(57)【要約】神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような運動ニューロン疾患の予防および処置のための方法、ならびに本方法において使用するための組成物および組み合わせ調製物が記載される。この方法は、そのような予防または処置を必要とする被験体の中枢神経系において、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害すること、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害することを含む。組成物は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患を予防または処置する方法であって、そのような予防または処置を必要とする被験体の中枢神経系において、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害すること、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害することを含む、方法。
【請求項２】
ＥＧＦＲシグナル伝達およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達が、前記被験体の小グリア細胞、アストロサイト、またはニューロンにおいて阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＧＦＲシグナル伝達が、小グリア細胞の活性化および／またはＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害するように阻害される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＤＰ４３の脱アセチル化を誘導することにより、ＴＤＰ４３の封入体の形成が阻害される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＧＦＲシグナル伝達が、前記被験体におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害することにより阻害される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲシグナル伝達が、前記被験体にＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤を投与することにより阻害される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ブリガチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、およびイコチニブからなる群より選択される小分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、Ｐ−糖タンパク質阻害剤とともに前記被験体に同時投与されるか、または逐次的に投与される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＧＦＲシグナル伝達が、ＥＧＦＲの細胞外結合ドメインへのリガンドの結合を阻害することによって阻害される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＧＦＲシグナル伝達が、ＥＧＦＲの細胞外結合ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体を前記被験体に投与することによって阻害される、請求項１から４、または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブおよびマツズマブからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−１βおよびＮＦｋＢの産生を阻害し、ならびに／またはＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害するように、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達が阻害される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＤＰ４３の封入体の形成が、ＴＤＰ４３のリン酸化を阻害することにより阻害される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達が、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４を阻害することにより阻害される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４の小分子阻害剤を前記被験体に投与することによって、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４が阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害剤が、レスタウルチニブ、タマチニブ、スニチニブ、ＳＵ−１４８１３、スタウロスポリン、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４、ＫＷ−２４４９、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、ＪＮＪ−２８３１２１４１、フェドラチニブ、アファチニブ、ルキソリチニブ、カネルチニブ、アルボシジブ、ボスチニブ、イマチニブ、バンデタニブ、ＰＨＡ−６６５７５２、ＢＩ−２５３６、ネラチニブおよびタンヅチニブからなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤がゲフィチニブである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
ゲフィチニブを前記被験体に投与することにより、ＥＧＦＲシグナル伝達、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達が阻害される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、前記被験体の脳または脊髄に直接投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４の阻害剤が、Ｐ−糖タンパク質阻害剤とともに前記被験体に同時投与されるか、または逐次的に投与される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経変性疾患が運動ニューロン疾患である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経変性疾患が家族性神経変性疾患である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
神経変性疾患の予防または処置において使用するための、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤。
【請求項２５】
神経変性疾患の予防または処置のための医薬の製造における、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の使用。
【請求項２６】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、小グリア細胞の活性化および／またはＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害するように、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＴＤＰ４３の脱アセチル化を誘導することによってＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害する、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害することによりＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤である、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ブリガチニブ、ラパチニブ、アファチニブおよびイコチニブからなる群より選択される小分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲの細胞外結合ドメインへのリガンドの結合を阻害する、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲの細胞外結合ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２４から２８または３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記モノクローナル抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブおよびマツズマブからなる群より選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、ＩＬ−１βおよびＮＦｋＢの産生を阻害する、ならびに／またはＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害するように、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害する、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、ＴＤＰ４３のリン酸化を阻害することによってＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害する、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４を阻害することによってＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害する、請求項２４から３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４の小分子阻害剤である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記阻害剤が、レスタウルチニブ、タマチニブ、スニチニブ、ＳＵ−１４８１３、スタウロスポリン、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４、ＫＷ−２４４９、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、ＪＮＪ−２８３１２１４１、フェドラチニブ、アファチニブ、ルキソリチニブ、カネルチニブ、アルボシジブ、ボスチニブ、イマチニブ、バンデタニブ、ＰＨＡ−６６５７５２、ＢＩ−２５３６、ネラチニブおよびタンヅチニブからなる群より選択される、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記阻害剤がゲフィチニブである、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項４０】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤がゲフィチニブである、請求項２４から３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤および前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が、脳または脊髄に直接投与される、請求項２４から４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤をさらに含む、請求項２４から４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記神経変性疾患が運動ニューロン疾患である、請求項２４から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記運動ニューロン疾患がＡＬＳである、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記神経変性疾患が家族性神経変性疾患である、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物であって、前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤および前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は異なる化合物である、薬学的組成物。
【請求項４７】
（ａ）ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤；および（ｂ）ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤を含む組み合わせ調製物であって、前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が異なる化合物である、組み合わせ調製物。
【請求項４８】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤をさらに含む、請求項４６に記載の薬学的組成物または請求項４７に記載の組み合わせ調製物。
【請求項４９】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、シクロスポリンＡ、ケトコナゾール、キニジン、リトナビル、ベラパミル、エベロリムス、およびエラクリダールからなる群より選択される、請求項８または請求項２０に記載の方法、または請求項４８に記載の薬学的組成物、もしくは組み合わせ調製物。
【請求項５０】
ゲフィチニブおよびＰ−糖タンパク質阻害剤を含む、組成物。
【請求項５１】
ゲフィチニブおよびＰ−糖タンパク質阻害剤、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５２】
（ａ）ゲフィチニブ；および（ｂ）Ｐ−糖タンパク質阻害剤を含む、組み合わせ調製物。
【請求項５３】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、シクロスポリンＡ、ケトコナゾール、キニジン、リトナビル、ベラパミル、エベロリムス、およびエラクリダールからなる群より選択される、請求項５０に記載の組成物、請求項５１に記載の薬学的組成物または請求項５２に記載の組み合わせ調製物。
【請求項５４】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤がキニジンである、請求項５０に記載の組成物、請求項５１に記載の薬学的組成物、または請求項５２に記載の組み合わせ調製物。
【請求項５５】
ＣＮＳへの直接投与に適しているか、または適合されている、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
内因性ＣＳＦ中に存在する１つまたは複数の電解質を含み、前記１つまたは複数の電解質が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン含有イオンおよび塩化物イオンから選択される、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
１５０ｍＭのナトリウムイオン、３ｍＭのカリウムイオン、１．４ｍＭのカルシウムイオン、０．８ｍＭのマグネシウムイオン、１．０ｍＭのリン含有イオン、および１５５ｍＭの塩化物イオンを含む溶液を含む、請求項５６に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および前記ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤がゲフィチニブである、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
神経変性疾患の予防または処置において使用するための、請求項５０から５８のいずれか一項に記載の組成物、薬学的組成物または組み合わせ調製物。
【請求項６０】
神経変性疾患を予防または処置するための医薬の製造における、請求項５０から５８のいずれか一項に記載の組成物、薬学的組成物または組み合わせ調製物の使用。
【請求項６１】
前記神経変性疾患が運動ニューロン疾患である、請求項５９または６０に記載の使用。
【請求項６２】
前記運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記神経変性疾患が家族性神経変性疾患である、請求項５９から６２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６４】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤がエラクリダールである、請求項８または２０に記載の方法、請求項４２に記載の使用、請求項４８に記載の薬学的組成物もしくは組み合わせ調製物、請求項５０に記載の組成物、請求項５１に記載の薬学的組成物、または請求項５２に記載の組み合わせ調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症のような運動ニューロン疾患の処置、および方法で使用するための組成物または組み合わせ調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、発話、歩行、呼吸および嚥下のような必須の随意筋活動を制御する細胞である運動ニューロンを破壊する、一群の進行性の神経学的障害である。通常、脳内の神経細胞（上位運動ニューロン）からのメッセージは、脳幹および脊髄内の神経細胞（下位運動ニューロン）に伝達され、そこから特定の筋肉へと伝達される。上位運動ニューロンは、下位運動ニューロンに、歩行または咀嚼などの動きを生じさせるよう指示する。下位運動ニューロンは、腕、脚、胸、顔、喉、および舌の動きを制御する。
【０００３】
最下部の運動ニューロンと筋肉の間のシグナルに混乱が存在する場合、筋肉は適切に作動しない；筋肉がだんだんと弱くなり、消耗し始め、制御不能な攣縮（線維束攣縮と呼ばれる）が発生する可能性がある。上位運動ニューロンと下位運動ニューロンとの間のシグナルに混乱が存在する場合、四肢の筋肉が硬直（痙縮と呼ばれる）を起こし、動きが遅く、辛くなり、膝や足首の痙動などの腱反射が過活動になる。時間とともに、随意運動を制御する能力が失われる可能性がある。
【０００４】
ＭＮＤは、それらが遺伝性（家族性）であるか散発性であるか、および変性が上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、またはその両方に影響を及ぼすか否かにより分類される。成人では、最も一般的なＭＮＤは、上部および下位運動ニューロンの両方に影響を及ぼす筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。それは遺伝性および散発性の形態を有し、腕、脚または顔の筋肉に影響を及ぼし得る。原発性側索硬化症（ＰＬＳ）は上位運動ニューロンの疾患である一方で、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）は脊髄中の下位運動ニューロンのみに影響を及ぼす。進行性球麻痺（ＰＢＰ）においては、脳幹の最下位運動ニューロンが最も影響を受け、不明瞭言語を起こし、咀嚼や嚥下が困難になる。ほぼすべての場合、腕と脚に穏やかな異常徴候がある。
【表１】
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【０００５】
ＡＬＳは、すべての随意筋へのシグナルを混乱させる、進行性の、最終的には致命的な障害である。運動ニューロン疾患およびＡＬＳという用語は、しばしば交換可能に使用される。ＡＬＳには、最も一般的には、４０歳から６０歳の間の人々が罹るが、若年者および年長者もまたこの疾患を発症する可能性がある。男性は女性よりも頻繁に冒される。家族性形態のＡＬＳはＡＬＳ症例の１０パーセントまたはそれ未満を占めており、現在までに１０を超える遺伝子が同定されている。しかしながら、発見された遺伝子変異の大部分は、非常に少数の症例の原因でしかない。成人におけるＡＬＳの最も一般的な家族性形態は、第２１染色体に位置するスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子またはＳＯＤ１の変異によって引き起こされる。
【０００６】
ＡＬＳやその他のＭＮＤの療法や標準処置はない。ＡＬＳを処置するために米国食品医薬品局が承認した唯一の処方薬であるリルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））は、寿命を２〜３ヶ月延長させるが、症状は緩和されず、吐き気や疲労のような望ましくない副作用を有する。この薬物は、運動ニューロンにシグナルを運ぶ神経伝達物質グルタメートの体内の自然産生を減少させる。多すぎるグルタメートは運動ニューロンに害を及ぼし、神経シグナル伝達を阻害すると考えられている。
【０００７】
哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）は、比較的少ない常在性免疫細胞および高度に特異的な血液脳関門（ＢＢＢ）と共に、免疫学的特権を持つと考えられている。しかしながら、神経変性疾患における免疫および炎症異常の存在が、かなりの証拠により支持されている。神経炎症は、小グリア細胞（小膠細胞症）、アストログリオーシス、および浸潤性免疫細胞の活性化および増殖によって特徴付けられる。それは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびＡＬＳを含む多くの神経変性疾患の病理学的特徴である。神経炎症応答は、運動ニューロンの生存に有益または有害であり得る。これらの異なる効果は、小グリア細胞／マクロファージおよびアストロサイトの異なる活性化状態によって誘発され、浸潤性Ｔ細胞によって調節される（Ｚｈａｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３年；８巻（４号）：８８８〜８９９頁）。
【０００８】
小グリア細胞は、ＣＮＳにおける免疫防御の第一線として作用し、そのプロセスを通して周囲の環境を調査する。小グリア細胞は、ＣＮＳの病理学的変化に敏感であり、損傷組織からの危険シグナルに応答する。ＡＬＳにおける運動ニューロン傷害の初期段階の間、運動ニューロンからの修復シグナルは、Ｍ２表現型への小グリア細胞の活性化を誘導すると考えられている。Ｍ２小グリア細胞は、運動ニューロンを修復し、さらなる損傷から保護するために神経保護因子（神経栄養因子および抗炎症因子のような）を放出する。アストロサイトもまた、神経栄養因子を分泌することによって神経保護プロセスに関与する。疾患が進行するにつれて、損傷した運動ニューロンは小グリア細胞を細胞傷害性Ｍ１表現型に変換する危険シグナルを放出する。Ｍ１小グリア細胞は、炎症促進性サイトカイン（腫瘍壊死因子α、ＴＮＦ−α、インターロイキン−１β、ＩＬ−１βのような）を放出し、活性酸素種を放出することによって神経毒性を促進する。これらの炎症促進性サイトカインは、小グリア細胞をさらに活性化し、過剰な神経毒性をもたらす。Ｍ１小グリア細胞はまた、アストロサイトの活性化を促進する。活性化されたアストロサイトは、活性酸素種および炎症促進性サイトカインの放出により有害な炎症表現型を獲得するが、これは次に小グリア細胞の活性化をさらに誘導し、運動ニューロンの変性を促進する。活性化されたグリア細胞はまた、末梢単球／マクロファージおよびＴ細胞をＣＮＳに動員し、さらに運動ニューロン変性を悪化させる。ＡＬＳにおける神経炎症性応答は、Ｚｈａｏら、上記参照、およびＬｅｗｉｓら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２０１２年、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８０３７０１）に概説される。
【０００９】
主に小グリア細胞に発現するパターン認識受容体（ＰＲＲ）は、組織の傷害または損傷に対する初期の応答物である。ＰＲＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる固有の微生物構造、例えば微生物核酸、細菌分泌系、および微生物細胞壁の成分を検出する。損傷した宿主細胞は、尿酸結晶、ＡＴＰ、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、熱ショックタンパク質ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０のような危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を放出することによってＰＲＲを誘発することもできる。ＰＲＲは、膜表面上、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、または、細胞質の内部、例えばＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、およびＡＩＭ２様受容体（ＡＬＲ）のいずれかに存在してもよい。ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰと遭遇する多くのＰＲＲは、核因子−ｋＢ（ＮＦ−κＢ）、アクチベータータンパク質１（ＡＰ１）およびインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）による遺伝子転写を促進するシグナル伝達カスケードを誘発する。標的遺伝子は、サイトカイン、インターフェロン、および他の炎症促進性または殺菌性タンパク質をコードする。
【００１０】
Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン−１受容体（ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ）スーパーファミリーは、細胞外免疫グロブリン様ドメインおよび細胞内Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１Ｒ（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる構造的に相同な、一群のタンパク質である。ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒスーパーファミリーのメンバーは、免疫応答において基本的な役割を果たす。これらの受容体は、微生物成分を検出し、複数の炎症性遺伝子の発現の増加をもたらす複雑なシグナル伝達経路を誘発する。スーパーファミリーには、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）サブファミリー、インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）サブファミリー、およびＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質（ＭｙＤ８８のような）が含まれる。
【００１１】
ＮＬＲおよびＡＬＲのサブセットは、明確な防御メカニズムを誘発する。これらのタンパク質は、インフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）と呼ばれるサイトゾルタンパク質複合体を構築する。活性になると、インフラマソームは、それ自身のカスパーゼ活性化および動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を介するか、または、インフラマソーム形成の間に結合する、アダプタータンパク質ＡＳＣのＣＡＲＤを介して、プロカスパーゼ−１（カスパーゼ−１の前駆体分子）に結合する。インフラマソームは、プロ−カスパーゼ−１分子の自己触媒的切断を誘導してカスパーゼ−１を形成するが、これはプロ−インターロイキン（ＩＬ）−１βのＩＬ−１β、炎症促進性サイトカインへのタンパク質分解的切断を含む、初期の炎症シグナルに応答した様々なプロセスを行うことができる。
【００１２】
ＩＬ−１βは、タイプＩ  ＩＬ−１受容体／ＩＬ−１アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）複合体を通ってシグナル伝達し、炎症促進性サイトカイン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−６、およびインターフェロン）、およびグリア内の好中球動員性ケモカイン（ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２）のＮＦｋＢ依存性転写を導く。ＩＬ−１βは、（ＮＦ−κＢを活性化することによって）それ自身の遺伝子の発現を誘導し、そのことによりＩＬ−１応答を増幅する正のフィードバックループとして役立つ。
【００１３】
ＲＮＡ結合タンパク質、特にトランス活性応答（ＴＡＲ）ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）は、運動ニューロン疾患および関連する神経変性障害の病因の中心である。ＴＤＰ４３は、ほとんどのＡＬＳ形態の特徴であるタンパク質性封入体の主要な成分である。ＴＤＰ４３は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合に関与する２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、およびグリシンリッチなカルボキシ末端ドメインを含有する。ＴＤＰ４３は主に核に局在化している。罹患した脳および脊髄に見られる病理学的なＴＤＰ−４３は、主に細胞質において異常に凝集している。ほぼすべての散発性およびＴＤＰ４３変異体の家族性症の例は、ＴＤＰ４３凝集を有する（Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１年１１月３０日；１３巻（１号）：３８〜５０頁）。沈殿したＴＤＰ４３タンパク質はポリリン酸化され、ユビキチン化される。リン酸化は凝集に密接に関連している。ＴＤＰ４３のアセチル化もまた、凝集プロセスの一部である。アセチル化は、ＲＮＡ結合を損ない、ＡＬＳにおける病理学的封入に大きく類似している不溶性の高リン酸化ＴＤＰ４３種の蓄積を促進する。アセチル化は、ＴＤＰ４３のＲＲＭ内のリシン残基に生じる。細胞質ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）はｉｎ  ｖｉｖｏでＴＤＰ４３と相互作用する。細胞質ＴＤＰ４３凝集体は効率良く脱アセチル化することができないが、ＨＤＡＣ６はＴＤＰ４３を脱アセチル化することが示されている（Ｃｏｈｅｎら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５年１月５日；６巻：５８４５頁）。
【００１４】
ＡＬＳのＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスモデルは、ＡＬＳについて最も広く使用されている動物モデルである（Ｇｕｒｎｅｙら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４巻：１７７２〜１７７５頁）。これらのマウスにおいては、ＡＬＳを引き起こすヒトＳＯＤ１遺伝子（Ｇ９３Ａ）の家族性変異が、内因性マウスＳＯＤ１プロモーターの制御下で、体全体にトランスジェニックに発現される。導入遺伝子の挿入は、下位運動ニューロンの変性疾患を引き起こし、導入遺伝子のコピー数が疾患の重篤度と相関するとともに、進行性の麻痺および最終的な死を導く。ＴＤＰ４３の細胞質の誤った局在化は、疾患の最終段階で起きる。
【００１５】
ｍＳＯＤマウスモデルは、ＡＬＳ患者で観察される神経炎症反応の多くの局面を再現する。ｍＳＯＤマウスにおいては、疾患の早期の前駆症状性段階では活性化小グリア細胞数の増加が観察され、末期までの疾患の進行では、腰椎脊髄の小グリア細胞数はさらにおよそ２倍増加する。いくつかの研究は、ｍＳＯＤマウスにおける炎症反応の調節が疾患の進行を変えることを実証し、ｍＳＯＤマウスの小膠細胞症が運動ニューロン変性に寄与したという示唆を導いた。しかしながら、ｍＳＯＤマウスにおいて炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αを切除したか、または小グリア細胞の増殖が遮断された実験においては疾患の進行の速度に影響が無く、小膠細胞症はｍＳＯＤマウスモデルにおける神経変性を悪化させないことを示唆している。
【００１６】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路が、神経変性状態の病理学において役割を果たす可能性があることが、いくつかの証拠により示唆される。ＥＧＦＲ阻害剤による処置は、緑内障のラットモデル（Ｌｉｕら、２００６年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６巻：７５３２〜７５４０頁）および脊髄損傷のラットモデル（Ｅｒｓｃｈｂａｍｅｒら、２００７年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７巻：６４２８〜６４３５頁）の両方において、神経保護的であることが報告されている。両方の研究において、著者らは、ＥＧＦＲ阻害が反応性アストロサイトを標的とすることを示唆している。さらに、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現は、ヒトＡＬＳ患者の脊髄およびＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスモデルの脊髄において１０倍を超えて上方調節されることが見出された（Ｏｆｆｅｎら、２００９年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３８巻：８５〜９３頁）が、これは、ＥＧＦＲシグナル伝達の薬理学的阻害がこの疾患の進行を遅らせるための可能な戦略であり得ることを示唆している。
【００１７】
ＳＯＤ１マウスおよびＡＬＳ患者の脊髄におけるＥＧＦＲレベルは、対照と比較して数１０倍増加する（Ｏｆｆｅｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９年６月；３８巻（２号）：８５〜９３頁）。ＥＧＦＲは、脊髄損傷の結果としてのアストロサイト活性化に強く関係している（Ｌｉら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．２０１１年６月；５８巻（７号）：８１２〜９頁；Ｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２０１４年，１１巻：７１頁）。活性化されたアストロサイトはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現し、軸索および樹状突起生成を阻害し、ニューロンのアポトーシスを誘導することができるＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を含む種々の炎症性サイトカインを放出する（Ｍｏｎｊｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３年１２月５日；３０２巻（５６５１号）：１７６０〜５頁）。さらに、ＥＧＦＲ阻害剤はニューロン再生を促進することが示されている一方で、ＥＧＦそのものはアストロサイトの発生を増加させることができる（Ｋｕｈｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年８月１日；１７巻（１５号）：５８２０〜９頁）。したがって、ＥＧＦＲは、脊髄におけるアストロサイトの活性化に中心的な役割を果たすことができる。
【００１８】
ＥＧＦＲはまた、小グリア細胞の活性化および増殖にも関与しており（Ｑｕら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２０１２年７月２３日；９巻：１７８頁）、ＥＧＦＲの遮断はＬＰＳに対する小グリア細胞応答を劇的に減少させる。同様にｉｎ  ｖｉｖｏで、ＥＧＦＲ遮断は、小グリア細胞およびアストロサイトの活性化、瘢痕形成、ならびに増強された軸索伸長を低減する（Ｑｕら、２０１２年、上記を参照）。
【００１９】
これらの所見は、ＡＬＳにおけるグリア細胞のＭＮ毒性表現型への形質転換が、ＥＧＦＲの遮断によって有意に修飾され得ることを示唆する。Ｌｅ  Ｐｉｃｈｏｎら、２０１３年（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、８巻（４号）：ｅ６２３４２；１〜１２頁）は、非小細胞肺癌の処置のために市販されているＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブが、ＡＬＳのＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて、有益な効果を有していたかを試験する研究を記載している。著者らは、エルロチニブが中枢神経系に浸透し、疾患発病および進行の複数の読出しによって測定されるように、中程度ではあるが統計学的に有意な症状遅延をもたらすことを報告している。しかしながら、処置は寿命が延長することなく、運動シナプスを保護せず、アストロサイトおよび小グリア細胞のマーカーの調節と相関しなかった。著者らは、エルロチニブはＡＬＳのＳＯＤ１マウスモデルの処置に有効ではないと結論付けている。このマウスモデルにおけるエルロチニブの有効性の欠如と、皮膚刺激および下痢を含む薬物の望ましくない副作用を考慮して、著者らは、エルロチニブはＡＬＳの処置についての良い臨床候補であるようには見えないと結論付けている。
【００２０】
したがって、ＡＬＳおよび他の神経変性疾患の処置の改善について、緊急の必要性があるままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１１年１１月３０日）１３巻（１号）：３８〜５０頁
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１５年１月５日）６巻：５８４５頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、ＡＬＳのような神経変性疾患の有効な処置は、複数の機能不全の経路およびプロセスの同時矯正が必要であることを認識した。
【００２３】
本発明によれば、そのような予防または処置を必要とする被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＥＧＦＲシグナル伝達を阻害すること；およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害すること；を含む神経変性疾患を予防または処置する方法が提供される。
【００２４】
また、本発明によれば、神経変性疾患の予防または処置において使用するための、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が提供される。
【００２５】
本発明はまた、神経変性疾患の予防または処置のための医薬の製造における、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ＣＮＳの中で、ＥＧＦＲシグナル伝達および／またはＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達は、小グリア細胞、アストロサイトもしくはニューロン内、小グリア細胞およびアストロサイト内、小グリア細胞およびニューロン内、アストロサイトおよびニューロン内、または小グリア細胞、アストロサイト、およびニューロン内において、阻害されてもよい。
【００２７】
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１としても知られている）は、受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。ファミリーの他のメンバーは、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４である。それらはすべて、（ｉ）システインリッチな細胞外Ｎ末端リガンド結合ドメインおよび二量体化アーム；（ｉｉ）疎水性膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）いくつかのリン酸化部位を有する細胞内で高度に保存された細胞質Ｃ末端チロシンキナーゼドメインからなる膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲの外部ドメインは、閉じた不活性コンフォメーション、および開いた活性コンフォメーションを有しており、互いに平衡状態にある。閉じたコンフォメーションは、リガンドが存在しない場合に好まれる。リガンドが結合すると、平衡がシフトし、開いたコンフォメーションを安定化させ、二量体化アームが別の受容体分子の同一の二量化アームと相互作用してホモ二量体を形成することを可能にする。ＥＧＦＲはまた、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む、ＨＥＲファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体化を促進する。したがって、ＥＧＦＲは、ホモ二量体化を介してそれ自体で、または他のＨＥＲファミリーメンバーとのヘテロ二量体化を介して、細胞シグナル伝達カスケードを開始することができる。
【００２８】
ＥｒｂＢファミリーメンバーは、ＥＧＦ、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピゲン（ＥＰＧ）およびニューレグリン１〜６（ＮＲＧ）を含む、１３の公知のリガンドにより活性化することができる。ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＡＲ、ＢＴＣおよびＥＰＲは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。種々のリガンドは、特異的ヘテロ二量体化を誘導することができ、例えば、ＥＧＦは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４とのＥＧＦＲのヘテロ二量体化を誘導することができる。したがって、ＥＧＦ受容体のホモ二量体化およびヘテロ二量化は、複雑なシグナル伝達カスケードを促進する（Ｓｅｓｈａｃｈａｒｙｕｌｕら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２０１２年（１６巻（１号）：１５〜３１頁）。
【００２９】
（図１に図示した）ＥＧＦＲシグナル伝達の活性化は、リガンド誘導性受容体二量体化によって誘発され、その後、１つの受容体の内在性キナーゼドメインに存在するチロシン残基が、パートナー受容体のＣ末端尾部の特異的残基（Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６８、Ｙ１１４８、Ｙ１１７３を含む）を交差リン酸化する。エフェクタータンパク質の動員は、エフェクタータンパク質上のＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン、および受容体の細胞内チロシンキナーゼドメイン上に存在するホスホチロシンモチーフを介して生じる。その後の解離において、活性化されたアダプターおよびエフェクタータンパク質は、ＫＲＡＳ−ＢＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスホリパーゼＣガンマタンパク質経路、抗アポトーシスＡＫＴキナーゼ経路およびＳＴＡＴシグナル伝達経路を含む、それらの対応するシグナル伝達カスケードをさらに刺激する。これは、細胞増殖、血管新生、移動、生存、および接着をもたらす。
【００３０】
アダプタータンパク質の１つであるＧＲＢ２は、１０６８のホスホチロシン残基に結合し、膜にＳＯＳを動員する。ＳＯＳは、ＲＡＦを膜に動員するＧＤＰ／ＧＴＰ交換を活性化する。ＲＡＦはＭＥＫをリン酸化し、次いで細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する。ＥＲＫは、細胞成長および増殖を誘導するいくつかの転写調節因子を活性化する。ＧＲＢ２（またはＧＡＢのような他のアダプタータンパク質）は、ＥＧＦＲシグナル伝達の別の主要な媒介物質であるＰＩ３Ｋを動員する。ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）に変換する。ＰＩＰ３はＡＫＴのＰＨドメインに結合し、これを原形質膜に動員する。ＰＤＫ１はＡＫＴをリン酸化するが、それは次いで、細胞生存を媒介する種々のタンパク質の活性を調節する。
【００３１】
ＥＧＦＲはまた、ホスホリパーゼＣを活性化し、これはＰＩＰ２を加水分解してイノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）および１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成する。ＩＰ３は小胞体からＣａ２＋の放出を誘導し、カルシウム調節経路を活性化する。ＤＡＧはプロテインキナーゼＣ経路を活性化させる。ＥＧＦＲ経路においてＰＫＣによって調節されるシグナル伝達モジュールの１つは、ＮＦκＢモジュールである。タンパク質ＳＲＣは、様々な細胞内におけるＲＡＳ、ＰＬＣ、およびＳＴＡＴタンパク質のような様々な経路の活性化で、重要な役割を果たす。ＥＧＦＲによって活性化される他のシグナル伝達モジュールには、ＦＡＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫおよびＥＲＫ５モジュールが含まれる。ＥＧＦＲは、ＪＮＫキナーゼを動員し、アクチン重合を調節するＲＡＣおよびＣＤＣ４２のようなＧタンパク質の活性化を介して、ＪＮＫ経路を誘導する。
【００３２】
ＥＧＦＲはまた、形質膜から、ＳＴＡＴ、ＰＣＮＡおよびＥ２Ｆタンパク質ファミリーのような他の転写調節因子と協力していくつかの遺伝子の発現を直接調節する核を含む他の細胞コンパートメントにトランスロケーションンする。
【００３３】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害することによって、または例えば受容体へのリガンドの結合を阻害することによって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の上流にあるＥＧＦＲシグナル伝達経路のポイントで、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することができる。
【００３４】
様々な細胞プロセスにおけるＥＧＦＲの機能的関与を考慮して、ＥＧＦＲ媒介効果を標的とし干渉するいくつかのアプローチが開発されている。様々なヒト悪性疾患においてＥＧＦＲを標的とするために現在用いられている２つの異なる治療アプローチは、小分子チロシンキナーゼ阻害剤およびモノクローナル抗体の使用である。チロシンキナーゼ阻害剤はＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインを標的とするが、抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する。このようなＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、神経変性疾患、特に運動ニューロン疾患の予防または処置のための本発明の方法において使用され得る。
【００３５】
ＥＧＦＲシグナル伝達の既知のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）アナログである。それらは、受容体チロシンキナーゼの細胞内触媒キナーゼドメイン上のＡＴＰ結合ポケットと競合して結合することによってＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し、それによって自己リン酸化およびいくつかの下流シグナル伝達経路の活性化を防ぐ。タイプＩおよびＩＩの可逆的阻害剤は、キナーゼ活性コンフォメーションを認識するＡＴＰ分子と競合する。不可逆的阻害剤は、求核性システイン残基と特異的に反応することにより共有結合的にキナーゼ活性部位に結合する。不可逆的阻害剤は、臨床効果の延長と頻繁な投与の必要性を減少させる利点を有する。
【００３６】
ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する小分子チロシンキナーゼ阻害剤の例には、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ブリガチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ、アファチニブおよびイコチニブ（ｉｃｏｔｉｎｉｂ）が含まれる。
【００３７】
ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９；商品名イレッサ）（ＵＳ５，７７０，５９９に記載される、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−４−アミン）は、白金ベースまたはドセタキセル化学療法の両方の失敗後のＮＳＣＬＣ患者の処置のために承認されている。ゲフィチニブは、アニリノキナゾリン由来のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。それは、選択的チロシンキナーゼ活性を有する経口活性低分子量ＥＧＦＲ阻害剤である。それは、セリン−スレオニンキナーゼ活性を阻害しない。ゲフィチニブは、他のＥｒｂＢファミリーメンバーと比較してＥＧＦＲに対して２００倍高い親和性を有する。ゲフィチニブの生物学的半減期は２８時間であり、吸収後のピーク血漿濃度は３〜７時間である。ゲフィチニブを用いた臨床試験では、毎日２５０または５００ｍｇの用量が進行性肺がんに対して有効であることが明らかにされている。フェーズＩ試験で評価された最大の耐用量は、７００ｍｇ／日であった。ＡＬＳのような神経変性疾患の処置のためのゲフィチニブの適切な用量範囲は、１日当たり１００〜７５０ｍｇ、例えば２５０ｍｇ／日である。
【００３８】
エルロチニブ（ＯＳＩ−７７４；商品名タルセバ）は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの経口的に強力で選択的に可逆な阻害剤の形態において利用できる、ゲフィチニブと同様の、ＦＤＡに認可された別の低分子量分子である。ゲフィチニブと同じく、エルロチニブは、受容体チロシンキナーゼ内のＡＴＰ結合ポケットと競合することによって、ＡＴＰアナログとして機能する。それはナノモル濃度でＥＧＦ依存性細胞増殖を阻害し、Ｇ１期における細胞周期の進行を遮断することが、ヒトがん細胞における研究により見出された。エルロチニブは現在、白金ベースの第一選択化学療法の４サイクル後に疾患が進行しなかった再発性のＮＳＣＬＣ患者および進行性のＮＳＣＬＣ患者の維持療法に承認されている。
【００３９】
ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方の経口的に活性で、可逆的および特異的な受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。ＥＧＦＲ阻害のその非選択的性質のために、それは改善された有効性とともにより広いスペクトルの抗腫瘍活性を説明する。この分子は、組換えＥＧＦＲおよびＨＥＲ２プロテインキナーゼのＡＴＰ結合ポケットに結合する。それは、組換えＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２チロシンキナーゼをそれぞれ１０．８および９．３ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で５０％（ＩＣ５０）阻害し、それ故、自己リン酸化および下流シグナル伝達のその後の阻害を防止する。
【００４０】
カネルチニブ（Ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ；ＣＩ−１０３３）は、３−クロロ−４−フルオロ−４−アニリノキナゾリン化合物である。それは、経口的に活性な低分子量の不可逆性汎ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤である。それは、ＥｒｂＢファミリー受容体に特異的なシステイン残基をアルキル化し、これらの受容体およびそれらの下流の分裂促進シグナル伝達経路の不可逆的阻害を生じるように設計された、新世代のチロシンキナーゼ阻害剤である。カネルチニブは、炭素６でＡＴＰ結合ポケットおよびアクリルアミド側鎖に結合し、ＥＧＦＲのシステイン残基７７３およびＨＥＲ２およびＨＥＲ４の残基７８４および７７８とそれぞれ密接に会合し、それらの恒久的な不活性化をもたらす。それはまた、ＥＧＦＲファミリーメンバーのヘテロ二量体化のためのパートナー受容体が利用可能ではないことによって、ＨＥＲ３依存性シグナル伝達を有効に阻害する。カネルチニブはまた、受容体のユビキチン化およびエンドサイトーシスを誘導する。成長阻害およびアポトーシスは、１マイクロモルまたはナノモル範囲で達成することができ、この選択性は、複数回用量動物研究で観察される最小の毒性を説明する。
【００４１】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の他の阻害剤が本発明に従って使用され得ることが理解されるであろう。
【００４２】
他の実施形態において、ＥＧＦＲシグナル伝達は、ＥＧＦＲの細胞外結合ドメインへのリガンドの結合を阻害することによって阻害され得る。ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインへのリガンドの結合を遮断するモノクローナル抗体は、受容体二量体化、自己リン酸化および下流シグナル伝達を防ぐ。そのような抗体はまた、受容体内部移行、ユビキチン化、分解および延長された下方調節を誘導する。ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合し、リガンド結合を遮断するモノクローナル抗体の例としては、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブが含まれる。
【００４３】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、アストロサイトおよび小グリア細胞の活性化を減少させ、ＩＬ−１βおよびＴＬＲリガンドに対するＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ応答を阻害する。
【００４４】
本発明の一実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達は、ＥＧＦＲによるＨＤＡＣ６のリン酸化を阻害するように阻害される。これは、例えば、ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼを阻害することによって、またはリガンドのＥＧＦＲへの結合を阻害することによって達成され得る。ＨＤＡＣ６はＴＤＰ４３を脱アセチル化することが示されている（Ｃｏｈｅｎら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５年１月５日；６巻：５８４５頁）。ＨＤＡＣ６のＥＧＦＲ媒介性リン酸化（Ｔｙｒ５７０での）は、ＨＤＡＣ６デアセチラーゼ活性を阻害する（Ｄｅｒｉｂｅら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．２００９年１２月２２日；２巻（１０２号）：ｒａ８４）ため、ＥＧＦＲの遮断はＨＤＡＣ６活性、故に、ＴＤＰ４３の脱アセチル化を増加させ、そのことによりＴＤＰ４３凝集を減少させる。
【００４５】
ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路は、図２に図示される（Ｌｏｉａｒｒｏら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２０１０年、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６７４３６３から得た）。それらの同族リガンドを認識する際に、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒタンパク質はホモまたはヘテロ二量体化（ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ）し、ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質（すなわち、ＭｙＤ８８、ＭＡＬ／ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦ、およびＴＲＡＭ）のそのＴＩＲドメインへの異なる組み合わせの動員を通じてシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＬＲ３を除いて、スーパーファミリーのすべての受容体は、ＭｙＤ８８を使用してそのシグナル伝達経路を開始する。いくつかの場合において、ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ１／２、およびＴＬＲ２／６の刺激により引き起こされた応答においてＭＡＬ／ＴＩＲＡＰのような他のアダプターと協同して働く。ＴＬＲ３媒介性シグナル伝達は、アダプター分子ＴＲＩＦのみを必要とし、これはまた、他のアダプターＴＲＡＭに関連してＴＬＲ４によって動員される。
【００４６】
ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ誘導性経路は、２つのクラス：ＭｙＤ８８依存性およびＭｙＤ８８非依存性の応答にサブグループ化することができる。ＭｙＤ８８依存性経路では、ＭｙＤ８８はＩＲＡＫ４、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ２と会合する。次いでＩＲＡＫ４はＩＲＡＫ１およびＩＲＡＫ２をリン酸化し、キナーゼＴＡＫ１を動員するためのプラットフォームとして役立つＴＲＡＦ６とのそれらの会合を促進する。活性化されると、ＴＡＫ１は、ＩＫＫα、ＩＫＫβおよびＮＥＭＯ（ＩＫＫγ）から構成されるＩＫＫ複合体を活性化し、これは、ＩκＢのリン酸化およびその後の分解を触媒し、ＮＦ−κＢ（すなわち、ｐ５０／ｐ６５）が自由に細胞質から核にトランスロケーションし、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子を活性化する。ＴＡＫ１はまた、ｐ３８およびＪＮＫのような分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、転写因子ＡＰ−１の活性化を導くことができる。ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の同時活性化は、炎症促進性サイトカインの産生を介して多面的な炎症応答を誘導する。転写因子ＩＲＦ７は、ＴＬＲ７、８、および９の下流でも活性化され、核へのトランスロケーション、およびＩＦＮαおよびＩＦＮ誘導性遺伝子の活性化をもたらす。
【００４７】
ＴＬＲ３およびＴＬＲ４は両方ともＭｙＤ８８非依存性経路のアダプターＴＲＩＦを介してシグナル伝達する。ＴＬＲ３は、アダプターとしてＴＲＩＦのみが必要である。ＴＲＩＦをＴＬＲ４に架橋するために、ＴＲＡＭの動員が必要となる。したがって、ＴＬＲ４は、ＴＬＲ４複合体のエンドサイトーシスを含む逐次的プロセスにおいて、ＭｙＤ８８依存性およびＴＲＩＦ依存性のシグナル伝達経路の両方を活性化することができる。最初にＴＬＲ４は、原形質膜でＭＡＬ／ＴＩＲＡＰＭｙＤ８８シグナル伝達を誘導する。その後、初期エンドソームへのエンドサイトーシスに続いて、ＴＬＲ４はＴＲＡＭ−ＴＲＩＦシグナル伝達を活性化する。ＴＲＩＦは、ＴＲＡＦ３と相互作用して非標準的ＩＫＫ、ＴＢＫ１、およびＩＫＫεを活性化し、ＩＲＦ３の二量体化および活性化をもたらし、核にトランスロケーションしてＩＦＮβおよびＩＦＮ誘導性遺伝子の転写を活性化する（Ｌｏｉａｒｒｏら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２０１０年、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６７４３６３）。
【００４８】
出願人は、ＩＲＦ３に対するＩＬ−Ｒ／ＴＬＲシグナル伝達経路の再平衡化（ｒｅｂａｌａｎｃｉｎｇ）が、ＭＮＤ（特に、ＡＬＳ）のような神経変性疾患において神経保護的であることを認識した。運動ニューロンの損傷は、ＨＭＧＢ１のようなＤＡＭＰの放出をもたらし、ＴＬＲ４受容体活性化、インフラマソーム活性化の増強、および小グリア細胞によるＩＬ−１β産生の増加をもたらすことが提案される。ＴＬＲ／ＩＬ−１シグナル伝達経路のＩＬ−１β媒介性活性化は、より多くのＮＦκＢ、したがってより多くのＩＬ−１βを生成し、したがって、運動ニューロン壊死を誘導し得るＩＬ−１β生成の自己維持サイクルを生成する（ＢｒｉｔｅｓおよびＶａｚ、Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４年５月２２日；８巻：１１７頁）。ｍＳＯＤ１マウスの小グリア細胞およびアストロサイトでは、上昇したＮＦｋＢ活性は関連する運動ニューロン壊死をもたらす（Ｆｒａｋｅｓら、Ｎｅｕｒｏｎ．２０１４年３月５日；８１巻（５号）：１００９〜２３頁）。脳において、ＮＦｋＢ活性の減少は、ＭＣＡＯニューロン損傷後の減少と関連する（Ｖａｒｔａｎｉａｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１１年１０月１４日；８巻：１４０頁）。運動ニューロンにおいて、ネクロトーシスは、ＮＦｋＢ産生を増加させるＲｉｐ−１を介して媒介され、ＮＦｋＢを標的とすることが治療上の選択肢となり得ることが示唆される。しかしながら、この転写因子の普遍的および多機能的な性質がこれを困難にしている。
【００４９】
出願人は、ＳＯＤ１マウスの脊髄におけるＩＬ−１βレベルの上昇、ＩＬ−１β産生を増加させるｍＳＯＤ１の能力、およびそのようなＩＬ−１βがＡＬＳ進行を加速させるという事実を認識した（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０年７月２０日；１０７巻（２９号）：１３０４６〜５０頁）が、これは、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の調節が、ＭＮＤ、特にＡＬＳのような神経変性疾患の予防および処置に有益であることを示唆する。さらに、小グリア細胞においてＬＰＳ応答を生成する活性なＥＧＦＲの明らかな要件（Ｑｕら、２０１２年）は、ＥＧＦＲの遮断がＴＬＲ刺激性炎症を減少させ得ることを示唆している。
【００５０】
ＴＲＩＦ経路の中心的構成要素であるＴＢＫ１におけるハプロ不全は、ｆＡＬＳを引き起こすのに十分であると示された（Ｆｒｅｉｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５年５月；１８巻（５号）：６３１〜６頁）。ＴＲＩＦ経路は、ＩＲＦ３産生に対するＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲ経路の一部であり、ＩＲＦ３は、一般的に神経保護的である。実際に、プレコンディショニングによる神経保護は、ＮＦｋＢからＩＲＦ３活性化に向かってＴＬＲ／ＩＬ−１シグナル伝達経路を駆動する（Ｖａｒｔａｎｉａｎら、２０１１年）。本発明者らは、ＩＲＦ３に対するＩＬ−Ｒ／ＴＬＲシグナル伝達経路の再平衡化が、ＭＮＤ（例えば、ＡＬＳ）のような神経変性疾患において神経保護的であることを認識した。特に、本発明者らは、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害が、ＩＬ−１／ＴＬＲ刺激後の優先的なＩＲＦ３の生成をもたらすことを理解した。これにより、ＮＦｋＢへの駆動が減少し、したがって、ＩＬ−１β産生、グリア活性化および運動ニューロン死が減少する。
【００５１】
したがって、本発明のある特定の実施形態によれば、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達は、ＩＬ−１βおよびＮＦｋＢの産生を阻害するように阻害される。
【００５２】
ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害は、マイドソーム（ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ）（マイドソームとは、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８およびＩＲＡＫ４キナーゼからなるオリゴマーシグナル伝達複合体である）の阻害によって、例えば、マイドソームキナーゼＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４を阻害することによって、達成され得る。
【００５３】
出願人は、ＴＤＰ４３とのＩＲＡＫ１の観察された会合（Ｌｉら、２０１４年、上記参照）が、ＴＤＰ４３のプライミングリン酸化を媒介し、このタンパク質の凝集、および細胞質蓄積を引き起こし、機能的異常性をもたらすことを認識した。したがって、特にＩＲＡＫ１キナーゼ活性の阻害による、またはＩＲＡＫ１によるＴＤＰ４３のリン酸化の上流でのＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害によるＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害は、ＴＤＰ４３のリン酸化もまた阻害することが期待され、したがって、ＴＤＰ４３の封入体の形成を阻害することが期待される。
【００５４】
ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４の小分子阻害剤を被験体に投与することにより、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４を阻害することができる。ＩＲＡＫ１の適切な阻害剤の例は、それらの親和性と共に、下の表に列挙される。本発明の特定の実施形態では、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４キナーゼ活性の阻害剤はゲフィチニブである。
【表２】
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【００５５】
Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は膜貫通排出ポンプであり、薬物がＣＮＳへ入ることを減少させる最も重要な薬物輸送体である。一部の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤（特に、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤）および／またはＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達の阻害剤（特に、ＩＲＡＫ１および／またはＩＲＡＫ４の小分子阻害剤）は、シグナル伝達阻害剤のＣＮＳ曝露を上昇させるために、（シクロスポリンＡ、ケトコナゾール、キニジン、リトナビル、ベラパミル、エベロリムス、またはエラクリダール（ｅｌａｃｒｉｄａｒ）（ＧＦ１２０９１８）のような）Ｐ−ｇｐ阻害剤と同時投与されてもよいし、または逐次的に投与されてもよい。
【００５６】
一実施形態によれば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害は、ゲフィチニブ（イレッサ）の被験体への投与によって達成される。ゲフィチニブは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達経路におけるＩＲＡＫ１およびＩＲＡＫ４のキナーゼ活性も阻害する。したがって、ゲフィチニブの投与は：
・ＥＧＦＲシグナル伝達を遮断し、したがって：
○アストロサイトおよび小グリア細胞活性化の低下
○ＩＬ−１βおよびＴＬＲリガンドに対するＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１応答の阻害
○ＨＤＡＣ６活性を増加させ、したがってＴＤＰ４３のアセチル化状態を減少させる（したがって凝集を阻害する）
・ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達を阻害し、したがって：
○ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達経路をＩＲＦ３産生に向けて（そしてＮＦｋＢ産生から遠ざかるように）再平衡化させ、神経保護と一致させる
○ＮＦｋＢ産生、炎症およびネクロトーシスの減少
○ＩＲＡＫ１キナーゼ活性の阻害を介してＴＤＰ４３のリン酸化（したがって凝集）を阻害する
【００５７】
ゲフィチニブは、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）基質である（Ｔｏｇａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２年９月；７０巻（３号）：３９９〜４０５頁を参照）。一部の実施形態では、ゲフィチニブは、ＣＮＳ曝露を上昇させるために、（シクロスポリンＡ、ケトコナゾール、キニジン、リトナビル、ベラパミル、エベロリムス、またはエラクリダール（ＧＦ１２０９１８）のような）Ｐ−ｇｐ阻害剤と同時投与されるか、または逐次的に投与される（マウスにおいて行われるように：Ｃｈｅｎら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１３年１１月；８２巻（２号）：３１３〜８頁）。
【００５８】
本発明によれば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物であって、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は異なる化合物である、薬学的組成物が提供される。
【００５９】
本発明によれば、（ａ）ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤；（ｂ）ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤を含む、組み合わせ調製物であって、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は異なる化合物である、組み合わせ調製物が提供される。
【００６０】
本発明によれば、Ｐ−糖タンパク質阻害剤をさらに含む、本発明の薬学的組成物または組み合わせ調製物がさらに提供される。
【００６１】
また、本発明によれば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、およびＰ−糖タンパク質阻害剤を含む組成物が提供される。
【００６２】
また、本発明によれば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、Ｐ−糖タンパク質阻害剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物も提供される。
【００６３】
本発明によれば、（ａ）ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤；（ｂ）ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤；および（ｃ）Ｐ−糖タンパク質阻害剤を含む、組み合わせ調製物もまた提供される。
【００６４】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は、同じ化合物であってもよいし、または異なる化合物であってもよい。一部の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は、ゲフィチニブであってもよい。他の実施形態（特に、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が同じ化合物である）では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は、ゲフィチニブを除外してもよい。
【００６５】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤、およびＰ−糖タンパク質阻害剤は、一緒に（すなわち同時投与）または任意の順序で逐次的に投与することができる。特定の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の前に投与される。
【００６６】
本発明によれば、ゲフィチニブおよびＰ−糖タンパク質阻害剤を含む組成物もまた、提供される。
【００６７】
本発明によれば、ゲフィチニブ、およびＰ−糖タンパク質阻害剤、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物もまた提供される。
【００６８】
さらに、（ａ）ゲフィチニブ；（ｂ）Ｐ−糖タンパク質阻害剤を含む、組み合わせ調製物がさらに提供される。
【００６９】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、シクロスポリンＡ、ケトコナゾール、キニジン、リトナビル、ベラパミル、エベロリムス、またはエラクリダール（ＧＦ１２０９１８）、例えばキニジンからなる群より選択され得る。特定の実施形態では、Ｐ−糖タンパク質阻害剤はエラクリダールである。
【００７０】
本発明によれば、神経変性疾患の予防または処置に使用するための本発明の組成物、薬学的組成物または組み合わせ調製物がさらに提供される。
【００７１】
また、本発明によれば、神経変性疾患の予防または処置のための医薬の製造における本発明の組成物、薬学的組成物または組み合わせ調製物の使用が提供される。
【００７２】
本発明によれば、有効量のゲフィチニブおよびＰ−糖タンパク質阻害剤を、そのような予防または処置を必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患を予防または処置する方法もまた提供される。
【００７３】
ゲフィチニブおよびＰ−糖タンパク質阻害剤は、同時投与されてもよく、または逐次的に投与されてもよい。
【００７４】
神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような運動ニューロン疾患であり得る。
【００７５】
神経変性疾患は、家族性または散発性の神経変性疾患であり得る。特定の実施形態では、神経変性疾患（特に、ＡＬＳのような運動ニューロン疾患）は、家族性神経変性疾患である。他の特定の実施形態では、神経変性疾患（特にＡＬＳのような運動ニューロン疾患）は散発性神経変性疾患である。
【００７６】
本発明の組み合わせ調製物の成分は、同時、別々、または逐次的な使用のためのものであってもよい。
【００７７】
本明細書で使用される「組み合わせ調製物」という用語は、組み合わせ成分（ａ）および（ｂ）が独立して投与され得るか、組み合わせ成分（ａ）および（ｂ）の区別される量での異なる固定された組み合わせの使用により投与され得る、という意味での「部分のキット」のことを指す。これらの成分は、同時に、または次々に投与することができる。成分が次々に投与される場合、好ましくは、投与の間の時間間隔は、成分の併用における処置される障害または疾患への効果が、（ａ）および（ｂ）の組み合わせ成分のいずれか１つのみの使用によって得られる効果よりも大きくなるように選択される。
【００７８】
組み合わせ調製物の成分は、１つの組み合わされた単位投与形態、または成分（ａ）の第１単位投与形態および成分（ｂ）の別途の第２単位投与形態として存在してもよい。組み合わせ調製物中に投与される組み合わせ成分（ａ）  対  組み合わせ成分（ｂ）の総量の比は、例えば、処置される患者亜集団の必要性に対処するように変化してもよいし、例えば患者の特定の疾患、年齢、性別、または体重に起因し得る単一の患者の必要性に対処するように変化してもよい。
【００７９】
好ましくは、少なくとも１つの有益な効果、例えば成分の１つの効果の増強、または組み合わせ成分（ａ）および（ｂ）の効果の相互増強、例えば相加効果を超えるもの、追加の有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、または組み合わせ成分（ａ）および（ｂ）の一方または両方の非有効用量と比較した組み合わせ治療効果、ならびに非常に好ましくは、組み合わせ成分（ａ）および（ｂ）の相乗効果が存在する。
【００８０】
本発明の一部の実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳ、ＰＬＳ、ＰＭＡ、ＰＢＰ、または偽性球麻痺、またはアルツハイマー病、またはパーキンソン病、または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のような運動ニューロン疾患である。
【００８１】
本明細書において使用する「処置」、「処置すること」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患もしくはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書中において使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患への素因を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない被験体において疾患を発症することを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を阻止または遅延させること；（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患を退行させることを含む。
【００８２】
本明細書で使用される用語「被験体」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどのすべての哺乳動物が含まれる。
【００８３】
本発明の方法において、被験体は、治療有効量のＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤（適切な場合、ならびにＰ−糖タンパク質阻害剤）で投与されるべきである。
【００８４】
「治療有効量」とは、疾患を処置するために被験体に投与された場合に、そのような疾患の処置を行うのに十分である、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の量を指す。「治療有効量」は、使用される阻害剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される被験体の年齢、体重などに応じて変化するであろう。
【００８５】
例えば、同時投与される場合、またはＰ−ｇｐ阻害剤と逐次的に投与される場合、ゲフィチニブの治療有効量は、１日当たり１００〜７５０ｍｇである。一部の実施形態では、例えば、ＣＮＳに（例えば、直接脳または脊髄に）直接投与される場合、Ｐ−ｇｐの阻害剤なしで投与される時に、ゲフィチニブの治療有効量は一日当たり１００〜７５０ｍｇであってもよい。
【００８６】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は、全身または局所経路を含む、ＣＮＳへの薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて被験体に投与してもよい。一般に、本発明により意図される投与経路には、経腸、非経口または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８７】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、包内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、および静脈内経路、すなわち消化管を介するもの以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、全身または局所送達を達成させるために行うことができる。全身送達が望まれる場合、投与は、典型的には、薬学的な調製物の侵襲的または全身的に吸収される局所または粘膜投与を含む。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば坐剤を用いた）送達が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。
【００８８】
従来の薬学的に許容可能な投与経路には、鼻内、筋肉内、気管内、髄腔内、頭蓋内、皮下、皮内、局所、静脈内、腹腔内、動脈内（例えば、頸動脈を経由した）、脊髄または脳の送達、直腸、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経路が含まれる。
【００８９】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤および／またはＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達の阻害剤は、例えば脳動脈の部位または脳組織への直接の注射および／または送達によって投与される。
【００９０】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤および／またはＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達の阻害剤は、脳室内（ＩＣＶ）投与のようなＣＮＳへの、特に脊髄または脳への直接送達によって投与される。脳への直接投与は、留置カニューレまたはポンプ（例えば、適切な位置に皮下移植された）のような制御された送達デバイスと組み合わせて行うことができる。ヒト被験体へのＩＣＶ投与の適切な方法は、例えば、Ｐａｕｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５年；１２５巻（３号）：１３３９〜１３４６頁に記載されている。
【００９１】
本発明の組成物は、例えばヒト被験体のＣＮＳ、特に脊髄または脳に直接投与するのに適した、またはこれに適合させた製剤で提供することができる。いくつかの実施形態では、製剤は、内因性ＣＳＦ中に存在する１つまたは複数の電解質を含む。特定の実施形態において、１つまたは複数の電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン含有イオン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｉｏｎ）、および塩化物イオンから選択される。特定の実施形態では、製剤には、処置される被験体、例えばヒト被験体の内因性ＣＳＦの電解質濃度と密接に一致する溶液が含まれる。例えば、特定の実施形態では、製剤には、１００〜２００ｍＭのナトリウムイオン；１〜５ｍＭカリウムイオン；１〜２ｍＭのカルシウムイオン；０．５〜１．５ｍＭのマグネシウムイオン；０．５〜１．５ｍＭのリン含有イオン；１００〜２００ｍＭの塩化物イオンのいずれか（または各々）を含む溶液が含まれる。例えば、特定の実施形態では、製剤には、１５０ｍＭのナトリウムイオン、３ｍＭのカリウムイオン、１．４ｍＭのカルシウムイオン、０．８ｍＭのマグネシウムイオン、１．０ｍＭのリン含有イオン、および１５５ｍＭの塩化物イオンを含む溶液が含まれる。
【００９２】
特定の実施形態では、例えばヒト被験体のＣＮＳに直接、特に脊髄または脳に直接投与することに適した、または適合させた本発明の組成物には、Ｐ糖タンパク質阻害剤が含まれない。
【００９３】
阻害剤は、単回用量または複数回用量で投与することができる。投与の適切な頻度は、１日当たり少なくとも１回、１日おき、１週間に１回、２、３または４週間に１回、毎月１回、２ヶ月、または３〜６ヶ月に１回であり得る。例えば、その半減期を考慮すると、ゲフィチニブの適切な投与頻度は少なくとも１日１回である。阻害剤は、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも３〜６ヶ月間、少なくとも１、２、３、４、もしくは５年間にわたって、または疾患の経過にわたって、または被験体の生存期間にわたって投与され得る。
【００９４】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤が異なる化合物である場合、それらは同時投与されてもよく、または逐次的に投与されてもよい。阻害剤が逐次的に投与される場合、それらはいずれの順序で投与されてもよい。第１の阻害剤が有効なままである間に、投与すべき第２の阻害剤を投与すべきであることは理解されるであろう。逐次的な投与のタイミングは、阻害剤のそれぞれの半減期およびそれらの生物学的利用能などの様々な要因に依存するであろう。しかしながら、典型的には、阻害剤は、互いに９６時間、７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、または１時間以内に投与されるべきである。
【００９５】
Ｐ−ｇｐ阻害剤が使用される場合、これは、ＥＧＦＲおよびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤と同時投与してもよく、またはＰ−ｇｐ阻害剤ならびにＥＧＦＲおよびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤は、例えば各々が互いに９６時間、７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、または１時間以内に逐次的に投与されてもよい（すなわち、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、ＥＧＦＲおよびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の前または後に投与してもよい）。例えば、ＥＧＦＲおよびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤がゲフィチニブであるならば、Ｐ−ｇｐ阻害剤およびゲフィチニブは、同時投与されてもよく、または各々が互いに９６時間、７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間または１時間以内に逐次的に投与されてもよい。Ｐ−ｇｐ阻害剤はゲフィチニブの前に投与してもよいし、ゲフィチニブをＰ−ｇｐ阻害剤の前に投与してもよい。特定の実施形態では、Ｐ−ｇｐ阻害剤はエラクリダールである。
【００９６】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤と同時投与または逐次的に投与されるＰ−ｇｐ阻害剤の量は、使用される特定の阻害剤に依存する可能性が高い。しかし、当業者は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤およびＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒ１シグナル伝達の阻害剤の治療有効量が処置されるべき被験体のＣＮＳに浸透することが確実となるように、投与する各々の阻害剤の適切な量を容易に決定することができる。例えば、以下の実施例３で得られた結果に基づくと、ヒト被験体のゲフィチニブの治療有効量は、同時投与される場合、または逐次的に投与される場合、１日当たり１００ｍｇのＰ−ｇｐ阻害剤エラクリダールと共に、１日当たり１００〜７５０ｍｇである。
【００９７】
薬学的組成物を調製する方法は、当業者に公知であるか、または明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、第１７版、１９８５年を参照されたい。
【００９８】
本発明の組成物は、適切な薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、または薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることによって薬学的組成物に処方することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような固体、半固体、液体または気体形態の調製物に処方することができる。
【００９９】
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、例えば：水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）などのような緩衝剤；可溶化剤；例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などのような非イオン性洗浄剤などの洗浄剤；グリセロール；等を含み得る。
【０１００】
薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに無毒であり、例えば、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤；（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせのような）保存剤；アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組み合わせのようなアミノ酸；単糖類、二糖類および他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；ゼラチンもしくは血清アルブミンのようなタンパク質；ＥＤＴＡのようなキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸のような糖類；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ  プルロニック、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【０１０１】
経口調製物の場合、本発明の薬学的組成物は、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤（ｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、保存剤および矯味矯臭剤を用いた、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するための適切な添加剤を含んでもよい。
【０１０２】
注射用の薬学的組成物は、植物または他の類似の油、プロピレングリコール、合成脂肪酸グリセリド、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール；ならびに望ましい場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤と共に活性成分を水性または非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化させることによって処方することができる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体（ｆｌｕｉｄ）および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づくもののような）などが含まれる。典型的には、注射可能な組成物は、液体溶液または懸濁物として調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物に適した固体形態もまた調製され得る。
【０１０３】
薬学的組成物は、液体形態、凍結乾燥形態または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であることができ、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成される。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、ある体積の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と同等である）を添加して戻すことである；しかしながら、抗菌剤を含む溶液は、非経口投与のための薬学的組成物の製造のために使用することができる；Ｃｈｅｎ（１９９２年）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ  １８巻、１３１１〜５４頁も参照されたい。
【０１０４】
製剤の張度を調節するために、張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）を製剤に含めることができる。例示的な張度剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸の群からの任意の成分、糖ならびにそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、水性製剤は等張性であるが、高張性または低張性溶液が適することがあり得る。「等張性」という用語は、生理学的塩溶液または血清のような、それが比較されるいくつかの他の溶液と同じ張度を有する溶液を意味する。
【０１０５】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、例のみの目的で以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、ＥＧＦＲシグナル伝達の概略図を示す。
【０１０７】
【図２】図２は、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達の概略図を示す。
【０１０８】
【図３】図３は、３つの異なるＡＬＳ患者（ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、およびＡＬＳ３）の線維芽細胞に由来するｉアストロサイト（ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）をマウス運動ニューロンとともに共培養したｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるゲフィチニブの効果を示す。ＡＬＳ  ｉアストロサイトは、共培養物中のマウスＨｂ９−ＧＦＰ運動ニューロンの播種の前に、様々な濃度のゲフィチニブで２４時間、前処理した。次いで、運動ニューロンの播種の２４時間後および７２時間後に、生存している運動ニューロンの数を測定し、運動ニューロンの生存パーセンテージを計算し、その後、それぞれの系統の未処理対照に対して正規化した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の事後検定を用いた一方向ＡＮＯＶＡ。データは平均±ＳＤである。ｎ＝５〜６。
【０１０９】
【図４】図４は、異なるＰ−ｇｐ阻害剤の事前投与とともにゲフィチニブの経口投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脳へのゲフィチニブの進入の分析の結果を示す。図は、経口用量の２時間後の血液（μＭ）（ａ）および脳（μＭ）（ｂ）内のゲフィチニブレベル、およびゲフィチニブ濃度の脳  対  血液比（ｃ）を示す。図は、ゲフィチニブの各々の用量（３０または１００ｍｇ／ｋｇ経口）について、（左から右へ順に）：ゲフィチニブ単独；ゲフィチニブ＋エベロリムス１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（−０．５ｈ）；ゲフィチニブ＋エラクリダール１０ｍｇ／ｋｇ静脈内（０時間）；およびゲフィチニブ＋エラクリダール１００ｍｇ／ｋｇ経口（−４時間）を示す。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１−ＡＬＳの処置）
２５０ｍｇのゲフィチニブをＡＬＳに罹患しているヒト被験体に６００ｍｇのキニジン（Ｐ−ｇｐ阻害剤）と共に１日１回、同時投与する。２５０ｍｇのゲフィチニブの投与は、およそ２５０ｎＭの血漿濃度をもたらす。マウスにおいては、このような血漿濃度はおよそ１００ｎＭの全脳濃度と関連している。ゲフィチニブとキニジンの同時投与は、ゲフィチニブに対する脳曝露を増加させる。そのような量のゲフィチニブの投与は、その薬理学的特性に基づきＥＧＦＲおよびＩＲＡＫ１を阻害するのに十分であると期待される：
ＥＧＦＲでのＫｉ：１ｎＭ
ＩＲＡＫ１でのＫｉ：７０ｎＭ
ＩＲＡＫ４でのＫｉ：５００ｎＭ
【０１１１】
（実施例２−ＡＬＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるゲフィチニブの効果）
この実施例は、ＡＬＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける運動ニューロン生存に対するゲフィチニブの効果を記載する。このモデルは、ヒト線維芽細胞由来アストロサイトおよびマウスＨｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンを共培養において使用する（Ｍｅｙｅｒら、２０１４年、ＰＮＡＳ  １１１巻、８２９〜８３２頁）。線維芽細胞は、アストロサイトに分化した誘導された神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）に再プログラミングされた。ＡＬＳ患者由来のアストロサイトは、共培養における野生型Ｈｂ９−ＧＦＰ＋マウス運動ニューロンの死を引き起こすが、これは正常（非ＡＬＳ）患者由来のアストロサイトには見られない特性である。興味深いことに、ＡＬＳアストロサイトは、運動ニューロンの存在下で１０〜１５倍増加した代謝および酸化ストレスのいくつかの異常を示す。
【０１１２】
材料および方法
ｉＮＰＣは、以前に記載されているように、ＡＬＳ患者線維芽細胞に由来しており（Ｍｅｙｅｒら、２０１４年、ＰＮＡＳ  １１１巻、８２９〜８３２頁）、追加補充されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、１×Ｎ−２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で少なくとも５日間培養することによりｉアストロサイトに分化させた。マウスＨｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンを、以前に記載されるように、マウスＨｂ９−ＧＦＰ＋胚性幹細胞から胚様体を介して分化させた（Ｈａｉｄｅｔ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９巻、８２４〜８２８頁；Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら、２００２年、Ｃｅｌｌ  １１０巻、３８５〜３９７頁）。
【０１１３】
フィブロネクチンでコーティングされた３８４ウェルプレート上に、１ウェル当たり３，０００個のヒトｉアストロサイトを播種した。２４時間後、ゲフィチニブ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号１３１６６）を、Ｅｃｈｏ５５０液体ハンドラー（Ｌａｂｃｙｔｅ）を用いて、１００％薬物グレードＤＭＳＯ中、ｉアストロサイト培地へ送達した。ＤＭＳＯの最終濃度は、すべてのウェルにおいて、培地中で０．２４％（ｖ／ｖ）であった。プレートを１，７６０×ｇで６０秒間、遠心分離した。２４時間後、運動ニューロン培地（ノックアウトＤＭＥＭ（４５％ｖ／ｖ）、Ｆ１２培地（４５％ｖ／ｖ）、ＫＯ血清代替物（１０％ｖ／ｖ）、５０ユニット／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×Ｎ−２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１５％濾過済みグルコース、０．０００８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦ）中に、１ウェル当たり２，０００個のマウスＨｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンを播種し、前処理したｉアストロサイトの上で共培養した。プレートを１，７６０×ｇで６０秒間、遠心分離した。２４時間および７２時間後、Ｈｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンを、ＩＮＣＥＬＬアナライザー２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化し、ＩＮＣＥＬＬアナライザーソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、生存している運動ニューロンの数を数えた。
【０１１４】
７２時間後、共培養物中に生き残った生存している運動ニューロン（少なくとも１つの軸索を有するＧＦＰ＋運動ニューロンと定義される）の数を、２４時間後の共培養物中における生存している運動ニューロンの数のパーセンテージとして計算した。その後、運動ニューロンの生存パーセンテージを、各々個々のｉアストロサイト系統についてＤＭＳＯ対照に対して正規化した。ダネットの事後検定を用いた一方向ＡＮＯＶＡを実行した。
【０１１５】
結果
図３にプロットされた結果は、ゲフィチニブが３人の異なる患者からの共培養物における運動ニューロン生存の用量依存性増加を促進することを示しており、ゲフィチニブがＡＬＳに罹った患者において有益な効果を有することを示唆している。
【０１１６】
結論
ＡＬＳアストロサイト／運動ニューロン共培養物における運動ニューロン生存の減少によって明らかとなるように、ＡＬＳ患者由来のアストロサイトの毒性がゲフィチニブによって減少することが、これらの結果から結論付けられた。理論に縛られることは望まないが、これらの結果はゲフィチニブによるＥＧＦＲおよびＩＲＡＫ１の阻害と一致している。そのような阻害は、マイドソーム駆動ＮＦｋＢの生成を阻害して、そのことによって運動ニューロンを保護することが期待される。
【０１１７】
（実施例３−Ｐ−ｇｐ阻害剤の存在下におけるゲフィチニブのＣＮＳへの浸透）
ゲフィチニブがＡＬＳの処置に有効であるためには、それがＣＮＳに入ることが重要である。この実施例は、異なるＰ−ｇｐ阻害剤の事前投与とともにゲフィチニブの経口投与に引き続く、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるゲフィチニブの脳への進入の分析結果を記載する。
【０１１８】
マウスには、単回用量のエベロリムス（１０ｍｇ／ｋｇ  腹腔内、−０．５ｈ）、エラクリダール（１０ｍｇ／ｋｇ  静脈内、０ｈ）、もしくはエラクリダール（１００ｍｇ／ｋｇ  経口）または用量なしのいずれかを与えた。その後、マウスに、単回経口用量のゲフィチニブを３０ｍｇ／ｋｇ経口または１００ｍｇ／ｋｇ経口のいずれかを与えた。ゲフィチニブの投与の２時間後に、血液および脳を採取し、飛行時間型質量分析法ＵＨＰＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳと組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーを用いて、血液および脳中のゲフィチニブレベルを測定した。結果を図４にプロットし、この図は、血液中（ａ）、脳（ｂ）のゲフィチニブレベル、およびゲフィチニブ脳濃度  対  ゲフィチニブ血中濃度の比（ｃ）を示す。ｎ＝３。個々の点、ならびに平均値およびＳＤが示される。
【０１１９】
低用量のゲフィチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ経口）および高用量のゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ経口）の両方で、１００ｍｇ／ｋｇ経口で投与されたＰ−ｇｐ阻害剤エラクリダールがゲフィチニブのＣＮＳ浸透を有意に増加させるという結果が示された。ゲフィチニブは、およそ０．７μＭのＩＲＡＫ１についてＩＣ９０およびおよそ１０ｎＭのＥＧＦＲについてＩＣ９０を有している（ＩＣ９０：酵素活性が９０％阻害される濃度）。この結果から、ゲフィチニブの投与前にエラクリダールを投与すると、マウスにおいては、ＣＮＳ内にＥＧＦＲおよびＩＲＡＫ１の両方を阻害するのに十分なゲフィチニブの濃度をもたらすと結論付けた。
【０１２０】
驚くべきことに、Ｐ−ｇｐ阻害剤エベロリムスは、ゲフィチニブの血漿曝露を増加させたが、１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内の用量ではＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてゲフィチニブのＣＮＳ浸透には影響を及ぼさなかったようであった。脳からゲフィチニブを排除することに関与する血液脳関門輸送体をエベロリムスが阻害しない可能性はあるものの、この理由は完全には理解されていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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