(57)【要約】  本開示はタンパク性ヘテロ二量体、タンパク性ヘテロ二量体を含む医薬組成物、薬剤及び／又はキット、タンパク性ヘテロ二量体を作製する方法、並びにその使用を提供する。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク性ヘテロ二量体であって、該ヘテロ二量体の一方の成員が、腫瘍抗原に対する結合特異性を示す標的化部分を形成するように複合した（ｉ）軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含み、該ヘテロ二量体の他方の成員がＮ末端からＣ末端に向かって、重鎖フラグメントに融合した免疫調節物質を含むポリペプチドを含み、該重鎖フラグメントが前記重鎖（ｉｉ）と複合して該ヘテロ二量体を形成する、タンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２】
前記標的化部分が膜タンパク質である腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３】
前記標的化部分が細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項２に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項４】
前記標的化部分がトランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヘレグリン受容体、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）及び低酸素誘導因子受容体（ＨＩＦＲ）からなる群から選択される細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項３に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項５】
前記標的化部分が成長因子、ホルモン又は細胞外基質分子である腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項６】
前記標的化部分がトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘレグリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、コラーゲン、エラスチン、ビグリカン、デコリン、ルミカン、ベルシカン、ペルレカン、Ｃ反応性蛋白、ＡｐｏＥ及びラミニンからなる群から選択される成長因子、ホルモン又は細胞外基質分子である腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項５に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項７】
前記標的化部分がＥＧＦＲ突然変異体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２９ｂ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２００、ＣＤ２７６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ２、ＰＭＣＨ、エンドプラスミン、ＣＳ１、ＣＥＡ、メソテリン、Ｇ２５０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＡＤＡＭ１７、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＧＰＡ３３、ＮＡＰｉ２ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＰＮＭＢ及びＴＲＯＰからなる群から選択される腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項８】
前記標的化部分がＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ突然変異体又はＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項９】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１０】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する、請求項９に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１１】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１２】
前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１３】
前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する、請求項１２に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１４】
前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１５】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１６】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する、請求項１５に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１７】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有する、請求項１６に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１８】
腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＨＥＲ３、抗ＨＥＲ４、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２９ｂ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２７６、抗ＣＸＣＲ３、抗ＣＸＣＲ５、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ９、抗ＣＲＴＨ２、抗ＰＭＣＨ、抗エンドプラスミン抗体、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＣＳ１、抗ＣＥＡ、抗メソテリン、抗Ｇ２５０、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＣ１６、抗ＰＳＭＡ、抗ＡＤＡＭ１７、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、抗ＭＣＳＰ、抗ＧＰＡ３３、抗ＮＡＰｉ２ｂ、抗ＳＴＥＡＰ１、抗ＣＥＡＣＡＭ１、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＧＰＮＭＢ、抗ＴＲＯＰ、抗ＴＦＧＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦＲ、抗ＦＧＦＲ、抗ＨＩＦＲ、抗ヘレグリン受容体、抗ＶＥＧＦ、抗ｃ−Ｍｅｔ，抗ＴＧＦ、抗ＥＧＦ、抗ＩＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ヘレグリン、抗ＰＤＧＦ、抗ＨＩＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−７、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１１、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１４、抗ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１６、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１９、抗ＩＬ−２０、抗ＩＬ−２１、抗ＩＬ−２２、抗ＩＬ−２３、抗ＩＬ−２４、抗ＩＬ−２５、抗ＩＬ−２６、抗ＩＬ−２７、抗ＩＬ−２８、抗ＩＬ−２９、抗ＩＬ−３０、抗ＩＬ−３１、抗ＩＬ−３２、抗ＩＬ−３３、抗ＩＬ−３４、抗ＩＬ−３５、抗ＩＬ−３６、抗コラーゲン、抗エラスチン、抗ビグリカン、抗デコリン、抗ルミカン、抗ベルシカン、抗ペルレカン、抗Ｃ反応性蛋白、抗ＡｐｏＥ及び抗ラミニンからなる群から選択される抗体である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１９】
腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体が抗ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ突然変異体又は抗ＨＥＲ２である、請求項１８に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２０】
前記免疫調節物質が免疫応答を増強する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２１】
前記免疫調節物質が免疫応答を低減する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２２】
前記免疫調節物質がサイトカインである、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２３】
前記免疫調節物質がインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンフォカイン及び腫瘍壊死因子からなる群から選択されるサイトカインである、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２４】
前記免疫調節物質がインターフェロンα、インターフェロンλ又はインターフェロンβである、請求項２２に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２５】
前記免疫調節物質がインターロイキン１０である、請求項２２に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２６】
前記ヘテロ二量体が、哺乳動物宿主細胞中で発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも３倍高い発現収率を示し、該対照タンパク質が２つの成員の二量体を含み、各々の成員が前記腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に前記免疫調節物質を更に含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２７】
前記哺乳動物宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２６に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２８】
前記ヘテロ二量体が、マウスにおいて発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも２倍長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示し、該対照タンパク質が２つの成員の二量体を含み、各々の成員が前記腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に前記免疫調節物質を更に含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２９】
前記重鎖（ｉｉ）及び前記重鎖フラグメントが各々、前記一方の成員及び前記他方の成員のヘテロ二量体化を媒介して前記ヘテロ二量体を形成する二量体化配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３０】
前記二量体化配列がヘテロ二量体化配列である、請求項２９に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３１】
前記ヘテロ二量体化配列が共有結合を介したヘテロ二量体化を達成する１つ又は複数の残基を含む、請求項３０に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３２】
前記二量体化配列が重鎖のＦｃ領域を含む、請求項２９又は３０に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３３】
前記二量体化配列がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常領域を含む、請求項２９又は３０に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３４】
前記ヘテロ二量体化が、前記重鎖（ｉｉ）及び前記重鎖フラグメント中に含有される前記二量体化又はヘテロ二量体化配列の非共有対親和性によって達成される、請求項２９又は３０に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３５】
前記重鎖フラグメントが前記免疫調節物質にインフレームで融合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３６】
前記重鎖フラグメントが前記免疫調節物質にリンカーを介してインフレームで融合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３７】
前記他方の成員が互いに、また前記重鎖フラグメントにインフレームで融合した２つ以上の免疫調節物質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３８】
前記他方の成員が同じタイプの２つ以上の免疫調節物質を含む、請求項３７に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３９】
前記他方の成員が異なるタイプの２つ以上の免疫調節物質を含む、請求項３７に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項４０】
前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項４１に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項４３】
薬学的に許容可能な賦形剤と請求項１〜３９のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのｉｎ  ｓｉｔｕ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下リポジトリによる投与のために配合される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害する薬剤及び／又はキットの製造における請求項１〜３９のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体の使用。
【請求項４６】
腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記腫瘍又は腫瘍細胞と有効量の請求項１〜３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体とを接触させることを含む、方法。
【請求項４７】
前記接触をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触をｉｎ  ｖｉｖｏで行う、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
タンパク性ヘテロ二量体を作製する方法であって、（ｉ）請求項４２に記載の宿主細胞を前記ヘテロ二量体の発現を達成する条件下で培養することと、（ｉｉ）発現された前記ヘテロ二量体を採取することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク性ヘテロ二量体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抗原に対する免疫応答は検出することができるが（非特許文献１）、疾患を引き起こす悪性細胞は多くの場合、拒絶をもたらす免疫応答を誘発することができない。研究により、サイトカイン及び共刺激分子等の免疫調節分子を導入することによって腫瘍細胞の免疫原性を高めることが可能であることが実証されているが、残存癌細胞の根絶には直接遺伝子導入では到達することができない広く散在する微小転移腫瘍デポジット（tumor deposits）を標的化することが必要となる場合がある。加えて、導入した免疫調節分子の発現及び安定性は十分というには程遠いものであることが多い。免疫系の細胞によって産生されるサイトカイン等の免疫調節物質は適応免疫応答の細胞を直接的又は間接的に活性化し、防御抗腫瘍免疫の誘発において重要な役割を果たすことができる。自然免疫系は細菌産物、又はＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びインターロイキン等の炎症性サイトカインの放出をもたらす「危険」シグナルによって引き起こされ得る。
【０００３】
多数の研究から、免疫調節物質が動物モデル及び癌患者の両方において抗腫瘍効果の発揮に有用であり得ることが示されている。しかしながら、免疫調節物質の適用に関連した短い半減期及び全身毒性のためにそれらの使用が大幅に限定されている。特許文献１では、腫瘍関連抗原を標的とする抗体のｃ末端に付着したインターフェロンを含むキメラ構築物が記載されている。しかしながら、かかるキメラ構築物によって発現される融合タンパク質は典型的にはｉｎ  ｖｉｖｏで非常に不安定であり、その発現収率は典型的には工業規模生産にとって十分に高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開２００８８０１１７２２５．８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Disis et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15: 3363-3367
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのため、工業規模で比較的高い収率で産生され、細胞及び／又は組織の過剰増殖と関連した障害又は疾患、例えば様々な新生物、種々のタイプの癌及び／又は腫瘍の治療に有用となるような比較的長い半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで有し得る免疫調節物質の発現の標的化が相当に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示はかかる必要性に対応するものであり、関連した利点ももたらす。本開示は腫瘍成長の阻害に有用なタンパク性ヘテロ二量体、並びに該タンパク性ヘテロ二量体を含む組成物、薬剤及び／又はキットを包含する。本開示はタンパク性ヘテロ二量体を生成する方法、及び癌の治療を含むが、これに限定されない腫瘍成長の阻害におけるタンパク性ヘテロ二量体の薬学的使用も提供する。
【０００８】
幾つかの態様では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は顕著な抗腫瘍活性を有する。幾つかの態様では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は高い発現収率を有する。幾つかの態様では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。幾つかの態様では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は大規模工業生産に特に好適である。
【０００９】
幾つかの態様では、本開示は、タンパク性ヘテロ二量体を提供する。幾つかの実施形態において、該ヘテロ二量体の一方の成員が、腫瘍抗原に対する結合特異性を示す標的化部分を形成するように複合した（ｉ）軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含み、該ヘテロ二量体の他方の成員がＮ末端からＣ末端に向かって、重鎖フラグメントに融合した免疫調節物質を含むポリペプチドを含み、該重鎖フラグメントが前記重鎖（ｉｉ）と複合して該ヘテロ二量体を形成する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分が膜タンパク質である腫瘍抗原に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、前記標的化部分が細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、前記標的化部分がトランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヘレグリン受容体、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）及び低酸素誘導因子受容体（ＨＩＦＲ）からなる群から選択される細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合することができる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分が成長因子、ホルモン又は細胞外マトリクス分子である腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、標的化部分は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘレグリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ｃ−Ｍｅｔ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポエチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、レプチン、トロンボポイエチン、アンギオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、コラーゲン、エラスチン、ビグリカン、デコリン、ルミカン、ベルシカン、ペルレカン、Ｃ反応性蛋白、ＡｐｏＥ及びラミニンからなる群から選択される成長因子、ホルモン又は細胞外マトリクス分子である腫瘍抗原に特異的に結合することができる。
【００１２】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分がＥＧＦＲ突然変異体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２９ｂ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２００、ＣＤ２７６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ２、ＰＭＣＨ、エンドプラスミン、ＣＳ１、ＣＥＡ、メソテリン、Ｇ２５０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＡＤＡＭ１７、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＧＰＡ３３、ＮＡＰｉ２ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＰＮＭＢ及びＴＲＯＰからなる群から選択される腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、前記標的化部分がＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ突然変異体又はＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。
【００１３】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。
【００１４】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する。幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。
【００１５】
幾つかの実施形態において、前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有する。幾つかの実施形態において、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＨＥＲ３、抗ＨＥＲ４、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２９ｂ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２７６、抗ＣＸＣＲ３、抗ＣＸＣＲ５、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ９、抗ＣＲＴＨ２、抗ＰＭＣＨ、抗エンドプラスミン抗体、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＣＳ１、抗ＣＥＡ、抗メソテリン、抗Ｇ２５０、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＣ１６、抗ＰＳＭＡ、抗ＡＤＡＭ１７、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、抗ＭＣＳＰ、抗ＧＰＡ３３、抗ＮＡＰｉ２ｂ、抗ＳＴＥＡＰ１、抗ＣＥＡＣＡＭ１、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＧＰＮＭＢ、抗ＴＲＯＰ、抗ＴＦＧＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦＲ、抗ＦＧＦＲ、抗ＨＩＦＲ、抗ヘレグリン受容体、抗ＶＥＧＦ、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ＴＧＦ、抗ＥＧＦ、抗ＩＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ヘレグリン、抗ＰＤＧＦ、抗ＨＩＦ、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン、抗性腺刺激ホルモン放出ホルモン、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、抗甲状腺刺激ホルモン、抗卵胞刺激ホルモン、抗黄体形成ホルモン、抗プロラクチン、抗成長ホルモン、抗副腎皮質刺激ホルモン、抗抗利尿ホルモン、抗オキシトシン、抗甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、抗成長ホルモン放出ホルモン、抗副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、抗ソマトスタチン、抗ドーパミン、抗メラトニン、抗チロキシン、抗カルシトニン、抗副甲状腺ホルモン、抗グルココルチコイド、抗ミネラルコルチコイド、抗アドレナリン、抗ノルアドレナリン、抗プロゲステロン、抗インスリン、抗グルカゴン、抗アミリン、抗エリスロポエチン、抗カルシトリオール、抗カルシフェロール、抗心房性ナトリウム利尿ペプチド、抗ガストリン、抗セクレチン、抗コレシストキニン、抗神経ペプチドＹ、抗グレリン、抗ＰＹＹ３−３６、抗レプチン、抗トロンボポイエチン、抗アンギオテンシノーゲン、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−７、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１１、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１４、抗ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１６、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１９、抗ＩＬ−２０、抗ＩＬ−２１、抗ＩＬ−２２、抗ＩＬ−２３、抗ＩＬ−２４、抗ＩＬ−２５、抗ＩＬ−２６、抗ＩＬ−２７、抗ＩＬ−２８、抗ＩＬ−２９、抗ＩＬ−３０、抗ＩＬ−３１、抗ＩＬ−３２、抗ＩＬ−３３、抗ＩＬ−３４、抗ＩＬ−３５、抗ＩＬ−３６、抗コラーゲン、抗エラスチン、抗ビグリカン、抗デコリン、抗ルミカン、抗ベルシカン、抗ペルレカン、抗Ｃ反応性蛋白、抗ＡｐｏＥ及び抗ラミニンからなる群から選択される抗体である。
【００１６】
例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ突然変異体及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択され得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体中に含まれる免疫調節物質は免疫応答を増強する。幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体中に含まれる免疫調節物質は免疫応答を低減する。例えば、免疫調節物質はサイトカインであり得る。幾つかの実施形態では、免疫調節物質はインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンフォカイン及び腫瘍壊死因子からなる群から選択されるサイトカインである。例えば、免疫調節物質はインターフェロンα、インターフェロンλ又はインターフェロンβであり得る。幾つかの実施形態では、免疫調節物質はインターロイキン１０、インターロイキン２及びスーパーインターロイキン（super interleukin）２からなる群から選択される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、哺乳動物宿主細胞において発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも３倍（例えば少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍又はそれ以上）高い発現収率を示し、対照タンパク質は２つの成員の二量体を含み、各々の成員が腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に免疫調節物質を更に含む。例えば、哺乳動物宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞であり得る。
【００１９】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、マウスにおいて発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも２倍（例えば少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍又はそれ以上）長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示し、対照タンパク質は２つの成員の二量体を含み、各々の成員が腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に免疫調節物質を更に含む。幾つかの実施形態では、対象のタンパク性ヘテロ二量体の重鎖（ｉｉ）及び重鎖フラグメントは各々、一方の成員及び他方の成員のヘテロ二量体化を媒介してヘテロ二量体を形成する二量体化配列を含む。二量体化配列はヘテロ二量体化配列であり得る。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体化配列は共有結合を介してヘテロ二量体化を達成する１つ又は複数の残基を含む。幾つかの実施形態では、二量体化配列は重鎖のＦｃ領域を含む。例えば、二量体化配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常領域を含み得る。
【００２０】
幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体化は重鎖（ｉｉ）及び重鎖フラグメント中に含有される二量体化又はヘテロ二量体化配列の非共有対親和性（non-covalent pairwise affinity）によって達成される。
【００２１】
幾つかの実施形態では、重鎖フラグメントは免疫調節物質にインフレームで融合する。例えば、重鎖フラグメントは免疫調節物質にリンカーを介してインフレームで融合していてもよい。
【００２２】
幾つかの実施形態では、他方の成員は互いに、また重鎖フラグメントにインフレームで融合した２つ以上の免疫調節物質を含む。例えば、他方の成員は同じタイプの２つ以上の免疫調節物質を含み得る。幾つかの実施形態では、他方の成員は異なるタイプの２つ以上の免疫調節物質を含む。
【００２３】
一態様では、本開示は、本開示の対象のタンパク性ヘテロ二量体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
一態様では、本開示は、本開示の単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２５】
一態様では、本開示は、本開示の単離ポリヌクレオチド又はベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
【００２６】
一態様では、本開示は薬学的に許容可能な賦形剤と本開示の単離タンパク性ヘテロ二量体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのｉｎ  ｓｉｔｕ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下リポジトリによる投与のために製剤化することができる。
【００２７】
一態様では、本開示は腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害する薬剤及び／又はキットの製造における対象のタンパク性ヘテロ二量体の使用を提供する。
【００２８】
更なる態様では、本開示は腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。幾つかの実施形態では、この方法は腫瘍又は腫瘍細胞と有効量の本開示のタンパク性ヘテロ二量体とを接触させることを含む。幾つかの実施形態では、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。幾つかの実施形態では、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００２９】
一態様では、本開示は（ｉ）本開示の宿主細胞をヘテロ二量体の発現を達成する条件下で培養することと、（ｉｉ）発現されたヘテロ二量体を採取することとを含む、タンパク性ヘテロ二量体を作製する方法を提供する。
【００３０】
本開示の付加的な態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、説明する以下の発明を実施するための形態から当業者に容易に明らかとなる。認識されるように、本開示では他の種々の実施形態が可能であり、その幾つかの細部を全て本開示から逸脱することのない様々な明白な点で変更することが可能である。したがって、図面及び本明細書は限定的なものではなく、本質的に例示的なものであるとみなされる。
【００３１】
参照による援用
本明細書に記載の全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個々に引用することにより本明細書の一部をなすことが示された場合と同じ程度において引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３２】
本開示の新規の特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴及び利点は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することによってより良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ及び対照Ｃ末端融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂの発現収率を示す図である。
【図２】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂについての薬物動態分析の結果を示す図である。
【図３】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬについての薬物動態分析の結果を示す図である。
【図４】ＥＧＦＲに対するヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂ及びＥｒｂ−ｈｕＩＦＮＬの特異的標的結合親和性を示す図である。
【図５】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ（Ａ）、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬ（Ｂ）及びＥｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２（Ｃ）の抗ウイルス活性を示す図である。
【図６】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ及びＥｒｂ−ｈｕＩＦＮＬのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。
【図７】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。
【図８】ＭＣＦ−７細胞株に対するヘテロ二量体Ｔｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を示す図である。
【図９】Ａ４３１細胞株に対するヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を示す図である。
【図１０】Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２ヘテロ二量体の精製についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥアッセイ結果を示す図である。レーン１：Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０（元のサンプル）；レーン２：Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０（フロースルー）；レーン３：Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０（溶出）；レーン４：タンパク質マーカー；レーン５：Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２（溶出）；レーン６：Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２（元）；レーン７：Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２（フロースルー）；レーン８：標準；レーン９：対照；レーン１０：ブランク；レーン１１：Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０（溶出、非還元）；レーン１２：Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２（溶出、非還元）。
【図１１】ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２についての薬物動態分析の結果を示す図である。
【図１２】Ａ４３１細胞株（Ａ）及びＢ１６細胞株（Ｂ）をそれぞれ用いたＥＧＦＲに対するヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の特異的標的結合親和性を示す図である。
【図１３】ＥＬＩＳＡアッセイによるＥＧＦＲに対するヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の特異的標的結合親和性を示す図である。
【図１４】ＥＧＦＲに対するヘテロ二量体Ｍａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２の特異的標的結合親和性を示す図である。
【図１５】ＭＣＦ−７細胞株（Ａ）及びＳＫ−ＢＲ−３細胞株をそれぞれ用いたＨＥＲ２に対するヘテロ二量体Ｔｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２及びＴｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２の特異的標的結合親和性を示す図である。
【図１６】ＳＫ−ＢＲ−３細胞株を用いたＨＥＲ２に対するヘテロ二量体Ｐｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の特異的標的結合親和性を示す図である。
【図１７】リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−αの放出の阻害におけるＥｒｂ−ｈｕＩＬ１０の活性を示す図である。
【図１８】リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−αの放出の阻害におけるＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の活性を示す図である。
【図１９】リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−αの放出の阻害におけるＭａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２の活性を示す図である。
【図２０】リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−αの放出の阻害におけるＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の活性を示す図である。
【図２１】リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−αの放出の阻害におけるＰｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の活性を示す図である。
【図２２】種々の濃度のＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４の腹腔内注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す図である。
【図２３】種々の濃度のＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の腹腔内注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す図である。
【図２４】種々の濃度のＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の腫瘍内注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の投与量依存性阻害を示す図である。
【図２５】Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の腹腔内注射によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害の比較を示す図である。
【図２６】種々の用量のＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍退縮の比較を示す図である。
【図２７】Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害に対する抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＮＫ１．１の効果を示す図である。
【図２８】静脈内注射した場合のヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２についての薬物動態分析の結果を示す図である。
【図２９】カニクイザルにおけるヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２についての薬物動態分析の結果を示す図である。
【図３０】マウスにおけるＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を示す図である。
【図３１】Ｃ５７ＢＬ／６  Ｂ１６−ＥＧＦＲマウスモデルにおけるＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２とＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２とのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示の実施形態を説明する前に、かかる実施形態が例示としてのみ提示され、本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替形態を本開示の実施において用いることができることを理解されたい。ここで、本開示から逸脱することなく多数の変更、変化及び置換が当業者に想起される。
【００３５】
他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができ、好適な方法及び材料を下記に説明する。抵触の場合は、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法及び実施例は一例にすぎず、限定を意図するものではない。ここで、本開示から逸脱することなく多数の変更、変化及び置換が当業者に想起される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、文脈上他に明らかに指示されない限り、単数形（The singular form "a," "an" and "the,"）は、概して複数の指示対象を含む。
【００３７】
「タンパク性」という用語は本明細書で使用される場合、概してポリペプチド若しくはタンパク質の、それらに関連する、それらに類似した、又はそれらである物質又は分子を指す。例えば本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、２つ以上のポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質又はヘテロ二量体であり得る。
【００３８】
「ヘテロ二量体」という用語は本明細書で使用される場合、概して２つの異なる成員から構成される分子（例えばタンパク性分子）を指す。ヘテロ二量体の２つの成員は構造、機能、活性及び／又は組成が異なっていてもよい。例えば、２つの異なる成員はこれらのポリペプチドを形成するアミノ酸残基の順序、数又は種類が異なるポリペプチドを含み得る。ヘテロ二量体の２つの異なる成員は各々独立して１つ、２つ又はそれ以上の単位、ポリペプチド鎖又は部分を含み得る。
【００３９】
「標的化部分」という用語は本明細書で使用される場合、概して標的分子、細胞、粒子、組織又は凝集体に特異的、選択的又は優先的に結合する分子、複合体又は凝集体を指す。例えば標的化部分は抗体、抗原結合抗体フラグメント、二重特異性抗体又は他の抗体ベースの分子若しくは化合物であり得る。標的化部分の他の例としては、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、核酸、ビオチン−アビジン結合対、結合ペプチド又はタンパク質等を挙げることができるが、これらに限定されない。「標的化部分」及び「結合部分」という用語は本明細書で区別なく使用される。
【００４０】
「腫瘍抗原」という用語は本明細書で使用される場合、概して、宿主において免疫応答を引き起こす能力を有し得る、腫瘍細胞において又は腫瘍細胞によって産生される抗原性物質を指す。例えば腫瘍抗原は腫瘍細胞の一部を構成し、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することが可能なタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はそのフラグメントであり得る。腫瘍抗原ペプチドは腫瘍細胞において腫瘍抗原の分解の結果として生成するペプチドである場合もあり、ＨＬＡ分子との結合によって細胞表面上で発現される際に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導又は活性化することができる。幾つかの実施形態では、「腫瘍抗原」という用語は、癌細胞上で排他的若しくは優先的若しくは差次的に発現され、及び／又は癌細胞と会合して（in association with）見られ、それにより癌に優先的若しくは特異的な標的をもたらす生体分子（例えばタンパク質、炭水化物、糖タンパク質等）を指す場合もある。例えば、優先的発現は、生物内の任意の他の細胞と比較した優先的発現、又は生物の特定の領域内での（例えば特定の器官又は組織内での）優先的発現であり得る。
【００４１】
「腫瘍抗原エピトープ」及び「腫瘍抗原決定基」という用語は本明細書で区別なく使用され、概して腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する腫瘍抗原中に存在するアミノ酸配列の部位を指す。
【００４２】
「免疫調節物質」及び「免疫修飾物質」という用語は本明細書で区別なく使用され、概して免疫系の機能に影響を及ぼす物質を指す。免疫調節物質は免疫応答を増強又は低減することができる。例えば免疫調節物質は、例えばサイトカイン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン、イミキモド、細菌に由来する細胞膜画分、ケモカイン、インターロイキン、シトシンリン酸−グアノシン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド及びグルカンの組み換え、合成及び／又は天然調製物を含むが、これらに限定されない免疫療法の活性物質であり得る。幾つかの例では、免疫調節物質はサイトカインである。
【００４３】
幾つかの実施形態では、免疫調節物質はインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンフォカイン及び腫瘍壊死因子からなる群から選択される。例えば、免疫調節物質はインターフェロンα、インターフェロンλ、インターフェロンβ、インターロイキン１０、インターロイキン２及びスーパーインターロイキン２からなる群から選択することができる。
【００４４】
「膜タンパク質」という用語は本明細書で使用される場合、概して生体膜と相互作用するタンパク質を指す。膜タンパク質は細胞又はオルガネラの膜と付着又は会合したタンパク質であり得る。例えば膜タンパク質は内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質又は膜結合ペプチドであり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は細胞表面受容体である。
【００４５】
「細胞表面受容体」という用語は本明細書で使用される場合、概して生物活性分子（例えばリガンド）に結合し、細胞に対するリガンドの効果を媒介する細胞表面タンパク質を指す。細胞表面受容体は、典型的にはシグナル伝達に関与する、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内エフェクタードメインとを含むマルチドメイン構造を有する膜結合タンパク質であり得る。受容体へのリガンドの結合は、エフェクタードメインと細胞内の他の分子（複数の場合もある）との間の相互作用を引き起こす受容体における立体配座変化をもたらし得る。この相互作用は細胞の代謝の変更をもたらし得る。受容体−リガンド相互作用に関連する代謝事象としては、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ産生の増大、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を挙げることができる。
【００４６】
「発現収率」という用語は本明細書でタンパク性ヘテロ二量体との関連で使用される場合、概して発現時に、例えば宿主細胞によって発現される場合に機能的形態で産生されるタンパク性ヘテロ二量体の量を指す。
【００４７】
「二量体化配列」という用語は本明細書で使用される場合、概して二量体を形成するか、又は二量体化を受けることが可能なアミノ酸配列を指す。二量体は２つの同一の成員によって形成されるホモ二量体であってもよい。二量体は２つの異なる成員によって形成されるヘテロ二量体であってもよい。場合によっては、ヘテロ二量体の２つの異なる成員は同一の二量体化配列を含み得る。
【００４８】
「ヘテロ二量体化配列」という用語は本明細書で使用される場合、概して優先的にヘテロ二量体の形成をもたらすか、又はヘテロ二量体化を受けるアミノ酸配列を指す。
【００４９】
「共有結合」という用語は本明細書で使用される場合、概して電子の共有によって原子間に形成される化学結合を指す。例えば、共有結合は極性であっても又は無極性であってもよい。幾つかの実施形態では、共有結合はジスルフィド結合である。
【００５０】
「非共有対親和性」という用語は本明細書で使用される場合、概して非共有相互作用、例えばイオン対、水素結合、双極子間相互作用、電荷移動相互作用、π−π相互作用、カチオン−π電子相互作用、ファンデルワールス相互作用及び分散相互作用、疎水性（親油性）相互作用、複合体形成（例えば遷移金属カチオンの複合体形成）、又はこれらの相互作用の組合せによって互いに結合することが可能な二量体化配列又はヘテロ二量体化配列を指す。
【００５１】
「リンカー」という用語は本明細書で使用される場合、概して２つのポリペプチド配列を接続又は連結する、例えば２つのポリペプチドドメインを連結する合成アミノ酸配列を指す。リンカーは２つのアミノ酸配列をペプチド結合によって接続することができる。幾つかの実施形態では、本開示のリンカーは生物活性部分を線状配列（linear sequence）中の第２の部分に接続する。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合体を指すように本明細書で区別なく使用される。重合体は線状であっても、又は分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化構成要素とのコンジュゲーション等の任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸重合体も包含する。この用語は１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する自然発生アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸重合体、及び自然発生アミノ酸重合体に当てはまる場合もある。この用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸を接合する従来のペプチド結合の変形を含む場合もある。例えば「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、α炭素がペプチド結合によって連結したアミノ酸の鎖であり得る。したがって、鎖の一方の末端（アミノ末端）の末端アミノ酸は遊離アミノ基を有し、鎖の他方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有し得る。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」という用語（Ｎ末端と略される）は、概してペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離αアミノ基、又はペプチド内の任意の他の位置のアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合はイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語は概して、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基又はペプチド内の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、アミド結合とは対照的にエーテルによって接合したアミノ酸等のペプチド模倣物を含むが、これに限定されない本質的に任意のポリアミノ酸を含む場合もある。
【００５３】
「アミノ酸」という用語は本明細書で使用される場合、概してＤ若しくはＬ光学異性体、又はその両方、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含むが、これらに限定されない天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を指す。標準的な１文字コード又は３文字コードがアミノ酸を指定するために使用される。
【００５４】
「天然Ｌアミノ酸」という用語は本明細書で使用される場合、概してグリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）のＬ光学異性体形態を指す。
【００５５】
「非自然発生」という用語は本明細書で使用される場合、概して野生型又は自然発生配列（例えば被験体内に見られるもの）に対応するものがない、それと相補的でない、又はそれと高度の相同性を有しないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を指す。例えば、非自然発生ポリペプチド又はフラグメントは、適切にアラインメントした場合に天然の配列と比較して９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％未満の又は更に低いアミノ酸配列同一性を有し得る。代替的には、非自然発生ポリペプチド又はフラグメントは、適切にアラインメントした場合に天然の配列と比較して９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％超の又は更に高いアミノ酸配列同一性を有し得る。
【００５６】
「親水性」及び「疎水性」という用語は本明細書で使用される場合、概して物質が水に対して有する親和性の程度を指す。親水性物質は水に対して強い親和性を有し、水に溶解する、水と混ざる又は水にぬれる傾向があるが、疎水性物質は水に対する親和性を実質的に欠き、水をはじき、水を吸収しない傾向があり、水に溶解しない又は水と混ざらない又は水にぬれない傾向がある。アミノ酸はそれらの疎水性に基づいて特性化することができる。多数の尺度が開発されている。一例はLevitt, M, et al., J Mol Biol (1976) 104:59によって開発された尺度であり、Hopp, TP, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 78:3824に挙げられている。「親水性アミノ酸」の例はアルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン及びグルタミンである。親水性アミノ酸アスパラギン酸（aspartate）、グルタミン酸（glutamate）及びセリン及びグリシンが特に興味を持たれている。「疎水性アミノ酸」の例はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン及びバリンである。
【００５７】
「フラグメント」という用語は、タンパク性分子（例えばポリペプチド又はタンパク質）との関連で使用される場合、概して治療活性及び／又は生物活性の一部を保持していても、又は保持していなくてもよい未変性生物活性タンパク質の切断型を指す。
【００５８】
「変異体」という用語はタンパク性分子（例えばポリペプチド又はタンパク質）との関連で使用される場合、概して生物活性タンパク質の治療活性及び／又は生物活性の少なくとも一部を保持する、未変性生物活性タンパク質に対して配列相同性を有するタンパク性分子を指す。例えば、変異体タンパク質は参照生物活性タンパク質と比較して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、「変異体」は、例えば部位特異的突然変異誘発、コード遺伝子の合成、挿入によって意図的に修飾されたタンパク質、又は突然変異によって偶発的に修飾されたタンパク質を含み得る。
【００５９】
「コンジュゲートした」、「連結した」、「融合した」及び「融合」という用語は本明細書で区別なく使用され、概して例えば化学的結合又は組み換え手段を含む手段による２つ以上の化学元素、配列又は構成要素の接合を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写が達成される場合にコード配列に操作可能に連結する。概して、「操作可能に連結する」は、連結しているＤＮＡ配列が近接し、リーディングフェーズ（reading phase）内又はインフレームであることを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持するような、連続したより長いＯＲＦを形成する２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の接合を指す。このため、得られる「融合ポリペプチド」は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに相当する２つ以上のフラグメント（このセグメントは通常は本質的にそのように接合しない）を含有する単一タンパク質である。「融合部位」は、２つ以上のフラグメントが互いに接合した配列を指す。場合によっては、融合部位は接合している２つ以上のフラグメント中の配列と同一の配列であり得る。場合によっては、融合部位は接合している２つ以上のフラグメントのいずれの配列にも同一でないギャップセグメントを更に含み得る。
【００６０】
ポリペプチドとの関連で、「線状配列」又は「配列」は、配列中の互いに隣り合う残基がポリペプチドの一次構造において近接するアミノ末端からカルボキシル末端の方向でのポリペプチド中のアミノ酸の順序である。「部分配列」は、一方又は両方の方向に付加的な残基を含むことが知られるポリペプチドの一部を形成する線状配列である。
【００６１】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は本明細書で区別なく使用され、概してデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその類似体の任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の３次元構造を有し、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード又は非コード領域、連鎖分析によって規定される遺伝子座（単数又は複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体の集合（assembly）の前に行われてもよく又はその後に行われてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド構成要素が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に標識化構成要素とのコンジュゲーション等によって更に修飾することができる。
【００６２】
「遺伝子」及び「遺伝子フラグメント」という用語は本明細書で区別なく使用され、概して転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子又は遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドがコード領域全体又はそのセグメントに広がり（cover）得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限りにおいて、ゲノムＤＮＡであっても又はｃＤＮＡであってもよい。「融合遺伝子」は、互いに連結した少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドから構成される遺伝子である。
【００６３】
「抗体」という用語は本明細書で使用される場合、概して免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を挙げることができる。本明細書で使用される場合、軽鎖はκ又はλのいずれかに分類することができる。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類することができ、これは免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ規定する。抗体は本開示で使用される場合、四量体を含む構造単位を有し得る。各々の四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され得、各々の対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０ｋＤ〜７０ｋＤ）を有し得る。各々の鎖のＮ末端は、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定し得る。軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）という用語は本明細書で使用される場合、概して軽鎖及び重鎖のそれぞれのこれらの領域を指す。抗体は無傷（intact）免疫グロブリン、又は様々なペプチダーゼでの消化によって産生される若しくはデノボ発現される多数のよく特性化されたフラグメントとして存在することができる。このため例えば、ペプシンによって抗体をヒンジ領域中のジスルフィド連結の下で消化し、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接合した軽鎖であるＦａｂの二量体）を作製することができる。Ｆ（ａｂ）’２はヒンジ領域中のジスルフィド連結を切断する穏和な条件下で還元され、それにより（Ｆａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい）。様々な抗体フラグメントが無傷抗体の消化に関して規定されているが、かかるＦａｂ’フラグメントが化学的に、又は組み換えＤＮＡ法を利用することによってデノボ合成され得ることが当業者には理解される。このため、抗体という用語は本明細書で使用される場合、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ及びダイアボディを含むが、これらに限定されない全抗体の修飾によって作製されるか、又は組み換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成される抗体フラグメントも含み得る。幾つかの実施形態では、抗体としてはＦａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及び一本鎖抗体、例えば連続したポリペプチドを形成するように可変重鎖及び可変軽鎖が（直接的に又はペプチドリンカーを介して）互いに接合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本開示における抗体及びフラグメントは二重特異性である。幾つかの実施形態では、二重特異性抗体又はそのフラグメントは少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する（例えば、少なくとも２つの異なるエピトープの少なくとも１つが腫瘍関連抗原である）。幾つかの実施形態では、抗体及びフラグメントは異種抗体であってもよく、例えば互いに連結した２つ以上の抗体又は抗体結合フラグメント（例えばＦａｂ）であっても、又はそれらを含んでいてもよく、各々の抗体又はフラグメントは異なる特異性を有する。
【００６５】
幾つかの実施形態では、本明細書で使用される抗体及びそのフラグメントは二重特異性であり得る。二重特異性抗体又はそのフラグメントは様々な構成であり得る。例えば、二重特異性抗体は単一抗体（又は抗体フラグメント）と類似し、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を有していてもよい。様々な実施形態では、二重特異性抗体は化学的技法（Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 5807）、「ポリドーマ（polydoma）」法（例えば米国特許第４，４７４，８９３号を参照されたい）、又は組み換えＤＮＡ法によって作製することができる。幾つかの実施形態では、二重特異性抗体は本明細書で使用される場合、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有していてもよく、その少なくとも１つが腫瘍抗原である。幾つかの実施形態では、抗体及びそのフラグメントは異種抗体であってもよい。異種抗体は互いに連結した２つ以上の抗体又は抗体結合フラグメント（例えばＦａｂ）であり、各々の抗体又はフラグメントは異なる特異性を有する。
【００６６】
「相同性」、「相同な」又は「配列同一性」という用語は本明細書で使用される場合、概して２つ以上のポリヌクレオチド配列間又は２つ以上のポリペプチド配列間の配列の類似性又は互換性を指す。プログラム（例えばＥｍｂｏｓｓ  Ｎｅｅｄｌｅ又はＢｅｓｔＦｉｔ）を使用して２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を決定する場合、デフォルト設定を用いてもよく、又は同一性、類似性若しくは相同性スコアを最適化するためにｂｌｏｓｕｍ４５若しくはｂｌｏｓｕｍ８０等の適切なスコア行列を選択してもよい。幾つかの実施形態では、相同なポリヌクレオチドはストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、これらの配列と比較して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、更には１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。相同なポリペプチドは、同程度の（comparable）長さの配列を最適にアラインメントした場合に、少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％若しくは少なくとも９７％若しくは少なくとも９８％の配列同一性を有するか、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６７】
「同一性パーセント」及び「同一性％」という用語は、ポリヌクレオチド配列との関連で使用される場合、概して標準化アルゴリズムを用いてアラインメントした少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間で一致する残基のパーセンテージを指す。かかるアルゴリズムを標準化された再現可能な方法で挿入し、配列中のギャップを比較して、２つの配列間のアラインメントを最適化することにより、２つの配列のより意味のある比較を達成することができる。同一性パーセントは規定のポリヌクレオチド配列の全長にわたって測定するか、又はより短い長さにわたって、例えばより長い規定のポリヌクレオチド配列から選ばれたフラグメントの長さにわたって測定することができる。本明細書において表、図又は配列表に示される配列によって支持される任意のフラグメントの長さを、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載するために用いることができることを理解されたい。
【００６８】
「配列同一性パーセント（％）」という用語は、本明細書で特定されるポリペプチド配列との関連で使用される場合、概して配列をアラインメントし、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、配列同一性の一環として任意の保存的置換を考慮せずに、第２の参照ポリペプチド配列又はその一部分のアミノ酸残基と同一のクエリ（query）配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）ソフトウェア等の公に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いた当該技術分野の技能の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。同一性パーセントは、規定のポリペプチド配列の全長にわたって測定してもよく、又はより短い長さ、例えばより長い規定のポリペプチド配列から選ばれるフラグメントの長さにわたって測定してもよい。本明細書において表、図又は配列表に示される配列によって支持される任意のフラグメントの長さを、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載するために用いることができることを理解されたい。
【００６９】
「宿主細胞」という用語は本明細書で使用される場合、概して対象のプラスミド若しくはベクターのレシピエントである可能性があるか、又はそれらのレシピエントとされていた、本開示のポリヌクレオチドを含むか、又は本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）を発現する個々の細胞、細胞株又は細胞培養物を含む。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含み得る。子孫は天然の、偶発的な又は意図的な突然変異のために（形態又はＤＮＡ相補体全体のゲノムが）元の親細胞に対して必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には本開示のベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした細胞が含まれ得る。宿主細胞は細菌細胞（例えば大腸菌（E. coli））、酵母細胞、又は他の真核細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞若しくは骨髄腫細胞であり得る。幾つかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【００７０】
「ベクター」という用語は本明細書で使用される場合、概して挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間に移入する、適切な宿主において自己複製することが可能な核酸分子を指す。この用語は、主として細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために機能するベクター、主としてＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製物、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含み得る。２つ以上の上記の機能をもたらすベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入した場合に、ポリペプチド（複数の場合もある）へと転写及び翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物をもたらすように機能することができる発現ベクターを含む好適な宿主細胞を含意する。
【００７１】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患の治療を含むが、これに限定されない、意図する用途を達成するのに十分な組成物（例えば、本明細書に記載されるタンパク性ヘテロ二量体）の量を指す。治療有効量は意図する用途（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）、又は治療される被験体及び病状、例えば被験体の体重及び年齢、病状の重症度、投与様式等によって変えることができ、当業者はこれを容易に決定することができる。この用語は標的細胞における特定の応答、例えば標的遺伝子導入、増殖及び／又はアポトーシスを誘導する用量に当てはまる場合がある。具体的な用量は選ばれる特定の化合物、採用される投与計画、他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与時期、投与対象の組織、及び行われる物理的送達システムに応じて異なる。
【００７２】
「治療」又は「治療する」又は「緩和する」又は「改善する」という用語は本明細書で区別なく使用され、治療的利益及び／又は予防的利益を含むが、これらに限定されない有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。本明細書で使用される場合、治療的利益は概して、治療される基礎障害の根絶又はその重症度の低減を指す。また、治療的利益は、被験体において改善が観察されるような基礎障害と関連する１つ又は複数の生理的症状の根絶、重症度の低減又は発生率の低減によって達成されるが、被験体が依然として基礎障害に苦しむこともある。予防的利益のために、組成物は特定の疾患を発症するリスクのある被験体、又はこの疾患の診断が下されていない場合であっても、疾患の１つ若しくは複数の生理的症状が報告されている被験体に投与することができる。
【００７３】
「治療効果」という用語は本明細書で使用される場合、概して上記のような治療的利益及び／又は予防的利益を包含する。予防的効果は、疾患若しくは症状の出現を遅らせる若しくは解消すること、疾患若しくは症状の兆候の発現を遅らせる若しくは解消すること、疾患若しくは症状の進行を減速する、食い止める若しくは逆行させること、又はこれらの任意の組合せを含む。
【００７４】
「併用（co-administration）」、「と組み合わせて投与する」という用語及びそれらと文法的に同等の用語は本明細書で使用される場合、概して両方の作用物質（agents）及び／又はそれらの代謝産物が被験体中に同時に存在するような動物への２つ以上の作用物質の投与を包含する。併用には別個の組成物での同時投与、別個の組成物で異なる時点での投与、又は両方の作用物質が存在する組成物での投与が含まれる。
【００７５】
「アンタゴニスト」及び「阻害物質」という用語は本明細書で区別なく使用され、概して標的タンパク質の活性又は発現を阻害することによって標的タンパク質の生物学的機能を阻害する能力を有する化合物を指す。したがって、「アンタゴニスト」及び「阻害物質」という用語は標的タンパク質の生物学的役割との関連で規定される。本明細書の好ましいアンタゴニストは標的と特異的に相互作用する（例えばそれに結合する）が、標的タンパク質が成員であるシグナル伝達経路の他の成員と相互作用することで標的タンパク質の生物活性を阻害する化合物もこの定義に具体的に含まれる。アンタゴニストによって阻害される好ましい生物活性は腫瘍の発生、成長又は進展と関連する。
【００７６】
「アゴニスト」という用語は本明細書で使用される場合、概して標的タンパク質の活性又は発現を阻害する又は高めることによって標的タンパク質の生物学的機能を開始する又は高める能力を有する化合物を指す。したがって、「アゴニスト」という用語は標的ポリペプチドの生物学的役割との関連で規定される。本明細書の好ましいアゴニストは標的と特異的に相互作用する（例えばそれに結合する）が、標的ポリペプチドが成員であるシグナル伝達経路の他の成員と相互作用することによって標的ポリペプチドの生物活性を開始する又は高める化合物もこの定義に具体的に含まれる。
【００７７】
「作用物質」又は「生物活性物質」という用語は本明細書で使用される場合、概して生物学的、薬学的又は化学的な化合物又は他の部分を指す。非限定的な例としては、単純若しくは複雑な有機若しくは無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素又は化学療法化合物が挙げられる。様々な化合物、例えば小分子及びオリゴマー（例えばオリゴペプチド及びオリゴヌクレオチド）、並びに様々なコア構造をベースとする合成有機化合物、を合成することができる。加えて、植物抽出物又は動物抽出物等の、様々な天然源からスクリーニング用の化合物を得ることができる。
【００７８】
「抗癌剤」、「抗腫瘍剤」又は「化学療法剤」という用語は本明細書で使用される場合、概して腫瘍性病態の治療に有用な任意の作用物質（agent）を指す。抗癌剤の一群には化学療法剤が含まれる。
【００７９】
「化学療法」という用語は本明細書で使用される場合、概して静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、膀胱内投与、皮下投与、経皮投与、口腔投与若しくは吸入、又は坐剤の形態を含む様々な方法による癌患者への１つ又は複数の化学療法薬及び／又は他の作用物質の投与を指す。
【００８０】
「細胞増殖」という用語は本明細書で使用される場合、概して細胞数が分裂の結果として変化する現象を指す。例えば、細胞増殖は細胞数の増大をもたらし得る。この用語は、増殖シグナルと一致して細胞形態が変化する（例えばサイズが増大する）細胞成長も包含する。
【００８１】
「ｉｎ  ｖｉｖｏで」という用語は本明細書で使用される場合、概して被験体の身体内で起こる事象を指す。
【００８２】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで」という用語は本明細書で使用される場合、概して被験体の身体外で起こる事象を指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは被験体の外で行われる任意のアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは死細胞又は生細胞を用いる細胞ベースのアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、無傷細胞を用いない無細胞アッセイも包含する。
【００８３】
「インターフェロン」（ＩＦＮ）という用語は本明細書で使用される場合、概してウイルス、細菌、寄生生物又は腫瘍細胞等の病原体の存在に応答して宿主細胞によって作製及び放出されるシグナル伝達タンパク質を指す。３つの主要タイプ、すなわちＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のインターフェロンが存在し、Ｉ型インターフェロンはＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βを含み、ＩＦＮ−αはＩＦＮ−αサブタイプ、例えばＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４等を更に含み得る。Ｉ型インターフェロンはウイルス複製を阻害し、抗寄生活性を有し、細胞増殖を阻害し、免疫細胞の細胞傷害性活性を刺激し、免疫調節に関与し、抗腫瘍効果を示し得る。ＩＩ型及びＩＩＩ型インターフェロンとしては、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ１（ＩＬ−２９）、ＩＦＮ−λ２（ＩＬ−２８ａ）及びＩＦＮ−λ３（ＩＬ−２８ｂ）を含み得る。本明細書で使用される場合、「インターフェロン」という用語は完全長インターフェロン、又は対応する野生型インターフェロンの生物活性を実質的に維持する（例えば対応する野生型インターフェロンの生物活性の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は更には少なくとも１００％の生物活性を有する）そのフラグメント（例えば切断型）若しくは変異体を含み得る。インターフェロンは本明細書で使用される場合、任意の哺乳動物種に由来し得る。幾つかの実施形態では、インターフェロンはヒト、ウマ、ウシ、ネズミ、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ラット、ヤギ、ヒツジ及び非ヒト霊長類からなる群から選択される種に由来する。
【００８４】
「インターロイキン」という用語は本明細書で使用される場合、概してＴリンパ球及び／又はＢリンパ球及び／又は造血細胞の発生及び分化を促進することが可能な分泌タンパク質又はシグナル伝達分子を指す。インターロイキンはヘルパーＣＤ４  Ｔリンパ球、並びに単球、マクロファージ及び内皮細胞によって合成され得る。本明細書で使用される場合、インターロイキン（ＩＬ）としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５及び／又はＩＬ−３６を挙げることができる。本明細書で使用される場合、「インターロイキン」という用語は完全長インターロイキン、又は対応する野生型インターロイキンの生物活性を実質的に維持する（例えば対応する野生型インターロイキンの生物活性の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は更には少なくとも１００％の生物活性を有する）そのフラグメント（例えば切断型）若しくは変異体を含み得る。インターロイキンは本明細書で使用される場合、任意の哺乳動物種に由来し得る。幾つかの実施形態では、インターロイキンはヒト、ウマ、ウシ、ネズミ、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ラット、ヤギ、ヒツジ及び非ヒト霊長類からなる群から選択される種に由来する。幾つかの実施形態では、インターロイキンは、例えばその受容体に対する親和性が増大又は減少した突然変異型であってもよい。特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−２Ｒβに対するその結合親和性を増大するようにＩＬ−２を改変することによって得ることができるスーパーＩＬ−２（ｓＩＬ２としても知られる；Nature 484, 529-533, 26 April 2012を参照されたい）であってもよい。ｓＩＬ−２における突然変異は主にサイトカインのコア中に存在し、分子動力学シミュレーションから、発生した突然変異によりＩＬ−２が安定化し、ＩＬ−２Ｒβ結合部位におけるヘリックスの柔軟性が低減して、ＣＤ２５に結合した場合と類似した最適化受容体結合配座へとなることが示されている。ＩＬ−２と比較すると、ｓＩＬ−２は細胞傷害性Ｔ細胞の優れた増加を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答の改善をもたらし、発現が比例的に低い制御性Ｔ細胞の増加を誘発し、肺水腫を低減した。
【００８５】
「抗体」という用語は本明細書で使用される場合、概して実質的に免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに様々な免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、これは免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ規定する。
【００８６】
「抗原結合部位」又は「結合部分」という用語は本明細書で使用される場合、概して抗原結合に関与する抗体の一部を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び／又は軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成され得る。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なるストレッチは、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られるより保存されたフランキングストレッチ間に介在する「超可変領域」と称される。このため、「ＦＲ」という用語は本明細書で使用される場合、概して免疫グロブリンの超可変領域間に隣接して自然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子には軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域が互いに関連して３次元空間に配置され、抗原結合「表面」を形成する。この表面は標的抗原の認識及び結合を媒介し得る。重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称され、例えばKabat et al. Sequences of proteins of immunological interest, 4thed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, Md. (1987)によって特性化される。
【００８７】
「抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体」という用語は本明細書で使用される場合、概してＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に特異的又は優先的に結合する抗体を指す。例えば、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体又は抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブ、ペルツズマブ又はその抗原結合フラグメントであり得る。
【００８８】
「抗ＥＧＦＲ抗体」という用語は本明細書で使用される場合、概してＥＧＦＲに特異的又は優先的に結合する抗体を指す。場合によっては、抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲの突然変異型（例えばＥＧＦＲの最も一般的な細胞外ドメイン突然変異であるＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩとしても知られる）；この突然変異はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２〜７の欠失をもたらし、突然変異受容体が任意の既知のリガンドに結合することを不可能にする）に結合する可能性がある。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ、Ｍａｂ８０６又はその抗原結合フラグメントであり得る。
【００８９】
「被験体」という用語は本明細書で使用される場合、概してヒト、又はネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット又はサルを含むが、これらに限定されない非ヒト動物を指す。
【００９０】
「抗ＥＧＦＲファミリー抗体」という用語は本明細書で使用される場合、概して上皮成長因子受容体ファミリーの成員に特異的に結合する抗体を指す。例えば、これはＥｒｂＢ−１（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とも指定されている）、ＥｒｂＢ−２（ヒトではＨＥＲ２、齧歯類ではｎｅｕとも指定されている）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３とも指定されている）及び／又はＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４とも指定されている）に結合する抗体であり得る。抗ＥＧＦＲファミリー抗体の例としては以下の抗体の１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ６．５、Ｃ６ｍＬ３−９、Ｃ６  ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８及びＨＥＲ４．Ｃ７等。例えば、米国特許出願公開第２００６／００９９２０５号及び米国特許出願公開第２００４／００７１６９６号（引用することにより本明細書の一部をなす）も参照されたい。
【００９１】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドという用語は本明細書で使用される場合、概して直接的に接合した又はペプチドコードリンカーによって接合したＶＨコード配列及びＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合的に連結したＶＨ（重鎖可変領域）：ＶＬ（軽鎖可変領域）ヘテロ二量体を指す（Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)を参照されたい）。
【００９２】
「成長及び／又は増殖の阻害」という用語は癌細胞とともに使用される場合、概して癌細胞の成長速度及び／又は増殖速度の減少を指す。例えば、これには（例えばアポトーシスによる）癌細胞の死が含まれ得る。幾つかの実施形態では、この用語は充実性腫瘍の成長及び／又は増殖の阻害、及び／又は腫瘍サイズの低減若しくは腫瘍の消失の誘導を指す場合もある。
【００９３】
「癌細胞表面マーカー」又は「癌細胞関連マーカー」という用語は本明細書で使用される場合、概して癌細胞上に排他的若しくは優先的若しくは差次的に発現され、及び／又は癌細胞と関連して見られ、それにより癌に優先的若しくは特異的な標的をもたらすタンパク質、炭水化物、糖タンパク質等の生体分子を指す。幾つかの実施形態では、優先的発現は生物内の任意の他の細胞と比較した優先的発現、又は生物の特定の領域内（例えば特定の器官又は組織内）での優先的発現であり得る。
【００９４】
「ＣＤ２０」という用語は本明細書で使用される場合、概して成熟Ｂ細胞の表面上で発現される非グリコシル化リンタンパク質を指す（例えば、Cragg et al. (2005) Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174を参照されたい）。ＣＤ２０はＢ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病又は皮膚／黒色腫癌幹細胞等に見られる場合もある。
【００９５】
タンパク性ヘテロ二量体、単離ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
一態様では、本開示はタンパク性ヘテロ二量体を提供する。ヘテロ二量体の一方の成員は、腫瘍抗原に対する結合特異性を示す標的化部分を形成するように複合した（ｉ）軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含み得る。ヘテロ二量体の他方の成員は、Ｎ末端からＣ末端に向かって重鎖フラグメントに融合した免疫調節物質を含むポリペプチドを含み得る。重鎖フラグメントは重鎖（ｉｉ）と複合してヘテロ二量体を形成することができる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、重鎖（ｉｉ）及び重鎖フラグメントは各々、一方の成員及び他方の成員のヘテロ二量体化を媒介してヘテロ二量体を形成する二量体化配列を含む。例えば、重鎖（ｉｉ）及び重鎖フラグメントは各々、二量体を形成するか、又は二量体化を受けることが可能なアミノ酸配列を含み得る。かかる二量体は２つの同一の二量体化配列又は２つの異なる二量体化配列によって形成することができる。
【００９７】
幾つかの実施形態では、二量体化配列はヘテロ二量体化配列であり、ヘテロ二量体は２つの異なる二量体化配列の二量体化によって形成される。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体化配列は共有結合を介してヘテロ二量体化を達成する１つ又は複数の残基を含む。
【００９８】
幾つかの実施形態では、二量体化配列は重鎖（抗体重鎖等）のＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態では、二量体化配列が各々独立して免疫グロブリンの定常領域（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンに由来する）又はその変異体を含む。幾つかの実施形態では、標的化部分の重鎖（ｉｉ）中及び重鎖フラグメント中の二量体化配列は各々、同じサブタイプの免疫グロブリンの定常領域を含む。例えば、上記免疫グロブリン定常領域は配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８に規定されるアミノ酸配列、又はそれと５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％超、若しくは更に高いアミノ酸配列同一性を有するその変異体を含み得る。
【００９９】
幾つかの実施形態では、重鎖フラグメント中に含まれる二量体化配列は免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）の定常領域のものであり得る。幾つかの実施形態では、ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である。幾つかの実施形態では、重鎖フラグメント中に含まれる二量体化配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と比較した場合にヒトＩｇＧ１定常領域の３４９位、３６６位、３６８位及び／又は４０７位に対応する位置にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖ等の点突然変異を含む。
【０１００】
幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体化は重鎖（ｉｉ）及び重鎖フラグメント中に含有される二量体化又はヘテロ二量体化配列の非共有対親和性によって達成される。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、重鎖フラグメントは免疫調節物質にインフレームで融合する。例えば、重鎖フラグメントは免疫調節物質にリンカーを介してインフレームで融合していてもよい。リンカーは２つのポリペプチド配列を、例えばペプチド結合を介して接続又は連結する合成アミノ酸配列であり得る。幾つかの実施形態では、リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドである。例えば、リンカーは１〜１０アミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸）、１〜１５アミノ酸（例えば１〜１１、１２、１３、１４、１５アミノ酸）、１〜２０アミノ酸、１〜３０アミノ酸又はそれ以上を含み得る。幾つかの実施形態では、リンカーは配列番号２７、配列番号８９、配列番号９０又は配列番号９１に規定されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーはタンパク質分解に抵抗性を示すか、又はタンパク質分解に実質的に抵抗性を示す。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体の一つの他方の成員は、互いに、また重鎖フラグメント（例えばＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２、Ｔｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２、Ｍａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２又はＰｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２に見られる）にインフレームで融合した２つ以上の（例えば２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の）免疫調節物質を含む。例えば、２つ以上の免疫調節物質は互いに及び／又は重鎖フラグメントにリンカーを介してインフレームで融合していてもよい。リンカーは２つのポリペプチド配列を、例えばペプチド結合を介して接続又は連結する合成アミノ酸配列であり得る。幾つかの実施形態では、リンカーは例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドである。２つ以上の免疫調節物質は同じタイプであっても、又は異なるタイプであってもよい。例えば、２つ以上の免疫調節物質は２つ以上のＩＬ１０であっても、又は１つ若しくは複数のインターフェロン及び１つ若しくは複数のインターロイキンであってもよい。幾つかの実施形態では、２つ以上の免疫調節物質の１つ又は複数が本開示の他の部分で記載される免疫調節物質のいずれかから選択され得る。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、標的化部分は膜タンパク質である腫瘍抗原に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、標的化部分は細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、細胞表面受容体はトランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヘレグリン受容体、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）及び低酸素誘導因子受容体（ＨＩＦＲ）からなる群から選択され得る。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、標的化部分は成長因子、ホルモン又は細胞外基質分子である腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、成長因子、ホルモン又は細胞外マトリクス分子は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘレグリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ｃ−Ｍｅｔ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポエチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、レプチン、トロンボポイエチン、アンギオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、コラーゲン、エラスチン、ビグリカン、デコリン、ルミカン、ベルシカン、ペルレカン、Ｃ反応性蛋白、ＡｐｏＥ及びラミニンからなる群から選択され得る。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、標的化部分は、ＥＧＦＲ突然変異体（例えば、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２９ｂ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２００、ＣＤ２７６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ２、ＰＭＣＨ、エンドプラスミン、ＣＳ１、ＣＥＡ、メソテリン、Ｇ２５０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＡＤＡＭ１７、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＧＰＡ３３、ＮＡＰｉ２ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＰＮＭＢ及びＴＲＯＰからなる群から選択される腫瘍抗原に特異的に結合する。例えば、標的化部分は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ突然変異体（例えば、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ）又はＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合することができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ（例えば対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む相補性決定領域（例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）を含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択することができる。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）から選択される。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号２９、配列番号３７、配列番号６０及び配列番号７１からなる群から選択することができる。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）であり得る。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１１、配列番号１５、配列番号５７及び配列番号６７からなる群から選択することができる。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有し得る。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択することができる。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３０、配列番号３８、配列番号５９及び配列番号７２からなる群から選択することができる。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１３、配列番号１７、配列番号５５及び配列番号６９からなる群から選択することができる。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有し、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３からなる群から選択することができ、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６からなる群から選択することができる。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択することができ、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択することができる。更なる例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択することができ、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択することができる。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択することができ、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖のＣＤＲ中に含まれるアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択することができる。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有し、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の可変領域中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む可変領域を含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）であり得る。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号２９に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３０に規定されるものであってもよい。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３７に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号３８に規定されるものであってもよい。更なる例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号６０に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号５９に規定されるものであってもよい。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号７１に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖の可変領域中に含まれるアミノ酸配列は配列番号７２に規定されるものであってもよい。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、標的化部分の（ｉ）軽鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有し、標的化部分の（ｉｉ）重鎖は、腫瘍抗原を特異的に対象とする同じ抗体の重鎖中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含有する。幾つかの実施形態では、同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。腫瘍抗原は本開示に規定又は列挙されるもののいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は抗ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ）、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、例えばＭａｂ８０６）又は抗ＨＥＲ２（例えばトラスツズマブ又はペルツズマブ）である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１１に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１３に規定されるものであってもよい。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１５に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号１７に規定されるものであってもよい。更なる例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号５７に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号５５に規定されるものであってもよい。別の例では、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号６７に規定されるものであってもよく、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の重鎖中に含まれるアミノ酸配列は配列番号６９に規定されるものであってもよい。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＨＥＲ３、抗ＨＥＲ４、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２９ｂ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２７６、抗ＣＸＣＲ３、抗ＣＸＣＲ５、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ９、抗ＣＲＴＨ２、抗ＰＭＣＨ、抗エンドプラスミン抗体、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＣＳ１、抗ＣＥＡ、抗メソテリン、抗Ｇ２５０、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＣ１６、抗ＰＳＭＡ、抗ＡＤＡＭ１７、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、抗ＭＣＳＰ、抗ＧＰＡ３３、抗ＮＡＰｉ２ｂ、抗ＳＴＥＡＰ１、抗ＣＥＡＣＡＭ１、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＧＰＮＭＢ、抗ＴＲＯＰ、抗ＴＦＧＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦＲ、抗ＦＧＦＲ、抗ＨＩＦＲ、抗ヘレグリン受容体、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＧＦ、抗ＥＧＦ、抗ＩＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ヘレグリン、抗ＰＤＧＦ、抗ＨＩＦ、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン、抗性腺刺激ホルモン放出ホルモン、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、抗甲状腺刺激ホルモン、抗卵胞刺激ホルモン、抗黄体形成ホルモン、抗プロラクチン、抗成長ホルモン、抗副腎皮質刺激ホルモン、抗抗利尿ホルモン、抗オキシトシン、抗甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、抗成長ホルモン放出ホルモン、抗副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、抗ソマトスタチン、抗ドーパミン、抗メラトニン、抗チロキシン、抗カルシトニン、抗副甲状腺ホルモン、抗グルココルチコイド、抗ミネラルコルチコイド、抗アドレナリン、抗ノルアドレナリン、抗プロゲステロン、抗インスリン、抗グルカゴン、抗アミリン、抗エリスロポエチン、抗カルシトリオール、抗カルシフェロール、抗心房性ナトリウム利尿ペプチド、抗ガストリン、抗セクレチン、抗コレシストキニン、抗神経ペプチドＹ、抗グレリン、抗ＰＹＹ３−３６、抗レプチン、抗トロンボポイエチン、抗アンギオテンシノーゲン、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−７、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１１、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１４、抗ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１６、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１９、抗ＩＬ−２０、抗ＩＬ−２１、抗ＩＬ−２２、抗ＩＬ−２３、抗ＩＬ−２４、抗ＩＬ−２５、抗ＩＬ−２６、抗ＩＬ−２７、抗ＩＬ−２８、抗ＩＬ−２９、抗ＩＬ−３０、抗ＩＬ−３１、抗ＩＬ−３２、抗ＩＬ−３３、抗ＩＬ−３４、抗ＩＬ−３５、抗ＩＬ−３６、抗コラーゲン、抗エラスチン、抗ビグリカン、抗デコリン、抗ルミカン、抗ベルシカン、抗ペルレカン、抗Ｃ反応性蛋白、抗ＡｐｏＥ及び抗ラミニンからなる群から選択される抗体である。例えば、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体は、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ突然変異体（例えば、抗ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ）又は抗ＨＥＲ２であり得る。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、免疫調節物質は免疫応答を増強する。免疫応答を増強することが可能な免疫調節物質の例としては、ＩＬ−２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、免疫調節物質は免疫応答を低減する。免疫応答を低減することが可能な免疫調節物質の非限定的な例としては、ＩＬ−１０及びトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−βが挙げられる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、免疫調節物質はサイトカインである。例えば、免疫調節物質はインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンフォカイン及び腫瘍壊死因子からなる群から選択されるサイトカインであり得る。幾つかの実施形態では、免疫調節物質はインターフェロンα、インターフェロンλ又はインターフェロンβである。幾つかの実施形態では、免疫調節物質はインターロイキン１０、インターロイキン２又はスーパーインターロイキン２である。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、宿主細胞中で発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも２倍高い発現収率を示す。例えば、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、対応する対照タンパク質よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍又はそれ以上高い発現収率を示すことができる。宿主細胞は植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は細菌細胞であり得る。幾つかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。対照タンパク質は２つの成員の二量体を含み、各々の成員は腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み得る。例えば、腫瘍抗原はタンパク性ヘテロ二量体中に含まれる標的化部分が結合するものと同一であってもよい。幾つかの実施形態では、対照タンパク質の各々の成員の重鎖はそのＣ末端に免疫調節物質を更に含む。例えば、免疫調節物質はタンパク性ヘテロ二量体中に含まれるものと同一であってもよい。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、被験体において発現されるか又は被験体に投与される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも２倍長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す。例えば、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は、被験体において発現されるか又は被験体に投与される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍又はそれ以上長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示すことができる。被験体は齧歯類（例えばマウス、ウサギ又はラット）、家畜（例えばネコ、ブタ、イヌ、ウシ、ウマ又はヒツジ）、野生の動物（例えばシカ、キツネ、オオカミ又はオオヤマネコ）又は霊長類（例えばサル又はヒト）等の哺乳動物であり得る。対照タンパク質は２つの成員の二量体を含み、各々の成員は腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み得る。例えば、腫瘍抗原はタンパク性ヘテロ二量体中に含まれる標的化部分が結合するものと同一であってもよい。幾つかの実施形態では、各々の成員の重鎖はそのＣ末端に免疫調節物質を更に含む。例えば、免疫調節物質はタンパク性ヘテロ二量体中に含まれるものと同一であってもよい。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、本開示は第１の成員（例えばポリペプチド）と、該第１の成員とは異なる第２の成員（例えばポリペプチド）とを含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。第１の成員は腫瘍関連抗原、癌細胞表面マーカー又は癌細胞関連マーカーに結合することが可能な標的化部分を含み得る。第２の成員は免疫グロブリンのＦｃ領域と、インターフェロン、インターロイキン又は任意の他の免疫調節物質とを含み得る。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ領域はインターフェロン、インターロイキン又は上記任意の他の免疫調節物質と化学的にカップリングする。例えば、これらはリンカーとカップリングすることができる。リンカーは、幾つか〜数十のアミノ酸を含み得るポリペプチドリンカーであってもよい。例えば、リンカーは１〜１０アミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸）、１〜１５アミノ酸（例えば１〜１１、１２、１３、１４、１５アミノ酸）、１〜２０アミノ酸、１〜３０アミノ酸又はそれ以上を含み得る。幾つかの実施形態では、リンカーは配列番号２７、配列番号８９、配列番号９０又は配列番号９１に規定されるアミノ酸配列を含み得る。幾つかの実施形態では、リンカーはタンパク質分解に抵抗性を示すか、又はタンパク質分解に実質的に抵抗性を示す。
【０１２３】
免疫調節物質の例としては、サイトカイン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、イミキモド、細菌に由来する細胞膜画分、ケモカイン、インターロイキン、シトシンリン酸−グアノシン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド及びグルカンの組み換え、合成及び／又は天然調製物が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、インターフェロンはＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン及びＩＩＩ型インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンλからなる群から選択される。例えば、インターフェロンはマウスインターフェロンβ、ヒトインターフェロンβ、マウスインターフェロンα４、ヒトインターフェロンα２又はヒトインターフェロンλであり得る。幾つかの実施形態では、インターロイキンはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５及びＩＬ−３６からなる群から選択される。例えば、インターロイキンはインターロイキン１０、インターロイキン２及び／又はスーパーインターロイキン２であり得る。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、標的化部分は腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体である。幾つかの実施形態では、標的化部分は癌細胞表面マーカー又は癌細胞関連マーカーに特異的に結合することが可能である。例えば、標的化部分はＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えばセツキシマブ）又はＨｅｒ−２に特異的に結合する抗体（例えばトラスツズマブ）等のＥＧＦＲファミリー成員に特異的に結合する抗体であり得る。幾つかの実施形態において、標的化部分は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ４、ＨＥＲ３、ＭＵＣ−１、Ｇ２５０、メソテリン、ｇｐ１００、ＣＳ１、チロシナーゼ及びＭＡＧＥからなる群から選択される標的に特異的に結合することが可能なマーカーである。幾つかの実施形態において、標的化部分は、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、ＡＢＴ−８０６、Ｓｙｍ００４、ペルツズマブ、マルゲツキシマブ（margetuximab）、パトリツマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、オカラツズマブ、ベルツズマブ、ＲＴＸＭ−８３、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、ダラツムマブ、エプラツズマブ、ブレンツキシマブ、リロツムマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、ダロツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、ＣＣ４９、Ｔ８４．６６、ラベツズマブ、アネツマブ、ｈｕ７Ｄ９．ｖ３、ＹＹＰ−２１８、ＹＰ−２２３、ＹＰ−３、ＳＤ１、ＳＤ２、１１１Ｉｎ−ＳＳ１−ｓｃＦｖＳＡ、ＭＤＸ−１３８２、ＲＧ−７７８７、ＭＤＸ−１４５９、ＴＦ−１０、ｍ１７０、ＰａｎｋｏＭａｂ、ＨｍＡｂ１６、エロツズマブ及びそれらのフラグメントからなる群から選択される抗体であるか、又はそれを含む。幾つかの実施形態において、標的化部分は一本鎖抗体であり、セツキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、ＡＢＴ−８０６、Ｓｙｍ００４、ペルツズマブ、マルゲツキシマブ、ＭＡＧＥ−１０１、パトリツマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、イブリツモマブ、オカラツズマブ、ベルツズマブ、ＲＴＸＭ−８３、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（アレムツズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）（ゲムツズマブ、対ＣＤ３３）、ダラツムマブ、エプラツズマブ、ブレンツキシマブ、リロツムマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、カツマキソマブ、ダロツズマブ、ガニツマブ、ギレンツキシマブ（対Ｇ２５０）、ＷＸ−Ｇ２５０（対Ｇ２５０）、ＣＣ４９（対ＴＡＧ−７２）、Ｔ８４．６６（対ＣＥＡ）、ラベツズマブ（対ＣＥＡ）、アネツマブ（対メソテリン）、ｈｕ７Ｄ９．ｖ３（対メソテリン）、ＹＹＰ−２１８、ＹＰ−２２３、ＹＰ−３、ＳＤ１、ＳＤ２、１１１Ｉｎ−ＳＳ１−ｓｃＦｖＳＡ、ＭＤＸ−１３８２、ＲＧ−７７８７、ＭＤＸ−１４５９、ＴＦ−１０、ｍ１７０（対ＭＵＣ１）、ＰａｎｋｏＭａｂ（対ＭＵＣ１）、ＨｍＡｂ１６（対ＭＵＣ１）及びエロツズマブ（対ＣＳ１）からなる群から選択される抗体のＣＤＲ及び／又は可変領域を含み得る。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、標的化部分は、リツキサン、ＩＦ５、Ｂ１、１Ｈ４、ＣＤ１９、Ｂ４、Ｂ４３、ＦＶＳ１９１、ｈＬＬ２、ＬＬ２、ＲＦＢ４、Ｍ１９５、ＨｕＭ１９５、ＡＴ１３／５、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）、４Ｄ５、ＨｕＣＣ４９及びそれらのフラグメントからなる群から選択される抗体であるか、又はそれを含む。幾つかの実施形態において、標的化部分は、ＥＧＦＲファミリー成員（複数の場合もある）に結合することが可能な抗体であり、又はその抗体を含む。幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲファミリー成員（複数の場合もある）に結合することが可能な抗体は、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．ＨＩ、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１Ｕ、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８及びＨＥＲ４．Ｃ７からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、標的化部分は、抗体のセツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はＭａｂ８０６であり、又はそれらを含む。幾つかの実施形態では、標的化部分はセツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はＭａｂ８０６の重鎖の３５４位及び／又は３６６位に対応する位置に点突然変異Ｓ３５４Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含む抗体である。点突然変異はタンパク性ヘテロ二量体の（ｉｉ）重鎖、又はヘテロ二量体タンパク質の第１の成員の重鎖定常領域中に含まれ得る。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体はセツキシマブ、トラスツズマブ、Ｍａｂ８０６又はペルツズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）中の３つのＣＤＲ配列及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）中の３つのＣＤＲ配列を含む。場合によっては、抗体はセツキシマブ、トラスツズマブ、Ｍａｂ８０６又はペルツズマブのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含み得る。例えば、抗体はそのＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９に規定されるものであり、及び／又はそのＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０に規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。別の例では、抗体はそのＶＬ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号３１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号３２（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号３３（ＣＤＲ−Ｌ３）にそれぞれ規定されるものであり、及び／又はそのＶＨ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号３４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号３５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号３６（ＣＤＲ−Ｈ３）にそれぞれ規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。更なる例では、抗体はそのＶＬのアミノ酸配列が配列番号３７に規定されるものであり、及び／又はそのＶＨのアミノ酸配列が配列番号３８に規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。別の例では、抗体はそのＶＬ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号３９（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号４０（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号４１（ＣＤＲ−Ｌ３）にそれぞれ規定されるものであり、及び／又はそのＶＨ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号４２（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４３（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号４４（ＣＤＲ−Ｈ３）にそれぞれ規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、抗体はそのＶＬのアミノ酸配列が配列番号６０に規定されるものであり、及び／又はそのＶＨのアミノ酸配列が配列番号５９に規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。一例では、抗体はそのＶＬ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号６４（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号６５（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号６６（ＣＤＲ−Ｌ３）にそれぞれ規定されるものであり、及び／又はそのＶＨ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号６１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６２（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号６３（ＣＤＲ−Ｈ３）にそれぞれ規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。更なる例では、抗体はそのＶＬのアミノ酸配列が配列番号７１に規定されるものであり、及び／又はそのＶＨのアミノ酸配列が配列番号７２に規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。別の例では、抗体はそのＶＬ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号７３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７４（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号７５（ＣＤＲ−Ｌ３）にそれぞれ規定されるものであり、及び／又はそのＶＨ中の３つのＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号７６（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号７７（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号７８（ＣＤＲ−Ｈ３）にそれぞれ規定されるものであり得る重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、抗体はセツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はＭａｂ８０６の重鎖の３５４位及び／又は３６６位に対応する位置に点突然変異Ｓ３５４Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含む。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体は一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ＳｃＦｖ）２及び完全長免疫グロブリンからなる群から選択される抗体であるか、又はそれを含む。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体は、ｉ）配列番号１１に規定されるアミノ酸配列を有する軽鎖、及び／又はｉｉ）配列番号１３に規定されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。別の例では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体は、ｉ）配列番号１５に規定されるアミノ酸配列を有する軽鎖、及び／又はｉｉ）配列番号１７に規定されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み得る。別の例では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体は、ｉ）配列番号５７に規定されるアミノ酸配列を有する軽鎖、及び／又はｉｉ）配列番号５５に規定されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み得る。別の例では、腫瘍関連抗原に結合することが可能な抗体は、ｉ）配列番号６７に規定されるアミノ酸配列を有する軽鎖、及び／又はｉｉ）配列番号６９に規定されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み得る。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体の第２の成員中に含まれる免疫グロブリンのＦｃ領域は以下の免疫グロブリンの定常領域から選択される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体の第１の成員中に含まれる標的化部分は抗体であるか又は抗体を含み、抗体はヘテロ二量体の第２の成員中に含まれるＦｃ領域と同じサブタイプの免疫グロブリンの定常領域に由来するＦｃ領域を含み得る。例えば、免疫グロブリン定常領域は配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８に規定されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するそのホモログを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、ホモログの配列同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体の第２の成員中の免疫グロブリンＦｃ領域は免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）の定常領域中のものと同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体の第２の成員中の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と比較した場合にヒトＩｇＧ１定常領域の３４９位、３６６位、３６８位及び／又は４０７位と対応する位置に点突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖを有するアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体の第２の成員は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４９、配列番号５１に規定されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するそのホモログを含む。幾つかの実施形態では、ホモログの配列同一性は少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。幾つかの実施形態では、標的化部分は、標的細胞によって発現されるマーカー（例えば、標的細胞の表面上に発現されるマーカー）又は標的細胞と関連するマーカーに特異的又は優先的に結合することが可能な分子であるか又はそれを含む。標的細胞は実質的に任意のタイプの細胞であってもよいが、特に細胞異常増殖（すなわち過剰増殖障害）を特徴とする疾患又は障害と関連する細胞に関するものであり得る。過剰増殖性疾患の例としては、乾癬、好中性白血球増加症（neutral leukocytosis）、赤血球増加症、血小板増加症及び癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
更に過剰増殖性障害（例えば、癌として特徴付けられるもの）の非限定的な例としては、充実性腫瘍、例えば乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌及びそれらの遠隔転移が挙げられる。過剰増殖性障害の更なる例としては、リンパ腫、肉腫及び白血病も挙げられる。乳癌の非限定的な例として、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌及び非浸潤性小葉癌が挙げられる。気道の癌の例としては、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌並びに気管支腺腫及び胸膜肺芽腫が挙げれられるが、それらに限定されない。脳腫瘍（brain cancers：脳癌）の例としては、脳幹グリオーマ及び視床下部グリオーマ、小脳星細胞腫及び大脳星細胞腫、髄芽腫、上衣腫並びに神経外肺葉腫瘍及び松果体腫瘍が挙げれられるが、それらに限定されない。男性生殖器の腫瘍には、前立腺癌及び精巣癌があるが、それらに限定されない。女性生殖器の腫瘍には、子宮内膜癌、子宮頸部癌、卵巣癌、膣癌及び外陰癌、並びに子宮肉腫があるが、それらに限定されない。消化管の腫瘍には、肛門癌、結腸癌、大腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵癌、直腸癌、小腸癌及び唾液腺癌があるが、それらに限定されない。尿路の腫瘍には、膀胱癌、陰茎癌、腎癌、腎盂癌、尿管癌及び尿道癌があるが、それらに限定されない。眼の癌には、眼内黒色腫及び網膜芽細胞腫があるが、それらに限定されない。肝癌の例としては、肝細胞癌（線維層状変異体を含む又は含まない肝細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）及び混合型肝細胞癌−胆管細胞癌が挙げられるが、それらに限定されない。皮膚癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌及び非黒色腫皮膚癌があるが、それらに限定されない。頭頸部癌には、喉頭部／下咽頭部／鼻咽頭部／中咽頭部の癌並びに口唇及び口腔の癌があるが、それらに限定されない。リンパ腫には、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病及び中枢神経系のリンパ腫があるが、それらに限定されない。肉腫には、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫及び横紋筋肉腫があるが、それらに限定されない。白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び有毛細胞白血病があるが、それらに限定されない。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、標的化部分は癌マーカーに結合する部分（例えば腫瘍関連抗原）である。これらのマーカーは必ずしも癌細胞に特有のものではないが、マーカーの発現が癌細胞において（正常健常細胞と比較して）上昇する場合、又はマーカーが周辺組織において同程度のレベルで存在しない場合（特に本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質が局所的に送達される場合）に効果的であってもよい。
【０１３４】
癌マーカーの例としては、ＮＤ４モノクローナル抗体によって認識される腫瘍マーカーが挙げられるが、これに限定されない。このマーカーは低分化大腸癌及び消化管神経内分泌腫瘍に見られる（例えば、Tobi et al. (1998) Cancer Detection and Prevention, 22(2): 147-152を参照されたい）。癌免疫療法の標的の他の例としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで殆どの腫瘍細胞において発現することが見出されているＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９等の膜結合補体調節糖タンパク質が挙げられる。ヒトムチン（例えばＭＵＣ１）も黒色腫に見られるｇｐ１００、チロシナーゼ及びＭＡＧＥと同様、腫瘍マーカーの例である。野生型ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、殆どの急性骨髄性、急性リンパ性及び慢性骨髄性白血病だけでなく、肺癌を含む様々なタイプの充実性腫瘍においても高レベルで発現される。
【０１３５】
急性リンパ性白血病は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９及びＣＤ２０によって特徴付けられている。急性骨髄性白血病はＴＡＡのＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３及びＣＤ３４によって特徴付けられている。乳癌はマーカーＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、Ｔａｇ−７２によって特徴付けられている。様々な癌がマーカーＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２及びＣＥＡによって特徴付けられている。慢性リンパ性白血病はマーカーＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５及びＨＬＡ−ＤＲによって特徴付けられている。有毛細胞白血病はマーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５によって特徴付けられている。ホジキン病はＬｅｕ−Ｍ１マーカーによって特徴付けられている。様々な黒色腫がＨＭＢ  ４５マーカーによって特徴付けられている。非ホジキンリンパ腫はＣＤ２０、ＣＤ１９及びＩａマーカーによって特徴付けられている。また、様々な前立腺癌がＰＳＭＡ及びＳＥ１０マーカーによって特徴付けられている。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は細胞型及び／又はその環境に不適切であるか、又は通常は生物の発生中にのみ存在する異常抗原（例えば胎児性抗原）を提示し得る。かかる抗原の例としては、通常は神経細胞の外表面膜上にのみ顕著なレベルで発現され、免疫系へのその曝露が血液脳関門によって制限されるジシアロガングリオシドであるスフィンゴ糖脂質ＧＤ２が挙げられる。ＧＤ２は神経芽細胞腫、髄芽腫、星状細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌、骨肉腫及び他の軟部組織肉腫を含む広範な腫瘍細胞の表面上に発現される。このため、ＧＤ２は免疫療法に好都合な腫瘍特異的標的である。
【０１３７】
他の種類の腫瘍細胞が、健常細胞の表面上では稀であるか又は存在せず、腫瘍細胞の無秩序な増殖及び分裂を引き起こす細胞シグナル伝達経路の活性化に関与している細胞表面受容体を提示し得る。例としては、乳癌腫瘍細胞の表面上に異常に高いレベルで産生される構成的活性化細胞表面受容体である（ＥｒｂＢ２）ＨＥＲ２／ｎｅｕが挙げられる。標的の他の有用な例としては、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
上記で論考されるマーカーのいずれも、本開示のヘテロ二量体中に含まれる標的化部分によって標的化することができる。幾つかの実施形態では、標的化されるマーカーはＥＧＦＲファミリーの成員（例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４）、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、５Ｅ１０、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ  １．２４、ＨＭＢ  ４５、ｌａ、Ｌｅｕ−Ｍ１、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＴＡＧ−７２、ホスファチジルセリン、ＣＳ１等の１つ又は複数である。
【０１３９】
一態様では、本開示は本開示のタンパク性ヘテロ二量体、その成員又はそのフラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態では、本開示は本開示のヘテロ二量体タンパク質、その成員又はそのフラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは当該技術分野で既知の組み換え法を用いて合成することができる。例えば、ポリヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成することができる。
【０１４０】
標準的な組み換えＤＮＡ法及び分子クローニング法としては、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis)及びT. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)及びAusubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)によって記載されるものが例示される。簡潔に述べると、対象の核酸をゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ及びＲＮＡから調製することができ、これら全てを細胞から直接的に抽出するか、又はＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない様々な増幅プロセスにより組換えによって作製することができる。
【０１４１】
核酸の直接化学合成は、典型的には成長ヌクレオチド重合体鎖の末端５’−ヒドロキシル基への３’ブロック及び５’ブロックヌクレオチド単量体の逐次付加を伴い、各々の付加は付加される単量体の３’位の成長鎖の末端５’−ヒドロキシル基の求核攻撃（典型的にはホスホトリエステル、ホスホラミダイト等のリン誘導体である）によって達成される。例えば、Matteuci et al., Tet. Lett. 521:719 (1980)、Caruthers et al.に対する米国特許第４，５００，７０７号、並びにSouthern et al.に対する米国特許第５，４３６，３２７号及び同第５，７００，６３７号を参照されたい。更なる態様では、本開示は本開示の単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ベクターは任意の線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター等であり得る。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを挙げることができる。幾つかの実施形態では、ベクターは発現ベクター、例えばファージ提示ベクターである。
【０１４２】
発現ベクターは、他でもない特定のタイプの宿主細胞における使用に好適であり得る。例えば、発現ベクターは宿主生物に導入することができ、これを次いで生存能力及びベクター中に含有される任意の遺伝子／ポリヌクレオチドの発現についてモニタリングする。
【０１４３】
発現ベクターは、発現時に発現ベクターを保有する宿主細胞の選択又は他の形での同定に有用な１つ又は複数の表現型形質をもたらす１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有していてもよい。真核細胞に好適な選択可能マーカーの非限定的な例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素及びネオマイシン耐性が挙げられる。
【０１４４】
対象のベクターは、確立されている様々な技法によって宿主細胞に安定に又は一過性に導入することができる。例えば、一方法は発現ベクターをカルシウム沈殿によって導入する塩化カルシウム処理を伴うものである。他の塩、例えばリン酸カルシウムを同様の手順に従って使用してもよい。加えて、エレクトロポレーション（すなわち、核酸に対する細胞の透過性を増大するための電流の印加）を用いることができる。形質転換法の他の例としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質転換、及び酢酸リチウムの存在下での熱ショックが挙げられる。脂質複合体、リポソーム及びデンドリマーを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることもできる。
【０１４５】
異種配列を宿主細胞に導入する際に、対象のベクターが導入された宿主細胞を同定するために様々な方法を実施することができる。例示的な選択法の一つは、個々の細胞を継代培養して個々のコロニーを形成し、続いて所望のタンパク質産物の発現を試験することを伴う。別の方法は、発現ベクター内に含有される選択可能なマーカー遺伝子の発現によってもたらされた表現型形質に基づいて異種配列を含有する宿主細胞を選択することを伴う。
【０１４６】
例えば、宿主細胞への本開示の様々な異種配列の導入は、ＰＣＲ、サザンブロット又はノーザンブロットハイブリダイゼーション等の方法によって確認することができる。例えば、核酸を得られる宿主細胞から調製し、対象の特異的な配列を対象の配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅することができる。増幅産物をアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動に供し、続いてエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液等によって染色するか、又はＤＮＡをＵＶ検出によって検出する。代替的には、対象の配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイゼーション反応に用いてもよい。特異的な遺伝子配列の発現はＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダイゼーションと組み合わせた逆転写によって、又はコードされる遺伝子産物と反応する抗体を用いた免疫測定法によって対応するｍＲＮＡを検出することで確認することができる。例示的な免疫測定法としては、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ及びサンドイッチ免疫測定法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
さらに、宿主細胞への本開示の様々な異種配列の導入は、異種配列がコードする酵素（例えば酵素マーカー）の酵素活性によって確認することができる。酵素は当該技術分野で既知の様々な方法によってアッセイすることができる。概して、酵素活性は調査中の酵素反応の産物の形成又は基質の変換によって確認することができる。反応はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得る。
【０１４８】
別の態様では、本開示は本明細書の他の部分で記載されるポリヌクレオチド又はベクターを含み、及び／又は本開示のタンパク性ヘテロ二量体及び／又はタンパク性ヘテロ二量体をコードする単離ポリヌクレオチドを発現することが可能な細胞（例えば宿主細胞）を提供する。幾つかの実施形態では、細胞は本開示のヘテロ二量体タンパク質及び／又はヘテロ二量体タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを発現する。細胞は真核細胞であっても、又は原核細胞であってもよい。適切な細胞を本開示のポリヌクレオチド又はベクターで形質転換又はトランスフェクトし、ヘテロ二量体タンパク質の発現及び／又は分泌に利用することができる。例えば、細胞は大腸菌細胞、他の細菌宿主細胞、酵母細胞又は様々な高等真核細胞（例えば不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞等）であり得る。幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを、特定の宿主細胞における発現に好適な発現制御配列に作動可能に接続する。
【０１４９】
タンパク性ヘテロ二量体を調製する方法
一態様では、本開示はタンパク性ヘテロ二量体を作製する方法を提供する。幾つかの実施形態では、この方法は、
（１）ヘテロ二量体の一方の成員を準備する工程、ここで、該一方の成員は、腫瘍抗原に対する結合特異性を示す標的化部分を形成するように複合した（ｉ）軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含む、
（２）上記ヘテロ二量体の他方の成員を準備する工程、ここで、該他方の成員は、Ｎ末端からＣ末端に向かって重鎖フラグメントに融合した免疫調節物質を含み、該重鎖フラグメントが前記重鎖（ｉｉ）と複合してヘテロ二量体を形成するポリペプチドを含む、及び、
（３）タンパク性ヘテロ二量体を得る工程、
を含む。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体を作製する方法は、本開示の宿主細胞をヘテロ二量体の発現を達成する条件下で培養する工程と、発現されたヘテロ二量体を採取する工程とを含む。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、本開示は本開示のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法を提供する。幾つかの実施形態では、この方法は、
（１）腫瘍関連抗原、癌細胞表面マーカー又は癌細胞関連マーカーに結合することが可能な標的化部分を含む第１の成員（例えば第１のポリペプチド）を準備する工程と、
（２）免疫グロブリンのＦｃ領域とインターフェロン、インターロイキン、又は任意の他の免疫調節物質とを含む第２の成員（例えば第２のポリペプチド）を準備する工程と、
（３）タンパク質ヘテロ二量体を得る工程と、
を含む。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、本開示のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法は、本開示の宿主細胞をヘテロ二量体タンパク質の発現を達成する条件下で培養する工程と、発現されたヘテロ二量体タンパク質を採取する工程とを含む。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、この方法はタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質を単離及び／又は精製する工程を更に含む。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、この方法は宿主細胞に本開示のヘテロ二量体、その１つ若しくは複数の成員、又はそのフラグメントをコード／発現するポリヌクレオチド／ベクターをトランスフェクト／形質転換する工程を更に含む。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質は、細胞内でタンパク質発現に好適な条件下でベクターを発現させることによって作製される。
【０１５６】
タンパク質発現に好適な条件において異なり得る因子としては、インキュベーション時間、温度及び培地等の因子が挙げられ、細胞タイプによって決まり、当業者によって容易に決定される。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質を作製するプロセスにおいて、発酵槽を含む培養物を増殖させるために使用することができる任意の装置において培養物中で宿主細胞を増殖させる。細胞は単層（monolayers）として増殖させても、又は表面に付着させて増殖させてもよい。代替的には、宿主細胞は懸濁液中で増殖させてもよい。細胞は無血清である培養培地中で培養させることができる。培地は８ｍＭ  Ｌ−グルタミン等のグルタミンを添加したＯｐｔｉ−ＣＨＯ（Invitrogen、カタログ＃１２６８１）；１０％仔ウシ血清、１０．５ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−３及びＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地；又は５％ＦＣＳ培地等であるが、これらに限定されない市販の培地であり得る。
【０１５８】
医薬組成物
一態様では本開示は医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、医薬組成物は本開示の単離タンパク性ヘテロ二量体（例えば単離ヘテロ二量体タンパク質）又は単離ポリヌクレオチドを含む。医薬組成物は薬学的に許容可能な賦形剤を更に含んでいてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、不活性固体希釈剤及び充填剤、希釈剤、滅菌水溶液、並びに様々な有機溶媒、透過促進剤、可溶化剤及びアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのｉｎ  ｓｉｔｕ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下リポジトリによる投与のために配合される。
【０１６０】
医薬組成物は腫瘍成長を阻害するために使用することができる。例えば、医薬組成物、薬剤及び／又はキットによって疾患の発症又は進行を阻害するか又は遅らせ、腫瘍サイズを低減し（更には腫瘍を実質的に排除し）、病状を緩和する及び／又は安定させることができ得る。
【０１６１】
非限定的な例示的な医薬組成物及びこれを調製する方法を下記に説明する。
【０１６２】
対象の医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、丸薬、粉末、持続放出配合物、溶液、懸濁液のような経口投与に好適な形態、滅菌溶液、懸濁液若しくはエマルションのような非経口注射に好適な形態、軟膏若しくはクリームのような局所投与に好適な形態、又は坐剤のような直腸投与に好適な形態であり得る。医薬組成物は正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形であってもよい。医薬組成物は、有効成分として本開示によるタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）を更に含み、従来の医薬担体又は賦形剤を含み得る。さらに、医薬組成物は他の薬剤又は医薬物質、担体、アジュバント等を含んでいてもよい。
【０１６３】
例示的な非経口投与形態としては、滅菌水溶液、例えばプロピレングリコール又はデキストロース水溶液中の活性タンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）の溶液又は懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。かかる剤形は、必要に応じてヒスチジン及び／又はリン酸塩等の塩を用いて適切に緩衝化することができる。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、本開示は、本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）と注射に好適な医薬賦形剤とを含有する注射用の医薬組成物を提供する。構成要素及び組成物中の作用物質の量は本明細書に記載される。
【０１６５】
本開示の医薬組成物を注射による投与のために組み込むことができる形態としては、水性若しくは油性懸濁液、又はゴマ油、コーン油、綿実油若しくはラッカセイ油を用いたエマルション、及びエリキシル、マンニトール、デキストロース、又は滅菌水溶液、並びに同様の医薬ビヒクルが挙げられる。
【０１６６】
生理食塩水溶液を注射に使用することもできる。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等（及びその好適な混合物）、シクロデキストリン誘導体及び植物油を用いてもよい。例えば分散液の場合に所要の粒径を維持するためのレシチン等のコーティング剤の使用、及び界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。
【０１６７】
滅菌注射溶液は、好適な量の本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）を、必要に応じて上記に列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌（filtered sterilization）を行うことによって調製することができる。概して、分散液は様々な滅菌有効成分を、基本分散媒と必要又は所望に応じて上記に列挙される他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、或る特定の望ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から任意の付加的な所望の成分に加えて有効成分の粉末を得る真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、本開示は、本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）と経口投与に好適な医薬賦形剤とを含有する経口投与用の医薬組成物を提供する。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、本開示は（ｉ）或る量の本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）と、任意に（ｉｉ）或る量の第２の作用物質と、（ｉｉｉ）経口投与に好適な医薬賦形剤とを含有する経口投与用の固体医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、組成物は（ｉｖ）或る量の第３の作用物質を更に含有する。幾つかの実施形態では、タンパク性ヘテロ二量体、第２の作用物質及び任意の第３の作用物質の量は、単独又は組合せで被験体の病態の治療に効果的な量である。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は経口摂取に好適な液体医薬組成物であり得る。経口投与に好適な本開示の医薬組成物は、各々が所定量の有効成分を粉末として、又は顆粒、溶液、若しくは水性若しくは非水性液体中の懸濁液、水中油型エマルション若しくは油中水型液体エマルションで含有するカプセル、カシェ剤若しくは錠剤、又は液剤若しくはエアゾールスプレー等の別個の剤形で与えることができる。かかる剤形は薬学の任意の方法によって調製することができるが、全ての方法が典型的には有効成分を１つ又は複数の他の成分を構成する担体と関連させる工程を含む。概して、組成物は有効成分と液体担体若しくは微細化固体担体又はその両方とを均一かつ密接に混和させた後、必要に応じて生成物を所望の形態（presentation）に成形することによって調製される。
【０１７１】
本開示は、水によって幾らかのポリペプチドの分解が促進され得るために、有効成分（例えば本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質）を含む無水医薬組成物及び剤形を更に包含する。例えば、製剤技術分野では配合物の保存期間又は経時的な安定性等の特徴を決定するために長期貯蔵をシミュレーションする手段として水を添加する場合がある（例えば５％）。本開示の無水医薬組成物及び剤形は、無水又は低水分含有成分及び低水分又は低湿度条件を用いて調製することができる。ラクトースを含有する本開示の医薬組成物及び剤形は、製造、包装及び／又は保管時の水分及び／又は湿度との実質的な接触が予想される場合に無水で作製することができる。無水医薬組成物はその無水性が維持されるように調製し、保管することができる。したがって、無水組成物は、好適な処方キット（formulary kit）に含まれ得るように水への曝露を防ぐことが知られる材料を用いて包装することができる。好適な包装の例としては、密封フォイル、プラスチック等、単位用量容器、ブリスターパック及びストリップパックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）は、従来の薬学配合法に従って医薬担体との密接混和物で組み合わせることができる。担体は投与に所望される調製物の形態に応じて広範な形態をとることができる。経口剤形用の組成物の調製においては、例えば経口液体調製物（懸濁液、溶液及びエリキシル等）若しくはエアロゾルの場合には水、グリコール、油、アルコール、着香料、保存料、着色料等の通常の医薬媒体のいずれを担体として用いてもよく、又はラクトースを用いない幾つかの実施形態では、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤等の担体を経口固体調製物の場合に使用することができる。例えば、好適な担体としては、固体経口調製物を含む粉末、カプセル及び錠剤が挙げられる。所望される場合、錠剤を標準的な湿式又は非湿式技法（aqueous or nonaqueous techniques）によってコーティングしてもよい。
【０１７３】
医薬組成物及び剤形に使用される好適な結合剤には、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン又は他のデンプン、ゼラチン、天然及び合成のガム、例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、トラガント粉末、グアーガム、セルロース及びその誘導体（例えば、エチルセルロース、アセチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、並びにそれらの混合物があるが、それらに限定されない。
【０１７４】
本明細書に開示の医薬組成物及び剤形に使用される好適な充填剤の例としては、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒又は粉末）、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファデンプン及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
水性環境に曝された場合に崩壊する錠剤を得るために、崩壊剤を本開示の組成物に使用してもよい。過剰の崩壊剤により瓶内で崩壊し得る錠剤が得られる可能性がある。過小量は崩壊が生じるのに不十分であり、剤形からの有効成分（複数の場合もある）の放出の速度及び程度が変更される可能性がある。このため、有効成分（複数の場合もある）の放出を有害に変更するような過小でも過剰でもない十分な量の崩壊剤が、本明細書に開示される化合物の剤形を形成するために用いられ得る。使用される崩壊剤の量は、配合物のタイプ及び投与様式に応じて異なり、当業者はこれを容易に認識することができる。約０．５重量パーセント〜約１５重量パーセントの崩壊剤又は約１重量パーセント〜約５重量パーセントの崩壊剤を医薬組成物に使用することができる。本開示の医薬組成物及び剤形を作製するのに使用することができる崩壊剤には、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモデンプン又はタピオカデンプン等のデンプン、アルファデンプン等のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ガム又はそれらの混合物があるが、それらに限定されない。
【０１７６】
本開示の医薬組成物及び剤形を作製するのに使用することができる滑沢剤には、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール等のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水添植物油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリル酸エチル、寒天及びそれらの混合物があるが、それらに限定されない。更なる滑沢剤には、例えばｓｙｌｏｉｄシリカゲル、合成シリカの凝固エアロゾル及びそれらの混合物がある。滑沢剤は医薬組成物の約１重量パーセント未満の量で任意に添加してもよい。
【０１７７】
水性懸濁液及び／又はエリキシルが経口投与に所望される場合、その有効成分は水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びそれらの様々な組合せ等の希釈剤とともに様々な甘味料又は着香料、着色料又は染料、また、そのように所望される場合、乳化剤及び／又は懸濁化剤と組み合わせることができる。
【０１７８】
錠剤はコーティングしなくても、又は消化管内での崩壊及び吸収を遅らせることで、より長期間にわたる持続的作用をもたらすために既知の技法によってコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質を用いることができる。経口使用のための配合物は、有効成分を不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合した硬ゼラチンカプセル、又は有効成分を水若しくは油媒体、例えばラッカセイ油、流動パラフィン若しくはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセルとしても与えることができる。
【０１７９】
本開示の医薬組成物及び剤形を形成するために使用することができる界面活性剤としては、親水性界面活性剤、親油性界面活性剤及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。親水性界面活性剤の混合物を用いても、親油性界面活性剤の混合物を用いても、又は少なくとも１つの親水性界面活性剤と少なくとも１つの親油性界面活性剤との混合物を用いてもよい。
【０１８０】
親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値がより低い界面活性剤は、親油性又は疎水性がより高く、油への溶解性がより大きくなり、ＨＬＢ値がより高い界面活性剤はより親水性であり、水溶液への溶解性がより大きくなる。親水性界面活性剤は概して、ＨＬＢ値が約１０を超える化合物、及びＨＬＢスケールが概して適用可能でないアニオン性、カチオン性又は両性イオン性化合物と考えられる。同様に、親油性（すなわち疎水性）界面活性剤はＨＬＢ値が約１０以下の化合物である。しかしながら、界面活性剤のＨＬＢ値は、概して工業、医薬及び化粧品エマルションの配合を可能にするために用いられる大まかな目安にすぎない。
【０１８１】
親水性界面活性剤はイオン性又は非イオン性のいずれであってよい。好適なイオン性界面活性剤には、アルキルアンモニウム塩；フシジン酸塩；アミノ酸、オリゴペプチド及びポリペプチドの脂肪酸誘導体；アミノ酸、オリゴペプチド及びポリペプチドのグリセリド誘導体；レシチン及び水添レシチン；リゾレシチン及び水添リゾレシチン；リン脂質及びそれらの誘導体；リゾリン脂質及びそれらの誘導体；カルニチン脂肪酸エステルの塩；アルキル硫酸の塩；脂肪酸塩；ドクサートナトリウム；アシルラクチレート；モノ及びジグリセリドのモノ及びジアセチル化酒石酸エステル；コハク酸化モノ及びジグリセリド；モノ及びジグリセリドのクエン酸エステル；並びにそれらの混合物があるが、それらに限定されない。
【０１８２】
上記の群のうち、イオン性界面活性剤には、例としてレシチン、リゾレシチン、リン脂質、リゾリン脂質及びそれらの誘導体；カルニチン脂肪酸エステルの塩；アルキル硫酸の塩；脂肪酸塩；ドクサートナトリウム；アシルアクチレート；モノ及びジグリセリドのモノ及びジアセチル化酒石酸エステル；コハク酸化モノ及びジグリセリド；モノ及びジグリセリドのクエン酸エステル；並びにそれらの混合物が挙げられる。
【０１８３】
イオン性界面活性剤は、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＶＰ−ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸の乳酸エステル、ステアロイル−２−ラクチレート、ステアロイルラクチレート、コハク酸化モノグリセリド、モノ／ジグリセリドのモノ／ジアセチル化酒石酸エステル、モノ／ジグリセリドのクエン酸エステル、コリルサルコシン、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、ミリステート、パルミテート、オレエート、リシノレート、リノレート、リノレナート、ステアレート、ラウリルサルフェート、テラセシルサルフェート、ドクセート、ラウロイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、ミリストイルカルニチン並びにこれらの塩及び混合物のイオン化形態であってよい。
【０１８４】
親水性の非イオン性界面活性剤の例としては、アルキルグルコシド；アルキルマルトシド；アルキルチオグルコシド；ラウリルマクロゴールグリセリド；ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、例えばポリエチレングリコールアルキルエーテル；ポリオキシアルキレンアルキルフェノール、例えばポリエチレングリコールアルキルフェノール；ポリオキシアルキレンアルキルフェノール脂肪酸エステル、例えばポリエチレングリコール脂肪酸モノエステル及びポリエチレングリコール脂肪酸ジエステル；ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル；ポリグリセロール脂肪酸エステル；ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル；ポリオールとグリセリド、植物油、水添植物油、脂肪酸及びステロールからなる群の少なくとも１つの成員との親水性エステル交換生成物；ポリオキシエチレンステロール、その誘導体及び類似体；ポリオキシエチル化ビタミン及びそれらの誘導体；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；及びそれらの混合物；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル並びにポリオールとトリグリセリド、植物油及び水添植物油からなる群の少なくとも１つの成員との親水性エステル交換生成物が挙げられるが、それらに限定されない。ポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、プロピレングリコール、ペンタエリトリトール、又はサッカリドであってよい。
【０１８５】
親水性の非イオン性界面活性剤の他の例としては、ラウリン酸ＰＥＧ−１０、ラウリン酸ＰＥＧ−１２、ラウリン酸ＰＥＧ−２０、ラウリン酸ＰＥＧ−３２、ジラウリン酸ＰＥＧ−３２、オレイン酸ＰＥＧ−１２、オレイン酸ＰＥＧ−１５、オレイン酸ＰＥＧ−２０、ジオレイン酸ＰＥＧ−２０、オレイン酸ＰＥＧ−３２、オレイン酸ＰＥＧ−２００、オレイン酸ＰＥＧ−４００、ステアリン酸ＰＥＧ−１５、ジステアリン酸ＰＥＧ−３２、ステアリン酸ＰＥＧ−４０、ステアリン酸ＰＥＧ−１００、ジラウリン酸ＰＥＧ−２０、トリオレイン酸ＰＥＧ−２５グリセリル、ジオレイン酸ＰＥＧ−３２、ラウリン酸ＰＥＧ−２０グリセリル、ラウリン酸ＰＥＧ−３０グリセリル、ステアリン酸ＰＥＧ−２０グリセリル、オレイン酸ＰＥＧ−２０グリセリル、オレイン酸ＰＥＧ−３０グリセリル、ラウリン酸ＰＥＧ−３０グリセリル、ラウリン酸ＰＥＧ−４０グリセリル、ＰＥＧ−４０パーム核油、ＰＥＧ−５０水添ヒマシ油、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、ＰＥＧ−３５ヒマシ油、ＰＥＧ−６０ヒマシ油、ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油、ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油、ＰＥＧ−６０コーン油、カプリン酸／カプリル酸ＰＥＧ−６グリセリド、カプリン酸／カプリル酸ＰＥＧ−８グリセリド、ラウリン酸ポリグリセリル−１０、ＰＥＧ−３０コレステロール、ＰＥＧ−２５フィトステロール、ＰＥＧ−３０ダイズステロール、トリオレイン酸ＰＥＧ−２０、オレイン酸ＰＥＧ−４０ソルビタン、ラウリン酸ＰＥＧ−８０ソルビタン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＯＥ−９ラウリルエーテル、ＰＯＥ−２３ラウリルエーテル、ＰＯＥ−１０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０ステアリルエーテル、コハク酸トコフェリルＰＥＧ−１００、ＰＥＧ−２４コレステロール、オレイン酸ポリグリセリル−１０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、モノステアリン酸スクロース、モノラウリン酸スクロース、モノパルミチン酸スクロース、ＰＥＧ１０−１００ノニルフェノールシリーズ、ＰＥＧ１５−１００オクチルフェノールシリーズ及びポロキサマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
好適な親油性界面活性剤には、例に過ぎないが、脂肪アルコール；グリセロール脂肪酸エステル；アセチル化グリセロール脂肪酸エステル；低級アルコール脂肪酸エステル；プロピレングリコール脂肪酸エステル；ソルビタン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル；ステロール及びステロール誘導体；ポリオキシエチル化ステロール及びステロール誘導体；ポリエチレングリコールアルキルエーテル；糖エステル；糖エーテル；モノ及びジグリセリドの乳酸誘導体；ポリオールと、グリセリド、植物油、水添植物油、脂肪酸及びステロールからなる群の少なくとも１つの成員との疎水性エステル交換生成物；脂溶性ビタミン／ビタミン誘導体；並びにそれらの混合物がある。この群のうち、好ましい親油性界面活性剤には、グリセロール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル及びそれらの混合物があり、又はポリオールと、植物油、水添植物油及びトリグリセリドからなる群の少なくとも１つの成員との疎水性エステル交換生成物がある。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、組成物は本開示のタンパク性ヘテロ二量体の良好な可溶化及び／又は溶解を確実にし、本開示のタンパク性ヘテロ二量体の沈殿を最小限に抑えるために可溶化剤を含む。これは非経口使用のための組成物、例えば注射用の組成物に特に重要であり得る。可溶化剤は親水性薬物及び／又は界面活性剤等の他の構成要素の溶解性を増大するため、又は組成物を安定した若しくは均一な溶液若しくは分散液として維持するために添加することもできる。
【０１８８】
好適な可溶化剤の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール及びその異性体、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、トランスクトール（transcutol）、ジメチルイソソルビド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び他のセルロース誘導体、シクロデキストリン及びシクロデキストリン誘導体等のアルコール及びポリオール；テトラヒドロフルフリルアルコールＰＥＧエーテル（グリコフロール）又はメトキシＰＥＧ等の平均分子量が約２００〜約６０００のポリエチレングリコールのエーテル；２−ピロリドン、２−ピペリドン、ε−カプロラクタム、Ｎ−アルキルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシアルキルピロリドン、Ｎ−アルキルピペリドン、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルアセトアミド及びポリビニルピロリドン等のアミド及び他の窒素含有化合物；プロピオン酸エチル、クエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、酪酸エチル、トリアセチン、プロピレングリコールモノアセテート、プロピレングリコールジアセテート、ε−カプロラクトン及びその異性体、δ−バレロラクトン及びその異性体、β−ブチロラクトン及びその異性体等のエステル；並びにジメチルアセトアミド、ジメチルイソソルビド、Ｎ−メチルピロリドン、モノオクタノイン、ジエチレングリコールモノエチルエーテル及び水等の当該技術分野で既知の他の可溶化剤。
【０１８９】
可溶化剤の混合物を使用することもできる。例としては、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ポリエチレングリコール２００〜１００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール及びジメチルイソソルビドが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい可溶化剤としては、ソルビトール、グリセロール、トリアセチン、エチルアルコール、ＰＥＧ−４００、グリコフロール及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０１９０】
含まれ得る可溶化剤の量は特に限定されない。所与の可溶化剤の量は生体に許容可能な（bioacceptable）量に限定され、当業者はこれを容易に決定することができる。状況によっては、例えば薬物の濃度を最大にするために生体に許容可能な量よりもはるかに過剰な量の可溶化剤を含むことが有利な場合もあり、過剰な可溶化剤を、組成物を被験体に与える前に蒸留又は蒸発等の従来の技法を用いて除去する。このため、存在する場合、可溶化剤は薬物及び他の賦形剤の総重量ベースで１０重量％、２５重量％、５０重量％、１００重量％又は最大約２００重量％の重量比であり得る。所望される場合、非常に少量、例えば５％、２％、１％又は更に低い量の可溶化剤を使用することもできる。典型的には、可溶化剤は約１重量％〜約１００重量％、より典型的には約５重量％〜約２５重量％の量で存在し得る。
【０１９１】
組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加剤及び賦形剤を更に含むことができる。このような添加剤及び賦形剤には、粘着防止剤（detackifier）、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、防腐剤、キレート剤、粘性調整剤、等張剤（tonicifier）、香味剤、着色剤、着臭剤、乳白剤、懸濁剤、結合剤、充填剤、可塑剤、滑沢剤及びそれらの混合物があるが、それらに限定されない。
【０１９２】
加えて、加工を促進するため、安定性を高めるため又は他の理由で酸又は塩基を組成物に組み込むことができる。薬学的に許容可能な塩基の例としては、アミノ酸、アミノ酸エステル、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、合成ハイドロカルサイト、水酸化アルミニウムマグネシウム、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、トリイソプロパノールアミン、トリメチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）等がある。薬学的に許容可能な酸、例えば酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ヒドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸等の塩である塩基も適している。多塩基酸の塩、例えばリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムも使用することができる。塩基が塩であるとき、陽イオンは、任意の使いやすい及び薬学的に許容可能な陽イオン、例えばアンモニウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属等であってよい。例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム及びアンモニウムが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９３】
好適な酸は薬学的に許容可能な有機又は無機酸である。好適な無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸等が挙げられる。好適な有機酸の例としては、酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ヒドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸等が挙げられる。
【０１９４】
幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、追加の治療的に及び／又は薬学的に所望の物質を含むことができる。例えば、追加の治療的に及び／又は薬学的に所望の物質は、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、フェニルアラニンマスタード、メルファラン、クロラムブコル（chlorambucol）、ウラシルマスタード、エストラムスチン、チオテパ、ブスルファン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シス−プラチナム、シスプラチン、カルボプラチン、アルトレタミン等）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、ペントスタチン等）、抗生物質（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、プロカルバジン等）、有糸分裂阻害剤（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビノレルビン硫酸塩等）、クロマチン機能阻害剤（例えば、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド等）、ホルモン及びホルモン阻害剤（例えばジエチルスチルベステロール、エストラジオール、エストロゲン、エステル化エストロゲン、エストラムスチン、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、レトロゾール、１７−ＯＨ−プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ゴセレリン、ロイプロリド、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等）、合成阻害剤（例えばアミノグルテチミド、ケトコナゾール等）、免疫調節剤（例えばリツキサン、トラスツズマブ、デニロイキンディフティトックス、レバミゾール、バシラスカルメットゲラン（bacillus Calmette-Guerin：カルメットゲラン桿菌）、インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、インターロイキン−２、アルデスロイキン等）及び他の物質、例えば１−アスパラギナーゼ、ペグアスパラガーゼ、ヒドロキシウレア、ロイコボリン、ミトタン、ポルフィマー、トレチノイン等を含むが、それらに限定されない抗腫瘍剤であってよい。
【０１９５】
本開示の医薬組成物は、治療有効量の活性物質（例えば本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質）を含み得る。治療有効量は、病態又は障害（例えば癌）及び／又は任意のその合併症を、該病態若しくは障害を患う又はそれを発症するリスクを有する被験体において（少なくとも部分的に）予防及び／又は治癒することが可能な対象の医薬組成物の量である。含まれる活性物質の具体的な量／濃度は投与方法及び患者の必要性によって異なる場合があり、例えば容量、粘度及び／又は患者の体重等に基づいて決定することができる。例えば、適切な投与量は約０．１ｍｇ／ｋｇ／日又は１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。場合によっては、投与量は更に高くてもよい。幾つかの実施形態では、適用される投与量は約３ｍｇ／ｋｇ／日〜約３．５ｍｇ／ｋｇ／日、３．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約７．２ｍｇ／ｋｇ／日、約７．２ｍｇ／ｋｇ／日〜約１１．０ｍｇ／ｋｇ／日、約１１．０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５．０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。幾つかの実施形態では、適用される投与量は約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば１日当たり約２０ｍｇ〜約５０ｍｇ（１日２回投与する）である。これらの具体的な用量を、当業者（例えば医師又は薬剤師）が特定の患者の病態、配合物及び／又は疾患に基づいて都合よく調整することができることを理解されたい。
【０１９６】
医学的使用及び治療方法
一態様では、本開示は腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害するための薬剤及び／又はキットの製造における本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）、単離ポリヌクレオチド又は医薬組成物の使用を提供する。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、薬剤及び／又はキットは標的細胞（例えば癌細胞）の成長若しくは分化を特異的及び／又は優先的に阻害するか、又は標的細胞（例えば癌細胞）を死滅させるために使用される。
【０１９８】
一態様では、本開示は腫瘍又は腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は腫瘍又は細胞と有効量の本開示のタンパク性ヘテロ二量体又はヘテロ二量体タンパク質とを接触させることを含み得る。幾つかの実施形態では、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。幾つかの実施形態では、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、上記接触は本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）、医薬組成物又は薬剤を被験体（例えば哺乳動物）に全身的又は局所的に投与することを含む。幾つかの実施形態では、上記接触は本開示のタンパク性ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体タンパク質）、医薬組成物又は薬剤を腫瘍部位に直接投与することを含む。幾つかの実施形態では、投与は経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのｉｎ  ｓｉｔｕ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下リポジトリによる投与によって行われる。
【０２００】
幾つかの実施形態では、腫瘍（例えば癌）又は腫瘍細胞（例えば癌細胞）は充実性腫瘍であるか、又は充実性腫瘍に由来する。例えば、癌はＢ細胞リンパ腫、肺癌、気管支癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系の腫瘍、末梢神経系腫瘍、食道癌、子宮頸部癌、黒色腫、子宮又は子宮内膜の癌、口腔又は咽頭部の癌、肝癌、腎癌、胆道癌、小腸又は虫垂の癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、精巣癌及び悪性線維性組織球腫からなる群から選択され得る。
【０２０１】
幾つかの実施形態では、癌又は癌細胞は被験体の身体内のもの、例えばヒト又は非ヒト動物（例えば哺乳動物）における癌又は癌細胞である。
【０２０２】
幾つかの実施形態では哺乳動物はヒトである。幾つかの実施形態では、哺乳動物はマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモット、サル又は任意の他の哺乳動物である。多くのかかる哺乳動物は、充実性腫瘍及び／又は他の癌を含む或る特定の疾患又は障害の前臨床モデルとして当該技術分野で既知の被験体であり得る（例えば、Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol. 170:793、Kerbel, 2003 Canc. Biol. Therap. 2(4 Suppl 1):S134、Man et al., 2007 Canc. Met. Rev. 26:737、Cespedes et al., 2006 Clin. TransL Oncol. 8:318）。
【０２０３】
本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、かかる実施形態が例示としてのみ提示されることが当業者には明白である。ここで、本開示から逸脱することなく多数の変更、変化及び置換が当業者に想起される。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替形態を本開示の実施において用いることができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲により本開示の範囲が規定され、これらの特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内の方法及び構造がそれにより包含されることが意図される。
【実施例】
【０２０４】
下記に提示する実施例及び調製物により、本開示のタンパク性ヘテロ二量体並びにそれを使用及び調製する方法が更に説明及び例示される。本開示の範囲は以下の実施例及び調製物の範囲によって何ら限定されないことが理解される。
【０２０５】
実施例１  ポリペプチドの修飾及び調製
１．１  セツキシマブの調製
セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ又はＥｒｂとしても知られる；上皮成長因子受容体ＥＧＦＲに対する抗体である）の重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列を得て、対応するこれらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて得た。次いで、セツキシマブの軽鎖（Ｅｒｂ−ＬＣ）をコードする核酸分子を合成した。Ｅｒｂ−ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１１に規定され、それをコードする対応するポリヌクレオチド配列は配列番号１２に規定される。次いで、点突然変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）をセツキシマブ重鎖遺伝子のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入し、修飾セツキシマブ重鎖をコードする核酸分子を合成し（本明細書でｅｒｂ−ｋｎｏｂと称される）、それをコードする対応するポリペプチドをＥｒｂ−ｋｎｏｂと指定した。Ｅｒｂ−ｋｎｏｂのアミノ酸配列は配列番号１３に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１４に規定される。
【０２０６】
１．２  トラスツズマブの調製
トラスツズマブの重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列を米国特許第７８７９３２５号（引用することにより本明細書の一部をなす）に従って得た。次いで、これらのアミノ酸配列をコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて得た。次いで、トラスツズマブの軽鎖（Ｔ−ＬＣ）をコードする核酸分子を合成した。Ｔ−ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１５に規定され、それをコードする対応するポリヌクレオチド配列は配列番号１６に規定される。次いで、点突然変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）をトラスツズマブ重鎖遺伝子のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入し、修飾トラスツズマブ重鎖をコードする核酸分子を合成し（本明細書でｔ−ｋｎｏｂと称される）、それをコードする対応するポリペプチドをＴ−ｋｎｏｂと指定した。Ｔ−ｋｎｏｂのアミノ酸配列は配列番号１７に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１８に規定される。
【０２０７】
１．３  ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、マウスインターフェロンα４（ＩＦＮａ４）（ＮＭ＿０１０５０４．２）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列をタンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」（配列番号２７）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加して、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。マウスＩＦＮａ４をコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号１に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２に規定される。
【０２０８】
１．４  ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、ヒトインターフェロンα２（ＩＦＮａ２）（ＮＭ＿０００６０５．３）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列をタンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」（配列番号２７）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加して、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。ヒトＩＦＮａ２をコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号３に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号４に規定される。
【０２０９】
１．５  ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、マウスインターフェロンβ（ＩＦＮβ）（ＮＭ＿００５０１８．２）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列を、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」（配列番号２７）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加して、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。マウスＩＦＮβをコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号５に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号６に規定される。
【０２１０】
１．６  ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、ヒトインターフェロンβ（ＩＦＮβ）（ＥＦ０６４７２５．１）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列を、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」（配列番号２７）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加して、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。ヒトＩＦＮβをコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号９に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１０に規定される。
【０２１１】
１．７  ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、ヒトインターフェロンλ（ＩＦＮＬ）（ＢＣ１１７４８２．１）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列を、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」（配列番号２７）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加して、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。ヒトＩＦＮＬをコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号７に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号８に規定される。
【０２１２】
１．８  対照Ｃ末端又はＮ末端融合タンパク質の調製
まず、セツキシマブ軽鎖及び重鎖の完全長アミノ酸配列を得た。次いで、これらをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計し、セツキシマブ軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を合成した。リンカー配列「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ」（配列番号２８）を重鎖のＣ末端に付加し、それによりセツキシマブ重鎖−リンカーを得た。次いで、マウスＩＦＮβ（ＮＭ＿００５０１８．２）をコードするＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。次いで、マウスＩＦＮβをコードするＤＮＡ配列をこのようにして得られるセツキシマブ重鎖−リンカーの３’末端に付加し、融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂをコードするポリヌクレオチド配列を作製し、合成した。ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂのアミノ酸配列は配列番号１９に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２０に規定される。
【０２１３】
同様に、セツキシマブ軽鎖及び重鎖の完全長アミノ酸配列を得た。次いで、これらをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計し、セツキシマブ軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を合成した。リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」を重鎖のＮ末端に付加し、それによりリンカー−セツキシマブ重鎖を得た。次いで、ヒトＩＦＮλ（ＢＣ１１７４８２．１）をコードするＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。次いで、ヒトＩＦＮＬをコードするＤＮＡ配列をこのようにして得られるリンカー−セツキシマブ重鎖の５’末端に付加し、融合タンパク質ＩＦＮＬ−ＥｒｂＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を作製し、合成した。ＩＦＮＬ−ＥｒｂＨＣのアミノ酸配列は配列番号２１に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２２に規定される。
【０２１４】
セツキシマブ軽鎖及び重鎖の完全長アミノ酸配列を得た。次いで、これらをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計し、セツキシマブ軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を合成した。リンカー配列「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ」（配列番号２８）を重鎖のＣ末端に付加し、それによりセツキシマブ重鎖−リンカーを得た。次いで、ヒトＩＦＮβ（ＥＦ０６４７２５．１）をコードするＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。次いで、ヒトＩＦＮβをコードするＤＮＡ配列をこのようにして得られるセツキシマブ重鎖−リンカーの３’末端に付加し、融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｈｕＩＦＮｂをコードするポリヌクレオチド配列を作製し、合成した。ＥｒｂＨＣ−ｈｕＩＦＮｂのアミノ酸配列は配列番号２３に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２４に規定される。
【０２１５】
セツキシマブ軽鎖及び重鎖の完全長アミノ酸配列を得た。次いで、これらをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計し、セツキシマブ軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を合成した。リンカー配列「ＧＳＧＧＧ」を重鎖のＮ末端に付加し、それによりリンカー−セツキシマブ重鎖を得た。次いで、ヒトＩＦＮβ（ＥＦ０６４７２５．１）をコードするＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。次いで、ヒトＩＦＮβをコードするＤＮＡ配列をこのようにして得られるリンカー−セツキシマブ重鎖の５’末端に付加し、融合タンパク質ｈｕＩＦＮｂ−ＥｒｂＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を作製し、合成した。ｈｕＩＦＮｂ−ＥｒｂＨＣのアミノ酸配列は配列番号２５に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２６に規定される。
【０２１６】
１．９  ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、ヒトインターロイキン１０（ｈｕＩＬ１０）（Ｐ２２３０１）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列を、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「（ＧＧＧＧＳ）３」（配列番号８９）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加し、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。ｈｕＩＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号４９に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号５０に規定される。
【０２１７】
１．１０  （ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅの調製
まず、ヒトインターロイキン１０（ｈｕＩＬ１０）（Ｐ２２３０１）の配列情報を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手し、それをコードする完全長ポリヌクレオチド配列を得た。次いで、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（すなわち、Ｐ０１８５７の残基１０４〜残基３３０）のアミノ酸配列を、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔによるヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｐ０１８５７）のアミノ酸配列に従って得た。その後、点突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）をＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントに導入した。それにより得られるポリペプチドはＦｃ−ｈｏｌｅと称される。次いで、リンカー配列「（ＧＧＧＧＳ）３」（配列番号８９）をＦｃ−ｈｏｌｅのＮ末端に付加し、リンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅを得た。次いで、それをコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて設計した。次いで、リンカー配列「（ＧＧＧＧＳ）３」（配列番号８９）をｈｕＩＬ１０の２つのコピー間に付加し、（ｈｕＩＬ１０）２を得た。次いで、（ｈｕＩＬ１０）２をコードするポリヌクレオチド配列をリンカー−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に付加し、それにより融合タンパク質（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅをコードするポリヌクレオチド配列を得て、合成した。（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅのアミノ酸配列は配列番号５１に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号５２に規定される。
【０２１８】
１．１１  ペルツズマブの調製
ペルツズマブの重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列を米国特許第７８７９３２５号（引用することにより本明細書の一部をなす）に従って得た。次いで、これらのアミノ酸配列をコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて得た。次いで、ペルツズマブの軽鎖（Ｐ−ＬＣ）をコードする核酸分子を合成した。Ｐ−ＬＣのアミノ酸配列は配列番号５７に規定され、それをコードする対応するポリヌクレオチド配列は配列番号５８に規定される。次いで、点突然変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）をペルツズマブ重鎖遺伝子のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入し、修飾ペルツズマブ重鎖をコードする核酸分子を合成し（本明細書でｐ−ｋｎｏｂと称される）、それをコードする対応するポリペプチドをＰ−ｋｎｏｂと指定した。Ｐ−ｋｎｏｂのアミノ酸配列は配列番号５５に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号５６に規定される。
【０２１９】
１．１２  Ｍａｂ８０６の調製
Ｍａｂ８０６の重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列を、米国特許第７８７９３２５号（引用することにより本明細書の一部をなす）に従って得た。次いで、これらのアミノ酸配列をコードする対応するＤＮＡ配列をオンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて得た。次いで、Ｍａｂ８０６の軽鎖（Ｍａｂ８０６−ＬＣ）をコードする核酸分子を合成した。Ｍａｂ８０６−ＬＣのアミノ酸配列は配列番号６７に規定され、それをコードする対応するポリヌクレオチド配列は配列番号６８に規定される。次いで、点突然変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）をＭａｂ８０６重鎖遺伝子のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入し、修飾Ｍａｂ８０６重鎖をコードする核酸分子を合成し（本明細書でｍａｂ８０６−ｋｎｏｂと称される）、それをコードする対応するポリペプチドをＭａｂ８０６−ｋｎｏｂと指定した。Ｍａｂ８０６−ｋｎｏｂのアミノ酸配列は配列番号６９に規定され、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号７０に規定される。
【０２２０】
実施例２  組み換えプラスミドの構築
実施例１に従って得られた核酸分子（ｈｕＩＦＮｂ−ＥｒｂＨＣ、ＥｒｂＨＣ−ｈｕＩＦＮｂ、ＩＦＮＬ−ＥｒｂＨＣ、ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｔ−ｋｎｏｂ、トラスツズマブ軽鎖（Ｔ−ＬＣと指定した）、Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ、セツキシマブ軽鎖（Ｅｒｂ−ＬＣと指定した）、ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ペルツズマブ軽鎖（Ｐ−ＬＣと指定した）、Ｐ−ｋｎｏｂ、Ｍａｂ８０６軽鎖（Ｍａｂ８０６−ＬＣと指定した）及びＭａｂ８０６−ｋｎｏｂをそれぞれコードする）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社）で消化した後、ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）にそれぞれサブクローニングした。得られたプラスミドをシークエンシングによって検証し、正しい組み換えプラスミドをｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮｂ−ＥｒｂＨＣ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＨＣ−ｈｕＩＦＮｂ、ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮＬ−ＥｒｂＨＣ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂ、ｐｃＤＮＡ４−Ｔ−ｋｎｏｂ、ｐｃＤＮＡ４−ＴＬＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ、ｐｃＤＮＡ４−ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ、ｐｃＤＮＡ４−ＰＬＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｐ−ｋｎｏｂ、ｐｃＤＮＡ４−Ｍａｂ８０６−ＬＣ及びｐｃＤＮＡ４−Ｍａｂ８０６−ｋｎｏｂとそれぞれ指定した。
【０２２１】
実施例３  タンパク性ヘテロ二量体の発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、１２×６００ｍＬの順化（domesticated）ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞の懸濁液を一過性トランスフェクションのために調製し、細胞を０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で播種した。２日後に、３つの細胞懸濁液のアリコートを遠心分離した後、６００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培養培地に再懸濁した。
【０２２２】
実施例２により得られた組み換え発現ベクターを以下の群に分けた：
群１：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｍｕＩＦＮａ４−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群２：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＣＬ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群３：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群４：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群５：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮＬ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群６：ｐｃＤＮＡ４−Ｔ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＴＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮａ２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群７：ｐｃＤＮＡ４−Ｔ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＴＣＬ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群８：ｐｃＤＮＡ４−Ｔ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＴＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群９：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｈｕＩＬ１０−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群１０：ｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群１１：ｐｃＤＮＡ４−Ｍａｂ８０６−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−Ｍａｂ８０６−ＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）；
群１２：ｐｃＤＮＡ４−Ｐ−ｋｎｏｂ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＰＬＣ（２００μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−（ｈｕＩＬ１０）２−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（２００μｇ）。
【０２２３】
各群のプラスミド混合物を６ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液を添加してトランスフェクションを行った。各群のプラスミド／ＰＥＩ混合物を６００ｍＬの細胞懸濁液にそれぞれ添加し、これを次いで３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養し、培地に５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１（インスリン様成長因子Ｉ）を添加した。４時間後に、培養物に６００ｍＬのＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン及び５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を添加し、１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後に、３．８ｍＭ  ＶＰＡを添加した。５、６日後に、５×１２００ｍＬの細胞の上清を回収し、粗タンパク性ヘテロ二量体サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。得られたサンプルを初めにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査すると、標的バンドが明らかに見られた（例を図１０に示す）。このようにして得られるタンパク性ヘテロ二量体を（それぞれ群１から群１２まで）Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２、Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬ、Ｔｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２、Ｔｍａｂ−ｈｕＩＦＮｂ、Ｔｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２、Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２、Ｍａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２及びＰｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２と指定した。
【０２２４】
実施例４  タンパク性ヘテロ二量体の発現収率
４．１  ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂとＣ末端融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂとの発現の比較
トランスフェクションの２日前に、２×１００ｍＬの順化ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞の懸濁液を一過性トランスフェクションのために調製し、細胞を０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で播種した。２日後に、細胞懸濁液を遠心分離した後、１００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培養培地に再懸濁した。発現プラスミドを「ヘテロ二量体群」と「Ｃ末端融合タンパク質群」とに分けた。ここで、ヘテロ二量体群はｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ｋｎｏｂ（３３μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＬＣ（３３μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ｍｕＩＦＮｂ−Ｆｃ−ｈｏｌｅ（３３μｇ）を含み、Ｃ末端融合タンパク質群はｐｃＤＮＡ４−Ｅｒｂ−ＬＣ（５０μｇ）＋ｐｃＤＮＡ４−ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂ（５０μｇ）を含んでいた。各群のプラスミド混合物を１ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液を添加してトランスフェクションを行った。各群のプラスミド／ＰＥＩ混合物を１００ｍＬの細胞懸濁液にそれぞれ添加した後、３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養し、培地に５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を添加した。４時間後に、培養物に１００ｍＬのＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン及び５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を添加し、１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後に、３．８ｍＭ  ＶＰＡを添加した。５、６日後に、一過性発現による培養上清を回収し、ヘテロ二量体及びＣ末端融合タンパク質の発現レベルをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）によって検査した。
【０２２５】
図１に示されるように、Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂヘテロ二量体の発現収率は８３ｍｇ／Ｌであり、Ｃ末端融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂの発現収率は３ｍｇ／Ｌであった。
【０２２６】
同様に、他の本開示のタンパク性ヘテロ二量体並びに対照Ｃ末端融合タンパク質及び／又はＮ末端融合タンパク質の発現収率を検査した。結果を下記表１にまとめる。
【０２２７】
【表１】
2018502147.tif 000003
【０２２８】
実施例５  タンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
５．１  ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂの薬物動態プロファイル
１２匹のＢａｌｂ／Ｃ雌性８週齢マウスを各群４匹のマウスで３つの群（群Ａ／Ｂ／Ｃ）に分けた。５０μｇ（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＥｒｂ−ｈｕＩＦＮｂタンパク性ヘテロ二量体を各マウスに静脈注射し、１００μｌの血液をヘテロ二量体の投与後１３の異なる時点で採取した。各時点で、血液を１つの群のマウスから採取し、３つの群を交代した。血清を単離した後、血清中のヘテロ二量体の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。プレートをマウス抗ｈＩｇＧ（Jackson Immuno Research：２０９−００５−０８２）でコーティングした後、適切に希釈した血清サンプルを添加した。その後、マウス抗ｈＩＦＮｂ−ビオチン（eBioscience：ＢＭＳ１０４４ＢＴ）を添加した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Sigma：Ｓ２４３８）をＴＭＢ発色のために添加した。Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂを標準として用いて標準曲線を得た。ＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメーターを算出した。得られた平均Ｃ−Ｔ曲線は図２に示される。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂについて算出された半減期（Ｔ１／２）は２７．４６８時間であり、ＥｒｂとｈｕＩＦＮβとのＣ末端融合タンパク質のＴ１／２は僅か８時間であることが報告される。
【０２２９】
５．２  ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬの薬物動態プロファイル
１２匹のＢａｌｂ／Ｃ雌性８週齢マウスを各群４匹のマウスで３つの群（群Ａ／Ｂ／Ｃ）に分けた。２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）のＥｒｂ−ｈｕＩＦＮＬタンパク性ヘテロ二量体を各マウスに静脈注射し、１００μｌの血液をヘテロ二量体の投与後１３の異なる時点で採取した。各時点で、血液を１つの群のマウスから採取し、３つの群を交代した。血清を単離した後、血清中のＦｃフラグメント及びｈｕＩＦＮＬの濃度をそれぞれ、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔に述べると、ＦｃフラグメントについてはＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。プレートを抗ｈＩｇＧ−Ｆｃフラグメント抗体（Bethyl：Ａ８０−１０４Ａ）でコーティングした後、適切に希釈した血清サンプルを添加した。その後、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ（Bethyl：Ａ８０−１０４Ｐ）を添加した後、ＴＭＢ発色を行った。ｈｕＩＦＮＬについては、ｈｕＩＦＮＬ  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience：８８−７２９６）を使用した。Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬを標準として用いて標準曲線を得た。ＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメーターを算出した。得られた平均Ｃ−Ｔ曲線は図３に示される。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬについて算出された半減期（Ｔ１／２）は５７．３０８時間である。
【０２３０】
５．３  ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の薬物動態プロファイル
１２匹のＣ５７Ｂｌ／６雌性８週齢マウスを各群４匹のマウスで３つの群（群Ａ／Ｂ／Ｃ）に分けた。２０μｇ（１ｍｇ／ｋｇ）のＥｒｂ−ｈｕＩＬ１０又はＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２タンパク性ヘテロ二量体をマウス（Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の各々について１２匹のマウス）に腹腔内注射し、１００μｌの血液をヘテロ二量体の投与後１３の異なる時点で採取した。各時点で、血液を１つの群のマウスから採取し、３つの群を交代した。血清を単離した後、血清中のＥｒｂ−ｈｕＩＬ１０又はＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の濃度をそれぞれ、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。プレートを５μｇ／ｍｌの精製抗ヒトＩＬ−１０（BioLegend、カタログ番号：５０１５０５）でコーティングした後、適切に希釈した血清サンプルを添加した。その後、抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（Sigma、Ａ０１７０）を添加した後、ＴＭＢ発色を行った。ＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメーターを算出した。得られた平均Ｃ−Ｔ曲線は図１１に示される。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０について算出された半減期（Ｔ１／２）は１７．６３時間であり、ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２について算出された半減期（Ｔ１／２）は３３．５６時間である。
【０２３１】
ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の薬物動態プロファイルを、２０μｇ（１ｍｇ／ｋｇ）のＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射することによって更に検査した。実験を腹腔内注射についての記載と同様に行った。ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。プレートを５μｇ／ｍｌの精製抗ヒトＩＬ−１０抗体（BioLegend、カタログ番号：５０１５０５）でコーティングした後、適切に希釈した血清サンプルを添加した。その後、ＥＧＦＲ−ビオチン及びＳＡ−ＨＲＰを添加し、続いてＴＭＢ発色を行った。ＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメーターを算出した。得られた平均Ｃ−Ｔ曲線は図２８に示される。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２について算出された半減期（Ｔ１／２）は４９．８時間である。
【０２３２】
５．４  ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２の薬物動態
１匹の雄性カニクイザルに０．２ｍｇ／ｋｇのタンパク性ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２を静脈注射した。５００μｌの血液をヘテロ二量体の投与の２週間後の１３の異なる時点で採取した後、血清中のヘテロ二量体の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。プレートを０．８μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質でコーティングした後、適切に希釈した血清サンプルを添加した。その後、抗ヒトＩＦＮαビオチン抗体（eBioscince、ＢＭＳ−１０１６ＢＴ）を添加した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Sigma：Ｓ２４３８）をＴＭＢ発色のために添加した。ＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメーターを算出した。得られた平均Ｃ−Ｔ曲線は図２９に示される。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２について算出された半減期（Ｔ１／２）はカニクイザルでは４１．６時間である。
【０２３３】
５．５  本開示の他のタンパク性ヘテロ二量体の薬物動態プロファイル
同様に、ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期（マウスにおける）を決定した。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂについて算出された半減期（Ｔ１／２）は３４．５時間である（データは示さない）。
【０２３４】
実施例６  対応する標的へのタンパク性ヘテロ二量体の結合
６．１  ＥＧＦＲへのＥｒｂ−インターフェロンタンパク性ヘテロ二量体の結合
ヒトＥＧＦＲ抗原を安定に発現するマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６細胞株、ATCC、ＣＲＬ−６４７５（商標））を用いて、ＥＧＦＲへのタンパク性ヘテロ二量体の結合を検査した。本開示のＥｒｂ−インターフェロンタンパク性ヘテロ二量体（又は対照Ｅｒｂ抗体セツキシマブ（Merck、Ｅｒｂｉｔｕｘ））及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＰＥ（eBioscience：１２−４９９８−８２）二次抗体の希釈系列を細胞に順次添加するフローサイトメトリーを用いた。次いで、フローサイトメトリーを行い、タンパク質濃度及びＰＥチャネルからの中間蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて投与量−効果曲線を作成した。図４に実証されるように、様々な本開示のＥｒｂ−インターフェロンタンパク性ヘテロ二量体（例えばＥｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬ及びＥｒｂ−ｈｕＩＦＮｂ）はＥＧＦＲに特異的に結合することができ、結合親和性は対照抗体セツキシマブとは顕著に異ならなかった。
【０２３５】
６．２  ＥＧＦＲへのＥｒｂ−インターロイキンタンパク性ヘテロ二量体の結合
ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１細胞株を用いて、ＥＧＦＲへのＥｒｂ−インターロイキンタンパク性ヘテロ二量体の結合を検査した。本開示のＥｒｂ−インターフェロンタンパク性ヘテロ二量体（又は対照Ｅｒｂ抗体（Merck、Ｅｒｂｉｔｕｘ））及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＰＥ（eBioscience：１２−４９９８−８２）二次抗体の希釈系列を細胞に順次添加するフローサイトメトリー分析を用いた。次いで、フローサイトメトリー分析を行い、タンパク質濃度及びＰＥチャネルからの中間蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて投与量−効果曲線を作成した。図１２のパネル（Ａ）に実証されるように、タンパク性ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０及びＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２は対照抗体セツキシマブと同様に標的ＥＧＦＲに特異的に結合する。
【０２３６】
その標的ＥＧＦＲへのＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の結合親和性も、ヒトＥＧＦＲを安定に発現するマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６細胞株）を用いて検査した。結果を図１２のパネル（Ｂ）に示す。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２が対照抗体セツキシマブと同様に標的ＥＧＦＲに特異的に結合することが明らかである。
【０２３７】
図１３に示されるように、ＥＧＦＲへのＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の特異的結合もＥＬＩＳＡを用いて確認した。
【０２３８】
６．３  ＥＧＦＲへのＭａｂ８０６−インターロイキンタンパク性ヘテロ二量体の結合
同様に、ＥＧＦＲへのＭａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２の結合親和性も、ヒトＥＧＦＲを安定に発現するマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６細胞株）を用いて検査した。Ｍａｂ８０６はＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体を標的とする抗体であるが、野生型ＥＧＦＲにも低い親和性で結合し得る。フローサイトメトリーを行った。結果を図１４に示す。図１４から明らかなように、Ｍａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２はＥＧＦＲに投与量依存的に結合する。
【０２３９】
６．４  Ｈｅｒ２へのＴｍａｂ−インターフェロン及びＴｍａｂ−インターロイキンタンパク性ヘテロ二量体の結合
それらの標的Ｈｅｒ２へのＴｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２及びＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の結合親和性も検査したが、実験はヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ATCC、ＨＴＢ−２２（商標））及びヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を用いて行った。結果はそれぞれ図１５のパネル（Ａ）（ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７による）及び図１５のパネル（Ｂ）（ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３による）に示す。図１５に示されるように、Ｔｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２及びＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２はどちらも対照抗体トラスツズマブと同様にＨＥＲ−２に特異的に結合する。
【０２４０】
６．５  Ｈｅｒ２へのＰｍａｂ−インターロイキンタンパク性ヘテロ二量体の結合
その標的Ｈｅｒ２に対するＰｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の結合親和性を、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を用いて検査した。結果は図１６に示す。図１６に示されるように、Ｐｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２はＨＥＲ−２に特異的に結合するが、その結合親和性は対照抗体トラスツズマブ及びペルツズマブほど良好ではない。
【０２４１】
実施例７  タンパク性ヘテロ二量体中に含まれる免疫調節物質の生物活性
７．１  Ｅｒｂ−インターフェロンヘテロ二量体中のインターフェロンの生物活性
マウス線維芽細胞株Ｌ９２９又はヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２にＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）標識水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を感染させ、細胞の抗ウイルス能の増大におけるインターフェロンの活性を検査した。ｍｕＩＦＮｂ、ｈｕＩＦＮａ２及びｈｕＩＦＮＬの活性をそれぞれ検査した。簡潔に述べると、細胞を本開示のタンパク性ヘテロ二量体の希釈系列の存在下で８時間培養した後、ＶＳＶ−ＥＧＦＰを感染させた適切な量の細胞を添加した。２４時間後に、感染細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析によって決定し、ウイルス感染に対するタンパク性ヘテロ二量体の保護率を算出した。次いで、ＥＣ５０を保護率の投与量−効果曲線及びタンパク性ヘテロ二量体の濃度に従って得た。図５に示されるように、ヘテロ二量体Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮａ２及びＥｒｂ−ｈｕＩＦＮＬは細胞をウイルス感染から保護した。
【０２４２】
７．２  Ｅｒｂ−インターロイキンヘテロ二量体中のインターロイキンの生物活性
インターロイキンは、リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激されるマクロファージからのＴＮＦ−αの放出を阻害することができる（David F. et al., 1991, The Journal of Immunology. Vol. 147. 3815-3822）。本開示のタンパク性ヘテロ二量体中のインターロイキンのこの活性を試験するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を９６ウェルプレートに播種し、浮遊細胞を３、４時間後に洗い流した。次いで、様々な濃度の本開示のＥｒｂ−ｈｕＩＬ１０又はＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２を添加し、２時間後に、２μｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間の刺激のために添加した。上清を回収し、ＴＮＦ−αの放出を、ＥＬＩＳＡを用いて検査した。ＥＬＩＳＡはＴＮＦ−αキット（eBioscience、８８−７３４６）に含まれる使用説明書に従って行った。簡潔に述べると、捕捉抗体をコーティングバッファーで希釈した後、Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８  ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。次いで、標準及び適切に希釈したサンプルを添加した。その後、検出抗体を用いて反応を検出し、ＴＭＢで発色させた。結果を図１７及び図１８に示す。図１７に実証されるように、Ｅｒｂ−ｈｕＩＬ１０はＴＮＦ−αの放出を投与量依存的に阻害する。図１８は、本開示のＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２もＴＮＦ−αの放出を投与量依存的に効果的に阻害し、投与量依存性阻害がＥｒｂ−ｈｕＩＬ１０と比較して更に明らかであることを示す。
【０２４３】
７．３  他のタンパク性ヘテロ二量体中の免疫調節物質の生物活性
同様に、他の本開示のタンパク性ヘテロ二量体中の免疫調節物質の生物活性も検査した。図１９は、本開示のＭａｂ８０６−（ｈｕＩＬ１０）２がＴＮＦ−αの放出を投与量依存的に効果的に阻害することを示す。図２０は、本開示のＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２によるＴＮＦ−α放出の投与量依存性阻害を示す。図２１は、本開示のＰｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２がＴＮＦ−αの放出を投与量依存的に効果的に阻害することを示す。
【０２４４】
実施例８  タンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
低レベルのＨｅｒ２抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２２（商標））を用いて、Ｔｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を評価した。簡潔に述べると、細胞を抗体トラスツズマブ、インターフェロンα又はＴｍａｂ−ｈｕＩＦＮａ２ヘテロ二量体の希釈系列の存在下で７２時間培養した後、細胞増殖をＣＣＫ８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）アッセイを用いて検査した。細胞増殖阻害率を算出し、投与量−効果曲線を得た。アポトーシスを７ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーアッセイによって検査した。トラスツズマブ単独は腫瘍細胞増殖を阻害しなかったが、本開示のタンパク性ヘテロ二量体がＭＣＦ７細胞成長を投与量依存的に顕著に阻害したことが図８から明らかである。タンパク性ヘテロ二量体の阻害効果は、インターフェロンと同程度である。アポトーシスの結果は様々な群間で顕著に異ならず（データは示さない）、本開示のタンパク性ヘテロ二量体が腫瘍細胞成長を効果的に阻害することができ、細胞アポトーシスに影響を及ぼさないことが示唆される。
【０２４５】
同様に、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株Ａ４３１を用いて、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮｂヘテロ二量体の抗腫瘍活性を評価した。簡潔に述べると、細胞を抗体セツキシマブ又はＥｒｂ−ｈｕＩＦＮｂヘテロ二量体の希釈系列の存在下で７２時間培養し、細胞増殖を、ＭＴＴ比色分析法を用いて検査した。細胞増殖阻害率を算出し、投与量−効果曲線を得た。図９から明らかなように、本開示のタンパク性ヘテロ二量体の抗腫瘍効果はセツキシマブよりも顕著に強く、阻害は投与量依存性である。
【０２４６】
実施例９  タンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
９．１  本開示のＥｒｂ−インターフェロンヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
Ｂ１６−ＥＧＦＲマウスモデルを用いて、本開示のタンパク性ヘテロ二量体の活性を検査した。簡潔に述べると、８週齢雌性Ｃ５７  ＢＬ／６マウスに７×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。１４日後に、腫瘍容積がおよそ７０ｍｍ３であることが測定された。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮｂヘテロ二量体、Ｃ末端融合タンパク質ＥｒｂＨＣ−ｍｕＩＦＮｂ、Ｅｒｂ−ｈｕＩＦＮＬヘテロ二量体又はＮ末端融合タンパク質ＩＦＮＬ−ＥｒｂＨＣを腫瘍部位にそれぞれｉｎ  ｓｉｔｕ投与した（２５μｇ／回、２日毎に１回、合計で３回）。腫瘍サイズを３日毎に測定し、腫瘍の容積を算出して、腫瘍成長曲線を得た。結果を図６に示す。図６から明らかなように、本開示のタンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は対応する融合タンパク質と同程度である。
【０２４７】
ヒトでは、ＥＧＦＲは腫瘍部位で高度に発現されるだけでなく、正常組織でも低い基準レベルで発現される。より密接にヒトにおける条件を模倣する動物モデルを得るために、Ｂ１６−ＥＧＦＲ腫瘍細胞を接種したＥＧＦＲトランスジェニックマウスもモデル系として使用し、本開示のヘテロ二量体の効果を評価した。簡潔に述べると、８週齢雌性ＥＧＦＲトランスジェニックＣ５７  ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。１４日後に、腫瘍容積がおよそ７０ｍｍ３であることが測定された。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４ヘテロ二量体又は対照セツキシマブ抗体を静脈内投与した（２００μｇ／回、３日毎に１回、合計で２回）。腫瘍サイズを３日毎に測定し、腫瘍の容積を算出して、腫瘍成長曲線を得た。結果を図７に示す。図７から明らかなように、本開示のタンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は非常に著しい。加えて、本実験では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体を腫瘍部位の代わりに全身投与し、それにより観察された優れた抗腫瘍効果からタンパク性ヘテロ二量体が腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に標的とすることが示される。
【０２４８】
Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性もＣ５７  ＢＬ／６野生型マウスモデルを用いて試験した。簡潔に述べると、８週齢雌性Ｃ５７  ＢＬ／６マウスに７×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍容積がおよそ４５ｍｍ３であることが測定された。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４ヘテロ二量体又は対照抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Merck）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４ヘテロ二量体は３つの異なる用量（それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ）で注射し、セツキシマブの投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、どちらも週２回、合計で３回投与した。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍の容積を算出して、腫瘍成長曲線を得た。結果は図２２に実証される。投与した各々の投与量について、Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４ヘテロ二量体は腫瘍容積をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に低減した。
【０２４９】
９．２  本開示のＥｒｂ−インターロイキンヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
実施例９．１と同様に、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性をＣ５７  ＢＬ／６マウスモデルを用いて試験した。簡潔に述べると、８週齢雌性Ｃ５７  ＢＬ／６マウスに７×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍容積がおよそ４５ｍｍ３であることが測定された。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２ヘテロ二量体又は対照抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Merck）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２ヘテロ二量体は４つの異なる用量（それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇ）で注射し、セツキシマブの投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、どちらも週２回、合計で３回投与した。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍の容積を算出して、腫瘍成長曲線を得た。結果は図２３に実証される。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２は腫瘍容積をｉｎ  ｖｉｖｏで投与量依存的に効果的に低減した。加えて、本実験では、本開示のタンパク性ヘテロ二量体を腫瘍部位の代わりに全身投与し、それにより観察された優れた抗腫瘍効果からタンパク性ヘテロ二量体が腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に標的とすることが示される。
【０２５０】
Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果も、ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２を腫瘍部位にｉｎ  ｓｉｔｕで注射することによって検査した。マウス腫瘍モデルを実施例９．２に記載のように作製した。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２ヘテロ二量体を腫瘍接種の７日後から３つの異なる用量（それぞれ０．２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）で注射し、３日毎に投与し、合計で３回投与した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を陰性対照として使用した。結果は図２４に実証される。図２４から明らかなように、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２は腫瘍部位に注射した場合に腫瘍容積をｉｎ  ｖｉｖｏで投与量依存的に効果的に低減した。
【０２５１】
Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２とＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４とのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の比較を図２５に示す。マウス腫瘍モデルを実施例９．２に記載のように作製した。Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２及びＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４をそれぞれ５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。これらは腫瘍接種の７日後から注射し、３日毎に投与し、合計で３回投与した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。図２５から明らかなように、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２及びＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４はどちらも腫瘍サイズの増大を効果的に阻害し、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の効果がより顕著に見られた。
【０２５２】
本研究では、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２及びＥｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４はどちらも腫瘍サイズの増大を効果的に阻害するが、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のみが治療したマウスの一部で完全な腫瘍退縮をもたらし、腫瘍退縮マウスのパーセンテージが用量依存的に増大することが見出された。腫瘍退縮率の分析は図２６に示した。Ｅｒｂ−ｍｕＩＦＮａ４はマウスにおける腫瘍成長を阻害したが、完全な腫瘍退縮は観察されず、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の投与は試験されたマウスの５０％という高さで完全な腫瘍退縮をもたらした。
【０２５３】
Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の抗腫瘍活性をもたらす機構を更に調査した。マウス腫瘍モデルを９．２に記載のように作製した。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２を腫瘍接種の７日後から４ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、３日毎に投与し、合計で３回投与した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。抗体を欠乏するＣＤ８、ＣＤ４及びＮＫ細胞２００μｇを５日目に指定の群に投与し、欠乏抗体を３日毎に繰り返し投与し、欠乏抗体の各々について合計で５回投与した。図２７から明らかなように、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の抗腫瘍効果は抗ＣＤ８抗体によって失われ、ＣＤ４又はＮＫ１．１の欠乏はＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の抗腫瘍活性に顕著に影響を及ぼさず、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の抗腫瘍活性がＣＤ８＋Ｔ細胞依存性である可能性があることが示唆された。
【０２５４】
実施例１０  タンパク性ヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化挙動
実施例９．１に示される手順と同様に、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のｉｎ  ｖｉｖｏ分布をＣ５７ＢＬ／６  Ｂ１６−ＥＧＦＲマウスモデルを用いて検査した。簡潔に述べると、８週齢雌性Ｃ５７  ＢＬ／６マウスに７×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍容積がおよそ４５ｍｍ３であることが測定された。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡＦ７５０）標識Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２ヘテロ二量体又は対照ヘテロ二量体Ｔｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射の２４時間後に、ＡＦ７５０免疫蛍光シグナルをＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（Perkin Elmer）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍の摘出後にスクリーニングした。結果（図３０に示される）から、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２の濃度がＥＧＦＲ陽性腫瘍でＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２よりもはるかに高いことが実証された。このため、本開示のタンパク性ヘテロ二量体は標的化組織（例えば腫瘍）をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に対象とすることができた。
【０２５５】
タンパク性ヘテロ二量体の抗腫瘍効果に対する腫瘍標的化の重要性を更に検査するために、Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２及びＴｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果をＣ５７ＢＬ／６  Ｂ１６−ＥＧＦＲマウスモデルを用いて試験した。手順は実施例９．１に記載されるものと同様であった。簡潔に述べると、８週齢雌性Ｃ５７  ＢＬ／６マウスに７×１０５のＢ１６−ＥＧＦＲ−ＳＩＹ細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍容積がおよそ４５ｍｍ３であることが測定された。ヘテロ二量体Ｅｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２、Ｔｍａｂ−（ｈｕＩＬ１０）２又はＰＢＳ（陰性対照）を４ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射は週２回行い、合計で３回注射した。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍の容積を算出して、図３１に示されるような腫瘍成長曲線を得た。結果からＥｒｂ−（ｈｕＩＬ１０）２のみが腫瘍成長を効果的に阻害することが実証され、そのｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果に対する腫瘍標的化の重要性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月29日(2017.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク性ヘテロ二量体であって、該ヘテロ二量体の一方の成員が、腫瘍抗原に対する結合特異性を示す標的化部分を形成するように複合した（ｉ）軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含み、該ヘテロ二量体の他方の成員がＮ末端からＣ末端に向かって、重鎖フラグメントに融合した免疫調節物質を含むポリペプチドを含み、該重鎖フラグメントが前記重鎖（ｉｉ）と複合して該ヘテロ二量体を形成する、タンパク性ヘテロ二量体。
【請求項２】
前記標的化部分がトランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヘレグリン受容体、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）及び低酸素誘導因子受容体（ＨＩＦＲ）からなる群から選択される細胞表面受容体である腫瘍抗原に特異的に結合する；及び／または、
前記標的化部分がトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘレグリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、コラーゲン、エラスチン、ビグリカン、デコリン、ルミカン、ベルシカン、ペルレカン、Ｃ反応性蛋白、ＡｐｏＥ及びラミニンからなる群から選択される成長因子、ホルモン又は細胞外基質分子である腫瘍抗原に特異的に結合する；及び／または、
前記標的化部分がＥＧＦＲ突然変異体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２９ｂ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２００、ＣＤ２７６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ２、ＰＭＣＨ、エンドプラスミン、ＣＳ１、ＣＥＡ、メソテリン、Ｇ２５０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＡＤＡＭ１７、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＧＰＡ３３、ＮＡＰｉ２ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＰＮＭＢ及びＴＲＯＰからなる群から選択される腫瘍抗原に特異的に結合する、
請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項３】
前記標的化部分がＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ突然変異体又はＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項４】
前記標的化部分の（ｉ）軽鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする抗体の軽鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有し、前記標的化部分の（ｉｉ）重鎖が、腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体の重鎖の対応するＣＤＲ中に含まれるものと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲを含有する、請求項１に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項５】
腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＨＥＲ３、抗ＨＥＲ４、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２９ｂ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２７６、抗ＣＸＣＲ３、抗ＣＸＣＲ５、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ９、抗ＣＲＴＨ２、抗ＰＭＣＨ、抗エンドプラスミン抗体、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＣＳ１、抗ＣＥＡ、抗メソテリン、抗Ｇ２５０、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＣ１６、抗ＰＳＭＡ、抗ＡＤＡＭ１７、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、抗ＭＣＳＰ、抗ＧＰＡ３３、抗ＮＡＰｉ２ｂ、抗ＳＴＥＡＰ１、抗ＣＥＡＣＡＭ１、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＧＰＮＭＢ、抗ＴＲＯＰ、抗ＴＦＧＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦＲ、抗ＦＧＦＲ、抗ＨＩＦＲ、抗ヘレグリン受容体、抗ＶＥＧＦ、抗ｃ−Ｍｅｔ，抗ＴＧＦ、抗ＥＧＦ、抗ＩＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ヘレグリン、抗ＰＤＧＦ、抗ＨＩＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−７、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１１、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１４、抗ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１６、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１９、抗ＩＬ−２０、抗ＩＬ−２１、抗ＩＬ−２２、抗ＩＬ−２３、抗ＩＬ−２４、抗ＩＬ−２５、抗ＩＬ−２６、抗ＩＬ−２７、抗ＩＬ−２８、抗ＩＬ−２９、抗ＩＬ−３０、抗ＩＬ−３１、抗ＩＬ−３２、抗ＩＬ−３３、抗ＩＬ−３４、抗ＩＬ−３５、抗ＩＬ−３６、抗コラーゲン、抗エラスチン、抗ビグリカン、抗デコリン、抗ルミカン、抗ベルシカン、抗ペルレカン、抗Ｃ反応性蛋白、抗ＡｐｏＥ及び抗ラミニンからなる群から選択される抗体である、請求項４に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項６】
腫瘍抗原を特異的に対象とする前記抗体が抗ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ突然変異体又は抗ＨＥＲ２である、請求項４に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項７】
前記免疫調節物質がインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンフォカイン及び腫瘍壊死因子からなる群から選択されるサイトカインである、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項８】
前記免疫調節物質がインターフェロンα、インターフェロンλ又はインターフェロンβである、請求項７に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項９】
前記免疫調節物質がインターロイキン１０である、請求項７に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１０】
前記ヘテロ二量体が、哺乳動物宿主細胞中で発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも３倍高い発現収率を示し、該対照タンパク質が２つの成員の二量体を含み、各々の成員が前記腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に前記免疫調節物質を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１１】
前記ヘテロ二量体が、マウスにおいて発現される場合に対応する対照タンパク質よりも少なくとも２倍長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示し、該対照タンパク質が２つの成員の二量体を含み、各々の成員が前記腫瘍抗原に特異的に結合する標的化部分を形成する軽鎖及び重鎖を含み、各々の成員の重鎖がＣ末端に前記免疫調節物質を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１２】
前記重鎖（ｉｉ）及び前記重鎖フラグメントが各々、前記一方の成員及び前記他方の成員のヘテロ二量体化を媒介して前記ヘテロ二量体を形成する二量体化配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１３】
前記二量体化配列が重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１２に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１４】
前記他方の成員が互いに、また前記重鎖フラグメントにインフレームで融合した２つ以上の免疫調節物質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離ポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞。
【請求項１７】
腫瘍又は腫瘍細胞の成長の阻害に使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク性ヘテロ二量体の使用。
【請求項１８】
タンパク性ヘテロ二量体を作製する方法であって、（ｉ）請求項１６に記載の宿主細胞を前記ヘテロ二量体の発現を達成する条件下で培養することと、（ｉｉ）発現された前記ヘテロ二量体を採取することとを含む、方法。
【国際調査報告】
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2018502147.tif 000037
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