(57)【要約】  本発明は、プロトキシン−ＩＩ変異体、プロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを製造及び使用する方法に関する。
2018512123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、前記ＩＣ50値が、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定され、前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、Ｗ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ置換を有し、残基番号付けが、配列番号１に従う、前記単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項２】
配列：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＸ4Ｘ5ＷＸ6ＱＸ7ＣＸ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14ＦＸ15ＣＸ16ＬＷＣＸ17ＫＫＬＬ（配列番号４３２）を含み、
Ｘ1は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ2は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ、又はＹであり、
Ｘ4は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ6は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ7は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ9は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ12は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ13は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ14は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ15は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ16は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ17は、Ｋ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を有し、
前記ポリペプチドが、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、前記ＩＣ50値が、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、請求項１に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項３】
前記Ｎ末端伸長が、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、若しくは３８５のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項４】
前記Ｃ末端伸長が、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、若しくは３９７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項５】
前記Ｎ末端及び／又は前記Ｃ末端伸長が、リンカーを介して前記プロトキシン−ＩＩ変異体に共役される、請求項３又は４に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項６】
前記リンカーが、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１、又は４０２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項７】
配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、又は４３１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項８】
ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０-8Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項９】
ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０-8Ｍ〜約１×１０-9ＭのＩＣ50値で阻害する、請求項８に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ1Ｘ2ＷＸ3ＱＸ4ＣＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9ＣＣＸ10Ｘ11ＦＸ12ＣＸ13ＬＷＣＸ14ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含み、
Ｘ1は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ2は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ3は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ4は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ5は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ6は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ7は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ9は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ11は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ12は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ13は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ14は、Ｋ又はＲである、請求項８又は９に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１１】
配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２、３３５、４０８、４０９、４１０、４２２、４２４、４２５、４２６、４２７、及び４２８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１２】
単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性であるアミノ酸配列を含み、
前記プロトキシン−ＩＩ変異体は、残基番号付けが配列番号１に従うときに、７位にＱ及び３０位にＬを有し、
前記ポリペプチドが、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、前記ＩＣ50値が、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１３】
遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド、又はブチルアミド基を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１４】
半減期延長部分に共役されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離融合タンパク質。
【請求項１５】
前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｆｃ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１２又は１５に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
単離プロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記プロトキシン−ＩＩ変異体を回収することとを含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
被験対象におけるＮａｖ１．７媒介疼痛を治療する方法であって、前記疼痛を治療するために、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
疼痛が、慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、術後疼痛、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する疼痛、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、又は多発性硬化症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験対象が、ヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
治療を必要とする被験対象における疼痛の治療における使用のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質。
【請求項２７】
疼痛が、慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、術後疼痛、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する疼痛、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、又は多発性硬化症である、請求項２６に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項２８】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢投与される、請求項２６又は２７に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項２９】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所投与される、請求項２８、３０、又は３１に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１５年３月３日に出願された米国特許仮出願第６２／１２７，３３９号に対する優先権の利益を主張し、その出願の開示内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、プロトキシン−ＩＩ変異体、それをコードする合成ポリヌクレオチド、並びにそれらを製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-Gated Sodium Channel）（ＶＧＳＣ）は、心筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在している。神経細胞では、ナトリウムチャネルは、閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャンネル機能が種々の医学的障害の根底にあると考えられており（Ｈｕｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１：２４３５〜４５、２００２）、そうした医学的障害としては、例えば、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ５：５８９〜６０２、２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ−Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ２１：１０７〜１５、２０１０）、ミオトニー（Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１２０：８０〜３、２０１０）、及び疼痛（Ｃｒｅｇｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ５８８：１８９７〜９０４、２０１０）が挙げられる。ナトリウムチャネルは、一般的に種々のサブユニットの複合体であり、その主要なものは、単独で機能するのに十分なポア形成αサブユニットである。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャンネルαサブユニットのファミリーの９つの既知のメンバーが、ヒトに存在し、Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９である。Ｎａｖ１．ｘサブファミリーは、２つのグループ、テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性及びＴＴＸ耐性に薬理学的に細分され得る。Ｎａｖ１．７（別名ＰＮ１又はｈＮＥ）は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によってコード化され、ＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンにおいて発現される。Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルとして機能する。
【０００５】
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、種々の疼痛状態に関係している。男性では、Ｎａｖ１．７の機能獲得型変異が、肢端紅痛症（ＰＥ）（四肢の焼けるような疼痛及び炎症を特徴とする疾患）（Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ４１：１７１〜４、２００４）、並びに発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４、２００６）に関連している。この観察と一致して、非選択性ナトリウムチャンネル遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンによって、これらの疼痛を伴う疾患の症状緩和を提供することができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ−Ｃｒｅｓｐｅｌら、Ａｎｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  １３０：４２９〜３３、２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４、２００６）。
【０００６】
ヒトにおけるＮａｖ１．７の機能喪失型突然変異は、疼痛刺激に対する完全な無感受性又は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）を引き起こす（Ｃｏｘら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：８９４〜８，２００６；Ｇｏｌｄｂｅｒｇらｅ、Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ７１：３１１〜９，２００７；Ａｈｍａｄら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２１１４〜２１，２００７）。
【０００７】
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型は、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性の増大に関係している。例えば、ヒトＮａｖ１．７におけるＲ１１５０Ｗ置換に至る多型ｒｓ６７４６０３０が、変形性関節症の疼痛、腰部椎間板切除術の疼痛、幻想痛、及び膵炎の疼痛に関係している（Ｒｅｉｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：５１４８〜５３、２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ突然変異Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンは、脱分極に応じた発生頻度を増加させた（Ｅｓｔａｃｉｏｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ６６：８６２〜６、２００９）。線維筋痛の無効形態は、ＳＣＮ９Ａナトリウムチャンネル多型ｒｓ６７５４０３１に関係しており、激しい線維筋痛を伴う患者の中には後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有するものがあり得ることを示している。（Ｖａｒｇａｓ−Ａｌａｒｃｏｎら、ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ１３：２３、２０１２）。
【０００８】
マウスでは、侵害受容ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａ遺伝子が欠失すると、機械的疼痛及び熱痛の閾値が下がり、並びに炎症性疼痛応答が下がるか又は停止する（Ｎａｓｓａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２７０６〜１１、２００４）。すべての感覚ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａを除去したら、機械的疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する反射逃避応答が停止した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの両方においてＳＣＮ９Ａを欠失させると、機械的疼痛、熱痛、及び神経障害性疼痛が停止し、Ｎａｖ１．７機能喪失型変異によってヒトに見られる無痛表現型が繰り返された（Ｍｉｎｅｔｔら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：７９１、２０１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、種々の疾患に伴う広範な疼痛の治療に有用であり得る。
【０００９】
クモ毒には、フエントキシン−ＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１、２００２）、プロトキシン−Ｉ、プロトキシン−ＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：１４７３４〜４７、２００２）、及びフリクソトキシン−ＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６９：４１９〜２９、２００６）を含む、多数のナトリウムチャンネル遮断ペプチドが含まれていることが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
広範囲の疼痛の適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬を特定することが必要とされている。具体的には、他の電位依存性ナトリウムチャンネルイソ型に勝るＮａｖ１．７に対する選択性を有する、新しいＮａｖ１．７遮断薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であり、プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定され、プロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ置換を有する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０又は４３１のアミノ酸配列を含む、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、残基番号付けが配列番号１に従うときに、７位にＱ及び３０位にＬを有し、ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、半減期延長部分に共役されている、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離融合タンパク質である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離プロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、本発明の宿主細胞を培養することと、細胞からプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することとを含む、方法である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離プロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、被験対象におけるＮａｖ１．７媒介疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために、有効量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて、３０ｎＭ以下のＩＣ50値でＮａｖ１．７を阻害するプロトキシン−ＩＩ変異体の属アミノ酸配列を示す。残基番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。属配列番号４０３。
【図２Ａ】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ50値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ50（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。
【図２Ｂ】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ50値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ50（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。ＳＥ：標準誤差。
【図３Ａ】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて、３０ｎＭ以下のＩＣ50値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。
【図３Ｂ】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて、３０ｎＭ以下のＩＣ50値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。
【図３Ｃ】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて、３０ｎＭ以下のＩＣ50値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ50（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ50９ａｖ１．７）の比によって計算した。残基番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。
【図４Ａ】ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示す図であり、足逃避潜時の測定を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後１日目（１）に行って評価している。***Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図４Ｂ】ペプチド投与後１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（最大可能効果）（ＭＰＥ％）として表されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示す。*Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図５Ａ】ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）、及びＣＦＡ注入後（０）、及びペプチド投与後１日目（１）のＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における、足逃避潜時の測定によって評価された、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示す。**Ｐ＜０．０１及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図５Ｂ】ペプチド投与後１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示す。*Ｐ＜０．０５及び**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ａ】ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）、及びＣＦＡ注入後（０）、及びペプチド投与後１日目（１）のＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における、足逃避潜時の測定によって評価された、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｂ】ペプチド投与後１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。***Ｐ＜０．００１及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｃ】ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。ＣＦＡ前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ後（０）、及びペプチド投与後１日目（１）の後足の触覚閾値。****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｄ】ペプチド後の１日目のパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表されるＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。***Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図７Ａ】ＣＦＡ前後及びペプチド投与後の種々の時点でのＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における足逃避潜時の測定によって評価されたＣＦＡモデルにおける熱痛覚過敏のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した逆転の時間経過を示す。**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は、化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。
【図７Ｂ】ＣＦＡ前後及びペプチド投与後の種々の時点での触覚閾値の測定によって評価されたＣＦＡモデルにおける触覚異痛症のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した逆転の時間経過を示す。＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は、化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。
【図８】ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによってホットプレート試験において著しい無痛覚が形成されたことを示す。熱逃避潜時の評価を、５０及び５５℃においてポンプ埋め込み前及び後に行った。ポンプ埋め込みは、制御ＰＢＳグループにおける潜時に対して影響はなかった。ポンプ後１日目に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによって治療されたマウスは、ＰＢＳグループと比べて長時間に渡って潜時を示した。*Ｐ＜０．０５及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図９】ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ前処理が、動物をカラギーナン誘発熱痛覚過敏から保護したことを示す。足逃避潜時の測定を、ポンプ前、及びポンプ後１日目で足底内カラギーナン注射前に行った。潜時の再測定を、カラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。
【図１０】野生型プロトキシン−ＩＩのＮＭＲ構造の表面表示を示す。左側の疎水面は、残基Ｗ５、Ｍ６、Ｗ７、Ｌ２３、及びＷ２４を含んでいる。選択性面は、右側に示されており、残基Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９、及びＷ３０を含んでいる。残基番号付けは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ配列番号１に従う。
【図１１Ａ】テールフリック試験における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のプロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、熱刺激に対する尾逃避潜時を測定した。
【図１１Ｂ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表される、テールフリック試験におけるプロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。***Ｐ＜０．００１及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１１Ｃ】ホットプレート試験（５２．５℃）における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のプロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、ホットプレート上での侵害刺激反応潜時を測定した。
【図１１Ｄ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表される、ホットプレート試験におけるプロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。***Ｐ＜０．００１及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１１Ｅ】ホルマリン試験におけるプロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。ラットの後足へのホルマリン注射は、二相性のフリンチング挙動を誘発した。相Ｉ（ホルマリン後０〜１０分）及び相ＩＩ（ホルマリン後１１〜６０分）のフリンチの総数を、自動装置によって測定した。群のサイズが小さいので、Ｅ）では統計は行わなかった。
【図１２Ａ】テールフリック試験における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、熱刺激に対する尾逃避潜時を測定した。
【図１２Ｂ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表される、テールフリック試験におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。*Ｐ＜０．０５及び**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１２Ｃ】ホットプレート試験（５２．５℃）における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、ホットプレート上での侵害刺激反応潜時を測定した。
【図１２Ｄ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表されるホットプレート試験におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。**Ｐ＜０．００１及び****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１２Ｅ】ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。ラットの後足へのホルマリンの注射は、二相性のフリンチング挙動を誘発した。相Ｉ（ホルマリン後０〜１０分）及び相ＩＩ（ホルマリン後１１〜６０分）のフリンチの総数を、自動装置によって測定した。**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、相Ｉ、*Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、相ＩＩ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１３Ａ】テールフリック試験における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、熱刺激に対する尾逃避潜時を測定した。
【図１３Ｂ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表される、テールフリック試験におけるＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を示す。***Ｐ＜０．００５対ＰＢＳ、ｔ検定。
【図１３Ｃ】ホットプレート試験（５２．５℃）における、単回クモ膜下（ＩＴ）投与後のＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を示す。ペプチド投与後の示された時間に、ホットプレート上での侵害刺激反応潜時を測定した。
【図１３Ｄ】単回クモ膜下（ＩＴ）投与後の最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表されるホットプレート試験におけるＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を示す。**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、ｔ検定。
【図１３Ｅ】ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を示す。ラットの後足へのホルマリンの注射は、二相性のフリンチング挙動を誘発した。相Ｉ（ホルマリン後０〜１０分）及び相ＩＩ（ホルマリン後１１〜６０分）のフリンチの総数を、自動装置によって測定した。*Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、相Ｉ、**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、相ＩＩ、ｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含むが、それらに限定されない、すべての刊行物は、参照によりあたかもそれらの全体が記載されているものと同様に、本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２３】
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法が、本発明を実施又は試験するために使用することができるが、例示的な組成物及び方法が、本明細書に記載される。
【００２４】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０アミノ酸を下回る小ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。ポリペプチドは、「タンパク質」と称され得る。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学作用により共有結合されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２６】
「相補配列」という用語は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド第を含む２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
「ベクター」という用語は、生物系内で複製することが可能である、又はそのような系間を移動することができる天然に存在しないポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的には、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にするように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの関心のタンパク質及び追加の要素をコードするｃＤＮＡを含有する。そのような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することが可能である生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であり得る。
【００２８】
「発現ベクター」という用語は、発現ベクター内に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を送るために生物系又は再構成された生物系において用いることができるベクターを意味する。
【００２９】
「変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩポリペプチドとは異なるか、あるいは配列番号１０７の配列を有する野生型プロトキシン−ＩＩのコードを、ヌクレオチド又はアミノ酸の１つ若しくは２つ以上の修飾、例えば、置換、挿入、又は欠失によって行うポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００３０】
本明細書の全体に渡って、プロトキシン−ＩＩ変異体内で置換された残基は、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩにおけるその位置に対応して番号付けされている。例えば、明細書における「Ｙ１Ａ」は、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩにおける位置１に対応する残基位置におけるチロシンとアラニンとの置換を指す。
【００３１】
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、天然の成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列要素の配置を隣接するエクソンと共有する公知の合成ポリヌクレオチドを指し、ゲノムＤＮＡ内に存在する介在するイントロンは取り除かれている。開始剤メチオニンをコードするコドンは、ｃＤＮＡに存在してもしなくてもよい。ｃＤＮＡは、例えば逆転写又は合成遺伝子アセンブリによって合成され得る。
【００３２】
本明細書で使用される「合成」又は「非天然の」とは、自然界に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチド分子を指す。
【００３３】
「Ｎａｖ１．７」（ｈＮＥ又はＰＮ１とも称される）又は「ｈＮａｖ１．７」は、本明細書で使用される場合、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号７９に示す配列を有する公知のヒトナトリウムチャンネルタンパク質タイプ９サブユニットαを指す。
【００３４】
「野生型プロトキシン−ＩＩ」又は「野生型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１（５０）：１４７３４−４７、２００２に記載されているように、アミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を有する、タランチュラＴｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ  ｐｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）毒素ペプチドを指す。
【００３５】
「組み換え型プロトキシン−ＩＩ」又は「組み換え型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号２に示すようなＧＰＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＯＨの配列を有するプロトキシン−ＩＩ融合タンパク質の発現及び以後の切断から得られる組み換え型プロトキシン−ＩＩを指す。組み換え型プロトキシン−ＩＩは、野生型プロトキシン−ＩＩと比較した際、２つのアミノ酸Ｎ末端伸長（残基Ｇ及びＰ）を取り入れている。
【００３６】
「ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する」又は「ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する」は、本明細書で使用される場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイにおいて、約１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50値で、ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン）によって誘発される膜脱分極を低減するための本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の能力であり、ここで、ベラトリジン誘発脱分極は、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール］）をアクセプタとして、またＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）をドナーとして使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現する細胞株において、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起して、ＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することによって、ＦＲＥＴシグナルの減少として測定され、測定は、測定される。
【００３７】
「ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイ」は、本明細書で使用する場合、実施例３で説明するアッセイである。
【００３８】
「実質的に同一である」という用語は、本明細書で使用する場合、比較している２つのプロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列が、同一であるか又は「非実質的な相違」を有するということを意味する。非実質的な相違とは、ペプチド特性に悪影響を与えないプロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列における１、２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸の置換である。本明細書で開示されるプロトキシン−ＩＩ変異体と実質的に同一であるアミノ酸配列は、本出願の範囲内である。一部の実施形態では、配列同一性は、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上とすることができる。同一性パーセントは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、ペアワイズアライメントによって、判定することができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として使用して、公共又は特許データベースに対する検索を実行して、例えば、関連配列を特定してもよい。そのような検索を実行するために使用される例示的なプログラムは、初期設定を使用する、ＸＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）スイートである。
【００３９】
本明細書では、表１に示すような従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを使用する。
【００４０】
【表１】
2018512123.tif 000003
【００４１】
本発明によって、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離プロトキシン−ＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）変異体ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法が提供される。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化に起因する脱分極を阻害するため、疼痛を伴う種々の状態及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用であり得る。
【００４２】
本発明の変異体は、Ｎａｖ１．７の強力阻害剤である。本発明は、プロトキシン−ＩＩ中のある残基置換が、選択性、合成収率、及び／又は同質性を高めることを、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の効能に悪影響を与えずに行うことを見出したことに少なくとも部分的に基づいており、具体的にはＷ７及びＭ１９、加えて残基Ｙ１及びＳ１１、更に加えて残基Ｅ１２、Ｒ２２及び（残基番号付けは配列番号１に従う）である。例えば、位置Ｗ７及びＷ３０における置換は、プロトキシン−ＩＩ変異体の折り畳み特性を高め、かつ収率を改善する。位置Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９、及びＷ３０における置換は、結果として得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のＮａｖ１．７に対する選択性を向上させる。
【００４３】
本発明の一実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定され、プロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌ置換を有する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＸ4Ｘ5ＷＸ6ＱＸ7ＣＸ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＸＣＣＸ13Ｘ14ＦＸ15ＣＸ16ＬＷＣＸ17ＫＫＬＬ（配列番号４３２）を含み、
Ｘ1は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ2は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ、又はＹであり、
Ｘ4は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ6は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ7は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ9は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ12は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ13は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ14は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ15は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ16は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ17は、Ｋ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００４６】
プロトキシン−ＩＩ位置Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌにおける置換は、結果として得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のリフォールディング及び収率を改善する。
【００４７】
一部の実施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、又は３８５のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、又は３９７のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して共役される。
【００５０】
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１、又は４０２のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、又は３８５のアミノ酸配列からなる。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、又は３９７のアミノ酸配列からなる。
【００５３】
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１、又は４０２のアミノ酸配列からなる。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＸ4Ｘ5ＷＸ6ＱＸ7ＣＸ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14ＦＸ15ＣＸ16ＬＷＣＸ17ＫＫＬＷ（配列番号４０３）を含み、
Ｘ1は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ2は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ、又はＹであり、
Ｘ4は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ6は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ7は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ9は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ12は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ13は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ14は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ15は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ16は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ17は、Ｋ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００５５】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、強力なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換え型プロトキシン−ＩＩ（配列番号２）は、実施例３で説明する実験の詳細を使用して、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞において、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の減少を測定する、ベラトリジン誘発脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約４×１０-9Ｍである。プロトキシン−ＩＩ変異体は、前述したアッセイ及び実験３におけるＩＣ50値が約３０×１０-9Ｍ以下のとき、すなわち組み換え型プロトキシン−ＩＩの１０倍以内であるとき、「強力な」Ｎａｖ１．７阻害剤である。明確にするために、３０×１０-9ＭのＩＣ50は、３．０×１０-8ＭのＩＣ50と同一である。
【００５６】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドは、自動化されたペプチドシンセサイザー上での固相ペプチド合成等の化学合成によって生成されてもよい。代替的に、本発明のポリペプチドは、無細胞発現系、例えば網状赤血球ライセートベースの発現系の使用によって、又は組み換え型の発現系によって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得てもよい。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を理解するであろう。例示的な方法では、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の生成は、それをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質として発現することであって、グリシン−リッチリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号８０）又は（ＧＧＧＧＳ）6（配列番号８１）を、プロテアーゼ切断可能リンカー、例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼに対する認識配列（ヒトライノウイルスからの組み換え型１４  ３Ｃプロテアーゼ）ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号８２）（ＨＲＶ３Ｃリンカー）に結合したものを用いて発現することと、発現された融合タンパク質を、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを用いて切断して組み換え型プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドを放出することと、によって行う。ヘキサヒスチジン（配列番号１０８）又は他のタグを使用して、公知の方法を使用する精製を容易にしてもよい。
【００５７】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書で説明した方法を使用して精製してもよい。例示的な方法では、ＨＳＡ融合タンパク質として発現され、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断された、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書で説明する固相抽出（ＳＰＥ）を使用して精製してもよい。
【００５８】
場合によりＮ末端及び／又はＣ末端伸長を有するプロトキシン−ＩＩ変異体、並びにプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の生成は典型的に、核酸レベルにおいて実現される。ポリヌクレオチドは、米国特許第６，５２１，４２７号及び同第６，６７０，１２７号に記載された方法による化学的遺伝子合成を使用して、所望の変異体を生成するために縮重したオリゴヌクレオチドを用いて、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発によって、合成されてもよい。変異体のライブラリは、標準的なクローニング技術によって生成されて、プロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを、発現用ベクターにクローニングしてもよい。
【００５９】
プロトキシン−ＩＩ変異体には、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、更なるＮ−及び／又はＣ末端アミノ酸を取り入れてもよく、例えばクローニング及び／又は発現方式によって得られる。例えば、ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質として変異体の発現後にＨＳＡから切断すると、更なる２つの残基（例えばＧ及びＰ）が各プロトキシン−ＩＩ変異体のＮ末端に取り入れられる場合がある。
【００６０】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書で説明した方法を使用して、ヒトＮａｖ１．７を阻害するその能力に関して試験される。例示的なアッセイは、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイである。別の例示的なアッセイは、公知のパッチクランプ技術を使用して、また本明細書で説明するように、Ｎａｖ１．７を介した電流の変化を測定するために、電気生理学的な記録を用いる。
【００６１】
本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、アミノ酸配列として、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８  ３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、���２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、又は４３１を含む、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００６２】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７を、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下のＩＣ50で阻害することができる。その範囲のＩＣ50値を示す例示的な変異体は、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、又は４３１に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。
【００６３】
表２、表３、及び表１４は、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の配列を示す。
【００６４】
【表２−１】
2018512123.tif 000004
【００６５】
【表２−２】
2018512123.tif 000005
【００６６】
【表３−１】
2018512123.tif 000006
【００６７】
【表３−２】
2018512123.tif 000007
【００６８】
【表３−３】
2018512123.tif 000008
【００６９】
【表３−４】
2018512123.tif 000009
【００７０】
【表３−５】
2018512123.tif 000010
【００７１】
【表３−６】
2018512123.tif 000011
【００７２】
【表３−７】
2018512123.tif 000012
【００７３】
【表３−８】
2018512123.tif 000013
【００７４】
【表３−９】
2018512123.tif 000014
【００７５】
【表３−１０】
2018512123.tif 000015
【００７６】
一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、約３×１０-8Ｍ以下のＩＣ50値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
【００７７】
一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、約３×１０-8Ｍ〜約１×１０-9ＭのＩＣ50値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
【００７８】
本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、アミノ酸配列：ＧＰＱＣＸ1Ｘ2ＷＸ3ＱＸ4Ｃｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9ＣＣＸ10ｘ11ＦＸ12ＣＸ13ＬＷＣＸ14ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含み、
Ｘ1は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ2は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ3は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ4は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ5は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ6は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ7は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ9は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ11は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ12は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ13は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ14は、Ｋ又はＲである、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００７９】
ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する例示的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、アミノ酸配列として、配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２、３３５、４０８、４０９、４１０、４２２、４２４、４２５、４２６、４２７、及び４２８を含む変異体である。
【００８０】
一部の実施形態では、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、組み換え型プロトキシン−ＩＩ（配列番号２）と比べたときに、Ｎａｖ１．７に対してより選択性である場合がある。ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、組み換え型プロトキシン−ＩＩは、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50は約２．２×１０-9Ｍであり、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ50は約６２×１０-9Ｍであり、したがってＮａｖ１．６に対するＩＣ50対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50の比は、約２８倍である。「選択性」又は「選択性の」又は「より選択性の」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」は、本明細書で使用される場合、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ50対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50の比（ＩＣ50（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７））が約３０以上であるプロトキシン−ＩＩ変異体を指す。Ｎａｖ１．６に対するＩＣ50は、Ｎａｖ１．７に対して説明したものと同様の方法を使用して、Ｎａｖ１．６を安定的に発現する細胞株を使用して、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、アッセイしてもよい。
【００８１】
選選択性を向上させるために突然変異させることができるプロトキシン−ＩＩ内の残基位置には、残基７、１１、１２、１４、１７、１８、及び１９、並びに場合により、残基１、２０、２２、及び２６が含まれる（配列番号１に従う残基番号付け）。選択性を向上させるための例示的な置換は、Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ｒ、Ｓ１１Ａ、Ｅ１２Ｔ、Ｍ１９Ｆ、Ｖ２０Ｓ、Ｒ２２Ｔ、及びＫ２６Ｒである。選択性が向上した例示的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５、又は３２６の変異体である。
【００８２】
本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：ＧＰＸ1ＣＱＫＷＭＱＸ2ＣＤＸ3Ｘ4ＲＫＣＣＸ5ＧＦＸ6ＣＸ7ＬＷＣＸ8ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含み、
Ｘ1は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ、又はＲであり、
Ｘ2は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｒ、又はＡであり、
Ｘ4は、Ｅ、Ｔ、又はＮであり、
Ｘ5は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ6は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ7は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ8は、Ｋ又はＲであり、
プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０-8Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００８３】
一部の実施形態では、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、配列：ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ1ＣＤＸ2Ｘ3ＲＫＣＣＸ4ＧＦＸ5ＣＸ6ＬＷＣＸ8ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ1は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ2は、Ｓ、Ｒ、又はＡであり、
Ｘ3は、Ｅ、Ｔ、又はＮであり、
Ｘ4は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ5は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ6は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ7は、Ｋ又はＲである。
【００８４】
別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
アミノ酸配列は、残基番号付けが配列番号１に従うときに、７位にＱ及び３０位にＬ有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００８５】
置換Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌを有するプロトキシン−ＩＩ変異体は、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、向上した折り畳み特性、収率、及び選択性を有する。
【００８６】
別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号７８（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
アミノ酸配列は、残基番号付けが配列番号１に従うときに、１位にＱ、７位にＱ、及び１９位にＦを有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定され、
ポリペプチドは、Ｎａｖ１．７を選択的に阻害する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００８７】
一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド、又はブチルアミド基を有し、これらは、常用の合成方法を介して生成されている。
【００８８】
本本発明の他の実施形態は、単離融合タンパク質であって、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８  ３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２���、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、又は４３１を含む、単離融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、公知のリーダー若しくは分泌シグナル配列、又は合成配列（例えば、クローニングステップ、又はタグ、例えばヘキサヒスチジンタグ（配列番号１０８）から得られる）であってもよい。このような第２のポリペプチドは、半減期延長部分であってもよい。一実施形態では、単離融合タンパク質は、半減期延長部分に共役された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む。
【００８９】
使用することができる例示的な半減期延長部分には、公知のヒト血清アルブミン、トランスチレチン（ＴＴＲ）、サイロキシン結合グロブリン（ＴＧＢ）、アルブミン結合ドメイン、又はＦｃ若しくはそのフラグメントが含まれる。生物学的に好適なポリマー又はコポリマーを使用してもよく、例えばエチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００、デキストラン、ポリリシン、脂肪酸及び脂肪酸エステル（異なる鎖長の）、例えばラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、オレエート、アラキドネート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサンニ酸、など、オクタン、又は炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ−、又はポリサッカリド）である。これらの部分は、プロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドとの直接融合であってもよく、また標準的なクローニング及び発現技術によって生成してもよい。代替的に、公知の化学的結合法を使用して、部分を本発明の組み換えにより生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体に結合させてもよい。
【００９０】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の半減期延長部分は、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００９１】
別の実施形態では、半減期延長部分は、プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して共役されている。好適なリンカーは公知であり、配列番号８０又は８１に示される配列を有するリンカーが含まれる。
【００９２】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を取り入れている例示的な融合タンパク質は、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、又は１０３のポリペプチド配列を有するものである。
【００９３】
更なる部分を取り入れた本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、いくつかの公知のアッセイによって、官能性に関して比較されもよい。例えば、ＰＥＧに結合されたプロトキシン−ＩＩ変異体の薬物動態学特性は、公知のインビボモデルで評価されてもよい。
【００９４】
更なるプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質は、本発明の範囲内である。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に対する更なる置換を、結果として得られる変異体又は融合タンパク質が、親ペプチドと比べたときに同様の特徴を保持する限り、行うことができる。例示的な修飾は、例えば同類置換であり、親分子のそれと同様の特徴を有するプロトキシン−ＩＩ変異体になる。保存的置換とは、それらの側鎖において関連したアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝子コードされるアミノ酸は、４つのファミリーに分類することができる：（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として共に分類される。又は、アミノ酸のレパートリーを、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニンヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、セリン及びトレオニンは場合により、脂肪族ヒドロキシルとして別個にグループ化される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；及び（６）イオウ含有（システイン及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１）として分類することができる。非同類置換（異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を伴う）をプロトキシン−ＩＩ変異体に施して、プロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすか否かは、本明細書に記載のアッセイを使用して、修飾ポリペプチド又は断片が、非修飾ポリペプチド又は断片と同様の様式で反応を生じる能力を評価することによって、容易に判定され得る。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質（複数の交換が起こる）は、同様に容易に試験することができる。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む単離合成ポリヌクレオチドである。
【００９６】
ある例示的な合成ポリヌクレオチドを本明細書で開示したが、他の合成ポリヌクレオチドとして、与えられた発現系において遺伝子コード又はコドン選択の縮重があるならば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするものも、本発明の範囲内である。例示的な合成ポリヌクレオチドは、例えば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする、配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４に示されるポリヌクレオチド配列である。当業者であれば、プロトキシン−ＩＩ変異体自体をコードする融合タンパク質におけるポリヌクレオチドセグメントを容易に特定することができる。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質をコード化する合成ポリヌクレオチド配列は、目的とする宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモータ及びエンハンサ等の１つ又は２つ以上の調節エレメントに動作可能に結合することができる。合成ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドは、自動化されたポリヌクレオチドシンセサイザー上での化学合成、例えば固相ポリヌクレオチド合成によって生成されてもよい。代替的に、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成されてもよい。既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は取得するための技術は、公知である。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも１つの非コード配列、例えば転写だが非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、マーカー又は公知のタグ配列、例えばヘキサ−ヒスチジン（配列番号１０８）又はＨＡタグ（融合ポリペプチドの精製を容易にする）をコードしてもよい。
【００９９】
本本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的背景に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。例えば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に挿入して、発現ベクター内の制御配列に動作可能に結合して効率的な発現（例えば、シグナル配列、プロモータ（例えば、天然に付随するか又は異種のプロモータ）、エンハンサ要素、及び転写終結配列）を確実にしてもよく、また本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択する。ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、宿主は、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の高レベル発現に好適な条件下で維持される。
【０１００】
好適な発現ベクターは典型的には、エピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするように、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０１０１】
好適なプロモータ及びエンハンサ因子は、当該技術分野において既知である。バクテリア細胞における発現に対して、好適なプロモータとしては、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、及びｔｒｃが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞における発現に対して、好適なプロモータとしては、軽及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモータ及びエンハンサ要素；サイトメガロウイルス即時初期プロモータ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモータ、初期及び後期ＳＶ４０プロモータ、レトロウイルスからの長鎖末端反復配列に存在するプロモータ、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモータ、及び様々な当該技術分野に既知の組織特異的プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。イースト菌における発現に対して、好適なプロモータは、構成的プロモータ、例えばＡＤＨ１  ＰＧＫ１、ＥＮＯ又はＰＹＫ１プロモータなど、又は調節可能なプロモータ、例えばＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモータである。適切なベクター及びプロモータの選択は、十分に当業者のレベル内である。
【０１０２】
数多くの好適なベクター及びプロモータが、当業者に既知であり、多くが、組み換え構築物を生成するために市販されている。例として以下のベクターを提供する。細菌性：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１０３】
プロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の発現用の例示的なベクターは、以下のものを有するベクターである。アンピシリン耐性選択マーカー、ＣＭＶプロモータ、ＣＭＶイントロン、シグナルペプチド、ネオマイシン耐性、複製のｆ１起点、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及び本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体、又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。「宿主細胞」という用語は、ベクターが導入されている細胞を指す。当然のことながら、宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指すことが意図されている。変異又は環境の影響のどちらかにより、特定の修飾が後の世代に起こる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌（archeal）細胞であってよい。
【０１０５】
大腸菌、バチルス、例えばバチルスズブチルス、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ菌、セラチア属、及び種々のシュードモナス種は、原核宿主細胞の例である。酵母などの他の微生物も、発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（例えば、Ｓ．セレビジアエ）及びピキアである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物起源のものでよい。哺乳類真核細胞には、不死化細胞株、例えばハイブリドーマ、又は骨髄腫細胞株、例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株が含まれる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞系としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【０１０６】
ポリヌクレオチド（例えばベクター）を宿主細胞に導入することは、当業者に公知の方法によって行うことができる。例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、顕微注入法、カチオン性脂質を介したトランスフェクション、及び電気穿孔法である。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を生成するための方法であって、本発明の宿主細胞を提供する工程と、宿主細胞を、本発明の少なくとも１つのプロトキシン−ＩＩ変異体の発現にとって十分な条件下で培養する工程と、を含む方法である。
【０１０８】
宿主細胞の培養は、所与のタイプの宿主細胞を維持又は伝搬するのに適しており、かつポリペプチドを発現するのに十分な、任意の条件下で行うことができる。ポリペプチドの発現にとって十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を、適切に緩衝化したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養することができる一方、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気条件下で３７℃で培養することができる。
【０１０９】
本発明の方法において、プロトキシン−ＩＩ変異体の発現は、種々の公知の方法を使用して確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、検出試薬を使用して、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣを使用して、確認することができる。
【０１１０】
本発明の別の態様は、生体組織におけるＮａｖ１．７の活性を調整する方法であり、本方法には、Ｎａｖ１．７を発現する生体組織を、Ｎａｖ１．７調節量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体と接触させることが含まれる。
【０１１１】
治療方法
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、疼痛の症状又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患を治療するか、低減するか、又は緩和するのが望ましい任意の治療において用いてもよい。
【０１１２】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体で治療される疼痛は、任意のタイプの疼痛、例えば慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、炎症状態に付随する疼痛、術後疼痛、熱痛、又は疾患及び変性に付随する疼痛であってもよい。
【０１１３】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体で治療される疼痛は、Ｎａｖ１．７媒介疼痛であってもよい。
【０１１４】
本明細書で使用するＮａｖ１．７媒介疼痛とは、増大したＮａｖ１．７チャネル活性に少なくとも一部起因する疼痛を指す。
【０１１５】
本発明の方法を使用して、任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０１１６】
疼痛及び／又はＮａｖ１．７媒介疼痛は、例えば末梢神経障害、中枢神経障害、神経圧迫又は絞扼性神経障害、例えば手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経圧迫、圧迫性神経根症、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫性神経根症及び神経根下背部痛、脊髄根損傷、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症性疾患、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、汎胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に付随する疼痛、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛及び付随する痛覚過敏及び異痛症、神経障害性疼痛及び付随する痛覚過敏及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病神経障害性疼痛、灼熱痛、切断又は膿瘍に由来する疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又は他の異質粒子又は分子に対する暴露、浸潤癌、癌、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損症、歯痛、痛風の疼痛、線維筋痛、脳炎、慢性アルコール中毒、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏、三叉神経痛、脳卒中、視床症候群、一般的頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管症候群及び非血管症候群、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、ぜんそく、上皮組織損傷又は機能障害、呼吸時の内臓運動能の障害、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、血管運動神経性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、労働及び送達中の疼痛、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１つ又は２つ以上の原因に由来し得る。
【０１１７】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体によって緩和され得る感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能障害の他の疾患には、掻痒、咳、及びぜんそくが含まれる。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体欠失が生じると、ヒスタミン誘発性そう痒に対する完全無感覚に至る（Ｇｉｎｇｒａｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０１３及び米国特許出願公開第２０１２／０１８５９５６号）。この発見は、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、掻痒の治療において有用であり得るということを示唆し、この掻痒は、皮膚若しくは炎症性疾患；又は炎症性疾患例えば腎臓若しくは肝胆汁性疾患、免疫学的疾患、薬物反応及び未知／特発の状態、例えば、皮膚炎、乾癬、湿疹、昆虫刺傷若しくは咬傷等の種々の原因によって生じ得る。また、Ｎａｖ１．７は、気道に神経を分布させる感覚神経において発現され（Ｍｕｒｏｉら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年１２月１日；５８９（Ｐｔ  ２３）：５６６３−７６；Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３年４月１０日）、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、咳、例えば、急性又は慢性咳、あるいは胃食道逆流疾患からの炎症によって生じる咳、及び気道の炎症性疾患、例えばぜんそく及びアレルギー関連の免疫応答、気管支けいれん、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及びしゃっくり（hiccups）（しゃっくり（hiccoughs）、しゃっくり（singultus））の治療において有用であり得ることを示唆している。ｓｈＲＮＡを使用してモルモットの節状神経節内のＮａｖ１．７をインビボでサイレンシングすることによって、機械的プロービングによって誘発される咳反射がほぼ停止した（Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３年４月１０日）。
【０１１８】
本発明の一態様は、被験対象における掻痒、咳、又はぜんそくを緩和又は治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、掻痒、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。
【０１１９】
本発明の別の態様は、被験対象におけるＮａｖ１．７媒介掻痒、Ｎａｖ１．７媒介咳、又はＮａｖ１．７媒介ぜんそくを緩和又は治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、掻痒、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。
【０１２０】
Ｎａｖ１．７媒介掻痒は、本明細書で使用される場合、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来する掻痒を指す。
【０１２１】
Ｎａｖ１．７媒介咳が、本明細書で使用される場合、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来する咳を指す。
【０１２２】
Ｎａｖ１．７媒介ぜんそくが、本明細書で使用される場合、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来するぜんそくを指す。
【０１２３】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、疼痛及び／又はＮａｖ１．７媒介疼痛の低減又は緩和の効果に関して、本明細書で説明した動物モデル、及び神経障害性疼痛のラット脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデル、カラギーナン誘発異痛症モデル、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発異痛症モデル、熱傷モデル、ホルマリンモデル及びＢｅｎｎｅｔｔモデルなどのモデル、並びに米国特許出願第２０１１／０１２４７１１号及び米国特許第７，９９８，９８０号に記載された他のモデルを使用して、試験されてもよい。カラギーナン誘発異痛症及びＣＦＡ誘発異痛症は、炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
【０１２４】
前述の動物モデルのいずれかを使用して、疼痛及び／又はＮＡｖ１．７媒介疼痛の治療における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体阻害剤の有効性を評価してもよい。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の有効性を、無治療又はプラシーボ対照に対して比べてもよい。付加的に又は代替的に、有効性の評価を１つ又２つ以上の既知の鎮痛薬剤に対して行ってもよい。
【０１２５】
本発明は、Ｎａｖ１．７媒介疼痛を本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を使用して治療する方法を提供する。本発明者らによる係属中の出願（米国特許出願第６１／７８１，２７６号）において、Ｎａｖ１．７遮断ペプチドを投与することは、疼痛の種々の動物モデルにおける疼痛を治療及び／又は緩和するのに効果的であり、文献に開示及び示唆されたこととは反対であることが見出されている。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、過剰発現のＮａｖ１．７を使用するか又は単離ニューロン（血液神経関門が、デシーシング又は高張食塩水注射を通して破壊される）上でのインビトロ細胞培養モデルでは、強力及び／又はＮａｖ１．７に対して選択的であることが示されているが、疼痛のインビボ動物モデルでは非効果的であることがこれまで証明されており、有効性がないことは、ペプチドが血液神経関門を通ることができないことに由来することが報告されている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えばＨａｃｋｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０９：Ｅ２０１８−２７、２０１２には、ＰｒｏＴｘ−ＩＩが単離神経における活動電位発火を阻害することは、神経周囲関門（このモデルにおける拡散障壁となる）が危うくならない限り、できないことが記載されている。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、急性及び炎症性疼痛のげっ歯類モデルにおいて非効果的であることが分かった。有望な説明によれば、ＰｒｏＴｘ−ＩＩは血液神経関門を横断することはできないと言われていた（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４、２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断薬は、経口バイオアベイラビリティが不十分であり、神経終末まで送達するのは困難であることが提言されおり、それらを治療薬として使用することは限定されていることを示唆する（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４、４９〜６２、２０１３）。
【０１２６】
Ｎａｖ１．７の発現は、末梢神経系において、例えば、侵害受容後根神経節（ＤＲＧ）において、とりわけ侵害受容小直径ＤＲＧニューロンにおいて、詳細には、皮膚内の末梢端において、脳内表現がほとんどない状態で行われる。Ｎａｖ１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が疼痛刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
【０１２７】
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７媒介疼痛を治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、Ｎａｖ１．７媒介疼痛を治療するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。
【０１２８】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体Ｎａｖ１．７を、Ｎａｖ１．７媒介疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患を治療することが望まれる任意の治療において用いてもよい。疼痛を「治療する」又は「治療」は、疼痛の知覚を防止するか、停止するか、阻害するか、低減するか、又は遅延することを部分的又は完全に含むことが意図されている。
【０１２９】
一部の実施形態では、Ｎａｖ１．７媒介疼痛は、慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、術後疼痛、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する疼痛、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷若しくは多発性硬化症、又は疾患及び変性に付随する疼痛である。
【０１３０】
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。また慢性的な背痛、変形性関節症、及び癌などの状態は、神経障害性関連疼痛の生成に至る場合があり、したがって潜在的に、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体での治療に適している。
【０１３１】
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７媒介疼痛は、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎、又は線維筋痛症に伴うものである。
【０１３２】
本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を第２のポリペプチドに共役して、融合タンパク質を形成してもよい。このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド阻害剤の半減期を延長するヒト血清アルブミンに対する公知のＦｃ融合又は融合である。共役は、グリシン−セリンリッチリンカー等のリンカーを介した直接共役であってもよい。このようなリンカーは、当該技術分野では公知である。更なる部分を取り入れている本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、そのＮａｖ１．７遮蔽能力、並びに公知の方法及び本明細書で説明した方法を使用して疼痛を治療又は低減することにおける有効性に対して比較されてもよい。
【０１３３】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体で治療することができる感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能障害の他の疾患としては、ぜんそく、咳、胸焼け、掻痒、皮膚炎、膀胱不安定性、及びＲｅｙｎａｕｄの疾患が挙げられる。
【０１３４】
医薬組成物
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、薬学的に許容されるビヒクル又は担体中で製剤化されてもよい。本発明の一実施形態は、本発明の単離プロトキシン−ＩＩ変異体と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物である。
【０１３５】
好適なビヒクル又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の公知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、並びに着色剤などの、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される賦形剤を含有することができる。好適なビヒクル、並びにそれらの製剤及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４０  ａｎｄ  ４１）に述べられている。
【０１３６】
本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を末梢投与によって投与してもよい。「末梢投与」又は「末梢投与される」とは、中枢神経系の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
【０１３７】
末梢投与は、局所的又は全身的であってよい。関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器等）、又は炎症組織への局所投与などの局所投与を使用して、治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与では、医薬組成物は被験対象の末梢神経系のほぼ全体に送達されることになり、更に組成物の性質によっては中枢神経系にも送達され得る。
【０１３８】
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置若しくは製剤が含まれる。
【０１３９】
本発明の医薬組成物には、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を持続性又は制御された送達製剤中に含ませる製剤が含まれる。これらの製剤は、例えば注射可能な微小球、生物浸食性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション、高分子化合物（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、ポリグリコール酸又はエチレンビニルアセテートコポリマー）、ビーズ又はリポソーム、ヒアルロン酸、又は埋め込み可能な薬物送達デバイスを使用することによって実現してもよい。
【０１４０】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路のための使用；特に液体溶液又は懸濁液の形態で、持続放出システムによる、若しくは埋め込み装置による、又は任意の他の投与による使用；例えば錠剤又はカプセルの形態で、口腔又は舌下投与のための使用；又は例えば粉末、点鼻剤、若しくはエアロゾル、又はある特定の薬剤の形態で鼻腔内での使用；ゲル、軟膏、ローション、クリーム若しくは粉剤、懸濁液若しくはパッチ送達システムの形態で、皮膚構造を変更するか若しくは経皮パッチ中の薬物濃度を増加させる化学的促進剤を用いて、又はタンパク質及びペプチドを含む製剤を皮膚上に塗布することを可能にする（国際公開第９８／５３８４７号）、若しくは過渡的な輸送経路を形成するために（例えば電気穿孔法）、若しくは皮膚を通る帯電薬剤の可動性を増加させるために（例えばイオン導入法）、電界を印加することを可能にする、又は超音波を印加すること（例えばソノフォレーシス）（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を可能にする薬剤を用いた、経皮的な使用、のために、調製されてもよい。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
【０１４１】
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、装置は、任意の適当な組織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（timed-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。
【０１４２】
このような製剤処方における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の濃度は、大幅に、例えば約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％から、又は２％〜５％、最大で１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％程度（重量で）まで変えることができる。また濃度の選択は、主に流体体積、粘性率、及び選択した特定の投与方法による他の要因に基づいて行う。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、貯蔵用に凍結乾燥して、使用前に好適なビヒクル中で再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質調製に対して効果的であることが分かっている。凍結乾燥及び再構成技術は、当該技術分野において公知である。
【０１４３】
本発明の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、及び／又はこれらの好適な代用物を更に含んでよい。
【０１４４】
適切な治療効果的な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。有効な用量は、望ましい結果をもたらすのに十分な量又は用量、すなわち任意の疼痛医学的状態に付随する疼痛の知覚を部分的若しくは完全に防止し、停止し、阻害し、低減し、又は遅延するのに十分な量又は用量を指す。有効な量は、特定のビヒクル及び選択された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に応じて変わってもよく、また治療すべき被験対象及び疼痛の重大性に関係する種々の要因及び状態に依存している。例えば、本発明の医薬組成物を投与すべき被験対象の年齢、体重、及び健康状態などの要因、並びに前臨床動物研究において得られる用量反応曲線及び毒性データが、考えられるものの中に入る。決定された用量は、必要ならば、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護士、獣医、又は獣医技師）によって適切に選択された適切な時間間隔で繰り返すことができる。所与の薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１４５】
したがって、筋肉注射用の本発明の医薬組成物を、１ｍｌの殺菌した緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物を、約２５０ｍＬの殺菌したＲｉｎｇｅｒの溶液及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。
【０１４６】
本発明の更なる実施形態
以下に、本明細書の他の箇所に記載した開示に従った本発明の更なる特定の実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態ののうちの１つ１つにもまた関係する。
【０１４７】
１）単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＸ4Ｘ5ＷＸ6ＱＸ7ＣＸ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14ＦＸ15ＣＸ16ＬＷＣＸ17ＫＫＬＬ（配列番号４０３）を含み、
Ｘ1は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ2は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ、又はＹであり、
Ｘ4は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ6は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ7は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ9は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ12は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ13は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ14は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ15は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ16は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ17は、Ｋ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を有し、
前記ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、前記ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定される、単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
２）前記Ｎ末端伸長は、アミノ酸配列として配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、又は３８５を含む、請求項１に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
３）前記Ｃ末端伸長は、アミノ酸配列として配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、又は３９７を含む、請求項１又は２に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
４）前記Ｎ末端伸及び／又は前記Ｃ末端伸長は、前記プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して共役される、請求項２又は３に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
５）前記リンカーは、アミノ酸配列として配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１、又は４０２を含む、請求項４に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
６）配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、又は３６８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
７）ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０-8Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
８）ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０-8Ｍ〜約１×１０-9ＭのＩＣ50値で阻害する、請求項７に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
９）アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ1Ｘ2ＷＸ3ＱＸ4ＣＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9ＣＣＸ10Ｘ11ＦＸ12ＣＸ13ＬＷＣＸ14ＫＫＬＷ（配列番号４０４）を含み、
Ｘ1は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、又はＳであり、
Ｘ2は、Ｋ、Ｓ、Ｑ、又はＲであり、
Ｘ3は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ4は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、
Ｘ5は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ6は、Ｓ、Ａ、又はＲであり、
Ｘ7は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、又はＱであり、
Ｘ8は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ9は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、又はＡであり、
Ｘ10は、Ｅ、Ｑ、又はＤであり、
Ｘ11は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ12は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ13は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ14は、Ｋ又はＲである、請求項７又は８に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１０）配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２、又は３３５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１１）前記変異体は、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１２）配列ＧＰＸ1ＣＱＫＷＭＱＸ2ＣＤＸ3Ｘ4ＲＫＣＣＸ5ＧＦＸ6ＣＸ7ＬＷＣＸ8ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含み、
Ｘ1は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ、又はＲであり、
Ｘ2は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ3は、Ｓ、Ｒ、又はＡであり、
Ｘ4は、Ｅ、Ｔ、又はＮであり、
Ｘ5は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ6は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ7は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ8は、Ｋ又はＲである、請求項１１に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１３）配列番号５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５、又は３２６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１４）配列ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ1ＣＤＸ2Ｘ3ＲＫＣＣＸ4ＧＦＸ5ＣＸ6ＬＷＣＸ8ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ1は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ2は、Ｓ、Ｒ、又はＡであり、
Ｘ3は、Ｅ、Ｔ、又はＮであり、
Ｘ4は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ5は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ6は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ7は、Ｋ又はＲである、請求項１２に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１５）単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号７８（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
ａ）前記アミノ酸配列は、残基番号付けが配列番号１に従うときに、１位にＱ、７位にＱ、及び１９位にＦを有し、
ｂ）前記ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、約３０×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害し、ＩＣ50値は、ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、２５×１０-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、測定され、
ｃ）前記ポリペプチドは、Ｎａｖ１．７を選択的に阻害する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１６）遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド、又はブチルアミド基を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。
１７）半減期延長部分に共役された請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離融合タンパク質。
１８）前記半減期延長部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｆｃ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
１９）請求項１２又は１５に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド。
２０）請求項１９に記載の前記単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
２１）請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
２２）単離プロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することと、を含む、方法。
２３）請求項１、６、１２、１３又は１５に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
２４）被験対象におけるＮａｖ１．７媒介疼痛を治療する方法であって、前記疼痛を治療するために、有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に投与することを含む、方法。
２５）前記疼痛は、慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、術後疼痛、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する疼痛、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、又は多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
２６）前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢投与される、請求項２４に記載の方法。
２７）プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所投与される、請求項２４に記載の方法。
２８）前記被験対象がヒトである、請求項２４に記載の方法。
２９）治療を必要とする被験対象における疼痛の治療に使用するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
３０）前記疼痛は、慢性疼痛、急性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、術後疼痛、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する疼痛、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、又は多発性硬化症である、請求項２９に記載のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
３１）前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢投与される、請求項２９又は３０に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
３２）前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所投与される、請求項２９、３０又は３１に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【０１４８】
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
【０１４９】
実施例１：プロトキシン−ＩＩ変異体の設計及び生成
プロトキシン−ＩＩ単一位置限定アミノ酸スキャニングライブラリ置換は、選択性、ペプチド収率、及び同質性をどの程度まで向上させることができるかを評価するために設計された。
【０１５０】
プロトキシン−ＩＩ変異体を、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断可能なＨＳＡ融合タンパク質として以下のＮ末端からＣ末端までのフォーマットで設計した。すなわち、６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体（配列番号１０８として開示された「６ｘＨｉｓ」）。リンカーは、（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８０であり、ＨＳＡは、配列番号１０６の配列を有し、ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチドは、配列番号８２の配列を有する）。各プロトキシン−ＩＩ変異体は、ＨＳＡから切断した後に、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰを有していた。
【０１５１】
変異体の特徴付けを、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを使用する膜脱分極アッセイにおいて、実施例３のＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイで説明したように、またＱＰａｔｃｈアッセイを使用した全細胞パッチクランプ実験において、実施例３で説明したように行った。
【０１５２】
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された単一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。
【０１５３】
発現ベクターの構造
設計されたプロトキシン−ＩＩ変異体遺伝子の生成を、米国特許第６，５２１，４２７号に記載された合成遺伝子組み立て技術を使用して行った。設計されたペプチド変異体のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳することを、ヒトの高頻度コドンを使用して行った。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用いて消化し、クローニングして設計した発現ベクターにすることを、各毒素変異体遺伝子をベクター内に含まれるシグナルペプチド及び融合パートナ（６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド（配列番号１０８として開示された「６ｘＨｉｓ」）に融合するようにして行った。標準的な分子生物学の手法を使用して、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを精製して、配列確認することを、プロトキシン−ＩＩペプチド変異体融合タンパク質を標準的な方法を使用して発現する前に行った。
【０１５４】
タンパク質発現
ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ  ＃  １２３３８）内に保持して、分割することを細胞濃度が１．５〜２．０×１０6細胞／ｍｌのときに行った。細胞の培養を、懸濁液中で、１２５ＲＰＭで振りながら、３７℃及び８％  ＣＯ2に設定された加湿培養器内で行った。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＤＮＡ／脂質複合体を使用して一過性にトランスフェクトすることを、それを１．０×１０6細胞／ｍｌに希釈した後に行った。複合体を生成するために、トランスフェクションのｍｌ当たり１．２５μｇのＤＮＡを、１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１２３０９）に希釈し、１．２５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ  ＃１６４４７）を、１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地に希釈した。ＤＮＡ及び最大トランスフェクション試薬を一緒に混合して、１０分間室温で保温することを、細胞に添加する前に行った。トランスフェクトされた細胞を、３７℃及び８％  ＣＯ2に設定された加湿培養器内に４日間置くことを、１２５ＲＰＭで振盪しながら行った。上澄みを細胞から分離することを、遠心分離によって５、０００×ｇにおいて１０分間行い、０．２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃４３１１５３）を通して濾過した後に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  １０Ｋ（Ｃａｔ  ＃ＵＦＣ９０１０９６）を使用して、３、７５０×ｇで約１０分間遠心することによって行った。
【０１５５】
実施例２：プロトキシン−ＩＩ変異体の精製
プロトキシン−ＩＩ変異体を、実施例１に示したＨＳＡ融合タンパク質として発現して、プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断することを、精製前に行った。２つの方法を、プロトキシン−ＩＩ変異体の効率的な精製に対して試験した。
【０１５６】
タンパク質の精製
ＲＰ−ＨＰＬＣによるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
分泌タンパク質を発現上澄みから精製することを、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ＃  １７−５２４７−０１）を使用するＩＭＡＣを介して行った。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質をカラムから溶出した。ピーク分画をプールして、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）で一晩中消化した。
【０１５７】
切断されたペプチド融合プールは、逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）カラム（Ｃａｔ＃  ００Ｂ−４２５２−Ｐ０−ＡＸ）を有するＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムを使用して、更に精製した。サンプルは、０〜６８％アセトニトリル（０．０５％  ＴＦＡ）直線勾配を用いてカラムから溶出した。溶出画分をプールして、一晩中凍結乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で再構成した。
【０１５８】
表４は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率を示す。平均ｍｇ収率／Ｌは、０．０１６１５であった。
【０１５９】
【表４】
2018512123.tif 000016
【０１６０】
固相抽出（ＳＰＥ）によるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
分泌タンパク質を発現上澄みから精製することを、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ＃  １７−５２４７−０１）を使用するＩＭＡＣを介して行った。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質をカラムから溶出した。ピーク分画をプールして、一晩中消化することをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）を用いて行った。切断されたサンプルを、５０ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ８０５０９６）内に充填して、切断されたペプチドを濾液分画内に収集した。
【０１６１】
ペプチドプールを９６ウェルの固相抽出ブロック（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｐｌｅｘａ  Ａ３９６９０３０）に充填して、更なる精製、脱塩、及び濃縮を行った。ブロックを真空マニフォールド（Ｗｈａｔｍａｎ）と共に使用した。ペプチドサンプルを水中の０．０５％  ＴＦＡに充填及び洗浄して、水中の０．０５％  ＴＦＡを用いたアセトニトリルの段階的勾配を用いて溶出した。溶出画分を次に、一晩中凍結乾燥して、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で再構成した。
【０１６２】
ペプチドは、補ったＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で再構成し、吸光度の測定を２８０ｎｍで行った。次に、各サンプルの吸光度係数を使用して、濃度値を計算した。２μｇの各ペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ  １５ウェルゲル上に充填して、ＭＥＳ緩衝液（無希釈）中で実行した。
【０１６３】
サンプルの分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ上で、０．０５％  ＴＦＡ直線勾配中の４〜８０％アセトニトリルを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＬｕｎａＣ１８（２）分析カラム（Ｃａｔ＃００Ａ−４０４１−Ｂ０）を用いて行った。すべてのペプチドの濃度を正規化して、それぞれの１０μＬを全部で１．３μｇ／サンプルに対して注入した。吸光度を２２０ｎｍにおいてモニタリングして、クロマトグラム分析をＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを使用して行った。
【０１６４】
表５は、ＳＰＥによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率（ｍｇ）を示す。平均ｍｇ収率／Ｌは、０．０５３５３であった。
【０１６５】
ＳＰＥ精製プロセスの効果は、精製の容易性及びスループット（なぜならば、サンプルの処理は９６−ウェルブロック内で並行して行われ、ＲＰ−ＨＰＬＣ上で順次に行われるわけではないので）並びに収率の向上である。ＲＰ−ＨＰＬＣの場合と比べて、ＳＰＥによって精製された変異体の収率（ｍｇ／Ｌ）は、平均して３倍超高かった。
【０１６６】
【表５】
2018512123.tif 000017
【０１６７】
実施例３：プロトキシン−ＩＩ変異体の特徴付け
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を膜脱分極及び全細胞パッチクランプアッセイにおいて特徴付けて、その効能及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。
【０１６８】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイ
生成されたペプチドが、Ｎａｖ１．７作動薬ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン；Ｂｉｏｍｏｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃  ＮＡ１２５）によって誘発される膜脱分極を阻害する能力を測定することを、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイを使用して、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１０１８）を電子受容体として、ＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）（Ｓｉｇｍａ）をドナーとして用いて、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起して、ＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することによって、行った。
【０１６９】
ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を培養することを、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において行った。培地には、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ  ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補った。５０μＬの採取細胞の平板培養を、２５，０００細胞／ウェルで、ポリ−リシンコーティングされた３８４−ウェルの黒色透明な下部プレート内で行った。プレートを室温（ＲＴ）に保温することを１５分行った後に、３７℃に一晩中保温した。保温はすべて、特に明記しない限りは暗所で行った。翌日、ウェルを４時間洗浄することをアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用いて行い、２５μＬのアッセイ緩衝液に再懸濁した。ＰＴＳ１８色素の２ｘストック（６μＭ）の調製を、ＤＭＳＯ中の１０％プルロニックＦ１２７に色素を１：１（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって行った。２５μＬの２ｘ  ＰＴＳ１８ストックをウェル内に添加して、細胞を染色することを３０分間室温で行った後に、色素をアッセイ緩衝液で洗い流した。ペプチドを、最終濃度の３倍の濃度で、アッセイ緩衝液（１０μＭ  ＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭ  ＶＡＢＳＣ−１を含む）中に懸濁し、背景蛍光を抑制した（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃  ２０１９８７）。２５μＬ／ウェルの懸濁されたペプチドを各ウェルに添加して、６０分間室温で保温した。脱分極を誘発することを２５μＭの最終濃度のベラトリジンによって（２５μＬ／ウェルの７５μＭ（３ｘ）ストック溶液を添加することによって）行い、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の減少の測定を、作動薬を添加した後に３０〜１００秒行った。各測定済みペプチドの１．３Ｘ希釈を、慣例によりベラトリジンを添加した後に行った。ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告する。
【０１７０】
合成プロトキシン−ＩＩ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の濃度反応曲線を各実験シリーズにおいて構成して、対照として使用した。シグナルを、陰性対照（作動薬ベラトリジン単独に対応する）値と陽性対照（１０μＭテトラカインの存在下でのベラトリジンに対応する）値との差に対して正規化することによって、各ウェルに対する蛍光カウントを、％応答に変換した。測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一性補正」（すべての蛍光トレースを平均初期開始強度に対して正規化する）及び「バイアス値を減ずる」（初期開始強度を各トレースから減ずる）を、オンした。各データポイントは、個々のウェルにおける応答を表していた。すべての個々のデータポイントを非線形最小二乗法フィッティングにおいて使用して、Ｈｉｌｌ関数に対するベストフィットを求めることを、Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を使用して行った。ＩＣ50値を、結果としての近似曲線から抽出した。陽性（Ｐ）及び陰性（Ｎ）対照の平均応答を使用して、ウェルにおける％応答の計算を以下のように行った：％応答＝１００*（Ｎ−Ｒ）／（Ｎ−Ｐ）。
【０１７１】
アッセイプレートは、その日に対する対照アンタゴニストの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合に容認した。
【０１７２】
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．５（配列番号１０５）、Ｎａｖ１．７（配列番号７９）又はＮａｖ１．６（配列番号４０７）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清と、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと、４００μｇ／ｍＬジェネティシンと、１００μＭ  ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）とを補った、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において培養した。細胞を、３７℃及び５％  ＣＯ２に保持して、５０〜９０％密集度に達した時点で分析試験を行った。テトラサイクリン誘導可能な方法（配列番号４０７）でヒトＮａｖ１．６を安定的に発現するＣＨＯ細胞は、１０％ウシ胎児血清と、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと、１０μｇ／ｍＬ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎと、４００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎとを補った、ＨＡＭｓ  Ｆ１２において培養した。細胞を、３７℃及び５％  ＣＯ２に保持して、約５０〜９０％密集度に達した時点で分析試験を行った。Ｎａｖ１．６発現を１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを用いて誘発することを、実験の２４〜４８時間前に行った。
【０１７３】
ＱＰａｔｃｈ  ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）において試験する前に、細胞を最初に解離することを０．０５％トリプシンを使用して行い（５分間、３７℃で）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、ゆるやかに粉砕して細胞集塊をバラバラにした。細胞密度を１〜２×１０6／ｍＬに調整することを同じ培地を用いて行い、細胞をＱＰａｔｃｈ  ＨＴの細胞「ホテル」に移して、数時間に渡って実験に使用した。ギガオームシール形成及び全細胞パッチクランプ記録用に、細胞外溶液は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４及び浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。アッセイで使用した電圧プロトコルは、以下のとおりである。保持電位が−７５ｍＶ（Ｎａｖ１．７）、−６０ｍＶ（Ｎａｖ１．６）、又は−１０５ｍＶ（Ｎａｖ１．５）から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極化してから、０ｍＶに５ｍｓ脱分極させた後、保持電位に戻した。このプロトコルを、液体供給時に６０秒ごとに１回繰り返した（下記参照）。細胞は、その他の場合には、前述の電圧プロトコルが実行されなかったときに保持電位に保持した。全細胞記録構成を設定する際、細胞外溶液を全部で５回供給すること（すべて、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物がある場合もない場合もあり、但し最後の供給では１μＭ  ＴＴＸ又は１０ｍＭリドカインを陽性対照として含んでいた）を、記録中の細胞上で行った。最初の液体供給には、対照緩衝液（５μｌ）のみが含まれていた。供給の５秒後、電圧プロトコルを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３回の液体供給（各５μｌ）には、試験化合物（３回の供給すべてに対して同じ化合物を同じ濃度で）又は対照緩衝液（対照細胞に対してのみ）が含まれていた。これらの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコルを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給には陽性が含まれており（３回の１０μｌ副供給からなり、それぞれ２秒間離した）、５秒後に同じ電圧プロトコルを２回実行してベースライン電流を得た。電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルタにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞に対して、最初の４回の液体供給における各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、陽性対照の存在下での最後のトレースのピーク電流振幅から最初に差し引いた後に、最初の（対照緩衝液）供給における最後のトレースのピーク電流振幅に対して、阻害率（％）として正規化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中の対照（通常５〜６個の）細胞の平均の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後の化合物供給における最後の２つのこのような値の平均（すなわち、試験化合物の各濃度に対する補正された阻害率（％）値）を、試験した特定の化合物濃度における各細胞に対する％阻害値として取った。各化合物濃度において試験したすべての細胞に対する阻害率（％）値を平均化して、濃度応答計算において使用した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±標準誤差として表されている。野生型プロトキシン−ＩＩは各実験において陽性対照として含めた。データは、プロトキシン−ＩＩの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合にのみ容認した。
【０１７４】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを使用して得られた選択プロトキシン−ＩＩ変異体に対するＮａｖ１．７のＩＣ50値を、表６に示す。
【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を、ヒトＮａｖ１．５に対する選択性に対して試験することを、ＱＰａｔｃｈを使用して行った。選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．５の両方のＩＣ50値を、表７に示すＱＰａｔｃｈを使用して得た。
【０１７７】
【表７】
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【０１７８】
実施例４．組み合わせプロトキシン−ＩＩ変異体の生成及び特性評価
いくつかのアプローチを使用して天然ペプチドと比較して更に改善された有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するために、コンビナトリアルライブラリーを設計した。
【０１７９】
限定アミノ酸スキャンをすべての非システインプロトキシン−ＩＩ位置において行うことを、多様化のためにＡ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｋ及びＳを使用して行った。これらの実験において、プロトキシン−ＩＩを発現して、一価のＦｃ融合タンパク質として試験することを、実施例１で説明したように行った。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させた置換Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ａが特定された。
【０１８０】
位置Ｍ６及びＭ１９における全アミノ酸スキャン（ｃｙｓ及びｔｒｐを除く）も行った。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させたＭ１９Ｆ置換が特定された。
【０１８１】
プロトキシン−ＩＩ／フエントキシン−ＩＶ単一位置キメラを双方向的に設計した。このライブラリの目的は、野生型プロトキシン−ＩＩの効能及び選択性プロファイルを保持したプロトキシン−ＩＩ変異体を得ることであり、フエントキシン−ＩＶに付随する有用なリフォールディング特性を実現するであろう。置換Ｒ２２Ｔ及びＥ１２Ｎがこのスキャンから特定された。
【０１８２】
ペプチドＮＶ１Ｇ１１５３を更に設計することを、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＳを使用した限定アミノ酸スキャンによって位置Ｙ１を多様化することによって、また電荷クラスタエンジニアリングによって行い、ペプチドの三次元構造内のすべての荷電残基組（Ｄ１０／Ｅ１２、Ｋ４／Ｅ１７、Ｄ１０／Ｅ１２／Ｒ１３）を突然変異させた。
【０１８３】
作用部位に対するペプチド分布を改善し、かつ結果として得られるペプチドの分子量を著しく増加させることなくペプチドの半減期を改善することを目的として、Ｎ−及びＣ末端伸長を選択ペプチド（例えば、ＮＶ１Ｇ１１５３）に導入した。使用したＮ−及びＣ末端伸長は表８及び９にそれぞれ示されており、また、Ｏｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３４、２６６〜２７２、２００８；Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１  ２９：４、３５２〜３５６；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙら、（２０１２）１０９：４０、１６０９５〜１６１００に記載されている。細胞透過性ペプチドＨＩＶ  Ｔａｔ及びポリアルギニンも使用した。種々のリンカーを使用して、プロトキシン−ＩＩ変異体をＮ−及び／又はＣ末端伸長に結合させた。使用したリンカーを表１０に示す。
【０１８４】
各キャンペーンからのプロトキシン−ＩＩ変異体を試験してＮａｖ１．７に対するそれらの効能及び選択性を調べることを、実施例３に説明した方法を使用して行った。Ｎａｖ１．７を、２００ｎｍ以下のＩＣ50値で阻害した変異体のアミノ酸配列を表３に示す。表１１は、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときの選択変異体におけるアミノ酸置換、及びＦＬＩＰＲ  ＴｅｔｒａアッセイにおけるＮａｖ１．７阻害のＩＣ50値を示す。
【０１８５】
【表８】
2018512123.tif 000020
【０１８６】
【表９】
2018512123.tif 000021
【０１８７】
【表１０】
2018512123.tif 000022
【０１８８】
【表１１−１】
2018512123.tif 000023
【０１８９】
【表１１−２】
2018512123.tif 000024
【０１９０】
【表１１−３】
2018512123.tif 000025
【０１９１】
【表１１−４】
2018512123.tif 000026
【０１９２】
【表１１−５】
2018512123.tif 000027
【０１９３】
【表１１−６】
2018512123.tif 000028
【０１９４】
【表１１−７】
2018512123.tif 000029
【０１９５】
【表１１−８】
2018512123.tif 000030
【０１９６】
【表１１−９】
2018512123.tif 000031
【０１９７】
【表１１−１０】
2018512123.tif 000032
【０１９８】
【表１１−１１】
2018512123.tif 000033
【０１９９】
【表１１−１２】
2018512123.tif 000034
【０２００】
【表１１−１３】
2018512123.tif 000035
【０２０１】
【表１１−１４】
2018512123.tif 000036
【０２０２】
野生型プロトキシン−ＩＩがＮａｖ１．７を、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて、約４ｎＭのＩＣ50値で阻害することは、実施例３で説明したとおりである。著しいＮａｖ１．７効能を保持する変異体を更に特徴付けた。図１は、Ｎａｖ１．７を、３０ｎＭ以下のＩＣ50値で阻害する、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の配列属を示す。
【０２０３】
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を試験して、そのＮａｖ１．７の阻害及びそのヒトＮａｖ１．６に対する選択性を調べることを、ＱＰａｔｃｈを使用して行った。ＱＰａｔｃｈを使用して得られた選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６の両方に対するＩＣ50値を、図２に示す。これらのペプチドはＮａｖ１．７をＩＣ50が３０ｎＭ以下で阻害し、Ｎａｖ１．６と比べたときにＮａｖ１．７に対して少なくとも３０倍の選択性があった。
【０２０４】
図２に示すペプチドのアミノ酸配列を図３に示す。これらのペプチドはすべて、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、Ｗ７Ｑ及びＭ１９Ｆ置換を有していた。
【０２０５】
プロトキシン−ＩＩ変異体を発現して精製することを実施例１で説明したように行うか、又は標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を野生型プロトキシンの収率と比べた。表１２には、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の収率がプロトキシン−ＩＩの収率よりも著しく高いことが示されており、変異体の折り畳み特性の向上が示されている。固相合成のスケールは０．５ｍｍｏｌであった。
【０２０６】
【表１２】
2018512123.tif 000037
【０２０７】
実施例５．プロトキシン−ＩＩ変異体は疼痛のインビボモデルにおいて効率的である。
材料及び方法
動物雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２４〜２６ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから発注、別個に収容）を、この研究で使用した。
【０２０８】
挙動試験
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｔｅｓｔ：機械的（触覚）閾値の評価を、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒｓによって、上下法（Ｄｉｘｏｎ、１９８０、Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）に従って行った。７つの段階的な刺激（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ繊維：０．０３、０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２ｇ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）を使用した。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ毛を後足上の中央の足底領域（骨隆起の間）に対して垂直に与えた。十分な力を印加して、フィラメントをわずかに曲げて、３秒間保持した。Ｃｈａｐｌａｎの論文に従って、肯定応答は、繊維を取り除いたときに、１）急に逃避するか又は２）即座に後ろへ下がることとすることができる。より詳細は、Ｃｈａｐｌａｎらを参照のこと。マウスを試験室内のワイヤメッシュに順応させることを、試験前に３０〜６０分間行った。
【０２０９】
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：変更されたＨａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｂｏｘを使用して、熱足逃避潜時（ＰＷＬ）を測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８、Ｐａｉｎ、３２：７７〜８８；Ｄｉｒｉｇら、１９９７、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３〜１９１）。このボックスは、ガラスの高床が一定温度（２７℃）に維持されたチャンバからなる熱侵害刺激はガラス表面下方の投影電球光線から発生する。光線を骨隆起（中央の足底）間の領域に向ける。「開始」ボタンによって光をオンしてタイマを開始する。刺激を受けた足に動き（例えば突然の逃避）があると、スイッチがトリガされて光がオフしタイマが停止する。潜時（秒）が表示される。動きが起きない場合、電球は２０秒（カットオフ）後にオフして、組織傷害を防止する。動物は、ＰＷＬ測定前の３０〜６０分間、ガラス表面上で慣れさせた。一定アンペア数を研究の全体に渡って使用した結果、少なくとも５分間離して行った３〜６回の読み取りに対して平均化したとき、予備試験の足逃避潜時において８〜１２秒となった。
【０２１０】
ＭＰＥ％計算：パーセント最大可能効果（ＭＰＥ％）＝（Ｔ1−Ｔ0）／（Ｔｃ−Ｔ0）×１００％。Ｔ0：０日目の閾値（ＣＦＡ後、ポンプ前）；Ｔ1：ポンプ埋め込み後、１日目の閾値；Ｔｃ：試験のカットオフ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験では２０秒、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験では２ｇ）。
【０２１１】
ホットプレート試験：動物を、１０”×１０”金属プレートを４つのプレキシグラス壁（高さ１５インチ）で囲んだものの上に置いた。プレートを５０又は５５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後ろ足を後ろへ下げるか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定して、動物をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を、４０秒後（５０℃）又は２０秒（５５℃）後にプレートから取り除いて、起こり得るわずかな組織損傷も防止した。このトライアルを、一日に１５〜６０分ごとに２〜５回繰り返した。
【０２１２】
炎症性疼痛モデル
ＣＦＡモデル：動物への麻酔をイソフルラン（４％導入及び２％維持）を用いて行い、２０μＬの１００％  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を一方の後足上の中央の足底領域に注射することを、２７ゲージ針が取り付けられた５０μＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して行った。Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎモデル：動物への麻酔をイソフルラン（４％導入及び２％維持）を用いて行い、２５μＬの２％λ−カラギーナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を生理食塩水中に溶解したものを、後足上の中央の足底領域に注射することを、インスリン注射器（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して行った。
【０２１３】
ミニポンプの埋め込み
Ａｌｚｅｔマイクロオスモティックミニポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ１００３Ｄ及び２００１Ｄ）を、製造業者のガイドに従って充填して呼び水を入れた。マウスにイソフルランを用いて麻酔した（５％導入；２％維持）。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。一対のピンセット又は止血鉗子を使用して、小さいポケットを形成することを、皮下結合組織を広げて離すことによって行った。流量調節要素が切開から離れる方向を向くようにしてポンプをポケットに挿入した。この後、７ｍｍのステープルを使用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
【０２１４】
データ解析
データは、平均±標準誤差として表されている。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、グラフ化及び統計分析を図った。時間に対する閾値を比較するため、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を、ｐ＜０．０５の有意水準で使用した。ホットプレート及びＭＰＥ％データを一方向ＡＮＯＶＡによって分析した後に、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った。
【０２１５】
結果
変異体ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＣＯＯＨ）、ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＣＯＯＨ）及びＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ２７７５−ＣＯＯＨ）の有効性を、ＣＦＡモデル（炎症性疼痛の一般的に使用されるモデル）において研究した。ＣＦＡを後足に注射することによって、足浮腫（図示せず）及び熱刺激（熱痛覚過敏）に対する過敏症が誘発された。これは、０日目における注射された足において熱潜時が下がったことで示される（図６Ａ）。熱痛覚過敏が完全に逆転することが、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨを６８４及び１８２４μｇ／日で、皮下浸透圧ミニポンプによって投与したときに生じた（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０２１６】
ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨによって、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏が６８４及び１８２４μｇ／日において十分に逆転された（図５Ａ及び５Ｂ）。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨはＣＦＡモデルにおける強い有効性を示した。熱潜時は、ＮＶ１Ｄ２７７５投与後のカットオフに近い値に到達しており（図６Ａ及び６Ｂ、１８２４μｇ／日）、これは、抗痛覚過敏効果に加えて強い無痛覚効果を示唆している。加えて、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによってＣＦＡ誘発触覚異痛症が逆転された（図６Ｃ及び６Ｄ、１８２４μｇ／日）。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの抗痛覚過敏効果は、ポンプを埋め込んでから早くも４時間後に見られた（図７Ａ）。効果が８時間において最大に達することが、熱及び触覚試験の両方において起こり（図７Ａ及び７Ｂ）、これは２４時間維持された。熱潜時及び触覚閾値は、ポンプ埋め込み後４８時間（ポンプが空であると予測されてから約２４時間後）で制御レベルに戻った（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０２１７】
ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏は容易に逆転することが、２つの更なるペプチド、ＮＶ１Ｄ３３６８−アミド（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＮＨ2）及びＮＶ１Ｄ３０３４−Ｎ−メチルアミド（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＮＨＭｅ）によって生じた。実験からの熱ＭＰＥ％を表１３にまとめる。
【０２１８】
【表１３】
2018512123.tif 000038
【０２１９】
またＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、ホットプレート試験において強い用量依存性有効性を示した（図８）。５０℃及び５５℃における潜時は、１８２４μｇ／日の投与の後にカットオフに近い値に達した。２２８μｇ／日において、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、熱潜時がＰＢＳ対照と比べて少なめだが著しく増加した。
【０２２０】
ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を、炎症性疼痛の別のモデル（カラギーナンモデル）において評価した。動物に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ又はＰＢＳポンプを埋め込んだ。熱逃避潜時の測定を、ポンプ前及びポンプ後１日目で行った。λ−カラギーナンを後足に注射して、熱潜時の再測定をカラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、１８２４μｇ／日において、著しい無痛覚を実現した（図９）。λ−カラギーナンを後足に注射すると、炎症が誘発されて（図示せず）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における熱足逃避潜時が短くなることが、４時間の試験時間に渡って生じた。（図９、ＰＢＳグループ）。動物をＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを用いて１８２４μｇ／日で前処理したところ、カラギーナン誘発痛覚過敏から十分に保護された。
【０２２１】
実施例６．組み合わせプロトキシン−ＩＩ変異体の生成及び特性評価
プロトキシン−ＩＩのアミノ酸スキャニングライブラリを作製した。プロトキシン−ＩＩのすべての非システイン位置において（Ｔｙｒ１、Ｇｌｎ３、Ｌｙｓ４、Ｔｒｐ５、Ｍｅｔ６、Ｔｒｐ７、Ｔｈｒ８、Ａｓｐ１０、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ａｒｇ１３、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｍｅｔ１９、Ｖａｌ２０、Ａｒｇ２２、Ｌｅｕ２３、Ｔｒｐ２４、Ｌｙｓ２６、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ２８、Ｌｅｕ２９  ａｎｄ  Ｔｒｐ３０）、次の残基を天然残基の代わりに置換した：Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、及びＴｙｒ。
【０２２２】
変異ペプチドをヒト血清アルブミンに対する組み換え融合体として発現し、ＨＲＶ３Ｃにより部位特異的に酵素によって切断して、実施例１に記載したプロトキシン−ＩＩ変異体を生成した。各プロトキシン−ＩＩ変異体は、ＨＳＡから切断した後に、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰを有していた。各プロトキシン−ＩＩ変異体に関して、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値を、ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ又はＱＰａｔｃｈを使用して実施例３に記載のプロトコルに従って測定した。ヒトＮａｖ１．７に対してＩＣ50≦１００ｎＭを示した変異体を、更なるｈＮａｖチャネルに対する選択性についてＱＰａｔｃｈ電気生理学を使用してカウンタースクリーニングした。選択的ヒットを同定し、組み換え発現及び固相ペプチド合成の両方により製造されるコンビナトリアルペプチドライブラリの設計に使用した。詳述したものと同じ戦略を使用して、コンビナトリアル変異体をスクリーニングした。
【０２２３】
この結果に基づくと、選択性を向上させるために突然変異させることができる位置としては、Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０が挙げられる（残基の番号付けは配列番号１に基づく）。
【０２２４】
プロトキシン−ＩＩの溶液構造をＮＭＲにより決定し、図１０に表面表示として示す。図の左側は、前述した（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３−６６３１）Ｍ６を取り巻くＴｒｐ残基、Ｗ５／Ｗ７／Ｗ２４のリングを示す。分子の反対側で、突然変異誘発及びＮＭＲ構造の両方を使用して、ｈＮａｖ１．７に対する選択性を他のナトリウムチャンネルイソ型の場合よりも向上させるために突然変異させることができる複数のアミノ酸位置からなるプロトキシン−ＩＩ上の選択性面をこの研究において同定した。選択性面上にある残基としては、残基Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０が挙げられる（残基の番号付けは配列番号１に基づく）。Ｎａｖ１．７に対する選択性に関与している選択性面及び複数位置の同定については、以前に記載されていない。
【０２２５】
Ｓｅｒ１１の変異は複数のＮａｖチャネルの活性に影響を与えることがこれまでに示されているので、Ｓｅｒ１１に置換を有するＰｒｏｔｏｘｉｎＩＩ変異体の選択性の向上は予想外であり、したがってこの残基はプロトキシン−ＩＩのＮａｖ１．７に対する選択性において何らかの役割を担ってはいないと結論付けられた（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３〜６６３１）。
【０２２６】
プロトキシン−ＩＩ変異体の合成的作製の重要なステップは、ジスルフィド対を形成する、直鎖ペプチドの酸化的リフォールディングである。リフォールディング後の天然プロトキシン−ＩＩの精製に関するＲＰ−ＨＰＬＣトレースは、ペプチドの不適切な折り畳みを示す、正確な質量ピークであるが異なる活性レベルを示す、異なる保留時間における多数のピークを明らかにした。
【０２２７】
ＲＰ−ＨＰＬＣ主要ピークの相対存在量、したがって正確に折り畳まれたペプチドの相対存在量は、様々なプロトキシン−ＩＩ位置で置換を行うことによって向上させることができた。Ｔｒｐ７又はＴｒｐ３０の変異は、結果として得られるプロトキシン−ＩＩ変異体の折り畳み特性を向上させた。Ｔｒｐ７及びＴｒｐ３０両方の変異は、共同して結果として得られるプロトキシン−ＩＩ変異体の折り畳みを更に向上させ、折り畳み困難なロトキシン−ＩＩ変異体の折り畳みを助けることができた。
【０２２８】
選択性を向上させる１つ又は２つ以上の置換（Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、及びＬｅｕ２９）を有し、かつＴｒｐ７及びＴｒｐ３０に変異を有するコンビナトリアル変異ペプチドを作製することにより、改善された選択性及び改善されたリフォールディング特性を有するペプチドがもたらされた。プロトキシン−ＩＩは、抑制システインノットペプチドのファミリー３に属する（Ｋｌｉｎｔら、Ｔｏｘｉｃｏｎ  ６０：４７８〜４９１，２０１２）。Ｔｒｐ７はすべてのファミリー３メンバーで保存されており、別のファミリー３抑制システインノットペプチドであるジンザオトキシン−Ｖのこの位置並びにＴｒｐ５及びＭｅｔ６の位置における置換は効能の損失をもたらした。このことは、ジンザオトキシン−Ｖの位置５、６及び７における疎水性残基がジンザオトキシン−ＶのＮａｖ１．７阻害効能に不可欠であることを示している（国際特許公開第２０１４／１６５２７７号）。Ｔｒｐ５／Ｍｅｔ６／Ｔｒｐ７は、プロトキシン−ＩＩでも保存されているので、リフォールディング特性を有意に改善しながらプロトキシン−ＩＩ活性の損失を伴わずにＴｒｐ７の極性置換を行うことができることは予想外であった。Ｔｒｐ３０の置換は、変異体ペプチドのＮａｖ１．７選択性及びリフォールディング特性を同時に向上させることが示され、個々の有利な置換は通常、１つのパラメータのみを改善するので、これは予想外であった。
【０２２９】
表１４は、選択生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体のアミノ酸配列を示す。
【０２３０】
【表１４】
2018512123.tif 000039
【０２３１】
選択変異体を、実施例３に記載のＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ又はＱＰａｔｃｈを使用してＮａｖ１．７の阻害について特徴付けた。表１５は、得られたＩＣ50値を示す。いくつかの変異体について、一定濃度における阻害率（％）をＱＰａｔｃｈの結果に関して記録した（プロトキシン−ＩＩの％）。
【０２３２】
【表１５】
2018512123.tif 000040
【０２３３】
選択変異体の選択性を、ヒトＮａｖ１．ｘチャネルに対して試験した。表１６はこれらの実験の結果を示す。各チャネルに対するＩＣ５０値はＱＰａｔｃｈを使用して測定した。
【０２３４】
【表１６】
2018512123.tif 000041
【０２３５】
プロトキシン−ＩＩ変異体を発現して精製することを実施例１で説明したように行うか、又は標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を野生型プロトキシンの収率と比べた。表１７には、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の収率がプロトキシン−ＩＩの収率よりも著しく高いことが示されており、変異体の折り畳み特性の向上が示されている。固相合成のスケールは０．１ｍｍｏｌであった。
【０２３６】
【表１７】
2018512123.tif 000042
【０２３７】
実施例７．プロトキシン−ＩＩ変異体はくも膜下投与後の疼痛のインビボモデルにおいて効率的である。
選択プロトキシン−ＩＩ変異体の、くも膜下投与後の疼痛の低減効果を評価した。
【０２３８】
ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ、ＮＶ１Ｄ３０３４及び６３９５５９１８を研究で使用した。急性熱痛（テールフリック及びホットプレート）及び損傷誘発疼痛（ホルマリンフリンチング）を測定する動物モデルを使用した。
【０２３９】
テールフリック試験：動物をテールフリック装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）上に置いた。装置は、赤外光局所加熱領域（直径５ｍｍ）を有する。動物の尻尾（遠位端から１／３〜１／２）を、局所加熱領域上に定置した。ビヒクルで処理した動物において１０秒以内にテールフリックを引き起こすように、熱源の温度を調節した。組織損傷を防止するために、文献で標準的な１５秒カットオフを使用した。熱刺激の開始と回避反応との間の経過時間を自動的に測定し、試験群ごとに記録した。
【０２４０】
ホットプレート試験：動物を、１０”×１０”の金属プレートを４つのプレキシグラス壁（高さ１５インチ）で囲んだものの上に置き、プレートを４８〜５５℃の温度に維持した。動物が足底領域を舐める、飛び上がる、又は声を出すときに、動物をプレートから取り除き、反応潜時を記録した。２０〜９０秒（カットオフ時間）以内に動物が応答を示さない場合、動物をプレートから取り除いて、起こり得るあらゆる組織損傷を防止した。
【０２４１】
ホルマリンフリンチング：注入側後肢のホルマリン誘発疼痛挙動（すなわち足フリンチ）を、自動「フリンチ応答」測定装置ＵＣＳＤを使用して測定した。装置は、動物の一方の足底領域に接着された金属バンドのあらゆる突然の動きを、装置床面の下に設置された運動センサを使用して検出する。ホルマリン注射の３０分から１時間前に、小さな金属バンドを一方の足底領域の足底面にシアノアクリレートの小滴を使用して取り付け、動物を試験チャンバに入れて環境順応させた。金属バンドの取り付けは、動物にとって刺激性があるようには見えなかった。金属バンドを有する足の背にホルマリン（２．５％、５０μＬ）を皮下注射した。足底内ホルマリン注射の直後に、動物を特注シリンダ（２５×１０×２０ｃｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に入れた。足フリンチは自動的に記録された。
【０２４２】
単回くも膜下投与後のテールフリック試験（図１１Ａ及び図１１Ｂ）及びホットプレート試験（図１１Ｃ、図１１Ｄ）における潜時の増加によって示されるように、急性熱痛モデルにおいて、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８は強力かつ長期の無痛覚を引き起こした。無痛覚の有意性及び期間は用量依存的であった。
【０２４３】
後足ホルマリン注射は、損傷誘発疼痛で一般的に使用されているモデルである。注射は、試験動物の疼痛を示す特徴的な二相性のフリンチング挙動を誘発する。図１１Ｅに示すように、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８のくも膜下注射で前処理された動物は、ホルマリン試験において軽度のフリンチを示し、損傷誘発疼痛が阻害されたことを示唆している。
【０２４４】
同様に、ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ及びＮＶ１Ｄ３０３４は、単回くも膜下投与後のテールフリック、ホットプレート及びホルマリン試験（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ）において有意な有効性を示した。
【図１】
2018512123.tif 000043
【図２Ａ】
2018512123.tif 000044
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2018512123.tif 000049
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2018512123.tif 000054
【図６Ｃ】
2018512123.tif 000055
【図６Ｄ】
2018512123.tif 000056
【図７Ａ】
2018512123.tif 000057
【図７Ｂ】
2018512123.tif 000058
【図８】
2018512123.tif 000059
【図９】
2018512123.tif 000060
【図１０】
2018512123.tif 000061
【図１１Ａ】
2018512123.tif 000062
【図１１Ｂ】
2018512123.tif 000063
【図１１Ｃ】
2018512123.tif 000064
【図１１Ｄ】
2018512123.tif 000065
【図１１Ｅ】
2018512123.tif 000066
【図１２Ａ】
2018512123.tif 000067
【図１２Ｂ】
2018512123.tif 000068
【図１２Ｃ】
2018512123.tif 000069
【図１２Ｄ】
2018512123.tif 000070
【図１２Ｅ】
2018512123.tif 000071
【図１３Ａ】
2018512123.tif 000072
【図１３Ｂ】
2018512123.tif 000073
【図１３Ｃ】
2018512123.tif 000074
【図１３Ｄ】
2018512123.tif 000075
【図１３Ｅ】
2018512123.tif 000076
【配列表】
2018512123000001.app
【国際調査報告】
2018512123.tif 000077
2018512123.tif 000078