(57)【要約】本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する方法であって、発現カセットを含むベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含し、ここでこの発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に対して作動可能に連結されているプロモーターを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の他の治療剤（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。したがって、特定の実施形態では、この方法は、高眼圧症（例えば、緑内障）の処置に有用な１つ以上の他の治療薬（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。【選択図】図１３
2018533976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のために、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項２】
発現カセットを含むベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含する、それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する方法であって、前記発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、方法。
【請求項３】
前記サブユニットが、１つ以上のさらなるサブユニットと多量体化することによって多量体イオンチャネルを形成し得る、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターまたは方法であって、処置が、アゴニストまたはアロステリックモジュレーターの投与の非存在下であるか；または多量体イオンチャネルのアゴニストまたはアロステリックモジュレーターが哺乳動物に投与されない、ベクターまたは方法。
【請求項５】
前記アゴニストがグリシンである、請求項４に記載のベクターまたは方法。
【請求項６】
前記多量体イオンチャネルが、内因性アゴニストによって活性化される、請求項３に記載のベクターまたは方法。
【請求項７】
前記核酸がクロライドチャネルのサブユニットをコードする、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項８】
前記核酸が、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）、γ−アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡＲ）またはグルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）のサブユニットをコードする、請求項７に記載のベクターまたは方法。
【請求項９】
前記核酸がＧｌｙＲのサブユニットをコードする、請求項８に記載のベクターまたは方法。
【請求項１０】
前記コードされたＧｌｙＲサブユニットが、α−１サブユニット、α−２サブユニット、α−３サブユニット、α−４サブユニット及びβサブユニットからなる群より選択される、請求項９に記載のベクターまたは方法。
【請求項１１】
コードされたＧｌｙＲサブユニットが、ＧｌｙＲ（ＧｌｙＲａ１）のアルファ−１−サブユニットである、請求項１０に記載のベクターまたは方法。
【請求項１２】
前記コードされたＧｌｙＲサブユニットが、ヒトＧｌｙＲａ１（ｈＧｌｙＲａ１）である、請求項１１に記載のベクターまたは方法。
【請求項１３】
前記核酸がＧＡＢＡＡＲのサブユニットをコードする、請求項８に記載のベクターまたは方法。
【請求項１４】
前記核酸が、ＧＡＢＡＡ−ρ受容体のサブユニットをコードする、請求項１３に記載のベクターまたは方法。
【請求項１５】
前記コードされたＧＡＢＡＡＲサブユニットが、ＧＡＢＲＡ１（α１）、ＧＡＢＲＡ２（α２）、ＧＡＢＲＡ３（α３）、ＧＡＢＲＡ４（α４）、ＧＡＢＲＡ５（α５）、ＧＡＢＲＡ６（α６）、ＧＡＢＲＢ１（β１）、ＧＡＢＲＢ１（β２）、ＧＡＢＲＢ１（β３）、ＧＡＢＲＧ１（γ１）、ＧＡＢＲＧ２（γ２）、ＧＡＢＲＧ３（γ３）、ＧＡＢＲＤ（δ）、ＧＡＢＲＥ（ε）、ＧＡＢＲＰ（π）、ＧＡＢＲＱ（θ）、ＧＡＢＲＲ１（ρ１）、ＧＡＢＲＲ２（ρ２）及びＧＡＢＲＲ３（ρ３）からなる群より選択される、請求項１３に記載のベクターまたは方法。
【請求項１６】
前記核酸がＧｌｕＣｌのサブユニットをコードする、請求項８に記載のベクターまたは方法。
【請求項１７】
前記コードされたＧｌｕＣ１サブユニットが、α１、α２Ａ、α２Ｂ、ＧＢＲ２Ａ（α３Ａ）、ＧＢＲ２Ｂ（α３Ｂ）及びβからなる群より選択される、請求項１６に記載のベクターまたは方法。
【請求項１８】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと比較して少なくとも１つの変異を含む、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項１９】
前記変異体サブユニットを含む多量体イオンチャネルが構成的に活性である、請求項１８に記載のベクターまたは方法。
【請求項２０】
前記変異体サブユニットを含む多量体イオンチャネルが、対応する野生型多量体イオンチャネルと比較してアゴニスト感受性が増強されている、請求項１８に記載のベクターまたは方法。
【請求項２１】
前記コードされたサブユニットがＭ２膜貫通ドメインを含み、少なくとも１つの変異が対応する野生型サブユニットと比較してＭ２膜貫通ドメインにある、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のベクターまたは方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの変異が、対応する野生型サブユニットと比較して、ロイシン９’残基にある、請求項２１に記載のベクターまたは方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの変異が、対応する野生型サブユニットと比較してＬ９’ＡまたはＬ９’Ｇである、請求項２２に記載のベクターまたは方法。
【請求項２４】
前記コードされたサブユニットが、前記少なくとも１つの変異がＬ２６３であるＧＡＢＡＡα−サブユニット；少なくとも１つの変異がＬ２５９であるＧＡＢＡＡβ−サブユニット；少なくとも１つの変異がＬ２７４にあるＧＡＢＡＡγ−サブユニット；または少なくとも１つの変異が対応する野生型サブユニットと比較してＴ３１４、Ｌ３１７もしくはＬ３０１である、ＧＡＢＡＣρ−サブユニットである、請求項１８または１９に記載のベクターまたは方法。
【請求項２５】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと約８０％の配列同一性〜約９９％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のベクターまたは方法。
【請求項２６】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと約９０％の配列同一性〜約９９％の配列同一性を有する、請求項２５に記載のベクターまたは方法。
【請求項２７】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと約９５％の配列同一性〜約９９％の配列同一性を有する、請求項２６に記載のベクターまたは方法。
【請求項２８】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと約９９％の配列同一性を有する、請求項２７に記載のベクターまたは方法。
【請求項２９】
前記プロモーターが調節可能なプロモーターである、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項３０】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項３１】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項３２】
前記プロモーターが、ヒトシナプシン−１プロモーター（Ｓｙｎ１またはｈＳｙｎ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、筋特異的デスミンプロモーター、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターまたはそのフラグメント及びキチナーゼ３様１（Ｃｈ３Ｌ１）遺伝子の５’プロモーター領域からなる群より選択される、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項３３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマロニーベースのウイルスベクターである、請求項３３に記載のベクターまたは方法。
【請求項３５】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項３４に記載のベクターまたは方法。
【請求項３６】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びｒＡＡＶ２／６からなる群より選択される、請求項３５に記載のベクターまたは方法。
【請求項３７】
前記ベクターがＡＡＶ６ベクターである、請求項３６に記載のベクターまたは方法。
【請求項３８】
前記ベクターがｓｃＡＡＶベクターである、請求項３４に記載のベクターまたは方法。
【請求項３９】
前記ｓｃＡＡＶベクターがｓｃＡＡＶ２ベクターである、請求項３８に記載のベクターまたは方法。
【請求項４０】
前記興奮性細胞関連の疾患または状態が、疼痛、炎症、高眼圧症または痙性緊張症である、請求項１または２に記載のベクターまたは方法。
【請求項４１】
前記興奮性細胞関連疾患が疼痛である、請求項４０に記載のベクターまたは方法。
【請求項４２】
前記疼痛が慢性疼痛である、請求項４１に記載のベクターまたは方法。
【請求項４３】
前記疼痛が、関節痛または神経因性疼痛である、請求項４１に記載のベクターまたは方法。
【請求項４４】
前記興奮性細胞関連の疾患または状態が炎症である、請求項４０に記載のベクターまたは方法。
【請求項４５】
前記炎症が関節炎症である、請求項４４に記載のベクターまたは方法。
【請求項４６】
前記ベクターがＡＡＶ６ベクターであり、前記プロモーターがヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターであり、前記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のベクターまたは方法。
【請求項４７】
前記ＧｌｙＲサブユニットが、前記サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲを生じる少なくとも１つの変異を含む、請求項４６に記載のベクターまたは方法。
【請求項４８】
前記興奮性細胞関連の疾患または状態が高眼圧症である、請求項４０に記載のベクターまたは方法。
【請求項４９】
前記興奮性細胞関連の疾患または状態が緑内障である、請求項４８に記載のベクターまたは方法。
【請求項５０】
前記ベクターがｓｃＡＡＶ２ベクターであり、前記プロモーターがマトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターであり、前記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、請求項４８または４９に記載のベクターまたは方法。
【請求項５１】
前記ＧｌｙＲサブユニットが、前記サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項５０に記載のベクターまたは方法。
【請求項５２】
前記興奮性細胞関連の疾患または状態が痙性緊張症である、請求項４０に記載のベクターまたは方法。
【請求項５３】
前記ベクターがＡＡＶ２またはＡＡＶ６ベクターであり、前記プロモーターがヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターであり、かつ前記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、請求項５２に記載のベクターまたは方法。
【請求項５４】
前記ＧｌｙＲサブユニットが、前記サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項５３に記載のベクターまたは方法。
【請求項５５】
前記ベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターであり、前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＣＡＧもしくは筋肉特異的デスミンプロモーターであり、前記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、請求項５２に記載のベクターまたは方法。
【請求項５６】
前記ＧｌｙＲサブユニットが、前記サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項５５に記載のベクターまたは方法。
【請求項５７】
前記ベクターがＡＡＶ８であり、前記プロモーターが筋特異的デスミンプロモーターである、請求項５５または５６に記載のベクターまたは方法。
【請求項５８】
１つ以上の他の治療剤を哺乳動物に投与することをさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つ以上の他の治療剤が、疼痛、炎症、高眼圧症及び／または痙性緊張症の処置に有用な薬剤である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ以上の他の治療剤が、前記多量体イオンチャネルのアゴニストまたはアロステリックモジュレーターではない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上の他の治療剤がグリシンではない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含むベクターを含む、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のための薬学的組成物、及び薬学的に許容される担体。
【請求項６３】
ａ）多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターと；ｂ）１種以上の他の治療剤との組み合わせであって；興奮性細胞関連の疾患または障害の予防的または治療的処置のための組み合わせ。
【請求項６４】
前記１つ以上の他の治療剤が、疼痛、炎症、高眼圧症及び／または痙性緊張症の治療に有用な薬剤である、請求項６３に記載の組み合わせ。
【請求項６５】
前記１つ以上の追加の治療剤が、前記多量体イオンチャネルのアゴニストでも、アロステリックモジュレーターでもない、請求項６３に記載の組み合わせ。
【請求項６６】
前記１つ以上の追加の治療剤がグリシンではない、請求項６５に記載の組み合せ。
【請求項６７】
多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含むベクターと；パッケージング材料と、前記ベクターをそれを必要とする哺乳動物に投与して興奮性細胞関連の疾患または状態を処置するための説明書とを備える、キット。
【請求項６８】
１つ以上の他の治療剤をさらに備える、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
発現カセットを含むベクターの使用であって、前記発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、それを必要とする哺乳動物における、興奮性細胞関連の疾患または状態の治療のための薬剤を調製するための、使用。
【請求項７０】
発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、薬物療法において使用するための多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項７１】
発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のために、多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項７２】
哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のための方法であって、前記細胞を、多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターと接触させることを包含する方法。
【請求項７３】
前記サブユニットが、１つ以上のさらなるサブユニットとともに多量体化し、多量体イオンチャネルを形成する、請求項７１または７２に記載のベクターまたは方法。
【請求項７４】
多量体イオンチャネルのアゴニストまたはアロステリックモジュレーターが哺乳動物に投与されない、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記アゴニストがグリシンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記多量体イオンチャネルが、内因性アゴニストによって活性化される、請求項７１または７２に記載のベクターまたは方法。
【請求項７７】
前記核酸が、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）、γ−アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡＲ）またはグルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）のサブユニットをコードする、請求項７１または７２に記載のベクターまたは方法。
【請求項７８】
前記核酸がＧｌｙＲのサブユニットをコードする、請求項７７に記載のベクターまたは方法。
【請求項７９】
前記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと比較して少なくとも１つの変異を含む、請求項７１または７２に記載のベクターまたは方法。
【請求項８０】
前記多量体イオンチャネルが構成的に活性である、請求項７９に記載のベクターまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／２３５，９１４号、２０１５年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／２３５，９２０号、２０１６年３月４日に出願された米国仮出願第６２／３０３，９０７号、及び２０１６年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３７８，５０９号（それらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる）の優先権利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
興奮性細胞（例えば、ニューロン及び筋肉細胞）の電気生理学的反応を調節する可能性は、潜在的に、神経筋の状態、疼痛及びこのような細胞の活性に関連する他の障害の処置につながる可能性がある。しかしながら、内因性イオンチャネルに作用するリガンドの投与は、全身送達による広範な副作用の可能性のために大きな障害をもたらす。さらに、局所的に作用する薬剤（例えば、銀またはカプサイシン）は、望ましくない副作用を有し、かつ永続的な損傷を引き起こす可能性がある。無脊椎動物において見出されるニコチニコイドファミリー受容体であるグルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）の発現が、ニューロンをサイレンシングするために使用された、リガンドゲートのアニオンチャネルの発現によるニューロン活性の調節は以前に示されている（Ｓｌｉｍｋｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（１７）：７３７３−９）。ＧｌｕＣｌは、低濃度で内因性の哺乳類のイオンチャネルに対してほとんど、または全く影響を及ぼさない高効力のリガンドであるイベルメクチンの添加によって選択的に活性化され得る。しかしながら、脊椎動物、特にヒト患者での使用のためには、このアプローチは、そのような外来タンパク質に対する免疫応答を生じさせ、潜在的な自己免疫疾患を引き起こすというリスクをもたらす。免疫リスクを克服するために、ヒトグリシンゲートのクロライドチャネル（ＧｌｙＲ）は、同様の様式で使用されている（Ｇｏｓｓ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（３）：５００−５０６；米国特許第８，９５７，０３６号）。しかし、チャネルを活性化するためにイベルメクチンの投与が必要であったＧｌｕＣｌの場合と同様に、ＧｌｙＲチャネルの活性化及びその後の生理学的効果は、アゴニスト（グリシン）の局所的または全身的投与によって達成された。グリシンは、２６−２４５分の範囲で身体の半減期が短い（Ｈａｈｎ  Ｒ．（１９９３）Ｕｒｏｌ  Ｒｅｓ．２１：２８９−９１）ので、米国特許第８，９５７，０３６号明細書に記載されている方法及び試薬による、持続的または慢性状態、例えば、慢性疼痛、高眼圧症または痙性緊張症の処置のための生理学的効果の維持は、大量のグリシンの反復した注射もしくは摂取；またはＧｌｙＲチャネルの選択的な長い半減期合成アゴニストの開発及びその後の反復投与を必要とする。したがって、興奮性細胞の電気生理学的活性の長期間の調節のためのさらなる方法及び試薬が必要とされる。さらに、興奮性細胞関連疾患及び状態を処置するために、新しい組成物及び方法が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８，９５７，０３６号明細書
【特許文献２】米国特許第８，９５７，０３６号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｌｉｍｋｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（１７）：７３７３−９
【非特許文献２】Ｇｏｓｓ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（３）：５００−５０６
【非特許文献３】Ｈａｈｎ  Ｒ．（１９９３）Ｕｒｏｌ  Ｒｅｓ．２１：２８９−９１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
したがって、本発明の特定の実施形態は、興奮性細胞の電気生理学的活性を調節するための方法及び試薬を提供する。
本発明の特定の実施形態は、発現カセットを含むベクターであって、ここで発現カセットが、多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、哺乳動物細胞の電気生理学的活性の調節（例えば、インビボ調節）のためのベクターを提供する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物細胞の電気生理学的活性の調節（例えば、インビボ調節）のための方法であって、細胞と（例えばインビボで）、多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターとを接触させることを包含する、方法を提供する。
【０００６】
本発明の特定の実施形態は、発現カセットを含むベクターの使用であって、この発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、哺乳動物細胞の電気生理学的活性の調節（例えば、インビボ調節）のための医薬を調製する使用、を提供する。
【０００７】
そのような方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）の興奮性細胞においてＧｌｙＲタンパク質の外因性発現を引き起こすことを包含し得る。その後、興奮性細胞は、ＧｌｙＲタンパク質のアゴニストとして作用する内因性グリシンに曝露される。内因性グリシンに応答する外因性ＧｌｙＲタンパク質（イオンチャネル）の調節は、外因性アゴニストまたは受容体のアロステリックモジュレーターの投与なしに、興奮性細胞の電気生理学的活性を調節する。
【０００８】
本発明の特定の実施形態では、構成的に活性なチャネルを形成するようにイオンチャネルのサブユニットを改変してもよく、この場合、アゴニストへの暴露はもはや必要ではない。この方法は、疼痛、高眼圧症及び痙性などの興奮性細胞関連の疾患または状態を処置するために使用してもよい。
【０００９】
したがって、本発明の特定の実施形態は、発現カセットを含むベクターであって、ここでこの発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的な処置のためのベクターを提供する。
【００１０】
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する方法であって、発現カセットを含む有効量のベクターを哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを包含し、ここでこの発現カセットは、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む方法、を提供する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、発現カセットを含むベクターの使用であって、ここで、この発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態の処置のための医薬を調製する使用、を提供する。
【００１２】
本発明の特定の実施形態は、発現カセットを含むベクターであって、ここでこの発現カセットが、薬物療法における使用のために多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、を提供する。
【００１３】
本発明の特定の実施形態は、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のための薬学的組成物であって、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクター、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、を提供する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態は、ａ）多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターと；ｂ）１種以上の他の治療剤との組み合わせであって、興奮性細胞関連の疾患または障害の予防的または治療的処置のための組み合わせ、を提供する。
【００１５】
本発明の特定の実施形態は、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターと；パッケージング材料と、それを必要とする哺乳動物にこのベクターを投与して興奮性細胞関連の疾患または状態を処置するための説明書とを備えるキット、を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、リガンドの非存在下でのＧｌｕＣｌ受容体のバックグラウンドコンダクタンスを示す。図１Ａ。ＧｌｕＣｌ  ＷＴからの電流応答の例。容量補償のない全細胞電圧クランプ細胞は、５０ｍｓにわたって−６０ｍＶから＋６０ｍＶまで傾斜した。膜Ｉｍにまたがる全電流は、容量性電流Ｉｃと抵抗性電流ＩＲとの和である。図１Ｂ。バックグラウンドコンダクタンスは、記録された細胞の数に対する各受容体の平均容量によって正規化した（カッコ内に示されている）。可溶性ＧＦＰを、ニセのトランスフェクション対照として用いた。
【図２−１】図２Ａ〜Ｆは、ＧｌｕＣｌチャネルを示す。図１Ａ。グルタメート及びＩＶＭ分子が結合した改変ＧｌｕＣｌαホモマーのチャネル（３ＲＩＦ．ｐｄｂ）の結晶構造（側面図）。アゴニストは、サブユニット界面で結合する；グルタミン酸は、細胞外ドメインに結合し、ＩＶＭは、膜貫通ドメインの上半分に結合する。図１Ｂ。ＧｌｕＣｌは、グルタミン酸及びＩＶＭによって異なって活性化される。電気生理学的トレースは、アフリカツメガエル卵母細胞で発現されたヘテロマーのＧｌｕＣｌαβチャネルから得た。図１Ｃ。細孔を形成するサブユニットの対称配置を示すＧｌｕＣｌチャネルの上面図。図１Ｄ、Ｅ、及びＦ。らせん形の細孔ライニングＭ２ドメインの残基。ロイシン９’は、高度に保存された細孔ライニング残基である。
【図２−２】図２Ａ〜Ｆは、ＧｌｕＣｌチャネルを示す。図１Ａ。グルタメート及びＩＶＭ分子が結合した改変ＧｌｕＣｌαホモマーのチャネル（３ＲＩＦ．ｐｄｂ）の結晶構造（側面図）。アゴニストは、サブユニット界面で結合する；グルタミン酸は、細胞外ドメインに結合し、ＩＶＭは、膜貫通ドメインの上半分に結合する。図１Ｂ。ＧｌｕＣｌは、グルタミン酸及びＩＶＭによって異なって活性化される。電気生理学的トレースは、アフリカツメガエル卵母細胞で発現されたヘテロマーのＧｌｕＣｌαβチャネルから得た。図１Ｃ。細孔を形成するサブユニットの対称配置を示すＧｌｕＣｌチャネルの上面図。図１Ｄ、Ｅ、及びＦ。らせん形の細孔ライニングＭ２ドメインの残基。ロイシン９’は、高度に保存された細孔ライニング残基である。
【図３】図３は、ヒトの目の解剖学的構造の特定の態様を示す。
【図４】図４は、１ミクロンの孔がより堅くなるのにともなう、１ミクロンの孔を有する可撓性膜の数学的モデルを示す。その孔を通るポアズイユ流の関係を用いて、水溶液の流動抵抗は、膜がより堅くなるにつれて変化しているとマーキングされる。３つの曲線が２〜３マイクロリットル／分の流量でプロットされている。この単純化された例によって、ＴＭがより堅くなるにつれて容易性が影響を受けることが示されている。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＧｌｙＲαサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現するＨＥＫ−２９３細胞の膜電位に対するグリシンの効果を示す。図５Ａ）グリシンは、ＧｌｙＲα−サブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現するＨＥＫ−２９３細胞の膜電位に用量依存的な効果を示す。図５Ｂ）グリシンに対する応答は、タウリン（１００μＭ）の存在によって影響されない。
【図６】図６は、ＧｌｙＲαサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜電位におけるグリシンに対する用量応答曲線を示す。グリシン±タウリンの添加の４．５分後に集められたデータによって、グリシンがＨＥＫ−２９３細胞のＧｌｙＲα−サブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）の膜電位に用量依存的な効果を有したことが示される。タウリンは、これらの細胞の膜電位に影響を及ぼさなかった。フィットした曲線によって、グリシンに対する応答が、１００μＭタウリン（ＥＣ５０＝４３μＭ）の存在によって有意に影響されなかった９２μＭというＥＣ５０濃度を有したことが示される。
【図７】図７は、ＧｌｙＲαサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現するＨＥＫ−２９３の膜電位に対するグリシン±タウリンの効果を示す。ＧｌｙＲαサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現するＨＥＫ−２９３細胞では、ベースライン膜電位（図５Ａ〜５Ｂのグリシンの添加の前の最初の２０秒を参照）（ベースライン）は、タウリンの添加によって有意に変化しなかった（３００μＭ）が、処置の４．５分後に測定した場合、グリシン（３００μＭ）の添加によって変化した。グリシン（３００μＭ）に対する処置後４．５分の応答は、タウリン（１００μＭ）の存在によって影響されなかった。
【図８】図８は、ラットにおける神経因性疼痛のＳＮＩモデルにおけるＧＴＸ−０１の鎮痛効果の時間経過を示す。ベースライン評価を−１日目に測定し、腓骨神経及び脛骨神経を切断する手術を第０日に行った。全てのラットは、手術後１０日目に機械的刺激（異痛症）に対して過敏である。ＧＴＸ−０１または対照ベクターを１０日目に投与した。末梢神経における遺伝子治療のウイルス送達と一致する、異痛症の時間依存性逆転が観察された。データ点は、４匹の動物「ＧＴＸ−０１」及び５匹の動物「対照」±ＳＥＭの平均を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】図９は、ＧＴＸ−０１または対照ベクターのいずれかで処置したＳＮＩラットの体重を示す。体重を測定し、研究を通して記録した。ＧＴＸ−０１対、対照ベクターで処置した動物の体重には差異は見られなかった。
【図１０】図１０によって、イベルメクチンがＧｌｕＣｌグルタミン酸受容体単独の野生型α−サブユニットを発現するＨＥＫ−２９３細胞の膜電位に用量依存的効果を示すことが示される。このことは、単量体のクロライド選択的チャネルがＧｌｕＣｌグルタメート受容体のα−サブユニットによって形成され得ることを実証する。
【図１１】図１１によって、イベルメクチン添加の４．５分後に集めたデータ（図１０に示す）は、イベルメクチンが、ＧｌｕＣｌグルタミン酸受容体の単量体の野生型α−サブユニット発現するＨＥＫ−２９３細胞の膜電位に用量依存的な効果を有することを示したことが図示される。データを曲線に当てはめると、イベルメクチンに対する応答は、１４７ｎＭのＥＣ５０濃度を有したことが示される。
【図１２】図１２では、ＧｌｕＣｌグルタメート受容体α−サブユニット単独のＬ９’Ａ変異を発現するＨＥＫ−２９３細胞において、ベースライン膜電位（イベルメクチン添加前の最初の２０秒前）が最大変化し、最大有効濃度のイベルメクチンによって刺激された場合に、ＧｌｕＣｌグルタミン酸受容体の野生型α−サブユニットを発現する細胞において見られたものと同等であったことが示される。ＧｌｕＣｌグルタミン酸受容体αサブユニットのＬ９’Ａ変異を発現する細胞では、イベルメクチンは、ベースライン時に測定されたものを上回り膜電位の変化を増強することはなかった。
【図１３】図１３は、ラットにおける神経因性疼痛のＳＮＩモデルにおけるＧＴＸ−０１＊の鎮痛効果の経時変化を示す。ベースライン評価を、−１日目に測定し、腓骨神経及び脛骨神経を切断する手術を第０日に行った。全てのラットは、手術後１０日目に機械的刺激（異痛症）に対して過敏である。ＧＴＸ−０１＊または対照ベクターを、１０日目に投与した。末梢神経における遺伝子治療のウイルス送達と一致する異痛症の時間依存的逆転が観察され、処置後１３日で異痛症の３３％逆転、ならびに処置後２２日目及び３５日目の両方で７７％の逆転であった。データ点は、６匹の動物（最終データ点で５匹）±ＳＤの平均を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４は、手術後４６日目にガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ：ＩＰ）を投与した場合の反応を示す。対照ベクター（対照）で以前に処置され、機械的刺激に対して過敏なままであった動物では、ガバペンチンは異痛症応答を投与後１時間で２５％、２時間で４４％減少させた。ガバペンチンは、以前にＧＴＸ−０１＊で処置した動物では機械的刺激に対するほぼ正常な応答に影響を与えなかった。点線は、手術前にこれらの動物で測定された平均ベースライン引っ込め閾値を表す（図１３参照）。データポイントは、５匹の動物±ＳＤの平均を表す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】図１５は、治療後２２日目に採取したＧＴＸ−０１＊処理動物からのＤＲＧの免疫組織化学的評価を示す。右側のパネルには、ＥＹＦＰ（ＧＴＸ−０１＊によって送達されたｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ遺伝子の産物）について陽性に染色された個々の細胞体。同様に、左パネルは、ＥＹＦＰについて陽性に染色された同じ動物由来の足の真皮層の下に位置する神経終末。
【図１６】図１６は、グリシンによって活性化される活性Ｃｌ−チャネルを形成するＧｌｙＲ受容体チャネル（ｈＧｌｙＲａ１）のα−１サブユニットで非トランスフェクション、ニセトランスフェクトされるか（ニセ（Ｍｏｃｋ））またはトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の生存率を示す。トランスフェクション後、細胞を、グリシンを含まない培地またはグリシン（４００μＭ）を含有するＤＭＥＭのいずれかで培養した。細胞生存率は、トランスフェクションの７２時間後にトリパンブルー色素排除を用いて測定した。
【図１７】図１７は、トランスフェクトされていないか、ニセトランスフェクトされた（ニセ（Ｍｏｃｋ））か、または野生型ＧｌｕＣｌαサブユニット（ＧｌｕＣｌ）、もしくは構成的に活性なＣ１−チャネル（ＧｌｕＣｌ＊）を形成するＧｌｕＣｌアルファサブユニットのＬ９’Ａ変異でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の細胞生存率を示す。細胞生存率は、トランスフェクションの４８時間後にトリパンブルー色素排除を用いて測定した。
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、細胞内Ｃａ＋＋におけるカルバコール（Ｃｃｈ）誘導増大、及び正常な健康ドナーの肺から培養された平滑筋細胞におけるフォルモテロール（１μＭ）によるその拮抗作用を示す。Ｃｃｈへの応答は、ＧｌｕＣｌアルファサブユニットＬ９’Ａ変異体（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ）でトランスフェクトされた両方のドナー由来の細胞において減少する。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、正常な健康ドナーの肺から培養された平滑筋細胞における細胞内Ｃａ＋＋のヒスタミン誘発性の増大を示す。ヒスタミン応答は、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴ（野生型ＧｌｙＲα−１サブユニット）でトランスフェクトされ、グリシン（１００μＭまたは１ｍＭ）に曝露された細胞では弱くなった。ヒスタミン応答もまた、グリシンを添加しないで、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ（ＧｌｙＲアルファ−１サブユニットＬ９’Ａ）でトランスフェクトした細胞では減弱した。
【図２０】図２０は、培養中のヒトＤＲＧ細胞の画像を示す。ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＧＦＰニューロン細胞（矢印）への暴露後４日目に、ＧＦＰの発現を示す。ＧＦＰ発現は、ニューロン対グリア細胞に限定される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法
本発明の特定の実施形態は、興奮性細胞の電気生理学的活性を調節する方法を提供する。
【００１８】
本発明の特定の実施形態はまた、哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のための方法であって、インビボで細胞を本明細書に記載のベクターと接触させることを包含する方法を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００２０】
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のための医薬を調製するための、本明細書に記載のベクターの使用を提供する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「哺乳動物細胞の電気生理学的活性の調節」という用語は、細胞の膜電位の変化であって、これは生物細胞の内部と外部との間の電位差である膜電位を指す。細胞の外部に関して、膜電位の典型的な値は、−４０ｍＶ〜−８０ｍＶの範囲である。例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）の導入を介して、細胞の内部をより負（過分極）にすることによってこの膜電位を増大させることで、細胞の電気的活性化の可能性を減少させること（脱分極）によって興奮性細胞の活性が低下される。細胞の電気生理学は、当技術分野で公知の技術を用いて、例えば、細胞膜を横切る電圧変化を検出するために使用されるＦＬＩＰＲ膜電位アッセイを用いて、本明細書に記載のパッチクランプ手順または蛍光に基づくアッセイを用いて、測定してもよい。
【００２２】
そのような方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）の興奮性細胞中の多量体イオンチャネルのサブユニット（例えば、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）のサブユニット）の外因性発現を引き起こすことを含み得る。特定の実施形態では、興奮性細胞は、イオンチャネルの内因性アゴニスト（例えば、グリシン）に曝露され得る。内因性アゴニストに応答するイオンチャネル（外因性サブユニットを含む）の調節は、イオンチャネルの外因性アゴニストまたはアロステリックモジュレーターの投与なしに、興奮性細胞の電気生理学的活性を調節する。特定の実施形態では、サブユニット（例えば、ＧｌｙＲまたはＧｌｕＣｌサブユニット）は、サブユニットの多量体化の際に、構成的に活性なイオンチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含み得る。構成的に活性なイオンチャネルの場合、アゴニストへの曝露はもはや必要ではなく、外因性アゴニストまたはチャネルのアロステリックモジュレーターの投与なしに、興奮性細胞の電気生理学的活性が調節されるであろう。
【００２３】
本明細書に記載されるように、興奮性細胞とは、イオンチャネル活性化の結果としてその膜電位に変動を経験する任意の細胞であり得る。そのような細胞としては、筋細胞、ニューロンなどが挙げられる。特定の実施形態では、興奮性細胞は、末梢ニューロン、骨格筋細胞または眼の小柱網細胞である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、細胞（例えば、興奮性細胞）において天然には発現されないタンパク質を指す。例えば、ＧｌｙＲは、一般には、主に脊髄及び下脳内の細胞で発現される。したがって、たとえ野生型ＧｌｙＲタンパク質（すなわち、突然変異タンパク質以外の）が、例えば末梢ニューロンにおいて発現される場合でも、そのような細胞におけるその発現は外因性である。また、外因性発現は、野生型発現よりも有意に高いレベルでのタンパク質の発現であり得る。このように、低レベルでタンパク質を発現する細胞におけるタンパク質の発現の誘発は、細胞が誘導の結果として測定可能なより多くのタンパク質を産生するように誘導される場合、「外因性」とみなされる。また、ＧｌｕＣｌタンパク質は、哺乳動物で発現されないことから、それらの発現は外因性であるとみなされることにも留意されたい。
【００２５】
本発明の特定の実施形態は、薬物療法における使用のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００２６】
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含する、それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する方法を提供する。
【００２７】
本発明の特定の実施形態は、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００２８】
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物において興奮性細胞関連の疾患または状態を処置するための医薬を調製するための、本明細書に記載のベクターの使用を提供する。
【００２９】
本明細書で使用される「興奮性細胞関連の疾患または状態」という用語は、アニオン（例えば塩化物）チャネル活性及びカチオン（例えば、ナトリウム）チャネル活性の正味の効果に基づいて興奮性細胞の電気生理学的活性から生じるか、それを伴うか、または関連する任意の疾患または状態を指す。特定の実施形態では、疾患または状態は、興奮性細胞における異常な電気生理学的活性の結果であり得る（すなわち、そのような疾患または状態に罹患していない哺乳動物の興奮性細胞に存在する電気生理学的活性と比較して）。興奮性細胞関連の疾患または状態は、当該分野で公知であり、例えば、疼痛（例えば、慢性疼痛、例えば関節痛または神経因性疼痛）、炎症（例えば、関節炎症）、高眼圧症（例えば、緑内障）及び痙性緊張症（痙性）が挙げられる。したがって、特定の実施形態では、興奮性細胞関連の疾患または状態は、疼痛（例えば、慢性疼痛、例えば関節痛または神経因性疼痛）、炎症（例えば、関節炎症）、高眼圧症（例えば、緑内障）または痙性緊張症（痙性）である。
【００３０】
特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の他の治療剤（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。したがって、特定の実施形態では、この方法は、高眼圧症（例えば、緑内障）の処置に有用な１つ以上の他の治療薬（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。特定の実施形態では、１つ以上の他の治療剤は、β遮断薬（例えば、Ｔｉｍｏｌｏｌ）または有害物質（例えば、Ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ）または炭酸脱水酵素阻害薬（例えば、アセタゾラミド）または交感神経刺激薬（例えば、Ｄｉｐｉｖｅｆｒｉｎ）またはプロスタグランジンアナログ（例えば、ラタノプロスト）またはＲｈｏキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態では、本方法はさらに、疼痛（例えば、慢性疼痛、例えば関節痛または神経因性疼痛）を処置するために有用な１つ以上の他の治療薬（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することを包含する。特定の実施形態では、この方法は、炎症（例えば、関節炎）の処置に有用な１つ以上の他の治療剤（例えば、医薬品）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。特定の実施形態では、１つ以上の他の治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、イブプロフェン）またはステロイドである。特定の実施形態では、この方法は、痙性緊張症の処置に有用な１つ以上の他の治療剤（例えば、バクロフェン、ベンゾジアゼピン、ダントロレンナトリウム、イミダゾリンまたはガバペンチンなどの薬剤）を哺乳動物に投与することをさらに包含する。特定の実施形態では、１つ以上の他の治療剤は、免疫系抑制剤、エンハンサー、抗生物質（例えば、殺微生物剤または殺菌剤）及びアドレナリンから選択され得る。
【００３１】
本明細書に記載されるように、本発明の方法において使用され得るベクターは、発現カセットを含んでもよく、ここで発現カセットは、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、内因性化合物によって活性化される。他の実施形態では、多量体イオンチャネルは、構成的に活性である。したがって、特定の実施形態では、アゴニスト（例えば、グリシン）またはイオンチャネルのアロステリックモジュレーターは、哺乳動物に投与されない。したがって、そのような実施形態では、上記の１つ以上の他の治療剤は、イオンチャネルのアゴニスト（例えば、グリシン）またはアロステリックモジュレーターではない。
【００３２】
本明細書で使用される「アゴニスト」という用語は、受容体／イオンチャネルに結合し、この受容体／イオンチャネルを活性化して生物学的応答を生成することができる化学物質を指す。例えば、グリシンはＧｌｙＲアゴニストである。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「アロステリックモジュレーター」という用語は、イオンチャネルを作動させるか、または拮抗（開放または閉鎖）し得る化学物質を指す。したがって、この用語は、アゴニスト及びアンタゴニストの両方を包含する。例えば、ＧｌｙＲのアゴニストとしてはグリシン、タウリン及びベータアラニンが挙げられ、一方で、ＧｌｙＲのアンタゴニストとしてはストリキニーネが挙げられる。さらに、この用語は、標的タンパク質、例えば受容体におけるアゴニストまたはインバースアゴニストの効果に間接的に影響を及ぼす（調節する）物質を包含する。アロステリックモジュレーターは、オルトステリックアゴニスト結合部位の部位とは異なる部位に結合し得る。通常、それらは、タンパク質構造内の立体配座変化を誘発する。正のアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）またはアロステリックエンハンサーは、標的タンパク質に対するオルトステロイドアゴニストの結合親和性または機能的効力を増強することによって、オルトステリックアゴニストの効果の増幅を誘導する。ネガティブモジュレータ（ＮＡＭ）は、オルトステリックリガンドの効果を減少させるが、オルトステリックリガンドの非存在下では不活性である。アロステリック結合部位を占有し、機能的に中性である物質は、サイレントアロステリックモジュレーター（ＳＡＭ）と呼ばれる。古典的なベンゾジアゼピンは、ＧＡＢＡＡ受容体の周知のＰＡＭである。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、哺乳類の食餌を改変することをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、食餌は、哺乳動物の内因性グリシンのレベルを増大または減少させるように改変され得る。
【００３５】
疼痛及び炎症の治療方法
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト患者）において疼痛（例えば、慢性疼痛、例えば、関節痛または神経因性疼痛）を処置する方法であって、本明細書に記載のベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含する方法、を提供する。特定の実施形態では、この方法を使用して疼痛の感覚を軽減し得る。
【００３６】
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト患者）における炎症（例えば関節炎）の治療方法であって、有効量の本明細書に記載のベクターを哺乳動物に投与することを包含する方法も提供する。
【００３７】
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物の疼痛または炎症を処置するための医薬を調製するための、本明細書に記載のベクターの使用を提供する。
【００３８】
本発明の特定の実施形態は、疼痛または炎症の治療的処置のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００３９】
最大１億人のアメリカ人が慢性疼痛を患っていると推定されている。慢性疼痛では、患者のかなりの割合が現在の治療では不十分であり、そのような状態の薬理学的及び非薬理学的介入における大きなギャップを強調する。疼痛は孤立した疼痛であってもよいし、または疼痛は特定の疾患と関連する場合もある。疼痛は、限定するものではないが、慢性術後疼痛、神経腫、例えば、断端神経腫及びモートン神経腫、仙腸痛を含む関節痛、背部痛及び任意の公知のヒト疾患に伴う疼痛などの特定の状態に関連し得、これには限定するものではないが、糖尿病、関節炎、心血管疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患（例えば、肺気腫）、感染性疾患（例えば、ウイルスまたは細菌の感染）、神経学的疾患（例えば、アルツハイマー病）、胃腸疾患、肝臓疾患、血液障害、アレルギー、内分泌疾患、及びがんが挙げられる。疼痛は、口腔癌（例えば、舌癌及び口腔癌）、咽頭、消化器系（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢及び膵臓）、呼吸器系（例えば、肺癌）、骨及び関節（例えば、骨転移、骨肉腫）、軟部組織、皮膚（例えば、黒色腫）、乳房、生殖器系（例えば、卵巣癌）、泌尿器系（例えば、膀胱癌、腎臓癌）、眼及び眼窩、脳及び神経系（例えば、神経膠腫）、または内分泌系（例えば、甲状腺）の癌に関連し得る。癌はまた、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫または白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）であり得る。また、慢性疼痛、例えば、限定するものではないが、脳卒中後疼痛または多発性硬化症に関連する疼痛、脊髄損傷、偏頭痛、ＨＩＶ関連神経障害性疼痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性神経障害、膵炎、炎症性腸症候群、腰痛疼痛、線維筋痛、または神経障害もしくは損傷から生じる疼痛、例えば、開胸術後痛もしくはヘルニア修復後痛、または切断後の「断端疼痛」、または神経損傷、例えば、側方大腿皮神経閉塞（メルジア症疼痛）または他の状況から生じる疼痛（これにより、疼痛は、例えば、絞扼、虚血または炎症に起因する神経損傷から生じる）である。
【００４０】
疼痛（例えば、慢性疼痛）の処置のために、本明細書に記載のベクターは、局所麻酔薬の送達に使用されるものと同様の従来の注射技術を用いて疼痛の部位に送達することができる。非限定的な例として、慢性術後疼痛（ＣＰＳＰ）またはヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）のような状態で皮膚から生じる疼痛を処置するために、皮内注射を使用しても、または皮下注射を使用してもよい。非限定的な例として、神経組織に直接注射を行って、モートン神経腫などの状態または切断後に生じる「断端神経腫」の状態を処置してもよい。また、非限定的な例として、糖尿病性神経障害または内臓癌に関連する疼痛などの局所痛の治療のために、神経線維及び神経幹または神経節に直接注射を行ってもよい。この治療法はまた、非限定的な例として変形性関節症、外傷、老化または炎症に伴う疼痛を低減するために関節に直接送達してもよい。これらの関節としては、椎間関節、仙腸関節、膝、股関節、肩、足首、手首、肘などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書に記載のベクターを用いて疼痛を処置する能力は、ある範囲の動物モデル、例えば、ヨード酢酸モノナトリウム誘発性変形性関節症（ＭＩＡ−ＯＡ）モデル（Ｂｏｖｅ  ＳＥ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １１（１１）；８２１−３０；Ｓｃｈｕｅｌｅｒｔ  Ｎ．及びＭｃＤｏｕｇａｌｌ  ＪＪ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６５（２）：１８４−１８８；Ｃｏｍｂｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７０（２−３）：２３６−２４０）または炎症性疼痛モデル、例えば、ＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）炎症性疼痛モデル（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ  ＪＣ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５．４．１−５．４．７、Ｍａｒｃｈ  ２０１２）を用いて試験してもよい。神経因性疼痛モデルはまた、神経の損傷から生じる疼痛など、例えば、Ｃｈｕｎｇの脊髄神経結紮モデル（Ｃｈｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．９９：３５−４５）、スペアード神経傷害（Ｓｐａｒｅｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｉｎｊｕｒｙ）モデル（Ｒｉｃｈｎｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  １８（５４）：ｐｉｉ  ３０９２）Ｂｅｎｎｅｔｔ慢性狭窄神経損傷モデル（Ａｕｓｔｉｎ  ＰＪ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  １３（６１）：ｐｉｉ  ３３９３）またはリゾホスファチジン酸モデル（Ｉｎｏｕｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１０（７）：７１２−７１８；Ｏｇａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｉｎ  １６（７）：９９４−１００４）を用いてもよい。
【００４２】
本明細書に記載のように、本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物における疼痛の処置のための方法であって、哺乳動物に有効量の本明細書に記載のベクターを投与することを包含する、方法を提供する。このような実施形態では、このベクターは、発現カセットを含むウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）であってもよく、ここでこの発現カセットは、プロモーター及びクロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターである。特定の実施形態では、この核酸は、ＧｌｙＲのサブユニットをコードする。特定の実施形態では、核酸は、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なイオンチャネルを生じる少なくとも１つの変異をサブユニットが含む、クロライドチャネルのサブユニットをコードする。特定の実施形態では、このサブユニットは、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含むＧｌｙＲサブユニットである。
【００４３】
グリシン及びタウリンの有意なレベルは、滑液（ＳＦ）、特に炎症を起こした関節のレベルにおいても存在する。以前の研究では、活動性関節炎状態の患者から抽出されたＳＦにおける興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）及び他の神経伝達物質のレベルの上昇が示されている（Ａｐｐｅｌｇｒｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．９９：５１９−５２１；Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０：３２６−３３５；ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２７：７３９−７４５）。さらなる研究では、関節リウマチ患者の血漿アミノ酸（ＡＡ）値の上昇が正常対照と比較して報告されている（Ｔｒａｎｇ  ＬＥ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：３９３−４０２）。増加したＳＦ  ＥＡＡレベルの供給源（複数可）は知られていないが、可能性としては、局所細胞産生、神経原性浸出、または滑膜を横切る血液または血漿からの受動拡散が挙げられる。症候性関節症におけるＳＦ  ＥＡＡの濃度上昇、ならびにＳＦ  ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ１−α濃度とのそれらの報告された関連付けによって、血漿からの受動拡散ではなく局所的な炎症性関節プロセスが、ＳＦ  ＥＡＡ濃度を決定することが示唆される（ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：６２１−６２７）。これを評価するために、ＭｃＮｅａｒｎｅｙ及びＷｅｓｔｌｕｎｄは、最近死亡した１４人の死体及び９人の活動性関節炎の患者の膝から血漿及び滑液を同時に採取し、ＥＡＡと他のＡＡのレベルを測定して区画としてＳＦ：血漿の濃度比を評価した。（ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  Ｔ．及びＷｅｓｔｌｕｎｄ  Ｋ．（２０１３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ．６（３）：４９２−４９７）。それらのデータによって、非関節炎サンプルでは、グリシン及びタウリンの平均ＳＦ：血漿濃度比がそれぞれ−２．１１及び−１．５７であることが示された。しかし、ライター症候群に罹患している患者では、グリシンの平均ＳＦ：血漿濃度比は、血漿中のＳＦの約２倍高かった。グリシンの上昇に加えて、ＳＦグルタメートのレベルもこの患者において７．５倍に有意に上昇した。
【００４４】
活動性関節炎におけるＳＦ  Ｇｌｕ及びＡｓｐ濃度の上昇の原因は不明であるが、可能性のある候補としては、血漿、関節嚢中の滑膜細胞もしくは骨細胞からの局所産生、または神経線維からの局所分泌が挙げられる。小さな生理学的分子は、通常、血漿と滑液の間で完全に平衡しているので、ＳＦ  Ｇｌｕ及びＡｓｐは、サイズに基づいて、血漿と完全に平衡すると予想され得る（ＭｃＣａｒｔｙ  Ｄ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ及びＡｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｏｏｐｍａｎ  ＷＪ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９７；ｐｐ：８１−１０２）。しかし、生前の関節炎のない死体由来のサンプルは、他の９つのＡＡと比較して、ＥＡＡ  ＳＦ：血漿濃度比を有意に低下させた。ＳＦ  Ｇｌｕ及びＡｓｐの有意に大きな区画比の相違によって、血漿がＳＦ  ＥＡＡの単独の、または主要な供給源ですらないことが示される。生前関節炎がある１人の死体における、及び活性炎症性関節炎プロセスを有するいくつかの患者における、より高いＳＦ：血漿濃度比によって、また、ＳＦ  ＥＡＡ濃度が関節における局所的な生理学的過程を反映するという仮説が支持される。これらの興奮性アミノ酸の最も可能性の高い供給源は、関節に物質Ｐを放出すると考えられるように、関節に供給される一次求心性神経末端からの刺激された放出であり得る（Ｙａｋｓｈ  ＴＬ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｆｆｅｒｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｖｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐａｉｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｕｂｎｅｒ  Ｒ、Ｇｅｂｈａｒｔ  ＧＦ．Ｂｏｎｄ  ＭＲ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ：５１−５４）。正常なラットに由来するＳＦ  ＥＡＡ値は、低値が能動性関節炎の非存在下で生理学的であり、炎症性関節において上昇することが示唆される（Ｌａｗａｎｄ  ＮＢ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐａｉｎ  ８６：６９−７４；Ｌａｗａｎｄ  ＮＢ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２４：１６９−１７７）。以前の研究では、サルの炎症関節を供給する中央の関節神経においてＧｌｕ免疫反応性の増大が示されている（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ  ＫＮ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１７：１５−２７）。したがって、グルタミン酸塩が神経線維によって関節に放出されることも想定することは合理的である。ラットのカオリン／カラギーナン誘発性関節炎モデルでは、末梢神経からの神経伝達物質の放出を減少させる、関節内リドカインによる前処置により、ＳＦ  Ｇｌｕの予想される増大が抑止された（Ｌａｗａｎｄ  ＮＢ．ｅｔ  ａｌ．（２０００））。局所的なグルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩は、局所的な骨細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞上の末梢受容体に結合して活性化し、局所的な炎症及び病状を増強または永続化し得る（Ｓｋｅｒｒｙ  ＴＭ．及びＧｅｎｅｖｅｒ  ＰＧ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２２：１７４−１８１；Ｌａｗａｎｄ  ＮＢ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２４：１６９−１７７；Ｆｌｏｏｄ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５６：２５２３−２５３４；Ｇｕ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｌ．７０：１９４−２０３；Ｌａｋｅｔｉｃ−Ｌｊｕｂｏｊｅｖｉｃ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｏｎｅ  ２５：６３１−６３７；ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９８：Ｒ５８４−５９８；Ｒａｍａｇｅ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １６：１５７６−１５８４）。従って、炎症を起こした関節を支配する局所求心性神経の過分極が疼痛を軽減するだけでなく、また関節への炎症促進性のメディエーターの放出を減少させることによって炎症を減少させるとの予想は妥当である。
【００４５】
高眼圧症の処置のための方法
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト患者）における高眼圧症（例えば、緑内障）を処置する方法であって、本明細書に記載のベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含する方法、を提供する。特定の実施形態では、投与は、哺乳動物において眼内圧を低下させる。
【００４６】
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物における高眼圧症を処置するための医薬を調製するための、本明細書に記載のベクターの使用を提供する。
【００４７】
本発明の特定の実施形態は、高眼圧症の治療的処置のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００４８】
緑内障は、世界で２番目に大きな失明の原因であり、２０２０年までに全世界で５，８６０万人、米国で３４０万人に増大すると予測されている。緑内障は、大まかには、２つの主なカテゴリー、開放隅角及び閉鎖隅角（または閉塞角）緑内障に分類され得る。図３を参照すると、ヒトの目の特徴を示す解剖図が示されている。緑内障に関して、「角度」とは虹彩と角膜との間の空間を指し、これを通じて流体（房水（ＡＨ））が小柱網（ＴＭ）を介して眼から排出されなければならない。閉塞隅角緑内障は、突然出現することがあり、しばしば疼痛を伴う；視力喪失は迅速に進行することがあるが、不快感は、永久的な損傷が生じる前に患者が医療処置を求めることにつながることが多い。開放角の慢性緑内障は、より遅い速度で進行する傾向があり、患者は、病気が有意に進行するまで視力を失ったことに気付かないことがある。開放隅角緑内障の正確な病因論は未知のままである。しかしながら、ほとんどの緑内障患者にとっての主要な危険因子、及び処置の焦点は、眼内圧（ＩＯＰ）の上昇、すなわち高眼圧症（ＯＨＴ）である。網膜神経線維層における細胞喪失による視野の進行性喪失は、ＯＨＴの直接の結果である。視力喪失は、運転能力などの患者の生活の質及び移動性に悪影響を及ぼし、重大なマイナスのマクロ経済的影響をもたらす可能性がある。本発明は、主として、開放隅角緑内障におけるＯＨＴの処置に関する。
【００４９】
ＩＯＰは、眼の毛様体によって生成される房水によって主に維持される。毛様体が房水を生成すると、房水は、まず、後眼房（レンズ及び虹彩で囲まれる）に流入する。その後、虹彩の瞳孔を通って前眼房（虹彩及び角膜に囲まれている）に流れる。ここから、房水は、ＴＭを通って流れ、シュレム管（ＳＣ）を介して正常な体循環に入る。ヒトの眼では、ＳＣは、平均して毎分約３μｌの房水を転送する。したがって、ＡＨの合成と排液との間の微妙なバランスによって眼圧が維持される。ＯＨＴの主なメカニズムは、線維柱帯網またはブドウ膜強膜路を通る流出の減少である。主要な流出経路は、ＴＭを介して行われ、ＴＭはまた、房水の流出抵抗に最も寄与し、本発明の治療上の焦点である。
【００５０】
緑内障管理の近代的な目標は、緑内障の損傷及び神経損傷を回避し、副作用を最小限に抑えながら患者の視野及び全身の生活の質を維持することである。緑内障のスクリーニングは、通常、標準眼検査の一部として実施され、眼圧検査を介したＩＯＰの測定を含むべきである。
【００５１】
ＩＯＰは、薬物（通常は点眼薬）により低下する場合がある。いくつかの異なるクラスの薬物が使用されており、各クラスにはいくつかの異なる薬物がある。しばしば、これらの医薬品のそれぞれの治療効果は、局所及び全身の副作用によって制限され得る。副作用が生じる場合、患者は一般的に、それらを容認するか、薬物レジメンを改善するために処置医師と連絡をとることを享受しなければならない。緑内障患者の視力喪失の主な理由として、投薬及びフォローアップ訪問の遵守不良が挙げられている（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ＢＬ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１４０：５９８）。
【００５２】
ＯＨＴを処置するために、特に先天性緑内障の患者のために、レーザー手術及び従来の手術の両方が行われている。彼らの成功率は高いものの、これらの手技は一般的に一時的な解決策であり、２年ごとのような定期的な再治療が必要である。ほとんどの場合、術後ＩＯＰを管理及び維持するためには依然として薬物治療が必要である。しかし、手術は必要な投薬量を減らす場合がある。
【００５３】
したがって、ＯＨＴの治療のための強固でかつ信頼できる治療法の必要性が依然として存在する。例えば、ＡＨの流出に対して水圧インピーダンスを低下させることによって、ＴＭの細胞を弛緩させてＩＯＰを低下させる処置方法。
【００５４】
伝統的な概念では、小柱網は不活性組織であり、それ自体の調節特性はない。この概念では、流出抵抗の調節は、毛様体筋によって決定される。しかし、過去２０年間に行われた研究により、毛様体筋によって受動的に拡張されることに加えて、小柱網は、それ自身の収縮特性を有すること、ならびにこの構造の収縮及び弛緩は、弛緩が眼圧を低下させるという意味で眼の流出に影響し得ることが確認された。十分な証拠によって、小柱網が平滑筋様の特性を有するという理論が支持される。さらに、小柱網細胞は、多数のトランスポーター、チャネル及び受容体を発現し、その多くは平滑筋収縮性を調節することが知られている。小柱網は、アセチルコリン及びエンドセリンなどの薬理学的薬剤に応答して収縮及び弛緩するように誘導され得ることが示された（Ｌｅｐｐｌｅ−Ｗｉｅｎｈｕｅｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．５３（１）：３３−３８；Ｓｔｕｍｐｆｆ  Ｆ．ａｎｄ  Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｔ  Ｍ．（２０００）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．２１４（１）：３３−５３）。細胞レベルでは、これは原形質膜の脱分極及び細胞内カルシウムの上昇と相まっている。この細胞内Ｃａ２＋の増大は、小胞体からのＣａ２＋の放出によって媒介されるが、Ｌ型電圧ゲートののＣａ２＋チャネルの開口を介して細胞外Ｃａ２＋の流入も媒介される。この効果は、Ｌ型電圧ゲートのチャネル遮断薬ニフェジピンによってブロックされ得る（Ｓｔｕｍｐｆｆ  Ｆ．及びＷｉｅｄｅｒｈｏｌｔ  Ｍ．（２０００）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．２１４（１）：３３−５３）。一方、小柱網の弛緩は、過分極及びＬ型カルシウムチャネルの閉鎖を誘発する、マキシ−Ｋチャネルの刺激と関連しているようである（Ｓｔｕｍｐｆｆ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４０（７）：１４０４−１４１７；Ｓｔｕｍｐｆｆ  Ｆ．及びＷｉｅｄｅｒｈｏｌｔ  Ｍ．（２０００）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．２１４（１）：３３−５３）。
【００５５】
ＴＭの弛緩は、例えば、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて測定されるような網目構造のより大きなコンプライアンスをもたらすであろう。このようにして測定されたヤング率（コンプライアンスの尺度）は、小柱網の流れ抵抗と相関することが示されている。図４（米国特許出願公開２０１３／０１８４３１８号Ａ１）に示されているように、正常眼の小柱網の顎傍領域（ＪＣＴ）領域のヤング率は、１．１〜６．５ｋＰａであるのに対して、緑内障眼のＪＣＴのヤング率は、１００〜２５０ｋＰａである。
【００５６】
本明細書に記載されているのは、ＴＭ細胞弛緩を引き起こすメカニズムである。これらの機構は、細胞内カルシウムの利用可能性を低下させるか、または細胞内の収縮要素を活性化するのに必要な細胞内カルシウムを利用する細胞の能力を弱めることによって、ＴＭ細胞の収縮性を低下させる。
【００５７】
ＴＭと平滑筋細胞との間の類似性、特に収縮を維持するために必要な細胞内Ｃａ２＋を提供するＬ型電圧ゲートのＣａ２＋チャネルの役割を考慮して、平滑筋細胞は、ＴＭ細胞の薬理学的特性のモデルとして有用であり得る場合があるようである。したがって、気道平滑筋のＣｌ−流入及びその後の弛緩による細胞の過分極（Ｙｉｍ  ＰＤ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２５（５）：１７０６−１７１７）が予想され、及び実施例８（図１８及び１９）によって示されるように、ＴＭ細胞の同様の過分極が、ＴＭの弛緩を生じることが予測される。
【００５８】
上述の技術を用いて小柱網細胞の表面上に発現される構成的に活性なチャネルの使用は、リガンド活性化チャネルまたは光活性化チャネル（米国特許番号２０１５０２１７１３３Ａ１号）を上回る有意な利点を有する。リガンド活性化チャネル及び光活性化チャネルの活性は、リガンドの利用可能性及び濃度または光の放射照度レベルに依存する。リガンド活性化チャネルは、リガンドの効力及び薬物動態（ＰＫ）特性に依存する。標的組織に対するリガンドの接近可能性（特に、眼内の問題）、リガンドの局所的な遊離濃度、及び組織内のリガンドの滞留時間は全て、リガンドゲートのチャネルの活性パターンの重要な決定因子である。オプシンは、光の光子によって活性化されたときにのみ活性であり、したがって、低光（例えば、夜間）の期間、チャネルは活性ではない。化学的または物理的活性化剤への依存性は、構成的に活性なチャネルにとっては問題ではなく、生理的効果は、全ての条件下で、かつ患者が任意の薬物を服用する必要なく持続する。ＯＨＴとＰＯＡＧの場合、これらの患者のコンプライアンスが３０〜７０％と推定されるため、これは非常に重要な利点である。オプシンの場合、日中ほとんどの患者には光が豊富であるが、夜間には、２１ｍｍＨｇ未満のＩＯＰを維持するために従来の薬物療法を使用する必要がある。リガンドゲートのチャネルの場合、これらは送達、代謝及びクリアランスという同じＰＫの問題、ならびに従来の薬理学的療法の使用を複雑にし、制限する副作用を起こしやすい。
【００５９】
構成的に活性なクロライドチャネルのサブユニットのような、外因性の遺伝物質（すなわち、イオンチャネルのサブユニット）をコードする遺伝子の組織特異的送達及び細胞選択的発現を利用して、非限定的な例として、化学的または物理的刺激のいずれも使用せずにＴＭ細胞内の収縮要素の弛緩を引き起こすアプローチが本明細書において提示されている。ＴＭの弛緩は、ＴＭ組織構造の透過性を増大させ、水圧インピーダンスの低下をもたらし、それによって高いＩＯＰを減少させてＯＨＴを制御する。
【００６０】
選択された外因性物質の哺乳類（例えば、ヒト患者）の眼への送達は、以下に記載されるような１つ以上のパラダイムに従ってもよく、これは、他のシステム及び／または構造に対するヒトの眼の独特の解剖学的位置／アクセスを利用し得る。Ｂｕｉｅ  ＬＫ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，５１；１：２３６−４８）に記載されているように、眼の流出経路の細胞の位置、形態及び生理学は、それら自身が効率的な遺伝子送達に役立つ。房水の自然な流れのおかげで、前房に送達された遺伝子は、優先的に小柱網に到達し得る。ベクターが一旦小柱網に到達すれば、小柱網細胞層の間及びその周りの流体の生理学的流れパターンは、より長い接触時間を有する転移分子を提供し得、細胞への進入を容易にし得る。
【００６１】
標的解剖学的構造の細胞内で発現されるべき外因性受容体遺伝子材料を含む、本明細書に記載のベクターの送達は、限定されるものではないが、内部局所注射または適用を含む、１つ以上の構成で、シリンジまたは他のデバイスによる注射を包含し得る（すなわち、内視鏡技術などを介して、一般的には外科手術アクセスの後、解剖学的構造の標的部分に関連する組織構造の表面上、または解剖学的構造自体への注入）。これらの注入構成の各々は、以下により詳細に検討される。
【００６２】
組織構造表面への房内投与または適用を利用して、遺伝物質（すなわち、本明細書に記載のベクター）を送達してもよい。組換えベクターは、そのような局所適用または曝露後に、組織及び感染細胞を通って拡散し得る。ウイルスベクターの局所適用の有効性は、ゲル中に懸濁したベクター溶液を用いて増大されている。一実施形態では、ベクターをゲル中に懸濁させ、組織の表面に適用するか、または標的組織と同じ解剖学的空間に配置してもよい。内部局所適用は、外科装置（カメラ、針、器具など）の挿入を可能にするために、眼の外層（複数可）及び他の関連組織構造を通して１つ以上の小さな切開を行うことができる腹腔鏡技術を用いて達成され得る。針は、（スリットランプ生体顕微鏡または手術顕微鏡のようなカメラまたは他の撮像装置によって視覚化されるように）、カメラ内に挿入されてもよい。全ての場合において、ベクターは、ゲル（例えば、Ａｂｂｏｔｔの商品名「Ｈｅａｌｏｎ」、またはＡｌｃｏｎの「Ｖｉｓｃｏａｔ」の商品名で販売されている製品）と混合し、次いで適切な組織の表面上に噴霧されても、塗装されても、または注射されてもよい。例えば、１×１０１１ｖｇのＡＡＶを含有する約０．１ｍＬの生理食塩水の用量を用いて、各１ｃｍ２の領域をカバーしてもよい。これらの範囲は例示的なものであり、標的ＴＭ細胞と対になる各ベクターについて用量を試験する。
【００６３】
局所適用の１つの特定の例において、高眼圧は、顕微鏡的視覚化の下で針を使用して眼の前房内のベクター溶液またはゲルを局所適用することによって対処して、光生成物質の適切な細胞への移動を達成することができる。このベクターは、ＴＭの細胞を感染させることを目的とする、利用可能なＴＭ表面のできるだけ多くを覆うように、前房の房水中にボーラスとして、またはＴＭ付近の複数の部位で、直接及び局所的に適用されてもよい。あるいは、ウイルスを含むゲルのプラグを前房に入れ、数時間にわたってウイルスを溶出させてもよい。ただし、プラグはＴＭを実質的に閉塞しないように配置するべきである。さらに別の実施形態では、同様の効果のために、ウイルス溶出性小柱栓を挿入してもよい。ベクトル注入を準備するために、Ａｌｃｏｎによる、ＢＳＳのような眼科用の平衡塩類溶液を使用してもよい。
【００６４】
前房へのアクセスは、プロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅとして、Ａｌｃｏｎが販売）のような局所麻酔剤を点滴した後に行われてもよく、Ｓｔｏｒｚによる、Ｓｅｉｂｅｌ  ３−Ｄ  Ｌｉｄ  Ｓｐｅｃｕｌｕｍのようなリッドスペキュラムを挿入して、前房へ針注射を挿入してもよい。あるいは、針注射の代わりに、ＡＳＩＣＯによるＭＩＰダイヤモンドナイフのような鋭利な刺し刃を使用することにより、上顎側頭葉で穿刺を行ってもよい。ある量の房水を排出してもよく、ベクター注入は、穿刺によりＡＣに挿入される、例えば、２５〜３０ゲージの前房カニューレ、例えば、Ｓｔｏｒｚによる、鈍い先端のＫｎｏｌｌｅ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ  Ｃａｎｎｕｌａを用いて行ってもよい。あるいは、置換された房水は、穿刺を介して術中に通気されてもよい。
【００６５】
本明細書に記載のベクター（例えば、本明細書に記載の野生型または改変クロライドチャネルのサブユニットをコードする）能力及び小柱網へのその送達は、ラット、マウスまたはウサギのような正常な実験動物における眼圧に対する処置の効果を測定するなどある範囲の動物モデルを用いて試験してもよい。そのような測定は、眼圧計を用いて、意識がある動物または鎮静状態の動物のいずれで行ってもよい。あるいは、高眼圧症のモデルを使用して、治療の効果を測定してもよい。１つのこのようなモデルは、０．５％の酢酸プレドニゾロンを３週間または４週間、毎日３回眼に投与することによって生成される（Ｇｅｒｏｍｅｔｔａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０（２）：６６９−７３）。
【００６６】
本明細書に記載するように、本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物における高眼圧症の処置方法であって、本明細書に記載の有効量のベクターを哺乳動物に投与することを包含する方法を提供する。このような実施形態では、ベクターは、発現カセットを含むウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）であってもよく、ここでは、発現カセットは、プロモーター及びクロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターはｓｃＡＡＶ２ウイルスベクターである。特定の実施形態では、プロモーターは、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターである。特定の実施形態では、核酸は、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なイオンチャネルを生じる少なくとも１つの変異をサブユニットが含む、クロライドチャネルのサブユニットをコードする。特定の実施形態では、このサブユニットは、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含むＧｌｙＲサブユニットである。
【００６７】
痙性緊張症の処置方法
本発明の特定の実施形態は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト患者）における痙性緊張症（痙性）を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載のベクターを哺乳動物に投与することを包含する方法、を提供する。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、哺乳類における痙性緊張（痙性）を処置するための医薬を調製するための、本明細書に記載のベクターの使用を提供する。
【００６９】
本発明の特定の実施形態は、痙性緊張（痙性）の治療的処置のための本明細書に記載のベクターを提供する。
【００７０】
痙性は、特定の筋肉が連続的に収縮する状態である。この収縮は、筋肉の硬直または緊張を引き起こし、正常な運動、発声及び歩行を妨害し得る。痙性は、通常、随意運動を制御する脳または脊髄の部分の損傷によって引き起こされる。損傷は、神経系と筋肉との間の信号のバランスの変化を引き起こす。この不均衡は、筋肉の活動を増大させる。痙性は四肢の筋肉及び関節に悪影響を及ぼし、成長する子供に特に有害である。
【００７１】
痙性は、世界中の推定１，２００万人以上に影響を与える。脳性麻痺（ＣＰ）の人々の約８０％が様々な程度の痙性を有する。ＣＰのいくつかの形態が米国では５０万人と推定され、これは約４０万人がある程度のＣＰ関連の痙性を伴うことに相当する。多発性硬化症（ＭＳ）の人々の約８０％は様々な程度の痙性を有する。ＭＳ患者は米国で４０万人と推定されているが、これは約３２万人がある程度のＭＳ関連の痙性を伴うことに相当する。痙性を生じ得る他の状態としては：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、酸素欠乏による脳損傷、脳卒中、脳炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）及びフェニルケトン尿症が挙げられる。
【００７２】
痙性は、筋肉の緊張の感覚と同じくらい軽い場合もあるし、または疼痛を伴う制御不能な四肢（最も一般的には脚と腕）の痙攣を生じるほど深刻な場合もあり得る。痙性はまた、関節内及び関節周囲の疼痛または緊張感を生じ、腰痛を引き起こす場合がある。痙性の有害な影響としては以下が挙げられる：筋肉の硬さ、運動の精度の低下、特定の作業の実行が困難；制御不能でしばしば疼痛を伴う筋肉収縮を引き起こす筋痙攣；脚の不随意的な交差；筋肉及び関節の変形；筋肉疲労；縦方向の筋の成長の阻害；筋肉細胞におけるタンパク質合成の阻害。これらは、尿路感染症、慢性的な便秘、発熱または他の全身的な疾患及び圧痛のようなさらなる合併症を引き起こす可能性がある。
【００７３】
以下の共通の目標を共有する、利用可能ないくつかのタイプの処置がある：痙攣の徴候及び症状の軽減；筋肉収縮の疼痛及び頻度の減少；歩行、衛生、日常生活の活動、及びケアの容易さの改善；身支度、摂食、移動及び入浴などの介護者の課題の軽減；対象物への到達、把持、移動及び解放などを含む自発運動機能の改善；小児のさらに正常な筋肉成長を可能にすること。これらの治療の選択肢としては、物理療法及び作業療法；経口薬、例えば、バクロフェン、ベンゾジアゼピン、ダントロレンナトリウム、イミダゾリン及びガバペンチンが挙げられる。髄腔内バクロフェン（ＩＴＢ）ポンプ及び選択的背側神経根切断術（ＳＤＲ）を含む外科的選択肢も利用可能である。
【００７４】
ボトックス（Ｂｏｔｏｘ）注射剤としても公知のボツリヌス毒素（ＢＴＡ）は、痙攣性の筋肉を麻痺させることによって、少量で使用すると効果的であることが証明されている。注射部位は、痙攣のパターンに基づいて注意深く決定される。ボトックスが筋肉内に注入されると、アセチルコリンの放出が阻止され、過活動性筋肉の弛緩が生じる。注射（複数可）は一般的には数日以内に効力を発揮するが、新しい神経終末が戻って罹患した筋肉（複数可）が回復するまで約１２−１６週間しか持続しない。投与可能な注射回数には限界がある。
【００７５】
したがって、痙性の治療の選択肢は限られているため、侵襲性が低く、より効果的で患者に優しい治療が必要である。
【００７６】
痙性の治療のために、本明細書に記載の有効量のベクターを哺乳動物（例えば、ヒト患者）に投与してもよい。例えば、複数の注射針を用いて、罹患した筋肉群にベクターを直接送達してもよい。処置中に、小さな電極が、患部の筋肉領域上の患者の皮膚にテープで取り付けられる。電極は、筋電図装置（ＥＭＧ）に取り付けられる。ＥＭＧを用いて、注射前に針の位置を確認し、正しい筋肉が識別されていることを確認する。次いで、医師が、患者に筋肉群を動かすように求める。患者がこれを行えない場合、医師は患者の運動範囲の運動を行う。これによって、彼または彼女は注射から最大の利益を得ることを助けられる。このベクターは、ＥＭＧ機械に取り付けられた小さな針を用いて筋肉に注入される。医師は、筋肉群に沿って、または多くの筋肉群内のいくつかの位置に少量のベクターを注射してもよい。これは、治療の利益を最大化するのに役立つ。特定の実施形態では、送達されるべきベクターは、Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌが記載したように、標的骨格筋群の全てもしくは一部（複数可）（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．６（２２０）：２２０ｒａ２１０）、またはＴｏｗｎｅらによって記載されているように、標的筋肉群を神経支配する運動神経の全てもしくは一部（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（１）：１４１−６）のいずれかの過分極を引き起こすように調整してもよい。筋肉細胞または神経細胞のいずれかの標的化は、使用されるベクターのタイプ（例えば、ＡＡＶベクターサブタイプのタイプ）、ならびに発現カセットに含まれるプロモーターのタイプに基づいて決定される。
【００７７】
本明細書に記載のベクターが痙性を処置する能力は、様々な動物モデルにおいて試験され得る。例えば、本発明のベクターは、選択された筋肉群に注射されてもよく、４〜６週間の期間後、神経刺激に応答する筋肉の機能は、動物全体において（Ｆｅｒｔｕｃｋ  ＨＣ．ｅｔ  ａｌ（１７７５）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６６、２０９−１３）、または標的筋肉及びその関連する運動神経を除去し、インビトロで電気神経刺激に対する応答を測定すること（Ｆｒａｎｃｏ  ＪＡ．（２０１４）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（９１）、ｅ５１９４８、ｄｏｉ：１０．３７９１／５１９４８）によって測定され得る。
【００７８】
特定の実施形態では、ベクターは、痙性を処置するために運動神経を標的とするように設計される。そのような状況では、ベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６またはＡＡＶ２）であってもよい。特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、発現カセットを含み、この発現カセットは、プロモーター及びクロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターである。特定の実施形態では、核酸は、ＧｌｙＲクロライドチャネルのサブユニットをコードする。特定の実施形態では、サブユニットは、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含むＧｌｙＲサブユニットである。
【００７９】
特定の実施形態では、ベクターは、痙性を処置するために骨格筋細胞を標的とするように設計される。そのような状況では、このベクターはＡＡＶベクターであってもよい。特定の実施形態では、このベクターはＡＡＶ８ベクターである。特定の実施形態では、このベクターはＡＡＶ９ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、発現カセットを含み、この発現カセットは、プロモーター及びクロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧまたは筋特異的デスミンプロモーターである。特定の実施形態では、核酸は、ＧｌｙＲクロライドチャネルのサブユニットをコードする。特定の実施形態では、サブユニットは、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含むＧｌｙＲサブユニットである。特定の実施形態では、ベクターは、発現カセットを含むＡＡＶ８ベクターであり、この発現カセットは、筋特異的デスミンプロモーター及びＧｌｙＲのサブユニットをコードする核酸を含み、このＧｌｙＲサブユニットは、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲチャネルを生じる少なくとも１つの変異を含んでいる。
【００８０】
発現カセット
本明細書に記載のベクターは、本発明の方法において使用され得る。そのようなベクターは、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする発現カセットを含み得る。
【００８１】
特定の実施形態では、発現カセットは、サブユニットが活性なイオンチャネルを形成する（例えば、多量体化する）ことができる多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、サブユニットは、１つ以上のさらなるサブユニットと多量体化することによって活性なイオンチャネルを形成する。特定の実施形態では、１つ以上のさらなるサブユニットは、内因性に発現される。特定の実施形態では、１つ以上の追加のサブユニットが組換え発現される。特定の実施形態では、多量体イオンチャネルはホモマーである。特定の実施形態では、多量体イオンチャネルはヘテロマーである。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「多量体」という用語は、同じ（ホモマー）または異なる（ヘテロマー）であり得る複数のサブユニットを含むイオンチャネルを指す。特定のタイプの多量体イオンチャネルは、それらの種々のサブユニット及び立体配座と同様に以下に考察される。本明細書中で使用される場合、「多量体化」という用語は、サブユニットであって、同一であっても異なっていてもよく、内因性に発現されても、または組換え発現されてもよく、会合して機能的イオンチャネルを形成する、サブユニットを指す。
【００８３】
特定の実施形態では、イオンチャネルは、クロライドチャネルであり／クロライドチャネル（例えば、選択的クロライドチャネル）として機能する。したがって、特定の実施形態では、核酸は、多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする。
【００８４】
特定の実施形態では、イオンチャネルは、カリウムチャネルであり／カリウムチャネル（例えば、選択的カリウムチャネル）として機能する。したがって、特定の実施形態では、核酸は、多量体カリウムチャネルのサブユニットをコードする。
【００８５】
イオンチャネル及びそのサブユニット
本発明の方法は、本明細書に記載のベクターを利用してもよい。そのようなベクターは、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする発現カセットを含んでもよい。例えば、これらのベクターを使用して、哺乳動物の特定の細胞（複数可）への多量体イオンチャネルの発現を標的とし、それによって細胞（複数可）（例えば興奮性細胞（複数可））の電気生理学的活性を調節してもよい。例えば、このような調節は、生理的効果（例えば、感覚ニューロンのコンダクタンスを変化させて疼痛を軽減する）をもたらし得る。
【００８６】
以下の表１は、Ｃｙｓループ受容体（すなわち、多量体イオンチャネル）、それらのサブユニット及びそれらのリガンドの非限定的なリストを含む。これらのイオンチャネル／サブユニットは、本明細書に記載の方法で使用してもよい。したがって、特定の実施形態では、イオンチャネルは、以下の表１に記載の少なくとも１つのサブユニットを含む。したがって、特定の実施形態では、発現カセットは、表１に記載のサブユニットから選択されるサブユニットをコードする核酸を含む。
【００８７】
特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）である。特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、アルファ−１サブユニット、アルファ−２サブユニット、及びアルファ−３サブユニット、アルファ−４サブユニット及びＧｌｙＲのβサブユニットからなる群より選択される。特定の実施形態では、ＧｌｙＲサブユニットは、１つ以上のさらなるサブユニットであって、同じであっても異なっていてもよく、内因性に発現されても、または組換えにより発現されてもよい、サブユニットと多量体化し得る。特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、ＧｌｙＲ（ＧｌｙＲａ１）のアルファ−１−サブユニットである。特定の実施形態では、ＧｌｙＲａ１は、ヒトＧｌｙＲａ１（ｈＧｌｙＲａ１）である。ＧｌｙＲサブユニットは、当該分野で公知である；様々なＧｌｙＲサブユニット配列の受託番号、ならびに特定のＧｌｙＲサブユニット配列が、以下に含まれる。
【００８８】
特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、γ−アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡＲ）である。特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、ＧＡＢＡＡ−ρ受容体（ＧＡＢＡＣ）である。特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、ＧＡＢＲＡ１（α１）、ＧＡＢＲＡ２（α２）、ＧＡＢＲＡ３（α３）、ＧＡＢＲＡ４（α４）、ＧＡＢＲＡ５（α５）、ＧＡＢＲＡ６（α６）、ＧＡＢＲＢ１（β１）、ＧＡＢＲＢ１（β２）、ＧＡＢＲＢ１（β３）、ＧＡＢＲＧ１（γ１）、ＧＡＢＲＧ２（γ２）、ＧＡＢＲＧ３（γ３）、ＧＡＢＲＤ（δ）、ＧＡＢＲＥ（ε）、ＧＡＢＲＰ（π）、ＧＡＢＲＱ（θ）、ＧＡＢＲＲ１（ρ１）、ＧＡＢＲＲ２（ρ２）及びＧＡＢＲＲ３（ρ３）からなる群より選択される。ＧＡＢＡＡＲサブユニットは、当該分野で公知であり；様々なヒトＧＡＢＡＡＲサブユニット配列についての受託番号としては以下が挙げられる：ＧＡＢＲＡ１（ＮＭ＿０００８０６）、ＧＡＢＲＡ２（ＮＭ＿０００８０７）、ＧＡＢＲＡ３（ＮＭ＿０００８０８）、ＧＡＢＲＡ４（ＮＭ＿０００８０９）、ＧＡＢＲＡ５（ＮＭ＿０００８１０）、ＧＡＢＲＡ６（ＮＭ＿０００８１１）、ＧＡＢＲＢ１（ＮＭ＿０００８１２）、ＧＡＢＲＢ２（ＮＭ＿０２１９１１）、ＧＡＢＲＢ３（ＮＭ＿０００８１４）、ＧＡＢＲＧ１（ＮＭ＿１７３５３６）、ＧＡＢＲＧ２（ＮＭ＿１９８９０４）、ＧＡＢＲＧ３（ＮＭ＿０３３２２３）、ＧＡＢＲＤ（ＮＭ＿０００８１５）、ＧＡＢＲＥ（ＮＭ＿００４９６１）、ＧＡＢＲＰ（ＮＭ＿０１４２１１）、ＧＡＢＲＱ（ＮＭ＿０１８５５８）、ＧＡＢＲＲ１（ＮＭ＿００２０４２）、ＧＡＢＲＲ２（ＮＭ＿００２０４３）及びＧＡＢＲＲ３（ＮＭ＿００１１０５５８０）。
【００８９】
特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、グルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）である。特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、α１、α２Ａ、α２Ｂ、ＧＢＲ２Ａ（α３Ａ）、ＧＢＲ２Ｂ（α３Ｂ）及びβからなる群より選択される。上記のように、ＧｌｕＣｌタンパク質は、哺乳動物において発現されず、免疫特権でない組織において免疫応答を引き起こし得る。したがって、本発明の特定の方法では、発現カセットを含むベクターであって、この発現カセットがＧｌｕＣｌのサブユニットをコードする核酸を含むベクターは、限定されるものではないが、中枢神経系（脳及び脊髄を含む）及び眼を含む免疫特権細胞に対して標的され得る。ＧｌｕＣ１サブユニットは、当該分野で公知である。種々のＧｌｕＣｌサブユニット配列の受託番号としては、ＧｌｕＣｌアルファ（ＡＹ１９５８０２．１）及びＧｌｕＣｌベータ（ＡＹ１９５８０３．１）が挙げられる。
【００９０】
特定の実施形態では、このサブユニットは、少なくとも１つの変異（すなわち、突然変異タンパク質サブユニット；例えば、対応する野生型サブユニットと比較して）を含む。特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、対応する野性型サブユニットに対して、約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００９１】
「野生型」または「天然に存在する」または「天然の」とは、なんら既知の突然変異なしに自然界に見出される正常な遺伝子、タンパク質または生物を指す。したがって、「野生型サブユニット」とは、なんら既知の突然変異のない自然界に見出される正常なサブユニットを指す。対応するサブユニットは、同じタイプ及び種のサブユニット、例えば、野生型ｈＧｌｙＲａ１と比較した変異体ｈＧｌｙＲａ１を指す。
【００９２】
特定の実施形態では、サブユニットは、（例えば、対応する野生型イオンチャネルと比較して）イオンチャネルのアゴニスト感受性を高める少なくとも１つの変異を含む。
【００９３】
特定の実施形態では、このイオンチャネルは、内因性アゴニスト／リガンドによって活性化され得る。
【００９４】
特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、そのサブユニットの多量体化の際に構成的に活性なイオンチャネルをもたらす少なくとも１つの変異を含む。そのような構成的に活性なイオンチャネルは、以下により詳細に考察される。
【表１−１】
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【表１−２】
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表１．Ｃｙｓ−ループリガンドゲートイオンチャンネルのメンバー及びそれらのそれぞれのサブユニット及びそれらのアミノ酸リガンド。列挙されたチャネルは、Ｃｙｓ−ループリガンドゲートのイオンチャネルの塩化物選択的メンバーである。成人型のＧｌｙＲは、３つのα１サブユニットと２つのβサブユニットまたは４つのα１サブユニット及び１つのβサブユニットの化学量論を有すると考えられるヘテロマーのα１β受容体である。５つのサブユニットは、ＧＡＢＡＡチャネルを形成するために異なる方法で組み合わせてもよい。ＧＡＢＡゲートのイオンチャネルを生成するための最低限の要件は、αサブユニット及びβサブユニットの両方を含むことであるが、脳内で最も一般的なタイプは、２つのα、２つのβ及びγを含む五量体（α１β２γ２）である。ＧｌｕＣｌチャネルは、αサブユニット及びβサブユニットからなる五量体構造である。α−及びβ−サブユニットの比率は固定されていないが、通常、それぞれ相補的な３または２つのβサブユニットを有する２または３つのαサブユニットからなる。ＧｌｙＲ及びＧｌｕＣｌの場合、α−サブユニットは、哺乳動物細胞系において機能的ホモ五量体受容体を形成し得る。
【００９５】
グリシン受容体（ＧｌｙＲ）
ＧｌｙＲは、中枢神経系（ＣＮＳ）における速い神経伝達を媒介するリガンドゲートのイオン向性受容体のニコチニコイド（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃｏｉｄ）スーパーファミリーのメンバーである。ＧｌｙＲの場合、グリシン（約１００μＭのＥＣ５０）または他のアゴニストの結合は、このアニオン選択性チャネルの一時的なゲーティングをもたらす。成人では、ＧｌｙＲは、典型的に２αサブユニット及び３βサブユニットの化学量論を有すると考えられている（Ｒａｊｅｎｄｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．７３（２）：１２１−４６）。しかしながら、ヒトα１サブユニットのみの異種発現は、天然のチャネルと本質的に同一の薬理学的特性を有する活性なグリシンゲートのチャネルを再構成するのに十分である（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２（５）：１４９１−１４９７；Ｊｅｎｓｅｎ  ＡＡ．及びＫｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｕ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６７（９）：１７８９−１７９９）。したがって、本発明の方法における使用のために、ＧｌｙＲタンパク質は、ＧｌｙＲの野生型サブユニット（例えば、α１、α２、α３、α４またはβ）であってもよい。特定の実施形態では、ＧｌｙＲサブユニットは、哺乳動物ＧｌｙＲサブユニットであってもよい。特定の実施形態では、ＧｌｙＲサブユニットは、対応する野生型ＧｌｙＲサブユニットと比較して、１つ以上の変異を含んでもよい（すなわち、核酸は、ＧｌｙＲサブユニットの突然変異タンパク質をコードし得る）。ＧｌｙＲタンパク質は、十分に特徴づけられており（Ｒａｊｅｎｄｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．７３（２）：１２１−４６）、哺乳動物種由来の多くのサブユニットをコードする配列は、遺伝子データベースで索引付けされているか、そうでなければ利用可能である。例えば、ＧｌｙＲのα１サブユニットに関連する配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００１７１（ヒト）、ＮＭ＿０２０４９２（マウス）及びＮＭ＿０１３１３３（ラット）で見出され得る。ＧｌｙＲのα２サブユニットに関連する配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００２０６３（ヒト）、ＣＲ４５０３４３（ｃＤＮＡ）（ヒト）、ＮＭ＿１８３４２７（マウス）及びＮＭ＿０１２５６８（ラット）に見出すことができる。ＧｌｙＲのアルファ３サブユニットに関連する配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６２９２９（ヒト）、ＮＭ＿００１０４２５４３（ヒト）、ＢＣ０３６０８６（ヒト）、ＮＭ＿０８０４３８（マウス）、ＡＹ２３０２０４（マウス）、ＡＦ３６２７６４（マウス）、及びＮＭ−０５３７２４（ラット）で見出され得る。ＧｌｙＲのアルファ４サブユニットに関連する配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１０２９７（マウス）及びＢＣ１１０６３０（マウス）で見出され得る。ＧｌｙＲのベータサブユニットに関連する配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００８２４（ヒト）、ＮＭ＿０１０２９８（マウス）及びＮＭ＿０５３２９６（ラット）に見出すことができる。
【００９６】
野生型ＧｌｙＲサブユニットに加えて、改変された活性を有するＧｌｙＲサブユニットの変異体（突然変異タンパク質）もまた公知であり、本発明の文脈で使用することができる。これに関して、核酸は、対応する野生型ＧｌｙＲサブユニット（すなわち、突然変異タンパク質ＧｌｙＲサブユニット）と比較して、１つ以上の突然変異を含むＧｌｙＲサブユニットをコードし得る。例えば、ＧｌｙＲタンパク質の特定の突然変異タンパク質は、カチオン性イオンチャネルを生じるような、変化したイオンチャネル特性を生じる（例えば、Δ２５０  Ａ２５１Ｅ：Ｋｅｒａｍｉｄａｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１９、３９３−４１０）。アロステリックモジュレーターの亜鉛増強または亜鉛阻害（Ｈｉｒｚｅｌ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：６７９−６９０）親和性の部位を欠く他の突然変異タンパク質が知られている（例えば、麻酔増強（Ｈｅｍｍｉｎｇｓ  ＨＣ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２６，５０３−１０）、またはリガンドに対する親和性（Ｒａｊｅｎｄｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ  １４、１６９−１７５；Ｓｃｈｒｎｉｅｄｅｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２、２５６−２５８）。ＧｌｙＲサブユニットの変異はまた、イオン透過（例えば、陰イオン選択性または陽イオン選択性チャネル）を選択的に変化し得、受容体サブユニットのリガンド結合ポケットを再設計して固有の薬理学的因子を認識する。例えば、特定のリガンドについてＧｌｙＲタンパク質の感度及び選択性を変更するために、ＧｌｙＲα１サブユニットにおいて、用量応答曲線を左または右にシフトさせると予想される（すなわち、グリシンに対してより少なくまたはより特異的である）点突然変異を作成してもよい。
【００９７】
変異体型のサブユニット（例えば、ＧｌｙＲ）は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて生成してもよい。このような方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ＤＮＡのリンカースキャニング突然変異誘発、及び化学的突然変異誘発が挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５ｔｈＥｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２００２）を参照のこと）。
【００９８】
本明細書中に記載されるベクターから標的細胞中で一旦発現されると、ＧｌｙＲサブユニットは、多量体化して細胞の表面上にチャネルを形成し得る（例えば、興奮性細胞）。これらのチャネルは、末梢循環グリシン（内因性グリシン）によって活性化され得る。グリシンの血中濃度は、約２３０〜３３０μＭであると報告されている。具体的には、正常成人男性では、２４２．０±４４．０μＭ、正常成人女性では２５８．０±６４．０μＭ（Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，８ｔｈ  Ｒｅｖ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．９３．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．：Ｍｅｄｉｃａｌ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｖ．，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏｒｐ．Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ｃ１９８１−１９９２）；正常成人では両方の性別とも３２９．９＋／−１０５．６μＭ（Ｐｓｙｃｈｏｇｉｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（２）：ｅ１６９５７）；正常な成人男性では２１２．４＋／−５７．４μＭ（Ｇｒａｎｔ  ＳＬ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．８４４（２）：２７８−８２）；正常な成人では両方の性別とも２３０．０μＭ（１７８．０−２８２．０μＭ）（Ｃｙｎｏｂｅｒ  ＬＡ．（２００２）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １８（９）：７６１−６）；正常な成人では両方の性別とも３２５．４＋／−１２６．８μＭ（Ｐｓｙｃｈｏｇｉｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（２）：ｅ１６９５７）であった。
【００９９】
神経の求心性がグリシン受容体のαサブユニットでトランスフェクトされた場合、神経細胞の生理学は、１）ヒト血中に報告されているグリシンの上記レベル；２）関節炎関節において、グリシンのレベルが血液中のレベルの約２倍であるという観察（ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  Ｔ．及びＷｅｓｔｌｕｎｄ  Ｋ．（２０１３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ．６（３）：４９２−４９７）；ならびに３）αサブユニットのみの発現によって形成されるＧｌｙＲのグリシン感受性の観察（ＥＤ５０＝８５〜１００μＭ）（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２（５）：１４９１−１４９７；Ｊｅｎｓｅｎ  ＡＡ．ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｕ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６７（９）：１７８９−１７９９）に基づいて、内因性のグリシンによって活性化されたグリシン受容体を介したＣｌ−の流入に起因する膜電位の変化により変化し得ることが想定され得る。
【０１００】
構成的に活性なイオンチャネル
上記で考察されたように、特定の実施形態では、多量体イオンチャネルは、構成的に活性なイオンチャネル（例えば、構成的に活性なＧｌｙＲまたはＧｌｕＣｌ）であってもよい。したがって、構成的に活性なイオンチャネルを、本発明の方法において使用してもよい（例えば、興奮性細胞の活性を調節し、慢性疼痛、高眼圧症または痙性などの興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する）。
【０１０１】
したがって、本発明の特定の実施形態では、発現カセットは、サブユニットが少なくとも１つの変異（すなわち、突然変異タンパク質サブユニット）を含む（その結果、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なイオンチャネルが生じる）、多量体イオンチャネル（例えば、単量体またはヘテロマーイオンチャネル）のサブユニットをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、構成的に活性なイオンチャネルは、クロライドチャネルとして機能する。特定の実施形態では、構成的に活性なイオンチャネルは、カリウムチャネルとして機能する。
【０１０２】
本明細書で使用される「構成的に活性なイオンチャネル」という用語は、連続的に活性化され、かつアゴニスト（例えば、化学的または生物学的）または物理的アクチベータ（例えば、圧力、熱または光）またはそれが活性化される細胞の電気生理学的状態に暴露される必要はないイオンチャネルを指す。イオンチャネルの活性を測定するためのアッセイは、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、実施例に記載のアッセイを用いて、イオンチャネルが構成的に活性化されているかどうかを判定してもよい。したがって、構成的に活性なイオンチャネルを利用するそのような実施形態では、アゴニストまたはアロステリックモジュレーターは、哺乳動物に投与されないであろう。
【０１０３】
非限定的な例として、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓグルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）の特定の変異は、構成的に活性または漏出性であることが示されている。これらの変異のいくつかは、表２に列挙されており、細胞膜で発現された場合、図１に記載されたそれらの活性は、塩化物イオンによって運ばれる基底コンダクタンスをもたらす。
【表２】
2018533976.tif 000005
表２：最小の側鎖（アラニンまたはグリシン）を有するアミノ酸に対するＧｌｕＣｌチャネルのα−サブユニットのＭ２ドメインにおけるロイシン９’残基の置換は、ＷＴ受容体とは有意に異なった、最大のバックグラウンドコンダクタンスを有する構成的にオープンなチャネルを生じた。β分岐側鎖（イソロイシン、バリンまたはスレオニン）を有する３つのＬ９’変異体は、平均してＷＴ受容体よりも大きなバックグラウンドコンダクタンスを有したが、この増大は、サンプリングされた細胞の数に対して統計的に有意ではなかった。
【０１０４】
興奮性細胞の電気的活性を調節するために本発明の方法において構成的に活性なクロライドチャネルを利用する実施形態では、非限定的な例として、改変グルタメートゲートのクロライド（ＧｌｕＣｌ）チャネルを用いてもよい。塩化ＧｌｕＣｌ電流は、伝統的な神経伝達物質グルタメート及び半合成抗蠕虫薬のイベルメクチン（ＩＶＭ）によってゲートされる。改変ホモマーのＧｌｕＣｌチャネルの３．３Å分解能の結晶構造によって、これらのアゴニストのそれぞれの結合部位の位置が明らかになる（図２Ａ、２Ｂ）。グルタメートは、２つのサブユニットの界面で細胞外ドメインに位置する古典的な神経伝達物質結合部位で結合する。イベルメクチンは、別個の通常ではない部位で結合し、隣接する２つのサブユニットの界面でも膜貫通らせんの上端部に挿入する。チャネルの構造的座標は、細孔ライニング残基の側鎖が明確に定義された開放孔構造を示す（図２Ｃ、２Ｄ）。１つの細孔ライニング残基、ロイシン９’（Ｌ９’）は、Ｍ２膜貫通ドメインの中間に存在する。Ｌ９’は、Ｃｙｓ−ループ受容体ファミリーのサブユニット間で高度に保存されており、疎水性チャネルゲートとして機能することが提唱されている（図２Ｅ、２Ｆ）（Ｕｎｗｉｎ  Ｎ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２９：１１０１−１１２４；Ｍｉｙａｚａｗａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：９４９−９５５；Ｂｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｏ．ａｎｄ  Ｓａｎｓｏｍ  ＭＳ．（２００６）  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ．３：１４７−１５９）。
【０１０５】
ＧｌｕＣｌチャネルのα−サブユニットのＭ２ドメイン中の高度に保存されたロイシン９’残基を７つの他の残基、Ｌ９’Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔのそれぞれに変異させた（それによりＬ９’ロイシン残基は、それぞれイソロイシン、フェニルアラニン、バリン、アラニン、グリシン、セリンまたはトレオニンで置換された）（表２参照）。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、容量性補償なしに全細胞構成で電圧クランプされた。リガンドの非存在下で、電圧は５０ｍｓにわたって−６０ｍＶから＋６０ｍＶまで連続的に傾斜された。ＷＴ電流応答の一例を図１Ａに示す。バックグラウンドコンダクタンスは、抵抗性電流傾斜の傾きから測定され、容量性電流オフセットから計算することができた各受容体の平均膜容量によって正規化された。ＧｌｕＣｌ  ＷＴ及びＷＴ−ＸＦＰ受容体は、ニセトランスフェクトされた対照と異なることはない、最小のバックグラウンドコンダクタンスを示した（図１Ｂ）。最小の側鎖を有する２つのＬ９’変異、Ｌ９’Ａ及びＬ９’Ｇは、ＷＴ受容体と有意に異なる最大のバックグラウンドコンダクタンスを有していた。（Ｆｒａｚｉｅｒ  ＳＪ．（２０１２）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧｌｕＣｌ／ＩＶＭ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  ｖｉａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１０６】
上記のような、野生型ＧｌｕＣｌチャネルの、自然のチャネル活性もしくは構成的にオープンなチャネルへの変換、またはＬ９’におけるアミノ酸置換によるＣｌ−細孔の例は、例示的な実施形態を意味する。同様の改変を、設計及び試験して、Ｃｙｓループ受容体ファミリーの任意のチャネル、特にグリシン受容体（ＧｌｙＲ）クロライドチャネル、ＧＡＢＡＡ及びＧＡＢＡＣ受容体、ただし、より一般的には任意の生物体からの任意のイオンチャネルを変換してもよい。構成的に活性なチャネルを生じるクロライドチャネルの自発的開口を生じることが示されたＧＡＢＡＡ及びＧＡＢＡＣ受容体のα、β、γ及びρ−サブユニットの、保存されたいくつかのアミノ酸への変異の具体例を表３に記載する。
【表３】
2018533976.tif 000006
表３．ＧＡＢＡＡ及びＧＡＢＡＣ受容体の自発的活性を増大させて構成的に活性なクロライドチャネルをもたらすことが報告されている、チャネル細孔内のロイシン及びチロシン残基への変異。（Ｃｈａｎｇ  Ｙ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ  ＤＳ．（１９９９）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７７：２５４２−２５５１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＳＡ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２７：１３４９−１３５８；Ｃｈａｎｇ  Ｙ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ  ＤＳ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３：５１１−５２３；Ｐａｎ  ＺＨ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６４９０−６４９５）。
【０１０７】
したがって、特定の実施形態では、構成的に活性なイオンチャネルは、構成的に活性なＧｌｕＣｌイオンチャネルである。特定の実施形態では、サブユニットはα−サブユニットであり、α−サブユニットは、多量体化して構成的に活性なＧｌｕＣｌイオンチャネルを形成し得る。特定の実施形態では、サブユニットは、表２に記載のサブユニットのＭ２ドメインにおける少なくとも１つの突然変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、表２に記載のＬ９’ＡまたはＬ９’Ｇである。
【０１０８】
特定の実施形態では、構成的に活性なイオンチャネルは、構成的に活性なＧｌｙＲである。特定の実施形態では、サブユニットはα−サブユニット（例えばα−１）であり、ここでは、α−サブユニットは多量体化して構成的に活性なＧｌｙＲイオンチャネルを形成し得る。特定の実施形態では、サブユニットは、表２に記載のサブユニットのＭ２ドメインにおける少なくとも１つの変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、表２に記載のＬ９’ＡまたはＬ９’Ｇである。
【０１０９】
特定の実施形態では、構成的に活性なイオンチャネルは、構成的に活性なＧＡＢＡＡ受容体である。特定の実施形態では、この構成的に活性なイオンチャネルは、構成的に活性なＧＡＢＡＣ受容体である。特定の実施形態では、サブユニットはα−、β−またはγ−サブユニットであり、α−、β−またはγ−サブユニットは、多量体化して構成的に活性なＧＡＢＡＡ受容体を形成し得る。特定の実施形態では、サブユニットはρ−サブユニットであり、このρ−サブユニットは多量体化して構成的に活性なＧＡＢＡＣ受容体を形成し得る。特定の実施形態では、サブユニットは、表３に記載される少なくとも１つの変異を含む。従って、特定の実施形態では、コードされたサブユニットは、Ｌ２６３（例えば、Ｌ２６３Ｓ）に少なくとも１つの変異を有するＧＡＢＡＡαサブユニット、Ｌ２５９に少なくとも１つの変異を有する（例えばＬ２５９Ｓ）ＧＡＢＡＡβサブユニット、Ｌ２７４に少なくとも１つの突然変異（例えばＬ２７４Ｓ）を有するＧＡＢＡＡγ−サブユニット、またはＴ３１４（例えばＴ３１４Ａ）、Ｌ３１７（例えば、Ｌ３１７Ａ）またはＬ３０１（例えば、Ｌ３０１Ａ、Ｌ３０１Ｇ、Ｌ３０１Ｓ、Ｌ３０１Ｔ、Ｌ３０１Ｖ、Ｌ３０１Ｙ）に少なくとも１つの突然変異を有するＧＡＢＡＣρ−サブユニットである。さらに、対応する突然変異は、他のタイプのイオンチャネル由来のサブユニットにおいてもなされ得る；そのような対応するアミノ酸は、配列アラインメントプログラムを用いて当業者によって同定され得る。
【０１１０】
プロモーター
特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、プロモーターをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、プロモーターは、核酸に作動可能に連結される。プロモーターは、標的化された細胞セット内のイオンチャネルサブユニットの発現を駆動するように選択され得る。これは、標的組織に特異性を付与し得る。したがって、特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【０１１１】
例えば、疼痛（感覚ニューロン）または痙性（運動ニューロン）の処置の場合のように、標的細胞型がニューロンである場合、選択されたプロモーターは、汎ニューロン（ｐａｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌ）ヒトシナプシン−１プロモーター（Ｓｙｎ１またはｈＳｙｎ）（Ｉｙｅｒ  ＳＭ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（３）：２７４−２７８）であろう。あるいは、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターまたはニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーター（いずれも神経特異的ではなく、それぞれが神経変性疾患の遺伝子療法試験で安全に利用されている））のようなユビキタスプロモーターを利用してもよい。
【０１１２】
痙性の処置のために骨格筋細胞を標的とする場合、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターまたは筋特異的デスミンプロモーターを使用してもよい（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．６（２２０）：２２０ｒａ２１０；Ｆａｌｋ  ＤＪ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：１５００７）。
【０１１３】
高眼圧症の処置のために小柱網（ＴＭ）を標的とする場合、流出経路のＴＭ細胞へのＡＡＶ媒介遺伝子移入を介した標的遺伝子発現は、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）遺伝子由来のプロモーターフラグメントを使用して以前に示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４５：１３８９−１３９５）。選択的な標的化はまた、ＴＭの最も外側の前方及び後方領域に特異的に向けられた発現を有するキチナーゼ３様１（Ｃｈ３Ｌ１）遺伝子の５’プロモーター領域を用いて達成されている（Ｌｉｔｏｎ  ＰＢ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４６：１８３−１９０）。さらに、小柱網の多数の遺伝子プロファイリング研究が公開されており、小柱網細胞選択的プロモーターの追加の別の構成が提供される（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４１：３６７８−３６９３；Ｗｉｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４３：３６９８−３７０４；Ｔｏｍａｒｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４４：２５８８−２５９６；Ｌｉｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．１２：７７４−７９０；Ｆａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４９：１８８６−１８９７；Ｆｕｃｈｓｈｏｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．８８：１０２０−１０３２；Ｐａｙｌａｋｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．１８：２４１−２５４；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５４：６３８２−６３８９）。
【０１１４】
したがって、特定の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の任意のプロモーターであり得る。特定の実施形態では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。
【０１１５】
特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシン−１プロモーター（Ｓｙｎ１またはｈＳｙｎ）、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、筋肉特異的デスミンプロモーター、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターまたはそのフラグメント、及びキチナーゼ３様１（Ｃｈ３Ｌ１）遺伝子の５’プロモーター領域からなる群より選択される。
【０１１６】
特定の実施形態では、プロモーターは、イオンチャネル／サブユニットの発現を特定の細胞型に限定するように設計された選択的プロモーターである。したがって、特定の実施形態では、このプロモーターは、イオンチャネル／サブユニット（例えば、構成的に活性なイオンチャネル）の発現を、小柱網の細胞及び／または房水の排液に関連する他の細胞に限定するように設計された選択的プロモーターである。特定の実施形態では、このプロモーターは、イオンチャネル／サブユニット（例えば、構成的に活性なイオンチャネル）の発現をニューロン細胞（例えば、ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ））に限定するように設計された選択的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、イオンチャネル／サブユニット（例えば、構成的に活性なイオンチャネル）の発現を筋肉細胞（例えば、デスミンプロモーター）に限定するように設計された選択的プロモーターである。
【０１１７】
特定の実施形態では、発現カセットは、マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子）をさらに含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、発現カセットは、核酸配列に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、エンハンサー）をさらに含む。発現制御配列及び配列を作動可能に連結するための技術は、当技術分野において周知である。
【０１１９】
細胞
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の発現カセットを含む細胞を提供する。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、眼に位置する細胞（例えば、小柱網細胞）、末梢神経系に位置する細胞（例えば、侵害受容性求心性神経細胞）または筋細胞である。特定の実施形態では、発現カセットは、ベクター中に含まれる。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマローニー系のウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ６ウイルスベクターである。
【０１２０】
ベクター
任意の適切な方法を用いて、哺乳動物（例えば、興奮性細胞などの哺乳類細胞）において、イオンチャネルサブユニット（例えば、ＧｌｙＲまたはＧｌｕＣｌなどのクロライドチャネルのサブユニット）の外因性発現を引き起こすかまたは誘導することができる。例えば、興奮性細胞のゲノム由来のサブユニットをコードする遺伝子の転写を活性化する薬剤を哺乳動物に投与してもよい。しかしながら、典型的には、イオンチャネルサブユニットの外因性発現は、遺伝子移入技術によって引き起こされるか、または誘導される。
【０１２１】
したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の発現カセットを含むベクターを提供する。さらに、特定の実施形態は、本明細書に記載のベクターを興奮性細胞（例えば、哺乳動物の興奮性細胞）に接触／導入させることを提供する。特定の実施形態はまた、本明細書に記載のベクターを哺乳動物に投与することを包含する（例えば、興奮性細胞における発現のため）。
【０１２２】
本明細書に記載の発現カセットを哺乳動物細胞（例えば、興奮性細胞）に導入するためには、任意の適切なベクターを使用してもよい。適切なベクターの例としては、プラスミド、リポソーム、分子コンジュゲート（例えば、トランスフェリン）、及びウイルスが挙げられる。
【０１２３】
特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルス発現系は、標的となる解剖学的構造における強力な発現レベルのために、高い感染性／コピー数と組み合わせて、迅速かつ多用途に実施するという二重の利点を有する。組換えウイルスベクター内にパッケージングされた所望のプロモーター−タンパク質配列をコードするＤＮＡの送達を含む技術などのウイルス発現技術は、標的された解剖学的構造を効果的にトランスフェクトするために哺乳動物で首尾よく利用されている。それらは、標的細胞の核に遺伝物質を送達し、それによって、そのような細胞が所望のタンパク質、例えばＧｌｕＣｌ、ＧｌｙＲまたは他のクロライドチャネルタンパク質のようなイオンチャネルのサブユニットを産生するように誘導する。イオンチャネルの場合、これらのタンパク質は、その後、細胞膜に輸送される。
【０１２４】
適切なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルス系のベクター及びパルボウイルス系のベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系のベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター及びアデノウイルス系のベクター）が挙げられる。特定の実施形態では、このベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマロニー系のウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、特定のタイプの標的化された興奮性細胞について既知の向性を有するＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、このＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びｒＡＡＶ２／６からなる群より選択される。特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ６ウイルスベクターである。
【０１２５】
本明細書中に記載されるように、本発明のベクターは、発現カセットを含んでもよく、ここでこの発現カセットは、多量体イオンチャネルのサブユニット（例えば、ＧｌｙＲまたはＧｌｕＣｌのサブユニット）をコードする核酸を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、所望の細胞集団においてのみタンパク質の発現を駆動する選択的プロモーターをさらに含んでもよい。皮膚、筋肉、関節、眼の部位、または他の周辺部位の接種後、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、感染された細胞内で、コードされたタンパク質（例えば、ＧｌｙＲまたはＧｌｕＣｌのサブユニット）の発現を促進する１つ以上の細胞（例えば、興奮性細胞）に感染する。しかしながら、このようなベクターは、典型的には複製欠損であるため、細胞内で複製して他の領域に広がることはない。したがって、選択指向性を有するＡＡＶベクターを用いてサブユニットをコードする核酸を送達する場合、接種部位を選択して、哺乳動物の予め選択された領域に対する処置を標的としてもよい。
【０１２６】
非限定的な例として、ＧｌｙＲクロライドチャネル構成の場合、典型的には、ウイルスベクターは、「ＧｌｙＲクロライドチャネル発現カセット」と呼ばれ得るものをパッケージングし、これは、ＧｌｙＲクロライドチャネルのサブユニットをコードするＤＮＡ及びＧｌｙＲクロライドチャネルタンパク質の発現を駆動するように選択されるプロモーターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の場合、目的の遺伝子（この例ではＧｌｙＲクロライドチャネルサブユニット）は、ただ１つの活性クロライドチャネル発現カセットを有する一本鎖構成であってもよい。
【０１２７】
ＧｌｕＣｌまたはＧｌｙＲクロライドチャネルの構成及び発現カセットをＡＡＶベクター内にパッケージングする場合、いくつかの構成を使用してもよい。ＡＡＶは、逆方向末端反復に隣接する４．７ｋｂの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを含む欠陥のあるパルボウイルスである。それらは感染のためのヘルパーアデノウイルスを必要とし、それらのゲノムは、複製及びパッケージングに必要とされるＡＡＶタンパク質をコードする。細胞に入ると、ウイルスｓｓＤＮＡは、宿主酵素によって転写的に活性な二本鎖ＤＮＡに変換される。組換えＡＡＶベクターは、そのウイルスタンパク質の両方をコードするＤＮＡを、導入遺伝子発現カセットで置き換え、したがって、なんらオープンなウイルスリーディングフレームを含まない。この置換により、約４．５ｋｂ（４５００塩基対（ｂｐ））の導入遺伝子挿入サイズが可能になる（Ｂｕｉｅ  ＬＫ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５１；１：２３６−４８）。以下の遺伝子コード配列サイズに基づいて、ＡＡＶウイルスベクターにパッケージングできるＧｌｕＣｌ及びＧｌｙＲサブユニットをコードする核酸を含む発現カセットの例を以下に示す：ＧｌｕＣｌのαサブユニット及びβサブユニット（以下に記載するチャネル）は、約１４００ｂｐであり；ＧｌｙＲαサブユニットは約１２００ｂｐであり；ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ））プロモーターの遺伝子コード配列のサイズは約５００ｂｐであり；一般的に使用される発現レポーターである単量体黄色蛍光タンパク質（ｍＹＦＰ）のサイズは、７２０ｂｐである。
ＧｌｕＣｌを含む発現カセットの例
１．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−αサブユニット（約２Ｋｂ）
２．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−βサブユニット（約２Ｋｂ）
３．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−αサブユニット＋ｍＹＦＰ（約２．７Ｋｂ）
４．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−βサブユニット＋ｍＹＦＰ（約２．７Ｋｂ）
５．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−αサブユニット＋ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−βサブユニット（約４Ｋｂ）
及び可能性としては：
６．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−αサブユニット＋ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｕＣｌ−βサブユニット＋ｍＹＦＰ（約４．７Ｋｂ）
ＧｌｙＲを含む発現カセットの例
１．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｙＲ−αサブユニット（約１．７Ｋｂ）
２．ｈＳｙｎプロモーター＋ＧｌｙＲ−αサブユニット＋ｍＹＦＰ（約２．４Ｋｂ）
【０１２８】
自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）構造では、互いに配列中で相補的でヘアピンループによって接続された発現カセットの２つのコピーが、ウイルスエンベロープ内に封入される。ｓｃＡＡＶは、より安定であり、特にいくつかの細胞、例えば小柱網細胞においてより高い発現レベルを示すと考えられている。ｓｃＡＡＶ発現カセットのサイズは、元の４．５〜２．２ｋｂから減少する（Ｂｕｉｅ  ＬＫ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５１；１：２３６−４８）。ｓｃＡＡＶのサイズ制限を考慮すれば、ＧｌｕＣｌ発現カセットの構成１または２（上記）及びおそらく３または４（上記）を、ｓｃＡＡＶウイルスベクターにパッケージングしてもよい。しかし、ＧｌｙＲ発現カセットの構成１または２（上記）のいずれかを、ｓｃＡＡＶウイルスベクターにパッケージングしてもよい。
【０１２９】
上記の発現カセットの上記説明において、ＧｌｕＣｌ及びＧｌｙＲ受容体を、非限定的な例として使用した。同様の発現カセットを設計し、ＧＡＢＡＡ及びＧＡＢＡＣ受容体のトランスフェクションに利用してもよい。さらに、遺伝子産物の発現は、ウイルスの異なる血清型（ウイルスキャプシドまたはコートタンパク質によって付与される）によって標的化され得る；異なる血清型は異なる組織指向性を示す。例えば、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ウイルスは、特定の細胞型（例えば、侵害受容ニューロンなどの感覚ニューロン）を標的とするように設計してもよい。
【０１３０】
ウイルスは、中枢神経系、及びその末梢の両方における多くの組織構造及び系を標的とするために利用されている。例えば、侵害受容器への遺伝子移入は、慢性疼痛の管理のための有望な戦略であり、これによって神経系の制限部位での導入遺伝子の発現が可能になり、それによって標的外効果を誘発することなく疼痛関連経路を選択的に標的とする。
【０１３１】
侵害受容ニューロンへの遺伝子移入は、ウイルス及び非ウイルスの両方の方法によって達成されている。タンパク質の発現を駆動するプラスミドＤＮＡは、感覚ニューロンに対してリポソームを介して（Ｍｅｕｌｉ−Ｓｉｍｍｅｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２６８９−７００）、エレクトロポレーション（Ｌｉｎ  ＣＲ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．  ３１７：１−４）及び中枢神経系への末梢注射または直接注射による高浸透圧希釈剤（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ＥＤ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐａｉｎ  １２６：２９４−３０８）によって送達されている。これらの方法の主な欠点は、一過性タンパク質発現が２週間を超えて持続しないことである。あるいは、ウイルスを使用して、さらに長い導入遺伝子発現を駆動してもよい。ウイルス媒介性遺伝子送達の有効性は、送達方法の種類及び使用されるウイルスの種類に主に依存する。アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、皮下（Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＰ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：３２１１−６；Ｇｏｓｓ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（３）：５００−５０６；米国特許第８９５７０３６号）、筋肉内（Ｇｈａｄｇｅ  ＧＤ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１３２−７）、神経内（Ｐａｌｍｅｒ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４：５６０４−１８）、髄腔内（Ｓｔｏｒｅｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｐａｉｎ  ２：４；Ｓｔｒｏｋｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：１０５５−６０、脊髄内（Ｐｅｚｅｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１３：１１０１−９；Ｍｅｕｎｉｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６７：１４８−５９、直接後根神経節注射（Ｘｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４：８９７−９０６）、及びまたＨＳＶの場合のウイルスの局所的適用（Ａｎｔｕｎｅｓ  Ｂｒａｓ  ＪＭ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：１２９９−３０３；Ｚｈａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  １０８：３０５−１３）を含めて多数の送達経路を通じて非侵害性経路に導入遺伝子を送達することが報告されている。これらの研究により、好都合な部位での導入遺伝子発現及び疼痛関連行動の付随する低下が生じるが、形質導入プロファイルは、しばしば特徴づけられていない。これは、エンケファリン、エンドモルフィン及びインターロイキンのような細胞外環境で作用する分泌された導入遺伝子を利用する研究では一般的であり、ここでは、罹患した細胞近傍に導入遺伝子を送達し、疼痛感覚を調節するにはごくわずかな形質導入細胞しか必要としない（Ｍａｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：４２−８）。
【０１３２】
２００９年に、Ｔｏｗｎｅらは、マウスの慢性疼痛の発生及び発症に関与する細胞機構を標的とするための遺伝子移入ツールとしての組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）血清型６を評価した。ｒＡＡＶは、それらの広い組織向性、効率的でかつ安定した形質導入（＞年）、低い免疫原性及びインビボで有糸分裂後細胞に感染する能力のおかげで、強力な遺伝子移入ベクターである（Ｍａｎｄｅｌ  ＲＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１３：４６３−８３）。血清型６のベクター（ｒＡＡＶ２／６）は、マウスにおける以前の実験（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１６：１０１８−２５）における静脈内送達後の感覚繊維形質導入、及び中枢神経系への直接注射後の神経の高い向性（Ａｚｅｒｅｄｏ  ｄａ  Ｓｉｌｖｅｉｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１８：８７２−８７）の観察から選択された。Ｔｏｗｎｅらは、種々の投与経路を通じてｒＡＡＶ２／６を送達し、後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ  ５（１）：５２）内で得られた形質導入プロファイルを正確にマッピング及び比較した（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ  ５（１）：５２）。ＤＲＧニューロンに遺伝子を送達する組換えＡＡＶ血清型６（ｒＡＡＶ２／６）の能力を評価した。さらに、５つの異なる投与経路による侵害受容器の形質導入が、マウスにおいて特徴づけられた。緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するｒＡＡＶ２／６の坐骨神経中への直接注射によって、Ｌ４  ＤＲＧニューロンの最大３０％ｅＧＦＰ陽性細胞が用量依存的に形質導入された。形質導入された細胞の９０％超が、小から中の大きさのニューロン（＜７００μｍ２）であり、主に侵害受容ニューロンのマーカーと共局在し、脊髄後角の表層の薄層にｅＧＦＰ陽性の中央末端繊維を有していた。形質導入の効率及びプロフィールは、マウスの遺伝的背景とは無関係であった。ｒＡＡＶ２／６の髄腔内投与は、最高レベルの形質導入をもたらし（約６０％）、同様のサイズプロファイルを有し、侵害受容ニューロンと共局在した。髄腔内投与はまた、子宮頸部及び胸部のレベルでＤＲＧニューロンに形質導入し、神経因性疼痛のマウスモデルにおいて匹敵するレベルの形質導入をもたらした。皮下及び筋肉内送達は、Ｌ４  ＤＲＧにおける形質導入のレベルが低かった。同様に、尾静脈注射による送達は、ＤＲＧ内の比較的少数のｅＧＦＰ陽性細胞をもたらしたが、この形質導入は、全ての脊椎レベルで観察され、大きな非侵害受容性細胞型に対応した。これらのデータから、ｒＡＡＶ２／６は、マウスの侵害受容ニューロンに導入遺伝子を送達するための効率的なベクターであると結論した。さらに、形質導入プロフィールの特徴付けは、神経障害性疼痛の背後の機序を解明するための遺伝子導入研究を容易にし得る。
【０１３３】
これらの研究は、後にＩｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）によって支持され、彼らは、光に応答して、興奮性または抑制性のオプシンのいずれかを有するマウスにおいて、求心性侵害受容器神経を選択的にトランスフェクトして、それぞれ、疼痛感覚を発生または抑制する送達ベクターとしてＡＡＶ６を再度使用した（Ｉｙｅｒ  ＳＭ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（３）：２７４−２７８）。これらの研究は、特定のニューロン集団が、特定のＡＡＶ血清型を用いて選択的に標的化され得ることを示す。この場合、疼痛感知ニューロンは、ＡＡＶ６を用いて選択的に標的化された。これらの研究はまた、ＡＡＶ６が、皮下及び筋肉内送達後の侵害受容性求心性神経によって取り込まれ得ることを実証する。これによって、慢性関節痛のための皮内または関節内注射の場合のような疼痛の部位への局所注入が、同じ手足（接触など）またはその手足の運動活動からの他のニューロン媒介性感覚に影響を及ぼすことなく、疼痛を伴う領域または関節を局所的に神経支配する、侵害受容性神経を特異的かつ選択的にトランスフェクトするためのＡＡＶベクター化遺伝子治療の実行可能な送達経路であることが強く示唆される。
【０１３４】
このアプローチの全体的な結果は、皮内、皮下または関節内経路を介して送達される局所麻酔薬の非常に長時間作用性の（長年にわたり持続することができる）麻酔効果に類似している。現在、仙腸関節ブロック（Ｒｕｐｅｒｔ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐａｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  １２（２）：３９９−４１８）としても知られている、例えば、仙腸関節における皮膚または関節内に局所麻酔薬を注入することは、一般的な手技である。
【０１３５】
別の実施形態では、遺伝子産物（例えば、イオンチャネルサブユニット）は、眼内の構造体に対して標的化されてもよい。マウス、ラット、及び霊長類の眼に遺伝子を導入するために、レンチウイルスベクター及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスベクターが首尾よく利用されている（Ｂｏｒｒａｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４３（８）：２５１３−２５１８）。加えて、これらは、良好な耐容性を示し、報告された副作用がなく比較的長期間にわたり高度に発現され、長期の処置パラダイムの機会を提供する。
【０１３６】
ウイルスは、毛様体上皮、毛様体筋網膜神経節細胞及び小柱網細胞を含むが、これに限定されない多くの組織構造及び系を標的にするために利用されている。今日まで、少なくとも６つの送達系が、関連する組織または細胞に遺伝子を送達する能力について試験されている。これらとしては、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス（ＬＶ；ネコ免疫不全ウイルス［ＦＩＶ］及びヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］）、リポソーム（ＬＰ）、及び裸のＤＮＡが挙げられる。これらのうち、ＡＡＶは、その安全性プロフィールのおかげで好ましいベクターであり得る。しかしながら、自己相補的なＡＡＶは、ＡＡＶを含む伝統的な一本鎖ＤＮＡよりもＴＭ細胞を感染させる上でより有効であり得るとことが文献報告で示唆されている。したがって、高眼圧症の処置のために小柱網内で遺伝物質が発現される特定の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補性ＡＡＶ２（ｓｃＡＡＶ２）であってもよい。このベクターは、マウス及び霊長類の目に、小柱網細胞において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の標的化及び長期発現を効果的にすることが示されている（Ｂｕｉｅ  ＬＫ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５１；１：２３６−４８）。
【０１３７】
本明細書で考察するように、本発明のベクター（例えば、ＧｌｙＲまたはＧｌｕＣ１サブユニットをコードする核酸を含む発現カセットを含む）は、痙性の処置のために使用され得る。特定の実施形態では、所望の効果をもたらすために必要とされるように、サブユニットの発現を筋肉ニューロンもしくは運動ニューロンのいずれかまたは両方に標的してもよい。例えば、痙攣性緊張（痙性）の処置のために運動ニューロンにおいて遺伝物質が発現される場合、ベクターとは、弛緩すべき筋の筋内または神経筋接合部に注入されたＡＡＶ６ベクターであり得る。このベクターは、非ヒト霊長類の運動ニューロン細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の標的化及び効果的な長期発現に有効であることが示されている（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（１）：１４１−６）。例えば、痙性緊張症（痙性）の処置のために、サブユニットが骨格筋で発現されるべき場合、ベクターはＡＡＶタイプ１、３、または５のうちの１つであり得る（Ｃｈａｏ  Ｈ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２（６）：６１９−２３）またはＡＡＶ８（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ６（２２０）：２２０ｒａ２１０）またはＡＡＶ９（Ｆａｌｋ  ＤＪ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：１５００７）。これらのベクターは、ＮＯＤ／ＳＣＩＯＤマウスの骨格筋細胞におけるイヌ第ＩＸ因子の標的化及び効果的な長期発現に有効であることが示されている。このベクターは、治療される筋肉に直接注射される。
【０１３８】
ベクターの調製及び投与
本明細書に記載のベクターを作製した後、ベクターを精製してもよい。組成物中のベクターの濃度を増強するためのベクター精製は、密度勾配精製、クロマトグラフィー技術、または限界希釈精製などの任意の適切な方法によって達成され得る。特定の精製技術は、当業者に公知であり、ベクターの種類（例えば、ＡＡＶの種類のようなウイルスの種類）に依存して変化するであろう。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターのようなウイルスベクターである。一般に、ウイルスベクターは、十分なウイルスを細胞集団に送達して、その細胞が所定の数のウイルスに確実に対抗することができるようにさせる場合に最も有用である。したがって、本発明は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含むストック、好ましくは均一ストックを提供する。ウイルスストック（例えば、ＡＡＶストック）の調製及び分析は、当技術分野において周知である。ウイルスストックは、ウイルス遺伝子型、ならびにそれらを調製するために使用されるプロトコール及び細胞系に大きく依存して、力価においてかなり変化する。特定の実施形態では、そのようなストックは、少なくとも約１０６ｐｆｕまたはさらにより具体的には少なくとも約１０７ｐｆｕなど、少なくとも約１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス力価を有する。さらにより具体的な実施形態では、力価は、少なくとも約１０８ｐｆｕ、または少なくとも約１０９ｐｆｕであってもよい。特定の実施形態では、ストックは、少なくとも約１０１０ｐｆｕまたは少なくとも約１０１１ｐｆｕの高力価のストックである。
【０１４０】
本発明はさらに、本明細書に記載のベクター（例えば、ＡＡＶベクター）及び担体を含む組成物を提供する。組成物の担体は、ベクターのための任意の適切な担体であり得る。担体は、典型的には液体であるが、固体であっても、または液体及び固体成分の組み合わせであってもよい。担体は、望ましくは、薬学的に許容される（例えば、生理学的または薬理学的に許容される）担体（例えば、賦形剤または希釈剤）である。薬学的に許容される担体は周知であり、容易に入手可能である。担体の選択は、組成物を投与するために使用される特定のベクター及び特定の方法によって少なくとも部分的に決定される。この組成物は、特に、組成物及び／またはその最終用途の安定性を高めるために、任意の他の適切な成分をさらに含んでもよい。従って、本発明の組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する。以下の処方及び方法は、単なる例示であり、決して限定するものではない。
【０１４１】
上記のように、本明細書に記載のベクターは、薬学的組成物として処方され、選択された投与経路に適合した様々な形態、すなわち、経口的にまたは非経口的に、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路で、ヒト患者のような哺乳動物宿主に投与されてもよい。
【０１４２】
ベクターは、皮内、皮下、気管内、筋肉内または眼内の注入もしくは注射によって投与されてもよい。局所（局地的）注射または非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。ベクターの溶液は、必要に応じて無毒性界面活性剤と混合されたた水中で調製してもよい。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製されてもよい。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。この製剤は、アンプル及びバイアルのような単位用量または複数用量密封容器で提供されてもよく、使用の直前に、注射のための、滅菌液体賦形剤、例えば、水を添加することしか必要としない凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保管されてもよい。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。
【０１４３】
注射または注入に適した医薬剤形としては、必要に応じてリポソームにカプセル化された、滅菌注射可能または注入可能な溶液もしくは分散液の即時調製に適合したベクターを含む、滅菌水溶液または分散液または滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、最終的な剤形は、製造及び貯蔵の条件下において無菌で、流動性があり、かつ安定でなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性のグリセリルエステル、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒、または液体分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０１４４】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上に列挙した種々の他の成分を用いて、適切な溶媒中に必要量のベクターを組み込み、続いて滅菌することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過された溶液中に存在する有効成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１４５】
本ベクターはまた、不活性希釈剤のような薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて局所投与することもできる。局所投与のために、本発明のベクターは、純粋な形態で、すなわちそれらが液体である場合に適用され得る。しかしながら、液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と組み合わせて、それらを組成物または製剤として皮膚に投与することが一般的に望ましいであろう。
【０１４６】
有用な液体担体としては、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、ここで本ベクターは、必要に応じて非毒性界面活性剤の助けを借りて有効なレベルで溶解または分散され得る。所与の用途のための特性を最適化するために、芳香剤及び追加の抗菌剤などのアジュバントを添加してもよい。得られた液体組成物は、吸収パッドから塗布してもよいし、包帯及び他の包帯に含浸させるために使用してもよいし、またはポンプ型噴霧器もしくはエアロゾル噴霧器を使用して患部に噴霧してもよい。
【０１４７】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性鉱物材料などの増粘剤もまた、液体担体と一緒に用いて、ユーザーの皮膚に直接塗布するための、展延性ペースト、ゲル、軟膏、石けんなどを形成してもよい。
【０１４８】
本発明のベクターを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科学的組成物の例は、当該分野で公知である。例えば、Ｊａｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照のこと。
【０１４９】
本明細書に記載のベクターの有用な用量は、インビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定してもよい。マウス及び他の動物における有効投薬量をヒトに外挿する方法は、当該分野で公知である；例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ  ＡＣ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９：８７６−８８５；Ｎａｔｈｗａｎｉ  ＡＣ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１（２１）：１９９４−２００４を参照のこと。
【０１５０】
処置に使用するのに必要なベクターの量は、投与経路、処置される状態の性質ならびに患者の年齢及び状態によって変化し、最終的には担当医または臨床医の裁量である。
【０１５１】
所望の用量は、単回用量で、または適切な間隔で、例えば１日あたり２、３、４またはそれ以上の副用量として投与される分割用量として都合よく与えられてもよい。副用量それ自体は、例えば、多数の別個のおおまかな間隔の投与にさらに分割されてもよい（目に対する複数の液滴の適用など）。
【０１５２】
本明細書で考察されるように、ベクターは、他の治療剤または生物学的に活性な薬剤、例えば興奮性細胞関連の疾患または状態、例えば疼痛、炎症、高眼圧症または痙性高緊張症を処置するのに有用な他の薬剤と組み合わされて投与されてもよい。さらに、免疫系抑制因子、エンハンサー、抗生物質またはアドレナリンは、本明細書に記載のベクターと組み合わせて投与されてもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のベクター、少なくとも１つの他の治療剤または生物学的に活性な薬剤、及び薬学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物も提供する。例えば、特定の適応症の処置に有用な治療因子が存在し得る。イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、ベクターのインビボ投与を伴う腫脹及び炎症ならびに生理学的苦痛を軽減するための組成物の一部であり得る。免疫系の抑制因子は、ベクター自体に対する、または障害に関連する任意の免疫応答を低下させるための複合方法と共に施されてもよい。あるいは、疾患に対する身体の自然防御をアップレギュレートするために、免疫増強剤を組成物に含めてもよい。抗生物質、すなわち殺菌剤及び殺菌剤は、遺伝子移入手順に関連する感染及び他の障害のリスクを低減するために存在し得る。さらに、アドレナリンのような薬理学的に活性な薬剤を、製剤に添加して血管収縮を誘発し、局所麻酔薬として使用されるように注射部位からのＡＡＶのクリアランスを減少させてもよい。本発明はまた、本明細書に記載のベクター、少なくとも１つの他の治療剤または生物活性剤、パッケージング材料、及び本明細書に記載のベクター、ならびに他の治療／生物学的に活性な薬剤（複数可）を動物に投与して、興奮性の細胞関連の疾患または状態を処置するための説明書を備えるキットを提供する。
【０１５３】
本発明の特定の実施形態
実施形態１．発現カセットを含むベクターであって、この発現カセットが、哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のために、多量体イオンチャネル（例えば、クロライドチャネル）のサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【０１５４】
実施形態２．哺乳動物細胞の電気生理学的活性のインビボ調節のための方法であって、多量体イオンチャネル（例えば、塩素チャネル）のサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターと細胞とを接触させることを包含する、方法。
【０１５５】
実施形態３．発現カセットを含むベクターであって、この発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のためのベクター。
【０１５６】
実施形態４．それを必要とする哺乳動物における興奮性細胞関連の疾患または状態を処置する方法であって、発現カセットを含むベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含し、ここでこの発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、方法。
【０１５７】
実施形態５．実施形態１−４のいずれか１つに記載のベクターまたは方法であって、ここでこのサブユニットが、１つ以上のさらなるサブユニットと多量体化することによって多量体イオンチャネルを形成し得る、ベクターまたは方法。
【０１５８】
実施形態６．実施形態１〜５のいずれか１つに記載のベクターまたは方法であって；処置がアゴニストまたはアロステリックモジュレーターの投与の非存在下であり、多量体イオンチャネルのアゴニストまたはアロステリックモジュレーターが哺乳動物に投与されない；及び／または哺乳動物細胞が外因性アゴニストまたは外因性アロステリックモジュレーターと接触していない、方法。
【０１５９】
実施形態７．アゴニストがグリシンである、実施形態６に記載に記載のベクターまたは方法。
【０１６０】
実施形態８．多量体イオンチャネルが内因性アゴニストによって活性化される、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１６１】
実施形態９．核酸がクロライドチャネルのサブユニットをコードする、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１６２】
実施形態１０．核酸が、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）、γ−アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡＲ）またはグルタメートゲートのクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ）のサブユニットをコードする、実施形態９に記載のベクターまたは方法。
【０１６３】
実施形態１１．核酸がＧｌｙＲのサブユニットをコードする、実施形態１０に記載のベクターまたは方法。
【０１６４】
実施形態１２．コードされたＧｌｙＲサブユニットが、α−１サブユニット、α−２サブユニット、及びα−３サブユニット、α−４サブユニット及びβ−サブユニットからなる群より選択される、実施形態１１に記載のベクターまたは方法。
【０１６５】
実施形態１３．コードされたＧｌｙＲサブユニットが、ＧｌｙＲのアルファ−１−サブユニット（ＧｌｙＲａ１）である、実施形態１２に記載のベクターまたは方法。
【０１６６】
実施形態１４．コードされたＧｌｙＲサブユニットが、ヒトＧｌｙＲａ１（ｈＧｌｙＲａ１）である、実施形態１３に記載のベクターまたは方法。
【０１６７】
実施形態１５．核酸がＧＡＢＡＡＲのサブユニットをコードする、実施形態１０に記載のベクターまたは方法。
【０１６８】
実施形態１６．核酸がＧＡＢＡＡ−ρ受容体のサブユニットをコードする、実施形態１５に記載のベクターまたは方法。
【０１６９】
実施形態１７．コードされたＧＡＢＡＡＲサブユニットが、ＧＡＢＲＡ１（α１）、ＧＡＢＲＡ２（α２）、ＧＡＢＲＡ３（α３）、ＧＡＢＲＡ４（α４）、ＧＡＢＲＡ５（α５）、ＧＡＢＲＡ６（α６）、ＧＡＢＲＢ１（β１）、ＧＡＢＲＢ１（β２）、ＧＡＢＲＢ１（β３）、ＧＡＢＲＧ１（γ１）、ＧＡＢＲＧ２（γ２）、ＧＡＢＲＧ３（γ３）、ＧＡＢＲＤ（δ）、ＧＡＢＲＥ（ε）、ＧＡＢＲＰ（π）、ＧＡＢＲＱ（θ）、ＧＡＢＲＲ１（ρ１）、ＧＡＢＲＲ２（ρ２）及びＧＡＢＲＲ３（ρ３）からなる群より選択される、実施形態１５に記載のベクターまたは方法。
【０１７０】
実施形態１８．上記核酸がＧｌｕＣｌのサブユニットをコードする、実施形態１０に記載のベクターまたは方法。
【０１７１】
実施形態１９．コードされたＧｌｕＣ１サブユニットが、α１、α２Ａ、α２Ｂ、ＧＢＲ２Ａ（α３Ａ）、ＧＢＲ２Ｂ（α３Ｂ）及びβからなる群より選択される、実施形態１８に記載のベクターまたは方法。
【０１７２】
実施形態２０．コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと比較して少なくとも１つの突然変異を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１７３】
実施形態２１．変異体サブユニットを含む多量体イオンチャネルが構成的に活性である、実施形態２０に記載のベクターまたは方法。
【０１７４】
実施形態２２．変異体サブユニットを含む多量体イオンチャネルが、対応する野生型多量体イオンチャネルと比較してアゴニスト感受性が増強されている、実施形態２０に記載のベクターまたは方法。
【０１７５】
実施形態２３．コードされたサブユニットが、Ｍ２膜貫通ドメインを含み、かつ少なくとも１つの変異が、対応する野生型サブユニットと比較してＭ２膜貫通ドメインにある、実施形態２０〜２２のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１７６】
実施形態２４．対応する野生型サブユニットと比較して、少なくとも１つの変異がロイシン９’残基にある、実施形態２３に記載のベクターまたは方法。
【０１７７】
実施形態２５．少なくとも１つの変異が野生型サブユニットと比較してＬ９’ＡまたはＬ９’Ｇである、請求項２４に記載のベクター、または方法。
【０１７８】
実施形態２６．コードされたサブユニットは、対応する野性型サブユニットと比較して、少なくとも１つの変異がＬ２６３であるＧＡＢＡＡα−サブユニット；少なくとも１つの変異がＬ２５９であるＧＡＢＡＡβ−サブユニット；少なくとも１つの変異がＬ２７４であるＧＡＢＡＡγ−サブユニット；または少なくとも１つの変異がＴ３１４、Ｌ３１７もしくはＬ３０１であるＧＡＢＡＣρ−サブユニットである、実施形態２０〜２２のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１７９】
実施形態２７．上記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと約８０％の配列同一性〜約９９％の配列同一性を有する、実施形態２０〜２６のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８０】
実施形態２８．上記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２７に記載のベクターまたは方法。
【０１８１】
実施形態２９．上記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２８に記載のベクターまたは方法。
【０１８２】
実施形態３０．上記コードされたサブユニットが、対応する野生型サブユニットに対して約９９％の配列同一性を有する、実施形態２９に記載のベクターまたは方法。
【０１８３】
実施形態３１．上記プロモーターが調節可能なプロモーターである、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８４】
実施形態３２．上記プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８５】
実施形態３３．上記プロモーターが組織特異的プロモーターである、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８６】
実施形態３４．上記プロモーターが、ヒトシナプスシン−１プロモーター（Ｓｙｎ１またはｈＳｙｎ）、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリベータ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーター、筋特異的デスミンプロモーター、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターまたはそのフラグメント、及びキチナーゼ３様１（Ｃｈ３Ｌ１）遺伝子の５’プロモーター領域からなる群より選択される、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８７】
実施形態３５．上記ベクターがウイルスベクターである、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１８８】
実施形態３６．上記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマロニー系のウイルスベクターである、実施形態３５に記載のベクターまたは方法。
【０１８９】
実施形態３７．上記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、実施形態３６に記載のベクターまたは方法。
【０１９０】
実施形態３８．上記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びｒＡＡＶ２／６からなる群より選択される、実施形態３７に記載のベクターまたは方法。
【０１９１】
実施形態３９．上記ベクターがＡＡＶ６ベクターである、実施形態３８に記載のベクターまたは方法。
【０１９２】
実施形態４０．上記ベクターがｓｃＡＡＶベクターである、実施形態３６に記載のベクターまたは方法。
【０１９３】
実施形態４１．上記ｓｃＡＡＶベクターがｓｃＡＡＶ２ベクターである、実施形態４０に記載のベクターまたは方法。
【０１９４】
実施形態４２．上記興奮性細胞関連の疾患または状態が、疼痛、炎症、高眼圧症または痙性緊張症である、実施形態３〜４１のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０１９５】
実施形態４３．上記興奮性細胞関連疾患が疼痛である、実施形態４２に記載のベクターまたは方法。
【０１９６】
実施形態４４．上記疼痛が慢性疼痛である、実施形態４３に記載のベクターまたは方法。
【０１９７】
実施形態４５．上記疼痛が関節痛または神経因性疼痛である、実施形態４３または４４に記載のベクターまたは方法。
【０１９８】
実施形態４６．上記興奮性細胞関連の疾患または状態が炎症である、実施形態４２に記載のベクターまたは方法。
【０１９９】
実施形態４７．上記炎症が関節炎である、実施形態４６に記載のベクターまたは方法。
【０２００】
実施形態４８．上記ベクターがＡＡＶ６ベクターであり、上記プロモーターがヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターであり、上記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、実施形態４２〜４７のいずれか１つに記載のベクターまたは方法。
【０２０１】
実施形態４９．上記ＧｌｙＲサブユニットが、サブユニットの多量体化の際に恒常的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態４８に記載のベクターまたは方法。
【０２０２】
実施形態５０．上記興奮性細胞関連の疾患または状態が高眼圧症である、実施形態４２に記載のベクターまたは方法。
【０２０３】
実施形態５１．上記興奮性細胞関連の疾患または状態が緑内障である、実施形態５０に記載のベクターまたは方法。
【０２０４】
実施形態５２．上記ベクターがｓｃＡＡＶ２ベクターであり、上記プロモーターがマトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーターであり、かつ上記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、実施形態５０または５１に記載のベクターまたは方法。
【０２０５】
実施形態５３．ＧｌｙＲサブユニットが、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲを生じる少なくとも１つの変異を含む、実施形態５２に記載のベクターまたは方法。
【０２０６】
実施形態５４．上記興奮性細胞関連の疾患または状態が痙性緊張症である、実施形態４２に記載のベクターまたは方法。
【０２０７】
実施形態５５．上記ベクターがＡＡＶ２またはＡＡＶ６ベクターであり、上記プロモーターがヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターであり、上記核酸がＧｌｙＲサブユニットをコードする、実施形態５４に記載のベクターまたは方法。
【０２０８】
実施形態５６．上記ＧｌｙＲサブユニットが、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲを生じる少なくとも１つの変異を含む、実施形態５５に記載のベクターまたは方法。
【０２０９】
実施形態５７．上記ベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターであり、上記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターまたはＣＡＧもしくは筋特異的デスミンプロモーターであり、上記核酸はＧｌｙＲサブユニットをコードする、実施形態５４に記載のベクターまたは方法。
【０２１０】
実施形態５８．上記ＧｌｙＲサブユニットが、サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態５７に記載のベクターまたは方法。
【０２１１】
実施形態５９．上記ベクターがＡＡＶ８であり、上記プロモーターが筋特異的デスミンプロモーターである、実施形態５７または５８に記載のベクターまたは方法。
【０２１２】
実施形態６０．１つ以上の他の治療剤を哺乳動物に投与することをさらに包含する、実施形態４〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１３】
実施形態６１．前記１つ以上の他の治療剤が、疼痛、炎症、高眼圧症及び／または痙性緊張症の処置に有用な薬剤である、実施形態６０に記載の方法。
【０２１４】
実施形態６２．１つ以上の他の治療剤が、多量体イオンチャネルのアゴニストまたはアロステリックモジュレーターではない、実施形態６０に記載の方法。
【０２１５】
実施形態６３．前記１つ以上の他の治療剤がグリシンでない、実施形態６２に記載の方法。
【０２１６】
実施形態６４．興奮性細胞関連の疾患または状態の予防的または治療的処置のための医薬組成物であって、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含むベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【０２１７】
実施形態６５．ａ）多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含むベクター；及びｂ）１種以上の他の治療剤と、の組み合わせであって；興奮性細胞関連の疾患または障害の予防的または治療的処置のための組み合わせ。
【０２１８】
実施形態６６．１つ以上の他の治療剤が、疼痛、炎症、高眼圧症及び／または痙性緊張症の処置に有用な薬剤である、実施形態６５に記載の組み合せ。
【０２１９】
実施形態６７．上記１つ以上の追加の治療剤が、多量体イオンチャネルのアゴニストでも、またはアロステリックモジュレーターでもない、実施形態６５の組み合せ。
【０２２０】
実施形態６８．上記１つ以上の追加の治療剤がグリシンではない、実施形態６７の組み合わせ。
【０２２１】
実施形態６９．多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含むベクター；パッケージング材料、及びそれを必要とする哺乳動物にこのベクターを投与して興奮性細胞関連の疾患または状態を処置するための説明書を備えるキット。
【０２２２】
実施形態７０．１つ以上の他の治療剤をさらに含む、実施形態６９に記載のキット。
【０２２３】
実施形態７１．発現カセットを含むベクターの使用であって、この発現カセットが、多量体イオンチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、それを必要とする哺乳動物において、興奮性細胞関連の疾患または状態の処置のための医薬を調製するための使用。
【０２２４】
実施形態７２．発現カセットを含むベクターであって、この発現カセットが、医学療法での使用のために多量体クロライドチャネルのサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【０２２５】
実施形態７３．その必要な哺乳動物において疼痛、炎症、高眼圧症または痙性緊張症を処置する方法であって、発現カセットを含むベクターの有効量を哺乳動物に投与することを包含し、上記発現カセットが、ＧｌｙＲのサブユニット（例えば、ＧｌｙＲａ１、例えば、ｈＧｌｙＲａ１）をコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、方法。
【０２２６】
実施形態７４．その必要な哺乳動物において疼痛、炎症、高眼圧症または痙性緊張症を処置する方法であって、発現カセットを含む有効量のベクターをこの哺乳動物に投与することを包含し、上記発現カセットが、ＧｌｕＣｌのサブユニット（例えば、ＧｌｕＣｌのαサブユニット）をコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、方法。
【０２２７】
実施形態７５．上記アゴニストまたはアロステリックモジュレーターが哺乳動物に投与されない、実施形態７３または７４に記載の方法。
【０２２８】
実施形態７６．前記コードされたサブユニットが少なくとも１つの変異を含む、実施形態７３〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
実施形態７７．グリシン受容体（ＧｌｙＲ）のα−サブユニットをコードする配列を含む核酸であって、前記αサブユニットが、前記サブユニットの多量体化の際に構成的に活性なＧｌｙＲをもたらす少なくとも１つの変異を含む核酸。
【０２３０】
実施形態７８．ＧｌｙＲのコードされたα−サブユニットが、α−１サブユニット、α−２サブユニット、及びα−３サブユニット及びα−４サブユニットからなる群より選択される、実施形態７７に記載の核酸。
【０２３１】
実施形態７９．ＧｌｙＲのコードされたα−サブユニットが、ＧｌｙＲのヒトα−サブユニットである、実施形態７７に記載の核酸。
【０２３２】
実施形態８０．ＧｌｙＲのコードされたα−サブユニットが、ＧｌｙＲのα−１−サブユニット（ＧｌｙＲａ１）である、実施形態７９に記載の核酸。
【０２３３】
実施形態８１．ＧｌｙＲのコードされたα−サブユニットが、ヒトＧｌｙＲａ１（ｈＧｌｙＲａ１）である、実施形態７９に記載の核酸。
【０２３４】
実施形態８２．ＧｌｙＲのコードされたα−サブユニットが、Ｍ２膜貫通ドメインを含み、かつ少なくとも１つの変異が、Ｍ２膜貫通ドメインにある（対応するＧｌｙＲの野生型α−サブユニットと比較して）、実施形態７７〜８１のいずれか１つに記載の核酸。
【０２３５】
実施形態８３．上記少なくとも１つの変異が、ロイシン９’残基にある（ＧｌｙＲの対応する野生型α−サブユニットと比較して）、実施形態８２に記載の核酸。
【０２３６】
実施形態８４．少なくとも１つの変異が表２に記載されている、実施形態８２に記載の核酸。
【０２３７】
実施形態８５．上記少なくとも１つの変異が、Ｌ９’ＡまたはＬ９’Ｇである（ＧｌｙＲの対応する野生型α−サブユニットと比較して）、実施形態８２に記載の核酸。
【０２３８】
実施形態８６．上記少なくとも１つの変異が、Ｌ９’Ａである、実施形態８２に記載の核酸。
【０２３９】
実施形態８７．上記核酸が、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態８２に記載の核酸。
【０２４０】
実施形態８８．上記核酸が、配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態８７に記載の核酸。
【０２４１】
実施形態８９．上記核酸が配列番号２を含む、実施形態８７に記載の核酸。
【０２４２】
実施形態９０．上記核酸が配列番号２からなる、実施形態８７に記載の核酸。
【０２４３】
実施形態９１．本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【０２４４】
実施形態９２．本明細書に記載の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【０２４５】
実施形態９３．上記プロモーターが調節可能なプロモーターである、実施形態９２に記載の発現カセット。
【０２４６】
実施形態９４．上記プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態９２に記載の発現カセット。
【０２４７】
実施形態９５．上記プロモーターが組織特異的プロモーターである、実施形態９２に記載の発現カセット。
【０２４８】
実施形態９６．上記プロモーターが、ヒトシナプスシン−１プロモーター（Ｓｙｎ１またはｈＳｙｎ）、ヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーター、筋特異的デスミンプロモーター、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）プロモーター、またはそのフラグメント及びキチナーゼ３様１（Ｃｈ３Ｌ１）遺伝子の５’プロモーター領域からなる群より選択される、実施形態９２に記載の発現カセット。
【０２４９】
実施形態９７．上記プロモーターがヒトシナプシン−１プロモーター（ｈＳｙｎ）である、実施形態９２に記載の発現カセット。
【０２５０】
実施形態９８．（例えば、実施形態９２〜９７のいずれか１つに記載されるような）本明細書に記載の発現カセットを含むベクター。
【０２５１】
実施形態９９．上記ベクターがウイルスベクターである、実施形態９８に記載のベクター。
【０２５２】
実施形態１００．上記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマローニーベースのウイルスベクターである、実施形態９９に記載のベクター。
【０２５３】
実施形態１０１．上記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、実施形態１００に記載のベクター。
【０２５４】
実施形態１０２．上記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びｒＡＡＶ２／６からなる群より選択される、実施形態１０１に記載のベクター。
【０２５５】
実施形態１０３．上記ベクターがＡＡＶ６ベクターである、実施形態１０２に記載のベクター。
【０２５６】
実施形態１０４．本明細書に記載のベクター（例えば、実施形態９８〜１０３のいずれか１つに記載のもの）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【０２５７】
実施形態１０５．本明細書に記載のベクターを含むウイルスストック。
【０２５８】
本明細書中に記載される本発明の方法において、本発明のベクター（例えば、実施形態９８〜１０３のいずれか１つに記載されるような）を使用してもよい。
【０２５９】
ＤＮＡ及びタンパク質配列は、ヒトＧｌｙＲａ１サブユニットについて以下に示される。野生型及びＬ９’Ａ変異体配列の両方がそれぞれ示されている。さらに、Ｍ２ドメインの配列も含まれる。
【０２６０】
核酸配列
ヒトＧｌｙＲａ１野性型
【化１】
2018533976.tif 000007
＊Ｌ９’残基のコドンは太字で示す。
【０２６１】
ヒトＧｌｙＲａ１  Ｌ９’Ａ突然変異タンパク質
【化２】
2018533976.tif 000008
＊Ｌ９’Ａ残基のコドンは太字で示す。
【０２６２】
タンパク質翻訳
ヒトＧｌｙＲａ１野性型
【化３】
2018533976.tif 000009
＊Ｍ２領域には下線を付し、Ｌ’９残基は太字で示す。
野性型ヒトＧｌｙＲａ１のＭ２領域
【化４】
2018533976.tif 000010
＊Ｌ’９残基は太字で示し、下線を付している。
【０２６３】
ヒトＧｌｙＲａ１  Ｌ９’Ａ突然変異タンパク質
【化５】
2018533976.tif 000011
＊Ｍ２領域には下線を付し、Ｌ’９Ａ残基は太字で示す。
Ｌ９’Ａ変異体ヒトＧｌｙＲａ１のＭ２領域
【化６】
2018533976.tif 000012
＊Ｌ’９Ａ残基は太字で示し、下線を付している。
【０２６４】
特定の定義
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、及びそのポリマーであって、糖、リン酸塩及びプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含む単量体（ヌクレオチド）から構成される一本鎖または二本鎖型のポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：５０８；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＪＢＣ，２６０：２６０５；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１。「核酸フラグメント」は、所与の核酸分子の画分である。大部分の生物におけるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含まれる情報のタンパク質への移動に関与している。「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーへの組み込みを可能にする合成、非天然または変更されたヌクレオチド塩基を必要に応じて含む、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。「核酸」、「核酸分子」、「核酸フラグメント」、「核酸配列またはセグメント」、または「ポリヌクレオチド」という用語はまた、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡと互換的に用いられてもよい。
【０２６５】
本発明の核酸分子、配列またはセグメントに関連する「部分」または「フラグメント」とは、発現のために他の配列に連結されている場合、少なくとも８０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも４００ヌクレオチドを有する配列を意味する。発現のために使用されない場合、「部分」または「フラグメント」とは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列に対応する、少なくとも９個、好ましくは１２個、より好ましくは１５個、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、例えばプローブ及びプライマー（オリゴヌクレオチド）を意味する。
【０２６６】
「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０２６７】
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を包含する。本発明の文脈において、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子または「単離された」または「精製された」ポリペプチドは、その本来の環境から離れて存在し、したがって自然の産物ではないＤＮＡ分子またはポリペプチドである。単離されたＤＮＡ分子またはポリペプチドは、精製された形態で存在してもよく、または非天然環境、例えばトランスジェニック宿主細胞などの中に存在してもよい。例えば、「単離された」または「精製された」核酸分子もしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞材料も、培養培地も実質的に含まず、または化学的に合成された場合、化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。一実施形態では、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいて、核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）が、ない。例えば、種々の態様において、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含んでもよい。実質的に細胞性物質を含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の混入タンパク質を有するタンパク質またはポリペプチドの調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生産される場合、好ましくは、培養培地は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の化学前駆体または目的の非タンパク質化学物質に相当する。開示されたヌクレオチド配列のフラグメント及び改変体ならびにそれによってコードされるタンパク質または部分長タンパク質もまた本発明に包含される。「フラグメント」または「部分」とは、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはそのポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の全長または全長未満を意味する。
【０２６８】
「天然に存在する」または「野生型」とは、人工的に生産されたものとは異なる天然に見出され得る物体を表すために使用される。例えば、天然の供給源から単離可能で、実験室でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【０２６９】
分子の「改変体」は、天然の分子の配列と実質的に同様である配列である。ヌクレオチド配列に関して、改変体は、遺伝子コードの縮重のために、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列を包含する。これらのような天然に存在する対立遺伝子改変体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技術を用いて同定することができる。改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば、天然タンパク質をコードする部位特異的突然変異誘発を用いて生成されたもの、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものを用いて生成されたものなどの、合成由来ヌクレオチド配列を含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列改変体は、天然（内因性）ヌクレオチド配列に対して、少なくとも４０、５０、６０〜７０％、例えば、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般には少なくとも８０％、例えば８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、〜９８％の配列同一性を有する。
【０２７０】
特定の核酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または核酸配列がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンによってアルギニンが特定されるあらゆる位置において、コードされたタンパク質を改変することなく、記載された対応するコドンのいずれかにコドンを変更してもよい。そのような核酸バリエーションは、「保存的に改変されたバリエーション」の１種である「サイレントなバリエーション」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されているあらゆる核酸配列は、また他に注記されている場合を除いて、あらゆる可能なサイレントバリエーションも記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＴＧを除く）を改変して、標準的な技術によって機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレントバリエーション」は、記載された各配列に暗示される。
【０２７１】
「組換えＤＮＡ分子」は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１）に記載されているような、ＤＮＡ配列を一緒に連結するために使用される組換えＤＮＡ技術及び手順を用いて一緒に連結されるＤＮＡ配列の組み合せである。
【０２７２】
「異種ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」という用語は、それぞれ、特定の宿主細胞の外来の供給源に由来する配列を指すか、または同じ供給源の場合には元の形態から改変されている配列を指す。したがって、宿主細胞中の異種遺伝子としては、特定の宿主細胞に対して内因性であるが改変されている遺伝子が挙げられる。これらの用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも包含する。したがって、この用語は、細胞に対して外来性もしくは異種性であるか、または細胞と相同であるが、宿主細胞核酸内の位置であって、通常そのエレメントが見出されない位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生じるように発現される。
【０２７３】
「相同な」ＤＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞に天然に付随するＤＮＡ配列である。
【０２７４】
「野生型」とは、正常な遺伝子、または既知の変異のない自然界に見られる生物体を指す。
【０２７５】
「ゲノム」とは、生物の完全な遺伝物質を指す。
【０２７６】
「ベクター」とは、とりわけ、自己伝播性または動員可能であってもなくてもよく、原核生物もしくは真核生物の宿主を、細胞ゲノムへの組み込みによって形質転換し得るか、または染色体外に存在し得る（例えば、複製起点を有する自律的に複製するプラスミド）、二本鎖または一本鎖の線状または環状形態の任意のウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターを包含すると定義される。
【０２７７】
「クローニングベクター」は、典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能を損なうことなく外来ＤＮＡ配列を決定可能な様式で挿入することができる、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定及び選択における使用に適したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【０２７８】
本明細書において用いられる場合、「発現カセット」とは、終止シグナルに作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指向し得るＤＮＡ配列を意味する。それはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、またセンスまたはアンチセンス方向に目的の機能的ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをコードしてもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、キメラとは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え型で得られたものであってもよい。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発生段階に特異的であってもよい。
【０２７９】
そのような発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に連結された本発明の転写開始領域を含む。このような発現カセットには、調節領域の転写調節下に目的の遺伝子を挿入するための複数の制限部位が設けられている。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【０２８０】
「ＲＮＡ転写物」という用語は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と呼ばれるか、または一次転写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、イントロンを含まず、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、ｍＲＮＡに由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡを指す。
【０２８１】
「調節配列」及び「適切な調節配列」とは、それぞれ、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列が挙げられる。それらには、天然配列及び合成配列、ならびに合成及び天然配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。上記のように、「適切な調節配列」という用語は、プロモーターに限定されない。しかし、本発明において有用ないくつかの適切な調節配列には、限定するものではないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター及びウイルスプロモーターが挙げられる。
【０２８２】
「５’非コード配列」とは、コード配列の５’（上流）に位置するヌクレオチド配列を指す。これは、開始コドンの上流に完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在し、ｍＲＮＡに対する一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響し得る（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２２５）。
【０２８３】
「３’非コード配列」とは、コード配列の３’（下流）に位置するヌクレオチド配列を指し、ポリアデニル化シグナル配列及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる。
【０２８４】
「翻訳リーダー配列」という用語は、ＲＮＡに転写され、翻訳開始コドンの上流（５’）の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在するプロモーターとコード配列との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を指す。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【０２８５】
「成熟」タンパク質という用語は、シグナルペプチドが無くなった、翻訳後プロセシングされたポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。「シグナルペプチド」とは、前駆体ペプチドを形成するポリペプチドと併せて翻訳され、分泌経路に入るために必要とされる、ポリペプチドのアミノ末端伸長を指す。「シグナル配列」という用語は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０２８６】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによってコード配列の発現を制御する、通常そのコード配列の上流（５’）のヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」としては、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位を特定するのに役立つ他の配列からなる短いＤＮＡ配列であり、発現制御のために調節エレメントが付加された最小プロモーターが挙げられる。「プロモーター」はまた、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができる調節エレメントに加えて最小プロモーターを含むヌクレオチド配列を指す。このタイプのプロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの本来のエレメントであっても、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、天然の遺伝子から完全に誘導されてもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントから構成されてもよい。プロモーターはまた、生理学的または発生的条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含んでもよい。
【０２８７】
「開始部位」は、位置＋１とも定義される、転写された配列の一部である第一のヌクレオチドを取り囲む位置である。この部位に関して、遺伝子及びその制御領域の他の全ての配列には番号が付けられている。下流の配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）は、陽性とされるが、上流の配列（主に５’方向の制御領域のもの）は陰性とされる。
【０２８８】
不活性であるか、または上流の活性化の非存在下で大幅に減少したプロモーター活性を有するプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントは、「最小プロモーターまたはコアプロモーター」と呼ばれる。適切な転写因子の存在下で、最小プロモーターは転写を可能にするように機能する。したがって、「最小またはコアプロモーター」は、転写開始に必要な全ての基本エレメント、例えば、ＴＡＴＡボックス及び／または開始剤のみからなる。
【０２８９】
「構成的発現」とは、構成的プロモーターまたは調節されたプロモーターを用いる発現を指す。「条件付き」及び「調節発現」とは、調節されたプロモーターによって制御される発現を指す。
【０２９０】
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合をいう。例えば、調節性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が位置する場合（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）、調節性ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結されている」かまたは「関連する」と言われる。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節性配列に作動可能に連結されてもよい。
【０２９１】
「発現」とは、内因性遺伝子、導入遺伝子の細胞における転写及び／または翻訳、ならびにセンス（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指す。アンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写を指してもよい。発現はまた、タンパク質の産生を指す場合もある。
【０２９２】
「転写停止フラグメント」とは、転写を終結し得るポリアデニル化シグナル配列のような１つ以上の調節シグナルを含むヌクレオチド配列を指す。転写停止フラグメントの例は、当該分野で公知である。
【０２９３】
「翻訳停止フラグメント」とは、翻訳を終結し得る１つ以上の調節性シグナル、例えば、３つのフレームの全てにおける１つ以上の終止コドンを含むヌクレオチド配列を指す。コード配列の５’末端で開始コドンに隣接するか、またはその近傍に翻訳停止フラグメントを挿入すると、翻訳が起こらないかまたは不適切な翻訳が生じる。部位特異的組換えによる翻訳停止フラグメントの排除は、開始コドンを用いた適切な翻訳に干渉しない、部位特異的配列をコード配列に残す。
【０２９４】
「シス作用配列」及び「シス作用エレメント」という用語は、その機能が、それらが同じ分子上にあることを必要とするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【０２９５】
「トランス作用配列」及び「トランス作用エレメント」という用語は、その機能が、それらが同じ分子上にあることを必要としないＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【０２９６】
以下の用語は、以下の２つ以上の配列（例えば核酸、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の間の配列関係を記載するために用いられる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。
【０２９７】
（ａ）本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットであっても、または全体であってもよい；例えば、全長ｃＤＮＡ、遺伝子配列もしくはペプチド配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡ、遺伝子配列もしくはペプチド配列として。
【０２９８】
（ｂ）本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、配列の連続し、かつ特定のセグメントを参照し、ここで比較ウインドウ内の配列は、２つの配列の最適なアラインメントのための、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウインドウは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド長であり、必要に応じて３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長さであってもよい。当業者は、配列中にギャップを含むことに起因する参照配列との高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが典型的には導入され、マッチの数から差し引かれることを理解する。
【０２９９】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。したがって、任意の２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、（１９７０）ＪＭＢ、４８：４４３の相同性整列アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４の類似方法の検索；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３のように改変された）である。
【０３００】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータの実行は、配列の同一性を決定するために配列の比較に利用してもよい。そのような実行には、限定されないが、以下が挙げられる：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから入手可能）におけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）及びＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトのパラメータを使用して実行可能である。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５；及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７によって詳しく記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記のＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズムに基づいている。ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴプログラム（１９９０）ＪＭＢ、２１５：４０３；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９０）は、上記のＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づいている。
【０３０１】
ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でワールドワイドウェブで入手可能）を通じて公開されている。このアルゴリズムは、データベースの配列中の同じ長さのワードに整列されたときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたは満足する、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを識別することによって、高いスコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを包含する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして働く。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下すると、各方向のワードヒットの延長が停止され、１つ以上のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下になるか、いずれかの配列の終わりに達する。
【０３０２】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標に相当する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸配列と参照核酸配列との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、試験核酸配列は、参照配列と類似しているとみなされる。
【０３０３】
比較目的のためにギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）をＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９中に記載されるとおり利用してもよい。あるいは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を用いて、分子間の遠隔の関係を検出する反復検索を行ってもよい。上記のＡｌｔｓｃｈｕｌらを参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のＢＬＡＳＴＸ）を使用してもよい。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでワールドワイドウェブを参照のこと。整列は目視検査によって手動で行ってもよい。
【０３０４】
本発明の目的のために、別の配列に対する配列同一性パーセントの決定のための配列の比較とは、そのデフォルトパラメータまたは任意の同等のプログラムを有するＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７またはそれ以降）を用いて行ってもよい。「等価プログラム」とは、問題の任意の２つの配列について、好ましいプログラムによって生成された対応するアライメントと比較したとき、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを意味する。
【０３０５】
（ｃ）本明細書中で使用される場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」とは、配列比較アルゴリズムによって、または目視検査によって測定されるような、特定の比較ウインドウにまたがって最大対応のために配列された場合同じである、２つの配列中の指定された残基のパーセンテージを指す。配列同一性のパーセンテージを、タンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる場合が多く、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させてないことが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、置換の保存的性質を補正するために、配列同一性パーセントを上方に調節してもよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは完全なミスマッチではなく部分的なものとして保存的置換を採点し、それにより配列同一性のパーセンテージを増大させることを包含する。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１を与え、非保存的置換にゼロのスコアを与えた場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように算出される。
【０３０６】
（ｄ）本明細書中で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値であって、比較ウインドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい値を意味する。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して適合した位置の数を得て、適合した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割ること、及びその結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０３０７】
（ｅ）（ｉ）配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを用いて記載されるアラインメントプログラムのうちの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、及び少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決定などを考慮に入れて、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認識するであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【０３０８】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである（下記参照）。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、本明細書中で他に認定された所望のストリンジェンシーの程度に依存して、約１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容される最大コドン縮重を用いて作製される場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの示唆は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応する場合である。
【０３０９】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの文脈における「実質的同一性」という用語は、あるペプチドが、特定の比較ウインドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、または９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントを行う。２つのペプチド配列が実質的に同一であるという指標は、１つのペプチドが第２のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であることである。したがって、ペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる第２のペプチドと実質的に同一である。
【０３１０】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント同一性を算出する。
【０３１１】
上記のように、２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブリダイズする」という語句は、その配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ分子を結合、二重化またはハイブリダイズさせることを指す。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることによって対応できるわずかなミスマッチを包含する。
【０３１２】
サザンハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。熱融点（Ｔｍ）は、標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度及びｐＨ下で）である。特異性とは、典型的にはポストハイブリダイゼーション洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ  ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７の式から概算されてもよく；Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（％形態）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％形態は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低下する；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整してもよい。例えば、９０％超の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃低下することができる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列及びその相補体についてのＴｍより約５℃低いように選択される。しかし、厳密にストリンジェントな条件は、Ｔｍより１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用し得；低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、ならびに所望の温度を使用して、当業者はハイブリダイゼーション及び／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的に記載されていることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満の温度になる場合、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見い出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨで特定の配列のＴｍよりも約５℃低いように選択される。
【０３１３】
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間、０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、以下のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二本鎖についての例示的な中程度のストリンジェンシー洗浄は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチドを超える二本鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４〜６ＸのＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．５Ｍ未満、より好ましくは約０．０１〜１．０Ｍの塩濃度、Ｎａイオン濃度（または他の塩）でｐＨ７．０〜８．３であり、及び温度は、典型的には、さらに長いプローブ（例えば＞５０ヌクレオチド）に関して、少なくとも約３０℃及び少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブで観察されるものよりも２倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に起こる。
【０３１４】
極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットでフィルター上に１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件の例は、５０％ホルムアミド、例えば５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、及び６０〜６５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ中での洗浄である。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液との３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１Ｘ〜２ＸのＳＳＣ（２０×  ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での５０〜５５℃の洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、３７℃での４０〜４５％ホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、及び５５〜６０℃での０．５Ｘ〜１ＸのＳＳＣでの洗浄を含む。
【０３１５】
「改変体」ポリペプチドは、天然タンパク質のＮ末端及び／もしくはＣ末端に対する欠失（いわゆる切断）または１つ以上のアミノ酸の付加による、天然タンパク質に由来するポリペプチド；天然タンパク質の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加；または天然タンパク質中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換を意図する。そのような改変体は、例えば、遺伝子多型またはヒトの操作から生じ得る。そのような操作のための方法は、当技術分野において一般的に公知である。
【０３１６】
したがって、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断及び挿入を含む様々な方法で改変してもよい。そのような操作のための方法は、当技術分野において一般的に知られている。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製してもよい。突然変異誘発及びヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，及びそこに引用される参考文献を参照。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅのモデルに見出され得る（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．１９７８）。保存的置換、例えば、アミノ酸の１つを類似の特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが好ましい。
【０３１７】
したがって、本発明の遺伝子及びヌクレオチド配列は、天然に存在する配列ならびに変異型の両方を含む。同様に、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにそれらのバリエーション及び改変型を包含する。そのような改変体は、所望の活性を保持し続けるであろう。特定の実施形態では、本明細書に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入及び置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化をもたらさない場合がある。しかしながら、そうする前に置換、欠失または挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、その効果が慣用的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解するであろう。
【０３１８】
コードされた配列中の単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、追加または削除する個々の置換の欠失または付加は、「保存的に改変された変異」であり、この変更によって、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換が生じる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。以下の５つの群は、お互いの保存的置換であるアミノ酸を各々が含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更、追加または欠失する個々の置換、欠失または付加も、「保存的に改変されたバリエーション」である。
【０３１９】
「形質転換」という用語は、核酸フラグメントの宿主細胞のゲノムへの移入であって、遺伝的に安定した遺伝をもたらす移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、トランスジェニック細胞を含む生物は「トランスジェニック生物」と呼ばれる。
【０３２０】
「形質転換された」、「トランスジェニック」、「形質導入された」及び「組換え体」とは、異種核酸分子が導入された宿主細胞または生物体を指す。核酸分子は、当該分野で一般的に公知であるゲノムに安定に組み込まれ得、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；及びＧｅｌｆａｎｄ、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；ならびにＩｎｎｉｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。公知のＰＣＲの方法には、限定するものではないが、対になったプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法が挙げられる。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」及び「トランスジェニック」細胞は、形質転換プロセスを経ており、それらの染色体に組み込まれた外来遺伝子を含む。「形質転換されていない」という用語は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。
【０３２１】
疾患状態／条件を処置することに関して、「治療上有効量」という用語は、単回投与または複数回投与として投与された場合、ある疾患の状態／条件の任意の症状、局面、または特徴に対して単独か、または任意の検出可能な正の効果を有し得る薬学的組成物に含まれる、ベクターの量を指す。そのような効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
【０３２２】
「処置する」及び「処置」という用語は、治療的処置及び予防的または予防性の手段の両方を指し、この目的は望ましくない生理学的変化または障害を予防または減少させることである。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果としては、限定するものではないが、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または緩和、及び緩解（部分的であろうと全体的であろうと）が、検出可能であろうと検出不可能であろうと挙げられる。「処置」は、治療を受けていない場合の予想される生存と比較して、生存期間を延長させることも意味する。治療を必要とするものとしては、既にその状態または障害を有するもの、ならびにその状態または障害を有する傾向があるもの、またはその状態または障害が予防されるべきものが挙げられる。
【０３２３】
本発明の方法は、哺乳動物（例えば、哺乳動物の興奮性細胞）、ならびに他の脊索動物門（例えば、鳥類、爬虫類、両生類、硬骨魚及び軟骨魚など）、例としては、ヒト、一般的な研究室動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ブタ、サル、類人猿など）及びネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジなどの獣医学的動物に対して適用され得る。
【実施例】
【０３２４】
本発明の特定の実施形態を、以下の非限定的な実施例によって例示する。
【０３２５】
実施例１
目的
この研究の目的は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるβサブユニット（単量体発現）の非存在下でのｈＧｌｙＲａ１単独の発現が、天然アゴニストであるグリシン及び／またはタウリンに応答する機能的チャネルを形成し得るか否かを決定することであった。
【０３２６】
材料
蛍光的にタグ化されたヒトグリシン受容体サブユニットα１及び単量体増強黄色蛍光タンパク質（ｍＥＹＦＰ）アイソフォームａの完全なコード配列を含むプラスミドベクターｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をこの研究で使用した。合成遺伝子ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰを、合成オリゴヌクレオチド及び／またはＰＣＲ産物から構築した。フラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入した。形質転換細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定によって確認した。
遺伝子名：ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ
遺伝子の大きさ：１３７４ｂｐ
ベクター骨格：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）
クローニング部位：ＢａｍＨＩ／ＡｓｃＩ
【０３２７】
細胞
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１５７３）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃２６１４０）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６０）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５）中で培養し、加湿インキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。３〜４日おきに１：５または１：１０の継代培養比でコンフルエントになったとき細胞を継代した。
【０３２８】
方法の説明
細胞培養
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎアッセイのために、ＨＥＫ−２９３細胞を、側面黒色／底透明の９６ウェルイメージングプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２１９）中で、プレート容量１００μｌ／ウェルで、２０，０００細胞／ウェルでプレートした。トランスフェクションのために、７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９８５−０７０）中の１６μｇの総ＤＮＡを、７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の３０μｌのＥｘｐｒｅｓｓＦｅｃｔと混合し、２０分間プレインキュベートし、次いで１５μｌ／ウェルで１００μｌの新鮮な培養培地を含む細胞に添加した。プレーティングの２４時間後に細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。トランスフェクション混合物を、培養物から３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間のインキュベーション期間後に取り出し、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０−０８１）を補充した新鮮なグリシンを含まない培養培地（Ｇｉｂｃｏ  １２３６０−０３８）で置き換えた。
【０３２９】
膜電位測定
ＦＬＩＰＲ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢＬＵＥ処方（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、＃Ｒ８０４２）を用いた蛍光に基づくアッセイを用いて、細胞膜を横切る電圧変化を検出した。染料ローディング緩衝液を、パッケージの文献に従って調製した。具体的には、ＢＬＵＥ試薬の１つのバイアルの内容物を、５ｍｌの１×アッセイ緩衝液で溶解し、続いてさらに５ｍｌの１×アッセイ緩衝液でバイアルを洗浄して、総量１０ｍｌの色素ローディング緩衝液を得た。色素ローディング緩衝液の未使用部分は−２０℃で保存し、５日以内に使用した。機能アッセイのために、培養培地を細胞から取り除き、５０μｌのグリシンを含まないＭＥＭと交換した。次いで、細胞に５０μｌのブルー色素（Ｂｌｕｅ  ｄｙｅ）ローディング緩衝液をロードし、３７℃／５％ＣＯ２で４０分間インキュベートした。シグナルは、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏデータ取得及び分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって操作されるＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３マルチモードベンチトップマイクロプレートリーダーを使用して検出した。励起波長及び発光波長は、それぞれ５３０ｎｍ及び５６５ｎｍに設定し、５５０ｎｍの発光カットオフとした。プレート読み取りは、３０℃で「低ＰＭＴ」設定で行った。最初の２０秒で基本蛍光が測定された実行時間は、グリシン誘導シグナルに対して３００秒であった。他のＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎパラメータは、１３０μｌというピペット高さ、１００μｌという初期ウェル容量、５０μｌという移動量（したがって、薬物濃度は３回調製した）、及び約３１μｌ／秒に相当する２という転送速度設定を含んでいた。
【０３３０】
グリシン及びタウリンに対する濃度／応答曲線を、ｈＧｌｙＲａ１トランスフェクト細胞において作成した。用いたグリシン及びタウリンの濃度は、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００μＭであった。１００μＭのタウリンの存在下でもグリシンに対する用量反応曲線を作成した。グリシン及びタウリンを１０ｍＭストックとしてＤＭＳＯに溶解し、−２０℃で０．３ｍＭアリコートとして保存した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎアッセイのグリシン及びタウリン濃度は、０．１％ＤＭＳＯを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む１×ＨＢＳＳを用いて調製した。
【０３３１】
実験的な処置
細胞を以下のプラスミド：ヒトグリシン受容体サブユニットα１、アイソフォームａ（ｈＧｌｙＲａ１）（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ）でトランスフェクトした。以下のアゴニストを使用して、ＧｌｙＲアルファサブユニット：グリシン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ２８７９）またはタウリン（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ０６２５）を刺激した。
【０３３２】
データに対して実行される計算または操作の説明
Ｒａｗ  ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎシグナルは、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ５から「．ｔｘｔ」ファイルとしてエクスポートして、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００８及びＯｒｉｇｉｎ  ７．０を使用してオフラインで分析した。
【０３３３】
統計
プールされたデータは平均±ＳＥＭとして示される。
【０３３４】
結果
ＧｌｙＲαサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）を発現する細胞では、膜電位における刺激されていない変化はなく（図５Ａ〜５Ｂ、図７）、タウリン濃度の増大に対する膜電位の変化にも応答しなかった（１μＭ〜１ｍＭ）（図６、図７）。これらの細胞では、増大する濃度のグリシン（１μＭ〜１ｍＭ）の添加は、９２μＭのＥＣ５０及び約３００μＭのＥＣ１００で膜電位の用量依存的変化を生じた（図５Ａ〜５Ｂ）（図６）。グリシンに対する応答は、タウリン（１００μＭ）の存在によって有意に影響されなかった（ＥＣ５０＝４３μＭ）。これらのデータは、同様のアッセイを用いて、Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（（１９８９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２（５）：１４９１−１４９７）（ＥＣ５０＝１００μＭ）ならびにＪｅｎｓｅｎ  ＡＡ．及びＫｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｕ．（（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６７（９）：１７８９−１７９９）（ＥＣ５０＝８２μＭ）によって以前に報告されたデータとよく一致している。
【０３３５】
これらのデータによってまた、これらの単量体チャネルが、ヒト血漿中に存在する正常な内因性レベルのグリシン（２４２〜２５８μＭ）によって活性化され得ることが示される（Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、８ｔｈ  Ｒｅｖ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．９３．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ、Ｗｅｓｔ  Ｃａｄｗｅｌｌ  ＮＪ．：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｖ．，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏｒｐ．Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ｃ１９８１−１９９２）。
【０３３６】
神経細胞で発現されると、ＨＥＫ−２９３細胞で測定された膜電位におけるこれらの変化は、ＧｌｙＲαサブユニットの単量体発現及びその後の受容体の内因性アゴニストグリシンへの暴露によって形成されたＣ１−選択的チャネルを介したＣｌ−イオンの流入に起因して過分極をもたらすと予想される。タウリンは、αβ−多量体ＧｌｙＲの部分アゴニストであると報告されているが、これらの研究では、単量体のチャネル上に直接効果はなく、グリシン応答に影響があった。タウリンは、ヒト血漿中に１４１〜１６２μＭの濃度で存在する（Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、８ｔｈ  Ｒｅｖ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．９３．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ、Ｗｅｓｔ  Ｃａｄｗｅｌｌ，ＮＪ．：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｖ．，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏｒｐ．Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ｃ１９８１−１９９２）。
【０３３７】
結論
ＨＥＫ−２９３細胞におけるグリシン受容体αサブユニット（ｈＧｌｙＲａ１）の単量体発現は、正常ヒト血漿中に存在する濃度でグリシンに応答する機能的なクロライドチャネルを形成する。
【０３３８】
実施例２
目的
正常な雄ラット血漿中に存在するグリシンレベルを測定し、ウイルスベクターを介して侵害受容ニューロンに送達され、続いて内因性グリシンによって活性化された場合のＧｌｙＲａ１の鎮痛効力を評価するのにラットが適した種であることを確認すること。
【０３３９】
方法
６匹の成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、Ｋ２ＥＤＴＡ上に血液を採取した。サンプルを遠心分離し、血漿を分離し、貯蔵及び輸送のために凍結させた。
【０３４０】
一旦、解凍し、血漿タンパク質が沈殿すれば、ラット血漿サンプル中のグリシン濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−４０００Ｑｔｒａｐ質量分析計及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｉｌｉｃａ  １００×２．１ｍｍ  ＨＰＬＣカラムを備えた島津２０Ａ  ＨＰＬＣ）で測定した。ＭＲＭスキャン（ｍ／ｚ、７６／４８）による陽性ＥＳＩイオン化を用いた。この方法の較正範囲は、１０〜５０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０３４１】
結果
雄ラット血漿中の血漿グリシンレベルは、１３．８〜２３．０μｇ／ｍＬ（１８４〜３０７μＭ）に及び平均が２４０．９±４５．２μＭ（平均±ＳＤ）であった。
【０３４２】
結論
ラット血漿中に存在するグリシンのレベルは、正常な成人の男性で報告された２４２．０±４４．０μＭ、及び正常な成人女性での２５８．０±６４．０μＭと同様である（Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、８ｔｈ  Ｒｅｖ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．９３．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ、Ｗｅｓｔ  Ｃａｄｗｅｌｌ、ＮＪ．：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｖ．，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏｒｐ．Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ｃ１９８１−１９９２）。ラット血漿中のグリシンレベルは、末梢組織で発現される場合、９２μＭのＥＣ５０及び約３００μＭのＥＣ１００（図６）を有する単量体ＧｌｙＲａ１チャネルを活性化するのに適した範囲内である。
【０３４３】
ラット及びヒト血漿中のグリシンレベルの類似性に基づいて、ラットは、ウイルスベクターを介して侵害受容ニューロンに送達され、続いて内因性グリシンによって活性化される場合、ＧｌｙＲａ１の鎮痛効力を評価するのに適した種である。
【０３４４】
実施例３
目的
慢性神経因性疼痛のラットモデルにおいて、痛覚過敏／異痛症応答を減弱させるＧＴＸ−０１の有効性を評価すること。
【０３４５】
材料
ウイルスベクター
ＡＡＶを用いて送達される遺伝子治療ＤＮＡ配列から構成される処置。遺伝子治療は、以下の成分から構成される：
・アデノ随伴ウイルス（血清型６）−ＡＡＶ６
・ヒトシナプスンプロモーター−ｈＳｙｎ
・ＧｌｙＲ受容体のα１−サブユニットをコードするＤＮＡ−ＧｌｙＲａ１
・緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰ
【０３４６】
このベクターは、Ｇｏｌｅｉｎｉ、Ｉｎｃ．がデザインし、クローニングして、合成し、バキュロウイルス発現系を利用して無血清条件下で、昆虫細胞においてＡＡＶベクターを産生するＢＡＣ−ｔｏ−ＡＡＶ技術を用いて、Ｖｉｒｏｖｅｃ、Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によってＡＡＶ６にパッケージングした。
【０３４７】
能動的処置：（ＧＴＸ−０１）ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＧｌｙＲａ１。ウイルスは、９．４１ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬを含有する水溶液として供給され、投与された。
【０３４８】
対照処置：（対照）ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＧＦＰ。ウイルスは、２．２２ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬを含有する水溶液として供給され、投与された。
【０３４９】
動物
１８２ｇと２２７ｇとの間の体重の９匹の雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）は、神経因性疼痛のＳＮＩモデルを確立するために下記のように手術を受けた。全ての動物は、規則的な間隔で再マーキングされた尾のマーキングによって個々に特定された。この試験を通して、動物は自由に食物及び水に接近することができた。
【０３５０】
方法
スペアード神経傷害（Ｓｐａｒｅｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｉｎｊｕｒｙ）（ＳＮＩ）モデル−手術
イソフルラン麻酔下で、大腿の外側表面の皮膚を切開し、大腿二頭筋を直接的に切開して切片を作製し坐骨神経及びその３つの末端枝（腓腹筋、総腓骨神経及び脛骨神経）を露出させた。ＳＮＩ手順は、脛骨及び総腓骨神経の軸索切断及び結紮を含んで、腓骨神経をそのまま残していた。一般的な腓骨神経及び脛骨神経を５．０本の絹で緊密に結紮し、結紮の遠位に切開し、遠位神経切痕の２±４ｍｍを除去した。無傷の腓腹神経との接触または伸展を避けるために十分な注意を払った。筋肉及び皮膚を２層で閉じた（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ  Ｉ．及びＷｏｏｌｆ  Ｃ．（２０００）Ｐａｉｎ  ８７（２）：１４９−１５８）。本研究では、これを第０日とみなした。
【０３５１】
機械的過敏症の試験
試験は、日周期サイクルの日中のみ（０６：００−１８：００ｈ）に実施した。ラットを、持ち上がった金網プラットフォーム上の倒置したプラスチックケージに入れ、足に完全に接近させた。ケージの探索及び主要なグルーミング活動が終了するまで、行動的調節を約１５分間許容した。試験された領域は、敏感性の劣る円環（足蹠）を避けて、腓腹神経分布における足底左後肢の側方領域であった。足には、対数的に増大する剛性（０．４１、０．７０、１．２０、２．００、３．６３、５．５０、８．５０及び１５．１０ｇ）（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を有する１の一連の８ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントと接触させた。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントは、足にわずかな座屈を引き起こすのに十分な力で足底面に対して垂直に与えられ、約６〜８秒間保持された。刺激は、数秒の間隔で提示され、以前の刺激に対する任意の行動反応の明らかな解明が可能になった。足が急に引っ込められた場合、陽性の反応が認められた。毛髪を除去した直後の尻込みもまた陽性の反応と考えられた。歩行はあいまいな反応と考えられ、そのような場合には刺激を繰り返した。正常な非手術ラットの観察に基づいて、より固いフィラメントが屈曲よりも脚全体を上昇させ、刺激の性質を実質的に変化する傾向があったので、試験の上限として１５．１０ｇフィラメントというカットオフ（より小さいラットの体重の約１０％）を選択した（Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３）。
【０３５２】
手術の１日前（−１日）、動物を機械的刺激（機械的感受性）に対するベースライン応答について試験した。手術後１０日目に、全ての動物を機械的感受性について再試験した。
【０３５３】
手術後１０日目に、動物を対照ベクターまたはＧＴＸ−０１のいずれかで処置した。全身麻酔下（イソフルラン）で、ＧＴＸ−０１または対照ベクターのいずれかを、後肢肉球の側方領域に皮下注射した２０μＬ（２×１０μＬ注射）の容量で、それぞれ１．８８ｅ１２及び４．４４ｅ１１のベクターゲノムの用量で投与した。
【０３５４】
処置後１４、２１、２９、３６、４４及び５１日目（手術後２４、３１、３９、４６、５４及び６１日目）に、動物を機械的感受性について再評価した。これらの測定の全てについて、オペレーターは動物の同一性に関して盲検化された。
【０３５５】
実験的な処置（２）
動物群に以下の処置の１つを与えた：
・ＧＴＸ−０１：４匹の動物に、２×１０μＬ／足というＡＡＶ６ウイルス調製物を、推定濃度９．４１ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬで与えた。このウイルスは、ｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｙＲａ１をコードしたＤＮＡを保持していた。
・対照：５匹の動物に、２×１０μＬ／足というＡＡＶ６ウイルス調製物を、推定濃度２．２２ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬで与えた。このウイルスは、ｈＳｙｎ−ＧＦＰのためにコードされたＤＮＡを保持していた。
【０３５６】
データに対して実行される計算または操作の説明
Ｄｉｘｏｎのアップダウン法を用いて５０％引っ込め閾値を決定した（Ｄｉｘｏｎ、ＷＪ．（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０：４４１−４６２；Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３）。このパラダイムでは、シリーズの中央で、２．０ｇのフィラメントで試験を開始した。刺激は、昇順であるか降順であるかにかかわらず、常に連続した方式で与えられた。最初に選択されたフィラメントに対する足の引っ込め応答がない場合、より強い刺激を与えた；足を引っ込めると、次に弱い刺激を選択した。Ｄｉｘｏｎによると、この方法による最適な閾値計算には、５０％閾値付近で６つの応答が必要である。閾値は知られていないので、閾値にいずれかの方向から近づくにつれて類似の応答の列が生成されることがある。したがって、全ての応答が注目されたが、応答閾値が最初に交差するまで、重要な６データ点のカウントは開始されず、この時点で、閾値にまたがる２つの応答を、一連の６の最初の２つの応答としてレトロスペクティブに指定した。ラットの応答に基づいて、連続的に上下に変化した刺激の継続的な提示に対する４つの追加的な応答が、一連の残りの部分を構成した。したがって、このパラダイムを用いて収集された実際の応答の数は、最小値４（足引っ込めの場合、２．０〜０．４ｇの下降範囲の４本のフィラメントまで連続しており：閾値は実際の刺激の範囲より下にある）から最大値９（１５．１ｇで５番目の上向性の刺激提示で最初の引っ込めが生じた後、１５．１ｇまたはそれ以下で引っ込めが続いていると仮定して４回の追加反応の誘発）まで変化し得る。刺激セットの消耗に対して連続的な陽性または陰性の反応が観察された場合、それぞれ１５．００ｇ及び０．２５ｇの値を割り当てた。得られた陽性及び陰性の反応パターンを、慣例、Ｘ＝撤回；０＝引っ込めなしを用いて表にして、５０％応答閾値は、ＣｈａｐｌａｎのバージョンのＤｉｘｏｎのアップダウン法（Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３；Ｄｉｘｏｎ  ＷＪ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０：４４１−４６２）に基づくアルゴリズムを使用して補間した。
【０３５７】
処置後１４、２１、２９、３６、４４及び５１日目の対照群とＧＴＸ０１処置群との間の機械的刺激に対する応答の差異を、対のないスチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性について分析した。
【０３５８】
結果
ＧＴＸ−０１群では、処置後２９日目（Ｐ＜０．００１）、３６日目（Ｐ＜０．００１）、４４日目（Ｐ＜０．００１）及び５１日目（Ｐ＜０．０１）に引っ込め閾値の上昇で測定されるとおり有意な鎮痛作用が示された。対照群（ｎ＝５）及びＧＴＸ−０１（ｎ＝４）の両方の群についてのデータを表４及び図８に示す。
【表４】
2018533976.tif 000013
表４．ラットの機械的閾値（ｇ）であって、このラットは、０日目に腓骨神経を無傷（スペアード神経傷害（ｓｐａｒｅｄ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ））で残して、脛骨及び総腓骨神経の軸索切開及び結紮を受け、１０日目に対照ウイルス（対照）またはＧＴＸ−０１のいずれかで処置された。機械的閾値（ｇ）データは、５匹の動物（対照）及び４匹のＧＴＸ−０１の平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。対照群及びＧＴＸ−０１群を、対になっていないスチューデントのｔ検定を用いて統計学的有意性について分析した。有意差は、＊＊Ｐ＜０．０１または＊＊＊Ｐ＜０．００１で示される。
【０３５９】
−１日目のベースラインデータをとって正常または１００％鎮痛に相当するものとし、１０日目のデータを０％鎮痛とし、ＧＴＸ−０１の投与後２９、３６、４４、及び５１日におけるＧＴＸ−０１の平均鎮痛効果は、それぞれ５２％、７０％、５９％及び５８％であった。
【０３６０】
体重を測定し、研究を通して記録した。ＧＴＸ−０１対対照ベクター（図９）で処置した動物の体重には差異は見られなかった。
【０３６１】
結論
他の薬剤を投与しないでＧＴＸ−０１を単回投与すると、ラットの慢性神経因性疼痛のＳＮＩモデルにおいて有意でかつ持続的な鎮痛効果が生じた。これは、Ｇｏｓｓ  ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（３）：５００−５０６及び米国特許第８，９５７，０３６号によって報告されたデータとは異なっており、かつ対照的であり、ここでは、彼らは、ＧｌｙＲａ１のウイルス送達後の鎮痛、及びその後の受容体アゴニスト（グリシン）が、「ホルマリン注入足の足底面」のような疼痛部位への注射の形態、または頸静脈を介した全身性の形態のいずれかで（間質性膀胱炎のモデルを処置するために）動物に投与された場合の引き続く発現についてのみ記載している。
【０３６２】
実施例４
目的
この研究の目的は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるβサブユニット（単量体発現）の非存在下でのＬ９’Ａ変異ＧｌｕＣ１αサブユニット単独の発現が、構成的に活性なクロライドチャネル（ＧｌｕＣｌ＊と称する）を形成できるか否かを決定することであった。
【０３６３】
材料
蛍光的にタグ化されたＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのＧｌｕＣｌαサブユニットの完全に最適化されたコード配列を含むプラスミドベクターＧｌｕＣＬｏｐｔｂｅｔｍＦＹＰＹ１８２Ｆ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、この研究では使用した。増強された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）挿入は、細胞内Ｍ３−Ｍ４ループ内に位置する。合成遺伝子ＧｌｕＣＬｏｐｔｂｅｔｍＦＹＰＹ１８２Ｆを、合成オリゴヌクレオチド及び／またはＰＣＲ産物から組み立てた。フラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入した。プラスミドＤＮＡを、形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。最終構築物を、配列決定によって確認した。
名称：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ｄａｍ＋ｄｃｍ＋ｔｏｎＡ  ｒｅｃ−）遺伝子名：ＧｌｕＣＬｏｐｔｂｅｔｍＦＹＰＹ１８２Ｆ
遺伝子のサイズ：２０４３ｂｐ
ベクターのバックボーン：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）
クローニング部位：ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ
【０３６４】
部位特異的突然変異誘発
ロイシン９’変異は、以下のフォワード及びリバースプライマーを使用して、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃６００２５０）を用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃２００５２２）を用いて行った：５’−ＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ｘｘｘ  ＡＣ−３’及び５’−ＧＣ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ｘｘｘ  ＣＡ−３’（ここで’ｘｘｘ’は、変異したＬｅｕ９’コドンを示す）。ＧｌｕＣｌ＊については、Ｌｅｕ９’をＡｌａに変異させた。全ての変異は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０３６５】
細胞
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１５７３）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃２６１４０）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０））を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５）中で培養し、加湿インキュベーター内で３７℃、及び５％ＣＯ２で維持した。３〜４日おきに１：５または１：１０の継代培養比でコンフルエントになると細胞を継代した。
【０３６６】
方法の説明
細胞培養
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎアッセイのために、黒色側面／透明底の９６ウェルイメージングプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２１９）中で、ＨＥＫ−２９３細胞を２０，０００細胞／ウェルで、１００μｌ／ウェルのプレート容積でプレートした。トランスフェクションのために、７５０μｌのＤＭＥＭ中の１６μｇの全ＤＮＡを、７５０μｌのＤＭＥＭ中の３０μｌのＥｘｐｒｅｓｓＦｅｃｔと混合し、２０分間プレインキュベートし、次いで１００μｌの新鮮な培養培地を含む細胞に１５μｌ／ウェルで加えた。プレートの２４時間後に細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。トランスフェクション混合物を、３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間のインキュベーション期間後に培養物から取り出し、新鮮な培養培地と交換した。
【０３６７】
膜電位測定
ＦＬＩＰＲ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢＬＵＥ処方（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、＃Ｒ８０４２）を用いた蛍光に基づくアッセイを使用して、細胞膜を横切る電圧変化を検出した。染料ローディング緩衝液を、パッケージの文献に従って調製した。具体的には、ＢＬＵＥ試薬の１つのバイアルの内容物を、５ｍｌの１×アッセイ緩衝液で溶解し、続いて別の５ｍｌの１×アッセイ緩衝液でバイアルを洗浄して、総量１０ｍｌの色素ローディング緩衝液を得た。色素ローディング緩衝液の未使用部分を−２０℃で保存し、５日以内に使用した。機能アッセイのために、培養培地を細胞から除去し、５０μｌのＤＭＥＭで置き換えた。次いで、細胞に５０μｌの青色色素ローディング緩衝液（Ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）をロードし、３７℃／５％ＣＯ２で４０分間インキュベートした。シグナルは、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｔｉｏｎ  ＆  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって操作されるＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３マルチモードベンチトップマイクロプレートリーダーを使用して検出した。励起波長及び発光波長は、それぞれ５３０ｎｍ及び５６５ｎｍに設定し、発光カットオフは５５０ｎｍであった。プレート読み取りは、３０℃で「低ＰＭＴ」設定で行った。最初の２０秒で測定された基礎蛍光の実行時間は、イベルメクチン誘発シグナルに対して３００秒であった。他のＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎパラメータは、ピペット高さ２３０μｌ、初期ウェル容量１００μｌ、トランスファー容量５０μｌ（したがって、薬物濃度は３倍に調製された）、及び約３１μｌ／秒に対応する２という転送速度設定を含んでいた。
【０３６８】
イベルメクチンに対する濃度／応答曲線は、ＧｌｕＣｌ＊及び野生型トランスフェクト細胞の両方で生じた。使用したイベルメクチン濃度は、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００ｎＭであった。イベルメクチンを、１０ｍＭストックとしてＤＭＳＯに溶解し、−２０℃で０．３ｍＭアリコートとして保存した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎアッセイのイベルメクチン濃度は、０．１％ＤＭＳＯを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む１×ＨＢＳＳを用いて調製した。
【０３６９】
実験的な処置
細胞を以下のプラスミドの１つでトランスフェクトした：
●ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ｌ（野性型）（ＧｌｕＣＬｏｐｔｂｅｔｍＦＹＰＹ１８２Ｆ）
●ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ（ＧｌｕＣｌ＊）
以下のアゴニストを用いて、トランスフェクトされた細胞を刺激した
●イベルメクチン（Ｓｉｇｍａ＃１８８９８）
【０３７０】
データに対して実行される計算または操作の説明
Ｒａｗ  ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ信号は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ５から‘．ｔｘｔ’ファイルとしてエクスポートされ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００８及びＯｒｉｇｉｎ  ７．０を使用してオフラインで分析した。
【０３７１】
統計
プールされたデータは平均±ＳＥＭとして示される。
【０３７２】
結果
野生型ＧｌｕＣｌα−サブユニットを発現する細胞では、膜電位の刺激されていない変化はなかった（図１０）。漸増濃度のイベルメクチンの添加は、１４７ｎＭのＥＣ５０（図１１）で膜電位における用量依存的変化を生じた（図１０）。
【０３７３】
Ｌ９’Ａ変異ＧｌｕＣｌαサブユニット（ＧｌｕＣｌ＊）を発現する細胞では、ベースライン膜電位が最大限に変化した（図１２）。この応答は、１μＭのイベルメクチンに応答して野生型ＧｌｕＣｌαサブユニットで見られた応答と大きさにおいて同様であった（図１０）。ＧｌｕＣｌ＊を発現する細胞に漸増用量のイベルメクチンを添加することは、膜電位の変化を増大させなかった（図１２）。
【０３７４】
神経細胞で発現させた場合、ＨＥＫ−２９３細胞で測定された膜電位におけるこれらの変化は、ＧｌｕＣｌαサブユニットの単量体発現及びその後の受容体アゴニストイベルメクチンの適用によって形成されたＣ１−選択性チャネルを介したＣｌ−イオンの流入による過分極をもたらすと予想される。ニューロン細胞におけるＧｌｕＣｌαサブユニットのＬ９’Ａ変異の単量体発現は、構成的に活性なＣ１−を形成することが予想され、これはアゴニストの添加なしに神経組織の永久超分極をもたらすと予想される。
【０３７５】
結論
ＨＥＫ−２９３細胞におけるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌグルタメート受容体α−サブユニットのＬ９’Ａ変異の単量体発現は、機能的かつ構成的に活性なクロライドチャネルを形成する。
【０３７６】
実施例５
目的
この研究の目的は、慢性神経因性疼痛のラットモデルにおいて、痛覚過敏／異痛症の応答を減弱させるＧＴＸ−０１＊の有効性を評価することであった。
【０３７７】
材料
ＡＡＶを用いて送達される遺伝子治療ＤＮＡ配列からなる処置。遺伝子療法は、以下の構成要素から構成される：
●アデノ随伴ウイルス（血清型６）−ＡＡＶ６
●ヒトシナプスンプロモーター−ｈＳｙｎ
●ＧｌｕＣｌ＊をコードするＤＮＡ−構成的にオープンなチャネルを生成するＬ９’Ａ変異を有するＧｌｕＣｌ受容体のαサブユニット。ｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ
●強化された黄色蛍光タンパク質−ＥＹＦＰ
【０３７８】
ベクターは、Ｇｏｌｅｉｎｉ、Ｉｎｃ．によって設計、クローニング及び合成し、バキュロウイルス発現系を利用して無血清状態下において昆虫細胞中でＡＡＶベクターを産生する独自のＢＡＣ−ｔｏ−ＡＡＶ技術を用いて、Ｖｉｒｏｖｅｃ、Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によってＡＡＶ６にパッケージングした。
【０３７９】
能動的処置：ＧＴＸ−０１＊
ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ。ウイルスは、９．７９ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬを含有する水溶液として供給され、投与された。
【０３８０】
コントロール処置：対照
ＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＥＹＦＰ。このウイルスは、２．２２ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬを含有する水溶液として供給され、投与された。
研究の終わりに、動物にガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ：ＩＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ１５４）を与えた。
【０３８１】
動物
神経因性疼痛のＳＮＩモデルを確立するために、下記のように手術を受けた２１頭の動物の初期集団から、体重２００〜２５０ｇ（６〜７週齢）の６匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）の２群を選択した。動物は、手術後１０日目の機械的感受性に基づいて選択した。選択された１２匹の動物は、機械的刺激と同様の過敏症を有した。選択された１２匹の動物は、機械的感受性に従ってランク付けされ、「処置」及び「対照」群に対して代替的に割り当てられ、機械的刺激と同様の過敏症を有する動物の２つの「バランスのとれた」群を作成した。全ての動物は、規則的な間隔で再マーキングされた尾のマーキングによって個々に特定した。この試験を通して、動物は自由に食物及び水に接近することができた。
【０３８２】
方法論
研究は、ＡｆａＳｃｉの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコールに従って行った。
【０３８３】
方法の説明
スペアード神経傷害（Ｓｐａｒｅｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｉｎｊｕｒｙ）（ＳＮＩ）モデル−手術：
イソフルラン麻酔下で、大腿の外側表面の皮膚を切開し、大腿二頭筋を直接的に切開し、坐骨神経及びその３つの末端枝（腓腹筋、総腓骨神経及び脛骨神経）を露出させる切片を作製した。ＳＮＩ手順は、脛骨及び総腓骨神経の軸索切断及び結紮を含んで、腓骨神経をそのまま残した。一般的な腓骨神経及び脛骨神経を、５．０の絹で緊密の結紮し、結紮の遠位に切開し、遠位神経切痕の２±４ｍｍを除去した。無傷の腓腹神経との接触または伸展を避けるために十分な注意を払った。筋肉及び皮膚を、２層で閉じた（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ  Ｉ．及びＷｏｏｌｆ  Ｃ．（２０００）Ｐａｉｎ  ８７（２）：１４９−１５８）。現在の研究では、これを第０日とみなした。
【０３８４】
機械的過敏症の試験：
試験は、日周期サイクルの日中のみ（０６：００−１８：００ｈ）行った。ラットは、持ち上がった金網プラットフォーム上の倒置したプラスチックケージに入れ、足に完全に接近させた。ケージの探索及び主要なグルーミング活動が終了するまで、行動的順応を約１５分間許容した。試験された領域は、敏感性に劣る円環（足蹠）を避けて、腓腹神経分布における足底左後肢の側方領域であった。足に対数的に増大する剛性（０．４１、０．７０、１．２０、２．００、３．６３、５．５０、８．５０及び１５．１０ｇ）（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を有する一連の８本のフォンフライ（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ）のフィラメントの１本と接触させた。フォンフライのフィラメントは、足にわずかな座屈を引き起こすのに十分な力で足底面に対して垂直に提示され、約６〜８秒間保持された。刺激は、数秒の間隔で提示され、以前の刺激に対するいずれの行動反応も明らかな解明を可能にした。足が急に引っ込められた場合、正の反応が認められた。毛髪を除去した直後の尻込みもまた正の反応と考えられた。歩行運動はあいまいな反応と考えられ、そのような場合には刺激を繰り返した。正常な未処置ラットの観察に基づいて、より強いフィラメントはバックルに対してよりも脚全体を持ち上げ、実質的に刺激の性質を変更する傾向があったので、試験の上限として１５．１０ｇフィラメントのカットオフ（より小さいラットの体重の約１０％）を選択した（Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３）。
【０３８５】
手術の１日前（−１日目）、動物を機械的刺激（機械的感受性）に対するベースライン応答について試験した。手術後１０日目に、全ての動物を機械的感受性について再試験した。
【０３８６】
手術後１０日目に、最大の機械的過敏症を有する１２匹の動物を、コントロールベクターまたはＧＴＸ−０１＊のいずれかの処置に関して選択した。全身麻酔下（イソフルラン）、ＧＴＸ−０１＊または対照ベクターを、左後肢肉球の横領域中に皮下注射した２０μＬ（２×１０μＬ注射）の容量で、それぞれ１．９６ｅ１２及び４．４４ｅ１１ベクターゲノムの用量で投与した。
【０３８７】
処置後１３日目、２２日目及び３５日目（手術後２３，３２及び４５日目）に、動物の機械的感受性について再評価した。これらの測定の全てについて、オペレーターは動物の同一性に関して盲検化された。
【０３８８】
処置後２２日目（手術後３２日目）に、対照及びＧＴＸ−０１＊処置群のそれぞれからの１匹の動物を安楽死させ、組織を採取し、下記のように処理した。
【０３８９】
処置後３６日目（手術後４６日目）に、動物にガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ：ＩＰ）を投与した。ガバペンチン投与の１時間後及び２時間後に、その動物を機械的刺激に対する感受性について評価した。
【０３９０】
組織採取：
処置後２２日目及び処置後３６日目の実験終了時に、動物をイソフルランの投与及びその後の開胸により安楽死させた。左背側根神経節（Ｌ４、Ｌ５及びＬ６）、左腓腹神経及び左後肢を採取し、４℃で、４％パラホルムアルデヒド中で１４日間固定し、次いで２０％スクロースに少なくとも２４時間移した。続いて組織を凍結切片にし、共焦点顕微鏡法を用いて組織学的評価のために染色した。ＹＦＰに対する一次抗体を使用して、ｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ遺伝子の発現を同定した。
【０３９１】
実験的な処置
動物群に以下の処置の１つを投与した：
ＧＴＸ０１＊−６匹の動物に、２×１０μＬ／足のＡＡＶ６ウイルス調製物を、推定濃度９．７９ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬで与えた。このウイルスは、ｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’ＡをコードしたＤＮＡを保持した。
【０３９２】
対照−６匹の動物に、２×１０μＬ／足のＡＡＶ６ウイルス調製物を、２．２２ｅ１３ウイルス粒子／ｍＬの推定濃度で与えた。このウイルスは、ｈＳｙｎ−ＥＹＦＰをコードしたＤＮＡを保持していた。
【０３９３】
除外パラメータ：
研究から除外した動物はいなかった。研究中に死亡した動物はなかった。
【０３９４】
データに対して実行される計算または操作の説明
５０％引っ込め閾値は、Ｄｉｘｏｎ（Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３；Ｄｉｘｏｎ  ＷＪ．（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０：４４１〜４６２）のアップダウン法を使用して決定した。このパラダイムでは、シリーズの中央で、フィラメント２．０ｇで試験を開始した。刺激は、昇順であるか降順であるかにかかわらず、常に連続して提示された。最初に選択されたフィラメントに対する足の引っ込め応答がない場合、より強い刺激を与えた；足を引っ込めると、次にさらに弱い刺激を選択した。Ｄｉｘｏｎによると、この方法による最適な閾値計算には、５０％閾値のすぐ近くに６つの応答が必要である。閾値は知られていないので、閾値にいずれかの方向から近づくにつれて類似の応答の列が生成されることがある。したがって、全ての応答が注目されたが、応答閾値が最初に交差するまで、重要な６データ点のカウントは開始されず、この時点で、閾値にまたがる２つの応答を、一連の６の最初の２つの応答としてレトロスペクティブに指定した。ラットの応答に基づいて、連続的に上下に変化した刺激の継続的な提示に対する４つの追加的な応答が、一連の残りの部分を構成した。したがって、このパラダイムを用いて収集された実際の応答の数は、最小値４（足引っ込めの場合、２．０〜０．４ｇの下降範囲の４本のフィラメントまで連続しており：閾値は実際の刺激の範囲より下にある）から最大値９（１５．１ｇで５番目の上向性の刺激提示で最初の引っ込めが生じた後、１５．１ｇまたはそれ以下で引っ込めが続いていると仮定して４回の追加反応の誘発）まで変化し得る。刺激セットの消耗に対して連続的な陽性または陰性の反応が観察された場合、それぞれ１５．００ｇ及び０．２５ｇの値を割り当てた。得られた陽性及び陰性の反応パターンを、慣例、Ｘ＝撤回；０＝引っ込めなしを用いて表にして、５０％応答閾値は、ＣｈａｐｌａｎのバージョンのＤｉｘｏｎのアップダウン法（Ｃｈａｐｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：５５−６３；Ｄｉｘｏｎ  ＷＪ．（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０：４４１−４６２）に基づくアルゴリズムを使用して補間した。
【０３９５】
処置後１３日目、２２日目及び３５日目の対照群とＧＴＸ−０１＊処置群との間の機械的刺激に対する応答の差異を、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性について分析した。ガバペンチンへの応答を、ガバペンチン投与の１時間後及び２時間後と、前処理値とを、対のないスチューデントのｔ検定を用いて比較することによって、統計的有意性について分析した。
【０３９６】
結果
−１日目に、研究のために選択された動物のベースライン引っ込め閾値は、６．２４±０．０９ｇ（対照群）及び６．２７±０．０９ｇ（ＧＴＸ−０１＊群）の平均値を有した。手術後１０日目に、対照ベクター及びＧＴＸ−０１＊処置のために選択された動物における引っ込め閾値は、それぞれ１．４０±０．１８ｇ及び１．５１±０．１４ｇであった。対照ベクターまたはＧＴＸ−０１＊のいずれかの投与後１３日目に、引っ込め閾値は１．５８±０．２８ｇ及び３．０７±０．６８ｇ（Ｐ＜０．００１）であった。処置後２２日までに、対照群の引っ込め閾値は、１．６９±０．１７ｇではほとんど変わらなかったが、ＧＴＸ−０１＊群のＧＴＸ−０１＊引っ込め閾値は、５．１８±０．７４ｇ（Ｐ＜０．００１）までさらに上昇した。試験した最後の時点（処置後３５日）に、対照群（２．５３±０．４０ｇ）における機械的刺激に対する過敏症のわずかな喪失があったが、ＧＴＸ−０１＊群は、機械的刺激に対する感受性のレベルを正常レベルに近く維持した（５．２１±０．４３ｇ）（Ｐ＜０．００１）（図１３）。
【０３９７】
−１日目のベースラインデータが正常または１００％鎮痛に相当するものとし、１０日目のデータを０％鎮痛とするならば、処置後１３日目、２２日目及び３５日目のＧＴＸ−０１＊の鎮痛効果は、それぞれ正常の３３％、７７％及び７７％である。
【０３９８】
手術後４６日目に、ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ：ＩＰ）は、以前に「コントロールベクター」を投与していた動物の機械的過敏症を減少させた。投与前、投与後１時間及び２時間後のそれらの動物における引っ込め閾値は、それぞれ２．４６±０．４９ｇ、３．４４±０．３６ｇ（Ｐ＜０．０１）及び４．１５±０．１９ｇ（Ｐ＜０．００１）であった（図１４）。ガバペンチンは、以前にＧＴＸ−０１＊で処置した動物における機械的刺激に対するほぼ正常な応答に影響を及ぼさなかった（図１４）。
【０３９９】
処置後２２日目に採取したＧＴＸ−０１＊処置動物からのＤＲＧの免疫組織化学的評価によって、ＥＹＦＰについて陽性に染色された個々の細胞体が示された（ＧＴＸ−０１＊によって送達されたｐＦＢ−ｈＳｙｎ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ遺伝子の産物）（図１５）。同様に、同じ動物由来の足の真皮層の下に位置する神経終末は、ＥＹＦＰに対して陽性に染色された（図１５）。これらのデータによって、ウイルスが注射部位の神経終末に取り込まれ、ＤＲＧの細胞体に輸送されること、及び遺伝子産物が神経終末に首尾よく発現されたことが示される。
【０４００】
結論
ＧＴＸ−０１＊の単回投与は、ラットにおける慢性神経因性疼痛のＳＮＩモデルにおいて、有意でかつ長時間作用性の鎮痛効果をもたらした。
【０４０１】
実施例６
目的
この研究の目的は、ＨＥＫ−２９３細胞中のヒトグリシン受容体サブユニットα１アイソフォームａ（ｈＧｌｙＲａ１）の単量体発現が、細胞生存率に影響を及ぼすか否かを決定することであった。
【０４０２】
方法
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１５７３）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃２６１４０）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５）中で培養し、加湿インキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。３〜４日おきに１：５または１：１０の継代培養比でコンフルエントになると細胞を継代した。次いで、細胞を透明な９６ウェル培養プレート中に１００μｌ／ウェルのプレーティング容量で２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。２４時間の培養後、細胞をニセトランスフェクションするか、またはｈＧｌｙＲａ１（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴ）でトランスフェクトした。トランスフェクションのために、７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９８５−０７０）中の１６μｇの総ＤＮＡを７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の３０μｌのＥｘｐｒｅｓｓＦｅｃｔと混合し、２０分間プレインキュベートし、次いで１００μｌの新鮮な培養培地を含む細胞に１５μｌ／ウェルで添加した。トランスフェクション混合物を３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートした後、培養から取り出し、新鮮なＤＭＥＭ（４００μＭグリシンを含む）または新鮮なグリシンを含まない、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０−０８１）を補充した培養培地（Ｇｉｂｃｏ  １２３６０−０３８）で置き換えた。未トランスフェクション、ニセトランスフェクション及びトランスフェクトされた細胞の半分をＤＭＥＭ（４００μＭグリシン含有）で培養し、残りの半分をグリシンを含まない培地中で培養した。７２時間後、細胞生存率のマーカーとしてトリパンブルー色素排除を用いて細胞生存率を測定した。双眼顕微鏡下で、染色されていない（生存）細胞及び染色された（生存不可能な）細胞を別々に数えた。５つの別々のウェルを各条件について評価した。
【０４０３】
結果
グリシンの非存在下及び存在下でのトランスフェクトされていない細胞は、平均細胞生存率がそれぞれ９４．６％及び９５．６％であった。ニセトランスフェクトされた細胞は、グリシンの非存在下では９３．８％、及びグリシン存在下では９２．８％の平均細胞生存率を有した。ｈＧｌｙＲａ１の単量体発現は、グリシン非存在下（細胞の９２．０％が生存可能）またはアルファサブユニットによって形成された単量体クロライドチャネルを活性化するグリシンの存在下（細胞の９４．０％が生存可能である）で細胞生存率に影響を与えなかった（図１６）。
【０４０４】
結論
グリシン受容体チャネル（ｈＧｌｙＲａ１）のアルファサブユニットの単量体発現及びそれに続くＨＥＫ−２９３細胞でのグリシンへの７２時間の曝露は、細胞生存率に影響を及ぼさなかった。
【０４０５】
実施例７
目的
この研究の目的は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＧｌｕＣｌαサブユニットのＬ９’Ａ変異の単量体発現が細胞生存率に何らかの効果を有するか否かを決定することであった。
【０４０６】
方法
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１５７３）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃２６１４０）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５）中で培養し、加湿インキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。３〜４日おきに１：５または１：１０の継代培養比でコンフルエントになると、細胞を継代した。次いで、細胞を透明な９６ウェル培養プレートに、１００μｌ／ウェルのプレート容積で２０，０００細胞／ウェルでプレートした。培養２４時間後、細胞をニセトランスフェクトするか、またはＧｌｕＣｌ（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴ）またはＧｌｕＣｌ＊（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ）のいずれかのα−サブユニットを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９８５−０７０）中の１６μｇの総ＤＮＡを、７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の３０μｌのＥｘｐｒｅｓｓＦｅｃｔと混合し、２０分間プレインキュベートし、次いで１００μｌの新鮮培養培地を含む細胞に１５μｌ／ウェルで添加した。トランスフェクション混合物を、３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間のインキュベーション期間後に培養物から取り出し、新鮮な培養培地で置き換えた。４８時間後、細胞生存率のマーカーとしてトリパンブルー色素排除を用いて細胞生存率を測定した。双眼顕微鏡下で、染色されていない（生存）細胞及び染色された（生存不可能な）細胞を、別々に数えた。５つの別々のウェルを各条件（非トランスフェクト、ニセトランスフェクト、ＧｌｕＣｌ及びＧｌｕＣｌ＊）について評価した。
【０４０７】
結果
トランスフェクトされていない細胞及びニセトランスフェクトされた細胞の平均細胞生存率は、それぞれ９４．８％及び９２．８％であった。ＧｌｕＣｌ野生型α−サブユニットの単量体発現は、細胞生存率に影響しなかった（９１．８％の細胞が生存可能であった）。構成的に活性なＣ１−チャネル（ＧｌｕＣｌ＊）を形成するＧｌｕＣｌαサブユニットのＬ９’Ａ変異の単量体発現は、細胞生存率に対して有意な効果を有さなかった（９４．０％の細胞が生存可能であった）（図１７）。
【０４０８】
結論
ＨＥＫ−２９３細胞におけるＧｌｕＣｌαサブユニットのＬ９’Ａ変異の単量体発現は、細胞生存率に影響を及ぼさなかった。
【０４０９】
実施例８
目的
ヒト平滑筋細胞におけるムスカリン受容体アゴニストカルバコールの添加時の遊離細胞内Ｃａ＋＋に対するＧｌｕＣｌ受容体αサブユニットＬ９’Ａ変異体及びグリシン受容体α−１サブユニット変異体（Ｌ９’Ａ）の効果を評価する。
【０４１０】
方法
ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した気管に由来した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ−１ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬ−１ストレプトマイシン及び２．５ｍｇ／ｍＬ−１アンフォテリシンＢを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中で培養し、この培地を、７２時間毎に交換した。ＨＡＳＭ細胞は天然の収縮性タンパク質の発現を保持しているため、第１〜５継代の継代培養ではＨＡＳＭ細胞を使用した。ＨＡＳＭ細胞は、健常な正常ドナーに由来した。
【０４１１】
ＧｌｕＣｌ受容体
細胞は、２人の個々のドナー（ＨＳＡＭ−Ｎ０３０１１６Ｋ／１及びＮ０８２７１５／３）の気管に由来した。それらを約８０％のコンフルエントまで増殖させ、次いでｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ（ＧｌｕＣｌ受容体αＬ９’Ａ変異体）でトランスフェクトするか、または７２時間トランスフェクションなしとした。細胞を２４時間血清飢餓状態にし、カルバコール（１０μＭ）で刺激する前にＦｌｕｏ  ８カルシウム感受性色素を１時間ロードした。カルバコール（１０μＭ）で刺激する前に、別々のウェルをフォルモテロール（１μＭ、１０分）で刺激した。この研究における全てのインキュベーション及び刺激は、グリシンを含む組織培養培地中で行った。
【０４１２】
Ｇｌｙ受容体
２つの個々のドナー（ＨＡＳＭ−Ｎ０７０１１２／３及びＮ０８２１１２／３）の気管に由来する細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させ、次いでｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴ（野生型ＧｌｙＲα−１サブユニット）、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ（ＧｌｙＲα−１サブユニットＬ９’Ａ）でトランスフェクトするか、または７２時間のトランスフェクションなしとした。細胞を２４時間血清飢餓状態にし、Ｆｌｕｏ  ８カルシウム感知色素を１時間負荷した後、ヒスタミンで刺激した。ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴでトランスフェクトした細胞を、グリシン（１００μＭまたは１ｍＭ）と１時間プレインキュベートした後にヒスタミン（１μＭ）で刺激した。ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａでトランスフェクトした細胞にグリシンは添加しなかった。この研究における全てのインキュベーション及び刺激は、グリシンを含まないクレブス緩衝液中で行った。両方の研究からの全てのデータは、相対蛍光単位として表される。
【０４１３】
結果
ＧｌｕＣｌ受容体の結果を、図１８Ａ〜Ｂに示す。具体的には、ムスカリン受容体アゴニストカルバコールの添加時に遊離の細胞内Ｃａ＋＋が増大した。細胞Ｎ０３０１１６Ｋ／１では、応答は非常に迅速であり、第２のドナーであるＮ０８２７１５／３由来の細胞中では緩やかであった。フォルモテロール（ベータ−アドレナリン受容体アゴニスト及び既知の平滑筋弛緩薬）は、カルバコール誘発性の細胞内Ｃａ＋＋増大を拮抗させた。構成的に活性なＧｌｕＣｌαサブユニットＬ９’Ａ突然変異（ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧｌｕＣｌｏｐｔａｌｐｈａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ）でトランスフェクトされた細胞も、カルバコールによって誘導された細胞内Ｃａ＋＋の減少を示した。これは両方のドナー由来の細胞で観察された。この観察は、この変異が構成的に活性なクロライドチャネルを生成して細胞の過分極を引き起こし、次にこれが電圧依存性Ｃａ＋＋（Ｌ型）チャネルの開口を弱め、これによって細胞内Ｃａ＋＋のレベルを低下するというＦｒａｚｉｅｒ（２０１２）の観察と一致する。
【０４１４】
ＧｌｙＲの結果を、図１９Ａ〜図１９Ｂに示す。具体的には、ヒスタミンの添加時に遊離の細胞内Ｃａ＋＋が増大した。細胞のＮ０８２１１２／３では、応答は非常に迅速であり、ドナーＮ０７０１１２／３由来の細胞では緩やかであった。グリシン（１００μｍまたは１ｍＭ）の存在下でｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−ＷＴ（野生型ＧｌｙＲアルファ−１サブユニット）でトランスフェクトした細胞では、細胞内Ｃａ中のヒスタミン誘発性の増大が拮抗された。ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｈＧｌｙＲａ１−Ｐ２Ａ−ｍＥＹＦＰ−Ｌ９’Ａ（ＧｌｙＲアルファ−１サブユニットＬ９’Ａ）でトランスフェクトされた両方のドナーからの細胞において、グリシンの非存在下ではヒスタミン応答と同等の拮抗作用が見られた。
【０４１５】
結論
ＧｌｕＣ１αサブユニットＬ９’Ａ変異体の観察は、この変異が細胞の過分極を引き起こす構成的に活性なクロライドチャネルを生成し、これが次に電圧依存性Ｃａ＋＋（Ｌ型）チャネルの開口を弱め、これによって細胞内Ｃａ＋＋のレベルを低下させることになるというＦｒａｚｉｅｒ（２０１２）の観察と一致する。
【０４１６】
ＧｌｙＲに関するこれらのデータは、ＧｌｙＲα−１サブユニットＬ９’Ａが、細胞の過分極を導く構成的に活性なクロライドチャネルを形成し、これが次に電圧依存性Ｃａ＋＋（Ｌ型）チャネルの開口を弱め、これによって細胞内Ｃａ＋＋のレベルを低下させるという仮説と一致する。
【０４１７】
実施例９
目的
ＡＡＶ６が培養中のヒト神経細胞を形質導入する能力を評価すること。
【０４１８】
方法
解剖顕微鏡下で、ドナーからの死後収集されたヒト後根神経節（ｈＤＲＧ）は、過剰な脂肪、結合組織、及び神経根を浄化させた。その後、神経節を小片にスライスした。これらの小片を、０．２５％コラゲナーゼＰ及び０．１％ディスパーゼＩの酵素カクテルで消化し、３７℃で１８時間インキュベートした。消化後、細胞をハンクス平衡塩類溶液で酵素溶液を用いずに洗浄した。
【０４１９】
精製後、解離した細胞を、組織培養皿にプレートした。プレート前に、皿を１０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リシン及び１型のラット−テールコラーゲンで処理した。細胞を、Ｂ−２７補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．４ｍＭのＬ−グルタミン、２．５ｇ／Ｌグルコース及び１％ウシ胎仔血清を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
【０４２０】
培養した細胞が一旦安定化すれば（４〜５日）、それらをＡＡＶ６−ｈＳｙｎ−ＧＦＰで形質導入し、２．２ｅ１１ｖｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加し、細胞と少なくとも６時間接触させた。その細胞を蛍光顕微鏡下で２〜３日毎に検査し、ＧＦＰ発現をチェックした。観察はデジタル画像によって記録した。
【０４２１】
結果
ＡＡＶ６ニューロン細胞への曝露の４日後に、ＧＦＰタンパク質の強い発現が示された（図２０）。ＧＦＰの発現は、全てのニューロン細胞において見られず、これはＡＡＶ６が小さな侵害受容ニューロンに対する選択性を示すことを示している、マウスにおける以前の研究と一致する（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ  ５（１）：５２）。グリア細胞も、ＧＦＰを発現しなかった。このレベルの選択性は、部分的にはＡＡＶ６向性に起因する可能性があり、ＧＦＰのニューロン選択的発現を可能にするｈＳｙｎプロモーターの使用によって確かに影響される。
【０４２２】
結論
これらのデータによって、ＡＡＶ６が培養中のヒト神経細胞に形質導入できることが示される。この観察は、げっ歯類で実証されているように、ＡＡＶ６が末梢に注射されるとき、注射領域で侵害受容ニューロンを形質導入し、それらのニューロンの生理学に影響を及ぼし得る遺伝子を送達することができることを示唆する。これらの観察は、内因性に活性化されるかまたは構成的に活性なクロライドチャネルを末梢侵害受容ニューロンに送達し、ヒトの末梢から脊髄への疼痛シグナルの伝達を防止するためのＡＡＶ６の使用の概念と一致する。
【０４２３】
参照によって援用されるのは、本明細書に引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての引用文献であって、あたかも各参照が個々にかつ具体的に参照により組み入れられるように示され、その全体が本明細書に記載される程度まで引用される文献である。
【０４２４】
本発明（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）を記述する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」、ならびに「ｔｈｅ」、また同様の指示対象の使用は、本明細書において別段示されることもなく、または文脈上明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、その範囲内におさまる各別個の値を個々に言及する簡略方法として役立つことを単に意図しており、それぞれの個別値は、あたかも本明細書に個別に列挙されているかのように、本明細書内に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意のかつ全ての例、または例示的な言語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより良く示すことを意図するだけであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求の要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０４２５】
本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の説明を読むことにより当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び等価物を包含する。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、それらの全ての可能なバリエーションにおける上記の要素の任意の組み合せが本発明に包含される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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