(57)【要約】本開示は、癌の治療方法に関する。具体的には、本開示は、Ｒａｆ阻害剤をＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することによる癌の治療方法を提供する。本開示は、癌を患っている対象の治療方法に関し、本方法は、対象に、Ｒａｆキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びＡｕｒｏｒａキナーゼまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、該Ｒａｆキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。一部の［実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を患っている対象の治療方法であって、前記対象に、
（ｉ）Ｒａｆキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、
（ｉｉ）Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、を投与することを含み、前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩の量が、それらの組み合わせが前記癌の前記治療において治療的に有効であるものである、前記方法。
【請求項２】
前記癌が固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が再発性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が難治性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍が切除不能である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が以前に治療されたことがない、請求項１〜３、または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が転移性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が局所進行性である、請求項１〜２、４〜６、または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌がＢ−Ｒａｆ変異陽性癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌がＮＲＡＳ変異陽性癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、皮膚癌、眼癌、消化管癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、中枢神経系癌、喉頭癌、子宮頸癌、リンパ系癌、泌尿生殖器癌、骨癌、胆道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、及び結腸癌から選択される、請求項１〜２または４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が皮膚癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記皮膚癌が黒色腫である、請求項１３の記載の方法。
【請求項１５】
前記黒色腫がＢ−Ｒａｆ突然変異型黒色腫である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記黒色腫がＮＲＡＳ突然変異型黒色腫である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が消化管癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記消化管癌が胃癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が結腸癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記中枢神経系癌が脳腫瘍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤が、Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆキナーゼを阻害する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤が、野生型Ｂ−Ｒａｆ及びＶ６００Ｅ  Ｂ−Ｒａｆキナーゼを阻害する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤が、化合物Ａ：
【化４】
2018502089.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤が化合物Ａである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤が、アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤がアリセルチブナトリウムである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｒａｆキナーゼ阻害剤が非晶質である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
癌を患っている対象の治療方法であって、前記対象に、
（ｉ）化合物Ａ
【化５】
2018502089.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｉｉ）アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩と、を投与することを含み、前記化合物Ａ及びアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩の量が、それらの組み合わせが前記癌の前記治療において治療的に有効であるものである、前記方法。
【請求項３０】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩が、投薬当たり最大６００ｍｇの量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物Ａが、各投与間に６日間の休止期間を伴って週に１回（ＱＷ）投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩が、投薬当たり最大約２００ｍｇの量で投与される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩が、投薬当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの量で投与される、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩が、１日２回で与えられる投薬当たり約３０ｍｇ〜約５０ｍｇの量で投与される、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩が、２８日周期の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に投与される、請求項２９、または３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩が、２８日周期の３週間、３日投与され、４日休止される、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩が、２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に投与される、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩が、２８日周期の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に、投薬当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの量で投与され、アリセルチブが、２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に、投薬当たり約３０ｍｇ〜約５０ｍｇの量で１日２回投与される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本開示は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／０９６，０２０号からの優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、電子的に読み取り可能な形式で本明細書と共に提出される配列表を含む。電子配列表ファイルは２０１５年１２月２２日に作成され、名称は「ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、サイズは２１ｋｂである。ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ電子ファイル中の配列表の内容全体が、この参照により本明細書に参照に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、癌の治療方法に関する。具体的には、本開示は、Ｒａｆ阻害剤をＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することによる癌の治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
２０１２年、癌症例は世界中で推定１４１０万件あった。この数字は、２０３５年までに２４００万件に増加すると予測されている。癌は、依然として米国における２番目に一般的な死因であり、死亡件数のほぼ１／４を占める。２０１４年には、米国において、新たに診断される癌症例は推定１，６６５，５４０件となり、癌による死亡は５８５，７２０件となる。医学の進歩により癌生存率は改善されてきたが、新規かつより有効な治療が継続的に必要とされている。
【０００５】
癌は、無制御な細胞再生を特徴とする。無制御な細胞再生は、細胞分裂、分化、及びアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの脱調節に起因する。有糸分裂は、一連の複雑な事象が２つの娘細胞への染色体分離の忠実度を確実にする細胞周期における一段階である。有糸分裂の進行は、有糸分裂キナーゼによって媒介されるタンパク質分解及びリン酸化事象によって大部分が調節される。Ａｕｒｏｒａキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ａｕｒｏｒａ  Ａ、Ａｕｒｏｒａ  Ｂ）は、中心体分離、紡錘体動態、紡錘体集合チェックポイント、染色体整列／分裂、及び細胞質分裂の調整を通して有糸分裂の進行を調節する。Ａｕｒｏｒａキナーゼの過剰発現及び／または増幅は、結腸及び乳房の腫瘍型を含むいくつかの腫瘍型における腫瘍形成と関連付けられている。更に、腫瘍細胞におけるＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害は有糸分裂停止及びアポトーシスをもたらし、これらのキナーゼが癌療法のための重要な標的であるであることを示唆する。
【０００６】
タンパク質キナーゼも、細胞再生プロセスにおいて重要な役割を担う。かかるキナーゼの部分的かつ非限定的なリストには、ａｂ１、ＡＴＫ、ｂｃｒ−ａｂ１、Ｂｌｋ、Ｂｒｋ、Ｂｔｋ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｍｅｔ、ｃ−ｓｒｃ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃＲａｆ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＲＫ、Ｆａｋ、ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、Ｆｇｒ、ＦＬＫ４、ｆｌｔ−１、Ｆｐｓ、Ｆｒｋ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＮＳ−Ｒ、Ｊａｋ、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ、ＰＫＣ、ＰＹＫ２、ｒｏｓ、ｔｉｅ１、ｔｉｅ２、ＴＲＫ、Ｙｅｓ、及びＺａｐ７０が含まれる。哺乳動物生物学において、かかるタンパク質キナーゼは、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を含む。
【０００７】
ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、細胞外シグナルを核へと中継して、遺伝子発現及び主要な細胞機能を調節するキナーゼカスケードで構成される。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路によって制御される遺伝子発現は、増殖、分化、アポトーシス、及び血管新生を含む基本的な細胞プロセスを調節する。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達のこれらの幅広い役割が、様々な型の癌において異常に活性化される。この経路内の遺伝子における突然変異は、構成的活性化タンパク質につながり、細胞増殖及びアポトーシスへの抵抗性の増加をもたらし得る。
【０００８】
Ｒａｆ（セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ）は、３つのＲａｆアイソフォームメンバー（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、及びＡ−Ｒａｆ）を提供する３つの遺伝子で構成される遺伝子ファミリーによってコードされる。これらのタンパク質の各々は、カルボキシ末端にて高度に保存されたアミノ末端調節領域及び触媒ドメインを共有する。各アイソフォームがＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路において役割を担うが、Ｂ−ＲａｆがＭＥＫの主な活性化因子であることが示されている。Ｂ−Ｒａｆは、Ｒａｓ：ＧＴＰによって細胞内細胞膜に集められ、ここでＢ−Ｒａｆが活性化される。かわって、Ｂ−ＲａｆはＭＥＫ１／２の活性化に関与し、ＭＥＫ１／２はＥＲＫ１／ＥＲＫ２を活性化する。Ｂ−Ｒａｆ遺伝子における突然変異により、Ｂ−Ｒａｆは、上流シグナルとは無関係にシグナル伝達することが可能となる。結果として、突然変異Ｂ−Ｒａｆタンパク質（Ｖ６００Ｅなど）は、ＭＥＫ及びＥＲＫの過剰な下流シグナル伝達を引き起こす。これが、過剰な細胞増殖及び生存ならびに腫瘍形成につながる。突然変異Ｂ−Ｒａｆによるシグナル伝達カスケードの過剰活性化は、複数の悪性腫瘍に関連付けられてきた。Ｂ−Ｒａｆ特異的阻害剤（ベムラフェニブなど）は実際に、突然変異Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅを発現する黒色腫の治療として有望であるが、耐性疾患の台頭への懸念が増大している。
【０００９】
したがって、より有効な治療レジメンが開発され得るならば有益であろう。Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異よりも多くのＲａｆタンパク質のアイソフォームを阻害する活性なＲａｆ阻害剤との組み合わせは、癌の治療に有用であり得、更には特定の抗癌剤への耐性を克服する可能性があり得る。具体的には、Ｒａｆ阻害剤のＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤との組み合わせが、特に有効である可能性がある。Ｒａｆ阻害剤のＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤との組み合わせは、相加的、または更には相乗的な治療効果を有し得る。このため、併用療法を含む新たな治療レジメンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、癌を患っている対象の治療方法に関し、本方法は、対象に、Ｒａｆキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びＡｕｒｏｒａキナーゼまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、該Ｒａｆキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。一部の実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態では、癌はＢ−Ｒａｆ変異陽性癌である。一部の実施形態では、癌はＮＲＡＳ変異陽性癌である。一部の実施形態では、癌は、皮膚癌、眼癌、消化管癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、中枢神経系癌、喉頭癌、子宮頸癌、リンパ系癌、泌尿生殖器癌、骨癌、胆道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、及び結腸癌から選択される。一部の実施形態では、Ｒａｆキナーゼ阻害剤は、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤はアリセルチブナトリウムである。
【００１１】
本開示は、癌を患っている対象の治療方法に関し、本方法は、対象に、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩、及びアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、該化合物Ａ及びアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。一部の実施形態では、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩は、投薬当たり最大６００ｍｇの量で、各投与間に６日間の休止期間を伴って週に１回（ＱＷ）投与され、アリセルチブまたはその薬学的に許容される塩は、１日２回与えられる投薬当たり約３０ｍｇ〜約５０ｍｇの量で、２８日周期の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫異種移植辺モデル（ＮＲＡＳ突然変異型）における単独投与及びアリセルチブとの併用投与による１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＱＤでの化合物Ａについての経時的な平均腫瘍体積を示すグラフである。
【図２】ＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫異種移植辺モデル（ＮＲＡＳ突然変異型）における単独投与及びアリセルチブとの併用投与による５０．０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷでの化合物Ａについての経時的な平均腫瘍体積を示すグラフである。
【図３】Ａ３７５黒色腫異種移植辺モデル（Ｂ−Ｒａｆ突然変異型）における単独投与及びアリセルチブとの併用投与による１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＱＤでの化合物Ａについての経時的な平均腫瘍体積を示すグラフである。
【図４】Ａ３７５黒色腫異種移植辺モデル（Ｂ−Ｒａｆ突然変異型）における単独投与及びアリセルチブとの併用投与による５０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷでの化合物Ａについての経時的な平均腫瘍体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、癌の治療のための新たな併用療法を提供する。具体的には、本開示は、癌を患っている対象の治療方法を提供し、本方法は、対象に、（ｉ）活性剤としてＲａｆ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第１の組成物と、（ｉｉ）活性剤としてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物とを投与することを含み、該活性剤の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。
【００１４】
本明細書で使用される用語は、別途示されない限り、以下の定義された意味が与えられる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「Ｒａｆキナーゼ」という用語は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼのファミリーのうちのいずれか１つを指す。本ファミリーは、３つのアイソフォームメンバー（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、及びＡ−Ｒａｆ）で構成される。Ｒａｆタンパク質キナーゼは、細胞外シグナルを核へと中継して、遺伝子発現及び主要な細胞機能を調節するキナーゼカスケードで構成されるＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与する。文脈によって別途示されない限り、「Ｒａｆキナーゼ」という用語は、非限定的に含む任意の種からの任意のＲａｆキナーゼタンパク質を指すことを意図される。一態様では、ＲａｆキナーゼはヒトＲａｆキナーゼである。
【００１６】
「Ｒａｆ阻害剤」または「Ｒａｆの阻害剤」という用語は、変異形態を含むセリン／トレオニンタンパク質キナーゼＲａｆの１つ以上のアイソフォームメンバー（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、及び／またはＡ−Ｒａｆ）と相互作用することができる化合物を表すように使用される。Ｒａｆ変異形態には、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９１、及び／またはＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａが含まれる。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｒａｆキナーゼは、少なくとも約少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％阻害される。一部の実施形態では、Ｒａｆキナーゼ活性を５０％低減するのに求められるＲａｆキナーゼ阻害剤の濃度は、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満である。
【００１８】
一部の実施形態では、かかる阻害剤は、１つ以上のＲａｆアイソフォームに選択的であり、これは即ち、Ｒａｆ阻害剤が、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的であるということである。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ（野生型）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋに選択的である。
【００２０】
「汎Ｒａｆ阻害剤」という用語は、Ｒａｆタンパク質のＢ−Ｒａｆアイソフォーム以外のものも阻害するＲａｆ阻害剤である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「Ａｕｒｏｒａキナーゼ」という用語は、有糸分裂の進行に関与する関連するセリン／トレオニンキナーゼのファミリーのいずれか１つを指す。細胞分裂において役割を担う様々な細胞タンパク質は、Ａｕｒｏｒａキナーゼ酵素によるリン酸化のための基質であり、ヒストンＨ３、ｐ５３、ＣＥＮＰ−Ａ、ミオシンＩＩ調節軽鎖、タンパク質ホスファターゼ−１、ＴＰＸ−２、ＩＮＣＥＮＰ、スルビビン、トポイソメラーゼＩＩアルファ、ビメンチン、ＭＢＤ−３、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、デスミン、Ａｊｕｂａ、ＸＩＥｇ５（アフリカツメガエル中）、Ｎｄｃ１０ｐ（出芽酵母中）、及びＤ−ＴＡＣＣ（ショウジョウバエ中）を含むが、これらに限定されない。Ａｕｒｏｒａキナーゼ酵素自体も、例えばＴｈｒ２８８での自己リン酸化のための基質である。文脈によって別途示されない限り、「Ａｕｒｏｒａキナーゼ」という用語は、Ａｕｒｏｒａ  Ａ、Ａｕｒｏｒａ  Ｂ、及びＡｕｒｏｒａ  Ｃを含むがこれらに限定されない、任意の種からの任意のＡｕｒｏｒａキナーゼタンパク質を指すことを意図される。一態様では、Ａｕｒｏｒａキナーゼは、Ａｕｒｏｒａ  ＡまたはＢである。一態様では、Ａｕｒｏｒａキナーゼは、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼである。
【００２２】
「Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤」または「Ａｕｒｏｒａキナーゼの阻害剤」という用語は、Ａｕｒｏｒａキナーゼと相互作用し、その酵素活性を阻害することができる化合物を表すように使用される。キナーゼ酵素活性を阻害するとは、Ａｕｒｏｒａキナーゼが基質ペプチドまたはタンパク質をリン酸化する能力を低減することを意味する。一部の実施形態では、かかるＡｕｒｏｒａキナーゼ活性の低減は、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％である。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ酵素活性を低減するのに求められるＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満である。
【００２３】
一部の実施形態では、かかる阻害剤は選択的である。即ち、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、Ａｕｒｏｒａキナーゼが、別の無関係の生物学的効果、例えば、異なるキナーゼの酵素活性の低減を産出するのに求められる阻害剤の濃度を下回る濃度にて基質ペプチドまたはタンパク質をリン酸化する能力を低減する。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、別のキナーゼの酵素活性も低減する。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、癌に関与する別のキナーゼの酵素活性を低減する。
【００２４】
「約」という用語は、本明細書において、約、その領域内、大まかに、またはおよそを意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用されるとき、これは、説明される数値の上下にその境界を拡張させることによって、その範囲を修正する。一般的に、「約」という用語は、本明細書において、１０％の変動で、明記される値を超える、及びそれ未満の数値を修飾するために使用される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）が、これに限定されない」を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、及び「治療すること」という用語は、対象が患っている癌に対する全範囲の介入、例えば、癌の１つ以上の症状を緩和、遅延、阻止、または反転するため、及び癌が実際に排除されない場合でも癌の進行を遅延させるための組み合わせの投与を含むことが意味される。治療は、例えば、症状の重症度、症状の数、または再発の頻度における減少、例えば、腫瘍成長の阻害、腫瘍成長の停止、または既に存在している腫瘍の退縮を含み得る。
【００２７】
併用療法に言及するために本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、組み合わせた効果が所望の生物学的または医学的応答を引き出す、即ち、標的の癌細胞を破壊するか、あるいは対象における癌の進行を遅延または停止させるように、共に摂取される薬剤の組み合わせの量を意味する。例えば、併用療法に言及するために本明細書で使用される「治療有効量」は、治療周期中の同じ日または異なる日に連続的または同時に共に投与されるときに有益な組み合わせた効果を有する、Ｒａｆ阻害剤の量及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の量であり得る。一部の実施形態では、組み合わせた効果は相加的である。一部の実施形態では、組み合わせた効果は相乗的である。更に、当業者であれば、治療有効量を用いた併用療法の場合、上の例のように、阻害剤の量及び／またはＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の量は、個々に治療的に有効である場合もそうでない場合もあることを認識することになる。
【００２８】
薬剤の細胞に対する効果に関する「細胞毒性効果」は、細胞の殺滅を意味する。「細胞毒性効果」は、細胞増殖の阻害を意味する。「細胞毒性剤」は、細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有することにより、細胞集団内の細胞を、それぞれ、枯渇させるか、またはその成長を阻害する薬剤を意味する。
【００２９】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物を意味し、「哺乳動物」にはヒトが含まれるが、これに限定されない。一部の実施形態では、対象は、本開示の方法に従う治療の開始前に、薬剤、例えば、Ｒａｆ阻害剤またはＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤によって治療を受けている。一部の実施形態では、対象は、癌の発症またはその再発を経験する危険にある。
【００３０】
別途明記しない限り、本明細書に示される構造は、１つ以上の同位体濃縮原子の存在だけが異なる化合物を含むことを意味する。例えば、重水素もしくはトリチウムによる水素原子の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素原子の置換を除く、本発明の構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。
【００３１】
本明細書に記載のある特定の化合物が互変異性形態で存在してもよく、全てのかかる化合物の互変異性形態が本開示の範囲内であることは、当業者には明らかとなる。別途明記しない限り、本明細書に示される構造は、その構造の全ての立体化学形態、即ち、各不斉中心についてのＲ及びＳ配置を含むことも意味する。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体、ならびに光学異性体及びジアステレオマーの混合物が本発明の範囲内である。
【００３２】
Ｒａｆキナーゼの活性を阻害することができる化合物が、本開示の方法において使用され得る。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆを阻害する。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄ、Ａ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、及びＣ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｄに選択的である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｋに選択的である。
【００３３】
具体的には、Ｒａｆ阻害剤には、本明細書に記載の化合物、ならびに例えば、ＷＯ  ２００６／０６５７０３、ＷＯ  ２０１０／０６４７２２、ＷＯ  ２０１１／１１７３８１、ＷＯ  ２０１１／０９０７３８、ＷＯ  ２０１１／１６１２１６、ＷＯ  ２０１１／０９７５２６、ＷＯ  ２０１１／０２５９２７、ＷＯ  ２０１１／０２３７７３、ＷＯ  ２０１１／１４７７６４、ＷＯ  ２０１１／０７９１３３、及びＷＯ  ２０１１／０６３１５９に開示の化合物が含まれる。Ｒａｆ阻害剤には、ベムラフィニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、ダブラフェニブ、及びエンコラチニブ（ｅｎｃｏｒａｔｉｎｉｂ）が含まれる。これらの化合物のいずれかの溶媒和及び水和形態も、本開示の方法における使用に好適である。これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、及びかかる塩の溶媒和及び水和形態も、本開示の方法における使用に好適である。これらのＲａｆ阻害剤は、上記の参照文献中で詳細に説明されている合成方法を含む、有機合成分野の当業者には周知のある数の方法で調製することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は低分子量化合物である。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は汎Ｒａｆ阻害剤である。具体的には、汎Ｒａｆ阻害剤には、化合物Ａ、ならびに例えば、ＷＯ  ２００９／００６３８９、ＷＯ２００６／０６５７０、及びＵＳ  ２０１３／０２５２９７７（ＤＰ−４９７８）に開示の化合物が含まれる。
【００３５】
Ｒａｆ阻害剤は、Ｒａｆキナーゼに結合するかつ／または阻害するその能力についてインビトロまたはインビボでアッセイすることができる。インビトロアッセイとしては、化合物がＲａｆキナーゼの酵素活性を阻害する能力を定量化するための方法としてＲａｆキナーゼによるＭＥＫのリン酸化を測定するための生化学ＦＲＥＴアッセイが含まれる。化合物も、Ｒａｆキナーゼ活性によって媒介される細胞または生理機能に影響するその能力についてアッセイすることができる。例えば、インビトロアッセイは、癌細胞における蛍光体−ＥＲＫの量を定量化する。これらの活性の各々についてのアッセイは、当該技術分野で既知である。
【００３６】
一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、（Ｒ）−２−（１−（６−アミノ−５−クロロピリミジン−４−カルボキサミド）エチル）−Ｎ−（５−クロロ−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル）チアゾール−５−カルボキサミド（化合物Ａ）またはその薬学的に許容される塩である。
【００３７】
【化１】
2018502089.tif 000003
化合物Ａは、ＷＯ  ２００９／００６３８９に記載されている。
【００３８】
Ａｕｒｏｒａキナーゼの酵素活性を阻害することができる化合物が、本開示の方法において使用され得る。具体的には、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤には、本明細書に記載の化合物、ならびに例えば、ＷＯ  ０５／１１１０３９、ＵＳ  ２００５／０２５６１０２、ＵＳ  ２００７／０１８５０８７、ＷＯ  ０８／０２１０３８、ＵＳ  ２００８／００４５５０１、ＷＯ  ０８／０６３５２５、ＵＳ  ２００８／０１６７２９２、ＷＯ  ０７／１１３２１２、ＥＰ  １６４４３７６、ＵＳ  ２００５／００３２８３９、ＷＯ  ０５／００５４２７、ＷＯ  ０６／０７０１９２、ＷＯ  ０６／０７０１９８、ＷＯ  ０６／０７０２０２、ＷＯ  ０６／０７０１９５、ＷＯ  ０６／００３４４０、ＷＯ  ０５／００２５７６、ＷＯ  ０５／００２５５２、ＷＯ  ０４／０７１５０７、ＷＯ  ０４／０５８７８１、ＷＯ  ０６／０５５５２８、ＷＯ  ０６／０５５５６１、ＷＯ  ０５／１１８５４４、ＷＯ  ０５／０１３９９６、ＷＯ  ０６／０３６２６６、ＵＳ２００６／０１６０８７４、ＵＳ２００７／０１４２３６８、ＷＯ  ０４／０４３９５３、ＷＯ  ０７／１３２２２０、ＷＯ  ０７／１３２２２１、ＷＯ  ０７／１３２２２８、ＷＯ  ０４／００８３３、及びＷＯ  ０７／０５６１６４に開示の化合物が含まれる。これらの化合物のいずれかの溶媒和及び水和形態も、本開示の方法における使用に好適である。これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、及びかかる塩の溶媒和及び水和形態も、本開示の方法における使用に好適である。これらのＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、上記の参照文献中で詳細に説明されている合成方法を含む、有機合成分野の当業者には周知のある数の方法で調製することができる。
【００３９】
一部の実施形態では、本選択的Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は低分子量化合物である。具体的には、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤には、本明細書に記載の化合物、ならびに例えば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ  ２００８／００４５５０１、ＵＳ  ７，５７２，７８４、ＷＯ  ０５／１１１０３９、ＷＯ  ０８／０２１０３８、ＵＳ  ７，７１８，６４８、ＷＯ  ０８／０６３５２５、ＵＳ  ２００８／０１６７２９２、ＵＳ  ８，０２６，２４６、ＷＯ  １０／１３４９６５、ＵＳ  ２０１０／０３１０６５１、ＷＯ  １１／０１４２４８、ＵＳ  ２０１１／００３９８２６、及びＵＳ  ２０１１／０２４５２３４に開示の化合物、４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸ナトリウム、ＫＷ−２４４９（Ｋｙｏｗａ）、ＥＮＭＤ−２０７６（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、及びＭＫ−５１０８（Ｖｅｒｔｅｘ／Ｍｅｒｃｋ）が含まれる。
【００４０】
Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼに選択的に結合するかつ／または阻害するその能力についてインビトロまたはインビボでアッセイすることができる。インビトロアッセイには、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼが基質タンパク質またはペプチドをリン酸化する能力の選択的な阻害を決定するためのアッセイが含まれる。代替的なインビトロアッセイは、化合物がＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼに選択的に結合する能力を定量化する。選択的阻害剤結合は、結合前の阻害剤を放射性標識し、阻害剤／Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ複合体を単離し、結合した放射性標識の量を決定することによって測定し得る。あるいは、選択的阻害剤結合は、新たな阻害剤を既知の放射性リガンドに結合したＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼと共にインキュベートする競合実験を行うことによって決定してもよい。化合物も、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ活性によって媒介される細胞または生理機能に影響するその能力についてアッセイすることができる。Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼと比較したＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼへの選択性を評定するために、阻害剤を、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼについて上に記載したものと類似のアッセイを使用して、Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼに特異的に結合するかつ／または阻害するその能力についてインビトロ及びインビボでアッセイすることもできる。阻害剤は、ｐＨｉｓＨ３の免疫蛍光検出によって、Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼの阻害が存在しない中でＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼを阻害するその能力について、インビトロ及びインビボでアッセイすることができる。（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００７）１０４，４１０６）。これらの活性の各々についてのアッセイは、当該技術分野で既知である。
【００４１】
一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸（式（Ｉ）の（アリセルチブ（ＭＬＮ８２３７））、またはその薬学的に許容される塩である。
【化２】
2018502089.tif 000004
【００４２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の薬学的に許容される塩は、式（ＩＩ）の４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸ナトリウム、またはその血漿形態である。
【化３】
2018502089.tif 000005
【００４３】
一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸ナトリウムである。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸ナトリウム一水和物である。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／０１６７２９２、ＵＳ  ８，０２６，２４６、及びＵＳ  ２０１１／０２４５２３４に記載の４−｛［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ｝−２−メトキシ安息香酸ナトリウム多形形態２である。
【００４４】
一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤と接触させた細胞の成長は、接触させていない細胞の成長と比較して少なくとも約５０％遅延する。一部の実施形態では、接触させた細胞の細胞増殖は、接触させていない細胞と比較して少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％阻害される。一部の実施形態では、「細胞増殖を阻害する」という語句は、接触させていない細胞と比較した、接触させた細胞の数の低減を含む。このため、Ｒａｆ阻害剤、及び接触させた細胞において細胞増殖を阻害するＡｕｒｏｒａキナーゼの阻害剤は、接触させた細胞に、増殖遅延、増殖停止、プログラム細胞死（即ち、アポトーシス）、または壊死細胞死を受けさせ得る。
【００４５】
別の態様では、本開示は、ｉ）Ｒａｆ阻害剤、及びｉｉ）Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。本開示は、癌の治療のための新たな併用療法を提供する。具体的には、本開示は、癌を患っている対象の治療方法を提供し、本方法は、対象に、（ｉ）活性剤としてＲａｆ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第１の組成物と、（ｉｉ）活性剤としてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物とを投与することを含み、該活性剤の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。
【００４６】
一部の実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態では、癌は再発性である。一態様では、再発癌は、癌が検出されなかった期間の後で再来した癌である。
【００４７】
一部の実施形態では、癌は難治性である。一態様では、難治性癌は癌治療に応答せず、これは抵抗性癌としても知られる。一部の実施形態では、腫瘍は切除不能である。一態様では、切除不能な腫瘍は、手術によって除去することができない。一部の実施形態では、癌は以前に治療されたことがない。一部の実施形態では、癌は局所進行性である。一態様では、「局所進行性」とは、多少広範囲に及ぶが未だ１つのエリアに限定されている癌を指す。一部の場合には、「局所進行性」は、手術のみで除去することを困難にする、広がってはいないが付近の臓器または組織を侵している小型腫瘍を指し得る。一部の実施形態では、癌は転移性である。一態様では、転移性癌は、それが始まった身体部分（原発部位）から他の身体部分に広がった癌である。
【００４８】
一部の実施形態では、癌はＢＲＡＦ変異陽性癌である。本明細書で使用される場合、「ＢＲＡＦ」または「Ｂ−Ｒａｆ」は、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００４３２４、配列番号３をコードする、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３３３、配列番号１（オープンリーディングフレームは配列番号２、配列番号１のヌクレオチド６２〜２３６２）に指定されるｍＲＮＡ配列と関する遺伝子である、Ｂ−Ｒａｆ癌原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼを指す。Ｂ−Ｒａｆの他の名称としては、ｒａｆＢ１及びヌーナン症候群７（ＮＳ７）が挙げられる。Ｂ−Ｒａｆは、セリン／トレオニンキナーゼとして機能し、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の調節に役割を担い、染色体７ｑに見出すことができる。
【００４９】
一部の実施形態では、癌はＢ−Ｒａｆ変異陽性癌である。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異は、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、またはＶ６００Ｋ突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異はＶ６００Ｅである。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異はＶ６００Ｄである。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異はＶ６００Ｋである。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異はＶ６００Ｅ＋Ｔ５２９１である。一部の実施形態では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異はＶ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａである。「Ｖ６００Ｅ突然変異」は、６００のアミノ酸位置でのバリンのグルタミン酸による置換を意味する。Ｔ５２９Ｉは、トレオニンからイソロイシンへのＢ−Ｒａｆゲートキーパー突然変異であり、Ｇ４６８Ａは、エクソン１１におけるＧ１４０３ＣでのＢ−Ｒａｆ２次突然変異である。「Ｖ６００Ｋ突然変異」は、６００のアミノ酸位置でのバリンのリジンによる置換を意味する。「Ｖ６００Ｄ突然変異」は、６００のアミノ酸位置でのバリンのアスパラギン酸による置換を意味する。Ｖ６００Ｋ突然変異は、バリン（Ｖ）からリジン（Ｋ）への、Ｂ−Ｒａｆにおける６００位でのアミノ酸置換をもたらす。Ｖ６００Ｋ突然変異は、バリン（Ｖ）からリジン（Ｋ））へのＢ−Ｒａｆにおける６００位でのアミノ酸置換をもたらす。
【００５０】
一部の実施形態では、癌はＮＲＡＳ変異陽性癌である。本明細書で使用される場合、「ＮＲＡＳ」または「Ｎ−Ｒａｓ」は、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００２５１５、配列番号６をコードする、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５２４、配列番号４（オープンリーディングフレームは配列番号５、配列番号７のヌクレオチド２５５〜８２４）に指定されるｍＲＮＡ配列と関する遺伝子である、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス性（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子相同体を指す。Ｎ−Ｒａｓの他の名称としては、リンパ球増殖性症候群ＩＶ型（ＡＬＰＳ４）、ＮＲＡＳ１、及びヌーナン症候群６（ＮＳ６）が挙げられる。Ｎ−Ｒａｓは、ＧＴＰアーゼ活性を有する癌遺伝子として機能し、染色体１ｐ上に見出され得る。Ｎ−Ｒａｓは、細胞骨格を通したそのシグナル伝達機能、及び細胞接着に対する作用を実行する、細胞膜、ならびにＲａｆ及びＲｈｏＡなどの様々なエフェクタータンパク質と相互作用する（Ｆｏｔｉａｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．２７：６７４２−６７５５）。
【００５１】
一部の実施形態では、癌はＮＲＡＳ変異陽性癌である。一態様では、ＮＲＡＳ突然変異は、Ｑ６１Ｒ突然変異である。
【００５２】
本開示は、癌を患っている対象の治療方法を提供する。一部の実施形態では、癌は、皮膚癌、眼癌、消化管癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、中枢神経系癌、喉頭癌、子宮頸癌、リンパ系癌、泌尿生殖器癌、骨癌、胆道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、及び結腸癌から選択される。一部の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ではない。一部の実施形態では、癌は、皮膚癌、眼癌、消化管癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、喉頭癌、子宮頸癌、リンパ系癌、泌尿生殖器癌、骨癌、胆道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、及び結腸癌から選択される。
【００５３】
一部の実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、及び骨髄異形成症候群から選択される。
【００５４】
一部の実施形態では、癌は、癌甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び結腸癌から選択される。一部の実施形態では、癌は、黒色腫または結腸癌である。
【００５５】
一部の実施形態では、癌は皮膚癌である。一部の実施形態では、皮膚癌は黒色腫である。一部の実施形態では、黒色腫はＢ−Ｒａｆ突然変異型黒色腫である。一部の実施形態では、黒色腫はＮＲＡＳ突然変異型黒色腫である。
【００５６】
一部の実施形態では、癌は消化管癌である。本明細書で使用される場合、「消化管癌」は、食道、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌としても知られる）、胆管系、膵臓、小腸、大腸、直腸、及び肛門の癌を含む。一部の実施形態では、消化管癌は、食道の腺癌、胃食道接合部の腺癌、または胃の腺癌である。一部の実施形態では、消化管癌は胃癌である。一部の実施形態では、癌は結腸癌である。結腸癌は、結腸直腸（ＣＲＣ）、腸、または直腸癌としても知られる。
【００５７】
一部の実施形態では、癌は中枢神経系癌である。一部の実施形態では、中枢神経系癌は脳腫瘍である。
【００５８】
一部の実施形態では、甲状腺癌は甲状腺癌腫である。
【００５９】
一部の実施形態では、泌尿生殖器癌は膀胱癌である。
【００６０】
Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、それらが癌の治療において相乗効果を提供するような方法で投与される。投与は、投与が所望の治療効果、即ち相乗効果を提供することを条件に、任意の好適な手段によることができる。一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、療法の同じ周期中、例えば、療法の１周期中、例えば、３または４週間の間に投与され、Ｒａｆキナーゼ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の両方が対象に投与される。
【００６１】
一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、対象に周期的に投与される。周期的療法は、一定期間の第１の薬剤（例えば、第１の予防薬または治療薬）の投与、及びそれに続く一定期間の第２の薬剤及び／または第３の薬剤（例えば、第２及び／または第３の予防薬または治療薬）の投与、及びこの連続投与の繰り返しを伴う。周期的療法は、療法のうちの１つ以上への抵抗性の発達を低減し、療法のうちの１つの副作用を回避もしくは低減し、かつ／または治療の有効性を改善し得る。
【００６２】
一部の実施形態では、薬剤が投与される治療期間の後は特定の期間の無治療期間が続き、この間、治療薬は対象に投与されない。この無治療時間の後は、同じかまたは異なる期間に渡る同じかまたは異なる頻度の後続の治療及び無治療期間が続き得る。一部の実施形態では、治療及び無治療期間は交互に行われる。周期的療法における治療の期間は、対象が完全寛解または部分寛解を達成するまで継続してもよく、この達成時に治療を停止し得ることが理解される。あるいは、周期的療法における治療の期間は、対象が完全寛解または部分寛解を達成するまで継続してもよく、この達成時に治療の期間を特定の数の周期に渡って継続してもよい。一部の実施形態では、治療の期間は、対象の応答とは無関係に特定の数の周期であり得る。一部の他の実施形態では、治療の期間は、対象が再発を起こすまで継続してもよい。
【００６３】
Ｒａｆ阻害剤の量または好適な用量は、治療される状態の重症度の性質、特定の阻害剤、投与経路、ならびに個々の対象の年齢、体重、全体的な健康、及び応答を含む、ある数の因子に依る。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆ、及び／またはＢ−ＲａｆＶ６００Ｅの阻害を達成するレベルである。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、及び／またはＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅの阻害を達成するレベルである。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、腫瘍退縮、または疾患進行、無進行生存、もしくは全生存の他の標準的な測定によって測定した場合に治療応答を達成するレベルである。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、治療応答を達成し、なおかつ治療薬の投与と関連付けられるいずれの副作用も最低限に抑えるレベルである。
【００６４】
Ｒａｆキナーゼの阻害剤の好適な１日用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、単剤としての最大耐量の約１０％〜約１００％の範囲であり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約１５％〜約１００％である。一部の一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約２５％〜約９０％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約３０％〜約８０％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約４０％〜約７５％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約４５％〜約６０％である。一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、または約１１０％である。
【００６５】
Ｒａｆ阻害剤の好適な用量は昼夜を問わず何時にでも摂取され得ることが理解される。一部の実施形態では、好適な用量のＲａｆ阻害剤の選択的阻害剤は、朝に摂取される。一部の他の実施形態では、好適な用量のＲａｆ阻害剤は、晩に摂取される。一部の他の実施形態では、好適な用量のＲａｆ阻害剤は、朝晩両方に摂取される。好適な用量のＲａｆ阻害剤は食物と一緒にまたは別に摂取してもよいことが理解される。一部の実施形態では、好適な用量のＲａｆ阻害剤は、食事と一緒に摂取される。一部の実施形態では、好適な用量のＲａｆ阻害剤は、空腹時に摂取される。
【００６６】
本開示は、癌を患っている対象の治療方法を提供し、本方法は、対象に、（ｉ）活性剤として化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を含む第１の組成物と、（ｉｉ）活性剤としてアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物とを投与することを含み、該活性剤の量は、それらの組み合わせが癌の治療において治療的に有効であるものである。一部の実施形態では、化合物Ａは、各投与間に６日間の休止期間を伴って週に１回（ＱＷ）投与される。Ｒａｆ阻害剤、例えば、化合物Ａの好適な週間用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、週に１回（ＱＷ）、最大約１５００ｍｇから変動し得る。ＱＷは、各投与間に６日間の休止期間を伴う投薬を意味する。一部の実施形態では、化合物Ａは、単回投薬として投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは、分割投薬として投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは、同日の分割投薬として投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは、複数回投薬で投与される。各投与間に６日間の休止期間を伴って週に１回の投薬当たり最大約１０００ｍｇからの好適な週間用量。化合物Ａの他の好適な週間用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、週に１回、投薬当たり約２００ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、化合物Ａの好適な週間用量は、投薬当たり最大６００ｍｇである。化合物Ａの他の好適な週間用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、約４００ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約４００ｍｇ〜約９００ｍｇである。一部の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約５００ｍｇ〜約９００ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約４００ｍｇ〜約６００ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約２００ｍｇ〜約５００ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約２００ｍｇ〜約３００ｍｇである。一部の実施形態では、好適な週間用量は、週に１回、投薬当たり約２００ｍｇ、３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、または約９００ｍｇである。
【００６７】
一部の実施形態では、化合物Ａは、投薬当たり最大約２００ｍｇから投与される。Ｒａｆ阻害剤、例えば、化合物Ａの好適な週間用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、投薬当たり最大約２００ｍｇから変動し得る。一部の実施形態では、化合物Ａは、単回投薬として投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは、分割投薬として投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは、複数回投薬で投与される。化合物Ａの他の好適な用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、投薬当たり約５０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であり得る。化合物Ａの他の好適な用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、投薬当たり約７５ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、投薬当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な用量は、１日２回、約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇである。一部の実施形態では、好適な用量は、投薬当たり約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１５５ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１８５ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１９５ｍｇ、または約２００ｍｇである。一部の実施形態では、化合物Ａの好適な用量は、投薬当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇである。
【００６８】
対象に投与されるＲａｆ阻害剤の用量は、投与頻度にも依ることになる。一部の実施形態では、化合物Ａは、各投与間に６日間の休止期間を伴って週に１回（ＱＷ）投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは毎日投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは隔日で投与される。一部の実施形態では、化合物Ａは２８日周期で投与され、これにおいて化合物Ａは、２８日周期の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に投与される。
【００６９】
所望の治療効果を提供する他のＲａｆ阻害剤用量または投与頻度が本開示における使用に好適であることが、当業者には容易に明らかとなる。
【００７０】
Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤の量または好適な用量は、治療される状態の重症度の性質、特定の阻害剤、投与経路、ならびに個々の対象の年齢、体重、全体的な健康、及び応答を含む、ある数の因子に依る。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、皮膚有糸分裂指数の増加もしくは腫瘍有糸分裂細胞における染色体整列及び紡錘体二極性の減少によって、または癌患者における有効露出量の他の標準的な測定によって測定した場合に、有効露出量を達成するレベルである。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、腫瘍退縮、または疾患進行、無進行生存、もしくは全生存の他の標準的な測定によって測定した場合に治療応答を達成するレベルである。一部の実施形態では、好適な用量レベルは、治療応答を達成し、なおかつ治療薬の投与と関連付けられるいずれの副作用も最低限に抑えるレベルである。
【００７１】
Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤の好適な１日用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、単剤としての最大耐量の約１０％〜約１００％の範囲であり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約１５％〜約１００％である。一部の一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約２５％〜約９０％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約３０％〜約８０％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約４０％〜約７５％である。一部の他の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約４５％〜約６０％である。一部の実施形態では、好適な用量は、単剤としての最大耐量の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、または約１１０％である。
【００７２】
Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤の好適な用量は昼夜を問わず何時にでも摂取され得ることが理解される。一部の実施形態では、好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、朝に摂取される。一部の他の実施形態では、好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、晩に摂取される。一部の他の実施形態では、好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、朝晩両方に摂取される。好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は食物と一緒にまたは別に摂取してもよいことが理解される。一部の実施形態では、好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、食事と一緒に摂取される。一部の実施形態では、好適な用量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、空腹時に摂取される。
【００７３】
アリセルチブの好適な１日用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、１日当たり約２０ｍｇ〜約１２０ｍｇの範囲であり得る。アリセルチブの他の好適な１日用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、１日当たり約３０ｍｇ〜約９０ｍｇの範囲であり得る。アリセルチブの他の好適な１日用量は、一般に、単回または分割または複数回投薬で、１日当たり約４０ｍｇ〜約８０ｍｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬当たり約１０ｍｇ〜約５０ｍｇである。一部の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬当たり約３０ｍｇ〜約５０ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬当たり約４０ｍｇ〜約５０ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬当たり約３０ｍｇ〜約４０ｍｇである。一部の他の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬当たり約２５ｍｇ〜約４０ｍｇである。一部の実施形態では、好適な用量は、１日当たり約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、または約１２０ｍｇである。ある特定の他の実施形態では、好適な用量は、１日２回与えられる投薬あたり約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、または約６０ｍｇである。一部の実施形態では、アリセルチブの好適な用量は、１日２回与えられる投薬あたり約４０ｍｇである。一部の実施形態では、アリセルチブの好適な用量は、１日２回与えられる投薬あたり約３０ｍｇである。一部の実施形態では、アリセルチブの好適な用量は、１日２回与えられる投薬あたり約３５ｍｇである。一部の実施形態では、アリセルチブの好適な用量は、１日２回与えられる投薬あたり約５０ｍｇである。
【００７４】
一部の実施形態では、第１の量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤が投与される第１の治療期間の後、同じまたは異なる量のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの同じまたは異なる選択的阻害剤が投与される別の治療期間を続けることができる。第２の治療期間の後は、他の治療期間を続けることができる。治療及び無治療期間の間に、１つ以上の追加の治療薬が対象に投与され得る。
【００７５】
一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、４週周期（例えば、２８日）の３週間、３日投与され、４日休止される。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、２８日周期で投与され、これにおいてＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に投与される。一部の実施形態では、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、２８日周期で１日２回投与され、これにおいてＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に投与される。一部の実施形態では、アリセルチブは、２８日周期で１日２回投与され、これにおいてＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に投与される。
【００７６】
Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａ  ａキナーゼ阻害剤の投与は、投与が所望の治療効果を提供することを条件に、同じ日または異なる日であることができる。本開示の一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤の投与は同じ日となる。本開示の一部の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤及びＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤の投与は同じ日及び／または異なる日となり、例えば、化合物Ａが２８日周期の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に投与され、アリセルチブが２８日周期の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に投与される。代替的な治療周期が、それらが所望の結果を生む限り、本開示に包含される。
【００７７】
Ａｕｒｏｅｒａ  Ａキナーゼ阻害剤は、単一の剤形または別個の剤形でＲａｆ阻害剤と共に投与してもよい。別個の剤形として投与する場合、Ｒａｆ阻害剤は、本開示のＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ阻害剤の投与前、投与時、または投与後に投与し得る。
【００７８】
一部の実施形態では、有益な量の本治療薬の投与は、１日２回で与えられる投薬当たり約３０〜約５０ｍｇの量（アリセルチブの量として測定）で２８日の治療周期中の１、２、３、８、９、１０、１５、１６、及び１７日目に行われるアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩の投与と組み合わせた、投薬当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの量（化合物Ａの測定量）で２８日の治療周期中の１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、及び２６日目に行われる化合物Ａの投与を包含する。一部の実施形態では、治療薬の有益な量は相乗的量である。一部の実施形態では、治療薬の有益な量は相加的量である。
【００７９】
一部の実施形態では、癌を患っている対象の治療方法は、ある量の化合物Ａとある量のアリセルチブまたはその薬学的に許容される塩との治療有効量の組み合わせを該対象に投与することを含む。これらの癌対象としては、Ｂ−Ｒａｆ突然変異を伴う黒色腫対象、ベムラフェニブまたは他のＢ−Ｒａｆ阻害剤に失敗した黒色腫対象、Ｎ−Ｒａｓ突然Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う黒色腫患者、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う結腸直腸癌対象、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う卵巣癌対象、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う肺癌対象、Ｎ−Ｒａｓ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴うＡＭＬ対象、Ｎ−Ｒａｓ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う肝臓癌対象、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥまたはＮ−Ｒａｓ突然変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う甲状腺癌対象、Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う膵臓癌、Ｂ−Ｒａｆ野生型を伴う胆道癌対象が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本開示は、癌を患っている対象における治療への応答期間の延長方法を提供し、本方法は、対象に、（ｉ）活性剤としてＲａｆ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第１の組成物と、（ｉｉ）活性剤としてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物とを投与することを含み、該活性剤の量は、それらの組み合わせが応答期間の延長に有効であるものである。
【００８１】
Ｒａｆ阻害剤は、当業者に既知の任意の方法によって投与することができる。例えば、Ｒａｆ阻害剤は、一部の実施形態では本明細書に記載のものなどのＲａｆ阻害剤及び薬学的に許容される担体の薬学的組成物として、第１の組成物の形態で投与することができる。一部の実施形態では、第１の組成物は、２０１４年３月２６日出願の米国仮特許出願第６１／９７０，５９５号及びＷＯ  ２０１５／１４８８２８に記載のような固体分散体押出成形物である。一部の実施形態では、第１の組成物は、ビニルピロリジノン−酢酸ビニルコポリマー及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む固体分散体押出成形物である。一部の実施形態では、コポリマーは、コポビドン（ｃｏｐｏｖｉｄｏｎｅ）、例えば、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４である。一部の実施形態では、第１の組成物は非晶質である。
【００８２】
Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、当業者に既知の任意の方法によって投与することができる。例えば、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤は、第２の組成物の形態、一部の実施形態では本明細書に記載のものなどのＡｕｒｏｒａ  Ａキナーゼの選択的阻害剤及び薬学的に許容される担体の薬学的組成物で投与することができる。一態様では、薬学的組成物は、経口投与に好適である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、腸溶性コーティングをされた錠剤などの経口投与用の錠剤である。かかる錠剤は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ  ２０１０／０３１０６５１に記載されている。一部の他の実施形態では、薬学的組成物は、経口投与用の液体剤形である。かかる液体剤形は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ  ２０１１／００３９８２６に記載されている。一部の実施形態では、これらの組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の治療薬を更に含む。
【００８３】
Ｒａｆ阻害剤またはＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の薬学的に許容される塩がこれらの組成物において利用される場合、塩は、好ましくは無機または有機の酸または塩基に由来する。好適な塩の概説については、例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９（１９７７）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００を参照されたい。
【００８４】
好適な酸付加塩の非限定な例としては、以下、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、ルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。
【００８５】
好適な塩基付加塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ｔ−ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、及びコリンなどの有機塩基を有する塩、アルギニン、リシンなどのアミノ酸を有する塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
また、塩基性窒素含有基は、例えば、メチル、エチル、プロピル、及びブチル塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの低級ハロゲン化アルキル；例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル硫酸塩などの硫酸ジアルキル；例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリル塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物；例えば、ベンジル及びフェネチル臭化物などのハロゲン化アラルキル、ならびにその他のものなどの薬剤を用いて、四級化してもよい。それにより、水または油溶性または分散性生成物が得られる。
【００８７】
「薬学的に許容される担体」という用語は、レシピエント対象に適合する物質を指す。一態様では、対象は哺乳動物である。一態様では、対象はヒトである。一態様では、物質は、薬剤の活性を終結させずに、活性剤を標的部位に送達するのに好適である。担体に関係する毒性または有害作用は、もしあるとすれば、好ましくは、活性薬剤の意図される使用に対して妥当なリスク対効果比に見合うものである。
【００８８】
「担体」、「アジュバント」、または「ビヒクル」という用語は、本明細書で互換的に使用され、所望される特定の剤形に好適である、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、及び他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、滑沢剤、ならびに同様物を含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００は、薬学的に許容される組成物の製剤化において使用される様々な担体、及びその既知の調製技法を開示している。一切の望ましくない生物学的効果を産生すること、あるいは薬学的に許容される組成物の任意の他の構成要素（複数可）と有害な様式で相互作用することなどによって、任意の従来の担体培地が本開示の化合物と適合しない場合を除いて、その使用は、本開示の範囲内にあると企図される。薬学的に許容される担体としての働き得る物質のいくつかの例は、イオン交換体と、アルミナと、ステアリン酸アルミニウムと、レシチンと、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質と、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、グリシン、ソルビン酸塩、またはソルビン酸カリウムなどの緩衝剤物質と、飽和植物脂肪酸、水、発熱物質を含有しない水、塩、または硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、及び亜鉛塩などの電解質、コロイドシリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、ラクトース、グルコース、スクロースなどの糖と、コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、トラガント末の部分グリセリド混合物と、麦芽と、ゼラチンと、タルクと、カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤と、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及びダイズ油などの油と、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのグリコールと、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステルと、寒天と、アルギン酸と、等張生理食塩水と、リンゲル液と、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、及びグリセロールなどのアルコールと、シクロデキストリンと、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と、鉱物油及びワセリンなどの石油炭化水素と、を含むが、これらに限定されない。着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤、ならびに酸化防止剤もまた、製剤者の判断に従って、組成物中に存在し得る。
【００８９】
本発明の薬学的組成物は、数ある中でも、従来の造粒、混合、溶解、カプセル化、凍結乾燥、または乳化プロセスなどの、当該技術分野で既知である方法によって製造することができる。組成物は、顆粒剤、沈殿物、または微粒子、凍結乾燥された、回転乾燥された、もしくは噴霧乾燥された粉末を含む粉末、非晶質粉末、錠剤、カプセル、シロップ剤、坐剤、注射、乳剤、エリキシル剤、懸濁剤、または溶液を含む、様々な形態で産出され得る。製剤は、任意選択で、所望される特定の剤形に好適なように、溶媒、希釈剤、及び他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、表面活性剤、ｐＨ調整剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、安定剤及び保存剤、固形結合剤、滑沢剤、ならびに同様物を含んでもよい。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、哺乳動物への薬学的投与のために製剤化される。一態様では、ヒトへの薬学的投与のため。本開示のかかる薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸的に、経鼻的に、口腔に、腟に、または移植されたリザーバを介して投与され得る。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射または注入技法を含む。好ましくは、組成物は、経口、静脈内、または皮下投与される。本開示の製剤は、短時間作用性、速放性、または長時間作用性であるように設計されてもよい。また更に、化合物は、全身的な方法よりもむしろ、腫瘍部位での投与（例えば、注射による）などの局所的な方法で投与することができる。
【００９１】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロ乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、シクロデキストリン、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及び脂肪酸エステルソルビタンなどの可溶化剤及び乳化剤、ならびにこれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤以外に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤などのアジュバントも含むことができる。
【００９２】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁剤は、好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して既知の技術に従って製剤化され得る。無菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、無菌の注射可能な溶液、懸濁剤、または乳剤であり得る。用いてもよい許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張食塩水がある。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒として慣習的に用いられる。この目的のためには、合成モノ−またはジグリセリドを含む、任意のブランドの固定油を用いることができる。更に、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用される。注入可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルタに通してろ過することにより、または使用前に無菌水もしくは他の注入可能な無菌培地中に溶解または分散され得る無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。非経口投与のために製剤化される組成物は、ボーラス注射または定時プッシュによって注射してもよく、または継続的注入によって投与してもよい。
【００９３】
本開示の化合物の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅らせることが望ましい場合がある。これは、水溶性の低い結晶または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって達成し得る。こうして化合物の吸収速度はその溶解速度に依存し、これは今度は結晶の大きさ及び結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与される化合物形態の遅延吸収は、化合物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する化合物の比及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に化合物を捕捉することによって調製される。
【００９４】
直腸または膣投与用組成物は、好ましくは、囲温度では固体であるが体温で液体であるために直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐薬ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤または担体と本開示の化合物を混合することによって調製することができる坐剤である。
【００９５】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、及び顆粒剤が挙げられる。かかる固体剤形において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体、ならびに／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸などの充填剤もしくは増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンもしくはタピオカデンプンなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、ならびにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの滑沢剤と混合される。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、剤形はまた、リン酸塩または炭酸塩などの緩衝剤を含んでもよい。
【００９６】
類似した型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量のポリエチレングリコール、及び同様物の賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、薬学的製剤分野において周知の腸溶性コーティング及び他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製され得る。それらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また腸管のある特定の部分にのみ、またはその部分に選択的に、任意選択で遅延された様式で、活性成分（複数可）を放出する組成物であることもできる。使用することができる埋封組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。類似した型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量のポリエチレングリコール、及び同様物の賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
【００９７】
活性化合物はまた、上述の１つ以上の賦形剤を有するマイクロカプセル化形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、薬学的製剤分野で周知の腸溶性コーティング、放出制御コーティング、及び他のコーティングなどのコーティング及び殻を用いて調製することができる。かかる固体剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。慣行であるように、かかる剤形はまた、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースなどの錠剤化滑沢剤及び他の錠剤化補助剤を含み得る。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。それらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また腸管のある特定の部分にのみ、またはその部分に選択的に、任意選択で遅延された様式で、活性成分（複数可）を放出する組成物であることもできる。使用することができる埋封組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。
【００９８】
本開示の化合物の局所または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、噴霧、吸入剤、またはパッチが挙げられる。活性成分は、薬学的に許容される担体及び必要に応じて任意の求められる保存剤または緩衝剤と無菌条件下で混合される。眼科用製剤、点耳薬、及び点眼薬もまた、本開示の範囲内にあることが企図される。更に、本開示は、身体への化合物の制御された送達を提供する更なる利点を有する経皮パッチの使用を企図する。かかり剤形は、適当な培地内に化合物を溶解または分配することによって作製することができる。吸収増強剤を使用して、皮膚を横切る化合物の流動を増加させることもできる。速度は、速度制御膜を提供することによって、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させることによってのいずれかで、制御することができる。
【００９９】
本開示の方法における使用のための組成物は、投与の簡便性及び用量の均一性のために単位剤形で製剤化してもよい。「単位剤形」という表現は、本明細書で使用される場合、治療すべき対象にとって適切な薬剤の物理的に別個の単位を指す。しかしながら、本開示の化合物及び組成物の１日の合計使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解される。非経口投与用の単位剤形は、アンプルまたは多用量容器中にあってもよい。
【０１００】
本開示は、キットを含み、本キットは、（ｉ）活性剤としてＲａｆ阻害剤またはその薬学的に塩を含む第１の組成物、及び（ｉｉ）活性剤としてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物、ならびに第２の組成物と組み合わせた第１の組成物を投与するための説明書を含む。
【０１０１】
本開示は、キットを含み、本キットは、対象における癌を治療するために使用されるとき、（ｉ）活性剤としてＲａｆ阻害剤またはその薬学的に塩を含む第１の組成物、及び（ｉｉ）活性剤としてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の組成物、ならびに第２の組成物と組み合わせた第１の組成物を投与するための説明書を含む。
【０１０２】
ベムラフェニブ（Ｒｏｃｈｅ）は、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異を伴う黒色腫患者の治療のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された。より最近では、ダブラフェニブ（Ｂ−Ｒａｆ阻害剤）及びトラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）が、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ陽性黒色腫を持つ患者のために認可された。両薬物は、第３相試験において化学療法と比較して平均無進行生存期間を顕著に改善した。しかしながら、ベムラフィニブによる場合のように、これらの応答は短命であるとされる（Ｌａｎｃｅｔ（２０１２；３８０：３５８−３６５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６７：１０７−１１４）。多くの他の標的化療法と同様、Ｂ−Ｒａｆ阻害への獲得抵抗性は、この患者集団における長期的な生存利益に対して治療的課題を提示する。
【０１０３】
Ｂ−Ｒａｆ阻害剤の利益を改善するため、黒色腫細胞を発現している突然変異型Ｂ−Ｒａｆをベムラフェニブに対して抵抗性にする機序を特定するための研究が続けられている。最近の研究は、ＭＡＰＫ経路の再活性化が、Ｂ−Ｒａｆ阻害に対する抵抗の機序であることを示した。抵抗性機序は、主に、Ｒａｓ／Ｒａｆ依存性のいずれかであるバイパス機序を通したＥＲＫシグナル伝達の再活性化、例えば、Ｎ−Ｒａｓ活性化（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０，４６８：９７３−７）、Ｈ−Ｒａｓ活性化（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，３６６：２０７−２１５）、またはＣ−Ｒａｆ上方調節（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０，４６８：９６８−７２、Ｍｏｎｔａｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，６８：４８５３−６１）、異常にスプライシングされたＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅの変異型（Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１，４８０：３８７−３９０、またはＲａｓ／Ｒａｆ依存性（Ｔｐｌ２／ＣＯＴ過剰発現）Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０，４６８：９６８−７２を伴う。その結果、複数の機序が、Ｂ−Ｒａｆ阻害がＢ−Ｒａｆ突然変異型癌におけるＭＡＰＫシグナル経路に与える影響を弱力化し得る。Ｂ−Ｒａｆ阻害に対する抵抗性を引き起こし得るＢ−Ｒａｆのゲートキーパー突然変異（Ｔ５２９Ｉ）は未だ臨床的に特定されていないが、かかる突然変異は抵抗性を引き起こすことが実験的に実証されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１０，２（３５）：ｒａ４１）。最近研究はまた、ＩＧＦ−１ＲまたはＰＤＧＦＲβなどのＲＴＫによるＭＡＰＫ余剰シグナル伝達経路の活性化が、Ｂ−Ｒａｆ阻害に対する獲得抵抗性における役割を担い得ることを示した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０，４６８：９７３−７、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１０，１８：  ６８３−９５、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１，７１：５０６７−７４）。ＭＡＰＫ再活性化がこれらの抵抗性機序の多くに関与することは明らかである。汎Ｒａｆ阻害剤は、ＭＡＰＫ再活性化を遮断すると予期される。
【０１０４】
加えて、ベムラフェニブ及びそのクローン類似体Ｎ−［３−（５−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル］プロパン−１−スルホンアミド（ＰＬＸ４７２０、市販の選択的Ｂ−Ｒａｆ阻害剤）を含むＢ−Ｒａｆ特異的阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ  野生型背景における他のＲａｆアイソフォームとの二量化を通した奇異性の経路活性化を誘導することが実証された（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４：４３１−４３５、Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４：４２７−４３０、Ｈｅｉｄｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１０，１４０：２０９−２２１）。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆ野生型の結合及びＢ−Ｒａｆ−Ｃ−Ｒａｆ二量化の刺激を通してＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を活性化すると考えられる。Ｂ−Ｒａｆ特異的阻害によるこの奇異性の経路活性化は、ベムラフェニブによる治療を受けた一部の黒色腫患者における皮膚の副作用（扁平上皮細胞癌など）の主な理由であると考えられる。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆ野生型遺伝的背景を持つ癌患者の治療には認可されておらず、これは、この遺伝的背景におけるその奇異性の経路活性化に起因する。
【０１０５】
化合物Ａは、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、及びＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ突然変異を含むＲａｆタンパク質のアイソフォームを阻害するＲａｆキナーゼ阻害剤である（実施例１を参照）。その汎Ｒａｆ活性に起因して、化合物Ａは、共にＢ−Ｒａｆ野生型遺伝的背景を持つＮ−Ｒａｓ突然変異及びＫ−Ｒａｓ突然変異などの上流シグナル伝達によるＭＡＰＫ経路活性化を伴う腫瘍細胞に対して活性である。このため、化合物Ａは、Ｂ−Ｒａｆ突然変異（黒色腫、結腸直腸、肺、卵巣、及び甲状腺癌腫など）またはＮ−Ｒａｓ突然変異、Ｂ−Ｒａｆ野生型（黒色腫、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、肝臓癌など）を伴う癌患者の治療に有望である（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２００７，７：２９５、Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１１，１１：７６１）。化合物Ａはまた、ベムラフェニブに対する抵抗性を発達させた黒色腫腫瘍細胞に対しても活性である。このため、化合物Ａは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤との組み合わせで、ベムラフェニブまたは他のＢ−Ｒａｆ阻害剤に失敗した皮膚癌患者に対して有効であると考えられる。
【０１０６】
本開示は、癌を患っている対象を本明細書に記載の薬学的組成物によって治療するかどうかの決定方法に関し、該方法は、
ａ）腫瘍細胞を含む対象試料中の遺伝子突然変異と関連付けられる少なくとも１つ以上のＢ−ＲａｆまたはＮ−Ｒａｓマーカーの少なくとも１つの特徴を測定することと、
ｂ）ステップａ）で測定した少なくとも１つの特徴が、本薬学的組成物による治療時の結果について参考になるかどうかを特定することと、
ｃ）この参考になる特徴が、腫瘍細胞が本薬学的組成物による治療に好都合な結果を示すＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ突然変異状態を持つ少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むことを示す場合に、対象を本薬学的組成物によって治療すると決定することと、を含む。
【０１０７】
本開示は、癌を患っている対象を、対象に本明細書に記載の薬学的組成物を投与することによって治療する方法に関し、該方法は、
ａ）腫瘍細胞を含む対象試料中の遺伝子突然変異と関連付けられる少なくとも１つ以上のＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓマーカーの少なくとも１つの特徴を測定することと、
ｂ）ステップａ）で測定した少なくとも１つの特徴が、本薬学的組成物による治療時の結果について参考になるかどうかを特定することと、
ｃ）この参考になる特徴が、腫瘍細胞が本薬学的組成物による治療に好都合な結果を示すＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ突然変異状態を持つ少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むことを示す場合に、対象を本薬学的組成物によって治療すると決定することと、を含む
【０１０８】
本開示は、癌と診断された対象における薬学的組成物による治療の薬理的有効性の増加した可能性の決定方法に関し、該方法は、対象からの癌（腫瘍）試料からの核酸試料をＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ突然変異試験またはＰＣＲに供することを含み、Ｂ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在は、治療の薬理学的有効性の増加した可能性を示す。
【０１０９】
本開示は、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することによる癌を患っている対象の治療方法に関し、該方法は、対象からの癌（腫瘍）試料からの核酸試料をＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ突然変異試験またはＰＣＲに供することを含み、Ｂ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在は、治療の薬理学的有効性の増加した可能性を示す。
【０１１０】
本開示は、癌を有する対象の治療方法に関し、該方法は、
ｉ）該対象からの癌試料からの核酸試料を得ることと、
ｉｉ）試料をＢ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ突然変異試験またはＰＣＲに供することと、
Ｂ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓにおける少なくとも１つの突然変異の存在を特定することと、
本明細書に記載の有効量の薬学的組成物を、Ｂ−Ｒａｆ及び／またはＮ−Ｒａｓ遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在が特定される試料が由来する対象に投与することと、を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、マーカーにおける突然変異は、核酸、例えば、マーカー遺伝子、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子と相関する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質、例えば、Ｂ−ＲａｆまたはＮ−Ｒａｓの配列決定によって特定することができる。核酸を配列決定するためのいくつかの配列決定方法が当該技術分野で既知である。核酸プライマーを、可能性のある突然変異部位を含む領域に結合するように設計することができ、あるいは野生型配列ではなく突然変異型配列を補完するように設計することができる。プライマー対は、マーカー遺伝子における可能性のある突然変異を含む領域を括るように設計することができる。プライマーまたはプライマー対は、マーカー遺伝子に対応するＤＮＡの一方または両方の鎖の配列決定に使用することができる。プライマーを、プローブ、例えば、核酸プローブ、例えば、ハイブリダイゼーションプローブと併用して、配列決定の前に目的の領域を増幅し、マーカー遺伝子における突然変異の検出のための配列量をブーストすることができる。配列決定し得る領域の例としては、遺伝子全体、遺伝子の転写産物、及び遺伝子または転写産物の断片、例えば、エクソンもしくは非翻訳領域、または変異部位を含むマーカーの部分のうちの１つ以上が挙げられる。プライマー選択及び配列または組成物分析を対象にする突然変異の例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって管理されているＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ（ｄｂＧａＰ）、及びＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって管理されているＣａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベース中のＣａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓなどの、突然変異情報を収集する公的なデータベースにおいて見出すことができる。
【０１１２】
配列決定方法は当業者に既知である。方法の例としては、Ｓａｎｇｅｒ法、ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）法、及びＮｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）法が挙げられる。電気泳動、例えば、キャピラリー電気泳動を使用してプライマー伸長標識化ＤＮＡ断片を分離することを含むＳａｎｇｅｒ法は、ハイスループット用途に対して自動化することができる。プライマー伸長配列決定は、目的の領域のＰＣＲ増幅後に行うことができる。ソフトウェアが配列ベースコール及び突然変異特定を支援し得る。ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）配列決定分析（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、目的位の特定の断片の実際の質量を予測質量と比較して突然変異を特定する質量分析法である。ＮＧＳ技術（「超並列配列決定」及び「第２世代配列決定」とも呼ばれる）は、概して、従来の方法よりもはるかに高いスループットを提供し、様々なアプローチを使用する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８：９５−１０９、及びＳｈｅｎｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｌｅｅ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：１１３５−１１４５において概説されている）。ＮＧＳ法は、試料中のマーカーにおける頻度の低い突然変異を特定することができる。一部のＮＧＳ法（例えば、ＧＳ−ＦＬＸ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴを参照）、Ｇｅｎｏｍｅ分析器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＬＩＤ（商標）分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ．００７（Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））は、環状アレイ配列決定を、フローセル及び様々なスキームにおいて空間的に分離されたＰＣＲ産物のクローン性増幅を用いてまたは用いずに使用して、配列決定酵素（例えば、ポリメラーゼまたはリガーゼ）によって組み込まれる標識した修飾ヌクレオチドを検出する。１つのＮＧＳ法においては、プライマー対をＰＣＲ反応で使用して目的の領域を増幅することができる。増幅された領域は、連結した産物にライゲーションすることができる。クローンライブラリがＰＣＲまたはライゲーション産物からフローセル中で生成され、これは、ポリメラーゼが、標識された塩基の同一性に応じて、４つのチャネルのうちの１つにおいて撮像される標識された可逆的に末端処理された塩基を加えるときに、シングルエンド配列決定のために更に増幅され（「ブリッジ」または「クラスター」ＰＣＲ）、その後、次のサイクルのために除去される。ソフトウェアが、突然変異を特定するためのゲノム配列との比較を支援し得る。別のＮＧＳ法は、ゲノム中の全遺伝子のエクソンの配列決定に焦点を当てるエクソーム配列決定である。他のＮＧＳ法と同じように、エクソンは、捕捉方法または増幅方法によって強化することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ、例えば、野生型または突然変異型マーカーに対応するゲノムＤＮＡは、当該技術分野で既知の方法を使用して生体試料においてインサイツとインビトロとの両方によって分析することができる。ＤＮＡは、試料から直接単離するか、あるいは別の細胞成分、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質を単離した後で単離し得る。ＤＮＡ単離用キット、例えば、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）が利用可能である。ＤＮＡは、かかるキットを使用して増幅することもできる。
【０１１４】
別の実施形態では、マーカーに対応するｍＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法を使用して生体試料においてインサイツとインビトロとの両方によって分析することができる。多くの発現検出本法は単離されたＲＮＡを使用する。インビトロ法については、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技法を腫瘍細胞からのＲＮＡの精製に利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を参照）。加えて、多数の組織試料を、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一段階ＲＮＡ単離プロセス（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者に周知の技法を使用して容易に処理することができる。ＲＮＡは、標準的な手順（例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９を参照）、溶液（例えば、トリゾール、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ、米国特許第５，３４６，９９４号を参照）、またはキット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｇｒｏｕｐ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）単離キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはＬＥＵＫＯＬＯＣＫ（商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｂｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して単離することができる。
【０１１５】
追加のステップを用いてＲＮＡ試料からＤＮＡを除去してもよい。細胞融解は非イオン系界面活性剤によって達成され、この後マイクロ遠心分離を続け、核、つまり細胞ＤＮＡの大部分を除去することができる。続いて、ＤＮＡ分析のためにＤＮＡを核から単離し得る。一実施形態では、ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン融解、続いてＲＮＡをＤＮＡから分離するためのＣｓＣｌ遠心分離を使用して、目的の様々な種類の細胞から抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−９９）。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡがオリゴ−ｄＴセルロースによる選択によって選択される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。あるいは、ＲＮＡのＤＮＡからの分離は、有機抽出によって、例えば、ホットフェノールまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて達成することができる。所望の場合、ＲＮＡｓｅ阻害剤を融解緩衝液に添加してもよい。同様に、ある特定の細胞型については、タンパク質変性／消化ステップをプロトコルに加えることが望ましい場合がある。多くの用途に対しては、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの他の細胞ＲＮＡに対してｍＲＮＡを強化することが望ましい。大部分のｍＲＮＡは、その３’末端にてポリ（Ａ）尾部を含む。これにより、それらを親和性クロマトグラフィーによって、例えば、セルロースまたはＳＥＰＨＡＤＥＸ．Ｒ（商標）培地などの固体支持体にカップリングしたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を使用して、強化することができるようになる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。結合させたら、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％のＳＤＳを使用して親和性カラムから溶出させる。
【０１１６】
例えば、試験対象から試料（例えば、腫瘍生検）を得た後での試料中のマーカーの特徴は、例えば核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）及び／または翻訳されたタンパク質の、例えばマーカーまたは複数のマーカーの特徴を検出または測定するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評定することができる。かかる方法の非限定的な例としては、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法が挙げられ、かつ任意選択で、ミスマッチ、即ち、突然変異または変形領域を短くするための「ミスマッチ切断」ステップ（Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）及び結果として得られる短くなった断片からの突然変異または変異の分離及び特定、核酸逆転写法、ならびに核酸増幅法及び増幅産物の分析が挙げられる。これらの方法には、遺伝子アレイ／チップ技術、ＲＴ−ＰＣＲ、例えばＧＬＰによって認可された研究室条件下でのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、インサイツハイブリダイゼーション、免疫組織化学、免疫ブロット、ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション）、ＦＡＣＳ分析、ノーザンブロット、サザンブロット、ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＤＮＡ分析Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、定量的ＰＣＲ、細菌人工染色体アッセイ、一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、または細胞遺伝学的分析が含まれる。
【０１１７】
２つの核酸間で少なくとも１つのヌクレオチドの差異を検出するための技法の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、既知の多形ヌクレオチドが中央に配置され（アレルまたは突然変異体特異的プローブ）、続いて完全マッチが見つかる場合にのみハイブリダイゼーションを許可する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを調製することができる（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０、及びＷａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３５４３）。かかるアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技法は、Ｎ−Ｒａｓの異なる多型領域または変異領域におけるいくつかのヌクレオチド変化の同時検出に使用することができる。例えば、特定のアレル変異体または突然変異体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを、固体支持体、例えば、ハイブリダイゼーション膜に結合させ、この支持体、例えば、膜を、その後、標識された試料核酸とハイブリダイズさせる。このようにして、ハイブリダイゼーションシグナルの分析により、試料核酸のヌクレオチドの同一性を明らかにすることができる。
【０１１８】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を表す。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本開示の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法、デバイス、及び物質を本明細書で説明する。本明細書で触れる全ての出版物は、例えば、本開示と関連して使用され得る出版物において報告される物質及び手順を説明及び開示する目的で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１９】
【表Ａ】
2018502089.tif 000006
実施例１：精製したＲａｆキナーゼアイソフォームによるキナーゼ阻害アッセイ
化合物Ａのキナーゼ活性を、ＷＯ  ２００９／００６３８９に記載のように生化学的蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して決定した。突然変異型Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、野生型Ｂ−Ｒａｆ、及び野生型Ｃ−Ｒａｆキナーゼについての化合物Ａの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を以下で表１に示す。化合物Ａは、Ｂ−Ｒａｆキナーゼの不活性ＤＦＧ−ｏｕｔ構成に結合する。
【表１】
2018502089.tif 000007
【０１２０】
実施例２：ＮＲＡＳ突然変異型ＳＫ−ＭＥＬ−２ヒト黒色腫異種移植片モデルにおけるインビボの腫瘍効能
生後８週の雌の無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、インビボの継代で増殖させた３０〜４０ｍｇの腫瘍断片を右側腹部にＳＣ接種した。腫瘍成長をノギスを用いて監視し、腫瘍体積を、式（０．５×［長さ×幅２］）を使用して算出した。平均腫瘍体積（ＭＴＶ）がおよそ１６７ｍｍ３（１００〜２４５ｍｍ３の範囲）に達したとき、動物を１２個の治療群（ｎ＝８／群）に無作為に分けた。動物に、腫瘍接種後１２日に開始してビヒクルまたは試験化合物のいずれかを投薬した。治療初日を０日目とした。
【０１２１】
試験化合物
化合物ＡをＰＥＧ  ４００中で製剤化し、結果として得られた懸濁液を透明な溶液が得られるまで温水槽中で超音波処理した。１０ｍｇ／ｍＬの溶液を、１００％のＰＥＧ  ４００でより低い用量に希釈した。
【０１２２】
アリセルチブナトリウムを、半体積のＷＦＩ中２０％のＨＰＢＣＤにおいて製剤化した後、ＷＦＩ中２％の重炭酸ナトリウムで最終体積（ＷＦＩ中１０％のＨＰＢＣＤ／１％のＮａＨＣＯ３）に希釈した。
【０１２３】
１００％のＰＥＧ  ４００（ビヒクル１）及びＷＦＩ中１０％のＨＰＢＣＤ／１％  ＮａＨＣＯ３（ビヒクル２）という２つのビヒクルを、ビヒクル群のマウスに同時に投与した（０．０５ｍＬ／１０ｇ  ＢＷ）。
【０１２４】
腫瘍測定：
腫瘍サイズ及び体重を、治療の初日に開始して週２回測定した。動物をその腫瘍が約２０００ｍｍ３に達したときに屠殺し、研究を治療開始後６２日目に終了した。
【０１２５】
腫瘍成長の阻害を、治療開始後２０日目のＴＧＩパーセント（ビヒクル群のＭＴＶ−治療群のＭＴＶ）／ビヒクル群のＭＴＶを算出することによって決定した。治療群及びビヒクルの間の腫瘍成長の統計的比較を、ΔＡＵＣに対する線形混合効果回帰分析を使用して実施した。
【０１２６】
効能を評価するために使用した追加のエンドポイントは、非特異的死亡、完全腫瘍寛解、及び研究終了（治療開始後６２日目）前のデータ収集最終日に測定可能な腫瘍が観察されなかったとして定義される無腫瘍生存体（ＴＦＳ）の数であった。完全寛解（ＣＲ）は、検出可能でないサイズ（３２ｍｍ３未満）への腫瘍質量の減少として定義した。
【０１２７】
統計的分析
ビヒクル対照と治療群との間の経時的な腫瘍成長傾向における差異を線形混合効果回帰モデルを使用して評定した。これらのモデルは、各動物を複数の時点で測定したことを考慮に入れる。モデルを比較のために適合させ、対照群及び治療群についての腫瘍体積対時間曲線下面積（ＡＵＣ）を、モデルから予測した値を使用して算出した。統計的に有意なｐ値は、２つの群（ビヒクル及び治療）についての経時的な傾向が異なることを示唆する。
【０１２８】
全ての腫瘍体積に、対数１０変換の前に１の値を加えた。これらの値を、治療群に渡って比較して、経時的な傾向の差異が統計的に有意であったかどうかを評定した。治療群の対を比較するために、以下の混合効果線形回帰モデルを、最尤法を使用してデータに適合させた。
【数１】
2018502089.tif 000008
【０１２９】
式中、Ｙｉｊｋは、ｉ番目の治療におけるｋ番目の動物のｊ番目の時点でのｌｏｇ１０腫瘍値であり、Ｙｉ０ｋは、ｉ番目の治療におけるｋ番目の動物における０日目（基線）の対数１０腫瘍値であり、ｊ日目は、平均中心時点であり、（日２ｊと併せて（ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄａｙ２ｊ））は、連続型変数として扱われ、ｅｉｊｋは、残余誤差である。同じ動物に対する経時的な反復測定を説明するために、空間的べき乗共分散マトリックスを使用した。相互作用項及び日２ｊ（ｄａｙ２ｊ）項を、統計的に有意でなかった場合には除去した。
【０１３０】
尤度比試験を使用して、治療群の所与の対が、統計的に有意な差異を呈したかどうかを評定した。完全モデルの−２対数尤度を、一切の治療項（縮小モデル）を持たないものと比較し、値の差を、カイ二乗試験を使用して試験した。検定の自由度を、完全モデルの自由度と縮小モデルの自由度との間の差異として算出した。
【０１３１】
対数腫瘍値（対数１０として解釈され得るＹｉｊｋ−Ｙｉ０ｋ（０日目からの倍数変化））における予測された差異は、各治療群についての平均ＡＵＣ値を算出するために上のモデルから取った。次にｄＡＵＣ値を以下のように算出した。
【数２】
2018502089.tif 000009
【０１３２】
これはＡＵＣｃｔｌが正であったと仮定した。ＡＵＣｃｔｌが負であった場合には、上式に−１を乗じた。
【０１３３】
相乗効果分析のため、対数腫瘍値における観察された差異を使用して、各動物についてのＡＵＣ値を算出した。治療群の動物を研究から除去した場合には、最後に観察された腫瘍値を全ての後続時点に持ち越した。対照、またはビヒクル群についてのＡＵＣを、上記の対モデルから予測した値を使用して算出した。相乗効果の測定値を以下のように定義した。
【数３】
2018502089.tif 000010
【０１３４】
式中、Ａｋ及びＢｋは個別治療群におけるｋ番目の動物であり、ＡＢｋは組み合わせ治療群におけるｋ番目の動物である。ＡＵＣｃｔｌは、対照群についてのモデル予測ＡＵＣであり、変動のない定数として扱った。相乗効果スコアの標準誤差を、Ａ群、Ｂ群、及びＡＢ群にかけての二乗標準誤差の合計の平方根として算出した。自由度を、Ｗｅｌｃｈ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ方程式を使用して推定した。仮説検定を行って、相乗効果スコアが０とは異なったかどうかを決定した。Ｐ値を、相乗効果スコアをその標準誤差で除すことによって算出し、上で算出した自由度を用いてｔ分布（両側）に対して試験した。
【０１３５】
効果を４つの異なるカテゴリーに分類した。相乗効果スコアが０未満であった場合に相乗的であると見なし、相乗効果スコアが０とは統計的に異ならなかった場合に相加的と見なした。相乗効果スコアがゼロを超えるが、組み合わせの平均ＡＵＣが２つの単剤治療間の最低平均ＡＵＣよりも低かった場合、その組み合わせは準相加的であった。相乗効果スコアがゼロを超え、かつ組み合わせの平均ＡＵＣが単剤治療のうちの少なくとも１つの平均ＡＵＣよりも大きい場合、その組み合わせは拮抗的であった。
【０１３６】
間隔解析は、要求される場合には、別の治療群及び時間間隔と比較した特定の治療群及び時間間隔に関与する。所与の群については、時間間隔、及び動物、１日当たりの腫瘍成長を、
【数４】
2018502089.tif 000011
によって推定し、式中、ΔＹは、目的の間隔にかけての対数１０腫瘍体積における差異であり、Δｔは、時間間隔の長さである。時点の一方または両方が欠けている場合には、その動物は無視した。次に、動物に渡る平均率を、不等分散を用いる両側不対ｔ検定を使用して比較した。検査した複数の比較及びエンドポイントに予め指定された調整はなかった。０．０５未満の全てのｐ値を統計的に有意であるとした。相乗効果分析：ｐ＞０．０５＝相加的；ｐ＜０．０５及びスコア＜０＝相乗的；ｐ＜０．０５、スコア＞０、及び組み合わせ成長率が両方の単剤成長速率より低い＝準相加的；ｐ＜０．０５、スコア＞０、及び組み合わせ成長率が単剤成長率の少なくとも１つより高い＝拮抗的。
【０１３７】
結果
上記の方法において記載したように行ったマウス異種移植片モデルを使用して、化合物Ａ及びアリセルチブのインビボの組み合わせ効果を評定した。この研究についての詳細は以下で表２に示す。表２でアリセルチブについて列挙する用量は遊離化合物の量である。
【表２−１】
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【表２−２】
2018502089.tif 000013
【０１３８】
組み合わせ分析の概要を表３に提供する。ビヒクル群と比較したとき、組み合わせ治療群の各々は、ＳＫ−ＭＥＬ−２ヒト黒色腫異種移植片を担持するマウスにおいて顕著な抗腫瘍活性を有した（ΔＡＵＣ、ｐ＜０．００１）。
【０１３９】
化合物Ａ（１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＱＤまたは５０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷ）とアリセルチブ（２０ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ、ＴＧＩ＝それぞれ８０．１％または７３．１％）とによる組み合わせ治療は、単剤療法をよりも腫瘍成長を阻害し、相乗効果分析は、化合物Ａとアリセルチブとの相互作用が、化合物ＡがＱＤで治療されたときには相加であったが、ＢＩＷで治療されたときには準相加的であったことを示した。各群についてのＭＴＶを図１及び２でグラフで表す。
【表３】
2018502089.tif 000014
【０１４０】
実施例３：突然変異型ヒト黒色腫異種移植片モデルにおけるインビボの腫瘍効能
各動物に、腫瘍モデル発達のために３×１０６のＡ３７５腫瘍細胞（０．１ｍＬ中、マトリゲルと１：１）を右側腹に接種した。体重及び腫瘍成長を週に２回監視した。腫瘍サイズを、ノギスを使用し、式Ｖ＝Ｗ２×Ｌ／２（式中、腫瘍異種移植片について、Ｖ＝体積、Ｗ＝幅、及びＬ＝長さ）を適用して、０．１ｍｍの位に測定した。異種移植片を、それらが接種後１１日で約１９５ｍｍ３の平均サイズに達するまで成長させた。適当なサイズの異種移植片を担持するマウスを１２個の群のうちの１個に無作為に割り当て、ビヒクル（１００％のＰＥＧ４００及び／またはＷＦＩ中１０％のＨＰβＣＤ＋１％のＮａＨＣＯ３）、及び／または試験物品：化合物Ａ（１２．５または５０ｍｇ／ｋｇ）、アリセルチブ（１０または２０ｍｇ／ｋｇ）、もしくは化合物Ａ／アリセルチブの組み合わせのいずれかであるその割り当てられた試験物質による治療を開始した。
【０１４１】
試験化合物
化合物Ａを１００％のＰＥＧ４００中で製剤化した（ビヒクル１）。化合物Ａを調製し、室温（１８〜２５℃）にて保管した。
【０１４２】
アリセルチブナトリウムを、注入用水（ＷＦＩ）中１０％のＨＰβＣＤ及び１％のＮａＨＣＯ３中で製剤化した（ビヒクル２）。アリセルチブを調製し、室温（１８〜２５℃）にて保管した。
【０１４３】
ビヒクル治療群の動物にビヒクル１及びビヒクル２の両方を与えた。
【０１４４】
ビヒクルまたは化合物の服用量は、体重１ｋｇ当たり５ｍＬであった。
【０１４５】
腫瘍測定
腫瘍サイズ及び体重を、動物のグループ分けの日（例えば、０日目）に開始して週に２回測定した。動物をその腫瘍が約２０００ｍｍ３に達したときに屠殺し、研究を治療開始後３８日目に終了した。
【０１４６】
腫瘍成長の阻害を、治療開始後２１日目のＴＧＩパーセント［（ビヒクル群のＭＴＶ−治療群のＭＴＶ）／ビヒクル群のＭＴＶ］を算出することによって決定した。治療群及びビヒクルの間の腫瘍成長の統計的比較を、ΔＡＵＣに対する線形混合効果回帰分析を使用して実施した。
【０１４７】
統計的分析
統計的分析を実施例２に記載のように実行した。
【０１４８】
結果
上記の方法において記載したように行ったマウス異種移植片モデルを使用して、化合物Ａ及びアリセルチブのインビボの組み合わせ効果を評定した。この研究についての詳細は以下で表４に示す。アリセルチブについて列挙する用量は遊離化合物の量である。
【０１４９】
化合物Ａ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ）及びアリセルチブの組み合わせ効果は相加的であり、一方で化合物Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＷ）及びアリセルチブの組み合わせ効果は相乗的であった。
【表４−１】
2018502089.tif 000015
【表４−２】
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【０１５０】
実施例４：マーカーの測定方法
Ｂ−Ｒａｆ  ＰＣＲに基づくアッセイ（供給業者：Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：８７０８０１）
Ｂ−Ｒａｆ  ＲＧＱ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖ２は、ＡＲＭＳ（登録商標）及びＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）という２つの技術を組み合わせて、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて突然変異を検出する。このアッセイは、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００突然変異Ｖ６００Ｅ（ＧＡＧ）及びＶ６００Ｅ複合体（ＧＡＡ）、Ｖ６００Ｄ（ＧＡＴ）、Ｖ６００Ｋ（ＡＡＧ）、Ｖ６００Ｒ（ＡＧＧ）を検出する。このキットは、Ｖ６００Ｅ（ＧＡＧ）及びＶ６００Ｅ複合体（ＧＡＡ）の存在を検出するが、それら同士を区別はしない。
ＡＲＭＳ
【０１５１】
特定の突然変異配列を、突然変異型ＤＮＡと一致するように設計されたアレル特異的プライマーによって選択的に増幅する。
【０１５２】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ
増幅の検出はＳｃｏｒｐｉｏｎｓを使用して行う。Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓは、蛍光標識したプローブに共有結合するＰＣＲプライマー（即ち、ＦＡＭ（商標）またはＨＥＸ（商標））、及び消光剤である。プローブをアンプリコンに結合させるＰＣＲ中、フルオロフォア及び消光剤は分離した状態となり、これが蛍光シグナルの増加をもたらす。
【０１５３】
手順
Ｂ−Ｒａｆ  ＲＧＱ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖ２は、二段階の手順を含む。第１のステップでは、対照アッセイを行って、試料中の増幅可能な全Ｂ−Ｒａｆ  ＤＮＡを評定する。第２のステップでは、突然変異及び対照アッセイを行って、突然変異型ＤＮＡの存否を決定する。
・対照アッセイ
ＦＡＭで標識した対照アッセイを使用して、試料中の増幅可能な全Ｂ−Ｒａｆ  ＤＮＡを評定する。対照アッセイは、Ｂ−Ｒａｆ遺伝子のエクソン３の領域を増幅する。プライマー及びＳｃｏｒｐｉｏｎプローブは、いずれの既知のＢ−Ｒａｆ多形性とも無関係に増幅するように設計される。
・突然変異アッセイ
各突然変異アッセイは、野生型ＤＮＡと特異的突然変異型ＤＮＡとを区別するために、ＦＡＭで標識したＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ及びＡＲＭＳプライマーを含む。
【０１５４】
データ分析：ΔＣｔ法
Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓリアルタイムアッセイは、反応開始時に存在する標的分子の目安として、バックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを検出するのに必要なＰＣＲ周期の数を使用する。シグナルがバックグラウンド蛍光を超えて検出される点を「周期閾値」（Ｃｔ）と呼ぶ。
【０１５５】
試料のΔＣｔ値は、同じ試料からの突然変異アッセイＣｔと対照アッセイＣｔとの間の差異として算出される。試料は、それらがそのアッセイに対するカットオフΔＣｔ値を下回るΔＣｔを付与する場合に、突然変異陽性として分類される。この値を上回ると、試料は本キットによって検出することができる突然変異のパーセンテージを下回る（アッセイの限界を超える）か、あるいは試料は突然変異陰性である。
【０１５６】
ＡＲＭＳプライマーを使用する際には、多少の非効率的なプライミングが生じ得、これが、突然変異を含まないＤＮＡからの極めて遅い背景Ｃｔを付与する。バックグラウンド増幅から算出した全てのΔＣｔ値は、カットオフΔＣｔ値を上回り、試料は突然変異陰性と分類される。
【０１５７】
各試料について、ΔＣｔ値を以下のように算出することで、突然変異及び対照Ｃｔ値が同じ使用に由来することを確実にする。
ΔＣｔ＝｛試料突然変異Ｃｔ｝−｛試料対照Ｃｔ｝
試料対照Ｃｔは２７〜３３の範囲であり得る。
試料突然変異Ｃｔは１５〜４０の範囲であり得る。
突然変異コールに許容されるΔＣｔは、６未満または７である。
【０１５８】
Ｎ−Ｒａｓ突然変異の測定方法は、Ｂ−Ｒａｆについて上に記載した方法と同様である。Ｎ−Ｒａｓ  Ｑ６１突然変異の検出のためのＱｉａｇｅｎ  Ｎ−Ｒａｓアッセイは以下を含む。
Ｑ６１Ｋ（１８１  Ｃ＞Ａ）
Ｑ６１Ｒ（１８２  Ａ＞Ｇ）
【図１】
2018502089.tif 000019
【図２】
2018502089.tif 000020
【図３】
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【図４】
2018502089.tif 000022
【配列表】
2018502089000001.app
【国際調査報告】
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2018502089.tif 000024