(57)【要約】  １，３−ＢＤＯ経路を有する非天然由来微生物が提供される。当該微生物は１，３−ＢＤＯ経路酵素として、２つのアセトアルデヒドの縮合を触媒して３−ヒドロキシブタナールを産生するアルドラーゼ、および３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに還元するアルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼの少なくとも１種類を発現する。当該微生物はさらにアセトアルデヒドを産生するために少なくとも１種類の酵素を発現し得る。生合成工程は、アルドラーゼ系の酵素を用いて２つのアセトアルデヒド分子を３−ヒドロキシブタナールに縮合し、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ系に属する酵素を用いて３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに選択的に還元することを含む。当該工程はさらに、生合成法によってアセトアルデヒドを産生することを含むことができる。【選択図】図２
2018519829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−ＢＤＯ経路を有する非天然由来微生物であって、前記微生物が１，３−ＢＤＯ経路酵素として、
２つのアセトアルデヒドの縮合を触媒して３−ヒドロキシブタナールを産生するアルドラーゼ、および
３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに還元する、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ、
の少なくとも１種類を含み、
ここで前記微生物は前記１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素をコードする少なくとも１種類の外因性核酸を含む、非天然由来微生物。
【請求項２】
前記微生物が、前記１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素をコードする、または前記１，３−ＢＤＯ経路由来酵素の発現に影響を及ぼす、外因性核酸に少なくとも１つの改変を含む、請求項１に記載の非天然由来微生物。
【請求項３】
前記微生物がアルドラーゼをコードする外因性核酸を含む、請求項１または２に記載の非天然由来微生物。
【請求項４】
前記アルドラーゼがデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項５】
前記アルドラーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４のアミノ酸配列、またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む、請求項４に記載の非天然由来微生物。
【請求項６】
前記外因性核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の非天然由来微生物。
【請求項７】
前記アルドラーゼ酵素が、前記酵素の活性部位に保存アミノ酸残基であるリジン１６７、リジン２０１、アスパラギン酸１６、およびアスパラギン酸１０２を含み、ここで各残基に付与された数字はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の大腸菌ＤＥＲＡのアミノ酸配列における残基番号を意味する、請求項４または５に記載の非天然由来微生物。
【請求項８】
前記微生物が、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼをコードする外因性核酸を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項９】
前記微生物が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含むアルド−ケトレダクターゼを発現する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項１０】
前記アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰ結合ポケットおよび活性部位における保存残基であるＡｒｇ２１４、Ａｒｇ２２７、Ａｒｇ２８１、Ｇｌｎ２８５、Ｇｌｙ２７９、Ａｒｇ２０８を含み、ここで２番目の数字はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する、請求項８または９に記載の非天然由来微生物。
【請求項１１】
前記外因性核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の非天然由来微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、ピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドおよび二酸化炭素を生じることができるデカルボキシラーゼをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項１３】
前記デカルボキシラーゼが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ＢＦＤ）、またはα−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）である、請求項１２に記載の非天然由来微生物。
【請求項１４】
前記デカルボキシラーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む、請求項１２に記載の非天然由来微生物。
【請求項１５】
前記ＢＦＤがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む、請求項１３に記載の非天然由来微生物。
【請求項１６】
前記ＫＤＣがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む、請求項１３に記載の非天然由来微生物。
【請求項１７】
前記微生物が表３で特定される酵素をさらに発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項１８】
ピルビン酸を利用する酵素をコードする１種類以上の遺伝子が、野生型と比べて前記非天然由来微生物から欠失される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項１９】
アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはビルビン酸ギ酸リアーゼをコードする１種類以上の遺伝子が、野生型と比べて前記非天然由来微生物から欠失される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の非天然由来微生物。
【請求項２０】
１，３−ＢＤＯを産生する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項による非天然由来微生物を、１，３−ＢＤＯを産生する条件下および十分な期間で培養することを含む、方法。
【請求項２１】
前記微生物がほとんど嫌気的な培養培地にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アルドラーゼ系の酵素を用いて２つのアセトアルデヒド分子を３−ヒドロキシブタナールに縮合することと、
アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ系に属する酵素を用いて３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに選択的に還元することと
を含む、生合成工程。
【請求項２３】
アセトアルデヒドを生合成法によって産生することをさらに含む、請求項２２に記載の工程。
【請求項２４】
ピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドを得ることをさらに含む、請求項２２に記載の工程。
【請求項２５】
高光学的純度な（Ｒ）−１，３−ＢＤＯを産生する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項による非天然由来微生物を培養すること、または請求項２２〜２４のいずれか一項による生合成工程を実施することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第６２／１９５，０１１号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、４２種の配列を含む配列リストをその説明の一部として含み、本出願とともに電子形式で出願され、この配列リストはその全体が本出願に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）を含む、有機化合物の産生のための生合成工程に関する。
【背景技術】
【０００４】
１，３−ブタンジオールは、約２２０億米ドルの年間世界市場を有する一般的なコモディティケミカルである１，３−ブタジエンの前駆体として使用することができる。１，３−ブタジエンはゴム、ラテックス、レジン、およびプラスチックを製造するために使用される重要な基本成分である。現在、１，３−ブタジエンは石油ベースの工程を用いて産生される。最近、主に１，３−ブタンジオールから触媒によって１，３−ブタジエンを産生することが契機となって、バイオテクノロジーによる経路を用いて１，３−ブタンジオールを製造することに大きな興味が集まっている。１，３−ブタジエンの前駆体であることに加えて、１，３−ブタンジオールは化粧品および医薬品における適応が発見されている。（Ｒ）−１，３−ブタンジオールのような１，３−ブタンジオールの高光学的純度型を使用して、フェロモン、芳香剤、および殺虫剤のような高価値な化合物を合成することができる。１，３−ブタンジオール産生のための技術が継続して求められている。
【発明の概要】
【０００５】
一つの態様では、１，３−ＢＤＯ経路を有する非天然由来微生物が提供される。微生物は１，３−ＢＤＯ経路酵素として、２つのアセトアルデヒドの縮合を触媒して３−ヒドロキシブタナールを生成するアルドラーゼ、および３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに還元するアルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼの少なくとも１種類を含む。微生物は１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素をコードする少なくとも１種類の外因性核酸を有する。
【０００６】
一つの実施形態では、非天然由来微生物は、１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素をコードする、または１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素の発現に影響を及ぼす、内因性核酸に少なくとも１つの改変を含む。
【０００７】
一つの実施形態では、微生物はアルドラーゼをコードする外因性核酸を有する。一つの実施形態では、外因性核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド配列を含む。一つの実施形態では、アルドラーゼはデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）である。一つの実施形態では、アルドラーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４のアミノ酸配列またはそれらの活性フラグメントもしくはホモログを含む。一つの実施形態では、アルドラーゼ酵素は酵素の活性部位に保存アミノ酸残基であるリジン１６７、リジン２０１、アスパラギン酸１６、およびアスパラギン酸１０２を含み、ここで各残基に付与された数字は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の大腸菌ＤＥＲＡのアミノ酸配列における残基番号を意味する。
【０００８】
一つの実施形態では、微生物はアルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼをコードする外因性核酸を含む。一つの実施形態では、微生物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含むアルド−ケトレダクターゼを発現する。一つの実施形態では、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰ結合ポケットおよび活性部位に保存残基であるＡｒｇ２１４、Ａｒｇ２２７、Ａｒｇ２８１、Ｇｌｎ２８５、Ｇｌｙ２７９、Ａｒｇ２０８を含み、ここで２番目の数字はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する。一つの実施形態では、外因性核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
一つの実施形態では、非天然由来微生物はさらに、ピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドと二酸化炭素を生じることができるデカルボキシラーゼを含む。様々な実施形態では、デカルボキシラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含み得るピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含み得るベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ＢＦＤ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含み得るα−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）を含む。微生物は表３に示す酵素を代替または追加で発現し得る。
【００１０】
一つの実施形態では、ピルビン酸を利用する酵素をコードする１つ以上の遺伝子は、野生型と比べて非天然由来微生物から欠失される。一つの実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする１つ以上の遺伝子は、野生型と比べて非天然由来微生物から欠失される。
【００１１】
また、１，３−ＢＤＯを産生するための方法が提供され、本明細書で説明される微生物を、１，３−ＢＤＯを産生する条件下で十分な期間培養することを含む。一つの実施形態では、この方法はほとんど嫌気的な培養培地で実施される。
【００１２】
また、生合成工程が提供され、２つのアセトアルデヒド分子を３−ヒドロキシブタナールにアルドラーゼ系の酵素を用いて縮合し、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ系に属する酵素を用いて３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに選択的に還元することを含む。一つの実施形態では、本工程はさらに生合成法によってアセトアルデヒドを産生することを含む。一つの実施形態では、本工程はさらにピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドを得ることを含む。
【００１３】
また、高光学的純度な（Ｒ）−１，３−ＢＤＯを産生する方法が提供され、本明細書で説明される非天然由来微生物を培養する、または本明細書で説明される生合成工程を実施することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一つの態様によるアセトアルデヒドの１，３−ＢＤＯへの転化の図式を示す図である。
【図２】遺伝子改変大腸菌によって実施され得る、グルコースを用いた１，３−ブタンジオール産生の合成経路を示す図である。
【図３】発酵を用いて１，３−ＢＤＯを産生するための５種の公開された経路を図式的に示す図である。
【図４】ＭＡＦＦＴを用いた１５種類のＤＥＲＡ（デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）酵素の多重配列アラインメントを図式的に示す図である。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用した。ＤＥＲＡのリン酸結合ポケットにある５残基を枠によって強調し、ＴＭ１５５９およびＥＣ１５３５に対する比較に基づいている。これらの残基はサーモトガ・マリティマ（ＴＭ１５５９）由来のＤＥＲＡに認められるものに保存されているが、大腸菌（ＥＣ１５３５）由来のＤＥＲＡとは異なる。
【図５】ＭＡＦＦＴを用いた１５種類のＤＥＲＡ酵素の多重配列アラインメントを図式的に示す図である。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用した。活性部位にあり、ドナーであるアセトアルデヒドとともに必要とされるシッフ塩基化中間体を形成する役割を果たす４残基を枠によって強調し、ＴＭ１５５９およびＥＣ１５３５に対する比較に基づいている。これらの残基はすべてのＤＥＲＡ酵素で厳密に保存されている（グリシン残基を有するＴＭ１５５９以外のすべての配列で保存されているＤ１６を除く（数字はＥＣ１５３５配列を意味する））。
【図６】アルド−ケトレダクターゼの多重配列アラインメントを図式的に示す図である。
【図７】３種類のデカルボキシラーゼの多重配列アラインメントを図式的に示す図である。
【図８】アセトアルデヒドアルドール縮合について、それぞれ異なる種由来の１０種類のアルドラーゼをスクリーニングした結果を示す図である。比活性は、各酵素を０．８ｍｇ含む反応混合物における５時間かけたアセトアルデヒド縮合での変化から測定した。スクリーニングしたアルドラーゼには、大腸菌（ＥＣ１５３５）、バチルス・セレウス（ＢＣＥ１９７５）、バチルス・ハロデュランス（ＢＨ１３５２）、およびバチルス・スブチリス（ＢＳＵ３９３８）由来のＤＥＲＡを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、アセトアルデヒドを１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）に転化する新規生化学経路に含まれる酵素をコードする遺伝子を発現することによって工学処理された非天然由来微生物を説明する。本開示はまた、１，３−ＢＤＯ産生経路の能力を改善するために使用することができる追加の遺伝子改変を説明する。遺伝子改変は、発現系を最適化に向かわすことができるか、または非天然微生物にとって収量、力価、および生産性を含む産生指標の改善のためのものであることができる。さらに、遺伝子改変は、限定されないが、原料に認められる阻害物質に対する耐性、生成物耐性、浸透圧耐性、および効率的な生成物分泌を含む非天然微生物特性を改善することを目的とすることができる。
【００１６】
定義
本明細書で使用されるとき、用語１，３−ＢＤＯは１，３−ブタンジオールを意味するために使用され、ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、１，３−ジヒドロキシブタン、および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールまたは（Ｓ）−１，３−ブタンジオールのいずれかの高光学的純度型としても知られている。
【００１７】
本明細書で説明されるとき、用語３−ＨＢおよび３ＨＢは３−ヒドロキシブタナールを意味するために交換可能で使用されており、３−ヒドロキシブチルアルデヒド、ヒドロキシブチルアルデヒド、および（Ｒ）−３−ヒドロキシブタナールまたは（Ｓ）−３−ヒドロキシブタナールとしての高光学的純度型としても知られている。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語ＤＥＲＡはアルドラーゼ系に属する酵素デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼを意味し、用語ＡＫＲはアルド−ケトレダクターゼ系を意味し、用語ＡＤＨは酵素アルコールデヒドロゲナーゼを意味し、用語ＰＤＣは酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼを意味し、用語ＢＦＤは酵素ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼを意味し、用語ＫＤＣは酵素α−ケト酸デカルボキシラーゼを意味する。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「酵素」は生化学反応を触媒することができる細胞によって産生されるタンパク質を含む。さらに、文脈に他に記載がない限り、本明細書で使用されるとき「酵素」は関連触媒活性を維持するタンパク質フラグメントを含み、関連触媒活性を維持するように合成された人工的酵素を含み得る。
【００２０】
酵素または（ポリ）ペプチドと関連する表現「由来」は、酵素または（ポリ）ペプチドが（微）生物から分離された、またはこれが（微）生物などから分離もしくは特徴付けられた酵素もしくは（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列のすべてもしくは生物学的に活性な部分を含むことを意味する。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「微生物」は、顕微鏡的な微細細胞として存在するいずれかの生物を意味することが意図され、原核もしくは真核細胞、または顕微鏡的な微細サイズを有する生物を包含し、すべての種の細菌、古細菌、および真正細菌、ならびに酵母および真菌のような真核微生物を含む。本用語はまた、生化学物質の産生のために培養することができるあらゆる種（例えば、植物および哺乳動物細胞を含む）の細胞培養を含む。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「非天然由来」は、微生物に関して使用される場合、対照とされた種の野生型株を含む、対照とされた種の自然発生株に通常認められない少なくとも１つの遺伝子変異を有する微生物を意味する。遺伝子変異は、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸、他の核酸付加、核酸欠失、および／または微生物遺伝子物質の他の機能的な崩壊を導入する改変を含む。このような改変は、例えば、参照とされた種に対して異種、同種、または異種および同種両方のポリペプチドのコード領域およびこの機能的フラグメントを含む。さらなる改変には、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変える非コード調節領域を含む。
【００２３】
用語「内因性」はホスト微生物を起源とする対照となる分子または活性を意味する。同様に、本用語はコーディング核酸の発現の対照として使用されるとき、微生物内に含まれるコーディング核酸の発現を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性」はホスト微生物に導入される分子または活性を意味する。分子は、例えば、ホスト染色体への統合などによって、またはプラスミドのような非染色体遺伝子材料として、ホスト遺伝子材料へのコーディング核酸導入によって導入することができる。コーディング核酸の発現に関して、本用語は発現可能な形態におけるコーディング核酸の微生物への導入を意味する。生合成活性に関して使用されるとき、本用語は対照ホスト生物に導入される活性を意味する。供給源は、例えばホスト微生物への導入後に活性を発現するコーディング核酸であることができる。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「ホモログ」は機能的に同等である、すなわち特定された配列識別番号のアミノ酸配列を有する酵素と同じ酵素活性を有するが、アミノ酸配列に限定された数のアミノ酸置換、欠失、挿入、または付加を有し得るタンパク質を意味する。タンパク質の機能を維持するため、置換は保存的置換であり得、アミノ酸を同様な特性を有するもので置換する。
【００２６】
様々な態様では、各酵素のホモログは、酵素に相当するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列と、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有し、酵素活性を維持するタンパク質を意味する。配列同一性を判断するためのアルゴリズムは、公開により利用可能であり、例えば国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）を通して利用可能であるＢＬＡＳＴを含む。当業者は、配列が相同性を示し、そのため類似または同一機能を示すほど類似しているかどうか判断することができる。
【００２７】
当業者は、部位特異的変異のような方法を用いて、本明細書で開示されるヌクレオチド配列からなる酵素のＤＮＡに置換、欠失、挿入、および／または付加を適切に導入することによって、各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））。各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドをホストに導入して発現させてホモログを得ることができる。
【００２８】
本明細書で説明されるそれぞれの酵素は、この酵素と機能的に同等な活性を保持する限り、追加アミノ酸配列を結合することができる。前述のように、各酵素またはそのホモログは、この酵素と機能的に同等な活性を保持する限り、（ポリ）ペプチドフラグメントであることができると理解される。
【００２９】
用語「異種の」は、対照とする種以外の供給源由来の分子または活性を意味し、一方、「同種」はホスト微生物由来の分子または活性を意味する。従って、本発明のコーディング核酸の外因性発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を使用することができる。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「操作によって連結された」は、１種類以上の発現制御配列と発現されるポリヌクレオチドにおけるコード領域の間の連結を意味し、このような方法では、発現が発現制御配列と両立できる条件下で達成される。
【００３１】
１，３−ＢＤＯはポリエステル可塑剤の製造における中間体として使用され、また、食品工業および化粧品工業適用での香料用の溶媒としての使用が発見されている。さらに、光学的に純粋な（Ｒ）−１，３−ＢＤＯは、フェロモン、芳香剤、および殺虫剤のような様々な光学的に活性な化合物の合成に使用され、ペネム系およびカルバペネム系抗生物質の合成用中間体である［Ｚｈｅｎｇ，Ｒ．−Ｃ．，Ｇｅ，Ｚ．，Ｑｉｕ，Ｚ．−Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｓ．＆Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．−Ｇ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （Ｒ）−１，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｆｒｏｍ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔａｎｏｎｅ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ  ＺＪＢ−０９１６２（新規分離株カンジダ・クルセイＺＪＢ−０９１６２による４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの不斉合成）．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９４，９６９−７６（２０１２）］。
【００３２】
１，３−ＢＤＯはバイオテクノロジー経路を用いて産生され得、主に触媒による１，３−ＢＤＯから１，３−ブタジエンの生成が契機となっている［Ｂｕｒｇａｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ｂｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．＆Ｐｈａｒｋｙａ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｔｏ  １  ３  ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ（合成ガスまたは他のガス炭素源およびメタノールを１  ３  ブタンジオールに転化するための方法および生物）．（２０１１）］。１，３−ブタジエンは、２２０億米ドルを超える可能性がある市場を有する基本成分のケミカルであり、ゴム、ラテックス、およびレジン、ならびにこれらの１種類以上を含む物品、例えばタイヤを製造するのに使用され得る。成分または中間体として１，３−ＢＤＯを用いて製造される製品の非限定例には、有機溶媒、ポリウレタンレジン、ポリエステルレジン、および低血糖剤が含まれる。従って、いくつかの実施形態では、成分として本明細書で説明される工程に従って調製される１，３−ＢＤＯを有する、または中間体として本明細書で説明される工程に従って調製される１，３−ＢＤＯを用いて製造される、有機溶媒、ポリウレタンレジン、ポリエステルレジン、および低血糖剤が提供される。
【００３３】
一つの態様では、前駆体としてアセトアルデヒドを使用した酵素的な変換を用いて１，３−ＢＤＯを産生するための新規経路が提供される。
【００３４】
一つの態様では、アルドラーゼ系の酵素を用いた２つのアルデヒド分子の３−ヒドロキシブタナールへの縮合、およびアルド−ケトレダクターゼ／オキシドレダクターゼ／アルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．ａ）系に属する酵素を用いた３−ヒドロキシブタナールの１，３−ＢＤＯへの選択的還元を含む経路が開示される。図１はこの経路の図式を示す。
【００３５】
別の態様では、後述の１つ以上の経路によるアセトアルデヒドの産生、アルドラーゼ系の酵素を用いた２つのアセトアルデヒド分子の３−ヒドロキシブタナールへの縮合、およびアルド−ケトレダクターゼ／オキシドレダクターゼ／アルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．ａ）系に属する酵素を用いた３−ヒドロキシブタナールの１，３−ＢＤＯへの選択的還元を含む経路が開示される。図２を参照する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、新規経路から産生される中間体３−ヒドロキシブタナールはエナンチオマー過剰である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、過剰に産生される３−ヒドロキシブタナールのエナンチオマーは（Ｒ）−３−ヒドロキシブタナールである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、新規経路から産生される１，３−ＢＤＯはエナンチオマー過剰である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、過剰に産生される１，３−ＢＤＯのエナンチオマーは（Ｒ）−１，３−ＢＤＯである。
【００４０】
公開されている多段階経路が少なくとも４〜５段階を必要とするのに対して、１，３−ＢＤＯ産生用の異種酵素によって触媒されるそれぞれは（図３はこのような経路の例を示す）、経路が短く、１，３−ＢＤＯの合成に２つの簡単な酵素触媒段階のみを必要とする。さらに、過去に報告されている経路のほとんどは、アラニン、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡなどのような合成が難しい前駆体を使用する。前駆体アセトアルデヒドは、既に大腸菌とサッカロマイセス・セレビシエの両方の中心炭素代謝に存在するように、高いフラックスを簡単に達成する利点がある。
【００４１】
一つの態様では、本明細書で説明されるアルドラーゼ酵素を用いて２つのアルデヒド分子を縮合することを含む、縮合することからなる、または縮合することから基本的になる工程が開示される。
【００４２】
アルドラーゼは求核性供与体の求電子性アルデヒド受容体への立体制御された付加によってアルドール縮合を触媒する。機構的な要求事項によって、アルドラーゼは求核性供与体成分に極めて特異的であるが、受容体範囲に広い適応性を示す。そのためアルドラーゼは求核性供与体に基づいて分類される。アルドラーゼの異なる系統は、１）アセトアルデヒド依存性アルドラーゼ、２）ピルビン酸／ホスホエノールピルビン酸依存性アルドラーゼ、３）ジヒドロキシアセトンリン酸／ジヒドロキシアセトン依存性アルドラーゼ、および４）グリシン依存性アルドラーゼである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アルドラーゼはアセトアルデヒド依存性アルドラーゼであり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、アルデヒドは供与体または受容体であり得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、供与体はアセトアルデヒド（エタナール）、プロパナール、２−メチルプロパナール、メチルグリオキサール、ラクトアルデヒド、グリコールアルデヒド、またはアクロレインを含み得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、供与体はピルビン酸、プロパノン（アセトン）、グリオキシル酸、または３−プロパノールを含む非アルデヒドであり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、受容体はアセトアルデヒド（エタナール）、プロパナール、ブタナール、イソブタナール、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、３−メチル−１−ペンタナール、４−メチル−１−ペンタナール、コハク酸セミアルデヒド、ラクトアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、シンナムアルデヒド、グリオキサール、グリオキシル酸、メチルグリオキサール、アクロレイン、スクシンジアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジピンアルデヒド、マロンジアルデヒド、マロン酸セミアルデヒド（３−オキソプロピオン酸）、ムコン酸セミアルデヒド、または２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの１種類以上を含み得る。
【００４８】
前述のように、２つのアセトアルデヒド分子の３−ヒドロキシブタナールへの縮合は、アルドラーゼ系の酵素を用いて実施し得る。一つの実施形態では、アルドラーゼ系の酵素は、デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）（ＥＣ  ４．１．２．４）である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＤＥＲＡ酵素は共有結合シッフ塩基中間体を形成するクラスＩアルドラーゼ系として説明することができる。すべての試験した構造において、ＤＥＲＡは従来の８ブレードＴＩＭバレルフォルドを形成している。ＤＥＲＡの多量体化状態は、生物の温度に依存していると思われる。例えば、大腸菌由来のＤＥＲＡはホモダイマーであるが、サーモトガ・マリティマ由来のＤＥＲＡはホモテトラマーである。多量体化度は、触媒反応に影響しないと考えられるが、様々な条件下における安定性に影響し得る。
【００５０】
一つの態様では、本明細書で説明されるＤＥＲＡは、バチルス属、エシェリキア属、サーモトガ属、デイノコッカス属、リステリア属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、およびメタノサーモバクター属の微生物に由来する。特定の実施形態では、ＤＥＲＡは、バチルス・ハロデュランス、バチルス・セレウス、バチルス・スブチリス、大腸菌、サーモトガ・マリティマ、デイノコッカス・ラジオデュランス、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、およびメタノサーモバクター・サームオートトロフィカス由来である。一つの態様では、本明細書で説明される工程で使用されるＤＥＲＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４のアミノ酸配列、またはそれらの活性フラグメントもしくはホモログを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＤＥＲＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む酵素である。
【００５２】
一つの態様では、アルドラーゼ酵素は酵素の活性部位に保存アミノ酸残基であるリジン１６７、リジン２０１、アスパラギン酸１６．およびアスパラギン酸１０２を含み、ここで各残基に付与された数字は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の大腸菌ＤＥＲＡのアミノ酸配列における残基番号を意味し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列におけるコドンに相当する。図４は様々なＤＥＲＡ酵素の多重配列アラインメントを示し、上記の主要保存残基を枠によって強調し、一方、図５は大腸菌ＤＥＲＡと比較したときに、最適なアセトアルデヒドアルドール縮合を付与し得るいくつかのＤＥＲＡ酵素における保存残基を強調している。
【００５３】
一つの態様では、Ｐｆａｍデータベース［Ｆｉｎｎ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｆａｍ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（タンパク質ファミリーデータベース）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４）４２（Ｄ１）：Ｄ２２２−Ｄ２３０］群ＰＦ０１７９１（ＤｅｏＣ／ＬａｃＤファミリーアルドラーゼ）に属する酵素はデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼを含み、またＩｎｔｅｒＰｒｏファミリーＩＰＲ００２９１５、ＩＰＲ０１３７８５、ＩＰＲ０１１３４３、およびＩＰＲ０２８５８１にも属する。当業者は、本明細書で説明されるＤＥＲＡのホモログであるようなタンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏおよびＰｆａｍファミリーに属するタンパク質配列を得ることができる。
【００５４】
３−ヒドロキシブタンアルデヒドの１，３−ＢＤＯへの還元は、適切なアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、アルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、またはアルデヒドレダクターゼを使用して、一つの実施形態ではＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨであり得る補酵素と同等な還元性物質を用いて実施し得る。しかし一つの実施形態では、ＡＤＨ、ＡＫＲ、オキシドレダクターゼ、またはアルデヒドレダクターゼは、３−ヒドロキシブチルアルデヒドに対してかなり特異的であり、アセトアルデヒドに作用せず、これによって副産物としてのエタノール産生がほとんど回避または排除される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される経路酵素をコードする核酸源は特に制限されず、いずれの種も含み得、コードされた遺伝子産物は関連反応を触媒することができる。酵素は限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、バチルス・セレウス、バチルス・ハロデュランス、バチルス・スブチリス、ヘリコバクター・ピロリ、ラクトバチルス・ブレビス、緑膿菌、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シリンガエ、ロドシュードモナス・パルストリス、サルモネラ・チフィムリウム、サッカロマイセス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカムの種由来であり得る。表１は例示的なアルド−ケトレダクターゼ酵素を含む。
【表１】
2018519829.tif 000003
【００５６】
一つの態様では、本明細書で説明される酵素はＩｎｔｅｒＰｒｏスーパーファミリーのファミリーＩＰＲ０２３２１０、ＩＰＲ００１３９５、ＩＰＲ０１８１７０、およびＩＰＲ０２０４７１に属することができ、β−α−βフォルドを有する酵素のアルド−ケトレダクターゼファミリーを説明しており、ＮＡＤＰ結合モチーフを含む平行な８つのβ／αバレルを含む。
【００５７】
一つの態様では、選択的に３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに還元することができるアルコールデヒドロゲナーゼ、アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）、オキシドレダクターゼ、またはアルデヒドレダクターゼが提供される。一つの実施形態では、この酵素源は特に制限されていない。
【００５８】
一つの態様では、本明細書で説明される酵素は、ＮＡＤＰ結合ポケットおよび活性部位における保存残基としてＡｒｇ２１４、Ａｒｇ２２７、Ａｒｇ２８１、Ｇｌｎ２８５、Ｇｌｙ２７９、Ａｒｇ２０８を含み、ここで２番目の数字はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示す。２種の例示的なアルド−ケトレダクターゼに保存される説明した主要残基を図６の多重配列アラインメントに示す。
【００５９】
一つの態様では、本明細書で説明されるアルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）は、シュードモナス属の微生物由来である。一つの態様では、本明細書で示されるＡＫＲは緑膿菌由来である。一つの態様では、本明細書で説明される工程で使用されるＡＫＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＡＫＲはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む酵素である。
【００６１】
２段階経路の開始代謝物は、共通中心代謝物であるアセトアルデヒドであるか、あるいはピルビン酸の脱炭酸によって産生され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、アセトアルデヒドはピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）（ＥＣ  ４．１．１．１）によるピルビン酸の脱炭酸によって産生され、アセトアルデヒドと二酸化炭素を生じる。Ｓ．セレビシエ由来のＰＤＣは脂肪族２−ケト酸について幅広い基質範囲を有する。これは大腸菌で広く研究、工学処理、および発現されている［Ｃａｎｄｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，Ｒ．Ｇ．，＆Ｍａｔｔｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．（１９９１）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ（活性酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼの発現）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１３７），５−９、Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ−Ｊａｂｓ，Ｍ．，Ｋｏｎｉｇ，Ｓ．，Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｓ．，＆Ｈｕｂｎｅｒ，Ｇ．（１９９６）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．セレビシエの一倍体株由来ピルビン酸デカルボキシラーゼの精製および特徴付け）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７７（５），３１３−７］。ザイモモナス・モビリス由来のＰＤＣも２−ケト酸について幅広い基質範囲を有し、広範に研究されて大腸菌で発現されている［Ｐｏｈｌ，Ｍ．，Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｐ．，Ｍｅｓｃｈ，Ｋ．，Ｂｒｕｈｎ，Ｈ．，＆Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．（１９９８）．Ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ（ザイモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼの活性部位変異体）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５３８−５４６、Ｃａｎｄｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｏｇａ，Ｊ．，Ｎｉｘｏｎ，Ｐ．Ｆ．，＆Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，Ｒ．Ｇ．（１９９６）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ−５０  ａｎｄ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−４９６  ｉｎ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼにおけるグルタミン酸−５０およびフェニルアラニン−４９６残基の役割）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３１５，Ｐｔ  ３，７４５−５１．Ｃｏｎｗａｙ，Ｔ．，Ｏｓｍａｎ，Ｙ．ａ，Ｋｏｎｎａｎ，Ｊ．Ｉ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．Ｍ．，＆Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．（１９８７）．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼのプロモーターおよびヌクレオチド配列）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９（３），９４９−５４．Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｐ．，Ｍｅｓｃｈ，Ｋ．，＆Ｂｒｕｈｎ，Ｈ．（１９９８）．Ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ（ザイモモナス・モビリス由来ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性部位変異体）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５３８−５４６．］。本明細書で説明される例示的なＰＤＣの配列識別を表２で認めることができ、ジェンバンク登録番号を用いて探索することができる。
【表２】
2018519829.tif 000004
【００６３】
一つの態様では、本明細書で説明されるＰＤＣはザイモモナス属の微生物由来である。一つの態様では、ＰＤＣはザイモモナス・モビリス由来である。一つの態様では、本明細書で説明される工程で使用されるＰＤＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列、またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む。
【００６４】
一つの実施形態では、ＰＤＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む酵素である。
【００６５】
また、アセトアルデヒドの産生のためにピルビン酸に作用することが認められているピルビン酸デカルボキシラーゼには、限定されないが、シュードモナス・プチダ由来のベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ＢＦＤ）（ＥＣ  ４．１．１．７）およびラクトコッカス・ラクティス由来の分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）が含まれる［Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．，Ｇｒａｆ，Ｔ．，Ｂｒｏｓｉ，Ｈ．，Ｆｒｉｎｄｉ−Ｗｏｓｃｈ，Ｉ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｌ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．，＆Ｐｏｈｌ，Ｍ．（２００９）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉａｍｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ（チアミン二リン酸依存性デカルボキシラーゼの比較特性化）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６１（１−２），３０−３５］．さらに、ＰＤＣおよびＢＦＤの変異体は部位特異的変異によって得られており、限定されないが、ＰＤＣ  Ｉ４７２Ａ、ＰＤＣ  Ｉ４７６Ｆ、ＰＤＣ  Ｉ４７２Ａ／Ｉ４７６Ｆ、ＢＦＤ  Ａ４６０Ｉ、ＢＦＤ  Ｆ４６４Ｉ、およびＢＦＤ  Ａ４６０Ｉ／Ｆ４６４Ｉを含み、アセトアルデヒド生成に向けたピルビン酸での活性も示している［Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｐ．，ＭｃＬｅｉｓｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｍ．，Ｉｄｉｎｇ，Ｈ．，Ｋｎｅｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｅｎｙｏｎ，Ｇ．Ｌ．，＆  Ｐｏｈｌ，Ｍ．（２００５）．Ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｂｅｎｚｏｙｌｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ザイモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼおよびシュードモナス・プチダ由来のベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼの基質特異性の交換）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ，１８（７），３４５−５７］。
【００６６】
一つの実施形態では、本明細書で説明されるＢＦＤはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、またはその活性フラグメントもしくはホモログのアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のＫＤＣのアミノ酸配列またはその活性フラグメントもしくはホモログを含む。
【００６７】
一つの態様では、ＢＦＤはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む酵素である。
【００６８】
一つの態様では、ＫＤＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む酵素である。
【００６９】
他の実施形態では、本明細書で説明される酵素のホモログは、本明細書で説明される工程で使用され得る。図７は本明細書で説明されるＰＤＣ、ＢＦＤ、およびＫＤＣの多重配列アラインメントを示し、脱炭酸化活性に必要とされるタンパク質ドメインを強調している。
【００７０】
特定の実施形態では、アセトアルデヒドはＰＤＣによるピルビン酸の脱炭酸化によって得られるが、他の実施形態では、アセトアルデヒドは下表３に示す反応経路の１つ以上によって（代替として、または追加で）得られる。
【表３】
2018519829.tif 000005
2018519829.tif 000006
2018519829.tif 000007
2018519829.tif 000008
【００７１】
一つの実施形態では、本明細書で説明される工程は、生きた細胞によって実施される。他の実施形態では、工程は溶解した細胞、または部分的もしくはほぼ完全に精製した酵素によってインビトロで実施される。一つの実施形態では、工程は透過処理した細胞によって実施される。他の実施形態では、方法はインビトロで実施され、酵素は固定化される。異なる支持体に酵素を固定化するための手段および方法は、当業者に良く知られている。
【００７２】
本明細書で説明される酵素（複数可）を発現する微生物は、様々な形態で提供され得、水性溶液もしくは培養培地などにおける生きた形態、または凍結乾燥もしくは錠剤型などの「休止」形態を含む。
【００７３】
一つの実施形態では、本方法は経路酵素（複数可）を産生する１種類以上のホスト微生物を用いて、培養で実施される。
【００７４】
一つの実施形態では、２つのアセトアルデヒド分子を縮合することができる本明細書で説明されるアルドラーゼをコードする核酸分子を含むように遺伝子改変された微生物が提供される。
【００７５】
一つの実施形態では、１，３−ＢＤＯ経路を有する非天然由来微生物が提供され、ここで微生物は１，３−ＢＤＯ経路酵素として、２つのアセトアルデヒドの縮合を触媒して３−ヒドロキシブタンアルデヒドを産生するアルドラーゼ、および３−ヒドロキシブタンアルデヒドを１，３−ＢＤＯに還元するアルド−ケトレダクターゼ、オキシドレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼを含み、ここで微生物はこの１，３−ＢＤＯ経路由来の酵素をコードする少なくとも１種類の外因性核酸を含む。一つの実施形態では、微生物はさらにピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドと二酸化炭素を生じるＰＤＣを含む。一つの実施形態では、微生物はアセトアルデヒドを産生するために、表３で特定される酵素、またはその活性フラグメントもしくはホモログを発現する。一つの実施形態では、１つを超える、またはすべての核酸はホスト微生物に対して外因性である。
【００７６】
一つの実施形態では、一つの実施形態による方法で使用される微生物は、２つのアセトアルデヒド分子を３−ヒドロキシブタナールに縮合することができるアルドラーゼをコードする核酸分子を含むように遺伝子改変される微生物である。一つの実施形態では、微生物は３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに還元することができるケトレダクターゼをコードする核酸を含むように遺伝子改変される。一つの実施形態では、微生物はピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドおよび二酸化炭素を生じることができるＰＤＣをコードする核酸を含むように遺伝子改変される。
【００７７】
対照が微生物に含まれる１種類を超える外因性核酸から作製されるとき、これは対照とされたコーディング核酸または生化学的活性を意味し、ホスト生物に導入される別々の核酸の数を意味しないと理解されるべきである。当業者によって理解されるように、このような外因性核酸は、別々の核酸分子、ポリシストロニック核酸分子、またはこれらの組み合わせでホスト生物に導入され得る。例えば、異なる酵素活性をコードする２種類以上の外因性核酸がホスト生物に導入されると、この２種類以上の外因性核酸は単一核酸、例えば単一プラスミド、別々のプラスミドとして導入することができ、ホスト染色体に単一部位または複数部位で統合することができ、それでも２種類以上の外因性核酸として考えられる。
【００７８】
当業者に明らかなように、選択されたホスト微生物に応じて、説明される１，３−ＢＤＯ経路酵素のいくつかまたはすべてにおける核酸はホスト生物に導入することができる。ホスト微生物が経路遺伝子の１種類以上を内因的に発現する場合、これらの遺伝子は、微生物が経路における酵素（複数可）をコードするこれらの核酸を欠如している場合以外、これらの遺伝子を導入する必要はない可能性がある。当業者に明らかなように、１種類以上の経路遺伝子を発現するホスト微生物が選択される場合、微生物は、酵素をコードする遺伝子が過剰発現される、および／または競合する経路の酵素またはタンパク質をコードする遺伝子が欠失され得るように工学処理され得る。
【００７９】
当業者にとって明らかなように、ホスト微生物は工学処理してＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨのコファクタープールを増加して、１，３−ＢＤＯに対する代謝フラックスを改善することができる。一つの実施形態では、大腸菌がホスト生物として使用される場合、グルコースリン酸イソメラーゼ（ｐｇｉ）遺伝子を欠失させて、ペントースリン酸経路に向かうフレックスを転じてＮＡＤＰＨプールを増加することができる。他の戦略では、ホスト大腸菌株に対して内因性ＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をクロストリジウム・アセトブチリカム由来の外因性ＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼで交換することを含み得る。別の方法では、ＮＡＤＨキナーゼ（Ｐｏｓ５Ｐ）をＳ．セレビシエからホスト大腸菌株に導入することができる。後者を使用して、ＮＡＤＰＨ依存性経路を通して産生される何種類かの生成物が首尾よく増加した［Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｄ．，Ｊｉｎ，Ｙ．−Ｓ．，＆Ｓｅｏ，Ｊ．−Ｈ．（２０１３）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ（増強された生体内変換のための大腸菌におけるＮＡＤＰＨリジェネレータの工学処理）．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９７（７）：２７６１−７２］。
【００８０】
当業者にとって明らかなように、大腸菌がホスト生物として選択される場合、ＮＡＤＨプールは、限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、およびピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）を含むＮＡＤＨ依存性酵素をコードする遺伝子の欠失を通して、競合する経路を制限することによって増加することができる（図２を参照）。
【００８１】
当業者にとって明らかなように、細菌微小区画（ＢＭＣ）はホスト株で発現されて、コファクタープールおよび経路代謝物濃度を増加、または経路中間体から生じる副産物生成を低下することができる。さらに、ＢＭＣは細胞に対する中間体アルデヒドの毒性効果を低下して、これらの揮発性性質による喪失を低下することができる［Ｃａｉ，Ｆ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｋｉｎｎｅｙ，Ｊ．Ｎ．，＆Ｋｅｒｆｅｌｄ，Ｃ．Ａ．（２０１４）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｓｈｅｌｌｓ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｓｈｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｂｏｘｙｓｏｍｅ  Ｓｈｅｌｌｓ（細菌微小区画シェルの工学処理：キメラシェルタンパク質およびキメラカルボキシソームシェル）．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１５，４（４）：４４４−５３］。大腸菌で発現されている天然由来ＢＭＣの例には、サルモネラ・エンテリカ由来のプロパンジオール利用ＢＭＣ（ｐｄｕ）およびエタノールアミン利用ＢＭＣ（ｅｕｔ）が含まれる。これらのＢＭＣにおけるタンパク質シェルは、１，３−１，３−ＢＤＯ経路酵素によって置換される内部経路を伴わずに発現され得る。
【００８２】
ホスト微生物は、例えば細菌、酵母、真菌、またはホスト生物として使用され得る他の様々な微生物のいずれかで産生される非天然微生物から選択することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細菌種は、大腸菌、バチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・セレウス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ブレビス、バチルス・プミルス、コリネバクテリウム・グルタミカム、ザイモモナス・モビリス、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・クルイベリ、クロストリジウム・オートエタノゲナム、モレラ・サーモアセチカ、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ティロブチリカム、クロストリジウム・テタノモルファム、破傷風菌、クロストリジウム・プロピオニカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・サブターミナレ、クロストリジウム・スティクランジィ、ラルストニア・ユートロファ、ウシ結核菌、ヒト結核菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダ、緑膿菌、シュードモナス・カルボキシドボランス（オリゴトロファ・カルボキシドボランス）、シュードモナス・スタッツェリ、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、アネロビオスピリウム・スクシニシプロデュセンス、アクチノバチルス・スクシノジェネス、マンヘイミア・スクシニシプロデュサンス、リゾビウム・エトリ、グルコノバクター・オキシダンス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・プランタラム、ストレプトマイシス・セリカラー、シトロバクター・フロインディ、シトロバクター・アマロナチカス、アシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・バイリイ、サーモトガ・マリティマ、ハロバクテリウム・サリナルム、セラチア・マルセッセンス、ロドスピリルム・ルブラム、イデネオーラ種、ロドバクター・カプスラータス、メチロコッカス・カプスラタス、メチロサイナス・トリコスポリウム、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、メチロシスチスＧＢ２５、メチロトロフス・カプスラツス、メチロモナス種１６ａ、ピロコッカス・フリオススを含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、酵母または真菌は、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロミコプシス・クラタゲンシス、クルイベロミセス・ラクティス、クルイベロミセス・マルキシナス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ニガー、ピキア・スティピティス、ピキア・パストリス、リゾプス・アリズス、リゾビウス・オリゼ、ヤロウィア・リポイチカ、イサチェンキア・オリエンタリス、イサチェンキア・オケデンタリス、カンジダ・ランビカ、カンジダ・ソルボキシロサ、カンジダ・ゼプリニナ、カンジダ・ゲオチャレス、ピキア・メンブラニファシエンス、ジゴサッカロマイセス・コンブチャエンシス、カンジダ・ソルボシボランス、カンジダ・ベンダーワルティ、カンジダ・ソルボフィラ、ジゴサッカロマイセス・ビスポルス、ジゴサッカロマイセス・リンツス、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・ブルデリ、デバリオマイセス・カステリイ、カンジダ・ボイディニイ、カンジダ・エシェリシイ、ピキア・ジャディニイ、ピキア・アノマラ、ペニシリウム・クリソゲナムを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、シアノバクテリアは、アカリオクロリス・マリーナＭＢＩＣ１１０１７、アナベナ種ＰＣＣ  ７１２０、アナベナ・バリアビリスＡＴＣＣ  ２９４１３、アグメネルム・クアドルプリカツム、クロロビウム・テピダムＴＬＳ、シアノセイス種ＡＴＣＣ  ５１１４２、グロイオバクター・ビオラセウスＰＣＣ  ７４２１、ミクロシスティス・エルギノーザＮＩＥＳ−８４３、ノストック・プンクチフォルメＡＴＣＣ  ２９１３３、プロクロロコッカス・マリヌスＭＥＤ４、プロクロロコッカス・マリヌスＭＩＴ９３１３、プロクロロコッカス・マリヌスＳＳ１２０、プロクロロコッカス・マリヌス株ＡＳ９６０１、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９２１１、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９２１５、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９３０１、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９３０３、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９３１２、プロクロロコッカス・マリヌス株ＭＩＴ  ９５１５、プロクロロコッカス・マリヌス株ＮＡＴＬ１Ａ、プロクロロコッカス・マリヌス株ＮＡＴＬ２Ａ、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ  ６３０１、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ  ７９４２、シネココッカス種ＣＣ９３１１、シネココッカス種ＣＣ９６０５、シネココッカス種ＣＣ９９０２、シネココッカス種ＪＡ−２−３Ｂ、シネココッカス種ＪＡ−３−３Ａｂ、シネココッカス種ＰＣＣ  ７００２、シネココッカス種ＲＣＣ３０７、シネココッカス種ＷＨ  ７８０３、シネココッカス種ＷＨ８１０２、シネコシスティス種ＰＣＣ  ６８０３、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１を含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、藻類は、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・ラインハーディ、クロレラ種、クリプテコディニウム・コーニー、シリンドロテカ種、ドナリエラ・プリモレクタ、イソクリシス種、モナランスサス・サリナ、ナノクロリス種、ナノクロリプシス種、ネオクロリス・オレアバンダンス、ニッチア種、フェオダクチルム・トリコルヌムタム、シゾキトリウム種、テトラセルミス・スエイカを含み得る。
【００８７】
しかし、他の実施形態では、ホスト微生物は特に制限されず、当業者は酵素活性（単数または複数）を、従来技術で知られている、および／または本明細書で説明される方法を用いて、いずれかの適切なホスト生物に組み込み得る。
【００８８】
大腸菌およびＳ．セレビシエは、遺伝子工学に適した十分特性化された微生物であるため、特に有用なホスト生物である。さらに、アセトアルデヒドは大腸菌およびＳ．セレビシエの両方の本来の代謝物であり、両種の中央炭素代謝に存在する。
【００８９】
本明細書で説明される酵素をコードする核酸分子は、単独またはベクターの一部として使用することができる。核酸分子は、核酸分子に含まれるポリヌクレオチドと操作によって連結された発現制御配列を含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌における翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にするのに適し得る。発現は異種ＤＮＡ配列の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を意味する。真菌および細菌における発現を確実にする調節構成要素は当業者によって知られており、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、標的化シグナルなどが含まれる。核酸分子と関連した使用のためのプロモーターは、その起源に対して、および／または発現される遺伝子に対して、同種または異種であり得る。適切なプロモーターは、例えば、それ自体が構成的発現に適しているプロモーターである。しかし、外部的な影響によって定められる時点でのみ活性化されるプロモーターも使用することができる。人工的および／または化学的に誘発可能なプロモーターも使用され得る。化学的に誘発可能なプロモーターは、限定されないが、Ｔ７もしくはＰｔｒｃのようなＩＰＴＧ誘導性プロモーター、または配列が当業者によって知られているＰＬｔｅｔＯ−１のようなテトラサイクリン誘導性プロモーターを含み得る。
【００９０】
種々の発現系の概要は、例えば、Ｂｉｔｔｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３（１９８７），５１６−５４４）およびＳａｗｅｒｓら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４６（１９９６），１−９）、Ｂｉｌｌｍａｎ−Ｊａｃｏｂｅ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（１９９６），５００−４）、Ｈｏｃｋｎｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（１９９４），４５６−４６３）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５（１９９７），４２７−４４０）に含まれる。酵母発現系の概要は、例えば、Ｈｅｎｓｉｎｇら（Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６７（１９９５），２６１−２７９）、Ｂｕｓｓｉｎｅａｕら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ８３（１９９４），１３−１９）、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら（Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６２（１９９２），７９−９３）、Ｆｌｅｅｒ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（１９９２），４８６−４９６）、Ｖｅｄｖｉｃｋ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２（１９９１），７４２−７４５）、およびＢｕｃｋｈｏｌｚ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９９１），１０６７−１０７２）によって示される。
【００９１】
発現ベクターは文献で広く説明されている。通常、これらは選択マーカー遺伝子および選択されたホストにおける複製を確実にする複製起点だけでなく、細菌またはウイルスプロモーター、そしてほとんどの場合に転写用の終結シグナルを含む。プロモーターと終結シグナルの間には、一般的に少なくとも１つの制限部位またはコードするＤＮＡ配列の挿入を可能にするポリリンカーが存在する。相当する遺伝子の転写を本来的に制御するＤＮＡ配列は、これが選択されたホスト生物において活性である場合、プロモーター配列として使用することができる。しかし、この配列はまた、他のプロモーター配列と交換することができる。遺伝子の構成的発現を確実にするプロモーターおよび遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導性プロモーターを使用することができる。これらの特性を有する細菌およびウイルスプロモーター配列は文献で詳細に報告されている。大腸菌およびＳ．セレビシエを含む微生物における発現のための調節配列は、当業者に知られている文献で報告されている。下流配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えばＴ７プロモーター［Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（１９９０），６０−８９］、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５［ＤｅＢｏｅｒら，ｉｎ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ（Ｅｄｓ），Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｐｒａｅｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８２），４６２−４８１、ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３），２１−２５］、Ｉｐ１、ｒａｃ［Ｂｏｒｏｓら，Ｇｅｎｅ  ４２（１９８６），９７−１００］である。転写の終結シグナルも文献で報告されている。
【００９２】
構成的プロモーターよりも高いポリペプチド収量をもたらし得る誘導性プロモーターを使用することができる。好ましくは、特定の実施形態では、２段階プロセスが使用され得、ホスト細胞は最初に最適条件下で比較的高い細胞密度まで培養され、ついで転写が誘発される。
【００９３】
当業者によって理解されるように、２種類以上の外因性コーディング核酸が共発現されるとき、両核酸は、例えば１つの発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入され得る。単一ベクター発現では、コーディング核酸は共通発現制御配列に操作によって連結、または１つの誘導性プロモーターおよび１つの構成的プロモーターのような異なる発現制御配列に連結することができる。
【００９４】
一つの実施形態では、経路中間体または生成物を産生する非天然由来微生物は、下流または上流経路酵素（複数可）を発現する別の生物（または他の複数生物）と組み合わせて使用して目的の生成物を産生し得ると理解される。例えば、野生型または工学処理した生物を使用して、ピルビン酸、アセトアルデヒド、および／または３−ヒドロキシブチルアルデヒドを産生および蓄積することができる。ついでこれらの中間体を１，３−ＢＤＯ経路遺伝子の１種類以上を発現する別の工学処理した生物のための基質として使用して、１，３−ＢＤＯに転化することができる。
【００９５】
他の実施形態では、本明細書で提供される微生物は任意に工学処理して１種類以上の副産物または代替経路を取り除くことができる。このような例示的な経路は、図２において×によって示される。一つの実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする１種類以上の遺伝子がホスト微生物から欠失される。一つの実施形態では、ホスト微生物は大腸菌であり、遺伝子ａｄｈＥ、ＩｄｈＡ、およびｐｆｌＢの一つまたはすべてが欠失される。大腸菌に本来的ならびにａｄｈＥ、ＩｄｈＡ、およびｐｆｌＢの１つ以上と相同的な他の遺伝子も欠失することができる。例えば、当業者は、多重配列アラインメントアルゴリズム（ＣｌｕｓｔａｌＷなど）によって、アセトアルデヒドのアルコールへの還元を触媒するａｄｈＥと同じ機能を占有するアルデヒドレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを特定することができる。アセトアルデヒドに活性を示す大腸菌に本来的なアルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼは、限定されないが、下表４に示す配列データを含む。
【表４】
2018519829.tif 000009
【００９６】
しかし、当業者はまた、１，３−ＢＤＯ経路における中間体である３−ヒドロキシブチルアルデヒドに対する上記のアルデヒドレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの活性を測定することができる。一つの実施形態では、３−ヒドロキシブチルアルデヒドに対する基質選択および活性を示す本明細書で説明されるアルデヒドレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの１種類以上が、ホスト生物で過剰発現されて１，３−ＢＤＯ産生を改善し得る。当業者はまた、配列同一性探索を実施して、３−ヒドロキシブチルアルデヒドに活性を示す大腸菌における本来のアルデヒドレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに対する他の生物由来のホモログを特定することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、１，３−ＢＤＯ経路はまた副産物を生成し得、酢酸、エタノール、およびアセトインを含み得る。特定の実施形態では、これらの副産物をアセトアルデヒド前駆体に転化する経路が過剰発現される。下記（表５）は副産物、酢酸、エタノール、およびアセトインをアセトアルデヒドに転化することができる経路である。
【表５】
2018519829.tif 000010
2018519829.tif 000011
【００９８】
一つの実施形態では、本発明の実施形態に従って使用されるピルビン酸は、再生可能な原料（グルコースなど）から産生される。一つの実施形態では、ホスト生物は糖の原料が与えられる。このような資源には、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、デンプン、およびこれらの組み合わせのような糖を含む。グルコースは様々な炭水化物含有源から得ることができ、コーン（トウモロコシ）、コムギ、ジャガイモ、キャッサバ、およびコメのような従来のバイオ再生可能資源、ならびにエネルギー作物、植物バイオマス、農業廃棄物、林業残余物、糖処理残渣、および植物由来生活廃棄物のような代替資源を含む。
【００９９】
炭水化物資源は再生可能な原料およびバイオマスを含み、例えばセルロースバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、およびリグニン原料が挙げられる。他の再生可能な原料およびバイオマスは当業者によって知られている。
【０１００】
本発明によって使用され得るバイオ再生可能原料資源には、炭水化物源を含むいずれかの再生可能な有機物質が含まれる。これらには、例えば、草、木材（硬材および軟材）、草木、および作物残余物が含まれる。他の資源には、例えば、廃棄物（例えば、使用済みペーパー、植物廃棄物、都市廃棄物など）を含むことができる。グルコースを含めた適切な炭水化物は、従来技術によって知られている方法を用いてバイオ再生可能物質から分離し得る。例えば、Ｃｅｎｔｉおよびｖａｎ  Ｓａｎｔｅｎ，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅｓ（再生可能物質のための触媒），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００７、Ｋａｍｍ，ＧｒｕｂｅｒおよびＫａｍｍ，Ｂｉｏｒｅｆｉｎｅｒｉｅｓ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（バイオ精製所−工業処理および生成物），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００６、Ｓｈａｎｇ−Ｔｉａｎ  Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｖａｌｕｅ−Ａｄｄｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（再生可能リソース新規技術および適用から得る付加価値生成物のためのバイオ処理），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂ．Ｖ．２００７、Ｆｕｒｉａ，Ｓｔａｒｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（食品工業におけるデンプン），Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３を参照する。Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ２００１におけるデンプン、糖、およびシロップに関するチャプターも参照する。デンプンをグルコースに転化する工程も従来技術で良く知られており、例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ２００９におけるＳｃｈｅｎｃｋ，“Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｒｕｐｓ（グルコースおよびグルコース含有シロップ）”を参照する。さらに、セルロースをグルコースに転化する方法が従来技術で知られており、例えば、Ｃｅｎｔｉおよびｖａｎ  Ｓａｎｔｅｎ，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅｓ（再生可能物質のための触媒），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００７、Ｋａｍｍ，ＧｒｕｂｅｒおよびＫａｍｍ，Ｂｉｏｒｅｆｉｎｅｒｉｅｓ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（バイオ精製所−工業処理および生成物），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００６；Ｓｈａｎｇ−Ｔｉａｎ  Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｖａｌｕｅ−Ａｄｄｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（再生可能リソース新規技術および適用から得る付加価値生成物のためのバイオ処理），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂ．Ｖ．２００７を参照する。
【０１０１】
代替炭素源はバイオディーゼル産生植物から得られる粗グリセロール、廃棄ポリ乳酸の分解から得られる乳酸、乳業から得られるラクトース、またはチーズホエイ透過物、キチンが豊富な廃棄物から得られるグルコサミンであり得る。炭素源はまた、カノーラオイル、ココナツオイル、コーンオイル、オリーブオイル、パームオイル、ベニバナオイル、ピーナッツオイル、ダイズオイル、ゴマオイル、ヒマワリオイル、およびこれらの混合物のような植物または植物産物から得られる脂肪酸およびこれらのエステル（モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）であり得る。
【０１０２】
別の炭素源は合成ガスまたは「シンガス」であり得、主にＨ２とＣＯの混合物でＣＯ２を含み得、有機または化石燃料をベースとした炭素質材のガス化産物である。
【０１０３】
一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、およびメタン（ＣＨ４）のようなＣ１化合物は、製鋼、オイル精製、石炭のような工業から生じる廃棄ガス、天然ガス、シェールガス、バイオガス、およびメタンハイドレートから原料として誘導され、バイオマスおよび家庭廃棄物のような持続的な資源ならびに農業廃棄物のガス化から産生される合成ガス（すなわち、シンガス）の形態であることができる。
【０１０４】
さらなる持続可能な炭素源は、ＣＯ２のギ酸またはシュウ酸への電気化学的還元を用い、発酵における炭素源としてこれらの化合物を用いることによって達成することができる。
【０１０５】
現在６種類の異なる経路が炭素固定に関して知られており、これらは還元的ペントースリン酸経路（カルビン）サイクル、還元的アセチル−ＣｏＡ（ウッド−ユングダール（Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ））経路、還元的クエン酸サイクル、３−ヒドロキシプロピオン酸二サイクル、ジカルボキシレート／４−ヒドロキシブチレートサイクル、および３−ヒドロキシプロピオネート／４−ヒドロキシブチレートサイクルである［Ｆｕｃｈｓ  Ｇ，２０１１  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｘａｔｉｏｎ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｆｅ？（二酸化炭素固定の代替経路：生命の初期進化への洞察？）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５：６３１−６５８］。これらの経路に加えて、合成炭素固定経路を使用することができ、経路のマロニル−ＣｏＡ−オキサロ酢酸−グリオキシル酸（ＭＯＧ）ファミリーのファミリーに該当する［Ｂａｒ−Ｅｖｅｎら，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ（合成炭素固定経路の設計および分析）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，２０１０，１０７：８８８９−８８９４］。
【０１０６】
一つの実施形態では、提供される工程は発酵装置で実施され得る。
【０１０７】
工学処理された生物は、種々の反応装置システムで培養することができ、工程は様々な操作モードで実施することができる。最も一般的に使用されるバイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクターまたは通気発酵装置である。発酵装置は無菌エアー供給を備え、バブル分散による撹拌が機械的な撹拌によって実行され、温度は蒸気または冷却水を循環させるジャケットまたはコイルを用いて維持し得る。通気容器では、大きい高さ／直径比（＞３）を選択して、バブルと液相の間の接触時間を増加し得る。バイオリアクターの他の異なる型は、混合が機械的な撹拌を伴わずに達成されるエアリフト式バイオリアクター、および生物触媒が固定されるときに使用される充填床または流動床バイオリアクターである。
【０１０８】
発酵は、バッチ、フェドバッチ、および連続モードの３つの異なるモードで実施することができる。標準的なバッチバイオリアクターは「閉じた」系が考えられる。バッチモードでは、すべての培地成分をバイオリアクターに、確実に無菌にして加える。培地が調製されていると、バイオリアクターを適切な接種材料で接種し、培地にいかなる変更も加えず、すなわち、いかなる追加成分も加えずに最後まで発酵を進める。しかし、酸および／または塩基のような成分を加えてｐＨを維持することができ、空気／酸素を加えて溶存酸素量を維持することができる。バッチ発酵では、バイオマスおよび生成物濃度は発酵が完了するまで時間経過で変化する。細胞は典型的な誘導期、対数増殖期、増殖静止期、ついで死滅期を経る。
【０１０９】
バッチモードの変更型がフェドバッチモードであり、工程が進行すると炭素源を含む栄養素が発酵装置に加えられる。
【０１１０】
バッチまたはフェドバッチモードに加えて、発酵の連続モードも使用することができる。連続システムはバッチモードと対照的に「開いた」系と考えられる。連続モードでは、所定の産生培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、等量のバイオリアクター内容物が同じ速度で取り除かれる。連続操作は、細胞を含む容器内容物が取り除かれるケモスタット中、または灌流培養を使用するバイオリアクター中で実施することができ、生きた細胞をバイオリアクターに戻してリサイクルすることが可能であり、高細胞密度を達成することができる。
【０１１１】
一般的に使用される発酵装置設計および様々な操作モードが、文献において非常に良く確立されている［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ（生物化学工学の基礎），２ｎｄ  Ｅｄ．Ｊ．Ｅ．Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ：Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（持続可能なバイオプロセスの開発：モデル化および評価），Ｅ．Ｈｅｉｎｚｌｅ，Ａ．Ｐ．Ｂｉｗｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌ．Ｃｏｏｎｅｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，２００６、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（バイオプロセス工学：基本概念），２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｌ．Ｓｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆ．Ｋａｒｇｉ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，２００１］。
【０１１２】
バッチ、フェドバッチ、または連続発酵処理が使用され得る。
【０１１３】
一つの実施形態では、本明細書で提供される工程はほとんど嫌気的な条件で実施される。「ほとんど嫌気的」は培養または増殖条件に関して使用されるとき、一つの実施形態では、酸素の量が液体培地中の溶存酸素における飽和の約１０％未満であることを意味する。一つの実施形態では、本用語は酸素が約１％未満の大気で維持される液体または固体培地の密閉チャンバーを含む。別の実施形態では、工程はほとんど好気的な条件下で実施される。本明細書で使用されるとき、用語「ほとんど好気的」は、培養または増殖条件に対して使用されるとき、一つの実施形態では、酸素の量が液体培地中の溶存酸素における飽和の約１０％以上であることを意味する。一つの実施形態では、本用語は酸素が約１％を超える大気で維持される液体または固体培地の密閉チャンバーを含む。バイオリアクター内で好気的または嫌気的条件を維持するための方法は、当業者に知られている。
【０１１４】
当業者によって理解されるように、様々な成分を培養培地に添加して、本明細書で説明される微生物の増殖および／または代謝プロセスを支持し得、例えば栄養素、ｐＨ調整剤、浸透圧保護剤を含む。
【０１１５】
生物は、ルリアベルターニブロス、テリフィックブロス、または酵母抽出物−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）培地などの増殖に適したいずれかの培地中で増殖させることができる。産生のため、ホストの選択に応じて、Ｍ９最少培地、酵母合成最少培地、酵母窒素ベース、ＢＧ−１１、またはこれらの変種のような合成最少培地を使用することができる。適切な最少培地は、組換え微生物を生育および維持するのに必要とされる少なくとも１種類の炭素源、少なくとも１種類の窒素源、塩、コファクター、緩衝剤、および他の成分を含まなければならない。炭素源は前述の炭素源の１種類以上であることができ、窒素源はアンモニア塩または硝酸塩であることができ、限定されないが、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＮＨ４ＯＨ、ＫＮＯ３、ＮａＮＯ３を含む。培地は複合窒素源または有機窒素源によって補充され得、尿素、酵母抽出物、カザミノ酸、ペプトン、トリプトン、ダイズ粉末、コーンスティープリカー、またはカゼイン加水分解物などが挙げられる。さらに、最少培地には微量元素を加えることができ、限定されないが、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４、ＣｕＳＯ４、Ｃｏ（ＮＯ３）２、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＫＩを含む。最少培地はビタミンおよび／または非ビタミン化合物が補充され得、限定されないが、ビオチン、パントテン酸、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸第二鉄アンモニウムを含む。培地は二酸化炭素を直接的な注入、またはＮａＨＣＯ３もしくはＮａ２ＣＯ３の形態のいずれかで補充することができる。
【０１１６】
使用するホスト生物に応じて、最少培地はｐＨ２．０〜１０．０のｐＨ範囲を適切に有し得る。
【０１１７】
発酵は２５〜４２℃の範囲の温度で実施され得る。選択されたホスト生物が好熱性である場合、高温が使用され得、培養温度は８０℃のような高温であり得る。
【０１１８】
発酵は好気的、微好気的、または嫌気的条件下で実施され得る。これはまた好気的増殖期および微好気的または嫌気的産生期を含む２種の異なる期のもとで実施され得る。無菌の空気または酸素を導入して、培地における所望の溶存酸素量を維持し得る。
【０１１９】
培地における生成物の量は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）のような従来技術で知られている方法で測定することができる。
【０１２０】
１，３−ブタンジオールの生成を測定する方法は、当業者によって知られており、さらに例３に例示される。例えば、生成物、中間体、および副産物生成は、屈折率および／またはフォトダイオードアレイ検出器（複数可）を備えたＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）、ＧＣ−ＦＩＤ（ガスクロマトグラフィー−炎イオン化検出器）、およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）のような方法によって分析することができる。外因性ＤＮＡ配列由来の個別酵素活性もまた、従来技術で良く知られた方法を用いて測定することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される工程は、さらに工程の生成物、例えば１，３−ＢＤＯを精製することを含む。精製のこのような方法は当業者に知られており、例えば、液体抽出、ろ過、蒸留、または蒸発を含む。発酵ブロスからの化合物の分離は、必要とされる化合物の最終純度に依存する。分離技術は、遠心分離、精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過、蒸発、結晶化、蒸留、およびイオン交換を含み得る。一般的な下流処理操作には、遠心分離または精密ろ過を用いた細胞の分離、限外ろ過を用いたブロスにおける付加固体の除去、ナノろ過、イオン交換、または蒸発結晶化を用いたブロスからの塩の除去、および蒸留を用いた１，３−ＢＤＯの最終精製を含む一連の工程を含む。
【０１２２】
当業者によって理解されるように、一つの実施形態では、本明細書で説明される微生物は、生成物に相当する分泌シグナルを有するホスト生物を選択する、または同生成物を得るためにホスト生物を工学処理するいずれかによって、生じる生成物を分泌するために産生され得る。例えば、膜結合トランスポータータンパク質をホスト生物で過剰発現させて発酵ブロスにおける１，３−ＢＤＯの分泌を改善することができ、限定されないが、ピルビン酸誘導性内膜タンパク質およびタンパク質の主要ファシリテータースーパーファミリーに属する推定的トランスポーターをコードするｙｈｊＸ遺伝子を含み、生成物は培養培地から回収することができる。他の実施形態では、生成物は微生物から抽出され得る。一つの方法では、微生物は破裂させることができ、培養培地または溶解物を遠心分離して微粒子細胞デブリを取り除くことができ、膜および可溶性タンパク質分画を必要に応じて分離し得る。
【０１２３】
これらに対する多くの修正が当業者によって考えられることが理解されるであろう。従って、上記説明および付随する図面は、本発明の説明のためのものであり、限定する意味ではないと解釈されるべきである。さらに、一般的に、本発明の原理に従って本発明のいかなる変更、使用、または適応も網羅することが意図されており、本発明が関連する技術内の既知または通例の実行において生じるような、本明細書で先に示された本質的な特徴に適用され得るような、そして添付の請求項の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含むと解釈されるべきである。
【０１２４】
本明細書で参照されるすべての文書は参考によって組み込まれるが、本明細書に参考によって全体または一部として組み込まれているいかなる特許、公開、または他の開示材料も、組み込まれた材料が本開示で示される定義、記述、または他の開示材料と対立しない範囲でのみ援用されると理解されるべきである。このように、そして必要な範囲まで、本開示は本明細書で明白に示されるように、参考によって明細書に援用されたいかなる対立する材料よりも優先する。
【０１２５】
上記で説明された本発明の実施形態は、例示としてのみ意図されている。従って、本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によってのみ制限されることが意図されている。
【０１２６】
例
本発明はさらに下記の例で説明される。示される例は本発明の説明のみであり、限定する意味はない。
【０１２７】
本文書で示される例で構築されて使用される株およびプラスミドを下表６にリスト化する。
【表６】
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【０１２８】
例１：１，３−ブタンジオール経路のためのＤＥＲＡ酵素の選択
本例は、１，３−ＢＤＯ経路のための酵素候補のスクリーニング、選択、および特徴付けを説明する。
【０１２９】
１，３−ＢＤＯ生合成経路における第一段階は、３−ヒドロキシブタナール（３ＨＢ）を生じるデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼによる２つのアセトアルデヒド分子の縮合である。２つのアセトアルデヒド分子を縮合することができるアルドラーゼを特定するため、７２種のクラスＩアルドラーゼホモログまたは推定的アルドラーゼのリストを、大腸菌デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）と類似した配列に基づいて特定した。これらの７２種の推定的アルドラーゼを表７に示す。
【表７】
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【０１３０】
さらに、大腸菌の活性部位における３つの残基は、アルドール縮合を生じるために重要である供与体アルデヒドとシッフ塩基中間体を形成する上で極めて重大な役割を演じることが認められている。これらの残基は、Ｌｙｓ１６７、Ｌｙｓ２０１、およびＡｓｐ１０２（数字は大腸菌ＤＥＲＡにおける残基番号を示す）である。多重配列アラインメントをＭＡＦＦＴを用いて実施して、７２種酵素のうち、厳密に保存された前述の残基を有する３４種を見出した。選択されたこれら３４種の酵素のリストを表８に示す。
【表８】
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【０１３１】
３４種の酵素から可能性のあるアルドラーゼ酵素のリストをさらに狭めるため、大腸菌ＤＥＲＡと比べてアセトアルデヒドに対して高いアルドール縮合活性を示すことが既に認められたＴ．マリティマ（ＴＭ１５５９）由来のアルドラーゼを選択した。そして、ＴＭ１５５９は大腸菌よりも優れている可能性があるＤＥＲＡを示した。このため、ＴＭ１５５９を基本として使用し、過去に特徴付けされていないが、高いアセトアルデヒドアルドール縮合活性を示す可能性があるＤＥＲＡについてスクリーニングした。
【０１３２】
本発明者によるＴ．マリティマ由来ＤＥＲＡの結晶構造のさらなる分析［Ｈｅｉｎｅ，Ａ．，Ｌｕｚ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｌｄｏｌａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ２−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ  ａｔ  ０．９９Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼの結晶構造に基づいたクラスＩアルドラーゼ結合部位構造の０．９９Ａ分解能での分析）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４３，１０１９−３４（２００４）］および多重配列アラインメント分析は、ＴＭ１５５９のリン酸結合ポケットにおける対象残基がアセトアルデヒドに対してアルドール縮合活性で演じる役割を有し得ることを示した。これらの残基は、大腸菌ＤＥＲＡ以外の３４種の残った酵素のうち、わずかな種類のＤＥＲＡ酵素で保存された。これらの残基はＮ２１Ｋ、Ｙ４９Ｎ、Ａ７１ＣまたはＶ、Ｋ１７２Ｆ、Ｎ１７６ＨまたはＧだった（最初の文字および数字はＥＣ１５３５における残基およびその位置を示し、最後の文字はＴＭ１５５９における相当する残基を示す）。これらの残基に基づき、リストを高いアセトアルデヒドアルドール縮合活性の可能性を有する１５種の酵素にさらに狭めた（ＴＭ１５５９およびＥＣ１５３５も比較のため本リストに含めた）。さらなる分析のために選択された１５種のＤＥＲＡの多重配列アラインメントを図４に示し、表９にリスト化する。
【表９】
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【０１３３】
例２：アセトアルデヒドアルドール縮合におけるＤＥＲＡ酵素のインビトロアッセイによる特徴付け
１５種のＤＥＲＡ、つまりＴ．マリティマおよび大腸菌由来のＤＥＲＡとともに１３種類の候補を、ホスト生物でそれぞれ発現させ、１０種を問題なく精製した（表９）。
【０１３４】
１０種の精製したＤＥＲＡ酵素を、既に報告されている酵素アッセイ［Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｄｕｍａｓ，Ｄ．Ｐ．＆Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｌｄｏｌａｓｅ  ａｓ  ａ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ｉｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ａｌｄｏｌ  Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ（不斉アルドール縮合における触媒としてのデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１４，７４１−７４８（１９９２）］を用いて、アセトアルデヒドアルドール縮合に対するこれらの活性についてスクリーニングした。簡単に説明すると、各酵素をアセトアルデヒドと５時間反応させた。各反応物から２０μＬ小分けを採取して氷上に置いた。ついで、サンプル２．５μＬを水で２０倍希釈した。反応物に残存するアセトアルデヒド量を測定するため、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ）、ｐＨ７．５に０．３ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍｇの酵母アルコールデヒドロゲナーゼを含む混合物に、希釈したサンプル６μＬを９６ウェルプレート中で加え、各ウェルは２００μＬの最終容量を含んだ。ＮＡＤＨの吸光度（ε３４０ｎｍ＝６２２０Ｍ−１・ｃｍ−１）を、プレートリーダーを用いて３４０ｎｍでモニタリングし、ＮＡＤＨ消費による吸光度の低下は、各反応液に残存するアセトアルデヒドの量に正比例した。このため、各反応液で消費されたアセトアルデヒドの量は、各アルドール反応で使用されたアセトアルデヒドの初期量と酵素測定で消費されたＮＡＤＨの量の差だった。比活性を、各酵素を０．８ｍｇ含む反応混合物で５時間にわたって消費されたアセトアルデヒドの量から測定した。
【０１３５】
測定の結果を図８に示す。１０種の酵素すべてがアセトアルデヒドアルドール縮合に対していくらかの活性を示した。Ｔ．マリティマ由来のＤＥＲＡが最も高い活性を示し、続いて６種の生物由来ＤＥＲＡが大腸菌ＤＥＲＡよりも高い活性を示すと考えられる。これら６種の生物はＴＭ１５５９とともに、Ａ７１Ｖの代わりにＡ７１Ｃを有する以外は、Ｎ２１Ｋ、Ｙ４９Ｎ、Ｋ１７２Ｆ、Ｎ１７６Ｇで厳密な保存残基を共有する（最初の文字および数字はＥＣ１５３５における残基および位置を示し、最後の文字はＴＭ１５５９における相当する残基を示す）。
【０１３６】
例３：ＤＥＲＡを用いたアセトアルデヒド縮合からの生成物の同定
例２で試験したＤＥＲＡによるアセトアルデヒドのアルドール縮合から形成される生成物を同定するため、酵素反応混合物を大容量で再度調製して高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。
【０１３７】
簡単に説明すると、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５にアセトアルデヒドを２０ｍＭおよびＢ．ハロデュランスＤＥＲＡを６００ｍｇ加えて６ｍＬの反応混合物を調製した。並行して、アセトアルデヒドを除く以外はこの反応物と同様に陰性コントロールを調製した。２つの混合物を室温でインキュベーションした。サンプル５００μＬを５分毎に１時間にわたってそれぞれから採取した。各サンプルに濃硫酸の２００μＬ小分けを加えて反応を停止させ、氷上に置いた。そしてサンプルを、屈折率検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００システムでＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用して、分析物、アセトアルデヒド、および３ＨＢを３０℃、５ｍＭのＨ２ＳＯ４、０．８ｍＬ／分、２０分作動時間の方法によって分離した。ピークをＲＩ検出器によって特定した。３−ＨＢ標準は１１．８分、アセトアルデヒド標準は１３．５分で溶出した。ＨＰＬＣを用いて試験した酵素には、Ｂ．ハロデュランス（ＢＨ１３５２）および大腸菌（ＥＣ１５３５）由来のものを含んだ（結果は示さない）。いずれの酵素を用いた反応も、アセトアルデヒド消費および３ＨＢ合成をもたらした。アセトアルデヒドおよび３ＨＢの濃度を表１０にまとめて示す。
【表１０】
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【０１３８】
例４：１，３−ブタンジオール経路のためのアルド−ケトレダクターゼ酵素の選択
本明細書で示される１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）を産生する生合成経路における第二段階は、アルド−ケトレダクターゼを用いて３ＨＢを１，３−ＢＤＯに還元することを含む。この反応に必要とされる酵素のスクリーニングを、３７種の推定的な候補アルド−ケトレダクターゼをスクリーニングすることによって実施した（表１１）。穏やかな条件下でアセトアルデヒドおよび３ＨＢに対する基質特異性を、Ｋ２ＨＰＯ４（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、基質（１ｍＭ）としてアセトアルデヒドおよび３−ヒドロキシブタナール、ならびにタンパク質（２０μｇ）を含む最終容量２００μｌの反応混合物において、９６ウェルプレート中で３７℃、３０分間、分光光度によって測定した。反応を、コファクターＮＡＤＰＨ（ε３４０ｎｍ＝６２２０Ｍ−１・ｃｍ−１）のＮＡＤＰ＋への転化の測定として３４０ｎｍでの吸光度低下によってモニタリングした。
【表１１】
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【０１３９】
緑膿菌（ＰＡ１１２７）由来の候補レダクターゼが選択され、これは３ＨＢに対して著しい活性を示したが、アセトアルデヒドに対する活性は示さなかったためだった。
【０１４０】
ＰＡ１１２７レダクターゼ触媒反応の生成物を、ＨＰＸ−８７Ｈカラム、６０℃、０．４ｍＬ／分、および５ｍＭのＨ２ＳＯ４の方法によるＨＰＬＣを用いて特定した。ピークをＲＩ検出器を用いて検出した。次の標準を最初に測定し、１，３−ＢＤＯが２８．４６分、アセトアルデヒドが２７．４６分、および３ＨＢが２３．３５分に溶出された。１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液、ｐＨ７．５に３ＨＢを５５ｍＭ混合し、またアセトアルデヒドを約３８ｍＭおよびＰＡ１１２７のレダクターゼ酵素６０ｍｇを含めることによって反応混合物を調製した。様々な時点で、反応混合物の小分けをＨＰＬＣによって分析した。酵素ＰＡ１１２７の存在下では、３ＨＢは時間経過で１，３−ＢＤＯ濃度の増加と同時に消費され、一方、アセトアルデヒド濃度は一定を維持した。３ＨＢの１，３−ＢＤＯへの転化は陰性コントロールで検出されず（表１２）、そのためＰＡ１１２７の３ＨＢに対する特異性が検証された。
【表１２】
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【０１４１】
例５：１，３−ＢＤＯ経路のインビトロ検証
アルドラーゼおよびレダクターゼ酵素の活性を一緒に試験するため、組み合わせた酵素反応を次の方法を用いて実施した。つまり、Ｂ．ハロデュランス由来のＤＥＲＡおよび緑膿菌由来のレダクターゼを、１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液、ｐＨ７．５に２５ｍＭアセトアルデヒド、ＤＥＲＡを６０ｍｇ、レダクターゼを６０ｍｇ、およびＮＡＤＰＨを２０ｍＭ含む０．６ｍＬの反応混合物で試験した。様々な時点で、各反応混合物の小分けを例４で説明された方法と同様にＨＰＬＣを用いて分析した。結果を表１３にまとめて示す。
【０１４２】
アセトアルデヒド濃度は時間経過で１，３−ＢＤＯの同時増加とともに低下した。３ＨＢまたは１，３−ＢＤＯのいずれの反応産物も酵素を加えない陰性コントロールでは特定されなかった。アセトアルデヒドの高い揮発性によって、反応の際にいくらか喪失した。残存する反応したアセトアルデヒドは、二重に連続したアルコール縮合生成物（２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロ−ヘキサピラノシド）に転化されている可能性があり、検証に利用可能な標準がないため、ＨＰＬＣによって特定できなかった。
【表１３】
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【０１４３】
例６：野生型大腸菌における１，３−ＢＤＯ経路のインビボ検証
１，３−ＢＤＯ経路遺伝子の発現に使用されるベクターバックボーンは、誘導性ｌａｃｌプロモーターを有し、アンピシリン耐性であるｐＴｒｃ９９ａだった。ＰＤＣ、ＤＥＲＡ、およびＡＫＲの発現に必要とされる３種類の遺伝子を、発現ベクターに組み込んだ。各ＤＮＡ部分を独自ヌクレオチド配列（ＵＮＳ）によってフランキングした［Ｏｒｅｌｌａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｅｎｅｒｔ，Ｆ．，Ｂｏｅｈｍ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．−Ｈ．，Ｗａｙ，Ｊ．Ｃ．，＆Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．ａ．（２０１４）．Ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｐａｒｔｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（合成生物学応用のための反復ＤＮＡ部分の独自ヌクレオチド配列誘導組み込み）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，９（９），２０７５−８９］。各部分を増幅するのに使用したプライマーを表１４に示す。そして、ＤＮＡ部分を、１つの部分の３’ＵＮＳに対する５’相同領域、および連続ＤＮＡ部分の５’ＵＮＳに対する３’相同領域を有するｓｓＤＮＡ結合オリゴを用いて、報告されているリガーゼサイクル反応（ＬＣＲ）によって組み立てた［Ｋｏｋ，Ｓ．Ｄｅ，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｓｌａｂｙ，Ｔ．，Ｄｕｒｏｔ，Ｍ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｖ．Ｆ．，Ｐａｔｅｌ，Ｋ．Ｇ．，Ｃｈａｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｓ．（２０１４）．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｖｉａ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（リガーゼサイクル反応による迅速で信頼性のあるＤＮＡ組み立て）．ＡＣＳ，３，９７−１０６］。簡単に説明すると、ＤＮＡ部分をＱ５（著作権）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を製造業者のプロトコルに従って用いてＰＣＲによって最初に増幅した。そして、ＰＣＲ産物を、５０μＬの各反応混合物にＤｐｎｌ酵素を１μＬ加えて３７℃で１時間、ついで８５℃で２０分間インキュベーションすることによって鋳型プラスミドを消化することで、Ｄｐｎｌによって消化した。そしてＰＣＲ産物をサーモサイエンティフィックから購入したＰＣＲ精製キットを用いて精製し、製造業者のプロトコルに従って実施した。精製後、ＤＮＡ部分をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（ニューイングランドバイオラボ）を用いてリン酸化した。（代替として、リン酸化プライマーを注文してこの段階を回避することができる）。簡単に説明すると、水で１×に希釈したアンプリガーゼ熱安定反応緩衝液に、Ｔ４  ＰＮＫを１０Ｕ、各精製ＤＮＡ部分を１００ｆｍｏｌ、５ｍＭのＡＴＰを含有させて２０μＬのリン酸反応液を調製した。反応混合物を３７℃で１時間、ついで６５℃で２０分間インキュベーションした。リン酸化後、リン酸化混合物を１５μＬ、アンプリガーゼ熱安定反応緩衝液を１μＬ、各オリゴブリッジを３０ｎＭ、８％ｖ／ｖＤＭＳＯ、０．４５Ｍベタイン、アンプリガーゼ熱安定ＤＮＡリガーゼを０．３Ｕ／μＬ加えて水で希釈し２５μＬにして、リガーゼサイクル反応混合物を２５μＬ調製した。温度サイクルとして、９４℃で２分、ついで９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６６℃で６０秒のサイクルを５０回、以後４℃を使用した。５０μＬの化学的コンピテント（代替として、電気的コンピテント細胞も使用し得る）大腸菌ＤＨ１０β細胞の形質転換を、５μＬのＬＣＲミックスによって実施した。そしてコロニーをＰＣＲ、制限消化、および／またはシークエンシングによって正確なプラスミドについてスクリーニングした。プラスミドをｐＢＤ３と名付けた。構築したプラスミドを野生型大腸菌ＭＧ１６５５に導入した。得られる株をｅｃＢＤ−６と名付けた。
【０１４４】
ｅｃＢＤ−６株を二相、フェドバッチ発酵によって三重試験で特徴付けした。単一コロニーで５ｍＬのＬＢ（１００μｇ／ｍＬカルベニシリン補充）を接種して種培養を調製し、２５０ｒｐｍに設定したロータリー振とう器で３７℃、一晩増殖させた。ついで、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した５０ｍＬのＴＢを一晩培養で接種して、６００ｎｍでの光学密度が０．６に達するまで３０℃で好気的に増殖させた。そして、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。タンパク質発現の５時間後、細胞をペレット化して３％（ｗ／ｖ）グルコースを含む最少塩培地（Ｍ９塩培地）２５ｍＬに高細胞密度で再懸濁化させた。発酵を密閉した２５０ｍＬバッフル付きフラスコにおいて３７℃で実施した。発酵開始から２０および５０時間で、グルコースを１５ｇ／Ｌの濃度で再度加えた。様々な時点でサンプルを採取して、細胞の光学的密度を６００ｎｍで測定した。基質および生成物の濃度を、ＵＶおよび屈折率検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ−３０００  ＨＰＬＣシステムを用いたＨＰＬＣ分析によって測定した。使用したカラムは溶出液として５ｍＭのＨ２ＳＯ４を用いたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈであり、３６℃で操作した。発酵９３時間後、ｅｃＢＤ−６は１．４２ｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールを産生した。
【０１４５】
表１４は１，３−ＢＤＯ経路遺伝子を発現するプラスミドｐＢＤ３の組み立てのためのプライマーを示し、ザイモモナス・モビリス由来のＰＤＣ、バチルス・ハロデュランス由来のＤＥＲＡ、および緑膿菌由来のＡＫＲを含む。ベクターバックボーンであるｐＴＲＣ９９ａもＵＮＳを含むプライマーで増幅させた。そして、４種のＤＮＡ部分をリガーゼサイクル反応によって組み立てた。
【表１４】
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【０１４６】
例７：ピルビン酸蓄積株の構築
ピルビン酸は１，３−ブタンジオール経路における最初の代謝物であるため、１，３−ブタンジオール産生を増加させるにはピルビン酸を蓄積することができるホスト生物を必要とする。後者は最も一般的な微生物の中心炭素代謝における主要な代謝物を表す。大腸菌では、ピルビン酸は何種類かの天然発酵副産物の主前駆体である（図２）。大腸菌でピルビン酸の高力価を生じさせるため、ピルビン酸を発酵生成物に導く経路を欠失させる。従って、３種の遺伝子であるａｄｈＥ（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）、ｌｄｈＡ（乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）、およびｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする）を大腸菌から欠失させて、それぞれエタノール、乳酸、およびギ酸の生成を排除する（図２）。遺伝子欠失は、ＫＥＩＯコレクションの相当する単一遺伝子欠失変異体からＰ１遺伝子導入法を用いて野生型株に連続的に移入した。遺伝子欠失は配列リストに示されるプライマーであるＦ−ａｄｈＥ−ｃｈｅｃｋおよびＲ−ａｄｈＥ−ｃｈｅｃｋ（配列ＩＤ３７および３８）、Ｆ−ｌｄｈＡ−ｃｈｅｃｋおよびＲ−ｌｄｈＡ−ｃｈｅｃｋ（配列ＩＤ３９および４０）、Ｆ−ｐｆｌＢ−ｃｈｅｃｋおよびＲ−ｐｆｌＡ−ｃｈｅｃｋ（配列ＩＤ４１および４２）を使用してＰＣＲを用いて確証した。３つの遺伝子欠失を有して得られる株をＬＭＳＥ−２５と名付けた。
【０１４７】
株ＬＭＳＥ−２５を、１５ｇ／Ｌのグルコース、３．５  ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇのチアミン、および１ｍｌの微量金属ストックを含むミネラル培地で特徴付けした。微量金属ストックは、０．１ＭのＨＣｌで調製し、１リットルあたり、１．６ｇのＦｅＣｌ３、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇの  ＣｕＣｌ２、０．２ｇのＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮａＭｏＯ４、および０．０５  ｇのＨ３ＢＯ３から構成された（Ｃａｕｓｅｙ，Ｔ．Ｂ．，Ｚｈｏｕ，Ｓ．，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ｋ．Ｔ．＆Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００，８２５−８３２）。特徴付けは４ＭのＫＯＨを用いてｐＨが７．０に制御され、溶存酸素コントロール（＞７０％）のために空気注入を有する５００ｍｌ発酵装置で実施された。
【０１４８】
コントロール野生型大腸菌は検出可能な量のピルビン酸を蓄積しなかったが、一方、変異株は５時間で０．６７ｇ／Ｌの最大力価を生じ、グルコースから２０％最大理論収率を生じた。
【０１４９】
例８：株ｅｃＢＤ−５の構築
株ｅｃＢＤ−５を、ピルビン酸産生株ＬＭＳＥ−２５にプラスミドｐＢＤ３を導入することによって構築した。このように作製した１，３−ブタンジオール産生大腸菌株（ｅｃＢＤ−５）は炭素源としてグルコースを用いたフェドバッチ発酵によって特徴付けし、準好気的条件下で実施した。株は最初に２５０ｍＬバッフル付きフラスコで、５０ｍＬのリッチ培地（テリフィックブロス）において３０℃で培養して経路タンパク質を発現させた。タンパク質発現の５時間後、細胞をペレット化させて３％（ｗ／ｖ）グルコースを含む最少塩培地（Ｍ９塩培地）２５ｍＬに高細胞密度で再懸濁させた。発酵を密閉した２５０ｍＬバッフル付きフラスコにおいて３７℃で実施した。発酵開始から２０および５０時間で、グルコースを１５ｇ／Ｌの濃度で再度加えた。実験を三重で実施した。
【０１５０】
様々な時点でサンプルを採取して、細胞の光学的密度を６００ｎｍで測定した。基質および生成物の濃度を、ＵＶおよび屈折率検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ−３０００  ＨＰＬＣシステムを用いたＨＰＬＣ分析によって測定した。使用したカラムは溶出液として５ｍＭのＨ２ＳＯ４を用いたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈであり、３６℃で操作した。
【０１５１】
発酵９３時間後、ｅｃＢＤ−５は２．１ｇ／Ｌの１，３−ＢＤＯを産生したが、これに対してコントロールｅｃＢＤ−６は１．４２ｇ／Ｌの１，３−ＢＤＯを産生した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月23日(2018.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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