(57)【要約】  カンジダ属、好ましくはカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、フルコナゾール耐性カンジダ属、ストレプトコッカス、スタフィロコッカスによって引き起こされる感染に対する効果的な診断薬又は治療処置としての抗ＣａＥＮＯ１抗体及びヒト化抗体を提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣａＥＮＯ１に位置する２８３ＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号１）、２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬ２８７（配列番号２）、２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）又は２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）からなるアミノ酸配列を含むエピトープ配列。
【請求項２】
ＣａＥＮＯ１に位置する２８３ＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号１）、２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬ２８７（配列番号２）、２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）又は２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）からなるアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合するカンジダα−エノラーゼに対する抗体。
【請求項３】
単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体又はその抗原結合部分であって、その単離された抗体又はその抗原結合部分がＣａＥＮＯ１に結合するように、配列番号５の軽鎖相補性決定領域１（Ｌ−ＣＤＲ１）又はＬ−ＣＤＲ１のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）又はＬ−ＣＤＲ２のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）又はＬ−ＣＤＲ３のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体の少なくとも１つと、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）又はＨ−ＣＤＲ１のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；配列番号９の重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）又はＨ−ＣＤＲ２のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；及び配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）又はＨ−ＣＤＲ３のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体の少なくとも１つとを含む、単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
配列同一性が少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１３及び１４に規定されるような配列からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖。
【請求項７】
配列番号１５及び１６に規定されるような配列からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖。
【請求項８】
（ｉ）配列番号１３及び１４からなる群から選択される配列に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖、又は配列番号１３及び１４のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体と、（ｉｉ）配列番号１５及び１６からなる群から選択される配列に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号１５及び１６のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体とを含む、ヒト化抗体。
【請求項９】
配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号１３に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖と、（ｉｉ）配列番号１５に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖（ｈｚＣａＳ１−Ｖ１）とを含む、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１４に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖と、（ｉｉ）配列番号１６に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖（ｈｚＣａＳ１−Ｖ３）とを含む、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載のエピトープ配列と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又はアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１３】
ワクチンとして使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項２〜１１のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
１つ以上の付加的な抗カンジダ薬、抗ストレプトコッカス薬又は抗スタフィロコッカス薬を更に含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記付加的な抗カンジダ薬がフルコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、エキノキャンディン、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギン、ボリコナゾール、アムホテリシンＢの脂質配合物、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、シクロピロックス、ミコナゾール、ケトコナゾール又はナイスタチンである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
被験体においてカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖を阻害し、それにより引き起こされる感染を治療する方法であって、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のα−エノラーゼに対する抗体を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
被験体においてカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖又はそれらによって引き起こされる感染を予防する方法であって、請求項１に記載のエピトープを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
被験体においてカンジダ症を治療する方法であって、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のα−エノラーゼに対する抗体を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記カンジダ症疾患が侵襲性カンジダ症、抗生物質カンジダ症、腸菌相のディスバイオシス、爪真菌症、皮膚カンジダ症又は粘膜カンジダ症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体においてフルコナゾール耐性カンジダの増殖を阻害するか、又はそれにより引き起こされる感染を治療する方法であって、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のα−エノラーゼに対する抗体を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記カンジダがフルコナゾール耐性カンジダ属である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フルコナゾール耐性カンジダ属がフルコナゾール耐性のＣ．アルビカンス又はＣ．トロピカリスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
カンジダによって引き起こされるバイオフィルム形成を阻害する方法であって、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のα−エノラーゼに対する抗体を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の抗ＣａＥＮＯ１抗体を前記生体サンプルと接触させることと、請求項１に記載のＣａＥＮＯ１のエピトープへの抗ＣａＥＮＯ１抗体の結合を検出することとを含み、該結合の存在が、前記被験体がカンジダ感染を患う疑いがあることを示す、方法。
【請求項２６】
被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、請求項１に記載のエピトープ配列と前記生体サンプルとを接触させることと、抗ＣａＥＮＯ１抗体への請求項１に記載のエピトープ配列の結合を検出することとを含み、該結合の存在が、前記被験体がカンジダ感染を患う疑いがあることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は感染性疾患に対する抗体に関する。特に、本発明はカンジダ、フルコナゾール耐性カンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスによって引き起こされる感染の診断及び治療のためのα−エノラーゼに対する抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カンジダ疾患は、抗真菌療法を行っても、慢性であり、治療が困難であり、死亡率及び罹患率が高いことが多い。カンジダ属は、世界的にＩＣＵ感染原因の第三位であり、全真菌感染の最大９０％を占めている。
【０００３】
侵襲性カンジダ症の診断は、特にフルコナゾール予防法を受けている患者における特定の臨床的特徴の欠如及びカンジダ種の単離のための血液培養の低い感度から困難である。カンジダ属に対する陽性血液培養が、依然としてカンジダ血症の診断の標準的検査法（gold standard）となっている。しかしながら、カンジダ属単離には過度の時間がかかり、効果的な抗真菌療法の遅れを招く場合がある。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が最も重要なヒト真菌病原体である。特に、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．アルビカンス）は皮膚、口腔組織、胃腸管及び膣を含む幾つかの部位で定着する日和見ヒト病原体である。Ｃ．アルビカンスは、５０．４％の臨床的カンジダ血症の原因となっている主要病原体でもある。カンジダ血症はカンジダ酵母が血流中に入ることで生じる可能性があり、健常な人々には殆ど見られない。ここ数十年間に、免疫機能不全の患者集団の増加のために、カンジダ血症は重要な問題となっている。アムホテリシン（ＡｍＢ）が真菌に対する抗真菌治療の標準薬であるが、この薬物の重大な副作用によりその臨床応用は制限されている。アゾールの長期にわたる広範な使用は、多剤耐性（ＭＤＲ）の急速な発生につながり、抗真菌療法において大きな障害を生じる。幾つかの報告から、フルコナゾールに対する耐性の発生率が過去２０年間で上昇していることが示されている。
【０００４】
エノラーゼは、解糖又は発酵が可能な全ての組織及び生物に存在する。ＥＮＯ１は、解糖経路の主要要素として初めて特定された。ＥＮＯ１はサイトゾル中で遍在的に発現し、プラスミノーゲン結合受容体として細胞表面上にも見られる。カンジダ・アルビカンスＥＮＯ１ヌル突然変異体は、変化した薬剤感受性、菌糸形成及び病原性を示す。真菌病原体カンジダ・アルビカンスにおけるＥＮＯ１の発現は、細胞増殖に重要である。カンジダ・アルビカンスにおけるＥＮＯ１の突然変異により、グルコースの存在下での細胞増殖が阻害される。ＳｃＦｖは、リンカーペプチドによって複合した重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域からなる組換え抗体タンパク質である。以前の研究では、抗ＣａＥＮＯ１  ｓｃＦｖ抗体（ＣａＳ１）がファージディスプレイによって単離されているが、ＣａＥＮＯ１とＣａＳ１との間の相互作用（エピトープ）は明らかでない。ＣａＥＮＯ１とプラスミノーゲンとの間の相互作用に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖ阻害に関する標的を探求及び開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、カンジダ（好ましくはカンジダ属、より好ましくはカンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis））、フルコナゾール耐性カンジダ（好ましくはフルコナゾール耐性カンジダ属）、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスによって引き起こされる感染に対する効果的な診断薬又は治療処置としての抗ＣａＥＮＯ１抗体（ＣａＳ１）及びヒト化抗体を提供する。
【０００６】
本発明では、組換えＣａＥＮＯ１及びＣａＳ１  ｓｃＦｖが首尾よく発現及び精製された。ＣａＳ１  ｓｃＦｖはＣ．アルビカンス、Ｓ．ニューモニエ、Ｓ．アウレウスのＥＮＯ１タンパク質を認識し、特にＣａＳ１  ｓｃＦｖは臨床由来のフルコナゾール耐性Ｃ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスに結合し、マウス及びヒトのものに対して弱い交差反応性を有する。
【０００７】
本発明は、ＣａＥＮＯ１に位置する２８３ＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号１）、２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬ２８７（配列番号２）、２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）又は２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）からなるアミノ酸配列を含むエピトープ配列も提供する。
【０００８】
本発明では、ポリクローナルＩｇＹ抗体がＣ．アルビカンスによって発現される組換えＣａＥＮＯ１タンパク質及びネイティブＣａＥＮＯ１に対して結合活性を示すことも見出され、強い体液性応答がニワトリにおいて誘発されることが実証された。短リンカー又は長リンカーを用いて構築された抗体ライブラリーの複雑度は、それぞれ２．４×１０６及び１．３６×１０７であった。ストリンジェントスクリーニング後に、優性ＣａＳ１  ｓｃＦｖはＣ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスのＥＮＯ１タンパク質を特異的に認識した。加えて、ＣａＳ１  ｓｃＦｖは臨床由来のフルコナゾール耐性Ｃ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスに結合する。ＣａＳ１はまた、Ｃ．アルビカンスの増殖を軽減し、口腔類表皮癌細胞（ＯＥＣＭ−１）へのその接着を阻害した。加えて、ＣａＳ１はフィブリン基質ゲル分解分析によって示されるように、プラスミノーゲンへのＣ．アルビカンスの表面ＥＮＯ１の結合を顕著に阻害した。注目すべきことに、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験から、ＣａＳ１抗体がカンジダ血症を有するマウスの生存時間を延長することが示された。その結果として、本発明では、ＣａＥＮＯ１に対して特異的結合活性を有する新規のＣａＳ１  ｓｃＦｖモノクローナル抗体が特定される。全ての結果は総合して、臨床応用のためにＣ．アルビカンスの感染に対する治療用抗体薬物を活用するのに大いに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の発現及び精製を示す図である。（Ａ）組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の発現を０．１ｍＭ（レーン１）、０．５ｍＭ（レーン２）及び１．０ｍＭ（レーン３）のＩＰＴＧによって誘導した。クマシーブルーを染色に使用した。（Ｂ）マウス抗Ｈｉｓ  ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧをウエスタンブロットに使用した。陽性対照：組換えＳａＥＮＯ１タンパク質。（Ｃ）発現及び超音波処理の後、Ｎｉ＋セファロースを使用して組換えＣａＥＮＯ１タンパク質を精製した。レーン１：Ｎｉ２＋セファロース結合後のＣａＥＮＯ１クローンの上清。レーン２：初回の洗浄バッファーの回収。レーン３：第１の溶出バッファーの回収。レーン４：２回目の溶出バッファー。レーン５：溶出後のＮｉ＋セファロースを表す。矢印は分子量約５０ｋＤａの組換えＣａＥＮＯ１タンパク質を表す。
【図２】ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットを用いた抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ抗体の分析を示す図である。（Ａ）精製組換えＣａＥＮＯ１タンパク質及びＢＳＡ（陰性対照）を、それぞれＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。次いで、ブロッキングプレートを、予備免疫化した又は７回目に免疫化したニワトリに由来する段階希釈ポリクローナルＩｇＹ抗体とともにインキュベートした。（Ｂ）Ｃ．アルビカンスの全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した（レーン１）。膜を予備免疫化した（レーン２）又は７回目に免疫化した（レーン３）ニワトリに由来する希釈ポリクローナルＩｇＹ抗体、続いてＨＲＰ標識ロバ抗ニワトリＩｇＹ（１：３０００）とともにインキュベートした。Ｃ．アルビカンスの細胞溶解物中で発現されたＥＮＯ１タンパク質の検出を矢印によって示す。
【図３】ｓｃＦｖ抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインの配列アラインメントを示す図である。１０個のｓｃＦｖのヌクレオチド配列を、４回のパニングを通して抗体ライブラリーから無作為に選択した。推定アミノ酸配列を、ニワトリ生殖系列遺伝子のアミノ酸配列とアラインメントした。アラインメントをブランクスペースにより最大化するために配列ギャップを導入した。
【図４】ＣａＳ１  ｓｃＦｖの発現及び精製を示す図である。発現及び超音波処理の後、Ｎｉ＋セファロースを使用してＣａＳ１  ｓｃＦｖを精製した。クマシーブルーを染色に使用した。レーン１：発現後のＣａＳ１  ｓｃＦｖクローンの全細胞溶解物。レーン２：Ｎｉ＋セファロース結合後の上清。レーン３：初回の洗浄バッファーの回収。レーン４：溶出バッファーの回収。レーン５：２回目の溶出バッファーの回収。レーン６：溶出後のＮｉ＋セファロース。矢印は分子量約２５ｋＤａのＣａＳ１  ｓｃＦｖを表す。
【図５】ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによるＣａＳ１  ｓｃＦｖのＫＤ決定を示す図である。（Ａ）精製ＣａＳ１  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。ＣａＳ１  ｓｃＦｖを段階希釈により一次抗体として使用した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧを二次抗体として使用した。ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを検出に使用した。（Ｂ）ＯＤ値をパーセンテージで算出した。ＣａＳ１  ｓｃＦｖのＫＤは０．４９８ｕｇ／ｍｌ＝１．８８×１０−８Ｍである。（Ｃ）ＣａＳ１  ｓｃＦｖを、固定形態の組換えＣａＥＮＯ１タンパク質と競合する段階希釈した遊離形態の組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧを二次抗体として使用した。ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを検出に使用した。（Ｄ）ＯＤ値をパーセンテージで算出した。ＣａＳ１  ｓｃＦｖのＫＤは４．４５ｕｇ／ｍｌ＝８．９×１０−８Ｍである。ＥＬＩＳＡデータを二連ウェルの平均±ＳＤとして表した。
【図６】ウエスタンブロットによるカンジダ属のＥＮＯ１タンパク質に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの結合活性を示す図である。（Ａ）５つのカンジダ属の全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した（左）。ＮＣ膜に転写した後、これらを材料及び方法に記載のように、７回目に免疫化したニワトリに由来する精製抗ＣａＥＮＯ１（１：３０００）（中央）又はＣａＳ１  ｓｃＦｖ（右）でプロービングした。（Ａ）のレーン１〜６は、それぞれＣ．アルビカンス、Ｃ．クルセイ、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．パラプシローシス及びＣ．グラブラータ、並びに精製組換えＣａＥＮＯ１の全細胞溶解物を含有するものとした。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるフルコナゾール耐性（ＦＬＵＲ）及びフルコナゾール感受性（ＦＬＵＳ）のＣ．アルビカンスの全細胞溶解物（レーン１〜７はそれぞれＣＡ６−１７、ＣＡ７−２６、ＣＡ７−３、ＣＡ１０−５０、ＣＡ７−３０、ＣＡ１０−６５、ＳＣ５３１４を表す）（左）、並びにウエスタンブロットによるＣａＳ１  ｓｃＦｖでのプロービング（右）。（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＦＬＵＲ及びＦＬＵＳのＣ．トロピカリスの全細胞溶解物（レーン１〜５はそれぞれＣＴ６−２９、ＣＴ１１−５２、ＣＴ６−５０、ＣＴ１２−５４、ＢＣＲＣ２０５２０を表す）（左）、並びにウエスタンブロットによるＣａＳ１  ｓｃＦｖでのプロービング（右）。（Ｄ）Ｃ．アルビカンス、Ｓ．ニューモニエ、Ｓ．アウレウス、マウス及びヒトの精製ＥＮＯ１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した（左）。ＮＣ膜に転写した後、記載のように精製ＣａＳ１  ｓｃＦｖでプロービングした（右）。レーンＭはタンパク質マーカーを含有するものとした。
【図７】ｓｃＦｖ  ＣａＳ１を用いたＣ．アルビカンスのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ａ）Ｃ．アルビカンスＳＣ  ５３１４を一晩培養し、１０５細胞を２ｍｌのＹＰＤ培地の入った各試験管に添加した。実験抗体（１）抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ（１００ｕｇ）、（２）対照ｓｃＦｖ（１００ｕｇ）、（３）ｓｃＦｖ  ＣａＳ１（１００ｕｇ）、（４）ＰＢＳを各試験管に添加し、３７℃で２時間、インキュベーター内で培養した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖（１：１５００）抗体を検出抗体として使用し、ＦＩＴＣロバ抗ヤギ抗体（１：１０００）を、反応を検出する展開抗体として使用した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１ｕｇ／ｍｌ）を細胞死の検出に使用した。（Ｂ）パネルＡにおけるフローサイトメトリー結果の定量化（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）。フローサイトメトリーは、二連実験の平均±ＳＤとして表した。
【図８】免疫蛍光染色によるＣ．アルビカンスに対するｓｃＦｖ  ＣａＳ１の分析を示す図である。抗ＣａＥＮＯ１抗体を、Ｃ．アルビカンス細胞表面ＥＮＯ１上のα−エノラーゼタンパク質の検出に使用した。（１）抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹでの検出、及びウサギ抗ニワトリ抗体のＦＩＴＣコンジュゲーションによる発現。（２）ｓｃＦｖ  ＣａＳ１での検出、並びにヤギ抗ニワトリ軽鎖抗体及びＦＩＴＣウサギ抗ヤギ抗体による発現。（３）無関連ｓｃＦｖを陰性対照に使用した。
【図９】Ｃ．アルビカンス増殖及び菌糸形成に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの効果を示す図である。（Ａ）Ｃ．アルビカンスをＹＰＤ培地中、３７℃で一晩培養した。１０８ｃｆｕ／ｍｌのＣ．アルビカンスを、等量の０．５ｍｇ／ｍｌ抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＳ１  ｓｃＦｖ又は１×ＰＢＳのそれぞれと室温で１時間混合した。１０倍希釈の各混合物１ｕｌをＹＰＤ寒天プレート上にスポッティングし、３７℃で一晩インキュベートした。（Ｂ）１０３ｃｆｕのＣ．アルビカンスをＰＢＳ（対照）、１０ｇ／ｍｌ又は１００ｇ／ｍｌ  ＣａＳ１  ｓｃＦｖと室温で１時間混合した。１ｕｌの各混合物をＹＰＤ寒天プレート上にスポッティングし、３７℃で５日間インキュベートした。菌糸形成を顕微鏡下で観察した。
【図１０】ＣａＳ１  ＳｃＦｖが口腔表皮細胞に対するＣ．アルビカンスの接着を阻害したことを示す図である。Ｃ．アルビカンスを１×ＰＢＳ、５０ｕｇ又は１００ｕｇのＣａＳ１  ｓｃＦｖと３７℃で１時間混合し、本文に記載のように培養ウェル内のＯＥＣＭ−１細胞に添加した。洗浄後に、Ｃ．アルビカンスに付着した細胞を、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｃ．アルビカンス抗体を添加することによって検出した。
【図１１】プラスミノーゲンへのＥＮＯ１の結合に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの効果を示す図である。ＣａＥＮＯ１とプラスミノーゲンとの結合を阻止するＣａＳ１  ｓｃＦｖの能力を、フィブリン基質ゲル分解分析によって評価した。Ｃ．アルビカンスのみ（１）、Ｃ．アルビカンス＋１ｕｇのプラスミノーゲン（２）又はＣ．アルビカンス＋１０ｕｇのプラスミノーゲン（３）を含有する様々なサンプルを、プレート上にスポッティングした。同様の実験を行ったが、Ｃ．アルビカンスを初めに１０ｕｇ（４）又は１００ｕｇ（５）のＣａＳ１  ｓｃＦｖと混合し、続いて１０ｕｇのプラスミノーゲンを添加した。プラスミノーゲンを含まないＣ．アルビカンス＋ＣａＳ１  ｓｃＦｖ（６）を陰性対照としてスポッティングした。
【図１２】ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖの発現及び精製を示す図である。発現及び超音波処理の後、Ｎｉ＋セファロースを使用してｈｚＣａＳ１  Ｖ１（Ａ）及びＶ３（Ｂ）ｓｃＦｖを精製した。クマシーブルーを染色に使用した（左パネル）。ウエスタンブロットにおけるマウス抗ＨＡ  ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ（右パネル）。矢印は分子量約２５ｋＤａのｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖを表す。レーン１：ｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖクローン細胞溶解物。レーン２：Ｎｉ２＋セファロース結合後のｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖの上清。レーン３：初回の洗浄バッファーの回収。レーン４：第１の溶出バッファーの回収。レーン５：溶出後のＮｉ＋セファロース。陽性対照：ＣａＳ１  ｓｃＦｖ。
【図１３】ＣａＥＮＯ１とｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３との結合親和性の決定を示す図である。ｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３及びＣａＳ１  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。（Ａ）クマシーブルーを染色に使用した。（Ｂ）マウス抗ヒトκ、λＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧをウエスタンブロットに使用した（右パネル）。（Ｃ）マウス抗ＨＡ  ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧを使用した。（Ｄ）ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを使用した。レーン１：ｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ１。レーン２：ｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ３。レーン３：ＣａＳ１  ｓｃＦｖ。
【図１４】ＥＬＩＳＡによるｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖのＫＤ決定を示す図である。（Ａ、Ｃ）精製ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖを段階希釈により一次抗体として使用した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧを二次抗体として使用した。ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを検出に使用した。（Ｂ、Ｄ）ＯＤ値をパーセンテージで算出した。ｓｃＦｖのＫＤ又は５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出し、モル濃度（Ｍ）によって表した。ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖのＫＤは、それぞれ１．５１ｕｇ／ｍｌ＝４．６×１０−８Ｍ及び２．１２ｕｇ／ｍｌ＝８．４×１０−８Ｍである。ＥＬＩＳＡデータを二連ウェルの平均±ＳＤとして表した。
【図１５】ＣａＳ１、ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖがプラスミノーゲンへのＣａＥＮＯ１の結合を阻害することを示す図である。Ｎｉ＋セファロース上のＣａＥＮＯ１を１００ｕｇのｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３及びＣａＳ１  ｓｃＦｖで１時間処理し、続いてプラスミノーゲン（２０ｕｇ）とともに１時間インキュベートした。ＣａＳ１  ｓｃＦｖを用いたＣａＥＮＯ１の各実験群をゲル上に滴下し、室温で２日間インキュベートして、ゲル分解結果を観察した。（１）プラスミノーゲン（１ｕｇ／ｕｌ）のみ。（２）Ｎｉセファロース（商標）（１０ｕｇ）上のＣａＥＮＯ１。（３）プラスミノーゲン（２０ｕｇ）を用いたセファロース（商標）（１０ｕｇ）上のＣａＥＮＯ１。（４〜６）ｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ（１００ｕｇ）で処理し、プラスミノーゲン（２０ｕｇ）とともにインキュベートしたセファロース（商標）（１０ｕｇ）上のＣａＥＮＯ１。
【図１６】ＣａＳ１  ｓｃＦｖとのＣａＥＮＯ１のエピトープが、ＣａＥＮＯ１とのプラスミノーゲンの結合部位に近いことを示す図である。ＣａＳ１  ｓｃＦｖとのＣａＥＮＯ１のエピトープ（２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９及び２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２）及びプラスミノーゲン結合部位（図の配列に示される最後のブロック領域）を示す。
【図１７】Ｃ．アルビカンスで試みたマウスの生存に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの効果を示す図である。マウスをグループ分けし、１０ｕｇ及び１００ｕｇのＣａＳ１  ｓｃＦｖ、１００ｕｇの抗ＤＡ  ｓｃＦｖ（非関連ｓｃＦｖ対照）又は１×ＰＢＳをそれぞれ含有する１０６のＣ．アルビカンスの混合物で試みた。マウスの生存を１日間隔で１０日間モニタリングした。ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体がマウスにおいてＣ．アルビカンスの致死的試みに対して顕著な保護活性をもたらすことは注目に値する。
【図１８】カンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成阻害アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明では、カンジダ、ストレプトコッカス及びスタフィロコッカスによって引き起こされる感染に対する効果的な診断薬又は治療処置としてのＣａＥＮＯ１のエピトープ及び抗ＣａＥＮＯ１抗体（ＣａＳ１）を開発する。
【００１１】
定義
以下の説明において多数の用語を使用するが、それらには特許請求される主題の理解を容易にするために以下の定義が与えられる。本明細書で明確に定義されない用語は、それらの平易な通常の意味に従って使用される。
【００１２】
他に指定のない限り、数量を特定していない単数形（"a" or "an"）は「１つ以上（one or more）」を意味する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は抗体が結合する抗原上の部位を指す。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「カンジダ症」という用語は、任意のタイプ（酵母のタイプ）のカンジダに起因する真菌感染を指す。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体の群に属する一本鎖、二本鎖及び多重鎖のタンパク質及びポリペプチドを指し、これらの抗体の合成変異体及び遺伝子操作変異体も含まれる。「抗体フラグメント」はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、並びに所望の標的エピトープ（単数又は複数）に対する特異性を有する抗体の任意の部分を含む。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、１つ以上の他の同一でない抗体の間で又はその存在下で産生される抗体を指す。概して、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生する幾つかの他のＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から産生される。通常は、ポリクローナル抗体は免疫化した動物から直接得られる。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。言い換えると、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えばハイブリドーマ、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクトした真核宿主細胞、又は均一な抗体をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクトした原核宿主細胞）の増殖により生じる均一な抗体からなる。これらの抗体は単一エピトープに対する抗体であり、極めて特異的である。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、従来の二本鎖抗体の重鎖及び軽鎖が接合して１つの鎖を形成した抗体を指す。通例、リンカーペプチドが二本鎖間に挿入されることで、適当なフォールディング及び活性結合部位の生成が可能となる。
【００１９】
「リンカーペプチド」という用語は、可変重鎖と可変軽鎖とを間接的に結合する働きをする抗体結合フラグメント（例えばＦｖフラグメント）内のペプチドへの言及を含む。リンカーは、例えば一連の単一アミノ酸又はアミノ酸の交互パターンがあり得る。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、重鎖及び軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見られる非連続な抗原結合部位を指す。ＣＤＲは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977)、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)、Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)、及びMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)によって記載されており、この定義には互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、１つの種に由来する抗体、例えばネズミ又はニワトリの抗体のＣＤＲが、その種に由来する抗体の可変重鎖及び軽鎖から、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン（フレームワーク領域）へと転写された組換えタンパク質を指す。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体に由来する。場合によっては、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列に接触又は接近した残基は、元のネズミ、齧歯類、ヒトに近い霊長類又は他の抗体の対応する残基で修飾され、例えば置き換えられていてもよい。ヒト化抗体は、（ａ）重要なフレームワーク残基を保持する若しくは保持しないヒトフレームワーク及び定常領域に非ヒトＣＤＲのみをグラフトすること、又は（ｂ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の置換えによってヒト様セクションで「クローキング（cloaking）」することを含む様々な方法によって達成することができる。本発明の実施において有用なかかる方法としては、Padlan, Mol. Immunol., 31 (3): 169-217 (1994)に開示される方法が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、１つの種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体又はニワトリ抗体、より好ましくはネズミ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体に由来する抗体重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインを含有する組換えタンパク質を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ファージディスプレイライブラリー」という用語は、各々が組換えにより表面タンパク質にインフレームで融合した外来ｃＤＮＡを含有するバクテリオファージの集団を指す。ファージは、ｃＤＮＡによってコードされる外来タンパク質をその表面上に提示する。細菌宿主、通例は大腸菌（E. coli）での複製後に、対象の外来ｃＤＮＡを含有するファージを、ファージ表面上の外来タンパク質の発現によって選択する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、２つの核酸又はポリペプチド配列との関連の「配列同一性」という用語は、指定の比較窓（comparison window）にわたって最大の一致でアラインメントした場合に同じである２つの配列中のヌクレオチド（又は残基）への言及を含む。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に関して使用する場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多く、この場合、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能的特性が変化しないことが認められる。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性のパーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整することができる。この調整を行う手段は当業者に既知である。通例、これは完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしての保存的置換のスコアリングを含み、それにより配列同一性パーセンテージを増大させる。このため、例えば同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にスコア０が与えられる場合、保存的置換には０〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えばMeyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988)のアルゴリズムに従って、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Intelligenetics、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）によって実行されるように算出される。２つのペプチド配列が実質的に同様であるという指標は、或るペプチドが第２のペプチドに対する抗体と免疫反応性であることである。このため、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは第２のペプチドと実質的に同様である。
【００２５】
「比較窓」は本明細書で使用される場合、配列が２つの配列を最適にアラインメントした後に同じ数の連続位置の参照配列に対して比較され得る約１０〜２０残基のセグメントへの言及を含む。比較のために配列をアラインメントする方法は当該技術分野で既知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータへの実装（Intelligenetics（カリフォルニア州マウンテンビュー）によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group（GCG）、米国ウィスコンシン州マディソン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない）によって行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins & Sharp, Gene 73: 237-244 (1988)及びHiggins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989)、Corpet, et al., Nucl. Acids Res. 16: 10881-90 (1988)、Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992)、並びにPearson, et al., Meth. in Molec. Biol. 24: 307-31 (1994)によって十分に説明されている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「診断（diagnostic）」又は「診断された（diagnosed）」という用語は、病的状態の存在又は性質を特定することを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する（treating）」等の用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患に罹る素因を有し得るが、それに罹っているとは診断されていない被験体において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑えること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を生じさせることを含む。
【００２８】
本明細書で区別なく使用される場合、「個体」、「被験体」、「宿主」及び「患者」という用語はネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄類（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」又は「効果的な量」という用語は、疾患の治療のために哺乳動物又は他の被験体に投与した場合に、疾患に対するかかる治療を達成するのに十分な対象の抗ＣａＥＮＯ１抗体の量を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「生体サンプル」という用語は、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用することができる個体、被験体又は患者から得られる様々なサンプルタイプを包含する。この定義には、血液及び生体起源の他の液体サンプル、生検標本若しくは組織培養物、又はそれに由来する細胞及びその子孫等の固形組織サンプルが包含される。
【００３１】
カンジダ・アルビカンスＥＮＯ１（ＣａＥＮＯ１）に位置するエピトープ及びカンジダα−エノラーゼに対する抗体
一態様では、本発明は、ＣａＥＮＯ１に位置する２８３ＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号１）、２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬ２８７（配列番号２）、２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）又は２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）からなるアミノ酸配列を含むエピトープ配列を提供する。一実施形態では、エピトープ配列は、ＣａＥＮＯ１に位置する２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）又は２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）からなるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
精製ＣａＳ１  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用する。エピトープ領域を、１９８ｂｐのヌクレオチドを含有するようにマッピングし、以下のアミノ酸配列（残基２３５〜３００）：ＤＫＡＧＹＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶＡＳＳＥＦＹＫＤＧＫＹＤＬＤＦＫＮＰＥＳＤＰＳＫＷＬＳＧＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰＩＶＳＩＥＤＰＦ（配列番号１９）（６６アミノ酸）が推論される。エピトープ位置を更に決定するために、部位特異的突然変異誘発を用いて、マッピングされた１９８ｂｐの抗原フラグメントのヌクレオチド配列に従う９つのペプチド発現ファージを構築した。一実施形態では、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体はアミノ酸残基３０１〜４３７にわたるプラスミノーゲンのフラグメントに結合し、その配列はＡＥＤＤＷＤＡＷＶＨＦＦＥＲＶＧＤＫＩＱＩＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＴＲＩＫＴＡＩＥＫＫＡＡＮＡＬＬＬＫＶＮＱＩＧＴＬＴＥＳＩＱＡＡＮＤＳＹＡＡＧＷＧＶＭＶＳＨＲＳＧＥＴＥＤＴＦＩＡＤＬＳＶＧＬＲＳＧＱＩＫＴＧＡＰＡＲＳＥＲＬＡＫＬＮＱＩＬＲＩＥＥＥＬＧＳＥＡＩＹＡＧＫＤＦＱＫＡ（配列番号２０）である。
【００３３】
一態様では、本発明は、単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体又はその抗原結合部分であって、その単離された抗体又はその抗原結合部分がＣａＥＮＯ１に結合するように、配列番号５の軽鎖相補性決定領域１（Ｌ−ＣＤＲ１）又はＬ−ＣＤＲ１のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）又はＬ−ＣＤＲ２のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）又はＬ−ＣＤＲ３のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体の少なくとも１つと、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）又はＨ−ＣＤＲ１のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；配列番号９の重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）又はＨ−ＣＤＲ２のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体；及び配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）又はＨ−ＣＤＲ３のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体の少なくとも１つとを含む、単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体又はその抗原結合部分を提供する。上述の配列同一性は少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であるのが好ましい。
【００３４】
重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を下記表に挙げる。
【００３５】
2018512174.tif 000003
【００３６】
2018512174.tif 000004
【００３７】
前述のＣＤＲ配列は、国際免疫遺伝学（international ImMunoGeneTics）情報システム（商標）（http://www.imgt.org）を用いて決定される。
【００３８】
幾つかの実施形態では、単離された抗ＣａＥＮＯ１抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
【００３９】
したがって、本発明は、配列：ＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧＧＳＧＳＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮＮＱＲＰＳＮＩＰＳＲＦＳＧＳＰＳＧＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣＧＳＲＤＳＳＹＶＧＶＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１１）からなるアミノ酸配列を含む抗ＣａＥＮＯ１  ｓｃＦｖモノクローナル抗体（ＣａＳ１）の軽鎖を提供する。本発明は、配列：ＴＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＲＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＩＤＹＧＭＱＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＧＳＳＧＳＳＴＮＹＧＡＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＤＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＫＳＡＧＧＹＣＶＮＧＡＧＣＮＧＧＳＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１２）からなるアミノ酸配列を含む抗ＣａＥＮＯ１  ｓｃＦｖモノクローナル抗体（ＣａＳ１）の重鎖を提供する。本発明は、配列番号１１の配列からなるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１２の配列からなるアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗ＣａＥＮＯ１  ｓｃＦｖモノクローナル抗体（ＣａＳ１）も提供する。
【００４０】
抗体分子は、抗体が全抗体と同じ結合特徴を有するか、又は全抗体と同等の結合特徴を有する限りにおいてポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又は任意の他の好適なタイプの抗体、例えば抗体のフラグメント又は誘導体、抗体の一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）又は合成ホモログであり得る。幾つかの実施形態では、抗体を組換えにより作製する、例えば任意の好適なファージディスプレイ又は組み合わせ方法によって作製することができる。抗体を生成する様々なファージディスプレイ及び組み合わせ方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Griffths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734、Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896、Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628、Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580、Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377、Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137、及びBarbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982に記載されている）。
【００４１】
抗体フラグメントは全抗体を切断するか、又はフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることによって作製することができる。抗体のフラグメントは、既刊文献（Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235, 1983、Parham, J. Immunol., 131: 2895, 1983）に記載されている方法によって調製することができる。かかるフラグメントは、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの一方又は両方を含有し得る。かかるフラグメントは一本鎖可変フラグメント抗体、すなわちｓｃＦｖ、ダイアボディ（dibodies）又は他の抗体フラグメントを含有していてもよい。
【００４２】
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短ペプチドリンカーによって軽鎖の可変領域に連結した抗体の重鎖の可変領域からなるポリペプチドである。このため、ｓｃＦｖは抗体結合部位全体を含む。これらの鎖は、細菌又は真核細胞において産生させることができる。
【００４３】
キメラ抗体又はヒト化抗体の作製等の様々な技法が、抗体のクローニング及び構築の手順を含み得る。対象の抗体の抗原結合可変軽鎖及び可変重鎖の配列はＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡライブラリースクリーニング等の様々な分子クローニング手順によって得ることができる。ネズミ抗体を発現する細胞に由来する抗体の可変重鎖又は軽鎖配列の遺伝子を、ＰＣＲ増幅及びシークエンシングによってクローニングすることができる。それらの確実性を確認するために、クローニングしたＶＬ及びＶＨの遺伝子を、Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989))に記載のように細胞培養物中でキメラ抗体として発現させることができる。次いで、可変重鎖又は軽鎖の遺伝子配列に基づいて、Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995))に記載のようにヒト化抗体を設計し、構築することができる。
【００４４】
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域を、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域で置き換えた組換えタンパク質である。キメラ抗体は、被験体に投与した場合に減少した免疫原性及び増大した安定性を示す。キメラ抗体を構築する方法は当該技術分野で既知である（例えば、Leung et al., 1994, Hybridoma 13: 469）。
【００４５】
キメラモノクローナル抗体は、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からヒト抗体の対応する可変ドメインへと転写することによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列で置き換える。ヒト化モノクローナル抗体の安定性及び抗原特異性を保存するために、１つ以上のヒトＦＲ残基をマウス対応残基に置き換えてもよい。ヒト化モノクローナル抗体は被験体の治療処置に使用することができる。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技法は当該技術分野で既知である（例えば、Jones et al., 1986, Nature, 321: 522、Riechmann et al., Nature, 1988, 332: 323、Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534、Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89: 4285、Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12: 437、Tempest et al., 1991, Biotechnology 9: 266、Singer et al., J. Immun., 1993, 150: 2844を参照されたい）。
【００４６】
一実施形態では、本発明はヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の以下のアミノ酸を提供する。
【００４７】
2018512174.tif 000005
【００４８】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号１３及び１４に規定されるような配列からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を提供する。
【００４９】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号１５及び１６に規定されるような配列からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を提供する。
【００５０】
更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１３及び１４からなる群から選択される配列に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖、又は配列番号１３及び１４のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体と、（ｉｉ）配列番号１５及び１６からなる群から選択される配列に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号１５及び１６のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体とを含むヒト化抗体を含む。上述の配列同一性は少なくとも９０％、９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であるのが好ましい。
【００５１】
好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号１３に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖と、（ｉｉ）配列番号１５に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖（ｈｚＣａＳ１−Ｖ１）とを含む。別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号１４に規定されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖と、（ｉｉ）配列番号１６に規定されるようなアミノ酸配列を有する重鎖（ｈｚＣａＳ１−Ｖ３）とを含む。
【００５２】
組換え方法に加えて、本明細書に開示される抗体及びその変異体は、標準ペプチド合成を用いて全体的又は部分的に構築することもできる。ポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、続いて配列の残りのアミノ酸の逐次添加を行うことによって達成することができる。固相合成の技法は、Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284、Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963、及びStewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984によって記載されている。より長いタンパク質は、より短いフラグメントへのアミノ末端及びカルボキシル末端の縮合によって合成することができる。
【００５３】
組成物及び投与方法
或る特定の実施形態は、本発明のエピトープ又は本発明のカンジダα−エノラーゼに対する抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に既知の任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材又は配合助剤を意図するものであるが、これらに限定されない。ポリオール、ポリエチレングリコール及びデキストラン等の希釈剤を、コンジュゲートの生物学的半減期を増大するために使用してもよい。
【００５４】
本発明の医薬組成物は従来の方法（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition、Mark Publishing Company、米国イーストン）に従って配合することができ、薬学的に許容可能な担体及び添加剤を含有していてもよい。例としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動促進剤及び矯味薬が挙げられるが、これらに限定されず、他の一般に使用される担体を適切に使用することができる。担体の具体例としては、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、サッカロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、無機塩等が挙げられる。
【００５５】
本発明は、カンジダ、ストレプトコッカス及びスタフィロコッカスの増殖を阻害し、それにより引き起こされる感染を治療する方法も提供する。
【００５６】
一実施形態は、被験体においてカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖を阻害し、それにより引き起こされる感染を治療する方法であって、本発明のα−エノラーゼに対する抗体を被験体に投与することを含む、方法に関する。したがって、被験体におけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖の阻害、又はそれにより引き起こされる感染の治療のための薬剤の製造における本発明のα−エノラーゼに対する抗体の使用も提供される。
【００５７】
別の実施形態は、被験体においてカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖又はそれらによって引き起こされる感染を予防する方法であって、本発明のエピトープを被験体に投与することを含む、方法に関する。したがって、被験体におけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖又はそれらによって引き起こされる感染の予防のための薬剤の製造における本発明のエピトープの使用も提供される。
【００５８】
幾つかの実施形態では、カンジダはＣ．アルビカンス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・グラブラータ、Ｃ．アルビカンスであり、ストレプトコッカスはＳ．ニューモニエであり、スタフィロコッカスはＳ．アウレウスである。
【００５９】
別の実施形態は、被験体におけるカンジダ症を治療する方法であって、本発明のα−エノラーゼに対する抗体を被験体に投与することを含む、方法に関する。したがって、被験体におけるカンジダ症の治療のための薬剤の製造における本発明のα−エノラーゼに対する抗体の使用も提供される。カンジダ症疾患は侵襲性カンジダ症、抗生物質カンジダ症、腸菌相のディスバイオシス（dysbiosis of the gut mycobiota）、爪真菌症、皮膚カンジダ症又は粘膜カンジダ症であるのが好ましい。
【００６０】
別の実施形態は、被験体においてフルコナゾール耐性カンジダの増殖を阻害するか、又はそれにより引き起こされる感染を治療する方法であって、本発明のα−エノラーゼに対する抗体を被験体に投与することを含む、方法に関する。したがって、被験体におけるフルコナゾール耐性カンジダ属の増殖の阻害、又はそれにより引き起こされる感染の治療のための薬剤の製造における本発明のα−エノラーゼに対する抗体の使用も提供される。フルコナゾール耐性カンジダはカンジダ属であるのが好ましく、フルコナゾール耐性カンジダはフルコナゾール耐性Ｃ．アルビカンス又はＣ．トロピカリスであるのがより好ましい。
【００６１】
別の更なる実施形態は、カンジダによって引き起こされるバイオフィルム形成を阻害する方法であって、本発明のα−エノラーゼに対する抗体を被験体に投与することを含む、方法を提供することである。したがって、カンジダによって引き起こされるバイオフィルム形成の阻害のための薬剤の製造における本発明のα−エノラーゼに対する抗体の使用も提供される。カンジダはＣ．アルビカンス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・グラブラータ、Ｃ．アルビカンスであるのが好ましい。バイオフィルムは、カンジダ異常増殖を覆すことが非常に困難であることの主な理由の１つである。長期にわたるカンジダ異常増殖はバイオフィルムを生じるのに十分な時間を有しており、多くの治療に対して高度に耐性である。バイオフィルムがより長く発生している程、抗真菌治療に対してより耐性となる。このため、抗真菌薬単独の使用はカンジダ異常増殖を阻害するのに十分でないことが多い。驚くべきことに、本発明では、本発明の抗体がカンジダのバイオフィルム形成を効果的に阻害し得ることが見出された。
【００６２】
上記の方法は、米国感染症学会（Infectious Disease Society of America：ＩＤＳＡ）により２００９年３月に公表された改訂ガイドライン（Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr, Calandra TF, Edwards JE Jr, et al. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2009 Mar 1.48 (5): 503-35）に記載の他の標準療法と同時に又はその後に本発明のα−エノラーゼに対する抗体を投与することも含む。
【００６３】
好ましい実施形態では、被験体は哺乳動物である。例示的な哺乳動物としては、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ等が挙げられる。抗体又はその医薬組成物を用いて治療され得る疾患としては、カンジダ症が挙げられる。カンジダ症の例としては、侵襲性カンジダ症、抗生物質カンジダ症、腸菌相のディスバイオシス、爪真菌症、皮膚カンジダ症及び粘膜カンジダ症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書に開示されるα−エノラーゼに対する抗体又はその医薬組成物は静脈内、局所的、腹腔内、動脈内、髄腔内、膀胱内又は腫瘍内に投与することができる。α−エノラーゼに対する抗体又はその組成物の有効量を実験的に決定し得ることが当業者には理解される。ヒト患者に投与する場合、α−エノラーゼに対する抗体又はその組成物の総１日使用量が、主治医により正しい医学的判断の範囲内で決定されることを理解されたい。任意の特定の患者に特異的な治療上効果的な用量レベルは、様々な要因：達成すべき細胞応答のタイプ及び程度；用いる特定のα−エノラーゼに対する抗体又はその組成物の活性；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別及び食生活；α−エノラーゼに対する抗体又はその組成物の投与時間、投与経路及び排出率；治療期間；α−エノラーゼに対する抗体又はその組成物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医療で既知の同様の要因によって決まる。
【００６５】
上記の特定した組成物及び治療方法は各々、付加的な抗カンジダ薬、抗ストレプトコッカス薬又は抗スタフィロコッカス薬を付加的に含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、本発明による使用に好適な抗カンジダ薬としては、フルコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、エキノキャンディン、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギン、ボリコナゾール、アムホテリシンＢの脂質配合物、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、シクロピロックス、ミコナゾール、ケトコナゾール及びナイスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。治療方法では、本発明のα−エノラーゼに対する抗体は付加的な１つ以上の抗カンジダ薬、抗ストレプトコッカス薬又は抗スタフィロコッカス薬と同時に、続いて又は別個に投与することができる。
【００６６】
カンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染の診断
本発明では驚くべきことに、抗ＣａＥＮＯ１抗体（ＣａＳ１）がカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染に対して効果的な診断薬又は治療処置であることが見出された。したがって、別の態様では、本発明は、被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、本発明の抗ＣａＥＮＯ１抗体を生体サンプルと接触させることと、本発明のＣａＥＮＯ１のエピトープへの抗ＣａＥＮＯ１抗体の結合を検出することとを含み、結合の存在が、被験体がカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を患う疑いがあることを示す、方法を提供する。代替的には、本発明は、被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、本発明のエピトープ配列を生体サンプルと接触させることと、抗ＣａＥＮＯ１抗体への本発明のエピトープ配列の結合を検出することとを含み、結合の存在が、被験体がカンジダ感染を患う疑いがあることを示す、方法を提供する。
【００６７】
本発明では、検出は定量的検出及び定性的検出を含む。定性的検出の例としては、以下のものが挙げられる：本発明のＣａＥＮＯ１のエピトープへの抗ＣａＥＮＯ１抗体の結合の有無の簡便な検出；結合が或る特定の量を超えて存在するか否かの決定；及び他のサンプル（例えば対照サンプル）との結合量の比較。
【００６８】
本発明の診断方法に使用される生体サンプルは、サンプルがＣａＥＮＯ１タンパク質を含有し得るサンプルである限りにおいて特に限定されない。具体的には、哺乳動物等の生物の身体から回収したサンプルが好ましい。ヒトから回収したサンプルがより好ましい。試験サンプルの具体例としては、血液、間質液、血漿、脳脊髄液、滑液、胸水、血清、リンパ液、唾液、尿、組織及び腹水が挙げられる。
【００６９】
本発明では、「対照」は、陰性対照及び健常被験体に由来する生体サンプルを含む比較の標準として働くサンプルを指す。陰性対照は、健常被験体から生体サンプルを回収し、それらを必要に応じて混合することによって得ることができる。対照におけるＣａＥＮＯ１のエピトープに対する抗ＣａＥＮＯ１抗体の結合のレベルは、被験体の生体サンプルにおける結合レベルと並行して検出することができる。代替的には、多くの健常被験体の生体サンプルにおける結合レベルを予め検出することによって、健常被験体における標準発現レベルを統計的に決定することができる。
【００７０】
本発明では、結合レベルは任意の方法によって決定することができる。試験サンプルにおいて結合を検出する方法は特に限定されない。放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、発光免疫測定（ＬＩＡ）、免疫沈殿（ＩＰ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）法及び一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）等の検出に抗ＣａＥＮＯ１抗体を用いた免疫学的方法が提供される。
【００７１】
本発明は、試験サンプル中のＣａＥＮＯ１への抗ＣａＥＮＯ１抗体の結合を検出する診断薬を含む、カンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくともカンジダ感染の診断薬を含む。
【００７２】
癌を診断するキットは、カンジダ感染の診断薬と抗ＣａＥＮＯ１抗体の検出に使用される別の要素とを組み合わせることによって作製することができる。より具体的には、本発明は、ＣａＥＮＯ１に結合する抗ＣａＥＮＯ１抗体及び抗体とＣａＥＮＯ１との間の結合を検出する試薬を含む、カンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断するキットに関する。加えて、測定操作を記載した取扱い説明書を本発明のキットに添付することができる。
【実施例】
【００７３】
材料及び方法
Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１タンパク質の発現及び精製
簡潔に述べると、Ｃ．アルビカンスα−エノラーゼ遺伝子をｐＱＥ３０プラスミド内で構築してｐＱＥ３０−ＣａＥＮＯ１ベクターを形成した後、得られるベクターを大腸菌ＢＬ２１細胞で形質転換した。細菌培養物を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖させ、同じＬＢ培地で１０倍に希釈し、ＯＤ６００が０．６〜１．０に達するまで更に増殖させた。ＣａＥＮＯ１タンパク質の発現を誘導するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養物中０．５ｍＭの最終濃度まで添加した。細胞ペレットを、１％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００を含有する２ｍｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、３サイクルの凍結（−７０℃）及び融解（３７℃）によって溶解させた。遠心分離の後、得られる細胞溶解物を、Ｎｉ２＋装填樹脂カラムを用いてインキュベートし、Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１タンパク質を製造業者（GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）の取扱い説明書に従って精製した。ヒト、マウス、Ｓ．ニューモニエ、Ｓ．アウレウスに由来するＥＮＯ１を同様にして発現させ、精製した。
【００７４】
動物免疫化
雌性白色レグホン（ガルス・ドメスティカス（Gallus domesticus））ニワトリを、等量のフロイント完全アジュバント（Sigma、米国）中５０ｇの精製Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１を用い、筋肉内注射により免疫化した。フロイント不完全アジュバント中のＨｉｓ−ＣａＥＮＯ１を用いた３回の付加的な免疫化を７日間隔で行った。各免疫化の後、卵黄中のポリクローナルＩｇＹ抗体を部分的に精製し、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって滴定して、体液性抗ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１免疫応答の存在を決定した。ＩｇＹ抗体を、以前に記載されているように１０％硫酸デキストランを用いて卵白から分離した卵黄から精製した（Akita EM, Nakai S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J Immunol Methods 1993; 160: 207-14、Akita EM, Nakai S. Production and purification of Fab'fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y (IgY). J Immunol Methods 1993; 162: 155-64）。精製ＩｇＹ抗体を、０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５ｍｌのＴＢＳに溶解し、−２０℃で保管した。
【００７５】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの構築及びパニング
抗体ライブラリーを以前の報告に基づいて確立した（Andris-Widhopf J, Rader C, Steinberger P et al. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 2000; 242: 159-81）。簡潔に述べると、最終免疫化後にニワトリから摘出した脾臓を、均質化のために即座にＴｒｉｚｏｌ（Gibco BRL.、米国）に入れた。１０μｇの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Invitrogen、米国）を用いて第一鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ニワトリ特異的プライマーを用いた増幅の後、重鎖及び軽鎖可変（ＶＨ及びＶＬ）領域のＰＣＲ産物を２回目のＰＣＲに供し、短リンカー又は長リンカーを有する完全長ｓｃＦｖフラグメントを形成し、これをＳｆｉＩで更に消化し、ｐＣｏｍｂ３Ｘベクターにクローニングした。組換えファージＤＮＡを、エレクトロポレーション（Bio-RadのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）によって大腸菌ＥＲ２７３８株に形質転換した。組換えファージの作製を、野生型ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージの添加によって開始し、これを続いて４％ポリエチレングリコール８０００及び３％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）で沈殿させ、最後に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、ｓｃＦｖ抗体ライブラリー中１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組換えファージを、精製Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１タンパク質（０．５μｇ／ウェル）でプレコーティングしたウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。非結合ファージを除去した後、結合したファージを０．１Ｍ  ＨＣｌ／グリシン（ｐＨ２．２）／０．１％ＢＳＡで溶出させ、２Ｍトリスベースバッファーで中和し、大腸菌ＥＲ２７３８株の感染に使用した。増幅したファージを沈殿させ、次回の選択のために上記のように回収した。４回目のバイオパニング後に、大腸菌ＥＲ２７３８に由来する全ファージミドＤＮＡを精製し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換した。無作為に選択したクローンのパネルを一晩培養し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するスーパーブロス（super broth）中で１００倍希釈し、８時間更に増殖させた。１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いた一晩の誘導の後、細菌を遠心分離によって採取し、ヒスチジン（Ｈｉｓ）結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁し、３サイクルの凍結、融解／超音波処理によって溶解させた。ｓｃＦｖ抗体をＮｉ２＋装填セファロース（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden）を用い、製造業者の取扱い説明書に従って精製した。精製したｓｃＦｖ抗体を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Merck Millipore、ドイツ）を用いて１×ＰＢＳ中で更に濃縮し、Ｃ．アルビカンスに対するそれらの結合能又は中和能について検査した。
【００７６】
Ｃ．アルビカンスの増殖及び菌糸形成
細胞増殖及び菌糸形成に対するｓｃＦｖ抗体の効果を決定するために、抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ（０．５ｍｇ／ｍｌ）又はＣａＳ１  ｓｃＦｖ（０．５ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを、Ｃ．アルビカンス（１×１０６ｃｆｕ）とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーションの後、１０倍希釈した１ｕｌの各混合物をＹＰＤ寒天プレート上にスポッティングし、３７℃で一晩インキュベートした。１０３ｃｆｕのＣ．アルビカンスを０μｇ／ｍｌ（１×ＰＢＳ対照）、１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌのＣａＳ１  ｓｃＦｖと室温で１時間混合した。その後、１ｕｌの各混合物をＹＰＤ寒天プレート上にスポッティングし、３７℃で５日間インキュベートした。
【００７７】
カンジダ属株
Ｃ．アルビカンス（ＳＣ  ５３１４）、Ｃ．クルセイ（臨床分離株）、Ｃ．トロピカリス（ＢＣＲＣ  ２０５２０）、Ｃ．パラプシローシス（ＢＣＲＣ  ２０５１５）及びＣ．グラブラータ（ＢＣＲＣ  ２０５８６）は、台北医学大学（台湾、台北）のChing-Hua Su博士の好意により提供された。Ｃ．アルビカンス（ＣＡ６−１７、ＣＡ７−２６、ＣＡ７−３、ＣＡ１０−５０、ＣＡ７−３０、ＣＡ１０−６５）、Ｃ．トロピカリス（ＣＴ１１−５２、ＣＴ６−２９、ＣＴ６−５０、ＣＴ１２−５４）、Ｃ．グラブラータ（ＣＧ５−８、ＣＧ８−１１、ＣＧ７−３７、ＣＧ５−６６）及びＣ．パラプシローシス（ＣＰ８−２０、ＣＰ１２−３７、ＣＰ６−２０、ＣＰ７−１７、ＣＰ８−４８）は、台北医学大学−萬芳病院の臨床検査部（Department of Laboratory Medicine, Wan Fang Hospital）（台湾、台北）の好意により提供された。カンジダ種をＹＰＤ培地中で培養し、それらの同一性をＣＨＲＯＭａｇａｒカンジダプレート（CHROMagar、フランス、パリ）によって確認した。ＭＩＣ試験ストリップを使用し、ＭＩＣを製造業者により推奨されるように８０％阻害で読み取った。
【００７８】
ウェスタンブロッティング
ＥＮＯ１タンパク質の存在を検出するために、精製組換えＥＮＯ１タンパク質又は５つのカンジダ属の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、ニトロセルロース膜（Amersham Biosciences、英国）に転写した後、ＴＢＳＴ中の５％スキムミルクを用いて１時間ブロッキングした。７回目の免疫化後のニワトリに由来する抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ（１：３０００）又は精製ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体（１μｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。激しく洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナルロバ抗ニワトリＩｇＹ抗体（１：３０００）（Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー）を添加し、結合したＩｇＹ抗体の検出のために更に１時間インキュベートした。また、ヤギ抗ニワトリ軽鎖抗体（１：３０００）（Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー）、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch、米国）を、結合したｓｃＦｖ抗体の検出に使用した。上記のように洗浄した後、膜をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又はＥＣＬ基質で発色させた。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４５００をＥＣＬ強度の検出に用いた。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡ
それらの結合反応性を検査するために、７回目の免疫化後にニワトリから精製した一連の希釈ＩｇＹ抗体（５００倍〜２５６０００倍）、又は組換えＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体（４０μｇ／ｍｌ〜０．０７８μｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡプレートウェルに固定化した精製ＣａＥＮＯ１（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。激しく洗浄した後、結合したＩｇＹ抗体を、ＨＲＰコンジュゲートポリクローナルロバ抗ニワトリＩｇＹ抗体（１：３０００）（Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー）を添加することによって検出し、結合したＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体をヤギ抗ニワトリ軽鎖抗体（１：３０００）（Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー）、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch、米国）によって検出した。上記のように洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Sigma、米国）を発色のためにウェルに添加した。１Ｎ  ＨＣｌを用いて反応を停止させ、光学密度を４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（BioTek Synergy HT）を用いて測定した。解離定数（ＫＤ）を方程式：グラム／分子量（Ｄａ）×容量（Ｌ）−１に従って算出した。
【００８０】
競合ＥＬＩＳＡのために上記の手順を行った。但し、一連の希釈ＣａＥＮＯ１タンパク質（５０μｇ／ｍｌ〜０．０９７μｇ／ｍｌ）を初めに等量のＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体（１μｇ／ｍｌ）と１時間混合し、結合特異性の検出のためにプレートに添加した。ＥＬＩＳＡ試験を各サンプルについて二連ウェルで行った。ＥＬＩＳＡデータは二連実験の平均±ＳＤとして提示した。
【００８１】
フィブリン基質ゲル分解分析
基質ゲルを線維素溶解活性検出のために調製した３３。Ｃ．アルビカンス（１０６細胞）を洗浄し、ＣａＳ１ｓｃＦｖ（１０μｇ及び１００μｇ）を用いて又は用いずに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を洗浄し、プラスミノーゲン（１０μｇ）とともに３０分間インキュベートした。混合物をＰＢＳで洗浄して、遊離プラスミノーゲンを除去した。得られる細胞ペレットを１．２５％低融点アガロース、トロンビン（０．０５Ｕ／ｍｌ、Sigma）及びフィブリノーゲン（２ｍｇ／ｍｌ、Sigma）を含有する基質ゲル中に入れた。ゲルを加湿チャンバ内、３７℃で１０時間〜１４時間、明らかなスポットの出現により線維素溶解活性の存在が示されるまでインキュベートした。
【００８２】
接着アッセイ
細胞接着アッセイを、ヒト口腔表皮細胞（ＯＥＣＭ−１）（ＸＸＸ）を用いて行った。Ｃ．アルビカンス（１×１０６ｃｆｕ）を、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体（５０μｇ又は１００μｇ）とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後に、混合物を２倍希釈し、９６ウェルプレート内で培養した１０４のＯＥＣＭ−１細胞に添加した。プレートを４℃で２時間更にインキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートを１０％ホルムアルデヒドで固定した。上記のように洗浄した後、ウェルをスキムミルクで１時間ブロッキングした。その後、ウサギ抗Ｃ．アルビカンス抗体（１：３０００、Bethyl、米国）を添加し、更に１時間インキュベートし、続いてＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（１：３０００、Bethyl、米国）を添加した。上記のような洗浄を常に工程間で行った。ＴＭＢを発色に使用し、これを１Ｎ  ＨＣｌで停止させた。色の強度をＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。
【００８３】
Ｃ．アルビカンス感染のマウスモデル
体重約３０ｇの合計２０匹のＩＣＲ雌性マウス（National Laboratory Animal Center（台湾）から購入）を、各群５匹のマウスの群に無作為に分けた。Ｃ．アルビカンスを一晩増殖させ、生理食塩水で洗浄した。４つの群のマウスを以下の調製物を用いて側尾静脈から処理した：（ｉ）１×ＰＢＳ単独；（ｉｉ）５０μｇのＣａＳ１とともにプレインキュベートした１×１０６ｃｆｕのＣ．アルビカンス細胞；（ｉｉｉ）１００μｇのＣａＳ１とともにプレインキュベートした１×１０６ｃｆｕのＣ．アルビカンス細胞；（ｉｖ）抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹとともにプレインキュベートした１×１０６ｃｆｕのＣ．アルビカンス細胞。マウスを生存について１日間隔で１０日間モニタリングした。マウスの全ての処理及び取扱いは、台北医学大学の動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって認可される動物実験プロトコルに従って行った。
【００８４】
実施例１  Ｈｉｓ−Ｃ．アルビカンスα−エノラーゼ（ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１）の融合タンパク質の発現及び精製
Ｃ．アルビカンスα−エノラーゼ遺伝子をｐＱＥ３０プラスミド内で構築して、ｐＱＥ３０−ＣａＥＮＯ１ベクターを形成した後、得られるベクターを大腸菌ＢＬ２１細胞で形質転換した。細胞の発現を濃度１．０ｍＭ、０．５ｍＭ及び０．１ｍＭのＩＰＴＧで４時間、５時間、８時間及び一晩にわたって誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ａ）及びウエスタンブロット分析（図１Ｂ）によって発現タンパク質が約４９ｋＤａの分子量を有することが見出された。
【００８５】
Ｃ．アルビカンスα−エノラーゼ遺伝子をｐＱＥ３０プラスミド内で構築して、ｐＱＥ３０−ＣａＥＮＯ１ベクターを形成した後、得られるベクターを大腸菌ＢＬ２１細胞で形質転換した。細胞の発現を濃度１．０ｍＭ、０．５ｍＭ及び０．１ｍＭのＩＰＴＧで４時間、５時間、８時間及び一晩にわたって誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析によって発現タンパク質が約４９ｋＤａの分子量を有することが見出された。上述の発現タンパク質が所望のＣａＥＮＯ１タンパク質であるかを確認するために、実施例１において得られるタンパク質をＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅで精製し、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、４９ｋＤａのタンパク質をＨｉｓ−ＣａＥＮＯ１として確認した（図１Ｃ）。
【００８６】
実施例２  抗原Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１に対するＨｉｓ−ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹポリクローナル抗体の結合アッセイ
５０μｇの実施例１の精製Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１タンパク質をニワトリに投与し、抗ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹポリクローナル抗体を産生させた。ポリクローナル抗体を卵からＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析によって精製した。精製抗体の結合能を、ウエスタンブロット及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＢＳＡを陰性対照として使用し、マウス抗ｈｉｓ  ＩｇＧを第１の抗体として使用し、ＨＲＰウサギ抗マウスＩｇＧを第２の抗体として使用した。ウエスタンブロット分析の後、Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１に特異的に結合する抗ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹポリクローナル抗体が３回の免疫化後に産生され、その結合能は各回の免疫化により増大した。
【００８７】
実施例３  ニワトリ抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹの結合活性、抗ＣａＥＮＯ１ライブラリーの構築及びパニング
ニワトリ抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹの体液性免疫応答をＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによって特定した（図２Ｂ）。免疫前血清及び非関連ＢＳＡタンパク質と比較して、７回目の免疫化後のＩｇＹ（５００倍〜２５６０００倍希釈）はＣａＥＮＯ１を認識した（図２Ａ）。
【００８８】
短リンカー及び長リンカーを用いた２つのライブラリーを、表１に示すように構築した。短リンカー及び長リンカーライブラリーのサイズは、それぞれ２．４×１０６及び１．３６×１０７と推定された。各パニング後の溶出力価を示した（表１）。４回目のパニング後に、ＣａＥＮＯ１結合ファージ変異体が大幅に濃縮された。これらの結果から、非特異的結合ファージがパニングプロセスによって除去され、特異的結合親和性を有するクローンが濃縮されたことが示唆された。配列はニワトリ免疫グロブリン生殖系列遺伝子に属することが確認された。ＣａＥＮＯ１に対して最も高い結合活性を有する短リンカーを特定した。この抗ＣａＥＮＯ１  ｓｃＦｖモノクローナル抗体をＣａＳ１と名付けた。
【００８９】
【表１】
2018512174.tif 000006
【００９０】
実施例３  ｓｃＦｖ抗体の遺伝子シークエンシング
ニワトリから精製した抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。コロニー＃１Ｓ１〜＃１Ｓ１２を単離し、ｏｍｐｓｅｑプライマー（５’−ＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧ−３’）を用いてシークエンシングし、シークエンシング結果をＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアによって分析した後、得られる配列をニワトリ生殖系列と比較した。１０個のクローン中の抗体が軽鎖及び重鎖で同じ配列を有することが見出された（図３）。
【００９１】
実施例４  ＣａＳ１  ｓｃＦｖの発現及び精製
最後のバイオパニングによる全ファージミドＤＮＡをＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌に形質転換し、個々のｓｃＦｖを分析した。ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントを含有するコロニーを選択し、１０ｍＬのＬＢ（Ｌａｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス（５０μｇ／ｍＬアンピシリン）中で振盪しながら３７℃で一晩培養した後、ＯＤ６００が０．４〜０．８に達するまで培養物を別の１００ｍＬのＬＢ（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）に移した。その後、得られる培養物を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧとともに６時間〜８時間インキュベートして、Ｈｉｓタグ付きＣａＳ１  ｓｃＦｖタンパク質を発現させた。次いで、培養物を遠心分離に供し、上清を捨て、ペレットを１ｍＬのＨｉｓ結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁した。大腸菌細胞を超音波処理で破壊した後、サンプルを３０００ｇの遠心分離に５分間供した。次に、上清中のＣａＳ１  ｓｃＦｖ融合タンパク質をＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（GE healthcare Life science、米国）によって、製造業者により提案されるように精製した。簡潔に述べると、サンプル上清をセファロースに添加し、１時間混合し、１０００ｇの遠心分離に５分間供した。上清を捨てた。セファロースを１ｍＬのＨｉｓ結合バッファーで２回洗浄して、洗浄液１及び洗浄液２を得た。５００μＬのＨｉｓ溶出バッファーをセファロースに添加し、１時間混合した。セファロースを１０００ｇの遠心分離に５分間供し、上清（溶出液１）を回収した。上記の工程を繰り返して溶出液２を得た。溶出液１及び２は精製Ｈｉｓ−ＣａＳ１  ｓｃＦｖを含有する。最後に、セファロースを５０μＬのＨｉｓ結合バッファーに再懸濁した。結合上清、洗浄液１、洗浄液２、溶出液１、溶出液２及びセファロースの画分を１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した（図４）。
【００９２】
実施例５  ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによるＣａＳ１  ｓｃＦｖのＫＤ決定
０．２５μｇのＨｉｓ−ＣａＥＮＯ１を９６ハーフエリアプレートの各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートして、タンパク質をウェルの底部に吸着させた。タンパク質を捨て、５％スキムミルクをウェルに添加し、プレートをブロッキングのために３７℃で１時間インキュベートした。一方、１μｇ／ｍＬ  ＣａＳ１を、５０μｇ／ｍＬ遊離形態Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１の２倍及び１０倍段階希釈サンプル（すなわち５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１３μｇ／ｍＬ、１．５６μｇ／ｍＬ、０．７８μｇ／ｍＬ、０．３９μｇ／ｍＬ、０．１９μｇ／ｍＬの遊離形態Ｈｉｓ−ＣａＥＮＯ１）の各々とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、コーティング及びブロッキングした上記のウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートして、競合反応を行った。その後、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、ヤギ抗ニワトリ軽鎖（１：３０００希釈）をそれに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、ロバ抗ヤギＨＲＰ抗体（１：５０００希釈）をそれに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによって呈色反応を開始し、反応を１Ｎ  ＨＣｌによって終了した。波長４５０ｎｍでの吸光度を検出してＯＤ４５０を得た。ＣａＥＮＯ１へのＣａＳ１の結合活性を決定するために、ＥＬＩＳＡ（図５Ａ及び図５Ｂ）及び競合ＥＬＩＳＡ（図５Ｃ及び図５Ｄ）を行った。図５Ａ及び図５Ｂに見られるように、ＣａＥＮＯ１へのＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体の結合活性は濃度依存的であり、ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによって測定されるようにＫＤはそれぞれ１．８８×１０−８Ｍ及び８．９×１０−８Ｍである。
【００９３】
実施例６  Ｃ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスの細胞溶解物に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの結合
このＣａＳ１  ｓｃＦｖを、異なるカンジダ種に対するその結合活性について評価した。５つのカンジダ一般株が得られ、５つのカンジダ種の全溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ左）及びその後のウエスタンブロットにおいて分析した。図４Ａ中央に見られるように、抗ＣａＥＮＯ１ポリクローナルＩｇＹは予想の通りに試験した５つのカンジダ種を認識することが可能である。しかしながら、ＣａＳ１  ｓｃＦｖは図６Ａ右のレーン１に見られるようにＣ．アルビカンス、レーン３に見られるようにＣ．トロピカリスとしか反応することができない。このＣａＳ１  ｓｃＦｖはＣ．クルセイ（レーン２）、Ｃ．パラプシローシス（レーン４）及びＣ．グラブラータ（レーン５）とは反応することができない。ＥＮＯ１タンパク質配列はＣ．アルビカンスとＣ．トロピカリスとで８３％相同であり、したがって、ＣａＳ１がＣ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスを認識し得る理由は、これら２つの種がＣａＳ１  ｓｃＦｖに結合し得る同様のエピトープを有することと示唆され得る。
【００９４】
さらに、臨床由来のカンジダ属のフルコナゾール耐性及び感受性株に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖ結合活性を検査した。カンジダ属及びそれらのＭＩＣを表２に挙げた。図４Ｄ〜図４Ｇに示されるように、ＣａＳ１  ｓｃＦｖはフルコナゾール耐性及び感受性Ｃ．アルビカンス（図６Ｂ）及びＣ．トロピカリス（図６Ｃ）に結合することができるが、Ｃ．グラブラータ及びＣ．パラプシローシスに結合することはできない（データは示さない）。これらのデータから、ＣａＳ１  ｓｃＦｖをフルコナゾール耐性Ｃ．アルビカンス及びＣ．トロピカリスの診断及び／又は治療に潜在的に使用することができることが示唆される。
【００９５】
加えて、図６Ｄに見られるように、ＣａＳ１  ｓｃＦｖが異なるＥＮＯ１種に結合することができることも観察された。Ｃ．アルビカンス（ＣａＥＮＯ１）、Ｓ．ニューモニエ（ＳｐＥＮＯ１）、Ｓ．アウレウス（ＳａＥＮＯ１）、マウス（ｍＥＮＯ１）及びヒト（ｈＥＮＯ１）に対するＥＮＯ１を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ｄ左）及びウエスタンブロット（図６Ｄ右）に供した。ＣａＳ１  ｓｃＦｖはＣａＥＮＯ１だけでなく、ＳｐＥＮＯ１及びＳａＥＮＯ１にも結合するが、ｍＥＮＯ１及びｈＥＮＯ１には非常に僅かしか結合しない（図６Ｄ右）。これらの結果から、Ｃ．アルビカンス、Ｓ．ニューモニエ及びＳ．アウレウスに由来するＥＮＯ１が、ＣａＳ１  ｓｃＦｖに結合することができる同様のエピトープを有し得ることが示唆される。
【００９６】
【表２】
2018512174.tif 000007
【００９７】
実施例７  Ｃ．アルビカンスの細胞表面上のα−エノラーゼに対するＣａＳ１抗体の特定のためのフローサイトメトリーアッセイ
抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖをＣ．アルビカンスと接触させた後、フローサイトメトリーアッセイに供した。抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖは８９．７±２．８％、４６．６４±３．１％及び２３±２．３％のＦＩＴＣ蛍光反応を示し（図７Ａ）、抗体がＣ．アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合することができることを意味している。さらに、染色用のヨウ化プロピジウムを使用して、Ｃ．アルビカンスの死亡率を特定し、抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖが９０±１．５％、３７±０．８％、２１±１％のＣ．アルビカンスを死滅させることが見出された（図７Ａ）。図７Ｂに示されるように、対照ｓｃＦｖ及び抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹと比較して、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１はＣ．アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合することで、それらを死滅させることができる。
【００９８】
実施例８  Ｃ．アルビカンスの細胞表面上のα−エノラーゼに対するＣａＳ１抗体を特定する免疫蛍光アッセイ
抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖを、Ｃ．アルビカンスの細胞表面上のα−エノラーゼに対するＣａＳ１抗体を特定する免疫蛍光アッセイに使用した。図８に示されるように、抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ（１）及びｓｃＦｖ  ＣａＳ１（２）はＣ．アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合するが、対照ｓｃＦｖ（３）は結合を示さない。
【００９９】
実施例９  ＣａＳ１  ｓｃＦｖによるＣ．アルビカンスの増殖及び菌糸形成の軽減
Ｃ．アルビカンスの増殖に対するＣａＳ１の効果を評価し、ＣａＳ１  ｓｃＦｖをＣ．アルビカンスとともにプレインキュベートし、寒天上にプレーティングした。図９Ａに見られるように、ＣａＳ１  ｓｃＦｖは１０−４に希釈した場合に、対照と比較してＹＰＤ寒天プレート上で観察されるＣ．アルビカンスの増殖を減少させた。抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹに対する阻害効果はｓｃＦｖ  ＣａＳ１  ｓｃＦｖと同様である。
【０１００】
菌糸形成もＣ．アルビカンスの病原性において重要な役割を果たすことが示された。そのため、ＣａＳ１  ｓｃＦｖが菌糸形成に影響を及ぼすかを更に調査した。ＣａＳ１  ｓｃＦｖをＣ．アルビカンスとともにプレインキュベートし、コロニー形態を検査した。図９Ｂに見られるように、対照コロニーの端に沿って菌糸が明らかに目に見えたが、ＣａＳ１  ｓｃＦｖで処理したコロニーでは非常に僅かしか又は全く観察されなかった。ＣａＳ１  ｓｃＦｖをＣ．アルビカンスとともにプレインキュベートした場合に菌糸形成の軽減効果が明白である。
【０１０１】
実施例１０  ヒト口腔ケラチノサイトＯＥＣＭ−１細胞に対するＣ．アルビカンスの結合の阻害
Ｃ．アルビカンス細胞（１×１０６）を、５０μｇ及び１００μｇのｓｃＦｖ  ＣａＳ１のそれぞれで処理し、得られる混合物をヒト口腔ケラチノサイトＯＥＣＭ−１細胞に添加して、ＯＥＣＭ−１細胞に対するＣ．アルビカンス細胞の結合能を試験した。ＰＢＳ対照と比較して、５０μｇ及び１００μｇのｓｃＦｖ  ＣａＳ１は、ＯＥＣＭ−１細胞に対するＣ．アルビカンス細胞の結合を顕著に低減した（図１０）。
【０１０２】
実施例１１  プラスミノーゲンへのＥＮＯ１の結合に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの効果
表面ＥＮＯ１がプラスミノーゲン受容体として作用し３２、プラスミノーゲンへの結合によりそれがプラスミンへと活性化され、ゲルに含まれるフィブリノーゲン（細胞外基質）の分解がもたらされることが知られている。ＣａＥＮＯ１−プラスミノーゲン会合の考え得る生物学的意義を試験するために基質ゲル研究を行い、この結合に対するＣａＳ１  ｓｃＦｖの効果を観察した。
【０１０３】
代表的なプレートは図１１に見られるものであった。プラスミノーゲンの非存在下で、カンジダ単独（図１１−１）又はＣａＳ１  ｓｃＦｖ単独（図９−６）は線維素溶解活性を示さなかった。１μｇ及び１０μｇのプラスミノーゲンとともにインキュベートしたＣ．アルビカンスは、線維素溶解活性の顕著な増大をもたらした（図１１−２及び図１１−３）。この結果から、ＣａＥＮＯ１に結合したプラスミノーゲンが基質ゲル中に存在するトロンビンによって活性化され、周囲のフィブリノーゲンを消化し得ることが示唆される。しかしながら、線維素溶解活性はＣａＳ１（１０μｇ及び１００μｇ）とともにプレインキュベートしたＣ．アルビカンスによって、図１１−４及び図１１−５に示されるようにプラスミノーゲン単独の存在下と比較して顕著に阻害することができる。ゲル中のフィブリノーゲンの分解の阻害が明白である。本発明者らの結果から、プラスミノーゲンへのＣａＥＮＯ１の結合がＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体によって用量依存的に顕著に低減したことが示唆される。
【０１０４】
実施例１２  感染マウスの生存率を拡大するＳｃＦｖ  ＣａＳ１によるＣ．アルビカンス毒性の中和
１×１０６細胞のＣ．アルビカンス溶液を、各１００μｇの抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖと混合した後、ＩＣＲマウス（各群５匹のマウス）に注射した。１０日後に、抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ、ｓｃＦｖ  ＣａＳ１及び対照ｓｃＦｖ群の生存率は、それぞれ１００％、８０％及び０％であった。抗ＣａＥＮＯ１  ＩｇＹ及びｓｃＦｖ  ＣａＳ１はＣ．アルビカンスの毒性を中和することができるため、マウスを延命するか又はマウスを死亡から保護し得ることが見出された。
【０１０５】
実施例１３  ＣＤＲグラフトによるＣａＳ１  ｓｃＦｖのヒト化
２つのヒト化ＣａＳ１  ｓｃＦｖ（Ｖ１及びＶ３）を設計した。ヒト化ＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ１をヒトフレームワーク（タンパク質構造データバンク：２ＪＩＸ−Ｌ、２ＺＫＨ−Ｈ）にグラフトし、この最も好適な長さの配列を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアによって分析した。ヒト化ＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ３を、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（タンパク質構造データバンク：２ＦＪＧ）の配列であるヒトフレームワークにグラフトした。これらのヒト化ＣａＳ１  ｓｃＦｖ（Ｖ１及びＶ３）はGemonics BioSci & Tech（台湾、新北市）によって合成され、ｐＣｏｍｂ３Ｘベクターにクローニングし、タンパク質発現のためにＴｏｐ  １０大腸菌内に導入した。発現されたＶ１及びＶ３タンパク質をＮｉ＋セファロースによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって分析した。
【０１０６】
図１２に示される結果のように、ヒト化ＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ１（図１３Ａ）及びＶ３（図１３Ｂ）抗体を、標的遺伝子を用いてプラスミドＤＮＡを合成するように設計した後、ＤＮＡを発現のためにＴｏｐ  １０大腸菌内に導入した。次いで、発現タンパク質をＮｉ＋セファロースで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。その後、発現タンパク質をウエスタンブロット（抗ＨＡタグ）によって確認した。
【０１０７】
実施例１４  ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３とのＣａＥＮＯ１の結合能の決定
ｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３及びＣａＳ１  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。図１３に示されるように、（Ａ）クマシーブルーを染色に使用し、（Ｂ）マウス抗ヒトκ、λＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧをウエスタンブロットに使用し（右パネル）、（Ｃ）マウス抗ＨＡ  ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧを使用し、（Ｄ）ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧ及びＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを使用した。レーン１：ｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ１。レーン２：ｈｚＣａＳ１  ｓｃＦｖ  Ｖ３。レーン３：ＣａＳ１  ｓｃＦｖ。
【０１０８】
実施例１５  ＥＬＩＳＡによるｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖのＫＤ決定
精製ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖを組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に使用した。ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖを、段階希釈により一次抗体として使用した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖ＩｇＧを二次抗体として使用した。ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧを検出に使用した（図１４Ａ及び図１４Ｃを参照されたい）。ＯＤ値をパーセンテージで算出した。ｓｃＦｖのＫＤ又は５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出し、モル濃度（Ｍ）によって表した。ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖのＫＤは、それぞれ１．５１ｕｇ／ｍｌ＝４．６×１０−８Ｍ及び２．１２ｕｇ／ｍｌ＝８．４×１０−８Ｍである。ＥＬＩＳＡデータを二連ウェルの平均±ＳＤとして表した（図１４Ｂ及び図１４Ｄを参照されたい）。
【０１０９】
実施例１６  ＣａＳ１、ｈｚＣａＳ１  Ｖ１及びＶ３  ｓｃＦｖはプラスミノーゲンへのＣａＥＮＯ１の結合を阻害する
Ｎｉ＋セファロース上のＣａＥＮＯ１を１００ｕｇのｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３及びＣａＳ１  ｓｃＦｖで１時間処理し、続いてプラスミノーゲン（２０ｕｇ）とともに１時間インキュベートした。ＣａＳ１  ｓｃＦｖを用いたＣａＥＮＯ１の各実験群をゲル上に滴下し、室温で２日間インキュベートし、ゲル分解結果を観察し、結果を図１５に示す。図１５−１では、プラスミノーゲン（１ｕｇ／ｕｌ）単独（陽性対照）の存在下で、ゲルに見られるように顕著な線維素溶解活性が示される。図１５−２では、プラスミノーゲンを含まないＮｉセファロース（商標）（１０ｕｇ）単独（陰性対照）上でのＣａＥＮＯ１は、ゲル中で線維素溶解活性を示さない。図１５−３では、プラスミノーゲン（２０ｕｇ）を含むセファロース（商標）（１０ｕｇ）上でのＣａＥＮＯ１が線維素溶解活性を示す。図１５−４、図１５−５、図１５−６では、ｈｚＣａＳ１  Ｖ１（図１５−４）、Ｖ３（図１５−５）、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ（図１５−６）（１００ｕｇ）で処理し、プラスミノーゲン（２０ｕｇ）とともにインキュベートしたセファロース（商標）（１０ｕｇ）上のＣａＥＮＯ１は、１５−３と比較して線維素溶解活性を示さない。したがって、結果から、ＣａＥＮＯ１に結合したプラスミノーゲンが基質ゲル中に存在するトロンビンによって活性化され、周囲のフィブリノーゲンを消化し得ることが示唆される。しかしながら、図１５−３に示されるように、線維素溶解活性はプラスミノーゲンの存在下と比較してｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３、ＣａＳ１  ｓｃＦｖとともにプレインキュベートしたＣａＥＮＯ１によって顕著に阻害することができる。ゲル中のフィブリノーゲンの分解の阻害は明白である（図１５−４、図１５−５、図１５−６）。本発明者らの結果から、プラスミノーゲンへのＣａＥＮＯ１の結合がｈｚＣａＳ１  Ｖ１、Ｖ３、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体によって顕著に低減されたことが示唆される。
【０１１０】
実施例１７  ＣａＳ１  ｓｃＦｖを用いたＣａＥＮＯ１のエピトープマッピング
９つのＰＣＲ増幅フラグメントを、ＰＥＴ−２１ａベクターにライゲートし、ＢＬ−２１大腸菌に形質転換した完全長ＣａＥＮＯ１（１３２３ｂｐ）を鋳型として用いて得た。挿入されたフラグメントの同一性をシークエンシング（Genomics BioSci & Tech、台湾、新北市）によって確認した。タンパク質発現をＩＰＴＧ誘導によって行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いて、発現組換えタンパク質を特性化した。
【０１１１】
ＣａＥＮＯ１のエピトープマッピングのために、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡでの組換えＣａＥＮＯ１タンパク質の認識に精製ＣａＳ１  ｓｃＦｖを使用した。エピトープ領域を、１９８ｂｐヌクレオチドを含有するようにマッピングし、推論アミノ酸配列（残基２３５〜３００）はＤＫＡＧＹＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶＡＳＳＥＦＹＫＤＧＫＹＤＬＤＦＫＮＰＥＳＤＰＳＫＷＬＳＧＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰＩＶＳＩＥＤＰＦ（配列番号１９）（６６アミノ酸）である。
【０１１２】
エピトープ位置を更に決定するために、部位特異的突然変異誘発（Kunkelの方法）を用いて、僅かな修飾を有する上述のマッピングされた１９８ｂｐの抗原フラグメントのヌクレオチド配列に従う９つのペプチド発現ファージを構築した（"Chapter 2, Constructing phage display libraries by oligonucleotide-directed mutagenesis" on Phage Display-APractical Approach, edited by Tim Clackson and Henry B. Lowman, OXFORD University Press 2004）。抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を有する修飾ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ  ＤＮＡをＥＲ２７３８大腸菌に形質転換した。ファージミドＤＮＡを大腸菌から抽出し、ＥｃｏＲＩ酵素による制限を用いた挿入について分析した。ウイルス粒子表面上に１０個のアミノ酸を発現する得られた各々のファージを、ＥＬＩＳＡにおいてＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体に対するそれらの反応性について検査した。合わせた結果から、ＣａＳ１  ｓｃＦｖが２４０ＫＧＫＶＧＩＡＭＤＶ２４９（配列番号３）及び２７８ＰＱＬＡＤＬＹＥＱＬＩＳＥＹＰ２９２（配列番号４）の間に位置する抗原エピトープ上のアミノ酸残基を認識することが示された。
【０１１３】
上記の９つの組換えＣａＥＮＯ１タンパク質を、ドットブロットにおける精製プラスミノーゲンの認識に使用した。結果から、ＣａＳ１  ｓｃＦｖ抗体がアミノ酸残基３０１〜４３７にわたるプラスミノーゲンのフラグメントに結合し、その配列がＡＥＤＤＷＤＡＷＶＨＦＦＥＲＶＧＤＫＩＱＩＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＴＲＩＫＴＡＩＥＫＫＡＡＮＡＬＬＬＫＶＮＱＩＧＴＬＴＥＳＩＱＡＡＮＤＳＹＡＡＧＷＧＶＭＶＳＨＲＳＧＥＴＥＤＴＦＩＡＤＬＳＶＧＬＲＳＧＱＩＫＴＧＡＰＡＲＳＥＲＬＡＫＬＮＱＩＬＲＩＥＥＥＬＧＳＥＡＩＹＡＧＫＤＦＱＫＡ（配列番号２０）であることが示された。上記の結果を図１６に示す。
【０１１４】
実施例１８  ＣａＳ１  ｓｃＦｖはＣ．アルビカンスに感染したＩＣＲマウスの生存率を延長する
動物モデルにおいてＣａＳ１の生存率を評価した。初めに、ＩＣＲマウスに１×１０６細胞のＣ．アルビカンスを、ＰＢＳ単独を用いて又は細胞をＣａＳ１（１０μｇ及び１００μｇ）とともに３７℃で１時間プレインキュベートして尾静脈注射した。図１７に見られるように、ＣａＳ１（１０μｇ及び１００μｇ）とのプレインキュベートは、ＰＢＳ対照と比較してマウスの生存率をそれぞれ４０％及び８０％に延長する。抗ヒャッポダ（Deinagkistrodon acutus）ｓｃＦｖ（抗ＤＡ）はヘビ毒に対する抗体であり、これを非関連ｓｃＦｖ対照として使用した。これらのデータから、ＣａＳ１  ｓｃＦｖが、ＩＣＲマウスにカンジダ血症の致死的チャレンジに対する部分保護活性をもたらすことが示唆される。
【０１１５】
実施例１９  カンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成阻害アッセイ
カンジダ・アルビカンス細胞をＹＰＤ培地中で培養した後、回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭグルコースを含有するＹＰＤ培地に１０７細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。９６ウェルプレートをＣａＳ１  ｓｃＦｖ又はフルコナゾールで処理した後、１ｍｌの細胞懸濁液を接種した。２時間の接着期間の後、ＰＢＳで洗浄することによって接種材料を除去し、１００ｍＭグルコースを含有するＹＰＤ培地をプレートに適用した。プレートをＣａＳ１  ｓｃＦｖ又はフルコナゾールで処理し、バイオフィルムを３７℃で７２時間増殖させた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、バイオフィルム形成を顕微鏡検査によって観察した（図１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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