(57)【要約】  本開示は、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規なヒト化抗体ならびにまた前記抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一側面から、本開示は、抗腫瘍活性を有する、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規なヒト化抗体または抗原結合性フラグメントに関する。本開示はまた、癌の治療のための薬物としての前記ヒト化抗体の使用も含んでなる。最後に、本発明は、前記抗体を単独で、または他の抗癌化合物と組み合わせてまたは複合化して含んでなる組成物、および癌の治療におけるそれらの使用を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列の相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、およびｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ４−４＊０７に由来するフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３（配列番号１８）、およびｉｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＪ６＊０１に由来するフレームワーク領域ＦＲ４（配列番号２０）を有する重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）ｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列の相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３、およびｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ１−３９＊０１  に由来するフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３（配列番号１９）、およびｉｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＪ４＊０１に由来するフレームワーク領域ＦＲ４（配列番号２１）を有する軽鎖可変ドメイン
を含んでなる、ＡＤＡＭ１７エピトープに結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
i)前記重鎖可変ドメインが、配列番号７の配列からなり、かつii)前記軽鎖可変ドメインが、配列番号８の配列からなる、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号９の配列または配列番号９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列からなる、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１０の配列または配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列からなる、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
配列番号９の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2 またはscFvフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
配列番号１１、１２、１３および１４の配列から選択される配列の重鎖ならびに配列番号１５の配列の軽鎖を含んでなる、請求項７に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト化抗体の親和性成熟突然変異体からなる、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
薬剤として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを有効成分として含んでなる組成物。
【請求項１２】
薬剤として使用するための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
癌の治療のための薬剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭部および頸部癌、腎臓癌および結腸癌の中から選択される癌である、請求項１３に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントまたは組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号１６の配列を含んでなる重鎖可変ドメインおよび配列番号１７の配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１５に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ１７と結合し得るヒト化抗体ならびに前記ヒト化抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。本発明はまた、癌の治療のための薬剤としての前記ヒト化抗体の使用も含んでなる。本発明は、前記抗体を単独で、または他の抗癌化合物と組み合わせてまたは複合化して含んでなる組成物、および癌の治療におけるそれらの使用を含む。
【０００２】
ＡＤＡＭ１７（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７(A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17)）は、ヘビ毒様プロテアーゼ、ＴＮＦ−αコンベルターゼ、ＴＮＦ−α−変換酵素（ＴＡＣＥ）およびＣＤ  １５６ｂとも呼ばれる、いくつかの病理学的に重要な基質の細胞外切断（エクトドメインシェディング（ectodomain shedding））を担う膜結合メタロプロテアーゼである。最初に膜結合プロＴＮＦ−α遊離可溶性タンパク質の切断を担う酵素として同定され、以来、ＡＤＡＭ１７は多数の膜結合前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングにおいて記載されている。ＡＤＡＭ１７によるエクトドメインシェディングは、細胞の膜から多数の可溶性サイトカインおよび増殖因子、例えば、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、エピレグリン、エピジェンおよびニューレグリンを遊離する。ＡＤＡＭ１７はまた、ＩＬ−６Ｒａ、ＩＬ−１ＲＩＩ、Ｈｅｒ４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ、Ｍｅｒ、ＴＮＦ−α  ＲＩ  ＆  ＩＩを含む多くの受容体のシェディングを媒介し、そこでの生理学的結果は、受容体シェディングもしくは可溶性リガンド捕捉を介したシグナルサイレンシング、またはＩＬ−６Ｒαおよびｇｐ１３０に関して記載されているような受容体のトランス活性化であり得る。ＡＤＡＭ１７は、多数の接着分子のシェディングおよび細胞外微小環境の成分、例えば、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ネクチン−４、ＣＤ４４およびコラーゲンＸＶＩＩを介して細胞外マトリックスのリモデリングおよび細胞−細胞接触に積極的に関与することができる。ＡＤＡＭ１７のよく理解されてない活性としては、細胞プリオンタンパク質およびアミロイド前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングが含まれる。
【０００３】
疑念を避けるため、明示されない限り、ＡＤＡＭ１７という表現は、配列番号２２の配列のヒトＡＤＡＭ１７に関する。
【０００４】
構造的には、ＡＤＡＭ１７は、プレプロタンパク質ドメイン（ａａ１〜２１４）、細胞外ドメイン（ａａ２１５〜６７１）、膜貫通ドメイン（ａａ６７２〜６９２）および細胞質ドメイン（ａａ６９３〜８２４）を含んでなる８２４アミノ酸のタンパク質からなる。
【０００５】
より詳しくは、細胞外ドメインは、配列番号２３の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ２１５〜４７４に相当する）のメタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメイン、配列番号２４の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ４７５〜５６３に相当する）のディスインテグリン（ＤＩ）ドメインおよび配列番号２５の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ５６４〜６７１に相当する）の膜近位（ＭＰＤ）ドメインから構成される。
【０００６】
ＡＤＡＭ１７は、アンタゴニスト抗体の作製のための技術上困難な標的として記載されており、実際に、所望の特徴を生じるための特異的結合剤の選択および最適化を必要とする複雑な選択戦略が記載されている。これまでに記載されているこのような特異的アンタゴニストは１つだけであり、抗体Ｄ１（Ａ１２）は、ディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインを同時に介してＡＤＡＭ１７と結合し得る。Ｄ１（Ａ１２）のアンタゴニスト活性は、そのアンタゴニスト活性を示すためにディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインの両方との結合に依存する。
【０００７】
本発明は、有効な抗腫瘍活性を有するＡＤＡＭ１７を標的とする適切な抗体の欠如を改善することを意図する。
【０００８】
第１の面において、本発明は、ＡＤＡＭ１７と結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【０００９】
マウスモデルモノクローナル抗体のヒト化は、マウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の可変抗体ドメインのヒトフレームワーク領域にグラフトすることで初めて達成された。また、それらのフレームワーク領域に存在している幾つかのアミノ酸残基は、ＣＤＲまたは抗原と相互作用し、ヒト化抗体中で復帰突然変異し得、結合特性またはその他の特性を改善すると確認された。
【００１０】
ヒト化抗体または任意のその抗原結合性フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【００１１】
疑念を避けるため、文脈がそうではないことを示さない限り、ＣＤＲという表現は、ＩＭＧＴにより定義される抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
【００１２】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢにおける３Ｄ構造において使用される。
【００１３】
３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。用語ＣＤＲ（単数または複数）は、本明細書では、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかを、もしくは全体でさえ示すために使用される。
【００１４】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性パーセンテージ」または「同一性％」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基パーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988)の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００１５】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、その２配列間の最適なアラインメントの参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る。同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【００１６】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用し、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
【００１７】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００１８】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
【００１９】
限定されない例として、下記表１は、対応する改変抗体の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も通常可能である。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本発明の態様は、
ａ）ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列の相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、およびｉｉ）ヒト生殖細胞系列(germline)ＩＧＨＶ４−４＊０７に由来するフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３（配列番号１８）、およびｉｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＪ６＊０１（配列番号２０）に由来するフレームワーク領域ＦＲ４を有する重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）ｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列の相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３、およびｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ１−３９＊０１に由来するフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３（配列番号１９）、およびｉｉｉ）ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＪ４＊０１に由来するフレームワーク領域ＦＲ４（配列番号２１）を有する軽鎖可変ドメイン
を含んでなることを特徴とする、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００２２】
用語「生殖細胞系列」または「生殖細胞系列配列」とは、有機体のゲノムＤＮＡに存在している、再配列されていない免疫グロブリンV、Dおよび/またはJ領域、あるいはその部分によりコードされるアミノ酸配列を指す。
【００２３】
生殖細胞系列は、親から子へ伝達されるような基本的な遺伝的メッセージを表し、それは前記遺伝子のコード配列中の任意の機能的再配列の前に伝達される。抗体の場合、可変（Ｖ）、多様（Ｄ、重鎖に特異的）、および結合（Ｊ）遺伝子をコードする個々の生殖細胞系列遺伝子の相同的組み換えによって、非生殖細胞系列生成物が生成される：重鎖についてはＶＤＪ、および軽鎖についてはＶＪ。生殖細胞系列遺伝子組み換え段階での核酸の挿入および欠失に対する潜在性は、ヒト免疫レパートリーによって生成することができる抗体の、ほぼ無限の多様性を担っている。一度組み換えられると、集まった遺伝子は、もはや親から子へ伝達可能でない機能的免疫グロブリン遺伝子を生成し、従ってもはや生殖細胞系列実体ではない。
【００２４】
ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子の生殖細胞系列配列は、ＩＭＧＴ、ＵＮＳＷＩｇ、ＮＣＢＩおよびＶＢＡＳＥ２等のキュレートした(curated)データベースから得て問い合わせることができる。
【００２５】
本明細書において使用される生殖細胞系列配列の情報源は、ＩＭＧＴ  Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列データベースである。疑念を避けるため、生殖細胞系列ＩＧＨＶ４−４＊０７、ＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびＩＧＫＪ４＊０１は、ＩＭＧＴ生殖細胞系列データベースから得られた。
【００２６】
本明細書によれば、指定配列「に由来する」という用語は、配列の起源(origin)を意味する。一つの態様において、特定の出発アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、出発配列のものまたはその部分と本質的に同一であるか（ここで、前記部分は、少なくとも３〜５個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、または少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなる）、またはさもなければ当業者であれば出発配列中にその起源を有することが同定可能である、アミノ酸配列を有する。
【００２７】
本明細書において、表現「親抗体」とは、本発明によるヒト化抗体が由来するマウス抗体を設計するために使用される。
【００２８】
本発明の態様において、ヒト化抗体は、親抗体の重鎖および／または軽鎖の１、２、３、４、５または６個のＣＤＲならびに選択された生殖細胞系列のフレームワーク領域を含んでなっていてもよい。本発明の別の態様において、ヒト化抗体は、親抗体の重鎖および／または軽鎖の６個のＣＤＲならびに選択された生殖細胞系列のフレームワーク領域を含んでなっていてもよい。
【００２９】
本明細書に開示されるヒト化抗体は、対応する生殖細胞系列配列と比較して、同様に、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域において、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／欠失を含んでなっていてもよい。このような突然変異は、親抗体のアミノ酸配列と生殖細胞系列配列とを比較することによって、すぐに解明することができる。本発明は、抗体、およびその抗原結合性フラグメントを含み、それらは、生殖細胞系列の任意のアミノ酸配列に由来し、ここで１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸は、対応するマウス残基（複数可）に、または対応するマウス残基（複数可）の保存アミノ酸置換（天然または非天然）に復帰突然変異される（このような配列変化は、本明細書において「復帰突然変異」と称する）。当業者であれば、選択した生殖細胞系列の重鎖および軽鎖の可変領域配列から出発して、１つ以上の個別の復帰突然変異またはそれらの組み合わせを含んでなる、多数の抗体および抗原結合性フラグメントを容易に生成することができる。特定の態様において、Ｖ．ｓｕｂ．Ｈ  および／またはＶ．ｓｕｂ．Ｌドメイン内の全てのフレームワーク残基は、マウス配列へ復帰突然変異する。別の態様において、特定の残基のみがマウス配列へ復帰突然変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク領域内で２つ以上の復帰突然変異の任意の組み合わせを含んでもよい（即ち、特定の個別残基が、マウス配列とは異なる特定のその他の残基が維持されている間に、マウス配列へ復帰突然変異される）。１つ以上の復帰突然変異を含有する抗体および抗原結合性フラグメントは、一度得ることができれば、改善した結合特異性、改善した結合親和性、改善したまたは強化したアンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性（場合により）、低減した免疫原性、改善した折り曲げ、改善した発現、改善した安定性、改善した軽鎖／重鎖の集合などの１つ以上の所望の特性のために容易に試験することができる。この一般的様式にて得られた抗体および抗原結合性フラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】
限定されない例として、ヒト化アプローチへの幾つかの概要が以下に言及される。
【００３１】
工程１．親抗体への最大の相同を伴い、ＶＬヒト生殖細胞系列ファミリーまたはＶＨヒト生殖細胞系列ファミリーのいずれかを選択すること。
【００３２】
工程２．対応するＶＨヒト生殖細胞系列ファミリーまたはＶＬヒト生殖細胞系列ファミリーのいずれかを選択して、ヒト抗体レパートリーに高い頻度を有するまたはＶＨ−ＶＬ集合を修正するような好ましい生物物理学的特徴をもたらすと知られている、ＶＨ／ＶＬ組み合わせを作成すること。これには、最も高い相同性を有するもの以外のその他のヒト生殖細胞系列ファミリーも含む。
【００３３】
工程３．フレームワーク領域において親抗体ともっとも高い相同性を有する、このヒト化生殖細胞系列ファミリーのメンバーを選択すること。
【００３４】
工程４．全てのフレームワーク一が、選択されたヒト生殖細胞系列およびその活性の評価および生物物理学特性に由来する、変異体を生成すること。
【００３５】
工程５．親残基を、ＣＤＲと相互作用すると同定された位置、または対応するタンパク質結晶構造モデルに基づく強い構造的関係を有する位置でフレームワーク内へ挿入すること。
【００３６】
工程６．特定の復帰突然変異を含有する変異体の、個別および組み合わせを評価すること。
【００３７】
工程７．復帰突然変異の異なる組み合わせおよび減少した数の復帰突然変異を含む、第一評価の結果に基づく、異なる変異体を生成すること。
【００３８】
本発明の側面は、ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７の配列からなり、かつｉｉ）軽鎖可変ドメインが配列坂東８の配列からなることを特徴とする、ヒト化抗体、またはその抗原結合性フラグメントからなる。
【００３９】
当業者であれば明白なことに、配列番号７および８の配列は、本発明による潜在的復帰突然変異が同定されるコンセンサス配列に対応する。本発明による抗体は、復帰突然変異を全く含んでならないか、または少なくとも１つを含んでなってもよい。
【００４０】
一つの態様において、本発明に記載された抗体の重鎖は、コンセンサス配列において同定された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個の復帰突然変異を含んでなっていてもよい。
【００４１】
一つの態様において、本発明に記載された抗体の軽鎖は、コンセンサス配列において同定された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の復帰突然変異を含んでなっていてもよい。
【００４２】
本発明の特定の態様は、重鎖可変ドメインが、配列番号９の配列、または配列番号９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列からなることを特徴とする、ヒト化抗体、またはその抗原結合性フラグメントである。
【００４３】
疑念を回避するために、上記の配列番号９の配列からなる重鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体は、同様にそれぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００４４】
本発明の別の特定の態様は、軽鎖可変ドメインが、配列番号１０の配列、または配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列からなることを特徴とする、ヒト化抗体、またはその抗原結合性フラグメントである。
【００４５】
疑念を回避するために、上記の配列番号１０の配列からなる軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体は、同様にそれぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を有する重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００４６】
本発明の別の態様において、ヒト化抗体は、配列番号９の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントからなる。
【００４７】
特定の側面において、本明細書に記載されたヒト化抗体は、従来技術に記載されている抗体とは対照的にシングルドメインを介してＡＤＡＭ１７と結合し得る。言い換えれば、本発明によるヒト化抗体は、単一のエピトープと結合し得るが、従来技術の抗体は、ディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインという２つの異なる独立したドメインから構成されるコンフォメーショナルエピトープに結合する。
【００４８】
この特性は、ヒト化抗体の結合が患者の性質、処置される病態の性質、患者の健康状態などによるＡＤＡＭ１７の特定のコンフォメーションに依存しないので、特に着目される。
【００４９】
一態様では、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合し、かつＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディング（shedding）を阻害するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載され、ここで、前記ＡＤＡＭ１７エピトープは、配列番号２５の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれる１つのエピトープからなる。
【００５０】
ＡＤＡＭ１７のＭＰＤに結合する抗体は、限定されるものではないが、免疫およびハイブリドーマ作製、モノクローナルＢ細胞選択、ファージディスプレー、リボゾームディスプレー、酵母ディスプレー、標的化遺伝子合成と組み合わせた発現免疫応答シーケンシングを含む、当業者に周知のいくつかの技術のうちのいずれかによって得ることができる。各方法は、標的抗原としてＡＤＡＭ１７タンパク質または選択されたサブドメインを用いて行うことができる。当業者ならば、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメイン、またはより詳しくは、ＭＰＤと結合する抗体の集団からＭＰＤ結合抗体を選択することができるであろう。続いての選択および特性決定は、ＭＰＤ結合に関する選択工程も意味し、それにより、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する総ての結合剤が、ＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対する結合に関して選択的にスクリーニングされる。あるいは、総ての選択工程はＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対して行うことができ、天然のＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する結合が、続いての選択および特性決定工程として使用される。
【００５１】
特定の態様によれば、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００５２】
「モノクローナル抗体」は、均質に近い抗体集団から生じる抗体を意味すると理解される。より詳しくは、集団の個々の抗体は、最小の割合で見られ得る少数の起こり得る自然突然変異以外は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の成長から生じる抗体からなり、一般に、１つおよび１つだけのクラスおよびサブクラスの重鎖と１タイプだけの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は特異性が高く、かつ、単一の抗原向けられる。
【００５３】
「結合(binding)」または「結合する(binds)」などは、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することが意図される。２つの分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、および表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑念を避けるため、それは、前記ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントが別の抗体と低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。好ましい態様としては、前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、非特異的分子（ＢＳＡ、カゼインなど）に対する結合に関するその親和性の少なくとも２倍の親和性でその抗原に結合する。しかしながら、別の態様として、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記抗原にのみ結合する。
【００５４】
より明白にするために、下記の表２に本発明のヒト化抗体に対応する、種々のアミノ酸配列をまとめた。
【００５５】
【表２】
2018502096.tif 000003
【００５６】
膜近位ドメイン（ＭＰＤ）、既述のように、ヒトＡＤＡＭ１７（配列番号２２の配列）のアミノ酸ドメイン５６４〜６７１からなる。ここで、マウスＡＤＡＭ１７の対応するＭＰＤもまたアミノ酸５６４〜６７１から構成されることも指摘できる。
【００５７】
特定の態様によれば、本明細書に記載のヒト化抗体は、メタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメインと結合せず、前記ＭＰドメインは配列番号２２の配列のアミノ酸２１５〜４７４から構成される。
【００５８】
特定の態様によれば、本明細書に記載のヒト化抗体はディスインテグリン（ＤＩ）ドメインと結合せず、前記ＤＩドメインは、配列番号２２の配列のアミノ酸４７５〜５６３から構成される。
【００５９】
シェディング活性を担うことが知られているＡＤＡＭ１７の触媒ドメインに干渉せずに、ＡＤＡＭ１７基質のシェディングを低減または阻害し得るアンタゴニスト、より詳しくは、抗体、一層より詳しくは、ヒト化抗体は記載されたことも示唆されたこともないので、この側面は驚くべきものである。言い換えれば、本明細書に記載のヒト化抗体は、病態の特定の状況において少なくとも１つの基質に関するＡＤＡＭ１７の酵素活性を選択的に低減または阻害することができ、前記病態は癌である。本明細書に記載のヒト化抗体の利点は、それが触媒ドメインとは結合しないが、その基質の全部または一部に対するＡＤＡＭ１７の酵素活性を低減または阻害できる可能性があることから、ＡＤＡＭ１７の全触媒活性を阻害しないと思われるという事実によるものであり得る。
【００６０】
一態様では、本出願に記載のヒト化抗体は、ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する。
【００６１】
本発明に関して、「ＩＣ５０」という表現は、達成可能な最大の半分の阻害を達成するのに必要な、用量応答評価における抗体の濃度を意味する。ＩＣ５０のこのような評価は、細胞からの基質シェディング評価または組換えタンパク質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチド切断アッセイによって行うことができる。
【００６２】
好ましい側面において、本ヒト化抗体は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）の細胞シェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００６３】
好ましい側面において、本発明によるヒト化抗体は、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子α）の細胞シェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００６４】
好ましい側面において、本発明によるヒト化抗体は、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）の細胞シェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００６５】
好ましい側面において、本発明によるヒト化抗体は、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）の細胞シェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００６６】
一態様では、本発明のヒト化抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されるＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質の細胞シェディングを阻害することを特徴とする。
【００６７】
一態様において、本発明のヒト化抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されるＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質の細胞シェディングを少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００６８】
一態様において、本発明のヒト化抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦの細胞シェディングを少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００６９】
別の側面によれば、本ヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【００７０】
別の態様では、本ヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下、より好ましくは約２ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【００７１】
「Ｋｄ」は、「Ｋｄ」または「ＫＤ」とも呼ばれ、特定の抗体−抗原複合体の解離定数を意味する。Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ  ここで、Ｋｏｆｆは、抗体−抗原複合体からの抗体解離の解離速度定数であり、Ｋｏｎは、抗体が抗原と会合する速度である(Chen Y. et al., 1999; J Mol Biol. 1999;293(4):865-81))。
【００７２】
一態様において、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記抗原結合性フラグメントがＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖのフラグメントであることを特徴とする。「抗原結合性フラグメント」とは、限定されるものではないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、またはその半減期がポリ（エチレン）グリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾により、もしくはリポソーム内への組み込みにより延長される任意のフラグメントからなる群から選択することができ、前記フラグメントは、本発明によるヒト化抗体の特徴的な可変ドメインのうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、前記「抗原結合性フラグメント」は、それらが由来するヒト化抗体の重鎖可変または軽鎖の部分配列で構成されるか、または前記部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来するヒト化抗体と同じ結合特異性および標的に対する十分な親和性、好ましくは、それが由来するヒト化抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。
【００７３】
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的エピトープまたは機能的エピトープとして定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。
エピトープはまた、コンフォメーショナルエピトープでもあり得る。特定の態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面群である決定基を含み得、特定の態様では、特定の三次元構造特徴、および／または特異的電荷特徴を持ち得る。疑念を避けるため、「単一のエピトープ」という表現は、必ずしも直鎖エピトープを意味する訳ではない。
【００７４】
本発明によるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【００７５】
非制限的態様として、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。例として、本発明による前記ＩｇＧ１アイソタイプヒト化抗体は、配列番号１１の配列の重鎖、およびそれぞれ配列番号４、５または６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。好ましい態様において、前記ヒト化抗体は、配列番号８の配列の軽鎖可変ドメイン、より好ましくは配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメイン、一層より好ましくは配列番号１５の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００７６】
別の非制限的態様として、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。例として、本発明による前記ＩｇＧ２アイソタイプヒト化抗体は、配列番号１２の配列の重鎖、およびそれぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。好ましい態様において、前記ヒト化抗体は、配列番号８の配列の軽鎖可変ドメイン、より好ましくは配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメイン、一層より好ましくは配列番号１５の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００７７】
別の非制限的態様として、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。例として、本発明による前記ＩｇＧ３アイソタイプヒト化抗体は、配列番号１３の配列の重鎖、およびそれぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。好ましい態様において、前記ヒト化抗体は、配列番号８の配列の軽鎖可変ドメイン、より好ましくは配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメイン、一層より好ましくは配列番号１５の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００７８】
別の非制限的態様として、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。例として、本発明による前記ＩｇＧ４アイソタイプヒト化抗体は、配列番号１４の配列の重鎖、およびそれぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。好ましい態様において、前記ヒト化抗体は、配列番号８の配列の軽鎖可変ドメイン、より好ましくは配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメイン、一層より好ましくは配列番号１５の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００７９】
言い換えると、本発明は、配列番号１１、１２、１３および１４の配列から選択された配列の重鎖および配列番号１５の配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００８０】
本発明の範囲の対象は、上記ヒト化抗体の親和性成熟突然変異体である。
【００８１】
好ましい態様において、前記親和性成熟突然変異体は、前記初期ヒト化抗体に比べて高い親和性を有する突然変異体からなる。
【００８２】
親和性成熟のために、当業者に既知のいずれかの方法を使用するべきである。限定されない例として、それは、可変ドメインの標的としたまたはランダムな突然変異生成、ＣＤＲ（複数可）の標的としたまたはランダムな突然変異生成、抗体ライブラリーまたは新規の重鎖または軽鎖との鎖混合、細胞改善またはその他の類似の適切な方法を言及することができ、その後選択およびより高い親和性のクローンのためのスクリーニングが続く。
【００８３】
本発明は、上記ヒト化抗体の親和性成熟突然変異体からなることを特徴とする、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００８４】
２０１２年１０月１８日にフランス, パリ75725, Cedex 15, 25 Rue du Docteur Roux, パスツール研究所、ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６から得られたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３からなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載されている。
【００８５】
本発明は、２０１２年１０月１８日にフランス, パリ75725, Cedex 15, 25 Rue du Docteur Roux, パスツール研究所、ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６から得られたマウス抗体１０２２Ｃ３からなる親抗体に由来する、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４系統の細胞の融合によって得られたものである。
【００８６】
ｉ）ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系統Ｉ−４６８６によって発現した抗体の重鎖ドメインの核酸配列、および
ｉｉ）ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系統Ｉ−４６８６によって発現した抗体の軽鎖ドメインの核酸配列  
を含んでなる、マウス、キメラ、ヒト化またはヒトのＡＤＡＭ１７抗体あるいはその抗原結合性フラグメントを特許請求することも本発明の目的である。
【００８７】
特定の態様において、本明細書に記載されたヒト化抗体は、配列番号25の配列の膜近位（ＭＰＤ）内に含まれてなる、ＡＤＡＭ１７のエピトープに結合することができる。
【００８８】
ヒト化抗体の別の好ましい特性は、それが５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０でＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質の細胞シェディングを阻害するということであり、前記ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質は、好ましくはＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよび／またはＨＢ−ＥＧＦから選択される。
【００８９】
別の態様において、ヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下、より好ましくは約２ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【００９０】
本発明の別の側面は、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に有効量の上記のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を含んでなる。
【００９１】
別の態様では、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するためのヒト化抗体が記載され、前記腫瘍細胞は、ＡＤＡＭ１７を発現する腫瘍細胞から選択される。
【００９２】
当業者ならば、サイトメトリー、免疫組織化学、抗体結合能（ＡＢＣ）などの既知の技術のいずれかによってＡＤＡＭ１７の発現レベルを容易に決定できるであろう。
【００９３】
限定されない例として、発現レベルは、ＡＤＡＭ１７に対する標識抗体の抗体結合能（ＡＢＣ）をサイトメトリーにより測定することで決定することができる。
【００９４】
一態様において、腫瘍細胞は、少なくとも５０００のＡＢＣを有するＡＤＡＭ１７を発現すると考えられる。
【００９５】
別の態様では、腫瘍細胞は、少なくとも１００００のＡＢＣを有するＡＤＡＭ１７を発現すると見なされる。
【００９６】
本発明は、同様に、薬剤としての使用のための、上記のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントからなる。
【００９７】
本発明は、同様に、有効成分として、本明細書に記載された、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる組成物に関する。好ましくは、前記ヒト化抗体は、賦形剤および／または薬学的に許容可能な担体によって補完されている。
【００９８】
本発明は、薬剤としての使用のための、本明細書に記載された組成物も含んでなる。
【００９９】
本発明は、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または当該ヒト化抗体を含んでなる組成物、特に癌の治療のための薬剤としてのその使用にも関する。
【０１００】
本発明は、それを必要とする患者における癌の治療方法にも向けられ、前記患者に治療的有効量の、少なくとも１つのヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントまたは当該ヒト化抗体を含んでなる組成物を投与することを含んでなり、それによって当該患者の癌を治療する。
【０１０１】
本発明は、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用、または当該ヒト化抗体を含んでなる組成物の使用、またはＡＤＡＭ１７を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬物の製造(preparation)のための使用にも関する。
【０１０２】
本発明は、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用、または当該ヒト化抗体を含んでなる組成物の使用、またはＡＤＡＭ１７を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬物の製造のための使用にも関する。
【０１０３】
本発明は、それを必要とする対象における腫瘍細胞増殖に関連する疾患を治療する方法であって、前記患者に、治療的有効量の、少なくとも１つのヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントまたは当該ヒト化抗体を含んでなる組成物を投与することを含んでなり、前記ヒト化抗体が、腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、それによって前記患者における疾患を治療する方法にも関する。
【０１０４】
好ましい様式において、前記癌は、エストロゲン関連乳癌、非小細胞肺癌、結腸癌および／または膵臓癌の中から選択される癌である。
【０１０５】
言い換えると、本発明は、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント、または当該ヒト化抗体を含んでなる組成物、癌の治療のための薬剤としてのその使用に関する。
【０１０６】
好ましい態様において、前記癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭部および頸部癌、腎臓癌および結腸癌の中から選択される癌である。
【０１０７】
本発明の別の側面は、記載されたヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸に関する。
【０１０８】
用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に使用され、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有せず、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかであるフラグメントまたは核酸の領域を定義する、改変されたまたは改変されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【０１０９】
ここで、本発明はそれらの天然の染色体環境にある、すなわち天然状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないことも含めておくべきであろう。本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは直接または例えばコピーにより間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。ここで、組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸も述べておくべきであろう。
【０１１０】
本発明の一態様は、配列番号１６の配列を含んでなる重鎖可変ドメインおよび配列番号１７の配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする、本発明のヒト化抗体をコードする、単離された核酸からなる。
【０１１１】
また、上述の核酸を含んでなるベクターも記載される。
【０１１２】
本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを目的とする。
【０１１３】
本発明のベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞内でヌクレオチド配列の転写／翻訳発現および／または分泌を可能とする要素を含み、その結果、コードされるヒト化抗体の発現／分泌をもたらす。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。好ましい態様では、このようなベクターは、宿主細胞内で安定な様式で維持され得るべきであり、場合により翻訳された抗体の分泌を指定する特定のシグナルを有してもよい。これらの種々要素は、使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は選択された宿主内で自己複製するベクターに挿入することもできるし、または選択された宿主の組み込みベクターとすることもできる。
【０１１４】
このようなベクターは、当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンをリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。
【０１１５】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらはクローンまたは本発明のヌクレオチド配列をクローニングするまたは発現させることを目的に、宿主細胞を形質転換するために使用される。
【０１１６】
本発明はまた、上記のベクターを含んでなる宿主細胞にも関する。
【０１１７】
宿主細胞は、原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、例えばまた、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞の中から選択することができる。昆虫細胞または植物細胞も使用可能である。
【０１１８】
本出願のもう１つの主題は、上記のヒト化抗体により形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物からなる。
【０１１９】
従ってまた、本明細書によるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントの生産のための方法であって、下記の工程：
ａ）上記の細胞の、培地および適当な培養条件での培養； 
ｂ）前記培養培地または前記培養細胞から出発して生産された前記抗体またはその抗原結合性フラグメントの回収；および
ｃ）前記抗体のヒト化
を含んでなることを特徴とする方法も記載される。
【０１２０】
本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの作製のための方法に使用される。その方法がベクターおよび／または本発明によるベクターにより形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え形態での本発明によるポリペプチドの作製のための方法もまた本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞は、前述のポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【０１２１】
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することが可能である。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌させる組換えタンパク質の生産に有利に使用することができる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実によって容易となる。
【０１２２】
本発明のポリペプチドはまた化学合成によって作製することもできる。１つのこのような作製方法もまた、本発明の対象である。当業者ならば、固相技術（特に、Steward et al, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 第2版参照）または部分的固相技術、フラグメントの縮合による、または溶液中での従来の合成によるなどの化学合成の方法を知っている。化学合成により得られ、対応する非天然アミノ酸を含有し得るポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１２３】
本発明の方法により得られる可能性のあるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントも本発明に含まれる。
【０１２４】
本発明は、薬剤として使用するための上記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【０１２５】
一態様において、本出願は、上記のヒト化抗体を含んでなる組成物に関する。
【０１２６】
一態様において、組成物は、組合せ製剤として、治療上有効な量の細胞傷害性薬剤をさらに含んでなることを特徴とする。
【０１２７】
組合せが構成される成分は、その組合せの最大有効性が得られるように、同時、個別、または逐次に投与してよく、各投与については、迅速投与から連続潅流までその持続時間の変更が可能である。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「同時投与」とは、単一のユニークな剤形による組成物の２つの化合物の投与を意味する。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「個別投与」とは、異なる剤形での本発明による組成物の２つの化合物の同時投与を意味する。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「逐次投与」とは、それぞれ異なる剤形で本発明による組成物の２つの化合物の連続的投与を意味する。
【０１３１】
「治療上有効な量」とは、本明細書で使用する場合、疾患の症状を予防、緩和、軽減もしくは改善する、または治療される患者の生存を延長するために有効な１つの化合物（または複数の化合物）の最小の濃度または量を意味する。治療上有効な量はまた、薬剤の毒性作用または有害作用に治療上有益な効果が上回るものである。より詳しくは、癌の治療に関して、治療上有効な量は、（１）腫瘍のサイズを縮小する（または好ましくは排除する）；（２）腫瘍転移を阻害する（すなわち、いくらか緩徐化する、好ましくは停止させる）；（３）腫瘍成長をいくらか阻害する（すなわち、いくらか緩徐化する、好ましくは停止させる）；および／または（４）癌に関連する１以上の症状をいくらか緩和する（または好ましくは、排除する）効果を有する量を意味する。
【０１３２】
一態様において、本組成物は、治療上有効な量の細胞傷害性薬剤を複合製剤としてさらに含んでなることを特徴とする。
【０１３３】
本発明の意味において、「複合体」とは一般に、１以上の細胞傷害性薬剤と物理的に連結されて、高度に標的化された化合物となった上記のヒト化抗体を少なくとも含んでなる組成物を意味する。
【０１３４】
一態様において、前記ヒト化抗体は、リンカーによって細胞傷害性薬剤に化学的に連結される。「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」は、共有結合を含んでなる化学部分または結合タンパク質を少なくとも１つの細胞傷害性薬剤に共有結合する原子の鎖を意味する。リンカーは、「切断不能」でも「切断可能」でもよい。
【０１３５】
本発明の組成物はまた、種々の希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、および当技術分野で周知の他の材料も含み得る。
【０１３６】
別の態様では、本組成物は、薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物である。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能なビヒクル」または「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合する溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび総てが含まれる。担体のタイプは、意図される投与経路に基づいて選択することができる。種々の態様では、担体は、静脈投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与または経口投与に好適なものである。薬学的に許容可能な担体としては、無菌水溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調合製剤のための無菌粉末が含まれる。薬学的に有効な物質のための媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。非経口投与可能な化合物を製造するための方法は周知であるか、または当業者に自明であり、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるRemington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)、およびその第18版および第19版にさらに詳しく記載されている。
【０１３８】
「細胞傷害性薬剤」または「細胞傷害性」とは、対象に投与した際に、細胞増殖の進展、好ましくは、対象の身体における癌の発生を、細胞の機能を阻害もしくは抑制することにより、かつ／または細胞死を引き起こすことにより治療または予防する薬剤を意図する。
【０１３９】
多くの細胞傷害性薬剤が単離または合成されており、細胞増殖を阻害すること、または腫瘍細胞を、決定的でなくとも少なくとも有意に破壊もしくは減少させることを可能とする。
【０１４０】
より詳しくは、細胞傷害性薬剤は、好ましくは、限定されるものではないが、薬物、毒素、放射性同位元素などからなる。
【０１４１】
別の側面によれば、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するための組成物が記載される。
【０１４２】
本発明はまた、薬剤の製造のための本組成物の使用を含んでなり、前記薬剤は、好ましくは癌の予防または治療を意図する。
【０１４３】
治療適用に関して、本発明の組成物は、ヒトに、ボーラスとしてもしくは一定期間にわたる持続的注入による静脈内に、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口の、局所的、または吸入経路により投与され得るものを含む、上述のものなどの薬学的に許容可能な投与形で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。本発明の前記組成物はまた、局部的ならびに全身性治療効果を発揮するように、腫瘍内、腫瘍近傍、病巣内、または病巣近傍経路により好適に投与される。
【０１４４】
本発明の他の特徴および利点は、例および図面とともに本明細書に示され、図面の凡例を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】図１Ａ：マウス１０２２Ｃ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図１Ｂ】図１Ｂ：ヒト化１０２２Ｃ３変異体（Ｖｎ）と生殖細胞系列ＩＧＨＶ２−５およびＩＧＫＶ１−３３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図１Ｃ】図１Ｃ：ヒト化１０２２Ｃ３変異体（Ｖｎ）と生殖細胞系列ＩＧＨＶ４−４およびＩＧＫＶ１−３９ならびに最終変異体ｈｚ１０２２Ｃ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２Ａ】図２Ａ：未処理細胞の基本シェディングレベルの百分率として表現される安定的に導入された細胞株Ａ４３１からのｍ１０２２Ｃ３とｈｚ１０２２Ｃ３の、Ｎｌｕｃ融合タンパク質ＡＲＥＧ（Ａ：平均は顕著に異なっている：不対ｔ試験（ａ＜０．０５）：ｐ＝０．０００５）のシェディングの最大阻害の比較。
【図２Ｂ】図２Ｂ：未処理細胞の基本シェディングレベルの百分率として表現される安定的に導入された細胞株Ａ４３１からのｍ１０２２Ｃ３とｈｚ１０２２Ｃ３の、Ｎｌｕｃ融合タンパク質ＴＧＦα  Ｂ：平均は顕著に異なっている：不対ｔ試験（ａ＜０．０５）：ｐ＝０．０００３）のシェディングの最大阻害の比較。
【図２Ｃ】図２Ｃ：未処理細胞の基本シェディングレベルの百分率として表現される安定的に導入された細胞株Ａ４３１からのｍ１０２２Ｃ３とｈｚ１０２２Ｃ３の、Ｎｌｕｃ融合タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（Ｃ：平均は顕著に異なっている：不対ｔ試験（ａ＜０．０５）：ｐ＝０．００６９）のシェディングの最大阻害の比較。
【図３】図３：、膜近位ドメインオーバーラッピングペプチドアレイに対する１０２２Ｃ３およびｃｈ９Ｇ４のペプチドマイクロアレイエピトープ特徴化、ハイブリダイゼーションシグナル比。
【図４】図４：確立されたＡ４３１異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図５】図５：フラグメントＡ４３１異種移植モデルにおける１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図６】図６：Ａ４３１異種移植モデルにおけるｍ１０２２Ｃ３（マウス型）とｃ１０２２Ｃ３（キメラ型）の比較。
【図７】図７：確立されたＣａＯＶ−３異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図８】図８：確立されたＯＶＩＳＥ異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図９】図９：確立されたＢｘＰＣ３異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１０Ａ】図１０Ａ：１．２５ｍｇ／ｋｇで使用された際のＣａＯＶ−３異種移植モデルに対する、マウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）との比較。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ：５ｍｇ／ｋｇで使用された際のＣａＯＶ−３異種移植モデルに対する、マウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）との比較。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：マウス抗体の作製
ヒトＡＤＡＭ１７に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１５〜２０μｇのヒトＡＤＡＭ１７組換えタンパク質（R
and D Systems、ｒｅｆ：９３０−ＡＤＢ、ｒｈＡＤＡＭ１７）で３回皮下免疫した。最初の免疫は完全フロイントアジュバント（アメリカ合衆国、メリーランド州、St Louis、Sigma）の存在下で行った。以降の免疫にはフロイントの不完全アジュバント（Sigma）を加えた。
【０１４７】
融合の３日前に、２個体の免疫マウス（血清力価測定に基づいて選択）をフロイントの不完全アジュバントとともに１５〜２０μｇのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質で追加免疫した。近位リンパ節の細断によりリンパ球を調製した後、それらをＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と１：４比（リンパ球：骨髄腫）で融合させた（アメリカ合衆国、メリーランド州、Rockville、ATCC）。融合プロトコールはKohler and Milstein (1975)により記載されているものであり、最後に、５０枚の９６ウェルプレートに播種した。次に、融合細胞に対して代謝ＨＡＴ選択を行った。融合およそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングでは、ハイブリドーマの上清を、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＡＤＡＭ１７に対して生成したｍＡｂの分泌に関して評価した。
【０１４８】
簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（アメリカ合衆国、ニューヨーク州、Corning、Costar 3690）をＰＢＳ中０．７μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＤＡＭ１７タンパク質（R and D Systems、ｒｅｆ：９３０  ＡＤＢ）５０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、ドイツ、ハイデルベルク、Serva Electrophoresis GmbH）を含有するＰＢＳで、３７℃にて２時間ブロックした(blocked)。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出し、５０μｌのサンプル（ハイブリドーマ上清または精製抗体）をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、アメリカ合衆国、ペンシルベニア州、West Grove、Jackson Immuno-Research Laboratories、Inc.）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈液として３７℃で１時間加えた。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、フランス、Interchim、Uptima）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１４９】
第２のスクリーニング工程として、選択されたハイブリドーマ上清をＡ１７２ヒト腫瘍細胞の表面で発現される細胞型のＡＤＡＭ１７と結合し得るｍＡｂに関してＦＡＣＳ分析により評価した。フローサイトメトリーによる選択のために、２×１０５細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００希釈したＡｌｅｘａ
４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、アメリカ合衆国、Eugene、Molecular Probes Inc.）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、各試験管にヨウ化プロピジウムを終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Facscalibur、Becton-Dickinson）により分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。各実験でアイソタイプ対照（Sigma、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）を使用した。少なくとも５０００細胞を用いて、蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を評価した。
【０１５０】
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈によってクローニングした。各コードにつき１枚の９６ウェルプレートを準備した。クローニング専用培養培地で８細胞／ｍｌに調整した１００μｌ容量の細胞懸濁液を各ウェルに添加した。７日目に、これらのウェルを顕微鏡で観察してクローニングおよびプレーティング効率を確認した後、これらのプレートに１００μｌのクローニング専用培養培地を再供給した。その後、９〜１０日目に、ハイブリドーマ上清を、それらのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。次に、アイソタイピングキット（カタログ番号５３００．０５、アメリカ合衆国、アラバマ州、Birmingham、Southern Biotech）を用いてクローニングされたｍＡｂのアイソタイプを調べた。各ハイブリドーマから１つのクローンを選択し、ｒｈＡＤＡＭ１７およびヒト腫瘍細胞（Ａ  １７２）に対するそれらの結合特異性確認するために拡大培養した。
【０１５１】
実施例２：ヒト化方法
可変ドメインのヒト化変異体を遺伝子合成（ルクセンブルク、Genecust）によって精製し、エピソーム性発現ベクターpCEP （Invitrogen）内でクローニングした。全てのクローニング工程を、実験室マニュアル（Sambrook and Russel, 2001）に記載された従来の分子生物学技術に従い、または供給者の指示に従い実行した。各ベクターを、Big Dye terminator cycle シーケンシングキット（アメリカ合衆国、Applied Biosystems）を用いてヌクレオチドシーケンシングによって確認し、3500 Genetic Analyzer（アメリカ合衆国、Applied Biosystems）を用いて分析した。一過性抗体発現のために、１ｍｌあたり２．１０６個の細胞を、２つの異なるベクターと、１：１の比で導入した。１つのベクターは、抗体重鎖をコードしていて、他方は、軽鎖をコードしていた。プラスミドＤＮＡ（最終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を、最終濃度１ｍｇ／ｍｌに水中で調製された直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Polysciences）と混合した。導入に使用したＤＮＡ対ＰＥＩの重量比は、１：４であった。複雑な形成のためには、細胞へ添加する前に、ＤＮＡおよびＰＥＩを１０分間インキュベートした。導入の４時間後、細胞を、１ｍｌあたり細胞１．１０６個の濃度まで同一の培地中で希釈し、バルプロ酸ナトリウム塩（Sigma - Ref. P4543-100G ）を最終濃度０，１５６ｎＭで添加した。発現容量は、中規模発現について、スクリーニング用５０ｍｌ生物反応器内でおよそ７ｍｌ〜数百ｍｌ異なっていた。抗体濃縮は、ForteBioバイオセンサーを用いて測定した。抗体を、タンパク質Ａ電磁ビーズまたはタンパク質Ａカラムを用いて上清から精製した。結合した抗体を、ｐＨ３にてＧｌｙ／ＨＣｌ  ０．１  Ｍバッファーで溶出し、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５バッファーに対して透析を行った。クマシー・ブルー染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、純度およびＶＨ／ＶＬ集合を評価した。サイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質凝集を測定した。
【０１５２】
実施例３：抗体集合および生殖細胞系列選択
発現抗体を、ｐＨ７．５に調節し、グリシンＨＣｌ  ０．１Ｍ、ｐＨ３とのｐＨシフトで溶出するタンパク質Ａセファロースカラム上で精製し、得られた溶出物を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５溶液に対する透析によってｐＨ７．５に調節した。タンパク質溶液を、ビシンコニン酸アッセイを用いて総タンパク量定量化によって標準化した。タンパク質の等量を、非還元状態においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分け、GelCode Blue Safe Protein Stain (BioRad)によって視覚化した。４つのヒト化変異体を、生殖細胞系列組み合わせＩＧＨＶ２−５とＩＧＫＶ１−３３、Ｖ１−４ｒについて、および１３個の変異体を、ＩＧＨＶ４−４とＩＧＫＶ１−３９、Ｖ５−Ｖ１７とｈｚ１０２２Ｃ３について分析した。生殖細胞系列ＩＧＨＶ２−５およびＩＧＫＶ１−３３に基づくヒト化変異体は、劣った集合抗体を明示し、Ｈ２Ｌ１およびＨ２Ｌ０が相当なレベルで存在していた（図１Ｂ）。ＩＧＨＶ４−４  およびＩＧＫＶ１−３９に基づく、親ｍ１０２２Ｃ３およびヒト化変異体は、主に正しく集合したＨ２Ｌ２（図１Ａ＆１Ｃ）を明示した（図１Ａ＆１Ｃ）。
【０１５３】
実施例４：腫瘍細胞株Ａ４３１からの組換え基質のＡＤＡＭ１７シェディング
NanoLuc（商標）ルシフェラーゼ（Promega）と融合されたプロＴＧＦα、プロＨＢ−ＥＧＦ、またはプロアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）を原形質膜で発現する安定トランスフェクトＡ４３１細胞株を作製した。これらの細胞の原形質膜におけるＡＤＡＭ１７活性は、NanoLuc（商標）ルシフェラーゼに融合された成熟リガンドの培養培地中への遊離をもたらした。培養培地サンプルにおけるNanoLuc（商標）ルシフェラーゼ活性の時間依存的測定はＡＤＡＭ１７活性を反映した。Ａ４３１基質−Ｎｌｕｃ細胞を９６ウェル培養プレート中に３００００細胞／ウェルで播種した。２日後、培養培地を、抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ（ｈｚ１０２２Ｃ３）または無関係のｍＡｂ（９Ｇ４）が種々の濃度で希釈された２００μｌの新鮮培養培地に置き換えた。培養（３７℃、ＣＯ２  ５％）２４時間後、総ての試験ウェルから５μｌの培養培地を採取し、ホワイトハーフエリア９６ウェルプレートの別々のウェルに分注した。１５μｌの（ＰＢＳ、ＢＳＡ  ０．１％  ｖ／ｖ）Nano-GloTMルシフェラーゼ基質（フリマジン）の添加後、各試験点の総発光をマルチモードマイクロプレートリーダー(Berthold Mithras LB940)にて０．１秒間読み取った。
【０１５４】
最大阻害効果（１０ｎＭ）をもたらした濃度にて、ｈｚ１０２２Ｃ３は、ｍ１０２２Ｃ３より、ＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ、ＴＧＦα−ＮｌｕｃまたはＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃの遊離の、顕著に増加した阻害を示した（それぞれ＋６．３５％  ±１．４７％；＋６．１２％  ±１．１３％および＋１０．１５％  ±２．９９％）（それぞれ図２Ａ〜２Ｃ）。
【０１５５】
ｍＡｂ  ｈｚ１０２２Ｃ３によりＴＧＦα、プロＨＢ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたは変異型プロＴＮＦαのシェディングの阻害に関して得られたＩＣ５０値を文献で公開されているものと比較した（表４）。ｍＡｂ  ｈｚ１０２２Ｃ３は、対照化合物比べて試験した総ての基質の細胞シェディングの有意に１０倍より大きい、好ましくは２０倍より大きい、好ましくは３０倍より大きい、好ましくは４０倍より大きい、好ましくは５０倍より大きい阻害を示した。
【０１５６】
【表３】
2018502096.tif 000004
【０１５７】
実施例５：ラベルフリー・リアル−タイムＳＰＲシングルサイクルカイネティック試験を用いたモノクローナル抗体ｈｚ１０２２Ｃ３  ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対するＡＤＡＭ−１７の細胞外ドメインの結合の解離定数の定義
各抗体（リガンドとして使用）を、両フローセル上で、カルボキシメチルデキストランマトリックスに共有結合したマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃで活性化されたBiacore CM5センサーチップ（GE Healthcare）の第２のフローセル上の２つの異なるレベルに結合させた。各抗体および捕捉の各レベルについて、２倍希釈スキームにより得られた１２．５〜２００ｎＭまたは６．２５〜１００ｎＭの範囲の濃度の可溶性ＡＤＡＭ１７（５２ｋＤａの分子量のアナライト）を５つの濃度で、流速３０μｌ／分にて、濃度の増殖範囲に注入した。９０秒の間、各濃度に注入した。５回目の注入後、解離相測定のために、ランニングバッファーを６００秒間注入した。各サイクルの終わりに、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ  １．７バッファーを３０秒間注入することによって表面を再生成した。得られたセンサーグラムを、第一に参照ＦＣ１表面（一切の抗ＡＤＡＭ１７抗体を含まない）からシグナルを差し引き、次に、ランニングバッファーの５回の注入（Biacore HBS-EPバッファー）から各抗体および捕捉の各レベルについて得られたセンサーグラムを差し引くことにより二重参照した。データは、BIAevaluation 3.1ソフトウエアを用い、１：１ラングミュアモデルを用いて処理した。
【０１５８】
結果を下記の表４にまとめる。
【０１５９】
【表４】
2018502096.tif 000005
【０１６０】
実施例６：ペプチドマイクロアレイエピトープ特徴化
JPT  Peptide Technologies GmbH、ドイツ、ベルリンによってペプチドマイクロアレイエピトープ特徴化が行われた。簡単に言うと、分析は次のように行われた：ＡＤＡＭ１７膜近位ドメインを介してオーバーラッピングペプチドスキャン（１５／１２）を表す３２直鎖状１５量体ペプチド配列を合成し（表５）、マイクロアレイスライド上で固定し、ＪＰＴは内部方法の対照地点として４つの追加ペプチドを含めた。さらに、ヒトＩｇＧおよびマウスＩｇＧを、マイクロアレイ上に共固定し、アッセイ対照としての役割を果たした。さらに、ｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質を、追加対照として共固定した。
【０１６１】
Multiwellインキュベーションチャンバーを用いてアッセイを行った。マイクロアレイを１００μｇ／ｍｌの１０２２Ｃ３または４℃にて一晩ブロッキングバッファー（Pierce International、Superblock TBS T20、注文番号37536）中に希釈した対照抗体ｃｈ９Ｇ４でインキュベートした。次いで、マイクロアレイを、３０℃にて６０分間ブロッキングバッファー中で希釈した１μｇ／ｍｌ  Ｃｙ５ラべリングした二次抗体（抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ、１０９−１７５−０９８）でインキュベートした。マイクロアレイを乾燥させた。各工程の前にマイクロアレイを洗浄バッファー（５０  ｍＭ  ＴＢＳバッファー、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、ｐＨ  ７．２）で洗浄した。
【０１６２】
高分解能蛍光スキャナーを用いてマイクロアレイをスキャンした。レーザー設定および適用解像度は、実行した総ての測定について同一であった。結果として得られた画像を、スポット認識ソフトウエアGenePix (Molecular Devices)を用いて分析し、定量化した。各スポットについて、平均シグナル強度を抽出した（０〜６５５３５の任意単位）。対照抗体ｃｈ９Ｇ４とのシグナル強度の比を、多数の実験間で比較し、シグナルが１０２２Ｃ３でｃｈ９Ｇ４より３倍高いペプチドが同定された（図３）。
【０１６３】
【表５】
2018502096.tif 000006
2018502096.tif 000007
【０１６４】
実施例７：ｍＡｂ  １０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
総てのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために、６〜８週齢の無胸腺マウスを使用した。これらの,マウスは上部に滅菌フィルターの付いたケージで飼い、無菌条件で維持し、仏国・欧州ガイドラインに従って取り扱った。
【０１６５】
ＡＤＡＭ１７発現レベルは、飽和濃度を決定するために、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）４℃で２０分間インキュベートした１×１０５細胞／１００μｌを漸増濃度のＭＡＢ９３０１（クローン１１１６３３、R&D systems）で染色することにより測定した。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞を再懸濁させ、４℃で２０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８抗体（Invitrogen Corporation、スコットランド、＃  Ａ１１０１７）とともにインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。次に、標識された細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Becton Dickinson、フランス、ル・ポン＝ド＝クレ）で分析した。生存細胞のみを分析するためにヨウ化プロピジウムを加えた。並行して、ＱＩＦＩＫＩＴビーズをフローサイトメトリーおよびモノクローナル抗体結合による抗体結合および細胞当たりの抗原密度の決定に用いた。ＱＩＦＩＫＩＴは、１０μｍ径の、異なるが、十分に定義された量のマウスｍＡｂ分子でコーティングされた一連のビーズを含む。ビーズは、一次マウスｍＡｂで標識された種々の抗原密度を有する細胞を模倣する。定量された抗原は抗体結合能（ＡＢＣ）単位で表す。
【０１６６】
７．１  Ａ４３１異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１７０００）を発現する類表皮癌細胞株Ａ４３１を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１０×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２０日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１６７】
得られた結果を図４にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される劇的な腫瘍阻害（４９日目で９７％）を示し、４９日目に、総ての処置マウスで腫瘍退縮を示し、６個体のうち２個体で完全退縮が達成された。
【０１６８】
７．２  腫瘍断片で確立されたＡ４３１異種移植モデル
見られたｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３の抗腫瘍活性のロバスト性を決定するために、まず、上記のように細胞移植により腫瘍を形成した。次に、腫瘍体積がおよそ２００〜３００ｍｍ３に達した際に、腫瘍を無菌的に摘出し、壊死領域を注意深く避けながら１ｍｍ３の断片に細断し、その後、これらの断片を、無胸腺マウスの新たな系統での腫瘍増殖のために用いた。この増殖を、腫瘍の成長と特徴の両方を安定化させるために３回行った後、およそ１４５ｍｍ３に達する腫瘍担持マウス６個体ずつ２群（腫瘍細胞注入後１４日）を作成した。１群に負荷用量２０ｍｇ／ｋｇで腹膜内処置を行った後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。第２群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１６９】
得られた結果を図５にまとめた。断片から確立された腫瘍は細胞移植から得られるものよりも速く増殖した。この所見は、これらの腫瘍のより悪性度の高い表現型と一致した。このより悪性度の高い状況では、ｍ１０２２Ｃ３は、３５日目に７３％に達する腫瘍阻害を有し、なお有意である。
【０１７０】
７．３  Ａ４３１異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのＩｇＧ１キメラ型（ｃ１０２２Ｃ３）の比較
ｍ１０２２Ｃ３とそのキメラ型を比較するために、Ａ４３１異種移植モデルを上記のように無胸腺マウスへの細胞移植によって確立した。図６に示された結果は、これら２つの化合物は、ｍ１０２２Ｃ３およびｃ１０２２Ｃ３でそれぞれ８２％および７５％に達する腫瘍阻害と同程度であることを示した。
【０１７１】
７．４  ＣａＯＶ３異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝２００００）を発現する卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後１８日射）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する５個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７２】
得られた結果を図７にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される劇的な腫瘍阻害を示し、６９日目に、総ての処置マウスで腫瘍退縮、５個体のうち１個体で完全退縮が見られた。腫瘍阻害は８４日目に９４％に達した。
【０１７３】
７．５  ＯＶＩＳＥ異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝４９０００）を発現する卵巣癌細胞株ＯＶＩＳＥを、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２８日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７４】
得られた結果を図８にまとめた。それらは、ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３により仲介される劇的な腫瘍阻害を示し、総ての処置されたマウスに腫瘍退化が観察され、５３日目には腫瘍阻害が５８％に到達した。
【０１７５】
７．６  ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１２６００）を発現する膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２５日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７６】
得られた結果を図９にまとめた。それらは、ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３により媒介される劇的な腫瘍阻害を示し、４７日目に７６％に到達した。
【０１７７】
７．７  ＣａＯＶ３異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）の比較
ｍ１０２２Ｃ３をそのヒト化型と比較するために、ＣａＯＶ３異種移植モデルを上記のようにＳＣＩＤマウスへの細胞移植によって確立した。
【０１７８】
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１２０００）を発現する、卵巣癌細胞株であるＣａＯＶ３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後１９８日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する５個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で、または２．５ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１．２５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７９】
図１０Ａおよび１０Ｂに示された得られた結果によって、２つの化合物は、１．２５ｍｇ／ｋｇで使用された場合、ｍ１０２２Ｃ３とｈｚ１０２２Ｃ３についてそれぞれ９３％と９４％に、５ｍｇ／ｋｇで使用された場合、両抗体について９４％に到達した腫瘍阻害と同程度であることが証明された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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