(57)【要約】  生体試料を受け入れるための複数の分離した区域（２２、２４、２６、２８、図１）を有する固体支持体１２を含む生体試料コレクタ５００が開示され、各々の区域は、例えば異なる化学処理を前記固体支持体に吸着させることによって化学的に区別される。エンベロープ５３０は、前記固体支持体を封入する。カバー部分５２０は、感染を防ぐために収集後の生体試料を覆うことができる。感染のリスクを低下させるために紫外光を収集した試料に当てることができる。【選択図】図２ａ
2018511803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の取扱い方法であって、
ａ）固体支持体（１２）を含む試料コレクタ（１０、１００、５００）を準備する工程であって、前記固体支持体（１２）が複数の化学的に区別される試料収容区域（２２、２４、２６、２８）を有する、工程と；
ｂ）生体試料を１または複数の前記区域（２２、２４、２６、２８）に適用する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
ｃ）前記１または複数の区域（２２、２４、２６、２８）を、前記生体試料中に存在するどんな感染性材料も実質的に不活化させるのに十分な紫外光に露出させる工程
をさらに含む、請求項１に記載の生体試料の取扱い方法。
【請求項３】
ｄ）１または複数の前記試料収容区域（２２、２４、２６、２８）の一部分を、例えば収容容器（３００）の中に押し抜くことによって切除する工程と；
ｅ）前記切除した部分を別の容器に移すことなく、前記切除した部分に由来するどんな生体材料にもアッセイを実施する工程
をさらに含む、請求項１または３に記載の試料の取扱い方法。
【請求項４】
前記アッセイが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ含有量の決定、ならびに／あるいはタンパク質同定、および／または酵素同定の１または複数を含み、いずれの場合も、どちらの前記宿主に関する生体試料材料または感染性材料に関する生体試料材料も前記試料の中で同定される、請求項３に記載の試料の取扱い方法。
【請求項５】
以下の１または複数の工程：
ａ）前記適用した試料を乾燥させる工程と；
ｂ）前記乾燥した区域（２２、２４、２６、２８）を、随意に感圧接着剤（５１０）によって適所に保持されるカバーフラップ（５２０）で覆う工程と；
ｃ）前記試料コレクタ（１０、１００、５００）を貯蔵する工程と
をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項６】
前記カバーフラップ（５２０）が、紫外光をそれを通して実質的に通過させる、請求項５に記載の試料の取扱い（ｈａｎｄｉｎｇ）方法。
【請求項７】
生体試料を受け入れるための複数の化学的に区別される試料収容区域（２２、２４、２６、２８）を有する固体支持体（１２）を含む生体試料コレクタ（１０、１００、５００）。
【請求項８】
前記化学的に区別される区域（２２、２４、２６、２８）が、１または複数の化学的に未処理の区域（２８）；弱塩基、キレート剤および陰イオン性界面活性剤の組合せで処理した１または複数の区域（２２）；タンパク質変性剤で処理した１または複数の区域（２４）；ならびに／あるいはタンパク質変性剤、還元剤、抗酸化剤および緩衝剤で処理した１または複数の区域（２６）を含む、請求項６に記載の試料コレクタ（１０、１００、５００）。
【請求項９】
全ての前記化学的に区別される区域（２２、２４、２６、２８）が、抗酸化剤を含む、請求項８に記載の試料コレクタ（１０、１００、５００）。
【請求項１０】
前記区域（２２、２４、２６、２８）を覆うためのカバー部分（１２０、５２０）を含む、使用時に前記固体支持体（１２）を保護するためのエンベロープ（１１０、５３０）をさらに含む、請求項７、８または９に記載の試料コレクタ（１０、１００、５００）。
【請求項１１】
前記エンベロープ（１１０、５３０）が、前記カバー（１２０、５２０）を使用時に適所に保持するための感圧接着剤（５１０）を含む、請求項１０に記載の試料コレクタ（１０、１００、５００）。
【請求項１２】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によるか、または請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の試料コレクタ装置によって感染性材料試料を収集するための収集方法。
【請求項１３】
前記材料が、出血性疾患、例えばエボラウイルス疾患などに関するＲＮＡ、またはヒト免疫不全ウイルス、またはインフルエンザウイルスなどの疾患に関連するＤＮＡである、請求項１２に記載の収集方法。
【請求項１４】
生体試料を受け入れるための複数の化学的に区別される試料収容区域（２２、２４、２６、２８）を有する固体支持体（１２）を含む生体試料コレクタ装置であって、前記装置が、使用時に前記固体支持体（１２）上のどんな感染性材料も不活性化するのに十分な強度および十分な持続時間で前記区域（２２、２４、２６、２８）を紫外光に露出させるように配置された紫外光源（２００）をさらに含む、装置。
【請求項１５】
前記固体支持体（１２）の一部を押し抜くように配置されたパンチ（２４０）、前記パンチを受け取るように配置された収容容器（３００）、および前記パンチを別の容器に移すことなく前記部分（２５０）でアッセイを実施するための手段をさらに含む、請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料コレクタおよびその取扱いに関する。特に、限定するものではないが、本発明は、エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）に感染した被験体など潜在的に感染性の被験体由来の生体試料の収集および取扱いに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関によれば、２０１４年１０月１日現在で、ＥＶＤの３，３４０件の死亡例を含む総数７，２０３件の症例が西アフリカ（ギニア、リベリア、シエラレオネ、セネガル、ナイジェリア）から報告された。当時、ＷＨＯおよびインペリアル・カレッジ・ロンドンの専門家は、西アフリカでエボラ抑制措置が迅速に強化されなければ感染数が指数的に上昇し続けることになると予測していた。
【０００３】
新しい処置およびワクチンなどの効果的な介入戦略が探究されている一方で、ＥＶＤの正確な診断が、その発生に反応する際の重要な要素であり、将来の発生に対する鍵となるということがわかった。現在、そのような伝染病の発生を制御することは、患者をエボラ治療センターかまたは別の環境のいずれかに適切に向ける研究室内試験に大いに頼っている。現行の実験室の能力は、ＥＶＤを確認するためのＰＣＲアッセイまたはラテラルフロー試験などのＥＬＩＳＡ／抗体に基づく試験などの分子アッセイの実施を移動実験室ユニットおよびその他の指定された実験室に頼る。これらの実験室は、理論上はエボラ治療センターと情報交換するべきである。これらの実験室は非常に重要であるが、２０１４年のＥＶＤの発生の際に、特に、影響を受けたアフリカ諸国において医療基幹施設がほとんどない所でそれらの実験室は全ての診断需要を処理することができなかったという認識が広まっている；従って、広範なバイオセイフティー要件を必要としない分散した医療施設で使用される、新しい迅速なポイント・オブ・コンタクト／ケアＥＶＤ検査が依然として緊急に必要とされている。ＥＶＤに加えて、その他の出血性疾患発生およびインフルエンザの新しい菌株などのその他の疾患、ならびにＨＩＶなどのより確立された疾患の診断のために、同じ需要は今後疑いなく生じるであろう。
【０００４】
そのような迅速なＥＶＤ試験は、早期診断およびエボラ治療センターまたはポイント・オブ・ケアへの照会を可能にし、患者と家族の早期支援、接触者追跡調査および隔離を通じて、患者およびコミュニティの成果を強化する。
【０００５】
被災地でＥＶＤに罹患する恐怖は、罹患率および患者試料収集の有効性を大いに減少させるかもしれない。このことは、次に、診断だけでなく、患者の結果に影響を及ぼす因子を検査する遺伝子およびその他の研究に利用可能な研究材料にも有害な効果を有することがあり得る。
【０００６】
ＥＶＤの診断のための現在好ましい方法は、ラテラルフローアッセイなどの抗体に基づく試験を用いる分子技術に基づく。しかし、異なる技術に基づく多数の方法およびバイオマーカーが、ＥＶＤの検出に潜在的に使用され得ることにも注意される。例えば、抗原検出試験は、それらが高感度であり得る場合に、このＥＶＤ発生の制御において有用な役割を果たすことがある。いくつかの自動半携帯型核酸増幅試験プラットフォームも、ＨＩＶ、ＴＢおよびマラリアなどのその他の疾患用に開発されており、適切なバイオセイフティー要件に適合する場合に、ＥＶＤ検出に使用される可能性がある。しかし、選択される技術およびバイオマーカーが何であれ、使用される検体の種類および収集要件は、散在する場所で使用するために実現可能な試験を達成する際に重要となる。試験を行うために現地スタッフに必要とされる訓練の量も最小限に保たれなければならない。
【０００７】
ＷＨＯは、ＥＶＤの効果的な診断のための特定の重要な考慮事項を、特にそのような診断が行われる可能性の高い臨床状況を考慮して規定した：
実験室の基幹施設がない／最小の分散した医療施設で使用可能；
確認検査の必要なく症候的に急性エボラウイルス感染患者と非エボラウイルス感染患者を区別する必要性；
９９％超の分析特異性；
静脈切開からの静脈血に優先して指先穿刺による採血だけからの診断；
試料調製がほとんど不要；
試薬使用の安定性−ＲＨ９０％で２４カ月よりも長い保存期間での室温（５〜５０℃）貯蔵。
【０００８】
本発明者らは、試料コレクタおよび試料の取扱いの改良によって、直前に述べた少なくとも重要な考慮事項に取り組むことができることに気付いた。
【０００９】
ＷＨＯは患者の効果的な診断および処置に注目したが、本明細書に記載される改良された患者試料コレクタおよび試料取扱い装置の実施形態にはその他の利点がある。特に、ＥＶＤ保菌者との接触は嫌がられるために、試料はあまり頻繁に収集されない。従って、上記のようにより限られた研究試料しか入手可能でない。試料を入手し、輸送し、より低い感染リスクで貯蔵し、多数のアッセイを実施できるような方法で貯蔵することができれば、それは、試料採取したＥＶＤおよびその他の感染症の理解の前進を容易にすることになることを本発明者らは理解した。
【００１０】
ＥＶＤへの感染
ＥＶＤの感染機構は十分にはわかっていないが、タンパク質によるウイルスの宿主細胞への侵入には２つの有力な候補があると考えられる：
１．１つ目はコレステロール輸送体タンパク質の、宿主にコードされるニーマン・ピックＣ１（ＮＰＣ１）であり、これは主細胞へのエボラビリオンの侵入およびその究極の複製に必須であると思われる。ある研究では、ＮＰＣ１遺伝子の１コピーを除去したマウスは、マウス適合型エボラウイルスに曝露した１５日後に８０パーセントの生存率を示したが、無修飾マウスの１０パーセントしか長くこれを生き延びなかった。別の研究では、小分子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）がＮＰＣ１と結合することを防ぐことによってＥＶＤ感染を抑制することが示された。そのため、ＮＰＣ１は、ウイルスＧＰと直接結合することによって感染を媒介するために、このフィロウイルスの侵入に決定的であることが示された。
【００１１】
この輸送体を欠くニーマン・ピックＣ型患者由来の細胞を実験室でエボラウイルスに曝露すると、細胞は生き残り、ウイルスに不浸透性と思われ、エボラが細胞への侵入をＮＰＣ１に頼っていることがさらに示された。ヒトのＮＰＣ１遺伝子の変異は、一部の個体をこの致命的なウイルス疾患に抵抗性にするための可能性のあるモードとして推測された。同じ研究は、同族のフィロウイルスであるマールブルグウイルスのウイルス侵入の際のＮＰＣ１の役割に関して同様の結果を記載した。さらなる研究は、ＮＰＣ１が、ウイルスＧＰとのその直接結合によってエボラ感染を媒介する重大な受容体であり、それがこの結合を媒介するＮＰＣ１の第２の「リソソーム」ドメインであるという証拠も提示した。
【００１２】
２．２つ目の候補は、ＴＩＭ−１（ＨＡＶＣＲ１としても知られている）である。ＴＩＭ−１は、ＥＶＤ糖タンパク質の受容体結合ドメインと結合して、ベロ細胞の受容性を増加させることが示された。その効果をｓｉＲＮＡでサイレンシングすることによりベロ細胞の感染を防いだ。ＴＩＭ１は、ＥＶＤ溶解によって深刻な影響を受けることが公知の組織（気管、角膜、および結膜）で発現した。ＴＩＭ−１のＩｇＶドメインに対するモノクローナル抗体、ＡＲＤ５は、ＥＶＤの結合および感染を阻止した。
【００１３】
合わせると、これらの研究は、ＮＰＣ１およびＴＩＭ−１がエボラ抗ウイルス薬の有力な治療標的であり、かつ迅速なフィールド診断アッセイの根拠であり得ることを示唆する。
【００１４】
ＥＶＤ複製
無細胞であるので、エボラなどのウイルスはどんな種類の細胞分裂によっても複製しない；むしろ、それらは、宿主とウイルスによってコードされる酵素の組合せを宿主細胞構造と一緒に使用して、それらの複数のコピーを作製する。これらは次に宿主細胞において自己組織化してウイルスの巨大分子構造となる。各々の個々の細胞を感染させる時にウイルスは一連のステップを完了する。ウイルスは、糖タンパク質（ＧＰ）表面ペプロマーを通じて宿主受容体に結合することによってその攻撃を開始し、宿主細胞で飲食されてマクロピノソームとなる。細胞を透過するために、ウイルス膜は小胞膜と融合し、ヌクレオカプシドが細胞質内に放出される。キャプシド形成された、マイナスセンスゲノムｓｓＲＮＡを、ポリアデニル化された、モノシストロニックｍＲＮＡｓの合成（３’−５’）の鋳型として使用し、宿主細胞のリボソーム、ｔＲＮＡ分子などを使用してｍＲＮＡを個々のウイルスタンパク質に翻訳する。
【００１５】
これらのウイルスタンパク質はプロセシングされる：糖タンパク質前駆体（ＧＰ０）はＧＰ１およびＧＰ２に切断され、それは次に細胞酵素および基質を用いて重度にグリコシル化される。これらの２つの分子は集合して、最初にヘテロ二量体となり、その後三量体となって表面ペプロマーを与える。分泌された糖タンパク質（ｓＧＰ）前駆体は切断されてｓＧＰとデルタペプチドとなり、その両方が細胞から放出される。ウイルスタンパク質レベルが上昇するにつれて、翻訳から複製への切り替えが起こる。マイナスセンスゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、相補＋ｓｓＲＮＡが合成される；次に、これを新しいゲノム（−）ｓｓＲＮＡの合成の鋳型として使用し、それは迅速にキャプシド形成される。新しく形成されたヌクレオカプシドおよびエンベロープタンパク質は宿主細胞の細胞膜で結合する；出芽が起こり、細胞を破壊する。
【００１６】
上記を考慮し、本発明者らは、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、およびタンパク質を、安全で感染しない方法で捕捉および貯蔵することができ、それによって診断用だけでなく今後の研究用にも使用することのできる試料を提供することのできる、貯蔵試料の取扱いからの以降の感染のリスクの低い多重フォーマットの試料コレクタが必要とされることを理解した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／１０６９７４号明細書
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、好ましい特徴が従属クレームによって定義される独立クレームに全て記載される試料取扱い方法、試料コレクタ、および試料コレクタ装置を提供する。本発明は、特許請求される感染性試料収集方法にも及ぶ。
【００１９】
本発明は、そのような組合せが本明細書において明示的に言及されているかまたは特許請求されているか否かに関わらず、本明細書で開示される特徴の任意の組合せにまで及ぶ。さらに、２つ以上の特徴が組み合わされて言及される場合、そのような特徴は、本発明の範囲を拡張することなく、別個に特許請求され得ることが意図される。
【００２０】
本発明は、多数の方法で実施することができ、その例示的な実施形態を図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の第１の試料コレクタの一実施形態を示す図である。
【図２ａ】エンベロープの中で用いられる図１の試料コレクタを示す図である。エンベロープは分解され予め組み立てられた状態で示される。
【図２ｂ】試料コレクタの第２の実施形態を形成するための、組立状態の、図２ａに示される試料コレクタの側面図を示す図である。
【図２ｃ】試料コレクタの第２の実施形態を形成するための、組立状態の、図２ａに示される試料コレクタの上面図を示す図である。
【図３ａ】試料コレクタの第３の実施形態、および試料コレクタで収集した試料をプロセシングするために、かつ試料アッセイに使用される装置の略図を示す図である。
【図３ｂ】試料コレクタの第３の実施形態、および試料コレクタで収集した試料をプロセシングするために、かつ試料アッセイに使用される装置の略図を示す図である。
【図３ｃ】試料コレクタの第３の実施形態、および試料コレクタで収集した試料をプロセシングするために、かつ試料アッセイに使用される装置の略図を示す図である。
【図４】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図５】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図６】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図７】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図８】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図９】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図１０】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図１１】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図１２】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【図１３】下により詳細に記載される実験結果に関するグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図１を参照すると、試料コレクタ１０は、固体支持材料１２、この例では例えば紙材料に形成されるセルロースファイバーマトリックス、を含むことが示される。固体支持体には、化学的に処理されていてもよいし、処理されていなくてもよい複数の別々の区域２０が含まれる。この例では、下で規定されるように、固体支持体の区域には、第１の区域２２、第２の区域２４、第３の区域２６および第４の区域２８が含まれる。
【００２３】
これらの区域２２、２４、２６、および２８は、毛管作用によって試料液が（例えば区域間で）運ばれることを制限する穿孔３０によって境界が定められている。使用時、試料コレクタ１０のこの実施形態は、指先穿刺から全血を収集するために用いられることができ、それは固体支持体１２の上に一方の側から他方の側までこすりつけられて複数の区域２２〜２８の各々の上に生体試料を提供することができる。
【００２４】
区域２２は、商業的にＦＴＡとして公知の特許製剤（弱塩基、キレート剤および陰イオン性界面活性剤を含む）で化学的に覆われている。この製剤は、コレクタ１０／１００の一部をコレクタから押し抜いてさらなる処理用の単一の容器に受け取ることを可能にする。一例として、研究目的のために、押し抜かれた試料をＳＴＲおよび遺伝的プロファイリングを実施するために使用して、患者の身元およびウイルスの細胞の侵入を促進する結合受容体のＤＮＡ配列を確認することができる。例えば、侵入を促進する変異を示す遺伝子プロファイルと同様に、ＥＶＤが結合する受容体に関連する遺伝子プロファイルを特定することができる。逆に、何らかの形態の耐性を示す個体の遺伝子プロファイルも得ることができる。重要なことには、化学処理は、生体試料の室温乾燥貯蔵を大幅に劣化させることなく可能にする。
【００２５】
区域２４は、タンパク質変性剤、例えば、液体状態でＤＮＡの単離を可能にするチオシアン酸グアニジンを含む、ＦＴＡ  ＥｌｕｔｅまたはＦＴＡｅとして商業的に公知の化学製剤で化学的に処理される。これは、下流の用途、例えばクローニング用のＦＴＡの代替手段として有利であり、そのＤＮＡを抽出するための簡単な溶出段階をもつ、ＤＮＡを貯蔵する手段を提供する。
【００２６】
区域２６は、タンパク質変性剤、還元剤および緩衝液、ならびに好ましくは酸化防止剤および／またはフリーラジカルトラップ剤を含む、ＲＳＭとして商業的に公知の特許化学被膜剤で化学的に処理される。例えば、タンパク質変性剤には、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、塩酸グアニジン、アルギニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、またはその任意の組合せが含まれてよい。還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）であってよく、緩衝液は３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）であってよく、酸化防止剤は、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）またはアスコルビン酸であってよい。被膜剤は、ウイルスＲＮＡと同様に被験体のｍＲＮＡの長期室温貯蔵および安定化を可能にする。ＲＳＭは、様々な温度範囲で無傷のＲＮＡ分子での長期貯蔵および安定化を促進する。ＥＶＤはｓｓＲＮＡウイルスであるので、ＲＳＭはこの感染性材料の貯蔵に適していることになる。
【００２７】
区域２８は、Ｗｈａｔｍａｎ９０３またはＷｈａｔｍａｎ３１ＥＴＦ紙として商業的に公知の覆われていない（化学的処理されていない普通紙）区域であり、酵素活性および構造調査などの用途のために未変性タンパク質の単離および分析を促進するために使用される。この紙は、宿主抗体；ウイルス糖タンパク質；宿主ＮＰＣ１発現；宿主ＴＩＭ−１発現；および酵素の調査を可能にする。
【００２８】
紫外光による分解から核酸を保護するために、区域２２、２４、２６または２８の一部または全部を酸化防止剤で覆うことが可能である。
【００２９】
それぞれの区域で吸着された上述の化学被膜剤は、室温で乾燥（または乾燥性）状態で目的の材料を保護し安定化させる試料コレクタを提供する。区域２２、２４、２６および２８は、たとえ区域の１つが化学処理されないとしても、このように化学的に区別されることができる。被膜は、好ましくは、穿孔されている固体支持体材料の連続ウェブの上に吸収性のコーティングホイールで連続的に塗布された後、既知技法で長さに切断される。
【００３０】
図２ａは、試料コレクタ１０、および、さらなるエンベロープ１１０を用いる試料コレクタ１００の第２の実施形態の分解組立図を示す。エンベロープ１１０は、この例では試料コレクタ１０を包むための折り目１３４で２つに折り畳まれるカード支持体１３０を含み、エンベロープ１１０は、下にある区域２２、２４、２６および２８の各々の部分を露出させる窓１３２を含む。エンベロープには、折り目１２２で折り畳まれる透明なカバー部分１２０がさらに含まれる。ひとたび組み立てると、コレクタ１０およびカバー部分１２０の一部は、カード支持体１３０の上部リーフ１３８と下部リーフ１３６の間に挟まれて、カバー１２０のフラップ１２４だけが露出し、区域の１またはそれ以上に試料が置かれて乾燥すれば、それらを覆うために窓１３２の上にすぐに折り重ねることができる。下部リーフ１３６は、下に記載されるように、区域の一部を取り外すことを可能にする窓１３２と相補的である窓１３７を有する。
【００３１】
図２ｂおよび２ｃは、組み立てた試料コレクタ１００の異なる図を示す。カード支持体１３０の上部および下部リーフ１３８および１３６は、例えば接着剤によって一緒に固定される。上部リーフ１３８には、感圧接着剤ストリップ１４０が含まれる。試料を区域２２、２４、２６および２８に適用し、乾燥する時間を置いた後、フラップ１２４をストリップ１４０に押圧し、フラップ１２４はストリップに付着し、それを適所に保持して窓１３２を覆い、試料の汚染および感染を防ぐことができる。
【００３２】
図３ａは、エンベロープ５２０／５３０の中に上記のような固体支持体１２を含む、第３の試料コレクタ５００を示す。ＥＶＤはこの環境で最大４８時間生き残ることができるので、どんなウイルス活性も不活化させるために、固体支持体１２を例えば約１００〜３００ｎｍの紫外光を数秒間発するＵＶ  ＬＥＤの列２００からの紫外光処置に供することが想定される。エンベロープには、証印（ｉｎｄｉｃｉａ）、および／またはバーコード、および／またはＲＦＩＤタグを識別することを可能にする露出領域５４０が含まれる。
【００３３】
図３ｂは、コレクタ５００の格納位置を示し、ここでエンベロープのフラップ５２０は、固体支持体を汚染から防ぐため、かつ、紫外光処理後に残留ウイルス活性がある場合には、ウイルス感染のリスクをさらに低下させるために固体支持体１２の上に折り曲げられる。フラップ５２０は、感圧接着剤５１０によって適所に保持されることができる。
【００３４】
図３ｃは、複数の直接パンチ・イン・アッセイ（ｄｉｒｅｃｔ  ｐｕｎｃｈ−ｉｎ  ａｓｓａｙｓ）を実施するための、コレクタ５００の開いた位置を示す。固体支持体１２の区域２２、２４、２６および／または２８の試料は、固体支持体１２の部分２５０を支持体の残部から切り取り、試薬３１０を含む収容容器３００の中に直接押し込むように、押抜き具２４０によって押し抜かれる。試料取扱いのこの段階は、最初の試料収集点から離れて行われる可能性が高い、そのため固体支持体１２を取り扱うことを回避できることは、感染リスクを避ける上で大きな利点である。特に、反応器の中に直接押し抜くことができ、必要なアッセイを実行することができることは有利である。区域２２、２４、２６、２８の全体を取って、その全ての区域についてアッセイすることは可能である。そのため、用語「部分」は、本明細書において、全ての区域を含むと解釈されなければならない。
【００３５】
すぐ上に記載したものと同じ取扱い手順は、試料コレクタ１０および１００に適用されることができる。コレクタ１００を使用する場合、フラップ１４０は、紫外光を透過させる修飾因子を含まないプラスチック材料、例えば厚さ０．２５ｍｍのＰＭＭＡまたはポリカーボネートから作製されることができる。ＵＶ処理は、特に不活性化を助ける化学処理のされていないＷｈａｔｍａｎ９０３紙の区域にウイルス不活性化をもたらす。
【００３６】
以下の記述は、生体試料からＤＮＡ、ＲＮＡタンパク質および酵素情報を決定する例に関する。それは、試料が収集されてからかなり後に、試料および試料コレクタを特殊な環境に曝すことなく、または生体試料材料の特殊な多段階の取扱いに供することなく、上述の種類の試料コレクタに含まれる試料から重要な情報を得ることが可能であることを示す。
【実施例】
【００３７】
１．タンパク質回収および検出
ａ．インターロイキン−２の直接測定−組換えＩＬ−２±担体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれ、カタログ２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ、ロットＡＥ４３０９１１２およびカタログ２０２−ＩＬ−１０μｇ、ロットＡＥ４３０９０８１）を５０ｐｇ／μｌまたは１００ｐｇ／μｌで血液（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に溶解した。一定分量［１μｌ、ＩＬ−２を５０ｐｇ（Ｂ）または１００ｐｇ（Ａ）含有］をＧＥヘルスケア９０３濾紙に適用した。これらの紙は、核酸もタンパク質を安定化する化学薬品も含浸させていない固体支持体の例である。生体試料を周囲温度および湿度で一晩乾燥させた。適用した試料の一部を、直径３ｍｍのハリスパンチ（ＧＥヘルスケア）を使用して取り外した。生体試料を含む単一のディスクを、完全に構成されたＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＤ２０５０、ロット２７３２７５）からの試薬でＩＬ−２について直接分析した。直接アッセイを「パンチ／ディスク・イン・ウェル」（“ｐｕｎｃｈ／ｄｉｓｃ  ｉｎ  ｗｅｌｌ”）に行った。アッセイの完了時に、光学密度を４５０ｎｍで測定した。ＩＬ−２の回収は、既知のＩＬ−２濃度の標準曲線と値を比較することによって決定した。
【００３８】
結果は、固体支持体に適用したＩＬ−２の大部分が、直接／パンチ・イン法（ｄｉｒｅｃｔ／ｐｕｎｃｈ−ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って回収されることができることを示す。
【００３９】
図４は、化学処理されていない９０３紙固体支持体上に存在するモデルタンパク質（ＩＬ−２）の測定値を示す。ＡおよびＢは、それぞれ、固体支持体に適用された１００ｐｇおよび５０ｐｇのＩＬ−２を表す。結果は、固体支持体に適用したＩＬ−２の大部分が、直接／パンチ・イン法（ｄｉｒｅｃｔ／ｐｕｎｃｈ−ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って回収されることができることを示す。
【００４０】
ｂ．細胞または回収された酵素から検出される酵素活性
タンパク質および酵素試験は、完全に構成されたＤＮアーゼおよびＲＮアーゼＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＤＮａｓｅ＆ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＡＭ１９７０＆ＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者の説明書に従って実行された。
【００４１】
ジデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）
１回目の一連の実験では、ヒト胚性幹細胞（ＧＥヘルスケア；細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍパンチを取り、それを上記のように化学処理されていない９０３紙に１０μｌ量で適用した。ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ活性を下に概説するように測定した。
【００４２】
２回目の一連の実験では、ヒト胚性幹細胞に添加された０．５ＵのＤＮアーゼかまたは１０μＵのＲＮアーゼのいずれかを含有するヒト胚性幹細胞（ＧＥヘルスケア；細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍパンチを取り、それを９０３紙に１０μｌ量で適用した。
【００４３】
ＤＮアーゼ活性の検出を、切断可能な蛍光標識ＤＮアーゼ基質を用いて以下の通り実行した。各々のパンチは、９６ウェルプレートの別々のウェルに押し出した。凍結乾燥したＤＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを、ＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェルに分配した（１０μｌ）。１０Ｘ  ＤＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｌ）およびヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験液（１００μｌ）を３７℃で６０分間インキュベートした。ＤＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＤＮアーゼによって切断されるとピンク色の蛍光を発する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関して、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（ミディアムゲイン（medium gain）を使用し励起／発光  ５３５／５９５ｎｍ）で測定した。ＤＮアーゼ活性を含有する溶液はピンク色の蛍光を生じたが、ＤＮアーゼ活性を含まない溶液は蛍光を発しなかった。従って、ＤＮアーゼのより高いレベルは、光出力量の増加に一致した。陰性対照は、試料の代わりにヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）から成った。ＤＮアーゼ活性は、化学処理されていない９０３紙を用いて、頻度依存的な方法で検出し定量化することができる。
【００４４】
図５  紙に基づく固体支持体から得られるモデル酵素（ＤＮアーゼ）の測定；９０３は、化学処理されていないセルロース系固体支持体の一例である。
【００４５】
図を参照
２．リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）回収および検出
ＲＮアーゼの検出は、切断可能な蛍光標識ＲＮアーゼ基質を用いて以下の通り実行した。各々のパンチは、９６ウェルプレートの別々のウェルに押し出した。凍結乾燥したＲＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを、ＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェルに分配した（１０μｌ）。１０Ｘ  ＲＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｌ）およびヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験液（１００μｌ）を３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＮアーゼ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＲＮアーゼによって切断されると緑色の蛍光を発する修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関して、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（ミディアムゲイン（medium gain）を使用し励起／発光  ４８５／５３５ｎｍ）で測定した。ＲＮアーゼを含有する溶液は緑色の蛍光を生じたが、ＲＮアーゼ活性を含まない溶液は蛍光を発しなかった。従って、ＲＮアーゼのより高いレベルは、光出力量の増加に一致した。陰性対照は、試料の代わりにヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）から成った。
【００４６】
これらのデータは、ＲＮＡアーゼ活性が、Ｗｈａｔｍａｎ（ＧＥヘルスケア）９０３紙に適用した生体試料から頻度依存的な方法で検出され定量化されることができることを示した。図６  紙に基づく固体支持体から得られるモデル酵素（ＲＮアーゼ）の測定；ＦＴＡは、化学処理された紙の一例であり、一方９０３は未処理の紙である。
【００４７】
３．直接増幅ワークフローでＦＴＡ試料収集カードを使用するゲノムＤＮＡ分析
ａ．Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ試料収集カード上の保存血からの直接ＰＣＲ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ試料収集カードに貯蔵された血液試料から直接ＤＮＡの増幅を支えることを示した（Ｃｈｕｍ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅ  ２０１３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＦＴＡカードは、化学薬品を塗布した紙系カードの例である。直接増幅ワークフローでは、事前のＤＮＡ抽出または精製段階は不要であり、カードは単にＰＣＲ反応混合物に添加される。
【００４８】
試料調製：新鮮血液またはヘパリン（１．４ＩＵ／ｍｌ）、Ｋ２ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍｌ）、またはクエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）とともに保存した血液を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡジーンカードに適用し、製造業者の説明書に従って乾燥させた。直接ＰＣＲには、カードの中の試料から直径１ｍｍのディスクを押し抜き、５０μｌのＰＣＲ反応体積で使用した。より大きいパンチまたはより小さい反応体積を使用した場合には、パンチを５０℃のＨ２Ｏ  ２０μＬで３分間洗浄した。Ｈ２Ｏを除去した後、下の表１に示されるように、すすいだパンチにＰＣＲ成分を直接添加した。
【００４９】
【表１】
2018511803.tif 000003
【００５０】
次に、成分をＰＣＲサーモサイクリングプロトコールに付した。この例では、下の表２に詳述されるように、プライマーＴｍ値が６９〜７２℃の場合に２段階プロトコールを使用した。この表は、代わりの３段階プロトコールも示す。
【００５１】
【表２】
2018511803.tif 000004
【００５２】
調査により、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ試料収集カード上に保存された血液からＤＮＡを直接増幅させることができることが確認された、しかし、様々なレベルの阻害が観察された。前処理がされていないと、ＦＴＡジーンカードの１ｍｍパンチは、５０μｌの反応体積でのみ良好に機能した。それより小さい反応体積には、非常に簡単な洗浄プロトコールが阻害物質を除去するために十分であった。カードパンチをＨ２Ｏで３分間洗浄した後、試料は、試験した全ての反応体積でＰｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔによる直接ＰＣＲ反応で使用するために十分な純度であった。
【００５３】
洗浄したＦＴＡパンチ（直径１ｍｍ）は、１ｋｂ、３．８ｋｂおよび７．５ｋｂのアンプリコンに特異的なプライマーとともに５０μｌの反応体積で使用した。いずれの場合も、ＰＣＲ反応は、適切なサイズの増幅産物を生成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、様々な種由来の血液に適合性である。ＳＯＸ２１遺伝子の上流の高度に保存された２３７ｂｐ領域（Ａ．Ｗｏｏｌｆｅ，Ｍ．Ｇｏｏｄｓｏｎ，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．３，ｅ７；２００４）は、ＦＴＡジーンカードの上で乾燥したいくつかの脊椎動物種の血液からうまく増幅された（図７参照）。
【００５４】
図７は、ヘパリンで処理し、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ試料収集カード上に保存したヒト血液由来の５００ｂｐゲノムＤＮＡ断片の直接増幅を示す。反応は、体積５０μｌ、２５μｌまたは１０μｌのＰＣＲ反応液で１ｍｍのパンチディスクをすすぐか、またはその中に直接入れて実施した。材料および方法に記載される２段階ＰＣＲプロトコールを使用した。１＝未洗浄ＦＴＡカード、２＝洗浄済みＦＴＡカード、（−）＝陰性対照および（＋）＝陽性対照（精製ヒトゲノムＤＮＡ）。
【００５５】
図８．ＥＤＴＡで処理し、ＦＴＡ試料収集カード上に保存したヒト血液由来の１ｋｂ、３．８ｋｂおよび７．５ｋｂのｇＤＮＡアンプリコンの直接ＰＣＲ。反応は、５０μｌの反応液中の１ｍｍパンチから実施した（７．５ｋｂ断片には、材料および方法に記載されるようにＦＴＡパンチをすすいだ）。１ｋｂ断片および７．５ｋｂ断片に２段階プロトコールを使用し、３．８ｋｂアンプリコンに３段階プロトコールを使用した。１＝ＦＴＡカード、（−）＝陰性対照、（＋）＝陽性対照（精製ヒトゲノムＤＮＡ）およびＭ＝ＤＮＡ分子量マーカー。
【００５６】
図９は、ＥＤＴＡで処理し、洗浄済みのＦＴＡジーンカード上に保存したいくつかの哺乳動物種由来の血液で実施した直接ＰＣＲを示す。反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔに含められる対照ユニバーサルプライマーおよび２０μｌの反応体積を用いて１ｍｍパンチから実施した。Ｍ＝ＤＮＡ分子量マーカー、（−）陰性対照および（＋）陽性対照（精製ヒトゲノムＤＮＡ）。
【００５７】
ｂ．ＦＴＡ試料収集カードに適用した生体試料からのゲノムＤＮＡ検出
ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＮＯＳ３ヌルマウス（１２９／Ｂ６バックグラウンド）由来のマウス組織を、ＦＴＡ試料収集カードに適用した。これらの固体支持体は、化学処理されたセルロース系の紙である。マウスを安楽死させ、解剖して器官（血液、心臓、脳、肺、肝臓、および腎臓）を採取した。器官を２枚の紙層の間に「挟んだ」。無菌ピペットを介して圧力を加えて、組織をセルロースマトリックスの各々に包埋した。組織ホモジネートのために、約５ｇの組織を１．５ｍｌマイクロチューブ中でプラスチック製ホモジナイザーを用いて処理した後、引き続いて紙マトリックスに適用した。適用後、全ての試料を２時間風乾させた後、密封したポーチの中で乾燥剤とともに貯蔵した。一部の例では、試料は処理の前に最大２カ月貯蔵された。
【００５８】
使い捨てのハリスマイクロパンチ（直径１．２ｍｍまたは３ｍｍ）を使用して、乾燥した組織試料をそれぞれ押し抜かれたディスクの形態でＦＴＡ紙カードから切除した。試料ディスクを乾燥した試料の中心から切除し、清潔なＤＮアーゼを含まない１．５ｍｌ微量遠心管に入れた。
【００５９】
ヌルまたは遺伝子ノックアウトＮＯＳ３マウスを、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）エキソン１０特異的フォワードプライマー、ｅＮＯＳ  Ｎｅｏ特異的フォワードプライマー、およびｅＮＯＳエキソン１２特異的リバースプライマーによるゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって同定した。
【００６０】
標的ＤＮＡのものを、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーを使用して、１０分の初期変性段階とその後の３６サイクルの９４℃で３５秒間、６５℃で１分間、および７２℃で１分間；とそれに続く７２℃で５分間の最終伸長段階によって増幅した。結果として得られるＰＣＲ産物を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎキャピラリー電気泳動システムを使用することによって可視化した。マウスＤＮＡの定量化は、マウス試料用のＰｒｉｍｅｒ  ＤｅｓｉｇｎゲノムＤＮＡ定量化キット（ｇＤＮＡ−ｍｏ−ｑ−ＤＤ）を製造業者の説明書に従って使用して実現した。個々の野生型（ＷＴ）およびＮＯＳヌル組織試料は、異なる紙カードに別々に適用した。紙マトリックス上に保存されたＤＮＡから遺伝子型変異体を区別する能力を例証するために、ある領域のＰＣＲ増幅をＷＴマウスおよびトランスジェニック（ＮＯＳ３ヌル、遺伝子ノックアウト）マウスで実行した。
【００６１】
図１０では、紙カード由来の組織から単離された増幅鋳型としてＤＮＡを使用する、ＮＯＳ遺伝子座に関連する、ＰＣＲアンプリコンが示される。レーン１〜５は、ＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６〜１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から増幅したＤＮＡである。
【００６２】
図１０−ＦＴＡ試料収集カードに適用された、ＷＴおよびＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウスから単離された組織に由来するＤＮＡ増幅産物。レーン１〜５は、ＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６〜１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から増幅したＤＮＡである。
【００６３】
図１０−ＦＴＡ試料収集カードに適用された、ＷＴおよびＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウスから単離された組織に由来するＤＮＡ増幅産物。レーン１〜５は、ＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６〜１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺、および腎臓）から増幅したＤＮＡである。
【００６４】
表３には、ＦＴＡ試料収集カード上に保存された組織から単離されたＤＮＡの増幅の成功が記録される。ＤＮＡは、１．２ｍｍパンチから単離された。「＋」は、アンプリコンの存在を示す。表４  ＷＴマウスとＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウスの両方に由来する産物をコードするゲノムＤＮＡのＤＮＡ増幅（ＮＤ＝未検および（＋）は、正確なサイズのＰＣＲ産物の存在を示す）。
【００６５】
【表３】
2018511803.tif 000005
【００６６】
ｃ．ＦＴＡ試料収集カードを使用する直接ＤＮＡ  ＳＴＲプロファイリング
実験を実行して、固体セルロース支持体マトリックス（「ＦＴＡ試料収集カード」；ＧＥヘルスケア、カタログコード：ＷＢ１２０２０５）に適用した１０６ヒト胚幹細胞（ＧＥヘルスケア；  細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ  ２８）から直接ＤＮＡを増幅した。直接増幅の手順は、生体試料を適用した試料収集カードから１．２ｍｍパンチを取ることを含む。このパンチをＳＴＲ増幅混合物に直接加える。この直接アプローチは、下流のワークフローの前にＦＴＡパンチに関連する化学製品を除去するための洗浄段階を必要としない。ここで、ＦＴＡカード上の血液スポットからのＤＮＡの直接増幅が行われた。直接ＳＴＲプロファイリングを、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍ（製品コードＤＣ８９０２、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて２８増幅サイクルを超えて二重の試料で行った。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍは、４色蛍光検出を利用し、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ６Ｓ１０４３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、アメロゲニン、ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＧＡ、Ｐｅｎｔａ  Ｄ、Ｐｅｎｔａ  Ｅ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸおよびｖＷＡを含む２１個の遺伝子座（２０個のＳＴＲ遺伝子座およびアメロゲニン）の共増幅を促進する。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍは、ホットスタート耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マスターミックスおよびプライマーを含む、ヒトゲノムＤＮＡの適切なＳＴＲ領域を増幅するために必要な全ての材料および試薬を提供する。このキットを使用して、ＦＴＡカードから押し抜いた直径１．２ｍｍの試料からＤＮＡを直接に増幅した。取扱説明書（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）に概説される手順に正確に従った。熱サイクリング条件は、９６℃１分間とそれに続いて２８サイクルの９４℃１０秒間、５９℃１分間および７２℃３０秒間であった。最後に、反応を６０℃に２０分間加熱した。
【００６７】
得られるＰＣＲ産物を、ＡＢＩ（商標）３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動システムを使用して分離し、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）ＩＤ  ｖ３．２ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で分析した。得られるＳＴＲプロファイルを調べ、標準およびピーク高さなどの品質測定基準と比較した。この調査により、先行する洗浄段階を経ずにＳＴＲ試薬ミックスに直接添加された、完全なＤＮＡ  ＳＴＲプロファイルがＦＴＡ紙から得られたことが実証された。
【００６８】
図１１は、ＦＴＡ試料収集カードに適用されたヒト胚幹細胞の直接ＳＴＲプロファイリングを示す。
【００６９】
４．特殊化された化学処理されたＲＮＡ安定化固体支持体
組織試料を、以前に記載されたような特殊化されたＲＮＡ安定化固体支持体紙カードに適用した。試料パンチを切除し、下に記載されるようにＧＥヘルスケアｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用してＲＮＡを単離した。ＲＮＡ定量化は、表Ｘに詳述されるような市販のｍＲＮＡ定量化キットを利用して、ＡＢＩ  ７９００  リアルタイムＰＣＲシステムで実施された。
【００７０】
ハリス３ｍｍ使い捨てマイクロパンチを使用して、パンチを乾燥した試料スポットの中心から切除し、清潔なＲＮアーゼを含まない１．５ｍｌ微量遠心管に入れた。ｉｌｌｕｓｔｒａ緩衝液ＲＡ１（３５０μｌ）を３．５μｌ  β−メルカプトエタノールと化合し、溶液をディスクに添加した。２０ゲージ針を用いてディスクをホモジナイズした。得られるホモジネートを、残留材料の後の除去のためにＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉフィルタカラムに移した。カラムを１分間１１，０００ｘｇで遠心し、ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉフィルタを廃棄した。均質化された溶解物はＲＮＡを含み、この濾液を新しいＲＮアーゼを含まない１．５ｍｌ微量遠心管に移した。
【００７１】
エタノール（７０％；３５０μｌ）を均質化された溶解物に添加し、２×５秒パルスでボルテックスすることにより混合した。各々の調製には、溶解物を２〜３回ピペット操作して、２ｍｌ微量遠心管に置かれたＲＮＡ  Ｍｉｎｉ−ｓｐｉｎカラムに適用した。この管を３０秒間８０００ｘｇで遠心し、フロースルーを廃棄した。ＲＮＡスピンカラムを新しい収集管に移した。ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭＤＢ緩衝液（３５０μｌ）を添加し、管を１１０００ｘｇで１分間遠心した。再度フロースルーを廃棄し、カラムを収集管に戻した。ＤＮアーゼ反応混合物を製造業者の説明書に従って調製し、ＲＮＡｓｐｉｎカラムの中に含まれるフィルタの表面に加えた。このＤＮアーゼインキュベーションを室温で１５分間実施した。洗浄緩衝液ＲＡ２（２００μｌ）をＲＮＡ  Ｍｉｎｉ−ｓｐｉｎカラムに適用し、カラムを１分間１１０００ｘｇで遠心した。再度フロースルーを廃棄し、カラムを収集管に戻した。緩衝液ＲＡ３  ６００μｌをＲＮＡ  Ｍｉｎｉ−ｓｐｉｎカラムに適用し、カラムを１分間１１０００ｘｇで遠心し、フロースルーを廃棄し、カラムを収集管に戻した。緩衝液ＲＡ３（２５０μｌ）による追加のカラム洗浄も実施した。膜を完全に乾燥させるために、カラムを２分間１１０００ｘｇで遠心し、カラムを最後にＲＮアーゼを含まない１．５ｍｌ微量遠心管に入れた。ＲＮアーゼフリー水（４０μｌ）をカラムに適用し、カラムを１１０００ｘｇで１分間遠心した。精製したＲＮＡは、すぐに下流のアプリケーションで使用するか、または使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００７２】
長期貯蔵後の複数の組織由来のＲＮＡの完全性を決定するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、紙カード上に貯蔵されたマウス組織試料から単離されたＲＮＡで実行した。これらは、乾燥剤の存在下で２カ月間貯蔵された。ｍＲＮＡ定量化は、製造業者の説明書に従って、ｉ）ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎげっ歯類ＧＡＰＤＨ対照キット（部品番号４３０８３１３）、ｉｉ）ネズミＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ、およびβアクチン遺伝子用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  リアルタイムＬＵＸ  ｍＲＮＡプライマーセット（それぞれ、カタログ１０５Ｍ−０２、１００Ｍ−０２、および１０１Ｍ−０２）またはｉｉｉ）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ製組織特異的遺伝子プライマーセット（詳細は表Ｘ参照）のいずれかを使用して達成した。
【００７３】
図１２は、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎげっ歯類ＧＡＰＤＨ対照キットを使用するいくつかの組織源由来のＧＡＤＰＨの相対発現レベルを示す。固体支持体カードに適用された試料から誘導したＲＮＡレベルは、マウスＲＮＡ標準試料からの定量化滴定曲線から生成された既知の値との比較によって決定された。匹敵するＧＡＰＤＨ  ＲＮＡレベルは、両方の紙の種類から単離されたＲＮＡから検出された。
【００７４】
ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ、およびβアクチンをコードするネズミｍＲＮＡの絶対的な定量化は、適切なＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎリアルタイムＬＵＸプライマーセットによって実行した。紙に適用された試料から誘導したＲＮＡレベルは、マウスＲＮＡ標準試料からの定量化滴定曲線から生成された既知の値との比較によって決定された。ＲＮＡの単離に関連するデータは、図Ｘに記載され、それが多数の組織種類由来のＲＮＡの貯蔵および安定化を支えることのできる材料であることを示す。
【００７５】
ＲＮＡ発現多重化分析は、逆転写酵素ＰＣＲ相補オリゴヌクレオチドプライマーおよび市販のＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのプローブならびに確立された方法および技法を用いて実施することができる。
【００７６】
図１２は、二重実験からの結果を表す、１つのグループになったカラムの対を示す。
【００７７】
５．ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ試料収集カードに適用した生体試料からのゲノムＤＮＡ分析の溶出
ａ．指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅに適用した生体試料から溶出したＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲ
全血および培養したＨｅＬａ細胞（濃度１×１０７／ｍｌ）を、指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードの上にスポットした。３ｍｍパンチをこれらのカードから取った（血液には２×３ｍｍのパンチおよびＨｅｌａ細胞には１×３ｍｍパンチ）。ＤＮＡを、ハイスループット溶出プロトコール（下記参照）に従って試料収集カードから溶出し、５μｌの溶出液を定量的ＰＣＲ  Ｒｎａｓｅ  Ｐ検出試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に製造業者の説明書に従って添加した。その上、１．２および３ｍｍのパンチも切除し、それらをＲｎａｓｅ  Ｐ検出試薬に添加する前に１ｍｌの溶出緩衝剤で最初に洗浄した。
【００７８】
指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅハイスループット溶出プロトコール−無菌の３ｍｍハリスパンチおよび無菌のカッティングマットを使用して、清潔な試料収集カードから押し抜いた２つの隣接するディスクを、９６ウェルＰＣＲプレートの１つのウェルに入れた（０．２ｍｌウェル、例えば、ＡＢｇｅｎｅで）。これらのディスクは、実験の間、陰性／紙だけの対照として使用される。血液スポットとスポットされない対照との間の相互汚染を防ぐため：各々の試料の種類に別々のパンチを使用した。異なる無菌の３ｍｍハリスパンチおよび無菌のカッティングマットを使用して、乾燥した血液スポットの中心から２つの隣接するディスクを押し抜き、９６ウェルＰＣＲプレートの１つのウェルに入れる。
【００７９】
ひとたび全てのディスクが押し抜かれ、９６ウェルプレートに移されれば、以下のような処理をする：
２００μｌの無菌の（室温）水を欠くウェルに添加し、プレートを密封し（例えば、Ｍｉｃｒｏａｍｐ光学接着剤フィルム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部品番号４３１１９７１で）、各回合計３秒で３回パルスボルテックスする（すなわち３×５秒、合計１５秒）。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心し、直ちに水を吸引し、廃棄する。ひとたび水が９６ウェルプレートの全ての試料から吸引されれば、６０μｌの滅菌水を各々のウェルに添加し、プレートをプレートシール（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ａフィルム（Ｂｉｏｒａｄ））で密封する。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心し、９８℃インキュベーションで３０分間加熱する。
【００８０】
３０分のインキュベーション段階の終わりに、プレートを熱から取り外し、最大の速度設定に設定されたボルテックスミキサーまたはプレートシェーカー（例えば、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｔｉｔｒａｍａｘ）を使用して、６０回（約１パルス／秒）パルスボルテックスする。プレートシールは、ウェル間の試料の汚染を防ぐために、これをする前にプレートにしっかりと取り付けられねばならない。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心する。ピペット（容量は６０μｌに設定）および無菌ピペットチップを使用して、溶出液を９６ウェルプレートのウェルから取り出し、別々の（空の）ウェルに移す。使用の準備ができるまで、溶出したＤＮＡを４℃で貯蔵する。
【００８１】
ＲＮＡａｓｅ  Ｐ特異的配列を、上記の手順を使用して指示ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅ試料収集カードに適用した生体試料から検出し、定量化した。そのために指示ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅに適用された試料が、直接ＰＣＲに基づく増幅ワークフローでの使用に従うことを示す（表４参照）。スポットされていないかまたは陰性対照のパンチは、ＲＮＡｓｅ特異的配列を生じなかった（データは示さず）。
【００８２】
【表４】
2018511803.tif 000006
【００８３】
表４は、指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅに適用した生体試料から溶出したヒトゲノムＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲの結果（ｒｅｓｉｌｔｓ）を示す。比較として、ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅ試料収集カードは、直接および洗浄済みパンチ・イン（ｐｕｎｃｈ−ｉｎ）プロトコールにも付した。
【００８４】
ｂ．ＨｅＬａ細胞由来のゲノムＤＮＡからヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８特異的ＤＮＡ配列を増幅させるために、Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ試薬（ＧＥヘルスケア）を指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅに適用されたＨｅｌａ細胞と組み合わせて使用する直接エンドポイント（Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）ＰＣＲ。培養したＨｅＬａ（１００μｌ）細胞を２．５×１０６／ｍｌの濃度で指示ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードにスポットした。１．２ｍｍパンチを、これらのカードから取り、２５μｌエンドポイントＰＣＲ反応に直接入れ、ＧＥＨＣ  ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＰｕｒｅＴａｑ  ＲｅａｄｙＴｏ  Ｇｏ（ＲＴＧ）ビーズを使用して増幅させた。ヒトｇＤＮＡを、対照鋳型として使用した。同じＰＣＲ成分を使用する液体フォーマットでこれを繰り返した。表６に詳細を記載する。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
フォワードおよびリバース配列は、ＨＰＶ型１８特異的であった。ＨＰＶ−１８ウイルスの存在は、図１３に示されるように３３４ｂｐのＰＣＲ産物の増幅によって示され、そこでは指示ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅと直接エンドポイントＰＣＲアプローチの組合せを使用する、ＨｅＬａ細胞に存在するＨＰＶ−１８特異的配列の増幅の成功が例示される。
【００８７】
実施形態を説明し図示してきたが、特許請求される本発明の範囲から逸脱することなく、それらの実施形態に追加、省略、および修正が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、試料コレクタ１０／１００は、試料収集のために４つの異なる区域を用いて説明され例示されているが、そのうちの３つは試料の貯蔵および保存を助けるための化学処理を有する。しかし、どんな診断または研究情報が必要であるかによって、それよりも多いかまたは少ない区域を使用することができることが理解される。上記の試料コレクタを形成するために使用される材料が好ましいが、その他の材料を良い効果で使用することもでき得る。「感染性材料」とは、本明細書において、任意の疾患を引き起こす微生物またはその他の病原体、例えば細菌、真菌、またはウイルスを意味する。
【符号の説明】
【００８８】
１０  生体試料コレクタ
１２  固体支持体、固体支持材料
２０  区域
２２  試料収容区域、第１の区域
２４  試料収容区域、第２の区域
２６  試料収容区域、第３の区域
２８  試料収容区域、第４の区域
３０  穿孔
１００  生体試料コレクタ
１１０  エンベロープ
１２０  カバー部分
１２２  折り目
１２４  フラップ
１３０  カード支持体
１３２  窓
１３４  折り目
１３６  下部リーフ
１３７  窓
１３８  上部リーフ、下部リーフ
１４０  感圧接着剤ストリップ、フラップ
２００  紫外光源
２４０  押抜き具
２５０  部分
３００  収容容器
３１０  試薬
５００  第３の試料コレクタ、生体試料コレクタ
５１０  感圧接着剤
５２０  カバー部分、エンベロープ、フラップ
５３０  エンベロープ
５４０  露出領域
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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