(57)【要約】以下を含む、成体心筋細胞および最終的に分化した組織における他の静止細胞のような成体細胞における、細胞周期関連遺伝子のサイレンシングを阻害することができる発現ベクター：（a）リジン特異的デメチラーゼ4D（KDM4D）をコードする核酸配列；（b）該核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現を誘導するまたはもたらすプロモーター；および（c）KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。ベクターは、心筋細胞の増殖を含む、哺乳動物における組織特異的な過形成を誘導するための方法において対象に投与され得る。本方法は、心筋梗塞や他の形態の心臓の損傷が生じた後の心機能の改善を含む再生医療を提供する。2018512874.tif 000014
2018512874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む発現ベクター：
（a）リジン特異的デメチラーゼ4D（KDM4D）をコードする核酸配列；
（b）該核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現をもたらすプロモーター；および
（c）KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。
【請求項２】
（b）のプロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項３】
組織特異的プロモーターが、心臓組織、骨格筋、ニューロン、膵島細胞、または肝細胞に特異的である、請求項2記載の発現ベクター。
【請求項４】
調節エレメントがテトラサイクリン応答エレメントである、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項2記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的過形成を誘導するための方法。
【請求項６】
請求項3記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞（CM）の過形成を誘導するための方法。
【請求項７】
請求項3記載の発現ベクターを含有する心筋細胞（CM）を、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物においてCMの過形成を誘導するための方法。
【請求項８】
KDM4DをCMに投与する段階を含む、CMの過形成を誘導するための方法。
【請求項９】
請求項3記載の発現ベクターを含有するCMを、哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物において心機能を改善する方法。
【請求項１０】
請求項3記載の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
【請求項１１】
KDM4Dを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法。
【請求項１２】
CM過形成を誘導するのに有効な条件下においてKDM4Dと共にCMを培養する段階を含む、CMを増殖させる方法。
【請求項１３】
CMが成体CM（ACM）である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
CMにおけるヒストンH3のリジン9（H3K9me3）レベルを減少させる段階を含む、心臓の再生を促進する方法。
【請求項１５】
減少させる段階が、心臓の再生を必要とする対象に請求項3記載の発現ベクターを投与することを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
発現ベクターが、該発現ベクターを含有するCMを投与することによって投与される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
減少させる段階が、KDM4Dを投与することを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
投与が全身投与である、請求項5〜6、8、10〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
投与が静脈内投与である、請求項5〜6、8、および10〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
投与が心筋内注射による、請求項5〜11、および14〜17のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2015年4月20日に出願された米国特許仮出願第62/150,159号の恩典を主張する。
【０００２】
EFS-WEBを介して提出された配列表の参照
2016年4月19日に作成され、EFS-Webを介して本明細書と共に電子的に提出された、サイズ15 kbの「UW57WOU1_ST25」という名の配列表のASCIIテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、核酸分子、ベクター、細胞、および関連組成物、ならびに静止細胞の増殖を誘導するためのそれらの使用および再生医療の方法におけるそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景 
哺乳動物の心筋細胞（CM）の大多数は生後まもなく増殖を停止し、その後の心臓の成長は、過形成、即ち細胞数の増加よりむしろ肥大化、即ち細胞サイズの増大から主に生じる。下等脊椎動物および新生仔哺乳動物損傷モデルにおいて認められる心臓の再生にはCMの増殖が必要とされるため、CMの細胞周期離脱を制御する機構を理解すること、そしてこの細胞周期離脱を元に戻すことができるかどうかということに大きな関心がある。
【０００５】
心不全につながる虚血性心疾患1、2は、世界中で死因の第一位となっている3。成人のヒトの心臓は損傷後に失われたCMを補充できないが、下等脊椎動物および哺乳動物モデルにおいては実質的な心臓の再生が認められる。ゼブラフィッシュ成魚4や新生仔マウス5は、心臓の≧15％が切除された後にその心臓を再生することができる。新生仔マウスの心筋梗塞（MI）モデルは哺乳動物における心臓再生能を示すための、より臨床的関連性の高い損傷モデルを提供する6、7。これらの研究に共通した知見は心臓の再生が生じる機構であった。損傷に応答して血餅の形成、炎症、およびコラーゲン沈着が認められたが、最終的には欠損した組織に新しいCMが再増殖した。予定運命図の研究により、新しい心筋細胞が、心筋前駆細胞または幹細胞とは違い、既存の心筋細胞の脱分化および増殖から生じたことが明らかになった4〜6。しかし、より後期の時点である出生後7日（P7）のマウスで心臓の損傷を誘導した場合には、ヒトMIで認められるものと同様に再生反応はなく、線維性瘢痕5、6が導かれた1、2。従って、哺乳動物の心臓は、生後間もなくその再生能を、即ちCM増殖が必要とされるプロセスを失う。
【０００６】
成体心臓において認められる乏しい再生反応から、成体においてはCMの代謝回転が全くないのかどうかという問題に興味が向けられている。ACMの増殖の程度については議論されてきたが、的確な研究によって、哺乳動物における年間再生率が0.8％であると評価された8、9。しかし、この非常に限られた新しいACMの供給源は既存のACMに由来することが示された8。MI後のACMの過形成率はわずかに増加したものの、ほとんどのDNA合成活性が、完全な細胞分裂ではなく倍数体化および多核形成をもたらした8。ACMの細胞分裂が非常にまれであることに一致して、ACMにおいては胎児CMと比べて細胞周期進行遺伝子の著しいダウンレギュレーションがあることが遺伝子発現解析によって明らかにされている10。大動脈狭窄（TAC）モデルでは、ACMにおけるG1/S期促進遺伝子の発現が刺激されるが、有糸分裂および細胞質分裂を促進する遺伝子はサイレンシングされたままである10。G1/S期の遺伝子はCMの肥大化に必要であるため11、12、その遺伝子発現の結果は、TACまたはMI後にACMにおいて示された、肥大化に制限された成長やDNA量の増加と一致する8、13。従って、ACMは細胞分裂とはつながりのない細胞の成長を行う14。興味深いことに、CMの肥大性成長への転換は出生後の再生能喪失と同時期に起こる5、6、13。
【０００７】
G2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の安定的なサイレンシングは、CMが最終分化を経る際に生じる遺伝子発現プロフィールの変化の一部を表している13。近年の研究では、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾、DNAメチル化、および非コードRNAのようなエピジェネティックな機構が、心臓の成長や疾患の際に起こる遺伝子発現の変化を導くことが示唆される6、15〜19。エピジェネティックな機構を調節することによって、青年期までのCMの増殖能や再生能の喪失を遅らせることが可能であるが、成体の心臓の再生については未だ理解されていない20。単純化すると、エピジェネティック的に定義された2つの型のクロマチン構造および機能がある：アクセス可能な、活発に転写されるユークロマチン、およびそれとは対照的に、凝縮された、転写型サイレンシングされたヘテロクロマチンである21、22。各々のクロマチン型はヒストン修飾とクロマチン関連タンパク質の別個のセットに関連している22〜24。ヒストン修飾は、その構造を物理的に変えることによって25〜27、また修飾特異的結合ドメインを有する他のエフェクタータンパク質を動員することによって21、22、異なる状態のクロマチンを確立すると考えられる。一般に、ユークロマチンではヒストンのアセチル化、H3K4me3、およびH3K36me3が増えており、それらは転写機構を動員する22。対照的に、ヘテロクロマチンでは、H3K9me3、H3K27me3、およびH4K20me3：ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）ファミリーメンバー、ポリコームタンパク質、および他の抑制的エフェクターを動員する抑制的メチル化が増えている21、22。興味深いことに、永続的に細胞周期を離脱した細胞は、核内のクロマチン形成において著しい差異を示す。増殖する胎児CMでは、限られたヘテロクロマチンが核内に多くの小さなfociを形成して存在するが、ACMでは、これらのfociが付加的なヘテロクロマチンと共に核ラミナにおける少数の大きなfociへと集積している10。他の非増殖性細胞においても同様のパターンが認められる；ヘテロクロマチンの集積は、最終分化および細胞周期離脱と同時期に起こる28〜30。
【０００８】
E2Fおよび網膜芽細胞腫ファミリーメンバー（Rb、p107、p130）は、細胞周期関連遺伝子とクロマチン構造制御の境界面にある31〜34。増殖している細胞においては、E2Fファミリータンパク質が多くの細胞周期進行関連遺伝子のプロモーターに認められるコンセンサス配列に結合し、細胞分裂の主要な制御因子として作用する34、35。低リン酸化型RbファミリーメンバーがE2Fに結合した場合、細胞周期関連遺伝子の発現および細胞の増殖が阻害される。しかし、分裂促進的な刺激はRbタンパク質のリン酸化を導くことが可能であり、E2Fが解離されて細胞周期関連遺伝子の発現が活性化される34。静止細胞とは対照的に、最終的に分化した骨格筋細胞および心筋細胞は分裂促進的な刺激に応答して増殖しない36、37。この永続的な細胞周期離脱は、H3K9me3およびH3K27me3関連タンパク質がE2F依存性遺伝子プロモーターへRb依存的に動員されることによって仲介される10、32、38、39。胎児CMと比較してACMでは、細胞周期関連遺伝子プロモーター上にH3K9me3およびH3K27me3が高度に濃縮されており、G2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子プロモーター上にH3K9me3の優先的な濃縮が示される10。ACM特異的なRbノックアウト（KO）は、生殖系列のp130の欠失と組み合わせると、ACMにおける細胞周期関連遺伝子のヘテロクロマチン形成を抑制した10。これらのマウスのACMでは、G2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子を含む細胞周期関連遺伝子がアップレギュレートされ、その結果ACMの増殖がもたらされた。Rb/p130 KOマウスは心不全を発症したが、それがACM増殖の結果であるのか、または遺伝子発現プロフィールのより幅広い変化や全体的なヘテロクロマチン形成の減少によるものなのかどうかは不明である10。Rbファミリータンパク質は細胞周期外での遺伝子発現をも司る多くのクロマチン修飾因子および転写因子と相互作用するため33、34、Rb/p130 KO心臓における変化を単一の因子または経路によるものとすることは難しい。H3K9me3メチルトランスフェラーゼSuv39h1をノックダウンすることによってインビトロにおいてH3K9me3の特異的摂動を生じさせた結果、ACMにおけるG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の特異的な再誘導を伴う、H3K9me3の全体的な減少が認められたが、これはインビボにおいては認められなかった10。HP1γのノックダウンでも、ACMにおいて後期細胞周期関連遺伝子が特異的に再誘導されたことから、インビトロにおいてはこれらの遺伝子のサイレンシングにH3K9me3およびその下流のエフェクターが必要であることが示されるが10、インビボにおけるその生理学的な役割は未だ明らかではない。
【０００９】
CMの細胞周期離脱を制御する機構を解明し、この細胞周期離脱を元に戻すことができるような方法を提供することがなおも必要である。心不全および関連死の発生率を低下させるための、虚血性心疾患を治療する方法がさらに必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、成体心筋細胞や最終分化組織における他の静止細胞のような成体細胞における、細胞周期関連遺伝子のサイレンシングを阻害できる発現ベクターを提供する。増殖を誘導するために本発明のベクターや方法を使用できる静止細胞や最終分化組織の他の例は、非限定的に、骨格筋、ニューロン、膵島細胞、および肝細胞を含む。これらのベクターや方法は、再生医療および組織修復のためのツールを提供する。
【００１１】
ある態様においては、発現ベクターは以下を含む：（a）リジン特異的デメチラーゼ4D（KDM4D）をコードする核酸配列；（b）核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現を誘導する、またはもたらすプロモーター；および（c）KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。任意で、ベクターは（d）核酸配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターをさらに含む。または、（b）において組織特異的プロモーターを選択することによって、KDM4Dの組織特異的な過剰発現を得ることができる。KDM4Dは、ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）の9番目のリジン残基（H3K9）を脱メチル化することによってヒストン修飾H3K9me3を特異的に取り除くことが可能である。
【００１２】
ある態様においては、（b）のプロモーターは組織特異的プロモーターである。別の態様においては、個別のプロモーターが上記の（b）および（d）において説明された機能を担う。組織特異的プロモーターの代表的な例は、非限定的に、心臓組織、骨格筋、ニューロン、膵島細胞、または肝細胞に特異的なプロモーターを含む。組織特異的なプロモーターは、特定の組織において優勢的に、核酸配列によってコードされる遺伝子の発現を促進する。ある態様においては、組織特異的プロモーターは心臓組織特異的である。α-ミオシン重鎖（αMHC）プロモーターは心臓特異的プロモーターの一例である。別の態様においては、組織特異的プロモーターは肝組織または肝細胞に特異的である。CBAプロモーターは肝臓特異的プロモーターの一例である。当技術分野において公知の組織特異的プロモーターの他の例は、ニューロンについてのニューロン特異的エノラーゼ（NSE）およびチューブリンα1プロモーター、肝細胞についてのα1-アンチトリプシンおよびアルブミン（ALB）プロモーター、ならびに心筋細胞についてのトロポニン、CMV、またはミオシン軽鎖2（MLC2）を含む。
【００１３】
発現（または過剰発現）を誘導的に抑制できる調節エレメントの代表的な例は、非限定的に、テトラサイクリン応答エレメントを含む。当業者には、同様の方法で使用して、一時的にでも組織学的にでもKDM4Dの発現を制御するために適合できる、調節された遺伝子発現の代替法が理解される。例えば、ある態様において調節エレメントはKDM4D発現の正の制御を可能にする一方、別の態様において調節エレメントはKDM4D発現の負の制御を可能にする。別の態様において調節エレメントはKDM4D発現の組織特異的および／または条件特異的な制御を可能にする。
【００１４】
本明細書において説明される方法で使用するためのベクターは、ウイルスベクター、および非ウイルスベクター、ウイルス様粒子、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、および当技術分野において公知の他のベクターを含む。ある態様においては、ベクターはウイルスベクターである。特定の態様においては、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、または静止細胞を感染させるのに適した他のベクターである。AAVベクターの代表的な例は非限定的に、AAV6およびAAV9を含む。
【００１５】
本発明はまた、KDM4Dを介して細胞中のH3K9me3レベルを減少させることによって哺乳動物細胞の増殖を誘導するための方法をも提供する。ある態様において本発明は、本明細書において説明されるように発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的な過形成を誘導するための方法を提供する。本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞（CM）の過形成を誘導するための方法も提供される。本発明は、哺乳動物において心筋細胞（CM）の過形成を誘導するための方法をさらに提供する。本方法は、本発明の発現ベクターを含有するCMを哺乳動物の心臓に移植する段階を含む。
【００１６】
本発明は、KDM4DをCMに投与する段階を含む、CMの過形成を誘導するための方法をさらに提供する。KDM4Dは、KDM4Dの活性を保護する、ペプチドの修飾および／または送達法を用いて投与することができる。投与は、経口、静脈内、皮下、または経皮投与であり得る。
【００１７】
ある態様において本発明は、本発明の発現ベクターを用いて遺伝子組換えされた細胞を器官に移植する段階を含む、哺乳動物における器官の機能を改善する方法を提供する。器官は、例えば、心臓、筋肉、脳、膵臓、または肝臓であり得る。ある態様において本発明は、本発明の発現ベクターを含有するCMを哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法を提供する。別の態様において本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法を提供する。KDM4Dを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法も提供される。
【００１８】
本発明は、CMの過形成を誘導するのに有効な条件下においてCMをKDM4Dと共に培養する段階を含む、CMを増殖させる方法をさらに提供する。ある態様においては、CMは成体CM（ACM）である。加えて、本発明は、CMにおけるヒストンH3のリジン9（H3K9me3）レベルを減少させる段階を含む、心臓の再生を促進する方法を提供する。ある態様においては、減少させる段階は、心臓の再生を必要とする対象に本発明の発現ベクターを投与することを含む。特定の態様において発現ベクターは、発現ベクターを含有するCMを投与することによって投与される。別の態様において減少させる段階は、KDM4Dを投与することを含む。
【００１９】
本発明の方法は、特定の状況について好適であると当業者に理解される様々な方法のうち任意の方法で対象に投与を行うことを含み得る。ある態様においては、投与は全身投与である。別の態様においては、投与は静脈内投与である。ある態様においては、投与は心筋内注射による。対象は典型的に哺乳動物である。ある態様においては、哺乳動物はヒトである。別の態様においては、哺乳動物は家畜である。家畜の例は、非限定的に、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびネコの対象を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】成長および疾患におけるヒストンデメチラーゼの特徴付け。（1A〜1D）成長を通じた、E15.5、P3、P7、および10週（成体）でのCMにおける（1A）心筋細胞遺伝子の、（1B）細胞周期進行遺伝子の、（1C）細胞周期制御因子の、および（1D）KDM4 H3K9me3デメチラーゼファミリーメンバーの発現レベル。（1E）脱分化したマウスACMにおけるHDMの遺伝子発現。（1F）ヒト虚血性心筋症サンプル（IHD）におけるKDM4D発現、発現はGAPDHを用いて正規化された。サンプル数：（A〜D）P0=3、P3=2、P7=4、10週=3。（1E）ACM=3、脱分化ACM=3。（1F）健常=2、IHD=3。統計：(1A〜1D)一元配置ANOVA/Tukey法、*P<0.05対E15.5、†P<0.05対P3、‡P<0.05対P7。（1E〜1F）両側t検定、*P<0.05。
【図２】心筋細胞特異的KDM4Dモデルの作製。（2A）BiTgマウスを得る繁殖手順およびBiTg CMにおけるKDM4D誘導を示す概略図。（2B）BiTg ACMおよびP14心臓においてはKDM4D導入遺伝子の発現が強く誘導される、誘導倍率対tet対照。（2C）BiTgマウスはCMにおいて特異的にKDM4D（FLAGタグ）の核局在を示す。（2D）9週のACMにおけるKDM4Dタンパク質誘導および特異的ヒストンメチル化の全体的レベル。サンプル数：（2B〜2D）各アッセイでの1群当たりの動物個体数は≧3であった。統計：一元配置ANOVA／Tukey法、*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。
【図３】KDM4D過剰発現ACMにおける遺伝子発現。（3A）「細胞プロセス」および（3B）「細胞周期プロセス」についての遺伝子オントロジーエンリッチメントスコア。GOエンリッチメントスコアは、9週のBiTg ACMにおいて対照と比べて>3倍増となった遺伝子が全て含まれるリストから作成した。（3C）9週のACMにおけるCMおよび細胞周期関連遺伝子の発現、誘導倍率対非Tg。サンプル数：（3A〜3B）対照=2、BiTg=2。（3C）非Tg=3、tet=6、tTA=3、BiTg=5。統計：（3A〜3B）発現が有意に変化した遺伝子を同定するために一元配置ANOVAを使用した（P<0.05）。有意なエンリッチメントスコアを有するGO用語（term）を同定するためにFisher直接確率検定を用いた（P<0.05）。（3C）一元配置ANOVA／Tukey法、*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。
【図４】KDM4D誘導マウスにおいては心臓質量が増大する。（4A）9週における、PFA固定BiTg心臓および対照心臓を示す代表的な画像、目盛=1mm。（4B）心臓成長の表現型はBiTgマウスに特異的であることを示す、9週におけるHW/BWの定量化。（4C）異なる齢のマウスにおける、HW/BWの定量化、各時点において対照に対して正規化を行った。（4D）9週の非Tg心臓およびBiTg心臓におけるH&E染色。（4E）9週の非Tg心臓およびBiTg心臓におけるWGA染色、TAC術後4週の非Tgマウスでは、目に見える線維化が生じた。サンプル数：（4A〜4B）非Tg=6、tet=11、tTA=9、BiTg=10。（4C）P0、対照=22、BiTg=9；P14、対照=14、BiTg=6；9週 対照=26、BiTg=10；7ヶ月 対照=19、BiTg=10。（D〜E）各群につきN≧3の中からの代表的な画像。統計：（4B）一元配置ANOVA／Tukey法、*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。（4C）両側t検定、対照対BiTg、*P<0.05。
【図５】BiTgマウスにおいては心筋細胞数が増加する。（5A）左図、9週の非TgおよびBiTgのPFA固定心臓におけるWGA染色、スケールバー=20μm。右図、ACM横断面積の定量化。分散した9週の単離CMにおいて測定された（5B）縦断面積の定量化および（5C）長さの定量化。下に代表的な画像。（5D）9週齢において計算されたACM体積、および（5E）ACM数。サンプル数：（5A〜5E）各アッセイでの各群当たりの動物個体数は≧3であった。統計：（5A）一元配置ANOVA／Tukey法、*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。（5B、5C）両側t検定、対照対BiTg、*P<0.05。（5D〜5E）標準誤差をコンピュータ算出するためにブートストラップ法を使用し、p値をコンピュータ算出するために並べ替え検定を用いた。*P<0.05。
【図６】成体BiTg心臓における、心筋細胞の持続性の低レベルの細胞周期活性。（6A）P14および（6B）9週の非TgおよびBiTgの心臓切片における、有糸分裂マーカーであるホスホH3（pH3）による染色。スケールバー=40μm。（6A）白矢印はpH3+ 非CM核を指す。黄色い矢頭はpH3+ CM核を指す。（6B）右図は四角く囲った部分の拡大図。スケールバー=10μm。（6C）9週のBiTg心臓における細胞周期進行マーカーKi67。スケールバー=10μm。（6D）7月齢のACMにおける核数の定量化。サンプル数：（6A〜6D）各アッセイでの1群当たりの動物個体数は≧3であった。統計：（6D）両側t検定、対照対BiTg、*P<0.05。
【図７】成体BiTg心臓において、KDM4Dの発現は過形成性の成長を誘導する。（7A）BiTgマウスにおける、CM特異的KDM4D発現の一時的な調節のためのドキシサイクリンの使用を示す概略図。（7B）成長に伴い制限されるKDM4D発現についてのプロトコルの予定表。（7C）ドキシサイクリン（dox）処理マウスの9週または3週の心室におけるKDM4D発現、tet対照と比較した誘導倍率。（7D）CM特異的KDM4D発現が誘導されていない（Dox E0-9w）、P14においてオフされた（Dox 2w-9w）、および構成的に発現された（doxなし）、9週のマウスモデルにおけるHW/BW。サンプル数：DoxE0-9w、対照=17、BiTg=4；Dox2w-9w、対照=11、BiTg=8；doxなし、対照=26、BiTg=10。統計：二元配置ANOVA/Tukey法、*P<0.05対DoxE0-9w対照およびBiTg、Dox2w-9w対照およびBiTg、ならびにdoxなし対照。
【図８】血行力学的負荷はBiTg心臓における過形成性の成長を刺激する。（8A）メタノール固定心臓の代表的な画像、ならびに（8B）術後10日における対照心臓およびBiTg心臓のHW/BWの定量化、スケールバー=2mm。（8C）施術マウスの代表的なMassonトリクローム染色。サンプル数：偽手術、対照=4、BiTg=4；TAC、対照=9、BiTg=8。統計：（8B）二元配置ANOVA/Tukey法、*P<0.05対偽手術対照、†P<0.05対偽手術BiTg、‡P<0.05対TAC対照。
【図９】圧負荷はBiTgマウスにおけるACMの有糸分裂活性を刺激する。（9A）TAC心臓の低倍率および高倍率の画像。スケールバー=40μm（上図）または20μm（下図）、白矢印はpH3+ 非CM核を指し、黄色の矢頭はpH3+ ACM核を指す。（9B）対照心臓およびBiTg心臓におけるACMの有糸分裂活性の定量化、術後10日。（9C）メタノール固定心臓におけるACM横断面積の定量化、術後10日。（9D）心筋細胞数の評価。サンプル数：（9A-9D）偽手術、対照=3、BiTg=3；TAC、対照=8、BiTg=7。統計：（9B、9C）二元配置ANOVA/Tukey法、*P<0.05対偽手術対照、†P<0.05対偽手術BiTg、‡P<0.05対TAC対照。（9D）標準誤差をコンピュータ算出するためにブートストラップ法を使用し、p値をコンピュータ算出するために並べ替え検定を用いた。*P<0.05対対照。
【図１０】KDM4AはACMにおけるH3K9me3およびH3K36me3を脱メチル化する。（10A）培養した野生型ACMにおける、アデノウイルスを介したKDM4A過剰発現プロトコルの予定表。（10B）（上図）未感染ACM、および（下図）lacZ-感染ACMにおける、β-ガラクトシダーゼ染色、>80％感染効率を示す。（10C）KDM4Aを発現するACMではH3K9me3およびH3K36me3の全体的な減少が認められるが、H3K27me3の減少が認められないことを示すイムノブロット（Millipore 07449）。ロード対照としてラミンA/C（Cell Signaling 47775）およびH3が使用された。サンプル数：各群につきN≧3。
【図１１】CM特異的KDM4D導入遺伝子の発現。（11A）9週齢における、様々なBiTg組織サンプルでのKDM4D導入遺伝子の発現、BiTg心臓における発現レベルに対して正規化。（11B）非CM心臓細胞においては発現がないことを示す、外因性KDM4D（FLAGタグ）免疫染色。
【図１２】BiTg ACMにおける細胞周期制御因子。（12A）9週のACMにおけるE2Fファミリーメンバーの遺伝子発現（RNA-seq、RPKM、対照に対する誘導倍率）。（12B）9週のACMにおける細胞周期制御因子のqRT-PCR、非Tgに対する誘導倍率。サンプル数：（12A）各群につきN=2、（12B）非Tg=3、tet=6、tTA=3、BiTg=5。統計：（12A）両側t検定、*P<0.05。（12B）一元配置ANOVA／Tukey法、*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。
【図１３】術後10日においてアポトーシス細胞は検出されない。（13A）ビブラトーム切片におけるTUNEL染色の代表的な画像。（13B）成体非施術マウスのデオキシリボヌクレアーゼI処理した心臓切片では強い核特異的シグナルがあり、本発明者らのアッセイでTUNEL染色を検出できることが示される。サンプル数：各群につきN=2。
【図１４】BiTg心臓では心筋の増加およびLV内腔の拡張が認められる。（14A）乳頭中央のビブラトーム切片の代表的な画像、スケールバー=2mm。（14B）心筋面積および（14C）LV内腔面積の定量化。サンプル数：各群につきN=3。統計：二元配置ANOVA/Tukey法、*P<0.05対偽手術対照、†P<0.05対偽手術BiTg、‡P<0.05対TAC対照。
【図１５】増殖性CMにおける独特のクロマチン構造。（15A）ヘテロクロマチンマーカーH3K9me3（Active Motif、39161）とユークロマチンマーカーH3K36me3（Diagenode、C15200183）の抗局在化を示す、胎児および出生後の野生型の心臓切片における免疫染色；出生後成長中におけるクロマチン形成の変化も認められる、スケールバー=5μm。（15B）BiTg心臓切片において、pH3+ ACM核（矢頭）は、典型的なACMクロマチン形成（矢印）とは対照的な、胎児CMに似たヘテロクロマチン形成を示す。
【図１６】新生仔マウス再生モデル。上の概略図は、P7においてMIを生じさせ、POD21において組織学的検査および遺伝子型解析のために屠殺したBiTgマウスの作製のための予定表を示している。瘢痕検出にはMI後21日にシリウスレッド＋ファストグリーン染色を使用する。線維化面積は（L600およびL800での線維化面積の総計／L600およびL800でのLVにおける心筋面積の総計）×100から得られたパーセンテージとして解析する。
【図１７】KDM4を過剰発現するマウスではMI後の再生が増強された。左図の組織学切片は、L0〜L1000の所定の時点で採取された非BiTgサンプルおよびBiTgサンプルを示す。右図の棒グラフはこれら2群についての、平均および最大の線維化面積のパーセントを示す。
【図１８】成体CM特異的KDM4Dの発現は、ACMにおいて後期細胞周期関連遺伝子発現を誘導するのに十分である。（18A）P21までのドキシサイクリン投与、およびその後のKDM4D過剰発現の概略図。（18B）E0-P21においてドキシサイクリン処理した、またはドキシサイクリン処理をしなかったtet対象およびBiTg対象の双方についてプロットしたKDM4Dの誘導倍率。（18C）非BiTg対象およびBiTg対象についての、所定の遺伝子の誘導倍率。
【図１９】MI後の成体CM特異的KDM4Dの発現および細胞周期活性を示す予備データ。ドキシサイクリン飼料をE0-P28に与えた。MIはKDM4D過剰発現期間の10週と、14週（MI後30日）に生じさせた。ホスホH3、ファロイジン、WGAおよびヘキストを用いて組織を検査し、対照（左図）とBiTg（右図）を比較した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、最終的に分化した細胞を、エピジェネティックな操作を介して増殖させるように誘導できるという予想外の知見に基づいている。従って本発明は、ACM細胞周期関連遺伝子のサイレンシングの制御におけるH3K9me3デメチラーゼの役割の発見に基づき、静止細胞において増殖を可逆的に誘導するための材料および方法を提供する。
【００２２】
ヒストンデメチラーゼ（HDM）の発見以前は40、H3K9me3およびヒストンメチル化は一般に永続的な指標であると考えられていた41。しかし、ヒストンメチル化の動的性質が理解されつつある一方で42〜44、心臓におけるHDMの機能についてはわずかしか知られてはいない。興味深いことに、H3K9me3デメチラーゼのKDM4ファミリーメンバーは、幾つかの形態の癌においてアップレギュレートされて、細胞の増殖や生存を促進すると考えられている45〜48。心臓においては、KDM4ファミリーの1メンバーであるKDM4Aについて研究されてきた17、49。マウスにおいては、CM特異的なKDM4Aの過剰発現によってTAC誘導の肥大および胎児CM遺伝子発現が悪化した一方、CM特異的なKDM4Aの欠失によって圧負荷の効果が減少した；しかしいずれの操作もベースラインにおいては影響なかった49。反応機構の研究から、新生仔CMにおいてはKDM4AのノックダウンによってANPプロモーターにおけるH3K9me3レベルが上昇し、ANPの発現を適度にダウンレギュレートすることが示された17。ANPの発現を誘導する前負荷を高めた、単離され鼓動している心臓モデルにおいては、ANPプロモーター上のH3K9me3およびHP1の濃縮は減少した17。しかし、本モデルにおいてはANP遺伝子プロモーター上のKDM4Aの発現および濃縮には変化がなかった17。従って、KDM4AがACMにおいて胎児CM遺伝子発現をどのように制御しているのかは明らかではない。これらの結果の解釈をさらに複雑にしているのは、KDM4Aは抑制的H3K9me3を脱メチル化できるが、H3K36me3の活性化も行うという二重基質特異性が、KDM4Aにはあるという事実である50〜52。本発明者らは、アデノウイルスを介してKDM4Aを過剰発現させたACMにおいては、これらの修飾のいずれの全体的なレベルも減少するということをも見出した。KDM4ファミリーの1メンバーであるKDM4Dは、強く特異的なH3K9デメチラーゼ活性を有することから、H3K9me3を特異的に研究する実験ツールとして特に有用性が高い。本研究以前には、KDM4Dについては探求されていなかった。
【００２３】
定義
特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての科学的および技術的な用語は、当技術分野において一般に使用される意味を有する。本明細書において使用される場合、以下の単語または句は特定の意味を有する。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「リジン特異的デメチラーゼ4D」または「KDM4D」は、ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）の9番目のメチル化リジン残基（H3K9）に特異的なデメチラーゼ活性を示すリジン特異的デメチラーゼのKDM4ファミリーの特定のメンバーを意味する。ある態様においては、KDM4DはSEQ ID NO：1において示されるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列は任意に、SEQ ID NO：2において示されるように、例えばMYCタグおよび／またはFLAGタグのようなタグをさらに含む。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「誘導的に抑制する」または「誘導的抑制」は、ある誘導条件を導入した際に遺伝子の発現を抑制できるような遺伝子発現の制御を意味する。誘導条件とは、抑制をもたらす作用物質の投与、または作用物質との接触であり得る。作用物質は、遺伝子発現を抑えるコリプレッサーが存在する場合以外は発現がオンとなる、抑制性遺伝子制御において認められるようなコリプレッサーであることが可能である。または、作用物質は、インデューサーが存在して遺伝子発現が可能になる場合以外は発現がオフとなる、誘導性遺伝子制御において認められるようなインデューサーであり得る。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「調節エレメント」は遺伝子発現を制御するエレメントを指す。調節エレメントは、ある条件の有りまたは無しに応じて、遺伝子発現を誘導または抑制することができる。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「テトラサイクリン応答エレメント」は、テトラサイクリンまたはその誘導体、例えばドキシサイクリンの存在下においてtet誘導性プロモーターからの発現を減少させる調節エレメントを指す。テトラサイクリン応答エレメントの一例は、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）と、単純ヘルペスウイルス（HSV）のVP16のC末端ドメインのような転写活性化ドメインとの融合によって作製される、テトラサイクリン調節性トランス活性化因子（tTA）である。
【００２８】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にあるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーの配列を指し、他に限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の仕方で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「プライマー」という用語は、増幅されるべきDNAのある領域に隣接するように設計されたオリゴヌクレオチドを意味する。あるプライマーペアーにおいて、一方のプライマーは、増幅されるべきあるポリヌクレオチド断片の末端のセンス鎖上にあるヌクレオチドに相補的であり、他方のプライマーは増幅されるべきポリヌクレオチド断片の別の末端のアンチセンス鎖上にあるヌクレオチドに相補的である。プライマーは少なくとも約11個のヌクレオチドを有し得、好ましくは、少なくとも約16個で約35個以下のヌクレオチドを有し得る。プライマーは典型的に、プライマーがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドと少なくとも約80％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「プローブ」という用語は、関心対象の別のオリゴヌクレオチドの少なくとも部分にハイブリダイズするような、天然のオリゴヌクレオチド、または組換え法もしくはPCR増幅による合成によって作製されたオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖または二本鎖であることが可能である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「活性断片」という用語は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするということと同じ機能を行い得る、オリゴヌクレオチドの実質的な部分を指す。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイズする」「ハイブリダイズしている」および「ハイブリダイゼーション」は、標準的な条件下においてオリゴヌクレオチドが標的DNA分子と非共有結合性の相互作用を形成することを意味する。標準的なハイブリダイズ条件は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが標的DNA分子にハイブリダイズすることを許容するような条件である。当技術分野において周知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーおよびその標的DNA分子についてのそのような条件は容易に決定される。標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は一般に、オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブに相補的な配列である。ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、非共有結合性の相互作用の形成を妨げない、ハイブリダイズしないヌクレオチドを含有し得る。あるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのハイブリダイズしないヌクレオチドは、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの末端に、またはハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置し得る。従って、あるオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーは、標準的なハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイゼーションが行われる限り、標的配列の全てのヌクレオチドに相補的である必要はない。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「相補鎖」および「相補的」という用語は、2つのDNA分子の互いに塩基対となる能力を指し、あるDNA分子上のアデニンは第二のDNA分子上のグアニンと塩基対をなし、あるDNA分子上のシトシンは第二のDNA分子上のチミンと塩基対をなす。あるDNA分子におけるヌクレオチド配列が第二のDNA分子におけるヌクレオチド配列と塩基対をなすことができる場合に、2つのDNA分子は互いに相補的である。例えば、2つのDNA分子5’-ATGCと5’-GCATは相補的であり、DNA分子5’-ATGCの相補鎖は5’-GCATである。相補鎖および相補的という用語は、あるDNA分子が、第二のDNA分子上の少なくとも１つのヌクレオチドとは塩基対をなさないような少なくとも1つのヌクレオチドを含有する場合の、2つのDNA分子をも包含する。例えば、2つのDNA分子5’-ATTGCおよび5’-GCTATの各々の3個目のヌクレオチドは塩基対をなさないが、本明細書において定義づけられるように、これら2つのDNA分子は相補的である。典型的に、上記に言及される標準的な条件下においてハイブリダイズする場合、2つのDNA分子は相補的である。典型的に、少なくとも約80％の配列同一性を有する場合、好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有する場合、2つのDNA分子は相補的である。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「１つの」または「ある」は、明らかに他に指示されない限り、少なくとも１つを意味する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、ある状態または疾患「を予防する」または「から保護する」は、状態または疾患の発症または進行を妨げる、低減させる、または遅延させることを意味する。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、天然に生じるDNA断片、DNA分子、コード配列、またはオリゴヌクレオチドがその天然の環境から切り離されること、または合成分子もしくはクローニングされた産物であることを意味する。好ましくは、DNA断片、DNA分子、コード配列、またはオリゴヌクレオチドは精製されている、即ち、他のDNA断片、DNA分子、コード配列、またはオリゴヌクレオチドおよび関連細胞産物もしくは他の不純物を本質的に含まない。  
【００３７】
ベクター
ある態様においては、発現ベクターは以下を含む：（a）リジン特異的デメチラーゼ4D（KDM4D）をコードする核酸配列；（b）核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現を誘導する、またはもたらすプロモーター；および（c）KDM4Dの過剰発現を誘導的に抑制する調節エレメント。任意に、ベクターは（d）核酸配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターをさらに含む。ある態様においては、組織特異的なKDM4Dの過剰発現は、（b）において組織特異的プロモーターを選択することによってなされる。ある態様においては、組織特異的発現は（b）と付加的なプロモーター（d）の双方によって提供される。KDM4Dは、ヒストン3の9番目のリジン残基（H3K9）を脱メチル化することによって、ヒストン修飾H3K9me3を特異的に除去することができる。
【００３８】
（b）のプロモーターは組織特異的プロモーターであることが可能であり、またある態様においては別々のプロモーターが上記の（b）や（d）において説明される機能を担う。組織特異的プロモーターの選択は、標的組織における優先的な発現を最大化する一方で他での意図されない発現を最小化するように企図される。組織特異的プロモーターの代表的な例は、非限定的に、心臓組織特異的プロモーター（ミオシン重鎖、トロポニンIまたはT）、骨格筋特異的プロモーター（ミオゲニン、MyoD、筋肉クレアチンキナーゼ）、ニューロン、膵島細胞、または肝細胞に特異的なプロモーターを含む。組織特異的プロモーターは、特定の組織において優勢的に、核酸配列によってコードされる遺伝子の発現を促進する。ある態様において組織特異的プロモーターは、心臓組織に特異的である。α-ミオシン重鎖（αMHC）プロモーターは、心臓特異的プロモーターの一例である。別の態様において組織特異的プロモーターは、肝臓組織、または肝細胞に特異的である。CBAプロモーターは肝臓特異的プロモーターの一例である。当技術分野において公知の組織特異的プロモーターの他の例は、ニューロンについてのニューロン特異的エノラーゼ（NSE）およびチューブリンα1プロモーター、肝細胞についてのα1-アンチトリプシンおよびアルブミン（ALB）プロモーター、ならびに心筋細胞についてのトロポニン、CMV、またはミオシン軽鎖2（MLC2）を含む。
【００３９】
発現（または過剰発現）を誘導的に抑制できる調節エレメントの代表的な例は、非限定的に、テトラサイクリン応答エレメントおよびホルモン反応性タンパク質を含む。当業者には、同様の方法で使用して、一時的にでも組織学的にでもKDM4Dの発現を制御するために適合できる、調節された遺伝子発現の代替法が理解される。例えば、ある態様において調節エレメントはKDM4D発現の正の制御を可能にする一方、別の態様において調節エレメントはKDM4D発現の負の制御を可能にする。別の例においては、調節エレメントは組織特異的および／または条件特異的なKDM4D発現制御を可能にする。KDM4Dの発現をオフにする能力が望ましいが、全ての態様で必要不可欠なわけではない。ある態様において本発明は、リジン特異的デメチラーゼ4D（KDM4D）をコードする核酸配列、および、核酸配列に機能的に連結された、KDM4Dの過剰発現を誘導する、またはもたらすプロモーターを含むベクターを提供する。
【００４０】
本明細書において説明される方法において使用するためのベクターはウイルスベクター、そして非ウイルスベクター、ウイルス様粒子、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、および当技術分野において公知の他のベクターを含む。ある態様においては、ベクターはウイルスベクターである。特定の態様においては、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、または静止細胞を感染させるのに適した他のベクターである。AAVベクターの代表的な例は、非限定的に、AAV6およびAAV9を含む。
【００４１】
KDM4Dアミノ酸配列（SEQ ID NO：1）：
2018512874.tif 000003
【００４２】
myc（下線）およびflag（網掛け）タグを有する任意の付加的なアミノ酸配列（SEQ ID NO：2）：
2018512874.tif 000004
【００４３】
組成物およびキット
本発明は、本明細書において説明される方法のためにキットとして提供することができる、および／または、使用することができる組成物を提供する。本発明の組成物は、本明細書において説明されるようなベクター、核酸分子、および細胞を含む。本発明の組成物およびキットは、本発明の実施を容易にするための付加的な容器、作用物質、および材料を包含し得る。
【００４４】
本発明の方法
本発明は、本明細書において説明されるように哺乳動物に発現ベクターを投与する段階を含む、哺乳動物において組織特異的過形成を誘導するための方法を提供する。本方法は、静止細胞の増殖または再生が関心対象となる任意の器官または組織に合わせて調整することができる。再生または増殖が関心対象となり得る組織の例は、非限定的に、心臓、筋肉、脳、神経系、膵臓および肝臓を含む。本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において心筋細胞（CM）の過形成を誘導するための方法も提供される。本発明は、哺乳動物において心筋細胞（CM）の過形成を誘導するための方法をさらに提供する。本方法は、本発明の発現ベクターを含有するCMを哺乳動物の心臓に移植する段階を含む。
【００４５】
本発明は、KDM4DをCMに投与する段階を含む、CM過形成を誘導するための方法をさらに提供する。KDM4Dは、KDM4Dの活性を保護するようなペプチド修飾および／または送達法を用いて投与することができる。投与は全身、局所、経口、静脈内、皮下、または経皮投与であり得る。
【００４６】
ある態様において本発明は、本発明の発現ベクターによる遺伝子組換え細胞を器官に移植する段階を含む、哺乳動物における器官の機能を改善する方法を提供する。器官は例えば、心臓、筋肉、脳、膵臓、または肝臓が可能である。ある態様において本発明は、本発明の発現ベクターを含有するCMを哺乳動物の心臓に移植する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法を提供する。別の態様において本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法を提供する。KDM4Dを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心機能を改善する方法も提供される。
【００４７】
本発明は、CM過形成を誘導するのに有効な条件下においてKDM4Dと共にCMを培養する段階を含む、CMを増殖させる方法をさらに提供する。ある態様においては、CMは成体CM（ACM）である。加えて、本発明は、CMにおけるヒストンH3のリジン9（H3K9me3）レベルを減少させる段階を含む、心臓の再生を促進する方法を提供する。ある態様において減少させる段階は、心臓の再生を必要とする対象に本発明の発現ベクターを投与することを含む。特定の態様においては、発現ベクターが発現ベクターを含有するCMを投与することによって投与される。別の態様において減少させる段階は、KDM4Dを投与する段階を含む。
【００４８】
本発明の方法は、特定の状況に好適であると当業者に理解される任意の種類の方法によって対象に投与を行うことを含み得る。ある態様においては、投与は全身投与である。別の態様においては、投与は静脈内投与である。ある態様においては、投与は心筋内注射による。対象は典型的に哺乳動物である。ある態様においては、哺乳動物はヒトである。他の態様においては、哺乳動物は家畜である。家畜の例は、非限定的に、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびネコの対象を含む。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明を説明するために、またそれを当業者が作製および使用するのを助けるために示される。実施例は、本発明の範囲を他に限定することを決して意図するものではない。
【００５０】
実施例1：心筋細胞の細胞周期停止のエピジェネティック制御 
本実施例は、ヒストンH3のリジン9（H3K9me3）のトリメチル化、即ちヘテロクロマチンと関連するヒストン修飾が成体CM（ACM）における細胞周期関連遺伝子のサイレンシングに必要であることを示す。これを試験するために、本発明者らは、CMにおいてヒストンデメチラーゼKDM4DによってH3K9me3が特異的に除去されているトランスジェニック（BiTg）マウスモデルを開発した。CMにおけるH3K9me3の消失は、ACMの細胞周期関連遺伝子のサイレンシングを優先的に妨げ、その結果CMの細胞周期進行が亢進される。正規化された心臓質量は出生後14日（P14）までに増加し、9週齢まで増加し続けた。BiTg心臓においてはACMのサイズではなくACMの数が有意に増加したことから、心臓の質量増加はCMの過形成によって説明されることが示唆される。H3K9me3を激減させた心臓を肥大性成長シグナルによって誘発すると、ACMの有糸分裂活性が刺激された。従って、ACMにおける細胞周期関連遺伝子のサイレンシングにはH3K9me3が必要であり、H3K9me3を激減させることによってインビボで過形成性の成長が行われることを本発明者らは示した。
【００５１】
方法
マウス実験
導入遺伝子の発現を調節するために使用したαMHC-tTAマウスはRobbins labによって作製された（60）。本発明者らは、KDM4Dの発現を促進するために、弱毒化αMHCプロモーターの上流にテトラサイクリン応答エレメントを有する、以前に公表されたレスポンダー構築物を使用した（60）。FLAGタグおよびMYCタグで標識したヒトKDM4D cDNA（origene RC212600）を含有するプラスミドはcDNA配列においてNotI制限酵素切断部位を有していたが、本発明者らはサイレント変異を誘導することによってそれを破壊した（Agilent 200521）。得られたcDNAをレスポンダー構築物にサブクローニングし、その後ベクター骨格を取り除き、精製し、マウス前核に注入した（ワシントン大学トランスジェニックコアファシリティー）。得られたtetトランスジェニックマウスをαMHC-tTA系統と繁殖させ、CM特異的KDM4D誘導モデルを生み出した。トランスジェニックマウスに関与する全ての実験について同腹仔対照を使用した。≧8世代戻し交配してC57/B6系とした、ブリーダーから得られた10〜12週齢の同腹仔に対してTAC手術および偽手術を行った。ケタミン（130 mg/kg 腹腔内投与）およびキシラジン（8.8 mg/kg 腹腔内投与）を用いてマウスを麻酔し、説明されるように26ゲージ針を用いて大動脈縮窄術に供した（103）。
【００５２】
CM細胞の単離および培養
ヘパリン処理したマウスをイソフルランで安楽死させ、心臓を摘出し、KB緩衝液（mmol/L;KCl 20、KH2PO4 10、K+-グルタミン酸70、MgCl2 1、グルコース25、タウリン 20、EGTA 0.5、HEPES 10、0.1%アルブミン、KOHによりpH 7.4）中で停止させた。精製ACM調製物を得るために、大動脈をカニューレ処置し、タイロード液（pH7.4、25uM ブレビスタチン-/-を添加）によって心臓を洗浄し、ランゲルドルフ灌流を用いてコラゲナーゼII（Worthington 4176）およびストレプトマイセス・グリセウスのプロテアーゼXIV（Sigma P5147）によって7分間分解した。心室を解離させ、得られた細胞懸濁液を、100μmメッシュを通して濾過した。低速遠心分離を3回行い、ACMを緩くペレット化し、懸濁液中の非CMを吸引し、ACM集団を密度精製し、>90％の棹型ACMを得た。胎児CMおよび出生後CMの調製物のために、Ads緩衝液（mmol/L: NaCl 116、HEPES 20、NAH2PO4 10.8、グルコース5.5、KCl 5.4、MgSO4 0.83）において心臓を洗浄し、酵素溶液（コラゲナーゼII, パンクレアチン(Sigma P3292)）と共に回転させながらインキュベートした。20分ごとに遊離細胞を血清中に回収し（分解の停止）、その結果2時間内に心臓全体が解離された。得られた細胞懸濁液をパーコール（Sigma P4937）密度勾配遠心を用いて分画し、CM層および非CM層を各々回収した。CM調製物の品質および純度は、免疫染色法、フローサイトメトリー、および細胞タイプ特異的マーカーのRNA発現によって確認された。
【００５３】
説明されるように（57）、対照ACMおよび脱分化ACMのcDNAを作製した。手短に言うと、ラミニンコーティングしたシャーレにACMをプレーティングし、成長因子と共に10〜14日間培養し、筋節形成の減少およびCC活性の上昇を得た。
【００５４】
RNAの単離および分析
TRISOL（Sigma T9424）フェノール／クロロホルム精製、それに続くデオキシリボヌクレアーゼ処理（Qiagen 74004）を用いたカラム精製によって細胞および組織からRNAを単離した。ヒト遺伝子発現の試験については、商業的な供給業者から健常なヒト心臓サンプルを得た（Clontech 636532、lot 1206518A；およびAgilent 540011、lot 6151000）。虚血性心疾患サンプルは、左室補助人工心臓の装着を受けた、同意を得ている60代の男性対象に由来した。  
【００５５】
製造者の手引に説明されるように（Roche 04896866001）、cDNAを合成した。サイバーグリーン（SYBR green）（Life Technologies 4472908）を用いてリアルタイムPCR装置（ABI 7900HT）においてqPCRを行った。スタンダードPCRと電気泳動によってプライマーを検証し、特定の標的バンドの確認と、プライマーダイマーができていないことの確認を行った。qPCR解離曲線はある特定の産物と一致していた。しきい値およびベースラインが自動で設定されるABI’s SDS 2.4ソフトウェアを使用してCt値を求めた。発現を定量化するために検量線法またはdCt法を使用し、各遺伝子の発現はGAPDHを用いて正規化した。しかし、図1A〜Dにおいては-log(Ct)値が示されている。CMの成長における異なる段階で安定して発現される好適な対照遺伝子を見つけるのは重要である（104）。S26やRplp0と比べて、全てのサンプルを通してGapdhが最も安定して発現される対照であったが、RNAインプットによる正規化と比べると、Gapdh発現はP3のCMにおいて減少してその後安定を保つため、Gapdh正規化の結果ではE15.5のCM遺伝子発現がおよそ2.5倍低く見積もられた；これは胎児心臓においては高い解糖系活性が認められることと一致している（105）。指定の遺伝子を高度に発現する組織または細胞を用いて検量線を作成した結果、qPCR効率は88〜97％であった。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
【００５６】
マウス（各々、SEQ ID NO：3〜50；以下、括弧内に個々のSEQ ID NO）：
2018512874.tif 000005
2018512874.tif 000006
【００５７】
マウス：以下の遺伝子についてはTaqMan（Life Technologies）試薬を使用した：
KDM2B（Mm01194587_m1）、KDM4A（Mm00805000_m1）、KDM6B（Mm01332680_m1）、KDM8（Mm00513079_m1）、GAPDH（Mm99999915_g1）。
【００５８】
ヒト（各々、SEQ ID NO：51〜54；以下、括弧内に個々のSEQ ID NO）：
2018512874.tif 000007
【００５９】
RNAseqライブラリ構築（Illumina Tru-Seq）およびペアエンドRNAシーケンシング（ABI3730XL）は、Stam Labのワシントン大学コアファシリティーによって行われた。Bowtie/Cufflinks packageを用いてリードアラインメントを行った。mRNA定量化、差次的発現解析、および遺伝子オントロジーについてはPartek Genomic Suitesを使用した。
【００６０】
2-D心エコー検査
0.5％イソフルラン使用下において、Visual Sonics Vevo 2100を用いてマウスの心電図および心機能を評価した。乳頭筋断面における傍胸骨短軸像をB-およびM-モードにおいて得た。400〜500 BPMの心拍数で画像を得た。遺伝子型については盲検化して、1人の操作者により画像処理および解析を行った。製造者の手引に従ってVevo Labs 1.7.0を用い、画像の定量化を行った。
【００６１】
タンパク質抽出およびウエスタンブロット法
単離したACMをペレット化し、溶解緩衝液（0.5％ NP-40、25mM KCl、5mM MgCl2、10mM Tris-HCl、pH8.0）中に再懸濁し、ホモジナイズし（Wheaton 358103）、可溶性細胞質タンパク質を分離させた。クロマチン関連タンパク質をDNAから分離させるために核濃縮ペレットに以下を含む処理を行った：超音波処理、MNase処理、ならびに1％ SDS、600mM NaCl、および20mM βMEの添加。BCAアッセイ（Thermo Scientific 23252）を用いて核タンパク質を定量化し、電気泳動のためにポリアクリルアミドゲルにロードし、続いてPVDF膜上に転写し、標識した抗体：KDM4D（Abcam ab93694）、H3K9me3（Abcam ab8898）、pan H3（Millipore 05-928）、H3K36me3（Active Motif 61101）、H3K9me2（Millipore 07-441）、およびH4K20me3（Abcam ab9053）をプローブとして検出を行った。HRPと結合させた二次抗体（Santa Cruz）およびECL検出法（Thermo Scientific 34095）を使用した。
【００６２】
組織学的試験ならびにCM径およびCM数の定量化
組織学的解析のために、停止させたP14または9週齢の心臓を4％PFAによって固定した。パラフィン切片はH＆E、Massonトリクロームによって染色した、またはFLAG（Sigma F7425）、α-アクチニン（Sigma A7811）、心筋トロポニンT（Thermo Scientific MS-295-P）、Ki67（Abcam ab15580）およびホスホH3（Abcam ab5176）抗体、および核を視覚化するためのヘキスト（Life Technologies H3570）を用いた標準プロトコルによって免疫染色した。共焦点顕微鏡（Nikon A1R）によって画像が得られた。ACM横断面積を評価するために、細胞膜のマーカーであるコムギ胚芽凝集素（WGA、Life Technologies W6748）によって切片を染色した。Nikon Ti-E scopeにおいて、全左心室のスティッチングされた画像を得た。本発明者らは、各切片における複数の領域を無作為に選択したが、大血管、心外膜および心内膜は除外した。そしてImageJの 「粒子分析」機能（WGA染色のネガ画像）を用いて動物個体当たり>1000細胞を解析し、その結果横断面積の直接測定を得た。ACMの縦断面積および長さの測定のために、4％PFAによって単離ACMを固定し、画像化した。各動物個体につき何百というACMの面積および長軸を手作業でトレースし、IｍageJの「計測」機能を用いて定量化した。本発明者らは以下の公式を用いてCM体積を計算した：（平均ACM長×平均ACM横断面積）。以下の公式によりCM数を見積もった：[平均心体積（心臓の質量/1.06、筋組織の密度（106）/平均ACM体積×0.75（成体マウス心体積のCMに占められる比率（106））]。動物個体当たり>100細胞について、ACM当たりの核数を手作業によって計測した。
【００６３】
厚みのある切片の画像化
施術マウスのホスホH3染色アッセイにおける細胞タイプの明確な同定のために、方法の項目においてその詳細が説明される、厚さ100μmの心臓切片を作製、染色、および画像化するための方法を本発明者らは開発した。手短に言うと、心臓をKB緩衝液において停止させ、KBによって灌流し、その後-20℃まで冷やしたメタノールによって灌流固定した。心臓をメタノール中で再水和した：PBS勾配（100：0、80：20、60：40）、その後PBSで洗浄し、5％低融点アガロース中にマウントした。Leica 1200s ビブラトームにより厚さ100μmの切片を切り出し、上記に挙げられた試薬およびファロイジン（ThermoFisher Scientific A22287）を用いて懸濁液中において染色した。染色した切片を0.01％ポリ-L-リジンでコーティングしたカバーガラスにマウントした。厚みのある切片の内部が見えるために必要な切片の透明度を高めるよう、それらを透明化した：一連の濃度のイソプロパノール（70％、85％、95％、100％）において切片をインキュベートし、続いてベンジルアルコールと安息香酸ベンジルの1：2溶液中にてインキュベートを行った。サンプルを調製し、共焦点顕微鏡によって画像化し、遺伝子型については盲検化して、1人の操作者により解析を行った。本発明者らは以下の公式を用いてpH3+ ACM数を計算した：[(pH3+ ACM核/mm3)/(核数/ACM)/(ACMmm3]。偽手術を施した心臓における横断面積測定値がベースラインより19.2％少なかったが、ホルムアルデヒドまたはアルコールによる固定後の細胞の縮小を比較した他の報告と一致して、この原因は固定の工程における相違であることに留意する（107）。このことから、術後のメタノール固定処理サンプルにおけるACM数を計算する際には、定数係数1.192をかけることによって全群の横断面積を補正した：[平均心体積（心臓質量/1.06、筋組織の密度（106）/平均ACM体積(平均ACMベースライン長×平均ACM術後の横断面積)×0.75（CMによって占められる、成体マウス心体積の比率(106））]。
【００６４】
統計
全ての結果は平均±平均の標準誤差で表される。一元配置ANOVAについてはGraphpad Prismを使用し、2群を超える群間比較の試験についてはTukey’s Post hoc多重比較検定を行った。二元配置ANOVAについてはGraphpad Prismを使用し、2つの独立変数の試験についてはTukey’s Post hoc 多重比較検定を行った。2群を比較する試験を解析するためにMicrosoft ExcelのF-testおよび両側t検定機能を使用した。計算のために異なる基本計測を組み合わせた結果（図5、DおよびE、ならびに図9D）については、標準誤差をコンピュータ算出するためにブートストラップ法（10,000 ブートストラップサンプル）を使用し、p値をコンピュータ算出するために並べ替え検定（100,000 モンテカルロサンプル）を使用した；ACM横断面積、ACM長、および心体積は独立変数であるとの仮定による。RNA-seq解析については、統計処理を行うためにPartek Genomic Suitesを使用した。
【００６５】
試験の承認
全ての動物試験は施設内動物実験審査委員会（IACUCプロトコル#4290-01）の承認、ワシントン大学機関ガイドライン、および実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った。ヒト虚血性心疾患サンプルは、署名しインフォームドコンセントを与えた参加者から得た；ヒトサンプルの使用はワシントン大学施設内治験審査委員会によって承認された（IRB#35358）。
【００６６】
アデノウイルス試験
製造者の手引（Agilent 240082）に従ってKDM4AおよびLacZに関連するアデノウイルスを作製した。ラミニンコーティングされたウェルで、1×ITS、1×PS、5mMタウリン、1mM ピルビン酸Na、5mMクレアチン、2mM L-カルニチン、および25mM ブレビスタチンを5％FBSの存在下で添加したM199培地において、単離したACMをプレーティングした。1時間後、2％FBS含有培地に培地を変え、150 moiのウイルスを加えた。ACMは2％FBSを含有する培地において採集の段階まで維持した。5mM フェリシアン化カリウム、5mM フェロシアン化カリウム、2mM MgCl2、および1mg/mL X-galにおいて4時間インキュベートした4％ PFA固定ACMについてβ-ガラクトシダーゼ染色を行った。
【００６７】
一時的に調節されたKDM4D誘導
ドキシサイクリン含有飼料（Harlan TD.00502）を指定の時点に自由に与えた。Dox 2週-9週群は、P14-9wからP18-9wまでの期間、doxを与えられたマウスを含むことに留意する。
【００６８】
心筋およびLVの面積の定量化
心臓の乳頭筋中央面からビブラトーム切片を切り出し、画像化した。ImageJにおいて心筋面積およびLV内腔面積を手作業でトレースし、「測定」ツールを用いて面積を計算した。
【００６９】
アポトーシスの定量化
製造者の手引に従ってTUNEL染色キット（Life Technologies C10618）を用い、ビブラトーム切片においてアポトーシスを可視化した。TUNEL標識に続き、WGA、ヘキストおよびファロイジンによって染色し、ビブラトーム切片についての手順にて説明されるように画像化した。
【００７０】
結果
CMにおけるH3K9me3ヒストンデメチラーゼ発現の特徴付け
細胞周期関連遺伝子発現の制御におけるH3K9me3の役割をよりよく理解するために、心臓の成長を通した、CMにおける細胞周期とH3K9me3-HDM遺伝子発現との関係を特徴付けた（図1）。過去の研究（9、53、54）と一致して、CM特異的な、細胞周期関連遺伝子の発現における成長に伴う変化は、ミオシンアイソフォームの転換ならびにACMにおけるG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の劇的なダウンレギュレーションを含んでいた（図1、AおよびB）。細胞周期転写制御因子E2F1はACMにおいては167倍ダウンレギュレートされた（P<0.0001、対E15.5 CM）一方、抑制的E2F4の発現は高いままであった（図1C）。骨格筋（35）およびCM（9）における以前の研究と一致して、Rbおよびp130と対照的に、p107が増殖性筋細胞において特異的に発現されるRbファミリーメンバーであることが見出された（図1C）。KDM4ファミリーメンバーの発現はそれほど劇的ではないが、胎児CM、G2/M、および細胞質分裂関連遺伝子の発現と同様のパターンに従っており、P7の後（図1D）、CMの再生能の喪失と同時期に（2、3）、適度にダウンレギュレートされた。ACMにおけるH3K9me3-HDMのダウンレギュレーションは、ACMにおける、胎児CMと比較した全体的なH3K9me3レベルの増加と一致している（9）。ACMにおいてKDM4Dの基底レベルが低いことは、限られた増殖能しかない組織におけるKDM4Dの発現に関する別の研究と一致している（55、56）。
【００７１】
ゼブラフィッシュや新生仔マウスの心臓再生モデルにおいて脱分化がCM増殖にとっての必要条件であると考えられるため（1〜3）、CM増殖に関与し得るHDMについてスクリーニングする目的で、本発明者らはCMの脱分化中にアップレギュレートされるHDMを探し求めた。哺乳動物のACMの脱分化は、インビトロにおいては成長因子と共に長期培養することによって成し遂げることができ、その結果筋節の分解および増殖能の回復が起こる（57）。様々なHDMを比較した図から認められるように、脱分化中にはKDM4Dが最も強くアップレギュレートされていた（401倍）（図1E；P<0.03）。ヒト肥大性心筋症サンプルにおいてはKDM4A発現が増加し、マウスにおいてはCM特異的KDM4A過剰発現によって肥大性の成長が悪化したため（49）、ヒトの虚血心筋においてKDM4Dはアップレギュレートされるのかどうかと考えた。虚血性心筋症を有する対象の心臓においては、本状況でのCM過形成が極めて少ないことと一致して、KDM4Dの発現に変化はなかった（図1F）（58）。
【００７２】
CMにおいてH3K9me3を特異的に激減させるためのトランスジェニックマウスモデルの作製
インビボでのACM細胞周期関連遺伝子のサイレンシングにおけるH3K9me3の役割を探求するために、本発明者らはKDMファミリーメンバー4Dを過剰発現させることにした。なぜならば：1)KDM4Dは最も特異的なH3K9me3デメチラーゼである（50〜52）（図10）、2)それは増殖性CMにおいて発現され、脱分化ACMにおいて増加する（図1、DおよびE）、3)それは肥大性成長が優勢に行われる心筋症サンプルにおいては発現されない（図1F）、4)それは非CMにおける増殖および生存を促進する（46〜48）、および5)機能獲得実験は重複する因子による補償をより受けにくいからである（59）。本発明者らは、テトラサイクリントランス活性化因子（tTA）がCMにおいて特異的に発現される、過去に特徴付けられているテトラサイクリン誘導性（tet-off）過剰発現モデルを使用した（60）。本発明者らは、弱毒化αMHCプロモーターに関連する、tTA結合配列を有するテトラサイクリン反応性プロモーターの下流にMYC-およびFLAG-タグ標識したKDM4D cDNAを含有するCM特異的トランスジェニックマウス系統を作製した（60）。ヘテロ接合体tet反応性KDM4D（tet）マウスと共にヘテロ接合体tTAマウスを繁殖させたところ、CMにおいて特異的にKDM4Dを構成的発現する二重トランスジェニック（BiTg）マウス（図2A）、ならびにシングルトランスジェニック対照（tetまたはtTA）および非トランスジェニック対照（非Tg）が得られた。BiTgのCMにおいては、tTAタンパク質が発現され、KDM4Dの上流のtet応答エレメントに結合し、KDM4D導入遺伝子発現を誘導する（図2A）。本発明者らは、P14および9週においてBiTgの心臓でKDM4D発現が強く誘導されることを確認した（図2B）。BiTgマウスの他の器官または非CM心臓細胞においては、KDM4D導入遺伝子発現は検出できなかった（図11、AおよびB）が、例外的に、αMHCプロモーターを用いた過去の報告（60）と一致して、BiTgの肺において低レベルで検出可能であった。心臓切片の免疫蛍光画像処理から、外来性KDM4Dタンパク質が特異的に発現され、BiTgのCMの核に局在化したことが示された（図2C）。ウエスタンブロット法により、BiTg ACMにおけるKDM4Dタンパク質の発現が確証され、全体的なH3K9me3レベルが激減したことが示された（図2D）。本発明者らはまた、他のKDM4ファミリーメンバーとは対照的に（図10）、KDM4Dデメチラーゼ活性はH3K9me3に特異的であり（50〜52）、ACMにおけるH3K9me2またはH3K36me3を脱メチル化しなかったことをも確証した（図2D）。特定の遺伝子座におけるメチル化レベルの変化の可能性は除外されていないが、H3K9me3およびHP1の下流の抑制的指標として関係付けられた（61〜63）、H4K20me3には変化がなかった（図2D）。
【００７３】
インビボにおいて、H3K9me3はACM細胞周期関連遺伝子のサイレンシングに必要とされる
インビボにおける全体的な遺伝子発現に対してH3K9me3の激減が与える影響を評価するために、本発明者らは9週のACMについてRNA配列決定を行った。制約なし勾配相関法(unconstrained slope correlation test)によって、全ゲノムトランスクリプトームを比較した場合にR2=0.9764が示され、非Tgと単一トランスジェニックマウスには遺伝子発現の違いが示されなかったため、対照ACMサンプルをグループ化した。RNA-seq解析によってBiTg ACMが138個の細胞プロセスのうち16個、および142個の細胞周期プロセスのうち16個に関わる遺伝子の発現を増加させたことが明らかになった（図3、AおよびB）。際立ったことに、細胞周期進行に関わる細胞のプロセスが優先的に増加していた（図3A）。細胞周期プロセス内では、後期細胞周期の、特に有糸分裂に関与する区分の期が遺伝子発現の増加を示していた（図3B）。本発明者らは、G2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子における増加をqRT-PCRによって確証した（5.8〜21.4倍、P<0.01）。また、胎児CM遺伝子も増加していた（図3C）。胎児CM遺伝子の発現は高い頻度で病的状態と関連するが、より未熟なCMに特異的な遺伝子の発現が、胎児や新生仔の心臓における増殖能力のあるCMでも変わらなかったことは留意されるべきである（9、64）（図1、AおよびB）。本発明者らはまた、細胞周期関連遺伝子転写制御因子についても試験し（図12、AおよびB）、細胞周期進行の正の制御因子E2F1およびE2F2が、BiTgマウスのACMにおいては対照ACMと比べて高度に発現されたことを見出した（>12倍、P<0.03）。抑制的E2FメンバーであるE2F4-6には変化がなかった。興味深いことに、増殖性筋細胞におけるE2F/Rbファミリーの発現と一致して（図1、BおよびC）、BiTgのACMにおいてはp107も増加した（図12B）。
【００７４】
CM特異的H3K9me3の激減は、心機能を変化させずにCM過形成を促進する
BiTgマウスは、9週における体重に対する心臓重量の比率（HW/BW）が20.8％増えており（図4B；P<0.0001）、目に見えてより大きな心臓を有していた（図4A）。HW/BWにおけるこの増加はBiTgマウスにおいてはP14で最初に明らかとなり（図4C；12.9％増、P<0.001）、KDM4Dの過剰発現が出生後の心臓の成長を特異的に促進したことが示唆された。この心臓の肥大は筋節の乱れ、線維化または脈管構造の変化とは関連しておらず（図4、DおよびE）、細胞外マトリックスにおいては増加がなかった（65）（図4E）。ACM横断面積の定量化または単離ACMの縦断面積および長さの直接測定では、対照と比較したBiTg ACMにおける径または算出体積の差異は明らかではなかった（図5、A〜D）。算出された筋細胞数から、BiTg心臓は対照と比較してACMが22％多かったことが示された（図5E；P<0.03）。H3K9me3激減の心機能に対する長期効果を決定するために、本発明者らは7月齢のBiTgマウスおよび対照マウスに対して心エコー検査を行った；駆出率、短縮率、心拍出量、および左心室サイズは全群において同様であった（表1）。心機能または形態における有意な差は認められなかった。
【００７５】
（表１）7月齢のBiTgマウスにおける正常な心機能および形態
7月齢のマウスにおける心エコー検査の結果。HR：心拍数、EF：駆出率、CO：心拍出量、LVEDD：左心室拡張末期径、LV質量：左心室質量。平均およびSEM値が示される。サンプル数：各遺伝子型につきN=3。統計：一元配置ANOVA/Tukey法。*P<0.05対非Tg、†P<0.05対tet、‡P<0.05対tTA。
2018512874.tif 000008
【００７６】
細胞周期活性を評価するために、P14および9週の心筋切片に対して、有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンH3セリン10（pH3）についての免疫染色を行った。BiTgマウスでのみ双方の時点においてpH3+ CMが認められた（図6、AおよびB）。9週の心臓において、一般的な細胞周期活性マーカーKi67についても同様の傾向が認められた（図6C）。7月齢のACM当たりの核数の定量化から、BiTg心臓においては単核ACMの増加および二核ACMの減少があることが明らかであった（図6D）。これらの知見は、BiTgマウスにおいて心臓の質量増加がCM過形成に続発したモデルと一致している。
【００７７】
BiTgマウスにおいては心臓の質量が9週齢まで増加した（図4C）。9週のBiTg ACMにおける細胞周期活性は、対照と比べて上昇はしたが（図6、BおよびC）稀であった（<2 pH3+ CM/200×視野）。質量の増加が、BiTg心臓において増加した数のCMの正常な出生後の肥大性成長と関係したのかどうか、または、進行中のCM過形成が存在したのかどうかを決定するために、本発明者らはKDM4Dの発現を停止させる目的でドキシサイクリン（Dox）を使用した（図7A）。本発明者らは、KDM4D発現が誘導されたことのない、または子宮内では誘導されたがP14において抑制されたBiTgマウスにおける心臓の質量を調べた（図7B）。Dox処理により、BiTg心室におけるKDM4D発現は、1週以内に対照レベルにまで減少した（図7C）。受胎からKDM4D発現を抑制した成体BiTgマウスでは、対照と区別がつかないHW/BWが示された（図7D）。KDM4Dを構成的に発現するBiTg心臓はP14においてより大きかった（図4C；12.9％増対対照；P<0.001）。しかし、2週でKDM4D発現がオフにされた場合、KDM4Dを構成的に発現するマウスと比較して、9週における心臓のサイズはより小さかった（図7D；7.9％対20.8％；P<0.05）。これらの知見から、KDM4Dの過剰発現は、2〜9週の間にさらにCM過形成を促進し続けることが示唆される。
【００７８】
肥大化シグナルはH3K9me3激減ACMの増殖を刺激する
対照と比べて高度にアップレギュレートされても、BiTg ACMにおける後期細胞周期関連遺伝子の発現は野生型の胎児CMおよび出生後CMよりはずっと少ない（図1Bと図3Cとを比較）。BiTg心臓において増加されてはいるが、細胞周期進行しているCMの絶対数も少なく、正規化された心臓質量は9週と7か月の間にさらには増加しなかった（図4C）ことから、成体BiTg心臓においてはベースラインでのCM増殖が非常に限られたものであることが示唆される。典型的に肥大性成長を生じるTAC後には、数多くの成長因子シグナル伝達経路の強い活性化があるため（9、66）、インビボにおいてKDM4DがACM増殖を促進する能力を試験するために優れたモデルではないかと考えられた。これにより、TACのような肥大性成長シグナルがH3K9me3激減ACMにおいて過形成を誘導するかどうか、または、それらが対照心臓と同様に肥大化を経るかどうかを決定することができた。BiTgおよび同腹仔対照は11週齢に偽手術またはTAC術を受け、術後10日に試験された。非施術マウスと同様に、偽手術を受けたBiTg心臓は、対照より目に見えて大きかった（図8A）。TACは、対照マウスにおけるHW/BWの20.9％の増加と比較して、BiTgマウスにおいてはHW/BWの48.2％の増加を誘導した（図8B；P<0.0001）。TAC誘導の心臓の成長がACMの肥大化または過形成のどちらによって生じたのかを決定するために、ACM横断面積を測定した。偽手術BiTg ACMは偽手術対照と同様であった（図5A）；しかし、TAC BiTg ACMについては、TAC対照ACMと比較して横断面積が12.5％小さかった（図9、AおよびC；P<0.05）。TAC後にACMでは長さではなく横断面積が増加するため（67）、本発明者らはCM数を評価し、BiTg心臓のACMにおいては対照と比較して56.6％の増加があったことを認めた（図9D、P<0.001）。TAC後にBiTg ACMが細胞周期進行していることを確証するために、ホスホH3についてアッセイを行い、BiTgマウスのpH3+ ACMにおいては対照マウスと比較して41倍の増加があったことを認めた（0.77％対0.019％；P<0.0001）（図9、AおよびB）。この細胞周期活性は線維化（図8Cおよび図9A）またはアポトーシスの増加（図13）とは関連していなかった。CMの細胞周期進行の再誘導が心機能に負の影響を与えるかどうかを決定するために、術後9日に2Dエコーを行った（表2）。TAC後、BiTgマウスにおいてはLVEDDが増加すると共に、駆出率が減少した。しかし、計算された心拍出量には変化はなく、これはおそらくBiTg心臓の心室のサイズによるものと推察される（図14）。
【００７９】
（表２）TAC施術マウスにおける心機能および形態
術後10日の12週齢のマウスにおける心エコー検査の結果。HR：心拍数、EF：駆出率、CO：心拍出量、LVEDD：左心室拡張末期径、LV質量：左心室質量。平均およびSEM値が示される。サンプル数：偽手術、対照=4、BiTg=4；TAC、対照=9、BiTg=8。統計：両側t検定、対照対BiTg、*P<0.05。
2018512874.tif 000009
【００８０】
考察
CMの増殖によって新生仔哺乳動物の心臓が再生できる（2、3）、およびACMが非常に限られてはいるが幾らかの分裂能を保持している（7）という発見から、ACMの細胞周期の制御についての興味が再燃している（4、69〜71）。哺乳動物の新生仔CMにおいて増殖を促進できる多くの戦略が、ACMにおいては効果がなかった（72、73）ことから、ACMにおいては増殖に対して強力な障壁があるということが強調されている。近年、心外膜パラクリン因子FSTL1（70）、miR-15の阻害（3）、およびNRG1コレセプターErbb2（74）がACM増殖を促進することが示唆されたが、ACMにおける分子機構および関連標的は未だ理解され得ないままである。本発明者らは以前に、ACMのG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子においてはヘテロクロマチンマーカーH3K9me3が胎児CMと比べて濃縮されることから、この指標がACM増殖に対する障壁と関係付けられることを見出した（9）。本例では、成長、脱分化、および疾患におけるH3K9me3デメチラーゼの発現が特徴付けられ、KDM4Dが胎児CMにおいて発現されたこと、そして脱分化するACMにおいてアップレギュレートされた主要なH3K9me3特異的デメチラーゼであったことが示される。CM特異的なKDM4Dの過剰発現はH3K9me3を特異的に激減させ、ACMにおけるG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の発現、心臓の質量、ACM数、およびACM有糸分裂活性の増加を導いた。
【００８１】
CMの増殖について新たに生じた興味によって、ACM増殖を検出するための改善された技法の必要性にも注目が集められている（75）。ACM増殖の標準的な指標は、期に特異的なまたは一般的な細胞周期マーカーの間接的なインサイチュー組織学的解析であった。しかし、CMまたは非CMのどちらにマーカーが存在するのかを決定するのが難しい可能性があるため、これらの結果がしばしば不確かであることが提言されてきた（75、76）。哺乳動物ACMの最短軸よりなおも有意に薄い、厚さ10μm未満の心臓切片を用いてほとんどの研究が行われ、高密度の心筋脈管構造および心臓細胞の大多数である非CMの存在によって、さらに混乱させられる（77）。本発明者らは、ACM全体の複数層を有する、厚みのある透明化した切片の高解像度の3D画像再構成を得られる新規のサンプル調製法および画像化技術を開発することによってこの限界に取り組み、KDM4D過剰発現マウスにおける有糸分裂ACMの一義的な同定を可能にした（図9）。本発明者らの方法は、CM系列追跡モデルにおけるインビボでの累積増殖標識法（マルチアイソトープ質量分析法）（7）、二重マーカーを用いたモザイク解析（78）、およびマルチカラークローナルアッセイ（76）からの知見を裏付けるものであり、ACMの増殖は頻度が低く刺激するのが難しいという（75）、新たに発生しつつあるコンセンサスを支持するものである。H3K9me3激減CMにおいては9週に後期細胞周期関連遺伝子の発現が著しく増加した（図3C）という事実はあったものの、それらの発現レベルは新生仔CMと比べてずっと低かった（図1B）。また、BiTg ACMの大多数がP14までに細胞周期を離脱したと考えられ（図6A）、HW/BWにおける対照との差異は9週後以降増大しなかったと考えられた（図4C）。このことから、H3K9me3に加えて複数の機構がACMにおける増殖を阻害することが示唆される。
【００８２】
インビボにおけるACM細胞周期関連遺伝子サイレンシングにはH3K9me3が必要とされるが、Rb/p130ダブルノックアウトによって抑制解除した後でさえもG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子においてはサイレンシングが維持されたため、H3K9me3のみではACMにおける細胞周期関連遺伝子の安定したサイレンシングを説明するには十分ではないことが、本実施例で確証される（9）。その試験においては、そのクロモドメインがH3K9me3に特異的に結合するHP1γを後期細胞周期関連遺伝子プロモーターからはずした。この試験からは、ACMにおける細胞周期関連遺伝子の安定したサイレンシングにはHP1γの動員が必要であること、および、H3K9me3は必要ではあるが、遺伝子をサイレンシングするためには十分ではないことが示唆された（9）。RbおよびH3K9me3はいずれも、多くの系においてHP1との結合に必要であるため、KDM4Dの過剰発現が、HP1γの結合基質をクロマチンから取り除くことによってACMにおける後期細胞周期関連遺伝子を抑制解除した可能性がある。それでも、RbとH3K9me3は多数の遺伝子上に存在するため、なぜ後期細胞周期関連遺伝子が優先的に抑制解除されるのかは不明のままである。おそらく、別個の複合体を形成して特定の遺伝子サブセットを標的化する、E2F-ファミリーメンバーとRb-ファミリーメンバーの特定の組み合わせに関連している可能性がある（33、34）。BiTg ACMにおいては、H3K9me3の激減によって最も増加したE2F/RbファミリーメンバーはE2F1およびp107であり（図12）、それは増殖性の胎児CMや新生仔CMにおいて特異的に発現されるのと同じE2F/Rbファミリーメンバーであることが本実施例によって示された（図1C）（9）。BiTg ACMにおいてHP1のE2F依存性遺伝子を標的化する能力が失われているのと同じく、p107は、Rbとは対照的に、HP1との結合が示されなかった（39）。それと一致して、Rbは、p107には認められない付加的なタンパク質結合ドメインやホスホ制御ドメインを有しており、p107の欠失ではRbの機能喪失について認められたような過形成表現型が示されなかった（79、80）。従って、E2F/Rbファミリーの発現レベルにおける選択的増加およびHP1の差次的な動員によって、BiTg ACMにおける後期細胞周期関連遺伝子の優先的な増加を説明することが可能である。
【００８３】
本実施例は、ACMには心機能への有害効果なく、適度なレベルのG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の発現に耐えうることを示した（図3および表1）。これはACMにある限度の細胞周期進行を行わせた他のモデルと同様である（76）が、ACMにおけるヘテロクロマチン形成の阻害および細胞周期への再進入の誘導が心機能の低下と関連していた（9）という本発明者らの過去の知見とは対照的である。KDM4Dマウスとモデルの根本的相違は、KDM4D過剰発現が１つのメチル化経路を特異的に標的化する一方、Rb/p130 KOは複数のエピジェネティック修飾（H3K9me3、H3K27me3、およびH4K20me3）を阻害した可能性が高いということである（9、32、33）。これは、なぜRb/p130 KOにおいては細胞周期全期の促進に関与する遺伝子がアップレギュレートされたのか、一方、なぜH3K9me3またはHP1γに特異的な阻害がG2/Mおよび細胞質分裂関連遺伝子の発現の優先的な増加を導くのかを説明し得る（9）（図3）。この見解と一致して、KDM4DマウスにおけるH3K9me3激減クロマチンは細胞周期進行中のpH3+ACMを例外として、Rb/p130モデルとは異なり、ヘテロクロマチンを含むその全体的な構造を維持していた（図15）。従って、他の細胞タイプにおけるH3K9me3激減に関する報告と一致して、複数の抑制的なメチル化がACMの全体的なクロマチン構造の維持における重複した役割を担っている（27、81、82）。
【００８４】
本発明者らは、胎児CMの核内において多くの小さなfociへと形成される限定されたヘテロクロマチンから、出生後CM核の核ラミナにおいて付加的なヘテロクロマチンと共に少数の大きなfociとなるヘテロクロマチンまで、ACMの出生後分化の間にはヘテロクロマチン構造における移行があることを提案した（9）（図15A）。本発明者らは、BiTgマウスにおけるpH3+ ACMは増殖性胎児CMと同様の、大きなクロマチン構造を有することを見出した（図15B）。研究によってそれらが独立して作用することは示唆されてはいる（27、82）ものの、さらに高次のクロマチン構造と遺伝子特異的制御との関係は明らかでない。興味深いことに、H3K9me3およびH3K9me3関連タンパク質もまた、DNA合成および有糸分裂に必要な全体的なクロマチン構造の変化に関与する、転写とは独立した機構を介して細胞周期を制御する（42、83）。当然のことながら、有糸分裂活性の特徴であるpH3は近接アミノ酸残基H3K9のトリメチル化によって阻害されるので、H3K9me3メチルトランスフェラーゼSuv39h1/2のダブルノックアウトの結果、pH3+マウス胎児線維芽細胞が増加した（84、85）。このことから、全体的なH3K9me3激減によって有糸分裂活性が促進されることが示唆される。KDM4D仲介のACM細胞周期活性化には幾つかの機構が寄与している可能性があるが、本発明者らは、H3K9me3を激減させることによって細胞周期関連遺伝子のサイレンシングが阻害されるが、成長促進刺激がない場合には付加的なリプレッサーが極端な細胞周期活性化を予防していると考えられるモデルを支持する証拠を提供した。
【００８５】
本結果は、別の主要な細胞増殖制御シグナル伝達経路、即ち器官サイズ調節Hippo/Yap経路の研究における知見と比較することができる。本経路は、CMの成長期から成体期を通じて、幾つかのCM特異的機能喪失マウスモデルおよび機能獲得マウスモデルについて熱心に研究された（71、93）。成体におけるYap1機能獲得はACM増殖を増加させたが、そのレベルは非Tgの新生仔CMより20倍少なかった（76）。著者らは、ACM増殖をブロックする複数の障壁を乗り越えるためにはYapの活性化単独では不十分であると仮定した。複数の他の系において、E2Fシグナル伝達がないとYapシグナル伝達は増殖を促すことができない（94〜96）。興味深いことに、インフォマティクスおよびクロマチン免疫沈降シーケンシング解析アプローチによって、多くの細胞周期関連遺伝子プロモーターにおいてE2F結合部位およびYap結合部位が互いに隣接することが見出され（95〜97）、それにより、E2FとYapが平行な経路である可能性が示唆される。実際に、肝臓再生モデルにおいては、RbファミリーメンバーのトリプルノックアウトによってE2F活性化を増強すると細胞増殖がもたらされた；しかし、増加された増殖はYapシグナル伝達の減衰によって経時的に減少した（97）。強制的なYap1活性化または肝部分切除術による肝臓サイズの縮小により、増殖におけるE2F仲介の増加が持続した。このことから、内在性Hippo/Yap経路が正常な器官サイズを感知および制御する顕著な能力を有すること、および、E2F仲介の増殖の増加は成長促進刺激またはYapシグナル伝達によって増強できることが示唆される。このことは、活性Yapレベルを増加させる（98）血行力学的負荷によって静止状態の成体KDM4D心臓においてでさえも劇的な増殖が刺激されたという本発明者らの知見と一致している。興味深いことに、出生後CMにおいては内因性Yap1タンパク質が高度に発現され、8週では維持されるが20週までには消失する（99）が、これが本発明者らのモデルにおいてHW/BWの増加が9週までに横ばいになることの説明となる可能性がある。E2FおよびYapの活性化の相乗作用も、ACM増殖に対する複数のブロックのモデルと一致している。CM細胞周期におけるE2F/RbファミリーとHippo/Yapシグナル伝達経路との関連性を試験する将来的な研究は、細胞周期関連遺伝子のH3K9me3制御が厳密にE2F依存性であるかどうかを明らかにする可能性がある。これらの経路の相対的な重要性は推測上のものであるが、ACM肥大化を典型的に誘導する成長シグナルは、H3K9me3激減ACMおよび以前に報告されたYap1マウスの双方においてACM増殖の再誘導をもたらした（76）。本実施例における非Tg ACMとYAP活性化モデルは、成長促進刺激後に同じような非常に限られた有糸分裂活性を示した（およそ0.02％(76)対0.019％  図9B）が、MI後に認められるYap1活性化ACMよりも実質的に多く、TAC後の有糸分裂BiTg ACMが認められることが見出された（0.77％  図9B対0.07％(76)）。全てのBiTg ACMが増殖能を保持していたかどうか、または高度に増殖性のACMのサブセットがあるのかどうかは明らかではないが、22時間の細胞周期のうち3時間 pH3シグナルが存在していれば（102）、TAC後10日にBiTg ACMのうち5.7％が活発に細胞周期進行していたことが示される。
【００８６】
結論として、CM特異的KDM4Dの誘導およびそれに続くH3K9me3の激減は、ACMにおける増殖能力を維持するのに十分である。これらの結果は、心臓の成長がどのように制御されるのか理解することを助け、CMの細胞周期進行の制御に関するH3K9me3や共通のエフェクター経路についての新たな役割を決定するものである。KDM4D過剰発現が正常な心機能には影響せずに、肥大化シグナルに応じて過形成を行わせたという事実から、臨床的な場面において再生反応を改善するためにKDM4Dを使用するということが支持される。局所的および一時的に調節されたKDM4D発現を用いることから、本戦略は遺伝子治療にとって非常に受け入れやすいものであり、心臓再生医療を提供するものである。
【００８７】
実施例2：新生仔マウス再生モデル
心臓組織の再生についての動物モデルは図16において説明される。本モデルを用いたところ、図17において説明されるように、KDM4D過剰発現マウスは組織学的解析について、MI（心筋梗塞）後における再生の増強を示す。MI後21日にKDM4D過剰発現マウスでは、平均線維化面積および最大線維化面積の双方において、対照マウスと比べて統計学的に有意な（p<0.05）減少が認められた。これらのデータから、心臓組織の再生医療についてのKDM4Dの有用性が示される。
【００８８】
実施例3：心臓再生のための遺伝子治療
遺伝子治療を用いた心臓再生の実施および評価のためにベクターを構築することができる。ベクターはAAV6もしくはAAV9のようなAAVウイルス、または心筋細胞についての特異性を提供する他のハイブリッドAAV血清型を用いて構築することができる。CM特異的発現についてはトロポニンプロモーターが使用される。AAV-KDM4Dベクター（SEQ ID NO：1および任意にSEQ ID NO：2を発現する）を心筋梗塞時にまたはその直後に、心臓組織に注入する。回復および再生をモニタリングするために、その後ある時間間隔で心エコー検査（ECHO）および心臓磁気共鳴（CMR）による心機能の評価を行う。試験の終わりに、梗塞サイズおよびACM増殖を評価する。
【００８９】
ある型の構築物においては、KDM4Dを再生の数週後に遮断して、KDM4Dレベルをベースラインまで戻し、一旦失われたCMを再配置させた。当業者には、損傷の程度および／または患者の反応性のような個々の状況を考慮し、同じ効果を得られる代替のベクターおよび／またはプロモーターの使用を可能にするために、ならびに、KDM4Dレベルをベースラインまで戻す前に処理期間の適切なタイミングをはかることを可能にするために行うことができるプロトコルの調整が理解される。
【００９０】
参考文献
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【００９１】
本明細書を通して様々な刊行物が引用される。本発明が属する最先端の技術をより十分に説明するために、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
当業者には、前述の説明において開示される概念および特定の態様が、本発明と同じ目的を実施するための他の態様の改変または設計のための基礎として容易に利用できることが理解される。当業者には、そのような同等の態様は、添付の特許請求の範囲において記載される本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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