(57)【要約】  本発明は、（ａ）水溶液中でタンパク質、トリメチロールプロパンエトキシレートのような分岐ポリマー、およびポリ（エチレンオキシド）のような直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る工程；を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法、並びに対応するゴム状材料に関する。ゴム状材料は、発光タンパク質および酵素を含む広い範囲の様々なタンパク質の固定化および安定化を可能にし、特に有利には、発光ダイオード（ＬＥＤ）用ダウンコンバート材料として、診断用途のため、およびバイオリアクターにおいて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および
（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る工程；
を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程
を含むゲルの製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
【請求項３】
分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ１〜２０炭化水素基であり、前記置換基はそれぞれ独立してヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に前記Ｃ１〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子により置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ１〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基、グリセロール基、ペンタエリスリトール基、ペンタエリスリチオール基、ジグリセロール基、トリグリセロール基、ジペンタエリスリトール基、テトラグリセロール基、ペンタグリセロール基、トリペンタエリスリトール基、ヘキサグリセロール基、トリメタノールアミン基、トリエタノールアミン基、トリイソプロパノールアミン基、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸基、クエン酸基、イソクエン酸基、トリメシン酸基、１，１，１−トリス（アミノメチル）プロパン基、１，１，１−トリス（アミノメチル）エタン基、トリス（アミノメチル）メタン基、プロパン−１，２，３−トリアミン基、トリス（２−アミノエチル）アミン基およびトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン基から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
分岐ポリマーに含まれる前記した少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒまたは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した３個のポリマー分岐を有し、分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位はトリメチロールプロパン基であり、分岐ポリマーに含まれる前記ポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−ＣＯ−Ｏ−Ｒ基〔各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである〕を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に、−ＯＨ、−ＯＲおよび−ＣＯ−Ｏ−Ｒ〔各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである〕から独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分岐ポリマーはトリメチロールプロパンエトキシレートである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分岐ポリマーはトリメチロールプロパンエトキシレートであり、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質は発光タンパク質または酵素である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において混合するポリマーを共有結合させる工程を含まない、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１および請求項３〜１１のいずれかに記載の方法により得られる、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料。
【請求項１３】
前記ゴム状材料は請求項９に記載の方法により得られる、請求項１２に記載のゴム状材料。
【請求項１４】
その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料であって、ゴム状材料は分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなり、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゴム状材料。
【請求項１５】
分岐ポリマーはトリメチロールプロパンエトキシレートであり、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、請求項１４に記載のゴム状材料。
【請求項１６】
請求項２および請求項３〜１１のいずれかに記載の方法によって得られるゲル。
【請求項１７】
タンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなるゲルであって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゲル。
【請求項１８】
ハイブリッド発光ダイオード用ダウンコンバート材料としての、請求項１２〜１５のいずれかに記載のゴム状材料の使用であって、ゴム状材料に固定化されたタンパク質は発光タンパク質である、使用。
【請求項１９】
発光ダイオードおよび被膜を含んでなるハイブリッド発光ダイオードであって、被膜は、請求項１２〜１５のいずれかに記載のゴム状材料の層を１層以上含む、ハイブリッド発光ダイオード。
【請求項２０】
請求項１２〜１５のいずれかに記載のゴム状材料を含んでなる、診断用デバイスまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）水溶液中でタンパク質、トリメチロールプロパンエトキシレートのような分岐ポリマー、およびポリ（エチレンオキシド）のような直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る工程；を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法、並びに対応するゴム状材料に関する。ゴム状材料は、発光タンパク質および酵素を含む広い範囲の様々なタンパク質の固定化および安定化を可能にし、特に有利には、発光ダイオード（ＬＥＤ）用ダウンコンバート材料として、診断用途において、およびバイオリアクターにおいて使用される。
【背景技術】
【０００２】
生物工学プロセスのためのタンパク質の固定化は、産業プロセスの過酷な条件、並びに生体触媒作用、診断、照明などのための貯蔵および適用条件に起因するこれらの材料の低い操作寿命を回避するための最も費用効果の高い手段として歓迎されている。この分野では、担体、マトリックスの性質、および固定化技術が重要なパラメーターである。
【０００３】
もっとも一般的に使用されている担体は、ｉ）有機材料、例えば、カルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、変性セファロース、イオン交換樹脂、活性炭、ポリマー、活性膜など、およびｉｉ）無機材料、例えば、シリカ、クレー、金属酸化物、珪藻土、ハイドロキシアパタイト、セラミック、ガラスなどに分類される。担体の選択には、タンパク質に対する親和性、反応性官能基の利用可能性、機械的安定性、剛性および生体適合性に関する考慮が必要である。
【０００４】
マトリックスの性質、およびタンパク質の特徴である化学的官能性は、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、機械的封じ込めなどの弱い相互作用による可逆的物理吸着から、タンパク質表面およびマトリックスおよび／または担体上に付着した基の間の共有結合性相互作用を介した不可逆的化学的アプローチに及ぶ固定化技術に影響する。要するに、２つの主な固体化技術、即ち、担体への直接吸着およびネットワーク内への捕捉が存在する。
【０００５】
あらゆる基材上への物理的吸着も非常に関心を持たれている。なぜなら、活性が低下すると、担体を再生できるからである。主な欠点は、ｉ）担体とタンパク質の両方の官能化が通常必要であること、ｉｉ）浸漬とインキュベーションという２つの工程からなる長い製造時間、ｉｉｉ）タンパク質の容易な浸出、およびｉｖ）ｐＨ、温度および／またはバッファーのイオン強度に起因した担体のエッチングである。
【０００６】
捕捉には、繊維、ポリマー、膜などのような担体または有機網目へのタンパク質の固定化が含まれる。この技術は、浸出プロセスを低減し、タンパク質の安定性を高める。有機網目の典型的な材料は、ポリアニオン性またはポリカチオン性ポリマーおよび多価対イオンポリマーの混合物、ゾル−ゲル、アルギン酸塩、カラゲーニン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ゼラチン、シリコンゴム、ポリウレタン、ポリビニルアルコールなどをベースとするポリマー／ゾルゲル複合体からなる。この方法の実際的な使用は、その技術適用を妨げる、ｉ）試薬に対するタンパク質の低い影響の受けやすさ、ｉｉ）製造プロセス中のタンパク質の失活の容易さ、ｉｉｉ）担体の低い負荷および／または破壊、ｉｖ）ガンマ線、ＵＶおよび／または熱処理、架橋などの化学反応を典型的に含むその調製のための過酷な条件の使用、ｖ）各々の特定のタンパク質のための各成分（プレポリマー、光増感剤、架橋剤など）の慎重な最適化の必要性、およびｖｉ）例えば薄いフィルムの製造、小型化、封入などに関する、最終材料の困難な加工性によって制限される。
【０００７】
捕捉のための様々な方法の中で、架橋のアプローチが最も一般的である。これは、溶液中でタンパク質と一緒にプレポリマーと光増感剤および／または架橋剤を混合し、次いで、これを、ｉ）ＵＶ照射に暴露し、ｉｉ）ポリマー含有モノマー溶液を凍結させ、続いてガンマ線照射により重合を補い、ｉｉｉ）重合プロセスを化学的に開始させ、さらに中和することによってゲル化させることにより行う。
【０００８】
タンパク質のそのような固定化または捕捉のこのような方法は、例えば、Mohamad NRら、Biotechnol Biotechnol Equip. 2015, 29（2）, 205-220；Datta Sら、3 Biotech. 2013, 3（1）, 1-9；US 5,763,409；およびUS 2013/0273531に記載されている。
【０００９】
しかし、既知のタンパク質ベース捕捉物のいずれも、光電子工学デバイスのカプセル化、診断のための様々な３Ｄ基材上への容易な付着および／または移動、小型化プロセスなどの技術的応用にとって重要なエラストマーまたはゴム様の特徴を示さない。
【００１０】
近年、白色発光ダイオード（ＷＬＥＤ）は、エネルギー効率の低い白熱電球や環境に優しくない蛍光灯に代わる重要な半導体光源として知られているので、その研究が非常に重要になりつつある。これまで、ＷＬＥＤの設計においては、２つの主な戦略が採用されている。１つ目では、色変換器として無機系材料、最も頻繁には希土類元素の蛍光体を使用する（Park JKら、Appl Phys Lett. 2004, 84, 1647；Jang HSら、Appl Phys Lett. 2007, 90, 041906；Xie RJら、Nitride Phosphors and Solid-State lighting, CRC Press, 2011；Tolhurst TMら、Adv Opt Mater, 2015, 3, 546；Zhang Rら、Laser Photon Rev. 2014, 8, 158）。それらは、丈夫かつ長寿命で、優れた照明性能を備えている。しかし、それらは、熱を放散するための特別な電子構成だけでなく、例えば、高温のようなかなり厳しい製造条件を必要とし、これは、大きいおよび／または可撓性のパネルへの実施を妨げる。さらに、これらの材料の不足のために、デバイス製造コストは非常に高い。２つ目のアプローチとして、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）が、大面積照明用途のための最も成熟した技術として浮上している（Reineke Sら、Rev Mod Phys. 2013, 85, 1245；Volz Dら、Green Chem. 2015, 17, 1988）。これらは、可撓性基材上に容易に製造することができるが、高性能のために多層構造を必要とする。従って、従来技術の白色ＯＬＥＤは、低コスト生産と高性能の点で明らかなトレードオフを示す（Reineke Sら、Rev Mod Phys. 2013, 85, 1245；Volz Dら、Green Chem. 2015, 17, 1988）。
【００１１】
上述の制限は、両方のアプローチの最良を組み合わせたハイブリッド無機／有機ＬＥＤ構成（ＨＬＥＤ）における鋭意検討を促進している（Heliotis Gら、Adv Mater. 2006, 18,334；Gu Eら、Appl Phys, 2007, 90, 031116；Huyal IOら、J Mater Chem. 2008, 18, 3568；Kim Oら、ACS Nano 2010, 4, 3397；Stupca Mら、J Appl Phys. 2012, 112, 074313；Ban Dら、Phys Status Solidi Curr Top Solid State Phys. 2012, 9, 2594；Jang EPら、Nanotechnology 2013, 24, 045607；Findlay NJら、J Mater Chem C 2013, 1, 2249；Lai CFら、Opt Lett. 2013, 38, 4082；Chen Jら、J Mater Sci. 2014, 49, 7391；Kim JY, Opt Commun. 2014, 321, 86；Shen P-Cら、Sci Rep. 2014, 4, 5307；Findlay NJら、Adv Mater. 2014, 26, 7290）。ＨＬＥＤは、無機ＬＥＤの優れた照明性能と、ＯＬＥＤに使用される有機化合物の低コスト生産および色調整容易性とを組み合わせることができる。
【００１２】
特に、ハイブリッド発光ダイオード（ＨＬＥＤ）は、高品質の白色発色ダイオードをもたらす連続励起後のブロードな低エネルギー発光バンドを特徴とするダウンコンバート有機材料で被覆された高エネルギー発光無機ＬＥＤ（３６０〜４７０ｎｍの発光波長）からなる。現行の白色ＬＥＤは色変換器としての希土類ベース蛍光体に基づいており、これは、封止プロセスと組み合わせることができず、デバイス製造における工程数を増加させるので、このアプローチの利点は製造の容易性および低コストである。最も使用されるダウンコンバート材料は、ポリマー、低分子、配位錯体および量子ドットである。これらの材料は、典型的にはＬＥＤチップ上またはガラス基材上に被覆され、ＬＥＤ上部に配置される。後者は、商業目的の可能性を伴わない優れた概念実証法と考えられる一方で、前者は、ＬＥＤチップ上に直接塗布する必要のあるＵＶ硬化性シーリング剤（シリコーン）を含む混合物の調製を必要とする。これは、チップの損傷、コスト、あらゆる３Ｄ形状での均質なカプセル化の欠如、およびデバイスの色度を微調整するためのカスケードエネルギー伝達プロセスを特徴とする多層カプセル化系の調製の点で、製造プロセスを損なう。これまで、多層カスケードカプセル化系の例は存在しておらず、蛍光タンパク質がポリスチレンミクロスフェアに閉じ込められた唯一の例は存在し、これはＬＥＤにおけるダウンコンバート材料として使用されている〔Hui KNら、Nanotechnology. 2008, 19（35）, 355203〕。
【００１３】
従って、残念ながら、毎日使用される技術としてＨＬＥＤを実施するには幾つかの障害がある。第一に、ほとんどの例は、白色光の高エネルギー構成要素を提供するために青色ＬＥＤを使用している。これは、高輝度出力で高い相関色温度（ＣＣＴ）および演色指数（ＣＲＩ）に同時に達することに限界をもたらし（Heliotis Gら、Adv Mater. 2006, 18, 334；Gu Eら、Appl Phys 2007, 90, 031116；Huyal IOら、J Mater Chem. 2008, 18, 3568；Kim Oら、ACS Nano 2010, 4, 3397；Stupca Mら、J Appl Phys. 2012, 112, 074313；Ban Dら、Phys Status Solidi Curr Top Solid State Phys. 2012, 9, 2594；Lai CFら、Opt Lett. 2013, 38, 4082；Chen Jら、J Mater Sci. 2014, 49, 7391；Kim JY、Opt Commun. 2014, 321, 86；Shen P-Cら、Sci Rep. 2014, 4, 5307；Findlay NJら、Adv Mater. 2014, 26, 7290）、色混合の成熟制御を達成するための好ましい選択肢としてＵＶ−ＬＥＤの使用が指摘されている。第二に、有機部分の選択は、効率および安定性の点で主要なボトルネックと考えられる。一方では、最も研究されているダウンコンバート材料（即ち、ポリマー、低分子、配位錯体および量子ドット）は、高い吸光係数を特徴とする鋭い吸収スペクトルと高効率のブロードな発光バンドとの組み合わせの限界を示す。さらに、本質的に白色のエミッターが少数存在する（Sun C-Yら、Nat Commun. 2013, 4, 2717；Bao Lら、Curr Org Chem. 2014, 740）。白色ＨＬＥＤは、典型的には、可視スペクトルの赤色領域の色品質を損なう２つの最大ピーク（青色領域のＬＥＤからの一方とオレンジ色領域の有機部分からの他方）を有するエレクトロルミネッセンス（ＥＬ）スペクトルを特徴とする。他方では、カプセル化系におけるダウンコンバート材料の適用には、ＵＶ硬化性または熱硬化性シーリング剤を含む混合物が必要である。この手順は、有機ダウンコンバート材料の分解などの問題、および制御されない相分離（Huyal IOら、J Mater Chem. 2008, 18, 3568）を招き、これは例えば、２つの相補的なエミッターを一緒に混合する場合、必要なエネルギー移動プロセスを妨げる。
【００１４】
酵素に基づく検出キットは、血液および尿を含む生物学的液体の範囲内の関連するバイオマーカー、代謝産物および核酸の濃度を測定するために、診断において一般的に使用されている。周囲温度でのほとんどの酵素の急速な分解に基づいて、これらのキットは−２０°Ｃで保存され、輸送には機能的コールドチェーンが必要とされる。従って、室温で保存するためにタンパク質を安定化することは有利である。ルーチンの使用を可能にし、周囲条件下での保存のためにタンパク質を安定化させるために、酵素は活性表面に固定または吸着され、脱水される。最も一般的には、これらの手順は架橋工程を含み、これはしばしば酵素活性に悪影響を及ぼす。或いは、安定化成分の存在下で酵素を凍結乾燥させる。タンパク質の製剤化は、凍結乾燥プロセス中の酵素の安定性、活性および分解にかなりの影響を及ぼす。酵素の様々な物理化学的特性は、全ての酵素を安定化させる一般的な調製手順の設計をほとんど不可能にする。さらに、調製に使用されるバッファーには、酵素測定に悪影響を及ぼし得るアミノ酸、糖または糖アルコールが含まれ得る。従って、架橋を回避した酵素の安定化、および安定化分子の添加のための一般的な方法が必要である。
【００１５】
US 2004/0156906は、少なくとも１つの負温度感受性高分子と特定の構造を有する１つの生分解性基とを含んでなる化学的架橋網目を有する感熱性かつ生分解性ミクロゲルを記載している。この文献はもっぱら、架橋コポリマーを含有するミクロゲルに関するものであり、特に、本発明に従って提供されるゲルの場合のように、特定の分枝ポリマーおよび直鎖ポリマーの両方を含んでなるゲルを開示していない。Gill Iら、Trends Biotechnol. 2000, 18（11）, 469-479は、タンパク質および架橋ポリウレタンポリマーからなるある種の生体複合材料を包含する、様々なポリマー内のタンパク質の非ゾル−ゲルカプセル化に関する。US 2013/0313593は、特定の発光ダイオード（ＬＥＤ）照明装置を記載している。Weber MDら、Adv Mater. 2015, 27（37）,5493-5498およびNiklaus Lら、Mater Horiz. 2016, doi: 10.1039/C6MH00038Jは、本明細書の優先日の後に公開され、本発明の特定の態様に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】US 5,763,409
【特許文献２】US 2013/0273531
【特許文献３】US 2004/0156906
【特許文献４】US 2013/0313593
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Mohamad NRら、Biotechnol Biotechnol Equip. 2015, 29（2）, 205-220
【非特許文献２】Datta Sら、3 Biotech. 2013, 3（1）, 1-9
【非特許文献３】Park JKら、Appl Phys Lett. 2004, 84, 1647
【非特許文献４】Jang HSら、Appl Phys Lett. 2007, 90, 041906
【非特許文献５】Xie RJら、Nitride Phosphors and Solid-State lighting, CRC Press, 2011
【非特許文献６】Tolhurst TMら、Adv Opt Mater, 2015, 3, 546
【非特許文献７】Zhang Rら、Laser Photon Rev. 2014, 8, 158
【非特許文献８】Reineke Sら、Rev Mod Phys. 2013, 85, 1245
【非特許文献９】Volz Dら、Green Chem. 2015, 17, 1988
【非特許文献１０】Heliotis Gら、Adv Mater. 2006, 18, 334
【非特許文献１１】Gu Eら、Appl Phys, 2007, 90, 031116
【非特許文献１２】Huyal IOら、J Mater Chem. 2008, 18, 3568
【非特許文献１３】Kim Oら、ACS Nano 2010, 4, 3397
【非特許文献１４】Stupca Mら、J Appl Phys. 2012, 112, 074313
【非特許文献１５】Ban Dら、Phys Status Solidi Curr Top Solid State Phys. 2012, 9, 2594
【非特許文献１６】Jang EPら、Nanotechnology 2013, 24, 045607
【非特許文献１７】Findlay NJら、J Mater Chem C 2013, 1, 2249
【非特許文献１８】Lai CFら、Opt Lett. 2013, 38, 4082
【非特許文献１９】Chen Jら、J Mater Sci. 2014, 49, 7391
【非特許文献２０】Kim JY, Opt Commun. 2014, 321, 86
【非特許文献２１】Shen P-Cら、Sci Rep. 2014, 4, 5307
【非特許文献２２】Findlay NJら、Adv Mater. 2014, 26, 7290
【非特許文献２３】Hui KNら、Nanotechnology. 2008, 19（35）, 355203
【非特許文献２４】Sun C-Yら、Nat Commun. 2013, 4, 2717
【非特許文献２５】Bao Lら、Curr Org Chem. 2014, 740
【非特許文献２６】Gill Iら、Trends Biotechnol. 2000, 18（11）, 469-479
【非特許文献２７】Weber MDら、Adv Mater. 2015, 27（37）,5493-5498
【非特許文献２８】Niklaus Lら、Mater Horiz. 2016, doi: 10.1039/C6MH00038J
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記のように、タンパク質の活性を維持しながら、種々の技術的用途に優れた機械的性質を示す、エラストマーマトリックスおよび／またはゴム状材料中にタンパク質を固定化するためのアプローチは、幾つかしか提案されていない。特に、既知の製造手順は、多成分混合物、並びにＵＶおよび／またはガンマ線照射、化学反応および熱処理を使用する硬化可能な工程を含む。これらの事実は、タンパク質の数および／または性質、よって、その技術的応用を制限する。従って、当技術分野において、調製、一般性、並びに上記欠点を克服するための小型化および／または３Ｄ基材におけるコーティングを必要とする最終的技術的用途に関して改良されたゴム状タンパク質ベース材料が必要とされている。例えば、安価な白色発光ダイオードを開発するためにダウンコンバートのアプローチで使用できるハイブリッド発光ダイオードのカプセル化系としてゴム状材料が必要とされている。具体的には、多層のような任意の３Ｄ基材および／またはカプセル化構造上に付着させることができる、環境に優しく、安価で安定なゴム材料が必要とされている。加えて、層内での効率的なカスケードエネルギー伝達スキームを可能にし、構成要素間の相分離の問題、励起子消滅などを解決する多層構造の製造方法の容易なアップスケールが必要とされている。
【００１９】
本発明は、上記欠点に対応し、架橋または硬化を必要としない、発光タンパク質および酵素を包含する広い範囲の様々なたんぱく質を固定化および安定化する新規かつ向上した方法を提供するという課題を解決する。本発明はまた、環境にやさしいハイブリッド発光ダイオード用ダウンコンバートカプセル材料として使用できる、その中に固定化された発光または蛍光タンパク質を含有する新規かつ向上した材料を提供するという課題を解決する。本発明はさらに、診断またはバイオリアクターにおいて有利に使用できる、その中に固定化された酵素または他のタンパク質を含有する新規かつ向上した材料に対する要求に対応する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
特に、本発明は、意外なことに、水または水溶液中のタンパク質を、トリメチロールプロパンエトキシレートのような分岐ポリマーとポリ（エチレンオキシド）のような直鎖ポリマーとの混合物に添加し、次いで、部分脱水／乾燥工程を経た結果、その中にタンパク質がその活性を保持しながら固定化／封入されたゴム状材料が生成されるという発見に基づく。これは、ヒドロラーゼ（イーストインベルターゼ）, キナーゼ（イーストヘキソキナーゼ）およびイソメラーゼ（イーストホスホグルコースイソマーゼ）を包含する様々なＥＣクラスに属する酵素および多種多様な発光タンパク質について実証され、これは、本発明の固定化技術の普遍的適用可能性を意味する。本発明に従って提供されるゴム状材料はまた、化学的架橋反応も、熱および／または照射処理も、固定化されるタンパク質の事前官能化の必要性も伴わずに製造できるため有利である。それは、あらゆる既知の３Ｄ形状を特徴とする有機または無機担体上に容易に移動でき、またはそのような担体上に直接製造できる。液滴塗布、回転塗布、噴霧塗布、ドクターブレード塗布などのような従来の付着技術を使用せずにあらゆる３Ｄ基材上にハイブリッド発光ダイオード用カスケードエネルギー移動カプセル化系を作製するための、その中に固定化された発光タンパク質を含有するゴム状材料の適用もまた、実証された。
【００２１】
従って、第一の態様では、本発明は、
（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および
（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る工程；
を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーが、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法を提供する。
【００２２】
第二の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の方法によって得られる、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を提供する。また、この第二の態様では、本発明は、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料であって、ゴム状材料は分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなり、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゴム状材料を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本発明の第一の態様の方法の工程（ａ）において得られたゲルの製造方法に関する。従って、第三の態様では、本発明は、
（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程； 
を含むゲルの製造方法であって、分岐ポリマーが、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法を提供する。
【００２４】
第四の態様では、本発明は、本発明の第三の態様の方法によって得られるゲルに関する。この第四の態様では、本発明は、タンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなるゲルであって、分岐ポリマーが、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゲルを提供する。
【００２５】
第五の態様では、本発明は、照明における、特に、環境への負荷が少ないハイブリッド発光ダイオード（例えばハイブリッド白色発光ダイオード）用ダウンコンバート材料としての、第二の態様のゴム状材料の使用に関する。この第五の態様では、本発明は、ハイブリッド発光ダイオード（例えばハイブリッド白色発光ダイオード）のためのダウンコンバートカスケードエネルギー移動カプセルとしての、第二の態様のゴム状材料の使用に関する。また、第五の態様では、本発明はまた、発光ダイオードおよび被膜を含んでなるハイブリッド発光ダイオード（例えばハイブリッド白色発光ダイオード）であって、被膜は１以上（例えば１、２、３、４または５）の本発明の第二の態様のゴム状材料の層を含有する、ハイブリッド発光ダイオードを提供する。本発明の第五の態様では、ゴム状材料に固定化されたタンパク質は発光タンパク質、好ましくは蛍光タンパク質である。
【００２６】
第六の態様では、本発明は、診断における、例えば、血液、血漿、尿またはその他の体液のような試料の中の１以上の代謝産物または核酸を検出するための、第二の態様のゴム状材料のインビトロ使用に関する。本発明はまた、診断用デバイスまたはキットにおける第二のゴム状材料の使用、および第二の態様のゴム状材料を含んでなる診断用デバイスまたはキットに関する。
【００２７】
第七の態様では、本発明は、バイオリアクターにおける第二の態様のゴム状材料の使用を提供する。本発明はまた、第二の態様のゴム状材料を含んでなるバイオリアクターを提供する。本発明のこの第七の態様では、ゴム状材料中に固定化されたタンパク質は酵素である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】記録者が実施例において使用した蛍光タンパク質および酵素について作成したものである（実施例１を参照）。ＧＳ、グリシン−セリンアミノ酸リンカー；ＳＨ２−、ＳＨ３−およびＰＡＢＣ−ドメインはタンパク質相互作用ドメインを表す；ＴＡＡ、ポリアデニル化信号；ＢａｍＨ１およびＳａｌ１、クローニングに使用される制限酵素認識部位；６ｘＨｉｓ、融合タンパク質の親和性精製のためのポリヒスチジン標識。酵素をコードする遺伝子はイースト（Saccharomyces cerevisiae, S.c）から取り出した。
【図２】低倍率（左）および高倍率（右）でのタンパク質ベースゲルのＴＥＭ画像（実施例１を参照）。
【図３】周囲条件下で保存したタンパク質ベースフィルムの水の経時的な重量変化（実施例１を参照）。
【図４】各付着工程時のタンパク質ベースフィルムの厚さおよび粗さの変化（実施例１を参照）。
【図５】左図は、ハイブリッド発光ダイオードの模式図を示す。１は電気的接続部を備える基材であり、２は高発光無機チップ、即ちこの場合は青色ＬＥＤであり、３はパッキングまたはカプセル化系であり、４はその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の１または複数の層からなるダウンコンバートカプセル化系である。右図は、白色ハイブリッドＬＥＤのオフおよびオンを示す。
【図６】左図は、診断用デバイスの模式図を示す。１は基材であり、２はその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料である。右図は、３つの異なった試験体（即ち、「対照」はその中に固定化された酵素を含有するゴム状材料であり、「＋基材」は２０μＬの試薬溶液が適用されている、その中に固定化された酵素を含有するゴム状材料であり、「−基材」は２０μＬの試薬不含有溶液が適用されている、その中に固定化された酵素を含有するゴム状材料である）の３１０ｎｍで励起したときの蛍光応答を示す。
【図７】上図は、周囲条件下で保存したmTagBFP（Ａ）およびmCherry（Ｂ）ゲルの経時的な吸収スペクトルを示す。下図は、空気中で２０分あたり１０°Ｃのステップで室温から９０°Ｃまで加熱したmTagBFP（Ｃ）およびmCherry（Ｄ）ゲルの吸収特性を示す。
【図８】酵素であるインベルターゼ（Ａ）、ヘキソキナーゼ（Ｂ）およびホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）（Ｃ）の活性を測定するための結合光試験の原理。
【図９】青色、緑色および赤色蛍光タンパク質に基づくカスケード被膜を有するバイオＨＬＥＤの図。mTagBFP（青色）、eGFP（緑色）およびmCherry（赤色）中に存在する発色団の構造を示す。
【図１０】上図は、周囲条件下（左図）および３１０ｎｍでの励起時（右図）でのタンパク質ベースゲルおよびゴム状材料の写真を示す。中図は、溶液（実線）、ゲル（白丸）およびゴム状材料（黒丸）中の３つのタンパク質の発光スペクトルを示す。下図は、ガラス基板からのゴム状材料の容易な剥離過程を強調した写真（上）、および手動でプラスチック製棒上に配置した１ｍｍの厚さを有するタンパク質ベースゴム状材料の写真（下）を示す。さらなる詳細は実施例１を参照。
【図１１】バッファー溶液中のmTagBFP（青色）、eGFP（緑色）およびmCherry（赤色）蛍光タンパク質の正規化された吸収スペクトル（上図）、正規化された発光スペクトル（中図）および正規化された励起スペクトル（下図）を示す（実施例１を参照）。
【図１２】貯蔵条件下での青色（Ａ）および緑色（Ｂ）蛍光タンパク質ベースゴムの吸収スペクトルの経時変化（実施例５および７を参照）。また、空気中で室温から９０°Ｃまで各々２０分間で１０°Ｃずつ加熱したときの、青色（Ｃ）および緑色（Ｄ）蛍光タンパク質ベースゴムの吸収特性も示す。
【図１３】被覆欠損蛍光タンパク質を用いたＵＶ−ＬＥＤ（左図）および青色ＬＥＤ（右図）のエレクトロルミネセンス（ＥＬ）スペクトル（上図）および比視感度（下図）の変化を示す（実施例７を参照）。
【図１４】ＵＶ−ＬＥＤ/mTagBFP（上図）および青色ＬＥＤ/eGFP/mCherry（下図）の印加電流に対するエレクトロルミネセンススペクトルおよびηcon。
【図１５】青色ＬＥＤ/eGFP（上図）およびＵＶ−ＬＥＤ/mTagBFP/eGFP/mCherry（下図）の印加電流に対するエレクトロルミネセンススペクトルおよびηcon。
【図１６】上図は、比較のための、構造２（記号）および青色ＬＥＤ（実線）の印加電流に対する発光効率。中図は、１０ｍＡの電流を流したときのＥＬスペクトルの経時変化を示す３Ｄプロット（左図）および構造２を有する実施デバイスの写真（右図）。下図は、１０ｍＡの電流を流したときの構造２の発光効率の相対的経時変化。さらなる詳細については実施例７を参照。
【図１７】上図は、比較のための、構造１（記号）およびＵＶ−ＬＥＤ（実線）の印加電流に対する発光効率。中図は、１００ｍＡの電流を流したときの構造１のＥＬスペクトルの経時変化を示す３Ｄプロット。下図は、１００ｍＡの電流を流したときの構造１の発光効率の相対的経時変化。さらなる詳細については実施例７を参照。
【図１８】実施例８で使用したバイオリアクターの設計および機構。
【図１９】有機ダウンコンバートパッキングを備えた青色ＬＥＤまたはＵＶ−ＬＥＤに基づくＷＨＬＥＤの模式図（実施例９を参照）。
【図２０】上図は、実施例９におけるマトリックスに使用した成分の例、即ち、架橋ポリマー（左図）、ＭＯＦ（中央左）、セルロース（中央右）、未架橋分岐（ｂ−ＰＥＯ）および直鎖（ｌ−ＰＥＯ）ポリエチレンオキシド誘導体（右図）。下図は、実施例９における発光物質の例、即ち、蛍光タンパク質（左図）、小分子（中央左）、ポリマー（中央右）および配位錯体（右図）。
【図２１】重量比１２：１のｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯの混合物と共に水（左図）およびアセトニトリル（右図）を用いて調製したゴム（直径約２．５ｃｍ）およびゲル（マグネチックスターラーに気付く）の写真。
【図２２】異なった質量比ｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯを有する水ベース（白丸）およびアセトニトリルベース（黒丸）ゲルの粘度関数（実施例９を参照）。
【図２３】各付着工程時のアセトニトリルベースゴムの厚さおよび粗さの変化（実施例９を参照）。
【図２４】１２：１（実線）、６：１（破線）および３：１（点線）の異なった質量比ｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯでの水ベースゴム（白丸）およびアセトニトリルベースゴム（黒丸）についての角振動数の関数としての貯蔵率Ｇ’（四角）および損失率Ｇ’’（三角）。
【図２５】上図は、ボール様形状（ルームライト）およびキッチンフォーク、ガラスピペットおよびプラスチックバイアルカップのような不規則３Ｄ表面（λexc＝３１０ｎｍ）に調製したコンパウンド３、４および７を含むゴム材料およびゲル（ルームライト、マグネチックスターラーを含む）の例の写真。中図は、コンパウンド３、４および７の化学構造。下図は、溶液中発光化合物（実線）およびゴム中発光化合物（点線）の発光スペクトル。実施例９を参照。
【図２６】実施例９で使用した、小分子（１〜３）、黒鉛量子ドット（４）、ポリマー（５）および配位錯体（６および７）のような発光物質の化学構造。
【図２７】溶液中発光化合物（実線）およびゴム中発光化合物（点線）の吸収（黒色）および発光（灰色）スペクトル。実施例９を参照。
【図２８】実施例９における水（星）およびアセトニトリル（四角）に基づく参照と比較した、質量比６：１のｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯおよび１（ダイヤモンド）、５（三角）および７（円）を用いて調製した様々なゴムについての貯蔵率の周波数掃引。差異は、ドーパントの存在でなく試料間の変動によって生じることに留意されたい。
【図２９】周囲貯蔵条件下での１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
【図３０】周囲貯蔵条件下で紫外線（３１０ｎｍ；８Ｗ）を照射したときの１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
【図３１】周囲貯蔵条件下で加熱したときの１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
【図３２】溶液中（黒色四角）およびゴム中（灰色三角）におけるコンパウンド１〜７の吸収変化の比較。実施例９を参照。
【図３３】上図は、ＣＣ−ＷＨＬＥＤ（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ各々についての300/200/100μｍおよび200/100/50μｍの値に関する３つの異なった被覆厚さ、即ち、より厚い（実線）、最適（破線）およびより薄い（点線）被覆厚さのＣＣ−ＷＨＬＥＤ（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ（右図）の典型的エレクトロルミネセンススペクトル。下図は、被覆厚さを厚くした場合の発光効率の変化。実施例９を参照。
【図３４】様々な電流を流したときのＳＭ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／１／２／３（上図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／４（下図）のエレクトロルミネセンススペクトル（左図）、および１０ｍＡの駆動電流を流したときの経時的発光効率。周囲条件下で作動するデバイスの写真も提供する（右図）。実施例９を参照。
【図３５】ＳＭ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／１／２／３（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／４のエレクトロルミネセンススペクトルの経時変化（右図）。実施例９を参照。
【図３６】上図は、様々な電流を流したときのＰ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／５（上図）およびＣＣ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／６／７（下図）のエレクトロルミネセンススペクトル（左図）および１０ｍＡの駆動電流を流したときの経時的発光効率（右図）。周囲条件下で作動するデバイスの写真も提供する（右図）。実施例９を参照。
【図３７】Ｐ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／５（左図）およびＣＣ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／６／７（右図）のエレクトロルミネセンススペクトルの経時変化。実施例９を参照。
【図３８】ＣＣ−ＷＨＬＥＤの推定寿命。実施例９を参照。
【図３９】分岐および直鎖ポリマーの様々な組み合わせを伴った溶液中タンパク質の正規化フォトルミネッセンススペクトル。実施例１０（Ａ）、１１（Ｂ）および１２（Ｃ）を参照。
【図４０】時間に対する、貯蔵条件下での水ベースおよびアセトニトリルベースゴム状フィルムの相対的重量変化。実施例１３を参照。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
一般的および好ましい特徴および態様の下記記載は、特に明記されていない限り、（具体的には、上記した本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の態様に従う方法、物および使用を包含する）本明細書に記載の方法、物および使用のそれぞれに関する。
【００３０】
本発明で使用する分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む。従って、分岐ポリマーには、分岐ポリマーの単一部分に各々結合する３つ以上のポリマー分岐が存在する。上記単一部分は、「中心分岐単位」と称される。
【００３１】
分岐ポリマーに含まれる中心分岐単位は、好ましくは３〜８個の置換基で置換されたＣ１〜２０炭化水素基であり、前記置換基は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、分岐ポリマーの少なくとも３個のポリマー分岐の各々は、Ｃ１〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合し；任意に、Ｃ１〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子（例えば１、２、３、４または５個の炭素原子）は、それぞれ独立して、酸素原子、窒素原子または硫黄原子、好ましくは酸素原子に置換されていてよい。少なくとも３個のポリマー分岐の各々は上記炭化水素基の異なった置換基に結合し、そのような中心分岐単位に結合できるポリマー分岐の最大数は炭化水素基の置換基の最大数と同一である、と理解される。上記炭化水素基は、好ましくはＣ３〜２０炭化水素基、より好ましくはＣ３〜１５炭化水素基、特に好ましくはＣ４〜１０炭化水素基である。炭化水素基は、好ましくは３、４、５または６個の置換基で、より好ましくは３、４または５個の置換基で、さらに好ましくは３または４個の置換基で、特に好ましくは３個の置換基で置換されている。炭化水素基の置換基は、それぞれ独立して、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）およびアミノ（−ＮＨ２）から選択され、好ましくは各々ヒドロキシである。ポリマー分岐に結合している置換基がヒドロキシ基である場合、ポリマー分岐には前記ヒドロキシ基がエーテル結合またはエステル結合を介して、好ましくは（例えば例示的分岐ポリマーであるトリメチロールプロパンエトキシレートのような）エーテル結合を介して結合していることが好ましい。ポリマー分岐に結合している置換基がカルボキシ基である場合、ポリマー分岐には前記カルボキシ基がエステル結合またはアミド結合を介して結合していることが好ましい。ポリマー分岐に結合している置換基がアミノ基である場合、ポリマー分岐には前記アミノ基がアミド結合を介して結合していることが好ましい。
【００３２】
従って、中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、前記置換基は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に、Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子（例えば１、２、３、４または５個の炭素原子）は各々酸素原子に置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合していることが好ましい。より好ましくは、中心分岐単位は、３〜８個のヒドロキシ基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、任意に、Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子（例えば１、２、３、４または５個の炭素原子）は各々酸素原子に置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基のヒドロキシ基の１つに結合している。さらに好ましくは、中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基、グリセロール基、ペンタエリスリトール基、ペンタエリスリチオール基、ジグリセロール基、トリグリセロール基、ジペンタエリスリトール基、テトラグリセロール基、ペンタグリセロール基、トリペンタエリスリトール基、ヘキサグリセロール基、トリメタノールアミン基、トリエタノールアミン基、トリイソプロパノールアミン基、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸基、クエン酸基、イソクエン酸基、トリメシン酸基、１，１，１−トリス（アミノメチル）プロパン基、１，１，１−トリス（アミノメチル）エタン基、トリス（アミノメチル）メタン基、プロパン−１，２，３−トリアミン基、トリス（２−アミノエチル）アミン基、およびトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン基から選択される。中心分岐単位はまた、トリ（Ｃ１〜８アルカノール）アミン基またはトリ（ヒドロキシ−Ｃ１〜８アルキレン）アミン基であってよい。特に好ましくは、中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基およびグリセロール基から選択される。最も好ましくは、中心分岐単位は、以下に示すようなトリメチロールプロパン基である。
2018521125.tif 000002
トリメチロールプロパン
【００３３】
分岐ポリマーに含まれる少なくとも３個のポリマー分岐は、互いに同じまたは異なっていてよく、好ましくは同じである。分岐ポリマーが３〜８個のポリマー分岐を有することが好ましくは、より好ましくは３、４、５または６個のポリマー分岐、さらに好ましくは３、４または５個のポリマー分岐、特に好ましくは３または４個のポリマー分岐、最も好ましくは３個のポリマー分岐を有する。ポリマー分岐は直鎖または分岐であってよく、樹枝状に分岐していてもよい。好ましくは、ポリマー分岐の各々は直鎖ポリマーである。より好ましくは、ポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒまたは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキル（例えばメチルまたはエチル）若しくはＣ２〜５アルケニル（例えばビニル）である。ポリ（アルキレンオキシド）は、例えばポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマー〔例えばエチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）とのブロックコポリマー、例えば構造ＥＯ−ＰＯ−ＥＯを有するブロックコポリマー〕であってよく、好ましくはポリ（エチレンオキシド）である。また、ポリ（アルキレンオキシド）は、好ましくは末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有し、より好ましくは末端−ＯＨ基を有する。前記末端基は、中心分岐単位とのポリ（アルキレンオキシド）の結合部に関してポリ（アルキレンオキシド）の異端または反対単に存在する。分岐ポリマーに含まれるポリマー分岐は、より好ましくは、それぞれ独立して、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）および前記コポリマーはそれぞれ末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有し、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである。さらに好ましくは、ポリマー分岐はそれぞれ独立して、末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である。
【００３４】
分岐ポリマーが約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａ、より好ましくは約３００Ｄａ〜約１２００Ｄａの数平均分子量を有することが好ましい。分岐ポリマーが２５°Ｃの温度および１ｂａｒ（１００ｋＰａ）の絶対圧力で水溶性であることがさらに好ましい。
【００３５】
分岐ポリマーがトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）であることが特に好ましい。その構造を以下に示す（ここで、各々の可変ｎは、対応するポリマー分岐の反復エチレンオキシドモノマー単位の数を示す）。
2018521125.tif 000003
トリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）
【００３６】
より好ましくは、分岐ポリマーは、約３００Ｄａ〜約１２００Ｄａ（例えば約４５０Ｄａ、約７３０Ｄａまたは約１０４０Ｄａ）の数平均分子量を有するトリメチロールプロパンエトキシレートであり、さらに好ましくは、分岐ポリマーは、約３５０Ｄａ〜約５５０Ｄａの数平均分子量を有するトリメチロールプロパンエトキシレートであり、最も好ましくは、分岐ポリマーは、約４５０Ｄａの数平均分子量を有するトリメチロールプロパンエトキシレートである。
【００３７】
分岐ポリマーのさらなる例は、トリメチロールプロパンエトキシレートメチルエーテルジアクリレート（ＴＭＰＥＭＥＤ）、例えば、約７０Ｄａ〜約２０００Ｄａ、好ましくは約２００Ｄａ〜約８００Ｄａ、より好ましくは約３８８Ｄａの数平均分子量を有するＴＭＰＥＭＥＤである。
2018521125.tif 000004
トリメチロールプロパンエトキシレートメチルエーテルジアクリレート（ＴＭＰＥＭＥＤ）
【００３８】
分岐ポリマーのさらなる例は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、例えば、約２００Ｄａ〜約３０００Ｄａ、好ましくは約４００Ｄａ〜約１６００Ｄａ、より好ましくは約８００Ｄａの重量平均分子量を有するＰＥＩである。
2018521125.tif 000005
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【００３９】
単独の分岐ポリマー、即ち１種の分岐ポリマーを使用することができ、２つ以上（例えば２、３、４または５）の異なった分岐ポリマーを使用することもできる。
【００４０】
本発明で使用される直鎖ポリマーは、特に限定されない。直鎖ポリマーは、好ましくは約１０ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａ、より好ましくは約５００ｋＤａ〜約７０００ｋＤａの数平均分子量を有することが好ましい。直鎖ポリマーが２５°Ｃの温度および１ｂａｒ（１００ｋＰａ）の絶対圧力で水溶性であることがより好ましい。直鎖ポリマーは、例えば、その２つの末端の各々に、−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒおよび−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒから独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）〔各Ｒは独立してＣ１〜５アルキル（例えばメチルまたはエチル）或いはＣ２〜５アルケニル（例えばビニル）である〕であってよく、または、直鎖ポリマーは、ポリ（アクリル酸）またはポリ（４−スチレンスルホン酸）であってよい。ポリ（アルキレンオキシド）は、例えば、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマー〔例えばエチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）とのブロックコポリマー、例えば構造ＥＯ−ＰＯ−ＥＯを有するブロックコポリマー〕であってよく、好ましくはポリ（エチレンオキシド）である。また、ポリ（アルキレンオキシド）の２つの末端の各々における末端基は、好ましくは、独立して、−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒから選択され、より好ましくは−ＯＨ基である。
【００４１】
従って、直鎖ポリマーが、−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒ（各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである）から独立して選択される末端基を２つの末端の各々に有するポリ（アルキレンオキシド）であることが特に好ましい。より好ましくは、直鎖ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）または前記コポリマーは、−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒ（各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである）から独立して選択される末端基をその２つの末端の各々に有する。さらに好ましくは、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である。特に好ましくは、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有し、約２０００ｋＤａ〜約７０００ｋＤａ、なお好ましくは約４０００ｋＤａ〜約６０００ｋＤａの数平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）である。最も好ましくは、直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有し、約５０００ｋＤａの数平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）である。
【００４２】
直鎖ポリマーのさらなる例は、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）、例えば約１００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａ、好ましくは約２５０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは約５００ｋＤａの数平均分子量を有するＰＥＯｘである。
2018521125.tif 000006
ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）
【００４３】
単独の直鎖ポリマー、即ち１種の直鎖ポリマーを使用することができ、或いは２つ以上（例えば２、３、４または５）の異なった直鎖ポリマーを使用することもできる。
【００４４】
本発明で使用されるタンパク質は特に限定されないが、好ましくは、発光タンパク質または酵素である。発光タンパク質は、好ましくは蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ティール蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、近赤外蛍光タンパク質、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mOrange、mCitrine、tdTomato、mTagBFP、dsRed、UnaG、eqFP611、Dronpa、TagRFPs、KFP、EosFP、DendraまたはIrisFPである。酵素は好ましくは、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、リラーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼである。タンパク質は、発光タンパク質または酵素（例えば上記した特定の発光タンパク質または酵素のいずれか）を含んでなる融合タンパク質であってもよく、それは、場合によりリンカー〔例えばグリシンおよび／またはセリンリッチリンカー、例えばグリシンおよびセリンから独立して選択され、２〜３５個のアミノ酸、好ましくは５〜１０個のアミノ酸からなるリンカー、またはReddy Chichili VPら、Protein Sci. 2013, 22(2)：153-67（同文献の表１を参照してここに組み込む）に記載のいずれか１つのリンカー〕を介して、アダプタータンパク質ドメイン〔例えばSrcホモロジー２ドメイン（SH2ドメイン）、Srcホモロジー３ドメイン（SH3ドメイン）またはポリ（Ａ）結合タンパク質Ｃ末端ドメイン（PABCドメイン）〕に融合されている。ポリマーは、好ましくは、２５°Ｃの温度および１ｂａｒ（１００ｋＰａ）の絶対圧力で水溶性である。単独のタンパク質、即ち１種のたんぱく質を使用することができ、或いは２つ以上（例えば２、３、４または５）の異なったタンパク質、２種以上の異なった発光タンパク質或いは２種以上の異なった酵素を使用することもできる。
【００４５】
分岐ポリマー、直鎖ポリマーおよびタンパク質は、合成化学または分子生物学の分野で知られている方法を用いて製造でき、および／または市販されている。
【００４６】
本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）で使用される水溶液は、特に限定されないが、好ましくは水溶液またはバッファー水溶液である。適当なバッファー水溶液の例は、特に、ホスフェートバッファー、HEPESバッファー、トリスバッファー、MOPSバッファー、MESバッファー、TESバッファー、CHESバッファー、PIPESバッファー、CAPSバッファー、HEPPSバッファー、イミダゾールバッファー、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーを包含する。バッファーのｐＨは、例えばＨＣｌまたはＮａＯＨ（またはＫＯＨ）を用いて、固定化タンパク質に所望されるように、特に、タンパク質が正しく折り畳まれる（例えば約６のｐＨ、約７のｐＨまたは約８のｐＨ）ｐＨに、或いはタンパク質が酵素の場合は酵素活性の最適ｐＨに、調節できる。好ましく例示されるバッファー水溶液はホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、これは、例えばCold Spring Harbor Protocol（doi：10.1101/pdb.rec8247）に従って調製することができる。タンパク質が（例えば約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で）、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファー水溶液中に供給されることが特に好ましい。バッファー水溶液は、１種以上のタンパク質安定剤、例えば、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、硫酸アンモニウム、トレハロース、または市販タンパク質安定剤、例えば「Thermo Scientific Protein Stabilizing Cocktail」（Life Technologies、製品番号89806）をさらに含有してよい。任意の他の水性溶媒または水性媒体（例えば少なくとも約６０体積％の水、好ましくは少なくとも約７０体積％の水、より好ましくは少なくとも約８０体積％の水、さらに好ましくは少なくとも約９０体積％の水、特に好ましくは少なくとも約９５体積％の水を含有するもの）を、タンパク質の安定性を確保するために、上記水溶液に代えて使用してもよい。
【００４７】
被覆および／または印刷の目的に十分な粘度を有するゲルを得るために、本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）で使用される分岐ポリマー、直鎖ポリマーおよびタンパク質の量比または質量比を調整することができる。
【００４８】
特に、本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）において、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを、３：１〜２０：１（分岐ポリマー：直鎖ポリマー）の質量比、より好ましくは４：１〜１５：１の質量比、さらに好ましくは６：１〜１２：１の質量比で混合することが好ましい。
【００４９】
工程（ａ）において分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを質量比約１２：１（分岐ポリマー：直鎖ポリマー）で混合する場合、工程（ａ）で使用する水溶液の総体積は、直鎖ポリマー１ｍｇあたり約１５μＬ〜約５０μＬ、より好ましくは直鎖ポリマー１ｍｇあたり約２０μＬ〜約４０μＬであることが特に好ましい。
【００５０】
本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）において使用されるタンパク質の量は、特に限定されない。例えば、タンパク質は、工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約３質量％〜約３５質量％の量で使用でき、これは、タンパク質が発光タンパク質（例えば蛍光タンパク質）である場合に特に好ましい。タンパク質が発光タンパク質（例えば蛍光タンパク質）である場合、タンパク質が工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約８質量％〜約１５質量％、さらに好ましくは約１０質量％の量で使用されることがより好ましい。タンパク質が酵素である場合、より少ない量が使用できる。例えば、タンパク質が酵素である場合、それは、本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約１質量ｐｐｍ〜約１質量％の量で、好ましくは直鎖ポリマーの質量に対して約０．００１質量％〜約０．５質量％の量で使用できる。
【００５１】
本発明の第一または第三の態様では、工程（ａ）が、第一に、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合する工程、次いで、水溶液中タンパク質を添加し、水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程、任意に前記混合中にさらに水溶液を添加してよい工程を含むことが好ましい。別の態様では、工程（ａ）は、水溶液中タンパク質を供給する工程、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーをタンパク質の水溶液に添加する工程、水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程、任意に前記混合中にさらに水溶液を添加してよい工程によって実施できる。いずれの場合も、工程（ａ）におけるタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーの混合を（例えば１５００ｒｐｍで）撹拌しながら実施することが好ましい。本発明の第一または第三の態様の方法における工程（ａ）を、周囲条件下、特に約１５°Ｃ〜約３５°Ｃ、好ましくは約２０°Ｃ〜約３０°Ｃ、より好ましくは約２５°Ｃの温度で実施することがより好ましい。
【００５２】
本発明の方法は、使用されるポリマーの架橋または硬化を必要とせず、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料（または当該ゴム状材料を得るために乾燥できる対応ゲル）の製造を可能にする点で特に有利である。従って、本発明の第一または第三の態様の方法が、工程（ａ）で混合されるポリマーを熱硬化、ＵＶ硬化または架橋する工程を含まないことが好ましい。方法が、工程（ａ）で混合されるポリマーを共有結合させる工程を含まないことも好ましい。さらに、本発明の様々な態様の各々において、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーが共有結合的に架橋されないことが好ましい。また、（存在する、例えば、本発明の第二の態様のゴム状材料に、または本発明の第四の態様のゲルにおいて）直鎖ポリマーおよび分岐ポリマーが共有結合的架橋を含まないことも好ましい。
【００５３】
本発明の第一の態様の方法では、工程（ｂ）は、その中に固定化されたタンパク質を含有するゴム状材料を得るために、工程（ａ）において得たゲルを乾燥する工程を含む。好ましくは、工程（ｂ）では、ゲルを部分的に脱水して、その中に固定化されたタンパク質を含有するゴム状材料を得る。例えば、ゲルは、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により部分的に脱水してよい。ゲルは、減圧を用いて部分的に脱水することが特に好ましい。従って、工程（ｂ）において、ゲルは、減圧ステーション／チャンバーにおいて（例えば約１ｍｂａｒ〜約１０ｍｂａｒの圧力で約１時間以内の時間、または約１０−５ｂａｒ〜約１０−９ｂａｒの圧力で約５秒〜約５分の時間）部分的に脱水することが好ましい。ゲルを減圧ステーション／チャンバーに導入する前に、ゲルを、任意の被覆または印刷法、特に溶媒ベース技術を用いて基材上に付着させることができる。ゲルを基材上に付着させる技術の例は、特に、ドクターブレード塗布, ロール−トゥ−ロール被覆、回転被覆、グラビア印刷、インクジェット印刷、フレキソ印刷、スクリーン印刷または３Ｄ印刷を包含する。それによりゲルは、後に記載する特定の基材を包含する任意の適当な基材上に付着させることができる。
【００５４】
ゴム状材料は、例えば約１０ｎｍ〜約１０ｍｍ、好ましくは約１０μｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するフィルムの形状で製造できる。
【００５５】
本発明の第二の態様のゴム状材料、または本発明の第一の態様に従って製造したゴム状材料は、基材／担体上にさらに付着させることができる。例えば、ゴム状材料は、例えばピンセットを用いて、基材上に機械的に付着させることができる。本発明は特に、基材上に付着したゴム状材料、および対応する製造方法であって、ゴム状材料を基材上に付着させることを含む方法に関する。別の態様では、基材上に付着したゴム状材料を直接得るために、本発明の第四の態様のゲルを、（例えば本発明の第一の態様の方法の工程（ｂ）に関連して上記したように）対応する基材の上で乾燥させることができる。さらに別の態様では、基材上に付着したゴム状材料は、（ａ）本発明の第四の態様のゲル（または本発明の第三の態様の方法において得たゲル）に基材を導入する工程；および（ｂ）基材上に付着したゴム状材料を得るために基材上ゲルを乾燥する工程を含む方法を用いて製造することもできる。この後者の方法は、三次元基材上にゴム状材料を付着させるのに特に適している。後者の方法の工程（ｂ）では、ゲルを、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により部分的に脱水してよく、好ましくは減圧を用いて部分的に脱水する。この段落に記載した様々な手順の各々は、基材／担体上のゴム状材料層の厚さが所望の厚さ（例えば約２０μｍ〜約１０ｍｍ）に達するまで繰り返すことができる。
【００５６】
ゴム状材料が付着できる基材／担体は特に限定されないが、例えばカルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、変性セファロース、イオン交換樹脂、活性炭、ポリマー、活性膜などの有機材料、および例えばシリカ、粘土、金属酸化物、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、セラミック、ガラスなどの無機材料から選択され得る。軟質基材を使用してもよく、その例は、例えばポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（エチレンナフタレート）、ポリ（イミド）、ポリ（カーボネート）またはそれらの組み合わせ若しくはそれらの誘導体のようなポリマー材料に基づく基材である。基材は、紙または紙状材料を含んでなるか、またはそれからなっていてもよい。好ましくは、ゴム状材料が付着できる基材は、カルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、シリカ、粘土、金属酸化物、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、セラミック、ガラス、紙、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（エチレンナフタレート）、ポリ（イミド）、ポリ（カーボネート）およびそれらの組み合わせから選択される。特に、基材は、上記材料から製造された三次元基材であってよい。
【００５７】
本発明のゴム状材料は、その中に固定化されたタンパク質を（例えば、室温、ルームライトおよび／または湿潤空気のような周囲条件により、高温により、および／または日光暴露により生じる）分解または損傷から保護する。これにより、貯蔵および輸送に関するかなりの利点がもたらされ、さらに、典型的には必要とされ得る高価な冷却システムの使用が不要になる。これによりまた、冷却がしばしば重要な因子である診断用途にとって、ゴム状材料が特に有利になる。従って、本発明の第六の態様では、本発明は、ゴム状材料を診断で使用する前に冷却しない診断における、ゴム状材料のインビトロ使用に関する。本発明はまた、診断で使用する前にゴム状材料を冷却せず貯蔵し、および／または約２０°Ｃ〜約３５°Ｃの温度で貯蔵する、ゴム状材料の診断におけるインビトロ使用に関する。同様に、本発明の第六の態様の診断デバイスまたはキットは、いかなる冷却システムも含まないことが好ましい。診断デバイスまたはキットは、使い捨て診断デバイスまたはキットであってもよい。また、診断デバイスまたはキットは、基材（例えば上記した特定の基材）に付着した（その中に固定化されたタンパク質を含む）ゴム状材料を含んでなるか、またはそれからなってよい。第六の態様で使用されるゴム状材料に固定化されたタンパク質は、好ましくは酵素（例えば上記した特定の酵素）である。
【００５８】
本発明の第五の態様のハイブリッド発光ダイオード（ハイブリッドＬＥＤ）は、例えば、下部の無機ＬＥＤ、場合により無機ＬＥＤ上の第一カプセル、およびその中に固定化された発光タンパク質を含むゴム状材料からなる第二カプセルを含んでなるか、またはそれからなる。この第二カプセルは好ましくは多層であり、無機ＬＥＤの上に直接、または（有機材料および／または無機材料から製造されていてよく、任意の３Ｄ形状を有していてよい）第一カプセルの上に配置されていてよい。第五の態様で使用される発光タンパク質は、先に記載した発光または蛍光タンパク質のいずれであってもよい。無機ＬＥＤにより励起されると、そのような発光タンパク質は、部分的に、高エネルギー光子を低エネルギー光子に転化し、これを合わせると無機ＬＥＤからの非吸収高エネルギー光子になり、無機ＬＥＤの色が変化する。
【００５９】
第五の態様では、本発明は、特に、その中に固定化された発光タンパク質を含むゴム状材料の、ハイブリッドＬＥＤのためのダウンコンバートカスケードエネルギー移動カプセルとしての使用に関する。そのようなカスケードエネルギー移動カプセルは、典型的には、その中に固定化された発光タンパク質を含むゴム状材料の複数層（例えば二層、三層、四層、五層、六層、七層、八層またはそれより多層）を含んでなるか、またはそれからなる。ここで、各対の隣接する層における発光タンパク質は、相補的吸収および放出特性を有する。下層は、例えば、励起時に無機ＬＥＤから高エネルギー光子を放出してよく、それは上層によって低エネルギー光子に一部転化される。無機ＬＥＤからの非吸収高エネルギー光子、ダウンコンバート下層、およびダウンコンバート上層の組み合わせが、好ましくは、白色ＬＥＤをもたらす。このように、その中に固定化された発光タンパク質を含むゴム状材料は、革新的カスケードエネルギー移動カプセル化系を用いた白色発光ダイオードの作製に使用することができ、これにより、多成分単層ダウンコンバートカプセル化系における相分離および励起子損失に関する問題は回避される。デバイスを周囲条件下で運転したとき、本発明の第五の態様のカプセル化系は、高輝度入力および有利な発光効率の下で有利な安定性を有するより高いレンダリング色を特徴とする。さらに、デバイスの発光出力は、ゴム状材料の厚さにより容易に変更でき、従って、全可視スペクトルをカバーする。
【００６０】
本発明によれば、本明細書に記載のゴム状材料の中に、タンパク質以外の分子または材料を固定化／封入することも想定されている。特に、本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の態様を包含する、本明細書に記載の様々な方法、物および使用のいずれかにおいて、各タンパク質に代えて活性材料（特に非タンパク質活性材料）を使用することもでき、本発明はまた、このことにも関する。活性材料（または非タンパク質活性材料）は特に限定されないが、例えば小分子、配位錯体、ポリマー、（特に炭素量子ドットまたは炭素ベース量子ドットを包含する）量子ドット、および（特に発光ナノ粒子を包含する）ナノ粒子から選択され得る。ポルフィリン、ペリレンジイミド（ＰＤＩ）またはその誘導体、クマリン、[Ru(bpy)3][PF6]、[Ir(ppy)2(bpy)][PF6]または[Ir(ppy)2(acac)]（好ましくは[Ru(bpy)3][PF6]または[Ir(ppy)2(acac)]）のような中性／帯電配位錯体、ポリ[(９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレニル−２，７−ジイル)−アルト−(ベンゾ[２，１，３]チアジアゾール−４，８−ジイル)]（Ｆ８ＢＴ）、ポリフルオレン（ＰＦＯ）、ポリ(１，４−フェニレン)（ＰＰＰ）、ポリ(１，４−フェニレンビニレン)（ＰＰＶ）のような発光ポリマー、またはシリカまたはＺｎＯのようなナノ粒子を使用してもよい。特に、例えばPt（II）、Pd（I）、Au（I）、Ru（II）、Ir（III）、Os（II）、Mn（II）、Zn（II）、Mg（II）、Cu（I）またはAl（III）といった金属コアに基づくホモレプティックまたはヘテロレプティック、中性または帯電の配位錯体を、活性材料として使用することができ、Pt（II）、Pd（I）、Au（I）、Ru（II）、Ir（III）、Os（II）、Mn（II）、Cu（I）またはAl（III）という金属コアに基づくホモレプティックまたはヘテロレプティック、中性または帯電の配位錯体が好ましい。同様に、活性材料は、下記群から選択される発光ポリマーであってもよい：２，５−ビス(クロロメチル)−１−メトキシ−４−(２−エチルヘキシルオキシ)ベンゼン、MDMO-PPV、（例えば、４０ｋＤａ〜７０ｋＤａのＭｎ、または７０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＭｎ、または１５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａのＭｎを有する）MEH-PPV、メチルビオロゲンジクロリドヒドレート、ポリ[２，５−ビス(３’，７’−ジメチルオクチルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ[９，９−ビス(２−エチルヘキシル)−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジイル]、ポリ[２−(２’，５’−ビス(２”−エチルヘキシルオキシ)フェニル)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ{[２−[２’，５’−ビス(２”−エチルヘキシルオキシ)フェニル]−１，４−フェニレンビニレン]−コ−[２−メトキシ−５−(２’−エチルヘキシルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]}、ポリ[２，５−ビスオクチルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ(２，５−ビス(１，４，７，１０−テトラオキサウンデシル)−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ(３−シクロヘキシルチオフェン−２，５−ジイル)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−ドデシルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ[(９，９−ジヘキシルフルオレン−２，７−ジイル)−コ−(アントラセン−９，１０−ジイル)]、ポリ[(９，９−ジヘキシルフルオレン−２，７−ジイル)−アルト−(２，５−ジメチル−１，４−フェニレン)]、ポリ[(９，９−ジヘキシルフル���レン−２，７−ジイル)−コ−(９−エチルカルバゾール−２，７−ジイル)]、ポリ(９，９−ｎ−ジヘキシル−２，７−フルオレン−アルト−９−フェニル−３，６−カルバゾール)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−ヘキシルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ(２，５−ジヘキシルオキシ−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ(２，５−ジオクチルフェニレン−１，４−エチレン)、ポリ(２，５−ジオクチル−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ[５−メトキシ−２−(３−スルホプロポキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ(３−オクチルチオフェン−２，５−ジイル)レジオランダム、ポリ[(ｍ−フェニレンビニレン)−アルト−(２，５−ジヘキシルオキシ−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｏ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｍ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｐ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[トリス(２，５−ビス(ヘキシルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン)−アルト−(１，３−フェニレンビニレン)]、（約１１００ｋＤａの重量平均分子量を有する）ポリ(９−ビニルカルバゾール)およびポリ(ｐ−キシレンテトラヒドロチオフェニウムクロリド)。または、活性材料は、Pei Q, Material Matters, 2007, 2.3, 26に記載の発光ポリマーであってもよい。活性材料はまた、非タンパク質染料、特に蛍光染料またはリン光性染料であってもよい。活性材料として使用できる例示的な染料、特に非タンパク質蛍光染料は、以下を包含するが、これらに限定されない：７−アミノアクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、Alexa Fluor染料、ATTO染料、ベンズアントロン、ビマン、９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、５，１２−ビス(フェニルエチニル)ナフタセン、ビスベンズイミド、カルセイン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、１−クロロ−９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、２−クロロ−９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、２−クロロ−９，１０−ジフェニルアントラセン、クマリン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（DiOC6）、DyLight Fluor染料、エピコッコノン、FlAsH-EDT2、Fluo-3、Fluo-4、FluoProbes染料、Fura-2、Fura-2−アセトキシメチルエステル、ヘプタメチン染料（例えばIR-780またはIR-808）、イミノクマリン、インディアンイエロー、ヨード−１、ラウルダン、ルシファーイエロー、メロシアニン（例えばメロシアニン５４０）、ナイルレッド、ペリレン、フロキシンＢ、フィコビリン（例えばフィコエリトロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリンまたはフィコシアノビリン）、ピラニン、ローダミン（例えばローダミンＢ、ローダミン１２３またはローダミン６Ｇ）、RiboGreen、ルブレン、（Ｅ）−スチルベン、（Ｚ）−スチルベン、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ、SYBR Green I、SYBR Safe、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス(バトフェナントロリンジスルフェート)ルテニウム（II）、テキサスレッド、チタンイエロー、６−メトキシ−(８−ｐ−トルエンスルホンアミド)キノリン（ＴＳＱ）、ウンベリフェロン、ビオラントロンまたはYOYO-1。好ましくは、上記活性材料として使用される非タンパク質蛍光染料は、キサンタン化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンまたはテキサスレッド）、シアニン化合物（例えばシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンまたはメロシアニン）、スクアライン化合物（例えばSetaまたはSeTau）、ナフタレン化合物（例えばダンシル化合物またはプロダン化合物）、クマリン化合物、オキサジアゾール化合物（例えばピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサゾールまたはベンズオキサゾール）、アントラセン化合物（例えば、DRAQ5、DRAQ7またはCyTRAK Orangeのようなアントラキノン）、ピレン化合物（例えばカスケードブルー）、オキサジン化合物（例えばナイルレッド、ナイルブルー、クレジルバイオレットまたはオキサジン１７０）、アクリジン化合物（例えばプロフラビン、アクリジンオレンジまたはアクリジンイエロー）、アリールメチン化合物（例えばオーラミン、クリスタルバイオレットまたはマラカイトグリーン）およびテトラピロール化合物（例えばポルフィン、フタロシアニンまたはビリルビン）から選択される。特に本発明の第五の態様の照明用途のために、その中に固定化された（上記した任意の染料を包含する）染料を含むゴム状材料を使用できる。活性材料は、その中に溶解できる適当な溶媒中、例えば水溶液（例えば水）中またはアセトニトリル（実施例２、特に多種多様な溶媒の適性を評価た表３を参照）中で使用できる。従って、本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六または第七の態様において使用されるタンパク質を（上記したような）活性材料に置き換える場合、活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを溶解するために、水溶液を使用してよいだけでなく、水溶液に代えて他の溶媒（例えばアセトニトリル）も使用できる。分岐ポリマーに活性材料を溶解し、次いで水および直鎖ポリマーを加え、活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合することもでき、このことは、分岐ポリマーに溶解できる活性材料にとって好ましいアプローチである。
【００６１】
特に記載されていない限り、明細書全体にわたって下記定義を適用する。
【００６２】
本明細書において使用される用語「ポリマー」は、同じ構造の反復単位（モノマー単位または反復モノマー単位とも称する）を２以上（例えば５以上、好ましくは１０以上）含む分子を意味する。
【００６３】
用語「直鎖ポリマー」は、モノマー単位が直鎖状、即ち単一直鎖状に結合しているポリマーを意味する。直鎖ポリマーは、分岐状または架橋状にモノマー単位を結合する共有結合または共有結合基を有さない。
【００６４】
用語「分岐ポリマー」は、少なくとも１つの分岐点（または分岐基）を含むポリマーであって、その全体にわたって３以上のモノマー単位が共有結合しているポリマーを意味する。従って、「分岐ポリマー」の分岐は完全モノマー単位からなる。一方、個々のモノマー単位に側鎖を有する（例えばポリスチレン）直鎖ポリマーは、分岐ポリマーの構成要素ではない。
【００６５】
用語「炭化水素基」は、炭素原子および水素原子からなる基を意味する。「Ｃ１〜２０炭化水素基」は、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基を意味する。
【００６６】
用語「アルキル」は、直鎖または分岐であってよい一価飽和非環式（即ち非環状）炭化水素基を意味する。従って、「アルキル」基は炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を含まない。「Ｃ１〜５アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。好ましい例としてのアルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えばｎ−プロピルまたはイソプロピル）またはブチル（例えばｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル）である。
【００６７】
用語「アルキレン」は、アルカンジイル基、即ち、直鎖または分岐であってよい二価飽和非環式炭化水素基を意味する。特に記載のない限り、用語「アルキレン」は、好ましくは、（特に直鎖Ｃ１〜４アルキレンを包含する）Ｃ１〜４アルキレンを意味し、より好ましくはメチレンまたはエチレンを意味する。
【００６８】
用語「アルケニル」は、直鎖または分岐であってよく、１以上（例えば１または２）の炭素−炭素二重結合を有する一方で炭素−炭素三重結合を有さない一価不飽和非環式炭化水素基を意味する。用語「Ｃ２〜５アルケニル」は、２〜５個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。好ましい例としてのアルケニル基は、エチニル、プロペニル（例えばプロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、またはプロプ−２−エン−１−イル）、ブテニル、ブタジエニル（例えばブタ−１，３−ジエン−１−イルまたはブタ−１，３−ジエン−２−イル）、ペンテニルまたはペンタジエニル（例えばイソプレニル）である。
【００６９】
成分の用語「数平均分子量」（または「Ｍｎ」）は、対応する成分（例えば分岐ポリマーまたは直鎖ポリマー）の各分子の分子量の平均（算術平均）を意味する。数平均分子量（Ｍｎ）は以下のように定義される：
【数１】
2018521125.tif 000007
［ここで、Ｎｉは分子量Ｍｉを有する各成分の分子の数であり、合計は存在する対応する成分の全ての分子量を含む］。成分（例えば分岐ポリマーまたは直鎖ポリマー）の数平均分子量は、当技術分野で知られている方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、粘度測定（粘度計）、浸透圧測定、光散乱測定（例えばZimm法を用いた）、束一的方法（例えば、蒸気圧浸透法、沸点上昇、凝固点降下または蒸気圧降下）、末端基測定または１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定できる。数平均分子量はＧＰＣまたは粘度測定を用いて測定することが好ましく、より好ましくはＧＰＣを用いる。ＧＰＣシステムは、較正標準としての分散度Ｍｗ／Ｍｎ＜１．１０（理想的にはＭｗ／Ｍｎ＝１）を有するアニオン性ポリマー化ポリスチレンに対して較正することができる。例えば、数平均分子量は、標準として（例えば上記したような）ポリスチレンを用い、４０°Ｃで、溶媒としてテトラヒドロフランを用い、カラムGMHHR-H（Tosoh Bioscience LLC）を備えたＧＰＣ装置C0-8011（Tosoh Bioscience LLC）を用いてＧＰＣにより測定できる。この方法では、溶媒として、テトラヒドロフランに代えて水を使用することもできる。別の態様では、数平均分子量は、標準として（例えば上記したような）ポリスチレンを用い、示差屈折率検出器を用い、４００ｍＬの注入量、約１ｍｇ／ｍＬの試料濃度で、１．０ｍＬ／分の流速で溶媒／キャリヤーとしてｏ−ジクロロベンゼンを用いて、１４０°Ｃで、Shodex Packed Column A-80M（昭和電工株式会社）を備えたＧＰＣ装置150（Waters Corporation）を用いてＧＰＣにより測定できる。数平均分子量を、標準としてポリスチレン（例えば分散度Ｍｗ／Ｍｎ＜１．１０を有するアニオン性ポリマー化ポリスチレン）を用い、示差屈折率検出器を用い、４００ｍＬの注入量、１．０ｍＬ／分の流速で約１ｍｇ／ｍＬの試料濃度で、溶媒として水を用い、４０°Ｃで、Shodex Packed Column A-80M（昭和電工株式会社）を備えたＧＰＣ装置150C（Waters Corporation）を用いてＧＰＣにより測定することが特に好ましい。
【００７０】
用語「タンパク質」は、本明細書において「ポリペプチド」または「ペプチド」と同義で使用され、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基との間に形成されたアミド結合により結合した、２以上のアミノ酸（好ましくは１０以上のアミノ酸、より好ましくは２０以上のアミノ酸、さらにより好ましくは５０以上のアミノ酸、さらにより好ましくは１００以上のアミノ酸、さらにより好ましくは１５０以上のアミノ酸、特に好ましくは２００以上のアミノ酸）のポリマーを意味する。タンパク質に含まれている（アミノ酸残基とも称される）アミノ酸は、２０の標準的なタンパク質を構成するα−アミノ酸（即ち、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびVal）から、またタンパク質を構成しないおよび／または非標準的なα−アミノ酸（例えばオルニチン、シトルリン、ホモリジン、ピロリジンまたは４−ヒドロキシプロリン）、およびβ−アミノ酸（例えばβ−アラニン）、γ−アミノ酸およびδ−アミノ酸から選択され得る。タンパク質に含まれるアミノ酸残基は、好ましくはα−アミノ酸から、より好ましくは（Ｌ−異性体またはＤ−異性体として存在でき、好ましくはＬ−異性体として存在する全てである）２０の標準的なタンパク質を構成するα−アミノ酸から選択される。タンパク質は、未変性であってもよいし、例えばそのＮ末端、そのＣ末端、および／またはそのアミノ酸残基の側鎖における官能基（特に１以上のLys、His、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asp、Gluおよび／またはArg残基の側鎖官能基）で変性されていてもよい。そのような変性は、例えば、Wuts PG & Greene TW, Greene's protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons, 2006における対応する官能基について記載した保護基の結合を包含してよい。そのような変性はまた、（ＰＥＧ化ペプチドまたはタンパク質を生成する）１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の共有結合、グリコシル化および／または１以上の脂肪酸によるアシル化（例えば１以上のＣ８〜３０アルカンまたはアルケン酸；脂肪酸アシル化ペプチドまたはタンパク質の生成）を包含してよい。また、そのような変性は、好ましくは、１以上の蛍光染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンまたはテキサスレッドを包含する本明細書に記載の非タンパク質蛍光染料）および／または１以上のリン光性染料の共有結合を包含する。特に記載のない限り、タンパク質が未変性であることが一般に好ましい。タンパク質に含まれるアミノ酸残基は、例えば（直鎖タンパク質を形成する）直鎖分子鎖として存在してよく、また１以上の環を形成していてもよい（環式タンパク質に相当する）。タンパク質は、２以上の同じまたは異なった分子からなるオリゴマーを形成していてもよい。タンパク質は、例えば約２００〜約８００のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなっていてよく、或いは、約２０ｋＤａ〜約８００ｋＤａの分子量を有していてもよい。
【００７１】
用語「ゴム状材料」は、粘度および弾性に関してゴムと同じまたは類似の性質を有する材料を意味する。この用語は、本明細書において、「弾性材料」、「エラストマー材料」、「エラストマー」、「ゴム材料」、「ゴムマトリックス」、「ゴム」または「合成ゴム」と同義に用いる。特に、本明細書が「ゴム状材料」を記載する場合、これは、「弾性材料」または「エラストマー材料」に関すると理解すべきであり、従って、用語「ゴム状材料」は本明細書全体において用語「弾性材料」または用語「エラストマー材料」と同義（即ち、入れ替え可能）である。
【００７２】
用語「含んでなる」（または「含む」または「含有する」）は、特に記載のない限りまたは逆のことが記載されていない限り、「とりわけ含有する」、即ち「別の任意の要素と一緒に…を含有する」を意味する。また、この用語は、より狭い意味である「本質的に…からなる」および「からなる」も包含する。例えば、用語「ＢおよびＣを含んでなるＡ」は、「とりわけＢおよびＣを含有するＡ」を意味し、Ａは別の任意の要素を含有してよく（例えば「Ｂ、ＣおよびＤを含有するＡ」も包含する）、さらに、この用語は、「本質的にＢおよびＣからなるＡ」および「ＢおよびＣからなるＡ」（即ち、ＢおよびＣ以外の成分はＡに含まれない）も包含する。
【００７３】
用語「約」は、記載数値、例えば記載数値の±１０％、記載数値の±５％を近似的に意味する。用語「約」を使用する場合、記載されている正確な数値の特定の参照も包含する。例えば、表現「約１００」は、９０〜１１０の範囲、特に９５〜１０５の範囲を意味し、好ましくは１００という特定の値を意味する。範囲の両端で用語「約」を使用する場合、それは、その記載数値の下限値−１０％〜その記載数値の上限値＋１０％の範囲、特にその記載数値の下限値−５％〜その記載数値の上限値＋５％の範囲を意味し、好ましくは、下限値の正確な数値と上限値の正確な数値とに規定された範囲を意味する。例えば、表現「約１０〜約２０」は、９〜２２の範囲、特に９．５〜２１の範囲を意味し、好ましくは１０〜２０を意味する。オープンエンド範囲の両端で用語「約」を使用する場合、それは、下限値−１０％からまたは上限値＋１０％からの対応する範囲、特に下限値−５％からまたは上限値＋５％からの対応する範囲を意味し、好ましくは、対応する端の正確な数値に規定されたオープンエンド範囲を意味する。例えば、表現「少なくとも約１０％」は、少なくとも９％、特に少なくとも９．５％、好ましくは少なくとも１０％を意味する。
【００７４】
本発明は特に、本明細書に記載の方法、物および使用の（一般的および／または好ましい特徴／態様のあらゆる組み合わせを包含する）特徴および態様の各々の組み合わせに言及していると理解すべきである。
【００７５】
本明細書において、特許出願、科学文献および製造メーカーのマニュアルを包含する多数の文献を引用している。本発明の特許性に関係すると考えられないが、これらの文献の開示の全てを引用してここに組み込む。より具体的には、個々の文献が参照して組み込まれて具体的かつ個々に記載されている場合と同程度に、全ての参考文献は参照してここに組み込まれる。
【００７６】
本発明は特に、下記項目に関する：
１．（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および
（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る工程；
を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
２．（ａ）水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程
を含むゲルの製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
３．分岐ポリマーは約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの数平均分子量を有する、上記項目１または２に記載の方法。
４．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ１〜２０炭化水素基であり、前記置換基はそれぞれ独立してヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に前記Ｃ１〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子により置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ１〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合している、上記項目１〜３のいずれかに記載の方法。
５．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、前記置換基はそれぞれ独立してヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に前記Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ酸素原子により置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合している、上記項目１〜４のいずれかに記載の方法。
６．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個のヒドロキシ基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、任意に前記Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ酸素原子により置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基のヒドロキシ基の１つに結合している、上記項目１〜５のいずれかに記載の方法。
７．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基、グリセロール基、ペンタエリスリトール基、ペンタエリスリチオール基、ジグリセロール基、トリグリセロール基、ジペンタエリスリトール基、テトラグリセロール基、ペンタグリセロール基、トリペンタエリスリトール基、ヘキサグリセロール基、トリメタノールアミン基、トリエタノールアミン基、トリイソプロパノールアミン基、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸基、クエン酸基、イソクエン酸基、トリメシン酸基、１，１，１−トリス（アミノメチル）プロパン基、１，１，１−トリス（アミノメチル）エタン基、トリス（アミノメチル）メタン基、プロパン−１，２，３−トリアミン基、トリス（２−アミノエチル）アミン基およびトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン基から選択される、上記項目１〜４のいずれかに記載の方法。
８．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基およびグリセロール基から選択される、上記項目１〜７のいずれかに記載の方法。
９．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基である、上記項目１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．分岐ポリマーに含まれる前記した少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒまたは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである、上記項目１〜９のいずれかに記載の方法。
【００７７】
１１．分岐ポリマーに含まれる前記した少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである、上記項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．分岐ポリマーに含まれる前記した少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）および前記コポリマーは各々、末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有し、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．分岐ポリマーに含まれる前記した少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、上記項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３〜８個有する、上記項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３または４個有する、上記項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３個有する、上記項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．分岐ポリマーはトリメチロールプロパンエトキシレートである、上記項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．トリメチロールプロパンエトキシレートは約３００Ｄａ〜約１２００Ｄａの数平均分子量を有する、上記項目１７に記載の方法。
１９．トリメチロールプロパンエトキシレートは約４５０Ｄａ、約７３０Ｄａまたは約１０４０Ｄａの数平均分子量を有する、上記項目１７または１８に記載の方法。
２０．トリメチロールプロパンエトキシレートは約４５０Ｄａの数平均分子量を有する、上記項目１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【００７８】
２１．直鎖ポリマーは約１０ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．直鎖ポリマーは約５００ｋＤａ〜約７０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒおよび−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒから独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルであるか、或いは直鎖ポリマーはポリ（アクリル酸）またはポリ（４−スチレンスルホン酸）である、上記項目１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒから独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．直鎖ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）および前記コポリマーは各々、その２つの末端の各々に末端基を有し、末端基は−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒから独立して選択され、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記項目１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、上記項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．直鎖ポリマーは約５０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記項目２６に記載の方法。
２８．タンパク質は発光タンパク質である、上記項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．タンパク質は酵素である、上記項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
３０．タンパク質は、場合によりリンカーを介して、アダプタータンパク質ドメインに融合された、発光タンパク質または酵素を含んでなる融合タンパク質である、上記項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００７９】
３１．発光タンパク質は蛍光タンパク質である、上記項目２８または３０に記載の方法。
３２．蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ティール蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、近赤外蛍光タンパク質、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mOrange、mCitrine、tdTomato、mTagBFP、dsRed、UnaG、eqFP611、Dronpa、TagRFPs、KFP、EosFP、DendraおよびIrisFPから選択される、上記項目３１に記載の方法。
３３．酵素は、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼである、上記項目２９または３０に記載の方法。
３４．アダプタータンパク質ドメインは、SH2ドメイン、SH3ドメインおよびPABCドメインから選択される、上記項目３０または上記従属項目３１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．工程（ａ）は、まず分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合し、次いで水溶液中タンパク質を添加し、水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成し、任意に前記混合中にさらなる水溶液を添加してよいことを含む、上記項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．工程（ａ）は、水溶液中タンパク質を供給し、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーをタンパク質の水溶液に添加し、水溶液中でタンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成し、任意に前記混合中にさらなる水溶液を添加してよいことを含む、上記項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
３７．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において３：１〜２０：１の質量比で混合する、上記項目１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において４：１〜１５：１の質量比で混合する、上記項目１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において６：１〜１２：１の質量比で混合する、上記項目１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．タンパク質は、工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約３質量％〜３５質量％の量で使用する、上記項目１〜３９のいずれかに記載の方法。
【００８０】
４１．タンパク質は、工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約１０質量％の量で使用する、上記項目１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．水溶液は水またはバッファー水溶液である、上記項目１〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．水溶液は、ホスフェートバッファー、HEPESバッファー、トリスバッファー、MOPSバッファー、MESバッファー、TESバッファー、CHESバッファー、PIPESバッファー、CAPSバッファー、HEPPSバッファー、イミダゾールバッファー、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー、クエン酸バッファーおよび酢酸バッファーから選択されるバッファー水溶液である、上記項目１〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において、約１２：１の質量比で混合し、工程（ａ）で用いる水溶液の総体積は、直鎖ポリマー１ｍｇあたり約１５μＬ〜約５０μＬである、上記項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．工程（ａ）で用いる水溶液の総体積は、直鎖ポリマー１ｍｇあたり約２０μＬ〜約４０μＬである、上記項目４４に記載の方法。
４６．方法は、工程（ａ）で混合されるポリマーを熱硬化、ＵＶ硬化または架橋する工程を含まない、上記項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．方法は、工程（ａ）で混合されるポリマーを共有結合させる工程を含まない、上記項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
４８．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは共有結合的に架橋されない、上記項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
４９．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは共有結合的架橋を含まない、上記項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
５０．工程（ｂ）において、ゲルを部分的に脱水して、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を得る、上記項目１または上記従属項目３〜４９のいずれかに記載の方法。
【００８１】
５１．工程（ｂ）において、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により、ゲルを部分的に脱水する、上記項目１または上記従属項目３〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．工程（ｂ）において、減圧を用いてゲルを部分的に脱水する、上記項目１または上記従属項目３〜５０のいずれかに記載の方法。
５３．工程（ｂ）において、減圧ステーション／チャンバーでゲルを部分的に脱水する、上記項目１または上記従属項目３〜５０のいずれかに記載の方法。
５４．工程（ｂ）において、約１ｍｂａｒ〜約１０ｍｂａｒの圧力で約１時間未満の間、減圧ステーション／チャンバーでゲルを部分的に脱水する、上記項目１または上記従属項目３〜５０のいずれかに記載の方法。
５５．減圧ステーション／チャンバーに導入する前に、溶媒ベース技術を用いて基材上にゲルを付着させる、上記項目５３または５４に記載の方法。
５６．減圧ステーション／チャンバーに導入する前に、ドクターブレード塗布、ロール−トゥ−ロール被覆、回転被覆、グラビア印刷または３Ｄ印刷により基材上にゲルを付着させる、上記項目５３〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．ゴム状材料は約１０ｎｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するフィルムの形状に製造される、上記項目１または上記従属項目３〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．ゴム状材料は約１０μｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するフィルムの形状に製造される、上記項目１または上記従属項目３〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．上記項目１または上記従属項目３〜５８のいずれかに記載の方法によって得られる、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料。
６０．ゴム状材料は分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなり、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料。
【００８２】
６１．上記項目２または上記従属項目３〜４９のいずれかに記載の方法によって得られるゲル。
６２．タンパク質、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなるゲルであって、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゲル。
６３．基材上に付着したゴム状材料の製造方法であって、上記項目５９または６０に記載のゴム状材料を基材上に付着させる工程を含む、方法。
６４．（ａ）上記項目６１または６２に記載のゲルに基材を導入する工程；および
（ｂ）基材上のゲルを乾燥させて、基材上に付着したゴム状材料を得る工程
を含む、基材上に付着したゴム状材料の製造方法。
６５．工程（ｂ）において、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により、ゲルを部分的に脱水する、上記項目６４に記載の方法。
６６．工程（ｂ）において、減圧を用いてゲルを部分的に脱水する、上記項目６４に記載の方法。
６７．基材上に付着されている、上記項目５９または６０に記載のゴム状材料。
６８．基材は三次元基材である、上記項目６３〜６６のいずれかに記載の方法或いは上記項目６７に記載のゴム状材料。
６９．基材は、カルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、シリカ、粘土、金属酸化物、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、セラミック、ガラス、紙、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（エチレンナフタレート）、ポリ（イミド）、ポリ（カーボネート）およびそれらの組み合わせから選択される、上記項目６３〜６６および６８のいずれかに記載の方法或いは上記項目６７または６８に記載のゴム状材料。
７０．ハイブリッド発光ダイオード用ダウンコンバート材料としての、上記項目５９または６０に記載のゴム状材料の使用であって、ゴム状材料中に固定されているタンパク質は発光タンパク質である、使用。
【００８３】
７１．ハイブリッド発光ダイオードのためのダウンコンバートカスケードエネルギー移動カプセルとしての上記項目５９または６０に記載のゴム状材料の使用であって、ゴム状材料中に固定されているタンパク質は発光タンパク質である、使用。
７２．発光ダイオードおよび被膜を含んでなるハイブリッド発光ダイオードであって、被膜は上記項目５９または６０に記載のゴム状材料の層を１つ以上含む、ハイブリッド発光ダイオード。
７３．ハイブリッド発光ダイオードはハイブリッド白色発光ダイオードである、上記項目７０または７１に記載の使用または上記項目７２に記載のハイブリッド発光ダイオード。
７４．上記項目５９、６０および６７〜６９のいずれかに記載のゴム状材料の、診断におけるインビトロ使用。
７５．上記項目５９、６０および６７〜６９のいずれかに記載のゴム状材料の、診断用デバイスまたはキットにおける使用。
７６．上記項目５９、６０および６７〜６９のいずれかに記載のゴム状材料を含んでなる診断用デバイスまたはキット。
７７．診断における使用前にゴム状材料は冷却されていない、上記項目７４に記載の使用。
７８．診断における使用前にゴム状材料は冷却を伴わずに貯蔵されている、上記項目７４に記載の使用。
７９．診断における使用前にゴム状材料は約２０°Ｃ〜約３５°Ｃの温度で貯蔵されている、上記項目７４に記載の使用。
８０．デバイスまたはキットは冷却システムを含まない、上記項目７５に記載の使用或いは上記項目７６に記載の診断デバイスまたはキット。
【００８４】
８１．ゴム状材料に固定化されたタンパク質は酵素である、上記項目７４、７５および７７〜８０のいずれかに記載の使用或いは上記項目７６または８０に記載の診断デバイスまたはキット。
８２．診断デバイスまたはキットは使い捨て診断デバイスまたはキットである、上記項目７５、８０または８１に記載の使用或いは上記項目７６、８０または８１に記載の診断デバイスまたはキット。
８３．ゴム状材料に固定化されたタンパク質は酵素である、バイオリアクターにおける上記項目５９、６０および６７〜６９のいずれかに記載のゴム状材料の使用。
８４．ゴム状材料に固定化されたタンパク質は酵素である、上記項目５９、６０および６７〜６９のいずれかに記載のゴム状材料を含んでなるバイオリアクター。
【００８５】
本発明はまた、以下の態様に関する。
１．（ａ）溶媒中で活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および
（ｂ）ゲルを乾燥し、その中に固定化された活性材料を含むゴム状材料を得る工程；
を含む、その中に固定化された活性材料を含むゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
２．（ａ）溶媒中で活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程
を含むゲルの製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
３．活性材料は非タンパク質活性材料である、上記態様１または２に記載の方法。
４．活性材料は、小分子、配位錯体、ポリマー、量子ドットおよびナノ粒子から選択される、上記態様１〜３のいずれかに記載の方法。
５．活性材料は、ポルフィリン、ペリレンジイミドまたはその誘導体、クマリン、中性または帯電配位錯体、発光ポリマー、ポリフルオレン、ポリ(１，４−フェニレン)、ポリ(１，４−フェニレンビニレン)および発光ナノ粒子から選択される、上記態様１〜４のいずれかに記載の方法。
６．活性材料は、Pt（II）、Pd（I）、Au（I）、Ru（II）、Ir（III）、Os（II）、Mn（II）、Zn（II）、Mg（II）、Cu（I）またはAl（III）の金属コアに基づく、ホモレプティックまたはヘテロレプティック、中性または帯電配位錯体である、上記態様５に記載の方法。
７．活性材料は、[Ru(bpy)3][PF6]、[Ir(ppy)2(bpy)][PF6]および[Ir(ppy)2(acac)]から選択される配位錯体である、上記態様５に記載の方法。
８．活性材料は、ポリ[(９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレニル−２，７−ジイル)−アルト−(ベンゾ[２，１，３]チアジアゾール−４，８−ジイル)]である発光ポリマーである、上記態様５に記載の方法。
９．活性材料は、シリカおよびＺｎＯから選択されるナノ粒子である、上記態様５に記載の方法。
１０．活性材料は、２，５−ビス(クロロメチル)−１−メトキシ−４−(２−エチルヘキシルオキシ)ベンゼン、MDMO-PPV、MEH-PPV、メチルビオロゲンジクロリドヒドレート、ポリ[２，５−ビス(３’，７’−ジメチルオクチルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ[９，９−ビス(２−エチルヘキシル)−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジイル]、ポリ[２−(２’，５’−ビス(２”−エチルヘキシルオキシ)フェニル)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ{[２−[２’，５’−ビス(２”−エチルヘキシルオキシ)フェニル]−１，４−フェニレンビニレン]−コ−[２−メトキシ−５−(２’−エチルヘキシルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]}、ポリ[２，５−ビスオクチルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ(２，５−ビス(１，４，７，１０−テトラオキサウンデシル)−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ(３−シクロヘキシルチオフェン−２，５−ジイル)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−ドデシルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ[(９，９−ジヘキシルフルオレン−２，７−ジイル)−コ−(アントラセン−９，１０−ジイル)]、ポリ[(９，９−ジヘキシルフルオレン−２，７−ジイル)−アルト−(２，５−ジメチル−１，４−フェニレン)]、ポリ[(９，９−ジヘキシルフルオレン−２，７−ジイル)−コ−(９−エチルカルバゾール−２，７−ジイル)]、ポリ(９，９−ｎ−ジヘキシル−２，７−フルオレン−アルト−９−フェニル−３，６−カルバゾール)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−ヘキシルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ(２，５−ジヘキシルオキシ−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ(９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレニル−２，７−ジイル)、ポリ(２，５−ジオクチルフェニレン−１，４−エチレン)、ポリ(２，５−ジオクチル−１，４−フェニレンビニレン)、ポリ[５−メトキシ−２−(３−スルホプロポキシ)−１，４−フェニレンビニレン]、ポリ(３−オクチルチオフェン−２，５−ジイル)レジオランダム、ポリ[(ｍ−フェニレンビニレン)−アルト−(２，５−ジヘキシルオキシ−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｏ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｍ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[(ｐ−フェニレンビニレン)−アルト−(２−メトキシ−５−(２−エチルヘキシルオキシ)−ｐ−フェニレンビニレン)]、ポリ[トリス(２，５−ビス(ヘキシルオキシ)−１，４−フェニレンビニレン)−アルト−(１，３−フェニレンビニレン)]、ポリ(９−ビニルカルバゾール)およびポリ(ｐ−キシレンテトラヒドロチオフェニウムクロリド）から選択される発光ポリマーである、上記態様１〜４のいずれかに記載の方法。
【００８６】
１１．活性材料は非タンパク質染料であり、好ましくは蛍光染料またはリン光性染料である、上記態様１〜３のいずれかに記載の方法。
１２．活性材料は、７−アミノアクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、Alexa Fluor染料、ATTO染料、ベンズアントロン、ビマン、９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、５，１２−ビス(フェニルエチニル)ナフタセン、ビスベンズイミド、カルセイン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、１−クロロ−９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、２−クロロ−９，１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、２−クロロ−９，１０−ジフェニルアントラセン、クマリン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド、DyLight Fluor染料、エピコッコノン、FlAsH-EDT2、Fluo-3、Fluo-4、FluoProbes染料、Fura-2、Fura-2−アセトキシメチルエステル、ヘプタメチン染料、IR-780、IR-808、イミノクマリン、インディアンイエロー、ヨード−１、ラウルダン、ルシファーイエロー、メロシアニン、メロシアニン５４０、ナイルレッド、ペリレン、フロキシンＢ、フィコビリン、フィコエリトロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリン、フィコシアノビリン、ピラニン、ローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、RiboGreen、ルブレン、（E）−スチルベン、（Z）−スチルベン、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ、SYBR Green I、SYBR Safe、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス(バトフェナントロリンジスルフェート)ルテニウム（II）、テキサスレッド、チタンイエロー、６−メトキシ−(８−ｐ−トルエンスルホンアミド)キノリン、ウンベリフェロン、ビオラントロンおよびYOYO-1から選択される非タンパク質蛍光染料である、上記態様１〜３および１１のいずれかに記載の方法。
１３．活性材料は、キサンタン化合物、シアニン化合物、スクアライン化合物、ナフタレン化合物、クマリン化合物、オキサジアゾール化合物、アントラセン化合物、ピレン化合物、オキサジン化合物、アクリジン化合物、アリールメチン化合物およびテトラピロール化合物から選択される非タンパク質蛍光染料である、上記態様１〜３および１１のいずれかに記載の方法。
１４．非タンパク質蛍光染料は、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンおよびテキサスレッドから選択されるキサンタン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
１５．非タンパク質蛍光染料は、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンおよびメロシアニンから選択されるシアニン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
１６．非タンパク質蛍光染料は、SetaおよびSeTauから選択されるスクアライン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
１７．非タンパク質蛍光染料は、ダンシルまたはプロダン化合物であるナフタレン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
１８．非タンパク質蛍光染料は、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサゾールおよびベンズオキサゾールから選択されるオキサジアゾール化合物である、上記態様１３に記載の方法。
１９．非タンパク質蛍光染料は、アントラキノンであるアントラセン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２０．アントラセン化合物は、DRAQ5、DRAQ7およびCyTRAK Orangeから選択される、上記態様１３または１９に記載の方法。
【００８７】
２１．非タンパク質蛍光染料は、カスケードブルーであるピレン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２２．非タンパク質蛍光染料は、ナイルレッド、ナイルブルー、クレジルバイオレットおよびオキサジン１７０から選択されるオキサジン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２３．非タンパク質蛍光染料は、プロフラビン、アクリジンオレンジおよびアクリジンイエローから選択されるアクリジン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２４．非タンパク質蛍光染料は、オーラミン、クリスタルバイオレットおよびマラカイトグリーンから選択されるアリールメチン化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２５．非タンパク質蛍光染料は、ポルフィン、フタロシアニンおよびビリルビンから選択されるテトラピロール化合物である、上記態様１３に記載の方法。
２６．分岐ポリマーは約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの数平均分子量を有する、上記態様１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ１〜２０炭化水素基であり、前記置換基はそれぞれ独立してヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に前記Ｃ１〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子によって置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ１〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合している、上記態様１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個の置換基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、前記置換基はそれぞれ独立してヒドロキシ、カルボキシおよびアミノから選択され、任意に前記Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ酸素原子によって置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基の置換基の１つに結合している、上記態様１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は３〜８個のヒドロキシ基で置換されたＣ３〜２０炭化水素基であり、任意に前記Ｃ３〜２０炭化水素基に含まれる１個以上の炭素原子はそれぞれ酸素原子によって置換されていてよく、少なくとも３個のポリマー分岐の各々はＣ３〜２０炭化水素基のヒドロキシ基の１つに結合している、上記態様１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基、グリセロール基、ペンタエリスリトール基、ペンタエリスリチオール基、ジグリセロール基、トリグリセロール基、ジペンタエリスリトール基、テトラグリセロール基、ペンタグリセロール基、トリペンタエリスリトール基、ヘキサグリセロール基、トリメタノールアミン基、トリエタノールアミン基、トリイソプロパノールアミン基、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸基、クエン酸基、イソクエン酸基、トリメシン酸基、１，１，１−トリス(アミノメチル)プロパン基、１，１，１−トリス(アミノメチル)エタン基、トリス(アミノメチル)メタン基、プロパン−１，２，３−トリアミン基、トリス(２−アミノエチル)アミン基およびトリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン基から選択される、上記態様１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００８８】
３１．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位は、トリメチロールプロパン基、トリメチロールエタン基、トリメチロールメタン基およびグリセロール基から選択される、上記態様１〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．分岐ポリマーに含まれる前記中心分岐単位はトリメチロールプロパン基である、上記態様１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．分岐ポリマーに含まれる少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒおよび−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立して、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである、上記態様１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．分岐ポリマーに含まれる少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立して、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルである、上記態様１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．分岐ポリマーに含まれる少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）および前記コポリマーは各々末端−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基を有し、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記態様１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．分岐ポリマーに含まれる少なくとも３個のポリマー分岐は、それぞれ独立して、末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、上記態様１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３〜８個有する、上記態様１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３または４個有する、上記態様１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．分岐ポリマーは中心分岐単位に結合したポリマー分岐を３個有する、上記態様１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．分岐ポリマーはトリメチロールプロパンエトキシレートである、上記態様１〜３９のいずれかに記載の方法。
【００８９】
４１．トリメチロールプロパンエトキシレートは約３００Ｄａ〜約１２００Ｄａの数平均分子量を有する、上記態様４０に記載の方法。
４２．トリメチロールプロパンエトキシレートは約４５０Ｄａ、約７３０Ｄａまたは約１０４０Ｄａの数平均分子量を有する、上記態様４０または４１に記載の方法。
４３．トリメチロールプロパンエトキシレートは約４５０Ｄａの数平均分子量を有する、上記態様４０〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．直鎖ポリマーは約１０ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記態様１〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．直鎖ポリマーは約５００ｋＤａ〜約７０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記態様１〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に、−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒおよび−ＣＯ−Ｎ（Ｒ）−Ｒから独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルまたはＣ２〜５アルケニルであるか、或いは直鎖ポリマーは、ポリ（アクリル酸）またはポリ（４−スチレンスルホン酸）である、上記態様１〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に、−ＯＨ、−ＯＲおよび−Ｏ−ＣＯ−Ｒから独立して選択される末端基を有するポリ（アルキレンオキシド）であり、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記態様１〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．直鎖ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーであり、前記ポリ（エチレンオキシド）、前記ポリ（プロピレンオキシド）および前記コポリマーは各々、その末端の各々に末端基を有し、末端基は−ＯＨ、−ＯＲまたは−Ｏ−ＣＯ−Ｒから独立して選択され、各Ｒは独立してＣ１〜５アルキルである、上記態様１〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．直鎖ポリマーは、その２つの末端の各々に、末端−ＯＨ基を有するポリ（エチレンオキシド）である、上記態様１〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．直鎖ポリマーは約５０００ｋＤａの数平均分子量を有する、上記態様４９に記載の方法。
【００９０】
５１．工程（ａ）は、まず分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合し、次いで溶媒中活性材料を添加し、溶媒中で活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成し、任意に前記混合中にさらなる溶媒を添加してよいことを含む、上記態様１〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．工程（ａ）は、溶媒中活性材料を提供し、活性材料含有溶媒に分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを添加し、溶媒中で活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成し、任意に前記混合中にさらなる溶媒を添加してよいことを含む、上記態様１〜５０のいずれかに記載の方法。
５３．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において３：１〜２０：１の質量比で混合する、上記態様１〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において４：１〜１５：１の質量比で混合する、上記態様１〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において６：１〜１２：１の質量比で混合する、上記態様１〜５４のいずれかに記載の方法。
５６．活性材料は、工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約３質量％〜３５質量％の量で使用する、上記態様１〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．活性材料質は、工程（ａ）において、直鎖ポリマーの質量に対して約１０質量％の量で使用する、上記態様１〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．溶媒は、活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを溶解できる、上記態様１〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．溶媒は水溶液である、上記態様１〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．水溶液は水またはバッファー水溶液である、上記態様５９に記載の方法。
【００９１】
６１．水溶液は、ホスフェートバッファー、HEPESバッファー、トリスバッファー、MOPSバッファー、MESバッファー、TESバッファー、CHESバッファー、PIPESバッファー、CAPSバッファー、HEPPSバッファー、イミダゾールバッファー、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー、クエン酸バッファーおよび酢酸バッファーから選択されるバッファー水溶液である、上記態様５９または６０に記載の方法。
６２．溶媒はアセトニトリルである、上記態様１〜５８のいずれかに記載の方法。
６３．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは、工程（ａ）において、約１２：１の質量比で混合し、工程（ａ）で用いる溶媒の総体積は、直鎖ポリマー１ｍｇあたり約１５μＬ〜約５０μＬである、上記態様１〜６２のいずれかに記載の方法。
６４．工程（ａ）で用いる溶媒の総体積は、直鎖ポリマー１ｍｇあたり約２０μＬ〜約４０μＬである、上記態様６３に記載の方法。
６５．方法は、工程（ａ）で混合されるポリマーを熱硬化、ＵＶ硬化または架橋する工程を含まない、上記態様１〜６４のいずれかに記載の方法。
６６．方法は、工程（ａ）で混合されるポリマーを共有結合させる工程を含まない、上記態様１〜６４のいずれかに記載の方法。
６７．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは共有結合的に架橋されない、上記態様１〜６４のいずれかに記載の方法。
６８．分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーは共有結合的架橋を含まない、上記態様１〜６４のいずれかに記載の方法。
６９．工程（ｂ）において、ゲルを部分的に脱水して、その中に固定化された活性材料を含むゴム状材料を得る、上記態様１または上記従属態様３〜６８のいずれかに記載の方法。
７０．工程（ｂ）において、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により、ゲルを部分的に脱水する、上記態様１または上記従属態様３〜６９のいずれかに記載の方法。
【００９２】
７１．工程（ｂ）において、減圧を用いてゲルを部分的に脱水する、上記従属態様３〜６９のいずれかに記載の方法。
７２．工程（ｂ）において、減圧ステーション／チャンバーでゲルを部分的に脱水する、上記態様１または上記従属態様３〜６９のいずれかに記載の方法。
７３．工程（ｂ）において、約１ｍｂａｒ〜約１０ｍｂａｒの圧力で約１時間未満の間、減圧ステーション／チャンバーでゲルを部分的に脱水する、上記態様１または上記従属態様３〜６９のいずれかに記載の方法。
７４．減圧ステーション／チャンバーに導入する前に、溶媒ベース技術を用いて基材上にゲルを付着させる、上記態様７２または７３に記載の方法。
７５．減圧ステーション／チャンバーに導入する前に、ドクターブレード塗布、ロール−トゥ−ロール被覆、回転被覆、グラビア印刷または３Ｄ印刷により基材上にゲルを付着させる、上記態様７２〜７４のいずれかに記載の方法。
７６．ゴム状材料は約１０ｎｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するフィルムの形状に製造される、上記態様１または上記従属態様３〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．ゴム状材料は約１０μｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するフィルムの形状に製造される、上記態様１または上記従属態様３〜７６のいずれかに記載の方法。
７８．上記態様１または上記従属態様３〜７７のいずれかに記載の方法によって得られる、その中に固定化された活性材料を含むゴム状材料。
７９．ゴム状材料は分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなり、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、その中に固定化された活性材料を含むゴム状材料。
８０．上記態様２または上記従属態様３〜６８のいずれかに記載の方法によって得られるゲル。
【００９３】
８１．活性材料、分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを含んでなるゲルであって、分岐ポリマーは中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、ゲル。
８２．基材上に付着したゴム状材料の製造方法であって、上記態様７８または７９に記載のゴム状材料を基材上に付着させる工程を含む、方法。
８３．（ａ）上記態様８０または８１に記載のゲルに基材を導入する工程；および
（ｂ）基材上のゲルを乾燥させて、基材上に付着したゴム状材料を得る工程
を含む、基材上に付着したゴム状材料の製造方法。
８４．工程（ｂ）において、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により、ゲルを部分的に脱水する、上記態様８３に記載の方法。
８５．工程（ｂ）において、減圧を用いてゲルを部分的に脱水する、上記態様８３に記載の方法。
８６．基材上に付着されている、上記態様７８または７９に記載のゴム状材料。
８７．基材は三次元基材である、上記態様８２〜８５のいずれかに記載の方法或いは上記態様８６に記載のゴム状材料。
８８．基材は、カルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、シリカ、粘土、金属酸化物、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、セラミック、ガラス、紙、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（エチレンナフタレート）、ポリ（イミド）、ポリ（カーボネート）およびそれらの組み合わせから選択される、上記態様８２〜８５および８７のいずれかに記載の方法或いは上記態様８６または８７に記載のゴム状材料。
８９．ハイブリッド発光ダイオード用ダウンコンバート材料としての、上記態様７８または７９に記載のゴム状材料の使用であって、ゴム状材料中に固定されている活性材料は非タンパク質染料である、使用。
９０．ハイブリッド発光ダイオードのためのダウンコンバートカスケードエネルギー移動カプセルとしての上記態様７８または７９に記載のゴム状材料の使用であって、ゴム状材料中に固定されている活性材料は非タンパク質染料である、使用。
【００９４】
９１．発光ダイオードおよび被膜を含んでなるハイブリッド発光ダイオードであって、被膜は上記態様７８または７９に記載のゴム状材料の層を１つ以上含む、ハイブリッド発光ダイオード。
９２．ハイブリッド発光ダイオードはハイブリッド白色発光ダイオードである、上記態様８９または９０に記載の使用または上記態様９１に記載のハイブリッド発光ダイオード。
９３．上記態様７８、７９および８６〜８８のいずれかに記載のゴム状材料の、診断におけるインビトロ使用。
９４．上記態様７８、７９および８６〜８８のいずれかに記載のゴム状材料の、診断用デバイスまたはキットにおける使用。
９５．上記態様７８、７９および８６〜８８のいずれかに記載のゴム状材料を含んでなる診断用デバイスまたはキット。
９６．診断における使用前にゴム状材料は冷却されていない、上記態様９３に記載の使用。
９４．診断における使用前にゴム状材料は冷却を伴わずに貯蔵されている、上記態様９３に記載の使用。
９８．診断における使用前にゴム状材料は約２０°Ｃ〜約３５°Ｃの温度で貯蔵されている、上記態様９３に記載の使用。
９９．デバイスまたはキットは冷却システムを含まない、上記態様９４に記載の使用或いは上記態様９５に記載の診断デバイスまたはキット。
１００．診断デバイスまたはキットは使い捨て診断デバイスまたはキットである、上記態様９４または９９に記載の使用或いは上記態様９５または９９に記載の診断デバイスまたはキット。
【００９５】
１０１．（ａ）溶媒中で分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程；および
（ｂ）ゲルを乾燥してゴム状材料を得る工程；
を含む、ゴム状材料の製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
１０２．（ａ）溶媒中で分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーを混合してゲルを生成する工程
を含むゲルの製造方法であって、分岐ポリマーは、中心分岐単位に結合した少なくとも３個のポリマー分岐を含む、方法。
１０３．分岐ポリマーは上記態様２６〜４３のいずれかに規定されているものである、上記態様１０１または１０２に記載の方法。
１０４．直鎖ポリマーは上記態様４４〜５０のいずれかに規定されているものである、上記態様１０１〜１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．前記態様５３〜５５および／または５９〜６８および／または７０〜７７のいずれかに記載の特徴によってさらに規定されている、上記態様１０１〜１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．上記態様１０１または上記従属態様１０３〜１０５のいずれかに記載の方法によって得られるゴム状材料。
１０７．上記態様１０２または上記従属態様１０３〜１０５のいずれかに記載の方法によって得られるゲル。
１０８．基材上に付着したゴム状材料の製造方法であって、基材上に上記態様１０６に記載のゴム状材料を付着させることを含む、方法。
１０９．（ａ）上記態様１０７に記載のゲルに基材を導入する工程；および
（ｂ）基材上のゲルを乾燥させて、基材上に付着したゴム状材料を得る工程
を含む、基材上に付着したゴム状材料の製造方法。
１１０．工程（ｂ）において、減圧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥または日光周囲環境蒸発により、ゲルを部分的に脱水する、上記態様１０９に記載の方法。
【００９６】
１１１．工程（ｂ）において、減圧を用いてゲルを部分的に脱水する、上記態様１０９に記載の方法。
１１２．基材上に付着されている、上記態様１０６に記載のゴム状材料。
１１３．基材は三次元基材である、上記態様１０８〜１１１のいずれかに記載の方法或いは上記態様１１２に記載のゴム状材料。
１１４．基材は、カルボキシメチルセルロース、デンプン、コラーゲン、シリカ、粘土、金属酸化物、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、セラミック、ガラス、紙、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（エチレンナフタレート）、ポリ（イミド）、ポリ（カーボネート）およびそれらの組み合わせから選択される、上記態様１０８〜１１１および１１３のいずれかに記載の方法或いは上記態様１１２または１１３に記載のゴム状材料。
【００９７】
本発明を説明図によっても説明する。添付の図は以下を示す。
図１：記録者が実施例において使用した蛍光タンパク質および酵素について作成したものである（実施例１を参照）。ＧＳ、グリシン−セリンアミノ酸リンカー；ＳＨ２−、ＳＨ３−およびＰＡＢＣ−ドメインはタンパク質相互作用ドメインを表す；ＴＡＡ、ポリアデニル化信号；ＢａｍＨ１およびＳａｌ１、クローニングに使用される制限酵素認識部位；６ｘＨｉｓ、融合タンパク質の親和性精製のためのポリヒスチジン標識。酵素をコードする遺伝子はイースト（Saccharomyces cerevisiae, S.c）から取り出した。
図２：低倍率（左）および高倍率（右）でのタンパク質ベースゲルのＴＥＭ画像（実施例１を参照）。
図３：周囲条件下で保存したタンパク質ベースフィルムの水の経時的な重量変化（実施例１を参照）。
図４：各付着工程時のタンパク質ベースフィルムの厚さおよび粗さの変化（実施例１を参照）。
図５：左図は、ハイブリッド発光ダイオードの模式図を示す。１は電気的接続部を備える基材であり、２は高発光無機チップ、即ちこの場合は青色ＬＥＤであり、３はパッキングまたはカプセル化系であり、４はその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の１または複数の層からなるダウンコンバートカプセル化系である。右図は、白色ハイブリッドＬＥＤのオフおよびオンを示す。
図６：左図は、診断用デバイスの模式図を示す。１は基材であり、２はその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料である。右図は、３つの異なった試験体（即ち、「対照」はその中に固定化された酵素を含有するゴム状材料であり、「＋基材」は２０μＬの試薬溶液が適用されている、その中に固定化された酵素を含有するゴム状材料であり、「−基材」は２０μＬの試薬不含有溶液が適用されている、その中に固定化された酵素を含有するゴム状材料である）の３１０ｎｍで励起したときの蛍光応答を示す。
図７：上図は、周囲条件下で保存したmTagBFP（Ａ）およびmCherry（Ｂ）ゲルの経時的な吸収スペクトルを示す。下図は、空気中で２０分あたり１０°Ｃのステップで室温から９０°Ｃまで加熱したmTagBFP（Ｃ）およびmCherry（Ｄ）ゲルの吸収特性を示す。
図８：酵素であるインベルターゼ（Ａ）、ヘキソキナーゼ（Ｂ）およびホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）（Ｃ）の活性を測定するための結合光試験の原理。
図９：青色、緑色および赤色蛍光タンパク質に基づくカスケード被膜を有するバイオＨＬＥＤの図。mTagBFP（青色）、eGFP（緑色）およびmCherry（赤色）中に存在する発色団の構造を示す。
図１０：上図は、周囲条件下（左図）および３１０ｎｍでの励起時（右図）でのタンパク質ベースゲルおよびゴム状材料の写真を示す。中図は、溶液（実線）、ゲル（白丸）およびゴム状材料（黒丸）中の３つのタンパク質の発光スペクトルを示す。下図は、ガラス基板からのゴム状材料の容易な剥離過程を強調した写真（上）、および手動でプラスチック製棒上に配置した１ｍｍの厚さを有するタンパク質ベースゴム状材料の写真（下）を示す。さらなる詳細は実施例１を参照。
【００９８】
図１１：バッファー溶液中のmTagBFP（青色）、eGFP（緑色）およびmCherry（赤色）蛍光タンパク質の正規化された吸収スペクトル（上図）、正規化された発光スペクトル（中図）および正規化された励起スペクトル（下図）を示す（実施例１を参照）。
図１２：貯蔵条件下での青色（Ａ）および緑色（Ｂ）蛍光タンパク質ベースゴムの吸収スペクトルの経時変化（実施例５および７を参照）。また、空気中で室温から９０°Ｃまで各々２０分間で１０°Ｃずつ加熱したときの、青色（Ｃ）および緑色（Ｄ）蛍光タンパク質ベースゴムの吸収特性も示す。
図１３：被覆欠損蛍光タンパク質を用いたＵＶ−ＬＥＤ（左図）および青色ＬＥＤ（右図）のエレクトロルミネセンス（ＥＬ）スペクトル（上図）および比視感度（下図）の変化を示す（実施例７を参照）。
図１４：ＵＶ−ＬＥＤ/mTagBFP（上図）および青色ＬＥＤ/eGFP/mCherry（下図）の印加電流に対するエレクトロルミネセンススペクトルおよびηcon。
図１５：青色ＬＥＤ/eGFP（上図）およびＵＶ−ＬＥＤ/mTagBFP/eGFP/mCherry（下図）の印加電流に対するエレクトロルミネセンススペクトルおよびηcon。
図１６：上図は、比較のための、構造２（記号）および青色ＬＥＤ（実線）の印加電流に対する発光効率。中図は、１０ｍＡの電流を流したときのＥＬスペクトルの経時変化を示す３Ｄプロット（左図）および構造２を有する実施デバイスの写真（右図）。下図は、１０ｍＡの電流を流したときの構造２の発光効率の相対的経時変化。さらなる詳細については実施例７を参照。
図１７：上図は、比較のための、構造１（記号）およびＵＶ−ＬＥＤ（実線）の印加電流に対する発光効率。中図は、１００ｍＡの電流を流したときの構造１のＥＬスペクトルの経時変化を示す３Ｄプロット。下図は、１００ｍＡの電流を流したときの構造１の発光効率の相対的経時変化。さらなる詳細については実施例７を参照。
図１８：実施例８で使用したバイオリアクターの設計および機構。
図１９：有機ダウンコンバートパッキングを備えた青色ＬＥＤまたはＵＶ−ＬＥＤに基づくＷＨＬＥＤの模式図（実施例９を参照）。
図２０：上図は、実施例９におけるマトリックスに使用した成分の例、即ち、架橋ポリマー（左図）、ＭＯＦ（中央左）、セルロース（中央右）、未架橋分岐（ｂ−ＰＥＯ）および直鎖（ｌ−ＰＥＯ）ポリエチレンオキシド誘導体（右図）。下図は、実施例９における発光物質の例、即ち、蛍光タンパク質（左図）、小分子（中央左）、ポリマー（中央右）および配位錯体（右図）。
【００９９】
図２１：重量比１２：１のｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯの混合物と共に水（左図）およびアセトニトリル（右図）を用いて調製したゴム（直径約２．５ｃｍ）およびゲル（マグネチックスターラーに気付く）の写真。
図２２：異なった質量比ｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯを有する水ベース（白丸）およびアセトニトリルベース（黒丸）ゲルの粘度関数（実施例９を参照）。
図２３：各付着工程時のアセトニトリルベースゴムの厚さおよび粗さの変化（実施例９を参照）。
図２４：１２：１（実線）、６：１（破線）および３：１（点線）の異なった質量比ｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯでの水ベースゴム（白丸）およびアセトニトリルベースゴム（黒丸）についての角振動数の関数ｒとしての貯蔵率Ｇ’（四角）および損失率Ｇ’’（三角）。
図２５：上図は、ボール様形状（ルームライト）およびキッチンフォーク、ガラスピペットおよびプラスチックバイアルカップのような不規則３Ｄ表面（λexc＝３１０ｎｍ）に調製したコンパウンド３、４および７を含むゴム材料およびゲル（ルームライト、マグネチックスターラーを含む）の例の写真。中図は、コンパウンド３、４および７の化学構造。下図は、溶液中発光化合物（実線）およびゴム中発光化合物（点線）の発光スペクトル。実施例９を参照。
図２６：実施例９で使用した、小分子（１〜３）、黒鉛量子ドット（４）、ポリマー（５）および配位錯体（６および７）のような発光物質の化学構造。
図２７：溶液中発光化合物（実線）およびゴム中発光化合物（点線）の吸収（黒色）および発光（灰色）スペクトル。実施例９を参照。
図２８：実施例９における水（星）およびアセトニトリル（四角）に基づく参照と比較した、質量比６：１のｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯおよび１（ダイヤモンド）、５（三角）および７（円）を用いて調製した様々なゴムについての貯蔵率の周波数掃引。差異は、ドーパントの存在でなく試料間の変動によって生じることに留意されたい。
図２９：周囲貯蔵条件下での１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
図３０：周囲貯蔵条件下で紫外線（３１０ｎｍ；８Ｗ）を照射したときの１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
【０１００】
図３１：周囲貯蔵条件下で加熱したときの１〜７に基づくゴムの吸収スペクトルの経時変化。実施例９を参照。
図３２：溶液中（黒色四角）およびゴム中（灰色三角）におけるコンパウンド１〜７の吸収変化の比較。実施例９を参照。
図３３：上図は、ＣＣ−ＷＨＬＥＤ（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ各々についての300/200/100μｍおよび200/100/50μｍの値に関する３つの異なった被覆厚さ、即ち、より厚い（実線）、最適条件（破線）およびより薄い（点線）被覆厚さのＣＣ−ＷＨＬＥＤ（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ（右図）の典型的エレクトロルミネセンススペクトル。下図は、被覆厚さを厚くした場合の発光効率の変化。実施例９を参照。
図３４：様々な電流を流したときのＳＭ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／１／２／３（上図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／４（下図）のエレクトロルミネセンススペクトル（左図）、および１０ｍＡの駆動電流を流したときの経時的発光効率。周囲条件下で作動するデバイスの写真も提供する（右図）。実施例９を参照。
図３５：ＳＭ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／１／２／３（左図）およびＱＤ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／４のエレクトロルミネセンススペクトルの経時変化（右図）。実施例９を参照。
図３６：上図は、様々な電流を流したときのＰ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／５（上図）およびＣＣ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／６／７（下図）のエレクトロルミネセンススペクトル（左図）および１０ｍＡの駆動電流を流したときの経時的発光効率（右図）。周囲条件下で作動するデバイスの写真も提供する（右図）。実施例９を参照。
図３７：Ｐ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／５（左図）およびＣＣ−ＷＨＬＥＤ青色ＬＥＤ／６／７（右図）のエレクトロルミネセンススペクトルの経時変化。実施例９を参照。
図３８：ＣＣ−ＷＨＬＥＤの推定寿命。実施例９を参照。
図３９：分岐および直鎖ポリマーの様々な組み合わせを伴った溶液中タンパク質の正規化フォトルミネッセンススペクトル。実施例１０（Ａ）、１１（Ｂ）および１２（Ｃ）を参照。
図４０：時間に対する、貯蔵条件下での水ベースおよびアセトニトリルベースゴム状フィルムの相対的重量変化。実施例１３を参照。
【０１０１】
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、実施例は、もっぱら説明の目的のためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例
実施例１：その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造
タンパク質および酵素の調製（組換えタンパク質の発現および精製）
複数の異なった発光タンパク質および酵素の調製および特徴付けを図１に示すように実施した。適当なプラスミドを有するE. coli strain M15 [pREP4]（pQE-9発現は、pQE-9発現ベクター由来のＮ末端6xHis標識を含有する全てを構築する、Qiagen）を、６００ｎｍで約０．５の光学密度まで、Amp（２００μｇ／ｍＬ）およびKan（１００μｇ／ｍＬ）抗生物質を含むＬＢ培地において２８°Ｃで培養した。組換えタンパク質発現を、２８°Ｃで１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドにより誘導した。２８°Ｃで４時間培養した後、細胞を採取し、−２０°Ｃで凍結した。凍結した細菌体を解凍し、リソチームを用いて化学的に、および超音波粉砕機を用いて機械的に分離した。次いで、QIAGENプロトコル（Henco K, A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, 第３版、1991）に従って、自然条件下でNi-NTA親和性クロマトグラフィーを用いて、発現したタンパク質を、清澄化された細胞溶解物から精製した。得られた精製タンパク質の濃度を測定し、試料をさらなる分析に付した（ヒドロゲルへの捕捉／一体化）。溶液中の発光タンパク質の定常状態吸収特性およびフォトルミネッセンス特性は、その調製の成功を裏付けていた（図１０および１１を参照）。
【０１０３】
この実施例では、（蛍光タンパク質または酵素のいずれかを含み、SH2、SH3またはPABCのようなヒトアダプタードメインに融合されている）複数の異なった融合タンパク質が容易に入手できたので、それらを使用した。発光または蛍光タンパク質の場合、そのような融合タンパク質の使用は、高い分子量および安定性の増大の故に有利である。しかし、（アダプタードメインに融合していない）対応するタンパク質もまた使用でき、同様の結果が得られる。
【０１０４】
その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の製造
ゴム状タンパク質ベース材料の生成前に、タンパク質ベースゲルを生成した。第一工程として、異なったタンパク質を含む上記溶液を各々、４：１の質量比の分岐ポリ（エチレンオキシド）化合物および直鎖ポリ（エチレンオキシド）化合物、即ち４５０質量ｍｏｌのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）および５×１０６質量ｍｏｌのＭｎを有する直鎖ポリ（エチレンオキシド）（ｌ−ＰＥＯ）と混合した。末端ヒドロキシル基により、タンパク質溶液との高い相溶性がもたらされ、網目に十分な水分子が保持された。このゲル網目は、主としてＴＭＰＥによりもたらされた一方で、ｌ−ＰＥＯはゲル化剤として作用した（Prodanov Lら、Biomaterials 2010, 31, 7758）。もっぱら適量の水を添加することによって、ゲル状材料の生成のために質量比を最適化した。検討範囲のタンパク質濃度において、ゲルおよび最終ゴム材料の生成はタンパク質の量に依存しなかった。図１０にも示すように、１：３６：３のおよその質量比でのタンパク質：ＴＭＰＥ：ｌ−ＰＥＯの最適化混合物が一晩の強撹拌時にゲルになる初期懸濁液として最良と説明される。ゲルの発光特性と初期溶液の発光特性との直接比較により、ゲル生成中のタンパク質の劇的な変質または分解は起こらない（図１０参照）（Prodanov Lら、Biomaterials 2010, 31, 7758）；溶液、ゲルおよびゴム状材料からの放出特性を比較すると分かる小さい変化（即ち約５〜１０ｎｍの最大シフトおよびスペクトルの若干の広がり）は、タンパク質骨格の小さい構造変化により製造もたらされ、これは、発色団の結合ポケットに有意な悪影響を及ぼさない；発光タンパク質の変質がフォトルミネッセンス特性の損失を意味することに留意すべきである、ことが分かる。また、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析により、タンパク質がゲル網目の中に完全に埋め込まれたことが裏付けられた（図２参照）。
【０１０５】
第二工程として、ドクターブレード塗布により、基材（例えば石英）上にゲルを付着させた（図１０参照）。支持体上に配置した厚さ５０μｍの矩形スタンプを用いて、ドクターブレード塗布を実施した。次いで、１時間未満の間、１〜１０ｍｂａｒの減圧状態にフィルムを導入した。最終層はゴム状材料として最良と説明され、水の低割合（即ち１．５質量％以下）の喪失は網目構造の崩壊を引き起こす。注目すべきは、周囲条件下での貯蔵状態で何週間にもわたって水が元に戻らないことである（図３参照）。図１０にも示されているように、ゴム状タンパク質ベース材料は、ピンセットで基材から容易に剥がされ、別の基材に容易に移動できる。例のように、タンパク質溶液において異なった質量比の緑色および赤色蛍光タンパク質を混合することにより、フィルムの色および組成は容易に制御できる。スタンプの厚さにより、または１０％未満の粗さを示す優れた付着により層を順に重ねる後続の付着により、ゴム材料の厚さを制御できる（図４参照）。
【０１０６】
その中に固定化された蛍光タンパク質を含むゴム状材料の製造の詳細な手順
その中に固定化された蛍光タンパク質を含む上記ゴム状材料（図１参照）の製造を、以下により詳細に説明する。
１．）組換え遺伝子構築物のクローニング
様々なタンパク質ドメインを組み合わせ、pQE-9発現構築物を作製するために、オーバーラップＰＣＲ法を実施した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いて、eGFPをSH2-ドメイン（eGFP）に融合し、mCherryをSH3-ドメインに融合し（mCherry）、mTagBFPをPABC-ドメインに融合した（mTagBFP）。蛍光タンパク質およびタンパク質相互作用ドメインを、両タンパク質ドメインの適当な折り畳みを可能にするグリシン−セリンリンカーシーケンスにより分離した。タンパク質の伸張により、より長くより安定な融合タンパク質がもたらされる。ＰＣＲおよびゲル抽出の後、T4 DNAリガーゼを用いて、Ｎ末端6xHisアフィニティー標識を含むpQE-9 E. coli発現ベクターにＤＮＡ断片を結合した。6xHis標識でのフレーム融合におけるＮ末端および構築物の右配向は、特異的制限酵素を用いて確保した（図１参照）。結合後、組換えプラスミドをXL1 Blue E. coli細胞に転換し、Sanger Sequencing（GATC）を用いて構築物の正しい順序を変更した。組換えタンパク質の発現のために、各遺伝子構築物を有するpQE-9プラスミドを、pREP4リプレッサープラスミドを有するE. coli M15細胞に転換した。転換E. coli細胞を、アンピシリン（pQE-9発現ベクター、２００μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（pREP4リプレッサープラスミド、２５μｇ／ｍＬ）を含むプレート上に選択した。
【０１０７】
２．）蛍光タンパク質の調製
適当なプラスミドを有するE. coli strain M15 [pREP4]（pQE-9発現は、pQE-9発現ベクター由来のＮ末端6xHis標識を含有する全てを構築する、Qiagen）を、６００ｎｍで約０．５の光学密度まで、アンピシリン（２００μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）抗生物質を含むLysogeny Broth（ＬＢ）培地（Bertani G, J Bacteriol. 1951, 62（3）, 293-300）において２８°Ｃで培養した。組換えタンパク質発現を、２８°Ｃで１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドにより誘導した。２８°Ｃで４時間培養した後、細胞を採取し、−２０°Ｃで凍結した。凍結した細菌体を解凍し、リソチーム処理および超音波処理により分離した。製造メーカー（QIAGEN）の指示に従って、自然条件下でNi-NTA親和性クロマトグラフィーにより、組換えタンパク質をアフィニティー精製した。NanoDrop Spectrophotometer ND-1000（Peqlab）を用いた２８０ｎｍでの吸収の測定により、得られた精製タンパク質の濃度を測定した。さらなる使用まで、精製タンパク質を溶離バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０；３００ｍＭのＮａＣｌ；２５０ｍＭのイミダゾール）中に溶解／貯蔵した。
【０１０８】
３．）タンパク質ベースゲルおよびゴム状材料の製造および特徴付け
以下のようにタンパク質ベースゲルを製造した。第一工程として、異なったタンパク質を含むバッファー溶液を、分岐ポリ（エチレンオキシド）化合物および直鎖ポリ（エチレンオキシド）化合物、即ち４５０質量ｍｏｌのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）および５×１０６質量ｍｏｌのＭｎを有する直鎖ポリ（エチレンオキシド）（ｌ−ＰＥＯ）と混合した。両材料はSigma Aldrichから購入し、そのまま使用した。回転塗布またはドクターブレード塗布付着技術を用いることによるさらなるフィルム形成を可能にするゲル状材料の生成のために、質量比を最適化した。検討範囲のタンパク質濃度において、ゲルおよび最終ゴム状材料の生成はタンパク質の量に依存しなかった。１：３６：３の質量比でのタンパク質：ＴＭＰＥ：ｌ−ＰＥＯの最適化混合物が一晩の周囲条件下での強撹拌（１５００ｒｐｍ）時にゲルになる初期懸濁液として最良と説明される（図１０参照）。蛍光タンパク質の存在は、定常状態の分光技術によって裏付けられた（定常状態吸収特性およびフォトルミネッセンス特性を各々、HORIBA Jobin YvonのPerkin Elmer Lambda and Fluoromax-p-spectrometerを用いて求めた）。A Kross OptronicのKruess屈折計装置を用いて屈折率を測定した。
【０１０９】
ゴム状材料を製造するために、ドクターブレード塗布により、基材（例えばスライドガラス）上にゲルを付着させた。支持体上に配置した厚さ５０μｍの矩形スタンプを用いて、ドクターブレード塗布を実施した。ゲルに基材を導入することにより、３Ｄ基材にゲルを適用することもできる。次いで、１時間未満の間、１〜１０ｍｂａｒの減圧状態にフィルムを導入した。最終材料は、ゴム状材料として最良と説明され、ピンセットで基材から容易に剥がされ、別の基材に容易に移動できた。スタンプの厚さにより、または優れた付着により層を順に重ねる後続の付着により、ゴム材料の厚さを制御できる。厚さおよび粗さは、Brukerの表面形状測定器DektakxTを用いて測定した。
【０１１０】
実施例２：異なった質量比の分岐ポリマーおよび直鎖ポリマー並びに異なった量のバッファー水溶液を用いたゴム状材料の製造
固定化されるタンパク質の不存在下、以下の表１および２に示すように、異なった質量比の分岐ポリマー〔この場合、４５０ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）〕および直鎖ポリマー〔この場合、５０００ｋＤａのＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）〕を用いて、本発明のゲルおよびゴム状材料の製造を実施した。実施例１に記載したように、ゴム生成を実施した。
【０１１１】
具体的には、以下の表１および２に示す異なった質量比で２つのポリマーを混合した。ＴＭＰＥは低粘性液体であるが、ＰＥＯは高撹拌条件でも溶解しない。この工程を促進するために、いくつかの量の（別にタンパク質のために使用される）バッファー溶液を添加した。
【０１１２】
【表１】
2018521125.tif 000008
【０１１３】
【表２】
2018521125.tif 000009
【０１１４】
表１にまとめるように、２００μＬのバッファーまでゲル生成は良好であったが、１５０μＬ〜２００μＬを用いて作製したゲルのみが、ドクターブレード技術を用いてフィルムを作製するのに十分良好であった。次工程では、最小量のＰＥＯを調べた。表２に示すように、５〜１０ｍｇのＰＥＯが、有用なゲルを得るのに最良の量であった。要約すると、ある量（１５０μＬ）の水を伴った１：６〜１：１２のＰＥＯ：ＴＭＰＥ質量比が、さらなる加工に最良な条件であることが見いだされた。
【０１１５】
様々な非水性溶媒を用いたゲル生成およびゴム状材料生成に関する別の実験結果を、以下の表３にまとめる（ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；ＤＣＢ＝ジクロロベンゼン；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン）：
【０１１６】
【表３】
2018521125.tif 000010
【０１１７】
実施例３：その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料のダウンコンバートカプセル化系としての応用
図５は、ダウンコンバートカプセル化系としてのその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料（実施例１を参照）を有する、ハイブリッド発光ダイオードの模式図を示す。４５０ｎｍのエレクトロルミネセンススペクトルを有する市販の青色発光ＬＥＤ（Luxeonから購入）を、この実施例で使用した。既に存在するシリコーンカプセルの３Ｄ形状を被覆するために、ＬＥＤを数秒間ゲルに浸漬でき、および／またはドロップキャスティングにより担体表面上にゲルを付着させることができる。次いで、実施例１に記載したように、被膜を乾燥した。一定および／またはパルス状の電流および電圧スキームで、デバイスを作動させることができる。この実施例では、Keithley 2400を用いて１０ｍＡの一定電流でＬＥＤを作動させ、Avantes分光光度計（Avaspec-ULS2048L-USB2）に連結した積分球（Avasphere 30-Irrad）を用いてエレクトロルミネセンススペクトルおよびデバイス特性をモニターした。周囲条件下でデバイスを作動させた。
【０１１８】
実施例４：その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の診断のための応用
図６は、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料（実施例１を参照）に基づく診断用デバイスの模式図を示す。その中に固定化された酵素を含むゴム状材料を、実施例１に記載した手順に従ってガラス基板上に製造した。一定量、即ち２０μＬの（バッファー組成物中にＮＡＤを含有する）試薬溶液を、その中に固定化された酵素を含有するゴム状材料の上にドロップキャストした。周囲条件下で数分間液滴を乾燥し、ＮＡＤからＮＡＤＨへの迅速な転換を達成した。３１０ｎｍおよび６０ＷのＵＶ照射下、ＮＡＤＨの青色蛍光性をモニターした。
【０１１９】
実施例５：その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の貯蔵安定性および熱安定性
その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料（実施例１を参照）の安定性を、周囲条件下で（即ち貯蔵安定性）、および空気中２０分あたり１０°Ｃの昇温ステップでの室温から９０°Ｃの加熱工程で（即ち熱安定性）調べた。このために、２セットの実験の吸収特性を、経時的にモニターした。図７および１２に示すように、ゲル中のタンパク質およびゴム材料中のタンパク質のいずれも、周囲貯蔵条件下で数週間にわたって十分な安定性を示した。熱安定性に関して、約６０〜８０°Ｃの温度まで吸収特性は変化していない。これから、吸収スペクトルにはタンパク質の変質に起因する特徴はない。これらの発見は明らかに、ゲルおよびゴム状材料のいずれの生成中も、そしてそれらは数週間周囲条件下で貯蔵した場合でさえ、タンパク質の構造が保護されていることを実証している。上記条件下で溶液においてタンパク質は変性する傾向にあることはよく知られているので（Mozziconacci Oら、Adv Drug Deliv Rev. 2015, DOI： 10.1016/j.addr.2014.11.016； Davies M, Aust Biochem. 2012, 43, 8）、これは自体注目すべき結果である。
【０１２０】
実施例６：ゴム状材料に固定化される酵素の活性測定
図８は、本発明のその中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料を用いた診断用デバイスの基本的原理を示す。分光光度計による３４０ｎｍの吸収極大でのＮＡＤＨの増加をモニタリングすることに基づく修正結合光学的試験を用いて、酵素活性（インベルターゼおよびホスホグルコイソメラーゼ）を測定した。この測光分析では、スクロース／グルコースの代謝回転がＮＡＤＨ生成反応に関連付けされる。従って、ＮＡＤＨの増加は、この反応におけるスクロース／グルコース代謝回転量の尺度であり、酵素活性を示す。
【０１２１】
インベルターゼ分析
測定用バッファーは、基質（スクロース、１０ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＮＡＤ（１ｍＭ）、Hepes/KOH ｐＨ７．６（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ヘキソキナーゼ（１Ｕ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、１Ｕ、示さず）およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G6P-DH、１Ｕ）を含有する。インベルターゼが活性であると、スクロースを、グルコースおよびフルクトース加水分解する。次いで、これらのヘキソースは、ヘキソキナーゼによりＡＴＰに依存してリン酸化され得る。グルコース−６−ホスフェートはさらに、酵素グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼにより酸化され、それによりＮＡＤＨを生じる。ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの吸収極大は異なるので、ＮＡＤＨは３４０ｎｍでもっぱら検出できる。フルクトースの経路は、グルコースの経路と同じなので示さない。バッファー中ホスホグルコイソメラーゼは、フルクトース−６−ホスフェートをグルコース−６−ホスフェートに転化する。
【０１２２】
ヘキソキナーゼ分析
測定用バッファーは、基質（グルコース、５ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＮＡＤ（１ｍＭ）、Hepes/KOH ｐＨ７．６（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G6P-DH、１Ｕ）を含有する。ヘキソキナーゼが活性であると、基質グルコースはリン酸化される。グルコース−６−ホスフェートは６−ホスホグルコノラクトンに転化され、並行してＮＡＤ＋は減少する。ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの吸収極大は異なるので、ＮＡＤＨは３４０ｎｍでもっぱら検出できる。
【０１２３】
ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）分析
測定用バッファーは、基質（フルクトース−６−ホスフェート、５ｍＭ）、ＮＡＤ（１ｍＭ）、Hepes/KOH ｐＨ７．６（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G6P-DH、１Ｕ）を含有する。ＰＧＩが活性であると、フルクトース−６−ホスフェートはグルコース−６−ホスフェートに異性体化され、次いで、これは、ＮＡＤＨ生成反応において酸化され得る。ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの吸収極大は異なるので、ＮＡＤＨは３４０ｎｍでもっぱら検出できる。
【０１２４】
上記分析において、ＮＡＤＨの発光特性の存在は、試験酵素が本発明のゴム状材料に固定されていると、試験酵素の活性が保持されていることを示す。これは明らかに本発明のゴム状材料の、診断のための検出キットへの応用が可能なことを示している。
【０１２５】
実施例７：ハイブリッド白色発光ダイオード（ＨＬＥＤ）における、その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の応用
この実施例では、本発明の青色、緑色および赤色蛍光タンパク質ベースゴム材料を用いた新規な被覆系を有するＵＶおよび青色ＬＥＤを組み合わせたバイオインスバイアードハイブリッド白色発光ダイオード（白色バイオＨＬＥＤ）を作製するための新規なアプローチを説明する。３つの態様が、この研究の主な達成を構成する。第一に、このために必要な要件、即ち、環境への負担が小さくかつ低コストな製造、中程度の蛍光性量子収量を伴った容易な色可変性、大きい吸収吸光係数を満たす（Shcherbakova DMら、Curr Opin Chem Biol. 2014, 20, 60；Chudakov DMら、Physiol Rev. 2010, 90, 1103）、新規なダウンコンバート材料として蛍光タンパク質をどのように使用できるかを実証した。制限は、標準的な被覆技術、並びに周囲条件下および／または中程度の温度における溶液中での中程度の安定性を妨げるバッファー水溶液の必要性であった。ここで、第二の達成になる。上記問題を解消するために、あらゆる基材上への容易かつ均質な被覆を可能にする、新規な被覆プロトコルを開発し、オプトエレクトロニクス応用に近づく蛍光タンパク質をもたらした。これは、中程度の減圧条件下でゴム状材料に転化するシーリングフリータンパク質ベースゲルを設計することにより可能となった。より重要なことに、ゲルに埋め込まれたタンパク質およびゴム材料に埋め込まれたタンパク質のいずれも、周囲条件下で意外なほど長期にわたって非変性状態であった。第三に、カプセル化のためのゴム材料の使用の主な利点は、全可視スペクトルの完全なカバーを可能にする、ボトムアップエネルギー移動過程でのカスケード構造の容易な作製である（図９参照）。この独自の特性により、作動条件下で１００時間を超えた後に損失が１０％未満であり、５０Ｌｕｍ／Ｗを特徴とした第一の白色バイオＨＬＥＤがもたらされた。
【０１２６】
青色（mTagBFP）、緑色（eGFP）および赤色（mCherry）蛍光タンパク質並びに対応するゲルを、実施例１に記載したように製造した。タンパク質折り畳みを保つための剛性および湿分に優れた媒体をゲルが提供することが要求される。ゲルの屈折率も測定した。タンパク質のタイプとは無関係に、全てのゲルが１．４３〜１．４４の平均屈折率を示した。この値は、シリコーンのようなＬＥＤに使用されるカプセル化材料の理想値（Ma Mら、Opt express, 2011, 19, A1135）に近かった。
【０１２７】
ドクターブレード塗布技術によるスライドガラス上への軟質フィルムの製造を可能にする優れた粘度をゲルは示すが、そのようなフィルムはカプセル化の目的には適さない。しかし、実施例１に記載したように、減圧ステーションにおいてフィルムを部分的に乾燥することにより、フィルム硬度は容易に向上させることができる。この過程では、それをゴム状材料として説明することを可能にする機械的性質を特徴とする硬質フィルムをもたらす、約１．５質量％の水の喪失に注目すべきである。例えば、フィルムは、基材から容易に剥がすことができ、例えば発光特性を維持する球を得るために引き伸ばしたり丸めたりすることもできる（図１０参照）。実施例１で説明したように、周囲条件下での貯蔵状態で何週間にもわたって水が元に戻らない（図３参照）ことは注目すべきであり、このことは、さらなるカプセル化は必要ないことを示している。タンパク質のタイプとは無関係に、数ミリメートルまでの厚さおよび低い平均粗さを有する硬質フィルムが、ドクターブレード塗布および乾燥工程の一連の反復により容易に得られる（図４および１０参照）。加えて、乾燥工程中の網目の崩壊は少なくとも１．８の値に屈折率を高め、これは使用する装置の検出限界である。これは、最終乾燥工程を伴ってＬＥＤの被覆を実施する際、フレネル反射損失をさらに抑制すべきことを示している（Ma Mら、Opt express, 2011, 19, A1135）。最後に、（対応するゲルのような）ゴムは、有利な貯蔵安定性を示す（実施例５および図１２参照）。上記観点から、ゴム／ゴム状材料は、ゲルと比べてダウンコンバート被覆目的に高度に適している。
【０１２８】
これらの発見に後押しされて、青色、緑色および赤色発光タンパク質ベースゴムの製造に基づく被覆系を用いてＵＶおよび青色ＬＥＤ（各々３９０ｎｍおよび４５０ｎｍでの極大）を組み合わせて、白色バイオＨＬＥＤを作製した。参考のために、まず、タンパク質を含まない異なった厚さを有する被膜で、ＬＥＤを変性した。例として、５００μｍまでの被覆厚さで発光効率値を約２０％上昇させながら、エレクトロルミネセンス（ＥＬ）スペクトルが変化しないことを特徴とする異なった駆動電流で被覆青色ＬＥＤを作動させた（図１３参照）。ヒトの目の明所視感度はこの実験で影響を受けないので、これは、光収集を高めるゴムの高屈折率に関する（Ma Mら、Opt express, 2011, 19, A1135）。
【０１２９】
次に、単一の青色、緑色および赤色タンパク質ベース被覆を用いて、ＵＶおよび青色ＬＥＤを変性した。蛍光タンパク質の励起特性から分かるように（図１１参照）、異なった電流を印加した際のダウンコンバートＥＬバンドおよびＬＥＤの極大の比として定義されるダウンコンバート効率（ηcon）は、図１４および１５にも示されているように、ＵＶ−ＬＥＤ/mTagBFPおよび青色ＬＥＤ/eGFPの組み合わせにおいて優れている。より印象的なことに、これらのデバイスは、１００％を超えるηcon値を特徴としており、これは、下塗りの過剰な発光を吸収するタンパク質での別の被覆を適用することにより蛍光被覆の発光を効率的にさらにダウンコンバートするための要件である。換言すると、タンパク質被覆の優れたダウンコンバート特性が、図１４に示すような各被膜の極大ピークを有するＥＬスペクトルをもたらすボトムアップエネルギー移動過程を特徴とするカスケードカプセルの作製を可能にする。
【０１３０】
慎重な最適化の後、ＵＶ−ＬＥＤ／mTagBFP／eGFP／mCherry（以下において「構造１」とも称する）および青色ＬＥＤ／eGFP／mCherry（以下において、「構造２」とも称する）の構造を有する白色バイオＨＬＥＤを成功裏に製造し、分析した。特に、駆動電流を高めると（図１４および１５参照）、ＥＬスペクトルは明らかに、意外なほど高い駆動電流まで１００％を超えたままのηconに呼応して、蛍光タンパク質の異なった極大を示す。この作動レジームで、いずれのバイオＨＬＥＤも、カラーコーディネート−０．３５〜０．３５（構造１）、０．３２〜０．３３（構造２）、ＣＲＩ−７０〜６０（構造１）、７５〜８０（構造２）およびＣＣＴ−４５００〜６０００Ｋ（構造１および２の両方）に関して優れた白色安定性を特徴とする。図１４および１５に示すように、高い駆動電流を適用すると、ＬＥＤ発光はゆっくりと優勢になる。この問題は、タンパク質含量の増加または被覆厚さの増加によって解決できる。とはいうものの、内部量子効率の低下の故に高い駆動電流を印加するとＬＥＤの発光効率が低下する点について言及することに価値はある。例として、図１６には、約２０ｍＡの印加電流まで構造２の発光効率がどのように極大化するか（ここからこの値は急激に低下する）を示す。我々は１０ｍＡでこのデバイスを作動させることとし、ＥＬスペクトルおよび発光効率の経時変化をモニタリングした（図１６参照）。図１７に示すように構造１を用いて同じ実験を実施した。
【０１３１】
ＥＬスペクトル形状に起因した優れた色品質に加えて、バイオＨＬＥＤの安定性も十分であった。図１６には、ＥＬスペクトルがほぼ一定であることが示されており、このことは、作動条件下で５０〜７０時間後に上塗りが分解したことを示している。このことは、タンパク質を酸化、従って変性させるＯＨ基および／または過酸化物基の生成が招く酸価的ストレスに関連している可能性が高い（Mozziconacci Oら、Adv Drug Deliv Rev. 2015, DOI：10.1016/j.addr.2014.11.016；Davies M, Aust Biochem. 2012, 43, 8）。より興味深いことは発光効率の変化であり、これは、１００時間後に初期値に対しる１０％未満の低下を特徴とする。この値は、現行のＨＬＥＤと比べて著しい。これまで、本発明のバイオＨＬＥＤと類似した構造を有するＬＥＤは、一日以内の迅速な分解を示す一方で、ダウンコンバート被覆がガラス基板上に付着されている場合に１００時間を超えて１０％未満の発光効率損失が達成され、このダウンコンバート被覆は約５ｍｍの間隔を伴ってＬＥＤ上に配置されていた（Findlay NJら、Adv Mater. 2014, 26, 7290）。
【０１３２】
結論として、本発明は、１００時間を超えて１０％未満の発光効率損失を有し、全可視スペクトルの完全なカバーを可能にする、タンパク質ベースカスケード被膜を特徴とする第一のバイオＨＬＥＤを提供する。これは、穏やかな減圧条件下での乾燥工程後に被覆目的に適したゴム材料になるゲルの中で蛍光タンパク質を安定化かつ加工するための新規な技術の開発によって達成された。本発明では、ゴム材料の易加工性を伴った、蛍光タンパク質の優れた特性の相乗効果（即ち、優れた貯蔵安定性および相補的吸収−発光特性）が、照明用途に適したカスケード被膜の設計に活用できることが実証された。これは、カスケード被膜をＨＬＥＤに適用した第一の例である。概して、この研究は、オプトエレクトロニクス応用において、特にＨＬＥＤを用いた照明用途において蛍光タンパク質を活用する新規なルートを開発する。
【０１３３】
上記バイオＨＬＥＤの製造および特徴付けに関するさらなる詳細を、以下に提供する。ＵＶおよび青色ＬＥＤをRoschwege GmbH and Luxeonからそれぞれ購入した。バイオＨＬＥＤの製造は、２つの工程手順に関する。第一に、ＬＥＤの上にタンパク質ベースゲル（実施例１を参照）を付着させて、表面を完全に湿潤させた。第二に、１時間未満の間、１〜１０ｍｂａｒの減圧チャンバーに被覆ＬＥＤを移動した。ＨＬＥＤの光ダウンコンバート効率を高めるために、この手順を反復した。また、青色、緑色および赤色ゲルを順に付着させる上記工程を反復することにより、カスケード被膜の設計を容易に実施した。被膜の厚さとは無関係に、カスケード被膜は、さらなる分析のためにＬＥＤ表面から容易に剥がすことができた。構造１および２を有するデバイスのための被膜の最適厚さは、それぞれ１〜１．５ｍｍに近い。電流源としてKeithley 2400を用いてバイオＨＬＥＤを特徴付ける一方で、球形Avasphere 30-Irradと共にAvantes分光光度計（Avaspec-ULS2048L-USB2）を用いてエレクトロルミネセンススペクトルの変化および発光効率をモニターした。
【０１３４】
実施例８：その中に固定化されたタンパク質を含むゴム状材料の、バイオリアクターにおける応用
一般的な概念は、図１８に示すような減圧システムを用いて活性成分としての酵素を含むゴム状材料に反応体溶液を通すことによって、反応体を所望の生成物に転換することである。
【０１３５】
ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）酵素、反応体ＮＡＤ（特色のない発光）および生成物ＮＡＤＨ（青色発光物質）を用いて、この実施例を行った。ゴム状材料は５〜１０分以内に反応体溶液に溶解するので、１００〜１５０ｍｂａｒの中程度の減圧を適用することが必要であり、少量の反応体溶液を使用した。第二に、約１０〜３０ｍｂａｒの強減圧を乾燥のために適用し、ゴム状材料を回収した。この手順で、約２０ｍＬの反応体溶液を生成物に転化した。
【０１３６】
この例は、その中に固定化された酵素を含む本発明のゴム状材料が、バイオリアクターにおいて有利に使用できることを示している。
【０１３７】
実施例９：その中に固定化された非タンパク質活性材料を含むゴム状材料の製造および応用
この例では、小分子、量子ドット、ポリマーおよび配位錯体のような幅広い活性化合物に基づく発光ゴム状材料を製造するための実施容易なプロトコルを例示する。このプロトコルと、類似した蛍光タンパク質ベースゴムを製造するためのプロトコルとの組み合わせは、このアプローチの普遍的性質を示している。これはまた、包括的な分光的およびレオロジー的調査を用いて評価される。さらに、新規な発光ゴムは、省エネ型半導体白色発光源を得るための半導体代替物として歓迎されている白色ハイブリッド発光ダイオード（ＷＨＬＥＤ）を開発するためのダウンコンバートパッキング系として適用される。この研究はまた、上記ダウンコンバート系の全てを用いて作製されるＷＨＬＥＤの中での直接比較により、この新規な照明技術の明確な見通しを提供する。本発明では、配位錯体に基づくゴムの使用が、連続作動条件下で１０００時間より優れている前例のない安定性を伴って、発光効率および色品質の両方に関して他より優れていた。これは、約１００Ｌｍ／Ｗの発光効率を維持しながら、従来のＷＨＬＥＤと比べて何十倍も向上したことを意味する。
【０１３８】
序論
白熱電球および蛍光灯は発光効率、安定性、および環境／リサイクル問題のバランスで行き詰まっているので、効率的かつ安定な白色半導体照明源の開発は、重要な最先端技術研究の１つである１。２つの主な代替案は、次世代の持続可能な電球を目指してほとんど準備がなされている。一方では、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）が、スクリーンおよび室内照明器具のための可撓性および薄い照明源を提供するための潜在的技術である２。しかし、少なくとも２０年間の努力にもかかわらず、白色ＯＬＥＤはまだ、低製造コストおよび高性能に関して明らかなトレードオフを示している２。他方では、９０年代初期にAkasaki、AmanoおよびNakamuraらにより青色ＬＥＤが先駆的に研究されたので、無機白色発光ダイオード（ＷＬＥＤ）が、産業界および科学界のいずれにおいても熱心に開発されている３。一般的に言えば、青色またはＵＶ発光ＬＥＤのチップは、典型的なＹ３Ａｌ５Ｏ１２；ＹＡＧ：Ｃｅおよびその誘導体のような希土類元素に基づく無機ダウンコンバートリン光体で被覆されている４。その結果、ＬＥＤ発光とダウンコンバート被膜発光の組み合わせにより、パッキング系を最適化した際の高い発光効率および安定性を特徴とするＷＬＥＤがもたらされる。その主な欠点は、ｉ）希土類クラスト材料を使用することによる高い製造コスト、ｉｉ）白色発光の色品質を損なう効率的真紅発光の不足、およびｉｉｉ）これらの材料をリサイクルするための効率的プロトコルの欠如である。従って、この戦略は、低コスト製造を伴った生態学的持続可能性に関するグリーン経済の土台をほとんど扱っていない１。
【０１３９】
代わりに、最近の研究では、いわゆる白色ハイブリッド無機／有機ＬＥＤ（ＷＨＬＥＤ）における環境への負荷が少ない有機ダウンコンバート材料の使用の可能性が、検討されている５〜８。ＷＬＥＤと同様、ＷＨＬＥＤの構造は、連続励起時の広い低エネルギー放出バンドを特徴とする（図１９および２０を参照）、カプセル化系が有機ベースダウンコンバート材料により置き換えられた標準無機青色−またはＵＶ−ＬＥＤからなる。この構造は、近年、高い色品質、即ち、０．３０〜３／０．３０〜３の国際委員会de l'Eeclairage（ＣＩＥ）座標、９０より大きい演色評価数（ＣＲＩ）、２５００〜６５００Ｋの間の相間色温度（CCT）を有するが、周囲条件下での連続励起時の発光物質の分解、マトリックスの分解または両方の分解に起因する約１００時間の低い安定性を伴うＷＨＬＥＤをもたらす５〜８。
【０１４０】
これまで、ダウンコンバート被膜を開発するための４つの異なったアプローチが存在する。第一に、ガラス基板またはＬＥＤパッキング上部のいずれかに、有機材料とＵＶ−または熱硬化性シーリング反応体との混合物からなる薄いフィルムを典型的には付着させる（図２０参照）５。複数の著者が、連続励起時のダウンコンバート材料の分解と作製時の被膜形態における相分離との両方が、数時間の値までＷＨＬＥＤの安定性を限定する共通因子であることを記載している５ｉ、ｋ、ｌ。しかし、発光物質を事前にカプセル化することに基づく、またはＬＥＤとダウンコンバート被膜とのギャップを広げる戦略は、約１００時間の安定性をもたらす５ｄ、ｏ、ｑ。第二に、興味深い代替アプローチが２０１３年にLiおよびSuらにより報告された６ａ。彼らは、複数のダウンコンバート材料の１つまたは混合物を埋め込むことができる、高エネルギー放出特性および調整可能寸法の細孔を示す金属有機骨格（ＭＯＦ）の使用を提案した（図２０参照）６。無機ＬＥＤは、ＭＯＦおよび吸着有機基の両方か、またはエネルギーを有機基にさらに輸送するＭＯＦのみを励起する。ＭＯＦベースアプローチが量子ドット、配位錯体および小分子に適合できることを、より興味深い複数のグループが示した６。従って、これは、商業目的のための大きな可能性を有する。従来技術として、７０〜９０のＣＲＩおよび５０Ｌｍ／Ｗより大きい発光効率を特徴とするＭＯＦカプセル化白色デバイスを伴うＷＨＬＥＤは達成されたが、今もなお、その安定性は深く研究されている。第三に、例えば無機および黒鉛量子ドットが埋め込まれており、セルロース誘導体に基づく新規な被膜（図２０参照）は、全可視スペクトルに及ぶ新規なＷＨＬＥＤをもたらしている７。そこでは、デバイスは０．３３／０．３７のＣＩＥ座標および３１．６Ｌｍ／Ｗまでの効率値を示すが、その安定性は報告されていない。最後に、水中の分岐ポリマーおよび直鎖ポリマーの組み合わせを伴った蛍光タンパク質の混合物に基づく新規なダウンコンバート被覆法が開発されている。後者は、バイオＷＨＬＥＤを作製するためのパッキング系として容易に適用される発光ゴム状材料にさらに転化されるゲルを生成する８。１２０時間後の効率の１０％未満の低下という有望な安定性と共に、他のアプローチのために注目すべき同様のＣＲＩおよび発光効率が示されている。そこでは、バイオＷＨＬＥＤの不安定性は、赤色発光タンパク質の分解にもっぱら起因している。この例では、小分子、量子ドット、ポリマーおよび配位錯体に及ぶ幅広い種類のダウンコンバート材料を実施するために本発明の新規なゴム状カプセル化法が容易に変更できることを示す。これは、ゴムに埋め込まれたダウンコンバート材料のフォトルミネッセンス特性の変化を測定するための分光学的解析、並びにゲルおよびゴムの両方の機械的性質を解明するためのレオロジー的分析によって、さらにサポートされている。最後に、上記ゴムに基づくＷＨＬＥＤが直接比較されているので、この研究はさらなる手段および開発のためのロードマップを提供する。
【０１４１】
もっとも顕著な結果として、中でも配位錯体の使用は有効であり、発光効率の若干の低下および色の未分解を伴った１０００時間を超える前例のない安定性を特徴とする。後者はまた、約４０００時間までと推定され、従来技術のＷＨＬＥＤと比べて一桁以上の安定性の向上を意味する。従って、高い発光効率（１００Ｌｍ／Ｗ）と数千時間の安定性との組み合わせが、低出力および中出力用途のＷＨＬＥＤの開発のための本発明のアプローチの可能性をおよび多用途性を強調していると結論付けられる。
【０１４２】
材料および方法
１．ゲルおよびゴム状材料の製造および特徴付け
小分子、ポリマーおよび配位錯体のような発光化合物の全ては、Merck and Sigma Aldrichから購入し、そのまま使用した。炭素量子ドットは、文献に従って調製した１０。ゲルは以下の通り製造した。第一工程として、分岐ポリ（エチレンオキシド）化合物および直鎖ポリ（エチレンオキシド）化合物、即ち４５０質量ｍｏｌのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）および５×１０６質量ｍｏｌのＭｎを有する直鎖ポリ（エチレンオキシド）（ｌ−ＰＥＯ）、および１ｍｇの発光化合物を、様々な量の溶媒、即ち水またはアセトニトリルと混合した。周囲条件下で一晩強撹拌（７５０または１５００ｒｐｍ）した際、この混合物はゲル化した。任意の基材、例えばスライドガラスの上にドクターブレード塗布によりさらにフィルム形成できるゲル状材料の生成のために、質量比を最適化させた。担体上に配置した厚さ５０μｍの矩形スタンプを用いて、ドクターブレード塗布を実施した。３Ｄ基材をゲルに導入することにより、３Ｄ基材上にゲルを適用することもできる。次いで、１時間未満の間１〜１０ｍｂａｒの減圧ステーションに、フィルムまたは被覆材料を導入した。最終材料は、ゴムとして最良と説明され、ピンセットで基材から容易に剥がして他の基材に移動することができた。スタンプの厚さにより、または優れた付着により層を順に重ねる後続の付着により、ゴムの厚さを制御できる。厚さおよび粗さは、Brukerの表面形状測定器DektakxTを用いて測定した。発光物質の存在は、分光技術〔Perkin Elmer Lambda, Fluoromax-p-spectrometer（Horiba-JobinYvon）、および統合されたTCSPCソフトウェアと共に供給されているSPEX Fluorolog-3（Horiba-JobinYvon）を用いて実施される、定常状態吸収特性およびフォトルミネッセンス特性、並びに励起状態の寿命およびフォトルミネッセンス量子収量〕によって裏付けられた。A Kross OptronicのKruess屈折計装置を用いて屈折率を測定した。
【０１４３】
２９５．１６Ｋの温度でMCR 301レオメーター（Anton Paar）を用いて、ゲルのおよびゴムだけのレオロジー的測定を実施した。２５ｍｍの直径および１°のコーン角度でコーンプレート形状を用いてゲルを調べた。２５ｍｍのプレート直径、１ｍｍのギャップ幅を有する平行ディスク配置で、ゴムの振動測定を実施した。測定材料の一次粘弾性レジームを測定するために、０．１％〜２％の範囲の変形において１ｒａｄ／秒の角振動数で、振幅掃引を実施した。０．１〜１００ｒａｄ／秒の範囲の角周波数で一次粘弾性レジームにおいて周波数掃引を実施した。２９７．７６Ｋの温度、平行ディスク配置でナローギャップレオメーターを用いて、発光物質がゴムのレオロジー特性に及ぼす影響を調べた。これは、UDS 200回転レオメーター（Physica）に基づく。ディスクとして、λ／４およびλ／１０の均一をそれぞれ有する７５ｍｍ直径および５０ｍｍ直径のガラス板を使用した。ギャップ幅を設定し、±０．７μｍ内の精度でギャップ幅をもたらす共焦点干渉計センサーを有するレオメーターから独立して測定した。この設定およびその調節に関するさらなる詳細は、H. Dakhilら、Appl. Rheol. 2014, 24, 63795に提供されている。約５〜９Ｎの垂直抗力で２００μｍのギャップ幅に試料を圧縮した。
【０１４４】
２．ＷＨＬＥＤの作製および特徴付け
Luxeon（LXHL-PR03）およびWinger（WEPRB3-S1）から青色ＬＥＤを購入した。ＷＨＬＥＤの製造は、二段階手順に関する。第一に、ＬＥＤ上にゲルを付着させて、完成表面を湿潤させた。第二に、１時間未満の間１〜１０ｍｂａｒの減圧チャンバーに被覆ＬＥＤを移動した。ＷＨＬＥＤの光ダウンコンバート効率を高めるために、この手順を反復した。また、高エネルギーおよび低エネルギー放出ゲルを順に付着させる上記工程を反復することにより、カスケード被膜の設計を容易に実施した。被膜の厚さとは無関係に、被膜は、さらなる分析のためにＬＥＤ表面から容易に剥がすことができた。被膜の最適厚さは、後に言及する。電流源としてKeithley 2400を用いてＷＨＬＥＤを特徴付ける一方で、球形Avasphere 30-Irradと共にAvantes分光光度計（Avaspec-ULS2048L-USB2）を用いてエレクトロルミネセンススペクトルの変化および発光効率をモニターした。
【０１４５】
結果および検討
バイオＷＨＬＥＤに関連して先に記載したように、マトリックスの組成、即ち図２０に示すように異なった質量比の分岐ポリ（エチレンオキシド）化合物および直鎖ポリ（エチレンオキシド）化合物（それぞれｂ−ＰＥＯおよびｌ−ＰＥＯ）を最適化して、それらを水性媒体中で希釈した蛍光タンパク質と混合した後にゲルおよびゴム材料を生成した８。水の添加を伴わずに、ゲルもゴムも生成されない。水に可溶性の化合物しか適用できないので、これはこの概念の多用途性を限定するであろう。この意見に挑戦するために、ゲルおよびゴムの両方を製造するために、極性プロトン性から、極性非プロトン性および非極性までの複数の溶媒を使用した。ここでは、様々な量の溶媒を用いてｂ−ＰＥＯおよびｌ−ＰＥＯを混合することにより、ゲルを生成した。周囲条件下で一晩強撹拌（７５０または１５００ｒｐｍ）した際、この混合物はゲル化した。任意の基材、例えばスライドガラスの上にドクターブレード塗布によりさらにフィルム形成できるゲル状材料の生成のために、質量比を最適化させた。使用する溶媒量、ｂ−ＰＥＯおよびｌ−ＰＥＯ混合物の組成、並びに撹拌条件とは無関係に、もっぱらアセトニトリルおよび水が、この例において採用した条件下で均一なゲルの生成に適していることが分かった（表４および図２１を参照）。水ベースゲルと同様８、アセトニトリルベースゲルの粘度特性により、被覆のために優れた取扱いが可能となった。実際、ｌ−ＰＥＯの量を変えることにより、粘度を制御できた（図２２参照）。ドクターブレード塗布技術によりスライドガラス上に軟質フィルムを製造するために、１５０μＬのアセトニトリルを含有するｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯ＝６：１質量比の混合物を選択した。穏やかな減圧条件下での乾燥工程時、即ち１質量％未満の溶媒損失で、（上記したように）軟質フィルムをゴム材料に転化した。最終材料は、ゴムとして最良と説明され、ピンセットで基材から容易に剥がして他の基材に移動することができた。ドクターブレード塗布および乾燥工程の一連の反復により、低い平均粗さ値（＜１０％）を伴ったミリメートルレジームまでの厚さが容易に達成された（図２３参照）。レオロジー分析により、水−およびアセトニトリルベースゴムのいずれもが、弾性および粘性材料挙動をそれぞれ定量化する、貯蔵率（Ｇ’）および損失率（Ｇ”）について類似した値を特徴とすることが分かった。唯一の例外は、最も高いｌ−ＰＥＯ含量（３：１質量比）を有するゴムであり、水ベースゴムはアセトニトリルベースゴムより高い機械的安定性を示した（図２４参照）。
【０１４６】
【表４】
2018521125.tif 000011
【０１４７】
いずれのゴムの一次粘弾性レジームも、１％歪み未満に限定された。ここで、Ｇ’はＧ”より常に大きいが、同じ桁の大きさである。ゴム状材料にとって典型的であるように、一次粘弾性範囲における周波数掃引は、もっぱら小さい周波数依存性を示した。一般に、ｌ−ＰＥＯ含量の増加は、Ｇ’値およびＧ”値の向上をもたらす（図２４参照）。最後に、いずれのゴムの屈折率も、１．８より優れており、これは、シリコーンのようなＬＥＤに使用されるカプセル化材料にとっての理想的な屈折率９に近接している。従って、新規なアセトニトリルベースゴムは、ＷＨＬＥＤの製造におけるカプセル化目的にも適している。
【０１４８】
次に、幅広い発光物質をゴムに一体化するために、水溶媒およびアセトニトリル溶媒の両方を使用する可能性を検討した。このために、先に記載したような様々な発光波長（λem）を有する市販発光物質、即ち、ｉ）クマリン３３４（１、λem＝４９６ｎｍ）、Fluorescein 27（２、λem＝５４４ｎｍ）、亜鉛−テトラフェニルポリフィリン（ZnTPP）（３、λem＝６０９、６２４、６５２ｎｍ）のような小分子、ｉｉ）水溶性黄橙色発光炭素ベース量子ドット〔４、λem＝４５０ｎｍ（λexc＝３１０ｎｍ）；λem＝５１９ｎｍ（λexc＝３９０ｎｍ）；５４９ｎｍ（λexc＝４５０ｎｍ）〕１０、ｉｉｉ）Super Yellowのような発光ポリマー（５、λem＝５５０ｎｍ）、並びにｉｖ）[Ir(ppy)2(acac)] （６、λem＝４７０、４９０ｎｍ）および[Ir(ppy)2(tb-bpy)][PF6]（７、λem＝５７０ｎｍ）〔ここで、ppyは２−フェニルピリジンであり、acacはアセチルアセトンであり、tb-bpyは４，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２−ジピリジルである〕のような配位錯体を選択した。これらの化学構造は、図２５および２６に示されている。
【０１４９】
ｂ−ＰＥＯ：ｌ−ＰＥＯ＝６：１の質量比でｂ−ＰＥＯおよびｌ−ＰＥＯを、１５０μＬのアセトニトリル（１〜３および５〜７）または水（４）を伴った１ｍｇの各発光物質と混合することによりゲルを生成した。図２５および２７には、一般にゴム生成時に化合物が分解していないことを示す、溶液およびゴムの両方における発光スペクトルおよび正規化された吸収の比較を示す。しかし、ゴム中マトリックスと小分子および黒鉛量子ドットとの強い相互作用は、発光の消失を示す、励起状態寿命の短縮、並びに赤色シフト（５〜１５ｎｍ）吸収および発光スペクトルにより強調される（図２７および表５を参照）。それどころか、ポリマーおよび配位錯体のゴムマトリックスへのカプセル化により、大なり小なり励起状態寿命は増大する（表５参照）。これは、周囲酸素の公知の発光消失を防ぐマトリックスへの化合物の有効なカプセル化に関連している可能性が高い。マトリックスは、発光ポリマーおよび配位錯体により適していると考えられる。図２８に示されているように、屈折率（＞１．８）およびレオロジー的パラメーター（即ちＧ’およびＧ”）に関するゴム材料の特性および生成のいずれにも、発光物質の添加はほとんど影響を及ぼさない。最後に、様々な状況下で、例えば室条件下（即ち貯蔵安定性）、周囲条件下でＵＶランプ（３１０ｎｍ、８Ｗ）により照射しながら（即ち照射安定性）、および周囲条件下で２０°Ｃずつ室温から１２０°Ｃに加熱ランプにより加熱しながら（即ち熱安定性）、有機化合物の吸収特性をモニターすることにより、ゴムの安定性を調べた。図２９、３０および３１に示すように、全てのゴムが優れた４０日間を超える貯蔵安定性を示す一方で、照射安定性は、配位錯体および量子ドットに基づくゴムについては十分であったが、小分子およびポリマーを含有するゴムでは十分ではなく、数時間後に分解した。また、加熱時の吸収特性の変化は、全てのゴムが１００°Ｃの温度まで安定であることを明らかに示した。
【０１５０】
【表５】
2018521125.tif 000012
【０１５１】
最後に、ＵＶ照射下での溶液とゴムとの発光化合物安定性の直接比較を図３２に示す。これは、マトリックスが化合物の全てをさらに安定化することを示している。このことは、小分子およびポリマーについて特に顕著である一方で、特に、炭素ベース量子ドットおよび配位錯体は溶液およびゴムの両方において十分な照射安定性を示した。従って、ゴム組成物とダウンコンバート材料との間の相互作用は、安定性および光物性に関して有益である。
【０１５２】
これらの発見を考慮して、先の材料および方法の段落に記載したように、小分子（ＳＭ−ＷＨＬＥＤ）、量子ドット（ＱＤ−ＷＨＬＥＤ）、ポリマー（Ｐ−ＷＨＬＥＤ）、および配位錯体（ＣＣ−ＷＨＬＥＤ）をゴムと組み合わせたカスケード被膜系を青色ＬＥＤ（即ち最大４５０ｎｍ）と組み合わせて白色発光ＨＬＥＤを作製した。ＷＨＬＥＤの製造は、二段階手順に関する。第一に、ＬＥＤ上にゲルを付着させて、完成表面を湿潤させた。第二に、１時間未満の間１〜１０ｍｂａｒの減圧チャンバーに被覆ＬＥＤを移動した。ＷＨＬＥＤの光ダウンコンバート効率を高めるために、この手順を反復した。被膜の厚さとは無関係に、被膜は、さらなる分析のためにＬＥＤ表面から容易に剥がすことができた。注目すべきことに、発光ダウンコンバート被膜の厚さの最適化は、図３３に示され、後に説明するように、白色色品質と高い発光効率との間の適当なバランスを得るために実現された。出発条件として、ＷＨＬＥＤの特性を乾燥窒素雰囲気下で測定し、その後、最も安定なデバイスを周囲条件下で測定した。
【０１５３】
ＳＭ−ＷＨＬＥＤは、１（０．１４ｍｍ）／２（０．０６ｍｍ）／３（０．１０ｍｍ）に基づく上塗りを有する青色ＬＥＤの構造を特徴とする。１０ｍＡから２５０ｍＡに駆動電流を高めると、エレクトロルミネセンススペクトルは、例えば１０ｍＡおよび２５０ｍＡのぞれぞれについて０．３５／０．３５〜０．２８／０．２８のＣＩＥ座標、９３および７８のＣＲＩ値、並びに４７７６および１０８５１ＫのＣＣＴを有する安定な白色を伴って全ての小分子について区別可能なピークを明らかに示した（図３４参照）。重要なことに、被膜が全パッキングを均一にカバーするので、これは視角（０、３０、４５、９０°）に依存しない（図３４参照）。次に、１０ｍＡの駆動電流で、デバイスの長期安定性を検討した。図３４および３５に示すように、この穏やかな駆動条件および不活性雰囲気下でさえ、０．３１／０．３２のＣＩＥ座標を有する初期白色光は、数時間以内に、０．２３／０．１６のＣＩＥ座標を有する青色領域に変化した。さらに、ＣＲＩは７７から６４に低下し、ＣＣＴは６６００から５９００Ｋに低下した。最後に、発光スペクトルの変化（即ち、３０％を超える損失を伴った約１時間）に起因して、発光効率は有意に低下した。この結果から、溶液およびゴムのいずれにおいても小分子が十分な光促進分解を示す（図３０および３２参照）ことが予想される。従って、このタイプの発光化合物を用いてさらなる実験は実施しなかった。
【０１５４】
小分子を用いて安定な白色照明源を得ることができなかったので、青色ＬＥＤ／４（０．１ｍｍ）を伴ったＱＤ−ＷＨＬＥＤを検討した。ＳＭ−ＷＨＬＥＤと同様、白色デバイスは、印加駆動電流とは無関係に容易に達成された（図３４参照）。より興味深く、作動条件および不活性雰囲気下での白色品質を経時的にモニターしたところ、約２０時間について、０．３３〜２／０．３２〜０のＣＩＥ座標、約９０〜９５のＣＲＩ値、および５５００〜６２００ＫのＣＣＴを示した（図３４および３５参照）。この運転時間を超えると、エレクトロルミネセンススペクトルの赤色寄与がより突出し、０．３６／０．３２のＣＩＥ座標、９０のＣＲＩ値、４１００ＫのＣＣＴ値、および発光効率の若干の低下を伴って白色品質が変化した。
【０１５５】
様々な励起および環境条件（即ち、温度、ｐＨ、照射など）の下でのこのタイプの材料のフォトルミネッセンス挙動の変化は今なお検討されているが１０、これは、トラップ状態からの放出を促進するマトリックスと外側置換基との相互作用に関するか、またはＱＤのコアを変える周辺置換基の放出に関するであろう。この段階では、ＱＤ−ＷＨＬＥＤを、周囲条件下で調べた。
【０１５６】
最初の３０時間、エレクトロルミネセンススペクトルは迅速に、黄色および赤色部におけるよりバランスのとれた寄与まで展開した（図３４および３５参照）が、より突出した青色成分（即ち、０．３３／０．３２のＣＩＥ、９４のＣＲＩ、５８００ＫのＣＣＴ）を伴った。これはまた、さらに低下する発光効率に影響した（図３４参照）。この時点の後、エレクトロルミネセンススペクトルは一定となった。従って、このタイプの材料の使用には２つの欠点、即ち、低いフォトルミネッセンス量子収量に関する約２Ｌｍ／Ｗの低い初期発光効率と、長期にわたるエレクトロルミネセンススペクトルの変化とがある。非常に期待できる結果が最近示されたので５ｑ、例えば有機シラン外側置換基および／またはカプセル化炭素ＱＤを伴った黒鉛量子ドットの適当な設計が、両方の問題を解決し得る点に注目することは重要である。
【０１５７】
次に、Ｐ−ＷＨＬＥＤの開発のために、既知の発光ポリマーの使用を検討した。最適化デバイスは、印加電流とは無関係に、青色ＬＥＤおよびポリマーにそれぞれ対応する４５０ｎｍおよび５６０ｎｍにおける２つの極大を伴った広いエレクトロルミネセンススペクトルを示した、青色ＬＥＤ／５（０．１ｍｍ）であった（図３６参照）。７０より若干優れたＣＲＩ値および６１５０〜５９００ＫのＣＣＴを伴った０．３２／０．３４のほぼ変化しなかったＣＩＥ座標により、白色光品質は強調された。中程度のＣＲＩは、可視スペクトルの赤色領域における低いエレクトロルミネセンス強度に起因する。より印象的なことは、不活性雰囲気下で約２００時間を超えて安定である約２００Ｌｍ／Ｗの高い発光効率である。効率値は、最良の無機白色発光ＬＥＤの全てと同様である。従って、続いて、同じＰ−ＷＨＬＥＤを周囲条件下で調べた（図３６および３３参照）。残念なことに、色品質および発光効率のいずれも低下したので（図３６および３７参照）、ポリマーの発光は、既知の光促進酸化プロセス５ｄ、１１により直ちに損傷を受けた。この発光ポリマーに基づく薄フィルム照明デバイスは、不活性雰囲気下で何千時間もの安定性を示すが、グローブボックスの外で試験する際は厳しいカプセル化を必要とするので１１ｂ、ｃ、この発見は意外ではなかった。実際、５の照射安定性は、他の発光化合物と比べて、溶液およびゴムにおいて中程度であった（図３０および３２参照）。従って、利用しにくい作製方法という欠点を有するＰ−ＷＨＬＥＤの寿命を改善するために、さらなるカプセル化系が必要であろう。
【０１５８】
最後に、最適化構造青色ＬＥＤ／６（０．１ｍｍ）／７（０．１ｍｍ）を有するＣＣ−ＷＨＬＥＤを検討した（図３６および３７参照）。１０〜２００ｍＡの異なった駆動電流を印加すると、青色ＬＥＤ６および７について明らかに区別可能な発光ピークが観察された。予想通り、０．３３〜０／０．３２〜０のＣＩＥ座標、８０より優れたＣＲＩ値、および６０００〜８５００ＫのＣＣＴが達成された。比較のために、不活性雰囲気下、エレクトロルミネセンススペクトルおよび発光効率の経時変化をモニタリングして、ＣＣ−ＷＨＬＥＤの安定性の検討を実施した（図３６および３７参照）。Ｐ−ＷＨＬＥＤと同様、ＣＣ−ＷＨＬＥＤは、約２００時間、色品質（即ち、ＣＩＥ：０．３２／０．３４；ＣＲＩ：８５；ＣＣＴ：約５５００〜６０００Ｋ）と発光効率（１００Ｌｍ／Ｗ）との両方に関して優れた安定性を示した。しかし、Ｐ−ＷＨＬＥＤとは対照的に、周囲作動条件下で１０００時間を超える色および効率の著しい安定性は注目に値する。これは、これらのゴムが、照射処理および加熱処理の両方の下での環境条件とは無関係の優れた安定性、並びにゴム材料におけるルミネセンス特性の向上を示すためと考えられる（上記参照）１２。興味深いことに、この長期にわたり色品質は安定であるが、図３６に示されているように、Ｎ２から周囲条件またはその逆にＣＣ−ＷＨＬＥＤを移動させると発光効率は直ちに低下または上昇する。これは、酸素により消光する既知のリン光に関し、Ｐ−ＷＨＬＥＤのために提案されているように、トップ分離被覆の使用により回避することもできる。発光効率の環境への依存を考慮すると、周囲条件下でその開始極大の半分に達するまで、このデバイスは約４０００時間の推定寿命を示す（図３８参照）。安定性に関してカプセル化の必要性はないが（上記参照）、より効率的なＣＣ−ＷＨＬＥＤの作製は有利であり得る。約数百時間の従来技術の安定性を有する５ｉ、ｋ、ｌ、ｏ、ｑ８ＷＨＬＥＤの安定性と比較すると、後者は、より有望である。
【０１５９】
結論
この例は、ＷＨＬＥＤの分野における２つの主な要点を提供する。一方では、ダウンコンバート照明方式用発光ゴムの容易な製造および応用を実証している。ここで、本アプローチの重要な利点は、ｉ）架橋およびＵＶ硬化または熱硬化法を用いないゴムのイン・サイチュ製造、並びにｉｉ）蛍光タンパク質８、小分子、炭素量子ドット、ポリマーおよび配位錯体のような発光物質の使用に関するその多用途性である。ここで、化合物の量を一定に保つことを確実にした。しかし、被覆厚さを低下させると、化合物濃度を高くした場合は、発光効率のさらなる向上が可能とならなければならない。これに関して、図３３に示すように、高品質白色発光を得るために後者を最適化した。加えて、被膜厚さが増大すると、発光効率は一時的に低下する（図３３参照）。一方、初めて、様々なダウンコンバート材料の直接比較が提供され、これにより、同じ作業条件下で、配位錯体に基づくダウンコンバートゴムカプセルを用いて作製されたＷＨＬＥＤは将来の躍進のための大きな可能性を有することが分かった。これは、環境条件とは無関係の１０００時間を超える（推定４０００時間）色品質（ＣＲＩ＞８０）および発光効率（＞１００Ｌｍ／Ｗ）に関する前例のない安定性によって実証された。フォトルミネッセンス量子収量が上昇する場合、炭素量子ドットの潜在的見通しは同様に重要である。注目すべきは、屋外条件下（即ち、５０〜７０°Ｃおよび８０％湿度）におけるデバイスの安定性の測定が興味深いことであるが、化合物全ての十分な熱安定性の故に、もたらされる結果への重要な変化は予想されない。より重要なことには、ダウンコンバート化合物の全ての照射安定性は、溶液中と比べるとゴム中で若干上昇するので、デバイス間での安定性の差異が化合物の本質的不安定性と関係し得ると仮定することは安全である。
【０１６０】
全ての無機白色ＬＥＤがＷＨＬＥＤよりはるかに高い安定性を特徴とするが、ここで供給されたＣＣ−ＷＨＬＥＤが全ての無機白色ＬＥＤと同様のＣＲＩおよび発光効率を示す一方で、その安定性は、従来技術のハイブリッド白色ＬＥＤと比べて一桁向上する点を指摘することは重要である。本発明の研究がＷＨＬＥＤ分野における将来の躍進のための目標を構成していると強く信じられる。これに関して、さらなる検討は、高い操作温度、および特に熱安定性有機物ベース被膜を有する、高性能ＬＥＤアレイのためのダウンコンバートカプセル化系の開発である。
【０１６１】
参考文献
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１２．R. D. Costaら、Inorg. Chem. 2011, 50, 7229.
【０１６２】
実施例１０：分岐ポリマーとしてのＴＭＰＥおよび複数の直鎖ポリマーを用いたゴム状材料の製造
本発明で提供されるアプローチの多用途性を調べるために、異なった質量比の分岐ポリマー〔この場合は、４５０ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）〕および様々な直鎖ポリマー〔この場合は、５０００〜８０００ｋＤａの範囲のＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、並びに５００ｋＤａのＭｎを有するポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）〕を用いて、本発明のゲルおよび最終ゴム状材料の製造を実施した。以下の表６〜８に示すように、様々な量の（別にタンパク質のために使用される）バッファー溶液を添加した。また、表９に、水性飽和ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ溶液と共に様々な質量比の分岐ポリマー〔この場合は、４５０ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）〕および直鎖ポリマー〔この場合は、５０００ｋＤａのＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ））を用いて実施した本発明のゲルおよび最終ゴム状材料の製造をまとめる。実施例１に記載したように、ゴム生成を実施した。
2018521125.tif 000013
トリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）
2018521125.tif 000014
ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）
2018521125.tif 000015
ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）
【０１６３】
【表６】
2018521125.tif 000016
【０１６４】
【表７】
2018521125.tif 000017
【０１６５】
【表８】
2018521125.tif 000018
【０１６６】
【表９】
2018521125.tif 000019
【０１６７】
新規なゴムに埋め込まれた蛍光タンパク質の適合性を調べるために、実施例１に記載したようにゴム生成について、蛍光タンパク質（０．１５ｍｇ）（この場合はmCherry）を含有する水ベースバッファー溶液を用いて、同じ実験を実施した。タンパク質ベースゴムと初期水ベースバッファー溶液との発光特性の直接比較により、ゴム生成中のタンパク質の劇的な変質または分解は起こらない（図３９Ａ参照）（Prodanov Lら、Biomaterials 2010, 31, 7758）；ＴＭＰＥと直鎖ポリマーとの様々なポリマー組み合わせを用いて得た溶液および最終材料からの放出特性を比較すると分かる小さい変化は、タンパク質骨格の小さい構造変化によってもたらされ、これは発色団の結合ポケットに有意な影響を及ぼさない；発光タンパク質の変質はフォトルミネッセンス特性の損失を意味する点に留意すべきである、ことが分かる。
【０１６８】
実施例１１：分岐ポリマーとしてのＰＥＩおよび複数の直鎖ポリマーを用いたゴム状材料の製造
実施例１０と同様に、この実施例は、複数の直鎖ポリマーと組み合わせて、分岐ＴＭＰＥポリマーを分岐ＰＥＩに変えることによるゴム状材料の生成を示す。様々な質量比の分岐ポリマー〔この場合は、ポリエチレンイミン（８００Ｄａの平均Ｍｗを有するＰＥＩ）〕および様々な直鎖ポリマー〔この場合は、５０００〜８０００ｋＤａのＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、並びに５００ｋＤａのＭｎを有するポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）〕を用いて、ゲルおよび最終ゴム状材料の製造を実施した。表９〜１２に示すように、様々な量の（別にタンパク質のために使用）バッファー溶液を添加した。実施例１に記載したように、ゴム生成を実施した。
2018521125.tif 000020
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【０１６９】
【表１０】
2018521125.tif 000021
【０１７０】
【表１１】
2018521125.tif 000022
【０１７１】
【表１２】
2018521125.tif 000023
【０１７２】
新規なゴムに埋め込まれた蛍光タンパク質の適合性を調べるために、実施例１に記載したようにゴム生成について、蛍光タンパク質（０．１５ｍｇ）（この場合はmCherry）を含有する水ベースバッファー溶液を用いて、同じ実験を実施した。タンパク質ベースゴムと初期水ベースバッファー溶液との発光特性の直接比較により、ゴム生成中のタンパク質の劇的な変質または分解は起こらない（図３９Ｂ参照）（Prodanov Lら、Biomaterials 2010, 31, 7758）；ＰＥＩと直鎖ポリマーとの様々なポリマー組み合わせを用いて得た溶液および最終材料からの放出特性を比較すると分かる小さい変化は、タンパク質骨格の小さい構造変化によってもたらされ、これは発色団の結合ポケットに有意な影響を及ぼさない；発光タンパク質の変質はフォトルミネッセンス特性の損失を意味する点に留意すべきである、ことが分かる。
【０１７３】
実施例１２：分岐ポリマーとしてＴＭＰＥＭＥＤおよび様々な直鎖ポリマーを用いたゴム状材料の製造
本発明で提供されるアプローチの多用途性を調べるために、異なった質量比の分岐ポリマー〔この場合は、３８８ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレートメチルエーテルジアクリレート（ＴＭＰＥＭＥＤ）〕および様々な直鎖ポリマー〔この場合は、５０００〜８０００ｋＤａの範囲のＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、並びに５００ｋＤａのＭｎを有するポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｘ）〕を用いて、本発明のゲルおよび最終ゴム状材料の製造を実施した。表１３〜１５に示すように、様々な量の（別にタンパク質のために使用される）バッファー溶液を添加した。実施例１に記載したように、ゴム生成を実施した。
2018521125.tif 000024
トリメチロールプロパンエトキシレートメチルエーテルジアクリレート（ＴＭＰＥＭＥＤ）
【０１７４】
【表１３】
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【０１７５】
【表１４】
2018521125.tif 000026
【０１７６】
【表１５】
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【０１７７】
新規なゴムに埋め込まれた蛍光タンパク質の適合性を調べるために、実施例１に記載したようにゴム生成について、蛍光タンパク質（０．１５ｍｇ）（この場合はmCherry）を含有する水ベースバッファー溶液を用いて、同じ実験を実施した。タンパク質ベースゴムと初期水ベースバッファー溶液との発光特性の直接比較により、ゴム生成中のタンパク質の劇的な変質または分解は起こらない（図３９Ｃ参照）（Prodanov Lら、Biomaterials 2010, 31, 7758）；ＰＥＩと直鎖ポリマーとの様々なポリマー組み合わせを用いて得た溶液および最終材料からの放出特性を比較すると分かる小さい変化は、タンパク質骨格の小さい構造変化によってもたらされ、これは発色団の結合ポケットに有意な影響を及ぼさない；発光タンパク質の変質はフォトルミネッセンス特性の損失を意味する点に留意すべきである、ことが分かる。
【０１７８】
実施例１３：その中に固定化された様々な発光物質を含むゴム状材料の製造
以下の表１６および１７に示すように、異なった質量比の分岐ポリマー〔この場合は、４５０ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）〕および直鎖ポリマー〔この場合は、５０００ｋＤａの範囲のＭｎを有するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）〕を用いて、本発明のゲルおよびゴム状材料の製造を実施した。実施例１に記載したように、ゴム生成を実施した。具体的には、以下の表１７に示すように様々な質量比で２つのポリマーを混合した。ＴＭＰＥは低粘性液体であるが、ＰＥＯは高撹拌条件でも溶解しなかった。この工程を促進するために、表１および２において既に記載した（実施例２参照）様々な量のアセトニトリルまたは水を添加した。
【０１７９】
【表１６】
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【０１８０】
【表１７】
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【０１８１】
表１６にまとめたように、１５μＬのアセトニトリルを用いた場合にゲル生成が最良であり、これは、ドクターブレード技術を用いてフィルムを作製するのに十分良好であることを意味する。次の段階では、最小量のＰＥＯを調べた。表１７に示すように、５〜１０ｍｇのＰＥＯが、有用なゲルを得るのに最良の量であった。まとめると、一定量（１５０μＬ）の水を伴った１：６〜１：１２のＰＥＯ：ＴＭＰＥ質量比が、さらなる加工のための最良の条件であることが分かった。
【０１８２】
最終層はゴム状材料として最良と説明され、ほとんどのアセトニトリルの減少は網目構造の崩壊を引き起こした。特に、周囲貯蔵条件下で何週間たっても、溶媒は元に戻らない（図４０参照）。ゴム状材料は、ピンセットで基材から容易に剥がして他の基材に容易に移動することができた。実施例１で既に説明したように、スタンプの厚さにより、または１０％未満の粗さを示す優れた付着により層を順に重ねる後続の付着により、ゴム材料の厚さを制御できる。
【０１８３】
その中に埋め込まれた様々な発光化合物を含むゴム状材料の製造
実施例１に記載したものと同様の手順で、発光ゲルおよびゴム状材料の生成を実施した。ここで、６：１の質量比で分岐ポリ（エチレンオキシド）化合物および直鎖ポリ（エチレンオキシド）化合物〔即ち、４５０ＤａのＭｎを有するトリメチロールプロパンエトキシレート（ＴＭＰＥ）および５×１０６ＤａのＭｎを有する直鎖ポリ（エチレンオキシド）（ｌ−ＰＥＯ）〕の混合物に直接粉末として市販発光化合物を添加でき、次いで、溶媒〔即ち、発光化合物の性質（溶解性、極性など）に応じて水またはアセトニトリルのいずれか〕を添加した。ここでは、末端ヒドロキシル基が、網目内に十分な溶媒分子を保持する、アセトニトリル溶液との高い適合性を提供することも提案している。ゲル網目は主にＴＭＰＥによってもたらされた一方で、ｌ−ＰＥＯはゲル化剤として作用した。発光物質の検討範囲において、ゲルおよび最終ゴム材料の生成は、封入化合物の量に依存しなかった。また、発光ゲルおよびゴム状材料は、実施例１および２に記載した上記タンパク質ベースのものと同じ性質、即ちゲルに３Ｄ基材を導入することによる３Ｄ基材への適用可能性を示した。スタンプの厚さにより、または優れた付着により層を順に重ねる後続の付着により、ゴム状材料の厚さを制御できた。発光化合物の存在は、定常状態の分光技術によって裏付けられた（定常状態吸収特性およびフォトルミネッセンス特性は各々、HORIBA Jobin YvonのPerkin Elmer Lambda and Fluoromax-p-spectrometerを用いて求めた）。
【０１８４】
最終材料と初期溶液との発光特性の直接比較により、発光ゴム状材料生成中の化合物の劇的な分解は起こらない；溶液およびゴム状材料からの放出特性を比較すると分かる小さい変化（即ち約５〜１０ｎｍの最大シフトおよびスペクトルの若干の広がり）は、発光化合物と周囲マトリックスとの小さい相互作用によってもたらされ、これは発光団に有意な影響を及ぼさない、ことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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