(57)【要約】本発明は、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３に結合する第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤＳに結合する第２結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、当該抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター及び当該ポリヌクレオチドもしくはベクターで形質転換されたまたは当該ポリヌクレオチドもしくはベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生方法、当該抗体構築物の医学的使用及び当該抗体構築物を含むキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３のエピトープクラスターに結合する第１ヒト結合ドメインを含み、かつＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインを含む、二重特異性抗体構築物であって、ヒトＣＤＨ３の前記エピトープクラスターが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸２９１〜３６３位（配列番号：３６）内に含まれる、前記二重特異性抗体構築物。
【請求項２】
前記第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸２９１〜３２７位（配列番号：３４）内に含まれるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体構築物。
【請求項３】
前記第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸３２８〜３６３位（配列番号：３５）内に含まれるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体構築物。
【請求項４】
前記第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸４０４〜４４０位（配列番号：３９０）内に含まれるエピトープにも結合する、請求項３に記載の抗体構築物。
【請求項５】
前記第１結合ドメインが、マカクＣＤＨ３、好ましくはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤＨ３にも結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項６】
前記第１結合ドメインが、
ａ）配列番号：１４９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１５０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１５２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号：１５９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１６０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１６２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１６３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号：１６９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１７０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１７２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１７３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号：１７９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１８０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１８２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１８３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号：１８９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１９０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１９２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１９３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号：１９９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２００に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２０２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２０３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号：２０９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２１０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２１２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２１３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｈ）配列番号：２１９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２２０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２２２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２２３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｉ）配列番号：２２９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２３０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２３１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２３２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２３３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２３４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｊ）配列番号：２３９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２４１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２４３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２４４に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、
請求項１、２及び５のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項７】
前記第１結合ドメインが、
ａ）配列番号：２７９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２８０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２８１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２８２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２８３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２８４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号：２８９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２９０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２９１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２９２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２９３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２９４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号：２９９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３００に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３０１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３０２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３０３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３０４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号：３０９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３１０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３１１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３１２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３１３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３１４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号：３１９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３２０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３２１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３２２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３２３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３２４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号：３２９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３３０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３３１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３３２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３３３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３３４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号：３３９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３４１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３４３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３４４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｈ）配列番号：３４９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３５０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３５１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３５２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３５３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３５４に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、
請求項１、３、４及び５のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項８】
前記第１結合ドメインが、配列番号：１５５、配列番号：１６５、配列番号：１７５、配列番号：１８５、配列番号：１９５、配列番号：２０５、配列番号：２１５、配列番号：２２５、配列番号：２３５、及び配列番号：２４５に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む、請求項６に記載の抗体構築物。
【請求項９】
前記第１結合ドメインが、配列番号：２８５、配列番号：２９５、配列番号：３０５、配列番号：３１５、配列番号：３２５、配列番号：３３５、配列番号：３４５、及び配列番号：３５５に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む、請求項７に記載の抗体構築物。
【請求項１０】
前記第１結合ドメインが、配列番号：１５６、配列番号：１６６、配列番号：１７６、配列番号：１８６、配列番号：１９６、配列番号：２０６、配列番号：２１６、配列番号：２２６、配列番号：２３６、及び配列番号：２４６に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む、請求項６または８に記載の抗体構築物。
【請求項１１】
前記第１結合ドメインが、配列番号：２８６、配列番号：２９６、配列番号：３０６、配列番号：３１６、配列番号：３２６、配列番号：３３６、配列番号：３４６、及び配列番号：３５６に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む、請求項７または９に記載の抗体構築物。
【請求項１２】
前記第１結合ドメインが、配列番号：１５５＋１５６、配列番号：１６５＋１６６、配列番号：１７５＋１７６、配列番号：１８５＋１８６、配列番号：１９５＋１９６、配列番号：２０５＋２０６、配列番号：２１５＋２１６、配列番号：２２５＋２２６、配列番号：２３５＋２３６、及び配列番号：２４５＋２４６に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項６、８または１０のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１３】
前記第１結合ドメインが、配列番号：２８５＋２８６、配列番号：２９５＋２９６、配列番号：３０５＋３０６、配列番号：３１５＋３１６、配列番号：３２５＋３２６、配列番号：３３５＋３３６、配列番号：３４５＋３４６、及び配列番号：３５５＋３５６に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項７、９または１１のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１４】
（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及び前述の形式のオリゴマーからなる群より選択される形式である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１５】
前記第１結合ドメインが、配列番号：１５７、配列番号：１６７、配列番号：１７７、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０７、配列番号：２１７、配列番号：２２７、配列番号：２３７、及び配列番号：２４７に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６、８、１０、１２または１４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１６】
前記第１結合ドメインが、配列番号：２８７、配列番号：２９７、配列番号：３０７、配列番号：３１７、配列番号：３２７、配列番号：３３７、配列番号：３４７、及び配列番号：３５７に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７、９、１１、１３または１４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１７】
前記第２結合ドメインが、ヒト及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１８】
配列番号：１５８、配列番号：１６８、配列番号：１７８、配列番号：１８８、配列番号：１９８、配列番号：２０８、配列番号：２１８、配列番号：２２８、配列番号：２３８、及び配列番号：２４８に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６、８、１０、１２、１４、１５または１７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項１９】
配列番号：２８８、配列番号：２９８、配列番号：３０８、配列番号：３１８、配列番号：３２８、配列番号：３３８、配列番号：３４８、及び配列番号：３５８に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７、９、１１、１３、１４、１６または１７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項２０】
配列番号：３７９、配列番号：３８０、配列番号：３８１、配列番号：３８２、配列番号：３８３、配列番号：３８４、配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７、配列番号：３８８、配列番号：３８９、配列番号：４２２、配列番号：４２３、配列番号：４２４、配列番号：４２５、配列番号：４２６及び配列番号：４２７に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６、８、１０、１２、１４、１５、１７または１８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項２１】
先行請求項のいずれか１項に定義される抗体構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に定義されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２１に定義される前記ポリヌクレオチドもしくは請求項２２に定義される前記ベクターで形質転換されるまたは請求項２１に定義される前記ポリヌクレオチドもしくは請求項２２に定義される前記ベクターをトランスフェクトされる、宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体構築物の産生方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に定義される前記抗体構築物の発現を可能にする条件下で請求項２３に定義される宿主細胞を培養することと、産生された抗体構築物を培養物から回収することとを含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項２４に記載の方法により産生される抗体構築物を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍またはがんの予防、処置または改善に使用するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項２４に記載の方法により産生される抗体構築物。
【請求項２７】
前記がんが、肺癌腫、頭頸部癌腫、原発性または二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性または二次性脳腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、食道癌腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、ＳＣＬＣ（小細胞肺がん）、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮がん、移行上皮癌腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼内黒色腫、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、腎臓がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）がん、小腸のがん、胆道がん、尿道のがん、腎細胞癌腫、子宮内膜の癌腫、甲状腺がん、精巣がん、皮膚扁平上皮細胞がん、黒色腫、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、骨肉腫、中皮腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び軟部肉腫からなる群より選択される、請求項２６に記載の抗体構築物。
【請求項２８】
前記がんが扁平上皮癌腫である、請求項２７に記載の抗体構築物。
【請求項２９】
腫瘍またはがんの処置、予防または改善の方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項２４に記載の方法により産生される抗体構築物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３０】
前記がんが、肺癌腫、頭頸部癌腫、原発性または二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性または二次性脳腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、食道癌腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、ＳＣＬＣ（小細胞肺がん）、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮がん、移行上皮癌腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼内黒色腫、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、腎臓がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）がん、小腸のがん、胆道がん、尿道のがん、腎細胞癌腫、子宮内膜の癌腫、甲状腺がん、精巣がん、皮膚扁平上皮細胞がん、黒色腫、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、骨肉腫、中皮腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び軟部肉腫からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが扁平上皮癌腫である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体構築物、請求項２４に記載の方法により産生される抗体構築物、請求項２２に定義されるベクター、及び／または請求項２３に定義される宿主細胞
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３に結合する第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター及びポリヌクレオチドもしくはベクターで形質転換されたまたはポリヌクレオチドもしくはベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生方法、抗体構築物の医学的使用及び抗体構築物を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
緒言：
カドヘリンのスーパーファミリーは、ヒトにおいて、いわゆる古典的カドヘリンのＰ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＲ−カドヘリンを含む１００超のメンバーを包含し、その古典的カドヘリンの各々は個々の組織セットにおいて活性である（Ｔａｋｅｉｃｈｉ  Ｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０２：６３９−５５（１９８８），ｖａｎ  Ｒｏｙ  Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，Ｖ１４：１２１−１３４（２０１４））。カドヘリンは、とりわけ、成体組織及び器官の発達に加えて、様々な組織のホメオスタシスにおいて不可欠な役割を果たす（Ｃｏｎａｃｃｉ−Ｓｏｒｒｅｌｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０９：９８７−９１，（２００２））。カドヘリンは、カルシウム依存性結合の形成により、また機械刺激を電気化学的活性に変換すること、すなわち、メカノトランスダクションと称されるプロセスにより、細胞−細胞接着プロセスを調節する膜貫通糖タンパク質である（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４８：３９９−４０４（２０００）；Ｙａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１４：１１６９−１１８０（２０００，Ｐａｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８２６，２９７−３１１（２０１２））。
【０００３】
胎盤カドヘリン（Ｐ−カドヘリン）は、カルシウム依存性細胞−細胞接着タンパク質３（ＣＤＨ３）としても知られ、約８００アミノ酸の大きな細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する１１８ｋＤａのタンパク質である。ＣＤＨ３  ＥＣＤは、５つのカドヘリンリピートを含み、これらは本明細書では（細胞外）ドメイン１〜５／Ｄｏｍ１〜Ｄｏｍ５／Ｄ１〜Ｄ５と称されて、各々が約１１０アミノ酸からなる。Ｐ−カドヘリンに対して最も高い配列相同性を有するタンパク質は、５３％の配列相同性を有するＥ−カドヘリン及び３９％の相同性を有するＮ−カドヘリンである。
【０００４】
Ｐ−カドヘリンの発現レベルは、健康な成人個体では低く、前立腺及び皮膚を含む重層上皮、乳房の筋上皮細胞の基底層または下層に限定されると考えられている（Ｔａｋｅｉｃｈｉ  Ｍ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０３：２６４９−５８，（１９８６）及びＳｈｉｍｏｙａｍａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４９：２１２８−３３（１９８９））。遺伝子ノックアウトマウスにおいてＰ−カドヘリン機能の喪失は、致死性ではないが、発達障害、加えて乳腺上皮の過形成及び異形成と関連することが示された（Ｇ．Ｌ．Ｒａｄｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３９：１０２５−１０３２（１９９７））。
【０００５】
健康な個体における低遺伝子発現レベルとは対照的に、Ｐ−カドヘリンの発現は、例えば、クローン病及び大腸炎のような免疫疾患を含むいくつかの疾患との関連において上方制御される（Ｈａｒｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ５０：５１３−５１９（２００２））。加えて、Ｐ−カドヘリンは、がん細胞の浸潤促進性について重要な役割を果たすと考えられている（Ｆｕｒｕｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ３８（４）：３４３−３５２（１９９７），Ｐａｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１（１６），５８６９−５８７７（２００５），Ｐａｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８２６，２９７−３１１（２０１２））。Ｐ−カドヘリンの上方制御は、結腸直腸、肺（ＮＳＣＬＣ）、乳房（トリプルネガティブ）、膵臓、頭頸部、甲状腺、頸部、卵巣及び胃のがんを含む、様々な腫瘍に関連して説明されてきた（Ｍｉｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：（１９）７７６０−７７６８（２００８）．，Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（２０）６４８７−６４９５（２００８），Ｐａｒｅｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１（１６）５８６９−５８７７（２００５），Ｄａｓｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４２，３０６−３１６（２００６），Ｊａｒｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；６５：（４）１５８７−１５９７（２００５）．，Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１０６，１７２−１７７（２００３），Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４１，８７７−８８５（２０１０））。さらに、Ｐ−カドヘリンの発現増加は、様々ながん型における患者の低生存率と相関することが観察された（Ｓｕｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１１；１７９：３８０−９０；Ｇａｍａｌｌｏ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４：６５０−６５４，（２００１）；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２（７）：１２４２−１２５２（２００４），Ｐａｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，８３０９−８３１７（２００４）），Ｔａｎｉｕｃｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５：３０９２−９；Ｐａｒｅｄｅｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；１１：５８６９−７７；Ｈａｒｄｙ  ＲＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ．２００２；５０：５１３−９；Ｐｅｒａｌｔａ  Ｓｏｌｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８６：１２６３−７２）。
【０００６】
心血管疾患に続いて、新生物は、非伝染病のカテゴリーにおける死因疾患の第２位であり、２０１３年には全世界の約８３０万人の死因となった（ＧＢＤ  ２０１３  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１５；３８５：１１７−７１）。がん症例の絶対数は１９９０年以降に４５．６％増加し、このことは、世界人口が増加して、人々が年を取り、確立されたリスク因子（例えば、喫煙、過体重、身体不活動）の有病率も増加しているという事実に起因し得る（ＧＢＤ  ２０１３  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１５；３８５：１１７−７１，Ｔｏｒｒｅ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１５；６５：８７−１０８）。男性では、肺がんが年間約１１０万人の推定症例数を有する主要死因であり、肝臓がんと胃がんがそれに続く。女性では、乳がんが年間約５０万人の症例を有する主要死因であり、肺がんと結腸がんがそれに続く。男性の肺がんの約１２０万人の症例、及び女性の乳がんの約１７０万人の症例に続き、約１４００万人の新たながんの症例が、２０１２年には世界中で発生していると推定される（Ｔｏｒｒｅ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１５；６５：８７−１０８）。要するに、がんは世界中の社会において大きな負担を構成するため、この疾患と闘うための処置選択肢が非常に必要である。
【０００７】
がんを処置するための一般的な戦略は、外科手術、続いて化学療法、放射線療法もしくはより最近では標的療法またはこれらの組合せ（例えば、腫瘍学のＮＣＣＮガイドライン）を伴う。化学療法剤は、５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）（５−ＦＵ）のようなヌクレオチド類似体、オキサリプラチンなどのＤＮＡ損傷剤及びイリノテカンのようなトポイソメラーゼ阻害剤またはドセタキセルなどの微小管阻害剤を包含し、これらは全て腫瘍細胞増殖の阻害をもたらす。標的療法としては、例えば、変異発がん性キナーゼを選択的に阻害する小分子化合物、例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ選択的化合物のベムラフェニブ（Ｇａｒｂｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；２０１：２１５−２５）（黒色腫の処置用に承認されている）、または肺がんの処置用に承認されている未分化リンパ腫リナーゼ（ｌｉｎａｓｅ）（ＡＬＫ）阻害剤のクリゾチニブ及びセリチニブ（Ｐａｌｌ  Ｇ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５；２７：１１８−２４）が挙げられる。加えて、抗体に基づく化合物、例えば、セツキシマブ及びパニツムマブ（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を認識して不活性化する。ＫＲＡＳ野生型結腸がんの処置用に承認されている）（Ｔｏｌ  Ｊ，Ｐｕｎｔ  ＣＪ．Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．２０１０；３２：４３７−５３）、またはトラスツズマブ（Ｈｅｒ２を認識する。乳がん療法用に承認されている（Ａｈｍｅｄ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；２２：１０１−１６）が存在する。
【０００８】
幅広い治療的介入の開発にもかかわらず、散発性症例を除いて、この不均一疾患に利用可能な治療法は存在しない。個体腫瘍の不均一性は、限られた数の患者のみが特定の療法に応答し、さらに腫瘍進行中に治療剤に対して耐性が発現するという事実を招く（Ｊａｍａｌ−Ｈａｎｊａｎｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；２１：１２５８−１２６６）。最後に、薬物の副作用もまた、処置の中断または中止を招き得るが、新規に開発された標的療法が、忍容性がより良好であると思われる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｎｅｔ／ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ−ｃａｎｃｅｒ−ｃａｒｅ／ｈｏｗ−ｃａｎｃｅｒ−ｔｒｅａｔｅｄ／ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ／ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔｓ−ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ；Ｓｕｎ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｍａｒ  １７．［刊行前に電子出版］）。
【０００９】
またこれらの理由によって、新規薬物の開発について依然として高い医学的必要性が存在する。
【００１０】
腫瘍細胞におけるＣＤＨ３の過剰発現は、二重特異性抗体、すなわち、ＣＤＨ３過剰発現腫瘍細胞を認識し、本抗体のＣＤ３結合部分により認識される細胞傷害性Ｔ細胞の再指向によりそれらの腫瘍細胞を死滅させる抗体を使用することによってがんを処置する新規手法の基礎を提供する。
【００１１】
ＲＮＡレベルで、または主として免疫組織化学を使用するタンパク質レベルのいずれかで実施されている発現分析により、ＣＤＨ３が、幅広い異なるがん型において高度かつ十分に検出可能なレベルで発現されることが実証され、これらのがん型としては、結腸がん（Ｍｉｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）、非小細胞がん及び小細胞肺がんを含む肺がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｌａｓ）、乳がん、好ましくはトリプルネガティブのがん（Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｐａｒｅｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｕｒａｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．）、膵臓がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ）、舌上の扁平上皮癌腫を含む頭頸部がん（Ｄａｓｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ；発明者らの未発表データ）、甲状腺がん（Ｊａｒｚａｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｌａｓ）、頸部がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、好ましくはステージＩＩ及び上記の卵巣がん（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｅｉｏｎ  ａｔｌａｓ）、胃がん（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ）、子宮内膜がん（Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；９：５５８９−６００；ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｌａｓ）、胆管がん（Ｂａｅｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；４３：１１０−７；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ）、膀胱がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ、発明者らの未発表データ）、前立腺がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ；発明者らの未発表データ）、精巣がん（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ）、軟部組織肉腫（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ）、食道がん（発明者らの未発表データ）、腎臓がん（発明者らの未発表データ）が挙げられる。
【００１２】
今後の分析により、さらなる腫瘍またはそれらのサブタイプにおいて発現増加を実証する可能性があるが、これらの腫瘍も、このような療法に関連する可能性がある。Ｆｏｔｏｕｈｉらは、例えば、小腸神経内分泌腫瘍におけるＣＤＨ３プロモーターのメチル化の低下を実証したが、これはＣＤＨ３タンパク質発現の増加をもたらす可能性がある（Ｆｏｔｏｕｈｉ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１４；９：９８７−９７）。正の相関が、ＣＤＨ３の発現増加とｍｉＲ−２０５、すなわち、肺扁平上皮癌腫に対する特異的マーカーであると思われるマイクロＲＮＡの発現増加との間で観察された（Ｈｕａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）．２０１４；１２７：２７２−８）。
【００１３】
腫瘍組織におけるＣＤＨ３の発現増加とは対照的に、正常組織におけるその発現は低いか、または検出できない（Ｍｉｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｄａｓｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐａｔｅｌ．，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｕｇｉｙｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊａｒｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｌａｓ）。総合すると、このことは、ＣＤＨ３が、提案される二重特異性抗体手法の好適な標的であるという証拠を提供する。
【００１４】
Ｐ−カドヘリンに結合する様々な抗体が記載されていて、十分に特徴付けされた大半が、以下の特許内で公開されている：ＷＯ９９１９４７７、ＷＯ０２／０９７３９５、ＷＯ０４／１１０３４５、ＷＯ０６／１１４７０４、ＷＯ０７／１０２５２５、ＷＯ２０１０／００１５８５、ＷＯ２０１０１２６１３７；ＷＯ２０１００５４００７、ＷＯ２０１１０５６９９７、ＷＯ２０１１０８０７９６、ＷＯ２０１１０７１５４１。
【００１５】
当該技術分野において既知の抗体のいくつかは、ＣＤＨ３の機能を、例えば、その接着特性に干渉することによりブロックするものであり、例えば、抗ＣＤＨ３抗体ＰＦ−０３７３２０１０などである（Ｚｈａｎｇ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０；１６：５１７７−８８）。インビトロで、この抗体は、ナノモル濃度でのβ−カテニンの解離などの細胞内シグナル伝達変化を伴って３Ｄスフェロイドの破壊をもたらすが、増殖を阻害しなかった。腫瘍成長及び転移の形成に加えて長期生存のインビボ阻害が、１０ｍｇ／ｋｇの用量での前臨床モデルにおいて、ＣＤＨ３の発現レベルに依存する手法で観察された。機構的に、インビボでの抗腫瘍効果が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のプロセスによりさらに媒介されることを排除できず、これは細胞傷害性Ｔ細胞と免疫グロブリンのＦｃドメインとの結合による細胞死滅を伴う。このような作用機構は、特許請求される抗ＣＤＨ３抗体のいくつかに起因していた。Ｐ−カドヘリン活性のブロッキングは、Ｐ−カドヘリン発現腫瘍の成長を阻害する手法として記載されているが、達成された結果はしばしば満足のいかないままであるが、その理由とは、それらが腫瘍成長を遅延させる、または最善でも腫瘍静止を誘導するが、腫瘍を排除することがないからである。
【００１６】
腫瘍成長に対するそれらの阻害効果を改善するために、抗体は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤（例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位体など）と複合化されて、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）、または広義には免疫複合体をもたらし得る。免疫複合体は、腫瘍への薬物部分の標的送達、及びその細胞内蓄積を可能にする。腫瘍細胞の死滅に関して、このような免疫複合体の効力は、細胞外ドメインを有する細胞膜に通常位置する標的分子の内在化挙動に加えて、各々の免疫複合体の作用機序のような様々なパラメータに強く依存する。概して、免疫複合体へのカップリングは、様々な抗体の抗腫瘍効力を有意に増強することが示された。
【００１７】
より最近では、標的分子に加えてＴ細胞にも結合する二重特異性分子が、上述した欠点の多くを回避するという有望な結果を示している。これらの薬物分子は、Ｔ細胞の非常に効果的な天然の死滅効果を利用するため、標的の機能を完全にブロックすることに、または標的細胞の増殖状態に依存しない。このような二重特異性分子の一例は、二重特異性抗標的×抗ＣＤ３一本鎖抗体構築物であり、これは非常に高い効率で標的細胞のＴ細胞関連死滅を媒介することがこれまでに示されている。例えば、ブリナツモマブを参照のこと。
【００１８】
二重特異性ｓｃＦｖ分子が、最終的に患者の治療に役立つことになる適切な原薬であると判断するためには、多数の異なる基準を満たさなければならない。これらの基準の組合せ及びストリンジェンシーにより、これらの必要性を満たす分子の発生が極めて珍しく予測不能な事象となる。最も明白な基準は、薬物候補の効率である。
【００１９】
このような分子の効率は、二重特異性分子の標的結合ドメインに関する、加えてＴ細胞動員部分に関する複数のパラメータに依存する。特に、二重特異性ｓｃＦｖ分子の標的結合部分に関しては予測不能であるが、その理由とは、それらが標的分子の三次構造に加えて四次構造を含むその分子の性質に非常に強く依存して変動するからである。効率を規定するパラメータの中でも、標的分子と二重特異性結合分子との間の結合速度に加えて正確な結合領域、いわゆる結合エピトープが、大きな役割を果たす。
【００２０】
抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体は、一般に任意のその他のモノクローナル抗体にも当てはまるように、それらの標的分子を非常に特異的に認識することによって機能する。この抗体は、それらの標的ＣＤＨ３分子上にある単一部位、またはエピトープのみを認識する。加えて、多くの抗体は、種特異的手法でそれらの機能を発揮することが見出されている。しかしながら、この種特異性は、ＣＤＨ３モノクローナル抗体（及びそれらの断片）にだけでなく、一般的なモノクローナル抗体にも固有であり、ヒト疾患を処置するための治療剤としてそれらを開発する上で重大な障害である。市販承認を得るために、任意の新規候補薬剤は、厳しい試験を通過しなければならない。この試験は、前臨床相及び臨床相に細分されるが、後者がヒト患者で実施されるのに対して、前者は動物で実施される。前臨床試験の目的は、薬物候補が所望の活性を有し、最も重要なことにはその候補が安全であると証明することである。薬物候補の、動物における安全性及び生じ得る有効性が前臨床試験で確立された場合に限り、この薬物候補は、各規制当局によってヒトでの臨床試験について承認される可能性が最も高くなる。薬物候補は、動物における安全性について以下の３つの方法で、すなわち、（ｉ）関連種、すなわち、薬物候補がオルソログ抗原を認識し得る種において、（ｉｉ）ヒト抗原を含有するトランスジェニック動物において、及び（ｉｉｉ）動物中に存在するオルソログ抗原と結合し得る薬物候補の代用物を使用することにより試験され得る。トランスジェニック動物の限界は、この技術が、典型的にはげっ歯類に限定されることである。げっ歯類とヒトとの間には、生理学上の有意差が存在し、安全性の結果をヒトに対して容易に当てはめることはできない。薬物候補の代用物の限界は、実際の薬物候補と比較して物質組成が異なることであり、多くの場合に、使用される動物は上で述べられるように制限を伴うげっ歯類である。したがって、げっ歯類で生成される前臨床データは、薬物候補に関する予測力が限定される。
【００２１】
安全性試験の好適な手法とは、関連種、好ましくは霊長類及び遺伝的類似性により、チンパンジーの使用である。しかしながら、チンパンジーは絶滅危惧種であると考えられていて、それらのヒト様性質を理由として、薬物安全性試験のためにこのような動物を使用することは、欧州では禁止されていて、他の地域でも厳しく制限されている。
【００２２】
当該技術分野において説明されているＴ細胞誘導二重特異性一本鎖抗体は、悪性疾患の処置に対して大きな治療可能性を有するが、これらの二重特異性分子の大半は、種特異的であるという点、及びヒト抗原を認識し、霊長類、すなわちマカク対応種のみを認識し得るという点で限定される。さらに、二重特異性分子の大半は、種の境界を越えてそれらの所望の機能を発揮できずに、結果として、ヒト及び霊長類ホモログを認識するが、例えば、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を発揮できない場合があるという点でさらに限定される。
【発明の概要】
【００２３】
発明の詳細な説明
本明細書に開示される様々ながん型の処置に関して利用可能なさらなる選択肢を有することが依然として必要であるため、本願では、ＣＤＨ３を対象とする１つの結合ドメインを有し、かつＴ細胞上のＣＤ３を対象とする第２結合ドメインを有する二重特異性抗体構築物の形態で、この問題を解決するための手段及び方法が提供される。
【００２４】
本発明は、第１の態様では、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３のエピトープクラスターに結合する好ましくは第１ヒト結合ドメインを含み、かつＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物を提供し、ヒトＣＤＨ３のエピトープクラスターは、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸２９１〜３６３位（配列番号：３６）内に含まれる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体構築物は、第１結合ドメインが、マカクＣＤＨ３、好ましくはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤＨ３にも結合するという点を特徴とする。
【００２６】
種を越えるこの機能性は、同じ分子が、前臨床動物試験において、加えてヒトでの臨床試験においても使用され得ることを意味する。これにより、種特異的代用分子と比較して、十分に比較可能な結果がもたらされ、動物試験の予測力が大幅に増加する。本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＣＤ３及びＣＤＨ３結合ドメインは、両方とも種間特異的かつ機能的であり、すなわち、ヒト抗原及びマカク抗原と反応してＴ細胞媒介性細胞傷害について比較可能な効果を発揮するので、これは、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性及び／または薬物動態プロファイルの前臨床評価のために、ならびに同一形態で、ヒトにおける薬物としての両方で使用され得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物における第１及び第２の結合ドメインの種間特異性は同一であると理解されるだろう。
【００２７】
上記を考慮すると、系統発生的に（ヒトから）遠い種における試験のために代用ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物を構築する必要性がなくなる。結果として、同一分子が、臨床試験に加えて市販承認後及び治療薬物投与においてヒトに投与されることを意図するのと同様に、動物の前臨床試験で使用され得る。ヒトに対するその後の投与において使用するものと同じ分子を前臨床動物試験に使用する能力により、前臨床動物試験で得られたデータのヒト症例への適用性が限定されてしまう危険性が実質的に排除されるか、または少なくとも大幅に減少する。要するに、ヒトに実際に投与されることになる分子と同じ分子を使用して、動物における前臨床安全性データを得ることは、ヒト関連シナリオに対するデータの適用性を保証するのに寄与する。対照的に、代用分子を使用する従来の手法では、代用分子は、前臨床安全性評価のために使用される動物試験システムに分子適合されなければならない。したがって、ヒト治療に実際に使用される分子は、薬物動態パラメータ及び／または生物活性において、前臨床試験に使用される代用分子とは配列が異なり、また構造も異なる可能性があり、結果として、前臨床動物試験で得られたデータのヒト症例への適用性／移行性が限定されてしまう。代用分子の使用は、完全に新たな構築物の構築、産生、精製及び特徴付けを必要とする。これにより、その分子を得るために余計な開発費用及び時間が必要となる。つまり、代用物は、ヒト治療に使用される実際の薬物に加えて別個に開発されなければならず、結果として２つの分子のために２系統の開発を実施しなければならない。したがって、本明細書に記載される種間特異性及び機能性（すなわち、反応性）を示す、本発明の好ましくはヒトＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の主な利点は、同一分子が、ヒトにおける、及び前臨床動物試験における治療剤に使用され得ることである。
【００２８】
本発明の種間特異的ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物により、ヒトへの投与を意図する薬物候補に試験動物を適合させること、例えば、トランスジェニック動物の作製なども、もはや必要ない。本発明の使用及び方法により、種間特異性及び反応性を示す本発明の好ましくはヒトＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、動物の遺伝子操作を一切行うことなく、マカクのような非チンパンジー霊長類での前臨床試験に直接使用され得る。当業者には周知の通り、試験動物を薬物候補に適合させる手法nは、前臨床安全性試験で得られた結果が、動物の改変ゆえにヒトにはあまり典型的ではなく、予測ができないというリスクを常にはらむ。例えば、トランスジェニック動物では、導入遺伝子によりコードされるタンパク質は、多くの場合に高度に過剰発現される。したがって、このタンパク質抗原に対する抗体の生物活性について得られたデータは、タンパク質がはるかに低く、より生理学的レベルで発現されるヒトについてのそれらの予測値が限定される場合がある。
【００２９】
本発明の好ましくはヒトＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のさらなる利点は、例えば、薬物動態動物試験の過程で動物前臨床試験の一部として使用される場合に複数の血液試料を抽出する能力である。複数の血液抽出物が、下等動物、例えばマウスよりも非チンパンジー霊長類ではるかに容易に得られ得る。複数の血液試料の抽出により、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって誘導される生物学的効果を決定するための血液パラメータの連続試験が可能となる。さらに、複数の血液試料の抽出により、研究者が、本明細書で定義されるような本発明の好ましくはヒトＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の薬物動態プロファイルを評価できる。加えて、潜在的な副作用が、血液パラメータに反映される本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物により誘導される場合があり、抗体の投与過程中に抽出される異なる血液試料で測定され得る。
【００３０】
種間特異性を示す、本明細書で定義されるような本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の利点は、以下の通りに簡潔にまとめられてよい。
【００３１】
第１に、前臨床試験で使用される、本明細書で定義されるような本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒト治療に使用されるものと同じである。したがって、薬物動態特性及び生物活性が異なり得る２つの独立した分子を開発する必要はもはやない。このことは、例えば、薬物動態結果が、例えば、従来の代用物手法よりも、より直接的にヒト設定に対して移行可能かつ適用可能であるという点で極めて有利である。
【００３２】
第２に、ヒトの治療薬を調製するための、本明細書で定義されるような本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の使用は、代用物手法よりも費用がかからず、かつ労働集約的ではない。
【００３３】
第３に、本明細書で定義されるような本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、１つの霊長類種における前臨床試験だけでなく、一連の異なる霊長類種における前臨床試験にも使用され、それによって霊長類とヒトとの間に種差が存在し得るリスクを限定し得る。
【００３４】
第４に、チンパンジーは、絶滅危惧種であるため、所望であれば動物試験が回避され得る。
【００３５】
第５に、複数の血液試料が、広範囲な薬物動態試験のために抽出され得る。
【００３６】
第６に、本発明の好ましい実施形態による抗体構築物がヒト起源であるため、結合分子に対する免疫反応の発生が、ヒト患者に投与される場合に最小化される。非ヒト種、例えば、マウスのように、マウス起源の治療分子に対してヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の発生をもたらす種に由来する薬物候補に特異的な抗体による免疫反応の誘導が排除される。
【００３７】
本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の治療的使用は、がん、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは癌腫及び以下に列挙されるようなその他のがん適応症に対する新規発明の治療手法を提供する。以下の実施例に示される通り、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＤＨ３発現ヒトがん細胞を死滅させるための有利なツールを提供する。さらに、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、古典的（単一特異的）ＩｇＧ分子またはＡＤＣと比較して有利な作用機序を提供する。
【００３８】
動物モデルにおける薬物候補の特徴付けには、関連動物種に対する種交差反応性が不可欠であり、種間親和性ギャップは、予測動物モデル設定を保証するために１０倍未満の親和性差に維持されるべきである。マカクザル（及び特にカニクイザル）は、効力及び毒性試験について最高の予測値を有する最も関連のある種に入ると考えられる。抗体構築物が効率基準を満たすかどうかを分析するために、各々の細胞傷害性アッセイを開発して適合させなければならない。
【００３９】
有害な副作用を予防するために、二重特異性抗体構築物の標的結合部分がＰカドヘリンに特異的に結合し、その上記の最も近いホモログ、または体内に存在するその他のタンパク質には一切結合しないことが保証されなければならない。
【００４０】
本発明の抗体構築物は、ＣＨＤ３細胞外ドメインＤ１（配列番号：１の１０８〜２１５位）に好ましくは結合せず、それらはＣＨＤ３細胞外ドメインＤ４（配列番号：１の４４１〜５４６位）に好ましくは結合せず、それらはＣＨＤ３細胞外ドメインＤ５（配列番号：１の５４７〜６５０位）に好ましくは結合しない。
【００４１】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、二重特異性抗体構築物は、第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸２９１〜３２７位（配列番号：３４）内に含まれるエピトープに結合するという点を特徴とする。アミノ酸２９１〜３２７位（配列番号：３４）に特異的に結合する抗体は、ヒトＣＤＨ３のＣＨＤ３細胞外ドメインＤ３（配列番号：１の３２８〜４４０位）に好ましくは結合しない。
【００４２】
本発明による好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３のエピトープに結合する好ましくは第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物として定義され得、抗体構築物は、ＣＤＨ３−１１、ＣＤＨ３−１２、ＣＤＨ３−１３またはＣＤＨ３−１４と称される抗体、すなわち、
・配列番号：１５５に示されるＶＨ領域及び配列番号：１５６に示されるＶＬ領域、
・配列番号：１６５に示されるＶＨ領域及び配列番号：１６６に示されるＶＬ領域、
・配列番号：１７５に示されるＶＨ領域及び配列番号：１７６に示されるＶＬ領域；または
・配列番号：１８５に示されるＶＨ領域及び配列番号：１８６に示されるＶＬ領域
を含む抗体と同じエピトープに結合するか、またはＣＤＨ３との結合についてそれと競合する。
【００４３】
本発明の別の態様では、二重特異性抗体構築物は、第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸３２８〜３６３位（配列番号：３５）内に含まれるエピトープに結合するという点を特徴とする。
【００４４】
本発明による好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３のエピトープに結合する好ましくは第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物として定義され得、抗体構築物は、ＣＤＨ３−２４と称される抗体、すなわち、配列番号：２８５に示されるＶＨ領域及び配列番号：２８６に示されるＶＬ領域を含む抗体と同じエピトープに結合するか、またはＣＤＨ３との結合についてそれと競合する。
【００４５】
本発明による別の好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３のエピトープに結合する好ましくは第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物として定義され得、抗体構築物は、ＣＤＨ３−２５、ＣＤＨ３−２６またはＣＤＨ３−２７と称される抗体、すなわち、
・配列番号：２９５に示されるＶＨ領域及び配列番号：２９６に示されるＶＬ領域、
・配列番号：３０５に示されるＶＨ領域及び配列番号：３０６に示されるＶＬ領域、または
・配列番号：３１５に示されるＶＨ領域及び配列番号：３１６に示されるＶＬ領域
を含む抗体と同じエピトープに結合するか、またはＣＤＨ３との結合についてそれと競合する。
【００４６】
抗体構築物が、結合について別の所与の抗体構築物と競合するか否かは、競合アッセイ、例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞に基づく競合アッセイなどで測定され得る。アビジン結合微粒子（ビーズ）も使用され得る。アビジンコーティングＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる場合、これらのビーズの各々は、アッセイが実施され得る基材として使用され得る。抗原がビーズ上にコーティングされ、次いで第１抗体でプレコートされる。第２抗体が添加されて、任意のさらなる結合が決定される。測定値はフローサイトメトリーにより生成される。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、二重特異性抗体構築物は、第１結合ドメインが、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸３２８〜３６３位（配列番号：３５）内に含まれるエピトープに、またヒトＣＤＨ３のアミノ酸４０４〜４４０位（配列番号：３９０）内に含まれるエピトープに結合するという点を特徴とする。
【００４８】
さらに、本発明の抗体構築物は、配列番号：１に示されるヒトＣＤＨ３のアミノ酸２１６〜２５２位または２５３〜２９０位内に含まれるエピトープに好ましくは結合しない。
【００４９】
さらに、本発明の抗体構築物は、配列番号：１に示されるヒトＣＤＨ３のアミノ酸３６４〜４０３位内に含まれるエピトープに好ましくは結合しない。
【００５０】
アミノ酸３２８〜３６３位（配列番号：３５）内に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体構築物は、ヒトＣＤＨ３のＣＨＤ３細胞外ドメインＤ２（配列番号：１の２１６〜３２７位）に好ましくは結合しない。
【００５１】
本発明の１つの利点は、ＣＤ３に結合する結合ドメイン及びＣＤＨ３に結合することができる結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物の提供であるのに対して、結合ドメインの両方とも、ヒト及びマカクＣＤＨ３に種間特異性を示す。予想外にも、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＤＨ３及びＣＤ３のヒト及びマカクＣＤＨ３ホモログに特異的に結合するだけでなく、ヒト及びマカクＣＤＨ３アッセイ系においてＴ細胞媒介性細胞傷害も発揮することが見出された。有利には、本発明は、ヒト及びマカクにおいてＴ細胞媒介性細胞傷害を示すＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物を提供する。この利点は、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸２９１〜３６３位（配列番号：３６）内に含まれるエピトープクラスターに結合するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、このような異なる試薬のうち１種以上を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載される方法に変更され得る、またはその方法と置換され得る、当業者に既知の同等のステップ及び方法への言及を含む。
【００５３】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素全てを指すと理解されるべきである。当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるようになる。このような等価物は、本発明によって包含されることを意図する。
【００５４】
「及び／または」という用語は、本明細書で使用される場合は必ず、「及び」、「または」及び「この用語によって接続される要素の全ての、または任意のその他の組合せ」という意味を含む。
【００５５】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内、最も好ましくは±５％以内を意味する。
【００５６】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を示唆するが、任意のその他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除は示唆しないと理解されるだろう。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で、または本明細書で使用される場合に時として「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で置換され得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「からなる」は、請求要素中で指定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲における基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。
【００５８】
本明細書の各場合では、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれも、他方の２つの用語のいずれかと置き換えられてよい。
【００５９】
「抗体構築物」という用語は、構造及び／または機能が、抗体の、例えば、全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく分子を指す。したがって、抗体構築物は、その特異的標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体構築物は、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義されてよい。本発明による構築物が基づいている抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が挙げられる。
【００６０】
本発明による「抗体構築物」の定義内には、ラクダ抗体及びバイオテクノロジーまたはタンパク質工学の方法またはプロセスにより生成されるその他の免疫グロブリン抗体を含む全長抗体または全抗体がある。これらの全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体であってよい。また、「抗体構築物」の定義内には、全長抗体の断片、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ｒＩｇＧ」（「半抗体」）などがある。本発明による抗体構築物はまた、抗体バリアントとも呼ばれる、改変された抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、次の構造によって例示される「ミニボディ」：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２、マルチボディ、例えば、トリアボディまたはテトラボディなど、及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディなど、または１つの可変ドメインのみを含む単一可変ドメイン抗体、すなわち、その他のＶ領域もしくはドメインとは無関係に抗原もしくはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨもしくはＶＬである場合のある抗体などであり得る。
【００６１】
さらに、「抗体構築物」という用語の定義には、一価、二価及び多価／多重価構築物、したがって、１つのみの抗原構造に特異的に結合する単一特異性構築物、加えて異なる結合ドメインによって２つ以上の抗原構造、例えば２つ、３つまたはそれを超える抗原構造と特異的に結合する二重特異性及び多特異性／多重特異性構築物を含む。さらに、「抗体構築物」という用語の定義には、１本のみのポリペプチド鎖からなる分子に加えて、２本以上のポリペプチド鎖からなる分子、すなわち、鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体もしくはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体もしくはヘテロオリゴマー）のいずれかであり得る分子を含む。上で同定された抗体及びそのバリアントまたは誘導体の例は、特に、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０ならびにＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９に記載されている。
【００６２】
本発明の抗体構築物は、好ましくは「インビトロ生成抗体構築物」である。この用語は、上記の定義による抗体構築物を指し、この場合、可変領域の全てまたは一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が、非免疫細胞選択、例えば、インビトロファージディスプレイ、タンパク質チップまたは候補配列が抗原に結合するそれらの能力について試験され得る任意のその他の方法で生成される。したがって、この用語は、動物の免疫細胞においてゲノム再編成によってのみ生成される配列を好ましくは除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学の使用により作製される抗体である。
【００６３】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が同一であって、少量で存在する場合のある想定される天然に存在する変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除く。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なる決定基（またはエピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位または決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物により合成され、したがって、その他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。
【００６４】
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養物により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてよいか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）によって作製されてよい。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【００６５】
次いで、ハイブリドーマは、標準的な方法、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などを使用して、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされ得る。任意の形態の関連抗原が免疫原として使用されてよく、例えば、これらは、組換え抗原、天然に存在する形態、それらの任意のバリアントまたは断片、加えてそれらの抗原ペプチドである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられるような表面プラズモン共鳴は、標的抗原、例えば、ＣＤＨ３またはＣＤ３イプシロンなどのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために使用され得る（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【００６６】
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。
【００６７】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連抗原は、非ヒト動物、例えば、げっ歯類（マウス、ハムスター、ウサギまたはラットなど）を免疫化するために使用され得る。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウスの抗体産生を欠損しているマウス系統をヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きな断片を用いて操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子から誘導される抗原特異的モノクローナル抗体が産生されて、選択されてよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５を参照のこと。
【００６８】
モノクローナル抗体は非ヒト動物から得ることもでき、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術を使用して改変、例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ化などが行われ得る。改変抗体構築物の例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照のこと）ならびにエフェクター機能（複数可）を変化させた抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、上記のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、及び上記のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）が挙げられる。
【００６９】
免疫学において、親和性成熟は、Ｂ細胞が免疫応答の過程中に抗原に対する親和性が増加した抗体を産生するプロセスである。同じ抗原への反復曝露により、宿主は親和性が連続的に増加した抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、成熟と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体断片を最適化するための使用に成功している。ＣＤＲ内のランダム変異は、放射線照射、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを使用して導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェーンシャッフリングによって増加され得る。通常、ファージディスプレイのようなディスプレイ法を使用する２または３ラウンドの変異及び選択により、低ナノモル濃度範囲の親和性を有する抗体断片が生じる。
【００７０】
抗体構築物における好ましい種類のアミノ酸置換変化は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される得られたバリアント（複数可）は、それらが生成された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有することになる。このような置換バリアントを生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７つの部位）が、各部位で全ての想定されるアミノ酸置換を生成するように変異される。このようにして生成された抗体バリアントは、繊維状ファージ粒子から一価の形態で、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として提示される。次いで、ファージディスプレイされたバリアントは、本明細書に開示されるようにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発が実施されて、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。代替として、または追加として、結合ドメインと例えば、ヒトＣＤＨ３との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であってよい。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。このようなバリアントが生成されると、バリアントのパネルが本明細書に記載されるようにスクリーニングされ、１つ以上の関連アッセイで優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択されてよい。
【００７１】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残部が別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、このような抗体の断片が、所望の生物活性を示す限り、これらの断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５，Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ２１７７０９６を参照のこと。
【００７２】
抗体、抗体構築物または抗体断片はまた、例えば、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７に開示される方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）により改変されてよい。簡潔に述べると、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析され得；これらのペプチドが、（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７で定義される）潜在的Ｔ細胞エピトープに相当する。ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載されているように、潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング」と称されるコンピュータモデリング手法が適用され得、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースが、ＶＨ配列及びＶＬ配列中に存在するモチーフについて検索され得る。これらのモチーフは、１８の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、それゆえ、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することにより、または好ましくは、単一アミノ酸置換により除去され得る。典型的には、保存的置換が行われる。多くの場合に、限定するわけではないが、ヒト生殖細胞系抗体配列中の位置に共通しているアミノ酸が使用されてよい。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ケンブリッジ、英国によってコンパイルされた）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲのヒト配列の供給源として使用され得る。コンセンサスヒトフレームワーク領域も、例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されているように使用され得る。
【００７３】
「ヒト化」抗体、抗体構築物またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体のその他の抗原結合部分配列など）は、大部分がヒト配列の抗体または免疫グロブリンであり、これらは、（ａ）非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列（複数可）を含有する。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲも）の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト（例えば、げっ歯類）種、例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどの超可変領域の残基（ドナー抗体）によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、「ヒト化抗体」はまた、本明細書で使用される場合にレシピエント抗体またはドナー抗体のどちらにも見出されない残基を含んでよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良かつ最適化するために行われる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含んでよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００７４】
ヒト化抗体またはそれらの断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメインからの同等の配列で置き換えることにより生成され得る。ヒト化抗体またはそれらの断片を生成する例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７により；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４により；ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；及びＵＳ６，４０７，２１３により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうち少なくとも１本からの免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列を単離、操作、及び発現させることを含む。このような核酸は、上記のような所定の標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから、加えてその他の供給源から得られてよい。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。
【００７５】
ヒト化抗体はまた、トランスジェニック動物、例えば、マウスなどのヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができない動物を使用して産生されてよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体を調製するために使用されてよい例示的なＣＤＲ移植法について説明している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体における全てのＣＤＲが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてよいか、またはＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置き換えられてよい。ヒト化抗体と所定の抗原との結合に必要な数のＣＤＲを置き換えることのみが必要である。
【００７６】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系置換及び／または復帰変異の導入により最適化され得る。このように変化された免疫グロブリン分子は、当該技術分野において既知のいくつかの技術のいずれかによって作製され得る（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２，及びＥＰ２３９４００）。
【００７７】
「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」及び「ヒト結合ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（上記の）によって説明されたものを含む、当該技術分野において既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に実質的に対応する抗体領域、例えば、可変及び定常領域またはドメインなどを有する抗体、抗体構築物及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、例えば、ＣＤＲにおける、特にＣＤＲ３におけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含んでよい。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置き換えられた少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える位置を有し得る。ヒト抗体、抗体構築物及び結合ドメインの定義はまた、本明細書で使用される場合に完全ヒト抗体を想定し、これは、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術または系を使用することにより誘導され得るもののような、抗体の非人工的及び／または遺伝子改変ヒト配列のみを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書に開示される抗体構築物について記載するために使用される場合、その産生環境の成分から同定、分離かつ／または回収された抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境からの全てのその他の成分と関連しないか、または実質的に関連しない。その産生環境の汚染成分、例えば、組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などは、典型的にはポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げることになる材料であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む場合がある。抗体構築物は、例えば、所与の試料において総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成してよい。単離タンパク質は、状況に応じて総タンパク質含有量の５重量％〜９９．９重量％を構成してよいと理解される。ポリペプチドは、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用により有意に高濃度で作製されてよく、結果として高い濃度レベルで作製される。この定義は、当該技術分野において既知の多種多様な生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生を含む。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）スピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均一になるまで精製されることになる。しかしながら、通常、単離抗体構築物は少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００７９】
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係では、標的分子（抗原）ＣＤＨ３及びＣＤ３それぞれの上にある所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメインを特徴付ける。第１結合ドメイン（ＣＤＨ３を認識する）の構造及び機能、ならびに好ましくは第２結合ドメイン（ＣＤ３）の構造及び／または機能もまた、抗体の、例えば、全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によれば、第１結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）ならびに３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第２結合ドメインはまた、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を好ましくは含む。より好ましくは、第２結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／または第２結合ドメインが、既存の（モノクローナル）抗体からのＣＤＲ配列を骨格に移植するのではなく、ファージディスプレイまたはライブラリースクリーニング法によって作製されるか、または入手可能であることが想定される。
【００８０】
本発明によれば、結合ドメインは、好ましくはポリペプチドの形態である。このようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学リンカーまたは化学架橋剤、例えば、グルタルアルデヒドなど）を含んでよい。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及び通常３０未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、共有ペプチド結合（アミノ酸鎖をもたらす）により互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む。「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、分子の群について説明し、通常は３０超のアミノ酸からなる。ポリペプチドは、多量体、例えば、二量体、三量体以上のオリゴマーなどをさらに形成する場合があり、すなわち、２つ以上のポリペプチド分子からなる。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であってよい。結果として、このような多量体の対応する高次構造は、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は抗体分子であり、これは、その天然に存在する形態で、２本の同一の軽ポリペプチド鎖及び２本の同一の重ポリペプチド鎖からなる。「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はまた、天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指し、この場合、修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾により達成される。「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、本明細書で言及される場合、化学修飾、例えばＰＥＧ化されてよい。このような修飾は、当該技術分野において周知であり、本明細書で以下に記載されている。
【００８１】
前述のように、結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでよいが；両方を含まなければならないわけではない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合にインタクトな抗原結合ドメインのある程度の抗原結合機能を保持する。（改変された）抗原結合抗体断片の例としては、（１）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片；（２）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有する、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（６）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の好ましくは後者（例えば、ｓｃＦＶライブラリーに由来するもの）が挙げられる。本発明による抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。
【００８２】
好ましくは、ＣＤＨ３に結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、非ヒト、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）などの可変及び／または定常領域を有する抗体または抗体構築物と関連する問題の一部を回避する。このようなげっ歯類由来タンパク質の存在は、抗体もしくは抗体構築物の迅速なクリアランスをもたらし得るか、または患者による抗体もしくは抗体構築物に対する免疫応答の生成をもたらし得る。げっ歯類由来抗体または抗体構築物の使用を回避するために、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物は、げっ歯類が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類にヒト抗体機能を導入することによって生成され得る。
【００８３】
ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングして再構築する能力及びそれらをマウス生殖細胞系に導入する能力は、非常に大きくまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能性成分を明らかにする強力な手法に加えてヒト疾患の有用なモデルを生成する強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するこのような技術の使用は、発生中のヒト遺伝子産物の発現及び調節、その他の系とのそれらの伝達、ならびに疾患の誘導及び進行へのそれらの関与について独自の洞察を提供し得る。
【００８４】
このような戦略の重要な実用化は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入により、抗体のプログラム発現及び組立てに加えて、Ｂ細胞発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を試験する機会が提供される。さらに、このような戦略は、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生のための理想的な供給源を提供し得るが、これはヒト疾患における抗体療法の保証を実現する上で重要なマイルストーンである。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスまたはマウス誘導体化ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー応答を最小限に抑えて、それによって投与された抗体／抗体構築物の効力及び安全性を増加させると予想される。完全ヒト抗体または抗体構築物の使用は、反復化合物投与を必要とする慢性及び再発性ヒト疾患、例えば、炎症、自己免疫、及びがんなどの処置において大きな利点を提供すると予想され得る。
【００８５】
この目的に対する１つの手法は、マウスの抗体産生性を欠損しているマウス系統を、このようなマウスがマウス抗体の不在下でヒト抗体の幅広いレパートリーを産生するだろうことを見越して、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を用いて操作することであった。大きなヒトＩｇ断片は、幅広い可変遺伝子多様性に加えて、抗体産生及び発現の適切な調節を保存する。抗体の多様化及び選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することにより、これらのマウス系統において再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む、対象となる任意の抗原に対する高親和性抗体を生成するはずである。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂが、容易に産生かつ選択され得る。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、コア可変及び定常領域配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座の、それぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系構成断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）で操作された。ヒトＩｇ含有ＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方についてマウス系と適合することが証明され、不活性化マウスＩｇ遺伝子と置換できた。このことは、Ｂ細胞発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生して、抗原特異的ヒトｍＡｂを生成するそれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、より多数のＶ遺伝子、さらなる調節エレメント、及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入により、感染及び免疫化に対してヒト体液性応答の特徴を示す実質的に完全なレパートリーが反復される場合があることを示唆した。Ｇｒｅｅｎらの研究は、最近、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座それぞれのメガベースサイズの生殖細胞系構成ＹＡＣ断片の導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超の導入まで拡張された。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書を参照のこと。
【００８６】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製は、米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、第０７／６１０，５１５号明細書、第０７／９１９，２９７号明細書、第０７／９２２，６４９号明細書、第０８／０３１，８０１号明細書、第０８／１１２，８４８号明細書、第０８／２３４，１４５号明細書、第０８／３７６，２７９号明細書、第０８／４３０，９３８号明細書、第０８／４６４，５８４号明細書、第０８／４６４，５８２号明細書、第０８／４６３，１９１号明細書、第０８／４６２，８３７号明細書、第０８／４８６，８５３号明細書、第０８／４８６，８５７号明細書、第０８／４８６，８５９号明細書、第０８／４６２，５１３号明細書、第０８／７２４，７５２号明細書、及び第０８／７５９，６２０号明細書；ならびに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；第６，１５０，５８４号明細書；第６，１１４，５９８号明細書；第６，０７５，１８１号明細書、及び第５，９３９，５９８号明細書ならびに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号明細書、第３０６８５０６Ｂ２号明細書、及び第３０６８５０７Ｂ２号明細書でさらに考察されて、図で示されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、ならびにＷＯ０３／４７３３６も参照のこと。
【００８７】
代替手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む、他者が、「ミニ遺伝子座」手法を利用した。ミニ遺伝子座手法では、外因性Ｉｇ遺伝子座が、Ｉｇ遺伝子座からの細片（個々の遺伝子）を含むことにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、及び第２定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物への挿入のための構築物へと形成される。この手法は、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５４５，８０７号明細書ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙのそれぞれ米国特許第５，５４５，８０６号明細書；第５，６２５，８２５号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；第５，６６１，０１６号明細書；第５，７７０，４２９号明細書；第５，７８９，６５０号明細書；第５，８１４，３１８号明細書；第５，８７７，３９７号明細書；第５，８７４，２９９号明細書；及び第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６１２，２０５号明細書；第５，７２１，３６７号明細書；及び第５，７８９，２１５号明細書、ならびにＣｈｏｉ  ａｎｄ  Ｄｕｎｎの米国特許第５，６４３，７６３号明細書、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、第０７／５７５，９６２号明細書、第０７／８１０，２７９号明細書、第０７／８５３，４０８号明細書、第０７／９０４，０６８号明細書、第０７／９９０，８６０号明細書、第０８／０５３，１３１号明細書、第０８／０９６，７６２号明細書、第０８／１５５，３０１号明細書、第０８／１６１，７３９号明細書、第０８／１６５，６９９号明細書、第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４ならびに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
【００８８】
Ｋｉｒｉｎもまた、ミクロセル融合により、大きな染色体片、または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成を実証した。欧州特許出願第７７３２８８号明細書及び第８４３９６１号明細書を参照のこと。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の可能な生成のための技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスが、ヒトリンパ細胞、例えば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞で再構成される。次いで、マウスは抗原で免疫化され、その抗原に対する免疫応答を生じ得る。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；第５，６９８，７６７号明細書；及び第５，９５８，７６５号明細書を参照のこと。
【００８９】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、産業界にキメラ抗体またはさもなければヒト化抗体を調製させる要因となった。しかしながら、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に抗体の慢性的なまたは複数回用量の利用において観察されることになると予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡの応答の懸念及び／または影響を低下させるために、ＣＤＨ３に対する完全ヒト結合ドメイン及びＣＤ３に対する完全ヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましい。
【００９０】
「に（特異的に）結合する」、「を（特異的に）認識する」、「を（特異的に）対象とする」、及び「と（特異的に）反応する」という用語は、本発明に従って、結合ドメインが、標的タンパク質または抗原（ＣＤＨ３／ＣＤ３）上に位置するエピトープの１つ以上の、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、最も好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と相互作用すること、または特異的に相互作用することを意味する。
【００９１】
「エピトープ」という用語は、結合ドメイン、例えば、抗体もしくは免疫グロブリンまたは抗体のもしくは免疫グロブリンの誘導体もしくは断片などが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であり、それゆえエピトープという用語は、本明細書においては時として「抗原構造」または「抗原決定基」とも称される。したがって、結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。この結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義するとも理解される。
【００９２】
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の三次元フォールディングによって近接した非連続アミノ酸の両方により形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、典型的には特有の配列中に少なくとも３つまたは少なくとも４つ、より通常には少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つ、例えば、約８〜約１０のアミノ酸を含み、また、より長く、少なくとも１５または２０アミノ酸、少なくとも２５または３０アミノ酸、あるいはそれを超えるものを含み得る。
【００９３】
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、必ずしも結合ドメインによって認識されるとは限らないエピトープ）である。典型的には、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはその断片の三次元構造を認識する（本発明との関連において、結合ドメインのうち１つに対する抗原がＣＤＨ３タンパク質内に含まれている）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光法ならびに部位特異的スピンラベル及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
提供される実施例は、所与の結合ドメインを特徴付けるさらなる方法について説明し、これは所与の結合ドメインが所与のタンパク質、特にＣＤＨ３の１つ以上のエピトープ（複数可）に結合するか否かの試験を含む。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「エピトープクラスター」という用語は、抗原の定義された連続ストレッチ中に位置するエピトープを示す。エピトープクラスターは、１つ、２つまたはそれを超えるエピトープを含み得る。抗体構築物はまた、エピトープクラスター内のエピトープに加えてこのクラスター以外のさらなるエピトープにも結合し得、これは不連続エピトープに対応し得る。不連続エピトープは通常、連続していない抗原のアミノ酸ストレッチを包含することを特徴とする。例えば、抗体構築物は、細胞外サブドメインのＤ３Ａ及びＤ３Ｃには結合し得るが、Ｄ３Ｂには結合し得ない。「エピトープクラスタリング」の構想もまた、本発明の抗体構築物の特徴を特徴付ける際に使用される。ＣＤＨ３の細胞外ドメインにおける、本発明との関連において定義されたエピトープクラスター及びエピトープが上記されていて、図１に示されている。
【００９６】
ヒトＣＤＨ３タンパク質中の細胞外ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）またはそのサブドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ）が、非ヒト及び非霊長類（例えば、ニワトリまたはマウス）ＣＤＨ３抗原の各々の細胞外ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）またはそのサブドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ）と交換される（ヒトＣＤＨ３を含む構築物をもたらし、１つのヒト細胞外ドメインまたはそのサブドメインが、その対応物である非ヒト細胞外ドメインまたはそのサブドメインで置き換えられる）場合、結合ドメインの結合性の低下が生じることになる。この低下は、ヒトＣＤＨ３タンパク質の各々のエピトープクラスターと比較して、ヒトＣＤＨ３タンパク質の各々の細胞外ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）またはそのサブドメインへの結合を１００％に設定することにより、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％；より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらに１００％である。上述したヒトＣＤＨ３／非ヒトＣＤＨ３キメラがＣＨＯ細胞中で発現されることが想定される。ヒトＣＤＨ３／非ヒトＣＤＨ３キメラが、異なる膜結合タンパク質、例えば、ＥｐＣＡＭなどの膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合されることも想定される。
【００９７】
非ヒト（例えば、マウスであるが、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリなどのようなその他の動物も考えられる場合がある）ＣＤＨ３抗原の各々の細胞外ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）またはそのサブドメインとの交換による結合のこの喪失を試験する方法が、実施例２に記載されている。抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定残基の寄与を決定するさらなる方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ  ＧＡ．Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照のこと）、分析される各残基が、例えば、部位特異的変異誘発によりアラニンで置き換えられる。アラニンが使用される理由としては、アラニンは嵩高くなく、化学的に不活性であるが、それにもかかわらず多くの他のアミノ酸が有している二次構造参照物を模倣するメチル官能基を有しているからである。時として、嵩高いアミノ酸、例えば、バリンまたはロイシンなどが、変異残基のサイズの保存が望まれる場合に使用され得る。アラニンスキャニングは、長年使用されてきた成熟した技術である。
【００９８】
結合ドメインとエピトープまたはエピトープクラスターとの間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原（ここでは、それぞれＣＤＨ３及びＣＤ３）上のエピトープまたはエピトープクラスターに対して顕著な親和性を示すこと、及び一般にＣＤＨ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と有意な反応性を示さないことを示唆している。「顕著な親和性」は、約１０−６Ｍ（ＫＤ）またはそれよりも強い親和性での結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合に特異的と考えられる。結合ドメインが標的と特異的に反応する、または結合するか否かは、とりわけ、結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応を、結合ドメインとＣＤＨ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することにより容易に試験され得る。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＣＤＨ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第１結合ドメインは、ＣＤＨ３以外のタンパク質に結合することができず、第２結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。
【００９９】
「本質的に／実質的に結合しない」または「結合することができない」という用語は、本発明の結合ドメインが、ＣＤＨ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と結合しない、すなわち、ＣＤＨ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に対して、ＣＤＨ３またはＣＤ３それぞれへの結合を１００％に設定することにより、３０％超の反応性を示さず、反応性は、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％以下であることを意味する。
【０１００】
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列中における特定のモチーフによりもたらされると考えられている。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／または三次構造の結果として、加えてこの構造の二次的修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特定の抗原との特異的相互作用は、その部位と抗原との単純な結合をもたらす場合がある。さらに、抗原相互作用部位とその特定の抗原との特異的相互作用は、代替としてまたは追加として、例えば、抗原の立体構造における変化の誘導、抗原のオリゴマー化などによるシグナルの開始をもたらす場合がある。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３に結合する好ましくは第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物を提供し、第１結合ドメインは、
ａ）配列番号：１４９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１５０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１５２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号：１５９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１６０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１６２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１６３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号：１６９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１７０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１７２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１７３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号：１７９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１８０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１８２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１８３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号：１８９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：１９０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：１９２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：１９３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号：１９９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２００に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２０２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２０３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号：２０９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２１０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２１２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２１３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｈ）配列番号：２１９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２２０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２２２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２２３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｉ）配列番号：２２９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２３０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２３１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２３２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２３３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２３４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｊ）配列番号：２３９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２４１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２４３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２４４に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３に結合する好ましくは第１ヒト結合ドメイン及びＴ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する好ましくは第２ヒト結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物を提供し、第１結合ドメインは、
ａ）配列番号：２７９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２８０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２８１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２８２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２８３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２８４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号：２８９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２９０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：２９１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：２９２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：２９３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：２９４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号：２９９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３００に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３０１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３０２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３０３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３０４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号：３０９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３１０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３１１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３１２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３１３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３１４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号：３１９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３２０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３２１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３２２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３２３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３２４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号：３２９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３３０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３３１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３３２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３３３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３３４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号：３３９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３４１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３４３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３４４に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｈ）配列番号：３４９に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：３５０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号：３５１に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号：３５２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：３５３に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号：３５４に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む。
【０１０３】
「可変」という用語は、それらの配列中で可変性を示し、かつ特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する抗体または免疫グロブリンドメインの一部（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の対合は、共に単一の抗原結合部位を形成する。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１として表される。各軽（Ｌ）鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重（Ｈ）鎖に連結される一方で、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結される。
【０１０４】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれて、６つのＣＤＲが三次元空間内で抗原結合表面を形成するための骨格を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、大部分がβシート配置をとって３つの超可変領域がそれに連結し、これらは、βシート構造に連結して、いくつかの場合にはその一部を形成しているループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接してまとまった状態になり、他方の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。定常ドメインは抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害及び補体活性化などを示す。
【０１０５】
「ＣＤＲ」という用語及びその複数形は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用に関与する残基の大部分を含有し、それゆえ抗体分子の機能活性に寄与するため、それらは抗原特異性の主たる決定基である。
【０１０６】
正確な定義のＣＤＲ境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムに依存する。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される番号付けシステムを含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触または任意のその他の境界定義により言及されてよい。境界が異なるにもかかわらず、これらのシステムの各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分についてある程度重複している。したがって、これらのシステムによるＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に対して長さ及び境界領域が異なる場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（種間配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的試験に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるためのさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照のこと。２つの残基同定技術が、重複しているが同一領域ではない領域を定義するような程度まで、それらはハイブリッドＣＤＲを定義するために組み合わされ得る。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔシステムに従った番号付けが好ましい。
【０１０７】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造に分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによってとられる主鎖の立体構造を指す。比較構造試験から、６つの抗原結合ループのうち５つが、利用可能な立体構造に関して限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けられ得る。したがって、抗体間で対応するループは、ループの大部分における高度なアミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有する場合がある（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、とられるループ構造とその周囲のアミノ酸配列との間には関連がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さならびにループ内、加えて保存的フレームワーク内（すなわち、ループの外側）の主要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの主要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
【０１０８】
「カノニカル構造」という用語はまた、例えば、Ｋａｂａｔ（上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．）により分類されるような、抗体の直鎖状配列についての考察を含んでよい。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（システム）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した手法で番号付けするために広く採用されている基準であり、本明細書内の他の箇所でも言及されるように、本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造の考察も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによって十分に反映されないこれらの差異が、Ｃｈｏｔｈｉａらの番号付けシステムにより説明され得る、かつ／またはその他の技術、例えば、結晶学及び二次元もしくは三次元コンピュータモデリングにより明らかにされ得る。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、適切なシャーシ配列の同定を可能にするカノニカルクラスに分類されてよい（例えば、様々なカノニカル構造をライブラリーに含めたいという要望に基づく）。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及び上記のＣｈｏｔｈｉａらにより記載されるような構造の考察ならびに抗体構造のカノニカル面を解釈するためのそれらの示唆は、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当該技術分野において周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照のこと。
【０１０９】
軽鎖のＣＤＲ３、及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定基を構成する場合がある。いくつかの抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３が、抗原と抗体との間の主な接触領域を構成すると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームが、抗体の結合特性を変化させるために、またはどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定するために使用され得る。したがって、ＣＤＲ３は典型的には、抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。Ｈ３は、例えば、２つのアミノ酸残基と同じくらい短いもの、または２６アミノ酸よりも大きいものであり得る。
【０１１０】
抗体遺伝子の配列は、組立て及び体細胞変異後に高度に変化し、これらの変化した遺伝子は１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に完全にまたは部分的に由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントにおけるインビボでの再編成により生成されてよい。あるいは、配列（複数可）は、再編成が生じること、例えば、インビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。あるいは、配列（複数可）の一部または全てが、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発、及びその他の方法によって得られてよく、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照のこと。レパートリーは配列を１つだけ含んでよいか、または遺伝的に多様な群中の配列を含む、複数の配列を含んでよい。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の抗体構築物の第１結合ドメインは、配列番号：１５５、配列番号：１６５、配列番号：１７５、配列番号：１８５、配列番号：１９５、配列番号：２０５、配列番号：２１５、配列番号：２２５、配列番号：２３５、及び配列番号：２４５に示される、ＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む。
【０１１２】
本発明の抗体構築物のさらなる実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：１５６、配列番号：１６６、配列番号：１７６、配列番号：１８６、配列番号：１９６、配列番号：２０６、配列番号：２１６、配列番号：２２６、配列番号：２３６、及び配列番号：２４６に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む。
【０１１３】
本発明の抗体構築物の別の実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：１５５＋１５６、配列番号：１６５＋１６６、配列番号：１７５＋１７６、配列番号：１８５＋１８６、配列番号：１９５＋１９６、配列番号：２０５＋２０６、配列番号：２１５＋２１６、配列番号：２２５＋２２６、配列番号：２３５＋２３６、及び配列番号：２４５＋２４６に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１結合ドメインは、配列番号：２８５、配列番号：２９５、配列番号：３０５、配列番号：３１５、配列番号：３２５、配列番号：３３５、配列番号：３４５、及び配列番号：３５５に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む。
【０１１５】
本発明の抗体構築物のさらなる実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：２８６、配列番号：２９６、配列番号：３０６、配列番号：３１６、配列番号：３２６、配列番号：３３６、配列番号：３４６、及び配列番号：３５６に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む。
【０１１６】
本発明の抗体構築物の別の実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：２８５＋２８６、配列番号：２９５＋２９６、配列番号：３０５＋３０６、配列番号：３１５＋３１６、配列番号：３２５＋３２６、配列番号：３３５＋３３６、配列番号：３４５＋３４６、及び配列番号：３５５＋３５６に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
【０１１７】
「二重特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、「少なくとも二重特異性」である抗体構築物を指す。すなわち、それは少なくとも第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含み、この場合、第１結合ドメインが１つの抗原または標的（ここでは、ＣＤＨ３）に結合し、第２結合ドメインが別の抗原または標的（ここでは、ＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性抗体構築物」という用語はまた、多重特異性抗体構築物、例えば、三重特異性抗体構築物などであり、後者は３つの結合ドメインを含み、または３種を超える（例えば、４種、５種などの）特異性を有する構築物を包含する。
【０１１８】
本発明による抗体構築物が（少なくとも）二重特異性である場合、それらは天然には存在せず、かつそれらは天然に存在する産物とは著しく異なる。したがって、「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照のこと。
【０１１９】
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでよいか、または含まなくともよい。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明に従って、本発明の抗体構築物における１つの（可変及び／または結合）ドメインならびに別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに連結されるアミノ酸配列を定義する。このようなペプチドリンカーの不可欠な技術的特徴は、このリンカーがいかなる重合活性も含まないということである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び第４，９３５，２３３号明細書またはＷＯ８８／０９３４４に記載されているものがある。
【０１２０】
リンカーが使用される場合、このリンカーは好ましくは、第１及び第２ドメインの各々が、互いに独立してそれらの示差的結合特異性を保持し得ることを保証するのに十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体構築物において少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーについては、これらのペプチドリンカーは、ほんの数個のアミノ酸残基、例えば、１２アミノ酸残基以下しか含まないことが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６または５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２または１アミノ酸（複数可）を含むが、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。「ペプチドリンカー」との関連において特に好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸Ｇｌｙからなってよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号：３９３）、またはそのポリマー、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、式中、ｘは１以上の整数である。ペプチドリンカーの特徴は、二次構造の促進の不在を含み、当該術分野において既知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３），Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。また、いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。ドメインの相互連結は、例えば、実施例に記載されるような遺伝子工学によって提供され得る。融合されて機能的に連結された二重特異性一本鎖構築物を調製する方法及びそれらを哺乳動物細胞または細菌中で発現させる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【０１２１】
したがって、本発明は、抗体構築物が（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及び上述した形式のいずれかのオリゴマーからなる群より選択される形式である好ましい実施形態を提供する。「形式である」という用語は、構築物が、例えば、本明細書に記載されるようにその他の部分への結合または融合によってさらに改変され得ることを除外しない。
【０１２２】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の抗体構築物は、「二重特異性一本鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｖＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは組換え方法を使用して、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製できる合成リンカーによって結合され得る。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来技術を使用して得られて、断片は全抗体または全長抗体と同じ手法で機能について評価される。したがって、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質であり、これらは通常、約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンを、加えて溶解性のためにセリンまたはトレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結させ得るか、またはその逆もまた同様のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【０１２３】
二重特異性一本鎖分子は当該技術分野において既知であり、ＷＯ９９／５４４４０，Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７，Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３，Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の産生について説明された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、上記のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）及び上記のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）は、選択された標的（複数可）を特異的に認識する一本鎖抗体構築物を産生するために適合され得る。
【０１２４】
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）または二重特異性一本鎖可変断片（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を連結することにより操作され得る。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは二価と呼ばれることになる（すなわち、それは同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは二重特異性と呼ばれることになる。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を作製することにより行われ、タンデムｓｃＦｖを生成し得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４を参照のこと）。別の可能性は、２つの可変領域をまとめて折り畳み、ｓｃＦｖを二量体化させるには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いるｓｃＦｖ分子の作製である。この種類は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０（１４）：６４４４−８を参照のこと）。
【０１２５】
本発明の抗体構築物のさらに好ましい実施形態によれば、結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）（標的抗原ＣＤＨ３またはＣＤ３のいずれかに結合する）は、上記のようなペプチドリンカーにより直接連結されるのではなく、結合ドメインが、記載されているようにダイアボディのために形成される。したがって、ＣＤ３結合ドメインのＶＨは、ペプチドリンカーによりＣＤＨ３結合ドメインのＶＬに融合されてよく、ＣＤＨ３結合ドメインのＶＨは、このようなペプチドリンカーによりＣＤ３結合ドメインのＶＬに融合される。
【０１２６】
単一ドメイン抗体は、その他のＶ領域またはドメインとは無関係に、特定の抗原に選択的に結合することができる（単量体）抗体可変ドメインを１つだけ含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科で見られる重鎖抗体から操作されたもので、これらはＶＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体が得られ得る。代替手法は、例えば、ヒトまたはげっ歯類からの一般的な免疫グロブリンの二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨまたはＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大半の研究が、現時点では重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディまたは単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【０１２７】
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体で構成されるモノクローナル抗体構築物であり、これらはＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記のような単一ドメイン抗体及び１つの上記のようなｓｃＦｖ分子で構成されるモノクローナル抗体構築物である。ここでも、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。
【０１２８】
一実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：１５７、配列番号：１６７、配列番号：１７７、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０７、配列番号：２１７、配列番号：２２７、配列番号：２３７、及び配列番号：２４７に示されるこれらの配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
別の実施形態では、第１結合ドメインは、配列番号：２８７、配列番号：２９７、配列番号：３０７、配列番号：３１７、配列番号：３２７、配列番号：３３７、配列番号：３４７、及び配列番号：３５７に示されるこれらの配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
本発明の抗体構築物は、標的分子のＣＤＨ３及びＣＤ３に結合するその機能に加えて、さらなる機能を有することも想定される。この形式では、抗体構築物は、ＣＤＨ３への結合により標的細胞を標的とすること、ＣＤ３結合により細胞傷害性Ｔ細胞活性を媒介すること、ならびにさらなる機能、例えば、ＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の動員により抗体依存性細胞傷害を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメイン、標識（蛍光など）、治療剤、例えば、毒素もしくは放射性核種など、及び／または血清半減期を増強する手段などを提供することによる三機能性または多機能性抗体構築物である。
【０１３１】
本発明の抗体構築物の血清半減期を延長する手段の例としては、ペプチド、タンパク質またはタンパク質のドメインが挙げられて、これらは抗体構築物に融合される、またはさもなければ抗体構築物に結合される。ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインの群は、ヒト体内において好ましい薬物動態プロファイルで、その他のタンパク質、例えば、血清アルブミンなどに結合するペプチドを含む（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照のこと）。これらの一例は、配列番号：４３７に示される。このような半減期延長（ＨＬＥ）ペプチドの代替構想は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照のこと）に結合するペプチドを含み、これもまた本発明の構築物のいくつかに使用される。タンパク質のより大きなドメインまたは完全タンパク質を結合する構想は、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのバリアントもしくは変異体（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６を参照のこと）またはそれらのドメインの融合に加えて、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメイン）及びそのバリアントの融合を含む。このようなＦｃドメインのバリアントは、二量体もしくは多量体の所望の対合を可能にするために、Ｆｃ受容体結合（例えば、Ｆｃγ受容体）を無効にするために、またはその他の理由のために最適化／改変されてよい。上記のＨＬＥ分子が１本の単一ポリペプチド鎖のみで構成される場合、それらは（ｉ）２つの別個の発現系を必要としない、及び（ｉｉ）「ダミー鎖」の不在ゆえに、高純度を有して単離され得るという利点を有する。ヒト体内で小タンパク質化合物の半減期を延長するための、当該技術分野において既知のさらなる構想は、これらの化合物、例えば、本発明の抗体構築物などのＰＥＧ化である。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明による二重特異性抗体構築物は、例えば、構築物の血清半減期を延長することを目的として、融合パートナー（タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドなど）と連結されてよい（例えば、ペプチド結合により）。これらの融合パートナーは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」もしくは「ＨＡＬＢ」）に加えてその配列バリアント、ＨＳＡに結合するペプチド、ＦｃＲｎに結合するペプチド（「ＦｃＲｎ  ＢＰ」）、または（抗体由来）Ｆｃ領域を含む構築物から選択され得る。これらの融合パートナーの例示的な配列は、配列番号：４０６〜４２１及び４３７〜４４４に示されている。一般に、融合パートナーは、直接（例えば、ペプチド結合により）またはペプチドリンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、「ｎ」は２以上の整数、例えば、２もしくは３もしくは４である）などのいずれかにより、本発明による二重特異性抗体構築物のＮ末端にまたはＣ末端に連結されてよい。好適なペプチドリンカーは、配列番号：３９２〜４００に示されている。
【０１３３】
ＣＤＨ３−１３（配列番号：１７８に示される二重特異性分子の全長配列）と称される抗体構築物は、構築物の血清半減期を延長することを目的として、融合タンパク質または融合ペプチドの選択物（例えば、配列番号：４３７〜４４４を参照のこと）とインフレームで連結された。これらの融合構築物の各々の配列は、配列番号：３７９〜３８９に示されている。「裸」二重特異性抗体構築物に対するこれらの融合パートナーの配列も同様に、本明細書に開示される抗体構築物のうち任意のその他に連結されてよい（Ｃ末端またはＮ末端に、それが対応し、ＣＤＨ３−１３のために示されている方法で）。
【０１３４】
したがって、本発明の二重特異性抗体構築物は、配列番号：４３７に示されるポリペプチドまたはアルブミン、好ましくはヒトアルブミンまたはそのバリアント（改善された特性、例えば、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性及び延長された血漿半減期などを有する）、最も好ましくは配列番号：４４３または４４４に示されるアルブミンをさらに含むことが想定される。これらの部分は、好ましくは二重特異性抗体構築物のＣ末端にインフレームで融合される。
【０１３５】
実施例１５は、アルブミンと本発明の二重特異性抗体構築物とのＣ末端融合が伴う予想外の利点をさらに示す。ヒト及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３ε鎖に特異的な結合ドメインを含む、これらの二重特異性Ｔ細胞誘導分子については、エピトープが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：２、４、６、または８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部であり、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含み、これらの分子が、非常に高濃度で使用される場合に、標的細胞の不在下であってもＴ細胞傷害を示したことが観察された。このような高濃度問題は、特定の投与経路に、または特定の標的設定及び所要の化合物濃度と組み合わされて関連する場合がある。Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合するこのような第２結合ドメインの好ましい例は、本明細書で以下に記載され、配列番号：４４５〜５３７に示される。血清アルブミンがこのような二重特異性構築物のＣ末端に融合される場合、Ｔ細胞傷害が回避され、これは図１３を参照のこと。理論に束縛されることを意図するものではないが、高濃度のＴ細胞誘導二重特異性抗体構築物の存在下における、かつ標的細胞の不在下におけるＴ細胞の活性化は、ＣＤ３結合ドメインによる抗体構築物の二量体化または多量体化により説明されてよい。このような二量体化または多量体化は、そのＴ細胞誘導作用機序についての抗体構築物の特徴を維持しながら、アルブミンまたはそのバリアントと抗体構築物のＣ末端との融合により立体的に損なわれる。
【０１３６】
したがって、本発明による好ましい抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順で、
・配列番号：１５７、配列番号：１６７、配列番号：１７７、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０７、配列番号：２１７、配列番号：２２７、配列番号：２３７、配列番号：２４７、配列番号：２８７、配列番号：２９７、配列番号：３０７、配列番号：３１７、配列番号：３２７、配列番号：３３７、配列番号：３４７、及び配列番号：３５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１結合ドメイン；
・配列番号：３９２〜４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号：４５３、配列番号：４６２、配列番号：４７１、配列番号：４８０、配列番号：４８９、配列番号：４９８、配列番号：５０７、配列番号：５１６、配列番号：５２５、配列番号：５３４、及び配列番号：５３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２結合ドメイン；ならびに
・場合により配列番号：３９２〜４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号：４３７、４４３及び４４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含む。
【０１３７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体構築物は、（２つの結合ドメインに加えて）２つのポリペプチド単量体を含む第３ドメインを含み、各々がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、この２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）は、ペプチドリンカーにより互いに融合される。好ましくは、この第３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順で：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３ドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号：４１４〜４２１に示されている。このポリペプチド単量体の各々は、配列番号：４０６〜４１３からなる群より選択される、またはこれらの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を好ましくは有する。別の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物の第１及び第２結合ドメインは、例えば、配列番号：３９２〜４００のいずれか１つからなる群より、好ましくは配列番号：３９２、３９３、３９５、３９６、３９７、３９９、及び４００のいずれか１つからなる群より選択されるペプチドリンカーにより第３ドメインに融合される。
【０１３８】
本発明に従って、「ヒンジ」はＩｇＧヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔ番号付けを使用した類推により同定され得る。Ｋａｂａｔの２２３〜２４３位を参照のこと。上記に従って、「ヒンジ」の最小要件は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＤ２３１〜Ｐ２４３のＩｇＧ１配列ストレッチに対応するアミノ酸残基である。ＣＨ２及びＣＨ３という用語は、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３を指す。これらの領域も同様に、Ｋａｂａｔ番号付けを使用した類推により同定され得る。ＣＨ２についてはＫａｂａｔの２４４〜３６０位及びＣＨ３についてはＫａｂａｔの３６１〜４７８位を参照のこと。免疫グロブリン間において、それらのＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２Ｆｃ領域、ＩｇＧ３Ｆｃ領域、ＩｇＧ４Ｆｃ領域、ＩｇＭ  Ｆｃ領域、ＩｇＡ  Ｆｃ領域、ＩｇＤ  Ｆｃ領域及びＩｇＥ  Ｆｃ領域の点でいくつかの変化があると理解される（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７（１９９３）を参照のこと）。Ｆｃ単量体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ単量体はまた、これらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ末端を含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃ単量体はＪ鎖を含んでよい。ＩｇＧについては、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３ならびに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ部分の境界は変化する場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、ＩｇＧ４については、それぞれ残基Ｄ２３１（ヒンジドメインの）〜Ｐ４７６（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）、またはＤ２３１〜Ｌ４７６を含むと定義され得、この場合、番号付けはＫａｂａｔに従う。
【０１３９】
したがって、本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順で、
（ａ）第１結合ドメイン；
（ｂ）配列番号：３９３、３９９及び４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２結合ドメイン；
（ｄ）配列番号：３９２、３９３、３９５、３９６、３９７、３９９、及び４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３ドメイン（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）の第１ポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号：４０２、４０３、４０４及び４０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
（ｇ）第３ドメイン（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）の第２ポリペプチド単量体
を含んでよい。
【０１４０】
本発明の抗体構築物が、Ｎ末端からＣ末端の順で、
（ａ）配列番号：１５７、配列番号：１６７、配列番号：１７７、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０７、配列番号：２１７、配列番号：２２７、配列番号：２３７、配列番号：２４７、配列番号：２８７、配列番号：２９７、配列番号：３０７、配列番号：３１７、配列番号：３２７、配列番号：３３７、配列番号：３４７、及び配列番号：３５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１結合ドメイン；
（ｂ）配列番号：３９３、３９９及び４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）配列番号：４５３、配列番号：４６２、配列番号：４７１、配列番号：４８０、配列番号：４８９、配列番号：４９８、配列番号：５０７、配列番号：５１６、配列番号：５２５、配列番号：５３４、及び配列番号：５３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２結合ドメイン；
（ｄ）配列番号：３９２、３９３、３９５、３９６、３９７、３９９、及び４００からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
（ｅ）配列番号：４１４〜４２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３ドメイン
を含むことも好ましい。
【０１４１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号：４２２、配列番号：４２３、配列番号：４２４、配列番号：４２５、配列番号：４２６、配列番号：４２７、配列番号：４２８、配列番号：４２９、配列番号：４３０、配列番号：４３１、配列番号：４３２、配列番号：４３３、配列番号：４３４、及び配列番号：４３５に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含むか、またはそれからなる。
【０１４２】
上記のＦｃ構築物のうち１つ及びマウス異種移植モデルにおけるその抗腫瘍活性を示す実施例１５も参照する。
【０１４３】
抗体構築物の共有結合修飾もまた本発明の範囲内に含まれて、一般に翻訳後に行われるが、必ずしもそうとは限らない。例えば、抗体構築物のいくつかの種類の共有結合修飾は、抗体構築物の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。
【０１４４】
最も一般的にはシステイニル残基を、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチルの誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０１４５】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカーボネートとの反応により誘導化されるが、その理由とは、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり；反応は、好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応物が挙げられる。
【０１４６】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ性条件で反応が実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジン基に加えてアルギニンイプシロンアミノ基と反応してよい。
【０１４７】
チロシル残基の特異的修飾は、スペクトル標識をチロシル残基中に導入することに特に関心を払いながら、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により行われてよい。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、好適な上記ラジオイムノアッセイのクロラミンＴ法に使用するための標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化される。
【０１４８】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）（式中、Ｒ及びＲ’は、場合により異なるアルキル基である）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
【０１４９】
二官能性剤を用いた誘導体化は、様々な方法に使用するために、本発明の抗体構築物を非水溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、反応性非水溶性マトリックス、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号明細書；第３，６９１，０１６号明細書；第４，１９５，１２８号明細書；第４，２４７，６４２号明細書；第４，２２９，５３７号明細書；及び第４，３３０，４４０号明細書に記載されているような臭化シアン活性化炭水化物及び反応基質などが、タンパク質固定化に用いられる。
【０１５０】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基へと頻繁に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内である。
【０１５１】
その他の修飾としては、プロリン及びリジンの水酸化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１５２】
本発明の範囲内に含まれる抗体構築物の別の種類の共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンを変化させることを含む。当該技術分野において既知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で考察される特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系は以下で考察される。
【０１５３】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用されてもよい。
【０１５４】
抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が（Ｎ結合型グリコシル化部位の）上記トリペプチド配列のうち１つ以上を含有するようにその配列を変化させることにより簡便に行われてよい。この変化はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位の）開始配列に対する１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によって行われてもよい。容易にするために、抗体構築物のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化により、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンを生成するように、あらかじめ選択された塩基でポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより好ましくは変化される。
【０１５５】
抗体構築物上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとタンパク質との化学的カップリングまたは酵素カップリングによるものである。これらの手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためにグリコシル化能を有する宿主細胞において、タンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング手法に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの基などの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの基などの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０に、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１５６】
出発抗体構築物上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に行われてよい。化学的脱グリコシル化は、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理により、ポリペプチドは無傷のままで、結合する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、ほとんどまたは全ての糖の切断がもたらされる。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２により、及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により説明されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載されるように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるように、化合物ツニカマイシンの使用により防止されてよい。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。
【０１５７】
抗体構築物のその他の修飾もまた、本明細書で想定されている。例えば、抗体構築物の別の種類の共有結合修飾は、抗体構築物を様々な非タンパク質性ポリマーに、例えば、限定されないが、様々なポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーなどを含むポリマーに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；第４，４９６，６８９号明細書；第４，３０１，１４４号明細書；第４，６７０，４１７号明細書；第４，７９１，１９２号明細書または第４，１７９，３３７号明細書に記載されている手法で連結することを含む。加えて、当該技術分野において既知のように、アミノ酸置換は、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促進するために、抗体構築物内の様々な位置で行われてよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームにより抗体構築物に結合されてよい。タンパク質を標識する様々な方法が当該技術分野において既知であり、本発明を実施する上で使用され得る。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、それらが検出されることになるアッセイに応じて様々なクラスに分類され、例として、以下：
ａ）放射性同位体または重同位体であってよい同位体標識、例えば、放射性同位体または放射性核種など（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）光学色素（発色団、リン光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）、例えば、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及び「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなど
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）
を含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性により検出される場合のある任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ならびにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む、好適な光学色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０１６０】
好適なタンパク質性蛍光標識としては、レニラ、プチロサルカス、またはエクオレア種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びレニラ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；第５，４１８，１５５号明細書；第５，６８３，８８８号明細書；第５，７４１，６６８号明細書；第５，７７７，０７９号明細書；第５，８０４，３８７号明細書；第５，８７４，３０４号明細書；第５，８７６，９９５号明細書；第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定されて（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以降、様々な異なるタンパク質で見られている。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチド及びそれらの誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を作製するのに好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されていて、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。ロイシンジッパーに融合された異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。１つの手法では、ロイシンジッパーペプチドに融合されたＣＤＨ３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞で発現されて、形成する可溶性オリゴマーＣＤＨ３抗体断片または誘導体が培養上清から回収される。
【０１６２】
本発明の抗体構築物はまた、さらなるドメインを含んでよく、これらは例えば、分子の単離に役立つか、または分子の適合された薬物動態プロファイルに関連する。抗体構築物の単離に役立つドメインは、ペプチドモチーフまたは二次導入部分から選択されてよく、これらは単離方法、例えば、単離カラムで捕捉され得る。このようなさらなるドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びそのバリアント（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）ならびにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲを特徴とする、本明細書に開示される全ての抗体構築物がＨｉｓタグドメインを含むことが好ましく、これは分子のアミノ酸配列中において連続したＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン、配列番号：４３６を参照のこと）の反復として一般に知られている。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に位置してよく、好ましくはＣ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）は、本発明による抗体構築物のＣ末端にペプチド結合により連結される。
【０１６３】
本発明の抗体構築物の第１結合ドメインは、標的細胞の表面上におけるヒトＣＤＨ３に結合する。ヒトＣＤＨ３のアミノ酸配列は、配列番号：１で表される。「表面上」という用語は、本発明との関連において、結合ドメインがＣＤＨ３細胞外ドメイン（ＣＤＨ３  ＥＣＤ）内に含まれるエピトープまたはエピトープクラスターに特異的に結合することを意味すると理解される。したがって、本発明による第１結合ドメインは、天然発現細胞もしくは細胞株により、かつ／またはＣＤＨ３で形質転換もしくは（安定に／一過性に）トランスフェクトされた細胞もしくは細胞株により発現される場合、ＣＤＨ３に好ましくは結合する。好ましい実施形態では、第１結合ドメインはまた、ＣＤＨ３がインビトロ結合アッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャードなどで「標的」または「リガンド」分子として使用される場合に、ＣＤＨ３に結合する。「標的細胞」は、その表面上でＣＤＨ３を発現する任意の原核細胞または真核細胞であり得；好ましくは標的細胞は、ヒトまたは動物の身体の一部である細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞などである。
【０１６４】
「ＣＤＨ３  ＥＣＤ」という用語は、ＣＤＨ３の膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に含まないＣＤＨ３の形態を指す。本発明のＣＤＨ３ポリペプチドについて同定される膜貫通ドメインは、その種類の疎水性ドメインを同定するための、当該技術分野において日常的に用いられている基準に従って同定されることが、当業者には理解されるだろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変動する場合があるが、本明細書で特に言及されるドメインのいずれかの末端では約５アミノ酸以下である可能性が最も高い。好ましいヒトＣＤＨ３  ＥＣＤは、配列番号：３に示されている。
【０１６５】
ヒトＣＤＨ３に対する第１結合ドメインの親和性は、好ましくは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ、最も好ましくは≦０．０５ｎＭである。親和性は、例えば、実施例に記載されるような、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイで、またはスキャッチャードアッセイで測定され得る。親和性を決定するその他の方法は、当業者には周知である。
【０１６６】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫で中心的な役割を果たすリンパ球の一種（それ自体が白血球の一種）である。Ｔ細胞にはいくつかのサブセットが存在し、各々が異なる機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、その他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などと区別され得る。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖で構成される。Ｔ細胞の９５％では、ＴＣＲはアルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と連結する場合、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子、及び活性化または放出転写因子によって媒介される一連の生化学的事象により活性化される。
【０１６７】
ＣＤ３受容体複合体はタンパク質複合体であり、４本の鎖で構成される。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２本のＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたは略してＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含有し、これはＴＣＲのシグナル伝達能に不可欠である。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトにおいて１１番染色体上に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によりコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３結合エピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７に対応する。
【０１６８】
多重特異性、少なくとも二重特異性抗体構築物によるＴ細胞の動員による標的細胞の再指向された溶解は、細胞溶解シナプス形成ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。連結されたＴ細胞は、一連の標的細胞溶解を行うことができ、ペプチド抗原プロセシング及び提示またはクローン性Ｔ細胞分化に干渉する免疫回避機構の影響を受けない。例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照のこと。
【０１６９】
ＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物により媒介される細胞傷害は、様々な方法で測定され得る。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または未刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源のものである、またはマカクＣＤＨ３を発現する、もしくはマカクＣＤＨ３をトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もマカク起源のもの、例えば、マカクＴ細胞株など、例えば、４１１９ＬｎＰｘであるはずである。標的細胞は、ＣＤＨ３、例えば、ヒトまたはマカクＣＤＨ３（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、ＣＤＨ３、例えば、ヒトまたはマカクＣＤＨ３で安定にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。あるいは、標的細胞は、ＣＤＨ３陽性天然発現細胞株であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面上により高レベルのＣＤＨ３を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は通常、約１０：１であるが、変動し得る。ＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）で、またはＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベーション時間）で測定され得る。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害反応）の変更も可能である。細胞傷害を測定するその他の方法が当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、ＡＴＰに基づくアッセイを含み、例えば、生物発光アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。
【０１７０】
本発明のＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物により媒介される細胞傷害活性は、好ましくは細胞に基づく細胞傷害性アッセイで測定される。この活性はまた、５１クロム放出アッセイでも測定されてよい。活性はＥＣ５０値で表され、これは半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性応答を誘導する抗体構築物の濃度）に相当する。好ましくは、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、≦５０００ｐｇ／ｍｌまたは≦４０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦３０００ｐｇ／ｍｌまたは≦２０００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌまたは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦４００ｐｇ／ｍｌまたは≦３００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２０ｐｇ／ｍｌまたは≦１０ｐｇ／ｍｌ、最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。
【０１７１】
上記の所与のＥＣ５０値は、異なるアッセイで測定され得る。当業者は、ＥＣ５０値が、刺激／濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合に未刺激のＰＢＭＣと比較して、より低いと予想され得ることを認識している。さらに、ＥＣ５０値は、低標的発現ラットと比較して、標的細胞が多数の標的抗原を発現する場合に、より低いことが予想され得る。例えば、刺激／濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がエフェクター細胞として使用される場合（及びＣＨＯ細胞などのＣＤＨ３トランスフェクト細胞またはＡ４３１などのＣＤＨ３陽性天然発現細胞株のいずれかが標的細胞として使用される場合）、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ、最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される場合、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦５０００ｐｇ／ｍｌもしくは≦４０００ｐｇ／ｍｌ（特に、標的細胞がＡ４３１などのＣＤＨ３陽性天然発現細胞株である場合）、より好ましくは≦２０００ｐｇ／ｍｌ（特に、標的細胞がＣＨＯ細胞などのＣＤＨ３トランスフェクト細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌもしくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、またはそれ以下である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株がエフェクター細胞として使用され、ＣＨＯ細胞などのマカクＣＤＨ３トランスフェクト細胞株が標的細胞株として使用される場合、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦２０００ｐｇ／ｍｌまたは≦１５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌまたは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦３００ｐｇ／ｍｌまたは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌである。
【０１７２】
好ましくは、本発明のＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＣＤＨ３陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、または溶解を本質的に誘導／媒介しない。「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「溶解を本質的に媒介しない」という用語は、Ａ４３１などのＣＤＨ３陽性細胞株の溶解を１００％に設定することにより、本発明の抗体構築物が、ＣＤＨ３陰性細胞の３０％を超える溶解を誘導または媒介しない、好ましくは２０％を超えない、より好ましくは１０％を超えない、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％を超えないことを意味する。これは通常、最大５００ｎＭでの抗体構築物の濃度に適用される。当業者は、さらに手間をかけることなく細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書は、細胞溶解を測定する方法の具体的な指示について教示する。
【０１７３】
個々のＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの間の細胞傷害活性の差は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップは、例えば、分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との間の比として算出され得る。本発明のＣＤＨ３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力ギャップは、好ましくは≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２、最も好ましくは≦１である。一例として、ＣＤＨ３−１３の効力ギャップは０．５であると決定されて、ＣＤＨ３−１３×ＣＤ３−ＨＬＥ（Ｆｃ）の効力ギャップは０．９であると決定されて、ＣＤＨ３−２５の効力ギャップは０．７であると決定されて、ＣＤＨ３−２５×ＣＤ３−ＨＡＬＢの効力ギャップは、同様に０．７であると決定された。
【０１７４】
本発明の抗体構築物の第１及び／もしくは第２（または任意のさらなる）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、霊長類の哺乳類目のメンバーに対して種間特異的である。種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態によれば、第１及び／または第２結合ドメインは、それぞれヒトＣＤＨ３及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（コモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルなど）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル、ならびに非ヒトのヒト亜科を含む（が、これらに限定されない）霊長類のＣＤＨ３／ＣＤ３にも結合することになる。
【０１７５】
本発明の一態様では、第１結合ドメインは、ヒトＣＤＨ３に結合し、さらにマカクＣＤＨ３、例えば、カニクイザルのＣＤＨ３（配列番号：５）などに、より好ましくはマカクＣＤＨ３  ＥＣＤに結合する。マカクＣＤＨ３に対する第１結合ドメインの親和性は、好ましくは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ、最も好ましくは≦０．０５ｎＭまたはさらに≦０．０１ｎＭである。
【０１７６】
好ましくは、マカクＣＤＨ３対ヒトＣＤＨ３［ｍａＣＤＨ３：ｈｕＣＤＨ３］との結合についての、本発明による抗体構築物の親和性ギャップ（例えば、ＢｉａＣｏｒｅにより、またはスキャッチャード分析により決定されるようなもの、実施例を参照のこと）は、０．１〜１０、より好ましくは０．２〜５、さらにより好ましくは０．３〜２．５、さらにより好ましくは０．４〜２、最も好ましくは０．５〜１である。
【０１７７】
本発明の抗体構築物の一実施形態では、第２結合ドメインは、ヒト及びコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルのＣＤ３イプシロンに結合する。好ましくは、第２結合ドメインは、これらのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する。第２結合ドメインは、ヒト及びマカク属ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することも想定される。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。さらにより具体的には、エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む。コモンマーモセット及びワタボウシタマリンは、両方ともマーモセット科のファミリーに属する新世界霊長類である一方で、コモンリスザルは、オマキザル科のファミリーに属する新世界霊長類である。
【０１７８】
Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインが、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが、本発明の抗体構築物について特に好ましい。
【０１７９】
本発明の抗体構築物の代わりの好ましい実施形態では、Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインは、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
【０１８０】
Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３５、３９、１２５、１２９、１６１または１６５に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含むことが、本発明の抗体構築物についてさらに好ましい。
【０１８１】
Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７または１８１に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含むことが代わりに好ましい。
【０１８２】
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７または２１に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５または１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３５または３９に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：３３または３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：５３または５７に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：５１または５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：７１または７５に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：６９または７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：８９または９３に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：８７または９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１０７または１１１に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１０５または１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２５または１２９に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１２３または１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１４３または１４７に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１４１または１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１６１または１６５に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１５９または１６３に示されるＶＨ領域；ならびに
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７９または１８３に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：１７７または１８１に示されるＶＨ領域
からなる群より選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインを特徴とする。
【０１８３】
ヒトＣＤ３に結合し、ＷＯ２００８／１１９５６７に開示されている上記の結合ドメインはまた、本配列番号：４４５〜５３７に示されている。
【０１８４】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、結合ドメイン及び特に第２結合ドメイン（Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する）は、以下の形式を有する：ＶＨ領域及びＶＬ領域の対が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順で配置される。ＶＨ領域はリンカー配列のＮ末端に配置され、ＶＬ領域はリンカー配列のＣ末端に配置されることが好ましい。
【０１８５】
本発明の上記抗体構築物の好ましい実施形態は、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号：２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞の表面上におけるヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインを特徴とする。
【０１８６】
本発明の一実施形態では、抗体構築物は、配列番号：１５８、配列番号：１６８、配列番号：１７８、配列番号：１８８、配列番号：１９８、配列番号：２０８、配列番号：２１８、配列番号：２２８、配列番号：２３８、及び配列番号：２４８に示されるこれらの配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１８７】
本発明の別の実施形態では、抗体構築物は、配列番号：３７９、配列番号：３８０、配列番号：３８１、配列番号：３８２、配列番号：３８３、配列番号：３８４、配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７、配列番号：３８８及び配列番号：３８９に示されるこれらの配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１８８】
本発明の別の実施形態では、抗体構築物は、配列番号：２８８、配列番号：２９８、配列番号：３０８、配列番号：３１８、配列番号：３２８、配列番号：３３８、配列番号：３４８、及び配列番号：３５８に示されるこれらの配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１８９】
本明細書に記載される抗体構築物のアミノ酸配列修飾もまた、想定される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体構築物のアミノ酸配列バリアントは、抗体構築物の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製される。下記アミノ酸配列修飾の全てが、非修飾親分子の所望の生物活性（ＣＤＨ３及びＣＤ３に結合すること）を依然として保持する抗体構築物をもたらすはずである。
【０１９０】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、その当該技術分野において認識されている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）；ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群より選択されるアミノ酸などを典型的には指すが、修飾、合成、または希少アミノ酸が、所望の場合に使用されてよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するものにグループ化され得る。
【０１９１】
アミノ酸修飾としては、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが、最終構築物に到達するように行われるが、ただし、最終構築物が所望の特徴を有することとする。アミノ酸変化、例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化などはまた、抗体構築物の翻訳後プロセスを変化させる場合がある。
【０１９２】
例えば、１、２、３、４、５、または６アミノ酸がＣＤＲの各々において挿入または欠失されてよい（当然のことながら、それらの長さに依存する）が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５アミノ酸がＦＲの各々において挿入または欠失されてよい。好ましくは、アミノ酸配列挿入としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ及び／またはカルボキシル末端融合、加えて単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。本発明の抗体構築物の挿入バリアントとしては、酵素の抗体構築物のＮ末端もしくはＣ末端への融合体または抗体構築物の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合体が挙げられる。
【０１９３】
置換変異誘発の最大の関心対象となる部位としては、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲ変化もまた想定される。置換は、好ましくは本明細書に記載されるような保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸がＣＤＲにおいて置換されてよいが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５アミノ酸がフレームワーク領域（ＦＲ）において置換されてよい。例えば、ＣＤＲ配列が６アミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうち１つ、２つまたは３つが置換されると想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５アミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つが置換されると想定される。
【０１９４】
変異誘発に好ましい位置である抗体構築物の特定の残基または領域の同定に有用な方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）においてＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓによって記載されているような「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれるものである。本方法では、抗体構築物内の標的残基の残基または標的残基の群が同定され（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなど）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられて、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を及ぼす。
【０１９５】
次いで、置換に対して機能感受性を実証するこれらのアミノ酸位置は、置換の部位において、または置換の部位に、さらなるまたはその他のバリアントを導入することにより改良される。したがって、アミノ酸配列変化を導入する部位または領域はあらかじめ決定されるが、変異の性質それ自体は、あらかじめ決定しておく必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を分析または最適化するため、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が、標的コドンまたは領域において実施されてよく、発現される抗体構築物バリアントが、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡにおいて所定の部位に置換変異を作製するための技術が周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発である。変異体のスクリーニングは、ＣＤＨ３またはＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
【０１９６】
一般に、アミノ酸が、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲのうち１つ以上または全てで置換される場合、その時に得られる「置換された」配列は、「元の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、より好ましくは６５％、さらにより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より特に好ましくは８０％同一であることが好ましい。このことは、配列がどの程度「置換された」配列と同一であるのかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５アミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１つの置換されたアミノ酸を有するために、好ましくはその置換された配列と８０％同一である。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換された配列と異なる程度の同一性を有してよく、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％を有してよいが、ＣＤＲＬ３は９０％を有してよい。
【０１９７】
好ましい置換（または置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、任意の置換（非保存的置換または以下の表１に列挙される「例示的な置換」のうち１つ以上を含む）が、抗体構築物が、第１結合ドメインによりに結合し、第２結合ドメインによりＣＤ３もしくはＣＤ３イプシロンに結合するその能力を保持する限り、かつ／またはそのＣＤＲが、その時に置換される配列と同一性を有する（「元の」のＣＤＲ配列と少なくとも６０％、より好ましくは６５％、さらにより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より特に好ましくは８０％同一である）限り、想定されている。
【０１９８】
保存的置換を、「好ましい置換」という表題で表１に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合には、表１で「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスに関連して以下にさらに記載されるようなより実質的な変化が導入されてよく、産物が所望の特徴についてスクリーニングされてよい。
【０１９９】
（表１）アミノ酸置換
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【０２００】
本発明の抗体構築物の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域中におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することにより行われる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づく群：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅに分類される。
【０２０１】
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とすることになる。抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般にセリンで置換されて、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止する場合がある。逆に、システイン結合（複数可）は、その安定性を改善するために抗体に付加されてよい（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０２０２】
アミノ酸配列について、配列同一性及び／または配列類似性は、当該技術分野において既知の標準的技術、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，サイエンスドライブ５７５、マディソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって説明されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを含むが、これらに限定されない技術を使用することにより、好ましくはデフォルト設定を使用して、または検査により決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢにより算出される：ミスマッチペナルティ＝１；ギャップペナルティ＝１；ギャップサイズペナルティ＝０．３３；及び結合ペナルティ＝３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
【０２０３】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを使用して関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の単純化を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３によって説明される方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップ加重＝３．００、デフォルトギャップ長加重＝０．１０、及び加重末端ギャップを含む。
【０２０４】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、次の値で設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ  Ｓパラメータ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的な値であり、対象の配列が検索されている特定のデータベースにおける特定の配列及び組成物の組成に応じてプログラム自体によって確立されるが；値は、感受性を高めるように調整されてよい。
【０２０５】
さらに有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されているようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；ギャップなしの伸長を開始するための２ヒット法、ギャップ長ｋに１０＋ｋのコストを負荷；１６に設定されたＸｕ、ならびにデータベース検索段階で４０に、及びアルゴリズムの出力段階で６７に設定されたＸｇを使用する。ギャップアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによって開始される。
【０２０６】
一般に、個々のバリアントＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には、相同性または同一性を少なくとも６５％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％に好ましくは増加させる。類似の手法で、本明細書で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗体構築物のコード配列中におけるヌクレオチド残基と同一の、候補配列中におけるヌクレオチド残基のパーセンテージと定義される。特定の方法は、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションをそれぞれ１及び０．１２５に設定する。
【０２０７】
一般に、個々のバリアントＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、相同性または同一性を少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％に好ましくは増加させる。したがって、「バリアントＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有している。
【０２０８】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究規模の条件下で、例えば、標準的な２ステップ精製プロセスにおいて高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体構築物の単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
【０２０９】
同様に、二量体抗体構築物アイソフォームの収量、したがって、抗体構築物の単量体パーセンテージ（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体抗体及び二量体抗体構築物の生産性ならびに算出された単量体パーセンテージは、例えば、ローラーボトル中における標準化された研究規模の産生からの培養上清のＳＥＣ精製ステップで得られ得る。一実施形態では、抗体構築物の単量体パーセンテージは、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。
【０２１０】
さらなる実施形態では、本発明による抗体構築物のヒト生殖細胞系に対する同一性のパーセンテージは、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。実施例７を参照のこと。ヒト抗体生殖細胞系遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が、処置中に患者内で薬物に対する免疫応答を誘発するリスクを減少させるための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（２００５）３−１０）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分の減少により、処置中に患者内で抗薬物抗体を誘導するリスクの低下がもたらされることを実証している。膨大な数の臨床的に評価された抗体薬物及び各々の免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化が、未変化の非ヒトＶ領域を持つ抗体（平均で患者の２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性を低下させる（平均で患者の５．１％）という傾向が示される。したがって、ヒト配列に対するより高度な同一性が、抗体構築物の形態のＶ領域に基づくタンパク質治療薬には望ましい。生殖細胞系同一性を決定するこの目的のために、ＶＬのＶ領域は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを使用してヒト生殖細胞系Ｖセグメント及びＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）のアミノ酸配列とアラインメントされ得、アミノ酸配列は、同一アミノ酸残基をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることによりパーセントで算出され得る。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても、ＶＨ  ＣＤＲ３が、その高い多様性及び既存のヒト生殖細胞系ＶＨ  ＣＤＲ３アラインメントパートナーの欠如により除外される場合がある点を除いて、同じであり得る。次いで、組換え技術が、ヒト抗体生殖細胞系遺伝子に対する配列同一性を増加させるために使用され得る。
【０２１１】
一実施形態では、抗体構築物は、≦５の好ましい血漿安定性（血漿の不在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比）を有し、より好ましくは≦４または≦３．５、さらにより好ましくは≦３または≦２．５、最も好ましくは≦２または≦１．５または≦１である。抗体構築物の血漿安定性は、ヒト血漿中における３７℃で２４時間の構築物インキュベーション、続いて５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおけるＥＣ５０の決定により試験され得る。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒトＣＤＨ３をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１として選択され得る。この目的に使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングシリンジにより収集された健康なドナーの血液から得られる。細胞成分を遠心分離によって除去し、上方の血漿相を回収してその後にプールする。対照として、抗体構築物を細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ−１６４０培地中で希釈する。血漿安定性を、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比として算出する。実施例１１を参照のこと。
【０２１２】
本発明の抗体構築物の単量体から二量体への転化率は、低いことが好ましい。転化率は、異なる条件下で測定されて、高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより分析され得る。例えば、抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内において７日間３７℃で、例えば、１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度で実施され得る。これらの条件下では、本発明の抗体構築物は、≦５％の二量体パーセンテージを示すことが好ましく、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％である。実施例９を参照のこと。
【０２１３】
本発明の二重特異性抗体構築物は、多数回の凍結／解凍サイクル後に非常に低い二量体転化率で存在することも好ましい。例えば、抗体構築物単量体は、一般的な製剤緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整され、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で３０分間の凍結、続いて３０分間室温で解凍）、続いて高性能ＳＥＣを行って、初期単量体抗体構築物のパーセンテージを決定したが、これは二量体抗体構築物に転化された。好ましくは、二重特異性抗体構築物の二量体パーセンテージは、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％であり、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％である。
【０２１４】
本発明の二重特異性抗体構築物は、好ましくは５０℃超または５２℃超の凝集温度で良好な熱安定性を示し、より好ましくは５４℃超または５５℃超、さらにより好ましくは５６℃超または５７℃超、最も好ましくは５８℃超または５９℃超である。熱安定性パラメータは、以下の通りに抗体凝集温度に関して決定され得る：濃度２５０μｇ／ｍｌでの抗体溶液を、単回使用キュベット中に移し、動的光散乱デバイス中に置く。試料を０．５℃／分の加熱速度で４０℃〜７０℃に加熱し、測定された半径を一定して取得する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を使用して、抗体の凝集温度を算出する。実施例１０を参照のこと。
【０２１５】
あるいは、温度融解曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定し、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定し得る。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ（ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国）ＶＰ−ＤＳＣデバイスを使用して実施される。抗体構築物を含有する試料のエネルギー取込みを、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較して２０℃〜９０℃まで記録する。抗体構築物を、例えば、ＳＥＣランニング緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整する。各々の融解曲線を記録するために、全体的な試料温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔで、試料及び製剤緩衝液参照のエネルギー取込みを記録する。試料から参照を差し引いたエネルギー取込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差を、各々の温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取込みが最初に最大となる温度として定義される。
【０２１６】
本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤＨ３パラログのＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ４、及びＣＤＨ５と交差反応しない（すなわち、結合しない）ことが、さらに想定される。さらに、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、マカク／ｃｙｎｏＣＤＨ３パラログのＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ４、及びＣＤＨ５と交差反応しない（すなわち、結合しない）ことが想定される。実施例６を参照のこと。
【０２１７】
本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体はまた、≦０．１の、最も好ましくは≦０．０５の濁度（精製単量体抗体を２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、一晩インキュベートした後にＯＤ３４０により測定される場合）を有することも想定される。実施例１２を参照のこと。
【０２１８】
さらなる実施形態では、本発明による抗体構築物は、酸性ｐＨで安定である。抗体構築物が、非生理学的ｐＨ、例えば、ｐＨ５．５など（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを実行するのに必要なｐＨ）でより大きな耐性を示すほど、負荷タンパク質の総量に対してイオン交換カラムから溶出される抗体構築物の回収率が高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、陽イオン）交換カラムからの抗体構築物の回収率は、好ましくは≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、最も好ましくは≧９０％である。
【０２１９】
本発明の二重特異性抗体構築物が、治療効力または抗腫瘍活性を示すことが、さらに想定される。このことは、例えば、実施例１４に開示される試験において評価され得る。
【０２２０】
当業者は、この試験の特定のパラメータ、例えば、注射される腫瘍細胞の数、注射部位、移植されるヒトＴ細胞の数、投与される二重特異性抗体構築物の量、及びタイムラインなどを変更または適合させながら、依然として有意義かつ再現可能な結果に到達する方法を知っている。好ましくは、腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０もしくは≦６０、より好ましくは≦５０もしくは≦４０、さらにより好ましくは≦３０もしくは≦２０、最も好ましくは≦１０もしくは≦５またはさらに≦２．５である。
【０２２１】
本発明はさらに、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
【０２２２】
ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３以上のヌクレオチド単量体で構成されるバイオポリマーである。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、直鎖状及び環状であり得る。それは、好ましくは宿主細胞中に含まれるベクター中に好ましくは含まれる。宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを用いた形質転換またはトランスフェクション後に、抗体構築物を発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、制御配列に機能的に連結される。
【０２２３】
遺伝子コードは、遺伝物質（核酸）内にコードされた情報をタンパク質に翻訳するルールのセットである。生細胞における生物学的解読は、ｔＲＮＡ分子を使用してアミノ酸を運搬し、一度にｍＲＮＡの３つのヌクレオチドを読み取り、ｍＲＮＡによって指定された順でアミノ酸を連結するリボソームにより達成される。コードは、次にタンパク質合成中に付加されることになるアミノ酸を、コドンと呼ばれるこれらの３ヌクレオチドの配列がどのように指定するかを定義する。いくつか例外はあるが、核酸配列中の３ヌクレオチドコドンは、単一のアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子が正確に同じコードでコードされるため、この特定のコードは、多くの場合にカノニカルまたは標準的な遺伝子コードと称される。遺伝子コードは所与のコード領域のタンパク質配列を決定する一方で、その他のゲノム領域は、これらのタンパク質が産生される時と場所に影響を与え得る。
【０２２４】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
【０２２５】
ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞中に移送するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに制限されない。一般に、遺伝子操作ベクターは、複製起点、マルチクローニングサイト及び選択可能マーカーを含む。ベクター自体は一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」として機能するより大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えてさらなる特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを包含する場合がある。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞中で導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に制御配列を有する。
【０２２６】
「制御配列」という用語は、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０２２７】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に機能的に連結されているか；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合にコード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していて、分泌リーダーの場合には連続し、かつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要がない。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより行われる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
【０２２８】
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞中に意図的に導入する方法である。この用語は、ほとんどの場合に真核細胞における非ウイルス法に使用される。形質導入は、多くの場合に核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介移入について説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、典型的には細胞膜において一過性の孔または「穴」の開口を伴い、物質の取込みを可能にする。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションにより、細胞スクイージングにより、またはカチオン性脂質と物質を混合してリポソームを作製し、これを細胞膜と融合させて、それらのカーゴを内部に蓄積させることにより実施され得る。
【０２２９】
「形質転換」という用語は、細菌への、また植物細胞を含む非動物真核細胞への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス移入について説明するために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜（複数可）によるその周囲からの直接取込み、それに続く外因性遺伝物質（核酸分子）の組込みに起因する細菌または非動物真核細胞の遺伝子変化である。形質転換は、人工的手段により行われ得る。形質転換を行うために、細胞または細菌は、コンピテントな状態にならなければならず、これは飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限的応答として生じる場合がある。
【０２３０】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子もしくはベクターで形質転換されたまたは本発明のポリヌクレオチド／核酸分子もしくはベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、本発明の抗体構築物をコードするベクター、外因性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエント；ならびに／または抗体構築物自体のレシピエントであり得る、またはレシピエントであった任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことを意図する。細胞への各々の物質導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実施される。「宿主細胞」という用語はまた、単一細胞の子孫または潜在的子孫を含むことも意図する。後続世代では、自然発生的、偶発的、もしくは意図的な変異のいずれかにより、または環境的影響により、一定の変化が生じる場合があるため、このような子孫は、実際には、親細胞と（形態学において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において）完全に同一ではない場合もあるが、依然として本明細書で使用される場合、この用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞としては、原核細胞または真核細胞が挙げられて、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに動物細胞、例えば、昆虫細胞及び哺乳動物細胞など、例えば、マウス、ラット、マカクまたはヒトも挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
本発明の抗体構築物は、細菌で産生され得る。発現後、本発明の抗体構築物は、可溶性画分において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離されて、例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び／またはサイズ排除により精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現される抗体を精製するためのプロセスと同様に実施され得る。
【０２３３】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌または酵母などは、本発明の抗体構築物に好適なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、多数のその他の属、種、及び株が一般的に利用可能であり、本明細書において有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス属宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６０４５）、Ｋ．ウィッカーハミー（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、Ｋ．ワルティー（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウイア属（ＥＰ４０２２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラ・クラシア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス属、例えば、シュワニオミセス オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）など；ならびに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、及びアスペルギルス属宿主など、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などである。
【０２３４】
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアントならびに宿主、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などからの対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、キンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１バリアント及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に従って本明細書において、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用されてよい。
【０２３５】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、アラビドプシス属及びタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用され得る。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に既知である。例えば、Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６−７８，Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９０−７９４，Ａｒｔｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：７４５−７５０，及びＦｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：９７９−９８６を参照のこと。
【０２３６】
しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２３７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物の産生方法を提供し、本方法は、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、及び産生された抗体構築物を培養物から回収することを含む。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、「培養すること」という用語は、培地中における好適な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖及び／または繁殖を指す。「発現」という用語は、本発明の抗体構築物の産生に関与する任意のステップを含み、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、これらに限定されない。
【０２３９】
組換え技術を使用する場合、抗体構築物は、ペリプラズム空間において細胞内で産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体構築物が細胞内で産生される場合、第１ステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子状残屑が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順について説明している。簡潔に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間超、解凍する。細胞残屑は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記ステップのいずれかに含まれてよく、抗生物質が外来汚染物質の成長を防止するために含まれてよい。
【０２４０】
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収または精製され得る。タンパク質精製のその他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などもまた、回収される抗体に応じて利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が、精製に有用である。
【０２４１】
アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドが結合されるマトリックスは、ほとんどの場合にアガロースであるが、その他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば、コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどは、アガロースを用いて達成され得る場合よりも、より速い流速及びより短い処理時間を可能にする。
【０２４２】
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。
【０２４３】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の抗体構築物（複数可）を、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１種以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤及び／またはアジュバントの好適な製剤をさらに含む。組成物の許容される構成要素は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって好ましくは非毒性である。本発明の医薬組成物としては、液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意かつ全ての水性及び非水溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョンなど、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒ならびにコーティングを意味し、これらは医薬投与に、特に非経口投与に適合する。医薬組成物におけるこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野において周知であり、このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化され得る。
【０２４５】
特定の実施形態は、本発明の抗体構築物ならびに本節及び本明細書内の他の箇所に例示的に記載されているものなどのさらなる１種以上の賦形剤を含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、この点に関して多様な目的、例えば、製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的特性を調整すること、例えば、粘度の調整など、ならびにまたは本発明のプロセスを調整し、有効性を改善する、かつもしくはこのような製剤及びプロセスを、例えば、製造中、輸送中、保存中、使用前の調製中、投与中、及びその後に生じるストレスによる分解及び損傷に対して安定化させることなどのために本発明で使用され得る。
【０２４６】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透を変更、維持または保持することを目的として製剤材料を含有してよい（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８’’  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような実施形態では、好適な製剤材料としては、
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／またはヒスチジンを含む、アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、プロリン、２−フェニルアラニンなど
・抗菌剤、例えば、抗細菌剤及び抗真菌剤など
・抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど；
・組成物を生理学的ｐＨで、またはそれよりもわずかに低いｐＨで、典型的には約５〜約８または９のｐＨ範囲内に維持するために使用される緩衝液、緩衝系及び緩衝剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩またはその他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩であり；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液；
・非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油など、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルなど；
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む水性担体；
・生分解性ポリマー、例えば、ポリエステルなど；
・増量剤、例えば、マンニトールまたはグリシンなど；
・キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）
・充填剤；
・単糖類；二糖類；及びその他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトールまたはキシリトールであってよい；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質性担体、例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは好ましくはヒト起源の免疫グロブリンなど；
・着色及び香味剤；
・イオウ含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど
・希釈剤；
・乳化剤；
・親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど）
・塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど；
・防腐剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなど；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素である）；
・金属錯体、例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体など；
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロース、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコールなど；
・懸濁化剤；
・界面活性剤または湿潤剤、例えば、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など；界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤及び／または好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであってよく；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ５０００である；
・安定性増強剤、例えば、スクロースまたはソルビトールなど；
・張度増強剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む非経口送達ビヒクル；
・水分及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）を含む静脈内送達ビヒクル
が挙げられてよいが、これらに限定されない。
【０２４７】
医薬組成物の異なる構成要素（例えば、上に列挙されたもの）は異なる効果を有し得ることが当業者には明らかであり、例えば、アミノ酸は緩衝液、安定剤及び／または抗酸化剤として機能し得；マンニトールは、増量剤及び／または張度増強剤として機能し得；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／または張度増強剤として機能し得るなどである。
【０２４８】
本発明の組成物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、組成物の使用目的に応じて、さらに生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。このような薬剤は、胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物及び／または当該技術分野において既知の薬剤、例えば、サイトカインなどである場合がある。本発明の抗体構築物が共同療法で、すなわち、別の抗がん薬と組み合わせて適用されることも想定される。
【０２４９】
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、目的の投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて、当業者により決定されることになる。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。特定の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼす場合がある。特定の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであってよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってよく、非経口投与用の組成物において一般的なその他の材料を補充する可能性がある。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる例示的なビヒクルである。特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤用薬剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存のために調製されてよい。さらに、特定の実施形態では、本発明の抗体構築物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化されてよい。
【０２５０】
非経口投与が検討される場合、本発明に使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の本発明の抗体構築物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水溶液の形態で提供されてよい。非経口注射に特に好適なビヒクルは滅菌蒸留水であり、その中で本発明の抗体構築物が、滅菌等張液として製剤化されて、適切に保持される。特定の実施形態では、調製は、所望の分子と、デポー注射により送達され得る生成物の制御放出または持続放出を提供する場合のある薬剤、例えば、注射用ミクロスフェア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどとの製剤化を含み得る。特定の実施形態では、循環中の期間の持続を促進する効果を有するヒアルロン酸もまた使用されてよい。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスが、所望の抗体構築物を導入するために使用されてよい。
【０２５１】
持続送達または制御送達／放出製剤中に本発明の抗体構築物を含む製剤を含む、さらなる医薬組成物が当業者には明らかだろう。様々なその他の持続送達または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性微粒子または多孔質ビーズ及びデポー注射などを製剤化するための技術もまた、当業者には既知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書を参照されたい。これは医薬組成物送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出について記載している。持続放出調製物は、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態で半透性ポリマーマトリックスを含んでよい。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（上記のＬａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号明細書）を挙げてよい。持続放出組成物はまた、当該技術分野において既知のいくつかの方法のうちいずれかにより調製され得るリポソームを含んでよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号明細書；第ＥＰ０８８，０４６号明細書及び第ＥＰ１４３，９４９号明細書を参照のこと。
【０２５２】
抗体構築物はまた、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）で、またはマクロエマルジョンで、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に封入されてよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２５３】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜に通して濾過することにより行われ得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかに実施されてよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存され得る。非経口組成物は、一般に滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により刺し通し可能な栓を有する静脈内輸液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０２５４】
本発明の別の態様は、本発明の製剤の自己緩衝抗体構築物を含み、これは国際特許出願第ＷＯ０６１３８１８１（Ａ２）号明細書（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているような、医薬組成物として使用され得る。タンパク質安定化ならびにこの点に関して有用な製剤材料及び方法に関する様々な説明、例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，」Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ」ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２），及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）などが利用可能である。特に本発明に従う自己緩衝タンパク質製剤のための賦形剤及びそのプロセスに関する部分、特に獣医学的用途及び／またはヒト医学的用途のタンパク質医薬製品及びプロセスに関して参照のこと。
【０２５５】
塩は、本発明の特定の実施形態に従って、例えば、製剤のイオン強度及び／もしくは等張性を調整するために、ならびに／または本発明に従う組成物のタンパク質もしくはその他の成分の溶解度及び／もしくは物理的安定性を改善するために使用されてよい。周知の通り、イオンは、タンパク質の表面上で荷電残基に結合することにより、ならびにタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽して、それらの静電相互作用、引力相互作用、及び反発相互作用の強度を減少させることによりタンパク質の天然状態を安定化し得る。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化し得る。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用もまた、分子間静電相互作用を減少させて、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防止または減少させることができる。
【０２５６】
イオン種は、タンパク質に対するそれらの効果の点で有意に異なる。イオン及びタンパク質に対するそれらの効果に関する多数のカテゴリー別順位が開発されていて、本発明に従って医薬組成物を製剤化する際に使用され得る。一例としてはホフマイスター系列であり、これはイオン性及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対するそれらの効果により順位付けする。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、溶液からタンパク質を沈殿させる（「塩析」）ために高濃度（例えば、＞１モルの硫酸アンモニウム）で一般的に使用される。カオトロープは、タンパク質を変性かつ／または可溶化させる（「塩溶」）ために一般的に使用される。「塩溶」及び「塩析」するためのイオンの相対的有効性は、ホフマイスター系列におけるそれらの位置を規定する。
【０２５７】
遊離アミノ酸は、本発明の様々な実施形態に従って本発明の製剤の抗体構築物に、増量剤、安定剤、及び抗酸化剤、加えてその他の標準的な用途として使用され得る。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用され得る。グリシンは、正確なケーキ構造及び特性を確保するために凍結乾燥において有用である。アルギニンは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方で、タンパク質凝集を阻害するために有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
【０２５８】
ポリオールとしては、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトールならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコールなど、ならびに本明細書における考察の目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質が挙げられる。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護するために、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方で有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の張度を調整するのに有用である。ポリオールの中でも、本発明の選択実施形態において有用なものはマンニトールであり、これは凍結乾燥製剤においてケーキの構造安定性を確保するために一般的に使用される。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保する。マンニトールは、一般にリオプロテクタント、例えば、スクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、好ましい薬剤の中でも、張度を調節するための薬剤、及び輸送中の凍結解凍ストレスまたは製造プロセス中のバルクの調製から保護するための安定剤として好ましい薬剤である。還元糖（遊離アルデヒドまたはケトン基を含有する）、例えば、グルコース及びラクトースなどは、表面のリジン残基及びアルギニン残基を糖化し得る。したがって、それらは、一般に本発明に従った使用に好ましいポリオールの中には入らない。加えて、このような反応種を形成する糖、例えばスクロースなども、酸性条件下でフルクトース及びグルコースへと加水分解され、結果として糖化を引き起こし、この点に関して本発明の好ましいポリオールの中には入らない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化するために、及びクライオプロテクタントとして有用であり、この点に関して本発明で使用され得る。
【０２５９】
本発明の製剤の抗体構築物に関する実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面上での吸着ならびに気−液、固−液、及び液−液界面における変性及び結果として生じる凝集の影響を受けやすい場合がある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例して増減する。これらの有害な相互作用は、一般にタンパク質濃度に反比例して増減し、典型的には物理的攪拌、例えば、製品の輸送及び取り扱い中に生じた攪拌などにより悪化する。界面活性剤は、表面吸着を防止する、最小限に抑える、または減少させるために日常的に使用される。この点に関して本発明で有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般的に使用される。この点に関して界面活性剤の使用は、タンパク質特異的であり、その理由とは、任意の所与の界面活性剤が、典型的にはあるタンパク質を安定化し、その他のタンパク質を不安定化することになるためである。
【０２６０】
ポリソルベートは酸化分解の影響を受けやすく、供給される場合、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な過酸化物量を多くの場合に含有する。結果として、ポリソルベートは慎重に使用されるべきであり、使用される場合、それらの最低有効濃度で用いられるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきであるという原則を例示している。
【０２６１】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、１種以上の抗酸化剤をさらに含む。タンパク質の有害な酸化は、医薬製剤において周囲酸素及び周囲温度の適切なレベルを維持することにより、かつ光への曝露を回避することにより、ある程度まで防止され得る。抗酸化賦形剤も同様に、タンパク質の酸化分解を防止するために使用され得る。この点に関して有用な抗酸化剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。本発明に従う治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の有効期限全体を通してそれらの活性を維持する。ＥＤＴＡが、この点に関して本発明に従った好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷し得る。例えば、特にグルタチオンなどの還元剤は、分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それら自体が製剤中のタンパク質を損傷する可能性を排除または十分に減少させるように選択される。
【０２６２】
本発明に従う製剤は、タンパク質補因子であり、かつタンパク質配位錯体を形成するのに必要な、例えば、特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要な亜鉛などの金属イオンを含んでよい。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスも触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、イソアスパラギン酸へのアスパラギン酸の異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加し得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化し得、これはＭｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２ならびにＦｅ＋２により不安定化され得、その凝集はＡｌ＋３イオンにより増加され得る。
【０２６３】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、１種以上の防腐剤をさらに含む。防腐剤は、同じ容器からの２回以上の抽出を伴う、複数回用量の非経口製剤を開発する場合に必要である。それらの主な機能は、微生物の成長を阻害し、医薬品の有効期限または使用期間全体を通して製品の無菌性を確保することである。一般的に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。防腐剤は、小分子非経口剤と共に使用されるという長い歴史を有するが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほぼ必ずタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これは複数回用量のタンパク質製剤におけるそれらの使用を制限する主な要因となっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬物は、単回使用のみのために製剤化されてきた。しかしながら、複数回用量製剤が可能な場合、それらは、患者の利便性、及び市場性の増加を可能にするというさらなる利点を有する。好例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例であり、保存製剤の開発により、より利便性の高い複数回使用注射ペンの提案が商品化をもたらした。ｈＧＨの保存製剤を含有する少なくとも４本のこのようなペンデバイスは、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）がフェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールを用いて製剤化される。いくつかの態様は、保存剤形の製剤化及び開発中に考慮される必要がある。医薬品中の有効防腐剤濃度が最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なうことなく、抗菌有効性を付与する濃度範囲を有する剤形の所与の防腐剤を試験することを必要とする。
【０２６４】
予想される可能性があるように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、防腐剤なしで凍結乾燥されて、使用時に防腐剤を含有する希釈剤で再構成され得る。これにより、防腐剤がタンパク質と接触している時間が短縮されて、付随する安定性リスクを有意に最小限に抑える。液体製剤では、防腐剤の有効性及び安定性が、製品の有効期限（約１８〜２４か月）全体にわたって維持されるべきである。留意すべき重要な点は、防腐剤の有効性が、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証されるべきであるということである。
【０２６５】
本明細書に開示される抗体構築物はまた、免疫リポソームとして製剤化されてよい。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質及び／または界面活性剤で構成される小さな小胞である。リポソームの成分は通常、生体膜の脂質配置に類似した二層形式で配置される。抗体構築物を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び第４，５４４，５４５号明細書；ならびにＷＯ９７／３８７３１に記載されるようなものなどの、当該技術分野において既知の方法により調製される。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、規定の孔サイズのフィルターを通して押し出される。本発明の抗体構築物のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているようなリポソームと複合化され得る。化学療法剤は、場合によりリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２６６】
医薬組成物は、製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として減菌バイアル中に保存されてよい。このような製剤は、すぐに使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存されてよい。
【０２６７】
本明細書で定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例に、ＷＯ９９／５４４４０に、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）によって記載されるように、細胞傷害性アッセイにより決定され得る。「効力」または「インビボ効力」は、本明細書で使用される場合、例えば、標準化されたＮＣＩ応答基準を使用した、本発明の医薬組成物による療法に対する応答を指す。本発明の医薬組成物を使用する療法の成功またはインビボ効力は、その意図される目的に対する組成物の有効性、すなわち、その所望の効果、すなわち、病的細胞、例えば、腫瘍細胞の枯渇を引き起こす組成物の能力を指す。インビボ効力は、各々の疾患単位について確立された標準的方法によってモニタリングされてよく、この方法としては白血球計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及びその他の確立された標準的方法が使用されてよい。さらに、コンピュータ支援断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ基準に基づく応答評価のために［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ，Ｖｏｓｅ  Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放出断層撮影走査、白血球計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、及び様々なリンパ腫特異的臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）ならびにその他の確立された標準的方法が使用されてよい。
【０２６８】
薬物、例えば、本発明の医薬組成物などの開発における別の大きな課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、薬物候補の薬物動態プロファイル、すなわち、所与の状態を処置する特定の薬物の能力に影響を及ぼす薬物動態パラメータのプロファイルが、確立され得る。特定の疾患単位を処置する薬物の能力に影響を与える薬物の薬物動態パラメータとしては、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝及び血清結合度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬剤の効力は、上述のパラメータの各々によって影響され得る。
【０２６９】
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的プロセス、例えば、代謝、排出などにより排除される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」とは、肝臓と最初に接触する際に、すなわち、薬物が肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の性質を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び器官などのような、身体の様々な区画全体にわたる薬物の保持度ならびにこれらの区画内における薬物の分布を意味する。「血清結合度」は、血清タンパク質、例えば、アルブミンなどと相互作用及び結合し、薬物の生物活性の減少または喪失をもたらす薬物の性質を意味する。
【０２７０】
薬物動態パラメータとしては、投与される所定量の薬物に関するバイオアベイラビリティ、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発現及び／またはＣｍａｘも挙げられる。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画中における薬物の量を意味する。「遅延時間」は、薬物の投与から血液または血漿中でのその検出及び測定可能性までの間の時間遅延を意味する。「Ｔｍａｘ」は、それ以降に薬物の最大血中濃度に到達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物で得られる最大の血中濃度である。その生物学的効果に必要とされる薬物の血中濃度または組織濃度に到達するまでの時間は、全てのパラメータに影響される。種間特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメータは、上で概略を述べたような非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験で決定されてよく、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）による刊行物にも記載されている。
【０２７１】
一実施形態では、本発明は、がんの予防、処置または改善に使用するための、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を提供する。
【０２７２】
本明細書に記載される製剤は、処置などを必要とする患者において本明細書に記載されるような病理学的健康状態の処置、改善及び／または予防における医薬組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置及び予防的または防止的手段の両方を指す。処置は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、治療する、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、またはそれに影響を及ぼすための、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に対して素因を有する患者の身体、単離組織、または細胞への製剤の適用または投与を含む。
【０２７３】
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、改善を必要とする対象への本発明による抗体構築物の投与による、本明細書で指定されるような種類の（転移性）腫瘍またはがんのうち１種を有する患者の疾患状態における任意の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）を指す。このような改善はまた、患者の（転移性）腫瘍またはがんの進行の緩徐または停止として見られる場合もある。「予防」という用語は、本明細書で使用される場合、予防を必要とする対象への本発明による抗体構築物の投与による、本明細書で指定されるような種類の（転移性）腫瘍またはがんのうち１種を有する患者における発症または再発の回避を意味する。
【０２７４】
「疾患」という用語は、本明細書に記載される抗体構築物または医薬組成物を用いた処置から恩恵を受けるだろう任意の状態を指す。これは、哺乳動物を問題となっている疾患に罹患しやすくさせる病態を含む、慢性及び急性障害または疾患を含む。
【０２７５】
「新生物」は異常成長する組織であり、通常は腫瘤を形成するが、必ずしもそうとは限らない。腫瘤を形成する場合でも、新生物は一般的に「腫瘍」と称される。新生物または腫瘍は、良性、潜在性悪性（前がん）、または悪性であり得る。悪性新生物は、一般的にがんと呼ばれる。新生物は通常、周囲組織に侵襲してそれを破壊し、転移を形成する場合がある。すなわち、新生物は身体のその他の部分、組織または器官に広がる。したがって、「転移がん」という用語は、元の腫瘍の１つではなく、その他の組織または器官に転移するがんを包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明では、それらはまた、「腫瘍」または「がん」という用語により包含される。
【０２７６】
好ましい実施形態では、本発明は、がんの予防、処置または改善に使用するための、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を提供し、この場合、がんは、肺癌腫、頭頸部癌腫、原発性または二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性または二次性脳腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、膠芽腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、食道癌腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、ＳＣＬＣ（小細胞肺がん）、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮がん、移行上皮癌腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼内黒色腫、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、腎臓がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）がん、小腸のがん、胆道がん、尿道のがん、腎細胞癌腫、子宮内膜の癌腫、甲状腺がん、精巣がん、皮膚扁平上皮細胞がん、黒色腫、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、骨肉腫、中皮腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び軟部肉腫、ならびに前述のもののいずれかに由来する転移がん疾患からなる群より選択される。（転移性）がんは、好ましくはＰカドヘリン陽性またはＰカドヘリン発現がんである。
【０２７７】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、がんの予防、処置または改善に使用するための、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を提供し、この場合、がんは（転移性）扁平上皮癌腫である。
【０２７８】
本発明はまた、（転移性）腫瘍またはがんの処置または改善方法を提供し、本方法は、処置または改善を必要とする対象に、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を投与するステップを含む。
【０２７９】
好ましい実施形態では、本発明は、腫瘍またはがんの処置または改善方法を提供し、この場合、がんは、肺癌腫、頭頸部癌腫、原発性または二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性または二次性脳腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、食道癌腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、ＳＣＬＣ（小細胞肺がん）、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮がん、移行上皮癌腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼内黒色腫、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、腎臓がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）がん、小腸のがん、胆道がん、尿道のがん、腎細胞癌腫、子宮内膜の癌腫、甲状腺がん、精巣がん、皮膚扁平上皮細胞がん、黒色腫、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、骨肉腫、中皮腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び軟部肉腫、ならびに前述のもののいずれかに由来する転移がん疾患からなる群より選択され、本方法は、処置または改善を必要とする対象に、本発明の抗体構築物または本発明の方法により産生される抗体構築物を投与するステップを含む。
【０２８０】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、腫瘍もしくはがんまたは転移性腫瘍もしくはがんの処置または改善方法を提供し、この場合、がんは（転移性）扁平上皮癌腫である。
【０２８１】
「必要とする対象」または「処置を必要とする」対象という用語は、既に障害を有する対象、加えて障害が予防されるべき対象を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及びその他の哺乳動物対象を含む。
【０２８２】
本発明の抗体構築物は一般に、特定の投与経路及び投与方法のために、特定の投与量及び投与頻度のために、特定の疾患における特定の処置のために、とりわけ、バイオアベイラビリティ及び持続性の範囲で設計されることになる。組成物の材料は、投与の部位に許容される濃度で好ましくは製剤化される。
【０２８３】
したがって、製剤及び組成物は、任意の好適な投与経路による送達のために本発明に従って設計されてよい。本発明との関連において、投与経路としては、
・局所経路（皮膚上、吸入、鼻、眼、耳介／耳、膣、粘膜など）；
・経腸経路（口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸など）；及び
・非経口経路（静脈内、動脈内、骨内、筋内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内など）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８４】
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、例えば、ボーラス注射などの注射による、または持続注入などの注入による、非経口投与、例えば、皮下または静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；第４，４３９，１９６号明細書；第４，４４７，２２４号明細書；第４，４４７，２３３号明細書；第４，４８６，１９４号明細書；第４，４８７，６０３号明細書；第４，５９６，５５６号明細書；第４，７９０，８２４号明細書；第４，９４１，８８０号明細書；第５，０６４，４１３号明細書；第５，３１２，３３５号明細書；第５，３１２，３３５号明細書；第５，３８３，８５１号明細書；及び第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
【０２８５】
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を提供する。非限定的な例として、中断のないまたは実質的に中断のない、すなわち、連続的な投与は、患者体内への治療剤の流入を計量するための、患者が装着する小型ポンプシステムによって実現されてよい。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、このポンプシステムを使用することにより投与され得る。このようなポンプシステムは一般に、当該技術分野において既知であり、一般的には注入される治療剤を含有するカートリッジの定期的な交換に依存する。このようなポンプシステムのカートリッジを交換する場合、さもなければ治療剤は患者体内へと中断されることなく流入するが、一時的な中断が生じる場合がある。このような場合、カートリッジ交換前の投与フェーズ及びカートリッジ交換後の投与フェーズは、本発明の薬学的手段及び方法の意味の範囲内で、このような治療剤の１回の「中断のない投与」を共に構成すると依然として見なされる。
【０２８６】
本発明の抗体構築物の連続または中断のない投与は、流体をリザーバから送り出すための流体送出機構及び送出機構を作動させるための作動機構を含む、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内または皮下投与であってよい。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、好適な組成物を患者の体内に送達するための針またはカニューレを含んでよい。このポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは無関係に、患者の皮膚に直接固定させまたは装着させて、それによってポンプシステムと患者の皮膚との直接接触を可能にしてよい。ポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間から最大で数日間装着され得る。ポンプシステムは、少量のリザーバを有する小型サイズのものであってよい。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のリザーバ容量は、０．１〜５０ｍｌであり得る。
【０２８７】
連続投与はまた、皮膚上に装着され、間隔を空けて交換されるパッチによる経皮投与であってよい。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、第１使用済みパッチの交換が、新しい第２パッチを、例えば、第１使用済みパッチにすぐ隣に隣接する皮膚表面上に、第１使用済みパッチの除去直前で配置するのと同時に達成され得ることが有利であるために、中断のない投与に特に適していることは注目すべきである。流入中断または動力電池の停止という問題が生じない。
【０２８８】
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥材料は、投与前に適切な液体で最初に再構成される。凍結乾燥材料は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥前にタンパク質が入れられていたものと同じ製剤で再構成されてよい。
【０２８９】
本発明の組成物は、例えば、用量漸増試験によって、本明細書に記載される種間特異性を示す漸増用量の本発明の抗体構築物を非チンパンジー霊長類、例えば、マカクに投与することにより決定され得る好適な用量で対象に投与され得る。上記のように、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験において、及びヒトにおける薬物として同一形態で有利に使用され得る。投与レジメンは、主治医及び臨床的要因により決定されることになる。医療技術分野においては周知の通り、任意の１人の患者に対する投与量は、患者の身体サイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与されているその他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
【０２９０】
「有効用量」または「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患に既に罹患している患者において疾患及びその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。この使用に効果的な量または用量は、処置される状態（適応症）、送達される抗体構築物、治療内容及び目的、疾患の重症度、以前の療法、患者の病歴及び治療剤に対する応答、投与経路、サイズ（体重、体表面積もしくは器官サイズ）ならびに／または患者の状態（年齢及び全身の健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全体的な状態に依存することになる。適切な用量は、一度にまたは一連の投与によって患者に投与され得るように、かつ最適な治療効果を得るために主治医の判断により調整され得る。
【０２９１】
典型的な投与量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれを超えてもよい。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、場合により１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ〜最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０２９２】
治療有効量の本発明の抗体構築物は、疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度もしくは期間の増加または疾患の苦痛による損傷もしくは障害の予防を好ましくはもたらす。ＣＤＨ３発現腫瘍を処置するために、治療有効量の本発明の抗体構築物、例えば、抗ＣＤＨ３／抗ＣＤ３抗体構築物は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を未処置患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデルにおいて評価されてよい。
【０２９３】
医薬組成物は、単独の治療薬として、または必要に応じて抗がん療法などの追加の療法、例えば、その他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と組み合わせて投与され得る。これらの薬物は、本明細書で定義されるような本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に、または抗体構築物の投与前もしくは投与後に時間的に定義された間隔及び用量で別個に投与されてよい。
【０２９４】
「有効かつ非毒性用量」という用語は、本明細書で使用される場合、重大な毒性作用を生じることなく、または本質的に生じることなく病的細胞の枯渇、腫瘍排除、腫瘍縮小または疾患の安定化をもたらすのに十分なほど高い、本発明の抗体構築物の忍容される用量を指す。このような有効かつ非毒性用量は、例えば、当該技術分野において説明されている用量漸増試験によって決定されてよく、重篤な有害副事象を誘導する用量未満とするべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
【０２９５】
「毒性」という用語は、本明細書で使用される場合、有害事象または重篤な有害事象で現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全般的な薬物の忍容性の欠如及び／または投与後の局所的寛容の欠如を指す場合がある。毒性はまた、薬物により引き起こされる催奇形作用または発がん作用を含み得る。
【０２９６】
「安全性」、「インビボ安全性」または「忍容性」という用語は、本明細書で使用される場合、投与直後に（局所的寛容）、及びより長期の薬物適用中に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与と定義する。「安全性」、「インビボ安全性」または「忍容性」は、例えば、処置中及びフォローアップ期間中に一定間隔で評価され得る。測定としては、臨床評価、例えば、器官の徴候、及び検査異常のスクリーニングが挙げられる。臨床評価が実施され、正常所見との差がＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ標準に従って記録／コードされてよい。器官の徴候としては、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に記載されているような、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準が挙げられてよい。試験されてよい検査パラメータとしては、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査ならびにその他の体液、例えば、血清、血漿、リンパ液または脊髄液、髄液などの検査が挙げられる。したがって、安全性は、例えば、理学的検査、撮像技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いるその他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインにより、検査パラメータを測定して、有害事象を記録することにより評価され得る。例えば、本発明による使用及び方法における非チンパンジー霊長類の有害事象は、組織病理学及び／または組織化学法により検査されてよい。
【０２９７】
上記の用語はまた、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ（１９９７年７月１６日）においても言及されている。
【０２９８】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明の方法により産生される抗体構築物、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
【０２９９】
本発明との関連において、「キット」という用語は、容器、入れ物またはその他の物にまとめて梱包された２つ以上の成分であって、そのうち１つが本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクターまたは宿主細胞に対応する成分を意味する。したがって、キットは、特定の目的を達成するのに十分な製品及び／または器具のセットとして記載され得、これは単品として販売され得る。
【０３００】
キットは、投与に適切な投与量（上記を参照のこと）で本発明の抗体構築物または医薬組成物を含有する、任意の適切な形状、サイズ及び材料（好ましくは防水性、例えば、プラスチックまたはガラス）の１つ以上の入れ物（バイアル、アンプル、容器、シリンジ、ボトル、バッグなど）を含んでよい。キットは、使用説明書（例えば、リーフレットまたは取扱説明書の形態で）、本発明の抗体構築物を投与するための手段、例えば、シリンジ、ポンプ、注入器など、本発明の抗体構築物を再構成するための手段及び／または本発明の抗体構築物を希釈するための手段をさらに含有してよい。
【０３０１】
本発明はまた、単回用量投与単位のためのキットを提供する。本発明のキットはまた、乾燥／凍結乾燥抗体構築物を含む第１入れ物及び水性製剤を含む第２入れ物を含有してよい。本発明の特定の実施形態では、シングルチャンバー及びマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含有するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】ヒトＣＤＨ３の、マウスＣＤＨ３の、及び１つの例示的なキメラＣＤＨ３（ここでは「Ｄ１Ｂマウス」）の５つの細胞外ドメインＤ１〜Ｄ５に関する略図である。下には５つのドメインを再度示し、さらにそれらを各々３つのサブドメインに分割したものを示す。例示的なＦＡＣＳシグナルの解釈（実施例２の「エピトープクラスタリング」を参照のこと）を右下に示す。
【図２−１】ヒトＣＤＨ３及びマウスＣＤＨ３の配列アラインメントならびに異なるドメイン：シグナルペプチド、プロペプチド、細胞外ドメインＤ１〜Ｄ５、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの例示的な表示を示す。５つの細胞外ドメインのマウス配列交換物をヒトＣＤＨ３骨格に導入し（実施例１を参照のこと）、次いで、キメラ構築物をエピトープクラスタリング（エピトープマッピング）に使用した（実施例２を参照のこと）。
【図２−２】ヒトＣＤＨ３及びマウスＣＤＨ３の配列アラインメントならびに異なるドメイン：シグナルペプチド、プロペプチド、細胞外ドメインＤ１〜Ｄ５、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの例示的な表示を示す。５つの細胞外ドメインのマウス配列交換物をヒトＣＤＨ３骨格に導入し（実施例１を参照のこと）、次いで、キメラ構築物をエピトープクラスタリング（エピトープマッピング）に使用した（実施例２を参照のこと）。
【図３】フローサイトメトリーによって示すような、ＣＨＯ細胞の表面上に発現したヒト及びマウスＣＤＨ３に加えて２０のキメラヒト−マウスＣＤＨ３構築物（５つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及び各ＥＣＤについて３つのサブドメイン）を示す。ＣＨＯ細胞上におけるヒト野生型ＣＤＨ３、マウス野生型ＣＤＨ３及びキメラＣＤＨ３構築物の発現を、マウス交差反応性であるモノクローナルマウスＩｇＧ１抗ヒトＣＤＨ３抗体で検証した。結合したモノクローナル抗体を、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ−ＰＥ（１：１００、５０μｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ番号１１５−１１６−０７１）で検出した。Ｄ１＊）：Ｈｕ  ＣＤＨ３  Ｄ１  ｍｕ−ＣＨＯ。
【図４Ａ】ＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングを示す。キメラＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングによって検出されるような、異なるエピトープクラスター／細胞外サブドメインに特異的な結合分子の例である。実施例２を参照のこと。図４Ａは、Ｄ１Ｂバインダーを示す。
【図４Ｂ】ＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングを示す。キメラＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングによって検出されるような、異なるエピトープクラスター／細胞外サブドメインに特異的な結合分子の例である。実施例２を参照のこと。図４Ｂは、Ｄ２Ｃバインダーを示す。
【図４Ｃ】ＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングを示す。キメラＣＤＨ３構築物のエピトープマッピングによって検出されるような、異なるエピトープクラスター／細胞外サブドメインに特異的な結合分子の例である。実施例２を参照のこと。図４Ｃは、Ｄ３Ａバインダーを示す。
【図５Ａ】示した細胞株に関する５μｇ／ｍＬの精製二重特異性抗体単量体のＦＡＣＳ結合分析を示す。実施例５も参照のこと。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体結合の検出を、二重特異性抗体のＣＤ３結合部分に特異的な自社マウス抗体で、続いてヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥで実施した。陰性対照は緩衝液のみ、続いて検出抗体であった。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性バインダー（エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ）を、ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞、ヒトＴ細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ上のヒトＣＤ３、ｃｙｎｏＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞、ｃｙｎｏＣＤ３発現Ｔ細胞株ＨＳＣ−Ｆ上のｃｙｎｏＣＤ３、ヒトＣＤＨ３陽性細胞株Ａ４３１、及びマウスＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞（陰性対照）へのそれらの結合について分析した。陰性対照を除いて、全ての場合で結合を検出した。
【図５Ｂ】示した細胞株に関する５μｇ／ｍＬの精製二重特異性抗体単量体のＦＡＣＳ結合分析を示す。実施例５も参照のこと。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体結合の検出を、二重特異性抗体のＣＤ３結合部分に特異的な自社マウス抗体で、続いてヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥで実施した。陰性対照は緩衝液のみ、続いて検出抗体であった。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性バインダー（エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ３Ａ）を、ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞、ヒトＴ細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ上のヒトＣＤ３、ｃｙｎｏＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞、ｃｙｎｏＣＤ３発現Ｔ細胞株ＨＳＣ−Ｆ上のｃｙｎｏＣＤ３、ヒトＣＤＨ３陽性細胞株Ａ４３１、及びマウスＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞（陰性対照）へのそれらの結合について分析した。陰性対照を除いて、全ての場合で結合を検出した。
【図５Ｃ】示した細胞株に関する５μｇ／ｍＬの精製二重特異性抗体単量体のＦＡＣＳ結合分析を示す。実施例５も参照のこと。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体結合の検出を、二重特異性抗体のＣＤ３結合部分に特異的な自社マウス抗体で、続いてヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥで実施した。陰性対照は緩衝液のみ、続いて検出抗体であった。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性バインダー（エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ）を、ヒトＣＤＨ３パラログのＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ４及びＣＤＨ５へのそれらの結合について分析した。パラログへの結合は検出しなかった。ｄｈｆｒ−／−ＣＨＯ細胞（陰性対照）への結合も検出しなかった。
【図５Ｄ】示した細胞株に関する５μｇ／ｍＬの精製二重特異性抗体単量体のＦＡＣＳ結合分析を示す。実施例５も参照のこと。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体結合の検出を、二重特異性抗体のＣＤ３結合部分に特異的な自社マウス抗体で、続いてヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥで実施した。陰性対照は緩衝液のみ、続いて検出抗体であった。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性バインダー（エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ３Ａ）を、ヒトＣＤＨ３パラログのＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ４及びＣＤＨ５へのそれらの結合について分析した。パラログへの結合は検出しなかった。ｄｈｆｒ−／−ＣＨＯ細胞（陰性対照）への結合も検出しなかった。
【図６】１８時間の５１クロム放出アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：刺激濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞。標的細胞：ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（図６Ａ）及びＤ３Ａ（図６Ｂ）に特異的な抗体。
【図７】１８時間の５１クロム放出アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるヒトＣＤＨ３陽性類表皮癌腫細胞株Ａ４３１に対する刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：刺激濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞。標的細胞：ヒトＡ４３１細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（図７Ａ）及びＤ３Ａ（図７Ｂ）に特異的な抗体。
【図８】４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する未刺激ヒトＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：未刺激ヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ５６−）。標的細胞：ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（図８Ａ）及びＤ３Ａ（図８Ｂ）に特異的な抗体。
【図９】４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるヒトＣＤＨ３陽性類表皮癌腫細胞株Ａ４３１に対する未刺激ヒトＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：未刺激ヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ５６−）。標的細胞：ヒトＡ４３１細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（図９Ａ）及びＤ３Ａ（図９Ｂ）に特異的な抗体。
【図１０Ａ】４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるマカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するマカクＴ細胞株の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：マカクＣＤ３陽性Ｔ細胞株ＬｎＰｘ４１１９。標的細胞：マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃに特異的な抗体。
【図１０Ｂ】４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるマカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するマカクＴ細胞株の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：マカクＣＤ３陽性Ｔ細胞株ＬｎＰｘ４１１９。標的細胞：マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ３Ａに特異的な抗体。
【図１０Ｃ】４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下におけるマカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するマカクＴ細胞株の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞：マカクＣＤ３陽性Ｔ細胞株ＬｎＰｘ４１１９。標的細胞：マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ１Ｂに特異的な抗体。
【図１１】ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（ＣＤＨ３−１３）のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を示す（実施例１４を参照のこと）。抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下においてＡ−４３１腫瘍の形成を用量依存的に予防する。測定開始時（５日目）に腫瘍体積が多いのは、大量の細胞混合物を１日目に注入したからである。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１２Ａ】ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（ＣＤＨ３−１３）のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性及び半減期延長（ＨＬＥ）抗体の抗腫瘍活性を示す（実施例１５を参照のこと）。ＨＬＥ抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下においてヒトＨＣＴ−１１６腫瘍の形成を用量依存的に予防する。図１２Ａは全体的な結果を示す。
【図１２Ｂ】ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃ（ＣＤＨ３−１３）のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性及び半減期延長（ＨＬＥ）抗体の抗腫瘍活性を示す（実施例１５を参照のこと）。ＨＬＥ抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下においてヒトＨＣＴ−１１６腫瘍の形成を用量依存的に予防する。図１２Ｂは、より高い抗体濃度（群２）について得られた結果を応答動物（７／１０）及び非応答動物（３／１０）に区別する。
【図１３】構築物のＣ末端におけるアルブミン融合の不在下（上部パネル）及び存在下（下部パネル）における、二重特異性抗体構築物を用いた標的細胞の不在下でのＴ細胞活性化を示す。
【実施例】
【０３０３】
以下の実施例は、本発明を説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０３０４】
実施例１
野生型及びキメラＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の生成
エピトープマッピングに使用するキメラ分子の構築のために、ヒトＣＤＨ３の５つの各細胞外ドメインＤｏｍ１〜Ｄｏｍ５（またはＤ１〜Ｄ５）の配列及びそれらのサブドメイン（Ａ、Ｂ及びＣ）の配列を、対応するマウス配列で置き換えた。以下の２０の分子を生成した；図１及び図２も参照のこと。
●Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ１  ｍｕ（ａａ  １０８−２１５）配列番号：１３
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ１Ａ  ｍｕ（ａａ  １０８−１４３）配列番号：１４
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ１Ｂ  ｍｕ（ａａ  １４４−１７９）配列番号：１５
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ１Ｃ  ｍｕ（ａａ  １８０−２１５）配列番号：１６
●Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ２  ｍｕ（ａａ  ２１６−３２７）配列番号：１７
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ２Ａ  ｍｕ（ａａ  ２１６−２５２）配列番号：１８
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ２Ｂ  ｍｕ（ａａ  ２５３−２９０）配列番号：１９
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ２Ｃ  ｍｕ（ａａ  ２９１−３２７）配列番号：２０
●Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ３  ｍｕ（ａａ  ３２８−４４０）配列番号：２１
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ３Ａ  ｍｕ（ａａ  ３２８−３６３）配列番号：２２
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ３Ｂ  ｍｕ（ａａ  ３６４−４０３）配列番号：２３
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ３Ｃ  ｍｕ（ａａ  ４０４−４４０）配列番号：２４
●Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ４  ｍｕ（ａａ  ４４１−５４６）配列番号：２５
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ４Ａ  ｍｕ（ａａ  ４４１−４７４）配列番号：２６
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ４Ｂ  ｍｕ（ａａ  ４７５−５１１）配列番号：２７
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ４Ｃ  ｍｕ（ａａ  ５１２−５４６）配列番号：２８
●Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ５  ｍｕ（ａａ  ５４７−６５０）配列番号：２９
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ５Ａ  ｍｕ（ａａ  ５４７−５８１）配列番号：３０
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ５Ｂ  ｍｕ（ａａ  ５８２−６１６）配列番号：３１
○Ｈｕ  ＣＤＨ３／Ｄｏｍ５Ｃ  ｍｕ（ａａ  ６１７−６５０）配列番号：３２
【０３０５】
上記のリストは、配列番号：１に示すようなヒトＣＤＨ３のアミノ酸配列内における、異なるドメイン（Ｄｏｍ１〜Ｄｏｍ５）の位置に加えて各々のサブドメインＡ〜Ｃの位置を示す。例えば、サブドメインＤ１Ａは、配列番号：１のアミノ酸１０８〜１４３位に位置している。上に列挙したその他の全てのドメインについても同様に適用される。
【０３０６】
ＣＨＯ細胞における発現のために、上記キメラ細胞外ドメインのコード配列の後にインフレームで人工Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカーのコード配列が続き、その後にヒトＥｐＣＡＭの膜貫通／細胞内ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２３５４で公開されているような配列のアミノ酸２６６〜３１４）に由来するドメインが続く。全てのキメラ構築物は、Ｎ末端シグナル配列（シグナルペプチド）及びプロペプチドを含んだ。
【０３０７】
ヒト、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）、マウス及びヒト／マウスキメラＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の生成のために、ヒトＣＤＨ３（配列番号：２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１７９３も参照のこと）、ｃｙｎｏＣＤＨ３（配列番号：６）、マウスＣＤＨ３（配列番号：１０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７８０９も参照のこと）及び２０のヒト−マウスＣＤＨ３キメラ（上記を参照のこと）の各々のコード配列を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）１４１−１５０に記載されている）と称されるプラスミドにクローニングした。マカクＣＤＨ３のコード配列を、カニクイザル脾臓ｃＤＮＡライブラリー（ＢｉｏＣｈａｉｎ）及びヒトＣＤＨ３ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１７９３）の非翻訳領域または保存配列領域にハイブリダイズするヒト配列特異的オリゴヌクレオチド
2018512860.tif 000003
を使用する標準的なクローニングによって得た。配列分析により、アカゲザルＣＤＨ３ＧｅｎＢａｎｋ配列（ＪＵ４７３８２６、ＪＵ４７３８２７）と比較して、コア細胞外ドメインのアミノ酸配列類似性が明らかとなった。全てのクローニング手順は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従って実施した。各構築物について、対応するプラスミドを、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７−５６６によって記載されているように、真核生物発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
【０３０８】
ＣＨＯ細胞上におけるＣＤＨ３（ヒト、マウス及びキメラ構築物）の発現を、マウス交差反応性であるモノクローナルマウスＩｇＧ１抗ヒトＣＤＨ３抗体を使用してＦＡＣＳアッセイで検証した。結合したモノクローナル抗体を、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ−ＰＥで検出した。陰性対照として、細胞を、第１抗体の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳでインキュベートした。試料をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図３に示す。ＣＨＯ細胞上におけるヒト及びｃｙｎｏＣＤＨ３の発現（実施例５を参照のこと）を、ＰＥ複合化Ｒ＆Ｄ８６１−Ｐで検出した。
【０３０９】
実施例２
マウスｓｃＦｖ断片のエピトープクラスタリング
ヒトもしくはマウスＣＤＨ３をトランスフェクトした細胞、またはキメラヒト／マウスＣＤＨ３分子をトランスフェクトした細胞（実施例１を参照のこと）を、ヒト／マカクＣＤＨ３に結合するｓｃＦｖを含有する粗非希釈ペリプラズム抽出物で染色した。結合したｓｃＦｖ分子を、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に５０μｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）、続いて抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ−ＰＥ（１：１００、５０μｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ番号１１５−１１６−０７１）で検出した。全ての抗体を、２％ＦＣＳを用いたＰＢＳで希釈した。陰性対照として、細胞を、ペリプラズム抽出物の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳでインキュベートした。試料をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図４に示す。
【０３１０】
具体的には、図４Ａは、ヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ１、より正確には、サブドメインＤ１Ｂを認識するバインダーを示す（各々のキメラＣＤＨ３構築物におけるＦＡＣＳシグナルの喪失）。ＣＤＨ３−６と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−４の親バインダーであることに留意されたい。ＣＤＨ３−１０と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−１、ＣＤＨ３−２及びＣＤＨ３−３の親バインダーである。図４Ｂは、ヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ２、より正確には、サブドメインＤ２Ｃを認識するバインダーを示す。ＣＤＨ３−２１と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−１１、ＣＤＨ３−１２及びＣＤＨ３−１４の親バインダーであることに留意されたい。ＣＤＨ３−２３と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−１３の親バインダーである。最後に、図４Ｃは、ヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ３、より正確には、サブドメインＤ３Ａを認識するバインダーを示す。バインダーＣＤＨ３−３２は、さらにサブドメインＤ３Ｃに結合することに留意されたい。ＣＤＨ３−３２と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−２５、ＣＤＨ３−２６及びＣＤＨ３−２７の親バインダーである。ＣＤＨ３−３３と称されるバインダーは、ＣＤＨ３−２４の親バインダーである。「親バインダー」という用語は、本文脈中において、最適化したバインダーを生成する、または得るためにさらに開発したバインダーを意味する。
【０３１１】
バインダーＣＤＨ３−１１、ＣＤＨ３−１２、ＣＤＨ３−１３及びＣＤＨ３−１４に対して同様にエピトープクラスタリング分析を行ったところ、それらは、ヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ２、より正確には、サブドメインＤ２Ｃを認識することが示された（データは示さず）。同じ分析を、バインダーＣＤＨ３−２４、ＣＤＨ３−２５、ＣＤＨ３−２６及びＣＤＨ３−２７を用いてさらに実施した。これらのバインダーは、ヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ３、より正確には、サブドメインＤ３Ａを認識した（データは示さず）。
【０３１２】
実施例３
ヒト及びカニクイザルＣＤＨ３に対する抗体親和性のＢｉａｃｏｒｅに基づく決定
Ｂｉａｃｏｒｅ分析実験を、ヒトアルブミン（ＨＡＬＢ）との組換えＣＤＨ３（それぞれヒト及びｃｙｎｏＣＤＨ３）融合タンパク質を使用して実施し、本発明の抗体のＣＤＨ３標的結合を決定した。
【０３１３】
詳細には、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造業者の説明書に従って酢酸緩衝液ｐＨ４．５を使用し、各組換え抗原に関しておよそ６００〜８００ＲＵで固定化した。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体試料を、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で希釈して、５つの濃度：５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１３ｎＭで負荷した。流速を３分間３０μｌ／分にして、次いで、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液を８分〜２０分間、再度３０μｌ／ｍｌの流速で適用した。チップの再生を、１０ｍＭグリシン１０ｍＭ  ＮａＣｌのｐＨ１．５溶液を使用して実施した。データセットを、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを使用して分析した。概して、２つの独立した実験を実施した。
【０３１４】
本発明によるＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、１桁のナノモル濃度範囲でヒトＣＤＨ３に対して高親和性を示した。マカクＣＤＨ３への結合は均衡したが、これも類似した範囲で親和性を示した。親和性値に加えて、算出した親和性ギャップを表２に示す。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３−×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、
・３１．８±１．９ｎＭのＫＤ（ｈｕ）、４０．９±３．８９ｎＭのＫＤ（ｃｙｎｏ）及び１．２９の親和性ギャップ、ならびに
・１２．９５±０．５ｎＭのＫＤ（ｈｕ）、１２．３５±０．３５ｎＭのＫＤ（ｃｙｎｏ）及び０．９５の親和性ギャップをそれぞれ有することが示された。
【０３１５】
（表２）Ｂｉａｃｏｒｅ分析により決定したヒト及びマカクＣＤＨ３に対するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性、ならびに算出した種間親和性ギャップ
2018512860.tif 000004
【０３１６】
実施例４
標的抗原陽性細胞上におけるヒト及びマカクＣＤＨ３に対するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体親和性のスキャッチャードに基づく分析ならびに種間親和性ギャップの決定
ヒトまたはマカクＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性もまた、ヒトＣＤＨ３とマカクＣＤＨ３との間の潜在的な親和性ギャップを測定する最も信頼できる方法としてスキャッチャード分析を用いて決定した。スキャッチャード分析では、飽和結合実験を、一価検出システムを使用して実施し、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体と各々の細胞株との一価結合を正確に決定する。
【０３１７】
２×１０４細胞の各々の細胞株（組換えヒトＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株、組換えマカクＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株）を、各ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の、１０〜２０ｎＭで開始する５０μｌの三重希釈系列（１：２で１２の希釈物）と共に（飽和に到達するまで）各々インキュベートし、続いて４℃の攪拌下において１６時間インキュベートして、残留物洗浄ステップを１回行った。次いで、細胞をさらに１時間、３０μｌのＣＤ３×ＡＬＥＸＡ４８８複合体溶液と共にインキュベートした。１回の洗浄ステップ後、細胞を、３．５％ホルムアルデヒドを含有する１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、さらに１５分間インキュベートして遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ装置及びＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。データを２つの独立した実験セットから生成し、各々３回反復した。各々のスキャッチャード分析値を算出して、最大結合（Ｂｍａｘ）を外挿した。半最大結合でのＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の濃度を、各々のＫＤを反映して決定した。３回反復した測定の値を双曲線として、及びＳ字曲線としてプロットし、最小結合から最適結合までの適切な濃度範囲を実証した。
【０３１８】
表３に示した値を、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体ごとの２つの独立した実験から得た。細胞に基づくスキャッチャード分析では、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤＨ３に対する親和性がナノモル濃度からサブナノモル濃度であり、およそ１の小さなｃｙｎｏ／ヒト種間ＣＤＨ３親和性ギャップを提示することを確認した。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、
・０．３７±０．１１ｎＭの細胞に基づく親和性（ｈｕ）、０．３５±０．０８ｎＭの細胞に基づく親和性（ｃｙｎｏ）及び０．９５の親和性ギャップ、ならびに
・０．３２±０．００３ｎＭの細胞に基づく親和性（ｈｕ）、０．５±０．０９ｎＭの細胞に基づく親和性（ｃｙｎｏ）及び１．５６の親和性ギャップをそれぞれ
有することが示された。
【０３１９】
（表３）細胞に基づくスキャッチャード分析により決定したＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）と、算出した親和性ギャップ  ＫＤマカクＣＤＨ３／ＫＤヒトＣＤＨ３。抗体を２つの独立した実験で測定し、各々３回反復した。
2018512860.tif 000005
【０３２０】
実施例５
二重特異性結合及び種間交差反応
ヒトＣＤＨ３及びＣＤ３への結合ならびにｃｙｎｏＣＤＨ３及びＣＤ３への結合を確認するために、二重特異性抗体を、
・ヒト及びｃｙｎｏＣＤＨ３のそれぞれをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、
・ヒトＣＤＨ３陽性類表皮癌腫細胞株Ａ４３１、
・ＣＤ３発現ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）、ならびに
・カニクイザルＣＤ３発現Ｔ細胞株ＨＳＣ−Ｆ
を使用してフローサイトメトリーにより試験した。さらに、マウスＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。
【０３２１】
フローサイトメトリーについては、２００，０００細胞の各々の細胞株を氷上で３０分間、５０μｌの精製二重特異性抗体と共に５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。細胞を２回ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で洗浄し、構築物の結合を、ＣＤ３結合部分に特異的な自社マウス抗体で検出した。洗浄後、結合したマウス抗体をヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥで検出した。試料をフローサイトメトリーにより測定した。
【０３２２】
結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤＨ３で、及びｃｙｎｏＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色し、それらはまた、ヒトＣＤＨ３陽性類表皮癌腫細胞株Ａ４３１（天然発現）に加えてヒト及びｃｙｎｏＴ細胞発現ＣＤ３も染色した。さらに、陰性対照細胞（マウスＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ）は染色しなかった。
【０３２３】
実施例６
ヒト及びマカクパラログに対する結合の不在の確認
ヒト及びマカクＣＤＨ３パラログ（ＣＤＨ１＝Ｅ−カドヘリン、ＣＤＨ２＝Ｎ−カドヘリン、ＣＤＨ４＝Ｒ−カドヘリン、及びＣＤＨ５＝ＶＥ−カドヘリン）を、ｄｈｆｒ−／−ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。タンパク質発現を、各々のパラログに特異的な抗体を用いてＦＡＣＳ分析で確認した。抗体は、Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ１８３８１（ＣＤＨ１用）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２−３２５９−４１（ＣＤＨ２用）、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓポリクローナルＡＦ２２１７（ＣＤＨ４用）及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号５５５６６１（ＣＤＨ５用）であった。
【０３２４】
本実施例で使用したパラログの配列を、配列表（配列番号：４１〜４４）に同定する。それらはまた、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にも見出され得る。
ＮＭ＿００４３６０［ヒトＣＤＨ１］
ＮＭ＿００１７９２［ヒトＣＤＨ２］
ＮＭ＿００１７９４［ヒトＣＤＨ４］
ＮＭ＿００１７９５［ヒトＣＤＨ５］
【０３２５】
フローサイトメトリーアッセイを実施例５に記載の通りに実施した。結果を図５Ｃ及び図５Ｄに示す。分析では、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体には、試験したヒトＣＤＨ３パラログのいずれとも交差反応するものはないことを確認した。
【０３２６】
本発明の抗体が、マカクＣＤＨ３パラログのＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ４、及びＣＤＨ５と交差反応しないことをさらに検証した（データは示さず）。ＣＨＯ細胞上におけるマカクパラログ発現を、ヒトパラログの上記のような同じ抗体で検証した。本実施例で使用したマカクパラログの配列を、配列表（配列番号４５〜４８）に同定する。それらはまた、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にも見出され得る。
ＸＭ＿００２８０２５１６［マカクＣＤＨ１］
ＪＵ３２１８８３［マカクＣＤＨ２］
ＸＭ＿００２８０２５１１［マカクＣＤＨ５］
【０３２７】
加えて、マカクＣＤＨ４配列を、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒから入手して（ＥＮＳＭＭＵＴ００００００１７２５２）、ヒトＣＤＨ４シグナルペプチド（アミノ酸１〜１９）とＮ末端においてインフレームで融合した。
【０３２８】
実施例７：
ヒト生殖細胞系との同一性
ヒト抗体生殖細胞系遺伝子に対する抗体配列の同一性／類似性を分析するために、本発明のＣＤＨ３バインダーを以下の通りにアラインメントした：全てのＣＤＲを含む完全ＶＬをヒト抗体生殖細胞系遺伝子（Ｖｂａｓｅ）に対してアラインメントし；ＣＤＲ１及び２を含むが、ＣＤＲ３は除く完全ＶＨをヒト抗体生殖細胞系遺伝子（Ｖｂａｓｅ）に対してアラインメントした。さらなる詳細については、本出願の明細書中に見出すことができる。結果を以下の表４に示す。
【０３２９】
（表４）ヒト生殖細胞系に対するＶＨ及びＶＬの同一性
2018512860.tif 000006
【０３３０】
実施例８
細胞傷害活性
ＣＤＨ３発現標的細胞に対するエフェクターＴ細胞の再指向における、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の効力を５つのインビトロ細胞傷害性アッセイで分析した：
・ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する刺激ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の再指向における、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の効力を、１８時間の５１クロム放出アッセイで測定した。結果は、図６を参照のこと。
・ＣＤＨ３陽性ヒト癌腫細胞株Ａ４３１に対する刺激ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の再指向における、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の効力を、１８時間の５１クロム放出アッセイで測定した。結果は、図７を参照のこと。
・ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する未刺激ヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞の再指向における、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した。結果は、図８を参照のこと。
・ＣＤＨ３陽性ヒト癌腫細胞株Ａ４３１に対する未刺激ヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞の再指向における、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した。結果は、図９を参照のこと。
・交差反応性ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体が、マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対してマカクＴ細胞を再指向させることができることを確認するために、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイを、エフェクターＴ細胞としてマカクＴ細胞株を用いて実施した。結果は、図１０を参照のこと。
【０３３１】
実施例８．１
刺激ヒトＴ細胞を用いたクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮した刺激Ｔ細胞を以下に記載するように得た。ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、クレムスミュンスター）を、市販の抗ＣＤ３特異的抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）を用いて１μｇ／ｍｌの最終濃度において１時間３７℃でコーティングした。非結合タンパク質を、ＰＢＳを用いた１回の洗浄ステップにより除去した。３〜５×１０７ヒトＰＢＭＣを、安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ−２  ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０でプレコートしたペトリ皿に添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を収集し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、細胞を上記と同じ細胞培養培地中で再度１日培養した。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、製造業者のプロトコールに従ってＤｙｎａｌ−Ｂｅａｄｓを使用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の枯渇により濃縮した。
【０３３２】
ＣｙｎｏＣＤＨ３またはヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒを用いて、５０％ＦＣＳを含む最終体積１００μｌのＲＰＭＩ中において６０分間３７℃で標識した。その後、標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、細胞傷害性アッセイに使用した。アッセイを、９６ウェルプレート中で総体積２００μｌの補充ＲＰＭＩ中において１０：１のＥ：Ｔ比で実施した。開始濃度０．０１〜１μｇ／ｍｌの精製二重特異性抗体及びその３倍希釈物を使用した。アッセイのインキュベーション時間は１８時間であった。細胞傷害性を、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）及び自然溶解（エフェクター細胞を含まない）の差と比較して、上清中で放出したクロムの相対値として決定した。全ての測定を４回反復して実施した。上清中におけるクロム活性の測定を、Ｗｉｚａｒｄ３インチガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ）で実施した。結果の分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ５（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施した。シグモイド用量反応曲線から分析プログラムにより算出したＥＣ５０値を、細胞傷害活性の比較に使用した。
【０３３３】
実施例８．２
ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する刺激ヒトエフェクターＴ細胞の再指向に関する効力
本発明によるＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を、標的細胞としてヒトＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、及びエフェクター細胞として刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析した。実験を実施例８．１に記載の通りに実施した。
【０３３４】
結果を図６及び表５に示す。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して、１桁のピコモル濃度範囲まで低下しても強力な細胞傷害活性を示した。特許請求される抗体は、ヒトＣＤＨ３の２９１〜３６３位に対応するエピトープクラスターに特異的であり、強力な二重特異性抗体媒介性細胞傷害活性を支持する良好なエピトープ活性関係を提示する。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、それぞれ３．６ｐＭ及び８．９ｐＭのＥＣ５０を有することが示された。
【０３３５】
（表５）標的細胞としてヒトＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、及びエフェクター細胞として刺激ヒトＣＤ８Ｔ細胞を使用して、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析したＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］
2018512860.tif 000007
【０３３６】
実施例８．３
ＣＤＨ３陽性ヒト癌腫株Ａ４３１に対する刺激ヒトエフェクターＴ細胞の再指向に関する効力
ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を、標的細胞の供給源としてＣＤＨ３陽性ヒト類表皮癌腫細胞株Ａ４３１、及びエフェクター細胞として刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析した。アッセイを実施例８．１に記載の通りに実施した。
【０３３７】
エフェクター細胞として刺激濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球及び標的細胞としてヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を用いた５１クロム放出アッセイの結果に一致して、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体も、天然発現標的細胞に対する細胞傷害活性が強力である（図７及び表６）。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、それぞれ１．２ｐＭ及び１６ｐＭのＥＣ５０を有することが示された。
【０３３８】
（表６）標的細胞の供給源としてＣＤＨ３陽性ヒト癌腫細胞株Ａ４３１、及びエフェクター細胞として刺激濃縮ヒトＣＤ８Ｔ細胞を用いて、１８時間の５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析したＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］
2018512860.tif 000008
【０３３９】
実施例８．４
未刺激ヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）、すなわち、輸血のために血液を収集する血液バンクの副産物からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により調製した。バフィーコートは、地域の血液バンクにより供給されて、ＰＢＭＣを血液採取と同じ日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離及びダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた広範囲な洗浄後、残留する赤血球を、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、１００μＭのＥＤＴＡ）とのインキュベーションにより、ＰＢＭＣから除去した。血小板を、１００×ｇでＰＢＭＣを遠心分離する際に上清から除去した。残留するリンパ球は、主にＢリンパ球及びＴリンパ球、ＮＫ細胞ならびに単球を包含する。ＰＢＭＣを３７℃／５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中における培養下で維持した。
【０３４０】
ＣＤ１４＋及びＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞の枯渇には、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、番号１３０−０５０−２０１）を使用し、ＮＫ細胞の枯渇には、ヒトＣＤ５６マイクロビーズ（ＭＡＣＳ、番号１３０−０５０−４０１）を使用した。ＰＢＭＣを計数し、１０分間室温において３００×ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、ＭＡＣＳ単離緩衝液［８０μＬ／１０７細胞；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号２００１２−０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、番号１０２７０−１０６）、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｅ−６５１１）］中で再懸濁した。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μＬ／１０７細胞）を添加し、１５分間４〜８℃でインキュベートした。細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（１〜２ｍＬ／１０７細胞）で洗浄した。遠心分離（上記を参照のこと）後、上清を廃棄して、細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μＬ／１０８細胞）中で再懸濁した。次いで、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０−０４２−４０１）を使用して単離した。ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を含まないＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ完全培地、すなわち、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号Ｓ０１１５）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号Ｋ０２９３）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号Ｌ１６１３）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号Ｌ０４７３）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号Ａ２２１３）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、番号ＦＧ１２１５）中において、３７℃でインキュベーター内において必要になるまで培養した。
【０３４１】
標的細胞標識化
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ｖ２２８８６）を使用して、標的細胞としてヒトＣＤＨ３またはマカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標識し、それらをエフェクター細胞と区別した。簡潔に述べると、細胞を採取してＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μＬ／１０６細胞）を含有するＰＢＳ中で１０６細胞／ｍＬに調整した。３７℃で３分間のインキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０５細胞／ｍＬに調整した。細胞の生命力を、０．５％（ｖ／ｖ）等張性ＥｏｓｉｎＧ溶液（Ｒｏｔｈ、番号４５３８０）を使用して測定した。
【０３４２】
フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイは、ＣＤＨ３二重特異性抗体の段階希釈物の存在下における、ｃｙｎｏまたはヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞の溶解を定量化するように設計した。等体積のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４＋細胞を含まないＰＢＭＣ）を混合して、Ｅ：Ｔ細胞比を１０：１とした。１６０μＬのこの懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。４０μＬのＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の段階希釈物及び陰性対照二重特異性（無関係な標的抗原を認識するＣＤ３に基づく二重特異性抗体）またはさらなる陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を添加した。二重特異性抗体媒介性細胞傷害反応は、７％ＣＯ２加湿インキュベーター中において４８時間進めた。次いで、細胞を新しい９６ウェルプレートに移して、標的細胞膜完全性の喪失を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１μｇ／ｍＬの最終濃度で添加することによりモニターした。ＰＩは、通常は生細胞から排除される膜不透過性色素であるのに対して、死細胞はそれを取込むため、蛍光放射により同定可能となる。
【０３４３】
試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ機器上でフローサイトメトリーにより測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）により分析した。標的細胞を、ＤｉＯ陽性細胞として同定した。ＰＩ陰性標的細胞を、標的生細胞に分類した。細胞傷害性のパーセンテージを、以下の式により算出した。
2018512860.tif 000009
【０３４４】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ）を使用して、細胞傷害性のパーセンテージを、対応する二重特異性抗体濃度に対してプロットした。用量反応曲線を、固定ヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価のために４つのパラメータロジスティック回帰モデルを用いて分析し、ＥＣ５０値を算出した。
【０３４５】
実施例８．５
ヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する未刺激ヒトＰＢＭＣの再指向に関する効力
ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を、標的細胞としてヒトＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、及びエフェクター細胞として未刺激ヒトＰＢＭＣを使用して、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで分析した。アッセイを上記の実施例８．４に記載の通りに実施した。
【０３４６】
エフェクター細胞として未刺激ヒトＰＢＭＣ及び標的としてヒトＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果を、図８及び表７に示す。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、それぞれ４．６ｐＭ及び５．６ｐＭのＥＣ５０を有することが示された。
【０３４７】
（表７）エフェクター細胞として未刺激ヒトＰＢＭＣ及び標的細胞としてヒトＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定したＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］
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【０３４８】
実施例８．６
ＣＤＨ３陽性ヒト癌腫株Ａ４３１に対する未刺激ヒトＰＢＭＣの再指向に関する効力
ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を、標的細胞の供給源としてＣＤＨ３陽性ヒト類表皮癌腫細胞株Ａ４３１及びエフェクター細胞として未刺激ヒトＰＢＭＣを使用して、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイでさらに分析した。アッセイを上記の実施例８．４に記載の通りに実施した。結果を図９及び表８に示す。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、それぞれ２．３ｐＭ及び３２ｐＭのＥＣ５０を有することが示された。
【０３４９】
（表８）エフェクター細胞として未刺激ヒトＰＢＭＣ及び標的細胞の供給源としてヒトＡ４３１細胞株を用いて、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定したＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］
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予想したように、ＥＣ５０値は、刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した細胞傷害性アッセイと比較して、エフェクター細胞として未刺激ＰＢＭＣを用いた細胞傷害性アッセイにおいて一般により高かった。
【０３５０】
実施例８．７
マカクＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞に対するマカクＴ細胞の再指向に関する効力
最後に、ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を、標的細胞としてマカク（ｃｙｎｏ）ＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、及びエフェクター細胞の供給源としてマカクＴ細胞株を使用して、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで分析した。マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：３２５６−６１（２０００））を、エフェクター細胞の供給源として使用した。マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞の標的細胞標識化及び細胞傷害活性のフローサイトメトリーに基づく分析を、上記の通りに実施した。
【０３５１】
結果を図１０及び表９に示す。細胞株４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞を、本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体、すなわち、ヒトＣＤＨ３の２９１〜３６３位に対応し、隣接するサブドメインＤ２Ｃ（２９１〜３２７位）及びＤ３Ａ（３２８〜３６３位）を包含しているヒトＣＤＨ３のエピトープクラスターに結合する抗体により、マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を効率的に死滅させるように誘導した。抗体は、このアッセイにおいて２桁から非常に低い４桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値を強く提示したため、これらの抗体がマカク系で非常に活性であることを裏付けた。
【０３５２】
抗ＣＤＨ３抗体の別の群をエピトープクラスタリング中に同定していて（実施例２を参照のこと）、これらはヒトＣＤＨ３の細胞外ドメインＤ１に、より具体的にはサブドメインＤ１Ｂに結合する。予想外にも、この群のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性は強力であるが、マカクＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対しては、非常に弱い細胞傷害活性を示すことを証明した（図１０Ｃ及び表９を参照のこと）。この群の抗体は、非常に高い４桁のｐｇ／ｍｌ範囲、さらに５桁のｐｇ／ｍｌ範囲のＥＣ５０値で有意に弱い効力を示した。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、それぞれ１．４ｐＭ及び４．０ｐＭのＥＣ５０を有することが示された。
【０３５３】
したがって、２９１〜３６３位に対応するＣＤＨ３のエピトープクラスターに結合する本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３抗体は、細胞外ドメインＤ１に、より具体的にはＣＤＨ３サブドメインＤ１Ｂに結合する抗体よりも、マカク系では約５〜ほぼ１０００倍も強力である。
【０３５４】
（表９）エフェクター細胞としてマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ及び標的細胞としてマカクＣＤＨ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した、２９１〜３６３位に対応するＣＤＨ３エピトープクラスターに結合するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体（列１〜８）のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］及びＣＤＨ３エピトープクラスター／サブドメインＤ１Ｂに結合するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体（列９〜１２）のＥＣ５０値［ｐｇ／ｍｌ］
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【０３５５】
実施例９
（ｉ）３回の凍結／解凍サイクル及び（ｉｉ）２５０μｇ／ｍｌでの７日間のインキュベーション後における単量体から二量体への転化
二重特異性ＣＤＨ３×ＣＤ３抗体単量体を、異なるストレス条件に曝露し、続いて高性能ＳＥＣを行って初期単量体抗体のパーセンテージを決定したが、これは抗体二量体に転化された。
【０３５６】
（ｉ）１５μｇの単量体抗体を、一般的な製剤緩衝液を用いて２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、次いで、−８０℃で３０分間凍結して、続いて３０分間室温で解凍した。３回の凍結／解凍サイクル後、二量体含有量をＨＰ−ＳＥＣにより決定した。
【０３５７】
（ｉｉ）１５μｇの単量体抗体を、一般的な製剤緩衝液を用いて２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、続いて３７℃で７日間インキュベートした。二量体含有量をＨＰ−ＳＥＣにより決定した。
【０３５８】
高分解能ＳＥＣカラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ、東京、日本）を、Ａ９０５オートサンプラーを備えたＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した。カラム平衡化及びランニング緩衝液は、ｐＨ６．６に調整した１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と２００ｍＭのＮａ２ＳＯ４からなった。抗体溶液（１５μｇタンパク質）を平衡化カラムに適用し、０．７５ｍｌ／分の流速で７ＭＰａの最大圧力で溶出を実施した。実行全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍの吸光度でモニターした。Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートで記録した２１０ｎｍシグナルのピーク積分により、分析を行った。二量体含有量を、二量体ピーク面積を単量体と二量体のピーク総面積で割ることにより算出した。
【０３５９】
結果を以下の表１０に示す。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ２Ｃに結合するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、３回の凍結／解凍サイクル後に、加えて３７℃での７日間のインキュベーション後に、≦１％の二量体パーセンテージ、より正確には０．０％の二量体パーセンテージを提示したため、これは非常に良好であると考えられる。エピトープクラスター／細胞外サブドメインＤ３ＡのＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の二量体転化率は、≦２％、より正確には０．２〜１．８％の値に到達したため、これは良好であると考えられる。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、３回の凍結／解凍サイクル後にそれぞれ１．１及び０．８４の二量体パーセンテージ、ならびに７日間のインキュベーション後に０．０の二量体パーセンテージ（両方ともＨＬＥ構築物）を有することが示された。
【０３６０】
（表１０）高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定した単量体対二量体ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体のパーセンテージ
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【０３６１】
実施例１０
熱安定性
抗体凝集温度を以下の通りに決定した：４０μｌの２５０μｇ／ｍｌでの抗体溶液を単回使用キュベットに移して、Ｗｙａｔｔ動的光散乱デバイスＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）内に置いた。試料を０．５℃／分の加熱速度で４０℃〜７０℃に加熱し、測定された半径を一定して取得した。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を、ＤＬＳデバイスとともに供給されたソフトウェアパッケージにより使用して、抗体の凝集温度を算出した。
【０３６２】
試験した全ての本発明のＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体は、以下の表１１に示すように、５４℃超の凝集温度を有する非常に良好な熱安定性を示した。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢを別個のアッセイで測定し、５６．３℃の熱安定性を有することが示された。
【０３６３】
（表１１）ＤＬＳ（動的光散乱）により決定した二重特異性抗体の熱安定性
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【０３６４】
実施例１１
ヒト血漿における２４時間のインキュベーション後の安定性
精製二重特異性抗体を、１：５の比でヒト血漿プール中において、３７℃で２４時間〜９６時間、２〜２０μｇ／ｍｌの最終濃度でインキュベートした。血漿インキュベーション後、抗体を、５１クロム放出アッセイにおいて刺激ヒトＴ細胞及びＣＤＨ３トランスフェクトＣＨＯ細胞と、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの開始濃度で、１０：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を用いて比較した（刺激ヒトＴ細胞を用いた実施例８．１のクロム放出アッセイに記載したアッセイ）。インキュベートしていない、新鮮な解凍二重特異性抗体を対照として含んだ。結果を表１２に示す。試験した全ての抗体が、≦４の良好な血漿安定性（ＥＣ５０血漿／ＥＣ５０対照）を有して、Ｄ３Ａに結合する抗体の群は、さらに≦３の血漿安定性を有した。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、
・４．４ｐＭの血漿を伴うＥＣ５０、３．６ｐＭの血漿を伴わないＥＣ５０、及び１．２の血漿対対照比、ならびに
・３．４ｐＭの血漿を伴うＥＣ５０、８．９ｐＭの血漿を伴わないＥＣ５０、及び０．４の血漿対対照比
をそれぞれ有することが示された。
【０３６５】
（表１２）血漿インキュベーションありの場合となしの場合の抗体のＥＣ５０値及び算出した血漿／対照値
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【０３６６】
実施例１２
２５００μｇ／ｍｌの抗体濃度における濁度
１ｍｌの２５０μｇ／ｍｌの精製単量体抗体溶液を、スピン濃縮ユニットにより２５００μｇ／ｍｌまで濃縮した。５℃で１６時間保存後、抗体溶液の濁度を、一般的な製剤緩衝液に対するＯＤ３４０ｎｍ光吸収測定により測定した。結果を以下の表１３に示す。試験した全ての抗体は、≦０．０５の非常に良好な濁度を有している。ＣＤＨ３−２５×Ｆ１２ｑ−ＨＡＬＢ及びＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＬＥ（Ｆｃ）を、別個のアッセイで各々測定し、２５００μｇ／ｍｌでそれぞれ０．０６６及び０．０２６の濁度を有することが示された。
【０３６７】
（表１３）２．５ｍｇ／ｍｌに一晩濃縮した後の抗体の濁度
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【０３６８】
実施例１４
ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体の治療効力
試験の１日目に、ヒト類表皮癌腫細胞株Ａ−４３１の細胞及び新たに単離したヒトＰＢＭＣを、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側側腹部の皮下に同時注射した（Ｅ：Ｔ細胞比１：２）。ビヒクル対照群１のマウス（ｎ＝５）にはエフェクター細胞を注射せずに、ビヒクル対照群２（ｎ＝１０、エフェクター細胞を注射）との比較のために非移植対照として使用し、抗体の不在下における腫瘍成長に対するＰＢＭＣの影響をモニターした。
【０３６９】
マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇ／日（群３、ｎ＝１０）、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日（群４、ｎ＝１０）、または０．００５ｍｇ／ｋｇ／日（群５、ｎ＝１０）の、細胞外ＣＤＨ３サブドメインＤ２Ｃに特異的に結合するＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体を、１日目の腫瘍細胞注入のおよそ２時間後から開始して、連続１０日間、毎日の静脈内ボーラス注射により投与した。
【０３７０】
試験中に腫瘍をキャリパーにより測定し、進行を腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較により評価した。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］を、Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析した群の中央値ＴＶ）／（対照群２の中央値ＴＶ）としてＴＶを算出することにより測定した。
【０３７１】
結果を図１１に示す。ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体を０．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルでマウスに投与することにより、腫瘍形成の完全な阻害をもたらし、試験の終了（４０日目）までに腫瘍を発症した動物はいなかった。
【０３７２】
実施例１５
ＨＣＴ−１１６腫瘍モデルにおけるＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性ＨＬＥ抗体の抗腫瘍活性
アッセイを、ヒトＨＣＴ−１１６結腸癌腫細胞を皮下に注射した雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて実施した。エフェクター細胞をインビトロで増殖させて、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化した（１２日目）。処置は、腫瘍が約２００ｍｍ３の体積に到達した時点で開始した（１７日目）。対照群は、Ｔ細胞を用いたｑ５ｄビヒクル処置群であった。配列番号：４２５を有する抗体を、５日ごと（ｑ５ｄ）に５ｍｇ／ｋｇ／投与（群２）及び０．５ｍｇ／ｋｇ／投与（群３）の濃度で、静脈内ボーラス注射により投与した。結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。特に、図１２Ｂは、応答動物（７／１０）及び非応答動物（３／１０）の観点から結果を区別する。動物の３０％における非応答の理由は定かではないが、図１２Ｂは、応答動物に対する５ｍｇ／ｋｇ濃度での半減期延長二重特異性構築物の投与が、抗体投与の時点から開始している腫瘍成長の停止をもたらすことを示す。
【０３７３】
実施例１６
Ｔ細胞活性化活性化アッセイ
健康なヒトドナーからの単離ＰＢＭＣを、ＣＤＨ３−１３×Ｉ２ＣまたはＣＤＨ３−１３×Ｉ２Ｃ−ＨＡＬＢ二重特異性抗体構築物の濃度を増加させながら（０．００１ｐＭ〜２０μＭの段階希釈物）、４８時間培養した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上での活性化マーカーＣＤ６９の発現を、免疫染色及びフローサイトメトリーならびに抗原特異的複合体ｍＡｂにより確認した。結果を図１３に示し、本明細書において上で考察されている。
【０３７４】
実施例１７
半減期延長ＣＤＨ３×ＣＤ３構築物のＣｙｎｏ薬物動態試験
雌カニクイザルに６０分間、０．０１５ｍｇ／ｋｇの半減期延長ＣＤＨ３×ＣＤ３二重特異性抗体構築物（投与体積１ｍｌ／ｋｇ）を含む緩衝液を用いて、ｉ．ｖ．注入を行った。試験した３つのＨＬＥ形式は、Ｐ１５６、ＨＡＬＢ、及びＨＡＬＢバリアント１（配列番号：４３７、４４３、及び４４４を参照のこと）であり、各々を各構築物のＣ末端に融合した。ｃｙｎｏモデルにおけるこれらのＨＬＥ構築物の半減期を、投与後９６時間の時点から試験終了の時点まで、４つ（Ｐ１５６）及び６つ（ＨＡＬＢ、ＨＡＬＢバリアント１）の時点で分析したそれらの血漿濃度に基づいて算出した。結果として、それぞれＰ１５６でのＨＬＥ構築物は５７時間の半減期を示し、ＨＡＬＢでのＨＬＥ構築物は６３〜８５時間の半減期を示し、ＨＡＬＢバリアント１でのＨＬＥ構築物は６８時間の半減期を示した。これらのＰＫ特性は、ヒトにおいて週に１回のｉ．ｖ．投薬を提案する。
【０３７５】
ＢＡＹＥＲ  ＩＩ配列
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【図１】
2018512860.tif 000140
【図２−１】
2018512860.tif 000141
【図２−２】
2018512860.tif 000142
【図３】
2018512860.tif 000143
【図４Ａ】
2018512860.tif 000144
【図４Ｂ】
2018512860.tif 000145
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2018512860.tif 000148
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2018512860.tif 000150
【図６】
2018512860.tif 000151
【図７】
2018512860.tif 000152
【図８】
2018512860.tif 000153
【図９】
2018512860.tif 000154
【図１０Ａ】
2018512860.tif 000155
【図１０Ｂ】
2018512860.tif 000156
【図１０Ｃ】
2018512860.tif 000157
【図１１】
2018512860.tif 000158
【図１２Ａ】
2018512860.tif 000159
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月17日(2018.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512860000001.app
【国際調査報告】
2018512860.tif 000162
2018512860.tif 000163
2018512860.tif 000164
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