(57)【要約】同じアデノウイルスベクターを用いた複数回のワクチン接種、およびアデノウイルスに対する既存の免疫を有する個体におけるワクチン接種を可能にするアデノウイルスベクターを使用してエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法が提供される。一局面において、エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスベクターを含む組成物が提供され、上記エボラウイルス抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して７０％〜１００％の配列同一性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスベクターを含む組成物であって、前記エボラウイルス抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して７０％〜１００％の配列同一性を有する、組成物。
【請求項２】
組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記組換え核酸ベクターが、複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、前記組成物がヒトに投与されると、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導することができ、前記免疫応答が細胞媒介性免疫を含む、組成物。
【請求項３】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記エボラウイルス抗原が、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
エボラウイルス抗原をコードする配列を含み、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を有する組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む組成物であって、前記エボラウイルス抗原が、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、組成物。
【請求項７】
前記エボラウイルス抗原が、２０、１５、１０、５、またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記エボラウイルス抗原が、２、３、または４アミノ酸の改変を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記エボラウイルス抗原が、１アミノ酸の改変を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記エボラウイルスが、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して１００％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組換え核酸ベクターが、トランスフェクトされた細胞において前記エボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組換え核酸ベクターが、ヒトにおいて前記エボラウイルス抗原を発現する細胞に対して基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍の特異的な免疫応答を誘導することができる、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ヒトが、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１７５超、または２００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
免疫原性成分をさらに含む、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３からなる群より選択されるサイトカインを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
０．８〜１．２ｍＬの範囲の体積の治療用溶液からなる組成物を含むバイアルであって、前記治療用溶液は、２．５〜７．５×１０１１個のウイルス粒子を含み、前記ウイルス粒子は、エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスを含む、バイアル。
【請求項３６】
組換え核酸ベクターが、トランスフェクトされた細胞において前記エボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる、請求項３５に記載のバイアル。
【請求項３７】
前記トランスフェクトされた細胞がＥ．Ｃ７細胞である、請求項３５または３６に記載のバイアル。
【請求項３８】
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、請求項３５から３７までのいずれか一項に記載のバイアル。
【請求項３９】
前記複製欠損性アデノウイルスが、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する特異的な免疫応答を誘導することができるタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項３５から３８までのいずれか一項に記載のバイアル。
【請求項４０】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４１】
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４２】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４３】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４４】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４５】
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４６】
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、請求項４５に記載のバイアル。
【請求項４７】
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、請求項３９に記載のバイアル。
【請求項４８】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、１．５×１０１１個、２．０×１０１１個、２．５×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む、請求項３５から４７までのいずれか一項に記載のバイアル。
【請求項４９】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む、請求項３５から４８までのいずれか一項に記載のバイアル。
【請求項５０】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５１】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５２】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５３】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５４】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５５】
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。
【請求項５６】
免疫原性成分をさらに含む、請求項３５から５５までのいずれか一項に記載のバイアル。
【請求項５７】
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む、請求項５６に記載のバイアル。
【請求項５８】
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、請求項５６に記載のバイアル。
【請求項５９】
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記ヒトに請求項１から３４までのいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項６０】
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記ヒトに請求項３５から５８までのいずれか一項に記載のバイアルの組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項６１】
前記投与するステップを少なくとも１回繰り返す、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記投与するステップを、前回の投与するステップの約３週間後に繰り返す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与するステップを、前回の投与するステップの約３カ月後に繰り返す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記投与するステップを２回繰り返す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、
（ａ）前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を投与するステップを含む処置の第１の相と、
（ｂ）その後の、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を投与するステップを含む処置の第２の相と
を含む、方法。
【請求項６６】
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記処置の第２の相の間に、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法。
【請求項６７】
ｎが１より大きい、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ｎが３である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ｍが１より大きい、請求項６６から６８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ｍが３である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の相が、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である、請求項６５から７０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２の相が、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である、請求項６５から７１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２の相を、第１の相の終了から３〜１６週間後に開始する、請求項６５から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１８日間離れている、請求項６５から７３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約２１日間離れている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大２４日間離れている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１０週間離れている、請求項６５から７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約１３週間離れている、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大１６週間離れている、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）処置の第１の相と第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップと
を含み、前記第２の相を、前記第１の相の終了から約３カ月後に開始する、処置方法。
【請求項８１】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原と同じものである、請求項５９から８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原とは異なるものである、請求項６５から８１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターと前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが同じものである、請求項６５から８２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、請求項６５から８３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、請求項６５から８４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６５から８５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６５から８６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、２５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む、請求項６５から８７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、２０、１５、１０、または５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、１アミノ酸の改変を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、請求項６５から９０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９１または９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９１から９３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、請求項６５から９４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９５または９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、請求項９５から９７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１、１．５×１０１１、２．０×１０１１、２．５×１０１１、３．０×１０１１、３．５×１０１１、４．０×１０１１、４．５×１０１１、４．８×１０１１、４．９×１０１１、４．９５×１０１１、または４．９９×１０１１個含む、請求項６５から９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１、６．５×１０１１、６．０×１０１１、５．５×１０１１、５．２×１０１１、５．１×１０１１、５．０５×１０１１、または５．０１×１０１１個含む、請求項６５から９９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍増大する、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、請求項５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
第１の複製欠損性アデノウイルスまたは第２の複製欠損性アデノウイルスが、前記ヒトにおいて樹状細胞に感染し、感染した前記樹状細胞が前記エボラウイルス抗原を提示し、それにより、前記免疫応答が誘導される、請求項５９から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記投与するステップが、皮下投与を含む、請求項５９から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ヒトが、前記投与するステップの前に、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、２００超、２２５超、２５０超、２７５超、または３００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、請求項５９から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、請求項５９から１１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ヒトが、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を同時に受けていない、請求項５９から１１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ヒトが、前記投与するステップの前に、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を受けていない、請求項５９から１２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ヒトが、自己免疫疾患を有さない、請求項５９から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ヒトが、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、またはＨＩＶを有さない、請求項５９から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ヒトが、自己免疫関連甲状腺疾患または白斑を有する、請求項５９から１２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を発現する細胞を有する、請求項５９から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を発現する細胞を有さない、請求項５９から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ヒトが、エボラウイルス感染の症状を少なくとも１つ、２つ、または３つ有する、請求項５９から１２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ヒトが、前記投与するステップの前に治療を受けている、請求項５９から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第１の相の前に、前記ヒトが、発熱、疲労、筋肉痛、頭痛および咽喉炎、嘔吐、下痢、皮疹、腎機能および肝機能障害、ならびに内出血および外出血などの特定の症状に対する、経口または静脈内輸液を用いた水分補給、血液製剤、免疫療法、薬物または治療からなる群より選択される少なくとも１つの薬物療法を受けている、請求項６５から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ヒトが、化学療法または放射線療法による処置を同時に受ける、請求項５９から１２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ヒトが、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、カペシタビン、マイトマイシン、レゴラフェニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアセチノフェンからなる群の少なくとも１つの薬物療法の施行を含む治療を同時に受ける、請求項５９から１３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞を含む、請求項５９から１３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、前記エボラウイルス抗原を、非感染細胞におけるエボラウイルス抗原のベースライン発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍過剰発現する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、エボラ感染細胞を含む、請求項１３２または１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、免疫細胞を含む、請求項１３２から１３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、血液細胞を含む、請求項１３２から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、上皮細胞を含む、請求項１３２から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記エボラウイルス抗原が、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する抗原である、請求項５９から１３７までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１５年１月９日に出願された米国仮出願第６２／１０１，９６８号に対する優先権（これは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）を主張する。
【０００２】
Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーであるエボラウイルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類における極めて致死性の高い出血熱の大流行と関連づけられる。ブンディブギョエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、およびスーダンエボラウイルスは全て、アフリカにおける広範な大流行に関連づけられている。西アフリカにおける現在のエボラ大流行の激烈さにより、日常的に診療を受けられないリスク集団のための、多くの株を網羅する長続きする圧縮的なエボラワクチンの医学的必要性が強調される。組換えアデノウイルスをベースとしたワクチンのいくつかでは、単回免疫後にエボラの複数の株からの良好な保護がもたらされたが、それらの有効性は、多くの場合、ヒトでは上記の通りアデノウイルスに対する既存の免疫によって損なわれる。
【０００３】
特に興味深いものは、ヒトにおいて広範囲にわたる安全性プロファイルをずっと維持しながら強固なＴ細胞媒介性免疫（Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ）（ＣＭＩ）応答を誘導するために繰り返し使用されているＡｄ５をベースとした免疫療法薬である。さらに、Ａｄ５ベクターは、確実に多量に製造することができ、また、保管および外来患者への投与のための送達に関して安定である。それにもかかわらず、既存の抗アデノウイルス５型中和抗体の発生頻度が高いことが、第１世代（Ｅ１欠失）のＡｄ５をベースとしたベクターの使用の主要な障害である。これらの抗体は、標的ＥＡに対する不十分な免疫賦活をもたらす以前の野生型アデノウイルス感染および／またはＡｄ５をベースとしたワクチンを用いた注射を繰り返すことによるアデノウイルス中和抗体の誘導のいずれかに起因して、潜在的なワクチン受容者中に存在する可能性がある。
【０００４】
アデノウイルスベクターに伴う主要な問題は、免疫コンピテントな被験体におけるアデノウイルスベクターおよびウイルスにより形質導入された細胞を排除する宿主免疫応答に主に起因して、それらが導入遺伝子発現を長期間持続させることができないことである。したがって、第１世代アデノウイルスベクターワクチンの使用は、アデノウイルス（Ａｄ）に対するワクチンの既存のまたは誘導された免疫によって重度に限定される（Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７７巻／７９９〜８０３頁（２００３年）；Ｃａｓｉｍｉｒｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７７巻／６３０５〜６３１３頁（２００３年））。１つのグループにより、多数のヒトが、遺伝子導入ベクターとして最も広く使用されている血清型であるアデノウイルス５型（Ａｄ５）に対する抗体を有すること、および試験されたヒトの３分の２がＡｄに対するリンパ球増殖性応答を有することが報告された（Ｃｈｉｒｍｕｌｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、６巻／１５７４〜１５８３頁（１９９９年））。別の研究では、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を有するアデノウイルスベクターワクチンでは、アジュバントを伴わないＤＮＡを使用して初回刺激された免疫応答を再免疫することができなかった（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７７巻／８７２９〜８７３５頁（２００３年））。別のグループにより、Ａｄ５を用いた単回免疫に起因してＡｄ５に対する既存の免疫を有する非ヒト霊長類は、ＨＩＶタンパク質に対する導入遺伝子に特異的な抗体を産生させること、ならびに全体的なＴ細胞応答を変化させることができないことが報告された（ＭｃＣｏｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、８１巻／６５９４〜６６０４頁（２００７年））。
【０００５】
既存の免疫がアデノウイルスベクターワクチンに干渉する多数の機構が存在するが、１つの主要な懸念は、中和抗体の存在、およびその後の、Ａｄ感染抗原を有する細胞の細胞媒介性免疫排除である。これらの応答は両方とも、いくつかのＡｄタンパク質に対するものであり得る。１つのアプローチは、ベクターワクチン用量を増加させることである。ワクチン用量を増加させることによりＡｄ免疫動物における所望の細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答の誘導を増大させることができる証拠があるが（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７７巻／８７２９〜８７３５頁（２００３年））、多くの場合、これにより、動物およびヒトにおいて許容されない有害作用が生じる。第１世代Ａｄ５ベクターワクチンを使用する場合、１つの選択肢は、初回刺激ワクチン接種として裸の（非ベクター化）ＤＮＡ、その後、Ａｄ５ベクターによる免疫を使用した異種初回刺激−追加刺激レジメンのアプローチを使用することである。このプロトコールでは、その後のＡｄ５に対する免疫応答が生じる可能性があり、したがって、同じウイルス骨格を利用する同じ（または異なる）アデノウイルスベクターワクチンを用いたさらなる再免疫（追加刺激）を施行することができない。したがって、現行の第１世代のＡｄ５ベクターを用いると、このアプローチの使用により、Ａｄ５により免疫された、ワクチン接種を受けた人におけるＡｄ５ベクターによる免疫のさらなる使用が抑止される可能性がある。
【０００６】
第１世代（Ｅ１欠失）アデノウイルスベクターワクチンは、レベルは低下しているがＡｄ後期遺伝子を発現し、これは野生型Ａｄウイルスよりも長い期間にわたる（Ｎｅｖｉｎｓら、Ｃｅｌｌ、２６巻／２１３〜２２０頁（１９８１年）；Ｇａｙｎｏｒら、Ｃｅｌｌ、３３巻／６８３〜６９３頁（１９８３年）；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７０巻／７２０９〜７２１２頁（１９９６年））。第１世代アデノウイルスベクターを免疫に使用する場合、ワクチン抗原は、免疫原性が高いＡｄカプシドタンパク質と同時に免疫系に提示される。これらのアデノウイルスベクターに伴う主要な問題は、生じる免疫応答が所望のワクチンエピトープに対するものである可能性が低く（ＭｃＭｉｃｈａｅｌら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２巻／２８３〜２９１頁（２００２年））、アデノウイルス由来の抗原に対するものである可能性がより高いこと、すなわち、抗原性の競合である。第１世代アデノウイルスベクターが強力な免疫原になる機構に関しては論争がある。Ａｄカプシドの組成またはウイルス遺伝子の毒性作用により、全身性の炎症が生じ、その結果、非特異的な免疫賦活性効果が生じるという仮説が立てられている。ＡｄのＥ１タンパク質は、感染後の炎症を阻害するように作用する（Ｓｃｈａａｃｋら、ＰＮＡＳ、１０１巻／３１２４〜３１２９頁（２００４年））。これらのタンパク質に関する遺伝子セグメントを除去すると、第１世代アデノウイルスベクターの場合、炎症のレベルが上昇する（Ｓｃｈａａｃｋら、ＰＮＡＳ、１０１巻／３１２４〜３１２９頁（２００４年）；Ｓｃｈａａｃｋら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻／７９〜８８頁（２００５年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈａａｃｋら、ＰＮＡＳ（２００４年）１０１巻／３１２４〜３１２９頁
【非特許文献２】Ｓｃｈａａｃｋら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５年）１８巻／７９〜８８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、より有効なエボラワクチンベクター候補が依然として必要とされていることが明らかである。長期間にわたる免疫応答、複数回のワクチン接種、およびＡｄに対する既存の免疫を有する個体におけるワクチン接種を可能にするＡｄワクチンベクター。本発明はこの利点および他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、標的抗原、特に、エボラ細胞に関連する抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法およびアデノウイルスベクターに関する。したがって本発明は、１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそれらの断片またはバリアントをコードする核酸配列をさらに提供する。したがって本発明は、本明細書にさらに記載されている任意の供給源に由来する標的抗原をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、および、そのような発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１０】
抗Ａｄ免疫を克服するための試みは、代替Ａｄ血清型および／またはＡｄ５ウイルスカプシドタンパク質の交替の使用を含むものであり、どちらも成功は限られており、また、得られるワクチンの体内分布を大きく変化させる潜在性を伴う。したがって、既存のＡｄ免疫の標的であることが公知のタンパク質である、Ｅ１欠失Ａｄ５ベクター由来のウイルスタンパク質の発現をさらに低下させることにより、完全に新規のアプローチを試みた。詳細には、初期１（Ｅ１）遺伝子領域の欠失および初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子領域の追加的な欠失を伴う新規の組換え型Ａｄ５プラットフォームが記載されている（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）。Ｅ２ｂ領域（ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体（ｐｒｅ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする）の欠失により、ウイルスＤＮＡ複製および後期ウイルスタンパク質発現が低下する。このベクタープラットフォームにより、がんおよび感染症の動物モデルにおいてＣＭＩ応答が首尾よく誘導されることが以前に報告されており、また、より重要なことに、この組換え型Ａｄ５遺伝子送達プラットフォームは、Ａｄ５免疫の障壁を克服するものであり、既存のＡｄ免疫および／またはベクターにより誘導されるＡｄ免疫の状況下で使用することができ、したがって、ワクチンの複数回の同種投与を可能にするものである。
【００１１】
本開示は、個体における１つまたは複数のエボラ抗原に対する免疫応答を生じさせるための組成物、方法およびキットを提供する。エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスベクターを含む組成物であって、エボラウイルス抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して７０％〜１００％の配列同一性を有する、組成物。
【００１２】
一態様では、組換え核酸ベクターを含む組成物であって、組換え核酸ベクターが、複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、組成物がヒトに投与されると、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導することができ、免疫応答が細胞媒介性免疫を含む、組成物が提供される。
【００１３】
一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む。
【００１４】
一態様では、エボラウイルス抗原をコードする配列を含み、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を有する組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む組成物であって、エボラウイルス抗原が、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、組成物が提供される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、２０、１５、１０、５、またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、２、３、または４アミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、１アミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、エボラウイルスは、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して１００％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、組換え核酸ベクターは、トランスフェクトされた細胞においてエボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、組換え核酸ベクターは、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対して基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍の特異的な免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、ヒトは、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１７５超、または２００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される。一部の実施形態では、組成物は、免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３からなる群より選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される。
【００１５】
一態様では、エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスを含むウイルス粒子を２．５〜７．５×１０１１個含む０．８〜１．２ｍＬの範囲の体積の治療用溶液からなる組成物を含むバイアルが提供される。
【００１６】
一部の実施形態では、組換え核酸ベクターは、トランスフェクトされた細胞においてエボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、トランスフェクトされた細胞はＥ．Ｃ７細胞である。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスは、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する特異的な免疫応答を誘導することができるタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、１．５×１０１１個、２．０×１０１１個、２．５×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、バイアルは、免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＦＮ−γ、��ＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される。
【００１７】
一態様では、ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトに本明細書に記載の組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【００１８】
一態様では、ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトに本明細書に記載のバイアルの組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【００１９】
一部の実施形態では、投与するステップを少なくとも１回繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを、前回の投与するステップの約３週間後に繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを、前回の投与するステップの約３カ月後に繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを２回繰り返す。
【００２０】
一態様では、ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を投与するステップを含む処置の第１の相と、その後の、ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を投与するステップを含む処置の第２の相とを含む方法が提供される。
【００２１】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、処置の第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップとを含む処置方法が提供される。
【００２２】
一部の実施形態では、ｎは１より大きい。一部の実施形態では、ｎは３である。一部の実施形態では、ｍは１より大きい。一部の実施形態では、ｍは３である。一部の実施形態では、第１の相は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である。一部の実施形態では、第２の相は、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である。一部の実施形態では、第２の相を、第１の相の終了から３〜１６週間後に開始する。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は少なくとも１８日間離れている。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は約２１日間離れている。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は最大２４日間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は少なくとも１０週間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は約１３週間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は最大１６週間離れている。
【００２３】
一態様では、処置の第１の相と第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップとを含み、第２の相を、第１の相の終了から約３カ月後に開始する、処置方法が提供される。
【００２４】
一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原は、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原と同じものである。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原は、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原とは異なるものである。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターと第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは同じものである。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原は、２５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原は、２０、１５、１０、または５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原は、１アミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、１．５×１０１１個、２．０×１０１１個、２．５×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原に対する免疫応答は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍増大する。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスまたは第２の複製欠損性アデノウイルスは、ヒトにおいて樹状細胞に感染し、感染した樹状細胞はエボラウイルス抗原を提示し、それにより、免疫応答が誘導される。一部の実施形態では、投与するステップは、皮下投与を含む。一部の実施形態では、ヒトは、投与するステップの前に、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、２００超、２２５超、２５０超、２７５超、または３００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５���０超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を同時に受けていない。一部の実施形態では、ヒトは、投与するステップの前に、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を受けていない。一部の実施形態では、ヒトは、自己免疫疾患を有さない。一部の実施形態では、ヒトは、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、またはＨＩＶを有さない。一部の実施形態では、ヒトは、自己免疫関連甲状腺疾患または白斑を有する。一部の実施形態では、ヒトは、エボラウイルス抗原を発現する細胞を有する。一部の実施形態では、ヒトは、エボラウイルス抗原を発現する細胞を有さない。一部の実施形態では、ヒトは、エボラウイルス感染の症状を少なくとも１つ、２つ、または３つ有する。一部の実施形態では、ヒトは、投与するステップの前に治療を受けている。一部の実施形態では、第１の相の前に、ヒトは、発熱、疲労、筋肉痛、頭痛および咽喉炎、嘔吐、下痢、皮疹、腎機能および肝機能障害、ならびに内出血および外出血などの特定の症状に対する、経口または静脈内輸液を用いた水分補給（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、血液製剤、免疫療法、薬物または治療からなる群より選択される少なくとも１つの薬物療法を受けている。一部の実施形態では、ヒトは、化学療法または放射線療法による処置を同時に受ける。一部の実施形態では、ヒトは、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｎａｂ）、カペシタビン、マイトマイシン、レゴラフェニブ、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｎａｂ）、パニツムマブ、およびアセチノフェン（ａｃｅｔｉｎｏｐｈｅｎ）からなる群の少なくとも１つの薬物療法の施行を含む治療を同時に受ける。一部の実施形態では、ヒトは、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞は、エボラウイルス抗原を、非感染細胞におけるエボラウイルス抗原のベースライン発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍過剰発現する。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞は、エボラ感染細胞を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞は、免疫細胞を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞は、血液細胞を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞は、上皮細胞を含む。一部の実施形態では、エボラウイルス抗原は、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する抗原である。
【００２５】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）で免疫したマウスからの抗体レベルを示す棒グラフを例示する。マウスは、Ａｄ５−ヌルウイルス粒子（ＶＰ）により１４日間隔で３回免疫した。抗Ａｄ抗体（中和抗体）レベルは、各免疫の後に増加した。
【００２７】
【図２】図２は、Ａｄ５−ヌルで免疫したマウスからの中和抗体（ＮＡｂ）レベルを示す棒グラフを例示する。マウスは、Ａｄ５−ヌルＶＰにより１４日間隔で３回免疫した。中和抗体レベルは、各免疫の後に増加した。光学濃度読取値は、生存能力のある標的細胞の存在を示す。
【００２８】
【図３】図３は、エボラウイルスゲノムの１つの構造を例示する。
【００２９】
【図４】図４は、Ｈｅｌａ細胞でのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターによる後期遺伝子の発現の欠如を例示する。Ｈｅｌａ細胞に、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＬａｃＺまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＬａｃＺベクターを感染させた。タンパク質溶解物を収集し、６６ｋＤのファイバータンパク質をウエスタンブロッティングによって検出した。陽性対照として、相補細胞株で増殖させたＡｄウイルスの生産的感染からのタンパク質溶解物の一部が含まれる。
【００３０】
【図５】図５は、ワクチン接種マウスおよび食塩水またはＡｄ５−ヌルを注射した対照マウスでの生存を例示する。
【００３１】
【図６】図６は、ワクチン接種マウス（上）または対照マウス（下）を例示する。対照マウスでは広範な炎症があるが、チャレンジの後のワクチン接種マウスでは広範な炎症はなかったことに留意する。
【００３２】
【図７】図７は、赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）力価がＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＡによる１回のワクチン接種の後にＡｄ５免疫サルで誘導されたことを例示する。ＨＡＩ活性が免疫の１４日後に検出され、２８日目までに１４日目のレベルを上回って有意に増加したことに留意する（Ｐ＜０．０１）。平均±ＳＥＭ。
【００３３】
【図８】図８は、生成された４つのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡをベースとしたワクチンを例示する。
【００３４】
【図９】図９は、Ａｄ５［Ｅ１、Ｅｂ２−］−ＧＰＥＺに２４時間感染させたＥ．Ｃ７細胞からのエボラＧＰの発現を例示する（左レーン）。概ね１２５ｋＤＡで泳動されるＧＰタンパク質バンドが左レーンに存在するが、右レーン（非感染細胞からの溶解物）では存在しなかったことに留意する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
以下の節に本発明の種々の態様をより詳細に記載する。本発明の各態様は、相反することが明確に示されていない限り、本発明の任意の他の態様（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴を、好ましいまたは有利であると示されている特徴のうちの任意の他の特徴と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「１つの（ａ）」という冠詞は、別段明確な定めがない限り、１つまたは複数を意味する。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「または（ｏｒ）」という用語は、接続的でも離接的でもあり得る。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、任意の実施形態を任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００３６】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも安全であるだけでなく、抗原特異的免疫応答の誘導に関してＡｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも優れていると思われることが発見されており、それにより、臨床応答をもたらすことができるエボラワクチンを送達するためのプラットフォームとしてはるかに適したものになる。他の場合では、免疫誘導には数カ月かかる可能性がある。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも安全であるだけでなく、抗原特異的免疫応答の誘導に関してＡｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも優れていると思われ、それにより、臨床応答をもたらすことができるエボラワクチンを送達するためのプラットフォームとしてはるかに適したものになる。
【００３７】
本発明の種々の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたエボラに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。本発明の他の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたエボラに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。本発明の他の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたエボラに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。
【００３８】
「アデノウイルス」（Ａｄ）とは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来する、エンベロープを有さないＤＮＡウイルスを指す。これらのウイルスは、これらに限定されないが、ヒト、トリ、ウシ、ブタおよびイヌの種において見いだすことができる。本発明は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科の４つの属（例えば、Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓおよびＳｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）のいずれかに由来する任意のＡｄの、Ｅ２ｂ欠失ウイルスベクター、または本明細書に記載されている他の欠失を含有するベクターの基礎としての使用を意図している。さらに、それぞれの種にいくつかの血清型が見いだされる。Ａｄはまた、これだけに限定されないが、遺伝子変異、欠失または転位を含めた、これらのウイルス血清型のいずれかの遺伝学的派生物に関する。
【００３９】
「ヘルパーアデノウイルス」または「ヘルパーウイルス」とは、特定の宿主細胞がなすことができないウイルスの機能をもたらすことができるＡｄを指す（宿主によりＥ１タンパク質などのＡｄ遺伝子産物がもたらされ得る）。このウイルスは、第２のウイルス、またはヘルパー依存性ウイルス（例えば、ｇｕｔｔｅｄまたはｇｕｔｌｅｓｓウイルス、またはＥ２ｂまたは本明細書に記載されている他の領域などの特定の領域が欠失したウイルス）では欠如している機能（例えば、タンパク質）をトランスにもたらすために使用される。第１の複製不能ウイルスは、第２のヘルパー依存性ウイルスを「助け」、それにより、細胞における第２のウイルスのゲノムの産生を可能にするといえる。
【００４０】
「アデノウイルス５型ヌル（Ａｄ５−ヌル）」とは、発現のためのいかなる異種核酸配列も含有しない非複製性Ａｄを指す。
【００４１】
「第１世代アデノウイルス」とは、初期領域１（Ｅ１）を欠失させたＡｄを指す。追加的な場合では、初期領域３（Ｅ３）も欠失させることができる。
【００４２】
「ｇｕｔｔｅｄ」または「ｇｕｔｌｅｓｓ」とは、ウイルスのコード領域を全て欠失させたＡｄベクターを指す。
【００４３】
「トランスフェクション」とは、真核細胞への外来核酸の導入を指す。トランスフェクションの例示的な手段としては、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔、微量注射、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃が挙げられる。
【００４４】
「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡが導入され組み込まれたことを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡが安定に組み込まれた細胞を指す。
【００４５】
「レポーター遺伝子」とは、レポーター分子（例えば、酵素）をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」は、これだけに限定されないが、酵素に基づく検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射性系、および発光系を含めた種々の検出系のいずれかで検出可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子；および他のレポーター遺伝子を使用することができる。
【００４６】
「異種配列」とは、天然ではライゲーションしていない、または天然では異なる位置でライゲーションしている核酸配列とライゲーションされる、またはライゲーションするように操作されるヌクレオチド配列を指す。異種核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列または天然に存在する配列に対するいくらかの改変を含み得る。
【００４７】
「導入遺伝子」とは、被験体の細胞またはゲノムに導入された天然の核酸配列または異種核酸配列または融合した相同な核酸配列または異種核酸配列のいずれかの任意の遺伝子コード領域を指す。導入遺伝子は、被験体の細胞に導入遺伝子を導入するために使用される任意のウイルスベクターに保有させることができる。
【００４８】
「第２世代アデノウイルス」とは、ウイルスからＥ１、Ｅ２、Ｅ３、および、ある特定の実施形態では、Ｅ４  ＤＮＡ遺伝子配列の全部または一部を欠失させた（除去した）Ａｄを指す。
【００４９】
「被験体」とは、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルまたは他の型のマカク）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび家禽を含めた任意の動物を指す。
【００５０】
「免疫原性断片」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞表面抗原受容体により特異的に認識され（すなわち、それと特異的に結合し）、その結果、断片を対して特異的である免疫応答を生じさせるポリペプチドの断片を指す。
【００５１】
「標的抗原」または「標的タンパク質」とは、免疫応答がそれに対するものであるタンパク質などの分子を指す。
【００５２】
「Ｅ２ｂ欠失」とは、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるように変異させたＤＮＡ配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」は、Ａｄゲノムから欠失（除去）させる特定のＤＮＡ配列と関連して使用される。Ｅ２ｂ欠失または「Ｅ２ｂ領域内に欠失を含有する」とは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、ある特定の実施形態では、１つ超の塩基対が欠失しており、さらなる実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対が欠失している。別の実施形態では、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対が欠失している。Ｅ２ｂ欠失は、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現および／または機能を妨げる欠失であってよく、したがって、Ｅ２ｂ特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｂ欠失は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ２ｂ領域の末端タンパク質前駆体の一方またはその両方の発現および／または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」とは、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるような、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列の１つまたは複数の点変異を指す。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。
【００５３】
「Ｅ１欠失」とは、少なくとも１つのＥ１遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるように変異させたＤＮＡ配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、「Ｅ１欠失」は、Ａｄゲノムから欠失（除去）させる特定のＤＮＡ配列と関連して使用される。Ｅ１欠失または「Ｅ１領域内の欠失を含有する」とは、ＡｄゲノムのＥ１領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、ある特定の実施形態では、１つ超の塩基対が欠失しており、さらなる実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対が欠失している。別の実施形態では、ＡｄゲノムのＥ１領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対が欠失している。Ｅ１欠失は、少なくとも１つのＥ１遺伝子産物の発現および／または機能を妨げる欠失であってよく、したがって、Ｅ１特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、Ｅ１欠失は、Ｅ１領域のトランス作用性転写調節因子の一方または両方の発現および／または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態では、「Ｅ１欠失」とは、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるようなＡｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列の１つまたは複数の点変異を指す。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。
【００５４】
「免疫応答を生じさせる（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「免疫応答を誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、１つもしくは複数の免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など）の数またはこれらの免疫細胞の１つもしくは複数の活性（ＣＴＬ活性、ＨＴＬ活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌のプロファイルの変化など）の統計的に有意な変化、例えば、増大または低下を指す。
【００５５】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では基本的に互換的に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含み得る。必ずしもではないが、追加的なコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してよく、また、必ずしもではないが、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料と連結していてよい。単離されたポリヌクレオチドとは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離されたＤＮＡ分子は、本明細書で使用される場合、大きな染色体断片または他の機能的な遺伝子もしくはポリペプチドコード領域などの無関係のコードＤＮＡの大部分を含有しない。これは、もともと単離されたＤＮＡ分子を指し、後で実験室において組換えによってセグメントに付加された遺伝子またはコード領域は排除されない。
【００５６】
当業者には理解される通り、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている標的抗原、抗原の断片、ペプチドなどを発現する、またはそれを発現するように適合させることができるゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドによりコードされる配列、ならびに、より小さな工学的に操作された遺伝子セグメントを含み得る。そのようなセグメントは、天然に単離されたものであってもよく、人間の手によって合成的に改変されたものであってもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通り、最大の対応でアラインメントした場合に２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じであれば、２つの配列は「同一」である。２つの配列間の比較は、一般には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、局所的な配列の領域類似性を同定し、比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０、通常３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントを指し、ここで、配列は、連続した位置の数が同じ参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、初期パラメータを使用して行うことができる。このプログラムにより、いくつかのアラインメントスキームが具体化される。
【００５８】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行うことができる。
【００５９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、例えば、本明細書に記載されているパラメータを用いて、本発明のポリヌクレオチドについてのパーセント配列同一性を決定するために使用することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。例示的な一例では、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア（ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）；常に０未満）を使用して累積スコアを算出することができる。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ減少した時；１つまたは複数の負スコア残基（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ）アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロまたはそれ未満になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に各方向へのワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）の伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸにより、アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラムでは、初期値としてワード長（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）１１、および期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を使用する。
【００６０】
「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０の位置の比較のウインドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定することができ、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、両方の配列内に同一の核酸塩基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出する。
【００６１】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されている特定の目的の抗原またはその断片をコードするヌクレオチド配列が多く存在することが当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明により具体的に意図されている。さらに、本発明で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内に入る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変化する内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、構造または機能が変化している。対立遺伝子は、標準の技法（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
【００６２】
本開示を読めば当業者には理解される通り、Ａｄゲノムの他の領域を欠失させることができる。したがって、Ａｄゲノムの特定の領域の「欠失」とは、本明細書で使用される場合、その領域によりコードされる少なくとも１つの遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるように変異させた特定のＤＮＡ配列を指す。ある特定の実施形態では、特定の領域の「欠失」とは、その領域によりコードされる発現および／または機能（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端タンパク質前駆体機能であるＥ２ｂ機能）が妨げられるようにＡｄゲノムから欠失させた（除去した）特定のＤＮＡ配列を指す。特定の領域内の「欠失」または「欠失を含有する」とは、Ａｄゲノムのその領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、ある特定の実施形態では、１つ超の塩基対が欠失しており、さらなる実施形態では、特定の領域から少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対が欠失している。別の実施形態では、欠失は、Ａｄゲノムの特定の領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対である。これらの欠失は、その領域によりコードされる遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるようなものである。したがって、欠失は、タンパク質のエクソンコード部分内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。さらなる実施形態では、Ａｄゲノムの特定の領域の「欠失」とは、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるような、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列の１つまたは複数の点変異を指す。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。Ａｄゲノム内の欠失または変異は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ＴＰ、ＰＯＬ、ＩＶ、およびＶＡ領域のうちの１つまたは複数におけるものであり得る。本発明の欠失アデノウイルスベクターは、組換え技法を使用して生成することができる。
【００６３】
当業者には理解される通り、本発明において使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子産物、および、欠失している可能性がある、必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して、高力価まで首尾よく成長させることができる。ある特定の実施形態では、Ｅ１およびＤＮＡポリメラーゼタンパク質だけでなく、Ａｄ−末端タンパク質前駆体も構成的に発現するＨＥＫ−２９３由来の細胞を使用することができる。一実施形態では、アデノウイルスベクターの高力価ストックを首尾よく成長させるために、Ｅ．Ｃ７細胞を使用する。
【００６４】
自己繁殖性アデノウイルスベクターから重大な遺伝子を欠失させるために、標的とされる遺伝子によりコードされるタンパク質をまずＨＥＫ−２９３細胞または同様の細胞において、Ｅ１タンパク質と同時発現させることができる。例えば、構成的に同時発現させた場合に無毒性であるタンパク質（または誘導的に発現される毒性のタンパク質）のみを選択的に利用することができる。ＨＥＫ−２９３細胞におけるＥ１遺伝子とＥ４遺伝子の同時発現が可能である。Ｅ１遺伝子と、ビリオン構造タンパク質であるタンパク質ＩＸ遺伝子を同時発現させることができる。Ｅ１遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびタンパク質ＩＸ遺伝子のさらなる同時発現も可能である。Ｅ１遺伝子および１００ｋ遺伝子は、Ｅ１遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子で可能なのと同様に、トランス相補性細胞株において首尾よく発現させることができる。
【００６５】
高力価のＥ２ｂ欠失Ａｄ粒子の成長において使用するための、Ｅ１遺伝子産物とＥ２ｂ遺伝子産物を同時発現する細胞株が記載されている。Ｅ２ｂ領域は、Ａｄゲノム複製のために不可欠であるウイルス複製タンパク質をコードする。有用な細胞株は、およそ１４０ｋＤａのＡｄ−ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはおよそ９０ｋＤａの末端タンパク質前駆体を構成的に発現する。特に、毒性を伴わずに、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体を高レベルで構成的に同時発現する細胞株（例えば、Ｅ．Ｃ７）が、複数回のワクチン接種において使用するためのＡｄの繁殖に使用するのに望ましい。これらの細胞株により、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。
【００６６】
ウイルス送達系に関するさらなる情報は、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：３１７〜３２１頁、１９８９年；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、５６９巻：８６〜１０３頁、１９８９年；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻：１７〜２１頁、１９９０年；米国特許第４，６０３，１１２号、４，７６９，３３０号、および５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６〜６２７頁、１９８８年；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：４３１〜４３４頁、１９９１年；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：２１５〜２１９頁、１９９４年；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：１１４９８〜１１５０２頁、１９９３年；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８８巻：２８３８〜２８４８頁、１９９３年；およびＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．、７３巻：１２０２〜１２０７頁、１９９３年に見いだすことができる。
【００６７】
異種核酸
本発明のアデノウイルスベクターは、一般には、それに対する免疫応答を生じさせることが望まれる１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそのバリアント、断片もしくは融合物をコードする改変または異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、免疫応答を調節することができる１つまたは複数のタンパク質、そのバリアント、その融合物またはその断片をコードする改変または異種核酸配列を含む。本発明のさらなる実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、炭疽防御抗原などの特定の抗原に対する１つまたは複数の抗体をコードし、受動免疫療法を可能にするものである。ある特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、治療効果（例えば、抗ウイルス機能、抗細菌機能、駆虫機能、または抗エボラ機能）を有する１つまたは複数のタンパク質をコードする改変または異種核酸配列を含む。したがって、本発明は、異種核酸配列を含む第２世代Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、改変または異種核酸配列は、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、そのバリアント、その断片、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、改変または異種核酸配列は、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、そのバリアント、その断片、またはこれらの組み合わせの組み合わせまたは融合である。一部の実施形態では、改変または異種核酸配列は、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、そのバリアント、その断片、またはこれらの組み合わせの組み合わせまたは融合である。
【００６８】
特に、本発明は、１つまたは複数の抗原性標的実体に対する複数回のワクチン接種を達成することができるように改善された、アデノウイルス（Ａｄ）をベースとしたワクチンを提供する。一部の実施形態では、改善されたアデノウイルス（Ａｄ）をベースとしたワクチンは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号２、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号４、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号６などの標的抗原、その断片、バリアントまたはバリアント断片を担持する複製欠損性アデノウイルスを含む。一部の実施形態では、改善されたアデノウイルス（Ａｄ）をベースとしたワクチンは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４などの標的抗原、その断片、バリアントまたはバリアント断片を担持する複製欠損性アデノウイルスを含む。標的抗原、例えば、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原のバリアントおよび／または断片、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、またはＶＰ２４などを、免疫原性の潜在性を含めた種々の因子に基づいて選択することができる。したがって、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原の変異体、例えば、ＧＰ抗原、ＮＰ抗原、ＶＰ４０抗原、ＶＰ３５抗原、ＶＰ３０抗原、またはＶＰ２４抗原の変異体は、野生型形態と比較して免疫応答を生じさせる能力が増大しているので、これを本発明の種々の実施形態において利用する。重要なことに、ワクチン接種は、Ａｄに対する既存の免疫の存在下で実施すること、および／または、以前に本発明のアデノウイルスベクターまたは他のアデノウイルスベクターを用いた免疫を複数回受けた被験体に投与することができる。本発明のアデノウイルスベクターは、これだけに限定されないが、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、もしくはＲＥＳＴＶ、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、もしくはＶＰ２４など、および／または、本明細書に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋにおいて公的に入手可能な１つもしくは複数のエボラウイルス株の１つもしくは複数の標的抗原に対する抗体の産生および細胞媒介性免疫応答を含めた、目的の抗原、例えば、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、またはＶＰ２４などに対する免疫応答を誘導するために、被験体に複数回投与することができる。
【００６９】
免疫原性ポリペプチドは、エボラザイール（Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ６６０３４７．２）またはその断片に由来するＲＮＡ配列であってよい。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有するヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号１からヒトゲノムに対して最適化された代替コドンによる置き換えにより生じる配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ＧｅｎＢａｎｋ配列（Ｚａｉｒｅ  ＫＪ６６０３４７）と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【００７１】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号２からヒトゲノムに対して最適化された代替コドンによる置き換えにより生じる配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ＧｅｎＢａｎｋ配列（Ｓｕｄａｎ  ＫＣ５４５３９２．１）と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【００７２】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号４の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号４からヒトゲノムに対して最適化された代替コドンによる置き換えにより生じる配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ＮＣＢＩ配列（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ＮＣ＿０１４３７２．１）と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【００７３】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号５の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列は、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号５からヒトゲノムに対して最適化された代替コドンによる置き換えにより生じる配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ＮＣＢＩ配列ブンディブギョエボラウイルス（ＮＣ＿０１４３７３．１）と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【００７４】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号６の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする配列は、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号６からヒトゲノムに対して最適化された代替コドンによる置き換えにより生じる配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型Ｒｅｓｔｏｎエボラウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＸ４７７１６６．１）と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【００７５】
種々の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルス由来ベクターは、Ｅ２ｂ領域、および場合によってＥ１領域の欠失を有し、当該欠失により、本明細書に記載されている通り免疫療法におけるベクターの使用に種々の利点が付与される。
【００７６】
アデノウイルスゲノム内のある特定の領域は、必須の機能を果たすものであり、本発明の複製欠損性アデノウイルスベクターを構築する際に実質的に保存される必要があり得る（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８５巻、２６１５〜２６２５頁（２００４年））；Ｌｅｚａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３００３〜３０１３頁（１９８８年）；およびＭｉｒａｌｌｅｓら、ＪＢＣ．、２６４巻、１８号、１０７６３〜１０７７２頁（１９８３年）を参照されたい）。
【００７７】
第１世代Ｅ１欠失アデノウイルス亜型５（Ａｄ５）をベースとしたベクターは、ワクチンとして使用するための有望なプラットフォームではあるが、天然に存在するまたは誘導されたＡｄ特異的中和抗体によって活性が妨害される。Ｅ１領域、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードするＥ２ｂ領域の欠失を伴うＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）では、後期ウイルスタンパク質発現が低減することにより、Ａｄ免疫宿主において、免疫学的クリアランスが回避され、コードされる抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答が誘導される機会がもたらされる。
【００７８】
エボラ抗原をコードするＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡを用いた複数回の同種免疫を本発明に従って使用して、マウスにおいて、既存のまたは誘導されたＡｄ５中和抗体が存在するにもかかわらず、抗エボラ活性を伴うＥＡに特異的な細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を誘導することができる。エボラを有する患者のコホートを、漸増用量のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡを用いて免疫することができる。多くのまたは大多数の患者において、既存のＡｄ５免疫が存在するにもかかわらず、ＥＡ特異的ＣＭＩ応答が観察され得る。重要なことに、最小の毒性、および患者全生存は、既存のＡｄ５中和抗体力価にかかわらず同様であり得る。エボラに感染した被験体において、新規のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］遺伝子送達プラットフォームを使用して、Ａｄ５特異的免疫が自然に獲得された状況と免疫により誘導された状況のどちらにおいても、エボラ抗原に対する有意なＣＭＩ応答を生じさせることができる。エボラ抗原特異的ＣＭＩは、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、１０超、２０超、３０超、４０超、５０超、１００超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、５０００超、１００００超、またはそれ超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）であり得る。したがって、本発明の方法および組成物は、組換え核酸ベクターに関し、ここで、組換え核酸ベクターは、複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、また、ヒトに投与されると、組成物により、前記ヒトにおいてエボラ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導することが可能である。免疫応答は、Ａｄ５に対する既存の免疫の存在下でさえも誘導することができる。一部の実施形態では、免疫応答は、既存のＡｄ５中和抗体力価の逆数が５０超、１００超、１５０超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、５０００超、６０００超、７０００超、８０００超、９０００超、１０００超、１２０００超、１５０００超またはそれ超であるヒト被験体において生じる。免疫応答は、本明細書に記載されている通り細胞媒介性免疫および／または体液性免疫を含み得る。免疫応答は、本明細書に記載されている通り、および当業者が利用可能である限りでは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、クロムの放出または等価のアッセイを含めた細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、およびさまざまなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用した遺伝子発現解析のうちの１つまたは複数、ならびに、免疫応答を測定するための当技術分野で公知の任意の他の適切なアッセイによって測定することができる。
【００７９】
エボラ関連抗原（ＥＡ）を送達することによって達成されるエボラ免疫療法により、いくらかの生存利益がもたらされるが、これらの戦略には限界があり、免疫学的により強力なワクチンが必要とされている。免疫原性が低いことに対処するために、アジュバントと免疫賦活性サイトカインの同時投与を含めた、種々の進歩した多成分ワクチン接種戦略が提供される。本発明は、生得的な炎症促進性シグナルを本質的にもたらす一方で、目的の抗原を発現するように同時に工学的に操作された組換え型ウイルスベクターに関する。ヒトにおいて広範囲にわたる安全性プロファイルをずっと維持しながら強固なＴ細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を誘導するために繰り返し使用されているアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）をベースとした免疫療法薬が特に興味深い。さらに、Ａｄ５ベクターは、確実に多量に製造することができ、また、保管および外来患者への投与のための送達に関して安定である。それにもかかわらず、第１世代（Ｅ１欠失）のＡｄ５をベースとしたベクターの使用の主要な障害は、既存の抗アデノウイルス５型中和抗体の発生頻度が高いことである。これらの抗体は、標的ＥＡに対する不十分な免疫賦活をそれぞれもたらす以前の野生型アデノウイルス感染および／またはＡｄ５をベースとしたワクチンを用いた注射を繰り返すことによるアデノウイルス中和抗体の誘導に起因して、潜在的なワクチン接種を受けた人に存在する可能性がある。
【００８０】
本明細書では、Ｔ細胞応答を増強する改変を伴うＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原の遺伝子挿入断片を含有し、少なくとも１つのＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原に対する免疫応答を生じさせる治療に関する本発明の種々の実施形態において使用されるＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームが提供される。このＡｄ５プラットフォームを用いた複数回の免疫を使用して、マウスにおいて、既存のＡｄ５免疫が存在するにもかかわらず、抗エボラ活性を伴う、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原に特異的なＣＭＩ応答を誘導することができる。一部の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］は、ＧｅｎＢａｎｋからのＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原のコード配列を含む。一部の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＮＣＢＩからのヒト分離株に由来するＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原の亜種のコード配列を含む。本明細書において提示されるＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、またはＲＥＳＴＶ免疫療法のフェーズＩ／ＩＩ臨床試験により、安全性および免疫原性がヒトにおいて実証されることが意図されている。既存のＡｄ５免疫の存在に関連した臨床転帰への実質的な影響を伴わずにＣＭＩを誘導することが可能である。
【００８１】
免疫応答の標的としてのＥＢＯＶ
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。そのゲノムは、サイズがおよそ１９ｋｂである一本鎖ＲＮＡ分子を含む。エボラビリオンは、「Ｕ」または「６」の牧羊杖の形状に見え得る線維状粒子であり、また、コイル状、トロイド状または分枝でもあり得る。一般に、エボラビリオンは、幅が８０ナノメートル（ｎｍ）であり、１４，０００ｎｍもの長さであり得る。ＥＢＯＶは、病原性のレベルが異なる少なくとも５つの別個の種に細分され得る。５つの異なるエボラウイルス（ＢＤＢＶ、ＥＢＯＶ、ＲＥＳＴＶ、ＳＵＤＶおよびＴＡＦＶ）のゲノムは、配列、ならびに遺伝子重複の数および位置が異なる。
【００８２】
エボラウイルスは、当該ウイルスにその特徴的な名称を与える線維状粒子を示し、エンベロープを有し、セグメントに分かれておらず、マイナス鎖ＲＮＡを有し、また、形態が変動する。エボラウイルスゲノムは、７つの遺伝子、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質（ＶＰ）３５、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）、ＶＰ３０、ＶＰ２４、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）を含有する。ＧＰ以外は、全ての遺伝子がモノシストロニックであり、１つの構造タンパク質をコードする。ウイルスの内部リボ核タンパク質複合体は、ＮＰに被包されたＲＮＡゲノムを含有し、ＶＰ３５、ＶＰ３０、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと会合して機能的な転写酵素レプリカーゼ複合体になる。リボ核タンパク質複合体のタンパク質は、インターフェロンアンタゴニストであるＶＰ３５などの追加的な機能を有する。ＶＰ４０は、マトリックスタンパク質であり、ウイルス粒子形成を媒介する。ＶＰ２４は、膜に付随し、インターフェロンシグナル伝達に干渉する別の構造タンパク質である。ＧＰは、唯一の膜貫通表面タンパク質であり、２つのジスルフィド連結したフューリン切断断片であるＧＰ−１およびＧＰ−２からなる三量体スパイクを形成する。他のモノネガウイルス目と比較したエボラウイルスの重要な特徴は、感染細胞から分泌される可溶性ＧＰの産生（ＧＰ遺伝子から）である。
【００８３】
一部の態様では、本開示は、ＢＤＢＶに由来する少なくとも１つの標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、ＥＢＯＶに由来する少なくとも１つの標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、ＲＥＳＴＶに由来する少なくとも１つの標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。別の態様では、本開示は、ＳＵＤＶに由来する少なくとも１つの標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。別の態様では、本開示は、ＴＡＦＶに由来する少なくとも１つの標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。別の態様では、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩに記載されているエボラウイルスに由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。
【００８４】
別の態様では、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩに記載されているエボラ株、例えば、ＢＤＢＶ、ＥＢＯＶ、ＲＥＳＴＶ、ＳＵＤＶおよびＴＡＦＶ、およびその他の組み合わせに由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。
【００８５】
エボラビリオンは、他のフィロウイルスのビリオンと同じく、７つのタンパク質（図３参照）：表面糖タンパク質（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、４つのビリオン構造タンパク質（ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、およびＶＰ２４）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）を含有し得る。
【００８６】
エボラウイルスの糖タンパク質は、２つのオープンリーディングフレームにコードされるという点で、普通ではない。ビリオンに組み入れられる膜貫通形態を発現させるためには転写編集が必要である。編集されていない形態からは、感染の過程の初期に大量に合成される非構造的分泌型糖タンパク質（ｓＧＰ）が産生される。一部の場合では、コードされるタンパク質が翻訳後に切り取られ、それにより、ウイルス粒子の表面上に位置する成熟分泌形態、ならびに糖によりコーティングされたより小さな部分が生成する。
【００８７】
一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンの糖タンパク質（ＧＰ）に由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンの核タンパク質（ＮＰ）に由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンに由来する４つのビリオン構造タンパク質（ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、およびＶＰ２４）の少なくとも１つに由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。例えば、組換えベクターは、少なくとも１つのエボラビリオンのＶＰ４０に由来する標的ウイルス抗原を含み得る。例えば、組換えベクターは、少なくとも１つのエボラビリオンのＶＰ３５に由来する標的ウイルス抗原を含み得る。例えば、組換えベクターは、少なくとも１つのエボラビリオンのＶＰ３０に由来する標的ウイルス抗原を含み得る。例えば、組換えベクターは、少なくとも１つのエボラビリオンのＶＰ２４に由来する標的ウイルス抗原を含み得る。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンのＬタンパク質に由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。
【００８８】
エボラの生活環は、宿主細胞と接触したビリオンから始まると考えられている。構造的な糖タンパク質（ＧＰ１、２として公知）は、標的とされる細胞に結合し、感染するウイルスの能力に関与する。ビリオンが、例えば、Ｃ型レクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、またはインテグリンなどの、宿主細胞上の特定の細胞表面受容体に付着し、その後、ウイルスエンベロープと宿主細胞の細胞膜が融合すると考えられている。ビリオンが宿主細胞に取り込まれた後、次いで、ビリオンは、酸性のエンドソームおよびリソソームに移動し、そこで、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ＧＰが切断される。
【００８９】
Ｌ遺伝子によりコードされるウイルスＲＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオカプシドが部分的に脱コーティングされ、遺伝子がプラス鎖ｍＲＮＡに転写され、次いで、それが、ビリオンを含む構造的なおよび非構造タンパク質に翻訳される。産生される最も豊富なタンパク質は核タンパク質であり、宿主細胞におけるその濃度は、Ｌが遺伝子転写からゲノム複製に切り替わるときを決定する。ウイルスゲノムの複製により、全長のプラス鎖アンチゲノムが生じ、これが今度は、マイナス鎖ウイルス後代のゲノムコピーに転写される。新しく合成された構造タンパク質およびゲノムは、自己組織化し、細胞膜の内側付近に蓄積する。ビリオンは、宿主細胞から出芽し、それらのエンベロープを出芽元の細胞膜から得る。次いで、成熟ウイルス後代粒子が他の細胞に感染してサイクルが繰り返される。
【００９０】
一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンのＬ遺伝子に由来する標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンの核タンパク質の産生が阻害されるような標的ウイルスを含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンのゲノム複製が阻害されるような標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンの出芽プロセスが阻害されるような標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。一態様では、本開示は、少なくとも１つのエボラビリオンの感染プロセスが阻害されるような標的ウイルス抗原を含む本明細書において提示される組換えベクターを提供する。
【００９１】
種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号２、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号４、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号５、および／またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号６では、樹状細胞に形質導入する能力が増大し、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症反応の低減および結果としてもたらされる既存のＡｄ免疫の回避を利用することによってワクチン中の抗原特異的免疫応答が改善される。
【００９２】
例えば、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４、および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌでは、樹状細胞に形質導入する能力が増大し得、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症反応の低減および結果としてもたらされる既存のＡｄ免疫の回避を利用することによってワクチン中の抗原特異的免疫応答が改善される。
【００９３】
種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号２、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号４、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号６の治療ワクチンおよび防止ワクチンは、ヒトの全生存（ＯＳ）を増大させるために使用することができ、また、技術的安全性の毒性プロファイル範囲を有する。例えば、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４、および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌの治療ワクチンおよび防止ワクチンは、ヒトの全生存（ＯＳ）を増大させるために使用することができ、また、技術的安全性の毒性プロファイル範囲を有する。
【００９４】
さらに、種々の実施形態では、本発明の組成物および方法により、エボラに感染したヒトの疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答が導かれる。さらに、種々の実施形態では、本発明の組成物および方法により、エボラへの感染のリスクが低いヒト、リスクが中程度のヒト、およびリスクが高いヒトの疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答が導かれる。
【００９５】
一部の態様では、本開示は、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、およびＲＥＳＴＶ抗原からなる群より選択される少なくとも１つの抗原を発現させるアデノウイルスをベースとしたベクターを使用する組成物および方法を提供する。例えば、本開示は、ＧＰ抗原、ＮＰ抗原、ＶＰ４０抗原、ＶＰ３５抗原、ＶＰ３０抗原、ＶＰ２４抗原、およびＬ抗原からなる群より選択される少なくとも１つの抗原を発現させるアデノウイルスをベースとしたベクターを使用する組成物および方法を提供する。
【００９６】
さらに、種々の実施形態では、本発明の組成物および方法により、エボラに感染したヒトの疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答が導かれる。さらに、種々の実施形態では、本発明の組成物および方法により、エボラへの感染のリスクが低いヒト、リスクが中程度のヒト、およびリスクが高いヒトの疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答が導かれる。
【００９７】
Ａｄ５をベースとしたエボラワクチン
アデノウイルスは、直鎖二本鎖ゲノムを含有する、正二十面体の、エンベロープを有さないカプシドを特徴とするＤＮＡウイルスのファミリーである。ヒトＡｄの中で、いかなる新生物疾患にも関連するものはなく、免疫適格性の個体において比較的軽度の自己限定性疾病が引き起こされるだけである。このウイルスによって発現される第１の遺伝子はＥ１遺伝子であり、これは、野生型ゲノムに存在する他のＡｄ５遺伝子プロモーターからの高レベル遺伝子発現が開始されるように作用する。ウイルスＤＮＡ複製および後代ビリオンの組み立てが感染細胞の核内で起こり、生活環全体は約３６時間かかり、細胞当たりビリオンおよそ１０４個の産生が伴う。野生型Ａｄ５ゲノムは、およそ３６ｋｂであり、ＤＮＡ複製の前に発現されるか後に発現されるかに応じて初期ウイルス機能および後期ウイルス機能に分けられる遺伝子をコードする。初期／後期の線引きは、Ａｄ５を予め感染させた細胞への重感染により、重感染ウイルス自体のゲノムが複製された後まで、重感染ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如がもたらされることが実証されているので、ほぼ絶対的なものである。理論に縛られることなく、これは、おそらく、被包される複製されたゲノムが存在するまで後期遺伝子（主にＡｄ５カプシドタンパク質）の発現を妨げる、Ａｄ５主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の複製依存性シス活性化に起因する。本発明の組成物および方法では、Ａｄベクター／ワクチンの進歩した生成の開発の特徴を活用する。
【００９８】
Ａｄ５ベクター
第１世代、またはＥ１欠失アデノウイルスベクターＡｄ５［Ｅ１−］は、導入遺伝子により遺伝子のＥ１領域のみが置き換えられるように構築される。一般には、野生型Ａｄ５ゲノムの約９０％がベクター内に保持される。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、複製する能力が低下しており、Ａｄ５  Ｅ１遺伝子を発現しない細胞への感染後に感染性ウイルスを産生することができない。組換え型Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの複製およびパッケージングが可能になるヒト細胞（一般には、２９３細胞）において繁殖する。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、ポジティブな特質をいくつも有し、最も重要なものの１つは、スケールアップおよびｃＧＭＰ生産が比較的容易であることである。現在、２２０件をはるかに超えるヒト臨床試験でＡｄ５［Ｅ１−］ベクターが利用されており、２千名超の被験体がウイルスをｓｃ、ｉｍ、またはｉｖで与えられている。さらに、Ａｄ５ベクターは組み込まれず、それらのゲノムはエピソームのままである。一般に、宿主ゲノム内に組み込まれないベクターに関しては、挿入性の変異誘発および／または生殖細胞系伝達のリスクは、仮にあったとしても非常に低い。従来のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターの運搬能は、ほぼ７ｋｂである。
【００９９】
ワクチンとして使用されるＡｄ５［Ｅ１−］ベクター
種々の抗原をコードするＡｄ５［Ｅ１−］ベクターにより、ｅｘ  ｖｉｖｏで曝露したＤＣの９５％に効率的に高力価のベクターで形質導入することができる。重要なことに、ベクターを用いた感染多重度（ＭＯＩ）の増大に伴って、ＤＣにおける外来遺伝子発現のレベルの上昇が認められた。種々の抗原をコードするＡｄ５［Ｅ１−］ベクター（腫瘍抗原ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＤＦ３／ＭＵＣ１、ｐ５３、ｈｕｇｐ１００黒色腫抗原、ポリオーマウイルスミドルＴ抗原を含む）を感染させたＤＣは、抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導する傾向があり、抗原提示能力が増強しており、かつ、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を開始する能力が改善されている。腫瘍特異的抗原をコードするＡｄ５ベクターによって形質導入したＤＣを用いた動物の免疫により、その動物に対して、それぞれの抗原を発現する腫瘍細胞によるチャレンジの際に有意なレベルの保護がもたらされることが実証されている。興味深いことに、ＩＬ−７をコードするＡｄの腫瘍内注射は、ＩＬ−７をコードするＡｄ５ベクターを用いて形質導入したＤＣの注射よりも抗腫瘍免疫の誘導において効果が低く、これにより、Ａｄ５ベクターによるＤＣへのｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入への関心がさらに高まる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ形質導入戦略は、例えば、ＤＣへのＣＴＬＡ４ＩｇのＡｄ５媒介性送達、ＤＣ  ＣＤ８０とＴ細胞上に存在するＣＤ２８分子の相互作用を遮断することによってレシピエント宿主における寛容を誘導する試みにも使用されている。
【０１００】
Ａｄ５ベクターのカプシドとＤＣ内およびそれ自体との相互作用により、いくつかの有益な応答が誘発され得、これにより、ＤＣの、Ａｄ５ベクターによりコードされる抗原を提示する傾向が増強され得る。例えば、未成熟のＤＣは、抗原の取り込みに特殊化されているが、Ｔ細胞活性化の比較的非効率的なエフェクターである。ＤＣ成熟化と同時に、Ｔ細胞免疫を駆動するＤＣの能力が増強される。一部の例では、本発明の組成物および方法はＤＣ成熟化の直接誘導をもたらすＡｄ５感染を活用する。マウス由来の未成熟の骨髄由来ＤＣの試験から、マウス由来の未成熟の骨髄由来ＤＣへのＡｄベクター感染により、ＤＣ成熟化に通常関連する細胞表面マーカー（ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＡＭ−１）が上方制御され得、ならびに、骨髄ＤＣ成熟化の際に下方制御されることが公知のインテグリンであるＣＤ１１ｃが下方制御され得ることが示唆される。一部の例では、Ａｄベクター感染により、ＤＣによる、ＤＣ成熟化のマーカーであるＩＬ−１２の産生が誘発される。理論に束縛されることなく、これらの事象は、おそらくＡｄ５により誘発されるＮＦ−κＢ経路の活性化に起因し得る。成熟ＤＣは、Ａｄベクターにより効率的に形質導入することができ、また、成熟ＣＤ８３＋ヒトＤＣ（末梢血単球に由来する）によって実証された通り、低ＭＯＩにおいてナイーブなＴ細胞の増殖を刺激するそれらの機能的潜在性は失われなかった。しかし、成熟ＤＣはまた、未成熟ＤＣよりも感染しにくい可能性がある。通常のＣＡＲ受容体感染機構を使用するのではなく、例えば、ＣＤ４０Ｌ受容体をウイルスベクター受容体として使用して、ＡｄベクターによるＤＣの感染を最適化するため、ならびに機能的成熟化を増強するための戦略として、カプシドタンパク質の改変を使用することができる。
【０１０１】
最も劇的に、非ウイルスベクターの抗ＨＩＶ免疫応答を誘導する潜在性をＡｄ５をベースとしたベクター系と直接比較したところ、Ａｄ５をベースとした系の方がはるかに優れていることが見いだされた。例えば、Ａｄ５ナイーブ霊長類モデルにおいて、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するＡｄ５［Ｅ１−］を用いたワクチン接種は、ＳＨＩＶ感染からの動物の保護に関して、ＨＩＶ−ｇａｇを発現する裸ＤＮＡワクチンを利用した同様の試みと比較して優れていた。したがって、ウイルスベクターは、裸のＤＮＡによるアプローチよりも優れたものであり得る。裸のＤＮＡ−ｇａｇワクチンを初回刺激ワクチン接種として使用し、次に、Ａｄ５［Ｅ１−］−ｇａｇワクチンでの追加刺激を使用する組み合わせ戦略（裸のＤＮＡ−ｇａｇベクターを単独で用いるそれらの臨床上の経験の際に構築する）では、以前にＤＮＡ−ＨＩＶ−ｇａｇをコードするベクターを単独で用いて見られたものよりも、ヒト試験におけるＴ細胞応答がさらに改善された。
【０１０２】
安全性および免疫原性を評価する最近のフェーズ１臨床試験において、健康な成人２０名に対して、エボラウイルスのザイール株およびスーダン株のＧＰ成分を含有する組換え型チンパンジーＡｄをベースとした（ｃＡｄ）ワクチン（ｃＡｄ−ＥＢＯ）を用いて１回、筋肉内にワクチン接種を行った。２０名の被験体全員においてＧＰ特異的抗体が誘導された。抗体力価は、２×１０１１個のウイルス粒子（ＶＰ）を受けた群（ｎ＝１０）において、２×１０１０個のＶＰを受けた群（ｎ＝１０）と比較して、最も高かった。達成された抗体応答は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を伴うチャレンジ試験においてワクチンにより誘導される防御免疫に付随することが報告された範囲内であることが認められた。ＧＰ特異的Ｔ細胞応答も、２×１０１１個のＶＰ用量を受けた被験体の間で、２×１０１０個のＶＰ用量を受けた被験体と比較して、より頻度が高かった。ワクチンは安全に許容され、重篤な有害作用は観察されなかった。重要なことに、被験体において抗チンパンジーＡｄ抗体も誘導され、これらの抗体により、防御免疫応答を維持するために必要になり得るさらなるワクチン接種（追加刺激）が妨げられるだろうことが実証された。追加刺激の難題を回避するために、これらの研究者は、ｃＡｄ−ＥＢＯワクチンと、エボラウイルスのＧＰを含有する組換え型改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（ＭＶＡ−ＥＢＯ）で構成される追加刺激ワクチンの組み合わせの安全性および免疫原性を評価する追加的な臨床試験の実施を提唱している。このアプローチが成功したとしても、ｃＡｄおよびＭＶＡの両方への中和抗体の発生は、これらの２つの組換えワクチンを使用したさらなる免疫を弱める可能性があるので、考慮しなければならない。
【０１０３】
Ａｄ５ベクターにより、ＥＡ、例えば、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、およびＲＥＳＴＶ抗原など、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、およびＬなどの高レベルかつ効率的な形質導入を可能にする独特の機会がもたらされる。Ａｄ５をベースとしたベクターが直面する主要な問題のうちの１つは、ヒト集団におけるＡｄに対する既存の免疫の傾向が高いこと、およびこれにより、あらゆる追加的なワクチン適用に関して、大多数のヒト集団における従来のＡｄ５［Ｅ１−］欠失（第１世代Ａｄ）の使用がどれほど妨げられるかである。
【０１０４】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−エボラワクチン：既存の抗Ａｄ５免疫の難題を克服するための、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ワクチンの使用
ヒトおよび動物における試験により、Ａｄ５に対する既存の免疫がＡｄをベースとしたワクチンの商業的使用に対する阻害因子になり得ることが実証されている。多数のヒトは、ヒトワクチンに最も広く使用されている亜型であるＡｄ５に対する抗体を有し、試験されたヒトの３分の２がＡｄ５に対するリンパ球増殖性応答を有する。この既存の免疫により、典型的なＡｄ５ワクチンを使用した免疫または再免疫が阻害される可能性があり、また、後の時点における、ワクチン接種を受けた人の、Ａｄ５ベクターを使用した第２の抗原に対する免疫が妨げられる可能性がある。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することが、熱心な調査の対象になっている。代替ヒト（Ａｄ５をベースとするものではない）Ａｄ５亜型、または、さらには非ヒト形態のＡｄ５を使用した調査が考察されている。これらのアプローチでは、最初の免疫には成功したとしても、その後のワクチン接種に、新規のＡｄ５亜型に対する免疫応答に起因して問題が生じる可能性がある。Ａｄ５免疫の障壁を回避するため、および最適な免疫応答を誘導するための第１世代Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの限られた有効性を改善するために、本発明の種々の実施形態は、次世代Ａｄ５ベクターをベースとしたワクチンプラットフォームに関する。新しいＡｄ５プラットフォームはＥ２ｂ領域の追加的な欠失を有し、それによりＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体遺伝子が除去されている。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームは、多くの可能性のある遺伝子を含めることを可能にするのに十分にクローニング能力が増大している。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの遺伝子運搬能が７ｋｂであるのと比較して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの遺伝子運搬能は、最大約１２ｋｂであり、必要に応じて複数の遺伝子のための空間がもたらされる。一部の実施形態では、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、または１１ｋｂ超の挿入断片をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターなどのＡｄ５ベクターに導入する。Ｅ２ｂ領域の欠失により、本発明のＡｄ５ベクターに有利な免疫性質が付与され、多くの場合、Ａｄウイルスタンパク質に対する免疫応答は最小化しながら、標的導入遺伝子抗原に対する強力な免疫応答が引き出される。
【０１０５】
種々の実施形態では、本発明のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにより、Ａｄ免疫の存在下であっても、ベクターにより発現されるワクチン抗原に対する強力なＣＭＩ、ならびに抗体が誘導される。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターではまた、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、有害反応、特に、肝毒性および組織傷害の出現も低下する。これらのＡｄ５ベクターの重要な面は、Ａｄ後期遺伝子の発現が著しく低減することである。例えば、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターに関してはカプシドファイバータンパク質の産生をｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターワクチンからはファイバーの発現が消失（ａｂｌａｔｅ）していた。野生型Ａｄに対する生得免疫応答は複雑である。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターから欠失したタンパク質は、一般に、重要な役割を果たすものである。詳細には、末端タンパク質前駆体またはＤＮＡポリメラーゼの欠失を伴うＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでは、注射後最初の２４〜７２時間の炎症がＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して低減する。種々の実施形態では、Ａｄ５遺伝子発現の欠如により、感染細胞が抗Ａｄ活性から見えなくなり、感染細胞が導入遺伝子を長期間にわたって発現することが可能になり、それにより、標的に対する免疫が発生する。
【０１０６】
本発明の種々の実施形態は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの樹状細胞に形質導入する能力を増大させること、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症反応の低減および結果としてもたらされる既存のＡｄ免疫の回避を利用することによってワクチン中の抗原特異的免疫応答を改善することを意図している。
【０１０７】
一部の場合では、この免疫誘導には数カ月かかる可能性がある。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも安全であるだけでなく、抗原特異的免疫応答の誘導に関してＡｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも優れていると思われ、それにより、臨床応答をもたらすことができるエボラワクチンを送達するためのプラットフォームとしてはるかに適したものになる。
【０１０８】
本発明の種々の実施形態、開発の必要性が長く探求されてきたエボラに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。
【０１０９】
種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターエボラワクチンを含む本発明の組成物および方法により、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大がもたらされる。
【０１１０】
アデノウイルスベクター
第１世代アデノウイルスベクターと比較して、本発明の第２世代Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターのある特定の実施形態は、追加的なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｐｏｌ）の欠失および末端タンパク質前駆体（ｐＴＰ）の欠失を含有する。第１世代アデノウイルスベクターの遺伝子運搬能が５〜６ｋｂであるのと比較して、Ｅ２ｂ欠失ベクターの遺伝子運搬能は最大１３ｋｂであり、種々の標的抗原のいずれかをコードする核酸配列のための空間が容易にもたらされる。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターはまた、第１世代アデノウイルスベクターと比較して有害反応も低減する。Ｅ２ｂ欠失ベクターではウイルス遺伝子の発現が低下し、この特性により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入遺伝子発現の拡張がもたらされる。
【０１１１】
野生型Ａｄに対する生得免疫応答は複雑であり得、アデノウイルスベクターから発現されるＡｄタンパク質が重要な役割を果たすと思われる。詳細には、Ｅ２ｂ欠失ベクターにおける末端タンパク質前駆体およびＤＮＡポリメラーゼの欠失により、注射後最初の２４〜７２時間の間の炎症が低減すると思われるが、第１世代アデノウイルスベクターでは、この期間中の炎症が刺激される。さらに、Ｅ２ｂ欠失により生じる追加的な複製遮断により、Ａｄ後期遺伝子の発現の１０，０００分の１の低下も導かれ、これは、Ｅ１、Ｅ３単独の欠失によってもたらされる低下をはるかに超えることが報告されている。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターによって産生されるＡｄタンパク質のレベルの低下により、Ａｄによる免疫または曝露を受けた個体における当該プラットフォームの反復使用を妨げる応答である、競合する望ましくないＡｄ抗原に対する免疫応答の潜在性が有効に減少する。第２世代Ｅ２ｂ欠失ベクターによる炎症反応の誘導の低減により、当該ベクターが、抗原提示細胞（すなわち、樹状細胞）への感染中に所望のワクチン抗原を発現し、抗原性の競合の潜在性を減少させ、その結果、第１世代アデノウイルスベクターを用いた同一の試みと比較して、所望の抗原に対するワクチンのより大きな免疫をもたらす潜在性が増大する。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターにより、第１世代アデノウイルスベクターを使用した前述のワクチン候補よりも安全であり、有効であり、かつ用途の多い、改善されたＡｄをベースとしたワクチン候補がもたらされる。
【０１１２】
したがって、第１世代Ｅ１欠失アデノウイルス亜型５（Ａｄ５）をベースとしたベクターは、ワクチンとして使用するための有望なプラットフォームではあるが、天然に存在するまたは誘導されたＡｄ特異的中和抗体によって活性が妨害される。理論に束縛されることなく、Ｅ１領域、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードするＥ２ｂ領域の欠失を伴うＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）では、例えば、後期ウイルスタンパク質発現が低減することにより、Ａｄ免疫宿主において、免疫学的クリアランスを回避し、コードされる抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導することができる。
【０１１３】
本発明は、米国特許第６，０６３，６２２号；同第６，４５１，５９６号；同第６，０５７，１５８号；同第６，０８３，７５０号；および同第８，２９８，５４９号に記載されているものなどのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの使用を意図している。Ｅ２ｂ領域の欠失を伴うベクターでは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現が損なわれ、かつ／または複製コンピテントＡｄ（ＲＣＡ）が生じる頻度が低下する。これらのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの繁殖は、欠失したＥ２ｂ遺伝子産物を発現する細胞株を利用して行うことができる。本発明は、そのようなパッケージング細胞株；例えば、ＨＥＫ−２９３細胞株に由来するＥ．Ｃ７（正式にはＣ−７と称される）も提供する。
【０１１４】
さらに、Ｅ２ｂ遺伝子産物であるＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体を、Ｅ．Ｃ７、または同様の細胞においてＥ１遺伝子産物と一緒に構成的に発現させることができる。Ａｄゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移行には、直接の利点がある：（１）運搬能の増大、および、（２）ＲＣＡが生じる潜在性の低減（一般には、ＲＣＡを生じさせるのに２つまたはそれ超の独立した組換え事象が必要とされる）。本発明において使用されるＥ１、Ａｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体発現細胞株により、ヘルパーウイルスの混入を必要とせずに、ほぼ１３ｋｂの運搬能を有するアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。さらに、ウイルスの生活環に欠かせない遺伝子（例えば、Ｅ２ｂ遺伝子）を欠失させる場合、他のウイルス遺伝子タンパク質の複製または発現に関してＡｄがさらに損なわれる。これにより、ウイルス感染細胞の免疫認識を低下させることができ、また、外来導入遺伝子発現の持続時間を延長させることが可能になる。
【０１１５】
Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したベクターは、一般には、Ｅ１領域およびＥ２ｂ領域からそれぞれのタンパク質を発現させることができない。さらに、当該ベクターは、ウイルス構造タンパク質の大部分の発現の欠如を示し得る。例えば、Ａｄの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、後期構造タンパク質Ｌ１からＬ５までの転写に関与する。ＭＬＰはＡｄゲノム複製前には活性が最小であるが、毒性が強いＡｄ後期遺伝子は、ウイルスのゲノム複製が起こった後にのみ、ＭＬＰから主に転写および翻訳される。この後期遺伝子転写のシス依存性活性化は、一般に、ポリオーマの成長においておよびＳＶ−４０などのＤＮＡウイルスの特徴である。ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体はＡｄ複製のために重要である（Ｅ４またはタンパク質ＩＸタンパク質とは異なる）。それらの欠失は、ＡＰＣなどの細胞におけるアデノウイルスベクター後期遺伝子発現、およびその発現の毒性作用に対して非常に有害であり得る。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本発明における使用が意図されているアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失、および場合によってＥ１領域の欠失を有するＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは、Ａｄゲノムの他の領域のいずれの欠失も有さない。別の実施形態では、本発明における使用が意図されているアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失、ならびに場合によってＥ１領域およびＥ３領域の欠失を有するＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは、他の領域の欠失を有さない。さらなる実施形態では、本発明における使用が意図されているアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失、ならびに場合によってＥ１、Ｅ３の欠失、ならびに同様に場合によってＥ４領域の部分的または完全な除去を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。別の実施形態では、本発明における使用が意図されているアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失、ならびに場合によってＥ１領域および／またはＥ４領域の欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは、他の欠失を含有しない。追加的な実施形態では、本発明における使用が意図されているアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ａ領域、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ４領域の欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。一実施形態では、本明細書で使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼ機能の欠失を有するベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。さらなる実施形態では、本明細書で使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の末端タンパク質前駆体機能の欠失を有する。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。別の実施形態では、本明細書で使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体機能の欠失を有する。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。特定の一実施形態では、本明細書での使用が意図されているアデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ１領域の少なくとも一部分が欠失している。一部の場合では、そのようなベクターは、「ｇｕｔｔｅｄ」アデノウイルスベクターではない。この点について、ベクターは、Ｅ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼと末端タンパク質前駆体機能の両方が欠失していてよい。追加的な実施形態では、本発明において使用するためのアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２ｂおよび／または１００Ｋ領域の欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一実施形態では、本明細書で使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２ｂおよび／またはプロテアーゼ機能の欠失を有するベクターを含む。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。さらなる実施形態では、本明細書で使用するためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の欠失を有し、一方、ファイバー遺伝子は変異または他の変化によって改変されている（例えば、Ａｄ親和性を変化させるために）。言及されているアデノウイルスベクターのいずれかにＥ３領域またはＥ４領域からの遺伝子の除去を追加することができる。ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、「ｇｕｔｔｅｄ」アデノウイルスベクターであってよい。
【０１１７】
本発明は、エボラ遺伝子に対する免疫のためのウイルス遺伝子送達プラットフォームを免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせて使用する、エボラに対する免疫療法のための組成物および方法も提供する。例えば、ウイルス遺伝子送達プラットフォームを使用するエボラに対する免疫療法のための組成物および方法は、ＰＤ１の阻害剤などの免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせて、エボラ遺伝子に対する免疫に使用することができる。これらの組成物および方法では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−エボラワクチンをチェックポイント阻害剤などの免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせて利用することができる。
【０１１８】
当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示された標的抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現または提示されたエボラ抗原などのエボラ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現または提示された、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、またはそれらの任意の組み合わせなどのＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＥＢＯＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＳＵＤＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＴＡＦＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＢＤＢＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＲＥＳＴＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＧＰに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＮＰに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＶＰ４０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＶＰ３５に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＶＰ３０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。
【０１１９】
当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示された複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、２つまたはそれ超のＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、例えば、ＧＰ抗原、ＮＰ抗原、ＶＰ４０抗原、ＶＰ３５抗原、ＶＰ３０抗原、ＶＰ２４抗原、およびＬ抗原の２つまたはそれ超などに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＥＢＯＶ抗原およびＳＵＤＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＴＡＦＶ抗原およびＢＤＢＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＲＥＳＴＶ抗原およびＥＢＯＶ抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＮＰに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＶＰ４０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＶＰ３５に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＶＰ３０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＧＰおよびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＮＰおよびＶＰ４０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＮＰおよびＶＰ３５に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＮＰおよびＶＰ３０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＮＰおよびＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＮＰおよびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ４０およびＶＰ３５に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ４０およびＶＰ３０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ４０およびＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ４０およびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ３５およびＶＰ３０に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ３５およびＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ３５およびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ３０およびＶＰ２４に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ３０およびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＶＰ２４およびＬに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。
【０１２０】
ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、もしくはＲＥＳＴＶ抗原、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、もしくはＬなど、または、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、もしくはＲＥＳＴＶ抗原、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、もしくはＬなどを発現および／もしくは提示する細胞に対する免疫応答を生じさせることを目的としたワクチンに、ＥＢＯＶ抗原、ＳＵＤＶ抗原、ＴＡＦＶ抗原、ＢＤＢＶ抗原、またはＲＥＳＴＶ抗原、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬなどの改変型を使用することができる。一般には、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性または異種標的タンパク質の免疫原性が、ネイティブなポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較して実質的に低下しないような、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。一部の場合では、前記１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入により、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性の増大がもたらされ得る。本明細書の他の箇所に記載されている通り、ポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアントまたはその断片（例えば、エピトープ）をコードし得、ここで、バリアントポリペプチドまたはその断片（例えば、エピトープ）の抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する傾向は、ネイティブなポリペプチドと比較して実質的に低減しない。ポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアントまたはその断片をコードし得、ここで、バリアントポリペプチドまたはその断片の抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する傾向は、ネイティブなポリペプチドと比較して実質的に増大する。
【０１２１】
特に、本発明は、１つまたは複数の抗原性標的実体に対する複数回のワクチン接種を達成することができるように改善されたＡｄをベースとしたワクチンを提供する。一部の実施形態では、改善されたＡｄをベースとしたワクチンは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＢＯＶなどの、標的抗原、その断片、バリアントまたはバリアント断片を担持する複製欠損性アデノウイルスを含む。標的抗原のバリアントまたは断片、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬなどを、免疫原性の潜在性を含めた種々の因子に基づいて選択することができる。変異体ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬを、それぞれ野生型ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬと比較した、免疫応答を生じさせる能力の増大のために利用することができる。重要なことに、ワクチン接種を、Ａｄに対する既存の免疫の存在下で実施することまたは以前に本発明のＡｄベクターまたは他のＡｄベクターを用いた免疫を複数回受けた被験体に投与することができる。Ａｄベクターは、これだけに限定されないが、１つまたは複数の標的抗原に対する抗体の産生およびＣＭＩ応答を含めた、目的の抗原、例えば、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬなどに対する免疫応答を誘導するために、被験体に複数回投与することができる。特定の実施形態では、標的抗原のバリアントまたは断片は、１つまたは複数の生物活性が低下するように改変されたものである。例えば、エボラタンパク質標的抗原を、タンパク質のウイルス活性が低下するまたは排除されるように改変することもでき、ウイルスタンパク質を、１つまたは複数の活性またはウイルスタンパク質が低下するまたは排除されるように改変することもできる。改変エボラタンパク質の例は、免疫原性が増大したバリアントタンパク質などのバリアントタンパク質をもたらす点変異を有するＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、またはＬである。
【０１２２】
上記のいずれかを含む所望の標的抗原ポリペプチドまたはその断片またはバリアント、または融合タンパク質を発現させるために、本明細書に記載されている通り、ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所に記載されている適切なＡｄに当技術分野で公知の組換え技法を使用して挿入する。
【０１２３】
組成物
エボラ免疫療法およびワクチンのためのウイルスベクター
組換え型ウイルスベクターを使用して、タンパク質をコードする遺伝子または抗原（例えば、ＥＡ）を発現させることができる。組換え型ウイルスベクターをベースとしたワクチンおよび免疫療法の利点として、遺伝子形質導入の効率が高いこと、標的細胞への遺伝子の送達が高度に特異的であること、強固な免疫応答が誘導されること、および細胞性免疫（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）が増大することが挙げられる。本開示は、ウイルスのゲノムの極めて重要な領域の欠失または挿入を含む組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示により提供されるウイルスベクターは、それに対する免疫応答を生じさせることが望まれる１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそのバリアント、断片もしくは融合物をコードする異種核酸配列を含み得る。
【０１２４】
本開示の方法および組成物で使用することができる適切なウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、プロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、自己相補性アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、またはセンダイウイルスが挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製コンピテントであってよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損性であってよい。複製欠損性ウイルスベクターに関しては、ウイルスのゲノムは、複製の追加的なラウンドおよびパッケージングに必要なコード領域が他の遺伝子で置き換えられ得るか、または欠失され得る。これらのウイルスは、それらの標的細胞に感染し、それらのウイルスペイロードを送達することはできるが、その後、細胞溶解および死を導く典型的な溶解経路を続けることができない。ウイルスベクターに応じて、複製欠損性ウイルスベクターにおいて許容されるＤＮＡまたはｃＤＮＡ挿入断片の典型的な最大長は、約８〜１０キロベース（ｋＢ）であり得る。
【０１２５】
レトロウイルス（例えば、逆転写酵素を含有する、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスなど）は、抗原を発現させるために使用されてきた。レトロウイルスベクターは、複製欠損性であってよい。レトロウイルスベクターは、マウス起源またはトリ起源のものであってよい。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するものであってよい。遺伝子発現のためにゲノムへの組み込みが必要であるレトロウイルスベクターを使用することができる。レトロウイルスベクターは、長期間遺伝子発現をもたらすために使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターは、ゲノムサイズがおよそ７〜１１ｋｂであってよく、また、ベクターは、７〜８ｋｂ長の外来ＤＮＡ挿入断片を有してよい。レトロウイルスベクターは、低免疫原性を示すように使用することができ、大多数の患者は、レトロウイルスベクターに対する既存の免疫を示さない。レトロウイルスベクターは、分裂細胞を感染させるために使用することができる。レトロウイルスベクターは、非分裂細胞は感染させないために使用することができる。
【０１２６】
レンチウイルスベクターは、抗原を発現させるために使用されてきた。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスを構成する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させるために使用することができる。レンチウイルスベクターは、分裂細胞を感染させるために使用することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞と分裂細胞の両方を感染させるために使用することができる。レンチウイルスは、一般に、レトロウイルスよりも広範な親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示す。ｔａｔおよびｒｅｖなどのいくつかのタンパク質により、レンチウイルスの複製が調節される。これらの調節タンパク質は、一般には、レトロウイルスには存在しない。導入遺伝子送達ベクターに工学的に操作することができる例示的なレンチウイルスは、ＨＩＶである。レンチウイルスベクターの利点は、レトロウイルスベクターの利点と同様である。レンチウイルスにより腫瘍形成が潜在的に誘発される可能性があるが、レンチウイルスの組み込み部位は細胞性プロモーターを有する部位から離れているので、このリスクはレトロウイルスベクターよりも低い。ＨＩＶをベースとしたベクターは、例えば、ＨＩＶウイルスエンベロープおよびベクター作製中に必要でない調節遺伝子の一部を欠失させることによって生成することができる。エンベロープにより細胞および組織特異性が決定されるので、親エンベロープの代わりに、いくつかのキメラまたは改変エンベロープベクターを生成する。
【０１２７】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターは、抗原を発現させるために使用されている。ＣＭＶはヘルペスウイルスのメンバーである。種特異的ＣＭＶを使用することができる（例えば、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）、例えば、ヒトヘルペスウイルス５型）。ＨＣＭＶは、カプシドで囲まれた２３５ｋｂの二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを含有する。エンベロープは、細胞受容体に結合する糖タンパク質ｇＢおよびｇＨを含有する。
【０１２８】
センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターは、抗原を発現させるために使用されてきた。ＳｅＶは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ科の、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳｅＶゲノムは、６種のタンパク質、および細胞への侵入を媒介し、その親和性を決定する２種のエンベロープ糖タンパク質、ＨＮタンパク質およびＦタンパク質をコードする。ベクターの安全性を改善するために、Ｆタンパク質を欠くＳｅＶベクターを複製欠損性ウイルスとして使用することができる。パッケージング細胞中に作製したＳｅＶベクターを使用してＦタンパク質を発現させることができる。Ｆ遺伝子を欠失させ、導入遺伝子を挿入したゲノムをパッケージング細胞にトランスフェクトすることができる。ＳｅＶは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含有し、ウイルスのゲノムは細胞質に局在化する。これにより、感染後すぐに起こる、ＳｅＶの速い遺伝子発現および遺伝毒性的利点が確実になる。ＳｅＶベクターは、高度に効率的な遺伝子移入を示すために使用することができる。ＳｅＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、非分裂細胞への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、分裂細胞への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、例えば、ヒト気道上皮細胞に効率的に形質導入するために使用することができる。ＳｅＶベクターは、例えば、粘膜（例えば、経口および経鼻）経路によって投与することができる。鼻腔内投与を使用して、ＳｅＶに対する既存の免疫の影響を筋肉内投与と比較して潜在的に低減することができる。他のウイルスベクターと比較して、導入遺伝子容量（３．４ｋｂ）は低い。ＳｅＶは、ヒトパラインフルエンザ１型（ｈＰＩＶ−１）ウイルスと高度に相同であり、したがって、ＳｅＶの使用に対してｈＰＩＶ−１に対する既存の免疫が作用し得る。
【０１２９】
アデノウイルスベクター
一般に、アデノウイルスは、広範な親和性を有し得、種々の分裂細胞型および非分裂細胞型に感染することができ、また、全身的にも哺乳動物の体内のより選択的な粘膜表面を通じても使用することができるので、臨床的に魅力的なものである。さらに、相対的な熱安定性により、それらの臨床使用がさらに容易になる。アデノウイルスは、直鎖二本鎖ゲノムを含有する、正二十面体の、エンベロープを有さないカプシドを特徴とするＤＮＡウイルスのファミリーである。一般に、アデノウイルスは、サイズが約３０〜３５キロベースと概算される二本鎖ＤＮＡゲノムを含む、エンベロープを有さないウイルスとして見いだされる。ヒトＡｄの中でいかなる新生物疾患にも関連するものはなく、免疫適格性の個体において比較的軽度の自己限定性疾病が引き起こされるだけである。このウイルスによって発現される第１の遺伝子はＥ１遺伝子であり、これは、野生型ゲノムに存在する他のＡｄ５遺伝子プロモーターからの高レベルの遺伝子発現が開始されるように作用する。ウイルスＤＮＡ複製および後代ビリオンの組み立ては感染細胞の核内で起こり、生活環全体は約３６時間かかり、細胞当たりビリオンおよそ１０４個の出現が伴う。野生型Ａｄ５ゲノムは、およそ３６ｋｂであり、ＤＮＡ複製の前に発現されるか後に発現されるかに応じて初期ウイルス機能および後期ウイルス機能に分けられる遺伝子をコードする。初期／後期の線引きは、Ａｄ５を予め感染させた細胞への重感染により、重感染ウイルス自体のゲノムが複製された後まで、重感染ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如がもたらされることが実証されているので、ほぼ絶対的なものである。理論に縛られることなく、これは、おそらく、被包される複製されたゲノムが存在するまで後期遺伝子（主にＡｄ５カプシドタンパク質）の発現を妨げる、Ａｄ５主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の複製依存性シス活性化に起因する。本発明の組成物および方法では、進歩した世代のＡｄベクター／ワクチン開発の特徴を活用する。アデノウイルスの直鎖状ゲノムは、一般に、２つのＤＮＡ複製起点（ＩＴＲ）に挟まれており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ媒介性転写のための８単位を有する。このゲノムは、５種の初期単位Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、およびＥ５、ウイルス複製の開始後に遅れて発現される２種の単位（ＩＸおよびＩＶａ２）、ならびにＬ１〜Ｌ５に細分される１つの後期単位（Ｌ）を有する。一部のアデノウイルスは、ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡと称される１種または２種のＲＮＡをさらにコードし得る。
【０１３０】
ヒト患者において生得免疫および適応免疫応答を誘導するアデノウイルスが提供される。ウイルスのゲノムの極めて重要な領域の欠失または挿入により、予測可能性が増大し、望ましくない副作用が低減されるように工学的に操作された組換え型ベクターが提供される。一部の態様では、本発明は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、ＩＸ、ＩＶａ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるゲノム欠失または挿入を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０１３１】
本開示は、変化したカプシドを有する組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一般に、アデノウイルスのカプシドは、２０面体の２０個の三角形の切子面を主に含み、各２０面体は、１２コピーのヘキソン三量体を含有する。さらに、他のいくつかの追加的なマイナーカプシドタンパク質、ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸも存在する。
【０１３２】
本開示は、１つまたは複数の変化したファイバータンパク質を含む組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一般に、三量体も形成するファイバータンパク質が１２カ所の頂点において五量体ペントンベースに挿入される。ファイバーは、細いＮ末端尾部、シャフト、およびノブドメイン（ｋｎｏｂ  ｄｏｍａｉｎ）を含み得る。シャフトは、様々な数のβストランド反復を含み得る。ノブは、１つまたは複数のループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊを含み得る。ファイバーノブループは、細胞受容体に結合し得る。本開示は、エボラを処置するためのワクチン系に使用するためのアデノウイルスベクターを提供する。
【０１３３】
本開示の方法および組成物で使用することができる適切なアデノウイルスとしては、これだけに限定されないが、ヒトサブグループＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを含めた種特異的アデノウイルスまたは本明細書において提示されるそれらの極めて重要なゲノム領域が挙げられ、サブグループは、免疫学的に別個の血清型にさらに分類することができる。さらに、本開示の方法および組成物で使用することができる適切なアデノウイルスとして、これだけに限定されないが、霊長類、ウシ、家禽、は虫類、またはカエルから同定される種特異的アデノウイルスまたはそれらの極めて重要なゲノム領域が挙げられる。
【０１３４】
一部のアデノウイルス血清型は、別個の器官を優先的に標的とする。ＡｄＨｕ１、ＡｄＨｕ２、およびＡｄＨｕ５（亜属Ｃ）などの血清型は、一般に、上気道に感染するが、亜属ＡおよびＦは胃腸器官に感染する。本開示は、エボラを処置するために別個の器官を優先的に標的とすることにおいて使用するための組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、組換え型アデノウイルスベクターを、哺乳動物における特異的な器官に対する親和性が低下するように変化させる。一部の適用では、組換え型アデノウイルスベクターを、哺乳動物における特異的な器官に対する親和性が増大するように変化させる。
【０１３５】
アデノウイルスの親和性は、宿主細胞受容体に付着するそれらの能力によって決定することができる。一部の例では、宿主細胞への付着のプロセスは、ファイバーの遠位ノブドメインの宿主細胞表面分子への最初の結合、その後、ペントンベース内のＲＧＤモチーフのαＶインテグリンとの結合を伴い得る。本開示は、宿主の特定の細胞型に感染するように遺伝子工学的に操作することができるように親和性を変化させた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、細胞特異的エボラ感染を処置するために親和性を変化させた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、サブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＦ、もしくはこれらの組み合わせの１つまたは複数のアデノウイルスに由来する変化させたファイバーノブまたはＲＧＤ配列の挿入を有する組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、１つまたは複数の特定の細胞型に対する親和性が低下したベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、１つまたは複数の特定の細胞型に対する親和性が増強されたベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、産物特異的Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答が低下したベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、産物特異的Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答が増強されたベクターがもたらされる。
【０１３６】
本開示は、ウイルス中和抗体の影響を回避するためまたは宿主細胞への形質導入を改善するために他の分子でコーティングされた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、ベクターの宿主細胞受容体への付着を補助するアダプター分子でコーティングされた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。例として、アデノウイルスベクターを、コクサッキーＡｄ受容体（ＣＡＲ）とＣＤ４０Ｌを接続し、その結果、樹状細胞への形質導入をもたらし、それにより、被験体における免疫応答を増強するアダプター分子でコーティングすることができる。他の標的細胞型への付着を増強するために同様に工学的に操作された他のアデノウイルスベクターも本開示に含まれる。
【０１３７】
Ａｄ５ベクター
ヒトおよび動物における試験により、Ａｄ５に対する既存の免疫がＡｄをベースとしたワクチンの商業用途に対する阻害因子になり得ることが実証されている。大半のヒトは、ヒトワクチンに最も広く使用されている亜型であるＡｄ５に対する抗体を有し、試験されたヒトの３分の２がＡｄ５に対するリンパ球増殖性応答を有する。この既存の免疫により、典型的なＡｄ５ワクチンを使用した免疫または再免疫が阻害される可能性があり、また、後の時点における、Ａｄ５ベクターを使用した、第２の抗原に対するワクチンによる免疫が妨げられる可能性がある。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することが、熱心な調査の対象になっている。代替ヒト（Ａｄ５をベースとするものではない）Ａｄ５亜型または、さらには非ヒト形態のＡｄ５を使用した調査が考察されている。これらのアプローチでは、最初の免疫には成功したとしても、その後のワクチン接種に、新規のＡｄ５亜型に対する免疫応答に起因して問題が生じる可能性がある。Ａｄ５免疫という障壁を回避するため、および第１世代Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの限られた有効性を改善して最適な免疫応答を誘導するために、本発明の種々の実施形態は、次世代Ａｄ５ベクターをベースとしたワクチンプラットフォームに関する。
【０１３８】
第１世代、またはＥ１欠失アデノウイルスベクターＡｄ５［Ｅ１−］は、導入遺伝子により遺伝子のＥ１領域のみが置き換えられるように構築される。一般には、野生型Ａｄ５ゲノムの約９０％がベクター内に保持される。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、複製する能力が低下しており、Ａｄ５  Ｅ１遺伝子を発現しない細胞への感染後に感染性ウイルスを産生することができない。組換え型Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの複製およびパッケージングが可能になるヒト細胞（例えば、２９３細胞）において繁殖する。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、ポジティブな特質をいくつも有し、最も重要なものの１つは、スケールアップおよびｃＧＭＰ生産が比較的容易であることである。現在、２２０件をはるかに超えるヒト臨床試験でＡｄ５［Ｅ１−］ベクターが利用されており、２千名超の被験体がウイルスをｓｃ、ｉｍ、またはｉｖで与えられている。さらに、Ａｄ５ベクターは組み込まれず、それらのゲノムはエピソームのままである。一般に、宿主ゲノム内に組み込まれないベクターに関しては、挿入性の変異誘発および／または生殖細胞系伝達のリスクは、仮にあったとしても非常に低い。従来のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターの運搬能は、７ｋｂに達する。
【０１３９】
Ｅ１領域、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードするＥ２ｂ領域の欠失を伴うＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）は、後期ウイルスタンパク質発現が低減することにより、Ａｄ免疫宿主において免疫学的クリアランスを回避し、コードされるエボラ抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導する機会がもたらされる。新しいＡｄ５プラットフォームはＥ２ｂ領域の追加的な欠失を有し、それによりＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体遺伝子が除去されている。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームは、多くの可能性のある遺伝子を含めることを可能にするのに十分である増大したクローニング能力を有する。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの遺伝子運搬能が７ｋｂであるのと比較して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの遺伝子運搬能は最大約１２ｋｂであり、必要に応じて複数の遺伝子のための空間がもたらされる。一部の実施形態では、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、または１１ｋｂ超の挿入断片をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターなどのＡｄ５ベクターに導入する。Ｅ２ｂ領域の欠失により、本発明のＡｄ５ベクターに有利な免疫性質が付与され、多くの場合、Ａｄウイルスタンパク質に対する免疫応答は最小化しながら、標的導入遺伝子抗原に対する強力な免疫応答が引き出される。
【０１４０】
種々の実施形態では、本発明のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにより、Ａｄ免疫の存在下であっても、ベクターにより発現されるワクチン抗原に対する強力なＣＭＩ、ならびに抗体が誘導される。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターではまた、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、有害反応、特に、肝毒性および組織傷害の出現も低下する。これらのＡｄ５ベクターの重要な面は、Ａｄ後期遺伝子の発現が著しく低減することである。例えば、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターに関してはカプシドファイバータンパク質の産生をｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターワクチンからはファイバーの発現が消失していた。野生型Ａｄに対する生得免疫応答は複雑である。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターから欠失したタンパク質は、一般に、重要な役割を果たすものである。詳細には、末端タンパク質前駆体またはＤＮＡポリメラーゼの欠失を伴うＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでは、注射後最初の２４〜７２時間の炎症がＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して低減したことを示した。種々の実施形態では、Ａｄ５遺伝子発現の欠如により、感染細胞が抗Ａｄ活性から見えなくなり、感染細胞が導入遺伝子を長期間にわたって発現することが可能になり、それにより、標的に対する免疫が発生する。
【０１４１】
本発明の種々の実施形態は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの、樹状細胞に形質導入する能力を増大させること、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症反応の低減および結果としての既存のＡｄ免疫の回避を利用することによってワクチン中の抗原特異的免疫応答を改善することを意図している。
【０１４２】
複製欠損性Ａｄ５ベクター
抗Ａｄ免疫を克服するための試みは、代替Ａｄ血清型および／またはＡｄ５ウイルスカプシドタンパク質の交代の使用を含むものであり、どちらも成功は限られており、また、得られるワクチンの体内分布を大きく変化させる潜在性を伴う。したがって、既存のＡｄ免疫の標的であることが公知であるタンパク質であるＥ１欠失Ａｄ５ベクター由来のウイルスタンパク質の発現をさらに低下させることによる完全に新規のアプローチを試みた。詳細には、初期１（Ｅ１）遺伝子領域の欠失および初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子領域の追加的な欠失を伴う新規の組換え型Ａｄ５プラットフォームが記載されている（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）。Ｅ２ｂ領域（ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードする）の欠失により、ウイルスＤＮＡ複製および後期ウイルスタンパク質発現が低下する。このベクタープラットフォームを使用して、エボラ感染の動物モデルにおいてＣＭＩ応答を誘導することができ、また、より重要なことに、この組換え型Ａｄ５遺伝子送達プラットフォームはＡｄ５免疫の障壁を克服し、既存のＡｄ免疫および／またはベクターにより誘導されるＡｄ免疫の状況下で使用することができ、したがって、ワクチンの複数回の同種投与を可能にするものである。特定の実施形態では、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む、血清型５の複製欠損性アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、変異体、天然のバリアントまたはその断片であってよい。
【０１４３】
一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、野生型免疫原性ポリペプチドまたはその断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする改変された配列を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、野生型ポリペプチドのサブユニットをコードする改変された配列を含む。本発明の組成物および方法は、一部の実施形態では、配列番号１、２、４、５または６に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むアデノウイルス由来ベクターに関する。
【０１４４】
一部の実施形態では、場合によって複製欠損性アデノウイルスに関するアデノウイルス由来ベクターは、配列番号１、２、４、５または６に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号１、２、４、５または６から代替コドンの置き換えにより生じる配列を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルス由来ベクターは、Ｅ２ｂ領域、および場合によってＥ１領域の欠失を有し、当該欠失により、本明細書に記載されている通り免疫療法におけるベクターの使用に種々の利点が付与される。
【０１４５】
アデノウイルスゲノム内のある特定の領域は、必須の機能を果たすものであり、本発明の複製欠損性アデノウイルスベクターを構築する際に実質的に保存される必要があり得る。これらの領域は、それらの全体が参照により組み込まれる、Ｌａｕｅｒら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８５巻、２６１５〜２５頁（２００４年）、Ｌｅｚａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、３００３〜１３頁（１９８８年）、およびＭｉｒａｌｌｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．、２６４巻、１８号、１０７６３〜７２頁（１９８３年）にさらに記載されている。配列番号１、２、４、５または６の一部、例えば、配列番号１、２、４、５または６の少なくとも約１００塩基、約２５０塩基、約５００塩基、約１０００塩基またはそれ超を含む部分などに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性値を有する配列を含む組換え型核酸ベクターは、本発明の範囲内に入る。
【０１４６】
本発明は、米国特許第６，０６３，６２２号；同第６，４５１，５９６号；同第６，０５７，１５８号；同第６，０８３，７５０号；および同第８，２９８，５４９号に記載されているものなどのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの使用を意図している。Ｅ２ｂ領域の欠失を伴うベクターでは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現が損なわれ、かつ／または複製コンピテントＡｄ（ＲＣＡ）が生じる頻度が低下する。これらのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの繁殖は、欠失したＥ２ｂ遺伝子産物を発現する細胞株を利用して行うことができる。そのようなパッケージング細胞株は本明細書において提示される；例えば、ＨＥＫ−２９３細胞株に由来するＥ．Ｃ７（正式にはＣ−７と称される）。
【０１４７】
さらに、Ｅ２ｂ遺伝子産物であるＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体を、Ｅ．Ｃ７、または同様の細胞においてＥ１遺伝子産物と一緒に構成的に発現させることができる。Ａｄゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移行には、直接の利点がある：（１）運搬能の増大、および、（２）ＲＣＡが生じる潜在性の低減（一般には、ＲＣＡを生じさせるのに２つまたはそれ超の独立した組換え事象が必要とされる）。本発明において使用されるＥ１、Ａｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体発現細胞株により、ヘルパーウイルスの混入を必要とせずに、１３ｋｂに達する運搬能を有するアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。さらに、ウイルスの生活環に欠かせない遺伝子（例えば、Ｅ２ｂ遺伝子）を欠失させる場合、複製または他のウイルス遺伝子タンパク質の発現のためのＡｄがさらに損なわれる。これにより、感染細胞の免疫認識を低下させることができ、および外来導入遺伝子発現の持続時間を延長させることができる。
【０１４８】
Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したベクターは、一般には、Ｅ１領域およびＥ２ｂ領域からそれぞれのタンパク質を発現させることができない。さらに、当該ベクターは、ウイルス構造タンパク質の大部分の発現の欠如を示し得る。例えば、Ａｄの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、後期構造タンパク質Ｌ１からＬ５までの転写に関与する。ＭＬＰはＡｄゲノム複製前には活性が最小であるが、毒性が強いＡｄ後期遺伝子は、ウイルスのゲノム複製が起こった後にのみ、ｍＬＰから主に転写および翻訳される。この後期遺伝子転写のシス依存性活性化は、一般に、例えばポリオーマおよびＳＶ−４０の成長におけるＤＮＡウイルスの特徴である。ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体はＡｄ複製のために重要である（Ｅ４またはタンパク質ＩＸタンパク質とは異なる）。それらの欠失は、ＡＰＣなどの細胞におけるアデノウイルスベクター後期遺伝子発現、およびその発現の毒性作用に対して非常に有害であり得る。
【０１４９】
アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域、および場合によってＥ１領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは、Ａｄゲノムの他の領域のいずれの欠失も有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失ならびにＥ１領域およびＥ３領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の領域の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失およびＥ１、Ｅ３の欠失およびＥ４領域の部分的または完全な除去を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失およびＥ１領域および／またはＥ４領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは、他の欠失を含有しない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ａ領域、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ４領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼ機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の末端タンパク質前駆体機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ１領域の少なくとも一部分を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターではない。この点について、ベクターは、Ｅ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼと末端タンパク質前駆体機能の両方が欠失していてよい。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２ｂおよび／または１００Ｋ領域の欠失を有してよい。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２ｂおよび／またはプロテアーゼ機能の欠失を有するベクターを含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の欠失を有し得、一方、ファイバー遺伝子は変異または他の変化によって改変されている（例えば、Ａｄ親和性を変化させるために）。言及されているアデノウイルスベクターのいずれかにＥ３領域またはＥ４領域からの遺伝子の除去を追加することができる。ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターであってよい。
【０１５０】
Ａｄゲノムの他の領域を欠失させることができる。Ａｄゲノムの特定の領域の「欠失」とは、その領域によりコードされる少なくとも１つの遺伝子産物の発現および／または機能（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端タンパク質前駆体機能であるＥ２ｂ機能）が妨げられるように変異させたまたは除去された特定のＤＮＡ配列を指す。欠失は、タンパク質のエクソンコード部分内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。特定の領域内の欠失とは、Ａｄゲノムのその領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。１つ超の塩基対を欠失させることができる。例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対を特定の領域から欠失させることができる。欠失は、Ａｄゲノムの特定の領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対であり得る。これらの欠失により、その領域によりコードされる遺伝子産物の発現および／または機能を妨げることができる。例えば、Ａｄゲノムの特定の領域は、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるような１つまたは複数の点変異を含んでよい。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。Ａｄゲノムにおける例示的な欠失または変異としては、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ＴＰ、ＰＯＬ、ＩＶ、およびＶＡ領域のうちの１つまたは複数が挙げられる。欠失アデノウイルスベクターは、例えば、組換え技法を使用して作出することができる。
【０１５１】
本発明において使用するためのＡｄベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子産物、および、欠失している可能性がある必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して、高力価まで首尾よく成長させることができる。Ｅ１およびＤＮＡポリメラーゼタンパク質だけでなく、Ａｄ−末端タンパク質前駆体も構成的に発現するＨＥＫ−２９３由来の細胞を使用することができる。例えば、アデノウイルスベクターの高力価ストックを成長させるために、Ｅ．Ｃ７細胞を使用することができる。
【０１５２】
自己繁殖性アデノウイルスベクターから重大な遺伝子を欠失させるために、標的とされる遺伝子によりコードされるタンパク質をまずＨＥＫ−２９３細胞または同様の細胞において、Ｅ１タンパク質と同時発現させることができる。例えば、構成的に同時発現させた場合に無毒性であるタンパク質（または誘導的に発現させる毒性のタンパク質）を選択的に利用することができる。ＨＥＫ−２９３細胞におけるＥ１遺伝子とＥ４遺伝子の同時発現が可能である（例えば、誘導性の、構成的でないプロモーターを利用する）。Ｅ１遺伝子と、ビリオン構造タンパク質であるタンパク質ＩＸ遺伝子を同時発現させることができる。さらに、Ｅ１遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびタンパク質ＩＸ遺伝子の同時発現も可能である。Ｅ１遺伝子および１００Ｋ遺伝子は、Ｅ１遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子で可能であるのと同様に、トランス相補性細胞株において発現させることができる。
【０１５３】
高力価のＥ２ｂ欠失Ａｄ粒子の成長において使用するためのＥ１遺伝子産物とＥ２ｂ遺伝子産物を同時発現する細胞株を使用することができる。有用な細胞株は、およそ１４０ｋＤａのＡｄ−ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはおよそ９０ｋＤａの末端タンパク質前駆体を構成的に発現する。毒性を伴わずに、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体を高レベルで構成的に同時発現する細胞株（例えば、Ｅ．Ｃ７）が、複数回のワクチン接種において使用するためのＡｄの繁殖に使用するのに望ましい。これらの細胞株により、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。
【０１５４】
本発明の組換え型Ａｄは、例えば、Ａｄベクターウイルスストックを適切なＭＯＩ（例えば、５）で感染させ、３７℃で４０〜９６時間インキュベートしたＥ．Ｃ７細胞を含有する組織培養プレートを使用して繁殖させることができる。感染細胞を回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、超音波処理することができ、２ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離によってウイルスを精製することができる。ウイルスを含有するバンドをカラムにわたって脱塩することができ、スクロースまたはグリセロールを添加することができ、アリコートを−８０℃で保管することができる。ウイルスを、Ａ１９５などの、その安定性が増強するように設計された溶液に入れることができる。ストックの力価を測定することができる（例えば、溶解後にウイルスのアリコートの２６０ｎｍにおける光学濃度を測定することによって）。組換え型Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクター全体を包含する直鎖状または環状のプラスミドＤＮＡをＥ．Ｃ７、または同様の細胞にトランスフェクトし、３７℃で、ウイルス産生の証拠（例えば、細胞変性効果）が示されるまでインキュベートすることができる。精製前に、産生されるウイルスの量を増大させるために、細胞からの馴化培地を使用してより多くの細胞に感染させることができる。精製は、例えば、２ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離または選択的濾過によって達成することができる。市販の製品または特注のクロマトグラフィーカラムを使用して、クロマトグラフィーによってウイルスを精製することができる。
【０１５５】
本発明の組成物は、感染させる細胞がある特定の数のウイルスに直面することを確実にするために十分なウイルスを含み得る。したがって、種々の実施形態では、本発明は、組換え型ＡｄのＲＣＡフリーストックなどの、組換え型Ａｄのストックを提供する。ウイルスストックは、主にウイルス遺伝子型およびプロトコールおよびそれらを調製するために使用される細胞株に応じて、力価が相当に変動し得る。ウイルスストックの力価は、少なくとも約１０６ｐｆｕ／ｍＬ、１０７ｐｆｕ／ｍＬ、または１０８ｐｆｕ／ｍＬ、またはそれ超、例えば、少なくとも約１０９ｐｆｕ／ｍＬ、１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、１０１１ｐｆｕ／ｍＬ、または１０１２ｐｆｕ／ｍＬなどであり得る。組換え型ウイルスおよびパッケージング細胞株の性質に応じて、本発明のウイルスストックの力価は、１ｍｌ当たり粒子約１０１３個またはそれ超でさえあり得る。
【０１５６】
抗原標的をコードするポリヌクレオチドおよびバリアント
本開示は、さらに、本明細書では１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドとも称される核酸配列を提供する。したがって、本発明は、本明細書にさらに記載されている任意の供給源に由来する標的抗原をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、および、そのような発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。所望の標的抗原ポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切なＡｄベクターに挿入することができる（例えば、組換え技法を使用して）。適切なアデノウイルスベクターは、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントならびに任意の所望のリンカーを含有し得る。当業者に周知の方法は、目的のポリペプチドおよび適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントをコードする配列を含有するこれらのアデノウイルスベクターを構築するために使用することができる。これらの方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。
【０１５７】
ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、本発明の標的抗原ポリペプチド／タンパク質／エピトープまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよく、そのような配列のバリアント、断片、または誘導体をコードする配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、標的抗原タンパク質をコードするものであってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ネイティブなヌクレオチド配列またはバリアントからは実質的に変動し得るが同様のタンパク質抗原をコードする、特定の細胞型における発現のために最適化された新規の遺伝子配列を表す。
【０１５８】
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、タンパク質（例えば、目的の標的抗原）をコードするネイティブな配列に対して実質的な同一性を有し、例えば、ポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ超の配列同一性を有する（例えば、標準のパラメータを使用したＢＬＡＳＴ解析）。これらの値は、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置決めなどを考慮に入れることによって決定するために適切に補正することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ネイティブなポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ超の配列同一性を含むタンパク質をコードするものであってよい。
【０１５９】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチド（例えば、標的タンパク質抗原）をコードする少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００またはそれ超の連続したヌクレオチド、およびその間の全ての中間の長さのヌクレオチドを含み得る。「中間の長さ」とは、この場合、例として出された値の任意の長さ、例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００から５００まで、５００から１，０００までの全ての整数を含むなどを指す。ポリヌクレオチド配列は、一方または両方の末端において、エピトープまたは異種標的タンパク質などのポリペプチドをコードするネイティブな配列には見いだされない追加的なヌクレオチドによって延長することができる。この追加的な配列は、開示された配列のいずれかの末端または開示された配列の両末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドまたはそれ超からなっていてよい。
【０１６０】
ポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、例えばプロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さの核酸断片を使用することができ、全長は意図された組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用のしやすさによって限定されることが好ましいことが意図されている。全長が約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実行に有用であることが意図されている。
【０１６１】
標的抗原配列を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチを使用することができる。ポリペプチド配列の特定の改変は、それらをコードする、基礎をなすポリヌクレオチドの変異誘発によって行うことができる。所望の変異のＤＮＡ配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、ならびにそれが跨がる欠失接合部の両側に安定な２重鎖を形成するためのサイズおよび配列の複雑さが十分であるプライマー配列をもたらすために十分な数の隣接するヌクレオチドを使用することによって変異体を作出するために、部位特異的変異誘発を使用することができる。例えば、約１４〜約２５ヌクレオチドほどの長さのプライマーを、配列の接合部の両側の約５〜約１０残基の変化を伴って使用することができる。変異は、選択されたポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチドの性質を改善する、変化させる、低減する、改変する、または他の点で変化させるため、および／または、コードされるポリペプチドの性質、活性、組成、安定性、または一次配列を変化させるために行うことができる。
【０１６２】
ポリヌクレオチド配列の変異誘発を使用して、ポリペプチドに含まれるエピトープの免疫原性または標的抗原の免疫原性などの、コードされるポリペプチドの１つまたは複数の性質を変化させることができる。ポリペプチドの免疫原性を試験するためのアッセイとしては、これだけに限定されないが、Ｔ細胞傷害性アッセイ（ＣＴＬ／クロム放出アッセイ）、Ｔ細胞増殖アッセイ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔなどが挙げられる。ペプチドの配列バリアントおよびそれらをコードするＤＮＡ配列を得るための他のやり方を使用することができる。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミンなどの変異誘発物質で処理して配列バリアントを得ることができる。
【０１６３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントまたは断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することにより、容易に調製することができる。断片は、ＰＣＲなどの核酸再生技術を適用することによって、組換えによる産生のために、選択された配列を組換えベクターに導入することによって、および、分子生物学の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技法によって得ることができる。
【０１６４】
ポリヌクレオチド配列を含有させ、産生させるために、種々のベクター／宿主系を利用することができる。例示的な系としては、組換え型バクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母ベクターで形質転換した酵母；ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、または細菌ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０１６５】
Ａｄベクター内に存在する制御エレメントまたは調節配列は、ベクターの非翻訳領域（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）−エンハンサー、プロモーター、および５’および３’非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み得る。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、さまざまな適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントを使用することができる。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）配列からなるＡｄ転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現することが可能な生存可能なウイルスを得るために、ウイルスのゲノムの必須ではないＥ１領域またはＥ３領域の挿入を使用することができる。さらに、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させるために、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用することができる。
【０１６６】
目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグナルを使用することもできる（例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列）。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源のものであってよい。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーを含めることによって増強することができる。選択されたポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために、転写または翻訳のいずれかに対して特定の終結配列を組み入れることもできる。
【０１６７】
ポリヌクレオチドにコードされる産物（例えば、標的抗原）の発現を検出および測定するための種々のプロトコールを使用することができる（例えば、産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する）。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。一部の適用には、所与のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する、２部位、モノクローナルに基づくイムノアッセイが好ましい場合があるが、競合結合アッセイも使用することができる。
【０１６８】
Ａｄベクターは、その産物を蛍光、発色基質もしくは蛍光基質などに対する酵素活性によってなどで検出することができる、または成長条件によって選択することができるレポーター遺伝子などの、検出または選択することができる生成物を含み得る。例示的なレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）が挙げられる。例示的な選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシンなどの薬物耐性が挙げられる。
【０１６９】
Ａｄベクターは、プロモーターまたは発現制御配列も含んでよい。プロモーターの選択は、一部において、標的とされる細胞型および所望の制御の程度または型に依存する。本発明に関して適切なプロモーターとしては、限定することなく、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、時間特異的プロモーター、または事象特異的プロモーターが挙げられる。構成的または非特異的プロモーターの例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーター、ウシパピローマウイルスプロモーター、およびアデノウイルスプロモーターが挙げられる。本発明に関しては、ウイルスプロモーターに加えて、細胞性プロモーターも適用できる。特に、いわゆるハウスキーピング遺伝子に対する細胞性プロモーターが有用である（例えば、β−アクチン）。ウイルスプロモーターは、一般に、細胞性プロモーターよりも強力なプロモーターである。誘導性プロモーターも使用することができる。これらのプロモーターとしては、デキサメタゾンによって誘導されるＭＭＴＶ  ＬＴＲ、重金属によって誘導されるメタロチオネイン、およびｃＡＭＰ反応エレメントを有し、ｃＡＭＰによって誘導されるプロモーター、熱ショックプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターを使用することにより、核酸を細胞に送達し、誘導因子が添加されるまで静止したままにすることができる。これにより、目的のタンパク質の産生のタイミングをさらに制御することが可能になる。事象、例えば、エボラ感染などが出現した際にのみ活性になるまたは上方制御される、事象型特異的プロモーター（例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲ）を使用することができる。ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターは、ウイルス感染時に生じるｔａｔ遺伝子産物が存在しなければ不活性である。一部の事象型プロモーターは、組織特異的でもある。好ましい事象型特異的プロモーターとしては、ウイルス感染時に活性化されるプロモーターが挙げられる。
【０１７０】
プロモーターの例としては、α−フェトプロテイン、α−アクチン、ｍｙｏ  Ｄ、癌胎児性抗原、ＶＥＧＦ受容体；ＦＧＦ受容体；ＴＥＫまたはｔｉｅ  ２；ｔｉｅ；ウロキナーゼ受容体；Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン；ＶＣＡＭ−１；エンドグリン；エンドシアリン；αＶ−β３インテグリン；エンドセリン−１；ＩＣＡＭ−３；Ｅ９抗原；フォン・ヴィルブランド因子；ＣＤ４４；ＣＤ４０；血管内皮カドヘリン；ノッチ４、高分子量黒色腫関連抗原；前立腺特異的抗原−１、プロバシン、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ｅｒｂ  Ｂ２；ｅｒｂ  Ｂ３；ｅｒｂ  Ｂ４；ＭＵＣ−１；ＨＳＰ−２７；ｉｎｔ−１；ｉｎｔ−２、ＣＥＡ、ＨＢＥＧＦ受容体；ＥＧＦ受容体；チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ＩＬ−２受容体；前立腺酸性ホスファターゼ、プロバシン、前立腺特異的膜抗原、α−クリスタリン、ＰＤＧＦ受容体、インテグリン受容体、α−アクチン、ＳＭ１およびＳＭ２ミオシン重鎖、カルポニン−ｈ１、ＳＭ２２α−アンジオテンシン受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、およびＣＤ４に対するプロモーターが挙げられる。
【０１７１】
ポリヌクレオチドの非特異的発現を低下させるためにリプレッサー配列、負のレギュレーター、または組織特異的サイレンサーを挿入することができる。複数のリプレッサーエレメントをプロモーター領域に挿入することができる。転写の抑制は、リプレッサーエレメントの方向またはプロモーターからの距離には左右されない。リプレッサー配列の１つの型は、インスレーター配列である。そのような配列は、転写を阻害し、バックグラウンド転写をサイレンシングすることが可能なものである。負の調節エレメントは、いくつもの異なる遺伝子のプロモーター領域に位置していてよい。リプレッサーエレメントは、オボアルブミン遺伝子のプロモーター領域内のＮＳＥと同様に、ステロイドなどの因子の非存在下で、転写のリプレッサーとして機能し得る。これらの負の調節エレメントは、輸卵管由来の特定のタンパク質複合体に結合し得、いずれもステロイドに対して感受性ではない。オボアルブミン遺伝子のプロモーターには３つの異なるエレメントが位置している。これらのエレメントの部分に対応するオリゴヌクレオチドは、ＴＫレポーターのウイルスによる転写を抑制し得る。サイレンサーエレメントのうちの１つは、他の遺伝子内のサイレンサー（ＴＣＴＣＴＣＣＮＡ（配列番号７））と配列同一性を共有する。
【０１７２】
さらに、リプレッサーエレメントは、例えばＩＩ型コラーゲン遺伝子を含めた種々の遺伝子のプロモーター領域に位置していてよい。ＨｅＬａ細胞由来の核因子は、サイレンサー領域を含有するＤＮＡ断片に特異的に結合し得る。リプレッサーエレメントは、カルバミルリン酸合成酵素遺伝子の転写を調節する役割を果たし得る。この遺伝子は、２つの異なる細胞型、肝細胞および腸粘膜の上皮細胞においてのみ発現する。負の調節領域は、コリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域、アルブミンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ−２）遺伝子プロモーター、および６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ遺伝子においても見られ、負の調節エレメントにより非肝細胞株の転写が阻害される。さらに、負の調節エレメントＴｓｅ−１が、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）を含めたいくつもの肝臓に特異的な遺伝子内に位置する。ＴＡＴ遺伝子発現は肝臓に特異的なものであり、グルココルチコイドおよびｃＡＭＰシグナル伝達経路の両方によって誘導可能である。ｃＡＭＰ反応エレメント（ＣＲＥ）は、Ｔｓｅ−１および肝細胞特異的エレメントによる抑制の標的として問うことができる。したがって、様々なそのようなエレメントが公知であるかまたは容易に同定されることが明らかである。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、所望の標的抗原の発現を増大させるエレメントを本明細書に記載されているＡｄベクターの核酸配列に組み入れることができる。例示的なエレメントとしては、内部リボソーム結合性部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。ＩＲＥＳにより、翻訳効率を上昇させることができる。その上、他の配列によっても発現を増強することができる。一部の遺伝子に関しては、特に５’末端の配列により、転写および／または翻訳が阻害され得る。これらの配列は、通常、ヘアピン構造を形成し得るパリンドロームである。一部の場合では、送達される核酸内のそのような配列を欠失させる。転写物または翻訳産物の発現レベルをアッセイして、いずれの配列が発現に影響を及ぼすかを確証または確認することができる。転写レベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプローブ保護などを含めた任意の公知の方法によってアッセイすることができる。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡを含めた任意の公知の方法によってアッセイすることができる。
【０１７４】
エボラ抗原特異的免疫療法およびワクチン
本開示は、本明細書で提供されるベクターおよび他のベクターを利用した、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬなどのエボラ抗原に対する、単一の抗原または組み合わせ抗原による免疫を提供する。本開示は、エボラ抗原に対する治療ワクチンを提供する。本開示は、エボラ抗原に対する予防ワクチンを提供する。さらに、種々の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法により、疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答を導くことができる。
【０１７５】
種々の抗原をコードするＡｄ５［Ｅ１−］ベクターを使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで曝露したＤＣの９５％に効率的に高力価のベクターで形質導入することができる。重要なことに、本発明者らは、ベクターを用いた感染多重度（ＭＯＩ）の増大に伴ってＤＣにおける外来遺伝子発現のレベルが上昇することを発見した。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターを感染させたＤＣは、種々のエボラ抗原をコードし得、抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導する傾向があり、抗原提示能力が増強しており、かつ／または、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を開始する能力が改善されている。腫瘍特異的抗原をコードするＡｄ５ベクターによって予め形質導入した樹状細胞（ＤＣ）を用いた動物の免疫を使用して、その動物に対して、それぞれの抗原を発現する腫瘍細胞によるチャレンジの際に有意なレベルの保護を誘導することができる。興味深いことに、ＩＬ−７をコードするＡｄの腫瘍内注射は、ＩＬ−７をコードするＡｄ５ベクターを用いて形質導入したＤＣの注射よりも抗腫瘍免疫の誘導において効果が低い。Ａｄ５ベクターによるＤＣへのｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入は本開示により意図されている。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ形質導入戦略を使用してレシピエント宿主寛容を誘導することができる。例えば、ＤＣへのＣＴＬＡ４ＩｇのＡｄ５媒介性送達により、ＤＣ  ＣＤ８０とＴ細胞上に存在するＣＤ２８分子の相互作用を遮断することができる。
【０１７６】
Ａｄ５ベクターのカプシドとＤＣの相互作用により、いくつかの有益な応答が誘発され得、これにより、ＤＣの、Ａｄ５ベクターによりコードされる抗原を提示する傾向が増強され得る。例えば、未成熟のＤＣは、抗原の取り込みに特殊化されているが、Ｔ細胞活性化の比較的非効率的なエフェクターである。ＤＣ成熟化と同時にＴ細胞免疫を駆動するＤＣの能力が増強される。一部の例では、本発明の組成物および方法はＤＣ成熟化の直接誘導をもたらすＡｄ５感染を活用する。マウス由来の未成熟の骨髄由来ＤＣへのＡｄベクター感染により、ＤＣ成熟化に通常関連する細胞表面マーカー（ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＡＭ−１）が上方制御され得、ならびに、骨髄ＤＣ成熟化の際に下方制御されるインテグリンであるＣＤ１１ｃが下方制御され得る。一部の例では、Ａｄベクター感染により、ＤＣによる、ＤＣ成熟化のマーカーであるＩＬ−１２の産生が誘発される。理論に束縛されることなく、これらの事象は、おそらく、Ａｄ５により誘発されるＮＦ−κＢ経路の活性化に起因し得る。成熟ＤＣは、Ａｄベクターにより効率的に形質導入することができ、また、成熟ＣＤ８３＋ヒトＤＣ（末梢血単球に由来する）によって実証される通り、低ＭＯＩにおいてナイーブなＴ細胞の増殖を刺激するそれらの機能的潜在性は失われない。しかし、成熟ＤＣはまた、未成熟ＤＣよりも感染しにくい可能性がある。
【０１７７】
通常のＣＡＲ受容体感染機構を使用するのではなく、例えば、ＣＤ４０Ｌ受容体をウイルスベクター受容体として使用して、ＡｄベクターによるＤＣの感染を最適化するため、ならびに機能的成熟化を増強するための戦略として、カプシドタンパク質の改変を使用することができる。
【０１７８】
種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、またはそれらの任意の組み合わせのワクチンを含む本発明の組成物および方法により、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大がもたらされる。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＧＰワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＮＰワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＶＰ４０ワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＶＰ３５ワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＶＰ３０ワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＶＰ２４ワクチンを含み得る。例えば、本発明の組成物および方法は、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大をもたらすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）Ｌワクチンを含み得る。
【０１７９】
上記の通り、本発明のアデノウイルスベクターは、目的の１つまたは複数の標的タンパク質または抗原をコードする核酸配列を含む。この点について、ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の異なる目的の標的抗原をコードする核酸を含有し得る。標的抗原は、全長のタンパク質であってもよく、その断片（例えば、エピトープ）であってもよい。アデノウイルスベクターは、１つの目的の標的タンパク質に由来する複数の断片またはエピトープをコードする核酸配列を含有してもよく、複数の異なる目的の標的タンパク質に由来する１つまたは複数の断片またはエピトープを含有してもよい。
【０１８０】
標的抗原は、それに対する免疫応答が生じることが望ましい任意の物質であってよいが、一般に、標的抗原はタンパク質である。標的抗原は、免疫応答を誘導する全長のタンパク質、タンパク質のサブユニット、タンパク質のアイソフォームまたはその断片（すなわち、免疫原性断片）を含むものであってよい。標的抗原またはその断片は、例えば、標的抗原の１つまたは複数の生物活性が低下するように、または、その免疫原性が増強されるように、改変することができる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、免疫原性断片は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。免疫原性断片は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子への結合が当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能であれば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に「結合する」ことができるものである。例えば、ポリペプチドのＭＨＣクラスＩに結合する能力は、ＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への１２５Ｉ標識されたβ−２−ミクログロブリン（β−２ｍ）の組み入れを促進する能力をモニターすることによって間接的に評価することができる（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：１６３，  １９９４を参照のこと）。あるいは、当技術分野で公知である機能性ペプチド競合アッセイを使用することができる。ポリペプチドの免疫原性断片は、一般に、同定することができる。免疫原性断片を同定するための代表的な技法としては、ポリペプチドを、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力についてスクリーニングすることが挙げられる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性断片は、そのような抗血清および／またはＴ細胞と、全長標的ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで反応する断片である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）。言い換えれば、免疫原性断片は、そのようなアッセイ内で、全長ポリペプチドの反応性と同様であるかまたはそれを超えるレベルで反応し得る。そのようなスクリーニングは、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、免疫応答を調節することができる、１つまたは複数のタンパク質、そのバリアント、その融合物またはその断片をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、炭疽防御抗原などの特定の抗原に対する１つまたは複数の抗体をコードし、受動免疫療法を可能にするものである。一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、治療効果（例えば、抗ウイルス機能、抗細菌機能、駆虫機能、または抗エボラ機能）を有する１つまたは複数のタンパク質をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、第２世代Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターは、異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸配列は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、バリアント、部分、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１８３】
標的抗原としては、これだけに限定されないが、種々のエボラウイルスに由来する抗原が挙げられる。一部の実施形態では、エボラタンパク質の部分またはバリアントを標的抗原として使用する。一部の実施形態では、標的抗原として使用されるエボラタンパク質の部分またはバリアントは、エボラタンパク質またはそれを含有する細胞に対する免疫応答をもたらす、改変された、例えば、増大された能力を有する。本発明のワクチンにより、抗原に対するワクチン接種を行うことができる。ワクチンは、エピトープを標的とするものであってもよい。抗原は、エボラウイルス抗原であってよい。エピトープは、エボラウイルスエピトープであってよい。そのようなエボラウイルスエピトープは、変異から生じたエボラウイルスに由来する抗原、および共有されるエボラ種特異的抗原などの、多種多様なエボラウイルスに由来するものであってよい。エボラ抗原（ＥＡ）は、通常は宿主によって発現されない抗原であってよい。エボラ関連抗原は、例えば、タンパク質またはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生体分子またはそれらの任意の組み合わせであってよい。
【０１８４】
本発明において有用な例示的なエボラタンパク質としては、これだけに限定されないが、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、およびＬのうちの任意の１つまたは複数が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、およびＬから選択される改変ポリペプチドをコードする標的抗原配列を含み、ポリペプチドまたはその断片は、記載の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する。
【０１８５】
本発明者らは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬを用いた複数回の同種免疫により、動物に既存のまたは誘導されたＡｄ５中和抗体が存在するにもかかわらず、抗エボラ活性を伴うＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬに特異的な細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答が誘導されることを発見した。エボラを有する患者のコホートを、漸増用量のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬを用いて免疫することができる。エボラに感染した被験体では、新規のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］遺伝子送達プラットフォームにより、Ａｄ５特異的免疫が自然に獲得された状況と免疫により誘導された状況のどちらにおいても、ＥＡであるＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬに対する有意なＣＭＩ応答が生じる。
【０１８６】
ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬ抗原特異的ＣＭＩは、例えば、１０超、２０超、３０超、４０超、５０超、１００超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、５０００超、１００００超、またはそれ超の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）であり得る。一部の実施形態では、免疫応答は、既存のＡｄ５中和抗体力価の逆数が５０超、１００超、１５０超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、５０００超、６０００超、７０００超、８０００超、９０００超、１０００超、１２０００超、１５０００超またはそれ超であるヒト被験体において生じる。免疫応答は、本明細書に記載されている通り細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）および／または体液性免疫を含み得る。免疫応答は、本明細書に記載されている通り、および当業者が利用可能である限りでは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、クロムの放出または等価のアッセイを含めた細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、およびさまざまなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用した遺伝子発現解析のうちの１つまたは複数、ならびに、免疫応答を測定するための当技術分野で公知の任意の他の適切なアッセイによって測定することができる。
【０１８７】
一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、ポリペプチドの野生型サブユニットに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するサブユニットをコードする改変された配列を含む。免疫原性ポリペプチドは、変異体ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬまたはそれらの断片であってよい。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号１の配列を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号１、２、４、５または６に対して少なくとも７０％  ７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号１、２、４、５または６から代替コドンによる置き換えによって生じた配列を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬ配列と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ超含む。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、エボラ抗原は、エボラウイルスに感染した個体から直接同定することができる。この点について、種々の公知の技術を使用してスクリーニングを行うことができる。例えば、一実施形態では、患者から細胞または組織生検材料を取得し、試料細胞からＲＮＡを単離し、遺伝子チップ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．からのもの）を使用してスクリーニングして、エボラウイルス抗原を同定する。エボラウイルス標的抗原が同定されたら、次いで、それを、当技術分野で公知の技法を使用してクローニングし、発現させ、精製することができる。
【０１９０】
次いで、この標的抗原を、１つもしくは複数のエピトープに連結するか、または、本明細書に記載されているカセットまたはウイルスベクターに組み入れるかもしくはそれに連結し、エボラに感染した患者由来の試料から単離された標的分子に対する免疫応答を変化させるために、患者に投与する。このように、本発明に関しては、「個人向けの」免疫療法およびワクチンが意図されている。一部の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６またはこれらの組み合わせに関連する個人向けのエボラ抗原を患者から特徴付け、標的抗原として、全体として、一部、またはバリアントとしてさらに利用する。
【０１９１】
組み合わせ免疫療法およびワクチン
本開示は、エボラ感染を処置するための組み合わせ免疫療法およびワクチン組成物を提供する。一部の態様では、本明細書において提示される組み合わせ免疫療法およびワクチンは、エボラ感染に関連する抗原に対する多標的化免疫療法薬アプローチを含み得る。一部の態様では、本明細書において提示される組み合わせ免疫療法およびワクチンは、エボラ感染に関連する抗原に対する多標的化抗原シグネチャ免疫療法薬アプローチを含み得る。種々の実施形態では、本発明の組成物および方法は、本明細書において提示されるエボラの免疫のための、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬの野生型またはバリアントを発現するウイルスをベースとしたベクターを提供する。これらのベクターにより、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬに対する免疫応答を生じさせることができる。
【０１９２】
一部の態様では、ベクターは、少なくとも１つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、少なくとも３つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、３つ超の抗原を含む。一部の態様では、ワクチン製剤は、ベクターと抗原を１：１の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：２の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：３の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：４の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：５の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：６の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：７の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：８の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：９の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：１０の比率で含む。
【０１９３】
一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原を含有する少なくとも２つのベクターを含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原標的を含有する少なくとも３つのベクターを含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原を含有する３つ超のベクターを含む。
【０１９４】
一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、少なくとも２つのベクターを含み、少なくとも２つのベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、少なくとも２つのベクターの第２のベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、少なくとも３つのベクターを含み、少なくとも３つのベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、少なくとも３つのベクターの第２のベクターは少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、３つまたはそれ超のベクターを含み、３つまたはそれ超のベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、３つまたはそれ超のベクターの第２のベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも２つの抗原を含有する３つ超のベクターを含む。
【０１９５】
種々の抗原の混合物を同時に投与する、または個体において同じベクターもしくは異なるベクターから発現させる場合、これらは互いと競合し得る。結果として、組み合わせ免疫療法またはワクチン中の発現された抗原を異なる濃度および比率で含む製剤は、投与後に有効かつ持続的な免疫応答が生じることを確実にするために、評価し、個体または個体の群に合わせて調整しなければならない。
【０１９６】
複数の抗原を含む組成物は、種々の比率で存在し得る。例えば、１つ超のベクターを伴う製剤は、種々の比率を有し得る。例えば、免疫療法またはワクチンは、２つの異なるベクターを以下の化学量論で有し得る：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、２：１、２：３、２：４、２：５、２：６、２：７、２：８、３：１、３：３、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、３：１、３：３、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、４：１、４：３、４：５、４：６、４：７、４：８、５：１、５：３、５：４、５：６、５：７、５：８、６：１、６：３、６：４、６：５、６：７、６：８、７：１、７：３、７：４、７：５、７：６、７：８、８：１、８：３、８：４、８：５、８：６、または８：７。例えば、免疫療法またはワクチンは、３つの異なるベクターを以下の化学量論で有し得る：１：１：１、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、２：１：１、２：３：１、２：４：１、２：５：１、２：６：１、２：７：１、２：８：１、３：１、３：３：１、３：４：１、３：５：１、３：６：１、３：７：１、３：８：１、３：１：１、３：３：１、３：４：１、３：５：１、３：６：１、３：７：１、３：８：１、４：１：１、４：３：１、４：４：１、４：５：１、４：６：１、４：７：１、４：８：１、５：１：１、５：３：１、５：４：１、５：５：１、５：６：１、５：７：１、５：８：１、６：１：１、６：３：１、６：４：１、６：５：１、６：６：１、６：７：１、６：８：１、７：１：１、７：３：１、７：４：１、７：５：１、７：６：１、７：７：１、７：８：１、８：１：１、８：３：１、８：４：１、８：５：１、８：６：１、８：７：１、８：８：１、１：１：２、１：２：２、１：３：２、１：４：２、１：５：２、１：６：２、１：７：２、１：８：２、２：１：２、２：３：２、２：４：２、２：５：２、２：６：２、２：７：２、２：８：２、３：１：２、３：３：２、３：４：２、３：５：２、３：６：２、３：７：２、３：８：２、３：１：２、３：３：２、３：４：２、３：５：２、３：６：２、３：７：２、３：８：２、４：１：２、４：３：２、４：４：２、４：５：２、４：６：２、４：７：２、４：８：２、５：１：２、５：３：２、５：４：２、５：５：２、５：６：２、５：７：２、５：８：２、６：１：２、６：３：２、６：４：２、６：５：２、６：６：２、６：７：２、６：８：２、７：１：２、７：３：２、７：４：２、７：５：２、７：６：２、７：７：２、７：８：２、８：１：２、８：３：２、８：４：２、８：５：２、８：６：２、８：７：２、８：８：２、１：１：３、１：２：３、１：３：３、１：４：３、１：５：３、１：６：３、１：７：３、１：８：３、２：１：３、２：３：３、２：４：３、２：５：３、２：６：３、２：７：３、２：８：３、３：１：３、３：３：３、３：４：３、３：５：３、３：６：３、３：７：３、３：８：３、３：１：３、３：３：３、３：４：３、３：５：３、３：６：３、３：７：３、３：８：３、４：１：３、４：３：３、４：４：３、４：５：３、４：６：３、４：７：３、４：８：３、５：１：３、５：３：３、５：４：３、５：５：３、５：６：３、５：７：３、５：８：３、６：１：３、６：３：３、６：４：３、６：５：３、６：６：３、６：７：３、６：８：３、７：１：３、７：３：３、７：４：３、７：５：３、７：６：３、７：７：３、７：８：３、８：１：３、８：３：３、８：４：３、８：５：３、８：６：３、８：７：３、８：８：３、１：１：４、１：２：４、１：３：４、１：４：４、１：５：４、１：６：４、１：７：４、１：８：４、２：１：４、２：３：４、２：４：４、２：５：４、２：６：４、２：７：４、２：８：４、３：１：４、３：３：４、３：４：４、３：５：４、３：６：４、３：７：４、３：８：４、３：１：４、３：３：４、３：４：４、３：５：４、３：６：４、３：７：４、３：８：４、４：１：４、４：３：４、４：４：４、４：５：４、４：６：４、４：７：４、４：８：４、５：１：４、５：３：４、５：４：４、５：５：４、５：６：４、５：７：４、５：８：４、６：１：４、６：３：４、６：４：４、６：５：４、６：６：４、６：７：４、６：８：４、７：１：４、７：３：４、７：４：４、７：５：４、７：６：４、７：７：４、７：８：４、８：１：４、８：３：４、８：４：３、８：５：４、８：６：４、８：７：４、８：８：４、１：１：５、１：２：５、１：３：５、１：４：５、１：５：５、１：６：５、１：７：５、１：８：５、２：１：５、２：３：５、２：４：５、２：５：５、２：６：５、２：７：５、２：８：５、３：１：５、３：３：５、３：４：５、３：５：５、３：６：５、３：７：５、３：８：５、３：１：５、３：３：５、３：４：５、３：５：５、３：６：５、３：７：５、３：８：５、４：１：５、４：３：５、４：４：５、４：５：５、４：６：５、４：７：５、４：８：５、５：１：５、５：３：５、５：４：５、５：５：５、５：６：５、５：７：５、５：８：５、６：１：５、６：３：５、６：４：５、６：５：５、６：６：５、６：７：５、６：８：５、７：１：５、７：３：５、７：４：５、７：５：５、７：６：５、７：７：５、７：８：５、８：１：５、８：３：５、８：４：５、８：５：５、８：６：５、８：７：５、８：８：５、１：１：６、１：２：６、１：３：６、１：４：６、１：５：６、１：６：６、１：７：６、１：８：６、２：１：６、２：３：６、２：４：６、２：５：６、２：６：６、２：７：６、２：８：６、３：１：６、３：３：６、３：４：６、３：５：６、３：６：６、３：７：６、３：８：６、３：１：６、３：３：６、３：４：６、３：５：６、３：６：６、３：７：６、３：８：６、４：１：６、４：３：６、４：４：６、４：５：６、４：６：６、４：７：６、４：８：６、５：１：６、５：３：６、５：４：６、５：５：６、５：６：６、５：７：６、５：８：６、６：１：６、６：３：６、６：４：６、６：５：６、６：６：６、６：７：６、６：８：６、７：１：６、７：３：６、７：４：６、７：５：６、７：６：６、７：７：６、７：８：６、８：１：６、８：３：６、８：４：６、８：５：６、８：６：５、８：７：６、８：８：６、１：１：７、１：２：７、１：３：７、１：４：７、１：５：７、１：６：７、１：７：７、１：８：７、２：１：７、２：３：７、２：４：７、２：５：７、２：６：７、２：７：７、２：８：７、３：１：７、３：３：７、３：４：７、３：５：７、３：６：７、３：７：７、３：８：７、３：１：７、３：３：７、３：４：７、３：５：７、３：６：７、３：７：７、３：８：７、４：１：７、４：３：７、４：４：７、４：５：７、４：６：７、４：７：７、４：８：７、５：１：７、５：３：７、５：４：７、５：５：７、５：６：７、５：７：７、５：８：７、６：１：７、６：３：７、６：４：７、６：５：７、６：６：７、６：７：７、６：８：７、７：１：７、７：３：７、７：４：７、７：５：７、７：６：７、７：７：７、７：８：７、８：１：７、８：３：７、８：４：７、８：５：７、８：６：５、８：７：７、または８：８：７。
【０１９７】
本開示は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含む組み合わせ免疫療法またはワクチンを提供する。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、野生型または改変された標的抗原は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、野生型または改変された標的抗原は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、野生型または改変された標的抗原は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、野生型または改変された標的抗原は、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、野生型または改変された標的抗原は、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１９８】
一部の態様では、本開示は、ＥＡに対する多標的化免疫療法薬と、免疫阻害経路の少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物とを含む組み合わせ免疫療法を提供する。本開示は、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原と、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む少なくとも１つの分子組成物とを含む組み合わせ免疫療法またはワクチンを提供する。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、野生型または改変されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬをコードする配列を含む少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原と、免疫チェックポイント阻害性経路の少なくとも１つの分子組成物を含んでよく、ここで、改変された標的抗原は、配列番号１、２、４、５、および／または６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１９９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、ＣＴＬＡ４を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子は、ＰＤ１を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、ＰＤＬ１を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、ＬＡＧ３を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、Ｂ７−Ｈ３を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、Ｂ７−Ｈ４を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子組成物は、ＴＩＭ３を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。一部の実施形態では、分子組成物は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３（すなわち、ＨＡＶｃｒ２）、ＧＡＬ９、およびＡ２ａＲに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む。
【０２００】
免疫学的融合パートナー抗原標的
本発明のウイルスベクターは、標的抗原の免疫原性を増大させるタンパク質をコードする核酸配列も含み得る。この点について、そのようなタンパク質を含有するアデノウイルスベクターを用いた免疫後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原と目的の標的抗原の免疫原性を増大させるタンパク質が融合した融合タンパク質であり得る。
【０２０１】
一実施形態では、そのような免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２断片などの、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．に由来するものである。Ｒａ１２組成物、および異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性の増強においてそれらを使用する方法は、米国特許出願第６０／１５８，５８５号および米国特許第７，００９，０４２号に記載されている。簡単に述べると、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域を指す。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および無毒性株の遺伝子によりコードされる３２ｋＤａのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が記載されている（例えば、米国特許出願第６０／１５８，５８５号；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．、６７巻：３９９８〜４００７頁（１９９９年）を参照されたい）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端断片は、高レベルで発現し、精製プロセス全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ｒａ１２は、それが融合している異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つのＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ｋＤａのＣ末端断片を含む。他のＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５、３０、６０、１００、２００、３００、またはそれ超のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよく、そのような配列のバリアントを含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチドバリアントは、コードされる融合ポリペプチドの生物活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に低下しないような１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得る。バリアントは、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、８０％、または９０％、またはそれ超の同一性を有し得る。
【０２０２】
免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質であるタンパク質Ｄに由来するものであってよい。一部の場合では、タンパク質Ｄ誘導体は、およそタンパク質の最初の３分の１（例えば、最初のＮ末端の１００〜１１０アミノ酸）を含む。タンパク質Ｄ誘導体は、脂質付加されたものであってよい。ある特定の実施形態の範囲内では、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基をＮ末端に含めて、ポリペプチドに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを上昇させることができ、発現エンハンサーとして機能し得る追加的な外因性Ｔ細胞エピトープをもたらす。脂質尾部により、抗原提示細胞への最適な抗原の提示を確実にすることができる。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質であるＮＳ１（赤血球凝集素）が挙げられる。一般には、Ｎ末端の８１アミノ酸を使用するが、Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なる断片を使用することができる。
【０２０３】
免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）であってよい。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格内のある特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはＤＥＡＥなどの一部のコリン類似体に対する親和性に関与する。この性質は、融合タンパク質を発現させるために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発に活用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製を使用することができる。別の実施形態の範囲内では、ＬＹＴＡの反復部分を融合ポリペプチドに組み入れることができる。反復部分は、例えば、残基１７８で始まるＣ末端領域において見いだすことができる。１つの特定の反復部分には残基１８８〜３０５が組み入れられる。
【０２０４】
一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分を含む。一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む１つまたは複数の免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３をコードする核酸、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３に対して実質的な同一性を有するタンパク質、ならびに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性成分を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分と融合または連結している。一部の実施形態では、抗原標的を細胞においてＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分と同時発現させる。
【０２０６】
免疫経路チェックポイントモジュレーター
一部の実施形態では、本発明の組成物を１つまたは複数の免疫経路チェックポイントモジュレーターと一緒に投与する。活性化シグナルと阻害シグナルの平衡によりＴリンパ球と疾患細胞の相互作用が調節され、ここで、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって開始される。阻害性の経路およびシグナルは、免疫チェックポイントと称される。正常な状況では、免疫チェックポイントは、自己免疫の制御および防止において重大な役割を果たし、また、病原性感染に応答して組織傷害からの保護も行う。
【０２０７】
本開示は、エボラ感染を処置するための、免疫チェックポイント阻害性経路を調節するためのウイルスベクターをベースとしたワクチンおよび組成物を含む組み合わせ免疫療法を提供する。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質の発現または活性を増大させることである。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質の発現または活性を低下させることである。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質のファミリーに影響を及ぼすものである。
【０２０８】
一般に、免疫阻害経路は、リガンド−受容体相互作用によって開始される。現在では、疾患において、疾患が、被験体において免疫耐性を誘導するための機構として免疫チェックポイント経路を利用することが明らかになっている。
【０２０９】
所与の疾患による被験体における免疫耐性または免疫阻害経路の誘導は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンド、受容体もしくはタンパク質の組換え型などの分子組成物、または免疫阻害経路の１つまたは複数を調節することが公知である抗体（Ｉｇ融合タンパク質であり得る）によって遮断することができる。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）などの、免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬を用いた予備臨床所見から、抗腫瘍免疫の増強の見込みが示されている。
【０２１０】
疾患細胞は複数の阻害性リガンドを発現することが可能であり、また、疾患浸潤性リンパ球は複数の阻害性受容体を発現するので、免疫チェックポイントタンパク質の二重または三重の遮断により、抗疾患免疫を増強することができる。本明細書で提示される組み合わせ免疫療法は、以下の免疫チェックポイントタンパク質のうちの１つまたは複数を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物を１つまたは複数含み得る：ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７−Ｓ１、Ｂ７ｘおよびＶＣＴＮ１としても公知）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知）、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知）、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３（ＨＡＶｃｒ２としても公知）、ＧＡＬ９、Ａ２ａＲおよびアデノシン。一部の実施形態では、分子組成物は、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、分子組成物は、小分子を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、リガンドの組換え型を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、受容体の組換え型を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、抗体を含む。一部の実施形態では、組み合わせ療法は、１つ超の分子組成物および／または１つ超の型の分子組成物を含む。当業者には理解される通り、今後発見される免疫チェックポイント阻害性経路のタンパク質も、本開示に包含されることが企画される。
【０２１１】
一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＣＴＬＡ４を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＰＤ１を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＰＤＬ１を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＬＡＧ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、Ｂ７−Ｈ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、Ｂ７−Ｈ４を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＴＩＭ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、調節は、発現の増大または増強である。他の実施形態では、調節は、発現の減少または欠如である。
【０２１２】
２つの例示的な免疫チェックポイント阻害剤として、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ１）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞において排他的に発現することが可能であり、そこでＴ細胞活性化の初期段階を調節する。ＣＴＬＡ−４は、共刺激性Ｔ細胞受容体ＣＤ２８と相互作用し、それにより、Ｔ細胞活性を阻害するシグナル伝達がもたらされ得る。ＴＣＲ抗原認識が起こったら、ＣＤ２８シグナル伝達によりＴＣＲシグナル伝達が増強され得、一部の場合では、活性化Ｔ細胞が導かれ、ＣＴＬＡ−４によりＣＤ２８のシグナル伝達活性が阻害される。本開示は、エボラ感染を処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法とＣＴＬＡ−４分子組成物の組み合わせを提供する。
【０２１３】
プログラム死細胞タンパク質リガンド−１（ＰＤＬ１）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、様々な組織および細胞型に分布している。ＰＤＬ１は、ＰＤ１阻害性Ｔ細胞活性化およびＣＴＬ媒介性溶解と相互作用し得る。ＰＤＬ１の有意な発現は種々のヒト腫瘍において実証されており、ＰＤＬ１発現は、腫瘍が宿主の抗腫瘍免疫応答から逃れる重要な機構の１つである。プログラム死−リガンド１（ＰＤＬ１）とプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ１）は、免疫チェックポイントとして相互作用する。この相互作用は、抗腫瘍免疫応答の鈍化およびその後の腫瘍の進行をもたらす主要な寛容機構であり得る。ＰＤ１は、活性化Ｔ細胞上に存在し、ＰＤ１の主要なリガンドであるＰＤＬ１は、多くの場合、腫瘍細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびにＢ細胞を含めた他の細胞上に発現する。ＰＤＬ１の有意な発現がＨＰＶ関連頭頸部がんを含めた種々のヒト腫瘍において実証されている。ＰＤＬ１は、Ｔ細胞上でＰＤ１と相互作用し、それによりＴ細胞活性化および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性溶解を阻害する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法とＰＤ１または抗ＰＤＬ１分子組成物の組み合わせを提供する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、エボラを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ１、ＰＤＬ１、モノクローナル抗体、またはこれらの組み合わせの組み合わせを提供する。
【０２１４】
免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞によって発現され得る。免疫チェックポイント分子は、免疫応答を下方調節または阻害するための「ブレーキ」として有効に機能し得る。免疫チェックポイント分子としては、これだけに限定されないが、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死１（ＰＤ１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても公知、受託番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知、受託番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知、受託番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＩＶＳＴＭ３としても公知、受託番号：ＮＭ＿１７３７９９）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣＩＯ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても公知、受託番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦｌ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられる。例えば、それを必要とする患者を処置するために、ＰＤ１を本発明のアデノウイルスワクチンと組み合わせることができる。
【０２１５】
表１は、網羅的なものではなく、本発明のアデノウイルスワクチンの効率を改善するために不活性化することができる例示的な免疫チェックポイント遺伝子を示す。免疫チェックポイント遺伝子は、表１に列挙されている遺伝子、ならびに共阻害性受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、ＴＣＲシグナル伝達、誘導性Ｔ−ｒｅｇ抑制、転写因子制御性消耗またはアネルギー、および低酸素症媒介性寛容性に関与するその他の遺伝子から選択することができる。
【表１】
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【０２１６】
アデノウイルスをベースとしたワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者におけるエボラ感染、進行、または症状の低減がもたらされ得る。本発明の別の実施形態では、アデノウイルスをベースとしたワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者の改善された全生存がもたらされ得る。一部の場合では、アデノウイルスワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者におけるエボラ特異的Ｔ細胞応答の頻度または強度が増大し得る。
【０２１７】
本発明には、アデノウイルスベクターをベースとしたワクチンの性能を改善するための、免疫チェックポイント阻害の使用も開示されている。上記免疫チェックポイント阻害は、ワクチン時に施行することができる。上記免疫チェックポイント阻害は、ワクチン後に施行することもできる。免疫チェックポイント阻害は、アデノウイルスワクチン投与と同時に起こり得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の１分後、２分後、３分後、４分後、５分後、６分後、７分後、８分後、９分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、４０分後、５０分後、または６０分後に起こり得る。免疫チェックポイント阻害はまた、ワクチン接種の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、または２４時間後に起こり得る。一部の場合では、免疫阻害は、ワクチン接種の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日後に起こり得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の前後の任意の時点で起こり得る。
【０２１８】
別の態様では、本発明は、抗原と免疫経路チェックポイントモジュレーターとを含むワクチンに関する。本発明は、被験体の細胞における免疫チェックポイントタンパク質、例えばＰＤ１、およびその天然の結合パートナー（複数可）の下方制御が有益であると思われる状態を有する被験体を処置するための方法に関し得る。
【０２１９】
免疫経路チェックポイントモジュレーターは、任意の抗原を含むアデノウイルスワクチンと組み合わせることができる。例えば、抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬであってよい。免疫経路チェックポイントモジュレーターをワクチンと組み合わせると、相乗効果が生じ得る。免疫経路チェックポイントモジュレーターをワクチンと組み合わせると、相加効果も生じ得る。
【０２２０】
製剤
本発明は、単独で、または薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、任意の経路によって投与することができるワクチン接種レジメンを含む医薬組成物を提供し、そのような投与は、単回投薬および複数回投薬のどちらでも行うことができる。より詳細には、医薬組成物は、種々の薬学的に許容される不活性な担体と、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ剤、手持ちキャンディ（ｈａｎｄ  ｃａｎｄｙ）、散剤、噴霧剤、水性懸濁剤、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形態で組み合わせることができる。そのような担体としては、固体希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および種々の無毒性の有機溶媒などが挙げられる。さらに、そのような経口医薬製剤は、当該目的のために一般に使用される種々の型の薬剤を用いて適切に甘味および／または風味を付けることができる。全体を通して記載されている組成物は、医薬品として製剤化することができ、疾患、例えば、エボラと診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物を処置するために使用することができる。
【０２２１】
投与に関して、アデノウイルスベクターストックを適切な緩衝液、生理的に許容される担体、賦形剤などと組み合わせることができる。ある特定の実施形態では、適切な数のウイルスベクター粒子（ＶＰ）を、滅菌ＰＢＳまたは食塩水などの適切な緩衝液中で投与する。本明細書に開示されているある特定の実施形態のウイルスベクター組成物は、皮下投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、または、さらには腹腔内投与のための特定の製剤として提供される。ある特定の実施形態では、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液の製剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合した水中に調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、スクアレンをベースとしたエマルション、スクアレンをベースとした水中油エマルション、油中水エマルション、水中油エマルション、非水性エマルション、パラフィン油中水エマルション、ならびにそれらの混合物ならびに油中の分散物も調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、嚥下によってまたは坐薬として投与する丸剤形態のための特定の製剤として提供することができる。
【０２２２】
注射による使用に適した例示的な医薬形態としては、滅菌された注射溶液または分散物を即時調製するための滅菌水溶液または分散物および滅菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りでは、流体形態が好ましい場合がある。製造および保管の条件下で安定な形態は本発明の範囲内に入る。種々の実施形態では、形態を、細菌、カビおよび真菌などの微生物の混入作用から保護する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および／または界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールによって容易にすることができる。等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい場合がある。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらすことができる。
【０２２３】
一実施形態では、水溶液として非経口投与するために、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、液体希釈剤をまず十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者には分かるであろう。例えば、１回投薬量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解させ、皮下注入用流体１０００ｍＬに添加するかまたは提唱される注入部位に注射することができる。処置を受ける被験体の状態に応じて投薬量のいくらかの変動が生じ得る。
【０２２４】
製剤の担体は、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを含んでよい。任意の従来の媒体または薬剤は、活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物への使用が意図されている。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、およびＬ。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、アジュバントなどの１つまたは複数の免疫賦活薬と併せて投与することができる。免疫賦活薬とは、抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞媒介性）を増強または強化する基本的にあらゆる物質を指す。免疫賦活薬の１つの型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントが、抗原を迅速な異化から保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油など、および免疫応答の刺激物質、例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来するタンパク質などを含有する。ある特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；陽イオン性にまたは陰イオン性に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａなどが市販されている。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１３などのサイトカイン、および増殖因子のようなその他のものもアジュバントとして使用することができる。
【０２２６】
本発明のある特定の実施形態の範囲内では、アジュバント組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するものであってよい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ）応答の誘導に有利な傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導に有利な傾向がある。本明細書において提示されるワクチンの適用後、患者においてＴｈ１型応答および／またはＴｈ２型応答を含む免疫応答が支持され得る。応答が主にＴｈ１型であるある特定の実施形態の範囲内では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルがＴｈ２型サイトカインのレベルよりも大きな程度まで上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準のアッセイを使用して容易に評価することができる。したがって、本発明の種々の実施形態は、複製欠損性ウイルスベクターによる処置と同時に供給されるサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１３を使用して、標的抗原、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対する免疫応答を生じさせる治療に関する。一部の実施形態では、サイトカインまたはサイトカインをコードする核酸を、本明細書に記載されている複製欠損性ウイルスベクターと共に投与する。一部の実施形態では、サイトカイン投与をウイルスベクター投与の前またはその後に実施する。一部の実施形態では、標的抗原、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対する免疫応答を生じさせることが可能な複製欠損性ウイルスベクターは、サイトカインをコードする配列をさらに含む。
【０２２７】
主にＴｈ１型応答を引き出すためのある特定の例示的なアジュバントとしては、例えば、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントが市販されている。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）によっても主にＴｈ１応答が誘導される。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、記載されている。免疫賦活性ＤＮＡ配列も記載されている。本発明において使用するための別のアジュバントは、Ｑｕｉｌ  Ａ、もしくはＱＳ２１およびＱＳ７を含めたその誘導体；エスチン；ジギトニン；またはｇｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンなどのサポニンを含む。他の製剤は、１つ超のサポニンを本発明のアジュバント組み合わせで、例えば、以下のＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスチン、またはジギトニンを含む群のうちの少なくとも２つの組み合わせで含んでよい。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔内噴霧剤、吸入剤、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。鼻腔内微小粒子樹脂およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物を使用した薬物の送達（米国特許第５，７２５，８７１号）は、製薬技術分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態の例示的な経粘膜薬物送達が記載されている。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物を適切な宿主細胞／生物体に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、脂質粒子、小胞などを使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化することができる。あるいは、本発明の組成物を、そのような担体ビヒクルの表面に共有結合または非共有結合のいずれかによって結合させることができる。
【０２３０】
潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は、当業者に一般に公知である（Ｌａｓｉｃ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８年７月；１６巻（７号）：３０７〜２１頁；Ｔａｋａｋｕｒａ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９８年３月；５６巻（３号）：６９１〜５頁；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．、１９９７年８月；３５巻（８号）：８０１〜９頁；Ｍａｒｇａｌｉｔ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１９９５年；１２巻（２〜３号）：２３３〜６１頁；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号を参照されたい）。
【０２３１】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁物、初代肝細胞培養およびＰＣ  １２細胞を含めた他の手順によってトランスフェクトすることが通常難しい、いくつもの細胞型で首尾よく使用されている。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線療法剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを種々の培養細胞株および動物に導入するために有効に使用されている。さらに、リポソームの使用には、全身送達後に自己免疫応答または許容されない毒性は付随しないと思われる。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、リポソームを水性媒体中に分散させたリン脂質から形成し、多重膜同心二重層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）とも称される）（ＭＬＶ）を自然に形成させる。
【０２３３】
あるいは、他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物の薬学的に許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルには、一般に、化合物を安定かつ再現性があるように閉じ込めることができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分解可能なポリマーを使用して設計することができる。そのような粒子は、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１９８８年；５巻（１号）：１〜２０頁；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、１９９８年３月；４５巻（２号）：１４９〜５５頁；Ｚａｍｂａｕｘら  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．、１９９８年１月２日；５０巻（１〜３号）：３１〜４０頁；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されている通り作出することができる。
【０２３４】
方法
本発明の組成物および方法は、種々の実施形態において、選択されたＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４に結合するＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬエピトープを認識するものなどの、ヒト細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活用する。ある特定の血清型のＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４を発現する個体を、本発明の方法および組成物を使用する療法に選択することができる。例えば、ある特定の血清型のＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４を発現する個体を、本明細書に記載されている方法および組成物を使用してＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬに対する免疫応答を生じさせることを含む療法に選択することができる。
【０２３５】
種々の実施形態では、これらのＴ細胞は、末梢血単核細胞を刺激するために、目的のエピトープでパルスした抗原提示細胞を使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養によって生成することができる。さらに、Ｔ細胞株はまた、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／もしくはＬラテックスビーズ、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／もしくはＬタンパク質をパルスしたプラスチック接着性末梢血単核細胞、またはＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／もしくはＬ  ＲＮＡを用いて感作させたＤＣを用いた刺激後に生成することもできる。Ｔ細胞は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬ免疫原をコードするワクチンベクターを用いて免疫した患者から生成することもできる。ＨＬＡ  Ａ２により提示されるＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬに由来するペプチドは、さらに、エボラに感染した患者において見いだすことができる。種々の実施形態では、本発明は、ワクチン−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬを用いて免疫された患者由来のＣＴＬを刺激することができる、ＨＬＡ  Ａ２により制限されるＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、および／またはＬのエピトープに関する。
【０２３６】
処置の方法
本発明のアデノウイルスベクターは、本明細書に記載されている１つまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるためのいくつものワクチンの状況で使用することができる。本発明は、本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。アデノウイルスベクターは、特に重要である。なぜなら、Ａｄに対する既存の免疫を有する被験体において免疫応答を生じさせるために使用することができ、また、以前の世代のアデノウイルスベクターを使用すると不可能なレジメンである、アデノウイルスベクターを使用した複数のラウンドの免疫を含むワクチン接種レジメンにおいて使用することができるという予想外の所見のためである。
【０２３７】
一般に、免疫応答を生じさせることとは、体液性応答および／または細胞媒介性応答の誘導を含む。目的の標的抗原に対する免疫応答を増大させることが望ましい場合がある。免疫応答を生じさせることは、ある特定の免疫系の細胞の活性および／もしくは数の低減またはある特定のサイトカインまたは他のエフェクター分子のレベルおよび／または活性の低下を伴い得る。免疫応答の変化（例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性）を検出するための種々の方法は当技術分野で公知であり、本発明の状況において有用である。この場合に有用な例示的な方法としては、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、クロムの放出または等価のアッセイを含めた細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、およびさまざまなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用した遺伝子発現解析が挙げられる。
【０２３８】
免疫応答を生じさせることは、本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して１．５倍から５倍の間の標的抗原特異的ＣＴＬ活性の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、アデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超の標的特異的ＣＴＬ活性の増大を含む。
【０２３９】
免疫応答を生じさせることは、標的抗原をコードする核酸を含む本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、適切な対照と比較して１．５倍から５倍の間のヘルパーＴ細胞の増殖などの標的抗原特異的ＨＴＬ活性の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超、標的特異的ＨＴＬ活性の増大を含む。この文脈において、ＨＴＬ活性は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または他のサイトカインなどの特定のサイトカインの産生の、上記の増大、または減少を含み得る。この点について、免疫応答を生じさせることは、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型応答へのシフトまたはある特定の実施形態では、Ｔｈ１型応答からＴｈ２型応答へのシフトを含み得る。他の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、主にＴｈ１型応答またはＴｈ２型応答の刺激を含み得る。
【０２４０】
免疫応答を生じさせることは、本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、適切な対照と比較して１．５倍から５倍の間の、標的特異的な抗体産生の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、アデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超の、標的特異的な抗体産生の増大を含む。
【０２４１】
したがって、本発明は、目的の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、個体に、ａ）Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、ｂ）標的抗原をコードする核酸とを含むアデノウイルスベクターを投与するステップと、個体にアデノウイルスベクターを少なくとも１回再投与するステップとを含み、それにより、標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、投与されるベクターが、ｇｕｔｔｅｄベクターではない方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２４２】
さらなる実施形態では、本発明は、Ａｄに対する既存の免疫を有する個体において、個体に、ａ）Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、ｂ）標的抗原をコードする核酸とを含むアデノウイルスベクターを投与し、個体にアデノウイルスベクターを少なくとも１回再投与し、それにより、標的抗原に対する免疫応答を生じさせることによって標的抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２４３】
Ａｄに対する既存の免疫に関しては、Ａｄ抗体の存在について試験するための抗体に基づくアッセイなどの、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、まず、個体がＡｄに対する既存の免疫を有することを決定し、次いで、本明細書に記載されている本発明のＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを投与することを含む。
【０２４４】
本発明の一実施形態は、個体において１つまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、個体に、Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、少なくとも１つの標的抗原をコードする核酸とを含む第１のアデノウイルスベクターを投与するステップと、個体に、Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、少なくとも１つの標的抗原をコードする核酸とを含む第２のアデノウイルスベクターを投与するステップを含み、第２のアデノウイルスベクターの少なくとも１つの標的抗原が第１のアデノウイルスベクターの少なくとも１つの標的抗原と同じものであるかまたは異なるものである、方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２４５】
したがって、本発明は、同じＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを用いた複数回の免疫または異なるＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを用いた複数回の免疫を意図している。それぞれの場合において、アデノウイルスベクターは、本明細書の他の箇所に記載されている１つまたは複数の標的抗原をコードする核酸配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、方法は、１つの標的抗原をコードするＥ２ｂ欠失アデノウイルスを用いた複数回の免疫、および同じアデノウイルスベクターの複数回の再投与を含み、それにより、標的抗原に対する免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２４６】
さらなる実施形態では、方法は、１つまたは複数の標的抗原をコードする第１のアデノウイルスベクターを用いた免疫、次いで、第１のアデノウイルスベクターによりコードされる抗原と同じであっても異なってもよい１つまたは複数の標的抗原をコードする第２のアデノウイルスベクターの投与を含む。この点について、コードされる標的抗原のうちの１つが異なるものであってもよく、コードされる抗原の全てが異なるものであってもよく、一部が同じものであって一部が異なるものであってもよい。さらに、ある特定の実施形態では、方法は、第１のアデノウイルスベクターを複数回投与するステップと、第２のアデノウイルスを複数回投与するステップとを含む。この点について、当該方法は、第１のアデノウイルスベクターを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれ超投与するステップと、第２のアデノウイルスベクターを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれ超投与するステップとを含む。投与の順序は、第１のアデノウイルスを１回または複数回逐次に投与するステップと、その後、第２のアデノウイルスベクターを１回または複数回逐次に投与するステップを含んでよい。ある特定の実施形態では、方法は、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを、それぞれ１回の投与、それぞれ２回の投与、それぞれ３回の投与などで交互に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを同時に投与する。他の実施形態では、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを逐次的に投与する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２４７】
当業者には容易に理解される通り、２つ超のアデノウイルスベクターを本発明の方法において使用することができる。３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の異なるアデノウイルスベクターを本発明の方法において使用することができる。ある特定の実施形態では、方法は、１つ超のＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを一度に投与するステップを含む。この点について、複数の目的の標的抗原に対する免疫応答を、それぞれが１つまたは複数の標的抗原をコードする核酸配列を含む複数の異なるアデノウイルスベクターを同時に投与することによって生じさせることができる。  
【０２４８】
エボラの症状を処置するまたは好転させるための方法も提供される。処置方法は、本明細書に記載されているエボラ感染に罹患しているまたはエボラ感染に罹患するリスクがある個体にアデノウイルスベクターを１回または複数回投与するステップを含む。したがって本発明は、エボラに感染するリスクがある個体において、そのようなウイルスに対するワクチン接種を行うための方法を提供する。リスクがある個体は、エボラにいつか曝露する可能性があるもしくは以前に曝露しているがエボラ感染の症状をまだ有さない個体、または、エボラ感染に特にかかりやすい個体であり得る。エボラ感染に罹患している個体を、標的抗原を発現し、かつ／または提示していることを決定することができ、それを本明細書における療法をガイドするために使用することができる。例えば、ある例が標的抗原を発現し、かつ／または提示していることを見いだし、その後、標的抗原、そのバリアント、断片またはバリアント断片をコードするアデノウイルスベクターを投与することができる。
【０２４９】
本発明は、標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする核酸のｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達のための、アデノウイルスベクターの使用を意図している。被験体に注射されたら、核酸配列が発現され、その結果、当該配列によりコードされる抗原に対する免疫応答がもたらされる。アデノウイルスベクターワクチンは、「有効量」、すなわち、選択された経路または投与経路で本明細書の他の箇所に記載されている免疫応答を引き出すために有効なアデノウイルスベクターの量で投与することができる。有効量は、宿主の標的エボラに対する保護または処置を容易にするために有効な免疫応答を誘導することができるものである。各ワクチン用量中のベクターの量は、一般に典型的なワクチンに付随する有意な有害作用を伴わずに、免疫応答、免疫保護的（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）応答または他の免疫療法的応答を誘導する量として選択される。ワクチン接種を行ったら、被験体をモニタリングして、ワクチン処置の有効性を決定することができる。ワクチン接種の有効性のモニタリングは、当業者に公知の任意の方法によって実施することができる。一部の実施形態では、血液または体液試料をアッセイして抗体のレベルを検出することができる。他の実施形態では、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、循環血液細胞からまたはリンパ組織細胞からの細胞媒介性免疫応答を検出することができる。
【０２５０】
本明細書に記載されている治療用組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体によって、および疾患によって変動し得、また、標準の技法を使用して容易に確立され得る。一般に、医薬組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内に（例えば、吸引によって）、丸剤形態で（例えば、嚥下、膣または直腸への送達用の坐薬）投与することができる。ある特定の実施形態では、１〜１０用量を５２週間にわたって投与することができる。ある特定の実施形態では、６用量を１カ月の間隔で投与し、その後、定期的にさらなる追加刺激ワクチン接種を行う。個々の患者に対して代替プロトコールが適する場合がある。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ超の用量を、１年間にわたって、または、３５週間、４０週間、４５週間、５０週間、５５週間、６０週間、６５週間、７０週間、７５週間、８０週間、８５週間、９０週間、９５週間または１００週間にわたってなどのより短い期間もしくはより長い期間にわたって投与することができる。用量は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間の間隔またはより長い間隔で投与することができる。
【０２５１】
ワクチンは、約４時間未満にわたって、より好ましくは、約３時間未満にわたって注入することができる。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内、好ましくは、さらには１５分以内に注入し、残りを次の２〜３時間にわたって注入することができる。より一般的には、投与されるワクチン構築物の投薬は、２週間ごとまたは３週間ごとに１回の投薬として、合計少なくとも３回の投薬を繰り返して施行することができる。または、構築物は、週２回、４〜６週間にわたって投与することができる。投薬スケジュールは、場合によって他の間隔で繰り返すことができ、また、投薬は、種々の非経口経路を通じて、用量およびスケジュールの適切な調整を伴ってもたらすことができる。本発明の組成物は、さまざまな関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与することができる。
【０２５２】
適切な用量とは、上記の通り投与した場合に、本明細書の他の箇所に記載されている標的抗原に対する免疫応答を促進することが可能なアデノウイルスベクターの量である。ある特定の実施形態では、免疫応答は、基底（すなわち、無処置）のレベルを少なくとも１０〜５０％上回る。ある特定の実施形態では、免疫応答は、基底レベルを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００またはそれ超上回る。そのような応答は、患者における標的抗原（複数可）抗体を測定することによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて患者の感染細胞を死滅させることが可能な細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、または免疫応答をモニタリングするための、当技術分野で公知の他の方法によってモニタリングすることができる。そのようなワクチンはまた、ワクチン接種を受けた患者において、ワクチン接種を受けていない患者と比較して問題の疾患の臨床転帰の改善を導く免疫応答を引き起こすことが可能なものであるべきである。一部の実施形態では、臨床転帰の改善は、疾患の処置、疾患の症状の軽減、疾患の進行の変化、または寿命の延長を含む。
【０２５３】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンでは、アデノウイルスベクターが治療的および／または予防的利益をもたらすために十分な量でもたらされる。そのような応答は、処置を受けた患者において、処置を受けていない患者と比較して、処置される特定の疾患についての臨床転帰の改善が確立されることによってモニタリングすることができる。モニタリングデータは経時的に評価することができる。経時的な疾患の進行を変化させることができる。そのような臨床転帰の改善は、処置を行う医師によって容易に認識される。標的タンパク質に対する既存の免疫応答の増大は、一般に、臨床転帰の改善と相関し得る。そのような免疫応答は、一般に、処置前および処置後に患者から得た試料を使用して実施することができる標準の増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して評価することができる。
【０２５４】
本発明の１つの利点は、特にＡｄに対する既存の免疫を有する個体において同じまたは異なるアデノウイルスベクターを用いた複数回のワクチン接種を施行することが可能なことであるが、本発明のアデノウイルスワクチンは、初回刺激および追加刺激レジメンの一部としても投与することができる。混合モダリティ初回刺激および追加刺激接種スキームにより、免疫応答の増強がもたらされ得る。したがって、本発明の一態様は、被験体を、目的の標的抗原を含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンを用いて、プラスミドワクチンを少なくとも１回投与することによって初回刺激し、所定の時間の長さを経過させ、次いで、アデノウイルスベクターを投与することによって追加刺激する方法である。複数回、例えば、１〜４回の初回刺激を使用することができるが、それより多くを使用することもできる。初回刺激と追加刺激の間の時間の長さは、一般には、約４カ月から１年まで変動し得るが、他の時間枠を使用することもできる。ある特定の実施形態では、被験体を、プラスミドワクチンを用いて１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ超、初回刺激し、次いで、４カ月後にアデノウイルスベクターを用いて追加刺激することができる。
【０２５５】
患者の選択
本発明の種々の実施形態は、選択された患者集団において１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の抗原に対する免疫応答を生じさせるための組成物および方法に関する。本明細書において提示される任意の組成物を個体に投与することができる。「個体」は、「被験体」または「患者」と互換的に使用することができる。個体は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、もしくはヒツジなどの動物であってよい。複数の実施形態では、個体は、ヒトである。複数の実施形態では、個体は、胎児、胚、または小児である。一部の場合では、本明細書において提示される組成物を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで投与する。一部の場合では、本明細書において提示される組成物を、個体に、エボラ感染を処置する方法として投与する。
【０２５６】
一部の場合では、被験体は、エボラ感染を有さない。一部の場合では、本発明の処置は、エボラ感染の前に施行する。被験体は、未検出のエボラ感染を有し得る。被験体は、低エボラ感染負荷量を有し得る。被験体はまた、高エボラ感染負荷量を有し得る。
【０２５７】
一部の実施形態では、患者は、他の療法を受けたことがある、場合によって、それを経て進行したことが必要であり得る。一部の場合では、個体がそのような療法を受けることを拒絶することにより、その患者を、本発明の方法および組成物を用いた療法適格プールに含めることが可能になる。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける個体の推定平均余命が少なくとも、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１４カ月、１５カ月、１８カ月、２１カ月、または２４カ月である必要があり得る。本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者プールは、年齢制限され得る。例えば、２歳超、３歳超、４歳超、５歳超、６歳超、７歳超、８歳超、９歳超、１０歳超、１１歳超、１２歳超、１３歳超、１４歳超、１５歳超、１６歳超、１７歳超、１８歳超、１９歳超、２０歳超、２１歳超、２５歳超、３０歳超、３５歳超、４０歳超、５０歳超、６０歳超、またはそれ超の年齢の個体が、本発明の方法および組成物を用いた療法に適格であり得る。別の例では、７５歳未満、７０歳未満、６５歳未満、６０歳未満、５５歳未満、５０歳未満、４０歳未満、３５歳未満、３０歳未満、２５歳未満、２０歳未満、またはそれ未満の年齢の個体が、本発明の方法および組成物を用いた療法に適格であり得る。
【０２５８】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者は、適切な血液学的機能を有する個体、例えば、１マイクロリットル当たり少なくとも１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれ超のＷＢＣ数、少なくとも５ｇ／ｄＬ、６ｇ／ｄＬ、７ｇ／ｄＬ、８ｇ／ｄＬ、９ｇ／ｄＬ、１０ｇ／ｄＬ、１１ｇ／ｄＬ、１２ｇ／ｄＬ、１３ｇ／ｄＬ、１４ｇ／ｄＬまたはそれ超のヘモグロビンレベル、１マイクロリットル当たり少なくとも５０，０００；６０，０００；７０，０００；７５，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００またはそれ超の血小板数のうちの１つまたは複数を有する個体；０．８を下回るまたはそれと等しい、１．０を下回るまたはそれと等しい、１．２を下回るまたはそれと等しい、１．３を下回るまたはそれと等しい、１．４を下回るまたはそれと等しい、１．５を下回るまたはそれと等しい、１．６を下回るまたはそれと等しい、１．８を下回るまたはそれと等しい、２．０を下回るまたはそれと等しい、２．５を下回るまたはそれと等しい、３．０を下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のＰＴ−ＩＮＲ値、１．２×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．４×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．５×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．６×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．８×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、２．０×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のＰＴＴ値を有する個体に限られる。種々の実施形態では、血液学的機能の指標の限度は、異なる性別および年齢群、例えば、０〜５歳、５〜１０歳、１０〜１５歳、１５〜１８歳、１８〜２１歳、２１〜３０歳、３０〜４０歳、４０〜５０歳、５０〜６０歳、６０〜７０歳、７０〜８０歳または８０歳超の個体に対して異なるように選択される。
【０２５９】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体から、試料、例えば、血清または尿試料を採取することができる。試料は、療法の前、その間、および／またはその後、例えば、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、または１２週間以内、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、９週間以内、または１２週間以内、療法の間に１週間、１０日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、９週間、または１２週間の間隔で、療法後に１カ月、３カ月、６カ月、１年、２年の間隔で、療法後１カ月以内、３カ月以内、６カ月以内、１年以内、２年以内、またはより長い期間以内、６カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはより長い持続時間にわたって、採取することができる。試料を、本明細書に記載されている血液学的機能の指標、腎機能の指標、または肝機能の指標のいずれか、ならびに当技術分野で公知の他の適切な指標、例えば、出産の潜在性がある女性についてはβ−ＨＣＧについて検査することができる。その点で、分画を伴う血球数、ＰＴ、ＩＮＲおよびＰＴＴを含めた血液検査および生化学検査、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＣＯ２、ＢＵＮ、クレアチニン、Ｃａ、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびグルコースを測定する検査は、本発明の範囲内に入る。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体由来の試料中のＨＩＶ抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ＢｓＡｇ）、またはＣ型肝炎抗体の存在または量を決定する。本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体由来の血清などの試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６に対する抗体またはＡｄ５ベクターに対する中和抗体などの生物学的マーカーを検査することができる。一部の場合では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体から血液試料などの１つまたは複数の試料を採取し、保管することができる。採取された試料を免疫学的評価についてアッセイすることができる。本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体を画像化試験で、例えば、胸部、腹部、または骨盤のＣＴスキャンまたはＭＲＩを使用して評価することができる。画像化試験は、本発明の方法および組成物を使用する療法の前、その間、またはその後、療法の間、および／またはその後、例えば、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、または１２週間以内、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内��６週間以内、８週間以内、９週間以内、または１２週間以内、療法の間に１週間、１０日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、９週間、または１２週間の間隔で、療法後に１カ月、３カ月、６カ月、１年、２年の間隔で、療法後１カ月以内、３カ月以内、６カ月以内、１年以内、２年以内、またはより長い期間以内、６カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはより長い持続時間にわたって実施することができる。
投薬量および投与
本発明の組成物および方法は、療法の間の種々の投薬量および投与レジメンを意図している。患者は、１つまたは複数の複製欠損性アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター、例えば、個体において、本明細書に記載されている標的抗原、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対する免疫応答を生じさせることが可能な、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号２、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号４、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−配列番号６を受けることができる。種々の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスを、そのような免疫応答に影響を及ぼすために適した用量で投与する。一部の場合では、複製欠損性アデノウイルスを、免疫当たり、１×１０９個を上回るまたはそれと等しい、２×１０９個を上回るまたはそれと等しい、３×１０９個を上回るまたはそれと等しい、４×１０９個を上回るまたはそれと等しい、５×１０９個を上回るまたはそれと等しい、６×１０９個を上回るまたはそれと等しい、７×１０９個を上回るまたはそれと等しい、８×１０９個を上回るまたはそれと等しい、９×１０９個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、４×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、５×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、６×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、７×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、８×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、９×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、４×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、５×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、６×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、７×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、８×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、９×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、１．５×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、またはそれ超のウイルス粒子（ＶＰ）である用量で投与する。一部の場合では、複製欠損性アデノウイルスを、免疫当たり、１×１０９個を下回るまたはそれと等しい、２×１０９個を下回るまたはそれと等しい、３×１０９個を下回るまたはそれと等しい、４×１０９個を下回るまたはそれと等しい、５×１０９個を下回るまたはそれと等しい、６×１０９個を下回るまたはそれと等しい、７×１０９個を下回るまたはそれと等しい、８×１０９個を下回るまたはそれと等しい、９×１０９個を下回るまたはそれと等しい、１×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、４×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、５×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、６×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、７×１０１０個を下回るまたはそれ��等しい、８×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、９×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、１×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、４×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、５×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、６×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、７×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、８×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、９×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、１×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、１．５×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のウイルス粒子である用量で投与する。種々の実施形態では、本明細書に記載されている所望の用量を適切な体積、例えば、約０．１〜１０ｍＬ、０．２〜８ｍＬ、０．３〜７ｍＬ、０．４〜６ｍＬ、０．５〜５ｍＬ、０．６〜４ｍＬ、０．７〜３ｍＬ、０．８〜２ｍＬ、０．９〜１．５ｍＬ、０．９５〜１．２ｍＬ、または１．０〜１．１ｍＬの体積の製剤緩衝液で投与する。体積は、これらの値のいずれかの範囲内の任意の範囲（例えば、約０．５ｍＬ〜約１．１ｍＬ）内に入り得ることが当業者には理解される。ウイルス粒子の投与は、送達のための種々の適切な経路を通じたものであってよく、例えば、注射による投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸引によって）、丸剤形態での投与（例えば、嚥下、膣または直腸への送達用の坐薬）であってよい。一部の実施形態では、皮下送達が好ましい場合があり、それにより樹状細胞へのより大きな接近をもたらすことができる。
【０２６０】
個体へのウイルス粒子の投与を繰り返すことができる。ウイルス粒子の繰り返し送達は、スケジュールに従ったものであってもよく、あるいは、必要に応じて実施することもできる。例えば、標的抗原、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対する個体の免疫を試験し、必要に応じて追加的な送達を補充することができる。一部の実施形態では、送達のスケジュールは、定期的な間隔でウイルス粒子を投与することを含む。スケジュールに従う期間および／または投与前に評価される必要に応じた投与の期間の１つまたは複数を含む共同送達レジメンを設計することができる。例えば、療法レジメンは、３週間に１回の皮下投与などの投与、次いで、死亡を含めた任意の理由で療法から除かれるまで、３カ月ごとの別の免疫療法処置を含んでよい。別のレジメンの例は、３週間ごとに３回の投与、次いで、３カ月ごとに別の３回の免疫療法処置のセット、を含む。別のレジメンの例は、第１の頻度での第１の投与回数を伴う第１の期間、第２の頻度での第２の投与回数を伴う第２の期間、第３の頻度での第３の投与回数を伴う第３の期間など、および場合によって、必要に応じて未決定の投与回数を伴う１つまたは複数の期間を含む。各期間中の投与の回数は、それぞれ独立に選択することができ、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回またはそれ超であり得る。各期間中の投与の頻度もそれぞれ独立に選択することができ、例えば、およそ毎日、２日に１回、３日に１回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月、６週間に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、１年に１回などであり得る。療法には最大１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、３０カ月、３６カ月またはそれ超の総期間がかかり得る。免疫間の予定された間隔は、免疫間の間隔が、その間隔の最大５分の１、４分の１、３分の１、または半分だけ修正されるように改変することができる。例えば、３週間間隔スケジュールに関しては、２０日間から２８日間の間（３週間−１日〜３週間＋７日）で免疫を繰り返すことができる。最初の３回の免疫に関して、第２の免疫および／または第３の免疫を遅らせる場合、その後の免疫をシフトさせることができ、それにより、免疫間の緩衝液の量を最小にすることが可能になる。例えば、３週間間隔スケジュールに関しては、免疫を遅らせる場合、その後の免疫を前の免疫の１７日後、１８日後、１９日後、または２０日後以降に行う予定にすることができる。
【０２６１】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号２、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号４、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号５、およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−配列番号６ベクターならびにこれらのベクターを使用して産生されるウイルス粒子などの本発明の組成物、は、種々の状態で、例えば、室温で、氷上で、または凍結させて提供することができる。組成物は、適切なサイズの容器、例えば、２ｍＬのバイアルに入れて提供することができる。一実施形態では、抽出可能なワクチン１．０ｍＬを伴う１  ２ｍｌのバイアルに、１ｍＬ当たり総ウイルス粒子５×１０１１個が含有される。温度および湿度を含めた保管条件は変動し得る。例えば、療法に使用するための組成物は、室温、４℃、−２０℃、またはそれ未満で保管することができる。
【０２６２】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して一般的な評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０２６３】
一般的な評価は、病歴、ＥＣＯＧ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ、カルノフスキーのパフォーマンスステータス、および主治医による、体重を伴う完全な身体検査のうちの１つまたは複数を含み得る。当該患者が最後の来診以来受けているまたは受けていた任意の他の処置、薬物療法、生物学的製剤、または血液製剤を記録することができる。あらゆる有害反応についてモニタリングするために、患者を診療所においてワクチン接種後、適切な期間にわたって、例えば、およそ３０分にわたって経過観察することができる。ワクチンの各投薬後の局所的なおよび全身性の反応源性を選択された時間にわたって、例えば、３日間（免疫の日およびその後２日間）にわたって毎日評価することができる。症状を報告するために日誌カードを使用することができ、局所的な反応源性を測定するために定規を使用することができる。免疫注射部位を評価することができる。胸部、腹部、および骨盤のＣＴスキャンまたはＭＲＩを実施することができる。
【０２６４】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して血液学的評価および生化学的評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。血液学的評価および生化学的評価は、化学的検査および血液学的検査のための血液検査、分画を伴うＣＢＣ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＣＯ２、ＢＵＮ、クレアチニン、Ｃａ、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、グルコース、およびＡＮＡのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０２６５】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に関して生物学的マーカーを評価する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０２６６】
生物学的マーカー評価は、適切な体積、例えば、約５ｍＬの血清試料に由来する配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６またはＡｄ５ベクターに対する抗体の測定の１つまたは複数を含み得る。決定され、利用可能である場合、バイオマーカーを再調査することができる。
【０２６７】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して免疫学的評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０２６８】
試験中および／または特定の回数の免疫後の特定の時点で免疫応答に対する影響があるか否かを決定するために、末梢血、例えば、約９０ｍＬを各免疫の前および少なくとも一部の免疫後の時点で採取することができる。免疫学的評価は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対するＴ細胞応答についてＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、多パラメータフローサイトメトリー分析、および細胞傷害性アッセイを使用してアッセイすることの１つまたは複数を含み得る。各採血からの血清を保管し、送付し、決定することができる。
【０２６９】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して、エボラ感染の評価またはエボラ複製アッセイを実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば処置前、０週目、３週目、６週目などの予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。エボラ感染は、処置前、少なくとも一部の免疫後の時点で、ならびに、選択された回数、例えば２回、３回、または４回の第１の処置の完了後、および例えば処置から除かれるまで、およそ毎週〜３カ月ごとの、１つまたは複数のエボラ免疫特異的検査を含み得る。
【０２７０】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、または配列番号６などの本明細書に記載されている標的抗原に対する免疫応答を、個体の末梢血試料などの試料から、ＥＬＩＳｐｏｔ、サイトカインフローサイトメトリー、または抗体応答などの免疫応答に関する１つまたは複数の適切な試験を使用して評価することができる。陽性免疫応答は、Ｔ細胞応答を測定することによって決定することができる。Ｔ細胞応答は、バックグラウンドに対して補正した、抗原を伴う６ウェル中のスポットの平均数が、対照の６ウェル中のスポットの数を１０だけ超え、かつ、抗原を含有する６ウェルと対照の６ウェルの単一の値間の差異がスチューデントのｔ検定を使用してｐ≦０．０５のレベルで統計的に有意であれば、陽性とみなすことができる。免疫原性アッセイは、各免疫の前および処置の期間中の予定した時点で行うことができる。例えば、処置の約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約１１週目、約１２週目、約１３週目、約１４週目、約１５週目、約１８週目、約２０週目、約２４週目、約３０週目、約３６週目、または約４８週目の免疫原性アッセイの時点を、この時に免疫を予定しなくても、予定することができる。一部の場合では、個体が、少なくとも最小数の免疫、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、またはそれ超の免疫を受けていれば、その個体を免疫応答について評価可能であるとみなすことができる。
【０２７１】
臨床応答の決定
一部の実施形態では、疾患の進行または臨床応答の決定は、測定可能／評価可能な疾患を有する患者の間で、ＲＥＣＩＳＴ１．１基準に従って行う。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において完全奏効（ＣＲ；標的部位の全ての抗原もしくは症状の消失、または全ての非標的部位の消失および非標的部位に関して抗原もしくは症状レベルの正常化）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において部分奏効（ＰＲ；標的部位のベースライン合計ＬＤを参照としてとり、標的部位の合計ＬＤの少なくとも３０％の減少）に影響を及ぼす。
【０２７２】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において安定病態（ＳＤ；標的部位について、処置開始からの最小の合計ＬＤを参照としてとり、ＰＲと認定されるのに抗原または症状の十分な低減もなく、ＰＤと認定されるのに十分な増加もない）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において不完全な応答／安定病態（ＳＤ；１つもしくは複数の非標的部位の持続）または／および非標的部位について正常限界を超える抗原もしくは症状の維持）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において進行性疾患（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＰＤ；処置開始から記録された最小の合計ＬＤを参照としてとり、抗原もしくは症状の合計ＬＤの少なくとも２０％の増加、または、１つもしくは複数の新しい抗原もしくは症状の出現または１つもしくは複数の非標的抗原もしくは症状の持続、または／および正常限界を超える抗原レベルの維持）に影響を及ぼす。
【０２７３】
キット
組成物、免疫療法またはワクチンは、キットの形態で供給することができる。本開示のキットは、処置レジメン情報を含めた投薬量およびまたは投与に関する指示をさらに含み得る。
【０２７４】
一部の実施形態では、キットは、組み合わせ多標的化エボラ免疫療法をもたらすための組成物および方法を含む。一部の実施形態では、キットは、エボラ感染の組み合わせ多標的化処置のための組成物および方法を含む。一部の実施形態のキットは、キット成分の投与に有用な成分および成分の調製の仕方に関する指示をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、処置前および処置後に適切な実験室検査を用いて患者のモニタリングを行うため、または結果および患者データを医療従事者に伝達するためのソフトウェアをさらに含み得る。キットを構成する成分は、乾燥した形態であっても液体の形態であってもよい。乾燥した形態である場合、キットは、乾燥材料を可溶化するための溶液を含み得る。キットは、液体または乾燥した形態の伝達因子も含み得る。伝達因子が乾燥した形態である場合、キットは、伝達因子を可溶化するための溶液を含む。キットは、成分の混合および調製用の容器も含み得る。キットは、例えば、針、管材料、塗布器、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器または任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルなどの、投与を補助するための器具も含み得る。本発明のキットまたは薬物送達システムはまた、一般には、商業的販売および配布のために本開示の組成物を密閉する手段も含む。
【実施例】
【０２７５】
（実施例１：Ａｄ５ヌルアデノウイルスベクターの複数回の注射は、抗アデノウイルス抗体を生成する）
この実施例は、注射された被験体でＡｄ５−ヌルの複数回の注射が抗アデノウイルス抗体の生成をもたらすことを示す。
【０２７６】
いかなる異種核酸配列も含有しないＡｄ５−ヌルアデノウイルスベクターが、マウスで中和免疫応答を生成することが実証された。１つの実験では、５〜７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１４日間隔でＡｄ５−ヌルウイルス粒子で免疫した。抗アデノウイルス抗体の存在を決定するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。このＥＬＩＳＡのために、１０９個のウイルス粒子を１００μＬの０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液ｐＨ９．６でマイクロタイターウェルの上にコーティングし、室温で一晩インキュベートした。標準の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）参照曲線のために、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇおよび０ｎｇの精製マウスＩｇＧを前記のマイクロタイターウェルの上にコーティングした。インキュベーションの後、全てのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の２５０μＬの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３回洗浄した。洗浄の後、２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳを全てに加え、室温で３０分の間インキュベートして未結合の部位をブロックした。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１／１００血清希釈溶液の２００μＬをウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。陽性対照のために、ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗アデノウイルス抗血清の１／１００００希釈溶液の２００μＬを、ウェルに加えた。対照ウェルは、ＢＳＡ／ＰＢＳだけを含有した。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、ＢＳＡ／ＰＢＳ中のペルオキシダーゼコンジュゲートγ−鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１／１００００希釈溶液の２００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、２００μＬの発色試薬（０．０６％過酸化水素を含有している０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．０中の０．５ｍｇ／ｍＬの１，２−フェニレンジアミン）を各ウェルに加え、室温で３０〜４０分の間インキュベートした。インキュベーションの後、各ウェルへの５０μＬの５Ｎ  ＨＣｌの添加によって呈色反応を停止した。次にマイクロウェルプレートリーダーで、全てのウェルを４９２ｎｍで読み取った。読取値が得られた後、未知試料の光学濃度読取値を標準のＩｇＧ曲線と関連付けて、ウェル当たりの結合したＩｇＧのｎｇを得た。これは、ＩＮＳＴＡＴ統計パッケージを使用して実行した。
【０２７７】
ＥＡに対する抗体を検出するＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートに、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中の１００ｎｇのＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬをコーティングし、室温で一晩インキュベートする。プレートは１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより室温で６０分間、次にブロックした。さらなる３回の洗浄の後、ＰＢＳ−Ｔで１／５０に希釈した血清をウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄後に１：５０００希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ（γ−鎖特異的）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体をウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１，２−フェニレンジアミン基質溶液を各ウェルに加える。１０％リン酸を追加することによって、反応を停止する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０  ＥＬＩＳＡリーダーで、吸光度を４９２ｎｍで測定する。ウェル当たりのＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬに結合したナノグラム当量のＩｇＧが、精製されたマウスＩｇＧを使用して生成され、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬのＥＬＩＳＡと同時に作り出した標準曲線を参照して得られる。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．３ソフトウェアを使用して結果を分析し、定量化した。
【０２７８】
１０１０のＡｄ−５−ヌルによる第１の注射から２週後に、抗アデノウイルスＩｇＧ抗体の有意なレベル（Ｐ＜０．００１）がマウスでは検出された（図１）。１０１０のアデノウイルスによる第２の注射から２週後に、有意により高いレベル（Ｐ＜０．００１）が観察された。１０１０のＡｄ５−ヌルによる第３の注射から２週後に、抗体の有意により高いレベル（Ｐ＜０．００１）が連続して観察された。各値は、各群の５匹のマウスのプールされた血清からの三連の決定の平均を表す。Ａｄ５−ヌルの複数回の注射は、被験体で抗アデノウイルス抗体の生成をもたらした。
【０２７９】
Ａｄに対する中和抗体の存在を決定するために、以下のアッセイを利用した。マイクロウェル組織培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）からなる２００μＬの培養培地で、５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間、１ウェル当たり細胞数２×１０３の細胞濃度でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を培養した。インキュベーションの後、１００μＬの培養培地を三連のウェルから取り出して、ウイルス粒子（ＶＰ）を含有する２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳと混合した。混合の後、１２０μＬの混合液をそれぞれのマイクロウェルに戻した。別のセットの三連のウェルでは、１００μＬの培養培地を取り出し、室温で１時間ＶＰと一緒に前にインキュベートした２０μＬの熱不活性化（５６℃で１時間）Ａｄ免疫マウス血清と混合した。混合の後、１２０μＬの混合液をそれぞれのウェルに戻した。三連の細胞対照ウェルでは、２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳを全培養培地容積について調整するために加えた。三連の培地のみの対照ウェルは、２２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳを含有した。組織培養プレートは、５％ＣＯ２中の３７℃でさらに３日間インキュベートした。インキュベーションの後、４０μＬのＰＲＯＭＥＧＡ細胞生存率試薬（Ｏｗｅｎ試薬）を全ウェルに加え、５％ＣＯ２中の３７℃で７５分の間インキュベートした。このアッセイでは、Ｏｗｅｎ試薬（ＭＴＳテトラゾリウム化合物）は、生存能力のある細胞によって組織培養培地に可溶性である有色のホルマザン生成物に生体内還元される。４９０ｎｍでの吸光度によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養物中の生細胞数に直接的に比例する。インキュベーションの後、光学濃度読み取りのために１５０μＬを各ウェルから取り出して、別のマイクロウェルプレートに移した。マイクロウェルプレートリーダーを使用して、４９２ｎｍでの光学濃度読取値がその後得られた。
【０２８０】
Ａｄに対する中和抗体の存在を検出するために、各々５匹のマウスの群に、１０１０のＡｄ５−ヌルを１回、２回または３回、２週間隔で注射した。ウイルスの最終注射の２週後に、マウスを放血させ、プールし、前記のように熱不活性化血清有り無しでインキュベートした４×１０７のＶＰを使用して中和抗体について評価した。単独で培養した細胞は、対照群の役目を果した。通常のマウスおよびＡｄ５ヌルを１回注射したマウスは、有意なレベルの中和抗体を示さなかった（図２）。Ａｄを２回注射したマウスは、ウイルスだけとインキュベートした細胞と比較して有意な（Ｐ＜０．０５）レベルの中和抗体を示した。Ａｄ５−ヌルを３回注射したマウスも、ウイルスだけとインキュベートした細胞と比較して有意な（Ｐ＜０．０１）レベルの中和抗体を示した。
【０２８１】
（実施例２：Ａｄ５［Ｅ１−］−ＥＡベクターワクチンは、Ａｄ５免疫マウスで再免疫の際にＥＡ特異的免疫応答を誘導する）
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームが、マウスにおける既存のＡｄ５免疫の存在下でエボラ関連抗原ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬに対してＣＭＩ応答を誘導することを示す。
【０２８２】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌを構築し、生成する。簡潔には、相同組換えに基づくアプローチを使用して、導入遺伝子をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターのＥ１領域にサブクローニングする。複製欠陥ウイルスをＥ．Ｃ７パッケージング細胞株で増殖させ、ＣｓＣｌ２精製し、滴定する。ウイルス感染力価を、Ｅ．Ｃ７細胞単層の上のプラーク形成単位（ＰＦＵ）として決定する。ＶＰ濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）破壊ならびに２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの分光測光によって決定する。
【０２８３】
Ａｄ５  ＣＥＡベクターの特徴付け
２つのＡｄ５−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬベクタープラットフォームのＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬ遺伝子発現を確認するために、初期の研究を実行した。最初に、ワクチンベクタープラットフォームをトランスフェクトした細胞で抗原を発現させ得ることを決定した。Ａ５４９細胞をＡＴＣＣから得、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−］−Ｌ；またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌをトランスフェクトした。ウエスタンブロット分析は、ベクタープラットフォームをトランスフェクトした細胞が、示される抗原を発現することを明らかにした。
【０２８４】
方法
Ａ５４９細胞に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌを５５５ＶＰ／細胞のＭＯＩで接種した。細胞を、５％ＣＯ２中の３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、３回凍結／解凍した。全細胞溶解物を７０℃で１０分間加熱した後、ゲルにローディングした。組換えＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬ対照は３０ｎｇ／レーンで、調製した溶解物は２０μＬ／レーンでローディングした。追加の陰性対照として試料ローディング緩衝液が含まれ、陽性対照はＭａｇｉｃ  Ｍａｒｋ  ＣＰウエスタンマーカーおよび組換えＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４および／またはＬであった。ゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液で６０分間ブロックした。膜をマウスモノクローナル抗ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬ一次抗体（１：１０００）および二次抗マウスＨＲＰ（１：２５００）コンジュゲート抗体でプローブした。膜を３回洗浄し、次にＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光試薬とインキュベートし、Ｘ線フィルムを膜に曝露させた後に発色させることによってバンド形成を可視化した。
【０２８５】
マウスでのＡｄ５免疫の誘導
誘導され得るＡｄ５免疫のレベルを評価するために、Ａｄ５ナイーブＣ５７Ｂｌ／６マウスの群に、Ａｄ５ベクタープラットフォーム（ＶＰ）を皮下注射する。２８〜４２日後に、血清試料を収集し、エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価について評価する。検出不能なＡｄ５  ＮＡｂ力価（エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価＜１／２５）を通常の対照マウスで観察することができる。１回の注射の後にＡｄ５  ＮＡｂ（１／２５〜１／５０のエンドポイント力価）が検出可能であり得るが、１０１０個のＡｄ５の３回の注射の後に劇的に増加することがある。したがって、追加のＡｄ５免疫研究では、マウスに１０１０のＡｄ５  ＶＰを２回注射して、これらの動物をＡｄ５免疫にする。
【０２８６】
Ａｄ５［Ｅ１−］−ＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡによるＡｄ５免疫マウスの免疫
これらの実験は、Ａｄ５免疫マウスでＡｄ５［Ｅ１−］−ＥＡおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡワクチンの免疫誘導能力を決定し、比較するように設計される。４〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群を、１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰにより２週間隔で２回免疫する。最後のＡｄ５−ヌル免疫の２週後、マウスを１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−］−ＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡにより１週間隔で３回免疫する。最後の免疫の２週後、マウスを安楽死させ、それらの脾臓および血清を分析のために収集する。
【０２８７】
インタクトなＥＡ抗原に曝露させた脾細胞で実行されるＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、ＣＭＩ応答を評価する。Ａｄ５［Ｅ１−］−ＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡによって皮下に免疫したＡｄ５免疫Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの脾細胞を収集し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞の数について評価する。免疫されたＡｄ５［Ｅ１−］−ＥＡマウスと比較してＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡで免疫したマウスからのアッセイした脾臓で、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方の分泌細胞の有意に増加した数を観察することができる。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡによるＡｄ５免疫マウスの免疫が、有意により高いＣＭＩ応答を誘導することを示すことができる。
【０２８８】
免疫されたマウスでの肝臓への有害作用の欠如
前記のようにＡｄ５［Ｅ１−］−ＥＡ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡで免疫したＡｄ５免疫雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの血清で、毒性研究を実行する。緩衝液単独を注射したＡｄ５ナイーブまたはＡｄ５免疫マウスが、対照の役目を果たす。処置による肝臓毒性を決定するために、第３の免疫の３日後に、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルを血液試料で評価する。いずれのベクターによる免疫の後にも、ＡＳＴレベルを対照を超えて上昇させることができない。アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）レベルも評価し、類似の結果を観察することができる。
【０２８９】
Ａｄ５免疫エボラ感染マウスにおけるＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ免疫療法
上で観察された成功裏の免疫学的結果に基づき、エボラ感染をマウスで確立し、その後処置した研究を、下記の通りに実行した。エボラ感染の後、マウスを新規のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡベクタープラットフォームで処置する。Ａｄ５免疫エボラ感染マウスをＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡベクターで処置できるかどうか決定するために、マウスをＡｄ５免疫にするために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１４日間隔で１０１０のＡｄ５［Ｅ１−］−ヌルＶＰを皮下に２回注射する。最後の注射から２週後に、７匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの２群に、１０６個のＥＡ発現細胞を皮下注射する。７日後、エボラ感染が明白になったとき、７、１３および１９日目に、１群のマウスを１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡによる遠位皮下注射によって処置する。注射緩衝液だけで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの群が、未処置対照の役割を果たす。全てのマウスは２１日間にわたってエボラ感染退行についてモニタリングされ、エボラウイルス感染力価が決定される。研究の終わりに、脾臓をマウスから収集し、ＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定する。
【０２９０】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＣＭＩ応答の分析。
ＩＦＮ−γ分泌リンパ球のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実行する。簡潔には、個々の患者試料から単離されたＰＢＭＣ（細胞数２×１０５／ウェル）をＥＡペプチドプールと３６〜４０時間インキュベートして、ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞を刺激する。Ａｄ５へのＣＭＩ応答は、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）に患者ＰＢＭＣを曝露させた後に決定する。０．２５μｇ／ウェルの濃度のコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）で細胞を刺激し、それらは陽性対照の役目を果たした。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを使用して有色スポット形成細胞（ＳＦＣ）を数え、陰性対照の減算の後に細胞数１０６当たり５０ＳＦＣが検出され、ＳＦＣが陰性対照ウェルのものより２倍以上高かったならば、応答は陽性であると考えられた。
【０２９１】
Ａｄ５中和抗体（ＮＡｂ）力価の決定。
エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価を決定する。簡潔には、１０％ウシ胎仔血清を含有する１００μＬのＤＭＥＭ中の熱不活性化試験血清の希釈溶液を、４×１０７ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−］−ヌルと混合し、室温で６０分の間インキュベートする。１０％熱不活性化子ウシ血清を含有するＤＭＥＭで５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間培養した、細胞数２×１０３／ウェルのＨＥＫ２９３細胞を含有するマイクロウェルに試料を追加する。混合物を、５％ＣＯ２中の３７℃でさらに７２時間インキュベートする。細胞死滅およびエンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価を測定するために、ＭＴＳテトラゾリウム生体内還元アッセイを使用する。１：２５未満の値を有するエンドポイント力価に、０の値を割り当てる。
【０２９２】
統計。
免疫応答を比較する統計分析を、マン−ホイットニー検定法（ＰＲＩＳＭ、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を用いて実行する。生存比較は、カプラン−マイヤープロット（ＰＲＩＳＭ、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を用いて実行する。Ａｄ５  ＮＡｂ力価およびＥＡ特異的ＣＭＩは、連続変数として分析する。ＥＡ特異的ＣＭＩの変化とＡｄ５  ＮＡｂ力価の関連は、スピアマン相関係数で検定する。生存とＡｄ５  ＮＡｂ力価の関連は、比例危険モデルのワルド検定で検定する。
【０２９３】
二次的目的は、本製品による免疫処置の後のＥＡ特異的免疫応答を評価することである。
【０２９４】
エボラ感染被験体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から樹状細胞を生成する；ワクチン接種後のこの患者からのＰＢＭＣを使用して、ＥＡに特異的な個々のＴ細胞株の樹立を試みる。簡潔には、リンパ球分離培地勾配を使用してＰＢＭＣを単離し、ＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁し（細胞数２×１０７）、６ウェルプレートに２時間接着させた。１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で、接着細胞を５日間培養する。培養培地は、３日ごとに補充する。
【０２９５】
（実施例３：臨床グレード多標的化ワクチンのＧＬＰ生産）
この実施例は、優良実験室規範（ｇｏｏｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＬＰ）を使用した、臨床グレードの多標的化ワクチンの生産を示す。以前に、優良製造実施基準（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に従ってＧＬＰ条件の下で５Ｌ細胞バイオリアクターを使用して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）製品を生産した。この実施例は、類似のアプローチを使用して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＥＡ製品ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４およびＬを５Ｌ細胞バイオリアクターで生産することができることを示すことができる。
【０２９６】
簡潔には、Ｅ．Ｃ７製造細胞株のバイアルを解凍し、Ｔ２２５フラスコに移し、１０％ＦＢＳ／４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭで５％ＣＯ２中の３７℃で初期培養する。拡大増殖後、Ｅ．Ｃ７細胞は１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫＳ（ＣＳ−１０）を使用して拡大増殖させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ無血清培地（ＳＦＭ）に移行する。Ｅ．Ｃ７細胞を、細胞バイオリアクター中で細胞数５×１０５／ｍＬの目標密度まで、５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間、ＳＦＭで培養する。次に、Ｅ．Ｃ７細胞に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌをそれぞれ感染させ、４８時間培養する。
【０２９７】
中流プロセシングを、臨床グレードのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌ製品を調製するために使用されるものと同一の様式で実行する。収集の３０分前に、濃縮のためにより優れた細胞ペレット化を促進するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼを培養物に追加する。遠心分離によってペレットにした後に、上清を廃棄し、ペレットは室温で９０分の間、１％ポリソルベート２０含有溶解緩衝液に再懸濁させる。溶解物をＢｅｎｚｏｎａｓｅで次に処理し、５Ｍ  ＮａＣｌの添加によって反応をクエンチする。スラリーを遠心分離し、ペレットを廃棄する。溶解物を濾過によって透明にし、２カラムイオン交換手順にかける。
【０２９８】
ワクチン製品を精製するために、２カラム陰イオン交換手順を実行する。第１のカラムにＱセファロースＸＬ樹脂を詰め、清潔にし、ローディング緩衝液で平衡化する。透明にした溶解物をカラムにローディングし、ローディング緩衝液で洗浄する。ワクチン生成物を溶出し、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌを含有する主溶出ピーク（溶出液）を、次の工程に進める。第２のカラムにＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ樹脂を詰め、清潔にし、ローディング緩衝液で平衡化する。第１の陰イオン交換カラムからの溶出液を第２のカラムにローディングし、ワクチン生成物を、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）から出発して５０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に移行する勾配で溶出させる。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および／または［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌを含有する溶出ピークを収集し、２〜８℃で一晩保存する。ピーク溶出画分は、濃縮および製剤化緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭトリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．０）に対するダイアフィルトレーションのための接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通して処理する。処理後、最終ワクチン生成物を濾過滅菌し、アリコートに分注し、≦−６０℃で保存する。１００％近くの純度の高度に精製された生成物が一般的に生成され、これらの生成物の類似の結果が予測される。
【０２９９】
生成されたＶＰ生成物の濃度および総数は、分光測光法で決定する。生成物純度は、ＨＰＬＣによって評価する。感染性活性は、キットを使用する感染性粒子のためのＡｄ５ヘキソン染色アッセイを実行することによって決定する。
【０３００】
ＥＡ発現を検証するために、ベクターをトランスフェクトした細胞からの溶解物を使用して、ウエスタンブロットを実行する。最終ワクチン生成物がマイコプラズマを含まず、微生物汚染度（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を有さず、１ｍＬ当たり２．５エンドトキシン単位（ＥＵ）未満のエンドトキシンレベルを示すことを決定するために、品質管理試験を実行する。免疫原性を確認するために、マウスで個々のベクターを試験する。
【０３０１】
（実施例７：単一および多標的化ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４、Ｌウイルスベクターの免疫原性）
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４もしくは［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌまたは１：１：１の比の２つまたはそれを超えるウイルスの１０１０ＶＰの組み合わせをｓ．ｃ．注射する。対照マウスには、３×１０１０ＶＰのＡｄ−ヌル（導入遺伝子挿入断片なし）を注射する。用量は２５μｌの注射緩衝液（３％スクロースを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で投与し、マウスは１４日間隔で３回ワクチン接種する。最終注射の１４日後に、脾臓および血清を収集する。血清は、−２０℃で冷凍する。７０μＭナイロン細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通して脾臓を静かに破砕することによって、脾細胞懸濁物を生成する。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の添加によって赤血球を除去し、脾細胞を２回洗浄してＲ１０（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよび１０％ウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁させる。ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリーによって、サイトカイン生産について脾細胞をアッセイする。
【０３０２】
免疫原性研究：
最後の免疫の２週後に、ＥＡペプチドプールへの脾細胞の曝露の後に、ＩＦＮ−γ分泌細胞（ＳＦＣ）のためにＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＣＭＩ活性を決定する。
【０３０３】
簡潔には、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞（ＳＦＣ）のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価されるＥＡに対するＣＭＩ応答は、多標的化免疫マウスで検出されるが、対照マウス（Ａｄ５−ヌル空ベクターを注射）では検出されない。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ応答の特異性は、無関係なＳＩＶ−ｎｅｆまたはＳＩＶ−ｖｉｆペプチド抗原への反応性の欠如によって確認される。陽性対照には、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）に曝露させた細胞が含まれる。
【０３０４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬ−特異的ＩＦＮ−γ−またはＩＬ−２−分泌Ｔ細胞を、新たに単離されたマウス脾細胞からのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定する。簡潔には、ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４またはＬに由来する単一のプールにおいて、０．２μｇ／ウェルの重複する１５ｍｅｒペプチドで、２×１０５個の脾細胞を刺激する。陽性対照として細胞を１ウェル当たり０．０６２５μｇの濃度のＣｏｎ  Ａで刺激し、ＳＩＶ−ＮｅｆおよびＳＩＶ−Ｖｉｆに由来する重複した１５ｍｅｒ完全ペプチドプールを無関係なペプチド対照として使用する。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを使用してＳＦＣの数を決定し、結果は１０６個の脾細胞当たりのＳＦＣの数として報告される。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）のレベルを決定するために、ＥＡ標的細胞を使用してＣＤＣＣ試験を実行する。
【０３０５】
細胞内サイトカイン刺激
脾細胞を調製する。９６ウェルＵ底プレート中の１ウェル当たり１×１０６個の生脾細胞を使用して、刺激アッセイを実行する。ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、ＶＰ２４およびＬのコード配列全体にわたる重複したペプチドのプールを、１１アミノ酸重複部を有する１５ｍｅｒとして合成し、凍結乾燥したペプチドプールをＤＭＳＯに溶解する。ＳＩＶ−ＶｉｆおよびＳＩＶ−Ｎｅｆに対応する、同じように構築したペプチドプールは、オフターゲット対照の役目を果たす。Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清および抗生物質）中の脾細胞を、２μｇ／ｍＬ／ペプチドのペプチドプールの添加によって３７℃および５％ＣＯ２で６時間刺激し、インキュベーションにはタンパク質輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）を２時間加える。刺激された脾細胞は、次にリンパ球表面マーカーＣＤ８αおよびＣＤ４について染色し、固定し、透過処理し、次にＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの細胞内蓄積について染色される。マウスＣＤ８α、ＣＤ４、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαに対する抗体を使用し、染色は抗ＣＤ１６／ＣＤ３２の存在下で実行した。フローサイトメトリーを実行し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアで分析する。
【０３０６】
補体依存性細胞傷害性アッセイ（ＣＤＣ）
９６ウェル組織培養マイクロプレートに、ＥＡ細胞を１ウェル当たり細胞数２×１０４の密度で一晩培養する。プールされた熱不活性化マウス血清を１：５０の希釈で追加し、３７℃で１時間インキュベートする。次にウサギ血清を補体の供給源として１：５０の希釈で追加し、細胞を３７℃でさらに２．５時間インキュベートする。製造業者の説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性アッセイを使用して、細胞培養上清をアッセイする。ＥＡ細胞のパーセント溶解は、式％溶解＝（実験的−標的  自発的）／（標的最大値−標的  自発的）×１００％によって計算する。
【０３０７】
抗エボラ免疫療法研究：
確立されたエボラ感染を有するマウスでの免疫療法研究で、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとした多重ワクチンの抗エボラ能力を試験するために研究を実行する。この研究では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとした多重ワクチンの個々の成分の抗エボラ活性を評価する。
【０３０８】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に対して、５×１０５個のＥＡ発現細胞を右側腹部に皮下注射する。マウスを、それぞれＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ヌル（導入遺伝子なし、例えば空のベクター）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＧＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＮＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ４０、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＶＰ３５、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ３０、［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＶＰ２４および［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｌの各々の１×１０１０ＶＰによる３回の皮下注射によって処置する。
【０３０９】
（実施例８：ワクチン標的としてのエボラウイルスＧＰおよびＮＰの使用。）
ＧＰおよび／またはＮＰを含むエボラウイルス遺伝子成分を含有するより早い世代の組換えＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−］）ワクチンを、研究所の場面で構築し、生成し、試験した。これらのワクチンを使用してマウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で有望な前臨床保護効果が得られたが、動物が既存のまたはＡｄ５ベクターによって誘導されたアデノウイルス免疫を示した場合、有効性は打ち消された。
【０３１０】
この実施例では、エボラウイルスのＧＰおよびＮＰ成分がワクチンで使用される。ザイールおよびスーダン株が大部分の種特異的症例致死率の原因であるので、これらの２つの株からのウイルス成分を最初に使用する。ＧＰが標的化され得る表面糖タンパク質であるので、それを用いる。エボラに対して広く反応性の免疫応答を誘導するために、エボラの両分離株からのＧＰ遺伝子を使用する。ＮＰが機能的トランスクリプターゼ−レプリカーゼ複合体へのＶＰ３５、ＶＰ３０およびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと結びつくので、ウイルス複製を妨害および／または阻止する免疫応答を誘導するワクチンでそれを使用する。この様式で、エボラに対して体液性および細胞媒介性の免疫（ＣＭＩ）応答を誘導するＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームをベースとした広く反応性のワクチンを開発する。
【０３１１】
ワクチンとしての組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターの使用。
強力な免疫応答を誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）への規定のエボラ抗原の曝露のために、ワクチンを皮下注射によって直接的に送達する。
【０３１２】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターエボラワクチンの増幅。
４つのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたワクチンを構築した（図８）。ザイール株ワクチンについては、現在の大流行（ザイールエボラウイルス分離株Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０７、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＫＪ６６０３４７）からのＧＰおよびＮＰのヌクレオチド配列をヒトコドン使用のために最適化し、ＣＭＶプロモーターの調節下のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにクローニングした。アデノウイルスＥ１およびＥ２ｂ遺伝子を安定して発現するＥ．Ｃ７細胞に線状化Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラスミド構築物をトランスフェクトし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ生成物およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＮＰＥＺ生成物を生成することによって、ウイルス粒子をレスキューした。
【０３１３】
スーダン株ワクチンについては、エボラウイルスのスーダン株（スーダンエボラウイルス分離株ＥｂｏＳｕｄ−６８２  ２０１２、完全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ５４５３９２．１）のＧＰおよびＮＰのヌクレオチド配列をヒトコドン使用のために最適化し、ＣＭＶプロモーターの調節下のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにクローニングした。アデノウイルスＥ１およびＥ２ｂ遺伝子を安定して発現するＥ．Ｃ７細胞に線状化Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラスミド構築物をトランスフェクトし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ生成物およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＮＰＥＳ生成物を生成することによって、ウイルス粒子をレスキューした。
【０３１４】
組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたワクチンの生成、精製および試験。
ＮＨＰによる後の研究のために追加のワクチンを調製する。Ｅ．Ｃ７細胞株は、高くて再現可能な収量でＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターを増殖させる。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用したＥ．Ｃ７ヒト細胞からの放出、ＣｓＣｌ勾配またはイオン交換クロマトグラフィーでの精製および５％スクロース含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対する透析によって、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターを製造、生産する。精製された組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたウイルスワクチンをアリコートにし、ドライアイス−エタノール浴で冷凍する。ウイルス粒子の感染性は、プラークアッセイを使用して測定する。ウイルス粒子（ＶＰ）の濃度を２６０ｎｍでの吸光度から計算し、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫のためのウイルスの量を決定するために使用する。トランスフェクトしたＡ５４９細胞溶解物からのウエスタンブロットにより、抗原導入遺伝子発現が検証される。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺによる２４時間のトランスフェクションの後のＥ．Ｃ７細胞の細胞溶解物中のエボラＧＰ（ザイール株）発現の例を、図９に示す。
【０３１５】
用量漸増免疫原性研究。
これらの研究は、臨床的に関連するＡｄ５免疫マウスモデルを使用して実行する。１０１０ＶＰのＡｄ５−ヌルによる２週間隔の２回の皮下注射によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＡｄ５免疫にする。第２の注射から２週後に、マウスがＡｄ５免疫であることを検証するためにＡｄ５中和Ａｂ（ＮＡｂ）について血清を試験する。このように処置したマウスおよびサルは１／１００〜１／２００のＡｄ５  ＮＡｂ力価を達成し、臨床治験では、全ての患者の間の平均の既存のＡｄ５  ＮＡｂ力価は１：１８９±１：７１（平均±ＳＥＭ）であった。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ／ＮＰＥＺおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ／ＮＰＥＳ（等しく組み合わせた混合物）の漸増用量による免疫の後に誘導される免疫応答を、評価する。Ａｄ５免疫マウスの群（ｎ＝５／群）を、４×１０８、４×１０９または４×１０１０ＶＰの上昇する用量を使用して、２週ごとに皮下経路によって２回免疫する（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ／ＮＰＥＺおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ／ＮＰＥＳの等量を含有するワクチン混合物）。対照マウス（ｎ＝５）に、同じスケジュールで４×１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射する。最終免疫の１４日後に、抗体（Ａｂ）および細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答を評価する。ＣＭＩ評価については、ＧＰまたはＮＰペプチドプールへの曝露の後にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−２分泌リンパ系細胞の数を測定するために、以前に記載したＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して個々のマウスからの脾細胞を評価する。精製された市販物を使用して、Ａｂ活性について血清試料を評価する。
【０３１６】
最も高い免疫原性用量を使用して、１または２用量が有効なワクチン接種のために必要とされるかどうか決定するために、１回または２回の皮下免疫を用いる研究を実行する。ワクチンの最も有効な用量を使用して、マウスの群（ｎ＝５／群）を２週ごとに１回または２回免疫する。対照マウス（ｎ＝５）に、同じスケジュールでＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（ＶＰの量はワクチンと同じ）を注射する。最終免疫の１４日後に、前述のようにＡｂおよびＣＭＩ応答を評価する。これらの研究は、有意な免疫応答を誘導するために１回または２回の免疫が必要とされるかどうかの決定を可能にする。
【０３１７】
ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリーによるＡｄ５免疫マウスでの免疫原性研究。
これらの研究のために、上で決定されるワクチン接種の最も有効な用量および頻度を使用する。インフルエンザワクチンによるサルでの概念実証研究では、赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）アッセイによって評価したときのＡｂ応答が最高レベルを生ずるために、最高３０日を必要とし得ることが観察された（図９）。したがって、皮下ワクチン接種の２週、３０日および６０日後のＡｄ５免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）でのＡｂ活性およびＣＭＩ応答を、ワクチン接種の最も有効な用量および頻度で評価する（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ／ＮＰＥＺおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ／ＮＰＥＳの等量を含有するワクチン混合物）。対照マウスに、同じスケジュールでＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（ＶＰの量はワクチンと同じ）を注射する。ワクチン接種の２週、３０日または６０日後に、個々のマウスから血清および脾細胞を収集する。ＧＰまたはＮＰペプチドプールへの曝露の後にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌リンパ系細胞の数を測定するために、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して個々のマウスからの脾細胞をＣＭＩ応答について評価する。ワクチンの評価では細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答も重要であるので、ＣＴＬ活性のためにＧＰまたはＮＰペプチドプールへの曝露の後に脾細胞でグランザイムＢ分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析する。なぜなら、これがＣＤ８機能的ＣＴＬ活性を測定するための優れたアッセイであるからである。ＥＬＩＳＡ技術を用いて、精製された市販のエボラウイルスタンパク質に対するＡｂ活性について血清試料を評価する。ウイルス中和活性について、個々のマウスからの血清でプラーク低減中和アッセイも実行する。
【０３１８】
最も高いＣＭＩ応答が観察される上記の研究に基づき、ワクチンによる免疫によって誘導されるＴ細胞免疫応答を特徴付けるために、フローサイトメトリー研究も実行する。ワクチン接種の最も有効な用量および頻度を使用して、Ａｄ５免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をワクチンで免疫する。対照マウス（ｎ＝５）に、同じスケジュールでＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（ＶＰの量はワクチンと同じ）を注射する。ワクチン接種後の最適な時間に基づき、脾臓を収集し、ＧＰまたはＮＰペプチドプールへの曝露後に、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α発現細胞のためにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって決定する。簡潔には、免疫されたマウスおよび対照マウスからの脾細胞を収集し、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、タンパク質輸送阻害剤の存在下で０．５μｇ／ｍｌのＧＰまたはＮＰペプチドプールと５時間インキュベートする。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を次に固定し、透過処理し、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αについて染色し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０３１９】
ワクチン接種したＡｄ５免疫マウスのウイルスチャレンジからの保護。
原理実証試験では、チャレンジ試験をマウスで実行する。ＢＡＬＢ／ｃマウスの２群（ｎ＝１５／群）を、前記のようにＡｄ５免疫にする。ワクチン接種のための最も有効な用量および頻度を使用して、１群をワクチンで免疫する（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ／ＮＰＥＺおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ／ＮＰＥＳの等量を含有するワクチン混合物）。対照群に、同じスケジュールでＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（ＶＰの量はワクチンと同じ）を注射する。誘導されたウイルス中和力価が達成されるとき、エボラの致死性マウス適応株による接種によってマウスをチャレンジする。エンドポイントのための体重減少および死亡までの時間をモニタリングする。チャレンジ後２１日間超にわたり、病的状態の臨床徴候についてマウスを毎日観察する。
【０３２０】
フェーズ２研究
フェーズ２研究では、ＮＨＰでのエボラワクチンの免疫原性を評価する。適当な免疫用量、追加刺激スケジュールおよび生エボラチャレンジ能力を決定する。さらに、エボラウイルスのザイールおよびスーダン株からの融合ＧＰおよびＮＰ遺伝子を含有するＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたプラットフォームを評価する。この様式で、２つの組換えベクター、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＺ／ＮＰＥＺ生成物およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＧＰＥＳ／ＮＰＥＳ生成物が生成される。１つの組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターに複数の遺伝子を導入することによって、４つの個々の組換えベクターの各々を生成し、組み合わせることと比較して、必要とされるウイルス粒子の数が有意に減少する。
【０３２１】
上記の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。この明細書で言及されるおよび／または出願データシートに掲載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０３２２】
実施形態の態様は、さらに他の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いるのに必要であるならば、改変されてもよい。
【０３２３】
上の発明を実施するための形態を考慮して、これらのおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきでなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と一緒に全ての可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018502922.tif 000028
【図６Ａ】
2018502922.tif 000029
【図６Ｂ】
2018502922.tif 000030
【図７】
2018502922.tif 000031
【図８】
2018502922.tif 000032
【図９】
2018502922.tif 000033
【配列表】
2018502922000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月8日(2017.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスベクターを含む組成物であって、前記エボラウイルス抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して７０％〜１００％の配列同一性を有する、組成物。
（項目２）
組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記組換え核酸ベクターが、複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、前記組成物がヒトに投与されると、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導することができ、前記免疫応答が細胞媒介性免疫を含む、組成物。
（項目３）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目１から３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記エボラウイルス抗原が、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、項目１から４までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
エボラウイルス抗原をコードする配列を含み、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を有する組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む組成物であって、前記エボラウイルス抗原が、２５またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、組成物。
（項目７）
前記エボラウイルス抗原が、２０、１５、１０、５、またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、項目５または６に記載の組成物。
（項目８）
前記エボラウイルス抗原が、２、３、または４アミノ酸の改変を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記エボラウイルス抗原が、１アミノ酸の改変を含む、項目７に記載の組成物。
（項目１０）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失を含む、項目１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失を含む、項目１から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記エボラウイルスが、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目１４に記載の組成物。
（項目１７）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目１４に記載の組成物。
（項目１８）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目１４に記載の組成物。
（項目１９）
前記エボラウイルス抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される配列に対して１００％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目１４に記載の組成物。
（項目２０）
前記組換え核酸ベクターが、トランスフェクトされた細胞において前記エボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる、項目１から１９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
前記組換え核酸ベクターが、ヒトにおいて前記エボラウイルス抗原を発現する細胞に対して基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍の特異的な免疫応答を誘導することができる、項目１から２０までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
前記ヒトが、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１７５超、または２００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目１から２１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目１から２４までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、項目１から２３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
免疫原性成分をさらに含む、項目１から３１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３からなる群より選択されるサイトカインを含む、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目３２に記載の組成物。
（項目３５）
０．８〜１．２ｍＬの範囲の体積の治療用溶液からなる組成物を含むバイアルであって、前記治療用溶液は、２．５〜７．５×１０１１個のウイルス粒子を含み、前記ウイルス粒子は、エボラウイルス抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損性アデノウイルスを含む、バイアル。
（項目３６）
組換え核酸ベクターが、トランスフェクトされた細胞において前記エボラウイルス抗原の過剰発現をもたらすことができる、項目３５に記載のバイアル。
（項目３７）
前記トランスフェクトされた細胞がＥ．Ｃ７細胞である、項目３５または３６に記載のバイアル。
（項目３８）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目３５から３７までのいずれか一項に記載のバイアル。
（項目３９）
前記複製欠損性アデノウイルスが、ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する特異的な免疫応答を誘導することができるタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目３５から３８までのいずれか一項に記載のバイアル。
（項目４０）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４１）
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４２）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４３）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４４）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４５）
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４６）
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、項目４５に記載のバイアル。
（項目４７）
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、項目３９に記載のバイアル。
（項目４８）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、１．５×１０１１個、２．０×１０１１個、２．５×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む、項目３５から４７までのいずれか一項に記載のバイアル。
（項目４９）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む、項目３５から４８までのいずれか一項に記載のバイアル。
（項目５０）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５１）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５２）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５３）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５４）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５５）
前記治療用溶液が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、項目４８または４９に記載のバイアル。
（項目５６）
免疫原性成分をさらに含む、項目３５から５５までのいずれか一項に記載のバイアル。
（項目５７）
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む、項目５６に記載のバイアル。
（項目５８）
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目５６に記載のバイアル。
（項目５９）
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記ヒトに項目１から３４までのいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目６０）
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記ヒトに項目３５から５８までのいずれか一項に記載のバイアルの組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目６１）
前記投与するステップを少なくとも１回繰り返す、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２）
前記投与するステップを、前回の投与するステップの約３週間後に繰り返す、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記投与するステップを、前回の投与するステップの約３カ月後に繰り返す、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記投与するステップを２回繰り返す、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
ヒトにおいてエボラウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、
（ａ）前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を投与するステップを含む処置の第１の相と、
（ｂ）その後の、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を投与するステップを含む処置の第２の相と
を含む、方法。
（項目６６）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記処置の第２の相の間に、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目６７）
ｎが１より大きい、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
ｎが３である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
ｍが１より大きい、項目６６から６８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
ｍが３である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記第１の相が、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である、項目６５から７０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記第２の相が、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である、項目６５から７１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記第２の相を、第１の相の終了から３〜１６週間後に開始する、項目６５から７２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１８日間離れている、項目６５から７３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約２１日間離れている、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大２４日間離れている、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１０週間離れている、項目６５から７６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約１３週間離れている、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大１６週間離れている、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
（ａ）処置の第１の相と第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、前記ヒトにおいてエボラウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するエボラウイルス抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップと
を含み、前記第２の相を、前記第１の相の終了から約３カ月後に開始する、処置方法。
（項目８１）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原と同じものである、項目５９から８０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原とは異なるものである、項目６５から８１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターと前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが同じものである、項目６５から８２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目６５から８３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目６５から８４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目６５から８５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して６０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目６５から８６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、２５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む、項目６５から８７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、２０、１５、１０、または５アミノ酸またはそれ未満の改変を含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターによりコードされるエボラウイルス抗原が、１アミノ酸の改変を含む、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目６５から９０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９１または９２のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９１から９３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目６５から９４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９５または９６のいずれかに記載の方法。
（項目９８）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９５から９７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、前記組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１、１．５×１０１１、２．０×１０１１、２．５×１０１１、３．０×１０１１、３．５×１０１１、４．０×１０１１、４．５×１０１１、４．８×１０１１、４．９×１０１１、４．９５×１０１１、または４．９９×１０１１個含む、項目６５から９８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１、６．５×１０１１、６．０×１０１１、５．５×１０１１、５．２×１０１１、５．１×１０１１、５．０５×１０１１、または５．０１×１０１１個含む、項目６５から９９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０３）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０４）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０５）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０６）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、項目９９または１００に記載の方法。
（項目１０７）
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍増大する、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記免疫応答が、中和性エボラウイルス抗原特異的抗体応答として測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記免疫応答が、エボラウイルス抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記エボラウイルス抗原に対する前記免疫応答が、ＥＬＩＳｓｐｏｔアッセイによって測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記エボラウイルス抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、エボラ感染細胞株由来または自己エボラ感染細胞由来の、同種エボラウイルス抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、項目５９から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
第１の複製欠損性アデノウイルスまたは第２の複製欠損性アデノウイルスが、前記ヒトにおいて樹状細胞に感染し、感染した前記樹状細胞が前記エボラウイルス抗原を提示し、それにより、前記免疫応答が誘導される、項目５９から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記投与するステップが、皮下投与を含む、項目５９から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記ヒトが、前記投与するステップの前に、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、２００超、２２５超、２５０超、２７５超、または３００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目５９から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目５９から１１８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記ヒトが、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を同時に受けていない、項目５９から１１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記ヒトが、前記投与するステップの前に、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、および免疫療法のいずれか１つによる治療を受けていない、項目５９から１２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記ヒトが、自己免疫疾患を有さない、項目５９から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記ヒトが、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、またはＨＩＶを有さない、項目５９から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記ヒトが、自己免疫関連甲状腺疾患または白斑を有する、項目５９から１２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を発現する細胞を有する、項目５９から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を発現する細胞を有さない、項目５９から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記ヒトが、エボラウイルス感染の症状を少なくとも１つ、２つ、または３つ有する、項目５９から１２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記ヒトが、前記投与するステップの前に治療を受けている、項目５９から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記第１の相の前に、前記ヒトが、発熱、疲労、筋肉痛、頭痛および咽喉炎、嘔吐、下痢、皮疹、腎機能および肝機能障害、ならびに内出血および外出血などの特定の症状に対する、経口または静脈内輸液を用いた水分補給、血液製剤、免疫療法、薬物または治療からなる群より選択される少なくとも１つの薬物療法を受けている、項目６５から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記ヒトが、化学療法または放射線療法による処置を同時に受ける、項目５９から１２９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記ヒトが、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、カペシタビン、マイトマイシン、レゴラフェニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアセチノフェンからなる群の少なくとも１つの薬物療法の施行を含む治療を同時に受ける、項目５９から１３０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記ヒトが、前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞を含む、項目５９から１３１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、前記エボラウイルス抗原を、非感染細胞におけるエボラウイルス抗原のベースライン発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍過剰発現する、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、エボラ感染細胞を含む、項目１３２または１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、免疫細胞を含む、項目１３２から１３４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、血液細胞を含む、項目１３２から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記エボラウイルス抗原を過剰発現する細胞が、上皮細胞を含む、項目１３２から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記エボラウイルス抗原が、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＴＡＦＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する抗原である、項目５９から１３７までのいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
表１は、網羅的なものではなく、本発明のアデノウイルスワクチンの効率を改善するために不活性化することができる例示的な免疫チェックポイント遺伝子を示す。免疫チェックポイント遺伝子は、表１に列挙されている遺伝子、ならびに共阻害性受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、ＴＣＲシグナル伝達、誘導性Ｔ−ｒｅｇ抑制、転写因子制御性消耗またはアネルギー、および低酸素症媒介性寛容性に関与するその他の遺伝子から選択することができる。
【表１】
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【国際調査報告】
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