(57)【要約】  本発明は、一般に、炎症性疾患を撲滅するための組成物および方法に、ならびに特に、炎症性障害、疾患、または不快感を予防、軽減および／または治療するための食料および／または飼料組成物の使用であって、組成物は少なくとも１つの規定のペクチンを含む使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
６５％未満のエステル化度（ＤＥ）を有することを特徴とする、患者における免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物。
【請求項２】
前記ペクチンのＤＥが、６０％未満である、請求項１に記載のエステル化ペクチン。
【請求項３】
前記ペクチンのＤＥが、５５％未満である、請求項１に記載のエステル化ペクチン。
【請求項４】
前記ペクチンのＤＥが、５０％未満である、請求項１に記載のエステル化ペクチン。
【請求項５】
アミド化されていない、請求項１に記載のエステル化ペクチン。
【請求項６】
前記ペクチンのＤＥが、少なくとも１％、好ましくは、少なくとも２％、より好ましくは、少なくとも３％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエステル化ペクチン。
【請求項７】
免疫媒介疾患および炎症性疾患が、タイトジャンクションを含有する組織の過剰または不所望な透過性によるＴＬＲ２の活性化により引き起こされる、請求項１〜６のいずれかに一項に記載の免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物。
【請求項８】
薬物の有害な副作用の予防において使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物。
【請求項９】
前記患者が、炎症性疾患を発症する可能性が高い、または罹患しているヒトまたは他の動物を意味する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記患者が、ヒト、鳥類、ウシ、イヌ、ウマ、ニワトリ、ネコ、ヤギ、ウサギ、ネズミ、イタチ、ヒツジ、魚類、ブタおよびキツネ動物である、患者における免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用される、ならびに薬物の有害な副作用の予防において使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物。好ましくは、前記患者は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ヒツジ、ブタまたは鳥類である。
【請求項１１】
食料または飼料配合物中での、６５％未満のエステル化度を有する少なくとも１つのペクチンの使用。
【請求項１２】
６５％未満のエステル化度（ＤＥ）を有する少なくとも１つのペクチンを含む配合物。
【請求項１３】
食料または飼料配合物である、請求項１２に記載の配合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、炎症性疾患を撲滅するための組成物および方法に、ならびに特に、炎症性障害、疾患、または不快感を予防、軽減および／または治療するための、食料および／または飼料組成物の使用に関する。
【０００２】
ヒトにおける炎症性疾患（またはさらには炎症関連障害）は、例えば、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎（変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫疾患、喘息、アトピー、心血管疾患、糖尿病、免疫老化、心臓または腎臓の虚血／再灌流傷害、猫伝染性腹膜炎、乳腺炎、乾癬、敗血症、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｍａｔｈｏｓｉｓ）、腫瘍転移、および内臓または皮膚リーシュマニア症などの疾患である。本発明は、炎症促進イベント、例えば、癌治療のための細胞増殖抑制剤の使用の間に生じるもの、または内臓損傷を引き起こす薬物使用の間の他の不快感を予防または治癒するために使用することができる。
【０００３】
これらの疾患のほとんどは、広範囲に及ぶ。
【０００４】
例えば、関節炎は、米国において身体障害の最も一般的な原因である。関節炎を有する２０００万人を超える者が、日々、重度の機能制限を有する。これは、ヒトおよび動物で発症し得る。本発明に関して、本発明者らは、標的とされる個体を説明するために、用語「患者」を使用する。これらの患者は、炎症性疾患を罹患しやすく、または罹患している。リウマチまたはリウマチ障害は、関節および／または結合組織で発症する医学的問題についての非特異的用語である。用語「リウマチ」は、口語表現および歴史的背景でも依然として使用されるが、医学文献でも技術文献でももはや頻繁には使用されず；単に「リウマチ」と呼ばれるいかなる認識された障害ももはや存在しない。慣習的な用語は、症状を「リウマチ」とみなすことが極めて十分とまで言わない一連の様々な問題を包含する。
【０００５】
「非関節リウマチ」は、「局所疼痛症候群」または「軟部組織リウマチ」としても公知であり、顕著な不快感および困難を引き起こし得る。さらに、それらの間の関節炎およびリウマチは、少なくとも２００の異なる病態を包含する。
【０００６】
リウマチおよび関節炎は、炎症および疼痛を特徴とする急性および慢性病態についての一般的用語である。リウマチは、筋および関節における炎症および疼痛、例として、関節炎を特徴とする病態の一般的なカテゴリーである。関節炎は、腫れおよび疼痛を引き起こす関節の炎症を特徴とする。関節炎の類型としては、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。リウマチ病態としては、感染性関節炎、関節リウマチ、リウマチ熱に起因する関節炎、外傷または変形性関節疾患に起因する関節炎、筋炎、神経原性関節障害、滑液包炎、線維筋炎および関節水腫が挙げられる。このような疾患の原因は完全に理解されているわけではないが、他の変性疾患、外傷、または自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥの結果であり得る。炎症は、外来因子による宿主侵入および免疫応答をもたらす機械的外傷、例えば、微生物因子、例えば、細菌およびウイルス、毒素、警告分子、ならびに新生組織形成に対する防御応答としても生じる。
【０００７】
これらの疾患および病態、炎症性疾患の例が共通して有するものは、炎症およびその結果の疼痛である。炎症性疾患を予防および治療する従来の方法は、一般に、鎮痛および抗炎症薬にフォーカスしてきた。典型的な方法は、経口医薬、例えば、ステロイド性コルチゾン誘導体および多数の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）にフォーカスしてきた。残念ながら、これらの薬物は、ほとんどの場合、不所望な副作用を示す。他の試みは、関節インプラント、例えば、膝または臀部インプラントにフォーカスしてきた。これらの方法は、患者に高額な侵襲性手術と、厳密かつ高額な理学療法レジメンを要求する顕著な回復期間とを受けることを強いる長期かつ複雑な外科的処置である。したがって、炎症性疾患を予防および治療する従来の方法の特徴である不所望な副作用および高額な外科的処置を回避する、炎症性疾患を予防および治療する新たな方法が必要とされている。
【０００８】
本発明が適用可能な別の例は、不健康な食事または薬物の使用により引き起こされる疾患および／または不快感および／または不所望な副作用の管理または予防におけるものである。
【０００９】
例えば、粘膜炎は、化学療法、例えば、一般に適用されるドキソルビシンにより引き起こされる小腸内の炎症である。この薬物は、粘膜損傷ならびに細胞内分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび熱ショックタンパク質（警告分子または危険関連分子パターンとも呼ばれる）の放出を引き起こしており、それらが結果として粘膜炎による重度の炎症性応答を引き起こす。粘膜炎は、本発明により予防または軽減することができる。粘膜炎は、限定されるものではないが、不健康な食事、医薬の使用または薬物の使用の結果としての炎症性応答の一例であると考えられる。
【００１０】
動物において、炎症性応答を含む胃腸障害が蔓延している。家畜（ブタ、猛禽および反芻動物）において、この現象は、大きな経済的損失を引き起こす。例えば、ブタ集団内で、欧州連合における全ての仔ブタ出生の総損失は約１７％になり、それらの損失のかなりの割合が粘膜面を介する感染に伴い得る（Ｌａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ．６６（２）：２６０−２６８）。離乳直後のブタの一時的な食欲不振は、腸機能不全、腸内感染の感受性の増加および下痢をもたらすそれらの問題の主因と考えられる。付随する病態生理学的変化としては、絨毛萎縮に伴う粘膜重量の２０〜３０％の低減（Ｌａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３，３０１−３１６）、腸バリア機能の損傷（Ｗｉｊｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．１０５（７）：９６７−９８１）、腸内微生物叢の恒常性の撹乱（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｔｒ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１９（ｌ）：６３−７８）ならびに免疫系の解剖学的および機能的発生の撹乱（Ｌａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ．６６（２）：２６０−２６８）が挙げられる。猛禽類においても、腸疾患は、動物性能の損害、死亡率の増加、および鳥類福祉の低減のため、経済的損失に顕著に寄与する（Ｔｉｍｂｅｒｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．４０（４）：３４１−３４７）。非特異的腸炎、コクシジウム症、ウイルス感染、腸内毒素症および細菌感染は、猛禽類において床湿りを引き起こす主な腸疾患として同定されている（Ｈｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．１５８（１８）：６１５−６２２）。種に関連するいくぶんの差異が存在するが、基礎をなす病態生理学的変化は、ブタのものと全く類似する。例えば、孵化直後のブロイラーにおける小腸発生は、低い飼料摂取レベルにおいて悪化する（Ｗｉｊｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｃｔａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ−Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６２（１），１−１２）。
【００１１】
過去には、それらの種類の問題を予防するために飼料内抗生物質成長促進剤が予防的に使用された。近年では、家畜におけるいくつかの抗生物質の予防的使用は、食料中の抗生物質残留および病原体の抗生物質耐性の増加に関する懸念に起因して、欧州連合において、または他国、例えば、米国において世論圧力の増加で禁止されている。したがって、動物についても、炎症性応答を含む胃腸障害を予防および治療する新たな方法が必要とされている。
【００１２】
驚くべきことに、規定の種類のペクチン（そのエステル化度に関する）が、炎症性障害、疾患、または不快感の予防、軽減および／または治療において有用であることが見出された。
【００１３】
「炎症性障害、疾患、または不快感の予防、軽減および／または治療」は、主に、
・上記列記の疾患のいずれかに罹るリスクを最小化すること、ならびに／または
・関連症状を改善すること、ならびに／または
・上記列記の疾患のいずれかに伴う疼痛もしくは不快感を緩和すること、ならびに／または
・上記列記の疾患のいずれかが生じ得るエピソード間の時間を延長すること、ならびに／または
・ヒトおよび動物の健康全般および福祉を改善すること
を意味する。
【００１４】
ペクチンは、陸上植物の一次細胞壁中に含有される構造的ヘテロ多糖である。これは、白色から淡褐色粉末として商業的に生産され、主に柑橘果実から抽出され、ゲル化剤として食料中、特にジャムおよびゼリー中で使用される。これは、充填剤、医薬品、甘味料中で、果実ジュースおよび乳飲料中の安定剤として、ならびに食物繊維源としても使用される。洋ナシ、リンゴ、グァバ、マルメロ、プラム、グーズベリー、オレンジ、および他の柑橘果実は大量のペクチンを含有する一方、軟質果実、例えば、サクランボ、ブドウ、およびイチゴは少量のペクチンを含有する。しかし、果実以外の他の植物源もペクチンを含み得る。例えば、ペクチンは、ジャガイモ、ダイズ、サトウダイコン、チコリ、ニンジン、トマト、エンドウ、アメリカボウフウ、および（サヤ）マメから調達することができる。これら全ての列記は、全く網羅的なものではない。主な資源が列記されるにすぎない。
【００１５】
以下の説明は、ペクチンおよび（部分）エステル化ペクチンの構造の一部を示す。
【化１】
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【００１６】
上記に示される式において、エステル化はメチル化であるが、他の基も使用され得る（例えば、アセチル）。ペクチンは、１つの基（例えば、ＣＨ３またはＣＯＣＨ３）により、または同一のオリゴマー構造の２つ以上の基によりエステル化され得る。アセチル化は、通常、２および／または３位のヒドロキシル基中の酸素において生じる一方、メチル化は、通常、５位のカルボキシル基において生じる。
【００１７】
本発明の範囲において、エステル化度は、骨格中のエステル化ペクチンモノマー単位の割合を説明するために使用される。
【００１８】
ペクチンは、α−１，４−結合Ｄ−ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）骨格（いわゆるホモガラクツロナンまたは平滑領域）と、アラビナン、アラビノガラクタンおよびガラクタンの側鎖が分岐しているα−（１，２）−結合Ｌ−ラムノシルおよびα−１，４−結合Ｄ−ガラクツロノシル残基の交互配列からなるセグメント（分岐ラムノガラクツロナンまたはヘアリー領域）とから構成される複合多糖である。ペクチンは、主に骨格中のラムノース部分に結合するガラクトースおよびアラビノースである中性糖（ＮＳ）によりデコレートされる。
【００１９】
市販のペクチンは、通常、酸抽出の結果として少量の中性糖を含有する（中性糖含有率は、約５％である）。ペクチンの他の構造的要素は、キシロガラクツロナンおよびラムノガラクツロナンＩＩである。ラムノガラクツロナンＩＩは、特有の糖残基、例えば、Ａｐｉ（Ｄ−アピオース）、ＡｃｅＡ（３−Ｃ−カルボキシ−５−デオキシ−Ｌ−キシロース）、Ｄｈａ（２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−リキソ−ヘプツロサル酸）およびＫｄｏ（２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸）を担持している。これらの様々な構造的要素の相対比率は、様々な植物起源および種々の派生市販製品によって顕著に変動し得る。
【００２０】
ペクチンの種々の構造的要素は、エステル化され得る。エステル化の主なタイプは、Ｏ−メチル、Ｏ−アセチルおよびＯ−フェルロイルである。他のいかなるタイプのエステル化も排除するものではない。エステル化の多くは、ＧａｌＡ残基上のホモガラクツロナン領域中に存在する。したがって、ＧａｌＡ残基は、フリーカルボキシル基を提示し得、またはそのカルボキシル基の１つ以上においてエステル化され得る。エステル化は、単一ＧａｌＡ残基のモノエステル化として生じ得るが、二重エステル化としても生じ得る。他のいかなる数のエステル化も排除するものではない。単一残基上のエステル化は、単一タイプのアルキル基（すなわち、メチル）または単一タイプのアシル基（すなわち、アセチル）を介するものであり得る。いかなる混合タイプのエステル化も排除するものではない。したがって、ＧａｌＡはメチル化され得（ＧａｌＡ残基当たり０または１つのメチル基をもたらす）、またはアセチル化され得る（Ｃ−２および／またはＣ−３上のヒドロキシル基の酸素上でそれぞれ０、１または２つのアセチル基をもたらす）。最後のものは、サトウダイコンおよびジャガイモペクチン中でそのまま生じる。
【００２１】
本発明のペクチンは、典型的には、５および８００ｋＤａのＭＷサイズ分布を有する。好ましくは、ＭＷサイズ分布は、５〜４００ｋＤａである。好ましくは、所与のペクチン組成物中のペクチン分子の大多数は、２００ｋＤａ未満のＭＷを有する。好ましくは、所与のペクチン組成物中のペクチン分子の大多数は、１００ｋＤａ未満のＭＷを有する。
【００２２】
エステル化度（ＤＥ）は、定義によれば、総ガラクツロン酸（フリーＧａｌＡおよび置換ＧａｌＡの合計）１００モル当たりに存在するエステルの量（モル）である。多くの市販のペクチンは、本質的には、メチル−エステルタイプのエステル化を有するため、ＤＥは、メチル化度（すなわち、ＤＭ）として表現されることが多い。その場合、エステル化度は、定義によれば、総ガラクツロン酸（フリーＧａｌＡおよび置換ＧａｌＡの合計）１００モル当たりに存在するメチル−エステルの量（モル）である。エステル化がアセチルタイプのものである場合、ＤＥは、アセチル化度（すなわち、ＤＡ）として表現されることが多い。その場合、エステル化度は、定義によれば、総ガラクツロン酸（フリーＧａｌＡおよび置換ＧａｌＡの合計）１００モル当たりに存在するアセチル−エステルの量（モル）である。単一ペクチン試料中の複数のタイプのエステル化の場合、ＤＥは、メチル化度（すなわち、ＤＭ）およびアセチル化度（すなわち、ＤＡ）に分けて表現されることが多い。これらは、上記のとおり計算される。あるいは、ＤＥは、総ガラクツロン酸（フリーＧａｌＡおよび置換ＧａｌＡの合計）１００モル当たりに存在する１つ以上のエステル化（メチルまたはアセチルタイプのいずれかである）により修飾されたガラクツロン酸残基の量（モル）により定義されるエステル化度として表現することができる。
【００２３】
本発明に関して、エステル化度（ＤＥ）という用語が使用され、記載される割合は、常に、エステル化（すなわち、メチル化）を介して置換されているＧａｌＡ残基の量に基づく。５０のＤＥは、考えられる全てのＧａｌＡ残基の５０％がエステル化（すなわち、メチル化）されていることを意味する。
【００２４】
以下の特許出願は、エステル化ペクチンの使用に関し、より具体的には、それは規定のエステル化度を有するエステル化ペクチンの使用に関する。
以下の区別がエステル化ペクチン間でなされる：
（ｉ）低エステル化ペクチン
（ｉｉ）高エステル化ペクチン。
【００２５】
低エステル化ペクチンは、５０％未満のエステル化度（ＤＥ）を有する。これは、考えられる位置の５０％未満がエステル化されていることを意味する。
高エステル化ペクチンは、５０％超のＤＥを有する。これは、考えられる位置の５０％超がエステル化されていることを意味する。
市販のＨＭ−ペクチンについてのＤＥ値は、典型的には、６０〜７５％の範囲であり、ＬＭ−ペクチンについての値は、２０〜４０％の範囲である（Ｓｒｉａｍｏｒｎｓａｋ，２００３，Ｓｉｌｐａｋｏｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３（１−２），２０６−２２８）。
【００２６】
上記のとおり、ペクチンは、ほぼ全ての高等植物中に存在する。食料産業のいくつかの副生物、例えば、柑橘果皮（柑橘ジュース生産の副生物）、リンゴ搾りかす（リンゴジュース製造の副生物）、サトウダイコン（甜菜糖産業の副生物）、および小程度でジャガイモ繊維、ヒマワリ頭部（油生産の副生物）およびタマネギが、それらの抽出に使用される（Ｍａｙ，１９９０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１２：７９−９９）。搾りかすまたは果皮からＨＭペクチンを抽出するための典型的なプロセスは、ｐＨ１〜３、５０〜９０℃において３〜１２時間の間、高温希釈鉱酸中で行われる（Ｒｏｌｉｎ，２００２，Ｉｎ：Ｐｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ；Ｓｅｙｍｏｕｒ  Ｇ．Ｂ．，Ｋｎｏｘ  Ｊ．Ｐ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，２２２−２３９）。乾燥柑橘果皮は乾燥物質基準で２０〜３０％のペクチンを含有し、乾燥リンゴ搾りかす中には、より少量が存在する（１０〜１５％）（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，１９８６，Ｐｅｃｔｉｎｓ．Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，３，２０５−２３０）。アルコール（通常、イソプロパノールであるが、メタノールまたはエタノールも使用される）を添加することにより、ペクチンを沈殿させる。最後に、ゼラチン状の塊を加圧し、洗浄し、乾燥させ、粉砕する（Ｍａｙ，１９９０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１２：７９−９９）。プロセス条件に応じて、５５〜８０％のＤＭを有するペクチンが得られる（Ｒｏｌｉｎ，２００２，Ｉｎ：Ｐｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ；Ｓｅｙｍｏｕｒ  Ｇ．Ｂ．，Ｋｎｏｘ  Ｊ．Ｐ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，２２２−２３９）。
【００２７】
低メチル化（ＬＭ）ペクチンは、主に、抽出の間の酸性度、温度および時間を制御することによる高メチル化（ＨＭ）ペクチンの脱エステル化により得ることができる。他のタイプのペクチンを生産するため、エステルは、抽出前またはその間に濃縮液体として、酸またはアルカリの作用により、または分離および乾燥前にアルコール性スラリー中で加水分解することができる。アルカリを使用する場合、反応は、低温において水溶液中で実施してポリマーのβ−脱離分解を回避しなければならない（Ｋｒａｖｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，，１９９２，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９，１１５−１２４）。ＬＭペクチンは、水性キレート剤、例えば、ヘキサメタリン酸塩により抽出することもできる（例えば、ジャガイモペクチン）（Ｖｏｒａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｎ：Ｆｏｏｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．Ｍ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，２８７−３３９）。ＬＭペクチンの生産のための酵素ペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）の使用は、化学的抽出についての代替例であり得る（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，１９８６，Ｐｅｃｔｉｎｓ．Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，３，２０５−２３０）。様々な反応の条件および時間は変動し、様々なＤＥを有するペクチンをもたらし、ＤＥが０ほど低いこともある。
【００２８】
市販のＬＭペクチンは、ほぼ専らＨＭペクチンに由来するが、ＬＭペクチンの天然源、例えば、成熟ヒマワリ頭部が存在する（Ｔｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，３７（ｌ）：４７−７３）。
【００２９】
ＤＥは、一般に公知の方法により測定することができる。
例えば、エステル化度は、いくつかの方法、例えば、滴定（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ，１９８１），ＩＲ分光分析（Ｇｎａｎａｓａｍｂａｎｄａｍ  ＆  Ｐｒｏｃｔｏｒ，２０００，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８，３２７−３３２；Ｈａａｓ  ＆  Ｊａｇｅｒ，１９８６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１（４），１０８７−１０８８；Ｒｅｉｎｔｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９６２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２７，４４１−４４５）およびＮＭＲ分光分析（Ｇｒａｓｄａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８４，１８３−１９１）を使用して測定することができる。ペクチンの鹸化後のメタノール含有率を分析するＨＰＬＣ（Ｃｈａｔｊｉｇａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３７，３９５−４０８；Ｌｅｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１６（６），５４７−５５０；Ｖｏｒａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１（１），６５−７０）およびＧＣヘッドスペース（Ｈｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１８（４），６６５−６６８；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４８（３），１００６−１００７）を使用する他の方法が開発されている。ポリマー自体のＤＭを測定するためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法が開発されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１，５５１−５５５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００１，ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９，５５８４−５５８８；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０８，１−８；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３２（１），２７−３２）。ＣＥ法の利点は、ＤＭを計算するために試料のＧａｌＡ含有率が要求されないことである一方、ＧＣヘッドスペースおよびＨＰＬＣ法に従えば、ＧａｌＡ値がＤＭ計算前に既知でなければならない。
【００３０】
驚くべきことに、６５％未満のＤＥを有する少なくとも１つのペクチンの使用が、炎症性障害、疾患、または不快感を予防、軽減および／または治療し得ることが見出された。
【００３１】
本発明によるペクチンは、好ましくは、アミド化されていない（アミド基がペクチン中に存在しない）。
【００３２】
さらに、驚くべきことに、この効果は、従来技術から公知のペクチンの使用と比較して低い濃度のペクチンにより達成される。これは、より低濃度の本ペクチンが、食料および／または飼料製品中により配合しやすいため、配合における利点をもたらす。
【００３３】
したがって、本発明は、６５％未満のエステル化度（ＤＥ）を有することを特徴とする、患者における免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００３４】
本発明に関するエステル化度は、好ましくは、Ａ．Ｇ．Ｊ．Ｖｏｒａｇｅｎ，Ｈ．Ａ．Ｓｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｐｉｌｎｉｋにより、Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｉｓｓｕｅ  １，ｐａｇｅｓ  ６５−７０，１９８６に公開された表題「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｃｔｉｎｓ  ｂｙ  ｈ．ｐ．ｌ．ｃ，」の刊行物に記載されているＨＰＬＣ法により測定される。
【００３５】
さらに、本発明は、患者にエステル化ペクチン（またはエステル化ペクチンの混合物）を投与することにより、炎症性障害、疾患、または不快感を予防、軽減および／または治療する（炎症性疾患を緩和する）方法（Ｍ）であって、ペクチンは、６５％未満のエステル化度を有する方法に関する。
【００３６】
実施例により説明されるとおり、より高いエステル化度を有するペクチン（本発明のペクチンよりも多い；すなわち、７５のＤＥ）は極めて有効性に乏しく、より高いペクチン投与量においてのみ有効である。
【００３７】
本発明に関して、ペクチンは、任意の公知の資源から得ることができる。好適な資源の列記は、上記に挙げられる。上記プロセスの１つを使用することにより、正確なＤＥを有するペクチンが得られる。
【００３８】
好ましくは、ペクチン（単一化合物として、または混合物において使用される場合）のＤＥは、６０％未満、より好ましくは、５５％未満、特に好ましくは、５０％未満である。
【００３９】
したがって、本発明はまた、６０％未満のＤＥを有するエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物である、免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００４０】
したがって、本発明はまた、５５％未満のＤＥを有するエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物である、免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００４１】
したがって、本発明はまた、５０％未満のＤＥを有するエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物である、免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用されるエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００４２】
したがって、本発明はまた、ペクチンが、６０％未満のＤＥを有する方法（Ｍ）である方法（Ｍ１）に関する。
【００４３】
したがって、本発明はまた、ペクチンが、５５％未満のＤＥを有する方法（Ｍ）である方法（Ｍ１’）に関する。
【００４４】
したがって、本発明はまた、ペクチンが、５０％未満のＤＥを有する方法（Ｍ）である方法（Ｍ１’’）に関する。
【００４５】
通常、ペクチンは、少なくとも１％の、好ましくは、少なくとも２の、より好ましくは、少なくとも３％のＤＥを有する。したがって、１〜６５％、２〜６５％、３〜６５％、１〜６０％、２〜６０％、３〜６０％、１〜５５％、２〜５５％および３〜５５％の範囲が存在する。
【００４６】
市販のペクチンは、いくつかの集団の混合物であり得る：置換基の分布は、分子内レベル（１つの単一ペクチンポリマー鎖内）または分子間レベル（１つの単一ペクチン試料内）で異なり得る。これは、全ての置換基、したがって、糖およびエステル化で保たれ、したがって、両方のカテゴリーがその後に続く語「置換基」により意味される。置換基は、完全にランダムに分布され得る。このランダム分布は、置換基が単一ペクチンポリマー鎖上で規則的に分布する場合、均等な分布パターンに従い得、より均一なペクチンポリマー鎖をもたらす。単一ペクチン試料中の全てのペクチンポリマー鎖が同一の均一タイプのものである場合、試料も均一と呼ぶことができる。
【００４７】
しかしながら、単一の均一ペクチンポリマー鎖は、他の均一ペクチンポリマー鎖を有するが、置換基の様々な分子内（しかし、依然として均一）分布を有する組成で存在し得る。この場合、ペクチン試料は、不均一とみなすべきである。
【００４８】
さらに、本発明によるエステル化ペクチンを改変することも可能である。考えられる改変の１つは、アミド化である。アミド化ペクチンは、ペクチンの改変形態である。その場合、ガラクツロン酸の一部をアンモニアによりカルボン酸アミドに変換する。これは、周知のプロセスに従って行う。アミド基は、典型的には、アミド化ＧａｌＡ残基のＣ−６位に存在する。ペクチンがアミド化されている場合、ＤＥは、アミド化度（すなわち、ＤＡＭ）として表現されることが多い。その場合、エステル化度は、定義によれば、総ガラクツロン酸（フリーＧａｌＡおよび置換ＧａｌＡの合計）１００モル当たりに存在するアミドの量（モル）である。
ペクチンの他の考えられる改変は、エチルまたはプロピルである。
【００４９】
好ましくは、ペクチンのエステル化タイプは、メチル化および／またはアセチル化のいずれかであり、より好ましくは、メチル化である。
【００５０】
したがって、本発明はまた、ペクチンのエステル化タイプが、メチル化および／またはアセチル化のいずれかである、免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用される上記のエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００５１】
したがって、本発明はまた、ペクチンのエステル化タイプが、メチル化である、免疫媒介疾患および炎症性疾患の治療において使用される上記のエステル化ペクチンまたはエステル化ペクチンの混合物に関する。
【００５２】
したがって、本発明はまた、ペクチンのエステル化タイプが、メチル化および／またはアセチル化のいずれかである方法（Ｍ）である方法（Ｍ１）に関する。
【００５３】
したがって、本発明はまた、ペクチンのエステル化タイプが、メチル化である方法（Ｍ）である方法（Ｍ１’）に関する。
【００５４】
天然、改変および市販のペクチンの様々な成分（すなわち、ＧａｌＡ含有率、中性糖含有率、メチルエステル化度、アセチル化度、アミド化度、非メチルエステル化ＧａｌＡの分布、分子量）を特徴付けする方法は、Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｇｕｉｌｌｏｔｉｎ氏の博士論文（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｐｅｃｔｉｎｓ．Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２００５．ＩＳＢＮ  ９０−８５０４−２６５−８）に十分に記載されている。
【００５５】
上記のとおり、規定のペクチンが、ヒトまたは動物の炎症性疾患を撲滅するために使用される。
用語「患者」は、炎症性疾患を発症する可能性が高い、または罹患しているヒトまたは他の動物、例として、鳥類、ウシ、イヌ、ウマ、ニワトリ（ｇａｌｌｉｎｅ）、ネコ、ヤギ、ウサギ、ネズミ、イタチ、ヒツジ、魚類、ブタおよびキツネ動物を意味する。好ましくは、患者は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ヒツジ、ブタまたは鳥類である。
【００５６】
本発明による規定のペクチンは、上記開示のとおり、炎症性障害、疾患、または不快感を予防、軽減および／または治療するために使用される。この結果は、本発明による規定のペクチンが、驚くべきことに、多くに疾患に、腸バリア機能の調節に、および免疫応答の調節に関与するＴＬＲ２に結合し得るという事実により得られる。
【００５７】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫系における重要な役割を担うタンパク質のクラスである。これらは、通常、微生物に由来する構造的に保存された分子を認識する歩哨細胞、例えば、マクロファージおよび樹状細胞中で発現される単一の膜貫通非触媒受容体である。これらの微生物が物理的バリア、例えば、皮膚または腸管粘膜を破壊すると、それらは免疫細胞応答を活性化させるＴＬＲにより認識される。ＴＬＲとしては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３が挙げられる。
【００５８】
驚くべきことに、低いエステル化度（すなわち、低ＤＥ）を有するペクチンのみがＴＬＲ２に十分に結合し得ることが見出された。具体的には、低いメチル化度（すなわち、低ＤＭ）を有するペクチンがＴＬＲ２に十分に結合し得る。
【００５９】
本発明による規定のペクチンとＴＬＲとの相互作用は、細胞ベースアッセイにより試験した。本発明に関して、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）を使用した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）システムは、いわゆるＳＥＡＰ発現を介して分子相互作用をモニタリングする迅速かつ簡便な方法を提供するために開発された種々の規定の細胞系および細胞培養培地からなる（詳細については実施例１参照）。この細胞アッセイは、市販されている。これらの試験の結果を、以下の実施例において全て詳細に開示する。低エステル化（特にメチル化）ペクチンが、驚くべき好影響を示すことが示された。
【００６０】
使用されるペクチンの量は、患者に応じて変動し得る。これは、十分な効果を示す量でなければならない。
【００６１】
患者により摂取されるペクチンは、任意の形態であり得る。ペクチンをそれ自体で、または他の成分との混合物中で使用することが可能である。混合物中で使用する場合、この混合物中の量は他の成分および混合物の形態に依存する。
【００６２】
使用される成分は、通常、混合物の使用に関して選択される。成分は、混合物の特性を改善するように機能し得、または混合物が最終組成物に配合されるために使用される場合、最終組成物を改善する役割を果たし得る。
【００６３】
成分は、１つ以上の目的を果たし得る。このような成分は、（その使用に応じて）食料または飼料グレードでなければならないことは明らかである。
【００６４】
ペクチンは、食料または飼料製品の一部でもあり得る一方、食料または飼料製品は、任意の一般に公知の使用形態であり得る。
【００６５】
使用されるペクチンの量は、（患者および／または標的炎症性疾患に応じて）変動し得る。これは、体重に依存する。通常、体重１Ｋｇ当たり、および１日当たり０．０１〜５ｇの量の、６５％未満のＤＥを有するペクチンが望ましい。
【００６６】
規定の食料または飼料製品中のペクチンの量は、通常、その食料または飼料製品に応じて変動する。これは、消費者／動物がこの食料または飼料製品をどのくらいの量で摂食するかにも依存的である。食料または飼料製品中の量は、その食料または飼料製品の通常の消費によりペクチンの必要な投与量が消費されるような量であるべきである。以下の実施例は、本発明を説明する役割を果たす。
【００６７】
［実施例］
［実施例１  ＴＬＲ２媒介ＮＦκＢ活性化のペクチン阻害］
［細胞系および培養］
細胞系は、１０％の脱補体ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）および１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ））を有するＤＭＥＭ培養培地（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））中で培養した。
【００６８】
ヒトＴＬＲ２およびＳＥＡＰ（可溶性胚性アルカリホスファターゼ（Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））を発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を使用した。ＴＬＲ２をアゴニストにより活性化させると、ＮＦκＢおよびＡＰ１が刺激されてそれらの細胞系中の核に移動する。ここで、ＳＥＡＰ遺伝子は、ＮＦκＢ／ＡＰ−１応答性プロモーターの制御下である。発現時、ＳＥＡＰ遺伝子産物は培地中に分泌され、Ｑｕａｎｔｉｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）溶液を使用して定量することができる。この酵素は活性に応じて桃色を青色に変換し、これを分光光度計により計測することができる。
【００６９】
１×ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を培養培地に添加してＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞の増殖のみを制御した。
【００７０】
［ペクチン源］
全てのペクチンは、柑橘類から単離される。０のＤＥを有するペクチンをＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣから入手した。７、２２、４５、６０および７５のＤＥを有するペクチンを、ＣＰ  Ｋｅｌｋｏから入手した。
【００７１】
［ＴＬＲ２−１のペクチン阻害］
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞を、ＴＬＲ２−１特異的アゴニストＰａｍ３ＣＳＫ４により活性化させた。様々なＤＥ値（０、７、２２、４５、６０および７５）のペクチンを、０．５、１および２ｍｇ／ｍｌにおいて添加した。対照として、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ(商標)ＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞をペクチンのみとインキュベートした。
【００７２】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞を、ウェル当たり１００μｌの容量を有する９６ウェルプレート中で５００，０００個の細胞／ｍｌにおいて播種した。細胞を一晩増殖させた。翌日、細胞を様々な濃度の様々なペクチンにより処理してＴＬＲ２に対する効果を試験した。ペクチンとの１時間のインキュベーション後、Ｐａｍ３ＣＳＫ４を１００ｎｇ／ｍｌの濃度において添加した。３７℃におけるペクチンおよびＰａｍ３ＣＳＫ４との２４時間のインキュベーション後、ＳＥＡＰ遺伝子の発現を測定した。インキュベートした細胞の上清を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ溶液と１：１０の比で混合した。ＳＥＡＰの存在により、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅが青色に変化する。ＮＦκＢ活性化を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーＶｅｒｓａ  Ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア、米国（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して６５０ｎｍにおける呈色強度を計測することにより定量した。アッセイを８つの技術的反復で９６ウェルプレート中において実施した。それぞれの実験を３回繰り返した。
【００７３】
【表１】
2018521172.tif 000003
【００７４】
驚くべきことに、ペクチンは、ＳＥＡＰ遺伝子発現のＮＦκＢ活性化後のＳＥＡＰ活性のレベルを介する６５０ｎｍにおけるＱｕａｎｔｉ−ｂｌｕｅの変色により測定されたとおり、ＴＬＲ２を阻害している。この阻害は低ＤＥを有するペクチンについて最大であったが、この阻害はそれぞれのペクチンの濃度に応じて全てのＤＥ値について見出された。より高いＤＥ値（４５、６０および７５）を有するペクチンの阻害効果は、明らかに濃度依存的であり、濃度が高くなると、（ペクチン分子および／または試料全体にわたるエステル化ＧａｌＡ残基の考えられる規則的または不均一な分布に起因して）＜６５％の局所ＤＥを有する分子内または分子間領域の絶対数が高くなり、したがって、（６５未満のＤＥを有するそれらの領域を介する）ＴＬＲ２の阻害が増加することを示唆した。
【００７５】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ(商標)ＴＬＲ２ＣＤ１４の生存率は、ペクチンの添加によっては影響を受けなかった（ＷＳＴ−１試薬を使用して試験した）。
【００７６】
［実施例２  ペクチンはＴＬＲ２に結合する］
［ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ発現プラスミドの構築］
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、フェンロ、オランダ（Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を使用してＲＮＡをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２−ＣＤ１４細胞から抽出した。オリゴｄＴプライマー（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ｄＮＴＰミックス（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）を供給業者の説明書に従って使用してｃＤＮＡを合成した。フォワードプライマー５’−ＧＣＧＣＡＣＣＧＧＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＧ−３’、リバースプライマー５’−ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＡＧ−３’およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ、米国）を使用してＨＥＫ−Ｂｌｕｅ(商標)ｈＴＬＲ２−ＣＤ１４からのｃＤＮＡを使用してコドン１〜コドン５８６のＴＬＲ２を合成した。プライマーは、制限酵素認識のために５’末端においてＧＣダブレットによりフランキングさせた。ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をフォワードおよびリバースプライマー中にそれぞれ含めた。ＰＣＲ産物をＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）およびプラスミドｐＳＥＬＥＣＴ−ＣＨＡ−ｂｌａｓｔｉ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）により消化して粘着末端を作出した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を使用して、ＰＣＲ増幅したＴＬＲ２エクトドメイン断片および線形プラスミドをライゲートした。ライゲートしたプラスミドを使用してＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ  １０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）を形質転換した。ブラストサイジン寒天培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を使用して、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を選択した。得られたコロニーをプラスミド中の遺伝子の正確な配向についてスクリーニングした。選択した正確なコロニーをブラストサイジン液体培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉプレップキットを使用してプラスミドを単離した。次いで、プラスミドを非突然変異クローンの選択のためにシーケンシングした（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ、ライデン、オランダ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））。
【００７７】
［ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ発現断片によるＨＥＫ２９３Ｔの形質移入］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェル培養プレート中で５００，０００個の細胞／ｍｌにおいて播種し、一晩インキュベートした。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）を使用することにより形質移入を実施した。配列確認済プラスミドを、制限酵素ＮｏｔＩ（Ｆａｓｔ  ｄｉｇｅｓｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）により線形化した。精製した１μｇの線形プラスミドを低血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）中で希釈し、３．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）と混合した。この形質移入ミックスを室温において３０分間インキュベートし、次いで培養培地中で既に播種した細胞に添加した。細胞を形質移入培地ミックスと２４時間インキュベートし、１０％の脱補体ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）および１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を有するＤＭＥＭ培養培地（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）中でブラストサイジンを使用して形質移入細胞を選択した。単一細胞クローンを単離してＨＥＫ２９３Ｔ  ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ細胞系を形成した。
【００７８】
［細胞培養］
１０％の脱補体ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）および５０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を有するＤＭＥＭ培養培地（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）中で細胞系を培養した。
【００７９】
［タンパク質免疫沈降］
ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩）、アプロチニン、Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｅ−６４、ＥＤＴＡおよびロイペプチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）からなるプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で１×ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ、米国（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ））を使用して、一晩増殖させたＨＥＫ２９３Ｔ  ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ細胞を４℃において１０分間溶解させ、次いで０％の出力において５秒間、２回超音波処理した。１４０００ｇにおいて１０分間の遠心分離後、上清を単離した。微小遠心分離チューブ中でＰｉｅｒｃｅ（登録商標）抗ＨＡアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を使用して、ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡタグ付きタンパク質を免疫沈降させた。ＨＡ合成ペプチド（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を使用して、単一ベッドボリュームのＨＡ合成ペプチドと３０Ｃにおいて１５分間、２回インキュベートすることによりタンパク質を競合的に溶出させた。単離タンパク質を脱塩し、Ｚｅｂａスピン脱塩カラムおよびデバイス、４０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を使用してＨＡペプチドを除去した。Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して、単離および脱塩したタンパク質を定量した。
【００８０】
［ＴＬＲ２およびペクチンの結合についてのＥＬＩＳＡ］
ＥＬＩＳＡ緩衝液は、０．０５ＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．２中の１ｍＭのＣａＣｌ２および１５０ｍＭのＮａＣｌから構成されるものであった。この緩衝液を洗浄に使用し、さらには抗体およびペクチンのための希釈剤としても使用した。３％の粉乳（ＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ、アメルスフォールト、オランダ（Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））をＥＬＩＳＡ緩衝液中で溶解させることにより、ブロッキング緩衝液を作製した。抗体溶液については、ブロッキング緩衝液とＥＬＩＳＡ緩衝液との１：２希釈物を抗体の溶解に使用した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、テュークスベリー、マサチューセッツ、米国（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ））を、５０μｌの５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌリジンにより３７Ｃにおいて１時間処理した。ウェルを４００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液により１回洗浄した。ペクチン（０、７、２２、４５  ６０および７５ＤＥ）をＥＬＩＳＡ緩衝液中で、１ｍｇ／ｍｌ濃度において溶解させ、５０μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７Ｃにおいて４時間インキュベートしてペクチンを結合させた。次いで、それぞれのウェルを４００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液により洗浄し、１００μｌのブロッキング緩衝液により４Ｃにおいて一晩ブロッキングした。ブロッキングステップ後、ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡ緩衝液により１回洗浄した。ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ融合タンパク質をペクチンコートウェルに、ウェル当たり０．３３μｇ、１μｇ、３μｇおよび９μｇの濃度においてアプライした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを３７Ｃにおいて３時間インキュベートした。ＨＡ合成ペプチドを陰性対照として、ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡ融合タンパク質と同様、ウェル当たり０．３３μｇ、１μｇ、３μｇおよび９μｇの濃度において使用した。Ｐｌａｎｔｐｒｏｂｅｓ（リーズ、英国（Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ））製のペクチン結合抗体ＬＭ１９（ＤＥ０および７について特異的）およびＬＭ２０（ＤＥ２２、４５、６０および７５について特異的）を、１：１００希釈物においてペクチン結合についての陽性対照として使用した。その後、ウェルを４００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液により５回洗浄し、５０μｌのＨＡタグについての一次検出抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、マサチューセッツ、米国（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ））と１：２００希釈でインキュベートした。一次抗体を、３７Ｃにおいて２時間インキュベートした。一次抗体インキュベーション後、プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液により再度５回洗浄した。洗浄後、５０μｌのビオチンタグ付き二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、アラバマ、米国（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ））をそれぞれのウェルに１：５００希釈でアプライした。ビオチンタグ付き抗体を３７Ｃにおいて１時間インキュベートした。このステップに続き、４００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液により５回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、ヘフェルレー、ベルギー（Ｈｅｖｅｒｌｅｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））（１００μｌ）をそれぞれのウェルに１：１０００希釈において添加した。３７Ｃにおける１時間のインキュベーション後、��レートを４００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液により７回洗浄した。最終的に、検出のため、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、マサチューセッツ、米国）をそれぞれのウェルにアプライし、３７Ｃにおいて３０分間インキュベートした。１００μｌの停止溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、マサチューセッツ、米国）を添加することにより、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートをプレートリーダーＶｅｒｓａ  Ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア、米国）中で４２０ｎｍにおいて読み取った。明確に示すため、陰性対照の値を、ＴＬＲ２エクトドメイン−ＨＡについて得られた値から差し引く。
【００８１】
【表２】
2018521172.tif 000004
【００８２】
驚くべきことに、低ＤＥを有するペクチンは、ＥＬＩＳＡ試験において得られた用量依存的な値により示されるとおり、ＴＬＲ２エクトドメインに直接結合している。
【００８３】
［実施例３  ペクチンは、ＴＬＲ２の炎症促進性経路のみを阻害し、その調節経路を阻害しない］
［細胞系］
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を５００，０００個の細胞／ｍｌにおいて１２ウェル培養プレート中で播種し、一晩インキュベートした。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）を使用することにより、形質移入を実施した。プラスミドｐＵＮＯ３−ｈＴＬＲ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を、ＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）により線形化した。１μｇの精製ＤＮＡを低血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）中で希釈し、３．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア、米国）と混合した。この形質移入ミックスを室温において３０分間インキュベートし、次いで培養培地中で既に播種した細胞に添加した。細胞を形質移入培地ミックスと２４時間インキュベートし、１０％の脱補体ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）および１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を有するＤＭＥＭ培養培地（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）中でＺｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（１５０μｇ／ｍｌ）を使用して形質移入細胞を選択した。単一細胞クローンを単離した。こうして得られたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１ＴＬＲ２細胞系は、ＴＬＲ２のみを発現し、ＣＤ１４を発現しない。
【００８４】
［ＴＬＲ２活性化および阻害アッセイ］
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１ＴＬＲ２細胞を、５００，０００個の細胞／ｍｌにおいて、ウェル当たり１００μｌの容量を有する９６ウェルプレート中で播種した。細胞を一晩増殖させた。翌日、細胞を様々なペクチンにより処理してＴＬＲ２に対する効果を試験した。ペクチンとの１時間のインキュベーション後、ＴＬＲ２−６特異的アゴニストＦＳＬ−１を１００ｎｇ／ｍｌの濃度において添加した。ペクチンおよびＦＳＬ−１との３７Ｃにおける２４時間のインキュベーション後、ＳＥＡＰ遺伝子の発現を測定した。インキュベートした細胞の上清を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ溶液と１：１０の比で混合した。ＳＥＡＰの存在により、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅが青色に変化する。ＮＦκＢ活性化を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーＶｅｒｓａ  Ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア、米国）を使用して６５０ｎｍにおける比色読取りを計測することにより定量した。アッセイを１０の技術的反復で９６ウェルプレート中において実施した。それぞれの実験を３回繰り返した。
【００８５】
【表３】
2018521172.tif 000005
【００８６】
データは、ＦＳＬ−１を介するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１ＴＬＲ２細胞における刺激がペクチンの存在により変化しないため、ペクチンがＴＬＲ２−６シグナリング経路を阻害しない一方、Ｐａｍ３ＣＳＫ４による刺激はペクチンがＴＬＲ２−１シグナリング応答を阻害することを明確に示していることを示す（実施例１）。
【００８７】
［実施例４  仔ブタの食餌中のペクチンは、タイトジャンクションの腸浸透性の軽減をもたらす］
［仔ブタ給餌試験設定］
幼若仔ブタ用の実験農場はフランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）（ベルギー（Ｂｅｌｇｉｕｍ））に位置し、それぞれが４つのペンを含有する８つのバタリーからなる。試験下の仔ブタはＴｏｐｉｇｓピエトレンの雑種であり、２１日目に離乳させる。仔ブタを離乳時、ならびに離乳から２および４週間後に個々に計量する。飼料摂取は、計量時に４匹の仔ブタのペンごとに登録する。到着時、新たな監視番号（Ｓａｎｉｔｅｌ  ｎｕｍｂｅｒ）を有する耳標を仔ブタに付ける。試験の間、獣医師およびＦｅｌａｓａ  Ｄ有資格者が、ＥＣ／８６／６０９法に記載の国際指針に従って実施される仔ブタ実験を監視する。
【００８８】
それぞれのペン（１．５ｍ×１．５ｍ）は、試験の開始時に４匹の仔ブタを収容する。それぞれのペンについて、１つの給餌装置（不断給餌）をミールまたはペレットについて設置する。１つの飲料ニプルをペンごとに設置する。開始温度は、離乳１０日後まで２８±２℃である。その後、温度を２５±２℃に減少させる。
【００８９】
市販の非薬用食餌を与える。非薬用は、仔ブタが試験前およびその間にいかなる治療抗生物質も受容しないことを意味する。食餌はミールの形態で与える。全ての飼料をそれらの栄養含有率について分析した。
【００９０】
１群当たり４匹の仔ブタについて、７つの反復で４つの処理を適用した（食餌Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。試験の開始時、仔ブタ（約７ｋｇの体重）を、重量ごとに異なるペンに割り当てた。この割り当ては、等しい平均重量と、それぞれの処理およびペンについての平均重量付近の等しい標準偏差とを有するように行う。微生物計数のため、および生検物の採取のため、仔ブタは、過剰用量のバルビツール酸塩（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）とそれに続く屠殺を受ける。その後、仔ブタに対して切開を実施する。微生物計数のための試料を直ちに加工する一方、組織化学的実験のために採取された試料を後の分析のために固定した。
【００９１】
全試験期間の間、微生物計数の期間を除き仔ブタに不断給餌する。その時、微生物計数を実施する３日前に仔ブタを給餌制限する。仔ブタは、１日３回、慎重に計量および記録されるある量の飼料を受容する。飼料を８．００、１３．００および１８．００において与える。必要な場合、病仔ブタを個々に（注射により）処理した。以下のパラメータを考慮した。（ｉ）個々の成長データ、（ｉｉ）ペン当たりの飼料摂取データ（最終損失について補正）、（ｉｉｉ）離乳、開始時および全試験期間の間の飼料転換比、（ｉｖ）糞便スコアおよび臨床スコア、（ｖ）タイトジャンクション、（ｖｉ）微生物分析、（ｖｉｉ）組織化学分析。
【００９２】
［食餌］
【００９３】
【表４】
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【００９４】
［ペクチン源］
ＤＥ３３および５５を有するペクチンは柑橘類から単離され、Ｈｅｒｂｓｔｒｅｉｔｈ  ＆  Ｆｏｘ（ノイエンブルク／ヴルティンゲン、独国（Ｎｅｕｅｎｂｕｒｇ／Ｗｕｒｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））から入手した。ダイズミール（ＳＢＭ）は南米起源（アルゼンチン（Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）、ブラジル（Ｂｒａｓｉｌ）および／またはパラグアイ（Ｐａｒａｇｕａｙ）からの混合物）のものであり、それを加工して、３３％の乾燥物質におけるＳＢＭを水道水と混合し、１２０Ｃにおいて３０分間オートクレーブ処理することにより残留ペクチンを抽出した。冷却後、得られた材料を凍結乾燥させ、粉砕し、そのまま食餌中で使用した。
【００９５】
［マンニトール−ラクツロース試験］
動物においてマンニトール−ラクツロース試験を実施することにより、回腸の透過性を定量した。ラクツロースは、全身感染および免疫問題に対する機会がより少ないため有益とみなされる完全な小腸を通過し得ない。
マンニトールは、代謝的に不活性な単糖であり、腸粘膜を介して受動的に吸収される。あらゆる吸着マンニトールが数時間以内に尿中で完全に排泄される。マンニトールを、体重１ｋｇ当たり０．３ｇのマンニトールにおいて胃ポンプに通して仔ブタに投与した（解剖４時間前）。ラクツロースは、代謝的に不活性な二糖であり、通常、粘膜バリアが損傷していない限り吸収されない。あらゆる吸収ラクツロースが６時間以内に尿中で完全に排泄される。ラクツロースを、体重１ｋｇ当たり０．７５ｇのラクツロースにおいて胃ポンプに通して仔ブタに投与した（解剖４時間前）。
次いで、解剖の間、仔ブタの尿を回収した。健常な腸を有する仔ブタにおいて、ラクツロースの平均吸収率は投与用量の１％未満である。尿中の＞１％のラクツロースの回収率は、二糖過剰透過性を示す。
健常な腸を有する仔ブタにおいて、マンニトールの平均吸収率は投与用量の＞１４％である。
尿中の＜１４％のマンニトールの回収率は、炭水化物吸収不良を示す。
より低いラクツロース／マンニトール比（Ｌ／Ｍ比）は、食餌の好影響を示す。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
示されるとおり、全てのペクチン、特にＤＥ３３および５５ペクチンを有するペクチンは低減したＬ／Ｍ比をもたらし、したがって、幼若ブタの小腸において好影響を有する。
【００９８】
［実施例５  食餌中のペクチンは、絨毛陰窩比の増加をもたらす］
仔ブタ給餌試験設定は、実施例４に記載のとおりとした。
［組織学的分析のための試料調製］
試料採取：十二指腸および／または回腸の試料を採取し、生理学的水（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗａｔｅｒ）（０．９％のＮａＣｌ）によりリンスする。２０ｍｌのホルマリン緩衝液（１ｍｌのホルムアルデヒド（３７％）／リットル）、４．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４＋１０．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４）中で貯蔵する。
包埋：パラフィン溶液をレシピエント中に注ぎ（完全に満たさない）、腸試料をレシピエント中で垂直に置く。４℃で凝固させ、レシピエントを完全に満たす。−３℃において凝固させる。
生検（Ｂｉｏｐｔ）：外科用メスを１０％のキシレンにより清浄化し、乾燥させる。切片（ｃｏｕｐｅ）をブラシおよび針により５０％のアルコールに移す。小片に切断し、ブラシにより蒸留水（６５℃）に移し、顕微鏡スライドに移す。試料を顕微鏡スライド上に置き、６０℃において一晩インキュベートする。
周囲温度におけるヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ））染色ステップ：
１）脱パラフィン
・１０％のキシレンにより３回洗浄する（５分間）
・１００％のエタノールにより２回洗浄する（３分間）
・エタノール９０％により１回洗浄する（３分間）
・エタノール７０％により１回洗浄する（３分間）
・水により１回洗浄する（３分間）
・水により１回洗浄する（３分間）
２）染色
・マイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン中でインキュベートする（６分間）
・水により１回洗浄する（５分間）
３）対比染色
・１０％のエオシン中でインキュベートする（５分間）
・水により１０回洗浄する（それぞれ３０秒間）
４）脱水
・エタノール９０％により１０回洗浄する（それぞれ３０秒間）
・エタノール７０％により１０回洗浄する（それぞれ３０秒間）
・エタノール１００％により２回洗浄する（５分間）
・１０％のキシレンにより３回洗浄する（５分間）
【００９９】
［絨毛長さおよび陰窩深さの定量］
上記の包埋組織学的試料をＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡により分析し、絨毛長さ（ｍｍ）および陰窩（深さ）を計測する。
【０１００】
【表６】
2018521172.tif 000008
【０１０１】
より長い絨毛はより高い吸収能を意味する一方、より長い陰窩はその逆を意味する。したがって、より高い絨毛陰窩比は、食餌の好影響であるとみなされる一方、より低い絨毛陰窩比は、それぞれの食餌の使用についての欠点であるとみなされる。示されるとおり、特にペクチンＤＥ３３および５５を有する食餌は、十二指腸および回腸の両方において向上した絨毛陰窩比を有し、そのことは、胃腸健常状態を改善するこれら両方のペクチンの潜在性を実証する。
【０１０２】
［実施例６  ペクチンは、ドキソルビシン誘導性粘膜炎において抗炎症剤として作用する］
粘膜炎は、粘膜バリア損傷とも称され、放射線療法および化学療法による治療の最も重度の副作用の１つである。粘膜バリアの炎症およびアポトーシスは両方ともその不連続性をもたらし、それによりバクテリアルトランスロケーションを促進する。粘膜炎の病態病理学において、５つの段階が重要である：（１）初期段階の間の、核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）の活性化をもたらす反応性酸素種の形成、（２）上方調節／メッセージ生成段階の間の、治療関連組織炎症およびアポトーシスをもたらすメッセンジャー分子、例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）の誘導、（３）より多くの炎症およびアポトーシスをもたらす、増幅／シグナリング段階におけるメッセンジャー分子の増幅、（４）潰瘍段階の間の、アポトーシスから生じる上皮バリアの不連続性（それにより、バクテリアルトランスロケーションを促進する）、および（５）細胞増殖を特徴とする自然治癒段階（Ｓｏｎｉｓ，２００４，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｎｕｒｓ．２０（１）：１１−５）；Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．６（５）：ｅｌ０００８７９）。
【０１０３】
［マウス］
Ｃ５７Ｂ１Ｌ／６雌マウス（７〜１０週齢）を、Ｊａｎｖｉｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、仏国（Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。動物の実験的使用は、フローニンゲン大学の動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）により承認された。全てのマウスは、実験開始前の２．５週間にわたり馴化させた。粘膜炎は、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、米国）の投与により誘導した。
【０１０４】
食餌  マウスに、不断ＲＭＨ−Ｂ食餌（ＡＢ  ｄｉｅｔｓ、ウールデン、オランダ（Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を供給した。供給業者により規定される食餌の成分は、コムギ、肉粉（８０％滅菌）、黄色デントコーン、全粒オートムギ、コムギミドリング粉、アルファルファ、ダイズ油、乾燥酵母、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、ＮａＣｌ、ｄｌ−メチオニン、ビタミンおよび微量元素である。マウスに水道から飲料水を供給し、水瓶を１週間に１回交換した。
【０１０５】
［ペクチン源］
ＤＥ７を有するペクチンを、ＣＰ  Ｋｅｌｋｏから入手した。
【０１０６】
［粘膜炎の誘導およびリードアウト］
ドキソルビシンを滅菌０．９％塩化ナトリウム中で溶解させ、アリコート中で４Ｃにおいて貯蔵した。ペクチン（７ＤＭ）を滅菌水中で溶解させ、１０または１１日間、１日２回、３ｍｇ／日において強制経口投与によりマウスに投与した。８日目、ドキソルビシンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度において腹腔内注射した。１０日目（４８時間のドキソルビシン）または１１日目（７２時間のドキソルビシン）にマウスを屠殺した。強制経口投与により水を受容する動物が、対照として役割を果たした。組織試料の回収後、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
【０１０７】
［マウスにおけるＴＬＲ２遮断］
ＴＬＲ２遮断抗体、クローンＴ２．５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、トゥールーズ、仏国）を、ドキソルビシン処理の１時間前に１０ｍｇ／ｋｇにおいて腹腔内投与した。
【０１０８】
［好中球数］
腹腔洗浄液を２ｍｌのＰＢＳにより回収して腹腔好中球流入液を回収した。腹腔洗浄液中の生存細胞の総数を、Ｚ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ  ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ブレア、カリフォルニア、米国（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して計数した。洗浄液を５００，０００個の細胞／ｍｌにおいて希釈し、１００μｌの細胞溶液をサイトスピン調製に適用した。サイトスピンスライドをギムザ染色（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）により、室温において１時間染色した。染色したスライドを浜松スライドスキャナ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ｓｌｉｄｅ  ｓｃａｎｎｅｒ）（浜松ホトニクス、日本（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｊａｐａｎ））中でスキャンし、２５０個の細胞において形態学的特性を使用して好中球を計数した。腹膜中の総細胞数およびサイトスピン調製物からの好中球数を使用して好中球の総数を計算した。
【０１０９】
【表７】
2018521172.tif 000009
【０１１０】
データから把握することができるとおり、ドキソルビシン誘導性粘膜炎により好中球数が５６倍だけ増加する。ＴＬＲ２遮断抗体クローンＴ２．５またはペクチンＤＥ７のいずれかによるＴＬＲ２の遮断は、好中球数を有意に低減させ、ペクチンが抗炎症剤として作用することを実証した。
【０１１１】
［実施例７  ペクチンは、健康上有益な微生物に対する好影響を有する］
［消化物回収］
ブタ糞便試料を、実験的食餌給餌の間、１４および２８日目に回収した（実施例４）。糞便回収期間後、動物を麻酔し、屠殺した。消化物試料を末端回腸、近位結腸、中位結腸および遠位結腸から回収した。それぞれの消化物の一部を、微生物叢組成物およびＳＣＦＡの分析のために１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で貯蔵した。これらのチューブを直ちに液体窒素中で凍結させ、−８０℃において貯蔵した。残りの量の消化物をさらなる分析まで直ちに−２０℃において貯蔵した。
【０１１２】
［ＤＮＡ抽出および微生物叢分析］
糞便ＤＮＡ抽出プロトコル（Ｓａｌｏｎｅｎ  Ａ，Ｎｉｋｋｉｌａ  Ｊ，Ｊａｌａｎｋａ−Ｔｕｏｖｉｎｅｎ  Ｊ，Ｉｍｍｏｎｅｎ  Ｏ，Ｒａｊｉｌｉｃ−Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ  Ｍ，Ｋｅｋｋｏｎｅｎ  ＲＡ，Ｐａｌｖａ  Ａ  ＆  ｄｅ  Ｖｏｓ  ＷＭ．２０１０．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｃａｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａｌ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１：１２７−１３４）を使用することにより、微生物ＤＮＡを２５０ｍｇの消化物から抽出した。ＤＮＡを逐次沈殿により単離し、最終的にＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、独国（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を製造業者の推奨に従って使用して精製した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させ、ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用することによりペアドエンドモードでシーケンシングした。
【０１１３】
［配列分析］
ＱＩＩＭＥ  １．９．０を使用して未処理Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｆａｓｔｑファイルを脱多重化し、品質フィルタリングし、分析した。
【０１１４】
【表８】
2018521172.tif 000010
【０１１５】
驚くべきことに、食餌へのペクチンの添加は、腸管中のプレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）種の保有率の増加をもたらす（これは健康指標である、Ｗｕ  ＧＤ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｃ，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ  Ｋ，Ｃｈｅｎ  ＹＹ，Ｋｅｉｌｂａｕｇｈ  ＳＡ，Ｂｅｗｔｒａ  Ｍ，Ｋｎｉｇｈｔｓ  Ｄ，Ｗａｌｔｅｒｓ  ＷＡ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ，Ｓｉｎｈａ  Ｒ，Ｇｉｌｒｏｙ  Ｅ，Ｇｕｐｔａ  Ｋ，Ｂａｌｄａｓｓａｎｏ  Ｒ，Ｎｅｓｓｅｌ  Ｌ，Ｌｉ  Ｈ，Ｂｕｓｈｍａｎ  ＦＤ  ＆  Ｌｅｗｉｓ  ＪＤ．２０１１．Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４：１０５−１０８参照）。
【０１１６】
これら全ての実験は、明らかに、かつ驚くべきことに、規定のペクチンが有意な改善を示すことを示す。
【国際調査報告】
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