(57)【要約】  本開示は、水溶性の近赤外(NIR)発光性化合物、その化合物を作製する方法、及びその化合物の使用を提供する。【選択図】図１
2018533640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I又は式II:
【化１】
2018533640.tif 000026
(式中、
A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
X1〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
W1は、分子ワイヤ部分であり、
R1〜R5のうちの少なくとも1つは、スルホン酸基である)
の構造を含む化合物。
【請求項２】
式I(a):
【化２】
2018533640.tif 000027
(式中、
R2〜R11は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルキル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
以下:
【化３】
2018533640.tif 000028
の構造を含む、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
以下:
【化４】
2018533640.tif 000029
の構造を含む、請求項2に記載の化合物。
【請求項５】
式II:
【化５】
2018533640.tif 000030
(式中、
A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
W1は、分子ワイヤ部分であり、
X1、X2及びX4〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1、R2及びR4〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
式II(a):
【化６】
2018533640.tif 000031
(式中、
L1は、
【化７】
2018533640.tif 000032
2018533640.tif 000033
及び上述の任意の組合せからなる群から選択され、
A1〜A8は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2からそれぞれ独立して選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
X1、X2及びX4〜X42は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1、R2及びR4〜R54は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
n1〜n8は、独立して、0〜10から選択される整数である)
の構造を含む、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
式II(b):
【化８】
2018533640.tif 000034
(式中、
X1、X2及びX4〜X20は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R2、R4〜R11及びR16〜R26は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
n1は、0〜5の整数である)
の構造を含む、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
式II(c):
【化９】
2018533640.tif 000035
(式中、
R16、R17、R19及びR20は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
n1は、0〜5の整数である)
の構造を含む、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
以下:
【化１０】
2018533640.tif 000036
の構造を含む、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
以下:
化合物が、入射光による励起時に、遠赤外光から近赤外光を発する、
化合物が水溶性である、
化合物が、最小限のソルバトクロミズムを示す、
化合物が、酸性環境又は塩基性環境のどちらでもスピロ環化を受けない、及び/又は
化合物が、光誘起電子移動を受けることができる、
の特徴のうちの1つ以上を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
化合物が、入射光による励起時に、遠赤外光から近赤外光を発することを特徴とし;水溶性であり;最小限のソルバトクロミズムを示し;酸性環境又は塩基性環境のどちらでも、スピロ環化を受けず;かつ光誘起電子移動を受けることができる、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
細胞をイメージングする方法であって、
細胞と請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物とを接触させるステップ、
第1の波長を有する光を細胞に照射するステップ、
第2の波長を有する光を検出することにより、細胞をイメージングするステップ
を含み、
光の第1の波長及び第2の波長が、異なる波長を有しており、第2の波長を有する光が、遠赤外から近赤外領域にある方法。
【請求項１３】
細胞と1つ以上の追加の光遺伝学的ツールとを接触させるステップ、及び
1つ以上の追加の波長の発光を検出することにより細胞をイメージングするステップ
をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
1つ以上の光遺伝学的ツールが、GFP、Ca2+インジケーター、cpGFPに基づく電圧センサー及びチャネルロドプシン2(ChR2)から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
膜電位を変化させる細胞における、膜電位の変化を測定する方法であって、
細胞と請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物とを接触させるステップ、
細胞を刺激して、活動電位を誘発するステップ、並びに
光学サンプリング及び/又は電気サンプリングにより、活動電位の発火を測定するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
光学サンプリングが、電子増倍型電荷結合素子を使用して測定される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、ホールセル電流クランプ法を使用して、又はフィールド刺激によって刺激される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、ニューロン、心筋細胞、筋細胞又は分泌細胞である、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
ニューロンの膜電位をインテロゲートする、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
緩衝溶液中に請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物を含む、又は緩衝溶液中に請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物を含む高濃度溶液であってその後使用前に希釈される溶液を含む、複数のアリコートを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119のもと、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、2015年7月28日出願の、仮特許出願第62/197,905号の優先権を主張する。
【０００２】
米国政府のライセンス権利
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された、助成金番号NS078561のもとで、米国政府の支援により行われたものである。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、水溶性の遠赤外から近赤外(NIR)発光性化合物、その化合物を作製する方法、及びその化合物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ニューロン及び心筋細胞のような興奮性細胞の膜電位(Vmem)の迅速な変化は、細胞のシグナル伝達、及びこのような特殊細胞の生理学的プロファイルを規定する中心的な役割を果たす。従来、Vmemはパッチクランプ電気生理学によりモニタリングして測定され、この場合、対象とする細胞に取り付けたマイクロ電極により、優れた時間的分解能で、膜電圧を非常に高い感度で記録することが可能になる。しかし、電極の使用は、非常に侵襲的であり、単細胞の細胞体に記録を制限し(空間クランプエラー)、著しく低いスループットである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、光電圧感知のための、光安定性の近赤外(NIR)プラットフォームの設計及び合成を提供する。本開示の化合物は、膜電圧の光学調査(インテロゲーション interrogation)のための光誘起電子移動(PeT)トリガーを使用する、NIR電圧感受性色素の分類である。本明細書において開示されている化合物は、生きている細胞において、鮮明な膜局在型NIR蛍光を示し、高い光安定性を有しており、かつニューロンにおいて優れた電圧感度を示す。本開示の化合物は、細胞小器官、Ca2+インジケーター及び電圧感受性蛍光タンパク質向けの蛍光染色剤と一緒に使用することができ、光遺伝学的アクチュエーターと組み合わせて使用することができる。本開示の化合物の高い、速度、感度、光安定性及びNIR蛍光プロファイルにより、本化合物は、ニューロン活動を非侵襲的に検討するための有用なプラットフォームになる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、式I:
【０００７】
【化１】
2018533640.tif 000003
(式中、A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、X1〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、R1〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、R1〜R5のうちの少なくとも1つは、スルホン酸基である)
の構造を含む化合物を提供する。
【０００８】
さらなる実施形態では、本開示はまた、式I(a):
【０００９】
【化２】
2018533640.tif 000004
(式中、R2〜R11は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルキル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を含む化合物を提供する。
【００１０】
さらに別の実施形態では、本開示は、以下:
【００１１】
【化３】
2018533640.tif 000005
の構造を含む化合物を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本開示は、以下:
【００１３】
【化４】
2018533640.tif 000006
の構造を含む化合物を提供する。
【００１４】
本開示はまた、式II:
【００１５】
【化５】
2018533640.tif 000007
(式中、A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、W1は、分子ワイヤ部分であり、X1、X2及びX4〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、R1、R2及びR4〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を含む化合物を提供する。
【００１６】
本開示はまた、式II(a):
【００１７】
【化６】
2018533640.tif 000008
(式中、L1は、
【００１８】
【化７】
2018533640.tif 000009
及び上述の任意の組合せからなる群から選択され、A1〜A8は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2からそれぞれ独立して選択され、R'は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、X1、X2及びX4〜X42は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、R1、R2及びR4〜R54は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、n1〜n8は、独立して、0〜10から選択される整数である)
の構造を含む化合物を提供する。
【００１９】
特定の実施形態では、本開示は、式II(b):
【００２０】
【化８】
2018533640.tif 000010
(式中、X1、X2及びX4〜X20は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、R2、R4〜R11及びR16〜R26は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、n1は、0〜5の整数である)
を含む化合物をさらに提供する。
【００２１】
ある種の実施形態では、本開示は、式II(c):
【００２２】
【化９】
2018533640.tif 000011
(式中、R16、R17、R19及びR20は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、n1は、0〜5の整数である)
の構造を含む化合物を提供する。
【００２３】
なおさらなる実施形態では、本開示はまた、以下:
【００２４】
【化１０】
2018533640.tif 000012
の構造を含む化合物を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本明細書において開示されている化合物は、以下の特徴のうちの1つ以上を有する:本化合物は、入射光による励起時に、遠赤外光から近赤外光を発光する;本化合物は水溶性である;本化合物は最小限のソルバトクロミズムを示す;本化合物は、酸性環境又は塩基性環境のどちらでも、スピロ環化を受けない;及び/又は本化合物は、光誘起電子移動を受けることができる。さらなる実施形態では、本明細書において開示されている化合物は、入射光による励起時に、遠赤外光から近赤外光を発光することを特徴とし;水溶性であり;最小限のソルバトクロミズムを示し;酸性環境又は塩基性環境のどちらでも、スピロ環化を受けず;かつ光誘起電子移動を受けることができる。
【００２６】
本開示はまた、細胞をイメージング(画像化)する方法であって、細胞と本明細書において開示されている化合物とを接触させるステップ、第1の波長を有する光を該細胞に照射するステップ、第2の波長を有する光を検出することにより細胞をイメージングするステップを含み、光の第1の波長及び第2の波長は、異なる波長を有しており、第2の波長を有する光は、遠赤外から近赤外領域/波長にある、方法を提供する。さらなる実施形態では、本方法は、細胞と1つ以上の追加の光遺伝学的ツールとを接触させるステップ、及び1つ以上の追加の波長の発光を検出することにより該細胞をイメージングするステップをさらに含む。光遺伝学的ツールの例には、以下に限定されないが、GFP、Ca2+インジケーター、cpGFPに基づく電圧センサー及びチャネルロドプシン2(ChR2)が含まれる。
【００２７】
本開示は、興奮性細胞における膜電位の変化を測定するための方法であって、該興奮性細胞と本明細書において開示されている化合物とを接触させるステップ、該細胞を刺激して活動電位を誘発するステップ、及び光学又は電気サンプリングにより、活動電位の発火を測定するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、この光学サンプリングは、電子増倍型電荷結合素子を使用して測定される。さらに別の実施形態では、興奮性細胞は、ホールセル電流クランプ法を使用して、又はフィールド刺激によって刺激される。興奮性細胞の例には、以下に限定されないが、ニューロン、心筋細胞、筋細胞又は分泌細胞が含まれる。さらに別の実施形態では、本方法は、ニューロンの膜電位を調査(インテロゲート)する。
【００２８】
特定の実施形態では、本開示はまた、緩衝溶液中に本明細書において開示されている化合物を含む、又は緩衝溶液中に本明細書において開示されている化合物を含む濃縮溶液であってその後使用前に希釈される溶液を含む、アリコートを含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ−Ｆ】Berkeley Red Sensor of Transmembrane potential 1(BeRST 1)のインビトロ及び細胞的特徴付けを示す図である。(A)水性緩衝液(50mM TBS、pH7.5、0.1%SDS)中のBeRST1の吸光度(青色)及び発光(赤色)スペクトルである。635nmで励起した。(B)HEK細胞中のBeRST1及びVF2.1.Cl色素の光安定性である。細胞に、200nMのBeRST1又はVF2.1.Clをロードし、次に、162W/cm2で、631nm(BeRST1)又は475nm(VF2.1.Cl)の一方で、10分間、連続照射した。画像は、20秒間の間隔で取得した。色素をロードした細胞に由来する正規化した蛍光強度を時間に対してプロットした。マゼンタ色の円は、BeRST1で染色された細胞を表し、緑色の円は、VF-2.1.Clで染色した細胞を表す。エラーバーは、n=6の個別の実験に対する、平均の標準誤差である。BeRST1による多色落射蛍光イメージングである。HEK細胞に、1μMのBeRST1、1μのHoechst33342及び5μMのローダミン123をロードした。(C)細胞膜に局在化しているBeRST1蛍光である。(D)ミトコンドリアに局在化しているローダミン123の蛍光である。(E)核に局在化しているHoechst33342の蛍光である。及び(F)HEK細胞の透過光DICである。スケールバーは10μmである。
【図２Ａ−Ｅ】Berkeley Redの分光学的特徴付けを示す図である。(A)水性緩衝液中のBRの吸光度(青色)及び発光(赤色)スペクトルである。(B)様々な誘電率(10〜90%の範囲のジオキサン/水の混合物によって達成される)又は(C)pH(2.5〜9の範囲)におけるBRのUV可視スペクトルである。BRの相対吸光度対(D)誘電率及び(E)pHのプロットである。
【図３Ａ−Ｃ】HEK細胞における(A、B) Berkeley Red及び(C)BeRST1の落射蛍光イメージングを表す図である。(A)1μMのBRにより染色されて、631nmの光(188W/cm2)を照射された細胞は、無視できる程の細胞蛍光しか示さない。(B)パネル(A)が明るく見えるのは、細胞内及び細胞外の空間間の非常に乏しいコントラストと共に、少量の色素の内在化(インターナリゼーション)を示している。(c)1μMのBeRST1により染色されて、631nmの光(80W/cm2、パネル(A)の2.4分の1(2.4x less)の光強度)を照射された細胞である。明瞭な膜染色が観察される。イメージングパラメータ及びディスプレイの設定はすべて、BeRST1の照射の場合に光強度が2.4分の1であることを除いて、パネル(A)及び(C)は同じである。スケールバーは20μmである。
【図４Ａ−Ｂ】HEK細胞におけるBeRST1の電圧感度を示す図である。(A)ホールセル電圧クランプ条件下における、BeRST1染色HEK細胞からの、蛍光の分数変化率(ΔF/F)対時間のプロットである。細胞を-60mVに保持し、20mV刻みで段階的に過分極電位又は脱分極電位(±  100 mV)にした。(B)ΔF/F対最終膜電位のプロットである。(エラーバーは、3つの異なる培養物から、n=15の細胞の平均の±標準誤差である)。
【図５Ａ−Ｄ】BeRST1による活動電位(AP)の視覚化を示す図である。(A)ラット海馬ニューロンを(B)1μMのBeRST1により染色し、フィールド刺激して、活動電位を誘発し、それを(C)光学的に記録した。光学サンプリング周波数は500Hzであり、EMCCDカメラを用い、63倍の倍率の下でで得る。スケールバーは10μmである。別の実験において、ニューロンにホールセル電流クランプを施し、活動電位の発火を誘起するよう刺激した。電気的及び光学的の両方(dual)の記録(1.8kHzのフレームレート)がパネル(D)に示されている。黒色トレースは電気生理学的記録であり、赤い丸は、光学的応答を表している。黒色トレースにおける活動電位の前後に、小さな刺激アーチファクトがあるのが明らかである。
【図６Ａ−Ｅ】1μMのBeRST1をロードした、又は何もロードしていないラット海馬ニューロンにおける、細胞の電気生理学的パラメータの比較を提示している図である。色素がロードされた条件及び色素不含の条件下で、誘発された活動電位を評価した。ロードしていないニューロン及び1μMのBeRST1をロードしているニューロンについて、全体でn=12及びn=11の細胞の活動電位を平均した。(A)ピーク活動電位の振幅、(B)半値全幅によって測定される活動電位期間、(C)細胞キャパシタンス、(D)立ち上がり時間又は(E)減衰時間を含めた、いくつかの電気生理学的パラメータ全体に統計的に有意な差異はない。対応のないt検定はp>0.5である。エラーバーはSEMである。
【図７Ａ−Ｈ】BeRST1によるGFP-ポジティブラット海馬ニューロンの誘発活動のイメージングを示す図である。(A)GFPを発現して(B)BeRST1により染色されたニューロンに由来する活動電位は、フィールド刺激により誘発され、パネル(A)及び(B)に表示されている対象とする領域で記録した(C〜H)。刺激を5Hzで与え、500Hzで光学的に記録した。
【図８Ａ−Ｃ】BeRST1によるGFP標識された細胞における自発的電圧のイメージングを示す図である。(A)GFPを発現して(B)BeRST1により染色されたラット海馬ニューロンの落射蛍光画像である。スケールバーは20μmである。(C)パネル(A)及び(B)に由来するニューロンの自発活動の光学トレースである。トレースの隣の数字は、パネル(B)中で表示されている細胞に相当する。光学サンプリングレートは、500Hzである。トレースは、バックグラウンドを相殺し、脱色(bleaching)は、Clampfitで補正した。
【図９Ａ−Ｅ】BeRST1及びGCaMP6sによる、電圧及びCa2+イメージングの両方を提示している図である。(A)BeRST1により染色され(B)GCaMP6sを発現したラット海馬ニューロンの落射蛍光画像である。スケールバーは20μmである。(C)パネル(A)及び(B)における、ニューロンのフィールド刺激中の逐次的なCa2+及び電圧のイメージングである。電圧(上側)及びCa2+(下側)により誘起された、蛍光の変化である。(D)電圧(左側)及び(E)Ca2+(右側)により誘起された、表示周波数における一連の活動電位に対する蛍光応答である。光学サンプリングレートは、BeRST1の場合、500Hzであり、GCaMP6sの場合、40Hzである。
【図１０Ａ−Ｆ】遺伝学的にコードされた電圧-蛍光タンパク質及び低分子の電圧感受性色素による、2色電圧イメージングを示す図である。(A)BeRST1により染色され(B)電圧感受性蛍光タンパク質ASAP1を発現したラット海馬ニューロンの落射蛍光画像である。(C)BeRST1染色、又は(D)ASAP1蛍光による、電圧の機能イメージングに関する拡大領域である。この拡大領域は、パネル(A)及び(B)中の白い四角い枠に対応している。スケールバーはすべて、20μmである。(E)BeRST1蛍光(上側のトレース)又はASAP1蛍光(下側のトレース)の変化によって検出される、5Hzでのフィールド刺激によって誘発される一連の活動電位である。(F)パネル(E)から拡大した単一活動電位である。マゼンタ色はBeRST1であり、緑色はASAP1蛍光である。光学サンプリングレートは、1.25kHzとした。トレースはバックグラウンドで補正済みであるが、脱色補正はしていない。
【図１１Ａ−Ｅ】ラット海馬ニューロンにおけるBeRST1の交互励起(クロス励起)を提示している図である。パネルA〜Cは、1μMのBeRST1をロードした培養物に由来する、(A)631nm、(B)475nm又は(C)390nm(波長はすべて9.7W/cm2である)で励起されたニューロンの同じ領域を表している。スケールバーは20μmである。(D)680nmにおける相対発光強度を各励起条件について定量する。エラーバーは、n=5の個別の細胞について、±SEMである。(E)631nm(6.7W/cm2)又は390nm(3.3W/cm2)の光で励起された場合の、BeRST1により染色されたニューロンの電圧感度である。蛍光の分数変化率は、(n=4の個別の細胞)、631nm及び390nmの励起について、それぞれ100mVあたり26%及び28%のΔF/Fであると算出される。
【図１２Ａ−Ｃ】BeRST1及びBRのインビトロでの交互励起を提示している図である。異なる励起波長を用いる、水性緩衝液(50mM TBS、pH7.5、0.1%SDS)中の、(A)BeRST1及び(B)BRの発光スキャンである。(C)BeRST1(黒色棒)及びBR(灰色棒)に関する、680nmにおける相対蛍光発光強度対励起波長である。
【図１３Ａ−Ｆ】BeRST1及びChR2による、光学電気生理学を示す図である。(A)YFP-ChR2を発現した(B)BeRST1により染色されたラット海馬ニューロンの落射蛍光画像である。パネル(B)上の挿入図は、点線の白い四角い枠により記入されている領域である。挿入画像は、パネル(D)及び(F)に関してデータを取得するために使用した単一の枠である。スケールバーは、20μm(パネルA/B)及び10μm(パネル(B)、挿入図)である。YFP-ChR2を発現し、BeRST1により染色されたニューロンの光遺伝学的刺激によって誘発される、膜電位の変化の(C)電気生理学的及び(D)光学的な記録を同時に示す。シアン光(475nmのLED、80mW/cm2)を、5Hzのレートで5msのパルスで与えた。パネル(C)及び(D)からの、赤い点線の四角い枠で強調されている活動電位の(E)電気生理学的及び(F)光学的記録の拡大表示である。光学サンプリングレートは、1KHzとした。光学トレースは、バックグラウンドで補正済みであるが、脱色補正はしていない。
【図１４Ａ−Ｅ】BeRST1及びChR2による、すべての光学電気生理学を示す図である。(A)BeRST1により染色され(B)YFP-ChR2を発現したラット海馬ニューロンの落射蛍光画像である。(C)パネル(A)中の白い四角い枠の拡大表示である。この画像は、パネル(D)及び(E)に関してデータを取得するために使用した単一の枠である。スケールバーは、20μmである。(D)10Hz又は(E)5Hzのレートのシアン光(475nm、0.08W/cm2)の5msパルスにより、パネル(A〜C)における、ニューロンの光遺伝学的刺激に対する光学的(上側)及び電気生理学的(下側)応答である。細胞を取り付けたパッチクランプ構成において、20kHzのサンプリングレートで電気生理学的記録を得た。1kHzで得た光学トレースは、脱色補正をしなかった。
【図１５Ａ−Ｇ】ネットワーク活動を撹乱するためのBeRST1及びChR2の使用を示すた図である。YFP-ChR2発現細胞において、(A)YFP-ChR2をトランスフェクトした、及び(B)BeRST1により染色された培養ラット海馬(C)ニューロンを、個別に2回、3秒間、475nmの光(80mW/cm2、5ms、5Hz、シアン色の棒)により刺激して活動を誘発した。スケールバーは20μmである。(D)パネル(C)における、DIC画像からのニューロンの略図であり、(E〜G)における対応するトレースと合致するよう色分けされている。青色ChR2+細胞は、見える範囲において、他のニューロンへの結合が可能になることが図示されている。BeRST1応答の光学的記録は、約30秒間で分離された(二重線(double hash))、(E)光学的記録セッション及び(F)その後の試験の間に、sCMOSカメラを用いて500Hzで取得した。トレースの数及び色は、パネル(A〜D)における、特定のニューロンを指す。赤い四角い枠は、パネル(G)において、明確とするために拡大したトレース領域を示す。灰色の点線は、パネル(G)において、BeRST1により染色されたニューロンのスパイクタイミングを目視で評価する一助となるよう提示されている。
【図１６】YFP-ChR2を発現するニューロンを示す図である。スケールバーは20μmである。画像領域全体は、665×665μmである。点線の四角い枠は、図15からのおおよそのイメージング領域を表示している。
【図１７】2,5-ジブロモ-ベンゼンスルホン酸イソプロピルエステルの1H NMRを示す図である。
【図１８】2,5-ジブロモ-ベンゼンスルホン酸イソプロピルエステルの13C NMRを示す図である。
【図１９】ブロモ-BRの1H NMRを示す図である。
【図２０】ブロモ-BRの13C NMRを示す図である。
【図２１】BRの1H NMRを示す図である。
【図２２】BRの13C NMRを示す図である。
【図２３】BeRST1の1H NMRを示す図である。
【図２４】BeRST1の13C NMRを示す図である。
【図２５】254nm及び650nmにおける、BeRST1のHPLCトレースを示す図である。
【図２６】2,5-ジブロモ-ベンゼンスルホン酸イソプロピルエステルに由来する有機リチウム試薬をその後のH+によりクエンチした(粗製反応混合物)、1H NMRスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「フルオロフォア」と言う場合、複数のこのようなフルオロフォアが含まれ、「電圧感受性色素」と言う場合、1つ以上の電圧感受性色素、又は当業者に公知のその等価物などが含まれる。
【００３１】
同様に、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び/又は」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」及び「含んでいる(including)」は、交換可能であり、限定を意図するものではない。
【００３２】
様々な実施形態の記載が、用語「を含む」を使用している場合、当業者であれば、一部の具体的な場合において、実施形態は、言い回し「から本質的になる(consisting essentially of)」又は「からなる(consisting of)」を使用して、代替的に説明され得ることを理解しているとさらに理解されたい。
【００３３】
本明細書において明記されている刊行物はすべて、本明細書における記載に関連して使用され得る方法を記載及び開示するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。さらに、刊行物において示されている、この開示中に明確に定義されている用語と類似の又は同等のいずれの用語に関しても、この開示において明確に提示されている用語の定義が、すべての点で優先するであろう。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語はすべて、この開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものに類似又は等価な多数の方法及び試薬が、本開示の方法及び組成物の実施に使用され得るが、例示的な方法及び物質をこれから記載する。
【００３５】
用語「アルキル」とは、炭素間に単共有結合を含む、炭素原子及び水素原子からなる有機基を指す。通常、この開示において使用される「アルキル」は、特に明記しない限り、1〜30個の炭素原子を含有する有機基を指す。2個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素は、直鎖状に結合されていてもよく、又は代替として、3個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素はまた、分岐状に連結されて、主鎖が1個以上の第二級、第三級又は第四級炭素を含有してもよい。アルキルは、特に明記しない限り、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい。
【００３６】
用語「アルケニル」とは、2個の炭素間に少なくとも1つの二重共有結合を含む、炭素原子及び水素原子からなる有機基を指す。通常、この開示において使用される「アルケニル」は、特に明記しない限り、1〜30個の炭素原子を含有する有機基を指す。C1-アルケニルは、主鎖の炭素に二重結合を形成することができるが、3個以上の炭素からなるアルケニル基は、2つ以上の二重結合を含むことができる。場合によっては(it certain instances)、アルケニル基は共役しており、別の場合、アルケニル基は共役しておらず、さらに別の場合、アルケニル基は、共役による広がりを有していること、及び非共役による広がりを有していることがある。さらに、2個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素は、直鎖状に結合されていてもよく、又は代替として、4個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素はまた、分岐状に連結されて、主鎖が1個以上の第二級、第三級又は第四級炭素を含有してもよい。アルケニルは、特に明記しない限り、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい。
【００３７】
用語「アルキニル」とは、2個の炭素間に三重共有結合を含む、炭素原子及び水素原子からなる有機基を指す。通常、この開示において使用される「アルキニル」は、特に明記しない限り、1〜30個の炭素原子を含有する有機基を指す。C1-アルキニルは、主鎖の炭素に三重結合を形成することができるが、3個以上の炭素からなるアルキニル基は、2つ以上の三重結合を含むことができる。2個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素は、直鎖状に結合されていてもよく、又は代替として、5個以上の炭素が存在する場合、これらの炭素はまた、分岐状に連結されて、主鎖が1個以上の第二級、第三級又は第四級炭素を含有してもよい。アルキニルは、特に明記しない限り、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい。
【００３８】
用語「シクロアルキル」とは、この開示において使用する場合、環を形成するように結合される、少なくとも3個〜12個以下の炭素原子を含むアルキルを指す。この開示のための「シクロアルキル」は、1〜12個のシクロアルキル環を包含し、この場合、シクロアルキルが、2つ以上の環である場合、このシクロアルキル環は、連結される、縮合される又はそれらの組合せになるように結合されている。シクロアルキルは、置換されていてもよく、若しくは非置換であってもよく、又は2つ以上のシクロアルキル環の場合、1つ以上の環は非置換であってもよく、1つ以上の環は置換されていてもよく、又はそれらの組合せであってもよい。
【００３９】
用語「シクロアルケニル」とは、この開示において使用する場合、環を形成するように結合される、少なくとも3個〜12個以下の炭素原子を含むアルケンを指す。この開示のための「シクロアルケニル」は、1〜12個のシクロアルケニル環を包含し、この場合、シクロアルケニルが、2つ以上の環である場合、このシクロアルケニル環は、連結される、縮合される又はそれらの組合せになるように結合されている。シクロアルケニルは、置換されていてもよく、若しくは非置換であってもよく、又は2つ以上のシクロアルケニル環の場合、1つ以上の環は非置換であってもよく、1つ以上の環は置換されていてもよく、又はそれらの組合せであってもよい。
【００４０】
この開示において使用される用語「アリール」は、環原子として炭素しか含んでいない非局在化パイ電子雲を有する、共役平面環系を指す。この開示のための「アリール」は、1〜12のアリール環を包含し、この場合、アリールが、2つ以上環である場合、これらのアリール環は、連結される、縮合される又はそれらの組合せになるように結合されている。アリールは、置換されていてもよく、若しくは非置換であってもよく、又は2つ以上のアリール環の場合、1つ以上の環は非置換であってもよく、1つ以上の環は置換されていてもよく、又はそれらの組合せであってもよい。
【００４１】
この開示において使用される用語「複素環」は、少なくとも1個の非炭素環原子を含有する環構造を指す。この開示のための「複素環」は、1〜12個の複素環を包含し、この場合、複素環が、2つ以上の環である場合、この複素環は、連結される、縮合される又はそれらの組合せになるように結合されている。複素環は、複素アリール若しくは非芳香族であってもよく、又は2つ以上の複素環の場合、1つ以上の環は非芳香族であってもよく、1つ以上の環はヘテロアリールであってもよく、又はそれらの組合せであってもよい。複素環は、置換されていてもよく、若しくは非置換であってもよく、又は2つ以上の複素環の場合、1つ以上の環は非置換であってもよく、1つ以上の環は置換されていてもよく、又はそれらの組合せであってもよい。通常、非炭素環原子は、N、O、S、Si、Al、B又はPである。2個以上の非炭素環原子が存在する場合、これらの非炭素環原子は、同一元素、又はN及びOなどの異なる元素の組合せのどちらかとすることができる。複素環の例には、以下に限定されないが:単環式複素環(アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ジオキソラン、スルホラン、2,3-ジヒドロフラン、2,5-ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、チオファン、ピペリジン、1,2,3,6-テトラヒドロ-ピリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ピラン、チオピラン、2,3-ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、1,4-ジヒドロピリジン、1,4-ジオキサン、1,3-ジオキサン、ジオキサン、ホモピペリジン、2,3,4,7-テトラヒドロ-1H-アゼピン、ホモピペラジン、1,3-ジオキセパン、4,7-ジヒドロ-1,3-ジオキセピン及びヘキサメチレンオキシドなど)、及び多環式複素環(インドール、インドリン、イソインドリン、キノリン、テトラヒドロキノリン、イソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、1,4-ベンゾジオキサン、クマリン、ジヒドロクマリン、ベンゾフラン、2,3-ジヒドロベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、クロマン、イソクロマン、キサンテン、フェノキサチイン、チアントレン、インドリジン、イソインドール、インダゾール、プリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、フェナントリジン、ペリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、1,2-ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾトリアゾール、チオキサンチン、カルバゾール、カルボリン、アクリジン、ピロリジジン及びキノリジジンなど)が含まれる。上記の多環式複素環に加えて、複素環には、2つ以上の環の間の環縮合が、両方の環に共通している2つ以上の結合及び両方の環に共通している3個以上の原子を含む、多環式複素環が含まれる。このような架橋複素環の例には、キヌクリジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン及び7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプタンが含まれる。
【００４２】
単独で、又は接尾語若しくは接頭語で使用される用語「複素環式基」、「複素環式部分」、「複素環式」又は「ヘテロシクロ」は、そこから1個以上の水素が除去された複素環を指す。
【００４３】
用語「ヘテロ」は、この開示のためのヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル又はヘテロ炭化水素などの接頭語として使用される場合、主鎖の部分として非炭素原子によって置きかえられた1個以上の炭素原子を有する、指定された炭化水素を指す。このような非炭素原子の例には、以下に限定されないが、N、O、S、Si、Al、B及びPが含まれる。ヘテロをベースとする主鎖中に2個以上の非炭素原子が存在する場合、この原子は、同一元素であってもよく、又はN及びOなどの異なる元素の組合せであってもよい。
【００４４】
用語「混合環系」とは、少なくとも2つの環を含有する場合により置換されている環構造であって、これらの環が、連結、縮合又はそれらの組合せにより一緒に結合している、環構造を指す。混合環系は、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール及び複素環を含む、様々な環タイプの組合せを含む。
【００４５】
炭化水素、複素環などに関する用語「非置換の」とは、主鎖が置換基を含まない構造を指す。
【００４６】
炭化水素、複素環などに関する用語「置換されている」とは、主鎖が1つ以上の置換基を含む構造を指す。
【００４７】
用語「置換基」は、水素原子の代わりの、置換されている、原子又は原子群を指す。この開示の目的に関すると、置換基は、重水素原子を含むと思われる。
【００４８】
用語「炭化水素」とは、炭素及び水素しか含有していない原子群を指す。この開示において使用され得る炭化水素の例には、以下に限定されないが、アルカン、アルケン、アルキン、アレーン及びベンジルが含まれる。
【００４９】
用語「官能基」又は「FG」とは、分子内の特定の原子群を指し、これらは、このような分子の特徴的な化学反応を担う。同一官能基は、それが構成要素となっている分子のサイズに関わりなく、同一又は類似の化学反応(1つ又は複数)を受けるが、その相対反応性は、近傍の官能基によって改変され得る。官能基の原子は、共有結合によって、互いに、及び分子の残りに連結している。この開示において使用することができるFGの例には、以下に限定されないが、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアルキル、置換又は非置換のヘテロアルケニル、置換又は非置換のヘテロアルキニル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のシクロアルケニル、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換の複素環、ハロ、ヒドロキシル、無水物、カルボニル、カルボキシル、カーボネート、カルボキシレート、アルデヒド、ハロホルミル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、オルトエステル、カルボキサミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロソ、ニトロ、ニトロソオキシ、ピリジル、スルフィドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィノ、ホスホノ、ホスフェート、Si(OH)3、Ge(OH)3、Sn(OH)3、Si(SH)4、Ge(SH)4、AsO3H、AsO4H、P(SH)3、As(SH)3、SO3H、Si(OH)3、Ge(OH)3、Sn(OH)3、Si(SH)4、Ge(SH)4、Sn(SH)4、AsO3H、AsO4H、P(SH)3、SO2、SO3-及びAs(SH)3が含まれる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、原子に結合している別の線と交差している波線は、存在しているが、構造中に図示されていない別の要素(entity)に、上記の原子が共有結合していることを示している。線と交差していないが、原子に結合している波線は、この原子が、結合又はある他のタイプの特定可能な会合によって、別の原子と相互作用していることを示す。
【００５１】
ニューロン及び心筋細胞のような興奮性細胞の膜電位(Vmem)の迅速な変化は、細胞のシグナル伝達、及びこのような特殊細胞の生理学的プロファイルを規定する中心的な役割を果たす。従来、Vmemはパッチクランプ電気生理学によりモニタリングして測定され、この場合、対象とする細胞に取り付けたマイクロ電極により、優れた時間的分解能で、膜電圧を非常に高い感度で記録することが可能になる。しかし、電極の使用は非常に侵襲的であり、単細胞の細胞体に記録を制限し(空間クランプエラー)、著しく低いスループットである。電圧を記録するための光学的技法は、最小限の侵襲性であり、センサー及び光子の送り込みを必要とし、高スループットとなり得るので、このような課題に対する実現可能な解決策をもたらす。Ca2+のイメージングは、電圧の直接的な光学測定の代わりとして、長い間使用されてきており、一つには、確実なイメージング剤は、低分子又は蛍光タンパク質に基づくかどうかに関わらず、感受性であり、幅広い範囲の生物学的環境(biological context)に適用可能で、かつ様々な色で現れるという理由からである。細胞内[Ca2+]([Ca2+]i)の上昇は、Vmemの脱分極が引き金となるので、Ca2+のイメージングを使用すると、Vmemの変化は不十分な概数しかもたらさない。さらに、[Ca2+]iの過渡信号は、数百ミリ秒間、続くので、かつCa2+センサー自体が、[Ca2+]iの上昇及び低下を緩和することができるので、迅速にスパイクするニューロン事象の解像は不可能になるか、又は困難となり、大規模なデコンボリューション(deconvolution)プロトコルが必要になる。
【００５２】
したがって、直接的な電圧のイメージングは、空間分解能、高スループット及びCa2+イメージングの最小限の非侵襲性を依然として実現しながらも、Vmemの直接的な読み出しを実現することができるので、魅力的である。最近、低分子、蛍光タンパク質、これらの2つの組合せ、又はオプシンの使用によって、蛍光電圧センサーの開発に新たな興味が持たれている。
【００５３】
本明細書において開示されている電圧感受性色素は、NIR枠(NIR window)において、励起及び発光プロファイルを有しており、これにより、本明細書において開示されている化合物と他の光学的ツールとを統合することが可能となる。例えば、形質膜の脱分極により、本明細書において開示されている化合物のNIR蛍光が急速に増加する(例えば、100mVあたり24%以上のΔF/F(≧24% ΔF/F))。さらに、組織片のようなより厚い生物試料又は動物全体におけるイメージングの場合、光子のエネルギーがより低いと、組織の損傷が低減され、分散がより少なくなり、一層少ない内在性発色団によってしか吸収されず、かつより低いレベルの自家蛍光しか生じないので、NIR励起及び発光プロファイル(650〜900nm)が望ましい。直接的な対比では、VoltageFluor、又はVF色素、Vmemの変化によってモジュレートされる光誘起電子移動(PeT)に依存する電圧感知のための低分子プラットフォームは、電磁スペクトルの青色/緑色領域にある励起及び発光プロファイルを有することにより、かなり制限を受ける。これらのVF色素は、480〜515nmの範囲で励起され、約530nmを発光するので、その発光は、いくつかの有用な光学的ツール、例えばGFP、オレゴングリーンBAPTA及びGCaMPファミリーのような確実なCa2+センサー、並びにチャネルロドプシン2(ChR2)のような光遺伝学的ツールなどとかなり重なる。したがって、本明細書において開示されている化合物は、VF色素又は他の化合物を使用する、より短波長でのイメージングに伴う欠点を回避する。
【００５４】
さらに、本開示の化合物は、細胞小器官、Ca2+インジケーター及び電圧感受性蛍光タンパク質向けの蛍光染色剤と一緒に使用することができ、チャネルロドプシン2(ChR2)(青色光を利用する)のような光遺伝学的アクチュエーターと組み合わせて使用することができ、本開示の化合物の赤色側にシフトしたスペクトルプロファイルにより、ニューロンにおける光学的な電気生理学が可能となる。
【００５５】
したがって、本開示は、電圧感知用途に使用するための、色素化合物の設計、合成及び特徴付けを記載している。本開示の化合物は、鮮明で、膜に局在化されている蛍光を示し、光安定性が高く、かつ電圧感受性がかなり高い。本化合物は、例えば、培養海馬ニューロンにおける活動電位を検出することができ、いくつかの他の光学的ツールを用いて容易に、インターフェース化することができる。したがって、本開示の化合物は理想的なことに、GFP、GCaMPのようなCa2+インジケーター、ASAP1などのcpGFPに基づく電圧センサー、及びChR2のような光遺伝学的ツールを用いる多色イメージングに好適である。本開示の化合物をChR2と一緒に使用することにより、単細胞及びニューロンマイクロ回路において、非侵襲的な記録及び膜電位の制御が可能になる。
【００５６】
本開示の化合物は、いかなる遺伝学的操作を必要としない、すべての細胞タイプに送達可能である、迅速な電圧変化に迅速に応答する、及び幅広い色の範囲にわたり調節が可能であるので、本開示の化合物を含む分子プローブは、膜電位の測定における重要な役割を果たす。さらに、本明細書において開示されているある種の実施形態では、本化合物は、フェニレンビニレン分子ワイヤをベースとするプラットフォームをさらに含むことができる。したがって、本明細書において開示されている化合物の発光プロファイルは、分子ワイヤプラットフォームの構造修飾に基づいて、又はフルオロフォアへの小さな変化を起こすことにより、調節することができる。したがって、本開示の化合物は、様々なシステムにおける、膜電位ダイナミクスをマッピングするための非常に貴重なツールとなる。
【００５７】
一実施形態では、本開示は、式I:
【００５８】
【化１１】
2018533640.tif 000013
(式中、
A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
X1〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を有する化合物を提供する。さらなる実施形態では、式IIのR1〜R5のうちの少なくとも1つは、スルホン酸基である。
【００５９】
別の実施形態では、本開示は、式I(a):
【００６０】
【化１２】
2018533640.tif 000014
(式中、R2〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルキル、場合により置換されている(C5〜C7)シクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を有する化合物を提供する。
【００６１】
なおさらなる実施形態では、本開示は、以下:
【００６２】
【化１３】
2018533640.tif 000015
の構造を有する化合物を提供する。
【００６３】
さらに別の実施形態では、本開示は、式II:
【００６４】
【化１４】
2018533640.tif 000016
(式中、
A1は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2から選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
W1は、分子ワイヤ部分であり、
X1、X2及びX4〜X11は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1、R2及びR4〜R15は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができる)
の構造を有する化合物を提供する。さらなる実施形態では、R1、R2、R4及びR5のうちの少なくとも1つは、スルホン酸基である。
【００６５】
一実施形態では、本開示はまた、式II(a):
【００６６】
【化１５】
2018533640.tif 000017
(式中、
L1は、
【００６７】
【化１６】
2018533640.tif 000018
2018533640.tif 000019
及び上述の任意の組合せからなる群から選択され、
A1〜A8は、CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'又はPbHR'2からそれぞれ独立して選択され、R'は、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル及び場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニルからなる群から選択され、
X1、X2及びX4〜X42は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R1、R2及びR4〜R54は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C12)アルキル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C12)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C12)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C11)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
n1〜n8は、独立して、0〜10から選択される整数である)
の構造を含む化合物を提供する。
【００６８】
さらなる実施形態では、R1、R2、R3及びR4のうちの少なくとも1つは、スルホン酸基である。
【００６９】
別の実施形態では、本開示は、式II(b):
【００７０】
【化１７】
2018533640.tif 000020
(式中、
X1、X2及びX4〜X20は、N又はCから独立して選択され、X基がNである場合、R基は存在せず、
R2、R4〜R11及びR16〜R26は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、nは、1〜5の整数である)
の構造を含む化合物を提供する。
【００７１】
別の実施形態では、本開示は、式II(c):
【００７２】
【化１８】
2018533640.tif 000021
(式中、
R16、R17、R19及びR20は、H、D、場合により置換されているFG、場合により置換されている(C1〜C6)アルキル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキル、場合により置換されている(C1〜C6)アルケニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルケニル、場合により置換されている(C1〜C6)アルキニル、場合により置換されている(C1〜C5)ヘテロアルキニル、場合により置換されているシクロアルキル、場合により置換されているシクロアルケニル、場合により置換されているアリール、場合により置換されている複素環、場合により置換されている混合環系から独立して選択され、1つ以上の隣接R基は、一緒になって連結し、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、アリール及び混合環系を含む群から選択される、1つ以上の置換されている環を形成することができ、
nは、0〜5の整数である)
の構造を有する化合物を提供する。
【００７３】
さらに別の実施形態では、本開示は、以下:
【００７４】
【化１９】
2018533640.tif 000022
の構造を有する化合物を提供する。
【００７５】
本明細書において図示されている任意の構造(例えば、式I、I(a)、II、II(a)、III)について、上述の構造の任意の共鳴体が、本明細書においてさらに企図されていることにさらに留意すべきである。例えば、式IIIの構造を有する化合物は、以下:
【００７６】
【化２０】
2018533640.tif 000023
2018533640.tif 000024
などの共鳴構造を含み得る。
【００７７】
本明細書において図示されている式は、荷電種(charged species)を有するものとして表示されているが、非荷電種(uncharged species)も本明細書において企図されることをさらに理解すべきである。したがって、これらの式は、図示されている正に帯電している窒素基及び負に帯電している硫黄基に加えて、帯電していない基を提示しているものと見るべきである。
【００７８】
本明細書に記載されているある種の実施形態では、本開示の化合物は、電圧感受性であることを特徴としており、入射光による励起時に、近赤外(NIR)領域の光を発する。本明細書に記載されている化合物の利点としては、生物試料からの吸収及び蛍光の干渉が最小限であること、安価なレーザーダイオードにより励起されること、並びに散乱が低減されること及び組織への浸透深さが増強されることが挙げられる。別の実施形態では、本明細書において図示されている化合物は、水溶性であること、及び/又は最小限のソルバトクロミズムを示すことをさらに特徴とする。
【００７９】
特定の実施形態では、本開示は、ニューロンにおける膜電位ダイナミクスをインテロゲートするための、本明細書において開示されている化合物を含むセンサーを提供する。なおさらなる実施形態では、このセンサーは、光誘起電子移動(Pet)によって始動される。
【００８０】
ある種の実施形態では、本開示は、本明細書において開示されている化合物を使用する方法であって、該化合物を入射光によって励起するステップ、該化合物による遠赤外光から近赤外光の発光を測定するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、化合物により発光される、650〜800nmの光が定量される。なおさらなる実施形態では、化合物により発光される、650nm〜685nmの光が定量される。別の実施形態では、本化合物は、波長380nm〜640nmを有する入射光に本化合物を曝露することにより励起され得る。さらに別の実施形態では、入射光は、約630nm又は約390nmの波長を有する。特定の実施形態では、本明細書において開示されている化合物は、細胞のイメージング、薬物のスクリーニング及び電圧感知の方法に使用することができる。さらなる実施形態では、本化合物は、理想的なことに、ニューロンにおける、膜電位ダイナミクスをインテロゲートするのに適している。なおさらなる実施形態では、本明細書において開示されている化合物は、膜電位/イオンチャネルに影響を及ぼす薬物をスクリーニングする、又は薬物の安全性及び/若しくは有効性をスクリーニングするのに有用である。
【００８１】
本開示は、生物細胞における膜電位に影響を及ぼす、潜在的な治療用薬物などの試験試料をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、試験試料又は薬剤の存在下及び非存在(対照の測定)下で、膜電位を測定するステップを含む。対照の測定は、推定上の薬物を除いて、試験試料の構成成分をすべて含有している試料を用いて、通常、行われる。試験薬剤の存在下で、対照に対して膜電位の変化が検出されると、この試験薬剤が活性であることが示される。膜電位はまた、公知の活性(すなわち、標準的な薬剤)又は推定上の活性(すなわち、試験薬剤)の薬理学的薬剤の存在下又は非存在下で決定することもできる。本明細書において開示されている方法によって検出される膜電位の差異により、試験薬剤の活性と標準的な薬剤の活性との比較が可能になる。薬物スクリーニングプロトコルの多数の組合せ及び置換(permutation)が当業者に公知であること、及びそれらを、本明細書において開示されている膜電位測定法を用いた使用に容易に適合させて、膜電位に影響を及ぼす化合物を特定することができることが認識されるであろう。このような方法のすべてを組み合わせて、本明細書において開示されている膜電位の決定技法を使用することが、本開示により企図されている。
【００８２】
特定の用途では、本開示は、膜における、イオンチャネル、ポンプ又は交換体の活動をモジュレートする化合物を特定する方法であって、(a)本開示の化合物(すなわち、電圧感受性色素)を細胞にロードして、これにより本明細書に記載されている膜電位を測定するステップ、(b)膜電位を決定するステップ、(c)試験試料/薬剤に細胞を曝露するステップ、(d)膜電位を再決定し、(b)における結果と比較して、試験試料の効果を決定するステップ、(e)場合により、イオンチャネル、ポンプ又は交換体をモジュレートする刺激に膜を曝露するステップ、及びこの膜電位を再決定し、(d)における結果と比較して、上記の刺激に対する応答における試験試料の効果を決定するステップを含む方法を提供する。
【００８３】
本明細書で使用する場合、イオンチャネルには、以下に限定されないが、ナトリウム、カルシウム、カリウム、非特異的陽イオン及び塩化物イオンのチャネルが含まれ、これらの各々は、構成的に開放された状態をとり得る、電圧によりゲーティングされ得る(電位依存性)、リガンドによりゲーティングされ得る(リガンド依存性)、又は細胞内シグナル伝達経路により制御され得る。
【００８４】
スクリーニングすることができる生物細胞には、以下に限定されないが、哺乳動物細胞の一次培養物と、哺乳動物の組織から分離した細胞の直接又は一次培養後のいずれかが含まれる。細胞タイプには、以下に限定されないが、白血球(white blood cell)(例えば、白血球(leukocyte))、肝細胞、膵臓ベータ-細胞、ニューロン、平滑筋細胞、腸の上皮細胞、心筋細胞、グリア細胞などが含まれる。本開示はまた、組換え細胞であって、その中にイオン輸送体、イオンチャネル、ポンプ及び交換体が遺伝子工学により挿入されて、発現される、組換え細胞の使用も含む。これらの細胞は、通常、L-M(TK-)細胞、神経芽細胞腫細胞、星状細胞腫細胞及び新生児の心筋細胞などの哺乳動物細胞である。
【００８５】
本明細書に記載されているスクリーニング方法は、固体表面の中で成長している細胞、又は固体表面上に堆積された細胞に行うことができる。一般的な技法は、マイクロタイタープレートウェルを使用することであり、この場合、蛍光の測定は、市販の蛍光プレートリーダーによって行われる。本開示には、自動化システム及び半自動化システムの両方での、高スループットスクリーニングが含まれる。
【００８６】
用語「膜電位モジュレーター」とは、細胞コンパートメント又は細胞内コンパートメントの静止膜電位又は刺激膜電位を改変することが可能な構成成分を指す。この用語には、個々の化合物、イオンチャネル、受容体、小孔形成タンパク質、又はこれらの構成成分の任意の組合せが含まれる。
【００８７】
キットもまた、本開示の特徴である。キットの実施形態は、本明細書に記載されている一般式のいずれか1つによる、少なくとも1つの化合物を含む。このようなキットは、光誘起電子移動に基づいた電圧感知用途に好適である。他の実施形態では、このようなキットは、薬物スクリーニング(例えば、膜電位/イオンチャネルに影響を及ぼす薬物のスクリーニング、又は薬物の安全性及び有効性に関するスクリーニング)に好適である。一部の実施形態では、本キットはまた、少なくとも1つの緩衝溶液を含み、ここで、本化合物は、興奮性細胞と組み合わせて使用すると、興奮性細胞の膜電位の変化を感知することが可能となろう。あるいは、緩衝液は、高濃度溶液として提供されてもよく、この高濃度溶液は、後に、使用前に希釈される。ある種の実施形態では、本化合物は、1つ以上の容器(例えば、試験管又はキュベット)に予め計量されて入れられていてもよく、続いて、この容器に緩衝液及び試験試料を添加することにより検出が行われる。
【００８８】
キットはまた、使い捨て試験管又はキュベットなどの、1つ以上の容器も含むことができ、この容器の中で、検出を行うことができる。キットは、検出を行うための指示書をさらに含んでもよい。
【００８９】
以下の実施例は、本開示を例示することが意図されており、限定を意図するものではない。これらの実施例は、使用され得る典型的なものであるが、当業者に公知の別の手順が、代替として使用されてもよい。
【実施例】
【００９０】
化学合成及び特徴付けの一般的方法。化学試薬及び溶媒(乾燥)は、市販供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。反応はすべて、オーブンで乾燥済みのフラスコ中、N2下で実施した。薄層クロマトグラフィー(TLC)(Silicycle、F254、250μm)及び分取薄層クロマトグラフィー(PTLC)(Silicycle、F254、1000μm)は、シリカゲルにより予めコーティングされている背面がガラスのプレート上で行い、UV光下で蛍光をクエンチ(消光)することにより可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、0.5〜1.0barで強制的に流した空気を使用して、Silicycle silica Flash F60(230〜400メッシュ)上で行った。NMRスペクトルは、Bruker AVB-400MHz、100MHz、AVQ-400MHz、100MHz、Bruker AV-600MHz、150MHzで測定した。NMRスペクトルは、TCIのクライオプローブ補助品を装備した、Bruker AVII-900MHz、225MHzで測定した。化学シフトは、百万分率(ppm)で表し、CDCl3の7.26ppm、77.0ppmを基準にした。カップリング定数は、ヘルツ(Hz)として報告する。分裂パターンは、以下の通りである:s、シングレット;d、ダブレット;sep、セプテット、dd、ダブレットのダブレット;ddd、ダブレットのダブレットのダブレット;dt、トリプレットのダブレット;td、ダブレットのトリプレット;及びm、マルチプレット。高分解能質量スペクトル(ESI EI)は、University of California(Berkeley)における、QB3/Chemistry質量分析法サービスによって測定した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び低分解能ESI質量分析法は、Advion CMS-L ESI質量分析計に連結した、Agilent Infinity1200分析機器で行った。分析用HPLCに使用したカラムは、流速1.0mL/分で、Phenomenex Luna C18(2)(4.6mm I.D.×150mm)とした。移動相は、0.05%ギ酸を含むMQ-H2O(溶離液A)及び0.05%ギ酸を含むHPLCグレードのアセトニトリル(溶離液B)とした。シグナルは、溶離液Bが10〜100%となるグラジエントを用いて、20分間、254nm及び650nmでモニタリングした。
【００９１】
分光学的検討。BR及びBeRST1の保存溶液は、DMSO中(1.0〜10mM)で調製し、0.10%(w/w)SDSを含有するTBS(50mM Tris-HCl、pH7.5、0.15M NaCl)溶液により希釈した(1:100〜1:1000の希釈)。UV-可視吸光度及び蛍光スペクトルは、Shimadzu2501分光測光器(Shimadzu)及びQuantamaster Master4L-フォーマット走査型分光蛍光計(Photon Technologies International)を使用して記録した。蛍光光度計は、LPS-220B 75-Wキセノンランプ及び電力供給、統合型点火装置を収容したA-1010Bランプ、切り替え可能な814光子カウンティング/アナログ式光電子増倍検出ユニット及びMD5020モータドライバーを装備している。試料は、1cmの経路長の石英キュベット(Sterna Cells)中で測定した。相対量子収率は、0.10%(w/w)SDSを含有するTBS溶液中、又はCH3OH中で測定し、CH3OH中の0.54の量子収率を有するクレシルバイオレットを基準にした。
【００９２】
細胞培養物。ヒト胎児由来腎臓293T(HEK)細胞を継代し、ポリ-D-リシン(PDL;1mg/mL;Sigma-Aldrich)により予めコーティングされている12mmのガラス製カバースリップ上でプレート培養(plated)し、電気生理学及びイメージングのために、それぞれ、〜15%及び50%の集密度を得た。HEK細胞をプレート培養し、4.5g/L D-グルコース、10%FBS及び1% Glutamaxを補給したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。
【００９３】
冷滅菌HBSS(Ca2+不含、Mg2+不含)中に、胎芽18日目のスプラーグドーリーラット(Charles River Laboratory)から海馬を切除した。特に明記しない限り、すべての切除生成物は、Invitrogenにより供給を受けた。海馬組織は、37℃で15分間、トリプシン(2.5%)で処理した。5%ウシ胎児血清(FBS;Thermo Scientific)、2% B-27、2% 1M D-グルコース(Fisher Scientific)及び1% glutamaxを補給した最小必須培地(MEM)中、火炎磨きしたパスツールピペットを使用して、組織をすりつぶした。解離細胞は、MEM補給培地(上記の通り)中で、カバースリップあたり、30,000〜40,000個の細胞密度で、PDLにより事前処理した(上記の通り)直径12mmのカバースリップ(Fisher Scientific)上でプレート培養した。5%CO2を有する加湿インキュベーター中、ニューロンを37℃で維持した。3日間のインビトロ(DIV)において、MEM補給培地の半分を除去し、2% B-27補給物及び1% glutamaxを含有するNeurobasal培地に交換した。遺伝学的ツールのトランスフェクションは、7DIVの時点で、Lipofectamine3000を使用して実施した。機能イメージングは、12〜15DIVのニューロンで行った電気生理学的実験を除き、13〜20DIVの成熟ニューロンで行った。
【００９４】
特に明記しない限り、HEK細胞及び海馬ニューロンのロードに関しては、BeRST1をDMSO中で1mMまで希釈し、次に、HBS(140mM NaCl、2.5mM KCl、10mM HEPES、10mM D-グルコース、1.3mM MgCl2及び2mM CaCl2、pH7.3及び290mOsmol)中、1:1000に希釈した。イメージング実験はすべて、HBS中で行った。
【００９５】
DNA構築物。本明細書に記載されている実験において使用した構築物には、チャネルロドプシン-2-YFP(ChR2-YFP)、puro-CAG-ASAP1及びGCaMP6sが含まれる。CHR2-YFPは、シナプシンプロモーターを使用して、チャネルロドプシン-2のニューロンの発現を推進する。Puro-CAG-ASAP1の発現は、ニワトリベータアクチンプロモーターによって推進される。GCaMP6sの発現は、哺乳動物細胞におけるサイトメガロウイルスプロモーターによって推進される。
【００９６】
一般的イメージングパラメータ。落射蛍光イメージングは、Spectra-X LightエンジンLED光(Lumencor)を装備した、Slidebook(v6、Intelligent Imaging Innovations)により制御した、AxioExaminer Z-1(Zeiss)で行った。複数のLEDによる同時入射励起は、Digidata 1332Aデジタイザ及びpCLAMP10ソフトウェア(Molecular Devices)によって始動される、Lumencorソフトウェアによって制御した。画像は、W-Plan-Apo  20x/1.0水浸対物レンズ(water objective)(20倍;Zeiss)又はW-Plan-Apo  63x/1.0水浸対物レンズ(63倍:Zeiss)のどちらかで取得した。画像は、OrcaFlash4.0 sCMOSカメラ(sCMOS;Hamamatsu)又はeVolve128EMCCDカメラ(EMCCD;Photometrix)のどちらかで焦点を合わせた。
【００９７】
HEK細胞におけるBeRST1の多色イメージング及び光安定性。HEK細胞を、BeRST1(1.0μM)、Hoechst33342(1.0μM、Molecular Probes)及びローダミン123(5.0μM、Sigma-Aldrich)を含有するHBSS溶液(Gibco)と共に、37℃で15分間、インキュベートした。顕微鏡画像は、W-Plan-Apo 63x/1.0対物レンズ(Zeiss)及びOracFlash4.0 sCMOSカメラ(Hamamatsu)により得た。BeRST1画像に関しては、励起光は、LED(67W/cm2;100msの曝露時間)から631/28(バンドパス)nmで送達し、発光は、四重極ダイクロイックミラー(quadruple dichroic mirror)(432/38、509/22、586/40、654nmのLP)を通過させた後、四重極発光フィルター(quadruple emission filter)(430/32、508/14、586/30、708/98nm)により集めた。Hoechst33342画像に関しては、励起光は、LED(33W/cm2;100msの曝露時間)から390/22nmで送達し、発光は、ダイクロイックミラー(510nmのLP)を通過させた後、発光フィルター(540/50nm)により集めた。ローダミン123画像に関しては、励起光は、LED(57W/cm2;100msの曝露時間)から475/34nmで送達し、発光は、ダイクロイックミラー(510nmのLP)を通過させた後、発光フィルター(540/50nm)により集めた。
【００９８】
HEK細胞を、HBSS中、BeRST1(0.20μM)及びVF2.1.Cl(0.20μM)と別々に、37℃で15分間、インキュベートした。データは、W-Plan-Apo 63x/1.0対物レンズ(Zeiss)及びEvolve 128emCCDカメラ(Photometrics)により得た。画像(ピクセルサイズ 0.38μm×0.38μm)は、一定照度のLED(162W/cm2;100msの曝露時間)で、10分間、20秒毎に撮影した。BeRST1画像に関しては、励起光は、631/28nmで送達し、発光は、四重極ダイクロイックミラー(432/38、509/22、586/40、654nmのLP)を通過させた後、四重極発光フィルター(430/32、508/14、586/30、708/98nm)により集めた。VF2.1.Cl画像に関しては、励起光は、475/34nmで送達し、発光は、ダイクロイックミラー(510nmのLP)を通過させた後、発光フィルター(540/50nm)により集めた。得られた蛍光曲線(バックグラウンドを差し引いた)を、t=0での蛍光強度で正規化し、平均した(各色素の6種の異なる細胞)。
【００９９】
細胞外刺激実験。細胞外フィールド刺激は、2つの白金電極(Warner)を含む記録用チャンバに連結したガラススティミュレーターによって送達され、Digidata1332Aデジタイザ及びpCLAMP10ソフトウェア(Molecular Devices)によって始動された。活動電位は、5Hzで送達された1msの80V電場電位により始動された。再発する活動を防止するため、HBSの浴溶液に、シナプスの遮断剤である、2,3-ジオキソ-6-ニトロ-1,2,3,4-テトラヒドロベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミド(NBQX;Santa Cruz Biotechnology)を10μM及びDL-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸(APV;Sigma-Aldrich)を25μM補給した。BeRST1の機能イメージングは、EMCCDカメラ及び63倍対物レンズを使用して行った。BeRST1は、127W/cm2の強度を有する631nmの光(LED;631nm、28nmのバンドパス)を用いて励起した。680/10nmのバンドパス発光フィルター(四重極ダイクロイックミラー(432/38nm、509/22nm、586/40nm、654nmのLP)を通過後)を用いて、又はGCaMP6s及びASAP実験の場合、四重極ダイクロイックミラーを通過させた後、QUADフィルター(四重極発光フィルター(430/32nm、508/14nm、586/30nm、708/98nm))を用いて、BeRST1からの発光を集めた。BeRST1イメージングの光学サンプリングレートは、ASAP1(1.25kHz)でイメージングした場合を除いて、0.5〜0.53kHzであった。緑色スペクトルの遺伝学的ツール(GFP、GCaMP6s及びASAP1)は、475nmの光(LED;475nm、34nmのバンドパス)を使用して照明した。機能イメージングの場合、GCaMP6sの場合、33W/cm2、及び一層弱い蛍光性ASAP1の場合、200W/cm2という強度を使用し、これは、このシステムの場合の最大の475nmのLED強度である。510nmのロングパスダイクロイックを通過させた後、540/50nmのバンドパスフィルターを用いて発光を集めた。GCaMP6s及びASAPの機能イメージングは、それぞれ、40Hz及び1.25kHzで行った。細胞の形態を示す画像は、EMCCD(GCaMP6s/ASAP1)又はsCMOS(GFP)カメラのどちらか一方と組み合わせた、低倍率の20倍対物レンズに切り替えることにより行った。
【０１００】
HEK細胞における電圧感度。BeRST1の機能イメージングは、0.5kHzのサンプリングレートで、EMCCDカメラからの画像キャプチャと一対の20倍対物レンズを使用して行った。BeRST1は、6.7W/cm2の強度を有する633nmのLEDを使用して励起した。初期電圧の特徴付けの場合(図4を参照されたい)、発光は、QUADフィルター及びダイクロイックを用いて集めた(上記を参照されたい)。励起クロストーク間の電圧感度の検討(図11を参照されたい)の場合、BeRST1は、上記の633nmのLED及び3.3W/cm2の強度を有する390nmの光(紫色LED、20nmのバンドパス)によって励起し、発光は、680/10nmのバンドパス発光フィルターを用いて集めた。
【０１０１】
細胞群のイメージング。多数の5超のニューロンからの機能的応答を見るイメージング実験(図8及び図15を参照されたい)は、20倍対物レンズを有するsCMOSカメラを使用して得られた、より大きな視野を必要とした。BeRST1は、20W/cm2の強度を有する633nmのLEDを使用して励起し、発光は、680/10nmのバンドパス発光フィルターを用いて集めた。画像は、0.5kHzのサンプリングレートが可能になるよう、4×4ビニングした(binned)。GFPは、475nmのLEDによって励起し、発光を、510nmのロングパスダイクロイックを通過させた後、540/50nmのバンドパスフィルターを用いて集めた。ChR2ポジティブニューロンは、510nmの光(LED;510nm、25nmのバンドパス)を用いる励起によるYFP融合によって特定し、発光は、三重(triple)ダイクロイックミラー(475/30nm、540/25nm、642/96nm)を通過させた後、三重発光フィルター(473/22nm、543/19nm、648/98nm)により集めた。ChR2は、5Hzの周波数において、475nmのLED光の80mW/cm2、5msのパルスによって活性化した。
【０１０２】
パッチクランプした海馬ニューロンにおけるBeRST1のイメージング。パッチしたニューロンの機能イメージングは、EMCCDカメラ及び20倍対物レンズを使用して行った。この対物レンズは、より大きな作動距離を有しており、パッチ電極の位置決めが可能となる。BeRST1は、10W/cm2の強度を有する633nmのLEDを使用して励起し、発光は、680/10nmのバンドパス発光フィルターを用いて集めた。活動電位波形の光学的評価に関しては(図5を参照されたい)、サンプリングレートは、1.8kHzに上昇させた。すべての光学的電気生理学(図13及び図14を参照されたい)に関しては、サンプリングレートは、1kHzに上昇させた。YFP画像を上記の通り集めた。ChR2は、5Hzの周波数において、475nmのLED光の80mW/cm2、5msのパルスによって刺激した。
【０１０３】
交互励起。クロストークは、390nm、475nm及び633nmのLEDを用いて、BeRST1(1μM)をロードした海馬ニューロンを励起することにより評価し、上記のLEDはすべて、9.7W/cm2の強度で照射した。680/10nmのバンドパス発光フィルターを用いて、発光を集めた。
【０１０４】
画像分析。HEK細胞における電圧感度の解析は、カスタムMatlabルーチン(custom Matlab routine)を使用して行った。手短に言うと、関心領域(region of interest、ROI)を蛍光強度に基づいて自動的に選択し、すべての画像フレームに対するマスクとして適用した。蛍光強度の値は、既知のベースライン及び電圧ステップエポックで計算した。ニューロンにおけるBeRST1電圧応答の解析に関しては、細胞本体を包含する関心領域をImageJに描き、各フレームに対する平均蛍光強度を抽出した。BeRST1の光安定性により、すべての未処理の蛍光フレームから平均バックグラウンド値を差し引き、各フレームに対するバックグラウンドを差し引くことによって生じるノイズ増幅を考慮しないことにより、ΔF/F値の計算が可能となった。すべての実施例のトレースが、平均されているわけではなかった。電気生理学的及び光学的に記録された活動電位を比較するため、イメージングトレースを、Clampfit10ソフトウェア(Molecular Devices)のスパイク検出アルゴリズムを使用して解析した。交互励起の定量の場合、画像はバックグラウンドを差し引いた。ROIは、最大ピクセル強度の25%に閾値を設けて(thresholding)、非染色領域を除去することにより作製した。染色されたニューロンの平均強度値を算出した。
【０１０５】
電気生理学。電気生理学的実験に関しては、5〜8MΩの抵抗を有するボロシリケートガラス(Sutter Instruments、BF150-86-10)からピペットを引き抜き、内部溶液:115mM  グルコン酸カリウム、10mM BAPTA四カリウム塩、10mM HEPES、5mM NaCl、10mM KCl、2mM ATP二ナトリウム塩、0.3mM GTP三ナトリウム塩(pH7.25、275mOsm)を充填した。記録は、室温でAxopatch200B増幅器(Molecular Devices)を用いて得た。シグナルは、Digidata1332Aを用いてデジタル化し、50kHzでサンプリングし、PC上、pCLAMP10ソフトウェア(Molecular Devices)で記録した。迅速なキャパシタンスは、オンセル構成で補償した。すべての電気生理学的実験に関して、電圧クランプの直列抵抗が30MΩ未満であった場合、記録だけを続行した。
【０１０６】
ホールセルに関しては、HEK293T細胞における電圧クランプ記録は、-60mVに維持し、100msの過分極又は脱分極ステップは、20mV刻みで-100〜+100mVに印加したた。
【０１０７】
海馬ニューロンにおけるホールセルの電流クランプ記録に関して、膜破裂の後、静止膜電位をI=0で評価及び記録し、データ取得中、モニタリングした。ニューロンは、電圧クランプの直列抵抗が30MΩ未満(<30MΩ)を表示すると、電流クランプモードに切り替えた。ピペット先端の抵抗は、ブリッジバランス補償を行うことにより補正した。
【０１０８】
ニューロンの膜上にBeRST1をロードすると、その活動電位の発火に何らかの影響を及ぼすかどうかを試験するため、0.05pA刻みで、10段階の500msの電流をニューロンに流した。各掃引から1番目の活動電位を、Clampfit10ソフトウェア(Molecular Devices)で解析し、増幅及び速度論データを得た。細胞キャパシタンスは、記録中、Clampexソフトウェアによって決定した。電気生理学的及びイメージング比較に関する単一活動電位を誘発するため、単一活動電位を誘発するために必要な閾値の2倍である、短い(10ms)電流注入を適用(印加)した。活動電位の解析は、Clampfit10ソフトウェアでスパイク検出アルゴリズムを使用して行った。
【０１０９】
ChR2誘発活動電位を電気生理学的に記録するため、ニューロンを細胞取付けモード(cell-attached mode)(0.5〜1GΩにシール)に保持するか、又は膜破裂後、データをI=0で取得した。
【０１１０】
スルホン化ケイ素ローダミンの設計及び合成。Berkeley Red Sensor of Transmembrane potential 1(BeRST1、「バースト」)、電圧感受性スルホン化ケイ素-ローダミン(Si-ローダミン)フルオロフォアの開発を記載する。BeRST1は、メソアリール環上にスルホン酸を有するSi-ローダミンコア(Berkeley Red又は「BR」と命名する)を特色とする。このスルホン化Si-ローダミン(スキーム1を参照されたい)は、Si置換キサンテンのためにNIR励起及び発光プロファイルもたらし、陰イオン性スルホネートがあるために、細胞膜の細胞外表面における色素の保持が改善される(以下を参照されたい)。
【０１１１】
【化２１】
2018533640.tif 000025
【０１１２】
BRは、中間体1及び3から3工程で合成され、中間体1及び3は、それぞれ1工程及び4工程で入手可能である。付随スルホネートを有するBRコアの合成における重要工程は、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(triflic anhydride)により活性化されたキサントン3への、1におけるリチウム-ハロゲン交換に由来する有機リチウム中間体の求核付加である。BBr3によるイソプロピルエステルの脱保護により、3工程通算で、BRが9%で得られた(スキーム1)。
【０１１３】
2,5-ジブロモベンゼンスルホン酸イソプロピル(2):3:2のCH2Cl2/iPrOH(v/v)(5.0mL)中、0℃で、塩化2,5-ジブロモベンゼンスルホニル(2.0g、6.0mmol、1.0当量)に1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(0.81g、7.2mmol、1.2当量)をゆっくりと加えた。白色沈殿の形成が開始した後、この反応混合物を周囲温度まで温め、30分間、撹拌した。ろ過によって沈殿物を除去した後、ろ液を真空で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(5:1のヘキサン/EtOAc)によって精製すると、生成物が白色固体(1.3g、3.7mmol、62%)として得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.25 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 4.86 (sep, J = 6.3 Hz, 1H), 1.38 (d, J = 6.3, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 138.8, 137.2, 136.8, 134.3, 121.4, 119.5, 79.3, 22.8; HRMS (EI) C9H10Br2O3S+[M]+の計算値355.8712, 実測値, 355.8717.
【０１１４】
5-ブロモ-2-(7-(ジメチルアミノ)-3-(ジメチルイミニオ(dimethyliminio))-5,5-ジメチル-3,5-ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン-10-イル)ベンゼンスルホネート(すなわち、ブロモ-Berkeley Red):3(0.10g、0.31mmol、1.0当量)のCH2Cl2(1.0mL)溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(0.10mL、0.59mmol、1.9当量)を加えた。次に、この溶液を周囲温度において30分間、撹拌した(溶液A)。別のフラスコ中で、2(0.33g、0.93mmol、3.0当量)をCH2Cl2(2.0mL)に溶解した。この溶液を-20℃まで冷却した後、n-BuLi(ヘキサン中の1.6M、0.58mL、0.93mmol、3.0当量)をゆっくりと加えた。10分後、この反応混合物に溶液Aを加えた。次に、この混合物を1時間、撹拌した。イソプロピルエステルにより保護された粗生成物をPTLC(5:1:1のヘキサン/EtOAc/CH2Cl2)により得て、CH2Cl2(2.0mL)中、1.0M BBr3に供した。この反応混合物を周囲温度で一晩、撹拌し、PTLC(10:1のCH2Cl2/CH3OH)により精製すると、所望の生成物が暗青色固体として得られた(25mg、0.046mmol、15%)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.51 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.1, 2.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 9.5, 2.8 Hz, 2H), 3.25 (s, 12H), 0.55 (見かけ上s, 3H), 0.53 (見かけ上s, 3H); 13C NMR (225 MHz, CDCl3) δ 173.6, 153.9, 148.3, 148.2, 143.5, 134.3, 132.2, 131.1, 130.2, 129.0, 122.9, 119.4, 113.3, 40.6, -0.9, -1.2; HRMS (ESI) C25H27BrN2NaO3SSi+[M + Na]+の計算値565.0587, 実測値, 565.0590.
【０１１５】
(2-(7-(ジメチルアミノ)-3-(ジメチルイミニオ)-5,5-ジメチル-3,5-ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン-10-イル)ベンゼンスルホネート)(すなわち、Berkeley Red)は、3(50mg、0.15mmol、1.0当量)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(26μL、0.15mmol、1.0当量)、1(83mg、0.30mmol、1.5当量)及びn-BuLi(ヘキサン中1.6M、0.19mL、0.30mmol、1.5当量)から、上記と同じ手順に従って調製した。この生成物は、暗青色固体(6.3mg、0.014mmol、9%)として得られた。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.35 (dd, J = 8.4, 1.3 Hz, 1H), 7.54 (ddd, J = 8.4, 7.5, 1.3 Hz, 1H), 7.39 (見かけ上td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 9.6, 2.9 Hz, 2H), 3.23 (s, 12H), 0.56 (見かけ上s, 3H), 0.53 (見かけ上s, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 175.8, 153.9, 148.2, 146.8, 143.8, 135.3, 129.4, 129.4, 128.9, 128.6, 127.9, 119.2, 113.3, 40.5, -0.9, -1.2; HRMS (ESI) C25H28N2NaO3SSi+[M + Na]+の計算値487.1482, 実測値, 487.1478.
【０１１６】
Berkeley Red(BR)は、水性緩衝液(図1A、50mM TBS、pH7.5及び0.1%SDS)中、658nmに中央値がある吸光度プロファイル、及び150,000M-1cm-1の吸光係数を示した。BRは、681nmにおいて強く発光するNIR蛍光を特徴とする(TBS/SDS緩衝液中ではΦfl=0.24及びメタノール中ではΦfl=0.32である)。電圧感知用途におけるBRの使用のための重要な要件は、BRは、細胞膜のような低誘電環境において、非蛍光状態に環化しないということである。このスピロ環化は、超解像顕微鏡のための有用な特性であるが、環化は、一層の疎水性構造をもたらし、形質膜を介する電圧センサーの通過を促進する。次に、内部膜及び細胞質ゾルの染色は、バックグラウンド蛍光を急激に上昇させ、イメージング実験から抽出することが可能である有用なシグナルを制限する。予測される通り、メソアリール環上にスルホン酸基を配置すると、スピロ環化が阻止され、吸光度の変化は、酸性環境又は塩基性環境(pH2.5〜9)のどちらでも観察されなかった(図2C及びEを参照されたい)。BR吸光度は、ε=6(10%水/ジオキサンv/v)からε=71(90%水/ジオキサンv/v)までの溶媒の誘電率の範囲にわたって変化しないままであり(図2B及びDを参照されたい)、BRは、最小限のソルバトクロミズムを示すことが確認される。BRの環境的な非感受性は、カルボキシSiローダミン誘導体とはまったく対照的であり、この誘導体は、溶媒の誘電性が変化すると、吸光度の大きな変動を示す。スピロ環化は、カルボキシルをスルホネートに置きかえることによって、効果的に最小化される。BRに浸されたHEK細胞が無視できる程の細胞質ゾルの蛍光しか示さないので、BRのスルホン酸は、それを細胞非透過性にすることがさらに確認された(図3を参照されたい)。
【０１１７】
BeRST1の設計及び合成。スルホン化Si-ローダミンBRが、鮮明なNIR蛍光、及びpH又は溶媒の誘電率(dielectric)によって変動しない吸光度を有するということが確定しているので、BRを、フェニレンビニレン分子ワイヤにより官能基化して、BeRST1を生成する。重要な臭素化Berkeley Red(ブロモ-BR、スキーム1)は、2のキレート支援リチオ化によって、15%の収率で合成された。リチオ化は、CH2Cl2中、−20℃で、有機リチウム化学種を付加させるために、3を活性化するためのトリフルオロメタンスルホン酸無水物を使用して行った。溶媒(THF、CH2Cl2)、試薬(nBuLi、iPrMgCl・LiCl)、添加物(MgSO4)及び温度(-78℃、-40℃及び22℃)の様々な組合せを含む他の様々な条件はすべて、反応を起こさない、不十分な収率、又は複雑な混合物をもたらした。
【０１１８】
最適化反応条件下での位置選択的リチオ化は、生成したリチウム化学種を酸でクエンチすると、1H-NMRにより、オルトリチオ化と一致する生成物が得られたことにより確認された(図26を参照されたい)。ブロモ-BRとメトキシ置換フェニレンビニレンジメチルアニリン分子ワイヤ4とのPd触媒によるHeckカップリングが、3工程で利用可能であり、シリカゲル上での精製後に、62%収率でBeRST1が得られた。BeRST1は、親BR色素に類似したスペクトル特性を示し、658nm及び683nmに中央値がある励起及び発光を有する(図1Aと図2Aを比較されたい)。BRと比べて、BeRST1の量子収率は、実質的に、水性緩衝液及びMeOH中で、それぞれ、0.017及び0.022に低下している。
【０１１９】
(5-((E)-4-((E)-4-(ジメチルアミノ)-2-メトキシスチリル)スチリル)-2-(7-(ジメチルアミノ)-3-(ジメチルイミニオ)-5,5-ジメチル-3,5-ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン-10-イル)ベンゼンスルホネート)(BeRST1)。ブロモ- Berkeley Red(5.0mg、9.2μmol、1.0当量)、4(2.6mg、9.3μmol、1.0当量)、Pd(OAc)2(1.1mg、4.5μmol、0.50当量)、P(o-tol)3(2.8mg、9.2μmol、1.0当量)及びNEt3(50μL)をDMF(0.10mL)に溶解した。この溶液を75℃で撹拌し、反応の進行をTLCによりモニタリングした。反応が完了した後、この粗製混合物をPTLC(10:1のCH2Cl2/CH3OH)により精製すると、生成物が暗緑色固体(4.2mg、5.7μmol、62%)として得られた。1H NMR (900 MHz, 10:1 CDCl3/CD3OD (v/v)) δ 8.34 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.46 (見かけ上s, 4H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.27-7.21 (m, 3H), 7.14 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.99-6.94 (m, 3H), 6.91 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 9.7, 2.8 Hz, 2H), 6.31 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.21 (s, 12H), 2.95 (s, 6H), 0.50 (見かけ上s, 3H) 0.48 (見かけ上s, 3H); 13C NMR (225 MHz, 10;1 CDCl3/CD3OD (v/v)) δ 173.3, 158.0, 153.9, 151.4, 148.1, 145.2, 143.3, 138.7, 138.5, 134.9, 134.4, 130.4, 129.6, 128.8, 127.1, 126.9, 126.2, 126.2, 126.2, 125.9, 124.1, 123.7, 119.3, 115.0, 113.2, 105.2, 95.6, 55.3, 40.3, -1.2, -1.4; HRMS (ESI) C44H48N3O4SSi+ [M + H]+の計算値742.3129, 実測値, 742.3118.
【０１２０】
BeRST1の細胞的特徴付け。BeRST1は、浴がHEK細胞に適用されると、細胞膜に局在化する(図1Cを参照されたい)。重要なことに、BeRST1の蛍光は、イメージング実験の過程全体で、細胞膜に局在化したままであった。これは、単離されたBRフルオロフォアとは対照的であり、BRフルオロフォアは、同一条件下でロードした後、無視できるほどの細胞蛍光しか示さず、BeRST1及びBR中のスルホネートは色素の内在化を防止する能力があることがさらに確定された(図3A対3Cを参照されたい)。
【０１２１】
BeRST1は、優れた光安定性を示し(図1Bを参照されたい)、強力な照射条件下(I=162W/cm2、631nmのLED)では、脱色半減期は約5分である。これは、他の光学的ツールと協同してBeRST1イメージングするために使用される強度よりもほぼ1桁高い(図8、13及び15を参照されたい)。比較すると、100mVあたり27%ΔF/Fという類似の電圧感度を有するVF2.1.Clは、同一の照射強度(I=162W/cm2、475nmのLED)下では、60秒未満の脱色半減期を有する。BeRST1は、入射照射においてVF2.1.Clより大きな吸光係数を有するので(150,000対90,000)、この比較は、VF2.1.Cl(フルオレセイン)に比べて、BeRST1(Si-ローダミン)の光安定性をわずかに過小評価している。BeRST1の電圧感度を決定するために、ホールセルパッチクランプ電気生理学を、1μMのBeRST1がロードされたHEK細胞に対して行った(図4A及び4Bを参照されたい)。BeRST1により電圧クランプされたHEK細胞の脱分極は、蛍光の速やかな増加をもたらす一方、過分極は、蛍光の低下をもたらす(図4Bを参照されたい)。BeRST1は、第1世代である青色光の励起可能なVoltageFluorと比べて、100mVあたりΔF/Fが約24%±5%となる電圧感度を有しており、生理学的関連性がある±100mVの間隔の範囲にわたって線形となる(図4Bを参照されたい)。
【０１２２】
ニューロンにおけるBeRST1を用いる電圧イメージング。BeRST1は、培養海馬ニューロンの細胞膜を十分、均等に染色した(図5A及び5Bを参照されたい)。BeRST1をロードした培養ニューロンに対するホールセルパッチクランプ電気生理学により、BeRST1は、活動電位(AP)を一回の試験で検出することができることが確定された。活動電位は、電流クランプモード下で誘発され、得られた光学的応答は、記録されたVmemの変化に正確に合致した(図5Dを参照されたい)。光学的に記録された活動電位(1.8kHzの光学サンプリング)は、同時記録される伝統的な電気生理学的トレースとは区別不能であった。活動電位のFWHM期間は、電気生理学的に測定した場合、1.65±0.15msであった一方、光学的活動電位の記録値は、1.97±0.14msの値となった(各条件についてn=7の細胞)。0.32msの差異は、0.56msという光学サンプリング間隔よりかなり小さく、したがって、イメージング装置の測定誤差範囲内である。これらの条件下での、活動電位に対するBeRST1からの光学応答は、約9.5%ΔF/F(±1.2%、n=7細胞)であった。
【０１２３】
イメージングを行わないホールセルパッチクランプ電気生理学を使用すると、BeRST1の存在は、ニューロンが活動電位を点火する能力又は活動電位の測定される特性において認識可能な影響を及ぼさないことが確定された。1μMのBeRST1を含む、又はそれを含まないニューロンにおける刺激に対する電気生理学的応答を比較した場合、ピーク活動電位の振幅、期間、立ち上がり時間、減衰時間又は細胞キャパシタンスに差異は観察されなかった(n=12及び11、色素不含及び色素をロードしたニューロン、図6を参照されたい)。同様に、活動電位は、フィールド刺激条件下で容易に検出可能であり、17.8%のΔF/F(±1.6%、n=5細胞)をもたらした(図5Cを参照されたい)。大部分の場合、再分極が活動電位後に目視可能であり、BeRST1の利用性にさらに着目して、全活動電位波形を検出して、それに関して報告する。
【０１２４】
BeRST1による多色イメージング。NIR枠における電圧センサーの利点の1つは、これらの新規ツールが、幅広い青色、緑色及び赤色の光学的ツールを用いてインターフェース化され得ることである。GFPに基づく遺伝学的にコードされた光学的ツールは、特に興味深く、これは、概して、これらの蛍光タンパク質は、その赤色の蛍光相当物よりも、幅広く使用され、予測可能な細胞挙動及び光物理的挙動を示すからである。BeRST1はいくつかの一般に使用される分子プローブによって、細胞の小器官:核及びミトコンドリアに対して多色イメージングを行うことができることが最初に確定された。3色の生きている細胞の同時イメージングは、BeRST1(図1Cを参照されたい)、ローダミン123ミトコンドリア染色(図1Dを参照されたい)及びHoescht33342核染色剤(図1Eを参照されたい)により行われた。これらの条件下では、別個の細胞の構成成分は、3色で明確に目視可能であり、多色イメージングに対するBeRST1の利用性が確立された(図1C〜Fを参照されたい)。
【０１２５】
機能情報は、細胞の一部から必要となることが多く、これらの細胞は、通常、蛍光タンパク質の標的発現によって特定される。BeRST1染色とGFP標識を一対にすることによって、BeRST1が多色機能イメージングを実現し得るかどうかを次に決定した。細胞質ゾルのGFPを発現するニューロンにBeRST1をロードし、次に、フィールド刺激により活動電位を誘発した(図7を参照されたい)。これらの条件下では、BeRST1は、GFPを発現しない細胞において、蛍光の大きな変化をもたらし、活動電位あたり、約9.2%(±1.6%)のΔF/Fとなり、SNRは、62:1であった。同じ視野におけるGFP発現細胞は、実質的に同じ応答をもたらし(8.7±0.8%のΔF/F、SNR=63:1、n=5の一対の細胞)、BeRST1の応答は、GFPの存在によっても、又はGFPの光学的な表面滲み(bleedthrough)若しくは交互励起によっても、低下しないことが確定される(図7を参照されたい)。したがって、この方法は、光学的に直交している蛍光タンパク質(GFP)を用いて、対象の細胞又は細胞内の場所を標識するために使用して、次に、この蛍光タンパク質によって規定される関心領域(ROI)から記録することができる。細胞外フィールド刺激により、GFPの存在はBeRST1の光学応答を減じないことが確認されたが、ニューロンはすべて細胞外フィールド刺激に応答するので、GFPポジティブ及びネガティブ細胞に由来する独立したシグナルをインテロゲートすることはできなかった。
【０１２６】
個々のニューロン活動が、GFPを発現する培養物中で空間的に分離され得ることを実証するため、GFPを発現し、BeRST1により標識化された同一培養物における自発活動をイメージングした。関心領域を画定するためにGFPを使用すると、対象とする細胞の活動は、周囲細胞と明確に区別することができた。図8では、GFPポジティブニューロン(#3及び#6)によって画定されたROIは、視野中に、他の4つの細胞とは著しく異なる活動を明確に示している。まとめると、これらの実験は、GFP対比染色と並行して、BeRST1がニューロン活動の多部位光学的記録をもたらす能力を実証している。
【０１２７】
BeRST1が、2色の多機能イメージングに関与する能力、すなわち、電圧イメージングと、Ca2+イメージング、電圧イメージング、又はChR2による光遺伝学的操作のいずれかとを組み合わせることを次に決定した。Ca2+センサーのGCaMPファミリーは、システム及び細胞の神経科学に対して、最も幅広く使用されている機能的プローブの1つである。しかし、GCaMPの励起及び発光スペクトルは、前世代のVoltageFluor(他の機能的プローブも同様)の領域(regime)内にまともに収まるので、このことは、GCaMPとPeTをベースとする電圧感受性色素との使用を排除する。細胞内Ca2+濃度の上昇に応答して蛍光の大きな増加をもたらす遺伝学的にコードされたCa2+センサーである、GCaMP6sを発現するニューロンは、BeRST1によって染色された(図9A及び図9Bを参照されたい)。GCaMP6s-ポジティブニューロン(図9Bを参照されたい)は、鮮明な緑色の細胞質ゾルの蛍光を示す一方、膜は、BeRST1によりはっきりと標識された(図9Aを参照されたい)。GCaMP6sを発現し、BeRST1により染色された単細胞から、フィールド刺激による活動電位が誘発され、最初にGCaMP6sに対する緑色のチャネル、次に、BeRST1に対するNIRチャネルにおいて、光学的記録が得られた(図9A及びBを参照されたい)。連続する光学トレースにおいて、Vmemの上昇及び[Ca2+]iの上昇の両方が、明確に目視可能である(図9Cを参照されたい)。BeRST1及びGCaMP6sの二重イメージングにより、電圧とCa2+のトランジェントを区別することが可能となり、電圧トランジェント(約15%のΔF/F)は、誘発された単一活動電位において、測定されたGCaMP6sシグナル(約5%のΔF/F)より先に起こる(図9Cを参照されたい)。電圧イメージングの利点の1つは、その一層遅い固有のシグナル及び遅いプローブ解離動態を伴うCa2+イメージングが解像できないことが多い迅速なスパイキングをデコンボリューションすることができる能力にある。GCaMP6sを発現し、かつBeRST1により染色されたニューロンが刺激を受けて、5、10及び20Hzにおいて一連の活動電位を誘発した場合、個々に誘発された活動電位に対応する個別のVmem応答が、すべての周波数において、BeRST1チャネルで目視可能であった一方(図9Dを参照されたい)、GCaMP6sによって測定されるCa2+応答は、GCaMP6s蛍光の立ち上がりエッジの小さな変化によって測定される通り、5Hzでしか認識可能ではなかった(図9Eを参照されたい)。このことは、多重シグナルが同一システムで解釈される必要がある機能イメージング実験に関与するBeRST1の能力を強調するものである。
【０１２８】
BeRST1及びGFPをベースとするフルオロフォアから発する非重なりシグナルは、2色電圧イメージングを行う特有の機会をもたらす。遺伝学的にコードされた電圧センサーであるASAP1は、培養ニューロンにおいて発現された。以前の通り、ニューロンをBeRST1により染色した(図10A〜Dを参照されたい)。誘発された一連の活動電位に応答して(図10Eを参照されたい)、ASAP1は、約6%±1.4%(S.E.M.、シグナル対ノイズ比(signal to noise ratio)であるSNRは8:1、n=4の細胞)の相対蛍光の低下をもたらし、これは、報告されている-4.8%のΔF/Fという値に一致している。同じ細胞において、同一の刺激パラメータ下では(図10Eを参照されたい)、BeRST1は、15%±2.1%の増加(S.E.M.、SNRは41:1、n=4の細胞)をもたらし、このことは、遺伝学的にコードされた、GFPに基づく相補的な電圧センサーを用いる、2色電圧イメージング及び迅速なスパイキング事象の測定における、BeRST1の利用性を強調するものである。
【０１２９】
BeRST1及びChR2による光学的電気生理学。「全光学的」電気生理学的方法で、生きている細胞のVmemの作動及び記録の両方に光を使用する実現可能性を実証するため、チャネルロドプシン2(ChR2)のような光遺伝学的ツールにより、BeRST1をインターフェース化した。より多く使用されている光遺伝学的ツールの1つである、ChR2の作動スペクトル(470nmのピーク応答)は、第1世代のVoltageFluor色素とかなりの重なりを含む。ChRの赤色がシフトした変形体が報告されているが、それらはすべて、スペクトルの青色領域に大きな応答ピークを含んでいる。この理由のために、活性化及び記録のための光学チャネルにおけるクロストークを回避するため、スペクトルのNIR領域に、電圧イメージング構成成分を移動させることが有利である。
【０１３０】
光誘起活動電位の光学的記録を実施する前に、BeRST1とChR2との間にいかなる光学的クロストークが存在するかを検討した。少量の交互励起がBeRST1に観察された。475nmで励起した場合、BeRST1染色細胞は、631nmでの励起により実現した約4%の強度である蛍光を示す(9.7W/cm2、475nm及び631nm、図11A〜Dを参照されたい)。ChR2は、BeRST1の典型的なイメージング光強度に比べて、かなり小さな光強度を必要とする(多細胞のイメージングの場合、80mW/cm2、475nm対20W/cm2、631nm)ので、実際のイメージング実験では、BeRST1シグナルの0.1%未満が、ChR2の交互励起に由来すると推定された。交互励起はまた、BR及びBeRST1誘導体のインビトロでの励起時に観察される(12A及び12Bを参照されたい)。シアン光(475nm)による、水性緩衝液中のBR又はBeRST1誘導体の励起は、630nmで励起した場合と比べて、それぞれ、全発光の約1%又は7%をもたらす(図12Cを参照されたい)。インビトロでの紫色の励起(390nm)は、全発光の16%(BR)及び35%(BeRST1)(図12Cを参照されたい)をもたらし、これは、細胞膜におけるBeRST1の交互励起(9.7W/cm2、390nmの励起の場合、約47%)と一致する(図11C及びDを参照されたい)。BeRST1により染色されたHEK細胞は、紫色の照射下でイメージングした場合、電圧感受性となる(図11Eを参照されたい、390nmの励起、3.3W/cm2、680nmの発光)。
【０１３１】
実験条件下では、BeRST1の交互励起は無視できる程(0.1%未満)しか起こらないということが確定したので、次に、BeRST1及びChR2がニューロン活動をプローブ及び混乱する(perturbing)ための光学的な直交ツールとして機能し得るかどうかを確立した。YFP-ChR2融合を一過的に発現し(図13A及び図14Bを参照されたい)、BeRST1をロードしたニューロンは、予期される通り、鮮明な膜染色をもたらした(図13B及び図14Aを参照されたい)。ホールセル(図13C及びDを参照されたい)又は細胞が取り付けられた(cell-attached)構成(図14Dを参照されたい)のどちらかのパッチクランプ電気生理学によって測定される通り、シアン光の短時間パルス(5 ms、475 nm、80mW/cm2)によるChR2の刺激は、膜電位の光誘起スパイクをもたらした。ChR2を欠く細胞における対照実験は、スパイクがないことを示している。BeRST1による光誘起スパイクの光学的記録は、電気生理学的に記録された活動に合致する(図13C対D、及び図E対F、並びに図14D及びEを参照されたい)。留意すべきことは、光学的記録中、BeRST1によって高いSNRが達成されることである。BeRST1のSNRは、感度の高いホールセルパッチクランプ法と比べて低い(図13C〜Fを参照されたい)が、BeRST1の光学的感度は、それほど感度が高くないオンセルパッチクランプ技法によって得られる記録(図14D及びEを参照されたい)と比較するのに好都合である。
【０１３２】
光遺伝学的ツールと組み合わせてBeRST1を使用する有効性の最終的な実証として、培養海馬ニューロンにおけるネットワーク挙動を調べた。インタクト(無傷)の脳中の細胞解像によるニューロンの結合及び機能の解析は依然として未解決の課題であり、このことにより、培養海馬ニューロンは、結合と機能の両方を検討するための魅力あるモデルシステムとなる。実際に、実験の証拠より、培養物中のニューロンは、シナプスの特異的な結合を作りだし、インビボで遭遇する結合に反映することが示されている。
【０１３３】
BeRST1により染色され、YFP-ChR2を発現するたった1つのニューロンを含む、海馬ニューロンの大きな領域(370×62μm、倍率20倍)をイメージングした(図15A〜C、及び図16を参照されたい)。以前の通り(図8を参照されたい)、数秒間の期間にわたる連続的な光学的記録により、大部分のニューロンが、記録エポックの間は、比較的静かなままであることが実証された。シアン光による、YFP-ChR2を発現するニューロンの活性化(475nm、80mW/cm2、5Hzで5ms、図15E〜Gを参照されたい、シアン色の棒)は、以前の通り(図13を参照されたい)、光学的刺激パターンに正確に従う、ChR2(+)ニューロン(図15を参照されたい、青色トレース)に由来するスパイクのバーストをもたらした。ChR(+)細胞しか光学的応答が捕捉されなかった以前の実験とは異なり(図13及び図14を参照されたい)、より大きな記録領域は、単一ニューロンの活性化がいかに周囲細胞に影響を及ぼすかに関する情報をもたらす(図15を参照されたい)。
【０１３４】
最初の光学的刺激の間(図15E及びFのシアン色の棒を参照されたい)、ニューロン1(図15C〜Eの黒色細胞及びトレースを参照されたい)、すなわちYFP-ChR2を発現するニューロン2(図8C〜Eの青色細胞及びトレースを参照されたい)に最も近いものは、ニューロン2における第2のAPに応答して、単一APを発火させる(図15Eの第1の赤い四角い枠及び図15Gの第1の領域を参照されたい)。ニューロン3(図15C〜E、紫色の細胞及びトレースを参照されたい)及び5(図15C〜Eのオレンジ色細胞及びトレースを参照されたい)は、ニューロン2の発火に弱くしか連携しておらず、ニューロン4(図15C〜Eの緑色の細胞及びトレースを参照されたい)に伝播するそれら自体、二重のスパイクを開始し、ニューロン2の光学的に誘起される発火パターンを妨害(図15D及びEの第1の赤い四角い枠を参照されたい)しているように思われる。この二重スパイクは、約12msで分離され、一層遅いCa2+イメージングによって解像するのは困難と思われる。
【０１３５】
光刺激の第2のエポックの間、ニューロン1の応答(図15D及び15Fの黒色細胞及びトレースを参照されたい)は抑制され、もはや光学的に制御されたニューロン2(図15D及びFの青色細胞及びトレースを参照されたい)からの合図に強く連携しているとは思われない。ニューロン3及び5の応答は、ニューロン2の発火に一層強力に関連している(図15F及びGの第1の赤い四角い枠を参照されたい)一方、ニューロン4(図15D及びFの緑色の細胞及びトレースを参照されたい)は、ニューロン2の光学的活性化前のいくつかの自発的なバーストを例外として、静かなままである。この「単純な」培養海馬のモデルでさえも、高度な相互関連性が存在し、このことは、Ca2+イメージングのような方法によって観察可能とは思われない。あわせて、これらの実験は、古典的な光遺伝学的ツールと協同して働き、ニューロンの結合及び機能の複雑さを光学的にインテロゲートするBeRST1の能力を確定するものである。
【０１３６】
いくつかの実施形態が、本明細書に記載されている。それにもかかわらず、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ−Ｆ】
2018533640.tif 000037
【図２Ａ−Ｅ】
2018533640.tif 000038
【図３Ａ−Ｃ】
2018533640.tif 000039
【図４Ａ−Ｂ】
2018533640.tif 000040
【図５Ａ−Ｄ】
2018533640.tif 000041
【図６Ａ−Ｅ】
2018533640.tif 000042
【図７Ａ−Ｈ】
2018533640.tif 000043
【図８Ａ−Ｃ】
2018533640.tif 000044
【図９Ａ−Ｅ】
2018533640.tif 000045
【図１０Ａ−Ｆ】
2018533640.tif 000046
【図１１Ａ−Ｅ】
2018533640.tif 000047
【図１２Ａ−Ｃ】
2018533640.tif 000048
【図１３Ａ−Ｆ】
2018533640.tif 000049
【図１４Ａ−Ｅ】
2018533640.tif 000050
【図１５Ａ−Ｇ】
2018533640.tif 000051
【図１６】
2018533640.tif 000052
【図１７】
2018533640.tif 000053
【図１８】
2018533640.tif 000054
【図１９】
2018533640.tif 000055
【図２０】
2018533640.tif 000056
【図２１】
2018533640.tif 000057
【図２２】
2018533640.tif 000058
【図２３】
2018533640.tif 000059
【図２４】
2018533640.tif 000060
【図２５】
2018533640.tif 000061
【図２６】
2018533640.tif 000062
【国際調査報告】
2018533640.tif 000063
2018533640.tif 000064
2018533640.tif 000065