(57)【要約】本発明は、三重陰性乳がんの検出のための組成物および方法を提供する。三重陰性乳がんを対象が有することを示すメタゲノムシグネチャーを該対象に由来する組織試料において検出するための組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法：
第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、該腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップ（PathoChip）アレイへハイブリダイズさせる工程；
第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせる工程であって、該参照試料が、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する、工程；
該第1のハイブリダイゼーションパターンと該第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程であって、該第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ該第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、該腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される、工程。
【請求項２】
前記微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーが、前記パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、前記腫瘍組織試料に由来する前記検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成され、該プローブが、マウス乳がんウイルス（MMTV）、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型（HTLV-1）、藤浪肉腫ウイルス（FSV）、サルウイルス40（SV40）、ジョン・カニンガム（John Cunningham）ウイルス（JC）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス16（HPV16）、ヒトパピローマウイルス6b（HPV6b）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV-1）、ウシ丘疹性口炎ウイルス（BPSV）、偽牛痘ウイルス（PCP）、タテラポックス（Taterapox）ウイルス（Tatera）、オーフウイルス（Orf）、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）、ブレブンディモナス（Brevundimonas）sp、スフィンゴバクテリア（Sphingobacteria）、プロビデンシア（Providencia）、プレボテラ（Prevotella）、ブルセラ（Brucella）、大腸菌（Escherichia coli （E.coli））、アクチノミセス（Actinomyces）、モビルンカス（Mobiluncus）、プロピニオバクテリア（Propiniobacteria）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ロチア（Rothia）、ペプチノフィルス（Peptinophilus）、キャプノサイトファーガ（Capnocytophaga）、プレイストフォラ（Pleistophora）、ピエドラ（Piedra）、ホンセカエア（Foncecaea）、フィアロフォラ（Phialophora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、トリチュリス（Trichuris）sp.、トキソカラ（Toxocara）sp.、リーシュマニア（Leishmania）sp.、タイレリア・エクイ（Theileria equi）（B.エクイ）、テラジア（Thelazia）sp.、またはパラゴニムス（Paragonimus）sp.からなる群より選択される微生物に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記第1のハイブリダイゼーションパターンが、前記パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、前記腫瘍組織試料に由来する前記検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成され、該プローブが、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法：
第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、該腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む第1のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程；
第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む第2のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程であって、該参照試料が、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する、工程；
該第1のハイブリダイゼーションパターンと該第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程であって、該第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ該第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、該腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される、工程。
【請求項５】
前記腫瘍組織試料が、生検試料、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料、または非固形腫瘍からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能に標識された核酸が、フルオロフォア、放射性リン酸、ビオチン、または酵素によって標識されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記フルオロフォアがCy3またはCy5である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
対象に由来する前記腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される場合、該対象に三重陰性乳がんに対する処置が提供される工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処置が手術、化学療法、または放射線治療を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、組成物。
【請求項１２】
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項１３】
前記核酸プローブが、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む、請求項12に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる微生物の群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項１５】
前記マイクロアレイが、バイオチップ、ガラススライド、ビーズ、または紙である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブとその使用のための説明材料とを含む、キット。
【請求項１７】
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイとその使用のための説明材料とを含む、キット。
【請求項１８】
MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる微生物の群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含む、キット。
【請求項１９】
前記核酸プローブが、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる2015年4月20日に出願された米国特許仮出願第62/150,126号に基づく優先権および恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
2015年の米国内の新しいがん症例の数は約160万件であり、死亡は500,000件を超えると推定されている（American Cancer Society,www.cancer.org）。1種または複数種のウイルスまたは微生物による感染は、がんの発症の3番目に多い原因であり、腫瘍の少なくとも20％を占める（Sawyers et al.(2013)Clin Cancer Res19,S4-98（非特許文献1）；de Martel et al.(2012)Lancet Oncol13,607-615（非特許文献2））。10種のウイルス（パピローマウイルス、B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルスBKpyV、JCpyV、およびMCpyV、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス8、ならびにT細胞白血病ウイルス1型および2型）、1種の細菌（ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））、ならびに2種の蠕虫（住血吸虫および肝吸虫）が、病因因子としてヒトがんの大きな原因となっていることが見出されている（de Martel et al.(2012)Lancet Oncol13,607-615（非特許文献2））。多くのウイルスおよびその他の微生物がヒトを宿主とするため、がんとの関連は、従来認識されていない感染または機序のために過小評価されている可能性が高い。微生物は、がんの起源および/または進行においても、がんに関連した病原においても、はるかに大きい役割を有する可能性がある。従って、がん型に関連した特異的なウイルスおよびその他の微生物因子（がん微生物シグネチャー）を知ることによって、原因、処置、および診断のための洞察が提供され得る。例えば、炎症または細胞過程の改変をもたらす1種または複数種の感染病原体による持続感染は、発がん過程に関与する可能性がある（Morales-Sanchez & Fuentes-Panana(2014)Viruses 6,4047-4079（非特許文献3））。あるいは、腫瘍微小環境は、これらの生物が正常組織においては繁殖するのが困難な方式で存続することができる特殊なニッチを提供する可能性がある。いずれのケースにおいても、特定のがんに関連した独特の微生物シグネチャーの同定は、マイクロバイオームとがんとの間の相互関係の理解のため、そして診断のため、不可欠である。さらに、特定のがんに関連しておりその原因となり得る病原を同定することが、重要である。しかしながら、組織試料中に低コピー数で存在する病原を検出することは困難であった。
【０００３】
ウイルス、細菌、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、蠕虫、および原虫を含む病原性生物を同定する必要は、近年より切実になっている。関連するウイルスおよび微生物について多くの腫瘍試料を迅速にスクリーニングするため、ウイルスおよびその他のヒト病原性微生物のDNAおよびRNAの平行検出のためのプローブセットを含有しているマイクロアレイに基づくテクノロジー（パソチップ（PathoChip））が開発されている（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714（非特許文献4））。パソチップの最新版は、全ての公知のウイルス、250種の蠕虫、130種の原虫、360種の真菌、および320種の細菌を表す60,000種のプローブを含有している。アレイは二つの型のプローブを含有している：各々の特定のウイルスおよび微生物に対する独特のプローブ、ならびにウイルス科のメンバーの間で保存されているゲノム領域を標的とし、それによって、その科の以前に特徴決定されていないメンバーの検出のための手段を提供する保存プローブ。パソチップスクリーニングテクノロジーは、試料中に低いゲノムコピー数で存在する微生物およびウイルスの検出を可能にする増幅工程を含む。従って、パソチップテクノロジーは、他のマイクロバイオームスクリーニングアッセイと比べて増加した感度および界のより広いカバレッジを有する。これは、複数の試料を、微生物因子の存在について、迅速に高感度にスクリーニングすることを可能にする。
【０００４】
デノボカタログ作製は、ヒトマイクロバイオームの中の種の数を拡張し、それらの分布を特徴決定するため、疾患に強く関連した病原体を効率的に同定するためのメタゲノムツールが必要である。マイクロバイオームを査定する能力は、病原の間の相互作用、および病原と共生生物との相互作用、宿主遺伝学、ならびに環境要因を理解するために必要であろう。数千の種が正常なヒトマイクロバイオームを構成することを考慮すれば（Relman.Nature 2012;486(7402):194-195（非特許文献5））、微生物コミュニティーは、正常な生理学にも、がんを含む疾患の原因およびそれに対する応答にも、実質的に影響する可能性が高い（Laass et al.Autoimmun Rev 2014（非特許文献6））。これらの効果は、胃腸管（Laass et al.Autoimmun Rev 2014（非特許文献6）;Major and Spiller.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2014;21(1):15-21（非特許文献7）；Schwarzberg et al.PLoS One 2014;9(1):e86708（非特許文献8）；Scharschmidt and Fischbach.Drug Discov Today Dis Mech 2013;10(3-4) （非特許文献9））、皮膚（Scharschmidt and Fischbach.Drug Discov Today Dis Mech 2013;10(3-4)（非特許文献9））、および気道（Martinez et al.Ann Am Thorac Soc 2013;10 Suppl:S170-179（非特許文献10）；Segal et al.Ann Am Thorac Soc 2014;11(1):108-116（非特許文献11）；Sze et al.HAnn Am Thorac Soc 2014;11 Suppl 1:S77（非特許文献12））のような常在マイクロバイオームを有することが公知の組織において、そして免疫応答および炎症応答（Gjymishka et al.Immunotherapy 2013;5(12):1357-1366（非特許文献13）；Kamada and Nunez.Gastroenterology 2014（非特許文献14）；Koboziev et al.Free Radic Biol Med 2013;68C:122-133（非特許文献15）；Ooi et al.PLoS One 2014;9(1):e86366（非特許文献16））において、精力的に調査されている。マイクロバイオームプロファイリングは、微生物および予想外の位置におけるそれらの存在のより不明瞭な役割も解明しており；がんに関連する例には、腫瘍微小環境のモジュレーション（Iida et al.Science 2013;342(6161):967-970（非特許文献17））および乳がん組織における細菌集団のディスバイオシス（Xuan et al,PLoS One 2014;9(1):e83744（非特許文献18））が含まれる。
【０００５】
従って、病原検出に基づく新規の組成物および方法は、がん、具体的には、感染病原体に関連したがんを診断し、がんと感染病原体との間の関連の理解を獲得するための手段を提供する可能性を有する。本発明はこれらの必要性を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sawyers et al.(2013)Clin Cancer Res19,S4-98
【非特許文献２】de Martel et al.(2012)Lancet Oncol13,607-615
【非特許文献３】Morales-Sanchez & Fuentes-Panana(2014)Viruses 6,4047-4079
【非特許文献４】Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714
【非特許文献５】Relman.Nature 2012;486(7402):194-195
【非特許文献６】Laass et al.Autoimmun Rev 2014
【非特許文献７】Major and Spiller.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2014;21(1):15-21
【非特許文献８】Schwarzberg et al.PLoS One 2014;9(1):e86708
【非特許文献９】Scharschmidt and Fischbach.Drug Discov Today Dis Mech 2013;10(3-4)
【非特許文献１０】Martinez et al.Ann Am Thorac Soc 2013;10 Suppl:S170-179
【非特許文献１１】Segal et al.Ann Am Thorac Soc 2014;11(1):108-116
【非特許文献１２】Sze et al.HAnn Am Thorac Soc 2014;11 Suppl 1:S77
【非特許文献１３】Gjymishka et al.Immunotherapy 2013;5(12):1357-1366
【非特許文献１４】Kamada and Nunez.Gastroenterology 2014
【非特許文献１５】Koboziev et al.Free Radic Biol Med 2013;68C:122-133
【非特許文献１６】Ooi et al.PLoS One 2014;9(1):e86366
【非特許文献１７】Iida et al.Science 2013;342(6161):967-970
【非特許文献１８】Xuan et al,PLoS One 2014;9(1):e83744
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に記載されるように、本発明は、試料において三重陰性乳がんを検出するための組成物および方法に関する。本発明の一つの局面は、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法を含む。方法は、第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせ、次いで、第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせる工程を含む。参照試料は、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する。次に、第1のハイブリダイゼーションパターンと第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する。第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される。
【０００８】
別の局面において、本発明は、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法を含む。方法は、第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を第1のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程を含む。第1のマイクロアレイは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む。次の工程は、第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、第2のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程を含む。第2のマイクロアレイは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む。参照試料は、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する。次いで、第1のハイブリダイゼーションパターンと第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する。第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む組成物を含む。本発明のさらに別の局面は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含む。
【００１０】
本発明の別の局面は、少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含む。プローブは、マウス乳がんウイルス（MMTV）、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型（HTLV-1）、藤浪肉腫ウイルス（FSV）、サルウイルス40（SV40）、ジョン・カニンガム（John Cunningham）ウイルス（JC）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス16（HPV16）、ヒトパピローマウイルス6b（HPV6b）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV-1）、ウシ丘疹性口炎ウイルス（BPSV）、偽牛痘ウイルス（PCP）、タテラポックス（Taterapox）ウイルス（Tatera）、オーフウイルス（Orf）、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）、ブレブンディモナス（Brevundimonas）sp、スフィンゴバクテリア（Sphingobacteria）、プロビデンシア（Providencia）、プレボテラ（Prevotella）、ブルセラ（Brucella）、大腸菌（Escherichia coli （E.coli））、アクチノミセス（Actinomyces）、モビルンカス（Mobiluncus）、プロピニオバクテリア（Propiniobacteria）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ロチア（Rothia）、ペプチノフィルス（Peptinophilus）、キャプノサイトファーガ（Capnocytophaga）、プレイストフォラ（Pleistophora）、ピエドラ（Piedra）、ホンセカエア（Foncecaea）、フィアロフォラ（Phialophora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、トリチュリス（Trichuris）sp.、トキソカラ（Toxocara）sp.、リーシュマニア（Leishmania）sp.、タイレリア・エクイ（Theileria equi）（B.エクイ(B.equi））、テラジア（Thelazia）sp.、またはパラゴニムス（Paragonimus）sp.からなる微生物の群より選択される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、少なくとも2、3種の核酸プローブを含むキットを含む。プローブは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される。キットは、その使用のための説明材料を含む。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、マイクロアレイを含むキットを含む。マイクロアレイは、少なくとも3種の核酸プローブを含む。プローブは、MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる微生物の群より選択される。
【００１３】
本明細書で図示された本発明の前記の局面または他の局面の様々な態様において、微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーは、パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成される。プローブは、MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる群より選択される微生物に由来する。
【００１４】
別の態様において、第1のハイブリダイゼーションパターンは、パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成される。プローブは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される。
【００１５】
さらに別の態様において、腫瘍組織試料は、生検試料、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料、または非固形腫瘍からなる群より選択される。さらに別の態様において、対象はヒトである。ある種の態様において、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される場合、対象に三重陰性乳がんに対する処置が提供される。三重陰性乳がんに対する処置には、手術、化学療法、または放射線治療が含まれる。
【００１６】
別の態様において、検出可能に標識された核酸は、フルオロフォア、放射性リン酸、ビオチン、または酵素によって標識されている。ある種の態様において、フルオロフォアはCy3またはCy5である。
【００１７】
さらに別の態様において、マイクロアレイ内の核酸プローブは、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む。別の態様において、キット内の核酸プローブは、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む。
【００１８】
ある種の態様において、マイクロアレイは、バイオチップ、ガラススライド、ビーズ、または紙である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1A〜1Jは、キャプチャーシーケンシングにおいて、選択されたプローブ（プローブプールVCP、プローブプールVSP、プローブプールPox、プローブプールB1およびB2、プローブプールP1およびP2）によってキャプチャーされた標的の同一性を明らかにする、パソチップのメタゲノムと整列したMiSeqリードを示す。個々のキャプチャーについて、Miseqリードと共に、ゲノム位置が示される。個々のキャプチャーについて、MiSeqリードの数と共に、個々のアクセッションのゲノム位置が記される。IGVのアライメントトラックは、上カバレッジトラックおよび下カバレッジトラックを示した。IGVは、標準色（水平の黒線）によって、期待値から逸脱するペアードエンドアライメントを示す。ミスマッチ塩基も、リードを表す灰色の整列配列バー上に黒で示される。キャプチャーシーケンシングにおいて、選択されたプローブによってキャプチャーされたウイルスシグネチャーおよびその他の微生物シグネチャーが、示される。
【図２】図2A〜2Dは、標的キャプチャーのために使用されたプローブの型を列挙している表である。プローブのヌクレオチド配列は、表2に列挙されている。
【図３】図3A〜3Gは、パソチップスクリーニングによって、100個の乳がん試料（個々40およびプール12）において、検出不可能なハイブリダイゼーションシグナル、低度のハイブリダイゼーションシグナル（＞30〜300）、中程度のハイブリダイゼーションシグナル（300〜3000）、および高度のハイブリダイゼーションシグナル（＞3000）（Cy3-Cy5）を示す候補生物のプローブの％を示す。対応対照（MC）および非対応対照（NC）は、それら対照と比べて有意な乳がん試料におけるプローブの検出を示すために含まれる。図3A〜3Cは、乳がん試料において検出されたウイルス候補の特異的プローブの検出％を示す。図3D〜3Eは、乳がん試料において低度のハイブリダイゼーションシグナル、中程度のハイブリダイゼーションシグナル、および高度のハイブリダイゼーションシグナルによって検出された細菌プローブの検出％を示す。図3Fは、乳がん試料において低度のハイブリダイゼーションシグナル、中程度のハイブリダイゼーションシグナル、および高度のハイブリダイゼーションシグナルによって検出された真菌プローブの百分率を示すチャートである。図3Gは、乳がん試料において低度のハイブリダイゼーションシグナル、中程度のハイブリダイゼーションシグナル、および高度のハイブリダイゼーションシグナルによって検出された寄生虫プローブの百分率を示すチャートである。
【図４】図4A〜4Dは、三重陰性乳がん試料に関連するウイルスシグネチャーおよび微生物シグネチャーの検出を示す。図4Aは、100個の三重陰性乳腺腫瘍試料において検出された保存ウイルスプローブおよび特異的ウイルスプローブについてのハイブリダイゼーションシグナル（試験値-参照値）を示す、腫瘍試料および対応対照（MC）試料および非対応対照（NC）試料（y軸）へハイブリダイズしたプローブ（x軸）のヒートマップである。図4Bは、プローブの分布率および腫瘍への減少するハイブリダイゼーションシグナルに従ってランク付けされた、100個の三重陰性乳腺腫瘍試料における特異的なウイルスシグネチャーの検出％を示す一連のグラフである。図4Cは、100個の三重陰性乳腺腫瘍試料において検出された、細菌、真菌、および寄生虫の保存プローブおよび特異的プローブについてのハイブリダイゼーションシグナル（試験値-参照値）を示す、腫瘍試料（y軸）にハイブリダイズしたプローブ（x軸）のヒートマップである。図4Dは、分布率および減少するハイブリダイゼーションシグナルに従ってランク付けされた、100個の三重陰性乳腺腫瘍試料における特異的な微生物シグネチャーの検出％を示す一連のグラフである。
【図５】100個の三重陰性乳がん試料における選択された候補感染病原体の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。試料は、類似したウイルス、細菌、真菌、および寄生虫の候補シグネチャー検出に基づき分類された。
【図６】図6A〜6Cは、PCRによるパソチップハイブリダイゼーション結果のバリデーションを示す一連の画像である。PCR増幅のためのプライマーは、パソチップスクリーニングにおいて使用された、標的へハイブリダイズした保存プローブおよび特異的プローブから設計された。PCRプライマーが設計されたプローブについてのがん試料および対照試料におけるヒートマップが、各PCR増幅ゲル画像について、左パネルに示される。増幅されたPCR産物は、パソチップハイブリダイゼーション結果をバリデートした。MC：対応対照（乳がん患者に由来する隣接する非がん性乳腺組織）；NC：非対応対照（健常個体に由来する乳腺組織）。NTC：鋳型無しの対照、すなわち、PCR反応における汚染を除外するために使用される滅菌水。
【図７】図7A〜7Dは、核酸キャプチャーおよびMiSeqデータ分析のために使用されたキャプチャープールを示す。図7Aは、4回の異なる分析から選択された、プローブ（Y軸）からの試験シグナル-参照シグナルを示すヒートマップである。示される5種のプローブプールを使用して、標的核酸の七（7）種の別々のキャプチャーを行った。図7B〜7Dは、三重陰性乳がん試料についてのMiSeqから入手された個々のリードを示す一連のパネルである。全ゲノムの増幅されたDNA＋cDNAを、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、およびウイロイドのビオチン化された保存プローブおよび特異的プローブのセットへハイブリダイズさせ、ストレプトアビジンビーズ上にキャプチャーし、タグメンテーション（tagmentation）ライブラリー調製およびペアードエンド250ntリードによるディープシーケンシングのために使用した。ウイルス保存プローブ（キャプチャープローブプールVCP）、ウイルス特異的プローブ（キャプチャープローブプールVSP）、ポックスウイルスプローブ（キャプチャープローブプールPox）、細菌プローブ（キャプチャープローブプールB1およびB2）、真菌/寄生虫およびウイロイドプローブ（キャプチャープローブプールP1およびP2）を使用したキャプチャーシーケンシングによって生成されたライブラリーに対して、MiSeqを行った。個々のキャプチャーからのMiseqリードは、パソチップのメタゲノム（チッププローブ）と整列させた場合に、示した生物のキャプチャープローブ領域に大部分がクラスター化することが見出された。ゲノム位置は、MiSeqリードの数と共に図に示され、ゲノム座標を表す。
【図８】図8A〜8Fは、7種の異なるキャプチャー反応、即ち、細菌プローブ（B1およびB2）、寄生虫-真菌-ウイロイドプローブ（P1およびP2）、pox保存プローブ（pox）、ウイルス特異的プローブ（VSP）、およびウイルス保存プローブ（VCP）における候補のMiSeqリードを列挙したものである。7種のキャプチャーシーケンシング（それぞれ、B1、B2、P1、P2、Pox、VCP、およびVSP）についての各生物にマッピングされたリードが要約される。具体的には、種全体（＊_org）、キャプチャープローブ領域（＊_プローブ）、およびプローブ外領域（＊_プローブ外）と整列したリードの総数を計数した。例えば、P1キャプチャーシーケンシングによって検出された生物DQ118536.1を参照すること。この生物と整列したリード（P1_org）は168個存在し、そのうちの160個のリード（p1_プローブ）がキャプチャープローブ領域と整列し、残りの8個のリード（P1_プローブ外）はキャプチャー外プローブ領域と整列した。各生物について、スコアカラムは、キャプチャープローブ領域およびプローブ外領域の両方にリードがマッピングされるキャプチャーシーケンシングの数を与える。例えば、P1キャプチャーシーケンシングおよびP2キャプチャーシーケンシングによるリードがプローブ領域およびプローブ外領域の両方へマッピングされることが見出されたため、生物DQ118536.1のスコアは2である。7種のキャプチャーシーケンシング条件の全てにおいてキャプチャープローブ領域にマッピングされたリードの総数を、プローブスコアカラムにおいて合計した。キャプチャープローブ領域にマッピングされたリードを有する候補生物（プローブスコア＞0）が、列挙され、スコアカラムによってランク付けされている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照が、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書において使用されるように、以下の用語は、他に明示されない限り、以下に与えられる意味を有する。
【００２１】
本明細書において使用されるように、冠詞「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、前後関係がそうでないことを明白に示さない限り、複数の指示を含む。例えば、「要素（an element）」とは、一つの要素または複数の要素を意味する。
【００２２】
本明細書において使用されるように、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される情況に依ってある程度変動するであろう。本明細書において使用されるように、量、濃度、時間の長さ等のような測定可能な値をさす場合、明示された値からの±20％または±10％、より好ましくは、±5％、さらに好ましくは、±1％、さらに好ましくは、±0.1％の変動は、開示された方法を実施するのに適切であるため、「約」という用語にはそのような変動が包含されるものとする。
【００２３】
「バイオマーカー」または「マーカー」とは、本明細書において使用されるように、一般に、疾患に関連している核酸分子、臨床的指標、タンパク質、またはその他の分析物をさす。ある種の態様において、核酸バイオマーカーは、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、蠕虫、および原虫を含むが、これらに限定されるわけではない病原性生物の、試料における存在を示す。様々な態様において、マーカーは、疾患（例えば、感染性疾患）を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象から入手された生物学的試料において、参照と比べてディファレンシャルに存在する。試料中に存在するバイオマーカーのレベルの平均値または中央値が、参照中に存在するレベルと統計的に異なる場合、そのマーカーはディファレンシャルに存在する。参照レベルは、例えば、清潔なまたは汚染されていない起源から入手された環境試料に存在するレベルであり得る。参照レベルは、例えば、健常対照対象から入手された試料に存在するレベル、または先の時点で、即ち、処置前に対象から入手されたレベルであってもよい。統計的有意性についての一般的な試験には、とりわけ、t検定、ANOVA、クラスカル・ウォリス、ウィルコクソン、マン・ホイットニー、およびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独でまたは組み合わせられて、対象が関心対象の表現型状態に属する相対確率の尺度を提供する。対象の試料における本発明のマーカーのディファレンシャルな存在は、対象が疾患（例えば、感染性疾患）を有するかもしくはそれを発症するリスクを有することの特徴決定において、対象の予後の判定のため、治療効力の評価のため、または処置計画の選択のため、有用であり得る。
【００２４】
「作用物質」とは、任意の核酸分子、低分子化合物、抗体、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００２５】
「改変」または「変化」とは、増加または減少を意味する。改変は、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％と小さくてもよいし、または40％、50％、60％であってもよいし、またはさらには70％、75％、80％、90％、もしくは100％と大きくてもよい。
【００２６】
「生物学的試料」とは、任意の組織、細胞、液体、または生物に由来するその他の材料を意味する。
【００２７】
「キャプチャー試薬」とは、核酸分子またはポリペプチドを選択するかまたは単離するために核酸分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬を意味する。
【００２８】
本明細書において使用されるように、「決定/判定すること」、「査定すること」、「アッセイすること」、「測定すること」、および「検出すること」という用語は、定量的決定および定性的決定の両方をさし、従って、「決定/判定すること」という用語は、本明細書において、「アッセイすること」、「測定すること」等と交換可能に使用される。定量的決定が意図される場合には、分析物等の「量を決定すること」という語句が使用される。定性的決定および/または定量的決定が意図される場合には、分析物の「レベルを決定すること」または分析物の「検出すること」という語句が使用される。
【００２９】
「検出可能な部分」とは、関心対象の分子に連結された場合に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段を介して後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば、ELISAにおいて一般的に使用される）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【００３０】
「断片」とは、核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、好ましくは、参照核酸分子または参照ポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含有している。断片は、5個、10個、15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個のヌクレオチドを含有していてよい。
【００３１】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸塩基の間のワトソンクリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対形成する相補的な核酸塩基である。
【００３２】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、そのネイティブの状態において見出される通常それに付随している成分が様々な程度に除去されている材料をさす。「単離する」とは、最初の起源または周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」とは、単離より高度の分離を意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物が、タンパク質の生物学的特性に物質的に影響を与えず、その他の有害な結果も引き起こさないよう、他の材料が十分に除去されている。即ち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって作製された場合には、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地が、または化学合成された場合には、化学的前駆物質もしくはその他の化学物質が、実質的に除去されている場合、精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じることを意味することができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質については、異なる修飾が、異なる単離されたタンパク質を生じることができ、それらは別々に精製され得る。
【００３３】
「参照」とは、比較の基準を意味する。当業者に明白であるように、適切な参照は、要素の効果を判定するために要素が変化させられるものである。一つの態様において、試料に存在する標的核酸分子のレベルは、清潔なまたは汚染されていない試料に存在する標的核酸分子のレベルと比較され得る。例えば、試料に存在する標的核酸分子のレベルは、対応する健常な細胞もしくは組織、または疾患の細胞もしくは組織（例えば、疾患、障害、もしくは状態を有する対象に由来する細胞もしくは組織）に存在する標的核酸分子のレベルと比較され得る。
【００３４】
「マーカープロファイル」とは、2種またはそれ以上のマーカー（例えば、ポリヌクレオチド）のシグナル、レベル、発現、または発現レベルの特徴決定を意味する。
【００３５】
「微生物」という用語は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫を含むが、これらに限定されるわけではない、一般的に使用される「微生物学」という用語の範囲内に分類される全ての生物を意味する。
【００３６】
「マイクロアレイ」という用語は、基質上に固定化された核酸プローブのコレクションを意味する。本明細書において使用されるように、「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾型ヌクレオチド、および一本鎖型または二本鎖型のそれらのポリマーをさす。その用語には、合成の、天然に存在する、天然には存在しない、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基もしくは結合を含有している核酸が包含される。本発明の方法において有用な核酸分子には、標的核酸（例えば、核酸バイオマーカー）に特異的に結合する核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシーの条件の下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載された遺伝子）またはその一部分の間で二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照すること）。
【００３７】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは、約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で入手され得、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは、少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で入手され得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは、少なくとも約37℃、最も好ましくは、少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの包含または排除のような追加のパラメータの変動は、当業者に周知である。ストリンジェンシーの様々なレベルは、必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDSにおいて30℃で行われるであろう。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）において37℃で行われるであろう。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて42℃で行われるであろう。これらの条件の有用な変動は、当業者に容易に明白であろう。
【００３８】
大部分の適用に関して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーが変動するであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。前記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少または温度の増加によって増加させられ得る。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは、少なくとも約42℃、さらに好ましくは、少なくとも約68℃の温度を含むであろう。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて25℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて42℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて68℃で行われるであろう。これらの条件についての追加の変動は、当業者に容易に明白であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。
【００３９】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか）または参照核酸配列（例えば、本明細書に記載された核酸配列のいずれか）との少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸の分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用された配列と、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも60％、より好ましくは、80％または85％、より好ましくは、90％、95％、96％、97％、98％、またはさらには99％もしくはそれ以上、同一である。
【００４０】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue,Madison,Wis.53705の配列分析ソフトウェアパッケージ、BLASTプログラム、BESTFITプログラム、GAPプログラム、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムが使用されてよく、e-3〜e-100の間の確率スコアが、密接に関連した配列を示す。
【００４１】
本明細書において使用されるように、「試料」という用語には、任意の組織、細胞、液体、または生物に由来するその他の材料のような生物学的試料が含まれる。
【００４２】
「特異的に結合する」とは、ある分子（例えば、核酸バイオマーカー）を認識しそれに結合するが、試料、例えば、生物学的試料の中の他の分子を実質的に認識せずそれに結合しない化合物（例えば、核酸プローブまたはプライマー）を意味する。
【００４３】
「実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャー」という用語は、相対的な用語であり、腫瘍試料において参照試料より多くの微生物が存在することを示すハイブリダイゼーションシグネチャーを意味する。
【００４４】
「実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない」という用語は、相対的な用語であり、参照試料において腫瘍試料より少ない微生物が存在することを示すハイブリダイゼーションシグネチャーを意味する。
【００４５】
「対象」とは、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコ、マウス、もしくはサルのような非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されるわけではない哺乳動物を意味する。「対象」という用語は、処置、観察、または実験の対象である動物（例えば、患者）をさすことができる。
【００４６】
「標的核酸分子」とは、分析されるポリヌクレオチドを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。「標的核酸分子」という用語は、最初の標的配列のアンプリコンもさす。様々な態様において、標的核酸分子は、1種または複数種の核酸バイオマーカーである。
【００４７】
「腫瘍組織試料」という用語は、対象における固形腫瘍および非固形腫瘍を含む、対象における腫瘍に由来する試料を意味する。
【００４８】
本明細書において使用されるように、「処置する」、「処置すること」、「処置」等の用語は、障害および/またはそれに関連した症状の低下または寛解をさす。障害または状態の処置は、障害、状態、またはそれらに関連した症状が完全に排除されることを必ずしも必要としないことが認識されるであろう。
【００４９】
本明細書に提供される範囲は、範囲内の値の全ての略記であることが理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
【００５０】
本明細書に提供される任意の化合物、組成物、または方法が、本明細書に提供される他の組成物および方法のうちの一つまたは複数と組み合わせられてもよい。本明細書において使用される用語法は、具体的な態様を記載するためのものに過ぎず、限定するためのものではないことも理解されるべきである。
【００５１】
特記されるかまたは前後関係から明瞭でない限り、本明細書において使用されるように、「または」という用語は、包括的であると理解される。
【００５２】
「含む（including）」という用語は、「含むが、これらに限定されるわけではない」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と交換可能に使用される。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、「含有している」、「有する」等の用語は、米国特許法においてそれらに与えられた意味を有していてよく、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる」または「本質的になる」は、同様に、米国特許法において与えられた意味を有し、その用語は無制限であり、列挙されたものの基本的なまたは新規の特徴が、列挙されたもの以外の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以外の存在を可能にするが、先行技術の態様は除外する。本発明の他の特色および利点は、その望ましい態様の以下の説明および特許請求の範囲から明白であろう。
【００５４】
説明
本発明は、対象に由来する組織試料において1種または複数種の感染病原体に由来する遺伝子材料の存在を検出する工程を含む、対象における三重陰性乳がんの検出または診断のための組成物および方法を特色とする。多数のウイルス、細菌、真菌、および寄生虫の感染病原体に由来する遺伝子材料の検出を含む、三重陰性乳がんを対象が有することを示すメタゲノミクスシグネチャーが同定された。
【００５５】
本明細書に記載されるように、100個の三重陰性乳がん（TNBC）試料ならび20個の対応対照および20個の非対応対照をスクリーニングするため、パソチップアプローチを使用した。関連するウイルスおよび微生物について多くの腫瘍試料を迅速にスクリーニングするため、本発明者らは、ウイルスおよびその他のヒト病原性微生物のDNAおよびRNAの平行検出のためのプローブセットを含有しているマイクロアレイに基づくアプローチ（パソチップ）を開発した（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）。パソチップの最新版は、全ての公知のウイルス、250種の蠕虫、130種の原虫、360種の真菌、および320種の細菌を表す60,000種のプローブを含有している。アレイは二つの型のプローブを含有している：各々の特定のウイルスおよび微生物に対する独特のプローブ、ならびにウイルス科のメンバーの間で保存されているゲノム領域を標的とし、それによって、その科の以前に特徴決定されていないメンバーの検出のための手段を提供する保存プローブ。パソチップスクリーニングテクノロジーは、試料中に低いゲノムコピー数で存在する微生物およびウイルスの検出を可能にする増幅工程を含む。従って、パソチップテクノロジーは、他のマイクロバイオームスクリーニングアッセイと比べて増加した感度および界のより広いカバレッジを有する。これは、複数の腫瘍試料を、微生物因子の存在について、迅速に高感度にスクリーニングすることを可能にする。
【００５６】
対照と比較して乳がん試料において有意に検出されるウイルスおよびその他の微生物配列を表すプローブが同定された。これらのプローブを、両方のPCR立証のために使用し、ハイブリダイズする配列を乳がん試料から選択するための磁気ビーズ上のキャプチャー試薬としても使用し、それらを、さらなる立証のため、miSeqによって配列決定した。データは、三重陰性乳がんについての独特の微生物シグネチャーを確立する。
【００５７】
乳がんおよび三重陰性乳がん（TNBC）
乳がんは、最も有病率の高いがんのうちの一つであり、2015年、米国内で200,000件の新しい症例が診断され、死亡は40,000を超えると推定されている（例えば、http://seer.cancer.gov/statfacts/html/breast.htmlを参照すること）。乳がんは、ある種のホルモンおよび増殖受容体の存在または欠如に基づきカテゴリ化される。四つの主要な型が存在する：内分泌受容体（エストロゲンまたはプロゲステロンの受容体）陽性、ヒト上皮増殖因子受容体2（Her2）陽性、三重陽性（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびHER2受容体が陽性）、ならびに三重陰性（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびHER2受容体の欠如）（www.webmd.com/breast-cancer）。後者の型の乳がんは、内分泌治療によって処置され得ず、疾患の最も侵襲性の型である（http://www.cancercenter.com）。遺伝学的に乳がんの素因を有する者において変異している遺伝子（例えば、BRCA1/2およびその他）（Shiovitz and Korde(2015)Ann Oncol20；Cornejo-Moreno et al.(2014)Isr Med Assoc J16,787-792；Sun et al.(2015)Int J Mol Sci16,4121-4135；Chacon-Cortes et al.,(2015)Tumour Biol14,14）、ならびにこれらのがんの発症および進行において主要な役割を果たす家族歴（Pilato et al.(2014)J Hum Genet59,51-53）、民族性（Tehranifar et al.(2015)Am J Epidemiol181,204-212）、肥満（Kruk(2014)Asian Pac J Cancer Prev15,9579-9586）、乳腺組織密度（Yaghjyan et al.(2015)Breast Cancer Res Treat13,13）、性別（Sherman and Lane(2014)J Cancer Educ17,17）、環境要因（Hiatt RA,Haslam SZ,& Osuch J(2009)Environ Health Perspect117,1814-1822）、および生活習慣に関連した要因（Kruk(2014)Asian Pac J Cancer Prev15,9579-9586）のようなその他の要因に研究が充てられている。しかしながら、いくつかの研究が、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、およびレトロウイルスとの関連を示しているものの（Shiovitz and Korde(2015)Ann Oncol20）、ウイルスおよび微生物の乳がんとの関連の決定には重点が置かれていない。
【００５８】
メタゲノムシグネチャーおよび三重陰性乳がん
本願において、全ての公知のウイルス因子、ならびにヒトに対して病原性の細菌、真菌、および寄生虫をカバーする60,000種のプローブのセットを含有しているパソチップアレイを使用して、100個の三重陰性乳がん試料において、主なウイルス、細菌、真菌、および寄生虫のゲノム配列を検出した。この高感度のアプローチは、個々の乳がん試料において複数のウイルスおよび微生物を検出した。これらの結果は、PCRおよび標的キャプチャーシーケンシングによってバリデートされた。階層的分析は、試験されたTNBC試料において少なくとも2種の主要な微生物シグネチャーが見出され得ることを示す。重要なこととして、データは、これらのウイルスおよびその他の微生物因子が腫瘍組織または腫瘍微小環境と如何に関連しているかに関して、限定された情報を提供する。データは、これらのウイルスおよび微生物が、TNBCの発症の原因となるかまたはそれに寄与することを示唆しない。これらのウイルスおよび微生物ががん病理に寄与している可能性もあるし、腫瘍組織および腫瘍微小環境が、それらが存続するために好都合なニッチを提供している可能性もある。少なくとも、これらのウイルスおよび微生物のシグネチャーの存在は、診断能力を提供する。
【００５９】
興味深いことに、TNBC試料は、少なくとも2種の異なる微生物シグネチャーを示す階層グループへ分類された。一方の階層シグネチャーには、ウイルス：ヘルペスウイルスシグネチャー（主として、βおよびγヘルペスウイルス様）；パラポックスウイルスシグネチャー（パラポックスウイルス科様）；フラビウイルス（C型肝炎様およびGB型肝炎様）；ポリオーマ（JC様、MCPV様、およびSV40様）；レトロウイルス（MMTV様、HERV-K様、HTLV様）；ヘパドナウイルス（B型肝炎様）、ならびにパピローマウイルス（HPV-2、6b、および18様）の分布率が高かった。この階層シグネチャーには、トリチュリス科、トキソカラ科、リーシュマニア科、バベシア科(Babesia)、およびテラジア科を表す寄生虫シグネチャーも、より高い傾向があった。寄生虫の転移性乳がんとの関連に関しては、一つの報告が存在する（Schafer A(1969)Experientia25,729-732）。第2の顕著な階層シグネチャーは、より少ないウイルスおよび寄生虫を示すが、多数の科（アクチノミセス科（Actinomycetaceae）、カウロバクテリウム科（Caulobacteriaceae）、スフィンゴバクテリウム科（Sphingobacteriaceae）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、プレボテラ科（Prevotellaceae）、ブルセラ科（Brucellaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、ペプトストレプトコッカス科（Peptostreptococcaceae）、フラボバクテリウム科（Flavobacteriaceae））の代表によって示されたより高い細菌含量を示し、それらのうちのいくつかは、がんに関連付けられている（Han and Andrade(2005)J Antimicrob Chemother55,853-859；Dobinsky et al.(1999)Eur J Clin Microbiol Infect Dis18,804-806；Alison et al.(2014)EJSO40,650-651；Gupta et al.(2012)Breast Care(Basel)7,153-154）。真菌シグネチャーは、2つの階層シグネチャーの間に比較的等しく見出され得、プレイストフォラ科、ピエドライア（Piedraia）科、ホンセカエア科、およびフィアロフォラ科の代表を示唆した。
【００６０】
パソチップスクリーニングは、いくつかの驚くべき結果も提供した。例えば、オクラモザイクウイルス（Stephan et al.(2008)Virus Genes36,231-240）およびカンキツウイロイドVに関連した配列の検出（図4A〜4Dおよび表5）。興味深いことに、ウイロイドのRNAの検出は、乳がんにおける核内ウイロイドを示唆した研究によって支持される（Schafer(1969)Experientia25,729-732）。さらに、食事性の生の果実および野菜は、多数の植物性のウイルスおよびウイロイドに個体を曝し、いくつかは存続し得る。スクリーニングは、バキュロウイルスに類似しているゲノム配列も検出した。特定の理論に拘束されないが、昆虫ウイルスおよび植物ウイルスのバリアントが特定の状況の下でヒトにおいて存続することは全くあり得る。
【００６１】
従って、新鮮な組織においてより多くの研究を行うことによって、TNBC微生物シグネチャーは拡張され得る。FFPE試料中のRNAウイルスゲノムは、より分解を受けやすいため、その後のスクリーニングはDNAウイルスに偏る可能性がある。にも関わらず、データは、TBNCにおける微生物シグネチャーを図示することが可能であり、このシグネチャーが正常組織においては過小提示されることを明白に示す。
【００６２】
一つの態様において、本発明は、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法を含む。方法は、第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせる工程、および第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせる工程を含む。参照試料は、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する。次に、第1のハイブリダイゼーションパターンと第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する。第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される。
【００６３】
前記方法の別の態様において、微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーは、パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成される。本発明の方法において有用な核酸プローブの数は、少なくとも3プローブ、少なくとも10プローブ、少なくとも30プローブ、少なくとも90プローブ、少なくとも120プローブ、少なくとも140プローブ、少なくとも160プローブ、またはそれらの間の全てのプローブ数であり得る。これらの数の核酸プローブの使用は、本明細書に記載された全ての各々の方法、組成物、およびキットに当てはまる。
【００６４】
前記方法の一つの態様において、プローブは、MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる群より選択される微生物に由来する。
【００６５】
前記方法は、パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって、第1のハイブリダイゼーションパターンが生成される工程を含んでもよい。このケースにおいて、プローブは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される。
【００６６】
別の態様において、本発明は、第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を第1のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程、および第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を第2のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程を含む、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法を含む。マイクロアレイは、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブから構成される。参照試料は、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する。次に、第1のハイブリダイゼーションパターンと第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する。第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーであちかつ第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される。
【００６７】
腫瘍組織試料は、生検試料、パラフィン包埋（FFPE）試料、または非固形腫瘍に由来してよい。また、対象はヒトであり得る。検出可能に標識された核酸は、（Cy3もしくはCy5のような）フルオロフォア、放射性リン酸、ビオチン、または酵素によって標識されていてよい。
【００６８】
前記方法は、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される場合、対象に三重陰性乳がんに対する処置を提供する工程も含み得る。処置の例には、手術、化学療法、または放射線治療が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
標的核酸分子
本発明の方法および組成物は、分析される生物学的試料における標的核酸分子の同定のために有用である。標的配列は、標的核酸分子を含む生物学的試料から増幅される。そのような試料は、真菌、胞子、ウイルス、または細胞（例えば、原核生物、ヒトを含む真核生物）を含み得る。そのような試料は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫の核酸分子を含み得る。具体的な態様において、本発明の組成物および方法は、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、蠕虫、および/または原虫を含む1種または複数種の病原性生物に由来する1種または複数種の核酸配列を検出する。
【００７０】
一つの態様において、試料は、組織試料または腫瘍試料のような生物学的試料である。（例えば、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、蠕虫、および/または原虫を検出するかまたは同定するための）1種または複数種のポリヌクレオチドバイオマーカーのレベルが、生物学的試料において測定される。一つの態様において、生物学的試料は、乳腺細胞または腫瘍細胞を含む組織試料、例えば、生検試料またはホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料である。例示的な試験試料には、体液（例えば、血液、血清、血漿、羊水、痰、尿、脳脊髄液、リンパ液、涙液、糞便、または胃液）、糞便、組織抽出物、および培養培地（例えば、病原細胞のような細胞が培養された液体）も含まれる。所望により、試料は、生物学的試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される標準的な方法を使用して、検出前に精製される。一つの態様において、病原の標的核酸は、試料において感染病原体の核酸配列の存在を検出するため、プライマーオリゴヌクレオチドによって増幅される。そのような核酸配列は、真菌、細菌、ウイルス、および酵母を含む病原に由来し得る。
【００７１】
標的核酸分子には、二本鎖および一本鎖の核酸分子（例えば、DNA、RNA、および本明細書に記載された核酸分子とハイブリダイズすることができる当技術分野において公知のその他の核酸塩基ポリマー）が含まれる。本発明の検出可能オリゴヌクレオチドプローブまたは検出可能プライマー/鋳型オリゴヌクレオチドによる検出のために適したRNA分子には、標的配列を含む二本鎖および一本鎖のRNA分子（例えば、メッセンジャーRNA、ウイルスRNA、リボゾームRNA、転移RNA、マイクロRNAおよびマイクロRNA前駆物質、ならびにsiRNA、または本明細書に記載されたもしくは当技術分野において公知のその他のRNA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の検出可能オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー/鋳型オリゴヌクレオチドによる検出のために適したDNA分子には、二本鎖DNA（例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、および合成二本鎖DNA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一本鎖DNA標的核酸分子には、例えば、ウイルスDNA、cDNA、および合成一本鎖DNA、または当技術分野において公知のその他の型のDNAが含まれる。一般に、検出のための標的配列は、約30〜約300ヌクレオチド長（例えば、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300ヌクレオチド）である。具体的な態様において、標的配列は、約60ヌクレオチド長である。検出のための標的配列は、プローブ配列と少なくとも約70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、またはさらには100％の同一性を有していてもよい。プローブ配列は、標的配列より長くてもよいしまたは短くてもよい。例えば、60ヌクレオチドプローブは、標的配列の少なくとも約44ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【００７２】
具体的な態様において、バイオマーカーは、生物学的試料にディファレンシャルに存在する生体分子（例えば、核酸分子）である。例えば、バイオマーカーは、別の表現型状態（例えば、三重陰性乳がんを有しないこと）と比較して、一つの表現型状態（例えば、三重陰性乳がんを有すること）の対象から採取される。異なるグループにおけるバイオマーカーの発現レベルの平均値または中央値が統計的に有意であると算出される場合、バイオマーカーは異なる表現型状態の間でディファレンシャルに存在する。統計的有意性についての一般的な試験には、とりわけ、t検定、ANOVA、クラスカル・ウォリス、ウィルコクソン、マン・ホイットニー、およびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独でまたは組み合わせられて、対象がある表現型状態または別の表現型状態に属する相対リスクの尺度を提供する。従って、それらは、疾患（例えば、三重陰性乳がんを有すること）を特徴決定するためのマーカーとして有用である。
【００７３】
プローブ選択
（例えば、複数の生物に対応する）複数の標的核酸分子の検出のために選択されたプローブのセットが、本発明の方法において使用される。様々な態様において、プローブのセットは、メタゲノムの構築、および感染病原体に関連した標的核酸分子を同定するプローブを選択するためのその使用に基づく。本明細書において使用されるように、「メタゲノム」とは、複数の生物に由来する、例えば、環境試料中の遺伝子材料をさす。メタゲノムは、プローブセットを選択するため、かつ/またはプローブセットをバリデートするため、使用される。いくつかの態様において、メタゲノムは、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、1500、2000個、またはそれ以上の生物の配列またはゲノムを含む。一例において、58の染色体を含むメタゲノムを生成するため、数千種の生物の核酸配列が連結された。
【００７４】
分離型メタゲノムプローブ選択
A. 個々のゲノム、遺伝子、および部分配列をアクセッションのローカルデータベースへダウンロードする。
B. 生物情報学的ツールを使用して低複雑度配列をマスクする。一例において、低複雑度配列をmdust（http：//doc.bioperl.org/bioperl-run/lib/Bio/Tools/Run/Mdust.html）を使用してマスクした後、ウイルスアクセッションにおける独特の領域をBLASTN 2.0MP-WashU31によって同定する。
C. 全ての他のアクセッションに対して各アクセッションの配列をBLASTNによって比較する。
D. 各アクセッション内の特異的な標的領域を同定する。
1. 250〜300bp領域。
2. 他のアクセッションまたはヒトゲノムとの70％またはそれ以上の配列相同性を有するわずか50個の連続するヌクレオチド。
E. 特異的な標的を補足する。
1. 0個または1個の標的部位を有するアクセッションを同定する。
2. ストリンジェンシーパラメータを、他のアクセッションとの50％またはそれ以上の配列相同性を有するわずか30個の連続するヌクレオチド、ヒトゲノムとの70％またはそれ以上の配列相同性を有するわずか50個の連続するヌクレオチドへ緩和する。
3. l.E.lからのアクセッションサブセットに対して標的領域同定を再実行する。
F. 保存された標的領域を同定する。
1. 少なくとも1個の他のアクセッションとの70％またはそれ以上の相同性を有する70〜300bp領域。
2. ヒトゲノムとの70％またはそれ以上の配列相同性を有する50個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを有する保存された標的を除去する。
G. プローブを選択する。
1. 特異的な標的領域および保存された標的領域に対してAgilentアレイCGHプローブ選択アルゴリズムを実行する。
2. Agilent設計スコアによってプローブをランク付けする。
3. 各アクセッションにおいて1〜5個の特異的な標的領域から1〜3番目にランク付けされたプローブを選択する。
4. 各保存された標的領域から1〜3番目にランク付けされたプローブを選択する。
【００７５】
連鎖型メタゲノムプローブ選択
A. 個々のゲノム、遺伝子、および部分配列をアクセッションのローカルデータベースへダウンロードする。
B. ゲノミクスバイオインフォマティクスツールの使用を容易にするため、全てのアクセッションを単一の連鎖型メタゲノムへコンパイルする。
1. 各アクセッションの間にスペーサーとして100個の非特異的ヌクレオチド（「N」）を置く。
2. 600万〜1000万塩基の染色体へアクセッションおよびスペーサーを接合する。
C. メタゲノム内の特異性についてAgilentアレイCGHプローブ選択アルゴリズムを実行する。
D. ヒト、マウス、および/またはその他の哺乳動物のゲノムに対する特異性についてプローブをフィルタリングする。
E. 特異的プローブを選択する。
1. Agilent設計スコアによってプローブをランク付けする。
2. 各アクセッションから10〜20番目にランク付けされたプローブを選択する。
3. プローブの間の少なくとも100bpの分離を要求する。
F. 保存プローブを選択する。
1. 1.Fと同様に保存された領域を同定する。
2. 各保存された領域から5〜10番目にランク付けされたプローブを選択する。
3. プローブの間の少なくともl00bpの分離を要求する。
G. 経験的プローブ選択
1. 全ての特異的プローブおよび保存プローブを含有しているマイクロアレイを製造する。
2. マイクロアレイを標識されたヒトDNAへハイブリダイズさせる。
3. 最低のクロスハイブリダイゼーションシグナルを有する5〜10個の特異的プローブを各アクセッションから選択する。
4. 最低のクロスハイブリダイゼーションシグナルを有する3〜5個の保存プローブを各保存された領域から選択する。
【００７６】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも2種の核酸プローブを含む。
【００７７】
試料調製
本発明は、DNAおよびRNAを含む試料に存在する複数の型の核酸を分析するための手段を提供する。様々な態様において、試料調製は、核酸分子（例えば、DNAおよびRNA）の混合物の抽出を含む。他の態様において、試料調製は、複数の生物、細胞型、感染病原体、またはそれらの組み合わせからの核酸の混合物の抽出を含む。一つの態様において、試料調製は、以下のワークフローを含む。
A. ゲノムDNAを断片化する。
B. ランダムプライム逆転写酵素によって全RNAを第一鎖cDNAへ変換する。
C. 化学的または酵素的な取り込みによって、ゲノムDNAをビオチンまたは蛍光色素によって標識する。
D. 化学的または酵素的な取り込みによって、cDNAをビオチンまたは蛍光色素によって標識する。
E. 同一の化学反応または酵素反応においてゲノムDNAおよびcDNAの混合物を標識する。
F. C＋Dを混合し、プローブのマイクロアレイへコハイブリダイズさせる。
G. Eをプローブのマイクロアレイへハイブリダイズさせる。
H. 標的とされたゲノムDNAを増幅する。
1. ゲノムDNAを非特異的に増幅するため、全ゲノム増幅（GE GenomiPhi,Sigma WGA,NuGEN Ovation DNA）を使用する。
2. 4.Cまたは4.Eのためのインプットとして増幅産物を使用する。
I. 標的とされた全RNAを増幅する。
1. 全RNAを非特異的に増幅するため、全トランスクリプトーム増幅（Sigma WTA,Ambion in vitro transcription,NuGEN Ovation RNA）を使用する。
2. インプットとして増幅産物を使用する。
【００７８】
試料をマイクロアレイ（例えば、パソチップ）へハイブリダイズさせ、マイクロアレイを様々なストリンジェンシーで洗浄する。蛍光の検出のため、マイクロアレイをスキャンする。バックグラウンド補正およびアレイ間ノーマライゼーションアルゴリズムを適用する。検出閾値を適用する。結果を統計的有意性について分析する。
【００７９】
核酸増幅
標的核酸配列は、任意で、検出される前に増幅される。「増幅」という用語は、1コピーまたは低コピー数の核酸配列分子から複数コピーの核酸を作製する過程を定義する。核酸配列の増幅は、当業者に公知の生化学的過程によってインビトロで実施される。同定の前に、または同定と同時に、ウイルス試料は、多様な機序によって増幅され得、それらのいくつかはPCRを用い得る。例えば、PCRのためのプライマーは、配列の領域を増幅するために設計され得る。RNAウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程が、一本鎖RNAから二本鎖DNAを生成するために使用されてよい。例えば、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(Ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Eds.Innis,et al.,Academic Press,San Diego,Calif.,1990)；Mattila et al.,Nucleic Acids Res.19,4967(1991)；Eckert et al.,PCR Methods and Applications 1,17(1991)；PCR(Eds.McPherson et al.,IRL Press,Oxford)；ならびに米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、および同第5,333,675号を参照すること。試料はアレイ上で増幅されてもよい。例えば、米国特許第6,300,070号、米国特許出願第09/513,300号を参照すること。
【００８０】
他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば、Wu and Wallace,Genomics 4,560(1989)、Landegren et al.,Science 241,1077(1988)、およびBarringer et al.Gene 89:117(1990)）、転写増幅（Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173(1989)およびWO88/10315）、自家持続配列複製（Guatelli et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990)およびWO90/06995）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第6,410,276号）、コンセンサス配列プライムPCR（CP-PCR）（米国特許第4,437,975号）、任意プライム（arbitrarily primed）PCR（AP-PCR）（米国特許第5,413,909号、同第5,861,245号）、ならびに核酸配列ベース増幅（NABSA）（米国特許第5,409,818号、同第5,554,517号、および同第6,063,603号を参照すること）が含まれる。使用され得る他の増幅法は、米国特許第5,242,794号、同第5,494,810号、同第4,988,617号、および米国特許出願第09/854,317号に記載されている。
【００８１】
追加の試料調製方法および核酸試料の複雑度を低下させるための技術は、Dong et al.,Genome Research 11,1418(2001)、米国特許第6,361,947号、同第6,391,592号、米国特許出願第09/916,135号、同第09/920,491号（米国特許出願公開第20030096235号）、同第09/910,292号（米国特許出願公開第20030082543号）、および同第10/013,598号に記載されている。
【００８２】
バイオマーカーの検出
本発明のバイオマーカーは、任意の適切な方法によって検出され得る。本明細書に記載された方法は、個々に使用されてもよいし、またはバイオマーカーのより正確な検出のため、組み合わせて使用されてもよい。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施する方法は、当技術分野において開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手法および条件は、適用に依って変動し、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Ed.Cold Spring Harbor,N.Y,2001)；Berger and Kimmel Methods in Enzymology,Vol.152,Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1987)；Young and Davism,P.N.A.S,80:1194(1983)において言及されたものを含む公知の一般的な結合法に従って選択される。反復的な調節されたハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置は、米国特許第5,871,928号、同第5,874,219号、同第6,045,996号、および同第6,386,749号、同第6,391,623号に記載されている。アレイからのハイブリダイゼーション結果を解釈するためのデータ分析アルゴリズム（E予測（E-predict））は、公に入手可能である（Urisman,2005,Genome Biol 6:R78を参照すること）。
【００８３】
一つの態様において、ハイブリダイズした核酸は、試料核酸に付着したまたは取り込まれた1種または複数種の標識を検出することによって検出される。標識は、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって付着させられるかまたは取り込まれ得る。一つの態様において、標識は、試料核酸の調製における増幅工程において同時に取り込まれる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドによるPCRは、標識された増幅産物を提供するであろう。別の態様において、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセインによって標識されたUTPおよび/またはCTP）を使用した前記の転写増幅は、転写された核酸へ標識を取り込ませる。別の態様において、PCR増幅産物は、断片化され、末端デオキシトランスフェラーゼおよび標識されたdNTPによって標識される。あるいは、標識は、最初の核酸試料（例えば、mRNA、ポリA mRNA、cDNA等）へ直接付加されてもよいし、または増幅が完了した後、増幅産物へ付加されてもよい。標識を核酸に付着させる手段は、当業者に周知であり、例えば、ニックトランスレーション、または核酸のキナーゼ処理による（例えば、標識されたRNAによる）末端標識、および試料核酸を標識（例えば、フルオロフォア）へ接合する核酸リンカーのその後の付着（ライゲーション）を含む。別の態様において、標識は、末端デオキシトランスフェラーゼを使用して、断片の末端へ付加される。
【００８４】
本発明において使用するために適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な組成物が含まれる。本発明において有用な標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチン；抗ビオチン抗体、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））；蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）；放射標識（例えば、3H、125I、35S、4C、または32P）；リン光標識；酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAにおいて一般的に使用されるその他のもの）；ならびにコロイド金または有色のガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズのような比色定量標識が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、および同第4,366,241号が含まれる。
【００８５】
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、放射標識は写真用フィルムまたはシンチレーション計数器を使用して検出され得；蛍光マーカーは、放射された光を検出するための光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は、有色の標識を可視化することによって単純に検出される。
【００８６】
シグナル検出および強度データの処理のための方法および装置は、例えば、米国特許第5,143,854号、同第5,547,839号、同第5,578,832号、同第5,631,734号、同第5,800,992号、同第5,834,758号；同第5,856,092号、同第5,902,723号、同第5,936,324号、同第5,981,956号、同第6,025,601号、同第6,090,555号、同第6,141,096号、同第6,185,030号、同第6,201,639号；同第6,218,803号；および同第6,225,625号、米国特許出願第10/389,194号、同第60/493,495号、ならびに（WO99/47964として公開された）PCT出願PCT/US99/06097に開示されている。
【００８７】
マイクロアレイによる検出
本発明の局面において、試料は、（バイオチップとしても公知の）マイクロアレイによって分析される。本発明の核酸分子は、マイクロアレイにおけるハイブリダイズ可能なアレイ要素として有用である。マイクロアレイは、一般に、固体の基質を含み、一般に、（吸着試薬またはアフィニティ試薬とも呼ばれる）キャプチャー試薬が付着させられる平面状の表面を有する。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス可能な位置を含み、その各々にキャプチャー試薬が結合している。
【００８８】
アレイ要素は、各要素が基質上の特定された位置に存在するよう、規則的に組織化される。有用な基質材料には、紙、ナイロン、もしくはその他の材料から構成された膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、およびその他の固体支持体が含まれる。アレイ要素の規則的な配置は、ハイブリダイゼーションのパターンおよび強度を、特定の遺伝子またはタンパク質の発現レベルとして解釈することを可能にする。例えば、核酸マイクロアレイを作製する方法は、当業者に公知であり、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第5,837,832号、Lockhart,et al.(Nat.Biotech.14:1675-1680,1996)、およびSchena,et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614-10619,1996)に記載されている。米国特許第5,800,992号および同第6,040,138号は、特定のヌクレオチド配列を含有している核酸の存在を検出するために使用され得る核酸プローブのアレイを作製する方法を記載している。最小の数の合成工程によって核酸、ペプチド、およびその他のポリマー配列の高密度アレイを形成する方法が公知である。核酸アレイは、光による化学的カップリングおよび機械的カップリングを含むが、これらに限定されるわけではない多様な方法によって、固体基質上で合成され得る。アレイの再配列決定に関する追加の説明および方法については、米国特許出願第10/658,879号、同第60/417,190号、同第09/381,480号、同第60/409,396号、および米国特許第5,861,242号、同第6,027,880号、同第5,837,832号、同第6,723,503号を参照すること。
【００８９】
本発明の一つの態様は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも2種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含む。マイクロアレイは、バイオチップであってもよいか、またはガラススライド上、ビーズ上、もしくは紙上にあってもよい。
【００９０】
核酸バイオチップによる検出
本発明の局面において、試料は、（核酸マイクロアレイとしても公知の）核酸バイオチップによって分析される。核酸バイオチップを作製するためには、PCT出願W095/251116（Baldeschweilerら）に記載されているように、化学的カップリング法およびインクジェットアプリケーション装置を使用して、オリゴヌクレオチドを合成するかまたは基質の表面に結合させることができる。あるいは、真空系、熱的、UV、機械的、または化学的な結合法を使用して、基質の表面にcDNA断片またはオリゴヌクレオチドを配置し連結するため、グリッド付きアレイが使用されてもよい。本発明において有用な例示的な核酸分子には、1種または複数種の病原性生物の核酸バイオマーカーに特異的に結合するポリヌクレオチドおよびそれらの断片が含まれる。
【００９１】
生物学的試料に由来する核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）を、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションプローブを作製するために使用することができる。生物学的試料は、一般に、例えば、（血液、血清、血漿、唾液、尿、腹水、嚢胞液等のような）体液；均質化された組織試料（例えば、生検によって入手された組織試料）；または患者試料から単離された細胞もしくは細胞の集団として、患者に由来する。いくつかの適用のため、培養細胞またはその他の組織調製物が使用されてもよい。標準的な方法に従って、mRNAが単離され、cDNAが生成され、ハイブリダイゼーションのために適した相補的RNAを作製するための鋳型として使用される。そのような方法は、当技術分野において周知である。RNAが蛍光ヌクレオチドの存在下で増幅され、次いで、バイオチップに結合した相補的なオリゴヌクレオチドにプローブ配列がハイブリダイズすることを可能にするため、標識されたプローブがマイクロアレイと共にインキュベートされる。
【００９２】
インキュベーション条件は、用いられるストリンジェンシーの程度に依って、正確な相補的マッチで、または様々な程度のより低い相補性で、ハイブリダイゼーションが起こるよう調整される。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、または約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で入手され得、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、最も好ましくは、少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で入手され得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、少なくとも約37℃、または少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの内含または排除のような追加のパラメータの変動は、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDSにおいて30℃で行われるであろう。態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）において37℃で行われるであろう。他の態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて42℃で行われるであろう。これらの条件の有用な変動は、当業者に容易に明白であろう。
【００９３】
ハイブリダイズしていないプローブの除去は、例えば、洗浄によって達成され得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーに関して変動し得る。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。前記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少または温度の増加によって増加させられ得る。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、少なくとも約42℃、または少なくとも約68℃の温度を含むであろう。態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて25℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて42℃で行われるであろう。他の態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて68℃で行われるであろう。これらの条件の追加の変動は、当業者に容易に明白であろう。
【００９４】
異なる核酸配列の全部について、ハイブリダイゼーションの欠如、存在、および量を測定するための検出システムは、当技術分野において周知である。例えば、同時検出は、Heller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.94:2150-2155,1997に記載されている。態様において、蛍光のレベルおよびパターンを決定するため、スキャナが使用される。
【００９５】
診断アッセイ
本発明は、疾患もしくは障害（例えば、三重陰性乳がん）またはそのような状態を発症する傾向の同定または特徴決定のために有用な多数の診断アッセイを提供する。一つの態様において、三重陰性乳がんは、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、蠕虫、および原虫を含む1種または複数種の病原性生物に由来する1種または複数種のバイオマーカーのレベルを定量化することによって特徴決定される。以下に提供される例は、これらのマーカーのレベルを検出する具体的な方法を記載するが、当業者は、本発明がそのような方法に限定されないことを認識する。マーカーレベルは、任意の標準的な方法によって定量可能であり、そのような方法には、リアルタイムPCR、サザンブロット、PCR、および/または質量分析が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００９６】
本明細書に記載されたマーカーのうちの2種またはそれ以上のレベルが、疾患、障害、状態のマーカープロファイルを定義する。マーカーのレベルは、参照と比較される。一つの態様において、参照は、三重陰性乳がんを有しない患者から入手された対照試料に存在するマーカーのレベルである。別の態様において、参照は、健常な（即ち、三重陰性乳がん陰性である）組織または細胞である。別の態様において、参照は、三重陰性乳がんの処置の前、最中、または後の患者に由来する生物学的試料に存在するマーカーの基線レベルである。さらに別の態様において、参照は標準化された曲線である。本明細書に記載されたマーカーのうちの1種または複数種（例えば、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、および/または原虫のバイオマーカーの組み合わせ）のレベルは、疾患、障害、または状態（例えば、三重陰性乳がん）を特徴決定するため、単独で使用されてもよいし、または他の標準的な方法と組み合わせて使用されてもよい。
【００９７】
ある種の態様において、本明細書に記載された1種または複数種の病原性生物は、キャプチャー試薬（例えば、抗体）を使用して、試料から単離されるかもしくは抽出され、かつ/またはELISAを使用して検出され得る。具体的な態様において、病原性生物をキャプチャーするための試薬には、ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズおよびビオチンによって標識されたプローブが含まれる。そのような技術は、さらに、核酸に基づくプローブを使用した病原性生物検出のため、または直接配列決定（例えば、miSeq；Illumin）のため、核酸を入手するために使用され得る。
【００９８】
キット
本発明は、三重陰性乳がんに関連した1種または複数種の生物学的な配列または因子の存在を示すバイオマーカーの検出のためのキットを提供する。キットは、三重陰性乳がんに関連した複数の生物学的因子の存在を検出するために使用され得る。キットは、三重陰性乳がんの診断または検出のために使用され得る。いくつかの態様において、キットは、三重陰性乳がんの検出のために特異的であるとして本明細書で図示された核酸バイオマーカーに対するプローブのパネルまたはコレクション（例えば、パソチップ）を含む。追加のまたは代替的な態様において、キットは、三重陰性乳がんに関連した病原性生物に特異的な抗体を含む。そのような抗体は、三重陰性乳がんに関連した病原性生物のELISAによる検出または抽出のために使用され得る（例えば、ビオチンによって標識された抗体が、ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズと共に使用され得る）。
【００９９】
いくつかの態様において、キットは、プローブ、核酸バイオマーカー、またはマイクロアレイチップのパネルを含有している1個または複数個の無菌容器を含む。そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知のその他の適切な容器型であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬の保持のために適したその他の材料で作製されていてよい。
【０１００】
説明書は、一般に、三重陰性乳がんの検出または診断のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。他の態様において、説明書は、治療剤の説明；三重陰性乳がんまたはその症状の処置または防止のための投薬スケジュールおよび投与；注意；警告；適応症；禁忌；過剰投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および/または参照：のうちの少なくとも一つを含む。説明書は、（存在する場合）容器に直接印刷されてもよいし、または容器に適用されるラベルであってもよいし、または容器内にもしくは容器と共に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーであってもよい。
【０１０１】
本発明の実施は、他に示されない限り、十分に当業者の範囲内にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)のような文献に完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、従って、本発明を行う際および実施する際に考慮され得る。具体的な態様のための特に有用な技術は、以下のセクションにおいて論じられるであろう。
【０１０２】
本発明の一つの態様は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むキットである。キットは、生物1種当たり約3〜5種のプローブを含む、約10〜30種の生物に由来するプローブを含むことができる。本発明の別の態様は、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含むキットである。キットは、その使用のための説明材料を含有している。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を行いかつ使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１０４】
材料および方法
パソチップ設計
パソチップアレイと名付けられた選択された微生物の60,000種のプローブセットの設計のためのメタゲノムアプローチが、以前に記載された（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）。設計されたプローブセットは、SurePrintガラススライドマイクロアレイ（Agilent Technologies Inc.）として製造された。プローブは60nt DNAオリゴマーとして表され、スライド1枚当たり60,000種のプローブが8回反復アレイで存在する。各生物に対する複数のプローブによる、これらの病原性のウイルス、原核生物、および真核生物の標的ゲノムを、上流の試料調製ならびに微生物のDNAおよびRNAを検出するための増幅プロトコール、ならびに下流のデータ分析と組み合わせる。ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍組織からのDNA＋RNAのパソチップスクリーニングは確立されており、発がん性ウイルスの検出は以前にバリデートされた（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）。以前の研究は、ヒトがんおよびその他の疾患における病原の存在を検出するための貴重な戦略として、PCRおよびHT配列決定と組み合わせられたパソチップテクノロジーの使用を証明した（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）。
【０１０５】
試料調製およびマイクロアレイ処理
匿名化したホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）三重陰性乳がん試料（n＝100）は、無電荷ガラススライド上の10μmの切片の形態で、Abramson Cancer Center Tumor Tissue and Biosample Coreから受容され、対応対照試料（n＝20）および非対応対照試料（n＝20）は、パラフィンロールとして提供された。対応対照は、がん組織が入手されたのと同一の患者の隣接した非がん性乳腺組織から入手された。非対応対照は、健常個体から入手された乳腺組織であった。ロールまたはFFPE試料に由来するマウントされた切片（1試料当たり5セクション）を、以前に記載されたように（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）、DNAおよびRNAの平行抽出のために使用した。抽出されたDNA/RNAの品質を、A260/280比を測定することによって査定した。抽出された核酸のサイズ分布を、アガロースゲル電気泳動によって決定した。抽出されたRNA試料およびDNA試料は、予想通りに部分的に分解され、RNAおよびDNA（各50ng）をインプットとして使用して、以前に記載されたようなRNA/DNA増幅に供された（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）。スクリーニングされた100個の三重陰性乳がん試料のうち、40個を、個々にスクリーニングし、60個を、1反応当たり5個の試料（各10ngのRNA/DNA）のプールにおいてスクリーニングしたため、全部で52のアレイが100個の三重陰性がん試料をスクリーニングするために使用された。対応対照および非対応対照をスクリーニングするため、各4アレイについて、20個の対応対照および20個の非対応対照から、1反応当たり5個の試料（各10ngのRNA/DNA）のプールを使用した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によってチェックしたところ、予想通り、FFPE試料についてのアンプリコンのサイズは200〜400bpの範囲であった。BJABヒトB細胞株から抽出されたヒト参照RNAおよびDNA（各15ng）も、WTAに供した。増幅産物を、PCR精製キット（Qiagen,Germantown,MD,USA）を使用して精製し、FFPEがん組織に由来する増幅産物（2μg）を、Cy3標識のために使用し（SureTag labeling kit,Agilent Technologies,Santa Clara,CA）、プローブのヒトDNAとのクロスハイブリダイゼーションを決定するための対照として、ヒト参照cDNA/DNA増幅産物（2μg）に対して、Cy5標識を実施した。標識されたDNAを精製し、標識の程度をCy3についてはA550、Cy5についてはA650によって決定した。標識された試料を、（例えば、AgilentTechnologies,Santa Clara,CAによって記載されたような）従来の方法を使用して、パソチップにハイブリダイズさせた。（製造業者の説明書に従い）ハイブリダイゼーション緩衝液の中にCGHブロッキング剤を含有しているハイブリダイゼーションカクテルを、標識された試験試料（Cy3）および参照（Cy5）に添加し、変性させ、Agilentハイブリダイゼーションオーブンにおいて回転させながら65℃で8チャンバーガスケットスライドの8×アレイ（パソチップは8アレイを含有しているガラススライドである）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを洗浄緩衝液を使用して洗浄し、Agilent SureScan G4900DAアレイスキャナを使用してスキャンした。
【０１０６】
パソチップデータの統計分析
データ分析は、以前に記載されたような（Baldwin et al.(2014)MBio5,e01714-01714）、Partek Genomics Suite（Partek Inc.,St.Louis,MO,USA）を使用して行われた。各腫瘍についてのプローブシグナルのスライディングウィンドウ分析を用いたタイリングアレイのモデルに基づく分析（Model-based analysis of tiling array）（MAT）；（特異的プローブおよび保存プローブの両方についての）個々のプローブレベル、ならびに（各アクセッションの全てのプローブを考慮した）アクセッションレベルで、分析を実施した。個々のレベル（特異的プローブ外れ値および保存プローブ外れ値）またはアクセッションレベル（アクセッション外れ値）での外れ値分析は、いくつかの試料において、より高度のハイブリダイゼーションシグナルを示すプローブを明らかにした。個々のプローブ（特異的プローブt検定、保存プローブt検定）またはアクセッションレベル（アクセッションt検定）での偽陽性率（FDR）多重補正を含む対応のあるt検定は、分析された100個の腫瘍試料において有意に検出されるプローブを明らかにした。二標本ウィルコクソン検定は、がん試料が対照（対応および非対応の両方）試料と比較して生物の候補シグネチャーの有意な検出を有するか否かを判定するために実施された。病原性シグネチャーの検出に基づく試料の階層的クラスタリングは、Rプログラム（ユークリッド距離、完全連結、未調整値）を使用して行われた。
【０１０７】
パソチップ結果のPCRバリデーション
PCRプライマーは、シグネチャーパターンを表すハイブリダイゼーションシグナルを有する生物の保存プローブおよび特異的プローブから設計された。各反応についてのPCR増幅反応混合物は、200ngの腫瘍DNA、ならびに各10pmolの順方向プライマーおよび逆方向プライマー（表1）、300μMのdNTP、ならびに2.5UのLongAmpTaq DNAポリメラーゼを含有していた。DNAを、5分94℃で変性させ、その後、30秒94℃、30秒48〜57℃、および20〜60秒65℃の30サイクルを行った。アニーリング温度は、使用される異なるプライマーのセットで異なり、大部分が、プライマーの各セットの順方向プライマーおよび逆方向プライマーの融解温度より5℃低かった。プライマーセットの各々についてのPCR条件は、表1に提供される。PCRによるパソチップハイブリダイゼーション結果のバリデーションは、図6A〜6Cに提示される。
【０１０８】
（表１）パソチップスクリーニングのPCRバリデーションのために使用されたプライマー
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【０１０９】
プローブキャプチャーおよびハイスループット配列決定
ハイスループット配列決定のためのライブラリーを生成するため、標的配列のライブラリーを磁気ビーズによってキャプチャーした。三重陰性乳がん試料においてのみ高度のハイブリダイゼーションシグナルを有する選択されたパソチッププローブを、5'ビオチン化DNAオリゴマーとして合成し（Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA）、5種のキャプチャープローブプール（プール1〜5）として混合し（図7A〜7D、表2、図2A〜2D）、腫瘍試料のプールにハイブリダイズさせた。プール1はポックスウイルス保存プローブを除く52種の選択されたウイルス保存プローブ（VCP）を含有しており；プール2は18種の保存ポックスウイルスプローブ（Pox）を含有しており；プール3は43種のウイルス特異的プローブ（VSP）を含有しており；プール4は20種の選択された細菌プローブ（B）を含み、プール5は28種の真菌、寄生虫のプローブ（P）を含有していた。（VCP、Pox、VSPキャプチャーのための）パソチップスクリーニングのために使用された100個のWTA産物を全てプールすることによって、または100個のWTA試料を2つのグループ（BプローブおよびPプローブに対して高度のハイブリダイゼーションシグナルを示す18個のWTA試料のプールを含むグループ1、ならびに残りのWTA試料を含むグループ2）にプールすることによって、標的をキャプチャーした。各キャプチャープローブプールを、3Mテトラメチルアンモニウムクロリド、0.1％サルコシル、50mMトリスHCl、4mM EDTA、pH8.0（1×TMAC緩衝液）を含有している反応混合物において各標的プールに添加した。七（7）種の個々の標的キャプチャー：VCP、Pox、VSP、B1、B2、P1、およびP2を行った。反応混合物を変性させ（10分100℃）、続いて、ハイブリダイゼーション工程（3時間60℃）を行った。Streptavidin Dynabeads（Life Technologies,Carlsbad,CA,USA）を室温で絶えず混合しながら添加し、続いて、0.30M NaCl＋0.030Mクエン酸ナトリウム緩衝液（2×SSC）でキャプチャーされたビーズプローブ標的複合体を3回洗浄し、0.1×SSCで3回洗浄した。キャプチャーされた一本鎖標的DNAを、ライブラリー調製および次世代配列決定のため、トリスEDTA（TE）で溶出させた。
【０１１０】
（表２）標的キャプチャーのために使用されたプローブ
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【０１１１】
7種のキャプチャーされた溶出液を、GenomePlex反応（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）によって再増幅し、精製し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分布について査定した。配列決定ライブラリーを、製造業者のプロトコールに従って、Nextera XT試料調製キット（Illumina,San Diego,CA,USA）を使用して、調製した。試料を、品質管理測定、ライブラリープーリング、およびペアードエンド250ntリードによるIllumina MiSeq器機を使用した配列決定のため、Washington University Genome Technology Access Center（St.Louis,MO）に提出した。予め処理された生リードを、低品質末端（Phredスコア＜30）を除去するため、トリミングした。リードを、Bowtie2（高感度局所モード）を使用して、ヒト参照ゲノムと整列させた（Langmead et al.(2009)Genome Biol10,R25）。高品質でヒトゲノムにマッピングされ得たリードを除外した。残りのリードを、Bowtie2（高感度局所モード）を使用して、パソチップメタゲノムと整列させた（Langmead et al.(2009)Genome Biol10,R25）。各ライブラリーからのリードの総数、ヒトゲノムに対してパソゲノム（pathogenome）にマッピングされたリードの数は、表6に示される。パソチップメタゲノムと整列した680,534個のリードが、7種のライブラリーから、存在した。マッピング品質スコアMapQ>=20の202,905個のリードを、Integrative Genomics Viewer 2.3.25を使用して、さらなる可視化および定量化分析のために使用した（Petropoulos(1997)Retroviral Taxonomy,Protein Structures,Sequences,and Genetic Maps.In:Coffin JM,Hughes SH,Varmus HE,editors.Retroviruses.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【０１１２】
（表６）MiSeqにおいて生成されたリードの数
2018512868.tif 000007
【０１１３】
結果
三重陰性乳がん試料のパソチップスクリーニングによってウイルスおよびその他の病原性生物のシグネチャーが検出された
TNBC試料（n＝100）を、パソチップを使用して、対応対照（n＝17）および非対応対照（n＝20）と共にスクリーニングした。全ての試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋アーカイブ試料（前記の材料および方法を参照すること）に由来した。スクリーニングされた100個のTNBC試料のうち、40個を、個々にスクリーニングし、60個を、1反応当たり5試料（各10ngのRNA/DNA）のプールにおいてスクリーニングし、全部で52のアレイを、100個の三重陰性がん試料をスクリーニングするために使用した。17種の対応対照および20種の非対応対照から、試料は、対応対照および非対応対照をスクリーニングするための各4つのアレイを有するようにプールされた。次いで、有意に高度のシグナルを有する試験試料に独特であるプローブを決定するため、対照において陽性であったノーマライズされたシグナルを、試験試料と比較した。結果は、がん試料中のウイルス保存プローブおよびウイルス特異的プローブ、ならびに細菌プローブ、真菌および寄生虫のプローブを検出した（図4A〜4D；表3〜4）。
【０１１４】
（表３）パソチップによって100個の三重陰性乳腺試料をスクリーニングすることによって検出されたウイルスおよび微生物のプローブシグネチャーの数
A. 個々のプローブ分析によって検出されたウイルスプローブシグネチャーの数
2018512868.tif 000008
B. 検出された特異的微生物プローブシグネチャーの数
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【０１１５】
（表４）100個の三重陰性乳がん試料において検出されたウイルスプローブおよび微生物プローブのハイブリダイゼーションシグナルおよび分布率（アクセッション1つ当たりの全プローブのハイブリダイゼーションシグナルの合計として算出）
候補を検出した方法が言及される；AO：アクセッション外れ値、SO：特異的プローブ外れ値、CO：保存プローブ外れ値、CT：保存プローブt検定；MAT：タイリングアレイのモデルに基づく分析。
（a）関連したウイルス因子
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（b）関連した細菌因子
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（c）関連した真菌因子
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（d）関連した寄生虫因子
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【０１１６】
プローブは、パソチップスクリーニングが、がん試料において、対応対照試料または非対応対照試料と比較して有意に高度のハイブリダイゼーションシグナルをこのプローブに対して示す場合、陽性と見なされた（図3A〜3G；表5）。
【０１１７】
（表５）対照に対する、乳がん試料において検出された微生物のプローブの割合
2018512868.tif 000014
2018512868.tif 000015
【０１１８】
表5は、対応対照および非対応対照試料に対して三重陰性乳がん試料において検出された候補生物のプローブの割合の統計的有意性を示す。有意性はウィルコクソン検定によって判定され、p値＜0.05の場合に、がん組織における病原シグネチャーの検出の割合は対照組織と比較して有意であると見なされた。
【０１１９】
三重陰性乳がん試料において検出されたウイルス、細菌、真菌、および寄生虫のシグネチャーは、分析された非対応対照試料および対応対照試料と比較して、がん試料と有意に関連していることが見出された（p＜0.05）。対照組織に対するがん組織におけるプローブシグナルによって決定される候補生物の関連についてのp値は、表5に提供されている。ウイルスについては異なる2種類のプローブセットが、パソチップに含有されている。第1は、特異的なウイルスを検出するために設計されている特異的プローブ、例えば、他の全てのヘルペスウイルスより、ヒトサイトメガロウイルスを検出するプローブである。第2のセットは、ウイルスまたは微生物の科のメンバーの間で高度に保存されている配列、例えば、全てのヘルペスウイルスの間で保存されている配列を表す保存プローブである。保存プローブの目的は、従来未知であった科のメンバー、例えば、新しいヒトヘルペスウイルスを検出することが可能であることである。
【０１２０】
TNBC試料によって検出された候補生物のプローブは、腫瘍試料において広範囲のハイブリダイゼーションシグナルを示した（図3A〜3G）。ここでは、シグナルの高低を区別せずに、生物の各プローブについて検出可能なハイブリダイゼーションシグナル（g-r>30）を有する試料の百分率を報告した。さらに、パソチップ上の特異的プローブによって検出された特異的なウイルスおよび微生物の名称が列挙される。しかしながら、具体的な理論に拘束されないが、特異的な検出による検出は、名称を挙げられた具体的なものではなく、密接に関連するファミリーメンバーを示唆している可能性がある。これは、TNBC試料が、特定のウイルスまたは微生物に対するプローブセットにおいて、ある範囲のハイブリダイゼーションシグナルを示したケースにおいて特に関連する。これは、これらの因子のゲノム領域が、その特定の腫瘍において欠失していること、または株における変動も意味し得る。
【０１２１】
保存プローブのうち、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、パラポックスウイルス科（Parapoxviridae）、ポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）に属するウイルスシグネチャーが、検出された。ヘルペスウイルス科については、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒトヘルペスウイルス1（HHV1；単純ヘルペス1型）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（KSHV）、エプスタインバーウイルスまたはヒトヘルペスウイルス4（EBV/HHV4）のプローブが、それぞれ、乳がん試料の92％、65％、96％、および78％において有意に検出された（図4A〜4Bおよび表5）。ポックスウイルス科においては、パラポックスウイルスに対する保存プローブが、三重陰性乳がん試料の83％において有意に検出された（p＜0.05）（図4A〜4Bおよび表5）。レトロウイルスのうち、藤浪肉腫ウイルス（FSV）およびマウス乳がんウイルス（MMTV）の特異的プローブが、それぞれ、乳がん試料の90.4％および78.8％において検出された（図4A〜4Bおよび表5）。ポリオーマウイルスのうち、特異的プローブは、それぞれ、乳がん試料の90.3％および75％においてメルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPV）およびSV40のシグネチャーを検出した（図4A〜4B）。パピローマウイルス科について、特異的プローブは、それぞれ、乳がん試料の78.8％、75％、84.6％、および78.8％において、HPV6b、HPV18、HPV2、およびHPV16を検出した（図4A〜4B）。特異的プローブは、それぞれ、がん試料の82.7％、90.4％、および86.5％において、GB型肝炎、C型肝炎、およびB型肝炎についてのシグナルを検出した（図4A〜4B）。
【０１２２】
検出されたウイルスプローブは、（ハイブリダイゼーション強度に関わらず）分布率に従ってランク付けされた場合、ヘパドナウイルスおよびフラビウイルス（86.5％）のシグネチャーを示し、続いて、パラポックスウイルス（83.3％）、ヘルペスウイルス（83.2％）、レトロウイルス（79.6％）、およびパピローマウイルス（79.3％）のシグネチャーを示した。しかしながら、減少するハイブリダイゼーションシグナル（各生物の個々のプローブの全ハイブリダイゼーションシグナル、即ち、プローブ合計/アクセッション）に従ってランク付けした場合には、ヘルペスウイルスプローブが、腫瘍における最も高度のハイブリダイゼーションシグナルを有し、パラポックスウイルス、フラビウイルス、ポリオーマウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、およびパピローマが後に続いた（図4A〜4Bおよび表4）。
【０１２３】
細菌シグネチャーは、三重陰性乳がん試料において検出され、分布率に従ってランク付けされた（図4C〜4D）。検出された細菌シグネチャーについて（図4C〜4Dおよび表3〜4）、最も高い分布率は、アルカノバクテリウムを検出するためのプローブであり（75％）、ブレブンディモナス、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、エスケリキア（Escherichia）、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、およびキャプノサイトファーガの16S rRNAシグネチャーを検出するプローブが後に続いた（図4C〜4D）。プレボテラの細菌プローブが、最も高度のハイブリダイゼーションシグナルを示し、ブレブンディモナス、モビルンカス、ロチア、ゲオバチルス、プロピニオバクテリア、アクチノミセス、およびアルカノバクテリウムのプローブについての極めて高度のハイブリダイゼーションシグナル；ペプチノフィルス、スフィンゴバクテリア、ブルセラ、プロビデンシア、およびキャプノサイトファーガのプローブについての中程度のハイブリダイゼーションシグナル、ならびにエスケリキアのプローブについての低度のハイブリダイゼーションシグナルが後に続いた。
【０１２４】
真菌シグネチャーは、乳がん試料の98％において検出されたプレイストフォラを認識するrRNAプローブのものであり、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、およびペシロミセスのプローブが後に続いた（図4C〜4Dおよび表4）。最も高度のハイブリダイゼーションシグナルは、ピエドラのプローブについて見られ、フィアロフォラ、ホンセカエア、およびプレイストフォラに対するプローブにおける高度のハイブリダイゼーションシグナル、ならびにペシロミセスのプローブについての中程度のハイブリダイゼーションシグナルが後に続いた（図4C〜4D）。
【０１２５】
トリチュリスの寄生虫シグネチャーを検出するプローブは、三重陰性乳がん試料の96％において検出され、トキソカラ、リーシュマニア、バベシア、およびテラジアが後に続いた（図4C〜4Dおよび表4）。ハイブリダイゼーションシグナルのランク付けに基づくと、トリチュリスのプローブが、最も高度のハイブリダイゼーションシグナルを示し、トキソカラのプローブについての高度のハイブリダイゼーションシグナル、ならびにテラジア、バベシア、およびリーシュマニアについての中程度のハイブリダイゼーションシグナルが後に続いた。
【０１２６】
階層的クラスタリングによってTNBC試料において2種の異なる微生物シグネチャーが明らかにされる
腫瘍試料における検出において類似性が存在するか否かを判定するため、100個の乳がん試料（52アレイ）をスクリーニングした結果の階層的クラスタリングを実施した。この分析は、試料を2つの広いグループへクラスター化した（図5）。グループBは、グループAのTNBC試料と比較して、ウイルスおよび真菌を検出するプローブについての強力なハイブリダイゼーションシグナルを示した。グループBのTNBC試料を、サブグループaにおいて低く、サブグループbにおいてより高度であることが見出された細菌因子および寄生虫因子についてのシグナルに基づき、さらにカテゴリ化した。グループAのTNBC試料においては、いくつかの試料（サブグループa）が、他（サブグループb）より、細菌および寄生虫に対するプローブの高度の検出を有していた。注目すべきことに、寄生虫トリチュリスに対するプローブは、スクリーニングされたほぼ全てのTNBC試料において検出された。しかしながら、試験されたTNBC試料が匿名化されていたため、2種の異なるシグネチャーの表現型上の理由は直ちには明らかでなかった。
【０１２７】
パソチップによって検出されたシグネチャーのPCRバリデーション
いくつかのウイルス、ならびに分布率の高い細菌（ブレブンディモナス）、真菌（プレイストフォラ）、および寄生虫（トリチュリス）のためのPCRプライマーを、これらのウイルスおよび生物についてのパソチップスクリーニングにおいて中程度〜高度のハイブリダイゼーションシグナルを示した保存パソチッププローブおよび特異的パソチッププローブに由来する配列に基づき設計した。これらのデータの例として、パピローマウイルスの保存プローブから設計されたパピローマウイルス保存プライマー7および8は、試料の多くについて有意なハイブリダイゼーションを示した。PCR結果は、パソチップスクリーニングにおいてパピローマウイルスプローブについて陽性であった試料Br15、Br16、およびBr38について、予想されたアンプリコンを示す。反対に、試料Br18は、パソチップスクリーニングにおいてこれらのプローブについて陰性であり、PCRによっても陰性であった（図6A〜6C）。試験された全てのケース（図6A〜6C）において、PCR増幅は、パソチップによって検出されたウイルス、ならびに選択された細菌、真菌、および寄生虫（図6A〜6C）について、予想されたアンプリコンを示した。PCR産物の配列決定は、適切なウイルスまたはその他の微生物の検出を確証した。同様に、特定のウイルスまたは生物についてパソチップスクリーニングによって陰性であった試料は、PCR分析において陰性であった。これらのデータは、TNBC試料におけるこれらの微生物の存在を支持するパソチップスクリーニングからの結果をバリデートする。
【０１２８】
三重陰性乳がんに関連したシグネチャー生物を同定するための標的配列決定のためのプローブキャプチャー
TNBC試料におけるウイルス、細菌、真菌、および寄生虫のパソチップ検出の追加のバリデーションのため、対照ではなく乳がん試料とのより強力なハイブリダイゼーションシグナルを有するプローブを、標的のキャプチャーおよび配列決定のために選択した。研究において分析された全ての三重陰性乳がん、対応対照、および非対応対照におけるそれらのプローブのハイブリダイゼーションシグナルは、図7Aにヒートマップとして提示される。5種のプローブプール（プローブプール1〜5）を、プールされた試料から標的をキャプチャーするために使用した。7種の標的キャプチャー反応を、5種のプローブプールによって実施した（図7A〜7D）[ウイルス保存プローブ（VCP）キャプチャー、Poxキャプチャー、ウイルス特異的プローブ（VSP）、細菌プローブキャプチャー（B1およびB2）、ならびに真菌/寄生虫/ウイロイドプローブキャプチャー（P1およびP2）]。7種のキャプチャーされた標的配列決定ライブラリーを、作成し、プールし、MiSeqを使用して配列決定した。MiSeqデータを、パソチップメタゲノムと整列させた。データは、Miseqリードの大部分が、キャプチャー反応において使用されたプローブのゲノム位置の付近にクラスター化することを示したが；時に、プローブ位置外に標的ゲノムの領域が検出された（図7B〜7D）。各キャプチャーについての候補生物のMiSeqリードの数は、図1A〜1Jおよび8A〜8Fに示される。
【０１２９】
ウイルスゲノム
MiSeqリードは、ポリオーマウイルス（SV40、JC、MCPV）；ヘルペスウイルス（HCMV）；パピローマウイルス（HPV16、HPV18、HPV2）；レトロウイルス（HTLV1、MMTV）、ポックスウイルス（偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、およびオーフウイルス）のウイルスゲノム領域の存在を確認した（図1A〜1J）。
【０１３０】
最も分布率の高いMiSeqリード（9669個）のうちの1個は、JCポリオーマウイルスの非コード制御領域と整列し、ウイルス保存プローブ（VCP）キャプチャーによって選択された。さらに、SV40およびMCPVの特異的プローブを使用した標的キャプチャーは、それぞれ、SV40およびMCVPのラージT抗原遺伝子にマッピングされた304個および1375個のMiseqリードを明らかにした。これらのデータは、三重陰性乳がんとのポリオーマ様ウイルスの関連を支持する。VCPキャプチャーも、HCMVのUL70（プライマーゼ）およびUL104（カプシド）にマッピングされた2,552個のMiSeqリードをもたらし、特異的プローブキャプチャーは、HCMV非コードRNA 4.9ならびUL77遺伝子およびUL98遺伝子にマッピングされた382個のリードを与えた。特異的プローブキャプチャーは、HPV16ゲノムのE2領域、E4領域、およびL2領域と整列した670個のリード、ならびにHPV18ゲノムのL1領域と整列した99個のリードをもたらした。さらに、HPV-2配列は、HPV-2 E1ならびにHPV-2 E4遺伝子とL2遺伝子との間のゲノム配列と整列した86個のリードによって示された。肝炎ウイルスゲノムは、C型肝炎遺伝子1型のE1/E2ポリタンパク質および非構造的5Aゲノム配列のプローブ配列と整列した111個のリードによって示された。九十六（96）個のリードが、B型肝炎のSタンパク質に対応するプローブと整列した。レトロウイルスゲノムは、7,319個のリードがHTLV-1のRex/Tax遺伝子およびenv遺伝子と整列したVCPキャプチャーによって検出され；VCPキャプチャーおよび特異的ウイルスプローブキャプチャーからの33個および78個のリードは、藤浪肉腫ウイルスのp140ポリタンパク質遺伝子にマッピングされた（Petropoulos(1997)Retroviral Taxonomy,Protein Structures,Sequences,and Genetic Maps.In:Coffin JM,Hughes SH,Varmus HE,editors.Retroviruses.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press）。さらに、特異的プローブキャプチャーは、マウス乳がんウイルスのスーパー抗原およびpol/env遺伝子と整列した138個の配列リードを与えた（Petropoulos(1997)Retroviral Taxonomy,Protein Structures,Sequences,and Genetic Maps.In:Coffin JM,Hughes SH,Varmus HE,editors.Retroviruses.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press）。ポックスウイルスゲノム領域は、637個のリードが、偽牛痘ウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子およびチロシンホスファターゼ遺伝子と整列し、3,277個のリードが、ウシ丘疹性口炎ウイルスのORF041（未知タンパク質（hypothetical protein））、ORF044（コアタンパク質）、およびORF064（mRNAキャッピング酵素ラージサブユニット）と整列し、588個のリードが、オーフウイルスの未知タンパク質をコードする遺伝子と整列したVCPキャプチャーによって示された。
【０１３１】
細菌ゲノム
標的のキャプチャーおよび配列決定のために使用された特異的細菌プローブは、パソチップスクリーニングによって検出された細菌シグネチャー；即ち、ブレブンディモナス・ディミヌタ、アルカノバクテリウム・ヘモリチクム(Arcanobacterium haemolyticum)、ペプトニフィルス・インドリクス、プレボテラ・ニグレセンス、プロピニオバクテリウム・ジェンセニー、およびキャプノサイトファーガ・カニモルサス（Capnocytophaga canimorsus）の16S rRNAゲノム位置と整列するMiSeqリードをもたらした（図1A〜1Jおよび図8A〜8F）。
【０１３２】
真菌および寄生虫のゲノム
真菌および寄生虫のプローブプール（P）は、以下の真菌生物：プレイストフォラ・ムレリ、ピエドライア・ホルテ、ペシロミセス・レニホルミス、フィアロフォラ・ベルコサ、およびホンセカエア・ペドロソイのrRNA遺伝子；ならびに以下の寄生虫：トリチュリス・トリチュラ、テラジア・グロサ、およびリーシュマニア・メジャーの18S rRNA領域にマッピングされた標的をキャプチャーした（図1A〜1J、7B〜7D、および8A〜8F）。
【０１３３】
パソチップスクリーニングデータは、ウイルスと多様ながんとの関連を示唆する他の報告の所見と一致している。例えば、以前の研究は、乳がんにおけるヘルペスウイルス様配列、パピローマウイルス様配列、ポリオーマウイルス様配列、およびMMTV様配列の存在を示唆している（Alibek et al.(2013)Infect Agent Cancer8,32；de Martel & Franceschi(2009)Crit Rev Oncol Hematol70,183-194；Porta et al.(2011)Cancer Lett305,250-262；Harkins et al.(2010)Herpesviridae1,8；Amarante and Watanabe(2009)J Cancer Res Clin Oncol135,329-337；Mazouni et al.(2011)Br J Cancer104,332-337；Piana et al.(2014)Virol J11,190；Pogo and Holland(1997)Biol Trace Elem Res56,131-142；Salmons et al.(2014)J Gen Virol95,2589-2593）。ある研究は、免疫組織化学によって、乳がん患者の生検標本における、対照と比較してはるかに高いHCMV感染率（97％）を報告した（Harkins LE,Matlaf LA,Soroceanu L,Klemm K,Britt WJ,Wang W,Bland KI,& Cobbs CS(2010)Herpesviridae1,8）。他のものは、PCRによって乳がん試料に由来するEBV DNAを報告し、EBVと乳がんのより重度の型との関連を示唆した（Alibek et al.(2013)Infect Agent Cancer8,32；Amarante and Watanabe(2009)J Cancer Res Clin Oncol135,329-337；Mazouni et al.(2011)Br J Cancer104,332-337）。1,535の症例を調査した研究は、EBVと乳がんリスクの増加との有意な関連を示した（Huo et al.(2012)PLoS One7,e31656）。T抗原遺伝子に由来するSV40 DNA配列は、PCRおよび免疫組織化学による確認によって決定されたように、109個の乳がん試料の22％において報告された（Alibek et al.(2013)Infect Agent Cancer8,32）。さらに、別のポリオーマウイルスJCVは、PCRによって、123の乳がん症例の23％において検出された（Hachana et al.(2012)Breast Cancer Res Treat133,969-977）。さらに、ハイリスクHPVと乳がんとの関連が示唆されている（Simoes et al.(2012)Int J Gynecol Cancer22,343-347）。最近の研究は、PCRによって、三重陰性乳がん患者の15％（40例）においてHPVを検出したが、40の非三重陰性症例においては検出しなかった（Hachana et al.(2012)Breast Cancer Res Treat133,969-977）。検出された最も高頻度の遺伝子型はHPV-16（28.6％）であり、他は、HPV-31、HPV-45、HPV52、HPV-6、HPV-66であった（Piana et al.(2014)Virol J11,190）。
【０１３４】
他の研究は、βレトロウイルスヒト乳がんウイルス（HMTV）と乳がんとの間の関連を提唱した。これは、乳がん試料においてMMTV様配列が検出され、正常組織においては検出されないことにより（Pogo BG & Holland JF(1997)Biol Trace Elem Res56,131-142）；HMTVは、MMTVとの95％の配列相同性を有する（Bittner and Imagawa(1953)Cancer Res13,525-528）。乳がんを有する患者に由来するenv、gag、およびsag HMTV遺伝子配列が、クローニングされ、配列決定され、乳がん患者におけるこのウイルスの存在が示唆された（Zenit-Zhuravleva et al.(2012)European Journal of Cancer 48）。複数のウイルスが同一の乳がん試料に共存し得ることが、EBV（68％）、HPV（50％）、およびMMTV（78％）の存在および共存を示す研究によって示唆された（Alibek et al.(2013)Infect Agent Cancer8,32）。要約すると、これらのデータは、腫瘍組織におけるウイルスの実質的な存在を示唆している。TNBCのパソチップスクリーニングは、これらのウイルスシグネチャーの多くが、細菌、寄生虫、および真菌のシグネチャーの存在と共に、一つの特定のがん、TNBCに関連していることを示している。
【０１３５】
TNBC試料が、少なくとも2種の異なる微生物シグネチャーを示す階層グループに分類されたことは興味深い。一方の階層グループ（グループB）においては、ウイルス：ヘルペスウイルスシグネチャー（主として、βヘルペスウイルス様およびγヘルペスウイルス様）；パラポックスウイルスシグネチャー（パラポックスウイルス科様）；フラビウイルス（C型肝炎様およびGB型肝炎様）；ポリオーマウイルス（JC様、MCPV様、およびSV40様）；レトロウイルス（MMTV様、HERV-K様、HTLV様）；ヘパドナウイルス（B型肝炎様）、ならびにパピローマウイルス（HPV-2様、6b様、および18様）の分布率が高い。この階層グループにおいては、真菌シグネチャーもより高い傾向があり、プレイストフォラ科、ピエドライア科、ホンセカエア科、フィアロフォラ科、およびペシロミセス科の代表が示唆された。細菌および寄生虫のシグネチャーは、2種の階層グループの間に等しく見出され得る。細菌のプローブは、多数の科（アクチノミセス科、カウロバクテリウム科、スフィンゴバクテリウム科、腸内細菌科、プレボテラ科、ブルセラ科、バチルス科、ペプトストレプトコッカス科、フラボバクテリウム科）の代表を含み、それらのいくつかはがんに関連付けられており、寄生虫シグネチャーは、（スクリーニングされたTNBC試料の大部分において高度に検出された）トリチュリス科、トキソカラ科、リーシュマニア科、テラジア科、およびバベシア科の代表を含んでいた。実際、寄生虫と転移性乳がんとの関連に関する一つの報告が存在する38。関連するウイルスシグネチャーが、以前の報告に基づく、可能性のある病原的役割に関して、手掛かりを提供し得ることは興味深い。階層的分析に基づき2種の異なるグループが存在するという事実は、関連する微生物に基づくTNBCの分離の可能性を示唆する。にも関わらず、これらのグループを特徴決定する将来の研究は、疾患についてのさらなる洞察を提供するために重要であろう。
【０１３６】
要約すると、標的特異的なプローブキャプチャーおよび配列決定のデータは、検出されたウイルス、その他の微生物、またはそれらの密接に関連するファミリーメンバーについてのゲノムシグネチャーが、正常組織よりはるかに高頻度にTNBC組織に関連していることを示唆するパソチップスクリーニングの結果を支持する。
【０１３７】
値および範囲が本明細書中に提供される場合、これらの値および範囲に包含される全ての値および範囲が、本発明の範囲内に包含されるものとすることが理解されるべきである。さらに、これらの範囲に入る全ての値、ならびに値の範囲の上限および下限も、本願によって企図される。
【０１３８】
当業者は、ルーチンの実験のみを使用して、本明細書に記載された具体的な手法、態様、請求項、および例の多数の等価物を認識するかまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると見なされ、本明細書に添付の特許請求の範囲によってカバーされた。例えば、反応時間、反応サイズ/体積、および溶媒、触媒のような実験試薬、圧力を含むが、これらに限定されるわけではない反応条件の、当技術分野において認識されている代替物による、ルーチンの実験のみを使用した修飾は、本願の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１３９】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。本発明は、具体的な態様に関して開示されたが、本発明の他の態様および変動が、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の当業者によって考案され得ることは明白である。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変動を全て含んで解釈されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
2018512868.tif 000023
【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
2018512868.tif 000026
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
2018512868.tif 000037
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2018512868.tif 000040
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018512868.tif 000046
【図７Ｃ】
2018512868.tif 000047
【図７Ｄ】
2018512868.tif 000048
【図８Ａ】
2018512868.tif 000049
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2018512868.tif 000051
【図８Ｄ】
2018512868.tif 000052
【図８Ｅ】
2018512868.tif 000053
【図８Ｆ】
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【配列表】
2018512868000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月14日(2018.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018512868000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（表１）パソチップスクリーニングのPCRバリデーションのために使用されたプライマー
2018512868.tif 000055
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ある種の態様において、マイクロアレイは、バイオチップ、ガラススライド、ビーズ、または紙である。
[本発明1001]
以下の工程を含む、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法：
第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、該腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップ（PathoChip）アレイへハイブリダイズさせる工程；
第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、パソチップアレイへハイブリダイズさせる工程であって、該参照試料が、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する、工程；
該第1のハイブリダイゼーションパターンと該第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程であって、該第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ該第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、該腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される、工程。
[本発明1002]
前記微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーが、前記パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、前記腫瘍組織試料に由来する前記検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成され、該プローブが、マウス乳がんウイルス（MMTV）、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型（HTLV-1）、藤浪肉腫ウイルス（FSV）、サルウイルス40（SV40）、ジョン・カニンガム（John Cunningham）ウイルス（JC）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス16（HPV16）、ヒトパピローマウイルス6b（HPV6b）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV-1）、ウシ丘疹性口炎ウイルス（BPSV）、偽牛痘ウイルス（PCP）、タテラポックス（Taterapox）ウイルス（Tatera）、オーフウイルス（Orf）、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）、ブレブンディモナス（Brevundimonas）sp、スフィンゴバクテリア（Sphingobacteria）、プロビデンシア（Providencia）、プレボテラ（Prevotella）、ブルセラ（Brucella）、大腸菌（Escherichia coli （E.coli））、アクチノミセス（Actinomyces）、モビルンカス（Mobiluncus）、プロピニオバクテリア（Propiniobacteria）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ロチア（Rothia）、ペプチノフィルス（Peptinophilus）、キャプノサイトファーガ（Capnocytophaga）、プレイストフォラ（Pleistophora）、ピエドラ（Piedra）、ホンセカエア（Foncecaea）、フィアロフォラ（Phialophora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、トリチュリス（Trichuris）sp.、トキソカラ（Toxocara）sp.、リーシュマニア（Leishmania）sp.、タイレリア・エクイ（Theileria equi）（B.エクイ）、テラジア（Thelazia）sp.、またはパラゴニムス（Paragonimus）sp.からなる群より選択される微生物に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第1のハイブリダイゼーションパターンが、前記パソチップ上の少なくとも3種の核酸プローブへの、前記腫瘍組織試料に由来する前記検出可能に標識された核酸のハイブリダイゼーションによって生成され、該プローブが、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
以下の工程を含む、対象に由来する腫瘍組織試料において三重陰性乳がんを検出する方法：
第1のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、該腫瘍組織試料に由来する検出可能に標識された核酸を、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む第1のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程；
第2のハイブリダイゼーションパターンを生成するため、参照試料に由来する検出可能に標識された核酸を、SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む第2のマイクロアレイへハイブリダイズさせる工程であって、該参照試料が、対象に由来し他の点では同一である非腫瘍組織に由来する、工程；
該第1のハイブリダイゼーションパターンと該第2のハイブリダイゼーションパターンとを比較する工程であって、該第1のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでありかつ該第2のハイブリダイゼーションパターンが実質的に微生物ハイブリダイゼーションシグネチャーでない場合、該腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される、工程。
[本発明1005]
前記腫瘍組織試料が、生検試料、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料、または非固形腫瘍からなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記対象がヒトである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記検出可能に標識された核酸が、フルオロフォア、放射性リン酸、ビオチン、または酵素によって標識されている、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記フルオロフォアがCy3またはCy5である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
対象に由来する前記腫瘍組織試料において三重陰性乳がんが検出される場合、該対象に三重陰性乳がんに対する処置が提供される工程をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記処置が手術、化学療法、または放射線治療を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、組成物。
[本発明1012]
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、マイクロアレイ。
[本発明1013]
前記核酸プローブが、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む、本発明1012のマイクロアレイ。
[本発明1014]
MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる微生物の群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含む、マイクロアレイ。
[本発明1015]
前記マイクロアレイが、バイオチップ、ガラススライド、ビーズ、または紙である、本発明1012〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブとその使用のための説明材料とを含む、キット。
[本発明1017]
SEQ ID NO:1〜160からなる群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイとその使用のための説明材料とを含む、キット。
[本発明1018]
MMTV、HTLV-1、FSV、SV40、JC、MCPV、HCMV、EBV、KSHV、HPV16、HPV6b、HBV、HCV-1、BPSV、PCP、Tatera、Orf、アルカノバクテリウム、ブレブンディモナスsp、スフィンゴバクテリア、プロビデンシア、プレボテラ、ブルセラ、大腸菌、アクチノミセス、モビルンカス、プロピニオバクテリア、ゲオバチルス、ロチア、ペプチノフィルス、キャプノサイトファーガ、プレイストフォラ、ピエドラ、ホンセカエア、フィアロフォラ、ペシロミセス、トリチュリスsp.、トキソカラsp.、リーシュマニアsp.、B.エクイ、テラジアsp.、パラゴニムスsp.からなる微生物の群より選択される少なくとも3種の核酸プローブを含むマイクロアレイを含む、キット。
[本発明1019]
前記核酸プローブが、約10〜約30種の微生物から選択され、かつ微生物1種当たり約3〜約5種のプローブを含む、本発明1016〜1018のいずれかのキット。
【国際調査報告】
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