(57)【要約】殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられるクレブシエラ・ニューモニエＯ１のＤ−ガラクタン−ＩＩ抗原を特異的に認識するヒトまたはヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）、その生成の方法、医学的および診断的使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられるクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１のＤ−ガラクタン−ＩＩを特異的に認識する、ヒトまたはヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）。
【請求項２】
ヒトまたはヒト化ｍＡｂである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ａ
以下のＣＤＲ配列により特性付けられる抗原結合部位：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；および
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
または
Ｂ
Ａにおいて定義された抗原結合部位の機能的バリアント、ここで、該機能的バリアントは、該ＣＤＲ配列のいずれか１以上において少なくとも１個の点変異を含み、さらにここで、
ｉ．該機能的バリアントは、該ｇａｌ−ＩＩエピトープに結合する特異性を有し；かつ／もしくは
ｉｉ．該機能的バリアントは、該抗原結合部位のヒト、ヒト化、もしくは親和性成熟バリアントである；
を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
完全長モノクローナル抗体、抗原結合部位およびＦｃ領域を組み込んでいる少なくとも１個のドメイン構築物を含むその抗体フラグメント、または少なくとも異種ペプチドもしくはポリペプチドに融合した前記の抗体フラグメントを含む融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３、好ましくはあらゆるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アロタイプのＦｃ、好ましくはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７により同定されるヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ１，１７の定常領域、またはＣ１ｑ結合部位を含むそのＦｃ部分もしくはその機能的バリアントを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満または１０−８Ｍ未満のＫｄでＯ１抗原に結合する親和性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を含む、人工モノクローナル抗体組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を含む医薬製剤であって、好ましくは非経口または粘膜配合物を含み、場合により薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含有する、上記医薬製剤。
【請求項９】
クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象の処置であって該対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために該対象に有効量の該抗体を投与することを含む処置における使用のための、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
対象が、免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である、請求項９に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
対象が、損なわれた食細胞の数および／または機能により特性付けられる宿主群のものであり、その宿主群が、以下：
ａ）遺伝性もしくは後天性の原発性または続発性免疫不全を患っている患者；
ｂ）ｘ月齢より若い新生児、６５歳より高齢の高齢患者、糖尿病、腎不全、硬変、トリソミー２１、外傷、もしくはＨＩＶを患っている患者、もしくは外科的介入もしくは副腎皮質ステロイドによる全身処置を受けたことがある患者；または
ｃ）入院患者もしくは特に急性治療もしくは集中治療室においてＫ．ニューモニエ疾患を患っている患者への暴露の際に感染したリスクがある病院職員；
のいずれかである、請求項９または１０に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
Ｋ．ニューモニエ疾患の院内または医原性大流行を防ぐための、請求項９〜１１のいずれかに記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
抗体が抗生物質性薬物との組み合わせで投与される、請求項９〜１２のいずれかに記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象を処置する方法であって、該対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために該対象に有効量の抗体を投与することを含む、上記方法。
【請求項１５】
抗体およびさらなる診断試薬を以下の構成要素：
ａ）該抗体；および
ｂ）該さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により該抗体および該診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相；
を含む組成物または部分のキット中に含み、好ましくはここで、該さらなる診断試薬が、診断用標識または該抗体および／もしくはその抗原に結合する該抗体の反応産物と特異的に反応する試薬である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体の診断製剤。
【請求項１６】
クレブシエラ・ニューモニエＯ１株により引き起こされた対象におけるクレブシエラ・ニューモニエＯ１の感染またはコロニー形成を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を提供し、そして
ｂ）該抗体が試験されるべき該対象の生物学的試料中の該ガラクタン−ＩＩエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエＯ１の感染またはコロニー形成を診断する；
を含む、上記方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む、組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を生成する方法であって、該抗体を発現することができる組み換え宿主細胞が、前記の抗体を産生するための条件下で培養または維持される、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１のＬＰＳ側鎖内のＤ−ガラクタン−ＩＩ（ガラクタンＩＩ、Ｄ−ｇａｌ  ＩＩ、ｇａｌ−ＩＩ）を特異的に認識するヒトＩｇＧ１抗体である殺菌性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレブシエラ・ニューモニエは、尿路感染症、肺炎、および敗血症の原因である院内日和見病原体であり、重大な罹患率および死亡率を引き起こしている。感受性のある患者は、しばしばこの片利共生腸内細菌により引き起こされる侵襲性感染症に対処することができない免疫機能不全を有する。
【０００３】
さらにもっと警戒すべきことは、多剤耐性（ＭＤＲ）株が最近出現して世界的に広がっており、それに対する療法選択肢が限られていることである。モノクローナル抗体は、新規の療法的アプローチに相当し得る。それでもなお、Ｋ．ニューモニエの表面上の接近可能な分子標的は、ほとんどの表面抗原を遮蔽するかさばる莢膜多糖を考慮すると、非常に限られている。一方で、容易に接近可能な莢膜多糖は、それを広いスペクトルの抗細菌アプローチに関して魅力的でないようにする高度な構造的および従って抗原的変動性を示す。
【０００４】
他の主な非タンパク質性表面抗原は、莢膜抗原よりも低い変動性を示すＬＰＳである。Ｋ．ニューモニエにおいて、ＬＰＳのＯ側鎖の構造に基づいて識別された１０種類より少ないＯ−血清群が存在する。最も一般的な血清型は、Ｏ１であり、それは、全てのＫ．ニューモニエ分離株の３分の１よりも多くにより発現されていることが報告された（１；２。Ｈｅｌｄらは、補体依存性のオプソニン化貪食作用性殺傷を誘導することができるが補体に媒介される殺傷を欠いており、従って食細胞の非存在下では殺菌性ではないマウスガラクタン−ＩＩ特異的マウスＩｇＧ２ｂ（Ｍａｂ  Ｒｕ．Ｏ１）を記載した（１）。
【０００５】
異なる地理的位置において分離された最近のＭＤＲ株を含む内部研究は、Ｏ１分離株の最高の罹患率を確証した（図１）。
天然存在抗体は、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる。ＩｇＧ内で、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）領域は、パラトープを含有し、抗原との結合相互作用を通して直接的な作用を及ぼすことができる。その他に、Ｆｃ領域は、様々なアクセサリー分子と相互作用して間接的なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、オプソニン化貪食作用（ＯＰＫ）としても知られている抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を媒介する。これらの後者の２種類のＦｃに媒介されるエフェクター機能は、細胞性および補体に媒介される反応が効率的な病原体除去に重要である感染症に対して特に重要である。
【０００６】
補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）において、Ｃ１ｑが、抗体に結合し、この結合が、補体カスケードを誘発し、それは、古典的経路での補体活性化の結果として標的細胞の表面における膜攻撃複合体（Ｃ５ｂ〜Ｃ９）の形成をもたらす。ＣＤＣエフェクター機能のレベルは、典型的にはヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３に関して高く、ＩｇＧ２に関して低く、ＩｇＧ４に関してゼロであるが、主に標的細胞および抗原のタイプに依存する。
【０００７】
ほとんどの臨床で蔓延しているＫ．ニューモニエ血清型において、Ｄ−ガラクタン−ＩＩは、Ｏ１抗原を定めるエピトープを提供し、Ｄ−ｇａｌ  ＩＩリピート単位構造：［−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−］により特性付けられる。
【０００８】
その存在は、宿主における細菌の補体に媒介される殺傷への耐性の原因である。従って、Ｄ−ガラクタン−Ｉのみを産生するＫ．ニューモニエ変異体は、血清感受性である（１３）。
【０００９】
食細胞は、粒子、微生物または死細胞を吸収し、飲み込み（貪食し）、そして消化することができる細胞である。専門の食細胞は、好中球、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびマスト細胞を含む。
【００１０】
Ｋ．ニューモニエＯ１抗原の詳細な生化学的構造は、以前に２つの独立したグループにより記載された（１１；１２）。Ｋ．ニューモニエＯ１抗原に対するポリクローナルおよびマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体が、上記のようにＴｒａｕｔｍａｎｎのグループにより産生させられ、特性付けられた（１〜３）。それらの実験データに基づいて、抗Ｏ１  ｍＡｂの療法的使用が、示唆された。
【００１１】
ＬＰＳ  Ｏ−抗原、特にＯ１抗原（ガラクタン−ＩＩ）に対する抗体が、以前に他のグループにより発現させられ、試験された。そのような抗体は、オプソニン化貪食作用性殺傷（ＯＰＫ）を誘導し（１）、クレブシエラ感染症のマウスモデルにおいて保護を与える（２）ことが示された。オプソニン化の可能性に基づいて、ガラクタン−ＩＩに対するｍＡｂの使用が、有望な抗細菌戦略として示された（２；３）。
【００１２】
Ｈｓｉｅｈらは、Ｏ１  ＬＰＳにおける免疫優性抗原としてのＤ−ガラクタン−ＩＩおよびワクチン設計におけるその意義を記載した（１４）。
Ｏ１抗原の詳細な構造分析ならびにこの構造に対するモノクローナル抗体に関する先行技術が、存在する。そのような先行技術の抗体は、そのオプソニン化機能に関して選択され、すなわち有効性は、感染した宿主の食細胞の機能に頼るであろう。しかし、日和見病原体としてのＫ．ニューモニエは、食細胞活性が重篤に損なわれている可能性のある免疫無防備状態の人（上記参照）に感染する傾向がある。
【００１３】
Ｋｕｂｏｔａらは、向上したエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害作用および補体依存性細胞傷害作用を有する設計された療法用抗体を記載している（１５）。
免疫無防備状態の患者は、正常な免疫反応を発現することができず、それは結果としてより弱い／損なわれた免疫系（免疫不全）をもたらす。免疫不全は、原発性（遺伝的欠陥が免疫細胞に影響を及ぼす場合）または続発性（要因が本来正常な免疫系を有する宿主に影響を及ぼし、それが結果として後天性免疫不全をもたらす場合）である可能性があり、それらは、抗体、リンパ球、食細胞、補体系の障害またはこれらの要因の組み合わせの結果もたらされ得る。
【００１４】
Ｋ．ニューモニエは、典型的には院内設定において大流行を引き起こすため、同じ臨床病棟に存在し、Ｋ．ニューモニエに感染した患者と医療設備または人員を共有している患者は、感染症にかかる高いリスクがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ヒトの対象を免疫予防および免疫療法のために処置するために、特に免疫無防備状態の患者を処置するために用いられることができる向上した抗体を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
その目的は、本発明の対象により解決される。
本発明によれば、クレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１のＤ−ガラクタン−ＩＩ、特にＬＰＳ内のＤ−ガラクタン−ＩＩエピトープ、またはＤ−ガラクタン−ＩＩ抗原を特異的に認識するヒト化またはヒトモノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）が提供され、その抗体は、殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられる。具体的には、抗体は、殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられるＣ１ｑ結合部位を含むＦｃ領域を含む。特に、本明細書で記載される抗体は、殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられるＣ１ｑ結合部位を含むヒト定常領域を含むクレブシエラ・ニューモニエＯ１のＤ−ガラクタン−ＩＩ抗原を特異的に認識するｍＡｂである。具体的には、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体の構造を含み、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃを含む。具体的には、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体である。
【００１７】
本明細書で用いられる際、抗体の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）は、１以上の補体タンパク質構成要素が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす反応である。
【００１８】
具体的には、抗体は、血清中で例えば標準的なＣＤＣアッセイにより決定されるような、循環中の抗原を有する細菌の補体に媒介される直接的な殺傷に対するＣＤＣ活性により特性付けられる。特に、抗体は、対照と比較した場合に細胞溶解の百分率における有意な増大が存在する場合、殺菌性ＣＤＣ活性を有する。ＣＤＣに関連する細胞傷害活性は、好ましくは絶対百分率の増大として測定され、それは、好ましくは５％より高く、より好ましくは１０％より高く、さらにもっと好ましくは２０％より高い。
【００１９】
それぞれが異なる抗原結合部位および異なるＣＤＲ配列を有する様々なＩｇＧ１型のモノクローナルヒト抗体が、Ｋ．ニューモニエ血清型Ｏ１の血清殺傷に対する天然の耐性にもかかわらずＣＤＣ活性により細菌を直接殺傷することができることは、驚くべきことであった。殺菌活性は、食細胞の欠陥を有する患者または免疫無防備状態の患者を処置する際に、特に関連する。
【００２０】
具体的には、抗体は、ヒト化（例えばキメラｍＡｂ、例えばヒト／マウスｍＡｂ、または他のヒト化ｍＡｂ、例えばヒトＩｇＧ１フレームワークへのＣＤＲ移植で得られるヒト化ｍＡｂを含む）またはヒトｍＡｂである。
【００２１】
特定の態様によれば、抗体は、以下のものを含む：
Ａ
以下のＣＤＲ配列により特性付けられる抗原結合部位：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；および
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
または
Ｂ
Ａにおいて定義された抗原結合部位の機能的バリアント、ここで、機能的バリアントは、ＣＤＲ配列のいずれか１以上において少なくとも１個の点変異を含み、さらにここで、
ｉ．機能的バリアントは、ｇａｌ−ＩＩエピトープに結合する特異性を有し；かつ／もしくは
ｉｉ．機能的バリアントは、抗原結合部位のヒト、ヒト化（例えばヒト／マウスキメラを含む）、もしくは親和性成熟バリアントである。
【００２２】
具体的には、ＣＤＲ１〜３配列は、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨドメイン）中に組み込まれており、ＣＤＲ４〜６配列は、抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬドメイン）中に組み込まれており、ヒトＶＨおよびＶＬフレームワーク配列、またはヒトフレームワーク配列に少なくとも６０％同一である、好ましくは７０％、８０％、または９０％のいずれかで同一であるフレームワーク配列を用いている。特定の例によれば、抗体は、ＶＨフレームワーク配列内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を組み込んだＶＨならびにＶＬフレームワーク配列内にＣＤＲ４、ＣＤＲ５、およびＣＤＲ６配列を組み込んだＶＬを含むヒト化抗体であり、ここで、フレームワーク配列は、ヒトＩｇＧ、特にヒトＩｇＧ１に由来し、またはここで、可変ドメインの抗原結合特異性を変化させず、かつそれぞれのＶＨもしくはＶＬフレームワーク配列に対して少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の同一性のいずれかを有するフレームワーク配列の少なくとも１種類の機能的バリアントが、用いられている。
【００２３】
具体的には、Ａにおいて定義される抗原結合部位は、８Ｅ９、Ｇ２−２７、またはＧ２−３３と名付けられ、本明細書において記載されている典型的な抗体のいずれかのものである。これらの抗体のそれぞれは、ＣＤＲ１〜６配列により定義される抗原結合部位と同じ抗原結合部位により特性付けられるが、抗体は、フレームワークまたは定常領域において異なる。ヒト−マウスキメラｍＡｂである８Ｅ９は、ヒトＩｇＧ１定常重鎖およびカッパ定常軽鎖領域を含み、従ってヒトＩｇＧ型であり、ヒト化Ｇ２−２７およびＧ２−３３は、ｍＡｂ  ８Ｅ９のさらなるヒト化で得られた。
【００２４】
本発明は、そのような抗体のバリアントにも関する。バリアントを提供するため、８Ｅ９、Ｇ２−２７またはＧ２−３３抗体のいずれかが、本明細書において親抗体と呼ばれ、それらのＣＤＲ配列は、本明細書において親ＣＤＲ配列と呼ばれる。親抗体またはそのそれぞれのＣＤＲ配列のいずれかの抗原結合部位の機能的バリアントを含む抗体は、特に機能的バリアント抗体として理解されており、それらのバリアントＣＤＲ配列は、本明細書において機能的に活性なＣＤＲバリアント配列と呼ばれる。
【００２５】
別途示されない限り、Ｋａｂａｔに従って番号付けされた、すなわちＫａｂａｔ命名法に従って決定されたＣＤＲ配列に対して参照がなされる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版 Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services. (1991)を参照）。本発明および特許請求の範囲は、同じ抗体およびＣＤＲであるが異なる番号付けおよび名付けられたＣＤＲ領域（ここでＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴ系に従って定義されている(The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212)）を有する抗体およびＣＤＲも包含するものとすることは、十分に理解されている。
【００２６】
特に、標的抗原に結合し、ＣＤＣ活性により特性付けられるように細胞傷害性であるバリアント抗体は、機能的に活性であると考えられる。親抗体のバリアントＶＨまたはＶＬドメイン、例えばそれぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列において改変を有するＶＨまたはＶＬドメインであって、機能的に活性である、例えば親抗体と同じエピトープ（すなわちｇａｌ−ＩＩエピトープ）に結合する、または同じ結合部位を含む、または同じ結合特徴を有するＶＨまたはＶＬドメインも用いられることができることは、実現可能である。本明細書において記載される抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列のいくつかが他の抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列により交換されている事ができることも、実現可能である。特定のバリアントは、以下のものを含むことができる：
・親抗体のドメインをシャッフルすることにより得られるＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせ、または
・親抗体の重鎖および軽鎖をシャッフルすることにより得られるＨＣおよびＬＣの組み合わせ。
【００２７】
例えば、機能的抗体バリアントは、第１親抗体のＶＨドメインおよび別の親抗体のＶＬドメインを含むことができる。別の例によれば、機能的抗体バリアントは、第１親抗体のＨＣドメインおよび別の親抗体のＬＣを含むことができる。
【００２８】
“機能的に活性な”バリアントとも呼ばれる機能的バリアントは、親ＣＤＲ配列中に少なくとも１個の点変異を含み、かつ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる機能的に活性なＣＤＲバリアントであることができる。
【００２９】
特定のバリアントは、例えば親抗体のヒト化バリアントであり、ここで、親ＣＤＲ配列が、ヒトまたはヒト化フレームワーク配列中に組み込まれており、ここで、場合により親ＣＤＲ配列のそれぞれの１、２、３、または４個のアミノ酸残基が、親またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を向上させるために点変異を導入することによりさらに変異していることができる。
【００３０】
具体的には、抗体は、親抗体のＣＤＲ配列のいずれかの機能的に活性なＣＤＲバリアントを含み、ここで、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、以下：
ａ）親ＣＤＲ配列中の１、２、もしくは３個の点変異；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端もしくは４つのＮ末端、もしくは４つの中央のアミノ酸位置のいずれかにおける１もしくは２個の点変異；および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性；
の少なくとも１つを含み、好ましくはここで、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、４または５アミノ酸未満からなるあらゆるＣＤＲ配列において１または２個の点変異を含む。
【００３１】
具体的には、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、本明細書において記載される機能的に活性なＣＤＲバリアントの少なくとも１つを含む。具体的には、機能的に活性なＣＤＲバリアントの１以上を含む機能的に活性なバリアント抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
【００３２】
特定の側面によれば、点変異は、１個以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
具体的には、抗体は、そのような親抗体のいずれかから、変異誘発により、それぞれのＣＤＲ配列、または例えば１個のＣＤＲループ内に、例えば５〜１８アミノ酸のＣＤＲの長さの範囲内に、例えば５〜１５アミノ酸もしくは５〜１０アミノ酸のＣＤＲ領域内に１、２もしくは３個の点変異を有する機能的に活性なＣＤＲバリアントを含むＣＤＲ変異体を用いて得られる。あるいは、機能的に活性なＣＤＲバリアントを含む抗体を提供するために、１個のＣＤＲループ内に、例えば５アミノ酸未満のＣＤＲの長さの範囲内に１〜２個の点変異が存在することができる。特定のＣＤＲ配列、例えばＣＤＲ２またはＣＤＲ５配列は、短い可能性がある。特定の態様によれば、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、４または５アミノ酸未満からなるあらゆるＣＤＲ配列中に１または２個の点変異を含む。
【００３３】
本明細書において、ＣＤＲ１、２、および３と番号付けされたＣＤＲは、ＶＨドメインの結合領域を表し、ＣＤＲ４、５、および６と番号付けされたＣＤＲは、ＶＬドメインの結合領域を表すことが、特に理解されている。
【００３４】
さらなる特異的抗体は、例えば抗体の親和性を向上させるように、および／または親抗体により標的とされているエピトープと同じエピトープもしくはその付近のエピトープを標的とする（エピトープシフト）がなおｇａｌ−ＩＩエピトープを特異的に認識するようにＣＤＲが変異した抗体として提供される。
【００３５】
具体的には、そのようなバリアントのＶＨまたは重鎖（ＨＣ）配列は、それぞれ別のバリアントのＶＨおよびＨＣ配列により置換されていることができ、特にここで、その他のバリアントは、同じ親抗体のあらゆる他のバリアントである。
【００３６】
具体的には、そのようなバリアントのＶＬまたは軽鎖（ＬＣ）配列は、それぞれ別のバリアントのＶＬおよびＬＣ配列により置換されていることができ、特にここで、その他のバリアントは、同じ親抗体のあらゆる他のバリアントである。
【００３７】
特定の側面によれば、抗体は、例えば異なる由来の組み換えＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、ここで、ＣＤＲおよびフレームワーク配列の少なくとも１つは、ヒト、ヒト化、キメラ、マウスまたは親和性成熟配列を含むが、ここで、フレームワークおよび特にＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３の、またはヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３定常領域バリアント（アロタイプ）のＦｃ領域、またはランダム化された、もしくは人工のアミノ酸配列（すなわち非天然存在配列）を含むがＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３亜型の構造を変化させていない組み換えＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３抗体のものである。
【００３８】
特に好ましい抗体は、親抗体のいずれかの結合部位、特にそれぞれのＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせにより形成される結合部位を含む。
具体的には、抗体は、抗体のＣ１ｑ結合（および場合によりＣＤＣ活性）を向上させるような１個以上の（いくつかの）点変異を含む、すなわち１個以上の（いくつかの）点変異または糖構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）によりＦｃ領域のＣ１ｑ結合部位を設計することによる設計されたｍＡｂである。具体的には、抗体は、向上したＣ１ｑ活性化によりＣＤＣ活性を向上させるように設計されることができる。
【００３９】
本発明は、さらに、８Ｅ９、Ｇ２−２７、もしくはＧ２−３３抗体のいずれかである、または８Ｅ９、Ｇ２−２７、もしくはＧ２−３３抗体のいずれかの結合部位を含む親抗体の機能的に活性な抗体バリアントを生成する方法を提供し、その方法は、バリアント抗体を得るために定常領域または相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）のいずれかにおいて少なくとも１個の点変異を設計すること、およびバリアント抗体の機能活性を、特にＯ１エピトープに１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満、さらには１０−１０Ｍ未満、または１０−１１Ｍ未満のＫｄで、例えばピコモル濃度範囲の親和性で結合する親和性により、そしてＣＤＣ活性により決定することを含む。機能活性を決定する際、機能的に活性なバリアントが、さらなる使用のために、そして場合により組み換え生成法による生成のために選択される。変異誘発により親抗体から得られたバリアント抗体は、当該技術で周知の方法により生成されることができる。
【００４０】
特定の側面によれば、バリアント抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する。
さらなる特定の側面によれば、バリアント抗体は、親抗体と同じ結合部位を含む。
具体的には、抗体は、１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満または１０−８Ｍ未満のＫｄでＯ１抗原に結合する親和性を有する。
【００４１】
本明細書で記載される抗体は、それがあらゆる他のＫ．ニューモニエ抗原と交差反応しないこと、および／またはその抗体があらゆる他のＫ．ニューモニエ抗原により低い親和性で結合し、例えばここで、（Ｏ１抗原以外の）他のＫ．ニューモニエ抗原と比べてＯ１抗原に優先的に結合するＫｄの差が、少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数であることが、特にさらに特性付けられている。
【００４２】
本明細書において親和性成熟抗体と呼ばれる親和性成熟により生成される親抗体のバリアントは、親抗体と比較して少なくとも１対数、または２対数、または３対数のＫｄの差により増大した結合親和性を有することができる。親和性成熟バリアントは、典型的には１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄでＯ１抗原に結合する親和性を有する。親抗体が１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄを有する親和性を有し、そして親抗体が親和性成熟を経ている場合、親和性成熟バリアントは、それぞれ１０−９Ｍ未満および１０−１０Ｍ未満のＫｄを有するさらに高い親和性を有することができる。
【００４３】
具体的には、抗体は、完全長モノクローナル抗体、抗原結合部位およびＦｃ領域を組み込んでいる少なくとも１個のドメイン構築物を含むその抗体フラグメント、または少なくとも異種ペプチドもしくはポリペプチドに融合した前記の抗体フラグメントを含む融合タンパク質である。
【００４４】
具体的には、抗体は、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ３、好ましくはあらゆるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アロタイプのＦｃ、好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはＦｃ部分、例えばアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７により同定されるヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ１，１７の定常領域を含む抗体またはそのＦｃ部分もしくはＦｃ領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ８により同定されるＩｇＧ１  Ｆｃ、またはＣ１ｑ結合部位を含むその機能的バリアントを含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ７は、ヒトＩｇＧ１のＧ１  ｍ１，１７アロタイプを同定し、ＳＥＱ  ＩＤ  ８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ７内に組み込まれたＦｃ部分を同定する。
【００４５】
あるいは、あらゆる他のヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３のいずれかのＦｃバリアントもしくは定常領域バリアント、またはヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３のアロタイプのＦｃもしくはＦｃ領域が、それがＣ１ｑ結合部位を含む限り用いられることができる。
【００４６】
本発明は、さらに、本明細書において記載される抗体をコードする単離された核酸を提供する。
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体、または前記の抗体のＶＨおよび／もしくはＶＬならびにＦｃ領域を含むタンパク質を発現するためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミドを提供する。
【００４７】
本発明は、さらに、本明細書で記載される核酸または発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体を生成する方法を提供し、ここで、本明細書で記載される宿主細胞は、前記の抗体を産生する条件下で培養または維持される。従って、本発明は、本明細書で記載される抗体を生成する方法を提供し、ここで、抗体を発現することができる組み換え宿主細胞は、前記の抗体を産生する条件下で培養または維持される。
【００４８】
特に好ましいのは、宿主細胞およびそのような宿主細胞を用いる生成法であり、その宿主細胞は、以下のものを含む：
−抗体軽鎖を発現するためのコード配列を組み込んでいる、本明細書において記載されるプラスミドまたは発現カセット；および
−抗体重鎖を発現するためのコード配列を組み込んでいる、本明細書において記載されるプラスミドまたは発現カセット。
【００４９】
さらなる側面によれば、本発明は、本明細書で記載される抗体を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）非ヒト動物をクレブシエラ・ニューモニエのＯ１抗原で免疫し、抗体を産生するＢ細胞を単離し；
ｂ）単離されたＢ細胞から不死化した細胞株を形成し；
ｃ）細胞株をスクリーニングしてＯ１抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し；そして
ｄ）モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を有する抗体のヒト化もしくはヒトＩｇＧもしくはＩｇＧ３形態、またはそのＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３誘導体を生成する。
【００５０】
特定の方法は、クラスＩｇＧ、例えば実質的に免疫グロブリンガンマ遺伝子によりコードされるＩｇＧおよび下位クラスＩｇＧ１またはＩｇＧ３を生成するスイッチバリアントクローンを生成するためのプロセスを含む。
【００５１】
本発明は、さらに、以下の工程を含む候補抗体を同定する方法を提供する：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を提供し；そして
ｂ）以下に関してアッセイする：
ｉ．試料中の、または試料により産生された抗体の、ガラクタン−ＩＩエピトープとの結合；および
ｉｉ．血清試料中のＫ．ニューモニエＯ１血清型の殺傷に関するＣＤＣ活性；
ここで、抗体およびエピトープの間の陽性結合反応、ならびに陽性ＣＤＣ活性は、その抗体を候補抗体として同定する。
【００５２】
本発明は、さらに、以下の工程を含む本明細書で記載される抗体を生成する方法を提供する：
ａ）本明細書で記載されたように同定された候補抗体を提供し；そして
ｂ）そのモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を有する抗体のヒト化もしくはヒトＩｇＧもしくはＩｇＧ３形態、またはそのＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３誘導体を生成する。
【００５３】
本発明は、さらに、本明細書で記載されるモノクローナル抗体、特に組み換え宿主細胞により産生され、宿主細胞培養物から単離された抗体を含む人工組成物を提供する。そのような組成物は、組成物を汚染するであろうヒト血清タンパク質を一切含まない。特に、組成物は、モノクローナル抗体の単一のセットのみを含むモノクローナル抗体組成物である。従って、組成物は、人工であり天然存在ではないと考えられる。
【００５４】
本発明は、さらに、好ましくは非経口または粘膜配合物を含み、場合により薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含有する、本明細書で記載される抗体を含む医薬製剤を提供する。
【００５５】
そのような医薬組成物は、抗体を唯一の有効物質として、または他の有効物質との組み合わせもしくは有効物質のカクテル、例えば少なくとも２もしくは３種類の異なる抗体の組み合わせもしくはカクテルとして含有することができる。
【００５６】
本発明によれば、本発明の抗体は、特に医学的、診断的または分析的使用のために提供される。
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体の医学的使用、および免疫予防または療法を必要とする対象を処置するそれぞれの方法を提供する。
【００５７】
具体的には、本発明は、クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象の処置であって、対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために、対象に有効量の抗体を投与することを含む処置における使用のための、本明細書で記載される抗体を提供する。
【００５８】
従って、本発明は、クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象を処置する方法であって、対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置もしくは予防のために、対象に有効量の抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００５９】
具体的には、対象は、免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である。
具体的には、対象は、損なわれた食細胞の数および／または機能により特性付けられる宿主群のものであり、その宿主群は、以下のいずれかである：
ａ）遺伝性もしくは後天性の原発性または続発性免疫不全を患っている患者；
ｂ）ｘ月齢より若い新生児、６５歳より高齢の高齢患者、糖尿病、腎不全、硬変、トリソミー２１、外傷、もしくはＨＩＶを患っている患者、もしくは外科的介入もしくは副腎皮質ステロイドによる全身処置を受けたことがある患者；または
ｃ）入院患者もしくは特に急性治療もしくは集中治療室においてＫ．ニューモニエ疾患を患っている患者への暴露の際に感染したリスクがある病院職員。
【００６０】
具体的には、抗体は、Ｋ．ニューモニエ疾患の院内または医原性大流行を防ぐために用いられる。
具体的には、抗体は、本発明に従う使用のために提供され、ここで、対象におけるｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−型のクレブシエラ・ニューモニエによる全身感染またはコロニー形成は、前記の対象の生物学的試料を抗体と接触させることにより生体外で決定され、ここで、抗体の特異的免疫反応が、感染またはコロニー形成を決定する。
【００６１】
具体的には、生物学的試料は、体液または組織試料、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ（ｌｕｎｇ  ｔａｐ）、鼻スワブもしくは痰、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である。具体的には、体液の試料は、特異的免疫反応に関して試験され、その試料は、尿、血液、血液分離物または血液培養物、吸引物、痰、挿管された対象の洗浄液および便からなる群から選択される。
【００６２】
具体的には、生物学的試料は、その生物学的試料由来のクレブシエラ・ニューモニエ分離株を生成するために処理され、その分離株は、そのｇａｌ−ＩＩ遺伝子型もしくは表現型および／またはＯ１（Ｄ−ｇａｌ−ＩＩ）抗原発現のレベルに関してさらに特性付けられることができる。細菌分離株を生成するための好ましい試料調製法は、細菌富化および培養工程を用いている。
【００６３】
具体的には、生物学的試料は、場合によりマトリックス効果を低減するためならびに試験の特異性および感度を増大させるための富化または精製の予備工程の後、試料において直接Ｏ１レベルを決定するために処理される。予備工程は、生物学的標本を標準的な培養手順に従って培養すること、例えば（排他的にではないが）ルーチン的な微生物学実験室において実施されているような標準的な増殖培地中での血液培養ならびに標本の固体寒天上での培養（表現型決定−すなわち耐性記録を含む）を含む。細菌は、病毒性因子の発現を増進するために異なる増殖培地（標準的な培地および／または化学的に明確な培地；高栄養素、低栄養素、制限増殖培地組成物）においてＣＦＵの拡張のために継代培養されることができる。細菌懸濁液は、可能性のあるマトリックス効果を除去するために標準的な緩衝溶液中で調製および洗浄されることができる。
【００６４】
具体的には、Ｏ１抗原は、免疫アッセイの少なくとも１つ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディプスティックアッセイおよびウェスタンブロット、もしくは質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＯ１発現を示す対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法のいずれかにより決定される。
【００６５】
特定の側面によれば、本発明の抗体を用いる免疫療法は、例えば様々な動物モデルにおいて決定されるように、生菌負荷に対して有効に保護することができる。
抗体は、例えばインビトロ血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）により例えば対照試料（抗体が添加されていない、または無関係な対照ｍＡｂが添加されている）を上回る少なくとも２０％の細菌の殺傷で決定されるようなそのＣＤＣ活性または補体に媒介される殺傷により、ｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−型のクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である。
【００６６】
抗体は、例えばインビトロオプソニン化貪食作用性殺傷アッセイ（ＯＰＫ）により例えば対照試料（抗体が添加されていない、または無関係な対照ｍＡｂが添加されている）を上回る少なくとも２０％の入力細菌の取り込みまたは２０％低い最終ＣＦＵ計数で決定されるような抗体に媒介される食作用により、ｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−型のクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である。
【００６７】
さらなる特定の側面によれば、抗体は、インビトロおよび／またはインビボで殺菌性であり、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む動物において標的とされる病原体を特異的に殺傷し、そしてインビボで病理発生、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のあらゆるモデルを阻害する。
【００６８】
特定の態様によれば、抗体は、菌血症を防止するために予防的有効用量、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ未満で投与される。
別の特定の態様によれば、抗体は、菌血症を処置するために療法上有効用量、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ未満で投与される。
【００６９】
具体的には、抗体は、抗体および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬製剤において投与される。
具体的には、抗体は、抗生物質性薬物との組み合わせで投与される。免疫療法との組み合わせのために用いられる典型的な抗生物質は、Ｋ．ニューモニエ感染を有する患者を処置するために典型的に用いられる抗生物質、例えばカルバペネム系、ポリミキシン系、チゲサイクリン、または非ベータラクタム型阻害剤を伴うベータラクタム系のいずれか１種類以上である。
【００７０】
本発明によれば、本明細書で記載される抗体は、特に医学的、診断的または分析的使用のために提供される。
本発明は、さらに、診断目的のための、特に対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染もしくはコロニー形成、または関連する疾患、例えば原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎の診断のための本明細書で記載される抗体の使用を提供する。
【００７１】
具体的には、対象は、ヒト、特に免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である。
具体的には、抗体は、本明細書で記載される使用のために提供され、ここで、対象におけるｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−型のクレブシエラ・ニューモニエによる全身感染またはコロニー形成は、生体外で前記の対象の生物学的試料を抗体と接触させることにより決定され、ここで、抗体の特異的免疫反応は、感染またはコロニー形成を決定する。
【００７２】
具体的には、生物学的試料は、体液または組織試料、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ（ｌｕｎｇ  ｔａｐ）、鼻スワブもしくは痰、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である。具体的には、体液の試料は、特異的免疫反応に関して試験され、その試料は、尿、血液、血液分離物または血液培養物、吸引物、痰、挿管された対象の洗浄液および便からなる群から選択される。
【００７３】
具体的には、生物学的試料は、その生物学的試料由来のクレブシエラ・ニューモニエ分離株を生成するために処理され、その分離株は、そのｇａｌ−ＩＩ遺伝子型もしくは表現型および／またはｇａｌ−ＩＩ抗原発現のレベルに関してさらに特性付けられることができる。細菌分離株を生成するための好ましい試料調製法は、細菌富化および培養工程を用いている。
【００７４】
具体的には、生物学的試料は、場合によりマトリックス効果を低減するためならびに試験の特異性および感度を増大させるための富化または精製の予備工程の後、試料において直接ｇａｌ−ＩＩレベルを決定するために処理される。予備工程は、生物学的標本を標準的な培養手順に従って培養すること、例えば（排他的にではないが）ルーチン的な微生物学実験室において実施されているような標準的な増殖培地中での血液培養ならびに標本の固体寒天上での培養（表現型決定−すなわち耐性記録を含む）を含む。細菌は、病毒性因子の発現を増進するために異なる増殖培地（標準的な培地および／または化学的に明確な培地；高栄養素、低栄養素、制限増殖培地組成物）においてＣＦＵの拡張のために継代培養されることができる。細菌懸濁液は、可能性のあるマトリックス効果を除去するために標準的な緩衝溶液中で調製および洗浄されることができる。
【００７５】
具体的には、ｇａｌ−ＩＩ抗原は、免疫アッセイの少なくとも１つ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディプスティックアッセイおよびウェスタンブロット、もしくは質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはｇａｌ−ＩＩ発現を示す対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法のいずれかにより決定される。
【００７６】
具体的には、本発明に従う診断的使用は、臨床標本から回収された純粋なクレブシエラ・ニューモニエ培養物からインビトロでクレブシエラ・ニューモニエの血清型を決定し、その細菌がＯ１型（すなわちｇａｌ−ＩＩを発現する）か否かを決定することを指す。
【００７７】
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体の診断製剤であって、抗体およびさらなる診断試薬を以下の構成要素：
ａ）抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により抗体および診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相；
を含む組成物または部分のキット中に含む診断製剤を提供する。
【００７８】
診断製剤は、場合により本発明の抗体およびさらなる診断試薬を組成物または部分のキット中に含む。
診断キットは、好ましくは生物学的試料中のｇａｌ−ＩＩ発現を決定するための全ての本質的な構成要素を、場合により一般的な、または非特異的な物質または構成要素、例えば水、緩衝剤または賦形剤を伴わずに含む。貯蔵安定キットは、好ましくは少なくとも６ヵ月間、より好ましくは少なくとも１または２年間貯蔵されることができる。それは、乾燥した（例えば凍結乾燥された）構成要素で構成されていることができ、かつ／または保存剤を含むことができる。
【００７９】
好ましい診断キットは、包装された、または事前包装された単位として提供され、例えばここで、構成要素は、１つの包装のみの中に収容され、それは、ルーチン的な実験を促進する。そのような包装は、例えば一連の生物学的試料の試験を実施するのに適した、１回以上の試験に必要な試薬を含むことができる。キットは、さらに適切には、標準または参照対照としてｇａｌ−ＩＩ抗原製剤を含有することができる。
【００８０】
診断組成物は、生物学的試料を含む反応混合物中での使用の準備ができた試薬、またはそのような試薬の保存形態、例えば貯蔵安定形態、例えば凍結乾燥形態；（例えば液体窒素中での）スナップフリーズ形態、超低温貯蔵（−７０℃および−８０℃）、低温貯蔵（−２０℃および５℃）および制御された室温（１５℃〜２７℃）；例えばグリセロールストック、組織パラフィンブロック、（バッカル）スワブおよび他の標準的な生物学的試料貯蔵法としての標準的な試料貯蔵形態であることができ、その試薬の保存形態は、使用の準備ができた試薬を得るために再構成または調製されることができる。そのような使用の準備ができた試薬は、典型的には水溶液、特に（生理学的）緩衝条件（例えばＥＤＴＡ緩衝、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、クエン酸緩衝液等）の形態である。
【００８１】
具体的には、さらなる診断試薬は、抗体および／またはその抗原に結合する抗体の反応産物と特異的に反応する試薬である。適切な診断試薬は、対象においてクレブシエラ・ニューモニエＯ１の感染またはコロニー形成を診断またはモニターするための免疫アッセイを実施するために適切に用いられる。適切な診断試薬は、溶媒、緩衝液、染料、抗凝固薬、本発明の抗体および／または抗体−抗原免疫複合体に特異的に結合するリガンドであることができる。
【００８２】
具体的には、本発明は、場合により標識を有する抗体および／または標識を有するさらなる診断試薬、例えば抗体または抗体のそれぞれの標的抗原との免疫複合体を特異的に認識する試薬、ならびに／または抗体および診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相を含有する、本発明の抗体の診断製剤を提供する。
【００８３】
抗体または診断試薬は、直接標識されることも間接的に標識されることもできる。間接的な標識は、ｇａｌ−ＩＩ抗原に対する抗体または診断試薬と複合体を形成する標識された結合剤を含むことができる。
【００８４】
標識は、典型的にはアッセイにおいて検出されることができる分子または分子の一部である。典型的な標識は、発色団、蛍光色素、または放射性分子である。ある態様において、抗体または診断試薬は、検出可能な標識にコンジュゲートしており、それは、それら自体が検出可能である分子（例えば蛍光部分、電気化学的標識、金属キレート等）ならびに検出可能な反応産物の生成により（例えば酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、またはそれ自体が検出可能であることができる特異的な結合分子により（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ等）間接的に検出されることができる分子を含み得る。
【００８５】
好ましい診断製剤またはアッセイは、例えば試験されるべき試料から得られたｇａｌ−ＩＩ型の細菌の抗体による凝集を試験するために、固相、例えばラテックスビーズ、金粒子等の上に固定された本発明の抗体を含む。
【００８６】
本発明は、さらに、クレブシエラ・ニューモニエＯ１株により引き起こされた対象におけるクレブシエラ・ニューモニエＯ１（Ｏ１血清型）の感染またはコロニー形成を診断する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）本発明に従う抗体を提供し、そして
ｂ）抗体が試験されるべき対象の生物学的試料中のガラクタン−ＩＩと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエＯ１の感染またはコロニー形成を診断する。
【００８７】
特定の側面によれば、本発明は、対象のクレブシエラ・ニューモニエＯ１による、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエによる感染を、そのような感染に対する療法による処置（例えば免疫療法の使用、例えば本発明の抗体による処置）の基礎を提供するために、本発明の診断学または本発明の診断法により決定するためのコンパニオン診断を提供する。
【００８８】
特定の側面によれば、本発明は、対象のクレブシエラ・ニューモニエＯ１による、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエによる感染を、例えば生菌の量が限られている臨床標本から遊離のＬＰＳを決定することにより診断するための高感度ベッドサイド診断学を提供する。そのようなアッセイの感度は、特に１００ｎｇ未満、好ましくは１０ｎｇ未満のＬＰＳである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】様々な源からのＭＤＲクレブシエラ分離株の血清型分布。
【図２】Ｏ１特異的ｍＡｂによる免疫ブロット。Ｏ１、Ｏ２、およびＯ３株から精製された１μｇのＬＰＳが、分離され、ＰＶＤＦ膜上にブロットされた。マウスｍＡｂ  ８Ｅ９の分離されたＬＰＳ試料への結合が、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ特異的抗体により検出された。
【図３】ヒト／マウスキメラ（８Ｅ９）およびヒト化（Ｇ２−２７およびＧ２−３３）Ｏ１特異的ｍＡｂによるＫ．ニューモニエＯ１株の表面染色。マウスｍＡｂ  ８Ｅ９は、まずキメラ化され（やはり８Ｅ９と呼ばれる）、続いてさらにヒト化されてＧ２−２７およびＧ２−３３をもたらした。これらは、８Ｅ９と同じＣＤＲを共有しているが、マウスのフレームワーク（ＦＲ）配列がヒトの配列により置き換えられた。Ｏ１特異的ｍＡｂの株Ａ）ＡＴＣＣ  ４３８１６（Ｏ１：Ｋ２）またはＢ）Ｋｐ２４（Ｏ１：Ｋ＋）に対する表面結合が、フローサイトメトリーにより検出された。柱状図は、測定された蛍光強度を示している。
【図４】Ｋ．ニューモニエ菌血症のマウスモデルにおけるＯ１特異的ｍＡｂによる保護。マウスが、キメラもしくはヒト化Ｏ１特異的ｍＡｂのどちらかにより、または無関係な対照ｍＡｂにより予防的に免疫された。生存が、その後の静脈内負荷の後にモニターされた。グラフは、それぞれ５匹のマウスの群を用いる３回の独立した実験のデータを組み合わせたものを示している。
【図５】ＣＤＣ活性を決定するための血清殺菌アッセイ。Ｋ．ニューモニエＰＣＭ−３７株（Ｏ１：Ｋ３７）が、２つの異なる（パネルＡ：正常ヒト血清＃１；およびＢ：正常ヒト血清＃２）５０％枯渇（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ヒト血清試料中で、様々な濃度の特異的または対照ｍＡｂの存在下で培養された。殺菌活性は、両方の時点における分割量のプレーティングにより決定された、インキュベーション期間の終了時（３ｈ）対開始時（Ｔ０）における回収された細菌の百分率として表されている。
【図６】配列  ＳＥＱ  ＩＤ  １：ＶＨ  ＣＤＲ１＝ＣＤＲ１  ＳＥＱ  ＩＤ  ２：ＶＨ  ＣＤＲ２＝ＣＤＲ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ３：ＶＨ  ＣＤＲ３＝ＣＤＲ３  ＳＥＱ  ＩＤ  ４：ＶＬ  ＣＤＲ１＝ＣＤＲ４  ＳＥＱ  ＩＤ  ５：ＶＬ  ＣＤＲ２＝ＣＤＲ５  ＳＥＱ  ＩＤ  ６：ＶＬ  ＣＤＲ３＝ＣＤＲ６  ＳＥＱ  ＩＤ  ７：ヒトＩｇＧ１（アロタイプＧ１ｍ１，１７）の定常領域  ＳＥＱ  ＩＤ  ８：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
【発明を実施するための形態】
【００９０】
用語“抗体”は、本明細書で用いられる際、抗体ドメインからなる、または抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとし、それは、リンカー配列を含む、または含まない免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインとして理解されている。ポリペプチドは、ループ配列により連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２個のベータストランドからなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとみなされる。抗体ドメインは、天然の構造のものであることができ、または例えば抗原結合特性もしくはあらゆる他の特性、例えば安定性もしくは機能的特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／もしくはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化により改変されていることもできる。
【００９１】
本明細書で記載される抗体は、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープに結合するための特異的結合部位、特に可変抗体ドメインの対、すなわちＶＬ／ＶＨ対のＣＤＲ結合部位を含む特異的結合部位および定常抗体ドメインを有することができ、特に完全長抗体である。
【００９２】
本明細書で記載される用語“抗体”は、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ３構造を指すものとし、それは、本明細書において２つのＶＬ／ＶＨ対を連結配列またはヒンジ領域と共に含む構造として理解されており、ここで、それぞれのＶＨドメインは、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列を含むＨＣの一部であり、それぞれのＶＬドメインは、ＶＬ−ＣＬ（特にカッパ）ドメイン配列を含むＬＣの一部であり、ここで、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは２量体化してＦｃを形成する。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３構造の抗体は、典型的には可変および定常抗体ドメインをヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３フレームワーク配列、または抗体ドメインのいずれかの末端が伸長した、もしくは短縮された配列と共に含む。同様に、ループ配列またはベータバレル配列は、抗体ドメインの３次構造を損なうことなく変異していることができる。用語“完全長抗体”は、一般に少なくともＦｃドメインの主な部分を含む（少なくともＦｃガンマ受容体結合部位を形成するＣＨ２−ＣＨ３接触面領域、および少なくともＦｃＲｎ結合部位を形成するＮ末端のＣＨ２領域を含む）あらゆる抗体分子を指して用いられている。句“完全長抗体”は、特に本明細書において特定の抗体分子がＦｃ領域を欠いている抗体フラグメント、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントではないことを強調するために用いられている。
【００９３】
用語“抗体”は、特に単離された形態の抗体を含むものとし、それは、異なる標的抗原に対して向けられた、または抗体ドメインの異なる構造配置を含む他の抗体を実質的に含まない。なお、単離された抗体は、単離された抗体の例えば少なくとも１種類の他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組み合わせを含有する組み合わせ製剤中に含まれることができる。
【００９４】
用語“抗体”は、ヒト種を含む動物、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、例えば雌鳥由来の抗体に適用されるものとし、その用語は、特に動物由来の配列、例えばヒト配列に基づく組み換え抗体を含むものとする。
【００９５】
本明細書において記載される抗体は、特にヒトまたはヒト化抗体である。ヒト化抗体は、特に異なる種の由来の配列を含むヒト／マウスまたはヒト／非ヒトキメラ抗体であることができる。例えば、ヒト／マウスキメラ抗体は、ヒトおよびマウス両方の由来の配列を含み、かつ典型的にはヒトＦｃ領域、ヒトＦｃまたは抗体のＦｃ領域もしくはＦｃ部分を含むヒト定常領域を含む。
【００９６】
用語“ヒト”は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むように理解されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入された変異）を、例えばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から単離された抗体を含む。
【００９７】
用語“ヒト化”は、抗体に関して用いられる際、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、その分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいている。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むかのどちらであることもできる。抗原結合部位は、野生型であるか、または例えば１以上のアミノ酸置換により改変されていることができ、好ましくはヒトの免疫グロブリンにより近く似るように改変されていることができる。ヒト化抗体のある形態は、全てのＣＤＲ配列を保持している（例えば、マウス抗体からの６個のＣＤＲ全部を含有するヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に関して変更されている１個以上のＣＤＲを有する。
【００９８】
用語“キメラ”は、抗体に関して用いられる際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が特定の種由来の抗体または特定のクラスに属する抗体における対応する配列に相同性であり、一方でその鎖の残りの区分が別の種またはクラスにおける対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、ある哺乳類種由来の抗体の可変領域を模しており、一方で定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同性である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域との組み合わせで、非ヒト宿主生物からの容易に利用可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いる現在既知の源に由来することができる。
【００９９】
典型的なヒトまたはヒト化抗体は、その抗体を発現するように形質転換された組み換え宿主細胞により生成されてそれから単離されることができ、または抗体もしくは抗体ドメインの組み換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体であることができ、または抗体遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製、発現、作製もしくは単離された抗体であることができる。
【０１００】
用語“抗体”は、抗体の誘導体、特に機能的に活性な誘導体も指すことは、理解されている。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体のあらゆる組み合わせおよび／または融合タンパク質として理解されており、ここで、抗体のあらゆるドメインは、１以上の他のタンパク質、例えば他の抗体、例えばＣＤＲループ、受容体ポリペプチドだけなくリガンド、骨格タンパク質、酵素、毒素等も含む結合構造のあらゆる位置において融合していることができる。抗体の誘導体は、様々な化学的技法、例えば共有結合カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等による他の物質への会合または結合により得られることができる。抗体に結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはそのあらゆる組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であることができる。特定の態様において、抗体は、生物学的に許容可能な化合物との特異的相互作用を可能にする追加のタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関して、それが抗体のその標的に対する結合への負の影響を有しない、または許容可能な負の影響を有する限り、特定の制限は存在しない。適切なタグの例は、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグを含む。別の特定の態様において、抗体は、標識を含む誘導体である。用語“標識”は、本明細書において用いられる際、“標識された”抗体を生成するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であることができ（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒することができる。
【０１０１】
本明細書で記載される好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくはそれは、例えばＣＤＣ（ＳＢＡ）、および／もしくはＯＰＫアッセイにおいて決定されるようにＫ．ニューモニエと戦う、または細菌負荷に対して保護する効力を有する。
【０１０２】
具体的には、本発明の抗体由来の抗体は、Ｏ１抗原への差次的結合において機能的に活性である、例えばＯ１抗原に特異的または選択的に結合するそのＣＤＲ領域またはＣＤＲバリアントの少なくとも１以上を含むことができる。
【０１０３】
親抗体または抗体配列、例えば親ＣＤＲまたはＦＲ配列由来の抗体は、本明細書において特に、例えばインシリコもしくは組み換え工学により、またはそうでなければ化学的誘導体化もしくは合成により得られた変異体またはバリアントとして理解されている。
【０１０４】
用語“抗体”は、親ＣＤＲ配列の機能的に活性なＣＤＲバリアントを有する抗体および親抗体の機能的に活性なバリアント抗体を含む抗体のバリアントも指すことは、理解されている。
【０１０５】
用語“バリアント”は、例えば、特に例えば抗体の安定性、エフェクター機能もしくは半減期を操作するために定常ドメインにおいて、または例えば当該技術で利用可能な親和性成熟技法により抗原結合特性を向上させるために可変ドメインにおいて特定の抗体アミノ酸配列もしくは領域を削除する、交換する、その中に挿入断片を導入する、またはアミノ酸配列を化学的に誘導体化するための変異誘発法により得られた抗体、例えば変異体抗体または抗体のフラグメントを特に指すものとする。例えばランダム化技法により得られる所望の位置における点変異を含め、既知の変異誘発法のいずれが用いられることもできる。ある場合には、位置は、例えば抗体配列をランダム化するために可能なアミノ酸の全てまたは好ましいアミノ酸の選択のどちらかにより、ランダムに選ばれる。用語“変異誘発”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するためのあらゆる当該技術で認識されている技法を指す。好ましいタイプの変異誘発は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、または他の部位特異的変異誘発を含む。
【０１０６】
用語“バリアント”は、特に機能的に活性なバリアントを包含するものとする。
ＣＤＲ配列の“機能的に活性なバリアント”という用語は、本明細書で用いられる際、“機能的に活性なＣＤＲバリアント”として理解され、抗体の“機能的に活性なバリアント”は、本明細書で用いられる際、“機能的に活性な抗体バリアント”として理解される。機能的に活性なバリアントは、１個以上のアミノ酸の挿入、削除もしくは置換によるこの配列（親抗体または親配列）の改変、またはアミノ酸配列中の（または配列の遠位端のどちらかもしくは両方における）１個以上のアミノ酸残基、もしくはヌクレオチド配列内の（または配列の遠位端のどちらかもしくは両方における）１個以上のヌクレオチドの化学的誘導体化、例えばＣＤＲ配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１、２、３、もしくは４個のアミノ酸、および／または中央の（すなわちＣＤＲ配列の中央における）１、２、３、もしくは４個のアミノ酸の配列の改変または化学的誘導体化の結果もたらされる配列を意味し、その改変は、この配列の活性に影響を及ぼさず、特にそれを損なわない。選択された標的抗原に対する特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性なバリアントは、なお予め決定された結合特異性を有するであろうが、これは、例えば特定のエピトープに対する細かい特異性、親和性、結合力、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ比等を変更するように、変更されていることができるであろう。例えば、親和性成熟抗体は、特に機能的に活性なバリアント抗体として理解されている。従って、親和性成熟抗体中の改変されたＣＤＲ配列は、機能的に活性なＣＤＲバリアントとして理解されている。
【０１０７】
具体的には、本発明の抗体の機能的に活性なバリアントは、Ｋ．ニューモニエＯ１のｇａｌ−ＩＩ抗原に特異的に結合する効力、ならびに循環中／血清中でＯ１血清型のＫ．ニューモニエ細菌を殺すＣＤＣ活性を有する。
【０１０８】
機能的に活性なバリアントは、例えば親抗体の配列を変更することにより得られることができ、それは、例えば本明細書において記載される親抗体のいずれかと同じ結合部位を含むが結合部位以外の抗体領域内に改変を有する抗体、またはそのような親抗体から結合部位内であるが抗原結合を損なわない改変により得られた抗体であり、好ましくは親抗体と実質的に同じ生物学的活性またはさらには向上した活性（Ｋ．ニューモニエのＯ１抗原に特異的または選択的に結合する能力および殺菌性ＣＤＣ活性またはＳＢＡアッセイにおける補体に媒介される殺傷の効力を含む）を有するであろう。場合により、機能的に活性なバリアントは、さらにＯＰＫアッセイにおいて、例えば特異的結合アッセイまたは（ＭＤＲ）Ｋ．ニューモニエを標的とする機能試験により決定されるような実質的に同じ生物学的活性で、抗体に媒介される食作用の効力を含むことができる。
【０１０９】
Ｋ．ニューモニエと戦う、またはそれを殺傷する抗体は、感染を制限もしくは予防する、かつ／またはそのような感染の結果もたらされる疾患状態を改善する、またはＫ．ニューモニエの病態形成、特に宿主の無菌の体の区画／部位中または内への播種および複製を阻害することができる。この点で、殺菌性ＣＤＣ活性により特性付けられる本明細書で記載される殺菌抗体は、“防御抗体”としても理解されており、それは、その抗体が能動または受動免疫において観察される感染性因子に対する免疫の原因であることを意味する。特に、本明細書で記載される防御抗体は、療法目的のために、例えば病原体により誘導される疾患症状、副作用または疾患の進行を予防する、改善する、処置する、または少なくとも部分的に停止させるための予防または療法のために能動的に用いられる。具体的には、防御抗体は、療法的適用後に（すなわち確立された感染に対して与えられる）、例えばＣＤＣもしくはオプソニン化貪食作用活性を誘導することにより生きたＫ．ニューモニエの細胞を殺す、もしくはその複製を妨げる、または細菌細胞全体もしくはそのＬＰＳ分子を無菌の体の部位から除去することができる。あるいは、予防的に適用される防御抗体は、上記の機序または他の機序の１つにより感染の確立（すなわちＫ．ニューモニエの無菌ではない部位から無菌の体の区画への拡散）を阻害する。
【０１１０】
用語“実質的に同じ生物学的活性”は、本明細書で用いられる際、実質的に同じ活性が、比較可能な抗体または親抗体に関して決定された活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または例えば２００％まで、またはさらに高い活性であることにより示されるような活性を指す。
【０１１１】
本明細書で記載された好ましいバリアントまたは誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくはそれは、Ｏ１抗原に特異的に結合し、かつＫ．ニューモニエの他の抗原には結合しない（少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数のＫｄ値の差を有する）効力を有し、かつさらに、例えばＫ．ニューモニエを標的とする特異的結合アッセイまたは機能試験により決定されるような実質的に同じ生物学的活性で、ＣＤＣまたはＳＢＡアッセイにおける補体に媒介される殺傷の効力を含み（例えば抗体を含有しない対照試料と比較した細菌計数における有意な低減を達成する）、かつ／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおける抗体に媒介される食作用の効力を含む（例えば抗体を含有しない対照試料と比較した細菌計数における有意な低減を達成する）。様々なアッセイにおける活性の有意な低減は、典型的には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％、約１００％（＋／−１％）の完全な低減に至るまでの低減を意味する。
【０１１２】
好ましい態様において、親抗体の機能的に活性なバリアントは、
ａ）抗体の生物学的に活性なフラグメントであり、そのフラグメントは、その分子の配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％もしくは９９％を含み；
ｂ）少なくとも１アミノ酸の置換、付加および／もしくは欠失によりその抗体から得られ、ここで、機能的に活性なバリアントは、その分子もしくはその一部、例えば抗体に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有し；かつ／または
ｃ）抗体もしくはその機能的に活性なバリアントおよびさらにそのポリペプチドもしくはヌクレオチド配列に対して異種である少なくとも１個のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる。
【０１１３】
本発明のある好ましい態様において、本明細書において記載される抗体の機能的に活性なバリアントは、上記のバリアントと本質的に同一であるが、それが異なる種の相同性配列に由来する点で、そのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とはそれぞれ異なっている。これらは、天然存在バリアントまたは類似体と呼ばれる。
【０１１４】
用語“機能的に活性なバリアント”は、天然存在対立遺伝子バリアント、ならびに変異体またはあらゆる他の非天然存在バリアントも含む。当該技術で既知であるように、対立遺伝子バリアントは、そのポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１個以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有することを特徴とする（ポリ）ペプチドの代わりの形態である。
【０１１５】
機能的に活性なバリアントは、例えば１個以上の点変異によるポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列の変更により得られることができ、ここで、その配列の変更は、本発明の組み合わせにおいて用いられる場合、変更されていないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持しているかまたは向上させている。そのような配列の変更は、（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含み得るが、それらに限定されない。
【０１１６】
特定の機能的に活性なバリアントは、ＣＤＲバリアントである。ＣＤＲバリアントは、ＣＤＲ領域における少なくとも１個のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列を含み、ここで、前記の改変は、アミノ酸配列の化学的または部分的変更であることができ、その改変は、そのバリアントが未改変配列の生物学的特徴を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によることができ、または１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加または挿入によることもでき、または１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によることもでき、またはそれらの組み合わせによることもできる。アミノ酸残基における置換は、例えばある疎水性アミノ酸で代わりの疎水性アミノ酸を置換する保存的置換であることができる。
【０１１７】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有する、酸性側鎖を有する、非極性脂肪族側鎖を有する、非極性芳香族側鎖を有する、非荷電極性側鎖を有する、小さい側鎖を有する、大きい側鎖を有するアミノ酸等である。
【０１１８】
点変異は、特に、結果として異なるアミノ酸に関する１以上の単一の（非保存的）アミノ酸またはアミノ酸のダブレットの置換もしくは交換、欠失または挿入において操作されていないアミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として理解されている。
【０１１９】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。この点において、アミノ酸は、６４種類の３つ組コドンによりコードされる２０種類の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０種類のアミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、および陰性電荷を有するアミノ酸に分けられることができる：
“中性”アミノ酸が、下記でそれらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に示されている：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）  非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）  極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）  非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）  極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）  非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）  非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）  非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）  非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）  非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）  非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）  極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）  極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）  非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）  極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）  非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）  極性、陽性（１０％）  中性（９０％）。
【０１２０】
“正に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）  極性、陽性；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）  極性、陽性。
【０１２１】
“負に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）  極性、陰性；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）  極性、陰性。
【０１２２】
本明細書で記載される抗体配列および相同体に関する“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”は、配列をアラインメントして必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義されており、保存的置換は配列同一性の一部としては一切考えない。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１２３】
抗体バリアントは、特に、例えば糖鎖工学により生成される特定の糖鎖付加パターンを有する相同体、類似体、フラグメント、改変またはバリアントを含むように理解されており、それは、機能的であり、機能的均等物の役目を果たすことができる（例えば特異的標的に結合し、機能的特性を有する）。
【０１２４】
特異的抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増大させるような、特にＣＤＣ活性および／またはＯＰＫ活性を増大させるような改変を組み込むように設計されていることができる。
そのような改変は、Ｆｃエフェクター機能の増大を達成するような変異誘発、例えばＦｃガンマ受容体結合部位における変異により、または抗体形式のＣＤＣ活性に干渉するような誘導体もしくは薬剤により、達成されることができる。
【０１２５】
Ｆｃエフェクター機能の有意な増大は、典型的にはＣＤＣまたはＯＰＫ活性により測定された際の未改変の（野生型）形式の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＦｃエフェクター機能における増大を指すように理解される。
【０１２６】
抗体配列に関する“糖鎖を操作された”バリアントという用語は、糖鎖工学の結果として改変された免疫原性または免疫調節（例えば抗炎症）特性、ＣＤＣを有する糖鎖付加バリアントを指すものとする。全ての抗体は、重鎖定常領域中の保存された位置において炭水化物構造を含有し、それぞれのイソ型は、Ｎ−連結型炭水化物構造の異なるアレイを有し、それは、タンパク質の組み立て、分泌または機能活性に可変的に影響を及ぼす。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３型抗体は、それぞれのＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７における保存されたＮ結合型糖鎖付加部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複雑な２分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれてポリペプチド主鎖との広範囲にわたる接触を形成しており、それらの存在は、抗体にとってＣＤＣまたはＯＰＫのようなエフェクター機能を媒介するために必須である。例えばＮ２９７を例えばＡに変異させることによるＮ２９７またはＴ２９９におけるＮ−グリカンの除去は、典型的には結果として低減したＣＤＣおよびＯＰＫを有する脱糖鎖された（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体形式をもたらす。具体的には、本発明の抗体は、糖鎖付加または糖鎖を操作されていることができる。
【０１２７】
抗体の糖鎖付加における主な違いは、細胞株の間で存在し、さらに軽微な違いが、異なる培養条件下で増殖した所与の細胞株に関して見られる。細菌細胞における発現は、典型的には脱糖鎖された抗体を提供する。２つに分かれた（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリンに制御される発現を有するＣＨＯ細胞は、向上したＡＤＣＣ活性を有することが報告された(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組み換え生成の間の糖鎖付加に影響を及ぼす因子は、増殖方式、培地の配合、培養密度、酸素添加（ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）、ｐＨ、精製スキーム等を含む。
【０１２８】
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）および／もしくは軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域またはその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な区間（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）は、“超可変領域”と呼ばれ、フレームワーク領域として知られるより保存された隣接する区間の間に挟まれている。抗原結合部位は、結合するエピトープまたは抗原の三次元表面に相補的である表面を提供し、超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲ中に組み込まれている結合部位は、本明細書において“ＣＤＲ結合部位”とも呼ばれる。
【０１２９】
本明細書で用語“標的”または“標的抗原”と互換的に用いられている用語“抗原”は、抗体結合部位により認識される標的分子全体またはそのような分子のフラグメントを指すものとする。具体的には、免疫学的に関連する、一般に“エピトープ”、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる抗原の部分構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造は、そのような結合部位により認識され得る。ｇａｌ−ＩＩ抗原のような特定の抗原は、炭水化物構造であり、場合により人工のキャリヤー上に提供される単離された抗原として、または他の場合にはその抗原を発現するＫ．ニューモニエ細胞もしくはその細胞画分の形態で提供されることができる。
【０１３０】
用語“エピトープ”は、本明細書で用いられる際、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成することができる、または特異的結合パートナーの一部であることができる分子構造を指すものとする。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物、生化学的物質、もしくは無機物、またはそれらの誘導体およびそれらのあらゆる組み合わせのいずれで構成されていることもできる。エピトープは、線状エピトープであることも立体構造エピトープであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一の区分で構成されている。線状エピトープは、隣接している、または重複していることができる。
【０１３１】
立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて三次構造を形成することにより寄せ集められたアミノ酸または炭水化物で構成され、そのアミノ酸は、線状配列中で必ずしも互いに隣接していない。具体的には、そしてポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中で隔てられているがポリペプチドが折り畳まれて未変性のタンパク質／抗原になる際に組み立てられて分子の表面上の一貫した構造になる２個以上の別々のアミノ酸残基の存在を特徴とする。
【０１３２】
本明細書において、用語“エピトープ”は、特に抗体により認識される単一のエピトープを指すものとする。
用語“発現”は、以下のように理解されている。発現産物、例えば本明細書で記載される抗体の所望のコード配列を含有する核酸分子および作動可能に連結された制御配列、例えばプロモーターが、発現目的のために用いられることができる。これらの配列により形質転換された、またはこれらの配列をトランスフェクションされた宿主は、コードされたタンパク質を生成することができる。形質転換を達成するために、その発現系は、ベクター中に含まれることができる；しかし、関連するＤＮＡは、宿主の染色体中に組み込まれることもできる。具体的には、その用語は、ベクターにより担持されて宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現に関する適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを指す。
【０１３３】
コードＤＮＡは、例えば抗体のような特定のポリペプチドまたはタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、制御、または他の方法で媒介もしくは調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であることも異なる遺伝子由来であることもでき、同じ生物由来であることも異なる生物由来であることもできる。組み換えクローニングベクターは、しばしばクローニングまたは発現のための１以上の複製系、宿主中での選択のための１以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
【０１３４】
本明細書で用いられる“ベクター”は、クローニングされた組み換えヌクレオチド配列の、すなわち組み換え遺伝子の転写および適切な宿主生物中でのそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として定義されている。
【０１３５】
“発現カセット”は、発現産物をコードしておりベクター中に定められた制限部位において挿入されることができるＤＮＡコード配列またはＤＮＡの区分を指す。カセットの制限部位は、カセットの正しい読み枠での挿入を確実にするように設計されている。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１以上の制限部位において挿入され、次いでベクターにより宿主細胞中に送達可能なベクターＤＮＡと一緒に運び込まれる。挿入された、または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡの区分または配列、例えば発現ベクターは、“ＤＮＡコンストラクト”と呼ばれることもできる。
【０１３６】
発現ベクターは、発現カセットを含み、さらに通常は宿主細胞中での自律複製のための起点またはゲノム組み込み部位、１以上の選択マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子または抗生物質、例えばｚｅｏｃｉｎ、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、その構成要素は作動可能であるように一緒に連結されている。用語“ベクター”は、本明細書で用いられる際、自律複製するヌクレオチド配列ならびにゲノム組み込み型ヌクレオチド配列を含む。一般的なタイプのベクターは、“プラスミド”であり、それは、一般に追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの自己完結的分子であり、それは、適切な宿主細胞中に容易に導入されることができる。プラスミドベクターは、しばしばコードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するために適した１以上の制限部位を有する。具体的には、用語“ベクター”または“プラスミド”は、それによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が、宿主細胞中に、その宿主を形質転換して導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するために導入されることができる媒介物を指す。
【０１３７】
用語“宿主細胞”は、本明細書で用いられる際、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書で記載される抗体を産生するように形質転換された一次対象細胞およびそのあらゆる子孫を指すものとする。（意図的な、もしくは偶発性の変異または環境における違いのため）全ての子孫が親細胞と正確に同一であるわけではないが、そのような変化した子孫は、その子孫が元の形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を保持している限り、これらの用語に含まれることは、理解されるべきである。用語“宿主細胞株”は、組み換え遺伝子を発現して組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体を生成するために用いられるような宿主細胞の細胞株を指す。用語“細胞株”は、本明細書で用いられる際、長期間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞株の確立されたクローンを指す。そのような宿主細胞または宿主細胞株は、細胞培養状態で維持される、および／または組み換えポリペプチドを生成するように培養されることができる。
【０１３８】
用語“単離された”または“単離”は、本明細書で核酸、抗体または他の化合物に関して用いられる際、それが“実質的に純粋な”形態で存在するために天然に関係しているであろう環境からうまく分離されているそのような化合物を指すものとする。“単離された”は、他の化合物もしくは物質を含む人工もしくは合成混合物、または根本的な活性に干渉せず、例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子は、天然存在ではない核酸分子、例えばコドン最適化された核酸もしくはｃＤＮＡ、または化学合成された核酸分子を含むことも意味する。
【０１３９】
同様に、本発明の単離された抗体は、例えばその組み合わせが天然に存在しない別の抗体もしくは有効薬剤との組み合わせ製剤において提供されている場合、特に非天然存在であり、または天然存在抗体の最適化されたバリアントもしくは親和性成熟バリアントであり、または抗体の製造可能性を向上させるように操作されているフレームワーク領域を有する抗体である。そのような最適化または操作により、抗体は、天然の抗体の状況においては見付からないであろう１以上の合成配列または特徴を含む。
【０１４０】
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”が、時々用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の天然存在ゲノム中でそのすぐ隣りにある配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、“単離された核酸”は、ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクター中に挿入された、または原核もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用される場合、用語“単離された核酸”は、主に上記で定義されたような単離されたＤＮＡ分子によりコードされているＲＮＡ分子を指す。あるいは、その用語は、それがその天然の状態で（例えば細胞または組織中で）会合しているであろう他の核酸からうまく分離されているＲＮＡ分子を指すことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでも）は、さらに、生物学的または合成的手段により直接生成され、その生成の間に存在する他の構成要素から分離された分子を表すことができる。
【０１４１】
ポリペプチドまたはタンパク質、例えば本発明の単離された抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は、特にそれらが天然に関係している物質、例えばそれらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がインビトロもしくはインビボで実施される組み換えＤＮＡ技術による場合にそれらが調製された環境（例えば細胞培養）において一緒に存在する他の化合物を含まない、または実質的に含まない化合物を指すものとする。単離された化合物は、希釈剤またはアジュバントと共に配合され、なお実際上単離されていることができる−例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または療法において用いられる場合、薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤と混合されることができる。特に、本発明の単離された抗体は、それが単離された、かつ純粋な形態で提供されている、好ましくは単離された抗体を唯一の有効物質として含む製剤において提供されているため、Ｋ．ニューモニエ株に対して産生されたポリクローナル血清製剤とは異なる。しかし、これは、単離された抗体が限られた数のさらなる十分に定められた（単離された）抗体を含む組み合わせ製品において提供されることを除外しない。単離された抗体は、固体、半液体または液体キャリヤー、例えばビーズ上で提供されることもできる。
【０１４２】
用語“Ｆｃ領域”は、本明細書で用いられる際、ＩｇＧ分子のパパイン消化により得られる結晶化可能な断片に相関する抗体の部分を指すものとする。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合により連結されているＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端側のおおよそ半分で構成されるＩｇＧ重鎖のＣ末端領域からなる。Ｆｃは、ヒンジ領域、またはＦｃおよびＦａｂ領域の間の免疫グロブリン重鎖のプロリンに富む部分であるヒンジ領域の一部を含み得る。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含む。Ｆｃ領域は、抗原結合活性を有さず、炭水化物部分およびＦｃ受容体（新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含む）に関する結合部位を含む。例として、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む抗体は、ヒトＩｇＧ１  ＳＥＱ  ＩＤ  ７およびＳＥＱ  ＩＤ  ８のそれぞれ野生型定常領域もしくはＦｃ、または野生型Ｆｃ配列のそれと少なくとも１個のアミノ酸改変により異なるＦｃ配列を含むそのバリアントを含有する。
【０１４３】
抗体のＦｃ領域は、例えばＦｃγＲＩ類、ＦｃγＲＩＩ類、ＦｃγＲＩＩ類、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌性プロテインＡ、ブドウ球菌性プロテインＧ、およびウイルス性ＦｃγＲを含むいくつかのＦｃ受容体と相互作用することができる。ＩｇＧクラスに関して、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ類）は、特に補体に媒介される殺菌活性に関して重要である。
【０１４４】
Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、エフェクター細胞を結合した抗原の部位に集め、典型的には結果として細胞内でシグナル伝達事象ならびに重要なそれに続く免疫反応、例えば炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃をもたらす。
【０１４５】
異なるＩｇＧ下位クラスは、ＦｃγＲ類に関して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的にはＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりもその受容体に実質的によりよく結合する。
【０１４６】
補体依存性細胞傷害作用において、Ｃ１ｑが、抗体に結合し、この結合が、補体カスケードを誘発し、それは、古典的経路での補体活性化の結果として標的細胞の表面における膜攻撃複合体（ＭＡＣ）（Ｃ５ｂ〜Ｃ９）の形成をもたらす。Ｆｃ上の特定の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑに関する接触面の役目を果たす。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＣ１ｑ結合に必要なアミノ酸残基は、ＣＨ２ドメイン中に位置している。
【０１４７】
ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、通常は４つのヒトＩｇＧ下位クラスの内で補体の活性化において最も効率的である。典型的には、ＩｇＧ分子上のＣ１ｑ結合部位は、ＣＨ２ドメイン中の残基Ｇｌｕ  ２３３−Ｐｒｏ２３８、Ｐｈｅ２４１、Ｖａｌ２６４−Ａｓｐ２７０、Ｔｙｒ２９６−Ａｓｎ２９７、Ｌｙｓ３２２、Ｐｒｏ３２９−Ｇｌｕ３３３の少なくとも１以上を含む。ＩｇＧ１のヒンジ領域中の残基（例えばＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３２）およびＩｇＧ３のヒンジ領域中の残基（例えばＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２７７）も、Ｃ１ｑ結合において重要である。
【０１４８】
ＩｇＧのＦｃ部分上の部位（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの間）は、新生児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介しており、その結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから再循環させて血流に戻す。ＩｇＧ  Ｆｃ上のＦｃＲｎに関する結合部位は、細菌性プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。
【０１４９】
Ｆｃ領域の特定の特徴は、Ｎ２９７において起こる保存されたＮ結合型糖鎖付加である。この炭水化物は、抗体に関する構造的および機能的役割を果たし、抗体が哺乳類の発現系を用いて生成される主な理由の１つである。ＩｇＧ  ＦｃドメインのＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的な結合は、特に糖鎖付加を必要とする。Ｎ２９７炭水化物の組成における変更またはその排除は、ＦｃのＦｃγＲまたはＣ１ｑへの結合に影響を及ぼす可能性がある。
【０１５０】
用語“生物学的試料”は、本明細書で用いられる際、Ｋ．ニューモニエを含有し得る生物学的物質を含有する、または含有する可能性のある対象、例えばヒトから得られたあらゆる物質を指すものとする。生物学的試料は、組織、流体または細胞培養試料であることができる。本発明に従う使用のための試料の例は、患者試料、例えば組織もしくは体液、特に呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ、鼻スワブもしくは痰、血液試料、便試料、皮膚および尿試料または脳脊髄液を含むが、それらに限定されない。
【０１５１】
生物学的試料は、典型的には複雑な生物学的マトリックス、例えば多数のタイプの生物学的分子および小さい有機分子を含有する複雑な粘性生物学的流体、例えばタンパク質物質に富む粘液性滲出物を含む。適切な添加剤または抽出手順が、試料中のマトリックスと関係している可能性のある非特異的結合を低減する、ならびに／または試料マトリックスの粘性もしくは固体構成要素を溶解する、および／もしくは分解することによりマトリックスの粘度を低下させるために、用いられることができる。生物からマーカーを遊離させる、ならびに／または生物学的マトリックスを分解する、および／もしくは液化させる試料調製法が、用いられることができる。分析されることができる生物学的マトリックスは、粘液を含有する試料、例えば鼻分泌物、痰（ｓｐｕｔｕｍ）、痰（ｐｈｌｅｇｍ）、咽頭滲出物、尿道または膣分泌物、およびそのような膜表面の洗浄物を含む。
【０１５２】
適切な試料調製法は、生物学的マトリックスのアッセイへの作用を低減するための方法工程を含む。そのような方法工程は、例えば捕捉、クロマトグラフィー、遠心分離および透析を含み得るが、それらに限定されない。
【０１５３】
対象から得られる物質は、細菌分離株の形態、例えば分離されたＫ．ニューモニエの培養に関する細胞培養物または細胞培養産物の形態であることもできる。培養培地は、Ｋ．ニューモニエ集団のみを富化するように選択的であることができ、または非選択的であることもできる。
【０１５４】
細菌分離株の調製は、典型的には試料をＫ．ニューモニエの増殖を増進する条件下で維持し、それにより試料中のＫ．ニューモニエ集団を富化するための培養工程を含む。
一度分離株が得られたら、細菌は、さらに例えばＯ型および発現されているｇａｌ−ＩＩのレベルを決定するために生化学的および／または血清学的試験により調べられることができる。いくつかのタイピング法が、Ｋ．ニューモニエ株を研究するために利用可能である。これらの方法は、典型的には血清タイピング、毒素タイピング、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）、またはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を含む遺伝的関係／系統に関する標準的なタイピングを含む。
【０１５５】
“ガラクタン−ＩＩ”、“ｇａｌ−ＩＩ”または“Ｄ−ｇａｌ  ＩＩ”とも呼ばれるＯ１抗原という用語は、ガラクトースポリマーおよびリピート単位：［−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−］の少なくとも１個を含む構造を含む、Ｋ．ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ−抗原の炭水化物構造を指すものとする。
【０１５６】
ｇａｌ−ＩＩ構造を含むそれぞれのＯ−抗原は、本明細書において“Ｏ１抗原”と呼ばれ、それは本明細書で記載されるＯ１特異的抗体により認識される“ｇａｌ−ＩＩエピトープ”を含む。Ｏ１抗原は、Ｏ１型のＫ．ニューモニエ（Ｋ．ニューモニエＯ１）のＬＰＳの外側部分として理解されており、それは、その中に組み込まれている１以上の特異的ｇａｌ−ＩＩエピトープを含む表面の接近可能な抗原性炭水化物構造である。
【０１５７】
“特異的”結合、認識または標的化は、本明細書で用いられる際、結合剤、例えば抗体またはその抗原結合部分が、分子の不均一な集団において標的抗原またはそれぞれのエピトープに関する認識可能な親和性を示すことを意味する。従って、指定された条件（例えば免疫アッセイ）下で、結合剤は、標的ｇａｌ−ＩＩ抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、選択されたように標的の同一性、高い、中程度の、または低い結合親和性または結合力の点で選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は、結合定数または結合力学が別の抗原と比較した場合に少なくとも１０倍異なる（少なくとも１対数の差として理解される）場合に達成され、好ましくは、その違いは、少なくとも１００倍であり（少なくとも２対数の差として理解される）、より好ましくは少なくとも１０００倍である（少なくとも３対数の差として理解される）。
【０１５８】
本発明の好ましい抗体は、Ｏ１抗原に高い親和性で、特に高いオンおよび／または低いオフ速度または高い結合力で結合している。抗体の結合親和性は、通常は解離定数（ＫｄまたはＫＤ）として知られる抗原結合部位の半分が占められる抗体の濃度に関して特性付けられる。通常、Ｋｄ＜１０−７Ｍを有する、ある場合には、例えば療法目的に関して、より高い親和性を有する、例えばＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍ、さらにもっと好ましくはＫｄ＜１０−１０Ｍを有する結合剤は、高親和性結合剤とみなされる。
【０１５９】
親和性成熟は、それにより標的抗原に関する増大した親和性を有する抗体が生成されるプロセスである。当該技術で利用可能な親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するあらゆる１以上の方法が、本明細書で開示される本発明の様々な態様に従って親和性成熟抗体を生成するために用いられることができる。典型的なそのような親和性成熟法および使用、例えばランダム変異誘発、細菌変異誘発株継代、部位特異的変異誘発、変異ホットスポットターゲッティング（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｏｔｓｐｏｔｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、倹約変異誘発（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、抗体シャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異誘発、ならびに本明細書で開示されている本発明の様々な態様に従う方法および使用の実施を受け入れられる親和性成熟ライブラリーを生成および使用する方法は、例えば、以下：Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352；国際公開第２０１２／００９５６８号；国際公開第２００９／０３６３７９号；国際公開第２０１０／１０５２５６号；米国特許出願公開第２００２／０１７７１７０号；国際公開第２００３／０７４６７９号において開示されている方法を含む。
【０１６０】
アミノ酸変異誘発または免疫グロブリン遺伝子分節中の体細胞突然変異の結果としてを含め、抗体の構造変化により、抗原への結合部位のバリアントが生成され、より大きい親和性に関して選択される。親和性成熟抗体は、親抗体よりも数対数倍（ｌｏｇｆｏｌｄ）大きい親和性を示し得る。単一の親抗体が、親和性成熟を受けることができる。あるいは、標的抗原に対する類似の結合親和性を有する抗体のプールが、親和性成熟した単独の抗体またはそのような抗体の親和性成熟したプールを得るために変更される親構造として考えられることができる。
【０１６１】
本明細書で記載される抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、結合の親和性において少なくとも２倍の増大、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親和性成熟は、結合親和性Ｋｄ＜１０−８Ｍの特異的標的結合特性を有する本発明の抗体を得るための親分子のそれぞれのライブラリー（いずれも中程度の結合親和性を有する抗体を用いる）を用いる選択キャンペーン（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃａｍｐａｉｇｎｓ）の過程で用いられることができる。あるいは、親和性は、本発明に従う抗体の親和性成熟により、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫｄに対応する高い値を得るように、さらにもっと増大させられることができる。
【０１６２】
特定の態様において、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。特定の態様において、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイにより決定される。特定の態様において、結合親和性は、速度論的方法により決定される。特定の態様において、結合親和性は、平衡／溶液法により決定される。
【０１６３】
用語“同じ特異性を有する”、“同じ結合部位を有する”または“同じエピトープに結合する”の使用は、均等なモノクローナル抗体が、同じまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特徴を示し、予め選択された標的結合配列への結合に関して競合することを示す。抗体分子の特定の標的に関する相対的特異性は、例えばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1988において記載されているような競合アッセイにより相対的に決定されることができる。
【０１６４】
用語“競合する”は、本明細書で抗体に関して用いられる際、第１抗体またはその抗原結合部分が、あるエピトープに、第１抗体のその同族エピトープとの結合の結果が第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して第２抗体の存在下で検出可能なほどに低下するように、第２抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に類似した様式で結合することを意味する。第２抗体のそのエピトープへの結合も第１抗体の存在下で検出可能なほどに低下するという代替案は、事実で有り得るが、事実である必要はない。すなわち、第２抗体が第１抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第１抗体は第２抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体のその同族のエピトープとの結合を（同程度まで、より大きい程度まで、またはより低い程度までのいずれであれ）検出可能なほどに阻害する場合、その抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（単数または複数）の結合に関して互いと“競合する”と言われる。ｇａｌ−ＩＩ抗原への結合に関する例示された抗体のいずれかと競合する抗体は、本発明により特に包含される。
【０１６５】
本明細書における競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定された際に約３０％より大きい相対的阻害を意味する。特定の状況において、例えば、競合分析が、抗原の結合の意図される機能を有するように設計された新規の抗体を選択する、またはスクリーニングするために用いられる場合、何が競合の適切なレベルであるかの基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが、望ましい可能性がある。従って、例えば、抗体が十分に競合的であると考えられる前に、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはさらには少なくとも１００％の相対的阻害が検出される競合的結合に関する基準を設定することが、可能である。
【０１６６】
用語“診断キット”は、本明細書で用いられる際、キットまたは部分のセットを指し、それは、組み合わせまたは混合物で、１種類以上の分析物もしくはマーカーの測定／検出を実施して疾患もしくは疾患状態を決定する、または疾患もしくは疾患の進行を予測するために用いられることができる。特に、キットは、少なくとも検出分子および／または結合剤を含有し、ここで、検出分子および／または結合剤は、分析物もしくはマーカーまたはそのような分析物もしくはマーカーの反応産物を特異的に認識する。加えて、様々な試薬またはツールが、キット中に含まれることができる。診断キットは、マイクロビーズまたは平面状のアレイもしくはウェルのような支持体、バイオマーカーの単離のための試薬、特異的な標的に向けられた検出分子、核酸の配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒または緩衝剤等、様々なリンカー、様々なアッセイ構成要素、ブロッキング剤等を含め、対象の方法を実施するためのあらゆる有用な試薬を含むことができる。
【０１６７】
キットは、診断法における使用のための説明書も含むことができる。そのような説明書は、例えば、キット中に含まれるデバイス、例えば診断目的のために生物学的試料を調製する、例えばマーカーを決定する前に細胞および／またはタンパク質含有画分を分離するためのツールまたはデバイス上で提供されることができる。キットは、貯蔵安定形態で好都合に提供されることができる（例えば少なくとも６ヵ月間の貯蔵寿命を有する商業的なキット）。
【０１６８】
特定の診断キットは、対象のマーカーに対して向けられた検出分子を含む、または検出分子の固定されたパターン化されたアレイを有する、好ましくは第１マーカーに対して向けられた第１結合試薬を含有する第１領域および第２マーカーに対して向けられた第２結合試薬を含有する第２領域を含む固体支持体も含む。
【０１６９】
特に、サンドイッチ形式が用いられることができる。例えば、１種類以上の結合剤が、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしている。１種類以上の結合剤は、検出分子の役目を果たすために検出可能標識にコンジュゲートしていることができる。他の態様において、１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。この構成において、１種類以上の結合剤は、捕捉剤の役目を果たすために生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができる。さらに、１種類以上の結合剤は、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができ、および／または１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。そのような場合、１種類以上の結合剤は、捕捉剤および検出剤のどちらかまたは両方の役目を果たすことができる。
【０１７０】
診断キットは、特に免疫アッセイにおける使用のために提供され、ここで、検出分子は、免疫反応により分析物またはマーカーに結合する特異的な結合剤である。そのような結合剤は、標的抗原に結合する抗体または抗体フラグメントまたは抗体様骨格であることができる。
【０１７１】
適切な免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディップスティックアッセイおよびウェスタンブロットのいずれかである。
【０１７２】
用語“Ｋ．ニューモニエ感染”および“Ｋ．ニューモニエのコロニー形成”は、以下のように理解されている：クレブシエラ・ニューモニエは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーであるグラム陰性細菌である。それは、遍在性細菌であり、それは、ヒト宿主にも、典型的には腸または上気道においてコロニー形成することができる。日和見病原体であり、それは、免疫系により適切に制御されない場合、これらの部位から無菌の体の部位に侵入することができる。これらの部位における制御されない細菌複製は、大部分においてＫ．ニューモニエから放出される内毒素（すなわちＬＰＳ）分子により媒介される炎症を誘導するであろう。菌血症の場合、内毒素分子は、敗血症性ショックを誘発し得る。
【０１７３】
Ｋ．ニューモニエのコロニー形成は、対象が十分に高い濃度のＫ．ニューモニエ細菌をそれらが検出され得る部位において有するが、細菌が徴候も症状も引き起こしていないことを意味する。コロニー形成は、長期間持続する可能性があり、解決は、生物に対する免疫応答、他の生物からのその部位における競合、そして時々抗微生物薬の使用により影響を受ける。
【０１７４】
一般に、Ｋ．ニューモニエにより引き起こされる菌血症は、既知の従来の抗細菌療法、例えば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系の炎症阻害剤による処置により、うまく処置されることができる。本発明は、Ｋ．ニューモニエを特異的に認識する抗生物質を用いる新規の免疫療法を提供し、それは、場合により抗細菌または抗炎症療法と組み合わせられる。Ｋ．ニューモニエ感染を有する患者を処置するために用いられる典型的な抗生物質は、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、アミノペニシリン系、カルバペネム系、フルオロキノロン系、チゲサイクリン、コリスチン等である。
【０１７５】
多剤耐性（ＭＤＲ）Ｋ．ニューモニエは、特に、３クラス以上の抗生物質、例えば以下の薬剤／群：ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、フルオロキノロン系、ニトロフラントイン、トリメトプリム（およびその組み合わせ）、ホスホマイシン、ポリミキシン系、クロラムフェニコール、アズトレオナム、またはチゲサイクリンへの耐性を示す株として理解されている。
【０１７６】
最近の抗生物質耐性株の出現により、この性質の菌血症の処置は、有意により困難になっている。Ｋ．ニューモニエ疾患を発現している患者は、Ｋ．ニューモニエ疾患を有しない患者よりも長い病院およびＩＣＵ滞在、高い死亡率、およびより大きい健康管理費用を有する。患者がＫ．ニューモニエにより重度にコロニー形成されている場合、Ｋ．ニューモニエ疾患を処置するよりもむしろ防止することにより、患者のケアが、向上する可能性があり、院内感染が、低減する可能性がある。
【０１７７】
Ｋ．ニューモニエ疾患は、特にＫ．ニューモニエ感染により引き起こされる疾患として理解されている。そのような疾患は、局所性および全身性疾患を含む。疾患の重症例は、例えば原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎である。
【０１７８】
用語“組み換え”は、本明細書で用いられる際、“遺伝子工学により調製されたこと、またはその結果であること”を意味するものとする。組み換え宿主は、特に発現ベクターもしくはクローニングベクターを含み、またはそれは、特に宿主に対して外来の核酸配列を用いて、組み換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。組み換えタンパク質は、それぞれの組み換え核酸を宿主中で発現させることにより生成される。用語“組み換え抗体”は、本明細書で用いられる際、組み換え的手段により調製、発現、作製または単離される抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである、もしくは染色体導入されている動物（例えばマウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）その抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体を含む。そのような組み換え抗体は、例えば抗体成熟の間に起こる再編成および変異を含むように操作された抗体を含む。本発明によれば、当該技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技法が、用いられることができる。そのような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)”を参照。
【０１７９】
選択的結合は、当該技術で既知の組み換え抗体最適化法によりさらに向上させられることができる。例えば、本明細書で記載される免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域は、選択されたＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の軽鎖シャフリング、デスティネイショナル変異誘発（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ＣＤＲアマルガム化（ＣＤＲ  ａｍａｌｇａｍａｔｉｏｎ）、および定方向変異誘発を含む１種類以上の最適化戦略を施されることができる。
【０１８０】
用語“対象”は、本明細書で用いられる際、温血哺乳類、特にヒトまたは非ヒト動物を指すものとする。Ｋ．ニューモニエは、臨床的に重要なヒトの病原体であり、それは、獣医学において現れつつある懸念でもある。それは、広い範囲の非ヒト動物種に存在する。従って、用語“対象”は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含む動物を指す。特に、本発明の医学的使用またはそれぞれの処置の方法は、Ｋ．ニューモニエ感染と関係する疾患状態の予防または処置を必要とする対象に適用される。その対象は、Ｋ．ニューモニエ感染のリスクがある、または早期もしくは後期疾患を含め疾患を患っている患者であることができる。用語“患者”は、予防的または療法的処置のどちらかを受けているヒトおよび他の哺乳類の対象を含む。従って、用語“処置”は、予防的および療法的処置の両方を含むことが意味されている。
【０１８１】
対象は、例えばＫ．ニューモニエ疾患状態の予防または療法のために処置される。特に、感染のリスクがあるかもしくはそのような疾患もしくは疾患の再発を発現しているかのどちらかである対象、またはそのような感染および／もしくはそのような感染と関係する疾患を患っている対象が、処置される。
【０１８２】
具体的には、用語“予防”は、病態形成の開始の防止または病態形成のリスクを低減するための予防的手段を包含することが意図されている防止手段を指す。
具体的には、処置は、病気の起因物としてのＫ．ニューモニエの病態形成に干渉することによることができる。
【０１８３】
用語“実質的に純粋な”または“精製された”は、本明細書で用いられる際、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、例えば核酸分子または抗体を含む調製物を指すものとする。純度は、その化合物に適した方法（例えばクロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）により測定される。
【０１８４】
本明細書において化合物、例えば本発明の抗体の“有効量”または“十分量”という用語のいずれとも互換的に用いられている“療法上有効量”という用語は、対象に投与された際に臨床的結果を含む有益な、または所望の結果を達成するために十分な量または活性であり、従って、有効量またはその同意語は、それが適用されている文脈に依存する。
【０１８５】
有効量は、そのような疾患または障害を処置、予防または阻害するために十分である化合物の量を意味することが意図されている。疾患の文脈において、本明細書で記載される抗体の療法上有効量は、特に疾患または病気を処置する、調節する、弱める、逆行させる、またはそれに影響を及ぼすために用いられ、それは、Ｋ．ニューモニエの病態形成、例えば粘膜表面の接着およびコロニー形成、無菌の体の部位内での制御されない複製、ならびに細菌生成物による宿主細胞の毒性の阻害から利益を得る。
【０１８６】
そのような有効量に対応するであろう化合物の量は、様々な要因、例えば所与の薬物または化合物、医薬配合、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置されている対象または宿主の同一性等に依存して変動するであろうが、それでもなお当業者によりルーチン的に決定されることができる。
【０１８７】
例えばそれを必要とするヒト患者に提供される本明細書で記載される抗体の療法上有効量は、特に０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、さらにもっと好ましくは２０ｍｇ／ｋｇまで、１０ｍｇ／ｋｇまで、５ｍｇ／ｋｇまでであることができるが、例えば急性疾患状態を処置するために、より高い用量の必要が示される可能性がある。用量は、非常に強力な抗体が用いられる場合、はるかに低いことができる。そのような場合、有効量は、０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、または少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、そして１０ｍｇ／ｋｇ未満または１ｍｇ／ｋｇ未満であることができる。
【０１８８】
さらに、療法上有効量の本発明の抗体を用いた対象の処置または予防計画は、１回の投与で構成されることができ、あるいは一連の適用を含むことができる。例えば、抗体は、少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回または少なくとも１ヵ月に１回投与されることができる。しかし、別の態様において、抗体は、対象に、所与の処置に関しておよそ週あたり１回からおよそ毎日の投与まで投与されることができる。処置期間の長さは、様々な要因、例えば疾患の重症度、急性または慢性疾患のどちらか、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性に依存する。処置または予防のために用いられる有効投与量は、特定の処置または予防計画の過程にわたって増大または減少し得ることも、理解されるであろう。投与量における変化は、当該技術で既知の標準的な診断アッセイの結果もたらされ、それにより明らかになる可能性がある。ある場合には、慢性投与が必要とされる可能性がある。
【０１８９】
予防的処置に関する用量は、典型的にはより低い範囲（例えば少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ未満）であり、特に、例えば対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態であると同定されている、および／もしくはＫ．ニューモニエと接触するリスクがある場合に、１回投与され、または長期処置スケジュール、例えば１年もしくは半年で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２用量により投与される。療法的処置に関する用量は、典型的には疾患の急性または慢性期に、典型的にはより高い範囲（例えば少なくとも０．０５または０．５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ未満）で投与され、特に疾患の治癒まで、１回以上の投与により、例えば規則的な間隔（例えば１日に少なくとも１、２、３、もしくは４回の投与、または１週間に少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６回の投与、または１ヵ月に少なくとも１、２、３、もしくは４回の投与）で投与される。
【０１９０】
クレブシエラ属の株により引き起こされる感染症の予防および処置のためのモノクローナル抗体を開発することを目的として、特異的ｍＡｂの分子標的は、適切にはクレブシエラ属において限られた不均一性を示すＬＰＳ  Ｏ−抗原である。そのようなＯ−側鎖は、かさばる莢膜多糖により完全に覆い隠されていないため、免疫的に適切であると考えられる。
【０１９１】
一度所望の結合特性を有する抗体が同定されたら、抗体フラグメントを含むそのような抗体は、例えばハイブリドーマ技法または組み換えＤＮＡ技術を含む当該技術で周知の方法により生成されることができる。
【０１９２】
組み換えモノクローナル抗体は、例えば、必要とされる抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、組み換え宿主細胞にそのコード配列を発現のために、周知の組み換え発現ベクター、例えば本発明のプラスミドまたは抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット（単数または複数）を用いてトランスフェクションすることにより、産生されることができる。組み換え宿主細胞は、原核および真核細胞、例えば上記の原核および真核細胞であることができる。
【０１９３】
特定の側面によれば、ヌクレオチド配列は、抗体をヒト化するための、または抗体の親和性もしくは他の特性を向上させるための遺伝子操作のために用いられることができる。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置において用いられる場合、免疫反応を避けるためにヒトの定常領域により近く似るように操作されることができる。ｇａｌ−ＩＩ標的に対するより大きな親和性およびクレブシエラ・ニューモニエに対するより大きな有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが、望ましい可能性がある。当業者には、１以上のポリヌクレオチドの変更が、抗体に対してなされ、なおその標的Ｏ１抗原に対する結合能力を維持することができることは、明らかであろう。
【０１９４】
様々な手段による抗体分子の生成は、一般に十分に理解されている。例えば、米国特許第６３３１４１５号(Cabilly et al.)は、抗体の組み換え生成のための方法を記載しており、ここで、重鎖および軽鎖は、単一の細胞中で単一のベクターから、または２つの別々のベクターから同時に発現される。Wibbenmeyerら(1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)ならびにLeeおよびKwak(2003, J. Biotechnology 101 :189-198)は、宿主細胞の別々の培養物中で発現されたプラスミドを用いる、別々に生成された重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の生成を記載している。抗体の生成に関連する様々な他の技法が、例えばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1988)において提供されている。
【０１９５】
所望であれば、例示された抗体のいずれかが、配列決定され、次いでポリヌクレオチド配列が、発現または増殖のためにベクター中にクローニングされることができる。抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中で維持されることができ、次いで宿主細胞は、将来の使用のために拡張され、凍結されることができる。細胞培養における組み換えモノクローナル抗体の生成は、Ｂ細胞からの抗体遺伝子の当該技術で既知の手段によるクローニングにより実施されることができる。
【０１９６】
別の側面において、本発明は、本発明の組み換え抗体の生成に関してコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
抗体をコードする核酸は、あらゆる適切な特徴を有することができ、あらゆる適切な特色またはその組み合わせを含むことができる。従って、例えば、抗体をコードしている核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であることができ、非天然存在塩基、改変された主鎖、例えば核酸の安定性を促進するホスホロチオエート主鎖、または両方を含むことができる。核酸は、好都合には標的宿主細胞（単数または複数）における所望の発現、複製、および／または選択を促進する特色を含む発現カセット、ベクターまたは本発明のプラスミド中に組み込まれることができる。そのような特色の例は、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサーエレメント構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終結構成要素等を含み、その数多くの適切な例が、既知である。
【０１９７】
本開示は、さらに、本明細書で記載されるヌクレオチド配列の１以上を含む組み換えＤＮＡコンストラクトを提供する。これらの組み換えコンストラクトは、ベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと連結させて用いられ、あらゆる開示された抗体をコードするＤＮＡ分子が、その中に挿入される。
【０１９８】
モノクローナル抗体は、培養状態の細胞株により抗体分子を生成するあらゆる方法、例えば組み換え真核（哺乳類または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞の培養を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例は、Kohlerらのハイブリドーマ法(1975, Nature 256:495-497)およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; and Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク), pp. 51-63)を含む。
【０１９９】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて同定または獲得されることができる。そのような方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターが、免疫処置のために用いられたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を引き出すために免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されることができる。次いで、リンパ球は、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させられてハイブリドーマ細胞を形成する。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、またはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。
【０２０１】
次いで、ｍＡｂは、そのｇａｌ−ＩＩ抗原の特異的結合に関するさらなる試験および例えば異なる診断または療法目的のための抗体の設計のために、ハイブリドーマ上清から精製されることができる。
【０２０２】
ｇａｌ−ＩＩ特異的抗体は、ある場合には、単一のｇａｌ−ＩＩ抗原に対するスクリーニングを通して現れる。差次的に結合するクローンを単離する可能性を増大させるために、異なる抗原に対して進行的にスクリーニングすることにより多数の選択圧を適用するであろう。
【０２０３】
所望の選択的結合特性を有する抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合配列を提示するライブラリーを用いるディスプレイ技術（例えばファージ、細菌、酵母または哺乳類細胞の使用；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するインビトロディスプレイシステム）により行われることができる。反応性は、例えば標準的なアッセイを用いるＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリーを伴う表面染色に基づいて評価されることができる。
【０２０４】
単離された抗原（単数または複数）は、例えば抗体ライブラリー、例えば酵母ディスプレイ式抗体ライブラリーから抗体を選択するために用いられることができる。
例えば、本発明は、特にｇａｌ−ＩＩ特異的抗体を提供し、それは、ｇａｌ−ＩＩ抗原に結合する特異性を有する抗体を同定するためのプロセスにより、例えば特異的発見選択スキームにより得られる。従って、ｇａｌ−ＩＩ標的との反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーは、標的との反応性に関して選択されることができる。
【０２０５】
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体および薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、本発明に従って、大量瞬時注射もしくは注入として、または継続的な注入により投与されることができる。そのような投与手段を容易にするために適した医薬用キャリヤーは、当該技術で周知である。
【０２０６】
薬学的に許容可能なキャリヤーは、一般に、本発明により提供される抗体または関連する組成物もしくは組み合わせと生理学的に適合性であるあらゆるおよび全ての適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容可能なキャリヤーのさらなる例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにあらゆるそれらの組み合わせを含む。
【０２０７】
あるそのような側面において、抗体は、所望の投与経路に適した１種類以上のキャリヤーと組み合わせられることができ、抗体は、例えばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル類、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩類、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され、場合によりさらに従来の投与のために打錠またはカプセル封入されることができる。あるいは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、および／または様々な緩衝液中で溶解されることができる。他のキャリヤー、アジュバント、および投与方式は、医薬の技術分野において周知である。キャリヤーは、制御放出材料または時間遅延材料、例えば単独もしくはろう剤を伴うモノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリン、または当該技術で周知の他の材料を含むことができる。
【０２０８】
追加の薬学的に許容可能なキャリヤーは、当該技術で既知であり、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳにおいて記載されている。液体配合物は、溶液、エマルジョンまたは懸濁液であることができ、賦形剤、例えば懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、およびキレート剤を含むことができる。
【０２０９】
本発明の抗体および１種類以上の療法的に有効な薬剤が配合されている医薬組成物が、意図されている。本発明の抗体の安定な配合物は、所望の程度の純度を有する前記の免疫グロブリンを、任意の薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤または安定化剤と、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される。インビボ投与のために用いられるべき配合物は、特に無菌であり、好ましくは無菌水溶液の形態である。これは、滅菌濾過膜を通す濾過または他の方法により容易に成し遂げられる。本明細書で開示される抗体および他の療法的に有効な薬剤は、イムノリポソームとして配合されることもでき、かつ／またはマイクロカプセル中に封入されていることもできる。
【０２１０】
本発明の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮、粘膜、局所、例えばゲル、軟膏、ローション、クリーム等、腹腔内、筋内、肺内（例えば吸入可能な技術または肺送達システムを用いる）、経膣、非経口、直腸、または眼内を含む様々な方法でなされることができる。
【０２１１】
非経口投与のために用いられる典型的な配合物は、例えば無菌溶液、エマルジョンまたは懸濁液としての皮下、筋内または静脈内注射に適した配合物を含む。
一態様において、本発明の抗体は、例えば疾患を修正または防止する単独療法としての、対象に投与される唯一の療法的に有効な薬剤である。
【０２１２】
別の態様において、本発明の抗体は、クレブシエラ・ニューモニエを標的とするためにカクテル中で、そのカクテルが例えば疾患を修正または防止する併用療法として対象に投与される１種類より多くの療法的に有効な薬剤を含有するように、さらなる抗体と組み合わせられ、例えば混合物または部分のキット中で組み合わせられる。
【０２１３】
さらに、本発明の抗体は、標準的な処置、例えば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害剤、ならびに／または他の抗体ベースの療法を含むがそれらに限定されない１種類以上の他の療法または予防剤との組み合わせで、例えば抗細菌または抗炎症剤を利用して投与されることができる。
【０２１４】
併用療法は、特に、例えばクレブシエラ・ニューモニエによる感染を処置するために用いられるような標準的な計画を利用している。これは、抗生物質、例えばチゲサイクリン、コリスチン、ポリミキシンＢ、および非ベータラクタム系阻害剤と組み合わせられたベータラクタム系を含むことができる。
【０２１５】
併用療法において、抗体は、混合物として、または１以上の他の療法計画と同時に（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）、例えば同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）療法の前、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは後のいずれで投与されることもできる。
【０２１６】
本発明の抗体またはそれぞれの医薬製剤の生物学的特性は、生体外で細胞、組織、および生物全体での実験において特性付けられることができる。当該技術で既知であるように、薬物は、疾患もしくは疾患モデルに対する処置に関する薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を測定するために、しばしばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含むがそれらに限定されない動物においてインビボで試験される。動物は、疾患モデルと呼ばれ得る。療法は、しばしばヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むがそれらに限定されないマウスにおいて試験される。そのような実験法は、適切な半減期、エフェクター機能、殺菌活性および／または能動もしくは受動免疫療法の際の免疫反応を有する療法薬として、または予防薬として用いられる抗体の可能性の決定のために意味のあるデータを提供することができる。あらゆる生物、好ましくは哺乳類が、試験のために用いられることができる。例えば、それらのヒトに対する遺伝的類似性のため、霊長類、サルが、適切な療法モデルである可能性があり、従って対象の薬剤または組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために用いられることができる。ヒトにおける試験が、最終的に薬物としての認可のために必要とされ、従って、これらの実験は当然意図されている。従って、本発明の抗体およびそれぞれの医薬組成物は、ヒトにおいてそれらの療法的もしくは予防的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床的特性を決定するために試験されることができる。
【０２１７】
特定の場合において、患者は、免疫無防備状態の患者である。一部の免疫無防備状態の患者は、原発性免疫不全または続発性免疫不全を患っていることができる。一部の免疫無防備状態の患者は、免疫抑制療法により、または化学療法剤により処置されているか、または処置されたことがある。一部の免疫無防備状態の患者は、移植患者である。
【０２１８】
免疫無防備状態の患者は、食細胞性障害、例えばより低い食細胞数および／または機能障害により特性付けられる食細胞性障害を患っている可能性がある。
以下の障害は、食細胞活性の障害または喪失を引き起こし得る：
食細胞の原発性免疫不全（４）：
１．慢性好中球減少症：
ａ．周期性好中球減少症
ｂ．重症先天性好中球減少症
ｃ．シュワックマン・ダイアモンド症候群
２．白血球粘着欠損症
ａ．１型
ｂ．２型
ｃ．Ｒａｃ  ２欠損症
３．シグナル伝達の欠陥
ａ．インターフェロン−γおよびインターロイキン−１２の欠陥
４．細胞内殺傷の欠陥
ａ．小児慢性肉芽腫病
ｂ．ミエロペルオキシダーゼ欠損症
ｃ．チェディアック・東症候群
ｄ．好中球特異的顆粒欠損症
食細胞の続発性免疫不全（５）：
１．好中球減少症／顆粒球減少症：血中の好中球／顆粒球の低減した数（１５００細胞／ｍｌ未満）
ａ．骨髄疾患（腫瘍浸潤、再生不良性貧血、血液悪性疾患、肉芽腫性疾患、照射、骨髄線維症）
ｂ．免疫介在性好中球減少症（ハプテンとして作用する薬物、自己免疫疾患）
ｃ．感染症（細菌性敗血症、マラリア、トキソプラズマ症、ウイルス感染症、例えばＥＢＶ、ＣＭＶ、インフルエンザ）
ｄ．栄養欠乏症（栄養失調、Ｂ−１２欠乏症）
ｅ．薬物、化学物質（マクロライド系、プロカインアミド系、フェノチアジド（ｐｈｅｎｏｔｉａｚｉｄ）、スルホンアミド系、クロラムフェニコール、アミノピリン、抗甲状腺薬、例えばチオウラシル、メチマゾール、チオシアネート、重金属）（６）
ｆ．化学療法、免疫抑制（自己免疫疾患の処置、移植後）
２．食細胞の機能／走化性障害または食細胞の生成を上方制御する能力の低下）（７）
ａ．新生児（ストレス条件下では、新生児性ＰＭＮは正常な食細胞活性および殺微生物活性で機能しない。満期新生児の血液から分離されたＰＭＮは、減少した走化性および接着能力を示す）（８）
ｂ．高齢者（低下した食細胞能力、細胞傷害性、酵素放出、低減した接着）（９）
ｃ．糖尿病（より低いＰＭＮによる殺傷、単球／マクロファージの機能不全（１０）、腎不全および硬変）
ｄ．トリソミー２１
ｅ．手術、外傷
ｆ．副腎皮質ステロイド類
ｇ．ＨＩＶ
食細胞の数および機能の欠陥を有する患者を同定するために、当業者により既知のあらゆる適切な技法が、適用されることができる。これらは、全血球算定、白血球百分率数、末梢血液スミア、接着、走化性、食作用、食細胞の細胞内殺傷の測定、特定の好中球酵素を測定する、または好中球に対する自己抗体を検出するためのアッセイを含むが、それらに限定されない。
【０２１９】
従って、本発明は、特に、直接的な、すなわち宿主の細胞性免疫の状態に依存しない殺菌活性を示す抗体を提供する。抗ガラクタン−ＩＩ  ｍＡｂのこの新規の作用方式に基づいて、そのようなｍＡｂは、免疫無防備状態の患者集団においてＫ．ニューモニエＯ１による侵襲的感染症の症例における追加または独立型療法として用いられることができるであろう。抗体は、低下した食細胞機能による免疫無防備状態を獲得するリスクがある個人（化学療法または放射線療法の前の癌患者、免疫抑制療法を受けている患者）における、またはＫ．ニューモニエの大流行による影響を受けた臨床病棟にいる患者における新規の防止手段を与えることができるであろう。
【０２２０】
本発明は、さらに、以下の実施例により、それに限定されることなく説明される。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：Ｏ１特異的ヒト化ｍＡｂの開発
Ｏ１炭水化物抗原に対するマウスｍＡｂが、標準的なハイブリドーマ技術により開発された。簡潔には、マウスは、亜致死用量の生菌により４回免疫された。脾細胞の融合後、特異的ハイブリドーマクローンが、抽出されたＯ１  ＬＰＳ（免疫ブロット）または得られたビオチン化多糖抗原（ＥＬＩＳＡ）ならびに細菌細胞全体を用いるフローサイトメトリーを用いて選択された。特異的ｍＡｂは、マウス−ヒトキメラ抗体（マウスの可変領域がヒトＩｇＧ１の定常重鎖およびカッパ定常軽鎖領域に融合したもの）として発現させられた。最も有効なｍＡｂは、ヒト化を施され、ここで、マウスのフレームワーク領域が、対応するヒトの領域により置き換えられ、超可変ＣＤＲ領域がマウスの配列として排他的に残された。
【０２２２】
Ｏ１  ｍＡｂの結合特異性は、分離され（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、抽出され、精製され、ＰＶＤＦ膜上にブロットされたＬＰＳ分子を用いる免疫ブロットにより確証された。Ｏ１  ｍＡｂの反応パターンは、ｍＡｂ  ８Ｅ９により例示される（図２）。そのｍＡｂは、１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させられた。ブロットは、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体およびルミノグラフィー（ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈｙ）を用いて現像された。Ｏ１特異的ｍＡｂは、長い分子量のＬＰＳの画分を染色し、これは、ガラクタン−ＩＩエピトープへの特異的結合を示唆している。Ｏ２型ＬＰＳ分子への結合の欠如は、（血清型Ｏ１の他のＯ抗原繰り返し単位であるガラクタン−Ｉは、Ｏ１およびＯ２  ＬＰＳ分子により共有されているため）この特異性を確証した。
【０２２３】
実施例２：Ｏ１  ｍＡｂは、莢膜のタイプに関わらず細菌表面に結合することができる
意図される殺菌活性に関して、ｍＡｂが表面に結合してＦｃ依存性のエフェクター機能を誘発することは、不可欠である。しかし、Ｋ．ニューモニエは、その表面分子を十分な莢膜多糖（ＣＰＳ）により遮蔽しており、それは高度な構造的多様性を示す。従って、発見されたＯ１特異的ｍＡｂが異なるＣＰＳコートの存在下で細菌表面に有効に結合することができることを示すことは、重要であると考えられた。
【０２２４】
Ｋ２（ＡＴＣＣ  ４３８１６）または遺伝学的に確証された非Ｋ２（臨床分離株）ＣＰＳのどちらかを発現するＫ．ニューモニエＯ１株の対数中期培養物が、４０μｇ／ｍｌのヒト化またはキメラＯ１特異的ｍＡｂ、続いてＡｌｅｘａ  ４８８で標識された二次抗ヒトＩｇＧを用いて染色された。細菌の蛍光は、フローサイトメトリーにより測定された。図３において描写されているように、Ｏ１特異的ｍＡｂは、両方の株において強い表面染色を示し、これは、異なるＣＰＳ分子がｍＡｂ結合に関してＯ１エピトープの接近可能性を妨げないことを示唆している。
【０２２５】
実施例３：菌血症のマウスモデルにおける保護能力
精製されたヒト化ｍＡｂならびにそれらの親キメラｍＡｂの保護的有効性が、Ｋ．ニューモニエ菌血症のマウスモデルにおいて試験された（図４）。マウスは、５０ｕｇのｍＡｂにより腹腔内に免疫され、２４時間後、Ｋ．ニューモニエＯ１：Ｋ２株ＡＴＣＣ  ４３８１６により致死的静脈内負荷（５×１０６ＣＦＵ）がかけられた。死亡率が、１０日間毎日モニターされた。キメラｍＡｂならびにヒト化誘導体は、両方とも、イソ型を一致させた無関係なｍＡｂを同じ用量で与えられた対照群と比較して有意な保護を示した。
【０２２６】
実施例４：食細胞に依存しない殺菌活性
Ｋ．ニューモニエ株は限られた食細胞能力を有する免疫無防備状態の患者に感染する傾向があることを考慮して、我々は、直接的な殺菌活性を有するｍＡｂを見付けることが重要であると考えた。ｍＡｂの食細胞に依存しない補体に媒介される殺菌活性が、いわゆる血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）において試験された。Ｏ１特異的ヒト化ｍＡｂであるＧ２−２７およびＧ２−３３ならびにそれらの親マウス−ヒトキメラｍＡｂは、試験された両方の血清試料において用量依存性の補体に媒介される細菌殺傷を誘発した。無関係な特異性を有するイソ型を一致させたｍＡｂを用いた場合、または用いられた血清を熱非働化（５６℃で３０分間）した場合（示されていない）、殺菌活性は、観察されず、これは、抗体依存性の補体に媒介される殺傷を確証している。
【０２２７】
この作用は、報告されたガラクタン−ＩＩ特異的マウスＩｇＧ２ｂ（それは補体依存性のオプソニン化貪食作用性殺傷を誘導することができたが）は、補体に媒介される殺傷を欠いていた（すなわち、食細胞の非存在下では殺菌活性が観察されなかった）ため、明らかではない（１）。
【０２２８】
参考文献リスト
【０２２９】
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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