クリームまたはローション等、乳濁液（水中油型または油中水型エマルションのいずれか）；マイクロエマルション；ゲル；軟膏；リポソーム；粉末；および標準眼科用調製物等、水溶液または懸濁液が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の送達に使用される局所キャリアは、乳濁液、ゲルまたは軟膏である。クリームおよびローション等のエマルションは、本発明に従った使用に適した局所製剤である。エマルションは、少なくとも２つの非混和性相を含む分散系であり、一方の相は、直径０．１μｍ〜１００μｍの範囲の液滴として他方の相において分散される。乳化剤が典型的に含まれて、安定性を改善する。
【００５５】
別の実施形態では、局所キャリアは、ゲル、例えば、２相ゲルまたは単相ゲルである。ゲルは、液体によって相互浸透した小型の無機粒子または大型の有機分子の懸濁液からなる半固体の系である。ゲル塊は、小型の別個の無機粒子のネットワークを含む場合、２相ゲルとして分類される。単相ゲルは、分散した高分子および液体の間に明らかな境界が存在しないように、液体全体に均一に分布した有機高分子からなる。本発明における使用に適したゲルは、REMINGTON:  THE  SCIENCE  AND  PRACTICE  OF  PHARMACY  １５１７〜１５１８頁（Alfonso  R.  Gennaro編、第１９版、１９９５年）に開示されている。本発明における使用に適した他のゲルは、米国特許第６，３８７，３８３号（２００２年５月１４日に発行）；同第６，５１７，８４７号（２００３年２月１１日に発行）；および同第６，４６８，９８９号（２００２年１０月２２日に発行）に開示されている。使用することができるポリマー増粘剤（ゲル化剤）は、化粧品および医薬品産業で頻繁に使用される親水性および水−アルコール性ゲル化剤等、当業者に公知のものを含む。好ましくは、ゲル化剤は、組成物の約０．２重量％〜約４重量％の間を構成する。剤は、カルボマーという採用された一般名を与えられた、架橋アクリル酸ポリマーであってよい。このようなポリマーは、水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは他のアミン塩基等の苛性材料による中和後に、清澄なまたは僅かに濁ったゲルを形成する。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、局所キャリアは、軟膏である。軟膏は、あるとしても殆ど水を含有しない油性半固体である。好ましくは、軟膏は、ワックス、ワセリンまたはゲル化ミネラルオイル等、炭化水素系である。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の局所製剤において使用される局所キャリアは、水溶液または懸濁液、好ましくは、水溶液である。周知の眼科用溶液および懸濁液は、本発明における使用に適した局所キャリアである。本発明の水性局所製剤のｐＨは、好ましくは、約６〜約８の範囲内である。ｐＨを安定化するために、好ましくは、有効量のバッファが含まれる。一実施形態では、緩衝剤は、水性局所製剤中に、製剤の約０．０５〜約１重量パーセントの量で存在する。本発明の水性局所製剤に浸透圧調整剤が含まれてよい。適した浸透圧調整剤の例として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、デキストロース、グリセリンおよびプロピレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。等張化剤の量は、製剤の所望の特性に応じて広く変動し得る。一実施形態では、浸透圧調整剤は、製剤の約０．５〜約０．９重量パーセントの量で水性局所製剤に存在する。好ましくは、本発明の水性局所製剤は、０．０１５〜０．０２５Ｐａ．ｓ（約１５ｃｐｓ〜約２５ｃｐｓ）の範囲の粘度を有する。本発明の水溶液の粘度は、例えば、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロクサマー、カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられるがこれらに限定されない、粘度調整剤を添加することにより調整することができる。
【００５８】
本発明の局所製剤は、保護剤、吸着剤、粘滑剤、軟化剤、保存剤、抗酸化剤、保湿剤、緩衝剤、可溶化剤、皮膚浸透剤および界面活性剤等、許容できる賦形剤を含むことができる。適した保護剤および吸着剤として、散布剤（dusting  powder）、ステアリン酸亜鉛（zinc  sterate）、コロジオン、ジメチコン、シリコーン、炭酸亜鉛、アロエベラゲルおよび他のアロエ産物、ビタミンＥ油、アラントイン（allatoin）、グリセリン、ワセリンならびに酸化亜鉛が挙げられるがこれらに限定されない。適した粘滑剤として、ベンゾイン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。適した軟化剤として、動物性および植物性脂肪および油、ミリスチルアルコール、ミョウバンならびに酢酸アルミニウムが挙げられるがこれらに限定されない。適した保存剤として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド、塩化デカリニウムおよび塩化セチルピリジニウム等、四級アンモニウム化合物；硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀およびチメロサール等、水銀剤；アルコール剤、例えば、クロロブタノール、フェニルエチルアルコールおよびベンジルアルコール；抗菌エステル、例えば、パラヒドロキシ安息香酸のエステル；ならびにクロルヘキシジン、クロロクレゾール、安息香酸およびポリミキシン等、他の抗微生物剤が挙げられるがこれらに限定されない。二酸化塩素（ＣｌＯ２）、好ましくは、安定化された二酸化塩素は、本発明の局所製剤による使用に好ましい保存剤である。適した抗酸化剤として、アスコルビン酸およびそのエステル、亜硫酸水素ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、トコフェロール、ならびにＥＤＴＡおよびクエン酸等のキレート剤が挙げられるがこれらに限定されない。適した保湿剤として、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、尿素およびプロピレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。本発明における使用に適した緩衝剤として、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、リン酸バッファ、乳酸バッファおよびホウ酸バッファが挙げられるがこれらに限定されない。適した可溶化剤として、四級塩化アンモニウム、シクロデキストリン、安息香酸ベンジル、レシチンおよびポリソルベートが挙げられるがこれらに限定されない。適した皮膚浸透剤として、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、オクチルフェニルポリエチレングリコール、オレイン酸、ポリエチレングリコール４００、プロピレングリコール、Ｎ−デシルメチルスルホキシド、脂肪酸エステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸メチル、グリセロールモノオレエートおよびプロピレングリコールモノオレエート）；およびＮ−メチルピロリドンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
図４は、ウイルス感染を処置するための方法４０１を図示する。方法４０１は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチド２２５と、ウイルスゲノム２２１における標的に相補的な部分２０９を含むＲＮＡ２０５とをコードする核酸１０５を含む組成物１０１を宿主細胞に導入するステップを含む。好ましくは、ポリペプチド２２５は、ＲＮＡ２０５に結合して複合体２０１を形成し、複合体は、ＲＮＡ内の標的化配列２０９を介してウイルスゲノム２２１における標的にハイブリダイズする。好ましい実施形態では、宿主細胞は、宿主とｉｎ  ｓｉｔｕであり、宿主は、哺乳動物である。
【００６０】
好ましくは、標的化配列２０９は、指定の類似性判定基準に従って標的にマッチし、類似性判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない。例えば、類似性判定基準は、標的化配列および標的が、２０ヌクレオチドストレッチ内で少なくとも６０％相補的であり、ここで、標的は、２０ヌクレオチドストレッチに隣接してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有すると定めることができる。方法４０１は、ウイルスゲノムの少なくとも一部分の転写を阻害する複合体２０１をもたらすことができる。
【００６１】
方法４０１を使用して、いずれか適したウイルスゲノムが標的とされてよい。例えば、ウイルスゲノムは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルス、Ｂ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症（sever）急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス（human  metapnemovirus）、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスまたはバンナウイルス等のウイルスに由来することができる。好ましい実施形態では、ウイルスゲノム２２１は、ヒト宿主に潜伏感染することができるウイルスのゲノムである。ある特定の実施形態では、宿主細胞への組成物の導入は、ヒト患者内の潜伏感染の局部リザーバーへの組成物の送達を含む。ウイルスゲノムにおける標的は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムにおけるｐｒｅＣプロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ１プロモーター；ＨＢＶゲノムにおけるＳ２プロモーター；またはＨＢＶゲノムにおけるＸプロモーターなどの標的を含むことができる。好ましい実施形態では、ウイルスゲノムにおける標的は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムにおけるウイルスＣｐ（Ｃプロモーター）を含む。
【００６２】
図５は、ＥＢＶ参照ゲノムを図示する。ＥＢＶゲノムを標的化するガイドＲＮＡを設計するために、図５に描写されているもの等、ＥＢＶ参照ゲノムを参照することができる。ＥＢＮＡ１等、重要な領域を標的とするガイドＲＮＡを設計することができる。ＥＢＮＡ１は、遺伝子制御および潜伏ゲノム複製を含む多くのＥＢＶ機能に決定的である。ＥＢＮＡ１コード領域の両端のいずれか（either  of  both  ends）へのガイドＲＮＡの標的化は、転写に有意に干渉することができる。図５に示す通り、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ１、２および６は、反復領域に収まり、複合体２０１による結合の確率を増加させる。このような「構造的」標的は、ウイルス機能に重要なタンパク質の発現への系統的干渉を可能にする。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ウイルスゲノムにおける標的は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ゲノムにおけるマイナー転写物プロモーター領域、ＫＳＨＶゲノムにおけるメジャー転写物プロモーターまたはその両方を含む。一部の実施形態では、ウイルスゲノムにおける標的は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＥｇｒ−１プロモーター；ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ４プロモーター；およびＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０プロモーターのうち１つまたは複数を含む。他の実施形態では、ウイルスゲノムにおける標的は、次から選択される標的を含む：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびサイトメガロウイルス最初期プロモーター。実施形態では、ウイルスゲノムにおける標的は、ＨＰＶ初期プロモーターまたはＨＰＶ後期プロモーターを含む。
【００６４】
本発明の一部の実施形態では、本発明の組成物またはこれによって少なくとも一部がコードされる複合体は、例えば、ウイルスに感染した宿主の細胞内における、転写の上方制御に使用される。例えば、図１または図３に示す通り、組成物１０１は、Ｃａｓ９酵素の非切断型バリアントを含むポリペプチドと、ウイルスゲノムにおける標的に相補的な標的化配列を含むＲＮＡとをコードする核酸１０５を含む。核酸１０５が、プラスミド３０１の一部である場合、ある特定の実施形態では、複合体２０１は、プラスミド３０１にハイブリダイズし、プラスミド３０１の少なくとも一部分の上方制御された転写を引き起こす。感染細胞内の核酸１０５の初期転写には、上方制御された転写が続いて上方制御された転写を増加させる、正のフィードバックサイクルに寄与することが有用となり得る。好ましくは、標的化配列２０９は、所定の判定基準に従って標的にマッチし、所定の判定基準に従って宿主ゲノムのいかなる部分にもマッチしない。一部の実施形態では、核酸１０５（例えば、プラスミド３０１内の）は、ウイルスのゲノム由来のプロモーターをさらにコードする。このような手段により、複合体２２５は、ウイルスに感染した宿主細胞内の転写を上方制御する。
【００６５】
一部の態様および実施形態では、本発明は、複合体を形成するｄＣａｓ９およびｇＲＮＡを提供することにより、ｄＣａｓ９を使用して転写を制御するための組成物および方法を提供し、ここで、複合体は、宿主細胞内の転写を上方制御する。例えば、プラスミド３０１が提供されてよく、これによると、ポリペプチド２２５は、ＲＮＡ２０５に結合して複合体２０１を形成し、複合体２０１は、プラスミド３０１にハイブリダイズし、プラスミド３０１の少なくとも一部分の上方制御された転写を引き起こす。プラスミド３０１は、制御配列、転写因子もしくは他の酵素の遺伝子、他の遺伝子、またはこれらの組合せ等、図３内に描写されていない他のエレメントを含有することができる。一部の実施形態では、宿主細胞内のプラスミドの初期転写は、上方制御された転写が続いて上方制御された転写を増加させる、正のフィードバックサイクルをもたらす。
【００６６】
参照による組み込み
特許、特許出願、特許公開、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツ等、他の文書の参照および引用が、本開示を通してなされている。このような文書は全て、あらゆる目的のため、これによりこれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
均等物
本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な修飾は、本明細書に引用されている科学および特許文献の参照を含む本文書の全内容から当業者には明らかになる。本明細書における主題は、その様々な実施形態における本発明の実施に適応され得る重要な情報、例証およびガイダンス、ならびにこれらの均等物を含有する。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
ＥＢＶの標的化
バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、ＮａｍａｌｗａおよびＤＧ−７５は、ＡＴＣＣから得て、ＡＴＣＣの推奨に従って１０％ＦＢＳおよびＰＳＡを補充したＲＰＭＩ  １６４０において培養することができる。ヒト初代肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０は、Ｃｏｒｉｅｌｌから得て、１０％ＦＢＳおよびＰＳＡを補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２において培養することができる。
【００６９】
Ｕ６プロモーター駆動キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および遍在性プロモーター駆動ｄＣａｓ９からなるプラスミドを得ることができる。ｄＣａｓ９タンパク質の後に融合されたＥＧＦＰマーカーは、ｄＣａｓ９陽性細胞の選択を可能にする。修飾されたキメラガイドＲＮＡ設計は、より効率的なＰｏｌ−ＩＩＩ転写およびより安定的なステム−ループ構造を可能にし得る（Chen  Bら（２０１３年）Dynamic  Imaging  of  Genomic  Loci  in  Living  Human  Cells  by  an  Optimized  CRISPR/Cas  System.、Cell  １５５巻：１４７９〜１４９１頁）。
【００７０】
合成イントロンを有する修飾されたＣＭＶプロモーター（ｐｍａｘ）は、Ｌｏｎｚａ対照プラスミドｐｍａｘ−ＧＦＰからＰＣＲ増幅される。修飾されたガイドＲＮＡ  ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）は、ＩＤＴから注文される。ＥＢＶ複製起点ｏｒｉＰは、Ｂ９５−８形質転換リンパ芽球様細胞株ＧＭ１２８９１からＰＣＲ増幅される。標準クローニングプロトコールを使用して、ｐＸ４５８にｐｍａｘ、ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）およびｏｒｉＰをクローニングして、本来のＣＡＧプロモーター、ｓｇＲＮＡおよびｆ１起点を置き換えることができる。ＥＢＶ  ｓｇＲＮＡは、図５に示すＥＢＶゲノムに基づいて設計することができる。ＤＮＡオリゴは、ＩＤＴから注文される。ｐＸ４５８における本来のｓｇＲＮＡプレイスホルダーは、陰性対照として役立つ。
【００７１】
リンパ球は、リポフェクションに対し抵抗性であることが公知であり、したがって、Ｒａｊｉ細胞へのＤＮＡ送達にはヌクレオフェクション（nucleofection）を使用することができる。Ｌｏｎｚａ  ｐｍａｘプロモーターは、Ｒａｊｉ細胞内で強い発現を提供することから、ｄＣａｓ９発現の駆動に選ばれる。Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩは、ＤＮＡ送達に使用される。各１００ｕｌ反応において、５百万個のＲａｊｉまたはＤＧ−７５細胞が、５ｕｇのプラスミドをトランスフェクトされる。細胞株Ｋｉｔ  ＶおよびプログラムＭ−０１３が、Ｌｏｎｚａの推奨に従って使用される。ＩＭＲ−９０については、プログラムＴ−０３０またはＸ−００５により、１００ｕｌの溶液Ｖにおいて、百万個の細胞が、５ｕｇのプラスミドをトランスフェクトされる。
【００７２】
ＥＢＶゲノムを標的化するガイドＲＮＡを設計するために、系統Ｂ９５−８由来のＥＢＶ参照ゲノム（図５を参照）を使用することができる。異なる転写制御目的のための７個のガイドＲＮＡ設計による６個の領域を標的とすることができる。ＥＢＮＡ１は、遺伝子制御および潜伏ゲノム複製を含む多くのＥＢＶ機能に決定的である。ゲノムのこの全領域の転写に干渉するために、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５は、ＥＢＮＡ１コード領域の両端に標的化されてよい。ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ１、２および６は、反復領域に収まり、ｄＣａｓ９による結合の成功率が増加する。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、宿主細胞形質転換に必須であり、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７は、それぞれこれら２種のタンパク質の５’エクソンを標的とするように設計される。
【００７３】
（実施例２）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的化
本発明の方法および材料を使用して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のような潜伏ウイルスゲノム等、特異的遺伝物質の転写を制御することができる。本発明は、標的細胞（例えば、肝細胞）への核酸（ＤＮＡプラスミド等）の効率的かつ安全な送達をさらに提供する。一実施形態では、本発明の方法は、標的ＨＢＶへの水力学的遺伝子送達を使用する。
【００７４】
図６は、ＨＢＶゲノムを図示する。ＨＢＶゲノムのためのアノテーション（すなわち、ゲノムの重要なフィーチャを同定する）を受け、ウイルス複製起点、末端反復配列、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列および反復性領域等、このようなフィーチャの１つの内に位置するｄＣａｓ９による標的化のための候補を選ぶことが好ましい場合がある。
【００７５】
Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のプロトタイプメンバーであるＨＢＶは、４２ｎｍの部分的二本鎖ＤＮＡウイルスであり、２７ｎｍヌクレオカプシドコア（ＨＢｃＡｇ）で構成され、それは表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する外側のリポタンパク質コート（エンベロープとも呼ばれる）で囲まれている。ウイルスは、３〜３．３ｋｂのほどけた環状の部分的二重鎖ＤＮＡと、ビリオンＤＮＡ鋳型におけるギャップを修復することができ、逆転写酵素活性を有する、ビリオン関連ＤＮＡ依存性ポリメラーゼとを含有する、エンベロープに包まれたビリオンを含む。ＨＢＶは、ポリメラーゼ（Ｐ）、コアタンパク質（Ｃ）、表面タンパク質（Ｓ）およびＸタンパク質をコードする４個の重複ＯＲＦを有するおよそ３２００ｂｐの環状の部分的二本鎖ＤＮＡウイルスである。感染において、ウイルスヌクレオカプシドは、細胞に進入し、核に達し、そこで、ウイルスゲノムが送達される。核において、第２の鎖のＤＮＡ合成が完了され、両方の鎖におけるギャップが修復されて、３．５、２．４、２．１および０．７ｋｂ長の４種のウイルスＲＮＡの転写のための鋳型として役立つ、共有結合により閉環した環状ＤＮＡ分子を生じる。これらの転写物は、ポリアデニル化され、細胞質へと輸送され、そこで、ウイルスヌクレオカプシドおよびプレコア抗原（Ｃ、ｐｒｅ−Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）、エンベロープＬ（大）、Ｍ（中）、Ｓ（小））ならびに転写トランス活性化タンパク質（Ｘ）へと翻訳される。エンベロープタンパク質は、内在性膜タンパク質として小胞体（ＥＲ）の脂質膜へと自身を挿入する。ゲノム全体に及び、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）と命名された３．５ｋｂ種は、ＨＢＶポリメラーゼおよびタンパク質キナーゼと一緒にコア粒子へとパッケージングされ、そこで、マイナス鎖ＤＮＡの逆転写のための鋳型として役立つ。ＲＮＡからＤＮＡへの変換は、粒子の内側で行われる。
【００７６】
ＨＢＶゲノムにおける塩基対のナンバリングは、制限酵素ＥｃｏＲ１の切断部位またはＥｃｏＲ１部位が存在しない場合は相同部位に基づく。しかし、コアタンパク質の開始コドンまたはＲＮＡプレゲノムの最初の塩基に基づく、他のナンバリング方法も使用される。ＨＢＶゲノムにおける全塩基対が、ＨＢＶタンパク質の少なくとも１種のコードに関与する。しかし、ゲノムは、転写のレベルを制御し、ポリアデニル化の部位を決定し、さらにはヌクレオカプシドへのキャプシド形成のための特異的転写物をマークする遺伝子エレメントも含有する。４種のＯＲＦは、様々なインフレームの開始コドンの使用により、７種の異なるＨＢＶタンパク質の転写および翻訳をもたらす。例えば、リボソームが、ａｄｗゲノムの位置１５５のＡＴＧから翻訳を始める場合、小型のＢ型肝炎表面タンパク質が生成される。リボソームが、位置３２１１の上流ＡＴＧから始める場合、中型のＢ型肝炎表面タンパク質が生成され、タンパク質の５’端における５５アミノ酸の付加が生じる。
【００７７】
ＯＲＦ  Ｐは、ゲノムの大部分を占有し、Ｂ型肝炎ポリメラーゼタンパク質をコードする。ＯＲＦ  Ｓは、３種の表面タンパク質をコードする。ＯＲＦ  Ｃは、ｅ型肝炎およびコアタンパク質の両方をコードする。ＯＲＦ  Ｘは、Ｂ型肝炎Ｘタンパク質をコードする。ＨＢＶゲノムは、ウイルス複製が起こるために必要な多くの重要なプロモーターおよびシグナル領域を含有する。４種のＯＲＦの転写は、４種のプロモーターエレメント（ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、コアおよびＸ）および２種のエンハンサーエレメント（Ｅｎｈ  ＩおよびＥｎｈ  ＩＩ）によって制御される。あらゆるＨＢＶ転写物は、ゲノムにおける１９１６〜１９２１に及ぶ領域に配置された共通アデニル化シグナルを共有する。その結果生じる転写物は、３．５ヌクレオチド〜０．９ヌクレオチドの長さに及ぶ。コア／プレゲノムプロモーターの配置のため、ポリアデニル化部位は、差次的に利用される。カノニカル真核生物ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）とは対照的に、ポリアデニル化部位は、ヘキサヌクレオチド配列（ＴＡＴＡＡＡ）である。ＴＡＴＡＡＡは、非効率的に働くことが公知であり、ＨＢＶによる差次的使用に適する。
【００７８】
Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳと呼ばれる、ゲノムによってコードされる４種の公知遺伝子が存在する。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされ、その開始コドンは、プレコアタンパク質が産生される上流のインフレームのＡＵＧ開始コドンによって先行される。ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のタンパク分解性プロセシングによって産生される。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子Ｐによってコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、１個の長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３つのセクション、ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２およびＳに分ける３個のインフレームの開始（ＡＴＧ）コドンを含有する。複数の開始コドンのため、大、中および小（ｐｒｅ−Ｓ１＋ｐｒｅ−Ｓ２＋Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ２＋ＳまたはＳ）と呼ばれる３種の異なるサイズのポリペプチドが産生される。遺伝子Ｘによってコードされるタンパク質の機能は、十分に理解されてはいないが、肝臓がんの発症に関連する。これは、細胞成長を促進する遺伝子を刺激し、成長制御分子を不活性化する。
【００７９】
図６を参照すると、ＨＢＶは、ＰｒｅＳ１により宿主細胞に結合することにより、その感染サイクルを開始する。ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡ（「ｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１」）は、コード配列の５’端に配置される。ｄＣａｓ９による結合は、いずれかのポリメラーゼ活性に干渉する。ＨＢＶは、同一反復ＤＲ１およびＤＲ２を両端に、ＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを５’端に有する、長いＲＮＡの形態によりそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに変換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。ＲＴに対するＲＮＡによってガイドされる転写制御（「ｓｇＨＢＶ−ＲＴ」）は、ＲＴ転写または翻訳に干渉する。ガイドＲＮＡのｓｇＨｂｘおよびｓｇＣｏｒｅは、ＨｂｘおよびＨＢＶコアタンパク質ならびにＤＲ２−ＤＲ１−イプシロンを含有する全領域の転写に干渉することができる。組み合わせた４種のｓｇＲＮＡも、ＨＢＶゲノムの非転写をもたらすことができる。
【００８０】
ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体の逆転写によってそのゲノムを複製する。ＲＮＡ鋳型は先ず、一本鎖ＤＮＡ種（マイナス鎖ＤＮＡ）に変換され、これはその後、プラス鎖ＤＮＡ合成のための鋳型として使用される。ＨＢＶにおけるＤＮＡ合成は、プラス鎖ＤＮＡ合成のためのＲＮＡプライマーを使用し、これは主に、一本鎖ＤＮＡにおける内部配置において開始する。プライマーは、ＲＮＡ鋳型の５’端からの配列非依存性の大きさ（measurement）である、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断により生成される。この１８ヌクレオチドＲＮＡプライマーは、マイナス鎖ＤＮＡの３’端にアニールされ、プライマーの３’端は、１２ヌクレオチド直接反復配列、ＤＲ１内に配置される。プラス鎖ＤＮＡ合成の大部分は、プライマー転座（primer  translocation）の結果として、マイナス鎖ＤＮＡの他端の付近に配置された１２ヌクレオチド直接反復配列、ＤＲ２から開始する。プラス鎖プライミングの部位は、重要である。ｉｎ  ｓｉｔｕプライミングは、二重鎖直鎖状（ＤＬ）ＤＮＡゲノムをもたらす一方、ＤＲ２からのプライミングは、環状化と命名される、第２の鋳型スイッチの完了後にほどけた環状（ＲＣ）のＤＮＡゲノムの合成をもたらし得る。ヘパドナウイルスが、プラス鎖ＤＮＡ合成のプライミングのために、この加えられた複雑さを有する理由は依然として不明であるが、プライマー転座の機構は潜在的な治療標的である。ウイルス複製は、ヘパドナウイルス（ヒト病原体、Ｂ型肝炎ウイルスを含む）慢性キャリア状態の維持に必要であるため、複製を理解し、治療標的を明らかにすることは、キャリアにおける疾患を制限するために重大な意味を持つ。
【００８１】
一部の実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、ＰｒｅＳ１等、フィーチャ内のヌクレオチドストリングを見出すことにより、ＨＢＶゲノムを標的化する。ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡは、コード配列の５’端に配置される。よって、これは、コード配列における５’の最大の標的の１種を表し、ｄＣａｓ９が、いかなる転写も防止し得るため、標的化に優れた候補である。
【００８２】
ＨＢＶは、同一反復配列ＤＲ１およびＤＲ２を両端に、ＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを５’端に有する、長いＲＮＡの形態によりそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに変換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。ｄＣａｓ９が、ＲＴに対するＲＮＡによってガイドされる場合、ＲＴ転写／翻訳が干渉され得る。図６は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的化される、ＨＢＶゲノムにおける重要な部分を示す。細胞における転写制御を達成するため、ｄＣａｓ９およびガイドＲＮＡをコードする発現プラスミドは、目的の細胞（例えば、ＨＢＶ  ＤＮＡを保有する細胞）に送達される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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