(57)【要約】本発明は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する臨床応答を予測するためのバイオマーカーに関する。特に、本発明は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する臨床応答を予測するための方法であって、前記患者におけるＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ、ＢＣＨＥ、及びその組合せからなる群より選択される予測バイオマーカーの発現を評価するステップを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における処置に対する応答を予測するためのインビトロ方法であって、該方法が、前記患者から得られた生物学的試料、例えば血液試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価するステップを含み、前記１つ以上のバイオマーカーが、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
評価するステップが、（ａ）前記患者から得られた生物学的試料中の選択されたバイオマーカーの１つ以上の発現を定量して、各定量されたバイオマーカーについての発現値を得ること、及び（ｂ）ステップ（ａ）で得られた各発現値を、対応する対照値と比較することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対照値が、非応答患者、応答患者及び／又は健康な対象において観察された発現値に対応する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置が、ＩｇＹ組成物、好ましくは経口投与用のＩｇＹ組成物である、請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記ＩｇＹ組成物が、好ましくは少なくとも２つの別個のグラム陰性細菌種からの、グラム陰性細菌又は、そのＬＰＳ含有部分で免疫処置されたメンドリから得られる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患、好ましくは：
−  慢性の広範囲にわたる疼痛、線維筋痛症、五十肩又は癒着性関節包炎、口腔粘膜炎、手根管症候群、及び膀胱症候群を含むが、これらに限定されない、突発性慢性疼痛症候群；
−  片頭痛、慢性頭頸部減速外傷、上顆炎、インピンジメント症候群；
−  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、非限定的に、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び過敏性腸症候群を含む慢性炎症性胃腸疾患；
−  クレスト症候群、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、強皮症；
−  骨関節炎及びアテローム動脈硬化症
からなる群より選択される疾患の１つを患うヒト対象である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
選択されたバイオマーカーの中の２、３、４、又は５つのバイオマーカーの発現が定量される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を処置する方法における使用のための抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物であって、前記患者における、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥの群より選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を評価することにより、前記患者が、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン製剤に対する応答者として選択される、抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物。
【請求項９】
方法が、前記１つ以上の選択されたバイオマーカーのそれぞれの発現レベルを対応する対照値と比較するステップを含むことを特徴とする、請求項８記載の使用のための抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物。
【請求項１０】
好ましくは経口投与用のＩｇＹ組成物、より好ましくはグラム陰性細菌又はそのＬＰＳ含有部分で免疫処置されたメンドリから得られたＩｇＹ組成物である、請求項８又は９記載の使用のための抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物。
【請求項１１】
末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される前記慢性疾患が：
−  慢性の広範囲にわたる疼痛、線維筋痛症、五十肩又は癒着性関節包炎、口腔粘膜炎、手根管症候群、及び膀胱症候群を含むが、これらに限定されない、突発性慢性疼痛症候群；
−  片頭痛、慢性頭頸部減速外傷、上顆炎、インピンジメント症候群；
−  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び過敏性腸症候群を含むが、これらに限定されない、慢性炎症性胃腸疾患；
−  クレスト症候群、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、強皮症；並びに
−  骨関節炎及びアテローム動脈硬化症
からなる群より選択される、請求項８〜１０のいずれか一項記載の使用のための抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物。
【請求項１２】
慢性疾患に冒された患者に抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物の治療上効果的な量を投与することを含む、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される前記慢性疾患を処置するための方法であって、前記患者が、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン薬の応答者であり、該応答者が、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥからなる群より選択される１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを評価することにより選択される、方法。
【請求項１３】
（ａ）患者からの生物学的試料、例えば血液試料を提供するステップ；
（ｂ）前記生物学的試料中の１つ以上の選択されたバイオマーカーの発現を評価するステップ；及び
（ｃ）評価するステップ（ｂ）に基づき、前記患者が、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者であると予測される場合に限り、患者に前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置の治療有効量を投与するステップ
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置が、ＩｇＹ組成物、好ましくは経口投与用のＩｇＹ組成物、より好ましくは、グラム陰性細菌又はそのＬＰＳ含有部分で免疫処置されたメンドリから得られたＩｇＹ組成物の治療上効果的な量である、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される前記慢性疾患が：
−  慢性の広範囲にわたる疼痛、線維筋痛症、五十肩又は癒着性関節包炎、口腔粘膜炎、手根管症候群、及び膀胱症候群を含むが、これらに限定されない、突発性慢性疼痛症候群；
−  片頭痛、慢性頭頸部減速外傷、上顆炎、インピンジメント症候群；
−  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び過敏性腸症候群を含むが、これらに限定されない、慢性炎症性胃腸疾患；
−  クレスト症候群、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、強皮症；並びに
−  骨関節炎及びアテローム動脈硬化症
からなる群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する臨床応答を予測するためのバイオマーカーに関する。特に、本発明は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する臨床応答を予測するための方法であって、該患者におけるＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ、ＢＣＨＥ、及びその組合せからなる群より選択される予測バイオマーカーの発現を評価するステップを含む方法を提供する。
【０００２】
背景
多様な慢性疾患が腸管リポ多糖（ＬＰＳ）の全身移行によりトリガー、持続又は強化されるという証拠は、増え続けている［Pinzone et al. 2012］。細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は、多臓器機能障害症候群［Louis et al. 2013］及び急性呼吸促迫症候群［Bernard et al., Am J Respir Crit Care Med 1994; 149: 818-824］の原因であると考えられる。インビトロ研究及びインビボ研究の両方から、ＬＰＳの投与が多様な反応を引き起こすことが示された［Windsor et al. 1993; Louis et al. 2013］。インビトロ研究は、ＬＰＳが内皮細胞のアポトーシスを直接誘導するわけではないことを示している。いくつかの研究は、内皮細胞のアポトーシスの原因として、ＬＰＳにより誘導される腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を指摘した［Bazzoni and Beutler N Engl J Med 1996; 334: 1717-1725; Buchman et al. Am J Physiol 1993, 265: H165-170; Polunovsky et al. Exp Cell Res 1994, 214: 584-594; Robaye et al. Am J Pathol 1991, 138: 447-453; Takei et al., J Gastroenterol Hepatol, 1995, 10: 65-67; Munshi et al. J Immunol. 2002 Jun 1;168(11):5860-6］。
【０００３】
ＬＰＳは、単球細胞表面のＣＤ１４により誘引されることも公知である［Devitt et al. 1998; Tapping et al. Nature 1998; 392: 505-509］。興味深いことに、これは、ＬＰＳを経由したシグナル伝達における第１のステップを反映すると広く考えられている。
【０００４】
臨床的視点からの別の問題は、ＬＰＳターンオーバーを含む治療的介入が全体的なアポトーシス応答に及ぼす影響に関する。これに関連して、免疫グロブリンは、無症状の免疫活性化に冒された患者にいくつかの有益な免疫効果を長期で発揮し得る。これは、細菌ＬＰＳ分子に対する抗体、及び同様に強いＬＰＳ阻害活性を発揮するラクトフェリンによって主に反映される［Bellamy et al. Biochim Biophys Acta 1992; 1121: 130-136、Appelmelk et al Infection and Immunity 1994; 62(2): 2628-2632; Inubushi et al. 2012］。しかし、経口抗ＬＰＳ免疫グロブリンのエフェクターメカニズムの効果及び特異性の全容は、完全には研究されていない。主要な１つのエフェクターメカニズムは、単球細胞におけるアポトーシスと関係し得る。
【０００５】
本発明者らは、抗ＬＰＳ抗体（免疫グロブリン）の経口投与に基づく新しい治療アプローチが、そのような処置を必要とする患者、例えば慢性疼痛症候群を有する患者の５０％超に有意又は完全な症状緩和をもたらすことを示した（未公表のデータ）。
【０００６】
ＬＰＳの移行及び炎症によりトリガーされる疾患についてのパラメーターの適切な科学的検証及び全体的な臨床的認定は、そのような疾患の処置に関する現在の見通しを劇的に変化させる可能性があろう。
【０００７】
予測バイオマーカーは、特定の治療法（薬物）に対する感受性又は抵抗（応答）の可能性に関連する。予測バイオマーカーという概念は、通常、治療法を調整して効力を最大化するという目標で個別の患者に適用される。より具体的で実際的な言い方では、本明細書に実証されるような予測バイオマーカーは、どの患者が、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者であるかを、臨床家が判定することを支援することができよう。
【０００８】
したがって、本発明の一目的は、個別の患者の経口免疫グロブリン療法の臨床的有益性（すなわち経口抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者）を判定するため及び非応答者に抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を施すことを回避するための、信頼できる予後診断アッセイ法を提供することである。患者を処置する前に応答者を選択するための方法は、個別化された治療的決定を可能にし、それは、今度は、患者にとって大きな心理的利益となり、健康アウトカムを向上し、地域社会にとっての経済的利益を提供する。
【０００９】
本発明の別の目的は、患者の生物学的試料、好ましくは血液試料から行うこともできる予後診断アッセイ法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、予後診断アッセイ法に従って応答者として診断された患者の少なくとも８０％、若しくは９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％が、実際に、ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する真の応答者であるがゆえに高度に特異的な、予後診断アッセイ法を提供することである。
【００１１】
この必要性を満たすために、本発明者らは、経口抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置前後の患者における広範囲の免疫パラメーターに焦点を合わせ、その結果を健康な対照個体のパラメーターと比較する実験室スクリーニングを行った。
【００１２】
したがって、本発明の方法により、これらの個体が抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を受ける前に患者の選択を行うことができる。これは、患者への精神的ストレスを緩和し、コストを節減する。
【００１３】
本発明者らによって行われた選別の結果から、１５個の特異的パラメーターのプロファイル（すなわち、予測バイオマーカー）が、計画された抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者と非応答者との区別を可能にすることが実証された。
【００１４】
好ましい実施態様の概要
一態様では、本発明は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する応答を予測するためのインビトロ方法であって、該患者から得られた生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価するステップを含む方法に関し、その際、該１つ以上のバイオマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥからなる予測バイオマーカーの群より選択される。
【００１５】
より具体的には、前記評価するステップは、前記患者の生物学的試料中の選択された予測バイオマーカーの１つ以上の発現を定量して発現値を得て、各発現値を、対応する対照値と、例えば健康志願者からの対応する発現値と比較するステップを含む。ある特定の実施態様では、そのような対照値は、健康な対象において観察される、対応するバイオマーカーの基準化平均発現値であり得る。
【００１６】
好ましい実施態様では、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、経口投与用の組成物、例えばＩｇＹ組成物である。特定の実施態様では、前記ＩｇＹ組成物は、好ましくは少なくとも２つの別個の細菌種から得られた、グラム陰性細菌又は、そのＬＰＳ含有部分で免疫処置されたメンドリから得られた、ＩｇＹ（又はその抗原結合部分）を含む。
【００１７】
前記実施態様と組み合わされる場合がある別の特定の実施態様では、前記方法は、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を患うヒト対象のために適用される。末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導されるそのような慢性疾患には、
−  慢性の広範囲にわたる疼痛、線維筋痛症、及び膀胱症候群を含むが、これらに限定されない、突発性慢性疼痛症候群；
−  片頭痛、慢性頭頸部減速外傷、上顆炎、インピンジメント症候群；
−  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び過敏性腸症候群を含むが、これらに限定されない、慢性炎症性胃腸疾患；
−  クレスト症候群、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、強皮症；並びに
−  アテローム動脈硬化症
が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の方法の特定の実施態様では、本発明の１５個の予測バイオマーカーの中の２、３、４、又は５つのバイオマーカーの発現が評価される。
【００１９】
前記実施態様と組み合わされる場合がある別の特定の実施態様では、生物学的試料は血液試料である。
【００２０】
前記実施態様と組み合わされる場合がある別の特定の実施態様では、前記発現は、リアルタイム定量ＰＣＲにより定量される遺伝子発現である。
【００２１】
前記実施態様と組み合わされる場合がある別の特定の実施態様では、前記発現は、特定の抗体により定量されるタンパク質バイオマーカーの発現である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を処置するための方法であって、該慢性疾患に冒された患者に抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物の治療上効果的な量を投与することを含む方法に関し、その際、該患者は、該抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物に対する応答者であり、該応答者は、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥからなる群より選択される１つ以上の予測バイオマーカーの発現を評価することにより選択される。典型的には、前記方法は、（ａ）患者から生物学的試料を提供するステップ；（ｂ）該生物学的試料中の上記と同義の１つ以上の予測バイオマーカーの発現を定量するステップ、及び（ｃ）該１つ以上のバイオマーカーの発現レベルに基づき、前記患者が、該抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物に対する応答者であると予測される場合に限り、患者に該抗ＬＰＳ免疫グロブリン組成物の治療有効量を投与するステップを含み得る。
【００２３】
詳細な説明
抗ＬＰＳ処置を必要とする患者における該処置に対する応答の予測を可能にする予後診断方法が、本発明により提供される。特に、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を患う患者における抗ＬＰＳ  ＩｇＹ処置などの抗ＬＰＳ処置に対する臨床応答の予測を可能にする方法及びキットが、本明細書において提供される。
【００２４】
本発明により、個別に又は組み合わせて、抗ＬＰＳ処置に対する臨床応答を高確率で予測する１５個のバイオマーカーのセットが特定された。これらの予測バイオマーカーの特定は、非応答患者と比べた応答患者の末梢血試料中のいくつかのサイトカイン又はサイトカイン受容体の発現の系統的定量により可能であった。
【００２５】
したがって、本発明の第１の目的は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者における該処置に対する応答を予測するための方法であって、該患者から得られた生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価するステップを含む方法からなり、その際、該１つ以上のバイオマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−アルファ、ＩＧＦ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＲＡＧＥ、ＧＤＮＦ及びＢＣＨＥからなる予測バイオマーカーの群より選択される。
【００２６】
本明細書における実施例に示されるように、本発明者らは、抗ＬＰＳ処置に対する応答患者と非応答患者との間で候補バイオマーカーの発現レベル値を比較したときに、健康な対象及び非応答対象のいずれかと比較して、応答対象における発現が統計的に異なるバイオマーカーを特定し、それらのバイオマーカーを本明細書で以下では「予測バイオマーカー」と呼び、下記の表１に挙げる。
【００２７】
抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置を必要とする患者
本明細書において互換的に使用される用語「患者」及び「対象」は、例えば、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を有するか、あるいは有する疑いがある対象を含む、動物界の任意のメンバー、好ましくは哺乳類、又はヒトを表す。
【００２８】
抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、実際に、末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を患う患者に有効であることが示されている。該ＣＤ１４＋単球は、グラム陰性細菌又はその部分により消化管内で活性化され、単球／マクロファージ関連サイトカインの過剰産生をもたらす。
【００２９】
グラム陰性細菌は、ヒト消化管マイクロバイオームの一部である。ある程度の内毒素リポ多糖ＬＰＳは、ヒトの防御システムにより耐容されるので、生理学的に健康な消化管環境において、これらのグラム陰性細菌は、ヒトの健康に全くリスクを引き起こさない。それは、実際に、宿主免疫系への正のフィードバックとして必要とされる。
【００３０】
病的状況では、グラム陰性細菌の過剰増殖及び粘膜炎によりトリガーされた消化管粘膜透過性の増強がある可能性がある。その両者は、粘膜下レベルでリポ多糖（ＬＰＳ）及び鞭毛、表面タンパク質などのグラム陰性細菌の他の成分の存在が増加すること、並びに結果として自然免疫系パターン認識受容体との接触が増加することをもたらす。
【００３１】
Waaga-Gasserらは、２００９年［International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Vol 47, No. 7/2009 (421-433)］に、特発性疼痛症候群を示している患者が、ＬＰＳにより活性化された後にアポトーシスにならないような活性化単球を有していることを示した。
【００３２】
したがって、ＬＰＳは、マクロファージの活性化に続いて、これらの細胞における機能障害的なアポトーシス誘導をトリガーする。これら２つの組合せは、正のフィードバックループ及び身体の全身部分へのＬＰＳシグナルの移行をもたらし、本質的に閾値以下の慢性炎症をもたらす。
【００３３】
この慢性炎症は、今度は症候性疾患に特異的な表現型をもたらす。
【００３４】
したがって、特定の実施態様では、そのような抗ＬＰＳ処置を必要とする患者は、全てがＬＰＳにより活性化された活性化（ＣＤ１４＋）単球により特徴付けられる、以下の慢性疾患の１つ以上を患う：
移行メカニズムに関連する疾患：
−  突発性慢性疼痛症候群（慢性の広範囲にわたる疼痛、線維筋痛症、膀胱症候群を含むが、これらに限定されない）などの疼痛関連疾患、
−  片頭痛、頭頸部減速外傷、上顆炎、インピンジメント症候群、
腸管における局所ＬＰＳ中和メカニズムに関連する疾患：
−  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群などの慢性炎症性胃腸疾患、
自己免疫疾患：
−  クレスト症候群、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、強皮症など、
他の疾患：
−  アテローム動脈硬化症、骨関節炎、認知症、アルツハイマー病、並びにうつ病及び統合失調症などの精神疾患など。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明の方法は、特発性疼痛症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）並びに／又は尋常性天疱瘡及び上顆炎、片頭痛、骨関節炎、五十肩若しくは癒着性関節包炎、口腔粘膜炎、手根管症候群を患う患者に適用される。
【００３６】
抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置
本明細書に使用される「抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置」は、リポ多糖（ＬＰＳ）又はそのようなリポ多糖若しくはそのＬＰＳ含有部分を産生する微生物に対する免疫グロブリン又はその抗原結合部分から作られた物質又は組成物を有効成分として含む任意の治療的処置に関する。
【００３７】
本明細書に使用され、当技術分野において十分に理解されているような「処置」は、臨床結果を含む有益な結果又は所望の結果を得るためのアプローチである。有益な結果又は所望の結果は、１つ以上の症状又は状態の軽減又は回復、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち増悪していない）状態、疾患の蔓延防止、疾患進行の遅延又は減速、疾患の後退、病状の回復又は緩和、及び寛解（部分寛解又は全寛解のいずれにせよ）を含むことができるが、これらに限定されない。
【００３８】
そのような抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、実際に、上述の末梢血中の活性化単球（ＣＤ１４＋）により誘導される慢性疾患を患う患者の処置に有効であることが示された。
【００３９】
活性化単球により誘導される慢性疾患を患う患者におけるそのような抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置及びその有益な結果の好ましい例は、国際公開公報第２０１２１３６５２２号及び国際公開公報第２０１２１３６５３４号に記載されている。
【００４０】
特定の一実施態様では、そのような抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、ＬＰＳ発現微生物又はＬＰＳ含有部分、より好ましくはグラム陰性細菌又はそのＬＰＳ含有部分に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む。
【００４１】
本明細書に使用される用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、抗体全体及びその任意の抗原結合フラグメント又は誘導体（すなわち「抗原結合部分」）又は単鎖を含む。特定の実施態様では、そのような抗体又は免疫グロブリンは、モノクローナル若しくはポリクローナルの抗体若しくは免疫グロブリン、又は免疫処置された動物若しくは組換え細胞から得られた免疫グロブリン、及びその抗原結合部分を含み得る。
【００４２】
天然抗体では、２つの重鎖がジスルフィド結合により相互に連結しており、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖と連結している。２種類の軽鎖、すなわちラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）がある。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合性などの重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に備わる。抗体結合部位は、主として、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から構成される。時として、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、全体的なドメイン構造に、したがって結合部位に影響する。相補性決定領域又はＣＤＲは、一緒になってネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの各軽鎖及び重鎖は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲをそれぞれ有する。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を表す。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。
【００４３】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているとはいえ、組換え方法を使用して、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対になって一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；及びHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照）を形成する単鎖タンパク質としてそれらのドメインを作ることができる合成リンカーによりそれらを繋ぐことができる。そのような単鎖抗体は、また、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技法を使用して得られ、インタクトな抗体と同様の方法で、フラグメントが有用性についてスクリーニングされる。
【００４４】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の製剤を表す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００４５】
本明細書に使用される用語「組換え抗体」は、動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体と、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ、から単離された抗体と、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体と、免疫グロブリン遺伝子配列の全て又は部分から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、創出又は単離された抗体とのような、組換え手段により調製、発現、創出又は単離された全ての抗体を含む。
【００４６】
用語「免疫グロブリン」は、また、キメラ抗体又はヒト化抗体を含む。
【００４７】
用語「キメラ抗体」は、非ヒト抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、並びにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を表す。
【００４８】
本発明により、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク及び定常領域を有するが、実質的に非ヒト抗体のまさにそのＣＤＲを保持する、抗体を表す。
【００４９】
特定の実施態様では、用語「抗原結合部分」は、抗体のＣＤＲを含む可変ドメインを含む、該抗体又は免疫グロブリンのフラグメントを表す。基本抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどを含む。抗体フラグメントの例として、Holliger et al Nature Biotechnology 23, issue 9 1126 - 1136 (2005)の総説も参照されたい。
【００５０】
用語「Ｆａｂ」は、分子量約５０，０００及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味し、その際、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理することにより得られるフラグメントのうちＨ鎖のＮ末端側約半分及びＬ鎖全体は、ジスルフィド結合を経由して一緒に結合している。
【００５１】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量と抗原結合活性とを有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することにより得られるフラグメントのうちヒンジ領域のジスルフィド結合を経由して結合している、Ｆａｂよりもわずかに大きい抗体フラグメントを表す。
【００５２】
用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる、約５０，０００の分子量と抗原結合活性とを有する抗体フラグメントを表す。
【００５３】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ＶＨをコードする遺伝子及びＶＬをコードする遺伝子がペプチドをコードするリンカーにより連結したものを含む融合遺伝子から通常発現される、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖ同士の結合により自然に形成することができるか、又は二価ｓｃ（Ｆｖ）２のように、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを結合させることにより生成することができるかのいずれかである。
【００５４】
メンドリの天然免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により架橋された軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を有する点で哺乳類免疫グロブリンに似ている。その分子は、抗原結合部位を有する可変部及び定常部で構成されている。メンドリの場合、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、Ｙ（ＩｇＹ）及びＡ（ＩｇＡ）の間で区別される。ＩｇＭは、哺乳類ＩｇＭと同じ機能を有する。ＩｇＭは、全ての脊椎動物に存在し、その高分子量により一次応答を送達する。最近の遺伝研究の結果は、ＩｇＹ分子が系統発生的に哺乳類のＩｇＧ及びＩｇＥの前駆体であることを示唆している。メンドリＩｇＹの重鎖は哺乳類ＩｇＧのヒンジ領域の代わりに追加的な定常ドメインを有するので、ＩｇＹと哺乳類ＩｇＧとの間に構造の明確な差がある。それで、ＩｇＹの分子量はＩｇＧと比較して高い。哺乳類ＩｇＧのようにＩｇＹは、その高い血清中濃度及び低い分子量で第２の応答を送達する免疫グロブリンである。文献では、用語ＩｇＧ及びＩｇＹは、時に、メンドリに関して同義語として使用されるので、最新の知見に基づき、国際ＥＣＶＡＭワークショップの枠組内で、用語ＩｇＹをくまなく使用すべきであることが決定された。（Schade et al 2005）。しかし、本明細書に使用される用語ＩｇＹは、そのようなＩｇＹの任意の抗原結合部分も含む。
【００５５】
「ＬＰＳ産生微生物」は、典型的には、グラム陰性細菌より選択され得、最も好ましくは、ストレプトバシラス モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、髄膜炎菌、クラミドフィラ（Chlamydophila）、クラミジア（chlamydia）、スピロヘータ、シアノバクテリア、プロテオバクテリア フィルム（Proteobacteria phylum）の種、特に腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、エンテロバクター（Enterobacter））、シュードモナス（Pseudomonas）細菌、レジオネラ（Legionella）細菌、ナイセリア（Neisseria）細菌、リケッチア（Rickettsia）細菌、パスツレラ マルトシダ（Pasteurella multocida）細菌及びバクテロイデス門（Bacteroidetes）株の種からなる群より選択され得る。
【００５６】
ＬＰＳ産生微生物の前記ＬＰＳ含有部分は、ＬＰＳ産生微生物により産生されるリポ多糖（ＬＰＳ抗原決定基とも呼ばれる）に対する免疫応答を生じることが可能な任意の抗原であり得る。
【００５７】
特定の実施態様では、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＧ及び／若しくは免疫グロブリンＹ、又はその抗原結合部分を含む又は本質的にそれからなる。
【００５８】
特定の実施態様では、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、ウシＩｇＧ、より具体的には初乳由来ウシＩｇＧ又はその抗原結合部分を含む。
【００５９】
好ましい実施態様では、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、抗ＬＰＳ  ＩｇＹ組成物、最も好ましくは、グラム陰性細菌に対して産生されたポリクローナルＩｇＹ抗体又はその抗原結合部分を含む。
【００６０】
以前の実施態様と組み合わせることができる好ましい実施態様では、ＩｇＹポリクローナル抗体は、少なくとも部分的に卵黄粉末、好ましくは脱脂又は部分脱脂卵黄粉末から得られたものである。
【００６１】
脱脂又は部分脱脂卵黄粉末は、標準的な工程（液体卵黄又は乾燥卵黄粉末からの脂肪の除去）により、好ましくは、限外濾過、水希釈、濾過、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、ヘキサン又は超臨界ＣＯ２を使用することにより得られる。脂肪を除去した後、脱脂された液体卵黄又は卵黄粉末が凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾燥される。
【００６２】
卵黄から得られたＩｇＹ組成物は、典型的には、例えば、ＨＤＬ及びＬＤＬなどのリポタンパク質、並びに卵黄の水溶性タンパク質、α−リベチン（８０kDa）、β−リベチン（４５kDa）及び／又はγ−リベチン（１５０kDa）を含み、該水溶性タンパク質は、卵に見られる酵素の大部分も含む（Ternes, Acker and Scholtyssek, Ei und Eiprodukte, 1994）。
【００６３】
メンドリ（又はその卵）から抗ＬＰＳ  ＩｇＹを得るために、ニワトリは、有利にはＬＰＳ産生微生物により免疫処置され得る。
【００６４】
特定の実施態様では、前記抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、グラム陰性細菌、又は好ましくは少なくとも２つの別個のグラム陰性細菌種由来のそのＬＰＳ含有部分で免疫処置されたメンドリの卵黄から得られた抗ＬＰＳ  ＩｇＹ組成物又はその抗原結合部分を含む。
【００６５】
例えば、抗ＬＰＳ処置の調製に適切な前記ＩｇＹ組成物は、以下の方法により得られ得る：
ａ）メンドリの少なくとも２つの別個の群の各群にＬＰＳ産生グラム陰性細菌で免疫処置し、ここで各群に異なる細菌種が与えられること、
ｂ）少なくとも２つの別個の群のそれぞれから抗体含有画分を得ること、
ｃ）結果として生じた抗体製剤が、各細菌種又はそのＬＰＳ含有部分に対する各抗体画分を全抗体含量の少なくとも３重量％含み、好ましくは、各微生物種に対する各特異的抗体の全量が全抗体含量の≧７重量％であるように、少なくとも２つの抗体含有画分を混合すること。
【００６６】
上記特異的産生方法により、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置は、別個のリポ多糖発現グラム陰性細菌を標的化する少なくとも２つの特異的抗体画分、例えば２つから１０個の間の特異的抗体画分を含むＩｇＹ組成物であり得；各場合において各特異的抗体画分が、抗体製剤の全抗体含量の少なくとも３重量％の抗体含量を有し；好ましくは、リポ多糖発現微生物に対するそのような特異的抗体画分の全量は、抗体製剤の全抗体含量の≧７重量％である。
【００６７】
特定の実施態様では、前記ＩｇＹ組成物は、大腸菌、サルモネラ、シゲラ、クレブシエラ、プロテウス、及びエンテロバクターからなる群より選択されるグラム陰性細菌に対する抗体画分を含む。より具体的には、好ましい一実施態様では、前記ＩｇＹ組成物は、大腸菌に対するポリクローナルＩｇＹからなる１つの画分及びネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）に対するポリクローナルＩｇＹからなる別の画分を含む。
【００６８】
より好ましくは、各特異的抗体画分は、ＩｇＹ組成物の全抗体含量の少なくとも４重量％を占め、なおより好ましくは、該特異的抗体の全量は、抗体製剤の全抗体含量のそれぞれ≧１０重量％である。
【００６９】
特定の一実施態様では、前記抗ＬＰＳ処置は、経口投与用に製剤化される。
【００７０】
好ましくは、前記抗ＬＰＳ処置は、経口投与用の上記ＩｇＹ組成物である。
【００７１】
予後診断方法
本発明の方法は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する患者の応答を予測可能にする。
【００７２】
本明細書に使用される用語「予測する」は、患者が前記処置に応答するかどうかを処置の前に高レベルの確率（統計的に有意）で判定することを可能にする方法を表す。したがって、用語「予測する」は、必ずしも絶対的な応答からなるわけではない。むしろ、この用語は、集団における平均確率と比較して当該患者が良好な応答者である確率がより高いことを判定可能にする応答からなり得る。
【００７３】
本明細書に使用される「抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答」又は「抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する臨床応答」は、該抗ＬＰＳ免疫グロブリンにより処置されるべき疾患の症状の少なくとも１つが、処置前の該症状と比較して処置後に減少している場合に同様に観察される。特定の実施態様では、慢性疾患の該症状は、疼痛、例えば、前記患者により毎日合計されたスコア（ＮＲＳ）（ＮＲＳ疼痛スコア値）により測定されるような慢性疾患に関連する特異的疼痛症状である。そのような特定の実施態様では、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答は、処置前の対応するＮＲＳ疼痛スコア値の平均値と比較して、処置（例えば５日間）後のＮＲＳ疼痛スコア値の平均値の有意な減少がある。
【００７４】
本明細書に使用される用語「減少する」又は「増加する」は、対照値の統計的に有意な減少又は増加、好ましくは、対照値の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％の減少又は増加を意味する。
【００７５】
本発明の方法によると、患者は、処置前に生物学的試料中の予測バイオマーカーの１つ以上の発現の評価に基づき応答者又は非応答者であると予測される。
【００７６】
本明細書に使用される用語「応答者」は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対してプラスの処置応答を示す又は示す可能性のある患者を意味する。実施態様では、応答者は、処置後に有意な疼痛緩和又は少なくとも１つの疼痛症状の全緩和さえ示す又は示す可能性のある、特発性疼痛症候群を患う患者である。
【００７７】
本明細書に使用される用語「非応答者」は、プラスの処置又は抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答を示さない患者か、又は示さない可能性がある患者を意味する。実施態様では、非応答者は、特発性疼痛症候群を患い、かつ処置後に疼痛症状のいずれかの任意の有意な疼痛緩和を示さない患者か、又は示さない可能性がある患者である。
【００７８】
したがって、本発明の方法は、（ａ）前記患者から得られた生物学的試料中の１つ以上の予測バイオマーカーの発現を定量し、（ｂ）得られた発現値を対応する対照値と比較するステップを含む。
【００７９】
本明細書に使用される用語「生物学的試料」は、該生物学的試料が、（ｉ）末梢血液細胞又は（ｉｉ）患者からの末梢血液細胞により産生される核酸若しくはタンパク質を含有しやすいことを条件として、対象から単離された組織、細胞、生体液及びその単離物、並びに対象内に存在する組織、細胞及び液体を含むことが意図される。特定の実施態様では、本発明の方法に使用するための前記生物学的試料は、末梢血液細胞試料及びタンパク質を含む血液試料である。
【００８０】
予測バイオマーカーの発現の定量
本発明の予測方法は、生物学的試料中の予測バイオマーカーの１つ以上の発現を評価するステップを含む。
【００８１】
本明細書に使用される用語「評価すること」は、典型的には、（ａ）前記対象から得られた生物学的試料中の選択された予測バイオマーカーの１つ以上の発現を定量して発現値を得るステップ、及び（ｂ）得られた、該予測バイオマーカーの各発現値を対応する対照値と比較するステップであって、それぞれの対照値と比較された発現値の差が、対象が抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者であることを示すステップを含む。
【００８２】
バイオマーカーの発現は、対象の生物学的試料、例えば血液試料中の予測バイオマーカーの遺伝子又はタンパク質の発現を決定することにより定量することができる。定量は、相対的（バイオマーカーの量を、公知の量のバイオマーカーを有する対照と比較すること、例えばその対照と比較して「より高い」又は「より低い」量を検出することによる）、又はより正確に言えば、少なくとも公知の対照量と比較して特定の量を決定することであり得る。
【００８３】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はその類似体のいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの例であるが、これらに限定されない：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの改変ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド構造への改変は、存在する場合、ポリマーの集合前又は後に付与することができる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により中断される可能性がある。ポリヌクレオチドを、さらに、標識成分とのコンジュゲーションなどによる重合後に改変することができる。本用語は、また、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を表す。特に特定又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるか、又は予測される、２つの相補的一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。
【００８４】
「遺伝子」は、転写及び翻訳された後で特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチド配列は、関連する遺伝子の比較的大きなフラグメント又は全長コード配列を特定するために使用することができる。比較的大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００８５】
「遺伝子発現」、「遺伝子産物」又は「発現」は、全て、本明細書において互換的に使用され、遺伝子が転写及び翻訳されるときに生成される核酸又はアミノ酸（例えば、ペプチド又はポリペプチド）、バイオマーカーのｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列；バイオマーカー遺伝子の発現、バイオマーカータンパク質の発現、バイオマーカーｍＲＮＡの発現；バイオマーカータンパク質の機能的効果、バイオマーカー遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの機能的効果、タンパク質、ｃＤＮＡ、遺伝子又はｍＲＮＡの活性を表す。
【００８６】
特定の実施態様では、「遺伝子発現」、「遺伝子産物」又は「発現」は、ｍＲＮＡ発現、ｃＤＮＡ発現、タンパク質転写及びタンパク質発現を意味する。
【００８７】
用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と互換的に使用され、その最も広い意味で、２個以上のサブユニットアミノ酸の化合物を表す。サブユニットは、ペプチド結合により連結されている可能性がある。
【００８８】
そのような定量方法は、代替的に、例えばリアルタイム定量ＰＣＲを行うことによって、及び、ＤＮＡマイクロアレイ、すなわち前記予測バイオマーカーの増幅されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸が上に所定の位置で結合している基材、を使用することによって、前記予測バイオマーカーの対応するｍＲＮＡを定量することを包含する、前記予測バイオマーカーの対応する遺伝子発現レベルを検出及び定量することを含み得る。
【００８９】
典型的には、特定の実施態様では、患者の生物学的試料から得られた、転写されたポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）の混合物は、逆転写及び定量的増幅に供される。前記ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡは、ＤＮＡマイクロアレイとのストリンジェントなハイブリダイゼーション又はノーザンブロットのいずれかによるインビトロ技法により検出され得る。
【００９０】
いずれにせよ、そのような検出アッセイ法及び定量アッセイ法の一般的原理は、予測バイオマーカー及びプローブを相互作用及び結合させるために適切な条件で十分な時間、予測バイオマーカー及びプローブを含有し得る試料又は反応混合物を調製することで、反応混合物中から検出（及び定量）することができる複合体を形成させることを含む。
【００９１】
バイオマーカーのこれらの検出アッセイ法及び定量アッセイ法は、多様な方法で行うことができる。特定のアッセイ法に適切な条件及びその成分は、当業者に周知である。
【００９２】
特定の実施態様では、予測バイオマーカーｍＲＮＡのレベルは、当技術分野において公知の方法を使用して、インビトロ形式により生物学的試料から決定することができる。
【００９３】
本発明の予測方法を実施する目的で生物学的マーカーを定量するための具体的な方法を本明細書において後述する。それらの方法は、実施例に記載されたLuminex及びＥＬＩＳＡ定量方法を含む。
【００９４】
ｃＤＮＡマイクロアレイによる予測バイオマーカーの定量
本実施態様により、本明細書全体にわたり開示された１５個の予測バイオマーカーのうち１つ又は２、３、４、５つ若しくは６つの組合せに基づきマイクロアレイが構築される場合がある。これらのバイオマーカー用のプローブが、マイクロアレイ上に配置される場合がある。これらのプローブは、ＰＣＲ方法に使用されるプローブと異なり得る。しかし、予測バイオマーカーを有する核酸（ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ物質のＰＣＲ増幅物）だけがハイブリダイズして陽性の結果を与え得るような条件で、それらを設計及び使用すべきである。
【００９５】
好ましい実施態様では、アレイは、さらに、１個以上の対照プローブを含む。
【００９６】
特定の実施態様では、前記プローブは、約５〜約５００個又は約５〜約２００個のヌクレオチド長、より好ましくは約１０〜約１００個のヌクレオチド長、最も好ましくは約１５〜約７０個のヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドであり得る。他の特に好ましい実施態様では、プローブは、約２０又は２５個のヌクレオチド長である。別の好ましい実施態様では、試験プローブは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、天然源から単離若しくはクローニングされる場合があり、又は天然核酸をテンプレートとして使用して天然源から増幅される場合がある。これらのプローブは、予測バイオマーカーの遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有し、その遺伝子の発現を検出するように設計されている。
【００９７】
関心対象の標的核酸（予測バイオマーカーの１個以上の対応する遺伝子発現）と結合する試験プローブに加えて、マイクロアレイは、いくつかの対照プローブを含むことができる。対照プローブは、本明細書において基準化対照；発現レベル対照；及びミスマッチ対照と呼ばれる３つに分類される場合がある。基準化対照は、核酸試料に添加される標識化参照オリゴヌクレオチド又は他の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド又は他の核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後の基準化対照から得られたシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、「読取り」効率及び完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイの間で変動させ得る他の要因における変動に関する対照を提供する。好ましい実施態様では、アレイ中の全ての他のプローブからのシグナル（例えば蛍光強度）の読取りを対照プローブからのシグナル（蛍光強度）で除算することにより、測定値が基準化される。事実上、任意のプローブが基準化対照として役立ち得る。しかし、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成及びプローブ長に応じて変動することが認識されている。好ましい基準化プローブは、アレイ中に存在する他のプローブの平均長を反映するように選択されるが、しかし、一連の長さに及ぶようにそれらを選択することもできる。基準化対照は、また、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することができるが、しかし、好ましい実施態様では、１つ又は少数のプローブだけが使用され、プローブは、十分にハイブリダイズして（すなわち二次構造なし）、いずれの標的特異的プローブともマッチしないように選択される。
【００９８】
発現レベル対照は、生物学的試料中の構成性発現される遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。事実上、任意の構成性発現される遺伝子が、発現レベル対照に適切な標的となる。典型的な発現レベル対照プローブは、ベータ−アクチン遺伝子、ＲＮＡ１８Ｓ、トランスフェリン受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）遺伝子、リボソームタンパク質ラージＰ０（ＲＰＬＰ０）遺伝子、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）遺伝子、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）遺伝子、グルクロニダーゼ−ベータ（ＧＵＳＢ）遺伝子、及びホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子を含む、構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に相補的な配列を有する。
【００９９】
差次的に発現される遺伝子用のオリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体は、当業者に公知の任意の固体又は半固体支持物質であることができる。適切な例には、メンブラン、フィルター、組織培養皿、ポリ塩化ビニル皿、ビーズ、試験ストリップ、シリコン又はガラスベースチップなどが含まれるがこれらに限定されない。適切なガラスウェーハ及びハイブリダイゼーション方法が、広く利用可能である。オリゴヌクレオチドが直接的又は間接的のいずれかで、共有結合的又は非共有結合的のいずれかで結合することができる任意の固体表面を使用することができる。一部の実施態様では、同じ固体支持体に共有結合するオリゴヌクレオチドもあれば、非共有結合するものもあることが望ましい場合がある。好ましい固体支持体は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイ上の所定の位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む。各所定の位置は、１つを超えるプローブ分子を含む場合があるが、所定の位置内の各分子は、同一の配列を有する。そのような所定の位置は、特徴（feature）と称される。
【０１００】
リアルタイム定量ＰＣＲによる予測バイオマーカーの定量
核酸（例えば、予測バイオマーカーのｍＲＮＡ）を定量するための方法は、リアルタイム定量ＰＣＲ方法（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を含み得る。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＰＣＲ産物が各増幅サイクルと共に蓄積するにつれて増加する蛍光レポート分子の検出に基づく。蛍光レポーター分子は、二本鎖ＤＮＡ（例えばSYBR Green I）と結合する色素又は配列特異的プローブ（例えば分子ビーコン又はTaqMan（登録商標）プローブ）を含む。そのような方法は、複数の予測バイオマーカーの発現を平行して定量することが可能な多重定量方法を含む。
【０１０１】
例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ方法の使用により本発明の予測バイオマーカーを定量するために、患者の血液細胞試料が収集される。該血液細胞を溶解し、標準法により全ＲＮＡを抽出する。
【０１０２】
次に、全ＲＮＡ抽出物を逆転写に続いてリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、実施例に記載のような）に供する。
【０１０３】
バイオマーカーポリペプチドの検出及び定量
バイオマーカーの発現レベルは、また、予測バイオマーカーのうち少なくとも１つのタンパク質発現又はタンパク質産物を調査することにより決定することができる。
【０１０４】
タンパク質レベルを決定することは、患者から得られた試料中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、それと結合する抗体の間で起こる任意の免疫特異的結合の量を測定すること、及びこれを、対照試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの免疫特異的結合の量と比較することを含む。バイオマーカーのタンパク質発現の量は、対照の発現と比較して増加又は減少する可能性がある。あるいは、１つを超える予測バイオマーカーの組合せをアッセイすることができる。
【０１０５】
当技術分野において、様々なイムノアッセイ法を含む様々な方法が、そのような生物学的試料中のタンパク質の発現レベルを検出するために公知である。それらには、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合性免疫吸着アッセイ法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫放射定量アッセイ法、インサイツ−イムノアッセイ法（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位体標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、共焦点顕微鏡法、酵素アッセイ法、表面プラズモン共鳴法及びＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
タンパク質レベルを決定することは、例えば、患者から得られた試料中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、それと結合する抗体の間に起こる任意の免疫特異的結合の量を測定することを含む。これらのアッセイ法は、また、標的バイオマーカーに対する標識化抗体の直接結合も含み得る。
【０１０７】
サンドイッチアッセイ法は、最も有用で一般に使用されているアッセイ法に含まれる。サンドイッチアッセイ技法のいくつかの変形が存在し、全てが本発明により包含されることが意図される。簡潔には、典型的なフォワードアッセイ法では、未標識化抗体が固体支持体上に固定化され、結合した分子と被験試料が接触される。抗体−抗原複合体を形成させるために十分な期間の適切なインキュベーション期間の後で、次に、抗原に特異的であるが、検出可能なシグナルを産生することができる、レポーター分子で標識された二次抗体が添加され、別の抗体−抗原−標識化抗体複合体の形成に十分な時間を見込んでインキュベートされる。あらゆる未反応物質が洗浄除去され、抗原の存在が、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定される。結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的、又は既知量のバイオマーカーを含む対照試料と比較することによる定量的のいずれかであり得る。
【０１０８】
フォワードアッセイ法に関する変形は、結合した抗体に試料及び標識化抗体の両方が同時に添加される同時アッセイ法を含む。これらの技法は、容易に明白であるような任意の小さな変形を含めて、当業者に周知である。典型的なフォワードサンドイッチアッセイ法では、バイオマーカーに特異性を有する一次抗体が、固体表面に共有結合又は受動結合される。
【０１０９】
結合工程は、当技術分野において周知であり、一般的に、架橋的共有結合又は物理吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は、被験試料を調製する際に洗浄される。次に、被験試料の一定分量が固相複合体に添加され、抗体に存在する任意のサブユニットを結合させるために十分な時間（例えば２〜４０分又はより好都合ならば一晩）及び適切な条件（例えば、２５℃ないし３２℃（両端の値を含む）などの、室温〜４０℃）でインキュベーションされる。インキュベーション期間に続いて、抗体サブユニットの固相が洗浄及び乾燥され、バイオマーカーの部分に特異的な二次抗体と共にインキュベートされる。二次抗体は、分子マーカーとの二次抗体の結合を指し示すために使用されるレポーター分子と連結されている。
【０１１０】
代替的な方法は、試料中の予測バイオマーカーを固定化すること、及び次にレポーター分子で標識化されている場合もあり、又は標識されていない場合もある特異的抗体に、固定化されたバイオマーカーを曝露することを含む。バイオマーカー標的の量及びレポーター分子のシグナル強度に応じて、結合したバイオマーカー標的は、抗体を用いた直接標識により検出可能であり得る。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識化抗体が、標的−一次抗体複合体に曝露されて標的−一次抗体−二次抗体三元性化合物を形成する。この複合体は、レポーター分子により発生されるシグナルにより検出される。
【０１１１】
本明細書に使用される「レポーター分子」は、その化学的性質により、抗原と結合した抗体の検出を可能にする、分析により特定可能なシグナルを与える分子を意味する。この種のアッセイ法に最も一般に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア又は放射性核種含有分子（すなわち放射性同位体）及び化学発光分子のいずれかである。
【０１１２】
酵素イムノアッセイ法又はＥＬＩＳＡアッセイ法の場合、酵素は、典型的には、一般的にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩により二次抗体にコンジュゲートされ得る。しかし、容易に認識されるように、当業者に容易に利用可能な、多種多様な異なるコンジュゲーション技法が存在する。一般に使用される酵素には、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に使用されるべき基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な変色を産生するために選ばれる。適切な酵素の例には、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。上述の発色基質の代わりに蛍光産物を生じる蛍光基質を採用することも可能である。いかなる場合でも、酵素標識化抗体が、一次抗体−分子マーカー複合体に添加され、結合させられ、次に、過剰な試薬が洗浄除去される。次に、適切な基質を含有する溶液が、抗体−抗原−抗体複合体に添加される。基質が、二次抗体と連結した酵素と反応し、定性的可視シグナルを与え、そのシグナルを通常は分光光度的にさらに定量して、試料中に存在したバイオマーカーの量の示度が与えられる場合がある。
【０１１３】
あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光化合物は、抗体の結合能を変化させずにその抗体と化学的に結合し得る。特定波長の光照明により活性化されると、蛍光色素標識化抗体は光エネルギーを吸着し、分子の励起状態を誘導し、続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色で光を放射する。蛍光標識化抗体は、ＥＩＡの場合と同様に、一次抗体−分子マーカー複合体と結合させられる。未結合の試薬を洗浄除去後に、次に、残りの三元性複合体が適切な波長の光に曝露され、観察された蛍光は、関心対象の分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光及びＥＩＡ技法は、両方とも、当技術分野において非常に確立している。しかし、放射性同位体、化学発光分子又は生物発光分子などの他のレポーター分子も採用される場合がある。
【０１１４】
予測バイオマーカーの発現レベルと対照値との比較
本発明の予測方法の特定の実施態様では、定量するステップは、このように、比較するステップに使用するための「生物学的試料中の各被験バイオマーカーについての「発現値」を得られるようにする。
【０１１５】
比較するステップに使用しやすいように、前記発現値は、発現レベルの絶対値を参照値と比較した後に得られる基準化（相対）値からなり得、該参照値は、例えば、生物学的試料中の参照タンパク質の発現レベル値からなる。
【０１１６】
処置前の患者における予測バイオマーカーの１つ以上の発現の定量後に得られた各発現レベル値は、対応する対照値と比較され、患者が応答者であるか又は非応答者であるかを判定可能にする。
【０１１７】
好ましくは、前記発現レベル値は、絶対発現レベル値を正常値と比較した後に得られる基準化相対値からなり、該正常値は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン、１８Ｓ  ＲＮＡ又はペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）などの構成性（又は参照）遺伝子の発現レベル値からなる。
【０１１８】
前記対照値は、例えば、健康な対象、応答患者及び／又は非応答患者の基準化（相対）平均値の平均値であり得る。そのような基準化平均値の例は、１５個の予測バイオマーカーのそれぞれについて下の実施例に示される。
【０１１９】
前記対照値は、また、本発明の方法のために使用される定量方法及び予測バイオマーカーに応じた日常的な実験法により決定することができる。
【０１２０】
例えば、前記対照値は、非応答患者について観察された発現レベル値に対応し、発現レベル値が対照値と統計的に異なる場合、例えば、対照値と比較して増加している又は対照値と比較して減少している場合、患者は応答者であると予測される。
【０１２１】
あるいは、前記対照値は、応答患者について観察された発現レベル値に対応し、発現レベル値が対照値と統計的に異ならない場合、患者は応答者であると予測される。
【０１２２】
本発明の方法のステップ（ｂ）に言及される比較は、手作業で又はコンピューターを援用して実施され得る。
【０１２３】
コンピューター援用比較のために、発現値は、データベースに記憶された対照値とコンピュータープログラムにより比較され得る。コンピュータープログラムは、さらに、比較の結果を評価する、すなわち、所望の判断を適切な出力形式で自動的に提供する場合がある。
【０１２４】
実施例に示されるように、ＩＬ６及びＢＣＨＥ予測バイオマーカーを除き、全てのバイオマーカーは、０．０００１以下のＰ値を有するので、本明細書に挙げた本発明による予測バイオマーカーのそれぞれは、抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答を予測するために関連している。
【０１２５】
アッセイ法において予測バイオマーカーを組み合わせることにより統計的関連性が改善され得る。特定の実施態様では、本発明の１５個の予測バイオマーカーのうち、２つの予測バイオマーカー、又は３、４、５、６、７若しくは８つの発現レベルまでもが評価される。
【０１２６】
予測バイオマーカーの２、３、４つ又はそれ超の任意の組合せが、本発明の方法により包含される。本発明の方法に使用するための予測バイオマーカーの特定の組合せを以下に挙げる：
（ｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ＋ＣＸＣＬ１０＋ＧＤＮＦ
（ｉｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ＋ＲＡＧＥ
（ｉｉｉ）  ＣＤ１４＋ＣＤ６８＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ
（ｉｖ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ
（ｖ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８
（ｖｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＦＮ−アルファ
（ｖｉｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＲＡＧＥ
又は既述のマーカーとの他の組合せ。
【０１２７】
比較するステップは、必ずしも、各バイオマーカーの発現値を対応する対照値と別々に比較することを含まない場合がある。特定の実施態様では、多バイオマーカーのスコア値は、発現値又はその基準化値を一緒に組み合わせることにより得ることができ、対応する多バイオマーカーのスコア対照値と比較することができる。
【０１２８】
予測バイオマーカー
本発明の１５個の予測バイオマーカーを、Ｇｅｎｂａｎｋ命名法に従って、本明細書において「遺伝子記号」とも称されるその頭字語名により下記に説明する：
【０１２９】
【表１】
2018512857.tif 000002
1http://www.uniprot.org/
【０１３０】
すでに上に説明したように、本発明においてバイオマーカーを参照する場合、代替的に、該バイオマーカーをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）、転写物ＲＮＡ分子若しくは対応するｃＤＮＡ若しくはタンパク質を含むその発現産物及び／又はその翻訳後改変物のいずれかを代替的に参照する場合がある。
【０１３１】
実施例の表２に示すように、予測バイオマーカーＣＤ１４、Ｃ６８、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮα、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＧＤＮＦ、ＲＡＧＥ及びＩＧＦ１の相対発現値ｄＣｔは、非応答患者における対応する相対発現値と比較して、応答患者において有意に低いことが示されている。
【０１３２】
予測バイオマーカーＢＣＨＥの相対発現値は、非応答患者における対応する相対発現値と比較して応答患者において有意に高いことが示されている。
【０１３３】
バイオマーカーの発現についてのアッセイ及び抗ＬＰＳ免疫グロブリンを用いた処置
患者が抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する応答者であると予測された後、該応答患者だけに適切な抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置の投与を、処置のクールにわたり単回、連続的又は間欠的に実施することができる。
【０１３４】
最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療法のために使用される組成物、治療の目的、及び処置される対象に応じて変動する。単回又は多回投与を、処置にあたる医師により選択される用量レベル及びパターンで実施することができる。適切な投薬製剤及び薬剤を投与する方法は、経験的に調整され得る。好ましくは、経口製剤が使用される。
【０１３５】
患者が抗ＬＰＳ免疫グロブリン処置に対する非応答者であると予測される場合、代替的な治療法が好ましい場合がある。
【０１３６】
抗ＬＰＳ処置の施行前に、表１から選択されるバイオマーカーの少なくとも１つをアッセイすることができる。あるいは、表１から選択された１５個のバイオマーカーのうち１つを超える、例えば２、３、４、５、６、７、若しくは８つ、又は全てを一緒にアッセイすることができる。
【０１３７】
本発明のキット
本発明は、また、上に開示された本発明の予測方法を実施するためのキットに関する。キットは、それぞれが予測バイオマーカー（その核酸又はタンパク質のいずれか）のうち１つ以上と特異的に結合することが可能な複数の試薬を含み得る。そのようなキットに適切な試薬には、抗体又は核酸が含まれる。例えば、そのようなキットは、上記のＤＮＡマイクロアレイを含む。そのようなキットは、代替的に、表１に挙げた予測バイオマーカーのうち１つ以上に関するＲＴ−ｑＰＣＲを実施するためのプライマー及びプローブを含み得る。
【０１３８】
したがって、本発明のモニタリング又は予測キットは、それぞれが予測バイオマーカーの１つの特異的な遺伝子又はタンパク質と特異的に結合可能な複数の試薬を含み得る。タンパク質バイオマーカーと特異的に結合するために適切な試薬は、抗体を含むが、これに限定されない。
【０１３９】
特定の実施態様では、キットは、以下の群のバイオマーカーを定量するための特定の試薬を含む：
（ｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ＋ＣＸＣＬ１０＋ＧＤＮＦ；
（ｉｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ＋ＲＡＧＥ；
（ｉｉｉ）  ＣＤ１４＋ＣＤ６８＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ；
（ｉｖ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８＋ＩＦＮ−アルファ；
（ｖ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＬ−８；
（ｖｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＩＦＮ−アルファ；若しくは
（ｖｉｉ）  ＣＤ１４＋ＴＬＲ４＋ＩＧＦ−１＋ＲＡＧＥ、
又は上述の特異的バイオマーカーとの他の組合せ。
【０１４０】
実施例
抗ＬＰＳ  ＩｇＹ処置の準備
下記の試料のための製剤原料の製造工程は、４つの主ステップを含んでいた。第１のステップは、６群のメンドリ（ニワトリ（Gallus gallus domesticus））に大腸菌Ｆ１８及びネズミチフス菌、ポルフィロモナス ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）Ｃ、ミュータンス菌（Streptococcus Mutans）の不活性化全細胞細菌、並びに真菌細胞カンジダ アルビカンス（Candida albicans）の抗原製剤をそれぞれワクチン接種することによるＩｇＹの卵産生であった。６つの異なるメンドリ群を保持した。各群に上記抗原の１つで免疫処置した。第２のステップは、卵黄の分離、低温殺菌及び卵黄の噴霧乾燥を含む卵処理であった。第３のステップは、ヘキサンを用いた脱脂及びオリゴ糖を用いた安定化であり、それに、第４のステップである、ワクチン接種後に６つの群から等量の脱脂卵黄粉末を混合することによる製剤原料の調製が続いた。混合された脱脂卵黄粉末（製剤原料）をそれ以上製剤化しなかった。それを患者に与え、水で嚥下させた。あるいは、それをプレーンヨーグルトの中に混ぜ、次に食べさせることもできた。それぞれの施設内標準を使用する競合ＥＬＩＳＡによりＩｇＹの比活性を測定した。
【０１４１】
実施例１：突発性慢性疼痛症候群を患う患者における予測バイオマーカー
被験患者のコホート
患者が分類にかかわらず慢性特発性疼痛を有し、あらゆる対症処置に許容可能な応答を有さなかった（慢性難治性疼痛症候群）場合、その患者（ｎ＝４０）を含めた。卵成分にアレルギーを有する患者を除外した。患者を４週間にわたり処置した。ＩｇＹ処置の最初の２週間の投薬量は、１日２回１．２５ｇ、続いて後半の２週間に１日２回２．５ｇであった。臨床パラメーター及び検査パラメーターの両方により治療効果を判断した。その結果、検査パラメーターは盲検的な判断を受けた。使用したプロトコールは、地域の医学倫理委員会により承認され、試料を取得する前にインフォームドコンセントが患者により与えられた。
【０１４２】
臨床パラメーター
疼痛の毎日の要約スコア（数値評価尺度ＮＲＳ）及び５つの生活の質のパラメーターを含む患者の疼痛日記。疼痛日記は、３つの異なる分類をされた疼痛症状（長期特発性疼痛を患う患者は、大部分の場合に１つを超える慢性疼痛症候群を示す）を毎日記録する選択肢を有していた。１つを超える慢性疼痛実体を有する患者は、試験の開始前に１回、症状を自分が感じる疼痛強度にグレード分けした（疼痛１＝最高グレード、疼痛３＝最低グレード）。
【０１４３】
試験の主要臨床評価項目を、３つの疼痛症状のうち少なくとも１つの平均ＮＲＳ疼痛スコア値２つの変化として定義した。
【０１４４】
一次評価項目
試験の開始前の５日間の平均値と試験の終了前の５日間の平均値との間の疼痛日誌のＶＡＳ疼痛スコアにおける変化。３つの恒常的疼痛症候群のうち少なくとも１つの数的評価尺度（ＮＲＳ）の少なくとも２点の減少を陽性結果として定義した。標的ＩｇＹを含む脱脂卵黄粉末の有効性を示すことができた。それぞれの患者を「応答者」と名付けた。
【０１４５】
二次評価項目
（ｉ）試験開始前の５日間の平均値と試験終了前の５日間の平均値との間の「生活の質のパラメーター」（疼痛日記のデータ）における変化。数的評価尺度（ＮＲＳ）の少なくとも２点の減少を陽性結果として定義した。
（ｉｉ）処置前の値と処置終了時の値との間のバイオマーカーの値の有意な変化（応答患者を表す）。
（ｉｉｉ）応答者と非応答者との間の治療前検査値の平均の有意な検査差（応答予測バイオマーカーの特定のため）。
（ｉｖ）予想外の有害反応の発生率及び重篤度
【０１４６】
合計４０人の患者から、３８個体からの末梢血を分析し、未処置の健康志願者（ｎ＝３０）の末梢血と比較した。
【０１４７】
リアルタイムＰＣＲ
ｑＲＴ−ＰＣＲを以下のように実施した：ドイツのビュルツブルグ大学で、ＩｇＹで処置された慢性疾患（慢性疼痛症候群）の患者から末梢血を２時点で採取した：（ｉ）ＩｇＹを用いた処置の開始前（Ｔ１＝０週目）及び（ｉｉ）ＩｇＹを用いた４週間処置の後（Ｔ２＝４週目）。
【０１４８】
このために、両時点で患者からＥＤＴＡ末梢血４０mlを採取した。血液細胞を得るために、ＥＤＴＡ血１部と溶解緩衝液（Qiagen社）５部を混合し、室温（ＲＴ）で１５分間保った。次に、チューブを３１１ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のペレットをＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco社）で洗浄した。この手順を３回行った。細胞を計数し、「凍結培地」（すなわち不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Gibco社）＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigma社）を使用して細胞５×１０６個/mlを希釈し、−８０℃で保存した）。
【０１４９】
定量リアルタイムＰＣＲに従う逆転写（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して遺伝子発現を分析した。製造業者の説明書に従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies, Carlsbad, CA）を使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を実施した。
【０１５０】
（ｉ）Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックス（Life Technologies）及びＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ法（Life Technologies）を製造業者の説明書の説明書に従って使用して遺伝子定量を行った。Biorad CFX96 TouchリアルタイムＰＣＲ検出システム（Biorad, Hercules, CA）で分析を行った。Biorad CFX Manager Analysisソフトウェア（Biorad）及びMicrosoft Excel 2010（Microsoft Corporation, Redmond, WA）並びに（ｉｉ）ＳＹＢＲ（登録商標）アッセイ法用のMESA GREEN qPCR MasterMix Plus（Eurogentec, Seraing, Belgium）及びＲＴ２ ｑＰＣＲプライマーアッセイ法（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて定量データを解析した。反応混合物の調製のために、ＳＹＢＲ（登録商標）アッセイ法用のMESA GREEN qPCR MasterMix Plus １２．５μl、ｄＨ２Ｏ ９．５μl及びＲＴ２ ｑＰＣＲプライマーアッセイ １．０μlを混合し、ｃＤＮＡ希釈物（ｃＤＮＡを１００ng含む）２．０μlを添加した。
【０１５１】
製造業者の説明書に従って、Biorad CFX96 TouchリアルタイムＰＣＲ検出システム（Biorad, Hercules, CA）で分析を行った。Biorad CFX Manager Analysisソフトウェア（Biorad）及びMicrosoft Excel 2010（Microsoft Corporation, Redmond, WA）を用いて定量データを解析した。
【０１５２】
ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン、１８Ｓ  ＲＮＡ及びＰＰＩＡを相対定量のために使用した。各試料を二つ組にすることにより再現性を確認した。平均閾値サイクル（Ｃｔ）の値を、レポーターの蛍光が一定の閾値に達するサイクル数として計算した。標的ウェル中の試料の平均Ｃｔ値とハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値との間の差（ｄＣｔ）を判断した。
【０１５３】
治療応答の予測バイオマーカーの特定
試験開始前（初回量のＤＹＰ ＩｇＹ産物の摂取前）及び試験最終日に血液試料を採取した。
【０１５４】
以下のバイオマーカーを分析した：インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）３、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、活性化Ｂ細胞核内因子カッパ−軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、高移動度群タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、サブスタンスＰ、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、フラクタルキン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ塩基性）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ブチリルチオコリン（ＢＣｈＥ）。
【０１５５】
タンパク質及び遺伝子の発現レベルを決定した。イムノビーズ式のマルチプレックスアッセイ法（Luminex分析）を使用して、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、及び塩基性ＦＧＦのタンパク質レベルを血清試料中から二つ組で測定し、捕捉抗体コーティングビーズ及び標識化検出抗体のパネルをBiosource（Camarillo, Germany）から購入した。試薬を予備検査し、製造業者が認定して、抗体コーティングビーズの間の交差反応性がないことを確認した。Bio-Plexシステム（Biosource）を使用してアッセイを行った。製造業者の説明書に従ってイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、患者の血清中からヒトＩＧＦ−１、サブスタンスＰ、ＬＴＢ４、ＲＡＧＥ、及びＢＣｈＥを測定した（R&D Systems, Wiesbaden, Germany）。
【０１５６】
患者から得られ、製造業者の説明書（Nycomed Pharma, Oslo, Norway）に従ってLymphoprep（登録商標）で分離した末梢血試料中の細胞の量を決定するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を２つの時点のそれぞれで使用した。細胞（５×１０５個）をＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ１４、抗ＣＤ６８、ＦＩＴＣコンジュゲート型抗ＣＤ４５及び７ ＡＡＤ、ＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ２５、ＦＩＴＣコンジュゲート型抗ＣＤ３及び７ ＡＡＤ並びにＰＥコンジュゲート型抗マウスＩｇＧ２ａで染色した。全ての抗体をBeckman Coulter（Krefeld, Germany）から購入した。FACS-Epics XL-MCL（Beckman Coulter）を用いた４色フローサイトメトリーを行い、Expo 32取得ソフトウェア（Beckman Coulter）を使用して細胞を分析した。視認可能なリンパ球をゲート通過させ、１０５個のイベントを収集した。
【０１５７】
結果
−  女性２４人及び男性１４人の患者３８人が試験を完了した。患者の平均年齢は５４歳であり、平均疼痛歴期間は１２．６年であった。
−  患者３８人全てが少なくとも１つの疼痛の経過を記録し、患者３０人が少なくとも２つの異なる分類をされた疼痛症候群の経過を記録し、２６人が３つの異なる分類をされた疼痛症候群の経過を記録した。
−  分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、ＩｇＹ処置に対する応答被験患者群について有意な疼痛緩和が示され、加えて、応答者を一緒の群に入れた場合、疼痛症候群１、２及び３について疼痛緩和が有意であった。これは、応答患者が群として平均して１つの疼痛症候群において有意な軽減並びに第２及び第３の疼痛実体において同じ軽減を示したことを意味する。
−  試験を完了した対象３８人のうち２４人が、主要評価項目の定義に従ってＩｇＹ応答者として特定された。
−  ２４人のＩｇＹ応答者全てが臨床応答基準及び検査応答基準の両方を満たした。
−  １４人の対象が、臨床応答基準及び検査応答基準の両方に届かないＩｇＹ非応答者として特定された。
−  関連する検査パラメーター（遺伝子発現）を、治療に関連するＩｇＹ効力についての潜在的な予測バイオマーカーとして特定することができた。
−  患者２人が、プロトコールの違反のため、１人が試験終了の数日前に発生した持続性の咳のため、試験から脱落した。
【０１５８】
主な治療効果は、ＩｇＹ投薬量２×２．５ｇでの試験の第二部の間に発生した。
【０１５９】
ＩｇＹ処置のための潜在的な予測マーカーとして選ばれた予測バイオマーカーの統計解析及び特定
Ｔ検定を使用して、健康志願者と非応答者又は応答者との間、及び非応答者と応答者との間で、使用された各パラメーターを比較した。さらに、それぞれのパラメーターも、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して非応答者及び応答者と一緒に健康志願者を比較した。使用した統計プログラムはGraphPad Prism5であった。健康志願者及び非応答者及び応答者の間でｐ＜０．０５で有意差があったパラメーターを、ＩｇＹ処置に関する潜在的な予測マーカーとして選んだ。
【０１６０】
下の表２に、応答者群と非応答者群との間の各予測バイオマーカーについての相対発現データを、統計的有意性を示すＰ値と共に示す。
【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
結論
多価抗グラム陰性全細菌免疫グロブリンＹは、慢性化の最晩期の患者であっても、特発性疼痛症候群を処置する完全に新しいアプローチを与え、広範囲にわたる慢性痛表現型の非常に複雑な病因における一主要構成要素として、新しい一般病原性メカニズムを初めて強調している。
【０１６３】
多価抗グラム陰性全細菌免疫グロブリンＹの経口適用は、患者の６０％超（治療応答者）に持続可能な疼痛緩和を招いた。
【０１６４】
健康な対象と疼痛患者とを識別するだけでなく、ＩｇＹ処置に応答する患者と応答しない患者とも識別する予測バイオマーカーが特定された。この観察は、適用前の経口多価抗グラム陰性全細菌免疫グロブリンＹの治療応答検査に予後診断の検査室スクリーニング検査が利用可能であることを示している。
【０１６５】
この観察を通して、潜在的な予測マーカーの代表例は、抗ＬＰＳ免疫グロブリン療法のための処置応答基準として血中のそのようなマーカーを用いて患者集団を特定できるようにする。
【０１６６】
参考文献
【０１６７】
【表３】
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【国際調査報告】
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