(57)【要約】本開示は、少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を各々含む少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む、多量体のヒト免疫不全ウイルス(HIV)タンパク質結合分子、例えば二量体IgA結合分子または五量体もしくは六量体IgM結合分子であって、各重鎖定常領域またはその断片がHIV抗原結合ドメインと結合している、多量体結合分子を提供する。多量体結合分子を含む組成物、多量体結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびに多量体結合分子を作製および使用する方法も提供する。2018512863.tif 000044
2018512863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々結合している少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を含み、少なくとも1つの抗原結合ドメインが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ウイルス粒子の表面に発現されるHIV抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合し、かつ前記結合分子が、HIV抗原に特異的に結合する前記少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む参照の単一結合単位分子と比べてより強力である、前記多量体結合分子。
【請求項２】
参照の単一結合単位分子がIgG抗体である、請求項1に記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子が、2つの二価IgA結合単位またはその断片およびJ鎖またはその断片もしくはその変種を含む二量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々結合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2に記載の結合分子。
【請求項４】
分泌成分またはその断片もしくは変種をさらに含む、請求項3に記載の結合分子。
【請求項５】
IgA重鎖定常領域またはその断片が各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、請求項3または請求項4に記載の結合分子。
【請求項６】
1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片が、Cα1ドメインをさらに含む、請求項5に記載の結合分子。
【請求項７】
IgA重鎖定常領域がヒトIgA重鎖定常領域である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項８】
各結合単位が、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項3〜7のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
前記結合分子が、5つまたは6つの二価IgM結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々結合している2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2に記載の結合分子。
【請求項１０】
IgM重鎖定常領域またはその断片が各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、請求項9に記載の結合分子。
【請求項１１】
1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項9または請求項10に記載の結合分子。
【請求項１２】
五量体であり、かつJ鎖またはその断片またはその変種をさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１３】
IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、請求項9〜12のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１４】
J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸またはその機能的断片を含む、請求項3または請求項12に記載の結合分子。
【請求項１５】
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であり、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、請求項3または請求項12または請求項14に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、請求項15に記載の結合分子。
【請求項１７】
ペプチドリンカーが少なくとも5個のアミノ酸、しかし25個以下のアミノ酸を含む、請求項16に記載の結合分子。
【請求項１８】
ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、またはSEQ ID NO: 104からなる、請求項17に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、請求項15〜18のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２０】
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項15〜19のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２１】
改変J鎖の結合ドメインがエフェクター細胞に結合する、請求項20に記載の結合分子。
【請求項２２】
改変J鎖がX[Ln]JまたはJ[Ln]Xを含み、式中Jが成熟天然J鎖またはその機能的断片を含み、Xが異種結合ドメインを含み、かつ[Ln]が、n個のアミノ酸からなるリンカー配列であり、ここでnが1〜100、1〜50、または1〜25の正の整数である、請求項20または請求項21に記載の結合分子。
【請求項２３】
JがSEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸を含む、請求項22に記載の結合分子。
【請求項２４】
nが5、10、15、または20である、請求項22または請求項23に記載の結合分子。
【請求項２５】
前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２６】
前記抗体またはその断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、単一ドメイン抗体(VHH)、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項25に記載の結合分子。
【請求項２７】
前記抗原結合断片がscFv断片またはVHHである、請求項26に記載の結合分子。
【請求項２８】
前記異種ポリペプチドがT細胞抗原またはNK細胞抗原に特異的に結合することができる、請求項20〜27のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２９】
前記異種ポリペプチドがT細胞抗原CD3に特異的に結合することができる、請求項28に記載の結合分子。
【請求項３０】
前記異種ポリペプチドが、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、またはそれらの組み合わせを含む、請求項29に記載の結合分子。
【請求項３１】
改変J鎖が、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、またはそれらの組み合わせを含む、請求項29または請求項30に記載の結合分子。
【請求項３２】
改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項30または請求項31に記載の結合分子。
【請求項３３】
前記異種ポリペプチドがNK細胞抗原CD16に特異的に結合することができる、請求項28に記載の結合分子。
【請求項３４】
前記異種ポリペプチドがSEQ ID NO: 112を含む、請求項33に記載の結合分子。
【請求項３５】
各結合単位が、定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本の重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項３６】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、HIVスパイクタンパク質に特異的に結合する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項３７】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、gp120上のエピトープ、gp41上のエピトープ、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、請求項36に記載の結合分子。
【請求項３８】
前記エピトープが、gp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、これらの領域のいずれかに結合している炭水化物、またはそれらの組み合わせに位置している、請求項37に記載の結合分子。
【請求項３９】
少なくとも1つの結合単位が、ウイルス粒子の表面に発現されるHIV抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する2つの抗原結合ドメインを含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本の重鎖が同一である、請求項1〜38のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４０】
前記少なくとも1つの結合単位内の2本の軽鎖が同一である、請求項39に記載の結合分子。
【請求項４１】
2つの軽鎖定常領域がヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、請求項39または請求項40に記載の結合分子。
【請求項４２】
ウイルス粒子の表面に発現されるHIV抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインを含む、請求項36〜41のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４３】
結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一である、請求項42に記載の結合分子。
【請求項４４】
少なくとも1つの抗原結合ドメインが、HIV感染リザーバー細胞に特異的に結合することができる、請求項1〜43のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４５】
リザーバー細胞が、非リザーバーHIV感染細胞と比較してHIV抗原を低いレベルで発現する細胞である、請求項44に記載の結合分子。
【請求項４６】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、該VHおよびVLが、それぞれSEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100のVHおよびVLアミノ酸配列からなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４７】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、該VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４８】
HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIV感染の予防、制御、もしくは処置、ウイルス排除の増強、HIV感染性の制御、および/またはHIV増殖の制御においてより強力である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４９】
HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIVの中和においてより強力であり、より多様なHIV変種もしくは分岐群またはそれらの組み合わせに結合し、かつそれらを中和することができる、請求項1〜47のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項５０】
HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてより強力な抗体媒介性、補体媒介性、または細胞媒介性のHIV感染細胞殺傷をもたらすことができる、請求項1〜47のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項５１】
細胞媒介性の殺傷がT細胞媒介性の殺傷である、請求項50に記載の結合分子。
【請求項５２】
HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてより少ない投与量で同等の利益を提供することができる、請求項1〜47のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項５３】
J鎖またはその機能的断片もしくは変種と、2本の重鎖および2本の軽鎖を各々含む5つの結合単位とを含む、単離されたIgM抗体またはその断片であって、各重鎖またはその断片が、ヒトμ定常領域またはその断片と、重鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO: 7とを含み、かつ各軽鎖が、ヒトκ定常領域と軽鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO: 8とを含み、前記抗体またはその断片が、HIVスパイク糖タンパク質のCD4結合部位に特異的に結合できる五量体IgM抗体にアセンブリすることができる、前記IgM抗体またはその断片。
【請求項５４】
重鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 113を含み、かつ軽鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 114を含む、請求項53に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５５】
J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 2またはその機能的断片を含む、請求項53または請求項54に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５６】
J鎖またはその断片が、J鎖に直接的または間接的に融合されている異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖である、請求項53〜55のいずれか一項に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５７】
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、請求項56に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５８】
ペプチドリンカーが少なくとも5個のアミノ酸、しかし25個以下のアミノ酸を含む、請求項57に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５９】
ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、またはSEQ ID NO: 104からなる、請求項58に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６０】
前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、請求項56〜59のいずれか一項に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６１】
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項56〜60のいずれか一項に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６２】
前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項61に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６３】
抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、VHH、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項62に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６４】
抗原結合断片がscFv断片である、請求項63に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６５】
前記異種ポリペプチドがCD3に特異的に結合することができる、請求項61〜64のいずれか一項に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６６】
改変J鎖がSEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、またはSEQ ID NO: 111を含む、請求項65に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６７】
改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項66に記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６８】
請求項1〜52のいずれか一項に記載の結合分子または請求項53〜67のいずれか一項に記載のIgM抗体もしくはその断片を含む、組成物。
【請求項６９】
請求項1〜52のいずれか一項に記載の結合分子のポリペプチドサブユニットまたは請求項53〜67のいずれか一項に記載のIgM抗体もしくはその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記ポリペプチドサブユニットが、IgM重鎖定常領域と、少なくとも、ウイルス粒子の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体結合ドメインの抗体VH部分とを含む、請求項69に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記ポリペプチドサブユニットが、
(a) VHアミノ酸配列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99からなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のHCDRにおける1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン; あるいは
(b) SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列
を含むVHドメインのC末端に融合されたヒトIgM定常領域またはその断片を含む、請求項70に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記ポリペプチドサブユニットが、ウイルス粒子の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体結合ドメインの抗体VL部分を含む、請求項69に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記ポリペプチドサブユニットが、
(a) VLアミノ酸配列SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100からなる、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のLCDRにおける1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン; あるいは
(b) SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列
を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項72に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
請求項70または請求項71に記載のポリヌクレオチドおよび請求項72または請求項73に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項７５】
前記ポリヌクレオチドが同じベクター上に位置している、請求項74に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ポリヌクレオチドが別々のベクター上に位置している、請求項74に記載の組成物。
【請求項７７】
J鎖、改変J鎖、その断片、またはその変種をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項74〜76のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも2つの別々のベクター上に位置している、請求項77に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが同じベクター上に位置している、請求項77に記載の組成物。
【請求項８０】
請求項75または請求項79に記載のベクター。
【請求項８１】
請求項76または請求項78に記載のベクター。
【請求項８２】
請求項69〜73のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項74〜79のいずれか一項に記載の組成物、または請求項80もしくは請求項81に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８３】
請求項82に記載の宿主細胞を培養する段階、および結合分子または抗体を回収する段階を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の結合分子または請求項53〜67のいずれか一項に記載のIgM抗体もしくはその断片を産生する方法。
【請求項８４】
請求項1〜52のいずれか一項に記載の多量体結合分子または請求項53〜67のいずれか一項に記載のIgM抗体もしくはその断片とヒト免疫不全ウイルス(HIV)ビリオン、HIV感染細胞、またはそれらの混合物とを接触させる段階
を含む、HIV感染を予防、制御、もしくは処置する、またはHIV感染性を制御する方法であって、
前記結合分子または抗体が、同一のHIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIV感染の予防、制御、もしくは処置において、またはHIV感染性の制御においてより強力である、
前記方法。
【請求項８５】
前記結合分子または抗体が、対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIVの中和においてより強力であり、より多様なHIV変種もしくは分岐群またはそれらの組み合わせに結合し、かつそれらを中和することができる、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
前記結合分子または抗体が、対応する参照の単一結合単位分子と比べてより強力な抗体媒介性、補体媒介性、または細胞媒介性のHIV感染細胞殺傷をもたらすことができる、請求項84または請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
細胞媒介性の殺傷がT細胞媒介性の殺傷である、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
請求項1〜52のいずれか一項に記載の多量体結合分子または請求項53〜67のいずれか一項に記載のIgM抗体もしくはその断片を、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した患者に投与する段階
を含む、患者におけるHIV感染を処置する方法であって、
前記結合分子または抗体が、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIV感染の予防、制御、もしくは処置、またはHIV感染性の制御においてより強力であるか、あるいはより少ない結合分子の用量しか必要としない、
前記方法。
【請求項８９】
前記結合分子が、対応する参照の単一結合単位分子と比較して、(i) HIVビリオンの感染性を低減させること、(ii) HIV感染細胞の数を低減させること、(iii) HIV感染を予防すること、(iv) ウイルス排除を増強すること、(v) HIV感染の徴候および症状を改善すること、または(vi) それらの任意の組み合わせにおいて、効力の増大を示す、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
対応する参照の単一結合単位分子がIgG抗体である、請求項84〜89のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2015年4月17日付で出願された米国仮特許出願第62/149,460号の恩典を主張するものであり、それは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、レンチウイルス科のレトロウイルスである。HIVは、一本鎖の陽性センスエンベロープRNAウイルスである。HIVは、T細胞、マクロファージおよび樹状細胞の破壊に起因する免疫系の機能不全をもたらす後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こす。HIVは非常に高い遺伝的変異性を有する。HIV-1およびHIV-2を含む2種類のHIVが同定されており、そのどちらも性的接触によってまたは血液を介して伝染し、両方ともAIDSを引き起こす。2つのウイルスは、HIV-1がHIV-2よりも多く見られ、毒性が強く、容易に伝染するという点で異なる。HIV-1は、エンベロープ(env)遺伝子の配列差異に基づき3つの群、M群、N群、O群、およびP群にさらに分類することができる。HIV-1のM群は、ゲノム配列および地理的分布の差異に基づき少なくとも9つのサブタイプ(または分岐群) (サブタイプA、B、C、D、F、G、H、J、およびK)にさらに分類される。HIV RNAゲノムの構造は、9つの遺伝子: gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、およびvpuを含む。一部のHIVゲノムには、tat、env、およびrevの融合体である、tevと呼ばれる10番目の遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は、以下のタンパク質をコードする。
2018512863.tif 000003
【０００３】
HIVエンベロープタンパク質gp160は、宿主細胞プロテアーゼによりタンパク質分解的に切断されて、gp120およびgp41を生じる。これらの2つの分子は、スパイクともいわれる、ウイルスエンベロープから突出するキャップおよびステム構造を形成する。キャップは3コピーのgp120から構成され、ステムは3コピーのgp41から構成される。ステムは、gp120/gp41複合体をウイルスエンベロープに固定する。エンベロープ糖タンパク質gp120は、感染細胞の表面およびウイルス粒子のウイルスエンベロープの両方に発現される。Envタンパク質のgp120部分は、ヘルパーT細胞のような標的細胞上のCD4受容体への結合を担い、ウイルスを宿主細胞に融合させる。HIVスパイク糖タンパク質の構造を図1に示す。
【０００４】
ウイルスタンパク質gp120は、宿主細胞への接触および侵入の要点であるので、ワクチン開発研究において特に重点を置かれてきた。しかしながら、細胞へのHIV侵入の機構には、共有結合した糖部分によるgp120エピトープのマスキングが含まれる。HIVビリオンが宿主細胞に接近している場合にのみ、宿主細胞受容体と相互作用するgp120の部分がマスクされない。同様に、糖タンパク質gp41は、gp120と非共有結合し、gp120がその標的に結合して立体構造変化を起こした後にのみ曝露されるようになる。宿主細胞に結合することによって誘発される立体構造変化は、gp41が宿主細胞へのビリオンの融合を補助することを可能にする。したがって、gp41はまた、抗ウイルス薬の潜在的標的としての臨床研究の注目を受けている。gp120およびgp41は高度に免疫原性であるが、それらのタンパク質はHIVタイプ、群および/または分岐群の間でかなり変化しうる。さらに、それらのタンパク質は頻繁に突然変異して抗原変種を形成し、急速に進化して宿主免疫応答を回避する。
【０００５】
したがって、多数のHIVタイプ、群、および分岐群の抗原決定基と交差反応できる治療用モノクローナル抗体の開発は、現在、精力的な研究の領域である。広範に中和を行うHIV抗体またはbnAbは、文献に記述されており、ウェブサイト「Broadly Neutralizing Antibodies Electronic Resource」, www.bnaber.org (Eroshkin AM, et al., Nucleic Acids Res. 42(1):D1133-9 (2014)（非特許文献1）)にまとめられている。
【０００６】
bnAbのエピトープは、gp41およびgp120ならびに周囲のグリカン層から構成されるヘテロ三量体HIVエンベロープスパイク上に見出される。線状のものおよび高次構造のものをともに含め、広範囲のスパイクエピトープが同定されており、bnAbによって結合される4つのエピトープが十分に特徴付けられている: 膜近位外部領域(MPER)、CD4結合部位、可変領域1/可変領域2 (V1/V2)ループ、および可変領域3 (V3)ループ(Hepler NL. et al. PLOS Comp. Biol. 10(9):e1003842 (2014)（非特許文献2）)。
【０００７】
MPERは、HIVスパイクの基部にあるgp41タンパク質上に位置する(Montero M. et al. MMBR 72(1):54-84 (2008)（非特許文献3）)。gp120上のCD4結合部位と相互作用するBnAbは、CD4結合を模倣することができる。例えば、CD4結合部位へのbnAb VCR01の結合は、ウイルス受容体を不能化しそれによってHIVウイルスを中和すると考えられる高次構造変化を引き起こす(Scheid JF. et al., Science 333(6049):1633-7 (2011)（非特許文献4）)。gp120上のV1/V2ループは、強力なbnAbの最もよく見られるエピトープの1つであることが示されている(Moore P.L. et al. J. Virol. 69(9):5723-33 (2011)（非特許文献5）)。gp120上のV3ループは、四次構造特異的な形で中和抗体によって標的とされている。グリカンシールドはまた、HIV中和抗体エピトープの高次構造に寄与し、bnAbと直接接触しうる; 逆に、グリカンは立体障害によって抗体結合を阻害しうる。
【０００８】
HIVは、中枢神経系、尿生殖路、およびリンパ系器官などの特定の組織の免疫特権状態のため、体全体のさまざまな組織中のリザーバー細胞に潜伏し続けると考えられている(Iglesias-Ussel et al., AIDS Rev., 13:13-29, 2011（非特許文献6）を参照のこと)。胃腸管(GIT)はHIV感染の主な標的であり、GIT中の粘膜部位に存在する多数のマクロファージが原因で主要な細胞リザーバーであると仮定されている(Brown et al., Clin. Vacc. Immunol., 21(11):1469-1473, 2014（非特許文献7）を参照のこと)。しかしながら、潜在感染した記憶T細胞が、HIVに対する最大のかつ最もよく理解されているリザーバーである。高活性抗レトロウイルス療法(HAART)で処置した場合でさえ、T細胞リザーバーは単独で著しく長い半減期を有し(Finzi, D., et al. 1999. Nature Med 5:512-7（非特許文献8）)、治療の中止によって急速なリバウンドおよびウイルス再出現を引き起こす。いくつかのCD4+ T細胞の感染に続いて、感染T細胞が静止状態に移行し、最終的には、転写が誘発される後の時間まで発現されないウイルスゲノムが統合されたゲノムコピー(プロウイルスDNA)を含む記憶CD4+ T細胞が形成されうるものと考えられる。他者らは、そのようなリザーバー細胞は、真に沈黙しているわけではなく、むしろ持続的または確率的に少量のウイルスを産生すると考えている。記憶T細胞は、静止しており、細胞分裂、分化、または活性化を起こさず、その転写機構が最小限の活性しか示さないので、理想的なHIVリザーバー細胞である。しかしながら、活性化すると、記憶T細胞は多量のウイルスを産生する可能性がある。休止中のHIVリザーバーの標的化は、集中的な研究の対象であり、HIV感染を管理し、最終的に排除する上での次の大きなハードルとなる。これらのHIVに感染したリザーバー細胞は、ほとんどの場合、当初感染したHIVウイルスの突然変異変種に感染する(Picker et al., Nature, 517:381-385, 2015（非特許文献9）を参照のこと)。
【０００９】
したがって、慢性的に感染した個体は、検出可能なレベルのHIVを保有していないが、それにもかかわらず、HIVへのさらなる曝露なしに、HIVを持ち続け、HIV感染に屈するか、または他者を感染させるかの可能性を持ち続ける。現在、慢性HIV感染を解消することが知られている公的に利用可能な処置はない。利用可能な治療法は、ウイルスが複製することを妨げることによって、単にさらなる感染を止めるだけである。さまざまなモノクローナル抗体および併用療法が、慢性HIV感染を含むHIVの処置の目的で研究されているが、いずれも市販されていない。それゆえ、慢性HIV感染において休止HIVを持つリザーバー細胞など、HIVを標的とする新しい治療法を開発する必要性が継続して残されたままである。したがって、容易に利用可能であり、臨床的適用および利用可能性にコスト障壁を突き付けない、より強力な処置に対する強い必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Eroshkin AM, et al., Nucleic Acids Res. 42(1):D1133-9 (2014)
【非特許文献２】Hepler NL. et al. PLOS Comp. Biol. 10(9):e1003842 (2014)
【非特許文献３】Montero M. et al. MMBR 72(1):54-84 (2008)
【非特許文献４】Scheid JF. et al., Science 333(6049):1633-7 (2011)
【非特許文献５】Moore P.L. et al. J. Virol. 69(9):5723-33 (2011)
【非特許文献６】Iglesias-Ussel et al., AIDS Rev., 13:13-29, 2011
【非特許文献７】Brown et al., Clin. Vacc. Immunol., 21(11):1469-1473, 2014
【非特許文献８】Finzi, D., et al. 1999. Nature Med 5:512-7
【非特許文献９】Picker et al., Nature, 517:381-385, 2015
【発明の概要】
【００１１】
概要
1つまたは複数のHIV抗原、例えばgp120/gp41抗原の結合に特異性を保有する多量体結合分子のさまざまな態様が開示される。
【００１２】
本開示は、少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子を提供し、ここで各結合単位は少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を含み、ここで各重鎖定常領域またはその断片は抗原結合ドメインと結合しており、ここで少なくとも1つの抗原結合ドメインは、ウイルス粒子の表面に発現されるヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合し、かつここで結合分子は、HIV抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてHIV感染の予防、制御、または処置においてより強力である。対応する参照の単一結合単位分子は、例えば、IgG抗体でありうる。
【００１３】
特定の局面において、少なくとも1つの抗原結合ドメインはHIVスパイクタンパク質に、例えばgp120上のエピトープ、gp41上のエピトープ、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する。特定の局面において、エピトープは、gp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、これらの領域に結合している炭水化物、またはそれらの組み合わせに位置している。
【００１４】
特定の局面において、提供される結合分子は、少なくとも2つの同一でない抗原結合ドメインを含む、多重特異性、例えば二重特異性である。2つの同一でない抗原結合ドメインは、非限定的に、共通のHIV抗原の異なるエピトープに、異なるHIV抗原に、またはHIV抗原および異種抗原に特異的に結合することができる。
【００１５】
特定の局面において、提供される結合分子は、2つの二価IgA結合単位またはその断片およびJ鎖またはその断片もしくはその変種を含む二量体結合分子である。これらの局面によれば、各結合単位は、抗原結合ドメインと各々結合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される二量体結合分子は、関連する分泌成分またはその断片もしくは変種をさらに含むことができる。本明細書において提供される二量体結合分子は、IgA定常領域ならCα2ドメインおよび/またはCα3-tpドメインを含むことができ、いくつかの局面においてCα1ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、IgA重鎖定常領域は、ヒトIgA重鎖定常領域である。本明細書において提供されるIgAに基づく二量体結合分子は、いくつかの局面において、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。
【００１６】
特定の局面において、提供される結合分子は、5つまたは6つの二価IgM結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、ここで各結合単位は、抗原結合ドメインと各々結合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、IgM重鎖定常領域またはその断片は、各々Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含むことができ、いくつかの局面において、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。提供される結合分子が五量体である場合、それはJ鎖、またはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。特定の局面において、IgM重鎖定常領域は、ヒトIgM定常領域である。
【００１７】
特定の局面において、本開示は、J鎖を含む二重特異性または多重特異性の二量体または五量体結合分子を提供する。J鎖は、例えば結合ドメインを含む改変J鎖であることができる。特定の局面において、改変J鎖はヒトJ鎖に由来し、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列23〜159番目、またはその機能的断片を含むことができる。特定の局面において、結合ドメインは、ペプチドリンカー有りまたは無しで、J鎖またはその断片とインフレームで融合されたポリペプチド配列である。特定の局面において、ペプチドリンカーは、少なくとも5個のアミノ酸、しかし25個以下のアミノ酸を含むことができる。特定の局面において、ペプチドは、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、またはSEQ ID NO: 104からなることができる。特定の局面において、改変J鎖は、式X[Ln]JまたはJ[Ln]Xを含むことができ、式中Jは成熟天然J鎖またはその機能的断片を含み、Xは異種結合ドメインを含み、かつ[Ln]は、n個のアミノ酸からなるリンカー配列であり、ここでnは1〜100、1〜50、または1〜25の正の整数である。特定の局面において、Nは5、10、15、または20である。
【００１８】
特定の局面において、結合ドメインは、J鎖またはその断片のC末端に位置する。特定の局面において、結合ドメインは、J鎖またはその断片のN末端に位置する。特定の局面において、結合ドメインは、J鎖またはその断片内に挿入される。特定の局面において、改変J鎖の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、例えばF(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFvまたは単一ドメイン抗体、例えばVHHである。特定の局面において、改変J鎖の結合ドメインは、1つまたは複数のエフェクター細胞、例えばT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージおよび/または好中球に結合する。エフェクター細胞がT細胞である場合、結合ドメインは、例えば、T細胞上のCD3またはCD8に結合することができる。エフェクター細胞がNK細胞である場合、結合ドメインは、例えば、NK細胞上のCD16、CD64、および/またはNKG2Dの1つまたは複数に結合することができる。エフェクター細胞がマクロファージである場合、結合ドメインは、例えば、マクロファージ上のCD14に結合することができる。エフェクター細胞が好中球である場合、結合ドメインは、例えば好中球上のCD16bおよび/またはCD177に結合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、またはそれらの組み合わせを含む。特定の局面において、改変J鎖は、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、またはそれらの組み合わせを含む。特定の局面において、改変J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができる。
【００１９】
特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の各結合単位は、定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本の重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。特定の局面において、少なくとも1つの結合単位は、ウイルス粒子の表面に発現されるHIV抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する2つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの局面において、結合単位内の2本の重鎖は同一であることができる。いくつかの局面において、結合単位内の2本の軽鎖は同一である。2つの軽鎖定常領域は、例えば、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域であることができる。
【００２０】
特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、ウイルス粒子の表面に発現されるHIV抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIV抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または12個の抗原結合ドメインを含むことができる。特定の局面において、結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一である。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、HIV感染リザーバー細胞、例えば、HIV感染細胞と比較してHIV抗原を低いレベルで発現する細胞の表面に発現または提示されるHIVスパイクタンパク質に特異的に結合することができる。
【００２１】
特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、ここでVHおよびVLは、それぞれSEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100のVHおよびVLアミノ酸配列からなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むことができる。
【００２２】
特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、ここでVHおよびVLは、それぞれ、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてHIV感染の予防、制御、もしくは処置、ウイルス排除の増強、HIV感染性の制御、および/またはHIV増殖の制御においてより強力である。特定の局面において、結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIVの中和においてより強力であることができ、より多様なHIV変種もしくは分岐群またはそれらの組み合わせに結合し、かつそれらを中和することができる。特定の局面において、結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてより強力な抗体媒介性、補体媒介性、または細胞媒介性、例えばT細胞媒介性のHIV感染細胞殺傷をもたらすことができる。特定の局面において、結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べてより少ない投与量で同等の利益を提供することができる。
【００２４】
本開示はさらに、J鎖またはその機能的断片もしくは変種と、2本の重鎖および2本の軽鎖を各々含む5つの結合単位とを含む単離されたIgM抗体またはその断片を提供し、ここで各重鎖またはその断片はヒトμ定常領域またはその断片と、重鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO: 7とを含み、かつここで各軽鎖はヒトκ定常領域と軽鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO: 8とを含み; ここで前記抗体またはその断片は、HIVスパイク糖タンパク質のCD4結合部位に特異的に結合できる五量体IgM抗体にアセンブリすることができる。特定の局面において、IgM抗体またはその断片は、重鎖アミノ酸配列SEQ ID NO: 113および軽鎖アミノ酸配列SEQ ID NO: 114を含むことができる。特定の局面において、J鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸またはその機能的断片を含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片は、J鎖に直接的または間接的に融合されうる異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカー、例えば、少なくとも5個のアミノ酸、しかし25個以下のアミノ酸を含むペプチドリンカー、例えば、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、またはSEQ ID NO: 104からなるペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合させることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合させることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは結合ドメインを含むことができ、例えば、異種ポリペプチドは抗体またはその抗原結合断片、例えばscFv断片、例えばCD3に特異的に結合できるscFv断片であることができる。特定の局面において、改変J鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、またはSEQ ID NO: 111を含む異種ポリペプチドを含むことができる。特定の局面において、改変J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができる。
【００２５】
本開示は、本明細書において提供される結合分子またはIgM抗体を含む組成物をさらに提供する。
【００２６】
さらに、本開示は、本明細書において提供される結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここでポリペプチドサブユニットは、IgM重鎖定常領域と、少なくとも、ウイルス粒子の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体結合ドメインの抗体VH部分とを含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、
VHアミノ酸配列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99からなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のHCDRにおける1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン; あるいは
SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列
を含むVHドメインのC末端に融合されたヒトIgM定常領域またはその断片を含むことができる。
【００２７】
さらに、本開示は、本明細書において提供される結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここでポリペプチドサブユニットは、ウイルス粒子の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、HIV感染細胞の表面に発現されるHIVスパイクタンパク質抗原、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体結合ドメインの抗体VL部分を含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、
VLアミノ酸配列SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100からなる、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のLCDRにおける1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン; あるいは
SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列
を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む。
【００２８】
本開示は、本明細書において提供されるVHおよびVL含有ポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。特定の局面において、ポリヌクレオチドは同じベクター上に位置する。特定の局面において、ポリヌクレオチドは別々のベクター上に位置する。特定の局面において、組成物は、J鎖、改変J鎖、その断片、またはその変種をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。特定の局面において、ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの別々のベクター上に位置する。特定の局面において、ポリヌクレオチドは同じベクター上に位置する。本開示は、記述された1つまたは複数のベクター、提供されたポリヌクレオチドもしくは提供されたポリヌクレオチド組成物または提供された1つまたは複数のベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本開示は、本明細書において提供される結合分子を産生する方法をさらに提供し、ここで本方法は、提供された宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む。
【００２９】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を予防、制御、もしくは処置する方法、またはHIV感染性を制御する方法をさらに提供し、ここで本方法は、本明細書において提供される結合分子とHIVおよびHIV感受性細胞の混合物とを接触させる段階を含み; ここで結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIV感染の予防、制御、もしくは処置において、またはHIV感染性の制御においてより強力である。特定の局面において、結合分子は、単一結合単位分子と比較して、感染細胞中のHIVを中和することにおいて効力の増大を示す。
【００３０】
本開示は、本明細書において提供される結合分子をヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した患者に投与する段階を含む、患者におけるHIV感染を処置する方法をさらに提供し; ここで結合分子は、HIV結合性の抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子と比べて、HIV感染の予防、制御、もしくは処置、またはHIV感染性の制御においてより強く、より強力であるか、あるいはより少ない結合分子の用量しか必要としない。この方法によれば、結合分子は、対応する参照の単一結合単位分子と比較して、(i) HIVビリオンの感染性を低減させること、(ii) HIV感染細胞の数を低減させること、(iii) HIV感染を予防すること、(iv) ウイルス排除を増強すること、(v) HIV感染の徴候および症状を改善すること、または(vi) それらの任意の組み合わせにおいて、効力の増大を示すことができる。特定の局面において、対応する参照の単一結合単位分子はIgG抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】HIVスパイク糖タンパク質上の種々の抗体結合部位の説明(Klein F., et al. Science 341:1199-1204 (2013)より変更)。
【図２Ａ】非還元SDS未変性PAGEによって測定される、HIV02抗体の発現およびアセンブリ。
【図２Ｂ】HIV12、HIV32およびHIV72 IgM+Jタンパク質のアセンブリ。タンパク質を非還元SDS未変性PAGEで電気泳動し、膜に転写し、抗J抗体でプローブした。レーン1, 参照IgM+J; レーン2, HIV02; レーン3, HIV32; レーン4, HIV72。
【図２Ｃ】HIV72 IgG、IgM+JおよびIgM+V5J二重特異性のアセンブリ。レーン1, 未変性マーカー、レーン2, HIV72 IgG; レーン3, HIV72 IgM; レーン4, HIV72 IgM+J; レーン5 HIV72 IgM+V5J。図の左側はゲルのクマシー染色を示し、右側は抗J鎖ウエスタンブロットを示す。
【図３−１】ELISAによるgp120へのHIV02 IgGおよびHIV02 IgM+Jの結合に及ぼす抗原コーティング濃度の影響。図3A: 1 μg/mlの抗原コーティング; 図3B: 0.8 μg/mlの抗原コーティング。
【図３−２】ELISAによるgp120へのHIV02 IgGおよびHIV02 IgM+Jの結合に及ぼす抗原コーティング濃度の影響。図3C: 0.6 μg/mlの抗原コーティング; 図3D: 0.4 μg/mlの抗原コーティング。
【図３−３】ELISAによるgp120へのHIV02 IgGおよびHIV02 IgM+Jの結合に及ぼす抗原コーティング濃度の影響。図3E: 0.2 μg/mlの抗原コーティング; 図3F: 0.1 μg/mlの抗原コーティング。
【図４】ELISAによるgp120へのHIV02 IgGおよびHIV02 IgM+Jの結合の比較。IgM+J分子は低い抗原密度でIgG分子よりも20倍良好である。
【図５】gp140発現CHO-PI細胞へのHIV02 IgG (図5A)およびIgM+J (図5B)の結合。
【図６】HIV02 IgM+Jによる複数の分岐群由来HIV分離株の中和。
【図７】HIV02 IgM+V10Jによる抗原依存性T細胞活性化。
【図８】HIV02+V10J HPLC-SECカラム画分のPAGE分析。
【図９】SEC精製されたHIV02 IgM+V10Jによる抗原依存性T細胞活性化。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
定義
用語「1つの(a)」または「1つの(an)」の実体は、その実体の1つまたは複数をいう; 例えば、「1つの結合分子(a binding molecule)」は、1つまたは複数の結合分子(one or more binding molecules)を表すと理解される。したがって、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。
【００３３】
さらに、「および/または」は、本明細書において用いられる場合、2つの指定された特徴または成分の各々を、他方とともにまたは他方を伴わずに明確に開示することと解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Aおよび/またはB」のような句において用いられる「および/または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(のみ)および「B」(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、Bおよび/またはC」のような句において用いられる「および/または」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図される: A、BおよびC; A、BまたはC; AまたはC; AまたはB; BまたはC; AおよびC; AおよびB; BおよびC; A (のみ); B (のみ); ならびにC (のみ)。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において用いられる用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００３５】
単位、接頭辞、および記号は国際単位系(SI)に認められている形式で表される。数の範囲は、その範囲を規定している数字を含む。特に定めのない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明細書において提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本開示のさまざまな局面の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってさらに完全に定義される。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、用語「非天然」物質、組成物、実体、および/または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせ、あるいはその任意の文法的異形は、当業者により「天然(に存在する)」と十分に理解される、あるいはいかなる時も裁判官または行政機関もしくは裁判機関により「天然(に存在する)」と判定もしくは解釈される、または判定もしくは解釈されうる物質、組成物、実体、および/または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、しかし除外するだけである条件付きの用語である。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結された単量体(アミノ酸)から構成される分子をいう。「ポリペプチド」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖をいい、特定の長さの産物をいうのではない。したがって、「ポリペプチド」の定義には、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2つもしくはそれ以上のアミノ酸の鎖をいうように用いられる任意の他の用語が含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾を非限定的に含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物をいうことが意図される。ポリペプチドは、生物学的供給源に由来することができ、または組換え技術によって産生されうるが、しかし必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含めて、任意の方法で生成することができる。
【００３８】
本明細書において開示されるポリペプチドは、約3もしくはそれ以上、5もしくはそれ以上、10もしくはそれ以上、20もしくはそれ以上、25もしくはそれ以上、50もしくはそれ以上、75もしくはそれ以上、100もしくはそれ以上、200もしくはそれ以上、500もしくはそれ以上、1,000もしくはそれ以上または2,000もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズのものであることができる。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているといわれ、規定された三次元構造を保有するのではなく、むしろ多数の異なる立体配座をとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないといわれる。本明細書において用いられる場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも1つの炭水化物部分と結合しているタンパク質をいい、炭水化物部分はそのタンパク質にアミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してつながれる。
【００３９】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変種または誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。組換えにより産生されたポリペプチドおよび宿主細胞中で発現されたタンパク質は、任意の適当な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、本明細書において開示されるように単離されたとみなされる。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、用語「非天然」ポリペプチドまたはその任意の文法的異形は、当業者により「天然(に存在する)」と十分に理解される、あるいはいかなる時も裁判官または行政機関もしくは裁判機関により「天然(に存在する)」と判定もしくは解釈される、または判定もしくは解釈されうるポリペプチドのそれらの形態を明示的に除外するが、しかし除外するだけである条件付きの用語である。
【００４１】
本明細書において開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変種、およびそれらの任意の組み合わせである。本明細書において開示される「断片」、「変種」、「誘導体」および「類似体」という用語は、例えば、抗原に特異的に結合する、対応する天然抗体またはポリペプチドの少なくともいくつかの特性を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、例えば、本明細書の他の箇所で論じられている特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が含まれる。例えばポリペプチドの変種は、上記のような断片、およびアミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。特定の局面において、変種は非天然に存在することができる。非天然に存在する変種は、当技術分野で公知の突然変異誘発技法を用いて産生することができる。変種ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加の特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変種ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」ということができる。本明細書において用いられる場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数のアミノ酸を有する対象ポリペプチドをいうこともできる。「誘導体」としては、20種類の標準アミノ酸の1つまたは複数の誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンを用いることができ; リジンの代わりに5-ヒドロキシリジンを用いることができ; ヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンを用いることができ; セリンの代わりにホモセリンを用いることができ; およびリジンの代わりにオルニチンを用いることができる。
【００４２】
「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含めて、当技術分野において定義されている。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は保存的置換である。特定の態様において、本開示のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、結合分子が結合する抗原への、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を抑止しない。抗原結合を消滅させないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を識別する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)を参照のこと)。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーRNA (mRNA)、cDNAまたはプラスミドDNA (pDNA)をいう。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるような、アミド結合)を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片をいう。
【００４４】
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から分離された核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態を意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチドまたはベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離されて」いると考えられる。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されたポリヌクレオチドセグメント、例えばPCR産物は、「単離されて」いると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは生理食塩水のような非天然溶液中の(部分的にもしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたRNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写産物が含まれ、ここで転写産物は自然界に見出されるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位もしくは転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、またはそれらを含んでもよい。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「非天然」ポリヌクレオチドまたはその任意の文法的異形は、当業者により「天然(に存在する)」と十分に理解される、あるいはいかなる時も裁判官または行政機関もしくは裁判機関により「天然(に存在する)」と判定もしくは解釈される、または判定もしくは解釈されうるポリヌクレオチドのそれらの形態を明示的に除外するが、しかし除外するだけである条件付きの定義である。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないとはいえ、コード領域の一部であるとみなすことができるが、しかし任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。2つまたはそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築体中に、例えば単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築体中に、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターが単一のコード領域を含有することができ、または2つもしくはそれ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。さらに、ベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、別のコード領域に融合されているかまたは融合されていないかのいずれかの、異種コード領域を含むことができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインのような、特殊なエレメントまたはモチーフをコードするものを非限定的に含む。
【００４７】
特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つまたは複数のコード領域に機能的に結合されたプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配するように1つまたは複数の調節配列と結合している場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および2つのDNA断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨害しないか、または転写されるDNA鋳型の能力を妨害しない場合、2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域およびそれに結合したプロモーターのような)は「機能的に結合して」いる。したがって、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができたなら、機能的に結合されている。プロモーターは、所定の細胞においてDNAの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合させて、細胞特異的な転写を指令することができる。
【００４８】
種々の転写制御領域が当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス(イントロン-Aと組み合わせた、前初期プロモーター)、シミアンウイルス40 (初期プロモーター)およびレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスのような)由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントのような、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が非限定的に含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ-グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適当な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター)が含まれる。
【００４９】
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント(特に、内部リボソーム侵入部位またはIRES、CITE配列ともいわれる)が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
他の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)、転移RNAまたはリボソームRNAの形態の、RNAであることができる。
【００５１】
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合されうる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、粗面小胞体を横切る伸長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドが、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することができ、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドを産生することを承知している。特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそれに機能的に結合されているポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能的誘導体が用いられる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を用いることができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【００５２】
本明細書において特定の結合分子、またはその抗原結合断片、変種もしくは誘導体が開示される。完全サイズの抗体に特に言及しない限り、「結合分子」という用語は、完全サイズの抗体ならびにそのような抗体の抗原結合サブユニット、断片、変種、類似体または誘導体、例えば、抗体分子と同じように抗原に結合するが、しかし異なるスキャフォールドを用いる操作された抗体分子または断片を包含する。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、「結合分子」という用語はその最も広い意味において、受容体、例えば、エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子をいう。本明細書においてさらに記述されるように、結合分子は、本明細書において記述される1つまたは複数の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定的な例は、抗体または抗原特異的結合を保持するその断片である。
【００５４】
「結合ドメイン」および「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、エピトープに特異的に結合するのに必要かつ十分な結合分子の領域をいう。例えば「Fv」、例えば、抗体の可変重鎖および可変軽鎖は、2つの別個のポリペプチドサブユニットまたは単一鎖のいずれかとして、「結合ドメイン」であると考えられる。
【００５５】
他の抗原結合ドメインには、非限定的に、ラクダ科の動物種に由来する抗体の可変重鎖(VHH)、またはフィブロネクチンスキャフォールドで発現される6つの免疫グロブリン相補性決定領域(CDR)が含まれる。本明細書において記述される「結合分子」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
【００５６】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。抗体(または本明細書において開示されるその断片、変種もしくは誘導体)は少なくとも重鎖の可変領域(ラクダ科の動物種の場合)または少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照のこと。特に指定のない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合断片から完全サイズの抗体、例えば、2本の完全な重鎖および2本の完全な軽鎖を含むIgG抗体、4本の完全な重鎖および4本の完全な軽鎖を含み、かつJ鎖および/もしくは分泌成分を含むことができるIgA抗体、または10本もしくは12本の完全な重鎖および10本もしくは12本の完全な軽鎖を含み、かつJ鎖を含むことができるIgM抗体に及ぶいかなるものも包含する。
【００５７】
以下でさらに詳細に論じられるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)として分類され、その中にいくつかのサブクラス(例えば、γ1〜γ4 またはα1〜α2)があることを認識するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA IgGまたはIgEとして決定するのがこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などは、十分に特徴付けられており、機能的特化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変型は、本開示を考慮して当業者に容易に認識され、したがって、本開示の範囲内である。
【００５８】
軽鎖はカッパまたはラムダ(κ、λ)のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、2本の重鎖の「尾部」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Y配置のフォーク端のN末端から各鎖の下部のC末端まで伸びる。特定の抗体、例えば、IgG抗体の基本構造は、ジスルフィド結合を介して共有結合した2つの重鎖サブユニットおよび2つの軽鎖サブユニットを含んで、本明細書において「H2L2」構造ともいわれる「Y」構造または「結合単位」を形成する。
【００５９】
「結合単位」という用語は、標準的な免疫グロブリン構造、すなわち、2本の重鎖もしくはその断片および2本の軽鎖もしくはその断片、または、例えばラクダ科の動物もしくは軟骨魚類(condricthoid)の抗体に由来する、2本の重鎖もしくはその断片に対応する、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の一部分をいうように本明細書において用いられる。特定の局面において、例えば、結合分子が二価の単一結合単位のIgG抗体またはその抗原結合断片である場合、「結合分子」および「結合単位」という用語は同義である。他の局面において、例えば、結合分子がIgA二量体、IgM五量体またはIgM六量体である場合、結合分子は「多量体」であり、2つまたはそれ以上の「結合単位」を含む。IgA二量体の場合は2つ、またはIgM五量体もしくは六量体の場合はそれぞれ5つもしくは6つである。結合単位は、完全長の抗体重鎖および軽鎖を含む必要はないが、しかし典型的には二価であり、すなわち、以下に定義されるような2つの「抗原結合ドメイン」を含む。本開示において提供される特定の結合分子は、五量体または六量体であり、IgM定常領域またはその断片を含む5つまたは6つの二価結合単位を含む。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、2つまたはそれ以上の結合単位、例えば、2つ、5つ、または6つの結合単位を含む結合分子は、「多量体」ということができる。「多量体」という用語は、2つ以上の単位を保有していることを意味する。したがって、例えば「多量体結合分子」は、2つ以上の結合単位を保有する。多量体結合分子は、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはさらに6つまたはそれ以上の結合単位を保有することができる。「二量体結合分子」は、2つの結合単位を含み、典型的には、J鎖をさらに含む二量体IgA分子である。「五量体結合分子」は、典型的には、J鎖をさらに含む五量体IgM結合分子である。「六量体結合分子」は、典型的には、六量体IgM結合分子である。対照的に、「単一結合単位分子」は、例えばIgG抗体でありうる。
【００６１】
本明細書において用いられる「野生型(WT) J鎖」、「天然配列J鎖」または「天然J鎖」という用語は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 2として提示される成熟ヒトJ鎖を含む、任意の動物種の天然配列IgMまたはIgA抗体のJ鎖をいう。
【００６２】
「改変J鎖」という用語は、天然配列J鎖ポリペプチドの変種をいうように本明細書において用いられる。改変J鎖は、完全長の成熟J鎖ポリペプチドまたはその機能的断片であることができ、非限定的に、アミノ酸挿入、欠失、置換、グリコシル化または脂質化のような非アミノ酸修飾を含むことができる。さらに、改変J鎖は、融合タンパク質としてJ鎖アミノ酸配列に導入されるか、またはジスルフィド結合もしくは化学的結合のような、他の技法によって結合もしくは結合体化されるかのいずれかの、結合部分のような異種部分を含むことができる。改変J鎖は、改変がIgMまたはIgAの効率的な重合およびそのような重合体の標的への結合を妨害しないという点で、典型的には機能的である。例示的な改変J鎖は、本明細書の他の箇所に、および参照により全体が本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 2015/153912に記述されている。「改変ヒトJ鎖」という用語は、非限定的に、例えば異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えばさらなる所望の結合ドメインの導入によって上記のように改変された、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の天然配列ヒトJ鎖またはその機能的断片を包含する。
【００６３】
用語「結合価」、「二価」、「多価」および文法上の同義語は、所定の結合分子または結合単位中の抗原結合ドメインの数をいう。例えば、所与の結合分子、例えばIgM抗体またはその断片に関して「二価」、「四価」および「六価」という用語は、それぞれ、2つの抗原結合ドメイン、4つの抗原結合ドメインおよび6つの抗原結合ドメインの存在を示す。典型的なIgM由来結合分子では、各結合単位は二価であるが、結合分子それ自体は10または12の結合価を有することができる。二価または多価の結合分子は、単一特異性であることができ、すなわち、抗原結合ドメインの全てが同じものであり、または例えば2つもしくはそれ以上の抗原結合ドメインが異なる、例えば、同一抗原上の異なるエピトープに結合するか、もしくは完全に異なる抗原に結合する場合、二重特異性または多重特異性であることができる。
【００６４】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合ができる任意の分子決定基を含む。特定の局面において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基(surface grouping)を含むことができ、特定の局面において、三次元構造特性、およびまたは特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。
【００６５】
「多特異的結合分子もしくは抗体」または「二重特異性結合分子もしくは抗体」とは、同一または異なる標的上の2つまたはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する結合分子、抗体またはその抗原結合断片をいう。「単一特異性」は、1つのエピトープにのみ結合する能力をいう。
【００６６】
「標的」という用語はその最も広い意味で、結合分子によって結合されうる物質を含むように用いられる。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であることができる。さらに、「標的」は、例えば、結合分子によって結合されうるエピトープを含む細胞、臓器または生物であることができる。
【００６７】
軽鎖と重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関して、可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)鎖部分の両方の可変領域(本明細書において「可変ドメイン」と互換的に呼ばれ得る)が抗原認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖(CL)および重鎖(例えば、CH1、CH2、またはCH3)の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などのような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域であり; CH3(またはIgMの場合はCH4)およびCLドメインはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端にある。
【００６８】
「完全長IgM抗体重鎖」は、N末端からC末端の方向に、抗体重鎖可変領域(VH)、抗体重鎖定常ドメイン1 (CM1またはCμ1)、抗体重鎖定常ドメイン2 (CM2またはCμ2)、抗体重鎖定常ドメイン3 (CM3またはCμ3)、および尾部も含みうる抗体重鎖定常ドメイン4 (CM4またはCμ4)を含むポリペプチドである。
【００６９】
「完全長IgA抗体重鎖」は、N末端からC末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体重鎖定常ドメイン1 (CA1またはCα1)、抗体重鎖定常ドメイン2 (CA2またはCα2)、抗体重鎖定常ドメイン3 (CA3またはCα3)、および尾部を含むポリペプチドであり、IgA1またはIgA2のいずれかであることができる。単量体IgA、二量体(J鎖含有) IgAおよび分泌IgAの構造は、例えば、Woof, JM and Russell, MW, Mucosal Immunology 4:590-597 (2011)に記述されている。
【００７０】
IgAおよびIgMの両方とも、「尾部」(tp)と呼ばれるC末端に18アミノ酸の伸長部分を保有する。IgM (μtp)およびIgA (αtp)尾部は7個のアミノ酸位置で異なる。IgMおよびIgA尾部は、さまざまな動物種の間で高度に保存されている。IgAおよびIgM尾部中の保存された最後から2番目のシステイン残基は、重合に関与することが実証されている。両方の尾部には、N結合型炭水化物付加部位が含まれており、その存在は、IgAにおける二量体形成、およびJ鎖組み入れ、およびIgMにおける五量体形成に必要である。しかしながら、尾部中のN結合型炭水化物の構造および組成は異なり、グリコシルトランスフェラーゼによるプロセッシングに対するグリカンの接近可能性の差を示唆している。
【００７１】
上記のように、可変領域、すなわち「抗原結合ドメイン」は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、結合分子、例えば抗体の、VLドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが組み合わさって、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VHおよびVL鎖の各々の3つのCDRによって定義される。特定の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、IgAは、全てジスルフィド結合を介して共有結合した2つのH2L2単位およびJ鎖を含む分子を形成することができ、IgMは、ジスルフィド結合を介して共有結合した5つまたは6つのH2L2単位およびいくつかの態様においてJ鎖を含む、五量体または六量体分子を形成することができる。特定の態様において、重合体IgAおよびIgM分子は、ジスルフィド結合を介して共有結合することもできる分泌成分を含むこともできる。さらに、IgAおよび五量体IgMの両方が重合体免疫グロブリン受容体(pIgR)に結合し、結合後に分泌されることが知られている(Mostov K. E., Ann. Rev. Immunol., 12:63-84, 1994, page 65を参照のこと)。
【００７２】
抗体抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境においてその3次元配置をとる場合に抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される短い、不連続的なアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域といわれる、抗原結合ドメイン中のアミノ酸残部は、さらに低い分子間変動性を示す。フレームワーク領域は主にβシート立体配座をとり、CDRがループを形成し、これがβシート構造をつなぎ、場合によってはβシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってCDRを正しい配向に位置付けるスキャフォールドを形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同族エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、さまざまな異なる方法で定義されているため、当業者により、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に識別されうる(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
【００７３】
当技術分野のなかで使用されかつ/または許容されている用語の定義が2つまたはそれ以上ある場合、本明細書において用いられる用語の定義は、明示的に反対の記載がない限り、そのような意味の全てを含むことが意図される。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続的な抗原結合部位を記述するための「相補性決定領域」(「CDR」)という用語の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)により、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)により記述されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。KabatおよびChothiaの定義には、互いに比較した場合にアミノ酸の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRをいうためのいずれかの定義(または当業者に公知の他の定義)の適用は、別段の指示がない限り、本明細書において定義および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記の参考文献の各々によって定義されるようなCDRを包含する適切なアミノ酸は、以下の表1に比較として記載される。特定のCDRを包含する正確なアミノ酸番号は、CDRの配列およびサイズに依って変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えてどのアミノ酸が特定のCDRを構成するかを日常的に決定することができる。
【００７４】
（表１）CDR定義＊
2018512863.tif 000004
＊表1中の全てのCDR定義の付番は、Kabatらにより記載された付番の規則によるものである(下記参照)。
【００７５】
CDRを含む、可変領域セグメントを識別するために、例えば、IMGT情報システム(www://imgt.cines.fr/) (IMGT(登録商標)/V-Quest)を用いて、免疫グロブリン可変ドメインを分析することもできる（例えば、Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008を参照されたい）。
【００７６】
Kabatらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の付番システムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいずれの実験データにも依らず、この「Kabat付番」システムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において用いられる場合、「Kabat付番」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)により記載されている付番システムをいう。しかしながら、Kabat付番システムの使用が明示されていない限り、本開示では全てのアミノ酸配列に連続付番が用いられる。
【００７７】
結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばFab、Fab'およびF(ab')2、Fd、Fv、一本鎖Fv (scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv (sdFv)、ラクダ科VHH抗体のような単一ドメイン抗体、VLドメインまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリによって産生された断片を含むが、これらに限定されることはない。ScFv分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記述されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)、またはサブクラスのものであることができる。二価であり、免疫グロブリン新規抗原受容体(IgNAR)可変ドメイン(VNAR)を含む一本鎖を含む、IgNARアイソタイプも企図される(Walsh et al., Virology 411:132-141, 2011を参照のこと)。
【００７８】
「特異的に結合する」とは、一般に、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間にいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、結合分子は、その抗原結合ドメインを介して、無作為な、関連のないエピトープに結合するよりも容易に、あるエピトープに結合する場合にそのエピトープに「特異的に結合する」といわれる。「特異性」という用語は本明細書において、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対的親和性を修飾する(qualify)ために用いられる。例えば、結合分子「A」は、結合分子「B」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「A」は、関連するエピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合するということができる。
【００７９】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1、10-3秒-1、5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1もしくは10-5秒-1  5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1もしくは10-7秒-1以下の解離速度(k(off))で標的抗原に結合するということができる。
【００８０】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種または誘導体は、103 M-1秒-1、5×103 M-1秒-1、104 M-1秒-1、5×104 M-1秒-1、105 M-1秒-1、5×105 M-1秒-1、106 M-1秒-1もしくは5×106 M-1秒-1または107 M-1秒-1以上の結合速度(k(on))で標的抗原に結合するということができる。
【００８１】
結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を、ある程度まで、遮断する範囲内でそのエピトープに選択的に結合する場合に、そのエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を競合的に阻害するといわれる。競合的阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば競合ELISAアッセイ法によって判定することができる。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%、競合的に阻害するということができる。
【００８２】
本明細書において用いられる場合、「親和性」という用語は、例えば免疫グロブリン分子の、1つまたは複数の抗原結合ドメインとの個々のエピトープの結合強度の尺度をいう。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) 27〜28頁を参照されたい。本明細書において用いられる場合、「結合活性」という用語は、抗原結合ドメインの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性をいう。例えば、Harlow 29〜34頁を参照されたい。結合活性は、集団における個々の抗原結合ドメインの、特定のエピトープとの親和性と、また、抗原および免疫グロブリンの結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、重合体のような、高度に反復性のエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の1つであろう。細胞表面上に高い密度で存在する受容体との二価モノクローナル抗体の間の相互作用も、高い結合活性のものであろう。
【００８３】
本明細書において開示される結合分子またはその抗原結合断片、変種または誘導体はまた、その交差反応性に関して記述または特定することができる。本明細書において用いられる場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体が第2の抗原と反応する能力; 2つの異なる抗原性物質間の関連性の尺度をいう。したがって、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導性エピトープと同じ多くの相補的な構造特性を含み、場合によっては、現に元のものよりも良好に適合することができる。
【００８４】
結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、抗原に対するその結合親和性に関して記述または特定することもできる。例えば、結合分子は、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 Mまたは10-15 M以下の解離定数またはKDで抗原に結合することができる。
【００８５】
一本鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含む抗体断片は、単独で、またはヒンジ領域、CH1、CH2、CH3もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分のうちの1つもしくは複数との組み合わせで存在することができる。ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分のうちの1つまたは複数と可変領域との任意の組み合わせを含みうる抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば抗体、またはその抗原結合断片は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物由来であることができる。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体であることができる。別の態様において、可変領域は、起源が軟骨魚類(例えば、サメ由来)であることができる。本明細書において用いられる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、以下におよび例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記述されるように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または1つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな、かつ場合によっては内因性免疫グロブリンを発現でき、一部のものでは発現できない、動物から単離された抗体を含む。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「重鎖サブユニット」または「重鎖ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、結合分子、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上方、中央および/または下方のヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはその変種もしくは断片の少なくとも1つを含むことができる。例えば、結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、VHドメインに加えて、CH1ドメイン; CH1ドメイン、ヒンジおよびCH2ドメイン; CH1ドメインおよびCH3ドメイン; CH1ドメイン、ヒンジおよびCH3ドメイン; またはCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むことができる。特定の局面において、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、VHドメインに加えて、CH3ドメインおよびCH4ドメイン; またはCH3ドメイン、CH4ドメインおよびJ鎖を含むことができる。さらに、本開示で用いるための結合分子は、一定の定常領域部分、例えば、CH2ドメインの全部または一部を欠くことができる。これらのドメイン(例えば、重鎖サブユニット)は、元の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されうることが、当業者によって理解されるであろう。
【００８７】
結合分子、例えば抗体またはその断片の重鎖サブユニットは、異なる免疫グロブリン分子に由来するドメインを含むことができる。例えば、ポリペプチドの重鎖サブユニットは、IgG1分子に由来するCH1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、部分的にはIgG1分子に由来し、部分的にはIgG3分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、部分的にはIgG1分子に由来し、部分的にはIgG4分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「軽鎖サブユニット」または「軽鎖ドメイン」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、VLまたはCL (例えば、CκもしくはCλ)ドメインの少なくとも1つを含む。
【００８９】
結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、それらが認識または特異的に結合する抗原のエピトープまたは部分に関して記述または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも2つのエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、高次構造およびタイプに依って、任意の数のエピトープを含むことができる。
【００９０】
前述のように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書において用いられる場合、「VH領域」または「VHドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「CH1ドメイン」という用語は、例えば、従来の付番スキームを用いてIgG抗体の約114番目のアミノ酸から約223番目のアミノ酸(114〜223番目のアミノ酸, Kabat付番システム; および118〜215番目のアミノ酸, EU付番システム; Kabat EA et al., op. cit参照)に及ぶ、免疫グロブリン重鎖の最初の(最もアミノ末端の)定常領域ドメインを含む。CH1ドメインはVHドメインに隣接しており、典型的なIgG重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端である。
【００９１】
本明細書において用いられる場合、「CH2ドメイン」という用語は、例えば、従来の付番スキームを用いてIgG抗体の約244番目のアミノ酸から360番目のアミノ酸(244〜360番目のアミノ酸, Kabat付番システム; および231〜340番目のアミノ酸, EU付番システム; Kabat EA et al., op. cit参照)に及ぶ重鎖分子の部分を含む。CH3ドメインは、IgG分子のCH2ドメインからC末端に及び、およそ108個のアミノ酸を含む。特定の免疫グロブリンクラス、例えばIgMは、CH4領域をさらに含む。
【００９２】
本明細書において用いられる場合、「ヒンジ領域」という用語は、IgG、IgAおよびIgD重鎖においてCH1ドメインをCH2ドメインに接続させる重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域はおよそ25個のアミノ酸を含み、柔軟であり、したがって2つのN末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。
【００９３】
本明細書において用いられる場合、「ジスルフィド結合」という用語は、2つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインはチオール基を構成し、これは第2のチオール基とジスルフィド結合を形成することができまたは架橋することができる。特定のIgG分子では、CH1およびCL領域はジスルフィド結合により連結され、2本の重鎖は、Kabat付番システムを用いて239および242に対応する位置(位置番号226または229, EU付番システム)で2つのジスルフィド結合により連結される。
【００９４】
本明細書において用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第1の種から得られまたは導出され、かつ定常領域(これはインタクトであっても、部分的であってもまたは改変されていてもよい)が第2の種から得られる抗体をいう。いくつかの態様において、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源(例えばマウスまたは霊長類)由来であり、定常領域はヒトのものである。
【００９５】
「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内に2つまたはそれ以上の異なるエピトープに特異的な抗原結合ドメイン(または「結合単位」)を有する抗体をいう。標準的な抗体構造に加えて他の結合分子は、2つの結合特異性で構築することができる。二重特異性抗体または多重特異性抗体によるエピトープ結合は、同時または逐次的であることができる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌できる細胞株の2つの例である。二重特異性抗体は、組換え手段によっても構築することができる(Strohlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010))。二重特異性抗体はダイアボディであることもできる。したがって、多量体である二重特異性結合分子は、潜在的に、それぞれ異なる特異性を有するいくつかの異なる抗原結合ドメインを保有することができる。例えば、IgM結合分子は、5または6つの結合単位を含み、各結合単位がおそらく2つの抗原結合ドメインを保有する多量体であると考えられる。それゆえ、そのようなIgM結合分子は、各抗原結合ドメインが、異なる識別可能なエピトープに結合することができるので、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、またはさらに12種類もの異なる特異性を有することができる。特定の局面において、各結合単位は単一特異性H2L2構造である。抗体を含む、二重特異性および多重特異性IgMおよびIgAの結合分子は、例えばPCT公開番号WO 2015/053887およびPCT公開番号WO 2015/120474に記述されており、それらの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。特定の局面において、異種結合ドメインは、PCT公開番号WO 2015/153912に、および本明細書の他の箇所に記述されているように、J鎖と結合していてもよい。
【００９６】
本明細書において用いられる場合、「操作された抗体」という用語は、CDRまたはフレームワーク領域のいずれかにおける1つまたは複数のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって重鎖および軽鎖のいずれかまたはその両方における可変ドメインが改変されている抗体をいう。特定の局面において、既知の特異性の抗体由来のCDR全体を、異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはサブクラスの抗体に由来することができるが、CDRはまた、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種由来の抗体に由来することができる。既知の特異性の非ヒト抗体由来の1つまたは複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植されている操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」といわれる。特定の局面において、CDRの全てがドナー可変領域由来の完全なCDRで置換されているわけではないが、それにもかかわらず、ドナーの抗原結合能力をレシピエント可変ドメインに移すことができる。例えば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号および同第6,180,370号に記載されている説明を考慮すれば、日常的な実験を行うことによって、または試行錯誤による試験によって機能的に操作されたまたはヒト化された抗体を得ることは十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【００９７】
本明細書において用いられる場合、「操作された」という用語は、合成手段による(例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリングまたはこれらの技法のいくつかの組み合わせによる)核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００９８】
本明細書において用いられる場合、用語「連結された」、「融合された」もしくは「融合」または他の文法上の同義語は、互換的に用いることができる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含む何らかの手段による、2つ以上のエレメントまたは成分の結合をいう。「インフレーム融合」は、元のORFの翻訳読み枠を維持する形で、連続的なさらに長いORFを形成させるための2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド読み取り枠(ORF)の結合をいう。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに対応する2つまたはそれ以上のセグメントを含んだ単一のタンパク質である(このセグメントは、通常、自然界ではそのように結合されていない)。したがって、読み枠は融合セグメントの全体にわたって連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的にまたは空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合することができるが、「融合された」CDRが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるCDR領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
【００９９】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接するアミノ酸が、ポリペプチドの一次構造において隣接している、アミノ末端からカルボキシル末端の方向へのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。
【０１００】
ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端」または「N末端」であるポリペプチドの部分は、連続ポリペプチド鎖において初めの方に来るその部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端」または「C末端」であるポリペプチドの部分は、連続ポリペプチド鎖において後の方に来るその部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域に対して「N末端」であり、定常領域は可変ドメインに対して「C末端」である。
【０１０１】
本明細書において用いられる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスをいう。このプロセスは、非限定的に、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の現れを含む。これには、非限定的に、メッセンジャーRNA (mRNA)への遺伝子の転写、およびそのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆物質の作出が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を産生する。本明細書において用いられる場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書において記述される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を伴う核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質分解的切断などを伴うポリペプチドをさらに含む。
【０１０２】
「処置する」もしくは「処置」もしくは「処置すること」または「緩和する」もしくは「緩和すること」のような用語は、診断された既存の病的状態または障害を治癒させる、遅らせる、その症状を軽減する、および/またはその進行を止めるもしくは遅くする治療手段をいう。「予防する」、「予防」、「回避する」、「抑止」などのような用語は、診断未確定の標的とされる病的状態または障害の発症を予防する予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段をいう。したがって、「処置を必要としている者」は、既に障害を有する者; 障害を有する傾向がある者; および障害が予防されるべきである者を含むことができる。
【０１０３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、農場動物、動物園の動物、スポーツ動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどのようなペット動物が含まれる。
【０１０４】
本明細書において用いられる場合、「治療から恩恵を受ける対象」および「処置を必要としている動物」のような語句には、1つまたは複数の抗原結合ドメインを含む、抗体のような結合分子の投与から恩恵を受ける、哺乳動物対象のような、対象が含まれる。そのような結合分子、例えば抗体は、例えば、診断手順のためにおよび/または疾患の処置もしくは予防のために用いることができる。
【０１０５】
多量体結合分子
本開示は、多量体HIV結合分子、すなわち、本明細書において定義される少なくとも2つ、例えば、2つ、5つ、または6つの「結合単位」を保有する結合分子を提供し、ここで多量体結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインが、 HIV抗原、例えばHIVタンパク質、例えばgp120および/またはgp41に特異的に結合することができる。本明細書において提供される多量体HIV結合分子によって結合されうるgp120および/またはgp41上の例示的なエピトープとしては、非限定的に、gp41の免疫優性領域、膜近位外部領域(MPER)、CD4結合部位、可変領域1/可変領域2 (V1/V2)ループ、グリカン-可変領域3 (V3)ループ、および/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物が挙げられる。例示的な多量体結合分子としては、5つもしくは6つの結合単位を有するIgM結合分子(五量体もしくは六量体結合分子)、または2つの結合単位を有するIgA結合分子が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１０６】
本明細書において提供される多量体結合分子は、単一結合単位から構成される結合分子、例えば二価IgG抗体と比較して、改善された結合特性または生物学的活性を有することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される多量体結合分子は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子と比べてより強力にHIVを中和し、より多様なHIV変種もしくは分岐群を結合かつ中和し、ウイルス排除を増強し、組織分布(例えば、粘膜表面への)を改善し、および/またはHIV感染を予防、制御、もしくは処置することにおいてより強力でありうる。特定の態様において、本明細書において提供される多量体結合分子は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子と比較して、HIV感染性および増殖を制御することにおいてより強力でありうる。特定の態様において、本明細書において提供される多量体結合分子は、例えば、HIV感染細胞、例えば極めて低レベルのHIV抗原を表面に発現するリザーバー細胞への結合ならびに/または抗体および/もしくは細胞媒介性のその殺傷によって、慢性感染を処置するために用いることができる。特定の態様において、多量体結合分子は、HIV感染細胞を活性化させかつ殺傷する、またはそのような細胞をエフェクター細胞のような独立した活性化物質での活性化後に殺傷するのにより有効でありうる。特定の態様において、本明細書において提供される多量体結合分子は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子のものと比べてより少ない投与量で同等の利益を提供しうる。特定の態様において、本明細書において提供される多量体結合分子の投与は、他のレトロウイルス療法、例えばARTの投与量の低減または修正を可能にしうる。例えば、以下の実施例7を参照されたい。「対応する参照の単一結合単位分子」という用語は、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えば本明細書において提供されるIgM抗体の1つまたは複数のHIV抗原結合ドメインと類似または同一の1つまたは2つのHIV抗原結合ドメインを有する単一結合単位から構成される結合分子をいう。
【０１０７】
特定の局面において、「対応する参照の単一結合単位分子」は、2つの同一の抗原結合ドメインを含むIgG抗体であり、ここでそれらの抗原結合ドメインは、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えば本明細書において提供されるIgM抗体の、少なくとも1つの結合単位、または少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位に含まれるものと同一である。
【０１０８】
「改善された結合特性」という用語は、単量体結合分子に対して改善されたまたは特有な多量体結合分子の任意の特徴に適用されうる非限定的な用語である。多量体結合分子は、例えば、感染した細胞、例えばHIVに感染したヒトの細胞においてHIVを中和することができ、それを必要とする個体に投与された場合に、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えば本明細書において提供されるIgM抗体のものと配列が類似または同一の抗原結合ドメインを保有する対応する参照の単一結合単位分子(例えばIgG分子)と比較して、限定されるものではないが、(i) HIVビリオンの感染性を低減させること、(ii) より多様なHIV変種もしくは分岐群を中和すること、(iii) HIV感染細胞(リザーバー細胞を含む)の数を低減させること、(iv) HIV感染を予防すること、(v) ウイルス排除を増強すること、および/または(vi) HIV感染の徴候および症状を改善することなどの、より強く、より強力であることが経験的に決定される活性を示すことができ、または質量もしくはモル当量でより少ない結合分子しか要しないことになりうる。
【０１０９】
上で言及した対応する参照の単一結合単位分子は、IgG結合分子でありうる。参照IgG結合分子は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのような、任意のアイソタイプのものでありうる。参照の結合分子は、典型的には、同じ動物由来である。したがって、多量体結合分子がヒトのものである場合、対応する参照の単一結合単位分子はまた、典型的には、ヒトのものであろう。逆に、多量体結合分子がウサギ結合分子である場合、対応する参照の単一結合単位分子はまた、ウサギ結合分子であろう。
【０１１０】
IgM結合分子
IgMは、抗原による刺激に応答してB細胞により産生される最初の免疫グロブリンであり、半減期5日間で血清中に1.5 mg/ml前後で存在する。IgMは、典型的には、多量体、例えば、五量体または六量体分子である。したがって、IgM分子は「多量体」結合分子である。5つまたは6つのIgM結合単位の各々は、2本の軽鎖および2本の重鎖を含む。上記で説明したように、IgGは3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を含むが、IgMの重(μ)鎖は、C末端「尾部」を含む第4の定常ドメイン(CH4)をさらに含む。ヒトIgM定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を含む。ヒトCμ1領域はSEQ ID NO: 1のおよそ5番目のアミノ酸〜およそ102番目のアミノ酸に及び; ヒトCμ2領域はSEQ ID NO: 1のおよそ114番目のアミノ酸〜およそ205番目のアミノ酸に及び、ヒトCμ3領域はSEQ ID NO: 1のおよそ224番目のアミノ酸〜およそ319番目のアミノ酸に及び、Cμ4領域はSEQ ID NO: 1のおよそ329番目のアミノ酸〜およそ430番目のアミノ酸に及び、および尾部はSEQ ID NO: 1のおよそ431番目のアミノ酸〜およそ453番目のアミノ酸に及ぶ。ヒトIgM定常領域のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)を以下に提供する。
2018512863.tif 000005
【０１１１】
IgM結合分子は、さらなる小さなポリペプチド鎖(J鎖)と複合体を形成して五量体IgM結合分子を形成することができる5つの結合単位(各「IgM結合単位」)を含むことができる。ヒトJ鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を含む。本明細書の他の箇所に記述されているように、J鎖は、例えば、ScFvまたはラクダ科抗体などの結合部分を含む変種J鎖であることができる。J鎖がなければ、IgM結合単位は典型的には六量体IgM結合分子になる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、六量体または五量体結合分子へのIgM結合単位のアセンブリは、Cμ3およびCμ4ドメインを含むと考えられる。したがって、本開示において提供される六量体または五量体IgM結合分子は、典型的には、少なくともCμ3およびCμ4ドメインを含むIgM定常領域を含む。ヒトJ鎖のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)を以下に提供する。
2018512863.tif 000006
【０１１２】
シグナルペプチド(SEQ ID NO: 2の1〜22番目のアミノ酸)に二重下線が引かれており、成熟J鎖配列はSEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸である。
【０１１３】
IgM重鎖定常領域は、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、および/または他のIgM重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、完全IgM重(μ)鎖定常ドメイン、例えばSEQ ID NO: 1、またはその変種、誘導体、もしくは類似体を含むことができる。
【０１１４】
五量体または六量体HIV結合分子
本開示は、HIV抗原、例えばHIVタンパク質、例えばHIVスパイクタンパク質に特異的に結合できる、本明細書において定義される5つまたは6つのIgM由来「結合単位」を有する結合分子である五量体または六量体HIV結合分子を提供する。特定の局面において、各結合単位は、2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。特定の局面において、IgM結合分子中の抗原結合ドメインは、起源がヒトのものである、もしくはヒト化されている、またはそれらの組み合わせである。本明細書において提供される五量体または六量体IgM結合分子は、単一結合単位から構成される結合分子、例えば二価IgG由来抗体と比較して、改善された結合特性または生物学的活性を有することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される五量体または六量体結合分子は、例えば、結合活性もしくは親和性の増大、またはエフェクター機能の増強を通じ、2つのHIV特異的抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子と比較して、例えばHIVリザーバー細胞への結合および/またはHIVリザーバー細胞の補体媒介性殺傷の達成により、慢性感染を標的とすることにおいてより強力でありうる。
【０１１５】
本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子は、同様に、合成構造またはキメラ構造から構成される一価または多価結合分子と比較して際立った特徴を保有することができる。例えば、ヒトIgM定常領域の使用により、キメラ定常領域または合成構造を含む結合分子と比べて免疫原性の低減、したがって安全性の増大を得ることができる。さらに、IgMに基づく結合分子は、より均質な発現産物をもたらす六量体または五量体オリゴマーを一貫して形成することができる。優れた補体結合は、IgMに基づく結合分子の有利なエフェクター機能でもありうる。
【０１１６】
上で言及した参照の単一結合単位は、IgG結合単位でありうる。参照IgG結合単位は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのような、任意のアイソタイプのものでありうる。参照の結合単位は、典型的には、同じ動物由来である。したがって、多量体結合分子がヒトのものである場合、参照の単一結合単位はまた、ヒトのものであるが、必ずしもヒトのものではない。すなわち、参照の単一結合単位は、IgG型のヒト化抗体でありうる。逆に、多量体結合分子がウサギ結合分子である場合、参照の単一結合単位はまた、ウサギ結合単位であろう。さらに、多量体結合分子が1つまたは複数の結合単位断片から構成される場合、参照の単一結合単位も等価な単一結合単位断片であろう。換言すれば、参照の単一結合単位は、参照の単一結合単位が等価な単一結合単位であることを除いて、多量体結合分子に含まれる結合単位と配列および構造がその他の点では同一である。
【０１１７】
特定の局面において、本開示は、それぞれ、5つまたは6つの結合単位を含む五量体または六量体結合分子を提供し、ここで各結合単位は2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。いくつかの態様において、IgM結合分子中の抗原結合ドメインは、起源がヒトのものである、もしくはヒト化されている、またはそれらの組み合わせである。
【０１１８】
本明細書において提供される多量体結合分子が五量体である場合、結合分子はJ鎖、またはその機能的断片、またはその変種をさらに含むことができる。五量体IgM結合分子がJ鎖を含む場合、J鎖はIgM結合分子と同じ種のものであることができる。すなわち、五量体IgM結合分子がヒトのものである場合、J鎖もヒトのものであることができる。特定の局面において、J鎖は、異種部分または1つもしくは複数の異種部分、例えば異種ポリペプチド配列、例えば天然配列に導入されたさらなる所望の結合ドメインを含む改変J鎖であることができる。特定の局面において、さらなる結合ドメインはCD3、例えばCD3ε、またはCD16に特異的に結合する。
【０１１９】
特定の局面において、結合単位における2つのIgM重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン、例えば抗体のFv部分、例えばヒトまたはマウス抗体のVHおよびVLと結合している。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、交差反応性HIV抗原結合ドメイン、例えば、2つまたはそれ以上のHIVタイプ、群、または分岐群由来のHIV抗原に結合できる抗原結合ドメインである。特定の局面において、抗原結合ドメインは、両方のHIVタイプ(タイプ1および2)由来のHIV抗原に結合することができる。特定の局面において、結合分子は、HIV-2の2つまたはそれ以上の群(M、NおよびO)由来のHIV抗原に結合することができる。特定の局面において、抗原結合ドメインは、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のHIV群または分岐群由来のHIV抗原に特異的に結合することができる。特定の局面において、結合分子は、2つまたはそれ以上のHIVタイプ、群、または分岐群の、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/またはgp41に結合することができる。gp120および/またはgp41エピトープ上の例示的なエピトープとしては、非限定的に、gp41、例えばgp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、および/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物が挙げられる。
【０１２０】
他の態様において、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子の各抗原結合ドメインは、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに独立して結合することができる。したがって、五量体IgM結合分子は、異なるHIV群、サブタイプまたは分岐群にわたり、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、またはさらに10種類もの異なる抗原またはエピトープに結合することができる。同様に、六量体IgM結合分子は、異なるHIV群、サブタイプまたは分岐群にわたり、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、または12種類もの異なる抗原またはエピトープに結合することができる。
【０１２１】
特定の局面において、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子は、2つまたはそれ以上のHIVタイプ、群、または分岐群の、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/またはgp41上のエピトープに結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。他の局面において、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子の2個またはそれ以上の抗原結合ドメイン、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個の抗原結合ドメインは、2つまたはそれ以上の異なるHIVスパイクタンパク質エピトープ、例えば、gp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、および/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物に結合することができる。いくつかの局面において、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子は、HIVスパイクタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むことができ、他のHIVタンパク質、例えばgag、pol、tat、rev、nef、vpr、vif、および/またはvpuに特異的に結合する他の抗原結合ドメインを含むことができる。あるいは、抗原結合ドメインの全ては、例えばHIVスパイクタンパク質上の特定のエピトープに対して、同じ特異性を保有することができる。1つの局面において、五量体または六量体HIV結合分子の全ての結合単位は、HIVスパイクタンパク質に特異的に結合し、例えば、五量体または六量体HIV結合分子は、同じスパイクタンパク質エピトープに結合する10個または12個の抗原結合ドメインを含むことができる。特定の局面において、10個または12個の抗原結合ドメインは、同一であることができる。
【０１２２】
特定の局面において、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子は、HIVビリオン粒子に結合することができ、および/またはHIV感染細胞の表面に結合することができる。特定の局面において、五量体または六量体HIV結合分子の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインは、HIVビリオン粒子に特異的に結合することができ、および/またはHIV感染細胞の表面に結合することができる。
【０１２３】
本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子により結合されるHIV抗原またはエピトープは、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/もしくはgp41、例えばgp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、ならびに/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物を含む、HIVタンパク質のいずれか1つまたは複数であることができる。さらに、本明細書において提供される五量体または六量体HIV結合分子は、2つまたはそれ以上の抗原、例えば、1つもしくは複数のHIV抗原もしくはエピトープおよび1つもしくは複数の異種抗原もしくはエピトープ、または2つもしくはそれ以上のHIV抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性であることができる。例えば、特定の局面において、本明細書において提供される多重特異性六量体または五量体HIV結合分子は、少なくとも2つの個々の結合ドメインが異なる抗原またはエピトープに結合する2つの抗原結合ドメインをそれぞれ含む5つまたは6つの結合単位を含むことができる。特定の非限定的な局面において、1つまたは複数の結合ドメインは、例えば、スパイクタンパク質のCD4結合部位内のエピトープに結合することができるが、残りの結合ドメインの1つまたは複数は、例えば、gp41の免疫優性領域、 CD4結合部位内の別のエピトープ、MPER領域内のエピトープ、V1/V2ループ、V3ループ、および/もしくはこれらの領域に結合している任意の炭水化物、またはスパイクタンパク質の任意の他の領域(例示的な結合ドメインは表3に提供されている)、あるいは別のHIVタンパク質のエピトープに結合することができる。別の局面において、多重特異性IgM結合分子は、個々のHIV群もしくは分岐群の異なるサブセットにまたは個々のHIV群もしくは分岐群に特異的な結合ドメインを含み、それによってより広範囲のHIVウイルスに対する活性を有する結合分子を提供することができる。抗体を含む、二重特異性および多重特異性IgMおよびIgA結合分子を作製する方法は、例えば、PCT公開番号WO 2015/053887およびPCT公開番号WO 2015/120474に記述されており、それらの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。特定の局面において、異種結合ドメインは、PCT公開番号WO 2015/153912に、および本明細書の他の箇所に記述されているように、J鎖と結合していてもよい。
【０１２４】
IgA結合分子
IgAは粘膜免疫で重要な役割を果たし、産生される全免疫グロブリンの約15%を構成する。IgAは単量体または二量体分子である。二量体IgA分子は、IgM分子よりもサイズが比較的小さいが、対応する参照の単一結合単位分子と比べて改善された結合特性も保有することができる。さらに、二量体IgA結合分子は、本明細書において提供される結合分子に対してより大きな組織分布を提供する粘膜部位に到達することができる。同様に、本明細書において提供される二量体IgA由来の結合分子は、5つまたは6つの結合単位を含む結合分子、例えば、本明細書の他の箇所に記述されるような六量体または五量体IgM由来の結合分子と区別されうる結合特性または生物学的活性を保有することができる。例えば、二量体結合分子はより小さく、例えば、より良好な組織透過を達成することができよう。二量体IgA結合分子は、2つのIgA単量体およびJ鎖を含むようにインビトロでの発現によって製造することができる。次に、二量体J鎖含有IgA分子は個体に投与され得、そこで、粘膜または粘膜組織に移動するIgA分子は、上皮細胞によって産生された膜結合型分泌成分(mSC, 重合体Ig受容体(pIgR)ともいわれる)に結合し、それと複合体を形成することができる。複合体は上皮細胞を横切って移動し、mSCは切断され、sIgAが粘膜表面に送達される(Kaetzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(19):87968800, 1991を参照のこと)。それゆえ、血流へのIgAの送達は、粘膜組織の標的化を提供することができる。
【０１２５】
IgA結合単位は、2本の軽鎖および2本のIgA重鎖を含む。IgAは、3つの重鎖定常ドメイン(Cα1、Cα2およびCα3)を含み、かつC末端「尾部」を含む。ヒトIgAは2つのサブタイプ、IgA1およびIgA2を有する。成熟ヒトIgA1定常領域は、典型的には、以下に提供されるアミノ酸配列SEQ ID NO: 3を含む。
2018512863.tif 000007
ヒトCα1領域はSEQ ID NO: 3のおよそ6番目のアミノ酸〜およそ98番目のアミノ酸に及び; ヒトCα2領域はSEQ ID NO: 3のおよそ125番目のアミノ酸〜およそ220番目のアミノ酸に及び、ヒトCα3領域はSEQ ID NO: 3のおよそ228番目のアミノ酸〜およそ330番目のアミノ酸に及び、および尾部はSEQ ID NO: 3のおよそ331番目のアミノ酸〜およそ352番目のアミノ酸に及ぶ。
【０１２６】
成熟ヒトIgA2定常領域は、典型的には、以下に提供されるアミノ酸配列SEQ ID NO: 4を含む。
2018512863.tif 000008
ヒトCα1領域はSEQ ID NO: 4のおよそ6番目のアミノ酸〜およそ98番目のアミノ酸に及び; ヒトCα2領域はSEQ ID NO: 4のおよそ112番目のアミノ酸〜およそ207番目のアミノ酸に及び、ヒトCα3領域はSEQ ID NO: 4のおよそ215番目のアミノ酸〜およそ317番目のアミノ酸に及び、および尾部はSEQ ID NO: 4のおよそ318番目のアミノ酸〜およそ340番目のアミノ酸に及ぶ。
【０１２７】
2つのIgA結合単位は、2本のさらなるポリペプチド鎖、J鎖(SEQ ID NO: 2)および分泌成分(SEQ ID NO: 76)との複合体を形成して、分泌IgA (sIgA)抗体を形成することができる。成熟分泌成分(SEQ ID NO: 76)のアミノ酸配列を以下に提供する。
2018512863.tif 000009
【０１２８】
理論によって束縛されることを望むわけではないが、IgA結合単位の二量体sIgA結合分子へのアセンブリは、Cα3および尾部ドメインを含むと考えられる。したがって、本開示において提供される二量体sIgA結合分子は、典型的には、少なくともCα3および尾部ドメインを含むIgA定常領域を含む。IgA重鎖定常領域は、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、および/または他のIgA重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、完全IgA重(α)鎖定常ドメイン、例えば、SEQ ID NO: 3もしくはSEQ ID NO: 4、またはその変種、誘導体、もしくは類似体を含むことができる。
【０１２９】
二量体HIV結合分子
本開示は、二量体HIV結合分子がHIV抗原、例えばHIVタンパク質、例えば
HIVスパイクタンパク質に特異的に結合できる少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む、本明細書において定義される2つまたはそれ以上のIgA結合単位を含む二量体結合分子を提供する。五量体または六量体HIV結合分子の文脈において上記で説明したように、本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、対応する参照の単一結合単位分子から構成される結合分子、例えば二価IgG抗体と比較して改善された結合特性または生物学的活性を保有することができる。例えば、二量体HIV結合分子は、特に粘膜表面への、組織透過または組織分布の改善をもたらすことができる。したがって、輸送および分泌のためにプロセッシングされた二量体IgA結合分子は、GIT中のHIVリザーバー細胞を標的とすることができる。
【０１３０】
上で言及した参照の単一結合単位は、IgG結合単位でありうる。参照のIgG結合単位は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのような、任意のアイソタイプのものでありうる。参照の結合単位は、典型的には、同じ動物由来である。したがって、多量体結合分子がヒトのものである場合、参照の単一結合単位はまた、ヒトのものであるが、必ずしもヒトのものではない。すなわち、参照の単一結合単位は、IgG型のヒト化抗体でありうる。逆に、多量体結合分子がウサギ結合分子である場合、参照の単一結合単位はまた、ウサギ結合単位であろう。さらに、多量体結合分子が1つまたは複数の結合単位断片から構成される場合、参照の単一結合単位も等価な単一結合単位断片であろう。換言すれば、参照の単一結合単位は、参照の単一結合単位が等価な単一結合単位であることを除いて、多量体結合分子に含まれる結合単位と配列および構造がその他の点では同一である。
【０１３１】
特定の局面において、本開示は、2つの結合単位を含む二量体HIV結合分子を提供し、ここで各結合単位は2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgA重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。抗HIV結合ドメインは、例えば、ヒトのものであるか、またはヒト化されている。
【０１３２】
本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、J鎖、もしくはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、分泌成分、もしくはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。
【０１３３】
IgA重鎖定常領域は、その定常領域が結合分子において所望の機能を果たすことができる、例えば、第2のIgA定常領域と結合して抗原結合ドメインを形成できる、または別のIgA結合単位と結合して二量体結合分子を形成できるならば、Cα1ドメイン、Cα2ドメイン、および/またはCα3ドメインの1つまたは複数を含むことができる。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα3ドメインもしくはその断片、尾部(TP)もしくはその断片、またはCα3ドメイン、TPもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、またはCα1ドメインもしくはその断片およびCα2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
【０１３４】
特定の局面において、所与の結合単位における2つのIgA重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン、例えば抗体のFv部分、例えばヒトまたはマウス抗体のVHおよびVLと結合している。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、交差反応性HIV抗原結合ドメイン、例えば、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のHIVタイプ、サブタイプまたは分岐群に特異的に結合できる抗原結合ドメインである。特定の局面において、抗原結合ドメインは、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のHIV群または分岐群由来のHIV抗原に特異的に結合することができる。特定の局面において、結合分子は、2つまたはそれ以上のHIVタイプ、群、または分岐群の、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/またはgp41に結合することができる。gp120および/またはgp41エピトープ上の例示的なエピトープとしては、非限定的に、gp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、および/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物が挙げられる。
【０１３５】
他の態様において、本開示の二量体HIV結合分子は、異なりかつ識別可能な特異性をそれぞれ有する2つの抗原結合ドメインを各々保有できる結合単位を含むことができる。したがって、二量体HIV結合分子は、4種類もの異なる特異性を保有することができる。
【０１３６】
特定の局面において、抗原結合ドメインは、両方のHIVタイプ(タイプ1および2)由来のHIV抗原に結合することができる。特定の局面において、二量体結合分子は、HIV-2の2つまたはそれ以上の群(M、NおよびO)由来のHIV抗原に結合することができる。特定の局面において、抗原結合ドメインは、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のHIV群または分岐群由来のHIV抗原に特異的に結合することができる。
【０１３７】
他の態様において、本明細書において提供される二量体HIV結合分子の各抗原結合ドメインは、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに独立して結合することができる。したがって、二量体HIV結合分子は、異なるHIV群、サブタイプまたは分岐群にわたり、2種類、3種類、または4種類もの異なる抗原またはエピトープに結合することができる。
【０１３８】
特定の局面において、本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、2つまたはそれ以上のHIVタイプ、群、または分岐群の、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/またはgp41上のエピトープに結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。他の局面において、本明細書において提供される二量体HIV結合分子の2個またはそれ以上の抗原結合ドメイン、例えば2個、3個、または4個の抗原結合ドメインは、2つまたはそれ以上の異なるHIVスパイクタンパク質エピトープ、例えば、gp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、および/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物に結合することができる。いくつかの局面において、本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、HIVスパイクタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むことができ、他のHIVタンパク質、例えばgag、pol、tat、rev、nef、vpr、vif、および/またはvpuに特異的に結合する他の抗原結合ドメインを含むことができる。あるいは、抗原結合ドメインの全てが、例えばHIVスパイクタンパク質上の特定のエピトープに対して、同じ特異性を保有することができる。1つの局面において、二量体HIV結合分子の全ての結合単位が、HIVスパイクタンパク質に特異的に結合し、例えば、二量体HIV結合分子は、同じスパイクタンパク質エピトープに結合する4個の抗原結合ドメインを含むことができる。特定の局面において、4個の抗原結合ドメインは、同一であることができる。
【０１３９】
特定の局面において、本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、HIVビリオン粒子に結合することができ、および/またはHIV感染細胞の表面に結合することができる。特定の局面において、五量体または六量体HIV結合分子の少なくとも2個、少なくとも3個、または少なくとも4個の抗原結合ドメインは、HIVビリオン粒子に特異的に結合することができ、および/またはHIV感染細胞の表面に結合することができる。
【０１４０】
本明細書において提供される二量体HIV結合分子により結合されるHIV抗原またはエピトープは、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/もしくはgp41、例えばgp41の免疫優性領域、MPER、CD4結合部位、V1/V2ループ、V3ループ、ならびに/またはこれらの領域に結合している任意の炭水化物を含む、HIVタンパク質のいずれか1つまたは複数であることができる。さらに、本明細書において提供される二量体HIV結合分子は、2つまたはそれ以上の抗原、例えば、1つもしくは複数のHIV抗原もしくはエピトープおよび1つもしくは複数の異種抗原もしくはエピトープ、または2つもしくはそれ以上のHIV抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性であることができる。例えば、特定の局面において、本明細書において提供される多重特異性二量体HIV結合分子は、少なくとも2つの個々の結合ドメインが異なる抗原またはエピトープに結合する2つの抗原結合ドメインをそれぞれ含む2つの結合単位を含むことができる。特定の局面において、1つまたは複数の結合ドメインは、例えば、スパイクタンパク質のCD4結合部位内のエピトープに結合することができるが、残りの結合ドメインの1つまたは複数は、例えば、CD4結合部位内の別のエピトープ、MPER領域内のエピトープ、スパイクタンパク質の任意の他の領域(例示的な結合ドメインは表3に提供されている)、または別のHIVタンパク質のエピトープに結合することができる。別の局面において、多重特異性IgA結合分子は、個々のHIV群もしくは分岐群の異なるサブセットにまたは個々のHIV群もしくは分岐群に特異的な結合ドメインを含み、それによってより広範囲のHIVウイルスに対する活性を有する結合分子を提供することができる。抗体を含む、二重特異性および多重特異性IgMおよびIgA結合分子を作製する方法は、例えば、PCT公開番号WO 2015/053887およびPCT公開番号WO 2015/120474に記述されており、それらの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。特定の局面において、異種結合ドメインは、PCT公開番号WO 2015/153912に、および本明細書の他の箇所に記述されているように、J鎖と結合していてもよい。
【０１４１】
多重特異性二量体、五量体、または六量体HIV結合分子
本明細書において提供される多重特異性、例えば二重特異性二量体HIV結合分子は、IgA抗体の二量体形態またはIgM抗体の六量体もしくは五量体形態に基づくことができ、ここで2対、5対、または6対の重鎖配列は、結合している軽鎖配列を伴ってまたは伴わないで存在することができる。例えば、本明細書において提供される二重特異性二量体HIV結合分子は2つのIgA (IgA1もしくはIgA2)結合単位、または5つもしくは6つのIgM結合単位から構成され得、J鎖、例えば本明細書の他の箇所に提供されている改変J鎖を含むことができる。
【０１４２】
本明細書において提供される多重特異性、例えば二重特異性二量体HIV結合分子は、分子が全体として、例えばgp120/41スパイクタンパク質の異なる領域、スパイクタンパク質エピトープおよび他のHIV抗原由来のエピトープ、またはHIV抗原および異種抗原に対する、少なくとも2つの結合特異性、例えば少なくとも2つの同一でない抗原結合ドメインを有する限りは単一特異性および/または二重特異性結合単位を含むことができる。特定の局面において、1つまたは複数の異種抗原がエフェクター細胞上に位置することができる（例えばT細胞上のCD3またはNK細胞上のCD16）。特定の局面において、同一でない抗原結合ドメインは、改変J鎖の一部であることができる。
【０１４３】
したがって、1つの態様において、本明細書において提供される多重特異性、例えば二重特異性二量体結合分子は、異なる結合標的に対する二価結合特異性を各々有する2つの単一特異性結合単位(AA、BB)を含むことができる。別の態様において、本明細書において提供される多特異性、例えば二重特異性二量体結合分子は、各結合単位が同じ2つの結合標的(AB、AB)に結合して二重特異性二量体結合分子を形成する2つの二重特異性結合単位を含むことができる。さらなる態様において、本明細書において提供される多重特異性二量体結合分子に存在する1つの結合単位は単一特異性(AA)であるが、他の結合単位は二重特異性(BC)であり、3つの(A、B、C)結合特異性を有する多重特異性結合分子をもたらす。さらなる態様において、各結合単位は二重特異性であるが、しかし1つの特異性が重複しており(例えばAB、AC)、3つの(A、B、C)結合特異性を有する多重特異性結合分子をもたらす。多重特異性二量体結合分子について上で論じられたように、5つまたは6つの結合単位の各々は、独立して単一特異性もしくは二重特異性(例えばAA、BB、CCなど)であることができ、または1つもしくは複数の結合単位は二重特異性(例えば、AB、AB、AC、CDなど)であることができる。したがって、本明細書において提供される多重特異性、例えば二重特異性五量体または六量体結合分子は、少なくとも2つの独立した抗原結合ドメイン、および12個までの異なる独立した抗原結合ドメインを含むことができる。例えば4つの同一でない抗原結合ドメイン(A、B、CおよびD)を有する、他の組み合わせは、本開示に基づいて容易に作製することができる。別の態様において、IgMまたはIgA結合単位の全てが単一特異性(例えばAA)であることができ、同一でない抗原結合ドメインが改変J鎖の一部であることができる。
【０１４４】
改変J鎖
特定の局面において、本明細書において提供されるHIV結合分子は、改変J鎖を組み入れて、多重特異性、例えば二重特異性であることができる。本明細書においておよびPCT公開番号WO 2015/153912において提供されるように、改変J鎖は異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えばさらなる所望の結合ドメインを含むことができ、これは、例えば、標的に特異的に結合できるポリペプチド結合ドメインを含むことができる。結合ドメインは、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、抗体-薬物結合体もしくはその抗原結合断片、または抗体様分子であることができる。ポリペプチド結合ドメインは、付加の位置およびタイプを適切に選択すること(例えば直接的または間接的な融合、化学的連結など)によって、J鎖に導入することができる。
【０１４５】
いくつかの態様において、改変J鎖は、標的抗原に特異的に結合することができるポリペプチドを非限定的に含みうる結合ドメインを含むことができる。特定の局面において、改変J鎖と結合している結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、および多重特異性抗体および抗体断片を含む、抗体またはその抗原結合断片であることができる。抗体断片は、非限定的に、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、scFv、(scFv)2断片、一本鎖抗体分子、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科VHH抗体、ミニボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であることができる。特定の局面において、抗体断片はscFvである。
【０１４６】
他の局面において、結合ドメインは、抗体様分子、例えば、ヒトドメイン抗体(dAb)、二重親和性再標的（DART）分子、ダイアボティ、ジ・ダイアボティ、二重可変ドメイン抗体、スタックド可変ドメイン(Stacked Variable Domain)抗体、小分子免疫製剤(Small Modular Immuno Pharmaceutical; SMIP)、サロボディ(Surrobody)、鎖交換操作ドメイン(SEED)-ボディ、またはTandAbであることができる。
【０１４７】
結合ドメインは、レシピエントIgMもしくはIgA分子のその結合標的への結合またはIgA二量体もしくはIgM五量体に効果的に組み入れられるJ鎖の能力を妨害することなく、その結合標的への結合ドメインの結合を可能にする任意の位置で天然J鎖配列に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、C末端の位置もしくは近傍に、成熟N末端(すなわち、シグナルペプチド切断後のSEQ ID NO: 2の23番目のアミノ酸)の位置もしくは近傍に、またはJ鎖の三次元構造に基づき、アクセス可能である内部位置に挿入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO: 2のヒトJ鎖の、C末端からの約10残基なしでまたは成熟N末端からの約10アミノ酸残基なしで天然配列J鎖に導入することができる。別の局面において、結合ドメインはSEQ ID NO: 2の天然配列ヒトJ鎖へSEQ ID NO: 2のシステイン残基114と123の間に、または別の天然配列J鎖の同等の位置に導入することができる。さらなる局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO: 2のJ鎖のような天然配列J鎖へ、グリコシル化部位の位置または近傍に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインはSEQ ID NO: 2の天然配列ヒトJ鎖へC末端から約10アミノ酸残基以内に導入することができる。
【０１４８】
導入は、直接的または間接的な融合により、すなわちペプチドリンカー有りまたは無しで、コードヌクレオチド配列のインフレームでの組み合わせによる、1本のポリペプチド鎖におけるJ鎖および結合ドメインの組み合わせにより達成することができる。ペプチドリンカー(間接的な融合)は、使用される場合、長さが約1〜50アミノ酸、または約1〜40アミノ酸、または約1〜30アミノ酸、または約1〜20アミノ酸、または約1〜10アミノ酸、または約1〜5アミノ酸、または約10〜20アミノ酸であることができ、J鎖配列に導入させたい結合ドメインの一端または両端に存在することができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、約1〜100アミノ酸長であることができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは5、10、15、または20アミノ酸長である。
【０１４９】
特定の局面において、成熟改変J鎖は式X[Ln]JまたはJ[Ln]Xを含み、式中Jは天然J鎖またはその機能的断片、例えば天然ヒトJ鎖(SEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸)であり、Xは結合ドメインであり、かつ[Ln]は、n個のアミノ酸からなるリンカー配列であり、ここでnは、例えば1〜100、1〜50、または1〜25の正の整数である。特定の局面において、n=5、10、15、または20である。特定の局面において、Lnは
2018512863.tif 000010
からなることができる。特定の局面において、Xは抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3 ScFvを含むことができる。特定の局面において、XはSEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、またはSEQ ID NO: 107を含むかまたはそれらからなる。
【０１５０】
2つ以上の異種ポリペプチド、例えば2つ以上の結合ドメインをJ鎖に導入することも可能である。
【０１５１】
改変J鎖は組換えDNA技術の周知の技法により、適当な原核または真核宿主生物において改変J鎖をコードする核酸を発現させることにより産生することができる。
【０１５２】
改変J鎖は、本明細書の他の箇所に記述されているように、レシピエントIgMまたはIgA結合分子の重鎖および軽鎖と同時発現させることができる。レシピエント結合分子は、改変J鎖の組み入れの前に、単一特異性、二重特異性、または多重特異性、例えば、単一特異性、二重特異性、または多重特異性IgAまたはIgM抗体であることができる。抗体を含む、二重特異性および多重特異性IgMおよびIgA結合分子は、例えば、PCT公開番号WO 2015/053887およびPCT公開番号WO 2015/120474に記述されており、それらの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０１５３】
特定の局面において、本明細書において記述される抗HIV IgMまたはIgA結合分子は、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫エフェクター細胞に対する結合特異性を有する改変J鎖を含むことができる。特定の局面において、エフェクター細胞はT細胞であり、結合標的はCD3 (以下で論じられる)またはCD8である。エフェクター細胞、例えばエフェクターT細胞(T細胞依存性殺傷もしくはTDCC)、またはNK細胞を活性化させ、リザーバー細胞を含めて、表面にHIV抗原、例えばHIVスパイク糖タンパク質を発現する感染細胞に再配向させることにより、本明細書において提供されるエフェクター細胞指向性の改変J鎖を含む二重特異性抗HIV IgMまたはIgA結合分子は、標的に対して増強された免疫応答、例えば、補体媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、TDCC、および/またはNK細胞媒介性殺傷を含む応答をもたらし、それによって効力および効能を増加させることができる。特定の局面において、改変J鎖を含む本明細書において提供される二重特異性抗HIV IgMまたはIgA結合分子は、HIV感染により引き起こされるもしくはHIV感染により悪化する疾患もしくは状態の処置のために用いることができ、ならびに/あるいはHIV中和、および/またはリザーバー細胞のようなHIV感染細胞の除去もしくは殺傷を導くことができる。
【０１５４】
T細胞の場合、分化クラスタ3 (CD3)は、歴史的にT3複合体として知られている多量体タンパク質複合体であり、3組の二量体(εγ, εδ, ζζ)としてアセンブリしかつ機能する4本の異なるポリペプチド鎖(ε, γ, δ, ζ)から構成される。CD3複合体は、T細胞受容体(TCR)と非共有結合的に結合するT細胞共受容体として働く。このCD3複合体の成分、特にCD3εは、本明細書において提供される二重特異性IgMまたはIgA結合分子の改変J鎖の標的でありうる。
【０１５５】
特定の局面において、二重特異性抗HIV×抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、抗体結合ドメインを介してHIV感染細胞またはHIVウイルス粒子に結合するが、J鎖はCD3、例えばCD3εに結合するように改変される。
【０１５６】
特定の局面において、本明細書において提供される改変J鎖の抗CD3結合ドメインは、scFvである。抗CD3 scFvは直接的にまたはscFvとJ鎖配列の間に導入される合成リンカー、例えば、
2018512863.tif 000011
を介して間接的にJ鎖のN末端の位置もしくは近傍に、またはJ鎖のC末端の位置もしくは近傍に融合させることができる。本明細書において提供される改変J鎖に含めるのに適した抗CD3結合ドメインには、表2に示される、アミノ酸配列SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107を含むScFv抗原結合ドメインが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１５７】
（表２）例示的なCD3異種結合ドメイン
2018512863.tif 000012
【０１５８】
特定の局面において、改変J鎖はリンカー、例えば
2018512863.tif 000013
を通じてヒトJ鎖のN末端に融合されたSEQ ID NO: 105の成熟scFvアミノ酸配列、本明細書においてn=5、10、15、または20であるOLnJといわれる改変J鎖を含む。OLnJは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチドをさらに含むことができる。特定の局面において、成熟改変J鎖はアミノ酸リンカー、例えば
2018512863.tif 000014
を通じてヒトJ鎖のC末端に融合されたSEQ ID NO: 105のscFv、本明細書においてn=5、10、15、または20であるJLnOといわれる改変J鎖を含む。JLnOは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチド、例えばSEQ ID NO: 2の1〜22番目のアミノ酸をさらに含むことができる。特定の局面において、他のシグナルペプチドを用いることができる。改変J鎖の発現、分泌、および本明細書において提供される抗HIV IgMまたはIgA結合分子への組み入れを促進するのに適したシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５９】
特定の局面において、改変J鎖はリンカー、例えば
2018512863.tif 000015
を通じてヒトJ鎖のN末端に融合された成熟scFvアミノ酸配列SEQ ID NO: 106、本明細書においてn=5、10、15、または20であるVLnJといわれる改変J鎖を含む。VLnJは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチドをさらに含むことができる。特定の局面において、成熟改変J鎖はアミノ酸リンカー、例えば
2018512863.tif 000016
を通じてヒトJ鎖のC末端に融合されたSEQ ID NO: 106のscFv、本明細書においてn=5、10、15、または20であるJLnVといわれる改変J鎖を含む。JLnVは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチド、例えばSEQ ID NO: 2の1〜22番目のアミノ酸をさらに含むことができる。特定の局面において、他のシグナルペプチドを用いることができる。改変J鎖の発現、分泌、および本明細書において提供される抗HIV IgMまたはIgA結合分子への組み入れを促進するのに適したシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。例示的な改変J鎖は、非限定的にV5J (SEQ ID NO: 108)、V10J (SEQ ID NO: 109)、V15J (SEQ ID NO: 110)、またはV20J (SEQ ID NO: 111)を含む。配列ごとに、成熟抗CD3 ScFv配列に一本の下線が引かれており、成熟ヒトJ鎖配列を斜体で示す。特定の局面において、成熟改変J鎖は、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、またはそれらの組み合わせであることができる。
2018512863.tif 000017
【０１６０】
特定の局面において、改変J鎖はリンカー、例えば
2018512863.tif 000018
を通じてヒトJ鎖のN末端に融合された成熟scFvアミノ酸配列SEQ ID NO: 107、本明細書においてn=5、10、15、または20であるULnJといわれる改変J鎖を含む。ULnJは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチドをさらに含むことができる。特定の局面において、成熟改変J鎖はアミノ酸リンカー、例えば
2018512863.tif 000019
を通じてヒトJ鎖のC末端に融合されたSEQ ID NO: 107のscFv、本明細書においてn=5、10、15、または20であるJLnUといわれる改変J鎖を含む。JLnUは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチド、例えばSEQ ID NO: 2の1〜22番目のアミノ酸をさらに含むことができる。特定の局面において、他のシグナルペプチドを用いることができる。改変J鎖の発現、分泌、および本明細書において提供される抗HIV IgMまたはIgA結合分子への組み入れを促進するのに適したシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６１】
当業者は、本明細書において提供される記述によってさらなる改変J鎖を容易に作製することができるであろう。
【０１６２】
上記のものなどの特定の局面において、本明細書において提供される二量体または五量体HIV結合分子と結合している改変J鎖は、エフェクター細胞、例えばT細胞、NK細胞、またはマクロファージに結合する抗原結合ドメインを含むことができる。特定の局面において、エフェクター細胞は、CD3、CD8、またはそれらの組み合わせを発現するT細胞、例えば、細胞傷害性T細胞である。この局面によれば、J鎖は、CD3 (CD3ε)結合ドメインまたはCD8結合ドメインの共有結合によって改変することができる。この構成では、本明細書において提供される二量体または五量体結合分子が、標的HIV抗原、例えばHIVスパイクタンパク質に対する結合特異性を提供する一方で、CD3結合またはCD8結合を通じたJ鎖のT細胞連結により細胞毒性能が提供される。J鎖またはその変種に共有結合されたCD3結合ドメインまたはCD8結合ドメインは、例えば、抗CD3抗体の一本鎖Fv (scFv)、または天然に存在する重鎖のみの抗体、例えばラクダ科の動物(ラクダ、ラマ、アルパカ)もしくは軟骨魚類(サメ、エイ)の一本鎖抗体、CD3結合特異性を有するスキャフォールド、例えばフィブロネクチン(例えばフィブロネクチンIII)であることができる。
【０１６３】
別の局面において、エフェクター細胞はナチュラルキラー(NK)細胞である。NK細胞は先天性免疫の重要な成分であり、サイトカインを放出し、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に対する細胞溶解活性を媒介するその能力により、宿主防御において重要な役割を果たす。NK細胞抗原は、非限定的に、CD16、CD32a、CD56、CD57、CD64、CD117 (またはc-kit)、リンパ球関連分子-2 (LFA-2またはCD2)、LFA-3 (CD58)、およびLFA-1 (CD11a/CD18)を含む接着分子を含む。この局面によれば、J鎖は、例えばCD16結合ドメインの共有結合によって改変することができる。この構成では、本明細書において提供される二量体または五量体結合分子が、標的HIV抗原、例えばHIVスパイクタンパク質に対する結合特異性を提供する一方で、J鎖のNK細胞連結により細胞毒性能が提供される。J鎖またはその変種に共有結合されたCD16結合ドメインは、例えば、抗CD16抗体の一本鎖Fv (scFv)、または天然に存在する重鎖のみの抗体(VHH)、例えばラクダ科の動物(ラクダ、ラマ、アルパカ)もしくは軟骨魚類(サメ、エイ)の一本鎖抗体、CD16結合特異性を有するスキャフォールド、例えばフィブロネクチン(例えばフィブロネクチンIII)であることができる。
【０１６４】
特定の局面において、改変J鎖はリンカー、例えば
2018512863.tif 000020
を通じてヒトJ鎖のN末端に融合された成熟VHHアミノ酸配列SEQ ID NO: 112 (表2)、本明細書においてn=5、10、15、または20であるCD16LnJといわれる改変J鎖を含む。CD16LnJは、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチドをさらに含むことができる。この局面による例示的な改変J鎖は、実施例1に記述されているアミノ酸配列SEQ ID NO: 125を含むことができる。特定の局面において、成熟改変J鎖はアミノ酸リンカー、例えば
2018512863.tif 000021
を通じてヒトJ鎖のC末端に融合されたSEQ ID NO: 112のVHH、本明細書においてn=5、10、15、または20であるJLnCD16といわれる改変J鎖を含む。JLnCD16は、輸送およびIgMまたはIgA結合分子へのアセンブリを容易にするシグナルペプチド、例えばSEQ ID NO: 2の1〜22番目のアミノ酸をさらに含むことができる。特定の局面において、他のシグナルペプチドを用いることができる。改変J鎖の発現、分泌、および本明細書において提供される抗HIV IgMまたはIgA結合分子への組み入れを促進するのに適したシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６５】
別の局面において、エフェクター細胞はマクロファージである。この局面によれば、J鎖は、例えばCD14結合ドメインの共有結合によって改変することができる。この構成では、本明細書において提供される二量体または五量体結合分子が、標的HIV抗原、例えばHIVスパイクタンパク質に対する結合特異性を提供する一方で、J鎖のマクロファージ連結により細胞毒性能が提供される。J鎖またはその変種に共有結合されたCD14結合ドメインは、例えば、抗CD14抗体の一本鎖Fv (scFv)、または天然に存在する重鎖のみの抗体、例えばラクダ科の動物(ラクダ、ラマ、アルパカ)もしくは軟骨魚類(サメ、エイ)の一本鎖抗体、CD14結合特異性を有するスキャフォールド、例えばフィブロネクチン(例えばフィブロネクチンIII)であることができる。
【０１６６】
別の局面において、エフェクター細胞は好中球である。この局面によれば、J鎖は、例えばCD16bまたはCD177結合ドメインの共有結合によって改変することができる。この構成では、本明細書において提供される二量体または五量体結合分子が、標的HIV抗原、例えばHIVスパイクタンパク質に対する結合特異性を提供する一方で、J鎖の好中球連結により細胞毒性能が提供される。J鎖またはその変種に共有結合されたCD16bまたはCD177結合ドメインは、例えば、抗CD16bもしくはCD177抗体の一本鎖Fv (scFv)、または天然に存在する重鎖のみの抗体、例えばラクダ科の動物(ラクダ、ラマ、アルパカ)もしくは軟骨魚類(サメ、エイ)の一本鎖抗体、CD16bもしくはCD177結合特異性を有するスキャフォールド、例えばフィブロネクチン(例えばフィブロネクチンIII)であることができる。
【０１６７】
操作されたHIV抗原結合ドメイン
特定の局面において、本明細書において提供されるHIV抗原結合ドメインは、6つもの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むことができ、ここで少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRが、以下の表3に記載のHIV mAbの対応するCDRと関連するか、またはいくつかの態様において同一であるか、または1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の単一アミノ酸置換を除いて同一である。
【０１６８】
クローニングされた可変領域を免疫グロブリンドメインへと遺伝的に操作し、そのような構築体を発現および精製するための方法は、公開されており、当業者の能力の範囲内である(例えば、Wu et al., MAbs, 1(4):339-47, 2009, and Wu et al., Nat. Biotechnol., 25:1290-7, 2007を参照のこと)。
【０１６９】
HIVエピトープに特異的な抗体を形成するために組み合わせる成熟VHおよびVLドメインをコードする例示的なペプチド配列を、表3に記載する。これらの配列、またはその変種、断片、もしくは誘導体を次いで、上記で説明したように、標準的な五量体もしくは六量体IgM構造、またはIgA構造へと操作することができる。
【０１７０】
（表３）HIVに結合する例示的なモノクローナル抗体
2018512863.tif 000022
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2018512863.tif 000030
【０１７１】
特定の局面において、本明細書において提供される二量体、六量体、または五量体結合分子のHIV抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、ここでVH領域、VL領域 またはVH領域およびVL領域の両方が、上記の表3に記載の参考文献に開示されたHIVモノクローナル抗体の対応するVHおよびVLに関連する。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、表3に列挙される抗体のVHおよびVLを含むIgG抗体よりも高い効力を示す。
【０１７２】
特定の局面において、VHは、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99のアミノ酸配列のいずれか1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７３】
特定の局面において、VLは、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100のいずれか1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７４】
特定の局面において、VHおよびVLアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７５】
特定の局面において、本明細書において提供される二量体、六量体、または五量体結合分子のHIV抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33およびSEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41およびSEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43およびSEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 77およびSEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79およびSEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89およびSEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91およびSEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100のVHおよびVLアミノ酸配列からなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む。
【０１７６】
特定の局面において、本明細書においてHIV02Mと指定された六量体または五量体IgM抗体は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 114を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 115を含むκ軽鎖を含むように提供される。特定の局面において、本明細書においてHIV12Mと指定された六量体または五量体IgM抗体は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 117を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 118を含むκ軽鎖を含むように提供される。特定の局面において、本明細書においてHIV32Mと指定された六量体または五量体IgM抗体は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 120を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 121を含むκ軽鎖を含むように提供される。特定の局面において、本明細書においてHIV72Mと指定された六量体または五量体IgM抗体は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 123を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 124を含むκ軽鎖を含むように提供される。IgM抗体HIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mが五量体である場合、それはJ鎖またはその機能的断片、例えばSEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸を含む野生型ヒトJ鎖または本明細書の他の箇所に提供されている改変J鎖、例えば式X[Ln]JまたはJ[Ln]X、式中Jは天然J鎖またはその機能的断片、例えば天然ヒトJ鎖(SEQ ID NO: 2の23〜159番目のアミノ酸)であり、Xは結合ドメイン、例えばSEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、またはSEQ ID NO: 112であり、かつ[Ln]は、n個のアミノ酸からなるリンカー配列であり、ここでnは、例えば1〜100、1〜50、または1〜25の正の整数であるものを含むJ鎖をさらに含むことができる。特定の局面において、n=5、10、15、または20、例えばSEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、またはSEQ ID NO: 104である。特定の局面において、改変J鎖は、V5J (SEQ ID NO: 108)、V10J (SEQ ID NO: 109)、V15J (SEQ ID NO: 110)、V20J (SEQ ID NO: 111)、C15J (SEQ ID NO: 125)、またはそれらの任意の組み合わせを含む、またはそれらからなりうる。
【０１７７】
特定の局面において、J鎖を有しないかまたは本明細書において提供される野生型もしくは改変J鎖をさらに含むかのいずれかの、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、単一結合単位の抗体、例えば表3に列挙される抗体の対応するVHおよびVLを含むIgG抗体よりも高い効力を示すことができる。例えば、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子と比べてより強力にHIVを中和し、より多様なHIV変種もしくは分岐群を結合かつ中和し、ウイルス排除を増強し、および/またはHIV感染を予防、制御、もしくは処置することにおいてより強力でありうる。さらに、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子と比較して、HIV感染性および増殖を制御することにおいてより強力でありうる。さらに、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、例えば、HIV感染細胞、例えば極めて低レベルのHIV抗原を表面に発現するリザーバー細胞への結合ならびに/または抗体および/もしくは細胞媒介性のその殺傷によって、慢性感染を処置するために用いることができる。さらなる例において、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、そのようなHIV感染細胞を活性化させかつ殺傷する、またはそのような細胞を、エフェクター細胞、例えばT細胞のような独立した活性化物質での活性化後に殺傷するのにより有効でありうる。さらなる例において、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体は、2つのHIV抗原結合ドメインしか含まない対応する参照の単一結合単位分子のものと比べてより少ない投与量で同等の利益を提供しうる。特定の局面において、本明細書において提供されるIgM抗体、例えばHIV02M、HIV12M、HIV32M、またはHIV72Mを含むIgM抗体の投与は、ARTのような、他の抗レトロウイルス療法の投与量の低減または修正を可能にしうる(例えば、以下の実施例7を参照のこと)。
【０１７８】
種々の異なる二量体、六量体、および五量体の結合分子は、本開示に基づき当業者によって企図され得、したがって本開示に含まれるが、特定の局面において、IgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを各結合単位が含む、上記の結合分子が提供される。特定の局面において、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを各結合単位が含む、上記の結合分子が提供される。
【０１７９】
さらに、特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位は、それぞれ、上記のHIV抗原結合ドメインの2つを含む。特定の局面において、結合分子の1つの結合単位、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位における2つのHIV抗原結合ドメインは、互いに異なっていてもよく、またはそれらは類似もしくは同一であってもよい。
【０１８０】
特定の局面において、結合分子の1つの結合単位内、または結合分子の2つの結合単位内の2本のIgA重鎖は同一である。特定の局面において、結合分子の1つの結合単位内、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位内の2本のIgM重鎖は、同一である。
【０１８１】
特定の局面において、結合分子の1つの結合単位内、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位内の2本の軽鎖は同一である。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位内の2本の同一の軽鎖は、κ軽鎖、例えば、ヒトκ軽鎖、またはλ軽鎖、例えばヒトλ軽鎖である。
【０１８２】
特定の局面において、本開示により提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの結合単位は、2本の同一のIgAもしくはIgM重鎖、および2本の同一の軽鎖を含む、または各々含む。この局面によれば、結合分子の1つの結合単位、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合単位におけるHIV抗原結合ドメインは、同一であることができる。さらにこの局面によれば、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体は、上記のHIV抗原結合ドメインの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12コピーを含むことができる。特定の局面において、結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一であることができ、特定の局面において、結合単位は同一の抗原結合ドメインを含むことができ、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個または少なくとも12個のHIV抗原結合ドメインが同一であることができる。
【０１８３】
特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、同じ抗原結合ドメインを含む対応する参照の単一結合単位分子のような、他の結合分子と比較して、有利な構造的および/もしくは機能的特性、または「改善された結合特性」を保有することができる。例えば、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、対応する参照の単一結合単位分子、例えば、上記のように多量体結合分子中に存在するのと同じVHおよびVL領域配列を含むIgG1結合分子と比べて、インビトロまたはインビボのいずれかで、生物学的アッセイ法において改善された活性または効力を保有することができる。生物学的アッセイ法には、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ法、T細胞依存性細胞傷害(TDCC)アッセイ法、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ法、細胞間伝播(CTCS)アッセイ法、ウイルストランスサイトーシスアッセイ法、補体依存性ウイルス溶解(virolysis)アッセイ法、ウイルス中和アッセイ法、細胞付着アッセイ法、ウイルス放出アッセイ法、免疫組織化学アッセイ法、直接細胞傷害アッセイ法、補体媒介細胞傷害アッセイ法などが含まれるが、これらに限定されることはない。そのようなアッセイ法を行うのに適したHIV糖タンパク質発現細胞には、例えば、CHO-gp120、CHO-gp140、Jurkat-522 F/Y細胞、またはgp140の膜固定型三量体形態を発現する哺乳類細胞、例えばJR-FL株(Go et al. 2015 J Virol 89:8245-8257)が含まれるが、これらに限定されることはない。特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体は、HIV抗原結合ドメインと同じHIVエピトープに特異的に結合する、等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力で、HIV中和、および/またはリザーバー細胞のようなHIV感染細胞の排除もしくは殺傷を導くことができる。
【０１８４】
「効力」または「結合特性」とは、所与の生物学的結果を達成する結合分子の能力をいう。例えば、効力は、所与の生物学的結果(EC100もしくはIC100)を達成するために必要な所与の結合分子の量、または所望の生物学的結果の50% (EC50もしくはIC50)を達成するために必要な所与の結合分子の量をいうことができる。生物学的結果は、例えば、組換えgp120もしくはgp41への結合、gp120/41発現細胞への結合、慢性的におよび/もしくは潜在的に感染した細胞株への結合、HIVウイルスもしくはHIV偽型ウイルスの中和、より多様なHIVウイルスもしくはHIV偽型ウイルスの中和、潜伏HIV感染細胞の殺傷、治療動物モデルにおけるHIVウイルスもしくはHIV感染細胞の低減、またはART中止後のHIVウイルスの長期にわたる非存在を含むことができる。
【０１８５】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、上記の二量体、六量体、または五量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換えおよび/または非天然のポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳されうる結合分子、結合単位、または抗原結合ドメインの一部分を意味する。例としては、非限定的に、抗体可変ドメイン、例えばVHもしくはVL、J鎖、分泌成分、一本鎖Fv、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、および/またはそれらの任意の断片、変種、もしくは誘導体が挙げられる。
【０１８６】
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、IgMもしくはIgA重鎖定常領域またはその断片、およびHIV抗原結合ドメインのVH部分を含むことができる。特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VHのC末端に融合されたヒトIgMもしくはIgA定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここでVHは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99を含むVHからなる、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含む。
【０１８７】
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、上記のHIV抗原結合ドメインの抗体VL部分を含むことができる。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、VLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができ、ここでVLは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100を含むVLからなる、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域を含む。
【０１８８】
特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VHのC末端に融合されたヒトIgMもしくはIgA定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここでVHは、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、またはSEQ ID NO: 99のアミノ酸配列のいずれか1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VLのC末端に融合されたヒト軽鎖定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここでVLは、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、またはSEQ ID NO: 100のいずれか1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
したがって、抗原結合ドメインを形成するために、HIV抗原に特異的に結合する、例えばHIVスパイクタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体の可変領域を、IgMおよび/またはIgA構造の発現ベクター鋳型へ挿入し、それによって少なくとも2つの二価結合単位を有する多量体結合分子を作製することができる。簡潔には、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列を、既存の分子から合成または増幅し、発現時に、ベクターが完全長の重鎖または軽鎖を生じるような適切な方向およびインフレームでベクターへ挿入することができる。これらの目的に有用なベクターは、当技術分野において公知である。そのようなベクターは、所望の鎖の発現を達成するために必要とされるエンハンサーおよび他の配列を含むこともできる。複数のベクターまたは単一のベクターを用いることができる。これらのベクターを宿主細胞にトランスフェクションし、次いで鎖を発現させ、精製する。発現の際、鎖は、文献に報告されているように、完全に機能的な多量体結合分子を形成する。次いで、完全にアセンブリした多量体結合分子を、標準的な方法によって精製することができる。発現および精製プロセスは、必要に応じて、商業的規模で実施することができる。
【０１９１】
本開示は、上記の二量体、六量体、または五量体結合分子を共同でコードしうる、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。特定の局面において、組成物は、IgMおよび/もしくはIgA重鎖またはその断片、例えば、IgMおよび/もしくはIgA重鎖が少なくともHIV抗原結合ドメインVHを含む上記のヒトIgM重鎖をコードするポリヌクレオチド、ならびに軽鎖またはその断片、例えば、少なくともHIV抗原結合ドメインVLを含むヒトκまたはλ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。提供されるポリヌクレオチド組成物は、J鎖、例えばヒトJ鎖、またはその断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される組成物を構成するポリヌクレオチドは、2つ、3つまたはそれ以上の別々のベクター、例えば発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。特定の局面において、本明細書において提供される組成物を構成する2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、単一のベクター、例えば発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。
【０１９２】
本開示は、本明細書において提供される二量体、五量体、もしくは六量体HIV結合分子、またはそのいずれかのサブユニットをコードする1つのポリヌクレオチドまたは2つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド、本明細書において提供されるポリヌクレオチド組成物、あるいは本明細書において提供される二量体、五量体、もしくは六量体HIV結合分子、またはそのいずれかのサブユニットをコードする1つのベクターまたはそれらを共同でコードする2つ、3つもしくはそれ以上のベクターを含む、宿主細胞、例えば原核生物または真核生物の宿主細胞をさらに提供する。特定の局面において、本開示により提供される宿主細胞は、本開示により提供される二量体、五量体、もしくは六量体HIV結合分子、またはそのサブユニットを発現することができる。
【０１９３】
関連する局面において、本開示は、本開示により提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子を産生する方法を提供し、ここで本方法は、上記の宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む。
【０１９４】
使用方法
本開示は、二量体IgAに基づくHIV結合分子、または五量体もしくは六量体IgMに基づくHIV結合分子を用いて、HIV感染を予防、制御、もしくは処置するための改善された方法、および/またはHIV感染性を、例えば2つもしくはそれ以上のタイプ、群、もしくは分岐群にわたって、中和するための改善された方法を提供する。以下に記述される方法では、表3に記載した参考文献に開示されている抗体ならびに対応するVHおよびVL配列、またはその変種、誘導体、もしくは類似体を非限定的に含めて、HIV抗原結合ドメインを含む多量体結合分子を利用することができ、ここで二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、上で開示および説明されたように、対応する参照の単一結合単位分子、断片、変種、誘導体、または類似体と比較して、改善されたウイルス中和および/または排除効力を提供することができる。例示的な対応する単一結合単位分子は、表3に提示した参考文献に記述されている。本開示に基づいた、関心対象の任意のHIV特異的抗原結合ドメインを含む二量体IgA結合分子、または五量体もしくは六量体IgM結合分子の構築は、十分に当業者の能力の範囲内である。そのような組成物の改善された結合特性は、例えば、上記で説明したように、低減された用量を用いることを可能にすることができ、または元の抗体による中和に対して抵抗性のあるウイルスのさらに効果的な中和を引き起こすことができる。「抵抗性」とは、HIV感染性、複製、放出などに対する、HIV抗体の活性の任意の程度の低減を意味する。
【０１９５】
特定の局面において、本開示は、改善されたHIVの中和、またはHIV感染細胞の殺傷を導くための方法を提供し、ここで本方法は、本明細書において記述される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体とHIVまたはHIV感染細胞とを接触させる段階を含み、ここで結合分子は、等量の対応する参照の単一結合単位分子、例えば単一特異性二価IgG抗体またはその断片よりも高い効力で、ウイルス中和、またはHIVリザーバー細胞の殺傷を導くことができる。特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体は、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体の少なくとも1つの結合単位と類似または同一のVHおよびVL領域であるか、またはそれを含む等量の対応する参照の単一結合単位分子よりも高い効力で2つまたはそれ以上のHIVタイプ、サブタイプまたは分岐群のウイルス中和を導くことができる。
【０１９６】
特定の局面において、本開示は、HIVリザーバー細胞に結合し、HIVリザーバー細胞の殺傷をもたらす所与の結合分子の能力を試験するための方法を提供する。本方法は、高コピー数から低コピー数、さらには単一コピー数に至るまでの一連の所定のレベルで、例えば、HIVスパイクタンパク質、例えばgp120および/またはgp41上のエピトープに関して、HIV抗原、例えばHIVタンパク質を発現する、細胞、例えば慢性的に感染したHIV患者由来の細胞、または一連の組換え細胞株を提供する段階を含む。細胞を次いで、抗体依存性、T細胞依存性、または補体依存性の細胞殺傷を可能にする条件の下で、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体と接触させることができ、最低コピー数のHIV抗原を発現する細胞の殺傷をもたらしうるそれらの結合分子を回収することができる。特定の局面において、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、等量の対応する参照の単一結合単位分子、例えば単一特異性二価IgG抗体またはその断片によって殺傷される細胞よりも低コピー数のHIV抗原を発現する細胞の殺傷を導くことができる。
【０１９７】
例えば、方法には、異なるタイプ、群、または分岐群のエンベロープHIVウイルス粒子に対する親和性および/または結合活性が判定されていないさまざまな結合分子のスクリーニングが含まれる。本発明の方法は、HIVウイルス粒子の表面に、リザーバー細胞のようなHIV感染細胞の表面に、またはそれらの組み合わせに結合するいっそう広範に中和を行う結合分子を同定するために利用することができる。このようにして、本明細書において開示されるように、本開示の方法において有用なさらなる結合分子を同定かつ利用することができる。
【０１９８】
このスクリーニング方法は、第1のタイプ、群、または分岐群のHIVまたはHIV感染細胞に特異的に結合することが知られている試験結合分子を、第2のタイプ、群、または分岐群のHIVまたはHIV感染細胞と接触させ、第2のHIVまたは感染細胞への結合について試験結合分子の親和性および/または結合活性を測定することにより達成することができる。したがって、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、同じ抗原結合ドメインを有する単一結合単位分子について明らかになりえていない交差反応性について試験することができる。
【０１９９】
そのような方法における細胞は、ヒト細胞のような、HIVに感染しうる任意の細胞でありうる。
【０２００】
特定の局面において、本開示は、より広範な交差反応性のHIV中和、またはHIVリザーバー細胞の殺傷を導くための方法を提供し、ここで本方法は、本明細書において記述される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体とHIVビリオンまたはHIV感染細胞とを接触させる段階を含み、ここでウイルスは、結合分子の1つまたは複数の抗原結合ドメインによって典型的に結合されるものとは異なるタイプ、群、または分岐群のものであり、ここで結合分子は、等量の対応する参照の単一結合単位分子、例えば単一特異性二価IgG抗体またはその断片よりも高い効力で、ウイルス中和、または異なるタイプ、群、もしくは分岐群のHIVリザーバー細胞の殺傷を導くことができる。特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体は、本明細書において提供される二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体の少なくとも1つの結合単位と類似または同一のVHおよびVL領域であるか、またはそれを含む等量の対応する参照の単一結合単位分子よりも多くのHIVタイプ、サブタイプまたは分岐群のウイルス中和を導くことができる。
【０２０１】
例えば、方法には、異なるタイプ、群、または分岐群のエンベロープHIVウイルス粒子に対する親和性および/または結合活性が判定されていないさまざまな結合分子のスクリーニングが含まれる。本発明の方法は、HIVウイルス粒子の表面に、リザーバー細胞のようなHIV感染細胞の表面に、またはそれらの組み合わせに結合するいっそう広範に中和を行う結合分子を同定するために利用することができる。このようにして、本明細書において開示されるように、本開示の方法において有用なさらなる結合分子を同定かつ利用することができる。
【０２０２】
このスクリーニング方法は、第1のタイプ、群、または分岐群のHIVまたはHIV感染細胞に特異的に結合することが知られている試験結合分子を、第2のタイプ、群、または分岐群のHIVまたはHIV感染細胞と接触させ、第2のHIVまたは感染細胞への結合について試験結合分子の親和性および/または結合活性を測定することにより達成することができる。したがって、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、同じ抗原結合ドメインを有する単一結合単位分子について明らかになりえていない交差反応性について試験することができる。
【０２０３】
そのような方法における細胞は、ヒト細胞のような、HIVに感染しうる任意の細胞でありうる。
【０２０４】
本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体、または六量体HIV結合分子は、他の結合分子と比較して有利な構造的または機能的特性を保有することができる。例えば、本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで、上記の生物学的アッセイ法において、同様に上記の対応する参照の単一結合単位分子、例えばIgGまたはその変種、類似体、もしくは誘導体よりも改善された結合特性を保有することができる。生物学的アッセイ法には、T細胞依存性細胞傷害アッセイ法(TDCC)、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ法、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ法、細胞間伝播(CTCS)アッセイ法、補体依存性ウイルス溶解アッセイ法、ウイルス中和アッセイ法、細胞付着アッセイ法、ウイルス放出アッセイ法、免疫組織化学アッセイ法、または直接細胞傷害アッセイ法が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２０５】
薬学的組成物および投与方法
本明細書において提供される多量体、例えば、二量体、五量体または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体を調製し、それを必要としている対象に投与する方法は、当業者に周知であり、または本開示を考慮して当業者により容易に決定される。多量体結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所によるものであることができる。本明細書において用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与を含む。これらの投与形態は適当な形態として企図されるが、投与のための形態の別の例は、注射のための、特に静脈内または動脈内注射または点滴のための溶液であろう。適当な薬学的組成物は、緩衝液(例えば酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝液)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、およびいくつかの態様では安定剤(例えばヒトアルブミン)を含むことができる。
【０２０６】
本明細書において提供される二量体、五量体または六量体HIV結合分子は、HIVに感染した対象においてHIV感染を治す、取り除く、またはそうでなければ排除することが望ましい疾患または障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。これに関して、開示される多量体結合分子は、投与を容易にし、活性剤の安定性を促進するように処方されうることが理解されよう。薬学的組成物はしたがって、生理学的食塩水、無毒性緩衝液、保存料などのような薬学的に許容される無毒性の無菌担体を含むことができる。本明細書において提供される二量体、五量体または六量体HIV結合分子の薬学的に有効な量は、標的への有効な結合を達成するのに、および治療的利益を達成するのに十分な量を意味する。適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)に記述されている。
【０２０７】
本明細書において提供される特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む許容される剤形で経口投与することができる。特定の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存料、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および/または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０２０８】
単一剤形を作出するために担体材料と組み合わせることができる二量体、五量体または六量体HIV結合分子の量は、例えば、処置される対象および特定の投与様式に依って変化するであろう。組成物は、単回用量、複数回用量として、または確立された期間にわたり輸液中で投与することができる。投薬レジメンを調整して、最適な所望の応答(例えば、治療的または予防的応答)をもたらすこともできる。
【０２０９】
本開示の範囲にしたがって、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体HIV結合分子は、治療効果を生じるのに十分な量で治療を必要としている対象に投与することができる。本明細書において提供される多量体結合分子は、本開示の抗体またはその抗原結合断片、変種または誘導体を、従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と既知の技法にしたがって組み合わせることにより調製される従来の剤形で対象に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および性質は、組み合わされるべき活性成分の量、投与の経路および他の周知の変量によって左右されうる。
【０２１０】
「治療的に有効な用量または量」または「有効な量」とは、投与されると、処置されるべき疾患または状態を有する患者の処置に関して肯定的な治療的応答をもたらす二量体、五量体または六量体HIV結合分子の量を意図する。
【０２１１】
HIV感染の処置のための、本明細書において開示される組成物の治療的に有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物(medication)、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に依って変化しうる。特定の局面において、対象または患者はヒトであるが、しかしトランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知の日常的な方法を用いて用量設定することができる。
【０２１２】
投与される二量体、五量体または六量体HIV結合分子、例えばIgM抗体の量は、本開示を考慮して過度の実験なしに当業者によって容易に決定される。投与様式および多量体結合分子のそれぞれの量に影響を及ぼす因子には、疾患の重篤度、疾患の病歴、ならびに治療を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態および身体状態が含まれるが、これらに限定されることはない。同様に、投与される二量体、五量体または六量体HIV結合分子の量は、投与様式および対象がこの薬剤の単回用量または複数回用量を受けるかどうかに依存するであろう。
【０２１３】
本開示はまた、HIV感染によって引き起こされる疾患または障害を処置、予防または管理するための薬物(medicament)の製造における二量体、五量体または六量体HIV結合分子の使用を提供する。
【０２１４】
本開示は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来技法を利用するものであり、これらは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技法は文献に十分に説明されている(例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.中を参照されたい)。
【０２１５】
抗体工学の一般原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)に記載されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)に記載されている。さらに、当技術分野において公知であり、具体的には記述されていない免疫学における標準的方法は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)およびMishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)にあるように従うことができる。
【０２１６】
免疫学の一般原理を記載している標準的な参考文献には、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) 「Monoclonal Antibody Technology」 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freeman & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)が含まれる。
【０２１７】
上記で引用した参考文献の全て、および本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。以下の実施例は、例示する目的で提供されるものであり、限定する目的で提供されるものではない。
【実施例】
【０２１８】
実施例1: 操作された抗HIV結合分子の構築およびアセンブリ
本明細書において提供されるさまざまなHIV抗体のVHおよびVL領域を、商業請負業者を通じて標準的な方法によりIgGおよびIgMバックグラウンドにクローニングすることができる。以下に提示される成熟タンパク質をシグナルペプチドとともに発現させて、分泌を促進することができる。
【０２１９】
HIV02:
本明細書においてそれぞれSEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8として提示された、米国特許第8,637,036号において提供されているgp120上のCD4結合部位に特異的なヒト抗体のVHおよびVLを、適切なベクターにクローニングして、それぞれ、アミノ酸配列SEQ ID NO: 113およびSEQ ID NO: 114を含むヒトIgGおよびIgM重鎖、ならびにSEQ ID NO: 115を含むκ軽鎖をコードさせた。ベクターをHEK293細胞(適切な場合には、以下に記述されるヒト野生型または改変J鎖をコードするベクターを有する)にトランスフェクションし、発現を許容し、IgG分子HIV02 IgG (HIV02G)、IgM分子HIV02 IgM (HIV02M)、IgM+J (HIV02M+J)、または改変J鎖を含むIgM+Jを産生させた。
【０２２０】
SEQ ID NO: 113: HIV02γ1重鎖
2018512863.tif 000031
【０２２１】
SEQ ID NO: 114: HIV02μ重鎖
2018512863.tif 000032
【０２２２】
SEQ ID NO: 115 HIV02κ軽鎖
2018512863.tif 000033
【０２２３】
HIV12:
本明細書においてそれぞれSEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96として提示された、Buchacher, A., I., AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:359-369 (1994)においておよびWO 2011/035205において提供されているgp120上のV3/グリカン領域に特異的なヒト抗体のVHおよびVLを、適切なベクターにクローニングして、それぞれ、アミノ酸配列SEQ ID NO: 116およびSEQ ID NO: 117を含むヒトIgGおよびIgM重鎖、ならびにSEQ ID NO: 118を含むκ軽鎖をコードさせた。ベクターをHEK293細胞(適切な場合には、以下に記述されるヒト野生型または改変J鎖をコードするベクターを有する)にトランスフェクションし、発現を許容し、IgG分子HIV12 IgG (HIV12G)、IgM分子HIV12 IgM (HIV12M)、IgM+J (HIV12M+J)、または改変J鎖を含むIgM+Jを産生させた。
【０２２４】
SEQ ID NO: 116: HIV12γ1重鎖
2018512863.tif 000034
【０２２５】
SEQ ID NO: 117: HIV12μ重鎖
2018512863.tif 000035
【０２２６】
SEQ ID NO: 118: HIV12軽鎖
2018512863.tif 000036
【０２２７】
HIV32:
本明細書においてそれぞれSEQ ID NO: 99およびSEQ ID NO: 100として提示された、Moore, J.P., and J. Sodroski J. Virol 70:1863-1872 (1996)においておよびWO 2006/044410において提供されているgp120上のCD4結合部位に特異的なヒト抗体のVHおよびVLを、適切なベクターにクローニングして、それぞれ、アミノ酸配列SEQ ID NO: 119およびSEQ ID NO: 120を含むヒトIgGおよびIgM重鎖、ならびにSEQ ID NO: 121を含むκ軽鎖をコードさせた。ベクターをHEK293細胞(適切な場合には、以下に記述されるヒト野生型または改変J鎖をコードするベクターを有する)にトランスフェクションし、発現を許容し、IgG分子HIV32 IgG (HIV32G)、IgM分子HIV32 IgM (HIV32M)、IgM+J (HIV32M+J)、または改変J鎖を含むIgM+Jを産生させた。
【０２２８】
SEQ ID NO: 119: HIV32γ1重鎖
2018512863.tif 000037
【０２２９】
SEQ ID NO: 120: HIV32μ重鎖
2018512863.tif 000038
【０２３０】
SEQ ID NO: 121: HIV32κ軽鎖
2018512863.tif 000039
【０２３１】
HIV72:
本明細書においてそれぞれSEQ ID NO: 97およびSEQ ID NO: 98として提示された、Pincus SH, et al., J Immunol 170: 22362241(2003)において提供されているgp41の免疫優性領域に特異的なヒト抗体のVHおよびVLを、適切なベクターにクローニングして、それぞれ、アミノ酸配列SEQ ID NO: 122およびSEQ ID NO: 123を含むヒトIgGおよびIgM重鎖、ならびにSEQ ID NO: 124を含むκ軽鎖をコードさせた。ベクターをHEK293細胞(適切な場合には、以下に記述されるヒト野生型または改変J鎖をコードするベクターを有する)にトランスフェクションし、発現を許容し、IgG分子HIV72 IgG (HIV72G)、IgM分子HIV72 IgM (HIV72M)、IgM+J (HIV72M+J)、または改変J鎖を含むIgM+Jを産生させた。
【０２３２】
SEQ ID NO: 122: HIV72γ-1重鎖
2018512863.tif 000040
【０２３３】
SEQ ID NO: 123: HIV72μ重鎖
2018512863.tif 000041
【０２３４】
SEQ ID NO: 124 HIV72κ軽鎖
2018512863.tif 000042
【０２３５】
野生型および改変J鎖:
それぞれ、5アミノ酸リンカー(GGGGS, SEQ ID NO: 101)または10アミノ酸リンカー(GGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 102)を介して成熟ヒトJ鎖のN末端に融合されたビシリズマブに対応する抗CD3 ScFvを含む、改変J鎖V5J (SEQ ID NO: 108)およびV10J (SEQ ID NO: 109)を標準的な方法によって構築した。例えば、PCT公開番号WO 2015/153912を参照されたい。
【０２３６】
成熟発現構築体は、約45 kDの分子量を有し、CD3の可溶性ε鎖(Sino Biological)またはT細胞(データは示していない)に結合することができる。
【０２３７】
さまざまな抗HIV重鎖および軽鎖に対応するDNA構築体、ならびに野生型(wt) J鎖または改変J鎖(例えば、V5JまたはV10J)配列のいずれかに対応するDNA構築体を、HEK293細胞に同時にトランスフェクションし、標準的な方法にしたがってタンパク質を発現させ、精製した。IgGまたはIgM+J型のHIV02、HIV12、HIV32およびHIV72抗体でトランスフェクションされたHEK293細胞は、標準的な方法による精製を可能にするのに十分なタンパク質を産生した。
【０２３８】
非還元SDS未変性PAGE
タンパク質サンプルを未変性PAGE(NativePAGE) 3〜12%ビス-トリス(Bis-Tris)ゲル(Novex)へ負荷した。トリス-酢酸SDS泳動用緩衝液(Novex)を添加し、ゲルを40Vで15分間、その後90Vで2時間泳動した。次に、ゲルを40%メタノール、10%酢酸中で10分間固定し、コロイドブルー染色キット(Novex)を用いて少なくとも3時間染色し、その後に水中で脱染色した。
【０２３９】
ウエスタンブロット検出
完了後、ゲルをXCell SureLock Mini-Cellから取り出し、30ボルトで1時間PVDF膜に転写した(Life Technologiesのマニュアルを参照のこと)。次いで、PVDF膜を25℃で1時間PBST中3%のBSA 20 mlでブロッキングした。
【０２４０】
抗J鎖ウエスタンブロットの場合、抗ヒトJ鎖抗体(SP105, Thermo Fisher)を4℃で終夜、リン酸緩衝生理食塩水, 0.05% TWEEN(商標) 20 (PBST)中3%のウシ血清アルブミン(BSA)中に1:500希釈で添加した。室温にて4回PBSTで洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギIgG (Jackson Immunology)をPBST中3%のBSA中に1:5,000希釈で添加し、室温で1時間インキュベートした。膜を室温にてPBSTで4回洗浄し、10分間、HRP化学発光基質(Thermo Fisher) 10 mlの添加により発色させた後にブロットをフィルムに曝露した。抗J鎖抗体は、未改変J鎖または改変J鎖のいずれかと同時発現されるIgMとのみ反応する。
【０２４１】
抗体発現およびアセンブリ:
細胞上清中に存在する抗体を、製造元の使用説明書にしたがいIgM抗体の場合にはCaptureSelectM (BAC, ThermoFisher カタログ2890.05)またはIgG抗体の場合にはプロテインAを用いて親和性クロマトグラフィーにより回収した。精製したタンパク質を以下に概説するように評価した。
【０２４２】
非還元SDS未変性PAGEによって評価した場合のHIV02抗体の発現およびアセンブリを図2Aに示す。HIV02Gは十分に発現し、IgG抗体へ効率的にアセンブリした。J鎖なしで発現されたHIV02Mは、アセンブリした高分子量IgMおよび低分子量抗体形態の混合物をもたらした。HIV02Mが野生型J鎖とともに発現された場合(HIV02M+J)、産生された物質の大部分は完全にアセンブリしたIgM抗体として泳動した。HIV02Mはまた、CD3を標的とする改変J鎖とともに発現されると、高分子量の二重特異性IgM抗体へ適切にアセンブリした(例えば、HIV02M+V10J; 図9を参照のこと)。
【０２４３】
HIV12M+J、HIV32M+JおよびHIV72M+Jの発現およびアセンブリを図2Bに示す。全3つのIgM+J抗HIVタンパク質は、タンパク質の各々におけるJ鎖の存在を実証するウエスタン分析によって証明されるように、高分子量IgM抗体へ適切にアセンブリした。
【０２４４】
HIV72G、HIV72M、HIV72M+JおよびHIV72M+V5Jの発現およびアセンブリを図2Cに示す。HIV72Gの重鎖および軽鎖は、十分に発現し、IgG抗体へ適切にアセンブリした(レーン2)。J鎖なしで発現された、HIV72Mのμ鎖および軽鎖も十分に産生され、大部分は高分子量IgM抗体へアセンブリした(レーン3)。野生型J鎖またはCD3を標的とする改変J鎖(V5J)とのHIV72μ鎖および軽鎖の同時発現は、ゲルのクマシー染色(左)によりまたは電気泳動されたタンパク質の抗J鎖ウエスタンにより証明されるように、それぞれ単一特異性(HIV72M+J; レーン4)または二重特異性(HIV72M+V5J; レーン5) IgM抗体の効率的なアセンブリをもたらした。
【０２４５】
他の改変J鎖:
あるいは、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)上のCD16抗原への結合を可能にする改変J鎖を構築することができる。例えば、CD16に特異的なラクダ科VHH結合ドメイン(例えば、SEQ ID NO: 112)を発現する改変J鎖を構築することができる。結合ドメインは、可動性アミノ酸リンカー(例えば、15アミノ酸)を用いJ鎖に連結されて、J鎖に連結された抗CD16ラクダ科ドメイン(C15J)をもたらす。二重特異性IgMを上記のように発現させ、精製し、非還元SDS未変性PAGEゲル上で分析することによりアセンブリを確認する。改変J鎖(C15J, SEQ ID NO: 125)の五量体IgMへの組み入れは、ウエスタンブロット法を用いて確認される。
【０２４６】
SEQ ID NO: 125
2018512863.tif 000043
【０２４７】
上記のように、この配列に対応するDNAを含む発現ベクターを合成し、抗HIV gp120/41 IgMの重鎖および軽鎖(SEQ ID NO 114および115)とともにHEK293細胞にトランスフェクションしてタンパク質を産生させ、これを次に、IgMに特異的なラクダ科抗体親和性マトリックスを用いて精製する。15アミノ酸リンカーを有する新しい抗CD16結合ドメインに融合されたJ鎖は、IgMに組み入れることが可能であり、対応するJ鎖を有する二重特異性IgMの五量体型は、J鎖を有しない六量体型と区別できる。
【０２４８】
実施例2: HIV特異的IgM結合分子のHIV抗原および抗原発現細胞への結合
HIV02GおよびHIV02M+JをELISAアッセイ法により、HIV gp120への結合について評価した。アッセイ法は、以下の方法によって行った。コーティング用緩衝液(100 mM重炭酸塩, pH 9.5) 100 μL中1.0 μg/mL (高密度抗原)のgp120抗原(HXB2株, Immune Tech, カタログ番号IT-001-0022p-PBS)または0.1 μg/mL (低密度抗原)までの希釈液により4℃で終夜、96ウェルマイクロタイタープレート(ポリスチレン, MaxiSorp ELISAプレート, Nunc)のウェルをコーティングした。次いで、プレートを0.05% PBS-Tweenで洗浄し、2% BSA-PBSでブロッキングした。ブロッキング後、連続希釈したサンプル(精製されたタンパク質または細胞培養上清) 100 μLをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、HRP結合マウス抗ヒトκ抗体(Southern Biotech, 9230-05. 2% BSA-PBS中で1:6000希釈した)とともに1時間インキュベートした。0.05% PBS-Tweenを用いた5回の最終洗浄の後、TMB基質(BD Biosciences, 555214) 100 μLを各ウェルに添加し、暗所中で15分間インキュベートした。次いで、1ウェルあたり2 N H2SO4または2 N HCl 50 μLを添加することによって反応を停止させた。次にA450データをマイクロプレート読取機で収集し、4パラメータロジスティックモデルを用いてPrismソフトウェア(GraphPad)で分析した。
【０２４９】
gp120 HBX2への結合の結果を図3A〜Fに示す。1 μg/mLの典型的な高抗原コーティング(図3A)では、HIV02M+JはIgG型(HIV02G)よりも効果的な結合を示し、それぞれEC50 2,300 ng/mL vs 320 ng/mL、つまり7倍の重量差を示した。モル基準で、HIV02M+Jは、このコーティング濃度でHIV02Gよりも42倍良好にgp120に結合した。
【０２５０】
gp120のコーティング濃度を1.0 μg/mLから0.8、0.6、0.4、0.2および0.1 μg/mLまで連続的に減少させ(図3Bから図3F)、それによってプレート上の抗原密度を低減させた場合、HIV02M+Jは強い結合を示し続けたが、HIV02G結合は急速に減少した。最も低い抗原密度(図3F、0.1 μg/ mLコーティング)では、HIV02G結合はほとんど検出できなかった。
【０２５１】
コーティング濃度が減少するにつれて、gp120へのHIV02Gの結合が急速に低下したので、EC10値を結合曲線から補間して、全てのコーティング濃度で抗原結合の結合比較を可能にした。この分析の結果を図4に示す。ELISAにおけるgp120コーティング濃度が1.0 μg/mLから0.1 μg/mLに減少するにつれて、IgGの結合と比べてIgM+Jの結合は重量を基準に5倍から20倍増加した。モル基準で、試験した最低濃度(0.1 μg/mL)で抗原をコーティングした場合、IgM+JはIgGよりも120倍良好にgp120に結合した。
【０２５２】
HIV02GおよびHIV02M+Jを、以下の方法により、細胞表面にgp120を発現するようにトランスフェクションされた細胞への結合についてさらに評価した。
【０２５３】
表面にHBX2 gp140 (gp120 + gp41の細胞外部分; CHO-gp140)またはgp160 (全長タンパク質; CHO-gp160)を発現するように操作されたCHO細胞(Weiss et al., 1993 J Virol 67:7060-7066)を、NIH AIDS Reagent Program (カタログ番号2284および2239)から入手し、その使用説明書にしたがって培養した。細胞を培地20 ml中、細胞3×106個/フラスコでT75フラスコ中に継代した−細胞に、使用の15〜18時間前に10 mMの酪酸ナトリウム(Sigma, カタログ番号B5887)を含有する新鮮な培地を補充した。染色当日に、細胞を細胞解離用緩衝液(Gibco, カタログ番号131510) 10 mLで取り除いた。培地から吸引除去した後に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで細胞をすすいだ。細胞解離用緩衝液10 mLを全てのフラスコに添加し、37℃で20〜30分間インキュベートした。次いで、フラスコを軽くたたくことにより細胞を取り除いて、単個細胞浮遊液を作製した。同量の培地をフラスコに添加して細胞解離用緩衝液を中和し、生細胞数を細胞計数器(BioRad TC20)上でトリパンブルー排除により決定した。FACS 2% FBS緩衝液(BD Pharmingen, カタログ番号554656) 60 μL中1.5×104個/ウェルの細胞を「V」底96ウェルプレートに添加した。抗体およびアイソタイプ対照をFACS 2% FBS緩衝液中で希釈し、終濃度が30 μg/mLとなるように各ウェルに50 μLを添加した。次いで、プレートを4℃で30分間インキュベートした。FACS 2% FBS緩衝液150 μLで細胞を洗浄した後に、プレートを1200 rpmで5分間遠心分離し(Sorvall Legend XIR遠心分離機)、細胞ペレットを乱さずに上清を穏やかに吸引した。4℃で30分間AlexaFluor 647標識抗ヒトκ軽鎖(BioLegend, カタログ番号316514)とともに処理細胞をインキュベートすることにより、抗体結合を検出した。洗浄工程を上記のように繰り返し、100分の1の7_AAD (BD Pharm, カタログ番号68981E)を含有するFACS 2% FBS 60 μL中に細胞を再懸濁した。FACSCALIBUR(商標) (Becton Dickinson)上で各サンプルについて少なくとも1,000事象を得て、データ分析をFLOWJO(商標) (FlowJo LLC)で行った。
【０２５４】
CHO-gp140細胞へのHIV02抗体の結合を図5Aおよび図5Bに示す。CHO-gp140細胞へのHIV02G結合は、FACSによって分析した場合、比較的低かった(図5A)。しかしながら、IgM型HIV02M+Jの結合は容易に検出され、はるかに強かった(図5B)。
【０２５５】
同様に、HIVに慢性的または潜在的に感染した細胞への抗HIV抗体の結合を調べることができる。CEM細胞(CEM-IIIb) (Popovic, M., et al., 1984. Science 224:497-500)のような慢性的に感染した細胞株は、細胞表面にHIV gp120/41エンベロープ糖タンパク質を構成的に発現するが、潜在的に感染した細胞株ACH2 (Folks TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:2365-2368, 1989.)、Jl.l (Perez VL, et al., J Immunol 147:3145-3148, 1991)およびOM10 (Butera et al., 1991 J Virol. 65(9):4645-4653)細胞株はサイトカイン腫瘍壊死αで活性化されて、細胞表面にHIV gp-120/41エンベロープ糖タンパク質を発現する。上記のモノクローナルまたは二重特異性IgM抗体ならびに適切な対照、例えば等価な抗HIV結合ドメインを保有するIgG抗体の連続希釈液を各細胞株とともにインキュベートし、洗浄して未結合抗体を除去し、次いで検出されるべき抗体のアイソタイプ、例えば、IgG、IgM、または抗体のκもしくはλ軽鎖に特異的な、蛍光色素で標識された二次抗体と混合する。インキュベーション後、モノクローナルまたは二重特異性抗体の結合をFACSCALIBUR(商標) (Becton Dickson)にてフローサイトメトリーにより分析する。
【０２５６】
実施例3: HIV特異的IgM結合分子によるHIVウイルス中和
インビトロHIVウイルス中和アッセイ法は、Richman et al., PNAS USA, 100(7): 4144-4149, 2003により記述されているものなどの、種々の標準的な技法を用いて行うことができる。
【０２５７】
このアッセイ法において、抗HIV抗体を、単一ラウンドの複製が可能なHIV偽ウイルスを用いることにより活性および効力について調べた。ホタルルシフェラーゼ指標遺伝子を組み入れたサブゲノムプラスミドpHIV-1lucΔu3と関心対象のHIV-1エンベロープタンパク質を発現する第2のプラスミドpCXASとをHEK293細胞に同時にトランスフェクションすることにより、1つまたは複数のHIV偽ウイルスが産生される。トランスフェクション後、偽ウイルスを収集し、37℃で1時間、試験すべき抗体の連続希釈液とともにインキュベートした。次いで、CD4に加えてCCR5およびCXCR4共受容体を発現するU87細胞に、陽イオンを添加しないでウイルス-抗体希釈液を接種した。感染細胞において発現されたルシフェラーゼ活性の量を測定することにより、接種72時間後にウイルス感染性を判定した。中和活性は、抗体陰性対照と比較した各抗体希釈液でのウイルス複製の阻害率(ルシフェラーゼ活性)として記述される: %阻害 = {1 - [ルシフェラーゼ + Ab/ルシフェラーゼ - Ab]} × 100。
【０２５８】
ウイルス中和アッセイ法の結果を図6に示す。分岐群A、B、C、D、F、G、AE、AG、CRF07-BCおよびCRF08-BCを含めウイルスのパネルに対してHIV02M+Jを試験した。HIV02M+Jは、試験した全てのウイルスを中和するのに成功し、10 μg/mLで75%〜100%の中和を示し、これらの臨床的に関連するHIV分岐群によって発現される異なるgp120タンパク質全てにHIV02M+Jが結合することを示した。無関係のアイソタイプ対照IgM+J抗体は、試験した偽ウイルスのいずれも中和しなかった(データは示していない)。
【０２５９】
実施例4: HIV特異的IgM結合分子によるT細胞活性化
二重特異性HIVxCD3抗体が抗原陽性標的細胞への結合時にT細胞を活性化できるかどうかを実証するために、以下のアッセイ法を行った。操作されたJurkat T細胞(Promega CS176403)およびgp120/gp41を発現するCHO-gp140細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI (Invitrogen)中で培養した。HIV02M、HIV02M+JおよびHIV02M+V10Jの連続希釈液を、白色384ウェルアッセイプレート中で20 μLの抗原発現細胞とともに37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。次いで、操作されたJurkat細胞(25000個)を混合物に添加して40 μLの最終容量とした。混合物を37℃、5% CO2で5時間インキュベートした。細胞混合物を次に、ルシフェリン(Promega, Cell Titer Glo)を含有する溶解用緩衝液20 μLと混合して、ルシフェラーゼレポーター活性の測定を可能にした。光出力をEnVisionプレート読取機により測定した。
【０２６０】
gp120特異的HIV02M、HIV02M+JおよびHIV02M+V10J抗体を調べる実験の結果を図7に示す。単一特異性HIV02MおよびHIV02M+J抗体は活性がなかったが、gp120xCD3二重特異性HIV02M+V10J抗体は用量依存的にT細胞活性化を引き起こした。
【０２６１】
PAGE分析により、HIV02M+V10Jのこの調製物が、未アセンブリおよび完全アセンブリIgMタンパク質の混合物を含むことが示唆された(図8, レーン2および8)。引き続いて、調製物を、TOSOH G4000 SWXLクロマトグラフィーカラムを備えたWaters 2695 HPLCシステムを利用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。カラムを、脱気した移動相(0.1 Mリン酸ナトリウム, 0.1 M硫酸ナトリウム pH 6.7)により45分間1 ml/分の流速および25℃の温度で平衡化させた。サンプルをろ過し、100 μlを15分間の実行時間に1 ml/分の流速で注入した。吸光度は、Waters EMPOWER(商標)ソフトウェアスイートを用いて280 nmでモニターし、それをクロマトグラムの生成と分析にも使用した。Waters Fraction Collector IIを用いて画分1 mLを集めた。その後、Spin X UF-6濃縮器(Corning, Ref# 431486)を用いて、集めた画分を濃縮し、20 mMクエン酸, 150 mM塩化ナトリウム, pH 6.0に緩衝液を交換した。
【０２６２】
HIV02M+V10J抗体の分析を図8に示す。非還元SDS未変性PAGEに基づいて、サイズ排除HPLCは、調製物を、精製された高分子量の、適切にアセンブリされたIgM HIV02M+V10J二重特異性物質(画分3および4)ならびに未アセンブリの、低分子量物質(画分5および6)に分離した。
【０２６３】
高度に精製されたHIV02M+V10Jによって誘発された抗原依存性T細胞活性化を図9に示す。このアッセイ法において、精製されたHIV02M+V10J抗体は、より高い活性化シグナルによって証明されるように、HIV02M+V10J出発物質よりも強力であった。
【０２６４】
実施例5: HIV特異的IgM結合分子の補体依存性細胞傷害
IgM表現型の抗体は、補体タンパク質C1qの効率的な関与を用いて、標的細胞に対する補体依存性細胞傷害(CDC)活性に影響を与えるのに特に適している。CDCを測定するため、表面にgp120を発現する組換え細胞を用いる(例えば、CHO-gp120、CHO-gp140、Jurkat-522 F/Y細胞またはgp140の膜固定型三量体形態を発現する哺乳類細胞、例えばJR-FL株(Go et al. 2015 J Virol 89:8245-8257))。標的細胞を洗浄し、細胞1.0×106個/mLの密度でCDCアッセイ用培地(RPMI 1640, 10%熱不活性化FBS)中に再懸濁し、10 μL/ウェルをNunc 384ウェル組織培養処理白色ポリスチレンプレートに添加する。例えば、五量体または六量体HIV結合分子、例えば、HIV02M、HIV02M+JまたはHIV02M+V10JのようなIgM抗体および適切な対照を含む試験抗体の連続3倍希釈液をアッセイ用培地中で調製し、10 μL/ウェルをアッセイプレートに添加し、プレートを5% CO2インキュベータ中37℃で2時間インキュベートして、オプソニン化を起こさせる。正常ヒト血清補体(Quidel)をアッセイ培地中で30%に希釈し、10 μL/ウェルをアッセイプレートに添加する。プレートを5% CO2インキュベータ中37℃で4時間インキュベートする。Cell Titer-Glo試薬(Promega)を使用のため融解し、15 μL/ウェルをアッセイプレートに添加する。プレートをプレート振盪機上で2分間穏やかに混合して細胞を溶解させ、次にEnVisionプレート読取機(Perkin-Elmer)で発光を測定する前に室温でさらに10分間混合する。バックグラウンドシグナルを差し引いた後に、抗体濃度に対して生存率をプロットし、GraphPad Prismを用いてEC50値を決定する。
【０２６５】
あるいは、慢性的にHIV感染した細胞株(例えば、CEM-IIIb)または潜在的に感染した細胞株(例えば、ACH2、Jl.l、OM10)を用いることができる。CEM-IIIb細胞は、その細胞表面にgp120/41 HIVエンベロープ糖タンパク質を構成的に発現するが、潜伏細胞株は活性化されて、HIV潜伏を示すgp120/41 HIVエンベロープ糖タンパク質を発現する。細胞を96ウェルプレート中に1ウェルあたり細胞50,000個で播種し、連続的に希釈した、本明細書において記述されたものなどのモノクローナル抗体または二重特異性抗体を添加し、次いでヒト血清補体(Quidel カタログ番号A113)を正常血清の10パーセントの終濃度まで添加する。反応混合物を37℃で4時間インキュベートする。Cell Titer Glo試薬(Promega カタログ番号G7572)を、各ウェルに存在する培地の容量に等しい容量で添加する。プレートを2分間振盪し、室温で10分間インキュベートし、その後にルミノメータで発光を測定する。
【０２６６】
実施例6: HIV特異的IgM結合分子によるHIV抗原発現細胞のT細胞指向性の殺傷
限定されるものではないが、HIV02M+V10Jのような二重特異性HIVxCD3抗体を、標的としてHIV+細胞を用いたT細胞依存性細胞傷害(TDCC)の誘導について試験する。使用される標的HIV+細胞は、その表面にgp120/gp41を組換え発現する細胞(例えば、CHO-gp140、CHO-gp160、Jurkat-522 F/Yもしくはgp140の膜固定型三量体形態を発現する哺乳類細胞、例えばJR-FL株(Go et al. 2015 J Virol 89:8245-8257))、慢性的に感染したCEM細胞(例えば、CEM-IIIb)または潜在的に感染した細胞株(例えば、ACH2、Jl.l、OM10)である。二重特異性HIVxCD3抗体を連続的に希釈し、さまざまな標的:エフェクター細胞比で標的細胞およびエフェクター細胞としての正常ドナー由来PBMCまたは精製/濃縮CD8+ T細胞と混合する。24〜72時間後、Cell titer glo (Promega)の添加によって細胞溶解または殺傷の量を分析し、その後にルミノメータで発光を測定する。
【０２６７】
あるいは、TDCC同時培養実験を、CD8+ T細胞急性リンパ芽球性白血病(TALL)細胞を用いて行うこともできる。gp120/pg41を発現する細胞(約6×103個の細胞)、例えば、CHO-gp140、CHO-gp160、Jurkat-522 F/Yもしくはgp140の膜固定型三量体形態を発現する哺乳類細胞、例えばJR-FL株(Go et al. 2015 J Virol 89:8245-8257))、慢性的に感染したCEM細胞(例えば、CEM-IIIb)または潜在的に感染した細胞株(例えば、ACH2、Jl.l、OM10)を、384ウェル黒色組織培養プレート上で1ウェルあたり10%熱不活性化FBSを補充したRPMI 1640培地の総容量45 μL中、異なる濃度の試験化合物、例えばHIVxCD3二重特異性抗体の存在下においてTALL細胞(ATCC CRL-11386) 3×104個と同時培養する。5% CO2インキュベータ中37℃で24時間のインキュベーション後、CytoTox-ONE基質試薬(Promega, G7891) 15 μLを各ウェルに添加して、死細胞から放出されるLDHのレベルを測定する。プレートを短時間振盪して試薬を混合し、その後、EnVisionプレート読取機(Perkin-Elmer)で蛍光シグナル(励起用485 nmおよび発光用615 nm)を測定する前に室温で90分間インキュベートする。次に、データをPrismソフトウェア(GraphPad)で分析してEC50を決定する。
【０２６８】
実施例7: HIV IgM結合分子によるHIV感染動物の処置
ヒトにおけるHIV-1感染の効果的な制御は、抗レトロウイルス治療(ART)薬の組み合わせを用いて達成される(Bartlett et al., AIDS 15(11): 1369-1377)。しかしながら、ARTが中止されると、短時間後にHIVウイルスが再出現または「リバウンド」し、少数の潜在的に感染した細胞が依然としてART処置個体に残存することを示唆するものである。この潜在的「リザーバー」は、HIV感染個体がその感染から治癒することに対する唯一最大の障害である。それゆえ、ARTによってHIV感染を検出可能なレベル以下に効果的に低減させてからの、HIV感染個体がその感染から治癒することをもたらしうる、潜在的に感染した細胞のリザーバーの標的化および殺傷にかなり関心が払われている。
【０２６９】
HIV潜伏のモデルは、HIV感染の治療法を開発することに向けた有望な取り組みとしてARTに加え免疫療法の組み合わせを分析し、ART中止後のウイルスのリバウンドを抑制または排除する可能性を判定するためにHorowitzら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(41):16538-43 and Klein et al., Nature 492(7427): 118-122 (2012))により用いられたヒト化BLTマウス(Denton et al., J Virol. 2012 Jan; 86(1):630-4 (2012))において記述されている。ヒト化マウスを8週齢時に、Klein et al. Nature 492(7427): 118-122 (2012によって記述されているようにヒトリンパ球の再構成についてスクリーニングする。測定可能なヒトリンパ球を有するマウスに、感染性HIV-1 YU2ウイルスを腹腔内注射し、定量的逆転写酵素PCRによって感染後2〜3週の時点でウイルス血症についてスクリーニングする。フマル酸テノホビルジソプロキシル(TDF; Gilead Sciences)、エムトリシタビン(FTC; Gilead Sciences)、ラルテグラビル(RAL; Merck)およびエファビレンツ(EFV; Bristol-Myers Squibb)の個々の錠剤を、すり鉢とすりこぎを用いて微粉末状に粉砕し、PBSに懸濁する。ART調製物を滅菌エッペンドルフ(Eppendorf)管に200 μLの用量に分注し、Denton et al. (2012)により報告された有効量に基づき、TDF、FTC、RALおよびEFVについてそれぞれ2.5、1.5、1.2および2.5 mg/マウスで経口胃管栄養法により毎日投与する。ヒト化YU2感染マウスの四(4)群は、経口胃管栄養法によりARTを0日目に5日間毎日受け始め、その後、群2、3および4は5日目に20 mg/kgで、それぞれHIV02G、HIV02MおよびHIV02M+V10Jを受け始める。群2、3および4は、5日目から42日目まで週2回、抗体療法を受け続ける。21日目に、全ての群でARTを終了する。HIV血漿ウイルス負荷、細胞関連HIV DNAおよびRNAを63日目までの試験期間を通じたさまざまな時点で判定して、潜伏期からのウイルスリバウンドの動態を判定する。同様に、他のヒト化マウスモデルを使用することもできる(Xhang & Su 2012 Cell. & Mol. Immunol. 9,237-244を参照のこと)。
【０２７０】
あるいは、インビボでの有効性の研究は、非ヒト霊長類において行うことができる。そのような慢性感染モデルの1つ(Barouch et al. 2013 Nature 503, 224-228)では、自発的ウイルス学的制御に関連するクラスI対立遺伝子Mamu-A＊01、Mamu-B＊08およびMamu-B＊17を発現しない特定病原体未感染アカゲザル(Macaca mulatta)が用いられる。感受性および抵抗性TRIM5α対立遺伝子について群のバランスを保つ。サル4〜5匹の群を無作為に割り付けて、ベースラインウイルス負荷のバランスを保つ。抗体投与9ヶ月前にアカゲザル由来SHIV-SF162P3高病原性攻撃ストック(challenge stock)を直腸内経路により動物に感染させる。二量体、五量体、または六量体HIV結合分子、例えば、HIV02M、HIV02M+JまたはHIV02M+V10JのようなIgM抗体、および適切な対照を、10 mg/kgまでの用量で静脈内経路により1回または2回サルに投与し、ウイルス負荷の評価のために週3回までサルに出血させる。あるいは、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子に加えて、抗レトロウイルス療法(例えばART)有りまたは無しで、感染したサルを処置する。抗レトロウイルス療法を中止したら、ウイルスのリバウンドを定量化する。同様に、感染したサルを抗レトロウイルス療法で処置し、中止したら、二量体、五量体、または六量体HIV結合分子で処置することができ、ウイルスのリバウンドを定量化する。
【０２７１】
本開示の広さおよび範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても制限されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されるべきである。
【図１】
2018512863.tif 000045
【図２Ａ】
2018512863.tif 000046
【図２Ｂ】
2018512863.tif 000047
【図２Ｃ】
2018512863.tif 000048
【図３−１】
2018512863.tif 000049
【図３−２】
2018512863.tif 000050
【図３−３】
2018512863.tif 000051
【図４】
2018512863.tif 000052
【図５】
2018512863.tif 000053
【図６】
2018512863.tif 000054
【図７】
2018512863.tif 000055
【図８】
2018512863.tif 000056
【図９】
2018512863.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月19日(2017.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512863000001.app
【国際調査報告】
2018512863.tif 000058
2018512863.tif 000059