(57)【要約】  本発明は、相同組換えに影響を与えるか、又は相同組換えを制御する因子、これらの因子をモニタリングする方法、相同組換えを調節する薬剤をスクリーニングするためのこれらの因子の使用、及び相同組換えを活性化又は調節する方法に関する。【選択図】図１ａ
2018512393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、
（ａ）前記細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激すること；
（ｂ）ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と前記細胞とを接触させること；
（ｃ）ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）部位へのＢＲＣＡ１動員を活性化又は刺激すること；
（ｄ）ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害又は除去すること；
（ｅ）ＵＳＰ１１の分解を阻害するか、又はＵＳＰ１１の活性を促進すること；並びに／又は
（ｆ）ＤＣＡＦ１０を阻害すること、
を含む方法。
【請求項２】
ＫＥＡＰ１又はＤＣＡＦ１０を阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、ＤＮＡ末端切除を再構成又は活性化することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ末端切除が活性化されるか、又は１本鎖ＤＮＡを作製するために再構成された細胞内で相同組換えを活性化する方法であって、前記細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法。
【請求項５】
ＤＮＡ末端切除が、５３ＢＰ１の発現若しくは活性を阻害し、ＣｔＩＰを上方制御又は発現することによって活性化される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ＣｔＩＰが、ＣｔＩＰ又はＣｔＩＰのアナログを投与することによって、上方制御されるか、又は発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＫＥＡＰ１及び５３ＢＰ１を阻害又は除去すること、並びにＣｔＩＰ若しくはＣｔＩＰのアナログを上方制御するか又は発現することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
５３ＢＰ１低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を投与することによって５３ＢＰ１を阻害する、請求項５、６、又は７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記細胞へ遺伝子編集システムを導入することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子編集システムが、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム又はジンクフィンガーヌクレアーゼシステムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列と関連した遺伝性障害を変更する方法であって、（１）請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従って前記細胞内で相同組換えを活性化すること；（２）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸と前記標的ポリヌクレオチド配列とを接触させることを含み、前記リボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断されることによって、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現を低下させるか、ノックアウトするか、又は望ましくない配列から所望の配列へ補正する方法。
【請求項１２】
前記細胞が細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が細胞周期のＧ１期（Ｇ１）にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、（ｉ）前記試料中の（ａ）ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２；（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２、とＢＲＣＡ２；（ｃ）ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２；及び／又は（ｄ）ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の複合体を単離すること；（ｉｉ）これらの複合体のレベルを測定すること；並びに（ｉｉｉ）ＵＳＰ１１の活性又は発現の指標としての対照と比較して、前記複合体の活性又は発現の増加若しくは減少を検出すること、を含む方法。
【請求項１５】
個体におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、前記対象からの試料中のＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ２の複合体をアッセイすること、並びに前記個体が前記ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法。
【請求項１６】
（ａ）５３ＢＰ１の阻害剤；（ｂ）ＫＥＡＰ１の阻害剤；及び（ｃ）ＣｔＩＰ又はＣｔＩＰのアナログを含む細胞内で相同組換え若しくは遺伝子編集を刺激又は活性化するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えに影響を与えるか、又は制御する因子、これらの因子をモニタリングする方法、相同組換えを調節する薬剤をスクリーニングするためのこれらの因子の使用、及び相同組換えを調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌及び卵巣癌の抑制因子であるＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２並びにＢＲＣＡ２は、相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）修復を促進する（８〜１０）。ＢＲＣＡ１は、このプロセスにおいて最低限２つの別々の段階で作用する。第一に、ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ末端切除を促進し（１１、１２）、ＤＮＡ末端切除は、相同性検索及び鎖侵入に必要な１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを生成するために核酸分解切断処理を含むＨＲの開始工程である（１）。第２に、ＢＲＣＡ１はＰＡＬＢ２と相互作用して（１３〜１５）、ＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ２（１３）及びＲＡＤ５１（１６、１７）の動員を引き起こす。ＤＳＢ部位に隣接するクロマチン上のＢＲＣＡ１の蓄積はＧ１細胞内で著しく抑制されることから（１８）、細胞周期のこの段階での相同組換えの強力な阻害が連想される。Ｇ１でのＢＲＣＡ１動員の阻害は、末端切除の２つの阻害剤である５３ＢＰ１及びＲＩＦ１タンパク質（１８、１９）に依存している（１８〜２２）。ＢＲＣＡ１はまた、ＰＡＬＢ２との相互作用を介してＢＲＣＡ２の動員の促進に関与している（１３〜１５）。
【０００３】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に欠陥を有する腫瘍を含めて、ＨＲによる２本鎖ＤＮＡ切断を修復する能力を損なった腫瘍は、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤に非常に感受性があることが示されている。ＰＡＲＰ阻害剤はまた、脳卒中、心筋梗塞、炎症性腸疾患、頭部外傷、及び神経変性疾患などの他の病状を治療することが提案されている。ユビキチン特異的ペプチダーゼ１１（ＵＳＰ１１）の阻害は、ＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を高度な感受性を持たせることが示されており、腫瘍におけるＵＳＰ１１の状態又は他のＨＲタンパク質の状態がＰＡＲＰ阻害剤の使用のためのバイオマーカーを提供し得ることが提案されている（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅら、ＪＢＣ  ２８５（１９），１４５６５−１４５７１，２０１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
相同組換え修復タンパク質に影響を与えるか、又は制御する因子の特定及び評価並びにＧ１細胞内でＨＲを抑制するのに必要かつ十分である事象の特定が望ましい。加えて、ＵＳＰ１１に影響を与えるか、又は制御する因子の特定及び評価は、ＰＡＲＰ阻害剤治療の選択及びモニタリング、特に、ＰＡＲＰ阻害剤の耐性の出現をさせないか、又は遅らせる治療の選択を容易にし得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、細胞周期が、ＢＲＣＡ２の機能をＳ／Ｇ２期に制限するためにＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２とＢＲＣＡ１の相互作用をしっかり制御することを見出した。ＰＡＬＢ２上のＢＲＣＡ１相互作用部位は、カリン３（ＣＵＬ３）−ＲＢＸ１と複合体を形成するＰＡＬＢ２相互作用タンパク質（６）であるＫＥＡＰ１で構成されたＥ３ユビキチンリガーゼによりターゲティングされる（７）。ＰＡＬＢ２のユビキチン化は、ＢＲＣＡ１との相互作用を抑制し、細胞周期の制御下にある脱ユビキチン化酵素のＵＳＰ１１によって相殺される。ＤＮＡ末端切除の活性化と組み合わせたＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の回復は、ＲＡＤ５１動員、予定外のＤＮＡ合成及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子ターゲティングアッセイによって測定されるとおり、Ｇ１期の細胞内でＨＲを誘導するのに十分であった。Ｇ１でＨＲを止める機構は、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリの阻害を含むＤＮＡ損傷部位へのＢＲＣＡ２動員の多段階阻止と連動したＤＮＡ末端切除の抑制から最低限なる。定義された因子によるＧ１細胞内でのＨＲ誘導能は、非分裂細胞又はＧ１期で休止している細胞内での遺伝子ターゲティング用途に使用され得る。研究結果はまた、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１１ターゲティングベースを提供する。
【０００６】
本発明者らはまた、ＵＳＰ１１が細胞周期−カリン４−ＲＩＮＧ−リガーゼ（ＣＲＬ４）によって制御され、ＤＣＡＦ１０がＵＳＰ１１  Ｅ３リガーゼのためのアダプターとして作用することを見出した。
【０００７】
本発明は、ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２の相互作用をアッセイすることにより、試料中のＵＳＰ１１の活性をモニタリングする方法を提供する。
【０００８】
本発明は、ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２、及びＢＲＣＡ２の相互作用をアッセイすることにより、試料中のＵＳＰ１１の活性をモニタリングする方法を提供する。
【０００９】
本発明は、ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２の相互作用をアッセイすることにより、試料中のＵＳＰ１１の活性をモニタリングする方法を提供する。
【００１０】
本発明は、ＤＣＡＦ１０をアッセイすることにより、試料中のＵＳＰ１１の活性をモニタリングする方法を提供する。
【００１１】
本発明は、（ａ）ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２；（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２；（ｃ）ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２；及び／又は（ｄ）ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の複合体をアッセイすることによって、試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
一態様において、本発明は、試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、（ｉ）試料中の（ａ）ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２；（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２；（ｃ）ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２；及び／又は（ｄ）ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の複合体を単離すること；（ｉｉ）これらの複合体のレベルを測定すること；並びに（ｉｉｉ）ＵＳＰ１１の活性若しくは発現の指標としての対照と比較して、複合体の活性又は発現の増加若しくは減少を検出すること、を含む方法を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、（ｉ）試料中の（ａ）ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２；（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２；（ｃ）ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２；及び／又は（ｄ）ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の複合体を免疫学的精製によって単離すること；（ｉｉ）これらの複合体のレベルを測定すること；並びに（ｉｉｉ）ＵＳＰ１１の活性若しくは発現の指標としての対照と比較して、複合体の活性又は発現の増加若しくは減少を検出すること、を含む方法を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明は、試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、（ｉ）試料中の（ａ）ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２；（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２；（ｃ）ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２；及び／又は（ｄ）ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の複合体を単離すること；（ｉｉ）単離した複合体からペプチド又はペプチド断片を調製すること；並びに（ｉｉｉ）これらのペプチド又はペプチド断片を質量分析に供することによってＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングすること、を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ＰＡＬＢ２のユビキチン化、特に、ＰＡＬＢ２のＮ末端のユビキチン化をアッセイすることにより、試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法を提供する。
【００１６】
一態様において、本発明は、ＰＡＬＢ２のユビキチン化をアッセイすることによって試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、試料中のＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼに結合したポリユビキチンの量を測定すること、並びにＵＳＰ１１の活性又は発現の指標としての対照と比較して、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼに結合したポリユビキチンの増加又は減少を検出すること、を含む方法を提供する。
を含似寄りむ
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＰＡＬＢ２のユビキチン化をアッセイすることによって試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法であって、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼの活性を測定すること、並びにＵＳＰ１１の活性又は発現の指標としての対照と比較して、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼ活性の増加又は減少を検出すること、を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、試験化合物又は薬剤の存在下又は非存在下で実行することができ、試験化合物又は薬剤の非存在下での対照と比較したＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体、及びＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上の活性又は発現の増加若しくは減少が検出されることは、該試験化合物又は薬剤が治療薬として、又は相同組換えを調節するのに有用であり得ることを示す。
【００１９】
一態様において、本発明は、本発明の方法を用いてＵＳＰ１１の活性又は発現に対する該薬剤の効果を決定することによって、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか又は遅らせる能力について薬剤を特定又は評価する方法を提供する。
【００２０】
一態様において、本発明は、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１に対する薬剤の効果を決定することによって、ＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる能力について薬剤を特定又は評価する方法に関する。
【００２１】
一態様において、本発明は、抗癌剤を検出する方法であって、試験化合物と不死化細胞とを接触させること、及び本発明の方法を用いてＵＳＰ１１活性又は発現をアッセイすること、を含む試験アッセイを行うことを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、相同組換えを調節する能力について薬剤を特定又は評価する方法であって、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上に対する試験化合物又は薬剤の効果を決定することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明は、ＨＲにおける欠陥と関連する疾患（すなわち、ＨＲ疾患）の治療のための治療薬をスクリーニングする方法であって、ＵＳＰ１１、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上を破壊又は調節する薬剤を特定することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法は、さらに、動物における有効性及び毒性について、特定した薬剤又はそのさらなる類似体の治療プロファイリングを行うこと；必要に応じて、許容される治療プロファイルを有すると特定された１以上の薬剤を含む医薬組成物を製剤化すること；並びに必要に応じて、対象又は個体に該薬剤を投与すること、を含み得る。
【００２５】
本発明は、個体におけるＨＲ疾患を治療する方法であって、本発明の方法に従ってＨＲを調節する薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させる方法であって、本発明の方法に従ってＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させる薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか、又は遅らせる方法であって、本発明の方法に従ってＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか、又は遅らせる薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体において癌を治療する方法であって、本発明の方法に従って特定された抗癌剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上をアッセイすることを含む方法を提供する。一態様において、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、対象からの試料中のＵＳＰ１１の活性又は発現をアッセイすることを含む方法を提供する。一態様において、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＰＡＬＢ２活性又は発現をアッセイすることを含む方法を提供する。
【００３０】
一態様において、対照と比較してＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上に減少がある場合に、ＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性があるとして対象を分類する。一態様において、対照と比較してＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上に増加がある場合に、ＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性があるとして対象を分類する。
【００３１】
ＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性を予測する方法は、さらに、該個体に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与することを含み得る。
【００３２】
本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤での治療を必要とする患者を治療する方法であって、（ａ）該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２のうちの１以上を検出し、該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性又は応答性があるかどうかを決定するために対照と比較することによって、該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性又は応答性があるかどうかを決定するために分析の結果を提供する試験を要求すること；及び（ｂ）該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性又は応答性がある場合に、該患者に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与すること、を含む方法を提供する。本発明のこの方法の態様において、該患者は乳癌を有している。本発明のこの方法の態様において、該患者は卵巣癌を有している。
【００３３】
一態様において、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤での治療を必要とする患者を治療する方法であって、（ａ）該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３を検出することによって、該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性であるかどうかを決定するために分析の結果を提供する試験を要求すること、及び（ｂ）該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性がある場合に、該患者に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与すること、を含む方法を提供する。本発明のこの方法の態様において、該患者は乳癌を有している。本発明のこの方法の態様において、該患者は卵巣癌を有している。
【００３４】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験で複数のカテゴリーのうちの１つに個体を割り当てる方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ複合体、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体をアッセイすることを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、疾患、特に癌に適切な治療計画を決定するための薬理遺伝学的方法、及びＰＡＲＰの応答性、特にＵＳＰ１１活性に基づく患者の選択に基づいて患者を治療する方法を提供する。
【００３６】
本発明の方法、特に、ＵＳＰ１１活性又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１活性をアッセイする方法は、新たな治療アプローチ及び化合物についての動物モデルベースのスクリーニング方法における読み出し情報として用いられ得る。一態様において、本発明の方法は、疾患状態の動物モデルにおける潜在的な新しい治療薬の有効性を予測するために利用される。
【００３７】
本発明は、細胞内で相同組換えを活性化又は調節する（例えば、促進する）方法であって、
（ａ）該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激すること；
（ｂ）ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）部位へのＢＲＣＡ１動員を活性化又は刺激すること；
（ｃ）ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と該細胞とを接触させること；
（ｄ）ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害又は除去すること；
（ｅ）ＵＳＰ１１の分解を阻害するか、又はＵＳＰ１１の活性を促進すること；並びに／又は
（ｆ）ＤＣＡＦ１０を阻害若しくは除去すること、
を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明は、細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、該細胞にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体を投与するか、又はそれらの複合体のアセンブリを刺激することを含む方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体を該細胞に投与するか、又はそれらの複合体と該細胞とを接触させることを含む方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内でＤＮＡ二本鎖切断を修復する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。
【００４２】
本発明の態様において、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリは、そのようなアセンブリを促進若しくは刺激する薬剤又は本発明の方法を用いて特定したそのようなアセンブリを促進又は刺激する薬剤を投与することによって促進又は刺激される。一実施形態において、該薬剤は、ＵＳＰ１１又はＵＳＰ１１のアゴニストである。一実施形態において、該薬剤は、ＣＲＬ−ＫＥＡＰ１の阻害剤である。一実施形態において、該薬剤は、ＫＥＡＰ１の阻害剤である。一実施形態において、該薬剤は、ＰＡＬＢ２変異体である。一実施形態において、該薬剤は、ＫＥＡＰ１との相互作用を破壊するＰＡＬＢ２変異体である。一実施形態において、該薬剤は、そのＬｙｓ２０、Ｌｙｓ２５及びＬｙｓ３０残基の変異を含むＰＡＬＢ２ある。
【００４３】
細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）生成経路が活性化された細胞で実行され得る。一態様において、該細胞内のｓｓＤＮＡ生成経路は、ＤＮＡ末端切除により活性化される。
【００４４】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が活性化され、１本鎖ＤＮＡを生成するか又は生成している細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が活性化され、１本鎖ＤＮＡを生成するか又は生成している細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。一実施形態において、該複合体のアセンブリは、ＨＲを調節する薬剤を投与することにより促進又は刺激される。一実施形態において、該薬剤は、本発明の方法を用いて特定された、ＨＲを調節する薬剤である。一実施形態において、該薬剤は、ＵＳＰ１１又はＵＳＰ１１のアゴニストである。一実施形態において、該薬剤は、ＣＲＬ−ＫＥＡＰ１の阻害剤である。一実施形態において、該薬剤は、ＫＥＡＰ１の阻害剤である。一実施形態において、該薬剤は、ＰＡＬＢ２変異体である。一実施形態において、該薬剤は、ＤＣＡＦ１０の阻害剤である。一実施形態において、該薬剤は、カリン４−ＲＩＮＧリガーゼの阻害剤である。
【００４６】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が活性化され、１本鎖ＤＮＡを生成するか又は生成している細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）の細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と該細胞とを接触させることを含む方法を提供する。
【００４７】
一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害する工程又はＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の阻害剤を投与する工程を含む方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＵＳＰ１１の分解を阻止する工程又はＵＳＰ１１活性を促進若しくは刺激する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ＵＳＰ１１又はそのアゴニストを投与することを含む。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０の細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＣＲＬ−ＫＥＡＰ１を阻害する工程又はＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の阻害剤を投与する工程及びＵＳＰ１１の分解を阻止する工程又はＵＳＰ１１活性を促進若しくは刺激する工程を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が活性化され、１本鎖ＤＮＡを生成するか又は生成しているＧ１又はＧ０の細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、（ａ）ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害すること；（ｂ）ＵＳＰ１１の分解を阻止するか、又はＵＳＰ１１活性を促進若しくは刺激すること；（ｃ）ＵＳＰ１１若しくはそのアゴニストを投与すること；（ｄ）ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の阻害剤を投与すること；（ｅ）ＤＣＡＦ１０の阻害剤を投与すること；及び／又は（ｅ）ＣＲＬ−ＫＥＡＰ１を阻害し、ＵＳＰ１１の分解を阻止すること、を含む方法を提供する。
【００４９】
細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法は、さらに、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡの）生成経路を活性化又は促進することを含み得る。一態様において、ｓｓＤＮＡ生成経路は、ＤＮＡ末端切除により活性化される。
【００５０】
細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法は、さらに、遺伝子編集システムを含み得る。一態様において、該遺伝子編集工程は、ヌクレアーゼと細胞とを接触させることを含む。本発明の態様において、該遺伝子編集システムは、ゲノム修飾を補正し得る。
【００５１】
本発明はまた、細胞、特に、Ｇ１の細胞内で相同組換えを抑制する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリを抑制することを含む方法を提供する。一実施形態において、該相互作用は、ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１又はそのアゴニストを投与することによって抑制される。一実施形態において、該相互作用は、ＵＳＰ１１のアンタゴニスト／阻害剤（例えば、ミトキサントロン）を投与することによって抑制される。一実施形態において、該相互作用は、本発明の方法を用いて特定されたＨＲを阻害又は抑制する薬剤を投与することによって抑制される。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００５３】
本発明はまた、該対象から得られた試料中のＵＳＰ１１活性のレベル、複合体又はバイオマーカーのレベルを決定するためのアッセイ；結果を処理するためのプロセッサ；結果とデータベースを比較するためのコンピュータコード化された説明書；及び比較の結果を提供するためのユーザディスプレイを含むシステム提供する。該データベースは、ＵＳＰ１１活性又はバイオマーカーレベルの基準値を含み得る。
【００５４】
本発明はまた、ゲノム修飾又は編集における本発明の方法、キット、及びシステムの使用を企図する。
【００５５】
一態様において、本発明は、さらに、ゲノム修飾又は編集における本発明の方法、組成物、キット、及びシステムの使用を企図するが、前記使用は手術若しくは治療によるヒト又は動物の身体の治療方法ではなく、かつ前記使用はヒトの生殖系列遺伝的同一性を変更するためのプロセスではないことを条件とする。ゲノム修飾は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更すること、細胞内でのポリヌクレオチド配列の発現を変更すること、変異した疾患遺伝子を含むモデル細胞を作製すること、又は遺伝子をノックアウトすること、を含み得る。本発明の使用は、さらに、外来の鋳型ポリヌクレオチドを挿入することにより切断された標的ポリヌクレオチドを修復又は編集することを含み得、該修復又は編集は、標的ポリヌクレオチドの１以上のヌクレオチドの挿入、欠損、又は置換を含む変異をもたらす。
【００５６】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変化及び変更が、発明を実施するための形態から当業者には明らかになるので、発明を実施するための形態及び本発明の好ましい実施形態を示す特定の実施例は、単に例示のために与えられることを理解されたい。
【００５７】
本発明を、これから、図面と関連して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｇ１におけるＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の阻害は、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１依存性である。ａ、照射（２グレイ）し、γ−Η２ΑΧ、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の免疫蛍光のために処理したＧ１同期化Ｕ２ＯＳ細胞の顕微鏡写真。ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＩＲ、電離放射線；ＷＴ、野生型。ｂ、ａ及び図５Ｄに示した実験の定量化。ＡＳＮ、非同期化分裂細胞。ＷＴ、野生型（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、Ｎ＝３）。ｃ、モック又はＳ若しくはＧ１期で同期化したＸ線照射２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からのＰＡＬＢ２の免疫沈降（ＩＰ）。通常の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ免疫沈降を対照として行った。サイクリンＡ染色により細胞周期の同期を確認する。左側の数字はｋＤａを示す。ゲルソースデータについては図５を参照されたい。ｄ、図７ａに示した実験の定量化。示したＧＦＰ−ＰＡＬＢ２ベクター及び低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡでトランスフェクトした５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞を照射（２０グレイ）した後、顕微鏡観察のために処理した（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｅ、示した遺伝子型を有する同期化及び照射した２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からの正常ＩｇＧ及びＰＡＬＢ２免疫沈降。左側の数字はｋＤａを示す。
【図２】ＰＡＬＢ２のユビキチン化はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を防止する。ａ、ＰＡＬＢ２のＮ末端及び変異体の配列（配列番号１〜３）。ｂ、示したＧＦＰ−ＰＡＬＢ２タンパク質を発現するＧ１又はＳ期で同期化した２９３Ｔ細胞由来の抽出物のＧＦＰ免疫沈降（ＩＰ）。ｃ、示したＨＡタグ付きＰＡＬＢ２タンパク質のＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１によるインビトロユビキチン化。ｄ、ＭＢＰ又はＭＢＰ−ＢＲＣＡ１−ＣＣとインキュベートしたユビキチン化ＨＡ−ＰＡＬＢ２（１−１０３）のプルダウンアッセイ。Ｉ、インプット；ＦＴ、フロースルー；ＰＤ、プルダウン。アスタリスクは、ＢＲＣＡ１結合能を有するＨＡ−ＰＡＬＢ２の断片を示す。ｂ〜ｄ、左側の数字はｋＤａを示す。
【図３】ＵＳＰ１１は、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の活性に対抗する。ａ、示した遺伝子型を有し、ＧＦＰ−ＵＳＰ１１コンストラクトでトランスフェクトし、カンプトテシン（ＣＰＴ）処理した２９３Ｔ細胞由来の抽出物の正常ＩｇＧ又はＰＡＬＢ２免疫沈降（ＩＰ）。ＥＶ、空ベクター；ＣＳ、Ｃ３１８Ｓ；ＷＴ、野生型。ｂ、示した遺伝子型を有し、オラパリブで処理した２９３Ｔ細胞のクローン原性生存アッセイ（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ≧３）。ｃ、示した遺伝子型を有するＣＰＴ処理２９３Ｔ細胞由来の抽出物の正常ＩｇＧ又はＰＡＬＢ２免疫沈降。ｄ、ユビキチン化ＨＡタグ付きＰＡＬＢ２（１−１０３）を含有し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＵＳＰ１１又はそのＣ２７０Ｓ（ＣＳ）変異体の濃度を増加させた脱ユビキチン化反応の免疫ブロット。ＵＳＰ２を対照として使用した。ＤＵＢ、脱ユビキチン化酵素。ｅ、細胞周期を同期化したＵ２ＯＳ細胞に照射（２０グレイ線量）し、免疫ブロッティングのために処理した。ＩＲ、電離放射線、ｆ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、照射したＵ２ＯＳ細胞からの抽出物の免疫ブロット。ＣＴＲＬ、対照。ｇ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、Ｇ１で同期化し、照射（２０グレイ）した５３ΒΡ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞の蛍光顕微鏡写真。５個を超えるγ−Ｈ２ＡＸ共局在ＢＲＣＡ２フォーカスを有する細胞の割合を示す（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。スケールバー、５μｍ。ａ、ｃ、ｄ、ｆにおいて左又は右の数字はｋＤａを示す。
【図４】Ｇ１期におけるＨＲの再活性化。ａ、非ターゲティング（ＣＴＲＬ）ｓｉＲＮＡ又はＫＥＡＰ１  ｓｉＲＮＡ及び野生型ＣｔＩＰ若しくはＴ８４７Ｅ（ＴＥ）変異体を発現するベクターと同時トランスフェクトし、Ｇ１で同期化し、照射（２グレイ）し、γ−Ｈ２ＡＸ及びＲＡＤ５１免疫蛍光のために処理した野生型（ＷＴ）及び５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞の定量化（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｂ、ａの代表的な顕微鏡写真。ＩＲ、電離放射線。ｃ、遺伝子ターゲティングアッセイの概略図。ｄ、非同期分割（ＡＳＮ）し、Ｇ１停止したＵ２ＯＳ細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング効率（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ＨＲ、相同組換え；ｓｇＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ。ｅ、示したｓｉＲＮＡ又はＰＡＬＢ２−ＫＲ発現ベクターでトランスフェクトしたＧ１停止細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｆ、相同組換えの細胞周期調節モデル。
【図５】Ｇ１  ５３ΒΡ１Δ細胞におけるＤＳＢ部位でのＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２蓄積の抑制。ａ、ヒト５３ＢＰ１遺伝子組織及び使用したｓｇＲＮＡのターゲティング部位の概略図。ボックスはエキソンを示す。（Ｅ：黄色、コード配列；茶色、非翻訳領域（ＵＴＲ））。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって導入された挿入欠損及びそれぞれの頻度を示す。ｂ、野生型（ＷＴ）及び５３ＢＰ１Δ及びＵ２ＯＳ細胞に何もしないか、又はＸ線照射（１０グレイ）し、その後、５３ＢＰ１蛍光顕微鏡のために処理した。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを染色し、核の輪郭をトレースした。ｃ、野生型（ＷＴ）及び５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞を５３ＢＰ１免疫ブロッティングのために処理した。チューブリンをローディング対照として使用した。ｄ、二重チミジンブロック及び解放後にＧ１で同期化するか、又は非同期分割（ＡＳＮ）した野生型（ＷＴ）並びに５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞に照射（２グレイ）し、γ−Η２ΑΧ、ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ２及びＢＲＣＡ１の免疫蛍光のために処理した。Ｇ１におけるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２染色に関する顕微鏡写真は図１ａに見られる。ｅ、二重チミジンブロックからの解放後にＧ１で同期化した野生型（ＷＴ）及び３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞に照射（２０グレイ）し、γ−Η２ΑΧ、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の免疫蛍光のために処理した。左はＧ１停止細胞についての代表的な顕微鏡写真であり、全実験の定量化を右に示す（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。
【図６】ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用は、細胞周期によって調節される。ａ、ＬａｃＯ／ＬａｃＲクロマチンターゲティングシステムの概略図。ｂ、Ｕ２ＯＳ  ２５６細胞を示したｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ及びＧＦＰ融合物でトランスフェクトした。ＧＦＰの蛍光を、ｌａｃＯアレイ局在化ｍＣｈｅｒｒｙフォーカスの部位で測定した。各円は、分析した１個の細胞を表し、バーは中央値にある。また、細胞をサイクリンＡ抗体で染色し、細胞周期位置を決定した（Ｎ＝３）。ＩＲ、電離放射線。ｃ、示したｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ及びＧＦＰ融合物でトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の代表的な顕微鏡写真；データをｄで定量化する。ｄ、ｌａｃＯアレイにＢＲＣＡ１又はＰＡＬＢ２のいずれかを係留するために、示したｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ及びＧＦＰ融合物でトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の定量化（Ｎ＝３）。ｅ、ＰＡＬＢ２構築及びその主要な相互作用タンパク質の概略図。ｆ、示したＧＦＰ−ＰＡＬＢ２変異体及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ−ＢＲＣＡ１−ＣＣでトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の定量化。また、細胞をサイクリンＡ抗体で染色し、細胞周期位置を決定した（Ｎ＝３）。
【図７】Ｇ１におけるＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の阻害は、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１に依存する。ａ、図１ｄに示した実験の代表的な顕微鏡写真。ｂ、図５ａに記載したように、ヒトＫＥＡＰ１遺伝子組織及び使用されるｓｇＲＮＡのターゲティング部位の概略図。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって導入された挿入欠損及びそれぞれの頻度を示す。ｃ、照射した２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からのＰＡＬＢ２の免疫沈降（ＩＰ）。正常ＩｇＧを用いたＩＰを対照として行った。ｄ、示した遺伝子型を有する２９３Ｔ細胞を、示したＨＡ−ＫＥＡＰ１コンストラクトでトランスフェクトし、Ｇ１又はＳ期で同期化し、照射した。細胞を、ＰＡＬＢ２免疫沈降（ＩＰ）のために処理した。ＥＶ、空ベクター；ＷＴ、野生型。ｅ、示したＧＦＰ−ＰＡＬＢ２変異体及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ−ＢＲＣＡ１でトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の定量化。また、細胞をサイクリンＡ抗体で染色し、細胞周期位置を決定した（Ｎ＝３）。ｆ、ＧＦＰ−ＰＡＬＢ２及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ−ＢＲＣＡ１−ＣＣ（野生型又はＫ１４０６Ｒ変異体）でトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の定量化。また、細胞をサイクリンＡ抗体で染色し、細胞周期位置を決定した。このパネルは、ＢＲＣＡ１のＰＡＬＢ２相互作用モチーフにおける唯一のリジンがＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ１相互作用の細胞周期調節に関与していないことを示す。ｅ、ｆ、各円は、分析した細胞を表し、バーは中央値にある（Ｎ＝３）。
【図８】ＰＡＬＢ２は、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１によりユビキチン化される。ａ、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ＨＩＳ６−Ｕｂを発現するＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−ＩｎＴ−ＲＥＸ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、Ｎｉ−ＮＴＡプルダウン（ＩＰ）のために処理した。ｂ、ＵＳＰ１１ターゲティングｓｉＲＮＡ及びＦｌａｇ−ＰＡＬＢ２発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、Ｆｌａｇ免疫沈降に続く質量分析（ＭＳ）のために処理した。特定したトリプシンジグリシン（ｄｉＧ）−ＰＡＬＢ２ペプチドの代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示す（Ｋ１６、上；Ｋ４３、下）。ｃ、ｌａｃＯ／ＬａｃＲクロマチンターゲティングシステム及びユビキチン化ＰＡＬＢ２のインビボ定量化の概略図。ｄ、示したｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ−ＰＡＬＢ２ベクターでトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の代表的な顕微鏡写真。細胞をＦＫ２免疫蛍光のために処理した。ＥＶ、空のベクター。スケールバー、５μｍ。ｅ、示したｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲ−ＰＡＬＢ２ベクターでトランスフェクトしたＵ２ＯＳ  ２５６細胞の定量化。細胞をＬａｃＯフォーカスでのＦＫ２蛍光の定量化のために処理した。各円は分析した細胞を表し、バーは中央値にある（Ｎ＝３）。また、細胞をサイクリンＡ抗体で染色し、細胞周期位置を決定した。統計的有意性を、クラスカル・ワリス検定によって決定した（＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図９】ＰＡＬＢ２のＫＥＡＰ１及びＵＳＰ１１依存的調節と相同組換えの分析。ａ、残基２０（ＰＡＬＢ２−ＫＣ２０−Ｕｂ）及び残基４５（ＰＡＬＢ２−ＫＣ４５−Ｕｂ）におけるＨＡ−ＰＡＬＢ２（１−１０３）の部位特異的化学ユビキチン化を、ジクロロアセトン連結により行った。その非修飾対応物と共に得られたユビキチン化ＰＡＬＢ２ポリペプチドを、ＢＲＣＡ１（ＭＢＰ−ＢＲＣＡ１−ＣＣ）のコイルドコイルドメインとＭＢＰとの融合によるプルダウンに供した。Ｉ、インプット；ＰＤ、プルダウン。アスタリスクは非特異的バンドを示す。ｂ、野生型及びＫＥＡＰ１Δ２９３Ｔ細胞を、指示した時間、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、次いで、ＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１免疫ブロッティングのために処理した。また、アクチンレベルをローディング対照として測定した。ｃ、カンプトテシン（ＣＰＴ；２００ｎＭ）で処理するか、又は処理しなかった２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からのＵＳＰ１１の免疫沈降（ＩＰ）。正常ＩｇＧを用いた免疫沈降を対照として行った。ｄ、Ｕ２ＯＳ  ＤＲ−ＧＦＰ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の時点で、Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターを含める場合と含めない場合で、細胞を示したｓｉＲＮＡ耐性ＵＳＰ１１発現ベクター（ＷＴ、野生型；ＣＳ、Ｃ３１８Ｓ及びＣＡ、Ｃ３１８Ａ触媒デッド変異体）又は空ベクター（ＥＶ）でさらにトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性細胞の割合を、各条件についてプラスミドトランスフェクション後４８時間の時点で決定し、Ｉ−ＳｃｅＩプラス非標的（ｓｉＣＴＲＬ）条件に対して正規化した（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｅ、ＵＳＰ１１Δ細胞及びＵＳＰ１１Δ／ＫＥＡＰ１Δ  ２９３Ｔ細胞を作製するために使用したヒトＵＳＰ１１（上）及びＫＥＡＰ１（下）遺伝子組織並びに（図５ａに記載した）ｓｇＲＮＡのターゲティング部位の概略図。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によって導入した挿入欠損及びそれぞれの頻度を示す。ＵＳＰ１１ノックアウトを最初に作製し、続いて、ＵＳＰ１１Δ／ＫＥＡＰ１Δ二重変異体を作製するために用いた。ｆ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＣＰＴ（２００ｎＭ）処理をした場合又はしない場合の２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からのＰＡＬＢ２の免疫沈降。正常ＩｇＧを用いた免疫沈降を対照として行った。
【図１０】ＵＳＰ１１は、ＰＡＬＢ２に対するＫＥＡＰ１作用と拮抗する。ａ、Ｕ２ＯＳ  ＤＲ−ＧＦＰ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトするか又はトランスフェクトしないで放置した（−）。トランスフェクション後２４時間の時点で、細胞をＩ−ＳｃｅＩ発現ベクターでトランスフェクトした（円）。各条件についてのＧＦＰ陽性細胞の割合を、プラスミドトランスフェクション後４８時間の時点で決定し、Ｉ−ＳｃｅＩプラス非標的（ＣＴＲＬ）条件に対して正規化した（平均±範囲、Ｎ＝３）。ｂ、親２９３Ｔ細胞（野生型（ＷＴ））又はＵＳＰ１１Δ派生細胞を、示したＧＦＰ−ＰＡＬＢ２コンストラクトでトランスフェクトし、ＣＰＴで処理し、ＧＦＰ免疫沈降（ＩＰ）のために処理した。ｃ、親２９３Ｔ細胞（野生型）又はＵＳＰ１１Δ派生細胞を、空ベクター（ＥＶ）又は示したＰＡＬＢ２発現ベクターでトランスフェクトした。次いで、ＰＡＲＰ阻害剤オラパリブに対する細胞の感受性を、クローン原性生存アッセイによって決定した（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。
【図１１】ＵＳＰ１１タンパク質安定性の特性。ａ、Ｇ１又はＳ／Ｇ２で同期化したＵ２ＯＳ細胞をシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で処理し、ＵＳＰ１１の安定性をモニタリングするために、示した時点で処理した。ｂ、Ｇ１又はＳ期で同期化し、ＩＲ（２０グレイ）で処理するか又は処理しなかった２９３Ｔ細胞から調製した抽出物からのＰＡＬＢ２の免疫沈降（ＩＰ）。ｃ、Ｕ２ＯＳ細胞に２又は２０グレイの線量を照射し、ＩＲ後の示した時間にＵＳＰ１１免疫ブロッティングのために処理した。アクチンをローディング対照として使用した。ｄ、モック処理するか、又はＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３（ＡＴＭｉ）、ＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１（ＡＴＲｉ）又はＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤ＮＵ７４４１（ＤＮＡＰＫｉ）とインキュベートしたＵ２ＯＳ細胞に照射（２０グレイ）し、ＵＳＰ１１及びアクチン（ローディング対照）免疫ブロッティングのために処理した。ｅ、細胞を紫外線（ＵＶ）放射（５０ｍＪ／ｃｍ−２）に暴露したことを除いて、ｄと同様の実験。ｆ、モック処理するか、又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２とインキュベートしたＵ２ＯＳ細胞に照射（２０グレイ）し、ＵＳＰ１１及びアクチン（ローディング対照）免疫ブロッティングのために処理した。ｇ、モック処理するか、又はカリン阻害剤ＭＬＮ４９２４とインキュベートしたＵ２ＯＳ細胞に照射（２０グレイ）し、ＵＳＰ１１及びアクチン（ローディング対照）免疫ブロッティングのために処理した。
【図１２】ＲＡＤ５１ローディングの再活性化及びＧ１での不定期なＤＮＡ合成。ａ、５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、二重チミジンブロックからの解放によってＧ１又はＳ／Ｇ２で同期化し、照射（２０グレイ）し、その後、蛍光顕微鏡検査のために処理した。ＤＡＰＩを用いて、核の境界を追跡し、サイクリンＡ染色を用いて、細胞周期位置を決定した。５個を超えるγ−Ｈ２ＡＸ共局在ＰＡＬＢ２フォーカスを有する細胞の割合を、平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３として示す。スケールバー、５μｍ。ｂ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、野生型ＣｔＩＰを発現する、照射したＧ１同期化野生型（ＷＴ）及び５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞の代表的な顕微鏡写真。ｃ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）を発現する照射したＧ１同期化野生型Ｕ２ＯＳ細胞の代表的な顕微鏡写真。ｄ、Ｕ２ＯＳ  ５３ＢＰ１Δ細胞をＧ１で同期化し、ＢｒｄＵを補充し、照射（２グレイ）し、γ−Ｈ２ＡＸ及びＢｒｄＵの免疫蛍光のために処理した。５個を超えるγ−Ｈ２ＡＸ共局在ＢｒｄＵフォーカスを有する細胞の割合を示す（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｅ、ラミンＡの典型的な核周囲の発現パターンを示す、ＣＲＩＳＰＲ−ｍＣｌｏｖｅｒシステムでターゲティングしたＵ２ＯＳ細胞の顕微鏡写真。ｆ、核内のＰＭＬフォーカスに特徴的な発現パターン特性を示すｍＣｌｏｖｅｒシステムでターゲティングしたＵ２ＯＳ細胞の顕微鏡写真。ｇ、図４ｄに提示した遺伝子ターゲティング（ＬＭＮＡ）実験のタイムライン。ｈ、図４ｅ及び図１３に提示した遺伝子ターゲティング（ＬＭＮＡ又はＰＭＬ）実験のタイムライン。
【図１３】Ｇ１での相同組換えの分析。ａ、ドナーの鋳型量を増加させ、ｓｇＲＮＡを含める場合（灰色）又は含めない場合（白）でトランスフェクトした非同期分割Ｕ２ＯＳ細胞においてＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング効率の定量化。遺伝子ターゲティング事象をフローサイトメトリーによって検出した（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ≧３）。ｂ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした非同期分割細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング効率の定量化。遺伝子ターゲティング事象をフローサイトメトリーによって検出した（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｃ、ＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）変異体を発現し、示したｓｉＲＮＡ又はＰＡＬＢ２−ＫＲ発現コンストラクトで同時トランスフェクトしたＧ１停止５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞内でフローサイトメトリーによって測定したＰＭＬ遺伝子座における遺伝子ターゲティング効率（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｄ、ＫＥＡＰ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）変異体を発現する、Ｇ１停止した親（野生型（ＷＴ））及び５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞内でフローサイトメトリーによって測定したＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング効率（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。ｅ、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、野生型又はＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）変異体のいずれかを発現している、Ｇ１停止した親（野生型（ＷＴ））及び５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞内でフローサイトメトリーによって測定したＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング効率（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。
【図１４】ＤＮＡ損傷に応答するＵＳＰ１１安定性の調節因子としてのＤＣＡＦ１０の特定。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞を他のＣＵＬ４相互作用タンパク質と共に既知の及び予測されるＤＣＡＦターゲティングｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたｓｉＲＮＡスクリーニング。細胞にＩＲ（２０グレイ）又はＵＶ（５０Ｊ／ｍ−２）のいずれかを照射し、３時間回復させ、次いで、ＵＳＰ１１免疫蛍光のために処理した。プロットした各点は、照射後に残ったＵＳＰ１１の割合に相当する。赤い点は、ｓｉＲＮＡ非ターゲティング対照（ＣＴＲＬ）及びＵＳＰ１１ターゲティングｓｉＲＮＡに相当し、赤い点は、ＣＵＬ４自体を含むコアＣＲＬ４因子に相当する。ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞を示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、２０グレイの線量を照射し、電離放射線後の示した時間でＵＳＰ１１免疫ブロッティングのために処理した。アクチンをローディング対照として使用した。
【図１５】ＵＳＰ１１の調節因子としてのＤＣＡＦ１０の検証。ａ．ＤＣＡＦ１０はＵＳＰ１１と相互作用する。２９３  Ｆｌｐ−ＩＮ／Ｔ−Ｒｅｘ細胞から調製した抽出物からのＦｌａｇ−ＵＳＰ１１の免疫沈降（ＩＰ）。細胞をＤＣＡＦ１０及びＤＣＡＦ１５抗体でプローブした。ｂ．示した遺伝子型のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の全細胞抽出物をＵＳＰ１１免疫ブロッティングのために処理した。チューブリンをローディング対照として使用した。ｃ．Ｕ２ＯＳ  ＤＲ−ＧＦＰ細胞を、示したｓｉＲＮＡ又は発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の時点で、細胞をＩ−ＳｃｅＩ発現ベクターでトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性細胞の割合を、各条件についてプラスミドトランスフェクション後４８時間の時点で決定し、Ｉ−ＳｃｅＩプラス非ターゲティング（ＣＴＲＬ）＋空ベクター（ＥＶ）条件に対して正規化した。
【図１６】ＫＥＡＰ１阻害は、Ｇ１細胞内でＨＲを活性化することができる。示したｓｉＲＮＡ及びＲ１  ＫＥＡＰ１阻害剤又はそのＦＮ３足場対照のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトしたＧ１停止細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティング（平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
開示した薬剤の調製及び使用並びに本明細書で使用した方法の実施は、特に断らない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、生化学、クロマチンの構造及び分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ及び関連分野の従来技術を利用する。技術は文献に完全に開示されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９及び第３版、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８７及び定期的な更新；シリーズの酵素学方法（ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ；Ｗｏｌｆｆｅ、クロマチンの構造と機能、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９８；酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、３０４巻、「クロマチン」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９９；並びに分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１１９巻、「クロマチンプロトコル」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、１９９９を参照されたい）。
【００６０】
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の定義は、当技術分野のものを補足し、本出願を対象とし、任意の関連する又は関連しない場合に帰属されるべきではない。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、特定の材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００６１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つ「（ａ）」、「１つ「（ａｎ）」、及び「その」は、特に文脈が明示しない限り、複数の言及を含む。本明細書で使用する場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素又は方法の工程を除外しない。
【００６２】
「遺伝子編集システム」は、限定されないが、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）システム、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ））システム及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含むゲノムのターゲティング及び編集用のシステムである（ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲシステムの概説についてはＮｅｍｕｄｒｙｉ  Ａ．Ａ．らのＡｃｔａ  Ｎａｔｕｒａｅ．２０１４  Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；６（３）：１９−４０；ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ及びＺＦＮシステムの概説についてはＧａｊ  Ｔ．らのＴｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；３１（７）：３９７−４０５；ＴＡＬＥＮシステムを説明している米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０；並びにＺＦＮシステムを説明しているＢｉｂｉｋｏｖａ  Ｍ．らのＧｅｎｅｔｉｃｓ．２００２；１６１（３）：１１６９−１１７５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  Ｊ．Ａ．らのＮａｔｕｒｅ  ２００９；４５９（７２４５）：４４２−４４５；Ｚｈａｎｇ  ＦらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０；１０７（２６）：１２０２８−１２０３３；Ｔｏｒｉｋａｉ  Ｈ．らのＢｌｏｏｄ．２０１２；１１９（２４）：５６９７−５７０５；Ｐｒｏｖａｓｉ  Ｅ．らのＪ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１２；１８（５）：８０７−８１５１、及びＬｏｍｂａｒｄｏ  Ａ．らのＮａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１；８（１０）：８６１−８６９を参照されたい）。
【００６３】
「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、一般的に、クリスパー（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  （ＣＲＩＳＰＲ））関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又は活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を指す。ＣＲＩＳＰＲシステムには、限定されないが、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくは部分活性ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列、ガイド配列、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写産物が含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズしたガイド配列を含み、１以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成する）の形成を促進する。「標的配列」又は「標的ポリヌクレオチド」は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する指定したガイド配列に標的配列がハイブリダイズするのに十分にガイド配列に相補的である配列を指す。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得、核、細胞質、又は細胞小器官、例えば、ミトコンドリア若しくは葉緑体の中に位置付けられ得る。内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、内因性ＣＲＩＳＰＲシステム内にＣＲＩＳＰＲ複合体が形成すると、標的配列の中又は近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、若しくはそれ以上の塩基対内）の一方又は両方の鎖が開裂する。
【００６４】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号及び同第８，８９５，３０８号；米国特許公開第２０１４−０３１０８３０号、同第２０１４−０２８７９３８号、同第２０１４−０２７３２３４号、同第２０１４−０２７３２３２号、同第２０１４−０２７３２３１号、同第２０１４−０２５６０４６号、同第２０１４−０２４８７０２号、同第２０１４−０２４２７００号、同第２０１４−０２４２６９９号、同第２０１４−０２４２６６４号、同第２０１４−０２３４９７２号、同第２０１４−０２２７７８７号、同第２０１４−０１８９８９６号、同第２０１４−０１８６９５８号、同第２０１４−０１８６９１９号、同第２０１４−０１８６８４３号、同第２０１４−０１７９７７０号及び同第２０１４−０１７９００６号、同第２０１４−０１７０７５３号、及び同第２０１５０２３２８８３号；欧州特許出願ＥＰ  ２７７１４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、ＥＰ  ２７６４１０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及びＥＰ  ２７８４１６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）；及びＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、ＷＯ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、ＷＯ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、ＷＯ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、ＷＯ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、ＷＯ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、ＷＯ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、ＷＯ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、ＷＯ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、ＷＯ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）に記載されている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一般的な情報はまた、以下の刊行物に記載されている：Ｃｏｎｇ，  Ｌ．らのＳｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；Ｊｉａｎｇ  Ｗ．らのＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；Ｗａｎｇ  Ｈ．らのＣｅｌｌ  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ．らのＮａｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ．２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ．２３；Ｒａｎ，Ｆ  Ａ．らのＣｅｌｌ  Ａｕｇｕｓｔ  ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；Ｈｓｕ，Ｐ．らのＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；Ｒａｎ，Ｆ  Ａ．らのＮａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１）：２２８１−３０��．（２０１３）；Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．らのＳｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １２．（２０１３）．（印刷前の電子出版）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．らのＣｅｌｌ  Ｆｅｂ．２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；Ｗｕ  Ｘ．らのＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）  Ａｐｒ．２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９；ＰｌａｔｔらのＣｅｌｌ  １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４；ＨｓｕらのＣｅｌｌ  １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎ．５，２０１４）（２０１４）；ＷａｎｇらのＳｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｊａｎ．３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１；ＤｏｅｎｃｈらのＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙオンライン出版  ３  Ｓｅｐ．２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６；Ｓｔｏｒｒｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．３９２３９，Ｍａｒｃｈ  １，２０１４；及びＳｗｉｅｃｈらのＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンライン出版  １９  Ｏｃｔ．２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５）。いくつかのプログラム、例えば、ＭＩＴのＣＲＩＳＰＲデザイン（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）及びドイツ癌研究センターが開発したＥ−ＣＲＩＳＰ（ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ）が、ガイド配列を設計するのに利用可能である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｅｄｉｔａｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Ｃａｒｉｂｏｕ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州バークレー）、ＣＲＩＰＳＲ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（スイスのバーゼル）、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）及びＩｎｔｅｌｌｉａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）が開発したシステムか、又はそれらから利用可能なシステムも含む。
【００６５】
「ＤＮＡ末端切除」は、一般に、３’末端１本鎖ＤＮＡの形成をもたらすＤＮＡ２本鎖切断の５’末端鎖の核酸分解を指す。真核生物におけるＤＮＡ末端切除は、２つの段階を含む：哺乳動物内でＭｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｎｂｓ１（ＭＲＮ）複合体によって触媒される遅い初期段階、及びエキソヌクレアーゼＥｘｏ１又はヘリカーゼブルーム症候群（ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｂｌｏｏｍ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のタンパク質（ＢＬＭ）によって触媒される第２のより速い段階。ＤＮＡ末端切除は、アクセサリータンパク質ＣｔＩＰ（網膜芽細胞腫結合タンパク質８としても知られる）のリン酸化を含む細胞周期活性化工程によって開始される。ＤＮＡ末端切除に関与する経路は、ＴＰ５３ＢＰ１（５３ＢＰ１）若しくはＲＩＦを阻害することによってＤＮＡ２本鎖切断へのＢＲＣＡ１動員を刺激又は活性化することによって、或いは、ＤＮＡ２本鎖切断部位への５３ＢＰ１又はＲＩＦの動員を阻止することによって活性化することができる。一態様において、ＤＮＡ末端切除は、５３ＢＰ１（若しくはＲＩＦ）の発現及び／又は活性を阻害し、構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰの変異型、例えば、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを発現させることによって活性化され得る。一態様において、ＤＮＡ末端切除は、５３ＢＰ１の阻害剤及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰの変異型、特に、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを用いて再構成又は活性化される。一態様において、ＤＮＡ末端切除は、精製したヒトタンパク質：ブルームヘリカーゼ（ＢＬＭ）；ＤＮＡ２ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ；エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）；ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、及びはＮＢＳ１（ＭＲＮ）を含む複合体；並びに複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）を用いて再構成又は活性化され得る（ＤＮＡ末端切除の説明についてはＮｉｍｏｎｋａｒ  Ａ．Ｖ．らのＧｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２５：３５０−３６２，２０１１；Ｈｕｅｒｔａｓ，Ｐ，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１７（１０：１１−１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．１７１０，２０１０；Ｊｉｍｅｎｏ  Ｓ．らのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ｄｏｅ：１０１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕｉ３８４，２０１５を参照されたい）。
【００６６】
「相同組換え」と「ＨＲ」は、類似又は同一のヌクレオチド配列のＤＮＡ鎖が交換される遺伝子組換えの種類を指す。ＨＲは、以下の一般的な工程によりＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するために細胞が使用することができる。ＤＳＢが、ヌクレアーゼ及びヘリカーゼによって切除され、３’  １本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オーバーハングを生成し、その上に、ＲＡＤ５１リコンビナーゼが核タンパク質フィラメントとして集合したときにＨＲが開始される。この構造は、修復ＤＮＡ合成のための鋳型として使用される相同な２本鎖ＤＮＡに侵入することができる。生じた中間体は代謝され、クロスオーバーのない生成物をもたらし、それによって、２本鎖切断前に存在していた、損傷を受けたＤＮＡ分子を復元することができる（Ｓａｎ  ＦｉｌｉｐｐｏらのＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８．７７：２２９−５７）。この用語はまた、１本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を用いた組換え、特に、切除を必要とし、５３ＢＰ１阻害剤によって活性化され得る１本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を用いた組換えを含む。
【００６７】
「ＨＲ疾患」は、ＨＲ欠陥と関連し得るか、又はＨＲ欠陥によって特徴づけられ得る障害として認識又は診断される全ての障害、疾患、状態、症候群又は徴候若しくは症状の組み合わせを指す。例示的な疾患には、例えば、癌、心不全、高血圧症及びアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患、呼吸器疾患、腎疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患を含む胃腸疾患、肝炎及び肝硬変を含む肝臓、胆嚢及び胆管の疾患、血液疾患、代謝疾患、糖尿病を含む内分泌疾患及び生殖疾患、骨及び骨塩の代謝疾患、関節リウマチ、エリテマトーデスなどの自己免疫疾患及び他の自己免疫疾患を含む免疫系疾患、関節炎を含む筋骨格及び結合組織疾患、軟骨無形成症、感染症、並びにアルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病など神経疾患が含まれる。
【００６８】
本発明の方法を用いて、相同組換えを媒介する遺伝子、例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＰ−１、ＵＳＰ１１、ＲＡＤ５１、及び／又はＤＣＡＦ１０の欠陥によって引き起こされる疾患をモニタリング又は治療することができる。
【００６９】
本発明の実施形態は、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、骨髄腫、骨肉腫、神経腫瘍、及び乳房、卵巣、及び前立腺などの臓器の癌を含むが、これらに限定されない様々な癌のモニタリング又は治療を提供する。
【００７０】
一実施形態において、本発明は、ＢＲＣＡ−１欠損、ＢＲＣＡ−２欠損、デュアルＢＲＣＡ−１／ＢＲＣＡ−２欠損、及びファンコニ貧血を有する癌のモニタリング又は治療を提供する。本発明の実施形態において、該癌は、乳癌、特に、浸潤性乳管癌及び浸潤性小葉癌である。本発明の実施形態において、該癌は、卵巣癌、特に、上皮性卵巣腫瘍、胚細胞卵巣腫瘍、及び性索間質性腫瘍である。
【００７１】
相同組換えを活性化又は調節するための本発明の方法を用いて、遺伝性障害と関連したポリヌクレオチドを遺伝的に変更してよい。いくつかの実施形態において、該遺伝性障害は、単一遺伝子障害である。いくつかの実施形態において、該遺伝性障害は、多遺伝子障害である。いくつかの実施形態において、該遺伝性障害は、１個以上のＳＮＰと関連する。本発明の特定の実施形態において、ゲノム修飾は点変異を補正する。
【００７２】
遺伝性障害及び遺伝性障害と関連するポリヌクレオチド配列の例は、公開された特許及び出願（例えば、米国出願公開第２０１５／０２４７１５０を参照されたい）、及び刊行物（例えば、補足情報を含めてＴｕｒｉｔｚ  Ｃｏｘ  Ｄ．Ｂ．らのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１，１２１−１３１，２０１５；及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ  Ｔ．Ｐ．及びＲ．Ｇ．Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｐｒｉｌ  ２００６、ページ２６１−２７６、及びそこに引用される出版物を参照されたい）に記載のワールドワイドウェブ（例えば、米国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館（マサチューセッツ州ベセスダ）又はマキュージック・ネイサンズ（ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ）遺伝医学研究所ジョンズ・ホプキンス大学（メリーランド州ボルティモア））上で見つけられ得る。
【００７３】
一態様において、該遺伝性障害は、筋肉の遺伝性障害である。一態様において、該遺伝性障害は、筋緊張性ジストロフィー１型である。一態様において、該遺伝性障害は、筋緊張性ジストロフィー２型である。一態様において、該遺伝性障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）でる。一態様において、該遺伝性障害は、ベッカー型筋ジストロフィーである。
【００７４】
一態様において、該遺伝性障害は、肝臓の遺伝性障害、例えば、α−１アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、Ｉ型チロシン血症、糖原病ＩＶ型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、シトリン欠損、コレステロールエステル蓄積症及び遺伝性果糖不耐症である。
【００７５】
一態様において、該遺伝性障害は、セリンプロテアーゼ阻害剤ＡＡＴをコードするセルピナ１遺伝子の変異に起因する常染色体劣性（共優性）疾患であるα−１アンチトリプシン欠損症である。
【００７６】
一態様において、該遺伝性障害は、肝臓中の銅のレベルを調節する肝細胞が主に発現するタンパク質であるＡＴＰ７Ｂ銅転移酵素をコードする遺伝子の変異に依存するウィルソン病である。
【００７７】
一態様において、該遺伝性障害は、肺の遺伝性障害である。
【００７８】
一態様において、該遺伝性障害は、膜貫通タンパク質のＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーのメンバーである嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患の嚢胞性線維症である。
【００７９】
本発明の他の態様において、該遺伝性障害は、血友病、α１−アンチトリプシン欠損症、カナバン病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、家族性アミロイド多発性神経障害、地中海貧血、テイ・サックス病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン、ムコ多糖症、ニーマン・ピック病、軟骨無形成症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、フリードライヒ運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、一遺伝子性高コレステロール血症及び他の単一遺伝子障害であり得る。
【００８０】
本発明の態様において、該遺伝性障害は鎌状赤血球貧血であり、本発明の方法は、そのパラログＨＢＤとの遺伝子変換によって変異したＨＢＢヘモグロビン遺伝子を補正することを含む。
【００８１】
「有効量」は、特定の生物学的結果を達成するのに効果的な、本明細書に記載の化合物又は組成物の量を指す。このような結果は、限定されないが、当技術分野において適切な任意の手段によって決定されるように、本明細書に開示される疾患又は状態の治療を含む。
【００８２】
「ＰＡＲＰ阻害剤」は、ＡＤＰＲＴ（ＮＡＤ：タンパク質（ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（重合））及びＰＡＲＳ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）シンテターゼ）とも呼ばれる核酵素ポリ（アデノシン５’−ジホスホ−リボース）ポリメラーゼ（「ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ」又は「ＰＡＲＰ」の阻害剤を指す。ＰＡＲＰ阻害剤は、Ｂａｎａｓｉｋらの「ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素及びモノ（ＡＤＰ−リボシル）トランスフェラーゼの特異的阻害剤（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｅ）  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌ）−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：３、１５６９−７５（１９９２）、及びＢａｎａｓｉｋらの「ＡＤＰリボシル化反応の阻害剤及び活性化因子（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，１８５−９７（１９９４）に記載されている。ＰＡＲＰ阻害剤は、以下の特許及び特許出願に開示又は記載されている：ＷＯ  ００／４２０４０；ＷＯ  ００／３９０７０；ＷＯ  ００／３９１０４；ＷＯ  ９９／１１６２３；ＷＯ  ９９／１１６２８；ＷＯ  ９９／１１６２２；ＷＯ  ９９／５９９７５；ＷＯ  ９９／１１６４４；ＷＯ  ９９／１１９４５；  ＷＯ  ９９／１１６４９；及びＷＯ  ９９／５９９７３；米国特許第８，８９４，９８９号、同第８，９４６，２２１号、同第８，７７８，９６６号、同第８，６６９，２４９号、同第８，６２３，８８４号、同第８，５９２，４１６号、同第８，５４６，３６８号、同第８，５４１，４１７号、同第８，５４１，４０３号、同第８，４２０，６５０号、同第８，３６２，０３０号、同第８，２３６，８０２号、同第８，２１７，０７０号、同第８，１８８，１０３号、同第８，１８８，０８４号、同第８，１８３，２５０号、同第８，１７３，６８２号、同第８，１２９，３８２号、同第８，０８８，７６０号、同第８，０８０，５５７号、同第８，０７１，６２３号、同第８，０５８，２７５号、同第８，０１２，９７６号、同第８，００８，４９１号、同第７，９９９，１１７号、同第７，９５６，０６４号、同第７，８７５，６２１号、同第７，８２０，６６８号、同第７，７５０，００８号、同第７，７３２，４９１号、同第７，７２８，０２６号、同第７，６５２，０１４号、同第７，６０１，７１９号、同第７，４６２，７２４号、同第７，０８７，６３７号、同第７，０４１，６７５号、同第６，９７７，２９８号、同第６，９２４，２８４号、同第６，７３７，４２１号、同第６，６３５，６４２号、同第６，４９５，５４１号、同第６，４４４，６７６号、同第６，３９５，７４９号、同第６，３８０，２１１号、同第６，３８０，１９３号、同第６，３４６，５３６号、同第６，１９７，７８５号、同第５，７５６，５１０号、及びＲｅ．３６，３９７。
【００８３】
本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤はオラパリブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤は、ベリパリブ（ＡｂｂＶｉｅ社、イリノイ州シカゴ）である。本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤は、ルカパリブ（Ｃｌｏｖｉｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社、コロダド州ボールダー）である。本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤は、ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、マサチューセッツ州レキシントン）である。本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤は、ＭＫ−４８２７（ニラパリブ）である（Ｔｅｓａｒｏ、マサチューセッツ州ウォルサム、ＭｏｎｔｏｎｉらのＦｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（４），第１８条、ページ１〜７も参照されたい）。本発明の態様において、該ＰＡＲＰ阻害剤は、タラゾパリブ（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ社、カリフォルニア州サンフランシスコ）である。
【００８４】
「試料」は、細胞（例えば、腫瘍細胞）、細胞株、細胞溶解物、及び生理液、例えば、血液若しくはその亜集団（例えば、白血球、赤血球）、血漿、血清、唾液、接眼レンズ液、脳脊髄液、汗、尿、糞便、涙、気管支洗浄、拭き取り検体、ミルク、腹水、乳頭吸引、針吸引、滑液、腹膜液、洗浄液などを含む組織、抽出物、又は細胞培養物などの任意の生物学的供給源に由来する試料である。該試料は、動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトから得ることができる。試料は、単一の個体に由来するか、又は分析前にプールすることができる。該試料は、血液からの血漿の調製、及び粘性流体の希釈など使用前に処理することができる。試料を治療する方法は、濾過、蒸留、抽出、遠心分離、濃縮、干渉成分の不活性化、及び試薬の添加などを含むことができる。
【００８５】
本発明の方法の実施形態において、該試料は、哺乳動物組織試料である。別の実施形態において、該試料は細胞溶解物である。別の実施形態において、該試料は細胞である。別の実施形態において、該試料はヒトの生理学的流体である。特定の実施形態において、該試料はヒト血清である。さらなる実施形態において、該試料は、白血球又は赤血球である。
【００８６】
用語「対象」、「個体」又は「患者」は、互換的に哺乳動物などの温血動物を指す。特に、該用語はヒトを指す。対象、個体又は患者は、本明細書に記載の疾患に罹患しているか、又は本明細書に記載の疾患を有するか若しくは本明細書に記載の疾患になりやすいことが疑われ得る。該用語はまた、馬、牛、羊、鶏肉、魚、ブタ、ネコ、イヌ、及び動物園の動物のヤギ、類人猿（例えば、ゴリラ若しくはチンパンジー）、並びにラット及びマウスなどのげっ歯類を含む、食糧のために飼育された、ペットとして飼育された、又は研究用に飼育された動物を含む。
【００８７】
ＵＳＰ１１、ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＫＥＡＰ１、５３ＢＰ１、ＤＣＡＦ１０、ＲＢＸ１、ＣＵＬ３及びＣｔＩＰのＮＣＢＩアクセス番号は表１にあり、それらのヒト配列は配列表にある。
【００８８】
スクリーニング及びモニタリングアッセイ
本発明は、ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２の相互作用、ＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２の相互作用、ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の相互作用、及び／又はＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２の相互作用をアッセイすることにより、ＵＳＰ１１の活性又は発現をモニタリングする方法を提供する。当業者に知られている日常的な方法を用いて、試料中のタンパク質相互作用をアッセイすることができる。例えば、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０、又はＵＳＰ１１−ＰＡＬＢ２の複合体は、例えば、免疫学ベースの精製（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）などの親和性技術を用いて単離することができ、ペプチドは、従来の方法（例えば、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、又は逆相高速液体クロマトグラフィー）を用いて単離した複合体から調製してもよく、ペプチド又はペプチド断片を質量分析（例えば、選択反応モニタリング質量分析（ｓＭＲＭ）、高分解能データ非依存分析（ＳＷＡＴＨ）、高分解能多重反応モニタリング（ＭＲＭＨＲ）又はＭＳ１ベースの定量化などの定量的質量分析に供してもよい。
【００８９】
本発明はまた、ＰＡＬＢ２のＮ末端のユビキチン化をアッセイすることによりＵＳＰ１１の活性をモニタリングする方法を提供する。当業者に知られている日常的な方法を用いて、試料中のユビキチン化をアッセイすることができる。例えば、ユビキチン化又はＰＡＬＢ２は、ＰＡＬＢ２の変化（例えば、重量、米国特許第６，４１３，７２５号を参照されたい）、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼに結合したポリユビキチンの量（例えば、ＥＰ  １２６８８４７を参照されたい）、及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１  Ｅ３リガーゼの活性（例えば、米国特許公開第２０１３／０１１６１５２を参照されたい）を測定することによってアッセイされ得る。選択反応モニタリング質量分析（ｓＭＲＭ）、高分解能データ非依存分析（ＳＷＡＴＨ）、高分解能多重反応モニタリング（ＭＲＭＨＲ）又はＭＳ１ベースの定量化などの質量分析技術を用いて、ＰＡＬＢ２  Ｎ末端からのペプチド上のユビキチン残骸をモニタリングし、その後、プロテアーゼ消化することもできる。より具体的な例において、ユビキチン化ＰＡＬＢ２のトリプシン消化に相当する同位体標識合成ペプチドの調製、特に、Ｌｙｓ１４、Ｌｙ１６、Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ２５、Ｌｙｓ３０、Ｌｙｓ４３又はＬｙｓ４５上でのユビキチン化に相当するものは、ＰＡＬＢ２ユビキチン化の程度を定量化するための内部標準として使用することができる。
【００９０】
一態様において、本発明は、試料中のＰＡＬＢ２ポリペプチドのユビキチン化をアッセイする方法であって、試料中のユビキチン化ＰＡＬＢ２ポリペプチドをプロテアーゼで消化し、それによって複数の試験ペプチドを生成すること；ユビキチンと試験ペプチドのリジン残基の間の少なくとも１つのイソペプチド結合の存在を質量分析によって決定し、ユビキチン化部位の数を決定し、それによって試料中のＰＡＬＢ２ポリペプチドのユビキチン化の量を決定すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、該試験ペプチドは、ＰＡＬＢ２  Ｎ末端からのものである。一実施形態において、リジン残基は、Ｌｙｓ１４、Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ２５、Ｌｙｓ３０、Ｌｙｓ４３又はＬｙｓ４５に相当する。該方法は、定量アッセイの対照を提供するためにＰＡＬＢ２の異なるペプチドサブ配列に対応するペプチド内部標準を利用してもよい。一態様において、ＰＡＬＢ２に対応する異なる合成ペプチド内部標準を生成し、別々に標識する。
【００９１】
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）も用いて、ＤＮＡベースの検出を使用して、ＢＲＣＡ２などのＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２との間の相互作用及び／又はＰＡＬＢ２相互作用タンパク質をアッセイすることによりＵＳＰ１１の活性をアッセイしてもよい。例えば、相互作用の結合パートナー（例えば、ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１）に対する一次抗体を細胞溶解物に添加する。ＰＬＡプローブ又は近接プローブと呼ばれる抗体の第２のセットは、一次抗体の第１のセットを認識する。ＰＬＡプローブは、近接したときに、アッセイ特異的ＤＮＡ分子を構築するＤＮＡ鎖を含有する。次いで、このＤＮＡ分子を、増幅し、例えば、蛍光プローブを用いて検出することができる（例えば、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  Ｏ．らのＮａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２００６  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３（１２）：９９５−１０００；Ｊａｒｖｉｕｓ  Ｍ．らのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００７  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；６（９）：１５００−９）を参照されたい）。
【００９２】
一態様において、本発明は、試料中のＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２相互作用をアッセイする方法であって、相互作用の各結合パートナーに対する一次抗体と該試料とを接触させること；それぞれが近接プローブと結合したオリゴヌクレオチドを有する、対応する一次抗体に結合する二次抗体を含む近接プローブと該試料とを接触させることを含み、近接プローブのオリゴヌクレオチドが互いに十分近接している場合に、該近接プローブのオリゴヌクレオチドは相互作用して、増幅産物を生成するローリングサークル複製により増幅された環状生成物を形成し、増幅産物を測定し、それによって該相互作用をアッセイ又は測定する方法を提供する。
【００９３】
ＢＲＣＡ１とのＰＡＬＢ２（又はＢＲＣＡ２などの関連タンパク質）インサイチュ共局在をモニタリングするアッセイはまた、ＵＳＰ１１活性をモニタリングする方法を提供することができる（本明細書の実施例を参照されたい）。例えば、（ＢＲＣＡ１又はγ−Η２ΑΧなどの他のマーカーによりマークされた）ＤＮＡ損傷部位におけるＰＡＬＢ２局在は、ＵＳＰ１１活性に依存する。そのようなアッセイにおいて、細胞を固定し、透過処理し、次いで、ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ２又はそれらの関連タンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１）を検出する抗体とインキュベートする。標識二次抗体を添加すると、フォーカスと呼ばれる核内構造体におけるＤＮＡ損傷部位でのタンパク質蓄積のインサイチュ可視化を可能にする。（電離放射線又は他の染色体異常の治療など）遺伝毒性傷害が加わると、「フォーカス」の数が増加し、アッセイのダイナミックレンジを増大させることを含めることができる。
【００９４】
近接ライゲーションアッセイ及びインサイチュ共局在アッセイを用いて、本明細書に開示した相互作用のいずれかをアッセイすることができることが理解されるであろう。
【００９５】
本発明の方法は、試験化合物又は薬剤の存在下又は非存在下で実行することができ、試験化合物又は薬剤の非存在下での対照と比較したＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体、及びＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上の活性又は発現の増加若しくは減少が検出されることは、該試験化合物又は薬剤が治療薬として、又は相同組換えを調節するのに有用であり得ることを示す。
【００９６】
一態様において、本発明は、本発明の方法を用いて、ＵＳＰ１１活性に対する薬剤の効果を決定することによって、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる能力について薬剤を特定又は評価する方法を提供する。一態様において、ＵＳＰ１１に対する負の効果は、該薬剤がＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞の感作物質であるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせることができることを示す。一態様において、ＵＳＰ１１に対する正の効果は、該薬剤がＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞の不十分な感作物質であることを示す。一態様において、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる薬剤の能力は、ＵＳＰ１１活性のレベルの、対照から得られるそのようなレベルと比較した時の減少によって決定される。一態様において、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる薬剤の能力は、ＵＳＰ１１活性のレベルの、対照から得られるそのようなレベルと比較した時の増加によって決定される。
【００９７】
本発明はまた、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、又はＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２に対する薬剤の効果を決定することによって、ＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる能力について薬剤を特定又は評価する方法に関する。一態様において、ＫＥＡＰ１（ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１活性の損失）に対する負の効果は、該薬剤がＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞の不十分な感作物質であることを示す。一態様において、ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１活性に対する正の効果は、該薬剤がＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞の感作物質であるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせることができることを示す。一態様において、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる薬剤の能力は、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の活性又は発現のレベルの、対照から得られたそのようなレベルと比較した時の増加によって決定される。一態様において、ＰＡＲＰ阻害剤に対して感作させるか、又はＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか若しくは遅らせる薬剤の能力は、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の活性又は発現のレベルの、対照から得られたそのようなレベルと比較した時の減少によって決定される。
【００９８】
さらに、本発明は、抗癌剤を検出する方法であって、試験化合物と不死化細胞とを接触させること、本発明の方法を用いて、ＵＳＰ１１活性又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を測定すること、及び試験化合物の非存在下での対照試験アッセイと比較すること、を含む試験アッセイを行うこと、を含む方法を企図する。一態様において、ＵＳＰ１１の活性は、細胞内のＵＳＰ１１、ＰＡＬＢ２、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体を測定することによりアッセイされる。一態様において、対照と比較して、ＵＳＰ１１の活性又は発現に対する該薬剤の負の効果が検出されることは、潜在的な抗癌剤又はＰＡＲＰ阻害剤の感作物質を示す。一態様において、対照と比較して、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体及び／若しくはＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体の活性又は発現に対する該薬剤の負の効果が検出されることは、潜在的な抗癌剤又はＰＡＲＰ阻害剤の感作物質を示す。一態様において、対照と比較して、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体の活性又は発現に対する該薬剤の正の効果が検出されることは、潜在的な抗癌剤又はＰＡＲＰ阻害剤の感作物質を示す。一態様において、ＵＳＰ１１活性のレベルの対照から得られるそのようなレベルと比較した時の減少は、薬剤が抗癌活性を有するか、又はＰＡＲＰ阻害剤の感作物質であることを示す。
【００９９】
本発明は、相同組換えを調節する能力について薬剤を特定又は評価する方法であって、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上に対する試験化合物又は薬剤の効果を決定することを含む方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞内で相同組換えを調節する能力について薬剤を特定又は評価する方法であって、（ｉ）該薬剤の存在下又は非存在下で、試料中の細胞内のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体をアッセイすること、並びに（ｉｉ）相同組換えを調節する薬剤の能力を示すものとして、対照と比較した試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１複合体及び／又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体の増加又は減少を検出すること、を含む方法を提供する。
【０１００】
本発明は、ＨＲの欠陥と関連する疾患（すなわち、ＨＲ疾患）の治療のための治療薬をスクリーニングする方法であって、ＵＳＰ１１、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＫＥＡＰ１、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び／若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体のうちの１以上を破壊又は調節する薬剤を特定することを含む方法を提供する。一態様において、対照と比較してＵＳＰ１１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体及び／若しくはＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体の活性又は発現に対する薬剤の正の効果が検出されることは、ＨＲ疾患の治療のための潜在的な治療剤を示す。一態様において、ＤＣＦＡ１０、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体の活性又は発現に対する薬剤の負の効果が検出されることは、ＨＲ疾患の治療のための潜在的な治療剤を示す。
【０１０１】
本発明の方法において使用される試験化合物は、単離された形態又は混合物中の任意の生成物であり得る。該試験化合物は、構造又は機能によって定義され得るか又は未定義であり得る。未定義の試験化合物の例としては、限定されないが、組織試料、生体液、細胞上清、植物調製物などが挙げられる。試験化合物は、Ｉｇテイル融合ペプチドを含む可溶性ペプチドなどのペプチド、Ｄ−及び／又はＬ−配置アミノ酸で作られたランダムペプチドライブラリー並びにコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、炭水化物、核酸、アンチセンス分子、ホスホペプチド（ランダム又は部分的縮重指向のホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む）、抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、単鎖抗体、断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、及びＦａｂ発現ライブラリー断片、並びにそのエピトープ結合断片））、有機若しくは無機の小分子、又は化合物のライブラリーであり得る。試験化合物は、内因性の生理学的化合物又は天然若しくは合成化合物であり得る。
【０１０２】
実施形態において、薬剤、特に、抗癌剤を特定するための本発明の方法は、並行して、１種以上の試験化合物を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、並行して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１０００、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも１０００種の試験化合物を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、化合物及び完全なコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングをアッセイする。ハイスループットスクリーニングを行うための方法は、当技術分野で周知である。本方法はまた、ロボットが実験を行うことができるように自動化することができる。
【０１０３】
実施形態において、薬剤、特に、抗癌剤を特定するための本発明の方法は、試験化合物の存在下で細胞を接触させる工程を含む。次いで、これらの細胞を観察して、試験化合物（複数可）がＵＳＰ１１活性、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２のユビキチン化、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ−ＫＥＡＰ１活性、ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２の相互作用、ＵＳＰ１１とＰＡＬＢ２の相互作用、ＵＳＰ１１とＤＣＡＦ１０の相互作用、及び／又はＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２の相互作用に影響を与えるかどうかを決定することできる。陽性対照及び陰性対照は、それぞれ、既知の量の試験化合物をアッセイに添加するか、又は化合物を添加しないで行われ得る。当業者は、適切な対照を選択し、実行することができる。
【０１０４】
試験化合物（複数可）の活性は未知である可能性があり、本発明の方法を用いて、選択した性質を示す化合物（例えば、ＰＡＲＰ阻害剤の感作物質）を特定してもよい。いくつかの実施形態において、試験化合物（複数可）の活性又は活性の種類は周知であるか又は予想され、本発明の方法を用いて、さらに、活性（例えば、特異性、有効性など）を特徴づけるか、又は最適化することができる。
【０１０５】
本発明の方法はまた、該試験化合物の存在下でＰＡＲＰ活性をアッセイすることを含み得る。ＰＡＲＰ活性は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマー（ＰＡＲ）の変化を測定し、当業者にとって日常的な方法を用いてＮＡＤレベル及び／又はＡＴＰレベルを測定することによってアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、ＮＡＤレベルは、該試験化合物の存在下で低下する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰレベルは、該試験化合物の存在下で低下する。いくつかの実施形態において、ＮＡＤレベルは、該試験化合物の存在下で増加する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰレベルは、該試験化合物の存在下で増加する。
【０１０６】
本発明の方法は、試験化合物の投与後に細胞が壊死したかどうかを決定する工程を含み得る。細胞が壊死したかどうかを決定するために、当業者に公知の日常的な方法を用いて、細胞の物理的特徴を分析することができる。例えば、壊死は、凝縮することなく、オルガネラ腫脹、原形質膜の崩壊、細胞内空胞形成、及び核分解を測定することによって決定され得る。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法は、さらに、動物内での有効性及び毒性について、特定された薬剤又はそのさらなるアナログの治療的プロファイリングを行うこと、必要に応じて、許容される治療プロファイルを有すると特定された１以上の薬剤を含む医薬組成物を製剤化すること、及び必要に応じて、対象又は個体に該薬剤を投与すること、を含み得る。
【０１０８】
一態様において、本発明の方法を用いて特定した薬剤及び組成物の治療活性は、適切な動物モデルを用いてインビボで評価され得る。このように、本発明のスクリーニング方法は、さらに、適切な動物モデルに該薬剤を投与することを含むインビボ研究を行うことを含み得る。
【０１０９】
本発明はまた、対象におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上をアッセイすることを含む方法を提供する。対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上の著しく異なるレベルは、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性（例えば、感受性）を示す。
【０１１０】
一態様において、本発明は、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２及びＫＥＡＰ１を検出することを含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較してＵＳＰ１１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２及びＫＥＡＰ１の著しく異なるレベルは、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性（例えば、感受性）を示す。
【０１１１】
一態様において、本発明は、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ、ＫＥＡＰ１及びＣＲＬ３を検出することを含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ、ＫＥＡＰ１及びＣＲＬ３の著しく異なるレベルは、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性（例えば、感受性）を示す。
【０１１２】
一態様において、対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上に減少がある場合、対象はＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性があるとして分類される。一態様において、対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上に増加がある場合、対象はＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性があるとして分類される。一実施形態において、対照と比較して、ＵＳＰ１１活性の著しく異なるレベル（例えば、より低いレベル）は、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１１３】
一態様において、本発明は、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３及びＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上を検出すること、並びに該対象が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性（例えば、感受性）があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２及びＫＥＡＰ１活性若しくは発現を検出すること、並びに該対象が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性（例えば、感受性）があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。
【０１１５】
一態様において、本発明は、対象においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１及びＣＲＬ３活性を検出すること、並びに該対象が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性（例えば、感受性）があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、本発明の方法を用いて、該個体からの試料中のＵＳＰ１１活性又は発現をアッセイすることを含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較して、ＵＳＰ１１活性又は発現の著しく異なるレベル（例えば、より低いレベル）は、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１１７】
一態様において、本発明は、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該個体からの試料中のＫＥＡＰ１を検出すること、及び該個体が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較して、ＫＥＡＰ１の著しく異なるレベル（例えば、より高いレベル）は、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１１８】
本発明はまた、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該個体からの試料中のＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１活性を検出すること、及び該個体がＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較して、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の著しく異なるレベル（例えば、より高いレベル）は、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１１９】
本発明はまた、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該個体からの試料中のＰＡＬＢ２ユビキチン化を検出すること、及び該個体がＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、対照と比較して、ＰＡＬＢ２ユビキチン化の著しく異なるレベルは、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１２０】
本発明はまた、個体においてＰＡＲＰ阻害剤に対する応答を予測するか、又は応答を分類する方法であって、該対象からの試料中のＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２の複合体を検出すること、及び該個体がＰＡＲＰ阻害剤に対して応答性（例えば、感受性）があるかどうかを決定するために対照と比較すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ２の複合体の著しく異なるレベル（例えば、存在しないか、又は低いレベル）は、該ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性を示す。
【０１２１】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、本発明の方法を用いて、該個体からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＰＡＬＢ２、ＰＡＬＢ２ユビキチン化、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体、ＰＡＬＢ２−ＵＳＰ１１複合体、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０複合体、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１−ＰＡＬＢ２複合体をアッセイすることを含む方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、本発明の方法を用いて、該個体からの試料中のＵＳＰ１１活性をアッセイすることを含む方法を提供する。
【０１２３】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、該個体からの試料中のＣＲＬ３−ＫＥＡＰ活性をアッセイすることを含む方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、該個体からの試料中のＵＳＰ１１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２及びＫＥＡＰ１を検出又は定量化することを含む方法を提供する。
【０１２５】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、該個体からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２及びＫＥＡＰ１を検出又は定量化することを含む方法を提供する。
【０１２６】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、該個体からの試料中のＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体を検出又は定量化することを含む方法を提供する。
【０１２７】
本発明は、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験において複数のカテゴリーの１つに個体を割り当てる方法であって、該個体からの試料中のＰＡＬＢ２ユビキチン化を検出又は定量化することを含む方法を提供する。
【０１２８】
一態様において、対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上の減少に基づいて、個体をＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験のためのカテゴリーに割り当てる。一態様において、対照と比較して、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２活性若しくは発現又はＰＡＬＢ２ユビキチン化のうちの１以上の増加に基づいて、個体をＰＡＲＰ阻害剤についての臨床試験のためのカテゴリーに割り当てる。
【０１２９】
当業者に知られている日常的な様々な方法を、試料中のバイオマーカーのＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１、ＣＲＬ３及び／若しくはそれらの複合体を検出又はアッセイするために使用することができる。試料中に存在するバイオマーカーレベルは、免疫アッセイ、分光法、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、顕微鏡、ノーザンブロット、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＤＮＡマイクロアレイ、及び抗体マイクロアレイ、若しくはそれらの組み合わせを含む又はそれらからなる群のいずれかの使用を含み得る任意の適切なアッセイによって決定され得る。
【０１３０】
本発明はまた、該対象から得られた試料中のＵＳＰ１１活性のレベル、複合体又はバイオマーカーのレベルを測定するためのアッセイ；結果を処理するためのプロセッサ；データベースと結果を比較するためのコンピュータコード化された説明書；及び比較の結果を提供するためのユーザディスプレイを含むシステムを提供する。該データベースは、ＵＳＰ１１活性又はバイオマーカーレベルの基準値を含み得る。
【０１３１】
治療方法
ＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性を予測する又は特徴付けるための本発明の方法は、さらに、個体又は対象に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与することを含み得る。一態様において、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤で対象を治療する方法であって、
ａ）本発明の方法を用いて１以上のＰＡＲＰ阻害剤に対する応答性又は感受性について該対象からの試料をアッセイすること；
ｂ）該対象が効果的に応答するか、又は感受性を示すＰＡＲＰ阻害剤を特定すること；
ｃ）該対象に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与すること
を含む方法に関する。
【０１３２】
一態様において、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤での治療を必要とする患者を治療する方法であって、（ａ）対象からの試料中のＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＫＥＡＰ１及び／又はＣＲＬ３を検出することによって、該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性を示すかどうかを決定するために分析の結果を提供する試験を要求し、該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性を示すかどうかを決定するために対照と比較すること；並びに（ｂ）該患者が該ＰＡＲＰ阻害剤に対して感受性を示す場合に、該患者に該ＰＡＲＰ阻害剤を投与すること、を含む方法を提供する。本発明のこの方法の態様において、該患者は乳癌を有している。本発明のこの方法の態様において、該患者は卵巣癌を有している。本発明の一態様において、該試験は、本明細書に開示した方法を用いて、ＵＳＰ１１の発現又は活性を検出する。
【０１３３】
本発明は、さらに、対象において癌を治療する方法であって、（ｉ）本発明の方法を用いてＰＡＲＰ阻害剤に対して応答する対象を選択すること、及び（ｉｉ）癌を治療するのに有効な量で該ＰＡＲＰ阻害剤を前記対象に投与すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、該癌は乳癌である。一実施形態において、該癌は卵巣癌である。
【０１３４】
本発明の方法を用いて特定した薬剤は、例えば、癌、虚血再灌流傷害、炎症性疾患、変性疾患、細胞傷害性化合物の有害作用からの保護、及び細胞傷害性癌治療の増強と関連する多数の治療用途を有する。本発明の方法を用いて特定した薬剤を用いて、癌細胞のアポトーシスを増加させ、腫瘍の増殖を制限し、転移を減少させ、かつ腫瘍を有する対象の生存を延長することにより、放射線及び化学療法が高められ得る。本発明の態様において、該薬剤を用いて、白血病、結腸癌、膠芽腫、リンパ腫、黒色腫、乳癌、卵巣癌及び子宮頸癌を治療することができる。
【０１３５】
本発明の他の態様において、該薬剤を用いて、限定されないが、レトロウイルス感染、関節炎、痛風、炎症性腸疾患、ＣＮＳ炎症、多発性硬化症、アレルギー脳炎、敗血症、敗血症性ショック、出血性ショック、肺線維症、ブドウ膜炎、糖尿病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、他の神経外傷、臓器移植、目の再灌流、腎臓の再灌流、腸の再灌流、骨格筋の再潅流、アセトアミノフェンの過量投与後の肝臓毒性、ドキソルビシン及び白金系抗悪性腫瘍薬からの心臓及び腎臓毒性、並びに硫黄マスタードに続発する皮膚損傷を治療することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤での治療に対する個体を感作させる方法であって、本発明の方法に従ってＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させる薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【０１３７】
いくつかの態様において、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤で治療される個体を治療する方法であって、本発明の方法を用いて特定したＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞を感作させる薬剤を該個体に投与することを含む方法を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか、又は出現を遅らせる方法であって、本発明の方法に従ってＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の出現をさせないか、又は出現を遅らせる薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【０１３９】
いくつかの態様において、本発明は、個体における癌を治療する方法であって、本発明の方法に従って抗癌剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【０１４０】
別の態様において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物における白血病、結腸癌、膠芽細胞腫、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、卵巣癌又は子宮頸癌を治療する方法であって、本発明の方法を用いて特定した治療上許容される量の薬剤又は治療上許容されるその塩を該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【０１４１】
別の態様において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物における細胞傷害性癌治療を高める方法であって、本発明の方法を用いて特定した、細胞傷害性癌治療を高める治療上許容される量の薬剤又はその治療上許容される塩を該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【０１４２】
一態様において、本発明は、個体におけるＨＲの欠陥と関連する疾患（すなわち、ＨＲ疾患）を治療する方法であって、本発明の方法に従ってＨＲを調節する薬剤を特定すること、及び該個体に該薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物におけるＨＲ疾患を治療するための医薬を調製するために、本発明の方法を用いて特定した薬剤の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物において腫瘍増殖を阻害するための医薬を調製するために、本発明の方法を用いて特定した薬剤の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物における癌を治療するための医薬を調製するために、本発明の方法を用いて特定した薬剤の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物における白血病、結腸癌、膠芽細胞腫、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、卵巣癌又は子宮頸癌を治療するための医薬を調製するために、本発明の方法を用いて特定した薬剤の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物における細胞傷害性癌治療の増強のための薬剤を調製するための、本発明の方法を用いて特定した薬剤の使用であって、該哺乳動物へ治療上許容される量の該薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【０１４４】
一実施形態において、本発明は、治療上許容される担体と組み合わせた、本発明の方法を用いて特定した薬剤、又はその治療上許容される塩を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、活性物質の有効量を、薬学的に許容されるビヒクルとの混合物に組み合わされるように、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物の調製のためのそれ自体公知の方法により調製することができる。適切な担体は、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ペンシルベニア州イーストン、１９８５）に記載されている。これに基づき、該組成物は、排他的ではないが、１種以上の薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤と関連し、適切なｐＨを有し、生理学的流体と等張である緩衝溶液中に含有される活性剤の溶液を含む。
【０１４５】
該医薬組成物は、単独で又は他の治療剤若しくは他の治療形態と組み合わせた治療薬として示されている。本発明の組成物は、他の治療剤若しくは治療薬、例えば、ＰＡＲＰ阻害剤と同時に、別々に、又は順次投与され得る。
【０１４６】
相同組換え法
本発明は、細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、
（ａ）該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激すること；
（ｂ）ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）部位へＢＲＣＡ１動員を促進若しくは刺激すること；
（ｃ）ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と該細胞とを接触させること；
（ｄ）ＫＥＡＰ１若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害すること；
（ｅ）ＵＳＰ１１の分解を阻害するか、若しくはＵＳＰ１１活性を促進すること；及び／又は、
（ｆ）ＤＣＡＦ１０を阻害すること
を含む方法を提供する。
【０１４７】
一態様において、該細胞は、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）にある。一態様において、該細胞は、非分裂細胞又はＧ１の休眠細胞である。一態様において、該細胞は、細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある。一態様において、本発明の方法は、細胞内で相同組換えを活性化又は調節するためにインビトロで使用される。
【０１４８】
一態様において、本発明は、細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、（ａ）該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激すること、並びに／又は（ｂ）ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と該細胞とを接触させること、を含む方法を提供する。
【０１４９】
一実施形態において、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリは、本発明の方法を用いて特定したＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体を促進又は刺激する薬剤を投与することによって促進又は刺激される。
【０１５０】
一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０にある細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害する工程を含む方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０にある細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、ＵＳＰ１１の分解を阻止するか、又はＵＳＰ１１活性を促進する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ＵＳＰ１１又はそのアゴニストを投与することを含む。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０にある細胞内で相同組換えを活性化する方法であって、ＫＥＡＰ１を阻害し、ＵＳＰ１１の分解を阻止する工程を含む方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０にある細胞内で相同組換えを活性化する方法であって、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害し、ＵＳＰ１１の分解を阻止する工程を含む方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞、特に、Ｇ１又はＧ０にある細胞内で相同組換えを活性化する方法であって、ＣＲＬ３を阻害し、ＵＳＰ１１の分解を阻止する工程を含む方法を提供する。
【０１５１】
本発明の方法は、ＤＮＡ末端切除が１本鎖ＤＮＡ生成を活性化する又は活性化した細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内で行われ得る。
【０１５２】
本発明は、ＤＮＡ末端切除が１本鎖ＤＮＡ生成を活性化する又は活性化した細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）若しくは細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内で相同組換えを活性化又は調節する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。一実施形態において、該複合体のアセンブリは、本発明の方法を用いて特定したＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激する薬剤を投与することによって促進又は刺激される。
【０１５３】
本発明はまた、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。
【０１５４】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が１本鎖ＤＮＡ生成を活性化する又は活性化した細胞、特に、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激することを含む方法を提供する。一実施形態において、該複合体のアセンブリは、本発明の方法を用いて特定したＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリ若しくはそれらの発生を促進又は刺激する薬剤を投与することによって促進又は刺激される。
【０１５５】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が１本鎖ＤＮＡ生成を活性化する又は活性化した、細胞周期のＧ１期（Ｇ１）又は細胞周期のＧ０期（Ｇ０）にある細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体と該細胞とを接触させることを含む方法を提供する。
【０１５６】
本発明はまた、ＤＮＡ末端切除が１本鎖ＤＮＡ生成を活性化する又は活性化した、Ｇ１又はＧ０にある細胞内でＤＮＡ２本鎖切断を修復する方法であって、（ａ）ＫＥＡＰ１及び／若しくはＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害すること；（ｂ）ＵＳＰ１１の分解を阻止するか、又はＵＳＰ１１活性を促進若しくは刺激すること；（ｃ）ＵＳＰ１１若しくはそのアゴニストを投与すること；並びに／又は（ｄ）ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１を阻害し、ＵＳＰ１１の分解を阻止すること、を含む方法を提供する。
【０１５７】
細胞内で相同組換えを活性化する方法は、さらに、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）生成経路を活性化又は促進することを含み得る。一態様において、ｓｓＤＮＡ生成経路は、ＤＮＡ末端切除により活性化される。一実施形態において、細胞内で相同組換えを活性化する方法は、さらに、ＤＮＡ末端切除を活性化することを含む。
【０１５８】
一実施形態において、ＤＮＡ末端切除は、５３ＢＰ１（又はＲＩＦ１）発現若しくは活性（例えば、ＤＳＢ部位への５３ＢＰ１の動員）を阻害し、かつ／又はＣｔＩＰを上方制御若しくは発現させることによって活性化又は促進される。一実施形態において、ＤＮＡ末端切除は、５３ＢＰ１（又はＲＩＦ１）発現若しくは活性（例えば、ＤＳＢ部位への５３ＢＰ１の動員）を阻害し、ＣｔＩＰを上方制御若しくは発現させることによって活性化又は促進される。一実施形態において、本方法は、限定されないが、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はヒストン脱アセチル化（ＨＤＡＣ）酵素ファミリー（例えば、トリコスタチンＡ）の阻害剤を含むアンタゴニストを用いて、かつ構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログ、例えば、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを用いて５３ＢＰ１を阻害することを含む。
【０１５９】
細胞内で相同組換えを活性化する方法は、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）部位へのＢＲＣＡ１動員を活性化することを含み得る。一実施形態において、ＢＲＣＡ１動員は、５３ＢＰ１（ＴＰ５３ＢＰ１）又はＲＩＦ１の発現を阻害すること、又はＤＳＢ部位への５３ＢＰ１若しくはＲＩＦ１の動員を阻害することによって活性化される。５３ＢＰ１又はＲＩＦ１は、限定されないが、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むアンタゴニストを用いて阻害され得る。一実施形態において、５３ＢＰ１は、ヒストン脱アセチル化（ＨＤＡＣ）酵素ファミリー、特に、ヒストン脱アセチル化阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、好ましくは、トリコスタチンで阻害される（Ｆｕｋｕｄａ  Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２０１５  Ａｕｇ；１０６（８）：１０５０−６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃａｓ．１２７１７．電子出版２０１５  Ｊｕｌ  １４）。
【０１６０】
一態様において、細胞内で相同組換えを活性化又は刺激する方法は、さらに、遺伝子編集システムを含む。一態様において、該遺伝子編集システムは、ヌクレアーゼと該細胞とを接触させることを含む。ヌクレアーゼの例としては、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、遺伝子工学処理したメガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、メガ又はホーミングエンドヌクレアーゼ、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼ、並びにメガ−ＴＡＬ及びコンパクトＴＡＬＥＮＳなどのヌクレアーゼ間の融合が挙げられる。
【０１６１】
一態様において、該遺伝子編集工程は、ＴＡＬＥＮシステムを含む。
【０１６２】
一態様において、該遺伝子編集工程は、ＺＦＮシステムを含む。
【０１６３】
一態様において、該遺伝子編集工程は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む。
【０１６４】
本発明の態様において、該遺伝子編集システムは、ゲノム修飾を補正し得る。ゲノム修飾は、遺伝性障害と関連する遺伝子座を有するポリヌクレオチド配列中の少なくとも１つの変異を含み得る。一態様において、該ゲノム修飾は、挿入、欠損及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該遺伝性障害は、単一遺伝子障害である。いくつかの実施形態において、該遺伝性障害は、複数遺伝子障害である。いくつかの実施形態において、該障害は、１個以上のＳＮＰと関連している。本発明の特定の実施形態において、該ゲノム修飾は、点変異を補正する。
【０１６５】
ゲノム修飾を補正するための本発明の方法の態様において、該遺伝子編集システムは、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸と該細胞とを接触させることを含み、該リボ核酸は、遺伝性障害と関連した標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、該標的ポリヌクレオチド配列は切断される。
【０１６６】
一態様において、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列と関連した遺伝性障害を変更する方法であって、（１）該システムが、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２又は細胞周期の間にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の相互作用を維持する薬剤を含む、細胞内で相同組換えを活性化するシステムと該細胞とを接触させること；並びに（２）標的ポリヌクレオチド配列と、クリスパー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸は、該標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、該標的ポリヌクレオチド配列が切断される方法を提供する。本方法は、該標的ポリヌクレオチド配列の発現を低下させるか、該標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトするか、又は望ましくない配列から所望の配列に該標的ポリヌクレオチド配列を補正し得る。
【０１６７】
一態様において、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列と関連した遺伝性障害を変更する方法であって、（１）細胞内で相同組換えを活性化するシステムと該細胞とを接触させることを含み、その際、該システムは、本発明のキット、ベクター（複数可）又は組成物を含み、特に、該システムは、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログを含み、好ましくは、該システムは、ＫＥＡＰ１阻害剤と、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤と、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕとを含み；かつ（２）該標的ポリヌクレオチド配列と、クリスパー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸は、該標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、該標的ポリヌクレオチド配列が切断される方法を提供する。本方法は、該標的ポリヌクレオチド配列の発現を低下させるか、該標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトするか、又は望ましくない配列から所望の配列に該標的ポリヌクレオチド配列を補正し得る。
【０１６８】
本発明は、対象における遺伝性障害を治療又は予防する方法であって、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２又は細胞周期の間にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２若しくはＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の相互作用を維持する薬剤を含み、細胞内で相同組換えを活性化するシステムと該細胞とを接触させ、かつ該標的ポリヌクレオチド配列とクリスパー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸とを接触させることによって、細胞内で遺伝性障害と関連する標的ポリヌクレオチド配列を改変することを含み、該リボ核酸は、該標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、該標的ポリヌクレオチド配列が切断されることによって遺伝性障害を治療又は防止する方法を企図する。
【０１６９】
一態様において、対象における遺伝性障害を治療又は防止する方法であって、細胞内で相同組換えを活性化するシステムと該細胞とを接触させることによって、該細胞内で遺伝性障害と関連する標的ポリヌクレオチド配列を改変することを含み、該システムは、本発明のキット、ベクター（複数可）又は組成物を含み、特に、該システムは、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログを含み、好ましくは、該システムは、ＫＥＡＰ１阻害剤と、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤と、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕとを含み；かつ（ｂ）該標的ポリヌクレオチド配列とクリスパー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１〜２個のリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸は、該標的ポリヌクレオチド配列の選択されたモチーフへＣａｓタンパク質を方向づけ、ハイブリダイズさせ、該標的ポリヌクレオチド配列が切断されることによって遺伝性障害を治療又は防止する方法を提供する。
【０１７０】
遺伝性障害を治療又は予防する方法は、該対象に該細胞を導入することによって、該標的ポリヌクレオチド配列と関連した遺伝性障害を治療又は予防することを含み得る。本方法は、外因性の鋳型ポリヌクレオチドを挿入することにより切断される標的ポリヌクレオチド配列を修復することを含み得、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチド配列の１以上のヌクレオチドの挿入、欠損、又は置換を含む変異をもたらす。
【０１７１】
一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、肺の遺伝性障害と関連している。一実施形態において、該標的ポリヌクレオチド配列は、嚢胞性線維症と関連しており、特に、該ポリヌクレオチド配列は、嚢胞性線維症膜貫通導体受容体（ＣＦＴＲ）遺伝子座である。ＣＦＴＲの変異（例えば、エキソン１１における５０８位のフェニルアラニンの欠損）は、嚢胞性線維症を引き起こす。
【０１７２】
一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、筋肉の遺伝性障害と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、筋ジストロフィーと関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）（ジストロフィン遺伝子の変異）と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、ベッカー型筋ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子の変異）と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチドは、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭＰＫ遺伝子の変異）又は筋緊張性ジストロフィー２型（ＣＮＢＰ遺伝子の変異）と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、鎌状赤血球貧血（変異ＨＢＢヘモグロビン）と関連している。
【０１７３】
本発明の態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、肝臓の遺伝性障害と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（セルピナ１遺伝子の変異）と関連している。一態様において、該標的ポリヌクレオチド配列は、ウィルソン病（ＡＴＰ７ＢのＣｕトランスロカーゼをコードする遺伝子の変異）と関連している。
【０１７４】
一態様において、本発明の方法は、さらに、その天然の対応物と比較して特性が強化した機能性タンパク質、特に、例えば、遺伝性障害を治療するための対象に欠けている又は欠損した機能性タンパク質を提供することを含む。本発明の実施形態において、本方法は、遺伝子編集システム及びその天然の対応物と比較して特性が強化した非天然タンパク質をコードする１以上の導入遺伝子の連続投与によって、それを必要とする対象の細胞に機能性タンパク質をコードする配列を組み込むことを含む。他の実施形態において、本方法は、対象において異常発現した１以上のタンパク質の機能的バージョンを発現する遺伝子改変細胞を該対象に投与することを含む。したがって、単離された細胞は、該対象に導入され得る（エキソビボ細胞療法）か、該対象の一部である場合は、細胞が改変され得る（インビボ）。特定の実施形態において、導入遺伝子（複数可）は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター及び／又はそれらの組み合わせを用いて送達される。
【０１７５】
本発明はまた、細胞、特に、Ｇ１の細胞内で相同組換えを抑制する方法であって、該細胞内でＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリを抑制することを含む方法を提供する。一実施形態において、該相互作用は、ＫＥＡＰ１又はＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１又はそのアゴニストを投与することによって抑制される。一実施形態において、該相互作用は、ＵＳＰ１１アンタゴニスト／阻害剤（例えば、ミトキサントロン）を投与することによって抑制される。一実施形態において、該相互作用は、本発明の方法を用いて特定した、相同組換えを抑制する薬剤を投与することによって抑制される。
【０１７６】
本発明の方法の構成要素は、限定されないが、ウイルスベースのシステム又は非ウイルスベースのシステムを含む当技術分野で公知の送達システムによって送達され得る。従来のウイルスベースのシステムは、例えば、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含み得る。一態様において、該発現ベクターは、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。一実施形態において、該ウイルスベースのシステムは、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである。非ウイルスベースのシステムの例としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン及びＤＮＡの取り込みを増強させる薬剤が挙げられる。
【０１７７】
一態様において、本発明は、相同組換えの活性化因子又は調節因子、及び必要に応じてＤＮＡ末端切除の活性化因子又は調節因子を含むベクターを提供する。一態様において、本発明は、ベクター内にコードされる以下の構成要素の１以上を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を提供する：１）ＤＮＡ末端切除の活性化因子、例えば、５３ＢＰ１（若しくはＲＩＦ）の発現又は活性の阻害剤並びに／又は構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰ化合物；２）相同組換えを活性化する因子、例えば、細胞周期の間に、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の相互作用を維持する因子；並びに必要に応じて、３）遺伝子編集システムの構成要素、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼシステムの構成要素。一実施形態において、該遺伝子編集システムの構成要素は、１以上の別々の発現ベクターにコードされている。
【０１７８】
別の態様において、本発明は、相同組換えの活性化因子又は調節因子、及び必要に応じてＤＮＡ末端切除の活性化因子又は調節因子を含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、以下の構成要素の１以上を含む組成物を提供する：１）ＤＮＡ末端切除の活性化因子、例えば、５３ＢＰ１（若しくはＲＩＦ）の発現若しくは活性の阻害剤及び／又は構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰ化合物；２）相同組換えを活性化する因子、例えば、細胞周期の間に、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の相互作用を維持する因子；並びに必要に応じて、３）遺伝子編集システムの構成要素、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼシステムの構成要素。一実施形態において、該遺伝子編集システムの構成要素は、１以上の別々の組成物中にある。
【０１７９】
ＤＮＡ末端切除の活性化因子の例としては、限定されないが、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８４７Ｇｌｕ、ＴＰ５３ＢＰ１  ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡ、及びＫＥＡＰ１に対するｓｈＲＮＡのコード配列を含む。ＴＰ５３ＢＰ１に対するｓｈＲＮＡは、ＲＩＦ１に対するｓｈＲＮＡ又はドミナントネガティブ５３ＢＰ１タンパク質を含むＤＳＢ部位への５３ＢＰ１の動員を阻止する薬剤で置換され得る。ＫＥＡＰ１に対するｓｈＲＮＡは、Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ２５及びＬｙｓ３０残基の変異を含有するか、又はＫＥＡＰ１との相互作用を妨害する変異を含有するＰＡＬＢ２変異体のコード配列で置換され得る。
【０１８０】
細胞周期の間に、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の相互作用を維持する因子の例としては、限定されないが、ＫＥＡＰ１の阻害剤、ＤＣＡＦ１０の阻害剤、Ｇ０及びＧ１細胞内でＵＳＰ１１発現を維持するＲＮＡ干渉剤、Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ２５又はＬｙｓ３０残基のうちの１以上の変異を含むＫＥＡＰ１−ＣＵＬ３−ＲＢＸ１によるユビキチン化の影響を受けないＰＡＬＢ２の変異型が挙げられる。ＫＥＡＰ１阻害剤の例としては、Ｇｕｎｔａｓ，Ｇ．ら（４４）に開示されているＫＥＡＰ１−ＮＲＦ２相互作用の強力な競合阻害剤であるモノボディが挙げられる。ＫＥＡＰ１阻害剤はまた、例えば、Ｃａｎｎｉｎｇ  Ｐ．ら，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｉｎ  Ｂ．，２０１５（４）：２８５−９９及びＷｅｌｌｓ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２０１５，４３（４）：６７４−９に記載されている。
【０１８１】
一実施形態において、本発明のベクターは、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログをコードする配列を含む。特定の実施形態において、本発明のベクターは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、５３ＢＰ１及びＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕの阻害剤をコードする配列を含む。特定の実施形態において、本発明のベクターは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤、並びにＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕをコードする配列を含む。
【０１８２】
一実施形態において、本発明の組成物は、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、５３ＢＰ１の阻害剤及びＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤、並びにＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを含む。
【０１８３】
キット
本発明は、さらに、本明細書に開示されるアッセイ若しくは方法を実行するか、又は本明細書に開示される組成物若しくはベクターを含むキットを提供する。一実施形態において、本発明のキットは、試料中のＵＳＰ１１活性を測定するための少なくとも１種類の試薬を含む。別の実施形態において、本発明のキットは、試料中のＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２−ＫＥＡＰ１、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２、ＵＳＰ１１−ＤＣＡＦ１０、又はＵＳＰ１１−ＰＡＬＢ２複合体を測定するための少なくとも１種類の試薬を含む。別の実施形態において、本発明のキットは、試料中のＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２−ＫＥＡＰ１又はＵＳＰ１１−ＰＡＬＢ２複合体を測定するための少なくとも１種類の試薬を含む。別の実施形態において、本発明のキットは、試料中のＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＵＳＰ１１、ＤＣＡＦ１０及びＫＥＡＰ１のレベルを測定するための試薬を含む。別の実施形態において、本発明のキットは、試料中のＰＡＬＢ２のユビキチン化、特に、ＰＡＬＢ２のＮ末端のユビキチン化を測定するための少なくとも１種類の試薬を含む。いくつかの実施形態において、該試薬は、ＰＣＲ反応において使用するための抗体又は核酸又はプライマーである。
【０１８４】
キットはまた、インサートの形態で適切な操作パラメータのための説明書を含み得る。該説明書は、試料を収集する方法について消費者に通知し得る。該キットは、較正及び比較のための標準（複数可）として使用される試料を含み得る。該キットはまた、試料中の活性又は検出されるバイオマーカーのレベルを較正試料又はチャートと比較するための説明書を含み得る。該キットはまた、活性又はバイオマーカーのどのレベルが本明細書に開示される疾患の診断かを示す説明書を含み得る。
【０１８５】
一態様において、本発明は、相同組換えを活性化するための本発明の方法の構成要素及び必要に応じて、遺伝子編集システムの構成要素のうちの１以上を含むキットを提供する。本発明のキットはまた、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム又はジンクフィンガーヌクレアーゼシステムを含むか、又はＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム又はジンクフィンガーヌクレアーゼシステムと組み合わせて使用され得る。一実施形態において、本発明のキットは、ＣＲＩＳＰＲシステムを含むか、又はＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせて使用される。一実施形態において、本発明のキットは、ＴＡＬＥＮシステムを含むか、又はＴＡＬＥＮシステムと組み合わせて使用される。一実施形態において、本発明のキットは、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステムを含むか、又はジンクフィンガーヌクレアーゼシステムと組み合わせて使用される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ベクターシステム及び該キットを使用するための説明書を含む。一態様において、該キットは、本明細書で説明したＤＮＡ末端切除の活性化因子及び相同組換えの活性化因子を含むベクターを含む。一態様において、該キットは、以下の構成要素のうちの１以上を含む１種以上のベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む：１）ＤＮＡ末端切除の活性化因子、例えば、５３ＢＰ１（若しくはＲＩＦ）の発現若しくは活性の阻害剤及び／又は構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰ化合物；２）相同組換えを活性化する因子、例えば、細胞周期の間にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を維持する因子；並びに必要に応じて、３）遺伝子編集システムの構成要素、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼシステムの構成要素。細胞周期の間にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を維持する因子の例は、本明細書に記載しており、限定されないが、ＫＥＡＰ１の阻害剤、例えば、Ｇ０及びＧ１細胞内でＵＳＰ１１発現を維持するＲＮＡ干渉剤、又はＬｙｓ２０、Ｌｙｓ２５又はＬｙｓ３０残基のうちの１以上の変異を含むＫＥＡＰ１−ＣＵＬ３−ＲＢＸ１によるユビキチン化の影響を受けないＰＡＬＢ２の変異型が挙げられる。ＤＮＡ末端切除の活性化因子の例としては、限定されないが、ＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８４７Ｇｌｕ、ＴＰ５３ＢＰ１  ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡ、及びＫＥＡＰ１に対するｓｈＲＮＡのコード配列を含む。ＴＰ５３ＢＰ１に対するｓｈＲＮＡは、ＲＩＦ１に対するｓｈＲＮＡ又はドミナントネガティブ５３ＢＰ１タンパク質を含むＤＳＢ部位への５３ＢＰ１の動員を阻止する薬剤で置換され得る。ＫＥＡＰ１に対するｓｈＲＮＡは、Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ２５及びＬｙｓ３０残基の変異を含有するか、又はＫＥＡＰ１との相互作用を妨害する変異を含有するＰＡＬＢ２変異体のコード配列で置換され得る。
【０１８７】
一実施形態において、本発明のキットは、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログをコードする配列を含む１種以上のベクターを含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、５３ＢＰ１の阻害剤及びＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕをコードする配列を含む１種以上のベクターを含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤、並びにＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕをコードする配列を含む１種以上のベクターを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本発明の組成物及び該キットを使用するための説明書を含む。一態様において、該キットは、本明細書で説明したＤＮＡ末端切除の活性化因子又は調節因子及び相同組換えの活性化因子又は調節因子を含む組成物を含む。一態様において、該キットは、以下の構成要素のうちの１以上を含む組成物を含む：１）ＤＮＡ末端切除の活性化因子、例えば、５３ＢＰ１（若しくはＲＩＦ）の発現若しくは活性の阻害剤及び／又は構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰ化合物；２）相同組換えを活性化する因子、例えば、細胞周期の間にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２又はＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２相互作用を維持する因子；並びに必要に応じて、３）遺伝子編集システムの構成要素、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼシステムの構成要素。一実施形態において、該遺伝子編集システムの構成要素は、別々のキット（複数可）である。
【０１８９】
一実施形態において、本発明のキットは、５３ＢＰ１の阻害剤、ＫＥＡＰ１阻害剤又はＤＣＡＦ１０阻害剤を含む組成物、及び構成的リン酸化を模倣するＣｔＩＰのアナログを含む組成物を含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、５３ＢＰ１の阻害剤及びＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを含む組成物を含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、ＫＥＡＰ１阻害剤（例えば、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤；実施例３を参照されたい）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される５３ＢＰ１の阻害剤、並びにＣｔＩＰ−Ｔｈｒ８７９Ｇｌｕを含む組成物を含む。
【０１９０】
いくつかの態様において、本発明のキットは、遺伝子編集キット、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム又はジンクフィンガーヌクレアーゼシステム用のキットと組み合わせて使用される。遺伝子編集キットは、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、及びＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＤ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。
【０１９１】
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。
【０１９２】
実施例１
以下の材料及び方法を、実施例に記載した研究に使用した。
【０１９３】
プラスミド
ＰＡＬＢ２のｃＤＮＡを、哺乳動物遺伝子コレクション（ＭＧＣ）から入手した。全長ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ１を、ＰＣＲにより増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＤＥＳＴ−ＧＦＰ、ｐＤＥＳＴ−Ｆｌａｇ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＲベクターに挿入した。同様に、ＢＲＣＡ１のコイルドコイルドメイン（残基１３６３〜１４３７）を、ＰＣＲにより増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１ベクターにサブクローニングし、ｍＣｈｅｒｒｙＬａｃＲ及びｐＤＥＳＴ−ＧＦＰベクターに挿入した。ＰＡＬＢ２のＮ末端ドメインを、ＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位を用いて、ＧＳＴ発現ベクターｐＥＴ３０−２−Ｈｉｓ−ＧＳＴ−ＴＥＶ（３１）に導入した。ＢＲＣＡ１のコイルドコイルドメインを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位を用いてｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングした。ＰＡＬＢ２の切断型は、部位特異的変異誘発を介して停止コドン又は欠損を導入することによって得た。全長ＣｔＩＰをＰＣＲにより増幅し、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングし、レンチウイルスコンストラクトｐＣＷ５７．１（Ｄａｖｉｄ  Ｒｏｏｔ博士より供与；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４１３９３）に挿入した。ＵＳＰ１１  ｃＤＮＡはＤａｖｉｄ  Ｃｏｒｔｅｚより供与され、ＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位を用いてｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１ベクターにクローニングした。ブタのＵＳＰ１１（ＵＳＰ１１）の細菌コドン最適化コード配列をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、６×Ｈｉｓ−ＧＳＴベクターｐＥＴＭ−３０−Ｈｔｂにサブクローニングした。ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ１及びＵＳＰ１１のコンストラクトのｓｉＲＮＡ耐性バージョンを、以前に記載した（１４）ように作製した。全長ＣＵＬ３及びＲＢＸ１を、以前に記載した（３２）ようにヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅し、それぞれＮｈｅＩ／ＸｍａＩ及びＢｓｓＨＩＩ／ＮｏｔＩを用いて二重発現ｐＦＢＤＭベクターにクローニングした。ＮＥＤＤ８  ｃＤＮＡはＤｍｉｔｒｉｓ  Ｘｉｒｏｄｉｍａｓより供与され、ｐＥＴ１７ｂベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中のＣ末端にある二重ＳｔｒｅｐＩＩタグに融合した。ヒトＤＥＮ１を、Ａｕｄｅ  Ｅｃｈａｌｉｅｒによって供給されたベクターから増幅し、ＰＣＲによって切断できないＮ末端ＳｔｒｅｐＩＩ２×タグに融合し、ｐＥＴ１７ｂベクターに挿入した。ｐＣＯＯＬ−ｍＫＥＡＰ１プラスミドは、Ｆｅｎｇ  Ｓｈａｏ博士より供与された。ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ２−ＫＥＡＰ１及びｐｃＤＮＡ３−ＨＡ２−ＫＥＡＰ１ΔΒΤΒは、Ｙｕｅ  Ｘｉｏｎｇ博士より供与された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２１５５６及び２１５９３）。以前に記載した（３３）ように、ｇＲＮＡＳを合成し、処理した。アニールしたｇＲＮＡを、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇより供与されたＣａｓ９発現ベクターｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ピューロ（ＰＸ４５９）又はｐＸ３３０−Ｕ６−キメラ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９にクローニングした（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４８１３９及び４２２３０）。ＬＭＮＡ又はＰＭＬ遺伝子座及びｍＣｌｏｖｅｒタグＬＭＮＡ又はＰＭＬを標的とするｇＲＮＡＳについては、以前に記載している（４５）。レンチウイルスパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２及びエンベロープベクターＶＳＶ−Ｇは、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏより供与された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２６０及び１２２５９）。Ｈｉｓ６−ユビキチンを、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ／ＴＯ骨格にクローニングした。全ての変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて部位特異的変異誘発によって導入し、全てのプラスミドの配列を確認した。
【０１９４】
細胞培養及びプラスミドトランスフェクション
全ての培養培地に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した。Ｕ−２−ＯＳ（Ｕ２ＯＳ）細胞をマッコイ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。親細胞を、マイコプラズマ汚染について試験し、ＳＴＲ  ＤＮＡプロファイリングによって認証した。プラスミドトランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。レンチウイルス感染を、以前に記載した（１８）ように行った。Ｕ２ＯＳ及び２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから購入した。Ｕ２ＯＳ  ２５６細胞は、Ｒ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇより供与された。
【０１９５】
抗体
以下の抗体を使用した：ウサギ抗５３ＢＰ１（Ａ３００−２７３Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ）、ウサギ抗５３ＢＰ１（ｓｃ−２２７６０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、マウス抗５３ＢＰ１（＃６１２５２３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マウス抗γ−Ｈ２ＡＸ（クローンＪＢＷ３０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ（＃２５７７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウサギ抗ＫＥＡＰ１（ａｂ６６６２０、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＮＲＦ２（ａｂ６２３５２、Ａｂｃａｍ）、マウス抗Ｆｌａｇ（クローンＭ２、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗チューブリン（ＣＰ０６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マウス抗ＧＦＰ（＃１１８１４４６０００１、Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗ＣＣＮＡ（ＭＯＮＸ１０２６２、Ｍｏｎｏｓａｎ）、ウサギ抗ＢＲＣＡ２（ａｂ９１４３、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＢＲＣＡ２（ＯＰ９５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ウサギ抗ＢＲＣＡ１（＃０７−４３４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＵＳＰ１１（ａｂ１０９２３２、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＵＳＰ１１（Ａ３０１−６１３Ａ、ベチル）、ウサギ抗ＲＡＤ５１（＃７０−００１、Ｂｉｏａｃａｄｅｍｉａ）、マウス抗ＢｒｄＵ（ＲＰＮ２０２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、マウス抗ＦＫ２（ＢＭＬＰＷ８８１０、Ｅｎｚｏ）、ウサギ抗ＰＡＬＢ２（３４）、ウサギ抗ＧＳＴ（ｓｃ−４５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ウサギ抗ＣＵＬ３（Ａ３０１−１０８Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ）、マウス抗ＭＢＰ（Ｅ８０３２、ＮＥＢ）、マウス抗ＨＡ（クローン１２ＣＡ５、Ｍ．Ｔｙｅｒｓ博士より供与され）、ウサギ抗ユビキチン（Ｚ０４５８、Ｄａｋｏ）及びマウス抗アクチン（ＣＰ０１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。以下の抗体を、免疫蛍光顕微鏡での二次抗体として使用した：アレクサフルオロ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ、アレクサフルオロ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ、アレクサフルオロ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ、アレクサフルオロ５５５ロバ抗ウサギＩｇＧ、アレクサフルオロ６４７ロバ抗マウスＩｇＧ、アレクサフルオロ６４７ロバ抗ヒトＩｇＧ、アレクサフルオロ６４７ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。
【０１９６】
ＲＮＡ干渉
本研究で用いた全てのｓｉＲＮＡは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した単一の２本鎖ｓｉＲＮＡであった。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トランスフェクションを、フォワードトランスフェクションモードでリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。使用される個々のｓｉＲＮＡ２本鎖は、ＢＲＣＡ１（Ｄ−００３４６１−０５）、ＰＡＬＢ２（Ｄ−０１２９２８−０４）、ＵＳＰ１１（Ｄ−００６０６３−０１）、ＣＵＬ１（Ｍ−００４０８６−０１）、ＣＵＬ２（Ｍ−００７２７７−００）、ＣＵＬ３（Ｍ−０１０２２４−０２）、ＣＵＬ４Ａ（Ｍ−０１２６１０−０１）、ＣＵＬ４Ｂ（Ｍ−０１７９６５−０１）、ＣＵＬ５（Ｍ−０１９５５３−０１）、ＫＥＡＰ１（Ｄ−１２４５３−０２）、ＲＡＤ  ５１（Ｍ−００３５３０−０４）、ＣｔＩＰ／ＲＢＢＰ８（Ｍ−００１３７６−００）、ＢＲＣＡ２（Ｄ−００３４６２−０４）、５３ＢＰ１（Ｄ−００３５４９−０１）及び非標的対照ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１２１０−０２）であった。特に明記しない場合を除いて、ｓｉＲＮＡを、細胞処理の４８時間前にトランスフェクトした。
【０１９７】
阻害剤及びファインケミカル
以下の薬物を、示した濃度で使用した：１００ｎｇ／ｍＬ−１でのシクロヘキシミド（ＣＨＸ；Ｓｉｇｍａ）、０．２μΜでのカンプトテシン（ＣＰＴ；Ｓｉｇｍａ）、１０μΜでのＡＴＭ阻害剤（ＫＵ５５９３３；Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μΜでのＡＴＲ阻害剤（ＶＥ−８２１；Ｐｈｉｌｉｐ  Ｒｅａｐｅｒより供与され）、１０μΜでのＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤（ＮＵ７４４１；Ｇｅｎｅｔｅｘ）、２μΜでのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ）、４０μΜでのロバスタチン（Ｓ２０６１；Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ドキシサイクリン（＃８６３４−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、５μΜでのＮｅｄｄ８活性化酵素阻害剤（ＭＬＮ４９２９；Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）及び示した濃度でのオラパリブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ）。
【０１９８】
免疫蛍光顕微鏡検査
多くの場合において、細胞をガラスカバー上で増殖させ、室温で２０分間、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、室温で２０分間、０．３％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００で透過処理し、室温で３０分間、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックした。或いは、細胞を−２０℃で１０分間、１００％冷メタノールで固定し、その後、室温で５分間、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡによりブロッキングした。次いで、細胞を室温で２時間、ＰＢＳ−ＢＳＡで希釈した一次抗体とインキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０．８μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを補充したＰＢＳ−ＢＳＡで希釈した二次抗体とインキュベートし、室温で１時間、ＤＮＡを染色した。Ｐｒｏｌｏｎｇ金封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカバーガラスをスライドガラス上にマウントした。共焦点画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０レーザー走査顕微鏡を用いて撮影した。ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２軸のＧ１対Ｓ／Ｇ２解析のために、最初に、細胞を二重チミジンブロックで同期化し、Ｓ期への移行を可能にするために解放し、解放後５時間及び１２時間の時点で２又は２０グレイのＸ線照射に暴露し、（示した）処理後１〜５時間固定した。ＤＮＡ複製の検査のために、細胞を、照射前３０分間、３０μΜのＢｒｄＵでプレインキュベートし、前述のように処理した。
【０１９９】
ＵＳＰ１１／ＫＥＡＰ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集
２９３Ｔ及びＵ２ＯＳ細胞を、５３ＢＰ１、ＵＳＰ１１又はＫＥＡＰ１のいずれかを標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡで一過的にトランスフェクトし、Ｃａｓ９に続いて２Ａ−ピューロマイシンカセットを含有するｐＸ４５９ベクターから発現させた。翌日、細胞を２日間、ピューロマイシンで選択し、サブクローニングし、単一コロニー又は亜集団を形成させた。クローンを、免疫ブロット及び／又は免疫蛍光によってスクリーニングし、５３ＢＰ１、ＵＳＰ１１又はＫＥＡＰ１発現の消失を確認し、続いて、ＰＣＲ及び配列決定により特徴付けた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってターゲティングしたゲノム領域を、ターボＰｆｕポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を、配列決定前にｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０２００】
オラパリブクローン原性アッセイ
２９３Ｔ細胞を、２４時間、示した用量のオラパリブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とインキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、トリパンブルー染色によって計数した。次いで、５００個の細胞を、各条件について二重にプレーティングした。以前に記載した（３５）ように、細胞生存アッセイを行った。
【０２０１】
組換えタンパク質生成
以前に記載した（３６、３７）ように、ＧＳＴ及びＭＢＰ融合タンパク質を生成した。簡単に説明すると、大腸菌内で発現させたＭＢＰタンパク質を、製造業者が記載したバッチ法に従ってアミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製し、１×ＰＢＳ、５％グリセロール中で保存した。大腸菌内で発現させたＧＳＴタンパク質を、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５μｇ／ｍＬ−１  ＡＥＢＳＦ及び１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）中のグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂で精製した。ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ中の５０ｍＭのグルタチオンを用いて樹脂から溶出する際に、Ｈｉｓ６−ＧＳＴタグを、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグルタチオン、１０％グリセロール、２ｍＭのクエン酸ナトリウム及び２ｍＭのβ−メルカプトエタノール中でＨｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼ（Ｆ．Ｓｉｃｈｅｒｉによって提供された）を用いて切断した。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質を、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのグルタチオン、１０％グリセロール、１ｍＭのクエン酸ナトリウム及び２ｍＭのβメルカプトエタノール中のＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて枯渇させ、続いて、遠心濃縮を行った（Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＧＳＴ−ｍＫＥＡＰ１を、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での陰イオン交換工程を追加して、以前に記載した（３８）ように精製した。インビトロ実験では、ＧＳＴタグはタンパク質上に残した。ＣＵＬ３及びＲＢＸ１の精製を、以前に記載した（３２）ように行った。Ｎｅｄｄ８及びＤｅｎ１を、テリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス培地中で増殖させた大腸菌ＢＬ２１内で発現させ、１６℃で、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で一晩誘導した。細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤を含めなかったＤＥＮ１発現細胞を除いて、リゾチーム、ユニバーサルヌクレアーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）、ベンズアミジン、ロイペプチン、ペプスタチン、ＰＭＳＦ及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した洗浄緩衝液（４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、溶解物を５０分間、２０，０００ｒｐｍで遠心分離により清澄化した。可溶性上清を、蠕動ポンプを用いて、３ｍＬ／分−１の流量で５ｍｌのＳｔｒｅｐ３０  Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジに結合させた。このカラムを、２０倍のカラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液で洗浄し、５倍のＣＶ洗浄緩衝液で溶出し、水に１：２で希釈し、最終塩濃度を減少させ、２．５ｍＭのデスチオビオチンを補充した。溶出画分をプールし、３ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ濃縮器を用いて、４ｍｌの総体積まで濃縮した。さらに、ＤＥＮ１を、スーパーデックス７５サイズ排除カラム上で精製し、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６のＨＥＰＥＳ、２％グリセロール及び１ｍＭのＤＴＴに緩衝液交換した。Ｃ−末端プロペプチド及びＳｔｒｅｐＩＩ２×タグを、室温で１時間、１：２０のモル比でＳｔｒｅｐＩＩ２×ＤＥＮ１とのインキュベーションによって除去した。ＤＥＮ１切断反応を、Ｚｅｂａ  ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上で緩衝液交換し、デスチオビオチンを除去し、Ｃ−末端プロペプチド及びＤＥＮ１を保持するＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカートリッジを通過させた。ＧＳＴタグ付きイノシシ（ブタ）ＵＳＰ１１タンパク質を、記載した（３９）ように大腸菌内で発現させた。細胞をリゾチーム処理及び、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、１×プロテアーゼ阻害剤混合物（２８４ｎｇ／ｍｌのロイペプチン、１．３７μｇ／ｍｌ−１のペプスタチンＡ、１７０μｇ／ｍｌ−１のＰＭＳＦ及び３３０μｇ／ｍｌ−１のベンズアミジン）及び５％グリセロール中での超音波処理によって溶解した。清澄化した溶解物を、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムにアプライし、溶解緩衝液で徹底的に洗浄し、ｐＨ  ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール及び２５ｍＭの還元グルタチオンで溶出した。ＤＵＢ活性を、蛍光ユビキチン−ＡＭＣ（Ｅｎｚｏ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でアッセイし、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて測定した。Ｈｉｓ６−ＴＥＶ−ユビキチンＧ７６Ｃを、製造者の説明書に従ってキレート化ＨｉＴｒａｐ樹脂上で精製し、続いて、Ｓ−７５カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィーを行った。該タンパク質を、１ｍＭの酢酸中で大規模透析し、凍結乾燥した。
【０２０２】
ＰＡＬＢ２のインビトロのユビキチン化及び脱ユビキチン化
ＰＡＬＢ２のＨＡタグ付きＮ末端断片（１−１０３）（１μΜ）を、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中の５０μΜの野生型（Ｕｂｉ  ＷＴ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）又はリジンレスユビキチン（Ｕｂｉ  Ｋ０，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１００ｎＭのヒトＵＢＡ１（Ｅ１）、５００ｎＭのＣＤＣ３４（Ｆ．Ｓｉｃｈｅｒｉ及びＤ．Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉによって提供された）、２５０ｎＭのＮＥＤＤ化ＣＵＬ３／ＲＢＸ１、３７５ｎＭのＧＳＴ−ｍＫＥＡＰ１及び１．５ｍＭのＡＴＰを用いて、インビトロでユビキチン化した。特に明記しない限り、ユビキチン化反応を、３７℃で１時間行った。ＵＳＰ１１媒介性脱ユビキチン化アッセイのために、ＨＡ−ＰＡＬＢ２（１−１０３）を、ｐＨ８の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ及び１．５ｍＭのＡＴＰを含有する緩衝液中での５０μＬの反応で、上記のような酵素濃度でリジンレスユビキチンを用いて、３７℃で１．５時間、最初にユビキチン化した。反応を、１ユニットのアピラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加により停止した。反応生成物を、１００ｎＭ、５００ｎＭ及び２５００ｎＭ（ＵＳＰ１１）並びに５００ｎＭ（ＵＳＰ２）の最終濃度を用いて、野生型又は触媒不活性（Ｃ２７０Ｓ）ＵＳＰ１１若しくはＵＳＰ２（Ｆ．Ｓｉｃｈｅｒｉ及びＥ．Ｚｅｑｉｒａｊによって提供された）と１；１の比で混合し、ｐＨ８の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０３％Ｂｒｉｊ−３５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３７５ｍＭのＡＴＰを含有する緩衝液中で、３０℃で２時間インキュベートした。
【０２０３】
精製したＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ１との間のプルダウン実験
ＰＡＬＢ２のインビトロユビキチン化反応生成物を、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭのＤＴＴ及び０．１％ＮＰ−４０の最終濃度の緩衝液で希釈した。２０μｇのＭＢＰ又はＭＢＰ−ＢＲＣＡ１−ＣＣを、０．１％ＢＳＡを補充した上記緩衝液中でアミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）に結合させ、その後、ユビキチン化生成物を添加した。プルダウン反応を４℃で２時間行い、徹底的に洗浄した。
【０２０４】
共免疫沈降
細胞を、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、氷上で５００μＬの溶解緩衝液（ｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）のカクテル及び脱ユビキチン化を阻害するためのＮ−エチルマレイミド）に溶解した。溶解物を４℃で１０分間、１５０００×ｇで遠心分離し、タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度を用いて評価した。等量のタンパク質（約０．５〜１ｍｇ）を、２μｇのウサギ抗ＰＡＬＢ２、ウサギ抗ＵＳＰ１１抗体、ウサギ抗ＧＦＰ抗体又は正常ウサギＩｇＧと４℃で５時間インキュベートした。プロテインＡ／プロテインＧ−セファロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の混合物を、さらに１時間添加した。ビーズを、遠心分離によって収集し、溶解緩衝液で２回、ＰＢＳで１回洗浄し、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で煮沸することによって溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングにより分析した。Ｆｌａｇ−ＰＡＬＢ２のＭＳ分析のために、一過的にトランスフェクトした１５０×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭの１，１０−フェナントロリン、５０Ｕのベンゾナーゼ及び５０Ｕのミクロコッカスヌクレアーゼを補充した高塩溶解緩衝液（ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＣａＣｌ２）に溶解した。清澄化した溶解物をＦｌａｇ−Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、続いて、溶解緩衝液及び５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで徹底的に洗浄した。
【０２０５】
質量分析
ｓｉＣＴＲＬをトランスフェクトするか、又はＵＳＰ１１のｓｉＲＮＡを枯渇させた２９３Ｔ細胞からの、一過的にトランスフェクトしたＦｌａｇ−ＰＡＬＢ２の免疫沈降後に、システイン残基を還元し、それぞれ、１０ｍＭのＤＴＴ（５６℃で３０分）及び１５ｍＭの２−クロロアセトアミド（室温で１時間）を用いてビーズ上でアルキル化した。タンパク質を、ビーズ上のトリプシン限定消化を用いて消化し（試料当たり１μｇのトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、米国ニュージャージー州）、３７℃で２０分）、完全乾燥させた。ＬＣＭＳ／ＭＳ分析のために、ペプチドを５％ギ酸中で再構成し、３．５μｍのゾルバックスＣ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）を研究室内で詰めた充填用チップと結合させた１２ｃｍのシリカカラム上にロードした。試料を、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ｎａｎｏＬＣ  ｕｌｔｒａ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州）と連結させたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）を用いて分析した。ペプチドを、０．１％ギ酸中の２％〜３５％アセトニトリルの９０分間の直線勾配を用いてカラムから溶出した。タンデムＭＳスペクトルを、上位２種類の最も豊富な多重荷電ペプチドについてデータ依存モードで取得し、非修飾型の、又はｄｉＧｌｙユビキチントリプシン消化レムナントを含む５種類の特異的Ｎ末端ＰＡＬＢ２トリプシン消化ペプチド（荷電状態１＋、２＋、３＋）についてのターゲティングスキャンを含めた。タンデムＭＳスペクトルを、衝突誘起解離を用いて得た。スペクトルを、Ｍａｓｃｏｔを用いて、最大４つの切断ミスを許容し、可変修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてカルバミドメチル（Ｃ）、アミド分解（ＮＱ）、酸化（Ｍ）、ＧｌｙＧｌｙ（Ｋ）及びＬｅｕＡｒｇＧｌｙＧｌｙ（Ｋ）（配列番号４）を含めて、ヒトＲｅｆＳｅｑ＿Ｖ５３データベースに対して検索した。
【０２０６】
インビトロユビキチン化ＨＡ−ＰＡＬＢ２（１−１０３）（５０μＬの全反応混合物）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で短時間流し、続いて、全レーンを切り出し、１０ｍＭのＤＴＴを用いてゲル内還元し（５６℃で３０分）、３７℃で１６時間、５０ｍＭの２−クロロアセトアミド及びトリプシン消化を用いてアルキル化した。消化したペプチドを、１０種類の特有の重同位体で標識したＮ末端ＰＡＬＢ２（ＡＱＵＡ）ペプチドの混合物（個々のペプチドの感受性試験に基づいてペプチドあたり８０〜１，２００ｆｍｏｌ／μＬの非修飾型又はｄｉＧ修飾型のいずれかの、Ｌｙｓ１６、２５、３０又は４３の周囲の領域の完全又は部分的なトリプシン消化物を含む）２０μＬと混合し、その後、３．５μｍのゾルバックスＣ１８を研究室内で詰めた充填用チップと結合させた１２ｃｍのシリカカラム上に６μＬをロードした。試料を、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ｎａｎｏＬＣ  ｕｌｔｒａ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、米国カリフォルニア州）と連結させたＯｒｂｉｔｒａｐ  ＥＬＩＴＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）上で測定した。ペプチドを、０．１％ギ酸中２％〜３５％アセトニトリルの１８０分の直線勾配を用いてカラムから溶出した。タンデムＭＳスペクトルを、上位２種類の最も豊富な多重荷電イオンについてデータ依存モードで取得し、軽同位体標識型又は重同位体標識型のいずれかの、１０種類の特異的Ｎ末端ＰＡＬＢ２トリプシン消化ペプチド（荷電状態１＋、２＋、３＋）についてのターゲティングスキャンを含めた。タンデムＭＳスペクトルを、衝突誘起解離を用いて取得した。スペクトルを、Ｍａｓｃｏｔを用いて、最大２つの切断ミスを許容し、可変修飾としてカルバミドメチル（Ｃ）、アミド分解（ＮＱ）、酸化（Ｍ）、ＧｌｙＧｌｙ（Ｋ）及びＬｅｕＡｒｇＧｌｙＧｌｙ（Ｋ）（配列番号４）を含めて、ヒトＲｅｆＳｅｑ＿Ｖ５３データベースに対して検索し、その後、スペクトルを手動で確認した。
【０２０７】
Ｈｉｓユビキチンプルダウン
Ｈｉｓ６−Ｕｂを安定発現している２９３  ＦＬＩＰ−ＩＮ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）で２４時間処理し、Ｈｉｓ６−Ｕｂ発現を誘導した。細胞を３０分間、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミドで前処理し、変性溶解緩衝液（６Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０１Ｍのβ−メルカプトエタノール、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）に溶解した。溶解物を、１分間の休憩をはさんで１０秒間で２回、氷上で超音波処理し、４℃で１０分間、１５０００×Ｇで遠心分離した。上清を、４℃で４時間、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）とインキュベートした。ビーズは、遠心分離によって収集し、変性溶解緩衝液で１回洗浄し、洗浄緩衝液（８Ｍの尿素、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０１Ｍのβ−メルカプトエタノール、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）で１回、及び０．１％トリトンＸ−１００を補った洗浄緩衝液で２回洗浄し、溶出緩衝液（０．２Ｍのイミダゾール、０．１５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３０％グリセロール、０．７２Ｍのβ−メルカプトエタノール、５％ＳＤＳ）で溶出し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングによって分析した。
【０２０８】
ＨＲベースの修復アッセイ
親Ｕ２ＯＳ細胞及び野生型ＣｔＩＰ又はＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）変異体を安定発現するＵ２ＯＳ細胞を、示したｓｉＲＮＡ及びＰＡＬＢ２−ＫＲコンストラクトでトランスフェクトし、単一チミジンブロックで同期化し、ドキシサイクリンで処理して、ＣｔＩＰ発現を誘導し、その後、４０μΜのロバスタチンを添加することによりＧ１期でブロックした。細胞をトリプシン処理により収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術を用いて、２．５μｇのｓｇＲＮＡプラスミド及び２．５μｇのドナーテンプレート（Ｌｏｎｚａ、プロトコルＸ−００１）を電気穿孔した。細胞を４０μΜのロバスタチンを補充した培地に播種し、２４時間増殖させ、その後、フローサイトメトリー分析を行った。
【０２０９】
ＰＡＬＢ２化学ユビキチン化
唯一の架橋可能なシステインで遺伝子操作したＰＡＬＢ２（１−１０３）ポリペプチドを、以下の変更を加えて、以前に記載した（４０、４１）ように架橋アルキル化によってユビキチン化した。精製ＰＡＬＢ２システイン変異体（６００μΜの最終濃度）を、ｐＨ８．８の３００ｍＭのトリス、１２０ｍＭのＮａＣｌ及び５％グリセロール中のＨｉｓ６−ＴＥＶ−ユビキチンＧ７６Ｃ（３５０μΜ）と混合した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）還元剤を最終濃度が６ｍＭになるまでこの混合物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。二反応性システイン架橋剤の１，３−ジクロロアセトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をジメチルホルムアミドに溶解し、最終濃度が５．２５ｍＭになるまでタンパク質混合物に添加した。反応を氷上で１時間進行させ、その後、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの添加によってクエンチした。Ｈｉｓ６−ＴＥＶ−ユビキチンをコンジュゲートさせたＰＡＬＢ２をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を通過させることによって濃縮した。
【０２１０】
本研究及び本研究の結果を以下に説明する。
【０２１１】
有糸分裂組換えが確実に姉妹染色分体間だけで発生する（４，５）ようにするため、相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ修復（１）をＧ１細胞で高度に抑制する（２，３）。多くのＨＲ因子は、細胞周期により調節されているが、Ｇ１細胞内で組換えを抑制するのに必要かつ十分である事象のアイデンティティーは不明である。この研究は、細胞周期がＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２とＢＲＣＡ１の相互作用をしっかり制御し、ＢＲＣＡ２の機能をＳ／Ｇ２期に制約することを見出した。ＰＡＬＢ２上のＢＲＣＡ１相互作用部位は、ＣＵＬ３−ＲＢＸ１と複合体を形成するＰＡＬＢ２相互作用タンパク質（６）であるＫＥＡＰ１で構成されたＥ３ユビキチンリガーゼによってターゲティングされる。ＰＡＬＢ２ユビキチン化は、ＢＲＣＡ１との相互作用を抑制し、それ自体が細胞周期の制御下にある脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ１１によって打ち消される。ＤＮＡ末端切除の活性化と組み合わせたＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の回復は、ＲＡＤ５１動員、予定外のＤＮＡ合成及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子ターゲティングアッセイによって測定されるように、Ｇ１にＨＲを誘導するのに十分である。Ｇ１でＨＲを禁止する機構は、最小限、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリの阻害を含む、ＤＮＡ損傷部位へのＢＲＣＡ２動員の多段階阻止と連動したＤＮＡ末端切除の抑制からなる。定義された因子によりＧ１細胞内でＨＲを誘導する能力は、非分裂細胞内での遺伝子ターゲティング用途で使用され得る。
【０２１２】
乳癌及び卵巣癌の抑制因子のＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２及びＢＲＣＡ２は、ＨＲによるＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）修復を促進する（８〜１０）。ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ末端切除を促進し、相同性検索及び鎖侵入に必要な１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを生成し（１）、ＰＡＬＢ２と相互作用し（１３〜１５）、ＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ２（１３）及びＲＡＤ５１（１６、１７）の動員を誘導する。ＤＳＢ部位に隣接するクロマチン上でのＢＲＣＡ１の蓄積は、Ｇ１細胞で抑制され（１８）、細胞周期のこの段階におけるＨＲの強力な阻害を連想させる。Ｇ１でのＢＲＣＡ１動員の阻害は、末端切除の２つの阻害物質（１８〜２２）である５３ＢＰ１及びＲＩＦ１タンパク質に依存することから（１８、１９）、ＢＲＣＡ１のこの調節は、元々、ＤＮＡ末端処理の刺激におけるその機能の観点から考えられた。
【０２１３】
しかしながら、ＢＲＣＡ１は、ＰＡＬＢ２との相互作用を介してＢＲＣＡ２の動員の促進にも関与している（１３〜１５）ので、本研究では、ゲノム編集による（ＴＰ５３ＢＰ１としても知られている）５３ＢＰ１の変異（５３ＢＰ１Δ；図５ａ〜ｃ）を介した、Ｇ１でのＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ１動員の誘発が、電離放射線（ＩＲ）誘発フォーカスにＢＲＣＡ２の蓄積をもたらすかどうかを調べた。ＢＲＣＡ１とは対照的に、ＢＲＣＡ２又はＰＡＬＢ２のいずれも、２〜２０グレイの範囲のＩＲ線量で、５３ＢＰ１を欠くＵ−２−ＯＳ（Ｕ２ＯＳ）細胞内でＧ１  ＤＳＢ部位へ動員されない（図１ａｂ及び図５ｄ、ｅ）。ＢＲＣＡ１及びＰＡＬＢ２は直接相互作用するので（１３、１４）、この結果は、Ｇ１細胞がＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を抑制することによってＢＲＣＡ２動員を阻止し得ることを示唆した。実際、ＰＡＬＢ２は、細胞周期位置に関わらずＢＲＣＡ２と相互作用するが、Ｓ期中にのみＢＲＣＡ１と効率的に相互作用する（図１ｃ）。ＤＮＡ損傷の存在は、Ｇ１に残留しているＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ１相互作用の損失につながるが、Ｓ期においてＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリにほとんど影響を与えなかった（図１ｃ）。全てのタンパク質はＧ１で発現したので（図１ｃ）、これらの結果は、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリが、細胞周期中に制御され、おそらくＤＳＢ部位でのＢＲＣＡ２の蓄積をＳ／Ｇ２期に制限することを示唆する。
【０２１４】
これらの結果を、ＧＦＰタグ付きＰＡＬＢ２とのｍＣｈｅｒｒｙタグ付きＬａｃＲ−ＢＲＣＡ１融合タンパク質の、組み込んだＬａｃＯアレイ（２３）での共局在化を評価する単一細胞アッセイを用いて確認した（図６ａ）。このＬａｃＲ／ＬａｃＯシステムは、細胞周期依存性で、かつＤＮＡ損傷感受性のＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を再現し（図６ｂ）、そのアミノ末端ＢＲＣＡ１相互作用ドメイン（残基１〜５０）の外側に位置するＰＡＬＢ２上の配列がＢＲＣＡ１と関連して細胞周期依存性調節に関与するということを発見するのを可能にした（図６ｃ、ｄ）。さらに、欠損変異誘発は、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の細胞周期依存性調節に関与するＰＡＬＢ２の残基４６〜１０３の範囲内に包含される単一領域を特定した（図６ｅ、ｆ）。この領域はＫＥＡＰ１の相互作用部位に相当し（６）、このタンパク質をＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の候補調節因子として特定する。
【０２１５】
ＫＥＡＰ１は、プロテアソーム分解のための酸化防止制御因子ＮＲＦ２を標的とするカリン３−ＲＩＮＧユビキチン（Ｕｂ）リガーゼ（ＣＲＬ３）用の基質アダプターであり（２４）、そのＫＥＬＣＨドメインを介してＰＡＬＢ２とＮＲＦ２の両方上の「ＥＴＧＥ」モチーフを認識する（６）。５３ＢＰ１Δ細胞からのＫＥＡＰ１の枯渇、又は全長ＰＡＬＢ２の中のＥＴＧＥモチーフの欠損（ＰＡＬＢ２ΔＥＴＧＥ）は、Ｇ１細胞においてＰＡＬＢ２  ＩＲ誘導性フォーカス形成を誘導した（図１ｄ及び図７ａ）。さらに、ＫＥＡＰ１がゲノム編集によって不活性化された細胞において（ＫＥＡＰ１Δ、図７ｂ）、安定なＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体が、Ｇ１とＳ期の両方において検出された（図１ｅ）。したがって、ＫＥＡＰ１は、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の阻害剤である。
【０２１６】
ＣＵＬ３もＰＡＬＢ２（図７ｃ）と相互作用し、５３ＢＰ１Δ  Ｕ２ＯＳ細胞内でのその枯渇は、Ｇ１でＰＡＬＢ２  ＩＲ誘導性フォーカスを脱抑制した（図１ｄ及び図７ａ）。さらに、Ｇ１同期化ＫＥＡＰ１Δ細胞において、そのＢＴＢドメインを欠くＣＵＬ３結合欠損ＫＥＡＰ１タンパク質（ΔＢＴＢ）の発現は、その野生型対応物とは異なり（図７ｄ）、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用を抑制することができなかった。これらの結果は、ＫＥＡＰ１がＰＡＬＢ２へＣＵＬ３を動員し、ＢＲＣＡ１との相互作用を抑制することを示唆する。
【０２１７】
ＬａｃＲ／ＬａｃＯシステム及び共免疫沈降アッセイを用いて、ＢＲＣＡ１相互作用ドメイン内の全ての８つのリジン残基を欠くＰＡＬＢ２の変異体（ＰＡＬＢ２−ＫＲ；図２ａ）が、細胞周期位置とは無関係にＢＲＣＡ１と相互作用することが見出された（図２ｂ及び図７ｅ、ｆ）。ＰＡＬＢ２−ＫＲの状況におけるこれらのリジンの再導入（ＰＡＬＢ２−ＫＲ／Ｋ３をもたらす；図２ａ）が、Ｇ１細胞内でのＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリの抑制につながるので、さらなる変異誘発により、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用の抑制に重要なものとしてＰＡＬＢ２の残基２０、２５及び３０が特定された（図２ｂ及び図７ｅ）。まとめると、これらの結果から、ＰＡＬＢ２と結合したＫＥＡＰ１が、ＰＡＬＢ２のＮ末端をユビキチン化して、ＢＲＣＡ１との相互作用を抑制する活性ＣＲＬ３複合体を形成するモデルが示唆された。
【０２１８】
ＰＡＬＢ２ユビキチン化は、細胞内で検出することができるが（図８ａ）、ＰＡＬＢ２のＮ末端のリジンに富む性質は、これまでのところ、Ｌｙｓ２０、２５又は３０上にインビボユビキチン化部位を明確にマッピングすることを妨げてきた。しかしながら、ユビキチン化が、質量分析によってＬｙｓ１６及びＬｙｓ４３上に検出され得ることは、ＰＡＬＢ２のＮ末端がユビキチン化されることを示す（図８ｂ）。相補的な実験セットにおいて、ＬａｃＯアレイへターゲティングされたＰＡＬＢ２は、コンジュゲートユビキチンに対する免疫反応性を誘導した（図８ｃ〜ｅ）。ＰＡＬＢ２とＵｂの共局在は、Ｇ１で最も高く、ＫＥＡＰ１相互作用モチーフ及びＬｙｓ２０／２５／３０残基の存在に依存し（図８ｄ〜ｅ）、ＰＡＬＢ２がＧ１細胞内のそれらの部位上でユビキチン化されるモデルと一致した。実際、ＰＡＬＢ２のＮ末端（残基１〜１０３；赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグに融合された）のユビキチン化は、ＰＡＬＢ２のＫＥＡＰ１相互作用ドメインに依存して、組換えＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１によって容易に再構成することができ（図２ｃ）、質量分析によってインビトロでＫＥＡＰ１によりユビキチン化されるものとしてＬｙｓ２５及びＬｙｓ３０を明白に特定した。
【０２１９】
ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１によるＰＡＬＢ２のユビキチン化は、残基１３６３〜１４３７（ＢＲＣＡ１−ＣＣ）を含むＢＲＣＡ１断片との相互作用を阻害し、この阻害は、ＢＲＣＡ１相互作用ドメインの外側のユビキチン化リジンの存在により、ＰＡＬＢ２の高度に修飾された形態を用いた時により明らかになった（図２ｄ）。重要なものとして特定した３つのうちの単一リジン残基のユビキチン化がＢＲＣＡ１との相互作用を阻害するかどうかを具体的に試験するために、化学的架橋を用いて、２０又は４５位に単一ユビキチン部分を設置した（ＰＡＬＢ２−Ｋｃ２０−Ｕｂ及びＰＡＬＢ２−Ｋｃ４５−Ｕｂをもたらす）。２０位におけるＰＡＬＢ２のユビキチン化は、ＢＲＣＡ１との相互作用を完全に抑制したが、残基４５の修飾はその相互作用に影響を及ぼさず（図９ａ）、インビボデータと同じであった（図７ｅ）。まとめると、これらの結果は、そのＮ末端上の特定の部位でのＰＡＬＢ２のユビキチン化がＢＲＣＡ１との相互作用を妨げることを示す。
【０２２０】
ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１のＥ３リガーゼの活性（図９ｂ）もＰＡＬＢ２とＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１の相互作用（図７ｃ）のどちらも、細胞周期によって調節されないので、ＰＡＬＢ２のユビキチン化は、細胞周期依存的に調節することが可能であった。ＫＥＡＰ１はＵＳＰ１１と物理的に相互作用し（２５）、脱ユビキチン化酵素は、ＢＲＣＡ２（２６）及びＰＡＬＢ２（図９ｃ）とも相互作用する。ＵＳＰ１１の枯渇は、遺伝子変換を修復し（２７）（図９ｄ）、ＰＡＲＰ阻害に対して過感受性をもたらし（２７）、それを未知の機能のＨＲ制御因子として特定する。共免疫沈降実験は、ＵＳＰ１１及びその触媒活性が特にＤＮＡ損傷の存在下で、安定したＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体の形成に必要であることを確認した（図３ａ及び図９ｅ、ｆ）。
【０２２１】
ＵＳＰ１１が、ＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１によるＰＡＬＢ２ユビキチン化に拮抗する場合は、ＫＥＡＰ１（又はＣＵＬ３）の除去は、ＵＳＰ１１の損失によって与えられる表現型を逆転させる必要がある。実際に、ＫＥＡＰ１の枯渇は、ゲノム編集によって調製されたＵＳＰ１１ノックアウト細胞（ＵＳＰ１１Δ）においてＰＡＲＰ阻害剤（ＰＡＲＰｉ）及びＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用に対する耐性を回復した（図３ｂ、ｃ及び図９ｅ）。同様に、ＣＵＬ３又はＫＥＡＰ１の枯渇は、ＵＳＰ１１枯渇細胞の遺伝子変換欠陥を逆転させた（図１０ａ）。ＰＡＬＢ２−ＫＲ変異体の導入は、ＢＲＣＡ１との相互作用を回復し、Ｌｙｓ２０／２５／３０に依存してＵＳＰ１Δ細胞内でのＰＡＲＰｉ感受性を逆転させた（図１０ｂ、ｃ）。組換えＵＳＰ１１は、ＰＡＬＢ２（１−１０３）を直接脱ユビキチン化することができるので、これらの結果は、ＵＳＰ１１が、ＰＡＬＢ２のＬｙｓ２０／２５／３０残基上の阻害性ユビキチン化を逆転させることによってＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体のアセンブリを促進することを示唆する。
【０２２２】
ＵＳＰ１１は、Ｇ１細胞で急速に代謝回転し、細胞周期のこの段階でＰＡＬＢ２とほとんど相互作用しないことが観察された（図１１ａ、ｂ）。さらに、ＤＮＡ損傷誘導時に、具体的には、Ｇ１期においてＵＳＰ１１の急速な損失がある（図３ｅ及び図１１ｂ、ｃ）。ＩＲ処理後ＵＳＰ１１の不安定化は、ＡＴＭシグナル伝達に依存しているが、ＵＶ照射後はＡＴＲ依存性である（図１１ｄ、ｅ）。Ｇ１におけるＵＳＰ１１の定常状態レベルの低下は、プロテアソーム分解の結果である（図１１ｆ）。ＣＲＬ４  Ｅ３のＵｂリガーゼは、ＭＬＮ４９２４、汎ＣＲＬ阻害剤での治療としてＵＳＰ１１の安定性制御（２８）（図１１ｇ）、又はＤＮＡ損傷誘発性分解からのＣＵＬ４（図３ｆ）によって保護されるＵＳＰ１１の枯渇に関与する可能性が最も高い。ＣＵＬ４の枯渇は、Ｇ１  ５３ＢＰ１Δ細胞においてＢＲＣＡ２及びＰＡＬＢ２  ＩＲ誘導性フォーカス形成をもたらし（図３ｇ及び図１２ａ）、最終的にＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリを制御する上流のシグナルとして作用するＣＲＬ４複合体によるＵＳＰ１１の調節と一致した。
【０２２３】
５３ＢＰ１の枯渇は、Ｇ１細胞において低いレベルのｓｓＤＮＡを生成するが（２９）、ＫＥＡＰ１の枯渇と５３ＢＰ１Δ変異を組み合わせても、抽出抵抗性ＲＡＤ５１  ＩＲ誘導性フォーカスを生じなかったことは、ＲＡＤ５１ヌクレオフィラメントがほとんど又は全く形成されないことを示唆する（図１２ｂ）。ｓｓＤＮＡ形成は、これらの細胞において不十分なままであったので、Ｇ１細胞内での切除を促進するＣｔＩＰのリン酸化模倣Ｔ８４７Ｅ変異体を利用した（３０）。野生型ＣｔＩＰとは異なり、ＫＥＡＰ１枯渇５３ＢＰ１Δ細胞へのＣｔＩＰ−Ｔ８４７Ｅの導入は、不定期ＤＮＡ合成と共に（図１２ｄ）Ｇ１細胞においてＲＡＤ５１  ＩＲ誘導性フォーカス形成を誘導した（図４ａ、ｂ及び図１２ｂ、ｃ）。これらの結果は、ＲＡＤ５１ヌクレオフィラメント形成の下流の工程、すなわち、鎖侵入、Ｄループ形成及びＤＮＡ合成は、Ｇ１で活性化され得ることを示唆した。
【０２２４】
生産的ＨＲがＧ１で活性化され得るかどうかを試験するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に刺激される遺伝子ターゲティングアッセイ（Ｐｉｎｄｅｒ  Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３，９３７９−９３９２，２０１５）を使用して、ラミンＡ（ＬＭＮＡ）又はＰＭＬ遺伝子の５’末端へのｍＣｌｏｖｅｒ蛍光タンパク質のコード配列の挿入を顕微鏡又はフローサイトメトリーによりモニタリングした（図４ｃ及び図１２ｅ、ｆ）。後者の方法は、定義したＤＮＡ含量を有する細胞のゲーティングを可能にする（Ｇ１細胞など）。同期プロトコルはまた、チミジンブロックからの解放後に得られるＧ１細胞が、２４時間のロバスタチン処理（２）によってＧ１で停止することを確立した（図１２ｇ、ｈ）。このシステムを用いて、アッセイの線形範囲内のドナーテンプレートの濃度を決定し、ＬＭＮＡ遺伝子座での遺伝子ターゲティングがＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリに依存していることを確認した（図１３ａ、ｂ）。また、ＨＲによる遺伝子ターゲティングがＧ１で高度に抑制されたことを確認した（図４ｄ）。
【０２２５】
切除とＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ１動員の組み合わせ活性化（すなわち、ＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）を発現する５３ＢＰ１Δ細胞において）は、Ｇ１細胞においてＬＭＮＡ又はＰＭＬ遺伝子座のいずれかで遺伝子ターゲティングを刺激するのに不十分であった（図４ｅ及び図１３ｃ）。しかしながら、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２相互作用が、ＫＥＡＰ１枯渇又はＰＡＬＢ２−ＫＲ変異体の発現のいずれかを用いて、切除コンピテントＧ１細胞において回復した場合、両方の遺伝子座における遺伝子ターゲティング事象のロバストな増加が検出された（図４ｅ及び図１３ｃ）。しかしながら、Ｇ１細胞の遺伝子ターゲティング頻度が、非同期分裂細胞のものよりも低いままであったことは、ＨＲの不完全な活性化を示唆した。５３ＢＰ１不活性化及びＣｔＩＰ（Ｔ８４７Ｅ）の発現は共に、Ｇ１  ＨＲに必要であり（図１３ｄ、ｅ）、末端切除及びＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ２動員の同時活性化が、細胞周期のこの段階で予定外の組換えを活性化するのに必要かつ十分であったことを示した。
【０２２６】
結論として、ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２複合体アセンブリの制御は、ＨＲによるＤＳＢ修復の細胞周期制御における重要な節である。この制御は、ＰＡＬＢ２上のＢＲＣＡ１相互作用部位上で収束し、Ｅ３リガーゼＣＲＬ３−ＫＥＡＰ１及び脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ１１の反対の活性によって強化され、後者は、ＣＲＬ４複合体によってＧ１で拮抗される（図４ｆ）。このモデルでは、Ｓ期のＵＳＰ１１の安定化が、ＤＳＢ部位でのＰＡＬＢ２−ＢＲＣＡ２の動員、及びその後のＲＡＤ５１のローディングを許可する。これらの研究はまた、Ｇ１細胞内でのＨＲの抑制が、主に可逆的であること、かつ端部切除及びＤＳＢ部位へのＢＲＣＡ２動員の組み合わせ抑制を伴うことを実証する（図４ｆ）。人体におけるほとんどの細胞が活発に循環せず、ひいては、ＨＲに対して不応であるので、本明細書に記載の操作は、より様々な組織における遺伝子ターゲティング治療を可能にするゲノム編集方法の開発をもたらす。
【０２２７】
実施例２
ＵＳＰ１１の分解のための基質アダプターとしてのＤＣＡＦ１０の特定
ＣＵＬ４−ＲＩＮＧ−リガーゼ（ＣＲＬ４）複合体は、カリン４（ＣＵＬ４）、ＲＢＸ１、ＤＤＢ１、ＤＤＡ１及びＤＣＡＦと呼ばれる基質アダプターで構成されている（４２）。ＵＳＰ１１のユビキチン化を媒介する基質アダプターを検索するために、他のＣＵＬ４相互作用タンパク質と共に、既知の及び予測されるＤＣＡＦを枯渇させることに焦点をあてたｓｉＲＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーを、ＵＳＰ１１レベルを免疫蛍光顕微鏡により評価するハイコンテンツ顕微鏡アッセイでスクリーニングした。細胞を紫外線（ＵＶ）又は電離放射線（ＩＲ）のいずれかで処理し、ＵＳＰ１１の分解を誘導した。データを非照射条件に正規化し、２つの独立した実験の平均を用いて、ＵＶ処理及びＩＲ処理後の値をプロットした。図１４ａに示したデータは、ＣＵＬ４枯渇後ＵＳＰ１１の予想される安定化に加えて、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１５及びＤＣＡＦ１７の枯渇はまた、ＵＳＰ１１の安定化につながったことを示す。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、オフターゲット効果の傾向があるので、次に、２つの独立したｓｉＲＮＡによるＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１５又はＤＣＡＦ１７のノックダウンが、免疫ブロッティング実験でＵＳＰ１１を安定することができるかどうかを評価した。ＵＳＰ１１の安定化は単一ｓｉＲＮＡを用いた場合にのみ観察することができ（図１４ｂ）、両方のｓｉＲＮＡによるＤＣＡＦ１０の枯渇がＵＳＰ１１のロバストな安定化をもたらすことが見出された（図１４ｂ）。ＣＲＬ４基質アダプターはその基質に結合するので（４２）、次に、ＤＣＡＦ１０又はＤＣＡＦ１５が共免疫沈降アッセイにおいてＵＳＰ１１と相互作用することができるかどうかを評価した。Ｆｌａｇタグ付きＵＳＰ１１を、ＨＥＫ２９３細胞抽出物から免疫沈降させた場合、Ｆｌａｇタグ付きＵＳＰ１１はＤＣＡＦ１０と相互作用するが、ＤＣＡＦ１５とは相互作用しなかった（図１５ａ）ことが見いだされ、ＤＣＡＦ１０は、分解についてＵＳＰ１１を標的にする本物の基質アダプターであることが強く示唆された。ＤＣＡＦ１０が実際にＵＳＰ１１の調節に関与しているかどうかをさらに評価するために、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、コンジェニック野生型（Ｄｃａｆ１０＋／＋）、ヘテロ接合（Ｄｃａｆ１０−／＋）及びＤｃａｆ１０−／−マウスから作製し、ＵＳＰ１１について免疫ブロットした。ＤＣＡＦ１０の枯渇は、マウス細胞内でのより高い定常状態レベルのＵＳＰ１１をもたらし（図１５ｂ）、ＤＣＡＦ１０がＣＲＬ４複合体ターゲティングＵＳＰ１１のアダプターであることと一致した。最後に、ＤＣＡＦ１０の過剰発現が、ダイレクトリピート（ＤＲ）−ＧＦＰアッセイを用いて顕著に相同組換えを抑制することができるかどうかを評価した（４３）。ＤＣＡＦ１５ではなく、ＤＣＡＦ１０の過剰発現は、ＵＳＰ１１の枯渇及び他のコアＨＲ因子と同じ規模でＨＲの減少をもたらした（図１５ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＤＣＡＦ１０がＵＳＰ１１を制御してＨＲを調節することを示唆する。
【０２２８】
実施例３
ＫＥＡＰ１の遺伝的にコードされた阻害剤はＧ１細胞内で相同組換えを促進することができる
Ｇ１細胞内での遺伝子ターゲティングの活性化は、５３ＢＰ１の除去、ＣｔＩＰ−Ｔ８４７Ｅの導入及びＰＡＬＢ２とＢＲＣＡ１との間の相互作用を必要とし、これはＫＥＡＰ１を除去することによって達成することができる。Ｇ１及び非分裂細胞内でのＨＲの活性化を可能にするシステムを開発するために、ＫＥＡＰ１  ｓｉＲＮＡがＫＥＡＰ１の阻害剤で置換することができるかどうかを決定した。Ｒ１と命名され、フィブロネクチン３（ＦＮ３）足場に基づく、最近記載されたＫＥＡＰ１の遺伝的にコードされた高親和性阻害剤を選択した（４４）。ＬＭＮＡ遺伝子ターゲティングアッセイ（４５）を、Ｇ１期で同期化した５３ΒΡ１ΔＵ２ＯＳ細胞で行い、そのＦＮ３対照のトランスフェクションでは生じないが、Ｒ１  ＫＥＡＰ１阻害剤のトランスフェクションにより、少ないにもかかわらず遺伝子ターゲティングのロバストな活性化及びＫＥＡＰ１枯渇をもたらした（図１６）。ＫＥＡＰ１の阻害は、非分裂細胞内でのＨＲの活性化にとって好都合な経路であり得る。
【０２２９】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、そのような実施形態は、本発明の一態様の単なる例示として意図され、任意の機能的に等価な実施形態は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０２３０】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照によりその全体が組み込まれることを具体的かつ個別に示したのと同程度に、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その中に報告され、本発明と関連して使用され得る方法論、試薬などを説明及び開示する目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきものは何もない。
【０２３１】
【表１】
2018512393.tif 000003
【０２３２】
参考文献
１．  Ｊａｓｉｎ，  Ｍ．  ＆  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  Ｒ．  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５，  ａ０１２７４０，  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１２７４０  （２０１３）．
２．  Ｈａｒｔｌｅｒｏｄｅ，  Ａ．，  Ｏｄａｔｅ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｍ，  Ｉ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．  ＆  Ｓｃｕｌｌｙ，  Ｒ．  Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｔｉｇｈｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｉ−ＳｃｅＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ１６５０１，  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１６５０１  （２０１１）．
３．  Ｒｏｔｈｋａｍｍ，  Ｋ．，  Ｋｒｕｇｅｒ，  Ｉ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｌ．  Ｈ．  ＆  Ｌｏｂｒｉｃｈ，  Ｍ．  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３，  ５７０６−５７１５  （２００３）．
４．  Ｋａｓｐａｒｅｋ，  Ｔ．  Ｒ．  ＆  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，  Ｔ．  Ｃ．  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ，  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２，  ８８６−８９７，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１１．１０．００７  （２０１１）．
５．  Ｐａｎｉｅｒ，  Ｓ．  ＆  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  Ｄ．  Ｐｕｓｈ  ｂａｃｋ  ｔｏ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｂｅｔｔｅｒ：  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６５９  （２０１３）．
６．  Ｍａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＡＬＢ２  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＫＥＡＰ１  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ＮＲＦ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３２，  １５０６−１５１７，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＣＢ．０６２７１−１１  （２０１２）．
７．  Ｇｅｎｓｃｈｉｋ，  Ｐ．，  Ｓｕｍａｒａ，  Ｉ．  ＆  Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｅ．  Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＣＵＬＬＩＮ３−ＲＩＮＧ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅｓ  （ＣＲＬ３ｓ）：  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ３２，  ２３０７−２３２０，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｂｏｊ．２０１３．１７３  （２０１３）．
８．  Ｒｏｙ，  Ｒ．，  Ｃｈｕｎ，  Ｊ．  ＆  Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｓ．  Ｎ．  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２：  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，  ６８−７８，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ３１８１  ｎｒｃ３１８１  ［ｐｉｉ］  （２０１１）．
９．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｌ．  ＆  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌｉｎｋｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ１  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，  ｄｏｉ：Ｓ０９６８−０００４（１２）０００９２−８  ［ｐｉｉ］  １０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１２．０６．００７  （２０１２）．
１０．  Ｐａｒｋ，  Ｊ．  Ｙ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．  ＆  Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ，  Ｐ．  Ｒ．  ＰＡＬＢ２：  Ｔｈｅ  ｈｕｂ  ｏｆ  ａ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４６，  ２６３−２７５，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２０１４．０６．００３  （２０１４）．
１１．  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ｂ．  Ｐ．，  Ｊｏｄｅｌｋａ，  Ｆ．  Ｍ．  ＆  Ｎｕｎｅｚ，  Ｒ．  ＢＲＣＡ１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｓＤＮＡ  ｂｙ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，  ５１８１−５１８９，  ｄｏｉ：６６／１０／５１８１  ［ｐｉｉ］  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０５−３２０９  （２００６）．
１２．  Ｓｔａｒｋ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｏｈ，  Ｊ．，  Ｐａｓｔｉｎｋ，  Ａ．  ＆  Ｊａｓｉｎ，  Ｍ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，  ９３０５−９３１６，  ｄｏｉ：２４／２１／９３０５  ［ｐｉｉ］  １０．１１２８／ＭＣＢ．２４．２１．９３０５−９３１６．２００４  （２００４）．
１３．  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＡＬＢ２  ｌｉｎｋｓ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９，  ５２４−５２９，  ｄｏｉ：Ｓ０９６０−９８２２（０９）００７２３−４  ［ｐｉｉ］  １０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２００９．０２．０１８  （２００９）．
１４．  Ｓｙ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｈｕｅｎ，  Ｍ．  Ｓ．  ＆  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  ＰＡＬＢ２  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｐ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，  ７１５５−７１６０，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１１１５９１０６  （２００９）．
１５．  Ｓｉｍｈａｄｒｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｌｅ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｄｅｆｅｃｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ＢＲＣＡ１−ＰＡＬＢ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９，  ２４６１７−２４６２９，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．５６６１４１  （２０１４）．
１６．  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ａ．，  Ｅａｒ，  Ｕ．  Ｓ．，  Ｋｏｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｈ．，  Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，  Ｒ．  Ｒ．  ＆  Ｂｉｓｈｏｐ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ＢＲＣＡ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｒａｄ５１  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，  ２３８９９−２３９０３，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｃ０００２７６２００  ［ｐｉｉ］  （２０００）．
１７．  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．，  Ｂｉｃｋ，  Ｇ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．  Ｙ．  ＆  Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ，  Ｐ．  Ｒ．  ＭＤＣ１  ａｎｄ  ＲＮＦ８  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ＢＲＣＡ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡＬＢ２  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２５，  ６０４９−６０５７，  ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．１１１８７２  （２０１２）．
１８．  Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ−Ｄｉａｚ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ５３ＢＰ１−ＲＩＦ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ１−ＣｔＩＰ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｃｈｏｉｃｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ４９，  ８７２−８８３，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１３．０１．００１  （２０１３）．
１９．  Ｆｅｎｇ，  Ｌ．，  Ｆｏｎｇ，  Ｋ．  Ｗ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．，  Ｗａｎｇ，  Ｗ．  ＆  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  ＲＩＦ１  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ＢＲＣＡ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８８，１１１３５−１１１４３，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４５７４４０  （２０１３）．
２０．  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  ＲＩＦ１  Ｉｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ５３ＢＰ１−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｒｅａｋ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，  ｄｏｉ：Ｓ１０９７−２７６５（１３）００００３−８  ［ｐｉｉ］  １０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１３．０１．００２  （２０１３）．
２１．  Ｂｕｎｔｉｎｇ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ５３ＢＰ１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｒｃａ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｒｅａｋｓ．  Ｃｅｌｌ  １４１，  ２４３−２５４，  ｄｏｉ：Ｓ００９２−８６７４（１０）００２８５−０［ｐｉｉ］  １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０３．０１２  （２０１０）．
２２．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｌｏｔｔｅｒｓｂｅｒｇｅｒ，  Ｆ．，  Ｂｕｏｎｏｍｏ，  Ｓ．  Ｂ．，  Ｓｆｅｉｒ，  Ａ．  ＆  ｄｅ  Ｌａｎｇｅ，  Ｔ．  ５３ＢＰ１Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＤＳＢ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｉｆ１  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ５’  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｄｏｉ：ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１５７３  ［ｐｉｉ］１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１５７３  （２０１３）．
２３．  Ｔａｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ５３ＢＰ１  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄａｍａｇｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２４９９  （２０１３）．
２４．  Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，  Ｈ．  ＆  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １６，  １２３−１４０，  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２４４３．２０１０．０１４７３．ｘ  （２０１１）．
２５．  Ｓｏｗａ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｇｙｇｉ，  Ｓ．  Ｐ．  ＆  Ｈａｒｐｅｒ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ．  Ｃｅｌｌ  １３８，  ３８９−４０３，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００９．０４．０４２  （２００９）．
２６．  Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，  Ａ．  Ｒ．，  Ａｐｇａｒ，  Ｓ．，  Ｄｏｌｉｏｓ，  Ｇ．，  Ｗａｎｇ，  Ｒ．  ＆  Ａａｒｏｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．  ＢＲＣＡ２  ｉｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＵＳＰ１１，  ａ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，  ７４４４−７４５５，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＣＢ．２４．１７．７４４４−７４５５．２００４  ２４／１７／７４４４  ［ｐｉｉ］  （２００４）．
２７．  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，  Ｔ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＰＡＲＰ）  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １１  （ＵＳＰ１１）  ａｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １４５６５−１４５７１，  ｄｏｉ：Ｍ１１０．１０４７４５  ［ｐｉｉ］  １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０．１０４７４５  （２０１０）．
２８．  Ｅｎｃｈｅｖ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ｓｃｈｕｌｍａｎ，  Ｂ．  Ａ．  ＆  Ｐｅｔｅｒ，  Ｍ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ：  ｂｅｙｏｎｄ  ｃｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ  ｌｉｇａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，  ３０−４４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３９１９  （２０１５）．
２９．  Ｙａｍａｎｅ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＲＰＡ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ５’−３’  ＤＮＡ−ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓ−Ｇ２／Ｍ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ３，  １３８−１４７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．１２．００６  （２０１３）．
３０．  Ｈｕｅｒｔａｓ，  Ｐ．  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｈｕｍａｎ  ＣｔＩＰ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４，  ９５５８−９５６５，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０８９０６２００  （２００９）．
３１．  Ｆｒａｄｅｔ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ５３ＢＰ１  ｉｓ  ａ  ｒｅａｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈ２Ａ  Ｌｙｓ  １５  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｍａｒｋ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ５０−５４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３１８  （２０１３）．
３２．  Ｅｎｃｈｅｖ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ａ．，  Ｂｅｕｒｏｎ，  Ｆ．  ＆  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅ．  Ｐ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＣＯＰ９  ｓｉｇｎａｌｏｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ２６Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｌｉｄ  ａｎｄ  ｅＩＦ３．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １８，  ５１８−５２７，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２０１０．０２．００８  （２０１０）．
３３．  Ｒａｎ，  Ｆ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８，２２８１−２３０８，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１３．１４３  （２０１３）．
３４．  Ｘｉａ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＢＲＣＡ２  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｒｔｎｅｒ，  ＰＡＬＢ２．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７１９−７２９，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００６．０５．０２２  （２００６）．
３５．  Ｏｒｔｈｗｅｉｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｔｏ  ｇｕａｒｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，  １８９−１９３，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４８０２４  （２０１４）．
３６．  Ｐａｎｉｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｎｄｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅｓ  ｏｒｇａｎｉｚｅ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ４７，  ３８３−３９５，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０５．０４５  （２０１２）．
３７．  Ｊｕａｎｇ，  Ｙ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  ＯＴＵＢ１  ｃｏ−ｏｐｔｓ  Ｌｙｓ４８−ｌｉｎｋｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｅ２  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４５，  ３８４−３９７，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０１．０１１  Ｓ１０９７−２７６５（１２）０００７７−９  ［ｐｉｉ］  （２０１２）．
３８．  Ｃｕｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ／ＮＥＤＤ８  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  １２１５−１２１８，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１９３８４４  （２０１０）．
３９．  Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，  Ｉ．  Ａ．，  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｊ．，  Ｅｉｆｌｅｒ，  Ｋ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｊ．  Ｖ．  ＆  Ｖｅｒｔｅｇａａｌ，  Ａ．  Ｃ．  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  １１  （ＵＳＰ１１）  Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｍａｌｌ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  （ＳＵＭＯ）−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃｈａｉｎｓ  ｔｏ  Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔ  ＲＩＮＧ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  （ＲＮＦ４）．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９０，  １５５２６−１５５３７，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．６１８１３２  （２０１５）．  
４０．  Ｌｏｎｇ，  Ｌ．，  Ｆｕｒｇａｓｏｎ，  Ｍ．  ＆  Ｙａｏ，  Ｔ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｉｍｉｃｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７０，  １３４−１３８，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１４．０７．００６  （２０１４）．
４１．  Ｙｉｎ，  Ｌ．，  Ｋｒａｎｔｚ，  Ｂ．，  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｎ．  Ｓ．，  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｓ．  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｄ．  Ｎｏｎｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，  １０００１−１００１０  （２０００）．
４２．          Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｘｉｏｎｇ，  Ｙ．  （２００９）．  ＣＲＬ４ｓ：  ｔｈｅ  ＣＵＬ４−ＲＩＮＧ  Ｅ３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３４，  ５６２−５７０．
４３．          Ｍｏｙｎａｈａｎ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｊ．Ｗ．，  Ｋｏｌｌｅｒ，  Ｂ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｊａｓｉｎ，  Ｍ．  （１９９９）．  Ｂｒｃａ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４，  ５１１−５１８．
４４．          Ｇｕｎｔａｓ，  Ｇ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｍｕｌｖａｎｅｙ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｃｌｏｅｒ，  Ｅ．Ｗ．，  Ｔｒｉｐａｔｈｙ，  Ａ．，  Ｌａｎｅ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｍａｊｏｒ，  Ｍ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｋｕｈｌｍａｎ，  Ｂ．  （２０１６）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＫＥＡＰ１−ＮＲＦ２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｄｅｓｉｇｎ  ＆  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ：  ＰＥＤＳ  ２９，  １−９．
４５．  Ｐｉｎｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｌｓｍａｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌｌａｉｒｅ，  Ｇ．  （２０１５）．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ’ｋｎｏｃｋ−ｉｎ’  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｏｃｔ  ３０；４３（１９）：９３７９−９２．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ９９３．  Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｏｃｔ  １．
【図１ａ】
2018512393.tif 000004
【図１ｂ】
2018512393.tif 000005
【図１ｃ】
2018512393.tif 000006
【図１ｄ】
2018512393.tif 000007
【図１ｅ】
2018512393.tif 000008
【図２ａ】
2018512393.tif 000009
【図２ｂ】
2018512393.tif 000010
【図２ｃ】
2018512393.tif 000011
【図２ｄ】
2018512393.tif 000012
【図３ａ】
2018512393.tif 000013
【図３ｂ】
2018512393.tif 000014
【図３ｃ】
2018512393.tif 000015
【図３ｄ】
2018512393.tif 000016
【図３ｅ】
2018512393.tif 000017
【図３ｆ】
2018512393.tif 000018
【図３ｇ】
2018512393.tif 000019
【図４ａ】
2018512393.tif 000020
【図４ｂ】
2018512393.tif 000021
【図４ｃ】
2018512393.tif 000022
【図４ｄ】
2018512393.tif 000023
【図４ｅ】
2018512393.tif 000024
【図４ｆ】
2018512393.tif 000025
【図５ａ】
2018512393.tif 000026
【図５ｂ】
2018512393.tif 000027
【図５ｃ】
2018512393.tif 000028
【図５ｄ】
2018512393.tif 000029
【図５ｅ】
2018512393.tif 000030
【図６ａ】
2018512393.tif 000031
【図６ｂ】
2018512393.tif 000032
【図６ｃ】
2018512393.tif 000033
【図６ｄ】
2018512393.tif 000034
【図６ｅ】
2018512393.tif 000035
【図６ｆ】
2018512393.tif 000036
【図７ａ】
2018512393.tif 000037
【図７ｂ】
2018512393.tif 000038
【図７ｃ】
2018512393.tif 000039
【図７ｄ】
2018512393.tif 000040
【図７ｅ】
2018512393.tif 000041
【図７ｆ】
2018512393.tif 000042
【図８ａ】
2018512393.tif 000043
【図８ｂ】
2018512393.tif 000044
【図８ｃ】
2018512393.tif 000045
【図８ｄ】
2018512393.tif 000046
【図８ｅ】
2018512393.tif 000047
【図９ａ】
2018512393.tif 000048
【図９ｂ】
2018512393.tif 000049
【図９ｃ】
2018512393.tif 000050
【図９ｄ】
2018512393.tif 000051
【図９ｅ】
2018512393.tif 000052
【図９ｆ】
2018512393.tif 000053
【図１０ａ】
2018512393.tif 000054
【図１０ｂ】
2018512393.tif 000055
【図１０ｃ】
2018512393.tif 000056
【図１１ａ】
2018512393.tif 000057
【図１１ｂ】
2018512393.tif 000058
【図１１ｃ】
2018512393.tif 000059
【図１１ｄ】
2018512393.tif 000060
【図１１ｅ】
2018512393.tif 000061
【図１１ｆ】
2018512393.tif 000062
【図１１ｇ】
2018512393.tif 000063
【図１２ａ】
2018512393.tif 000064
【図１２ｂ】
2018512393.tif 000065
【図１２ｃ】
2018512393.tif 000066
【図１２ｄ】
2018512393.tif 000067
【図１２ｅ】
2018512393.tif 000068
【図１２ｆ】
2018512393.tif 000069
【図１２ｇ】
2018512393.tif 000070
【図１２ｈ】
2018512393.tif 000071
【図１３ａ】
2018512393.tif 000072
【図１３ｂ】
2018512393.tif 000073
【図１３ｃ】
2018512393.tif 000074
【図１３ｄ】
2018512393.tif 000075
【図１３ｅ】
2018512393.tif 000076
【図１４ａ】
2018512393.tif 000077
【図１４ｂ】
2018512393.tif 000078
【図１５ａ】
2018512393.tif 000079
【図１５ｂ】
2018512393.tif 000080
【図１５ｃ】
2018512393.tif 000081
【図１６】
2018512393.tif 000082
【配列表】
2018512393000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512393000001.app
【国際調査報告】
2018512393.tif 000157
2018512393.tif 000158
2018512393.tif 000159
2018512393.tif 000160
2018512393.tif 000161
2018512393.tif 000162