(57)【要約】T細胞の培養増殖のための微環境を作り出す方法。増殖したT細胞は、様々な治療および研究目的のために使用され得る。
2018511320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対するワクチン接種を受けた被験体由来の血液試料から得られた少なくとも1つのT細胞を含むT細胞集団を増殖させる方法であって、前記T細胞を、1つ以上の樹状細胞（「DC」）またはその前駆体と、少なくとも2つのサイトカインと、T細胞増殖因子と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記血液試料が、前記ワクチン抗原に特異的な前記集団の少なくとも1つのT細胞と少なくとも1つのDC前駆体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記DC前駆体が前記抗原でパルスされ、抗原特異的I型樹状細胞（「DC1」）に活性化され、次いで前記T細胞と共培養されて抗原特異的DC1を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2つの前記サイトカインが、インターロイキン-7（「IL-7」）とインターロイキン-15（「IL-15」）とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記T細胞増殖因子がインターロイキン-2（「IL-2」）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
a）前記患者試料からの前記T細胞を、前記抗原特異的T細胞自己I型樹状細胞（DC1）とin vitroで共培養する工程と；
b）工程a）からの前記細胞をIL-7およびIL-5と接触させ、刺激された抗原特異的T細胞を生成する工程と；
c）その後、前記の刺激された抗原特異的T細胞をIL-2と接触させ、それによって抗原特異性および細胞機能を維持する増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程
とをさらに含む方法。
【請求項７】
工程a）〜c）を1回から少なくとももう3回繰り返し、さらに増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記T細胞がCD4+である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原がHER2である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
HER2に対するワクチン接種を受けた乳がん患者由来の血液試料から得られた少なくとも1つのCD4+T細胞を含むCD4+T細胞集団を増殖させる方法であって、前記CD4+T細胞を、1つ以上の樹状細胞（「DC」）またはその前駆体と、少なくとも2つのサイトカインと、T細胞増殖因子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１１】
前記試料中の少なくとも1つのDC前駆体を、少なくとも1つのHER2 MHCクラスIIペプチドでパルスし、前記CD4+T細胞と接触させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも2つの前記サイトカインが、インターロイキン-7（「IL-7」）とインターロイキン-15（「IL-15」）とを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記T細胞増殖因子がインターロイキン-2（「IL-2」）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、
a）請求項１１からの前記T細胞を前記HER2パルスDC1と共培養する工程と；
b）工程a）からの前記細胞をIL-7およびIL-15と接触させ、刺激された抗原特異的T細胞を生成する工程と；
c）その後、前記の刺激された抗原特異的T細胞をIL-2と接触させ、それによって抗原特異性および細胞機能を維持する増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程
とを含む方法。
【請求項１５】
工程a）〜c）を1回から少なくとももう3回繰り返し、さらに増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、前記試料が、
ペプチド42-56：HLDMLRHLYQGCQVV（配列番号1）；
ペプチド98-114：RLRIVRGTQLFEDNYAL（配列番号2）；
ペプチド328-345：TQRCEKCSKPCARVCYGL（配列番号3）；
ペプチド776-790：GVGSPYVSRLLGICL（配列番号4）；
ペプチド927-941：PAREIPDLLEKGERL（配列番号5）；および
ペプチド1166-1180：TLERPKTLSPGKNGV（配列番号6）；
を含むHER2 MHCクラスIIペプチドでパルスされる方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権主張】
【０００１】
本出願は、2015年3月26日に出願された特許文献１の優先権および利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明の実施形態は、治療およびエピトープマッピング用T細胞の感作および増殖のためのin vitro人工リンパ節法、ならびにそれに基づく診断モニタリング方法、治療方法およびツールに関する。
【背景技術】
【０００３】
乳がん発症の生涯リスクは、8人に1人程度である。erb-B2がん遺伝子（HER-2/neu）は、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、胃食道腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍および他の固形腫瘍の大多数において過剰発現される分子ドライバーである。約20〜25%の乳がんを含むいくつかの腫瘍型における分子発がんドライバーであるHER2の過剰発現（「HER2pos」）（非特許文献１）は、急激な臨床経過、化学療法に対する耐性、および乳がんにおける全体的な予後不良（「BC」）と関連している。非特許文献２（「Hensonら」）および非特許文献３を参照。初期BCにおいて、HER2の過剰発現は、浸潤性の増強（非特許文献４）、腫瘍細胞遊走（非特許文献５）、および血管新生促進因子の発現（非特許文献６）と関連し、HER2の腫瘍形成性環境促進における重要な役割を示唆している。非浸潤性乳管がん（「DCIS」）患者の遡及的分析では、HER2を過剰発現するDCIS病変は、HER2過剰発現のないDCIS病変に比べて浸潤性乳がんと関連する可能性が6倍以上であった。
【０００４】
HER2を標的とする分子標的治療薬（すなわち、HERCEPTIN（登録商標）/トラスツズマブ）は、化学療法との併用で、HER2pos BC患者において有意に生存率を改善するが（非特許文献７)、かなりの割合の患者がそのような治療に耐性を示すようになる（非特許文献８）。治療失敗のリスクが高い患者サブグループを特定する戦略が、HER2を標的とする治療に対する応答率を向上させる新規アプローチと同様に必要である。HER2を標的とする分子標的治療薬、すなわちトラスツズマブは、このタイプの乳がんにおいて驚くべきプラスの臨床効果をもたらしたが、進行した疾患状態における既存のHER2療法に対するほぼ全面的な抵抗性、加えて標的療法を受ける女性のかなりの割合の疾患再発は、HER2を標的としたさらなる戦略の必要性を証明する。腫瘍の進行を緩和するためにHER2に対する免疫系を活性化し、働き掛けながら再発を予防するワクチンの期待は、まだ完全には実現されていない。HER2乳がんを診断および治療するためのさらなる試験および治療法が必要とされている。
【０００５】
HER2による乳がん形成における全身性抗HER2 CD4+Th1応答の役割は、近年解明されている。HER2特異的および制御性T細胞（Treg）非依存的であると思われるHER2pos乳がんにおける腫瘍形成連続体にわたる抗HER2 CD4+Th1応答の進行性消失が同定されている。具体的には、抗HER2 CD4+Th1応答とHER2発現および疾患の進行との逆相関が存在する。Th1の反応性プロファイルは、抗HER2 Th1免疫の有意な段階的低下を、HER2pos乳がん形成における連続体（HD（健常ドナー）→BD（良性乳房生検）→HER2neg-DCIS（非浸潤性乳管がん）→HER2neg-IBC（浸潤性乳がん）→HER2pos-DCIS→HER2pos-IBC（浸潤性乳がん））にわたって示す。非特許文献９および2015年3月13日に出願された特許文献２（まとめて以下、「Dattaら」）を参照。HER2pos-浸潤性乳がんにおける抗HER2 Th1応答の抑制は、HER2-パルス1型極性化樹状細胞（「DC1」）ワクチン接種後に差次的に回復したが、トラスツズマブおよび化学療法（「T/C」）によるHER2標的療法の後には、または外科的切除もしくは放射線などの他の標準的療法によってでは、抑制応答は回復しなかった。Id。回復した抗HER2 Th1応答はまた、少なくとも約6ヶ月以上持続するようである。
【０００６】
Tリンパ球サブセット（CD4+またはCD8+）の増殖は、養子療法を実施するのに、またはペプチドベースのワクチンの標的抗原上のエピトープを同定するのに十分なT細胞を獲得するための必須工程である。T細胞の増殖は、原理的には単純な過程である。しかしながら、実際には、低いレベルの増殖、早発活性化誘導性細胞死（アポトーシス）、または抗原特異性および／もしくは機能の消失を含む多くの技術的問題が存在する。
【０００７】
問題の一部は、in vitroで、抗原特異的T細胞増殖が起こる体内環境、すなわちリンパ節で複製することができないことにある。これらは、抗原提示樹状細胞および上皮細胞などの間質細胞を含むTリンパ球とは別に、多数の異なる細胞型を含む特殊化した組織である。T細胞の増殖および細胞機能の維持に重要な接触依存性シグナル（表面レセプター）および水溶性シグナル（サイトカイン）を提供することによって、これらの細胞型のそれぞれは異なる役割を果たす（現在定義されているが、まだ特性評価が不完全）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮特許出願第62/138,969号
【特許文献２】米国特許出願第14/658,095号
【特許文献３】米国特許出願公開第2013/0183343A1号
【特許文献４】米国特許第6,096,532号
【特許文献５】米国特許第5,985,653号
【特許文献６】米国特許第5,888,807号
【特許文献７】米国特許第5,190,878号
【特許文献８】米国特許第5,980,889号
【特許文献９】米国特許第5,913,998号
【特許文献１０】米国特許第5,902,745号
【特許文献１１】米国特許第5,843,069号
【特許文献１２】米国特許第5,787,900号
【特許文献１３】米国特許第5,626,561号
【特許文献１４】米国特許第6,464,973号
【特許文献１５】国際公開00/26230号
【特許文献１６】国際公開01/83559号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Meric, F., et al., J. Am Coll. Surg. 194:488-501 (2002)
【非特許文献２】Henson, E.S., Clin. Can. Res. 12:845-53 (2006)
【非特許文献３】Wang, G.S., Mol. Med. Rep. 6:779-82 (2012)
【非特許文献４】Roses, R.E., et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers & Prev. 18(5): 1386-9 (2009)
【非特許文献５】Wolf-Yadlin, A., et al., Molecular Systems Biology 2:54 (2006)
【非特許文献６】Wen, X.F., et al., Oncogene 25:6986-96 (2006)
【非特許文献７】Piccart-Gebhart., M.J., et al., N. Eng. J. Med 353:1659-72 (2005)
【非特許文献８】Pohlmann, P.R., et al., Clin. Can. Res. 15:7479-91 (2009) ("Pohlman, et al.")
【非特許文献９】Datta, J., et al., Oncolmmunology 4(10):el027474. DOI:10.1080/2162402X.2015. 1022301 (2015)
【非特許文献１０】Sambrook and Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
【非特許文献１１】Ausubel et al., 2012, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY
【非特許文献１２】Koski, G. K., et al., J. Immonother. 35(1): 54 (2012)
【非特許文献１３】Sharma, A., et al., Cancer 118(17):4354 (2012)
【非特許文献１４】Fracol, M., et al., Ann. Surg. Oncol. 20(10):3233 (2013)
【非特許文献１５】Lee, M. K. 4th, et al., Expert Rev. 8(1 l):e74698 (2013)
【非特許文献１６】Czerniecki, B.J., et al., Cancer Res. 67(4):1842 (2007)
【非特許文献１７】Czerniecki, B. J., et al., Cancer Res. 67(14):6531 (2007)
【非特許文献１８】Datta, J., et al., Cancer Immunol. Res. 3:455-463 (2015)
【非特許文献１９】Mottez, E., et al, J Exp Med., 181(2):493-502 (Feb 1, 1995)
【非特許文献２０】Remmington's Pharmaceutical Sciences in US Pharmacopeia, 1984 Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA
【非特許文献２１】Hammer et al., Adv. Immunol. .66:67-100 (1997)
【非特許文献２２】Sturniolo et al., Nat. Biotechnol. 17:555-61 (1999)
【非特許文献２３】Manici et al., J. Exp. Med 189:871-76 (1999)
【非特許文献２４】de Lalla et al., J. Immunol. 163:1725-29 (1999)
【非特許文献２５】Cochlovius et al., J. Immunol. 165:4731-41 (2000)
【非特許文献２６】Roberge, J. Y. et al (1995) Science 269: 202-204
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
新しいがんの治療方法が必要とされている。特に、乳がんおよび他のタイプのがんを治療または予防するためのさらなる免疫療法アプローチが必要である。本発明の実施形態はそのような目的に向けられている。
【００１１】
例示的な実施形態をより良く理解するために、他のおよびさらなる特徴とその利点とともに、添付の図面と併せて以下の説明を参照し、特許請求された実施形態の範囲を添付の特許請求において指摘する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一つの広範な態様では、抗原に対するワクチン接種を受けた被験体由来の血液試料から得られた少なくとも1つのT細胞を含むT細胞集団を増殖させる方法であって、T細胞を、1つ以上の樹状細胞（「DC」）またはその前駆体と、少なくとも2つのサイトカインと、T細胞増殖因子と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、血液試料は、ワクチン抗原に特異的な集団の少なくとも1つのT細胞と少なくとも1つのDC前駆体とを含む。
【００１４】
別の態様では、DC前駆体が抗原でパルスされ、抗原特異的I型樹状細胞（「DC1」）に活性化され、次いでT細胞と共培養されて抗原特異的DC1を生成する。
【００１５】
別の態様では、少なくとも2つのサイトカインは、インターロイキン-7（「IL-7」）とインターロイキン-15（「IL-15」）とを含む。
【００１６】
別の態様では、T細胞増殖因子はインターロイキン-2（「IL-2」）を含む。
【００１７】
別の態様では、本方法は、
a）患者試料からのT細胞を、抗原特異的T細胞自己I型樹状細胞（DC1）とin vitroで共培養する工程と；
b）工程a）からの細胞をIL-7およびIL-5と接触させ、刺激された抗原特異的T細胞を生成する工程と；
c）その後、刺激された抗原特異的T細胞をIL-2と接触させ、それによって抗原特異性および細胞機能を維持する増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程
とをさらに含む。
【００１８】
別の態様では、本方法は、工程a）〜c）を1回から少なくとももう3回繰り返し、さらに増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程をさらに含む。
【００１９】
別の態様では、T細胞はCD4+である。
【００２０】
別の態様では、抗原はHER2である。
【００２１】
別の広範な態様では、HER2に対するワクチン接種を受けた乳がん患者由来の血液試料から得られた少なくとも1つのCD4+T細胞を含むCD4+T細胞集団を増殖させる方法であって、CD4+T細胞を、1つ以上の樹状細胞（「DC」）またはその前駆体と、少なくとも2つのサイトカインと、T細胞増殖因子と接触させる工程を含む方法がある。
【００２２】
別の態様では、試料中の少なくとも1つのDC前駆体を、少なくとも1つのHER2 MHCクラスIIペプチドでパルスし、CD4+T細胞と接触させる。
【００２３】
別の態様では、少なくとも2つのサイトカインは、インターロイキン-7（「IL-7」）とインターロイキン-15（「IL-15」）とを含む。
【００２４】
別の態様では、T細胞増殖因子はインターロイキン-2（「IL-2」）を含む。
【００２５】
別の態様では、本方法は、
a）T細胞をHER2パルスDC1と共培養する工程と；
b）工程a）からの細胞をIL-7およびIL-15と接触させ、刺激された抗原特異的T細胞を生成する工程と；
c）その後、刺激された抗原特異的T細胞をIL-2と接触させ、それによって抗原特異性および細胞機能を維持する増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程
とを含む。
【００２６】
別の態様では、工程a）〜c）を1回から少なくとももう3回繰り返し、さらに増殖した抗原特異的T細胞集団を生成する工程をさらに含む。
【００２７】
別の態様では、試料は、
ペプチド42-56：HLDMLRHLYQGCQVV（配列番号1）；
ペプチド98-114：RLRIVRGTQLFEDNYAL（配列番号2）；
ペプチド328-345：TQRCEKCSKPCARVCYGL（配列番号3）；
ペプチド776-790：GVGSPYVSRLLGICL（配列番号4）；
ペプチド927-941：PAREIPDLLEKGERL（配列番号5）；および
ペプチド1166-1180：TLERPKTLSPGKNGV（配列番号6）；
を含むHER2 MHCクラスIIペプチドでパルスされる。
【００２８】
例示的な実施形態をより良く理解するために、その他の特徴およびその利点とともに、添付の図面と併せて以下の説明を参照し、特許請求された実施形態の範囲を添付の特許請求において指摘する。
【００２９】
以下の発明を実施するための好ましい実施形態は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。実施形態を例示する目的で、図面には本発明の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、好ましい実施形態は、図面に示される実施形態の正確な構成および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アジュバントHER2パルスDC1ワクチンを受け、ネオアジュバント療法後に残存疾患を有する4人のHER2+IBC患者の抗HER2 Th1応答レパートリーを示す。各患者は異なる色で描写されており、ワクチン接種前、ワクチン接種3ヶ月後、およびワクチン接種6ヶ月後の反応性ペプチドの数（n）（「応答レパートリー」とも呼ばれる）を示す。平均応答レパートリーは、ワクチン接種前の0.5±1ペプチドから、ワクチン接種3ヶ月後には3.25±0.96ペプチド（p=0.01）、およびワクチン接種6ヶ月後には4±0.8ペプチド（p=0.01）に増加した。
【図２】アジュバントHER2パルスDC1ワクチンを受け、ネオアジュバント療法後に残存疾患を有する4人のHER2+IBC患者の抗HER2 Th1累積応答を示す。各患者は異なる色で描写されており、ワクチン接種前、ワクチン接種3ヶ月後、およびワクチン接種6ヶ月後の累積応答（SFC/106細胞）を示す。患者平均累積応答は、ワクチン接種前の36.5±38.3SFC/106から、ワクチン接種3ヶ月後には151.0±60.0SFC/106（p=0.04）、およびワクチン接種6ヶ月後には198.4±39.7SFC/106（p=0.02）に改善した。
【図３】IL-2で刺激したHER2ペプチドパルスDC1ワクチン対IL-2/7/15で刺激したものでワクチン接種した患者由来のHER2特異的DC1と共培養したCD4+T細胞間の直接比較を、それぞれ2人の異なる患者について示す。それぞれの患者由来の未成熟DC（「iDC」）を、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。赤い外枠は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す。ペプチド／刺激プロトコルの各セットについて：「対照抗原」は、対照抗原と共培養した非特異的iDCを示す；「特異的抗原」は、HER2抗原／ペプチドでパルスしたiDCと共培養した抗HER2 CD4+T細胞を表す；および「T細胞」は、培養培地中の抗HER2 CD4+T細胞を表す。増殖倍率（増殖後のT細胞数／増殖前のT細胞数として定義される）を示すグラフは、それぞれ右側に示されている。特異性は、抗原特異的IFN-γ産生によってELISAにより測定した。
【図４】IL-2で刺激したHER2ペプチドパルスDC1ワクチン対IL-2/7/15で刺激したものでワクチン接種した患者由来のHER2特異的DC1と共培養したCD4+T細胞間の直接比較を、それぞれ2人の異なる患者について示す。
【図５】特異的応答に続いて非特異的免疫応答を示す：図５は、HER2特異的DC1での1回目の刺激／増殖に続く特異的応答を示し、図６は、非特異的抗CD3/CD28での2回目の刺激／増殖後のその特異的応答のその後の消失を示す。HER2特異的DC1でのCD4+T細胞の1回目の刺激は、図５の赤い外枠によって示されるように、複数の特異的免疫応答をもたらした。図６は、非特異的抗CD3/CD28刺激でのHER2特異的CD4+T細胞の2回目の刺激が4倍の増殖をもたらしたが（横グラフ）、ペプチド群の3/4で特異性が失われたことを示す。患者由来のiDCを、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。
【図６】図６は、非特異的抗CD3/CD28での2回目の刺激／増殖後のその特異的応答のその後の消失を示す。
【図７】非特異的免疫応答に続いて特異的免疫応答を示す：図７は、CD4+T細胞の非特異的増殖を示す。図８は、HER2特異的DC1でのその後の刺激の後に特異性を得ることができないことを示す。非特異的抗CD3/CD28でのCD4+T細胞の1回目の刺激は、3.8倍の増殖をもたらした（図７）。HER2特異的DC1での非特異的CD4+T細胞の2回目の刺激は、特異的免疫応答をもたらさなかった（図８）。患者由来のiDCを、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。
【図８】図８は、HER2特異的DC1でのその後の刺激の後に特異性を得ることができないことを示す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、HER2特異的Th1細胞のin vitroでの一次／1回目の増殖を示し、IL-2で増殖させたHER2特異的DC1対IL-2/7/15で増殖させたものと共培養したCD4+T細胞を比較している。未成熟DC（「iDC」）を、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。赤い外枠（図９Ｂ）は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す。ペプチド／刺激プロトコルの各セットについて：「対照抗原」は、対照抗原と共培養した非特異的iDCを示す；「特異的抗原」は、HER2抗原／ペプチドでパルスしたiDCと共培養した抗HER2 CD4+T細胞を表す；および「T細胞」は、培養培地中の抗HER2 CD4+T細胞を表す。図９Ａは、Th1細胞の平均増殖倍率（増殖後のT細胞数／増殖前のT細胞数として定義される）が、IL-2、IL-7、およびIL-15で刺激した場合に、IL-2単独でよりも有意に良好であった（2.6±0.75対1.0±0.12；p=0.001）ことを表す。図９Ｂは、抗原特異的IFN-γ産生によって、ELISAにより測定される様々なペプチド／増殖プロトコルの特異性を示す。IL-2、IL-7、およびIL-15での刺激ならびにIL-2単独での刺激は両方とも、同じHER2ペプチド776-790において特異的Th1応答をもたらした。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、HER2パルスDC1対抗CD3/CD28のin vitroでの二次／2回目の増殖を示す。HER2-ペプチドパルスDC1および抗CD3/CD28でのTh1細胞の再刺激は、それぞれ同様の増殖倍率（3.9±1.0対4.3±2.0、p=0.7）をもたらした（図１０Ａ）。しかしながら、図１０Ｂは、HER2特異的DC1でのTh1細胞の刺激は特異的Th1応答を増強したが；それに対して、抗CD3/CD28での非特異的刺激はHER2ペプチド特異性の全体的な消失をもたらしたことを示す。以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5）を使用した。赤い外枠（図１０Ｂ）は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す（すなわち、ペプチド42-56およびペプチド776-790特異的Th1細胞のDC1再刺激）。ペプチド／刺激プロトコルの各セットについて：「対照抗原」は、対照抗原と共培養した非特異的iDCを示す；「特異的抗原」は、HER2抗原／ペプチドでパルスしたiDCと共培養した抗HER2 CD4+T細胞を表す；および「T細胞」は、培養培地中の抗HER2 CD4+T細胞を表す。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、HER2パルスDC1でのTh1細胞の三次／3回目の増殖を示す（ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5）を使用した）。表示のHER2特異的DC1での3回目の刺激の後、平均増殖倍率（4.32±0.5、43.7倍の累積増殖（図１１Ａ）および抗原特異性（図１１Ｂ）の両方が再び増加し、特に4つのペプチド全てが特異性を示し、IFN-γ産生を増加させた。
【図１２】図１２〜１５は、IL-2/7/15でのHER2特異的CD4+Th1細胞の反復in vitro刺激（4回）の連続的結果を示す。全ての図１２〜１５について、それぞれの左のパネルは、IFN-γ産生によるペプチド特異性を示す（「Tet」は破傷風患者対照である）；それぞれの右のパネルは、使用された特異的HER2-ペプチドの増殖倍率を示す。図１２では、上の図で使用した他の4つに加えて、2つのさらなるMHCクラスIIペプチドを用いてiDCをパルスした：ペプチド927-941（配列番号5）；およびペプチド1166〜1180（配列番号6）。しかし、増殖倍率の結果（図１２、右のパネル）に見られるように、ペプチド328-345特異的およびペプチド1166-1180特異的Th1細胞はさらなる増殖に十分な細胞を産生せず、したがって、あとの4つのペプチドに特異的なHER2 Th1細胞のみをそのように使用した。続いて、1回目の刺激についての図１２では、ペプチド776-790特異的Th1細胞についてのみ特異性を示す；2回目の刺激についての図１３では、ペプチド42-56-およびペプチド776-790特異的Th1細胞に対する特異性の増加を示す；3回目の増殖についての図１４では、4つのペプチド全てに対する特異性を示し、4回目の増殖についての図１５では、ペプチドの1つ（ペプチド927-941）に対する特異性の消失を示し、あとの3つのHER2特異的ペプチドは残っている。
【図１３】2回目の刺激についての図１３では、ペプチド42-56-およびペプチド776-790特異的Th1細胞に対する特異性の増加を示す。
【図１４】3回目の増殖についての図１４では、4つのペプチド全てに対する特異性を示す。
【図１５】4回目の増殖についての図１５では、ペプチドの1つ（ペプチド927-941）に対する特異性の消失を示し、あとの3つのHER2特異的ペプチドは残っている。
【図１６】全てのHER2特異的Th1細胞について、図１２〜１５に示す4つの増殖の累積増殖倍率を示し、各群の最後の棒線（点）が累積増殖倍率を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の実施形態の図、画像、および説明は、明確な理解に関連する要素を示すために簡略化されているが、同時に、明瞭にするために、本発明の実施形態において見られ得る多くの他の要素を排除していることが理解されるべきである。当業者は、本発明の実施形態を実施するために他の要素が望ましいこと、および／または必要とされることを認識するであろう。しかしながら、そのような要素は当該技術分野でよく知られており、そのような要素は本発明の実施形態のより良い理解を容易にしないため、そのような要素の説明はここでは提供しない。
【００３２】
本明細書を通しての「一実施形態」または「実施形態」などの言及は、その実施形態に関連して説明した特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」などの表現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているわけではない。
【００３３】
さらに、本開示の原理の理解を促進する目的で、本明細書に示され説明された実施形態を参照し、特定の言語を使用してこれを説明する。とはいえ、本開示の範囲の限定はそれによって意図されないことが理解されるであろう；説明または図示された実施形態の任意の改変およびさらなる修正ならびに本明細書に示される開示の原則のさらなる適用は、本開示が関連する技術分野の当業者が通常思いつくように企図される。範囲の全ての制限は、1つ以上の発行された特許の最終請求に従い、それに述べられているように決定されるべきである。
【００３４】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の発明主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の方法および材料が本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。
【００３５】
一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける本明細書で使用される命名法および実験手順は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。
【００３６】
標準技術が、核酸およびペプチド合成に使用される。技術および手順は、一般に、当該技術分野における従来方法および様々な一般的参考文献（例えば、非特許文献１０および非特許文献１１）に従って行われ、それらはこの文書全体を通して提供される。
【００３７】
本明細書で使用される命名法および以下に記載の分析化学および有機合成において使用される実験手順は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。標準技術またはそれらの修正が、化学合成および化学分析に使用される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、この節においてそれに関連する意味を有する。
【００３９】
冠詞「一」（「a」および「an」）は、本明細書では、1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）の文法的対象物を指すために使用される。一例として、「一実施形態」は、1つの実施形態または複数の実施形態を意味する。
【００４０】
本明細書において、量、時間的期間などのような測定可能な値を指す際に使用される「約」は、特定の値から±20%、または±10%、または±5%、または±1%、または±0.1%の変動を包含することを意味するし、そのような変形が開示の方法を実行するのに適切であるようにする。
【００４１】
本明細書で使用される乳がんの「アジュバント療法」は、長期生存の可能性を増加させるための一次治療（すなわち、手術）後に与えられる任意の治療を指す。「ネオアジュバント療法」は、一次療法の前に与えられる治療である。
【００４２】
本明細書で使用する用語「抗原」または「ag」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として作用することができることを、当業者は理解するであろう。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムDNAから誘導することができる。任意のDNAは、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含み、したがって本明細書でその用語が使用されるような「抗原」をコードすることを、当業者であれば理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明の実施形態は、限定されないが、複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は様々な組み合わせで配置されて所望の免疫応答を誘発することは、容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生成もしくは合成され得るか、または生体試料に由来し得ることは、容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４３】
「抗原提示細胞」または「APC」は、T細胞を活性化する能力がある細胞であり、単球／マクロファージ、B細胞および樹状細胞（「DC」）を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
「抗原パルスAPC」または「抗原負荷APC」には、抗原にばく露され、その抗原によって活性化されたAPCが含まれる。例えば、APCは、in vitroで、例えば抗原の存在下での培養中に、Ag負荷され得る。APCはまた、抗原へのばく露によってin vivoで負荷されてもよい。「抗原負荷APC」は、2つの方法のうちの1つで従来調製される：（1）抗原ペプチドとして知られている小ペプチド断片を、APCの外側に直接「パルス」させる；または（2）APCによって摂取される全タンパク質もしくはタンパク質粒子とともにAPCをインキュベートする。これらのタンパク質は、APCによって小ペプチド断片に消化され、最終的にAPC表面に輸送され、提示される。さらに、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、抗原負荷APCを生成することもできる。
【００４５】
「抗HER2応答」は、HER2タンパク質に対して特異的な免疫応答である。
【００４６】
本明細書で使用される用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、またはがん状態に関連する様々な生理的症状の改善によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、最初に腫瘍の発生を予防する際の、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体を結合させる能力によっても明らかにされ得る。
【００４７】
「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死の過程である。カスパーゼ-3は、頻繁に活性化される細胞死プロテアーゼである。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「自己」は、それが後に導入される同一個体に由来する任意の物質を指す。
【００４９】
本明細書で使用される用語「B細胞」は、骨髄および／または脾臓に由来する細胞として定義される。B細胞は、抗体を産生する形質細胞に成長することができる。
【００５０】
「結合ペプチド」。「HER2結合ペプチド」を参照。
【００５１】
本明細書で使用される用語「がん」は、その独特な特性-正常な制御の消失-が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および／または転移をもたらす細胞の過剰増殖と定義される。例には、限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、食道がん、膵臓がん、結腸直腸がん、胃がん、腎臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がん、胚細胞腫瘍などが挙げられる。
【００５２】
「CD4+Th1細胞」、「Th1細胞」、「CD4+Tヘルパー1型細胞」、「CD4+T細胞」などは、表面タンパク質CD4を発現し、高レベルのサイトカインIFN-γを産生するTヘルパー細胞のサブタイプとして定義される。「Tヘルパー細胞」も参照。
【００５３】
「累積応答」は、患者群の複合免疫応答を意味し、所与の患者群からの6つ全てのMHCクラスII結合ペプチド由来の反応性スポットの総和（IFN-γELISPOT分析からの106細胞あたりのスポット形成細胞「SFC」）として表される。
【００５４】
「DCワクチン接種」、「DC免疫化」、「DC1免疫化」などは、免疫系を利用して特異的分子を認識し、それらに対する特異的応答を開始する自己樹状細胞を使用する戦略を指す。
【００５５】
用語「樹状細胞」または「DC」は、in vivo、in vitro、ex vivo、もしくは宿主内もしくは被験体内に存在するか、または造血幹細胞もしくは単球に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞およびその前駆体は、種々のリンパ器官、例えば脾臓、リンパ節から、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。DCは、樹状細胞体から多方向に伸びる薄膜（葉状仮足）を有する特徴的な形態を有する。典型的には、樹状細胞は、高レベルのMHCおよび共刺激（例えば、B7-1およびB7-2）分子を発現する。樹状細胞は、in vitroでのT細胞の抗原特異的分化を誘導することができ、in vitroおよびin vivoでの一次T細胞応答を開始することができる。ワクチン生産の文脈において、「活性化DC」は、リポ多糖「LPS」などのToll様受容体アゴニストにばく露されたDCである。活性化されたDCは、抗原負荷されていてもいなくてもよい。「成熟DC」も参照。
【００５６】
「DC-1極性化樹状細胞」、「DC1」および「1型極性化DC」は、IL-12、IL-18およびIL-23などのThr駆動サイトカインを分泌する成熟DCを指す。DC1は、細胞性免疫を完全に促進することができる。DC1は、本明細書の好ましい実施形態では、HER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスされる。
【００５７】
「HER2」は、ヒト上皮増殖因子受容体（「EGFR」）ファミリーのメンバーである。HER2は、ヒト乳がんの約20〜25%において過剰発現され、多くの他のがんにおいて発現される。
【００５８】
本明細書で使用される「HER2結合ペプチド」、「HER2 MHCクラスII結合ペプチド」、「結合ペプチド」、「ペプチド抗原」、「HER2ペプチド」、「免疫原性MHCクラスII結合ペプチド」、「抗原結合ペプチド」、「HER2エピトープ」、「反応性ペプチド」などは、全ヒト乳がんの約20〜25%に見られる標的であるHER2/neuタンパク質の配列に由来するまたは基づくMHCクラスIIペプチド、およびその等価物を指す。HER2細胞外ドメイン「ECD」は、細胞外にあって、細胞膜に固定されているか、または循環しているHER2のドメインを指し、その断片を含む。HER2細胞内ドメイン「ICD」は、細胞の細胞質内のHER2/neuタンパク質のドメインを指す。好ましい実施形態によれば、HER2エピトープまたはそうでなければ結合ペプチドは、3つのHER2 ECDペプチドおよび3つのHER2 ICDペプチドを含有する6つのHER2結合ペプチドを含む。
【００５９】
好ましいHER2 ECDペプチドは、
ペプチド42-56：HLDMLRHLYQGCQVV（配列番号1）；
ペプチド98-114：RLRIVRGTQLFEDNYAL（配列番号2）；および
ペプチド328-345：TQRCEKCSKPCARVCYGL（配列番号3）；
を含み、
好ましいHER2 ICDペプチドは、
ペプチド776-790：GVGSPYVSRLLGICL（配列番号4）；
ペプチド927-941：PAREIPDLLEKGERL（配列番号5）；および
ペプチド1166-1180：TLERPKTLSPGKNGV（配列番号6）；
を含む。
【００６０】
「HER2pos」は、一種の乳がんならびに多数の他の種類のがんの分類または分子サブタイプである。HER2陽性は、現在、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）アッセイによる遺伝子増幅および2+または3+の病理学的染色強度によって定義されている。
【００６１】
「HER2neg」は、FISHによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの場合、0〜2+の病理学的染色の範囲を包含することができる。
【００６２】
インターロイキン2（「IL-2」または「IL2」）は、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種であるインターロイキンである。IL-2は、主要なT細胞成長および増殖因子である。
【００６３】
インターロイキン7（「IL-7」または「IL7」）は、リンパ節の間質上皮細胞によって産生される造血成長因子である。IL-7は、リンパ球の増殖および生存に必須である。
【００６４】
インターロイキン15（「IL-15」または「IL15」））は、T細胞増殖活性化および生存因子である。IL-15は、線維芽細胞、樹状細胞およびマクロファージによって産生される。
【００６５】
「単離された」とは、自然状態から変化したまたは除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、その自然状態の共存する物質から部分的または完全に分離された同一核酸またはペプチドは「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非天然環境中、例えば宿主細胞中などに存在し得る。
【００６６】
本明細書で使用される用語「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、その多くが抗原提示に関与する進化関連表面タンパク質をコードする遺伝子の特定のクラスターとして定義され、組織適合性の最も重要な決定因子である。クラスI MHC、またはMHCクラスIは、主にCD8 Tリンパ球に対する抗原提示において機能する。クラスII MHC、またはMHCクラスIIは、主にCD4+Tリンパ球（Tヘルパー細胞）への抗原提示において機能する。
【００６７】
本明細書で使用される「成熟DC」は、高レベルのMHCクラスII、CD80（B7.1）およびCD86（B7.2）分子を含む分子を発現する樹状細胞を意味する。対照的に、未成熟DC（「iDC」）は、低レベルのMHCクラスII、CD80（B7.1）およびCD86（B7.2）分子を発現するが、まだ抗原を取り上げることができる。「成熟DC」はまた、in vivo、in vitro、ex vivo、またはDC1極性化していてもよい（すなわち、細胞性免疫を完全に促進することができる）宿主内または被験体内において存在する抗原提示細胞を指す。
【００６８】
抗HER2 CD4+Th1免疫応答について分析された各被験体群について、CD4+Th1応答（または「Th1応答」）の「測定基準」が定義される：（a）全体的な抗HER2応答性（≧1の反応性ペプチドに応答する被験体のパーセントとして表される）；（b）応答レパートリー（各被験体群によって認識される反応性ペプチドの平均数（n）として表される）；および（c）累積応答（各被験体群からの6つのMHCクラスII結合ペプチド由来の反応性スポットの総和（IFN-γELISPOT分析からの106細胞あたりのスポット形成細胞「SFC」）として表される）。
【００６９】
「非不確かなHER2neg」は、遺伝子増幅されておらず、病理学的染色では0または1+と定義される。「不確かなHER2neg」は、遺伝子増幅されていないが、病理学的染色では2+と定義される。
【００７０】
「応答性」または「抗HER2応答性」は、本明細書において互換的に使用され、6つの結合ペプチドの少なくとも1つに応答する被験体のパーセンテージを意味する。
【００７１】
「応答レパートリー」は、各被験体群によって認識される反応性ペプチドの平均数（「n」）として定義される。
【００７２】
本明細書で使用する「試料」または「生体試料」は、血液、器官、組織、エキソソーム、血漿、唾液、尿およびその他の体液を含むが、これらに限定されない被験体由来の生体物質を意味する。試料は、被験体から得られた任意の物質源であり得る。
【００７３】
用語「被験体」、「患者」、「個体」などは、本明細書において互換的に使用され、in vitroであろうとin situであろうと、本明細書に記載の方法に適している任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、被験体または個体はヒトである。
【００７４】
本明細書で使用される用語「標的療法」は、通常は正常細胞にほとんど損傷を与えずにがん細胞増殖に関与する特定の標的分子を妨害する薬物または他の物質を使用して、抗腫瘍効果を達成するがん治療を指す。対照的に、従来の細胞傷害性化学療法薬は、活発に分裂する細胞全てに対して作用する。乳がん治療モノクローナル抗体、特にトラスツズマブ／HERCEPTIN（登録商標）は、HER2/neu受容体を標的とする。
【００７５】
「T/C」は、トラスツズマブおよび化学療法として定義される。これは、乳がん手術の前後にトラスツズマブおよび化学療法の両方を受ける患者を指す。
【００７６】
本明細書で使用される用語「T細胞」または「T-細胞」は、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺由来細胞として定義される。
【００７７】
用語「Tヘルパー細胞」、「ヘルパーT細胞」、「Th細胞」などは、本明細書において細胞に関して使用され、当業者によって識別可能な異なる細胞型を含むリンパ球（白血球の一種）のサブグループを表す。特に、Tヘルパー細胞は、その主要な機能が他のBおよびTリンパ球ならびに／またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターT細胞である。ヘルパーT細胞は、「Th1」または「1型」および「Th2」または「2型」表現型として知られている2つの主要なサブタイプの細胞に分化する。これらのTh細胞は、他の白血球を刺激するか、またはそれらと相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。本明細書で使用される「Th1細胞」、「CD4+Th1細胞」、「CD4+Tヘルパー1型細胞」、「CD4+T細胞」などは、表面糖タンパク質CD4を発現した成熟T細胞を指すために使用される。CD4+Tヘルパー細胞は、樹状細胞などの抗原提示ペプチド（「APC」）の表面上に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原が提示されると、活性化される。MHC抗原複合体によるCD4+Tヘルパー細胞の活性化に際して、それは、インターフェロンγ（「IFN-γ」）などの高レベルのサイトカインを分泌する。そのような細胞は、宿主細胞の内部に存在し、特定の疾患を引き起こす微生物に対して非常に有効であると考えられており、ヒトがんにおける抗腫瘍応答において決定的に重要である。
【００７８】
用語「細胞傷害性T細胞」または「CD8+T細胞」または「キラーT細胞」は、がん細胞、感染細胞、または他の方法で損傷を受けた細胞などの標的細胞を死滅させるTリンパ球である。
【００７９】
「Treg」、「Treg」および「制御性T細胞」は、本明細書では、免疫系の警察官であり、免疫系の抗がん活性を制御するように作用する細胞を指すために使用される。それらはいくつかのがんにおいて増加し、これらのがんのタイプにおいて免疫療法に対して耐性のあるメディエーターである。
【００８０】
「治療有効量」または「有効量」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載されるように、患者に投与されると、特定の生物学的結果をもたらすのに有効である化合物、製剤、物質または組成物の量を指す。「治療有効量」を構成する、本明細書に記載の化合物、製剤、物質または組成物の量は、化合物、製剤、物質または組成物、疾患の状態およびその重症度、治療を受ける患者の年齢などによって異なる。治療有効量は、当業者によって、彼／彼女自身の知識および本開示を考慮して、規定通りに決定され得る。
【００８１】
用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、および「治療（treatment）」は、本明細書に記載の治療または予防措置を指す。「治療」方法は、そのような治療を必要とする被験体に、本発明の実施形態の組成物または方法を施すことであり、例えば、疾患もしくは障害に罹患している被験体に、またはそのような疾患もしくは障害を最終的に獲得し得る被験体に、障害もしくは再発性疾患の1つ以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度の軽減、もしくは改善させるために、または被験体の生存を、そのような治療のない場合で予想される以上に延長させるために施す。
【００８２】
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに物質を投与した後に免疫応答を誘発するために使用される物質として定義される。被験体に導入されると、ワクチンは、抗体、サイトカインの産生および／または他の細胞応答を含むが、これに限定されない免疫応答を誘発することができる。
【００８３】
範囲：本開示を通じて、実施形態の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記述は、単に便宜上のもので、簡潔さのためのものであり、実施形態の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値はもちろん、全ての可能な部分的範囲も具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記述は、その範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6はもちろん、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分的範囲も具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００８４】
ここで、いくつかの実施形態を詳細に参照し、その例も添付の図面、写真、および／または図解で例示する。
【００８５】
（説明）
本発明の実施形態は、ネオアジュバント化学療法後に残存疾患を有し、抗HER2 1型Tヘルパー（Th1）細胞免疫不全および再発性疾患の重大なリスクを有するHER2+浸潤性乳がん（「IBC」）患者に関する。Dattaらによって、抗HER2 CD4+T細胞応答は、乳がん連続体に沿って徐々に減少することが示された - 健常ドナーおよび良性疾患患者では強壮な応答、HER2+非浸潤性乳管がんを患者では抑制反応、およびHER2+IBC患者ではほとんど反応しなかった。本明細書では、（A）アジュバント1型極性化樹状細胞（「DC1」）ワクチン接種と、（B）抗HER2 Th1免疫を回復するための養子T細胞移植用の抗原特異的t細胞を増殖する方法との役割について検討する。
【００８６】
本発明の実施形態は、抗原特異的CD4+またはCD8+T細胞の培養増殖のための微環境をin vitroで作製する方法にも関する。増殖した抗原特異的T細胞は、種々の治療および研究目的のために、例えば、がんまたは慢性ウイルス感染症などの感染性疾患、他の状態の養子T細胞療法、および／またはペプチドベースのワクチンの産生を促進するための標的抗原上のエピトープの同定などに使用することができる。
【００８７】
本発明の実施形態の一つは、タンパク質またはペプチド抗原と組み合わせて自己I型樹状細胞（「DC1」）を使用し、T細胞をin vitroで刺激する。刺激後、少なくとも2つの可溶性因子（例えば、サイトカイン）をT細胞に添加する。いくつかの例では、少なくとも2つの可溶性因子は、インターロイキン-7（「IL-7」）およびインターロイキン-15（「IL-15」）である。可溶性因子をT細胞に添加した後、T細胞増殖因子を添加する。場合によっては、T細胞増殖因子はインターロイキン-2（「IL-2」）である。可溶性因子は、DC1によって天然に産生されるものに加えて、T細胞機能の増殖および獲得／維持を援助する。この刺激過程は、T細胞が治療またはエピトープ走査／マッピングに十分な数になるまで、毎週周期で繰り返すことができる。特定の実施形態では、T細胞は、抗原特異性および細胞機能を維持しながら、養子免疫療法およびエピトープマッピング研究に必要なレベルまで増殖される。
【００８８】
（HER-2パルスDC1ワクチン接種に対するin vivoでのTh1応答：IBC患者における抗HER2CD4+Th1応答の回復）
HER2pos-乳がんにおける腫瘍形成性連続体にわたる抗HER2 CD4+Th1応答の進行性消失の同定に加えて、Dattaらによって教示されるように、HER2pos-浸潤性乳がんにおける抗HER2 Th1応答の抑制は、HER2-パルス1型極性化樹状細胞（「DC1」）ワクチン接種後に差次的に回復した。トラスツズマブおよび化学療法（「T/C」）によるHER2標的療法の後には、または外科的切除もしくは放射線などの他の標準的治療によってでは、抑制応答は回復しなかった。回復した抗HER2 Th1応答は、少なくとも約6ヶ月間またはかなり長い間持続するようである。
【００８９】
（方法：）
ネオアジュバント療法後に残存疾患を有するHER2+IBC患者に、アジュバントHER2パルスDC1ワクチン接種をした。ELISPOTでIFN-γ産生を測定することにより、HER2クラスIIペプチドでパルスしたPBMCから免疫応答を生成した。応答は、CD4+Th1応答の3つの測定基準で評価した：（1）全体的な抗HER2応答性（≧1のペプチドに応答する）、（2）反応性ペプチドの数（応答レパートリー）、および（3）6つのHER2ペプチドにわたる累積応答。ワクチン接種前のTh1応答を、ワクチン接種3ヶ月後および6ヶ月後の応答と比較した。
【００９０】
Dattaらは、DC1ワクチンを作製する方法を記載している。非特許文献１２（Koskiら）；非特許文献１３（Sharmaら）；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；および特許文献３も参照。簡潔には、患者の単球は、白血球除去療法および溶出によって、他の白血球から最初に分離される。次いで、これらの単球を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）とインターロイキン（「IL」）-4を含む無血清培地（「SFM」）中で、未成熟樹状細胞（「iDC」）となるまで培養する。次いで、これらの細胞を、好ましくは、6つのHER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスし、この場合において、配列番号1〜6によって同定される結合ペプチド、次いでインターフェロン（「IFN」）-γおよびリポ多糖（「LPS」）を添加し、成熟および活性化過程を完了させ、DC1への完全なDC活性化を達成してから患者に注射して戻す。非特許文献１４を参照。HLA-A2pos患者の場合、細胞の半分はMHCクラスI結合ペプチドでパルスし、残りの半分は異なるMHCクラス1結合ペプチドでパルスする。
【００９１】
Dattaらはまた、循環抗がんCD4+Th1応答（すなわち、IFN-γ分泌）を生成し、得られたIFN-γ産生を検出および測定する血液検査／アッセイを記載している。そのような血液検査は、DC1ワクチン接種前の患者、およびワクチン接種3ヶ月後および6ヶ月後の患者に対して行った。好ましい実施形態では、CD4+Th1細胞および抗原提示細胞またはその前駆体を含有する被験体血液試料は、被験体が罹患しているがんのタイプに基づき、前記被験体において免疫応答を誘導する能力があるMHCクラスII免疫原性ペプチドでパルスされる。好ましくは、抗原提示細胞またはその前駆体は、成熟もしくは未成熟樹状細胞またはその単球前駆体である。特に好ましい実施形態では、がんは好ましくはHER2発現性であり、哺乳動物被験体は好ましくはヒトであり、より好ましくはがんはHER2pos乳がんであり、ヒト被験体は女性である。
【００９２】
哺乳動物被験体において循環抗HER2 CD4+Th1応答を生成するための好ましい実施形態は、増殖されていない末梢血単核細胞（「PBMC」）を被験体から単離し、被験体において免疫応答を生じさせる能力があるHER2由来MHCクラスII抗原性結合ペプチドを含む組成物でPBMCをパルスすることによって提供される。いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、PBMC試料中に存在するCD4+Th1細胞に結合ペプチドが提示されると、それらはCD4+Th1細胞を活性化し、活性化CD4+Th1細胞はインターフェロンγ（「IFN-γ」）を産生する。被験体のPBMC試料に含まれる前駆多能性単球から誘導されたDC1（1型極性化樹状細胞）は抗原提示細胞（「APC」）であり、結合ペプチドへのばく露により抗原負荷APCとなり、試料中の被験体のCD4+Thl細胞にMHCクラスII抗原結合ペプチドを提示し、それによりCD4+Th1細胞を活性化してIFN-γを産生／分泌する。そのように産生されたIFN-γを、続いて分析用に測定する。
【００９３】
この場合、この好ましい実施形態によれば、各患者のPBMCを、6つのHER2特異的MHCクラスIIペプチド、特に配列番号1〜6で同定される配列を有するものでパルスした。抗HER2 CD4+Th1細胞によって産生されたIFN-γを、IFN-γ酵素結合免疫スポット（「ELISPOT」）アッセイによって検出および測定した。
【００９４】
HER2posがんについての特に好ましい実施形態では、DC、未成熟または1型極性化DC1を、患者において免疫応答を引き起こす能力があるHER2に由来するまたはそれに基づく6つのMHCクラスII結合ペプチドを含む組成物でパルスする。HER2 MHCクラスII結合ペプチドまたはエピトープは、
ペプチド42-56：HLDMLRHLYQGCQVV（配列番号1）；
ペプチド98-114：RLRIVRGTQLFEDNYAL（配列番号2）；
ペプチド328-345：TQRCEKCSKPCARVCYGL（配列番号3）；
ペプチド776-790：GVGSPYVSRLLGICL（配列番号4）；
ペプチド927-941：PAREIPDLLEKGERL（配列番号5）；および
ペプチド1166-1180：TLERPKTLSPGKNGV（配列番号6）；
を含む。
【００９５】
ドナーがA2.1血液型である実施形態では、HER2 MHCクラスIペプチドまたはエピトープは、
ペプチド369-377：KIFGSLAFL（配列番号7）；および
ペプチド689-697：RLLQETELV（配列番号8）
を含む。
【００９６】
被験体血液試料由来の予め刺激を受けていない精製CD4+T細胞を、被験体において免疫応答を引き起こす能力があるHER2由来MHCクラスII抗原性結合ペプチドを含む組成物でパルスした自己未成熟または成熟樹状細胞（「iDC」または成熟「DC」）と共培養することにより、循環抗HER2 CD4+Th1応答を哺乳動物被験体において引き起こす代替の好ましい実施形態も、Dattaらは記載している。いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、結合ペプチドがT細胞試料中に存在するCD4+Th1細胞に提示される場合、それらはCD4+Th1細胞を活性化し、活性化されたCD4+Th1細胞はIFN-γを産生／分泌する。未成熟DCはDC1に成熟し、それはMHCクラスII結合ペプチドを試料中に存在する被験体のCD4+Th1細胞に提示し、それによりCD4+Th1細胞が活性化され、IFN-γが産生され、その後分析用に測定される。
【００９７】
被験体において抗HER2免疫応答を引き起こすための代替の好ましい実施形態のいずれにおいても、抗HER2 CD4+Th1細胞によって産生されたIFN-γを、IFN-γ酵素結合免疫スポット（「ELISPOT」）アッセイにより検出および測定するが、他の検出方法を使用してもよいことが当業者によって理解されるべきである。例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ELISA」）、および免疫蛍光（「IF」）を、免疫応答のモニタリングに使用することができる。あるいは、患者の免疫モニタリングの場合、全CD4+細胞スポットを示すELISPOTなどのストレートIFN-γ試験に対するものとして、またはこれに加えて、IFN-γ対IL-10の比を測定することが有利であり得る。そのような試験は、リスクのある患者にとって特に有利である。さらに、免疫蛍光の使用は、蛍光によって結果を読み取るELISPOTリーダーの使用により、免疫応答を測定し可視化する他の方法を提供する。そのような場合、結果をアレンジして、同じ患者試料において、それぞれが異なる色で示された2つ、3つ、またはそれ以上のサイトカイン／その他の分泌免疫分子を示すことができる。この場合では、IFN-γELISPOTを使用した。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態は、6つのHER2 MHCクラスII結合ペプチド／エピトープを特徴とするが、患者において十分に免疫学的に活性である限り、HER2分子全体の任意の構成要素を他の結合ペプチドの供給源として使用することができるため、他の可能なMHCクラスII HER2ペプチドを本発明の実施形態において使用することができる。
【００９９】
（結果：）
応答性：刺激を受けていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェル中＞20SFC/106細胞として定義される免疫応答を、ワクチン接種前には1人のIBC患者しか示さなかった。ワクチン接種前の結果と比較して、全てのワクチン接種を受けたIBC患者は、抗HER2 IFN-γposThl応答における＞2倍の増加として定義される免疫応答を示した。
【０１００】
応答レパートリー：図１は、IBC患者において、ワクチン接種前の0.5±1ペプチドから、3ヶ月後には3.25±0.96ペプチド（p=0.01）、および6ヶ月後には4±0.8ペプチド（p=0.01）に増加した平均レパートリーを示す。
【０１０１】
累積応答：図２は、ワクチン接種前の36.5±38.3SFC/106から、3ヶ月後には151.0±60.0SFC/106（p=0.04）、および6ヶ月後には198.4±39.7SFC/106（p=0.02）に改善した患者における平均累積応答を示す。
【０１０２】
乳がんに加えて、例えば脳、膀胱、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、結腸直腸および胃などの多くの他のHER2pos固形がんがあり、それらに対して本明細書に記載の実施形態の物質および方法を、診断および治療のために使用することができる。したがって、上記の6つの抗HER2結合性ペプチドを本明細書の実施形態に従って使用し、これらのおよび他のHER2発現性がんを検出することができ、診断に有用な免疫応答を引き起こすことができる。
【０１０３】
ワクチンは、上記の同じ抗HER2結合ペプチドを用いてHER2発現性腫瘍を標的化するように開発されてもよく、または免疫原性であるHER2の任意の組成物、例えばDNA、RNA、ペプチド、もしくはタンパク質など、もしくはICDおよびECDドメインなどのそれらの構成要素を使用してもよい。例えば、被験体を、全HER2タンパク質に対してワクチン接種することができ、上記の6つの結合ペプチドを使用して、患者の免疫応答をモニターすることができる。同様に、HER1、HER3、およびc-METを含むHER2ファミリーの他のメンバーなどの他のタイプのがんについても、ワクチンを開発することができる。
【０１０４】
本発明の好ましい実施形態は、女性のHER2pos乳がんの治療および診断に向けられているが、本発明の実施形態は女性のヒトに限定されないことは、当業者には容易に理解されるべきである。本発明の好ましい実施形態は、男性のヒト、例えばHER2発現性前立腺がん、ならびに他の哺乳動物被験体を含む。
【０１０５】
同定された抗HER2 CD4+Th1応答の減少は、そのような血液検査で生じ、検出された免疫応答が、もっぱらがん診断／応答予測因子として使用されること、または、ここの例のように、特殊なワクチンの使用と並行して、患者の免疫応答を回復させることを可能にする。したがって、本明細書に記載の好ましい実施形態は、がん診断および治療の焦点を、患者免疫、ならびに、がんに対する免疫応答を決定および／または予測する血液検査の使用に変え、それは再発のリスクがある患者を含み、腫瘍細胞の同定に依存する診断および治療法とは対照的である。
【０１０６】
（HER2特異的TH1細胞のin vitro増殖）
（方法）
in vitroで、HER2特異的Th1細胞を、HER2ペプチドパルスDC1との共培養によって生成し、IL-2単独またはIL-2、IL-7、およびIL-15を用いて増殖させた。続いて、Th1細胞を、反復HER2-ペプチドパルスDC1共培養または抗CD3/CD28刺激のいずれかによって増殖させた。増殖倍率を、以下のように定義した：（増殖後の#T細胞／増殖前の#T細胞）；特異性は、抗原特異的IFN-γ産生によってELISAにより測定した。
【０１０７】
T細胞増殖に関連する本発明の実施形態は、決してCD4+T細胞に限定されない。したがって、本発明の実施形態は、キメラ抗原レセプターT細胞（「CART細胞」）、細胞傷害性Tリンパ球（CD8+）、ならびに他の全種類のT細胞を増殖させるための方法を提供する。例えば、非特許文献１８を参照。
【０１０８】
本発明の実施形態は、がんまたは他の状態の養子療法用に、ヘルパー（CD4+）または細胞傷害性（CD8+）のいずれかの抗原特異的T細胞の治療量を生成するためのリンパ節の環境を複製することに関する。増殖した抗原特異的Tリンパ球は、ペプチドベースのワクチンの産生を促進するための標的抗原上のエピトープの同定に使用することもできる。
【０１０９】
本実施形態は、リンパ節の環境を複製するin vitro環境を提供する。その実施形態では、リンパ節の複製は、1つ以上の以下の要素を培養条件に供給することを含む：1型樹状細胞、IL-15、IL-7およびIL-2。
【０１１０】
1型樹状細胞は、ペプチド抗原を処理してT細胞へ提示し、表面発現されたCD80およびCD86（T細胞上のCD28カウンターレセプターに結合する）、ならびにCD40（T細胞上のCD40Lと相互作用する）を含む、いわゆる「共刺激分子」を供給する。さらに、DCは、IFN-γ産生（T細胞機能）だけでなく、長寿命（抗アポトーシス因子）を援助するインターロイキン12（「IL-12」）などの可溶性因子を産生する。DCは、T細胞成長に重要な多くの他の因子を産生する。DCは通常リンパ節において見られ、T細胞の活性化および増殖にとって重要であることが知られている。
【０１１１】
IL-15は、T細胞増殖活性化および生存因子である。IL-15は、線維芽細胞、樹状細胞およびマクロファージによって産生される。
【０１１２】
IL-7は、リンパ節の間質上皮細胞によって産生される因子である。IL-7は、リンパ球の増殖および生存に必須である。
【０１１３】
IL-2は、主要なT細胞成長および増殖因子である。
【０１１４】
したがって、本実施形態は、特定のサイトカインおよび特定のタイプの樹状細胞を組み合わせ、その一方で、リンパ球添加の特定のタイミングおよび特定の配列を用いて所望のT細胞を生成するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、T細胞は、抗原特異性および細胞機能を維持しながら、養子免疫療法およびエピトープマッピング研究に必要なレベルまで増殖される。
【０１１５】
（T細胞の供給源）
増殖の前に、T細胞の供給源を被験体から得る。被験体の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、被験体はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本明細書の特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のT細胞株を使用することができる。特定の実施形態では、当業者に知られている任意の数の技法、例えばフィコール分離などを使用して被験体から採取した血液単位から、T細胞を得ることができる。好ましい一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球除去療法によって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。一実施形態では、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。代替実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いていてもよく、または全てではないにしても多くの2価陽イオンを欠いていてもよい。洗浄後、細胞を、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca不含、Mg不含PBSに再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
【０１１６】
別の実施形態では、赤血球を溶解し、例えばPERCOLL（商標）勾配での遠心分離によって単球を枯渇させることにより、T細胞を末梢血液から単離する。あるいは、T細胞を臍帯から単離することができる。いずれにせよ、T細胞の特定の亜集団を、陽性または陰性選択技術によってさらに単離することができる。
【０１１７】
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。好ましい方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。
【０１１８】
陽性または陰性選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変えることができる。特定の実施形態では、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させ（すなわち、細胞の濃度を増加させ）、細胞およびビーズの最大の接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、細胞20億個/mlの濃度が使用される。別の実施形態では、細胞10億個/mlの濃度が使用される。さらなる実施形態では、細胞1億個/mlより多くが使用される。さらなる実施形態では、細胞1千万、1.5千万、2千万、2.5千万、3千万、3.5千万、4千万、4.5千万、または5千万個/mlの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、細胞7.5千万、8千万、8.5千万、9千万、9.5千万、または1億個/mlの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、1.25億個または1.5億個細胞/mlの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもたらすことができる。
【０１１９】
刺激のためのT細胞は、洗浄工程後に凍結することもでき、それは単球除去工程を必要としない。理論に縛られることを望むものではないが、凍結およびその後の解凍工程は、顆粒球およびある程度の単球を細胞集団から除去することにより、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液およびパラメーターが当該技術分野で知られており、この文脈において有用であるが、非限定的な実施例では、ある方法は、20%DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンを含むPBS、または他の適切な細胞凍結培地の使用を伴う。次いで、細胞を毎分1°の割合で-80℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相に保存する。-20℃または液体窒素中で直ちに非氷温凍結する方法はもちろん、氷温凍結する方法を用いてもよい。
【０１２０】
（T細胞の活性化および増殖）
一般に、本実施形態のT細胞を、リンパ節を複製する条件下で増殖する。一実施形態では、リンパ節の複製は、1つ以上の以下の要素を培養条件に供給することを含む：1型樹状細胞、IL-15、IL-7およびIL-2。一実施形態では、抗原特異的T細胞を、1つ以上の1型樹状細胞、IL-15、IL-7およびIL-2の存在下で増殖させることができる。
【０１２１】
一実施形態では、DCと接触させるなどして、T細胞を本明細書に記載のように刺激することができる。DCは、共刺激分子をT細胞に供給することができる。T細胞をDCと接触させた後、T細胞をIL-15、IL-7およびIL-2の存在下で培養する。
【０１２２】
いくつかの例では、T細胞を、1つ以上のDC、IL-15、IL-7、およびIL-2を含む混合物と共培養する。本実施形態の1つでは、混合物を数時間（約3時間）〜約14日間、またはその間の任意の整数値の時間で共培養してもよい。別の実施形態では、混合物を21日間培養してもよい。一実施形態では、T細胞を約8日間培養する。別の実施形態では、T細胞を2〜3日間一緒に培養する。T細胞の培養時間が60日以上になるように、数回の刺激のサイクルが望まれる場合もある。T細胞培養に適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、IL-2、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβおよびTNF-αまたは当業者に知られている細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640もしくはX-vivo 15）が挙げられる。細胞増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清であるか、もしくは適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは規定のホルモン一式、ならびに／またはT細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカイン（単数または複数）が補充されたRPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15およびX-Vivo 20、Optimizerが挙げられる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、被験体に注入される細胞の培養物ではなく、実験的培養物にのみ含まれる。標的細胞は、増殖を援助するのに必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、37℃）で維持される。
【０１２４】
一実施形態では、T細胞を、抗原特異性および細胞機能を維持しながら、養子免疫療法およびエピトープマッピング研究に必要なレベルまで増殖させる。したがって、任意の細胞数が、本実施形態の文脈内にある。本発明の方法によって刺激した細胞を、シグナル伝達の誘導、細胞表面マーカーの発現および／または増殖によって示されるように活性化する。CD4+T細胞に適切なそのようなマーカーの1つは、重要な免疫調節分子であるIFN-γの産生である。IFN-γの産生は、免疫応答の増幅に極めて有益である。
【０１２５】
T細胞に関して、本明細書に記載の様々な増殖方法から生じるT細胞集団は、使用される条件に応じて様々な特異的表現型特性を有し得る。そのような表現型特性には、CD25、CD154、IFN-γおよびGM-CSFの発現の増強、ならびにCD137、CD134、CD62LおよびCD49dの発現の変化が含まれる。これらの部位の発現を差次的に制御する能力は、非常に重要であり得る。例えば、抗原提示細胞（樹状細胞、単球、さらには白血病B細胞またはリンパ腫など）で発現されるCD40分子との接触を介した、「テーラードT細胞」上のCD154のより高いレベルの表面発現は、抗原提示および免疫機能を増強する。そのような戦略は現在、抗体または組み換えCD40Lを介してCD40をライゲーションするために、様々な会社によって採用されている。本明細書に記載の手法は、この同じシグナルが、より生理学的な様式で、例えばT細胞によって送達されることを可能にする。T細胞活性化過程を調整することによってIFN-γ分泌を増加させる能力は、抗腫瘍および抗ウイルス応答にとって重要なTh1型免疫応答の生成を促進するのに役立ち得る。CD154と同様に、GM-CSFの発現の増加は、特に、APC前駆細胞の、より機能的に適格な樹状細胞などのAPCへの成熟を促進するその効果を介して、APC機能を増強するのに役立ち得る。CD137およびCD134の発現を変化させることは、T細胞のアポトーシスシグナルに抵抗する能力または感受性がある能力に影響し得る。CD62Lおよび／またはCD49dおよび／またはCCR7などの接着/ホーミング受容体の発現の制御は、注入されたT細胞がリンパ器官、感染部位、または腫瘍部位に帰着する能力を決定し得る。
【０１２６】
T細胞集団の表現型特性は、当業者に知られている標準フローサイトメトリー法およびELISA法を含む様々な方法によって観察することができる。
【０１２７】
当業者は、本明細書に記載の細胞刺激方法が様々な環境（すなわち、容器）において実施され得ることを容易に理解するであろう。例えば、そのような容器は、培養フラスコ、培養バッグ、または細胞を保持することができる任意の容器であってもよく、好ましくは滅菌環境である。一実施形態では、バイオリアクターも有用である。例えば、いくつかの製造業者は、現在、細胞を増殖させるために使用することができ、本発明の実施形態の方法と組み合わせて使用することができる装置を作製している。例えば、Celdyne社、ヒューストン、テキサス州；Unisyn Technologies、ホプキントン、マサチューセッツ州；Synthecon社、ヒューストン、テキサス州；Aastrom Biosciences社、アナーバー、ミシガン州；Wave Biotech社、ベドミンスター、ニュージャージー州を参照。さらに、そのようなバイオリアクターを扱う特許には、特許文献４；特許文献５；特許文献６；および特許文献７が挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
一実施形態では、揺動速度の変化および様々な異なる揺動角度を可能にする、土台となるロッカープラットフォームを備えるバイオリアクター、例えば「The Wave」（Wave Biotech社、ベドミンスター、ニュージャージー州）が使用される。当業者は、細胞の最適な増殖のための適切な動作を可能にする任意のプラットフォームが、本発明の実施形態の文脈内にあることを認識するであろう。特定の実施形態では、本発明の実施形態の刺激および増殖の方法は、培養容器を、培養過程中に毎分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回揺動させることに備える。ある実施形態では、本発明の実施形態の刺激および増殖の方法は、揺動プラットフォームの角度を1.5°、2°、2.5°、3°、3.5°、4°、4.5°、5°、5.5°、6°、6.5°、7°、7.5°、8°、8.5°または9.0°に設定することに備える。
【０１２９】
特定の実施形態では、バイオリアクター容器の容量は、約0.1リットル〜約200リットルの培地に及ぶ。当業者は、培養に使用される容量が、出発細胞数および所望の最終的な細胞数に依存して変化することを容易に理解するであろう。特定の実施形態では、T細胞などの本発明の実施形態の細胞を、約0.2×106細胞/ml〜約5×106細胞/mlの初期濃度、およびその間の任意の濃度で播種する。特定の一実施形態では、細胞を最初に静的環境で培養し、培養の1、2、3、4、5、6、7、8日後、またはそれより後の日に揺動プラットフォーム上のバイオリアクターに移してもよい。関連する実施形態では、上記のように、刺激、活性化、および増殖の全過程が、揺動プラットフォームおよび一体型磁石を含むバイオリアクター内で行われる。例示的なバイオリアクターには、「The Wave」が含まれるが、これに限定されない。
【０１３０】
特定の一実施形態では、細胞刺激法は、約0.1ml/分〜約10ml/分などの様々な速度での培地の灌流を可能にする、バイオリアクターなどの閉鎖系で実施される。したがって、特定の実施形態では、そのような閉鎖系の容器は、出口フィルタ、入口フィルタ、ならびに閉鎖系へのおよび閉鎖系からの滅菌移送のための試料ポートを備える。他の実施形態では、そのような閉鎖系の容器は、シリンジポンプと、閉鎖系へのおよび閉鎖系からの滅菌移送のための制御とを含む。さらなる実施形態は、バイオリアクター容器の重量の連続的な監視によって培地の投入および排出を制御するためのロードセルなどの装置を備える。一実施形態では、系はガスマニホールドを含む。別の実施形態では、本発明の実施形態のバイオリアクターは、周囲空気およびCO2の混合物をバイオリアクター容器に供給し、容器を正圧に維持するCO2ガス混合ラックを含む。別の実施形態では、本発明の実施形態のバイオリアクターは、可変加熱体を含む。
【０１３１】
一実施形態では、培地を、2、3、4、5または6日目から、1日約0.5〜5.0リットルで、所望の最終容量が得られるまで容器に入れることができる。別の実施形態では、培地を、1日2リットルで、4日目から、容量が10リットルに達するまで容器に入れる。所望の容量に達したら、培地の灌流を開始することができる。特定の実施形態では、系を通る培地の灌流は、培養の約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12日目に開始する。別の実施形態では、容積が約0.1リットル〜約200リットルの培地となったら灌流を開始する。特定の一実施形態では、最終体積が4、5、6、7、8、9、10または20リットルまたはそれ以上の体積となったら灌流を開始する。灌流の速度は、約0.5ml/分〜約10ml/分とすることができる。特定の実施形態では、灌流速度は、約1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、または8.0ml/分である。
【０１３２】
さらなる実施形態では、T細胞などの細胞を、閉鎖静止系で5日間まで培養し、その後、様々な速度での培養容器の揺動を可能にする揺動体を含む閉鎖系に移す。
【０１３３】
特定の態様では、本発明の実施形態の方法論は、T細胞などの細胞を、約2週間未満で、約6×106細胞/ml〜約90×106細胞/mlの濃度とする増殖を提供する。特に、本明細書中の方法論は、T細胞を、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、または85X106細胞/mlの濃度およびその中の全ての濃度とする増殖を提供する。特定の実施形態では、細胞は、培養の約5、6、7、8、9、10、11、または12日目までに、上記のいずれかのような所望の濃度に達する。一実施形態では、T細胞は、培養の約4日目〜約12日目に約24時間で少なくとも約1.5倍に増殖する。一実施形態では、T細胞などの細胞は、約2週間未満で、約100×106の出発細胞数から、合計約500×109細胞にまで増殖する。さらなる実施形態では、T細胞は、約2週間未満で、約500x106の出発細胞数から、合計約500x109細胞にまで増殖する。関連する実施形態では、細胞は、約2週間未満で、約100〜500×106の出発細胞数から、合計約200、300または400×109細胞に増殖する。
【０１３４】
（治療）
特定の実施形態では、T細胞の集団を最初に抗原、例えば腫瘍標的抗原と接触させ、次いで、1つ以上のDC、IL-15、IL-7、およびIL-2を含む本実施形態の混合物にさらす。特定の一実施形態では、特定の抗原を、単独で、またはアジュバントと組み合わせて、または樹状細胞にパルスして、患者にワクチン接種することにより抗原特異的T細胞を誘導する。本実施形態の刺激方法を使用した増殖で使用するための抗原特異的細胞は、in vitroで生成されてもよい。
【０１３５】
本発明の実施形態の別の態様は、抗原特異的T細胞を増殖させるための方法であって、前記抗原に特異的なT細胞の活性化を誘導するのに十分な時間、T細胞の集団を抗原と接触させる工程と；抗原特異的T細胞の前記集団を、ex vivoで、1つ以上のDC、IL-15、IL-7およびIL-2を含む混合物と、前記抗原に特異的なT細胞の増殖を誘導するのに十分な条件下でおよび時間接触させ、それにより抗原特異的T細胞を増殖させる工程とを含む方法を提供する。一実施形態では、抗原は腫瘍標的抗原である。別の実施形態では、抗原は、抗原提示細胞上でパルスされるか、または抗原提示細胞によって発現される。別の実施形態では、T細胞の集団をex vivoで前記抗原と接触させる。別の実施形態では、本方法は、少なくとも1回の前記抗原特異的T細胞のペプチド-MHC四量体選別を含む。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも1回の前記抗原特異的T細胞のペプチド-MHC四量体磁気選別をさらに含む。
【０１３６】
本明細書の実施形態の別の態様は、本明細書で提供される方法に従って増殖した抗原特異的T細胞をがん患者に投与することを含むがんの治療方法を提供する。
【０１３７】
本発明の方法に従って生成したT細胞を、自己免疫疾患を治療するために使用することもできる。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、後天性免疫不全症候群（AIDS、自己免疫要素を有するウイルス性疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎-若年性、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性真性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、全身性硬化症（SS）としても知られている）、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１３８】
本発明の方法に従って生成された細胞はまた、炎症性障害を治療するために使用することもできる。炎症性疾患の例としては、慢性および急性炎症性障害が挙げられるが、これらに限定されない。炎症性疾患の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支ぜんそく、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発肺傷害が挙げられる。
【０１３９】
本発明の実施形態は、動物におけるがん細胞または悪性細胞の存在を予防、阻害または減少させるための方法であって、動物に抗がん有効量の本発明の実施形態の抗腫瘍細胞を投与することを含む方法も提供する。
【０１４０】
本発明の実施形態によって考慮されるがんであって、それに対する免疫応答が誘導されるか、またはその存在下で予防、阻害、もしくは減少されるべきであるがんには、限定されるものではないが、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、膵臓がん、食道がん、脳がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、肝細胞癌腫、鼻咽頭癌腫、ALL、AML、CML、CLL、および当該技術分野で知られている他の新生物が挙げられる。
【０１４１】
あるいは、本明細書に記載の組成物を使用して、病原性生物、例えばウイルス（例えば、一本鎖RNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖DNAウイルス、HIV、A型、B型およびC型肝炎ウイルス、HSV、CMV、EBV、HPV）、寄生虫（例えば、プラスモジウム種、リーシュマニア種、住血吸虫種、トリパノソーマ種などの原生動物病原体および後生病原体）、細菌（例えば、マイコバクテリア、サルモネラ菌、連鎖球菌、大腸菌、ブドウ球菌）、真菌（例えば、カンジダ種、アスペルギルス種）ならびにニューモシスチス・カリニなどに対する応答性を誘導または増強することができる。
【０１４２】
本主題の組成物を投与することにより動物において誘導される免疫応答には、CD8+T細胞によって媒介され、腫瘍および感染細胞を死滅させることができる細胞性免疫応答と、CD4+T細胞応答とが含まれ得る。CD4+T細胞による活性化後に抗体を産生するB細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導され得る。本発明の実施形態の組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析するために、当該技術分野で十分に説明されている様々な技術が使用され得る。
【０１４３】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の実施形態の組成物の正確な量は、医師により、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者の状態における個体差を考慮して決定することができる。本発明の実施形態の対象細胞を含む医薬組成物は、適切な臨床試験中に決定される用量で投与され得ると一般に規定されている。本発明の実施形態の細胞は、これらの用量で複数回投与されてもよい。特定の患者に対する最適な用量および治療計画は、医学分野の当業者により、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって容易に決定され得る。
【０１４４】
本発明の実施形態の細胞は、適切な臨床試験において決定される用量および経路および時点で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。本発明の実施形態の細胞は、他の方法と組み合わされてもよい。投与用の本発明の実施形態の細胞は、治療を受けている患者に対して自己由来、同種異系または異種性であり得る。所望であれば、治療はまた、マイトジェン（例えば、PHA）またはリンホカイン、サイトカイン、および／もしくはケモカイン（例えば、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、M1P1-αなど）を投与し、本明細書に記載のように、免疫応答の誘導を増強することを含んでもよい。
【０１４５】
本発明の実施形態の細胞の投与は、任意の好都合な様式で行われてもよい。本発明の実施形態の細胞はまた、患者に皮下、皮内、筋肉内、静脈内（「i.v.」）注射または腹腔内投与されてもよい。いくつかの例では、細胞は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。他の例では、本実施形態の細胞は、i.v.注射によって投与される。他の例では、本実施形態の細胞は、腫瘍またはリンパ節に直接注射される。
【０１４６】
本発明の実施形態の細胞は、任意の数のマトリックスを用いて投与することもできる。本発明の実施形態は、典型的にはT細胞の調節を介して、免疫系を援助、維持、または調節するための人工リンパ器官として作用するという新規な文脈の中で、そのようなマトリックスを利用する。したがって、本発明の実施形態は、組織工学において有用性が実証されているマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の実施形態の組成物、装置および方法において使用され得るマトリックスのタイプは、事実上無限であり、生体および合成マトリックスの両方を含み得る。特定の一実施例では、特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；または特許文献１３によって明記された組成物および装置が利用される；これらの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。マトリックスは、一般に哺乳動物宿主に投与された場合に生体適合性であることに関連した特徴を含む。マトリックスは、天然および／または合成物質から形成されてもよい。マトリックスは、インプラントなど、永久構造物もしくは取り外し可能構造物を動物の体内に残すことが望ましい場合には非生分解性であってもよい；または生分解性であってもよい。マトリックスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファパッド、繊維、中空繊維、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔質組成物、またはナノ粒子の形態を取ることができる。さらに、マトリックスは、播種された細胞または生成されたサイトカインまたは他の活性薬剤の持続放出を可能にするように設計することができる。特定の実施形態では、マトリックスは柔軟で弾力性があり、無機塩、水性流体および酸素を含む溶解した気体状薬剤などの物質に対して透過性である半固体足場として説明され得る。
【０１４７】
本明細書では、マトリックスを生体適合性物質の例として使用する。しかしながら、現行の実施形態はマトリックスに限定されず、したがって、用語マトリックス（「matrix」または「matrics」）が出現するところでは、これらの用語は、細胞保持または細胞横断を可能にし、生体適合性であり、巨大分子の横断を、物質自体が半透膜であるように物質を直接通過させるか、または特定の半透過性物質と組み合わせて使用されることで可能にする能力がある装置および他の物質を含むように読まれなければならない。
【０１４８】
本発明の実施形態の一態様では、本明細書において増殖した細胞は、特許文献１４に記載のように、in vivoでアジュバントとして使用することができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載の抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、自己抗原など）などの目的の抗原に対して、in vivoで免疫応答を誘導するワクチンとして、細胞を使用することができる。一実施形態では、細胞を、単独で投与して、または他の免疫調節因子と組み合わせて、および他の既知療法と組み合わせて使用し、in vivoで免疫応答を生成することができる。
【０１４９】
（エピトープの同定）
一実施形態では、抗原特異的T細胞を増殖させるための組成物および方法が提供される。T細胞を、1つ以上のDC、IL-15、IL-7、およびIL-2と接触させることを含む工程によって、抗原特異的T細胞を増殖させることができる。増殖したT細胞を使用して、抗原特異的T細胞受容体（「TCR」）およびそれに由来するエピトープを同定することができる。例えば、増殖したT細胞由来のTCRをクローニングすることができる。クローニングされたTCRは、所望の疾患または障害を治療する特異的養子T細胞療法の開発に有望なツールを提示する。例えば、クローニングされたTCRを使用して、ワクチンに有用なペプチド／抗原を生成することができる。
【０１５０】
感染に対抗するそれらの役割に加えて、T細胞は、がん性細胞の破壊にも関与している。自己免疫疾患は、身体の様々な部分に対する抗原特異的T細胞攻撃にも関連している。これらの疾患に関与する機構の理解および介入を妨げる主要な問題の1つは、研究すべき抗原に特異的なT細胞を同定することが難しいことである。
【０１５１】
TCRは、構造中の抗体分子と密接に関連しており、抗原結合に関与するが、抗体とは異なり、遊離抗原を認識しない；その代わりに、抗原提示分子によって結合および提示される抗原断片に結合する。抗原提示分子の重要なグループは、抗原ペプチドおよびタンパク質フラグメントをT細胞に提示するMHCクラスIおよびクラスII分子である。
【０１５２】
TCRの抗原結合部位における可変性は、抗体の抗原結合部位と同様の様式で作製され、また、膨大な数の異なる抗原に対する特異性も提供する。多様性は、TCRのジスルフィド結合アルファ（α）およびベータ（β）、またはガンマ（γ）およびデルタ（Δ）ポリペプチドのN末端ドメインの相補性決定領域（「CDR」）において生じる。CDRループは、共にクラスター化され、抗体の抗原結合部位に類似したMHC抗原結合部位を形成するが、TCRでは、種々の鎖はそれぞれ、抗体と比較して、さらに2つの超可変ループを含む。特異的抗原に対するTCR多様性も、抗原が結合してTCRに提示されるAPCの表面上のMHC分子に直接関連する。
【０１５３】
本明細書の他の箇所に記載の実施形態では、ペプチドは、適切なT細胞を生成するために、樹状細胞のMHC分子内に位置することができる。いくつかの実施形態では、細胞を、37℃、5%CO2で4時間、様々な濃度のペプチドとインキュベートすることによりMHC分子を細胞外ペプチド負荷し、次いで無血清RPMIで1回洗浄する。しかし、別の実施形態では、抗原提示細胞は、可撓性リンカーペプチドによって少なくともMHCクラスI分子アルファ鎖に連結されたペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。したがって、発現されると、融合タンパク質は、MHCクラスI結合溝を占めるペプチドを生じる。適切なMHCクラスI分子および共刺激分子は、公開データベースから入手可能である。そのような融合分子の合成のさらなる詳細は、非特許文献１９において見ることができる。ペプチドとMHC分子との融合タンパク質を発現させることの利点は、はるかに高い濃度のペプチドが抗原提示細胞の表面上に提示されることである。
【０１５４】
T細胞の調製におけるいくつかの状況では、抗原提示細胞とT細胞との間にHLA適合が存在することが好ましい。すなわち、抗原提示細胞は、T細胞のドナーがHLA陽性である対立遺伝子のMHC分子を提示する。いくつかの実施形態では、これは、第1および第2個体がHLA適合である第1個体由来の抗原提示細胞と第2個体由来のT細胞とを得ることによって達成される。
【０１５５】
しかし、代替実施形態では、抗原提示細胞およびT細胞は同一個体から得られるが、抗原提示細胞は類似のHLA対立遺伝子のMHC分子をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、リンカーを介してペプチドに連結されたMHC分子をコードするタンパク質をコードする。ヒトには多数のHLAクラスI対立遺伝子が存在し、抗原提示細胞によって提示されるMHC分子は、原則として、これらの対立遺伝子のいずれかであり得る。しかし、HLA-A*0201対立遺伝子が特によく見られるので、MHC分子はこの対立遺伝子であることが好ましい。しかし、任意のHLA-A2対立遺伝子が使用可能であり、またはHLA-A1、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A24などの他の対立遺伝子を代わりに使用してもよい。
【０１５６】
さらなる実施形態では、がんに罹患している患者への送達に適したT細胞を調製するための方法が提供される。この方法は、第1HLA対立遺伝子のHLA分子を発現する樹状細胞を提供し、HLA分子の結合溝にペプチドを配置することを含む。ペプチドは、本発明の実施形態のペプチドであってもなくてもよい。次いで、T細胞を樹状細胞で刺激するが、T細胞は、第1HLA対立遺伝子に関してHLA適合している個体から得られるまたは取得可能である。本明細書の他の箇所に記載のように、樹状細胞は第1ドナー個体から、T細胞は第2ドナー個体から得られるのいずれかであり、そこでは第1および第2ドナー個体はHLA適合する。非プロフェッショナル抗原提示細胞ではなく、樹状細胞を用いる利点は、それがT細胞のより非常に強い刺激をもたらすことである。
【０１５７】
これらの実施形態では、ペプチドは細胞型特異的ペプチドであること、すなわち、特定の細胞においてのみ、または特定の細胞において他の細胞型よりもはるかに高いレベル（例えば、少なくとも10倍高い濃度）で発現されるタンパク質から得られるペプチドであることが好ましい。
【０１５８】
本明細書に記載の実施形態に従って調製されたT細胞は、患者のがんを治療するために患者に投与される。原則として、本実施形態のT細胞は、白血病、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、多発性骨髄腫などを含む多くの異なるタイプのがんの治療に使用することができる。
【０１５９】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の実施形態のT細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬調製物が提供され、その詳細は、非特許文献２０において見ることができる。
【０１６０】
本明細書の他の箇所で論じるように、ペプチドをT細胞に提示するために使用されるMHC分子のHLA対立遺伝子は、患者によっても発現されるHLA対立遺伝子であり、したがって、T細胞が患者に投与される場合、それらはHLA対立遺伝子のMHC分子上に提示されるペプチドを認識する。
【０１６１】
いくつかの代替実施形態では、複数のセット（例えば、2または3セット）のT細胞が提供され、各T細胞は、異なるペプチドに特異的である。それぞれの場合において、本明細書の他の箇所に記載のように、T細胞は同種異系であり、すなわちT細胞の調製中にペプチドが提示されるMHC分子のHLA対立遺伝子は、T細胞が得られるドナー個体において発現されないHLA対立遺伝子である。ペプチドは、全て同一の細胞特異的タンパク質由来であってもよく、または同一の細胞型に特異的であるが異なるタンパク質由来であってもよい。いくつかの実施形態では、複数のセットのT細胞を同時投与するが、他の実施形態では、それらを順次投与する。
【０１６２】
増殖抗原特異的T細胞が参照されている。しかしながら、T細胞の重要な特徴は、T細胞上に表示されるT細胞受容体（「TCR」）であること、より具体的には、ペプチドとMHC分子との複合体に対するT細胞受容体の特異性であることが理解されるべきである。したがって、いくつかの代替実施形態では、本明細書の他の箇所に記載のようなT細胞の調製に続いて、特定のペプチドに特異的なT細胞のT細胞受容体を、特定の対立遺伝子のMHC分子と複合体形成した場合に収集し、配列決定する。次いで、T細胞受容体をコードするcDNA配列を生成し、それを使用してT細胞（例えば、患者自身のT細胞またはドナーからのT細胞）においてT細胞受容体を組み換え発現させることができる。例えば、cDNAを、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはワクシニアベクターなどのベクターに組み込んでもよい。あるいは、T細胞をトランスフェクトするために、裸のDNAまたはリポプレックスおよびポリプレックスまたはmRNAを使用するなどの非ウイルスアプローチを続けてもよい。
【０１６３】
したがって、組み換え発現されたTCRは天然に産生されるため、ドナー個体から「取得可能な」T細胞には、本明細書の他の箇所に記載の様式で組み換えにより得られるT細胞が含まれる。
【０１６４】
トランスフェクトされたT細胞もその内因性TCRを示すため、トランスフェクションの前にT細胞を事前に選択し、移植片対宿主病を引き起こす可能性のあるT細胞を排除することが好ましい。いくつかの実施形態では、T細胞を、それらの内因性TCRの特異性が分かるように事前に選択する。例えば、グリピカン-3と反応するT細胞が選択される。他の実施形態では、T細胞は患者から得られるため、患者に対して自然に寛容である。このアプローチは、患者のT細胞が健康である場合にのみ採用することができる。
【０１６５】
いくつかの別の実施形態では、T細胞受容体は、全体としては組み換え発現しないが、その結合特異性を担うT細胞受容体の領域を、これらの領域の確定を維持する構造に組み込む。より具体的には、T細胞受容体の相補性決定領域（CDR）1〜3を配列決定し、これらの配列は組み換えタンパク質中の同じ構造で維持される。
【０１６６】
一実施形態では、増殖したT細胞は、TCRおよびエピトープ／それらに関連する抗原をクローニングするための供給源を提供する。同定されたエピトープ／抗原は、ワクチンを生成するために使用することができる。一実施形態では、ワクチン接種抗原は、エピトープマッピングによって同定される特定のアミノ酸位置でポリペプチド（例えば、標的抗原）を修飾することによって構築することができる。したがって、本発明の実施形態は、エピトープマッピングによって標的抗原における修飾のために関連位置を同定する方法、標的抗原を関連位置で修飾して変異体を生成する方法、および変異体を別個の候補調製物に含める方法を含む。
【０１６７】
ワクチン接種抗原ポリペプチドは、特許文献１５および特許文献１６に詳細に開示されているものを含む多くの方法によってエピトープマッピングされ得る。要約すると、これらの方法は、エピトープパターンのデータベース（抗タンパク質抗体に特異的に結合することが知られているペプチド配列の入力から決定される）と、所与のタンパク質の3-D構造をエピトープパターンデータベースに対して分析するアルゴリズムとを使用する。これは、そのタンパク質上の可能なエピトープ、およびエピトープの一部となるタンパク質配列中の各アミノ酸の選好を決定する。
【０１６８】
別の態様では、候補MHCクラスIIエピトープを同定するための方法が提供される。特定の実施形態では、候補エピトープ同定用コンピューター実装アルゴリズムを使用して、候補エピトープを同定することができる。そのようなコンピュータープログラムには、例えば、TEPITOPEプログラム（例えば、非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５を参照）、ならびに他のコンピューター実装アルゴリズムが含まれる。
【０１６９】
候補エピトープ同定用コンピューター実装アルゴリズムは、例えば、単一タンパク質において、非常に大きなタンパク質において、関連タンパク質群（例えば、相同体、オーソログ、もしくは多型変異体）において、非関連タンパク質の混合物において、組織または器官のタンパク質において、または生物のプロテオームにおいて、候補エピトープを同定することができる。このアプローチを、既知候補分子標的の分析に加えて、T細胞エピトープの同定のための効率的で、感度が高く、特異的なアプローチとして使用し、発現されたタンパク質の配列情報（例えば、推定オープンリーディングフレームまたはcDNAライブラリーから）に基づいて複雑な組織または生物を調べることが可能となる。
【０１７０】
候補エピトープの同定に続いて、候補エピトープ（単数または複数）に対応するペプチドまたはペプチドのプールを形成することができる。例えば、一旦候補エピトープが同定されると、候補エピトープまたはその一部に及ぶオーバーラップペプチドを調製し、MHCクラスII分子によるエピトープの結合を確認し、必要に応じてそのエピトープの同定を改善することができる。あるいは、ペプチドのプールを、候補エピトープ同定用コンピューター実装アルゴリズムを用いて同定された複数の候補エピトープを含むように調製することができる。
【０１７１】
（T細胞エピトープペプチド）
T細胞エピトープペプチド／結合ペプチド／ペプチドは、タンパク質抗原に由来し得る短いペプチドである。細胞を提示する抗原は、表面MHC分子を介して抗原に直接結合することができ、および／または抗原を内在化し、それをMHC分子に結合する能力がある短い断片に処理することができる。MHCに結合するペプチドの特異性は、ペプチドと特定のMHC分子のペプチド結合溝との間の特異的相互作用に依存する。
【０１７２】
MHCクラスI分子に結合するペプチドは、通常6〜30アミノ酸、より一般的には7〜20アミノ酸または8〜15アミノ酸の長さである。ペプチドのアミノ末端アミン基は、ペプチド溝の一端の不変部位と接触し、カルボキシ末端のカルボキシレート基は、溝の他端の不変部位に結合する。したがって、典型的には、そのようなペプチドは、疎水性または塩基性カルボキシ末端を有し、極限アミノ末端にプロリンがない。ペプチドは、溝に沿って延長された確定状態にあり、主鎖原子と溝に並ぶ保存されたアミノ酸側鎖との間のさらなる接触を有する。ペプチド長の変化は、しばしばプロリンまたはグリシン残基でのペプチド主鎖のねじれによって適応される。
【０１７３】
MHCクラスII分子に結合するペプチドは、通常、少なくとも10アミノ酸、例えば約13〜18アミノ酸の長さであり、ずっと長くすることができる。これらのペプチドは、両末端が開いているMHCIIペプチド結合溝に沿って延長した確定状態にある。ペプチドは、主に、ペプチド結合溝に並ぶ保存された残基との主鎖原子の接触によって適所に保持される。
【０１７４】
本明細書の実施形態で使用されるペプチドは、化学的方法を用いて作製されてもよい。例えば、ペプチドを、固相技術（非特許文献２６）によって合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えば、ABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin Elmer）を使用して、製造業者が提供する指示書に従って完了することができる。
【０１７５】
あるいは、ペプチドは、組み換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製されてもよい。例えば、ペプチドを、全長グリピカン-3タンパク質からの切断によって得てもよい。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認され得る。
【０１７６】
本明細書の実施形態で使用されるペプチドは、抗原提示細胞およびT細胞を含む抗原提示系において試験することができる。例えば、抗原提示系は、ネズミ脾細胞調製物、扁桃由来のヒト細胞またはPBMCの調製物であってもよい。あるいは、抗原提示系は、特定のT細胞株／クローンおよび／または特定の抗原提示細胞型を含み得る。
【０１７７】
T細胞の活性化は、T細胞増殖（例えば、3Hチミジン取込みを用いて）またはサイトカイン産生を介して測定することができる。TH1型CD4+T細胞の活性化は、例えば、ELISPOTアッセイなどの標準技術によって検出され得るIFN-γ産生を介して検出することができる。
【０１７８】
免疫応答中の抗原特異的T細胞の測定は、ワクチン開発、自己がん治療、移植、感染症、炎症、自己免疫、毒性研究などにおける重要なパラメーターである。ペプチドライブラリーは、抗原特異的T細胞のモニタリングにおいて重要な試薬である。本発明の実施形態は、試料中のT細胞の分析におけるペプチドライブラリーの使用のための改良された方法を提供し、診断、予後および免疫モニタリング方法を含む。さらに、抗腫瘍治療におけるペプチドライブラリーの使用は、本明細書の他の箇所に記載されており、望ましくない標的細胞の不活性化または排除が可能な抗原特異的T細胞の単離、または他の免疫細胞の調節が可能な特異的T細胞の単離を含む。本発明の実施形態は、1つ以上の腫瘍由来ペプチドを含むMHC多量体にも関する。
【０１７９】
特定の抗原ペプチドの同定は、がんに対する診断および治療戦略の開発のための新たな機会を提供する。有利には、新規なT細胞エピトープの同定は、どちらも免疫モニタリングの高感度化を実現する分析ツールとして有用なMHCクラスIおよびクラスII多量体、四量体および五量体の産生を可能にする。さらに、疾患の再発のリスクがある個体の末梢における抗原特異的CTLの検出は、有用な診断ツールである。
【０１８０】
実施形態は、がん治療に有用なペプチドを同定するための組成物および方法も提供する。HLA-A*0201に結合すると予測される候補タンパク質由来のペプチド配列は、コンピューターアルゴリズムによって同定することができる。ペプチドは、500nM以下のカットオフ値で予測される親和性に従って合成用に選択されるが、より高い値も選択され得る。ペプチドを合成し、HLA-A*0201への結合を、生化学アッセイを用いて確認することができる。ペプチド結合を、100%と指定された合否対照ペプチド、および陽性対照ペプチドで得られた結合と比較する。対応するHLA-A*0201-ペプチド多量体も、合否対照ペプチドよりも高い結合親和性を有するペプチドについて合成する。これらのペプチドを、特異的ペプチド-HLA-A*0201複合体と特異的に反応するT細胞株を生成する能力について試験する。細胞株は、多量体、四量体、または五量体陽性T細胞と呼ぶことができる。多量体陽性細胞は、対応するペプチドに対する高い免疫原性を示す。さらなる応答を測定して、サイトカインINF-γの産生、標的細胞の脱顆粒および死滅を評価することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ペプチドをワクチンとして患者に直接投与することができる。したがって、ペプチドは、特異的タンパク質の免疫原性エピトープであり、それらのそれぞれのタンパク質に対するT細胞応答を誘発するために使用される。いくつかの実施形態では、実施形態のポリペプチドをワクチンとして患者に直接投与する。例えば、白血病の患者では、造血細胞特異的タンパク質由来のペプチドを含むポリペプチドを、そのタンパク質に対するT細胞応答を誘発するために患者に投与する。T細胞応答は、がん性細胞を含む造血細胞の死をもたらすが、これらの細胞に特異的であり、他の細胞型に対する免疫応答をもたらすことはない。
【０１８２】
多くの患者において、そのようなペプチドを直接投与しても、細胞特異的タンパク質が「自己タンパク質」であり、ポリペプチドに結合する能力があるどのT細胞も、患者のHLA対立遺伝子のMHC分子上に提示された場合に寛容化されるため、T細胞応答は誘発されないことにも留意すべきである。すなわち、反応性である可能性のあるT細胞は、選択過程中に患者の胸腺で破壊されるか、または中枢もしくは末梢の耐性機構によって不活性化される。したがって、本明細書のペプチドを使用して、同種異系ドナー個体から得られるまたは取得可能であるT細胞を生成することが好ましい。この個体は、好ましくは、患者のがHLA陽性であるHLA対立遺伝子についてHLA陰性であるべきである。例えば、患者がHLA対立遺伝子HLA-A*0201についてHLA陽性である場合、HLA-A*0201について陰性である個体からT細胞を得る。ドナー個体は、その他では患者とHLA-適合であることが一般に好ましい。次いで、HLA-A*0201対立遺伝子のMHC分子を提示し、ペプチドで負荷された抗原提示細胞（APC）が提供される。次いで、ドナー個体のT細胞をAPCで刺激し、得られた細胞を増殖させる。
【０１８３】
次いで、HLA-A*0201抗原と複合体を形成している場合に本明細書で使用されるペプチドに結合する能力がある増殖したT細胞を、複数のペプチド-MHC分子（例えば、五量体または四量体）を含む人工構造物を用いて濃縮する。T細胞の混合物中の特定のペプチド-HLA-A*0201複合体に特異的なT細胞は、それらと混合されたときに、これらの構造物に結合する能力を有する。続いて、T細胞を、人工構造物に結合する能力を有する磁気ビーズと混合する。次いで、それらに結合した人工構造物およびT細胞を、ビーズの磁気引力によって残りの混合物から除去する。
【０１８４】
（治療）
抗原特異的T細胞を、毎日数回の頻度で動物に投与することができ、または1日1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回などの低い頻度で、もしくは数ヶ月に1回、さらには1年に1回もしくはそれ以下などのさらにより低い頻繁で投与してもよい。投薬の頻度は、当業者には容易に明らかであり、限定されるものではないが、治療される疾患のタイプおよび重症度、動物の種類および年齢などの任意の数の要因に依存する。
【０１８５】
抗原特異的T細胞を、様々な他の化合物（とりわけ、サイトカイン、化学療法剤および／または抗ウイルス剤など）と同時投与してもよい。あるいは、化合物（単数または複数）を、抗原特異的T細胞の1時間前、1日前、1週間前、1ヶ月前もしくはそれ以上前に投与してもよく、またはその任意の順列で投与してもよい。さらに、化合物（単数または複数）を、抗原特異的T細胞の投与の1時間後、1日後、1週間後もしくはそれ以上後に投与してもよく、またはその任意の順列で投与してもよい。頻度および投与計画は、当業者には容易に明らかであり、限定されるものではないが、治療される疾患のタイプおよび重症度、動物の年齢および健康状態、投与される1つまたは複数の化合物の同一性、種々の化合物および抗原特異的T細胞の投与経路などの任意の数の要因に依存する。
【０１８６】
治療方法において、抗原特異的T細胞組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のためのものであってもよい。予防的に提供する場合、組成物を任意の症状の前に提供するが、特定の実施形態では、1つ以上の症状の発症後にワクチンを提供し、さらなる症状が発症するのを防止するか、または現症状が悪化するのを防ぐ。組成物の予防的投与は、その後の感染または疾患を予防または改善するのに貢献する。治療的に提供する場合、医薬組成物を、感染症または疾患の症状の発症時または発症後に提供する。したがって、本発明のT細胞組成物を、疾患誘発剤への予想されるばく露の前もしくは疾患状態の前に、または感染もしくは疾患の発症後のいずれかに提供してもよい。
【０１８７】
組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を得る量であり、そのような量は、当業者によって型通りの事項として決定され得る。例えば、がんまたは病原体に対する免疫系不全を治療するのに有効な量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原へのばく露時に抗原特異的免疫応答の発生をもたらすのに必要な量である。本用語は、「十分な量」と同義語でもある。
【０１８８】
任意の特定の適用のための有効量は、治療される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体の大きさ、および／または疾患もしくは状態の重症度などの要因によって異なる。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、本発明の実施形態の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【実施例】
【０１８９】
好ましい実施形態を、以下の実験例を参照してさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供しており、特記しない限り、限定することを意図するものではない。したがって、好ましい実施形態は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１９０】
さらなる説明がない限り、当業者は、前述の説明および以下の実施例を用いて、本発明の実施形態を作製および利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、好ましい実施形態を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１９１】
（実施例１：DC1ワクチン接種を受けた乳がん患者における抗HER2 CD4+Th1応答の回復）
以下の研究を設計し、アジュバント1型極性化樹状細胞（「DC1」）ワクチン接種の役割を調査した。
【０１９２】
（ネオアジュバント療法後に残存疾患を有するHER2+IBC患者のDC1ワクチン接種）
ネオアジュバント療法後に残存疾患を有する4人のHER2+IBC患者は、アジュバントHER2パルスDC1ワクチンを受けた。各患者のTh1免疫応答を、DC1ワクチン接種前、DCワクチン接種3ヶ月後、およびワクチン接種6ヶ月後に決定し、6つのHER2クラスIIペプチド（配列番号1〜6）でパルスした患者PBMCから、上記のようにELISPOTを介してIFNγ産生を測定することにより生成した。自己DC1ワクチンを前述のように調製した。応答は、（1）全体的な抗HER2応答性（≧1のペプチドに応答する）、（2）反応性ペプチドの数（応答レパートリー）、および（3）6つのHER2ペプチドにわたる累積応答で評価した。
【０１９３】
（結果：）
応答性：刺激を受けていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェル中＞20SFC/106細胞として定義される免疫応答を、ワクチン接種前には1人のIBC患者しか示さなかった。ワクチン接種前の結果と比較して、全てのワクチン接種を受けたIBC患者は、抗HER2 IFN-γposThl応答における＞2倍の増加として定義される免疫応答を示した。
【０１９４】
応答レパートリー：図１は、ワクチン接種前の0.5±1ペプチドから、3ヶ月後には3.25±0.96ペプチド（p=0.01）、および6ヶ月後には4±0.8ペプチド（p=0.01）に増加した平均レパートリーを示す。
【０１９５】
累積応答：図２は、ワクチン接種前の36.5±38.3SFC/106から、3ヶ月後には151.0±60.0SFC/106（p=0.04）、および6ヶ月後には198.4±39.7SFC/106（p=0.02）に改善した平均累積応答を示す。
【０１９６】
（結論：）
ネオアジュバント化学療法での治療後に残存疾患を有するHER2+IBC患者のHER2パルスDC1ワクチン接種は、抗HER2 Th1免疫応答を高める。
【０１９７】
抗HER2 Th1免疫応答は、幅（応答レパートリー）および深さ（累積応答）の両方で増加する。
【０１９８】
（実施例２：HER2-特異的Th1細胞のin vitroでの増殖）
以下の研究を設計し、抗HER2 Th1免疫を回復させる上での養子T細胞移植の役割を調査した。T細胞を、抗原特異性および細胞機能を維持しながら、養子療法およびエピトープマッピング研究に必要なレベルまで増殖させる。
【０１９９】
簡潔には、in vitroで、HER2特異的Th1細胞を、HER2ペプチドパルスDC1との共培養により生成し、IL-2単独またはIL-2、IL-7およびIL-15を用いて増殖させた。続いて、Th1細胞を、反復HER2-ペプチドパルスDC1共培養または抗CD3/CD28刺激のいずれかによって増殖させた。増殖倍率を、以下のように定義した：（増殖後の#T細胞／増殖前の#T細胞）；ELISAによる抗原特異的IFNγ産生により特異性を測定した。
【０２００】
本明細書に示されるように、IL-2、IL-7およびIL-15で刺激されたHER2ペプチドパルスDC1とのCD4+T細胞の反復共培養は、高度に特異的な抗HER2 Th1細胞の有意な増殖をもたらし、養子移植用細胞の潜在的な集団を提供する。特定のペプチド特異的DC1ならびにIL-2、IL-7、およびIL-15刺激との共培養は、リンパ節環境を模倣し、抗原特異的Th1細胞の任意の集団を有意に増殖するために使用され得る。
【０２０１】
いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、被験体がタンパク質抗原（例えば、腫瘍標的抗原）に対してワクチン接種を受ける場合、ワクチン接種後に被験体から血液を除去し、採取することができると考えられる。採取した血液は、樹状細胞前駆体ならびに腫瘍標的抗原に特異的な低レベルのT細胞を含む。DC前駆体およびT細胞を互いに分離する。DC前駆体を、腫瘍標的タンパク質／抗原で負荷／パルスし、次いでDC1状態に活性化することができる。次いで、抗原特異的DC1をT細胞と共培養し、サイトカイン（IL-15、IL-7およびIL-2）を適切な順序で共培養物に添加する。このサイクルを、T細胞が十分な数（例えば、1×109）に増殖するまで毎週繰り返すことができる。T細胞を元の被験体に供給し、被験体の体が自然に産生できない多量のT細胞を被験体に注入する。抗原特異的T細胞のこの大規模な部隊は、強い抗腫瘍活性を有することができる。
【０２０２】
（実施例３：T細胞を増殖するための方法）
（HER2特異的DC1の調製：）
前述のように、HER2ペプチドパルスDC1ワクチンでワクチン接種されたHER2乳がん患者（DCIS）からDC前駆体を得た。DC前駆体は、タンデム白血球除去療法／向流遠心溶出法によって得た。DCを、3×106細胞で、GM-CSF 50ng/ml（Berlex社、リッチモンド、カリフォルニア州）を有する1mlマクロファージ無血清培地（SFM-Gibco Life Technologies社、カールズバッド、カリフォルニア州）中37℃でインキュベートした。細胞を最初に播種した48〜72時間後に、DCを、単一HER2ペプチド抗原（42-56,98-114,328-345,776-790,927-941,1166-1180（配列番号1〜6））；20μg/ml）でパルスした。成熟のために、DCを、6時間後にIFN-γ（1000U/ml）で、次の日にリポ多糖（「LPS」）（10ng/ml）でさらに活性化させた。HER2特異的DC1を、LPS投与の6時間後に、最大のIL-12産生時点で採取した。
【０２０３】
（CD4+T細胞の調製：）
リンパ球を、タンデム白血球除去療法／向流遠心溶出法により、事前にワクチン接種（HER2-パルスDC1ワクチン接種）を受けた乳がん患者からも得た。CD4+T細胞は、ヒトCD4+T細胞Enrichment Kit（Stemcell Technologies社；バンクーバーBC、カナダ）を用いる陰性選択により精製した。CD4+T細胞を、2x106細胞/mlで、培養培地（イスコフ培地、1%L-グルタミン、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸、Mediatech；マナッサス、バージニア州、および5%熱不活性化ヒトAB血清）中に再懸濁した。
【０２０４】
（DC1-CD4+共培養：）
DC1を、CD4+T細胞と共に、1:10の比率（2×105個のDC1/mlと2×106個のCD4+T細胞/ml）で24ウェルプレートに播種し、37℃でインキュベートした。組み換えヒトIL-7（10ng/ml）およびIL-15（10ng/ml）（BioLegend社；サンディエゴ、カリフォルニア州）を、共培養の48〜72時間後に添加した。IL-7およびIL-15を添加してから24時間後に、組み換えヒトIL-2（5U/ml）を添加した。
【０２０５】
（試験用のHER2特異的iDCおよび再刺激用のHER2特異的DC1：）
DCのさらに2つの群を、上記のように調製した。1つの群では、各ウェルを単一ペプチド抗原（20ug/ml）でパルスし、未成熟DC（「iDC」）とみなした。第2群では、各ウェルを単一ペプチド抗原（20μg/ml）でパルスし、上記のようにDC1に成熟させた。前のDC1共培養の7〜9日後に、HER2特異的CD4+T細胞を採取した。ELISA試験用に、T細胞をiDCと共培養した。インターフェロンガンマ産生を、ELISAアッセイによって、製造業者の推奨およびプロトコルに従って測定した。T細胞もDC1と共培養し、上記のようにIL-7/15およびIL-2で刺激した。このサイクルを、CD4+T細胞とHER2特異的DC1との共培養と共に合計4回繰り返した。
【０２０６】
（増殖方法の概要：）
前述のように、HER2特異的DC1を開発する
1日目：単球を培養する（各ペプチドの1つのウェル）
4日目：HER2特異的DC1を成熟させる
AM：抗原（20μg/ml）でパルスする。
PM（6時間後）：IFN-γを添加する
5日目：CD4+T細胞およびDC1共培養物を精製する。
AM：LPS
6時間後：共培養：2x106個のCD4+T細胞と2x105個のDC1
*共培養の48〜72時間後：IL-7（10ng/ml）およびIL-15（10ng/ml）を添加する
IL-7/15を添加してから24時間後：IL-2（5U/ml）を添加する
（IL-2単独条件では、IL-2を共培養の72〜96時間後に添加した（IL-2がIL2/7/15群に加えられたのと同時に）
ELISA試験用のHER2特異的iDCならびに再刺激用のHER2特異的DC1の両方を作る
9日目〜11日目：単球を培養する（各ペプチドの2つのウェル）
単球を培養してから48時間後：HER2特異的未成熟DCを処理し、DC1を成熟させる
iDC：抗原（20μg/ml）でパルスする（将来のiDCおよびDC1に同時に与えられる）
DC1：AM：抗原（20μg/ml）でパルスする。
PM（6時間後）：IFN-gを添加する
翌日：iDC共培養およびDC1共培養（すなわち、DC1共培養の7〜9日後）
DC1：AM：LPS
HER2特異的CD4+T細胞を採取する
HER2特異的iDCを採取する
→共培養：2x106個のCD4+T細胞と2x105個のiDC
HER2特異的DC1を収穫する
→共培養：2x106個のCD4+T細胞と2x105個のDC1
翌日：iDC共培養物にELISAを実行する
上記過程を繰り返す；IL7/15刺激時に再開する（*）
【０２０７】
（結果：）
図３〜１６に結果を示す実験および研究において、上述の方法を使用した：
【０２０８】
図３および図４は、IL-2で刺激したHER2特異的DC1対IL-2/7/15で刺激したもので共培養したCD4+T細胞間の直接比較を、HER2パルスDC1ワクチン接種を受けた2人の異なる患者についてそれぞれ示す。
【０２０９】
簡潔には、それぞれの患者由来の未成熟DC（「iDC」）を、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。赤い外枠は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す。したがって、図３では、特異性は、ペプチド42-56-IL2/7/15プロトコル；ペプチド98-114-IL-2プロトコルおよびIL-2/7/15プロトコル、ペプチド328-345両プロトコル、ならびにペプチド776-790、両プロトコルで示された。図４では、特異性は、ペプチド776-790、両プロトコルのみで示された。増殖倍率（増殖後のT細胞数／増殖前のT細胞数として定義される）を示すグラフを、各図の右側に示す。一般に、それぞれの増殖倍率データによって示されるように、IL-2/7/15刺激の増殖倍率は、IL-2刺激単独よりも大きかった。特異性は、抗原特異的IFN-γ産生によってELISAにより測定した。
【０２１０】
図５および図６は、特異的応答に続いて非特異的免疫応答を示す：図５は、HER2特異的DC1での1回目の刺激／増殖に続く特異的応答を示し、図６は、非特異的抗CD3/CD28での2回目の刺激／増殖後のその特異的応答のその後の消失を示す。
【０２１１】
HER2特異的DC1でのCD4+T細胞の1回目の刺激は、図５の赤い外枠によって示されるように、複数の特異的免疫応答をもたらした：ペプチド42-56、IL2/7/15プロトコル；ペプチド98-114、両プロトコル、ペプチド328-345、両プロトコル、およびペプチド776-790、両プロトコル。図６は、非特異的抗CD3/CD28刺激でのHER2特異的CD4+T細胞の2回目の刺激が4倍の増殖をもたらしたが（横グラフ）、ペプチド群の3/4で特異性が失われたことを示す（ペプチド328-345のみがCD3/28増殖後に特異性を示した）。患者由来のiDCを、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、上記のようにDC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。
【０２１２】
図７および図８は、非特異的免疫応答に続いて特異的免疫応答を示す：図７は、CD4+T細胞の非特異的増殖を示す。図８は、HER2特異的DC1でのその後の刺激の後に特異性を得ることができないことを示す。非特異的抗CD3/CD28でのCD4+T細胞の1回目の刺激は、3.8倍の増殖をもたらした（図７）。HER2特異的DC1での非特異的CD4+T細胞の2回目の刺激は、特異的免疫応答をもたらさなかった（図８）。患者由来のiDCを、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド328-345（配列番号3）、およびペプチド776-790（配列番号4）でパルスし、上記のようにDC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。
【０２１３】
図９Ａおよび図９Ｂは、HER2特異的Th1細胞のin vitroでの一次／1回目の増殖を示し、IL-2で増殖させたHER2特異的DC1対IL-2/7/15で増殖させたものと共培養したCD4+T細胞を比較している。iDCを、以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5）でパルスし、DC1に成熟させた。次いで、得られたHER2パルスDC1をCD4+T細胞と共培養し、表示のようにIL-2単独またはIL-2/7/15で刺激した。赤い外枠（図９Ｂ）は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す。図９Ａは、Th1細胞の平均増殖倍率（増殖後のT細胞数／増殖前のT細胞数として定義される）が、IL-2、IL-7、およびIL-15で刺激した場合に、IL-2単独でよりも有意に良好であった（2.6±0.75対1.0±0.12；p=0.001）ことを表す。図９Ｂは、抗原特異的IFN-γ産生によってELISAにより測定される様々なペプチド／増殖プロトコルの特異性を示す。IL-2、IL-7、およびIL-15での刺激ならびにIL-2単独での刺激は両方とも、同じHER2ペプチド776-790において特異的Th1応答をもたらした。
【０２１４】
一次増殖の要約：IL-2対IL-2/7/15。Th1細胞の平均増殖倍率は、IL-2、IL-7、およびIL-15で刺激した場合に、IL-2単独でよりも有意に良好であった（2.6±0.75対1.0±0.12；p=0.001）（図９Ａ）。IL-2、IL-7、およびIL-15での刺激ならびにIL-2単独での刺激は両方とも、同じHER2ペプチド（ペプチド776-790）において特異的Th1応答をもたらした（図９Ｂ）。
【０２１５】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、HER2パルスDC1対抗CD3/CD28のin vitroでの二次／2回目の増殖を示す。HER2-ペプチドパルスDC1および抗CD3/CD28でのTh1細胞の再刺激は、それぞれ同様の増殖倍率（3.9±1.0対4.3±2.0、p=0.7）をもたらした（図１０Ａ）。しかしながら、図１０Ｂは、HER2特異的DC1でのTh1細胞の刺激は特異的Th1応答を増強したが；それに対して、抗CD3/CD28での非特異的刺激はHER2ペプチド特異性の全体的な消失をもたらしたことを示す。以下のMHCクラスIIペプチド：ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5）を使用した。赤い外枠（図１０Ｂ）は、特異性が示された（特異的抗原：対照抗原IFN-γ産生の比が2：1より大きい）特異的ペプチドおよび刺激プロトコルを表す（すなわち、ペプチド42-56特異的Th1細胞およびペプチド776-790特異的Th1細胞のDC1再刺激）。
【０２１６】
二次増殖の要約：HER2ペプチドパルスDC1対抗CD3/CD28。HER2-ペプチドパルスDC1および抗CD3/CD28でのTh1細胞の再刺激は、それぞれ同様の増殖倍率（3.9±1.0対4.3±2.0、p=0.7）をもたらした（図１０Ａ）。しかしながら、HER2特異的DC1でのTh1細胞の刺激は特異的Th1応答を増強したが、それに対して、抗CD3/CD28での非特異的刺激はHER2ペプチド特異性の全体的な消失をもたらした（図１０Ｂ）。
【０２１７】
HER2パルスDC1でのTh1細胞の三次増殖。表示のHER2特異的DC1での3回目の刺激の後、平均増殖倍率（4.32±0.5、43.7倍の累積増殖（図１１Ａ）および抗原特異性（図１１Ｂ）の両方が再び増加し、特に4つのペプチド全て（ペプチド42-56（配列番号1）、ペプチド98-114（配列番号2）、ペプチド776-790（配列番号4）、およびペプチド927-941（配列番号5））が特異性を示し、IFN-γ産生を増加させた。
【０２１８】
三次増殖の要約：HER2ペプチドパルスDC1。HER2特異的DC1での3回目の刺激の後、平均増殖倍率（4.32±0.5、43.7倍の累積増殖（図１１Ａ）ならびに特異性 - 特異的ペプチドの数およびIFN-γ産生の両方（図１１Ｂ）ともに再び増加した。
【０２１９】
全体として、同じ数のT細胞を有する図９Ｂ、１０Ｂおよび１１Ｂにおいて、IFN-γ産生は対数的に増殖ごとに上昇することが見られた。2回目の刺激の非特異的CD3/CD28（図１０Ｂ）では、特異性の全体的な消失も見られた。細胞はTh1表現型として増殖し、各刺激でより特異的かつより強くなった50〜200倍の増殖（図９Ａ、１０Ａおよび１１Ａ）を伴った。
【０２２０】
図１２〜１５は、IL-2/7/15でのHER2特異的CD4+Th1細胞の反復in vitro刺激（4回）の連続的結果を示す。図１２〜１５に示される全ての結果について、それぞれの左のパネルは、IFN-γ産生によるペプチド特異性を示す（「Tet」は破傷風患者対照である）；それぞれの右のパネルは、使用された特異的HER2-ペプチドの増殖倍率を示す。図１２では、上述の研究で使用した他の5つに加えて、さらなるMHCクラスIIペプチドを用いてiDCをパルスした：ペプチド1166〜1180（配列番号6）。しかし、増殖倍率の結果（図１２、右のパネル）に見られるように、ペプチド328-345特異的Th1細胞およびペプチド1166-1180特異的Th1細胞はさらなる増殖に十分な細胞を産生せず、したがって、あとの4つのペプチドに特異的なHER2 Th1細胞のみを使用した。
【０２２１】
続いて、1回目の刺激についての図１２では、ペプチド776-790特異的Th1細胞に対してのみ特異性を示す；2回目の刺激についての図１３では、ペプチド776-790特異的Th1細胞に加えて、ペプチド42-56に対する特異性の増加を示す；3回目の増殖についての図１４では、4つ全てのペプチド特異的Th1細胞（ペプチド42-56、ペプチド98-114、ペプチド776-790、およびペプチド927-941）に対する特異性を示し、4回目の増殖についての図１５では、ペプチドの1つ（ペプチド927-941）に対する特異性の消失を示し、あとの3つのHER2特異的ペプチドは残っている（ペプチド42-56、ペプチド98-114、ペプチド776-790）。
【０２２２】
図１６は、全てのHER2特異的Th1細胞について、図１２〜１５に示す4つの増殖の累積増殖倍率を示し、各群の最後の棒線（点）が累積増殖倍率を示している。平均累積倍率は100倍を超えていた。
【０２２３】
（結論：）
IL-2、HL-7、およびIL-15で刺激されたHER2-ペプチドパルスDC1とのCD4+T細胞の反復共培養は、高度に特異的な抗HER2 Th1細胞の有意な増殖をもたらし、養子移植用細胞の潜在的な集団を提供する。
【０２２４】
全4回の刺激のそれぞれの刺激は、いずれかの限界に達することなく、増殖倍率の増加および抗原特異性の増加の両方をもたらした。実際、100〜400倍の増殖が示された。
【０２２５】
ペプチド特異的DC1ならびにIL-2、IL-7、およびIL-15刺激との共培養は、リンパ節環境を模倣し、抗原特異的Th1細胞の任意の集団を有意に増殖するために使用され得る。当業者であれば、T細胞増殖に関する本発明の実施形態は、決してCD4+t細胞に限定されないことを容易に認識するであろう。したがって、本発明の実施形態は、CART細胞、細胞傷害性Tリンパ球（CD8+）ならびに他の全種類のT細胞を増殖させるための方法を提供する。
【０２２６】
本明細書に示す結果は、ネオアジュバント化学療法での治療後に残存疾患を有するHER2+IBC患者のHER2パルスDC1ワクチン接種は、抗HER2 Th1免疫応答を高めることを実証する。抗HER2 Th1免疫応答は、幅（応答レパートリー）および深さ（累積応答）の両方で増加する。HER2特異的Th1細胞の養子移植は、CD4+Th1免疫応答を復活させる役割を果たし得る。IL-2、IL-7およびIL-15で刺激されたHER2-ペプチドパルスDC1での反復共培養は、高度に特異的な抗HER2 Th1細胞の有意な増殖をもたらすことができる。
【０２２７】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
本開示は、例示および説明を目的として提示されているが、消耗または限定を意図したものではない。多くの修正および変形が当業者には明らかであろう。本実施形態は、原理および実用的な適用を説明し、当業の他の人々が、意図される特定の用途に適した様々な修正を伴う様々な実施形態の開示を理解できるようにするために選択および記載された。
【０２２９】
例示的な実施形態は、添付の図面を参照して本明細書に記載されているが、実施形態はそれらの特定の説明に限定されず、本開示の範囲または精神を逸脱することなく、様々な他の変更および修正が当業者によって考案され得ることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および等価物の変形の全てを含むと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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