(57)【要約】象牙質生成を増強するための、および親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達するための方法および組成物が提供される。一部の場合では、本方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与するステップを含む。一部の場合、本方法は、歯の露出した象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させるステップ（例えば、それにより、親油性薬剤が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透する）を含む。本開示の方法を実施するためのキットもまた提供される。
2018502094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与することを含む、象牙質生成を増強するための方法。
【請求項２】
前記歯髄が、露出した歯髄であり、前記投与することが、前記露出した歯髄を前記Ｗｎｔ刺激性組成物と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与することが、象牙質を前記Ｗｎｔ刺激性組成物と接触させることであって、それにより、前記Ｗｎｔ刺激性組成物が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｗｎｔ刺激性組成物が、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記親油性Ｗｎｔ刺激剤がＷｎｔタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｗｎｔタンパク質がヒトＷｎｔ３Ａである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達する方法であって、
前記歯の露出した象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させることであって、それにより、前記親油性薬剤が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透することを含む、方法。
【請求項８】
前記個体が歯の過敏症を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記歯の歯髄組織が露出していない、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させることの前に、前記露出した象牙質を生じるために、前記歯の象牙質を露出させるステップをさらに含む、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記親油性薬剤が、脂質部分を有する増殖因子である、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記親油性薬剤が、脂質部分を有するＷｎｔ刺激剤である、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｗｎｔ刺激剤がＷｎｔタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｗｎｔタンパク質がヒトＷｎｔ３Ａである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序論）
多くの歯痛は、歯の中央の室を占める結合組織、血管組織、リンパ組織、および神経組織の炎症を引き起こす慢性細菌感染の結果である。まとめて歯髄と呼ばれるこれらの組織が慢性的に炎症を起こした場合、それらは、根管処置として知られる手順において除去されなければならない。細菌感染が歯髄室へ侵入していない場合でさえも、細菌副産物が、残存する歯構造を通って拡散し、慢性歯髄炎症を引き起こし得るため、根管処置は必要とされ得る。これらの状態を処置しようとする努力において、歯髄覆罩と呼ばれる１世紀にわたって続く手順が用いられる場合が多く、それは、残存する歯構造に、高ｐＨの抗菌環境を生じる水酸化カルシウムなどの材料を設置することからなる。
【背景技術】
【０００２】
歯の過敏症は、何百万人という人々を冒し、歯髄腔を隔離する象牙質の量が不十分であることに遡ることができる。正常には、象牙質は、歯冠ではエナメル質により、歯根では歯肉組織により隔離されている。歯の過敏症は、これらの隔離物が悪化すると起こり得る。例えば、歯の過敏症は、深い虫歯、深い歯科修復物（例えば、アマルガム、コンポジット、クラウンなど）、歯周病のため、または加齢のために生じ得る。
【０００３】
再生歯科医学の一つの目標は、天然象牙質の同じ構造的および生物学的性質をもつ象牙質の（例えば、象牙芽細胞からの）発生を刺激することである。そうすることで、存在する歯の活力および機能が保存され得る。象牙芽細胞は、石灰化を起こす細胞外基質を分泌し、歯髄室内に捕捉される。歯髄腔が露出していない限り、医薬（例えば、治療剤）の歯髄組織への送達は困難である。歯髄は、歯髄腔を熱的、化学的、および他の侵害性刺激から保護する石灰化基質である象牙質に囲まれている。歯髄にアクセスするための唯一の手段は、機械的露出（ドリリング）か、または象牙質細管を介しての医薬の送達のいずれかによる。象牙質細管は、象牙芽細胞突起が入っている、細い（２．５μｍ直径）、流体で満たされた管である。
本開示は、（例えば、歯髄露出、歯の過敏症などの状況において）親油性薬剤を歯髄組織に送達するための、および／または歯髄組織による象牙質生成を増強するための組成物および方法を提供する。
刊行物
Han  et  al.,  PLoS  One.  2014  Feb  10;9(2):e88890;  Yang  and  Liu,  Stem  Cells  In  Oral  Medicine.  2012;1(1):  3-8;  Arioka  et  al.,  Biochem  Pharmacol.  2014  Aug  15;90(4):397-405;  Biomaterials.  2015  Jan;39:145-54,  Epub  2014  Nov  22;  Thesleff  and  Tummers,  StemBook  [Internet].  Cambridge  (MA):  Harvard  Stem  Cell  Institute;  2008-2009  Jan  31;  Minear  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2010  Apr  28;2(29):29ra30;  Westendorf  et  al.,  Gene.  2004  Oct  27;341:19-39;  Moon  et.  al.,  Nat  Rev  Genet.  2004  Sep;5(9):691-701;  Dhamdhere  et  al.,  PLoS  One.  2014  Jan  6;9(1):e83650;  Zhao  et  al.,  Methods  Enzymol.  2009;465:331-47;米国特許出願公開第２０１４０３７１１５１号、同第２０１２０１１５７８８号、同第２０１２０３２９７９０号、同第２０１２０２３１０９１号、および同第２００８０２２６７０７号；ＰＣＴ国際公開第２０１２１２２０８１号；ならびに米国特許第８８０９２７２号。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０３７１１５１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０１１５７８８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０３２９７９０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／０２３１０９１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８／０２２６７０７号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１２／１２２０８１号
【特許文献７】米国特許第８８０９２７２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Han  et  al.,  PLoS  One.  2014  Feb  10;9(2):e88890
【非特許文献２】Yang  and  Liu,  Stem  Cells  In  Oral  Medicine.  2012;1(1):  3-8
【非特許文献３】Arioka  et  al.,  Biochem  Pharmacol.  2014  Aug  15;90(4):397-405
【非特許文献４】Biomaterials.  2015  Jan;39:145-54,  Epub  2014  Nov  22
【非特許文献５】Thesleff  and  Tummers,  StemBook  [Internet].  Cambridge  (MA):  Harvard  Stem  Cell  Institute;  2008-2009  Jan  31
【非特許文献６】Minear  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2010  Apr  28;2(29):29ra30
【非特許文献７】Westendorf  et  al.,  Gene.  2004  Oct  27;341:19-39
【非特許文献８】Moon  et.  al.,  Nat  Rev  Genet.  2004  Sep;5(9):691-701
【非特許文献９】Dhamdhere  et  al.,  PLoS  One.  2014  Jan  6;9(1):e83650
【非特許文献１０】Zhao  et  al.,  Methods  Enzymol.  2009;465:331-47
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
象牙質生成を増強するための、および親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達するための方法および組成物が提供される。一部の実施形態では、本方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与するステップを含む。一部の場合、歯髄は、露出した歯髄であり、投与ステップは、露出した歯髄をＷｎｔ刺激性組成物と接触させることを含む。一部の場合、投与ステップは、象牙質をＷｎｔ刺激性組成物と接触させるステップを含み、それにより、Ｗｎｔ刺激性組成物が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透する。一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤を含む。一部のそのような場合、親油性Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔタンパク質（例えば、脂質部分を有するＷｎｔタンパク質）である。一部の場合、Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ３Ａ（例えば、ヒトＷｎｔ３Ａ）である。したがって、一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物は、リポソームＷｎｔ（Ｌ−Ｗｎｔ）、例えば、リポソームＷｎｔ３Ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、本方法は、歯の露出した象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させる（例えば、それにより、親油性薬剤が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透する）ステップを含む。一部の場合、個体は、歯の過敏症を有し、または（例えば、歯科的手順の後）歯の過敏症を発症するリスクがある。一部の場合、歯の歯髄は露出しており、一部の場合には、歯の歯髄は露出していない。一部の場合、本方法は、接触させるステップの前に、歯の象牙質を露出させるステップを含む。一部の場合、親油性薬剤は、脂質部分を有する増殖因子である。一部の場合、親油性薬剤は、脂質部分を有するＷｎｔ刺激剤である。一部のそのような場合、Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔタンパク質（例えば、脂質部分を有するＷｎｔタンパク質）である。一部の場合、Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ３Ａ（例えば、ヒトＷｎｔ３Ａ）である。したがって、一部の場合、脂質構造の非水相内に挿入される親油性薬剤は、リポソームＷｎｔ（Ｌ−Ｗｎｔ）、例えば、リポソームＷｎｔ３Ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）である。
【０００８】
一部の場合、Ｗｎｔ３Ａタンパク質は、歯髄腔に送達される。親油性ＷＮＴ３Ａタンパク質は、脂質小胞に繋ぎ止めることができ、それにより、そのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性を安定化させることができる。リポソームＷｎｔ３Ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）製剤は、露出した象牙質に適用することができ、それにより、リポソーム粒子は、歯の外側から歯髄腔に伸びる象牙質細管を通って、象牙質を貫通する。そこで、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、歯髄細胞の生存と増殖の両方を増強することができ、歯を隔離し、かつ熱的および化学的傷害から歯髄を保護する象牙質（例えば、第三象牙質）の形成を刺激することができる。新しい象牙質形成を刺激することにより、歯髄の細菌感染および全体的な歯の過敏症のリスクが低下し、根管治療、広範な補綴置換、および抜歯の必要性が減少する。本方法は、歯の過敏症に対する身体の自然応答を増大することができる。すなわち、リポソームタンパク質治療用物質の局所適用は、歯髄細胞を刺激して、より多くの象牙質を生成することができ、そうすることで、歯をさらに隔離することができる。本方法は、一般的な修復歯科学、歯科補綴学、および歯周療法学において幅広い適用を有する。本開示の方法を実施するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】象牙芽細胞は、Ｗｎｔ応答性である。（Ａ）骨格的に成熟したマウスにおいて、ペンタクローム染色は、象牙質（黄色から黄緑色）、歯髄（紫色）および歯槽骨（黄色）を識別する。（Ｂ）より高い倍率の歯髄−象牙質複合体は、前象牙質および象牙質（青色および青黄色）に並置される歯髄細胞および象牙芽細胞（ピンク色）の組織化を例示する。（Ｃ）単に分裂した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）歯髄腔において、分泌象牙芽細胞は、ネスチン免疫染色に対して陽性である。（Ｄ）これらの分裂した分泌象牙芽細胞は、ＤＳＰを発現する。それぞれ成体Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウスにおける（Ｅ）Ｘ−ｇａｌ染色および（Ｆ）ＧＦＰ蛍光により、分裂した分泌象牙芽細胞および歯髄細胞がＷｎｔ応答性であることが実証される。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｏｄ、象牙芽細胞；ｐ、歯髄；ｐｄ、前象牙質。スケールバー：４００μｍ（Ａ）、２５μｍ（Ｂ〜Ｅ）、１０μｍ（Ｆ）。
【００１０】
【図２Ａ−Ｈ】図２。Ａｘｉｎ２欠失は、歯牙形成または歯髄−象牙質ホメオスタシスを崩壊しない。（Ａ〜Ｆ）骨格的に成熟した雄（Ａ、Ｃ、Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける臼歯領域のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）再構築。定量化したμＣＴは、年齢適合性別適合成体Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの臼歯における（Ｇ）象牙質容量、または（Ｈ）象牙質およびエナメルミネラル密度の差異がないことを実証する。ペンタクローム染色は、（Ｉ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄腔の細胞充実性および組織化を示す。（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｌ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける象牙芽細胞ならびに副象牙芽細胞（sub-odontoblast）のＸ−ｇａｌ染色；（Ｌ）におけるより強い染色は、ＬａｃＺ遺伝子の２つのコピーを保有するＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスに起因する。（Ｍ）Ｌｅｆ１、Ａｘｉｎ２エクソン１およびＰＣＮＡの相対的な発現レベルに関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｎ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｏ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるネスチン免疫染色。（Ｐ）ネスチン、ＤＳＰＰ、ＯＣおよびＣｏｌ１の発現に関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｐ、歯髄。スケールバー：５００μｍ（Ａ〜Ｆ）、および１００μｍ（Ｉ〜ＬおよびＮ〜Ｏ）。
【図２Ｉ−Ｏ】図２。Ａｘｉｎ２欠失は、歯牙形成または歯髄−象牙質ホメオスタシスを崩壊しない。（Ａ〜Ｆ）骨格的に成熟した雄（Ａ、Ｃ、Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける臼歯領域のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）再構築。定量化したμＣＴは、年齢適合性別適合成体Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの臼歯における（Ｇ）象牙質容量、または（Ｈ）象牙質およびエナメルミネラル密度の差異がないことを実証する。ペンタクローム染色は、（Ｉ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄腔の細胞充実性および組織化を示す。（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｌ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける象牙芽細胞ならびに副象牙芽細胞（sub-odontoblast）のＸ−ｇａｌ染色；（Ｌ）におけるより強い染色は、ＬａｃＺ遺伝子の２つのコピーを保有するＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスに起因する。（Ｍ）Ｌｅｆ１、Ａｘｉｎ２エクソン１およびＰＣＮＡの相対的な発現レベルに関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｎ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｏ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるネスチン免疫染色。（Ｐ）ネスチン、ＤＳＰＰ、ＯＣおよびＣｏｌ１の発現に関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｐ、歯髄。スケールバー：５００μｍ（Ａ〜Ｆ）、および１００μｍ（Ｉ〜ＬおよびＮ〜Ｏ）。
【図２Ｐ】図２。Ａｘｉｎ２欠失は、歯牙形成または歯髄−象牙質ホメオスタシスを崩壊しない。（Ａ〜Ｆ）骨格的に成熟した雄（Ａ、Ｃ、Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける臼歯領域のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）再構築。定量化したμＣＴは、年齢適合性別適合成体Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの臼歯における（Ｇ）象牙質容量、または（Ｈ）象牙質およびエナメルミネラル密度の差異がないことを実証する。ペンタクローム染色は、（Ｉ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄腔の細胞充実性および組織化を示す。（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｌ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける象牙芽細胞ならびに副象牙芽細胞（sub-odontoblast）のＸ−ｇａｌ染色；（Ｌ）におけるより強い染色は、ＬａｃＺ遺伝子の２つのコピーを保有するＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスに起因する。（Ｍ）Ｌｅｆ１、Ａｘｉｎ２エクソン１およびＰＣＮＡの相対的な発現レベルに関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｎ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｏ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるネスチン免疫染色。（Ｐ）ネスチン、ＤＳＰＰ、ＯＣおよびＣｏｌ１の発現に関して評価したＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯髄組織の定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｐ、歯髄。スケールバー：５００μｍ（Ａ〜Ｆ）、および１００μｍ（Ｉ〜ＬおよびＮ〜Ｏ）。
【００１１】
【図３Ａ−Ｅ】図３。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける急性歯髄露出に対する傷害応答。（Ａ）１４日目のＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおいて、ペンタクローム染色は、歯髄傷害部位を占める、ピンク色の無細胞肉芽組織を識別する。（Ｂ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて、歯髄傷害部位は、細胞の黄緑色の石灰化基質および高密度浸潤物によって占められる。（Ｃ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける歯髄傷害部位を示す組織形態計測的分析の定量化。偏光下での、（Ｄ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋傷害部位および（Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ傷害部位のピクロシリウスレッド染色。それぞれＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの組織における、（Ｆ〜Ｇ）ＤＳＰおよび（Ｈ〜Ｉ）ネスチンに関する免疫染色。Ａｘｉｎ２エクソン１発現が測定された（Ｌ）において定量化した（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。ＴＵＮＥＬ染色は、（Ｍ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるプログラム細胞死を示す。（Ｏ）ＣＡＳＰ８発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。傷害の７日後の、（Ｐ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＫｉ６７免疫染色。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｆ、分岐部；ｇｒ、肉芽組織；ｐ、歯髄。スケールバー：５０μｍ（Ｋ〜Ｌ）、１００μｍ（Ｎ〜Ｏ）、５０μｍ（Ｈ〜Ｉ）、１００μｍ（Ａ〜Ｂ）、１００μｍ（Ｄ〜Ｉ）、２５μｍ（Ｎ）および５０μｍ（Ｏ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。二重アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図３Ｆ−Ｉ】図３。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける急性歯髄露出に対する傷害応答。（Ａ）１４日目のＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおいて、ペンタクローム染色は、歯髄傷害部位を占める、ピンク色の無細胞肉芽組織を識別する。（Ｂ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて、歯髄傷害部位は、細胞の黄緑色の石灰化基質および高密度浸潤物によって占められる。（Ｃ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける歯髄傷害部位を示す組織形態計測的分析の定量化。偏光下での、（Ｄ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋傷害部位および（Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ傷害部位のピクロシリウスレッド染色。それぞれＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの組織における、（Ｆ〜Ｇ）ＤＳＰおよび（Ｈ〜Ｉ）ネスチンに関する免疫染色。Ａｘｉｎ２エクソン１発現が測定された（Ｌ）において定量化した（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。ＴＵＮＥＬ染色は、（Ｍ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるプログラム細胞死を示す。（Ｏ）ＣＡＳＰ８発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。傷害の７日後の、（Ｐ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＫｉ６７免疫染色。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｆ、分岐部；ｇｒ、肉芽組織；ｐ、歯髄。スケールバー：５０μｍ（Ｋ〜Ｌ）、１００μｍ（Ｎ〜Ｏ）、５０μｍ（Ｈ〜Ｉ）、１００μｍ（Ａ〜Ｂ）、１００μｍ（Ｄ〜Ｉ）、２５μｍ（Ｎ）および５０μｍ（Ｏ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。二重アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図３Ｊ−Ｌ】図３。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける急性歯髄露出に対する傷害応答。（Ａ）１４日目のＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおいて、ペンタクローム染色は、歯髄傷害部位を占める、ピンク色の無細胞肉芽組織を識別する。（Ｂ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて、歯髄傷害部位は、細胞の黄緑色の石灰化基質および高密度浸潤物によって占められる。（Ｃ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける歯髄傷害部位を示す組織形態計測的分析の定量化。偏光下での、（Ｄ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋傷害部位および（Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ傷害部位のピクロシリウスレッド染色。それぞれＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの組織における、（Ｆ〜Ｇ）ＤＳＰおよび（Ｈ〜Ｉ）ネスチンに関する免疫染色。Ａｘｉｎ２エクソン１発現が測定された（Ｌ）において定量化した（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。ＴＵＮＥＬ染色は、（Ｍ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるプログラム細胞死を示す。（Ｏ）ＣＡＳＰ８発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。傷害の７日後の、（Ｐ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＫｉ６７免疫染色。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｆ、分岐部；ｇｒ、肉芽組織；ｐ、歯髄。スケールバー：５０μｍ（Ｋ〜Ｌ）、１００μｍ（Ｎ〜Ｏ）、５０μｍ（Ｈ〜Ｉ）、１００μｍ（Ａ〜Ｂ）、１００μｍ（Ｄ〜Ｉ）、２５μｍ（Ｎ）および５０μｍ（Ｏ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。二重アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図３Ｍ−Ｑ】図３。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける急性歯髄露出に対する傷害応答。（Ａ）１４日目のＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおいて、ペンタクローム染色は、歯髄傷害部位を占める、ピンク色の無細胞肉芽組織を識別する。（Ｂ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて、歯髄傷害部位は、細胞の黄緑色の石灰化基質および高密度浸潤物によって占められる。（Ｃ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける歯髄傷害部位を示す組織形態計測的分析の定量化。偏光下での、（Ｄ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋傷害部位および（Ｅ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ傷害部位のピクロシリウスレッド染色。それぞれＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの組織における、（Ｆ〜Ｇ）ＤＳＰおよび（Ｈ〜Ｉ）ネスチンに関する免疫染色。Ａｘｉｎ２エクソン１発現が測定された（Ｌ）において定量化した（Ｊ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｋ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおける傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。ＴＵＮＥＬ染色は、（Ｍ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるプログラム細胞死を示す。（Ｏ）ＣＡＳＰ８発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。傷害の７日後の、（Ｐ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および（Ｑ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＫｉ６７免疫染色。略記：ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｆ、分岐部；ｇｒ、肉芽組織；ｐ、歯髄。スケールバー：５０μｍ（Ｋ〜Ｌ）、１００μｍ（Ｎ〜Ｏ）、５０μｍ（Ｈ〜Ｉ）、１００μｍ（Ａ〜Ｂ）、１００μｍ（Ｄ〜Ｉ）、２５μｍ（Ｎ）および５０μｍ（Ｏ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。二重アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【００１２】
【図４Ａ−Ｃ】図４。ＷＮＴ３Ａは、ヒト歯髄幹細胞およびマウス骨髄由来幹細胞の増殖ならびに生存を刺激する。（Ａ）ヒト歯髄幹細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）処置の１２時間後、ｈＤＰＳＣの増殖能力は、ＢｒｄＵ組み入れを使用してアッセイした。（Ｃ）ＣＡＳＰ３発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）全骨髄細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。全骨髄細胞がＬ−ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＰＢＳに曝露された１２時間後に、（Ｅ）Ｋｉ６７発現および（Ｆ）ＴＵＮＥＬ活性を評価した。スケールバー：１００μｍ（Ｂ、Ｅ、Ｆ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図４Ｄ−Ｅ】図４。ＷＮＴ３Ａは、ヒト歯髄幹細胞およびマウス骨髄由来幹細胞の増殖ならびに生存を刺激する。（Ａ）ヒト歯髄幹細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）処置の１２時間後、ｈＤＰＳＣの増殖能力は、ＢｒｄＵ組み入れを使用してアッセイした。（Ｃ）ＣＡＳＰ３発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）全骨髄細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。全骨髄細胞がＬ−ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＰＢＳに曝露された１２時間後に、（Ｅ）Ｋｉ６７発現および（Ｆ）ＴＵＮＥＬ活性を評価した。スケールバー：１００μｍ（Ｂ、Ｅ、Ｆ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図４Ｆ】図４。ＷＮＴ３Ａは、ヒト歯髄幹細胞およびマウス骨髄由来幹細胞の増殖ならびに生存を刺激する。（Ａ）ヒト歯髄幹細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）処置の１２時間後、ｈＤＰＳＣの増殖能力は、ＢｒｄＵ組み入れを使用してアッセイした。（Ｃ）ＣＡＳＰ３発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）全骨髄細胞のＬ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ処置の６時間、１２時間、２４時間後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。全骨髄細胞がＬ−ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＰＢＳに曝露された１２時間後に、（Ｅ）Ｋｉ６７発現および（Ｆ）ＴＵＮＥＬ活性を評価した。スケールバー：１００μｍ（Ｂ、Ｅ、Ｆ）。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【００１３】
【図５Ａ−Ｆ】図５。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、象牙質再生を誘導する。（Ａ）Ｌ−ＰＢＳ処置ラットにおける、および（Ｂ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおける、傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。術後４日目の、（Ｃ、Ｃ’）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｄ、Ｄ’）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＴＵＮＥＬ染色。術後４日目の、（Ｅ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｆ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＰＣＮＡ発現。傷害の１４日後の（Ｇ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｈ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットのペンタクローム染色。（Ｉ）修復象牙質基質の定量化。偏光下での、（Ｊ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｋ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置傷害部位における、傷害の１４日後の歯髄傷害のピクロシリウスレッド染色。術後１４日目の、（Ｌ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｍ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるネスチン発現、ならびに（Ｎ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｏ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるＤＳＰ発現。省略形：象牙質、ｄ；ｉｎ、傷害部位。スケールバー：２００μｍ（Ａ〜Ｄ）、１００μｍ（Ｃ’、Ｄ’）、５０μｍ（Ｅ〜Ｆ）、２５μｍ（Ｇ〜Ｏ）、５０μｍ。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図５Ｇ−Ｉ】図５。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、象牙質再生を誘導する。（Ａ）Ｌ−ＰＢＳ処置ラットにおける、および（Ｂ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおける、傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。術後４日目の、（Ｃ、Ｃ’）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｄ、Ｄ’）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＴＵＮＥＬ染色。術後４日目の、（Ｅ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｆ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＰＣＮＡ発現。傷害の１４日後の（Ｇ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｈ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットのペンタクローム染色。（Ｉ）修復象牙質基質の定量化。偏光下での、（Ｊ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｋ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置傷害部位における、傷害の１４日後の歯髄傷害のピクロシリウスレッド染色。術後１４日目の、（Ｌ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｍ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるネスチン発現、ならびに（Ｎ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｏ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるＤＳＰ発現。省略形：象牙質、ｄ；ｉｎ、傷害部位。スケールバー：２００μｍ（Ａ〜Ｄ）、１００μｍ（Ｃ’、Ｄ’）、５０μｍ（Ｅ〜Ｆ）、２５μｍ（Ｇ〜Ｏ）、５０μｍ。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図５Ｊ−Ｏ】図５。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、象牙質再生を誘導する。（Ａ）Ｌ−ＰＢＳ処置ラットにおける、および（Ｂ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおける、傷害の４日後の歯髄傷害のペンタクローム染色。術後４日目の、（Ｃ、Ｃ’）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｄ、Ｄ’）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＴＵＮＥＬ染色。術後４日目の、（Ｅ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｆ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットの歯髄腔におけるＰＣＮＡ発現。傷害の１４日後の（Ｇ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｈ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットのペンタクローム染色。（Ｉ）修復象牙質基質の定量化。偏光下での、（Ｊ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｋ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置傷害部位における、傷害の１４日後の歯髄傷害のピクロシリウスレッド染色。術後１４日目の、（Ｌ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｍ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるネスチン発現、ならびに（Ｎ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｏ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置ラットにおけるＤＳＰ発現。省略形：象牙質、ｄ；ｉｎ、傷害部位。スケールバー：２００μｍ（Ａ〜Ｄ）、１００μｍ（Ｃ’、Ｄ’）、５０μｍ（Ｅ〜Ｆ）、２５μｍ（Ｇ〜Ｏ）、５０μｍ。単一アスタリスクは、Ｐ＜０．０１を意味する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【００１４】
【図６】胚１８．５のマウス臼歯において、（Ａ）ペンタクローム染色は、エナメル器（点線）および歯間葉を識別する。（Ｂ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋胚からの大臼歯芽のＸ−ｇａｌ染色。隣接する組織切片で、（Ｃ）Ｌｅｆ１免疫染色は、外側エナメル器において、および凝縮している歯間葉において、Ｗｎｔ応答性細胞を識別する。生後７日目に、（Ｄ）過ヨウ素酸シッフ染色は、分裂した象牙芽細胞およびそれらの新たに分泌された象牙質基質（ピンク色）を識別し、それはエナメル芽細胞によって産生される新たに分泌されたエナメル基質（赤色）に近い。（Ｅ）これらの分裂した分泌象牙芽細胞は、ＤＳＰを発現する。（Ｆ）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおいて、分裂した分泌象牙芽細胞が、Ｗｎｔ応答性があることが、Ｘ−ｇａｌ染色により実証される。省略形：ａｍ、エナメル芽細胞；ａｂ、歯槽骨；ｄ、象牙質；ｄｆ、歯小嚢；ｄｐ、歯乳頭；ｅ、エナメル質；ｅｏ、エナメル器；ｍ、歯間葉；ｏｄ、象牙芽細胞；ｐ、歯髄；ｐｄ、前象牙質。スケールバー：１００μｍ（Ａ〜Ｃ）、１００μｍ（Ｄ）、２５μｍ（Ｅ〜Ｆ）。
【００１５】
【図７】健康な歯（上部）および歯髄が露出した歯（底部）の概略図。
【００１６】
【図８】（Ａ）ヒトで見られることを模倣した、有管象牙質（黄色）を切開するが歯髄腔（ピンク色）にまで貫通しない非貫通性窩洞形成。（Ｂ）ＧＦＰを発現する細胞を識別するために染色したパネルＡに隣接するセクション。これらの窩洞形成は、タモキシフェンの存在下で、Ｗｎｔ応答性細胞がＧＦＰを発現する組換え事象を受けるトランスジェニックマウスにおいて作成した。歯髄細胞は、Ｗｎｔ応答性であり、この動物において、タモキシフェンは、ＷＮＴ３Ａタンパク質を送達するのに使用されるものと同一のリポソーム粒子を介して送達した。したがって、ＧＦＰ陽性細胞は、タモキシフェン曝露の手段のみが、象牙質細管を介するものであった歯髄腔におけるＷｎｔ応答性細胞を表す。Ｂ’およびＢ”は、リポソームタモキシフェン送達の結果としてＧＦＰを発現する、より高い倍率のＷｎｔ応答性象牙芽細胞を示す。（Ｃ〜Ｄ）窩洞形成（有管象牙質を切開するが歯髄腔にまで貫通しない）に対する歯髄応答および局所的リポソームＰＢＳ送達。少量の修復象牙質が、修復応答を刺激する身体の自然能力と調和して作製される（Ｄにおける白色点線）。（Ｅ〜Ｆ）パネルＣ〜Ｄなどの類似の窩洞形成に対する歯髄応答、および露出した象牙質への局所的Ｌ−ＷＮＴ３Ａ送達。かなり多くの修復象牙質が、歯髄室で観察される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
象牙質生成を増強するための、および親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達するための方法および組成物が提供される。一部の場合、本方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与するステップを含む。一部の場合、本方法は、歯の露出した象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させる（例えば、それにより、親油性薬剤が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透する）ステップを含む。本開示の方法を実施するためのキットもまた提供される。
【００１８】
本方法および組成物が記載される前に、この発明が、記載された特定の方法または組成物に限定されず、そのために、当然のことながら、変化し得ることは理解されるべきである。本明細書で使用された専門用語は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、かつ本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１９】
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上、明らかに他の指示がない限り、下限の単位の１０分の１ごとに介在する値もまた特定的に開示されることは理解されている。提示された範囲内の任意の提示される、または介在する値と、その提示された範囲内の任意の他の提示される、または介在する値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本発明の範囲内に包含される。提示された範囲における任意の特定的に除外された限界に従って、これらのより小さい範囲の上限および下限は、非依存的に、その範囲に含まれる場合もあるし、除外される場合もあり、そのより小さい範囲に一方の限界が含まれ、どちらの限界も含まれず、または両方の限界が含まれる各範囲もまた、本発明の範囲内に包含される。提示された範囲が限界の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００２０】
他に規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似した、または等価の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの可能かつ好ましい方法および材料が今、記載されている。本明細書に言及された全ての刊行物は、その刊行物が引用されていることに関して、方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられている。矛盾が存在する範囲について、本開示が、組み入れられた刊行物のいかなる開示にも優先すると理解される。
【００２１】
この開示を読めば当業者に明らかであるように、本明細書に記載および例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得、またはそれらと組み合わせられ得る別個の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能である任意の他の順序で行うことができる。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、明らかに他の指示がない限り、複数の指示物を含むことは留意されなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「そのペプチド」への言及は、１つまたは複数のペプチド、および当業者に知られたそれらの等価物、例えば、ポリペプチドへの言及を含むなどである。
【００２３】
本明細書で論じられた刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示について単に提供されているだけである。本発明が、先行発明という理由によるそのような刊行物に先行する権利をもたないという了解として解釈されるべきものは本明細書にはない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性がある。
定義
【００２４】
後に続く説明において、当分野で通常、使用されるいくつかの用語が利用される。本明細書および特許請求の範囲、ならびにそのような用語に与えられる範囲の明瞭かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。その用語はまた、１個または複数のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに加えて、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００２６】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、加えて、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、加えて、後で修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合しているアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能する化学的化合物を指す。
【００２７】
用語「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の個体、特にヒトを指す。処置を目的とした「哺乳動物」または「哺乳類の動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、それには、ヒト、飼い慣らされた動物および農業用動物、ならびに動物園用、スポーツ用、またはペット用動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどが挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
組成物
【００２８】
本開示は、歯髄組織による象牙質生成を増強するための組成物および方法を提供する。そのような方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与することを含む。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤（例えば、Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔタンパク質）を含む。
【００２９】
本開示はまた、親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達するための組成物および方法を提供する。一部の場合、親油性薬剤は、増殖因子（例えば、脂質部分を有する増殖因子）である。一部の場合、親油性薬剤は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤（例えば、Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔタンパク質）である。
【００３０】
脂質構造
【００３１】
一部の実施形態では、本薬剤（例えば、目的の薬剤）は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤である。脂質構造は、親油性薬剤（例えば、脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔタンパク質、増殖因子など）の活性をｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に維持するために重要であり得る。本親油性薬剤（例えば、脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔタンパク質、増殖因子など）は、脂質構造の水相に封入されず、むしろ、脂質膜に組み込まれ、膜の外層に挿入され得る。そのような構造は、例えばリポソーム内に、薬剤（例えば、タンパク質）を製剤化する通常の方法から予想されない。そのような脂質構造内に組み込まれたＷｎｔタンパク質は、本明細書で、Ｌ−Ｗｎｔと呼ばれる（例えば、そのような脂質構造に組み込まれたＷｎｔ３Ａは、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａと呼ぶことができる）。親油性薬剤（例えば、Ｗｎｔタンパク質）をリポソームまたはミセルの外面に繋ぎ止めるために使用される方法は、そのタンパク質のリポソーム外のディスプレイを際立たせるための部分（例えば、タンパク質はアミノ酸配列を有し得る）を利用することができる。一部の場合、粗リポソームがまず、あらかじめ形成され、その後、親油性薬剤（例えば、脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔタンパク質、増殖因子など）を、（リポソーム外薬剤（例えば、Ｗｎｔタンパク質）の添加を好む）その粗混合物へ加えることができ、続いて、サイズフィルタリング、透析などを含み得る様々な製剤化ステップを行う。適切な脂質には、脂肪酸、トリアシルグリセロールなどの中性脂肪、脂肪酸エステルおよびセッケン、長鎖（脂肪）アルコールおよびワックス、スフィンゴイドおよび他の長鎖塩基、糖脂質、スフィンゴ脂質、カロテン、ポリプレノール、ステロールなど、加えて、テルペンおよびイソプレノイドが挙げられる。例えば、ジアセチレンリン脂質などの分子が使用され得る。疎水性および親水性部分、正味の正電荷を有し、かつ水中、それだけで自発的に二層小胞またはミセルを形成することができる脂質、合成脂質、および脂質類似体を含む、陽イオン性分子が含まれる。中性電荷で製造されたリポソーム、例えば、ＤＭＰＣを使用することができる。リン脂質と組み合わせて脂質ミセルまたは二重層へ安定的に組み入れられ得るいかなる両親媒性分子も使用することができ、それは、ミセルまたは二重膜の内部の疎水性領域と接触したその疎水性部分、および膜の外部の極性表面へ向けられたそれの極性頭部基部分を有する。
【００３２】
用語「陽イオン性両親媒性分子」は、生理的ｐＨにおいて正電荷をもつ分子、より具体的には、例えば、第四アンモニウム塩部分を含む構成的に正電荷をもつ分子を包含することを意図される。陽イオン性両親媒性分子は、典型的には、親水性極性頭部基および親油性脂肪族鎖からなる。同様に、陽イオン性極性頭部基を有するコレステロール誘導体もまた有用であり得る。例えば、Farhoodら（１９９２年）Biochim.  Biophys.  Acta、１１１１巻：２３９〜２４６頁；Vigneronら（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(USA)、９３巻：９６８２〜９６８６頁参照。目的の陽イオン性両親媒性分子には、例えば、イミダゾリニウム誘導体（ＷＯ９５／１４３８０）、グアニジン誘導体（ＷＯ９５／１４３８１）、ホスファチジルコリン誘導体（ＷＯ９５／３５３０１）、およびピペラジン誘導体（ＷＯ９５／１４６５１）が挙げられる。本発明に使用され得る陽イオン性脂質の例には、ＤＯＴＩＭ（ＢＯＤＡＩとも呼ばれる）（Saladinら、（１９９５年）Biochem.、３４巻：１３５３７〜１３５４４頁）、ＤＤＡＢ（Roseら、（１９９１年）BioTechniques  １０巻（４号）：５２０〜５２５頁）、ＤＯＴＭＡ（米国特許第５，５５０，２８９号）、ＤＯＴＡＰ（EiblおよびWooley（１９７９年）Biophys.  Chern.、１０巻：２６１〜２７１頁）、ＤＭＲＩＥ（Feignerら、（１９９４年）J.  Bioi.  Chern.、２６９巻（４号）：２５５０〜２５６１頁）、ＥＤＭＰＣ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．から市販されている）、ＤＣＣ  ｈｏｉ（GauおよびHuang（１９９１年）Biochem.  Biophys.  Res.  Comm.、１７９巻：２８０〜２８５頁）、ＤＯＧＳ（Behrら、（１９８９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：６９８２〜６９８６頁）、ＭＢＯＰ（ＭｅＢＯＰとも呼ばれる）（ＷＯ９５／１４６５１）、およびＷＯ９７／００２４１に記載されたものが挙げられる。活性を必要とされないが、一部の実施形態では、脂質構造は、ターゲティング基、例えば、親水性頭部基へ共有結合性または非共有結合性に結合したターゲティング部分を含み得る。ターゲティング部分と結合するのに有用な頭部基には、例えば、ビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、α−ハロカルボニル（ahalocarbonyl）化合物、α，β−（a,p-）不飽和カルボニル化合物、アルキルヒドラジンなどが挙げられる。ターゲティング部分を両親媒性分子に連結するのに使用される化学基もまた、当技術分野において知られているように、カルバメート；アミド（アミン＋カルボン酸）；エステル（アルコール＋カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル；マレイミド＋スルフィドリル）、シッフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアネート）、チオウレア（アミン＋イソチオシアネート）、スルホンアミド（アミン＋塩化スルホニル）、ジスルフィド；ヒドラゾン（hyrodrazone）、脂質などが挙げられる。例えば、ターゲティング部分は、ＤＡＧＰＥ、ＰＥＧ−ＰＤＡアミン、ＤＯＴＡＰなどの市販されている脂質をイソシアネートへ変換し、その後、トリエチレングリコールジアミンスペーサーで処理して、アミン末端を有するチオカルバメート脂質を生じることにより形成され得、そのチオカルバメート脂���は、そのターゲティング部分のパラ−イソチオシアノフェニルグリコシドでの処理により、所望のターゲティング糖脂質を生じる。この合成は、ナノ粒子に組み込まれる両親媒性分子と、細胞表面受容体と結合するリガンドとの間に間隔をあける水溶性可動性リンカー分子を提供し、それにより、リガンドが、細胞表面上のタンパク質受容体へ容易にアクセスできるようになる。リポソームＷｎｔ組成物およびそれらの使用についてのさらなる情報は、米国特許出願公開第２０１４０３７１１５１号、同第２０１２０１１５７８８号、および同第２００８０２２６７０７号；ならびに米国特許第８８０９２７２号（それらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）に見出される。
【００３３】
一部の場合、リポソームまたはミセルが送達ビヒクルとして使用される。リポソームは、リン脂質二重層で構成される膜を有する球状小胞である。リポソームは、（卵のホスファチジルエタノールアミンのような）混合型脂質鎖を有する天然由来リン脂質、またはＤＯＰＥ（ジオレオリルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な界面活性剤コンポーネントで構成することができる。リポソームは、封入された水溶液のコアを含有する場合が多い；一方、水性材料を含有しない脂質球はミセルと呼ばれる。ｗｎｔタンパク質は脂質相に存在し、封入された水相に存在しないため、本開示の組成物のためにミセルがリポソームと互換的に使用され得る。脂質は、公知のリポソームまたはミセル形成脂質の任意の有用な組合せであり得、それには、ホスファチジルコリンなどの陽イオン性脂質、またはコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどの中性脂質が挙げられる。
【００３４】
一部の実施形態では、特定の流動度または剛性度を達成するように、血清中の構造の安定性をコントロールするようになど、小胞形成脂質が選択される。より硬い脂質二重層、または液晶二重層を有するリポソームは、相対的に硬い脂質、例えば、相対的に高い相転移温度、例えば、最高６０℃を有する脂質の組み入れにより達成される。硬い、すなわち、飽和した脂質は、脂質二重層におけるより高い膜の剛性に寄与する。コレステロールなどの他の脂質コンポーネントもまた、脂質二重層構造における膜の剛性に寄与することが知られている。脂質流動性は、相対的に高い流動性の脂質、典型的には、相対的に低い、液体から液晶への相転移温度、例えば、室温、またはそれ未満を有する脂質相を有するものの組み入れにより達成される。
【００３５】
リポソームは、Szoka,  F.,  Jr.ら、Ann.  Rev.  Biophys.  Bioeng.、９巻：４６７頁（１９８０年）に詳述されたものなどの様々な技術により調製され得る。典型的には、リポソームは、単純な脂質フィルム水和技術により形成することができる、多層状小胞（ＭＬＶ）である。この手順において、適切な有機溶媒中に溶解した、上記で詳述された型のリポソーム形成脂質の混合物は、容器において蒸発して、薄いフィルムを形成し、それが、その後、水性媒体により覆われる。その脂質フィルムは水和して、例えば、一部の場合、０．１ミクロンから１０ミクロンまでの範囲のサイズを有する、ＭＬＶを形成する。
【００３６】
本開示のリポソーム、ミセルなどは、選択されたサイズ範囲、例えば、０．００５〜０．５ミクロンの間（例えば、０．０１〜０．５、０．０２〜０．５、０．０２５〜０．５、０．０５〜０．５、０．０７５〜０．５、０．１〜０．５、０．００５〜０．４、０．０１〜０．４、０．０２〜０．４、０．０２５〜０．４、０．０５〜０．４、０．０７５〜０．４、０．１〜０．４、０．００５〜０．３、０．０１〜０．３、０．０２〜０．３、０．０２５〜０．３、０．０５〜０．３、０．０７５〜０．３、０．１〜０．３、０．００５〜０．２、０．０１〜０．２、０．０２〜０．２、０．０２５〜０．２、０．０５〜０．２、０．０７５〜０．２、０．１〜０．２、０．００５〜０．１、０．０１〜０．１、０．０２〜０．１、０．０２５〜０．１、０．０５〜０．１、０．０７５〜０．１、０．０２〜０．０５、または０．０２〜０．３５ミクロン）の実質的に均一なサイズを有し得る。
【００３７】
ＲＥＶおよびＭＬＶについての一つの効果的なサイジング方法は、０．０３〜０．２ミクロンの範囲、典型的には０．０５、０．０８、０．１、または０．２ミクロンの選択された一定のポアサイズを有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含む。膜のポアサイズは、その膜を通っての押し出し（特に、その調製物は、同じ膜を通して２回またはそれ超、押し出される）により生じたリポソームの最大サイズにおおよそ対応する。ホモジナイゼーション方法はまた、１００ｎｍまたはそれ未満のサイズまでリポソームのサイズを低下させるのに有用である。
【００３８】
本開示の医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。多くの薬学的に許容される担体が、本開示の組成物に用いられ得る。一般的に、生理食塩水が、薬学的に許容される担体として用いられる。他の適切な担体には、例えば、安定性を増強するための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含む、水、緩衝用水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。これらの組成物は、通常の、周知の滅菌技術により滅菌され得る。生じた水溶液は、使用のためにパッケージングされ得、または無菌条件下で濾過され、かつ凍結乾燥され得、その凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌水溶液と組み合わされ得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質を含有し得る。
【００３９】
担体における脂質構造の濃度は様々であり得る。一般的に、その濃度は、約０．１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、通常、約１〜５００ｍｇ／ｍｌ、約５〜１００ｍｇ／ｍｌなどであり得る。当業者は、異なる脂質コンポーネントでの処置、または特定の患者の処置を最適化するためにこれらの濃度を変化させ得る。
【００４０】
本組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏの治療有効用量の親油性薬剤（例えば、ｗｎｔタンパク質）を含み得、１つまたは複数の親油性薬剤のカクテル（例えば、１つまたは複数のｗｎｔタンパク質、１つまたは複数の他の親油性薬剤に加えて１つまたは複数のＷｎｔタンパク質など）を含み得る。
【００４１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路／Ｗｎｔタンパク質
【００４２】
一部の実施形態では、本薬剤（例えば、目的の薬剤）は、Ｗｎｔ刺激剤である。Ｗｎｔ刺激剤は、標的細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路の活性を増加させる。「Ｗｎｔ応答性」である標的細胞（および／または組織）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を作動させることによりＷｎｔタンパク質の細胞外存在に応答することができる細胞／組織である。Ｗｎｔ応答性細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路（下記でより詳細に記載されている）のコンポーネント、例えば、Ｗｎｔタンパク質と結合することができる受容体（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体）を含む。全ての細胞がＷｎｔ応答性とは限らない。一部の実施形態では、標的細胞／組織はＷｎｔ応答性である。一部の実施形態では、標的細胞は、Ｗｎｔ応答性ではない。一部の実施形態では、標的細胞がＷｎｔ応答性であるかどうかが知られていない。一部の実施形態では、標的細胞がＷｎｔ応答性であるかどうかが知られている。一部の実施形態では、標的細胞は、一部の細胞がＷｎｔ応答性であり、かつ一部の細胞がＷｎｔ応答性ではない、標的細胞の不均一な集団（すなわち、不均一な標的細胞集団）の部分である（例えば、一部の場合において、歯髄などの標的組織は、Ｗｎｔ応答性である細胞、加えて、Ｗｎｔ応答性ではない細胞を含む）。一部の実施形態では、不均一な標的細胞集団のどの細胞がＷｎｔ応答性（例えば、幹細胞）であるかが知られている。一部の実施形態では、不均一な標的細胞集団のどの細胞がＷｎｔ応答性であるかが知られていない。
【００４３】
胚形成中の様々な段階におけるＷｎｔシグナル伝達コンポーネントの誤制御は、破局的な発生欠陥をもたらし、一方、成人における誤制御は、がんを含む様々な疾患状態をもたらす。Ｗｎｔシグナル伝達経路の以下の２つの主要な支流がある：（１）古典的β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路、および（２）非古典的β−カテニン非依存性経路（平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達が挙げられる）（Gaoら、Cell  Signal.、２０１０年５月；２２巻（５号）：７１７〜２７頁．電子出版２００９年１２月１３日）。本明細書で使用される場合、用語「Ｗｎｔシグナル伝達」および「Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達」は、古典的β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路を指すために互換的に使用される。そのために、「Ｗｎｔ刺激剤」とも呼ばれるＷｎｔシグナル伝達刺激物質（すなわち、アゴニスト）（例えば、Ｗｎｔ３Ａ）は、β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路からのアウトプットを増加させ、一方、Ｗｎｔシグナル伝達阻害物質（すなわち、アンタゴニスト）は、β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路からのアウトプットを減少させる。
【００４４】
タンパク質β−カテニンが細胞核へ入った時、Ｗｎｔ経路の活性化が最高に達する（古典的β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路の最近の概説について、Cleversら、Cell、２０１２年６月８日；１４９巻（６号）：１１９２〜２０５頁：Wnt/β-catenin  signaling  and  diseaseを参照）。しかしながら、Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、遊離の細胞質β−カテニンは、β−カテニン破壊複合体として当技術分野において知られた複合体へ組み入れられ、その複合体は、アキシン、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ−３β）の各タンパク質を含む。β−カテニンのＧＳＫ−３βによるリン酸化は、β−カテニンをユビキチン経路および（例えば、βＴＲＣＰを介した）分解へと指定する。
【００４５】
β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達経路）の伝達は、細胞表面受容体の２つの異なるファミリー：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）受容体ファミリーおよびＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）ファミリーとの分泌性Ｗｎｔリガンドの結合により引き起こされる（Akiyama、Cytokine  Growth  Factor  Rev.、１１巻：２７３〜８２頁（２０００年））。この結合は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）タンパク質の活性化をもたらし、そのタンパク質は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）活性（すなわち、β−カテニンのリン酸化）を阻害し、β−カテニンの細胞質内安定化をもたらす。その後、安定化されたβ−カテニンは、核へ入り、転写因子のＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞特異的転写因子／リンパ系エンハンサー因子）ファミリーと会合して、下流の標的遺伝子の転写を誘導する。
【００４６】
Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、β−カテニンの細胞質内（およびしたがって、核内）のレベルは、その経路の負の制御コンポーネントにより低く維持され、一方、Ｗｎｔシグナル伝達の存在下では、β−カテニンの細胞質内（およびしたがって、核内）のレベルは、その経路の正の制御コンポーネントにより安定化される。このため、（例えば、ウェスタンブロットによりモニターされる）β−カテニンレベルは、細胞のＷｎｔシグナル伝達経路が刺激されているか、または阻害されているかの洞察を与えることができる（例えば、β−カテニンのレベルの増加は、シグナル伝達の増加を示し、レベルの減少はシグナル伝達の減少を示す）。同様に、（例えば、蛍光顕微鏡法、ウェスタンブロットなどによりモニターされる）核内のβ−カテニンレベルもまたモニターして、シグナル伝達の増加または減少を決定することができる。
【００４７】
Ｗｎｔ経路の「正の制御コンポーネント」とは、Ｗｎｔ経路を増強し（すなわち、刺激し）、したがって、Ｗｎｔ経路のシグナル伝達活性の増加（すなわち、Ｗｎｔ経路のシグナル伝達アウトプットの増加、例えば、標的遺伝子発現の増加、レポーター活性の増加、β−カテニンのレベルの増加など）を生じることにより機能するタンパク質を意味する。Ｗｎｔ経路の既知の正の制御コンポーネントの例には、Ｗｎｔ（分泌性、細胞外）、Ｎｏｒｒｉｎ（分泌性、細胞外）、Ｒ−スポンジン（分泌性、細胞外）、ＰＯＲＣＮ、Ｗｌｓ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６、Ｔｓｐａｎ１２、Ｌｇｒ４、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、Ｄｖｌ、β−カテニン、ならびにＴＣＦ／ＬＥＦが挙げられるが、決してそれらに限定されない。Ｗｎｔ経路の分泌性の正の制御コンポーネント（例えば、Ｗｎｔ、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−スポンジンなど）は、本明細書において、「Ｗｎｔ刺激ポリペプチド」と呼ばれる。一部の場合、Ｗｎｔ刺激ポリペプチドはＷｎｔタンパク質である。
【００４８】
適切なＷｎｔポリペプチド（すなわち、Ｗｎｔタンパク質）には、ヒトＷｎｔポリペプチドが挙げられるが、決してそれに限定されない。本出願における目的のヒトＷｎｔタンパク質には以下が挙げられる（受託番号は、関連したＷｎｔタンパク質をコードするｍＲＮＡについてである）：Ｗｎｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ−２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ−３（参照配列：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ−５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ−５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６５２２）、Ｗｎｔ−７Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ−７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ−８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ−８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ−９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９５）、Ｗｎｔ−９Ｂ（Ｗｎｔ−１５）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ−１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ−１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ−１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６０８７））。各メンバーは、ファミリーとの様々な程度の配列同一性を有するが、全てが、スペーシングが高度に保存されている２３〜２４個の保存されたシステイン残基を含有する、小さい（すなわち、３９〜４６ｋＤ）、アシル化され、パルミトイル化された、分泌性糖タンパク質をコードする（McMahon,  A  Pら、Trends  Genet.、１９９２年；８巻：２３６〜２４２頁；Miller,  J  R.、Genome  Biol.、２００２年；３巻（１号）：３００１．１〜３００１．１５頁）。本発明における目的の他のＷｎｔポリペプチドには、飼い慣らされた動物および農業用動物、ならびに動物園用動物、実験動物、またはペット用動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫などを含む、任意の哺乳動物由来の上記のオルソログが挙げられる。
【００４９】
Ｗｎｔタンパク質は、胚形成中の細胞間相互作用を制御する、高度に保存された分泌性シグナル伝達分子のファミリーを形成する。用語「Ｗｎｔ」または「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔタンパク質」または「Ｗｎｔポリペプチド」は、互換的に使用され、天然配列のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチド断片、およびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は、システイン残基と共有結合したパルミテートを含む。「天然配列」のポリペプチドは、それの産生に使用された方法に関わらず、天然由来のＷｎｔポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。そのような天然配列のポリペプチドは、内因性Ｗｎｔタンパク質を産生する細胞から単離することができ、または組換えもしくは合成の手段により生成することができる。したがって、天然配列のポリペプチドは、例えば、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意の他の哺乳類種由来、もしくは非哺乳類種、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなど由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【００５０】
用語「天然配列のＷｎｔポリペプチド」は、非限定的に、ヒトおよびマウスＷｎｔポリペプチドを含む。ヒトＷｎｔタンパク質には、以下が挙げられる：Ｗｎｔ１、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００５４２１．１；Ｗｎｔ２、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８２．１、脳、視床、胎児および成人の肺、ならびに胎盤に発現している；Ｗｎｔ２Ｂの２つのアイソフォーム、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００４１７６．２およびＮＰ０７８６１３．１。アイソフォーム１は、成人の心臓、脳、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および結腸に発現している。成人の脳において、それは、主に、尾状核、視床下核、および視床に見出される。胎児の脳、肺、および腎臓においても検出される。アイソフォーム２は、胎児の脳、胎児の肺、胎児の腎臓、尾状核、精巣、およびがん細胞株に発現している。Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３Ａは、発生しつつある神経管の形態形成中の細胞間シグナル伝達において別々の役割を果たし、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ１１  ０３８０．１およびＸ５６８４２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ５６７０４）を有する。
【００５１】
天然ヒトＷｎｔ３Ａアミノ酸配列（ＮＰ＿１４９１２２．１）は、配列番号１９として特定的に開示されている。Ｗｎｔ４はＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ１１  ０３８８．２を有する。Ｗｎｔ５ＡおよびＷｎｔ５ＢはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８３．１およびＡＫ０１３２１８を有する。Ｗｎｔ６はＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００６５１３．１を有する；Ｗｎｔ７ＡはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００４６１６．２を有する。Ｗｎｔ７ＢはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ４７８６７９．１を有する。Ｗｎｔ８Ａは２つのオルタナティブ転写産物、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ１１４１３９．１およびＮＰ４９０６４５．１を有する。Ｗｎｔ８ＢはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８４．１を有する。Ｗｎｔ１０ＡはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ０７９４９２．２を有する。Ｗｎｔ１０ＢはＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８５．２を有する。Ｗｎｔ１１はＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００４６１７．２を有する。Ｗｎｔ１４はＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８６．１を有する。Ｗｎｔ１５はＧｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ００３３８７．１を有する。Ｗｎｔ１６は、オルタナティブスプライシングにより産生される２つのアイソフォーム、Ｗｎｔ−１６ａおよびＷｎｔ−１６ｂを有し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照は、ＮＰ０５７１７１．２およびＮＰ４７６５０９．１である。列挙された全てのＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、および他のデータベース配列は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【００５２】
用語「天然配列のＷｎｔタンパク質」または「天然配列のＷｎｔポリペプチド」は、開始Ｎ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を有するまたは有さない、かつ天然シグナル配列を有するまたは有さない天然タンパク質を含む。その用語は、具体的には、Ｎ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を有するまたは有さない、かつ天然シグナル配列を有するまたは有さない、３５２アミノ酸長の天然ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドを含む。
【００５３】
「バリアント」ポリペプチドは、天然配列のポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する、下記で定義されているような生物学的活性のあるポリペプチドを意味する。そのようなバリアントには、１個または複数のアミノ酸残基が天然配列のＮ末端もしくはＣ末端に、またはその内部に付加されているポリペプチド；約１個から４０個までのアミノ酸残基が欠失し、および任意選択で、１個または複数のアミノ酸残基によって置換されているポリペプチド；ならびに、生じた産物が天然に存在しないアミノ酸を有するようにアミノ酸残基が共有結合性に修飾されている上記ポリペプチドの誘導体が挙げられる。通常、生物学的活性のあるＷｎｔバリアントは、天然配列のＷｎｔポリペプチドと少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性を有する。
【００５４】
「キメラ」Ｗｎｔポリペプチドは、異種性ポリペプチドと融合または結合したＷｎｔポリペプチドまたはその部分（例えば、１つまたは複数のドメイン）を含むポリペプチドである。キメラＷｎｔポリペプチドは、一般的に、天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通した少なくとも１つの生物学的性質を共有する。キメラポリペプチドの例には、Ｗｎｔポリペプチドの一部を免疫グロブリン配列と組み合わせる、イムノアドヘシン、および「タグポリペプチド」と融合したＷｎｔポリペプチドまたはその部分を含む、エピトープタグ付きポリペプチドが挙げられる。タグポリペプチドは、抗体を作製することができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それがＷｎｔポリペプチドの生物学的活性に干渉しないように十分短い。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６個のアミノ酸残基、通常には、約６〜６０個の間のアミノ酸残基を有する。
【００５５】
天然配列のＷｎｔポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通した、質的な生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」には、対応する天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通した生物学的活性を有するという条件での、天然配列の断片、ならびに天然配列のＷｎｔポリペプチドの誘導体およびそれの断片が挙げられるが、それらに限定されない。用語「誘導体」は、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列バリアントとその共有結合的修飾の両方を包含する。
【００５６】
機能アッセイ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、活性のレベルを決定すること、または試験モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に、例えば、骨再生の促進、幹細胞増殖の上方制御などを決定すること、非機能アッセイ、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシーまたは銀染色ゲル上での定量化などにおいて存在するＷｎｔタンパク質の量を定量すること、および総Ｗｎｔに対するｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的活性のあるＷｎｔの比率を決定することにより、組成物中のＷｎｔタンパク質の特異的活性を決定し得る。
【００５７】
Ｗｎｔタンパク質の有効用量は、供給源、純度、調製方法などに依存して異なり得る。Ｗｎｔタンパク質がＬ−Ｗｎｔ３Ａである場合、その有効用量は、通常、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌであり、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌの場合もある。
【００５８】
上記で論じられているように、一部の実施形態では、Ｗｎｔタンパク質（例えば、Ｗｎｔ３Ａ、例えば、ヒトＷｎｔ３Ａ）は、脂質構造の非水相内、例えば、リポソーム、ミセル、脂質ラフトなどの表面内、乳濁液中などに挿入される。一部の実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は、リポソーム膜またはミセルの外面に、それの活性型立体構造で提示されている。脂質構造がリポソームである場合、Ｗｎｔタンパク質はリポソーム内に、例えば、水相内に封入されないことが望ましくあり得る。脂質含有粒子は、典型的には、Ｗｎｔタンパク質をディスプレイし、その粒子は、少なくとも１つの脂質部分を有するｗｎｔタンパク質の少なくとも１個のコピーを含み、その組成は、その粒子の外面上にディスプレイされた、少なくとも５０％のＷｎｔポリペプチドを含有する。一部の場合、Ｒ−スポンジンが、リポソームＷＮＴ３Ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）の水性のコア内に含まれ得、そうすることにより、歯髄細胞のＷｎｔ依存性活性化を増幅および拡大する。
【００５９】
例えば、Dhamdhereら、PLoS  One.、２０１４年１月６日；９巻（１号）：ｅ８３６５０頁；およびZhaoら、Methods  Enzymol.、２００９年；４６５巻：３３１〜４７頁（それらのどちらもその全体が参照により本明細書に組み入れられている）を参照。
【００６０】
本Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路からのアウトプットの増加（すなわち、標的遺伝子発現の増加）を生じる、任意の分子（例えば、化学的化合物；非コード核酸、例えば、非コードＲＮＡ；ポリペプチド；ポリペプチドをコードする核酸など）である。例えば、Ｗｎｔ刺激剤は、その経路の正の制御コンポーネントの発現を安定化させ、増強し、もしくはその機能を増強することにより、またはその経路の負の制御コンポーネントの発現を不安定化させ、減少させ、もしくはその機能を阻害することにより、機能することができる。したがって、Ｗｎｔ刺激剤は、その経路の正の制御コンポーネント（例えば、Ｗｎｔタンパク質）、またはその経路の１つもしくは複数の正の制御コンポーネントをコードする核酸であり得る。Ｗｎｔ刺激剤はまた、その経路の正の制御コンポーネントをｍＲＮＡかまたはタンパク質のいずれかのレベルで安定化させる小分子または核酸であり得る。
【００６１】
一部の実施形態では、Ｗｎｔ刺激剤は、β−カテニンを安定化させ、したがって、β−カテニンの核内レベルを上昇させることにより、機能する。β−カテニンは、複数の異なる様式で安定化させることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路の複数の異なる負の制御コンポーネントは、β−カテニンの分解を促進することにより機能するため、本Ｗｎｔ刺激剤は、その経路の負の制御コンポーネントの（ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで機能する）小分子阻害物質または核酸阻害物質（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）であり得る。例えば、一部の実施形態では、Ｗｎｔ刺激剤は、ＧＳＫ−３βの阻害物質である。一部のそのような実施形態では、ＧＳＫ−３βの阻害物質は、小分子の化学的化合物（例えば、ＴＷＳ１１９、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ  ２１６７６３、ＳＢ  ４１５２８６、ＣＨＩＲ−９８０１４など）である。
【００６２】
ＴＷＳ１１９：３−（６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）フェノールはDingら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、２００３年６月２４日；１００巻（１３号）：７６３２〜７頁により記載されている。ＢＩＯ：６−ブロモ−３−［（３Ｅ）−１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−（３Ｚ）−２Ｈ−インドール−２−オンまたは（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムは、Meijerら、Chem  Biol.、２００３年１２月；１０巻（１２号）：１２５５〜６６頁によって記載されている。ＣＨＩＲ−９９０２１：６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルは、Bennettら、J  Biol  Chem.、２００２年８月２３日；２７７巻（３４号）：３０９９８〜１００４頁によって記載されている。ＳＢ  ２１６７６３：３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンは、Crossら、J  Neurochem.、２００１年４月；７７巻（１号）：９４〜１０２頁によって記載されている。ＳＢ  ４１５２８６：３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンは、Crossら、J  Neurochem.、２００１年４月；７７巻（１号）：９４〜１０２頁によって記載されている。ＣＨＩＲ−９８０１４：Ｎ２−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチル）−５−ニトロピリジン−２，６−ジアミンは、Ringら、Diabetes.、２００３年３月；５２巻（３号）：５８８〜９５頁によって記載されている。各参考文献は、参照により本明細書に具体的に組み入れられている。
【００６３】
一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、親油性薬剤である。親油性ではない上記の薬剤について、Ｗｎｔ刺激剤は、脂質部分にコンジュゲートしたそのような薬剤であり得る。
【００６４】
Ｗｎｔ刺激剤の有効用量は、少なくとも０．１μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭ、少なくとも５μＭ、通常には、５００μＭ以下、２５０μＭ以下、１００μＭ以下、または５０μＭ以下であり得る。
【００６５】
Ｗｎｔ経路の「負の制御コンポーネント」とは、Ｗｎｔ経路をアンタゴナイズし（すなわち、阻害し）、したがって、経路アウトプットの減少（すなわち、Ｗｎｔ経路のシグナル伝達アウトプットの減少、例えば、標的遺伝子発現の減少、レポーター活性の減少、β−カテニンのレベルの減少など）を生じることにより機能するタンパク質を意味する。Ｗｎｔ経路の既知の負の制御コンポーネントの例には、ＷＩＦ、ｓＦＲＰ、ＤＫＫ、Ｗｎｔ５、Ｗｎｔ１１、Ｎｏｔｕｍ、ＷＩＳＥ／ＳＯＳＴ、アキシン、ＡＰＣ、ＧＳＫ−３β、ＣＫ１γ、ＷＴＸ、およびβＴｒＣＰが挙げられるが、決してそれらに限定されない。Ｗｎｔ経路の負の分泌性制御コンポーネントは、本明細書では「Ｗｎｔ阻害ポリペプチド」と呼ばれる。
【００６６】
Ｗｎｔ阻害ポリペプチド（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の分泌性制御コンポーネント）には、Ｗｎｔ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、およびＬＲＰタンパク質の間での適切な相互作用に干渉する、ＷＩＦ（Ｗｎｔ阻害因子）、ｓＦＲＰ（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質）、ＤＫＫ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）、Ｎｏｔｕｍ、およびＷＩＳＥ／ＳＯＳＴファミリーのメンバーが挙げられる（Melkonyanら、１９９７年、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９４巻（２５号）：１３６３６〜４１頁；Moonら、１９９７年、Cell、８８巻（６号）：７２５〜８頁；Fediら、１９９９年、J  Biol  Chem、２７４巻（２７号）：１９４６５〜７２頁；Nusse、２００１年、Nature、４１１巻（６８３５号）：２５５〜６頁；Cleversら、Cell.、２０１２年６月８日；１４９巻（６号）：１１９２〜２０５頁：Wnt/β-catenin  signaling  and  disease）。大抵のＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ刺激ポリペプチドであるが、ある特定のＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ５およびＷｎｔ１１）はＷｎｔ阻害ポリペプチドである。Ｗｎｔ５およびＷｎｔ１１は、非古典的（非β−カテニン依存性）Ｗｎｔシグナル伝達を刺激することが実証されており、古典的（β−カテニン依存性）Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することも実証されている。したがって、用語「Ｗｎｔポリペプチド」は、いくつかのＷｎｔ刺激ポリペプチド、加えて、いくつかのＷｎｔ阻害ポリペプチドを包含する。
【００６７】
上記の薬剤は、様々な方法で調製することができる。例えば、本Ｗｎｔ刺激性組成物および／または本親油性薬剤（例えば、Ｗｎｔタンパク質）は、薬学的に許容される賦形剤と共に、薬学的に許容される塩およびエステルなどと共になど、用量単位として、（一緒に、または別個に）調製することができる。組成物は、医薬組成物として提供することができる。
医薬組成物
【００６８】
適切な薬剤は、治療的使用、例えば、ヒト処置に適した医薬組成物において提供することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、本開示の１つまたは複数の治療用実体（例えば、本Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤）を含み、かつ薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される賦形剤、および／またはそれらのエステルもしくは溶媒和物を含む。一部の実施形態では、本Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤の使用には、別の治療剤（例えば、象牙質刺激性薬剤、歯髄生存促進剤、抗感染剤など）と併用した使用が挙げられる。本Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤を含む治療用製剤は、望ましい純度を有する薬剤（複数可）を、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、賦形剤、および／または安定剤と混合することにより（Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１６版、Osol,  A.編（１９８０年））、（例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形で）調製することができる。本Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤を有する組成物を、良い医療行為と一致した様式で、製剤化し、投薬され、投与することができる。この関連において考慮されるべき因子には、処置されることになっている特定の障害、処置されることになっている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医師に公知の他の因子が挙げられる。
【００６９】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般的に安全であり、無毒であり、かつ望ましい、医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤を意味し、それには、ヒトの薬学的使用に加えて、獣医学的使用に許容される賦形剤が挙げられる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合、気体であり得る。
【００７０】
「薬学的に許容される塩およびエステル」とは、薬学的に許容され、かつ所望の薬理学的性質を有する塩およびエステルを意味する。そのような塩には、化合物内に存在する酸性部分が無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩が挙げられる。適切な無機塩には、アルカリ金属、例えばナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウム、ならびにアルミニウムと形成される塩が挙げられる。適切な有機塩には、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と形成される塩が挙げられる。そのような塩にはまた、無機酸（例えば、塩化水素酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸などのアルカンスルホン酸およびアレンスルホン酸）と形成される酸付加塩が挙げられる。薬学的に許容されるエステルには、化合物内に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、およびホスホノキシ基から形成されるエステル、例えば、Ｃ１〜６アルキルエステルが挙げられる。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、一酸一塩もしくは一酸一エステル、または二塩もしくは二エステルであり得、同様に、２つより多い酸性基が存在する場合、そのような基の一部または全部が、塩化またはエステル化され得る。この発明において名付けられた化合物は、非塩化もしくは非エステル化の形で、または塩化および／もしくはエステル化の形で存在し得、そのような化合物の名称は、最初（非塩化かつ非エステル化）の化合物と、それの薬学的に許容される塩およびエステルの両方を含むことを意図される。また、この発明において名付けられたある特定の化合物は、１つより多い立体異性形態で存在し得、そのような化合物の名称は、全ての単一の立体異性体、およびそのような立体異性体の（ラセミ体であろうとなかろうと）全ての混合物を含むことを意図される。
【００７１】
用語「薬学的に許容される」、「生理的に耐容される」、およびそれらの文法的変化形は、それらが組成物、担体、希釈剤、および試薬に言及する場合、互換的に使用され、その材料が、その組成物の投与を禁止するだろう程度までの望ましくない生理的効果の発生なしに、ヒトに、またはヒトに対して投与できることを表す。
【００７２】
「用量単位」は、処置されることになっている特定の個体のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して、所望の治療効果（複数可）を生じるように計算された活性化合物（複数可）のあらかじめ決められた量を含有することができる。単位剤形についての明細は、（ａ）活性化合物（複数可）の固有の特性および達成され得る特定の治療効果（複数可）、ならびに（ｂ）そのような活性化合物（複数可）を調合することの当技術分野において特有の制限により規定され得る。
【００７３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー（例えば、ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロースなど）、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）などの大きく、ゆっくり代謝される高分子を含み得る。
【００７４】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに無毒であり、それには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；例えば、アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル（octadecyidimethylbenzyl）アンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムイオンなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性表面活性剤が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられ得る製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
【００７５】
成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉され得る。そのような技術は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１６版、Osol,  A.編（１９８０年）に開示されている。
【００７６】
組成物は、液体溶液かまたは懸濁液かのいずれかのような注射物質として調製することができる；注射前の、液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適した固形もまた調製することができる。その調製物はまた、上記で論じられているように、アジュバント効果の増強のために、リポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどのマイクロ粒子内に乳化または封入することができる。Langer、Science、２４９巻：１５２７頁、１９９０年、およびHanes、Advanced  Drug  Delivery  Reviews、２８巻：９７〜１１９頁、１９９７年。この発明の薬剤は、活性成分の徐放またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化することができるデポー注射剤または埋め込み型調製物の形で投与することができる。医薬組成物は、無菌で、実質的に等張性であるように、かつ米国食品医薬局の全ての製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に全面順守して、製剤化することができる。
方法
【００７７】
本開示は、歯髄組織による象牙質生成を増強するための組成物および方法を提供する。そのような方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与することを含み得る。一部の場合、歯髄は、露出した歯髄であり、前記投与は、露出した歯髄をＷｎｔ刺激性組成物と接触させることを含む。一部の場合、前記投与は、象牙質をＷｎｔ刺激性組成物と接触させ、それにより、Ｗｎｔ刺激性組成物が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透することを含む。上記で論じられているように、Ｗｎｔ刺激剤は、親油性Ｗｎｔ刺激剤であり得る。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔタンパク質（例えば、脂質部分を有するＷｎｔタンパク質）（例えば、Ｗｎｔ３Ａタンパク質）である。一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤（例えば脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔタンパク質；例えば脂質部分を有する、Ｗｎｔ３Ａタンパク質など）を含む。したがって、一部の場合、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤はＬ−Ｗｎｔ（例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）である。
【００７８】
本開示は、親油性薬剤を個体の歯の歯髄組織に送達するための組成物および方法を提供する。そのような方法は、歯の象牙質（例えば、露出した象牙質）を、脂質構造（例えば、リポソーム、ミセルなど）の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させ、それにより、親油性薬剤が、象牙質を通って下層の歯髄組織まで浸透することを含み得る。一部の場合、個体は歯の過敏症を有する。一部の場合、前記歯の歯髄組織は露出していない。一部の場合、前記歯の歯髄組織は露出している。一部の場合、方法は、象牙質を接触させる前に、象牙質を露出させるステップを含む。一部の場合、親油性薬剤は増殖因子（例えば、脂質部分を有する増殖因子）である。一部の場合、親油性薬剤は、親油性Ｗｎｔ刺激剤である。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔタンパク質（例えば、脂質部分を有するＷｎｔタンパク質）（例えば、Ｗｎｔ３Ａタンパク質）である。したがって、一部の場合、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤はＬ−Ｗｎｔ（例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）である。
【００７９】
一部の場合、方法は、象牙質を接触させる前に（例えば、象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を有する組成物と接触させる前に）、象牙質を露出させるステップを含む。例えば、（例えば、歯科的手順の部分として）本方法を実施する時、存在する金属またはプラスチック修復物、齲蝕象牙質、または他の医薬（例えば、歯髄ライニング材）を除去し、したがって、象牙質を露出させることができる。一部の場合、露出した象牙質は、例えば、スメア層を除去するために、象牙質を接触させる前に、（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、例えば、１５〜１７％などの穏やかな溶剤で）清掃される。一部の場合、象牙質表面は、象牙質を接触させる前に（例えば、象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させる前に）、すすぐことができる。一部の場合、象牙質表面は、象牙質を接触させる前に（例えば、象牙質を、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含む組成物と接触させる前に）、すすぎ、その後、優しく風乾することができる。一部の場合、（例えば、齲蝕したエナメル質の除去後、および例えば、調製物が象牙質へ及ぶ場合には）、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を有する本組成物（例えば、Ｌ−Ｗｎｔ、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａなど）は、追加の象牙質を生成するように歯髄細胞を刺激するために、象牙質へ適用され得る（例えば、象牙質は、本組成物と接触させることができる）。
【００８０】
一部の場合、個体（例えば、本方法および／または組成物を使用して処置されるべき個体）は歯の過敏症を有する。個体が過敏な歯を有する場合、歯を磨くこと、デンタルフロスできれいにすること、食べること、および飲むことなどのある特定の行為が歯に鋭い一時的な痛みを引き起こし得る。過敏な歯は、摩耗した歯のエナメル質または露出した歯根の結果であり得る。歯の過敏症は、虫歯、齲蝕病変、亀裂の入った、もしくは折れた歯、最近詰められた充填剤、もしくは他の歯科的手順（例えば、歯の修復、漂白など）の副作用、歯周病などの因子により、および／または加齢の結果として、引き起こされ得る。一部の場合、処置されるべき歯の歯髄は、（例えば、歯が折れること、虫歯、歯科的手順などにより）露出している（例えば、図７参照）。一部の場合、処置されるべき歯の歯髄は、露出していない。一部の場合、個体（例えば、本方法および／または組成物を使用して処置されるべき個体）は、虫歯、齲蝕病変、亀裂の入った、もしくは折れた歯、最近詰められた充填剤、歯科的手順（例えば、歯の修復、漂白など）の副作用、および歯周病のうちの１つまたは複数を有する。
【００８１】
例えば、一部の場合、齲蝕病変は、歯髄腔の近くにあり、または歯髄腔を侵害しているように見え（例えば、Ｘ線写真上で見え）得る。本方法（例えば、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの適用）は、生存可能な歯髄腔内の幹細胞、前駆細胞、および／または象牙芽細胞を活性化し、そうすることで、象牙質形成を刺激／増強するために使用することができる。象牙質は、被覆物として働くことができ、残存する歯髄組織を（例えば、外傷から）保護することができる。
【００８２】
一部の場合、歯の歯髄組織は露出しており、方法は、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量で、個体の歯の歯髄に投与する方法である。一部の場合、歯髄組織は、傷害、齲蝕病変など（例えば、折れた歯、虫歯など）に起因して露出し得る。一部の場合、歯髄組織は、意図的に（例えば、歯科的手順を実施する人により）露出させることができる。例えば、歯髄組織は、本方法および／またはいくつかの他の歯科的手順のために、歯の準備中に露出させることができる。一部の場合、本方法は、露出した歯髄を生じるように歯の歯髄を露出させるステップを含む。一部の場合、投与は、露出した歯髄を、Ｗｎｔ刺激剤を含むＷｎｔ刺激性組成物と接触させることを含む。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、親油性Ｗｎｔ刺激剤である。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、Ｗｎｔタンパク質（例えば、脂質部分を有するＷｎｔタンパク質）（例えば脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔ３Ａタンパク質）である。一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性Ｗｎｔ刺激剤（例えば脂質部分を有する、例えば、Ｗｎｔタンパク質；例えば脂質部分を有する、Ｗｎｔ３Ａタンパク質など）を含む。したがって、一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物はＬ−Ｗｎｔ（例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ）を含む。一部の場合、歯髄組織は、（例えば、歯科的手順を実施する人により）意図されたことではなく、露出し得る。
【００８３】
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／または生理的効果を得ることを一般的に指すように、本明細書で使用される。その効果は、疾患またはその症状（複数可）を完全に、もしくは部分的に防止する点で予防的であり得、ならびに／または疾患および／もしくはその疾患に起因し得る有害作用についての部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒の点で治療的であり得る。本方法は、予防のためにも治療のためにも有用である。したがって、本明細書で使用される場合、用語「処置すること」は、既存の状態（例えば、歯の過敏症、歯髄露出など）の処置と、（例えば、象牙質の減少に関連した症状の前に歯の象牙質を増加させるための；例えば、歯科的手順後に、将来的な歯の過敏症を防止し、その可能性を低下させ、またはその重症度を低下させるための方法としての）防止的処置との両方を指すように使用される。治療効果の証拠は、既存の状態と比較して、または処置の非存在下での予想される転帰と比較して、状態の重症度のいかなる減少でもあり得る。治療効果は、臨床転帰の点から測定することができ、または免疫学的もしくは生化学的試験（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達活性が誘導されたかどうかを決定する試験）により決定することができる。処置されるべき個体は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類であり得、特に治療の評価のための、例えばウサギ、ラット、マウスなどの実験動物、ウマ、イヌ、ネコ、農場動物などであり得る。
【００８４】
治療的処置は、対象が投与前に冒されている場合の処置であり、予防的処置は、対象が投与前に冒されていない場合の処置である。一部の実施形態では、対象は、処置前に、冒されるようになる可能性が増加しており、または冒されるのではないかと疑われる。一部の実施形態では、対象は、冒されるようになる可能性が増加しているのではないかと疑われる。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「歯髄露出」または「歯髄露出」は、歯髄組織の露出を指す。健康な歯において、歯髄は象牙質内にあるが（例えば、図７参照）、歯髄露出は、炎症、感染、膿瘍形成などをもたらし得る。歯髄露出は、外傷（例えば、亀裂の入った歯）、齲蝕、窩洞形成などに起因し得る。一部の場合、歯髄は、歯科的手順中に（例えば、それの結果として）、露出される（それは、意図的な露出の場合もあるし、意図的ではない露出の場合もある）。歯髄露出は、急性であり得（例えば、亀裂の入った歯）、またはある期間にかけて（例えば、窩洞の形成により）生じ得る。一部の場合、本方法は、歯髄を本Ｗｎｔ刺激性組成物と接触させる前に、歯の歯髄を露出させるステップを含む。
【００８６】
一部の場合、本方法は、歯髄腔の近くにあり、または歯髄腔を侵害しているようにＸ線写真上で見える深い修復物（アマルガム、コンポジットレジン、クラウン）の設置後に実施される。一部の場合、本方法は、若年患者において、または歯髄腔が故意ではなく露出している患者において、直接的歯髄覆罩後、実施される。一部の場合、本方法は、歯の過敏症を防止し、および／またはその可能性を低下させるために、任意の歯の修復物（アマルガム、コンポジットレジン、クラウン）の設置後、実施される。一部の場合、本Ｗｎｔ刺激性組成物は、歯周病患者について、ルートプレーニングおよびスケーリング後、歯根表面へ局所的に適用される。一部の場合、本Ｗｎｔ刺激性組成物（例えば、Ｌ−Ｗｎｔ、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａなど）が、齲蝕したエナメル質の除去が一般的に十分と考えられている初発性齲蝕病変を有する歯に適用される。本明細書に記載された方法の全ては、一般的な修復歯科学、歯科補綴学、および歯周病学において幅広い適用を有する。
【００８７】
一部の場合、本方法は、例えば、歯科修復物、齲蝕病変、歯周病により、または加齢の結果として引き起こされる、過敏な歯（歯の過敏症）の処置である。例えば、齲蝕病変が、歯髄腔の近くにあり、または歯髄腔を侵害しているように、Ｘ線写真上で見える歯において、本組成物（例えば、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ）の適用は、生存可能な歯髄腔内の幹細胞、前駆細胞、および／または象牙芽細胞を活性化し、そうすることで、第三象牙質形成を刺激するために使用することができる。この第三象牙質は、被覆物として働くことができ、残存する歯髄組織を外傷から保護する。
【００８８】
一部の場合、Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された（例えば、Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔタンパク質などの）親油性薬剤（例えば、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ）が、象牙質に適用される（または一部の場合、露出した歯髄に適用される）。言い換えれば、一部の場合、象牙質および／または露出した歯髄を、Ｗｎｔ刺激性組成物、および／または脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤（例えば、Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔタンパク質）と接触させる。本組成物は、１〜３０分間（例えば、１〜１５分間、２〜１５分間、２〜１２分間、４〜１５分間、４〜１２分間、５〜１５分間、５〜１２分間、５〜１０分間、７〜１５分間、７〜１２分間、または８〜１２分間）の間に、再適用することができる。一部の場合、象牙質および／または露出した歯髄を本組成物と接触させた後、歯は、標準の歯置換材料（コンポジットレジン、アマルガム、グラスアイオノマーセメントなど）を用いて塞がれる。一部の場合、本方法は、歯を塞ぐステップを含む。一部の場合、象牙質および／または露出した歯髄を、１分間から３０分間までの範囲（例えば、１〜１５分間、２〜１５分間、２〜１２分間、４〜１５分間、４〜１２分間、５〜１５分間、５〜１２分間、５〜１０分間、７〜１５分間、７〜１２分間、または８〜１２分間）でのある期間にわたって２回またはそれ超（例えば、３回またはそれ超、４回またはそれ超、５回またはそれ超）、本組成物と接触させる。
【００８９】
治療用製剤の用量は、状態の性質、投与の頻度、投与様式、薬剤の宿主からのクリアランスなどに依存して幅広く異なる。初回用量は、より多く、続いて、より少ない維持用量量であり得る。用量は、毎週もしくは隔週のように低頻度で投与することができ、またはより多くの場合、より少ない用量へ分割して、毎日、週２回、もしくはそうでなければ、有効用量レベルを維持するための必要に応じて、投与することができる。
【００９０】
一部の実施形態では、本組成物（例えば、ｗｎｔ刺激性組成物、親油性薬剤を含む組成物など）の投与は、局部投与により実施される。本明細書で使用される場合、局部投与は、局所投与を指すが、身体への処置の部位（例えば、歯の傷害、歯の過敏症の見える所、またはその近く）における注射または他の導入も指し得る。
【００９１】
一部の実施形態では、本組成物は、短期間、投与され、例えば、単回投与または一連の投与が、例えば、１日間、２日間、３日間、またはそれ超で、最長１週間または２週間にわたって実施される。投与される用量のサイズは、医師によって決定され得、疾患の性質および重大さ、患者の年齢および健康状態、ならびに手順および／または組成物に対する患者の耐容性などのいくつかの因子に依存する。
【００９２】
用語「同時投与」、「同時投与する」、および「と併用して」は、２つまたはそれ超の治療剤（例えば、本Ｗｎｔ刺激性組成物および／もしくは脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤；ならびに／または別の象牙質刺激剤、歯髄生存促進剤、抗感染剤など）の、一斉に、並行して、または特定の時間制限をもたずに順次での投与を含む。一実施形態では、薬剤は、標的組織（例えば、歯髄および／または象牙質）と、または対象の身体において同時に接触し、またはそれらの生物学的もしくは治療的効果を同時に発揮する。一部の実施形態では、治療剤は、同じ組成物または単位剤形の中にある。一部の実施形態では、治療剤は、別々の組成物または単位剤形の中にある。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与前（例えば、数分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）、投与と同時に、または投与後（例えば、例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）に投与することができる。一部の場合、（例えば、医薬組成物として製剤化された）本Ｗｎｔ刺激性組成物および／もしくは脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤は、１つまたは複数の追加の薬剤（例えば、象牙質刺激剤、歯髄生存促進剤、抗感染剤、および／または増殖因子など）と同時投与される。そのような投与は、本開示の１つまたは複数の薬剤の投与に対して、追加の薬剤の並行（すなわち、同時）、前、または後の投与を含み得る。一部の実施形態では、処置は、本Ｗｎｔ刺激性組成物および／もしくは脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤の、別の薬剤（例えば、象牙質刺激剤、歯髄生存促進剤、抗感染剤、および／または増殖因子など）との組合せを投与すること（同時投与）により達成される。
【００９３】
処置は、抗生物質、サイトカインなどの他の活性剤と併用され得る。抗生物質の種類には、ペニシリン、例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなど；β−ラクタマーゼ阻害物質と併用したペニシリン；セファロスポリン、例えば、セファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタムなど；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド；テトラサイクリン；マクロライド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン；クロラムフェニコール（cloramphenical）；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシンなどが挙げられる。サイトカインにもまた、例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２などが挙げられ得る。
【００９４】
「治療有効用量」または「治療的用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療効力を達成する）のに十分な量である。治療有効用量は、１回または複数の投与で投与することができる。この開示の目的のために、本Ｗｎｔ刺激性組成物および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤の治療有効用量は、疾患および／または傷害の状態（例えば、歯髄露出、歯の過敏症など）を緩和し、寛解させ、安定化させ、逆転させ、防止し、その進行を減速させ、または遅らせるのに十分である量である。したがって、治療有効用量の、本Ｗｎｔ刺激性組成物および／または脂質構造の非水相内に挿入された本親油性薬剤は、歯髄により生成される象牙質の量を増加させることができ、歯髄における細胞死（例えば、ＴＵＮＥＬ染色、Ｃａｓｐ８発現、ＣＡＳＰＡＳＥ  ３発現などの技術を用いて検出することができる）を減少させることができ、歯髄における細胞増殖（例えば、Ｋｉ６７免疫染色、ＢｒｄＵ組み入れなどの技術を用いて検出することができる）を増加させることができ、歯髄における分化した象牙芽細胞の数（例えば、ネスチンおよび／または細胞外基質タンパク質ＤＳＰなどの発現マーカーを用いて検出することができる）を増加させることができ、歯髄における高度に組織化された有管象牙質基質のレベルを増加させることができ、および歯髄における（有管真正象牙質を示唆する）線状組織化を有するコラーゲン基質のレベル（例えば、ピクロシリウスレッド染色および偏光により検出することができる）を増加させることができる。
【００９５】
そのために、一部の場合、本方法は、歯髄により生成される象牙質の増加、歯髄における細胞死の減少（例えば、ＴＵＮＥＬ染色、Ｃａｓｐ８発現、ＣＡＳＰＡＳＥ  ３発現などの技術を用いて検出することができる）、歯髄における細胞増殖の増加（例えば、Ｋｉ６７免疫染色、ＢｒｄＵ組み入れなどの技術を用いて検出することができる）、歯髄における分化した象牙芽細胞の数の増加（例えば、ネスチンおよび／または細胞外基質タンパク質ＤＳＰなどの発現マーカーを用いて検出することができる）、歯髄における高度に組織化された有管象牙質基質のレベルの増加、および／または歯髄における（有管真正象牙質を示唆する）線状組織化を有するコラーゲン基質のレベルの増加（例えば、ピクロシリウスレッド染色および偏光により検出することができる）について歯髄を評価するステップを含む。「増加」および／または「減少」は、任意の便利な対照（例えば、あらかじめ決められた値、処置されていない対照の歯、処置前に評価された同じ患者由来の試料、プラセボ（例えば、食塩水）で処置された対照など）と比較してのものであり得る。
【００９６】
一部の場合、本方法は、処置がＷｎｔシグナル伝達（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性）を刺激した（例えば、増加させた）かどうかを評価するステップを含む。そのような活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路の標的遺伝子の発現、Ｗｎｔレポーターの増加など）を検出するために任意の便利な方法を使用することができる。「増加」および／または「減少」は、任意の便利な対照（例えば、あらかじめ決められた値、処置されていない対照の歯、処置前に評価された同じ患者由来の試料、プラセボ（例えば、食塩水）で処置された対照など）と比較してのものであり得る。
【００９７】
用量および頻度などのパラメータについてのガイドラインが、活性剤の分子量、投与の型、例えば、鼻腔内、吸入、局所的、注射、全身性（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内）などの様々な因子について調整することができることは当業者により理解されている。本組成物／薬剤は、局所的、経口、非経口、肺内、および鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内（ボーラスまたはゆっくりの点滴）、動脈内、腹腔内、髄腔内、または皮下投与が挙げられる。投与は、注射、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜外などの非経口経路、ならびに経口、経鼻、眼、直腸、または局所的を含み得る。徐放性投与もまた、本開示に特定的に含まれる（例えば、デポー注射または侵食性植込錠など）。限局性送達が企図され、例えば、象牙質への局所投与、および／または露出した歯髄組織との接触である。
【００９８】
上記で言及されているように、本組成物／薬剤は、薬学的に許容される担体（本薬剤がそれの適用を促進するために組み合わせられる、天然または合成の１つまたは複数の有機または無機成分）と製剤化することができる。薬学的に許容されることが公知の他の水性および非水性の等張性無菌溶液および無菌懸濁液が当業者に知られているが、適切な担体には、無菌食塩水が挙げられる。「有効量」は、病的な、変性の、または損傷した状態を寛解させ、またはその進行を遅らせることができる量を指す。有効量は、個人レベルで決定され得、処置されるべき症状および求められる結果の考慮に、一部、依存する。
キット
【００９９】
方法に用いられるキットもまた提供される（例えば、本発明の医薬組成物の成分の１つまたは複数を有する１つまたは複数の容器を含む、医薬パックまたはキット）。本キットは、（例えば、歯髄による象牙質の生成を増強するのに十分な用量での）Ｗｎｔ刺激剤および／または脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を含むＷｎｔ刺激性組成物を含み得る。一部の場合、Ｗｎｔ刺激剤は、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤である。一部の実施形態では、キットは、２つもしくはそれ超のＷｎｔ刺激剤、および／または脂質構造の非水相内に挿入された２つもしくはそれ超の親油性薬剤（例えば、別々の脂質構造の非水相内に、それぞれ挿入された２つもしくはそれ超の親油性薬剤および／または同じ脂質構造の非水相内に挿入された２つもしくはそれ超の親油性薬剤）を含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔ刺激剤および／または脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤が剤形（例えば、治療的有効な剤形）として提供される。キットの関連において、Ｗｎｔ刺激剤および／または脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤は、任意の便利なパッケージング（例えば、スティックパック、用量パックなど）での液体または固体の形で提供することができる。キットの薬剤は、同じまたは別々の容器で提供することができる。例えば、キットは、１つの容器にＷｎｔ刺激剤を、別の容器に、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を有する。別の例として、キットは、１つの容器にＷｎｔ刺激剤を、別の容器に別のＷｎｔ刺激剤を有し得る。さらに別の例として、キットは、１つの容器に、脂質構造の非水相内に挿入された親油性薬剤を、別の容器に、脂質構造の非水相内に挿入された異なる親油性薬剤を有し得る。一部の場合、本キットの薬剤は、同じ容器で提供される。上記のキットは、本方法に関連した歯科的手順についての試薬および／またはコンポーネント（例えば、歯の上を覆うため、象牙質を露出させるため、歯髄を露出させるためなどの試薬および／またはコンポーネント）を含み得る。
【０１００】
上記コンポーネントに加えて、本キットは、（ある特定の実施形態では）本方法を実施するための使用説明書をさらに含み得る。これらの使用説明書は、本キット内に様々な形で提供され得、その使用説明書のうちの１つまたは複数がキット内に提供されてもよい。これらの使用説明書が提供され得る１つの形は、キットのパッケージング内の、パッケージ挿入物としてなどの適切な媒体または基材上に印刷された情報、例えば、情報が印刷されている１枚または複数枚の紙としてある。これらの使用説明書のさらに別の形は、情報が記録されているコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどである。提供され得るこれらの使用説明書のさらに別の形は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを経由して使用され得るウェブサイトアドレスである。
【０１０１】
本発明は、今、十分に記載されようとしているが、様々な変化および改変が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、なされ得ることは、当業者には明らかであろう。
実験
【０１０２】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、かつ使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが何を本発明者らの発明とみなすかの範囲を限定することを意図するものでも、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が確認される。他に規定がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気、または大気付近においてである。
【０１０３】
この明細書に引用された全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられているように示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられている。
【０１０４】
本発明は、本発明の実施のための好ましい形態を含むように、本発明者により見出され、または提案された特定の実施形態に関して記載されている。本開示を鑑みれば、多数の改変および変化が、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態においてなされ得ることは、当業者によって認識されているだろう。例えば、コドン重複性により、タンパク質配列に影響することなく、基本的なＤＮＡ配列に変化が生じ得る。さらに、生物学的機能等価の考慮により、生物学的作用を種類または量において影響を及ぼすことなく、タンパク質構造に変化を生じ得る。全てのそのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図される。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
下記の実験は、ＷＮＴ３Ａのリポソーム再構成形態が、生物模倣化合物として使用される場合に、傷害を受けた歯髄において細胞を活性化して、象牙質再生を刺激するタンパク質の安定な形態を産生することを示す。Ｗｎｔ増幅環境は、歯髄傷害、例えば、アポトーシスを受けている細胞数が有意に低減した後の、優れた歯髄治癒と関連付けられ、傷害を受けた象牙芽細胞の有意に良好な生存および第三象牙質の増加をもたらすことがわかった。歯髄細胞は、象牙質分泌象牙芽細胞に分化することによってＷｎｔ刺激の上昇に応答した。したがって、Ｗｎｔ応答を一過性に増幅することにより、歯髄の活力をもたらした。
【０１０６】
材料および方法
【０１０７】
動物
【０１０８】
スタンフォード大学動物実験委員会およびパリ・デカルト大学動物実験員会（協定ＣＥＥＡ３４．ＣＣ．０１６．１１、Ｃｏｍｉｔｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｐｏｕｒ  ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ  ｎ°３４、パリ、フランス）は、全ての実験手順を承認した。ラットは、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから購入した。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ（＃１１８０９８０９）およびＡｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋（それぞれ、＃０１８８６７および＃００７５７６）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した。Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウスに関して、タモキシフェンを、連続５日間ＩＰ送達した（４．０ｍｇ／２５ｍｇの体重）であった。
【０１０９】
動物の手術
【０１１０】
成体雄マウス（３〜５ヵ月齢）を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。総計で、７２匹のマウス（Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウス３６匹およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウス３６匹）を使用した。直径φ０．３ｍｍの円形バール（Ｅ０１２３、Ｄｅｎｔｓｐｌｙ  Ｍａｉｌｌｅｆｅｒ、バレーグ、スイス）で窩洞を作出し、続いて＃６Ｋ−やすりを使用して、歯髄を露出させた。グラスアイオノマーセメント（３Ｍ）を使用して、傷害を覆った。実験で指示した時間で、マウスを屠殺した。
【０１１１】
ラットにおいて、直径φ０．２ｍｍの円形バールで窩洞を作出し、続いて根管回転式ニッケル−チタンやすりシステム（Ｐｒｏｔａｐｅｒ、Ｄｅｎｔｓｐｌｙ）を使用して、歯髄を露出させた。歯髄露出後、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝１８）またはＬ−ＰＢＳ（Ｎ＝１８）のいずれかで処置したビーズを、ブラントスティールプローブを使用して、歯髄室に埋め込んだ（ビーズの調製に関する詳細については下記を参照。Ｂｉｏｄｅｎｔｉｎｅセメント（Ｓｅｐｔｏｄｏｎｔ、Ｓａｉｎｔ−Ｍａｕｒ  ｄｅｓ  Ｆｏｓｓｅ’ｓ、フランス）を使用して、傷害を覆った。実験で指示した時間で、マウスを屠殺した。
【０１１２】
Ｌ−ＷＮＴ３Ａの調製および送達
【０１１３】
精製した組換えヒトＷＮＴ３Ａタンパク質を、記載されているように（１３）リポソーム小胞と共にインキュベートした。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（１０ｎｇ、（１４）を参照）またはＬ−ＰＢＳ（各状態に関してＮ＝１８）を、関連溶液（１５）中で、３７℃で一晩浸漬させたＡｆｆｉ−Ｇｅｌアガロース床（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に送達した。
【０１１４】
試料調製、加工処理、組織学、組織形態計測学、および細胞アッセイ
【０１１５】
上顎を収集して、皮膚および筋肉の外側層を除去して、組織を固定した。組織を、８μｍ厚で切開して、確立した手順（１６）を使用して加工処理した。組織学的染色は、記載されているように（１６）実施した。最低６つの切片を使用して、新たな象牙質の量を定量化した。組織形態計測学的測定は、記載されているように（１７）実施した。
【０１１６】
Ｘ−ｇａｌ染色は、記載されているように（１８）実施した。ＴＵＮＥＬ染色は、製造業者（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）により記載されているように実施した。免疫染色は、標準的な手順（１０）を使用して実施した。細胞増殖分析に関して、ＢｒｄＵ標識試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）は、製造業者の使用説明書に従って、ＩＰ注射したか、または培養培地に添加した。１２時間後に、動物を屠殺して、骨髄由来幹細胞および歯髄細胞の両方を１２時間後に固定した。
【０１１７】
一次抗体およびそれらの希釈物は、以下の通りであった：抗ビオチン化ＢｒｄＵ（１：２００）、抗ネスチン（１：３００）、抗Ｋｉ６７（１：２００）、抗ＰＣＮＡ（１：１０００）、抗ＤＳＰ（１：１０００）。
【０１１８】
歯髄幹細胞および骨髄処置
【０１１９】
ヒト歯髄幹細胞は、ピカンマ病院区域の倫理委員会、タンペレ、フィンランド（Ｒ０６００９）に従って、記載されているように（１９）単離した。細胞は、１０％ウシ胎児血清を有するＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞は、３７℃で６、１２および２４時間、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（有効濃度＝０．０６μｇ／ｍＬ）で処置した。その後、ＲＮＡを単離して、ｑＲＴ−ＰＣＲ（下記参照）およびＢｒｄＵ組み入れ（下記）によって分析した。
【０１２０】
骨髄を、成体マウスの大腿骨および脛骨から収集し、等分して、類似のサイズの試料を生じた。試料間の変動が１０％未満であることを確実にするために、ＤＮＡ含有量を測定した（２０）。各分割量を、３７℃で４時間、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（有効濃度＝０．１５μｇ／ｍＬ）を含有する１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ  ２０μＬと共にインキュベートした。その後、ＲＮＡを単離して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析したか、または組織を４％ＰＦＡ中に４℃で固定して、凍結切片化のためのＯＣＴへ加工処理した。ＴＵＮＥＬ活性およびＫｉ６７発現は、１０μｍの切片を使用して分析した（上記参照）。
【０１２１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
【０１２２】
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは製造業者の使用説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって合成した。ＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、記載されているように（１０）実施した。全ての反応は、三連で実施した。
【０１２３】
下記プライマーセットを使用した：
Ａｘｉｎ２、５’−ＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧ−３’（センス）（配列番号１）および５’−ＣＣＴＴＣＡＴＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＣＡＣ−３’（アンチセンス）（配列番号２）；
Ａｘｉｎ２エクソン１、５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣ−３’（センス）（配列番号３）および５’−ＧＡＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＡＧＣ−３’（アンチセンス）（配列番号４）；
ＣＡＳＰ３、５’−ＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴ−３’（センス）（配列番号５）および５’−ＧＧＣＣＣＡＴＧＡＡＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧ−３’（アンチセンス）（配列番号６）；
Ｌｅｆ１、５’−ＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣ−３’（センス）（配列番号７）および５’−ＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号８）；
ＰＣＮＡ、５’−ＣＴＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡ−３’（センス）（配列番号９）および５’−ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴＡ−３’（アンチセンス）（配列番号１０）；
ネスチン：５’−ＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＴＣＧＣＴＴＡＧＡＧ−３’（センス）（配列番号１１）および５’−ＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴ−３’（アンチセンス）（配列番号１２）；
象牙質シアロホスホタンパク質（ＤＳＰＰ）：５’−ＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＴ−３’（センス）（配列番号１３）および５’−ＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＧ−３’（アンチセンス）（配列番号１４）；
オステオカルシン：５’−ＴＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧ−３’（センス）（配列番号１５）および５’−ＧＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣ−３’（アンチセンス）（配列番号１６）；ならびに
Ｉ型コラーゲン：５’−ＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＧＴＣＴＧ−３’（センス）（配列番号１７）および５’−ＣＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧ−３’（アンチセンス）（配列番号１８）。
【０１２４】
象牙質容量およびミネラル密度マイクロＣＴ分析
【０１２５】
上顎のマイクロコンピュータ断層撮影は、５μｍの解像度でＳｋｙＳｃａｎ  １１７６スキャナー（ＳｋｙＳｃａｎ、Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー）を使用して実施した。スキャンは、４５ｋＶ、５５６ｍＡで行った。修正Ｆｅｌｄｋａｍｐコーンビームアルゴリズムを使用して、５０％に設定したビーム硬化補正を使用して、切片の再構築が達成された。ＣＴＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（バージョン１．０２；ＳｋｙＳｃａｎ）は、形態計測学的定量のために用いた。
【０１２６】
修復象牙質組織形態計測学
【０１２７】
顕微鏡をビデオカメラおよびコンピュータに連結している半自動画像分析器を用いて、一定倍率（２５０倍）で（２１）、ラット臼歯からの切片を形態計測的に検査した。試料（１群当たりのＮ＝６の臼歯）１つ当たり６つの切片を、歯髄露出部位で採取した。１４日目に、象牙質橋の多孔性は、修復象牙質内に細胞を含有する空間の割合を測定することによって、マッソントリクロームで染色した切片で決定した。
【０１２８】
統計分析
【０１２９】
結果は、独立した反復の平均値±標準誤差値として示される。スチューデントｔ検定を使用して、この論文に記載している差異を定量化した。Ｐ≦０．０５は、有意であるとみなした。
【０１３０】
結果
【０１３１】
象牙芽細胞がＷｎｔ応答性である場合
【０１３２】
象牙芽細胞は、中間径フィラメントタンパク質ネスチン（図１Ｃ（２２））、および象牙質シアロタンパク質、ＤＳＰ（図１Ａ〜図１Ｄ（２３））の発現によって、歯髄細胞と区別される。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウス（ここでは、Ｗｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２のプロモーターが、ＬａｃＺ発現を駆動する（２４、２５））からの組織のＸ−ｇａｌ染色を使用して、歯髄腔の内表面を裏打ちしている象牙芽細胞は、Ｗｎｔ応答性であった（図１Ｅ）。第２の誘導性Ａｘｉｎ２レポーター系統（Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋）により、象牙芽細胞が内因性Ｗｎｔシグナルに応答することを立証した：ＧＦＰ免疫蛍光は、象牙質にまで及ぶ象牙芽細胞の細胞体および突起において容易に明らかであった（図１Ｆ）。胚および産後早期の歯組織（図６）の分析により、象牙芽細胞も同様にＷｎｔ応答性であることが示され、これらの細胞がそれらの生涯全体にわたってＷｎｔ応答性状況を維持することを示した。
【０１３３】
Ａｘｉｎ２の欠失は、象牙質／歯髄複合体に影響を及ぼさない
【０１３４】
負のＷｎｔ制御因子Ａｘｉｎ２が欠失されており（２４、２５）、またＷｎｔ応答性が上昇される（１０、２６）Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスを使用して、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスからの歯の肉眼形態を評価して、有意な差は歯髄腔のサイズ、または歯槽骨の厚さおよび密度で見出されず、歯髄室のサイズは、Ａｘｉｎ２欠失で影響を受けなかった（図２Ａ〜図２Ｆ）。象牙質容量（図２Ｇ）、ならびにエナメルおよび象牙質のミネラル密度もまた、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて等価であった（図２Ｈ）。組織学的検査により、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ歯髄がヘテロ接合体および野生型同腹子と識別不可能であることが示された（図２Ｉ、図２Ｊ；各遺伝子型に関してＮ≧２０）。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺおよびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおけるＸ−ｇａｌ＋ｖｅ細胞の分布は、変化がなく、注目すべき唯一の差異は、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＸ−ｇａｌ染色の強度であり、それは、ホモ接合体マウスがＬａｃＺ遺伝子の２つのコピーを保有するため予測される（図２Ｋ、図２Ｌ）。
【０１３５】
Ａｘｉｎ２は、Ｗｎｔシグナル伝達のリガンド依存性阻害物質であり、したがって、Ｗｎｔ刺激の非存在下では、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスは、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋および野生型マウスでみられるものと等価である（１０、２４）、ベースラインＷｎｔシグナル伝達を示すはずであると予想される。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ベースラインＷｎｔシグナル伝達が、Ｌｅｆ１およびＡｘｉｎ２（エクソン１）発現で測定される場合に、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋およびＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて等価であることが立証された（図２Ｍ）。細胞増殖のマーカー（図２Ｍ）および歯原性タンパク質ネスチン（図２Ｎ、図２Ｏ）、ＤＳＰＰ、オステオカルシンおよびＩ型コラーゲン（図２Ｐ）は、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスとＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスとの間で発現レベルの有意な差を示さなかった。
【０１３６】
Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスは、急性歯髄露出後に優れた修復応答を示す
【０１３７】
急性歯髄露出に対するＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスおよびそれらのＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照同腹子の応答を試験した。術後の１４日目までに、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋マウスにおける歯髄腔は、大部分が壊死していた（Ｎ＝６；図３Ａ）。明らかに異なる応答が、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスで観察され、ここで、壊死歯髄組織の代わりに、窩洞は、修復象牙質によって占められた（Ｎ＝６；図３Ｂ；Ｃで定量化）。この基質の組織化は、ピクロシリウスレッド染色を使用して、また偏光下での視覚化を用いて検査した。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照において、組織化されたコラーゲンネットワークは、傷害部位では明白ではなかった（図３Ｄ）；対照的に、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスでは、橋を形成している高密度で濃縮されたコラーゲンファイバーネットワークは、明らかであった（図３Ｅ）。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスでは、象牙質分泌細胞は、ＤＳＰ（図３Ｇ）およびネスチン（図３Ｉ）に関して免疫陽性であったが、対照ではそうではなかった。
【０１３８】
術後の４日目に、肉芽組織は、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照では歯髄室を充填した（Ｎ＝６；図３Ｊ）。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスは、最小の肉芽組織を示した（Ｎ＝６；図３Ｋ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、内因性Ｗｎｔ応答が、Ａｘｉｎ２エクソン１発現で測定される場合に、対照と比較してＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて著しく上昇することが明らかとなった（図３Ｌ）。
【０１３９】
歯髄の露出は、広範囲な細胞壊死を引き起こし（２８）；傷害によって損傷した歯髄細胞が、死ぬ可能性があるか、または回復する可能性がある場合には、潜在的なアポトーシスの期間も存在する（２９）。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照において、大量のＴＵＮＥＬ染色により、これらの死滅細胞が識別された（図３Ｍ）。Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて、術後の４日目でさえ、極めて少ないＴＵＮＥＬ＋ｖｅ細胞が明らかであった（図３Ｎ）。アポトーシスは、主にカスパーゼ活性によって制御され（３０）、ＴＵＮＥＬ染色によって予想されるように、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおけるＣａｓｐ８発現は、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照におけるその発現よりも著しく低かった（図３Ｏ）。細胞増殖は、Ｋｉ６７免疫染色によって示されるように、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋対照と比較してＡｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいてより大きかった（図３Ｐ、図３Ｑ）。したがって、内因性Ｗｎｔシグナル伝達における有意な上昇を引き起こす急性歯髄傷害に応答して、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスは、それらヘテロ接合体同腹子よりも良好な結果をもたらした。上昇したＷｎｔ環境は、細胞死の低減、細胞増殖の増強、および歯髄の修復反応の全体的な改善と相関していた。
【０１４０】
Ｗｎｔシグナル伝達は、歯髄幹細胞においてアポトーシスおよび増殖を調節する
【０１４１】
Ｗｎｔ刺激単独が、歯髄細胞において細胞死を低減させて、細胞増殖を増強するのに十分であるかどうかを試験した。歯髄幹細胞は、ヒトの歯から単離して（１９）、まずＷＮＴ３Ａタンパク質に対するそれらの応答性に関して分析した（１３）。６時間の処置内で、歯髄幹細胞は、少なくとも２４時間持続したＡｘｉｎ２発現の４．８倍の増加を示した（図４Ａ）。歯髄幹細胞の有糸分裂活性は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置によって著しく増加した（図４Ｂ）。ヒトＣＡＳＰＡＳＥ  ３発現は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置によって著しく低減した（図４Ｃ）。
【０１４２】
それらの未分化状態では、歯髄および骨髄は、等価な組織とみなされている（３１、３２）。続いて、収集したばかりの骨髄が、ヒト歯髄幹細胞と類似の方法でＬ−ＷＮＴ３Ａに応答したかどうかを試験した。マウスからの全骨髄を収集して、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはＬ−ＰＢＳで処置し、２４時間以内に、Ｗｎｔ応答性の有意な増加を検出した（図４Ｄ）。Ｗｎｔ応答性の上昇は、細胞増殖の増加（図４Ｅ）および細胞死の低減（図４Ｆ）と同時に発生した。したがって、ＷＮＴ刺激への曝露は、２つの幹細胞集団において、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させて、有糸分裂活性を増強し、アポトーシスを低減するのに十分である。
【０１４３】
Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、急性歯髄露出後に歯髄の活力を保存する
【０１４４】
次に、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを低減させて、細胞増殖を促進する能力を考慮して、Ｌ−ＷＮＴ３Ａが、急性傷害後に歯髄組織において類似の効果を誘発し得るかどうかを試験した。急性歯髄露出を野生型ラットで発生させて、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはＰＢＳのリポソーム製剤（Ｌ−ＰＢＳ）で処置し、続いて細菌混入を防止するために密封した。組織学的分析により、傷害のサイズおよび程度は、処置群間で等価であることが立証された（両方の処置群に関してＮ＝６；図５Ａ、図５Ｂ）。
【０１４５】
術後の４日目に、Ｌ−ＰＢＳ対照は、広範囲な歯髄壊死およびアポトーシスを示し（Ｎ＝６、図５Ｃ、図５Ｃ’）；Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置した場合、ＴＵＮＥＬ染色は、最小限であった（Ｎ＝６；図５Ｄ）。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置試料において観察されるＴＵＮＥＬ染色は、概して、露出の部位付近にある歯髄腔の天井に制限された（Ｎ＝６；図５Ｄ’）。
【０１４６】
Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスにおいて観察されるような上昇したＷｎｔ環境において、細胞増殖は、傷害後に著しく上昇し（図３）；これにより、より活発な修復応答が示唆される。傷害を受けた歯髄のＬ−ＷＮＴ３Ａ処置後の同じ効果が観察された：Ｌ−ＰＢＳ処置した歯髄露出に対して、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置試料では、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）免疫染色は、はるかに広範囲であった（図５Ｅ、図５Ｆを比較）。
【０１４７】
Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置した歯髄におけるアポトーシスの低減および増殖の増加は、優れた修復応答に至った。Ｌ−ＰＢＳの場合、歯髄は主に、術後の１４日目に、非有管（atubular）骨様象牙質と呼ばれる非晶質骨様の組織で占められた（（３３）；図５Ｇ）のに対して、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置した場合、歯髄腔は、非常に組織化された有管象牙質基質で充填された（図５Ｈ）。先の定量分析に類似して（図３Ｃ）、象牙質は、Ｌ−ＰＢＳ対照と比較して、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置試料ではより高密度であるように見えた（図５Ｉ）。
【０１４８】
修復象牙質基質は、ピクロシリウスレッド染色および偏光によって視覚化される場合、２つの群間で明らかに異なっていた：Ｌ−ＰＢＳ試料では、コラーゲン基質は、骨に特徴的であるバスケットを編んだパターンを示し（図５Ｊ）；Ｌ−ＷＮＴ３Ａ試料では、コラーゲン基質は、有管真正象牙質を示唆する直鎖状組織化を有していた（図５Ｋ）。
【０１４９】
分化した象牙芽細胞は、ネスチンを発現して（３４）；Ｌ−ＷＮＴ３Ａ試料と比較して、Ｌ−ＰＢＳ処置試料では、ネスチン＋ｖｅ細胞は、ほとんど検出されなかった（図５Ｌ、図５Ｍ）。分化した象牙芽細胞はまた、細胞外基質タンパク質ＤＳＰも発現して（２３）、ＤＳＰ＋ｖｅ細胞は主に、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置した歯髄と比較して、Ｌ−ＰＢＳ処置した歯髄には存在しなかった（図５Ｎ、図５Ｏ）。
【０１５０】
論述
【０１５１】
侵害性刺激に直面すると、ヒト歯髄は、少なくとも若年患者において、頑強な修復応答を高めることが可能である（３５、３６）。より高齢の個体では、歯髄は、壊死によって同じ侵害性刺激に応答する（３５）。
【０１５２】
産後の１５日目に、臼歯象牙芽細胞および門歯先端にある象牙芽細胞は、それらのＷｎｔ応答性を損失することが、これまでの報告で示された（４４）。分裂した分泌象牙芽細胞が、成人期までＷｎｔシグナルに対するそれらの依存を維持するかどうかの問題に、本明細書では対処した。２つの別個のアプローチを使用した：第１に、成体Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／＋Ｗｎｔレポーターマウスからの凍結切片化された組織を分析して、分裂した象牙芽細胞および歯髄細胞は共に、Ｘ−ｇａｌ＋ｖｅであることがわかった（図１Ｅおよび図２Ｋ）。第２に、成体Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋Ｗｎｔレポーターマウスからの組織もまた、分裂化した象牙芽細胞が、ＧＦＰ＋ｖｅであることを例証した（図１Ｆ）。したがって、成体象牙芽細胞および歯髄細胞は、成人期においてＷｎｔ応答状況を維持する。
【０１５３】
Ｗｎｔ刺激の非存在下で、Ａｘｉｎ２ＬａｃＺ／ＬａｃＺ細胞は、野生型細胞と同様に挙動する（１０）。Ａｘｉｎ２がリガンド依存的な様式でＷｎｔシグナル伝達を抑圧する（２４、２５）ので、Ａｘｉｎ２の除去は、Ｗｎｔ応答の増幅をもたらす（１０、２４）。歯髄傷害に対する応答は、負のＷｎｔ制御因子を除去することによって（図３）、または外因性ＷＮＴ３Ａタンパク質を供給することによって（図５）Ｗｎｔシグナル伝達を上昇させることにより増強させることができ、それは歯髄腔の修復応答を著しく改善するのに十分である。
【０１５４】
歯髄におけるＷＮＴ作用のメカニズムは、この組織内で幹／前駆細胞の応答に幾分起因し得る。ヒト歯髄幹細胞は、Ｗｎｔ経路を強力に上方に活性化することによって、有糸分裂的に活発になることによって、およびアポトーシスの実行段階を媒介する酵素（５０）であるカスパーゼ活性を下方制御することによって、ヒトＷＮＴ３Ａタンパク質に応答した（図４、図５）。集合的に、これらの生物学的応答は、治癒応答を改善しようとする治療的な戦略で有益である。
【０１５５】
これらの生物学的応答に加えて、Ｌ−ＰＢＳおよびＬ−ＷＮＴ３Ａ処置後に形成される修復石灰化組織のタイプにおいて、差異が顕著であった（図５）。Ｌ−ＰＢＳ処置試料では、骨様の石灰化基質（骨様象牙質）が生じる。象牙質と比較して、骨様象牙質は多孔性であり、したがって傷害を受けた歯髄のその外観は、最適以下の治癒応答を表す。Ｌ−ＷＮＴ３Ａの場合、修復基質は、天然象牙質に似ていた（図５Ｈ、図５Ｋ）。この象牙質基質は、天然ＤＳＰ＋ｖｅ分泌象牙芽細胞によって産生され（図５Ｍ）、それは、生存可能な歯髄腔を外部環境と効果的に分離する象牙質橋を形成した。かかる象牙質橋は、対照では明らかでなかった。
【０１５６】
本開示は、内因性Ｗｎｔシグナル伝達に対する歯髄細胞の依存を活用するアプローチ（例えば、根管療法に対する）を提供する（図３、図４）。ＷＮＴ３Ａタンパク質のリポソーム再構成形態は、歯髄細胞を死から効果的に保護して、歯髄における未分化細胞の増殖を刺激し、それが、歯髄治癒を一緒に著しく向上させた。治癒を改善するためのＬ−ＷＮＴ３Ａを介して内因性幹細胞を活性化する戦略は、ヒトにおいて歯髄再生を達成するための実行可能な手段を表す。
【０１５７】
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【０１５８】
（実施例２）
本明細書中に提供する実施例は、象牙質細管によるＬ−Ｗｎｔ３Ａの浸透および歯髄細胞の活性化を実証する。
【０１５９】
げっ歯類象牙質細管およびヒト象牙質細管は、類似した直径を有する。したがって、げっ歯類モデルを使用して、象牙質細管による歯髄までのＬ−ＷＮＴ３Ａの浸透を実証した（図８）。リポソーム混合物の局所適用は、象牙質細管に浸透する。ＷｎｔレポーターＡｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウス系統では、疎水性タモキシフェン分子の送達は、ＷＮＴ３Ａをパッケージングするために使用するのと同じリポソームと関連して、窩洞形成の直下に位置する歯髄細胞においてＣｒｅ媒介性組換え事象をもたらす。Ｌ−ＷＮＴ３Ａ曝露は、象牙芽細胞に関する生存シグナルとして作用する。通常、有毒な（例えば、熱、化学物質）作用物質への曝露後に、大部分の象牙芽細胞は、死滅して；これは最終的には、根管として知られるプロセスによって、壊死歯髄の除去および不活性な充填材料によるその置換を必要とする。象牙芽細胞が生存促進性シグナルＬ−ＷＮＴ３Ａに曝露されると、細胞死は、著しく減少する。
【０１６０】
リポソームは、ジミリストイルホスファチジルコリン脂質から製作した。リポソームは、タモキシフェンを用いて作製して、タモキシフェン誘導性マウス系統Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋と組み合わせて使用して、それらの浸透を、１４日にわたってモニタリングした。リポソームは、深い窩洞形成の下にある細胞にまで浸透する点で、また細胞の遺伝的組換えを誘導する点で効果的であった。Ｌ−ＷＮＴ３Ａの、歯髄幹および前駆細胞における、および象牙芽細胞における増殖を刺激する能力は、上記で実証された。Ｌ−ＷＮＴ３Ａの、カスパーゼ８媒介性メカニズムによるプログラム細胞死を削減する能力は、上記で実証された。Ｌ−ＷＮＴ３Ａの、象牙質シアロタンパク質（ＤＳＰ）およびネスチンを含む象牙質分泌に関連する分子の発現を増強する能力も、本明細書中で実証されている。
【図１】
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【図２Ａ−Ｈ】
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【図２Ｉ−Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図３Ａ−Ｅ】
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【図３Ｆ−Ｉ】
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【図３Ｊ−Ｌ】
2018502094.tif 000009
【図３Ｍ−Ｑ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ−Ｆ】
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【図５Ｇ−Ｉ】
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【図５Ｊ−Ｏ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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