(57)【要約】  癌などのＰＩ３Ｋ経路に関連する病態治療のためのバイオマーカー、およびＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を使用する方法を記載する。具体的には、癌の治療における患者選択のためのバイオマーカー、ならびに治療的処置の方法、診断キット、および検出の方法を記載する。ここでは、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子および／またはＡＫＴ遺伝子など）の変異、かつ野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する癌は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に好都合に応答する可能性が、より高い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を患う患者を治療する方法であって、
（ａ）前記癌を代表する、かつ前記患者からあらかじめ単離した試料において、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｂ）前記試料中のＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｃ）前記試料中のＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｄ）（ｉ）前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、変異体であると決定された場合；
（ｉｉ）前記ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型であると決定された場合；および
（ｉｉｉ）前記ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型であると決定された場合に、
前記患者に、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＰＩＫ３Ｒ１、およびＰＩＫ３Ｒ２から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分が、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記癌が、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、膀胱癌、脳癌、結腸直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、陰茎癌、または他のＰＩ３キナーゼ依存性のである、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
前記癌が、乳癌である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−プロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−カルボキサミドである、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
癌を患う患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者の癌細胞中のＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｂ）前記患者の癌細胞中のＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｃ）前記患者の癌細胞中のＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；
（ｄ）前記癌細胞が、
（ｉ）変異したＡＫＴ遺伝子；
（ｉｉ）野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子；および
（ｉｉｉ）野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子
を有する場合、前記患者に、有効量のＡＫＴ阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項８】
前記阻害剤が、４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−プロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−カルボキサミドである、請求項７の方法。
【請求項９】
前記癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子および野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する、前記癌の治療のための、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用。
【請求項１０】
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分が、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３である、請求項９の使用。
【請求項１１】
前記阻害剤が、４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−プロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−カルボキサミドである、請求項９〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
治療のための、癌を患う患者を除外するための方法であって、
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して潜在的に感受性がある癌を有する候補患者を特定することと；
候補患者からあらかじめ単離した、癌を代表する試料中のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること（ここでは、前記患者は、前記癌細胞が、変異体ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して除外される）と
を含む方法。
【請求項１３】
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分が、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の、また、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４の、その癌細胞遺伝子状態が、既に決定されている患者において、癌を治療する方法であって、前記癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子および野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、前記患者に前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分が、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３である、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、その全体が参照によって組み込まれる、２０１５年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２１９，６９８号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界中で最もよく見られる癌の一つであり、毎年、１，３００，０００を超える症例が診断され、４５０，０００を超える人が死亡している。乳癌を治療する際の最大の課題の一つは、その不均一性である。大量ＤＮＡシーケンシングの出現が、乳癌の変異の全体像を提供しており、こうした大量ＤＮＡシーケンシングと、コピー数多型および遺伝子発現データとの組み合わせによって、乳癌の１０の統合的クラスターへの分類ができるようになっている（非特許文献１および非特許文献２）。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路は、癌細胞増殖、生存、代謝、およびアポトーシスの重要なメディエーターであることが公知であり（非特許文献３）、１０の統合的クラスターの分析は、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒性、αポリペプチド（ＰＩＫ３ＣＡ）、すなわちＰＩ３Ｋのαアイソフォーム（ＰＩ３Ｋα）をコードする遺伝子が、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）クラスターのいくつかにおいて頻繁に変異することを示している。全体的に見ると、ＰＩＫ３ＣＡは、ルミナルＡ乳癌症例の４５％において変異する（非特許文献４）。これらの研究は、腫瘍発生におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に関係する非常に様々な他の研究（特許文献１にまとめられている）と共に、癌の治療のためのＰＩ３Ｋ−α阻害剤を発見するための、かなりの研究努力をもたらしてきた。しかし、癌患者における奏効率は、一般に低く、今日まで、ＰＩ３Ｋ−α阻害を標的にする抗癌剤は承認されていなかった。
【０００３】
ＡＫＴは、ＰＩ３Ｋの主なエフェクターとして、乳癌における成長因子受容体シグナル伝達の結果として乳癌において高頻度で見られる。ＡＫＴは、ＰＩ３Ｋ活性によって産生されたリン脂質ＰＩＰ３およびＰＩＰ２によって活性化される。膜結合型ＰＤＫ１は、ＰＩＰ３によって、直接活性化され、活性化ループ上に位置するＴｈｒ３０８上のＡＫＴをリン酸化する。ＨＥＲ２−陽性乳癌では、例えば、ＰＩ３Ｋ経路は、活性化され、Ｔｈｒ３０８およびＴｈｒ４７３のリン酸化によって測定された場合に高い活性のＡＫＴをもたらす（ＭＴＯＲＣ２によって媒介される）。ＥＲ＋乳癌では、ＰＩＫ３ＣＡ変異を活性化することが一般的であり、これは、高レベルＰＩＰ３およびＰＩＰ２を維持するための成長因子活性化、したがって、ＡＫＴによって媒介される経路活性の必要性よりも優先する。ＰＩ３Ｋ活性化のすべてのシグナル伝達効果が、ＡＫＴシグナル伝達に起因するはずであるというわけではないが、このキナーゼは、経路における重要な中核であり続け、薬物発見および開発における懸命な努力の焦点である。ＡＫＴアイソフォームＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３の阻害剤が開発されており、乳癌において、現在、臨床試験中である。ＡＫＴ１の変異を活性化することが、ＥＲ＋ルミナル乳癌において突き止められている。変異した症例の８０％超では、影響を与えるコドンは、リジンへの高頻度の変異（Ｅ１７Ｋ変異）を有するＧｌｕ１７である。ＥＲ＋ルミナル乳癌では、この変異の保有率は、およそ３％である。この変異活性化または他の変異活性化が、ＡＫＴ阻害剤に対する感受性を与えることが考えられ、この仮説は、現在、臨床で試験されている。
【０００４】
乳癌患者の最近のゲノム研究はまた、特にＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４、すなわちＪＮＫ細胞死経路の２つ上流のＭＡＰＫの変異の不活性化を介する、細胞生存の促進または癌におけるアポトーシスにおける、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の果たし得る役割を明らかにし始めている（非特許文献５）。ＭＡＰ３Ｋ１（１３〜２０％）およびＭＡＰ２Ｋ４（〜８％）の変異は、ルミナルＡ乳癌において見られ、ＰＩＫ３ＣＡとＭＡＰ３Ｋ１との両方の同時変異は、１１．５６％のＰＩＫ３ＣＡ変異体で、臨床試料において報告されている（非特許文献６）。
【０００５】
ＰＩＫ３ＣＡとＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子との同時変異が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答に寄与するように作用する機構は、（仮にあったとしても）わからないままである。さらに、こうした患者の応答における、ＡＫＴとＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子との同時変異の役割（もしある場合には）については、ほんの少ししか知られていない。したがって、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡおよびＡＫＴ遺伝子など）の遺伝子変異とＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子変異との間の相互作用、および腫瘍発生におけるその役割、ならびに、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での患者の治療におけるいずれかのこうした相互作用の関連性を理解する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１１４９２８号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｕｒｔｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８６，３４６−３５２
【非特許文献２】Ｄａｗｓｏｎ  Ｓ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，２０１３，３２，６１７−６２８
【非特許文献３】Ｆｒｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｍｍｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１４，１３：１４０−１５６
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４９０，６１−７０
【非特許文献５】Ｐｈａｍ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ、２０１３，４，４１９−４２６
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４９０，６１−７０  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ，４８６，３５３−３６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書は、癌などのＰＩ３Ｋ経路と関連する病態の治療のためのバイオマーカー、およびＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばＰＩ３Ｋ−α阻害剤）またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を使用する方法を記載する。詳細には、本明細書は、癌の治療における患者選択のためのバイオマーカー、ならびに治療的処置の方法、診断キット、および検出の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書で記載するのは、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）をコードする遺伝子の状態、およびＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４をコードする遺伝子の状態と、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性との間の関連の特定および特徴付けである。したがって、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者、特に癌患者を選択する、および／または治療に治療的に応答する可能性が低い患者の治療を回避する、したがって不必要な治療、およびこうした有効ではない治療に伴われる可能性があるいずれかの副作用を回避ための、機会、方法、およびツールを提供する。
【００１０】
本明細書は、一つには、患者選択ツールおよび方法（個別化医療が含まれる）に関する。この選択は、治療されることとなる癌細胞が、野生型のもしくは変異したＰＩ３Ｋ経路の上流成分（野生型のもしくは変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または野生型のもしくは変異したＡＫＴ遺伝子など）、および野生型のもしくは変異したＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有するかどうかに基づいている。したがって、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴなど）の遺伝的状態（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｕｓ）、およびＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４の遺伝子状態（ｇｅｎｅ  ｓｔａｔｕｓ）は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性のバイオマーカーとして使用することができる。具体的には、本明細書は、変異−陽性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子、および変異−陽性ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子と、その結果生じる、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性の低下との間の関連を記載する。あるいは、本明細書は、変異−陽性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子、および野生型ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子と、その結果生じる、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性の増大との間の関連を記載する。
【００１１】
一態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、（ａ）前記癌を代表する、かつ前記患者からあらかじめ単離した試料において、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと；（ｂ）前記試料中のＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；（ｃ）前記試料中のＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；（ｄ）（ｉ）前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、変異体であると決定された場合；（ｉｉ）前記ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型であると決定された場合；および（ｉｉｉ）前記ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型であると決定された場合に、前記患者に、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することとを含む方法が記載される。
【００１２】
別の態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、（ａ）前記患者の癌細胞におけるＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；（ｂ）前記患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；（ｃ）前記患者の癌細胞におけるＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；（ｄ）前記癌細胞が、（ｉ）変異したＡＫＴ遺伝子；（ｉｉ）野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子；および（ｉｉｉ）野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合、前記患者に、有効量のＡＫＴ阻害剤を投与することを含む方法が記載される。
【００１３】
別の態様では、前記癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子、および野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異を有する、前記癌の治療のための、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が記載される。
【００１４】
別の態様では、治療のための、癌を患う患者を除外するための方法であって、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して潜在的に感受性がある癌を有する候補患者を特定することと；候補患者からあらかじめ単離した、癌を代表する試料中のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること（ここでは、前記患者は、前記癌細胞が、変異体ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して除外される）とを含む方法が記載される。
【００１５】
別の態様では、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の、また、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４の、その癌細胞遺伝子状態が、既に決定されている患者において、癌を治療する方法であって、前記癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子、および野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異を有する場合に、前記患者に前記ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することを含む方法が記載される。
【００１６】
ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に癌が応答することとなる患者について高められる、または該患者を選択することとなるバイオマーカーの明確な必要性が存在する。ある薬剤に応答する可能性が低い患者を特定する患者選択バイオマーカーはまた、非応答性の癌を有する患者の不必要な治療ないし、こうした薬剤の副作用の可能性を減じ、また、その治療効果から恩恵を受ける可能性が最も高い患者を治療について選択できるようにするので、癌の治療において重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】乳癌細胞株におけるＰＩＫ３ＣＡ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異状態を示す。
【図２Ａ】ＰＩＫ３ＣＡ変異乳癌細胞株におけるＭＡＰ３Ｋ１  ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡターゲティング後の基礎ｐＡＫＴ（Ｔ３０８）レベルの誘導を示す。
【図２Ｂ】ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子破壊後の基礎ｐＡＫＴ（Ｔ３０８）レベルの誘導、および化合物Ａ（ＰＩ３ＫαおよびＰＩ３Ｋδ阻害剤）に対する部分抵抗性、親（Ｐ．）ＭＣＦ７細胞と比較した場合の変異体細胞株（ＣＲ１．４およびＣＲ２．５）における処理を示す。
【図３】親ＭＣＦ７細胞（左パネル）およびＭＡＫ３Ｋ１欠損ＭＣＦ７  ＣＲ２．５細胞（右パネル）における、漸増レベルの化合物Ａ、化合物Ｂ（ＡＫＴ阻害剤）、およびＧＤＣ−００６８（ＡＫＴ阻害剤）での治療の、ＭＡＰ３Ｋ１、ｐＪＮＫ、ｐＰＲＡＳ４０、ｐＳ６  ＲＰ（Ｓ２３５／２３６）、およびビンキュリンのレベルに対する効果を示す。
【図４】化合物Ａおよび化合物Ｂでの５００ｎＭ処理後の、親ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ（Ａ）、ＭＣＦ７（Ｃ）、ならびにＭＡＰ３Ｋ１変異体ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ  ＣＲ２．３（Ｂ）およびＭＣＦ７  ＣＲ１．４細胞の増殖・時間経過を示す。
【図５】化合物Ａ、化合物Ｂ、およびｍＴＯＲ阻害剤（ＡＺＤ２０１４）を用いる、親−対−ＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞株の増殖についてのＩＣ５０の比較を示す。
【図６】６０および６６時間の５００ｎＭの化合物Ａ、化合物Ｂ、およびＤＭＳＯ処理後の、親−対−ＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞株のコンフルエントの割合を示す。
【図７Ａ】３Ｄ−マトリゲル腺房（ａｃｉｎａｒ）構造における、体積（左グラフ）およびアポトーシス（右グラフ）におけるＭＡＰ３Ｋ１喪失の効果を示す。ＭＣＦ７親（灰色）およびＭＣＦ７  ＣＲ２．５（黒色）腺房（ａｃｉｎｉ）ならびにＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ親（灰色）およびＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ  ＣＲ２．９（黒色）腺房を、ＤＭＳＯ（−）または化合物Ｂ（＋）で１５日間処理した。
【図７Ｂ】２μＭ化合物Ｂの非存在（灰色）または存在（黒色）下での、ＭＣＦ７親−対−ＭＣＦ７  ＣＲ２．５腺房の、外層細胞のｐＳ６平均強度の定量化を示す。
【図８】２つの時点（２５および４５日）での、ＭＣＦ７親−対−ＭＣＦ７  ＣＲ２．５異種移植片の腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
バイオマーカーは、「正常な生物学的過程、発病過程、または治療介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価される特徴」と述べることができる。バイオマーカーは、そのバイオマーカーの存在またはレベルと、状態または疾患のいくつかの態様（その状態または疾患の、存在、レベルまたは変化レベル、タイプ、段階、その状態または疾患に対する感受性、またはその状態または疾患を治療するために使用される薬物に対する応答性が含まれる）との間に相関が存在する場合に、ある特定の状態または疾患と関連するあらゆる特定可能および測定可能な指標である。この相関は、質的、量的、または質的と量的の両方あり得る。一般的に、バイオマーカーは、化合物、化合物断片、または化合物の基である。こうした化合物は、生物中に見られる、または生物によって産生される、タンパク質（およびペプチド）、核酸、ならびに他の化合物を含めたあらゆる化合物であり得る。
【００１９】
バイオマーカーは、予測力を有することができ、そのようなものとして、特定の状態または疾患の存在、レベル、タイプ、または段階（特定の微生物または毒素の存在またはレベルが含まれる）、特定の状態または疾患に対する感受性（遺伝的感受性が含まれる）、または特定の治療（薬物治療が含まれる）に対する応答を予測または検出するために使用することができる。バイオマーカーは、研究および開発プログラムの効率を高めることによって、薬物発見および開発の未来において、ますます重要な役割を果たすことになることが考えられる。バイオマーカーは、診断薬、疾患進行のモニター、治療のモニター、および臨床成績の予測因子として使用することができる。例えば、様々なバイオマーカー研究プロジェクトが、特定の癌の、また、特定の循環器および免疫疾患のマーカーを特定しようと試みている。新しい有効なバイオマーカーの開発は、医療および薬物開発の費用の有意な減少と、非常に様々な疾患および状態についての治療の有意な改善の両方をもたらすであろうと考えられている。
【００２０】
臨床試験を最適に設計する、また、これらの試験から最高の情報を得るために、バイオマーカーが必要とされる可能性がある。マーカーは、代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）および癌細胞、またはマーカーが検出可能であり得る他の患者試料において測定可能であり得る。理論上、これらのマーカーはまた、有効性と相関することとなり、したがって、最終的には患者選択のために使用される可能性がある。
【００２１】
したがって、本発明のこの態様の根底をなす技術的問題は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療についての患者の層別化のための手段の特定である。この技術的問題は、特許請求の範囲および／または本明細書の説明において特徴付けられる態様の提供によって解決される。
【００２２】
本明細書の実施例において詳述する通り、ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異を有する細胞が、概して、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤による成長阻害に対して感受性が低いことが判明した。成長阻害は、細胞増殖の阻害および／または細胞死の増加の結果として起こり得る。
【００２３】
本明細書は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する細胞の感受性を決定する方法を提供する。この方法は、前記細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）の状態と、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の状態を決定することを含む。細胞は、上流成分の変異（変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）を有し、かつ変異したＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がない可能性が高いと特定される。したがって、上流成分の（例えばＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子における）変異と、変異したＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する患者は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して特に感受性が低いと予測される。細胞は、上流成分の変異（変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）を有し、かつ野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が高いと特定される。したがって、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）の変異と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する患者は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対して特に感受性があると予測される。
【００２４】
変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する患者は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤での治療に対して感受性があると予測される。変異したＡＫＴ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する患者は、ＡＫＴ阻害剤での治療に対して感受性があると予測される。
【００２５】
細胞、または細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が、細胞成長分析において（細胞増殖の阻害を通して、および／または細胞死の増加を通して）細胞数の増加を阻害する場合に、該阻害剤に対して感受性がある。本明細書に記載する方法は、どの細胞、または細胞の集団が、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が、より高いかということを、成長阻害によって予測するために有用である。
【００２６】
本開示はさらに、一つには、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答性の可能性を決定するために使用することができる方法であって、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を投与するかどうかを決定することを含む方法に基づいている。具体的には、本発明の方法は、患者の癌細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）の、またＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の、遺伝子状態（例えば、野生型か変異しているか）の決定を含む。上流成分の変異（変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）と、変異したＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の存在は、癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤と接触させた場合に成長阻害によって応答する可能性が低いことを示す。したがって、上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）の、またＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の、（癌細胞における）遺伝子状態は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などの、前記上流成分の阻害剤での治療について、患者を選択するために使用することができる。
【００２７】
さらに、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が高い患者の特定のためのインビトロ方法を開示する。開示するのはまた、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異状態を検出することが可能なオリゴ−またはポリヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用である。開示するのはまた、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４変異の検出のためのキットの使用である。
【００２８】
開示するのはまた、癌を患う患者が、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での医薬的処置に応答する可能性が高いかを決定するためのインビトロ方法であって、（ｉ）前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと；（ｉｉ）前記試料においてＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）が変異を含有するかを決定するステップと；（ｉｉｉ）前記試料においてＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む前記方法である。ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異の非存在は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する癌の特定は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する応答について高めることとなる。野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する個々の癌は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に応答する見込みが最大である。
【００２９】
第２のこうした方法は、（ｉ）前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと；（ｉｉ）前記試料においてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が変異を含有するかを決定するステップと；（ｉｉｉ）前記試料においてＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異かつＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異の非存在は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する癌の特定は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する応答について高めることとなる。変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する個々の癌は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に応答する見込みが最大である。
【００３０】
さらなるこうした方法は、（ｉ）前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと；（ｉｉ）前記試料においてＡＫＴ遺伝子が変異を含有するかを決定するステップと；（ｉｉｉ）前記試料においてＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む。ＡＫＴ遺伝子の変異かつＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異の非存在は、ＡＫＴ阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、変異したＡＫＴ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する癌の特定は、ＡＫＴ阻害剤に対する応答について高めることとなる。変異したＡＫＴ遺伝子と野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を含有する個々の癌は、ＡＫＴ阻害剤に応答する見込みが最大である。
【００３１】
試料「癌を代表する」は、（例えば、生検組織から、または血液中に見られる細胞から）単離された実際の癌細胞含有試料であってもよいし、さらに処理されている試料、例えば癌細胞含有試料からのＰＣＲ増幅核酸の試料であってもよいし、患者の血液または他の体液中に見られる循環遊離ＤＮＡなどの癌由来の核酸の試料であってもよい。
【００３２】
定義：
「ＡＫＴ阻害剤」は、プロテインキナーゼＢとしても公知であるＡＫＴのアイソフォームのいずれかを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。ＡＫＴ阻害剤の例としては、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ（ｉｐａｔａｓｅｒｔｉｂ）（ＧＤＣ−００６８）、アフレセルチブ（ａｆｕｒｅｓｅｒｔｉｂ）（ＧＳＫ−２１１０１８３）、４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−プロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−カルボキサミド、ならびに国際公開第２００６／０４６０２３号パンフレット、国際公開第２００６／０４６０２４号パンフレット、および国際公開第２００９／０４７５６３号パンフレットに記載されているもの
が挙げられる。
【００３３】
「アレル」は、その特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列によって他の形態と区別される、遺伝子座の特定の形態を指す。
【００３４】
「増幅反応」は、標的核酸の、非標的核酸に対する特異的増幅をもたらす核酸反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、よく知られている増幅反応である。
【００３５】
「癌」は、本明細書では、腫瘍性形質への細胞の形質転換に起因する、腫瘍性成長成長を指すために使用される。こうした細胞の形質転換は、しばしば遺伝子変異を含む。
【００３６】
「遺伝子」は、発現を制御する、５’または３’隣接領域内に位置し得る（遺伝子の転写される部分の範囲内ではない）プロモーター、エクソン、イントロン、および他の配列因子を含む、ＲＮＡ産物の調節された生合成のためのすべての情報を含有するＤＮＡのセグメントである。
【００３７】
「遺伝子状態」は、遺伝子が、野生型か野生型でない（すなわち変異体）かということを指す。
【００３８】
「標識」は、分析試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す検出可能なシグナルを生じることが可能な組成物を指す。適切な標識としては、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、生物発光部分などが挙げられる。したがって、標識は、分光、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。
【００３９】
「非同義多様性」は、別の（変更された）ポリペプチド配列の産生をもたらす、遺伝子のコード配列内の、または該コード配列とオーバーラップする多様性（相違（ｖａｒｉａｎｃｅ））を指す。これらの多様性は、タンパク質機能に影響を与える可能性も与えない可能性もあり、ミスセンスバリアント（別のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換をもたらす）、ナンセンスバリアント（未成熟終止コドンの産生により、切断されたポリペプチドをもたらす）、および挿入／欠失バリアントが含まれる。
【００４０】
「同義多様性」は、コードされるポリペプチドの配列に影響を与えない、遺伝子のコード配列内の多様性（相違）を指す。これらの多様性は、タンパク質機能に間接的に（例えば、遺伝子の発現を変えることによって）影響を与える可能性があるが、反証がない限り、一般に、差しさわりがないと考えられる。
【００４１】
「核酸」は、当技術分野で公知である通りの、天然に見られる天然の核酸、および／または改変された骨格または塩基を有する改変された人工核酸を含めた、一本鎖または二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を指す。
【００４２】
「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、ホスホイノシチド−３−キナーゼのアイソフォーム（ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、およびＰＩＫ３ＣＧ遺伝子の遺伝子産物など）のいずれか１つを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ＰＩ３Ｋ−α、ＰＩ３Ｋ−β、およびＰＩ３Ｋ−σ阻害剤が挙げられる。ＰＩ３Ｋ−βおよびＰＩ３Ｋ−σ阻害剤の例は、（Ｒ）−８−（１−（３，５−ジフルオロフェニルアミノ）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−モルホリノ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−６−カルボキサミドおよびイデラリシブである。
【００４３】
「ＰＩ３Ｋ−α阻害剤」は、ホスホイノシチド−３−キナーゼのα−アイソフォームを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。ＰＩ３Ｋ−α阻害剤の例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＤＣ００３２、１−（４−（５−（５−アミノ−６−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ピラジン−２−イル）−１−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピペリジン−１−イル）−３−ヒドロキシプロパン−１−オン、ならびに国際公開第２００９／０８０７０５号パンフレット、国際公開第２０１０／０２９０８２号パンフレット、国際公開第２０１１／０００９０５号パンフレット、および国際公開第２０１４／１１４９２８号パンフレットに記載されているものが挙げられる。
【００４４】
「プライマー」は、コピーされるべき核酸鎖と相補的であるプライマー伸長生成物の合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を指す。プライマーの長さおよび配列は、プライマーが伸長生成物の合成を予備刺激することが可能であるような長さでなければならない。典型的なプライマーは、標的配列と実質的に相補的な、長さが少なくとも約７ヌクレオチドの配列を含有するが、いくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含有するが、より長いまたは短いプライマーも用いることができる。
【００４５】
「多型部位」は、ある集団において少なくとも２つの代替配列が見られる、遺伝子座内の位置である。
【００４６】
「多型」は、多型部位での、個人において認められる配列多様性を指す。多型には、ヌクレオチド置換、挿入、欠失、およびマイクロサテライトが含まれ、必ずしもではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能の検出可能な違いをもたらし得る。発現またはタンパク質機能に対する影響の証拠がない場合、非同義バリアントを含めた共通（ｃｏｍｍｏｎ）多型は、一般に、野生型遺伝子配列の定義に含まれるとみなされる。検証、観察される頻度、および疾患関連性を含めた、ヒト多型および関連するアノテーションの目録は、ＮＣＢＩによって管理されている（ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／）。遺伝子配列の文脈で使用される場合の用語「多型」は、化合物の固体状態形態の文脈で使用される場合の用語「多型」（これは、化合物の結晶性または非結晶性の性質である）と混同されるべきではないことに留意されたい。当業者は、その文脈によって、意図される意味を理解するであろう。
【００４７】
「プローブ」は、検出されるべきアレルの標的配列と厳密なに相補的である配列を有する、一本鎖の配列特異的なオリゴヌクレオチドを指す。
【００４８】
「応答」は、患者の２つの主要群：部分応答または安定な疾患を示す群、および進行性の疾患の徴候を示す群への分類を含む固形癌効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）に従って行われる測定によって定義される。
【００４９】
「生存」は、患者の全生存期間および無増悪生存期間を包含する。「全生存」（ＯＳ）は、薬物投与の開始から、いずれかの原因による死亡までの時間と定義される。「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、薬物投与の開始から、進行性疾患の最初の出現またはいずれかの原因による死亡までの時間と定義される。
【００５０】
「ＰＩ３Ｋ経路の上流成分」は、ｍＴＯＲの上流である（かつｍＴＯＲは含まれない）ＰＩ３Ｋ経路の遺伝成分を指す。ＰＩ３Ｋ経路の上流成分としては、ＰＩ３Ｋのアイソフォーム（ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、およびＰＩＫ３ＣＧ遺伝子が含まれる）、ＡＫＴのアイソフォーム（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３遺伝子が含まれる）、ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＰＩＫ３Ｒ１、およびＰＩＫ３Ｒ２、特にＰＩＫ３ＣＡおよびＡＫＴ（ＡＫＴ１およびＡＫＴ２など）が挙げられる。ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤としては、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＰＩ３Ｋ−α、ＰＩ３Ｋ−β、およびＰＩ３Ｋ−σ阻害剤など、例えばＰＩ３Ｋ−α阻害剤）、およびＡＫＴ阻害剤が挙げられる。
【００５１】
治療のための選択の方法
一態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと；癌を代表する該患者試料におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が野生型か変異体かを決定することと；該患者試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００５２】
別の態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと；癌を代表する該患者試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００５３】
該方法は、実際の患者試料単離ステップを含むことも除くこともできる。したがって、一態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、該患者患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００５４】
別の態様では、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００５５】
一態様では、該方法は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の状態の決定を含む。
【００５６】
別の態様では、患者は、その癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子ならびに野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。
【００５７】
別の態様では、該方法は、ＡＫＴ遺伝子の状態の決定を含む。
【００５８】
別の態様では、患者は、その癌細胞ＤＮＡが、変異したＡＫＴ遺伝子ならびに野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。
【００５９】
別の態様では、患者は、その癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子、および変異体ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子または変異体ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について選択されない。
【００６０】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００６１】
別の態様によれば、ＡＫＴ阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＡＫＴ阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００６２】
別の態様によれば、ＡＫＴ阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＡＫＴ阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００６３】
さらなる態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、該阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００６４】
一態様では、患者は、該癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子、および野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。他の態様では、患者は、該癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、変異体ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤での治療について選択されない。
【００６５】
別の態様では、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、該阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
【００６６】
一態様では、患者は、該癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。他の態様では、患者は、該癌細胞ＤＮＡが、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、変異体ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤での治療について選択されない。
【００６７】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答性を予測するための方法であって、該患者の癌細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が野生型か変異体かを決定することと；該患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する患者の応答性を予測することを含む方法が提供される。
【００６８】
別の態様によれば、癌に罹患したヒト患者における、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療の有効性の見込みを決定するための方法であって、該患者の癌細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；それに基づいて、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する患者の応答性を予測することを含む方法が提供される。
【００６９】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を除外するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌細胞含有試料におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること（ここでは、その癌細胞ＤＮＡが、変異体ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子または変異体ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、該患者は、該阻害剤での治療について選択されない）を含む方法が提供される。
【００７０】
治療の方法
別の態様によれば、そのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の、またＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４の、癌細胞遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分についての変異体遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７１】
別の態様によれば、その癌細胞ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ遺伝子状態、ならびにＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７２】
別の態様では、その癌細胞ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７３】
別の態様では、その癌細胞ＡＫＴ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７４】
別の態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者の癌細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子の変異体または野生型状態を決定することと；患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異体または野生型状態を決定することと；該細胞が、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
【００７５】
さらなる態様によれば、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと；該患者の癌細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと；患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７６】
さらなる態様によれば、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと；該患者の癌細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該癌細胞が、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７７】
さらなる態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと；該患者の癌細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該癌細胞が、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
【００７８】
さらなる態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌細胞含有試料を提供することと；該患者の癌細胞中のＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；患者の癌細胞におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該癌細胞が、変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する場合に、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「有効な」および「有効性」には、薬理学的有効性と生理学的安全性との両方が含まれる。薬理学的有効性は、治療が患者における所望の生物学的効果をもたらす能力を指す。生理学的安全性は、治療の施与に起因する（しばしば副作用と呼ばれる）、細胞、器官、および／または生物体レベルでの、毒性のレベル、または他の有害な生理学的影響を指す。「それほど有効でない」は、治療が、治療的に有意な、より低いレベルの薬理学的有効性および／または治療的により高いレベルの有害な生理学的影響をもたらすことを意味する。
【００８０】
スクリーニングの方法
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
【００８１】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
【００８２】
さらなる態様では、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
【００８３】
さらなる態様では、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるＡＫＴ遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと；該患者からあらかじめ単離した試料におけるＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
【００８４】
阻害剤およびその使用
別の態様によれば、その癌細胞がＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００８５】
別の態様によれば、その癌細胞が変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００８６】
別の態様では、その癌細胞が変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００８７】
さらなる態様では、その癌細胞が変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００８８】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００８９】
別の態様によれば、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００９０】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００９１】
さらなる態様では、変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００９２】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００９３】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤が提供される。
【００９４】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００９５】
別の態様によれば、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００９６】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００９７】
さらなる態様では、変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００９８】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【００９９】
さらなる態様では、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異を有すると特定された癌細胞を伴う癌の予防および治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【０１０１】
いっそうさらなる態様では、本発明は、変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子または変異したＡＫＴ遺伝子と、野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の予防および治療における使用のための、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【０１０２】
該医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、植込錠、カプセル、液体含有カプセル、散剤、持続放出製剤、座剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、または使用に適した任意の他の形態の形をとることができる。
【０１０３】
投与は、例えば、局所（すなわち、医薬組成物が、その作用が所望される場所に直接的に投与される）、経腸または経口（すなわち、医薬組成物が、消化管を介して与えられる）、または非経口（すなわち、医薬組成物が、消化管以外の他の経路によって、例えば注射によって与えられる）であり得る。
【０１０４】
一態様では、活性な化合物またはその塩（ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などの、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤）、および任意選択で別の治療的または予防的薬剤は、通例の手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために適合された医薬組成物として製剤化される。一般的に、静脈内投与のための活性な化合物は、滅菌した等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤も含むことができる。静脈内投与のための組成物は、任意選択で、注射の部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般に、これらの成分は、単位剤形で、例えば、アンプルなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは共に混合して提供される。活性な化合物が、注入によって投与されることとなる場合、これを、例えば、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて施与することができる。活性な化合物が、注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを、これらの成分を投与前に混合できるように提供することができる。
【０１０５】
経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ錠、水性または油性の懸濁剤、顆粒剤、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、またはエリキシル剤の形態であり得る。経口的に投与される組成物は、医薬として美味な調製物を提供するための、１以上の任意選択の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテーム、またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑油、またはチェリーなどの香味剤；着色剤；および保存剤を含有することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料も、使用することができる。経口用組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なビヒクルを含むことができる。こうしたビヒクルは、特定の態様では、医薬品グレードのものである。
【０１０６】
本発明による使用のための組成物は、１以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使用する従来の方式で製剤化することができる。したがって、活性な化合物および任意選択で別の治療または予防的薬剤ならびにその生理学的に許容できる塩および溶媒和化合物は、（口または鼻を通した）吸入または通気による投与、または経口、非経口、または粘膜（例えば頬側、膣内、直腸内、舌下）投与のための医薬組成物に製剤化することができる。一態様では、局所的または全身的な非経口投与が使用される。
【０１０７】
経口投与については、該組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬として許容し得る賦形剤を伴って従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることもできるし、使用前の水または他の適切なビヒクルでの構成のための乾燥生成物として提供することもできる。こうした液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、もしくは食用硬化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン、もしくはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコール、もしくは分留された植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルもしくはソルビン酸）などの医薬として許容し得る添加物を伴う従来の手段によって調製することができる。これらの調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有することができる。
【０１０８】
いくつかの態様では、本明細書に開示する化合物または塩は、０．１〜１ｍｇ、１〜１０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、または５００ｍｇから５ｇの前記活性な化合物またはその塩を含む医薬組成物として投与することができる。
【０１０９】
いっそうさらなる態様によれば、適切な単位剤形中のＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤；患者が野生型または変異体のＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；患者が野生型または変異体のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を含有するための容器手段、およびＰＩ３Ｋ経路上流成分、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４試験手段；ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
【０１１０】
いっそうさらなる態様によれば、適切な単位剤形中のＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤；患者が野生型または変異体のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；患者が野生型または変異体のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を含有するための容器手段、およびＰＩＫ３ＣＡ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４試験手段；ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
【０１１１】
いっそうさらなる態様では、適切な単位剤形中のＡＫＴ阻害剤；患者が野生型または変異体のＡＫＴ遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；患者が野生型または変異体のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段；ＡＫＴ阻害剤を含有するための容器手段、およびＡＫＴ、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４試験手段；ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
【０１１２】
遺伝子状態：野生型か変異体か
本明細書の目的では、野生型の遺伝子状態は、遺伝子の正常または適切な発現、かつ、コードされるタンパク質の正常な機能を示すことが意図される。一方、変異状態は、癌（本明細書に記載する通りの）における、異常または不適切な遺伝子発現、または、変異したＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴなど）の、また、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４の公知役割と一致する変更された機能を有するタンパク質の発現を示すことが意図される。限定はされないが、変異、増幅、欠失、ゲノム再編成、またはメチル化プロファイルの変化を含めた、いずれかの数の遺伝的またはエピジェネティックな変更が、変異状態をもたらす可能性がある。しかし、それにもかかわらず、こうした変更が、正常なタンパク質の適切な発現、または機能的に等価なバリアントをもたらす場合、遺伝子状態は、野生型とみなされる。機能的変異遺伝子状態を一般的にもたらさないであろうバリアントの例としては、同義コーディングバリアントおよび共通多型（同義または非同義）が挙げられる。下に論じる通り、遺伝子状態は、機能分析によって評価することもできるし、参照配列から検出された逸脱の性質から推論することもできる。
【０１１３】
ある種の態様では、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ遺伝子など）および／またはＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の野生型または変異の状態は、遺伝子の非同義核酸多様性の存在または非存在によって決定される。アノテートされた機能的影響を伴わない、公知の共通多型に相当する、観察された非同義多様性は、変異体の遺伝子状態に関与しない。
【０１１４】
変異状態を意味するＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）および／またはＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の他の多様性には、ｐｒｅ−ｍＲＮＡからｍＲＮＡへのプロセシング間のイントロン／エクソン接合部の認識を低下させるスプライス部位多様性が含まれる。これは、エクソンスキッピング、またはスプライスされたｍＲＮＡへの正常なイントロン配列の包含（イントロン保持または潜在的なスプライスジャンクションの利用）をもたらす可能性がある。これは、続いて、正常なタンパク質に対する挿入および／または欠失を伴う異常なタンパク質の産生をもたらす可能性がある。したがって、他の態様では、イントロン／エクソン接合部にスプライス部位認識配列を変えるバリアントが存在する場合、遺伝子は、変異状態を有する。
【０１１５】
ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）および／またはＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の非同義、タンパク質発現、もしくは活性喪失（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）変異、および／または機能喪失変異は、本明細書に記載する態様における使用のために特に適しており、本開示の態様を提供する。さらなる態様では、こうした変異は、フレームシフト変異、スプライス部位変異、ナンセンス変異、および／またはミスセンス変異であり得る。
【０１１６】
ＰＩＫ３ＣＡ変異の特徴付け
国際公開第２０１４／１１４９２８号パンフレットは、乳癌に関してＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａで実施された（ＣＯＳＭＩＣデータベース（Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｅｐ  ２０１１）に基づく）調査を記載しており、ここでは、＞５Ｋヒト腫瘍をカバーするデータセットから、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の＞５５の異なる変異が特定された。大多数の変異は、＜１％の頻度で生じ、３つは１〜３％の頻度で生じたが、４変異が、ＰＩＫ３ＣＡ変異全体の〜８８％を占めていた。これらは、Ｃ末端キナーゼドメインにおけるキナーゼドメインミスセンス変異、Ｈ１０４７Ｒ（５５％）およびＨ１０４７Ｌ（５％）、ならびにらせん状ドメイン残基、Ｅ５４５Ｋ（１８％）およびＥ５４２Ｋ（１１％）であった。他のよく見られる乳癌変異の、より多くのリストは、網羅的であることを意図しないが、Ｒ３８Ｈ、Ｒ３８Ｃ、Ｒ８８Ｑ、Ｎ３４５Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｅ４５３Ｑ、Ｐ５３９Ｒ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｐ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｍ１０４３Ｖ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｙを包含する。したがって、最も一般的な変異の検出に焦点を合わせ、それによって、大多数のＰＩＫ３ＣＡ変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された腫瘍試料から単離されたＤＮＡ内のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン１、４、７、９、および２０における１７変異（Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ｄ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｒ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ、Ｎ３４５Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｒ８８Ｑ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｇ１０４９Ｒ、およびＭ１０４３Ｉ）を検出するために、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＣｏｂａｓ（商標）ＰＩＫ３ＣＡ変異テスト（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）が設計される。このキットは、ＥＲ＋ｖｅ乳癌の変異の〜９５％を捕捉することが可能である。変異の分布は、他の腫瘍型では異なり、診断戦略は、それに応じて適合させることができる。例えば、子宮内膜癌では、乳癌と比較して、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子コード配列全体を通した変異拡散の、より均一な分布が存在し、タンパク質のＮ末端領域における、より多くの変異を伴う（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｄ，ＴＣＧＡ  ２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２によって伝えられた）。
【０１１７】
ＰＩＫ３ＣＡについては、遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＧ＿０１２１１３）、ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００６２１８）、およびタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿００６２０９またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入：Ｐ４２３３６）に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号：５、１０、１５、および２０で示す。参照遺伝子（ゲノム領域）配列は、５０００塩基の上流配列および２０００塩基の下流配列を含む。ＰＩＫ３ＣＡ内の変異は、よく知られており（ＣＯＳＭＩＣデータベース−Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、当業者は、野生型とのＤＮＡまたはタンパク質配列の比較に基づいて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子状態、すなわち、ある特定のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
【０１１８】
ＰＩＫ３ＣＡについて開示された遺伝子およびｍＲＮＡ参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、配列番号．２０で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の２つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する１以上の同義変化（この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない）、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型（例えば生殖系列多型）、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
【０１１９】
ＡＫＴ変異の特徴付け
乳癌を含めたヒトの癌において、ＡＫＴ１ミスセンス点変異が特定されている（下の参考文献１〜３参照）。Ｅ１７Ｋ、すなわちヒトの癌における最も一般的なＡＫＴ１変異に加えて、いくつかの他の変異（Ｌ５２Ｒ、Ｃ７７Ｆ、およびＱ７９Ｋ）が、機能的に形質転換していることが示されている（下の参考文献４、５参照）。ＡＫＴ１タンパク質とＡＫＴ２タンパク質との高い配列同一性を考慮すると（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース−ＥＭＢｌ−ＥＢＩ／Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＡＫＴ２の対応する変異も形質転換していることが考えられる。
【０１２０】
ＡＫＴ１については、遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＧ＿０１２１８８）、ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００５１６３）、およびタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿００５１５４またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入：Ｐ３１７４９）に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号：１、６、１１、および１６で示す。ＡＫＴ２については、遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＧ＿０１２０３８）、ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  受入番号：ＮＭ＿００１６２６）、およびタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  受入番号：ＮＰ＿００１６１７またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入：Ｐ３１７５１）に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号：２、７、１２、および１７で示す。ＡＫＴ１およびＡＫＴ２内の変異は、比較的低い頻度で生じ（ＣＯＳＭＩＣデータベース−Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、当業者は、野生型とのＤＮＡまたはタンパク質配列の比較に基づいて、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２遺伝子状態、すなわち、ある特定のＡＫＴ１またはＡＫＴ２遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
【０１２１】
ＡＫＴ１およびＡＫＴ２について開示された遺伝子、ｍＲＮＡ配列、およびタンパク質の参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、（ＡＫＴ１について）配列番号．１６で、また（ＡＫＴ２について）配列番号．１７で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の２つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する１以上の同義変化（この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない）、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型（例えば生殖系列多型）、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
【０１２２】
１．Ｆｌａｔｌｅｙ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＩＫ３ＣＡ−ＡＫＴ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （２０１３）  ４４，  １３２０−１３２７．
２．Ｓｔｅｍｋｅ−Ｈａｌｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰＩＫ３ＣＡ，  ＰＴＥＮ  ａｎｄ  ＡＫＴ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００８）  ６８，  ６０８４−６０９１．
３．Ｔｒｏｘｅｌｌ，  Ｍ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ＰＩＫ３ＣＡ／ＡＫＴ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （２０１０）．  ２３，  ２７−３７．
４．Ｙｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｏｔｓｐｏｔ  ＡＫＴ１  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  （２０１２）  ４，  ２９−３４．
５．Ｃａｒｐｔｅｎ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＡＫＴ１  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２００７）  ４４８，  ４３９−４４４．
【０１２３】
ＭＡＰ３Ｋ１および／またはＭＡＰ２Ｋ４変異の特徴付け
文献（下の参考文献１〜４参照）中のいくつかの報告は、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の高頻度の変異を特定した。変異は、いずれかの機能ドメインにおける明らかな濃縮なしに、各遺伝子のコード配列にわたって分布していた。このパターンは、腫瘍抑制遺伝子（ここでは、いわゆる「機能喪失」変異（スプライシング、ナンセンス、およびフレームシフト変異）が、機能性タンパク質の発現を抑制する）としての遺伝子の機能を示す。ＭＡＰ３Ｋ１については、１９％の場合では、変異は、コード配列の非同義変化をもたらす（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４，４：４１０−４２６）が、大多数の場合では、変異は、フレームシフト欠失または挿入である（変異の５９％）。その例は、Ｒ２７３ｆｓ＊２７．Ｉ７６１ｆｓ＊３５などのフレームシフト変異、ならびにＳ４３１＊およびＳ１３４４＊などのナンセンス変異である。したがって、機能喪失変異の検出に焦点を合わせ、それによって、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４については、遺伝子、ｍＲＮＡ、およびタンパク質に関する参照配列が利用可能である（表１）。個々の参照配列の配列番号を、下の表１に示す。
【０１２４】
【表１】
2018531223.tif 000002
【０１２５】
ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４内の変異は、よく知られており（ＣＯＳＭＩＣデータベース−Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、当業者は、野生型とのＤＮＡまたはタンパク質配列の比較に基づいて、遺伝子状態、すなわち、ある特定のＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
【０１２６】
ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４について開示された遺伝子およびｍＲＮＡおよびタンパク質の参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、（ＭＡＰ３Ｋ１について）配列番号．１９で、また（ＭＡＰ２Ｋ４について）配列番号．１８で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の２つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する１以上の同義変化（この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない）、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型（例えば生殖系列多型）、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
【０１２７】
１．Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１２）  ４９０，  ６１-７０．
２．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｎａｔｕｒｅ  （２０１２）  ４８６，  ４００-４０４．
３．Ｅｌｌｉｓ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｆｏｒｍｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１２）  ４８６，  ３５３−６０．
４．Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ２，０００  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１２）  ４８６，  ３４６-３５２．
【０１２８】
治療の有効性の見込みを決定するための方法
別の態様によれば、癌に罹患したヒト患者における、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療の有効性の見込みを決定するための方法であって、前記患者のＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）における、野生型遺伝子に対する少なくとも１つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出することと；前記患者のＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子における、野生型遺伝子に対する少なくとも１つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出すること（ここでは、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）における少なくとも１つの非同義核酸相違の存在、かつＭＡＰ３Ｋ１遺伝子とＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の両方における少なくとも１つの非同義核酸相違の非存在は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療が有効となる可能性が高いことを示す）とを含む方法が提供される。
【０１２９】
別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する個人の感受性を評価するための方法であって：
（ｉ）該個人からの癌細胞ＤＮＡにおけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）の非同義的変異状態を決定することと；
（ｉｉ）該個人からの癌細胞ＤＮＡにおけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の非同義的変異状態を決定することと；
（ｉｉｉ）該癌細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子またはＡＫＴ遺伝子など）と、ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の非同義的変異状態を参照することにより、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に対する該個人の感受性の可能性を決定することと
を含む方法が提供される。
【０１３０】
ＰＩＫ３ＣＡの遺伝子状態を決定するための、当業者に利用可能な多数の技術が存在する。該遺伝子状態は、核酸配列の決定によって決定することができる。これは、全長遺伝子のダイレクトシーケンシング、またはその遺伝子内の特定の部位、例えば共通に変異される部位の分析を介する可能性がある。
【０１３１】
決定するための代替手段は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が野生型か変異体かに関わりなく、転写された遺伝子の機能を評価することである。このＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の機能的変異は、限定はされないがＡｋｔおよびＳ６キナーゼの活性化を含めた、細胞における経路の下流シグナル伝達の増大をもたらす、増大した脂質キナーゼ活性を有するタンパク質を生じる。細胞において発現される場合のＰＩＫ３ＣＡバリアントの機能状態を評価するための分析には、限定はされないが、
（ｉ）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のキナーゼ活性の産物、ホスファチジルイノシトール−三リン酸（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の産生増大；
（ｉｉ）リン酸化されたＡｋｔまたはＳ６キナーゼのレベル上昇；
（ｉｉｉ）ＰＩＫ３ＣＡのバリアントで遺伝子導入されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖巣およびコロニー形成の増大；
が含まれる（Ｉｋｅｎｏｕｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５  ６５，４５６２−４５６７）。
【０１３２】
関連するＤＮＡ試料をプロファイルするための代替手段は、超並列シーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、すなわちＮＧＳとしても公知である）を含む。超並列シーケンシング方法は、これらの遺伝子の遺伝子型を決定するために使用することができ、限定はされないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅプラットフォームが、その例である。
【０１３３】
試料
遺伝子状態について試験されることとなる患者の試料は、個人から入手したまたは入手可能なあらゆる癌組織もしくは癌細胞含有試料、または血液／血漿もしくは他の体液中に見られる可能性がある循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）などの癌核酸を含有する試料であり得る。試験試料は、好都合には、個人から入手した血液、口腔スワブ、生検組織、または他の体液もしくは組織の試料である。具体例としては、循環癌細胞、血漿または血清中の循環ＤＮＡ、卵巣癌患者の腹水から単離した細胞、肺内に癌を有する患者の肺喀痰、乳癌患者からの穿刺吸引物、尿、末梢血、細胞擦過物、毛包、皮膚パンチ、または頬側試料が挙げられる。
【０１３４】
試験試料が、試験試料における配列に相当する核酸配列と同等のものであり得るということ、すなわち、試料核酸内の領域の全部または一部を、分析の前に、いずれかの好都合な技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、第一に増幅することができることを理解されたい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、または分画された細胞もしくは細胞全体のＲＮＡであり得る。特定の態様では、ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり、ランダムプライマーまたはポリＡプライマーを使用して第一鎖ｃＤＮＡを標識するための鋳型として直接使用される。試験試料中の核酸またはタンパク質は、標準の方法論に従って、試料から抽出することができる（Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（２０１２，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１−３，ＩＳＢＮ  ９７８１９３６１１３４２２）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０１３５】
本発明の診断方法は、個人または患者からあらかじめ採取した試料を使用して実施することができる。こうした試料は、凍結によって保存する、または、ホルマリン−パラフィンまたは他の媒体中で固定および包埋することができる。あるいは、新鮮な癌細胞含有試料を入手して使用することができる。
【０１３６】
本明細書に開示する方法は、あらゆる適切な癌由来の細胞を使用して適用することができる。治療に適した癌は、本明細書に記載する。
【０１３７】
変異の保有率
ＰＩＫ３ＣＡの変異は、臨床腫瘍に広く見られるが、各遺伝子の変異の保有率は、腫瘍組織型によって著しく異なる。例えば、ＰＩＫ３ＣＡ変異は、乳癌においては比較的に一般的であるが、腎臓腫瘍においては比較的に稀である（表２）。
【０１３８】
【表２】
2018531223.tif 000003
【０１３９】
【表３】
2018531223.tif 000004
【０１４０】
ＡＫＴ１およびＡＫＴ２の変異は、臨床腫瘍に広く見られ、変異の保有率は、腫瘍組織型によって変わる（表３および４）。
【０１４１】
【表４】
2018531223.tif 000005
【０１４２】
【表５】
2018531223.tif 000006
【０１４３】
ＭＡＰ３Ｋ１の変異は、乳房、胃、および子宮癌を含めた多くの癌型に見られる（表５）。すべての乳癌研究を合計した保有率は、およそ６％であるが、特定の型の乳癌では、より高い可能性がある。例えば、乳癌において見られる変更の７５％は、ルミナルＡ、ＨＥＲ２陰性／ＥＲ＋癌に見られ、ここでは、ＭＡＰ３Ｋ１変異の保有率は、１１％から１６％であり得る。
【０１４４】
【表６】
2018531223.tif 000007
【０１４５】
ＭＡＰ２Ｋ４の変異は、乳房、結腸、膵臓、および胃を含めた多くの癌型に見られる（表６）。すべての乳癌研究を合計した保有率は、およそ３％であるが、特定の型の乳癌では、より高い可能性がある。例えば、乳癌において見られる変更の７５％は、ルミナルＡ、ＨＥＲ２陰性／ＥＲ＋癌に見られ、ここでは、ＭＡＰ２Ｋ４変異の保有率は、８％から１０％であり得る。
【０１４６】
【表７】
2018531223.tif 000008
【０１４７】
いずれの当業者にも明らかであろう通り、この頻度データは、新しいものとして、絶えず改善および更新されており、より包括的なデータが、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）およびＩＣＧＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）などのヒト癌ゲノムプロファイリングコンソーシアムから出てくる。したがって、ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ従属物およびＭＡＰ３Ｋ１および／またはＭＡＰ２Ｋ４従属物を伴う追加の腫瘍型が、同定され、本明細書に記載する通りのＰＩ３Ｋ−α阻害剤またはＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療に適している可能性がある。
【０１４８】
関連する適応
癌の治療が示される場合、これは、転移の予防および転移、すなわち癌の拡散の治療を指すことができることが理解されよう。したがって、本明細書に開示する方法は、転移を有しない患者を、転移が発生するのを阻止するためにまたは発生するまでの期間を延長するために治療するために、また、既に転移を有している患者を、転移それ自体を治療するために治療するために、使用される可能性がある。さらに、癌の治療は、定着した原発腫瘍（１または複数）および進行している原発腫瘍（１または複数）の治療を指すことができる。
【０１４９】
したがって、癌の治療の一態様は、転移の予防に関する。
【０１５０】
別の態様では、癌の治療は、転移の治療に関する。
【０１５１】
別の態様では、癌の治療は、定着した原発腫瘍（１または複数）または進行している原発腫瘍（１または複数）の治療に関する。
【０１５２】
本明細書では、癌の治療は、癌それ自体の予防を指すことができる。
【０１５３】
一態様では、癌が言及される場合、これは、腫瘍細胞の増殖、生存、侵襲性、および遊走能力をもたらすシグナル伝達ステップに含まれるＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害に対して感受性がある腫瘍を指すことができる。
【０１５４】
一態様では、癌は、ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ遺伝子などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の変異を保持するものである。
【０１５５】
一態様では、癌は、変異、増幅、または他の異常に基づくＰＩＫ３ＣＡ−従属物またはＡＫＴ−従属物を呈するものである。
【０１５６】
一態様では、癌は、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、膀胱癌、脳癌、結腸直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、陰茎癌、および他のＰＩ３キナーゼ依存性の癌から選択される。
【０１５７】
一態様では、癌は、乳癌である。
【０１５８】
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性の乳癌である。
【０１５９】
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性のルミナル乳癌である。
【０１６０】
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性のルミナルＡ乳癌である。
【０１６１】
一態様では、癌は、転移状態である。
【０１６２】
一態様では、癌は、転移状態ではない。
【０１６３】
核酸の検出のための方法
本発明の状況では、薬物治療に対する応答を予測するために、変異したＰＩ３Ｋ経路の上流成分（ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴなど）の、また、変異したＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４核酸の検出を用いることができる。これらの遺伝子の変異は、ＤＮＡレベルで起こるので、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ、ならびに転写物およびタンパク質それ自体の変異または相違の検出に基づくことができる。検出される変異が、対象において実際に発現されることを確実にするために、転写物および／またはポリペプチドの分析によってゲノムＤＮＡの変異を確認することが望ましい可能性がある。
【０１６４】
ある遺伝子内の１以上の位置でのバリアントヌクレオチドの存在または非存在を検出するために使用することができる、数多くの分析手順が存在することが、当業者には明らかであろう。一般に、アレル多様性の検出は、変異識別技術、任意選択で増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応に基づくものなど）および任意選択でシグナル発生系を必要とする。当技術分野で利用可能な多数の変異検出技術が存在し、これらを、当技術分野で利用可能な多くのものが存在するうちのシグナル発生系と組み合わせて使用することができる。アレル多様性の検出のためのたくさんの方法が、Ｎｏｌｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，１９９７，４３，１１１４−１１２０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＭ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．，２０１１，１１，６３５−６４２；Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．，２０１０，１１，６８５−６９６によって；また標準の教科書、例えば‘‘Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ’’，Ｅｄ．ｂｙ  Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６、および‘‘ＰＣＲ’’，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７に概説されている。
【０１６５】
上に述べた通り、癌を有する患者におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中のある特定の相違または複数の相違の存在または非存在を決定することは、様々な様式で実施することができる。こうした試験は、一般に、生体試料、例えば、組織生検、尿、便、喀痰、血液、細胞、組織擦過物、胸部吸引物、または他の細胞性材料から収集されたＤＮＡまたはＲＮＡを使用して実施され、また、限定はされないが、ＰＣＲ、アレル特異的プローブを用いるハイブリダイゼーション、酵素による変異検出、ミスマッチの化学的切断、質量分析、または（ミニシーケンシングを含めた）ＤＮＡシーケンシングを含めた様々な方法によって実施することができる。
【０１６６】
適切な変異検出技術としては、増幅不応性変異システム（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ（商標））、増幅不応性変異システム線形伸長（ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＡＬＥＸ（商標））、競合的オリゴヌクレオチドプライミングシステム（ＣＯＰＳ）、Ｔａｑｍａｎ、分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、および制限部位に基づくＰＣＲ、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術が挙げられる。
【０１６７】
当業者は、上に記載した技術と同様の技術を、ＡＫＴおよび／またはＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異を検出するために使用できることを知っているであろう。特定の態様では、バイオマーカー遺伝子内のヌクレオチドを決定するために用いられる方法は、アレル特異的増幅（アレル特異的ＰＣＲ）−例えば増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ）、シーケンシング、アレル識別分析、ハイブリダイゼーション、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）から選択される。
【０１６８】
特定の態様では、アレル特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションは、以下によって実施することができる：（１）例えば多くのＤＮＡチップ適用と同様に、溶液中の標識された試料を伴う、固相（例えば、ガラス、ケイ素、ナイロン膜）に結合させたアレル特異的オリゴヌクレオチド；または（２）結合された試料（しばしば、クローン化したＤＮＡまたはＰＣＲ増幅したＤＮＡ）、および溶液中の標識されたオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションによるシーケンシングを可能にするための、特異的または短いアレル）。診断試験は、２以上の相違の同時決定を可能にする、しばしば固形状支持体上の、一団の相違を含むことができる。こうしたハイブリダイゼーションプローブは、当技術分野で周知であり（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（２０１２，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１−３，ＩＳＢＮ  ９７８１９３６１１３４２２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）、２以上の相違部位にまたがることができる。
【０１６９】
したがって、一態様では、少なくとも１つの変異の存在または非存在の検出は、推定上の変異部位を含有するＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ核酸および／またはＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４核酸を、少なくとも１種の核酸プローブと接触させることを提供する。プローブは、相違部位を含み、かつその相違部位に相補的ヌクレオチド塩基を含有する、核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、優先的にハイブリッド形成する。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知の標識を使用する、検出可能な標識を用いて検出することができる。こうした標識としては、限定はされないが、放射性、蛍光、色素、および酵素標識が挙げられる。
【０１７０】
別の態様では、少なくとも１つの変異の存在または非存在の検出は、推定上の変異部位を含有するＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ核酸および／またはＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４核酸を、少なくとも１種の核酸プローブと接触させることを提供する。プライマーは、相違部位を含み、かつその相違部位に相補的ヌクレオチド塩基を含有する、核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、優先的にハイブリッド形成する。
【０１７１】
特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央に（その結果、増幅は、ディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する；例えば、Ｇｉｂｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７，２４３７−２４８を参照のこと）、または、一方のプライマーの３’最末端に（ここでは、適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防止または低下させ得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，１９９３，Ｔｉｂｔｅｃｈ，１１  ２３８を参照のこと））、対象となる変異に対して相補的なヌクレオチド塩基を保持することができる。
【０１７２】
さらに別の態様では、少なくとも１つの変異の存在または非存在の検出は、少なくとも１つの核酸配列を配列決定することと、得られた）配列を公知の野生型核酸配列と比較することを含む。
【０１７３】
あるいは、少なくとも１つの変異の存在または非存在は、少なくとも１つの核酸配列の質量分析的決定を含む。
【０１７４】
一態様では、少なくとも１つの核酸相違の存在または非存在の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む。仮定上の相違を含有する標的核酸配列が増幅され、増幅された核酸のヌクレオチド配列が決定される。増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することは、少なくとも１つの核酸セグメントを配列決定することを含む。あるいは、増幅産物を、自動化されたおよび手動のゲル電気泳動などを含めて、そのサイズに従って増幅産物を分離することが可能なあらゆる方法を使用して分析することができる。
【０１７５】
ゲノム核酸の変異は、好都合には、増幅された核酸断片の移動度シフトに基づく技術によって検出される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９６，２３９，６１−９は、競合的移動度シフトアッセイによる一塩基変異の検出を記載している。さらに、Ｍａｒｃｅｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９９，２６，１１３４−１１４８の技術に基づく分析が、商業的に利用可能である。
【０１７６】
ある特定の実施例では、ミスマッチの存在の結果としての、毛細管系における二重鎖核酸の移動度シフトに基づいて変異の存在を検出するために、キャピラリー・ヘテロ二重鎖分析を使用することができる。
【０１７７】
試料からの、分析のための核酸の産生は、一般に、核酸増幅を必要とする。多くの増幅方法が、酵素による連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自家持続配列複製など）に、または、クローン化されているベクターのすべてまたは一部の複製に頼っている。好ましくは、本発明に従う増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって示される通り、指数関数的な増幅である。
【０１７８】
多くの標的およびシグナル増幅方法が、文献に、例えば、これらの方法の一般的概説が、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８  ２４２，２２９−２３７  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １９９０，１０，５４−５５に記載されてきた。これらの増幅方法は、本発明の方法において使用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑβバクテリオファージレプリカーゼ、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、転写産物シーケンシングを用いるゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。様々な増幅技術における使用に適したプライマーは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。
【０１７９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特に、米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されている核酸増幅方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼによってもたらされるプライマー伸長反応のサイクルの繰り返しからなる。標的ＤＮＡを、熱変性させ、増幅されるべきＤＮＡの逆鎖上の、標的配列を挟む２つのオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼを伴う使用のためのプライマーとなる。ＤＮＡは、プライマー伸長によってコピーされて、両方の鎖の第２のコピーが作製される。加熱する変性、プライマーハイブリダイゼーション、および伸長のサイクルを繰り返すことによって、標的ＤＮＡを、約２から４時間で百万倍以上に増幅することができる。ＰＣＲは、増幅の結果を決定するための検出技術と共に使用されるべきである分子生物学ツールである。ＰＣＲの利点は、ＰＣＲが、標的ＤＮＡの量をおよそ４時間で百万から十億倍増幅することによって感受性を高めることである。ＰＣＲは、診断的状況において、あらゆる公知の核酸を増幅するために使用することができる（Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９４，５２：２４７−２５２，）。
【０１８０】
増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ（商標））（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，２５０３−２５１６）などのアレル特異的増幅技術はまた、一塩基変異を検出するために使用することができる。適切なＰＣＲ増幅条件下では、プライマーの３’末端に位置する一塩基ミスマッチが、完璧に適合するアレルの優先的増幅のために十分であり（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、上記）、近縁の種の識別を可能にする。上に記載したプライマーを使用する増幅システムの基本は、ミスマッチした３’残基を有するオリゴヌクレオチドが、適切な条件下で、ＰＣＲにおいてプライマーとして機能しないこととなることである。この増幅システムは、アガロースゲル電気泳動後の反応混合物の目視検査のみによるジェノタイピングを可能にする。
【０１８１】
増幅産物の分析は、自動化されたおよび手動のゲル電気泳動、質量分析などを含めて、そのサイズに従って増幅産物を分離することが可能なあらゆる方法を使用して実施することができる。
【０１８２】
核酸の単離、増幅、および分析の方法は、当業者にとって慣行的であり、プロトコルの例は、例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（２０１２，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１−３，ＩＳＢＮ  ９７８１９３６１１３４２２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）で見ることができる。ＰＣＲ増幅において使用される方法に特に有用なプロトコル源は、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｓ．Ｇ．Ｍａｉｌｅｒ、Ｒ．Ｂｅｙｎｏｎ、Ｃ．ＨｏｗｅによるＰＣＲ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０００），ＩＳＢＮ：０３８７９１６００８である。
【０１８３】
本明細書はまた、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子もしくはＡＫＴ遺伝子、および／またはＭＡＰ３Ｋ１遺伝子およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子内の標的核酸を増幅するための縮重プライマーと、増幅プロトコルおよび結果の分析を含む説明書を含む、予測および診断キットを記載する。あるいは、このキットは、増幅および増幅産物の分析を実施するための、緩衝液、酵素、および容器も含むことができる。このキットは、スクリーニングの構成部品、または診断キット（ＤＮＡマイクロアレイなどの他のツールを含む）、または他の補助物も含むことができる。好ましくは、キットはまた、正常な組織試料、および／または参照遺伝子における様々な相違を表す一連の試料から単離された核酸などの、１以上の対照鋳型を提供する。
【０１８４】
一態様では、キットは、それぞれの対が参照（ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴ、および／またはＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４）遺伝子の異なる領域（各領域  相違の可能性の部位）を増幅し、それによって、１つの反応またはいくつかの並行する反応における生体試料におけるいくつかの遺伝子相違の発現の分析のためのキットを提供することが可能な、２以上のプライマー対を提供する。
【０１８５】
キット中のプライマーは、増幅産物の検出および核酸相違の結果解析を容易にするために、標識、例えば蛍光標識することができる。キットはまた、１回の分析で２以上の相違が検出されるようにすることもできる。したがって、組み合わせキットは、参照遺伝子の別のセグメントを増幅することが可能なプライマーを含むこととなる。これらのプライマーは、相違を区別するように、例えば別の蛍光標識を使用して、別の方式で標識することができる。
【０１８６】
開示されるのはまた、限定はされないが、現在市販されているＰＩＫ３ＣＡ変異検出キットおよびＡＫＴ変異検出キットを含めた、ＰＩＫ３ＣＡまたはＡＫＴおよび／またはＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４変異の検出のためのキットの使用である。
【０１８７】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＰＩＫ３ＣＡは、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
【０１８８】
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定／特定される特定の変異体型のＰＩＫ３ＣＡは、Ｒ３８、Ｒ８８、Ｎ３４５、Ｃ４２０、Ｅ４５３、Ｐ５３９、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ、Ｑ５４６、Ｍ１０４３、Ｍ１０４３、およびＨ１０４７Ｒ位置のものである。
【０１８９】
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定／特定される特定の変異体型のＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ５４２、Ｅ５４５、およびＨ１０４７位置のものである。
【０１９０】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＡＫＴは、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
【０１９１】
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定／特定される特定の変異体型のＡＫＴは、Ｅ１７Ｋ、Ｌ５２Ｒ、Ｃ７７Ｆ、およびＱ７９Ｋ位置のものである。
【０１９２】
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定／特定される特定の変異体型のＡＫＴは、Ｅ１７Ｋ位置にある。
【０１９３】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ３Ｋ１は、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
【０１９４】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ３Ｋ１は、未成熟翻訳停止をもたらす変異を特徴とする型である。
【０１９５】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ３Ｋ１は、機能喪失をもたらす変異を特徴とする型である。
【０１９６】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ３Ｋ１は、コード配列の非同義変化をもたらす変異を特徴とする型である。
【０１９７】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ３Ｋ１は、Ｒ２７３ｆｓ＊２７．Ｉ７６１ｆｓ＊３５、Ｓ４３１＊、およびＳ１３４４＊位置のものである。
【０１９８】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ２Ｋ４は、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
【０１９９】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ２Ｋ４は、未成熟翻訳停止をもたらす変異を特徴とする型である。
【０２００】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ２Ｋ４は、機能喪失をもたらす変異を特徴とする型である。
【０２０１】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ２Ｋ４は、コード配列の非同義変化をもたらす変異を特徴とする型である。
【０２０２】
上のすべての態様については、決定／特定される変異体型のＭＡＰ２Ｋ４は、位置Ｒ２７３ｆｓ＊２７．Ｉ７６１ｆｓ＊３５、Ｓ４３１＊、およびＳ１３４４＊のものである。
【０２０３】
本明細書全体を通して、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態について言及する。誤解を避けるために、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、ＰＩ３Ｋ遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、およびＰＩＫ３ＣＤ遺伝子が含まれる）の状態、ＡＫＴのアイソフォーム（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３遺伝子が含まれる）の状態、ＰＴＥＮ遺伝子の状態、ＰＤＫ１遺伝子の状態、ＳＧＫ遺伝子の状態、ＩＮＰＰ４Ｂ遺伝子の状態、ＩＮＰＰ５Ｄ遺伝子の状態、ＰＩＫ３Ｒ１遺伝子の状態、およびＰＩＫ３Ｒ２遺伝子の状態を包含する、追加の態様が提供される。ある特定の追加の態様は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のみの状態が包含される、本明細書に記載される態様のいずれかである。さらなる特定の追加の態様は、ＡＫＴ遺伝子のみの状態が包含される、本明細書に記載される態様のいずれかである。
【０２０４】
同様に、また、誤解を避けるために、ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子とＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の両方を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子のみの状態を包含する追加の態様、およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子のみの状態を包含するさらなる態様が提供される。
【０２０５】
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でＡＫＴ遺伝子について言及する場合、追加の態様は、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２から選択される遺伝子である。いっそうさらなる態様では、該遺伝子は、ＡＫＴ１遺伝子のみである。いっそうさらなる態様では、該遺伝子は、ＡＫＴ２遺伝子のみである。
【０２０６】
さらに、本明細書全体を通して、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤について言及する。誤解を避けるために、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、ＰＩ３Ｋアイソフォームの阻害剤（ＰＩ３Ｋ−α、ＰＩ３Ｋ−β、およびＰＩ３Ｋ−σ阻害剤など）を包含する追加の態様、ならびにＡＫＴのアイソフォームの阻害剤（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ１／２、およびＡＫＴ３阻害剤が含まれる）を包含する追加の態様を包含する追加の態様が提供される。
【０２０７】
いっそうさらなる態様では、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤について言及される場合、前記阻害剤は、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤およびＡＫＴ阻害剤から選択される。
【０２０８】
同様に、いずれかの特定の態様が、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤およびＡＫＴ阻害剤からの阻害剤の選択を包含する場合、前記阻害剤がＰＩ３Ｋ−α阻害剤のみである追加の態様、および前記阻害剤がＡＫＴ阻害剤のみである追加の態様が提供される。
【０２０９】
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でＰＩ３Ｋ−α阻害剤について言及する場合には必ず、前記阻害剤が１−（４−（５−（５−アミノ−６−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ピラジン−２−イル）−１−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピペリジン−１−イル）−３−ヒドロキシプロパン−１−オン（化合物Ａ）である追加の態様が提供される。
【０２１０】
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でＡＫＴ阻害剤について言及する場合、追加の態様は、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２から選択されるＡＫＴのアイソフォームの阻害剤である。さらなる態様では、阻害剤は、ＡＫＴ１／２アイソフォームの二重阻害剤である。いっそうさらなる態様では、阻害剤は、アイソフォームＡＫＴ１のみの阻害剤である。さらなる態様では、阻害剤は、アイソフォームＡＫＴ２のみの阻害剤である。
【０２１１】
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でＡＫＴ阻害剤について言及する場合には必ず、前記阻害剤が４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−プロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−カルボキサミド（化合物Ｂ）である追加の態様が提供される。
【実施例】
【０２１２】
実験プロトコルにおいて使用される略語：
ＰＩＰ２：ＰＩ（４，５）Ｐ２、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸
ｓ．ｃ．：皮下に
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＴＲＩＳ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：エチレングリコール四酢酸
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地
４ＮＱＯ：４−ニトロキノリンＮ−オキシド
ＥＭＥＭ：イーグル最小必須培地
ＣＯ２：二酸化炭素
ＰＢＳＴ：リン酸緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ
Ａｂ：抗体
ＭＴＳ試薬：［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩；ＭＴＳ］および電子結合試薬（フェナジンメトサルフェート）ＰＭＳ。
【０２１３】
実施例１：ＰＩＫ３ＣＡ−ＭＡＰ３Ｋ１二重変異体プロファイルについての公知の細胞株変異の分析。
ＰＩＫ３ＣＡ−変異体バックグラウンドにおける、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性に対する、ＭＡＰ３Ｋ１機能喪失の影響を試験するために、臨床試料において特定される変異、および公的なドメインで利用可能な細胞株に存在する変異の包括的な調査を実施した。これらの細胞株はいずれも、所望のＰＩＫ３ＣＡ−ＭＡＰ３Ｋ１二重変異体プロファイルと適合する遺伝的プロファイルを有しなかった。ＰＩＫ３ＣＡ変異とＭＡＰ３Ｋ１変異を含有することが判明した細胞株のみ、結果を潜在的に混乱させて所望されない部位外影響（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ  ｅｆｆｅｃｔ）の可能性を生じるであろう、他の遺伝子内の欠失も含有していた（図１）。
【０２１４】
実施例２：ＰＩＫ３ＣＡ変異とＭＡＰ３Ｋ１変異の両方を含有する細胞株の産生、およびＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の活性に対するＭＡＰ３Ｋ１発現消失の効果の分析。
利用可能な細胞株が存在しなかったので、２つの方法によって：第１に、ｓｉＲＮＡ導入を介するＭＡＰ３Ｋ１の発現の一過性ノックダウンによって（図２Ａ）；第２に、高精度遺伝子編集技術を使用してＭＡＰ３Ｋ１遺伝子内の挿入または欠失を永続的に誘発することによって（図２Ｂ）、ＰＩＫ３ＣＡ変異およびＭＡＰ３Ｋ１不活性化を再現する細胞株モデルを産生した。
【０２１５】
この手法とは関係なく、ＰＩＫ３ＣＡ変異体細胞株という状況でのＭＡＰ３Ｋ１不活性化は、ｐＡＫＴ（Ｔ３０８）のレベルの増大をもたらす。
【０２１６】
方法１：ｓｉＲＮＡ導入を介するＭＡＰ３Ｋ１の発現の一過性ノックダウン
ＭＣＦ７細胞は、ヒト乳癌由来である。これは、エストロゲン受容体（ＥＲ）を発現し、かつＨＥＲ２、すなわちＥＧＦＲファミリーの成長因子受容体の発現を欠くことを特徴とする。これらの理由で、この細胞株は、ＥＲ＋／ＨＥＲ２−ルミナル乳癌についての許容できるモデルとみなされる。第２の細胞株、Ｔ４７Ｄは、同様の特性を有する。さらに、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の「ホットスポット」変異を保持し、ＰＩ３Ｋαアイソフォーム選択的化合物での治療後に、経路阻害と生存率の両方に対する感受性が最も高いもののうちの一つである。ＭＣＦ７は、変異ｃ．１６３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ５４５Ｋ）を保持し、Ｔ４７Ｄは、変異ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｈ１０４７Ｒ）を保持する。
【０２１７】
商業的に利用可能ないくつかの起源のｓｉＲＮＡ二重鎖（Ｓｉｇｍａ、ＤｈａｒｍａｃｏｎおよびＱＩＡＧＥＮ）を、ウエスタンブロッティングによって全長タンパク質の発現をモニタリングすることによって、ＭＡＰ３Ｋ１の効率的なノックダウンについて試験した。最良の働きをするｓｉＲＮＡ二重鎖の選択後、細胞を、事前のｓｉＲＮＡ媒介性ＭＡＰ３Ｋ１ノックダウンを伴うまたは伴わずに、ＰＩ３Ｋα選択的阻害剤化合物Ａで処理した。ｓｉＲＮＡノックダウン効果の一過性の性質が原因で、細胞生存率分析は実施可能ではなかった。
【０２１８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびプラスミド導入のためのプロトコル。
細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、一過的に遺伝子導入した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入したＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＭＡＰ３Ｋ１  ｓｉＲＮＡおよびスクランブル陰性対照を遺伝子導入して、４０ｎＭの最終濃度にした。プラスミドの導入は、１５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤと混合した１０μｇ  ＤＮＡを使用して行い、２４および４８時間インキュベートした。
【０２１９】
ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ細胞内のリン酸化されたＡＫＴ（Ｔ３０８）を測定するためのプロトコル。
低継代ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞を、ＡＺ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、以前に記載されている通りに培養した（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ，３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）。野生型およびＭＣＦ１０Ａ−ＰＩ３ＫαＨ１０４７Ｒは、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって提供された。
【０２２０】
培養後、細胞を溶解させ、タンパク質をイムノブロッティング（ＩＢ）（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ，３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）によって分析した。膜を、ＭＡＰ３Ｋ１に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、リン酸化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびビンキュリン（Ｓｉｇｍａ）を使用してブロットした。結合した抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体および化学発光分析（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ，３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）を用いて検出した。
【０２２１】
方法２：ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子における挿入または欠失の産生
ＭＡＰ３Ｋ１不活性化の効果をさらに試験する、また、ヒト乳房腫瘍に見られる変異を模倣するために、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｓｗｅｄｅｎの高精度遺伝子編集技術を利用して、その発現を不活性化するために、ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子における挿入または欠失を産生した。所望されるコンストラクトを用いるＭＣＦ７およびＭＣＦ１０Ａ−ＰＩ３ＫαＨ１０４７Ｒの導入後、個々の細胞を、細胞選別によって選択し、クローンとして成長させた。ＭＣＦ７変異体クローンは、ＭＣＦ７−ＣＲ１およびＭＣＦ７−ＣＲ２であった。ＭＣＦ１０Ａ−ＰＩ３ＫαＨ１０４７Ｒ細胞において産生された変異体クローンは、ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ−ＣＲ１およびＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ−ＣＲ２であった。
【０２２２】
ＭＡＰ３Ｋ１変異体クローンの産生および検証のためのプロトコル。
ｇＲＮＡは、以前に記載された手順（Ｄｏｕｄｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，（６２１３）：１２５８０９６，２０１４；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４，１３８０−９，２０１３；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２，５６９−５７６，２０１４）を使用して設計した。ＭＡＰ３Ｋ１座位を標的にするｇＲＮＡを、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＧＦＰをコードするベクターにサブクローニングし、この配列を、その後確認した。細胞を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して一過的に遺伝子導入し、緑色蛍光（ＧＦＰ）について選別した。モノクローナル培養株を、限界希釈によって選択した。
【０２２３】
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して、増殖クローンから単離した。標的領域を増幅するためのＰＣＲ反応を、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して実施した。１０μｌのＰＣＲ産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を、直接的に変性させ（９５℃、１０分）、ハイブリッド形成させ（−０．１℃／１秒）、ＣｅｌＩ酵素（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｔｉｃ）で処理した。消化された産物を、１０％アクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析した。
【０２２４】
変異したゲノムＤＮＡのサンガーシーケンシング：ＣｅｌＩ分析のために使用された同じＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏクローン化（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、試料あたり少なくとも５つの個々のクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、Ｍ１３リバースプライマーを使用して配列決定した。
【０２２５】
実施例２Ａ
ｓｉＲＮＡ導入を介して産生された細胞株を使用する、ＭＡＰ３Ｋ１発現消失の、化合物Ａの薬理学的活性に対する効果を、ＰＩ３Ｋαの下流のシグナル伝達出力（ｒｅａｄｏｕｔ）の阻害のレベルをモニタリングすることによって調べた。この経路の主な出力は、トレオニン３０８でのＡＫＴのリン酸化である。このリン酸化は、ＰＤＫ１（それ自体がＰＩ３Ｋによって産生されるＰＩＰ３（ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸）によって活性化される）によって実施される。さらなる経路出力は、Ｔｈｒ２４６でのＰＲＡＳ４０（プロリンリッチＡＫＴ１基質）のリン酸化である。このリン酸化は、ｍＴＯＲＣ１複合体の活性化およびｐ７０Ｓ６Ｋの活性化を可能にし、リボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化の増強をもたらす。ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞における化合物ＡによるＰＩ３Ｋαの選択的阻害の影響をモニタリングした（これは、経路活性化および生存について、このアイソフォームに依存することが示されている）（Ｆｒｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＴ，１０：１１５８／１５３５−７１６３，２０１４）。ＭＣＦ７細胞は、活性化しているホットスポットＥ５４５Ｋ変異に起因する、ＰＩ３Ｋ経路の高い基礎レベルの活性を有することが示されている。
【０２２６】
２５０ｎＭ化合物Ａでの２４時間の治療は、ＭＡＰ３Ｋ１  ｍＲＮＡ上で不活性な対照ｓｉＲＮＡ二重鎖であらかじめ遺伝子導入された対照細胞におけるＴｈｒ３０８上のＡＫＴのリン酸化の著しい低下をもたらした（図２Ａ）。一方、ＭＡＰ３Ｋ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、より高い基礎レベルのｐＡＫＴ−Ｔｈｒ３０８シグナル（〜１０倍（ＭＣＦ７）および２．３〜倍（Ｔ４７Ｄ）増大をもたらした（図２Ａ）。
【０２２７】
実施例２Ｂ
高精度遺伝子編集技術を使用して産生された、選択されたＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞株（ＭＣＦ７クローンＣＲ１．４およびＣＲ２．５）を使用して、経路活性も評価した。ＭＡＰ３Ｋ１のｓｉＲＮＡノックダウンを使用する前に観察された通り、この遺伝子の不活性化は、ＭＡＰ３Ｋ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現消失をもたらした。先に見られた通り、ＭＡＰ３Ｋ１の喪失は、Ｔｈｒ３０８上のｐＡＫＴの基礎レベルの増大をもたらした。さらに、化合物Ａを使用するＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害は、ウエスタンブロッティングによって評価されるＴｈｒ３０８上のｐＡＫＴに対するその影響に基づくと、それほど顕著ではない（図２Ｂ）。
【０２２８】
実施例３：親細胞株に対するＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞株の、成長速度ならびに化合物Ａおよび化合物Ｂに対する感受性を決定するための増殖分析。
実施例２に記載したプロトコルおよび方法に従って、本発明者らは、ＰＩＫ３ＣＡ変異体細胞株を使用して、化合物Ａに対する感受性に対するＭＡＰ３Ｋ１欠失の影響を、化合物ＢおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＡＫＴ阻害剤ＧＤＣ−００６８と比較した。
【０２２９】
対照ＭＣＦ７（親）およびＭＡＰ３Ｋ１欠損（ＣＲ２．５）細胞株を、完全増殖培地で培養し、以前に記載されている通りに、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびＧＤＣ−００６８で処理した。一晩のインキュベーション後、細胞溶解物を調製し、ＰＩ３Ｋ経路におけるリン酸化されたタンパク質に対して特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングによって分析した（図３）。
【０２３０】
ＭＡＰ３Ｋ１およびｐＪＮＫ対照ブロットは、それぞれ、タンパク質発現が遺伝子編集を介して効率的に阻害されること、また、経路の機能的不活性化に反映されることを示す。ｐＰＲＡＳ４０抗体は、ＡＫＴ活性の出力として使用した。これは、ＭＣＦ７  ＣＲ２．５細胞株が、より高いｐＰＲＡＳ４０の基礎レベルを有し、さらに、これが化合物Ａ、化合物Ｂ、およびＧＤＣ−００５８阻害に対して抵抗性であることを示す。ｐＳ６  ＲＰ抗体は、ＰＩ３Ｋα活性の遠位出力として使用した。これは、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびＧＤＣ−００６８が、親ＭＣＦ７細胞におけるｐＳ６  ＲＰ活性を効率的に阻害することができるのに対して、ＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞（ＣＲ２．５）は、すべての処理に対して抵抗性であることを示す（図３）。
【０２３１】
このデータは、ＭＡＰ３Ｋ１およびＰＩＫ３ＣＡの同時変異が、ＰＩ３Ｋα経路阻害剤に対する抵抗性を増進すること、また、これは、ＡＺ阻害剤（化合物Ａおよび化合物Ｂ）に特異的ではなく、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＧＤＣ−００６８  ＡＫＴ阻害剤でも観察される一般的な抵抗性現象であることを示唆する。
【０２３２】
実施例４：親細胞株に対するＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞株の、成長速度ならびに化合物Ａおよび化合物Ｂに対する感受性を決定するための増殖分析。
ＭＡＰ３Ｋ１の有害な変異を有し、かつＭＡＰ３Ｋ１タンパク質の発現を有しないことが確認されたクローンを使用して、単層での成長を特徴付け、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ技術を使用して、従来の増殖培地における単層培養での細胞増殖を測定した。
【０２３３】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ技術を使用する増殖分析のためのプロトコル
ＭＣＦ７およびＭＣＦ１０Ａ細胞を、９６ウェルプレートに、それぞれ、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地または５％のＨＳ（ウマ血清）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、２０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。３７℃での１６時間のインキュベーション後、化合物Ａの濃度、化合物Ｂ（３０μＭから１１７ｎＭ）、またはＡＺＤ２０１４（１５μＭから６６ｎＭ）を、分析プレートに添加した。次いで、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅに入れ、６時間ごとに３日間スキャンされるように設定した。コンフルエントデータの相対的割合を、対照のＤＭＳＯ処理細胞に対して規準化し、ＰＲＩＳＭ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して非線形回帰曲線に当てはめた。
【０２３４】
クローンＭＣＦ７−ＣＲ１．４、ＭＣＦ７−ＣＲ１．８、およびＭＣＦ７−ＣＲ２．５は、親ＭＣＦ７細胞よりも２倍速く増殖した。同様に、クローンＨ１０４７Ｒ−ＣＲ２．３およびＨ１０４７Ｒ−ＣＲ２．７は、親ＭＣＦ１０ＡＨ１０４７Ｒ細胞よりも速く増殖した（増殖曲線は示さない）。
【０２３５】
上流ＰＩ３Ｋ経路阻害剤・化合物Ａ（ＰＩ３Ｋα選択的、国際公開第２０１４／１１４９２８号パンフレット参照）、および化合物Ｂ（ＡＫＴ１／２アロステリック阻害剤、国際公開第２００９／０４７５６３号パンフレット参照）、ならびにｍＴＯＲＣ１／２複合体の下流経路阻害剤（ＡＺＤ２０１４、国際公開第２００８／０２３１６１号パンフレット参照）の、Ｈ１０４７Ｒ−ＣＲ２．３およびＭＣＦ７−ＣＲ１．４の増殖に対する効果を試験した（図４、５、および６）。５００ｎＭ化合物Ｂは、ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ親細胞とＭＣＦ７親細胞との両方の増殖を阻害することが可能であったが、得られるＭＡＰ３Ｋ１−変異体細胞株の成長に対する効果は有しなかった（図４および図６）。ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ親細胞と比較して、クローンＨ１０４７Ｒ−ＣＲ２．３の増殖に対する最大効果の半分のために必要とされる化合物Ｂの濃度（ＩＣ５０）は、１０倍増大していることが推定された（図５）。ＭＣＦ７細胞では、増殖に関して、同様の観察が行われた。５００ｎＭ化合物Ｂは、親のＭＣＦ７細胞の成長を低下させることが可能であったが、化合物Ｂの、ＭＣＦ７−ＣＲ１．４の増殖に対する効果は存在しなかった（図４〜Ｄおよび図６Ｂ）。この場合、増殖に関するＩＣ５０は、３倍増大した（図５）。
【０２３６】
本発明者らはまた、化合物Ａの、両方の組の細胞株の増殖に対する効果を試験した。本発明者らは、化合物Ａが、クローンＨ１０４７Ｒ−ＣＲ２．３の増殖に関して、親系統ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ系統と比較して、より高いＩＣ５０を有することを発見した（図４Ａ〜Ｂ、および図５）。ＭＣＦ７−ＣＲ１．４では、親のＭＣＦ７細胞と比較して、同様の効果が見られた（図４Ｃ〜Ｄ、および図５）。
【０２３７】
一方、親細胞株とＭＡＰ３Ｋ１変異体細胞株を比較すると、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤ＡＺＤ２０１４のＩＣ５０の有意な変化は見られなかった（図５）。ＡＺＤ２０１４は、親と変異体バックグラウンドのどちらにおいても、増殖を低下させるのに効率的であった。
【０２３８】
まとめると、これらのデータは、ＰＩＫ３ＣＡ変異のバックグラウンドにおけるＭＡＰ３Ｋ１遺伝子不活性化が、化合物Ａおよび化合物Ｂ、すなわちＰＩ３Ｋ経路の上流成分の２種の阻害剤による癌細胞の増殖の阻害を低下させることを示唆する。一方、下流成分の阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２による増殖の阻害は、ＭＡＰ３Ｋ１不活性化によって影響を受けない。
【０２３９】
実施例５：３Ｄ成長培養における、ＭＡＰ３Ｋ１活性化または喪失の、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤に対する効果の分析
培養で成長させる癌細胞は、３次元形式（３Ｄ）で培養された場合に、阻害剤に対して非常に異なる感受性を示すことができることが知られている。上皮細胞は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の影響下で、十分に組織化された偏向した腺状構造を形成する。ＥＣＭへの接着は、正常な上皮細胞増殖、分化、および生存の制御に必要である。３Ｄマトリゲルは、上皮細胞に適切なインテグリンの足場を提供することによって、インビボのヒト腫瘍状況をある程度再現する。これは、細胞運命決定および薬物感受性を決定する可能性がある受容体および生存タンパク質上の発現に不可欠である。最後に、３Ｄ培養における管腔形成の、また、乳腺発達中の乳管伸長の研究はどちらも、管腔クリアランスにおけるアノイキスの重要な役割を裏付ける（Ｄｅｂｎａｔｈ  ｅｔ  ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，５：６７５−６８８，２００５））。ＭＡＰ３Ｋ１は、ＪＮＫ経路の活性化を介する（アノイキスを含めた）ストレス応答において活性化されることが報告されているので、３Ｄ成長培養は、ＭＡＰ３Ｋ１不活性化または喪失の、細胞成長および生存に対する、より明らかな効果、ならびにＰＩ３Ｋ経路の阻害剤に対する感受性に対するその影響を示すはずである。
【０２４０】
３Ｄ−マトリゲル培養のためのプロトコル
３Ｄ培養については、細胞を、商業的に利用可能な成長因子減少型（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ）マトリゲル（Ｍｇｅｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にプレーティングし、成長させた（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ，３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）。ＩＦ分析のための固定の前に、エンドポイント（第１５日）まで３日ごとに、腺房を５００ｎＭ化合物Ｂで処理した。３Ｄ−マトリゲルＭＣＦ１０Ａ腺房構造は、第１５日に固定し、サイズ測定およびＩＦ顕微鏡分析のために処理した（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ，３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）。
【０２４１】
アノイキス分析については、細胞を収集した（Ａｖｉｖａｒ−Ｖａｌｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＢ、３１（１７）：３６１６−２９，２０１１）。定量化後、５．１０５／ｍｌの細胞を、指示された時点で、適切な増殖培地を伴う超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内に保持した、および／または化合物Ｂで処理した。
【０２４２】
形態形成の１５日後、遺伝子編集を介するＭＡＰ３Ｋ１−阻害（ＭＣＦ７  ＣＲ２．）は、腺房の数を実質的に増加させなかったが、対照（親ＭＣＦ７）腺房と比較した場合に、腺房体積を有意に増大させた（図７Ａ、左パネル）。これは、細胞増殖の増大または／および細胞死（ＥＣＭ欠乏細胞におけるアノイキス）の減少によって説明される可能性がある。後者を試験するために、管腔形成（アノイキスが起こる主要区画）を分析するための、カスパーゼ３（アノイキス出力）での染色、および共焦点エクアトリアル切断（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を実施した。
【０２４３】
さらに、化合物Ｂ処理が、対照培養株（ＭＣＦ７親）における腺房体積を有意に低下させたのに対して、この効果は、ＭＡＰ３Ｋ１欠損腺房において部分的に逆戻りした（図７Ａ、左パネル）。したがって、化合物Ｂが、ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ対照腺房において、陽性の切断カスパーゼ３事象の数の有意な増加を誘発したのに対して、この増加は、ＭＡＰ３Ｋ１欠損ＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ腺房では有意ではなかった（図７Ａ、右パネル）。
【０２４４】
これらのデータは、ＭＡＰ３Ｋ１喪失が、細胞死を低下させ、ＰＩ３Ｋ経路の上流阻害剤によって媒介されるアポトーシスの誘導を減弱することを示唆している。
【０２４５】
ＭＡＰ３Ｋ１阻害が、化合物Ｂ（図３）に対する感受性を低下させることを示唆する以前の２Ｄインビトロデータを確認するために、本発明者らは、３Ｄ−腺房を、ＰＩ３Ｋα経路マーカーｐＳ６  ＲＰで染色した。ＥＣＭ接着細胞（外縁に位置する）は、親腺房において、ｐＳ６  ＲＰに対して陽性であった。予測通り、ｐＳ６  ＲＰ陽性細胞の数は、ＭＣＦ７−ＣＲ２．５において、より大きかった（図７Ｂ、灰色バー）。最後に、化合物Ｂ治療が、親腺房における陽性ｐＳ６  ＲＰ細胞の数を激しく減少させたのに対して、この効果は、ＭＣＦ７  ＣＲ２．５腺房では逆戻りした（図７Ｂ、黒色バー）。
【０２４６】
実施例６：親の対照細胞株に対するＭＡＰ３Ｋ１欠損の成長率を比較するための、インビボ異種移植片分析。
本発明者らは、早期発癌事象をモデル化するために、３Ｄ  ＭＣＦ７およびＭＣＦ１０Ａ−Ｈ１０４７Ｒ培養株分析を使用した。この手法を使用して、本発明者らは、ＭＡＰ３Ｋ１喪失が、腫瘍成長体積を促進し、化合物Ｂ誘導性のアポトーシスを妨げることを観察した。これらは、２Ｄインビトロ分析よりも、より生理学的な手法に相当するが、本発明者らは、インビボ分析を使用して、これを実証した。図８は、移植後２５および４５日でのＭＣＦ７親−対−ＭＣＦ７  ＣＲ２．５の腫瘍体積の違いを示す。第４５日には、違いは、有意ではないのに対して、第２５日には、ＭＡＰ３Ｋ１欠損細胞は、親よりも大きい腫瘍を有し、ＣＲ２．５クローンが、より効率的に生着し、親の対照細胞よりも早く成長することを示唆している。
【０２４７】
方法３：インビボ研究
親ＭＣＦ７および変異体ＭＡＰ３Ｋ１  ＭＣＦ７  Ｃ２．５細胞を、先に記載した通りに、完全増殖培地中で培養した。８０％コンフルエントに到達したら、培養物を以前に記載されている通りに、トリプシン処理し、計数し、移植した（Ｋｅｖｉｎ  Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＭＣＴ，１０．１１５８／１５３５−７１６３．ＭＣＴ−１５−０６８７）。要約すると、５×１０６細胞を、０．５０ｍｇ／２１ｄエストロゲンペレット移植で、ＳＣＩＤマウスの側腹部の皮下に移植した。腫瘍は、目に見えるようになったら、週２回測定し、動物は、体重減少が認められない限り、週２回計量した。腫瘍が約１．６ｃｍ３に到達した時、または腫瘍／動物状態を書き取る時、実験を停止させた。
【０２４８】
本明細書に記載した実施例は、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の遺伝的状態と、ＭＡＰ３Ｋ１／ＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の状態との間の関連を示す。具体的には、ＭＡＰ３Ｋ１またはＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の変異が、ＰＩ３Ｋ−α阻害剤およびＡＫＴ阻害剤などのＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤の効果の低下をもたらすことが示される。一方、ｍＴＯＲなどのＰＩ３Ｋ経路の下流成分の阻害剤では、影響は見られなかった。したがって、ＰＩ３Ｋ経路の上流成分の阻害剤での治療について検討されている患者にとって、患者のＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子の遺伝的状態が決定されることが好都合である。野生型ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４遺伝子を有する患者が、治療について優先的に選択されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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