(57)【要約】本開示は、例えば、ＴＩＡ−１の核酸ベースの阻害剤を提供する。阻害剤は、例えば、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）でありうる。核酸ベースの阻害剤を使用して、例えば、アルツハイマー病および前頭側頭型認知症など、神経変性障害を処置することができる。一局面では、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を低減することが可能である、核酸ベースの阻害剤が提供される。
2018531046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を低減することが可能である、核酸ベースの阻害剤。
【請求項２】
少なくとも１カ所の化学修飾を含む、請求項１に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド１５２６〜１５４５を含む第２の領域と少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド重複する、配列番号１のＴＩＡ−１核酸配列の第１の領域とハイブリダイズすることが可能である、請求項１または２に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項４】
配列番号１のヌクレオチド１５２６〜１５４５を含む第２の領域の少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド以内である、配列番号１のＴＩＡ−１核酸配列の第１の領域とハイブリダイズすることが可能である、請求項１または２に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項５】
配列番号２の配列、または配列番号２と比べて、１、２、３、４、もしくは５カ所を超えない、置換、挿入、もしくは欠失を有する配列を含む、請求項１または２に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項６】
配列番号２とハイブリダイズすることが可能である配列をさらに含む、請求項５に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項７】
配列番号２とハイブリダイズすることが可能である前記配列が、配列番号３と比べて、１、２、３、４、または５カ所を超えない、置換、挿入、または欠失を有する配列である、請求項６に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項８】
配列番号４の配列、または配列番号４と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０カ所を超えない、置換、挿入、もしくは欠失を有する配列を含む、請求項１または２に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項９】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖干渉ｄｓＲＮＡ（ｌｉＲＮＡ）、アプタマー、またはリボザイムを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１０】
二本鎖領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１１】
前記二本鎖領域が、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対の長さである、請求項１０に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１２】
約１〜約３（例えば、約１、２、または３）ヌクレオチドの、１つまたは２つの突出末端を含む、請求項１０または１１に記載の核酸阻害剤。
【請求項１３】
１つまたは２つの平滑末端を含む、請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸阻害剤。
【請求項１４】
一本鎖である、請求項１から５のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１５】
ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび逆位デオキシ無塩基残基から選択される１または複数の化学修飾を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１６】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の化学修飾ヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１７】
１または複数のコンジュゲート部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１８】
前記コンジュゲート部分が、１または複数の切断可能な結合、例えば、ホスホジエステル連結を介して、核酸に付着している、請求項１７に記載の核酸ベースの阻害剤。
【請求項１９】
神経変性障害を処置するための、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を低減することが可能である、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤。
【請求項２０】
神経変性障害を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体へと、治療有効量の、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸ベースの阻害剤を投与するステップを含み、これにより、前記被験体を処置する方法。
【請求項２１】
前記核酸ベースの阻害剤が、請求項１から１８のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤である、請求項１９または２０に記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２２】
第２の抗神経変性剤または抗神経変性療法を、前記被験体へと投与するステップをさらに含む、請求項１９から２１のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２３】
前記被験体が、哺乳動物、例えば、ヒトである、請求項１９から２２のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２４】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項１９から２３のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２５】
前記神経変性障害が、タウオパチーである、請求項１９から２４のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２６】
前記神経変性障害が、運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１９から２５のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２７】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉認知症（ＦＴＬＤ−ＴＤＰ）、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、および脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項１９から２６のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２８】
全タウレベルが低下せず、例えば、タウレベルが増大する、請求項１９から２７のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２９】
ストレス顆粒が、タウタンパク質、例えば、ミスフォールディングしたタウタンパク質、例えば、抗体ＭＣ１により認識されるエピトープを含むタウタンパク質を含む、請求項１９から２８のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３０】
ストレス顆粒の安定性の低下、または溶解度の増大を含む、請求項１９から２９のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３１】
（例えば、非処置試料もしくは被験体と比較して、または処置を伴わない疾患について予測される経過と比較して）ストレス顆粒の数もしくはサイズを低減するか、ストレス顆粒の形成を阻害するか、またはストレス顆粒について陽性である細胞の数を低減する方法であって、細胞を、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸ベースの阻害剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項３２】
細胞生存を延ばす方法であって、前記細胞を、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸ベースの阻害剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項３３】
タウのミスフォールディングを阻害する方法であって、ミスフォールディングしたタウを有する細胞を、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸ベースの阻害剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項３４】
請求項１から１８のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤と、前記核酸ベースの阻害剤を神経変性疾患を処置するのに使用するための指示とを含む、キット。
【請求項３５】
請求項１から１８のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤をコードするベクター。
【請求項３６】
プロモーター、選択マーカー、ポリアデニル化部位のうちの１または複数をさらに含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである、請求項３５または３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１から１８のいずれかに記載の複数の核酸ベースの阻害剤を含むかまたはコードする、請求項３５から３７のいずれかに記載のベクター。
【請求項３９】
請求項１から１８のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤と、１または複数の、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１から１８のいずれかに記載の核酸ベースの阻害剤を作製する方法であって、固相合成を実施して、複数のヌクレオチドを、あらかじめ規定された順序で重合させるステップを含み、これにより、前記核酸ベースの阻害剤を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１５年１０月１４日に出願された米国連続番号６２／２４１，５３５および２０１６年５月４日に出願された米国連続番号６２／３３１，７９５（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
この出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参考として本明細書に援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年１０月１１日に作成され、Ａ２１３７−７０１３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、そして１５，７４３バイトのサイズである。
【０００３】
連邦政府によって資金提供された研究または開発に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金番号Ｆ３１ＡＧ０４２２１３、Ｒ０１ＡＧ０５０４７１、Ｒ０１ＮＳ０８９５４４および１Ｒ４３ＮＳ０９５４８１−０１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
多くの神経変性疾患の特徴のうちの１つは、脳内および中枢神経系内のタンパク質封入体の蓄積である。これらの封入体は、タンパク質および他の細胞成分の、不溶性の凝集物であって、細胞に対する損傷を引き起こし、機能障害を結果としてもたらす凝集物である。タウ、α−シヌクレイン、ハンチンチン、およびβ−アミロイドなどのタンパク質は全て、脳内で封入体を形成し、アルツハイマー病およびハンチントン病を含む、多数の神経変性疾患の発症と関連することが見出されている。神経変性疾患はまた、ＲＮＡと、凝集したＲＮＡ結合性タンパク質とを含有する、ストレス顆粒とも関連する。
【０００５】
ＴＩＡ−１とは、ＲＮＡ結合性タンパク質であり、コアの核形成ストレス顆粒タンパク質である。核の形成に続き、二次的なＲＮＡ結合性タンパク質が動員されて、成熟ストレス顆粒が形成されるが、これは、ストレス誘導性の翻訳の抑制の鍵となる構成要素である。ＴＩＡ１は、神経変性障害を伴う被験体の脳組織内で、神経病態と共局在化する。
【０００６】
当技術分野では、ストレス顆粒を離解しうるか、またはそれらの形成を阻害しうる組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、とりわけ、ＴＩＡ−１の核酸ベースの阻害剤を提供する。神経変性障害は、ＴＩＡ−１およびタウを含有しうる、ストレス顆粒の形成と関連する。本明細書の実施例１が示す通り、ストレス顆粒の形成の傾向がある細胞内では、ＴＩＡ−１のノックダウンは、ストレス顆粒の形成を低減する。本開示は、例えば、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤で被験体を処置することにより、神経変性障害を処置する方法を提供する。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を低減することが可能である、核酸ベースの阻害剤を提供する。
【０００９】
ある特定の態様では、本開示はまた、神経変性障害を有する被験体を処置する方法であって、被験体へと、治療有効量の、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸ベースの阻害剤、例えば、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を投与するステップを含み、これにより、被験体を処置する方法も提供する。関連する態様では、本開示は、神経変性障害を処置するための、医薬を製造するための、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を提供する。関連する態様では、本開示は、神経変性障害を処置するための、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を提供する。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示はまた、（例えば、非処置試料もしくは被験体と比較して、または処置を伴わない疾患について予測される経過と比較して）ストレス顆粒の数もしくはサイズを低減するか、ストレス顆粒の形成を阻害するか、またはストレス顆粒について陽性である細胞の数を低減する方法であって、細胞を、核酸ベースの阻害剤、例えば、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤と接触させるステップを含む方法も提供する。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示はまた、細胞生存を延ばす方法であって、細胞を、核酸ベースの阻害剤、例えば、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤と接触させるステップを含む方法も提供する。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示はまた、タウのミスフォールディングを阻害する方法であって、ミスフォールディングしたタウを有する細胞を、核酸ベースの阻害剤、例えば、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡを標的とする、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤と接触させるステップを含む方法も提供する。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示はまた、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤と、核酸ベースの阻害剤を神経変性疾患を処置するのに使用するための指示とを含むキットも提供する。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示はまた、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤をコードし、任意選択で、プロモーター、選択マーカー、ポリアデニル化部位のうちの１または複数（例えば、これらのうちの２つまたは３つ）をさらに含むベクターも提供する。複数の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである。複数の実施形態では、ベクターは、複数の、本明細書で記載される、核酸ベースの阻害剤を含むかまたはコードする。
【００１５】
ある特定の態様では、本開示はまた、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤と、１または複数の、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示はまた、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を作製する方法であって、固相合成を実施して、複数のヌクレオチドを重合させるステップを含む方法も提供する。ヌクレオチドは、あらかじめ規定された順序で重合させ、これにより、核酸ベースの阻害剤を作製することができる。ある特定の態様では、本開示はまた、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を作製する方法であって、本明細書で記載されるベクターを含む細胞を、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の発現を可能とする条件下で培養するステップを含む方法も提供する。
【００１７】
ある特定の態様では、本開示はまた、ストレス顆粒のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を、ストレス顆粒を発生させる細胞、例えば、本明細書で記載される物理化学的ストレス因子で処理された細胞と接触させるステップを含み、ストレス顆粒の形成の減少は、ＴＩＡ−１阻害剤が、ストレス顆粒の形成の阻害剤であることを指し示す方法も提供する。
【００１８】
本明細書の態様のうちのいずれか、例えば、本明細書における核酸ベースの阻害剤、キット、組成物、使用のための組成物、および方法のうちのいずれかでは、核酸ベースの阻害剤は、下記の特性のうちの１または複数を有しうる。
【００１９】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、少なくとも１カ所の化学修飾を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、配列番号１のヌクレオチド１５２６〜１５４５を含む第２の領域と少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド重複する、配列番号１のＴＩＡ−１核酸配列の第１の領域とハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、配列番号１のヌクレオチド１５２６〜１５４５を含む第２の領域の少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド以内である、配列番号１のＴＩＡ−１核酸配列の第１の領域とハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＴＩＡ−１  ＲＮＡへの結合について、配列番号４のｓｈＲＮＡと競合することが可能である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＴＩＡ−１  ＲＮＡへの結合について、配列番号４のヘアピンに由来するガイド配列である、配列番号２の核酸と競合することが可能である。
【００２１】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、配列番号２の配列、または配列番号２と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０カ所を超えない、置換、挿入、もしくは欠失を有する配列を含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、配列番号２とハイブリダイズすることが可能である配列をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号２とハイブリダイズすることが可能である配列は、配列番号３と比べて、１、２、３、４、または５カ所を超えない、置換、挿入、または欠失を有する配列である。一部の実施形態では、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの）ミスマッチがないか、または１つ以下のミスマッチで、ヒトＴＩＡ−１核酸、例えば、配列番号１の核酸とハイブリダイズすることが可能な領域を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、配列番号４の配列、または配列番号４と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０カ所を超えない、置換、挿入、または欠失を有する配列を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖干渉ｄｓＲＮＡ（ｌｉＲＮＡ）、アプタマー、またはリボザイムを含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ｓｈＲＮＡではない。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、二本鎖領域を含む。一部の実施形態では、二本鎖領域は、約３０塩基対の長さである。複数の実施形態では、二本鎖領域は、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９塩基対の長さである。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、約１〜約３（例えば、約１、２、または３）ヌクレオチドの、１つまたは２つの突出末端を含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、１つまたは２つの平滑末端を含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、平滑末端、例えば、約１〜約３（例えば、約１、２、または３）ヌクレオチドの５’突出、または３’突出を伴うｓｈＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、一本鎖である。
【００２４】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび逆位デオキシ無塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）から選択される１または複数の化学修飾を含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の化学修飾ヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤のあらゆるヌクレオチドは、化学修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、１または複数のコンジュゲート部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、１または複数の切断可能な結合、例えば、ホスホジエステル連結を介して、核酸に付着している。
【００２５】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡの切断を促進することが可能である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡの分解を促進することが可能である。
【００２６】
本明細書で記載される使用のための方法または組成物のうちのいずれかは、以下のステップまたは特徴のうちの１または複数を伴いうる。
【００２７】
一部の実施形態では、方法は、第２の抗神経変性剤または抗神経変性療法を、被験体へと投与するステップをさらに含む。例えば、本明細書における使用のための組成物についての一部の実施形態では、患者は、第２の抗神経変性剤または抗神経変性療法で処置されたか、処置されつつあるか、または処置される。
【００２８】
一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えば、ヒトである。一部の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病である。一部の実施形態では、神経変性障害は、タウオパチーである。一部の実施形態では、神経変性障害は、運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。一部の実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）（ＦＴＬＤ−ＴＤＰ）、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、および脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）から選択される。
【００２９】
一部の実施形態では、全タウレベルは低下せず、例えば、タウレベルは増大する。一部の実施形態では、ストレス顆粒は、タウタンパク質、例えば、ミスフォールディングしたタウタンパク質、例えば、抗体ＭＣ１により認識されるエピトープを含むタウタンパク質を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、方法は、ストレス顆粒の安定性の低下、または溶解度の増大を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにおける細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ニューロンである。
【００３２】
一部の実施形態では、タウタンパク質は、野生型タウまたは変異体タウ、例えば、Ｐ３０１Ｌタウ、例えば、Ｓ３９６、Ｓ４０４、またはＳ３９６およびＳ４０４の両方における、非リン酸化タウまたはリン酸化タウである。
【００３３】
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、ストレス顆粒の形成を阻害する。核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、ストレス顆粒の形成を、対照と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（すなわち、完全な阻害）阻害しうる。
【００３４】
一部の実施形態では、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、ストレス顆粒を離解する。核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、ストレス顆粒を、対照と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（すなわち、完全な分散）分散させるかまたは離解しうる。
【００３５】
一部の実施形態では、方法は、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を投与する前に、被験体を、神経変性疾患もしくは神経変性障害、筋骨格系疾患もしくは障害、網膜疾患、またはウイルス感染を伴うと診断するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を投与する前に、被験体を、神経変性疾患または神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、タウオパチー、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＦＴＤＰ−１７、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、および脊髄性筋萎縮症などの運動ニューロン疾患）を伴うと診断するステップをさらに含む。
【００３６】
一部の実施形態では、疾患または障害の病態は、ストレス顆粒を含む。ストレス顆粒を含むこととは、被験体における細胞内のストレス顆粒の数が、対照および／もしくは健常被験体と比べて、または前記疾患もしくは障害の発病の前と比べて、変化することを意味する。ストレス顆粒を組み込む、例示的な疾患および障害の病態は、神経変性疾患、筋骨格系疾患、がん、網膜疾患、およびウイルス感染を含むがこれらに限定されない。
【００３７】
一部の実施形態では、細胞を、物理化学的ストレス因子で処理する。一部の実施形態では、物理化学的ストレス因子は、亜ヒ酸塩、栄養素の枯渇、熱ショック、浸透圧ショック、ウイルス、遺伝子毒性ストレス、放射線、酸化ストレス、酸化ストレス、ミトコンドリア阻害剤、および小胞体ストレス因子から選択される。一部の実施形態では、物理化学的ストレス因子は、紫外線またはｘ線照射である。一部の実施形態では、物理化学的ストレス因子は、ＦｅＣｌ２またはＣｕＣｌ２および過酸化物により誘導される酸化ストレスである。
【００３８】
当業者には、単に例示的なものであり、制限的なものではない、本明細書の本開示から、本発明の、さらに他の目的および利点が明らかであろう。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、当業者は、他の実施形態も認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｊ：タウは、ＴＩＡ１の細胞体樹状突起局在化を増大させ、ストレス顆粒を強化する。Ａ）ＴＩＡ１−ＧＦＰレンチウイルス±ＡＡＶ１−ＷＴタウ−Ｖ５またはＡＡＶ１−Ｐ３０１Ｌタウ−Ｖ５を形質導入した、初代海馬タウノックアウトニューロン内の、Ｖ５（タウ）、ＧＦＰ（ＴＩＡ１）、およびＭＡＰ２についてのイメージング。画像は、タウが、ＴＩＡ１の、突起部への移動およびＳＧの形成を増大させることを指し示す（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図１Ｂおよび１Ｃ）ＷＴタウまたはＰ３０１Ｌタウは、タウ−／−ニューロン内のＴＩＡ１顆粒を増大させる。顆粒の密度（図１Ｂ）および面積（図１Ｃ）は、内因性ＴＩＡ１染色および外因性ＴＩＡ１−ＧＦＰ蛍光の両方について、ニューロン１つ当たりのＴＩＡ１点を定量化するＩｍａｇｅＪを使用して決定した（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図１Ｄ）ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰレンチウイルス±ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入されたタウ−／−初代海馬ニューロンについて、生細胞イメージングを行った。ニューロン１つ当たりの移動粒子の数は、ＢｉｔＰｌａｎｅ（Ｉｍａｒｉｓ）により決定した（条件１つ当たりのＮ＝２０）。図１Ｅ〜１Ｇ）ＴＩＡ１＋顆粒の面積  対  タウ−／−ニューロン内の細胞体からの距離の散布図。図１Ｅ）ＴＩＡ１−ＲＦＰ、図１Ｆ）ＷＴタウ／ＴＩＡ１−ＲＦＰ、図１Ｇ）Ｐ３０１Ｌタウ／ＴＩＡ１−ＲＦＰを形質導入されたニューロンについての、ＴＩＡ１平均顆粒速度  対  顆粒面積（条件１つ当たりのＮ＝２０）。図１Ｈ）前進（＋）方向および後退（−）方向の両方における、ＴＩＡ１陽性顆粒の正味の変位の定量化（条件１つ当たりのＮ＝２０）。図１Ｉ）ＴＩＡ１およびＷＴタウまたはＰ３０１Ｌタウ（またはトランスフェクションについての対照としてのβ−ｇａｌ）を過剰発現させるのに続き、ＴＩＡ１、ＰＡＢＰ、およびタウ（タウ１３抗体により同定される）について陽性のＳＧの形成を誘導する亜ヒ酸塩処理（０．５ｍＭ；３０分間）にかけられた、ＨＴ２２不死化海馬細胞。タウ＋ＳＧの形成は、シクロヘキシミド処理（１０μｇ／ｍＬ；ＣＨＸ）により逆転される。図１Ｊ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、またはＰ３０１Ｌ±ＴＩＡ１−ＲＦＰをトランスフェクトされたＨＴ２２細胞に由来する溶解物中および免疫沈降物中の、タウ１３、ＴＩＡ１、およびアクチンのレベルを示す、免疫ブロットおよび免疫沈降。
【図１ＢＣＤ】同上。
【図１ＥＦＧ】同上。
【図１Ｈ】同上。
【図１Ｉ】同上。
【図１Ｊ】同上。
【００４０】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄ：タウは、脳内のＴＩＡ１結合性プロテオームを調節する。内因性ＴＩＡ１を、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよびタウ−／−マウス（Ｎ＝３）の成体（１０カ月齢）大脳皮質から免疫沈降させ、関連するタンパク質を、質量分析により同定し、ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクスリソース（ＮＩＨ）を使用して解析した。図２Ａ）Ｋｅｙｗｏｒｄｓデータベースを使用して決定される、ＷＴ試料中またはタウ−／−試料中で、統計学的に有意な濃縮（ＦＤＲ＜０．２０）を示す、機能アノテーションターム。赤色で強調されたタームは、ＷＴ大脳皮質内において、ｑ値が、タウ−／−大脳皮質内と対比して、１００倍超有意であるアノテーションタームを表す（ｎｓ＝有意ではない）。３つを超える共通のアノテーションクラスターを含有するエッジだけを示す。図２Ｂ）ＷＴマウスの大脳皮質内の、ＴＩＡ１結合性プロテオームについて描示するネットワーク概略図。ＤＡＶＩＤ機能クラスタリング解析により決定される通り、ノードを結び合わせるエッジは、結び合わされたタンパク質の間で共通の、機能アノテーションターム（＞３）を描示する。赤色で強調されたタンパク質が、解析された３つのタウ−／−試料のうちのいずれにおいても検出されなかったことから、それらのＴＩＡ１との相互作用が、タウ依存的であることが指し示される。ノードサイズは、ＷＴ試料（Ｎ＝３）中の反復の程度に比例する。背景の円は、ＴＩＡ１ネットワーク内のタンパク質クラスターであって、ＲＮＡ代謝（橙）、細胞骨格（黄）、小胞／シナプス機能（グレー）、およびミトコンドリア（緑）を含むタンパク質クラスターを指し示す。図２Ｃ）プロテオーム研究のために使用される、ＴＩＡ−／−マウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびタウ−／−マウスの大脳皮質溶解物からのＴＩＡ１の免疫沈降。ＴＩＡ１は、Ｃ５７ＢＬ／６溶解物中およびタウ−／−溶解物中では明らかであったが、ＴＩＡ１−／−溶解物では非存在であった。ＴＩＡ−／−ＩＰ中に存在するあらゆるタンパク質を、プロテオーム解析から除外することにより、非特異的にＩＰしたタンパク質を排除した。質量分析研究により示唆される通り、タウ−／−大脳皮質内では、ＲＰＬ７およびＥＷＳＲ１の、ＴＩＡ１への結合が大幅に低減された。これに対し、ＤＤＸ５の、ＴＩＡ１への結合は、タウの非存在の影響を受けなかった。図２Ｄ）１１カ月齢のｒＴｇ４５１０マウスの前頭皮質内のＴＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ｈｎＲＮＰＤ、ＲＰＬ７、ＴＤＰ−４３、およびＦＵＳ（赤）、ＰＨＦ１（緑）、およびＤＡＰＩ（青）についての免疫組織化学。スケールバー：２０μｍ。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【００４１】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆ：ＴＩＡ１の、タウとの会合。図３Ａ）タウは、ＴＩＡ１と免疫沈降し、ＴＩＡ１は、初代海馬タウノックアウトニューロン内の、ＭＣ１＋ミスフォールディングタウに結合していることが見出される。左パネル：ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入した初代海馬タウ−／−ニューロンからの溶解物中の、全タウ（タウ１３）、リン酸化タウ（ＰＨＦ１）、ＴＩＡ１、およびアクチンのレベルを示す免疫ブロット。中パネル：ＴＩＡ１の免疫沈降に続く、タウ１３、ＰＨＦ１、およびＴＩＡ１による免疫ブロット法。右パネル：ＭＣ１タウの免疫沈降に続く、タウ１３、ＰＨＦ１、およびＴＩＡ１による免疫ブロット法。図３Ｂ）ＴＩＡ１−ＨＡ±ＷＴタウをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの溶解物中の、ＨＡ抗体による免疫沈降であって、ＲＮアーゼＡによる処理後における結合の喪失を示す免疫沈降。図３Ｃ）Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（対照）マウスと対比した、ＴＩＡ１−／−マウスに由来する初代大脳皮質ニューロン内の、高レベルの全タウ（タウ５抗体）を示す免疫ブロット。図３Ｄ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、Ｐ３０１Ｌタウをトランスフェクトされ、ｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＴＩＡ１を共トランスフェクトされたＨＴ２２細胞からの溶解物中の、高レベルの全タウ（タウ１３抗体）を示す、免疫ブロットおよび免疫沈降。ＭＣ１抗体による、上記の溶解物からの、タウの免疫沈降に続く、タウ１３抗体による免疫ブロット法は、ＴＩＡ１のノックダウンによる、ＭＣ１タウの増大を示した。図３Ｅ）ＴＩＡ１または対照ｓｈＲＮＡ（＋ＧＰＦ）をトランスフェクトされ、ミスフォールディングしたタウ（ＭＣ１）およびＭＡＰ２について染色された海馬ニューロンについての免疫細胞化学。ＴＩＡ１  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたニューロンは、ＭＣ１反応性の低減を示す。図３Ｆ）ＴＩＡ１または対照ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたニューロン内の、ＭＣ１レベルの定量化（Ｎ＝５０）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー：１０μｍ。
【図３ＢＣＤ】同上。
【図３ＥＦ】同上。
【００４２】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅ：ＴＩＡ１は、ミスフォールディングしたタウの、ＳＧへの固定を促進する。図４Ａ）ＴＩＡ１は、海馬ニューロン内のＭＣ１＋顆粒を促進する。ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入され、ＥＧＦＰレンチウイルスまたはＴＩＡ１−ＧＦＰレンチウイルスを共形質導入された初代タウ−／−海馬ニューロン内の、ＭＣ１タウおよびＭＡＰ２についての免疫細胞化学。スケールバー：１０μｍ。樹状突起の突起部についての、高倍率の挿入図は、ＭＣ１染色を示す。スケールバー：４μｍ。図４Ｂ）ニューロン１つ当たりのＭＣ１顆粒カウントの定量化（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図４Ｃ）平均ＭＣ１顆粒面積の定量化（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図４Ｄ）光変換型ＷＴタウ（ＰＣ−タウ）についての生細胞イメージング。ＰＣ−タウの光変換後、ニューロンを、最大６時間にわたりイメージングした。代表的な画像を、ＴＩＡ１を共発現する細胞内の顆粒内のタウの安定化を示す、０時間および６時間の時点を示す。図４Ｅ）光変換後の様々な時点におけるニューロンに由来する、ＰＣ−タウの定量化（条件１つ当たりのＮ＝２０）。スケールバー：１０μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４ＢＣ】同上。
【図４ＤＥ】同上。
【００４３】
【図５ＡＢＣ】図５Ａ〜５Ｇ：ＡＡＶ１  ＲＦＰまたはＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入されたタウ−／−海馬ニューロンの初代培養物中の、タウ（タウ１３抗体）およびＭＡＰ２についての免疫細胞化学。右列は、高倍率（矢印は、タウ顆粒を同定する）の画像を示す。図５Ａ）非処理。図５Ｂ）ピューロマイシン。図５Ｃ）シクロヘキシミド。図５Ｄ）ＴＩＡ１およびＷＴタウのトランスフェクション、ならびにｐ３８キナーゼ阻害剤（ＳＢ２０３５８０；２０μＭ）による処理の後における、ＨＴ２２細胞内の、タウ誘導性のＴＩＡ１＋ＳＧおよびＰＨＦ１＋顆粒の阻害。図５Ｅ）５つの異なるキナーゼ阻害剤：ＧＳＫ３β（ＸＸＶＩ；２０μＭ）、ＣＤＫ２／５（アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ａｌｋｙｌｂｅｎｚｙｌｄｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉｕｍｕ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；５μＭ）、ｐ３８  ＭＡＰＫ（ＳＢ２０３５８０；２０μＭ）、ＭＡＲＫ／Ｐａｒ−１（３９６２１；２０μＭ）、およびＦｙｎ（ＰＰ２；２０ｎＭ）のうちの１つによる、２４時間にわたる処理の後における、ＨＴ２２細胞内の、ＳＧおよびタウ顆粒の阻害の定量化。図５Ｆ）ＴＩＡ１およびＷＴタウのトランスフェクション、ならびにＰＫＲ阻害剤（Ｃ１６；１μＭ）またはＰＥＲＫ阻害剤（ＧＳＫ２６０６４１４；５０ｎＭ）による、２４時間にわたる処理の後における、ＨＴ２２細胞内の、タウ誘導性のＴＩＡ１＋  ＳＧの阻害。図５Ｇ）キナーゼ阻害剤で処理された細胞内の、顆粒カウントの定量化。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。低倍率：１０μｍ、挿入図：２μｍ。
【図５ＤＥ】同上。
【図５ＦＧ】同上。
【００４４】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｈ：タウを伴うＴＩＡ１の発現は、海馬ニューロン内の樹状突起の長さを低減する。図６Ａ）ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌタウを形質導入されたＷＴマウスまたはタウ−／−マウスに由来する海馬ニューロン（初代培養物；ＤＩＶ２１）についての代表的な樹状突起トレースであって、ＭＡＰ２による標識化を使用するトレース。図６Ｂ）樹状突起の長さの定量化（条件１つ当たりのＮ＝３０）。図６Ｃ）ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌタウを形質導入された、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ初代海馬ニューロン内およびＴＩＡ１−／−初代海馬ニューロン内の、樹状突起の長さの定量化（条件１つ当たりのＮ＝３０）。図６Ｄ）ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌタウを形質導入され、翻訳阻害剤である、ピューロマイシン（ＳＧ促進）またはシクロヘキシミド（ＳＧ阻害）で処理されたタウ−／−マウスに由来する、海馬ニューロン（初代培養物；ＤＩＶ２１）内の樹状突起の長さの変化％の定量化。比較は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（対照）マウスに由来するニューロンに対する比較である（条件１つ当たりのＮ＝３０）。図６Ｅ）Ｄにおける実験と同じ実験であるが、ＴＩＡ−／−ニューロン内でなされた実験（条件１つ当たりのＮ＝３０）。図６Ｆ）ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌタウを形質導入されたＷＴの初代大脳皮質ニューロン内の、シナプトフィシン、ＰＳＤ−９５、カスパーゼ３、および切断型カスパーゼ３のレベルを示す免疫ブロット。図６Ｇ）ＤＮＡの断片化の、比色による定量化であって、アポトーシスを測定する定量化（ＴｉｔｅｒＴＡＣＳ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット；Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）。基底条件下および２５μＭのサルブリナール（条件１つ当たりのＮ＝６ウェル）による処理下における、ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌタウを形質導入されたタウ−／−初代海馬ニューロン（ＤＩＶ２１）。図６Ｈ）カスパーゼによる切断の、発光による定量化（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ））。ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴまたはＰ３０１Ｌを形質導入され、２５μＭのサルブリナールで処理されたタウ−／−初代海馬ニューロン（ＤＩＶ２１）内の、カスパーゼによる切断の量の比較（条件１つ当たりのＮ＝６ウェル）。スケールバー：１０μｍ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６ＢＣ】同上。
【図６ＤＥ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図６ＧＨ】同上。
【００４５】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂ：ＴＩＡ１のハプロ不全は、タウオパチーを阻害する。図７Ａ）ホスホタウ（ＰＨＦ１）レベル、シナプスの喪失（シナプトフィシン）レベル、およびＴＩＡ１レベルを、Ｐ３０１Ｓタウ、Ｐ３０１Ｓタウ／ＴＩＡ１＋／−、または野生型対照を発現する、２．５カ月齢マウスにおいて定量化した。レベルを、海馬の歯状回およびＣＡ３野について示す。同様の結果は、大脳皮質内でも明らかであった。図７Ｂ）２．５カ月齢の、ＷＴ、ＴＩＡ１＋／−、Ｐ３０１Ｓタウ、またはＰ３０１Ｓタウ／ＴＩＡ１＋／−交配体の大脳皮質に由来する、可溶性（Ｓ３）画分およびサルコシル不溶性（Ｐ３）画分についての免疫ブロット。ハプロ不全は、不溶性画分中の、全タウおよびリン酸化タウのレベルの低減をもたらす。
【図７Ｂ】同上。
【００４６】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｊ：図８Ａ）ＴＩＡ１±ＷＴタウまたはＰ３０１タウを共発現させるのに続く、亜ヒ酸塩処理（１５μＭ、６時間）または亜ヒ酸塩＋シクロヘキシミド処理（１０μｇ／ｍＬ）により形成される、タウ陽性顆粒（タウ１３抗体により同定される）を伴うＨＴ２２不死化海馬細胞内の、ＴＩＡ１、ＰＡＢＰ、およびタウ（タウ１３抗体）についての免疫細胞化学を示す、図１Ａ〜１Ｊからの拡張データ。スケールバー：１０μｍ。図８Ｂ）図８Ａの細胞内の、タウ（タウ１３）陽性封入体、ＴＩＡ１陽性封入体、およびＰＡＢＰ陽性封入体の定量化。Ｎ＝５０。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図８Ｃ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、またはＰ３０１Ｌタウをトランスフェクトされ、ＤＭＳＯビヒクルまたは２５μＭのサルブリナールで処理されたＨＴ２２細胞内の、内因性ＴＩＡ１についての免疫細胞化学。挿入図は、高倍率を示し、矢印は、ＴＩＡ１顆粒を指示する。図８Ｄ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、またはＰ３０１Ｌタウを共トランスフェクトされ、ＤＭＳＯビヒクルまたは２５μＭのサルブリナールで処理されたＨＴ２２細胞内にトランスフェクトされた、ＴＩＡ１−ＲＦＰについての蛍光イメージング。挿入図は、高倍率を示し、矢印は、ＴＩＡ１顆粒を指示する。図８Ｅ）内因性ＴＩＡ１の標識化および外因性ＴＩＡ１−ＲＦＰ蛍光の両方についての、ＴＩＡ１陽性顆粒密度の定量化（Ｎ＝５０）。ＨＴ２２細胞内では、ＳＧカウントの増大が、ＷＴよりＰ３０１Ｌで大きいのに対し、初代海馬ニューロン（図１Ｃおよび１Ｄを参照されたい）内では、ＳＧカウントの増大は、ＷＴよりＰ３０１Ｌで小さいことに注目されたい。初代ニューロンの挙動と、ニューロン細胞系の挙動とのこの差違は、一貫して観察され、高度に分化した非分裂海馬ニューロンと、不死化ニューロン細胞系との生理学的差違を反映しうるであろう。図８Ｆ）内因性ＴＩＡ１の標識化および外因性ＴＩＡ１−ＲＦＰ蛍光の両方についての、ＴＩＡ１陽性顆粒サイズの定量化（Ｎ＝５０）。図８Ｇ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ−ＥＧＦＰ、またはＰ３０１Ｌタウ−ＥＧＦＰのトランスフェクション、およびＴＩＡ１−ｍＲＦＰの共トランスフェクションの２４時間後における、ＨＴ２２細胞内で、ＴＩＡ１−ＲＦＰについての生細胞イメージングを行った。イメージングは、Ｃｏｌｉｂｒｉ  ＬＥＤにより照明され、加熱ステージおよびＣＯ２チャンバーを伴う、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡を使用して行った。５００μＭの亜ヒ酸塩を、細胞へと添加し、ＳＧの形成を刺激し、１５秒ごと、３０分間にわたり、撮像した。０、６、および１２分について示される、代表的な画像であって、６分における矢印が、ＳＧの形成を指し示す画像。高倍率の挿入図を示す。図８Ｈ）条件１つ当たりの、時間をわたっての細胞１つ当たりの平均ＳＧ数の定量化（条件１つ当たりのＮ＝１２）は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）における「スポット」特徴であって、＞１μｍ２である全ての顆粒を同定する特徴を使用して行った。図８Ｉ）ＳＧの形成までの平均値時間の定量化であって、各イメージング細胞（Ｎ＝１２）内の、最初のＳＧの検出までの時間により規定される定量化。図８Ｊ）条件１つ当たりの��時間をわたってのＳＧの平均面積について描示するグラフ（条件１つ当たりのＮ＝１２）。定量化は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）における「スポット」特徴を使用して行った。スケールバー：１０μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８Ｂ】同上。
【図８ＣＤ】同上。
【図８ＥＦ】同上。
【図８Ｇ】同上。
【図８ＨＩＪ】同上。
【００４７】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂ：図９Ａ）ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクスリソース（Ｈｕａｎｇ  ｄａら、２００９年）を使用して決定される、ＷＴ大脳皮質またはタウＫＯ大脳皮質について、ＴＩＡ１に関連するプロテオームの、統計学的に有意な濃縮（ベンジャミニの補正ｐ値＜０．０５）を示す機能類型の比較。ＧＯ遺伝子オントロジーアノテーションによる、濃縮された機能類型の列挙。図９Ｂ）ＴＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ＨＮＲＮＰＤ、ＲＰＬ７、ＴＤＰ−４３、およびＦＵＳを指向する抗体を使用して、８カ月齢のＰ３０１Ｌ  ｒＴｇ４５１０マウスに由来する大脳皮質についての免疫組織化学。スケールバー：１０μｍ。
【図９Ｂ】同上。
【００４８】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｇ：ＴＩＡ１のノックダウンはまた、ＨＴ２２細胞内のＭＣ１タウ顆粒の形成も低減した。図１０Ａ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、またはＰ３０１Ｌタウ（ＥＧＦＰを介して視覚化された）をトランスフェクトされ、ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ（スクランブル；左パネル）およびｓｈＴＩＡ１（右パネル）を共トランスフェクトされたＨＴ２２細胞内の、ＭＣ１タウおよびｅＴＩＡ１についての免疫細胞化学。図１０Ｂ）顆粒を有するＭＣ１＋細胞の百分率の定量化（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図１０Ｃ）条件１つ当たりの、ＭＣ１＋トランスフェクト細胞の百分率の定量化（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図１０Ｄ）ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、またはＰ３０１Ｌタウをトランスフェクトされ、ＴＩＡ１−ＲＦＰ（ＲＦＰを介して視覚化された）を共トランスフェクトされたＨＴ２２細胞内の、ＭＣ１（ミスフォールディングした）タウについての免疫細胞化学。スケールバー：１０μｍ。下パネルは、顆粒を伴う細胞を、高倍率（矢印は、ＭＣ１＋／ＴＩＡ１＋顆粒を指示する；スケールバー：１０μｍ）で示す。図１０Ｅ）顆粒を有するＭＣ１＋細胞の百分率の定量化（条件１つ当たりのＮ＝１００）。図１０Ｆ）ＴＩＡ１についてもまた陽性である、ＭＣ１＋顆粒の百分率の定量化。図１０Ｇ）β−ｇａｌ、Ｐ３０１Ｌタウ、Ｐ３０１Ｌタウ−ＰＭＩＭ、またはＰ３０１Ｌタウ−ＮＵＬＬをトランスフェクトされ、次いで、５μＭのＭＧ１３２または５０μＭのクロロキンで、一晩にわたり処理されたＨＴ２２細胞に由来する溶解物中の、全タウ（タウ１３）、リン酸化タウ（ＰＨＦ１）、ＴＩＡ１−ＲＦＰ、内因性ＴＩＡ１（ｅＴＩＡ１）、およびアクチンのレベルを示す免疫ブロット（条件１つ当たりのＮ＝１００）。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０ＢＣ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０ＥＦ】同上。
【図１０Ｇ】同上。
【００４９】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ：ＴＩＡ１は、ミスフォールディングしたタウの、ＳＧへの固定を促進する。図１１Ａ）ＴＩＡ１−ＲＦＰ±ＥＧＦＰ、ＷＴタウ、ＷＴタウ−ＰＭＩＭ、Ｐ３０１Ｌタウ、またはＰ３０１Ｌタウ−ＰＭＩＭをトランスフェクトされたＨＴ２２細胞に由来する全溶解物についての免疫ブロット。ＷＴタウ−ＰＭＩＭ構築物は、ＡＤにおいてリン酸化の増大を呈示する１４の部位を、アスパラギン酸で置きかえた（Ｈｏｏｖｅｒら、２０１０年）。これに続き、ＴＩＡ１についての免疫沈降／免疫ブロットを行うのに続き、ＴＩＡ１結合タンパク質複合体と、ＴＩＡ１非結合タンパク質複合体との分画（１％のサルコシル）および免疫ブロット法を行った。図１１Ｂ）不溶性タウレベルの、可溶性タウレベルに対する比の定量化であって、ＴＩＡ１結合画分中の、不溶性タウの、可溶性タウに対する比の増大を示す定量化。Ｐ３０１Ｌタウの、ＴＩＡ１への結合が、ＰＭＩＭ修飾の影響を強くは受けなかったことから、Ｐ３０１Ｌ変異は、凝集に対して、リン酸化の影響と同様の影響を及ぼし、２つの変化は相加的ではないと示唆される（Ｎ＝３）。
【００５０】
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜１２Ｃ：ホスホ模倣タウは、ＴＩＡ１顆粒の形成を増大させる。図１２Ａ）タウのリン酸化は、ＴＩＡ１＋顆粒を、内因的に増大させ（図１２Ａ、画像；図１２Ｃ、定量化）、ＴＩＡ１が過剰発現したＴＩＡ１＋顆粒を増大させる（図１２Ｂ、画像；図１２Ｃ、定量化）（Ｎ＝５０）。ＥＧＦＰまたはタウ（Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｌ  ＰＭＩＭまたはＰ３０１Ｌ  ＮＵＬＬ）をトランスフェクトされ、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または２５μＭのサルブリナールで処理されたＨＴ２２細胞内の、内因性ＴＩＡ１についての免疫細胞化学。ＷＴタウ−ＮＵＬＬ構築物は、ＡＤにおいてリン酸化の増大を呈示する１４の部位を、アラニンで置きかえた（Ｈｏｏｖｅｒら、２０１０年）。タウＮＵＬＬ構築物は、顆粒を伴う少数の細胞を呈示した。低減は、パネルの最後から２番目の行に示される細胞の広視野画像（「広視野」と表示された）において明らかである。しかし、タウＮＵＬＬを発現する希少な細胞は、より大型の傾向がある顆粒を呈示したが、読者が、顆粒が存在した少数の細胞について評価することを可能とするために、ＮＵＬＬタウについて示される画像は、顆粒を含有する細胞を提示する。スケールバー：１０μｍ。挿入図＝高倍率、スケールバー：２μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２Ｃ】同上。
【００５１】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｅ：ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける、シナプスおよびニューロンの喪失をレスキューする。図１３Ａ：６カ月齢の、非トランスジェニック（ＷＴタウ）海馬およびＰＳ１９（Ｐ３０１Ｓタウ）海馬のＣＡ３領域内の、ＮｅｕＮおよびシナプトフィシン（ＳＹＰ）についてのＩＨＣ。スケールバー：２０ｕｍ。図１３Ｂ：Ａの相対ＳＹＰ発現の定量化。チューキーの事後検定（群１つ当たりのｎ＝６）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１３Ｃ：９カ月齢の非トランスジェニックマウスおよびＰＳ１９マウスにおけるＣＡ３についての、代表的なクレシルバイオレット染色。スケールバー：２０ｕｍ。図１３Ｄ：Ｃにおける視野１つ当たりの、Ｎｉｓｓｌ＋ニューロンの数の定量化。チューキーの事後検定（群１つ当たりのｎ＝６）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１３Ｅ：Ｅの平均大脳皮質厚の定量化。チューキーの事後検定（群１つ当たりのｎ＝４〜６）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３ＢＣ】同上。
【図１３ＤＥ】同上。
【００５２】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｅ：ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおいて、機能的保護および挙動上の保護を付与する。図１４Ａ：６および９カ月齢のＷＴマウスおよびＰＳ１９マウスにおける、微小管（ＭＴ）結合画分（ペレット；Ｐ）中および非結合画分（上清；Ｓ）中で検出される全タウについての免疫ブロット。図１４Ｂ：ＡにおけるＭＴ結合タウの、ＭＴ非結合タウに対する比の定量化。スチューデントのｔ検定（群１つ当たりのｎ＝４）による＊ｐ＝０．０１３８。図１４Ｃ：６カ月齢のＰＳ１９大脳皮質内の、アセチル化ａ−チューブリンの、全ａ−チューブリンに対する比の定量化。スチューデントのｔ検定（群１つ当たりのｎ＝４）による＊ｐ＝０．０１３８。図１４Ｄ：６カ月齢の非トランスジェニックマウスおよびＰＳ１９マウスについての、Ｙ迷路自発的交替運動課題（Ｙ  ｍａｚｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔａｓｋ）における、適正な交替運動のパーセント。チューキーの事後検定（群１つ当たりのマウスのｎ＝１６〜２０）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＝０．０２１３、＊＊ｐ＝０．００７２。図１４Ｅ：Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウス（ｎ＝１２）についての、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−（ｎ＝１６）マウスと比較した、カプラン−マイヤー生存プロット。ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソンの検定による＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１４ＢＣ】同上。
【図１４ＤＥ】同上。
【００５３】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｇ：ＴＩＡ１の低減は、タウのリン酸化の二相性の変化を誘発する。図１５Ａ：Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスと対比した、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスの、３（上パネル）および６（下パネル）カ月齢の海馬のＣＡ３領域内の、ＤＡＰＩ、ＮｅｕＮ、およびＣＰ１３（Ｓ２０２）ホスホタウについてのＩＨＣ。スケールバー：２０ｕｍ。図１５Ｂおよび１５Ｃ：３（図１５Ｂ）および６（図１５Ｃ）カ月齢のＰＳ１９マウスについての、視野１つ当たりの相対ＣＰ１３免疫蛍光の定量化。スチューデントのｔ検定（群１つ当たりのｎ＝６）による＊ｐ＝０．０２６６、＊＊ｐ＝０．００４４。図１５Ｄ：９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスの、外側嗅内皮質（ＬＥｎｔ）内の、ＤＡＰＩおよびＰＨＦ１（Ｓ３９６／Ｓ４０４）ホスホタウについてのＩＨＣ。スケールバー：１０ｕｍ。図１５Ｅ：図１５ＤのＰＨＦ１＋細胞の数の定量化。ボンフェローニの事後検定（群１つ当たりのｎ＝５）を伴う三元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＝０．０４８３、＊＊ｐ＝０．００２８。図１５Ｆ：Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋ＬＥｎｔ内およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−ＬＥｎｔ内の、ＰＨＦ１＋細胞についての、倍率６３倍の画像。スケールバー：２ｕｍ。図１５Ｇ：Ｆの、ＴＩＡ１の共局在化を伴うＰＨＦ１＋細胞パーセントの定量化。スチューデントのｔ検定（群１つ当たりのｎ＝５）による＊＊ｐ＝０．００７４。
【図１５ＢＣ】同上。
【図１５ＤＥ】同上。
【図１５ＦＧ】同上。
【００５４】
【図１６ＡＢ】図１６Ａ〜１６Ｅ：ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける神経原線維もつれの形成を加速化させる。図１６Ａ：９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスにおける、ガリアスシルバーで染色された神経原線維もつれについての代表的な画像。スケールバー：４０ｕｍ。図１６Ｂ：前頭皮質（一次運動野；Ｍ１）内、外側嗅内皮質（ＬＥｎｔ）内、およびＣＡ３内の、ガリアスシルバー＋のもつれの数の定量化。ボンフェローニの事後検定（群１つ当たりのｎ＝５）を伴う三元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５。図１６Ｃ：チオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）で染色された、９カ月齢の非トランスジェニックマウスおよびＰＳ１９マウスの、ＬＥｎｔについての代表的な画像。スケールバー：２０ｕｍ。挿入図は、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋  ＬＥｎｔ内およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−  ＬＥｎｔ内の、ＴｈｉｏＳ＋のもつれについての高倍率画像を描示する。図１６Ｄ：ＣのＴｈｉｏＳ蛍光の定量化。スチューデントのｔ検定（群１つ当たりのｎ＝５）による＊ｐ＝０．０２１３。図１６Ｅ：９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスについて、同じ動物のＣＡ３内の、Ｎｉｓｓｌ＋ニューロンの数に対してプロットされた、ガリアスシルバー＋のもつれの数（ｒ２＝０．０７）。
【図１６ＣＤ】同上。
【図１６Ｅ】同上。
【００５５】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｆ：ＴＩＡ１の低減は、タウ凝集の生化学特性および構造的特性をシフトさせる。図１７Ａ：６および９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋大脳皮質およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−大脳皮質の、Ｓ１ｐ画分（上）中およびＰ３画分（下）中の、全タウ（タウ１３）についての免疫ブロット。図１７Ｂおよび１７Ｃ：図１７ＡのＳ１ｐ画分（図１７Ｂ）中およびＰ３画分（図１７Ｃ）中の、タウ蓄積の定量化。ボンフェローニの事後検定（群１つ当たりのｎ＝４）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５。図１７Ｄ：Ａの、Ｓ１ｐ画分中のタウの、Ｐ３画分中のタウに対する比。ボンフェローニの事後検定（群１つ当たりのｎ＝４）を伴う二元ＡＮＯＶＡによる＊＊ｐ＜０．０１。図１７Ｅ：６および９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋大脳皮質およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−大脳皮質のＳ１ｐ画分中およびＰ３画分中の、ＴＩＡ１、ＰＡＢＰ、およびＤＤＸ５についての免疫ブロット。図１７Ｆ：９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋海馬およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−海馬内の、タウ凝集構造についての、代表的な透過電子顕微鏡画像。
【図１７ＢＣＤ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１７Ｆ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
そうでないことが言明されるか、または文脈から含意されない限り、以下の用語および語句は、下記で提供される意味を含む。そうでないことが言明されるか、または文脈から含意されない限り、下記の用語および語句は、それが関する技術分野において、その用語および語句が獲得した意味を除外しない。定義は、特定の実施形態についての記載の一助となるように提供されるものであり、本発明の範囲は、特許請求の範囲だけにより限定されるため、特許請求される本発明を限定することを意図するものではない。さらに、文脈によりそうでないことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００５７】
本明細書で使用される「〜を含むこと」または「〜を含む」という用語は、本発明に不可欠な、組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素に言及するときに使用されるが、それらが不可欠な場合であれ、そうでない場合であれ、指定されなかった要素の包含に対して開かれている。
【００５８】
本明細書で使用される「〜から本質的になること」という用語は、所与の実施形態に要求される要素を指す。用語は、本発明のこの実施形態の、基本的な特徴および新規の特徴または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
【００５９】
「〜からなること」という用語は、本明細書で記載される、組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素であって、実施形態についてのこの記載において列挙されていない、任意の要素を除外する、組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を指す。
【００６０】
そうでないことが指し示されない限り、本明細書で使用される成分または反応条件の数量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語で修飾されていると理解されるものとする。百分率との関連で使用される場合の「約」という用語は、±１％を意味しうる。
【００６１】
文脈によりそうでないことが明確に指し示されない限り、単数形の用語である「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、１つまたは１つを超えるものを指す。同様に、文脈によりそうでないことが明確に指し示されない限り、「または」という語も、「および」を含むことを意図する。
【００６２】
本開示の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な方法および材料を使用しうるが、下記では、適切な方法および材料について記載する。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。「ｅ．ｇ．」という略号は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ」に由来し、本明細書では、非限定的な例を指し示すのに使用される。したがって、「ｅ．ｇ．」という略号は、「例えば」という用語と同義である。
【００６３】
本明細書では、「低下した」、「低減された」、「低減」、「低下する」、または「〜を阻害する」という用語は全て、一般に、有意な量の減少を意味するように使用される。しかし、疑義を回避するために、「低減された」、「低減」、「減少する」、または「〜を阻害する」とは、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の減少、または最大で１００％を含む減少（例えば、基準試料と比較した非存在のレベル）、あるいは基準レベルと比較して、１０〜１００％の間の任意の減少を意味する。
【００６４】
本明細書では「増大した」、「増大する」、「〜を増強する」、または「〜を活性化させる」という用語は全て、一般に、有意な量の増大を意味するように使用されるが、疑義を回避するために、「増大した」、「増大する」、「〜を増強する」、または「〜を活性化させる」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の増大、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増大、または最大で１００％を含む増大、あるいは基準レベルと比較して、１０〜１００％の間の任意の増大、あるいは基準レベルと比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増大、または２倍〜１０倍の間もしくはこれを超える任意の増大を意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「〜を投与する」という用語は、所望の効果がもたらされるように、所望の部位における、組成物の、少なくとも部分的な局在化を結果としてもたらす方法または経路による被験体への組成物の配置を指す。本明細書で記載される核酸ベースの阻害剤または組成物は、当技術分野で公知の、任意の適切な経路であって、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアゾール）投与、肺投与、鼻投与、直腸投与、髄腔内投与、および局所投与（口腔内投与および舌下投与を含む）を含む、経口経路または非経口経路を含むがこれらに限定されない経路を介して投与することができる。例示的な投与方式は、注射、注入、点滴、吸入、または摂取を含むがこれらに限定されない。「注射」は、限定せずに述べると、静脈内注射および静脈内注入、筋内注射および筋内注入、動脈内注射および動脈内注入、髄腔内注射および髄腔内注入、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射および脳室内注入、関節包内注射および関節包内注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心内注射および心内注入、皮内注射および皮内注入、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射および経気管注入、皮下注射および皮下注入、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射および関節内注入、被膜下注射および被膜下注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内注射および脊髄内注入、脳脊髄内注射および脳脊髄内注入、ならびに胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射および胸骨内注入を含む。一部の実施形態では、組成物を、静脈内注入または静脈内注射により投与する。
【００６６】
疾患または障害の「処置」、「防止」、または「好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」とは、このような疾患もしくは障害の発病を遅延させるかもしくは阻止するか、このような疾患または障害と関連する状態の進行、増悪もしくは悪化、または重症度を、逆転するか、緩和するか、好転させるか、阻害するか、緩徐化するか、または停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の、少なくとも１つの症状を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和する。
【００６７】
本明細書で使用される「有効」および「有効性」という用語は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性とは、処置が、患者において、所望の生物学的効果を結果としてもたらす能力を指す。生理学的安全性とは、処置の投与の結果として得られる、細胞レベル、臓器レベル、および／または生物レベルにおける、毒性または他の生理学的有害作用（副作用と称することが多い）のレベルを指す。「低度に有効」とは、処置が、治療的に有意な、低レベルの薬理学的有効性および／または治療的に高レベルの生理学的有害作用を結果としてもたらすことを意味する。
【００６８】
本明細書で使用される、障害（例えば、本明細書で記載される障害）を処置するのに有効な化合物または組み合わせの量、「治療有効量」、「有効量」、または「有効クール（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｒｓｅ）」とは、被験体への、単回用量または複数回用量の投与時の、被験体の処置、または障害（例えば、本明細書で記載される障害）を伴う被験体の治癒、緩和、軽減、もしくは改善において、このような処置の非存在下で予測されるものを越えて有効である、化合物または組み合わせの量を指す。治療有効量の決定は十分に、当業者の能力の範囲内にある。一般に、治療有効量は、被験体の既往歴、年齢、状態、性別のほか、被験体における医学的状態の重症度および種類、ならびに薬学的に活性の他の薬剤の投与により変動しうる。
【００６９】
本明細書で使用される「被験体」とは、ヒトまたは動物を意味する。通例、動物は、霊長類、齧歯類、家畜、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカクザル、例えば、アカゲザルを含む。齧歯類は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科動物種、例えば、イエネコ、イヌ科動物種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケを含む。患者または被験体は、前出の任意のサブセット、例えば、上記の全てを含むが、ヒト、霊長類、または齧歯類など、１または複数の群または種を除外する。ある特定の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。本明細書では、「患者」および「被験体」という用語を互換的に使用する。被験体は、雄の場合もあり、雌の場合もある。被験体は、神経変性疾患もしくは神経変性障害、がんと関連する疾患もしくは障害、ウイルス感染と関連する疾患もしくは障害、またはこのような疾患もしくは障害と関連する、１もしくは複数の合併症を伴うと既に診断されているか、またはこれらを患うかもしくはこれらを有すると同定されているが、必ずしも既に処置を受けているとは限らない被験体でありうる。
【００７０】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、リボヌクレオチドであれ、デオキシリボヌクレオチドであれ、いずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態、例えば、骨格または塩基に対する修飾であれ、ヌクレオチドのポリマー形態を指す。用語はまた、ヌクレオチド類似体から作製された、ＲＮＡまたはＤＮＡの同等物、類似体を含み、記載される実施形態に応じて、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むようにも理解されるものとする。
【００７１】
核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤
本明細書で使用される「核酸ベースの阻害剤」とは、標的核酸に対して、それとハイブリダイズするのに十分な配列相補性を有し、例えば、標的ＲＮＡの分解を促進するか、または標的ＲＮＡの翻訳を遮断することにより、遺伝子産物の翻訳を阻害する核酸である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ｍＲＮＡとハイブリダイズしうる核酸である。ある実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡである。
【００７２】
ＴＩＡ−１の核酸ベースの阻害剤は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ機構）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）により機能する、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）でありうる。ある実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、標的ｍＲＮＡに結合し、例えば、標的ｍＲＮＡの切断または翻訳の阻害により、例えば、翻訳開始を阻害することにより、そこからのタンパク質の産生を阻害する。
【００７３】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、変異体ＴＩＡ−１の産物を、野生型ＴＩＡ−１の産物と比較して、優先的または特異的に阻害する。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、ＴＩＡ−１の第１のアイソフォーム、例えば、第１のスプライスアイソフォームの産物を、ＴＩＡ−１の第２のアイソフォームの産物と比較して、優先的または特異的に阻害する。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、特定の変異体または多型（一塩基多型（ＳＮＰ）など）を、第２の対立遺伝子、例えば、野生型対立遺伝子と比べて標的とする。この場合には、核酸ベースの阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、変異または多型を含有するＴＩＡ−１の領域を標的としうる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２つのＴＩＡ−１対立遺伝子を、同等の効能、例えば、約２０％、１５％、１０％、５％、２％、または１％以内のノックダウン効能で標的とする。この場合には、核酸ベースの阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、変異も多型も伴わないＴＩＡ−１の領域を標的としうる。
【００７４】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＴＩＡ−１の領域、例えば、配列番号１で明示される、ＴＩＡ−１配列の領域と相補的である。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１配列の領域は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１配列の領域は、ＴＩＡ−１、例えば、配列番号１に明示されるＴＩＡ−１配列の、
【数１】
2018531046.tif 000003
【数２】
2018531046.tif 000004
【数３】
2018531046.tif 000005
【数４】
2018531046.tif 000006
【数５】
2018531046.tif 000007
【数６】
2018531046.tif 000008
【数７】
2018531046.tif 000009
【数８】
2018531046.tif 000010
【数９】
2018531046.tif 000011
【数１０】
2018531046.tif 000012
で始まる。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１配列の領域は、ＴＩＡ−１の５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、イントロン内、またはエクソン内に配置されている。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１配列の領域は、５’ＵＴＲと、コード領域との境界部、３’ＵＴＲとコード領域との境界部、イントロンとエクソンとの境界部（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の）、またはエクソンとエクソンとの境界部（例えば、スプライスｍＲＮＡ内の）と重複する。
【００７５】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、５０％を超えるＡＵヌクレオチドまたはＡＴヌクレオチド、例えば、少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％の、ＡヌクレオチドまたはＴヌクレオチドまたはＵヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、５０％を超えるＧＣヌクレオチド、例えば、少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％の、ＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドである。
【００７６】
ＴＩＡ−１遺伝子は場合によって、ＴＩＡ１、Ｔ細胞拘束性細胞内抗原１（Ｔ−Ｃｅｌｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＴＩＡ１細胞傷害性顆粒関連ＲＮＡ結合性タンパク質、またはＷＤＭと称する。ＴＩＡ−１タンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有し、細胞傷害性リンパ球の標的細胞に対して、核酸分解活性を保有する。ＴＩＡ−１遺伝子は、タンパク質分解性プロセシングを経て、１５ｋＤａの成熟形態をもたらす、約４０ｋＤａのタンパク質をコードする。
【００７７】
一部の実施形態では、ヒトＴＩＡ−１遺伝子の配列は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１５年５月１１日付けの、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＧ＿０２９９６７（４６２０４ｂｐ）のエントリーにおいて明示されている配列である。一部の実施形態では、ヒトＴＩＡ−１遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０２２０３７．２において明示されているアイソフォーム１配列であり、本明細書では、配列番号１：
【化１】
2018531046.tif 000013
【化２】
2018531046.tif 000014
【化３】
2018531046.tif 000015
として提供する。
【００７８】
配列番号１では、配列番号４のｓｈＲＮＡに対する結合性部位を形成する、ヌクレオチド１５２６〜１５４５に下線を付す。
【００７９】
一部の実施形態では、ヒトＴＩＡ−１遺伝子の配列は、参照によりその全体において組み込まれる、２０１５年３月１５日付けの、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０２２１７３．２において明示されている、アイソフォーム２の配列である。
【００８０】
一部の実施形態では、ヒトＴＩＡ−１  ｍＲＮＡの配列は、下記で明示される、ＴＩＡ−１タンパク質のスプライスアイソフォームをコードするｍＲＮＡ配列であり、この場合、ＳＰ｜Ｐ３１４８３として同定される配列は、配列番号５であり、ＳＰ｜Ｐ３１４８３−２として同定される配列は、配列番号６であり、ＳＰ｜Ｐ３１４８３−３として同定される配列は、配列番号７である。
【化４】
2018531046.tif 000016
【００８１】
一部の実施形態では、ＴＩＡ−１核酸ベースの阻害剤は、配列番号４の短鎖ヘアピン配列：
【化５】
2018531046.tif 000017
を含む。
【００８２】
下線を付した配列番号４の配列は、下記で配列番号２および３として提供される、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を指し示す。
【００８３】
本明細書では、配列番号４のヘアピンのガイド鎖配列を、配列番号２：ＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣとして提供する。
【００８４】
本明細書では、配列番号４のヘアピンのパッセンジャー鎖配列を、配列番号３：ＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴとして提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、ＴＩＡ−１核酸ベースの阻害剤は、配列番号８の短鎖ヘアピン配列：
【化６】
2018531046.tif 000018
を含む。
【００８６】
下線を付した配列番号８の配列は、下記で配列番号９および１０として提供される、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を指し示す。配列番号８のｓｈＲＮＡは、マウスＴＩＡ−１核酸、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年２月１５日に受託番号：ＮＭ＿０１１５８５下でＧｅｎｂａｎｋに寄託されたＴＩＡ−１転写物改変体１ｍＲＮＡと完全に相補的にハイブリダイズすることが可能である。配列番号８のｓｈＲＮＡは、例えば、２つのミスマッチで、ヒトＴＩＡ−１核酸とハイブリダイズすることが可能である。
【００８７】
本明細書では、配列番号８のヘアピンのガイド鎖配列を、配列番号９：ＡＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣとして提供する。
【００８８】
本明細書では、配列番号８のヘアピンのパッセンジャー鎖配列を、配列番号１０：ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＴとして提供する。
【００８９】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）
ＴＩＡ−１機能を低下させるのに有用な、核酸ベースの阻害剤は、例えば、ＲＮＡｉ機構により作用するｄｓＲＮＡなどのｄｓＲＮＡでありうる。ＲＮＡｉとは、被験体、例えば、動物における、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程であって、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される過程を指す。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含むと理解される。ｄｓＲＮＡによるＴＩＡ−１の阻害は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断を結果としてもたらす、タンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼの、ｄｓＲＮＡ媒介性の活性化から生じる、インターフェロン応答を誘発しないことが典型的である。
【００９０】
ＴＩＡ−１、例えば、野生型ＴＩＡ−１または変異体ＴＩＡ−１を標的とするｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書で記載される通り、非修飾の場合もあり、化学修飾される場合もある。ｄｓＲＮＡは、化学合成することもでき、ベクターから発現させることもでき、酵素により合成することもできる。本開示はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、細胞内の、ＴＩＡ−１遺伝子の発現または活性をモジュレートすることが可能な、多様な化学修飾による合成ｄｓＲＮＡ分子も特色とする。化学修飾ｄｓＲＮＡの使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、および／または細胞への取込みの改善などを介して、天然ｄｓＲＮＡ分子の多様な特性を改善する。
【００９１】
核酸を標的とするｄｓＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡからなる場合もあり、ヘアピン構造を形成するようにフォールディングする、１つのＲＮＡ鎖からなる場合もある。ヘアピン型ｄｓＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと称することが典型的である。
【００９２】
ＴＩＡ−１、例えば、変異体ＴＩＡ−１遺伝子または野生型ＴＩＡ−１遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡは、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターから発現させることができる。ある特定の実施形態では、ＴＩＡ−１遺伝子の発現を阻害するのに適するｄｓＲＮＡは、アデノウイルスまたはレンチウイルスによるｓｉＲＮＡライブラリーなど、ｓｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定する。
【００９３】
ある実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とするｄｓＲＮＡは、約１５〜約３０塩基対の長さ（例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）塩基対の長さである。ある実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とする各ｄｓＲＮＡ鎖は、独立に、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さ（例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９ヌクレオチドの長さ）である。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１〜約３（例えば、約１、２、または３）ヌクレオチドの突出末端を含む。「突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸長すること、またはこの逆を意味する。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子の一方の末端において突出を有する場合もあり、両方の末端において突出を有する場合もある。一部の実施形態では、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端に位置するか、代替的に、センス鎖の３’末端に位置する。一部の実施形態では、突出は、ＴＴジヌクレオチド突出またはＵＵジヌクレオチド突出、例えば、ＴＴジヌクレオチド突出またはＵＵジヌクレオチド突出である。例えば、ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖、１９塩基対の二重鎖領域、および３’末端のジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、両方の末端が平滑末端であるか、または代替的に、末端のうちの一方が平滑末端である二重鎖核酸を含む。
【００９４】
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、各鎖が約１８〜約２８ヌクレオチドの長さ、例えば、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さである、第１の鎖および第２の鎖を含み、ｄｓＲＮＡの第１の鎖は、ＴＩＡ−１  ＲＮＡに対して、ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を介して、ＴＩＡ−１  ｍＲＮＡの切断を方向づけるのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、ｄｓＲＮＡの第２の鎖は、第１の鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００９５】
ある実施形態では、ＴＩＡ−１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、遺伝子の野生型形態および変異体形態を標的とする場合もあり、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子アイソフォームを標的とする場合もあり、同じ遺伝子の異なるスプライスアイソフォームを標的とする場合もある。例えば、ｄｓＲＮＡは、異なるアイソフォームのうちの、２つまたはこれを超えるアイソフォーム内で同一な配列を標的とするであろう。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、変異体のＴＩＡ−１  ＲＮＡ、または特定のＴＩＡ−１多型を、優先的または特異的に標的とするであろう。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、野生型のＴＩＡ−１  ＲＮＡを、優先的または特異的に標的とするであろう。
【００９６】
ある実施形態では、ＴＩＡ−１  ＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡは、１または複数の化学修飾を含む。このような化学修飾の非限定的な例は、限定せずに述べると、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホジエステル連結、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ無塩基残基の組込みを含む。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、前記修飾のうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、骨格修飾を含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾を含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくとも１つの骨格修飾と、少なくとも１つの糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾とを含む。このような化学修飾は、細胞内で、ＲＮＡｉ活性を保存する一方で、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増大させることが示されている。さらに、１または複数のホスホロチオエート置換は、十分に許容され、修飾ｄｓＲＮＡ構築物に、血清安定性の実質的な増大を付与することが示されている。本明細書の、例えば、「化学修飾核酸」と題する節では、他の適切な化学修飾についても記載する。
【００９７】
ある実施形態では、ＴＩＡ−１  ＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを含む一方で、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。修飾ヌクレオチドを使用して、安定性、活性、および／またはバイオアベイラビリティーなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける特徴を改善することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、分子内に存在するヌクレオチドの総数に対する、ある百分率としての修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、ｄｓＲＮＡは一般に、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の修飾ヌクレオチド）を含みうる。
【００９８】
一部の実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とするｄｓＲＮＡは、約２１ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リボヌクレオチドを含有せず、別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１または複数のリボヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は独立に、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、各鎖は、他の鎖のヌクレオチドと相補的な、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡの鎖のうちの１つは、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と相補的なヌクレオチド配列を含み、ｄｓＲＮＡの第２の鎖は、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と実質的に同様なヌクレオチド配列を含む。
【００９９】
ある実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とするｄｓＲＮＡは、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域と、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と実質的に同様なヌクレオチド配列を有するセンス領域とを含む。ある実施形態では、アンチセンス領域と、センス領域とは独立に、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドと相補的な、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と相補的なアンチセンス領域は、ＴＩＡ−１遺伝子の対応する領域と比較して、最大で１、２、３、４、または５カ所のミスマッチ、挿入、または欠失を含む。一部の実施形態では、ＴＩＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列またはその部分と相補的なアンチセンス領域は、ＴＩＡ−１遺伝子の対応する領域との完全な相補性を有する。
【０１００】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、および他の核酸分子など、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することが可能な核酸分子を含むことを意味する。加えて、本明細書で使用される「ＲＮＡｉ」という用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳の阻害、またはエピジェネティクスなど、配列特異的ＲＮＡ干渉を含むことを意味する。
【０１０１】
アンチセンス核酸
適切な核酸ベースの阻害剤は、アンチセンス核酸を含む。理論に束縛されずに述べると、アンチセンス阻害は典型的に、少なくとも１つの鎖またはセグメントが、切断されるか、分解されるか、または他の形で作動不能とされるように、オリゴヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチドセグメントの、水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づくと考えられる。
【０１０２】
アンチセンス剤は、ＴＩＡ−１  ＤＮＡに結合しうる。複数の実施形態では、アンチセンス剤は、複製もしくは転写またはこれらの両方を阻害する。理論に束縛されずに述べると、アンチセンス剤はまた、標的ＲＮＡの、例えば、タンパク質翻訳の部位へのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１または複数のＲＮＡ分子種をもたらすＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡを伴う触媒活性または複合体形成を阻害するようにも機能しうると考えられる。
【０１０３】
アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０核酸塩基（すなわち、約８〜約８０ヌクレオチド）、例えば、約８〜約５０核酸塩基、または約１２〜約３０核酸塩基を含みうる。一部の実施形態では、アンチセンス剤は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基の長さである。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、および標的核酸とハイブリダイズし、その発現をモジュレートする、他の短鎖触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、標的遺伝子内の配列と相補的な、少なくとも８つの連続核酸塩基のストレッチを含みうる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列と１００％相補的である必要はない。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ｍＲＮＡ（例えば、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの正常な機能のうちの１または複数に干渉しうる。理論に束縛されずに述べると、干渉されるｍＲＮＡの機能は、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳の部位へのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１または複数のｍＲＮＡ分子種をもたらすＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関与しうる触媒活性など、全ての鍵となる機能を含むと考えられる。特異的タンパク質の、ＲＮＡへの結合もまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより干渉されうる。
【０１０５】
例示的なアンチセンス化合物は、標的核酸、例えば、ＴＩＡ−１をコードするｍＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含む。相補領域は、約８〜約８０核酸塩基の間にわたり広がりうる。化合物は、１または複数の修飾核酸塩基を含みうる。修飾核酸塩基は、例えば、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシンなどの５−置換ピリミジンと、Ｃ５−プロピニルシトシンおよびＣ５−プロピニルウラシルなどのＣ５−プロピニルピリミジンとを含みうる。他の適切な修飾核酸塩基は、Ｎ４−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノシトシンおよびＮ４，Ｎ４−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノシトシンを含む。修飾核酸塩基はまた、例えば、７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリンなどの、７−置換−５−アザ−７−デアザプリンおよび７−置換−７−デアザプリンも含みうる。これらの例は、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、および２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンを含む。さらに、Ｎ６−メチルアミノアデニンおよびＮ６，Ｎ６−ジメチルアミノアデニンを含むＮ６−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノプリンおよびＮ６，Ｎ６−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノプリンもまた、適切な修飾核酸塩基である。同様に、例えば、６−チオグアニンを含む他の６−置換プリンも、適切な修飾核酸塩基を構成しうる。他の適切な核酸塩基は、２−チオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン、および２−フルオログアニンを含む。前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかの誘導体もまた、適切である。前出の化合物のうちのいずれかの置換基は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニルなどを含みうる。アンチセンス剤はまた、本明細書の、「化学修飾核酸」と題する節において記載される化学修飾も有しうる。
【０１０６】
マイクロＲＮＡ
一部の実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とするのに適する、核酸ベースの阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断、翻訳の抑制／阻害、またはヘテロクロマチンサイレンシングにより、標的ｍＲＮＡの発現を調節する一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、１８〜２５ヌクレオチド、典型的に、２１〜２３ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、本明細書で記載される、１または複数の修飾などの化学修飾を含む。複数の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＴＩＡ−１を標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤へとプロセシングされる。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＴＩＡ−１を標的とする、核酸ベースの阻害剤、例えば、ｍｉＲＮＡは、標的ＴＩＡ−１  ｍＲＮＡとの部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。ｍｉＲＮＡは、それらの標的に対する部分的な相補性を有することが多い。例として述べると、部分的な相補性は、核酸ベースの阻害剤と、対応する標的核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間で生じる、バルジ、ループ、または突出を結果としてもたらしうる、多様なミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超えるミスマッチまたはヌクレオチドバルジなど、非塩基対合ヌクレオチド）を含みうる。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡはまた、本明細書の、例えば、「化学修飾核酸」と題する節において記載される化学修飾も有しうる。
【０１０９】
長鎖干渉核酸
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、長鎖干渉核酸を含む。長鎖干渉核酸は、典型的に、二本鎖核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。長鎖干渉核酸は、場合によって、哺乳動物細胞内で、免疫刺激性であり、例えば、インターフェロン応答を活性化させうる。インターフェロン応答は、翻訳の全般的な抑制および全般的なＲＮＡ分解をもたらしうる。
【０１１０】
一部の実施形態では、長鎖干渉核酸は、各々、独立に、約５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４５０〜５００、または５００ヌクレオチドを超える長さである、１つまたは２つの鎖を含む。一部の実施形態では、長鎖干渉核酸は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４５０、または５００ヌクレオチドの長さである。
【０１１１】
長鎖干渉ＲＮＡはまた、本明細書の、例えば、「化学修飾核酸」と題する節において記載される化学修飾も有しうる。
【０１１２】
アプタマー
核酸アプタマーとは、典型的に、標的に強力かつ特異的に結合するように操作された、短鎖で、構造化された、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、治療薬として使用することもでき、別の治療薬（例えば、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンス分子）を、所望の場所へと送達する標的化剤として使用することもできる。したがって、一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、アプタマーと、第２の部分とを含み、この場合、第２の部分は、ｍＲＮＡの分解または翻訳の阻害を媒介することが可能な核酸を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、アプタマーは、ニューロン内、例えば、ＣＮＳのニューロン内に存在する標的、例えば、標的タンパク質に結合する。標的は、例えば、ニューロンの細胞表面上に存在しうる、例えば、膜貫通タンパク質、表面会合タンパク質、脂質アンカータンパク質、または炭水化物部分でありうる。
【０１１４】
アプタマーは、ハイスループットスクリーニング技術を使用して、例えば、異なる候補配列のプールをもたらし、標的に対するアフィニティーを伴う配列を選択し、標的に対するアフィニティーを有した配列に基づき、新たなプールを創出し（例えば、変異誘発を伴う増幅を実施することにより）、所望のアフィニティーを伴うアプタマーが作出されるまで、これらのステップを繰り返して作製することができる。
【０１１５】
アプタマーはまた、本明細書の、例えば、「化学修飾核酸」と題する節において記載される化学修飾も有しうる。
【０１１６】
ＣＲＩＳＰＲ系
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを含む。「ＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスタリングされた、規則的に間隔を置いた短鎖回文リピートのセット、またはこのようなリピートのセットを含む系を指す。「Ｃａｓ」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、ＴＩＡ−１などの標的遺伝子の発現を変更する、例えば、その発現を消失させるのに使用しうる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系を指す。
【０１１７】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムのうちの約４０％および配列決定された古細菌のうちの９０％において見出される（Ｇｒｉｓｓａら（２００７年）、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、８巻：１７２頁）。この系は、プラスミドおよびファージなど、外来遺伝エレメントに対する耐性を付与する、原核生物免疫系の一種であり、獲得免疫の形態をもたらす（Ｂａｒｒａｎｇｏｕら（２００７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻：１７０９〜１７１２頁；Ｍａｒｒａｇｉｎｉら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２２巻：１８４３〜１８４５頁）。
【０１１８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類など、真核生物の遺伝子編集（特異的遺伝子のサイレンシング、増強、または変化）における使用のために改変されている（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら（２０１２年）、Ｎａｔｕｒｅ、４８２巻：３３１〜８頁）。これは、真核生物細胞へと、特異的にデザインされたＣＲＩＳＰＲと、１または複数の適切なＣａｓとを含有するプラスミドを導入することにより達成することができる。
【０１１９】
場合によって、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互になったリピートとスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ内では、スペーサーは通例、プラスミド配列またはファージ配列など、細菌に対して外来の配列を含み、ＴＩＡ−１を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサーは、ＴＩＡ−１の遺伝子配列に由来しうる。
【０１２０】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するＲＮＡは、構成的に発現し、Ｃａｓタンパク質により、スモールＲＮＡへとプロセシングされる。これらは、リピート配列により挟まれるスペーサーを含む。これらのＲＮＡは、外因性遺伝エレメントを、ＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルでサイレンシングするように、他のＣａｓタンパク質を導く（Ｈｏｒｖａｔｈら（２０１０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１６７〜１７０頁；Ｍａｋａｒｏｖａら（２００６年）、Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁）。したがって、スペーサーは、ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分子に対する鋳型として働く（Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１巻：８３３〜８３６頁）。
【０１２１】
これらは、多く異なる種類の細菌内で天然に存在するので、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置と、Ｃａｓ遺伝子およびそれらの産物の構造、機能、および数とは、種により、幾分か異なる（Ｈａｆｔら（２００５年）、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．、１巻：ｅ６０頁；Ｋｕｎｉｎら（２００７年）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．、８巻：Ｒ６１頁；Ｍｏｊｉｃａら（２００５年）、Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、６０巻：１７４〜１８２頁；Ｂｏｌｏｔｉｎら（２００５年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５１巻：２５５１〜２５６１頁；Ｐｏｕｒｃｅｌら（２００５年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５１巻：６５３〜６６３頁；およびＳｔｅｒｎら（２０１０年）、Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｇｅｎｅｔ．、２８巻：３３５〜３４０頁）。例えば、Ｃｓｅ（Ｃａｓの亜型；Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質（例えば、ＣａｓＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−リピート単位へとプロセシングする、機能的な複合体である、Ｃａｓｃａｄｅを形成する（Ｂｒｏｕｎｓら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：９６０〜９６４頁）。他の原核生物では、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物をプロセシングする。Ｅ．ｃｏｌｉ内の、ＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活化は、ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３は要求するが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２は要求しない。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓおよび他の原核生物におけるＣｍｒ（Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール）タンパク質は、相補的な標的ＲＮＡを認識し、切断する、スモールＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと共に、機能的な複合体を形成する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重螺旋の各鎖につき１つの、２つの活性切断部位を伴うヌクレアーゼである、Ｃａｓ９タンパク質に依拠する。Ｃａｓ９と、修飾ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ＲＮＡとの組み合わせを、遺伝子編集のための系内で使用することができる（Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１巻：８３３〜８３６頁）。他の適切なＣａｓタンパク質は、その相同体が、ＡｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓおよびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅにおいて見出される、Ｃｐｆ１タンパク質を含む。
【０１２２】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＩＡ−１遺伝子を編集する（例えば、１または複数の塩基対を付加するか、または欠失させる）こともでき、早期停止を導入し、したがって、ＴＩＡ−１遺伝子の発現を低下させることもでき、ＴＩＡ−１の凝集ドメイン（例えば、Ｇｉｌｋｓら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．、２００４年１２月、１５巻（１２号）：５３８３〜９８頁において記載されている、例えば、プリオン様のポリグリシンリッチドメイン）を不活化させるかまたは除去することもでき、ＴＩＡ−１のレベルまたは活性を低減する変異を導入することもでき、これらの任意の組み合わせを施すこともできる。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ干渉と同様に使用し、ＴＩＡ−１遺伝子を、可逆的にオフにすることもできる。哺乳動物細胞内では、例えば、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断するように、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、ＴＩＡ−１プロモーターへと導きうる。
【０１２３】
例えば、米国公開第２０１４００６８７９７号；およびＣｏｎｇ（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻：８１９〜８２３頁において記載されている、当技術分野で公知の技術を使用して、ＴＩＡ−１を阻害する、人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を作出することができる。例えば、Ｔｓａｉ（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：６号、５６９〜５７６頁、米国特許第８，８７１，４４５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，７９５，９６５号；同第８，７７１，９４５号；および同第８，６９７，３５９号において記載されている、ＴＩＡ−１を阻害する当技術分野で公知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた作出することができる。
【０１２４】
化学修飾核酸
核酸ベースの阻害剤は、１または複数の化学修飾を含みうる。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、前記修飾のうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の骨格修飾を含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾を含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の骨格修飾と、１または複数の糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾とを含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の核酸塩基修飾を含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の核酸塩基修飾と、１または複数の糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾とを含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の核酸塩基修飾と、１または複数の骨格修飾とを含む。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、１または複数の核酸塩基修飾と、１または複数の糖修飾、例えば、２’Ｏ修飾と、１または複数の骨格修飾とを含む。本明細書では、多様な核酸塩基修飾、糖修飾、および骨格修飾が明示される。
【０１２５】
修飾核酸塩基は、例えば、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、５−Ｃ−メチルヌクレオチドなどの５−置換ピリミジンと、Ｃ５−プロピニルシトシンおよびＣ５−プロピニルウラシルなどのＣ５−プロピニルピリミジンとを含みうる。他の適切な修飾核酸塩基は、Ｎ４−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノシトシンおよびＮ４，Ｎ４−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノシトシンを含む。修飾核酸塩基はまた、例えば、７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリンなどの、７−置換−５−アザ−７−デアザプリンおよび７−置換−７−デアザプリンも含みうる。これらの例は、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、および２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンを含む。さらに、Ｎ６−メチルアミノアデニンおよびＮ６，Ｎ６−ジメチルアミノアデニンを含むＮ６−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノプリンおよびＮ６，Ｎ６−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノプリンもまた、適切な修飾核酸塩基である。同様に、例えば、６−チオグアニンを含む他の６−置換プリンも、適切な修飾核酸塩基を構成しうる。他の適切な核酸塩基は、２−チオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン、および２−フルオログアニンを含む。前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかの誘導体もまた、適切である。前出の化合物のうちのいずれかの置換基は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニルなどを含みうる。修飾核酸塩基はまた、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、４−チオ−ウリジン、Ｎ３−メチルウリジン、および２，６−ジアミノ−プリンも含む。修飾核酸塩基はまた、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチドまたは「非環状」ヌクレオチドでもありうる。一部の実施形態では、ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、高アフィニティーで、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なる塩基のうちの１つと対合しうる。ユニバーサル塩基は、ヒポキサンチン、ニトロアゾール、イソカルボスチリル類似体、アゾールカルボキサミド、芳香族トリアゾール類似体、イノシン、デオキシイノシン、ニトロアゾール類似体、および疎水性芳香族非水素結合塩基を含む。
【０１２６】
骨格修飾は、ホスフェートおよび／または糖への修飾を含む。修飾骨格は、１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホジエステル連結、ボラノホスフェート連結、またはこれらの組み合わせを含みうる。修飾骨格を伴う核酸はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）も含む。
【０１２７】
例えば、ＲＮＡ分子への糖修飾は、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’Ｏ−アルキルリボヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）、２’−アミノエチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、および２’−ＯＨを、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮなどの基で置きかえた糖修飾リボヌクレオチド［式中、Ｒは、アルキル部分である］を含む。アルキル部分は、例えば、直鎖の場合もあり、分枝鎖の場合もあり、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える炭素を有しうる。飽和炭化水素基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどの相同体および異性体などの基を含むがこれらに限定されない。糖修飾はまた、ロックト核酸（ＬＮＡ）、非ロックト核酸（ＵＮＡ）も含む。複数の実施形態では、修飾糖は、例えば、４’−（ＣＨ２）−−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）２−−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；または４’−ＣＨ（ＣＨ３）−−Ｏ−２’（ｃＥｔ）を含む二環式糖である。複数の実施形態では、修飾糖は、３’−フルオロ−ＨＮＡ（ヘキシトール核酸）または４’−（ＣＨ２）ｎ−−Ｏ−２’架橋［式中、ｎは、１または２である］を含む。複数の実施形態では、修飾糖を有するヌクレオチドは、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）、またはフルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）などの修飾テトラヒドロピランヌクレオシドである。
【０１２８】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンス分子は、例えば、Ｒｉｇｏら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ２’−ＯＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ」、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、３５０巻：４６〜５５頁、２０１４年７月において記載されている、２’Ｏ−Ｍｅ（２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチド、ＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノ）ヌクレオチド、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）ヌクレオチド、およびＳ−ｃＥｔヌクレオチド（ｃＥｔ；２’，４’−拘束２’−Ｏ−エチル）のうちの１または複数を含む。複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンスＲＮＡは、１または複数の２’ＭＯＥヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の２’−ＭＯＥヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤（例えば、アンチセンスＲＮＡ）のあらゆるヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。複数の実施形態では、２’−ＭＯＥヌクレオチドは、以下の式：
【化７】
2018531046.tif 000019
に従う構造を有する。
【０１２９】
複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンスＲＮＡは、１または複数のｃＥｔ（例えば、Ｓ−ｃＥｔ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のｃＥｔ（例えば、Ｓ−ｃＥｔ）ヌクレオチドを含む。
【０１３０】
複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンスＲＮＡは、１または複数のｃＥｔ（例えば、Ｓ−ｃＥｔ）ヌクレオチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）、１または複数の２’ＭＯＥヌクレオチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）、および１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）を含む。複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンスＲＮＡは、１または複数の２’ＭＯＥヌクレオチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）および１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）を含む。複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤、例えば、アンチセンスＲＮＡは、１または複数の２’−デオキシヌクレオシド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはこれを超える）を含む。
【０１３１】
複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、逆位無塩基部分、ヘキシトール核酸、４−Ｃ−ヒドロキシメチルデオキシリボ核酸、２’デオキシチミジン、２’−アミノエチル、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１または複数を含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、例えば、５’位において、式：
【化８】
2018531046.tif 000020
のうちの１つを有する部分を含み、式中、
Ｔ１は、式：
【化９】
2018531046.tif 000021
を有するリン部分であり、式中、
ＲａおよびＲｃは、各々、独立に、保護ヒドロキシル、保護チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、
Ｒｂは、ＯまたはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、各々、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシであり、
各置換された基は、ハロゲン、ＯＪ１、Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）、＝ＮＪ１、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＮ、ＯＣ（＝Ｘ２）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ２）Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）、およびＣ（＝Ｘ２）Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）から独立に選択される、任意選択で保護された１または複数の置換基を含み、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ３であり、
Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は、各々、独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１３３】
複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、例えば、５’位において、式：
【化１０】
2018531046.tif 000022
のうちの１つを有する部分を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、例えば、５’位において、式：
【化１１】
2018531046.tif 000023
のうちの１つを有する部分を含み、式中、
Ｔ１は、式：
【化１２】
2018531046.tif 000024
を有するリン部分であり、式中、
ＲａおよびＲｃは、各々、独立に、保護ヒドロキシル、保護チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、
Ｒｂは、ＯまたはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、各々、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシであり、
Ｑ３は、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ５）またはＣ（Ｒ６）（Ｒ７）であり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、各々、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
各置換された基は、ハロゲン、ＯＪ１、Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）、＝ＮＪ１、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＮ、ＯＣ（＝Ｘ２）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ２）Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）、およびＣ（＝Ｘ２）Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）から独立に選択される、任意選択で保護された１または複数の置換基を含み、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ３であり、
Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は、各々、独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１３５】
複数の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、１−アミノヘキサン、１２−ヒドロキシドデシル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、１２−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）］ドデシル（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト誘導体、２，３−ジクロロベンゼン、２，４−架橋核酸、２，４−炭素環式エチレン架橋核酸−ロックト核酸、２，４−炭素環式ロックト核酸−ロックト核酸、２，４−ジフルオロベンゼン、２，４−ジフルオロトルエン、２，４−ジフルオロトルエン−２−デオキシリボヌクレオチド、２−アミノエトキシメチル、２−アミノエチル、２−アミノプロポキシメチル、２−アミノプロピル、２−アミノプリンリボヌクレオチド、２−シアノエチル、２−デオキシ、２−デオキシ−２−アミノプリン−２−デオキシリボヌクレオチド、２−デオキシ−２−フルオロ、２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオアラビノ核酸、２−デオキシ−２−フルオロアラビノ核酸、２−デオキシ−２−フルオロウリジン、２−デオキシ−２−Ｎ，４−Ｃ−エチレン−ロックト核酸、２−デオキシイノシン、２−デオキシネブラリン、２−デオキシチミジン、２−グアニジノエチル、２−ヒドロキシ、２−ヒドロキシエチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、２−メトキシ、２−メチル、２−Ｎ−アダマント−１−イル−メチルカルボニル−２−アミノ−ロックト核酸、２−Ｎ−ピレン−１−イルメチル−２−アミノ−ロックト核酸、２−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２−Ｏ−アリルリボース、２−Ｏ−ベンジル、２−Ｏ−フルオロ、２−Ｏ−グアニジノエチルリボース、２−Ｏ−グアニジノプロピル、２−Ｏ−リシルアミノヘキシル、２−Ｏ−メトキシエチルリボース、２−Ｏ−メチル−４−チオリボース、２−チオウリジン、３−アミノ、３−Ｏ−メチルリボース、４−Ｃ−アミノメチル−２−Ｏ−メチルリボース、４−Ｃ−ヒドロキシメチルデオキシリボ核酸、４−メチルベンズイミダゾール、４−チオリボース、５−アミノ、５−ブロモウリジン、５−コレステロール、５−フルオロ−２−デオキシウリジン、５−ヨードウリジン、５−メチルシトシン、５−ニトロインドール−２−デオキシリボヌクレオチド、５−ニトロインドールリボヌクレオチド、５−Ｏ−メチル、５−Ｏ−メチルチミジン、５−ホスフェート、５−チオ、無塩基（２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−３−オール）、アルファ−Ｌ−ロックト核酸、アミノイソヌクレオチド−アデニン、アミノイソヌクレオチド−チミジン、アントラセン、ビオチン、ボラノホスフェート、ボロンクラスター、シクロヘキセニル核酸、Ｄ−イソヌクレオシド−アデニン、Ｄ−イソヌクレオシド−ウラシル、デオキシアデニン、デオキシウリジン、ジアミノプリン、ジフルオロトルイルヌクレオチド、ジヒドロウリジン、ジメトキシ−ニトロフェニルエチル基、ドデシル誘導体、フルオレセイン、フルオロベンゼン、フルオロウリジン、ガラクトース、グルコサミン類似体、ヘキシトール核酸、ヒドロキシフェニルコンジュゲート、ヒポキサンチン、イノシン、逆位デオキシ無塩基、逆位デオキシチミジン、逆位チミジン、Ｌ−イソヌクレオシドチミジン、ラウリン酸、メチル、メチルシトシン、メチレンアミド、メチルウリジン、モルホリノウリジン、Ｎ−３メチルウリジン、Ｎ−ヘキシルヘキサデカンアミド、Ｎ４−エチル−Ｎ４２−デオキシ−５−メチルシチジン、Ｎ６−エチル−Ｎ６−２−デオキシアデノシン、ナフタレン修飾、ネブラリン、オキセタン−ロックト核酸、パルミチン酸、ペプチド核酸、フェニル、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、プロピニルウリジン、シュードウリジン、ピューロマイシン、ピレン修飾、セリノール核酸、チミジン類似体、トリアゾール連結核酸、トリシクロデオキシリボ核酸、トリフルオロメチルベンゼン、非ロックト核酸、キシロ−３−フルオロリボース、キシロ−Ｏ−メチルリボース、［１，１−ビフェニル］−３，５−ジメタノール、［３−（ヒドロキシメチル）−５−ナフタレン−１−イルフェニル］メタノール、［３−（ヒドロキシメチル）−５−フェナントレン−９−イルフェニル］メタノール、［３−（ヒドロキシメチル）−５−ピレン−１−イルフェニル］メタノール、［３−（ヒドロキシメチル）フェニル］メタノール、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１または複数を含む。
【０１３６】
自己送達ＲＮＡ
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、自己送達ＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）を含む。例示的な自己送達ＲＮＡは、Ａｄｖｉｒｎａにより製造されている。一部の例示的なＲＮＡは、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７９６，４４３号および同第９，０８０，１７１号において開示されている。
【０１３７】
一部の実施形態では、ｓｄＲＮＡは、一本鎖ホスホロチオエート領域、短鎖二重鎖領域、ヌクレアーゼ安定化化学修飾、および親油性化学修飾のうちの１または複数、例えば、これらの全てを含む。一部の実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ガイド鎖と、パッセンジャー鎖とを含む単離二本鎖核酸分子であって、二本鎖領域と、一本鎖領域とを含む単離二本鎖核酸分子を含む。二本鎖領域は、例えば、８〜１５ヌクレオチド長でありうる。一本鎖領域は、ガイド鎖の３’末端にあることが可能であり、かつ／または４〜１２ヌクレオチド長でありうる。一本鎖領域は、１または複数カ所の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ所のホスホロチオエート修飾を含有しうる。一部の実施形態では、単離二本鎖核酸分子のヌクレオチドのうちの少なくとも４０％が修飾される。疎水性コンジュゲートは、単離二本鎖核酸分子に付着させることができる。疎水性コンジュゲートは、小分子、任意選択で、ステロール型分子、任意選択で、コレステロールを含みうる。一部の実施形態では、単離二本鎖核酸分子は、ヘアピンを形成しない。
【０１３８】
一部の実施形態では、ｓｄＲＮＡは、第２のポリヌクレオチドおよび標的遺伝子と相補的な第１のポリヌクレオチドと、任意選択で、第１のポリヌクレオチドより、少なくとも６ヌクレオチド短い第２のポリヌクレオチドとを含む単離非対称核酸分子を含む。第１のポリヌクレオチドは、例えば、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチドの一本鎖領域を含みうる。第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ所のホスホロチオエート修飾を含有しうる。非対称核酸分子はまた、例えば、８〜１５ヌクレオチド長の二本鎖領域も含みうる。一部の実施形態では、二本鎖領域内のＣおよびＵヌクレオチドのうちの少なくとも５０％が、２’Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾される。疎水性コンジュゲートは、非対称核酸分子に付着させることができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｓｄＲＮＡは、標的遺伝子に対する相補性を有する、例えば１７〜２１ヌクレオチドの長さのガイド鎖と、例えば、８〜１６ヌクレオチドの長さのパッセンジャー鎖とを含む、単離二本鎖核酸分子を含む。単離二本鎖核酸分子は、例えば、８〜１５ヌクレオチドの二本鎖領域と、一本鎖領域とを含みうる。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、二本鎖領域と、一本鎖領域とを有する二本鎖核酸分子を形成することが可能であり、この場合、一本鎖領域は、任意選択で、ガイド鎖の３’末端にあり、例えば、４〜１２ヌクレオチドの長さである。一本鎖領域は、１または複数カ所の、例えば、約２〜１２カ所のホスホロチオエート修飾を含みうる。一部の実施形態では、単離二本鎖核酸分子のヌクレオチドのうちの少なくとも４０％が修飾される。二本鎖核酸分子を、疎水性コンジュゲートへと連結することができる。一部の実施形態では、単離二本鎖核酸分子は、ヘアピンを形成しない。
【０１４０】
一部の実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ガイド鎖と、パッセンジャー鎖とを含み、この場合、ｓｄＲＮＡは、二本鎖領域と、一本鎖領域とを含む。二本鎖領域は、例えば、８〜１５ヌクレオチド長でありうる。一本鎖領域は、例えば、ガイド鎖の３’末端にあることが可能であり、例えば、４〜１２ヌクレオチド長でありうる。一部の実施形態では、一本鎖領域は、１または複数カ所の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ所のホスホロチオエート修飾を含有する。一部の実施形態では、単離二本鎖核酸分子のヌクレオチドのうちの少なくとも４０％が修飾される。一部の実施形態では、少なくとも２つのＵおよび／またはＣは、疎水性修飾、例えば、チオフェン修飾、エチニル修飾、イソブチルベンジル修飾、およびイミダゾール修飾からなる群から選択される疎水性修飾を含む。一部の実施形態では、疎水性修飾は、Ｕおよび／またはＣの、４または５位に位置する。
【０１４１】
コンジュゲート
本開示のコンジュゲート部分（また、単に「コンジュゲート」とも称する）は、直接的または間接的にヌクレオチドにつながり、様々な手段により、細胞への侵入を標的としうる部分である。例えば、コンジュゲート部分は、脂質性でありうる。したがって、脂質ベースのコンジュゲート部分は、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、およびステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレイド酸（ｌｉｎｏｌｅａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、リノレン酸、およびミリスチン酸を含む脂肪酸を含みうる。代替的に、コンジュゲート部分は、膜移行性（例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、ＭＡＰ）またはカチオン性（例えば、ポリ（ｌｙｓ）、ポリ（ａｒｇ）、ポリ（ｈｉｓ）、ポリ（ｌｙｓ／ａｒｇ／ｈｉｓ）、またはプロタミン）であるペプチドを含むタンパク質性でありうる。
【０１４２】
代替的に、コンジュゲート部分は、例えば、特定の受容体を標的とするか、またはそれ自体を膜へと挿入し、エンドサイトーシス経路により吸収されることが可能な小分子でありうる。したがって、アダマンタン、ポリ芳香族炭化水素（例えば、ナフタレン、フェナントレン、またはピレン）、大員環化合物（ｍａｃｒｏｃｙｌｅ）、ステロイド、または他の化学的足場に基づく小分子は全て、適切なコンジュゲートである。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、抗体またはその抗原結合性部分（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリ（アルキルピリジニウム）塩、またはカチオン性アルブミンなどのカチオン性ポリマーに基づきうる。
【０１４４】
場合によって、コンジュゲート部分は、受容体のリガンドであるか、または受容体と会合する分子と会合しうる。このクラスには、胆汁酸、小分子薬リガンド、ビタミン、アプタマー、炭水化物、ペプチド（ホルモン、タンパク質、タンパク質断片、抗体、または抗体断片を含むがこれらに限定されない）、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、毒素（例えば、細菌毒素）、その他が含まれる。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、受容体のリガンド、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）のリガンド、例えば、１つ、２つ、または３つの、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含むリガンドを含む。一部の実施形態では、三叉型スペーサーを使用して、３つのＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖の３’末端に付着させる。また、ステロイド性のコンジュゲート、例えば、コレステロール、コレスタノール、コラン酸、スチグマステロール、プレグネロン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、エストラジオール、エルゴステロール、その他も含まれる。適切なコンジュゲート部分は、コレステロール（ＣＨＯＬ）、コレスタノール（ＣＨＬＮ）、コラン酸（ＣＨＬＡ）、スチグマステロール（ＳＴＩＧ）、およびエルゴステロール（ＥＲＧＯ）を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、他の供給源へとコンジュゲートさせたｓｉＲＮＡの喪失可能性を消滅させるように、特定の受容体を標的とする分子を修飾する。例えば、コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡを、正常な血清の存在下に置く場合、この物質の大きな割合は、血清中のアルブミンおよび／または他のタンパク質と会合し、したがって、ｓｉＲＮＡは、例えば、ＬＤＬとの相互作用にとって利用不要となる。この理由で、コンジュゲート部分は、それらが、それらの意図された標的（例えば、ＬＤＬ）へ継続して結合または会合するが、意図されない結合パートナー（例えば、血清アルブミン）に対するアフィニティーは低下させるように修飾することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、腎クリアランスを低減しうるＤｙｎａｍｉｃ  ＰｏｌｙＣｏｎｊｕｇａｔｅ（ＤＰＣ）を含む。ＤＰＣでは、核酸を、加水分解性リンカーにより、膜破壊性ポリマー（ポリ（ブチルアミノビニルエーテル）など）に付着させる。リンカーは、ジスルフィド基を含みうる。ＤＰＣはまた、ＤＰＣが、標的細胞により取り込まれると、エンドソーム内の酸性環境において脱落する、ＰＥＧ部分も含む。ＤＰＣはまた、ＧａｌＮＡｃ標的化リガンドも含みうる。ＰＥＧ部分は、カルボキシル化ジメチルマレイン酸化学を使用して、ポリマーへと連結することができる。ＤＰＣポリマーは、例えば、非制御型重合を使用して作製することもでき、原子移動ラジカル重合および可逆的付加−断片化鎖移動を含む、制御型ラジカル重合を使用して作製することもできる。
【０１４７】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、細胞透過性ペプチド、例えば、エンドサイトーシスまたは非エンドサイトーシス機構を介する細胞取込みを誘導しうる細胞透過性ペプチドを含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、蛍光分子、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ローダミン、またはこれらの誘導体を含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤は、ＰＥＧ部分を含む。
【０１５０】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、各々が参照によりその全体において組み込まれる、Ｋａｎａｓｔｙら、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１２巻、２０１３年１１月、９６７頁；またはＧａｖｒｉｌｏｖａら、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲｎａ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｙａｌｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８５巻（２０１２年）、１８７〜２００頁において記載されている部分へとコンジュゲートさせる。
【０１５１】
発現構築物
本明細書で記載される核酸ベースの阻害剤、例えば、本明細書で記載されるアンチセンス核酸またはｄｓＲＮＡは、遺伝子構築物、例えば、細胞内で薬剤を発現させ、産生するのに使用しうる核酸を送達する遺伝子治療プロトコールの一部として使用される構築物へと組み込むことができる。発現構築物はまた、核酸ベースの阻害剤を作製するのにも使用することができ、次いで、核酸ベースの阻害剤を、被験体へと投与することができる。発現構築物は、任意の生物学的に有効な担体、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、構成要素である遺伝子を、細胞へと、効果的に送達することが可能な、任意の製剤または組成物により投与することができる。手法は、組換えレトロウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス１を含むウイルスベクター内、または組換え細菌プラスミド内もしくは組換え真核生物プラスミド内への対象遺伝子の挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞に直接トランスフェクトするが、プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化させた（例えば、抗体をコンジュゲートさせた）ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ（ｇｒａｍａｃｉｄｉｎ  Ｓ）、人工ウイルスエンベロープ、または他のこのような細胞内獲得物（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅａｒｎｅｒ）のほか、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実行される、遺伝子構築物またはＣａＰＯ４沈殿の直接的な注射を一助として送達することができる。ある実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクターである。ある実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。ある実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
【０１５２】
ある実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸の、細胞への導入は、核酸、例えば、ｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用を含む。細胞へのウイルスベクターの感染は、標的とされる細胞の大部分が、核酸を受容しうる利点を有する。加えて、ウイルスベクター内でコードされる分子、例えば、ウイルスベクター内に含有されるｃＤＮＡも、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現する。
【０１５３】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、外因性遺伝子を、特に、ヒトへと移入するための、組換え遺伝子送達系として使用することができる。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率的な送達をもたらし、移入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡへと、安定的に組み込まれる。組換えレトロウイルスを作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞に、このようなウイルスを感染させるためのプロトコールは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９年）、９．１０〜９．１４節；および他の標準的な実験マニュアルにおいて見出すことができる。適切なレトロウイルスの例は、当業者に公知の、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。エコトロピックレトロウイルス系およびアンフォトロピックレトロウイルス系の両方を調製するのに適するパッケージングウイルス株の例は、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ、２、およびＡｍを含む。レトロウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、様々な遺伝子を、上皮細胞を含む、多くの異なる細胞型へと導入するのに使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３９５〜１３９８頁；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：６４６０〜６４６４頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：３０１４〜３０１８頁；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：６１４１〜６１４５頁；Ｈｕｂｅｒら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：８０３９〜８０４３頁；Ｆｅｒｒｙら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：８３７７〜８３８１頁；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１８０２〜１８０５頁；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７６４０〜７６４４頁；Ｋａｙら（１９９２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３巻：６４１〜６４７頁；Ｄａｉら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０８９２〜１０８９５頁；Ｈｗｕら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻：４１０４〜４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１３６号、同第ＷＯ８９／０２４６８号、同第ＷＯ８９／０５３４５号、および同第ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。
【０１５４】
別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを活用する。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：４３１〜４３４頁；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁を参照されたい。当業者には、アデノウイルスＡｄ株５型ｄ１３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する、適切なアデノウイルスベクターが公知である。
【０１５５】
対象遺伝子の送達に有用な、さらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、７巻：３４９〜３５６頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：３８２２〜３８２８頁；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６２巻：１９６３〜１９７３頁を参照されたい。
【０１５６】
ある実施形態では、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を、組換えＡＡＶにより送達する。ある実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを、宿主細胞のゲノムへと組み込みうる。複数の実施形態では、ウイルス、例えば、ＡＡＶは、被験体のゲノムへ組み込まれない。複数の実施形態では、ウイルス、例えば、ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子および／もしくはｃａｐ遺伝子、ならびに／またはこれら以外でゲノムへの組み込みを促進する他の遺伝子を欠く。ある実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一体にアニールして、二本鎖ＤＮＡを形成する、両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。開示される方法において使用されうるＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、および／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、および／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０を含み、開示される方法ではまた、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、およびＡＡＶ２／９などの偽型ＡＡＶも使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターは、最大で約５ｋｂの核酸、例えば、約１〜５、２〜５、３〜５、４〜５、または約５ｋｂの核酸を含む。
【０１５７】
複数の実施形態では、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、ウイルス、例えば、ＡＡＶウイルスにより送達されるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを含む。本明細書の、例えば、「ＣＲＩＳＰＲ系」と題する節では、多様なＣＲＩＳＰＲ法について記載する。複数の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲを、ＡＡＶを介して、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓｗｉｅｃｈら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３巻、１０２〜１０６頁（２０１５年）において記載されている通り、例えば、ニューロンへと送達する。
【０１５８】
複数の実施形態では、送達法は、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＫｏｔｔｅｒｍａｎおよびＳｃｈａｆｆｅｒ、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１４年７月、１５巻（７号）：４４５〜４５１頁；Ｂｏｒｅｌら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  ａｓ  ａ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２２巻４号、６９２〜７０１頁、２０１４年４月、Ｍｃｉｎｔｙｒｅら、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｈＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＲＮＡｉ」、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１年、９巻：９頁において記載されている送達法である。
【０１５９】
複数の実施形態では、ウイルス、例えば、ＡＡＶは、１または複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを含む。複数の実施形態では、ＤＮＡは、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の発現を駆動しうる、１または複数のプロモーター、例えば、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１プロモーターなどのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター、またはＰｏｌ  ＩＩプロモーターをさらに含む。複数の実施形態では、ＤＮＡは、１または複数の転写ターミネーター配列を含む。複数の実施形態では、ＤＮＡは、複数のカセットを含み、この場合、１または複数のカセット（例えば、全てのカセット）は、プロモーター、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）をコードする配列、および転写ターミネーターを含む。複数の実施形態では、ＤＮＡは、カセットの間のスペーサー、例えば、約１０〜１，０００、１００〜２００、１００〜１６０、１１０〜１５０、１２０〜１４０、または約１３０ヌクレオチドのスペーサーを含む。一部の実施形態では、隣接するカセットを、同じ配向性で配置し、一部の実施形態では、隣接するカセットを、逆の配向性で配置する。
【０１６０】
複数の実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは、複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤、または複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも２つまたはこれを超える（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、１００、もしくは２００、またはこれを超える）核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤配列、例えば、同じ配列のコピー、または異なる配列を含むかまたはコードする。一部の実施形態では、複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、同じ配列のコピーであり、他の実施形態では、複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、２つまたはこれを超える（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０またはこれを超える）異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数の核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、１つの核酸分子の一部として構成される、例えば、コンカタマーを形成するか、または複数のカセットとして構成される。
【０１６１】
複数の実施形態では、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ）は、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１プロモーターなどのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター、またはＰｏｌ  ＩＩプロモーターでありうる。プロモーター、例えば、ＷＰＲＥプロモーター、ＮＳＥプロモーター、ＥＦプロモーター、シナプシンプロモーター、ＰＤＧＦプロモーター、エノラーゼプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ペリオスチンプロモーター、またはＧＦＡＰプロモーター、またはこれらの転写活性部分もしくは改変体は、ニューロン内で活性でありうる。プロモーターは、ＰＮＳおよび／またはＣＮＳ（例えば、線条体、海馬、大脳皮質、または黒質）のニューロン内で活性でありうる。プロモーターは、ニューロンに特異的でありうる。ニューロン内で活性のプロモーターについては、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｍｅｖｉｋら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｏｍｅ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＰ−ｓｅｑ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、５巻：１２６０９頁；Ｘｕら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  （ＡＡＶ−２）  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００１年）、８巻、１３２３〜１３３２頁；Ｐｅｅｌら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７年）、４巻、１６〜２４頁；およびＰｉｒａｓら、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ９  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａ  ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１６年）、１〜１０頁において記載されている。
【０１６２】
キット
本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、キットにより提供することができる。
【０１６３】
ある実施形態では、キットは、（ａ）本明細書で記載される核酸ベースの阻害剤、例えば、本明細書で記載される核酸ベースの阻害剤を含む組成物（この場合、例えば、化合物は、本明細書で記載される阻害剤でありうる）と、任意選択で、（ｂ）情報材料とを含む。情報材料は、記載的材料の場合もあり、指示的材料の場合もあり、マーケティング材料の場合もあり、または本明細書で記載される方法および／または本明細書で記載される方法のための本明細書で記載される阻害剤の使用に関する、他の材料の場合もある。
【０１６４】
一実施形態では、情報材料は、阻害剤の製造、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチ情報または製造地情報などの情報を含みうる。一実施形態では、情報材料は、阻害剤を投与するための方法に関する。
【０１６５】
一実施形態では、情報材料は、本明細書で記載される阻害剤を、本明細書で記載される方法を実施するのに適する形で、例えば、適切な用量、剤形、または投与方式（例えば、本明細書で記載される用量、剤形、または投与方式）で投与するための指示を含みうる。別の実施形態では、情報材料は、本明細書で記載される阻害剤を、適切な被験体、例えば、ヒト、例えば、本明細書で記載される障害を有するか、またはこれに対する危険性があるヒトへと投与するための指示を含みうる。
【０１６６】
キットは、本明細書で記載される阻害剤を含有する組成物のための、１または複数の容器を含みうる。一部の実施形態では、キットは、阻害剤および情報材料のための、別個の容器、仕切り、またはコンパートメントを含有する。例えば、組成物は、ボトル内、バイアル内、またはシリンジ内に含有させることができ、情報材料は、プラスチック製のスリーブ内またはパケット内に含有させることができる。他の実施形態では、キットの別個の要素を、単一の、仕切りなしの容器内に含有させる。例えば、阻害剤は、情報材料を、ラベルの形態で付着させた、ボトル内、バイアル内、またはシリンジ内に含有される。一部の実施形態では、キットは、各々が、本明細書で記載される阻害剤の、１または複数の単位剤形（例えば、本明細書で記載される剤形）を含有する、複数の個々の容器（例えば、パック）を含む。例えば、キットは、各々が、本明細書で記載される阻害剤の単一の単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、フォイルパケット、またはブリスターパックを含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分の変化または蒸発に対して不透過性）、および／または遮光性でありうる。
【０１６７】
キットは任意選択で、組成物の投与に適するデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点滴注入器（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブまたは木製スワブ）、または任意のこのような送達デバイスを含む。ある実施形態では、デバイスは、例えば、手術用の挿入のためにパッケージングされた、医療用インプラントデバイスである。複数の実施形態では、デバイスは、ＣＮＳ、例えば、脳への送達に適するインプラントである。
【０１６８】
一部の実施形態では、キットは、２つまたはこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える核酸ベースの阻害剤、例えば、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を含む。ＴＩＡ−１阻害剤は、例えば、ＴＩＡ−１の異なる領域を指向する場合もあり、異なる化学修飾を含む場合もあり、異なるコンジュゲート部分を含む場合もある。
【０１６９】
組み合わせ療法
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を、神経変性疾患のためのさらなる処置と併せて投与する。神経変性疾患は、例えば、タウオパチー、例えば、アルツハイマー病；運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）；前頭側頭葉認知症（ＦＴＬＤ−ＴＤＰ）；ハンチントン病；クロイツフェルト−ヤコブ病；および脊髄性筋萎縮症でありうる。
【０１７０】
一部の実施形態では、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）のためのさらなる処置は、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ）、およびガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）などのコリンエステラーゼ阻害剤である。さらなる処置はまた、メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストでもありうる。
【０１７１】
一部の実施形態では、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ）のためのさらなる処置は、バクロフェンもしくはチザニジン（Ｚａｎａｆｌｅｘ）などの筋弛緩剤、またはリルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ）などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである。
【０１７２】
一部の実施形態では、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）のためのさらなる処置は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）などの、抗うつ剤または抗精神病薬である。ＳＳＲＩは、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）、セルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ）、パロキセチン（Ｐａｘｉｌ）、フルボキサミン（Ｌｕｖｏｘ）、シタロプラム（Ｃｅｌｅｘａ）、およびエスシタロプラム（Ｌｅｘａｐｒｏ）を含む。非ＳＳＲＩ抗うつ剤は、トラゾドン（Ｄｅｓｙｒｅｌ）、ベンラファキシン（Ｅｆｆｅｘｏｒ）、デュロキセチン（Ｃｙｍｂａｌｔａ）、ブプロピオン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ）、およびミルタザピン（ｍｉｒｔａｚｅｐｉｎｅ）（Ｒｅｍｅｒｏｎ）を含む。一部の実施形態では、さらなる処置は、失語症のための処置、例えば、ブロモクリプチン（Ｐａｒｌｏｄｅｌ）である。
【０１７３】
医薬組成物および送達法
医薬組成物中の、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の量および濃度のほか、被験体へと投与される医薬組成物の数量は、被験体の医学的に関連のある特徴（例えば、年齢、体重、性別、他の医学的状態など）、医薬組成物中の化合物の溶解度、化合物の効力および活性、ならびに医薬組成物の投与方式など、臨床的に関連のある因子に基づき選択することができる。投与経路および投与レジメンのさらなる情報について、読者は、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｃｏｒｗｉｎ  Ｈａｎｓｃｈ；Ｃｈａｉｒｍａｎ  ｏｆ  Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｂｏａｒｄ）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年の、５巻、２５．３章を参照されたい。
【０１７４】
核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、経口投与することもでき、非経口投与（皮下投与、筋内投与、または静脈内投与を含む）することもでき、直腸投与することもでき、経皮投与することもでき、口腔内投与することもでき、鼻投与することもできる。阻害剤は、全身投与することもでき、局所投与することもできる。組成物、例えば、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を含む医薬組成物は、本明細書で記載される化合物のうちの任意の１または複数を含みうる。
【０１７５】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、患者の系に入り、それによって代謝および他の同様の過程の下に置かれるような、作用部位、例えば、中枢神経系への直接的な投与以外の化合物、薬物、または他の物質の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【０１７６】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、通例注射による腸内投与および局所投与以外の投与方式を意味し、限定せずに述べると、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入を含む。
【０１７７】
核酸ベースの阻害剤は、薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、ｐＨ調整剤、および緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、および湿潤剤などの賦形剤のうちの１または複数を含む担体と共に製剤化することができる。さらに、一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、マイクロカプセルにより、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル、またはマイクロエマルジョン）内の、コアセルベーション法または界面間重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈａｓｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）により送達する。
【０１７８】
本明細書では、「薬学的に許容される」という語句は、健全な医療判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当な有益性／危険性比に適う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。
【０１７９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、対象のアンタゴニストを、１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分へと運ぶかまたは輸送することに関与する、液体または固体の、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料など、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して傷害性でないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として働きうる材料の一部の例は、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど、その誘導体；（４）粉末トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑石；（８）ココアバターおよび坐剤用の蝋などの賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張性生理食塩液；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；（２１）Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）などのシクロデキストリン；ならびに（２２）医薬製剤中で用いられる、他の非毒性の適合性物質を含む。
【０１８０】
ある実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、ＣＮＳへと、例えば、脳、例えば、脳へと直接、例えば、髄腔内送達または脳室内送達により送達する。ある実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、脳脊髄液（ＣＳＦ）へと送達する。核酸ベースの阻害剤はまた、植込み型デバイスからも送達することができる。ある実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、例えば、カテーテルを使用し、任意選択で、ポンプを使用する注入により送達する。一部の実施形態では、ポンプは、脳内ポンプである。一部の実施形態では、ＣＮＳ送達のための製剤は、エクソソームまたはリポソームを含む。
【０１８１】
例えば、ＣＮＳへの導入法はまた、再充填型デバイスによりもたらすこともでき、生体分解性デバイスによりもたらすこともできる。近年、タンパク質性生物学的薬剤を含む薬物の制御送達のための、多様な徐放性ポリマーデバイスが開発され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験されている。生体分解性ポリマーおよび非分解性ポリマーの両方を含む、様々な生体適合性ポリマー（ハイドロゲルを含む）を使用して、特定の標的部位における、化合物の持続放出のためのインプラントを形成することができる。
【０１８２】
核酸ベースの阻害剤は、眼周囲注射、結膜注射、テノン嚢下注射、前房内注射、硝子体内注射、眼内注射、網膜下注射、結膜下注射、球後注射、または細管内注射など、眼組織注射により、眼へと直接送達することもでき；カテーテル、または多孔性材料、非多孔性材料、もしくはゼラチン性材料を含む、網膜ペレット、眼内インサート、坐薬（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ）、もしくはインプラントなど、他の留置デバイスを使用する、眼への直接的な適用により、眼へと直接送達することもでき；局所的な点眼剤または軟膏により、眼へと直接送達することもでき；結膜円蓋内の徐放性デバイス、あるいは強膜と隣接する（経強膜）かもしくは強膜の中（強膜内）または眼内に植え込まれた徐放性デバイスにより、眼へと直接送達することもできる。前房内注射は、薬剤が、小柱網に到達することを可能とする、角膜を介する前房への注射でありうる。細管内注射は、シュレム管から排出する静脈集合管への注射、またはシュレム管への注射でありうる。
【０１８３】
眼への送達のためには、核酸ベースの阻害剤を、眼科的に許容可能な保存剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透増強剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、または水と組み合わせて、水性の滅菌眼科用懸濁物または滅菌眼科用溶液を形成することができる。溶液製剤は、干渉ＲＮＡを、生理学的に許容される等張性水性緩衝液中に溶解させることにより調製することができる。さらに、溶液は、核酸ベースの阻害剤を溶解させる一助とするように、許容可能な界面活性剤を含みうる。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を添加して、阻害剤の保持を改善することができる。
【０１８４】
滅菌眼科軟膏製剤を調製するために、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を、鉱油、液体ラノリン、または白色ワセリンなど、適切なビヒクル中で、保存剤と組み合わせることができる。滅菌眼科ゲル製剤は、当技術分野で公知の方法に従い、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、Ｎ．Ｃ．）などの組み合わせから調製された親水性基剤中に、核酸ベースの阻害剤を懸濁させることにより調製することができる。例えば、眼内注射のために、ＶＩＳＣＯＡＴ（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、Ｔｅｘ．）を使用することができる。他の組成物は、核酸ベースの阻害剤が眼内によく浸透しない場合には、クレモフォール（ｃｒｅｍｅｐｈｏｒ）およびＴＷＥＥＮ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）などの浸透増強剤を含有しうる。
【０１８５】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、リポソーム製剤として製剤化する。製剤は、例えば、カチオン性脂質である、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−｛２，３−ジオレイルオキシ｝プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド）、安定核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（商標）（日本、北海道、北海道システムサイエンス株式会社）、ｉ−Ｆｅｃｔ（商標）（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｅｄｉｎａ、ＭＮ、ＵＳＡ）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＰＰＣ、ＭＰＥＧ２００−Ｃ−ＤＭＡなどのＰＥＧ−脂質、中性脂質（例えば、１，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、１−オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）などのカチオン性脂質、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。リポソームは、カチオン性脂質、イオン化可能な脂質、またはこれらの両方を含みうる。脂質、例えば、イオン化可能な脂質は、アミンヘッド基、リンカー基、および１または複数の（例えば、２つの）疎水性テールを含みうる。一部の実施形態では、リポソームは、ＰＥＧ、例えば、脂質アンカーＰＥＧを含む。一部の実施形態では、リポソームは、例えば、そのコアにおいて、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）−リシン修飾コレステロール、またはこれらの両方を含む。一部の実施形態では、リポソームは、コレステロールを含む。一部の実施形態では、リポソームは、標的化部分、例えば、標的細胞上の表面タンパク質に結合する部分を含む。標的化部分は、例えば、リポタンパク質であるＡｐｏＥ、レチノール結合性タンパク質（ＲＢＰ）、またはＧａｌＮＡｃを含みうる。
【０１８６】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、合成の脂質様物質（例えば、「リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）」）により製剤化する。
【０１８７】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、ナノ粒子、例えば、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）ベースのナノ粒子として製剤化する。一部の実施形態では、ＣＤＰベースのナノ粒子は、ジアミン保有型シクロデキストリン単量体と、スベルイミノ酸ジメチルとの間の段階的成長重合により合成された、ポリカチオン性オリゴマー（ｎ≒５）であり、アミジン官能基を伴うオリゴマーをもたらす。ポリマー末端は、例えば、エンドソームエスケープの一助とするように、イミダゾール官能基でキャッピングすることができる。ポリマーはまた、アダマンタン−ＰＥＧ（ＡＤ−ＰＥＧ）、アダマンタン−ＰＥＧ−トランスフェリン（ＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ）、またはこれらの両方も含みうる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２０〜２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、腎濾過を回避するのに十分な程度大きいが、食細胞によるクリアランスを避けるのに十分な程度小さい。一部の実施形態では、ナノ粒子は、キトサン、シクロデキストリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、またはデンドリマー（高分枝状ポリマー分子）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、コアにおいて、金属性物質を含む。金属性物質は、例えば、酸化鉄、コバルト鉄、金鉄、またはニッケル鉄でありうる。金属性コアを伴うナノ粒子は、例えば、核酸ベースの阻害剤を連結するために、糖または他のポリマーのコーティングを含みうる。
【０１８８】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、オリゴヌクレオチドナノ粒子（ＯＮＰ）として製剤化する。ＯＮＰは、ＤＮＡ四面体構造など、あらかじめ規定された三次元構造へとハイブリダイズするようにデザインされた、相補的ＤＮＡ断片を含みうる。ＯＮＰは、１または複数の（例えば、２つ、３つ、またはこれを超える）葉酸塩リガンドを含みうる。
【０１８９】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、例えば、両親媒性のブロックコポリマーを含む、ポリマー性ミセルと共に製剤化する。
【０１９０】
一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、各々が参照によりその全体において組み込まれる、Ｋａｎａｓｔｙら、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１２巻、２０１３年１１月、９６７頁；またはＧａｖｒｉｌｏｖａら、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲｎａ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｙａｌｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８５巻（２０１２年）、１８７〜２００頁において記載されている組成物のうちのいずれかとして製剤化する。
【０１９１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、２つまたはこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える核酸ベースの阻害剤、例えば、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を含む。ＴＩＡ−１阻害剤は、例えば、ＴＩＡ−１の異なる領域を指向する場合もあり、異なる化学修飾を含む場合もあり、異なるコンジュゲート部分を含む場合もある。
【０１９２】
本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を伴う製剤に適する薬剤の非限定的な例は、脂質ナノ粒子（例えば、Ｓｅｍｐｌｅら、２０１０年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２月、２８巻（２号）：１７２〜６頁を参照されたい）；Ｐ−糖タンパク質阻害剤（リチノビルまたはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）；持続放出送達のための、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）マイクロスフェアなどの生体分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ，  Ｄ  Ｆら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、８巻、４７〜５８頁）；およびポリブチルシアノアクリレート製のナノ粒子など、負荷したナノ粒子を含む。本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤のための送達戦略の、他の非限定的例は、Ｂｏａｄｏら、１９９８年、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、８７巻、１３０８〜１３１５頁；Ｔｙｌｅｒら、１９９９年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４２１巻、２８０〜２８４頁；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．、９２巻、５５９２〜５５９６頁；Ｂｏａｄｏ、１９９５年、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、１５巻、７３〜１０７頁；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら、１９９８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６巻、４９１０〜４９１６頁；およびＴｙｌｅｒら、１９９９年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．、９６巻、７０５３〜７０５８頁において記載されている材料を含む。
【０１９３】
核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の、細胞への送達を増強するように、二本鎖ＲＮＡ結合性ドメインを含む核酸結合性タンパク質が使用されている（例えば、Ｅｇｕｃｈｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２７巻：５６７〜５７１頁（２００９年）を参照されたい）。本明細書で開示される実施形態において有用な、例示的な核酸結合性ドメインは、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００９３０２６号において列挙されている核酸結合性ドメインを含むがこれらに限定されない。
【０１９４】
多数のタンパク質形質導入ドメイン／ペプチドは、形質導入ドメインへと連結された異種分子（例えば、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤などのカーゴ分子）の取込みを容易としうる。このようなペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、マクロピノサイトーシスと称する過程を介する取込みを容易としうる。マクロピノサイトーシスとは、エンドサイトーシスの非選択的形態である。例示的なペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのホメオタンパク質である、アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．、３巻：１１２１〜３４頁、１９９１年；Ｊｏｌｉｏｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：１８６４〜８頁、１９９１年；Ｌｅ  Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：９１２０〜４頁、１９９３年）、単純ヘルペスウイルスの構造タンパク質であるＶＰ２２（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ、８８巻：２２３〜３３頁、１９９７年）、ＨＩＶ−１転写活性化因子のＴＡＴタンパク質（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ、５５巻：１１７９〜１１８８頁、１９８８年；ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ、５５巻：１１８９〜１１９３頁、１９８８年）、およびプリオンタンパク質のカチオン性Ｎ末端ドメインに由来しうる。他の例示的なペプチド形質導入ドメインについては、国際特許出願公開第ＷＯ０８／００８，４７６号において記載されている。ペプチド形質導入ドメインは、受容体非依存的な形で融合させた生体分子の取込みを増大させることが可能であり、広範にわたる細胞型に形質導入することが可能であり、最小限の毒性を提示するか、または毒性を呈示しないことが可能である（Ｎａｇａｈａｒａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、４巻：１４４９〜５２頁、１９９８年）。
【０１９５】
本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤は、送達ビヒクルとコンジュゲートさせることもでき、標的細胞または標的組織へと、他の形で送達することもできる。ある特定の実施形態では、本開示は、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤のコンジュゲートおよび／または複合体を提供する。このようなコンジュゲートおよび／または複合体は、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の、細胞など、生物学的系への送達を容易とするのに使用しうる、リガンドベースおよびポリマーベースの送達モダリティーを含む。本明細書で提供されるコンジュゲートおよび複合体は、細胞膜を越えて、治療化合物を移入させ、薬物動態を変更し、かつ／または本明細書で記載される核酸分子の局在化をモジュレートすることにより、治療活性を付与しうる。このようなコンジュゲートの非限定的な例については、米国公開第ＵＳ２００８／０１５２６６１Ａ１号および同第ＵＳ２００４／０１６２２６０Ａ１号（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−ＰＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）；ならびに米国特許出願第ＵＳ２００３−０１３０１８６号；ならびに米国特許第７，８３３，９９２号；同第６，５２８，６３１号；同第６，３３５，４３４号；同第６，２３５，８８６号；同第６，１５３，７３７号；同第５，２１４，１３６号；および同第５，１３８，０４５号において記載されている。
【０１９６】
多様な実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤へと、共有結合的に付着させることができる。付着させるＰＥＧは、任意の分子量、例えば、約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）でありうる。
【０１９７】
一部の実施形態では、送達法は、トランスポゾン（例えば、ＳＢＴＳ、ＰＢ、またはｐＴ２ベースのトランスポゾン）を活用する。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を、（例えば、ＣＮＳへと、例えば、腰椎穿刺を介して）１、２、３、４、５、または６カ月ごとに約１回投与する。
【０１９９】
投与量
核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の、実際の投与量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望の治療的応答を達成するのに有効な量の阻害剤を得るように変動させることができる。
【０２００】
選択される投与量レベルは、用いられる特定のＴＩＡ−１阻害剤の活性、投与経路、投与回数、用いられる特定のＴＩＡ−１阻害剤の排出速度、処置の持続期間、用いられる特定の化合物と組み合わせて使用される、他の薬物、化合物、ならびに／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態、および以前の病歴など、医療技術分野で周知の因子を含む様々な因子に依存するであろう。
【０２０１】
当技術分野で通常の技能を有する医師または獣医師は、要求される医薬組成物の有効量を、たやすく決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師であれば、医薬組成物中で用いられる、本発明の化合物の用量を、所望の治療的効果を達成するために要求されるレベルより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を徐々に増大させることができるであろう。
【０２０２】
単一の剤形を作製するのに、担体物質と組み合わせうる、ＴＩＡ−１阻害剤の量は一般に、治療効果をもたらす阻害剤の量であろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．１％〜９９％、例えば、約５％〜約７０％、例えば、１０％〜約３０％の阻害剤の範囲であろう。
【０２０３】
毒性および治療的効能は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物中または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を呈示する組成物が好ましい。
【０２０４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の策定において使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずにＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。
【０２０５】
治療有効用量はまず、細胞培養アッセイ、例えば、実施例１で記載する細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する治療薬の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで策定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニタリングすることができる。
【０２０６】
処置の持続期間および頻度に関しては、熟練した臨床医は、処置を施す場合の治療的利益を決定し、投与量を増大させるのか、減少させるのか、投与頻度を増大させるのか、減少させるのか、処置を中断するのか、処置を再開するのか、または処置レジメンに他の変更をもたらすのかを決定するために、被験体をモニタリングすることが典型的である。投与スケジュールは、薬物への被験体の感受性など、多数の臨床的因子に応じて、毎週１回〜毎日で変動させることができる。所望の用量は、１回で投与することもでき、部分用量、例えば、２〜４回の部分用量へと分け、ある期間にわたり、例えば、１日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することもできる。このような部分用量は、単位剤形として投与することができる。一部の実施形態では、投与は、長期で、例えば、数週間または数カ月間にわたり毎日の１回または複数回の用量で行う。投与スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、または６カ月間またはこれを超える期間にわたり、毎日１回、毎日２回、毎日３回、もしくは毎日４回、または毎日これを超える回数の投与である。一部の実施形態では、核酸ベースの阻害剤を、１２、１８、２４、３０、もしくは３６カ月またはそれより長い期間ごとに約１回投与する。
【０２０７】
本発明は、本明細書の医薬組成物および調製物のうちのいずれかによる、ＴＩＡ−１阻害剤の製剤を想定する。さらに、本開示は、本明細書の投与経路のうちのいずれかを介する投与も想定する。当業者は、処置される状態と、処置される患者の全般的な健康状態、年齢、およびサイズとに基づき、適切な製剤および投与経路を選択することができる。
【０２０８】
適応症および処置法
一部の実施形態では、患者は、神経変性疾患の危険性を増大させ、かつ／またはストレス顆粒の形成を促進するＴＩＡ−１変異を含む。変異は、例えば、Ｅ３８４Ｋでありうる。Ｈａｃｋｍａｎら、「Ｗｅｌａｎｄｅｒ  ｄｉｓｔａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＩＡ１」、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．、７３巻：５００〜５０９頁（２０１３年）を参照されたい。したがって、一部の実施形態では、ＴＩＡ−１核酸ベースの阻害剤は、Ｅ３８４Ｋ  ＴＩＡ−１変異体をコードする核酸とハイブリダイズする。一部の実施形態では、患者は、タウタンパク質機能の異常、例えば、微小管関連タンパク質であるタウの、樹状突起への誤った局在化を有する。
【０２０９】
一部の実施形態では、患者は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ／ＴＬＳ（ＦＵＳ）、アタキシン−２（ＡＴＸＮ２）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１／Ｂ２（ｈｎＲＮＰＡ１／Ｂ２）、オプチニューリン、マトリン−３、アンジオゲニン、および生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）において、１または複数の変異を有する。一部の実施形態では、患者（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、または脊髄小脳性運動失調を有する患者）は、ＴＡＦ１５内またはＥＷＳＲ１内に変異を有する。一部の実施形態では、患者（例えば、ミオパチーを有する患者）は、ＴＩＡ１内またはＶＣＰ内に変異を有する。複数の実施形態では、患者は、１Ｎ４Ｒタウ内に、Ｐ３０１Ｓ変異を有する。一部の実施形態では、患者（例えば、ＡＬＳまたはＦＴＤを有する患者）は、Ｃ９ｏｒｆ７２内の変異、例えば、ヘキサヌクレオチドリピートの拡大、例えば、ヘキサヌクレオチドの、約２０または３０を超えるリピートを有する。一部の実施形態では、患者は、ＲＢＰである、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１（ＦＭＲＰ）内に、トリヌクレオチドリピートの拡大を有する。
【０２１０】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ｔａｒ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ−１）、ＴＩＡ１細胞傷害性顆粒関連ＲＮＡ結合性タンパク質様１（ＴＩＡＲ、ＴＩＡＬ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質１（Ｇ３ＢＰ−１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質２（Ｇ３ＢＰ−２）、トリステトラプロリン（ＴＴＰ、ＺＦＰ３６）、ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）、または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ、ＦＭＲ１）を含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ｔａｒ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ−１）、ＴＩＡ１細胞傷害性顆粒関連ＲＮＡ結合性タンパク質様１（ＴＩＡＲ、ＴＩＡＬ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質１（Ｇ３ＢＰ−１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質２（Ｇ３ＢＰ−２）、ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）、または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ；ＦＭＲ１）を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ｔａｒ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ−１）、ＴＩＡ１細胞傷害性顆粒関連ＲＮＡ結合性タンパク質様１（ＴＩＡＲ、ＴＩＡＬ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質１（Ｇ３ＢＰ−１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質２（Ｇ３ＢＰ−２）、またはｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）を含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ｔａｒ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ−１）を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ＴＩＡ１細胞傷害性顆粒関連ＲＮＡ結合性タンパク質様１（ＴＩＡＲ、ＴＩＡＬ１）を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質１（Ｇ３ＢＰ−１）を含む。
【０２１７】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質結合タンパク質２（Ｇ３ＢＰ−２）を含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、トリステトラプロリン（ＴＴＰ、ＺＦＰ３６）を含む。
【０２１９】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）を含む。
【０２２０】
一部の実施形態では、ストレス顆粒は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ、ＦＭＲ１）を含む。
【０２２１】
神経変性疾患：理論により束縛されることを望まずに述べると、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を使用して、病態がストレス顆粒を組み込む神経変性疾病の進行を遅延させることができる。このような疾病は、ＡＬＳおよび前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む。この群はまた、アルツハイマー病、ＦＴＬＤ−Ｕ、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト−ヤコブ病、および多系統タンパク質症も含む。
【０２２２】
本明細書で使用される「神経変性疾患」という用語は、ニューロンの喪失または変性を特徴とする神経疾患を指す。「神経変性疾患」という用語は、遺伝因子、または異常なタンパク質の蓄積に帰せられるニューロンの細胞死（アポトーシス）などの関与により引き起こされる疾患を含む。加えて、神経変性疾患は、神経変性運動障害、ならびに記憶喪失および／または認知症と関連する神経変性状態も含む。神経変性疾患は、タウオパチーおよびα−シヌクレオパチーを含む。例示的な神経変性疾患は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＦＴＬＤ−Ｕ、プログラニュリンタンパク質内またはタウタンパク質内の変異により引き起こされるＦＴＤ、封入体ミオパチーを伴う前頭側頭型認知症（ＩＢＭＰＦＤ）、運動ニューロン疾患を伴う前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症を伴う筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病、ウシ海綿状脳症、クールー病、またはスクレピー）、レビー小体病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、ポリグルタミン（ポリＱ）リピート病、トリヌクレオチドリピート病、大脳変性疾患、初老期認知症、老年認知症、第１７染色体と関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽性球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、原発性側索硬化症、ピック病、原発性進行性失語症、皮質基底核認知症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ＨＩＶ関連認知症、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、ダウン症、多系統萎縮症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、例えば、Ｉ型ＳＭＡ（例えば、ウェルドニッヒ−ホフマン病）、ＩＩ型ＳＭＡ、ＩＩＩ型ＳＭＡ（例えば、クーゲルベルク−ヴェランダー病）、および関節拘縮を伴う先天性ＳＭＡ）、進行性球脊髄性筋萎縮症（例えば、ケネディー病）、ポストポリオ症候群（ＰＰＳ）、脊髄小脳性運動失調、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症（ＰＡＮＫ）、脊髄変性疾患／運動ニューロン変性疾患、上位運動ニューロン障害、下位運動ニューロン障害、加齢関連障害および認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ症候群、リティコ−ボディグ病（Ｌｙｔｉｇｏ−ｂｏｄｉｇ）（筋萎縮性側索硬化症−パーキンソニズム−認知症）、グァム型パーキンソニズム−認知症、海馬硬化症、大脳皮質基底核変性症、アレクサンダー病、アプラー病、クラッベ病、神経ボレリア症、神経梅毒、サンドホフ病、シルダー病、バッテン病、コケイン症候群、カーンズ−セイヤー症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、遺伝性痙性対麻痺、リー症候群、脱髄性疾患、てんかん、振戦、うつ病、躁病、不安および不安障害、睡眠障害（例えば、ナルコレプシー、致死性家族性不眠症）、急性脳傷害（例えば、脳卒中、頭部損傷）、および自閉症を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「α−シヌクレオパチー」という用語は、脳の神経細胞内の、α−シヌクレインの凝集またはα−シヌクレインの異常を伴う、神経変性障害または神経変性疾患を指す（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ，  Ｎ．ら（１９９９年）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻：５７８２〜５７９１頁；Ｒｉｄｅｏｕｔ，  Ｈ．Ｊ．ら（２００４年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９巻：４６９１５〜４６９２０頁）。α−シヌクレオパチーは、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、ピック病、ダウン症、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハラーフォルデン−シュパッツ症候群などを含むがこれらに限定されない。
【０２２３】
本明細書で使用される「タウオパチー」という用語は、脳内のタウタンパク質の病理学的凝集と関連する神経変性疾患を指す。タウオパチーは、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、またはピック複合を含む。
【０２２４】
筋骨格系疾患：本明細書で規定される筋骨格系疾患および筋骨格系障害とは、筋肉、靭帯、腱、および関節のほか、それらを支持する骨格構造に影響を及ぼす状態である。理論により束縛されることを望まずに述べると、ＤＵＸ４の全長アイソフォームなど、ある特定のタンパク質の発現の異常は、タンパク質の代謝回転を阻害し、細胞傷害性タンパク質の発現および凝集を増大させることが示されている（Ｈｏｍｍａ，  Ｓ．ら、Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｎｅｕｒｏｌ（２０１５年）、２巻：１５１〜１６６頁）。これに対し、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を使用して、筋骨格系疾患、例えば、筋細胞または運動ニューロンの、例えば、核内、細胞質内、または細胞体内の、ストレス顆粒タンパク質の蓄積を結果としてもたらす筋骨格系疾患を、防止または処置することができる。例示的な筋骨格系疾患は、筋ジストロフィー、顔面肩甲骨上腕型筋ジストロフィー（例えば、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２）、フリードリヒ運動失調、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、ミトコンドリア脳筋症（ＭＥＬＡＳ）、多発性硬化症、封入体ミオパチー、封入体筋炎（例えば、散発性封入体筋炎）、ポストポリオ筋萎縮症（ＰＰＭＡ）、運動ニューロン疾患、ミオトニー、筋強直性ジストロフィー、サルコペニア（ｓａｃｒｏｐｅｎｉａ）、痙縮、多巣性運動ニューロパチー、炎症性ミオパチー、麻痺、ならびにＴＩＡ−１またはタウの発現の異常、およびタンパク質恒常性の変更と関連する、他の疾患または障害を含む。加えて、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を使用して、前記筋骨格系疾患、例えば、後湾症、緊張低下症、下垂足、運動機能不全、筋力低下、筋萎縮症、ニューロン喪失、筋痙攣、歩行の変更または異常、ジストニア、星状細胞増加症（例えば、脊髄内の星状細胞増加症）、肝疾患、炎症、頭痛、疼痛（例えば、背部痛、頸部痛、脚部痛、炎症性疼痛）などにより引き起こされるか、またはこれらと関連する症状を防止または処置することができる。一部の実施形態では、筋骨格系疾患または筋骨格系疾患の症状は、神経変性疾患または神経変性疾患の症状と重複する場合がある。
【０２２５】
網膜疾患：本明細書で規定される網膜疾患および網膜障害は、網膜および眼の他の部分に影響を及ぼし、視力の減退および失明に寄与しうる。いくつかの網膜疾患は、網膜細胞内および近傍の組織内またはこれらの間の、タンパク質封入体およびストレス顆粒の蓄積を特徴とする。加えて、網膜疾患はまた、ＡＬＳおよびＦＴＤなど、神経変性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患の症状またはこれらの前駆症状でもありうる（Ｗａｒｄ，  Ｍ．Ｅ．ら（２０１４年）、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２１１巻（１０号）：１９３７頁）。したがって、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を含む、タンパク質封入体およびストレス顆粒の形成を阻害しうる化合物の使用は、網膜疾患の防止または処置において、重要な役割を果たしうる。
【０２２６】
例示的な網膜疾患は、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、糖尿病性網膜症、ヒストプラスマ症、黄斑円孔、黄斑パッカ、ビエッティ結晶状角膜網膜ジストロフィー、網膜剥離、網膜菲薄化、網膜芽細胞腫、若年性網膜症、アッシャー症候群、硝子体剥離、レフサム病、色素性網膜炎、オンコセルカ症、コロイデレミア、レーバー先天性黒内障、網膜分離症（例えば、若年性網膜分離症）、スターガルト病、眼筋麻痺（ｏｐｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ）などを含むがこれらに限定されない。
【０２２７】
ウイルス感染：ストレス顆粒は、ウイルス感染が、細胞複製機構の、ウイルスタンパク質の産生に向けた略取を伴うことが多いので、ウイルス疾病の間に形成されることが多い。この場合には、ストレス顆粒の阻害剤は、ウイルス機能への干渉に有用でありうる。他のウイルスは、ＳＧの形成を阻害して、細胞がストレス応答を動員することを防止すると考えられる。このような場合、ストレス顆粒の誘導因子は、ウイルス活性に干渉し、ウイルス感染に対抗しうる（例えば、サルブリナール、ＰＥＲＫ阻害剤、およびストレス顆粒誘導因子）。ＳＧ生物学が調べられている２つのウイルスは、西ナイルウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む（Ｅｍａｒａ，  Ｍ．Ｅ．およびＢｒｉｎｔｏｎ，  Ｍ．  Ａ．（２００７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０４巻（２１号）：９０４１〜９０４６頁）。したがって、本明細書で記載される核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤を含む、タンパク質封入体およびストレス顆粒の形成を阻害しうる化合物の使用は、ウイルス感染の防止および／または処置に有用でありうる。
【０２２８】
例示的なウイルスは、西ナイルウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、水疱、トリインフルエンザウイルス、天然痘、ポリオウイルス、ＨＩＶ、エボラウイルスなどを含むがこれらに限定されない。
【０２２９】
一部の実施形態では、処置法は、２つまたはこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える核酸ベースの阻害剤、例えば、核酸ベースのＴＩＡ−１阻害剤の投与を含む。ＴＩＡ−１阻害剤は、例えば、ＴＩＡ−１の異なる領域を指向する場合もあり、異なる化学修飾を含む場合もあり、異なるコンジュゲート部分を含む場合もある。
【実施例】
【０２３０】
（実施例１：微小管関連タンパク質であるタウは、ストレス顆粒生物学を調節する）
微小管関連タンパク質であるタウの樹状突起への誤った局在化は、タウオパチーの特徴であるが、樹状突起におけるタウの役割は、よく理解されてはいない。本実施例は、樹状突起ＲＮＡ顆粒の調節における、タウの新規の機能について報告する。タウは、ストレス顆粒（ＳＧ）の形成を加速化させ、ＲＮＡ結合性タンパク質であるＴＩＡ１の、ＲＮＡの代謝と関連するタンパク質との、正常な相互作用に要求される。タウの喪失は、ＴＩＡ１の、リボソームタンパク質およびＲＮＡ結合性タンパク質を含む、ＲＮＡ代謝タンパク質との相互作用をなくす。逆に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＩＡ１の低減が、タウタンパク質により引き起こされる病態および毒性を阻害するのに対し、ＴＩＡ１の過剰発現は、タウのミスフォールディングを誘導し、神経変性を刺激する。翻訳生物学におけるタウの役割は、新規の薬理学的介入を同定し、ＳＧの形成の薬理学的阻止またはＴＩＡ１のノックアウトを介する阻止は、タウ顆粒を低減し、タウ媒介性の神経変性を遮断する。逆に、ＳＧの形成の刺激は、タウ顆粒を増大させる。これらの結果は、タウについての新規の機能を提示し、タウオパチーの薬物療法のための新たな経路を指示する。
【０２３１】
序説
ＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）とは、スプライシング、ＲＮＡヘリカーゼ活性、ＲＮＡポリメラーゼの伸長および核からの移出を含む、ｍＲＮＡの成熟を調節するように、核内で機能する、約８００のタンパク質のクラスである（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＫｅｄｅｒｓｈａ、２００８年）。ＲＢＰはまた、細胞質中でも機能し、そこでは、ＲＮＡの翻訳、トラフィッキング、隔離、および分解を調節する。ＲＢＰの機能は、ＲＮＡの翻訳／タンパク質の合成と統合され、「翻訳シグナル伝達」と称する、複数のシグナル伝達カスケードにより強力に調節される。ＲＢＰの細胞質での作用は、細胞体とシナプスとの間の大きな距離が、ｍＲＮＡ転写物のトラフィッキングにおけるＲＢＰの比例的に大きな役割を要求するため、神経生物学において、重要な役割を果たす（Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１１年）。
【０２３２】
増大する証拠は、神経疾患過程を、ニューロンのＲＢＰの機能不全、ＲＮＡ顆粒、およびストレス顆粒（ＳＧ）と関連づける（Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１１年；Ｒａｍａｓｗａｍｉら；Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１３年；Ｗｏｌｏｚｉｎ、２０１２年）。ＲＢＰは、ＲＮＡ顆粒を構成する、最もよく特徴づけられたタンパク質成分である。ＳＧは、ストレスへの翻訳応答時に蓄積される、特定の種類のＲＮＡ顆粒である。「ＳＧ」という用語は、外因性ストレス因子（例えば、亜ヒ酸塩）の存在下で、または複数のＳＧ成分が示される実験において形成されるＲＮＡ顆粒について記載する場合に使用され、他の実験については、より一般的な「ＲＮＡ顆粒」という用語を使用して記載する。Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ１）などのＲＢＰは、それらの生理学的で可逆的な凝集を促進する、プリオン様の、ポリグリシンリッチドメインを含有する（ＢｕｃｈａｎおよびＰａｒｋｅｒ、２００９年；Ｇｉｌｋｓら、２００４年；Ｔｈｏｍａｓら、２０１１年）。ＴＩＡ１は、コア核形成ＳＧタンパク質である。核の形成に続き、二次的なＲＢＰが動員されて、成熟ＳＧが形成されるが、これは、ストレス誘導性の翻訳抑制の鍵となる構成要素である。ＳＧは、隔離されたｍＲＮＡを、再誘発、保存、または分解へと選別することにより、ｍＲＮＡトリアージにおいて動的役割を果たす。
【０２３３】
ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ／ＴＬＳ（ＦＵＳ）、アタキシン−２、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１／Ｂ２（ｈｎＲＮＰＡ１／Ｂ２）、オプチニューリン、マトリン−３、アンジオゲニン、および生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）における変異は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、運動ニューロン疾患を引き起こす（Ｌｉら、２０１３年）。別のＲＢＰである、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１（ＦＭＲＰ）におけるトリヌクレオチドリピートの拡大は、脆弱Ｘ症候群を引き起こす（Ｐｅｎａｇａｒｉｋａｎｏら、２００７年）。疾患と関連する、ＲＢＰ内の変異の多くは、これらのタンパク質が凝集する傾向を増大させると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９年；Ｋｉｍら、２０１３年；Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら、２００９年）。本発明者らおよび他の研究者のラボによる研究は、変異がまた、ＲＮＡ顆粒の形成も増大させることから、より大型でより豊富であるＳＧをもたらすほか、より大型でより緩徐な輸送顆粒であるＳＧももたらすことを示す（Ａｌａｍｉら、２０１４年；Ｃｏｌｏｍｂｒｉｔａら、２００９年；Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１０年ｂ；Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１４年）（Ｐａｔｅｌら、２０１５年）。近年になって、組換えＦＵＳおよび組換えｈｎＲＮＡＰＡ１を用いた研究により、疾患関連変異の有害作用が強調された。これらのタンパク質は、正常では、溶液相とゲル相との間を循環して、脂肪滴を形成する能力を呈示する。しかし、いずれかのタンパク質における変異は、相転移を損なうことから、安定的なアミロイド様原線維の形成をもたらす（Ｐａｔｅｌら、２０１５年）（Ｎｏｔｔら、２０１５年）（Ｍｏｌｌｉｅｘら、２０１５年）（Ｌｉｎら、２０１５年）。
【０２３４】
ＴＩＡ１を含むＳＧタンパク質は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉認知症（ＦＴＬＤ−ＴＤＰ）、ＡＬＳ、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、および脊髄性筋萎縮症を伴う被験体の脳組織のほか、これらの疾患の動物モデルにおいても、神経病態と共局在化する（Ｋｅｄｅｒｓｈａら；Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１０年ｂ；Ｔｈｏｍａｓら、２０１１年；Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１２年；Ｗｏｌｏｚｉｎ、２０１２年）。タウの生物学は、ＴＩＡ１と、密接に関連しており、これらのタンパク質は、ヒトタウオパチーを伴う被験体に由来する脳組織のほか、タウオパチーの動物モデルに由来する脳組織においても、疾患経過にわたり、互いと共時的に蓄積する（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１２年）。
【０２３５】
タウは、ＳＧの形成を促進し、主要なＳＧ成分である、ＴＩＡ１との、タンパク質相互作用のパターンをモジュレートする。タウと、ＴＩＡ１との相互作用は、タウのミスフォールディングと、ＳＧ部位におけるアセンブリーとを促進し、突起部の変性と、初代ニューロン内のアポトーシスマーカーの刺激とを結果としてもたらす。ＴＩＡ１の低減は、タウのミスフォールディングを阻害し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方におけるシナプスの喪失を低減する。これらの結果は、タウが、ニューロンのＲＢＰ生物学において重要な役割を果たすことを指し示すことから、タウのミスフォールディングについての新規の機構を示唆し、ＡＤなど、タウオパチーの病態生理が、ＲＢＰ生物学の機能不全と関連する可能性を提起する。
【０２３６】
結果：
タウは、ＴＩＡ１の細胞体樹状突起局在化を増大させる
ＷＴマウスおよびタウ−／−マウスに由来する海馬ニューロンの初代培養物中の、ＴＩＡ１の分布について検討して、タウが、ＴＩＡ１の分布を調節するのかどうかについて探索した（図１Ａ）。タウ−／−マウスに由来する初代海馬ニューロンに、ＴＩＡ１−ＧＦＰ±ＡＡＶ１  ＷＴタウ−Ｖ５またはＡＡＶ１  Ｐ３０１Ｌタウ−Ｖ５を形質導入した。ＴＩＡ１は、少数のＴＩＡ１顆粒により、タウ−／−マウスに由来するニューロン内の、強力な核への局在化を呈示した（図１Ａ）。タウを加えたＴＩＡ１の発現は、細胞体樹状突起におけるＴＩＡ１の量を劇的に増大させ、ＴＩＡ１は、強力な顆粒特徴を呈示する（図１Ａ）。定量化は、Ｐ３０１Ｌタウが、ＴＩＡ１  ＳＧのサイズを、ＷＴタウと比較して著明に増大させたが、ＷＴタウより少数のＳＧを産生したことを示す（図１Ａ〜１Ｃ）。これは、ＴＤＰ−４３などのＲＢＰ内の、疾患関連変異により、ニューロン内でもたらされる効果と顕著に類似する（Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１４年）。
【０２３７】
タウが、ＴＩＡ１  ＲＮＡ顆粒の形成を調節する能力は、ＲＮＡ顆粒のトラフィッキングにおけるタウの生物学的役割を示唆するが、これについて、生細胞イメージングを使用して探索した。タウ−／−ニューロン（ＤＩＶ３）に、ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰ（ＲＦＰの単量体形態）±ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入し、ＤＩＶ２１において、ニューロンをイメージングした。粒子の局在化を示す収集したトレースと、ＴＩＡ１顆粒のトラックとは、タウの発現に伴う、顆粒の移動の減少を示す（図１Ｄ〜１Ｇ）。タウは、ＴＩＡ１顆粒の正味の変位および速度を阻害したが、後退（−）移動を、前進（＋）移動より幾分大きく阻害した（図１Ｈ）。顆粒サイズは、顆粒の速度と逆相関し（図１Ｄ〜１Ｇ）、この傾向は、特に、Ｐ３０１Ｌタウに関して顕著であり、この場合、顆粒面積対速度グラフは、約１．２μｍ２において、明白な変曲点を示す（図１Ｇ）。ＳＧの形成と同様、この効果は、ＴＤＰ−４３顆粒の中での、サイズと、顆粒の移動との関係と顕著に類似する（Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１４年）（Ａｌａｍｉら、２０１４年）。
【０２３８】
タウは、ＳＧの数およびサイズを増大させる
次に、タウの、ＳＧの形成に対する影響について探索したが、ストレス条件下における研究を容易とするように、マウス海馬ニューロンに由来する、ＨＴ２２細胞を使用した。海馬ニューロンについての観察と同様に、ヒトタウ（４Ｒ０Ｎ  ＷＴおよび４Ｒ０Ｎ  Ｐ３０１Ｌ）の発現は、ＨＴ２２細胞内のＳＧの形成を増大させた（図１Ｉ）。ＨＴ２２細胞に、ヒトタウ（４Ｒ０Ｎ  ＷＴおよび４Ｒ０Ｎ  Ｐ３０１Ｌ）と、ＴＩＡ１とを形質導入し、次いで、ＳＧを誘導するように、±亜ヒ酸塩（０．５ｍＭ、３０分間）について検討し、細胞を、１分間ごとに、２０分間にわたりイメージングした。タウの過剰発現は、基底条件下およびストレス条件下におけるＲＮＡ顆粒の形成を、強力に増大させた（図１Ｉ、８Ａ、８Ｂ）。これらのＴＩＡ１顆粒の二重標識付けは、２つのＳＧマーカー：ＴＩＡ１およびＰＡＢＰについて陽性であるため、それらが真に、ＳＧであり、加えて、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドとの共処理が、タウ／ＳＧ複合体の形成を防止するのに対し、２５ｕＭのサルブリナールによる処理は、ＳＧレベルを増強することも裏付けた（図１Ｉ、８Ｃ〜８Ｆ）；サルブリナールとは、ＳＧの形成を増大させ、延ばすＧＡＤＤ３４阻害剤である（Ｂｏｙｃｅら、２００５年）。
【０２３９】
ＴＩＡ１とタウとの相互作用はまた、生化学的に明らかでもあった。免疫沈降（ＩＰ）を実施して、ＴＩＡ１が、タウと会合するのかどうかについて調べた。ＨＴ２２細胞に、ＷＴタウ（４Ｒ０Ｎ）と、ＴＩＡ１とをトランスフェクトし、ヒト特異的タウ１３抗体を使用して、複合体をＩＰするのに続き、ＴＩＡ１に対する免疫ブロット法を行い、抗ＴＩＡ１によるＩＰに続き、タウ１３による免疫ブロット法もまた実施したところ、頑健な会合を指し示す説得的な証拠がもたらされた（図１Ｊ）。
【０２４０】
ＳＧは、ストレス応答の重要な要素であり、図１Ａ〜１Ｊ内のデータは、タウが、ＳＧの形成を増強することを指し示すため、生細胞イメージング法を適用して、タウの、ストレス顆粒の動態に対する影響について検討した。タウを、ＴＩＡ１−ＲＦＰと共に発現させることは、ＳＧの形成速度を、強力に増大させた（図８Ｇ〜８Ｉ）。Ｐ３０１Ｌタウは、ＳＧの形成速度を、ＷＴタウより加速化させ、より大型のＳＧへの固定を増大させた（図８Ｇ〜８Ｊ）。こうして、タウは、ＳＧの形成を加速化させる。まとめると、これらの研究は、ＳＧを含むＲＮＡ顆粒のトラフィッキングおよびアセンブリーの調節における、タウの重要な役割を指示する。
【０２４１】
ＳＧは、タンパク質合成の、ストレスへの適合を反映すると考えられ、タンパク質合成の、ストレス誘導性変化は、タンパク質合成の全体的な低減と関連することが典型的である。タウ（４Ｎ０Ｒ、Ｐ３０１Ｌ）を過剰発現する細胞についての解析は、タウの過剰発現に応答した、総タンパク質合成の減少を示したが、これは、上記のデータと符合することから、タウが、ＳＧおよび翻訳によるストレス応答を促進することが示唆される（データは示さない）。
【０２４２】
タウは、ＴＩＡ１の、そのプロテオームとの相互作用を調節する
プロテオーム研究は、ＴＩＡ１と相互作用するタンパク質調節における、タウの、驚くべき新規の役割を明らかにした。タウが、ＴＩＡ１タンパク質による相互作用に対する制御を及ぼすのかどうかについて探索するため、ＴＩＡ１を、１０カ月齢のＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウス、タウ−／−マウス、およびＴＩＡ１−／−マウスの大脳皮質組織から免疫沈降させた。ＴＩＡ１免疫沈降の特異性は、抗ＴＩＡ１抗体を伴う免疫ブロット法により検証し（図２Ｃ）、結果として得られるＴＩＡ１プロテオームを、質量分析により検討した。ＷＴ脳またはタウ−／−脳からのＴＩＡ１免疫沈降物中には存在するが、ＴＩＡ１−／−脳からのＴＩＡ１免疫沈降物中には存在しない、１６３のタンパク質を同定した（表１）。プロテオミクスにより同定されたタンパク質の会合は、新鮮な試料に対する質量分析の反復のほか、タウと、質量分析により強力なシグナルをもたらした３つのタンパク質：ＲＰＬ７、ＥＷＳＲ１、ＤＤＸ５とについての免疫ブロットによっても検証した（図２Ｃ）。ＮＩＨを介して利用可能な、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）バイオインフォマティクスリソースを使用して、ＴＩＡ１に関連するプロテオームの、統計学的に有意な濃縮（偽発見率＜０．２）を示す、遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームおよび機能（ＫＥＹＷＯＲＤ）タームを、ＷＴ大脳皮質またはタウ−／−大脳皮質について決定した（図２Ａおよび９Ａ）（Ｈｕａｎｇ  ｄａら、２００９年）。各条件において、ＴＩＡ１結合性タンパク質が果たす、共通の機能的役割について理解するように、ネットワークを構築した。ネットワーク内では、タンパク質をつなぐ直線は、共通のアノテーションされた機能を指し示す（図２Ｂ）。ノードのサイズは、ＷＴ試料中の反復の程度に対応する（図２Ｂ）。予測される通り、ＷＴマウスの脳からＴＩＡ１を免疫沈降することは、ＲＮＡの代謝について濃縮されるタンパク質を同定し（図２Ａ）、ミトコンドリア機能および小胞／シナプス機能に関与するタンパク質もまた、有意な濃縮を呈示した（図２Ａ）。ＷＴマウス大脳皮質内の、ＴＩＡ１結合性タンパク質のネットワークは、リボソームタンパク質（例えば、ＲＢＬ６、ＲＢＬ７、ＲＢＬ１０Ａ、ＲＢＬ１３、およびＲＢＬ１３Ａ、ＭＲＰＬ４６、ＲＰＳ３、およびＲＰＳ４Ｘ）、翻訳調節タンパク質（ＥＩＦ４Ａ１、ＰＡＢＣ１およびＮＡＣＡ）、低分子核リボヌクレオタンパク質（ＳＮＲＮＰ７０およびＳＮＲＰＢ）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰＦ、ＨＮＲＮＰＲ、およびＨＮＲＮＰＵＬ２、ＥＷＳＲ１およびＳＹＮＣＲＩＰ）、およびヘリカーゼであるＤＤＸ５およびＤＤＸ１７など、ＲＮＡ代謝と関連する、複数のタンパク質を含む（図２Ｂ）。タウの欠失が、ＲＮＡ代謝と関連するタンパク質を含む、ネットワーク内の多くのタンパク質との、ＴＩＡ１の相互作用を低減したことは、重要なことである（図２Ａおよび２Ｂ）。ＷＴマウス脳およびタウ−／−マウス脳に由来する、ＴＩＡ１結合性プロテオームについての、このネットワーク解析は、タウの喪失が、ＥＷＳＲ１、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＭＲＰＬ４６、ＲＢＭ１７、およびＳＮＲＮＰ７０を含む複数のコアＴＩＡ１結合性タンパク質との相互作用をなくすことから、タウが、ＴＩＡ１と相互作用するタンパク質の調節において果たす重要な役割を強調する（図２Ｂ）。ＴＩＡ１の、ＳＩＲＴ２などのタンパク質との相互作用は、新規であり、脳に固有の調節的相互作用を指示しうるであろう。Ｕ１  ＳＮＲＮＰファミリーのメンバー（ＳＮＲＮＰ７０、ＳＮＲＰＢ、およびＲＢＭ１７）の、ＴＩＡ１ネットワークにおける卓越は目覚ましい（図２Ｂ）。先行研究は、ＡＤ脳内の、細胞質のＳＮＲＮＰ７０凝集物の高度な蓄積を同定した（Ｂａｉら、２０１３年）。ＴＩＡ１ネットワーク内にＳＮＲＮＰ７０を組み入れるためのタウの要件は、ＳＮＲＮＰ７０の機能における、タウの、推定される生物学的重要性を指示し、ＡＤ脳内のＳＮＲＰＮＰ７０の蓄積が、タウの病態生理を反映する可能性を提起する。より一般に、これらの結果は、タウタンパク質の存在が、ＴＩＡ１の、ＲＮＡ代謝機構との正常な関連に要求されることを示唆する。
【０２４３】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【０２４４】
ＴＩＡ１プロテオーム内のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタウ病態と共局在化する
ＴＩＡ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、タウ病態と共局在化する。ＴＩＡ１結合性プロテオームにおける、タウの強力な役割は、ＴＩＡ１に関連するＲＢＰが、ヒトタウオパチーおよびタウオパチーのマウスモデルにおけるタウ病態と共局在化しうる可能性を提起した。１１カ月齢のｒＴｇ４５１０マウスに由来する脳組織（前頭皮質）を、ＴＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ｈｎＲＮＰＤ、ＲＰＬ７、ＴＤＰ−４３、およびＦＵＳに対する抗体で標識し（図２Ｄおよび９Ｂ）、全ての試料を、ＰＨＦ１で共標識した。ＴＩＡ１ネットワーク内に存在するタンパク質（ＴＩＡ１、ＥＷＳＲ１、ｈｎＲＮＰＤ、およびＲＰＬ７）は全て、ＰＨＦ１陽性タウ病態と共に共局在化した。ＲＰＬ７の反応性は、タウ病態の外縁に局在化する傾向があるため、注目すべきであった（図２Ｄ）。ＴＩＡ１結合性ネットワークの一部ではない、ＴＤＰ−４３またはＦＵＳについては、ＰＨＦ−１陽性タウ病態との共局在化が観察されなかった（図２Ｄおよび９Ｂ）。
【０２４５】
ＴＩＡ１と、タウとは、生化学的に相互作用する
タウの、ＴＩＡ１との会合は、初代ニューロン培養物内でも明らかであった。タウ−／−マウスに由来する海馬ニューロンを、培養物中で増殖させ、ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウ±ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰ（またはｍＲＦＰ）を形質導入した（図３Ａ）。ＴＩＡ１によるＩＰは、全タウ（全タウを認識するヒト特異的抗体である、タウ１３）、ホスホタウ（Ｓ３９６／４０４においてリン酸化したタウを認識する抗体である、ＰＨＦ１）、およびミスフォールディングしたタウ（タウオパチーと関連する、ミスフォールディングしたタウエピトープを検出するモノクローナル抗体である、ＭＣ１）が、外因性ＴＩＡ１および内因性ＴＩＡ１に結合することを指し示した（図１０Ａ）。溶解物の、ＲＮアーゼによる前処理、または３つのＲＮＡ認識モチーフを欠くＴＩＡ１構築物の使用が、会合を消失させたことから、タウは、ＲＮＡ中間体を介して、ＴＩＡ１と会合することが指し示される（図３Ｂ；ＲＮアーゼＡによる処理についてのデータが示される）。ＲＮＡ中間体の役割は、タウが、ＲＮＡ顆粒の生物学に参与するという仮説を裏書きする。タウは、ＲＮＡと直接相互作用しうるが、先行研究により示唆される通り、配列非依存的な形であるか、またはＲＮＡ結合性タンパク質への結合を介して、配列依存的な形であろう（Ｋａｍｐｅｒｓら、１９９６年）（Ｗａｎｇら、２００６年）。
【０２４６】
ＴＩＡ１のタウとの会合の、ＲＮＡ中間体への依存性にも拘らず、イメージングは、２つのタンパク質の、互いとの近接した並置を示した。ナノメートルスケールでのイメージングを可能とする、超高解像度顕微鏡法は、神経突起内の、ＴＩＡ１と、タウとの、緊密な物理的近接性を明らかにした。ＤＩＶ２１の、マウス海馬タウ−／−ニューロンに、ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰおよびＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入し、固定し、ＭＣ１で標識した。結果は、ＴＩＡ１と、タウとの緊密な会合を示した（データは示さない）。タウの非存在下で、ＴＩＡ１は、固定の低減を呈示した（データは示さない）。これらのデータは、ＴＩＡ１が、初代ニューロン内の、ＭＣ１＋顆粒の数およびサイズを増大させることを指し示すことから、おそらく、ＴＩＡ１が、ＴＩＡ１＋ＳＧと共に生じることが公知である、タンパク質凝集の調節を促進する能力を反映する（Ｇｉｌｋｓら、２００４年）。この文脈では、タウおよびＴＩＡ１のいずれもが、プリオン様凝集を助長しうる低複雑性配列の、大きなストレッチを有することに注目すべきである。
【０２４７】
ＴＩＡ１は、タウレベルを調節する
ＴＩＡ−／−（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）に由来するＤＩＶ２１初代大脳皮質ニューロン内の内因性マウスタウレベルを、ＷＴ由来のものに対して比較すると、内因性ＴＩＡ１が、全タウタンパク質のレベルを調節することを裏付けた。免疫ブロットは、ＴＩＡ１−／−マウスにおける内因性ＴＩＡ１（ｅＴＩＡ１）の欠如と、対照系統と比較した、全タウレベルの対応する増大とを示した（図３Ｃ）。タウレベルの上昇にも拘らず、ＴＩＡ１の低減は、ＭＣ１レベルにより示される通り、タウのミスフォールディングを低下させた。ＴＩＡ１の、ｓｈＴＩＡ１によるノックダウンは、免疫ブロットにより裏付けられる通り、ＴＩＡ１レベルの強力な低減を誘発した（図３Ｄ）（形質導入効率が大きいために、ノックダウンは、ＨＴ２２細胞内で行ったことに注目されたい）。次に、初代海馬ニューロンに、ＷＴヒトタウを感染させ、ｓｈＴＩＡ１またはスクランブル（ｓｈＳｃｒ）をトランスフェクトして、ＴＩＡ１をノックダウンした。ＤＩＶ２１における、ＭＣ１反応性についての解析は、ＴＩＡ１のノックダウンが、ＭＣ１レベルの頑健な低下を誘発することを裏付けた（図３Ｅおよび３Ｆ）。ＴＩＡ１のノックダウンはまた、ＨＴ２２細胞内のＭＣ１タウ顆粒の形成も低減した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。ＭＧ１３２も、クロロキンも、ＨＴ２２細胞内の、ＴＩＡ１の過剰発現と関連する、タウの低下を防止しなかったため、ＴＩＡ１が、タウタンパク質のレベルを調節する機構は、プロテアソーム系またはオートファジー系に対する、限定的な依存性を有すると考えられる（図１０Ｇ）。
【０２４８】
ＴＩＡ１は、顆粒タウの、安定性および不溶性を増大させる
ＴＩＡ１の過剰発現は、頑健な相互応答を呈示し、ＭＣ１反応性のレベルを上昇させた。タウ−／−海馬ニューロンに、ＷＴタウＡＡＶ９またはＰ３０１ＬタウＡＡＶ９、およびＴＩＡ１−ＧＦＰレンチウイルスまたはＧＦＰレンチウイルスを形質導入し、ＭＣ１タウおよびＴＩＡ１について免疫標識した。イメージングは、タウと、ＴＩＡ１とを共発現するニューロンが、タウ単独を発現するニューロン内では明らかでない突起部において、豊富なＭＣ１＋顆粒を提示し、ＴＩＡ１の共発現が、顆粒のサイズを増大させることを裏付けた（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０２４９】
ＴＩＡ１がタウ顆粒を促進する能力は、ＴＩＡ１が、顆粒内のタウの安定性を増大させるという仮説をもたらした。この仮説について調べるため、シアンから、緑へと、安定的に転換する、光変換型タウ（ＰＣ−タウ；ＷＴ  ４Ｎ０Ｒ）構築物を作出し、大脳皮質ニューロン（ＤＩＶ５）に、ＰＣ−タウ±ＴＩＡ１をトランスフェクトし、ＤＩＶ２１において、光活性化を実施し、次いで、６時間にわたりイメージングした。ｍＣｈｅｒｒｙ対照に加えて、ＰＣ−タウをトランスフェクトされたニューロンは、散在して存在する緑色タウ蛍光、および顆粒内に存在する緑色タウ蛍光の両方を呈示した。タウ蛍光は、６時間にわたり、元の蛍光レベルの約４０％のレベルへと、安定的に低下した（図４Ｄおよび４Ｅ）。これに対し、ＰＣ−タウ＋ＴＩＡ１をトランスフェクトされた大脳皮質ニューロンは、減衰速度の大幅な低減を呈示し、ＰＣ−タウ蛍光は、６時間後においても、８０％超を維持した（図４Ｄおよび４Ｅ）。ＴＩＡ１とともにタウを発現させることがまた、高い割合のタウに、顆粒へと局在化させ、このことは、図４Ａ〜４Ｃとも符合した。これらのデータは、ＴＩＡ１が、顆粒内のタウを安定化させることを指し示す。
【０２５０】
ＳＧ内のミスフォールディングしたＭＣ１＋タウの存在と組み合わされた、顆粒内のタウの安定化は、ＴＩＡ１が、顆粒内の不溶性タウの形成を増大させる可能性を提起した。この仮説について調べるため、ＨＴ２２細胞に、ＷＴタウまたはＰ３０１Ｌタウ±ＴＩＡ１−ＲＦＰをトランスフェクトした（図１１Ａ）。ＴＩＡ１を免疫沈降させ、ＴＩＡ１結合画分およびＴＩＡ１非結合画分を、サルコシル可溶性画分およびサルコシル不溶性画分へと、生化学的に分画した。ＴＩＡ１の過剰発現は、ＴＩＡ１と会合する不溶性タウ（ＷＴおよびＰ３０１Ｌ）の量が増大した（図１１Ａおよび１１Ｂ）不溶性ＴＩＡ結合画分を除き、全ての画分中のタウのクリアランスを促進した（図１Ａ）。したがって、これらの知見は、ＴＩＡ１との会合が、神経原線維もつれの形成において鍵となるステップであると考えられる、不溶性タウの形成を促進することを示唆する。
【０２５１】
翻訳阻害剤およびキナーゼ阻害剤は、樹状突起内の、ＳＧおよびタウ顆粒をモジュレートする
タウと、ＴＩＡ１との相互作用は、ニューロン内のタウ顆粒の形成をモジュレートするための新規の手法を指示する。ＳＧは、翻訳の阻害により調節される。シクロヘキシミドは、伸長を防止し、リボソームをｍＲＮＡ上で停滞させ、ＳＧの形成を阻害するのに対し、ピューロマイシンは、６０Ｓのリボソームサブユニットを、ｍＲＮＡから放出させ、ＳＧの形成を促進する、早期の翻訳終結を引き起こす。ニューロン細胞系内のタウ顆粒についての解析は、シクロヘキシミドが、タウ顆粒の形成を防止する（図１Ａ、８Ａ、および８Ｂ）のに対し、ピューロマイシンは、タウ顆粒の形成を刺激することを裏付けた（データは示さない）。タウ顆粒は、ニューロンの樹状突起内でも、同様の形で調節されうることが仮定される。
【０２５２】
タウ−／−海馬ニューロンの初代培養物に、ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウ±ＡＡＶ１−ｍＲＦＰまたはＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰを形質導入した（図５Ａ〜５Ｇ）。ＷＴタウまたはＰ３０１ＬタウおよびｍＲＦＰ対照を発現するニューロンは、突起部に沿って比較的散在して広がるタウを呈示し、かすかな顆粒しか明らかにならなかった（図５Ａ）。しかし、ＷＴタウまたはＰ３０１Ｌタウの、ＴＩＡ１を伴う共形質導入は、タウおよびＴＩＡ１について陽性の、大型の顆粒を伴う突起部を結果としてもたらし、散在性のタウは、ほとんどから全くもたらさなかった（図５Ａ；矢印）。２つの異なる翻訳阻害剤である、ピューロマイシンおよびシクロヘキシミドの効果の比較は、翻訳シグナル伝達の役割を強調した。ニューロンを、ＤＩＶ２１で処理し、タウ１３およびＭＡＰ２について免疫標識し、イメージングした（図５Ｂおよび５Ｃ）。ピューロマイシンによる処理は、より大型で豊富なタウ顆粒をもたらしたが、これは、ＴＩＡ１／タウの過剰発現により、特に強調された（図５Ｂ）。逆に、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）による処理は、散在して広がる樹状突起のタウ（およびＴＩＡ１）をもたらし、小さく、明確ではない顆粒しか伴わなかった（図５Ｃ）。こうして、タウおよびＴＩＡ１の局在化および顆粒形成はいずれも、翻訳シグナル伝達によりモジュレートされる。
【０２５３】
ニューロン内のＳＧ生物学におけるタウの役割はまた、タウ動態を調節するキナーゼがまた、ニューロン内のタウ媒介性のＳＧの形成も調節しうることも示唆する。例えば、プロリン指向性キナーゼは、タウをリン酸化し、これにより、タウを、微小管から解離させ、タウが凝集する傾向を増大させることが公知である（Ｌｅｅら、２０１１年；ＭａｔｅｎｉａおよびＭａｎｄｅｌｋｏｗ、２００９年）。ＧＳＫ３β、ＣＤＫ５、ｐ３８、ＭＡＲＫ、およびＦｙｎの化学的阻害剤は全て、ＴＩＡ１およびホスホタウ（Ｐ−Ｓ３９６／４０４、ＰＨＦ１）に陽性である顆粒の形成を著明に阻害した（図５Ｄおよび５Ｅ）。最も強力なＳＧの阻害は、これらのキナーゼの各々の下流において作用することが公知である（ＲｏｕｘおよびＢｌｅｎｉｓ、２００４年）、ｐ３８阻害剤について観察された。
【０２５４】
ホスホ模倣タウ構築物の使用は、ＳＧの形成のモジュレートにおけるタウリン酸化の直接的な役割を裏付けた。ＡＤにおいてリン酸化の増大を呈示する１４の部位を、アスパラギン酸またはアラニンで置きかえた、ホスホ模倣（ＰＭＩＭ）タウ構築物またはホスホ−ヌル（ＰＮＵＬＬ）タウ構築物（Ｈｏｏｖｅｒら、２０１０年）を使用して、トランスフェクションを実施した。ＨＴ２２細胞に、Ｐ３０１Ｌタウ、Ｐ３０１Ｌ  ＰＭＩＭタウ、またはＰ３０１Ｌ  ＰＮＵＬＬタウ±ＴＩＡ１−ＲＦＰをトランスフェクトした。細胞を、±２５μＭのサルブリナールで処理し、ＳＧを、内因性ＴＩＡ１（図１２Ａおよび１２Ｃ）またはトランスフェクトされたＴＩＡ１−ＲＦＰ（図１２Ｂおよび１２Ｃ）についてイメージングした。イメージングは、ホスホ模倣タウの存在下で、多くのＳＧを示し、ホスホ−ヌルタウの存在下で、より少数のＳＧを示した（図１２Ａ〜１２Ｃ）。サルブリナールによる処理は、全ての条件下で、ＳＧの数を増大させた（サルブリナールは、ＰＰ２Ａアダプタータンパク質である、ＧＡＤＤ３４を阻害するが、これは、ｅＩＦ２αのリン酸化を増大させ、ｍＲＮＡの翻訳を低減する）（Ｂｏｙｃｅら、２００５年）。これらのデータは、ニューロン内のＳＧおよびタウ顆粒の形成のモジュレーターとしての、タウの直接的なリン酸化を指示する。
【０２５５】
真核生物における翻訳開始因子であるｅＩＦ２αは、リン酸化により調節される。本発明者らは、ｅＩＦ２αをリン酸化する２つのキナーゼである、ＰＫＲまたはＰＥＲＫの阻害もまた、タウ媒介性のＳＧの形成を阻害しうるのかどうかについて探索した。ＳＧは、ＴＩＡ１±ＷＴタウのトランスフェクションにより誘導した。２４時間後、細胞を、ＰＫＲの阻害剤（Ｃ１６；１μＭ；Ｓｉｇｍａ）またはＰＥＲＫの阻害剤（ＧＳＫ２６０６４１４；５０ｎＭ；ＥＭＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、次いで、２４時間後に、ＳＧ数を定量化した。ＰＫＲアンタゴニストまたはＰＥＲＫアンタゴニストは、タウ媒介性のＳＧの形成を強力に阻害した（図５Ｆおよび５Ｇ）。したがって、翻訳指向キナーゼの阻害もまた、タウ媒介性のＳＧの形成を低下させる。
【０２５６】
ＴＩＡ１は、タウを発現する初代海馬ニューロンの樹状突起の長さを短縮する
結果は、タウがＴＩＡ１＋ＳＧの形成を促進し、ＴＩＡがタウの異化およびタウの固定の両方を増強する、ＴＩＡ１とタウとの機能的な相互作用を示唆する。ＴＩＡ１とタウとの機能的な相互作用はまた、神経変性にも拡大されるが、この場合、これらの結果は、ＴＩＡ１のノックアウトが、タウ媒介性の変性を阻害するのに対し、ＴＩＡ１の過剰発現は、タウ媒介性の変性を増大させることを示す。変性に対する影響について探索した。タウ−／−マウスまたはＴＩＡ１−／−マウスに由来する海馬ニューロン（ＤＩＶ３）に、ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウ±ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはＡＡＶ１−ｍＲＦＰを形質導入し、ＤＩＶ２１において、ＭＡＰ２についてイメージングした（図６Ａおよび６Ｂ）。ＴＩＡ１とタウとの共発現は、樹状突起の長さを著明に短縮したが、タウまたはＴＩＡ１と独立した影響はなかった（図６Ａ〜６Ｃ）。Ｐ３０１Ｌタウはまた、それ自体でも、毒性を引き起こし、Ｐ３０１Ｌタウを形質導入されたニューロンは、ＷＴタウを形質導入されたニューロンと比較して、樹状突起の有意な短縮を呈示した。しかし、ＴＩＡ１のノックアウトは、この毒性を防止した。ＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入されたＴＩＡ１−／−マウスに由来する海馬ニューロン（ＤＩＶ３）は、ＡＡＶ９−ＷＴタウをトランスフェクトされたニューロンと同様の、神経突起の長さを呈示した（図６Ｃ）。これらのデータは、ＴＩＡ１の発現が、Ｐ３０１Ｌタウの発現と関連する、樹状突起の短縮に必要であることを指し示す（図６Ｃ）。
【０２５７】
さらなる研究は、ＴＩＡ１およびタウによる、樹状突起の長さのモジュレーションが、翻訳シグナル伝達に対して感受性であることを示唆する。タウ−／−初代海馬ニューロンおよびＴＩＡ１−／−初代海馬ニューロンに、ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウ±ＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰまたはＡＡＶ１−ｍＲＦＰを形質導入し、ＤＩＶ２１に、翻訳阻害剤である、ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）またはシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）で処理した。シクロヘキシミドによる翻訳阻害が、樹状突起の長さに影響を及ぼさなかったのに対し、ＳＧを誘導する、ピューロマイシンによる処理は、ＴＩＡ１／タウの過剰発現と関連する、樹状突起の長さの短縮を強化した（図６Ｄおよび６Ｅ）。
【０２５８】
生化学アッセイを使用したところ、毒性の誘導もまた明らかであった。シナプスマーカーおよびアポトーシスマーカーのレベルについて、ＡＡＶ１−ｍＲＦＰまたはＡＡＶ１−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰ±ＡＡＶ９−ＷＴタウまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウを形質導入された、ＷＴ初代大脳皮質ニューロンにおける免疫ブロットにより検討した。被験マーカーは、シナプトフィシン、ＰＳＤ−９５、カスパーゼ３、および切断型カスパーゼ３を含んだ。データは、タウおよびＴＩＡ１を共形質導入されたニューロン内の、シナプス前マーカーであるシナプトフィシンの明らかな喪失を指し示し、これは軸索末端の対応する喪失を指し示す（図６Ｆ）。ＴＩＡ１およびタウを共形質導入されたニューロンでは、切断型カスパーゼ３のレベルもまた上昇したことから、毒性の増強が指し示されるが（図６Ｆおよび６Ｈ）、これは、２５μＭのサルブリナールを伴う共時的な処理により強化された（図６Ｈ）。興味深いことに、シナプス後マーカーである、ＰＳＤ−９５のレベルの変化は、顕著ではなかった（図６Ｆ）。ＤＮＡの断片化についての解析はまた、ＴＩＡ１が、タウを発現するニューロン内のアポトーシスを増大させることも示した（図６Ｇ）。これらのデータは、ＳＧの形成が、ＴＩＡ１の過剰発現またはＳＧ誘導因子への曝露と共に生じるなど、増強される条件下では、ＴＩＡ１の、タウとの相互作用が、神経変性を促進しうることを示唆する。
【０２５９】
ＴＩＡ１のハプロ不全は、タウ媒介性の変性を低減する
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＴＩＡ１がまた、タウ媒介性の神経変性にも要求されることを裏付ける。Ｐ３０１Ｓタウマウスを、ＴＩＡ１ノックアウトマウスと交配することにより、タウ媒介性の神経変性におけるＴＩＡ１の役割について探索した。タウ病態および変性についてのマーカーを、２．５カ月で検討したところ、海馬内では、シナプスの喪失およびタウの高リン酸化がまず明らかであった。既に報告されている通り、２．５カ月齢のＰ３０１Ｓマウスの歯状回およびＣＡ１領域では、シナプスの喪失が明らかであった（図７Ａ）。ＰＨＦ１抗体により、タウの高リン酸化もまた明らかであり（図７Ｂ）、ＭＣ１抗体およびＣＰ１３抗体により、反応性のいくらかの増強もまた明らかであったが、より低度のものであった（データはこれから示す）。Ｐ３０１Ｓタウ／ＴＩＡ１＋／−マウスが、シナプスの喪失を示さず（図７Ａ；シナプトフィシンパネル）、抗タウ抗体であるＰＨＦ１、ＭＣ１、またはＣＰ１３に対する反応性を示さなかった（図７Ａ；およびデータは示さない）ことは、重要なことである。
【０２６０】
タウ病態の喪失はまた、生化学的分画によっても明らかであった。Ｐ３０１Ｓ交配体に由来する海馬試料および大脳皮質試料を、生化学的に分画し、次いで、免疫ブロットにかけた。予測される通り、Ｐ３０１Ｓタウマウスは、サルコシル不溶性画分中の全タウレベルおよびリン酸化タウレベルが豊富であった（図７Ｂ）。しかし、Ｐ３０１Ｓタウ／ＴＩＡ１＋／−マウスでは、全タウおよびリン酸化タウは、総溶解物画分中の全タウの変化が存在しないにも拘らず、明らかな低減を示した（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＴＩＡ１のハプロ不全が、タウオパチーの進行を阻害することを指し示すことから、疾患過程におけるＴＩＡ１の重要性を指し示す。
【０２６１】
考察
タウは古典的に、軸索トラフィッキングにおいて重要な役割を果たす、微小管結合性タンパク質として機能すると考えられているが、タウオパチーでは、タウは、細胞体樹状突起コンパートメント内に蓄積し、そこで、タンパク質凝集物を形成する。細胞体樹状突起における蓄積の背後にある細胞の論理については、よく理解されていない。これらの結果は、タウの局在化の、細胞体樹状突起コンパートメントへのシフトが、翻訳ストレス応答の一部である、ＲＮＡ／タンパク質複合体であるＳＧの形成を容易とするように生じることを示唆する。ＳＧは、通常、ストレスに応答して、小型の不溶性高分子複合体として、細胞体内および樹状突起内に蓄積する。神経変性疾患では、ＳＧは、極めて大型となり、タウ（ＡＤにおける）およびＴＤＰ−４３（筋萎縮性側索硬化症における）などの病理学的タンパク質と会合する（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１２年）（Ｌｉｕ−Ｙｅｓｕｃｅｖｉｔｚら、２０１０年ａ）。適度な場合、このストレス応答は、有益でありうるが、過活性のＳＧ応答は、タウの過剰発現およびＴＩＡ１を伴う共発現またはピューロマイシンによる処理により引き起こされる応答など、有害な変性応答を引き起こす。
【０２６２】
ＴＩＡ１は、核のスプライシングに関与するタンパク質であることが公知であるが、近年の研究はまた、ＴＩＡ１が、細胞質ＳＧの核を形成するコアタンパク質のうちの１つであることも示す（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＫｅｄｅｒｓｈａ、２００８年）。脳内でＴＩＡ１と会合するタンパク質のネットワークは、機能的な観点で、極めて強く関連する、１４のタンパク質を含む。このタンパク質の群は、スプライソソームと典型的に関連するＲＢＰ（ｓｎＲＮＰ７０、ＳＮＲＰＢ、ＤＤＸ５、およびＲＢＭ１７）、ｍＲＮＡ輸送と関連するＲＢＰ（ＨＮＲＮＰＲおよびＥＷＳＲ１）、および複数のリボソームタンパク質（例えば、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＳ３、ＲＰＳ４Ｘ）を含む。リボソームタンパク質の卓越は、このネットワーク内のＲＮＡ翻訳における重要な役割を強調する。タウの喪失は、このコアネットワーク内の１４のタンパク質中、５つのタンパク質である、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＥＷＳＲ１、ＳＮＲＮＰ７０、およびＲＢＭ１７に対する、ＴＩＡ１の結合をなくし、これは、この翻訳機構内および輸送機構内のタウの役割を指示する（図３Ｂ）。タウ−／−ニューロン内では、ＴＩＡ１は、樹状突起への局在化の低減を示し（図１Ａおよび１Ｂ）、これは、トラフィッキングタンパク質との相互作用の変更を示唆するが、この局在化の変更の機構は、いまだ決定されないままである。タウとＴＩＡ１との相互作用は、ＴＩＡ１が、チューブリンと相互作用して、酵母内の微小管を調節することを裏付ける、近年の研究と並行する（Ｌｉら、２０１４年）。ＳＩＲＴ２およびクラスリン（ＣＬＴＢ）など、その結合が、タウ依存的である。新規のＴＩＡ１結合性タンパク質の存在は、体細胞内より、ニューロン内またはグリア内でより顕著でありうる相互作用を指示する。
【０２６３】
ニューロンは、樹状突起内およびシナプス内のＲＮＡ生物学を管理しなければならないため、ニューロンと、大半の末梢細胞とでは、ＴＩＡ１結合性プロテオームが異なりうるであろう。ＲＮＡは、シナプスへと輸送されなければならず、そこで、ＲＮＡの翻訳は、活性依存的な翻訳を介して、シナプス活性と緊密に関連する。これは、ＲＢＰが、ニューロン内（および、おそらくは、グリア内）の核外で、細胞活性に対して、体細胞内よりはるかに大きなフットプリントを発揮することを意味する。脳ＴＩＡ１ネットワークにおける、ＨＮＲＮＰＲ、ＳＹＮＣＲＩＰ、およびＥＷＳＲ１など、ＲＮＡ輸送に重要なＲＢＰの存在と組み合わされた、リボソームタンパク質の卓越は、ストレス時のＲＮＡ輸送および翻訳の調節における、タウの、重要な、新規の役割を強調する。基底条件下では、タウは、樹状突起内に、ごく低レベルで存在する（Ｆｒａｎｄｅｍｉｃｈｅら、２０１４年）。しかし、近年の研究は、ストレスが、タウに、細胞体樹状突起コンパートメントへと局在化させることを裏付ける（Ｈｏｏｖｅｒら、２０１０年；Ｓｔａｍｅｒら、２００２年；Ｚｅｍｐｅｌら、２０１３年）；（ＺｅｍｐｅｌおよびＭａｎｄｅｌｋｏｗ、２０１４年）。タウは、この文脈では、ＲＮＡ顆粒の輸送を緩徐化し、他のＳＧタンパク質とＴＩＡ１の相互作用を調節するように機能することができ、このことがＳＧの形成および翻訳ストレス応答を促進するであろう。
【０２６４】
ＴＩＡ１プロテオーム成分についての免疫組織化学研究は、ＡＤおよび他のタウオパチーの病態生理における、ＴＩＡ１プロテオームネットワークの重要な役割を強調する既存の研究を補完する。検討された５つのＲＢＰの各々が、タウ病態と共に共局在化した。ＳＮＲＮＰ７０もまた、凝集する強力な傾向を呈示し、近年、ＡＤにおいて、細胞質内の不溶性凝集物として蓄積することが示されている（Ｂａｉら、２０１３年；Ｄｉｎｅｒら、２０１４年）。ＳＮＲＮＰ７０の凝集は、他のＲＮＡ結合性タンパク質と共有される、低複雑性のプリオン様ドメインにより媒介され（Ｄｉｎｅｒら、２０１４年）、ＳＮＲＮＰ７０はまた、他のＲＢＰと同様に、ＲＮＡ顆粒の成分でもある（Ｂｅａｕｄｏｉｎら、２００９年；ＢｕｃｋｉｎｇｈａｍおよびＬｉｕ、２０１１年）。これらの結果は、タウの喪失が、ＴＩＡ１ネットワークからの、ＳＮＲＮＰ７０の喪失を引き起こすため、ＳＮＲＮＰ７０が、タウ媒介性の複合体を介して、ＴＩＡ１と相互作用することを示唆する。ネットワークはまた、ＲＰＬ７を、その結合もまた、タウの存在に依存し、タウ病態と関連することもまた観察されている、別のＴＩＡ１相互作用性タンパク質としても同定する（Ｍｉｎｊａｒｅｚら、２０１３年）。これらの交差し合う証拠の断片は、タウオパチーにおいて凝集したＳＮＲＮＰ７０およびＲＰＬ７の蓄積が、共通の高活性ＳＧ経路から生じ、これがまた、凝集したタウの蓄積ももたらすモデルを示唆する。
【０２６５】
ＴＩＡ１は、ＳＧのコア核形成成分である。ＴＩＡ１の欠失またはノックダウンは、ＳＧを形成する細胞の能力を低減する。ＴＩＡ１の低減は、タウのミスフォールディングおよび毒性を低減させるため、本発明者らのデータは、タウおよびＴＩＡ１の、双方向的な調節を指し示す。ＴＩＡ１を欠く培養ニューロン内では、Ｐ３０１Ｌタウは、毒性を呈示しない。この観察はまた、ハプロ不全が、リン酸化タウの蓄積を低減し、シナプスの喪失を防止する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても顕著に明らかであった。タウ病態の、ＴＩＡ１レベルに対する感受性は、薬物療法への新規の手法を示唆するため、特に、重要である。ホモ接合性のＴＩＡ１の欠失は、関節炎および免疫機能不全を引き起こすが、ＴＩＡ１についてヘテロ接合性のマウスは、神経変性の低減を示すにも拘らず、強力な免疫学的表現型を呈示しない（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００４年）。これらの結果は、ＲＢＰが、タウ病態および変性と関連する生物学的過程の重要な要素であることを示唆する。
【０２６６】
神経変性疾患におけるタンパク質の凝集は、古典的に、機能不全性のタンパク質のミスフォールディングによるものと考えられてきた。シャペロンが、ミスフォールディングを防止するが、タンパク質がミスフォールディングする場合、細胞は、病理学的分子種を消失させるか、または損傷を受けるはずである（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ、２０１１年）。しかし、ＳＧおよび他のＲＮＡ顆粒は、可逆的なタンパク質の凝集を、重要な生理学的機能を有する経路の一部として呈示する（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１２年）（Ｐａｔｅｌら、２０１５年）（Ｎｏｔｔら、２０１５年）（Ｍｏｌｌｉｅｘら、２０１５年）（Ｌｉｎら、２０１５年）。ＲＢＰは、液体状態と固体状態とを循環する、固有の能力を呈示する。細胞内では、ＲＢＰは、ＳＧを形成するように凝集するが、これは、状態遷移であり、ストレスが消失すれば、消散する。単離ＲＢＰは、状態間を循環しうるが、過程は、より高度に調節される可能性がはるかに高く、細胞は、これらの顆粒を誘導する場合もあり、消散させる場合もある、多数の生化学経路を含有し、これらの経路の各々は、薬物発見の潜在的な標的となる。本発明者らは、タウの、微小管との会合を調節することが公知である、プロリン指向性キナーゼがまた、タウ媒介性のＳＧ経路も調節することを示す。ＳＧ経路への注目は、調節への新規の手法を強調する。例えば、ＳＧの形成の阻害をめぐって積み重ねられた薬物発見の試みは、ＡＬＳの療法に有用でありうる、ＴＤＰ−４３の凝集を防止する、新規の薬剤を同定するのに成功裏に使用されている（Ｂｏｙｄら、２０１４年）（Ｋｉｍら、２０１４年）。翻訳阻害剤は、調節のための、別の新規の機構を提供する。翻訳阻害剤である、ピューロマイシンまたはシクロヘキシミドは、タウ媒介性のＳＧの形成を、相互的に誘導または防止し、また、ＴＩＡ１の、タウとの過剰発現と関連する変性もモジュレートする。ピューロマイシンおよびシクロヘキシミドが毒性であることは認めざるを得ないが、本発明者らは、ＰＫＲおよびＰＥＲＫを含む、ｅＩＦ２αのリン酸化を調節するキナーゼが、タウ媒介性のＳＧの形成を調節することを示す。これらのキナーゼは特に、疾患過程を、β−アミロイドと関連する毒性の阻止を含む、複数のレベルで阻害すると考えられるため、ＡＤなどのタウオパチーに有効でありうるであろう（Ｏｈｎｏ、２０１４年）。したがって、ＲＮＡ顆粒生物学におけるタウの役割は、タウオパチーの病態生理における、可逆的なタンパク質の凝集の潜在的な役割を浮き彫りにし、ＡＤおよび他のタウオパチーに対する薬物療法のための、対応する、広範にわたる、新たな道筋を提示する。
【０２６７】
材料および方法
マウス：タウ−／−マウスは、Ｄａｗｓｏｎおよび共同研究者により記載されている（Ｄａｗｓｏｎら、２００１年）通りに作出した。ＴＩＡ１−／−マウスは、Ｐｉｅｃｙｋらにより記載されている（Ｐｉｅｃｙｋら、２０００年）通りに作出した。
【０２６８】
細胞培養物：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＴ２２細胞にトランスフェクトし、２４時間にわたりインキュベートし、２４時間後に処理した（２５ｕＭのサルブリナール、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド）。４８時間後、細胞を、４％のＰＦＡ中で固定した。
【０２６９】
初代マウスＰ０海馬培養物を、Ｂ−２７を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、２１日間にわたり増殖させた。
【０２７０】
ＡＡＶ形質導入：ＤＩＶ２で、ニューロンに、ＡＡＶ９ベクター（ｍＲＦＰ、ＴＩＡ１  ｓｈＴＩＡ１−ＧＦＰ、またはｓｈＣｏｎｔｒｏｌ−ＧＦＰ）を、ＭＯＩ  ２０で形質導入した。ＤＩＶ７で、ニューロンに、ＡＡＶ９−ＷＴタウウイルスまたはＡＡＶ９−Ｐ３０１Ｌタウウイルス（ＭＯＩ  ２０）を形質導入した。
【０２７１】
免疫細胞化学を、既に記載されている（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅら、２０１２年）通りに実施した。使用される一次抗体は、タウ：ＣＰ−１３、ＰＨＦ−１、ＭＣ１（各々、１：１５０）、およびタウ１３（１：５，０００）；ＳＧ：ＴＩＡ１（１：４００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ニューロンマーカー：ＭＡＰ２（１：１０００；Ａｖｅｓ）であった。
【０２７２】
イメージング：Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０を使用して、共焦点顕微鏡法を実施した。
【０２７３】
画像解析：ＳＧ密度および樹状突起の突起部は、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して（ＩｍａｇｅＪのプラグインである、ＮｅｕｒｏｎＪを使用して、樹状突起の測定のために、ＭＡＰ２陽性突起部をトレースして）定量化した。顆粒の移動および形成は、Ｂｉｔｐｌａｎｅ  Ｉｍａｒｉｓ  Ｔｒａｃｋソフトウェア（Ｉｍａｒｉｓ）を使用して定量化した。
【０２７４】
光変換：光変換型ＷＴヒトタウ（ＰＣ−タウ）は、ヒト４Ｎ０Ｒタウを、ｐＰＳ−ＣＦＰ２−Ｃ哺乳動物発現ベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ；型番ＦＰ８０１）へとサブクローニングすることにより作出した。ＤＩＶ５において、初代大脳皮質培養物（Ｅ１６）に、トランスフェクトし、ＤＩＶ１８〜２３まで経過させてから、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０  Ｄｕｏ  Ｓｃａｎ顕微鏡上の、４０５ｎｍダイオードレーザーを使用して、光変換にかけた。
【０２７５】
生化学分画：ＨＴ２２細胞を、１倍濃度のＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１倍濃度のホスファターゼ阻害剤カクテル（ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ）、および１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を伴うＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、超音波処理し、スピンダウンして、上清を回収した。溶解物をまず、４℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離し、上清を、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝液可溶性タンパク質として回収し、ペレットを再度超音波処理し、尿素緩衝液中に再懸濁させた。
【０２７６】
サルコシル不溶性タウ画分およびサルコシル可溶性タウ画分：１％のサルコシル洗浄剤を加えた、ＲＩＰＡ緩衝液中の上清（１００μｇのタンパク質を伴う１００μｌ）を、室温で１時間にわたり回転混合（ｒｏｔａｔｅ）し、次いで、１００，０００×ｇのスピンで、１時間にわたり遠心分離した（室温）。上清を回収し、サルコシルペレットを、１００ｍＭのＤＴＴを含有する試料緩衝液中に再懸濁させた。
【０２７７】
免疫ブロット法は、１５ウェル、４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％のミルク中で１時間にわたりブロッキング、ＰＢＳ中、４℃で一晩にわたる抗体インキュベーション（１：７，５００のタウ１３、１：５００のＰＨＦ１、１：５００のＴＩＡ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：５００、シナプトフィシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：１，０００のＰＳＤ−９５（ＮｅｕｒｏＭａｂ）、１：１，０００のカスパーゼ３または切断型カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、または１：１０，０００のアクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により行った。二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）は、５％のミルク中、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。現像は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して行った。
【０２７８】
免疫沈降：溶解物（１００〜３００μｇ）を、ｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、あらかじめ清明化させ、次いで、４℃で一晩にわたり、０．５μｌのＰＨＦ−１抗体、１μｌのタウ−５抗体（Ａｂｃａｍ）、１μＬのＭＣ１抗体、または０．５μＬのＴＩＡ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、または１：２００のＨＡ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を使用して、ＩＰを行うのに続き、５０μｌの、プロテインＧによる、ｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズを添加し、４℃で１時間にわたるインキュベーションにかけた。ビーズをスピンダウンし、洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸し、ブロットした。プロテオーム研究のために使用されるＩＰ法の詳細については、補足の方法を参照されたい。
【０２７９】
タンパク質合成の測定：手順は、各群の細胞を、ピューロマイシンで、３０分間にわたり処理し、１２Ｄ１０抗体で免疫ブロットを行う、ＳＵｎＳＥＴプロトコール（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００９年）に従った。
【０２８０】
プロテオミクス：定量的プロテオーム解析は、各試料中で検出される、ＴＩＡ１のＴＩＣレベルに対して正規化されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定される、タンパク質についての全イオン電流（ＴＩＣ）を使用して実施した。ＷＴ条件およびタウＫＯ条件に固有のものとして同定された、１６３のタンパク質を、ＤＡＶＩＤ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇツール（Ｈｕａｎｇら、２００８年；Ｈｕａｎｇら、２００９年）にかけた。濃縮のＦＤＲ＜０．０５とする、結果として得られる１２のクラスターを同定し、１６３のタンパク質の各々を、クラスタリングされた遺伝子セット内の、そのメンバーとしての位置に基づき、クラスターと関連させた。タンパク質の対の間で共有されるクラスターの数をカウントすることにより、タンパク質の間でネットワークを誘導し、プログラムであるＧｅｐｈｉ  ０．８．２により視覚化した。
【０２８１】
細胞死研究：カスパーゼ３／７による切断は、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量化した。アポトーシスは、ＤＮＡの断片化を定量化すること（ＴｉｔｅｒＴＡＣＳ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット；Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）により検出した。
【０２８２】
補足の材料および方法
タウ−／−マウス：これらのタウノックアウトマウスは、元来、Ｄａｗｓｏｎおよび共同研究者（Ｄａｗｓｏｎら、２００１年）により記載されている通りに作出された。略述すると、Ｄａｗｓｏｎおよび共同研究者は、ＭＡＰＴ遺伝子を破壊することにより、タウ欠損マウスを創出した。操作されたマウスは、タウタンパク質を発現せず、身体的に正常に見え、生殖可能である。タウ欠損マウスに由来する胚性海馬培養物は、軸索および神経突起の伸長部により測定される成熟の有意な遅延を示す（Ｄａｗｓｏｎら、２００１年）。タウ−／−マウスおよび対照系統（Ｂ５７Ｂｌ／６）のいずれの飼育動物も、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入され、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて飼育された。
【０２８３】
ＴＩＡ１−／−マウス：これらのＴＩＡ１ノックアウトマウスは、元来、Ｐｉｅｃｙｋら（Ｐｉｅｃｙｋら、２０００年）により記載されている通りに作出した。これらのマウスは、生存可能であるが、軽微な関節炎を発症し、内毒素ショックにより感受性である。これらのマウスはまた、ポリソーム分解の変更も呈示する。これらのマウスに由来する初代ニューロンは、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡにおける、Ｐａｕｌ  Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室から得た。
【０２８４】
ＨＴ２２の培養およびトランスフェクション：ＨＴ２２細胞は、１０％のウシ胎仔血清、１倍濃度のＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１倍濃度のＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１倍濃度の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（１Ｌ当たり４．５ｇのグルコース）培地中で維持した。細胞は、毎週２回、１：５で継代した。細胞は、無血清培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ）中のトランスフェクションの１日前において、１２ウェルプレート内の、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングされた、１８ｍｍのカバースリップ上に播種した（カバースリップ１枚当たり７５，０００個）。ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の比を１：２として、細胞にトランスフェクトし、ウェル１つ当たり２μｇの全ＤＮＡを送達した。ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを、５分間にわたりインキュベートしてから、ＤＮＡ／ＯｐｔｉＭＥＭを添加した。次いで、トランスフェクション混合物を、室温で、２０分間にわたりインキュベートしてから、細胞へと添加した。５００μＬの培地を除去し、５００μＬのトランスフェクション混合物を、滴下により、各ウェルへと添加した。細胞を、２４時間にわたりインキュベートし、この後で、２５μＭのサルブリナールを、半数のプレートへと添加し、２４時間にわたりインキュベートすることができる。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、４％のＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ中で保存した。
【０２８５】
ｓｈＲＮＡのトランスフェクション：トランスフェクションは、ＴＩＡ１  ３’−ＵＴＲ  Ｃｌｏｎｅ  ３０１３０２（Ｓｉｇｍａ）またはスクランブルｓｈＲＮＡ対照±ＥＧＦＰ、ＷＴタウ−ＥＧＦＰ、またはＰ３０１Ｌタウ−ＥＧＦＰに対してＭｉｓｓｉｏｎ  ｓｈＲＮＡを使用して、上記で言明した通りに行った。細胞は、４％のＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ中で保存するか、または免疫ブロット法のために、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。
【０２８６】
初代ニューロン培養物：初代海馬培養物は、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＷＴマウス、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＴＩＡ１−／−マウス、またはＣ５７Ｂｌ／６タウ−／−マウスに由来するＰ０仔から作出した。海馬は、ＨＥＰＥＳおよびＰｅｎＳｔｒｅｐで緩衝処理された、ハンクス緩衝塩溶液中で切除し、０．１２５％のトリプシンにより、３７℃で１５分間にわたり解離するのに続き、すりつぶした。解離された細胞を、ポリ−Ｄリシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）であらかじめコーティングされたカバースリップのプレート上に播種した。ニューロンを、Ｂ−２７を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、２１日間にわたり増殖させた。
【０２８７】
過剰発現の形質導入：ＤＩＶ３で、ニューロンに、ＡＡＶ９−ＴＩＡ１−ｍＲＦＰウイルスまたはＡＡＶ９−ｍＲＦＰウイルス（ＭＯＩ  ２０）を形質導入した。ＤＩＶ７で、ニューロンに、ＡＡＶ１−ＷＴタウ−Ｖ５ウイルスまたはＡＡＶ１−Ｐ３０１Ｌタウ−Ｖ５ウイルス（ＭＯＩ  ２０）を形質導入した。ニューロンを、免疫標識および共焦点顕微鏡法のために、４％のＰＦＡ中で固定するか、またはＰＢＳ中で、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤と共に、超音波処理を介して溶解させた。
【０２８８】
ノックダウンの形質導入：ＤＩＶ３で、ニューロンに、ＡＡＶ９−ｓｈＴＩＡ１−ＧＦＰウイルスまたはＡＡＶ９−ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ−ＧＦＰウイルス（ＭＯＩ  ２０）を形質導入した。ＤＩＶ７で、ニューロンに、ＡＡＶ１−ＷＴタウ−Ｖ５ウイルスまたはＡＡＶ１−Ｐ３０１Ｌタウ−Ｖ５ウイルス（ＭＯＩ  ２０）を形質導入した。ニューロンを、免疫標識および共焦点顕微鏡法のために、４％のＰＦＡ中で固定するか、またはＰＢＳ中で、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤と共に、超音波処理を介して溶解させた。
【０２８９】
タウキナーゼ阻害剤研究：ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を、１０％のＦＢＳと、１％の各非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンとを補充した、５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で維持した。細胞を、ポリ−Ｄリシンであらかじめコーティングされた１８ｍｍのガラスカバースリップ上に播種し、２４時間後に、製造元の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０μＭのサルブリナール（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；型番２０２３３２）、または以下の小分子タウキナーゼ阻害剤：５μＭのＧＳＫ３β阻害剤であるＸＸＶＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；型番３６１５６９）、５μＭのＣｄｋ  ２／５（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；型番２１９４４８）、２５０ｎＭのｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＳＢ２０３５８０）、２０μＭのＭＡＲＫ／Ｐａｒ−１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；３９６２１）、または２０ｎＭのＦｙｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＰＰ２；型番ＰＨＺ１２２３）のうちの１つを加えたＤＭＳＯで、２４時間にわたり処理した。細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で、１２分間にわたり固定し、ＰＢＳ中、４℃で保存した。ＴＩＡ１封入体およびリン酸化タウ封入体に標識し、免疫細胞化学についての方法の節（下記を参照されたい）で記載される通りに解析した。
【０２９０】
細胞死研究：カスパーゼ３／７による切断は、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量化した。アポトーシスは、ＤＮＡの断片化を定量化すること（ＴｉｔｅｒＴＡＣＳ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット；Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）により解析した。
【０２９１】
免疫細胞化学：カバースリップを、ＰＢＳ中で、５分間ずつ３回にわたり洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で、１５分間にわたり洗浄した。カバースリップを、ＰＢＳ中で、３分間ずつ３回にわたり洗浄し、ＰＢＳ中に１０％のロバ血清で、１時間にわたりブロッキングした。インキュベーションは、５％のロバ血清／ＰＢＳ中で、タウおよびＴＩＡ１に対する一次抗体により、一晩にわたり実施した。使用される一次抗体は、以下：タウについては：ＣＰ−１３、ＰＨＦ−１、ＭＣ１（１：１５０；Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＰｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓにより恵与された）、およびタウ１３（１：５，０００；Ｓｋｉｐ  Ｂｉｎｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎにより恵与された）の通りに使用した。ストレス顆粒については：ＴＩＡ１（１：４００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。ニューロンマーカーについては：ＭＡＰ２（１：１０００、Ａｖｉｓ）。
【０２９２】
免疫組織化学：
顕微鏡法
共焦点顕微鏡法：顕微鏡法は、４０５、４８８、５４３、および６３３ｎｍのレーザーを保有する、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して実施した。画像は、６３倍の油浸対物レンズを使用して捕捉した。ＬＳＭ製の、特許権のあるソフトウェアを、デジタル画像解析のために使用した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して、画像を、図面へと組み合わせた。
【０２９３】
基礎顕微鏡法：定量解析および領域解析は、ＬＥＤ蛍光照明、デジタルカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍ；Ｚｅｉｓｓ）を装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１を使用して行い、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアにより解析した。
【０２９４】
生細胞顕微鏡法：４０５、４８８、５４３、および６３３ｎｍのレーザーを保有することが可能な、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＳＵ  ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｄｉｓｋ共焦点顕微鏡、またはＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１を使用して、生細胞イメージングを実施した。経時画像は、６３倍の油浸対物レンズを使用して、３０秒間隔で、最大６時間にわたり捕捉した。解析は、Ｉｍａｒｉｓ／Ｂｉｔｐｌａｎｅソフトウェアを使用して行った。
【０２９５】
光変換：光変換型ＷＴヒトタウ（ＰＡ−タウ）は、ヒト０Ｎ４Ｒタウを、ｐＰＳ−ＣＦＰ２−Ｃ哺乳動物発現ベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ；型番ＦＰ８０１）へとサブクローニングすることにより作出した。この発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、シアンから緑色の蛍光タンパク質をコードし、哺乳動物細胞内の高発現のために最適化されている。初代大脳皮質培養物は、Ｃ５７Ｂｌ／６ＷＴマウスに由来する、Ｅ１６の胚から作出し、生細胞イメージングに適する、ＭａｔＴｅｋガラス底ディッシュ上で培養した。ＤＩＶ５において、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；製造元の指示に従う）を使用して、ニューロンに、ＰＡ−ＷＴ±ＲＦＰ−ＴＩＡ１またはｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトし、ＤＩＶ１８〜２３まで経過させてから、光変換にかけた。光退色を最小限とする、タウの効率的な光変換のために、倍率を６３倍とする、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０  Ｄｕｏ  Ｓｃａｎ上で、４０５ｎｍダイオードレーザーを使用して、活性化を最適化し、実施した。出力を２０％とする４０５ｎｍレーザーを使用して、光変換を実施した。試料を、まず、走査して、レーザー処理の前に、光変換が生じていないことを確認した。予備的イメージング時の光変換を防止するため、出力を９％とする４０５ｎｍレーザーにより、レーザーを設定し、７〜８００のゲインを使用して、イメージングした。次に、出力を２０％とする４０５ｎｍレーザーにより、光変換を達成し、２０回にわたる処理の反復により、試料を走査し、この後で、光変換を確認するように、再度イメージングした。
【０２９６】
レーザーの活性化の後、ニューロンを、倍率を６３倍とする、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１上、２０分間隔で、６時間にわたりイメージングした。ＩｍａｇｅＪを使用して、時点＝０におけるニューロン細胞体の輪郭を手動で描出し、後続の各時点における、このＲＯＩ内の蛍光強度を解析することにより、ニューロン細胞体におけるタウ蛍光の定量化を実施した。全ての値は、所与のニューロンについての初期蛍光強度に対する百分率として表す（すなわち、各ニューロンについて、独立に、時点＝０を、１００％と設定した）。
【０２９７】
画像解析：細胞の顆粒カウント：ＳＧ密度は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、細胞数のために制御された、６３倍のフレーム１つ当たりの、＞１ｍｍ２の点の数を計算することにより定量化した。これは、画像を閾値化し、これを使用して、粒子の機能性を解析することにより行った。初代ニューロン内の顆粒のカウントおよび面積の定量化は、ＩｍａｇｅＪの、フリーハンドツールを使用して、ニューロンの輪郭を描出し、画像を閾値化し、核を覆うマスクを創出し、粒子解析ツールを使用することにより行った。
【０２９８】
共局在化：タウ封入体と、ストレス顆粒との潜在的な相互作用を解析するために、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭソフトウェアを使用して、共局在化の定量化を行い、共局在化の程度についてのＲ値を記録した。
【０２９９】
ニューロンの顆粒カウント：初代ニューロン内の顆粒のカウントおよび面積の定量化は、ＩｍａｇｅＪの、フリーハンドツールを使用して、ニューロンの輪郭を描出し、画像を閾値化し、核を覆うマスクを創出し、粒子解析ツールを使用することにより行った。
【０３００】
樹状突起の長さ：樹状突起の突起部の測定は、ＩｍａｇｅＪのプラグインである、ＮｅｕｒｏｎＪを使用して行った。ソフトウェアを使用して、個々の細胞のＭＡＰ２陽性突起部をトレースすることにより、ピクセル測定値をもたらし、次いで、顕微鏡のスケーリングパラメータを使用して、これを、マイクロメートルに計算し戻すことができる。
【０３０１】
生細胞における顆粒のトラフィッキング：測定および解析は、Ｉｍａｒｉｓ／Ｂｉｔｐｌａｎｅソフトウェア上の、Ｉｍａｒｉｓ  Ｔｒａｃｋを使用して行った。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭソフトウェアを使用して、共局在化の定量化を行い、共局在化の程度についてのＲ値を記録した。樹状突起の突起部の測定は、ＩｍａｇｅＪのプラグインである、ＮｅｕｒｏｎＪを使用し、ＭＡＰ２陽性突起部をトレースして行った。
【０３０２】
生化学分画
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ画分：ＨＴ２２細胞を、１倍濃度のＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１倍濃度のホスファターゼ阻害剤カクテル（ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ）、および１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を伴う、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳＤＳ、０．５ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム）中に溶解させ、超音波処理し、スピンダウンして、上清を回収した。溶解物をまず、４℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離し、上清を、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝液可溶性タンパク質として回収した。キャリーオーバーにより引き起こされる夾雑を防止するため、ペレットを再度超音波処理し、４℃、１００，０００×ｇで、３０分間にわたり遠心分離した。ＲＩＰＡ緩衝液不溶性ペレットは、１００ｍＭのＤＴＴを含有する試料緩衝液中に再懸濁させた。ウェスタンブロットにより、可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を解析した。
【０３０３】
サルコシル不溶性タウ画分およびサルコシル可溶性タウ画分：タウについて濃縮された画分を作製するために、サルコシル洗浄剤による１０％溶液１０μＬを、１００μｇの上清へと添加した。さらなるＲＩＰＡを使用して、１００μＬの最終容量をもたらした。この試料を、室温で１時間にわたり回転混合してから、室温、１００，０００×ｇのスピンで、１時間にわたり遠心分離した。上清を、別個の管に回収し、サルコシルペレットを、１００ｍＭのＤＴＴを含有する試料緩衝液中に再懸濁させた。
【０３０４】
免疫ブロット法：１５ウェルの４〜１２％のビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上の勾配ＰＡＧＥを使用して、免疫ブロットを実施した。ブロッキングは、５％のミルク中、ＲＴで１時間にわたり行った。一次抗体インキュベーションは、ＰＢＳ中に１：７，５００のマウスモノクローナルタウ１３、１：５００のマウスモノクローナルＰＨＦ１、１：５００のヤギポリクローナルＴＩＡ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：５００のマウスモノクローナルシナプトフィシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：１，０００のマウスモノクローナルＰＳＤ−９５（ＮｅｕｒｏＭａｂ）、１：１，０００のウサギポリクローナルカスパーゼ３または切断型カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、または１：１０，０００のマウスモノクローナルアクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に、４℃で、一晩にわたった。二次抗体は、５％のミルク中、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。現像は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して行った。
【０３０５】
免疫沈降：等量の溶解物を、ｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、４℃で１時間にわたり、あらかじめ清明化させた。試料をスピンダウンし、溶解物を除去し、０．５μｌのＰＨＦ−１抗体、１μｌのタウ５抗体（Ａｂｃａｍ）、１μＬのＭＣ１抗体、または０．５μＬのＴＩＡ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、各細胞溶解物（１００〜３００μｇ）へと添加し、試料を、回転ホイール上、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。５０μｌのｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズを、試料へと添加し、次いで、試料を、４℃で、さらに１時間にわたりインキュベートした。ビーズをスピンダウンし、共免疫沈降緩衝液中で、３回にわたり洗浄した。ビーズを、ＳＤＳ試料緩衝液中、９５℃で、５分間にわたり煮沸した。次いで、タンパク質を、ウェスタンブロットにより解析した。
【０３０６】
分画を伴う免疫沈降：等量の溶解物を、ｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、４℃で１時間にわたり、あらかじめ清明化させた。試料をスピンダウンし、溶解物を除去し、０．５μＬのＴＩＡ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、各細胞溶解物（１０００μｇ）へと添加し、試料を、回転ホイール上、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。５０μｌのｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅビーズを、試料へと添加し、次いで、試料を、４℃で、さらに１時間にわたりインキュベートした。ビーズをスピンダウンし、ビーズが結合しなかった部分を除去し、サルコシル緩衝原液を、１％まで添加し、超音波処理し、５５，０００ｇで、１時間にわたり遠心分離し、上清を採取し、「非ＴＩＡ１結合性可溶性」と命名し、ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液中で１回洗浄し、５５，０００ｇで、１５分間にわたり遠心分離した。ペレットを、１００ｍＭのＤＴＴを伴う試料緩衝液中に再懸濁させ、「非ＴＩＡ１結合性不溶性」と命名した。共時的に、セファロースビーズを、共免疫沈降緩衝液中で、３回にわたり洗浄した。次いで、ビーズを、１％のサルコシル緩衝液中で、１時間にわたり回転混合し、次いで、スピンダウンした。上清を、ＴＩＡ１結合性可溶性画分として採取した。ビーズを、ＳＤＳ試料緩衝液中、９５℃で、５分間にわたり煮沸し、これを、「ＴＩＡ１結合性不溶性画分」と命名した。次いで、タンパク質を、ウェスタンブロットにより解析した。
【０３０７】
プロテオミクスのための免疫沈降：１０カ月齢の、ＴＩＡ１−／−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（遺伝子バックグラウンド）雄マウス、タウ−／−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス、およびＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、イソフルランチャンバー内で麻酔をかけ、氷冷ＰＢＳで潅流した。次いで、脳を切除して、後脳、海馬、および大脳皮質を分離した。組織を、ドライアイス上のメタノール中への浸漬によりゆっくり凍結させ、プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ；型番０４６９３１５９００１）カクテル、およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ；型番０４９０６８３７００１）カクテルを補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ６．８）中で、ホモジナイズした。製造元の指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２６１４８）に従い、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＩＰカラム上に固定化された１０μｇのヤギ抗ＴＩＡ−１ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；型番ｓｃ−１７５１）を使用して、ＴＩＡ−１を、２ｍｇの大脳皮質溶解物から免疫沈降させた。次いで、ＴＩＡ−１  ＩＰ溶出物を、Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番ＮＰ０３２３）上で分離し、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番ＬＣ６０６０）で染色した。次いで、全ゲルレーンを、切り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析のために、ＵＭａｓｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ施設へと送付した。
【０３０８】
プロテオミクス、ゲル内消化：ゲルスライスを、１×１ｍｍの小片へと切り刻み、３０分間にわたり、１ｍｌの水を伴う、１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れた。水を除去し、２５０ｍＭの重炭酸アンモニウム５０ｕｌを添加した。還元のために、４５ｍＭの１，４ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液２０μｌを添加し、試料を、５０℃で、３０分間にわたりインキュベートした。試料を、室温へと冷却し、次いで、アルキル化のために、１００ｍＭのヨードアセトアミド溶液２０μｌを添加し、３０分間にわたり反応させた。ゲルスライスを、１ｍｌの水アリコートで、２回にわたり洗浄した。水を除去し、５０：５０（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム：アセトニトリル）１ｍｌを、各管に入れ、試料を、室温で、１時間にわたり、インキュベートした。次いで、溶液を除去し、２００ｕｌのアセトニトリルを、各管へと添加すると、この時点で、ゲルスライスは、白色不透明となった。アセトニトリルを除去し、ゲルスライスを、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ内でさらに乾燥させた。ゲルスライスを、０．０１％のＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）：５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中に２ｎｇ／μｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ）７５μｌ中に、再度湿潤化させた。さらなる重炭酸緩衝液を添加して、ゲルスライスの完全な浸漬を確保した。試料を、３７℃で、２１時間にわたりインキュベートした。次いで、各試料の上清を除去し、別個の１．５ｍｌエッペンドルフ管に入れた。ゲルスライスを、８０：２０（アセトニトリル：１％のギ酸）１００ｕｌにより、さらに脱水した。抽出物を、各試料の上清と組み合わせた。次いで、試料を、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ内で乾燥させた。試料を、０．１％のトリフルオロ酢酸中に、５％のアセトニトリル２５μｌ中に溶解させてから、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
【０３０９】
Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ上のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：３．０μｌのアリコートを、特注で充填された２ｃｍ×１００μｍ  Ｃ１８  Ｍａｇｉｃ  ５μｍ粒子トラップカラムへと直接注入した。次いで、標識ペプチドを、溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｎａｎｏ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム上で、流量を１分当たり３００ナノリットルとして、９０分間で、９５％の溶媒Ａ（水中に０．１％のギ酸）〜３５％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中に０．１％のギ酸）の直線勾配により、カスタム充填エミッター（７５μｍ×２５ｃｍ  Ｃ１８  Ｍａｇｉｃ  ３μｍ粒子）から噴霧させた。データ依存的取得は、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、分解能を７０，０００として、３００〜１７５０ｍ／ｚにおける全ＭＳ走査を取得するのに続き、選択幅を１．６Ｄａとし、分解能を１７，５００として、ＨＣＤ断片化下で、１０のＭＳ／ＭＳ走査を取得する実験に従い実施した。生データファイルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４）で処理してから、Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５）により、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに対して検索をかけた。活用される検索パラメータは、２カ所の逸失切断部を伴う、完全トリプシン消化、親イオンの質量許容差１０ｐｐｍ、およびフラグメントの質量許容差０．０５Ｄａであった。カーバミドメチルシステインによる固定修飾と、アセチル（タンパク質Ｎ末端）、Ｎ末端グルタミンについてのピログルタミン酸、メチオニンの酸化による可変修飾とを考慮した。検索結果を、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）へとロードした。
【０３１０】
プロテオーム解析：各試料中で検出されるＴＩＡ−１のＴＩＣレベルに対して正規化された、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質についての全イオン電流（ＴＩＣ）を使用して、定量的プロテオーム解析を実施した。ＴＩＡ−１  ＫＯ大脳皮質組織内で同定されたタンパク質は、ＩＰ抗体に対する非特異的結合性タンパク質と考え、全ての解析から除外した。次いで、各試料中で同定されたタンパク質の、完全な遺伝子リストを、ＮＩＨのウェブサイトを介して利用可能な、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）リソースへとアップロードした。ＫＥＹＷＯＲＤＳ機能類型、ＧＯ遺伝子オントロジー、ＩＮＴＥＲＰＲＯタンパク質ドメイン、およびＫＥＧＧパスウェイプログラムを使用して、各データセット内で濃縮された遺伝子類型を同定するように、遺伝子リストを解析した。ベンジャミニによる補正ｐ値を＜０．０５とする類型を、統計学的に有意であると考えた。次いで、統計学的に有意な類型のｐ値を、試料間で比較して、各類型についての濃縮倍数を決定した。
【０３１１】
ＤＡＶＩＤおよびネットワーク視覚化解析：ＷＴ条件およびタウＫＯ条件に固有のものとして同定された、１６３のタンパク質を、ＤＡＶＩＤ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇツール（Ｈｕａｎｇら、２００８年；Ｈｕａｎｇら、２００９年）にかけた。濃縮のＦＤＲ＜０．０５とする、結果として得られる１２のクラスターを同定し、１６０（１６３）のタンパク質の各々を、クラスタリングされた遺伝子セット内の、そのメンバーとしての位置に基づき、クラスターと関連させた。ネットワークは、アノテーションクラスターを共有するタンパク質対の間のつながりを加算することにより創出した。エッジの重みは、タンパク質対の間で共通の、アノテーションクラスターの数として決定され、より厚いエッジは、タンパク質の間の、強い機能的な関連を表す（任意の２つのタンパク質の間で共通の、最小数のクラスターは１であり、最大数のクラスターは、８であった）。結果として得られるネットワークを、ソフトウェアであるＧｅｐｈｉ  ０．８．２により視覚化し、Ｆｏｒｃｅ  Ａｔｌａｓ  ２レイアウトアルゴリズムを使用してアレンジした。ネットワークは、ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語（Ｐｙｔｈｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ならびにＰｙｔｈｏｎによるパッケージである、ｎｅｔｗｏｒｋＸ（Ｈａｇｂｅｒｇ、２００８年）、ＮｕｍＰｙ、およびｐａｎｄａｓ（Ｊｏｎｅｓ、２００１年）を使用して生成した。
【０３１２】
統計学的解析：チューキーによる事後検定を伴うＡＮＯＶＡを使用して、＞２群を伴う実験について解析する；試料サイズは、実験ごとに提示する。顆粒の移動について研究するため、集団内の顆粒の、移動した距離、速度の解析、および方向の百分率を比較するために、片側ｐ値を伴う、マン−ホイットニーの対応のない検定を完遂した。
【０３１３】
（実施例２：ＲＮＡ結合性タンパク質であるＴＩＡ１の低減は、タウ凝集に非依存的なタウオパチーに対して保護する）
要約
ＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）は、ｍＲＮＡの輸送、翻訳、およびストレス応答を媒介する、ＲＮＡ顆粒を形成する凝集の調節により、転写物の局在化および活用を制御する。ＲＢＰの凝集は、アルツハイマー病など、タウオパチーの病態の一種であり、Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ１）のＲＮＡ顆粒との、タウの相互作用は、初代海馬ニューロン内の、タウ媒介性の神経変性を促進する。しかし、ＲＮＡ顆粒の、タウオパチーの進行における役割は、未知であった。本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＩＡ１の低減が、タウオパチーについてのＰＳ１９マウスモデルの、神経変性を緩和し、生存を延ばすことを示す。ＴＩＡ１の低減と関連する保護は、微小管へのタウの結合の増大、微小管の安定化、空間作業記憶の改善、ならびにシナプスおよびニューロンの喪失の低減を含んだ。注目すべきことに、この保護は、タウのリン酸化および神経原線維もつれの増大にも拘らず生じた。これらの知見は、タウオパチーでは、タウが、複数の経路を介して凝集することを示唆する。ＴＩＡ１の低減による、ＲＢＰの凝集の阻害が、固有の変性の特性を伴う凝集経路に対して、保護を誘発することは、重要なことである。
【０３１４】
導入
微小管関連タンパク質であるタウ（ＭＡＰＴ、またはタウ）のミスフォールディングおよび凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などのタウオパチーの決定的な病理学的特徴である。タウは通常、軸索内に位置し、そこで、微小管に結合し、これを安定化させるように機能する。タウオパチーでは、タウは、細胞体樹状突起コンパートメントへと誤って選別され、そこで、ミスフォールディングし、不溶性神経原線維もつれ（ＮＦＴ）へと凝集する。近年の研究は、タウが、ＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）と相互作用し、部分的に、ストレス顆粒と称する、ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成を促進することにより、翻訳ストレス応答を調節することを指し示す。しかし、タウオパチーの進行における、ＲＢＰおよびストレス顆粒の役割は、未知である。
【０３１５】
ＲＢＰは、疾患の病態および遺伝学への、それらの頻繁な関与のために、神経変性疾患の分野において、ますます注目を集めつつある。ＲＢＰの構造は、これらのタンパク質が、可溶性状態と液滴状態の間の、可逆的な相転移を媒介する、グリシンリッチの低複雑性（すなわち、「プリオン様」）ドメインを含有するために、特に際立っている。これらの低複雑性ドメインの自己凝集は、ＲＢＰおよびクライアントｍＲＮＡ転写物の凝集の調節を促進し、ＲＮＡ顆粒を形成する。ＲＢＰは、主に、核で機能して、ＲＮＡの転写、スプライシング、および成熟を媒介するが、それらのＲＮＡ顆粒への凝集の調節はまた、それらが、核−細胞質シャトリング、ｍＲＮＡ輸送、翻訳の開始／抑制、および翻訳ストレス応答を含む、多様な細胞質機能を媒介することも可能とする。細胞質ＲＮＡ顆粒は、とりわけ、ニューロン内で、重要かつ豊富であるが、これは、樹状突起棘および軸索末端における、特化したｍＲＮＡの、広範な輸送および局所的調節を要求する。ＲＢＰ内の低複雑性ドメインにより媒介される凝集は、疾患へのそれらの関与のために重要であると考えられる。ＴＤＰ−４３内、ＦＵＳ内、ｈｎＲＮＰＡ１／Ｂ２内、ＴＡＦ１５内、ＥＷＳＲ１内、ＡＴＸＮ２内、および他のＲＢＰ内の変異が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＤ、または脊髄小脳性運動失調を引き起こすのに対し、ＴＩＡ１内およびＶＣＰ（ストレス顆粒を離解するタンパク質）内の変異は、ミオパチーを引き起こす。これらの疾患関連ＲＢＰの多くはまた、これらの疾患（すなわち、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＴＩＡ１）の各々における、主要な病理学的凝集物も表す。ＦＵＳ内およびｈｎＲＮＰ  Ａ１内の疾患関連変異は、組換えＲＢＰの、可溶性状態から、液滴状態への相転移を加速化させ、液滴から、不溶性原線維への不可逆的な転移を直接促進することが可能であるため、凝集過程は、これらのＲＢＰの生化学挙動と直接関連しうる。こうして、ＲＢＰの機能不全は、神経変性疾患の発生に、大きな影響を及ぼすと考えられる。
【０３１６】
ＲＢＰの凝集は、タウオパチーにおける病理学的特徴である。核形成ストレス顆粒タンパク質Ｔ細胞細胞内抗原１（ＴＩＡ１）を含むＲＢＰは、患者組織内で、ＮＦＴと共に共局在化し、疾患のマウスモデル（Ｔｇ４５１０、ＰＳ１９）では、タウの凝集と共に、徐々に蓄積する。ＴＩＡ１を含有するストレス顆粒との、タウの会合が、培養海馬ニューロン内の、タウのミスフォールディングおよび毒性を促進するのに対し、ＴＩＡ１のノックダウンまたはノックアウトは、タウのミスフォールディングおよび毒性を阻害することは、重要なことである。本実施例は、内因性ＴＩＡ１の低減が、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタウオパチーの進行に対しても保護するのかどうかについて探索し、ＴＩＡ１の低減が、タウ凝集の、加齢に関連する、驚くべき増大にも拘らず、強力に神経保護性であることを裏付ける。
【０３１７】
結果
Ｔｉａ１のヘテロ接合性のノックアウトは、ＰＳ１９タウオパチーマウスにおけるＴＩＡ１の発現を低減する
ｉｎ  ｖｉｖｏのタウオパチーの進行における、内因性ＴＩＡ１の役割について探索するために、タウオパチーのＰＳ１９トランスジェニックマウスモデルを使用した。ＰＳ１９マウスは、マウスプリオンプロモーターの制御下で、ＦＴＤと関連する、Ｐ３０１Ｓ変異を伴う、ヒト１Ｎ４Ｒタウを過剰発現し、これにより、ＮＦＴ、ニューロンの喪失、および早期の死亡を特徴とする、加齢依存性進行性タウオパチーをもたらす。ＰＳ１９マウスを、Ｔｉａ１−／−マウスまたはバックグラウンド系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスと交配して、それぞれ、同じ混合型の遺伝子バックグラウンド上で、内因性Ｔｉａ１対立遺伝子の１つまたは２つのコピーを発現する、タウオパチーマウスを作出した。内因性ＴＩＡ１タンパク質レベルの低減を確認するために、ＰＳ１９マウスを、３カ月齢まで経過させ、ＴＩＡ１タンパク質発現を、ウェスタンブロット解析により定量化した。予測される通り、Ｔｉａ１のヘテロ接合性のノックアウトは、ＰＳ１９マウスの脳組織内の、ＴＩＡ１タンパク質の発現を、５０％を超えて低減した（データは示さない）。さらに、Ｔｉａ１の、ヘテロ接合性の欠失を伴うＰＳ１９では、細胞質ＴＩＡ１顆粒の数も低減された（データは示さない）。本実施例の目的では、内因性Ｔｉａ１遺伝子の、ヘテロ接合性の欠失を伴うか、または欠失を伴わないＰＳ１９マウスを、それぞれ、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−およびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋と称する。
【０３１８】
ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける、シナプスおよびニューロンの喪失をレスキューする
ＴＩＡ１の低減は、初代培養海馬ニューロン内のタウ毒性に対して保護する。したがってまず、ＴＩＡ１の低減がまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、シナプスおよびニューロンの変性にも影響するのかどうかについて探索した。ＰＳ１９マウスは、シナプス前変性に先立って、８〜１２カ月齢の間に、進行性のニューロン喪失を呈示する。軸索末端およびニューロン細胞体のいずれもが高密度であり、ＰＳ１９マウスにおける、シナプスおよびニューロンの喪失が、この領域内でよく特徴づけられるため、本研究は、海馬のＣＡ３領域（他の領域の中でも）に焦点を当てた。非トランスジェニック（ＷＴタウ）マウスと比較して、６カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスは、シナプス前末端のタンパク質である、シナプトフィシン（ＳＹＰ）のレベルの低減を呈示したが、この低減は、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスでは防止された（図１３Ａ〜１３Ｂ）。次いで、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスの、海馬（ＣＡ３）内および外側嗅内皮質（ＬＥｎｔ）内の総ニューロン数を、定量化した。９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスでは、Ｎｉｓｓｌ陽性ニューロン細胞体およびＮｅｕＮ（ニューロン特異的核タンパク質）陽性核の数は、ＣＡ３内およびＬＥｎｔ内のいずれにおいても、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスと比較して増大した（図１３Ｃ〜１３Ｄ）。次いで、９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスの大脳皮質内の層ＩＩ／ＩＩＩの軟膜表面と、基部との間の長さを測定することにより、ＴＩＡ１の低減の、大脳皮質の粗大な萎縮に対する効果を評価した。Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスが、層ＩＩ／ＩＩＩの厚さの、ほぼ２倍の低減を呈示したのに対し、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスは、非トランスジェニックマウスと、大きくは異ならなかった（図１３Ｅ）。したがって、データは、ＴＩＡ１の低減が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、タウ媒介性の神経変性に対して保護することを示唆する。
【０３１９】
ＴＩＡ１の低減は、タウ指向性の微小管の安定化を促進する
ＴＩＡ１の低減と関連する神経保護が、正常なタウ機能を促進したのかどうかについて探索するため、ＴＩＡ１の低減が、微小管（ＭＴ）の安定化を改善するのかどうかについて探索した。既に記載されている通り、ＲＡＢ緩衝液中の遠心分離により、ＭＴ結合（ペレット；Ｐ）画分と、ＭＴ非結合（上清；Ｓ）画分とを分離した。予測される通り、タウが、６〜９カ月齢の間の、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスのＭＴ非結合（Ｓ）画分中に、徐々に蓄積したことから、ＭＴからのタウの脱離が指し示される（図１４Ａ）。しかし、９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスのＭＴ非結合（Ｓ）画分中では、著明に少量のタウが検出された結果として、ＭＴ結合（Ｐ）タウの、ＭＴ非結合（Ｓ）タウに対する比の、３倍の増大がもたらされる（図１４Ａ〜１４Ｂ）。さらに、ＴＩＡ１の低減が、アセチル化α−チューブリンの、総α−チューブリンに対する比を増大させた（図１４Ｃ）ことから、タウの、ＭＴへの結合の増大はまた、ＭＴの安定化も促進することが示唆される。
【０３２０】
ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおいて、認知機能障害を緩和し、寿命を延長する
次に、ＴＩＡ１の低減が、ＰＳ１９マウスの挙動上の表現型を改善するのかどうかを決定した。ＰＳ１９マウスは、Ｙ迷路自発的交替運動課題（Ｙ  ｍａｚｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔａｓｋ）における認知機能障害、ならびにオープンフィールド（ＯＦ）および高架式十字迷路（ＥＰＭ）課題における活動亢進／不安緩解を呈示する。Ｙ迷路では、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスは、非トランスジェニックマウスと比較して、自発的交替運動の低減を呈示した（図１４Ｄ）ことから、空間作業記憶の機能障害が指し示される。注目すべきことに、ＴＩＡ１の低減は、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスの動作を、正常な作業記憶レベルへとレスキューした（図１４Ｄ）が、非トランスジェニックマウスでは、効果を及ぼさなかった（図１４Ｄ）。Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスは、Ｙ迷路またはＯＦ課題において、それらの運動活動は異ならなかったことから、それらの動作の改善が、運動挙動の変更に帰せられうる可能性は除外されることは、重要なことである（データは示さない）。したがって、ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける認知機能障害を好転させるが、運動表現型は変更しない。
【０３２１】
ＰＳ１９マウスは、運動失調および後肢麻痺のために早期に死亡し、９カ月間の中央値生存および１２カ月齢までの死亡率９０％が既に報告されている。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドと交配されたＰＳ１９マウス（Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋）は、この寿命表現型を再現する（図１４Ｅ）。しかし、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスは、平均で２．３カ月間長く生存し、４７％が、運動症状を伴わずに、１２カ月齢まで生存する（図１４Ｅ）。したがって、ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける寿命を延長する。
【０３２２】
ＴＩＡ１の低減は、タウのリン酸化の二相性の変化を誘発する
ＡＤおよびＦＴＤにおいて凝集したタウは、様々な疾患特異的ホスホエピトープにおいて、異常に高リン酸化している。こうして、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、リン酸化タウの、加齢依存的な蓄積を、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスにおいて比較した。予測される通り、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスは、３カ月齢までに、海馬内に、検出可能レベルのＣＰ１３（Ｓ２０２）−リン酸化タウおよびＡＴ８（Ｓ２０２／Ｔ２０５）−リン酸化タウを蓄積した（図１５Ａ）。３カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスの大脳皮質内または小脳内では、リン酸化タウが全く観察されないかほとんど観察されなかったことは、ＰＳ１９マウスにおいて予測される疾患の進行と符合する。これに対し、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスは、海馬（ＣＡ１、ＣＡ３）内で、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスと比較して、ＣＰ１３リン酸化タウおよびＡＴ８リン酸化タウのレベルの低減を呈示した（図１５Ａ）ことから、ＴＩＡ１の低減は、ＰＳ１９マウスにおける病態の発病を遅延させることが示唆される。
【０３２３】
次いで、６〜９カ月齢において、ＣＰ１３−リン酸化タウおよびＰＨＦ１−リン酸化タウのレベルを測定することにより、ＴＩＡ１の低減が、疾患の後期において、いかにして、タウのリン酸化に影響を及ぼすのかを決定した。ＰＨＦ１陽性タウは、原線維性のタウ凝集物と高度に相関する、ホスホエピトープ（Ｓ３９６／Ｓ４０４）においてリン酸化したタウを選択的に標識する。驚くべきことに、ＴＩＡ１の低減は、６および９カ月における、ＣＰ１３陽性リン酸化タウレベルの上昇をもたらした（図１５Ａ〜１５Ｂ）が、これは、免疫ブロット解析によりさらに確認された（データは示さない）。さらに、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスでは、ＰＨＦ１陽性ニューロンの数が、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスと比較して増加した（図１５Ｄ〜１５Ｅ）。リン酸化タウの変化にも拘らず、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスにおける全タウのレベルは、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスと大きくは異ならなかった（データは示さない）。さらに、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋  ＬＥｎｔ大脳皮質内では、ＰＨＦ１陽性封入体のうちのほぼ２０％が、細胞質ＴＩＡ１と共局在化したのに対し、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスでは、ＴＩＡ１を含有したのは、ＰＨＦ１封入体のうちの５％未満であった（図１５Ｆ〜１５Ｇ）。Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスでは、ＴＩＡ１は、ＰＨＦ１陽性ニューロン内であってもなお、大半が核へと限局された（図１５Ｆ）。したがって、ＴＩＡ１の低減は、初期には、リン酸化タウ病態のレベルを低下させたが、疾患の後期では、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスは、高レベルのリン酸化タウを蓄積した。
【０３２４】
ＴＩＡ１の低減は、神経原線維もつれの蓄積を加速化させる
ＴＩＡ１の低減が、タウのリン酸化を増大させるという驚くべき知見は、ＴＩＡ１の低減がまた、神経原線維もつれ（ＮＦＴ）にも影響する可能性を提起した。ＰＳ１９マウスでは、成熟ＮＦＴを、不溶性のベータ−プリーツ原線維に結合する、比色色素および蛍光色素により、視覚化することができる。ガリアスシルバー染色およびチオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）の両方による組織学法を使用して、９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスにおけるＮＦＴ負荷を解析した。予測される通り、９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスは、ガリアス陽性であり、かつＴｈｉｏＳ陽性のもつれを、海馬および側頭皮質の全体にわたり、広範に発症した（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、および１６Ｄ）。興味深いことに、ＴＩＡ１の低減は、前頭皮質（一次運動野；Ｍ１）および側頭皮質（ＬＥｎｔ）のいずれにおいても、ガリアスシルバー陽性ニューロンの数を加速化させた（図１６Ｂ）が、また、ＴｈｉｏＳ蛍光のレベルも上昇させた（図１６Ｄ）。海馬のＣＡ３領域内では、ガリアスシルバー陽性のもつれの数が影響を受けなかったことは、おそらく、このモデルにおける、他の脳領域と比べた、ＣＡ３内の病態レベルの進行を反映する（図１６Ｂ）。しかし、９カ月齢における、ＣＡ３内の同等数のもつれにも拘らず、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスまたはＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスのいずれにおいても、もつれの負荷と、ニューロンの喪失との関係は見られなかった（ｒ２＝０．０７；図１６Ｅ）。したがって、ＰＳ１９マウスにおけるＴＩＡ１の低減と関連する神経保護が、ＮＦＴ非依存的に生じることは、ＮＦＴが、タウオパチーにおけるニューロンの喪失の原因ではないことを示唆する研究と符合する。
【０３２５】
ＴＩＡ１の低減は、タウ凝集の生化学および構造的特性を変更する
Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスにおける、脳病態と、疾患表現型との間の驚くべき断絶は、ＴＩＡ１の低減が、タウ凝集物の構造的特性または生化学特性を変更し、毒性の低いタウ分子種を産出するという仮説をもたらした。異なる系統のタウ凝集物が、タウオパチーマウスへと注入されると、繁殖および病態生理の顕著に異なるパターンを呈示することを踏まえると、とりわけ、この可能性は高いと考えられた。さらに、Ｈｓａｉｏ法を使用する生化学分画研究は、ＴＢＳ抽出性（Ｓ１）画分、サルコシル可溶性（Ｓ３）画分、およびサルコシル不溶性（Ｐ３）画分の分離が、顕著に異なる構造的特性を伴うタウ凝集物をもたらすことを示している。注目すべきことに、ＴＢＳ抽出性画分に由来する不溶性物質（Ｓ１ｐ）は、ｒＴｇ４５１０マウスにおける神経変性の程度と高度に相関する、６４ｋＤのタウ分子種を含有する。したがって、６および９カ月齢のＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスおよびＰ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／−マウスの大脳皮質に由来する脳ホモジネートを、生化学的に分画した。予測される通り、タウは、Ｐ３０１Ｓ  ＴＩＡ１＋／＋マウスの、Ｓ１ｐ画分中およびＰ３不溶性画分中の両方において、徐々に蓄積した（図１７Ａ〜１７Ｂ）。興味深いことに、ＴＩＡ１の低減は、Ｓ１ｐ画分中で検出されるタウのレベルを、選択的に低下させる一方で、Ｐ３画分中のタウのレベルを共時的に上昇させる（図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃ）。Ｓ１ｐ画分中では、ＰＡＢＰおよびＤＤＸ６を含む、ＴＩＡ１陽性ストレス顆粒と関連するさらなるＲＢＰもまた低減される一方で、Ｓ３画分（図示しない）内またはＰ３画分（図１７Ｄ）内では、変化しなかった。この結果は、ＴＩＡ１により媒介されるＲＢＰの凝集が、ＴＢＳ抽出性タウ凝集物の形成を促進し、この経路を阻害することは、タウの凝集を、代替的な経路へとシフトさせることを示唆する。
【０３２６】
考察
正常では軸索のタンパク質であるタウは、ストレスに応答して、細胞体樹状突起コンパートメントへと誤って局在化して、ミトコンドリアの輸送および翻訳ストレス応答を調節する。タウは、この過程の一部として、ストレス顆粒コア核形成タンパク質であるＴＩＡ１を含む凝集しやすい多様なＲＮＡ結合性タンパク質と相互作用する。タウの、ＲＮＡ顆粒との会合が、初代ニューロン内の、タウのミスフォールディングおよび毒性を刺激することは、重要なことである。本研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ顆粒形成の低減がまた、ＰＳ１９マウスにおけるタウオパチーの進行に対しても保護することを示す。
【０３２７】
結果は、ＴＩＡ１の低減が、ニューロン喪失の低減、タウの微小管への結合の増大、認知の改善、および寿命の延長を含め、疾患表現型の多くの側面を改善することを示す。驚くべきことに、この挙動上の保護は、神経原線維もつれの加齢依存的な増大にも拘らず生じた。この知見は、神経原線維もつれが、タウオパチーにおける神経変性の直接の一因ではないことを示唆する研究を強調する。さらに、本研究は、ＲＢＰの凝集が、神経原線維もつれに固有の変性の特性を伴う、毒性のタウ凝集物の形成を促進することを示唆する。本研究は、Ｔｉａ１の、ヘテロ接合性のノックアウトが、ＮＦＴおよびサルコシル不溶性タウの持続的蓄積を代償として、この系統のタウ凝集物を選択的に除去するので、ＴＩＡ１に対するこれらのタウ凝集物の驚くべき依存性を裏付ける。これらの結果は、異なる系統のタウ凝集物が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、タウの病態生理および毒性の顕著に異なるパターンをもたらすことを裏付ける、タウ繁殖研究を補完する。
【０３２８】
数十年にわたり、実験的治療薬は、タウオパチーを含む神経変性障害を伴う患者の脳からの不溶性凝集物のクリアランスを標的としてきた。これらの化合物のうちの多くが、アミロイド原線維および神経原線維もつれを効果的に低減する能力にも拘らず、現在のところ、疾患修飾利益を、患者へともたらした化合物はない。これらの結果は、特異的タウ分子種を標的とするか、または、特に、毒性転帰を伴う生物学的経路をモジュレートする治療薬に対する必要を強調する。本研究からの知見は、ＲＢＰの凝集の低減が、タウオパチーを処置するための、実行可能な治療戦略であることを示唆する。しかし、ＴＩＡ１の低減が、ＰＳ１９マウスにおけるタウオパチーに対して保護する、驚くべき能力にも拘らず、タウ凝集の変更および他の生物学的経路の推定上の神経保護性変化の相対的寄与については、いまだ決定されていない。
【０３２９】
均等物
本明細書で開示される任意の実施形態の、１または複数の特色は、それらもまた、本発明の範囲内にある、さらなる実施形態をもたらすように、本発明の範囲内で、組み合わせ、かつ／または再編成しうることが認識されるであろう。
【０３３０】
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することが可能であろう。このような均等物は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０３３１】
前出の例示的な実施形態において、本発明について記載し、例示してきたが、本開示は、例だけを目的としてなされたものであり、以下の特許請求の範囲だけにより限定される、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明の実施の詳細には、多数の変化を施しうることが理解される。開示された実施形態の特色は、それらもまた、本発明の範囲内にある、さらなる実施形態をもたらすように、本発明の範囲および精神において、多様な形で、組み合わせ、かつ／または再編成することができる。当業者は、規定の実験だけを使用して、本開示で具体的に記載される、具体的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することが可能であろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲内に包摂されることを意図する。
【０３３２】
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。それらの全体における、これらの刊行物の開示は、本明細書で記載され特許請求される本発明の日付の、当業者に公知である当技術分野の最新技術について、より完全に記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１ＢＣＤ】
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【図１ＥＦＧ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３ＢＣＤ】
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【図３ＥＦ】
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【図４Ａ】
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【図４ＢＣ】
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【図４ＤＥ】
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【図５ＡＢＣ】
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【図５ＤＥ】
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【図５ＦＧ】
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【図６Ａ】
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【図６ＢＣ】
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【図６ＤＥ】
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【図６Ｆ】
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【図６ＧＨ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８ＣＤ】
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【図８ＥＦ】
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【図８Ｇ】
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【図８ＨＩＪ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０ＢＣ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０ＥＦ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３ＢＣ】
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【図１３ＤＥ】
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【図１４Ａ】
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【図１４ＢＣ】
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【図１４ＤＥ】
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【図１５Ａ】
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【図１５ＢＣ】
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【図１５ＤＥ】
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【図１５ＦＧ】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６ＣＤ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７ＢＣＤ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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