(57)【要約】  本発明は、キチン、加水分解物、及び昆虫から１つ以上の所望の産物を生産する方法に関する。より具体的には、本発明は、昆虫のクチクラを圧搾し、タンパク質溶解酵素を用いて当該昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程を含む、昆虫から１つ以上の所望の産物を生産する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンであって、アミノ酸含量が、乾燥体の全重量に対して４５重量％以下であり、灰含量が、乾燥体の全重量に対して３．５重量％以下であり、４５％以上の相違による純度（ｐｕｒｉｔｙ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を有する、キチン。
【請求項２】
加水分解物であって、乾燥体の全重量に対して４０重量％以上のタンパク質、乾燥体の全重量に対して１０重量％以下の灰、及び１２，４００ ｇ／ｍｏｌを上回る水溶性タンパク質含量が５０％未満である、加水分解物。
【請求項３】
昆虫から１つ以上の所望の産物を生産する方法であって、以下の工程：
（ｉ）昆虫のクチクラを挽き潰す工程；
（ｉｉ）当該昆虫のクチクラを圧搾する工程；及び
（ｉｉｉ）タンパク質溶解酵素で当該昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
を含む、方法。
【請求項４】
挽き潰し工程の前に昆虫を殺す工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
更に、酵素加水分解の前に酸化剤で昆虫クチクラを処理する工程を含む、請求項３又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記昆虫が、鞘翅目、鱗翅目、直翅目及び双翅目からなる群から選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、アミノペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼからなる群から選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記所望の産物が、キチン及び／又はキトサンである、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記所望の産物が加水分解物である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
昆虫クチクラからキトサンを生産する方法であって、以下の工程：
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）タンパク質溶解酵素で昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）キチンを回収する工程；
を含み、任意で当該クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る、方法。
【請求項１１】
請求項３〜８及び１０のいずれか１項に記載の方法により取得できるキチン。
【請求項１２】
昆虫から加水分解物を生産する方法であって、以下の工程：
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）タンパク質溶解酵素で昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）加水分解物を回収する工程；
を含み、任意で当該昆虫クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る、方法。
【請求項１３】
請求項３〜７、９及び１２のいずれか１項に記載の方法により取得できる加水分解物。
【請求項１４】
昆虫クチクラからキトサンを生産する方法であって、以下の工程：
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）プロテアーゼで昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）キチンを回収する工程；
ｆ）回収したキチンを脱アセチル化する工程；
ｇ）キトサンを回収する工程；
を含み、任意で当該昆虫クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫から１つ以上の所望の産物を生産する方法に関する。より具体的には、本発明は、昆虫のクチクラを酵素的に加水分解することにより、キチン及び／又はキトサンを生産する方法に関する。また、本発明は、特定のキチン及び加水分解物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、「キチン」は、あらゆる種類のキチン誘導体、即ち、Ｎ−アセチルグルコサミン単位及びＤ−グルコサミン単位を含むあらゆる種類の多糖類誘導体、特にキチン−ポリペプチドコポリマー（「キチン／ポリペプチド複合体」とも表記する）を意味する。
【０００３】
キチンは、生物界でセルロースに次いで多く合成されるポリマーであると言われている。実際に、キチンは、生物界で多くの生物種によって合成されており、それは、甲殻類及び昆虫の外骨格や、真菌を囲み保護する側壁の構成成分である。より具体的には、昆虫において、キチンは、外骨格の３〜６０％を占める。
【０００４】
「キトサン」は、本発明において、キチンの脱アセチル化産物を意味する。通常、キチンとキトサンとの間の境界は、アセチル化の程度であり、アセチル化が５０％未満のものがキトサンと呼ばれ、アセチル化が５０％を上回るものがキチンと呼ばれる。
【０００５】
キチン及び／又はキトサンは美容（美容組成物）、医療及び医薬（医薬組成物、火傷の治療、生体材料、角膜被覆材（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、縫合材料）、栄養学及び食品加工、技術（濾過、テクスチャー化（ｔｅｘｔｕｒｉｚｉｎｇ）、凝集又は吸着剤、特に水濾過及び浄化）等の様々な用途に用いられる。実際に、キチン及び／又はキトサンは、生体適合性で、生分解性で、非毒性の材料である。
【０００６】
伝統的に、キチンは、甲殻類、頭足類から、あるいはより例外的には真菌類から、化学的に抽出される。この化学ルートは、大量の試薬（例えば塩酸、水酸化ナトリウム及び漂白剤）を使用し、それらは、天然に存在する、例えば甲殻類の殻の中に存在するときのキチンの構造を変性する作用を有する。更に、そうした化学ルートの殆どは人類及び環境に有害で、処理を要する大量の廃液を生じる。最後に、甲殻類起源のキチン及び／又はキトサンは、敏感な人々においてアレルギー反応を生じ得る。
【０００７】
キチンを抽出する他のルートは、酵素ルートである。このルートはより穏和と見做され、故にキチン及び／又はキトサンをより良く保存することが出来る。しかしながら、このルートにより得られたキトサンは茶色を帯び、市販品質の白色の粉末を得る為に、精製工程を要する。従って、既存の方法は、酵素加水分解の前に実施される酸による脱ミネラル化の工程及び／又は酵素加水分解の後に実施される酸化剤によるキチンの漂白の工程等の、キチンから不純物を除去する１つ以上の工程を含む。これらのキチンの精製のための２つの工程は、残念ながら、キチンの化学構造を変化させる作用を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明者らは、加水分解、即ち昆虫クチクラを圧搾する工程の前に、化学処理工程を実施することにより、より純粋で、元の構造に近い構造を有する、キチンを得られることを実証した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、以下の工程：
（ｉ）昆虫クチクラを圧搾する工程、及び
（ｉｉ）タンパク質溶解酵素で昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程
を含む、昆虫から１つ以上の所望の産物を生産する方法に関する。
【００１０】
「所望の産物」は、より具体的にはキチン及び／又はキトサン及び／又は加水分解物を意味する。
【００１１】
「加水分解物」は、タンパク質の酵素加水分解により得られる、タンパク質、加水分解したタンパク質、ペプチド、アミノ酸及び／又はタンパク質に由来する他の化合物を含有する産物を示す。
【００１２】
所望の産物は、昆虫から得られる。「昆虫」は、成虫、蛹、又は幼虫等のあらゆる成長段階の昆虫を意味する。好ましくは、本発明の方法で用いる昆虫は食用である。
【００１３】
より具体的には、前記昆虫は、鞘翅目、双翅目、鱗翅目、等翅目、直翅目、膜翅目、ゴキブリ亜目（Ｂｌａｔｔｏｐｔｅｒａ）、半翅目、カメムシ目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ目及びシリアゲムシ目から、好ましくは鞘翅目、双翅目、直翅目及び鱗翅目からなる群から選択され得る。
【００１４】
好ましくは、前記昆虫は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ，  Ｈｅｒｍｅｔｉａ  ｉｌｌｕｃｅｎｓ，  Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ，  Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓ  ｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ，  Ｚｏｐｈｏｂａｓ  ｍｏｒｉｏ，  Ｂｌａｔｔｅｒａ  ｆｕｓｃａ，  Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ，  Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｏｒｕｓ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ，  Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ，  Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｍｅｇａｃｅｐｈａｌａ，  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ，  Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ，  Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ及びＳａｍｉａ  ｒｉｃｉｎｉからなる群から選択される。
【００１５】
より好ましくは、前記昆虫は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ，  Ｈｅｒｍｅｔｉａ  ｉｌｌｕｃｅｎｓ，  Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ，  Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓ  ｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ，  Ｚｏｐｈｏｂａｓ  ｍｏｒｉｏ，  Ｂｌａｔｔｅｒａ  ｆｕｓｃａ，  Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ，  Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｍｅｇａｃｅｐｈａｌａ，  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ，  Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ，  Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ及びＳａｍｉａ  ｒｉｃｉｎｉからなる群から選択され、なおもより好ましくはＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒである。
【００１６】
本発明の方法において、１つ以上の昆虫種が、好ましくは単一の昆虫種が使用され得る。複数の種が使用される場合、例えばＨｅｒｍｅｔｉａ  ｉｌｌｕｃｅｎｓ及びＭｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａのような、２つの近縁種を選択するのが有利である。
【００１７】
前記昆虫は自然採集したものよりも飼育したものが好ましい。例えば、前記昆虫は昆虫飼育場で飼育される。特定の飼育場で昆虫を繁殖することで、昆虫媒介感染症に関連するリスクを制限及び排除できるだけでなく、例えば殺虫剤のような昆虫由来の食品の毒性に関連するリスクを制限することも出来る。更に、飼育は、昆虫の供給の質をコントロールし、供給のコストを限定することも出来る。
【００１８】
「昆虫クチクラ」は、昆虫から分離されたクチクラだけでなく、昆虫全体を含む、昆虫の幾つか又は全ての他の昆虫の構成成分を含むクチクラも意味する。実際に、本発明の方法を、挽き潰した昆虫等の昆虫全体に、又は適切な方法によって自然に分離され回収された、昆虫の抜け殻及び／又は脱皮した皮のような、クチクラを含む昆虫の部分のみに、適用することも出来る。
【００１９】
クチクラは、昆虫の表皮により分泌される外側層（又は外骨格）である。一般に、クチクラは以下の３つの層により形成される：
−上表皮（ｅｐｉｃｕｔｉｃｌｅ）、クチクラの最外側の薄い層（４μｍ未満）；この層は水を透過せず、撥水性のワックスと、少量のタンパク質及びキチンを含有する；
−外表皮（ｅｘｏｃｕｔｉｃｌｅ）、クチクラの中間層；日焼け（ｔａｎｎｉｎｇ）により硬化した、クチクラの剛性を保つタンパク質、キチン及び任意でメラニンから本質的になる；
−内表皮（ｅｎｄｏｃｕｔｉｃｌｅ）、薄い柔軟な層で、タンパク質とキチンの混合物からなる。
【００２０】
昆虫クチクラの圧搾の主目的は、脂肪に富む搾り汁の除去及び／又は加水分解の基質を提供するための圧搾塊の圧縮である。
【００２１】
本発明の方法において、昆虫クチクラの圧搾で、油脂（又は脂質）含量が２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１２％以下、尚もより好ましくは１０％以下の圧搾塊を得られる。
【００２２】
本発明において、数値範囲は包括的であると理解されたい。更に、数字の前に「約」又は「のオーダー」が有る場合、これは、その数字の数値の±１０％の値を想定している。
【００２３】
同様に、圧搾塊を圧縮して加水分解の基質を生成するために、昆虫クチクラの圧搾は、乾燥物質の含量が３０〜６０％、好ましくは４０〜５５％、より好ましくは４５〜５０％の圧搾塊を得ることを可能とする。
【００２４】
任意の圧搾系が昆虫クチクラの圧搾を実施するのに使用でき、例えば単スクリュー又は双スクリュー圧搾（Ａｎｇｅｌ型の双スクリュー圧搾）、フィルター圧搾（Ｃｈｏｑｕｅｎｅｔ型のフィルター圧搾）、プラテン圧搾（ｐｌａｔｅｎ  ｐｒｅｓｓ）が用いられる。これらの系は、上記のオイル及び／又は水成分を取得するために圧搾条件を決定出来る当業者にとって周知である。
【００２５】
本発明の方法において、昆虫クチクラの圧搾の後に、酵素的加水分解を行う。
【００２６】
好ましくは、酵素的加水分解は、１つ以上のタンパク質溶解酵素、好ましくはプロテアーゼを用いて実施される。本発明において、「ペプチダーゼ」及び「プロテアーゼ」の語は、タンパク質のペプチド結合の溶解を起こす酵素を示すのに区別無く使用される。有利な場合、タンパク質加水分解は、４〜８時間、好ましくは４〜５時間、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃、そしてｐＨ６〜８、好ましくは６．５〜７．５で実施される。
【００２７】
酵素加水分解は、単一のプロテアーゼで、又は１つ以上のプロテアーゼを含む酵素の混合物で、より好ましくは、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの混合物、又はプロテアーゼ及びポリサッカラーの混合物等の、幾つかのプロテアーゼの混合物を用いて実施され得る。
【００２８】
好ましくは、プロテアーゼは、アミノペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼからなる群から選択される。
【００２９】
有利な場合、酵素は以下のものから選択され得る：
【表１】
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【００３０】
有利な場合、加水分解に用いる酵素は、Ｐｒｏｌｙｖｅ  ＮＰ等のアスパラギン酸エンドペプチダーゼである。この種類の酵素は、特にこの種類の酵素が鞘翅目、より好ましくはＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒから取得される圧搾塊の加水分解において利用される場合、取得されるキチンの純度の面で、非常に良好な結果を得ることを可能とする。
【００３１】
酵素又は酵素の混合物は、推定乾燥物の重量の０．２〜１０重量％、好ましくは０．４〜８重量％、より好ましくは０．５〜２％導入される。「推定乾燥物の重量」は、より具体的には昆虫又は昆虫の一部由来の乾燥物の重量を意味し、例えば酵素加水分解工程に入るときに推定される。
【００３２】
酵素活性の面で、導入される酵素又は酵素混合物の量は、含水量が３０〜７０％の変換される基質、即ち昆虫又は湿らせた昆虫部分の含水重量１００ｇあたり２０００〜５０００ＳＡＰＵ（「分光学的酸プロテアーゼ単位」、下記実施例５に記載される）、好ましくは３０００〜４０００ＳＡＰＵの活性に相当する。
【００３３】
有利な場合、酵素加水分解工程は、新鮮な水等の水の存在下で実施される。酵素加水分解において用いる水の量は、水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなるように決定される。常温常圧条件下で水の密度は１．０ｇ／ｍＬであるから、この比率は、水の重量と昆虫の重量の比率にも対応する。
【００３４】
本発明の方法は、純度（又は重量純度）が４０〜９０％、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、尚もより好ましくは８０％のオーダーであるキチンを取得することを可能とする（実施例２及び図２）。
【００３５】
更に、本発明の方法は、特に消化性、脂質及び／又はタンパク質の含量、タンパク質のサイズ又はアミノ酸組成の面で、幾つかの有利な特性を有する加水分解物を取得することを可能とする。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法は、圧搾工程の前に挽き潰し工程を含む。
【００３７】
従って本発明の特に好ましい態様は、昆虫から所望の１つ以上の産物を生産する方法に関し、以下の工程：
（ｉ）昆虫のクチクラを挽き潰す工程；
（ｉｉ）当該昆虫のクチクラを圧搾する工程；及び
（ｉｉｉ）タンパク質溶解酵素で当該昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
を含む。
【００３８】
この挽き潰し工程は、酵素的加水分解の間で酵素が基質に接触するのを促進するために、クチクラ及び／又は昆虫を粒子にするという目的を有する。この工程は、圧搾工程の前に行われる場合、搾り汁の除去及び固形物の単離を促進することを可能とする。
【００３９】
この挽き潰し工程は、圧搾塊と圧搾により生じた搾り汁との間で、昆虫由来の脂質の分離を改善することを可能とする。実際に、図４に示すように、挽き潰し及び圧搾の両方を含む方法で得られた圧搾塊は、圧搾のみを含む方法で得た圧搾塊と比較して、脂質含量が少ない。
【００４０】
より具体的には、本発明の方法において、昆虫クチクラの挽き潰し及び圧搾は、脂質（オイル）含量が１５％以下、好ましくは１２％以下、尚もより好ましくは１０％以下である圧搾塊を得ることを可能とする。
【００４１】
挽き潰しは、有利な場合、ナイフミルのようなミキサー−グラインダーを用いて実施され得る。
【００４２】
好ましくは、挽き潰しを終えた時点で昆虫の粒子のサイズは、１ｃｍ（顕微鏡を用いて観察できる最大の粒子サイズ）以下、好ましくは０．５ｃｍ以下、なおもより好ましくは３００μｍ〜０．５ｃｍ、好ましくは５００μｍ〜０．５ｃｍ、なおもより好ましくは５００μｍ〜１ｍｍである。
【００４３】
挽き潰しを促進するために所定の量の水が添加され得る。添加する水の量は、水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなるように決定される。
【００４４】
有利な場合、本発明の方法は、圧搾及び／又は挽き潰し工程の前に昆虫を殺す工程も含む。
【００４５】
この殺す工程は、冷血動物及び／又は小型の動物（甲殻類、魚類、貝類等）の養殖における公知の方法、例えば冷却（凍結）、加熱（熱湯処理）、酸素除去等により実施され得る。有利な場合、この昆虫を殺す工程は、熱湯処理により実施される。熱湯処理は、昆虫を殺すだけでなく、微生物の残留も低下させ（劣化のリスク及び健康リスクの減少）、自己溶解を引き起こし変色を引き起こす昆虫の内部酵素を不活性化もする。この熱湯処理は、動物の福祉を尊重するために、そして科学的推奨に従い、可能な限り迅速に昆虫が死ぬように実施される。
【００４６】
あるいは、昆虫はブランチング（ｂｌａｎｃｈｉｎｇ）によって殺されてもよい。ブランチングは、上記熱湯処理と同じ利点を有する。
【００４７】
有利な場合、昆虫は、例えば熱湯処理又はブランチングによって殺され、そして圧搾の前に挽き潰される。
【００４８】
好ましくは、熱湯処理工程は、水、例えば新鮮な水中、９５〜１０５℃で、好ましくは１００℃のオーダーで、２〜２０分間、好ましくは５〜１５分間実施される。
【００４９】
この熱湯処理工程で導入される水の量は、水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなるように決定される。
【００５０】
あるいは、ブランチング工程は、８０〜１３０℃、好ましくは９０〜１２０℃の温度の蒸気及び／又は水で実施される。
【００５１】
本発明の方法は、更に、酵素加水分解の前に酸化剤で昆虫クチクラを処理する工程を含み得る。
【００５２】
好ましくは、本発明の方法において、クチクラの処理に用いる酸化剤は、過酸化水素、過マンガン酸カリウム、オゾン及び次亜塩素酸ナトリウムからなる群から選択され、なおもより好ましくは、過酸化水素である。
【００５３】
有利な場合、酸化剤が過酸化水素である場合、昆虫クチクラの処理に導入するこの薬剤の量は、過酸化水素の含量が昆虫全重量に対し１〜３３重量％、好ましくは２〜１２重量％、好ましくは６重量％のオーダーとなる量である。
【００５４】
好ましくは、酸化剤による昆虫クチクラの処理は、水、例えば新鮮な水の存在下で実施される。有利な場合、当該クチクラの処理に用いる水の量は、水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなるように決定される。
【００５５】
酸化剤による昆虫クチクラの処理は、以下の１つ以上の工程の間に実施され得る。
−熱湯処理と同時及び／又は熱湯処理後、より好ましくは熱湯処理と同時。あるいはブランチングと同時及び／又はブランチング後、より好ましくはブランチングと同時。より好ましくは、熱湯処理又はブランチングの間に昆虫クチクラの処理が実施される場合、昆虫を熱湯処理するのに用いる水に酸化剤を添加するのが有利である。
−挽き潰しの前、同時及び／又は後。より好ましくは、挽き潰しの間に昆虫クチクラの処理が実施される場合、挽き潰しに用いる水に酸化剤を添加するのが有利である。
−圧搾の前及び／又は同時。
−昆虫クチクラの処理の特別な工程の間。
【００５６】
有利な場合、酵素加水分解に用いる酵素混合物又は酵素を不活性化するために、酵素加水分解の後に熱不活性化の工程が有ってもよい。
【００５７】
本発明の最後に、キチンは、酵素加水分解反応混合物の圧搾又は遠心分離によって回収され得る。この段階で、キチン副産物、即ち加水分解物も回収される。
【００５８】
本発明の好ましい態様は、下記でより詳細に記載される。
【００５９】
具体的には、この好ましい態様は、キチンの穏和な精製、第二の圧搾、洗浄操作、任意の濾過及び洗浄の工程等の、本発明の方法にとって有利な様々な工程を記載する。
【００６０】
最後に、キチンは一般に粉末の形態で市販されるため、第二の挽き潰しが実施されてもよい。後者は、キチンからキトサンを調製するための脱アセチル化反応を促進するために実施されてもよい。脱アセチル化反応の条件は、下記で詳細に記載される好ましい態様の工程１０により完全に記載される。
【００６１】
昆虫クチクラからキチンを生産する特に有利な方法は、以下の工程を含む。
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）タンパク質溶解酵素で昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）キチンを回収する工程；
任意で当該クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る。
【００６２】
工程ａ）〜ｅ）や酸化剤による処理の好ましい態様は、下記好ましい態様の対応する工程又は上記に示されている。
【００６３】
本発明は、キチン、例えば本発明の方法により取得されたキチンにも関する。本発明の方法で用いる穏和な条件のため、このキチンの構造は、昆虫クチクラ中で天然に存在するキチンに近い構造を有し、一方純度は高く、４０〜９０％、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、尚もより好ましくは８０％のオーダーになる。
【００６４】
本発明のキチンは、以下の有利な特徴を１つ以上有する。
−灰の含量が、乾燥物の全重量に対して４％未満、好ましくは３．５％未満、より好ましくは２．５％以下（特にキチンが草食昆虫から調製される場合）、より好ましくは２％未満、なおもより好ましくは１．５％以下（特にキチンがＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒから調製される場合）、なおもより好ましくは１％未満である。
−純度（又は重量純度）が４０〜９０％、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、なおもより好ましくは８０％のオーダーである。
−（Ｃ−Ｏ）／（Ｃ−Ｈ）比が０．３０〜０．５６、好ましくは０．３１〜０．５３である機能表面存在度（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）。
−乾燥物の全重量に基づく脂質の合計含量≦１４重量％。
−非飛翔性昆虫からキチンが調製される場合脂質含量≦５％。
−全アミノ酸≦４５％。
−キチンが飛翔性昆虫から調製される場合全アミノ酸≦１６％。
−Ａｌａ，  Ｇｌｙ，  Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ，  Ｓｅｒ，  Ｔｙｒ，  Ｖａｌのいずれか３つ以上のアミノ酸の相対存在度（−      ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ）≦１０％。
−キチンがＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒから調製される場合、Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ，  Ｖａｌの相対存在度≦１０％。
−キチンがＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒから調製される場合、Ａｌａの相対存在度≦１２％。
−比色純度≧４０％。
−キチンが酵素加水分解においてＰｒｏｌｙｖｅ  ＮＰを用いて調製される場合比色純度≧５０％。
−相違による純度（ｐｕｒｉｔｙ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）≧４５％、好ましくは≧４９％。
−キチンがＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒから調製される場合、相違による純度≧５２％。
−キチンが飛翔性昆虫から調製される場合、相違による純度≧７０％。
−アセチル化度≧７０％および結晶化度≦０．６１。
−アセチル化度≧７０％および結晶化度≦０．４２。
【００６５】
キチンは、アミノ酸を４５％以下、灰を３．５％以下、好ましくは２．５％以下含有し、そして相違による純度が４５％以上、好ましくは４９％以上である。
【００６６】
好ましくは、キチンは上記特性を全て有する。
【００６７】
上記の特徴を測定する全ての単位及び方法は実施例、より具体的には実施例５に記載されている。
【００６８】
昆虫から加水分解物を生産する特に有利な方法は、以下の工程を含む。
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）タンパク質溶解酵素で昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）加水分解物を回収する工程；
任意で当該クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る。
【００６９】
工程ａ）〜ｅ）や酸化剤処理等の様々な工程の好ましい態様は、下記好ましい態様における対応する工程又は上記に示されている。
【００７０】
本発明は、加水分解物、例えば本発明の方法により取得される加水分解物にも関する。
【００７１】
本発明の加水分解物は、以下の有利な特徴を１つ以上有する。
−灰の含量が、乾燥物の全重量に対して４％未満、好ましくは３％未満（特にキチンが草食昆虫から調製される場合）である。
−消化性、特にペプシン消化性に優れ、９５％を上回り、好ましくは９６％を上回り、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。ペプシン消化性は、Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ７２／１８８／ＥＥＣに規定の方法に従い測定される。
−タンパク質／ペプチド含量が、７０％以上、好ましくは７１％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上（特に加水分解物が非飛翔性昆虫から調製される場合）である。
−１２４００ｇ／ｍｏｌの水溶性タンパク質含量が、水溶性タンパク質の全重量に対して２０％未満、好ましくは１８％未満である。
−脂質含量が、１４％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％以下（特に加水分解物が非飛翔性昆虫から調製される場合）、より好ましくは２％以下、尚もより好ましくは１％以下である。
−最も豊富なアミノ酸が、プロリン、アラニン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン及び／又はバリンである。「最も豊富」とは、アミノ酸組成において、あるアミノ酸の相対量が、アミノ酸の全重量に対して５％超、好ましくは７％超であることを意味する。プロリンの含量が高いことは特に興味深い。
−Ａｓｐ，  Ｇｌｕ，  Ａｌａ，  Ｇｌｙ，  Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ，  Ｔｙｒ，  Ｖａｌ，  Ｌｙｓから選択される５つ以上のアミノ酸の相対存在量が≧６％である。
−Ａｓｐ，  Ｇｌｕ，  Ａｌａ，  Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ，  Ｔｙｒ，  Ｖａｌから選択される３つ以上のアミノ酸の相対存在量が≧８％である。
【００７２】
より具体的には、「水溶性タンパク質」は、タンパク質（又は粗タンパク質）の中で、ｐＨが６〜８、有利な場合７．２〜７．６の水溶液中に溶解し得るものを意味する。
【００７３】
好ましくは、水溶液はｐＨ６〜８、有利な場合７．２〜７．６の緩衝溶液である。
【００７４】
好ましくは、緩衝溶液は、ｐＨが７．４±０．２のリン酸緩衝ＮａＣｌ溶液である。
【００７５】
加水分解物は、４０％以上のタンパク質、１０％以下、好ましくは８％以下の灰を含有し、１２４００ｇ／ｍｏｌより大きい水溶性タンパク質量は５０％未満、好ましくは４３％未満である。
【００７６】
「草食性昆虫」は、通常の食物として動物性タンパク質を摂取しない昆虫を意味する。草食性昆虫の例として、鞘翅目、鱗翅目又は直翅目が想定され得る。
【００７７】
「飛翔性昆虫」は、成虫が飛翔できる昆虫を意味し、飛翔出来ない昆虫を「非飛翔性」と表現する。飛翔性昆虫の例として、鱗翅目又は双翅目が想定され得る。非飛翔性昆虫の例として、鞘翅目又は直翅目が想定され得る。
【００７８】
上記の特徴の単位及び測定方法は、実施例、特に実施例５に記載されている。
【００７９】
好ましくは、加水分解物は上記の特徴を全て有している。
【００８０】
本発明の加水分解物は、そのグルコサミン含量及び／又はその誘導体（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン）含量により、より具体的には、加水分解物の乾燥物の全重量に対して０．０１重量％以上、好ましくは０．０８重量％以上の含量により、他の種類の加水分解物と区別出来る。
【００８１】
本発明において、規制又は指令の参照は、本願の出願日に施行されていた当該規制又は指令に関係する。
【００８２】
加水分解物は、有利な場合、様々な種類の動物に適合するように、栄養プロフィールのバランスをとるための添加物が補給され得る。
【００８３】
加水分解物は、有利な場合、濃縮され、そして乾燥加水分解物を取得するために乾燥させられる。あるいは、加水分解物は、液体の形態であり得る。これらの加水分解物は、特に動物用の食品又は食品成分として使用でき、あるいは加工されて、例えばアミノ酸が単離され得る。
【００８４】
昆虫クチクラからキトサンを生産する特に有利な方法は、以下の工程を含む。
ａ）昆虫を殺す工程；
ｂ）昆虫を挽き潰す工程；
ｃ）昆虫を圧搾する工程；
ｄ）プロテアーゼで昆虫クチクラを酵素的に加水分解する工程；
ｅ）キチンを回収する工程；
ｆ）回収したキチンを脱アセチル化する工程；
ｇ）キトサンを回収する工程；
任意で当該昆虫クチクラが、工程ｄ）の前に酸化剤で処理され得る。
【００８５】
工程ａ）〜ｇ）及び酸化剤による処理の好ましい態様は、上記に、又は下記の好ましい態様における対応する工程に言及されている。
【００８６】
本発明は、本発明の方法により得られるキトサンにも関する。
【００８７】
本発明の方法により取得できるキチン及び／又はキトサンは、有利な場合、以下のような様々な用途に利用できる。
−美容、医薬、栄養又は食品組成物。
−火傷治療、第二の皮膚、角膜被覆材又は縫合材料等のための生体材料。
−濾過、テクスチャー化、凝集及び／又は吸着剤、特に水濾過及び浄化。
【００８８】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、図１に模式的に示す以下の工程を含む。幾つかの工程は好ましい態様において任意のものとして示される。
【００８９】
工程１：昆虫を殺す
この殺す工程１は、微生物の混入を減少（劣化のリスク及び健康リスクを減少する）しつつ昆虫を殺すことを可能とし、自己溶解及び急速な変色を引き起こす昆虫の内部酵素を不活性化することを可能とする。  
【００９０】
昆虫は熱湯処理を用いて殺され得る。
【００９１】
昆虫、好ましくは幼虫は、２〜２０分間、好ましくは５〜１５分間熱湯処理される。好ましくは、熱湯の温度は９５〜１０５℃、好ましくは１００℃である。
【００９２】
この熱湯処理工程１で導入される水の量は、水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなるように決定される。
【００９３】
あるいは、昆虫はブランチングにより殺され得る。好ましくは、昆虫は、温度８０〜１３０℃、好ましくは９０〜１２０℃、より好ましくは９５〜１０５℃、なおもより好ましくは９８℃の水蒸気（水蒸気ノズル又はベッド）で、又は温度９５〜１０５℃、好ましくは１００℃の熱湯（スプレーノズルにより）で、又は温度８０〜１３０℃、好ましくは９０〜１２０℃、より好ましくは９５〜１０５℃の混合モード（水＋水蒸気）でブランチングされる。ブランチングチャンバー中の滞留時間は、１〜１５分、好ましくは３〜７分である。
【００９４】
この工程において、下記中間工程で示される詳細に従い、酸化剤を含有する熱湯処理水又はブランチング水を用いて昆虫クチクラを処理することも可能である。
【００９５】
中間工程（任意）：酸化剤によるクチクラの処理
酸化剤によりクチクラを処理する特別な工程が、本発明の方法に組み込まれ得る。有利な場合、このクチクラ処理の中間工程は、殺す工程１及び挽き潰し工程２の間に実施される。
【００９６】
この中間工程は、好ましくは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、オゾン（Ｏ３）及び次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）からなる群から選択され、より好ましくは、過酸化水素である。
【００９７】
第一の態様において、工程１の後、熱湯処理により後者が実施されるとき、任意で熱湯を４０〜６０℃のオーダー、好ましくは５０℃のオーダーに冷却した後、熱湯処理タンク中に酸化剤が直接導入される。
【００９８】
市販の過酸化水素は、通常は水溶液の形態で、例えば水の全重量に対し３０重量％の溶液である。
【００９９】
処理のために導入される過酸化水素の量は、過酸化水素量が昆虫の全重量に対し１〜３３重量％、好ましくは２〜１２重量％、好ましくは６重量％のオーダーとなるように調整される。
【０１００】
第二の態様において、昆虫は、熱湯処理タンクから取り出され、篩にかけられ、そしてタンクに再び導入される。
【０１０１】
過酸化水素は希釈水溶液の形態でタンクに導入され、過酸化水素含量は、水の全重量に対し１〜３３重量％、好ましくは２〜１２重量％、好ましくは６重量％のオーダーとなるように調整される。
【０１０２】
工程２：挽き潰し
昆虫は熱湯処理又は処理タンクから、又はブランチングチャンバーから取り出され、それらは篩にかけられ、昆虫を粒子に粉砕できるナイフミルのようなグラインダー中に置かれる。
【０１０３】
挽き潰しを促進するため、所定の量の水が添加され得る。水の量は、工程１で導入される水の量と類似しており：水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなる。また、この工程を実施するために中間工程で生じた熱湯及び／又は水を保持することも可能である。この水は酸化剤を含有している可能性が有る。この場合、クチクラの処理は、熱湯処理工程１と挽き潰し工程２との間、又はクチクラの処理の中間工程の間、及び挽き潰し工程の間に行われる。
【０１０４】
好ましくは、挽き潰しの終了時、昆虫粒子のサイズは１ｃｍ（顕微鏡を用いて観察できる最大の粒子サイズ）未満、好ましくは０．５ｃｍ未満である。好ましくは、粒子サイズは５００μｍ〜０．５ｃｍ、なおもより好ましくは５００μｍ〜１ｍｍである。
【０１０５】
粒子のサイズを、２５０μｍ未満のように過剰に小さくする必要は無い。
【０１０６】
この挽き潰し工程２は、酵素が基質に達するのを促進する。
【０１０７】
この工程において、その前の中間工程で示されている方法に従い、クチクラを処理するために、挽き潰しミルちゅうに酸化剤を導入することも可能である。
【０１０８】
クチクラの処理を引き潰しと同時に実施しない場合、この工程の間に、製品の保存や安定性のために通常用いる抗酸化剤を添加することが可能である。
【０１０９】
工程３：昆虫クチクラの圧搾
挽き潰し工程２で得た湿ったペーストを、それを圧搾して脂肪フラクションとタンパク質フラクションを両方含有するジュースを分離できる手順に従い、圧搾機中に置く。
【０１１０】
好ましくは、圧搾工程は、オイル含量が２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１２％以下、尚もより好ましくは１０％以下である圧搾塊を得ることを可能とする。
【０１１１】
同様に、圧搾工程は、乾燥体の含量が３０〜６０％、好ましくは４０〜５５％、より好ましくは４５〜５０％の圧搾塊を得ることを可能とする。
【０１１２】
圧搾工程では、例えば単スクリュー又は双スクリュー圧搾（Ａｎｇｅｌ型の双スクリュー圧搾）、フィルター圧搾（Ｃｈｏｑｕｅｎｅｔ型のフィルター圧搾）、プラテン圧搾（ｐｌａｔｅｎ  ｐｒｅｓｓ）等の任意の圧搾系が用いられる。これらの系は、上記のオイル及び／又は水成分を取得するために圧搾条件を決定出来る当業者にとって周知である。
【０１１３】
挽き潰し工程２で得た湿ったペーストが酸化剤を含有する水を含有する場合、圧搾工程３の前にこの酸化剤の少なくとも一部を排除するのが有利であり得る。
【０１１４】
圧搾工程３は、任意で、熱湯処理した昆虫から出発した挽き潰し工程２の前に実施され得る。しかしながら、挽き潰し工程２の後に圧搾工程３を実施するのが有利である。
【０１１５】
この圧搾工程３は、圧搾汁及び圧搾塊を得ることを可能とする。
【０１１６】
工程４：酵素加水分解
挽き潰し工程２の湿ったペースト又は圧搾工程３の圧搾塊は、水を入れた加水分解タンクに入れられる。
【０１１７】
任意で、そして下記のように、分離工程１２のタンパク質フラクションは、圧搾塊と混合することにより、この酵素加水分解工程４に再導入され得る。
【０１１８】
任意で、そして熱湯が酸化剤を含まない場合、熱湯は回収され加水分解工程に再び導入され得る。実際に、この水は、熱湯処理の作用により可溶化した昆虫フラクションを含有しており、加水分解に後者を使用することにより、その損失を減少出来る。幾つかのワックスが溶存している場合があるので、任意で、熱湯処理の水は脱脂される。
【０１１９】
この酵素加水分解工程４に導入される水の量は熱湯処理工程１に導入される水の量と類似しており：水の体積（ｍＬ）と昆虫の重量（ｇ）の比率が好ましくは０．３〜１０、より好ましくは０．５〜５、なおもより好ましくは０．７〜３、なおもより好ましくは１のオーダーとなる。
【０１２０】
酵素加水分解は、例えば市販のプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いて実施され、４〜８時間、より好ましくは４〜５時間、ｐＨ６〜８、より好ましくは６．５〜７．５、温度４０〜６０℃、より好ましくは４５〜５５℃で行われる。
【０１２１】
加水分解工程で導入される酵素の量は、加水分解に供される乾燥物の推定全重量に対し１０重量％未満、好ましくは６％未満、より好ましくは２％のオーダーである。
【０１２２】
タンパク質溶解加水分解により、ペプチド、グルコサミン及びオリゴキチンを含有する可溶性相及びキチン、主にキチン−ポリペプチドコポリマーから形成される固形残留物がもたらされる。
【０１２３】
工程５：熱不活性化
前記反応の酵素の活性を停止し、加水分解の可溶性相を安定化するために、この汁を、８０〜１０５℃で、１０〜２５分、好ましくは１５〜２０分間加熱することにより、熱不活性化を行う。一つの手順において、この熱不活性化工程５は、農業食物産業の通常の滅菌技術に従い実施される。他の手順において、酵素不活性化は、ＩＲ下の加熱又はＵＶ照射により、又はマイクロ波加熱により実施される。
【０１２４】
工程６：圧搾
主にキチンからなる固形残留物は、回収され、そしてこの圧搾物を可溶相にもう一度注入するために、この残留物の最大限の脱水のための圧搾機中で圧搾する。そのように形成された圧搾された残留物は、主にキチン−ポリペプチドコポリマーの形態のキチンから本質的になる。
【０１２５】
工程７及び８（任意）：洗浄及び乾燥
固形残留物は、当業者に公知の既存の技術によって、洗浄され、濾過され、再び洗浄され、そして乾燥される。
【０１２６】
有利な場合、乾燥系は、キチン−ポリペプチドコポリマーの構造を保護するように設計され：比重測定法、通気及び空気の組成がコントロールされる。有利な場合、乾燥は、温度６０〜８０℃、好ましくは７０℃のオーダーの通気ストーブ中で実施され得る。
【０１２７】
任意で、これらの工程は、最後の脱脂工程を含み得：固形残留物をＨＣｌで処理して、最後の脂質残留物、特にクチクラワックスを除去する。
【０１２８】
次の工程９〜１１は、キチンをキトサンに変換するものであるから、所望の産物がキトサンである場合にのみ用いられる。
【０１２９】
工程９（任意）：挽き潰し
主にキチンを含有する乾燥させた固形残留物を、例えばカッティング（ナイフ）ミル中で挽き潰す。
【０１３０】
脱アセチル化反応によるキチンからのキトサンの生産は、キチン粒子のサイズに大幅に依存している。故に、脱アセチル化前の乾燥固形残留物を非常に細かく挽き潰すことは、下記表１に示すように、脱アセチル化の収率及び速度の増大を可能とする。
【表２】
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【０１３１】
表１に示した試験で実施された脱アセチル化の条件は、以下の通りである：反応時間４時間、１００℃、ＮａＯＨ水溶液３０ｖｏｌ％、キチン：ＮａＯＨ溶液の推定比率１：２０。
【０１３２】
その結果、固形残留物は、好ましくは、２００μｍ未満、好ましくは１６０μｍ未満の粒径まで挽き潰される。
【０１３３】
工程１０：脱アセチル化
固形残留物、任意で工程９で挽き潰された固形残留物は、濃水酸化ナトリウム溶液の入ったリアクター中に入れられ、４〜２４時間、好ましくは６〜１８時間反応させられる。３０〜４０％の水酸化ナトリウム水溶液は、挽き潰されたキチンの重量（ｇ）／水溶液中の水酸化ナトリウムの体積（ｍＬ）の比率が１：５０〜１：１０、好ましくは１：２０のオーダーとなるように添加される。タンクを加熱し、脱アセチル化温度は８０〜１５０℃、好ましくは９０〜１２０℃、より好ましくは１００℃とする。
【０１３４】
キトサンは粉末の形態で得られる。
【０１３５】
キトサンは、特にラジカルの付加（カルボキシル化、ヒドロキシル化等）による、官能基化を可能とする、当業者に公知の任意の操作に供され得る。
【０１３６】
工程１１（任意）：乾燥
キトサン粉末は、乾燥物顔料が８５％超、より好ましくは９０％超の粉末を得るために、３０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃、好ましくは約６０℃で乾燥させられる。
【０１３７】
次の工程は、脂肪フラクション及びタンパク質フラクションを圧搾工程３で得た汁から回収する工程であるので、そのような回収が望まれる場合にのみ用いられる。
【０１３８】
工程１２：分離
圧搾汁は、脂肪フラクション（昆虫オイル）とタンパク質フラクション（昆虫血リンパタンパク質）とを分離するために、１つ以上の分離工程に供され得る。これらの工程は、遠心分離、デカンティング、逆浸透による分離、超遠心、超臨界ＣＯ２、又はこれらの技術の幾つかの組み合わせ等の、当業者に周知の任意のオイル分離技術により実施され得る。
【０１３９】
脂肪フラクションの分離は、昆虫の中の非常に多様な組成のオイルの存在の観点から複雑で有り得、そして脂肪酸は、単鎖（Ｃ２〜Ｃ５）に加え非常に長い鎖（例えばワックスにおいて＞Ｃ２５）を有し得る。遠心分離中にこれらのオイルの融点（約３８℃）を越えて温度を上げると、このクリームを安定化出来、汁の残りからの脂肪フラクションの分離を促進出来る。そして、遠心分離物は、オイルとタンパク質の最良の可能な分離のために、所定の手順に従いデカンティング（デカンター又はＴｒｉｃａｎｔｅｒ型の）を受ける。
【０１４０】
これらの工程は、脂肪フラクションを取得することを可能とする。
【０１４１】
脂肪フラクションの取得後、タンパク質フラクションを、加水分解工程４の直前に、圧搾工程３で得た圧搾塊と混合し得る。実際に、圧搾工程３において、しばしば２０％を超えるタンパク質が汁の中に損失するので、このフラクションを回収して加水分解工程に供することは有益である。
【０１４２】
工程１３（任意）：濃縮
１つの手順において、濃縮は、水成分の真空蒸発により実施される。この濃縮物は、１０％超、好ましくは２０％超の乾燥抽出物を有する。この操作は乾燥を促進し、産物の保存及び安定性改善に通常用いる添加物が、この工程で添加され得る。
【０１４３】
工程１４（任意）：乾燥
前記濃縮物は、例えばスプレー／気化（「スプレー乾燥」）等の当業者に公知の技術により最後に乾燥され、これは、抽出物、即ちペプチド及びグルコサミン（特にＨ２Ｏ２（本質的に）によるキチンの部分的加水分解で得られる）に富む濃縮物の乾燥粉末の取得を可能とする。
【０１４４】
本発明の他の特徴及び利点は、例示を目的として示されるか下記実施例と、以下の各図面を参照して、明確になり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明の好ましい態様のフロー図である。
【図２】挽き潰し及び圧搾の１つ以上の予備的工程を含む酵素的方法により得られたキチンの純度を比較するグラフである。
【図３】キチンが抽出された中間体の異なるフラクション中で測定された脂質含量を比較する図である。
【図４】挽き潰し及び圧搾の予備的工程、又は圧搾の予備的工程を含む、酵素的方法により取得された圧搾汁及び圧搾塊の中の脂質の分配を示す。
【図５】それらのモル質量（％）で表されるタンパク質／ペプチドの本発明の加水分解物中及び圧搾汁中の分配を示す。
【図６】本発明の加水分解物を構成するアミノ酸の相対的分配を示すグラフである。
【図７】キチン中のアミノ酸の相対量を示すグラフである。
【図８】加水分解物中の灰含量に対する圧搾の効果（昆虫が異なる）。
【図９】加水分解物中の灰含量に対する圧搾の効果（酵素が異なる）。
【図１０】挽き潰し及び圧搾方法を用いた加水分解物中の灰含量（昆虫が異なる）。
【図１１】Ｐｒｏｌｙｖｅを用いて実施された加水分解において方法及び昆虫が異なる場合の大型タンパク質の相対存在量。
【図１２】Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒに適用された方法及び酵素が異なる場合の大型タンパク質の相対的存在量。
【図１３】加水分解物のタンパク質含量に対する圧搾の効果（酵素が異なる）。
【図１４】加水分解物のタンパク質含量に対する圧搾の効果（昆虫が異なる）。
【図１５】加水分解物の脂質含量に対する圧搾の効果（酵素が異なる）。
【図１６】加水分解物の脂質含量に対する圧搾の効果（昆虫が異なる）。
【図１７】取得された加水分解物のペプシン消化性（暫定）。
【図１８】ＴＭ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図１９】ＴＭ＋Ｓｕｍｉｚｙｍｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２０】ＴＭ＋Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２１】ＴＭ＋Ｎｅｕｔｒａｓｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２２】ＨＩ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２３】ＧＭ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２４】ＡＤ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図２５】キチン中の灰含量に対する圧搾の効果（酵素が異なる）。
【図２６】異なる昆虫由来のキチン中の灰含量。
【図２７】キチン中の脂質含量。
【図２８】キチン中のアミノ酸含量。
【図２９】ＴＭ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：キチン中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３０】ＴＭ＋Ｓｕｍｉｚｙｍｅ：キチン中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３１】ＴＭ＋Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：キチン中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３２】ＴＭ＋Ｎｅｕｔｒａｓｅ：キチン中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３３】ＨＩ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３４】ＧＭ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：  加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３５】ＴＭ＋Ｐｒｏｌｙｖｅ：  加水分解物中のアミノ酸の相対的存在量。
【図３６】Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒに適用された方法及び酵素が異なる場合のキチンの重量純度。
【図３７】Ｐｒｏｌｙｖｅを用いて方法及び昆虫が異なる場合のキチンの重量純度。
【図３８】Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒを用いて方法及び酵素が異なる場合の比色純度。
【図３９】Ｐｒｏｌｙｖｅを用いて方法及び昆虫が異なる場合のキチンの比色純度。
【図４０】キチンの相違による純度。
【図４１】Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒにおける方法により取得されたキチンのアセチル化度。
【図４２】Ｐｒｏｌｙｖｅを用いた方法により取得されたキチンのアセチル化度。
【図４３】二光子蛍光顕微鏡によるクチクラの画像。
【図４４】取得されたキチンの結晶化度。
【図４５】加水分解物中のタンパク質のサイズ。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：本発明の方法の例
ビーカーに６００ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた６００ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、６００ｍＬの水と混合した。そのように取得された液体を、以下の条件下で、Ａｎｇｅｌ型ツインスクリュープレスを用いて圧搾した。
−速度＝８２ｒｅｖ／ｍｉｎ；
−Ｗ（エネルギー）＝３ＨＰ（馬力）又は２．６８ｘ１０６Ｊ；
−間隙率（推定）＝第一部分０．５ｍｍ及び最終部分０．２ｍｍ。
【０１４７】
圧搾汁及び１３６．４９±４．４８ｇ（湿重量）の圧搾塊が取得され、そのが、次の工程に使用された。しかしながら、含水量及び／又は脂質含量において実質的に類似する圧搾塊の抽出及び取得が可能である限り、任意の他の圧搾手段も使用され得た。例えば、以下の特徴を有するＣｈｏｑｕｅｎｅｔ型フィルタープレスを用いた他の試験が実施された。
−セルの濾過表面積＝５０ｃｍ２；
−圧力＝２〜８ｂａｒ；
−温度＝２０〜８０℃；
−間隙率＝２５〜８０μｍ；
−濾過終端部の流速＝１００〜２５０ｍＬ／ｈ。
【０１４８】
圧搾塊は、プロテアーゼ（Ｐｒｏｌｙｖｅ  ＮＰ  ｃｏｎｃ）の１％（圧搾塊の湿重量に対し）溶液６００ｍＬを入れたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、全体をマグネチックスターラー下４５℃で４時間撹拌した（ｐＨはおよそ６．５）。そしてＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを９０℃のウォーターバスに１５分間漬けて、酵素を不活性化し、その溶液を、熱いまま０．４５〜０．５μｍで濾過した。このように取得したキチンを、７０℃で２４時間乾燥させた。そして、１６．９９±１．７７ｇのキチンが、この方法によって取得された。これらの条件下、加水分解物（加水分解後に得られた濾過物）は、乾燥物含量５．０５％の６０９．９８±１０．９ｇを示し、これは、凍結乾燥後、３０．８±０．５５ｇの乾燥加水分解物を取得出来る。
【０１４９】
実施例２：酵素加水分解前の機械的工程の取得されるキチンの純度に対する影響
挽き潰しのみ（挽き潰し１）、挽き潰し後に圧搾、挽き潰し後に圧搾及び第二の挽き潰し（挽き潰し２）、及び圧搾のみの、異なる種類の機械的前処理が試験された。
【０１５０】
圧搾において、実施例１に記載のＡｎｇｅｌ型が使用された。
【０１５１】
１．材料及び方法
挽き潰し１回のキチンの生産
ビーカーに２００ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた２００ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、２００ｍＬの水と混合した。そのように取得された液体を、プロテアーゼ（Ｐｒｏｌｙｖｅ）を２ｇ含有するＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、全体をマグネチックスターラー下４５℃で４時間撹拌した（ｐＨはおよそ６．５）。そしてＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを９０℃のウォーターバスに１５分間漬けて、酵素を不活性化し、その溶液を、熱いまま０．４５〜０．５μｍで濾過した。このように取得したキチンを、７０℃で２４時間乾燥させた。そして、８．１３±０．２７ｇのキチンが、この方法によって取得された。
【０１５２】
挽き潰し後圧搾のキチンの生産
ビーカーに２００ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた２００ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、２００ｍＬの水と混合した。そのように取得された液体を、ツインスクリュー型の圧搾機に通した。そうして得られた圧搾塊３０ｇを、１５０ｍＬの水及びプロテアーゼ（Ｐｒｏｌｙｖｅ）を０．３ｇ含有するＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、全体をマグネチックスターラー下４５℃で４時間撹拌した（ｐＨはおよそ６．５）。そしてＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを９０℃のウォーターバスに１５分間漬けて、酵素を不活性化し、その溶液を、熱いまま０．４５〜０．５μｍで濾過した。このように取得したキチンを、７０℃で２４時間乾燥させた。そして、４．７１±０．１１ｇのキチンが、この方法によって取得された。
【０１５３】
第一の挽き潰し（挽き潰し１）後圧搾及び第二の挽き潰し（挽き潰し２）のキチンの生産
ビーカーに２００ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた２００ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、２００ｍＬの水と混合した。そのように取得された液体を、ツインスクリュー型の圧搾機に通した。そうして得られた圧搾塊を、７０℃のオーブン中で２４時間乾燥させ、それを２５０μｍに挽き潰した。そうして得られた粉末１０ｇを、５０ｍＬの水及びプロテアーゼ（Ｐｒｏｌｙｖｅ）を０．１ｇ含有するＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、全体をマグネチックスターラー下４５℃で４時間撹拌した（ｐＨはおよそ６．５）。そしてＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを９０℃のウォーターバスに１５分間漬けて、酵素を不活性化し、その溶液を、熱いまま０．４５〜０．５μｍで濾過した。このように取得したキチンを、７０℃で２４時間乾燥させた。そして、４．９３±０．１２ｇのキチンが、この方法によって取得された。
【０１５４】
圧搾のみのキチンの生産
ビーカーに２００ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた２００ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、ツインスクリュー型の圧搾機に通した。そうして得られた圧搾塊９０ｇを、４５０ｍＬの水及びプロテアーゼ（Ｐｒｏｌｙｖｅ）を０．９ｇ含有するＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、全体をマグネチックスターラー下４５℃で４時間撹拌した（ｐＨはおよそ６．５）。そしてＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを９０℃のウォーターバスに１５分間漬けて、酵素を不活性化し、その溶液を、熱いまま０．４５〜０．５μｍで濾過した。このように取得したキチンを、７０℃で２４時間乾燥させた。そして、６．４８±０．２８ｇのキチンが、この方法によって取得された。
【０１５５】
化学的ルートによるキチンの生産
ビーカーに５０ｇのＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの幼虫を入れ、事前に沸騰させた５０ｍＬの水を入れた１００℃のウォーターバス中に置いた。５分後、ビーカーをウォーターバスから出し、幼虫を抜き取り、６０ｍＬの水と混合した。そうして得られた液体を、１−Ｌベセルに写し、５００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ溶液を添加した。全体をマグネチックスターラー下９０℃で１時間撹拌した。内容物を濾過し、固形残留物を５００ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を入れた１−Ｌボトルに移し、全体を９０℃で２４時間撹拌した。そして、０．９４４±０．００５ｇの化学的に純粋なキチンが取得された。
【０１５６】
純度の計算
キチンの純度は、取得された乾燥残留物と化学抽出で得たものとの重量を比較することにより決定され、最初の乾燥物の約５％である。
【０１５７】
脂質含量の測定
２ｇの試料をビーカーに入れ、そこに、０．２ｇのＮａ２ＳＯ４及び１５ｍＬのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２／１  ｖ／ｖ）を添加した。全体をマグネチックスターラーで２０分間撹拌し、溶液を濾過し、残留物を再び１０ ｍＬのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２／１ｖ／ｖ）が入ったビーカーに入れた。全体をマグネチックスターラーで１５分間撹拌し、溶液を濾過し、溶媒相を組み合わせ、定常重量になるまで蒸発させた。脂質含量は、試料の当初重量（２ｇ）に対する抽出−蒸発後の重量のパーセンテージとして決定した。
【０１５８】
１．結果
図２に示すように、本発明の方法は、取得されるキチンの純度に影響し、最小限の圧搾を行った場合に最良の結果が得られた。最良の結果は、挽き潰し後に圧搾した場合に得られ、即ち、キチンの純度は７８％であり、最も悪かったのが引き潰しのみの場合で、即ちキチンの純度は４８％であった。
【０１５９】
キチンが抽出された中間体をより詳細に解析したところ、脂質含量が低い場合、取得されるキチンの純度が高くなることが示された（図３）。「中間体」とは、酵素加水分解に供される、即ち、加水分解前の最後の工程、即ち、上記生産方法において、挽き潰し工程１若しくは２又は圧搾工程で生成される産物を意味する。
【０１６０】
キチン及び加水分解物の汁中に含まれる脂質の解析は、実際に、中間体中に存在する初期の脂質含量に応じて、キチン中の脂質含量は相対的に一定で７〜１５％であるのに対し、加水分解物中の脂質含量は、１１〜４７％に変動することを示す（図３）。
【０１６１】
より具体的には、中間体の脂質含量が３５％である場合：
−加水分解で得られるキチンの純度は５０％程度で、１０％の脂質を含有し得、そして
−加水分解物の脂質含量は、それ自体４０％近くになり得る。
【０１６２】
しかしながら、中間体の脂質含量が７％である場合：
−加水分解で得られるキチンの純度は８０％で、脂質含量は８％となり得、そして加水分解物も、１０％のオーダーの低い脂質含量を有し得る。
【０１６３】
これは、初期の脂質含量が高い、例えば１２％を上回っている場合、加水分解を引き起こす酵素がタンパク質の加水分解だけでなく、触媒機能の多様性（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）により脂質も加水分解していることを示唆する。従って、初期の脂質がそれぞれ３５及び７％であった場合、類似したキチン中の脂質含量が取得され、即ち８．６及び７．９％である。しかしながら、キチンの純度は、この場合、それぞれ４８から８４％を通過する。従って、一方で５２％の不純度、他方で１６％の不純度の内、平均で８％がこの脂質によるもので、尚もキチンに付着しているタンパク質の量は、従って、加水分解に供される中間体中により多くの脂質が存在していた場合、３８ポイント高い。
【０１６４】
最後に、圧搾の上流の挽き潰しの重要性も試験された（図４）。従って、圧搾塊と圧搾汁との間の脂質の分配は遥かに効果的であることが明確に見られ、予備的な挽き潰しが実施された場合１２．９：８７．１であり、圧搾のみの場合４２．７：５７．３であった。
【０１６５】
実施例３：加水分解物の解析
実施例１において取得した加水分解物に対して詳細な解析を行った。
【０１６６】
１．グルコサミン含量
加水分解物中のグルコサミン及び幾つかの他の糖の含量を、メタノリシス及びシリル化後のガスクロマトグラフィーによって解析した。
【０１６７】
手順：
試料１０ｍｇ及び内部標準５０μｇを、メタノール５００μＬ／３Ｎ塩酸混合物中に、１１０℃で４時間置いた（又は１３０℃で２４時間）。混合物をＡｇ２ＣＯ３で中和した。５０μＬの無水酢酸を添加して再アセチル化した。常温暗黒下で一昼夜置いた後、試料を遠心分離し（１５分３０００ｒｐｍ）、上澄を蒸発させた。化合物をピリジン１００μＬに溶かし、１００μＬのＢＳＴＦＡ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）と共に常温で一昼夜インキュベーションした。これを蒸発させ、残留物を７００μＬのＣＨ２Ｃｌ２中に取り、ＧＣ中に注入した。
【０１６８】
温度プログラム：１２０℃で１分間、１．５℃／分の勾配で１８０℃まで上げ、そして２℃／分で２００℃まで上げる。
検出：ＦＩＤ
カラム：ＨＰ−５ＭＳ（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）
内部標準：ｍｙｏ−イノシトール
【０１６９】
様々な成分が測定され、２つの異なる方法で計算された（表２）。加水分解物中のグルコサミン含量は０．１〜０．１５重量％で、グルコースとの比率が０．０４〜０．０５であることが見て取れる。
【表３】
2018502203.tif 000004
【０１７０】
１．タンパク質のサイズ
加水分解物中のタンパク質／ペプチドのサイズは、ＨＰＬＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ２０Ａ装置により、室温で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００  ＧＬカラム上で、アセトニトリル（ＡＣＮ）３０％、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％の緩衝剤中で、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで評価された。検出は２０５ｎｍで実施され、注入された試料の体積は２０μＬであった。
【０１７１】
更に、実施例１で調製された圧搾汁中のタンパク質／ペプチドのサイズも、比較のために同一の条件下で評価された。
【０１７２】
圧搾汁と加水分解物との間のタンパク質のサイズの比較（図５）は、加水分解物中に存在するペプチドのバルク、７６％は、分子量が１３０〜９００Ｄａであることを明確に示す。しかしながら、低消化性（分子量１３００Ｄａ超）のタンパク質の割合は、３１％から２％に減少する。同様に、分子量１３０Ｄａを下回るペプチドの割合も、３８％から１５％に減少する。従って、消化性及び食味の基準は、提案された酵素処理により改善する。
【０１７３】
１．消化性
加水分解物のペプシン消化性のレベルは、全タンパク質の９９．６％と見積もられている。これは外部機関により測定され、用いられた方法はＤｉｒｅｃｔｉｖｅ  ７２／１９９／ＥＥＣを順守し、脱脂せずに実施された。
【０１７４】
２．タンパク質含量
加水分解物中のタンパク質含量は、８４．８％と推定される。これは外部機関により測定され、相関係数６．２５でＫｊｅｌｄａｈｌ法により測定された。用いられた方法は、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９を順守している。
【０１７５】
３．脂質含量
加水分解物中の脂質含量は、０．７±０．５％と推定される。これは外部機関により測定され、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９  （ｍｅｔｈｏｄ  Ｂ）に適合する、いわゆる「加水分解」法により測定された。
【０１７６】
４．アミノ酸組成
様々な酵素で処理した後に得られた加水分解物のアミノ酸組成を解析した（図６）。これは、プロリンが優勢であり、ヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）（プロリンの代謝産物で幾つかの生物、例えば甲殻類中には存在しない）が存在することを示す。プロリン及びその代謝産物のヒドロキシプロリンは、特にアルギニン及びグルタミン酸等の他のアミノ酸の合成を促すことにより代謝に本質的な役割を果たす。大半の哺乳類はプロリンを合成できるが、新生児、鳥類及び魚類によるこのアミノ酸の生産は不十分であるため、プロリン及びヒドロキシプロリンの供給は、幾つかの動物の成長を促進するのに用いられる場合がある。更に、プロリンは哺乳類の乳中に含まれる第一のアミノ酸であり１２％の含量で存在するが、植物タンパク質中の含量は遥かに低く、大豆では２．９％、トウモロコシでは０．８％程度である。従って、この加水分解物は、乳と同等かつ植物タンパク質中に見られるよりも遥かに多いプロリン含量を有することが見出された。
【０１７７】
優勢に存在する他のアミノ酸は、アラニン、ロイシン及びグルタミン酸（グルタミンと共に）である。それらの相対量は９％超である。しかしながら、システイン及びメチオニン等の硫黄含有アミノ酸の量は少なく、０．５％のオーダーである。
【０１７８】
これらの結果を決定するのに用いた方法（酸加水分解）では、トリプトファン及びアルギニン等のアミノ酸を検出することは出来なかった。更に、アスパラギンはアスパラギン酸に完全に転換し、グルタミンはグルタミン酸に転換したため、Ａｓｐ及びＧｌｕピークとして観察されるものは、実際は、それぞれアスパラギン酸とアスパラギンの合計、及びグルタミン酸とグルタミンの合計である。
【０１７９】
実施例４：キチンの解析
詳細なアミノ酸解析が、実施例１で取得したキチンに対して実施された。
【０１８０】
アミノ酸の全含量は、コポリマー１００ｇあたり３２．３ｇである（アミノ酸の合計として決定した）。存在するアミノ酸は、主にバリン、グリシン、アラニン及びチロシンである（図７）。
【０１８１】
解析は下請けで行われ、結果は、トリプトファンにおいてはＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  １３９０４法により、他のアミノ酸においてはＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  １３９０３法により取得された。
【０１８２】
実施例５：使用された製造方法に従う加水分解物及びキチンの同定
Ｉ．材料及び方法
ａ）材料
昆虫
様々な昆虫が試験された：
−鞘翅目：Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  （Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒ又はＴＭ）
−鱗翅目：Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ  （Ｇ．  ｍｅｌｏｎｅｌｌａ又はＧＭ）
−双翅目：Ｈｅｒｍｅｔｉａ  ｉｌｌｕｃｅｎｓ  （Ｈ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓ又はＨＩ）
−直翅目：Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ  （Ａ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ又はＡＤ）
【０１８３】
酵素
加水分解工程において様々な酵素が使用された。
【０１８４】
この酵素活性の測定は、タンパク質溶解酵素によるカゼインの加水分解の間の２７５ｎｍでのチロシン放出の測定の原理に基づく（Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡＰＵ  Ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ，  ｂｙ  Ｋａｒｅｎ  ＰＲＡＴＴ）。
【化１】
2018502203.tif 000005
ＳＡＰＵ／ｇ  ＝プロテアーゼの１つの分光光度単位
ΔＡ＝相関吸光度（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）
ｉ＝原点でのｙ−軸
１１＝最終反応体積
Ｍ＝校正曲線の傾き
３０＝反応時間（分）
Ｃ＝添加した酵素溶液中の酵素の濃度（ｇ／ｍＬ）
１＝添加した酵素溶液の体積（ｍＬ）
【０１８５】
校正曲線は、リン酸緩衝剤（０．２Ｍ、ｐＨ７）中の様々な濃度のチロシン溶液の吸光度を測定することにより得られる。
【０１８６】
５ｍＬのカゼイン溶液（０．７％ｗ／ｖ、リン酸緩衝剤０．２Ｍ、ｐＨ７、９０℃で３０分間加熱し３．７５ｇ／Ｌｓｏｌｕｔｉｏｎ添加）を１ｍＬの試験する酵素溶液（１００ｍＬのグリシン緩衝剤０．０５Ｍ中に０．１５ｇ）と共に３７℃で３０分間インキュベーションした。そして５ｍＬのＴＣＡ溶液（１８ｇＴＣＡ、１１．３５ｇの無水酢酸ナトリウム２１ｍＬの氷酢酸、脱塩水で１リットルの溶液を作製した）を添加し、ボルテックスで混合し、濾過し、２７５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１８７】
対照は同様に調製されたが、酵素を添加せず、代わりに１ｍＬの脱塩水を添加して反応体積を揃えた。
【０１８８】
使用した様々な酵素（Ｐｒｏｌｙｖｅ  ＮＰ，  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ３７０７１，  Ｎｅｕｔｒａｓｅ及びＳｕｍｉｚｙｍｅ）において測定した活性を、表３に列挙する。
【表４】
2018502203.tif 000006
表３．使用した酵素の活性及び酵素量の対応
【０１８９】
ｂ）製造方法
挽き潰しのみの製造方法（図面では「挽き潰し」と表記される）
６００ｇの新鮮な昆虫（Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒ，  Ｇ．  ｍｅｌｏｎｅｌｌａ又はＨ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合は幼虫；Ａ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの場合はコオロギ）をチャンバーに入れ、それらを蒸気で殺した（１１５℃、５分間）。昆虫を混合器中に入れ、昆虫１００ｇに対し７５ｍＬの水を入れ、全体を混合した。そうして得られた産物１００ｇ（湿重量）を濃縮器を繋げたメカニカルスターラーを有する三つ首フラスコに入れ、活性が３７８９ＳＡＰＵのタンパク質溶解酵素を添加した。４５℃で４時間反応させた。１５分間温度を９５℃に上げ、反応混合物を最後に濾過した（０．４０〜０．４５μｍ）。残留物を７０℃で２４時間乾燥させたものを酵素的精製経路により取得されたキチンとし、濾過物を凍結及び凍結乾燥させたものを加水分解物とした。
【０１９０】
この方法は、いずれの昆虫又は酵素を試験する場合であっても同じである。
【０１９１】
挽き潰しの後圧搾する製造方法（図面では「挽き潰し＋圧搾」と表記される）
６００ｇの新鮮な昆虫（Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒ，  Ｇ．  ｍｅｌｏｎｅｌｌａ又はＨ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合は幼虫；Ａ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの場合はコオロギ）をチャンバーに入れ、それらを蒸気で殺した（１１５℃、５分間）。昆虫を混合器中に入れ、昆虫１００ｇに対し７５ｍＬの水を入れ、全体を混合し、圧搾した（ツインスクリュープレス又はフィルタープレス、又は他の圧搾系）。そうして得られた産物１００ｇ（湿重量）を濃縮器を繋げたマグネチックスターラーを有する三つ首フラスコに入れ、５００ｍＬの水を入れ、活性が３７８９ＳＡＰＵのタンパク質溶解酵素を添加した。４５℃で４時間反応させた。１５分間温度を９０℃に上げ、反応混合物を最後に濾過した（０．４０〜０．４５μｍ）。残留物を７０℃で２４時間乾燥させたものを酵素的精製経路により取得されたキチンとし、濾過物を凍結及び凍結乾燥させたものを加水分解物とした。
【０１９２】
この方法は、いずれの昆虫又は酵素を試験する場合であっても同じである。
【０１９３】
ｃ）解析
灰含量の測定
灰含量は、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９  ｄａｔｅｄ  ２７−０１−２００９に基づく方法により決定された。
【０１９４】
タンパク質のサイズの測定
１００ｍｇの試料を１０ｍＬのリン酸／ＮａＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．４、０．１３７ｍＭ）中に導入した。試料を１分間撹拌し（ボルテックス）、１分間９００Ｇで遠心分離し、そして０．４５μｍメンブレンで濾過した。解析は、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｌ  ＧＦＣ−３００カラムを備えた立体排除クロマトグラフィー系で実施され、使用された溶離液はリン酸／ＮａＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．４、０．１３７ｍＭ）であり、流速は１．０ｍＬ／分であり、２８０ｎｍでＵＢ検出器により検出された。
【０１９５】
タンパク質含量の測定
タンパク質含量はＤｕｍａｓ法により取得され、変換係数は６．２５であり、標準的なＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  １６６３４−１に基づく。
【０１９６】
脂質含量の測定
脂質含量は、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９  -  ｍｅｔｈｏｄ  Ｂ  -  ＳＮに基づく方法により取得される。
【０１９７】
ペプシン消化性
ペプシン消化性は、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ７２／１９９／ＥＣに記載の方法により測定される。
【０１９８】
アミノ酸の相対存在量
アミノ酸の存在量は、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９  ｄａｔｅｄ  ２７−０１−２００９  -  ＳＮに由来する方法により決定された。トリプトファン含量は、ＥＣ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １５２／２００９  ｄａｔｅｄ  ２７−０１−２００９  -  ＳＮに基づく方法により別個に決定された。相対存在量は、アミノ酸含量と各アミノ酸の含量とを関連付けることにより計算された。
【０１９９】
アミノ酸含量
アミノ酸含量は、トリプトファンを含む各アミノ酸において取得された各数値を合計して決定された。
【０２００】
重量純度
重量純度は、取得された乾燥残留物と化学抽出により得られたものとの間で重量を比較することにより決定され、後者は、最初の乾燥物の約５％と評価される。
【０２０１】
比色純度
試料の色は、赤、緑及び青（ＲＧＢ）の三色に従いＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて画像を解析することにより推定され、それらの平均は、実際の色の評価を表す。Ｃｈｉｔｉｎｅ  Ｆｒａｎｃｅが販売するエビキチンを標準とし（純度１００％）、生産された試料の比色純度は、この色のパーセンテージとして計算された（試料の色と標準の色との間の比率）。
【０２０２】
相違による純度
この測定のために、既知の不純物（アミノ酸、脂質及び灰）の量を絶対純度（１００％）の値から差し引いて、相違により推定された純度の値を取得した；即ち、タンパク質を３０％、脂質を１０％及び灰を１％含有する試料の純度は、１００−３０−１０−１＝５９％となる。
【０２０３】
結晶化度
測定は、Ｌｙｎｘｅｙｅ  ＸＥ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ装置（Ａ２５  ＤａＶｉｎｃｉ  ｄｅｓｉｇｎ）を用いてＷＡＸＳ（広角Ｘ−線散乱）技術に従い実施された。結果は、Ｌｏｅｌｏｖｉｃｈ，  Ｍ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．：  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１４，  ３，  ７−１４に記載の方法により解釈された。
【０２０４】
アセチル化度
この測定は、８００ＭＨｚ磁石を備えた１３Ｃ  ＮＭＲ  ＣＰ／ＭＡＳ  （Ｂｒｕｋｅｒ）装置を使用して実施された。
【０２０５】
結果は、Ｓｉｍｉｏｎａｔｔｏ  Ｇｕｉｎｅｓｉ，  Ｌ．；  Ｇｏｍｅｓ  Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，  Ｅ．  Ｔ．  Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００６，  ４４４，  １２８−１３３  ａｎｄ  Ｈｅｕｘ，  Ｌ．；  Ｂｒｕｇｎｅｒｏｔｔｏ，  Ｊ．；  Ｄｅｓｂｒｉｅｒｅｓ，  Ｊ．；  Ｖｅｒｓａｌｉ，  Ｍ．−Ｆ．；  Ｒｉｎａｕｄｏ，  Ｍ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０００，  １，  ７４６−７５１に記載の方法により解析された。
【０２０６】
原子及び機能表面吸光度の測定
これらの測定は、ＲＸ  Ｋａ  Ａ１光源（１４８６．６  ｅＶ）、モノクロメーター及び磁性レンズを備えたＸＰＳ  Ｅｓｃｏｌａｂ  ２５０  （ＶＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）装置を使用して実施された。
【０２０７】
事前に粉末にされた試料を４８〜７２時間真空下においてから解析した。
【０２０８】
二光子蛍光顕微鏡によるクチクラの画像化
ＤＩＳＣＯ装置（Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｓｏｌｅｉｌ）上での多光子顕微鏡。
【０２０９】
Ｌａｍｂｄａ  ｅｘｃ＝８１０  ｎｍ，  パワー１８％，  ターコイズブルー及びオーカーフィルター４０６／１５  （ＳＨＧ），  青色フィルター４６０／６０，  緑色フィルター５５０／８８。
【０２１０】
ＩＩ．加水分解物
ａ）灰
圧搾は、いずれの昆虫を試験した場合であっても、取得される加水分解物中の灰含量に顕著な影響を有する（図８）。実際に、灰含量の減少は５２％に達し、比例する減少は、昆虫が本来ミネラルに富むか否かに拘らず殆ど類似している。従って、Ｈ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合、灰含量の変化は、挽き潰しを有する方法を用いた場合の７．５ｇ／乾燥重量１００ｇから圧搾工程と加えた場合の３．８ｇ／乾燥重量１００ｇに４９％減少し、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒの場合、その変化は５ｇ／乾燥重量１００ｇから２．４ｇ／乾燥重量１００ｇに５２％減少する。
【０２１１】
圧搾は、いずれの酵素を試験した場合であっても、取得される加水分解物中の灰含量に顕著な影響を有する（図９）。具体的には、酵素の種類に拘らず、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒの場合、加水分解物中の灰含量は、圧搾を有する方法を用いた場合３％未満である。
【０２１２】
加水分解物中の灰含量（挽き潰し＋圧搾方法）は、いずれの昆虫を使用した場合であっても、４ｇ／乾燥重量１００ｇ未満である（図１０）。
【０２１３】
ｂ）加水分解物中のタンパク質のサイズ
圧搾工程の使用は、明らかに、いずれの昆虫（図１１）又は酵素（図１２）を使用した場合であっても、タンパク質溶解酵素の性能を改善できる。従って、大型のタンパク質の相対存在量は、挽き潰し工程のみ含む方法と比較して顕著に落ち、昆虫種に拘らず、Ｐｒｏｌｙｖｅを用いて加水分解を実施した場合、最終的な加水分解物は、大型タンパク質を最大でも１０．３％しか含有しておらず；使用する酵素に拘らず、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒの加水分解の場合１７．５％以下である。
【０２１４】
ｃ）タンパク質含有量
加水分解物のタンパク質含有量は、使用する方法に高度に依存している。従って、挽き潰しを単独で適用する場合、使用する酵素に拘らず、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒから取得した場合、加水分解物の乾燥物に対してタンパク質含量は５３．５９±１．５％にしかならない（図１３）。しかしながら、挽き潰しの後に圧搾をする場合、加水分解物中のタンパク質含量は８４．５８±１．４％になり、使用する酵素によっては５３−６２％増大する。
【０２１５】
この増大は、昆虫が最初にタンパク質に乏しい場合により大きくなり、Ｇ．  ｍｅｌｏｎｅｌｌａの場合、タンパク質含量は４１．２５％から７１％に変化し、８６％近い増大を示し、そしてＨ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合、それは３４．２％から７４．５％に変化し、その増大は１１８％にもなる（図１４）。
【０２１６】
ｄ）脂質含有量
圧搾は、試験する酵素（図１５）又は昆虫（図１６）に拘らず、加水分解物中の脂質含有量に相当な影響を有する。実際に、脂質含有量の減少は５１．４から９７．７％と劇的であり、Ｈ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合、２８．６から１３．９％（５１．４％減少）、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒにＮｏｖｏｚｙｍｅを用いた場合、３３．８５から０．９％に減少する（９７．３％減少）。
【０２１７】
ｅ）ペプシン消化性
そのように取得された加水分解物のペプシン消化性は非常に高く、試験された酵素又は昆虫に拘らず、９６％超であった（図１７）。
【０２１８】
ｆ）アミノ酸吸光度
圧搾工程の使用は、試験された昆虫又は酵素に拘らず、アラニン及びチロシン並びにより少ない程度にバリン、セリン及びグリシン等のクチクラ中に存在する他のアミノ酸のより良好な抽出を得ることを可能とする（図１８〜２４）。これらの結果は、酵素的に精製されたキチン中に存在するアミノ酸に対するものとも比較されるべきである（図２９〜３５）。
【０２１９】
補足：特にアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む幾つかのアミノ酸の相対的存在量は減少するが、それらの量は同じ又は特定のケースでは僅かに増大しさえする。圧搾工程を有する方法により抽出されるアミノ酸の合計量が増大するからである（加水分解物中のタンパク質含量を参照）。
【０２２０】
ＩＩＩ．キチン
ａ）灰
加水分解物の場合よりも僅かであるが、キチン中の灰含量も、圧搾工程によって影響を受ける。従って、使用される酵素に応じて２５％〜２８．６％の減少が観察される（図２５）。
【０２２１】
キチン中の灰含量（挽き潰し＋圧搾法により取得した）は、試験した昆虫に拘らず（図２６）極めて低い。従って、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒの場合、最大の灰含量は１０．５ｇ／乾燥物１００ｇで、本来ミネラルに富む昆虫であっても、３．５ｇ／乾燥物１００ｇ未満程度である。
【０２２２】
ｂ）キチン中の脂質含量
加水分解物の場合よりも僅かだが、キチン中の脂質含量も、圧搾工程が加わる方法の場合に減少する（図２）。その効果は本質的に酵素に依存し、Ｓｕｍｉｚｙｍｅでの１５％からＮｏｖｏｚｙｍｅでは６０％にも達する。昆虫に拘らず、Ｐｒｏｌｙｖｅを用いて反応が実施された場合、この現象はＨ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓにおける５０％からＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒにおける５８％の間に位置する。
【０２２３】
全ての昆虫において、脂質含量は１２％未満であり、非飛翔性昆虫において６％以下である。
【０２２４】
ｃ）キチン中のアミノ酸の含有量及び相対存在量
圧搾工程は、キチンに結合したタンパク質の大部分を排除できる。タンパク質含有量の直接の測定はキチンの実際の構造中に存在するアミド官能基により困難であるため、このタンパク質含量は、アミノ酸の合計によって推定された（図２８）。従って、試験された酵素又は昆虫に拘らず、圧搾工程が加えられた場合、アミノ酸の合計は５〜５４％減少していることが見られる。
【０２２５】
アミノ酸の相対的存在量は圧搾工程により殆ど影響を受けないが、アラニンを含む幾つかのアミノ酸は、圧搾工程が実施された場合に良く抽出されるように見える（図２９〜３５）。しかしながら、全ての昆虫において、アラニン、チロシン及びプロリン、並びに僅かだがバリン、グリシン、ロイシン及びセリンは、キチンに主に結合しているアミノ酸であり、それらの含量は全てのアミノ酸に対して平均２３〜４０％であり、これらのアミノ酸の間でも、圧搾工程が方法に加えられた場合、キチンにおいて最大の減少が見られ、加水分解物において最大の増大（最大７〜３０％に達する）が見られる（図１８〜２４）。
【０２２６】
ｄ）重量純度
試験された酵素（図３６）又は昆虫（図３７）に拘らず、圧搾工程の使用により重量純度は改善する。従って、Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒにＰｒｏｌｙｖｅを用いる場合それは４８．７％から７７．１％に、Ｈ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓにＰｒｏｌｙｖｅを用いる場合３３．７％から８７．９％に変化する。
【０２２７】
ｅ）比色純度
重量純度ほど顕著ではないが、試験された昆虫又は酵素に拘らず（図３８及び３９）、本方法の部分を構成する場合、比色純度の改善も観察される。
【０２２８】
ｆ）相違による純度
圧搾を有する方法で得られたキチン中の脂質、灰及びアミノ酸含量の減少により、このキチンにおける相違による純度は、試験された昆虫又は酵素に拘らず顕著に増大し、Ｈ．  ｉｌｌｕｃｅｎｓの場合１３％、Ｐｒｏｌｙｖｅを用いるＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒの場合７４％に達する（図４０）。
【０２２９】
ｇ）キチンのアセチル化度
アセチル化度は、圧搾工程が本方法に加えられることにより顕著に影響を受ける（図４１及び４２）。実際に、血リンパから脂質及びアミノ酸を除去することは、酵素に対し、キチンに結合するタンパク質のペプチド結合の開裂の改善をもたらすキチンの表面に対する酵素のアクセス性を改善するが、触媒機能の多様性を通じて、キチンのアミド結合の開裂ももたらす。従って、本方法により得られたＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒのキチンのアセチル化度は７６〜７９％である一方、圧搾工程の無い場合それは９１％であり、厳しい温度及び試薬条件下で実施された化学的加水分解であっても、アセチル化度は８５％である。
【０２３０】
考慮される他の昆虫、特にＧ．  ｍｅｌｏｎｅｌｌａ及びＡ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓにおいて、アセチル化度は前記方法によって影響を受け、それは、有る場合には８３％から７４％、他の場合では１００％から９５％に変化する。
【０２３１】
キチンの溶解性及び加工性はアセチル化度にかなり具体的に連動しているため、このキチンのＮ−アセチルグルコサミン単位のアミド結合の同時加水分解は、これらの条件下で実施される酵素的加水分解の予想外の肯定的な効果である。
【０２３２】
ｈ）原子及び機能表面存在量
精製を進行するとき、キチンの表面上の原子の分布は、相対酸素含量における増大、及び相対炭素含量における減少を示す（表４）。
【０２３３】
更に、表面上の炭素原子の結合は、炭化水素型（Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｃ）の優勢な結合からアルコール型（Ｃ−Ｏ）又はカルボニル型（Ｃ＝Ｏ）の結合に移行する傾向がある。アミド型（Ｎ−Ｃ＝Ｏ）の結合の減少もある。
【０２３４】
しかしながら、最も代表的なのは、アルコール結合／炭化水素結合比（Ｃ−Ｏ／Ｃ−Ｈ）であり、酵素的に精製されたキチンの文脈において、この比率は０．３１〜０．５６、より具体的には０．３９〜０．４１である。
【０２３５】
表４において：
−「粗クチクラ」は、天然の状態でのクチクラのキチンを意味し、切開により昆虫から取り出された直後に解析された；
−「酵素的に精製されたキチン（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）」は、挽き潰し＋圧搾及び酵素Ｎｏｖｏｚｙｍｅ３７０７１の存在下での酵素加水分解を含む方法で得たキチンを意味する；
−「酵素的に精製されたキチン（Ｐｒｏｌｙｖｅ）」は、挽き潰し＋圧搾及び酵素Ｐｒｏｌｙｖｅ  ＮＰの存在下での酵素加水分解を含む方法で得たキチンを意味する；
−「酵素的に精製されたキチン」は、挽き潰し＋圧搾及び酵素Ｐｒｏｌｙｖｅの存在下での酵素加水分解を含む方法で得たキチンを意味する；
−「精製キチン」は、昆虫中のキチンの量を決定するのに用いるのと同じ化学的精製により得られるキチンを意味する。
【表５】
2018502203.tif 000007
表４：キチンの表面砲の幾つかの原子及び結合の分布
【０２３６】
ｉ）二光子蛍光顕微鏡によるクチクラの画像化
本発明の方法による酵素的経路によるキチンの部分的精製は、構造の外形上に溢れたタンパク質を除去しつつ、化学的精製と比較してキチンの「充填」タンパク質を保存することにより全体の柔軟性を維持することを可能とする（図４３）。
【０２３７】
図４３中の用語は、上記セクションＩＩＩ  ｈ）と同じである。
【０２３８】
ｊ）結晶化度
試験した昆虫又は酵素に拘らず、取得したキチンの結晶化度、即ち結晶部分とアモルファス部分の比率は０．４２〜０．６１である。
【０２３９】
一般に、結晶化指数度という用語は、文字通り、即ちピーク高（面積ではない）の比率を意味するものとして用いられる。この測定は、エラーの本質的なリスクを有する。しかしながら、比較の目的において、試料の結晶化指数度も測定され、全ての昆虫において８８〜９５％であり、鞘翅目及び鱗翅目において９０％を上回る場合もある。
【０２４０】
実施例６：圧搾汁由来のタンパク質フラクションの回収を有する本発明の方法
Ｉ．材料及び方法
ａ）材料
昆虫
以下の昆虫が試験された：
−甲虫：Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  （Ｔ．  ｍｏｌｉｔｏｒ又はＴＭ）。
【０２４１】
酵素
Ｐｒｏｌｙｖｅが加水分解に使用された。
【表６】
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【０２４２】
ｂ）製造方法
挽き潰しの後圧搾を有する（図中「挽き潰し＋圧搾」と表記される）製造方法
幾つかのバッチが、以下のように変換された：６００ｇの新鮮なＴ．  ｍｏｌｉｔｏｒ幼虫をチャンバーに入れ、それらを蒸気で殺した（１１５℃、５分間）。昆虫を混合器中に入れ、昆虫１００ｇに対し７５ｍＬの水を入れ、全体を混合し、圧搾した（ツインスクリュープレス又はフィルタープレス、又は他の圧搾系）。
【０２４３】
圧搾塊を７０℃で一昼夜乾燥させた。一方圧搾汁は３０００ｇで３０分間遠心分離し、固体部分（血リンパの不溶性タンパク質）を回収した。
【０２４４】
圧搾塊１２５ｇと不溶性血リンパタンパク質１２５ｇ（湿重量、乾燥重量はこの約３０重量％）を濃縮器を繋げたマグネチックスターラーを有する三つ首フラスコに入れ、１２５０ｍＬの水を入れ、活性が９５００ＳＡＰＵのタンパク質溶解酵素を添加した。４５℃で４時間反応させた。１５分間温度を９０℃に上げ、反応混合物を最後に濾過した（０．４０〜０．４５μｍ）。残留物を７０℃で２４時間乾燥させたものを酵素的精製経路により取得されたキチンとし、濾過物を凍結及び凍結乾燥させたものを加水分解物とした。
【０２４５】
ｃ）解析
灰含量の測定、脂質含量の解析、アミノ酸の相対存在量、及びタンパク質のサイズの測定は、実施例５と同様に実施された。
【０２４６】
ＩＩ．取得された産物の特徴
取得された産物、キチン及び加水分解物は、解析及び特徴付けられた（表５、図４５）。
【表７】
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ｎ．ａ．：該当無し
表５：特徴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2018502203.tif 000043
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2018502203.tif 000049
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【国際調査報告】
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2018502203.tif 000057
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