(57)【要約】  ここに提供されるのは、グリピカン−３に結合する第１０フィブロネクチンIII型ドメイン(１０Ｆｎ３)を含む、ポリペプチドである。また提供されるのは、診断および治療適用に使用するための、グリピカン−３に結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む融合分子である。グリピカン−３  １０Ｆｎ３薬物コンジュゲートも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むフィブロネクチンベース足場(ＦＢＳ)を含むポリペプチドであって、ここで、ループの１以上が野生型ＦＢＳドメインの対応するループに対して改変されており、ヒトグリピカン−３(ＧＰＣ３)に１μM以下のＫＤで結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
ＦＢＳがフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)ドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｆｎ３ドメインがヒト第１０フィブロネクチンIII型(１０Ｆｎ３)ドメインである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＢＣループが
(ａ)配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９；および
(ｂ)配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９のＢＣループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＢＣループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＤＥループが
(ａ)配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００；および
(ｂ)配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００のＤＥループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＤＥループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＦＧループが
(ａ)配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８および
(ｂ)配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８のＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＦＧループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
それぞれＢＣループが配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＤＥループが配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そしてＦＧループが配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１および３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループが１、２または３アミノ酸置換を含む、請求項１〜６の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
(ａ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号６、７および８を含む；
(ｂ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号６、７および８の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｃ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号１９、２０および２１を含む；
(ｄ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号１９、２０および２２の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｅ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号３２、３３および３４を含む；
(ｆ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号３２、３３および３４の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｇ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含む；
(ｈ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号４５、４６および４７の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｉ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号５８、５９および６０を含む；
(ｊ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号５８、５９および６０の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｋ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号７１、７２および７３を含む；
(ｌ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号７１、７２および７３の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｍ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号８４、８５および８６を含む；
(ｎ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号８４、８５および８６の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｏ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１０１を含む；
(ｐ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号９９、１００および１０１の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む、
請求項１〜７の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＦＢＳが配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表され、そして
(ａ)それぞれ配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｂ)それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｃ)それぞれ配列番号１９、２０および２１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｄ)それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｅ)それぞれ配列番号３２、３３および３４に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｆ)配列番号３２、３３および３４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｇ)それぞれ配列番号４５、４６および４７に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｈ)配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｉ)それぞれ配列番号５８、５９および６０に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配を含むか；
(ｊ)配列番号５８、５９および６０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｋ)それぞれ配列番号７１、７２および７３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｌ)配列番号７１、７２および７３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｍ)それぞれ配列番号８４、８５および８６に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｎ)配列番号８４、８５および８６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｏ)それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｐ)配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｑ)配列番号９９、１００および１２９のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｒ)配列番号９９、１００および１５６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｓ)配列番号９９、１００および１８３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｔ)配列番号９９、１００および２１０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｕ)配列番号９９、１００および２３７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｖ)配列番号９９、１００および２６４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｗ)配列番号９９、１００および２６４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；または
(ｘ)配列番号９９、１００および３１８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む、
請求項１〜８の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＦＢＳが配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３および９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＦＢＳが配列番号５、１８、３１、４４、５７、７０、８３および９８の何れかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＦＢＳが配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７または３１９〜３４３の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＦＢＳが配列番号９８、１０２〜１２８、１２９〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含む、請求項１〜１２の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＦＢＳが配列番号５、１８、３１、４４、５７、７０、８３、９８、１２８、１５５、１８２、２０９、２０９、２３６、２６３、２９０および３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＦＢＳが配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＦＢＳが配列番号９８、１０２〜１２８、１２９〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ＦＢＳが、グリピカン−３との結合について配列番号９８のアミノ酸配列を含むＦＢＳと競合する、請求項１〜１６の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＦＢＳが、ＨＱＶＳＦＦ(配列番号２０９)を含むグリピカン−３内の１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する、請求項１〜１７の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ＦＢＳが、ＥＱＬＬＱＳＡＳＭ(配列番号２１０)を含むグリピカン−３内の１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する、請求項１〜１８の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＦＢＳが、ＨＱＶＳＦＦ(配列番号２０９)およびＥＱＬＬＱＳＡＳＭ(配列番号２１０)を含むグリピカン−３内の不連続アドネクチン部位に結合する、請求項１〜１９の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
さらに異種タンパク質を含む、請求項１〜２０の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
さらにポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態(ＰＫ)部分を含む、請求項１〜２１の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＦＢＳのＣ末端がアミノ酸配列ＰｍＸｎからなる部分に結合し、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１の整数である、請求項１〜２２の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ｍが１または２であり、ｎが１〜１０の整数である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
部分がシステインを含む、請求項２３または２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり、ここで、Ｃはシステインであり、各Ｘは独立して任意のアミノ酸である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり１ＣＸｎ２、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ｎ１およびｎ２が独立して１〜５の整数である、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
部分がＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ(配列番号３８２)、ＰＩＥＫ(配列番号３８３)、ＰＩＤＫＰ(配列番号３８４)、ＰＩＥＫＰ(配列番号３８５)、ＰＩＤＫＰＳ(配列番号３８６)、ＰＩＥＫＰＳ(配列番号３８７)、ＰＩＤＫＰＣ(配列番号３８８)、ＰＩＥＫＰＣ(配列番号３８９)、ＰＩＤＫＰＳＱ(配列番号３９０)、ＰＩＥＫＰＳＱ(配列番号３９１)、ＰＩＤＫＰＣＱ(配列番号３９２)、ＰＩＥＫＰＣＱ(配列番号３９３)、ＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９４)およびＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)からなる群から選択される、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
部分がＰＣまたはＰＰＣである、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
部分がＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)およびＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)からなる群から選択される、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
部分がＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Ｃ末端部分におけるシステインが異種部分にコンジュゲートする、請求項２５〜３２の何れかに記載のポリペプチド。
【請求項３４】
異種部分が検出可能部分である、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
異種部分が薬物部分であり、ＦＢＳと薬物部分がＦＢＳ−薬物コンジュゲートを形成する、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１〜３１の何れかに記載のＦＢＳ部分を含むＦＢＳ−薬物コンジュゲートであって、薬物部分が、リンカーによりＦＢＳ部分にコンジュゲートしている、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項３７】
リンカーがヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドまたはペプチド含有リンカーである、請求項３６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項３８】
リンカーがペプチジルリンカーである、請求項３７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項３９】
ペプチジルリンカーがＶａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号４６７)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、請求項３８に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４０】
薬物部分が細胞毒性薬物である、請求項３６〜３９の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４１】
細胞毒性薬物選択が
(ａ)カリチアマイシンのようなエンジイン類およびウンシアラマイシン；
(ｂ)ツブリシン；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンのアナログのようなＤＮＡアルキル化剤；
(ｄ)エポチロン；
(ｅ)オーリスタチン；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体；
(ｇ)ＤＭ１およびＤＭ４のようなマイタンシノイド
ならびにこれらのアナログおよび誘導体
からなる群から選択される、請求項４０に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４２】
薬物部分が
【化１】
2018533369.tif 000069
である、請求項４１に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４３】
薬物部分が式(II)
【化２】
2018533369.tif 000070
の構造を有する合成ツブリシンアナログである、請求項３６〜４１の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４４】
ＦＢＳおよび薬物部分が、式(III)
【化３】
2018533369.tif 000071
の構造を有するリンカー部分とコンジュゲートする、請求項３６〜４３の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４５】
薬物−部分−リンカーが式(IV)
【化４】
2018533369.tif 000072
の構造を有し、ここで、マレイミド基をＦＢＳのシステインのスルフヒドリル基と反応させて、それにより薬物−部分−リンカーとＦＢＳの間にチオエーテル結合を形成させる、請求項４４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４６】
ＦＢＳ部分がシステインを含むＣ末端部分を含む、請求項３６〜４５の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４７】
Ｃ末端部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり、ここで、Ｃはシステインであり、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎが０または少なくとも１である整数である、請求項４６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４８】
ｍが１または２であり、ｎが１〜１０の整数である、請求項４７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項４９】
部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなり、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、請求項４６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５０】
ｎ１およびｎ２が独立して１〜５の整数である、請求項４９に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５１】
Ｃ末端部分がＰＣまたはＰＰＣである、請求項４７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５２】
部分がＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)およびＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)からなる群から選択される、請求項４９に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５３】
部分がＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号１６)である、請求項５２に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５４】
式(Ｉ)
【化５】
2018533369.tif 000073
〔式中、ｍは１、２、３または４であり、Ａｄｘは１μM以下のＫＤでヒトＧＰＣ３に特異的に結合するアドネクチンであり、“Ａｄｘ”に結合する硫黄原子はアドネクチンのシステインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５５】
Ａｄｘがヒト１０Ｆｎ３ドメインであり、ここで、
(ａ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号６、７および８を含むか；
(ｂ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号１９、２０および２１を含むか；
(ｃ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号３２、３３および３４を含むか；
(ｄ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含むか；
(ｅ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号５８、５９および６０を含むか；
(ｆ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号７１、７２および７３を含むか；
(ｇ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号８４、８５および８６を含むか；
(ｈ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１０１を含むか；
(ｉ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１２９を含むか；
(ｊ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１５６を含むか；
(ｋ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１８３を含むか；
(ｌ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２１０を含むか；
(ｍ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２３７を含むか；
(ｎ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２６４を含むか；
(ｏ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２６４を含むか；または
(ｐ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および３１８を含み、
１０Ｆｎ３ドメインがアミノ酸配列ＰｍＣＸｎまたはＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなるＣ末端部分を含み、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、請求項５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５６】
Ｃ末端部分がＰＣまたはＰＰＣ、ＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)またはＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)である、請求項５５に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５７】
部分がＰＣまたはＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号１６)である、請求項５２に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５８】
Ａｄｘが配列番号１２〜１７、２４〜３０、３８〜４３、５１〜５６、６４〜６９、７７〜８２、９０〜９７、１１０〜１２７、１３７〜１５４、１６４〜１８１、１９１〜２０８、２１８〜２３５、２４５〜２６２、２７２〜２８９、２９９〜３１６および３２６〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項５９】
Ａｄｘが配列番号１１０〜１２７、１３７〜１５４、１６４〜１８１、１９１〜２０８、２１８〜２３５、２４５〜２６２、２７２〜２８９、２９９〜３１６および３２６〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項６０】
Ａｄｘが配列番号１１０〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項６１】
請求項１〜３５の何れかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項６２】
請求項３６〜６０の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項６３】
本質的に内毒素がない、請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
請求項１〜３５の何れかに記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項６５】
の何れかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター請求項１〜３５。
【請求項６６】
請求項１〜３５の何れかのポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞。
【請求項６７】
請求項１〜３５の何れかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、請求項６６に記載の細胞を該ポリペプチドの発現に適当な条件下培養し、該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
【請求項６８】
請求項６１または６２に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるグリピカン−３疾患または障害を軽減または阻止する方法。
【請求項６９】
グリピカン−３疾患または障害が癌である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
癌が肝細胞癌、メラノーマ、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、卵巣癌または肺扁平上皮癌である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項１〜６２の何れかに記載のポリペプチド、ＦＢＳ−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物および使用指示を含む、キット。
【請求項７２】
サンプルと請求項１〜３５の何れかに記載のポリペプチドを接触させ、ＦＢＳのグリピカン−３への結合を検出または測定することを含む、サンプルにおけるグリピカン−３を検出または測定する方法。
【請求項７３】
式(Ｉ)
【化６】
2018533369.tif 000074
〔式中、ｍは１であり、Ａｄｘは配列番号１１０〜１１７および２７２〜２８９の何れかのアミノ酸配列を含むアドネクチンであり、そして、“Ａｄｘ”に結合する硫黄原子はアドネクチンのＣ末端システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項７４】
式(Ｉ)
【化７】
2018533369.tif 000075
〔式中、ｍは２であり、Ａｄｘは配列番号１１９〜１２６および２８１〜２８８のアミノ酸配列を含むアドネクチンであり、“Ａｄｘ”に結合している硫黄原子はアドネクチンの２Ｃ末端システインの各々のスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項７５】
式(VI)
【化８】
2018533369.tif 000076
〔式中、システインに結合する硫黄原子は、システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【請求項７６】
式(VII)
【化９】
2018533369.tif 000077
〔式中、システインに結合する硫黄原子は、システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２３日出願の米国仮出願６２／２２２,６３３号に基づく優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に明示的に包含させる。本明細書をとおして引用するあらゆる特許、特許出願および引用文献は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
グリピカン−３は、グリコシルホスファチジルイノシトール固定ヘパリン硫酸プロテオグリカンのグリピカンファミリーに属する腫瘍胎児抗原である。グリピカン類は、Ｗｎｔ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、骨形成タンパク質および線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)を含むいくつかの増殖因子の活性を制御する(Filmus et al. FEBS J. 2013, 280:2471-2476)。グリピカン類は、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカンと称される複合多糖鎖への共有結合的結合により特徴付けられる。グリピカン類は、細胞−細胞外マトリクス界面での細胞シグナル伝達に関与する(Sasisekharan et al., Nature Reviews|Cancer, Volume 2 (2002))。今日まで、ヒトグリピカンファミリーの６つの異なるメンバーが同定されている。細胞膜結合グリピカン−３は、１以上のジスルフィド結合により結合した２サブユニットからなる。
【０００３】
グリピカン−３は、発育中胎児肝臓および胎盤で発現され、正常成体組織では下方制御または発現抑制される。グリピカン−３遺伝子の変異および枯渇は、ヒトにおけるシンプソン・ゴラビ・ベーメルまたは異形症症候群を担う。グリピカン−３は種々の癌および特に、肝細胞癌(“ＨＣＣ”)、メラノーマ、ウィルムス腫瘍および肝芽腫で発現される(Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005))。グリピカン−３の細胞表面形態は、ＨＣＣ(＞５０％)および肺扁平上皮癌(約２５％)を含む癌で高度に発現される。
グリピカン−３は、転写因子β−カテニンの細胞質蓄積および核移行を誘発する古典的Ｗｎｔシグナル伝達の刺激により、インビトロおよびインビボで腫瘍成長を促進する(Filmus, supra)。ＧＰＣ３がいくつかのＷｎｔ(Capurro et al., Cancer Res., 2005, 65:6245-6254)およびＷｎｔのシグナル伝達受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ(Filmus, et al., Genome Biol., 2008, 9:224)と複合体を形成できることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＨＣＣは、世界的に癌関連死の三番目の原因である。毎年、ＨＣＣでの死亡は、約百万名を占める(Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77(2005))。肝臓の硬変に至るＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび慢性的な大量の飲酒が、ＨＣＣの最も一般的な原因のままである。その発生率はＣ型肝炎ウイルス感染の広がりにより米国で劇的に増加しており、今後２０年で増えると予測される。ＨＣＣは、主に肝移植または腫瘍切除により処置される。患者予後は、根底にある肝機能および診断時の腫瘍のステージによる(Parikh and Hyman, Am J. Med. 120(3):194-202(2007))。有効なＨＣＣ処置戦略が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
ここに提供されるのは、ヒトグリピカン−３に結合するフィブロネクチンベース足場(ＦＢＳ)を含むポリペプチドおよび、治療剤および診断剤として適するこれらのポリペプチドのコンジュゲートである。
【０００６】
ある態様において、提供されるのは、ヒトグリピカン−３(ＧＰＣ３)に特異的に結合するＦＢＳを含むポリペプチドである。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは治療剤または診断剤にコンジュゲートする。
【０００７】
他の態様において、提供されるのは、対象に抗ＧＰＣ３  ＦＢＳまたは抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ−薬物コンジュゲートを含むポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、ヒト対象における癌を処置する方法である。ある実施態様において、該癌は、非癌性細胞と比較してグリピカン−３を過発現する。ある実施態様において、該癌は肝臓癌(例えば、肝細胞癌、肝芽腫)、メラノーマ、ウィルムス腫瘍または肺癌(例えば、肺扁平上皮癌)である。
【０００８】
他の態様において、提供されるのは、細胞と抗ＧＰＣ３  ＦＢＳを含むポリペプチドを、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳのＧＰＣ３への結合を可能にする条件下で接触させ、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳおよびＧＰＣ３を含む複合体を検出することを含む、インビトロおよびインビボでＧＰＣ３を検出する方法である。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、検出可能標識(例えば、ＦＩＴＣ)と結合する。
【０００９】
また提供されるのは、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳポリペプチドおよび／または抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ薬物コンジュゲートを含む、医薬および診断組成物を含む組成物である。
【００１０】
また提供されるのは、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳをコードする核酸分子ならびにこのような核酸を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞である。また提供されるのは、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳポリペプチドまたは抗ＧＰＣ３  ＦＢＳコンジュゲートおよび使用指示を含むキットである。
【００１１】
本発明の他の特性および利点は、次の詳細な記載および実施例から明らかとなり、これらは限定的と解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、代表的抗ＧＰＣ３アドネクチンポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。４５７８Ｆ０３(配列番号９)、４５７８Ｈ０８(配列番号１８)、４５７８Ｂ０６(配列番号３５)、４６０６Ｆ０６(配列番号４８)、５２７３Ｃ０１(配列番号６１)、５２７３Ｄ０１(配列番号７４)、５２７４Ｅ０１(配列番号８７)、６５６１Ａ０１(配列番号８７)、６０７７Ｆ０２(配列番号１０２)、６０９３Ａ０１(配列番号４６３)。
【００１３】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ＤＡＲ１およびＤＡＲ２ツブリシンアナログ−ＧＰＣ３アドネクチン薬物コンジュゲートの構造を模式的に記載する。
【００１４】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトグリピカン−３陽性細胞に結合する抗ＧＰＣ３アドネクチン類のフローサイトメトリー結果を示す。
【００１５】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＨｅｐ３ＢおよびＨ４４６細胞に結合する抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２のフローサイトメトリー結果を示す。
【００１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２によるＨｅｐ３ＢおよびＨ４４６細胞の細胞増殖阻害を示す。
【００１７】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２によるＨｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞の細胞増殖阻害を示す。
【００１８】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｈ４４６およびＨｅｐＢ３細胞への抗ＧＰＣ３アドネクチン、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２の内在化率を示す棒グラフである。
【００１９】
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、１５分および８時間時点での膜および内在化ＡＦ４８８標識抗ＧＰＣ３アドネクチン、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２を示す。
【００２０】
【図９】図９は、マウスにおけるツブリシンアナログ−抗ＧＰＣ３アドネクチン薬物コンジュゲートの曝露プロファイルを示すグラフである。
【００２１】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、腫瘍体積縮小および体重変化パーセントとして測定した、ＨｅｐＧ２異種移植モデルにおける抗ＧＰＣ３アドネクチン薬物コンジュゲートの有効性を示すグラフである。
【００２２】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、腫瘍体積縮小および体重変化パーセントとして測定した、ＨｅｐＧ２異種移植モデル(ＴＶ０＝３８０〜４８０mm３)におけるＤＡＲ１およびＤＡＲ２の有効性を示すグラフである。
【００２３】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、腫瘍体積縮小および体重変化パーセントとして測定した、ＨｅｐＧ２異種移植モデル(ＴＶ０＝２２８〜３５０mm３)におけるＤＡＲ２の有効性を示すグラフである。
【００２４】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、腫瘍体積縮小および体重変化パーセントとして測定した、ＨｅｐＧ２異種移植モデル(ＴＶ０＝５１４〜６７３mm３)におけるＤＡＲ２の有効性を示すグラフである。
【００２５】
【図１４】図１４は、質量分析法により決定した、ヒトＧＰＣ３(配列番号３４４のアミノ酸１〜５５９、続いて６×ｈｉｓ)の一般的消化ペプチドを示す。
【００２６】
【図１５】図１５は、ＨＤＸ−ＭＳにより決定した、ヒトＧＰＣ３におけるＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２アドネクチン結合部位のグラフ表示である。
【００２７】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、抗ＧＰＣ３  ＤＧ変異体と親抗ＧＰＣ３アドネクチンの結合動態の比較グラフである。
【００２８】
【図１７】図１７は、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞を移植されたＮＳＧマウスへの種々の用量のＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡまたは対照非結合ＡｄｘＤＣの投与後の日数の関数としての腫瘍体積を示し、グリピカン−３発現が高い細胞株由来異種移植片でＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡが効果的であることを示す。
【００２９】
【図１８】図１８は、Ｈ４４６腫瘍細胞を移植されたＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスへの種々の用量のＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡまたは対照非結合ＡｄｘＤＣの投与後の日数の関数としての腫瘍体積を示し、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡがグリピカン−３の発現が低い細胞株由来異種移植片の増殖を減速させることを示す。
【００３０】
【図１９】図１９は、マウスに０.２２μM／kgの３Ｈ  ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣを投与０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後に採ったマウス組織の定量全身オートラジオグラフィー(ＱＷＢＡ)を示し、正常組織に対するＨｅｐ３Ｂ腫瘍への優先的取り込みを示す。
【００３１】
【図２０】図２０は、マウスに０.０１５μM／kgの３Ｈ  ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣを投与０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後に採ったマウス組織のＱＷＢＡを示し、正常組織に対するＨｅｐ３Ｂ腫瘍への優先的取り込みを示す。
【００３２】
【図２１】図２１は、マウスに０.２２μM／kgの３Ｈ  ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣを投与０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後に採ったマウス組織のＱＷＢＡを示し、非結合対照ＡｄｘＤＣに比して、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍への高い取り込みを示す。
【００３３】
【図２２】図２２は、マウスに０.２２μM／kgの３Ｈ  ＲＧＥ＿ＡｄｘＤＣ(対照、非ＧＰＣ３結合ＡｄｘＤＣ)を投与０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後に採ったマウス組織のＱＷＢＡを示し、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣに比して、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍への低い取り込みを示す。
【００３４】
【図２３】図２３は、マウスに３Ｈ  ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣまたは非結合ＡｄｘＤＣ対照(“ＲＧＥ＿ＡＤｘＤＣ”)を投与０.１７時間、１時間、５時間、２４時間、４８時間および１６８時間後の種々のマウス組織における総放射能濃度を示す。各組織についての棒は、先のセンテンスに示した順で示す。
【００３５】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、１０nM(図２４Ａ)または１nM(図２４Ｂ)ヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＧのＢＣループ(配列番号９８のアミノ酸１５〜２１)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＢＣループの配列は、配列番号１のアミノ酸１５〜２１に示す。
【００３６】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、１０nM(図２５Ａ)または１nM(図２５Ｂ)ヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡのＢＣループ(配列番号９８のアミノ酸１５〜２１)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＢＣループの配列は、配列番号１のアミノ酸１５〜２１に示す。
【００３７】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、１０nM(図２６Ａ)または１nM(図２６Ｂ)ヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＧのＤＥループのヒートマップを示す。ｗｔ  ＤＥループの配列は、配列番号１のアミノ酸５２〜５５に示す。
【００３８】
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、１０nM(図２７Ａ)または１nM(図２７Ｂ)ヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡのＤＥループのヒートマップを示す。ｗｔ  ＤＥループの配列は、配列番号１のアミノ酸５２〜５５に示す。
【００３９】
【図２８】図２８は、１０nMヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＧのＦＧループ(配列番号９８のアミノ酸６９〜７９)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＦＧループの配列は、配列番号１のアミノ酸７７〜８７に示す。
【００４０】
【図２９】図２９は、１nMヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＧのＦＧループ(配列番号９８のアミノ酸６９〜７９)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＦＧループの配列は、配列番号１のアミノ酸７７〜８７に示す。
【００４１】
【図３０】図３０は、１０nMヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡのＦＧループ(配列番号９８のアミノ酸６９〜７９)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＦＧループの配列は、配列番号１のアミノ酸７７〜８７に示す。
【００４２】
【図３１】図３１は、１nMヒトグリピカン−３−ビオチンを使用するポジショナルスキャニングにより得たＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡのＦＧループ(配列番号９８のアミノ酸６９〜７９)のヒートマップを示す。ｗｔ  ＦＧループの配列は、配列番号１のアミノ酸７７〜８７に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここに使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により共通して理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類似のまたは等価なあらゆる方法および組成物を、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および組成物は、ここに記載される。
【００４４】
用語“グリピカン−３”、“グリピカンプロテオグリカン３”、“ＧＰＣ３”、“OTTHUMP00000062492”、“ＧＴＲ２−２”、“ＳＧＢ”、“ＤＧＳＸ”、“ＳＤＹＳ”、“ＳＧＢＳ”、“ＯＣＩ−５”および“ＳＧＢＳ１”は相互交換可能に使用され、ヒトグリピカン−３のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログを含む。例示的ヒトグリピカン−３の完全アミノ酸配列は、Genbank/NCBI accession number NM_004484(配列番号３４４)を有する。
【００４５】
“アミノ酸残基”は、ペプチド結合の形成において、水分子(窒素側からＨ＋およびカルボン酸側からＯＨ−)が除かれた後のアミノ酸の残存部分をいう。
【００４６】
“ポリペプチド”は、長さ、翻訳後修飾または機能と関係なく、２以上のアミノ酸のあらゆる配列をいう。ポリペプチドは、引用により本明細書に包含させる米国特許６,５５９,１２６号に記載のもののような、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた多様な標準的化学的方法の何れでも修飾してよい(例えば、アミノ酸を保護基で保護できる；カルボキシ末端アミノ酸を、末端アミド基にできる；アミノ末端残基を、例えば、親油性を増強する基で修飾できる；またはポリペプチドを、化学的グリコシル化または他に修飾して安定性またはインビボ半減期を増大できる)。ポリペプチド修飾は、環状化合物または他の分子のような他の構造のポリペプチドへの結合を含んでよく、改変された配置(すなわち、ＲもしくはＳまたはＬもしくはＤ)の１以上のアミノ酸を含むポリペプチドも含み得る。
【００４７】
“単離”ポリペプチドは、同定されており、その天然環境の成分から分離および／または回収されているものである。その天然環境の混入成分は、ポリペプチドの診断または治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。ある実施態様において、ポリペプチドは、(１)ローリー法で決定して、ポリペプチドの９５重量％を超えて、最も好ましくは９９重量％を超えて、(２)スピニング・カップ配列決定機器の使用により少なくともＮ末端または内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度までまたは(３)クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を使用する還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製する。
【００４８】
ここで使用する“１０Ｆｎ３ドメイン”または“１０Ｆｎ３部分”または“１０Ｆｎ３分子”は、野生型１０Ｆｎ３およびその生理活性バリアント、例えば、標的タンパク質のような標的に特異的に結合する生理活性バリアントをいう。野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み得る。野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの生理活性バリアントは、配列番号１を含む１０Ｆｎ３ドメインに比して、少なくとも、最大または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸変化、すなわち、置換、付加または欠失を含む、１０Ｆｎ３ドメインである。
【００４９】
“アドネクチン”または“Ａｄｘ”または“アドネクチン”または“ａｄｘ”は、標的に特異的に結合するように修飾されている(野生型配列に対して)、ヒト１０Ｆｎ３分子をいう。
【００５０】
“ＧＰＣ３アドネクチン”または“抗ＧＰＣ３アドネクチン”は、例えば、１μM以下のＫＤで、ＧＰＣ３に特異的に結合するアドネクチンをいう。
【００５１】
ここで使用する１０Ｆｎ３ドメイン(または部分または分子)の“領域”は、ループ(ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ)、βストランド(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ)、Ｎ末端(配列番号１のアミノ酸残基１〜７に対応)またはＣ末端(配列番号１のアミノ酸残基９３〜９４に対応)の何れかをいう。
【００５２】
１０Ｆｎ３ドメイン(または部分)の“北極ループ”は、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの何れか一つをいう。
【００５３】
１０Ｆｎ３ドメイン(または部分)の“南極ループ”は、１０Ｆｎ３ドメインのＡＢ、ＣＤおよびＥＦループの何れか一つをいう。
【００５４】
“足場領域”は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインのあらゆる非ループ領域をいう。足場領域は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ  βストランドならびにＮ末端領域(配列番号１の残基１〜７に対応するアミノ酸)およびＣ末端領域(配列番号１の残基９３〜９４に対応するアミノ酸)を含む。
【００５５】
ここでの“パーセント(％)アミノ酸配列同一性”は、配列をアラインし、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後の、選択配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義し、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性決定目的でのアラインメントは、当分野における技術範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴＳＭ、ＢＬＡＳＴＳＭ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ(登録商標))ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアの使用により、達成できる。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含む、アラインメント測定のための適当なパラメータを決定できる。
【００５６】
ここでの目的のために、あるアミノ酸配列Ａの、あるアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性(これは、別法として、あるアミノ酸配列Ｂに対してある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含むあるアミノ酸配列Ａと表記できる)を、次のとおり計算する。１００×分数Ｘ／Ｙ(式中、ＸはＢＬＡＳＴＳＭ、ＢＬＡＳＴＳＭ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ(登録商標))のような配列アラインメントプログラムにより、そのプログラムのＡおよびＢのアラインメントで同一マッチとして採点されたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂにおける総アミノ酸残基数である)。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくないとき、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないことは認められる。
【００５７】
ここで使用する用語“アドネクチン結合部位”は、特定のアドネクチンと相互作用または結合する、タンパク質(例えば、ＧＰＣ３)の部位または部分をいう。アドネクチン結合部位は、連続アミノ酸またはタンパク質の三次折りたたみにより並置された非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸により形成されたアドネクチン結合部位は、典型的に変性溶媒に曝されても維持されるが、一方三次折りたたみにより形成されたアドネクチン結合部位は、典型的に変性溶媒での処理により喪失する。
【００５８】
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンに対するアドネクチン結合部位は、プロテアーゼマッピングおよび変異解析を含むが、これらに限定されない抗体のエピトープマッピングのために典型的に使用される標準的技法により決定され得る。
【００５９】
ここで使用する、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基は、(１)残基の側鎖または主鎖の非水素原子何れかが、複合体の実験的に決定した三次元構造に基づき、結合標的の原子の何れかの５オングストローム内に見られるときおよび／または(２)残基の野生型１０Ｆｎ３(例えば、配列番号１)におけるその均等物への、アラニンへのまたは当該残基と類似サイズのまたは小さい側鎖を有する残基への変異が、標的に対する測定された平衡解離定数の増加(例えば、ｋｏｎの増加)をもたらすならば、標的への“結合に貢献する”とみなされる。
【００６０】
ＧＰＣ３に結合するＦＢＳの文脈においてここで相互交換可能に使用する用語“特異的に結合する”、“特異的結合”、“選択的結合”および“選択的に結合する”は、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、BIACOREアッセイ)のような、しかしこれらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、ＧＰＣ３に対して親和性を示すが、異なるポリペプチドには顕著に結合しない(例えば、約１０％未満の結合)、ＦＢＳをいう。本用語はまた、例えば、ここに記載するＦＢＳの結合ドメインが、１以上の種(例えば、ヒト、齧歯類、霊長類)からのＧＰＣ３に特異的であるが、他のグリピカン類(例えば、グリピカン−１、グリピカン−２、グリピカン−５、グリピカン−６)とは交差反応しない場合にも適用可能である。
【００６１】
ＧＰＣ３に結合するアドネクチン類の文脈においてここで使用する用語“優先的に結合する”は、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、BIACOREアッセイ)のような、しかしこれらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、ここに記載するアドネクチンが、異なるポリペプチドよりも少なくとも約２０％を超えてＧＰＣ３に結合する状況をいう。
【００６２】
例えば、ＧＰＣ３に結合するアドネクチン類の文脈において、ここで使用する用語“ＫＤ”は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して、特定のアドネクチン−タンパク質(例えば、ＧＰＣ３)相互作用またはアドネクチンのタンパク質(例えば、ＧＰＣ３)に対する親和性の解離平衡定数をいう。ここで使用する“所望のＫＤ”は、意図する目的に十分であるアドネクチンのＫＤをいう。例えば、所望のＫＤは、インビトロアッセイ、例えば、細胞ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて機能効果をもたらすのに必要なアドネクチンのＫＤを意味し得る。
【００６３】
タンパク質に結合するアドネクチン類の文脈においてここで使用する用語“ｋａ”は、アドネクチンのアドネクチン／タンパク質複合体への会合の会合速度定数を意味することを意図する。
【００６４】
タンパク質に結合するアドネクチン類の場合にここで使用する用語“ｋｄ”は、アドネクチン／タンパク質複合体からのアドネクチンの解離の解離速度定数であることを意図する。
【００６５】
アドネクチン類の場合にここで使用する用語“ＩＣ５０”は、インビトロまたはインビボアッセイの何れかで、最大阻害応答の５０％レベル、すなわち、最大阻害応答と未処理応答の半分まで応答を阻害するアドネクチンの濃度をいう。
【００６６】
ここで使用する用語“グリピカン活性”または“グリピカン−３”活性は、ＧＰＣ３による細胞シグナル伝達の活性化、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化と関係する、増殖調節または形態形成活性の１以上をいう。例えば、ＧＰＣ３は、腫瘍細胞増殖を、Ｗｎｔおよび／またはＦｒｉｚｚｅｌｅｄタンパク質との複合体形成により調節し得る。ＧＰＣ３はまたＦＧＦとの相互作用により、シグナル伝達経路および腫瘍細胞増殖を活性化し得る。ＧＰＣ３活性は、ここに記載するもののような、当分野で承認されている方法を使用して決定できる。用語“グリピカン−３活性”または“グリピカン−３活性に拮抗する”または“グリピカン−３に拮抗する”は、ここに提供する抗ＧＰＣ３  ＦＢＳおよび抗ＧＰＣ３薬物コンジュゲートが、インビボまたはインビトロでＧＰＣ３の活性を中和または拮抗する能力をいうために、相互交換可能に使用される。抗ＧＰＣ３  ＦＢＳの活性にcanしてここで使用する用語“阻害”または“中和”は、生物活性または特性、疾患または状態(例えば、腫瘍細胞増殖)を含むが、これらに限定されない、阻害するものの、例えば、進行または重症度の実質的に拮抗、阻止、防止、制限、遅延、中断、排除、停止、低減または逆転をする能力を意味する。阻害または中和は、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上である。
【００６７】
ここで使用する用語“結合”は、２以上の分子の関係をいう。結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。結合はポリペプチドと化学基または他のポリペプチド部分の間であり得る。結合はまた遺伝子的(すなわち、組み換えにより融合)であり得る。このような結合は、化学的コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質産生のような多種多様な当分野で認められている技法を使用して、達成できる。
【００６８】
用語“ＰＫ”は、“薬物動態”に関する頭字語であり、対象による、例として、吸収、分布、代謝および排泄を含む、化合物の特性を包含する。ここで使用する“ＰＫ調節タンパク質”または“ＰＫ部分”は、生物活性分子に融合したまたはそれと共に投与したとき、生物活性分子の薬物動態特性に影響するあらゆるタンパク質、ペプチドまたは部分をいう。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例は、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合剤(米国公開２００５／０２８７１５３号および２００７／０００３５４９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８３８０４号およびＷＯ２００９／１３３２０８号に開示)、ヒト血清アルブミンおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、ＦｃまたはＦｃそのフラグメントおよびバリアントおよび糖(例えば、シアル酸)を含む。
【００６９】
ポリペプチドの血清または血漿“半減期”は、一般に、例えば、天然機構によるポリペプチドの分解および／またはポリペプチドのクリアランスまたは隔離による、インビボで、ポリペプチド血清濃度の５０％減少にかかる時間として定義され得る。半減期は、薬物動態分析によるような、それ自体既知の方法で決定し得る。適当な技法は当業者に明らかであり、例えば、一般に適当な用量のポリペプチドの霊長類への投与、一定間隔での該霊長類からの血液サンプルまたは他のサンプル採取、該血液サンプルにおけるポリペプチドのレベルまたは濃度決定およびこうして得たデータ(のプロット)からの、ポリペプチドのレベルまたは濃度が投与による初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間の計算の工程を含む。半減期を決定する方法は、例えば、Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists (1986); Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996); and Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, Second Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)に記載される。
【００７０】
血清半減期は、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積(ＡＵＣ)のようなパラメータを使用して表し得る。“半減期延長”は、これらのパラメータの何れか一つ、これらのパラメータの何れか二つまたはこれらのパラメータの全三つの延長をいう。ある実施態様において、半減期延長は、ｔ１／２−アルファおよび／またはＡＵＣまたは両方の延長を伴うまたは伴わない、ｔ１／２−ベータおよび／またはHL_Lambda_zの延長をいう。
【００７１】
用語“検出可能”は、背景シグナルを超えてシグナルを検出する能力をいう。用語“検出可能シグナル”は、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を含むが、これに限定されない非侵襲的イメージング技法由来のシグナルをいう。検出可能シグナルは、対象から産生され得る他の背景シグナルから検出可能および区別可能であり得る。換言すると、検出可能シグナルと背景の測定可能なおよび統計的に有意な差(例えば、統計的に有意な差は、検出可能シグナルと背景の約０.１％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または４０％またはそれ以上のような、検出可能シグナルおよび背景の区別のために十分な差)がある。標準および／または較正曲線を使用して、検出可能シグナルおよび／または背景の相対強度を決定できる。
【００７２】
ここに記載する造影剤を含む組成物の“検出可能とする有効量”は、臨床用途に利用可能な機器を使用して許容できる画像を作成するのに十分な量として定義される。ここに提供する造影剤の検出可能とする有効量は、１回以上の注射で投与され得る。検出可能とする有効量は、個体の感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、個体の特異的応答などのような因子により変わり得る。造影組成物の検出可能とする有効量はまた使用する計器および方法によっても変わり得る。このような因子の最適化は、十分に当分野における技術レベル内である。ある実施態様において、ＧＰＣ３造影剤、例えば、ここに記載のものは、２以上、例えば、３、４、５以上の区別化係数(すなわち、特異的シグナル対背景シグナル)を提供する。
【００７３】
ここで相互交換可能に使用する用語“個体”、“対象”および“患者”は、動物、好ましくは哺乳類(非霊長類および霊長類を含む)、例えば、ヒトをいう。
【００７４】
“癌”は、体内の異常細胞の無制御の増殖により特徴付けられる広範な群の種々の疾患をいう。無制御の細胞分裂および成長分裂および増殖は、近隣組織を侵襲し、またリンパ系または血流を介して身体の遠位部分に転移もし得る悪性腫瘍の形成をもたらす。
【００７５】
対象の“処置”または“治療”は、疾患と関係する症状、合併症、状態または生化学的兆候の発症、進行、進展、重症度または再発の後退、軽減、改善、阻止、減速または防止を目的とする、対象に実施されるあらゆるタイプの介入もしくは過程または活性剤の投与をいう。
【００７６】
抗ＧＰＣ３アドネクチン類の場合にここで使用する“投与”または“投与する”は、対象へのここに記載するＧＰＣ３アドネクチンまたはＧＰＣ３アドネクチンベースのプローブまたは標識プローブ(“造影剤”とも称する)の導入をいう。あらゆる投与経路が適し、例えば、静脈内、経口、局所、皮下、腹腔内、動脈内、吸入、経腟、経直腸、経鼻、脳脊髄内への導入または体区画への注入が使用され得る。
【００７７】
ここで使用する用語“共投与”などは、選択した複数薬物の一患者への投与を包含することを意図し、これら薬物を同一または異なる投与経路でまたは同一または異なる時点で投与するレジメンを含むことを意図する。
【００７８】
用語“治療有効量”は、対象に治療効果を与えるのに必要な薬物の、少なくとも最小用量であるが、毒性用量未満である量をいう。
【００７９】
ここで使用する“有効量”は、所望の結果の達成に、必要な用量および期間の点で、少なくとも有効である量をいう。
【００８０】
ここで使用する“十分量”は、所望の結果の達成に十分な量をいう。
【００８１】
用語“サンプル”は、組織サンプル、細胞サンプル、体液サンプルなどをいう。サンプルは対象から採取し得る。組織サンプルは、毛髪(毛根を含む)、口腔粘膜検体、血液、唾液、精液、筋肉を含むまたは何れかの内部臓器からのものであり得る。体液は、尿、血液、腹水、胸水、髄液などであり得るが、これらに限定されない。身体組織は、皮膚、筋肉、子宮内膜、子宮および子宮頸部組織であり得るが、これらに限定されない。
【００８２】
概要
ここに提供されるのは、ヒトグリピカン−３に結合する新規フィブロネクチンベース足場ポリペプチドである。このようなポリペプチドを他の治療剤および診断剤と結合でき、例えば、グリピカン−３を発現する細胞および組織(例えば、グリピカン−３を過発現する癌細胞)を治療剤および診断剤にターゲティングさせるのに有効である。
【００８３】
Ｉ. 抗ＧＰＣ３フィブロネクチンベース足場
ここで使用する“フィブロネクチンベース足場”または“ＦＢＳ”タンパク質または部分は、フィブロネクチンIII型(“Ｆｎ３”)反復に基づき、ある標的、例えば、標的タンパク質に特異的に結合するように修飾できる、タンパク質または部分をいう。Ｆｎ３は、免疫グロブリン(Ｉｇ)折畳み構造(すなわち、７βストランドおよび６ループからなるＩｇ様βサンドイッチ構造)を有する、小(約１０kDa)ドメインである。フィブロネクチンは１８個のＦｎ３反復を有し、反復間の配列相同性は低いが、これらは全て高度に類似する三次構造を共有する。Ｆｎ３ドメインはまた接着分子、細胞表面分子、例えば、サイトカイン受容体および糖結合ドメインのようなフィブロネクチン以外の多くのタンパク質にも存在する。レビューとして、Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992); Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994); Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994); Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994)参照のこと。用語“ＦＢＳ”タンパク質または部分は、これら他のタンパク質(すなわち、非フィブロネクチン分子)からのＦｎ３ドメインに基づく足場を含むことを意図する。
【００８４】
Ｆｎ３ドメインは、小さく、単量体であり、可溶性であり、かつ安定である。ジスルフィド結合を欠き、それゆえに、還元条件下安定である。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ベータまたはベータ様ストランドＡ、ループＡＢ、ベータまたはベータ様ストランドＢ、ループＢＣ、ベータまたはベータ様ストランドＣ、ループＣＤ、ベータまたはベータ様ストランドＤ、ループＤＥ、ベータまたはベータ様ストランドＥ、ループＥＦ、ベータまたはベータ様ストランドＦ、ループＦＧおよびベータまたはベータ様ストランドＧを含む。７個の逆平行βストランドは、安定コアを形成し、同時に、ベータまたはベータ様ストランドを連結するループからなる２個の“面”を形成する２個のベータシートとして配置される。ループＡＢ、ＣＤおよびＥＦは一方の面(“南極”)に位置し、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧは逆の面(“北極”)に位置する。
【００８５】
Ｆｎ３分子におけるループは、抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)と構造的に類似し、改変されたとき、標的、例えば、標的タンパク質へのＦｎ３分子の結合に関与し得る。ベータまたはベータ様ストランドおよびＮ末端またはＣ末端領域のようなＦｎ３分子の他の領域は、改変されたとき、また標的への結合に関与し得る。何れかのまたは全てのループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧが、標的への結合に参加し得る。ベータまたはベータ様ストランドの何れも、標的への結合に参加し得る。Ｆｎ３ドメインはまた１以上のループおよび１以上のベータまたはベータ様ストランドを介して標的に結合し得る。結合はまたＮ末端またはＣ末端領域を必要とし得る。
【００８６】
抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、１以上の溶媒露出ループが無作為化または変異されている第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、すなわち、ヒトＦｎ３の第１０モジュール(１０Ｆｎ３)に基づき得る。野生型ヒト１０Ｆｎ３部分のアミノ酸配列は次のとおりである。
【化１】
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【００８７】
ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループに下線を引き、ＢＣ、ＦＧおよびＤＥループは太字とし、βストランドはループ領域の各々の間にまたはそれらに隣接して位置し、そしてＮ末端領域は斜体で示す。配列番号１の最後の２アミノ酸残基は、Ｃ末端領域の部分である。コア１０Ｆｎ３ドメインはアミノ酸９(“Ｅ”)から始まり、アミノ酸９４(“Ｔ”)で終わり、８６アミノ酸ポリペプチドに対応する。コア野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインは配列番号２に示す。バリアントおよび野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方とも同じ構造、すなわちＡ〜Ｇと名付けられた７ベータストランドドメイン配列および７ベータストランドドメイン配列を連結する６ループ領域(ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ)により特徴づけられる。Ｎ末端およびＣ末端の最も近くに位置するベータストランドは、ベータ様高次構造を溶解に対応合させ得る。配列番号１において、ＡＢループは残基１４〜１７に対応し、ＢＣループは残基２３〜３１に対応し、ＣＤループは残基３７〜４７に対応し、ＤＥループは残基５１〜５６に対応し、ＥＦループは残基６３〜６７に対応し、ＦＧループは残基７６〜８７に対応する。
【００８８】
従って、ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ部分(例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチン)は、一般に次の変性配列：
【化２】
2018533369.tif 000003
またはそれぞれ１、２、３、４、５、６または７Ｎ末端アミノ酸を欠く配列により規定される１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【００８９】
配列番号３において、ＡＢループは(Ｘ)ｕにより表され、ＢＣループは(Ｘ)ｖにより表され、ＣＤループは(Ｘ)ｗにより表され、ＤＥループは(Ｘ)ｘにより表され、ＥＦループは(Ｘ)ｙにより表され、そしてＦＧループはＸｚにより表される。Ｘは何れかのアミノ酸を表し、そしてＸ後の下付き文字は、整数でのアミノ酸の数を表す。特に、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは各々独立して２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７または６〜７の範囲のアミノ酸であり得る。ベータストランドの配列(配列番号３において下線)は、配列番号３に示す対応するアミノ酸に対して全７足場領域にわたり０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。ある実施態様において、ベータストランドの配列は、配列番号３に示す対応するアミノ酸に対して全７足場領域にわたり、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の置換、例えば、保存的置換を有し得る。
【００９０】
ループ領域内の全ての残基ではないが、所望の標的に対する強親和性を有する１０Ｆｎ３結合ドメインを達成するために修飾または改変されなければならないことが理解されるべきである。さらに、高親和性抗ＧＰＣ３  １０Ｆｎ３結合ドメインを産生する一方で、ループ領域における挿入および欠失もまたなされてよい。“改変”は、鋳型配列(すなわち、対応する野生型ヒトフィブロネクチンドメイン)に対する１以上のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失、置換またはこれらの組み合わせを含む。
【００９１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ部分は、非ループ領域が配列番号１の非ループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１ループが改変されている、１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【００９２】
ある実施態様において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される１以上のループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３における対応するループに対して、長さを短くしても長くしてもよい。何れかのポリペプチドにおいて、１以上のループの長さを伸ばしても、１以上のループの長さを短くしても、これらの組み合わせでもよい。ある実施態様において、あるループの長さは２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜２５、１０〜２０または１０〜１５アミノ酸伸ばしてよい。ある実施態様において、あるループの長さは１〜１５、１〜１１、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、２〜１０または２〜５アミノ酸短くしてよい。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループは１３残基長であり、一方抗体重鎖における対応するループは４〜２８残基の範囲である。それゆえに、ある実施態様において、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、ポリペプチドにおいて、標的結合に対するＦＧに依存して、可能な限り最大の柔軟性および標的親和性を得るために、長さならびに配列を改変し得る。
【００９３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ部分は第十フィブロネクチンIII型(１０Ｆｎ３)ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインはループ、ＡＢ、ループ、ＢＣ、ループ、ＣＤ、ループ、ＤＥ、ループＥＦおよびループＦＧを含み、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列に対して、改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１ループを有する。ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンは、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１または２の非ループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１ループは改変されている。ある実施態様において、ＢＣおよびＦＧループは改変されており、ある実施態様において、ＢＣおよびＤＥループは改変されており、ある実施態様において、ＤＥおよびＦＧループは改変されており、そしてある実施態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは改変されており、すなわち、１０Ｆｎ３ドメインは天然に存在しないループを含む。ある実施態様において、ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループは改変されている。ある実施態様において、１以上の特異的足場改変は１以上のループ改変と組み合わされる。
【００９４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  １０Ｆｎ３の非リガンド結合配列は、１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造的安定性を維持するならば、改変され得る。ある実施態様において、１０Ｆｎ３ドメインの非ループ領域は１以上の保存的置換により修飾され得る。１０Ｆｎ３ドメインのアミノ酸の５％、１０％、２０％または３０％以上ほども多くが、リガンドに対する１０Ｆｎ３の親和性を実質的に変えることなく、保存的置換により改変され得る。ある実施態様において、非ループ領域、例えば、βストランドは、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２〜１５、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、５〜１５または５〜１０の範囲の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的実施態様において、足場修飾は、１０Ｆｎ３結合剤のリガンドに対する結合親和性を、１００倍、５０倍、２５倍、１０倍、５倍または２倍未満減少させ得る。このような変化は、インビボで１０Ｆｎ３の免疫原性を変え得るものであり、免疫原性が低減されるとき、このような変化は望ましいものであり得る。ここで使用する“保存的置換”は、対応する対照残基と物理的または機能的に類似する残基である。すなわち、保存的置換およびその対照残基は類似するサイズ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する。保存的置換の例は、Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 (1978 and Supp.)における許容される点変異について定義された基準を満たすものを含む。保存的置換の例は、次の群内の置換を含む。(ａ)バリン、グリシン；(ｂ)グリシン、アラニン；(ｃ)バリン、イソロイシン、ロイシン；(ｄ)アスパラギン酸、グルタミン酸；(ｅ)アスパラギン、グルタミン；(ｆ)セリン、トレオニン；(ｇ)リシン、アルギニン、メチオニン；および(ｈ)フェニルアラニン、チロシン。
【００９５】
ある実施態様において、Ａｓｐ  ７、Ｇｌｕ  ９およびＡｓｐ  ２３の１以上が、例えば、非負荷電アミノ酸残基(例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど)のような他のアミノ酸に置き換えられる。１０Ｆｎ３足場における有利なまたは中立である多様な付加的改変が開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (December 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)参照。
【００９６】
他の実施態様において、疎水性コアアミノ酸残基(上記配列番号３で太字の残基)は固定され、何らかの置換、保存的置換、欠失または付加は、１０Ｆｎ３足場における疎水性コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。それ故に、ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドの疎水性コア残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン(例えば、配列番号１)に対して修飾されていない。
【００９７】
１０Ｆｎ３分子は、Ｆｎ３ドメインの第１０および第１１反復の間に可動性リンカー、すなわち、ＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号３６９)を含んでよい。Ｃ末端にＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号３６９)を有する野生型１０Ｆｎ３ポリペプチドは、
【化３】
2018533369.tif 000004
で表される。
【００９８】
ある実施態様において、インテグリン結合モチーフ“アルギニン−グリシン−アスパラギン酸”(ＲＧＤ)(配列番号１のアミノ酸７８〜８０)の１以上の残基を、インテグリン結合を破壊するように置換してよい。ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドのＦＧループはＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。ある実施態様において、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列(Ｎ末端からＣ末端方向で)により置き換えられる。ある実施態様において、ＲＧＤ配列はＳＧＥまたはＲＧＥにより置き換えられる。
【００９９】
Ａ. 抗ＧＰＣ３アドネクチン類例
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ(例えば、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合するアドネクチン)のＢＣループは、配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９に示すアミノ酸配列を含み、所望により、ＢＣループは、配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９のＢＣループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含む。
【０１００】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳのＤＥループは、配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００に示すアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＤＥループは、配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００のＤＥループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含む。
【０１０１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳのＦＧループは配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８に示すアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＦＧループは、配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８のＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含む。
【０１０２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン(すなわち、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合するアドネクチン)のＢＣループは配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９に示すアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＢＣループは、配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９のＢＣループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含み、抗ＧＰＣ３アドネクチンのＤＥループは配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００に示すアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＤＥループは、配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００のＤＥループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含み、そして抗ＧＰＣ３  ＦＢＳのＦＧループは配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８に示すアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＦＧループは、配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８のＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換、欠失または挿入を含む。
【０１０３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ；および配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８に示すアミノ酸配列を含むＦＧループを含む。
【０１０４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、それぞれ、配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９；７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００；および８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含み、ＦＢＳがＧＰＣ３への結合を維持することを可能とするアミノ酸置換をＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに有する。
【０１０５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ、配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ配列番号６、７および８に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１０７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン(例えば、ヒト１０Ｆｎ３を含む抗ＦＢＳ部分)は配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１０８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号１９、２０および２１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ配列番号１９、２０および２１に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１１１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号３２、３３および３４に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号３２、３３および３４に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号３２、３３および３４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１１４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号４５、４６および４７に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループｃはそれぞれ配列番号４５、４６および４７に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１１７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号５８、５９および６０に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配を有する。
【０１１８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはアミノそれぞれ配列番号５８、５９および６０に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号５８、５９および６０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１２０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号７１、７２および７３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１２１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号７１、７２および７３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号７１、７２および７３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１２３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号８４、８５および８６に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ配列番号８４、８５および８６に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号８４、８５および８６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１２６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
ある実施態様において、ｔｈｅ抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＦＧループは、０、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１２９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１２９に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１２９のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１３１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１５６に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１５６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１３３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１８３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および１８３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１３５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２１０に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２１０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１３７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２３７に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２３７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１３９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２６４に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１４０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２６４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１４１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２９１に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１４２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および２９１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１４３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、１００および３１８に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣループは、０、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有し、ＤＥループは、０、１、２または３アミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する。
【０１４４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは配列番号３に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループｈａｖｉｎｇそれぞれ配列番号９９、１００および３１８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
【０１４５】
このような抗ＧＰＣ３アドネクチン類の足場領域は、配列番号３の足場アミノ酸残基と比較して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このような足場修飾は、抗ＧＰＣ３アドネクチンが所望のＫＤでＧＰＣ３に結合できる限り、製造され得る。
【０１４６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、ここに開示し、例えば、配列番号５、１８、３１、４４、５７、７０、８３および９８の何れかを有する抗ＧＰＣ３アドネクチンのものと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３の何れかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ；および配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号１９、２０および２１に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ；および配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号３２、３３および３４に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ；および配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号４５、４６および４７に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ；および配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号５８、５９および６０に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号７１、７２および７３に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号８４、８５および８６に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および１２９に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および１２９に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および１５６に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および１８３に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および２１０に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および２３７に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および２６４に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および２９１に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、それぞれ配列番号９９、１００および３１８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループおよび配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３または９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３、９８、１２８、１５５、１８２、２０９、２０９、２３６、２６３、２９０および３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、さらに、ＰｍＸｎ、ＰｍＣＸｎおよびＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなる群から選択されるＣ末端部分(ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍ、ｎ、ｎ１およびｎ２は独立して０であるかまたは１、２、３、４、５以上の整数である)を含む。
【０１６８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号９８、１０２〜１２８、１２９〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望によりＣ末端に１以上のヒスチジン(例えば、６ｘＨｉｓ)がある。
【０１７０】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号１０２〜１２７の群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号１１４〜１１８を含む。他の実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号１２３〜１２７を含む。
【０１７１】
ここに提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１、すなわち、配列番号９９、１００および１０１のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含む。ここに提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチド、ここで、ポリペプチドは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含む。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチド、ここで、ポリペプチドは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、ＦＧループにおける２アミノ酸残基ＤＧの一方が他のアミノ酸で置換されている。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチド、ここで、ポリペプチドは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、ＦＧループにおけるＤＧのアミノ酸残基Ｄ(すなわち、Ｄ７８；ナンバリングは配列番号１０２のものに対応)が、他のアミノ酸、例えば、Ｅ、Ｓ、ＡおよびＧに置換されている。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチド、ここで、ポリペプチドは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、ＦＧループにおけるＤＧのアミノ酸残基Ｇ(すなわち、Ｄ７９)が、他のアミノ酸残基、例えば、Ｓ、Ａ、ＬまたはＶで置換されている。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチド、ここで、ポリペプチドは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８を含むＦＧループを含む１０Ｆｎ３ドメインを含む。この段落に記載するポリペプチドの何れもポリペプチドのＣ末端に直接的または間接的に結合するシステイン残基を含んでよくおよび／またはポリペプチドのＣ末端に直接的または間接的に結合する次のアミノ酸残基または配列の一つを含んでよい：Ｐ、ＰＣ、ＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)またはＰＣＰＰＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)。
【０１７２】
また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含む。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループまたはＤＧの１アミノ酸においてそれと異なるものを含む。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドは、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８を含むＦＧループを含む。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドはＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、さらに、ポリペプチドのＣ末端に直接的または間接的に結合するシステイン残基を含む。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３に１０−７以下のＫＤで特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、ポリペプチドは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、さらに、ポリペプチドのＣ末端に直接的または間接的に結合する次のアミノ酸残基または配列の一つ：Ｐ、ＰＣ、ＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)またはＰＣＰＰＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)を含む。
【０１７３】
ここに提供されるのは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１またはＡＤＸ＿６９１２＿Ｇ０２(Ｎ末端メチオニンを伴うまたは伴わない)のアミノ酸配列を含み、６ｘＨｉｓテイルを伴うまたは伴わないポリペプチドである。
【０１７４】
またここに提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１、すなわち、配列番号９９、１００および１０１のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。ここに提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含み、ここで、ＦＧループにおける２アミノ酸残基ＤＧの一方が他のアミノ酸で置換されている、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含み、ここで、ＦＧループにおけるＤＧのアミノ酸残基Ｄ(すなわち、Ｄ７８；ナンバリングは配列番号１０２のものに対応)が、他のアミノ酸、例えば、Ｅ、Ｓ、ＡおよびＧに置換されている、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループを含み、ここで、ＦＧループにおけるＤＧのアミノ酸残基Ｇ(すなわち、Ｄ７９)が、他のアミノ酸残基、例えば、Ｓ、Ａ、ＬまたはＶで置換されている、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８を含むＦＧループを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。この段落に記載する１０Ｆｎ３タンパク質の何れもそのＣ末端に直接的または間接的に結合するシステイン残基を含んでよくおよび／またはＣ末端に直接的または間接的に結合する次のアミノ酸残基または配列の一つを含んでよい：Ｐ、ＰＣ、ＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)またはＰＣＰＰＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)。
【０１７５】
また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含み、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１を含むＦＧループまたはＤＧの１アミノ酸においてそれと異なるものを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含み、配列番号９９を含むＢＣループ、配列番号１００を含むＤＥループおよび配列番号１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８を含むＦＧループを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、さらに、そのＣ末端に直接的または間接的に結合するシステイン残基を含む、１０Ｆｎ３タンパク質である。また提供されるのは、ヒトＧＰＣ３と１０−７以下のＫＤで特異的に結合し、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１コア配列、すなわち、配列番号９８またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるまたはそれと１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)、欠失または付加により異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、さらに、そのＣ末端に直接的または間接的に結合する次のアミノ酸残基または配列の一つを含む、１０Ｆｎ３タンパク質である：Ｐ、ＰＣ、ＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)またはＰＣＰＰＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)。
【０１７６】
ここに提供されるのは、ＡＤＸ＿６０７７＿Ａ０１またはＡＤＸ＿６９１２＿Ｇ０２(Ｎ末端メチオニンを伴うまたは伴わない)のアミノ酸配列を含み、６ｘＨｉｓテイルを伴うまたは伴わない１０Ｆｎ３タンパク質である。
【０１７７】
また提供されるのは、ツブリシンアナログのような薬物部分にコンジュゲートした、上記段落に記載したポリペプチドまたは１０Ｆｎ３タンパク質の一つを含む薬物コンジュゲートである。
【０１７８】
さらに提供されるのは、Ｃ末端に１以上のシステインを含む１０Ｆｎ３ドメインを含む１０Ｆｎ３タンパク質またはポリペプチドであり、ここで、少なくとも１個のシステインがここに記載するツブリシンアナログにコンジュゲートする。例えば、１０Ｆｎ３ドメインを含む１０Ｆｎ３タンパク質またはポリペプチドは、アミノ酸配列ＰｍＣｎ(ここで、ｍおよびｎは独立して１以上の整数である)を含むペプチドに結合でき、ここで、１以上のシステインがここに記載するツブリシンアナログにコンジュゲートする。
【０１７９】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類の何れか一つのＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループアミノ酸配列(例えば、配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３)は、非１０Ｆｎ３ドメインタンパク質足場に移植される。例えば、ループアミノ酸配列の１以上は、抗重鎖または軽鎖の１以上のＣＤＲループまたはそのフラグメントと交換されるか、またはそれに挿入される。他の実施態様において、１以上のアミノ酸ループ配列が交換されたまたは挿入されたタンパク質ドメインは、コンセンサスＦｎ３ドメイン(Centocor, US)、アンキリン反復タンパク質(Molecular Partners AG, Zurich Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd, Cambridge, MA)、単一ドメインラクダ類ナノボディ(Ablynx, Belgium)、リポカリン(例えば、アンチカリン；Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、アビマー(Amgen, CA)、アフィボディ(Affibody AG, Sweden)、ユビキチン(例えば、アフィリン；Scil Proteins GMBH, Halle, Germany)、タンパク質エピトープ模倣体(Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland)、ヘリックスバンドル 足場(例えばアルファボディ、Complix, Belgium)、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメイン(Covagen AG, Switzerland)またはアトリマー(Anaphor, Inc., CA)を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
Ｂ. 交差競合抗ＧＰＣ３アドネクチン類
また提供されるのは、ここに記載する特定の抗ＧＰＣ３アドネクチン類と、ヒトＧＰＣ３への結合について競合(例えば、交差競合)するアドネクチン類である。このような競合アドネクチン類は、標準的ＧＰＣ３結合アッセイにおけるここに記載するアドネクチン類のＧＰＣ３への結合を競合的に阻害する能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えＧＰＣ３タンパク質がプレートに固定化され、アドネクチン類の一つが蛍光標識され、非標識アドネクチン類が標識アドネクチンの結合と競合して外す能力が評価される、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用できる。
【０１８１】
ある実施態様において、競合的ＥＬＩＳＡ形式を実施して、２個の抗ＧＰＣ３アドネクチン類がＧＰＣ３の重複アドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる。ある形式において、アドネクチン＃１をプレート上に被覆し、次いでこれを遮断および洗浄する。このプレートに、ＧＰＣ３単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベートしたＧＰＣ３を添加する。適当なインキュベーション時間の後、プレートを洗浄し、ビオチニル化抗ＧＰＣ３ポリクローナル抗体のようなポリクローナル抗ＧＰＣ３抗体でプローブし、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートおよび標準的テトラメチルベンジジン発色法で検出する。ＯＤシグナルがアドネクチン＃２でプレインキュベートしたものとしていないもので同じであるならば、２個のアドネクチン類は互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、ＧＰＣ３／アドネクチン＃２混合物添加ウェルのＯＤシグナルがＧＰＣ３単独添加のものより低いならば、アドネクチン＃２の結合は、アドネクチン＃１のＧＰＣ３への結合により遮断されると確認される。
【０１８２】
あるいは、同様の実験を表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ、例えば、Biacore)で実施できる。アドネクチン＃１をＳＰＲチップ表面に固定し、続いてＧＰＣ３単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベートしたＧＰＣ３を注入する。ＧＰＣ３／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルがＧＰＣ３単独のものと同程度以上であるならば、２個のアドネクチン類は互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、ＧＰＣ３／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルがＧＰＣ３単独の結合シグナルより低いならば、アドネクチン＃２の結合は、アドネクチン＃１のＧＰＣ３への結合により遮断されると確認される。これらの実験の特性は、飽和濃度のアドネクチン＃２の使用である。ＧＰＣ３がアドネクチン＃２で飽和されていないならば、上記結論は有効ではない。同様の実験を使用して、ある２個のＧＰＣ３結合タンパク質が重複アドネクチン結合部位に結合するかを決定できる。
【０１８３】
上に例示する両方のアッセイは逆の順番で実施してもよく、そこで、アドネクチン＃２が固定化され、ＧＰＣ３−アドネクチン＃１がプレートに添加される。あるいは、アドネクチン＃１および／または＃２をモノクローナル抗体および／または可溶性受容体−Ｆｃ融合タンパク質に置き換えてよい。
【０１８４】
他の実施態様において、競合をＨＴＲＦサンドイッチアッセイを使用して決定できる。
【０１８５】
候補競合抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンのＧＰＣ３への結合を少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％阻害できおよび／またはそれらの結合は少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％阻害され得る。％競合は、上記方法を使用して決定できる。
【０１８６】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類と競合する分子はアドネクチンである必要はなく、抗体、小分子、ペプチドなどを含むが、これらに限定されないＧＰＣ３に結合するあらゆるタイプの分子であり得る。
【０１８７】
ある実施態様において、アドネクチンは、特定のここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンとＧＰＣ３上の同じアドネクチン結合部位に結合する。プロテアーゼマッピング、変異解析、ＨＤＸ−ＭＳ、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴のような標準的マッピング技法を使用して、アドネクチンが対照アドネクチンと同じアドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。
【０１８８】
ある実施態様において、ここに提供する抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、ヒトＧＰＣ３上の不連続アドネクチン結合部位に結合する。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、配列番号３４５を含むヒトＧＰＣ３(配列番号３４４)内の、例えば、１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、配列番号３４６を含むヒトＧＰＣ３(配列番号３４４)内の、例えば、１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する。他の実施態様において、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、一方が配列番号３４５を含み、他方が配列番号３４６を含む、例えば、１０〜２０アミノ酸残基の２領域に結合する。
【０１８９】
Ｃ. Ｎ末端およびＣ末端修飾抗ＧＰＣ３アドネクチン類
ある実施態様において、アドネクチンのＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１を含む、１０Ｆｎ３ドメインの対応する領域のアミノ酸配列に比して、欠失、置換または挿入により修飾される。
【０１９０】
ある実施態様において、例えば、配列番号１におけるような、例えば、“ＶＳＤ”で始まる配列を有する、アドネクチン類の最初の１、２、３、４、５、６、７、８または９残基のアミノ酸配列は、ここに提供するポリペプチドにおいて修飾または欠失され得る。例示的実施態様において、例えば、配列番号１におけるような、“ＶＳＤ”で始まる配列を有する、アドネクチン類のアミノ酸１〜７、８または９に対応するアミノ酸は、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸長を有する代替Ｎ末端領域で置き換えられる。
【０１９１】
ＰＣ３アドネクチンコア配列または  “ＶＳＤ”から始まるものに付加できる代替Ｎ末端領域の例は、(一文字アミノ酸コードで表して)Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤ(配列番号３５１)およびＧＶＳＤＶＰＲＤ(配列番号３５２)を含む。他の適当な代替Ｎ末端領域は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号３５３)、ＸｎＤＶＰＲＤＬ(配列番号３５４)、ＸｎＶＰＲＤＬ(配列番号３５５)、ＸｎＰＲＤＬ(配列番号３５６)、ＸｎＲＤＬ(配列番号３５７)、ＸｎＤＬ(配列番号３５８)またはＸｎＬを含み、ここで、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ここで、ｎ＝１のとき、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２のとき、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加されるとき、Ｍは通常開裂されて、Ｎ末端がＧとなる。他の実施態様において、代替Ｎ末端領域はアミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ(配列番号３５９)を含む。ある実施態様において、Ｎ末端伸張は、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【０１９２】
ある実施態様において、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸長を有する代替Ｃ末端領域を、例えば、配列番号１におけるような、“ＲＴ”で修了するＧＰＣ３アドネクチン類のＣ末端領域に付加できる。代替Ｃ末端領域配列の例は、例えば、ＥＩＥＫ(配列番号３６０)、ＥＧＳＧＣ(配列番号３６１)、ＥＩＥＫＰＣＱ(配列番号３６２)、ＥＩＥＫＰＳＱ(配列番号３６３)、ＥＩＥＫＰ(配列番号３６４)、ＥＩＥＫＰＳ(配列番号３６５)、ＥＩＥＫＰＣ(配列番号３６６)、ＥＩＤＫ(配列番号３６７)、ＥＩＤＫＰＣＱ(配列番号３６８)またはＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号３６９)を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなる。ある実施態様において、Ｃ末端領域はＥＩＤＫＰＣＱ(配列番号３６８)からなる。ある実施態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、ＥおよびＤ残基を含むＣ末端伸張配列に結合し、８〜５０、１０〜３０、１０〜２０、５〜１０および２〜４アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、テイル配列は、配列がＥＤの直列反復を含むＥＤベースのリンカーを含む。例示的実施態様において、テイル配列は、２〜１０、２〜７、２〜５、３〜１０、３〜７、３〜５、３、４または５  ＥＤ反復を含む。ある実施態様において、ＥＤベースのテイル配列はまた例えばＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣのような付加的アミノ酸残基も含み得る。このような配列は、一部、残基ＤおよびＫが除去されている、ＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号３６９)のような既知アドネクチンテイル配列に基づく。ある実施態様において、ＥＤベースのテイルは、ＥＤ反復前にＥ、ＩまたはＥ１残基を含む。
【０１９３】
ある実施態様において、ＮまたはＣ末端伸張配列は、既知リンカー配列(例えば、表１３における配列番号４２６〜４５１)を有する１０Ｆｎ３ドメインと結合する。ある実施態様において、配列は、薬物動態部分への結合が促進されるように、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に位置し得る。例えば、ＧＳＧＣのようなシステイン含有リンカーを、システイン残基の部位特異的ペグ化を促進するために、Ｃ末端に付加し得る。
【０１９４】
ある実施態様において、ＧＰＣ３アドネクチン類のＣ末端アミノ酸ＲＴ(すなわち、例えば、配列番号１における、アミノ酸９４)に結合できる代替Ｃ末端部分は、アミノ酸ＰｍＸｎを含み、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１である整数である。ある実施態様において、ｍは１、２、３以上であり得る。例えば、ｍは１〜３であってよくまたはｍは１〜２であり得る。“ｎ”は０、１、２、３以上であってよく、例えば、ｎは１〜３または１〜２であり得る。
【０１９５】
ＰｍＸｎ部分は、１０Ｆｎ３部分のＣ末端アミノ酸、例えば、９４番目のアミノ酸(配列番号１のアミノ酸ナンバリングに基づく)に直接結合し得る。ＰｍＸｎ部分は、１０Ｆｎ３部分の９４番目のアミノ酸にペプチド結合により結合し得る。配列番号１の最後の単一プロリン残基は、“９５Ｐｒｏ”または“Ｐｒｏ９５”または“Ｐ９５”または“９５Ｐ”と称する。
【０１９６】
ある実施態様において、ｎは０ではなく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であり得る。例えば、ｎは、０〜１０、０〜５、０〜３、１〜１０、１〜５、１〜３または１〜２であり得る。しかしながら、１０を超えるアミノ酸がプロリンに結合し得る。例えば、直列ＦＢＳ部分または他のポリペプチドと融合したＦＢＳ部分において、ＦＢＳ部分のＣ末端アミノ酸は１以上のプロリンと結合でき、最後のプロリンは第二のＦＢＳ部分または異種部分に結合する。それゆえに、ある実施態様において、ｎは、０〜１００、０〜２００、０〜３００、０〜４００、０〜５００以上の範囲の整数であり得る。
【０１９７】
ある実施態様において、ＧＰＣ３アドネクチンのＣ末端に結合するＰｍＸｎは、システインを含む。例えば、プロリンの後の最初のアミノ酸はシステインであってよく、システインは分子の最後のアミノ酸であってよくまたはシステインに１以上のアミノ酸が続いてよい。システインの存在は、異種部分、例えば、化学的部分、例えば、ＰＥＧのＦＢＳ部分へのコンジュゲーションを可能とする。システインを含むＰｍＸｎ部分の例はＰｍＣＸｎを含み、ここで、Ｃはシステインであり、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１である整数である。ある実施態様において、ｍは１、２、３以上であり得る。例えば、ｍは１〜３であってよくまたはｍは１〜２であってよい。“ｎ”は０、１、２、３以上であってよく、例えば、ｎは１〜３または１〜２であり得る。他のＰｍＸｎ部分の例は、２システイン、例えば、ＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２を含み、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である。例えば、ｎ１は１、２、３、４または５であってよく、ｎ２は１、２、３、４または５であってよい。ＰｍＸｎ部分の例は、表１に挙げるものを含む。
【表１】
2018533369.tif 000005
【０１９８】
ある実施態様において、例えば、ＰｍＸｎ部分は、ＰＣ、ＰＰＣおよびＰＣＣからなる群から選択される。他の実施態様において、ＰｍＸｎ部分はＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２である。ある実施態様において、ＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２は、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)およびＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)からなる群から選択される。
【０１９９】
ここに記載するＣ末端修飾の何れも、ＧＰＣ３アドネクチン類に適用され得る。
【０２００】
ＰｍＸｎ部分、例えば、表１に示すものの何れも、ヒスチジンテイル、例えば、６ｘＨｉｓタグまたは他のタグが続き得る。これは、ヒスチジンテイルがＰｍＸｎに含まれ得ることを除外するものではない。
【０２０１】
ある実施態様において、フィブロネクチンベース足場タンパク質は、代替Ｎ末端領域配列および代替Ｃ末端領域配列の両方および所望により６×ｈｉｓテイルを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【０２０２】
II. 多価ポリペプチド
ある実施態様において、タンパク質は、ＧＰＣ３  ＦＢＳおよび少なくとも一つの他のＦＢＳを含む。多価ＦＢＳは、共有結合している２、３以上のＦＢＳを含み得る。例示的実施態様において、ＦＢＳ部分は、２個の１０Ｆｎ３ドメインを含む、二重特異性または二量体タンパク質を含む。
【０２０３】
多価タンパク質におけるＦＢＳ部分、例えば、１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーにより結合され得る。ポリペプチドリンカー例は、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２アミノ酸を有するポリペプチドを含む。１０Ｆｎ３ドメインを連結する適当なリンカーは、互いに独立して折り畳まれ、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成する、別々のドメインを可能とするものである。適当なリンカーの具体例は、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、プロリン−アラニンベースのリンカーならびにここに記載する任意の他のリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーはグリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０および３〜２０アミノ酸長であり得る。このようなリンカーの例は、ＧＰＧ、ＧＰＧＰＧＰＧ(配列番号４３６)およびＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧ(配列番号４３７)を含む。ある実施態様において、リンカーはプロリン−アラニンベースのリンカーである。これらのリンカーはプロリンおよびアラニン残基を含み、３〜３０、１０〜３０、３〜２０および６〜１８アミノ酸長であり得る。このようなリンカーの例は、ＰＡＰＡＰＡ(配列番号４３８)、ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ(配列番号４３９)およびＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ(配列番号４４０)を含む。ある実施態様において、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０および１０〜２０アミノ酸長であり得る。このようなリンカーの例は、例えば、(ＧＳ)５−１０(配列番号４６４)、(Ｇ４Ｓ)２−５(配列番号４６５)および(Ｇ４Ｓ)２Ｇ(配列番号４６６)を含み得る。このようなリンカーの例は、配列番号４２７〜４３９を含む。例示的実施態様において、リンカーはＡｓｐ−Ｌｙｓ(ＤＫ)対を含まない。
【０２０４】
III. 薬物動態部分
治療的目的で、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、薬物動態(ＰＫ)部分に直接的または間接的に結合させ得る。薬物動態改善は、認識される治療的要求により評価し得る。タンパク質が投与後に血清中に利用可能なまま残存する時間を延長することにより、バイオアベイラビリティの増加および／または投与間隔の延長がしばしば望まれる。ある場合、タンパク質の血清濃度の時間的持続性を改善すること(例えば、投与直後および次回投与直前のタンパク質血清濃度の差を小さくすること)が望まれる。抗ＧＰＣ３アドネクチンは、非修飾抗ＧＰＣ３アドネクチンと比較して、哺乳類(例えば、マウス、ラットまたはヒト)におけるポリペプチドのクリアランス速度を２倍を超えて、３倍を超えて、４倍を超えてまたは５倍を超えて低下させる部分と結合させ得る。薬物動態の改善の他の指標は、しばしばアルファ期およびベータ期に分けられる血清半減期を含み得る。何れかまたは両方の期が、適当な部分の結合により顕著に改善され得る。例えば、ＰＫ部分は、ポリペプチドの血清半減期を、Ｆｎ３ドメイン単独と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、４００％、６００％、８００％、１０００％またはそれ以上改善し得る。
【０２０５】
ここでは“ＰＫ部分”と称する、血液からのタンパク質のクリアランスを遅延させる部分は、ポリオキシアルキレン部分(例えば、ポリエチレングリコール)、糖(例えば、シアル酸)および耐容性良好であるタンパク質部分(例えば、Ｆｃおよびそのフラグメントおよびバリアント、トランスフェリンまたは血清アルブミン)を含む。抗ＧＰＣ３アドネクチンはまた米国公開２００７／００４８２８２号に記載のとおり、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント(部分)またはバリアントに融合させまたはここに記載するとおり１以上の血清アルブミン結合アドネクチンに融合させ得る。
【０２０６】
本発明において使用できる他のＰＫ部分は、引用により本明細書に包含させる、Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76)に記載のものを含む。このようなＰＫ部分は、ヒト血清アルブミン融合体、ヒト血清アルブミンコンジュゲート、ヒト血清アルブミン結合物(例えば、アドネクチンＰＫＥ、ＡｌｂｕｄＡｂ、ＡＢＤ)、ＸＴＥＮ融合体、ＰＡＳ融合体(すなわち、３アミノ酸プロリン、アラニンおよびセリンに基づく組み換えＰＥＧ模倣体)、炭水化物コンジュゲート(例えば、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ))、グリコシル化、ポリシアル酸コンジュゲートおよび脂肪酸コンジュゲートを含むが、これらに限定されない。
【０２０７】
ある実施態様において、本発明は、ポリマー糖であるＰＫ部分に融合した抗ＧＰＣ３アドネクチンを提供する。ある実施態様において、ＰＫ部分はポリエチレングリコール部分またはＦｃ領域である。ある実施態様において、ＰＫ部分は、米国公開２００７／０１７８０８２号および２００７／０２６９４２２号に記載のような血清アルブミン結合タンパク質である。ある実施態様おいて、ＰＫ部分はヒト血清アルブミンである。ある実施態様において、ＰＫ部分はトランスフェリンである。
【０２０８】
ある実施態様において、ＰＫ部分は、ポリペプチドリンカーにより抗ＧＰＣ３アドネクチンに結合される。ポリペプチドリンカー例は、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２アミノ酸を有するポリペプチドを含む。Ｆｎ３ドメインを連結するための適当なリンカーは、互いに独立して折り畳まれ、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成する、別々のドメインを可能とするものである。例示的実施態様において、リンカーはＡｓｐ−Ｌｙｓ(ＤＫ)対を含まない。適当なリンカーの一覧が表１４(例えば、配列番号４２６〜４５１)に提供される。
【０２０９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、血液または標的組織においてプロテアーゼにより開裂可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーにより、例えば、抗ＨＳＡアドネクチンに結合される。このような実施態様を使用して、良好な送達または治療的特性またはより効率的な産生のために抗ＧＰＣ３アドネクチンを遊離させ得る。
【０２１０】
付加的リンカーまたはスペーサーを、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間のＦｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に導入できる。
【０２１１】
ポリエチレングリコール
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ＰＥＧは、周知の、水可溶性ポリマーであり、市販されているか、または当分野で周知の方法によるエチレングリコールの開環重合により製造され得る(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)。用語“ＰＥＧ”は、サイズまたはＰＥＧ末端の修飾と無関係に、あらゆるポリエチレングリコール分子を含むよう、広義に使用され、式Ｘ−Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ(ここで、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１〜４アルキルである)により表され得る。ＰＥＧは、分子の化学合成に起因する結合反応に必要なまたは分子のパーツの最適距離のためのスペーサーとして作用するさらなる化学的基を含んでよい。さらに、このようなＰＥＧは、相互に結合した１以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。１を超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多アームまたは分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧは、例えば、欧州公開出願４７３０８４Ａ号および米国特許５,９３２,４６２号に記載される。
【０２１２】
免疫グロブリンＦｃドメイン(およびフラグメント)
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは、免疫グロブリンＦｃドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントに融合される。ここで使用する“機能的Ｆｃ領域”は、ＦｃＲｎを結合する能力を保持する、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントである。ある実施態様において、機能的Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するが、エフェクター機能は有しない。Ｆｃ領域またはそのフラグメントがＦｃＲｎに結合する能力は、当分野で知られる標準結合アッセイにより決定され得る。他の実施態様において、Ｆｃ領域またはそのフラグメントはＦｃＲｎに結合し、天然Ｆｃ領域の少なくとも一つの“エフェクター機能”を有する。例示的“エフェクター機能”は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御などを含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチン)と結合するために必要であり、このような抗体エフェクター機能を評価するための当分野で知られる種々のアッセイを使用して、評価できる。
【０２１３】
“天然配列Ｆｃ領域”は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。“バリアントＦｃ領域”は、少なくとも１アミノ酸修飾により、天然配列Ｆｃ領域と異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１アミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に約１〜約１０アミノ酸置換および好ましくは約１〜約５アミノ酸置換を有する。ここでのバリアントＦｃ領域は、好ましくは天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性を有し、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％配列同一性を有する。
【０２１４】
例示的実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１サブクラスに由来するが、しかしながら、他のサブクラス(例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４)も使用され得る。下に示すのは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメインの配列である。
【０２１５】
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号４６３)
【０２１６】
コアヒンジ配列は下線を付し、ＣＨ２およびＣＨ３領域は通常の文字である。Ｃ末端リシンは任意であることに注意すべきである。この配列のアロタイプおよび変異体もまた使用し得る。当分野で知られるとおり、変異体は、Ｆｃの多様な特性、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期が調節されるように、設計できる。
【０２１７】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン融合体に使用するＦｃ領域はＣＨ１領域を含む。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン融合体に使用するＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン融合体に使用するＦｃ領域はＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含む。
【０２１８】
ある実施態様において、“ヒンジ”領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域の配列番号４６３の１〜１６位(ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ；配列番号４６４)にわたるコアヒンジ残基を含む。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン−Ｆｃ融合は、一部、ヒンジ領域内の配列番号の６位および９位でのシステイン残基による、多量体構造(例えば、二量体)に適合する。
【０２１９】
IV. ベクターおよびポリヌクレオチド
またここに提供されるのは、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類をコードする核酸である。当業者には認識されるとおり、第三塩基同義性により、ほとんど全てのアミノ酸が、コードヌクレオチド配列における１を超える三つ組コドンにより表され得る。さらに、微小な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列に保存的置換をもたらすが、遺伝子産物の生物活性を実質的に変えないと予測される。それゆえに、ここに記載するタンパク質をコードする核酸配列は、配列をわずかに修飾しても、なおその各遺伝子産物をコードし得る。ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類およびそれらの融合体をコードする例示的核酸は、配列番号４５２〜４６２に示す配列を有する核酸を含む。
【０２２０】
ここに開示する抗ＧＰＣ３アドネクチンを含む種々のタンパク質の何れかをコードする核酸は、化学的、酵素的または組み換え的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択する細胞型による。特定化されたコドン使用頻度パターンが、大腸菌および他の細菌ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について明らかにされている。例えば、Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996); and Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)参照。
【０２２１】
核酸操作の一般的技法は、例えば、引用により本明細書に包含させるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)および定期的改訂版に記載される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントに操作可能に結合する。このような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御するための任意オペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。通常複製起点により付与される宿主で複製する能力および選択遺伝子が形質転換体を認識する能力がさらに取り込まれる。
【０２２２】
ここに記載するタンパク質は組み換えにより直接的にだけでなく、好ましくは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである、異種ポリペプチドと共にポリペプチドとして産生され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識および処理(すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂)されるものである。天然シグナル配列を認識および処理しない原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母分泌のために、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子(サッカロマイセスおよびクリベロマイセスアルファ因子を含む)または酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたはＰＣＴ公開ＷＯ９０／１３６４６号に記載のシグナルで置き換え得る。哺乳類細胞発現のために、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌型リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内でタンパク質をコードするＤＮＡにライゲートし得る。
【０２２３】
発現およびクローニングベクターの両方は、ベクターの１以上の選択宿主細胞における複製を可能とする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製可能とし、複製起点または自己複製配列を含むものである。このような配列は、多様な細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点が大部分のグラム陰性菌に適し、２μプラスミド起点が酵母に適し、種々のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)が哺乳類細胞におけるクローニングベクターにおいて有用である。一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターに必要ではない(ＳＶ４０起点が、早期プロモーターを含むため典型的に唯一使用され得る)。
【０２２４】
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。典型的選択遺伝子は、(ａ)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を与える、(ｂ)栄養要求性欠失を補うまたは(ｃ)複合培地から利用可能ではない必須栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、桿菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０２２５】
酵母において使用するための適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖能を欠く酵母の変異体株、例えば、ATCC(登録商標) No. 44076またはPEP4-1の選択マーカーである。Jones, Genetics, 85:12(1977)。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、次いで、トリプトファン非存在下での増殖による形質転換の検出に有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株(ATCC(登録商標) 20,622または38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を担持する既知プラスミドにより補われる。
【０２２６】
発現およびクローニングベクターは、通常宿主生物により認識され、タンパク質をコードする核酸に操作可能に結合したプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に適するプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーターシステムおよびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の既知細菌プロモーターが適する。細菌システムにおいて使用するためのプロモーターはまたタンパク質をコードするＤＮＡに操作可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含む。
【０２２７】
プロモーター配列は真核生物について知られる。事実上全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される位置から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ富領域を含む。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる他の配列はＣＮＣＡＡＴ(配列番号４６５)領域であり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。大部分の真核生物遺伝子の３’末端はＡＡＴＡＡＡ(配列番号４６６)配列であり、これは、コード配列の３’末端へのポリＡテイル付加のためのシグナルであり得る。これらの配列全てが、真核生物発現ベクターに、好適に挿入される。
【０２２８】
酵母宿主で使用する適当な促進配列の例は、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸異性化酵素、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸異性化酵素、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーターを含む。
【０２２９】
生育条件による転写制御のさらなる利点を有する誘導型プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現で使用するための適当なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ特許公開７３,６５７号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１２４７１８号およびＷＯ２０１２／０５９４８６号にさらに記載される。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０２３０】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノム、異種哺乳類プロモーター、例えば、ＡＣＴＩＮ(登録商標)プロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターにより、このようなプロモーターが宿主細胞システムと適合性である限り、制御され得る。
【０２３１】
ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして、好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIII  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳類宿主においてＤＮＡを発現させるシステムは、米国特許４,４１９,４４６号に開示される。このシステムの改変は、米国特許４,６０１,９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下の、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes et al., Nature, 297:598-601(1982)も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列がプロモーターとして使用され得る。
【０２３２】
タンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物における転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加させる。哺乳類遺伝子からの多くのエンハンサー配列が、現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン)。しかしながら、一般的に、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(ｂｐ  １００〜２７０)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化の増強エレメントについてまたYaniv, Nature, 297:17-18(1982)も参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドコード化配列の５’位または３’位でベクターに接合され得るが、好ましくはプロモーターの５’部位に置かれる。
【０２３３】
真核生物宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞)において使用される発現ベクターはまた転写停止およびｍＲＮＡ安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時には３’、非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。ある有用な転写停止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６号およびそこに開示される発現ベクター参照。
【０２３４】
組み換えＤＮＡはまたタンパク質の精製に有用であり得る、あらゆるタイプのタンパク質タグ配列も含み得る。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ(登録商標)タグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを含むが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主で使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、関連する記載を引用により本明細書に包含させる、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)に記載される。
【０２３５】
発現構築物は、当業者には明らかなとおり、宿主細胞に適する方法を使用して、宿主細胞に導入され得る。核酸を宿主細胞に導入する多様な方法は当分野で知られ、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染(ベクターが感染性因子であるとき)を含むが、これらに限定されない。
【０２３６】
適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌またはバチルス属を含む。酵母、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエのようなサッカロマイセス種もポリペプチド産生に使用し得る。種々の哺乳類または昆虫細胞培養システムも組み換えタンパク質発現に使用できる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルスシステムは、Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47(1988)によりレビューされている。適当な哺乳類宿主細胞株の例は、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株を含む。精製タンパク質は、適当な宿主／ベクターシステムを組み換えタンパク質を発現するように培養することにより産生される。ＦＢＳタンパク質を、次いで、培養培地または細胞抽出物から精製する。
【０２３７】
Ｖ. タンパク質産生
宿主細胞は、ここに記載する発現またはクローニングベクターで、タンパク質産生のためにトランスフォームされ、プロモーター誘発、形質転換体選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾した慣用の栄養培地で培養される。
【０２３８】
タンパク質産生に使用される宿主細胞は、多様な培地で培養できる。Ｈａｍ'ｓ  Ｆ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(Sigma))、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((ＤＭＥＭ)、(Sigma))のような市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。さらに、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44(1979)、Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255(1980)、米国特許４,７６７,７０４号、４,６５７,８６６号、４,９２７,７６２号、４,５６０,６５５号または５,１２２,４６９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０３４３０号、ＷＯ８７／００１９５号または米国特許ＲＥ３０,９８５に記載の培地の何れも、宿主細胞の培養培地として使用し得る。これらの培地の何れも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子)、塩類(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸)、緩衝剤(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシン薬物)、微量元素(マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される)およびグルコースまたは等価なエネルギー源が添加され得る。任意の他の必要な添加物も、当業者に知られる適当な濃度で存在し得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で先に使用されたものであり、当業者には明らかである。
【０２３９】
ここに開示するタンパク質はまた無細胞翻訳システムを使用しても産生できる。このような目的で、タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡを産生しインビトロ転写を可能とするためにおよび使用する特定の無細胞システムにおけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能とするために、修飾されなければならない(哺乳類または酵母無細胞翻訳システムのような真核生物または細菌無細胞翻訳システムのような原核生物)。
【０２４０】
タンパク質はまた化学合成により産生できる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)に記載の方法により)。タンパク質への修飾も化学合成によって行い得る。
【０２４１】
ここに開示するタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られるタンパク質の単離／精製方法により精製され得る。非限定的例は、抽出、再結晶、塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム使用)、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分布またはこれらの任意の組み合わせを含む。精製後、タンパク質を、濾過および透析を含むが、これらに限定されない当分野で知られる多様な方法の何れかにより、異なる緩衝液に変えおよび／または濃縮してよい。
【０２４２】
精製タンパク質は、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋および最も好ましくは少なくとも９８％または９９％純粋である。純度の正確な数値と関係なく、タンパク質は医薬製品として使用するのに十分純粋である。
【０２４３】
大腸菌においてアドネクチン類を発現する一つの方法は次のとおりである。アドネクチンをコードする核酸を、ＰＥＴ９ｄベクターにＨＩＳ６タグの上流にクローン化し、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ細胞にトランスフォームし、２４ウェル形態で５０μg／mLカナマイシン含有５ml  ＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養させる。新鮮５ml  ＬＢ培地(５０μg／mLカナマイシン)培養物を、一夜培養物からの２００μlの吸引により誘導型発現のために調製し、それを適当なウェルに分配する。培養物を３７℃でＡ６００  ０.６〜０.９まで増殖させる。１mM  イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を６時間、３０℃で発現させ、１０分、２７５０ｇで４℃での遠心分離により採取する。
【０２４４】
細胞ペレット(２４ウェル形態)を４５０μlの溶解緩衝液(５０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、１×CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail-EDTAフリー(Roche)、１mM  ＰＭＳＦ、１０mM  ＣＨＡＰＳ、４０mM  イミダゾール、１mg／ml  リゾチーム、３０μg／ml  ＤＮＡｅ、２μg／ml  アプロチニン、ｐＨ８.０)に再懸濁し、室温で１〜３時間震盪することにより溶解させる。ライセートを、９６ウェル、１.２ml捕獲プレートを備えた９６ウェルWhatman GF/D Unifilterに移し、陽圧で濾過することにより、浄化し、再び整列させる。浄化ライセートを、平衡化緩衝液(５０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、４０mM  イミダゾール、ｐＨ８.０)で平衡化されている９６ウェルニッケルまたはコバルトキレートプレートに移し、５分インキュベートする。非結合物質を陽圧により除去する。樹脂を０.３ml／ウェルの洗浄緩衝液＃１(５０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、５mM  ＣＨＡＰＳ、４０mM  イミダゾール、ｐＨ８.０)で２回洗浄する。各洗浄を陽圧により除去する。溶出前に、各ウェルを５０μl  溶出緩衝液(ＰＢＳ＋２０mM  ＥＤＴＡ)で洗浄し、５分インキュベートし、この洗浄を陽圧により廃棄する。タンパク質を、さらに１００μlの溶出緩衝液を各ウェルに適用することにより溶出する。室温で３０分インキュベーション後、プレートを５分、２００ｇで遠心分離し、溶出前に溶出捕獲プレートの底に添加した５μlの０.５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む、９６ウェル捕獲プレートに溶出タンパク質が回収される。溶出タンパク質を、野生型１０Ｆｎ３ドメインをタンパク質標準として用いる総タンパク質アッセイで提供する。
【０２４５】
不溶性アドネクチン類の中規模発現および精製の方法は次のとおりである。アドネクチン、続くＨＩＳ６タグをコードする核酸を、ｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０mlの接種培養(単一播種コロニーから産生)を使用して、５０μg／ml  カルベニシリンおよび３４μg／ml  クロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に接種する。培養物を、３７℃でＡ６００  ０.６〜１.０まで増殖させる。１mM  イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を４時間、３０℃で増殖させ、３０分、＞１０,０００ｇで４℃の遠心分離により採取する。細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、２５mlの溶解緩衝液(２０mM  ａＨ２Ｐ０４、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、１×完全Protease Inhibitor Cocktail-EDTAフリー(Roche)、ＩmM  ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を氷上で使用して再懸濁させる。細胞溶解を、Model M-l 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する高圧均質化(＞１８,０００psi)により達成する。不溶性フラクションを、３０分、２３,３００ｇで４℃の遠心分離により分離する。ライセートの遠心分離により回収した不溶性ペレットを、２０mM  リン酸ナトリウム／５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４で洗浄する。ペレットを６.０Ｍ  塩酸グアニジンの２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７.４溶液に音波処理により溶解し、続いて３７℃で１〜２時間インキュベーションする。再可溶化ペレットを０.４５μmで濾過し、２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ／６.０Ｍ  グアニジンｐＨ７.４緩衝液で平衡化したＨｉｓｔｒａｐカラムに負荷する。負荷後、カラムを、同じ緩衝液のさらなる２５ＣＶで洗浄する。結合タンパク質を、２０mM  リン酸ナトリウム／５００mM  ＮａＣｌ／６.０Ｍ  ｇｕａｎ−ＨＣｌ  ｐＨ７.４中の５０mM  イミダゾールで溶出する。精製タンパク質を、５０mM  酢酸ナトリウム／１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ４.５に対する透析により再折り畳みさせる。
【０２４６】
可溶性アドネクチン類の中規模発現および精製のための方法は次のとおりである。アドネクチン、続いてＨＩＳ６タグをコードする核酸をｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０mlの接種培養(単一播種コロニーから産生)を使用して、５０μg／ml  カルベニシリンおよび３４μg／ml  クロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に接種する。培養物を、３７℃でＡ６００  ０.６〜１.０まで増殖させる。１mM  イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を４時間、３０℃増殖させ、３０分、＞１０,０００ｇで４℃の遠心分離により採取する。細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、２５mlの溶解緩衝液(２０mM  ＮａＨ２Ｐ０４、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、１×完全Protease Inhibitor Cocktail-EDTAフリー(Roche)、ＩmM  ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を氷上で使用して再懸濁させる。細胞溶解は、Model M-1 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する高圧均質化(＞１８,０００psi)により達成される。可溶性フラクションを、３０分、２３,３００ｇで４℃の遠心分離により分離する。上清を０.４５μmフィルターにより浄化する。浄化ライセートを、２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７.４で予め平衡化したＨｉｓｔｒａｐカラム(ＧＥ)に充填する。次いで、カラムを同じ緩衝液の２５カラム体積、続いて２０カラム体積の２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ／２５mM  イミダゾール、ｐＨ７.４および次いで３５カラム体積の２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ／４０mM  イミダゾール、ｐＨ７.４で洗浄する。タンパク質を、１５カラム体積の２０mM  リン酸ナトリウム／５００Ｍ  ＮａＣｌ／５００mM  イミダゾール、ｐＨ７.４で溶出し、フラクションをＡ２ｓｏでの吸光度に基づきプールし、ｌＸＰＢＳ、５０mM  Ｔｒｉｓ、１５０mM  ＮａＣｌ；  ｐＨ８.５または５０mM  ＮａＯＡｃ；１５０mM  ＮａＣｌ；ｐＨ４.５に対して透析する。あらゆる沈殿物を０.２２μmでの濾過により除去する。
【０２４７】
VI. 生物物理学的および生化学的特徴付け
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類の結合を、平衡定数(例えば、解離、ＫＤ)および速度定数(例えば、結合速度定数、ｋｏｎおよび解離速度定数、ｋｏｆｆ)として評価し得る。アドネクチンは、一般に標的分子に１μM、５００nM、１００nM、１０nM、１nM、５００pM、２００pMまたは１００pM未満のＫＤで結合するが、高いＫＤ値は、ｋｏｆｆが十分に低いかまたはｋｏｎが十分に高いとき許容される。
【０２４８】
結合親和性についてのインビトロアッセイ
抗ＧＰＣ３アドネクチンの結合親和性を決定するアッセイの例は、結合平衡除外アッセイ(ＫｉｎＥｘＡ)(Blake et al., JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43)、Biacoreシステム(Uppsala, Sweden)での表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295:268)およびホモジニアス時間分解蛍光法(ＨＴＲＦ)アッセイ(Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68)のような液相方法を含むが、これらに限定されない。
【０２４９】
ある実施態様において、生体分子相互作用をBiacoreシステムを用いてリアルタイムでモニターでき、これは、最大３００nm離れた表面の屈折率における変化のため、ガラス支持上の表面の薄い金フィルムの表面での光の共鳴角の変化の検出にＳＰＲを使用する。Biacore分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和性定数を導く。結合親和性は、Biacore表面プラズモン共鳴システム(Biacore, Inc.)を使用する結合および解離速度定数の評価により得る。バイオセンサーチップは、標的の共有結合カップリングのために活性化される。次いで、標的は希釈され、チップ上に注入されて、固定化物質の応答単位のシグナルが得られる。共鳴単位(ＲＵ)でのシグナルが固定化物質の質量に比例的であるため、これは、マトリクス上の固定化標的密度の範囲を表す。結合および解離データを同時に、１：１二分子相互作用についての正味の発現速度を解くための包括的分析に適合させて、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＲｍａｘ(飽和時の最大応答)のための最良フィット値を得る。結合の平衡解離定数、ＫＤを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてのＳＰＲ測定値から計算する。
【０２５０】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、実施例２に記載するＳＰＲ親和性アッセイにおいて１μM以下、５００nM以下、４００nM以下、３００nM以下、２００nM以下、１５０nM以下、１００nM以下、９０nM以下、８０nM以下、７０nM以下、６０nM以下、５０nM以下、４０nM以下、３０nM以下、２０nM以下、１５nM以下、１０nM以下、５nM以下または１nM以下のＫＤを示す。
【０２５１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンは関連タンパク質に実質的に結合しない、例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチンはグリピカン−１、グリピカン−２、グリピカン−４またはグリピカン−６に実質的に結合しない。
【０２５２】
上記アッセイは一例であり、タンパク質間の結合親和性の決定について当業者に知られるあらゆる方法(例えば、蛍光ベース移動(ＦＲＥＴ)、酵素結合免疫吸着アッセイおよび競合的結合アッセイ(例えば、放射免疫アッセイ)が、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類の結合親和性の評価に使用され得ることは理解されるべきである。
【０２５３】
結合についての細胞アッセイ
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンおよびそのコンジュゲートは、グリピカン−３を発現する細胞に内在化する。ポリペプチド内在化を評価するための標準的アッセイは当分野で知られ、例えば、ＨｕｍＺａｐ内在化アッセイを含む。腫瘍細胞、例えばＨｅｐ−３ｂまたはＨｅｐ−Ｇ２(それぞれATCC Deposit No. HB-8064およびHB-8065)への結合を評価するために、細胞をAmerican Type Culture Collectionのような公的に利用可能な供給源から得て、フローサイトメトリー分析のような標準的アッセイに使用できる。
【０２５４】
VII. 薬物コンジュゲート
また提供されるのは、治療剤または薬物部分にコンジュゲートしたＦＢＳドメイン、例えば、アドネクチンを含む、ポリペプチドである。アドネクチン−薬物コンジュゲート(ＡｄｘＤＣ)において、ＦＢＳ部分(例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチン)は薬物部分にコンジュゲートされ、アドネクチンは、ＡｄｘＤＣを癌細胞のようなＧＰＣ３を発現する標的細胞に指向させる、ターゲティング剤として機能する。そこに着いたら、薬物が標的細胞内部またはその近傍で放出されて、治療剤として作用する。作用機序および、例えば、癌治療における、抗体と共に使用する薬物コンジュゲートの用途のレビューのために、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc., 5:147 (2006)参照のこと。
【０２５５】
薬物コンジュゲートでの使用に適当な薬物部分は、サイトキシンまたは放射性毒素を含む。細胞毒または細胞毒性剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ介入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸分裂阻害剤を含む、細胞に有害な(例えば、殺す)あらゆる薬物を含む。
【０２５６】
適当な薬物の例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログを含む。治療剤はまた、例えば、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＳＮＵ)およびロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金(II)(ＤＤＰ)  シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミスラマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ))および有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)を含む。本発明の抗ＧＰＣ３アドネクチンとコンジュゲートできる治療的細胞毒の他の好ましい例は、デュオカルマイシン、カリケアミシン、マイタンシンおよびオーリスタチンおよびこれらの誘導体を含む。
【０２５７】
アドネクチン薬物コンジュゲートを使用して、ある生物学的応答を修飾でき、薬物部分は古典的化学療法剤に限定されるとして解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素のような酵素的に活性な毒素またはその活性フラグメント、腫瘍壊死因子またはインターフェロン−ガンマのようなタンパク質または、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１(“ＩＬ−１”)、インターロイキン−２(“ＩＬ−２”)、インターロイキン−６(“ＩＬ−６”)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(“ＧＭ−ＣＳＦ”)、顆粒球コロニー刺激因子(“Ｇ−ＣＳＦ”)または他の増殖因子のような、生物学的応答修飾剤を含み得る。
【０２５８】
抗ＧＰＣ３アドネクチンは、当分野で利用可能なリンカー技術を使用して、治療剤にコンジュゲートできる。細胞毒のアドネクチンへのコンジュゲートに使用されているリンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低ｐＨによる開裂を受けやすいまたはカテプシン(例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ)のような腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる開裂を受けやすいリンカーが選択され得る。細胞毒の例は、例えば、全て引用によりその全体を本明細書に引用により包含させる米国特許６,９８９,４５２号、７,０８７,６００および７,１２９,２６１号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１７２１０号、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８０４号、ＰＣＴ／ＵＳ０６／３７７９３号、ＰＣＴ／ＵＳ０６／０６００５０号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０７１１号、ＷＯ／２００６／１１０４７６号および米国特許出願６０／８９１,０２８号に記載されている。
【０２５９】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンおよび治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーのような開裂可能リンカーによりコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号４６７)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み得るペプチジルリンカーである。ＦＢＳ−ＤＣは、開示を引用により本明細書に包含させる、米国特許７,０８７,６００号、６,９８９,４５２号、および７,１２９,２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０号、ＷＯ０７／０３８６５８号、ＷＯ０７／０５１０８１号、ＷＯ０７／０５９４０４号、ＷＯ０８／０８３３１２号、およびＷＯ０８／１０３６９３号、米国特許公開２００６／００２４３１７号、２００６／０００４０８１号、および２００６／０２４７２９５号に記載のものに準ずる方法により製造できる。
【０２６０】
リンカーは、それ自体、抗ＧＰＣ３アドネクチンのＰｍＸｎ部分のシステインに、例えば、マレイミド化学を使用して、結合、例えば、共有結合により結合していてよく、ここで、少なくとも一つのＸがシステインである。例えば、リンカーは、抗ＧＰＣ３アドネクチン−ＰｍＸｎに共有結合でき、ここで、少なくとも一つのＸがシステインである。例えば、リンカーは抗ＧＰＣ３アドネクチン−ＰｍＣｎに結合でき、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｍおよびｎは少なくとも１、例えば、１〜３の整数である。システインへのライゲーションは、マレイミド化学を使用して、当分野で知られるとおり実施できる(例えば、Imperiali, B. et al., Protein Engineering:  Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 22, pp. 65-96, Gross, H.J., ed. (2009))。リンカーが抗ＧＰＣ３ＦＢＳのシステインに結合するために、リンカーは、例えば、マレイミド部分を含んでよく、この部分が、次いでシステインと結合して、共有結合を形成する。ある実施態様において、システイン周囲のアミノ酸は、化学反応を促進するために最適化される。例えば、システインは、一続きの正荷電アミノ酸により囲まれるシステインより反応を速くするために、負荷電アミノ酸で囲み得る(ＥＰ１０７４５６３号)。薬物部分の抗ＧＰＣ３アドネクチンのシステインへの結合は、部位特異的結合である。
【０２６１】
癌処置のために、薬物は、好ましくは標的癌細胞の死を引き起こす、細胞毒性薬物である。抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ−ＤＣにおいて使用できる細胞毒性薬物は、例えば、次のタイプの化合物ならびにそれらのアナログおよび誘導体を含む。
(ａ)カリチアマイシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 and 3466参照)およびウンシアラマイシン(例えば、Davies et al., ＷＯ２００７／０３８８６８Ａ２号(２００７)；Chowdari et al., ＵＳ８,７０９,４３１Ｂ２号(２０１２)；およびNicolaou et al., ＷＯ２０１５／０２３８７９Ａ１号(２０１５)参照)のようなエンジイン；
(ｂ)ツブリシン(ｓｅｅ、例えば、Domling et al., ＵＳ７,７７８,８１４Ｂ２号(２０１０)；Cheng et al., ＵＳ８,３９４,９２２Ｂ２号(２０１３)；およびCong et al., ＵＳ８,９８０,８２４Ｂ２号(２０１５)参照)；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンのアナログのようなＤＮＡアルキル化剤(例えば、Boger, ＵＳ６,５４５８,５３０Ｂ１号(２００３)；Sufi et al., ＵＳ８,４６１,１１７Ｂ２号(２０１３)；およびZhang et al., ＵＳ８,８５２,５９９Ｂ２号(２０１４)参照)；
(ｄ)エポチロン(例えば、Vite et al., ＵＳ２００７／０２７５９０４Ａ１号(２００７)およびＵＳ  ＲＥ４２９３０Ｅ号(２０１１)参照)；
(ｅ)オーリスタチン(例えば、Senter et al., ＵＳ６,８４４,８６９Ｂ２号(２００５)およびDoronina et al., ＵＳ７,４９８,２９８Ｂ２号(２００９)参照)；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体(例えば、Howard et al., ＵＳ２０１３／００５９８００Ａ１号(２０１３)；ＵＳ２０１３／００２８９１９Ａ１号(２０１３)；およびＷＯ２０１３／０４１６０６Ａ１号(２０１３)参照)；および
(ｇ)ＤＭ１およびＤＭ４のようなマイタンシノイド(例えば、Chari et al., ＵＳ５,２０８,０２０号(１９９３)およびAmphlett et al., ＵＳ７,３７４,７６２Ｂ２号(２００８)参照)。
【０２６２】
前記薬物部分の引用文献は、薬物部分を適切に開示することに加えて、それらをコンジュゲートするのに適する薬物−リンカー化合物の製造に使用できるリンカーも開示する。薬物−リンカー化合物の製造に関して、特に関連する記載は、Chowdari et al., ＵＳ８,７０９,４３１Ｂ２号(２０１２)；Cheng et al., ＵＳ８,３９４,９２２Ｂ２号(２０１３)；Cong et al., ＵＳ８,９８０,８２４Ｂ２号(２０１５)；Sufi et al., ＵＳ８,４６１,１１７Ｂ２号(２０１３)；およびZhang et al., ＵＳ８,８５２,５９９号に見られる。
【０２６３】
好ましくは、薬物部分はＤＮＡアルキル化剤、ツブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンイジンまたはマイタンシノイド化合物、例えば、
【化４】
2018533369.tif 000006
である。
【０２６４】
コンジュゲーションが行われる官能基は、上記の最初の５個の薬物の場合はアミン(−ＮＨ２)基、最後の２個の薬物の場合はメチルアミン(−ＮＨＭｅ)基である。
【０２６５】
薬物をアドネクチンにコンジュゲートするために、リンカー基が必要である。薬物をリンカーと組み合わせて薬物−リンカー化合物を形成し、次いで、これをアドネクチンとコンジュゲートさせる。薬物−リンカー化合物は、式(Ｉ)
【化５】
2018533369.tif 000007
〔式中、
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から独立して選択され；
ｐは１、２、３または４であり；
ｑは２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは１、２、３、４または５であり；
ｓは０または１である。〕
により表される。
【０２６６】
式IIにおいて、−ＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐ−はポリペプチドであり、その長さはｐの値により決定される(ｐが１ならばジペプチド、ｐが３ならばテトラペプチドなど)。ＡＡａはポリペプチドのカルボキシ末端であり、そのカルボキシル基は薬物Ｄ(または存在するならば、自己犠牲基Ｔ)のアミン窒素とペプチド(アミド)結合を形成する。逆に、最後のＡＡｂはポリペプチドのアミノ末端であり、そのα−アミノ基は、それぞれｓが１または０であるかにより、
【化６】
2018533369.tif 000008
とペプチド結合を形成する。好ましいポリペプチド−ＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐ−はＶａｌ  Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ  Ｇｌｙ、Ｖａｌ  ＧｌｎおよびＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｉｔである(Ｈ２Ｎ  Ｖａｌ  Ｃｉｔ  ＣＯ２Ｈのように、通常のＮ側からＣ側への方向で記載)。より好ましくは、ポリペプチドはＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ａｌａである。好ましくは、ポリペプチドＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐは、標的(癌)細胞内に見られる酵素、例えばカテプシンおよび特にカテプシンＢにより開裂可能である。
【０２６７】
添字ｓが１であるとき、薬物−リンカー(Ｉ)はポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)基を含み、これは、有利に薬物−リンカー(Ｉ)の溶解性を改善し、アドネクチンへのコンジュゲーションが促進される  −  水性媒体中で行われる工程である。また、ＰＥＧ基は、アドネクチンとペプチド−ＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐ−の間のスペーサーとして働き、大きなアドネクチンが、ペプチド開裂酵素の作用を立体的に妨害しない。
【０２６８】
添字ｔが０または１であることにより示されるとおり、自己犠牲基Ｔは、所望により存在する。自己犠牲基は、ＡＡａまたはＡＡｂからの開裂が、場合によって、自己犠牲基がそれ自体薬物Ｄから離脱し、薬物Ｄを、その治療機能を発揮させるために遊離させる一連の反応を開始するようなものである。存在するとき、自己犠牲基Ｔは、好ましくはｐ−アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢＣ)基であり、その構造を下に示し、アスタリスク(＊)は、薬物Ｄのアミン窒素に結合したＰＡＢＣの末端を示し、波線(〜〜)は、ポリペプチド−ＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐ−に結合する末端を意味する。
【化７】
2018533369.tif 000009
【０２６９】
使用できる他の自己犠牲基は、Feng, ＵＳ７,３７５,０７８Ｂ２号(２００８)に開示の置換チアゾールである。
【０２７０】
式(Ｉ)のマレイミド基は、下に示す、アドネクチンのスルフヒドリル基によるマイケル付加反応を経る、アドネクチンへの結合のための反応性官能基である。
【化８】
2018533369.tif 000010
【０２７１】
あるいは、アドネクチンのリシン残基の側鎖におけるε−アミノ基を、２−イミノチオランと反応させて、遊離チオール(−ＳＨ)基を導入できる。チオール基は、薬物−リンカー(Ｉ)におけるマレイミド基と反応し、コンジュゲーションを実施できる。
【化９】
2018533369.tif 000011
【０２７２】
この後者の方法でのコンジュゲーションは、イミノチオランにより修飾されるリシン残基の数および位置の予測が困難であるため、“ランダムコンジュゲーション”と呼ばれることがある。
【０２７３】
ある実施態様において、ＦＢＳ薬物コンジュゲート、例えば、ＡｄｘＤＣにおける治療剤は、ツブリシンまたはツブリシンアナログである。ツブリシンは、ホモプシン、ドラスタチンおよびクリプトフィシンを含む、天然に存在する抗有糸分裂ポリペプチドおよびデプシペプチドの群に属する(Hamel et al., Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 2002, 2:19-53)。ツブリシンは、チューブリンの微小管への凝集を阻害し、影響を受けた細胞をＧ２／Ｍ期に蓄積させ、アポトーシスを受けさせる(Khalil et al., ChemBioChem 2006, 7:678-683)。
【０２７４】
天然に存在するツブリシンに加えて、ここに提供するＦＢＳ足場薬物コンジュゲート、例えば、ＡｄｘＤＣでの使用に適する強力な細胞毒性活性を有する合成ツブリシンアナログが、例えば、米国特許８,３９４,９２２号および８,９８０,８２４号に記載されている(引用により本明細書に包含)。
【０２７５】
ある実施態様において、ＡｄｘＤＣにおける治療剤は合成ツブリシンアナログであり、式(II)
【化１０】
2018533369.tif 000012
により表される構造を有する。
【０２７６】
例えば、式IIを有する薬物部分を、ＦＢＳ足場、例えば、抗ＧＰＣ３  ＦＢＳ足場にコンジュゲートするために、リンカー部分が使用され、これは、式(III)
【化１１】
2018533369.tif 000013
により表される構造を有する。
【０２７７】
このリンカー部分は、バリン−シトルリン(Ｖａｌ−Ｃｉｔ、通常のＮ側からＣ側方向で記載)ジペプチドを含み、これは、ＡｄｘＤＣが標的癌細胞に到達し、それに内在化した後、細胞内酵素カテプシンＢにより開裂され、そうして、治療剤をその細胞毒性効果を発揮させるために放出するように設計される(Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem Lett., 1998, 8:3341~3346; Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem Lett., 1998, 8:3347-3352; Dubowchik et al., Bioconjugate Chem., 2002, 13:855-869)。
【０２７８】
薬物(II)およびリンカー(III)をカップリングして、式(IV)により表される構造を有する薬物−リンカー化合物を産生し、これが、次いで、アドネクチンとコンジュゲートされる。薬物−リンカー(IV)の製造は、Cheng et al., ＵＳ８,３９４,９２２Ｂ２号(２０１３)に記載され(例えば、図２０ｂおよび実施例２２参照)、その記載を引用により本明細書に包含させる。当業者は、薬物−リンカー(IV)存在下、任意的自己犠牲基もＰＥＧ基も存在しないが、このような基は、望むならば取り込ませ得ることを認識する。
【０２７９】
ＡｄｘＤＣコンジュゲートの製造において、式(IV)により表される構造を有する治療剤−リンカー化合物を製造し、次いで、これをＦＢＳ足場とコンジュゲートさせる。
【化１２】
2018533369.tif 000014
【０２８０】
ある実施態様において、ＦＢＳ−薬物コンジュゲートは、式(Ｖ)により表される構造を有する。
【化１３】
2018533369.tif 000015
〔式中、ｍは１、２、３、４以上である。ある実施態様において、ｍは１である。他の実施態様において、ｍは２である。〕
【０２８１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン(Ａｄｘ)のＣ末端システイン残基の側鎖におけるチオール基を、化合物(Ｖ)のマレイミド基と反応させて、コンジュゲーションを行う。
【化１４】
2018533369.tif 000016
【０２８２】
他の実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン(Ａｄｘ)のＣ末端に位置する２個のシステインのチオール基を、化合物(IV)におけるマレイミド基と反応させて、アドネクチンあたり２薬物分子のコンジュゲーションを行う(例えば、ＤＡＲ２、図２)。
【０２８３】
ある実施態様において、コンジュゲートにおける抗ＧＰＣ３Ａｄｘは、セクションＩＡにおいて上記したアミノ酸配列を有し、これは、システインを含むＣ末端テイルを含むように修飾されている。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３Ａｄｘは、配列番号５、９〜１０、１８、２２〜２３、３１、３５〜３６４４、４８〜４９、５７、６１〜６２、７０、７４〜７５、８３、８７〜８８、９８、１０２〜１０５、１２８、１３０〜１３２、１５５、１５７〜１５９、１８０、１８４〜１８６、２０〜、２１１〜２１３、２３６、２３８〜２４０、２６３、２６５〜２６７、２９０、２９２〜２９４、３１７および３１９〜３２１からなる群から選択されるコアアミノ酸配列を含み、これは、システインを含むＣ末端部分を含むように修飾される。
【０２８４】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３Ａｄｘは、ここに定義する、ＰｍＣＸｎまたはＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなるＣ末端部分を含むように修飾されている。ある実施態様において、Ｃ末端部分は、ＰＣ、ＰＣＣまたはここに記載するＣ末端配列の何れか、例えば、配列番号４０９〜４２３に示すアミノ酸配列からなる。ある実施態様において、Ｃ末端部分はＰＣまたはＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)からなる。
【０２８５】
ある実施態様において、修飾抗ＧＰＣ３  Ａｄｘは、ＰｍＣＸｎからなるＣ末端部分を含み、配列番号１１〜１４、２４〜２７、３７〜４０、５０〜５３、６３〜６６、７６〜７９、８９〜９３、１０６〜１１８、１３３〜１４５、１６０〜１７２、１８７〜１９９、２１４〜２２６、２４１〜２５３、２６８〜２８０、２９５〜３０７および３２２〜３３４からなる群から選択される。
【０２８６】
ある実施態様において、修飾抗ＧＰＣ３  ＡｄｘはＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなるＣ末端部分を含み、配列番号１５〜１７、２８〜３０、４１〜４３、５４〜５７、６７〜７０、８０〜８３、９４〜９７、１１９〜１２７、１４６〜１５４、１７３〜１８１、２００〜２０８、２２７〜２３５、２５４〜２６２、２８１〜２８９、３０８〜３１６および３３５〜３４３からなる群から選択される。
【０２８７】
特定の実施態様において、薬物コンジュゲートにおいて使用するための抗ＧＰＣ３  Ａｄｘは、配列番号１１４〜１１８、１２３〜１２７、１４１〜１４５、１５０〜１５４、１６８〜１７２、１７７〜１８１、１９５〜１９９、２０４〜２０８、２２２〜２２６、２３１〜２３５、２４９〜２５３、２５８〜２６２、２７６〜２８０、２８５〜２８９、３０３〜３０７、３１２〜３１６、３３０〜３３４、および３３９〜３４３の何れかである。
【０２８８】
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類はまた細胞毒性放射性医薬品を産生するために、放射性同位元素ともコンジュゲートできる。診断または治療に使用するための抗体とコンジュゲートできる放射性同位元素の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射性コンジュゲートを製造する方法は、当分野で確立されている。
【０２８９】
VIII. 医薬組成物
また提供されるのは、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類およびコンジュゲートを含む薬学的に許容される組成物であり、ここで、組成物は本質的に内毒素および／または発熱物質がない。
【０２９０】
製剤を製造するための当分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見ることができる。非経腸投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油または水素化ナフタレンを含む。生体適合性、生物分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを、化合物の放出制御のために使用してよい。ナノ粒子製剤(例えば、生物分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム)を、化合物の体内分布のために使用してよい。他の有用な可能性のある非経腸送達システムは、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、インプラント可能注入システムおよびリポソームを含む。製剤中の化合物の濃度は、投与する薬物の用量および投与経路を含む、多数の因子により変わる。
【０２９１】
タンパク質を含む治療製剤は、所望の程度の純度を有するここに記載のタンパク質を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形で保存用に調製される(Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980))。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール)、低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストランを含む単糖、二糖および他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖、ナトリウムのような塩形成性カウンターイオン、金属錯体(例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体)および／またはＴｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ(登録商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０２９２】
ポリペプチドは、所望により医薬業界で一般に使用される非毒性酸付加塩または金属錯体のような薬学的に許容される塩の形で投与され得る。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのような重合酸および塩酸、臭化水素酸硫酸、リン酸などのような無機酸を含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。ある例において、ポリペプチドは、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウム存在下で製剤される。
【０２９３】
ここでの製剤はまた処置する特定の適応症により必要に応じて１を超える活性化合物、好ましくは互いに有害に作用しない、相補的活性を有するものを含んでよい。このような分子は、意図する目的に有効である量で、組み合わせ好適に存在する。
【０２９４】
タンパク質はまた、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、それぞれ、例えば、コアセルベーション技法または界面重合により、製造したマイクロカプセルに、コロイド性薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルションに封入してもよい。このような技法は、Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)に開示される。
【０２９５】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過により容易に達成される。
【０２９６】
徐放性製剤を製造し得る。徐放性製剤の適当な例は、ここに記載するタンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスであり、このマトリクスは有形物、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであり得る。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリュープロリド酢酸塩からなる注射可能マイクロスフェア)およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超える分子の放出を可能とするが、あるヒドロゲルは、タンパク質をそれより短期間で放出する。カプセル化タンパク質が体内に長時間残る場合、それらは、３７℃での湿気への曝露の結果として変性または凝集し、生物活性喪失および免疫原性の変化の可能性が生じる。関与する機構により安定化させるための合理的な戦略が考案されている。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると判明したならば、安定化は、スルフヒドリル残基修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量制御、適当な添加物使用および特定のポリマーマトリクス組成物開発により達成され得る。
【０２９７】
治療適用のために、タンパク質を、対象に、薬学的に許容される剤型で投与する。それらは、静脈内にボーラスとしてまたは一定時間にわたり連続的に、筋肉内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所または吸入経路で投与できる。タンパク質はまた局所的ならびに全身治療効果を発現させるように腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変周囲経路でも投与し得る。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状態を考慮して、当業者により決定され得る。適当な担体、希釈剤および／または賦形剤の例は、(１)約１mg／ml〜２５mg／mlヒト血清アルブミンを含む、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ約７.４、(２)０.９％食塩水(０.９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ)および(３)５％(ｗ／ｖ)デキストロースを含む。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで実施され得る。
【０２９８】
タンパク質および１以上の付加的治療剤の投与は、共投与であれ、逐次投与であれ、治療適用について上記のとおり行い得る。共投与のための適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は当業者により共投与される特定の治療剤の性質による。
【０２９９】
凍結乾燥されているのではなく、水性剤型で存在するとき、タンパク質は、典型的に約０.１mg／ml〜１００mg／mlの濃度で製剤されるが、この範囲から逸脱した広範な変動が許容される。疾患処置のために、タンパク質の適当な用量は、処置する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、タンパク質投与が予防目的か治療目的か、先の治療の経過、患者の病歴および融合体への応答および処置医の裁量による。タンパク質は、患者に一度にまたは一連の処置にわたり好適に投与される。
【０３００】
治療的に有効な用量は、投与されたものに治療効果を生じる用量である。正確な用量は処置する障害により、既知技法を使用して当業者が確認できる。好ましい用量は、約１０mg／平方メートル〜約２０００mg／平方メートル、より好ましくは約５０mg／平方メートル〜約１０００mg／平方メートルである。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣは、１日あたり約０.０１μg／kg〜約５０mg／kg、１日あたり０.０１mg／kg〜約３０mg／kgまたは１日あたり０.１mg／kg〜約２０mg／kg投与される。
【０３０１】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣは、連日(例えば、１日１回、２回、３回または４回)または低頻度(例えば、隔日に１回、週に１回または２回、２週に１回、３週に１回または毎月)で投与し得る。さらに、当分野で知られるとおり、年齢ならびに体重、一般的健康、性別、食習慣、投与時間、薬物相互作用および疾患の重症度についての調節が必要であるかもしれず、当業者により日常的な実験により確認され得る。
【０３０２】
IX. 治療方法
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類およびその薬物コンジュゲートは、例えば、健常組織と比較して、ＧＰＣ３、例えば、高レベルのＧＰＣ３を発現する、腫瘍細胞を有する癌の処置における使用に適する。ある実施態様において、癌は、肝臓癌(例えば、肝細胞癌(ＨＣＣ)または肝芽腫)、メラノーマ、肉腫、肺癌(例えば、肺扁平上皮癌)およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。さらに、ここに記載するＧＰＣ３アドネクチン類は、難治性または再発性悪性腫瘍の処置への使用に適する。
【０３０３】
ここで使用する用語“対象”は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。好ましい対象は、ＧＰＣ３活性または高レベルのＧＰＣ３を発現する望ましくない細胞により介在される障害を有するヒト患者である。Ｗｈｅｎ抗ＧＰＣ３アドネクチン類またはその薬物コンジュゲートを他の薬物と一緒に投与するとき、２剤は何れの順番で投与しても同時に投与してもよい。
【０３０４】
例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチン類、多特異性または二重特異性分子およびその薬物コンジュゲートを、インビボまたはインビトロで次の生物活性の１以上の誘発のために使用できる。それは、ＧＰＣ３発現細胞の増殖阻害および／または死滅のため、ヒトエフェクター細胞存在下ＧＰＣ３発現細胞の食作用またはＡＤＣＣの介在のためまたは、例えば、ＧＰＣ３リガンドのＧＰＣ３への結合遮断により、ＧＰＣ３活性を潜在的に調節するための使用である。
【０３０５】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、免疫原性剤、例えば、癌細胞調製物、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、抗原提示細胞、例えば、腫瘍関連抗原担持樹状細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞と組み合わせる(He et ah, 2004)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐｌ００のペプチドのようなメラノーマ抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴＩおよび／またはチロシナーゼ、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞を含む。ＧＰＣ３遮断はまた化学療法レジメ、放射線、手術、ホルモン除去および血管新生阻害剤ならびに他の免疫療法剤(例えば、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＬＡＧ−３アドネクチン類または抗体)を含む標準的癌処置とも有効に組み合わせ得る。
【０３０６】
ここに提供されるのは、抗ＧＰＣ３アドネクチンおよび／または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、免疫応答の刺激に、それにより、対象における免疫応答の増強、刺激または上方制御に有効である、１以上の付加的薬物、例えば、小分子薬物、抗体またはその抗原結合部分と(同時にまたは連続的に)投与する、組み合わせ治療の方法である。
【０３０７】
一般に、例えば、ここに記載の、抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、癌免疫剤、例えば、(ｉ)刺激性(例えば、共刺激性)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞のような免疫細胞の阻害性シグナルまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストと組み合わせてよく、この何れも、抗原特異的Ｔ細胞応答のような免疫応答増強をもたらす。ある態様において、癌免疫剤は、自然免疫に関与する細胞、例えば、ＮＫ細胞の(ｉ)刺激性(共刺激性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストまたは(ii)阻害性(共阻害性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストであり、ここで、癌免疫剤は自然免疫を増強する。このような癌免疫剤は、しばしば、免疫チェックポイント制御剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
【０３０８】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激性または阻害性分子を標的とする薬物と投与する。例えば、ここに記載する、例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチン類および／または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、対象に、免疫応答を増加させるために、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬物と投与し得る。例えば、抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(VIＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６またはＢ７ファミリーメンバーに特異的に結合する共刺激性もしくは共阻害性受容体を含む、膜結合リガンドのＢ７ファミリーのメンバーを標的とする(または特異的に結合する)薬物と投与し得る。
【０３０９】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα  １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＮＧＦＲのような分子のＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバー(リガンドまたは受容体)を標的とする薬物と投与し得る(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。
【０３１０】
Ｔ細胞応答は、次の薬物の１以上の投与により刺激され得る。
(１)上記のようなＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３のようなＴ細胞活性化を阻害する(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)タンパク質および次のタンパク質ＴＩＭ−３、ガレクチン  ９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、VIＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の何れかのアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)；および／または
(２)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨのようなＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
【０３１１】
上記タンパク質の一つを調節し、癌の処置のために、抗ＧＰＣ３アドネクチン類および／または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣｓ、例えば、ここに記載のものと組み合わせ得る薬物の例は、ヤーボイＴＭ(イピリムマブ)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)および／またはＭＫ４１６６を含む。
【０３１２】
抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣはまたピジリズマブ(ＣＴ−０１１)とも投与してよいが、ＰＤ−１結合への特異性は疑問視されている。
【０３１３】
癌の処置のために抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞の活性化受容体のアゴニストである。例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせてよい。
【０３１４】
Ｔ細胞活性化はまた可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、例えば、癌を有する、対象に、
Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと投与し得る。
【０３１５】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、例えば、癌のような増殖性疾患の処置のための、免疫応答の刺激のために、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニスト(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制サイトカイン”)および／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激性受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０３１６】
組み合わせ治療のためのさらに他の薬物は、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４号、ＷＯ１１／１０７５５３号、ＷＯ１１／１３１４０７号、ＷＯ１３／８７６９９号、ＷＯ１３／１１９７１６号、ＷＯ１３／１３２０４４号)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９号、ＷＯ１３１６９２６４号、ＷＯ１４／０３６３５７号)を含むＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体のようなＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むが、これに限定されないマクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬物を含む。
【０３１７】
抗ＧＰＣ３アドネクチン類または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬物とも投与し得る。
【０３１８】
抗ＧＰＣ３アドネクチンおよび／または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと組み合わせ得る付加的薬物は、腫瘍抗原提示を促進する薬物、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモドまたは腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)とも組み合わせ得る。
【０３１９】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと組み合わせ得るさらに他の治療は、Ｔｒｅｇ細胞を阻害または枯渇する治療、例えば、ＣＤ２５と特異的に結合する薬物を含む。
【０３２０】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと組み合わせ得る他の治療は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼのような代謝酵素を阻害する治療である。
【０３２１】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと共に使用し得る他のクラスの薬物は、アデノシン形成を阻害するまたはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬物を含む。
【０３２２】
癌の処置に抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣと組み合わせ得る他の治療は、Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／阻止する治療および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療を含む。
【０３２３】
抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、１を超える癌免疫剤と組み合わせてよく、例えば、次の１以上のような免疫経路の複数要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせ得る。それらは、腫瘍抗原提示を増強する治療(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)、例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路阻害および／またはＴｒｅｇｓまたは他の免疫抑制細胞の枯渇もしくは遮断による、負の免疫制御を阻害する治療、例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／またはＧＩＴＲ経路を刺激するおよび／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激する、アゴニストでの、正の免疫制御を刺激する治療、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増加させる治療、例えば、ＣＤ２５のアンタゴニス(例えば、ダクリズマブ)を使用するまたはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による、腫瘍におけるＴｒｅｇｓのようなＴｒｅｇｓを枯渇または阻害する治療、腫瘍におけるサプレッサー骨髄細胞の機能に影響する治療、腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)、遺伝子的に修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体により修飾された細胞を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入(ＣＡＲ−Ｔ治療)、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼのような代謝酵素を阻害する治療、Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／阻止する治療、腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療、免疫刺激性サイトカインの投与または免疫抑制サイトカインの遮断である。
【０３２４】
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類および／または抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、正の共刺激性受容体をライゲートするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱させる遮断剤の１以上、アンタゴニストおよび抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増加させる薬物、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路にうちかつ薬物(例えば、阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)遮断、Ｔｒｅｇｓ枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による)、ＩＤＯのような代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは消耗回復／阻止)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬物の１以上と共に使用し得る。
【０３２５】
ここに提供されるのは、癌を有する対象の処置のための医薬の製造のための、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンの使用である。本発明は、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンを用いる処置の方法の実施態様全てに対応する、任意のここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンの医薬用途を提供する。
【０３２６】
XI. 検出可能標識
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類はまた多様な診断的およびイメージング適用に有用である。ある実施態様において、抗ＧＰＣ３アドネクチンを、インビボで検出可能である部分で標識し、このような標識アドネクチン類を、インビボ造影剤として、例えば、全身造影に使用し得る。例えば、ある実施態様において、対象におけるＧＰＣ３陽性腫瘍を検出する方法は、対象に検出可能標識に結合した抗ＧＰＣ３アドネクチンを投与し、適当な時間後、対象における標識を検出することを含む。
【０３２７】
抗ＧＰＣ３アドネクチン造影剤を使用して、ＧＰＣ３のレベル増加が関連する障害または疾患、例えば、腫瘍がＧＰＣ３を選択的に過発現する癌を検出し得る。類似の方法で、抗ＧＰＣ３アドネクチンを使用して、対象、例えば、ＧＰＣ３レベルを減少させるために処置されている対象におけるＧＰＣ３レベルおよび／またはＧＰＣ３陽性細胞(例えば、腫瘍細胞)をモニターできる。抗ＧＰＣ３アドネクチン類を、修飾を伴いまたは伴わずに使用してよく、検出可能部分の共有結合または非共有的結合により標識し得る。
【０３２８】
検出可能標識は、インビトロ診断の分野で現在使用されている種々のタイプの何れであってもよく、金コロイドのような金属ゾルを含む粒子性標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と共に提示されるＩ１２５またはＴｃ９９のような同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応によるような増幅後に明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む。ビオチニル化抗ＧＰＣ３  ＦＢＳは、次いで、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出可能となる。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は酵素アルカリホスファターゼであってよく、１,２ジオキセタン基質、例えば、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１  ３,７}デカン}−４−イル)フェニルリン酸(ＣＳＰＤ)ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ＳＴＡＲ(登録商標)または当分野で周知の他の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)のような適当なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成により検出する。
【０３２９】
使用し得る検出可能部分は、放射性物質、例えば、放射性重金属、例えば、鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放出体、１８Ｆ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１２４Ｉ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、１１Ｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１４Ｉｎ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃまたは１５３Ｓｍを含む。
【０３３０】
検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適当なレベルで蓄積するとき、裸眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などのような計器を使用して達成でき、全て標準的実務に従う。
【０３３１】
検出可能部分は、当分野で知られる方法で、システインと結合する。検出可能部分が放射性薬物、例えば、さらにここに記載するものであるとき、検出可能部分を、ＦＢＳにマレイミド−ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド−ＤＢＣＯのようなマレイミド含有キレート剤のようなシステインと反応性のキレート剤を使用して結合させる。マレイミド−ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド−ＤＢＣＯは、ＦＢＳのＣ末端のシステイン(例えば、ＰｍＸｎ部分により、ここで、少なくとも一つのＸはシステインである)と反応し、ＦＢＳ−ＮＯＤＡＧＡまたはＦＢＳ−ＤＢＣＯを各々産生できる。次のキレート剤の何れかを、システインを反応性の部分を含むまたは含むように修飾できる限り、使用してよい。それらは、ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体(ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、Ｏｘｏ−ＤＯ３Ａ)、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒおよび誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ''−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡおよび誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡベースのキレート剤およびこれらの近接アナログおよび誘導体である。
【０３３２】
ある実施態様において、ＦＢＳをＰＥＴトレーサーで標識して、インビボ造影剤と使用する。例えば、ＦＢＳを、ＰＥＴトレーサー６４Ｃｕで標識し得る。６４Ｃｕは、マレイミド−ＮＯＤＡＧＡのようなキレート剤を用いて、Ｃ末端システインでＦＢＳと結合し得る。
【０３３３】
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンベースの造影剤を合成するための、６４Ｃｕおよび１８Ｆのような放射性核種ポリペプチドを標識するための他の当分野で承認されている方法も使用され得る。例えば、引用により、内容をその全体を本明細書に包含させる、ＵＳ２０１４／０２７１４６７号；Gill et al., Nature Protocols 2011;6:1718-25; Berndt et al. Nuclear Medicine and Biology 2007;34:5-15, Inkster et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013;23:3920-6参照。
【０３３４】
ある実施態様において、ＧＰＣ３造影剤は、抗ＧＰＣ３アドネクチンベースの造影剤の造影コントラスト増強またはアビディティー増加のために、少しずつ造影剤の血液ＰＫを増加させるために、ＰＥＧ分子(例えば、５KDa  ＰＥＧ、６KDa  ＰＥＧ、７KDa  ＰＥＧ、８KDa  ＰＥＧ、９KDa  ＰＥＧまたは１０KDa  ＰＥＧ)を含み得る。
【０３３５】
XI. ＧＰＣ３の検出
インビボ検出方法
ある実施態様において、標識抗ＧＰＣ３アドネクチン類を使用して、ＧＰＣ３陽性細胞または組織、例えば、ＧＰＣ３発現腫瘍を造影できる。例えば、標識抗ＧＰＣ３アドネクチンを、標識アドネクチンが目的の組織(例えば、ＧＰＣ３発現腫瘍)に取り込まれるのに十分な量で対象に投与する。次いで、対象を、使用する特定の放射性核種に適する時間の後、ＰＥＴのようなイメージングシステムを使用して、造影する。標識抗ＧＰＣ３アドネクチン結合ＧＰＣ３発現細胞または組織、例えば、ＧＰＣ３発現腫瘍を、次いで、イメージングシステムにより検出する。
【０３３６】
ＧＰＣ３造影剤でのＰＥＴイメージングを使用して、ＧＰＣ３を定質的または定量的に検出し得る。ＧＰＣ３造影剤をバイオマーカーとして使用し、対象におけるＧＰＣ３陽性シグナルの存在または非存在が、例えば、対象がある治療、例えば、癌治療に応答するまたは対象が治療に応答するもしくはしないことを示し得る。
【０３３７】
ある実施態様において、疾患(例えば、腫瘍)の進行または退縮を、時間または処置の関数として造影できる。例えば、腫瘍のサイズを、癌治療(例えば、化学療法、放射線療法)を受けている対象でモニターし、腫瘍退縮の程度を、標識抗ＧＰＣ３アドネクチン検出に基づき、リアルタイムでモニターできる。
【０３３８】
造影剤(例えば、１８Ｆ−アドネクチン造影剤、６４Ｃｕ−アドネクチン造影剤)の目的の細胞または組織(例えば、腫瘍)への取り込みをもたらすのに有効な量は、例えば、宿主の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣、投与の時間、投与経路、用いる特定のプローブの排泄速度、処置の期間、用いる特定の組成物と組み合わせてまたは同時に使用される他の薬物の存在および他の因子を含む、多様な因子により得る。
【０３３９】
ある実施態様において、ＧＰＣ３を発現する組織のイメージングを、標識抗ＧＰＣ３アドネクチンの投与前、中および後に実施する。
【０３４０】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚および他の臓器、またはＧＰＣ３を発現するこれらの臓器と関連する腫瘍のＰＥＴイメージングに有用である。
【０３４１】
ある実施態様において、抗ＧＰＣ３造影剤は、少なくとも５０％、７５％、２、３、４、５以上のコントラストを提供する。実施例は、使用された全ての抗ＧＰＣ３アドネクチン類が、２以上のＰＥＴコントラストを提供し、アドネクチン類の親和性が重要であったことを示す。
【０３４２】
短半減期放射性核種(例えば、１８Ｆ)での造影(例えば、ＰＥＴ)に使用するとき、放射標識抗ＧＰＣ３アドネクチン類は、好ましくは静脈投与される。他の投与経路も、使用する放射性核種の半減期によっては、好適である。
【０３４３】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を対象に投与し、造影剤を検出することにより、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を使用して、対象におけるＧＰＣ３陽性細胞を検出し、検出造影剤が対象におけるＧＰＣ３陽性細胞の位置を規定する。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。
【０３４４】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を対象に投与し、造影剤を検出することにより、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を使用して、対象におけるＧＰＣ３発現腫瘍を検出し、検出造影剤が対象における腫瘍の位置を規定する。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。
【０３４５】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤の画像を、造影剤を対象に投与し、陽電子放出断層撮影により造影剤の分布をインビボでイメージングすることにより得る。
【０３４６】
従って、ここに提供されるのは、ＧＰＣ３を発現する組織または細胞の定量的画像を得る方法であり、方法は、細胞または組織とここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を接触させ、陽電子放出断層撮影を使用して、ＧＰＣ３を発現する組織を検出または定量することを含む。
【０３４７】
またここに提供されるのは、ここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤の造影有効量を、ＧＰＣ３発現腫瘍を有する対象に投与し、腫瘍における該造影剤の放射線放射を陽電子放出断層撮影を使用して検出することを含み、ここで、放射線放射が腫瘍において検出される、ＧＰＣ３発現腫瘍を検出する、方法である。
【０３４８】
またここに提供されるのは、対象におけるＧＰＣ３発現腫瘍の存在を診断する方法であり、方法は、
・  処置を必要とする対象にここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を投与し；そして
・  対象の少なくとも一部分の放射性画像を得て、造影剤の存在または非存在を検出することを含み；
・  ここで、背景を超える造影剤の存在および位置は疾患の存在および位置の指標である。
【０３４９】
またここに提供されるのは、対象におけるＧＰＣ３発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の進行をモニターする方法であり、方法は、
・  処置を必要とする対象にここに記載する抗ＧＰＣ３造影剤を最初の時点で投与し、腫瘍のサイズを決定するために対象の少なくとも一部分の画像を得て；
・  対象に抗腫瘍治療を投与し；
・  対象に造影剤をその後少なくとも１時点以上投与し、各時点で対象の少なくとも一部分の画像を得ることを含み；
・  ここで、各時点の腫瘍の寸法および位置が疾患進行の指標である。
【０３５０】
インビトロ検出方法
ＧＰＣ３をインビボで検出することに加えて、ここに記載するもののような抗ＰＤＬ１アドネクチン類を、サンプル中の標的分子の検出に使用できる。方法は、サンプルとここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類を接触させ、ここで、該接触は、抗ＧＰＣ３アドネクチン−標的複合体形成を可能とする条件下で実施し、そして、該複合体を検出し、それにより該サンプルにおける該標的を検出することを含む。検出は、例えば、Ｘ線検査、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴のような、当分野で認識される任意の技術を使用して実施し得る。サンプルはヒトまたは他の哺乳類由来であり得る。診断的目的で、適当な標識物質は、全身造影のための放射性同位体およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
【０３５１】
検出可能標識は、は、インビトロ診断の分野で現在使用されている種々のタイプの何れであってもよく、金コロイドのような金属ゾルを含む粒子性標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と共に提示されるＩ１２５またはＴｃ９９のような同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応によるような増幅後に明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む。ビオチニル化ＦＢＳは、次いで、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出可能となる。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は酵素アルカリホスファターゼであってよく、１,２ジオキセタン基質、例えば、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１  ３,７}デカン}−４−イル)フェニルリン酸(ＣＳＰＤ)ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ＳＴＡＲ(登録商標)または当分野で周知の他の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)のような適当なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成により検出する。他の標識は、上記イメージングのセクションに示したものを含む。検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適当なレベルで蓄積するとき、裸眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などのような計器を使用して達成でき、全て標準的手法に従う。
【０３５２】
XII. キットおよび製品
ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチン類およびその薬物コンジュゲートを、予定された量の試薬と、ここに記載する治療または診断方法における使用指示の包装された組み合わせであるキットとして提供できる。
【０３５３】
例えば、ある実施態様において、ここに記載する障害または状態の処置または予防に有用なまたはここに記載する検出方法において使用するための物質を含む製品が提供される。製品は、容器およびラベルを含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような多様な材料から製造し得る。容器は、インビボイメージングのためのここに記載する組成物を有してよく、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。組成物における活性剤は、ここに記載する抗ＧＰＣ３アドネクチンまたは抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣである。製品は、さらに、リン酸緩衝化食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第二容器をさらに含み得る。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用指示が記載された添付文書を含む、商業的なおよび使用者の立場から望ましい他の物質もさらに含み得る。
【０３５４】
実施態様の例示
１. ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むフィブロネクチンベース足場(ＦＢＳ)を含むポリペプチドであって、ここで、ループの１以上が野生型ＦＢＳドメインの対応するループに対して改変されており、ヒトグリピカン−３(ＧＰＣ３)に１μM以下のＫＤで結合する、ポリペプチド。
【０３５５】
２. ＦＢＳがフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)ドメインである、実施態様１に記載のポリペプチド。
【０３５６】
３. Ｆｎ３ドメインがヒト第１０フィブロネクチンIII型(１０Ｆｎ３)ドメインである、実施態様２に記載のポリペプチド。
【０３５７】
４. ＢＣループが
(ａ)配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９；および
(ｂ)配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９のＢＣループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＢＣループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３５８】
５. ＤＥループが
(ａ)配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００；および
(ｂ)配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５または１００のＤＥループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＤＥループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３５９】
６. ＦＧループが
(ａ)配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８および
(ｂ)配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１または３１８のＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換、挿入または欠失を有するＦＧループ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６０】
７. それぞれＢＣループが配列番号６、１９、３２、４５、５８、７１、８４または９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＤＥループが配列番号７、２０、３３、４６、５９、７２、８５および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そしてＦＧループが配列番号８、２１、３４、４７、６０、７３、８６、１０１、１２９、１５６、１８３、２１０、２３７、２６４、２９１および３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により、ＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループが１、２または３アミノ酸置換を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６１】
８. 
(ａ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号６、７および８を含み；
(ｂ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号６、７および８の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｃ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号１９、２０および２１を含む；
(ｄ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号１９、２０および２２の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｅ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号３２、３３および３４を含む；
(ｆ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号３２、３３および３４の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｇ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含む；
(ｈ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号４５、４６および４７の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｉ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号５８、５９および６０を含む；
(ｊ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号５８、５９および６０の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｋ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号７１、７２および７３を含む；
(ｌ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号７１、７２および７３の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｍ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号８４、８５および８６を含む；
(ｎ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号８４、８５および８６の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む；
(ｏ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１０１を含む；
(ｐ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも一つが配列番号９９、１００および１０１の各ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対して１、２または３アミノ酸置換を含む、
前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６２】
９. ＦＢＳは配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ(Ｘ)ｖ、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｚとして表され、そして
(ａ)それぞれ配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｂ)それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｃ)それぞれ配列番号１９、２０および２１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｄ)それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｅ)それぞれ配列番号３２、３３および３４に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｆ)配列番号３２、３３および３４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｇ)それぞれ配列番号４５、４６および４７に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｈ)配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｉ)それぞれ配列番号５８、５９および６０に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配を含むか；
(ｊ)配列番号５８、５９および６０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｋ)それぞれ配列番号７１、７２および７３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｌ)配列番号７１、７２および７３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｍ)それぞれ配列番号８４、８５および８６に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｎ)配列番号８４、８５および８６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｏ)それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
(ｐ)配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｑ)配列番号９９、１００および１２９のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｒ)配列番号９９、１００および１５６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｓ)配列番号９９、１００および１８３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｔ)配列番号９９、１００および２１０のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｕ)配列番号９９、１００および２３７のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｖ)配列番号９９、１００および２６４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；
(ｗ)配列番号９９、１００および２６４のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含むか；または
(ｘ)配列番号９９、１００および３１８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む、
前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６３】
１０. ＦＢＳが、配列番号３、５、１８、３１、４４、５７、７０、８３および９８の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６４】
１１. ＦＢＳが配列番号５、１８、３１、４４、５７、７０、８３および９８の何れかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６５】
１２. ＦＢＳが、配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７または３１９〜３４３の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６６】
１３. ＦＢＳが配列番号９８、１０２〜１２８、１２９〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６７】
１４. ＦＢＳが配列番号５、１８、３１、４４、５７、７０、８３、９８、１２８、１５５、１８２、２０９、２０９、２３６、２６３、２９０および３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６８】
１５. ＦＢＳが配列番号５、９〜１８、２２〜３１、３５〜４４、４８〜５７、６１〜７０、７４〜８３、８７〜９８、１０２〜１２８、１３０〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３６９】
１６. ＦＢＳが配列番号９８、１０２〜１２８、１２９〜１５５、１５７〜１８２、１８４〜２０９、２１１〜２３６、２３８〜２６３、２６５〜２９０、２９２〜３１７および３１９〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７０】
１７. ＦＢＳが、グリピカン−３との結合について配列番号９８のアミノ酸配列を含むＦＢＳと競合する、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７１】
１８. ＦＢＳが、ＨＱＶＳＦＦ(配列番号２０９)を含むグリピカン−３内の１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７２】
１９. ＦＢＳが、ＥＱＬＬＱＳＡＳＭ(配列番号２１０)を含むグリピカン−３内の１０〜２０アミノ酸残基の領域に結合する、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７３】
２０. ＦＢＳが、ＨＱＶＳＦＦ(配列番号２０９)およびＥＱＬＬＱＳＡＳＭ(配列番号２１０)を含むグリピカン−３内の不連続アドネクチン部位に結合する、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７４】
２１. さらに異種タンパク質を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７５】
２２. さらにポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態(ＰＫ)部分を含む、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７６】
２３. ＦＢＳのＣ末端がアミノ酸配列ＰｍＸｎからなる部分に結合し、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１の整数である、前記実施態様の何れかに記載のポリペプチド。
【０３７７】
２４. ｍが１または２であり、ｎが１〜１０の整数である、実施態様２３に記載のポリペプチド。
【０３７８】
２５. 部分がシステインを含む、実施態様２３または２４に記載のポリペプチド。
【０３７９】
２６. 部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり、ここで、Ｃはシステインであり、各Ｘは独立して任意のアミノ酸である、実施態様２５に記載のポリペプチド。
【０３８０】
２７. 部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり１ＣＸｎ２、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、実施態様２５に記載のポリペプチド。
【０３８１】
２８. ｎ１およびｎ２が独立して１〜５の整数である、実施態様２８に記載のポリペプチド。
【０３８２】
２９. 部分がＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ(配列番号３８２)、ＰＩＥＫ(配列番号３８３)、ＰＩＤＫＰ(配列番号３８４)、ＰＩＥＫＰ(配列番号３８５)、ＰＩＤＫＰＳ(配列番号３８６)、ＰＩＥＫＰＳ(配列番号３８７)、ＰＩＤＫＰＣ(配列番号３８８)、ＰＩＥＫＰＣ(配列番号３８９)、ＰＩＤＫＰＳＱ(配列番号３９０)、ＰＩＥＫＰＳＱ(配列番号３９１)、ＰＩＤＫＰＣＱ(配列番号３９２)、ＰＩＥＫＰＣＱ(配列番号３９３)、ＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９４)およびＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号３９５)からなる群から選択される、実施態様２３に記載のポリペプチド。
【０３８３】
３０. 部分がＰＣまたはＰＰＣである、実施態様２６に記載のポリペプチド。
【０３８４】
３１. 部分がＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)およびＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)からなる群から選択される、実施態様２７に記載のポリペプチド。
【０３８５】
３２. 部分がＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)である、実施態様３１に記載のポリペプチド。
【０３８６】
３３. Ｃ末端部分におけるシステインが異種部分にコンジュゲートする、実施態様２５〜３２の何れかに記載のポリペプチド。
【０３８７】
３４. 異種部分が検出可能部分である、実施態様３３に記載のポリペプチド。
【０３８８】
３５. 異種部分が薬物部分であり、ＦＢＳと薬物部分がＦＢＳ−薬物コンジュゲートを形成する、実施態様３３に記載のポリペプチド。
【０３８９】
３６. 実施態様１〜３１の何れかに記載のＦＢＳ部分を含むＦＢＳ−薬物コンジュゲートであって、薬物部分が、リンカーによりＦＢＳ部分にコンジュゲートしている、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９０】
３７. リンカーがヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドまたはペプチド含有リンカーである、実施態様３６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９１】
３８. リンカーがペプチジルリンカーである、実施態様３７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９２】
３９. ペプチジルリンカーがＶａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号４６７)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、実施態様３８に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９３】
４０. 薬物部分が細胞毒性薬物である、実施態様３６〜３９の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９４】
４１. 細胞毒性薬物が
(ａ)カリチアマイシンのようなエンジイン類およびウンシアラマイシン；
(ｂ)ツブリシン；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンのアナログのようなＤＮＡアルキル化剤；
(ｄ)エポチロン；
(ｅ)オーリスタチン；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体；
(ｇ)ＤＭ１およびＤＭ４のようなマイタンシノイド
ならびにこれらのアナログおよび誘導体
からなる群から選択される、
実施態様４０に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９５】
４２. 薬物部分が
【化１５】
2018533369.tif 000017
である、実施態様４１に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９６】
４３. 薬物部分が式(II)
【化１６】
2018533369.tif 000018
の構造を有する合成ツブリシンアナログである、実施態様３６〜４１の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９７】
４４. ＦＢＳおよび薬物部分が、式(III)
【化１７】
2018533369.tif 000019
の構造を有するリンカー部分とコンジュゲートする、実施態様３６〜４３の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９８】
４５. 薬物−部分−リンカーが式(IV)
【化１８】
2018533369.tif 000020
の構造を有し、ここで、マレイミド基をＦＢＳのシステインのスルフヒドリル基と反応させて、それにより薬物−部分−リンカーとＦＢＳの間にチオエーテル結合を形成させる、実施態様４４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０３９９】
４６. ＦＢＳ部分がシステインを含むＣ末端部分を含む、実施態様３６〜４５の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４００】
４７. Ｃ末端部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎからなり、ここで、Ｃはシステインであり、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎが０または少なくとも１である整数である、実施態様４６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０１】
４８. ｍが１または２であり、ｎが１〜１０の整数である、実施態様４７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０２】
４９. 部分がアミノ酸配列ＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなり、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、実施態様４６に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０３】
５０. ｎ１およびｎ２が独立して１〜５の整数である、実施態様４９に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０４】
５１. Ｃ末端部分がＰＣまたはＰＰＣである、実施態様４７に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０５】
５２. 部分がＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)およびＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)からなる群から選択される、実施態様４９に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０６】
５３. 部分がＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号１６)である、実施態様５２に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０７】
５４. 式(Ｉ)
【化１９】
2018533369.tif 000021
〔式中、ｍは１、２、３または４であり、Ａｄｘは１μM以下のＫＤでヒトＧＰＣ３に特異的に結合するアドネクチンであり、“Ａｄｘ”に結合する硫黄原子はアドネクチンのシステインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０８】
５５. Ａｄｘがヒト１０Ｆｎ３ドメインであり、ここで、
(ａ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号６、７および８を含むか；
(ｂ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号１９、２０および２１を含むか；
(ｃ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号３２、３３および３４を含むか；
(ｄ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含むか；
(ｅ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号５８、５９および６０を含むか；
(ｆ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号７１、７２および７３を含むか；
(ｇ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号８４、８５および８６を含むか；
(ｈ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１０１を含むか；
(ｉ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１２９を含むか；
(ｊ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１５６を含むか；
(ｋ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および１８３を含むか；
(ｌ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２１０を含むか；
(ｍ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２３７を含むか；
(ｎ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２６４を含むか；
(ｏ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および２６４を含むか；または
(ｐ)ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループがそれぞれ配列番号９９、１００および３１８を含み、
１０Ｆｎ３ドメインがアミノ酸配列ＰｍＣＸｎまたはＰｍＣＸｎ１ＣＸｎ２からなるＣ末端部分を含み、ここで、各Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、ｎ１およびｎ２は独立して０または少なくとも１の整数である、実施態様５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４０９】
５６. Ｃ末端部分がＰＣまたはＰＰＣ、ＰＣＧＣ(配列番号４１２)、ＰＣＰＣ(配列番号４１３)、ＰＣＧＳＧＣ(配列番号４１４)、ＰＣＰＰＰＣ(配列番号４１５)、ＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号４１６)、ＰＣＧＳＧＳＧＣ(配列番号４１７)、ＰＣＨＨＨＨＨＣ(配列番号４１８)、ＰＣＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４１９)、ＰＣＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２０)、ＰＣＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２１)、ＰＣＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２２)、ＰＣＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２３)、ＰＣＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２４)またはＰＣＧＳＧＳＧＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４２５)である、実施態様５５に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４１０】
５７. 部分がＰＣまたはＰＣＰＰＰＰＰＣ(配列番号１６)である、実施態様５２に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４１１】
５８. Ａｄｘが配列番号１２〜１７、２４〜３０、３８〜４３、５１〜５６、６４〜６９、７７〜８２、９０〜９７、１１０〜１２７、１３７〜１５４、１６４〜１８１、１９１〜２０８、２１８〜２３５、２４５〜２６２、２７２〜２８９、２９９〜３１６および３２６〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４１２】
５９. Ａｄｘが配列番号１１０〜１２７、１３７〜１５４、１６４〜１８１、１９１〜２０８、２１８〜２３５、２４５〜２６２、２７２〜２８９、２９９〜３１６および３２６〜３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４１３】
６０. Ａｄｘが配列番号１１０〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様５４に記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４１４】
６１. 実施態様１〜３５の何れかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【０４１５】
６２. 実施態様３６〜６０の何れかに記載のＦＢＳ−薬物コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【０４１６】
６３. 本質的に内毒素がない、実施態様６１または６２に記載の組成物。
【０４１７】
６４. 実施態様１〜３５の何れかに記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【０４１８】
６５. 実施態様１〜３５の何れかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【０４１９】
６６. 実施態様１〜３５の何れかのポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞。
【０４２０】
６７. 実施態様１〜３５の何れかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、実施態様６６に記載の細胞を該ポリペプチドの発現に適当な条件下培養し、該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
【０４２１】
６８. 実施態様６１または６２に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるグリピカン−３疾患または障害を軽減または阻止する方法。
【０４２２】
６９. グリピカン−３疾患または障害が癌である、実施態様６８に記載の方法。
【０４２３】
７０. 癌が肝細胞癌、メラノーマ、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、卵巣癌または肺扁平上皮癌である、実施態様６９に記載の方法。
【０４２４】
７１. 実施態様１〜６２の何れかに記載のポリペプチド、ＦＢＳ−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物および使用指示を含む、キット。
【０４２５】
７２. サンプルと実施態様１〜３５の何れかに記載のポリペプチドを接触させ、ＦＢＳのグリピカン−３への結合を検出または測定することを含む、サンプルにおけるグリピカン−３を検出または測定する方法。
【０４２６】
７３. 式(Ｉ)
【化２０】
2018533369.tif 000022
〔式中、ｍは１であり、Ａｄｘは配列番号１１０〜１１７および２７２〜２８９の何れかのアミノ酸配列を含むアドネクチンであり、そして、“Ａｄｘ”に結合する硫黄原子はアドネクチンのＣ末端システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４２７】
７４. 式(Ｉ)
【化２１】
2018533369.tif 000023
〔式中、ｍは２であり、Ａｄｘは配列番号１１９〜１２６および２８１〜２８８のアミノ酸配列を含むアドネクチンであり、“Ａｄｘ”に結合している硫黄原子はアドネクチンの２Ｃ末端システインの各々のスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４２８】
７５. 式(VI)
【化２２】
2018533369.tif 000024
〔式中、システインに結合する硫黄原子は、システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４２９】
７６. 式(VII)
【化２３】
2018533369.tif 000025
〔式中、システインに結合する硫黄原子は、システインのスルフヒドリル基の硫黄原子である。〕
により表される構造を有する、ＦＢＳ−薬物コンジュゲート。
【０４３０】
援用による取り込み
本出願をとおして引用する全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイト、特許および公開特許出願は、本明細書に全部がまたは一部が記載されるのと同程度に、引用により明示的に本明細書に包含させる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２１４６６号の内容は、ここに引用により明示的に本明細書に包含させる。
【０４３１】
本発明を、ここで、次の実施例を参照して説明するが、これは単なる説明であり、本発明を限定する意図はない。本発明を詳細におよびその特定の実施態様を参照して記載しているが、その精神および範囲から逸脱することなく、、種々の変化および修飾をなし得ることは、当業者には明らかである。
【実施例】
【０４３２】
実施例１：抗グリピカン−３結合アドネクチン類の選択、発現および精製
グリピカン−３(ＧＰＣ３)結合アドネクチン類を、グリピカン−３タンパク質でスクリーニングしたアドネクチンライブラリーから単離し、またはライブラリーから同定されたクローンからＰＲＯｆｕｓｉｏｎにより親和性成熟させた。ＲＮＡ−タンパク質技術およびフィブロネクチン−ベース足場タンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な記載に関して、引用により本明細書に包含させる、Szostak et al., 米国特許６,２５８,５５８号、６,２６１,８０４号、６,２１４,５５３号、６,２８１,３４４号、６,２０７,４４６号、６,５１８,０１８号、ＰＣＴ公開ＷＯ００／３４７８４号、ＷＯ０１／６４９４２号、ＷＯ０２／０３２９２５号、およびRoberts et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302(1997)参照。
【０４３３】
良好な結合および生物物理学的特性を有する７アドネクチン類のアミノ酸およびヌクレオチド配列を下に提供する。
ＡＤＸ＿４５７８＿Ｆ０３
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHPPHPNIVSYHIYYGETGGNSPVQEFTVEGSKSTAKISGLKPGVDYTITVYAVAPEIEKYYQIWINYRTEGSGS*(配列番号１０)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACTTGGAAGTGGTTGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCTCTTGGCATCCGCCGCATCCGAACATCGTTTCTTACCATATCTACTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGGAAGGTTCTAAATCTACTGCTAAAATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTACGCTGTTGCTCCGGAAATCGAAAAATACTACCAGATTTGGATTAATTACCGCACAGAAGGCAGCGGTTCCTAA(配列番号４５２)
ＡＤＸ＿４５７８＿Ｈ０８
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGYDYGDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPDGSNTATISGLKPGVDYTITVYAVEAYGKGYTRYTPISINYRTEIDKPSQ*(配列番号２３)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGGTTACGACTACGGTGACTCTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGACGGTTCTAACACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAAGCTTACGGTAAAGGTTACACTCGTTACACTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(配列番号４５２)
ＡＤＸ＿４５７８＿Ｂ０６
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWFPDRYVYYITYGETGGNSPVQEFTVEGHKQTAYISGLKPGVDYTITVYAIYYYPDDFQGYPQPISINYRTEGSGS*(配列番号３６)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACTTGGAAGTGGTTGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCTCTTGGTTCCCGGACCGTTACGTTTACTACATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGGAAGGTCATAAACAGACTGCTTACATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTACGCTATCTACTACTACCCGGACGACTTCCAGGGTTACCCGCAGCCGATTTCTATTAATTACCGCACAGAAGGCAGCGGTTCCTAA(配列番号４５４)
ＡＤＸ＿４６０６＿Ｆ０６
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNSGHSGQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRYGYTATISGLKPGVDYTITVYAVAHSEASAPISINYRTEIDKPSQ*(配列番号４９)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGAACTCTGGTCATTCTGGTCAGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTCGTTACGGTTACACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGCTCATTCTGAAGCTTCTGCTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(配列番号４５５)
ＡＤＸ＿５２７３＿Ｃ０１
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDPYEEERYYRITYGETGGNSPVQEFTVPAFHTTATISGLKPGVDYTITVYAVTYKHKYAYYYPPISINYRTEIDKPSQ*(配列番号６２)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGACCCGTACGAAGAAGAACGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGCTTTCCATACTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACAAACATAAATACGCTTACTACTACCCGCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(配列番号４５６)
ＡＤＸ＿５２７３＿Ｄ０１
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPSYKDDRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSFHQTATISGLKPGVDYTITVYAVTYEPDEYYFYYPISINYRTEIDKPSQ*(配列番号７５)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGGAACCGTCTTACAAAGACGACCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTTCTTTCCATCAGACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGAACCGGACGAATACTACTTCTACTACCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(配列番号４５７)
ＡＤＸ＿５２７４＿
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGDYHPHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHETATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKADKYPPISINYRTEIDKPSQ*(配列番号８８)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGGTGACTACCATCCGCATCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTGAACATGAAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGACGGTGAAAAAGCTGACAAATACCCGCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(配列番号４５８)
【０４３４】
７種のＧＰＣ３結合アドネクチン類の結合特性を、組み換えＧＰＣ３を使用するＥＬＩＳＡおよびＧＰＣ３陽性ＣＨＯ細胞株およびＨｅｐＧ２ヒト腫瘍細胞株を使用するフローサイトメトリーにより決定した。フローサイトメトリー実験について、ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−グリピカン−３細胞またはＨｅｐＧ２腫瘍細胞株をバーゼンで処理し、ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ  ２.５％ＦＢＳ)に再懸濁した。ＦＡＣＳ緩衝液に希釈したアドネクチン類を、細胞と、１時間、４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄後、細胞を抗Ｈｉｓ抗体と２μg／mlでインキュベートし、１時間、４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、細胞をＦＩＸ緩衝液(ＰＢＳ中２.５％ホルムアルデヒド)に再懸濁した。分析を、BB Biosciences FACS Cantoで実施した。
【０４３５】
ＥＬＩＳＡ実験の結果を表３に示し、フローサイトメトリー結果例を図３Ａ〜Ｄに示す。サイズ排除クロマトグラフ(ＳＥＣ)で決定したアドネクチン類の凝集スコアも表２に提供する。これらのアドネクチン類の何れも顕著に凝集しなかった。
【表２】
2018533369.tif 000026
【０４３６】
ＡＤＸ＿５２７４＿Ｅ０１のＣ末端を、Ｃ末端システインおよび６ｘＨｉｓテイルの包含により修飾し、アドネクチンＡＤＸ＿６５６１＿Ａ０１を産生した。
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGDYHPHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHETATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKADKYPPISINYRTPCHHHHHH(配列番号９４)
【０４３７】
ＡＤＸ＿６５６１＿Ａ０１をコードする核酸を、ループＢＣ、ＤＥまたはＦＧにおけるアミノ酸残基をコードする各ヌクレオチド位置に小フラクションの置換を導入することにより多様化させた。ＡＤＸ＿６５６１＿Ａ０１に関連するアドネクチン配列の得られたライブラリーを、次いで、高ストリンジェンシー条件下、ヒトＧＰＣ３への結合についてのＰＲＯｆｕｓｉｏｎ(ｍＲＮＡディスプレイ)により、インビトロ選択した。選択完了後富化したクローンを配列決定し、ＨＴＰＰ形式で表し、さらに分析した。
【０４３８】
選択は、アドネクチンＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２を高親和性でヒトＧＰＣ３に結合するとして同定した。ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列は次のとおりである。
【表３】
2018533369.tif 000027
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGATGACTACCATGCGCATCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTGAACATGTGACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGACGGTGAAAAGGCTGCCACAGATTGGTCAATTTCCATTAATTACCGCACACCGTGCCACCATCACCACCACCACTGA(配列番号４５９)
【０４３９】
他のグリピカン分子への抗ＧＰＣ３アドネクチンの結合を試験し、結果は、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２がヒトＧＰＣ３と特異的に結合し、他のヒトグリピカン類ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＧＰＣ５およびＧＰＣ６と交差反応しないことを示す。
【０４４０】
実施例２：薬物部分のコンジュゲーションのためのＣ末端システインを有するアドネクチン類
薬物部分に結合するアドネクチン類を製造するために、アドネクチン類を、そのＣ末端を修飾して、次のＣ末端アミノ酸配列の一つを含むようにした。ＮＹＲＴＰＣ(配列番号４６６；ＤＡＲ１アドネクチン類、すなわち、単一薬物部分に結合するための、リンカー内に単一システインを有するアドネクチン類形成のため)；ＮＹＲＴＰＣＣ(配列番号４６７；ＤＡＲ２アドネクチン類、すなわち、システインあたり１個の２薬物部分に結合するために、リンカーに２システインを有するアドネクチン類形成のため)；ＮＹＲＴＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４６８；６ｘＨｉｓテイルを有するＤＡＲ１アドネクチン類形成のため)およびＮＹＲＴＰＣＰＰＰＰＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号４６９；６ｘＨｉｓテイルを有するＤＡＲ２アドネクチン類形成のため)。
【０４４１】
１以上のシステイン残基を含む非コンジュゲートアドネクチン類のジスルフィド結合二量体を阻止するため、アドネクチン類のシステイン残基を、次のとおりカルボキシメチル化した。アドネクチン溶液を還元剤(５mM  ＤＴＴまたは５mM  ＴＣＥＰ)で処理し、３０分、室温でインキュベートした。ヨードアセトアミド(５００mM、Sigma P/N A3221-10VL)を、最終濃度５０mMまで添加した。サンプルを、１時間、暗所で室温でインキュベートした。サンプルを次いでＰＢＳまたは酢酸ナトリウム緩衝液に対して透析した。
【０４４２】
実施例３：ＧＰＣ３−アドネクチン薬物コンジュゲート(ＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣ)の産生
アドネクチン類、例えば、ＧＰＣ３アドネクチン類の産生：アドネクチンをコードする、例えば、アミノ酸配列ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＳＤＤＹＨＡＨＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＥＨＶＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＹＤＧＥＫＡＡＴＤＷＳＩＳＩＮＹＲＴＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号１１８；ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２)を有するタンパク質をコードする核酸(配列番号４５９)を、ｐＥＴ９ｄ(EMD Biosciences, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓ−Ｓ細胞で発現させた。２０mlの接種培養(単一播種コロニーから産生)を、２.５リットルUltra Yieldフラスコ(Thomson Instruments Co. P/N 931136-B)中、５０μg／mlカナマイシンを含む１リットルのMagic Media大腸菌発現培地(Invitrogen, Catalog K6803A/B)の接種に使用した。培養物を、３７℃で６時間、続いて２０℃で１８時間、２２５RPMで震盪させながら増殖させた。インキュベーション時間の後、培養物を、３０分、≧１０,０００ｇで４℃の遠心分離により採取した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを解凍し、２５mLの溶解緩衝液(２０mMリン酸ナトリウム、５００mM  塩化ナトリウム、５mM  ジチオスレイトール、１×CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail-EDTAフリー(Roche)に、ULTRA-TURRAXホモジナイザー(IKA-Works)を氷上で使用して再懸濁させた。細胞溶解を、Model M-110P Microfluidizer(Microfluidics)を使用する高圧均質化(≧１８,０００psi)により達成した。不溶性フラクションを、３０分、２３,３００ｇで４℃の遠心分離により分離し、廃棄した。可溶性フラクションを０.２ミクロン減圧フィルターで濾過した。濾過上清を、２０mMリン酸ナトリウム／５００mM  塩化ナトリウムｐＨ７.４＋５mM  ＤＴＴ緩衝液で平衡化したHistrapカラム(GE Healthcare P/N 17-5248-02)に充填した。充填後、カラムを１０ＣＶ平衡化緩衝液、続いて１０ＣＶの４０mM  イミダゾールの平衡化緩衝液、続いて１０ＣＶ２.０Ｍ  塩化ナトリウムのＰＢＳ溶液で洗浄した。結合タンパク質を、２０mMリン酸ナトリウム中５００mM  イミダゾール／５００mM  塩化ナトリウムｐＨ７.４＋５mM  ＤＴＴで溶出した。ＨｉｓＴｒａｐカラムからの溶出液を、Ｇ２５ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して５０mM  酢酸ナトリウム／１０mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５に交換することにより緩衝液交換した。次いで、サンプルをカチオン交換クロマトグラフィーカラム(SP HP, GE Healthcare 17-1152-01)に付した。結合タンパク質を、５０mM  酢酸ナトリウムｐＨ５.５緩衝液中、塩化ナトリウム濃度を増加させる勾配で溶出した。フラクションを、ツブリシンとのコンジュゲーションのためにプールした。
【０４４３】
ツブリシンアナログ−リンカーの産生：式(IV)の構造を有するツブリシンアナログ−リンカー化合物を、米国８,３９４,９２２号(引用により本明細書に包含)に記載のとおり製造した。
【化２４】
2018533369.tif 000028
【０４４４】
アドネクチン−薬物コンジュゲーション：ツブリシンアナログ−リンカーのＣ末端システインを有するアドネクチン類へのコンジュゲーションを、次のとおり実施した。
【０４４５】
ツブリシンアナログとコンジュゲートするアドネクチンのサンプルを５mM  ＴＣＥＰで処理し、室温で約１時間インキュベートした。ＴＣＥＰを、５０mM  ＮａＯＡｃ／１０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ５.５で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラム(GE Healthcare)で除去した。ツブリシンアナログを１００％ＤＭＳＯに溶解し、最終濃度の５×モル濃度で添加し、反応物を２時間、ＲＴ、続いて一夜、４℃でインキュベートした。未反応ツブリシンアナログを除去するために、反応混合物を、上記のとおりＳＰカチオン交換カラムに再適用した。
【０４４６】
Ｃ末端近くに２システイン残基を含むアドネクチン類、例えば、ＧＰＣ３アドネクチン類を、上記と同じ方法を使用して、２分子のツブリシンアナログとコンジュゲートし、ＤＡＲ２(薬物−アドネクチン比２)アドネクチン類を産生した。
【０４４７】
Nanodrop 8000分光光度計(Thermo Scientific)を使用して、タンパク質濃度を決定した。コンジュゲートおよび非コンジュゲートアドネクチンの分子量を、Zorbax C8 RRHDカラムを備えたAgilent Technologies 6540 UHD Accurate Mass Q-ToF LC-MSを使用して、ＬＣ−質量分析法で決定した。
【０４４８】
アドネクチン類の発現、精製、コンジュゲートおよびアルキル化のこれら技法を使用して、表３に挙げるアドネクチン類およびアドネクチン−薬物コンジュゲートを製造した。
【表４】
2018533369.tif 000029
【表５】
2018533369.tif 000030
【０４４９】
実施例４：抗ＧＰＣ３アドネクチン類およびＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣのインビトロ特徴付け
サイズ排除クロマトグラフィー：標準的サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を、中規模方法から得られた候補アドネクチン類で実施した。中規模物質のＳＥＣを、Agilent 1100または1200 HPLCシステムで、Superdex 200 10/30またはSuperdex 75 10/30カラム(ＧＥ Healthcare)を使用し、Ａ２１４nmおよびＡ２８０nmでのＵＶ検出および蛍光検出(励起２８０nm、放出３５０nm)を用いて実施した。１００mM  硫酸ナトリウム／１００mMリン酸ナトリウム／１５０mM  塩化ナトリウム、ｐＨ６.８の緩衝液を、用いるＳＥＣカラムについて適当な流速で使用した。ゲル濾過標準(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を、分子量較正に使用した。
【０４５０】
熱安定性：ＨＴＰＰアドネクチン類の熱走査蛍光(ＴＳＦ)分析を、相対的熱安定性をスクリーニングするために実施した。サンプルを、ＰＢＳ中０.２mg／mlで正規化した。ＰＢＳで１：４０希釈した１μlのＳｙｐｒｏ橙色色素を、２５μlの各サンプルに添加し、プレートを透明９６ウェルマイクロプレート接着シールで密閉した。サンプルを、BioRad RT-PCR機を使用して、温度を２５℃〜９５℃に２℃／分で上げながら操作した。データをBioRad CFX manager 2.0ソフトウェアを使用して分析した。ＴＳＦにより得られたＴｈ値は、４０℃〜７０℃の融解範囲にわたり、ＤＳＣにより得られたＴｍ値とよく相関することを示している。これが、この技術の許容される作業範囲と考えられる。ＮＤ(“データ無し”)の結果は、遷移曲線の傾斜が、その導かれるピーク(蛍光の経時的変化率)が、ノイズと区別するには小さすぎるときに得られる。“ＮＤ”結果は熱安定性の指標として解釈されるべきではない。透析ＨＴＰＰ’ｄおよび中規模アドネクチン類の示差走査熱量測定(ＤＳＣ)分析を実施して、各Ｔｍを決定した。０.５mg／ml溶液を、VP-Capillary Differential Scanning calorimeter(GE Microcal)で、温度を１５℃から１１０℃に、１℃／分の速度で、７０p.s.i圧下上げながら操作した。データを、適当な緩衝液の対照ランに対して、Originソフトウェア(OriginLab Corp)の最良フィットを使用して分析した。
【０４５１】
ＳＰＲ親和性測定：表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)を、α−ＧＰＣ３アドネクチン類およびツブリシンコンジュゲートＡｄｘＤＣのオフレート(ｋｄ)および結合親和性を計算するために、Biacore T100計器(ＧＥ Healthcare)を使用して実施した。組み換えヒト(ａａ  １〜５５９)およびマウス(ａａ  ２５〜５５７)グリピカン−３タンパク質(R&D Systems)を、１０mM  酢酸ナトリウムｐＨ４.５で１０μg／mlに希釈し、製造業者のアミンカップリングプロトコール(ＧＥ Healthcare)に従い、ＣＭ５バイオセンサーの有効フローセルに個々に固定化し、フローセルあたり各タンパク質約１０００ＲＵ固定化密度を標的とした。ＳＰＲ実験を、３７℃でＨＢＳ−Ｐ＋(１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０.０５％(ｖ／ｖ)  Surfactant P20、ｐＨ７.４)ランニング緩衝液(ＧＥ Healthcare)を使用して実施した。親和性測定のために、２００〜１.５６nMの一連の濃度のα−ＧＰＣ３アドネクチン類およびＡｄｘＤＣをランニング緩衝液中で調製し、ヒトおよびマウスＧＰＣ３バイオセンサーフローセルにわたり３０μl／分で注入した。オフレート測定のために、単一２００nMアドネクチン／ＡｄｘＤＣ濃度を、同一条件を使用して注入した。１０mM  グリシンｐＨ１.７の１回の３０秒注入を使用して結合アドネクチンおよびアッセイサイクル間のＧＰＣ３表面の再生をした。
【０４５２】
速度定数ｋａ(ｋｏｎ)およびｋｄ(ｋｏｆｆ)を、Biacore T100 Evaluationソフトウェアｖ２.０.４(ＧＥ Healthcare)における１：１結合モデルに適合させた対照減算センサーグラムから導いた。親和性定数、ＫＤを、速度定数ｋｄ／ｋａ比から計算した。
【０４５３】
細胞結合アッセイ：ｈｕＧＰＣ３陽性細胞Ｈｕｈ７へのＧＰＣ３アドネクチン類の結合を、本質的に次のとおりのフローサイトメトリーにより評価した。Ｈｕｈ７癌腫細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞を、Lonza, Cat. # 17-711EからのＥＤＴＡ細胞解離溶液であるバーゼンを使用して採取した。腫瘍細胞(１Ｅ５細胞／反応)をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０.０５％Ｎａアジド)に懸濁し、一連の希釈ＡｄｘＤＣと１時間、氷上で混合した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、結合ＡｄｘＤＣを社内抗足場モノクローナルＡｂおよび(RnD Systems), cat# NL007からのＰＥコンジュゲート抗体で検出し、フローサイトメーターで読んだ。データ分析を、FlowJoソフトウェアを死油して行い、最大結合の５０％のＥＣ５０を、ＰＲＩＳＭTMソフトウェア、version 5.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を使用して決定した。
【０４５４】
細胞増殖阻害アッセイ：３Ｈチミジン取り込み阻害が試験細胞株の増殖阻害を示す３Ｈチミジンアッセイを使用して、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２細胞の増殖に対するＡｄｘＤＣの用量依存的阻害効果を評価した。ヒト腫瘍細胞株をAmerican Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)から得て、ＡＴＣＣからの指示に従い培養した。細胞を１.２５×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、１：３連続希釈のＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣをウェルに添加した。プレートを７２時間インキュベートした。プレートを、総インキュベーション時間の最後の２４時間ウェルあたり１.０μCiの３Ｈ−チミジンでパルスし、採取し、Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments, Meriden, CT)で読んだ。ＥＣ５０値  −  最大細胞増殖阻害の５０％が達成されるアドネクチン薬物コンジュゲート濃度  −  を、ＰＲＩＳＭTMソフトウェア、version 4.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を使用して決定した。
【０４５５】
ＤＡＲ１およびＤＡＲ２形態のＡｄｘＤＣコンジュゲートのインビトロ特性を表４に要約する。
【表６】
2018533369.tif 000031
ａｌｋ  −  アルキル化(キャップ付アドネクチン)について測定；他の全ての測定はＤＡＲ１  ＡｄｘＤＣ(ＰＥＧ無し)について
【０４５６】
実施例５：ヒトＨｅｐ３ＢおよびＨ４４６腫瘍細胞に対するＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣの細胞結合
ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣを、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭで増殖させたヒトＨｅｐ３Ｂ肝細胞癌細胞および１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで増殖させたＨ４４６小細胞肺癌腫細胞に対する結合についてフローサイトメトリーで評価した。細胞を、Mediatch (Corning:  Manassas, VA 20109), Cat. # 25-056-CLからの非酵素的細胞解離溶液であるCellstripperを使用して採取した。腫瘍細胞(２５,０００／反応)をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ＋０.０１％ＮａＮ３)に懸濁し、一連の希釈ＡｄｘＤＣと１時間、氷上で混合した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、結合ＡｄｘＤＣをR&D Systems, cat# IC050PからのＨｉｓタグ  ＰＥコンジュゲート抗体で検出し、フローサイトメーターで読んだ。データ分析をFlowJoソフトウェアを使用して行い、最大結合の５０％のＥＣ５０を、ＰＲＩＳＭTMソフトウェア、version 5.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を使用して決定した。
【０４５７】
図４Ａ〜Ｄに示す結果は、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２が両方のタイプのヒト腫瘍細胞に結合することを示す。
【０４５８】
実施例６：ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣはＨｅｐ３Ｂ、Ｈ４４６およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する
この実施例は、ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２がＨｅｐ３Ｂ(グリピカン３高)ＨＣＣ細胞、Ｈ４４６(グリピカン３低)ＳＣＬＣ細胞およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞の細胞増殖を阻害することを示す。チミジン取り込みアッセイを上記のとおり実施した。図５Ａ〜Ｂおよび６Ａ〜Ｂに示す結果は、ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２が３つの異なる細胞株の細胞増殖を阻害するが、対照ＡｄｘＤＣアドネクチンコンジュゲートはこれらの細胞の増殖を阻害しないことを示す。
【０４５９】
実施例７：ＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣについての細胞表面結合アッセイ経時変化
内在化試験前に最大標的結合を確認するために、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２  ＤＡＲ１(すなわち、“ＰＣ”を有するが、コンジュゲートしていない)のＧＰＣ−３陽性細胞Ｈｅｐ３Ｂへの結合を、次の結合アッセイを使用して決定した。ＡＦ−４８８蛍光標識アドネクチンＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２および陰性対照(ＮＢＣ)  ＡＤＸ＿６０９３＿Ａ０１をＨｅｐ３Ｂ細胞結合アッセイに使用した。結合分析のために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３８４ウェルプレートに播種し、１６時間インキュベートして、細胞を接着させ、その後細胞を２％ホルムアルデヒドで固定した。１００nMのＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２およびＡＤＸ＿６０９３＿Ａ０１を細胞プレートに添加し、室温で７時点(０分、１０分、１５分、２０分、６０分、１２０分および１８０分)インキュベートした。結合後、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄し、セルあたりの総細胞蛍光強度を次いでハイコンテンツ分析を使用して測定した。
【０４６０】
結果は、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２が細胞表面への速い結合を示したことを示す。１００nMのアドネクチンを使用して、９５％を超える結合プラトーに達するのに２時間で十分であることが判明した。
【０４６１】
実施例８：ＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣの動的内在化
抗グリピカン３アドネクチン誘発内在化を定量するために、ハイコンテンツAlexa quenchingアッセイを適用した。Ｈｅｐ３ＢおよびＨ４４６細胞を３８４ウェルプレートに播種し、１６時間、３７℃でインキュベートした。次いで１００nMのＡＦ−４８８蛍光標識ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２  ＤＡＲ１を細胞プレートに添加し、３７℃で記載時間インキュベートし、その後固定化および消光させた。内在化アドネクチンは、非消光可能シグナルを超える蛍光の増加として測定した。各時点での“非消光対照”からの総蛍光を、細胞に最初に結合したアドネクチンの量の指標として使用するため、並行してモニターした。細胞の画像をArrayscanにより撮り、アドネクチンの局在化を決定し、細胞蛍光強度定量化に使用した。
【０４６２】
定量化試験は、Ｈｅｐ３Ｂ(約１.１×１０６活性結合コピー／細胞)のＧＰＣ３受容体の高発現レベルおよびＨ４４６細胞(約２.６×１０５活性結合コピー／細胞)での低レベル発現を示した。固定化後、総および細胞内ＦＬを決定し、アドネクチン分子内在化の測定に使用した。
【０４６３】
これらのアッセイの結果は、抗ＧＰＣ３アドネクチンが中〜低速(Ｔ１／２＞１時間)でＨｅｐ３ＢおよびＨ４４６細胞により内在化され(図７)、＞９０％内在化に６時間後に到達することを示す。図８に示すとおり、１５分時点で、抗ＧＰＣ３アドネクチンの大部分は膜結合であり、８時間時点までに、ＧＰＣ３−アドネクチンシグナルの大部分が細胞の内部にある。
【０４６４】
実施例９：ＧＰＣ３−ＡｄｘＤＣのインビボ薬物動態
抗ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ(ＤＡＲ１)の全身性曝露プロファイルをマウスで決定した。雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス(１３週齢)に、単一用量の高(２４０nmｏｌ／kg)および低(２４nmｏｌ／kg)用量のＧＰＣ３結合および非結合対照ＡｄｘＤＣ(各々ＧＰＣ３  ＤＡＲ１  ＡｄｘＤＣおよびＲＧＥ  ＡｄｘＤＣ)を次の実験設計に従い静脈投与した。記載する採血時点は、ＣＰＤ抗凝血剤(クエン酸−リン酸−デキストロース溶液、Sigma C7165)を使用する連続尾静脈採血であった。これらの血液サンプルから得た血漿を分け、分析準備完了まで−８０℃で保存した。
【表７】
2018533369.tif 000032
【０４６５】
ＡｄｘＤＣ血漿レベルを、２つの異なる形式でMesoscale(ＭＳＤ)リガンド結合アッセイで分析した。コンジュゲートおよび非コンジュゲートアドネクチンアッセイの総レベルのためのＭＳＤアッセイは、捕捉のために社内作製抗Ｈｉｓモノクローナル抗体(４μg／mlで)および検出のために貯留社内作製ウサギ抗足場ポリクローナルを１：１００００希釈で、続いてヤギ抗ウサギスルホタグ付抗体(１μg／mlで)を使用した。インタクトコンジュゲートアドネクチンのＭＳＤアッセイは、捕捉のために社内作製抗Ｈｉｓモノクローナル抗体(４μg／mlで)および検出のために社内作製スルホタグ付マウス抗ツブリシン抗体(１μg／mlで)を使用した。
【０４６６】
表６(Non-compartmental Phoenix Winnonlin分析、ＮＣＡモデル)および図９(抗ツブリシンＭＳＤアッセイ)に示すこのアッセイの結果は、ＡｄｘＤＣがマウスにおいて短い曝露プロファイルを有することをさらに示す。
【表８】
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【０４６７】
実施例１０：齧歯類異種移植モデルにおける腫瘍成長阻害
非ペグ化ＧＰＣ３−ツブリシン薬物コンジュゲートの有効性をＣＤ１マウスおよびFischerラットで試験した。
【０４６８】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤおよびＣＤ１雌マウス(１３週齢、Charles River Laboratories, Wilmington, MAから)および雌Fischerラット(１０週齢、Charles River Laboratories, Wilmington, MAから)を、温度制御室に逆１２時間暗／明サイクルで飼育した。水および標準的固形飼料餌は自由に摂取できた。安全性試験のために動物を無作為化し、体重(約２０〜２５ｇ)に基づき対照または試験ＡｄｘＤＣを受ける処置群に分配した。
【０４６９】
ヒト肝細胞癌であるＨｅｐ３Ｂを、１０％ＦＢＳ(Thermo Cat # ATK-33398)添加EMEM Cat# ATCC 30-2003を使用して培養に維持した。有効性試験のために、異種移植片を１００μlのＨｅｐ３Ｂ  ５×１０６細胞(Standard Phenol Red Matrigel, Corning Cat# 354234を用いる５０％細胞懸濁)を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下移植して作製した。インビボ有効性を証明するために、ＡｄｘＤＣを５０mM  ＮａＯＡｃ／１５０mM  ＮａＣｌ／ｐＨ５.５またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中、静脈内注射した。対照は非結合対照ＡｄｘＤＣで処理した。試験動物(ｎ＝８動物／群)に、３日毎に種々の用量のＡｄｘＤＣを計６回静脈内投与した。体重測定値を無作為化前、無作為化日および処置期間中週２回および試験の最後に記録した。腫瘍成長を、週２回デジタルカリパス測定を使用してモニターした。結果を、対応のある両側スチューデントｔ検定分析を使用して表かした。代表的試験設計および３日毎投与を使用する結果を表７および図１０に示す。
【表９】
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【０４７０】
毎週投与をＨｅｐ３Ｂ異種移植で評価した。結果は、０.１μmol／kgでのＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２−９６１  ＤＡＲ１およびＤＡＲ２のＱＷ投与がＨｅｐＧ２異種移植を有効に阻害することを示し、ＴＶ０＝３８０〜４８０３(図１１)、ＴＶ０＝２２８〜３５０ｍｍ３(図１２)およびＴＶ０＝５１４〜６７３mm３(図１３)であった。
【０４７１】
要約すると、ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣの毎週投与はＨＣＣ腫瘍異種移植の増殖を阻害し、ＤＡＲ１およびＤＡＲ２  ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣは同等な腫瘍成長阻害を示し、これは標的依存的であった。さらに、腫瘍負荷誘発体重減少の予防は、ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣの抗腫瘍活性と相関した。
【０４７２】
マウス安全性試験において、ＣＤ１マウスを、ＧＰＣ３および非結合対照ＡｄｘＤＣの両方で、種々の用量で、有効用量(０.１μmol／kg)の５倍である０.５μmol／kgの最高用量まで計９回、隔日静脈内処置した。ＭＴＤはＣＤ１マウス安全性試験で同定されなかった。腎臓毒性は、いかなる群、いかなる用量または頻度でも観察されなかった。ＣＤ１マウスにおいて、ＡｄｘＤＣの半減期は約２０分であった(上記ＭＳＤアッセイ)。体重減少は観察されず、全マウスは、計画的死体解剖まで処置中生存した。血清化学および血液学を、投与期間中一定間隔でそれぞれAbaxis Veterinary Diagnostics計器、VETSCAN VS2およびHM5を使用して評価した。ベースラインと比較して、血清化学または血液学で有意差は観察されなかった。病理組織学を、試験の最後に採取した心臓、肝臓、脾臓および腎臓組織のＨ＆Ｅ染色により観察された。評価した組織の何れでも用量限定的毒性は観察されず、最小／軽度尿細管上皮神経障害が全群で観察された。
【０４７３】
Fischerラット安全性試験において、ＡｄｘＤＣの半減期は約３０分であった(上記ＭＳＤアッセイ)。幾分かの用量依存的耐容性および骨格筋変性が、０.３６μmol／kg用量の最も高頻度な投与(隔日)で見られ、骨髄または肝臓病理組織学変化または心臓毒性は観察されなかった。これらの所見は、同じラット試験を、同じ用量範囲でＡｄｘＤＣの毎週投与を使用して実施したとき観察されなかった。
【０４７４】
全体として、低全身性曝露に一致する短血漿半減期および低標的外毒性にも関わらず、優れた有効性が両齧歯類種で観察された。
【０４７５】
実施例１１：ＨＤＸ−ＭＳを使用するヒトＧＰＣ３上のアドネクチン結合部位のマッピング
ヒトＧＰＣ３(アミノ酸配列は図１４に示す)上のアドネクチン結合部位を、水素・重水素交換質量分析法(ＨＤＸ−ＭＳ)を使用して評価した。水素／重水素交換質量分析法(ＨＤＸ−ＭＳ)は、溶液におけるタンパク質高次構造および配座動力学を、重水素交換率および主鎖アミド水素の程度によりモニターすることによりプローブする。ＨＤＸのレベルは主鎖アミド水素の溶媒接近性およびタンパク質の高次構造による。ＨＤＸによるタンパク質質量増加をＭＳにより厳密に測定できる。この技術を酵素的消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造的特性を得らることができ、表面露出ペプチドと、内側に折り畳まれたものまたはタンパク質−タンパク質複合体の界面で隔離されているものの区別が可能となる。典型的に、重水素標識および続く消光実験、続いてオンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ分析が実施される。
【０４７６】
ＨＤＸ−ＭＳによりＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２により認識されるヒトＧＰＣ３上のアドネクチン結合部位をマッピングする前に、非重水素化実験を実施して、ＧＰＣ３サンプルの共通消化ペプチドの一覧を作成し、ＧＰＣ３について８７.４％の配列包括度を達成した(図１４)。この実験において、１０mMリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を標識工程中使用し、続いて消光緩衝液(２００mMリン酸緩衝液と４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)を添加した。
【０４７７】
アドネクチン結合部位マッピング実験について、５μLの各サンプル(ＧＰＣ３またはＧＰＣ３とＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２)を５５μL  ＨＤＸ標識緩衝液(Ｄ２Ｏ中１０mMリン酸緩衝液、ｐＤ７.０)と混合して、標識反応を開始した。反応を種々の時間実施した：１分、１０分および２４０分。各標識反応時間の最後に、反応を消光緩衝液(１：１、ｖ／ｖ)添加により消光し、消光サンプルを分析用のWaters HDX-MSシステムに注入した。観察された共通消化ペプチドを、ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２非存在下／存在下でのその重水素取り込みレベルによりモニターした(図１４および１５)。
【０４７８】
ＨＤＸ−ＭＳ測定から得た実験データは、ＡＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２が、ヒトＧＰＣ３における２ペプチド領域からなる不連続アドネクチン結合部位を認識することを示す。
領域１：ＨＱＶＲＳＦＦ(ＧＰＣ３のアミノ酸残基３６〜４２)；配列番号３５６
領域２：ＥＱＬＬＱＳＡＳＭ(ＧＰＣ３のアミノ酸残基９０〜９８)；配列番号３４６
【０４７９】
実施例１２：ＤＧバリアントの作製
ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２のアミノ酸配列分析は、分子のＦＧループにおけるＤＧがアスパラギン酸異性化のリスクが低いはずであることを示した。
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDDYHAHRYYRITYGETGGNSPVQEFT
VPGEHVTATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKAATDWSISINYRTPCHHHHHH
(配列番号１１８)
ＤＧ部位に変異を有するＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２の８バリアントを作製した。これらの異性体の配列を表８に要約する。
【表１０】
2018533369.tif 000035
【０４８０】
実施例１３：ＤＧバリアントの生物物理学的特徴付け
各１００〜１５０mgの８変異体を、上記のとおり製造し、精製し、アルキル化した。３〜５mgの８アルキル化バリアントを、１〜３mg／mLでＳＥＣ、ＤＳＣ、ＧＰＣ３結合(ＳＰＲ  １ｐｔオフレート)、ＭＳおよびＨＩＣに付した。結果を表９に要約する。
【表１１】
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【０４８１】
８ＤＧ変異体中６個が、親アドネクチンと比較してｋｏｆｆの３〜５倍増加を示し、単量体かつ熱安定であった。ヒトおよびマウスＧＰＣ３のアルキル化ＧＰＣ３  ＤＧ変異体アドネクチン類の結合親和性を、Biacore T100で、ＨＢＳ−Ｐ＋ランニング緩衝液とヒトおよびマウスＧＰＣ３タンパク質[Ｈｕ(Ｆｃ  ２,３)およびＭｕ(Ｆｃ  ４)ＧＰＣ３−Ｈｉｓ(R&D Systems)]の直接固定化を、１８０秒結合、６００秒解離のために注入した２００〜１.５６nMシリーズと共に用いてさらに評価した。データをBiaEvaluationソフトウェアの１：１結合モデルに適合させ、表１０に要約する。
【表１２】
2018533369.tif 000037
【０４８２】
データは、これらのＧＰＣ３  ＤＧ変異体が親ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２と比較してヒトおよびマウスＧＰＣ３に対する親和性が約３〜５倍減少していることを示す。親和性差異は、速いオフレートにより導かれ、一方オンレートは親アドネクチンと一致した(図１６)。
【０４８３】
実施例１４：ＤＧバリアントの細胞結合および免疫原性評価
ＤＧ  ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ変異体におけるＤＧバリアントのｈｕＧＰＣ３への結合を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で増殖させたＨｕｈ７癌腫細胞への結合についてのフローサイトメトリーにより評価した。細胞を、Lonza, Cat. # 17-711EからのＥＤＴＡ細胞解離溶液であるバーゼンを使用して採取した。腫瘍細胞(１Ｅ５細胞／反応)をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０.０５％Ｎａアジド)に懸濁し、ＡｄｘＤＣの一連の希釈と、１時間、氷上で混合した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、結合ＡｄｘＤＣを社内抗足場モノクローナルＡｂおよび(RnD Systems), cat# NL007からのＰＥコンジュゲート抗体で検出し、フローサイトメーターで読んだ。データ分析をFlowJoソフトウェアを使用して行い、最大結合の５０％のＥＣ５０を、ＰＲＩＳＭTMソフトウェア、version 5.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を使用して決定した。
【０４８４】
(非ＤＧ変異体)の抗Ｈｉｓ検出に関して、社内作製ＡＰＣ−コンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を使用した以外、同じプロトコールを使用した。
【０４８５】
表１１に示す結果は、変異体が親アドネクチンと同等のＥＣ５０値を有することを示す。
【０４８６】
ｈｕＧＰＣ３に対するＤＧバリアントも、ヒトＰＢＭＣ増殖アッセイを使用するヒトにおける免疫応答を惹起する可能性について評価した。世界的集団頻度に極めて適合するＨＬＡクラスIIハプロタイプを有する４０ドナーからのＰＢＭＣを、ＤＧバリアントまたは対照存在下、７日間培養した。アッセイの最後に、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖についてＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を示したドナーのパーセンテージを、ヒト免疫原性リスクの読み取りとして分析した。アッセイ結果は、表１１に要約するとおり、ＤＧからＤＡ変異体(ＰＩ−０５５６６０)が、他のＤＧ変異体(３６〜５４％陽性応答)と比較して、免疫原性(ＩＭＧ)の有意に低いリスクを有することを示す(１８％のドナーが陽性と応答)。
【表１３】
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【０４８７】
ＤＡバリアントＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１(“ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡバリアント−ＤＡＲ１”または“ＤＡバリアントＡｄｘＤＣ  ＤＡＲ１”)の特性の要約を表１２に示す。
【表１４】
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＊  非コンジュゲートタンパク質について測定
【０４８８】
実施例１５：ＦＩＴＣ標識およびペグ化抗ＧＰＣ３アドネクチン類
ＦＩＴＣ標識：ＡＤＸ＿６０７７＿Ｆ０２および非結合対照アドネクチンをＤＴＴまたはＴＣＥＰで還元し、続いてＧ２５ゲル濾過クロマトグラフィーまたは透析した。過剰のフルオレセイン−５−マレイミド試薬(Thermo Scientific)を添加し、混合物を室温で約２時間インキュベートし、続いてＧ２５ゲル濾過クロマトグラフィーまたは大規模透析(３〜４緩衝液変化)した。得られた標識の程度を、製造業者の指示に従い吸光度でおよび／または質量分析法により測定した。ヒトおよびマウスＧＰＣ３に対するＦＩＴＣ標識およびペグ化ＧＰＣ３の結合親和性を先の実施例に記載のとおり評価し、結果を表１３に要約する。
【表１５】
2018533369.tif 000040
【０４８９】
データは、ＦＩＴＣ標識およびペグ化抗ＧＰＣ３アドネクチン類の両方が、ヒトおよびマウスＧＰＣ３に対する結合親和性を保持することを示す。
【０４９０】
実施例１６：ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡおよびＤＧ分子のさらなる特性
ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ  ＤＡバリアント−ＤＡＲ１は、加速安定性試験において、ｐＨ６.０で化学的および生物物理的安定を示した。さらに、ヒトＧＰＣ３(ＳＰＲによる)に対するその親和性は、４週間、４０℃の後変化しなかった。
ＤＡバリアントのアスパラギン酸異性化は、親ＤＧ分子より約４倍低かった。３週間、４０℃でｐＨ６またはｐＨ７インキュベーション後のＤＧ分子のＤ８０のパーセント異性化はそれぞれ３.６および２.４であった。
ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＧ)は、ＣＤＦラット(Ｑ７Ｄｘ４)において毎週投与で有利な毒性プロファイルを示した(表１４)。ＧＰＣ３  ＡｄｘＤＣ毎週投与(Ｑ７Ｄｘ４)下で、ＣＤＦラットにおいて血液学または血清化学プロファイルにおける有害応答はみられなかった。
【表１６】
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＊  “ＮＢＣ”は、非結合ＡｄｘＤＣ(アドネクチン薬物コンジュゲート)をいう
【０４９１】
実施例１７：ＧＰＣ３アドネクチン薬物コンジュゲートは、インビボでヒトＧＰＣ３異種移植組織に結合する
ヒトＧＰＣ３高発現Ｈｅｐ３Ｂ異種移植組織を、０.０４μg／ml濃度のＦＩＴＣコンジュゲートＧＰＣ３結合アドネクチンＤＧ分子(“ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＧ)”)ＤＡＲ１と、または０.２μg／mlの非ＧＰＣ３結合アドネクチンとインキュベートした。結果は、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＧ)分子がＨｅｐ３Ｂ異種移植組織に結合し、一方非結合アドネクチンは顕著に結合しなかったことを示す。
他の組織も結合について試験し、結果は、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＧ)の胎盤への幾分非特異的な結合があることを示す。しかしながら、本分子は胃、心臓、腎臓、肝臓、皮膚または扁桃腺組織に顕著に結合しない。
ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＡ)  ＤＡＲ１は、異種移植Ｈｅｐ３Ｂに、類似するが、弱い結合を示した。飽和結合は０.２μg／mlで達成された。
【０４９２】
実施例１８：ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＡ)は、グリピカン−３を高発現する細胞株由来異種移植で高度に効果的である
Ｈｅｐ３Ｂ(肝細胞癌；２６０,０００  ＧＰＣ３分子／細胞)異種移植をＮＳＧマウスで使用した。ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＡ)  ＤＡＲ１または非結合対照アドネクチンをｉ.ｖ.で、毎週、３回、表１５に示す用量で投与した。
【表１７】
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ＴＧＩＤ２６＊：２６日目の腫瘍成長阻害
表１５および図１７に示す結果は、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＡ)がインビボでＨｅｐ３Ｂ腫瘍成長阻害に有効であることを示す。
【０４９３】
同様の実験を、グリピカン−３(Ｈ４４６)低発現細胞株由来異種移植で実施した。Ｈ４４６細胞は、約４０,０００ヒトＰＣ３分子／細胞の小細胞肺癌腫細胞である。細胞をＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに注射した。
【表１８】
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表１６および図１８に示す結果は、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣ(ＤＡ)がこれらの腫瘍の増殖を遅延させることを示す。
【０４９４】
実施例１９：正常組織と比較したＨｅｐ３Ｂ腫瘍へのＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣの優先的取り込み
マウスに３Ｈ標識ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣを０.０１５μmol／kgまたは０.２２μmol／kgで投与し、放射能を０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後Whole-Body Autoradiography(ＱＷＢＡ)で測定した。
図１９および２０に示す結果は、次のことを示す。
・  腫瘍および高度に灌流された組織への迅速な分布；
・  照射１６８時間後に高レベル放射能が腫瘍に残り、他の組織の放射能はないかまたは低い；
・  腎臓における顕著な放射能：放射能の約３０％が尿に排泄；および
・  高および低用量群で類似の発現パターン。
類似の実験において、マウスに３Ｈ標識ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣまたは非結合ＡｄｘＤＣ対照を０.２２μmol／kgで投与し、０.１７時間、１時間、５時間および１６８時間後放射能をＱＷＢＡで測定した。
図２１および２２に示す結果は、非結合対照(ＲＧＥ  ＡｄｘＤＣ)に対してＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣを有するＨｅｐ３Ｂ腫瘍への高い取り込みがあることを示す。他の組織における分布プロファイルは、ＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣおよび非結合ＡｄｘＤＣ対照で同等である。
腫瘍および組織におけるＧＰＣ３＿ＡｄｘＤＣの総放射能濃度を図２３に示す。本図は、他の組織よりはるかに高いレベルのＧＰＣ３−＿ＡｄｘＤＣが腫瘍にあることを示す(腎臓以外)。
【０４９５】
実施例２０：抗ＧＰＣ３アドネクチン類のポジショナルスキャニング
この実施例は、ＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号３６９)を除去し、ＰＣを付加し、ここで、アミノ酸７９(すなわち、“ＤＧ”の“Ｄ”)がＧ(元のクローンのとおり)またはＡである、６０７７＿Ｆ０２のポジショナルスキャニングを記載する。
アミノ酸７９でのみ異なる２個のタンパク質を、ライブラリー構築中に混合した。ヒトグリピカン−３−ビオチンへの結合を１００nM、１０nMおよび１nMで決定した。各バッチについて、１０nM選択溶出をｆｌａｇ溶出と比較し、１nM選択溶出もｆｌａｇ溶出と比較した。これは、各ループにつき４個のヒートマップを作成した：７９がＧであるとき１０nM；７９がＧであるとき１nM；７９がＡであるとき１０nM；および７９がＡであるとき１nM。
ＦＧループについて、３セグメントを一緒に合わせ、完全ヒートマップを示した。７９位について、Ｇに対して正規化した一つのヒートマップを作成し、Ａに対して正規化した一つのヒートマップを作成した。
ヒートマップの形式の結果を図２４〜３１に示す。ヒートマップにおいて、＞１の数字は有利な置換を示すが、しかしながら、＞０.２のあらゆる数値も、置換として許容される。数が高いほど、置換がより有利である。例えば、ヒートマップは、ＤＧ親アドネクチンについて次のことを示す。
−  ループＢＣ(すなわち、配列ＳＤＤＹＨＡＨ(配列番号９８のアミノ酸１５〜２１))において：
ｏ  Ｓ２３を任意のアミノ酸で置換し得る；
ｏ  Ｄ２４は好ましくは何らかの他のアミノ酸で置換されないが、ＳおよびＥは許容される；
ｏ  他の許容される置換はヒートマップから導かれることができ、ここで、＞０.２の数字のあらゆる置換は許容され、＞１の数字は好ましい。
【０４９６】
均等物
当業者は、日常的なものを超える実験をせずとも、ここに記載する本発明の具体的実施態様の多くの均等物を認識するかまたは確認できる。このような均等物は、添付する特許請求の範囲に含まれる。
【０４９７】
【表１９】
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【表２０】
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【０４９８】
【表２１】
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【表２２】
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【０４９９】
【表２３】
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【表２４】
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【０５００】
【表２５】
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【表２６】
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【０５０１】
【表２７】
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【表２８】
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【０５０２】
【表２９】
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【表３０】
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【０５０３】
【表３１】
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【表３２】
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【０５０４】
【表３３】
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【表３４】
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【０５０５】
【表３５】
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【表３６】
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【０５０６】
【表３７】
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【表３８】
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【０５０７】
【表３９】
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【表４０】
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【０５０８】
【表４１】
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【表４２】
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【０５０９】
【表４３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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