(57)【要約】  本発明の実施形態は、体液由来の１以上のバイオマーカーを検出する方法であって、固体支持体に保存されていた体液試料由来のバイオマーカーに対する１以上のアッセイを実施するステップを含み、バイオマーカーの変化が脳における生物学的事象の指標を与える、方法を提供する。本発明は、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人を特定するため、人を、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関してモニタリングするため、候補薬剤の有効性を評価するための、関連する方法もまた提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液由来の１以上のバイオマーカーを検出する方法であって、
固体支持体に保存されていた体液試料由来のバイオマーカーに対する１以上のアッセイを実施するステップ
を含んでおり、バイオマーカーの変化が脳における生物学的事象の指標を与える、方法。
【請求項２】
体液が血液又は脳脊髄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマーカーが、トランスサイレチン、クラスタリン、シスタチンＣ、Ａ１ＡｃｉｄＧ、細胞内接着分子１、チトクロームＣ４、色素上皮由来因子、アルファ１アンチトリプシン、ＲＡＮＴＥＳ、アポリポタンパク質Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（遺伝子型）、アポリポタンパク質Ａ１、神経特異的エノラーゼ、脳由来神経栄養因子、補体因子Ｈ、アルファマクログロブリン、血清アミロイドＰ、セルロプラスミン、アミロイドベータ、フィブリノーゲンアルファ鎖前駆体、ケラチン１型細胞骨格９（Ｋｅｒａｔｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ９）、血清アルブミン前駆体、ＳＰＡＲＣ様１タンパク質（ＳＰＡＲＣ−ｌｉｋｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ）、プラスミノーゲン結合タンパク質、タウ、シヌクレイン、タウキナーゼ及びタウホスファターゼの１以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が繊維材料、例えばセルロース繊維材料又はガラス繊維／マイクロファイバー材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固体支持体が多孔質ポリマー、例えばポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、硝酸セルロース、酢酸セルロース、アルギン酸塩又は酸化アルミニウムなどの多孔質膜材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
支持体表面に、弱塩基、キレート化剤、陰イオン界面活性剤及び／又はチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤を含む化学物質が含浸されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１以上のアッセイの実施が、試料を含有する固体支持体からカットされたパンチから直接実施され、適宜、カットされたパンチを洗浄して、アッセイ反応の前に潜在的な阻害性化学物質を除去するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１以上のアッセイが、核酸分子に関するアッセイ、又はタンパク質系アッセイ又は抗体系のアッセイ又は酵素系のアッセイから選択される様々なアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料が、固体支持体に予め保存され、室温で保管される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
変化が、バイオマーカーのレベルの増減、対照又は正常な個人に存在するバイオマーカーの不在、対照又は正常な個人に不在なバイオマーカーの存在及びゲノムレベルのＤＮＡの多型又は突然変異から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人を特定する方法であって、
請求項１に記載の方法に従って１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
検出結果に基づいて、その人に認知症又はアルツハイマー病のリスクがあるか否かを予測するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関して人をモニタリングする方法であって、
人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、
請求項１に記載の方法に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
検出されたバイオマーカーの経時的変化に基づいて、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行を予測するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
検出ステップを、保存試料のいくつかの一部を使用して実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
検出ステップを、保存試料の一部を使用して、経時的に繰り返す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バイオマーカーの検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
候補薬剤の有効性を評価する方法であって、
候補薬剤を使用して治療した認知症又はアルツハイマー病を有する人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、
請求項１に記載の方法に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
薬剤が認知症又はアルツハイマー病を有する人の処置に有効であるか否かを予測するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体材料に固定された認知症及びアルツハイマー病関連バイオマーカーを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、現在のところ世界的に４４００万人の個人を侵している。この数は２０５０年までに１億３５００万人にまで上昇すると思われる。現在の世界的なコストは６０００億ドルである。アルツハイマー病に関する処置の研究は、思わしいものではない。２００２年から２０１２年の間、この疾患の予防又は回復を目的とする試験の９９％超が不成功に終わっている。すべての不成功の原因は、疾患が始まってからおよそ１０年後に症状が現れるので、患者の処置にはすでに遅すぎることである。したがって、より早期に患者を特定することが、認知症研究の優先事項の１つである。
【０００３】
近年、研究者らは、認知症の始まりを予測できる血液中の一連の血漿タンパク質を特定し、これらのバイオマーカーが、新しい認知症薬のための血液検査／試験を開発するための個人の特定に使用可能であることを提示した。４５２人の健康人の血中タンパク質を、２２０人の軽度認知機能障害を有する人及び４７６人のアルツハイマー病を有する人の血中タンパク質と比較した。このことから、研究者らは、軽度認知機能障害を有する患者が８７％の正確さでアルツハイマー病の発症へと進行すると述べることができた。この結果は、候補者の早期特定を可能にし、それによって、将来の臨床試験成功の機会を増やすことを可能にする。これらのバイオマーカーは、最終的にアルツハイマー病に進行する人及びしたがって早期に臨床試験に参加可能な人を特定する有望な手段をさらに示す。早期処置は、好ましい薬効及びそれによる療法の可能性が上昇する。
【０００４】
試料の保管及び検出を改善して、認知症又はアルツハイマー病発症のリスクにある人の特定を容易にする必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１４３５７４号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、認知症及びアルツハイマー病に関連するバイオマーカーの検出を支援する、バイオマーカーの検出及び定量を容易にする新規な方法を記載する。血液、血漿又は他の関連生体試料型を固体支持体に収集し、タンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡなどのバイオマーカーを固定及び検出する。これらのバイオマーカーは固体支持体で安定なままであり、長期保管後にも検出可能である。
【０００７】
一態様では、体液由来の１以上のバイオマーカーを検出する方法であって、固体支持体に保存されていた体液試料由来のバイオマーカーに対する１以上のアッセイを実施するステップを含み、バイオマーカーの変化が脳における生物学的事象の指標を与える、方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人を特定する方法であって、本発明の特定の態様に係る方法を使用して１以上のバイオマーカーを検出するステップと、検出結果に基づいて、その人に認知症又はアルツハイマー病のリスクがあるか否かを予測するステップとを含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関して人をモニタリングする方法であって、人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、本発明の特定の態様に係る方法を使用して、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、検出されたバイオマーカーの経時的変化に基づいて、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行を予測するステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、候補薬剤の有効性を評価する方法であって、候補薬剤を使用して治療した認知症又はアルツハイマー病を有する人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、本発明の特定の態様に係る方法を使用して、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、薬剤が認知症又はアルツハイマー病を有する人の処置に有効であるか否かを予測するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる詳細及び有利性を、以下の説明及び特許請求の範囲から明らかにするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、固体支持体からのモデルタンパク質（ＩＬ−２）の測定を示す。
【図２】図２は、固体支持体からのモデル酵素（ＤＮａｓｅ）の測定を示す。
【図３】図３は、固体支持体からのモデル酵素（ＲＮａｓｅ）の測定を示す。
【図４】図４は、ヘパリンにより処置し、様々な固体支持体に保存したヒト血液由来の、５００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片の直接増幅の結果を示す。
【図５】図５は、ＥＤＴＡにより処理し、様々な固体支持体に保存したヒト血液由来の、１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのゲノムＤＮＡアンプリコンの直接ＰＣＲの結果を示す。
【図６】図６は、ＥＤＴＡにより処理し、９０３及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカード試料収集カードに保存した、いくつかの哺乳動物種由来の血液に対して実施した直接ＰＣＲの結果を示す。
【図７】図７は、ＷＴ及びＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウス由来の両方のＤＮＡ増幅産物を示す。
【図８】図８は、いくつかの組織源由来のＧＡＤＰＨの相対発現レベルを示す（青／明色及び赤／暗色は、異なる固体材料を指す）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
様々な技術により、血液お又は他の組織試料における遺伝子又はタンパク質標的の発現改変の評価に使用可能な、ゲノミクス及びプロテオミクス分析の機会が提供される。例えば、血液及び／又は脳脊髄液中のバイオマーカーの固体支持体への収集／保管に続けて、固体支持体上の試料を直接検出試薬に加え、バイオマーカー又は目的の分析物の予備精製をせずに、バイオマーカー検出法、例えば、限定するものではないが、免疫アッセイ及び核酸増幅／検出技術に供する、容易な直接検出又はパンチ−イン技術を行うことができる。
【００１４】
本発明者は、いくつかのゲノミクス及びプロテオミクスのバイオマーカー及び／又は他の目的の分析物の重要性を、脳における事象へのそれらの関連に関して再検討し、Ｗｈａｔｍａｎ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されるような固体支持体へのこれらのマーカーの収集を提案する。
【００１５】
したがって一実施形態では、本発明は、体液由来の１以上のバイオマーカーを検出する方法であって、固体支持体に保存されていた体液試料由来のバイオマーカーに対する１以上のアッセイを実施するステップを含み、バイオマーカーの変化が脳における生物学的事象の指標を与える、方法を提供する。特定の実施形態では、１以上のアッセイは、核酸分子に関するアッセイ、又はタンパク質系アッセイ又は抗体系のアッセイ又は酵素系のアッセイを含む。特定の実施形態では、変化は、バイオマーカーのレベルの増減であり得る。変化は、対照又は正常な個人に存在するバイオマーカーの不在であっても、又はその逆であってもよい。変化は、ゲノムレベルの変化（すなわち、単一のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失もしくは他の突然変異又はゲノムレベルの多型）であってもよい。
【００１６】
特定の実施形態では、体液は血液又は脳脊髄液である。
【００１７】
科学文献の調査により、約２５種の認知症又はアルツハイマー病関連タンパク質及び核酸バイオマーカーが特定されている。これらのバイオマーカーの発現は、タンパク質、抗体、酵素又はＲＮＡ系遺伝子発現アッセイを使用して検出することができ、ゲノムの突然変異は、ＤＮＡレベルで検出することができる。認知症及びアルツハイマー病に関与するバイオマーカーのリストを下記の表１に記載する。
【００１８】
【表１】
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タンパク質及び核酸バイオマーカーを検出する方法は公知である。このようなアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現又はタンパク質発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、等温増幅、免疫ＰＣＲ、マイクロアレイアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫学的技術、ゲル電気泳動（２ＤＥ）、キャピラリー電気泳動（ＴＯＦ  ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）、炎光光度法、原子吸光光度法及び可視分光光度法からなる群から選択することができる。
【００１９】
特定の実施形態では、試料は、固体支持体に予め保存されている。生体試料は、固体支持体に容易に適用され、周囲温度において保存のために乾燥させることができる。
【００２０】
特定の実施形態では、固体支持体は繊維材料、例えばセルロース繊維材料又はガラス繊維／マイクロファイバー材料である。
【００２１】
特定の実施形態では、固体支持体は、多孔質ポリマー、例えばポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、硝酸セルロース、酢酸セルロース、アルギン酸塩又は酸化アルミニウムなどの多孔質膜材料能である。
【００２２】
特定の他の実施形態では、支持体表面に、弱塩基、キレート化剤、陰イオン界面活性剤及び／又はチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤を含む化学物質が含浸されている。
【００２３】
特定の他の実施形態では、固体支持体は、限定するものではないが、ＦＴＡ紙、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ紙、Ｗｈａｔｍａｎ９０３紙又はアルギン酸塩コーティング支持体である。
【００２４】
本明細書において、ＦＴＡ（ＦＴＡマイクロカード、ＦＴＡ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ及びＦＴＡクラシックを含む）は、安定化化学物質、例えば弱塩基、キレート化剤及び陰イオン界面活性剤で処理して、支持体表面に安定化化学物質を含浸させたセルロース繊維紙である。このような方法で、生体試料物質は、乾燥させた物質として固体支持体上に何ヶ月又は何年もの間保管可能であり、それによって、固体支持体を周囲温度において必要に応じて実験室へ輸送する時間を得ることができる。その後、例えば、固体支持体から生体試料物質を精製することによって、容易な回収が可能である。又は、試料は、直接又は洗浄によるパンチ−インプロトコルを使用して処理することができる。固体支持体への試料保管により、試料の一部を取り出し、必要に応じてその部分を試験することによって、試料を経時的に再試験することができる。
【００２５】
本明細書において、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅは、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤でコーティングされた、同様の紙を表す。本明細書において９０３は未コーティングのセルロース繊維紙を表す。
【００２６】
特定の固体支持体は、ＷＯ２０１２１１３９１１、ＷＯ２０１２１１３９０７、ＷＯ２０１２１１３９０６及びＷＯ２０１３１６５８７０に記載されており、当該文献の各開示は参照によりその全体がと本明細書に組み込まれる。
【００２７】
上記の固体支持体は、概して平坦な構成での使用が意図されるが、別の方法では、例えば、筒上で使用することもできる。
【００２８】
特定の実施形態では、１以上のアッセイが、試料を含有する固体支持体からカットされたパンチから直接実施される。したがって、アッセイは、生体試料（すなわち、血液）が適用された固体支持体からカットされたパンチから直接実施することができる。試料を含有するパンチは、アッセイ反応液に直接加えることができる。適宜、容易な「パンチ−イン」添加は、カットされたパンチ（固体支持体＋試料）を洗浄して、反応液に加える前に潜在的な阻害性化学物質を除去して実施してもよい。
【００２９】
特定の実施形態では、バイオマーカーは、固体支持体から単離及び／又は精製され、その後検出される。固体支持体で乾燥された試料からタンパク質及び核酸分子を精製する方法は公知である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーをアッセイすることができる。例えば、２、３、４又は５種のバイオマーカーを検出して、脳における目的の生物学的事象を評価することができる。いくつかの実施形態では、表１のすべてのバイオマーカーを検出して、目的の生物学的事象を評価することができる。これらのバイオマーカーは、タンパク質及び核酸バイオマーカーの検出に関して上で記載した方法を含む、様々なアッセイを使用して検出することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、アッセイは、マルチプレックスであってよい。したがって、複数のバイオマーカーを単一の反応で検出することができる。
【００３２】
特定の実施形態では、１以上のアッセイは、凍結乾燥試薬を使用して実施される。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（ＲＴＧ）製品などの凍結乾燥試薬が周知である。これらの試薬は、特異的核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡなど、又は抗体を分析し、目的の特異的タンパク質バイオマーカーを検出するためのプライマーを含有し得る。
【００３３】
特定の実施形態では、１以上のアッセイは、シクロデキストリンの存在下で実施される。シクロデキストリンは、特定の固体支持体の外側をコーティングしている洗浄剤の捕捉剤（ｓｅｑｕｅｓｔｏｒ）として作用し、したがって、直接増幅アッセイを含む、改善されたＤＮＡ増幅アッセイが実施可能である。
【００３４】
特定の実施形態では、バイオマーカーは、検出後に定量される。
【００３５】
特定の実施形態では、試料は、固体支持体に予め保存され、室温で保管される。固体支持体に保存された生体試料は、長期間安定であり得、例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ２９−００８２−３３  ＡＡを参照されたい。
【００３６】
特定の態様では、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人を特定する方法であって、本発明の特定の実施形態に従った方法により１以上のバイオマーカーを検出するステップと、検出結果に基づいて、その人に認知症又はアルツハイマー病のリスクがあるか否かを予測するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較する。
【００３７】
特定の態様では、人を、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関してモニタリングする方法を提供する。本方法は、人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、本発明の特定の実施形態に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、検出されたバイオマーカーの経時的変化に基づいて、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行を予測するステップとを含む。
【００３８】
特定の実施形態では、検出ステップは、いくつかの保存試料の一部を使用して実施する。特定の実施形態では、検出ステップは、保存試料の一部を使用して、経時的に繰り返す。
【００３９】
特定の実施形態では、人を、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関してモニタリングする方法は、バイオマーカーの検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップをさらに含む。
【００４０】
特定の態様では、候補薬剤の有効性を評価する方法を提供する。本方法は、候補薬剤を使用して治療した認知症又はアルツハイマー病を有する人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、本発明の特定の実施形態に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、薬剤が認知症又はアルツハイマー病を有する人の処置に有効であるか否かを予測するステップとを含む。
【００４１】
特定の実施形態では、検出ステップは、いくつかの保存試料の一部を使用して実施する。特定の実施形態では、検出ステップは、保存試料の一部を使用して、経時的に繰り返す。
【００４２】
特定の実施形態では、候補薬剤の有効性を評価する方法は、検出結果を、認知症又はアルツハイマー病を有する、又は有さない人からの対照と比較するステップをさらに含む。
【実施例】
【００４３】
下記の実施例は、本発明に従った方法及び実施形態を例示する意図のものだけであり、したがって、特許請求の範囲を限定すると解釈するべきではない。
【００４４】
実施例１：固体支持体からのインターロイキンの直接測定
組換えＩＬ−２±キャリア（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれ、カタログ番号２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９１１２及びカタログ番号２０２−ＩＬ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９０８１）を血液（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５０ｐｇ又は１００ｐｇ／μｌで溶解した。アリコート（５０（Ｂ）又は１００（Ａ）ｐｇのＩＬ−２を含有する１μｌ）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ９０３ろ紙に適用した。
【００４５】
これらの試料を、周囲温度及び湿度において一晩乾燥させた。パンチした直径３ｍｍのディスクを、適切なサイズのパンチを使用して各紙から切り抜いた。単一のディスクを、完全に構成されたＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ２０５０、ロット２７３２７５）の試薬を用いて、ＩＬ−２に関して直接分析した。直接アッセイを「パンチ−イン−ウェル」で実施した、すなわち、９０３ろ紙の一部をパンチアウトし、従来型のマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ  ｐｌａｔｅ）の反応ウェルに配置した。
【００４６】
アッセイの完了において、光学密度を４５０ｎｍにおいてモニターした。ＩＬ−２の回収を、公知のＩＬ−２濃度の標準曲線と値とを比較することによって決定した。回収率を図１に示し、タンパク質が固体支持体に堆積された場合、有効量のタンパク質が回収可能であることを実証した。
【００４７】
【表２】
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表１のバイオマーカーの多くは、表２に例示するように、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して検出可能である。
【００４８】
したがって、血液又は脳脊髄液などの生体試料由来のタンパク質は、固体支持体で安定であり、既存のタンパク質検出方法を使用して検出及び定量可能である。
【００４９】
実施例２：細胞又は固体支持体に転写された酵素からのモデル酵素の検出
タンパク質及び酵素試験を、完全に構成されたＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＡＭ１９７０及びＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って実施した。
【００５０】
ジデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）
実験の第１段階において、０．１２５−０．５ＵのＤＮａｓｅを、ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで適用した。ＤＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した（データ非掲載）。
【００５１】
実験の第２段階において、ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで上述の通り適用された１０6のヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍのパンチを採取した。ＤＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した。
【００５２】
実験の第３段階において、１．２ｍｍのパンチを、ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで適用された、０．５ＵのＤＮａｓｅ又は１０μＵのＲＮａｓｅが添加され、このいずれかを含有する１０6のヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）から採取した。
【００５３】
ＤＮａｓｅ活性の検出を、切断可能な蛍光標識ＤＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）及びヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍの基質はＤＮａｓｅにより切断されると、ピンク色の蛍光を発する改変されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（励起／発光  ５３５／５９５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ  ｇａｉｎ）使用）で測定した。ＤＮａｓｅ活性を含む溶液はピンク色の蛍光を発生し、一方、ＤＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＤＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。ＤＮＡａｓｅ活性は、固体支持体として９０３又はＦＴＡ紙を使用して、変化量依存様式で検出及び定量することができる。図２は、ＤＮａｓｅ及び酵素活性の回収が、ＦＴＡ化学的処理ろ紙（ＦＴＡ）及び９０３未処理ろ紙（９０３）において達成されたことを実証している。
【００５４】
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）
ＲＮａｓｅの検出を、切断可能な蛍光標識ＲＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）及びヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、この試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍの基質はＲＮａｓｅにより切断されると、緑色の蛍光を発する改変されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（励起／発光  ４８５／５３５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ  ｇａｉｎ）使用）において測定した。ＲＮａｓｅを含む溶液は緑色の蛍光を発生し、一方、ＲＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＲＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。ＲＮＡａｓｅ活性は、９０３又はＦＴＡ紙を使用して、変化量依存様式で検出及び定量することができる（図３）。
【００５５】
したがって、生体試料由来の酵素は、固体支持体で乾燥可能であり、依然として安定である。酵素活性の検出及び酵素の定量は、既存の方法を使用して実施可能である。
【００５６】
実施例３：Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ及び９０３カードに保存された血液からの直接ＰＣＲ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３、ＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードを含む様々な固体支持体に保管された血液試料からの直接ＤＮＡ増幅を支援することが実証された（Ｃｈｕｍ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅ  ２０１３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＦＴＡ及びＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードは、化学的コーティング紙系カードの例であり、９０３カードは化学的に処理されていない。直接増幅ワークフローにおいて、事前のＤＮＡ抽出又は精製ステップは必要なく、単にカードをＰＣＲ反応混合物に加えるだけである。
【００５７】
試料調製：新鮮な血液又はヘパリン（１．４ＩＵ／ｍＬ）と一緒に保存された血液、Ｋ2ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）を、製造業者の取扱説明書に従って、Ｗｈａｔｍａｎ９０３カード、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカード又はＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードに適用し、乾燥させた。直接ＰＣＲのために、カード中の試料の直径１ｍｍのディスクをパンチアウトし、下記の体積のＰＣＲ反応液で使用した：Ｗｈａｔｍａｎ９０３：１０−５０μｌ、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカード：２５−５０μｌ及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカード：５０μｌ。
【００５８】
より多量又はより少量の反応液体積を使用する場合、パンチを２０μＬの水で５０℃において３分間洗浄した。水を除去後、すすいだパンチにＰＣＲ成分を直接加えた。使用したパラメーター及び試薬を、以下の表３、４及び５に列挙した。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
【表５】
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図４は、ヘパリンで処理し、様々なカードに保存したヒト血液由来の、５００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片の直接増幅の結果を示す。反応を、すすぐか、又は直接のいずれかで、体積５０、２５又は１０μｌのＰＣＲ反応液に入れた１ｍｍのパンチから実施した。材料及び方法に記載した２ステップＰＣＲプロトコルを使用した。
【００６２】
図５は、ＥＤＴＡにより処理し、様々なカードに保存したヒト血液由来の、１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのｇＤＮＡアンプリコンの直接ＰＣＲの結果を示す。反応を、５０μｌの反応液中で１ｍｍのパンチから実施した（ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードのパンチは、７．５ｋｂ断片に関しては水ですすくことによって洗浄した）。２ステッププロトコルを１ｋｂ及び７．５ｋｂ断片に使用し、３．８ｋｂアンプリコンには３ステッププロトコルを使用した。
【００６３】
図６は、ＥＤＴＡで処理し、９０３及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードに保存した、いくつかの哺乳動物種由来の血液に対して実施した直接ＰＣＲの結果を示す。反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔに含まれるユニバーサルコントロールプライマー及び体積２０μｌの反応液を使用して、１ｍｍのパンチから実施した（ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードはすすいだ）。Ｍ  サイズマーカー、−  陰性対照、＋  陽性対照（精製ヒトゲノムＤＮＡ）。
【００６４】
ＰＣＲ研究により、ＤＮＡが、様々なフィルターカードに保管した血液から直接増幅可能であることを確認した。
【００６５】
９０３カードに由来する試料はほとんど阻害されず、１ｍｍのパンチは１０μｌほどの少量の反応液体積で使用可能であることを示した。ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡカードは、様々なレベルの阻害を示した。ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅは、直接ＰＣＲ反応をわずかに阻害し、２５−５０μｌの反応液において１ｍｍのディスクは十分反応したが、１０μｌの反応液中に入れた場合、ＰＣＲは完全に阻害された。ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードは、最も高いレベルの阻害を示した。予備処理を全くしなければ、ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードの１ｍｍのパンチは、体積５０μｌの反応液においてだけ十分反応した。より少量の反応液体積では、非常に容易な洗浄プロトコルが、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカード両方から阻害因子を除去するために十分であった。カードのパンチを水で３分間洗浄後、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いた直接ＰＣＲ反応に使用するための十分な純度の試料を、すべての反応液体積で試験した。
【００６６】
９０３カード由来のパンチ並びにＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードのすすいだパンチ（すべて直径１ｍｍ）を、１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのアンプリコンに特異的なプライマーを用いて、体積５０μｌの反応液に使用した。すべての場合において、ＰＣＲ反応により、適切なサイズの増幅産物が製造された。
【００６７】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、様々な種由来の血液に適合性である。ＳＯＸ２１遺伝子の上流の高度に保存された２３７ｂｐ領域（Ａ．Ｗｏｏｌｆｅ，Ｍ．Ｇｏｏｄｓｏｎ，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．３，ｅ７；２００４）を、９０３及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードにおいて乾燥させた多数の脊椎動物種の血液から増幅することに成功した。
【００６８】
実施例４：固体支持体材料に適用された生体試料を使用した遺伝子型決定
多数の癌が、遺伝子再配列に関与している。ユーイング肉腫ブレークポイント領域１（Ｅｗｉｎｇ  ｓａｒｃｏｍａ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ１）（ＥＷＳＲ１）は多数の肉腫において転座される。近年、その再配列は、唾液腺硝子化明細胞癌において記載されている（Ｓｈａｈ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．３７：５７１−８  ＥＷＳＲ１  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｖｅｒｙ  ｃｏｍｍｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｙａｌｉｎｉｚｉｎｇ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。この研究は、固体支持体材料の有望性を例示しており、複雑な哺乳動物ゲノム内のこのような遺伝子再配列に関するスクリーニングの可能性についての見解がこの文献に記載された。
【００６９】
ＤＮＡ試料の収集、保管及び検出
ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＮＯＳ３ヌルマウス（バックグラウンド１２９／Ｂ６）由来のネズミ組織を、様々な紙系の固体支持体に適用した。これらのマウスを安楽死させ、解剖して臓器（血液、心臓、脳、肺、肝臓及び腎臓）を収集した。これらの臓器を２枚の紙の層に「サンドイッチ」した。それぞれのセルロースマトリックスにはめ込まれた組織に、滅菌ピペットにより圧力を印加した。組織ホモジネート用に、およそ５ｍｇの組織を、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて、プラスチックダウンス型ホモジナイザーを使用して処理し、次いで適切な紙マトリックスに適用した。適用後、すべての試料を２時間風乾させ、その後密閉されたポーチにおいて乾燥剤と一緒に保存した。適宜、試料は処理まで最大２ヶ月保存した。
【００７０】
ＤＮＡの遺伝子型決定及び定量
Ｈａｒｒｉｓの使い捨てマイクロパンチ（直径１．２ｍｍ又は３ｍｍ）を使用して、それぞれ紙カードから乾燥組織試料を、パンチされたディスクの形態で切り取った。試料ディスクを乾燥試料の中心から切り取り、清潔なＤＮａｓｅ非含有１．５ｍｌ微小遠心管に入れた。
【００７１】
ヌル又は遺伝子ノックアウトＮＯＳ３マウスを、内皮型酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）エクソン１０特異的フォワードプライマー（５’−ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＴＧ−３’）、ｅＮＯＳ  Ｎｅｏ特異的フォワードプライマー（（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴ−３’）及びｅＮＯＳエクソン１２特異的リバースプライマー（５’−ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＡＣ−３’）を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定した。
【００７２】
標的ＤＮＡを、初回１０分の変性ステップ、次いで９４℃３５秒、６５℃１分及び７２℃１分を３６サイクル、その後７２℃５分間の最終伸長で、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎキャピラリー電気泳動システムを使用して可視化させた。マウスＤＮＡの定量を、マウス試料用Ｐｒｉｍｅｒ  ＤｅｓｉｇｎゲノムＤＮＡ定量キット（ｇＤＮＡ−ｍｏ−ｑ−ＤＤ）を使用して製造業者の使用説明書に従って行った。個別の野生型（ＷＴ）及びＮＯＳ３ヌルの組織試料を、様々な紙カードに別々に適用した。紙マトリックスに保存されたＤＮＡから遺伝子型変異体を識別する能力を例示するために、ある領域のＰＣＲ増幅をＷＴ及びトランスジェニック（ＮＯＳ３ヌル、遺伝子ノックアウト）マウスに実施した。
【００７３】
図７において、紙カード由来の組織から単離されたＤＮＡを増幅鋳型として使用した、ＮＯＳ遺伝子座に関係するＰＣＲアンプリコンを示す。レーン１−５はＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺及び腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６−１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺及び腎臓）から増幅されたＤＮＡである。
【００７４】
【表６】
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表６において、様々な固体支持体材料に保管された組織から単離されたＤＮＡの増幅が成功したことが記録されている。ＤＮＡを１．２ｍｍのパンチから単離した。「＋」は、アンプリコンの存在を示す。
【００７５】
図７及び表６（上記）は、ＷＴ及びＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウス由来の両方のＤＮＡ増幅産物をそれぞれ示している。結果は、両方の試料源に関して、正確にサイズ決定されたＤＮＡアンプリコンが、固体紙支持体マトリックスに適用されたすべての臓器／組織源から単離されたＤＮＡから製造されたことを示している。これらのデータは、１．２ｍｍのＨａｒｒｉｓマイクロパンチが固体紙支持体に保管された組織から十分なＤＮＡを切り取り、２つの遺伝子型変異体を識別可能であることを示している。
【００７６】
実施例５：ＲＮＡの収集、精製及び定量
組織試料を、記載の固体支持体紙カードに適用した。試料のパンチを切り取り、ＲＮＡを下記のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用して単離した。ＲＮＡの定量を、ＡＢＩ７９００リアルタイムＰＣＲシステムにおいて市販のｍＲＮＡ定量キットを利用して実施した。
【００７７】
Ｈａｒｒｉｓの３ｍｍ使い捨てマイクロパンチを使用して、パンチを乾燥試料スポットの中心から切り取り、清潔なＲＮａｓｅ非含有１．５ｍｌの微小遠心管に入れた。ｉｌｌｕｓｔｒａバッファーＲＡ１（３５０μｌ）を３．５μｌのβ−メルカプトエタノールと組合せ、この溶液をディスクに添加した。ディスクを、２０ゲージの針を使用して均質化した。得られたホモジネートを、その後で残留物質を除去するためにＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターカラムに移した。このカラムを１１，０００×ｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターを廃棄した。均質化された溶解物はＲＮＡを含有し、このろ液を新しいＲＮａｓｅ非含有の１．５ｍｌ微小遠心管に移した。
【００７８】
エタノール（７０％；３５０μｌ）を均質化溶解物に添加し、２×５秒のパルスでボルテックスにより混合した。各調製物に関して、溶解物をピペットにより２−３回上下させ、２ｍｌの微小遠心管に入れたＲＮＡミニスピンカラムに適用した。この遠心管を８０００×ｇで３０秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。ＲＮＡスピンカラムを新しい採取管に移した。
【００７９】
ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭＤＢバッファー（３５０μｌ）を加え、この管を１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。ＤＮａｓｅ反応混合物を製造業者の使用説明書に従って調製し、ＲＮＡスピンカラム内に入っているフィルター表面に添加した。このＤＮＡｓｅインキュベーションは、室温に置いて１５分間実施した。
【００８０】
洗浄バッファーＲＡ２（２００μｌ）をＲＮＡミニスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。
【００８１】
６００μｌのバッファーＲＡ３をＲＮＡ  Ｍｉｎｉスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。バッファーＲＡ３（２５０μｌ）でさらにカラムを洗浄した。膜を完全に乾燥させるために、カラムを１１０００×ｇで２分間遠心分離し、このカラムを最終的にヌクレアーゼ非含有１．５ｍｌ微小遠心管内に入れた。
【００８２】
ＲＮａｓｅ非含有水（４０μｌ）を該カラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。精製されたＲＮＡは、直ちに下流の用途に使用するか、又は使用まで−８０℃において使用まで保存するかのどちらかであった。
【００８３】
長期保存後の複数組織由来のＲＮＡの完全性を判定するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、紙カードに保管されたマウス組織試料から単離されたＲＮＡに対して実施した。これらを、乾燥剤の存在下で２ヶ月保存した。ｍＲＮＡの定量を、製造業者の使用説明書に従って、ｉ）ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎの齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールキット（部品番号４３０８３１３）、ｉｉ）ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのネズミＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ及びＢｅｔａ−Ａｃｔｉｎ遺伝子用リアルタイムＬＵＸ  ｍＲＮＡプライマーセット（それぞれ、カタログ番号１０５Ｍ−０２、１００Ｍ−０２及び１０１Ｍ−０２）又はｉｉｉ）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓによる組織特異的遺伝子プライマーセットのいずれかを使用して成し遂げた。
【００８４】
図８は、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールキットを使用した、いくつかの組織源からのＧＡＤＰＨの相対発現レベルを示す。２つの異なる固体支持体カードに適用された試料由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。同程度のＧＡＰＤＨ  ＲＮＡレベルが、両方の紙タイプから単離されたＲＮＡから検出された。
【００８５】
ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチンをコードするネズミｍＲＮＡの絶対定量を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの適切なリアルタイムＬＵＸプライマーセットを用いて実施した。２つの異なる固体支持体カードに適用された試料由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。ＲＮＡの単離に関係するデータを図８に記載するが、このデータは、支持体材料が多数の組織型由来のＲＮＡの保存及び安定化を支持できることを実証している。
【００８６】
本発明の特定の実施形態を示し記載してきたが、本発明の教示から逸脱することなく、変更及び改良をなし得ることは当業者には明らかであると思われる。前述の説明及び添付の図面で示された事項は、例示としてのみ提示されるものであり、限定するものではない。発明の実際の範囲は、先行技術に基づいてその正しい視野において検討される場合、添付の特許請求の範囲で定義されることを意図する。
［実施態様１］
体液由来の１以上のバイオマーカーを検出する方法であって、
固体支持体に保存されていた体液試料由来のバイオマーカーに対する１以上のアッセイを実施するステップを含み、
バイオマーカーの変化が脳における生物学的事象の指標を与える、方法。
［実施態様２］
体液が血液又は脳脊髄液である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
バイオマーカーが、トランスサイレチン、クラスタリン、シスタチンＣ、Ａ１ＡｃｉｄＧ、細胞内接着分子１、チトクロームＣ４、色素上皮由来因子、アルファ１アンチトリプシン、ＲＡＮＴＥＳ、アポリポタンパク質Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（遺伝子型）、アポリポタンパク質Ａ１、神経特異的エノラーゼ、脳由来神経栄養因子、補体因子Ｈ、アルファマクログロブリン、血清アミロイドＰ、セルロプラスミン、アミロイドベータ、フィブリノーゲンアルファ鎖前駆体、ケラチン１型細胞骨格９（Ｋｅｒａｔｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ９）、血清アルブミン前駆体、ＳＰＡＲＣ様１タンパク質（ＳＰＡＲＣ−ｌｉｋｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ）、プラスミノーゲン結合タンパク質、タウ、シヌクレイン、タウキナーゼ及びタウホスファターゼの１以上である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
固体支持体が繊維材料、例えばセルロース繊維材料又はガラス繊維／マイクロファイバー材料である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様５］
固体支持体が多孔質ポリマー、例えばポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、硝酸セルロース、酢酸セルロース、アルギン酸塩又は酸化アルミニウムなどの多孔質膜材料である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様６］
支持体表面に、弱塩基、キレート化剤、陰イオン界面活性剤及び／又はチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤を含む化学物質が含浸されている、実施態様１に記載の方法。
［実施態様７］
１以上のアッセイの実施が、試料を含有する固体支持体からカットされたパンチから直接実施され、適宜、カットされたパンチを洗浄して、アッセイ反応の前に潜在的な阻害性化学物質を除去するステップを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様８］
固体支持体からバイオマーカーを精製して、その後バイオマーカーを検出するステップをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様９］
バイオマーカーの２以上がアッセイされる、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１０］
１以上のアッセイが、核酸分子に関するアッセイ、又はタンパク質系アッセイ又は抗体系のアッセイ又は酵素系のアッセイから選択される様々なアッセイである、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１１］
１以上のアッセイがマルチプレックスである、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１２］
１以上のバイオマーカーを定量するステップをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１３］
試料が、固体支持体に予め保存され、室温で保管される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１４］
変化が、バイオマーカーのレベルの増減、対照又は正常な個人に存在するバイオマーカーの不在、対照又は正常な個人に不在なバイオマーカーの存在及びゲノムレベルのＤＮＡの多型又は突然変異から選択される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１５］
１以上のアッセイが、核酸分子に関するアッセイ、又はタンパク質系アッセイ又は抗体系のアッセイ又は酵素系のアッセイを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１６］
認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人を特定する方法であって、
実施態様１に記載の方法に従って１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
検出結果に基づいて、その人に認知症又はアルツハイマー病のリスクがあるか否かを予測するステップと
を含む方法。
［実施態様１７］
検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップを含む、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行に関して人をモニタリングする方法であって、
人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、
実施態様１に記載の方法に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
検出されたバイオマーカーの経時的変化に基づいて、認知症又はアルツハイマー病の発症又は進行を予測するステップと
を含む方法。
［実施態様１９］
検出ステップを、いくつかの保存試料の一部を使用して実施する、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
検出ステップを、保存試料の一部を使用して、経時的に繰り返す、実施態様１９に記載の方法。
［実施態様２１］
バイオマーカーの検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップをさらに含む、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２２］
候補薬剤の有効性を評価する方法であって、
候補薬剤を使用して治療した認知症又はアルツハイマー病を有する人由来の多数の生体試料を経時的に得て、固体支持体に保存するステップと、
実施態様１に記載の方法に従って、保存試料のいくつかから１以上のバイオマーカーを検出するステップと、
薬剤が認知症又はアルツハイマー病を有する人の処置に有効であるか否かを予測するステップと
を含む方法。
［実施態様２３］
検出ステップを、いくつかの保存試料の一部を使用して実施する、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
検出ステップを、保存試料の一部を使用して、経時的に繰り返す、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
検出結果を、認知症又はアルツハイマー病のリスクのある人又はリスクのない人からの対照と比較するステップをさらに含む、実施態様２２に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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