(57)【要約】  １つ以上の基準サブチリシンと比較して向上した安定性および／または汚れ除去性を有する１つ以上のバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン変異体を含む１つ以上のサブチリシン変異体、それをコードする核酸、ならびにその製造および使用に関連する組成物および方法が本明細書中に開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８５に対して、
（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；
（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；
（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；
（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９；
（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて５６；
（ｖｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１１４；
（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１２６；
（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて２４２；
（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて９９＋１２８；
（ｘ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋２４２；または
（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋９９＋１２８
から選択される位置に２、３もしくは４つまたははそれを超える変異を含むアミノ酸配列を含む単離サブチリシン変異体であって、
但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、
前記変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、単離サブチリシン変異体。
【請求項２】
配列番号８５に対して、
（ｉ）１Ａ、４Ｉ、９Ｓ、２１Ｖ、２４Ｆ、２７Ｋ、３６Ａ、３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４２Ｔ、４３Ｖ、４４Ｓ、４７Ｖ、５４Ｓ、５５Ｍ／Ｇ、５６Ｎ／Ｙ、７４Ｄ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１０２Ｉ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１１７Ｉ、１１９Ｖ、１２１Ｓ、１２６Ｔ、１２８Ａ、１３１Ｔ、１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、１４４Ｇ、１５８Ｔ、１５９Ｉ、１６０Ｓ、１６９Ｌ、１８２Ｓ、１８８Ａ、１９０Ｌ、１９７Ｉ、１９８Ｇ、２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、２２４Ｉ／Ｖ、２３１Ｋ、２３２Ｎ、２３７Ｔ、２４２Ｄ／Ｑ、２４５Ｌ、２４６Ｓ／Ｋ、２５４Ｔ、２５５Ｎ、２５６Ｌ、および２５７Ｙ；
（ｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑ；または
（ｉｉｉ）３９Ｅ、９９Ｒ、１２６Ｔおよび１２８Ａ；
（ｉｖ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ；
（ｖ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて５６Ｎ／Ｙ；
（ｖｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；
（ｖｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて２４２Ｄ／Ｑ；
（ｉｘ）３９Ｅ、５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて９９Ｒ＋１２８Ａ；
（ｘ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ＋２４２Ｄ／Ｑ；または
（ｘｉ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ＋９９Ｒ＋１２８Ａ
から選択される、２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項３】
（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；
（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；
（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；
（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９；
（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて５６；
（ｖｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて１１４；
（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６；
（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２；
（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて９９＋１２８；
（ｘ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋２４２；または
（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋９９＋１２８
から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む単離サブチリシン変異体であって、
但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、
前記変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、単離サブチリシン変異体。
【請求項４】
（ｉ）Ｑ１、Ｖ４、Ｓ／Ｔ９、Ｉ／Ｖ２１、Ｓ２４、Ｋ／Ｒ２７、Ｓ３６、Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｎ／Ｔ４２、Ｉ４３、Ｒ／Ｓ４４、Ａ／Ｖ４７、Ｐ／Ｓ５４、Ｓ／Ｔ５５、Ｔ５６、Ｎ７４、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ｉ／Ｖ１０２、Ａ／Ｔ１１４、Ｍ１１７、Ｉ１１９、Ｎ１２１、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８、Ｉ／Ｓ／Ｔ１３１、Ｑ／Ｒ１４３、Ｄ／Ｇ１４４、Ｎ／Ｓ１５８、Ｉ／Ｖ１５９、Ｇ１６０、Ｍ１６９、Ｎ／Ｓ１８２、Ｓ／Ｔ１８８、Ｉ１９０、Ｖ１９７、Ｇ／Ｎ１９８、Ｎ／Ｐ２１２、Ａ／Ｖ２２４、Ｋ／Ｒ２３１、Ｎ／Ｙ２３２、Ａ／Ｎ２３７、Ｎ２４２、Ｋ２４５、Ｎ２４６、Ｓ２５４、Ｓ２５５、Ｑ２５６およびＦ２５７；
（ｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２；
（ｉｉｉ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８；
（ｉｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９；
（ｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＴ５６；
（ｖｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｔ１１４；
（ｖｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６；
（ｖｉｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２；
（ｉｘ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｔ５６、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｒ９９＋Ａ／Ｆ１２８；
（ｘ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９＋Ｎ２４２；または
（ｘｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９＋Ｓ／Ｒ９９＋Ａ／Ｆ１２８
から選択される、２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項５】
（ｉ）１Ａ、４Ｉ、９Ｓ、２１Ｖ、２４Ｆ、２７Ｋ、３６Ａ、３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４２Ｔ、４３Ｖ、４４Ｓ、４７Ｖ、５４Ｓ、５５Ｍ／Ｇ、５６Ｎ／Ｙ、７４Ｄ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１０２Ｉ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１１７Ｉ、１１９Ｖ、１２１Ｓ、１２６Ｔ、１２８Ａ、１３１Ｔ、１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、１４４Ｇ、１５８Ｔ、１５９Ｉ、１６０Ｓ、１６９Ｌ、１８２Ｓ、１８８Ａ、１９０Ｌ、１９７Ｉ、１９８Ｇ、２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、２２４Ｉ／Ｖ、２３１Ｋ、２３２Ｎ、２３７Ｔ、２４２Ｄ／Ｑ、２４５Ｌ、２４６Ｓ／Ｋ、２５４Ｔ、２５５Ｎ、２５６Ｌおよび２５７Ｙ；
（ｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑ；
（ｉｉｉ）３９Ｅ、９９Ｒ、１２６Ｔおよび１２８Ａ；
（ｉｖ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて３９Ｅ；
（ｖ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて５６Ｎ／Ｙ；
（ｖｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；
（ｖｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて２４２Ｄ／Ｑ；
（ｉｘ）３９Ｅ、５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて９９Ｒ＋１２８Ａ；
（ｘ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて３９Ｅ＋２４２Ｄ／Ｑ；または
（ｘｉ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせて３９Ｅ＋９９Ｒ＋１２８Ａ
から選択される、２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項６】
（ｉ）Ｑ１Ａ、Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｉ２１Ｖ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｓ／Ｔ５５Ｇ／Ｍ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｉ／Ｓ１３１Ｔ、Ｑ／Ｒ１４３Ａ／Ｑ／Ｔ、Ｄ１４４Ｇ、Ｎ／Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｎ１８２Ｓ、Ｓ／Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ／Ｐ２１２Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ／Ｖ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ／Ｎ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ／Ｑ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｋ／Ｓ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；
（ｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑ；
（ｉｉｉ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａ；
（ｉｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ；
（ｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＴ５６Ｎ／Ｙ；
（ｖｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＡ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；
（ｖｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６Ｔ；
（ｖｉｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＮ２４２Ｄ／Ｑ；
（ｉｘ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＳ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ；
（ｘ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ＋Ｎ２４２Ｄ／Ｑ；または
（ｘｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ
から選択される、２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項７】
（ｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｔ＋Ｉ２１Ｖ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ１７７Ｅではなく；
（ｉｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅではなく；
（ｉｉｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｎ２５３Ｄではなく；
（ｉｖ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｉ２１Ｖ＋Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ２５３Ｄではなく；
（ｖ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｑ３７Ｅ＋Ｑ２５６Ｅではなく；かつ／または
（ｖｉ）配列番号８５に対する２１の位置での前記変異は、前記変異体が、４、３６、４２、４７、５６、８７、９９、１０２、１１４、１８８、２２４、２３７、２４２および２５５から選択される１つ以上の位置での配列番号８５に対する変異を含む場合にはバリンではない
ことを条件とする、請求項１または２に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項８】
（ｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換は、Ｓ３９Ｔ＋Ｉ２１Ｖ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ１７７Ｅではなく；
（ｉｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅではなく；
（ｉｉｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｎ２５３Ｄではなく；
（ｉｖ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換は、Ｉ２１Ｖ＋Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ２５３Ｄではなく；
（ｖ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換は、Ｑ３７Ｅ＋Ｑ２５６Ｅではなく；かつ／または
（ｖｉ）２１の位置での前記置換は、前記変異体が、４、３６、４２、４７、５６、８７、９９、１０２、１１４、１８８、２２４、２３７、２４２および２５５から選択される１つ以上の位置での置換を含む場合にはバリンではない
ことを条件とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項９】
（ｉ）５６、１１４および１２６から選択される位置での配列番号８５に対する１つ以上の変異；
（ｉｉ）５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔから選択される位置での配列番号８５に対する１つ以上の変異；
（ｉｉｉ）５６、１１４および１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；
（ｉｖ）Ｔ５６、Ａ／Ｔ１１４およびＡ／Ｓ１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；
（ｖ）５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換；または
（ｖｉ）Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／ＱおよびＡ／Ｓ１２６Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換
を含むアミノ酸配列を含む単離サブチリシン変異体であって、
但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換または変異の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、
前記変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、単離サブチリシン変異体。
【請求項１０】
以下：
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４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１
４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２３７Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０４３Ｖ−Ｒ０４４Ｓ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０４３Ｖ−Ｒ０４４Ｓ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２２４Ｖ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｆ２５７Ｙ；Ｖ００４Ｉ−Ｔ００９Ｓ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２２４Ｖ−Ｋ２４５Ｌ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｐ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｔ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｋ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３６Ａ−Ａ０３７Ｎ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ１８２Ｓ−Ｉ１９０Ｌ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ−Ｋ２４５Ｌ；Ｔ００９Ｓ−Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｎ１８２Ｓ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｎ２１２Ｓ−Ａ２２４Ｖ−Ｙ２３２Ｎ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ｖ００４Ｉ−Ｔ００９Ｓ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ａ２２４Ｉ−Ｒ２３１Ｋ−Ｋ２４５Ｌ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｎ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｐ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｎ２１２Ｔ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；
Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２２４Ｖ−Ｎ２４２Ｄ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｓ１５８Ｔ−Ａ２２４Ｖ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｐ０５４Ｓ−Ｔ０５６Ｙ−Ａ０５７Ｑ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ａ２２４Ｖ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０４３Ｖ−Ｒ０４４Ｓ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ１２６Ｔ；Ｔ１１４Ｑ；Ｔ０５６Ｙ；Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ；Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｔ０５６Ｙ−Ｔ１１４Ｑ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ；Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｔ０５６Ｙ−Ｔ１１４Ｑ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｎ２４２Ｄ；Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ；Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ；Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ；Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０８５Ｓ−Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｅ０８７Ｄ−Ｔ１１４Ｑ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０８５Ｓ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；およびそれらの組み合わせ
から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１１】
ＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフ（ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸である）をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１２】
バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１４】
ＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフ（ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸である）を含む親アミノ酸配列に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１５】
配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親アミノ酸配列に由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１６】
タンパク質分解活性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
参照サブチリシンと比較して１つ以上の向上した特性を有し、前記向上した特性は、向上したプロテアーゼ活性、洗剤における向上した洗浄能力、および洗剤における向上した熱安定性から選択され、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１８】
前記向上した特性は、
（ｉ）向上したプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質でＰＩ＞１を有する、向上したプロテアーゼ活性；
（ｉｉ）洗剤における向上した洗浄能力であって、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した洗浄能力；および／または
（ｉｉｉ）洗剤における向上した熱安定性であって、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した熱安定性
である、請求項１７に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項１９】
（ｉ）前記プロテアーゼ活性は、実施例３のプロテアーゼ活性アッセイに従って測定され；
（ｉｉ）前記洗剤における洗浄能力は、実施例４の衣類およびＡＤＷ用洗剤アッセイにおける洗浄能力に従って測定され、かつ／または
（ｉｉｉ）前記洗剤における熱安定性は、実施例４の安定性アッセイに従って測定される、請求項１７または１８に記載の単離サブチリシン変異体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の１つ以上の単離サブチリシン変異体を含む組成物。
【請求項２１】
洗剤組成物である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記洗剤組成物は、衣料用洗剤、布柔軟用洗剤、食器洗い用洗剤および硬質表面洗浄用洗剤から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
１つ以上のカルシウムイオンおよび／もしくは亜鉛イオン；１つ以上の酵素安定化剤；約０．００１重量％〜約１．０重量％の前記変異体；１つ以上の漂白剤；１つ以上の補助剤；ならびに／またはアシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１、４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、追加のセリンプロテアーゼ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の追加の酵素もしくは酵素誘導体をさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
リン酸塩を含まないか、もしくはリン酸塩を含有し、かつ／またはホウ素を含まないか、もしくはホウ素を含有する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
粒状、粉末、固体、棒状、液体、錠剤、ゲル、ペースト、または単位用量組成物である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
洗浄の必要な表面または物品を、有効量の請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異体または請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み、かつ任意選択により、前記表面または物品を前記変異体または組成物と接触させた後、前記表面または物品を濯ぐ工程をさらに含む、洗浄の方法。
【請求項２７】
前記物品は、食器または布である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異体をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはカセット。
【請求項３０】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９に記載のベクターもしくはカセットを含む組み換え宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異体を含む組成物であって、殺菌用、医療機器洗浄用、動物餌料用、コンタクトレンズ洗浄用、創傷清拭用または織物、レザーもしくは羽毛加工用組成物である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１つ以上の基準サブチリシンと比較して向上した安定性および／または汚れ除去性を有する１つ以上のバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン変異体を含む１つ以上のサブチリシン変異体、それをコードする核酸、ならびにその製造および使用に関連する組成物および方法が本明細書中に開示される。セリンプロテアーゼを含有する組成物は、布および硬質表面の洗浄ならびに様々な工業用途における使用に好適である。
【背景技術】
【０００２】
セリンプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合の加水分解を開始する活性部位セリンを有する酵素（ＥＣ番号３．４．２１）である。セリンプロテアーゼには、その構造により、２つの広範なカテゴリー：キモトリプシン様（トリプシン様）およびサブチリシン様がある。原型サブチリシン（ＥＣ番号３．４．２１．６２）が最初にバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られた。サブチリシンおよびそのホモログは、ＭＥＲＯＰＳ分類スキームのＳ８ペプチダーゼファミリーのメンバーである。Ｓ８ファミリーのメンバーは、アミノ酸配列中にＡｓｐ、ＨｉｓおよびＳｅｒの順に並ぶ触媒三残基を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
セリンプロテアーゼは、工業用酵素の分野で長年にわたって知られているが、特定の条件および使用に適したさらなるセリンプロテアーゼが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本変異体、組成物および方法は、従来の分子生物学的手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）によって生成された組み換えセリンプロテアーゼに関する。本明細書に開示のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードセリンプロテアーゼを含有する組成物は、布および硬質表面の洗浄ならびに様々な工業用途における使用に好適である。
【０００５】
いくつかの実施形態は、配列番号８５に対して、（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９；（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて５６；（ｖｉ）（３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１１４；（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１２６；（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて２４２；（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて９９＋１２８；（ｘ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋２４２；または（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋９９＋１２８から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超える変異を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【０００６】
他の実施形態は、（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９；（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて５６；（ｖｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて１１４；（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６；（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２；（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて９９＋１２８；（ｘ）３７，４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋２４２；または（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋９９＋１２８から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【０００７】
さらなる実施形態は、（ｉ）配列番号８５に対して、５６、１１４および１２６から選択される位置での１つ以上の変異；（ｉｉ）配列番号８５に対して、５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔから選択される位置での１つ以上の変異；（ｉｉｉ）５６、１１４および１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；（ｉｖ）Ｔ５６、Ａ／Ｔ１１４およびＡ／Ｓ１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；（ｖ）５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換；または（ｖｉ）Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／ＱおよびＡ／Ｓ１２６Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換または変異は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【０００８】
他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーである。
さらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。またさらに他の実施形態において、本明細書に記載の少なくとも１つの変異体は、タンパク質分解活性を有し、配列番号１８または８５の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解または洗浄活性と比べて高いタンパク質分解または洗浄活性を有する。他の実施形態において、タンパク質分解活性は、カゼイン加水分解である。
【０００９】
他の実施形態は、界面活性剤と、少なくとも１つの本明細書に記載の変異体とを含む組成物を対象としている。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのカルシウムイオンおよび／もしくは亜鉛イオン、少なくとも１つの安定剤、少なくとも１つの漂白剤、リン酸塩、またはホウ素をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸塩を含まず、および／またはホウ素を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、粒状、粉末、固体、棒状、液体、錠剤、ゲル、ペーストまたは単位用量組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の追加の酵素または酵素誘導体をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、表面または製品を、本明細書に記載の少なくとも１つの組成物と接触させる工程を含む、洗浄の方法を対象とする。他の実施形態は、本明細書に記載の変異体を生成する方法であって、本明細書に記載の変異体の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を安定に形質転換させる工程を含む、方法を対象とする。さらに他の実施形態は、本明細書に記載の変異体の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＢＳＰ−００８０１（黒色の線）と、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン（中間の灰色の線）およびサブチリシンＢＰＮ’（明るい灰色の線）の主鎖フォールディングとの比較を示す。ＢＳＰ−００８０１中の触媒三残基の側鎖を参考のために示す。少数の外部ループは別として、３つのサブチリシン全てでフォールディングパターンが保存されている。
【図２】バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１における置換の構造上の位置を示す。親酵素に対するＢＳＰ−００８０１中の１０個の置換のうちの８個（Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７ＤおよびＴ１１４Ａ）が、第１のカルシウム結合部位に近い分子の１つの面に沿って存在している。
【図３】触媒三残基（明色の棒体として示す）および１０個の置換の側鎖（黒色の棒体として示す）を有するＢＳＰ−００８０１構造の第２の図を示す。この図は基質結合面を上から見た図であり、Ｓ９９ＲおよびＦ１２８Ａが、亜部位Ｓ４−Ｓ１に対応する、基質結合面を形成する３つのループのうちの２つに位置しているのを見ることができる。
【図４】ＢＳＰ−００８０１における追加の置換の位置を示す。６個の追加の置換が、この変異体の能力を増大させることが分かっている。これらのうちの３つ（（Ｎ４２Ｔ、Ｓ５６ＹおよびＮ７４Ｄ）が分子の１つの面に沿って存在し、他の３つが（Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６ＴおよびＳ１５８Ｔ）が基質結合領域を形成するループに存在している。
【図５】触媒三残基、および１０個の置換の側鎖（明るい灰色の棒体として示す）を有するＢＳＰ−００８０１構造の第２の図を示す。能力をさらに増大させる追加部位を黒色の棒状体として示す。この図は基質結合面を上から見た図であり、３つの追加部位の位置（Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６ＴおよびＳ１５８Ｔ）（亜部位Ｓ４−Ｓ１を形成する３つのループのそれぞれに１つ）を見ることができる。
【図６Ａ−Ｆ】表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの予測成熟形態のアミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６のアミノ酸配列、ならびに表６−１および６−２に挙げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。コンセンサス配列をアライメントの下に示す。
【図７Ａ−Ｆ】表４のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの予測成熟形態のアミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６；ならびに表６−１に挙げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。コンセンサス配列をアライメントの下に示す。
【図８Ａ−Ｆ】表５の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異サブチリシンの予測成熟形態のアミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６、ならびに表６−１に挙げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。コンセンサス配列をアライメントの下に示す。
【図９】表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６、ならびに種々の他の細菌セリンプロテアーゼの系統樹を示す。
【図１０】表４のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６、および種々の他の細菌セリンプロテアーゼの系統樹を示す。
【図１１】表５の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６、および種々の他の細菌セリンプロテアーゼの系統樹を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの予測成熟形態、およびＢｇｉ０２４４６のアミノ酸配列の構造アライメントを示し、これらの配列がＡｓｐ（Ｄ）３２およびＨｉｓ（Ｈ）６５間に伸びる共通モチーフを共有することが示されている。
【図１３】この方向で視認し得るＢＳＰ−００８０１中の他の部位のいくつかに対するＮ２４２Ｄ置換の位置を示す。Ｎ２４２Ｄは、基質結合面および第１のカルシウム結合部位に近接する面から遠く離れて位置している。それは第２のカルシウム結合部位により近く存在している。
【図１４Ａ−Ｆ】Ｂｇｉ０２４４６、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異サブチリシン、および表７の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレード変異サブチリシンのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１５】表７のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６、表６−１および６−２に挙げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列、ならびにＢｇＡＰ変異体ＭＬ２、ＭＬ４、ＭＴ１、ＭＴ２、ＭＦ１のアミノ酸配列の系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
従来の分子生物学的手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）によって生成された組み換えセリンプロテアーゼに関連する変異体、組成物および方法が本明細書に記載されている。本明細書に開示のセリンプロテアーゼを含有するプロテアーゼ組成物は、布および硬質表面の洗浄ならびに様々な工業用途、例えば、繊維、皮および羽毛の加工などにおける使用に好適である。本明細書に開示の少なくとも１つのバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードセリンプロテアーゼは、また、タンパク質分解用組成物、例えば、限定されないが、洗濯用および食器洗い用洗剤、パーソナルケア組成物、ならびにヒトの食品および動物用飼料に含有させるのに非常に適している。
【００１３】
本組成物および本方法を詳細に説明する前に、明確性のために、以下の用語を定義する。定義されていない用語および略語は、当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味を有するものとする。本明細書において他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。別段の指示がない限り、本開示の実施には、分子生物学、タンパク質工学および微生物学において通常使用される従来技術が含まれる。本開示の実施にあたり、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な方法および材料が使用されるが、いくつかの好適な方法および材料を本明細書に記載する。この直下に定義する用語は、本明細書全体を参照することにより、より十分に説明される。
【００１４】
文脈中に明らかな別段の指示がない限り、本明細書で使用される単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形を含む。別段の指示がない限り、核酸は５’から３’の方向に左から右へと記載され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右へと記載される。反対の指示がない限り、本開示が本明細書に記載の特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことに留意されたい。
【００１５】
本明細書全体を通して示される数値の上限は全て、それより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより小さい数値限定を全て含む。本明細書全体を通して示される数値の下限は全て、それより大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより大きい数値限定を全て含む。本明細書全体を通して示される数値範囲は全て、それより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲に入る全てのより狭い数値範囲を全て含む。
【００１６】
本明細書中、数値に関連して使用される「約」という用語は、文脈中に特に別段の定義がされていない限り、その数値の±０．５の範囲を指す。例えば、「約６のｐＨ値」という句は、ｐＨ値が特に別段の定義がされていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
【００１７】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体のアミノ酸の置換または変異の命名は、次の１つ以上を使用する：位置；位置：アミノ酸の置換または変異；あるいは開始アミノ酸：位置：アミノ酸置換。「位置」（すなわち、５、８、１７、２２など）への言及は、そのような位置に存在し得る開始アミノ酸、および開始アミノ酸からの変異、またはそのような位置に存在し得る置換を包含する。「位置：アミノ酸の置換および／または変異」（すなわち、１Ｓ／Ｔ／Ｇ、３Ｇ、１７Ｔなど）への言及は、そのような位置に存在し得る開始アミノ酸、ならびに開始アミノ酸から変化し得、かつ／またはそのような開始アミノ酸を置換し得るアミノ酸を包含する。置換アミノ酸と開始アミノ酸が同じ場合の開始アミノ酸は、アミノ酸置換から除かれる。開始アミノ酸、またはアミノ酸置換、またはアミノ酸変異への言及は、さらに、スラッシュ（「／」によって区切られた数個の開始、置換または変異アミノ酸としても表され得る。例えば、Ｄ２７５Ｓ／Ｋは、２７５位がセリン（Ｓ）またはリシン（Ｋ）で置換され、Ｐ／Ｓ１９７Ｋは、１９７位の開始アミノ酸プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されていることを示している。
【００１８】
所与のアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、配列番号８５に対応して番号付けされている。すなわち、配列番号８５のアミノ酸配列は、参照配列となる。例えば、ＢＧ４６−クレードサブチリシンまたは本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体のアミノ酸配列は、本明細書に記載するようなアライメントアルゴリズム使用して配列番号８５のアミノ酸配列とアラインし、配列番号８５のアミノ酸残基とアラインする（好ましくは、最適にアラインする）所与のアミノ酸配列中の各アミノ酸残基に、対応するアミノ酸残基の位置番号を参照して便宜的に番号を付す。例えば、本明細書に記載するような配列アライメントアルゴリズムは、クエリー配列と比較して対象配列に挿入または欠失が生じている場所を特定する。さらに、例えば、配列番号１９などの、Ｎ末端にＱＴＶＰを有するバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーは、番号付けする目的で、図１４に示した配列番号８５とアラインされる。
【００１９】
「変異」という用語は、「配列番号８５に対する２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸変異」という句で使用される場合、配列番号８５の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる各アミノ酸を包含する。例えば、目的変異体の配列を配列番号８５とアラインし、変異体の各位置を配列番号８５と比較して、配列番号８５の対応する位置に存在するアミノ酸と異なり、各位置のアミノ酸を特定し、配列番号８５中の対応するアミノ酸と異なる各アミノ酸を変異とする。
【００２０】
本明細書で使用される「プロテアーゼ」および「プロテイナーゼ」という用語は、タンパク質およびペプチドを分解する能力を有する酵素を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成しているペプチドまたはポリペプチド鎖においてアミノ酸同士を結び付けるペプチド結合を加水分解することによって「タンパク質分解」を行う能力を有する。このタンパク質消化酵素としてのプロテアーゼの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性を測定する多くのよく知られた手順がある。例えば、タンパク質分解活性は、好適な基質を加水分解する各プロテアーゼの能力を分析する比較検定法によって特定し得る。プロテアーゼまたはタンパク質分解活性に有用な基質の例としては、限定されないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシのコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシのエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）およびウシのケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を使用する比色分析法が、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，３７６，４５０号明細書を参照されたい）。ｐＮＡペプチジルアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９９：３１６−３２０、１９７９を参照されたい）も活性酵素濃度の測定に使用される。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質、例えば、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際のｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度を、分光光度計により４１０ｎｍで測定するが、生成速度は活性酵素濃度に比例する。さらに、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度の測定も、精製タンパク質試料における総タンパク質濃度の測定に使用することができる。基質／タンパク質濃度の活性は、酵素比活性を示す。
【００２１】
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、特定の野生型、親または参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指し、それには、例えば、アミノ酸の１つ以上の自然発生または人工の置換、挿入または欠失が含まれる。同様に、ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、ヌクレオチド配列が特定の野生型、親または参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親または参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかであろう。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての菌株が含まれ、例えば、限定されないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロドゥランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属について、分類学的な再編成が継続的に行われていることは認識されている。したがって、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むものとする。ストレスの多い環境下での耐性内生胞子の産生がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の典型的な特徴と見ななされるが、この特徴は、近年名付けられたアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アニューリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも適用される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、参照アミノ酸または核酸配列になされた変化を指す。この用語は、置換、挿入および欠失を包含するものとする。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、標的細胞または組織へ核酸を導入または転移するために使用される核酸コンストラクトを指す。通常、ベクターは外来ＤＮＡを細胞または組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクターなどが挙げられる。通常、ベクターは、複製起点、マルチクローニングサイト、および選択マーカーを含む。標的細胞へのベクターの導入プロセスは、一般に、形質転換と称される。いくつかの実施形態において、本発明は、好適な宿主中でＤＮＡ配列を発現させ、組み換えポリペプチド鎖のフォールディングおよび転座を起こすことができる好適なプロ配列（例えば、分泌シグナルペプチド配列など）に作動可能に結合しているセリンプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体または成熟セリンプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを含む。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「発現カセット」、「発現プラスミド」または「発現ベクター」という用語は、標的細胞中で目的の核酸を発現させるために、組み換え技術または合成によって生成された核酸コンストラクトまたはベクターを指す。発現ベクターまたは発現カセットは、通常、外来核酸の配列を駆動するプロモーターヌクレオチド配列を含む。発現ベクターまたは発現カセットはまた、通常、標的細胞中で特定の核酸の転写を許容する他の特定の核酸エレメントを含む。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込むことができる。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる染色体外ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、環状であり得、通常、クローニングベクターとして使用される。
【００２７】
「導入される」という用語は、核酸の細胞への導入に関連して本明細書で使用する場合、核酸配列を細胞に転移するのに好適な方法を指す。そのような導入方法としては、限定されないが、原形質融合、形質移入、形質転換、エレクトロポレーション、接合および形質導入が挙げられる。形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意的なゲノムへの組み込み、および発現によって生ずる細胞の遺伝子変化を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、核酸は、他の核酸配列と機能的に関連した状態に置かれたとき、他の核酸配列に「作動可能に結合している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターがコード配列の転写に作用する場合、ヌクレオチドコード配列に作動可能に結合している。リボソーム結合部位が、コード配列の転写を促進するような位置にある場合、それはコード配列に作動可能に結合し得る。通常、「作動可能に結合している」ＤＮＡ配列は、隣接している。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適当な制限酵素認識部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の方法に従って合成ポリヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードし、コード領域の前後の領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指す。ある場合には、遺伝子は、個々のコードセグメント（エクソン）間に介在配列（イントロン）を含む。
【００３０】
本明細書で使用する場合、細胞に関して使用される「組換え体」は、通常、細胞が外来核酸配列の導入によって修飾されているか、または細胞がそのように修飾された細胞に由来するものであることを示している。例えば、組み換え細胞は、細胞の天然の（非組み換え）形態内に同一の形態で存在しない遺伝子、または修飾され、細胞に再導入された天然遺伝子（細胞の天然型に存在する）を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除かずに修飾された細胞に内在する核酸を含み得る。そのような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および当業者に知られた関連技術によって得られるものが挙げられる。組み換えＤＮＡ技術としては、インビトロで組み換えＤＮＡを生成する技術、および組み換えＤＮＡが発現または増殖し得る細胞に組み換えＤＮＡを導入し、それによって組み換えポリペプチドを産生する技術が挙げられる。ポリヌクレオチドまたは核酸の「組み換え」および「組み換える」は、一般に、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド鎖または断片を組み立てまたは結合して、新しいポリヌクレオチドまたは核酸を生成することを指す。
【００３１】
核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の状態で、または当業者に知られた方法による人為的操作で転写または翻訳されてポリペプチドまたはその断片を産生する場合、ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸のアンチセンス鎖はまた、配列をコードすると言われる。
【００３２】
「宿主鎖」および「宿主細胞」は、目的ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに好適な宿主を指す。
【００３３】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。アミノ酸に対して、生物学的命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ連合委員会に準拠して定義される１文字また３文字コードが、本開示全体を通して使用される。１文字のＸは、２０個のアミノ酸のいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によりコードさせることができることも理解される。変異は、親アミノ酸の一文字コードに続いて位置番号、その後、変異アミノ酸の１文字コードによって名付けることができる。例えば、グリシン（Ｇ）の８７位でのセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」または「Ｇ８７Ｓ」と表される。
【００３４】
「プロ配列」または「プロペプチド配列」は、プロテアーゼの適切なフォールディングと分泌に必要である、シグナルペプチド配列と成熟プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指し、それらは分子内シャペロンと呼ばれることもある。プロ配列またはプロペプチド配列の開裂により、成熟活性プロテアーゼが生成される。細菌セリンプロテアーゼは、多くの場合、プロ酵素として表される。
【００３５】
「シグナル配列」および「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟形態または前駆体形態の分泌または直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常、前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端に位置している。シグナル配列は、内因性または外因性であり得る。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、通常、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切り離される。
【００３６】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「成熟」形態という用語は、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの機能的形態を指す。
【００３７】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」形態という用語は、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に結合しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を指す。前駆体はまた、プロ配列のアミノ末端の作動可能に結合している「シグナル」配列を有し得る。前駆体はまた、翻訳後活性に関連するさらなるポリペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの成熟形態を残すためにそれから開裂したポリペプチド）を有し得る。
【００３８】
アミノ酸配列または核酸配列に関連した「野生型」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列が天然の配列、すなわち自然発生の配列であることを示す。本明細書で使用する場合、「自然発生の」という用語は、天然に見出されるもの（例えば、タンパク質または核酸配列）を指す。逆に、「非自然発生の」という用語は、天然には見出されないもの（例えば、実験室で生成された、または野生型配列の修飾で生成された、組み換え核酸およびタンパク質配列）を指す。
【００３９】
アミノ酸残基の位置に関連して、本明細書で使用される「〜に対応している」または「〜に対応する」または「対応する」は、タンパク質またはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基、またはタンパク質またはペプチド中の列挙された残基と類似の、相同の、または均等なアミノ酸残基を指す。本明細書で使用する場合、「対応する領域」は、一般に、関連するタンパク質または参照タンパク質における類似の位置を指す。
【００４０】
「〜に由来する」および「〜から得られた」という用語は、対象の微生物の株により産生された、または産性可能なタンパク質のみならず、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質、およびそのようＤＮＡ配列を含む宿主生物において産生されたタンパク質も指す。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、対象のタンパク質を特定し得る特徴を有するタンパク質を指す。例を挙げると、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼ」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって天然に産生される、タンパク質分解活性を有する酵素、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）源によって産生されるが、遺伝子工学技術により、セリンプロテアーゼをコードする核酸で形質転換された他の宿主細胞によって産生されるようなセリンプロテアーゼを指す。
【００４１】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関連した「同一の」という用語は、配列比較アルゴリズムまたは配列解析アルゴリズムによる測定で、対応が最大になるように２つの配列をアラインさせたときに同じとなる、２つの配列中の核酸またはアミノ酸を指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「％同一性」またはパーセント同一性」または「ＰＩＤ」は、タンパク質配列同一性を指す。パーセント同一性は、この分野で知られた標準の手法によって測定することができる。有用なアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０、１９９０；およびＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照されたい）が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、いくつかの検索パラメータを使用し、その殆どはデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性から最も関連する配列を見出すが、２０個未満の残基からなるクエリー配列では推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２，１９９７；およびＳｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２９９４−３００５，２００１）。核酸配列検索用のデフォルトＢＬＡＳＴパラメータの例には、次のものが挙げられる：隣接ワード閾値（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  ｗｏｒｄｓ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１１；Ｅ‐値カットオフ（Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ）＝１０；スコアリングマトリクス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝‐３）；ギャップオープニング（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝５；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝２。アミノ酸配列検索用のデフォルトＢＬＡＳＴパラメータの例には、次のものが挙げられる：ワードサイズ（Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝３；Ｅ値カットオフ（Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ）＝１０；スコアリングマトリクス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝１１；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、適合している同一残基の数を、最適／最大アライメントのためのプログラムによって創出されるギャップを含む「参照」配列の総残基数で除すことによって決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリー」配列と呼ぶ。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「相同タンパク質」または「相同プロテアーゼ」は、一次、二次および／または三次構造に明らかな類似性が認められるタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質をアラインしたときの、線状のアミノ酸配列の類似性を指し得る。タンパク質配列の相同性探索は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ製のＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、閾値（Ｅ値カットオフ）０．００１で行うことができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅ  ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，ＺｈａｎｇＪ，ＺｈａｎｇＺ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，ＬｉｐｍａｎＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｔ１；２５（１７）：３３８９−４０２）。この情報を使用して、タンパク質配列を分類することができる。系統樹はアミノ酸配列により構築することができる。アミノ酸配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅスイートなどのプログラムで入れることができ、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法（齋藤および根井，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ，４：４０６−４２５，１９８７）によって樹形図を作成することができる。樹の構築は、木村の配列距離補正を使用し、ギャップを含む位置を無視して計算することができる。ＡｌｉｇｎＸなどのプログラムは系統樹に示された分子名に続く括弧内の計算した距離値を表示することができる。
【００４４】
分子間の相同性を理解することにより、分子の進化史および分子の機能に関する情報を明らかにすることができ、新しい配列を有するタンパク質が既に同定されているタンパク質に相同であれば、新しいタンパク質の生化学的機能を強く示す。存在する２つの存在物間の最も基本的な関係は、相同性であり、２つの分子は、それらが共通の祖先に由来している場合、相同であるといわれる。相同分子またはホモログは、パラログとオーソログの２つに分類することができる。パラログは、１つの種に存在するホモログである。パラログは、多くの場合、生化学的機能の詳細が相違する。オーソログは、異なる種に存在するホモログであり、類似または同一の機能を有する。タンパク質スーパーファミリーは、共通の祖先を推察し得るタンパク質の最大のグループ（クレード）である。通常、この共通の祖先は、配列アライメントと機構に基づいている。スーパーファミリーは、一般的に、ファミリー内に配列類似性を示すいくつかのタンパク質ファミリーを含んでいる。「タンパク質クラン」という用語は、通常、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼ分類系に基づくプロテアーゼスーパーファミリーに対し使用される。
【００４５】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムは、配列アライメントアルゴリズムの他の例である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０，１９９４を参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターは、次の通りである：ギャップオープニングペナルティ（Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０；ギャップエクステンションペナルティ（Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５；タンパク質重量マトリクス（Ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ；ＤＮＡ重量マトリクス（ＤＮＡｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ；ディレイ発散数列％（Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ％）＝４０；ギャップ分離距離（Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝８；ＤＮＡトランジション重量（ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５０；リスト親水性残基（Ｌｉｓｔ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ；ユースネガティブマトリクス（Ｕｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＯＦＦ；トグル残基スペシフィックペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）＝ＯＮ；トグル親水性ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ＝ＯＮ；およびトグルエンドギャップ分離ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  ｅｎｄ  ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝ＯＦＦ）。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、いずれか一方の末端で起こる欠失が含まれる。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドの一方の末端（またはポリペプチド内）で５個のアミノ酸が欠失した変異体は、「参照」ポリペプチドに対して、９９％（４９５／５００同一残基×１００）のパーセント配列同一性を有する。そのような変異体は、ポリペプチドに対し「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含される。
【００４６】
核酸およびポリヌクレオチドは、少なくとも部分的または完全に他の成分、例えば、限定されないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合、「単離されて」いる。同様に、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも部分的または完全に他の成分、例えば、限定されないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合、「単離されて」いる。モル基準で、分離された種は、組成物中に他の種より多く含まれている。例えば、分離種は、存在する全ての高分子種の少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％（モル基準で）を含み得る。目的の種は、実質的に同質に（すなわち、組成物中に従来の検出法で汚染種が検出されない）まで精製されていることが好ましい。純度および均質性は、核酸またはタンパク質の試料をそれぞれアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル電気泳動にかけた後、染色によって可視化するなど、当該技術分野でよく知られた多くの手法で決定することができる。必要に応じて、高分解能技術、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または類似の手段を、材料の精製に使用することができる。
【００４７】
核酸またはポリペプチドに適用される「精製された」という用語は、一般に、当該技術分野でよく知られた分析技術で測定したときに、実質的に他の成分を含まない核酸またはポリペプチドを示す（例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィーの溶出液および／または密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する。例えば、電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは「精製されて」いる。精製された核酸またはポリペプチドは、純度（例えば、モル基準での重量％）が少なくとも５０％であり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％またはそれを上回る。関連する意味で、精製または濃縮技術の適用後、分子濃度が実質的に増加した場合に組成物はその分子が濃縮される。「濃縮された」という用語は、組成物中に、その出発組成物よりより高い相対濃度または絶対濃度で含まれる化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、または他の特定の材料もしくは成分を指す。
【００４８】
「ホウ素を実質的に含まない組成物」または「ホウ素を実質的に含まない洗剤」という句は、ホウ素を微量、例えば、おそらく他の組成物または洗剤成分の約１０００ｐｐｍ未満（１ｍｇ／ｋｇまたはリットルは１ｐｐｍに等しい）、約１００ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、または約５ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満含有する組成物または洗剤をそれぞれ指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「機能分析」という用語は、タンパク質の活性の指標を示すものである。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質について、それが通常の容量で機能する能力を分析する分析系を指す。例えば、プロテアーゼの場合、機能分析は、タンパク性基質を分解するプロテアーゼの効果を決定することを含む。
【００５０】
「洗浄活性」という用語は、タンパク質分解、加水分解、洗浄、または開示されている他のプロセスで使用されている条件下でセリンプロテアーゼポリペプチドまたは参照プロテアーゼによって達成される洗浄能力を指す。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドまたは参照プロテアーゼの洗浄能力は、物品または表面上の１つ以上の各種酵素感受性の染み（例えば、食品、草、血液、インク、ミルク、油および／または卵タンパク質によって生じた染みなど）を洗浄するための様々な分析法を使用することによって測定することができる。変異プロテアーゼまたは参照プロテアーゼの洗浄能力は、物品または表面上の染みを標準的な洗浄条件に置き、様々なクラマトグラフィ、分光光度法、または他の定量法を用いて染みが除去される程度を評価することによって測定することができる。洗浄分析および洗浄法の例は当該技術分野でよく知られており、限定されないが、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，６０５，４５８号明細書に記載のもの（これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに以下に示す実施例に含まれている洗浄分析および洗浄法が挙げられる。
【００５１】
セリンプロテアーゼポペプチドまたは参照プロテアーゼの「洗浄有効量」という用語は、特定の洗浄用組成物において酵素活性が所望のレベルに達成するプロテアーゼ量を指す。そのような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄の適用、洗浄用組成物の具体的な組成、および液体または乾燥（例えば、粒状、タブレット状、棒状）組成物が要求されるか否かなどの多くの因子に基づく。
【００５２】
「洗浄補助材」という用語は、洗浄用組成物に含まれる、本開示のセリンプロテアーゼポリペプチド以外の液体、固体または気体からなる材料を指す。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄用組成物は１つ以上の洗浄補助剤を含む。各洗浄補助材は、通常、洗浄用組成物の具体的なタイプおよび形態（例えば、液状、粒状、粉末状、棒状、ペースト状、スプレー状、タブレット状、ゲル状、泡状、その他の組成物）に応じて選択される。各洗浄補助材は、組成物中の使用プロテアーゼ酵素と親和性のあるものが好ましい。
【００５３】
洗浄用組成物および洗浄配合物には、物体、物品および／または表面の洗浄、漂白、殺菌および／または滅菌に適した任意の組成物が含まれる。そのような組成物および配合物としては、限定されないが、例えば、液体および／または固体組成物、例えば洗浄もしくは洗剤組成物（例えば、液状、タブレット状、ゲル状、粒状および／または固形の、衣類用洗浄もしくは洗剤組成物、緻密に織られた織布用洗剤組成物；ガラス、木、セラミックおよび金属からなるカウンタートップおよび窓などの硬質表面洗浄用組成物および配合物；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布用消臭剤；布用柔軟剤；ならびに織物、衣類用補助洗浄もしくは洗剤組成物、衣類洗浄用添加組成物、および衣類洗浄用プレ−スポッター組成物；食器洗い用組成物、例えば手もしくは手作業による食器洗い用組成物（例えば、「手」もしくは「手作業」により食器洗い用洗剤）、および自動食器洗い用組成物（例えば、「自動食器洗い用洗剤」）が挙げられる。本発明では、単一単位剤形、例えば、丸剤、錠剤、ジェルキャップ、または予め測定した粉末もしくは液体などの他の単一単位剤形も使用される。
【００５４】
洗浄用組成物または洗浄配合物は、本明細書で使用される場合、別段の指示がなければ、粒状もしくは粉末状の万能もしくは重質洗剤、特に洗浄洗剤；液状、粒子状、ゲル状、固形状、タブレット状、ペースト状もしくは単位剤形の万能洗剤、特に、いわゆる重質液体（ＨＤＬ）型洗剤もしくは重質乾燥（ＨＤＤ）型洗剤；緻密に織られた織布用液体洗剤；手もしくは手作業による食器用洗剤、例えば高起泡型洗剤；家庭用もしくは業務用の、手もしくは手作業による食器洗い用、自動食器洗い用、または食器もしくはテーブルウエア用洗剤（各種タブレット状、粉末状、固形状、粒状、液状、ゲル状および濯ぎ助剤型のものを含む）；ヒトおよび他の動物用の液体の洗浄剤および殺菌剤、例えば、抗菌性手洗浄型、洗浄棒、口腔洗浄液、義歯洗浄剤、車用洗浄剤、カーペット洗剤、浴室洗剤、ヘアシャンプーおよび／もしくはヘアリンス；シャワージェル、フォームバスおよび金属クリーナー；ならびに漂白付加剤、および「ステインスティック」もしくは前処理剤などの洗浄補助剤を含む。いくつかの実施形態では、粒状組成物は、「コンパクト」形であり、いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」型である。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「布用洗浄用組成物」には、手洗い用および洗濯機用の衣類用洗剤組成物、例えば、衣類用添加組成物、ならびに染みが付着した布（例えば、クロス、リネンその他の織物材料）の浸漬および／または前処理での使用に好適な組成物が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「非布用洗浄用組成物」には、非織物（すなわち、非布）表面洗浄用組成物、例えば、限定されないが、手もしくは手作業による食器洗い用、または自動食器洗い用の洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、コンタクトレンズ洗浄用組成物、創傷清拭組成物、およびパーソナル洗浄用組成物が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「洗剤組成物」または「洗剤配合物」という用語は、汚れたもしくは汚い物体、例えば、特定の布および／または非布性の物体または物品を洗浄するための洗浄媒体中で使用することを意図した組成物に関連して使用される。そのような本開示の組成物は、特定の洗剤組成物または配合物に決して限定されるものではない。実際、いくつかの実施形態において、本開示の洗剤は、少なくとも１つの本開示のセリンプロテアーゼポリペプチド、およびさらに、１つ以上の、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩）、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤、蛍光色素、固結防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤および／または可溶化剤を含む。いくつかの例では、ビルダー塩は、ケイ酸塩とリン酸塩との混合物、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトイウム）より多く含む混合物である。本開示のいくつかの組成物、例えば、限定されないが、洗浄用組成物または洗剤組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩もしくはリン酸塩ビルダー）を含まない。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「漂白」という用語は、材料（例えば、布、衣類、パルプなど）または表面に対し、十分な時間、ならびに／または適切なｐＨおよび／もしくは温度条件下で処理して、材料の増白（すなわち、白化）および／または清浄化を達成することを指す。漂白に好適な化学物質の例としては、限定されないが、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、プロテアーゼ（例えば、本開示のセリンプロテアーゼポリペプチド）の「洗浄能力」は、組成物にセリンプロテアーゼポリペプチドが添加されていない洗剤と比較して、洗剤にさらなる洗浄能力を付与する、セリンプロテアーゼポリペプチドの洗浄に対する貢献度を指す。洗浄能力は、関連する洗浄条件下で比較される。いくつかの試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水の硬度、洗浄者、時間、ｐＨおよび／または温度などの他の関連する因子を、特定の市場区分の家庭用途（例えば、手もしくは手作業による食器洗い、自動食器洗い、食器の洗浄、テーブルウエアの洗浄、衣類の洗浄など）に一般的な条件と同様になるように調節することができる。
【００６０】
「関連する洗浄条件」という用語は、本明細書では、家庭において、手による洗浄、自動食器洗い機による洗浄、または衣類用洗剤の市場区分で実際に使用されている条件、特に、洗浄温度、時間、洗浄者、泡濃度、洗剤の種類、および水の硬度を示すために使用される。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「殺菌」という用語は、物品表面からの汚染物質の除去、および物品表面の微生物の抑制または絶滅を指す。本開示が特定の表面、物品、または除去すべき汚染物質もしくは微生物に限定されることを決して意図するものではない。
【００６２】
本明細書における「コンパクト」形の洗浄用組成物は、密度に最も反映され、組成の観点からは、無機フィラー塩の量に最も反映される。無機フィラー塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来からの成分である。従来の洗剤組成物では、フィラー塩は、相当量、通常、組成物全体の約１７〜約３５重量％含まれている。対照的に、コンパクト組成物では、フィラー塩は、組成物全体の約１５重量％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、フィラー塩は、組成物の約１０重量％を超えない量、より好ましくは、約５重量％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、無機フィラー塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の硫酸塩および塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、フィラー塩は硫酸ナトリウムである。
【００６３】
洗浄用途、および洗浄方法、ならびに各種工業用途に有用な１つ以上のサブチリシン変異体を本明細書中に開示する。一実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のセリンプロテアーゼまたはサブチリシン変異体は、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーである。他の一実施形態では、本明細書中に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、単離され、組み換えられ、実質的に純粋で、かつ／または非自然的に生成されたポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗浄が必要な物品または表面の１つ以上の洗浄方法に有用な１つ以上の洗浄用組成物に組み込むことができる。
【００６４】
いくつかの実施形態は、配列番号８５に対して、（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９；（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて５６；（ｖｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１１４；（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１２６；（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて２４２；（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて９９＋１２８；（ｘ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋２４２；または（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９＋９９＋１２８から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超える変異を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。。さらに他の実施形態は、配列番号８５に対して、（ｉ）１Ａ、４Ｉ、９Ｓ、２１Ｖ、２４Ｆ、２７Ｋ、３６Ａ、３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４２Ｔ、４３Ｖ、４４Ｓ、４７Ｖ、５４Ｓ、５５Ｍ／Ｇ、５６Ｎ／Ｙ、７４Ｄ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１０２Ｉ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１１７Ｉ、１１９Ｖ、１２１Ｓ、１２６Ｔ、１２８Ａ、１３１Ｔ、１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、１４４Ｇ、１５８Ｔ、１５９Ｉ、１６０Ｓ、１６９Ｌ、１８２Ｓ、１８８Ａ、１９０Ｌ、１９７Ｉ、１９８Ｇ、２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、２２４Ｉ／Ｖ、２３１Ｋ、２３２Ｎ、２３７Ｔ、２４２Ｄ／Ｑ、２４５Ｌ、２４６Ｓ／Ｋ、２５４Ｔ、２５５Ｎ、２５６Ｌ、および２５７Ｙ；（ｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｉｉ）３９Ｅ、９９Ｒ、１２６Ｔおよび１２８Ａ；（ｉｖ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ；（ｖ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて５６Ｎ／Ｙ；（ｖｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；（ｖｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて１２６Ｔ；（ｖｉｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｘ）３９Ｅ、５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて９９Ｒ＋１２８Ａ；（ｘ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ＋２４２Ｄ／Ｑ；または（ｘｉ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上の変異と組み合わせて３９Ｅ＋９９Ｒ＋１２８Ａから選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超える変異を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【００６５】
他の実施形態は、（ｉ）１、４、９、２１、２４、２７、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４７、５４、５５、５６、７４、８０、８５、８７、９９、１０２、１１４、１１７、１１９、１２１、１２６、１２８、１３１、１４３、１４４、１５８、１５９、１６０、１６９、１８２、１８８、１９０、１９７、１９８、２１２、２２４、２３１、２３２、２３７、２４２、２４５、２４６、２５４、２５５、２５６および２５７；（ｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２；（ｉｉｉ）３９、９９、１２６および１２８；（ｉｖ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９；（ｖ）３７、３９、４７、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて５６；（ｖｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１２６、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて１１４；（ｖｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２８および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６；（ｖｉｉｉ）３７、３９、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２；（ｉｘ）３９、５６、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて９９＋１２８；（ｘ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、９９、１１４、１２６および１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋２４２；または（ｘｉ）３７、４７、５６、８０、８５、８７、１１４、１２６および２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９＋９９＋１２８から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【００６６】
さらに他の実施形態は、（ｉ）Ｑ１、Ｖ４、Ｓ／Ｔ９、Ｉ／Ｖ２１、Ｓ２４、Ｋ／Ｒ２７、Ｓ３６、Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｎ／Ｔ４２、Ｉ４３、Ｒ／Ｓ４４、Ａ／Ｖ４７、Ｐ／Ｓ５４、Ｓ／Ｔ５５、Ｔ５６、Ｎ７４、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ｉ／Ｖ１０２、Ａ／Ｔ１１４、Ｍ１１７、Ｉ１１９、Ｎ１２１、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８、Ｉ／Ｓ／Ｔ１３１、Ｑ／Ｒ１４３、Ｄ／Ｇ１４４、Ｎ／Ｓ１５８、Ｉ／Ｖ１５９、Ｇ１６０、Ｍ１６９、Ｎ／Ｓ１８２、Ｓ／Ｔ１８８、Ｉ１９０、Ｖ１９７、Ｇ／Ｎ１９８、Ｎ／Ｐ２１２、Ａ／Ｖ２２４、Ｋ／Ｒ２３１、Ｎ／Ｙ２３２、Ａ／Ｎ２３７、Ｎ２４２、Ｋ２４５、Ｎ２４６、Ｓ２５４、Ｓ２５５、Ｑ２５６およびＦ２５７；（ｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２；（ｉｉｉ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８；（ｉｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９；（ｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＴ５６；（ｖｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｓ１２６、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｔ１１４；（ｖｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｆ１２８およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６；（ｖｉｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２；（ｉｘ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９、Ｔ５６、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｒ９９＋Ａ／Ｆ１２８；（ｘ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ｓ／Ｒ９９、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＡ／Ｆ１２８から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９＋Ｎ２４２；または（ｘｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７、Ａ／Ｖ４７、Ｔ５６、Ｉ／Ｖ８０、Ｎ／Ｓ８５、Ｄ／Ｅ／Ｑ８７、Ａ／Ｔ１１４、Ａ／Ｓ１２６およびＮ２４２から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９＋Ｓ／Ｒ９９＋Ａ／Ｆ１２８から選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。。さらに他の実施形態は、（ｉ）１Ａ、４Ｉ、９Ｓ、２１Ｖ、２４Ｆ、２７Ｋ、３６Ａ、３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４２Ｔ、４３Ｖ、４４Ｓ、４７Ｖ、５４Ｓ、５５Ｍ／Ｇ、５６Ｎ／Ｙ、７４Ｄ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１０２Ｉ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１１７Ｉ、１１９Ｖ、１２１Ｓ、１２６Ｔ、１２８Ａ、１３１Ｔ、１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、１４４Ｇ、１５８Ｔ、１５９Ｉ、１６０Ｓ、１６９Ｌ、１８２Ｓ、１８８Ａ、１９０Ｌ、１９７Ｉ、１９８Ｇ、２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、２２４Ｉ／Ｖ、２３１Ｋ、２３２Ｎ、２３７Ｔ、２４２Ｄ／Ｑ、２４５Ｌ、２４６Ｓ／Ｋ、２５４Ｔ、２５５Ｎ、２５６Ｌおよび２５７Ｙ；（ｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｉｉ）３９Ｅ、９９Ｒ、１２６Ｔおよび１２８Ａ；（ｉｖ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９Ｅ；（ｖ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて５６Ｎ／Ｙ；（ｖｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１２６Ｔ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；（ｖｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２８Ａおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて１２６Ｔ；（ｖｉｉｉ）３７Ｔ／Ｎ、３９Ｅ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｘ）３９Ｅ、５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて９９Ｒ＋１２８Ａ；（ｘ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、９９Ｒ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび１２８Ａから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９Ｅ＋２４２Ｄ／Ｑ；または（ｘｉ）３７Ｔ／Ｎ、４７Ｖ、５６Ｎ／Ｙ、８０Ｖ、８５Ｓ、８７Ｄ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、１２６Ｔおよび２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて３９Ｅ＋９９Ｒ＋１２８Ａから選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。またさらに他の実施形態は、（ｉ）Ｑ１Ａ、Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｉ２１Ｖ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｓ／Ｔ５５Ｇ／Ｍ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｉ／Ｓ１３１Ｔ、Ｑ／Ｒ１４３Ａ／Ｑ／Ｔ、Ｄ１４４Ｇ、Ｎ／Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｎ１８２Ｓ、Ｓ／Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ／Ｐ２１２Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ／Ｖ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ／Ｎ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ／Ｑ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｋ／Ｓ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｉｉ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａ；（ｉｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ；（ｖ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＴ５６Ｎ／Ｙ；（ｖｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ；（ｖｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｆ１２８ＡおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＡ／Ｓ１２６Ｔ；（ｖｉｉｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＮ２４２Ｄ／Ｑ；（ｉｘ）Ｓ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ；（ｘ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＦ１２８Ａから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ＋Ｎ２４２Ｄ／Ｑ；または（ｘｉ）Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ａ３７Ｎ／Ｔ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ／Ｑ８７Ｄ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ａ／Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ／Ｑから選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせてＳ／Ｐ／Ｔ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａから選択される位置に２、３もしくは４つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。。
【００６７】
他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を対象とし、但し、（ｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｔ＋Ｉ２１Ｖ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ１７７Ｅではなく；（ｉｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅではなく；（ｉｉｉ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｎ２５３Ｄではなく；（ｉｖ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｉ２１Ｖ＋Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ２５３Ｄではなく；（ｖ）配列番号８５に対する前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｑ３７Ｅ＋Ｑ２５６Ｅではなく；かつ／または（ｖｉ）配列番号８５に対する２１の位置での前記変異は、前記変異体が、４、３６、４２、４７、５６、８７、９９、１０２、１１４、１８８、２２４、２３７、２４２および２５５から選択される１つ以上の位置での配列番号８５に対する変異を含む場合にはバリンではないことを条件とする。さらに他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を対象とし、但し、（ｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｔ＋Ｉ２１Ｖ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ１７７Ｅではなく；（ｉｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅではなく；（ｉｉｉ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｎ２５３Ｄではなく；（ｉｖ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｉ２１Ｖ＋Ｓ３９Ｅ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｄ８７Ｅ＋Ｍ１２２Ｌ＋Ｎ２５３Ｄではなく；（ｖ）前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異は、Ｑ３７Ｅ＋Ｑ２５６Ｅではなく；かつ／または（ｖｉ）２１の位置での置換は、前記変異体が、４、３６、４２、４７、５６、８７、９９、１０２、１１４、１８８、２２４、２３７、２４２および２５５から選択される１つ以上の位置での置換を含む場合にはバリンではないことを条件とする。
【００６８】
さらなる実施形態は、（ｉ）５６、１１４および１２６から選択される位置での配列番号８５に対する１つ以上の変異；（ｉｉ）５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔから選択される位置での配列番号８５に対する１つ以上の変異；（ｉｉｉ）５６、１１４および１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；（ｉｖ）Ｔ５６、Ａ／Ｔ１１４およびＡ／Ｓ１２６から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換；（ｖ）５６Ｎ／Ｙ、１１４Ａ／Ｐ／Ｑおよび１２６Ｔ選択される１つ以上のアミノ酸置換；または（ｖｉ）Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ／Ｔ１１４Ａ／Ｐ／ＱおよびＡ／Ｓ１２６Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって但し、前記２、３もしくは４つまたはそれを超える変異または置換の１つ以上は非自然的に発生することを条件とし、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【００６９】
またよりさらなる実施形態は、以下：Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ−Ｔ１８８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｉ１９０Ｌ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｒ１４３Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｇ１６０Ｓ−Ｆ２５７Ｙ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２１２Ｓ−Ｆ２５７Ｙ；Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｄ１４４Ｇ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ１９８Ｇ；Ｉ０２１Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｍ１１７Ｉ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１３１Ｔ−Ｒ１４３Ｑ−Ｄ１４４Ｇ−Ａ２２４Ｖ；Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ｑ００１Ａ−Ｉ０８０Ｖ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１３１Ｔ−Ｒ１４３Ａ−Ｄ１４４Ｇ−Ｍ１６９Ｌ−Ｉ１９０Ｌ−Ｓ２５４Ｔ−Ｓ２５５Ｎ−Ｑ２５６Ｌ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｍ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ｔ００９Ｓ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｖ１９７Ｉ；Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ａ２２４Ｖ；Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ；Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｎ２４２Ｄ−Ｎ２４６Ｋ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ｖ００４Ｉ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ１８２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０２４Ｆ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２３７Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８
５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２３７Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０４３Ｖ−Ｒ０４４Ｓ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ｉ０４３Ｖ−Ｒ０４４Ｓ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２２４Ｖ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｆ２５７Ｙ；Ｖ００４Ｉ−Ｔ００９Ｓ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ａ２２４Ｖ−Ｋ２４５Ｌ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｐ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｔ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｋ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ｓ０３６Ａ−Ａ０３７Ｎ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ−Ｋ２４５Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ１８２Ｓ−Ｉ１９０Ｌ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０４２Ｔ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｎ０７４Ｄ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ−Ｎ２４２Ｑ−Ｋ２４５Ｌ；Ｔ００９Ｓ−Ｓ０３６Ａ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｎ１８２Ｓ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２４２Ｄ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｎ２１２Ｓ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ｎ２１２Ｓ−Ａ２２４Ｖ−Ｙ２３２Ｎ−Ｋ２４５Ｌ−Ｎ２４６Ｓ−Ｓ２５５Ｎ；Ｖ００４Ｉ−Ｔ００９Ｓ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ａ−Ｎ１２１Ｓ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｑ−Ａ２２４Ｉ−Ｒ２３１Ｋ−Ｋ２４５Ｌ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ａ０４７Ｖ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｇ１６０Ｓ−Ｎ２４２Ｄ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｖ１０２Ｉ−Ｔ１１４Ｑ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｔ１８８Ａ−Ｉ１９０Ｌ−Ｆ２５７Ｙ；Ｒ０２７Ｋ−Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｎ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｐ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｒ１４３Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｎ２１２Ｔ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５６Ｙ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ−Ｅ０８７Ｄ−Ｓ０９９Ｒ−Ｔ１１４Ｑ−Ｉ１１９Ｖ−Ｓ１２６Ｔ−Ｆ１２８Ａ−Ｓ１５８Ｔ−Ｖ１５９Ｉ−Ｇ１６０Ｓ−Ｆ２５７Ｙ；Ａ０３７Ｔ−Ｓ０３９Ｅ−Ｉ０４３Ｖ−Ａ０４７Ｖ−Ｔ０５５Ｇ−Ｔ０５６Ｙ−Ｎ０７４Ｄ−Ｉ０８０Ｖ−Ｎ０８５Ｓ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から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むサブチリシン変異体であって、但し、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている、サブチリシン変異体を対象としている。
【００７０】
一実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ＋Ｎ２４２Ｄを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。またさらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ＋Ｉ４３Ｖを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ＋Ａ４７Ｖを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。いくつかの実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａ＋Ｉ８０Ｖを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｓ３９Ｅ＋Ｓ９９Ｒ＋Ｆ１２８Ａと、（ｉ）Ｑ１Ａ、Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｉ２１Ｖ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ／Ｑ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ａ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉ）Ｑ１Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｒ２７Ｋ、Ｎ４２Ｔ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ、Ａ２２４Ｖ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉｉ）Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ５７Ｑ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ／Ｑ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｖ）Ｔ９Ｓ、Ｒ２７Ｋ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５５Ｇ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｖ）Ｔ９Ｓ、Ｒ２７Ｋ、Ｎ４２Ｔ、Ｔ５５Ｇ、Ｉ１１９Ｖ、Ｇ１６０Ｓ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｖｉ）Ｎ７４Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｓ１５８ＴおよびＮ２１２Ｓ；（ｖｉｉ）Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７ＤおよびＴ１１４Ａ；（ｖｉｉｉ）Ｎ４２Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６Ｔ、Ｓ１５８ＴおよびＮ２４２Ｄ；（ｉｘ）Ｔ５６Ｙ、Ｔ１１４Ｑ、Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ；（ｘ）Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｉ８０ＶおよびＮ２４２Ｄ；（ｘｉ）Ｉ４３Ｖ；（ｘｉｉ）Ａ４７Ｖ；（ｘｉｉｉ）Ｉ８０Ｖ；（ｘｉｖ）Ｎ２４２Ｄ；または（ｘｖ）（ｉ）〜（ｘｉｖ）群の１つ以上の組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換とを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。
【００７１】
さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｎ２４２Ｄを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｎ２４２Ｄと、（ｉ）Ｑ１Ａ、Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｉ２１Ｖ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ａ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉ）Ｑ１Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ、Ａ２２４Ｖ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉｉ）Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ５７Ｑ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｖ）Ｔ９Ｓ、Ｒ２７Ｋ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５５Ｇ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｖ）Ｓ３９Ｅ、Ｓ９９Ｒ、Ｆ１２８Ａ、Ｔ５６Ｙ、Ｔ１１４ＱおよびＳ１２６Ｔ；（ｖｉ）Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８ＡおよびＳ１５８Ｔ；（ｖｉｉ）Ｉ４３Ｖ、Ａ４７ＶおよびＩ８０Ｖ；（ｖｉｉｉ）Ｉ４３Ｖ；（ｉｘ）Ａ４７Ｖ；（ｘ）Ｉ８０Ｖ；ならびに／または（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）群の１つ以上の組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換とを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。
【００７２】
さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｉ８０Ｖを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、アミノ酸置換Ｉ８０Ｖと、（ｉ）Ｑ１Ａ、Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｉ２１Ｖ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ａ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉ）Ｑ１Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｎ７４Ｄ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｍ１１７Ｉ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｄ１４４Ｇ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｍ１６９Ｌ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｎ１９８Ｇ、Ｎ２１２Ｓ、Ａ２２４Ｖ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５５Ｎ、Ｑ２５６ＬおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｉｉ）Ｖ４Ｉ、Ｔ９Ｓ、Ｓ２４Ｆ、Ｒ２７Ｋ、Ｓ３６Ａ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ｒ４４Ｓ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｓ、Ｔ５５Ｍ／Ｇ、Ｔ５６Ｎ／Ｙ、Ａ５７Ｑ、Ｎ７４Ｄ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｐ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１２１Ｓ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｒ１４３Ａ／Ｔ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｖ１５９Ｉ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１８２Ｓ、Ｔ１８８Ａ、Ｉ１９０Ｌ、Ｖ１９７Ｉ、Ｎ２１２Ｓ／Ｔ／Ｋ、Ａ２２４Ｉ／Ｖ、Ｒ２３１Ｋ、Ｙ２３２Ｎ、Ａ２３７Ｔ、Ｎ２４２Ｄ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ／Ｋ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｉｖ）Ｔ９Ｓ、Ｒ２７Ｋ、Ａ３７Ｔ／Ｎ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｔ５５Ｇ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ａ／Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｒ１４３Ａ／Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｋ２４５Ｌ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙ；（ｖ）Ｓ３９Ｅ、Ｓ９９Ｒ、Ｆ１２８Ａ、Ｔ５６Ｙ、Ｔ１１４Ｑ、Ｓ１２６ＴおよびＮ２４２Ｄ；（ｖｉ）Ｓ３９Ｅ、Ｎ４２Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６Ｔ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１５８ＴおよびＮ２４２Ｄ；（ｖｉｉ）Ｉ４３Ｖ、Ａ４７ＶおよびＮ２４２Ｄ；（ｖｉｉｉ）Ｉ４３Ｖ；（ｉｘ）Ａ４７Ｖ；（ｘ）Ｎ２４２Ｄ；ならびに／または（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）群の１つ以上の組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換とを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。
【００７３】
さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を対象としており、前記変異体は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーである。さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を対象としており、前記変異体は、ＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフをさらに含み、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸である。
【００７４】
他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の変異体は、親アミノ酸配列に由来し、前記親はバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードのメンバーである。またさらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の変異体は、ＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフを含む親アミノ酸配列に由来し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸である。またよりさらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の変異体は、親アミノ酸配列に由来し、前記親アミノ酸配列は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７５】
よりさらなる実施形態は、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびにＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸であり、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。また、よりさらなる実施形態は、（ｉ）Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換；（ｉｉ）Ｎ４２Ｔ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９ＲおよびＦ１２８Ａから選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびに（ｉｉｉ）ＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸であり、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらに他の実施形態は、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびにＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）モチーフを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸であり、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらに他の実施形態はＮ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびにＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸であり、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。さらなる実施形態は、Ｎ７４Ｄ、Ｉ８０Ｖ、Ｖ１０２Ｉ、Ｔ１１４Ｑ、Ｉ１１９Ｖ、Ｓ１２６Ｔ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１５８Ｔ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２４２Ｄ、Ｓ２５５ＮおよびＦ２５７Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換；Ｎ４２Ｔ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９ＲおよびＦ１２８Ａから選択される１つ以上のアミノ酸置換；ならびにＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）モチーフを含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供し、ここで、頭文字Ｄは、活性部位アスパラギン酸残基であり、最後から二番目のＨは、活性部位ヒスチジンであり、およびＸは、任意のアミノ酸であり、変異体のアミノ酸の位置は、配列番号８５のアミノ酸配列に対応して番号が付されている。
【００７６】
さらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。さらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。さらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８または８５のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。またさらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。
【００７７】
上記のように、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有し、したがって、洗浄用途、例えば、限定されないが、食器製品、テーブルウエア製品、布類、および硬質表面（テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床、天井などの硬質表面）を有する製品の洗浄方法に有用である。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む１つ以上の洗浄用組成物を対象としている。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性）は、当業者によく知られた手順によって容易に測定することができる。以下に示す実施例は、酵素活性および洗浄能力の評価方法を記載する。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の染み（例えば、血液／ミルク／インクまたは卵黄などのタンパク質による染み）を除去する能力、硬質表面に対する洗浄能力、または衣類、食器もしくはテーブルウエア製品に対する洗浄能力は、当該技術分野でよく知られた手順により、かつ／または例えば、実施例に記載した手順などにより容易に測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、界面活性剤の存在下でプロテアーゼ活性を有する。他の実施形態では、界面活性剤は、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、両性界面活性剤、半極性ノニオン界面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ活性は、カゼイン加水分解活性を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ活性は、ジメチルカゼイン加水分解活性を含む。
【００７８】
他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号８５の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性に比べ、より高いプロテアーゼ活性を有し、かつ／または配列番号８５の配列を有するプロテアーゼの洗浄活性に比べ、より高い洗浄活性を有する。さらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号１８の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性に比べ、より高いプロテアーゼ活性を有し、かつ／または配列番号１８の配列を有するプロテアーゼの洗浄活性に比べ、より高い洗浄活性を有する。よりさらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の特性が向上している。向上した特性は、向上したプロテアーゼ活性、洗剤における向上した洗浄能力、および洗剤における向上した熱安定性から選択され、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。また、よりさらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の向上した特性を有する。向上した特性は、向上したプロテアーゼ活性、洗剤における向上した洗浄能力、および洗剤における向上した熱安定性から選択され、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。さらに他の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の向上した特性を有する。向上した特性は、（ｉ）向上したプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質でＰＩ＞１を有する、向上したプロテアーゼ活性；（ｉｉ）洗剤における向上した洗浄能力であって、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した洗浄能力；および／または（ｉｉｉ）洗剤における向上した熱安定性であって、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した熱安定性であり、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。またさらによりさらなる実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の向上した特性を有する。向上した特性は、（ｉ）向上したプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質でＰＩ＞１を有する、向上したプロテアーゼ活性；（ｉｉ）洗剤における向上した洗浄能力であって、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した洗浄能力；および／または（ｉｉｉ）洗剤における向上した熱安定性であって、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有する、洗剤における向上した熱安定性であり、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。他の一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を対象とし、ここで、プロテアーゼ活性が実施例３のプロテアーゼ活性アッセイに従って測定され；洗剤における洗浄能力が実施例４の衣類およびＡＤＷ洗剤アッセイにおいて測定され、かつ／または洗剤における熱安定性が実施例４の安定性アッセイに従って測定される。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、広範囲のｐＨ条件にわたってプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、基質としてのアゾカゼインにプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約４．０〜約１２．０のｐＨでプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約８．０〜約１２．０のｐＨでプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約８．０〜約１２．０のｐＨで最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のサブチリシン変異体は、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０または１１．５を超えるｐＨでプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のサブチリシン変異体は、１２．０、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０または８．５未満のｐＨでプロテアーゼ活性を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約１０℃〜約９０℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約５０℃〜約７５℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約５０℃〜約７５℃の温度で最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃を超える温度で活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、７５℃、７０℃、６５℃、６０℃または５５℃未満の温度で活性を有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗浄用組成物において洗浄能力を示す。洗浄用組成物は、酵素の安定性および能力に有害であり、洗浄用組成物を、酵素、例えば、セリンプロテアーゼにとって機能を保持するには過酷な環境とする成分を含むことが多い。したがって、酵素を洗浄用組成物に入れて、酵素機能（例えば、洗浄能力によって示されるようなセリンプロテアーゼ活性）を期待することはささいなことではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、自動食器洗い機（ＡＤＷ）用洗剤組成物において洗浄能力を示す。いくつかの実施形態では、自動食器洗い機（ＡＤＷ）用洗剤組成物における洗浄能力は、卵黄による染みの洗浄を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、衣類用洗剤組成物において洗浄能力を示す。いくつかの実施形態では、衣類用洗剤組成物における洗浄能力は、血液／ミルク／インクによる染みの洗浄を含む。本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、漂白成分の有無にかかわらず洗浄能力を示す。
【００８１】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体には、１つ以上の保存的または非保存的なアミノ酸の挿入、欠失および／または置換などの様々な変化を加えることができる（そのような変化がポリペプチドの酵素活性を実質的に変えない場合を含む）。同様に、本明細書に記載の１つ以上の核酸も、特定のコドンが同じまたは異なるアミノ酸をコードし、サイレント変異（例えば、ヌクレオチドの変異によってコードされるアミノ酸が変わらない場合など）または非サイレント変異をもたらすような、１つ以上のコドンにおける１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の置換、配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の付加または挿入、ならびに／あるいは配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の開裂、または１つ以上の切断などの様々な変化を加えることができる。核酸配列における多くのそのような変化は、元の核酸配列によってコードされたポリペプチド酵素と比べて、得られるコードされたポリペプチド酵素の酵素活性を実質的に変えないであろう。本明細書に記載の１つ以上の核酸配列はまた、発現系（例えば、細菌発現系）で最適発現を提供する１つ以上のコドンを含むように修飾することができ、一方、必要に応じて、前記１つ以上のコドンは依然として同じアミノ酸をコードする。
【００８２】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のアミノ酸置換およびおよび／または変異を有する配列を含み、また、保存的および非保存的置換または変異などの１つ以上の追加のアミノ酸置換または変異を含む、所望の酵素活性（例えば、プロテイナーゼ酵素活性または洗浄活性）を有する１つ以上のポリペプチドを対象としており、このポリペプチドは、所望の酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を示すか、維持するかまたはほぼ維持する。いくつかの実施形態では、タンパク質分解活性は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の洗浄活性または能力に反映される。例えば、アミノ酸置換には、限定されないが、１つ以上の非保存的置換、および／または１つ以上の保存的アミノ酸置換が含まれ得る。保存的アミノ酸残基置換は、通常、アミノ酸残基の１つの機能分類内のメンバーを、同じ機能分類に属する残基と交換することを含む（保存的アミノ酸残基は、機能的に相同であると見なされるか、またはパーセント機能相同性の計算において保存される）。例えば、アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニンは、機能的に類似しており、したがって、保存的アミノ酸置換として互いに機能し得る。アスパラギン酸とグルタミン酸は、保存的置換として互いに機能し得る。アスパラギンとグルタミンは、保存的置換として互いに機能し得る。アルギニン、リシンおよびヒスチジンは、保存的置換として互いに機能し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンは、保存的置換として互いに機能し得る。フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、保存的置換として互いに機能し得る。
【００８３】
他の保存的アミノ酸置換群は、予想可能である。例えば、アミノ酸は、機能または化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）の類似性から分類することができる。例えば、脂肪族群は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）を含み得る。互いに保存的置換と考えられるアミノ酸を含む他の群としては、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性非荷電性残基：システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）およびプロリン（Ｐ）；親水性非荷電性残基：セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）が挙げられる。アミノ酸のさらなる群は、当業者によく知られており、各種の標準的なテキストに記載されている。本明細書中のポリペプチド配列の一覧は、上記置換基と共に、保存的に置換されたポリペプチド配列全ての発現リストを示す。
【００８４】
より保存的な置換が上記アミノ酸残基の分類中に存在するが、それらも同様にまたは代替的に好適であり得る。より保存的な置換のための保存グループとしては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００８５】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の保存的置換または変異は、同じ保存的置換基の保存的に選択されたアミノ酸と共に、僅かな割合、場合により５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満または１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個未満のアミノ酸の置換または変異を含む。
【００８６】
本明細書に記載の１つ以上の核酸は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、通常、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現による、組み換え産生（例えば、発現）に有用である。
【００８７】
いくつかの実施形態は、配列番号１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７または６９の核酸配列に対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の核酸配列同一性を有する１つ以上の核酸配列を対象としている。他の実施形態は、配列番号１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７または６９の核酸配列に相補的な核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを対象としている。さらに他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを対象としている。よりさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドまたは核酸は、単離され、組み換えられ、実質的に純粋で、かつ／または非自然発生のポリヌクレオチドまたは核酸である。
【００８８】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸配列を含む、合成的に生成された核酸を対象としている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、組み換え技術により、相同のプロペプチド配列（例えば、Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド）を用いて発現される。
【００８９】
本発明の核酸は、好適な合成、操作、および／もしくは単離技術、またはこれらの組み合わせによって生成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者によく知られている固相合成技術などの標準核酸合成技術によって生成することができる。そうした技術では、通常、最大５０個またはそれを超える核酸塩基からなる断片を合成し、その後、連結して、実質的に必要な連続核酸配列を形成する。本発明の核酸の合成はまた、当該技術分野で知られている好適な方法によって促進することができる。そのような方法としては、限定されないが、古典的なアミド亜リン酸法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−６９［１９８１を参照されたい］）；またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．によって報告されている方法（Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−８０５［１９８４］を参照されたい）が挙げられる。通常、それらは自動化合成法で実施される。本発明の核酸はまた、ＤＮＡ自動合成装置で生成することができる。カスタマイズした核酸を様々な市販先に注文することができる（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、およびＤＮＡ２．０）。核酸を合成するその他の技術および関連原理は当該技術分野で知られている（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３［１９８４］；およびＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６［１９８４］を参照されたい）。
【００９０】
上述したように、核酸の修飾に有用な組み換えＤＮＡ技術は当該技術分野で知られている。例えば、制御エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写およびｃＤＭＡ生成、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）は当業者に知られ、当業者によって既に使用されている。本明細書に記載の１つ以上のヌクレオチドはまた、１つ以上のハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、あるいは本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓをスクリーニングし単離する手順、およびＰＣＲにより増幅する手順は当業者によく知られており当業者に知られた標準的な文献に記載されている。本明細書に記載の核酸は、天然に存在する（例えば、酵素または親プロテアーゼをコードする）ポリヌクレオチド骨格を、例えば、知られた変異誘発法（例えば、部位特異的変異誘発法、部位飽和変異誘発法およびインビトロ遺伝子組み換え法）によって改変することによって得ることができる。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードすることができる修飾ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が、当該技術分野において知られており、例えば、限定されないが、部位飽和変異誘発法、系統的変異導入法、挿入変異、欠失変異、ランダム変異誘発法、部位特異的変異誘発法および定方向進化、ならびに各種の他の組み換え方法が挙げられる。
【００９１】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター、本明細書に記載の１つ以上の核酸もしくはポリヌクレオチドを含む１つ以上の発現ベクターもしくは発現カセット；本明細書に記載の１つ以上の核酸もしくはポリヌクレオチドを含む１つ以上の単離された、実質的に純粋な、もしくは組み換えられたＤＮＡコンストラクト；本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上の単離もしくは組み換えられた細胞；およびそのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、細胞、細胞培養物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物を含む１つ以上の組成物を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のベクター（例えば、発現ベクターもしくはＤＮＡコンストラクト）を含む１つ以上の組み換え細胞を提供する。ベクターは、本明細書に記載の１つ以上の核酸もしくはポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組み換え細胞は、そのような１つ以上のベクターで形質転換または形質移入されるが、他の方法も利用可能であり、当該技術分野では知られている。そのような細胞は、通常、宿主細胞と呼ばれる。いくつかのそのような細胞は、細菌細胞、例えば、限定されないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などの（バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞を含む。本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）を提供する。
【００９３】
他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の核酸またはポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列が、効率の良い遺伝子発現に必要な１つ以上の追加の核酸セグメント（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーター）に作動可能に結合している発現ベクターまたは発現カセットである。ベクターは、転写ターミネーターおよび／または選択遺伝子、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子を含み得、それは、抗菌剤含有培地での増殖によってプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養維持を可能にする。
【００９４】
発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、あるいは代替の実施形態では、両方の要素を含む。ベクターの例としては、限定されないが、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照されたい；バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に好適な複製プラスミドはｐ．９２にリストされたものを含む）また、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５−６２４を参照されたい）、およびｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩが挙げられる。
【００９５】
細胞内での目的タンパク質（例えば、セリンプロテアーゼポリペプチド）の発現および産生には、セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピー、ある場合には、複数のコピーを含む少なくとも１つのベクターが、セリンプロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞に形質転換される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列（およびベクターに含まれる他の配列）が、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターが細胞内の独立染色体外因子として残る。本発明は、染色体外核酸因子、および宿主細胞ゲノムに組み込まれた入来ヌクレオチド配列をいずれも提供する。本明細書に記載の１つ以上のベクターは、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、組み込みを可能にし、任意選択により宿主染色体にポリヌクレオチドの増幅を可能にする組み込みベクター上に存在する。組み込み部位の例は、当業者にはよく知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターであるプロモーターによってなされる。他の実施形態では、プロモーターは前駆体プロテアーゼと異種であるが、宿主細胞では機能する。細菌宿主細胞での使用に好適なプロモーターの例としては、限定されないが、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）・アミラーゼ遺伝子；バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）・アルカリプロテアーゼ遺伝子；バチルス・サブチリス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）・アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）・キシロシダーゼ遺伝子；バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ；およびバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）・アルファ−アミラーゼ遺伝子が挙げられる。さらなるプロモーターとしては、限定されないが、Ａ４プロモーター、ならびにファージ・ラムダのＰＲまたはＰＬプロモーター、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられる。
【００９６】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、差細菌および真菌などの好適な微生物の宿主細胞で産生され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、グラム陽性菌によって産生され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、エシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）またはピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の宿主細胞によって産生される。バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の宿節細胞の例としては、限定されないが、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ミセリオフテラ属種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｅｒａ  ｓｐｐ）、およびヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ）、ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の他の生物が挙げられる。いくつかの実施形態では、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  宿主細胞は、セリンプロテアーゼポリペプチドの産生に使用される。米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同４，７６０，０２５号（再発行特許出願第３４，６０６号）明細書には、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に使用することができる種々のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株が記載されているが、他の好適な株も使用することができる。
【００９７】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に使用することができるいくつかの細菌株を挙げると、非組み換え（すなわち、野生型）バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株、ならびに種々の天然に存在する菌株および／または組み換え株がある。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、組み換え菌株であり、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その宿主に導入されている。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株、特に組み換えバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。多くのバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が知られており、限定されないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０、およびＰＥＰ  ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７３：２１５−２２８［１９７３］を参照されたい；また米国特許第４，４５０，２３５号、同４，３０２，５４４号、および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照されたい）。バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発現宿主細胞としての使用は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１−８７［１９８２］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６−８０４［１９８６］；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９−４７［１９８８］を参照されたい）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲおよびｄｅｇＱの少なくとも１つに変異または欠失を含むバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）である。いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ遺伝子にあり、いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４−８３４［１９９０］；およびＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２−５６７（１９９７）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９−７３４０［２００１］を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７−１４１５［１９９９］を参照されたい）；および／またはｏｐｐＡもしくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３−１８５（１９９１）を参照されたい）に変異または欠失を含む。実際、ｏｐｐＡ遺伝子の変異と同じ表現型を生じさせるｏｐｐオペロンの変異はいずれも、本発明の変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株のいくつかの実施形態で使用されると考えられる。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で起こるが、一方、他の実施形態では、変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を産生させるために使用することができる変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、上記遺伝子の１つ以上に既に変異を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株である。さらに、内因性プロテアーゼ遺伝子の変異および／または欠失を含むバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）宿主細胞も使用される。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）宿主細胞は、５つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含み、一方、他の実施形態では、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）宿主細胞は、９つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号明細書）。
【００９９】
宿主細胞は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法により、本明細書に記載の１つ以上の核酸で形質転換される。プラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターを用いて核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に導入し、そのようなプラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターをそのような細胞に形質転換する方法はよく知られている。いくつかの実施形態では、プラスミドは、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離され、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へ形質転換される。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの介在微生物を使用することは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主に直接導入される。
【０１００】
当業者は、本明細書に記載の１つ以上の核酸配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入するのに好適な方法はよく知っている（例えばＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐｐ．５７−７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８−７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５−１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１−１３５［１９８６］；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１−１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１−２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３−２１７［１９８１］；およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］を参照されたい）。実際、プロトプラスト形質転換および形質移入、形質導入、ならびにプロトプラスト融合などの方法はよく知られており、ここで使用するのに適している。当該技術分野で知られているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換方法としては、プラスミドマーカーレスキュー形質転換などの方法があり、これは、部分的に相同の内在プラスミドを運ぶコンピテントセルによってドナープラスミドを取り込むことを含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５−５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５−１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７−１０８７［１９８３］；およびＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５−１２１１（１９８７）を参照されたい）。この方法では、入ってくるドナープラスミドが、染色体の形質添加に類似した方法で、染色体形質転換を内在する「ヘルパー」プラスミドの相同領域に再結合する。
【０１０１】
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞を直接、本明細書に記載の１つ以上の核酸を含むＤＮＡコンストラクトまたはベクターで形質転換する（すなわち、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターを宿主細胞に導入する前に増殖させるために、または他のプロセスで、介在細胞を使用しない）。本明細書に記載の１つ以上のＤＮＡコンストラクトまたはベクターの宿主細胞への導入には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を宿主ゲノムに挿入せずに宿主細胞に導入するための、当該技術分野で知られた物理的および化学的方法が含まれる。そのような方法としては、限定されないが、塩化カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、裸ＤＮＡ、リポソームなどが挙げられる。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターをプラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換する。さらなる実施形態では、当該技術分野で知られた方法で、選択マーカーを変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から欠失させる（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８［１９８４］；およびＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ２４７：２５５−２６４［２０００］を参照されたい）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の形質添加された細胞を、従来の培地で培養する。温度、ｐＨなどの、好適な具体的培養条件は、当業者に知られており、また科学文献に十分に記載されている。いくつかの実施形態では、発明は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体、または本明細書に記載の１つ以上の核酸を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の発現を許容する条件下において好適な培地で培養し、その後、得られた変異体を培養物から回収する。いくつかの実施形態では、細胞によって産生された変異体を培地から従来の手順で回収する。手順としては、限定されないが、例えば、遠心分離または濾過によって宿主細胞を培地から分離し、上清または濾液のタンパク質成分を塩（例えば、硫酸アンモニウム）で沈澱させ、クロマトグラフィーによる精製（例えばイオン交換、ゲル濾過、アフィニティなど）を行うことが挙げられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞によって産生されたセリンプロテアーゼポリペプチドは、培地へ分泌される。精製促進ドメインをコードする核酸配列をタンパク質の精製促進に使用することができる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはＤＮＡコンストラクトは、セリンプロテアーゼポリペプチドの精製を促進する精製促進ドメインをコードする核酸配列をさらに含み得る（例えば、Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３（１９９３）を参照されたい）。そのような精製促進ドメインとしては、限定されないが、例えば、固定化金属による精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートタンパク質（Ｐｏｒａｔｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１［１９９２］を参照されたい）、固定化免疫グロブリンによる精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、ＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システムにおいて使用されるドメインが挙げられる。精製ドメインと異種タンパク質間の、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能な配列）を包含するものも精製の促進に使用される。
【０１０５】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体などの酵素の酵素活性を検出および測定するアッセイはよく知られている。プロテアーゼ（例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体）の活性を検出および測定する様々なアッセイも当業者には知られている。特に、カゼインまたはヘモグロビンから酸可溶性ペプチドを放出させ、２８０ｎｍでの吸光度として測定するか、またはフォリン法により比色定量で測定することに基づくアッセイは、プロテアーゼの活性に利用可能である。他のアッセイの例は、色素生成基質の可溶化を含む（例えば、Ｗａｒｄ，“Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ．２５１−３１７を参照されたい）。他のアッセイの例としては、限定されないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムアッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に知られた多くのさらなる文献が、好適な方法を提供している（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１−７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９−１２９［１９９４］；およびＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１−２２７（１９９９）を参照されたい）。
【０１０６】
成熟プロテアーゼ（例えば、本明細書に記載の１つ以上の成熟サブチリシン変異体）の生成レベルの測定に様々な方法を使用することができる。そのような方法としては、限定されないが、ポリクローナル抗体またはプロテアーゼに特異的なモノクローナル抗体を使用する方法が挙げられる。方法の例としては、限定されないが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよびその他のアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］）を参照されたい）。
【０１０７】
いくつかの他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の成熟サブチリシン変異体の生成または産生方法を提供する。成熟セリンプロテアーゼポリペプチドは、シグナルペプチドまたはプロペプチド配列を含まない。いくつかの方法は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、例えば、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞）などの組み換え細菌宿主細胞中で生成または産生することを含む。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、変異体の産生を促す条件下で培養することを含む、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を産生する方法を提供する。いくつかのそのような方法は、培養物から変異体を回収することをさらに含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を産生する１つ以上の方法であって、（ａ）本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを、細胞（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などの細菌細胞）の集団に導入する工程；および（ｂ）発現ベクターによってコードされる変異体の産生を促す条件下で培地中の細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。いくつかのそのような方法は、（ｃ）細胞または培地から変異体を単離する工程をさらに含む。
【０１０９】
特に断らない限り、本明細書に示される全ての成分または組成物レベルは、その成分または組成物の活性レベルに関してなされ、市販品に含まれ得る不純物、例えば、残留溶媒または副生物は除く。酵素成分の重量は、全活性タンパク質量を基準とする。特に記載がない限り、パーセンテージおよび比率は重量によって計算する。特に記載がない限り、パーセンテージおよび比率は、全組成物に基づいて計算される。本発明の組成物には、洗剤組成物などの洗浄用組成物が含まれる。例示した洗剤組成物において、酵素レベルは全組成物の重量による純粋な酵素で表され、別段の規定がなければ、洗剤成分は全組成物の重量によって表される。
【０１１０】
本発明の目的には必須ではないが、以下に示す非限定的な添加剤リストは、目的の洗浄用組成物での使用に好適である。いくつかの実施形態では、これらの添加剤は、例えば、洗浄能力を補助または増大させるため、洗浄する基材の処理のため、あるいは香水、着色剤、染料などと同様に洗浄用組成物の美観を変えるために組み込まれる。ある実施形態は、１つ以上の補助剤と、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体とを含む組成物を対象としている。特定の組成物で使用される補助剤の特徴およびその添加濃度は、組成物の物理的形態、および組成物が使用される洗浄作業の性質によるであろう。
【０１１１】
好適な補助剤としては、限定されないが、漂白触媒、追加酵素、酵素安定化剤（例えば、酵素安定化系）、キレート剤、蛍光増白剤、防汚ポリマー、染料移行剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、光活性化剤、蛍光剤、柔軟剤、加水分解可能な界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、カラースペックル、シルバーケア（ｓｉｌｖｅｒｃａｒｅ）、さび防止および／もしくは腐食防止剤、アルカリ源、溶解剤、キャリア、加工助剤、顔料、ｐＨ調整剤、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料移行阻害剤、沈澱助剤、分散剤、追加酵素、酵素安定化剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素源、プリフォーム過酸、高分子分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤、柔軟剤、キャリア、屈水性誘発物質、加工助剤、ならびに／または顔料が挙げられる。他の補助剤の好適な例および使用濃度は、米国特許第５，５７６，２８２号明細書、同第６，３０６，８１２；６，３２６，３４８号明細書、同第６，６１０，６４２号明細書、同第６，６０５，４５８号明細書、同第５，７０５，４６４号明細書、同第５，７１０，１１５号明細書、同第５，６９８，５０４号明細書、同第５，６９５，６７９号明細書、同第５，６８６，０１４号明細書および同第５，６４６，１０１号明細書に見出すことができる。１つ以上の補助剤と本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体との混合性が悪い実施形態では、補助剤と変異体を分離させておくのに好適な方法を、それらの２つの成分の混合が適切になるまで使用することができる。そのような分離方法としては、当該技術分野で知られている好適な方法（例えば、ゲルカプセル、カプセル化、錠剤、物理的分離など）が挙げられる。上述した補助剤は、本明細書に記載の洗浄用組成物の残りを構成することができる。
【０１１２】
本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面洗浄用途、自動食器洗いおよび手による食器洗いを含む食器洗い用途、ならびに義歯、歯、毛髪および皮膚の洗浄などの化粧用途、例えば、限定されないが、自動食器洗い機または洗濯機の殺菌などの殺菌用途で使用することが有利である。本発明の酵素はまた、コンタクトレンズの洗浄、創傷清拭用途での使用に好適である。さらに、低温溶液で高い効果を示すという優れた利点があるため、洗濯用途に理想的に適している。さらに、本発明の酵素は粒状および液状組成物において使用される。
【０１１３】
他の一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物を対象としている。いくつかの実施形態では、組成物は洗浄用組成物である。他の実施形態では、組成物は洗剤組成物である。さらに他の実施形態では、組成物は、衣類用洗剤組成物、自動食器洗い（ＡＤＷ）用組成物、手（手作業）による食器洗い用洗剤組成物、硬質表面洗浄用組成物、眼鏡洗浄用組成物、医療機器洗浄用組成物、殺菌（例えば、悪臭または微生物）用組成物、およびパーソナルケア洗浄用組成物から選択される。さらに他の実施形態では、組成物は、衣類用洗剤組成物、ＡＤＷ用組成物、または手（手作業）による食器洗い用洗剤組成物である。よりさらなる実施形態は布用洗浄用組成物を対象とするが、一方、他の実施形態は非布用洗浄用組成物を対象としている。いくつかの実施形態では、洗浄用組成物はホウ素を含まない。他の実施形態では、洗浄用組成物はリン酸塩を含まない。さらに他の実施形態において、組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、賦形剤、補助剤および／または追加の酵素の１つ以上とを含む。
【０１１４】
またさらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、リン酸塩を含有するか、リン酸塩を含まないか、ホウ素を含むか、ホウ素を含まないか、またはこれらの組み合わせである。他の実施形態では、組成物は、ホウ素を含有しない組成物である。いくつかの実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ酸安定化剤は添加されていない組成物である。他の一実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が５．５％未満の組成物である。さらなる一実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が４．５％未満の組成物である。またさらに他の一実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が３．５％未満の組成物である。またさらに、さらなる一実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が２．５％未満の組成物である。よりさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が１．５％未満の組成物である。他の一実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が１．０％未満の組成物である。さらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が０．５％未満の組成物である。さらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素を実質的に含有しない組成物である。
【０１１５】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体はまた、洗浄添加剤製品に使用される。いくつかの実施形態では、低温溶液洗浄用途で使用される。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む洗浄添加剤製品を提供する。この添加剤は、さらなる漂白効果が望まれる場合の洗浄プロセスでの使用に理想的に適している。そのような例としては、限定されないが、低温溶液洗浄用途が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加剤製品の最も簡素な形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体である。いくつかの実施形態では、添加剤は、洗浄プロセスで添加するための剤形にパッケージされている。いくつかの実施形態では、添加剤は、過酸化物源が使用され、漂白効果の向上が望まれる洗浄プロセスで添加するための剤形にパッケージされている。
【０１１６】
粒状組成物用に例示される充填剤およびキャリアとしては、限定されないが、例えば、硫酸塩、炭酸塩およびケイ酸塩；タルクならびにクレーが挙げられる。液状組成物用に例示される充填剤またはキャリアとしては、限定されないが、例えば、水、またはポリオールおよびジオールを含む低分子量の第１級および第２級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、そのような充填剤またはキャリアを約５％〜約９０％含有する。そのような組成物に酸性充填剤を含有させ、洗浄方法または洗浄用途で生じる溶液ｐＨを低下させることができる。
【０１１７】
他の一実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、ゲル、錠剤、粉末、粒状、固体、液体、単位用量、およびこれらの組み合わせの形態を有する。さらに他の一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、低水量コンパクト処方、低水量ＨＤＬもしくはＵＤ、または高水量処方もしくはＨＤＬから選択される形態を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の洗浄用組成物は、単位用量形態を有する。他の実施形態では、単位用量形態は、丸剤、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、小袋、袋、多区画袋、および予め定量した粉末または液体から選択される。いくつかの実施形態では、単位用量形態は多区画袋内の成分の放出が制御されるように設計されている。好適な単位用量形態および放出制御製剤は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書；国際公開第０２／１０２９５５号パンフレット；米国特許第４，７６５，９１６号明細書；米国特許第４，９７２，０１７号明細書および国際公開第０４／１１１１７８号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、単位用量形態は、水溶性のフィルムまたは袋に含有された錠剤または粉末である。
【０１１８】
本洗浄用組成物または洗浄添加剤は、有効量の本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、単独で、または１つ以上の追加酵素と共に含む。通常、本洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、少なくとも約０．０００１重量パーセント、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、または約０．０１〜０．１重量パーセント含む。他の一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、組成物１グラム当たり、約０．０１〜約１０ｍｇ、約０．０１〜約５ｍｇ、約０．０１〜約２ｍｇ、約０．０１〜約１ｍｇ、約０．０５〜約１ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約３ｍｇ、約０．５〜約２ｍｇ、約０．５〜約１ｍｇ、約０．１〜約１０ｍｇ、約０．１〜約５ｍｇ、約０．１〜約４ｍｇ、約０．１〜約３ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約１ｍｇ、ｏｒ約０．１〜約０．５ｍｇ含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、タンパク質性の染みの除去が必要な表面の洗浄に有用または有効なものとして、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を有効量含む。
【０１２０】
本明細書中の洗浄用組成物は、通常、水による洗浄で使用している間、その洗浄水のｐＨが、約４．０〜約１１．５、または約５．０〜約１１．５、または約５．０〜約８．０、または約７．５〜約１０．５となるように調合される。液体製品配合物は、通常、約３．０〜約９．０または約３〜約５のｐＨを有するように調合される。粒状の洗濯用製品は、通常、約９〜約１１のｐＨを有するように調合される。いくつかの実施形態は、洗浄条件下においてアルカリ性のｐＨ、例えば、約８．０〜約１２．０、または約８．５〜約１１．０、または約９．０〜約１１．０のｐＨを有するように調合された１つ以上の洗浄用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、洗浄条件下において中性のｐＨ、例えば、約５．０〜約８．０、または約５．５〜約８．０、または約６．０〜約８．０、または約６．０〜約７．５のｐＨを有するように調合される。いくつかの実施形態では、中性ｐＨ条件は、洗浄用組成物を２０℃で、脱イオン水に１：１００（重量：重量）で溶解させ、従来のｐＨ計を使用して測定した場合に測定され得る。推奨される使用濃度でのｐＨの調整手法としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられるが、手法は当業者にはよく知られている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を粒状組成物または液体中で使用する場合、粒状組成物の貯蔵中に変異体を他の成分から保護するため、変異体はカプセル化した粒子の形態にあるようにすることが望ましい。さらに、カプセル化は、洗浄プロセス中における変異体の利用をコントロールする手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化は、変異体および／または追加酵素の能力を増大させる。これに関し、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、当該技術分野で知られている好適なカプセル化材でカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、通常、変異体の少なくとも一部をカプセル化する。通常、カプセル化材は水溶性および／または水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、ガラス転移温度（Ｔｇ）が０℃以上である。Ｔｇは、国際公開第９７／１１１５１号パンフレットに、より詳細に記載されている。カプセル化材は、一般に、炭水化物、天然または合成ガムキチン、キトサン、セルロースおよびセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、ならびにこれらの組み合わせから選択される。カプセル化材が炭水化物である場合、通常、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの典型的な実施形態では、カプセル化材はデンプンである（例えば、欧州特許第０９２２４９９号明細書、米国特許第４，９７７，２５２号明細書、米国特許第５，３５４，５５９号明細書および米国特許第５，９３５，８２６号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタアクリロニトリルおよびこれらの混合物などのプラスチックから作られたミクロスフェアであり、使用される市販のミクロスフェアとしては、限定されないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、およびＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ  Ｃｏｒｐ．、Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ、ＰＡ）によって提供されるものが挙げられる。
【０１２２】
種々の洗剤処方、洗浄水の容量、洗浄水の温度、および洗浄時間など、洗浄に関与するプロテアーゼが暴露される様々な洗浄条件がある。低洗剤濃度系には、洗浄水中に約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が存在する洗剤が含まれる。中洗剤濃度系には、洗浄水中に約８００ｐｐｍ〜約２０００の洗剤成分が存在する洗剤が含まれる。高洗剤濃度系には、洗浄水中に約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が存在する洗剤が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、または約２０℃〜約３０℃、または約１５℃〜約２５℃、ならびに約１５℃〜約３５℃の範囲内の他の全ての組み合わせ、および１０℃〜４０℃の全範囲の温度での洗浄に好適な「冷水洗剤」を使用する。
【０１２３】
地理的相違により、通常、水の硬度も異なっている。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を混合した、１ガロン当たりのグレインを単位として記載される。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）とマグネシウム（Ｍｇ２＋）の計測値である。米国における水の殆どは硬質であるが、硬度は異なっている。中等度の硬さ（６０−１２０ｐｐｍ）から硬質（１２１−１８１ｐｐｍ）の水は６０〜１８１ｐｐｍを有する。
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、少なくとも一組の洗浄条件下（例えば、水温、水の硬度、および／または洗剤濃度）で驚くべき洗浄能力を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗浄能力において、他のセリンプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼと同等である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、高酸化安定性、高熱安定性、種々の条件下での高洗浄能力、および／または高キレート剤安定性を示す。
【０１２６】
他の実施形態は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％の１つ以上の補助剤とを含む１つ以上の洗浄用組成物を対象としている。他の実施形態は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％の１つ以上の補助剤とを含む１つ以上の洗浄用組成物を対象としている。
【０１２７】
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体、および１つ以上の追加の酵素を含む。１つ以上の追加の酵素は、追加のセリンプロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、非セリンプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシザーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼおよびキシロシダーゼ、またはこれらの組み合わせもしくは混合物から選択される。いくつかの実施形態は、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼおよび／またはセルラーゼなどの従来の酵素を、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体、および／または１つ以上の追加セリンプロテアーゼと共に含む酵素の組み合わせ（すなわち、「カクテル」）を対象としている。
【０１２８】
他の一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体、および１つ以上の追加のプロテアーゼを含む。好適なプロテアーゼとしては、動物、野菜または微生物起源のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、微生物プロテアーゼが使用される。いくつかのの実施形態では、化学的に修飾された変異体または遺伝子操作により修飾された変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（例えば、サブチリシン、レンツス、アミロリケファシエンス、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８）が挙げられる。追加のプロテアーゼの例としては、限定されないが、国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、国際公開第２００８／０１０９２５号パンフレット、国際公開第０９／１４９２００号パンフレット、国際公開第０９／１４９１４４号パンフレット、国際公開第０９／１４９１４５号パンフレット、国際公開第１０／０５６６４０号パンフレット、国際公開第１０／０５６６５３号パンフレット、国際公開第２０１０／０５６６３５６号パンフレット、国際公開第１１／０７２０９９号パンフレット、国際公開第２０１１／１３０２２号パンフレット、国際公開第１１／１４０３６４号パンフレット、国際公開第１２／１５１５３４号パンフレット、国際公開第２０１５／０３８７９２号パンフレット、国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレット、国際公開第２０１５／０８９４４１、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号明細書、米国特許第５，８０１，０３９号明細書、米国特許第５，３４０，７３５号明細書、米国特許第５，５００，３６４号明細書、米国特許第５，８５５，６２５、再発行特許出願第３４，６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、米国特許第５，７００，６７６米国特許第６，３１２，９３６号明細書、米国特許第６，４８２，６２８号明細書、米国特許第８，５３０，２１９、米国仮特許出願第６２／１８０６７３号明細書および同第６２／１６１０７７号明細書、ならびに国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０２１８１３号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５５９００号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７４９７号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７４９２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５１２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５２６号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５２０号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５０２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２２２８２号明細書および国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第１６／３２５１４号明細書に記載のもの、さらに、国際公開第１９９９０１４３４１号パンフレット、国際公開第１９９９０３３９６０号パンフレット、国際公開第１９９９０１４３４２号パンフレット、国際公開第１９９９０３４００３号パンフレット、国際公開第２００７０４４９９３号パンフレット、国際公開第２００９０５８３０３号パンフレット、国際公開第２００９０５８６６１号パンフレット、国際公開第２０１４０７１４１０号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０３２号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０３４号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０５４、および国際公開第２０１４／１９４１１７号パンフレットに記載のメタロプロテアーゼが挙げられる。追加のプロテアーゼの例には、トリプシン（例えば、ブタもしくはウシ起源）および国際公開第８９／０６２７０号パンフレットに記載されたフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼが含まれるがそれらに限定されない。市販のプロテアーゼとしては、限定されないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬＴＭ、ＭＡＸＡＰＥＭＴＭ、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸＴＭ、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥＴＭ、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺＴＭプロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺＴＭプロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺＴＭプロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、およびＰＵＲＡＦＡＳＴＴＭ（ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）１６Ｌ、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭＴＭ、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ  ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）およびＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰＴＭおよびＢＬＡＰＴＭバリアント（Ｈｅｎｋｅｌ）；ならびにＫＡＰ（バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）サブチリシン（Ｋａｏ）が挙げられる。メタロプロテアーゼの例としては、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で発現する中性メタロプロテアーゼの組換え形であるｎｐｒＥ（例えば、国際公開第０７／０４４９９３号パンフレットを参照されたい）、およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の精製中性メタロプロテアーゼであるＰＭＮが挙げられる。
【０１２９】
他の一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のリパーゼとを含む組成物を対象としている。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のリパーゼを含む。リパーゼの例としては、限定されないが、細菌または真菌起源のものが挙げられる。リパーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により修飾された変異体であり得る。リパーゼの例としては、限定されないが、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８０６８号明細書および同第３０５２１６号明細書を参照されたい）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８０２３号明細書を参照されたい）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、例えば、カンジダ・アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、カンジダ・アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡもしくはＢ；例えば、欧州特許第２１４７６１号明細書を参照されたい）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）およびシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８２７２号明細書を参照されたい）、シュードモナス・セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１３７６号明細書を参照されたい）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号明細書を参照されたい）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：２５３−２６０［１９９３］）；バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ［例えば、ＪＰ６４／７４４９９２を参照されたい］；およびバチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第９１／１６４２２号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。クローン化リパーゼの例としては、限定されないが、ペニシリウム・カメンベルティイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０３：６１−６７［１９９１］を参照されたい）、ゲオトリクム‐カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０６：３８３−３８８［１９８９］を参照されたい）、および各種のリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼ、例えば、リゾプス・デレマール（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０９：１１７−１１３［１９９１］を参照されたい）、リゾ��ス・ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９［１９９２］）、およびリゾプス・オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼが挙げられる。クチナーゼなどの他のタイプのリパーゼポリペプチド酵素、例えば、限定されないが、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号パンフレットを参照されたい）およびフザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）由来のクチナーゼ（例えば、国際公開第９０／０９４４６号パンフレットを参照されたい）もいくつかの実施形態で使用される。市販のリパーゼの例としては、限定されないが、Ｍ１ＬＩＰＡＳＥＴＭ、ＬＵＭＡ  ＦＡＳＴＴＭおよびＬＩＰＯＭＡＸＴＭ（ＤｕＰｏｎｔ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ならびにＬＩＰＡＳＥ  ＰＴＭ（Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ）が挙げられる。
【０１３０】
さらなる一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のアミラーゼとを含む組成物を対象としている。
ある実施形態において、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のアミラーゼを含む。アルカリ性溶液中での使用に好適なアミラーゼ（例えば、アルファおよび／またはベータ）は、そのような組成物に含めるのに有用であり得る。アミラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により修飾された変異体であり得る。アミラーゼの例としては、限定されないが、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書、国際公開第９１００３５３号パンフレット、国際公開第９４０２５９７号パンフレット、国際公開第９４１８３３１４号パンフレット、国際公開第９５１０６０３号パンフレット、国際公開第９５２６３９７号パンフレット、国際公開第９５３５３８２号パンフレット、国際公開第９６０５２９５号パンフレット、国際公開第９６２３８７３号パンフレット、国際公開第９６２３８７４号パンフレット、国際公開第９６３０４８１号パンフレット、国際公開第９７１０３４２号パンフレット、国際公開第９７４１２１３号パンフレット、国際公開第９７４３４２４号パンフレット、国際公開第９８１３４８１号パンフレット、国際公開第９８２６０７８号パンフレット、国際公開第９９０２７０２号パンフレット、国際公開第９９０９１８３号パンフレット、国際公開第９９１９４６７号パンフレット、国際公開第９９２３２１１号パンフレット、国際公開第９９２９８７６号パンフレット、国際公開第９９４２５６７号パンフレット、国際公開第９９４３７９３号パンフレット、国際公開第９９４３７９４号パンフレット、国際公開第９９４６３９９号パンフレット、国際公開第００２９５６０号パンフレット、国際公開第００６００５８号パンフレット、国際公開第００６００５９号パンフレット、国際公開第００６００６０号パンフレット、国際公開第０１１４５３２号パンフレット、国際公開第０１３４７８４号パンフレット、国際公開第０１６４８５２号パンフレット、国際公開第０１６６７１２号パンフレット、国際公開第０１８８１０７号パンフレット、国際公開第０１９６５３７号パンフレット、国際公開第０２０９２７９７、ＷＯ０２１０３５５号パンフレット、国際公開第０２３１１２４号パンフレット、国際公開第２００４０５５１７８号パンフレット、国際公開第２００４１１３５５１号パンフレット、国際公開第２００５００１０６４号パンフレット、国際公開第２００５００３３１１号パンフレット、国際公開第２００５０１８３３６号パンフレット、国際公開第２００５０１９４４３号パンフレット、国際公開第２００５０６６３３８号パンフレット、国際公開第２００６００２６４３号パンフレット、国際公開第２００６０１２８９９号パンフレット、国際公開第２００６０１２９０２号パンフレット、国際公開第２００６０３１５５４号パンフレット、国際公開第２００６０６３５９４号パンフレット、国際公開第２００６０６６５９４号パンフレット、国際公開第２００６０６６５９６号パンフレット、国際公開第２００６１３６１６１号パンフレット、国際公開第２００８０００８２５号パンフレット、国際公開第２００８０８８４９３号パンフレット、国際公開第２００８０９２９１９号パンフレット、国際公開第２００８１０１８９４号パンフレット、国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレット、国際公開第２００９０６１３８０号パンフレット、国際公開第２００９０６１３８１号パンフレット、国際公開第２００９１００１０２号パンフレット、国際公開第２００９１４０５０４号パンフレット、国際公開第２００９１４９４１９号パンフレット、国際公開第２０１０／０５９４１３号パンフレット、国際公開第２０１００８８４４７号パンフレット、国際公開第２０１００９１２２１号パンフレット、国際公開第２０１０１０４６７５号パンフレット、国際公開第２０１０１１５０２１号パンフレット、国際公開第１０１１５０２８号パンフレット、国際公開第２０１０１１７５１１号パンフレット、国際公開第２０１１０７６１２３号パンフレット、国際公開第２０１１０７６８９７号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５２号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５３号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５４号パンフレット、国際公開第２０１１０８２４２５号パンフレット、国際公開第２０１１０８２４２９号パンフレット、国際公開第２０１１０８７８３６号パンフレット、国際公開第２０１１０９８５３１号パンフレット、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレット、国際公開第２０１３１８４５７７号パンフレット、国際公開第２０１４０９９５２３号パンフレット、国際公開第２０１４１６４７７７号パンフレットおよび国際公開第２０１５０７７１２６に記載されるアミラーゼなどの細菌または真菌起源のものが挙げられる。市販のアミラーゼの例としては、限定されないが、ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）およびＢＡＮＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＥＦＦＥＣＴＥＮＺＴＭＳ１０００、ＰＯＷＥＲＡＳＥＴＭ、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺＴＭＳ  １００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺＴＭＳ１１０、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺＴＭＳ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）およびＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。
【０１３１】
また、さらなる一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のアミラーゼとを含む組成物を対象としている。
ある実施形態において、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のセルラーゼを含む。好適なセルラーゼは本明細書に記載の組成物において使用され得る。セルラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により修飾された変異体であり得る。セルラーゼの例としては、限定されないが、例えば、国際公開第２００５０５４４７５号明細書、国際公開第２００５０５６７８７号明細書、米国特許第７，４４９，３１８号明細書、米国特許第７，８３３，７７３号明細書、米国特許第４，４３５，３０７号明細書；欧州特許第０４９５２５７号明細書および米国仮特許出願第６２／２９６，６７８号明細書に記載されているような細菌または真菌起源のものが挙げられる。市販のセルラーゼの例としては、限定されないが、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＮＯＺＹＭＥ（登録商標）およびＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＰＲＥＭＩＵＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺＴＭ１００、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺＴＭ２００／２２０およびＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２０００（ＤｕＰｏｎｔ）；ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）ＴＭ（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、成熟野生型または変異セルラーゼの一部または断片として組み込まれており、そこではＮ末端の一部が欠失している（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号明細書を参照されたい）。
【０１３２】
よりさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のマンナナーゼとを含む組成物を対象としているある実施形態において、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のマンナナーゼを含む。マンナナーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により修飾された変異体であり得る。マンナナーゼの例としては、限定されないが、例えば、国際公開第２０１６／００７９２９号明細書；米国特許第６，５６６，１１４号明細書、同第６，６０２，８４２号明細書および同第６，４４０，９９１号明細書：ならびに米国仮特許出願第６２／２５１５１６号明細書、同第６２／２７８３８３号明細書および同第６２／２７８３８７号明細書に記載されているような細菌または真菌起源のものが挙げられる。市販のマンナナーゼの例としては、限定されないが、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ならびにＥＦＦＥＣＴＥＮＺＴＭＭ１０００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（登録商標）Ｍ１００、ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録商標）およびＰＵＲＡＢＲＩＴＥＴＭ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。
【０１３３】
またよりさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼとを含む組成物を対象としているある実施形態において、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のペルオキシダーゼまたはオキシダーゼを含む。ペルオキシダーゼは、過酸化水素またはその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩）と組み合わせて使用してもよく、またオキシダーゼは、酸素と組み合わせて使用してもよい。ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼは、「漂白液」用に（すなわち、洗浄液中で衣類を一緒に洗った際に、１つの染色した衣類から他の衣類に織物染料が移行するのを防止するために）、単独で、または増強剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号パンフレットおよび同第９５／０１４２６号明細書を参照されたい）。ペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により修飾された変異体であり得る。ペルオキシダーゼ／オキシダーゼの例としては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、追加の酵素、例えば、限定されないが、ペルヒドロラーゼ（例えば、国際公開第２００５／０５６７８２号明細書、国際公開第２００７１０６２９３号明細書、国際公開第２００８０６３４００号明細書、国際公開第２００８１０６２１４号明細書および国際公開第２００８１０６２１５号明細書を参照されたい）が使用される。
【０１３５】
さらに他の一実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の組成物に含有される、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体、および１つ以上の追加の酵素は、それぞれ独立して、約１０％までの範囲であり、洗浄用組成物の残りは、１つ以上の補助剤である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に示す１つ以上のサブチリシン変異体は、タンパク質性の染みの除去を必要とする様々な表面の洗浄に有用な組成物に含まれる。そのような洗浄用組成物としては、硬質表面、布類および食器類の洗浄などの用途用の洗浄用組成物が挙げられる。実際、いくつかの実施形態は、布用洗浄用組成物を提供するが、他の実施形態は非布用洗浄用組成物を提供する。いくつかの実施形態はまた、口腔ケア（例えば、歯磨き剤、練り歯磨き、マウスウオッシュなど、および義歯洗浄用組成物）、皮膚および毛髪洗浄用組成物などのパーソナルケアに適した洗浄用組成物を提供する。本発明は任意の形態（すなわち、液体、粒状、棒状、半固形状、ゲル、エマルション、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含すること意図している。
【０１３７】
例として、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を使用する洗浄用組成物のいくつかを、以下により詳細に記載する。いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、洗濯機による洗浄方法において使用するために調合されており、その組成物は、少なくとも１つの界面活性剤、および少なくとも１つのビルダー化合物、ならびに有機ポリマー化合物、漂白剤、追加酵素、泡抑制剤、分散剤、汚れ懸濁剤、再付着防止剤および腐食防止剤から選択される１つ以上の補助剤を含有する。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物はまた柔軟剤（すなわち、追加の補助剤として）を含有する。
【０１３８】
本明細書に記載の組成物はまた、固体または液体形態の洗剤添加剤製品に使用される。そのような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の能力を補完および／または増強することを目的としており、洗浄プロセスの任意の段階で添加することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中の洗濯用洗剤組成物の密度は、２０℃の測定で、約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方、他の実施形態では、約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
【０１３９】
手作業による食器洗い法で使用する組成物として調合する実施形態では、組成物は、少なくとも１つの界面活性剤と、有機ポリマー化合物、起泡増強剤、第ＩＩ族金属イオン、溶剤、屈水性誘発物質溶剤および追加酵素から選択される少なくとも１つの補助剤を含有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号明細書において提供されたような各種の洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と共に使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物はコンパクトな粒状布用洗浄用組成物である。他の実施形態では、組成物は、着色した布類の洗濯に有用な粒状布用洗浄用組成物である。さらなる実施形態では、組成物は、洗浄能力によって柔軟性を提供する粒状布用洗浄用組成物である。さらなる実施形態では、組成物は、重質液状布用洗浄用組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されているような布用洗浄用組成物である。さらに、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、欧州または日本の洗浄条件下で特に有用な粒状衣類用洗剤組成物に使用される（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号明細書を参照されたい）。
【０１４１】
またさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む食器洗い用組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されているような硬質表面用洗浄用組成物である。いくつかのさらなる実施形態は、米国特許第６，３７６，４５０号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されるような、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む口腔ケア組成物を提供する。
【０１４２】
本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、任意の好適な形態に調合することができ、調合者により選択される任意の方法で調製することができる（例えば、米国特許第５，８７９，５８４号明細書、同第５，６９１，２９７号明細書、同第５，５７４，００５号明細書、同第５，５６９，６４５号明細書、同第５，５６５，４２２号明細書、同第５，５１６，４４８号明細書、同第５，４８９，３９２号明細書および同第５，４８６，３０３号明細書を参照されたい。低ｐＨ洗浄用組成物が所望される場合、そのような組成物のｐＨは、モノエタノールアミンなどの物質、またはＨＣｌなどの酸性物質を添加することによって調整される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、酸性化粒子またはアミノカルボキシルビルダーを含む。アミノカルボン酸ビルダーの例としては、アミノカルボン酸、その塩および誘導体が挙げられる。ある実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、グリシン−Ｎ、Ｎ−二酢酸、または一般式ＭＯＯＣ−ＣＨＲ−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＭ）２（式中、ＲはＣ１〜１２アルキル基であり、Ｍはアルカリ金属である）で表される誘導体などのアミノポリカルボン酸ビルダーである。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシルメチルイヌリンおよびその塩と誘導体、アスパラギン酸−Ｎ−モノ酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、ＩＤＳ（イミノ二酢酸）およびその塩と誘導体（Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）など）、アルファ−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（アルファ−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）、ならびにスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）およびそのアルカリ金属塩と誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、約４００μ〜約１２００μの重量幾何平均粒径および少なくとも５５０ｇ／Ｌのかさ密度を有する。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、少なくとも約５％のビルダーを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、有機酸および鉱酸などの任意の酸を含む。有機酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、カプリン酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、セバシン酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸およびグリコキシル酸など、１または２個のカルボキシル基を有し、場合により、最大１５個の炭素原子、特には最大１０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、酸は、クエン酸である。鉱酸としては、塩酸および硫酸が挙げられる。場合により、酸性化粒子は、アミノカルボン酸ビルダーを高濃度で含む高活性粒子である。硫酸は、さらに、最終粒子の安定性に寄与することが分かっている。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、少なくとも１つの界面活性剤および／または界面活性剤系を含み、その界面活性剤は、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、両性界面活性剤、半極性ノニオン界面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗剤組成物の約０．１重量％〜約６０重量％の濃度で含まれ、代替の実施形態では、濃度は約１重量％〜約５０重量％であり、さらに他の実施形態では、濃度は約５重量％〜約４０重量％である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、１つ以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含む。少なくとも１つのビルダーを含むいくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、ビルダーを組成物の少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％、または約５重量％〜約４０重量％含む。ビルダーとしては、限定されないが、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩およびアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩およびアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、およびカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の種々の、アルカリ金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸）、ならびにポリカルボン酸塩（例えば、メリット酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸などのポリカルボン酸、ならびにこれらの可溶性の塩が挙げられる。実際、本明細書に記載の１つ以上の実施形態では、任意の好適なビルダーが使用されると考えられる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ビルダーは、クエン酸塩、およびポリリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム６水和物、トリポリリン酸カリウム、およびミックストリポリリン酸ナトリウム・カリウムなど）などの水溶性の硬質イオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）を形成する。本明細書に記載の１つ以上の組成物には、任意の好適なビルダー、例えば、当該技術分野で知られているもの（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）が使用されると考えられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ここで使用されるビルダーとしては、リン酸塩ビルダーおよび非リン酸塩ビルダーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ビルダーはリン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは非リン酸塩ビルダーである。含まれる場合、ビルダーは、本組成物の０．１重量％〜８０重量％、５重量％〜６０重量％、または１０重量％〜５０重量％の濃度で使用される。いくつかの実施形態では、本生成物は、リン酸塩ビルダーおよび非リン酸塩ビルダーの混合物を含む。好適なリン酸塩ビルダーとしては、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩またはオリゴマーポリリン酸塩、例えば、これらの化合物のアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ビルダーは、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）であり得る。さらに、組成物は、炭酸塩および／またはクエン酸塩、好ましくは、中性ｐＨの達成を促進するクエン酸塩を含み得る。他の好適な非リン酸塩ビルダーとしては、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的に、または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸モノマー、ならびにそれらの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記化合物の塩として、アンモニウム塩、および／またはアルカリ金属塩、すなわち、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩、例えばナトリウム塩が挙げられる。好適なポリカルボン酸としては、非環式、脂環式、複素環式および芳香族のカルボン酸は挙げられ、いくつかの実施形態では、それらは少なくとも２つのカルボキシル基を含み得、それらのカルボキシル基は、いずれの場合も互いに分離され、ある場合には、２個以下の炭素原子によって分離される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、少なくとも１つのキレート剤を含む。好適なキレート剤としては、限定されないが、銅キレート剤、鉄キレート剤および／またはマンガンキレート剤、ならびにこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１つのキレート剤を使用する実施形態では、組成物は、組成物の約０．１重量％〜約１５重量％、または約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
【０１５０】
いくつかのさらに他の実施形態では、本明細書に示された洗浄用組成物は、少なくとも１つの沈澱助剤を含有する。好適な沈澱助剤としては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ炭酸塩、ポリテレフタル酸などの防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトなどのクレー、およびこれらの混合物が挙げられる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいくつかの実施形態に再付着防止剤が使用される。いくつかの実施形態では、ノニオン界面活性剤が使用される。例えば、自動食器洗いの実施形態では、表面を改質する目的で、特に、シーティングため、膜および染みの形成を避けるため、および光沢をよくするため、ノニオン界面活性剤が使用される。これらのノニオン界面活性剤はまた、汚れの再付着防止に使用される。いくつかの実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野で知られているノニオン界面活性剤である（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ノニオン界面活性剤は、エトキシ化ノニオン界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコール、およびアミンオキシド界面活性剤であり得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、１つ以上の染料移行阻害剤を含む。好適な高分子染料移行阻害剤としては、限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１つの染料移行阻害剤を使用する実施形態では、洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、または約０．１重量％〜約３重量％の染料移行阻害剤を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ケイ酸塩が、本明細書に記載の１つ以上の組成物に含まれる。このような実施形態のいくつかでは、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、および／または結晶性フィロケイ酸塩）が使用される。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は、約１％〜約２０％の濃度で含まれる。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約５重量％〜約１５重量％の濃度で含まれる。
【０１５４】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、分散剤を含有する。好適な水溶性有機材料としては、限定されないが、ホモポリマー酸もしくはコポリマー酸、またはそれらの塩が挙げられ、これらでは、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって互いに分離している少なくとも２つのカルボキシル基を含む。
【０１５５】
いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物に使用される酵素は、好適な手法によって安定化されている。いくつかの実施形態では、本発明において使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンの水溶性イオン源を存在させることによって安定化される。イオン源がそのようなイオンを酵素に供給する。いくつかの実施形態において、酵素安定化剤としては、ｔオリゴ糖類、多糖類、およびアルカリ土類金属などの無機の二価金属塩、例えばカルシウム塩、例えばギ酸カルシウムなどが挙げられる。本発明では、酵素の安定化に種々の手法が使用されると考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明において使用される酵素は、最終組成物中に亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）および／またはマグネシウム（ＩＩ）イオン、ならびに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）およびオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性イオン源を存在させることによって安定化される。イオン源がそのようなイオンを酵素に供給する。塩化物および硫酸塩も本発明のいくつかの実施形態において使用される。好適なオリゴ糖類および多糖類（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野で知られている（例えば、国際公開第０７／１４５９６４号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸およびフェニルボロン酸誘導体（例えば、国際公開第９６／４１８５９号パンフレットに記載のもの）ならびに／またはペプチドアルデヒド、例えば、さらに、国際公開第２００９／１１８３７５号パンフレットおよび国際公開第２０１３００４６３６号パンフレットに記載されているものも使用される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤および／または漂白触媒が、本明細書に記載の１つ以上の組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、無機および／または有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定されないが、過酸化水素化物の塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過酸化水素化物塩は、アルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過酸化水素化物塩は、追加の保護なしに結晶性の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、塩は被覆される。本発明では、当該技術分野で知られている任意の好適な塩が使用される（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤が、本明細書に記載の１つ以上の組成物に使用される。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度の洗浄過程で漂白作用を増大させる有機過酸前駆体である。本発明での使用に好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下において、好ましくは約１個〜約１０個、特には約２個〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸、および／または任意選択により過安息香酸を与える化合物が挙げられる。追加の漂白活性化剤は当該技術分野で知られており、本発明において使用される（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。
【０１５８】
さらに、いくつかの実施形態において、かつ本明細書にさらに記載されているように、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、少なくとも１つの漂白触媒を含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、ならびにコバルト、銅、マンガンおよび鉄の錯体が使用される。本発明では、追加の漂白触媒が使用される（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号明細書、米国特許第５，２２７，０８４号明細書、米国特許第４，８１０４１０号明細書、国際公開第９９／０６５２１号パンフレットおよび欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が本発明において使用される。いくつかの実施形態では、金属漂白触媒は、明確な漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンカチオン）、漂白触媒活性を殆どまたは全く有さない補助的金属カチオン（例えば、亜鉛またはアルミニウムカチオン）、ならびに触媒および補助的金属カチオンに対して明らかな安定化定数を有する分離剤（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｅ）（特に、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性の塩が使用される）を含む触媒系を含む（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、マンガン化合物によって触媒される。そのような化合物およびその使用濃度は当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号明細書を参照されたい）。さらなる実施形態では、コバルト漂白触媒が本明細書に記載の１つ以上の組成物において使用される。種々のコバルト漂白触媒が当該技術分野で知られており（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号明細書および同第５，５９５，９６７号明細書を参照されたい）、既知の手順で容易に調製することができる。
【０１６０】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、マクロポリサイクリックリジッドリガンド（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｇｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。現実問題として、かつ限定するものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物および洗浄プロセスは、水性洗浄媒体中に活性ＭＲＬ種を少なくとも１億分の１のオーダーで供給するように調整され、いくつかの実施形態では、水溶液中に、ＭＲＬを約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍ供給する。いくつかの実施形態では、目的の遷移金属漂白触媒中の遷移金属として、限定されないが、マンガン、鉄およびクロムが挙げられる。ＭＲＬとして、また、限定されないが、架橋されている特別のウルトラリジッドリガンド（ｕｌｔｒａ−ｒｉｇｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順で容易に調製することができる（例えば、国際公開第２０００／３２６０１号パンフレットおよび米国特許第６，２２５，４６４号明細書を参照されたい）。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は金属ケア剤を含む。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、および非鉄金属（例えば、銀および銅）などの金属の変色、腐食および／または酸化の防止および／または抑制に使用される。好適な金属ケア剤としては、欧州特許第２１００９４９号明細書、国際公開第９４２６８６０号パンフレットおよび国際公開第９４／２６８５９号パンフレットに記載のものが挙げられる）。いくつかの実施形態では、金属ケア剤は亜鉛塩である。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の金属ケア剤を約０．１重量％〜約５重量％含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ液体衣類用洗剤は、洗浄性アニオン界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルコキシル化アルキルスルフェート、アルキルホスフェート、アルキルホスホネート、アルキルカルボキシレートおよび／またはそれらの混合物の群から選択される）、および任意選択的に、ノニオン界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルコキシル化アルコールアルキル、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８エトキシル化アルキルアルコールおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含む洗浄性界面活性剤（１０重量／重量％〜４０重量／重量％）を含み得、任意選択的に、洗浄性アニオン界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）と洗浄性ノニオン界面活性剤の重量比は１：１より大きい。好適な洗浄性界面活性剤としては、また、洗浄性カチオン界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物および／またはそれらの混合物からの群から選択される）；双性および／または両性の洗浄性界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインの群から選択される）；両性界面活性剤；半極性ノニオン界面活性剤、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【０１６３】
組成物は、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（分岐親水性および疎水性を有するアルコキシル化ポリマー、例えば０．０５重量％〜１０重量％の範囲のアルコキシル化ポリアルキレンイミンの群から選択される）、および／またはランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、グリセロールなどの飽和ポリアルコール、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性骨格と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリルもしくはメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、およびこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖からなる）からなる界面活性強化ポリマーを含むことができる。
【０１６４】
組成物は、防汚ポリマー（アニオンでエンドキャップしたポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、サッカリド、ジカルボン酸、ポリオールおよびその組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含む、ランダムもしくはブロック配置のポリマー、ランダムもしくはブロック配置のエチレン−テレフタレート系ポリマーおよびそのコポリマー、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ  ＳＦ、ＳＦ−２およびＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ  ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００およびＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ  ＳＬなど）、再付着防止ポリマー（０．１重量％〜１０重量％、例えば、カルボン酸ポリマー、例えば、アクリル酸、マレイン酸（もしくは無水マレイン酸）、フマル酸、イタコン酸、少なくとも１つのモノマーを含むポリマーなど、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸メチレンマロン酸およびこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１つのモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、ならびに／またはポリエチレングリコール、分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲）；
セルロースポリマー（例えば、アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロース（その例としては、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシメチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物が挙げられる）から選択されるもの）、およびカルボン酸ポリマー（マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマーまたはポリアクリレートホモポリマーなど）などの追加のポリマーを含むことができる。
【０１６５】
組成物はさらに、飽和もしくは不飽和の脂肪酸、好ましくは、飽和もしくは不飽和の、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；沈澱助剤（その例としては、多糖類、好ましくはセルロースポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、ＤＡＤＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、イミダゾリニウムハロゲン化物およびこれらの混合物とのランダムもしくはブロック配置のコポリマー、カチオングアーガム、カチオンヒドロキシエチルセルロースなどのカチオンセルロース、カチオンデンプン、カチオンポリアクリルアミド、ならびにこれらの混合物が挙げられる）を含むことができる。
【０１６６】
組成物はさらに、その例として、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾールならびに／またはそれらの混合物が挙げられる染料移行阻害剤；その例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、またはメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸、およびそれらの塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、およびそれらの誘導体が挙げられるキレート剤が含むことができる。
【０１６７】
組成物は、任意選択により、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスフォリパーゼ、リソホスフォリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、およびこれらの混合物から選択される酵素（一般に、活性酵素約０．０１重量％〜活性酵素０．５重量％）を含むことができる。組成物は、酵素安定化剤（その例としては、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤，、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、または４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含むことができる。
【０１６８】
組成物はさらに、シリコーンまたは脂肪酸をベースとした泡抑制剤；色相染料、カルシウムカチオンおよびマグネシウムカチオン、視覚信号成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、ならびに／または構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリドおよびトリグルセリド、ジステアリン酸エチレングリコール、微結晶性セルロース、セルロース系材料、極細繊維セルロース、生体高分子、キサンタンガム、ゲランガム、およびこれらの混合物からなる群から選択される）を含むことができる。
【０１６９】
組成物は、任意の液状形態、例えば、液体もしくはゲルの形態、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、単位用量形態、例えば、錠剤、カプセル剤、小袋、袋および多区画袋で提供される。いくつかの実施形態では、単位用量形態は、多区画袋（または他の単位用量形態）内の成分の放出が制御されるように設計されている。好適な単位用量形態および放出制御形態は、当該技術分野で知られている（単位用量形態および放出制御形態での使用に好適な材料について、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書、国際公開第０２／１０２９５５号パンフレット、米国特許第４，，７６５９１６号明細書、米国特許第４，９７２，０１７号明細書および国際公開第０４／１１１１７８号パンフレットを参照されたい）。いくつかの実施形態では、単位用量形態は、水溶性フィルム包んだ錠剤、または水溶性の袋で提供される。様々な単位用量形態が、欧州特許第２１００９４７号明細書および国際公開第２０１３／１６５７２５号パンフレットに示されており、当該技術分野で知られている。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、変異型セリンプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼを含む高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末衣料用洗剤は、洗浄性アニオン界面活性剤（例えば、直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルコキシル化アルキルスルフェート、アルキルホスフェート、アルキルホスホネート、アルキルカルボキシレートおよび／またはそれらの混合物）、洗浄性ノニオン界面活性剤（例えば、直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換のＣ８〜Ｃ１８エトキシル化アルキルアルコールおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、洗浄性カチオン界面活性剤（例えば、（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物およびそれらの混合物）、双性および／または両性の洗浄性界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）；両性界面活性剤；半極性ノニオン界面活性剤、ならびにそれらの混合物を含む洗浄性界面活性剤；ビルダー（リン酸塩非含有ビルダー（例えば、ゼオライトビルダー［その例として、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰおよびゼオライトＭＡＰが挙げられる（０ｗｔ％から１０重量％未満の範囲）］；リン酸塩ビルダー［その例として、トリポリリン酸ナトリウムが挙げられる（０重量％から１０重量％未満の範囲）］；クエン酸、クエン酸塩、およびニトリロ三酢酸またはその塩（１５重量％未満の範囲）；ケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウムもしくはケイ酸カリウム、またはメタケイ酸ナトリウム（０重量％から１０重量％未満の範囲）あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））；炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムおよび／または重炭酸ナトリウム（０重量％から１０重量％未満）；ならびに漂白剤（例えば、フォトブリーチ（例えば、スルホン化亜鉛フタリシアニン、スルホン化アルミニウムフタリシアニン、キサンテン染料、およびそれらの混合物）；疎水性もしくは親水性漂白活性化剤（例えば、ドデカノイルオキベンゼンスルホネート、デカノイルオキベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸もしくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、およびノナノイルオキシベンゼンスルホネート、ニトリル第四級物、およびそれらの混合物）；過酸化水素源（例えば、無機過酸化水素化物塩（その例としては、過ホウ酸のナトリウム塩のモノもしくはテトラ水和物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩または過ケイ酸塩）；疎水性および／もしくは親水性プリフォーム過酸（例えば、過カルボン酸およびその塩、過炭酸およびその塩、過イミド酸およびその塩、過硫酸およびその塩）、およびそれらの混合物、ならびに／または漂白触媒（例えば、イミン漂白促進剤（例えば、イミニウムカチオンおよびポリイオン）；イミニウム双性イオン；変性アミン；変性アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；ペルフオロイミン；環状糖ケトンおよびそれらの混合物；ならびに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンカチオンと、亜鉛またはアルミニウムなどの補助的金属カチオン、およびエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、それらの水溶性の塩などの分離剤（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｅ）との併用）を含むことができる。
【０１７２】
組成物はさらに、酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ，セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスフォリパーゼ、リソホスフォリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、およびこれらの混合物を含み得る。
【０１７３】
組成物はさらに、追加の洗剤成分、例えば、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤、布インテグリティおよびカチオンポリマーを含む追加ポリマー、ダイロック成分、布柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、アルコキシル化ポリアミン、布用沈澱助剤および／またはシクロデキストリンを含み得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本発明のセリンプロテアーゼを含む自動食器洗い（ＡＤＷ）用洗剤組成物である。ＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で含まれる、エトキシル化ノニオン界面活性剤、アルコキシル化アルコール界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコールまたはアミンオキシド界面活性剤の群から選択される２つ以上のノニオン界面活性剤；リン酸塩（モノリン酸塩、ジリン酸塩、トリポリリン酸塩、もしくはオリゴマーポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ）、またはリン酸非含有ビルダー［アミノ酸をベースとした化合物（その例としては、ＭＧＤＡ（メチル−グリシン−二酢酸）、およびその塩と誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ、Ｎ二酢酸）およびその塩と誘導体、ＩＤＳ（イミノジコハク酸）およびその塩と誘導体、カルボキシメチルイヌリン、およびその塩と誘導体、およびそれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）およびそれらの塩が挙げられる）］、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的に、または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸モノマー、ならびにそれらの塩（０．５重量％〜５０重量％の範囲で）を含む５〜６０％の範囲のビルダー；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を付与する）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥助剤（ポリエステル、特に、アニオンポリエステル（任意選択により、縮重合に資する３〜６価のモノマー、特に官能性の酸、アルコールまたはエステルさらに含む）、ポリカーボネート−、ポリウレタン−および／またはポリウレア−ポリオルガノシロキサン化合物もしくは反応性環状炭酸塩およびウレア型のその前駆体化合物から選択される）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウムまたはケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウムおよび結晶性フィロケイ酸塩）；無機漂白剤（例えば、過酸化水素化物の塩、例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）、および有機漂白剤（例えば、有機ペルオキシ酸、例えば、ジアシルおよびテトラアシルペルオキシド、特に、ジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸およびジペルオキシヘキサデカン二酸）；漂白活性化剤−約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆体；漂白触媒（マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、ＭｎおよびＦｅビスピリジルアミンおよび関連錯体、ならびにペンタアミンアセテートコバルト（ＩＩＩ）および関連錯体から選択される）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属ケア剤（ベンゾトリアゾール、金属塩および錯体、ならびに／またはケイ酸塩から選択される）；自動食器洗い用洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（アシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１、４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼおよびキシロシダーゼ、ならびにこれらの混合物）；ならびに酵素安定化成分（オリゴ糖類、多糖類、および無機の二価金属塩から選択される）を含むことができる。
【０１７５】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含み得る代表的な洗剤配合物は、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレット、第７８〜１５２頁、特に第９４〜１５２頁の表に見出すことができる。酵素タンパク質であるセリンプロテアーゼは、通常、洗浄用組成物に、組成物の０．００００１重量％〜１０重量％配合される。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の０．０００１重量％超、０．００１重量％超、０．０１重量％超または０．１重量％超のセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の１重量％未満、０．１重量％未満、０．０１重量％未満または０．００１重量％未満のセリンプロテアーゼを含む。
【０１７６】
また、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を用いて、布を処理する（例えば、織布の糊抜きするため）組成物および方法も提供される。布の処理方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照されたい）。例えば、布の感触および外観は、布を溶液中でセリンプロテアーゼと接触させることを含む方法によって改善することができる。布は、加圧下で溶液により処理することができる。
【０１７７】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、布を織っている間、もしくは織りあげた後、または糊抜き段階、もしくは１工程以上の追加の布加工工程で適用することができる。布を織っている間、糸はかなり強い機械的歪みを受ける。織機で織る前に、多くの場合に縦糸をサイジング用デンプンまたはデンプン誘導体で被覆し、引張強さを増大させて破断を防止する。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、追っている間、または織りあげた後に、これらのサイジング用デンプンまたはデンプン誘導体を除去するために適用することができる。織った後、さらに、布が均質で洗浄に耐えるものであることを確かなものにする加工を行う前に、サイズコーティングを除去するために、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体が使用される。
【０１７８】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、布例えば、綿含有布などの布の糊抜きのために、単独で、または他の糊抜き用薬剤および／または他の糊抜き用酵素と共に、例えば、水性組成物中に洗剤添加剤として使用することができる。インジゴ染色デニム布および衣服上にストーンウォッシュ外観を作り出すための組成物および方法にアミラーゼも使用することができる。衣類の製造のために、布を切断し、衣類または衣服に縫製することができる。それらには、その後、仕上げ処理が行われる。特に、デニムジーンズを製造するために、様々な酵素による仕上げ法が開発されている。デニム衣服の仕上げは、通常、酵素による糊抜きで始まり、その間、衣服はタンパク質分解酵素の作用を受け、布に軟らかさが付与され、綿は、その後の酵素による仕上げ工程がより受けやすくなる。セリンプロテアーゼは、デニム衣服の仕上げ（例えば、バイオストーニングプロセス）、酵素による布の糊抜きおよび柔軟性の付与、ならびに／または仕上げプロセスの各方法において使用することができる。
【０１７９】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、さらに、動物、およびそれらの続く分解物または処理物、例えば、羽毛、皮膚、毛髪、皮などからのタンパク質の酵素による除去に使用される。ある場合には、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む溶液に動物の死骸を浸漬することにより、伝統的な熱湯への浸漬または羽毛の除去プロセスと比べて皮膚の損傷を防止することができる。ある実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、羽毛の消化または羽毛の分解開始に適した条件下で羽毛に噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、上記のように、酸化剤と組み合わせて使用することができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、原羽毛に付着した油または脂肪の除去が、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体に使用によって促進される。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、羽毛の洗浄、ならびに繊維の清浄および部分的脱水のための組成物に使用される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、羽毛からのタンパク質の回収に使用される。いくつかの他の実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、９５％のエタノールまたは他の有機溶媒を含み、約０．５体積／体積％の界面活性剤を含むか、または含まない洗浄液に適用される。さらに他の実施形態では、開示したプロテアーゼポリペプチドは、羽毛からのタンパク質の回収に使用される。開示したプロテアーゼポリペプチドは、単独で、または好適な羽毛加工法もしくはタンパク質分解法、例えば国際出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６２号明細書、国際出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６３号明細書、および国際出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６４号明細書（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、回収したタンパク質は、その後、動物または魚の餌料に使用することができる。
【０１８１】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、動物用餌料組成物、動物用餌料添加剤および／またはペットフードの成分として使用することができる。他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を、１つ以上の動物用餌料成分および／または動物用餌料添加剤成分および／またはペットフード成分と混合することを含む、そのような動物用餌料組成物、動物用餌料添加剤組成物および／またはペットフード組成物の調製方法に関する。さらに、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、動物用餌料組成物および／または動物用餌料添加剤組成物および／またはペットフード組成物の調製に使用することができる。
【０１８２】
「動物」という用語は、非反芻動物および反芻動物の全てを含む。特定の実施形態において、動物は、ウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、限定されないが、子ブタ、成長ブタ、雌ブタなどのブタ類；ダチョウ、アヒル、ニワトリ、ブロイラー、産卵ニワトリなどの家禽類、サケ、マス、テラピア、ナマズ、コイなどの魚類、およびシュリンプ、クルマエビなどの甲殻類が挙げられる。さらなる実施形態において、動物は、反芻動物、例えば、限定されないが、ウシ、若ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリキン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン、二ルガイである。
【０１８３】
本文脈では、「ペットフード」という用語は、家庭で飼う動物、例えば、限定されないが、イヌ、ネコ、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；カナリヤ、インコおよびオウムなどの鳥のペット；カメ、トカゲおよびヘビなどの爬虫類のペット；ならびに熱帯魚およびカエルなどの水生ペットのための飼料を意味すると解されるものとする。
【０１８４】
「動物用餌料組成物」、「飼料」および「飼い葉」という用語は、互換的に使用され、ａ）穀物、例えば、小穀類（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびこれらの組み合わせ）および／または大穀類、例えばトウモロコシまたはソルガム；ｂ）穀物からの副産物、例えば、コーングルテンミール、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシをベースとした穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、ふすま、シャープス、ホイートショーツ（ｗｈｅａｔ  ｓｈｏｒｔｓ）、米ぬか、籾殻、カラスムギの殻、オイルやしの種、および柑橘パルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ハウチワマメ、エンドウマメ、ソラマメ、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエー、コプラ、ゴマなどのソースから得られたタンパク質；ｄ）野菜および動物源から得られた油脂類；ｅ）ミネラル類およびビタミン類を含む群から選択される１つ以上の餌料材料を含み得る。
【０１８５】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、メカニカルパルプ、亜硫酸塩法により製造されたパルプなどの紙パルプの酵素による漂白に使用される。一般的には、紙パルプは、紙パルプの漂白に好適な条件下で、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体とインキュベートする。いくつかの実施形態では、パルプは、酸素、オゾン、過酸化物またはペルオキシ酸で漂白された、塩素を含まないパルプである。いくつかの実施形態では、サブチリシン変異体は、低リグニン量を示す改良または連続蒸開法によって製造されたパルプの酵素による漂白に使用される。いくつかの他の実施形態では、サブチリシン変異体は、単独で、あるいは好ましくはキシラナーゼ酵素および／またはエンドグルカナーゼ酵素および／またはアルファ−ガラクトシダーゼ酵素および／またはセロビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて使用される。
【０１８６】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、さらに、酵素による組織の創傷清拭に使用される。これは、壊死または損傷した組織の除去、例えば、回復を促進するための創傷からの除去を含む。
【０１８７】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、さらに、組織培養に使用される。特に、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、細胞を採集する工程などで、細胞培養壁に付着した細胞を懸濁または再懸濁させるために使用することができる。培養細胞と皿との間のタンパク質の結合を切断して、細胞の溶液中への懸濁を可能にするために、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を使用することができる。
【０１８８】
本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、さらに、食品添加剤、消化剤または食品加工助剤として使用される。
【実施例】
【０１８９】
本開示の好ましい実施形態および態様を示し、説明するために以下の実施例を提示するが、これを限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１９０】
以下の実験の開示では、次の省略形を用いる：ＡＤＷ（自動食器洗い）；ＢＭＩ（血液、牛乳およびインク）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）；ＣＨＥＳ（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）；ＤＭＣ（ジメチルカゼイン）；ＨＤＤ（強力ドライ用／粉末）；ＨＤＬ（強力液体）；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）；ＮＤ（実施せず）；ＯＤ（光学濃度）；ＰＡＳ（ポリアクリルスウォッチ（ｓｗａｔｃｈ））；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ｐｐｍ（百万分率）；ＱＳ（十分量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ＡＡＰＦ（スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド）；ＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）；ｖ／ｖ（対体積体積）；ｗ／ｖ（対体積重量）。
【０１９１】
実施例１
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの非相同発現
確立された分子生物学的手法を用いて、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンを生成する操作を行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。後の実施例に記載のようにして、全てのサブチリシンを発現させ、回収した。成熟バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン配列をコードする、一連の人口ＤＮＡ配列（これは野生型バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢｇｉ０２４４６プロテアーゼの配列に複数のアミノ酸改変を導入する）を生成させた（野生型プロテアーゼについては、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０７０１０７号明細書に、またＡｐｒＢＧとしてはＤｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）、２４（２）、１９７−１９８（アクセッション番号ＡＧＳ７８４０７．１）に、より詳細な記載がある）。
【０１９２】
実施例２
野生型Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列またはバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンのプロペプチド配列のいずれかを用いた、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレード成熟ＢＳＰ−００８０１の発現
バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロ配列（配列番号５）のコントロール下に発現させた、加工成熟酵素ＢＳＰ−００８０１をキャラクタライズし、アミノ酸配列がＮ末端にＱＱを有する２６９個のアミノ酸であることを示した（アミノ酸配列については配列番号１８、ヌクレオチド配列については配列番号１５）。Ｂｇｉ０２４４６プロ配列（配列番号４）のコントロール下に発現させた、加工成熟酵素ＢＳＰ−００８０１をキャラクタライズし、アミノ酸配列がＮ末端に単一のＱを有する２６８個のアミノ酸であることを示した（配列番号２０）。プレプロ酵素ＢＳＰ−００８０１のアミノ酸配列は配列番号１６である。プロ酵素のアミノ酸配列は配列番号１７である。
【０１９３】
バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロ配列（配列番号５）のコントロール下に発現させた、加工成熟酵素Ｂｇｉ０２４４６をキャラクタライズし、アミノ酸配列がＮ末端にＱＱを有する２６９個のアミノ酸であることを示した（配列番号８５）。Ｂｇｉ０２４４６プロ配列（配列番号４）のコントロール下に発現させた、加工成熟酵素Ｂｇｉ０２４４６をキャラクタライズし、アミノ酸配列がＮ末端に単一のＱを有する２６８個のアミノ酸であることを示した（配列番号１９）。
【０１９４】
表３、４および５に同定されている加工成熟酵素のアミノ酸配列は、Ｂｇｉ０２４４６プロ配列のコントロール下に発現させたものであり、ＢＰＮ’（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１１：７９１１−２５）およびＰＢ９２プロテアーゼ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５７：９０１−９０９）などの相同セリンプロテアーゼの未成熟ジャンクションに関する知識に基づき、Ｎ末端にＱＱＴＶＰを有する２６９個のアミノ酸であると推測したが、替りにＱＹＶＰが観察された。
【０１９５】
実施例５で使用する加工成熟酵素ＢＳＰ−００８０１（配列番号１８）は、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロ配列（配列番号５）のコントロール下に、以下の方法に従って発現させた。２０１５年６月１７日出願の米国仮特許出願第６２／１８１１９２号明細書（代理人整理番号４０９４７）に、Ｂｇｉ０２４４６プロ配列およびバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロ配列を経由してＢＳＰ−００８０１成熟酵素を発現させる方法のより詳しい説明がある。
【０１９６】
表１に掲げたプライマーを使用して増幅することにより、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド配列（ヌクレオチド配列については配列番号２、アミノ酸配列については配列番号３）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６（配列番号４）またはバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）（配列番号５）のいずれかのプロ配列およびバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１への遺伝子に対応する配列（配列番号６）を含むＤＮＡカセットを合成した。当業者に知られている手法を用い、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＳＧＩ  ＤＮＡ  Ｃａｔ＃  ＧＡ１１００−１０）によりＰＣＲフラグメントをアセンブルして最終の発現カセットを作成した。細胞を形質転換し、クロラムフェニコール選択下、スキムミルクプレート上で培養した。
【０１９７】
【表２】
2018521646.tif 000003
【０１９８】
表３、４および５に示したバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド配列（配列番号３）、Ｂｇｉ０２４４６プロ配列、人口配列毎の成熟プロテアーゼ配列およびａＢＰＮ’ターミネーターからなる発現カセットを用いてバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に生成させた。各発現カセットをｐＨＹＴ複製型シャトルベクターにクローン化し、適切なバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に導入した。ｐＨＹＴベクターは、ＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用してテトラサイクリン耐性遺伝子の後ろにターミネーター（配列番号１３）を加えることによりｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）から得た。ｐＨＹ３００ＰＬＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位も、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化したリンカー（配列番号１４）を使用して削除した。
【０１９９】
表３、４および５に示したバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンを生成させるために、尿素を主な窒素源とし、グルコースを主な炭素源とし、頑健な細胞増殖のために１％ソイトンを追加した、ＭＯＰｓバッファーベースの強化半合成培地において、各種ｐＨＹＴプラスミドで形質転換されたバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株を培養した。インキュベーション後、遠心分離およびろ過により、分泌されたプロテアーゼを培地から分離した。清澄化した培養物上清を、後述のように試験および精製に使用した。
【０２００】
実施例３
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンのプロテアーゼ活性
表３、４および５に示したＢｇｉ０２４４６およびバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンのプロテアーゼ活性を、ジメチルカゼイン（ＤＭＣ）基質の加水分解を測定することにより試験した。ＤＭＣ試験に使用した試薬溶液は、１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．５中に２．５％ｗ／ｖのＤＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、試薬Ａ中に０．０７５％のＴＮＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。試薬Ａ：１５ｍＬの４Ｎ  ＮａＯＨ中に４５．４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２０（Ｍｅｒｃｋ）を加え、脱イオン水で最終容量を１０００ｍＬにしたもの。プロテアーゼ上清は希釈溶液で希釈した：１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０で、５分間の加水分解期間中、直線的な応答を得るのに必要な濃度にまで希釈。Ａ９６−ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を９５μｌのＤＭＣ基質で満たし、次いで５μｌの希釈プロテアーゼ上清を加えた。その後、穏やかに撹拌しながら、試薬Ａ中のＴＮＢＳＡ１００μＬを加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動力学モードで使用して、４０５ｎｍで５分間、室温で活性を測定した。各試料の読み取り値から、プロテアーゼを含有しないブランクの吸収を減じた。プロテアーゼ活性はｍＯＤ／ｍｉｎで表した。
【０２０１】
Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン（ＤＭＣ）の加水分解を測定することにより、表７に示したＢｇｉ０２４４６ａｎｄおよびバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンのプロテアーゼ活性を試験した。ＡＡＰＦの加水分解試験に使用した試薬溶液は：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有する、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．６、（トリス希釈バッファー）；１０ｍＭのＣａＣｌ２および０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有する１００ｍＭのトリスバッファー  ｐＨ８．６（トリス／Ｃａバッファー）；ならびにＤＭＳＯ中１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。試験用基質溶液の調製には１００ｍｌのＴｒｉｓ／Ｃａバッファーに１ｍｌのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液を加え、十分に混合した。１ｍｇ／ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ試験用溶液を含有するＭＴＰプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ７８１１０１）に酵素試料を加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動力学モードで使用し、４０５ｎｍで３分間、室温で活性を試験した。各試料の読み取り値から、プロテアーゼを含有しないブランクの吸収を減じた。プロテアーゼ活性はｍＯＤ・ｍｉｎ−１で表した。
【０２０２】
実施例４
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの洗浄性能および安定性の測定
Ｚｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ３カラムを用いたＵＨＰＬＣにより、培養物上清中のプロテアーゼ濃度を決定した。培養物上清を希釈バッファー（トリス２５ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ２）により適度に希釈した。バッファーＡ（０．１％トリフルオロ酢酸）とバッファーＢ（０．０７％アセトニトリル）の勾配を有するカラムにより、試料を溶離させた。精製親酵素の標準曲線に基づき、試料のタンパク質濃度を計算した。
【０２０３】
各バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼの洗浄性能を、ＧＳＭ−Ｂ処方（表２参照）、ｐＨ１０．５および卵黄マイクロスウォッチ（ＰＡＳ−３８、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、皿に適用（ＡＤＷ）して測定した。予め型に切り取り、ＡＤＷ性能試験に使用したＰＡＳ−３８スウォッチは、濯ぎを行ったものもあれば、行わなかったものもある。濯ぎを行ったＰＡＳ３８スウォッチを調製するには、１０ｍＭのＣＡＰＳバッファー１８０μｌ、ｐＨ１１をＰＡＳ３８マイクロスウォッチを含有するＭＴＰに加えた。プレートに封をし、ｉＥＭＳインキュベータ内において６０℃、振盪速度１１００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、バッファーを除去し、スウォッチを脱イオン水で濯ぎ残留バッファーを除去した。プレートを空気乾燥させ、性能試験に供した。酵素を添加する前に、硬度３７４ｐｐｍの水に溶解した３ｇ／ｌのＧＳＭ−Ｂ溶液でマイクロスウォッチプレートを満たした。
【０２０４】
ＢＭＩマイクロスウォッチ（綿布に血液／牛乳／インク）（ＥＭＰＡ−１１６、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、各バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼの洗濯物（ＨＤＬ）洗浄性能を試験した。予め型に切り取り（ＭＴＰに合わせるために）、浸漬したマイクロスウォッチを含有するプレートを使用した。酵素を加える前に、マイクロスウォッチプレートを硬度２５０ｐｐｍの水に溶解した２．７ｇ／ｌのＰｅｒｓｉｌ  Ｎｏｎ−Ｂｉｏ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）液体洗剤で満たした（この洗剤はホウ素または酵素を含有しない市販の液体洗剤であり、この試験で使用するために購入した）。
【０２０５】
インキュベーション（ＰＡＳ−３８スウォッチは４０℃で３０分間インキュベートし、ＥＭＰＡ１１６スウォッチは２５℃で１５分間インキュベートした）に引き続き、ＥＭＰＡ−１１６およびＰＡＳ−３８スウォッチについて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで吸収を読み取った。各試料の値からブランクコントロール（無酵素）の値を減じて吸収結果（以下、「ブランク減算吸収」）を得た。各条件および各バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼについて、ブランク減算吸収を同一条件の親プロテアーゼのそれで除すことにより性能指数（ＰＩ）を計算した。この試験に含め、また、ラングミュア式またはＨｉｌｌシグモイド式にフィッティングした、親プロテアーゼの標準曲線から、親プロテアーゼの値を決定した。
【０２０６】
【表３】
2018521646.tif 000004
【０２０７】
安定性の測定のために、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼをストレスバッファーで適切に希釈した。続いて、実施例３に記載したＤＭＣ試験を用い、熱インキュベーション工程の前後でプロテアーゼのタンパク質分解活性を測定した。熱インキュベーション工程の温度および時間は、参照用プロテアーゼの残留活性が約３０％になるように選択した。トリス−ＥＤＴＡ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ９；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．００５％Ｔｗｅｅｎ）緩衝条件で安定性を測定した。ストレス無負荷の活性に対するストレス負荷活性の比を取り、１００を乗じることにより残留活性の％を計算したバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼの残留活性を、親プロテアーゼのそれで除すことにより安定性ＰＩを得た。
【０２０８】
表４に示すバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンを親プロテアーゼとして用い、また、その後の変異誘発に供して表５に示すＢＳＰ−００８０１の変異体を得た。以下の表中に使用されているＮＤは未決定を意味する。
【０２０９】
【表４】
2018521646.tif 000005
【０２１０】
【表５】
2018521646.tif 000006
【０２１１】
【表６】
2018521646.tif 000007
【０２１２】
【表７】
2018521646.tif 000008
【０２１３】
【表８】
2018521646.tif 000009
【０２１４】
【表９】
2018521646.tif 000010
【０２１５】
【表１０】
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【０２１６】
【表１１】
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【０２１７】
【表１２】
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【０２１８】
【表１３】
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【０２１９】
【表１４】
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【０２２０】
【表１５】
2018521646.tif 000016
【０２２１】
実施例５
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１の結晶学的構造
バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロ配列のコントロール下、実施例１および２に記載の方法に従って、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１を生成させた。
【０２２２】
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１の精製のために、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭのＭＥＳに対して培養物上清を透析した。その後、試料をろ過し、２５ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．４および１ｍＭの塩化カルシウムで平衡化したアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳ）に供した。塩化ナトリウムの直線的な勾配により、タンパク質を溶離した。目的のタンパク質を単離し、最終濃度が４０％になるまでプロピレングリコールを加えた。
【０２２３】
Ｘ線結晶学により、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１（配列番号１８）の３次元構造を決定した。ＢＳＰ−００８０１サブチリシンの構造は、単位格子の寸法が２．５Åの分解能でａ＝７５．１９、ｂ＝７５．１９、ｃ＝２０２．３Åおよびγ＝１２００の非対称ユニット中に１分子を有する空間群Ｐ６１２２内で決定された。２５ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．４＋１ｍＭの塩化カルシウム＋４０％のプロピレングリコール溶液中２２．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質で開始した、水滴法により結晶を得た。リザーバー溶液には、２．０Ｍの硫酸アンモニウム＋５％のイソプロパノールを含有させた。等量のタンパク質溶液とリザーバーとを混合し、平衡化させた。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘ８  Ｐｒｏｔｅｕｍシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｘｉｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によりデータを収集した。開始モデルとして、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンすなわちｐｄｂ登録名１ＪＥＡの座標による分子置換を用いて構造を決定した。プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ、Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６４８６−５０１、２０１０）を使用して、得られた電子密度内でＢＳＰ−００８０１の座標をフィッティングした。フィッティングおよび再フィッティングによる修正後、ＣＣＰ４ソフトウェアスイートのＲＥＦＭＡＣプログラムを使用し、標準のデフォルトを用いて座標の精密化を行った。最終モデルは良好な立体化学を表しており、２．５Åまでの全てのデータでＲ−ｗｏｒｋは０．１９でありＲ−ｆｒｅｅは０．２５であった。
【０２２４】
図１で、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１の構造を、別の市販サブチリシン：サブチリシンＢＰＮ’およびバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンの主鎖の折り畳みと比較する。構造は、共通の触媒三連構造（ＢＳＰ−００８０１の場合、残基Ａｓｐ３２、Ｈｉｓ６２およびＳｅｒ２１５に対応）を有しており相同である。
【０２２５】
親バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢｇｉ０２４４６に対して、ＢＳＰ−００８０１変異体に存在する置換（Ａ３７Ｔ／Ｎ；Ｓ３９Ｅ；Ｉ４３Ｖ；Ａ４７Ｖ；Ｉ８０Ｖ；Ｎ８５Ｓ；Ｅ８７Ｄ；Ｓ９９Ｒ；Ｔ１１４Ａ；Ｆ１２８Ａ）を図２に示す。これらの置換は構造中の２つの領域に分布することが分かった。大部分のサブチリシンと同様、ＢＳＰ−００８０１は２つのカルシウム結合部位を有する。第１の部位は非常に高い親和性を有するという特性を示し、洗剤中の分子の安定性に関係している。Ｂｇｉ０２４４６と比較すると、ＢＳＰ−００８０１で見られた１０個の置換中の８個は、図２に示すように、強固な結合部位を形成する輪の上、すなわちこのカルシウム部位から拡がっている表面に沿って存在している。直前に述べた表面は、次の残基を含む一連の外側の輪からなる：２５−２７、３７−４３、４７−４８、５５−５７、７２−７４、８５−８７および１１４−１１７。サブサイトＳ４−Ｓ１に対応する基質結合領域の３つの輪、これらはＢＳＰ−００８０１の次の残基に対応する：９７−１０２、１２４−１３０および１５４−１６１。他の２つの置換、Ｓ９９ＲおよびＦ１２８Ａは、図３に示すようにこれらの輪のうちの２つの上に見出される。
【０２２６】
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢＳＰ−００８０１変異体の性能をさらに向上させる別の部位が同定され、これらの部位の６ヶ所は先に同定した２つの領域に沿って均等に分布していることが分かる。図４は比較を容易にするために図２と同じ向きにしてある。図４では、元の１０の置換は明灰色で示し、追加された６つの部位における残基の側鎖は黒色の枝で示してある。部位Ｎ４２Ｔ、Ｓ５６ＹおよびＮ７４Ｄは、ＢＳＰ−００８０１置換の８つが見出されるのと同じ表面に沿って存在する。図５は、３つの追加された部位、Ｖ１０２Ｉ、Ｓ１２６ＴおよびＳ１５８Ｔとの比較のために、Ｎ７４Ｄを見ることができる図３と類似の表示であり、追加部位はサブサイトＳ４−Ｓ１を形成する輪の上に見出される。
【０２２７】
上で述べた領域では見出されない、追加の置換の１つを図１３に示す。この図では、Ｎ２４２Ｄ置換の位置が、この向きで見られるいくつかの他の部位と相対的に見ることができる。驚くべきことに、この部位は、基質結合表面および第一カルシウム結合部位近傍の表面からはるかに離れて存在する。それは第２カルシウム結合部位のより近傍に見出される。
【０２２８】
実施例６
相同プロテアーゼの同定
ＢＳＰ−００８０１（配列番号１８）の予測成熟形態アミノ酸配列（２６９個の残基）を、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベースに対してＢＬＡＳＴサーチ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５：３３８９−４０２、１９９７）に供した。検索パラメータ既定値に設定し、クエリー配列として配列番号１８を使用した類似の検索をＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅに対して行った。検索結果のサブセットを表６−１および６−２に示す。両検索セットに対する同一性パーセント（ＰＩＤ）は、同一残基の数をペアワイズアライメントにおける整列残基の数で除した値で定義される。「配列長」の名前が付された列は、記載されたアクセッション番号に関するタンパク質配列の長さ（アミノ酸の数で）であり、「アライメントの長さ」の名前が付された列はアライメントされたタンパク質配列の長さ（アミノ酸の数で）であり、これはＰＩＤの計算に使用した。
【０２２９】
【表１６】
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【０２３０】
【表１７】
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【０２３１】
実施例７
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの配列分析
表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン予測成熟形態アミノ酸配列；国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０７０１０７号明細書で開示されたバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６；ならびに表６−１および６−２に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを図６Ａ〜Ｆに示す。表４のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン予測成熟形態アミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６；および表６−１に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを図７Ａ〜Ｆに示す。表５の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異体サブチリシン予測成熟形態アミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６；および表６−１に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列のアライメントを図８Ａ〜Ｆに示す。配列は、既定値のパラメータを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３−４６８０、１９９４）によりアライメントした。
【０２３２】
図９に記載の系統樹は、表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン予測成熟形態のアミノ酸配列；国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０７０１０７号明細書で開示されたバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６；ならびに表６−１および６−２に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列を使用して作成した。図９から分かるように、表３のサブチリシンは、国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットで開示された、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードを形成するＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６サブチリシンと同じ領域に群をなして存在しており、したがって表３のサブチリシンは、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードの一部である。
【０２３３】
図１０に記載の系統樹は、表４のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン予測成熟形態のアミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６；および表７−１に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列を使用して作成した。図９および図１０から分かるように、表４のサブチリシンは、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６サブチリシンと同じ領域に群をなして存在しており、したがって表４のサブチリシンは、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードの一部である。
【０２３４】
図１１に記載の系統樹は、表５の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異体サブチリシン予測成熟形態のアミノ酸配列；バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＢｇｉ０２４４６；および表７−１に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列を使用して作成した。図９および図１１から分かるように、表５のサブチリシンは、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６サブチリシンと同じ領域に群をなして存在しており、したがって表５のサブチリシンは、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードの一部である。表５の全バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異体サブチリシンの系統樹が作成されたとき、それらは全てバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードの一部であった（データは示さず）。
【０２３５】
配列をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅスイートに入力し、近隣結合法（ＮＪ）法（齋藤および根井、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ、４：４０６−４２５、１９８７）を使用してガイドツリーを作成した。ＮＪ法は分析する全ての配列ペア間の距離マトリックスを使って動作する。これらの距離は、配列間の相違度に関係する。樹形図は配列アライメントが済んでから計算される。樹の構築は次のパラメータを使って計算した。木村の配列距離補正およびギャップを含む部位を無視した。図９〜１１に示す系統樹の表示にはＭＥＧＡ  ６プログラムを使用した。
【０２３６】
実施例８
表３に掲げたバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードプロテアーゼの独特の特徴
既定値のパラメータを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３−４６８０、１９９４）により、表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの予測成熟形態およびＢｇｉ０２４４６のアミノ酸配列をアライメントした。図１２Ａ〜Ｃに示すアライメントによれば、表３のサブチリシンはＡｓｐ（Ｄ）３２とＨｉｓ（Ｈ）６５との間に展開するモチーフを共有することが示された。これらの酵素全てで、Ａｓｐ（Ｄ）３２、Ｈｉｓ（Ｈ）６２およびＳｅｒ（Ｓ）２１５により触媒三連構造が形成されている。モチーフＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）は、表３のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンおよび国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットで開示されており、先に同定したバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンに特有の配列ＴＴＡＤＬを含有する。図６Ａ〜Ｆに示す、アライメントした全てのバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンはモチーフＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＰＴＴＡＤＬＮＸＨＧＴＨ（配列番号７１）またはＤＸＧＩＸＸＨＳＤＬＸＸＸＧＧＡＳＸＸＸＸＸＸＴＴＡＤＬＸＸＨＧＴＨ（配列番号７２）を共有している（このモチーフは国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットにより完全に記載されている）。
【０２３７】
実施例９
追加のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン洗浄性能および安定性の測定
実施例３に記載のマイクロスウォッチ規模の洗浄性能および安定性試験で、次の表７に示す追加のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンを試験した。これらのタンパク質は、発現用にバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド配列を使用し、実施例２に記載のようにして生成させた。
【０２３８】
【表１８】
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【０２３９】
【表１９】
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【０２４０】
実施例１０
バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンの配列分析
Ｂｇｉ０２４４６、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードＢＳＰ−００８０１変異体サブチリシンおよび表７の複数のバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレード変異体サブチリシン成熟形態のアミノ酸配列アライメントを図１４Ａ〜Ｆに示す。配列は、既定値のパラメータを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）によりアライメントした。図１５に記載の系統樹は、表７の成熟形態バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシン、国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットで開示されたバチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）クレードサブチリシンＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１およびＢｇｉ０２４４６のアミノ酸配列；表６−１および表６−２に掲げた複数のプロテアーゼのアミノ酸配列ならびにＢｇＡＰ変異体ＭＬ２、ＭＬ４、ＭＴ１、ＭＴ２、ＭＦ１（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２に記載）のアミノ酸配列を使用して作成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ−１】
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【図６Ｃ−２】
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【図６Ｄ−１】
2018521646.tif 000032
【図６Ｄ−２】
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【図６Ｅ−１】
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【図６Ｅ−２】
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【図６Ｆ−１】
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【図６Ｆ−２】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｃ−１】
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【図７Ｃ−２】
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【図７Ｄ−１】
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【図７Ｄ−２】
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【図７Ｅ−１】
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【図７Ｅ−２】
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【図７Ｆ−１】
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【図７Ｆ−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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