(57)【要約】  本開示は、造血幹細胞または前駆細胞移植の分野に関する。より具体的には、内皮細胞との同時培養および同時投与によって、造血幹細胞または前駆細胞の増殖および生着を改善する方法、組成物およびキットを提供する。上記方法、組成物およびキットは、疾患または骨髄破壊的処置によって引き起こされる造血不全に関連する様々な障害の治療に有用である。
2018521074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象における幹細胞移植の方法であって、
（ａ）造血幹細胞または造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、ＨＳＰＣの増殖を可能にする条件下で、内皮細胞（ＥＣ）と、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比で第１の期間接触させることにより増殖させて、ＨＳＰＣおよびＥＣを増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比で含む増殖細胞集団を製造すること、および
（ｂ）工程（ａ）から得た増殖細胞集団を対象へ輸注すること、
を含み、増殖および輸注の工程を通してＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が維持される、方法。
【請求項２】
ＨＳＰＣが、造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＳＰＣが、対象と同種である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＨＳＰＣが、臍帯血ＨＳＰＣである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＳＰＣが、対象に関して自己由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＳＰＣが、遺伝子修飾定常状態骨髄由来ＨＳＰＣである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＣが、血管ＥＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＥＣが、増殖に先立って有糸分裂が不活性化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変ＥＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ６＋でもある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＣが、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＣが、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＣが、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ６ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が、プラスミドベクターの形態である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子が、改変ＥＣのゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＣが、分化したＥＣである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＣが、成体ＥＣである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＣが、胚ＥＣではない、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＣが、ヒトＥＣである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＣが、初代ＥＣである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＣが、ヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比が、少なくとも約２００：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
第１の期間が、約１日〜約２４日である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
増殖細胞集団が、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０６個〜約１．０×１０８個のＨＳＰＣを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比が、約１０：１〜約１：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が、増殖工程中のＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な接触、ならびに組み合わせた増殖工程および輸注工程中のＨＳＰＣおよびＥＣの連続的な近接を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
対象の循環血液中の血小板数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１５日〜約３５日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約５日〜約２０日後までに少なくとも約１００／μＬとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１０日〜約２５日後までに少なくとも約５００／μＬとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１０００日後に少なくとも約５００／μＬとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
対象が、骨髄破壊的処置によって引き起こされる造血不全を有するか、または、血液疾患、骨髄造血幹細胞移植を要する障害、感染による免疫不全、Ｔ細胞に影響を及ぼす感染性疾患、ＨＩＶ、遺伝性免疫不全、重症複合免疫不全、赤血球に影響を及ぼす遺伝性疾患、貧血およびファンコニ貧血から選択される障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
必要とする対象における幹細胞移植に使用するためのＨＳＰＣおよびＥＣを含む組成物であって、幹細胞移植が、請求項１に記載の方法を含む、組成物。
【請求項３５】
ＨＳＰＣが、造血幹細胞である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＨＳＰＣが、対象と同種である、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ＨＳＰＣが、臍帯血ＨＳＰＣである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
ＨＳＰＣが、対象に関して自己由来である、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３９】
ＨＳＰＣが、遺伝子修飾定常状態骨髄由来ＨＳＰＣである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ＥＣが、血管ＥＣである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
ＥＣが、増殖に先立って有糸分裂が不活性化されている、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４３】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変ＥＣである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４４】
ＥＣが、Ｅ４ＯＲＦ６＋でもある、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ＥＣが、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
ＥＣが、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
ＥＣが、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ６ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
核酸分子が、プラスミドベクターの形態で存在する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
核酸分子が、改変ＥＣのゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
ＥＣが、分化したＥＣである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５１】
ＥＣが、成体ＥＣである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５２】
ＥＣが、胚ＥＣではない、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５３】
ＥＣが、ヒトＥＣである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５４】
ＥＣが、初代ＥＣである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５５】
ＥＣが、ヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５６】
初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比が、少なくとも約２００：１である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５７】
第１の期間が、約１日〜約２４日である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５８】
増殖細胞集団が、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０６個〜約１．０×１０８個のＨＳＰＣ細胞を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項５９】
増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比が、約１０：１〜約１：１０である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６０】
ＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が、増殖工程中のＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な接触、ならびに組み合わせた増殖工程および輸注工程中のＨＳＰＣおよびＥＣの連続的な近接を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６１】
対象の循環血液中の血小板数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１５日〜約３５日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６２】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約５日〜約２０日後までに少なくとも約１００／μＬとなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６３】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１０日〜約２５日後までに少なくとも約５００／μＬとなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６４】
対象の循環血液中の好中球絶対数が、対象への増殖細胞集団輸注から約１０００日後に少なくとも約５００／μＬとなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６５】
対象が、骨髄破壊的処置によって引き起こされる造血不全を有するか、または、血液疾患、骨髄造血幹細胞移植を要する障害、感染による免疫不全、Ｔ細胞に影響を及ぼす感染性疾患、ＨＩＶ、遺伝性免疫不全、重症複合免疫不全、赤血球に影響を及ぼす遺伝性疾患、貧血およびファンコニ貧血から選択される障害を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項６６】
対象がヒトである、請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１９４，４６０号の優先権を主張し、該仮特許出願の内容は、参照によりその全体が本書に組み込まれる。
【０００２】
参照による組み込み
参照による組み込みが認められる管轄のためには、本開示で引用される参照文献は全て、それらの全体が参照により本書に組み込まれる。さらに、本書中で引用または言及する製品についての製造者の指示書またはカタログはいずれも、参照により本書に組み込まれる。参照により本書に組み込まれる文書、またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。
【０００３】
背景
分野
本教示は、改善された幹細胞療法のための方法および組成物に関し、特に、造血幹細胞および前駆細胞の増殖および生着、ならびに幹細胞移植レシピエントの造血系の免疫再構築を促進するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
緒言
造血幹細胞または前駆細胞移植（ＨＳＣＴ）は、多様な血液学的障害の治療の重要な構成要素である。概して、ＨＳＣＴには、自家移植および同種移植の２つの種類がある。自家移植においては、骨髄破壊的処置に続いて、レシピエント自身の細胞が輸注される。同種細胞移植では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性を最低限に抑え、合併症の低減をもたらす。同種移植においては、通常レシピエントのＭＨＣと適合するドナーを用いて、ドナー幹細胞の輸注がなされる。しかしながら、適合非血縁ドナー（ＭＵＤ）移植は依然、強い移植片対宿主反応と関連付けられ、したがって高い死亡率をもたらす。
【０００５】
造血幹細胞および／または前駆細胞（ＨＳＰＣ）の供給源には主に、骨髄、末梢血および臍帯血の３つがある。臍帯血（ＵＣＢ）は、血縁および非血縁同種造血幹細胞移植のための他の造血前駆細胞供給源（例えば、骨髄および動員処置された末梢血）に代わる、実用的な代替的供給源である。しかしながら、臍帯血は、容易に入手可能であり、移植片対宿主病のより低い発生率を示す一方で、いずれも免疫再構築の成功と臨床的意義にとって重要な多系列の細胞（multilineage cells）（例えば、好中球、血小板、赤血球）の生着が遅いという特徴を有する。したがって、臍帯血由来のＨＳＰＣを用いて血液学的障害を治療することは非常に有望であるものの、造血回復の遅いことが大きな障害となっており［Laughlin, et al., N. Eng. J. Med. 351: 22; 2265-2275 (2004)］、生着効率は未だ、骨髄または末梢血由来のＨＳＣを用いた場合よりも著しく低い［Rocha et al., N. Eng. J. Med. 351: 22; 2276-2285 (2004)］。
【０００６】
造血幹細胞は、サイトカインの混合物を含む特別な培地組成物中で増殖させることができる。幹細胞増殖技法は、米国特許第６，３２６，１９８号、米国特許第６，３３８，９４２号、米国特許第６，３３５，１９５号等により、当該技術分野で公知である。KobayashiらおよびButlerらは最近、プロ造血細胞（pro-hematopoietic）生存および増殖シグナルの発現を導くＡｋｔ／Ｍｔｏｒ経路を最小限に活性化するアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１遺伝子による形質導入によって初代ヒト内皮細胞（ＥＣ）から生成されるプロ造血細胞血管ニッチの生成について報告した［Kobayashi et al., Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010); Butler et al., Blood 120, 1344-1347 (2012)］。典型的なＨＳＰＣ／ＥＣ増殖手順では、６：１〜３：１の初期ＥＣ：ＨＳＰＣ比で、小さな細胞培養フラスコ中に堆積した単層のＥＣ上でＨＳＰＣを同時培養する。２４〜４８時間後にＨＳＰＣを採り、第２のフラスコ中のさらなる単層ＥＣ上で培養し、これを、必要数のＨＳＰＣが得られるまで繰り返す。しかしながら、かかるフラスコベースの増殖の１つの大きな欠点は、開放イベント（oven event）の数が多く（通常の手順で１８００にも登る）、そのため汚染の危険性が非常に高いことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣおよび他の造血要素の臨床上有用な増幅を可能にするインビトロの培養方法および系が、依然必要とされている。ヒトの治療において、例えば骨髄移植、輸注可能な血液構成成分または遺伝子療法として使用するために、ある骨髄要素を十分な量で供給するために、該要素の大量生産を可能とする系が必要とされている。本明細書中に記載する方法は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、当該技術分野におけるこの長年の必要性を解決し、少なくとも２５：１、５０：１、１００：１、または５００：１の、さらに好ましくは１０００：１、２０００：１または３０００：１もの高い初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比で、閉鎖系のバイオリアクター中でＨＳＰＣを内皮細胞と同時培養することによって、先例のないレベルのＨＳＰＣ増殖を提供するものである。重要なことに、ＨＳＰＣとＥＣとの間の相互作用は、増殖工程中に乱されることなく保たれ、それによりＨＳＰＣとＥＣとの間の連続的な細胞間コミュニケーションを維持し、増殖の効率および全体的な生産量を高めることができる。さらに、培養フラスコなどの開放的な細胞培養環境と比較して開放イベントの数が低減され、それにより汚染の危険性を大幅に低減することができる。
【０００９】
本明細書中に記載する方法に従って増殖されるＨＳＰＣは、特に、ＥＣとの組み合わせとしてＨＳＣＴレシピエントに投与される場合に、有益な薬理学的効果を有し、ここで、ＨＳＰＣとＥＣとの間で、連続的な相互作用が増殖時および投与時を通して維持される。この同種内皮細胞の、血液循環中および／または組織中の一過性の存在は、多系列の細胞の生着の向上、および生着の持続期間の延長、ならびに比較的迅速な初期生着（例えば好中球数によって測定される）などの、ＨＳＣＴの有益なインビボ結果を導く。本明細書中で初めて実証するように、このことは、内皮細胞が、ＨＳＣとの同時培養の前に照射され、複製することができない場合においても言えることである。
【００１０】
したがって、本発明の一側面は、必要とする対象における幹細胞移植の方法であって、（ａ）造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、ＨＳＰＣの増殖を可能にする条件下で、内皮細胞（ＥＣ）と、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比で第１の期間接触させることにより増殖させて、ＨＳＰＣおよびＥＣを増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比で含む増殖細胞集団を製造すること、および（ｂ）工程（ａ）から得た増殖細胞集団を対象へ輸注すること、を含み、増殖および輸注の工程を通してＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が維持される、方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる側面は、必要とする対象における幹細胞移植に使用するためのＨＳＰＣおよびＥＣを含む組成物であって、幹細胞移植が、本明細書中に記載する方法を含む、組成物に関する。好ましくは、本明細書中に記載し示すように、ＥＣは増殖工程および輸注工程にわたってＨＳＰＣと連続的に近接する。さらに好ましくは、ＥＣは、少なくとも増殖工程中に、ＨＳＰＣと連続的に接触する。
【００１２】
幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約２００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約３００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約４００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約５００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約６００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約７００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１０００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約２０００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約３０００：１である。
【００１３】
幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１０：１〜約１：１０である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１０：１〜約１：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約９：１〜約２：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約８：１〜約３：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約７：１〜約４：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約６：１〜約５：１である。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、本明細書中に記載する方法に従って、ＨＳＰＣおよび内皮細胞を、単離、増殖、保存および投与するためのキットまたは系に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の簡単な説明
図面は、単に説明のためのものであり、本教示の範囲の限定を意図するものではないことは、当業者に理解される。
【図１】Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣに対する放射線曝露の影響を示す位相差顕微鏡画像を示す。ＥＣを、標準的な培養条件下に採取して、Ｅ４ＯＲＦ１形質導入した。次に、細胞を２つのフラスコに分け入れ、１００％コンフルエントになるまでさらに培養した。一方の容器は未処理とし（左図）、他方の容器には、セシウム照射器により１５００ｃＧｙで照射した（右図）。位相差顕微鏡検査によって、２つのフラスコ間に差は検出されなかった。
【図２】１週間の培養期間にわたる、照射（下段）および非照射（上段）Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣの一連の位相差顕微鏡画像を示す。２つのフラスコの細胞を半コンフルエトになるまで培養し、その時点で、一方のフラスコ（下段）には、セシウム照射器を使用して１５００ｃＧｙで照射した。両フラスコをさらに１週間の培養に付し、照射の１日後、５日後および７日後に位相差顕微鏡画像を撮影した。
【図３】照射（下段）および非照射（上段）Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣを用いて同時培養したＨＳＰＣの位相差顕微鏡画像を示す。６ウェルプレート中で、臍帯血由来の精製ＨＳＰＣ（ＣＤ３４＋）を、非照射および１５００ｃＧｙ照射Ｅ４ＯＲＦ１  ＥＣのコンフルエントな単層と同時培養した。１１日間の細胞増殖および連続継代培養の最後に、元の培養ウェル（「マザーウェル」、左の列）と連続継代培養によって得た最終ウェルの１つ（「エンドウェル」、右の列）との両方の位相差顕微鏡画像を撮影した。
【図４】照射（下段）および非照射（上段）Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣとのＨＳＰＣ同時培養のフローサイトメトリーデータを示す。６ウェルプレート中で、臍帯血由来の精製ＨＳＰＣ（ＣＤ３４＋）を、照射または非照射Ｅ４ＯＲＦ１  ＥＣいずれかのコンフルエントな単層と同時培養した。１１日間の増殖の最後に、造血細胞をフローサイトメトリーによって分析した。左の列の図は、ＣＤ４５（汎造血細胞表面マーカー）の発現に関して染色された細胞の結果を示す。右の列の図は、ＣＤ３４（ＨＳＰＣ陽性マーカー）およびＣＤ３８（ＨＳＰＣ陰性マーカー）の発現に関して二重染色された細胞の結果を示す。
【図５】短期（左図）および長期（右図）のＨＳＰＣ−Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣ同時培養および生じたＥＣ減少を示す代表的な位相差顕微鏡画像を示す。６ウェルプレート中で、臍帯血由来の精製ＨＳＰＣ（ＣＤ３４＋）を、ＥＣのコンフルエントな単層と同時培養した。ＨＳＰＣ集団の増殖につれ、該非接着細胞は穏やかに離されて、より大きい新鮮なＥＣ層上に配置される。この「マザーウェル」と称される元のウェルに、さらなる培地を再供給する。全ての同時培養ウェルに対して、このプロセスをおよそ４８時間毎に繰り返す。新鮮なＥ４ＯＲＦ１  ＥＣ上で播種した同じ増殖ＨＳＰＣの１日だけの同時培養（左図）と比較して、７日間の同時培養の間にマザーウェル中のＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣは減少する（右図）。
【図６】連続的にＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣおよびＨＳＰＣを接触させた場合のバイオリアクター中における総造血細胞増殖の測定結果を、サイトカイン単独を用いて増殖させた場合、および不連続的にＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣおよびＨＳＰＣを接触させて増殖させた場合と比較して示す。臍帯血由来の精製ＨＳＰＣ（ＣＤ３４＋）を、フラスコ中でサイトカイン単独を用いて、フラスコ中でＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣの単層上で、またはＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣを予め導入した中空繊維バイオリアクター中で、増殖させた。フラスコ中でのサイトカイン単独を用いる増殖およびＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣ上の増殖においては、増殖中に細胞を濯いで再播種するために、培養プロセスを中断する必要があった。培養の６日目に、ＣＤ４５＋細胞集団の細胞の計数およびフローサイトメトリー計測を行った。
【図７】連続的にＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣおよびＨＳＰＣを接触させた場合のバイオリアクター中におけるＨＳＰＣ増殖のコロニー形成アッセイ測定結果を、サイトカイン単独を用いて増殖させた場合、および不連続的にＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣおよびＨＳＰＣを接触させて増殖させた場合と比較して示す。略号「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位である。複数の顕微鏡視野におけるコロニーの頻度を用いて外挿することにより、総増殖集団におけるＣＦＵの数を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
定義
本開示に関して、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は、特に別途定義されない限り、当業者に一般的に理解される意味を有しうる。したがって、下記用語は、下記意味を有することが意図される。
【００１７】
「同種」は、同じ種の成員から誘導されるか、同じ種の成員に由来するか、または同じ種の成員であることを指し、ここで、成員は、遺伝的関係があるか、または遺伝的関係はないが遺伝的に類似する。「同種移植」は、ドナーからレシピエントへの細胞または臓器の移動であって、レシピエントがドナーと同じ種であるものを指す。
【００１８】
「自家」は、その同じ対象もしくは患者にから誘導されるか、またはその同じ対象もしくは患者に由来することを指す。「自家移植」は、対象自身の細胞または臓器を収集し再移植することを指す。
【００１９】
「委任（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）骨髄系前駆細胞」または「骨髄系前駆細胞」または「ＭＰ」は、最終的に骨髄系列の最終分化細胞のいずれかになることが可能であるが、リンパ系列の細胞には通常分化しない、多能性または単能性の前駆細胞を指す。したがって、「骨髄系前駆細胞」は、骨髄系列における任意の前駆細胞を指す。骨髄系列の委任前駆細胞は、本明細書中で定義されるような寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰを包含し、また、単能性赤血球前駆細胞、巨核球前駆細胞、顆粒球前駆細胞およびマクロファージ前駆細胞をも包含する。骨髄系前駆細胞の異なる細胞集団は、それらの分化能、および細胞マーカーの特徴的なセットの存在によって、他の細胞と区別可能である。
【００２０】
「骨髄系共通前駆細胞」または「ＣＭＰ」は、顆粒球／単球（ＧＭＰ）前駆細胞および巨核球／赤血球（ＭＥＰ）前駆細胞を生じる能力により特徴付けられる細胞を指す。これらの前駆細胞は、自己再生能力は小さいかまたは無いが、骨髄系樹状、骨髄系赤血球、赤血球、巨核球、顆粒球／マクロファージ、顆粒球およびマクロファージ細胞を生じることが可能である。
【００２１】
本明細書中で使用する用語「連続的な相互作用」は、少なくとも、本明細書中に記載する１つまたは複数のプロセス工程中のＨＳＰＣのＥＣとの連続的な近接を指す。この文脈における「近接」は、同一の培地、例えば細胞培養培地、輸注培地、または増殖工程と輸注工程の間の任意の工程（例えば、増殖細胞集団の収集、または増殖細胞集団を含む医薬組成物の調製）に使用される任意の培地における、ＨＳＰＣおよびＥＣの組み合わされた存在を指す。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣおよびＥＣは、組み合わされた増殖工程および輸注工程中に、連続的に近接する。換言すると、ＨＳＰＣおよびＥＣは、増殖工程全体にわたって、かつ輸注工程が完了するまで、同じ培地中に同時に存在する。例えば、増殖工程中のどの時点でも、（例えばＨＳＰＣをさらなるＥＣと接触させるために）ＨＳＰＣが増殖培地から取り出される、ということがない。さらに、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する方法は、輸注工程に先立ち増殖ＨＳＰＣを含む増殖細胞集団から内皮細胞を除去する精製工程を含まない。本明細書中で使用する用語「連続的な相互作用」はまた、本明細書中に記載する１つまたは複数のプロセス工程中のＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な接触を指しうる。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣおよびＥＣは、増殖工程中に連続的に接触する。この文脈において、ＨＳＰＣと内皮細胞の間の「接触」という用語は、ＨＳＰＣとＥＣの間の距離が５００μｍ以下であるという距離関係にあることを指す。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の距離は、４００μｍ以下である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の距離は、３００μｍ以下である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の距離は、２００μｍ以下である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の距離は、増殖を行う容器の内部寸法未満であるか、またはそれに等しい。
【００２２】
「培養すること」は、様々な種類の培地上もしくは培地中での細胞または生物の繁殖を指す。「同時培養すること」は、様々な種類の培地上もしくは培地中での２つまたはそれ以上の異なる型の細胞または生物の繁殖を指し、例えば、幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣおよび内皮細胞が同時培養され得る。
【００２３】
「改変」という用語は、本明細書中で細胞に関して使用される場合、そこで記載される表現型（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋）を生じるように、またはそこで記載される核酸分子もしくはポリペプチドを発現するように、人間によって改変された細胞を指す。「改変細胞」という用語は、自然に存在する細胞を包含することを意図せず、その代わりに、例えば、組換え核酸分子を含む細胞、または別の方法で人工的に（例えば、遺伝子修飾によって）変更された細胞（この変更は、例えば、細胞が、変更されなければ発現しないポリペプチドを発現するように、または細胞が、未改変の内皮細胞で観察されるよりも実質的に高いレベルでポリペプチドを発現するように、なされる）を包含することが意図される。
【００２４】
細胞の文脈における「増殖」は、同一であるかまたは同一でない初期集団の細胞からの、１つまたは複数の特徴的な細胞型の増加を指す。増殖に使用される初期細胞は、増殖により生じる細胞と同じである必要はない。例えば、増殖した細胞は、初期集団の細胞の成長および分化によって生じるものであり得る。細胞の分化能を特徴付けるために用いられる限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）アッセイは、増殖という用語から除外される。
【００２５】
「遺伝子修飾（遺伝的修飾）」または「遺伝子修飾された」は、細胞の正常なヌクレオチドに対する任意の付加、欠失または破壊を指す。本発明の方法は、ＨＳＰＣまたは内皮細胞への外因性または外来遺伝子導入（または核酸配列導入）の任意の遺伝子修飾方法を包含することが意図される。「遺伝子修飾（遺伝的修飾）」という用語は、遺伝子デリバリービヒクルの使用を含み、形質導入（インビボまたはインビトロのいずれかでの、ウイルスによるレシピエントへの核酸導入）、トランスフェクション（単離核酸の細胞による取込み）、リポソームによる導入、および当該技術分野で周知の他の手段を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
「移植片対宿主病」または「ＧＶＨ」または「ＧＶＨＤ」は、異なるＭＨＣクラスのリンパ球が宿主に導入され、宿主に対する反応を起こすときに生じる細胞応答を指す。
【００２７】
「顆粒球／マクロファージ前駆細胞」または「ＧＭＰ」は、骨髄系共通前駆細胞に由来し、顆粒球およびマクロファージ細胞を生じる能力により特徴付けられるが、骨髄系列の赤血球細胞または巨核球は通常生じない細胞を指す。
【００２８】
「造血器疾患」は、造血器悪性腫瘍、異常ヘモグロビン症、および免疫不全を含むが、これらに限定されない、任意の血液障害を指す。
【００２９】
「造血幹細胞または前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」は、本明細書中で定義するようなＨＳＣ、ならびに造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能である多能性非自己再生前駆細胞、および造血系のある特定の細胞型へ分化することが可能な寡能性および単能性前駆細胞を包含する。ＨＳＰＣは、本明細書中で定義するようなＣＭＰ、ＭＰ、ＭＥＰ、およびＧＭＰを含む。
【００３０】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球樹状細胞、骨髄系樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球細胞を含む造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能な、クローン原性の自己再生多能性細胞を指す。造血系の他の細胞と同様に、ＨＳＣは、通常、細胞マーカーの特徴的なセットの存在によって規定される。
【００３１】
「単離された」は、生成物、化合物または組成物が、天然におけるか合成的にもたらされるかに関わらずその自然に生じる状態において伴う少なくとも１つの他の生成物、化合物または組成物から分離されていることを指す。
【００３２】
「マーカー表現型決定」は、細胞の表現型（例えば、分化状態および／または細胞型）を決定するための、その細胞上のマーカーまたは抗原の同定を指す。これは、細胞上に存在する抗原を認識する抗体を使用する免疫表現型決定によって行われ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよいが、一般的には他の細胞マーカーと最小の交差反応性を有するように選択される。ある細胞分化または細胞表面マーカーはその細胞が由来する動物種に特有であり、別の細胞マーカーは種間で共通であり得ることを理解すべきである。種間で等価な細胞型を規定するそのようなマーカーには、種が構造（例えば、アミノ酸配列）において相異しても、同一マーカーの同定がなされる。細胞マーカーは、細胞表面分子［ある状況下では、細胞分化（ＣＤ）マーカーとも称される］、および遺伝子発現マーカーを包含する。遺伝子発現マーカーは、細胞型または分化状態を示す発現された遺伝子のセットである。遺伝子発現プロフィールは、細胞表面マーカーを反映し得るが、一部として非細胞表面分子を含んでもよい。
【００３３】
「巨核球／赤血球前駆細胞」または「ＭＥＰ」は、骨髄系共通前駆細胞に由来し、赤血球細胞および巨核球を生じる能力により特徴付けられるが、顆粒球、マクロファージまたは骨髄系樹状細胞を通常生じない細胞を指す。
【００３４】
「骨髄破壊的」または「骨髄破壊」は、通常細胞毒性剤または放射線への曝露による、造血系の機能障害または破壊を指す。骨髄破壊は、造血系を破壊する高用量の細胞毒性剤または全身照射によってもたらされる完全な骨髄破壊を包含する。骨髄破壊はまた、非骨髄破壊的なコンディショニングによって引き起こされる、完全に満たない骨髄破壊の状態をも包含する。したがって、非骨髄破壊的コンディショニングは、対象の造血系を完全には破壊しない処置を指す。
【００３５】
「自己再生」は、分裂して親細胞と同一の（例えば、自己再生）特性を有する少なくとも１つの娘細胞を生成する、細胞の能力を指す。別の娘細胞は、特定の分化経路に進むものであり得る。例えば、自己再生造血幹細胞は、分裂して、娘幹細胞、および骨髄系またはリンパ系経路の分化に向かう別の娘細胞を形成する。委任前駆細胞は通常、自己再生能力を失っており、細胞分裂により、より分化の進んだ（即ち、限定された）表現型を示す２つの娘細胞を生成する。
【００３６】
「分別」は、それが細胞に関する場合、マーカーの物理学的特性または存在に基づいて細胞を分離すること（例えば、側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）を用いる分別、または標識抗体を使用する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ））、または細胞マーカーの存在に基づいて細胞を解析すること、例えば分離を行わないＦＡＣＳを指す。
【００３７】
「幹細胞」は、筋、上皮、神経および骨幹細胞などの、様々な細胞型の幹細胞を指す。本発明は、特にＨＳＰＣに関する。
【００３８】
「対象」または「患者」は、互換的に使用され、特に示されている場合を除いて、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよび他の哺乳動物種などの哺乳動物を指す。
【００３９】
「実質的に純粋な細胞集団」は、総細胞集団を構成する細胞のうち、ある特定の細胞マーカー特性および分化能を有する細胞の集団の占める割合が、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％であることを指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」は、細胞集団において、指定のアッセイ条件下に特定のマーカー特性および分化能を示さない細胞の占める割合が、約５０％よりも少ない、好ましくは約２０〜２５％よりも少ない、より好ましくは約１０〜１５％よりも少ない、最も好ましくは約５％よりも少ないことを指す。
【００４０】
「治療用遺伝子」は、遺伝子全体、または遺伝子の機能的に活性な断片を指す。治療用遺伝子は、内因性遺伝子の欠陥または欠損によって起こる患者における欠乏を補うことが可能であり得る。さらに、治療用遺伝子は、感染性因子の産生または機能に拮抗し、病理学的プロセスに拮抗し、宿主の遺伝子構成を改善し、生着を促進し、または幹細胞の治療効果を高めるものであり得る。
【００４１】
「異種」は、異なる種、例えば、ヒトと齧歯類、ヒトとブタ、ヒトとチンパンジー等の成員から誘導されるか、それらの成員に由来するか、またはそれらの成員であることを指す。「異種移植」は、ドナーからレシピエントへの細胞または臓器の導入において、レシピエントがドナーとは異なる種であることを指す。
【００４２】
造血幹細胞または前駆細胞の増殖
本開示は、ＨＳＰＣ生着を促進するための方法、組成物、および系またはキットについて記載する。一側面においては、必要とする患者においてＨＳＰＣの生着を向上する方法であって、ＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用を維持しながら、ＨＳＰＣをＥＣと同時培養することおよび同時輸注することを含む方法を提供する。本明細書において初めて実証するように、増殖および輸注の工程全体を通してＨＳＰＣとＥＣの間で連続的な相互作用を維持することにより、増殖の効率、および得られた増殖ＨＳＰＣの生着を向上し、それにより、免疫再構築の速度および完全性を改善し、したがってＨＳＰＣ移植を受ける移植患者の生存を改善する。
【００４３】
造血幹細胞は、自己再生が可能な多能性幹細胞であり、許容条件下で造血系のあらゆる種類の細胞を生じる能力により特徴付けられる。ＨＳＣ自己再生とは、ＨＳＣ細胞が分裂して、同じ自己再生および分化能を有する少なくとも１つの娘細胞を産生する（即ち、細胞分裂によりさらなるＨＳＣを生じる）能力を指す。自己再生は、造血系の補充のための未分化幹細胞の継続的な供給源を提供する。ＨＳＣを同定するのに有用なマーカー表現型は、当該技術分野で公知のものでありうる。ヒトＨＳＣの場合、細胞マーカー表現型は好ましくは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）＋Ｌｉｎ−を含む。マウスＨＳＣの場合、例示的な細胞マーカー表現型は、Ｓｃａ−１＋ＣＤ９０＋［例えば、Spangrude, G. J. et al., Science 1:661-673 (1988)を参照］、またはｃ−ｋｉｔ＋ＴｈｙｌｏＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋［例えば、Uchida, N. et al., J. Clin. Invest. 101(5):961-966 (1998)を参照］である。アルデヒド脱水素酵素［Storms et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 96:9118-23 (1999)を参照］、ＡＣ１３３［Yin et al., Blood 90:5002-12 (1997)を参照］、およびＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）［Kiel Cell 2005, 121(7) 1109-21を参照］などの他のＨＳＣマーカーも有用でありうる。
【００４４】
ＨＳＣは、骨髄、末梢血、臍帯血、ならびに造血および骨髄前駆細胞を含むことが知られる他の供給源（肝臓、特に胎児肝臓を包含する）を包含する様々な供給源から得ることができる。末梢血および臍帯血は、ＨＳＣの豊富な供給源である。細胞を得るために、当該技術分野において知られ、一般的に実施される方法を用いる。例えば、骨髄細胞を調製する方法は、Sutherland et al., Bone Marrow Processing and Purging: A Practical Guide (Gee, A. P. ed.), CRC Press Inc. (1991)に記載されている。ＨＳＣはまた、胚幹細胞［Thomson et al., Science 282:1145 (1998)］および生殖細胞［Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726 (1998)］などの始原幹細胞供給源から、適切な増殖および分化技法を用いて誘導することもできる。
【００４５】
ＨＳＣ細胞は、本明細書中で一般的に記載するように、造血系を有する任意の動物種に由来する。好ましくは、適切な動物は、例として、齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類（例えば、ヒト）等を包含するがそれらに限定されない哺乳動物である。
【００４６】
本発明の一側面は、必要とする対象における幹細胞移植の方法であって、（ａ）造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、ＨＳＰＣの増殖を可能にする条件下で、内皮細胞（ＥＣ）と、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比で第１の期間接触させることにより増殖させて、ＨＳＰＣおよびＥＣを増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比で含む増殖細胞集団を製造すること、および（ｂ）工程（ａ）から得た増殖細胞集団を対象へ輸注すること、を含み、増殖および輸注の工程を通してＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が維持される、方法に関する。
【００４７】
本発明のさらなる側面は、必要とする対象における幹細胞移植に使用するためのＨＳＰＣおよびＥＣを含む組成物であって、幹細胞移植が、
（ａ）ＨＳＰＣを、ＨＳＰＣの増殖を可能にする条件下で、内皮細胞（ＥＣ）と、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比で第１の期間接触させることにより増殖させて、ＨＳＰＣおよびＥＣを増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比で含む増殖細胞集団を製造すること、および（ｂ）工程（ａ）から得た増殖細胞集団を対象へ輸注すること、を含み、ここで、増殖および輸注の工程を通してＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用が維持される、
組成物に関する。
【００４８】
幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、造血幹細胞である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、対象と同種である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血ＨＳＰＣである。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、対象に関して自己由来である。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、遺伝子修飾定常状態骨髄由来ＨＳＰＣである。
【００４９】
幾つかの好ましい実施形態では、内皮細胞は、遺伝子改変されている。アデノウイルス初期４（Ｅ４）領域は、少なくとも６つのオープンリーディングフレームを含有する（Ｅ４ＯＲＦ）。Ｅ４領域全体は、内皮細胞の血管形成を調節し生存を促進するが、増殖は促進しないことが示されている［例えば、Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66を参照］。臨床的または実験的に、内皮細胞の血管形成を誘導するため、または内皮細胞の生存もしくは増殖を促進するために、Ｅ４領域全体を使用することは、Ｅ４ＯＲＦの幾つかが有害な作用を有し得るので、望ましくない場合がある。例えば、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子は、アポトーシスを誘導することが知られている［Yamano et al. (1999) J. Virol. 73:10095-103］。また、Ｅ４ＯＲＦは免疫原性であり、したがって、Ｅ４ＯＲＦ全てを対象に投与することは望ましくない場合がある。Rafiiら（国際公開第２００８０８９４４８号）により、内皮細胞の血管形成の誘導ならびに生存および増殖の促進に有用なＥ４ＯＲＦ領域内の配列が同定されている。
【００５０】
ＥＴＶ２［Lee et al., Cell stem cell, 2: 497-507 (2008); Sumanas et al., Blood, 111: 4500-4510 (2008)]、ＦＬＵ［Liu et al., Current Bio. 18: 1234-1240 (2008)]、およびＥＲＧ［McLaughlin et al., Blood, 98: 3332-3339 (2001)］を含む、Ｅ−２６（ＥＴＳ）ファミリーの転写因子（ＴＦ）の幾つかの成員が、血管発生および血管形成の調節に関連付けられている［De Val et al., Dev Cell, 16: 180-195 (2009); Sato et al., Cell Struct Funct, 26: 19-24 (2001)］。これらのＴＦは、ＥＣの発生および機能に関連する遺伝子の発現を直接的に調節する。成体ＥＣは、ＦＬＵ、ＥＲＧ（アイソフォーム１および２）、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、Ｅｌｆｌ、Ｅｌｋｌ、ＶＥＺＦおよびＥＴＶ６などの幾つかのＥＴＳ因子を構成的に発現するが、ＥＴＶ２は、胚発生中に一過性に発現され、成体ＥＣには存在しない［Kataoka et al., Blood, 118: 6975-6986 (2011); Lelievre et al., The International Journal Of Biochemistry and Cell Biology, 33: 391-407 (2001)］。
【００５１】
幾つかの実施形態では、ＥＣは、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを発現するように改変されている（即ち、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変内皮細胞である）。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、上記に列挙するものなどの１つまたは複数のＥＴＳファミリー転写因子を発現するように改変されている（即ち、ＥＴＳ＋改変内皮細胞である）。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ＥＴＳファミリー転写因子ＥＴＶ２を発現するように改変されている（即ち、それらは、ＥＴＶ２＋改変内皮細胞である）。幾つかの実施形態では、ＥＣは、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞である。幾つかの実施形態では、ＥＣは、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞である。幾つかの実施形態では、ＥＣは、Ｅ４ＯＲＦ６＋である。幾つかの実施形態では、ＥＣは、ＥＴＳファミリー転写因子をコードする組換え核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、ＥＣは、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、ＥＣは、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、ＥＣは、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ６ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドベクターの形態である。幾つかの実施形態では、核酸分子は、改変ＥＣのゲノムＤＮＡに組み込まれている。幾つかの実施形態では、ＥＣは、分化したＥＣである。幾つかの実施形態では、ＥＣは、成体ＥＣである。幾つかの実施形態では、ＥＣは、胚ＥＣではない。幾つかの実施形態では、ＥＣは、ヒトＥＣである。幾つかの実施形態では、ＥＣは、初代ＥＣである。幾つかの実施形態では、ＥＣは、ヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）である。
【００５２】
幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約２００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約３００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約４００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約５００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約６００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約７００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約８００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約９００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１０００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１１００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１２００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１３００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、少なくとも約１４００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、約１５００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、約２０００：１である。幾つかの実施形態では、初期ＥＣ／ＨＳＰＣ比は、約３０００：１である。
【００５３】
幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１日〜約２４日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１日〜約１２日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約３日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約４日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約５日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約６日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約７日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約８日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約９日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１０日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１１日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１２日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１３日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１４日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１５日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１６日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１７日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１８日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約１９日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２０日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２１日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２２日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２３日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２４日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２５日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２６日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２７日である。幾つかの実施形態では、第１の期間は、約２８日である。
【００５４】
幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１０：１〜約１：１０である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約９：１〜約１：９である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約８：１〜約１：８である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約７：１〜約１：７である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約６：１〜約１：６である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約５：１〜約１：５である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約４：１〜約１：４である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約３：１〜約１：３である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約２：１〜約１：２である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１０：１〜約１：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約９：１〜約２：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約８：１〜約３：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約７：１〜約４：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約６：１〜約５：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１０：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約９：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約８：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約７：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約６：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約５：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約４：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約３：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約２：１である。幾つかの実施形態では、増殖ＨＳＰＣ／ＥＣ比は、約１：１である。
【００５５】
幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約２０倍〜約３００００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約１０００倍〜約１００００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約１０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約２０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約３０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約３５００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約４０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約５０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約６０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約７０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約８０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約９０００倍増殖する。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、増殖工程中に約１００００倍増殖する。
【００５６】
幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用は、増殖工程中のＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な接触、ならびに組み合わせた増殖工程および輸注工程中のＨＳＰＣおよびＥＣの連続的な近接を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する方法は、増殖細胞集団を収集すること、および輸注工程で使用するための増殖細胞集団を含む医薬組成物を調製することをさらに含む。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣとＥＣの間の連続的な相互作用は、組み合わせた増殖工程、収集工程、医薬組成物調製工程および輸注工程中のＨＳＰＣおよびＥＣの連続的な近接を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する方法は、輸注に先立ち増殖ＨＳＰＣから内皮細胞を分離する精製工程を含まない。幾つかの実施形態では、第１の期間中に、人的な相互作用または増殖妨害は存在しない。幾つかの実施形態では、追加のサイトカインが、第１の期間中に添加される。幾つかの実施形態では、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３（ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３）リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）が、第１の期間中に添加される。幾つかの実施形態では、増殖工程における開放イベント数は６以下である。
【００５７】
増殖に先立って、ＨＳＰＣおよびＥＣを、選択および精製（陽性および陰性選択方法の両方を包含しうる）に付して、実質的に純粋な細胞集団を得ることができる。一態様では、フローサイトメトリーとも称される蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、異なる細胞集団を分別および分析する。ＨＳＰＣまたはＥＣ集団に特異的な細胞マーカーを有する細胞を、細胞マーカーに結合する抗体、または通常は抗体の混合物でタグ付けする。異なるマーカーに対する各抗体は、検出可能な分子、特に、他の抗体に結合された他の蛍光色素との識別が可能な蛍光色素に結合される。一連のタグ付けされたか、または「染色された」細胞を、蛍光色素を励起する光源を通過させて流し、細胞からの蛍光スペクトルを検出することにより、特定の標識抗体の存在を決定する。異なる蛍光色素を同時検出することによって（当該技術分野でマルチカラー蛍光細胞ソーティングとも称される）、提示する細胞マーカーの組み合わせが異なる細胞を同定し、細胞集団中の他の細胞から単離することができる。例として側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）、および生体色素染色（例えば、ヨウ化プロピジウムによる）を包含するがこれらに限定されない、他のＦＡＣＳパラメーターは、大きさおよび生存性に基づく細胞の選択を可能にする。ＦＡＣＳによるＨＳＰＣの分別および解析は、とりわけ、米国特許第５，１３７，８０９号、同第５，７５０，３９７号、同第５，８４０，５８０号、同第６，４６５，２４９号；Manz, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11872-11877 (2002)、およびAkashi, K. et al., Nature 404(6774): 193-197 (2000)に記載されている。蛍光活性化細胞ソーティングに関する一般的なガイダンスは、例えば、Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 4th Ed., Wiley-Liss (2003)およびOrmerod, M.G., Flow Cytometry: A Practical Approach, 3rd Ed., Oxford University Press (2000)に記載されている。
【００５８】
細胞の精製は、本明細書中に記載する方法の組み合わせをも包含すると理解すべきである。典型的な組み合わせは、例えば白血球アフェレーシスのような、望ましくない細胞および細胞物質の大部分を除去するのに有効な初期手順を含みうる。第２の工程は、基質と結合された抗体を用いる免疫吸着によって、前駆細胞集団の１つまたは複数に共通するマーカーを発現する細胞を単離することを含みうる。例えば、抗ＣＤ３４抗体を含有する磁気ビーズは、ＣＤ３４抗原を通常発現する、ＨＳＣ、ＣＭＰおよびＧＭＰ細胞を、結合および捕捉することができる。特異的な細胞マーカーのセットに対する抗体を用いるＦＡＣＳ分別などの、異なる細胞型の分別能がより高いさらなる工程を行って、所望の細胞の実質的に純粋な集団を得ることができる。別の組み合わせでは、抗ＣＤ３４抗体を結合した磁気ビーズを用いて初期分離を行った後、ＦＡＣＳによるさらなる精製を行いうる。
【００５９】
増殖を行うための場は当業者周知であり、例えば、開放細胞培養環境（例えば培養フラスコ）、および閉鎖細胞培養環境（例えば、細胞接着に関して変更が加えられているか、または加えられていない閉鎖系ウェーブバッグバイオリアクター、および閉鎖系ミニバイオリアクター、例えば、中空繊維または所望の場合に細胞の接着を可能にする他の系もしくはコーティングを含むミニバイオリアクター）を包含する。幾つかの実施形態では、増殖を行うための場は、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Terumo BCT, Lakewood, CO）である。
【００６０】
治療効果を達成するのに必要な細胞の量は、当該目的のための従来の手順に従って、経験的に決定しうる。概して、治療目的で細胞を投与するのに、細胞は、薬理学的有効用量で投与される。「薬理学的有効量」または「薬理学的有効用量」とは、所望の生理学的効果をもたらすのに十分な量、または、特に生着または患者の生存に関して、所望の結果を達成することが可能な量を意味する。治療的有益性はまた、軽快が実現されるかどうかにかかわらず、基礎疾患または障害の進行を阻止または遅延することを包含する。上記で定義するような薬理学的有効用量はまた、以下でさらに記載するような、細胞と組み合わせて使用される治療化合物にも当てはまる。
【００６１】
造血幹細胞移植の移植片は、患者の年齢、体重および健康状態、適応症の性質および重篤性に応じて広範に変えることができる。そのような条件の考慮により、ＨＳＰＣの適切な投与量範囲は様々である。幾つかの実施形態では、移植片は、対象１ｋｇ当たり約１×１０６個〜約１．０×１０８個のＨＳＰＣを含有する。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０６個〜約１．０×１０８個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約２．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約３．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約４．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約５．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約６．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約７．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約８．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約９．０×１０６個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約２．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約３．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約４．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約５．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約６．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約７．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約８．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約９．０×１０７個のＨＳＰＣを含む。幾つかの実施形態では、増殖細胞集団は、対象１ｋｇ当たり約１．０×１０８個のＨＳＰＣを含む。
【００６２】
臍帯血ユニットは、単一の胎盤および臍帯から収集される血液である。臍帯血ユニット中の有核細胞の数は様々である。さらに、臍帯血ユニット中の有核細胞の数は、凍結および解凍後に減少している場合がある。したがって、ＨＳＰＣを投与するのに、有核細胞数を測定したのが、ユニットを解凍する前であったか後であったかを記録することは有益である。
【００６３】
患者への細胞の移植は、当該技術分野で一般的に用いられる方法で行う。好ましい投与方法は、静脈内輸注である。上述するように、輸注する細胞の数は、性別、年齢、体重、疾患または障害のタイプ、障害のステージ、その細胞集団中の所望の細胞の割合（例えば、細胞集団の純度）、および治療的有益性をもたらすのに必要な細胞数などの要因を考慮して決定しうる。
【００６４】
細胞は、１回の輸注によって投与するか、または治療効果を生じるのに十分な規定される期間にわたる継続的な輸注によって投与することができる。治療が継続的な輸注を含む場合、異なる細胞集団の輸注を行ってもよい。以下でさらに記載するように、薬学的に許容される担体を、患者への細胞輸注のために使用しうる。このような担体は通常、例えば、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）もしくは補充されていない基本細胞培養培地、または当該技術分野で公知であるような培地を含みうる。
【００６５】
本明細書中に記載する造血幹細胞移植の方法は、様々な障害の治療に使用することができる。幾つかの実施形態では、障害は、疾患または骨髄破壊的処置によって引き起こされる造血不全に関する。幾つかの実施形態では、障害は、造血器疾患である。幾つかの実施形態では、障害は、骨髄造血幹細胞移植を要する障害である。幾つかの実施形態では、障害は、感染によるかまたは遺伝性の免疫不全である。幾つかの実施形態では、障害は、感染による免疫不全である。幾つかの実施形態では、障害は、ＨＩＶである。幾つかの実施形態では、障害は、遺伝性免疫不全である。幾つかの実施形態では、障害は、Ｔ細胞に影響を及ぼす感染性疾患／遺伝子疾患（例えば、それぞれ、ＨＩＶ、ＳＣＩＤ）、および赤血球に影響を及ぼす遺伝性疾患（異常ヘモグロビン症）を包含する血液疾患である。幾つかの実施形態では、障害は、貧血である。幾つかの実施形態では、障害は、ファンコニ貧血である。幾つかの実施形態では、障害は、造血器悪性腫瘍である。本明細書中で使用する場合、「治療」は、疾患、障害または望ましくない状態のための、治療的もしくは予防的処置または抑制手段を指す。治療は、疾患の重篤度を低下させるか、疾患の進行を抑制するか、または疾患を解消するために、本発明の細胞を適切な形態で、疾患症状の発症に先立って、および／または疾患もしくは症状が臨床的もしくはそれ以外に現れた後に、投与することを包含する。疾患の予防は、障害もしくは疾患の症状の発症を、好ましくはその障害に対する感受性が高い対象において、延期または遅延させることを包含する。幾つかの実施形態では、対象はヒトである。
【００６６】
本開示はさらに、実質臓器、細胞または組織移植の分野における改善されたＨＳＣＴの方法をも提供する。例として、本開示は、心臓、肺、肝臓、腎臓、島細胞、皮膚、内分泌臓器または膵臓の移植で使用するための内皮細胞増殖ＨＳＰＣをさらに提供するが、それに限定されない。
【００６７】
幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１５日〜約３５日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２０日〜約３０日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２０日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２１日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２２日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２３日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２４日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２５日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２６日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２７日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２８日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２９日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の血小板数は、対象への増殖細胞集団輸注から約３０日後までに少なくとも約２００００／μＬとなる。
【００６８】
幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約５日〜約２０日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約５日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約６日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約７日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約８日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約９日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１０日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１１日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１２日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１３日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１４日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１５日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１６日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１７日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１８日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１９日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２０日後までに少なくとも約１００／μＬとなる。
【００６９】
幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１０日〜約２５日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１０日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１１日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１２日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１３日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１４日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１５日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１６日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１７日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１８日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１９日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２０日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２１日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２２日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２３日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２４日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２５日後までに少なくとも約５００／μＬとなる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約２００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約３００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約４００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約５００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約６００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約７００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約８００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約９００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。幾つかの実施形態では、対象の循環血液中の好中球絶対数は、対象への増殖細胞集団輸注から約１０００日後に少なくとも約５００／μＬとなる。
【００７１】
補助的処置
様々な補助的処置が、本明細書中に記載する方法とともに使用され得る。一態様では、補助的処置として、とりわけ、抗真菌剤、抗細菌剤、および抗ウイルス剤が挙げられる。
【００７２】
一態様では、補助的に投与される作用物質は、抗真菌剤である。真菌感染は、骨髄破壊的処置およびＨＳＣＴを受けた患者において重大な問題である。生着の遅いレシピエント、およびＧＶＨＤを発症する患者は、通常、真菌感染の危険性が高い。真菌感染のタイプは多様であり、とりわけ、カンジダ症［例えば、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）による）、アスペルギルス症（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）による］、ムコール症［例えば、リゾビウム・アールヒズス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）による］、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、およびコクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）を含む。
【００７３】
補助的投与用の抗真菌剤は一般的に、全身性抗真菌剤でありうる。このタイプの有用な抗真菌剤の１つは、ポリエンマクロライド系抗生物質のファミリーに属するアンホテリシンＢである。アンホテリシンＢは、デオキシコール酸との複合体としての製剤、コレステリル硫酸（ｃｈｏｌｅｓｔｅａｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むコロイド懸濁液中の製剤、ならびに大豆レシチン、コレステロールおよびジステアロイルホスファチジルグリセロールで作られるリポソームに封入された製剤を包含する様々な製剤中で利用可能であり、他の製剤は、当該技術分野で公知である。
【００７４】
別の抗真菌剤は、フッ化ピリミジンであるフルシトシンである。フルシトシンは真菌により脱アミノ化されて、代謝拮抗薬かつＤＮＡ合成阻害剤である５−フルオロウラシルを生成する。フルシトシンは通常、クリプトコッカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）感染およびカンジダ症（ｃａｎｄｉａｄｏｓｉｓ）に使用される。フルシトシンは、単独でも使用されるが、一般的にアンホテリシンＢと併用される。
【００７５】
イミダゾールおよびトリアゾールは、広範なアゾールベース抗真菌剤の代表的なものである。イミダゾールおよびトリアゾールは、ステロール１４−α−デメチラーゼを阻害し、その結果、エルゴステロール生合成を阻害し、電子伝達などの細胞膜ベースの活性を阻害すると考えられる。アゾールベースの抗真菌剤は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、およびカンジダ・ネオフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのある特定のタイプのカンジダ症に対して有効である。全身投与に適するアゾール抗真菌剤の例としては、とりわけケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎｚａｏｌｅ）、イトラコナゾール（ｉｔｒａｃａｎａｚｏｌｅ）、フルコナゾール、エコナゾール、ボリコナゾール、およびテルコナゾール（ｔｅｒｃａｎｏｚｏｌｅ）が挙げられる。
【００７６】
真菌感染に加え、好中球減少症を伴う患者は、様々な細菌病原体に感染しやすい。骨髄破壊的レジメンおよびＨＳＣＴを受けた患者においては、グラム陽性菌（例えば、連鎖球菌および黄色ブドウ球菌）およびグラム陰性菌（例えば、大腸菌および緑膿菌）の両方の細菌による感染率が高い。敗血症（Ｓｅｐｔｅｃｅｍｉａ）はよく見受けられる。さらに、生着の遅延、ならびに肺炎連鎖球菌およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）などの被包性細菌に対する免疫応答回復の障害は、ＧＶＨＤを伴う移植レシピエントの罹患率を増加させる。
【００７７】
補助的抗細菌療法には、特定の細菌病原体に適している任意の公知の抗生物質を使用することができる。これは、広域スペクトラム抗生物質、およびより標的が絞られた抗細菌化合物の両方を包含する。増殖骨髄系細胞を用いた場合に適している様々な種類の抗細菌剤としては、例えば、キノロンおよびフルオロキノロン、β−ラクタム抗生物質、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、および様々なそれらの関連物質（ｃｏｇｅｎｅｒｓ）が挙げられるが、それに限定されない。例示的なキノロン化合物として、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、ロメフロキサシン、およびモキシフロキサシンが挙げられる。例示的なβ−ラクタム抗生物質として、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ）、アンピシリン、カルベニシリン、メチシリン、カルバペネム、およびセファロスポリン［例えば、セファロチン、セファマンドール、セファクロール、セフォニシド、セフォテタン、セフォタキシム（ｃｅｆａｔｏｘａｉｍｅ）、セフタジジム、セフチゾキシム、セフェピム］が挙げられる。例示的なアミノグリコシドとしては、ネオマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、およびネチルマイシンが挙げられる。例示的なマクロライドとしては、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシンおよびソリスロマイシンが挙げられる。他の抗生物質は、当業者に明らかである。
【００７８】
骨髄破壊を受けた患者およびＨＳＣＴにおいては、ウイルス感染も問題となる。概して、ウイルス感染の危険性の増加は、骨髄破壊的処置によってもたらされる細胞性免疫の障害に起因する。そのような感染の多くが、血清陽性患者中または血清陽性ドナーの細胞中に存在する潜伏ウイルスの再活性化に起因する。一般的に遭遇するウイルスは、とりわけ、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス−６、エプスタインバーウィルス、アデノウイルス等を包含する。細胞輸注の補助薬として選択される抗ウイルス化合物は、患者が遭遇するウイルスに適切なものである。有用な抗ウイルス化合物は、例えば、アシクロビル、シドホビル、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル、ビダラビン、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ホミビルセン、イミキモドおよびリバビリンを包含するが、それに限定されない。レトロウイルスに対する治療剤としては、とりわけ、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤［例えば、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミブジン（ｌａｍｉｖｉｄｕｄｉｎｅ）］、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン（ｄｅｌｖｉｒｕｄｉｎｅ）］、およびプロテアーゼ阻害剤［例えば、サキナビル（ｓａｑｕｉｎｉｖｉｒ）、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビルおよびロピナビル］が挙げられる。
【００７９】
抗真菌剤、抗細菌剤、および抗ウイルス剤は、感染の発生を低減するための予防として、または感染が起こってから使用され得る。予防は、特に、免疫抑制患者によく起こる真菌感染に対して、および血清陽性患者または血清陽性移植ドナーにおけるウイルス感染に対して適用される。したがって、治療目的のための実施形態は、ＨＳＰＣ、ＭＰ細胞、および抗真菌化合物、抗細菌化合物または抗ウイルス化合物の組み合わせを含む。
【００８０】
さらなる実施形態では、補助的に投与される作用物質は、最終的に分化される骨髄系細胞、特に顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球細胞の分化および動員を向上する、サイトカインまたは増殖因子である。顆粒球発生を向上するために、サイトカインＣ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを使用しうる。Ｇ−ＣＳＦは、ＨＳＣＴにおいて好中球の生着および産生を加速させるのに有効である。別の実施形態では、サイトカインまたは増殖因子は、トロンボポエチンである。ＴＰＯの投与は、移植された前駆細胞の生着を向上し、巨核球および血小板の発生を促進する［Fox, N et al., J. Clin. Invest. 110:389-394 (2002); Akahori, H. et al., Stem Cells 14(6):678-689 (1996)］。
【００８１】
当業者には明らかなように、補助的療法には、様々な賦形剤および媒体ならびに投与経路を用いうる。代表的な処方技術は、とりわけ、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000)に教示されている。
【００８２】
医薬組成物は概して、薬学的に許容される担体、および薬理学的有効量の化合物もしくはその混合物、またはその適切な塩を含む。医薬組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、エアロゾル、固体、丸剤、錠剤、カプセル、ゲル、外用クリーム、坐剤、経皮パッチ、および当該技術分野で公知の他の剤形として製剤化され得る。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、医薬組成物の製剤化における、当業者に公知の標準的な薬学的に許容される担体のいずれをも含む。したがって、化合物は、それ自体、例えば薬学的に許容される塩として、またはコンジュゲートとして存在するように、薬学的に許容される希釈剤［例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水性エタノール、または溶液形態としたグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば、植物油、動物油、合成油等）、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、硫酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート８０等］中の製剤として、または適切な賦形剤中の固形製剤として調製され得る。
【００８４】
医薬組成物は多くの場合、必要に応じて、１つまたは複数の緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール等）、静菌薬、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、レシピエントの血液に対し製剤を等張、低張またはやや高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、防腐剤、香味剤、甘味剤、および着色化合物をさらに含む。
【００８５】
組成物中に当業者に公知の任意の適切な担体を用い得るが、担体のタイプは通常、投与様式に応じて異なり得る。治療用組成物は、例えば、経口、経鼻、粘膜、直腸、膣内、局所外用、静脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋内内投与を包含する任意の適切な投与様式のために製剤化され得る。
【００８６】
本明細書中に記載する医薬組成物は、密封アンプルまたはバイアルなどの、単位用量または複数回用量容器で提供し得る。かかる容器は通常、使用するまで製剤の滅菌性および安定性を保つように密封される。製剤は概して、前記のように、油性もしくは水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして貯蔵し得る。あるいは、医薬組成物は、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを要する凍結乾燥状態で貯蔵し得る。
【００８７】
宿主への投与量は、投与物、予防または治療といった投与目的、宿主の状態、投与様式、投与回数、投与の間隔等に応じて異なり得る。これらは、当業者が経験的に決定することができ、治療応答の程度に応じて調節し得る。適切な用量を決定する際に考慮すべき要因として、対象の大きさおよび体重、対象の年齢および性別、症状の重篤度、疾患のステージ、作用物質のデリバリー方法、作用物質の半減期、および作用物質の効力が挙げられるが、これらに限定されない。考慮すべき疾患のステージには、疾患が急性期であるか慢性期であるか、再発期であるか寛解期であるかということ、および疾患の進行性が含まれる。
【００８８】
治療上有効量の投与量および投与回数の決定は、当業者がその技能の範囲内で十分行うことができる。例えば、細胞培養または他のインビトロアッセイにより、初期有効用量を推定することができる。次いで、循環濃度または組織濃度（細胞培養アッセイによって決定される循環または組織ＩＣ５０を包含する）を導く動物モデルにおいて用量を検討し得る。
【００８９】
キット
本明細書中に記載する方法は、ＨＳＰＣ生着を向上するためのキットによって促進され得る。キットは、増殖および／または単離細胞を包含するＨＳＰＣ、ＥＣを包含するがそれに限定されない細胞、および／または補助的治療用化合物、ＨＳＰＣおよびＥＣを単離または増殖させるための手段、細胞を患者に投与するための手段、またはそれらの任意の組み合わせを含有し得る。キットは、薬学的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用の容器、抗体のいずれかもしくは全て、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。キットには通常、ラベルが付けられ、ラベルは、キットの内容物の使用に関する説明または他の情報を提供する任意の文書または記録物［電子的またはコンピューターが読める形態（例えば、ディスク、光ディスク、メモリーチップまたはテープ）であり得る］を含む。
【００９０】
本発明の実施には、別途示さない限り、当業者の技能における細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学等の従来の技法を用い得る。これらの技法は現在文献に十分に開示されており、特に、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989；Methods of Enzymology のシリーズ(Academic Press, Inc.)、およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., (1987)が参照される。
【００９１】
実施例
本教示の態様は、下記実施例に照らしてさらに理解され得る。実施例は、いかなる場合でも本教示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９２】
実施例１：非照射ＥＣを用いたＨＳＰＣの増殖
非照射Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣは、伝統的なフラスコベースの培養で、およそ１５〜２０回、１：４のスプリットで継代培養する増殖能力を有する。本方法において、非照射Ｅ４ＯＲＦ＋１改変ＥＣを、コンフルエントになるまで表面の平坦な培養容器中で十分量にまで増殖させることができる。平板培養細胞の量は、出発材料の量および増殖の長さに依存し得る。例えば、１０日間の増殖には、（それぞれ、直径がおよそ３５ｍｍの）６ウェルのディッシュ３プレート分相当が必要であり得る。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを、これらのウェルにおいてコンフルエントになるまで、完全成長培地中で培養する。コンフルエントの時点で、培地をコンディショニング培地に切り替える。コンディショニング培地中で２４時間後、ＣＤ３４＋精製細胞（例えば臍帯血（ＵＣＢ）由来）を、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを予め播種したウェル上に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるサイトカインと共に播種することができる。２日後、培地を収集し、細胞をペレット化し、新鮮なサイトカイン含有培地中に再懸濁させ、最初と同様に前もって調整した２つのさらなるウェルに分散させる。「マザーウェル」または「マザーフラスコ」と称される第１のウェルにもまた、さらなるサイトカイン含有培地を再供給する。１０日目まで、このプロセスを１日おきに繰り返す。この時点で、全てのウェルが、増殖ＨＳＰＣおよびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣを含有する。場合によっては、中空繊維バイオリアクターなどのバイオリアクターを利用してもよい。中空繊維を、プライミングし、コーティングし、調整して（例えば、製造者の指示書に従って）、完全成長培地中におよそ５×１０７個のＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣを播種することができる。バイオリアクターはこの細胞を「養い」、６日間増殖させることができる。この時点で、コンフルエントに近くなったバイオリアクターにおいて、培地を、サイトカインを含まないコンディショニング培地と交換して、ＨＳＰＣの早期の分化を駆動し得る血清［例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）］を除去する。２４時間後、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣは、ＨＳＰＣを受け入れる準備が整っている。ＵＳＢ試料は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の赤血球（ＲＢＣ）除去製品として凍結保管することができる。原始ＣＤ３４＋集団の精製および増殖に先立って、この細胞材料を洗浄する。そのために、試料を３７℃のビーズ浴中で解凍する。氷が残存しないか目視検査し、ユニットを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐｒｏｄｉｇｙデバイスまたは類似のシステムの流体工学に無菌接合する。この時点で細胞をＤＮアーゼとともにインキュベートする。これは、解凍後に生育不能細胞があった場合に、その核酸が凝集および粘性をもたらし得るからである。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐｒｏｄｉｇｙデバイスまたは同等のデバイスは、冷凍保存剤を除去するために細胞を洗浄することができ、さらに試料からＲＢＣを除去することができる。依然Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐｒｏｄｉｇｙデバイス中において、ＨＳＰＣを精製するために、細胞をＣＤ３４マイクロビーズとともにインキュベートする。最後に、洗浄工程を行う。続いて、マイ���ロビーズ結合ＣＤ３４＋細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭａｃｓデバイスまたは類似のデバイスに注入して、該標識ＣＤ３４＋細胞を磁気精製する。利用可能なＣＤ３４＋の５０〜７０％の回収率が見込まれる。
【００９３】
次に、精製ＣＤ３４＋分画を、サイトカインのＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３Ｌをそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌ補充した、総量２００ｍｌのＨＳＰＣ増殖培地に注入する。続いて、この環境を、バイオリアクターの、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣと同じ内部チャンバーに導入する（増殖の０日目）。増殖を通して、ＨＳＰＣ増殖培地（サイトカインを含まない）は、代謝産物の交換のためにおよそ０．４ｍｌ／分の速度で外部チャンバーから連続的に供給され、９０％Ｎ２、５％Ｏ２および５％ＣＯ２が供給されるガス交換モジュールを含む再循環ループにおいておよそ３０ｍｌ／分の速度で循環する。さらに、増殖の２日目および４日目に、サイトカインのＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３Ｌをそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌ補充したＨＳＰＣ増殖培地２００ｍｌのボーラスを、内部チャンバーに添加する。増殖６日目後に増殖を停止させ、その時点で、細胞材料全体を収集する。
【００９４】
実施例２：照射ＥＣを用いたＨＳＰＣの増殖
Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣは、放射線またはマイトマイシンＣなどの有糸分裂不活性化刺激を受けた後も、ＨＳＰＣを増殖させるのに十分に有用である。有糸分裂不活性化後の細胞を使用するために、その最終培養容器中にコンフルエントで存在する細胞に、有糸分裂不活性化刺激を与え、コンディショニング培地に切り替える前に完全培地中で２４時間回復させる。有糸分裂不活性化した細胞をバイオリアクター中で使用する場合は、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣ、またはＥＴＶ２＋Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣ、またはＥ４ＯＲＦ１＋Ｅ４ＯＲＦ６＋改変ＥＣを、細胞数がおよそ１０億個になるまで増殖させる。細胞は、有糸分裂不活性化刺激による処理後に冷凍保存し得る。次に、有糸分裂不活性化されたＥＣ試料の全体をバイオリアクターに注入して、２４時間付着させる。その後、培地のコンディショニングをさらに２４時間行う。続いて、ＣＤ３４＋細胞（例えばＵＣＢ由来）を、サイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ）を補充した、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣと同じバイオリアクター区画に導入する。この時点以降、細胞は互いに解離されない。２日目および４日目に、サイトカインを補充した培地の２００ｍｌボーラスを供給する。収集条件および全ての他の条件は、実施例１のものと同じである。
【００９５】
実施例３：ＣＦＵアッセイ
コロニー形成単位または「ＣＦＵ」は、インビトロモデルにおいて細胞の幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を判断するための手段である。既知数の細胞を、規定培地（即ち、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）を含む、メチルセルロースでコーティングした培養フラスコ上で平板培養する。２週後、規定の形態を有するコロニーが、仮定の幹細胞によって形成される。そのようなコロニーは定量可能であり、所定の集団中のＨＰＳＣの決定のために用いることができる。ＨＳＰＣの増殖速度は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを用いた場合の、バイオリアクターでの増殖において最も大きく、フラスコベースの増殖がそれに続き、サイトカイン単独を用いた増殖によるＨＳＰＣ増殖量は最も少なかった（図７を参照）。
【００９６】
実施例４：フローサイトメトリー
単離したばかりの臍帯血由来（未処理）、サイトカイン単独を用いて６日間増殖させた細胞由来、フラスコ中でＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣ上で６日間増殖させた細胞由来、または中空繊維バイオリアクター中でＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣ上で６日間増殖させた細胞由来の造血細胞のいずれも、フローサイトメトリーによって分析した。細胞集団を、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ３８に関して同時染色した。これら細胞表面抗原に特異的な抗体に結合した異なるフルオロフォアによって、各パラメーターを識別することが可能であった。ＣＤ４５−細胞を、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変細胞として同定した。ＣＤ４５は、汎造血細胞マーカーである。ＣＤ４５＋集団全体の中で、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞はＣＤ４５＋ＣＤ３４−細胞と比較して、より原始的なＨＳＰＣ集団を含む。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、さらに原始的なＨＳＰＣ集団を含む。これらの原始的細胞集団の増殖速度は、一貫して、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣを用いた場合の、バイオリアクターでの増殖において最も大きく、フラスコベースの増殖がそれに続き、サイトカイン単独を用いて処理した場合の増殖量は最も少なかった
【００９７】
実施例４：増殖ＥＳＰＣの移植
Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣとの連続的な接触によって増殖されるＨＳＰＣは、例えば相互作用がＨＳＰＣの連続継代および再播種によって中断される増殖によって得られるＨＳＰＣと比較した場合、生着性に優れた産物をもたらし得る。この中断を排除することによって、本新規様式で増殖されるＨＳＰＣは、リンパ系、骨髄系および赤血球系列のより迅速な生着をもたらし、より迅速な、骨髄破壊後の各血球数の回復をもたらし得る。それはまた、増殖のためのＥ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣの使用が、長期再増殖幹細胞を維持すると考えられるので、長期の生着も改善し得る。Ｅ４ＯＲＦ１＋改変ＥＣとの連続的な接触による増殖はまた、１個の成体が単一ドナー由来の単一ＵＣＢユニットに由来する移植片を受け取るために、またはさらに、単一成体への移植片の複数回輸注のために、あるいは複数の成体に単一ＵＣＢドナーからの複数の輸注を行うために、十分なＨＳＰＣ材料の生成をもたらし得る。予想される迅速な生着はまた、入院の短縮の可能性、全ての等級のＧＶＨＤの発生率の低下、再発のレベルの低下、移植関連死亡率（ＴＲＭ）の低下、感染の危険性の低下、移植不全の発生の低減、他の場合では使用不可能であるような少ない提供量の臍帯血でも利用可能であること、稀なＨＬＡ型の臍帯血に関するＵＣＢ提供へのアクセスの向上、治療費の全体的な低減、移植レシピエントの寿命の延長、および／または移植レシピエントの生活の質の向上を包含する、一連の他の有益性をもたらし得る。
【００９８】
本発明の特定の実施形態の上記記載は、説明を目的とするものである。それらは、網羅的であること、または本発明を開示される特定の形態に限定するものであること、を意図するものではなく、明らかに、上記の教示に照らして多くの修飾および変更が可能である。上記の実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最も良く説明するため、そしてそれにより、他の当業者が、本発明および様々な実施形態を、意図する特定の使用に適するように様々な修飾を伴って、最も良く利用できるようにするために、選択し記載したものである。
【００９９】
本明細書において、引用する特許、特許出願、刊行物および参照文献は全て、各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同等に、参照により明らかに組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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