(57)【要約】  単独のまたは抗癌剤と組み合わせたＴＬＲ４アゴニストおよびその医薬組成物、その使用、ならびに癌における使用を含む、前記組成物または組合せを投与することを含んでなる処置方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための、抗癌薬と組み合わされていてもよいＴＬＲ４アゴニストの組成物。
【請求項２】
ＴＬＲ４アゴニストがアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）である、請求項１に記載の組成物または組合せ。
【請求項３】
ＴＬＲ４アゴニストが式Ｉの化合物である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物または組合せ。
【請求項４】
ＴＬＲ４アゴニストが式１ａの化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物または組合せ。
【請求項５】
ＴＬＲ４アゴニストがＣＲＸ−６０１、ＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物または組合せ。
【請求項６】
ＴＬＲ４アゴニストまたは請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合せを１種類以上の薬学的に許容可能な担体とともに含んでなる組合せキット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＬＲ４アゴニストまたは組合せを薬学的に許容可能な希釈剤または担体とともに含んでなる医薬組成物。
【請求項８】
治療上有効な量の抗癌剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＬＲ４モジュレーターを含んでなる第２の医薬組成物。
【請求項９】
癌の処置のための薬剤の製造における請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴＬＲ４アゴニストの組合せまたは医薬組成物の使用。
【請求項１０】
療法において使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組合せまたは医薬組成物。
【請求項１１】
癌の処置に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組合せまたは医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組合せまたは医薬組成物を投与することを含んでなる、処置を必要とするヒトにおいて癌を処置する方法。
【請求項１３】
治療上有効な量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗癌剤および請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＬＲ４アゴニストを投与することを含んでなる、処置を必要とするヒトにおいて癌を処置する方法。
【請求項１４】
抗癌剤とＴＬＲ４アゴニストが同時に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
抗癌剤とＴＬＲ４アゴニストが任意の順序で逐次投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
抗癌剤とＴＬＲ４アゴニストが全身投与、例えば静脈投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗癌剤が全身投与、例えば静脈投与され、ＴＬＲ４アゴニストが腫瘍内投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗癌剤が腫瘍内投与され、ＴＬＲ４アゴニストが全身投与、例えば静脈投与される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗癌剤とＴＬＲ４アゴニストが腫瘍内投与される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
癌が固形腫瘍である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＬＲ４アゴニストがアブスコパル効果を提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において癌を処置する方法に関する。特に、本発明は、単独のまたは他の抗癌剤と組み合わせた１以上のＴＬＲ４アゴニストの投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を含む過剰増殖性障害の有効な処置は、腫瘍学の分野で継続的な目標である。一般に、癌は、細胞分裂、分化およびアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの脱調節から生じ、無限成長、局部的拡大および全身転移の能力を有する悪性細胞の増殖を特徴とする。正常なプロセスの脱調節は、シグナル伝達経路の異常および正常細胞で視られるものとは異なる因子に対する応答を含む。
【０００３】
免疫療法は過剰増殖性障害を処置するための１つのアプローチである。科学者および臨床医が様々なタイプの癌免疫療法の開発で遭遇した主要なハードルは、腫瘍退縮をもたらすロバストな抗腫瘍応答を惹起するために自己抗原（癌）に対する免疫寛容を破ることであった。腫瘍を標的とする低分子および高分子薬剤の従来の開発とは異なり、癌免疫療法は、より持続的な効果を誘導し、かつ、再発を最小にするために、エフェクター細胞の記憶プールを生成する能力を有する免疫系の細胞を標的とする。
【０００４】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の合成リガンドである。ある種のＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであることが知られ、ワクチンアジュバントとして、また免疫動物においてサイトカイン生産を刺激し、マクロファージを活性化し、自然免疫応答を増強し、かつ、抗体生産を促進するために有用である。
【０００５】
癌治療には最近多くの進展があったにも関わらず、癌の影響を受けている個体のより有効かつ／または増強された治療の必要がなお存在する。抗腫瘍免疫を増強するために治療アプローチを組み合わせることに関する本明細書の組成物、組合せおよび方法はこの必要に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００６】
よって、本発明は、癌療法において使用するための、単独のまたは抗癌剤と組み合わせた、場合により他のＴＬＲ４アゴニストと組み合わせたＴＬＲ４アゴニストを提供する。
【０００７】
また、本発明のＴＬＲ４アゴニスト組成物でヒトにおける癌を処置する方法、および療法、好ましくは、癌の療法のための組み合わせたＴＬＲ４アゴニストの使用も提供される。
【０００８】
癌処置を必要とする対象、好ましくは、ヒトの免疫応答を調節するための方法であって、前記対象に有効量のＴＬＲ４アゴニスト単独または組合せを、例えば１以上の医薬組成物で投与することを含んでなる方法がさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｌ１２１０マウス白血病保有ＢＤＦ１マウスのマイトマイシン−ＣとＣＲＸ  ５２７による処置を示すグラフである。
【図２】図２は、ＭＯＴ担腫瘍ＣｅＨ／ＦｅＪマウスのマイトマイシン−Ｃによる処置を示すグラフである。
【図３】図３は、野生型ＭＯＴ担腫瘍マウスにおけるマイトマイシン−ＣおよびＣＲＸ−５２７を示すグラフである。
【図４】図４は、ＴＬＲ４変異ＭＯＴ担腫瘍マウスにおけるマイトマイシン−ＣおよびＣＲＸ−５２７を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣＲＸ  ５２７の水性鼻腔内サブミクロンエマルション１μｇ  １０μｇ処方物の比較を示すグラフである。
【図６】図６は、ＣＲＸ  ５２７の水性ＩＮサブミクロンエマルション処方物の比較を示すグラフである。
【図７】図７は、マイトマイシン−ＣとＣＲＸ−５２７の単回併用処置を示すグラフである。
【図８】図８は、マイトマイシン−Ｃでの単回の局所処置とその後のＣＲＸ−５２７での全身処置の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、マイトマイシン−Ｃによる２回の局所処置とその後のＣＲＸ  ５２７での全身処置を示すグラフである。
【図１０】図１０は、マウスにおいてＢ１６メラノーマ肺転移を処置するＩＰシクロホスファミドと組み合わせた静脈内ＣＲＸ−５２７  ＩＮを示すグラフである。
【図１１】図１１は、ビヒクル、ＣＲＸ−５２７単独、シクロホスファミド単独およびＣＲＸ−５２７とシクロホスファミドとで処置したマウスの肺の腫瘍の写真である。
【図１２】図１２は、ビヒクル、ＣＲＸ−５２７単独、シクロホスファミド単独およびＣＲＸ−５２７とシクロホスファミドとで処置したマウスの肺の腫瘍の写真である。
【図１３】図１３は、ビヒクル、ＣＲＸ−５２７単独、シクロホスファミド単独およびＣＲＸ−５２７とシクロホスファミドとで処置したマウスの肺の腫瘍の写真である。
【図１４】図１４は、ビヒクル、ＣＲＸ−５２７単独、シクロホスファミド単独およびＣＲＸ−５２７とシクロホスファミドとで処置したマウスの肺の腫瘍の写真である。
【図１５】図１５は、ビヒクル、ＣＲＸ−５２７単独、シクロホスファミド単独およびＣＲＸ−５２７とシクロホスファミドとで処置した後のマウスの肺の腫瘍成長（ルシフェラーゼ活性として測定）を示すグラフである。
【図１６】図１６は、４Ｔ１担持ＢＡＬＢ／ｃマウスのヒトグレードサイトキサンの処置を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＴ−２６同系マウスモデルにおける腫瘍成長に対するＣＲＸ−５２７（ＴＬＲ４）の効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、結腸癌のＣＴ−２６同系マウスモデルにおける４、２０、または１００μｇのＴＬＲ−４アゴニスト（ＣＲＸ−６０１）の用量依存的抗腫瘍活性（腫瘍体積により経時的に測定）を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて腫瘍内投与されたＣＲＸ−６０１の用量依存的抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて腫瘍内投与されたＣＲＸ−６０１の用量依存的生存利益を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて静脈投与されたＣＲＸ−６０１の用量依存的抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて静脈投与されたＣＲＸ−６０１の生存利益を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて静脈投与されたＣＲＸ−６０１の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて腫瘍内投与されたＣＲＸ−６０１の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて静脈投与されたＣＲＸ−６０１の生存利益を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて腫瘍内投与されたＣＲＸ−６０１の生存利益を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ＣＴ２６同系マウスモデルにおいて静脈投与または腫瘍内投与されたＣＲＸ−６０１の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＣＲＸ−６０１のリポソーム処方物の腫瘍内投与で処置したマウスにおける抗腫瘍活性のグラフを示す。
【図２９】図２９は、１回／週、合計３用量で静脈投与した２５μｇ／マウスのＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１の抗腫瘍活性（腫瘍成長阻害により経時的に測定）を示すグラフである（＊ｐ値＝０．０４１、＊＊ｐ値＝＜０．００１）。
【図３０】図３０は、１回／週、合計３用量で静脈投与する２５μｇ／マウスのＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１で処置したマウスの生存曲線を示すグラフである（＊ｐ値＝０．０３）。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
組成物および組合せ
１以上のＴＬＲ４アゴニスト、特に、ＡＧＰの投与により抗癌または抗腫瘍効果を誘導することが本発明の１つの実施態様の目的である。抗癌剤と組み合わせたＴＬＲ４アゴニストの投与により抗癌剤の抗腫瘍効果を高めること、増強すること、改善すること、増大させること、およびそうでなければ変化させることが、本発明のもう１つの実施態様のさらなる目的である。本明細書では、ＴＬＲ４アゴニスト組成物およびＴＬＲ４アゴニストと抗癌剤との組合せが記載される。
【００１１】
よって、本明細書で使用する場合、用語「本発明の組合せ」は、ＡＧＰなどのＴＬＲ４アゴニストと癌薬剤とを含んでなる組合せに関し、これらはそれぞれ本明細書に記載されるように別個にまたは同時に投与され得る。
【００１２】
本明細書で使用する場合、用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は互換的に使用され、単数形であっても複数形であっても、悪性化を受けた、または異常なもしくは調節を欠いた成長または過剰増殖をもたらす細胞変化を受けた細胞を意味する。このような変化または悪性化は通常、細胞を宿主生物にとって病的なものとし、よって、病的であるかまたは病的となり得、介入を必要とするかまたは介入から利益を享受し得る前癌または前癌性細胞も含まれるものとする。原発性癌細胞（すなわち、悪性化の部位付近から得られる細胞）は、十分に確立された技術、特に、組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。癌細胞の定義には、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけでなく癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含む。これには転移した癌細胞、ならびに癌細胞に由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。固形腫瘍として通常現れる癌のタイプについていう場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えばＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手法によって、腫瘍塊に基づいて検出可能なもの、および／または患者から得ることのできるサンプルにおける１以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能であるものである。言い換えれば、この用語は、本明細書において、臨床医が前癌、癌、腫瘍、その場成長(in situ growths)、ならびに後期転移性成長と呼称するものを含め、いずれのステージの細胞、新生物、癌、および腫瘍も含む。腫瘍は、液性腫瘍を意味する造血系腫瘍、例えば、血液細胞などの腫瘍であり得る。このような腫瘍に基づく病態の具体例としては、慢性骨髄球性白血病または急性骨髄球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫；およびリンパ腫などが挙げられる。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語「薬剤(agent)」は、組織、系(system)、動物、哺乳動物、ヒト、または他の対象において所望の効果をもたらす物質を意味するものと理解される。よって、用語「抗癌剤」は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、または他の対象において抗癌効果をもたらす物質を意味するものと理解され、同様に、類義語「抗新生物薬」は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、または他の対象において抗新生物効果をもたらす物質を意味するものと理解される。また、「薬剤」単一の化合物であっても、または２以上の化合物の組合せもしくは組成物であってもよいと理解される。
【００１４】
用語「処置する(treating)」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、治療的療法を意味する。特定の病態に関して処置は、（１）その病態もしくはその病態の生物学的発現の１以上を改善すること、（２）（ａ）その病態につながるもしくはその病態の原因である生物学的カスケードの１以上の点、もしくは（ｂ）その病態の生物学的発現の１以上に干渉すること、（３）その病態に関連する症状、効果もしくは副作用の１以上、またはその病態もしくはその処置に関連する症状、効果もしくは副作用の１以上を緩和すること、あるいは（４）その病態もしくはその病態の生物学的発現の１以上の進行を緩徐化することを意味する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「予防」は、ある病態もしくはその生物学的発現の尤度もしくは重篤度を実質的に低減するため、またはそのような病態もしくはその生物学的発現の開始を遅延させるための薬物の予防的投与を意味すると理解される。当業者は「予防」は絶対的な用語ではないことを認識するであろう。予防的療法は、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合または対象が発癌物質に曝されていた場合など、対象に癌を発症する高いリスクがあると見なされる場合に適当である。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、例えば、研究者または臨床医により求められる組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起する薬物または医薬剤の量を意味する。さらに、用語「治療上有効な量」は、そのような量を受容していない対応する対象に比べて、処置、治癒、予防の改善、または疾患、障害、もしくは副作用の改善、または疾患もしくは障害の進行速度の低下をもたらすいずれの量も意味する。この用語はまた、その範囲内に、正常な生理学的機能を増進するのに有効な量も含む。
【００１７】
一つの実施態様では、本発明の組合せの治療上有効な量（またはその組合せの成分それぞれの治療上有効な量）の投与は、それらの組合せがある成分化合物の治療上有効な量の個々の投与に比べて以下の改良された特性のうち１以上をもたらすという点で、個々の成分化合物よりも有利である：ｉ）最も活性の高い単剤よりも大きい抗癌効果、ｉｉ）相乗的もしくは極めて相乗的な抗癌活性、ｉｉｉ）副作用プロフィールの軽減を伴った高い抗癌活性を提供する投与プロトコール、ｉｖ）毒性作用プロフィールの軽減、ｖ）治療域の拡大、またはｖｉ）成分化合物の一方または両方のバイオアベイラビリティの増大。
【００１８】
本発明はさらに、本明細書に示されるＴＬＲ４成分のうち１以上と１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の組合せは、抗癌剤およびＴＬＲ４モジュレーターを含んでなってよく、それらはそれぞれ同じまたは異なる担体、希釈剤または賦形剤を含んでよい。担体、希釈剤または賦形剤は、その処方物の他の成分と適合し、医薬処方物の能力があり、かつ、そのレシピエントに有害でないという点で許容可能でなければならない。
【００１９】
本発明の組合せの成分、そのような成分を含んでなる医薬組成物は、任意の順序で、また、異なる経路で投与してもよく、本成分およびそれらを含んでなる医薬組成物は同時に投与してもよい。
【００２０】
本発明の別の面によれば、本発明の組合せの成分と１種類以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を混合することを含む、医薬組成物の製造方法も提供される。
【００２１】
本発明の成分は、いずれの適当な経路によって投与してもよい。いくつかの成分については、好適な経路としては、経口、直腸、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、膣、および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、および硬膜外を含む）が含まれる。好ましい経路は、例えば、本組合せのレシピエントの状態および処置される癌によって異なり得ることが認識されるであろう。また、投与される薬剤のそれぞれは同じまたは異なる経路で投与されてよいこと、およびそれらの成分は一緒に混合されてもまたは別個の医薬組成物であってもよいことも認識されるであろう。
【００２２】
一つの実施態様では、本発明の組合せの１以上の成分は静脈投与される。別の実施態様では、本発明の組合せの１以上の成分は腫瘍内投与される。別の実施態様では、本発明の組合せの１以上の成分は全身投与、例えば、静脈投与され、本発明の組合せの１以上の他の成分は腫瘍内投与される。別の実施態様では、本発明の組合せの成分の総てが全身投与、例えば、静脈投与される。別の実施態様では、本発明の組合せの成分の総てが腫瘍内投与される。例えば本段落の実施態様のいずれにおいても、本発明の成分は１以上の医薬組成物として投与される。
【００２３】
抗原結合タンパク質および抗体
「抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）」は、抗体または抗体と同様に機能する操作分子を含め、抗原と結合するタンパク質を意味する。このような別の抗体形式としては、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、およびミニボディが含まれる。また、本開示に従って任意の分子の１以上のＣＤＲが、好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／０１６４３０１号参照）またはＥＧＦドメイン上に配置された別の足場も含まれる。ＡＢＰはまた、このような抗体または他の分子の抗原結合フラグメントも含む。さらに、ＡＢＰは、適当な軽鎖と対合される場合、全長抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、二重特異性もしくは二重パラトープ分子またはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、ビ、トリまたはテトラボディ、Ｔａｎｄａｂｓなど）の形式とされた本発明のＶＨ領域を含んでなってもよい。ＡＢＰは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４；またはＩｇＭ；ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはその修飾変異体である抗体を含んでなり得る。抗体重鎖の定常ドメインは相応に選択することができる。軽鎖定常ドメインは、κまたはλ定常ドメインであり得る。ＡＢＰはまた、抗原結合領域と非免疫グロブリン領域を含んでなるＷＯ８６／０１５３３に記載のタイプのキメラ抗体であってもよい。
【００２４】
よって、本明細書において、本発明のＡＢＰまたは、受容体と結合し、かつ、好ましい実施態様では、下記のうちの１以上を行うものである：受容体を介してシグナル伝達を調節する、受容体の機能を調節する、受容体のシグナル伝達を促進する、受容体の機能を刺激する、または受容体のシグナル伝達を補助刺激する。当業者ならば、このような機能を立証する様々な周知のアッセイを容易に認識するであろう。
【００２５】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗原結合ドメイン、場合により、免疫グロブリン様ドメインまたはそのフラグメントを有する分子を意味し、モノクローナル（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥおよびその修飾変異体）、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重パラトープ性、二重特異性およびヘテロコンジュゲート抗体、または閉鎖立体配座多重特異性抗体が含まれる。「抗体」は、異種、同種異系、同系、または他のその修飾形態を含んだ。抗体は単離または精製されてよい。抗体はまた、組換え型、すなわち、組換え手段によって生産されてもよく、例えば、参照抗体と９０％同一の抗体は、当技術分野で公知の組換え分子生物学技術を用い、特定の残基の突然変異誘発により作製することができる。よって、本発明の抗体は、天然抗体構造の形式とされてもよいし、あるいは適当な軽鎖と対合とされる場合、全長組換え抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、二重特異性もしくは二重パラトープ分子またはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、ビ、トリまたはテトラボディ、Ｔａｎｄａｂｓなど）の形式とされてもよい、本発明の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含んでなり得る。抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，またはＩｇＧ４またはその修飾変異体であり得る。抗体重鎖の定常ドメインは相応に選択することができる。軽鎖定常ドメインは、κまたはλ定常ドメインであり得る。抗体はまた、抗原結合領域と非免疫グロブリン領域を含んでなるＷＯ８６／０１５３３に記載のタイプのキメラ抗体であってもよい。
【００２６】
当業者ならば、本発明のＡＢＰおよび抗体は関連の受容体のエピトープと結合することを認識するであろう。ＡＢＰのエピトープは、その抗原の、ＡＢＰが結合する領域である。２つのＡＢＰは、それぞれがその抗原に対する他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合には、同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合に、競合抗体を含まない対照に比べて、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍を超える一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは、７５％、９０％またはさらには９９％阻害する（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるJunghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的に総てのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減または排除する場合には、２つの抗体は同じエピトープを有する。また、同じエピトープは、例えば、一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減または排除する場合には、「オーバーラッピングエピトープ」を含み得る。
【００２７】
結合の強度は、本発明のＡＢＰまたは抗体の用量および投与に重要であり得る。一つの実施態様では、本発明のＡＢＰまたは抗体は、受容体、好ましくは、ヒト受容体と高い親和性で結合する。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合、抗体は受容体と、１〜１０００ｎＭまたは５００ｎＭ以下の親和性、または２００ｎＭ以下の親和性、または１００ｎＭ以下の親和性、または５０ｎＭ以下の親和性、または５００ｐＭ以下の親和性、または４００ｐＭ以下の親和性、または３００ｐＭ以下で結合する。さらなる面において、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合、抗体は受容体と、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの間または約５０ｎＭ〜約１５０ｎＭの間で結合する。本発明の一つの面において、抗体は受容体と１００ｎＭ未満の親和性で結合する。
【００２８】
さらなる実施態様では、結合はＢｉａｃｏｒｅにより測定される。親和性は、ある分子、例えば、本発明の抗体と、別の分子、例えば、その標的抗原との、単一の結合部位における結合の強度である。抗体とその標的との結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）によって決定することができる。例えば、当技術分野で公知のＢｉａｃｏｒｅ法は、結合親和性を測定するために使用され得る。
【００２９】
アビディティーは、例えば相互作用価を考慮した、２分子の複数部位の互いの結合の合計強度である。
【００３０】
一つの面において、ＡＢＰまたは抗体と受容体の相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭの間、または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭの間、または５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。当業者ならば、ＫＤ数値が小さいほど結合が強いことを認識するであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、Ｍ−１を単位とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者ならば、ＫＡ数値が大きいほど結合が強いことを認識するであろう。
【００３１】
解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、一方の腕のＡＢＰまたは抗体と他方の腕の受容体の複合体の安定性、すなわち、毎秒に減衰する複合体画分を表す。例えば、０．０１ｓ−１のｋｄは、毎秒複合体の１％が減衰することに等しい。ある実施態様では、解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、１×１０−５ｓ−１以下、または１×１０−６ｓ−１以下である。ｋｄは１×１０−５ｓ−１〜１×１０−４ｓ−１の間、または１×１０−４ｓ−１〜１×１０−３ｓ−１の間であり得る。
【００３２】
例えば、受容体、受容体のエピトープまたはフラグメントとの結合をめぐる本発明のＡＢＰまたは抗体と参照抗体の間の競合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅにより決定することができる。一つの面では、競合アッセイはＢｉａｃｏｒｅにより行われる。この競合にはいくつかの可能性のある理由がある：その２つのタンパク質は同じまたはオーバーラップするエピトープと結合し得るか、結合の立体阻害が存在し得るか、または第１のタンパク質の結合が第２のタンパク質の結合を回避もしくは低下させる抗原の立体配座変化を誘導し得る。
【００３３】
「結合フラグメント」は、本明細書で使用する場合、抗原結合部位を含みかつ本明細書で定義される受容体と結合し得る、例えば、限定されるものではないが、親または全長抗体の同じエピトープと結合し得る、本発明のＡＢＰまたは抗体の部分またはフラグメントを意味する。
【００３４】
本発明のＡＢＰおよび抗体の機能的フラグメントが本明細書で企図される。
【００３５】
よって、「結合フラグメント」および「機能的フラグメント」は、無傷抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環から急速に排除され、無傷抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性があるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント (Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983)) であり得る。また、Ｆｖフラグメント(Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135; Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594)も含まれる。これらの種々のフラグメントは、プロテアーゼ切断または化学切断（例えば、Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)参照）などの従来の技術を用いて作製される。
【００３６】
「機能的フラグメント」は、本明細書で使用する場合、抗原結合部位を含みかつ親ＡＢＰまたは抗体と同じ標的と結合し得る、例えば、限定されるものではないが、同じエピトープと結合し得る、かつまた、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の１以上の調節または他の機能を保持する、本発明のＡＢＰまたは抗体の部分またはフラグメントを意味する。
【００３７】
本発明のＡＢＰおよび抗体は、天然抗体構造の形式とされ得る本発明の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含んでなり得るので、機能的フラグメントは、本明細書に記載の全長ＡＢＰまたは抗体の結合または１以上の機能を保持するものである。よって、本発明のＡＢＰまたは抗体の結合フラグメントは、適当な軽鎖と対合され得る場合、ＶＬまたはＶＨ領域、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、二重特異性もしくは二重パラトープ分子またはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、ビ、トリまたはテトラボディ、Ｔａｎｄａｂｓなど）のフラグメントを含んでなり得る。
【００３８】
用語「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列を意味する。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。
【００３９】
ＣＤＲ配列には様々なナンバリング規則が存在することは当業者には自明であろう；Ｃｈｏｔｈｉａ(Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883)、Ｋａｂａｔ(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))、ＡｂＭ（バース大学）およびＣｏｎｔａｃｔ（ユニヴァーシティ・カレッジ・ロンドン）。「最小結合単位」を得るためには、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いて最小オーバーラッピング領域を決定することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの一部分であり得る。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基がＣＤＲ配列の一部と考えられ、また、当業者によりそのように理解されるであろうことを意味し得る。ＣＤＲ定義のいくつかは使用される個々の刊行物によって異なる場合があることに留意されたい。
【００４０】
そうではないことが述べられない限り、および／または具体的に示される配列がなければ、本明細書で「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」という場合には、既知の規則のいずれかに従ってナンバリングされたアミノ酸配列を意味し、あるいは、ＣＤＲは、可変軽鎖の「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」、ならびに可変重鎖の「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と呼称される。特定の実施態様では、ナンバリング規則は、Ｋａｂａｔ規則である。
【００４１】
用語「ＣＤＲ変異体」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの、例えば、１、２または３個のアミノ酸置換、欠失または付加により修飾されたＣＤＲを意味し、ここで、ＣＤＲ変異体を含んでなる修飾抗原結合タンパク質は、修飾前の抗原結合タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。修飾可能な各ＣＤＲは単独でまたは別のＣＤＲと組み合わせて修飾され得ることが認識されるであろう。一つの面において、修飾は、置換、特に、例えば表１に示されるような保存的置換である。
【００４２】
【表１】
2018522053.tif 000002
【００４３】
例えば、変異体ＣＤＲにおいて、最小結合単位のアミノ酸残基は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義の一部としてＣＤＲを含んでなるフランキング残基が保存的アミノ酸残基で置換されていてもよいこと以外は同じままであり得る。
【００４４】
上記のような修飾ＣＤＲまたは最小結合単位を含んでなるこのような抗原結合タンパク質は、本明細書では、「機能的ＣＤＲ変異体」または「機能的結合単位変異体」と呼称する場合がある。
【００４５】
抗体は、いずれの種のものであってもよく、または交差種に投与するために好適となるように修飾されてもよい。例えば、マウス抗体由来のＣＤＲはヒトへの投与のためにヒト化され得る。いずれの実施態様においても、抗原結合タンパク質は場合によりヒト化抗体である。
【００４６】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１つ（または複数）のヒト免疫グロブリンに由来する一種の操作抗体を意味する。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更されてもよい（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（商標）データベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓタンパク質データベースから、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性により選択されたものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸ベースでの）を特徴とするヒト抗体は、重鎖定常領域および／またはドナーＣＤＲの挿入のための重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与し得る好適なアクセプター抗体も同様に選択され得る。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要はないことに留意されたい。従来技術はこのようなヒト化抗体を生産するいくつかの方法を記載している−例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１参照。
【００４７】
なおさらなる実施態様では、ヒト化抗体は、ＩｇＧであるヒト抗体定常領域である。別の実施態様では、ＩｇＧは、上記の参照文献または特許公報に開示されている配列である。
【００４８】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関して、用語「同一の」または「同一性」は、最適にアラインされ、適当な挿入または欠失と比較された場合の２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。
【００４９】
２配列間の同一性パーセントは、それらの２配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列に共有される同一の位置の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記のように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００５０】
クエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列の間の同一性パーセントは、ペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントが実行された後にサブジェクト核酸配列がクエリー核酸配列での１００％クエリー被覆率を有する場合にＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される「同一性」である。このようなクエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルト設定を用い、低複雑性領域のフィルターをオフにして行われる。重要なこととして、クエリー核酸配列は、本明細書の１以上の請求項で特定される核酸配列により記載され得る。
【００５１】
クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントが実行された後にサブジェクトアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列での１００％クエリー被覆率を有する場合にＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される「同一性」値である。このようなクエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定を用い、低複雑性領域のフィルターをオフにして行われる。重要なこととして、クエリーアミノ酸配列は、本明細書の１以上の請求項で特定される核酸配列により記載され得る。
【００５２】
本明細書の本発明のいずれに実施態様においても、ＡＢＰまたは抗体は、示されるまたは参照される、例えば、配列番号によって定義される配列と９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、または９０パーセントの同一性を有するいずれか１つまたは総てのＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬを有し得る。
【００５３】
ＴＬＲ−４アゴニスト
本発明の組合せは、ＴＬＲ−４アゴニスト、すなわち、例えば、結合し、ＴＬＲ４と結びつくことによって立体配座変化またはシグナル伝達を誘導することによりＴＬＲ４を活性化する分子を含んでなる。
【００５４】
好ましいＴＬＲ−４アゴニストは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物（ＡＧＰ）である。Ｔｏｌｌ様受容体４は、細菌ＬＰＳ（リポ多糖）を認識し、活性化された際に自然免疫応答を誘導する。ＡＧＰは、細菌ＬＰＳの脂質Ａタンパク質の単糖模倣剤であり、化合物の「アシル鎖」上のエーテルおよびエステル結合を用いて開発された。これらの化合物の製造方法は既知であり、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる例えばＷＯ２００６／０１６９９７、米国特許第７，２８８，６４０号および同第６，１１３，９１８号、ならびにＷＯ０１／９０１２９に開示されている。他のＡＧＰおよび関連の方法は、米国特許第７，１２９，２１９号、米国特許第６，５２５，０２８号および米国特許第６，９１１，４３４号に開示されている。本発明の組成物で使用されるアシル鎖上にエーテル結合を有するＡＧＰは既知であり、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるＷＯ２００６／０１６９９７に開示されている。特に注目されるのは、ＷＯ２００６／０１６９９７の段落［００１９］〜［００２１］で式（ＩＩＩ）に従って示され、記載されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物である。
【００５５】
本発明で使用されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物は、次のように式１で示される構造を有し、
【化１】
2018522053.tif 000003
式中、
ｍは、０〜６であり；
ｎは、０〜４であり；
Ｘは、ＯまたはＳ、好ましくは、Ｏであり；
Ｙは、ＯまたはＮＨであり；
Ｚは、ＯまたはＨであり；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｃ７−２０アシルおよびＣ１−２０アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４は、ＨまたはＭｅであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ、−ＰＯ３Ｒ８Ｒ９、−ＯＰＯ３Ｒ８Ｒ９、−ＳＯ３Ｒ８、−ＯＳＯ３Ｒ８、−ＮＲ８Ｒ９、−ＳＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｒ８、および−ＣＯＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択され、ここで、Ｒ８およびＲ９はそれぞれＨおよび（Ｃｌ−Ｃ４）アルキルから独立に選択され；かつ
各Ｒ６およびＲ７は独立にＨまたはＰＯ３Ｈ２である。
【００５６】
式１において、直鎖脂肪アシル残基(the normal fatty acyl residues)（すなわち、第２級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、Ｒ１Ｏ、Ｒ２Ｏ、およびＲ３Ｏ）が結合されている３’立体中心の立体配置はＲまたはＳ、好ましくは、Ｒである（カーン・インゴルド・プレローグ順位則(Cahn-Ingold-Prelog priority rules)により設計される通り）。Ｒ４およびＲ５が結合されているアグリコン立体中心の立体配置はＲまたはＳであり得る。鏡像異性体およびジアステレオマー両方の総ての立体異性体ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内に入ると見なされる。
【００５７】
ヘテロ原子Ｘとアグリコン窒素原子の間の炭素原子の数は、変数「ｎ」により決定され、０〜４の整数、好ましくは０〜２の整数であり得る。
【００５８】
直鎖脂肪酸Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の鎖長は、約７〜約１６炭素、好ましくは約９〜約１４炭素であり得る。鎖長は同じであっても異なっていてもよい。いくつかの好ましい実施態様には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が１０または１２または１４である鎖長が含まれる。
【００５９】
式１は、Ｌ／Ｄ−セリル、−トレオニル、−システイニルエーテルおよびエステル脂質ＡＧＰ、アゴニストおよびそれらの同族体（ｎ＝１〜４）の両方、ならびに種々のカルボン酸生物学的等価体（すなわち、Ｒ５は塩形成能のある酸性基であり；リン酸基はグルコサミン単位の４位または６位のいずれかにあり得るが、好ましくは４位にある）を包含する。
【００６０】
式１のＡＧＰ化合物を使用する本発明の好ましい実施態様では、ｎは０であり、Ｒ５はＣＯ２Ｈであり、Ｒ６はＰＯ３Ｈ２であり、かつ、Ｒ７はＨである。この好ましいＡＧＰ化合物は、次のように式１ａの構造として示され、
【化２】
2018522053.tif 000004
式中、ＸはＯまたはＳであり；ＹはＯまたはＮＨであり；ＺはＯまたはＨであり；各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はＣ７−２０アシルおよびＣ７−２０アルキルからなる群から独立に選択され；かつＲ４はＨまたはメチルである。
【００６１】
式１ａでは、直鎖脂肪酸アシル残基（すなわち、第２級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、Ｒ１Ｏ、Ｒ２Ｏ、およびＲ３Ｏ）が結合されている３’立体中心の立体配置は、ＲまたはＳ、好ましくは、Ｒである（カーン・インゴルド・プレローグ順位則により設計される通り）。Ｒ４およびＣＯ２Ｈが結合されているアグリコン立体中心の立体配置はＲまたはＳであり得る。鏡像異性体およびジアステレオマー両方の総ての立体異性体ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内に入ると見なされる。
【００６２】
式１ａは、Ｌ／Ｄ−セリル、−トレオニル、−システニルエーテルまたはエステル脂質ＡＧＰアゴニストを包含する。
【００６３】
式１および式１ａの両方において、Ｚは、二重結合により結合されたＯ、または互いに一重結合により結合されている２個の水素原子である。すなわち、本化合物は、Ｚ＝Ｙ＝Ｏの場合にはエステル結合型、Ｚ＝ＯかつＹ＝ＮＨの場合にはアミド結合型、およびＺ＝Ｈ／ＨかつＹ＝Ｏの場合にはエーテル結合型である。
【００６４】
式１の特に好ましい化合物は、ＣＲＸ−６０１およびＣＲＸ−５２７と呼称される。それらの構造は次のように示される。
【化３】
2018522053.tif 000005
加えて、別の好ましい実施態様は、示された構造を有するＣＲＸ−５４７を用いる。
【化４】
2018522053.tif 000006
【００６５】
ＡＧＰバッファー
本発明の一つの実施態様では、ＴＬＲ４アゴニスト、好ましくはＡＧＰを含んでなる組成物は、両性イオン性バッファーを用いて干渉される。好適には、両性イオン性バッファーはアミノアルカンスルホン酸または好適な塩である。アミノアルカンスルホン酸(amninoalkanesulfonic)バッファーの例として、限定されるものではないが、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ／ＥＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＢＳおよびＰＩＰＥＳが挙げられる。好ましくは、バッファーは、市販の注射製品に使用するためのものなど、ヒトでの使用に好適な薬学的に許容可能なバッファーである。最も好ましくは、バッファーはＨＥＰＥＳである。
【００６６】
処置の方法
本発明の組成物および組合せは、ＴＬＲ４の結合が有益である障害に有用性を持つと考えられる。
【００６７】
よって、本発明はまた、療法、特に、ＴＬＲ４の結合が有益である障害、特に、癌の処置において使用するための本発明の組成物または組合せを提供する。
【００６８】
本発明のさらなる面は、本発明の組合せを投与することを含んでなるＴＬＲ４の結合が有益である障害の処置の方法を提供する。
【００６９】
本発明のさらなる面は、ＴＬＲ４の結合が有益である障害の処置のための薬剤の製造における本発明の組合せの使用を提供する。好ましい実施態様では、障害は癌である。
【００７０】
本発明の組合せによる処置に好適な癌の例としては、限定されるものではないが、原発および転移形態の頭頸部癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられる。好適には、癌は、脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、バナヤン−ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨の巨細胞腫瘍、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ＡＭＬ、慢性好中球性白血、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫  巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）および精巣癌から選択される。
【００７１】
加えて、処置される癌の例としては、バレット腺癌；胆道癌；乳癌；子宮頸癌；胆管癌；膠芽腫、星状細胞腫（例えば、多形性膠芽腫）および脳室上衣細胞腫などの原発性ＣＮＳ腫瘍、ならびに続発性ＣＮＳ腫瘍（すなわち、中枢神経系の外側に起源する腫瘍の中枢神経系への転移）を含む中枢神経系腫瘍；大腸管結腸癌を含む結腸直腸癌；胃癌；頭頸部の扁平上皮癌を含む頭頸部癌；白血病およびリンパ腫、例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫および赤白血病を含む血液癌；肝細胞癌；小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌；卵巣癌；子宮内膜癌；膵臓癌；下垂体腺腫；前立腺癌；腎臓癌；肉腫；メラノーマを含む皮膚癌；および甲状腺癌が挙げられる。
【００７２】
好適には、本発明は、脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、バナヤン−ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫および甲状腺癌から選択される癌を処置するまたはその重篤度を軽減するための方法に関する。
【００７３】
好適には、本発明は、卵巣癌、乳癌、膵臓癌および前立腺癌から選択される癌を処置するまたはその重篤度を軽減するための方法に関する。
【００７４】
好適には、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における前癌症候群を処置するまたはその重篤度を軽減するための方法に関し、前癌症候群は、子宮頸上皮内新生物、意義不明単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、子宮頸病変、皮膚母斑（前メラノーマ）、前立腺上皮内（管内）新生物（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、結腸ポリープおよび重症性肝炎または肝硬変から選択される。
【００７５】
本発明の組合せは、単独でまたは１以上の他の治療剤と組み合わせて使用してよい。よって、本発明は、さらなる面において、本発明の組合せを１または複数のさらなる治療剤とともに含んでなるさらなる組合せ、その組合せを含んでなる組成物および薬剤、ならびに療法、特に、ＴＬＲ４の結合に感受性のある疾患の処置におけるさらなる組合せ、組成物および薬剤の使用を提供する。
【００７６】
実施態様では、本発明の組合せは、癌処置  の他の治療方法と併用可能である。特に、抗新生物療法において、上述のもの以外の他の化学療法薬、ホルモン剤、抗体薬剤ならびに手術および／または放射線処置との併用療法が想定される。よって、本発明による併用療法には、ＴＬＲ４アゴニストの投与ならびに他の抗新生物薬を含む他の治療剤の任意選択による使用が含まれる。このような薬剤の組合せは一緒にまたは別個に投与されてよく、別個に投与される場合には、これは同時に行ってもよいし、または任意の順序で、近接した時間または離れた時間の両方で逐次に行ってもよい。一つの実施態様では、医薬組合せは、ＴＬＲ４アゴニスト、および場合により少なくとも１種類のさらなる抗新生物薬を含む。
【００７７】
一つの実施態様では、さらなる抗癌療法は、手術および／または放射線療法である。
【００７８】
一つの実施態様では、さらなる抗癌療法は、少なくとも１種類のさらなる抗新生物薬である。
【００７９】
処置される感受性腫瘍に対して活性を有するいずれの抗新生物薬も本組合せで使用可能である。有用な典型的な抗新生物薬は、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤；白金錯体；ナイトロジェンマスタード、オキシアザホスホリン、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、およびトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの抗生物薬；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プリンおよびピリミジン類似体ならびに葉酸拮抗化合物などの代謝拮抗物質；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体型チロシン血管新生阻害剤；免疫治療剤；アポトーシス促進薬；および細胞周期シグナル伝達阻害剤が含まれる。
【００８０】
微小管阻害剤または有糸分裂阻害剤：微小管阻害剤または有糸分裂阻害剤は、細胞周期のＭ期、すなわち有糸分裂期の間に腫瘍細胞の微小管に対して活性である細胞周期特異的薬剤である。微小管阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられる。
【００８１】
ジテルペノイドは、天然源に由来し、細胞周期のＧ２／Ｍ期に作用する細胞周期特異的抗癌剤である。ジテルペノイドは、微小管のβ−チューブリンサブユニットと結合することによりこのタンパク質を安定化させると考えられている。その後タンパク質の分解が阻害され、有糸分裂が停止し、細胞死をたどると思われる。ジテルペノイドの例としては、限定されるものではないが、パクリタキセルおよびその類似体であるドセタキセルが挙げられる。
【００８２】
パクリタキセル、５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサ−ヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−ベンゾエートの（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの１３−エステルは、タイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)から単離された天然ジテルペン生成物であり、注射液タキソール(TAXOL)（商標）として市販されている。パクリタキセルは、テルペンのタキサンファミリーのメンバーである。パクリタキセルは、米国における難治性卵巣癌の治療に用(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989)および乳癌の治療(Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991)に承認されている。パクリタキセルは、皮膚における新生物(Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46)および頭頸部癌(Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)の治療のための潜在的候補である。またこの化合物は、多発性嚢胞腎疾患(Woo et. al., Nature, 368:750. 1994)、肺癌、およびマラリアの治療にも可能性を示している。パクリタキセルで患者を治療すると、閾値濃度（５０ｎＭ）を超える投与期間に関連して(Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)、骨髄抑制が起こる（複数の細胞系譜、Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998）。
【００８３】
ドセタキセル、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの５β−２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４−アセテート２−ベンゾエートとの１３−エステルの三水和物は、注射液としてタキソテール(TAXOTERE)（商標）として市販されている。ドセタキセルは、乳癌の治療に指示される。ドセタキセルは、ヨーロッパイチイの針葉から抽出した天然の前駆物質１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩを使用して製造された、パクリタキセル（前項参照）の半合成誘導体である。
【００８４】
ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ由来の細胞周期特異的抗新生物薬である。ビンカアルカロイドは、チューブリンと特異的に結合することによって細胞周期のＭ期（有糸分裂）に作用する。その結果、結合されたチューブリン分子は、重合して微小管になることができない。有糸分裂は中期で停止し、細胞死をたどると考えられている。ビンカアルカロイドの例としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。
【００８５】
ビンブラスチン、硫酸ビンカロイコブラスチンは、注射液としてベルバン(VELBAN)（商標）として市販されている。ビンブラスチンは、種々の固形腫瘍の第二選択療法として指示される可能性があるが、精巣癌、ならびにホジキン病、リンパ球性および組織球性リンパ腫を含む種々のリンパ腫の治療に主として指示される。骨髄抑制がビンブラスチンの用量制限副作用である。
【００８６】
ビンクリスチン、ビンカロイコブラスチンの２２−オキソ−硫酸塩は、注射液としてオンコビン(ONCOVIN)（商標）として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の治療に指示されており、ホジキンおよび非ホジキン悪性リンパ腫の治療計画の中でも使用されている。脱毛および神経学的作用がビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、程度は低いが、骨髄抑制および胃腸粘膜炎作用が生じる。
【００８７】
酒石酸ビノレルビンの注射液（ナベルビン(NAVELBINE)（商標））として市販されているビノレルビン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−Ｃ’−ノルビンカロイコブラスチン［Ｒ−（Ｒ＊，Ｒ＊）−２，３−ジヒドロキシブタン二酸（１：２）（塩）］は、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、単剤として、またはシスプラチンなどの他の化学療法薬と組み合わせて、種々の固形腫瘍、特に、非小細胞肺癌、進行性乳癌、およびホルモン不応性前立腺癌の治療に指示される。骨髄抑制がビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用である。
【００８８】
白金錯体：白金配位錯体は、非細胞周期特異的抗癌剤であり、ＤＮＡと相互作用する。白金錯体は、腫瘍細胞に侵入し、アクア化を受け、ＤＮＡとの鎖内架橋および鎖間架橋を形成し、腫瘍に対して有害な生物学的作用を引き起こす。白金配位錯体の例としては、限定されるものではないが、オキサリプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチンが挙げられる。
【００８９】
シスプラチン、シス−ジアンミンジクロロ白金は、注射液としてプラチノール(PLATINOL)（商標）として市販されている。シスプラチンは、主として転移性の精巣癌および卵巣癌ならびに進行性膀胱癌の治療に指示される。
【００９０】
カルボプラチン、ジアンミン［１，１−シクロブタン−ジカルボキシレート（２−）−Ｏ，Ｏ’］白金は、注射液としてパラプラチン(PARAPLATIN)（商標）として市販されている。カルボプラチンは、主として進行性卵巣癌の第一選択および第二選択治療に指示される。
【００９１】
アルキル化剤：アルキル化剤は、非細胞周期特異的抗癌剤(non-phase anti-cancer specific agents)であり、かつ、強力な求電子試薬である。一般に、アルキル化剤は、アルキル化によって、リン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、およびイミダゾール基などのＤＮＡ分子の求核部分を介してＤＮＡと共有結合を形成する。このようなアルキル化によって核酸機能が破壊され細胞死に至る。アルキル化剤の例としては、限定されるものではないが、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチンなどのニトロ尿素；ならびにダカルバジンなどのトリアゼンが挙げられる。
【００９２】
シクロホスファミド、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキシアザホスホリン２−オキシド一水和物は、注射液または錠剤としてシトキサン(CYTOXAN)（商標）として市販されている。シクロホスファミドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病の治療に指示される。
【００９３】
メルファラン、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンは、注射液または錠剤としてアルケラン(ALKERAN)（商標）として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不能な卵巣上皮癌の待期療法に指示される。骨髄抑制がメルファランの最も一般的な用量制限副作用である。
【００９４】
クロラムブシル、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンゼンブタン酸は、ロイケラン(LEUKERAN)（商標）錠剤として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病、ならびにリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病などの悪性リンパ腫の待期療法に指示される。
【００９５】
ブスルファン、ジメタンスルホン酸１，４−ブタンジオールは、マイレラン(MYLERAN)（商標）錠剤として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の待期療法に指示される。
【００９６】
カルムスチン、１，３−［ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素は、ＢｉＣＮＵ（商標）として凍結乾燥物質の単一バイアルとして市販されている。カルムスチンは、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫用に、単剤として、または他の薬剤と組み合わせて、待期療法に指示される。
【００９７】
ダカルバジン、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドは、材料の単一バイアルとしてＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（商標）として市販されている。ダカルバジンは、転移性悪性黒色腫の治療、および他の薬剤と組み合わせてホジキン病の第二選択治療に指示される。
【００９８】
抗生物質系抗新生物薬：抗生物質系抗新生物薬は、非細胞周期特異的薬剤であり、ＤＮＡと結合するかまたはＤＮＡにインターカレートする。一般に、このような作用によって安定なＤＮＡ複合体かまたは鎖の切断が生じ、それにより核酸の通常機能が乱れ、細胞死に至る。抗生物質系抗新生物薬の例としては、限定されるものではないが、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン；ダウノルビシンおよびドキソルビシンなどのアントロサイクリン；ならびにブレオマイシンが挙げられる。
【００９９】
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンＤとしても知られ、注射液の形態でコスメゲン(COSMEGEN)（商標）として市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療に指示される。
【０１００】
ダウノルビシン、（８Ｓ−シス−）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、リポソーム注射形態としてダウノキソーム(DAUNOXOME)（商標）として、または注射液としてセルビジン(CERUBIDINE)（商標）として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行性ＨＩＶ関連カポジ肉腫の治療における寛解導入に指示される。
【０１０１】
ドキソルビシン、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル，７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、注射可能な形態としてルベックス(RUBEX)（商標）またはアドリアマイシンＲＤＦ(ADRIAMYCIN RDF)（商標）として市販されている。ドキソルビシンは、主として急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の治療に指示されるが、いくつかの固形腫瘍およびリンパ腫の治療における有用成分でもある。
【０１０２】
ブレオマイシン、ストレプトミセス・ヴェルチシルス(Streptomyces verticillus)の株から単離された細胞傷害性グリコペプチド系抗生物質の混合物は、ベレノキサン(BLENOXANE)（商標）として市販されている。ブレオマイシンは、単剤として、または他の薬剤と組み合わせて、扁平上皮癌、リンパ腫、および精巣癌の待期療法に指示される。
【０１０３】
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤：トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、限定されるものではないが、エピポドフィロトキシンが挙げられる。
【０１０４】
エピポドフィロトキシンは、マンドレイク植物由来の細胞周期特異的抗新生物薬である。エピポドフィロトキシンは、一般に、トポイソメラーゼＩＩとＤＮＡとの三元複合体を形成してＤＮＡ鎖の切断を引き起こすことによって、細胞周期のＳ期およびＧ２期において細胞に影響を及ぼす。この鎖切断が蓄積し、細胞死をたどる。エピポドフィロトキシンの例としては、限定されるものではないが、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【０１０５】
エトポシド、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射液またはカプセル剤としてベプシド(VePESID)（商標）として市販されており、一般にＶＰ−１６として知られている。エトポシドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、精巣癌および非小細胞肺癌の治療に指示される。
【０１０６】
テニポシド、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−テニリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射液としてブモン(VUMON)（商標）として市販されており、一般にＶＭ−２６として知られている。テニポシドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、小児における急性白血病の治療に指示される。
【０１０７】
代謝拮抗性抗新生物薬：代謝拮抗性抗新生物薬は、ＤＮＡ合成を阻害すること、またはプリンもしくはピリミジン塩基の合成を阻害し、それによりＤＮＡ合成を制限することによって細胞周期のＳ期（ＤＮＡ合成）に作用する、細胞周期特異的抗新生物薬である。その結果、Ｓ期は進行せず、細胞死をたどる。代謝拮抗性抗新生物薬の例としては、限定されるものではないが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メカプトプリン(mecaptopurine)、チオグアニン、およびゲムシタビンが挙げられる。
【０１０８】
５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ピリミジンジオンは、フルオロウラシルとして市販されている。５−フルオロウラシルを投与すると、チミジル酸合成が阻害され、またＲＮＡおよびＤＮＡの両方に組み込まれる。その結果は一般に細胞死である。５−フルオロウラシルは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、および膵癌の治療に指示される。他のフルオロピリミジン類似体としては、５−フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）および５−フルオロデオキシウリジン一リン酸が挙げられる。
【０１０９】
シタラビン、４−アミノ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンは、シトサール−Ｕ(CYTOSAR-U)（商標）として市販されており、一般にＡｒａ−Ｃとして知られている。シタラビンは、成長中のＤＮＡ鎖へのシタラビンの末端組み込みによってＤＮＡ鎖の伸長を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。他のシチジン類似体としては、５−アザシチジンおよび２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）が挙げられる。
【０１１０】
メルカプトプリン、１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン一水和物は、プリントール(PURINETHOL)（商標）として市販されている。メルカプトプリンは、現時点でまだ特定されていないメカニズムによってＤＮＡ合成を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示す。メルカプトプリンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。有用なメルカプトプリン類似体はアザチオプリンである。
【０１１１】
チオグアニン、２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオンは、タブロイド(TABLOID)（商標）として市販されている。チオグアニンは、現時点でまだ特定されていないメカニズムによってＤＮＡ合成を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示す。チオグアニンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。他のプリン類似体としては、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビンが挙げられる。
【０１１２】
ゲムシタビン、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β−異性体）は、ジェムザール(GEMZAR)（商標）として市販されている。ゲムシタビンは、Ｓ期にて、またＧ１／Ｓ境界を通る細胞の進行を遮断することによって、細胞期特異性を示す。ゲムシタビンは、シスプラチンと組み合わせて局所進行性非小細胞肺癌の治療に指示され、また単独で局所進行性膵癌の治療に指示される。
【０１１３】
メトトレキサート、Ｎ−［４［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸は、メトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成に必要とされるジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害を介して、ＤＮＡの合成、修復、および／または複製を阻害することによって、特にＳ期に細胞周期作用を示す。メトトレキサートは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、および膀胱癌の治療に指示される。
【０１１４】
トポイソメラーゼＩ阻害剤：カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体を含むカンプトテシン類は、トポイソメラーゼＩ阻害剤として入手可能または開発中である。カンプトテシン細胞傷害活性は、そのトポイソメラーゼＩ阻害活性に関連すると考えられている。カンプトテシンの例としては、限定されるものではないが、イリノテカン、トポテカン、および下記の７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０−カンプトテシンの種々の光学形態が挙げられる。
【０１１５】
イリノテカンＨＣｌ、（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４−ヒドロキシ−９−［（４−ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン塩酸塩は、注射液カンプトサール(CAMPTOSAR)（商標）として市販されている。イリノテカンは、その活性代謝物ＳＮ−３８とともにトポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合する、カンプトテシンの誘導体である。細胞傷害性は、トポイソメラーゼＩ：ＤＮＡ：イリンテカンまたはＳＮ−３８の三元複合体と複製酵素との相互作用により引き起こされる回復不能な二本鎖切断の結果として生じると考えられている。イリノテカンは、結腸または直腸の転移性癌の治療に指示される。
【０１１６】
トポテカンＨＣｌ、（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸塩は、注射液ハイカムチン(HYCAMTIN)（商標）として市販されている。トポテカンは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合して、ＤＮＡ分子のねじれ歪みに応答してトポイソメラーゼＩにより引き起こされる一本鎖切断の再連結を妨げるカンプトテシンの誘導体である。トポテカンは、転移性の卵巣癌および小細胞肺癌の第二選択治療に指示される。
【０１１７】
ホルモンおよびホルモン類似体：
ホルモンおよびホルモン類似体は、ホルモンと癌の増殖および／または増殖の欠如との間に関係がある癌を処置するために有用な化合物である。癌処置に有用なホルモンおよびホルモン類似体の例としては、限定されるものではないが、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の処置において有用なプレドニゾンおよびプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン依存性乳癌の処置において有用な、アミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン；ホルモン依存性乳癌および子宮内膜癌の処置において有用な酢酸メゲストロールなどのプロゲクチン；前立腺癌および良性前立腺肥大の処置において有用なエストロゲン、アンドロゲン、および抗アンドロゲン作用薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンおよび５α−レダクターゼ、例えば、フィナステリドおよびデュタステライド；ホルモン依存性乳癌およびその他の感受性癌の処置において有用なタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェンなどの抗エストロゲン作用薬、ならびに米国特許第５，６８１，８３５号、同第５，８７７，２１９号、および同第６，２０７，７１６号に記載されているものなどの選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭＳ）；ならびに前立腺癌の処置のために黄体形成ホルモン（ＬＨ）および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびその類似体、例えば、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、酢酸ゴセレリンおよびルプロリドが挙げられる。
【０１１８】
シグナル伝達経路阻害剤：シグナル伝達経路阻害剤は、細胞内変化を引き起こす化学プロセスを遮断または阻害する阻害剤である。本明細書で使用する場合、この変化は細胞増殖または分化である。本発明において有用なシグナル伝達阻害剤としては、限定されるものではないが、受容体チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断剤、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達およびＲａｓ癌遺伝子の阻害剤が含まれる。
【０１１９】
いくつかのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞増殖の調節に関与する種々のタンパク質の特定のチロシル残基のリン酸化を触媒する。このようなタンパク質チロシンキナーゼは、大きく受容体または非受容体型キナーゼとして分類することができる。
【０１２０】
受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する膜貫通タンパク質である。受容体チロシンキナーゼは細胞増殖の調節に関与し、一般に、増殖因子受容体と呼ばれる。これらのキナーゼの多くの不適当なまたは制御を欠いた活性化、すなわち、例えば、過剰発現または突然変異による異常なキナーゼ増殖因子受容体活性は、制御を欠いた細胞増殖をもたらすことが示されている。よって、このようなキナーゼの異常な活性は悪性組織増殖に関連付けられている。結果として、このようなキナーゼの阻害剤は癌処置法を提供することができる。増殖因子受容体には、例えば、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦｒ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４、ｒｅｔ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦｒ）、免疫グロブリン様および上皮細胞増殖因子同一性ドメインを有するチロシンキナーゼ(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains)（ＴＩＥ−２）、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦＩ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（ｃｆｍｓ）、ＢＴＫ、ｃｋｉｔ、ｃｍｅｔ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）  受容体、Ｔｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）、エフリン（ｅｐｈ）受容体、およびＲＥＴ癌原遺伝子が挙げられる。増殖受容体のいくつかの阻害剤が開発下にあり、リガンドアンタゴニスト、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。増殖因子受容体および増殖因子受容体機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818; Shawver et al DDT Vol 2, No. 2 February 1997；およびLofts, F. J. et al, “Growth factor receptors as targets”, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, Workman, Paul and Kerr, David編, CRC press 1994, Lond
onに記載されている。
【０１２１】
増殖因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは、非受容体型チロシンキナーゼである。抗癌剤の標的または潜在的標的となる、本発明において有用な非受容体型チロシンキナーゼには、ｃＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｊａｋ、ｃＡｂｌ、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびＢｃｒ−Ａｂｌが含まれる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤は、Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80;およびBolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０１２２】
ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断剤は、ＰＩ３−Ｋ  ｐ８５サブユニット、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、アダプター分子（Ｓｈｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２）およびＲａｓ−ＧＡＰをはじめとする、様々な酵素またはアダプタータンパク質においてＳＨ２またはＳＨ３ドメイン結合を混乱させる薬剤である。抗癌剤の標的としてのＳＨ２／ＳＨ３ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32に記載されている。
【０１２３】
セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤、例えば、ＭＡＰキナーゼカスケード遮断剤、これには、Ｒａｆキナーゼ（ｒａｆｋ）、マイトジェンまたは細胞外調節キナーゼ(Mitogen or Extracellular Regulated Kinase)（ＭＥＫ）、および細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の遮断剤；およびＰＫＣ（α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ）の遮断剤を含むタンパク質キナーゼＣファミリーメンバー遮断剤が含まれる。ＩｋＢキナーゼファミリー（ＩＫＫａ、ＩＫＫｂ）、ＰＫＢファミリーキナーゼ、ａｋｔキナーゼファミリーメンバー、およびＴＧＦβ受容体キナーゼ。このようなセリン／トレオニンキナーゼおよびそれらの阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226;米国特許第6,268,391号;およびMartinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０１２４】
ＰＩ３−キナーゼ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫ、およびＫの遮断剤を含むホスファチジルイノシトール(Phosphotidyl inositol)−３キナーゼファミリーメンバーの阻害剤もまた本発明において有用である。このようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8; and Zhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545に記載されている。
【０１２５】
また、ホスホリパーゼＣ遮断剤およびミオイノシトール類似体などのミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も本発明において有用である。このようなシグナル阻害剤は、Powis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, Paul Workman and David Kerr編, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０１２６】
シグナル伝達経路阻害剤の別の群は、Ｒａｓ癌遺伝子の阻害剤である。このような阻害剤には、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニル−ゲラニルトランスフェラーゼ、およびＣＡＡＸプロテアーゼの阻害剤、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型突然変異ｒａｓを含有する細胞においてｒａｓ活性化を遮断し、それにより抗増殖薬として作用することが示されている。Ｒａｓ癌遺伝子阻害は、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102;およびBioChim. Biophys. Acta, (19899) 1423(3):19-30で考察されている。
【０１２７】
前述のように、受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストもまたシグナル伝達阻害剤として働き得る。この群のシグナル伝達経路阻害剤には、受容体チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用が含まれる。例えば、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｃ２２５  ＥＧＦＲ特異的抗体（Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照）ハーセプチン（商標）ｅｒｂＢ２抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kinases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照）；および２ＣＢ  ＶＥＧＦＲ２特異的抗体（Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）。
【０１２８】
抗血管新生薬：
（ｉ）非受容体型ＭＥＫ血管新生阻害剤(non-receptorMEKngiogenesis inhibitors)をはじめとする抗血管新生薬も有用であり得る。例えば、血管内皮細胞(vascular edothelial)増殖因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［アバスチン（商標）］、およびその他の機構によって働く化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）などの抗血管新生薬。
【０１２９】
免疫治療剤：免疫治療医計画に使用される薬剤もまた、式（Ｉ）の化合物との組合せにおいて有用であり得る。例えば患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏアプローチを含む免疫療法アプローチ、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインによるトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを低減するアプローチ、サイトカイントランスフェクト樹状細胞などのトランスフェクト免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を使用するアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチ。
【０１３０】
アポトーシス促進薬：アポトーシス促進計画で使用される薬剤（例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）も、本発明の組合せにおいて使用可能である。
【０１３１】
細胞周期シグナル伝達阻害剤：細胞周期シグナル伝達阻害剤は、細胞周期の制御に関与する分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるタンパク質キナーゼファミリーおよびそれらとサイクリンと呼ばれるタンパク質ファミリーとの相互作用が、真核細胞周期の進行を制御している。細胞周期の正常な進行には、種々のサイクリン／ＣＤＫ複合体の協調した活性化および不活化が不可欠である。細胞周期シグナル伝達のいくつかの阻害剤が開発下にある。例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６をはじめとするサイクリン依存性キナーゼおよびそれらの阻害剤の例は、例えば、Rosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
【０１３２】
一つの実施態様では、本発明の組合せは、ＴＬＲ４アゴニストと、微小管阻害剤、白金錯体、アルキル化剤、抗生物質薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ホルモンおよびホルモン類似体、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンＭＥＫ血管新生阻害剤(non-receptor tyrosine MEKngiogenesis inhibitors)、免疫治療剤、アポトーシス促進薬、および細胞周期シグナル伝達阻害剤から選択される少なくとも１種類の抗新生物薬とを含んでなる。
【０１３３】
一つの実施態様では、本発明の組合せは、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドから選択される微小管阻害剤である、ＴＬＲ４アゴニストおよび少なくとも１種類の抗新生物薬を含んでなる。
【０１３４】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、ジテルペノイドである。
【０１３５】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、ビンカアルカロイドである。
【０１３６】
一つの実施態様では、本発明の組合せは、ＴＬＲ４アゴニストと白金錯体である少なくとも１種類の抗新生物薬である。
【０１３７】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、パクリタキセル、カルボプラチン、またはビノレルビンである。
【０１３８】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、カルボプラチンである。
【０１３９】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、ビノレルビンである。
【０１４０】
さらなる実施態様では、少なくとも１種類の抗新生物薬は、パクリタキセルである。
【０１４１】
一つの実施態様では、本発明の組合せは、ＴＬＲ４アゴニストとシグナル伝達経路阻害剤である少なくとも１種類の抗新生物薬とを含んでなる。
【０１４２】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、増殖因子受容体キナーゼＶＥＧＦＲ２、ＴＩＥ２、ＰＤＧＦＲ、ＢＴＫ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦｒ、ＩＧＦＲ−１、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、またはｃ−ｆｍｓの阻害剤である。
【０１４３】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、セリン／トレオニンキナーゼｒａｆｋ、ａｋｔ、またはＰＫＣ−ζの阻害剤である。
【０１４４】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、キナーゼのｓｒｃファミリーから選択される非受容体チロシンキナーゼの阻害剤である。
【０１４５】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、ｃ−ｓｒｃの阻害剤である。
【０１４６】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、ファルネシルトランスフェラーゼおよびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの阻害剤から選択されるＲａｓ癌遺伝子の阻害剤である。
【０１４７】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋからなる群から選択されるセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤である。
【０１４８】
さらなる実施態様では、シグナル伝達経路阻害剤は、二重ＥＧＦｒ／ｅｒｂＢ２阻害剤、例えば、Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン（以下の構造）である。
【化５】
2018522053.tif 000007
【０１４９】
一つの実施態様では、本発明の組合せは、式Ｉの化合物またはその塩もしくは溶媒和物と細胞周期シグナル伝達阻害剤である少なくとも１種類の抗新生物薬とを含んでなる。
【０１５０】
さらなる実施態様では、細胞周期シグナル伝達阻害剤は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６の阻害剤である。
【０１５１】
一つの実施態様では、本発明の方法および使用における哺乳動物は、ヒトである。
【０１５２】
示されるように、治療上有効な量の本発明の組合せ（抗癌剤とＴＬＲ４アゴニスト）がヒトに投与される。一般に、投与される本発明の薬剤の治療上有効な量は、例えば、対象の齢および体重、処置を必要とする厳密な病態、病態の重篤度、処方物の性質、および投与経路を含むいくつかの因子によって異なる。最終的に、治療上有効な量は、主治医の裁量にある。
【０１５３】
以下の実施例は単に例示を意図し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１５４】
非限定例  化学療法とＡＧＰ処置の組合せは、マウス癌モデルにおいて（化学療法またはＡＧＰ単独に比べて）生存の有意な増進をもたらす。ＣＲＸ−５２７と化学療法の間の相乗作用の証拠が以下の系で見られる：マウス白血病モデル（Ｌ１２１０）、マウス卵巣奇形腫モデル（ＭＯＴ）、マウスメラノーマモデル（Ｂ１６）、乳癌（４Ｔ１）。
【０１５５】
実施例１  Ｌ１２０マウス白血病モデル：化学療法と免疫調節の組合せは抗癌応答を改善する
化学療法薬マイトマイシンＣとＡＧＰ  ＣＲＸ−５２７からなる併用処置がいずれかの処置単独よりも担癌マウスの生存を延長させるかどうかを調べるために、０日目にＬ１２１０マウス白血病細胞（腹腔内（ＩＰ）経路を介して１０４腫瘍細胞）を接種したＢＤＦ１マウス（各群１０個体）を、１）処置無し（無処置対照）、２）６日目にマイトマイシンＣ（４０μｇ）の腹腔内注射、３）７日目にＣＲＸ−５２７−ＡＦ（水中０．０２％ジパルミトイルホスファチジルコリンであるＡｑｕｅｏｕｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＡＦ）中、１００μｇ  ＣＲＸ−５２７）のＩＰ注射、または４）６日目にマイトマイシンＣのＩＰ注射、次いで、７日目にＣＲＸ−５２７−ＡＦのＩＰ注射、で処置した。５４日目までの生存曲線を各群について図１に示す。マイトマイシンＣとＣＲＸ−５２７の両方を投与したマウスは、いずれかの成分単独を投与したマウスに比べて有意に延長した生存を示した。
【０１５６】
実施例２：  マウス卵巣腫瘍（ＭＯＴ）モデル
化学療法および免疫調節薬の投与のタイミング
マイトマイシンＣとＣＲＸ−５２７の両方を投与したマウスはまた、マウス卵巣腫瘍（ＭＯＴ）モデルでも、いずれかの成分単独を投与したマウスに比べて有意に延長した生存を示した。化学療法薬とＴＬＲ４リガンドの投与のタイミングが抗癌応答に重要であるかどうかを決定するために、０日目にマウス卵巣腫瘍（ＭＯＴ）細胞（ＩＰ経路を介して１０４腫瘍細胞）を接種したＣ３Ｈ／ＦｅＪマウス（各群１０個体）を、１）処置無し（無処置対照）、２）６日目にマイトマイシンＣ（４０μｇ）、３）４日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥ（２％水中油スクアレンを含有する型安定エマルション処方物中１０μｇ）、次いで、６日目にマイトマイシンＣ、４）５日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥ、次いで、６日目にマイトマイシンＣ、５）６日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥとマイトマイシンＣの両方、６）６日目にマイトマイシンＣ、次いで、７日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥ、７）６日目にマイトマイシンＣ、次いで、１０日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥ、および８）６日目にマイトマイシンＣ、次いで、１１日目にＣＲＸ−５２７−ＳＥで処理した。マイトマイシンＣおよびＣＲＸ−５２７−ＳＥ投与の用量／経路は常にそれぞれ４０μｇ  ＩＰおよび１０μｇ  ＩＰとした。マイトマイシンＣと同時にまたはその後５日までにＣＲＸ−５２７を投与した群は、処置無し（無処置対照）、マイトマイシン単独またはＣＲＸ５２７−ＳＥの後にマイトマイシンＣを受容した群に比べて有意に延長した生存期間を示し（図２）、マイトマイシンＣなどの化学療法薬と同時にまたはその後にＣＲＸ−５２７などの有効なＴＬＲ４リガンドが投与される場合に、この癌モデルにおける併用療法の利益が見られることを示唆する。
【０１５７】
実施例３  ＴＬＲ４依存性
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）をコードする遺伝子に突然変異を有し、結果として、リポ多糖（ＬＰＳ）などのＴＬＲ４リガンドまたはＣＲＸ−５２７などのＡＧＰに応答しない。本発明者らは、野生型マウスでＣＲＸ−５２７により惹起された抗癌活性が機能的ＴＬＲ４に依存することを示すためにこれらのＴＬＲ４不応答マウス（各群１０個体）を用いた。予想されたように、ＣＲＸ−５２７は、単独でまたはマイトマイシンＣと組み合わせて投与した場合にＣ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ野生型マウスの生存を増進した（図３）が、ＭＯＴ担持Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの生存は増進しなかった（図４）。
【０１５８】
実施例４  処方物
ＣＲＸ−５２７で見られる抗癌活性に関する処方物の効果をＭＯＴ腫瘍モデルで評価した。図５に示される実験で、０日目にＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（野生型ＴＬＲ４、各群１０個体）にＭＯＴ腫瘍（１０４腫瘍細胞ＩＰ）を接種した。６日目にマイトマイシンＣ（４０μｇ  ＩＰ）を投与し、ＡＦ（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｆｏｌｍｕｌａｔｉｏｎ＝水中０．０２％ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＩＮ（Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ＝水中２％グリセロール）またはＳＥ（Ｓｔａｂｌｅ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ＝２％水中油型スクアレン）中に処方した１または１０μｇのＣＲＸ−５２７を７日目にＩＰ経路を介して投与した。この場合にも、マイトマイシンＣ単独による処置は、非処置対照に比べて生存に小さな増大をもたらした。マイトマイシンＣ処置の１日後のＣＲＸ−５２７の投与は生存の延長をもたらし、ＳＥおよびＩＮ処方物はＡＦ処方物に比べて効力の増強を示した。このＳＥおよびＩＮ処方物において増強された効力は図５および６に示され、高レベルの保護を誘導するためには、ＡＦ処方物では１０μｇ用量のＣＲＸ−５２７が必要とされたが、ＳＥおよびＩＮの両処方物は１および１０μｇの両用量で極めて有効であることを見て取ることができる。この実験の結果は、このモデルにおけるＣＲＸ−５２７の効力が処方物を介して増強され得ることを示す。
【０１５９】
実施例５  適応免疫の誘導
図７に示されるデータは、マイトマイシンＣおよびＣＲＸ−５２７による併用処置によりＭＯＴ腫瘍が治癒したマウスは同じ腫瘍での再チャレンジに対して耐性がある（組織学的データに基づいて通常の割合で屈したナイーブ対照マウスに比べて）ことを示す。この結果は、再チャレンジ時に腫瘍の成長を緩慢にし、かつ、生存を延長することができる処置／治癒マウスにおいて腫瘍特異的適応免疫応答が生成されることを示す。この実験での群の大きさは１０個体であった。
【０１６０】
実施例６  免疫調節薬の多回処置の効果および局所投与と全身投与の効果
図８および９に示されるデータは、併用療法の成分が異なる経路により首尾よく投与され得ることを示す。本実験では、マイトマイシンＣは、ＭＯＴ担持マウスにＩＰ経路を介して投与し、ＣＲＸ−５２７−ＩＮは、ＩＰまたはＩＶ経路のいずれかにより投与した。生存の延長は両成分をＩＰ経路を介して受容した群でより顕著であったが、ＩＰ経路を介してマイトマイシンＣおよびＩＶ経路を介してＣＲＸ−５２７−ＩＮを受容した群もまた特に本併用療法の２回の投与の後に保護された。図８および９に示されるデータはまた、ＭＯＴ腫瘍モデルにおいて本併用療法による２回の処置が１回の処置より生存の延長に有効であることを示す。この結果は、複数回の処置がこのような治療剤の転帰に効果を持ち得ることを示す。
【０１６１】
実施例７  Ｂ１６メラノーマ系
化学療法薬とＡＧＰの併用療法の有効性はまた、Ｂ１６−Ｆ１０と呼称される非免疫原性腫瘍を用いてマウスメラノーマモデルでも試験した。これらの実験では、０日目にＢＤＦ１マウスにＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（１．５×１０３ＩＶ）を接種した。その後種々の時点で、担癌マウスをシクロホスファミド（ａｋａサイトキサン）単独（３ｍｇ  ＩＰ）、ＣＲＸ−５２７−ＩＮ（１０μｇ）単独またはこれら２剤の組合せで処置した。図１０に示されるように、５日目のＣＲＸ−５２７−ＩＮ単独での処置は生存の改善をもたらさなかったが、５日目のシクロホスファミド単独での処置は中等度の延長をもたらした。しかしながら、ＣＲＸ−５２７−ＩＮおよびシクロホスファミドを一緒に投与した群は、他の群に比べて生存の改善を示した。
【０１６２】
さらなる実験では、緑色蛍光タンパク質でトランスフェクトしたＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞を、マウス肺への腫瘍の転移を定量するために使用した。緑色蛍光タンパク質はＢ１６−Ｆ１０担持マウスの肺における腫瘍量の定量を可能とするので、読み出しとして肺腫瘍量を用い、種々の処置計画の有効性を評価することが可能であった。０日目にＢＤＦ１マウスにＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（１．５×１０３ＩＶ）を接種した。１日目に担腫瘍マウス（各群５個体）にビヒクル（５００μｌ生理食塩水ＩＰおよび１００μｌ  ＳＥビヒクルＩＶ）、ＣＲＸ−５２７−ＳＥ（１００μｌ中１０μｇ  ＩＶ）、シクロホスファミド（５００ｕｌ水中４ｍｇ  ＩＰ）またはＣＲＸ−５２７−ＳＥ（１００μｌ中１０μｇ  ＩＶ）とシクロホスファミド（５００ｕｌ水中４ｍｇ  ＩＰ）の両方を注射した。２６日目に、マウスを犠牲にし、それらの肺を採取した。各マウスの肺の写真を撮影した後、どのくらいのＢ１６−Ｆ１０腫瘍が存在したか決定するためにルシフェラーゼ活性が定量できるようにホモジナイズした。視覚的検査により（図１１〜１４）、シクロホスファミド／ＣＲＸ−５２７の組合せで処置したマウス（図１４）が他のいずれの群よりも肺の腫瘍量が少なかったことが明らかである。この所見は、肺をホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性を評価した際に確認された。図１５に示されるデータは、シクロホスファミドおよびＣＲＸ−５２７で処置したマウス由来の肺が、ビヒクルまたはいずれかの薬剤単独で処置したマウスよりも、それらの肺のルシフェラーゼ活性が有意に低く、ゆえに腫瘍が少なかったことし示し、この系における併用療法の優位性が確認される。
【０１６３】
実施例８  乳癌(breast cance)モデルにおける併用療法
また、化学療法薬とＡＧＰなどのＴＬＲ４リガンドを組み合わせる利益は４Ｔ１マウス  乳癌モデルでも確認された。この転移性癌モデルを用いて行った実験については、０日目に４Ｔ１腫瘍細胞（５０μＬ中７×１０３）を各マウスの下部乳腺に注射した。１４日目に原発腫瘍を外科的に摘出し、１５日目にマウス（各群１０個体）をビヒクル、シクロホスファミド（３ｍｇ  ＩＰ）またはシクロホスファミド（３ｍｇ  ＩＰ）とＣＲＸ−５２７（種々の用量ＩＶ）で処置した。図１６に示される結果は、併用療法を受容した群は、ビヒクルまたはシクロホスファミド単独を受容した群よりも長い生存期間を有したことを示す。Ｌ１２１０、ＭＯＴまたはＢ１６−Ｆ１０系で収集されたデータほど明確ではないものの、これらの結果は、化学療法薬とＣＲＸ−５２７などの免疫調節薬での併用療法がいずれか単独での処置よりも優れているという主張を支持する。
【０１６４】
実施例９：  ＴＬＲ−４（ＣＲＸ−５２７）での処置を用いたＣＴ−２６試験の結果
ＣＴ２６マウス結腸癌（ＣＴ２６．ＷＴ；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２６３８）細胞株をＡＴＣＣから入手した。これはＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン−（ＮＮＭＵ）で誘導した、当技術分野で公知の未分化結腸癌細胞株である。例えば、それは、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるWang M, et al. Active immunotherapy of cancer with a nonreplicating recombinant fowlpox virus encoding a model tumor-associated antigen. J. Immunol. 154: 4685-4692, 1995 (PubMed: 7722321)に記載されている。腫瘍細胞の調製については、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ−２６３８、ロット番号５９２２７０５２）からのＣＴ−２６（マウス結腸癌細胞）の凍結（−１４０℃）バイアルを解凍し、翌週にわたって基本ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ含有）培地で培養した。
【０１６５】
ＣＴ−２６細胞（１２代）をフラスコから完全培地中に採取した。細胞を遠心分離し、ＲＰＭＩ（ＦＢＳ不含）に再懸濁させ、この工程を３回繰り返した。細胞密度および生存率をトリパンブルー排除により確認した。次に、細胞を所望の密度（５×１０５細胞／ｍＬ）に希釈し、氷上で維持した。
【０１６６】
漸増用量のＣＲＸ５２７を、腫瘍成長の低下におけるそれらの有効性に関して評価した。動物の体重を測定し、０日目に、マウス当たり０．５×１０５のＣＴ２６腫瘍細胞を右後四半部に接種した。３０％の失敗率（試験の開始時に大きすぎるか小さすぎる）を仮定して合計１３０個体のマウスに腫瘍細胞を接種し、目標は各群につきｎ＝１０とすることである。腫瘍細胞接種の後、腫瘍成長および全体重を試験期間中、週に３回測定する。１０日目または１１日目に平均腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３になった際に無作為化を行う。無作為化日に開始し、動物に週２回(biweekly)、合計６用量で、ＣＲＸ５２７またはビヒクルのｉ．ｐ．投与を行う。マウスは、腫瘍が２回の連続測定で＞２０００立法ミリメートルに達するまで、他の理由（すなわち、体重低下＞２０％、腫瘍上の潰瘍形成など）で試験から除かれるまで、または試験の終了まで試験に留める。安楽死後、腫瘍を取り出し、フロー分析のための解離および／またはＩＨＣ分析のためのＦＦＰＥを行う。
【０１６７】
処置                    用量（マウス当たり）        マウス数
群０：０．５×１０５細胞／      ビヒクル                    １０〜１３
群ａ：０．５×１０５細胞／      ＣＲＸ−５２７；４μｇ      １０〜１３
群ｂ：０．５×１０５細胞／      ＣＲＸ−５２７；２０μｇ    １０〜１３
群ｃ：０．５×１０５細胞／      ＣＲＸ−５２７；１００μｇ  １０〜１３
０日目：腫瘍細胞のｓｃ接種
１、４、６、８日目：動物の体重を測定し、腫瘍を確認し、測定した。
無作為化日（およそ１０日目）：動物を無作為化し、適当な群を表すケージに入れた。
試験終了まで週２回(biweekly)の投与：動物に上記で示す量（マウス当たり）のＴＬＲ化合物ＣＲＸ−５２７またはビヒクルをｉｐ投与した。
試験終了まで週３回(triweekly)の測定：動物の体重を測定し、腫瘍を測定した。
【０１６８】
示された用量で図１７の結果を作成するために上記のプロトコールを使用した。ほとんど総ての場合、０．５×１０５のＣＴ−２６結腸直腸腫瘍細胞を右後四半部に接種したＢａｌｂ／ｃマウスは腫瘍を発達させ、ビヒクル（２％グリセロール）のみをｉ．ｐ．注射した場合に予想通り進行した。ＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−５２７は、ビヒクル処置動物に比べて腫瘍成長を用量依存的に阻害した。図１７。用量依存は、このモデルの生存率にも見られた。類似の実験で、ＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１も腫瘍成長を阻害した。表２および図１８参照。
【０１６９】
【表２】
2018522053.tif 000008
【０１７０】
実施例１０：抗癌剤および式ＩのＴＬＲ−４標的分子による単剤療法および併用処置
材料および方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性試験
ＴＬＲ４アゴニスト（ＣＲＸ−６０１）のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、マウスＣＴ−２６結腸癌同系固形腫瘍モデルにおいて単剤療法としておよび治療抗体と組み合わせて（組合せデータは示されていない）評価した。これらの試験に７〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を用いた。マウスＣＴ−２６結腸癌細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２６３８  ロット番号５９２２７０５２）を、加湿、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターにて１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ増殖培地で培養した。対数増殖期の培養ＣＴ−２６細胞を組織培養フラスコから採取し、５分間、４℃にて４５０ｘｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットとした。上清をデカントし、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再び、５分間、４℃にて４５０ｘｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットとした。細胞をＦＢＳ不含の無菌ＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、５００，０００細胞／ｍｌの細胞濃度に調整した。１００μｌの細胞株を皮下注射により各Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に移植した。１０日または１１日後、平均腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達した際に、マウスを腫瘍サイズに従って試験コホートに無作為化し、初回処置用量を与えた。ＴＬＲ４アゴニスト（ＣＲＸ−６０１）またはビヒクルを示されているように全身静脈注射または直接腫瘍内注射により投与した。静脈投与および腫瘍内投与に使用したＣＲＸ−６０１ビヒクルは、示されている場合、０．５％であった。ＣＲＸ−６０１リポソーム腫瘍内投与については、ＧＳＫにより作製されたＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソームロット番号１７８３−１５７−Ｂを使用した。治療抗体は、週に２回、合計６用量で与える腹腔内注射により投与した。ノギス測定を週に２回行って腫瘍成長を評価し、＜２，０００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを３０日〜およそ１１５日まで試験で維持した。２回の連続測定で＞２，０００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスまたは開放潰瘍を形成した腫瘍を有するマウスは試験から除いた。腫瘍体積は、式（０．５２）×（長さ）×（幅２）を用いて計算した。試験３では、無腫瘍マウスの元の接種部位とは反対の側腹部にＣＴ−２６腫瘍細胞を上記のように再投与し、腫瘍成長を上記のようにモニタリングした。試験は総て、実験動物の管理、福祉および処置に関するＧＳＫポリシーに従って行い、ＧＳＫの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により審査されている。
【０１７１】
免疫表現型分類およびサイトカイン分析
初回ＣＲＸ−６０１投与後０日目、１日目および８日目にＣＴ−２６マウスから腫瘍、血液および組織を採取した。マウス白血球および解離させた腫瘍単細胞を、免疫表現型分類向けの多色フローサイトメトリー分析のために表面または細胞内染色抗体で新たに染色した。同じ試験からのマウス血漿サンプルを用いてマルチプレックスサイトカイン分析を行った。
【０１７２】
統計分析
試験１および２に関して、腫瘍成長阻害の有意性を決定するために、初回投与後１１日目（試験１）または１５日目（試験２）の腫瘍体積を、異なる処置群の間で比較した。分析前に、異なる処置群の不等分散性のために腫瘍体積を自然対数に変換した。次に、これらの変換データに対してＡＮＯＶＡの後にペアワイズ比較を行った。ＳＡＳ９．３およびＲ３．０．２分析ソフトウエアを使用した。所与の時点での異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。生存分析のためのイベントは腫瘍体積２０００ｍｍ３または腫瘍の潰瘍化のいずれか早い方であった。打ち切り体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と２つの観測日（打ち切り体積を超えた最初の観測と打ち切り体積直前の一観測）の間に直線を当てはめることにより評価した。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する９５％信頼区間を計算した。次に、ＫＭ生存曲線が任意の２群の間で統計的に異なったかどうかをログランク検定により検定した。処置群間での生存分析によるイベントまでの日数の比較および示される日数での対数変換した腫瘍体積から生のｐ値ならびに偽陽性率（ＦＤＲ）補正ｐ値を決定した。ＦＤＲ補正ｐ値≦０．０５を有するものを統計的に有意であるとした。
【０１７３】
試験３では、腫瘍成長阻害の有意性を決定するために、初回投与後１２日目の腫瘍体積を異なる処置群間で比較した。処置を標準的ＡＮＯＶＡ法、次いで、多重度に関するＦＤＲ補正により比較した。等分散性（等分散）のために応答は体積の平方根である。所与の時点で異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。これらの生存分析について、「死亡」は、腫瘍体積打ち切り（２０００ｍｍ３）を超えることを意味する。「生存率」は、「死亡」していないマウスの割合を意味し、「生存期間」は、「死亡」までの日数を意味する。マウスが２つの測定日の間で体積打ち切りを超えた場合は、「死亡」の日を線形補間により評価した。マウスが２回以上体積打ち切りを超えた場合は、最初に超えた際を使用した。処置は２処置の標準的ログランク検定により比較した。ログランクｐ値は、ＦＤＲ（偽陽性率）法を用いて多重度に関して補正した。有意性はＦＤＲ≦０．０５と定義した。計算およびグラフはＲソフトウエア、バージョン３．２．３を用いて行った。
【０１７４】
結果
試験１〜３は、ＣＲＸ−６０１および治療抗体により単独および互いに組み合わせたものの両方で処置したマウスにおける腫瘍サイズおよび生存期間を評価するために行った。
【０１７５】
試験１
腫瘍内投与のＣＲＸ−６０１単剤療法活性を決定するために、マウスに５×１０４のＣＴ−２６細胞を接種し、材料および方法に記載の通りに腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達した際に、以下に挙げた１０群に無作為化した。
【０１７６】
群１：週２回、合計６用量で腫瘍内投与されるビヒクル
群２：週２回、合計６用量で腫瘍内投与されるＣＲＸ−６０１  ０．１μｇ／マウス
群３：週２回、合計６用量で腫瘍内投与されるＣＲＸ−６０１  １μｇ／マウス
群４：週２回、合計６用量で腫瘍内投与されるＣＲＸ−６０１  １０μｇ／マウス
群５：ＣＲＸ−６０１  ５０μｇ／マウスの単回投与
【０１７７】
腫瘍内投与では、ＣＴ−２６同系マウス腫瘍モデルにおけるＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１に関して用量依存的抗腫瘍活性（腫瘍成長阻害により経時的に測定）が見られた。１０μｇおよび５０μｇを投与したマウスは初回投与後１１日目に、ビヒクルに比べて統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）腫瘍成長阻害を示した。結果を図１９に示す。
【０１７８】
本試験においてＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１で処置したマウスはまた、生存期間においても統計的に有意な増大を示した。５０μｇを投与したマウスは、試験が終了したＣＴ２６腫瘍細胞接種後４２日までにビヒクルに比べて統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）増加を示した。この日において、５０μｇおよび１０μｇ  ＣＲＸ−６０１群のマウスだけが試験に残っていた。５０μｇ群の４個体のうち３個体のマウスは無腫瘍であり、４個体目のマウスは８５４．１９ｍｍ３の腫瘍体積を示した。１０μｇ群で残った１個体のマウスは無腫瘍であった（図２０参照）。
【０１７９】
試験２
静脈内投与のＣＲＸ−６０１単剤療法活性を決定するために、マウスに５×１０４のＣＴ−２６細胞を接種し、材料および方法に記載の通りに腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達した際に、以下の１０群に無作為化した。
【０１８０】
群１：週２回、合計６用量で静脈内投与されるビヒクル
群２：週２回、合計６用量で静脈内投与されるＣＲＸ−６０１  １μｇ／マウス
群３：週２回、合計６用量で静脈内投与されるＣＲＸ−６０１  １０μｇ／マウス
群４：ＣＲＸ−６０１  １００μｇ／マウスの単回投与
【０１８１】
静脈内投与では、ＣＴ−２６同系マウス腫瘍モデルにおけるＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１に関して用量依存的抗腫瘍活性（腫瘍成長阻害により経時的に測定）が見られた。１０μｇおよび１００μｇを投与したマウスは初回投与後１５日目に、ビヒクルに比べて統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）腫瘍成長阻害を示した（図２１参照）。
【０１８２】
このＣＴ−２６同系マウス腫瘍モデルにおいてＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１で処置したマウスはまた、生存期間においてもビヒクルに比べて統計的に有意な増大を示した。１００μｇを投与したマウスは、ＣＴ−２６腫瘍細胞接種後３２日目の試験が終了した際に、生存にビヒクルに比べて統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）増大を示した。この群で残った３個体のうち１個体のマウスは無腫瘍であったが、他のマウスは１５００．４９および９６２．６１ｍｍ３の腫瘍体積を示した。１０μｇ投与群で残った１個体のマウスは１８８．０ｍｍ３の腫瘍体積を有した（図２２参照）。
【０１８３】
試験３
ＣＲＸ−６０１活性を単独と治療抗体との組合せで（組合せデータは示されていない）比較する組合せ試験の一部として、ＣＲＸ−６０１を、０．５％グリセロール／４％デキストロースビヒクルを用いた静脈内（ＩＶ）またはＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム処方物を用いた腫瘍内（ＩＴ）のいずれかで投与し、マウスに５×１０４のＣＴ−２６細胞を接種し、材料および方法に記載の通りに腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達した際に、以下の１０群に無作為化した。群１および５はそれぞれ、静脈内／腹腔内および腫瘍内／腹腔内の対照群であった。群２および７にはＣＲＸ−６０１を投与した。群３、４、６、および８には、ＣＲＸ−６０１と治療抗体の組合せ（組合せデータは示されていない）を投与した。
【０１８４】
群１：週１回、合計３用量で静脈内投与されるビヒクル（０．５％グリセロール／４％デキストロース）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
群２：週１回、合計３用量で静脈内投与されるＣＲＸ−６０１  ２５μｇ／マウス（０．５％グリセロール／４％デキストロース中）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
群５：週１回、合計３用量で腫瘍内投与されるビヒクル（ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
群７：週１回、合計３用量で腫瘍内投与されるＣＲＸ−６０１  ２５μｇ／マウス（ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム中）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
【０１８５】
抗腫瘍活性は、初回投与の１２日後に処置群に関して評価した（腫瘍成長阻害により経時的に測定）。準最適単剤療法である２５μｇ／マウス用量のＣＲＸ−６０１は、静脈内投与（群２  図２３）または腫瘍内投与（群７、リポソーム処方物図２４）した場合に、対応する対照群（それぞれ群１および群５）に比べて、統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）腫瘍成長阻害を示した。
【０１８６】
このＣＴ−２６同系マウスモデル試験では、生存の優位性を初回投与後８０日目にも決定した。単剤療法ＩＶ（群２）として投与したＣＲＸ−６０１は、対照群１に比べて生存の統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）増大を示した（図２５）。群２には、１０個体のうち完全な腫瘍退縮を示すマウスが５個体いた。ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム処方物（群７）を用いて腫瘍内単剤療法として投与したＣＲＸ−６０１は、対照群５に比べて生存に統計的に有意な（＊ｐ値≦０．０５）増大を示した（図２６）。８０日目のナイーブ対照マウスおよび完全に退縮した無腫瘍マウスにＣＴ２６腫瘍細胞で再チャレンジを行った。ＣＴ２６腫瘍は、ナイーブ対照マウスでは予想通り成長したが、処置群マウスでは腫瘍成長はなく、拒絶された。この結果は、ＣＲＸ−６０１による持続的抗腫瘍記憶を示唆する（図２７）。この腫瘍成長の欠如は、ＣＲＸ−６０１による持続的抗腫瘍記憶を示唆する。
【０１８７】
実施例１１  ＣＲＸ−６０１のアブスコパル効果
試験４
アブスコパル効果は、局部的腫瘍処置後の遠隔腫瘍の退縮として表される。アブスコパル効果を評価するために、材料および方法に単回腫瘍接種に関して記載されている通りに、マウスの左側腹部に５×１０４のＣＴ−２６細胞を、また、右側腹部に５×１０４のＣＴ−２６細胞を接種した。よって、この試験では、各マウスは、右側腹部に１個、左側腹部に１個という２個の腫瘍を有した。マウスを、腫瘍サイズが右側腹部でおよそ１００ｍｍ３に達し、左側腹部腫瘍サイズが同等であった場合に、以下に示す１０群に無作為化した。単独および治療抗体と組み合わせた場合（組合せデータは示されていない）のＣＲＸ−６０１活性のアブスコパル効果を決定するために計画された試験において、ＣＲＸ−６０１を、ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム処方物を用いて、左側腹部腫瘍にのみ腫瘍内（ＩＴ）投与した。腫瘍サイズを右および左両方の側腹部腫瘍でモニタリングした。この試験の結果は、癌の処置のためにＣＲＸ−６０１単独を投与することの有効性を裏づけるエビデンスを提供する。
【０１８８】
群１：週１回、合計３用量で腫瘍内投与されるビヒクル（ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
群２  週１回、合計３用量で腫瘍内投与されるＣＲＸ−６０１  ２５μｇ／マウス（ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム中）＋週２回、合計６用量で腹腔内投与されるラットＩｇＧ１  ２５μｇ／マウス
【０１８９】
抗腫瘍活性を処置群に関して評価した（腫瘍成長阻害により経時的に測定）。いずれかまたは両方の腫瘍が２，０００ｍｍ３に達すればマウスを試験から除いた。試験によれば、初回投与の６０日後に、試験に残っていた全マウスが完全に無腫瘍であり、アブスコパル効果および生存の優位性が決定された。ＣＲＸ−６０１のアブスコパル効果は、左側腹部の局所的腫瘍ＩＴ注射が遠隔の右側腹部腫瘍の退縮をもたらした場合に認めた。図２８は、群２において、１０個体のマウスがリポソームＣＲＸ−６０１腫瘍内注射を受け、１０個体中２個体のマウス（マウス＃４およびマウス＃６）が処置された腫瘍部位で完全な腫瘍退縮を示し（濃いグレーの線）。マウス＃４およびマウス＃６は両方とも他の側腹部の処置されてない遠隔腫瘍にも完全な腫瘍退縮を示した（薄いグレーの線）ことを示し、このことは、ＣＲＸ−６０１のＩＴ注射がアブスコパル効果をもたらしたことを示唆した（図２８）。ＣＲＸ−６０１（リポソーム）ＩＴ注射は、対照群（ブランクリポソーム＋ラットＩｇＧ１  ＩＴ、群２、ｐ＝０．０１１、グラフは示されてない）に比べて有意な生存利益をもたらした。
【０１９０】
実施例１２  ＥＭＴ６同系腫瘍モデル
ＴＬＲ４アゴニスト（ＣＲＸ−６０１）のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、マウスＥＭＴ６乳房上皮同系固形腫瘍モデルにおいて、対照および抗ＰＤ−１処置に対する単剤療法として評価した。７〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ、Ｅｎｖｉｇｏ）をこれらの試験に使用した。マウスＥＭＴ６乳房上皮細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ロット番号ＣＲＬ−２７５５）を５％ＣＯ２の加湿、３７℃インキュベーターにて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ増殖培地中で培養した。対数増殖期の培養ＥＭＴ６細胞を組織培養フラスコから採取し、５分間、４℃にて４５０ｘｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットとした。上清をデカントし、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再び、５分間、４℃にて４５０ｘｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットとした。細胞をＦＢＳ不含の無菌ＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度に調整した。１００μｌの細胞株を皮下注射により各Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に移植した７日または９日後、平均腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達した際に、マウスを腫瘍サイズに従って試験コホートに無作為化し、初回処置用量を与えた。ＴＬＲ４アゴニスト（ＣＲＸ−６０１）またはビヒクルを週１回、合計３用量で全身静脈内投与により投与した。ＣＲＸ−６０１ビヒクルは、０．５％グリセロール／４％デキストロース、ｅＥ  ８１０１１５−Ｖであった。ラット抗マウスＰＤ−１受容体抗体（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ番号プライマーＢＥ０１４６、ロット番号５７９２−５９９０１６Ｊ１）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ番号ＢＥ００８９、ロット番号６０１４１６Ｍ１Ｂ）１日おきに合計３用量で与える腹腔内注射により投与し、初回用量は初回ＣＲＸ−６０１用量と同時に与えた。ノギス測定を週に３回行って腫瘍成長を評価し、２回の連続測定で＞２，０００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスまたは開放潰瘍を形成した腫瘍を有するマウスは試験から除いた。腫瘍体積は、式（０．５２）×（長さ）×（幅２）を用いて計算した。試験は総て、実験動物の管理、福祉および処置に関するＧＳＫポリシーに従って行い、ＧＳＫの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により審査されている。腫瘍成長阻害の有意性を決定するために、初回投与の１９日後の腫瘍体積を異なる処置群の間で比較した。処置を標準的ＡＮＯＶＡ法とその後の多重度に関するＦＤＲ補正により比較した。等分散性（等分散）のために応答は体積の平方根である。所与の時点で異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。これらの生存分析について、「死亡」は、腫瘍体積打ち切り（２０００ｍｍ３）を超えることを意味する。「生存率」は、「死亡」していないマウスの割合を意味し、「生存期間」は、「死亡」までの日数を意味する。マウスが２つの測定日の間で体積打ち切りを超えた場合は、「死亡」の日を線形補間により評価した。マウスが２回以上体積打ち切りを超えた場合は、最初に超えた際を使用した。処置は２処置の標準的ログランク検定により比較した。ログランクｐ値は、ＦＤＲ（偽陽性率）法を用いて多重度に関して補正した。有意性はＦＤＲ≦０．０５と定義した。計算およびグラフはＲソフトウエア、バージョン３．２．３を用いて行った。
【０１９１】
マウスコホートは次の通りであった。
群１：ビヒクル＋２００μｇラットＩｇＧ２ａ
群２：２５μｇ  ＣＲＸ−６０１＋２００μｇラットＩｇＧ２ａ
群３：ビヒクル＋２００μｇ抗ＰＤ−１
【０１９２】
静脈内投与を用い、ＥＭＴ６同系マウス腫瘍モデルにおいてＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１に関して抗腫瘍活性（腫瘍成長阻害により経時的に測定）を観察した。２５μｇ  ＣＲＸ−６０１を投与したマウスは、初回投与１９日後に、ビヒクル群１に比べて（＊＊ｐ値＜０．００１）、また、抗ＰＤ−１処置群３（＊ｐ値＝０．０４１）に比べて統計的に有意な腫瘍成長阻害を示した。結果を図２９に示す。抗ＰＤ−１処置は、初回投与１９日後に、ビヒクル群１に比べて統計的に有意な腫瘍成長阻害を示した（＊ｐ値＝０．０３）。
【０１９３】
この試験においてＴＬＲ４アゴニストＣＲＸ−６０１で処置したマウスはまた、生存期間にも統計的に有意な増大を示した。２５μｇ  ＣＲＸ−６０１を投与したマウスは、ＥＭＴ６腫瘍細胞接種３３日後までに、ビヒクル群１に比べて生存に統計的に有意な増大を示した（＊ｐ値＝０．０３）。この日において、２５μｇ  ＣＲＸ−６０１群から６個体のマウスが残っていた。４個体のマウスは無腫瘍であったが、２個体のマウスは６４９および３８２ｍｍ３の腫瘍体積を有していた。２００μｇ抗ＰＤ−１を投与したマウスは、ＥＭＴ６腫瘍細胞接種３３日後までに、ビヒクル群１に比べて生存に統計的に有意な（ｐ値＝０．１９９）増大を示した。この日において、抗ＰＤ−１群から５個体のマウスが試験に残っていた。３個体のマウスは無腫瘍であったが、２個体のマウスは１５１７および９１７ｍｍ３の腫瘍体積を有してした。結果を図３０に示す。
【図１】
2018522053.tif 000009
【図２】
2018522053.tif 000010
【図３】
2018522053.tif 000011
【図４】
2018522053.tif 000012
【図５】
2018522053.tif 000013
【図６】
2018522053.tif 000014
【図７】
2018522053.tif 000015
【図８】
2018522053.tif 000016
【図９】
2018522053.tif 000017
【図１０】
2018522053.tif 000018
【図１１】
2018522053.tif 000019
【図１２】
2018522053.tif 000020
【図１３】
2018522053.tif 000021
【図１４】
2018522053.tif 000022
【図１５】
2018522053.tif 000023
【図１６】
2018522053.tif 000024
【図１７】
2018522053.tif 000025
【図１８】
2018522053.tif 000026
【図１９】
2018522053.tif 000027
【図２０】
2018522053.tif 000028
【図２１】
2018522053.tif 000029
【図２２】
2018522053.tif 000030
【図２３】
2018522053.tif 000031
【図２４】
2018522053.tif 000032
【図２５】
2018522053.tif 000033
【図２６】
2018522053.tif 000034
【図２７】
2018522053.tif 000035
【図２８−１】
2018522053.tif 000036
【図２８−２】
2018522053.tif 000037
【図２９】
2018522053.tif 000038
【図３０】
2018522053.tif 000039
【国際調査報告】
2018522053.tif 000040
2018522053.tif 000041
2018522053.tif 000042
2018522053.tif 000043
2018522053.tif 000044
2018522053.tif 000045