(57)【要約】本発明は、広範にわたる工業的および医学的に重要な酵素から選択される１種以上の酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための機械、組成物、および方法を提供する。ＢＮＣは自己集合されたかつ磁気固定化された酵素である。機械、組成物、および方法は、卓上製造量から工業製造量まで十分に拡張可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．酵素容器と、
ｂ．磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）容器と、
ｃ．酵素ポンプと、
ｄ．ＭＮＰポンプと、
ｅ．ＭＮＰディスラプターと、
ｆ．ＢＮＣミキサーと、
を含む、バイオナノ触媒（ＢＮＣ）の自動製造機械であって、
前記酵素容器が酵素調製物を保持するように操作可能であり、前記酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒し、前記ＭＮＰ容器がＭＮＰ調製物を保持するように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプが前記ＭＮＰ調製物を前記ＭＮＰディスラプターに送るように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプが複数の破砕ＭＮＰを前記ＭＮＰディスラプターから前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、前記酵素ポンプが酵素調製物を前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、前記ミキサーが前記破砕ＭＮＰと酵素調製物とを混合して前記ＢＮＣを形成するように操作可能である、機械。
【請求項２】
前記ＭＮＰディスラプターがソニケーターである、請求項１に記載の機械。
【請求項３】
前記ソニケーターがソニケーターコイルと超音波処理容器とをさらに含み、前記ソニケーターコイルが、前記超音波処理容器内で前記ＭＮＰを超音波処理するように操作可能である、請求項２に記載の機械。
【請求項４】
前記ソニケーターがインラインソニケーターである、請求項２に記載の機械。
【請求項５】
前記ソニケーターを冷却するように操作可能な冷却システムをさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の機械。
【請求項６】
前記冷却システムが水冷システムである、請求項５に記載の機械。
【請求項７】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを機械的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項８】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを磁気的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項９】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを熱的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項１０】
前記ＢＮＣミキサーがミキシングティーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１１】
前記ＢＮＣミキサーがミキシングコイルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１２】
前記酵素ポンプが機械力または重力により前記酵素調製物を前記ＢＮＣミキサーに送る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１３】
前記ＭＮＰポンプが機械力または重力により前記ＭＮＰ調製物を前記ＭＮＰディスラプターに送る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１４】
骨格材容器内で磁気骨格材調製物と前記ＢＮＣとを混合してレベル２集合体中のＢＮＣを製造するように操作可能な磁気骨格材容器をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１５】
前記磁気骨格材容器が前記ＢＮＣと前記骨格材とを機械的に混合するように操作可能である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１６】
前記磁気骨格材容器が前記ＢＮＣと前記骨格材とを磁気的に混合するように操作可能である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１７】
前記磁気レベル２集合体が磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１８】
安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣを集合させるためのテンプレーターをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１９】
前記レベル２集合体に磁気がある、請求項１８に記載の機械。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の前記機械を用いて前記ＭＮＰ調製物と前記酵素調製物とを組み合わせる工程を含む、ＢＮＣの製造方法であって、前記酵素調製物が、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、イソメラーゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、方法。
【請求項２１】
前記ＢＮＣが約１ｍｌ未満の量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＮＣが約１ｍｌ〜１０ｍｌの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＢＮＣが約１０ｍｌ〜１００ｍｌの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＣが約１００ｍｌ〜１リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＮＣが約１リットル〜１０リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＢＮＣが約１０リットル〜１００リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢＮＣが約１００リットル〜１０００リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＢＮＣが約１キロリットル〜１０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＮＣが約１０キロリットル〜２０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＢＮＣが約２０キロリットル〜５０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＢＮＣが約５０キロリットル超の量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣをテンプレート化する工程をさらに含む、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）と、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素と、を含む自己集合バイオナノ触媒（ＢＮＣ）組成物であって、前記酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒する、ＢＮＣ組成物。
【請求項３４】
前記酵素が約５〜２，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度であり、かつ前記ＭＮＰが約５０〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３３に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３５】
前記酵素が約５〜１５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３６】
前記酵素が約５〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３５に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３７】
前記酵素が約５〜５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３６に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３８】
前記酵素が約１００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３９】
前記ＭＮＰが約５００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３８に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４０】
前記ＭＮＰが約１０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３９に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４１】
前記ＭＮＰが約５０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項４０に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４２】
前記ＭＮＰが約１０，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項４１に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４３】
前記ＭＮＰが約５０００〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４４】
安定化レベル２集合体をさらに含む、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４５】
前記レベル２集合体に磁気がある、請求項４４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４６】
前記磁気レベル２集合体が磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である、請求項４５に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４７】
前記ＢＮＣと前記拡散性基質とを接触させる工程と、前記拡散性生成物を捕集する工程と、を含む、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のＢＮＣ組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範にわたる工業的および医学的に重要な酵素から選択される１種以上の酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための機械、組成物、および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
磁気酵素固定化は、酵素の周りに自己集合するメソ多孔性磁気クラスター中への酵素の封入を含む。固定化効率は、酵素およびナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面、ならびに接触時間をはじめとするいくつかの因子に依存する。バイオ触媒プロセスで工業目的に使用される酵素は、きわめて効率的、プロセス前およびプロセス中に安定、数回のバイオ触媒サイクルに再使用可能、かつ経済的でなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、広範にわたる工業的および医学的に重要な酵素から選択される１種以上の酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための機械、組成物、および方法を提供する。ＢＮＣは、自己集合されて磁気ナノ粒子中に酵素を磁気固定化する。方法は、固定化時の酵素活性の損失を防止し得るとともに酵素充填を最大化し得る。機械、組成物、および方法は、卓上製造から工業製造まで分量および数量を十分に拡張可能である。
【０００４】
したがって、本発明は、酵素容器と、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）容器と、酵素ポンプと、ＭＮＰポンプと、ＭＮＰディスラプターと、ＢＮＣミキサーと、を含む、バイオナノ触媒（ＢＮＣ）の自動製造機械であって、酵素容器が酵素調製物を保持するように操作可能であり、酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒し、ＭＮＰ容器がＭＮＰ調製物を保持するように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプがＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプターに送るように操作可能であり、ＭＮＰポンプが複数の破砕ＭＮＰをＭＮＰディスラプターから前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、酵素ポンプが酵素調製物をＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、ミキサーが破砕ＭＮＰと酵素調製物とを混合して前記ＢＮＣを形成するように操作可能である、機械を提供する。
【０００５】
一実施形態において、ＭＮＰディスラプターはソニケーターである。好ましい実施形態において、ソニケーターはソニケーターコイルと超音波処理容器とをさらに含み、ソニケーターコイルは前記超音波処理容器内でＭＮＰを超音波処理するように操作可能である。他の実施形態において、ソニケーターはインラインソニケーターである。
【０００６】
別の実施形態において、機械は前記ソニケーターを冷却するように操作可能な冷却システムを含む。好ましい実施形態において、冷却システムは水冷システムである。
【０００７】
別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを機械的に破砕するように操作可能である。別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを磁気的に破砕するように操作可能である。別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを熱的に破砕するように操作可能である。
【０００８】
別の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングティーを含む。別の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングコイルを含む。
【０００９】
別の実施形態において、酵素ポンプは機械力または重力により酵素調製物をＢＮＣミキサーに送る。別の実施形態において、ＭＮＰポンプは機械力または重力によりＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプターに送る。
【００１０】
別の実施形態において、機械は、骨格材容器内で磁気骨格材調製物とＢＮＣとを混合してレベル２集合体としてＢＮＣを製造するように操作可能な磁気骨格材容器をさらに含む。好ましい実施形態において、磁気骨格材容器はＢＮＣと骨格材とを機械的に混合するように操作可能である。別の好ましい実施形態において、磁気骨格材容器はＢＮＣと骨格材とを磁気的に混合するように操作可能である。
【００１１】
別の実施形態において、機械は、安定化レベル２集合体としてＢＮＣを集合させるためのテンプレーターをさらに含む。好ましい実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。より好ましい実施形態において、磁気レベル２集合体は磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載される機械を用いてＭＮＰ調製物と酵素調製物とを組み合わせる工程を含む、ＢＮＣの製造方法であって、酵素調製物が、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、イソメラーゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、ＢＮＣは約１ｍｌ未満の量で製造される。好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１ｍｌ〜１０ｍｌの量で製造される。別の好ましい実施形態において、前記ＢＮＣは約１０ｍｌ〜１００ｍｌの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１００ｍｌ〜１リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１リットル〜１０リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１０リットル〜１００リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１００リットル〜１０００リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１キロリットル〜１０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１０キロリットル〜２０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約２０キロリットル〜５０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約５０キロリットル超の量で製造される。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣをテンプレート化する工程をさらに含む。
【００１５】
本発明は、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）と、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素と、を含む自己集合バイオナノ触媒（ＢＮＣ）組成物であって、酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒する、組成物を提供する。
【００１６】
ＢＮＣ組成物のいくつかの実施形態において、酵素は約５〜２，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度であり、かつＭＮＰは約５０〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。好ましい実施形態において、酵素は約５〜１５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約５〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約５〜５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約１００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約１，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約１０，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５，０００〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。
【００１７】
別の実施形態において、ＢＮＣ組成物は安定化レベル２集合体をさらに含む。好ましい実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。より好ましい実施形態において、磁気レベル２集合体は磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。
【００１８】
本発明は、ＢＮＣと拡散性基質とを接触させる工程と拡散性生成物を捕集する工程とを含む、本明細書に記載されるＢＮＣ組成物の使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】例示的な自動ＢＮＣ製造機械の概略図。
【図２】例示的な自動ＢＮＣ製造機械の絵図。
【図３】自動ＢＮＣ製造機械で生成された固定化ＨＲＰの活性。活性は桃色キノンイミン色素の形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加により測定した。
【図４】自動ＢＮＣ製造機械を用いてＢＮＣ中に充填された酵素の量。グラフはＭＮＰ中に固定されたＨＲＰタンパク質の濃度を示す（レベル１）。また、磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）中にさらに含有されるＢＮＣ中のＨＲＰタンパク質の濃度も示す（レベル２）。
【図５】さまざまなポンプスピードで自動ＢＮＣ製造機械から得られた溶出サンプルの反応速度。図は遊離ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と磁気固定化ＨＲＰとを比較する。示された速度は２．５ｍＭ  ＨＲＰを用いた反応の最初の３１５秒間から導出される。
【図６】キノンイミン色素形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加により分光測光法で測定された固定化ＨＲＰのフェノール酸化活性。遊離ＨＲＰ（白）。バイオマイクロ触媒（ＢＭＣ）は、磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）と、ｐＨ６のＨＲＰとｐＨ１１の磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）とを自動混合することにより作製されたバイオナノ触媒（ＢＮＣ）と、で構成された。ＢＮＣは４０％の酵素充填率（酵素／ＭＮＰ）を有し、ＢＭＣは５．６％の酵素充填率（酵素／（ＭＮＰ＋ＭＭＰ））を有していた。これらの「自動」ＢＭＣは、さまざまな流量（１０〜６０ｍＬ／ｍｉｎ、ハッチング）を用いて連続フローで集合させた。ＢＭＣは、ｐＨ６のＨＲＰとｐＨ１１のマグネタイトナノ粒子とを手動で組み合わせて構成された。手動ＢＮＣは、４０％の酵素充填率を有し、５．６％の酵素充填率でＢＭＣを形成するようにＭＭＰ上にテンプレート化された（黒）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、非常に高レベルの磁気固定化酵素を有するナノクラスターを製造するための組成物および方法を提供する。ナノクラスターは自己集合により形成され、ナノ粒子１グラム当たり５〜２０，０００マイクログラムの酵素を含有する。組成物および方法は、低減された方法工程および化学試薬を有し、工業目的のスケールアップに理想的である。
【００２１】
本発明は、使用前および使用中にきわめて活性かつ安定な磁気固定化酵素を含む自己集合メソ多孔性ナノクラスターを提供する。この技術は、３つの統合組織化レベルでの生化学とナノテクノロジーと生物工学とのブレンドであり、レベル１は、磁気メソ多孔性ナノクラスター合成用の磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）による酵素の自己集合である。このレベルは、酵素を固定化するために分子自己封入機構を使用する。自己集合磁気ナノ粒子中に固定化された酵素は、本明細書では「バイオナノ触媒」（ＢＮＣ）と呼ばれる。レベル２は、磁気マトリックスなどの他の集合体中へのＢＮＣの安定化である。特定の実施形態において、ＢＮＣは、商業用途または他の用途でマイクロまたはマクロ構造上または構造中に「テンプレート化」される。一実施形態において、レベル２テンプレートは磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。レベル３は、レベル１＋２固定化酵素を使用するための製品調整である。
【００２２】
ＭＮＰは、温度、イオン強度、ｐＨ、溶媒など、バイオ触媒プロセスで酵素を使用するためのより広範にわたる操作条件を可能にする。ＭＮＰのサイズおよび磁化は、ＢＮＣの形成および構造に影響を及ぼす。これは封入酵素の活性に有意な影響を及ぼす。自己集合ＭＮＰクラスターは、種々の反応条件下で驚くべき回復力を示すため、高分子樹脂、架橋ゲル、架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）、架橋磁気ビーズなどに取って代わる優れた酵素固定化材料として使用可能である。さらに、拡散性基質上への酵素の任意の適用に使用可能である。
【００２３】
ＢＮＣは、クラスター化磁気ナノ粒子間の格子間の隙間であるメソ細孔を含有する。酵素は、磁気ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部中に固定される。本明細書において使用される際、「磁気」という用語は、永久磁性、超常磁性、常磁性、および強磁性挙動を含むあらゆるタイプの有用な磁気特性を包含する。
【００２４】
磁気ナノ粒子またはＢＮＣは、ナノスケール、すなわち、一般に５００ｎｍ以下のサイズを有する。本明細書において使用される際、「サイズ」という用語は、磁気ナノ粒子が大体またはほぼ球形であるとき、磁気ナノ粒子の直径を指し得る。磁気ナノ粒子が、大体またはほぼ球形でない（例えば、ほぼ卵形または不規則である）場合、「サイズ」という用語は、最も長い寸法または磁気ナノ粒子の３次元の平均のいずれかを指し得る。「サイズ」という用語はまた、磁気ナノ粒子の集団におけるクラスター化平均サイズを指し得る。
【００２５】
異なる実施形態において、磁気ナノ粒子は、正確に、約、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、もしくは１ｎｍ以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。
【００２６】
ＢＮＣにおいて、個別の磁気ナノ粒子は、上に示されるサイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、初晶）であり得る。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体は、ナノ粒子よりサイズが大きく、一般に、少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。異なる実施形態において、凝集体は、正確に、約、少なくとも、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、もしくは８００ｎｍ超、以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。
【００２７】
典型的に、一次および／または凝集磁気ナノ粒子またはそのＢＮＣは、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、一次または凝集体サイズの任意の範囲が、一次または凝集体サイズの全範囲の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍおよび約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ以下）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約５、１０、１５、もしくは２０ｎｍおよび約５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ以下）は、一次粒径の全範囲の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍ未満、または約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約２０、１０、もしくは５ｎｍ未満、または約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００２８】
磁気ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）またはそのＢＮＣは、それらを構成する個々の初晶の量に応じて、多孔性の相当の欠如を含む任意の多孔度を有し得る。特定の実施形態において、凝集体は、格子間のメソ細孔（すなわち、充填配置によって形成される、一次磁気ナノ粒子間に位置するメソ細孔）を含有することによってメソ多孔性である。メソ細孔は、一般に、少なくとも２ｎｍかつ５０ｎｍ以下のサイズである。異なる実施形態において、メソ細孔は、正確にまたは約、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍの細孔径、または上記の例示的な細孔径のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔径を有し得る。粒径の場合と同様に、メソ細孔は、典型的に、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、メソ細孔径の任意の範囲が、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、少なくとも約２、３、もしくは５、および８、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｎｍ以下）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４、もしくは５ｎｍ未満、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００２９】
磁気ナノ粒子は、当該技術分野において公知の組成物のいずれかを有し得る。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、磁性であるゼロ価の金属部分であるかまたはそれを含む。このようなゼロ価の金属のいくつかの例としては、コバルト、ニッケル、および鉄、ならびにそれらの混合物および合金が挙げられる。他の実施形態において、磁気ナノ粒子は、コバルト、ニッケル、もしくは鉄、またはそれらの混合物の酸化物などの、磁性金属の酸化物であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、明確なコアおよび表面部分を有する。例えば、磁気ナノ粒子は、鉄、コバルト、またはニッケル元素で構成されるコア部分および金、白金、パラジウム、または銀の層などの、金属酸化物または貴金属コーティングなどの、不動態化層で構成される表面部分を有し得る。他の実施形態において、金属酸化物磁気ナノ粒子またはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁気ナノ粒子表面上の電荷数を減少させ得、それにより、溶液中の分散性を有益に高め、ＢＮＣのサイズを良好に制御し得る。貴金属コーティングは、酸化、浸出によるかまたはシトレート、マロネート、もしくはタートレートなどの有機酸をキレートするときはキレートによる可溶化から磁気ナノ粒子を保護し、生化学反応または過程に使用される。不動態化層は、任意の好適な厚さ、特に、少なくとも、約、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、または１０ｎｍ以下、または未満、またはこれらの値のいずれか２つによって境界される範囲内の厚さを有し得る。
【００３０】
本発明に有用な磁性材料は、当該技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイトまたは磁鉄鉱）、コバルト、およびニッケルなどの鉱石を含む強磁性体および強磁性材料を含む。他の実施形態において、希土類磁石が使用される。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素などが挙げられる。さらに他の実施形態において、磁石は、複合材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト、およびアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態において、磁気ナノ粒子は、酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当該技術分野において公知の磁性または超常磁性酸化鉄組成物、例えば、マグネタイト（ＦｅｓＯ／Ｏ、赤鉄鉱（α−Ｆｅ２θ  ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｃ＞３）、または式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａが二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、またはそれらの組合せ）であり、Ｂが三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋、またはそれらの組合せ）である）で表されるスピネルフェライトのいずれかであり得る。
【００３１】
特定の実施形態において、磁気ナノ粒子の以上のメソ多孔性凝集体（ＢＮＣ）は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２のレベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１のレベルの集合体はＢＮＣに見いだされる。第２のレベルの集合体は連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの取込みに見いだされる。いくつかの実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。
【００３２】
マクロ多孔性磁気骨格に対して本明細書で用いられる「連続」という用語は、微粒子集合体でない材料、すなわち、互いに集合して巨視的構造を形成する粒子や離散物で構築されてない材料を意味する。微粒子集合体とは対照的に、連続構造は、シームレスかつ均一な構造を周期的に中断するマクロ細孔の周りで実質的にシームレスかつ均一である。したがって、連続骨格中のマクロ細孔は、凝集粒子間の間隙空間ではない。それにもかかわらず、一次連続骨格の集合または凝集が一次連続骨格間の間隙空間により形成されたマクロ細孔（例えば、約５０ｎｍ超かつ約１００まで）を含んでいない限り、より小さい一次連続骨格の集合または凝集から連続骨格を構築可能である。特にセラミック材料や元素材料などの無機材料の場合、連続骨格は結晶ドメインまたは相境界を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００３３】
「パーセント固定化収率」または「％固定化収率」という用語は、固定化前のサンプル中の酵素の初期量と比較して固定化物またはナノ粒子調製物中に取り込まれた酵素のパーセント（質量または活性により測定される）を意味する。
【００３４】
特定の実施形態において、磁気ナノ粒子の以上のメソ多孔性凝集体（ＢＮＣ）は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２のレベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１のレベルの集合体はＢＮＣに見いだされる。第２のレベルの集合体は連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの取込みに見いだされる。少なくともＢＮＣの存在により全階層的触媒集合体には磁気がある。
【００３５】
マクロ多孔性骨格は、５０ｎｍ超のサイズを有するマクロ細孔（すなわち、マクロスケールサイズの細孔）を含有する。異なる実施形態において、マクロ細孔は、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１ミクロン（１μｍ）、１．２μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、もしくは１００μｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズを有する。
【００３６】
マクロ多孔性骨格は、マクロ細孔を収容可能である限り、任意の好適なサイズを有し得る。典型的な実施形態において、マクロ多孔性骨格は、少なくとも１つのマクロスケールのサイズ寸法を有する。少なくとも１つのマクロスケールの寸法は５０ｎｍ超であり、以上に提供されたマクロ細孔の値のいずれかであり得るとともに特に、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、もしくは１ｃｍの寸法、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズであり得る。サイズ寸法の１つのみまたは２つがマクロスケールである場合、残りの１つまたは２つの寸法は、ナノスケール、例えば、以上に提供された磁気ナノ粒子の値のいずれか（例えば、独立して、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｎｍ、または上記の値の任意の２つよって境界される範囲内の値）であり得る。いくつかの実施形態において、マクロ多孔性骨格のサイズ寸法の少なくとも２つまたは全てがマクロスケールである。
【００３７】
実施形態の第１のセットにおいて、ＢＮＣが取り込まれる連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。すなわち、ＢＮＣの不在下でさえも磁気がある。例えば、磁気ポリマー組成物で構成することにより連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。磁気ポリマーの例は、当技術分野で周知のようにテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）とエメラルジン系ポリアニリン（ＰＡＮｉ）との組合せでのＰＡＮｉＣＮＱである。代替的または追加的に、ＢＮＣに属さない磁気粒子を埋め込むことにより連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。ＢＮＣに属さない磁気粒子は、例えば、ＦＲＰ酵素やいずれの酵素にも一体化されていない磁気ナノまたはマイクロ粒子であり得る。磁気マイクロ粒子は、以上に提供されたマクロ細孔サイズまたはサイズ分布を有し得るが、マクロ細孔サイズに依存するわけではない。特定の実施形態において、磁気マイクロ粒子は、約、正確に、または少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズを有する。いくつかの実施形態において、連続マクロ多孔性骨格は、ＢＮＣの少なくとも一部分に吸着された磁気マイクロ粒子が埋め込まれているか、または磁気マイクロ粒子がＢＮＣに一体化も吸着もされていない。
【００３８】
実施形態の第２のセットにおいて、ＢＮＣが取り込まれる連続骨格には磁気がない。それにもかかわらず、少なくとも取り込まれたＢＮＣの存在により非磁気骨格を含有する全階層的触媒集合体には磁気が残留する。
【００３９】
一実施形態において、連続マクロ多孔性骨格（またはその前駆体）はポリマー組成物を有する。ポリマー組成物は、当技術分野で公知の有機、無機、またはハイブリッド有機−無機の固体ポリマー組成物のいずれかであり得るとともに、バインダーとして作用する合成ポリマーまたはバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロ多孔性骨格は、水または階層的触媒の使用が意図される他の媒体への溶解もその中での分解もしない。合成有機ポリマーのいくつかの例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸またはポリメタクリレート塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコールなど）、フルオロポリマー（例えば、ポリビニルフルオリド、ポリビニリデンフルオリド、ポリテトラフルオロエチレンなど）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、およびそれらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーのいくつかの例としては、多糖（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、およびアルギン酸）、ポリ乳酸、ならびにポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定例において、セルロースは微生物または藻類に由来するセルロースであり得る。無機またはハイブリッド有機−無機のポリマーのいくつかの例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成により調製されるもの）およびポリホスファゼンが挙げられる。いくつかの実施形態において、以上に提供されたいずれか１つ以上のクラスまたは特定のタイプのポリマー組成物は、マクロ多孔性骨格として除外される。
【００４０】
別の実施形態において、連続マクロ多孔性骨格（またはその前駆体）は非ポリマー組成物を有する。非ポリマー組成物は、例えば、セラミック組成物または元素組成物を有し得る。セラミック組成物は、結晶、多結晶、またはアモルファスであり得るとともに、酸化物組成物（例えば、アルミナ、ベリリア、セリア、イットリア、またはジルコニア）および非酸化物組成物（例えば、炭化物、ケイ化物、窒化物、ホウ化物、または硫化物の組成物）をはじめとする当技術分野で公知の組成物のいずれかを有し得る。元素組成物もまた、結晶、多結晶、またはアモルファスであり得るとともに、炭素、アルミニウム、ケイ素などの任意の好適な元素組成物を有し得る。
【００４１】
他の実施形態において、ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子間の間隙空間としてマクロ細孔を含む磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）の集合（すなわち凝集）を含む（またはそれにより構築される）非連続マクロ多孔性支持体中に存在する。磁気マイクロ粒子は典型的には強磁性であり、マグネタイトまたは他の強磁性材料で作製可能である。ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子の凝集のマクロ細孔の少なくとも一部分に埋め込まれ、磁気マイクロ粒子の表面上に存在し得る。ＢＮＣは、磁気的相互作用により磁気マイクロ粒子の表面に一体化可能である。磁気マイクロ粒子は、金属酸化物または貴金属のコーティング層で被覆してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＢＮＣ−ＭＭＰ集合体は、階層的触媒集合体を提供するように以上に記載される連続マクロ多孔性骨格中に取り込まれる（すなわち、埋め込まれる）。
【００４２】
個別の磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な磁性度を有する。例えば、磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ骨格集合体は、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｅｍｕ／ｇ以下の飽和磁化（Ｍｓ）を有し得る。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体は、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（ｎｏ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）（すなわち、以下（ｕｐ  ｔｏ））または未満、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ、もしくは０．１ｅｍｕ／ｇ以下または未満の残留磁化（Ｍｒ）を有する。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体の表面磁場は、約または少なくとも、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ガウス（Ｇ）、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の磁場であり得る。微粒子が含まれる場合、微粒子はまた、上記の磁気強度のいずれかを有し得る。
【００４３】
磁気ナノ粒子またはその凝集体は、得られるＢＮＣを生成するために、用途に応じて、飽和レベル以下または未満の好適な量の酵素を吸着するように作製され得る。異なる実施形態において、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｐｍｏｌ／ｍ２以下、または未満の酵素を吸着し得る。あるいは、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、飽和レベルの約、少なくとも、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％以下、または未満である量の酵素を吸着し得る。
【００４４】
磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な細孔容積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、もしくは１ｃｍ３／ｇ以下、または未満の細孔容積、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔容積を有し得る。磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍ２／ｇ以下、または未満の比表面積を有し得る。
【００４５】
ＭＮＰ、それらの構造、組織、好適な酵素、および使用が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットおよび米国仮特許出願第６２／１６３，０３２号明細書に記載されている。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態はヒドロラーゼを含む。ヒドロラーゼは、基質として水を用いて多くのタイプの化学結合の加水分解を触媒する。基質は、典型的には、破壊された結合の部位に水素基とヒドロキシル基とを有する。ヒドロラーゼは、酵素のＥＣ番号分類でＥＣ３として分類される。ヒドロラーゼは、作用を受ける結合に基づいてさらにいくつかのサブクラスに分類可能である。例示的なヒドロラーゼおよび加水分解される結合としては、ＥＣ３．１：エステル結合（エステラーゼ：ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ）、ＥＣ３．２：糖（ＤＮＡグリコシラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．３：エーテル結合、ＥＣ３．４：ペプチド結合（プロテアーゼ／ペプチダーゼ）、ＥＣ３．５：ペプチド結合以外の炭素−窒素結合、ＥＣ３．６  酸無水物（ヘリカーゼおよびＧＴＰアーゼをはじめとする酸無水物ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．７  炭素−炭素結合、ＥＣ３．８  ハロゲン化物結合、ＥＣ３．９：リン−窒素結合、ＥＣ３．１０：硫黄−窒素結合、ＥＣ３．１１：炭素−リン結合、ＥＣ３．１２：硫黄−硫黄結合、およびＥＣ３．１３：炭素−硫黄結合が挙げられる。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはグリコシドヒドロラーゼである。この酵素は、植物材料の分解（例えば、セルロースをエタノール製造に使用されるグルコースに分解するためのセルラーゼ）、食品製造（たとえば、糖転化、マルトデキストリン製造）、および紙製造（紙パルプからのヘミセルロースの除去）をはじめとするさまざまな用途を有する。
【００４８】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはリポラーゼ１００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）である。それは神経因性疼痛、不安障害、および癲癇に使用される抗痙攣薬剤プレガバリン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｙｒｉｃａ（登録商標）として市販されているものなど）を合成するために使用される。これらの病態に世界人口の約１％が罹患している。リポラーゼ１００Ｌは、所要の出発材料を３９％低減しかつ１単位当たり廃棄物を８０％削減することが判明した。
【００４９】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはγ−ラクタマーゼ（例えば、ＥＣ３．１．５．４９）である。それはアバカビル製造の中間体ビンスラクタムを製造するために使用される（ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療するための抗レトロウイルス薬剤）。化学量論プロセスから触媒フロープロセスへの変更により単位操作数が１７から１２に低減されかつ廃棄物が３５％低減されることが判明した。そのほかに毒性物質の塩化シアノゲンの使用が最小限に抑えられる。
【００５０】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはラクターゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．１０８）である。この酵素は、ラクトースフリー乳を製造するために乳中のラクトースを単糖に分解する。この重要な製品は、乳糖不耐症である世界人口の約１５％に役立つ。
【００５１】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはペニシリンアミダーゼ（例えば、ＥＣ３．５．１．１１）である。この酵素は、ペニシリンをカルボン酸および６−アミノペニシラネート（６−ＡＰＡ）に開裂する。６−ＡＰＡは、天然および合成のペニシリン誘導体のコア構造である。この酵素は、特定の感染症に対処するように調整された半合成ペニシリンを製造するために使用される。
【００５２】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはニトリラーゼ（例えば、ＥＣ３．５．５．１）である。この酵素は、ニトリルをカルボキシル基に開裂してアンモニアを遊離する。それは、さまざまな脂肪族および芳香族ニトリル化合物（対応するカルボン酸の中には工業的に重要なものがある）に対して活性である。Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １１（１）：１４２（２０１２）。ニトリラーゼは、３−シアノピリジンからニコチン酸（ビタミンＢ３またはナイアシンとしても知られる）を製造するために利用される。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ３４５（４）：４２５−４３５（２００３）。ニコチン酸は、食品の栄養サプリメントおよび医薬の中間体としての用途を有する。例えば、ニトリラーゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）を製造するために使用される。それはｍｅｓｏ−３−ヒドロキシグルタロニトリルからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへの反応を触媒し、後者はアトルバスタチンのコアを形成する。
【００５３】
ヒドロラーゼは次の参照文献で考察されており、その全体が参照により本明細書に援用される。Ａｎａｓｔａｓ，Ｐ．Ｔ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，２００９、Ｄｕｎｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗ  Ｗｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｄｓ．Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１０、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（１２）：１４７０−９０（２０１０）、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６（１２）：１９８６−１９９３（２０１２）。
【００５４】
ある実施形態において、本発明は、過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素を提供する。特定の実施形態において、ＨＰＰ酵素は、ＥＸ  １．１．３亜属のものであり得るオキシダーゼである。特定の実施形態において、オキシダーゼは、ＥＣ  １．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．８（Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１５（２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１８（第二級アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２２、ＥＣ  １．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２５、ＥＣ  １．１．３．２６、ＥＣ  １．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２９（Ｎアシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３１、ＥＣ  １．１．３．３２、ＥＣ  １．１．３．３３、ＥＣ  １．１．３．３４、ＥＣ  １．１．３．３５、ＥＣ  １．１．３．３６、ＥＣ  １．１．３．３７  Ｄ−アラビノノ−ｌ，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成性）、ＥＣ  １．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）であり得る。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態はヒドロキシラーゼを含み得る。ヒドロキシル化は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有機化合物に導入する化学プロセスである。ヒドロキシル化は、空気中での有機化合物の酸化分解の第１の工程である。ヒドロキシル化は、親油性化合物をより容易に排出される親水性生成物に変換することにより解毒の役割を果たす。いくつかの薬剤（例えば、ステロイド）は、ヒドロキシル化により活性化または脱活性化される。ヒドロキシラーゼは当技術分野で周知である。例示的なヒドロキシラーゼとしては、プロリンヒドロキシラーゼ、リシンヒドロキシラーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態はニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含む。それは、ニトリルから高エナンチオ純度のキラルカルボン酸およびアンモニアへの加水分解を触媒する加水分解酵素（ＥＣ３．５．５．１）である。ＮＩＴ活性は、マンデロニチリルから（Ｒ）−マンデル酸への変換をモニターすることにより測定し得る。この結果、分光測光法でモニターし得るｐＨ低下を生じる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態はヒドラターゼを含む。それは水の元素の付加または除去を触媒する酵素である。ヒドロリアーゼまたはヒドラーゼとしても知られるヒドラターゼは、Ｃ−Ｏ結合の水和または脱水を触媒し得る。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態はオキシドレダクターゼを含む。この酵素は、一方の分子から他方の分子への電子の移動を触媒する。これは、一方の物質から他方の物質へのＨおよびＯ原子または電子の移動を含む。それは、典型的には補因子としてＮＡＤＰまたはＮＡＤ＋を利用する。
【００５９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、ポリ塩化ビフェニルやフェノール化合物などの汚染物質の分解、石炭の分解、および木材加水分解物の発酵増強に使用される。本発明はさらに、バイオセンサーおよび疾患診断での使用を含む。
【００６０】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯ）である。このグループのオキシドレダクターゼは、１つ以上のヒドリド（Ｈ−）を電子受容体（通常はＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋またはＦＡＤやＦＭＮなどのフラビン補酵素）に移動する還元反応により基質を酸化する。例示的なデヒドロゲナーゼとしては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００６１】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の製造に使用されるオキシドレダクターゼのケトレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１８４）である。このバイオ触媒プロセスは、出発材料を実質的に低減し、有機溶媒の使用を制限し、かつ廃棄物ストリームの生分解性を増加させるので、商業的に重要である。
【００６２】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ１．１．９９．１０）である。それは薬剤製造に使用される補因子をリサイクルするために製薬会社により使用される。それはグルコースからグルコネートへの変換を触媒する。ＮＡＤＰ＋はＮＡＤＰＨに還元される。これはＡｖａｓｔａｎ製造に使用される。
【００６３】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＰ４５０（ＥＣ１．１４．１４．１）である。それは医薬品工業で酸化が困難な場合に使用される。いくつかの実施形態において、Ｐ４５０は化学代謝物および薬剤代謝物の製造に使用される。好ましい実施形態において、ｐ４５０のコスト、一貫性、および効率は、グルコースデヒドログレンナーゼ（ＧＤＨ）またはギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を含む補因子再生系（例えば、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋）を併用した場合、改善される。
【００６４】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＥＣ１．１１．１．６などのカタラーゼである。カタラーゼは全ての真核生物および多くの原核生物で観測される。それは過酸化水素を水および酸素に分解することにより過酸化ストレスを調節する統合的役割を果たす。カタラーゼは、ヘム系活性部位をそれぞれ含有する４つの同一のサブユニットを有する高活性テトラマーである。Ｇａｅｔａｎｉｔ  ＆  Ｋｉｒｋｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１（１４）：４３４３−７（１９８４）。カタラーゼは、過酸化水素の排出または調節のための多くの工業用途を有する。例としては、テキスタイル漂白での残留過酸化物の除去、グルコン酸などの酸性度調整剤の製造、またはチーズ製造などのオキシダーゼを利用するプロセスでの阻害濃度の過酸化物の蓄積の防止が挙げられる。Ｂｅｔａｎｃｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ１９（３）：７６３−７６７（２００３）。
【００６５】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースオキシダーゼ（例えば、ノタチン、ＥＣ１．１．３．４）である。グルコースオキシダーゼは、グルコースから過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。それは、例えば、ペルオキシダーゼなどの過酸化水素消費酵素のための酸化剤として過酸化水素を発生するために使用される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明はフリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素を包含する。いくつかの実施形態において、ＦＲＰはペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは生体系に広範に見いだされ、フェノールから芳香族アミンに至るまで多種多様な芳香族化合物を酸化するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水に還元するオキシドレダクターゼのサブセットを形成する。ペルオキシダーゼは非常に強力な酵素であるとはいえ、過剰の過酸化物の存在下での強い阻害が原因で工業環境での活用が困難なことで有名である。本発明は、反応ターンオーバーの増加および阻害の低減を提供する。したがって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を工業スケールで使用し得る。
【００６７】
ペルオキシダーゼは、亜属ＥＣ  １．１１．１に属する。特定の実施形態において、ＥＣ  １．１１．１酵素は、ＥＣ  １．１１．１酵素は、より詳細には、例えば、ＥＣ  １．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．４、ＥＣ  １．１１．１．５（シトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．８（ヨウ化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１０（塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）であり得る。
【００６８】
他の実施形態において、ペルオキシダーゼはまた、機能によってさらに特定されてもよく、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、または万能ペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼはまた、真菌、微生物、動物、または植物ペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ピーナッツペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、オオムギペルオキシダーゼ、またはペルオキシダシンとして特定され得る。特定の実施形態において、ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【００６９】
ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ（ＬＰ／ＧＯＸ）抗菌系は、乳汁、唾液、涙液、および粘液などの体液中に天然に存在する（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。この系は、哺乳動物および高等生物に無害な２つの天然化合物であるチオシアネート（ＳＣＮ−）およびヨウ化物（Ｉ−）を用いる（Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））。ＬＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、それぞれ次亜チオシアン酸塩（ＯＳＣＮ−）および次亜ヨウ素酸塩（ＯＩ−）へのチオシアネートおよびヨウ化物イオンの酸化を触媒する。この系中のＨ２Ｏ２は、酸素の存在下で、β−Ｄ−グルコースに対するＧＯＸの活性によって提供される。これらのフリーラジカル化合物は、ひいては、微生物の細胞膜中のスルフヒドリル基を酸化し（Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），１１８７（１９８３）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）、これは、膜透過性の低下（Ｗａｎ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６２，３５５−３６２（２００１））および最終的に微生物細胞死につながる。
【００７０】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、ホースラディッシュ植物Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に見いだされるヘム含有オキシドレダクターゼ酵素である。それは通常は過酸化水素と一緒に色素原基質に作用して、標的分子の分光測光検出性を向上させる光輝着色生成物複合体を生成するので、通常は生化学シグナルアンプリファイヤーおよびトレーサーとして使用される。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のこの特性は、齧歯動物神経系毛細血管の透過性研究に適用されてきた。より最近では、ＨＲＰは、種々の芳香族化合物を分解する能力があるため、フェノール廃水の可能なレメディエーション戦略の一部として提案されている。Ｃｈａｕ  ＆  Ｌｕ，Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，１９４（３）：２５９−２６９  （１９９６）、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１５（５）：９７４−９８０（２０１４）。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態はトランスフェラーゼを含む。「トランスフェラーゼ」とは、特定の官能基を一方の分子から他方の分子に移動する酵素のクラスを意味する。移動される基の例としては、メチル基およびグリコシル基が挙げられる。トランスフェラーゼは、化学発癌性物質や環境汚染物質などの物質を処理するために使用される。そのほかに、人体に見いだされる毒性化学物質および代謝物に対処するためにまたはそれらを中和するために使用される。
【００７２】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはトランスアミナーゼである。トランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸との間の反応を触媒する。それはアミノ酸の合成に重要である。それは肝損傷の重要な指標である。アミノ基転移において、一方の分子上のＮＨ２基は他方の分子上の他の基（例えば、ケト基）の＝Ｏと交換される。
【００７３】
より好ましい実施形態において、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。それは、アミノアクセプターのカルボキシル基の位置へのアミノドナー分子のアミノ基の移動を触媒する  Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２（６）：９９３−１００１（２０１２）。この酵素は全ての生物で観測され、アミノ酸合成および窒素代謝で重要な役割を担う。ω−トランスアミナーゼは、基質の立体選択性および生成物の立体特異性が高いので、非天然アミノ酸および光学的に純粋なキラルアミンまたはケト酸の製造に利用される。ω−トランスアミナーゼはまた、従来の化学的方法よりもプロセスが単純化された活性医薬中間体のバイオ触媒キラル分割の用途も有する。Ｓｃｈａｅｔｚｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１（１９）：８２４４−８２４８（２００９）。それは特にシタグリプチン（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．によりＪａｎｕｖｉａ（登録商標）（抗糖尿病薬剤）として市販されている）の合成に使用される。工学操作されたω−トランスアミナーゼは、バイオ触媒活性を例えば２５，０００倍に向上させ、結果的にシタグリプチン収率を全体で１３％増加させかつ全プロセス廃棄物を１９％低減することが判明した。
【００７４】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはチミジル酸シンテターゼ（例えば、ＥＣ２．１．１．４５）である。この酵素は糖ヌクレオチドおよびオリゴ糖の製造に使用される。それは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数１】
2018519838.tif 000002
【００７５】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．５．１．１８）である。この酵素は他のトリペプチドへのグルタチオンの導入を触媒する。それは食品工業で酸化剤として使用されるほか、医薬品工業で抗老化薬剤および皮膚製剤の製造にも使用される。
【００７６】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルコキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２）である。この酵素はグルコース−６−リン酸へのグルコースのリン酸化を促進する。それは食品工業で製造ストリーム中のグルコース濃度の低減および医薬品工業で糖尿病薬剤の製造などに使用される。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはリボフラビンキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２６）である。より好ましい実施形態において、リボフラビンキナーゼは食品工業でフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の製造に使用される。ＦＭＮは、橙色〜赤色の食品着色添加剤および過剰のリボフラビン（ビタミンＢ２）の分解剤である。リボフラビンキナーゼは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数２】
2018519838.tif 000003
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態はエンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）を含む。この酵素はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存的にアルケン還元を触媒する。エンレダクターゼの例としては、ＦＭＮ含有旧黄色酵素（ＯＹＥ）ファミリーのオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．６．９９）、クロストリジウムエン酸レダクターゼ（ＥｎｏＲｓ、Ｃ１．３．１．３１）、フラビン非依存中鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ、ＥＣ１．３．１）、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ、ＥＣ１．１．１．２０７−８）、ロイコトリエンＢ４デヒドロゲナーゼ（ＬＴＤ）、キノン（ＱＯＲ）、プロゲステロン５ｂ−レダクターゼ、ラットプレゴンレダクターゼ（ＰＧＲ）、タバコ二重結合レダクターゼ（ＮｔＤＢＲ）、シアノバクテリアＯＹＥ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来ＬａｃＥＲ、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）種ＪＡ８１由来Ａｃｈｒ−ＯＹＥ４、および酵母ＯＹＥが挙げられる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態はイミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）を含む。イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）は光学的に純粋な第２級環状アミンの合成を触媒する。それは第２級または第３級アミン生成物化合物を形成するようにケトンまたはアルデヒド基質および第１級または第２級アミン基質を変換し得る。例示的なＩＲＥＤは、パエニバチルス・エルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）Ｂ６９、ストレプトマイセス・イポモエアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｉｐｏｍｏｅａｅ）９１−０３、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０、およびアセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）に由来するものである。ＩＲＥＤは、国際公開第２０１３／１７００５０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）で詳細に考察されている。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はリアーゼである。それは加水分解や酸化以外のプロセスにより基質から原子団が除去される脱離反応を触媒する。新しい二重結合または環構造が得られることが多い。リアーゼには７つのサブクラスが存在する。好ましい実施形態において、高エステル化ペクチン（例えば、果実中のもの）を低分子に分解するためにペクチンリアーゼが使用される。本発明の他の好ましい実施形態は、オキシニトリラーゼ（マンデロニトリルリアーゼまたは脂肪族（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとも呼ばれる）を含む。それはマンデロニトリルをシアン化水素＋ベンズアルデヒドに開裂させる。
【００８１】
好ましい実施形態において、リアーゼはヒドロキシニトリルリアーゼ（例えば、ＥＣ４．１．２、プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）リアーゼの突然変異）である。ヒドロキシニトリルリアーゼは、広範にわたる化学反応および酵素反応に対する汎用ビルディングブロックとして機能し得るシアノヒドリンの形成を触媒する。それはより低ｐＨで酵素のスループットおよび安定性を向上させるために使用され、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））の製造に使用可能である。反応プロセスは、Ｇｌｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４８１５（２００３）（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、リアーゼは２−デオキシ−Ｄ−リボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。それは、例えば、Ｌｉｐｉｔｏｒ製造でスタチン側鎖を形成するために使用される。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、リアーゼは（Ｒ）−マンデロニトリルリアーゼ（ＨＮＬ、ＥＣ４．１．２．１０）である。それはジルチアゼム製造に使用される前駆体シアノヒドリンのｔｈｒｅｏ−３−アリール−２，３−ジヒドロキシプロパン酸を合成するために使用される。ジルチアゼムは、高血圧および胸痛（アンギナ）を治療する心臓治療薬剤である。血圧の低下は、卒中および心臓発作のリスクを低減する。それはカルシウムチャネルブロッカーである。ジチアゼムおよびその製造は、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．１：１１２１−４９（２０１１）およびＡｅｈｌｅ  Ｗ．２００８．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｗｅｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，ＧｍｂＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（両方ともその全体が参照により援用される）に記載されている。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、リアーゼはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１）である。それは３−シアノピリジンをニコチンアミド（ビタミンＢ３、ナイアシンアミド）に変換するために商業的に使用される。それはまた、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）の活性医薬成分レベチラセタムの調製にも使用される。
【００８５】
別の好ましい実施形態において、リアーゼはフェニルリン酸カルボキシラーゼである。それは、たとえば、室温かつ大気圧未満のＣＯ２圧の下でフェノールのリン酸化に使用される。この酵素は、１００％の選択率でフェノールおよびＣＯ２からの４−ＯＨ安息香酸の合成を触媒する。４−ＯＨ安息香酸はそのエステルの調製に使用される。より好ましい実施形態において、酵素は、化粧品および点眼液で保存剤として使用されるパラベンの製造に使用される。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はカルボニックアンヒドラーゼである。カルボニックアンヒドラーゼ（ＥＣ４．２．１．１）は全ての生物に存在するユビキタス金属酵素である。それはきわめて有効な公知の酵素の１つであり（Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  ＆  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７：１７５−９５（２０００））、ＣＯ２交換、ｐＨ調整、およびＨＣＯ３−分泌をはじめとする多くの生理学的役割を果たす（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３０（５Ｓ  Ｓｕｐｐｌ）：１４３７Ｓ−４６Ｓ（２０００））。カルボニックアンヒドラーゼはまた、ＣＯ２隔離およびカルサイト製造で潜在的工業用途を有する（Ｂｏｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．２０１３：２２−２７（２０１３））。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はイソメラーゼである。イソメラーゼは、分子の異性化、すなわち、一方の異性体から他方の異性体に変換する反応を触媒する。それは結合の破壊および形成が行われる分子内転位を促進可能であるか、またはコンホメーション変化を触媒可能である。イソメラーゼは当技術分野で周知である。
【００８８】
好ましい実施形態において、イソメラーゼは糖製造に使用される。より好ましい実施形態において、イソメラーゼはグルコースイソメラーゼのＥＣ５．３．１．１８である。他の実施形態において、グルコースイソメラーゼは、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種により製造される。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルコースをＤ−キシルロースおよびＤ−フルクトースに変換する。この変換は、高フルクトースコーンシロップの製造およびバイオ燃料の分野で重要な反応である。
【００８９】
グルコースイソメラーゼ（ＧＩＳ）（ＥＣ５．３．１．５）は、最も広く使用されている工業用酵素の１つである。それはグルコースから高フルクトースコーンシロップを製造するために使用される  ＧＩＳは、Ｄ−（＋）−フルクトースおよびＤ−（＋）−グルコースの可逆的異性化を触媒する（Ｂｈｏｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０（２）：２８０−３００（１９９６））。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、イソメラーゼはマレイン酸シス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）である。それはマレイン酸からフマル酸への変換を触媒する。フマル酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、ポリエステル樹脂、食品・飲料添加剤、および染料媒染剤のバイオ触媒的製造に重要である。
【００９１】
別の好ましい実施形態において、イソメラーゼはリノール酸シス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．５）である。それは共役リノール酸（ＣＬＡ）の異性化を触媒する。ＣＬＡは、肥満、糖尿病、癌、炎症、およびアテローム形成を治療するうえで多くの潜在的な健康上の有益性を有することが報告されている。ＣＬＡの異なる異性体は、示差的な生理学的作用を発揮し得る。したがって、酵素は単一の異性体を調製するために使用される。
【００９２】
本発明の他の好ましい実施形態では、イソメラーゼはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１）である。それはＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸の相互変換を触媒する。トランスケトラーゼまたはアルドラーゼと組み合わせて、トリオースリン酸イソメラーゼは種々の糖または糖アナログの立体選択的多酵素的合成に使用される。好ましい実施形態は、Ｄ−キシルロース５−リン酸のワンポット酵素的調製である。この合成は、Ｄ−フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）によりフルクトース１，６−二リン酸のレトロアルドール開裂から開始される。続くラセミ化でトリオースリン酸イソメラーゼは、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）によりキシルロース５−リン酸に変換される２当量のＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の生成を促進する。
【００９３】
本発明の他の実施形態において、酵素はリガーゼである。この酵素は、ヌクレオシド三リン酸の加水分解と組み合わせて２つの分子を連結一体化する共有結合の形成を触媒する。リガーゼは当技術分野で周知であり、通常は組換え核酸用途に使用される。好ましい実施形態において、ＤＮＡリガーゼはＥＣ６．５．１．１である。
【００９４】
好ましい実施形態において、リガーゼはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２、ＡＣＣ）である。ＡＣＣは、脂質合成および酸化経路の接合の役割を担い得る。それは、抗生物質の製造、糖尿病、肥満、およびメタボリック症候群の他の病変の治療など、臨床目的で本明細書に開示される本発明と併用される。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、リガーゼはプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ、ＥＣ６．４．１．３）である。それは、ミトコンドリアマトリックス中でＤ−メチルマロニル−ＣｏＡを生成するプロピオニル−ＣｏＡのビオチン依存カルボキシル化を触媒する。メチルマリル−ＣｏＡは、多くの有機化合物の生合成さらには炭素同化のプロセスの重要な中間体である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、グルタミンシンテターゼ（ＧｌｕＳ）（ＥＣ６．３．１．２）は磁気固定化される。それは、脳、肝臓、および腎臓をはじめとする人体の種々の部分に見いだされる。グルタミンシンテターゼは、グルタメートからグルタミンを形成するためにＡＴＰおよびＮＨ３（アンモニア）を使用する。グルタミンは、医薬および健康食品で使用するために製造される重要なアミノ酸である。２００１年では、Ｌ−グルタミンの全世界年間製造量は約２０００メートルトンであった。］Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２１（Ａｐｒｉｌ  ２００２）：１−９（２００３）およびＫｕｓｕｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３１：２５５２Ｓ−２５５５Ｓ（２００１）。
【００９７】
ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、本発明に使用される酵素を発現する組み換え細胞を使用する。組み換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。ある実施形態において、細胞は、酵素を発現するプラスミドなどの発現ベクターにより形質転換される。他の実施形態において、ベクターは、例えば、転写開始、転写終結、翻訳開始および翻訳終結のための、１つまたは複数の遺伝子シグナル（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）を有する。本明細書において、酵素をコードする核酸は、好適な宿主生物へと適切に形質転換されるときにそれが発現されるようにベクター中でクローン化され得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において周知であるように、細菌、真菌、植物、または動物に由来し得る。
【００９８】
本発明はＢＮＣの自動連続製造プロセスを提供する。いくつかの実施形態において、機械は酵素固定化のために連続フロー製造を提供する。さらなる実施形態では、機械は工業スケールで使用される。
【００９９】
図１は、プロセスの例示的フロー図を示す。ナノ粒子は単分散状態を達成するために超音波処理される。それは制御された比およびｐＨで酵素と混合される。いくつかの実施形態において、超音波処理後、ナノ粒子は酵素が個別にポンプ送入される混合ループに送られる。好ましい実施形態において、ＢＮＣは温置ループ内で製造される。他の好ましい実施形態は、連続フロー製造技術分野で公知のように流量、チューブの長さおよび直径を変化させる。他の実施形態において、温置直後、ＢＮＣは、最終的に触媒が使用されるまで貯蔵し得る安定レベル２構造を形成するように磁気骨格と混合される。好ましい実施形態において、ＢＮＣは連続撹拌下で磁気骨格と混合される。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素調製物は単分散ＭＮＰとの混合前に酵素容器内に保持される。それは、適正な温度およびｐＨ条件下での貯蔵を可能にする任意の材料から作製可能である。いくつかの実施形態において、容器は、容器の壁への酵素調製物の非特異的結合を抑制する。したがって、それはガラス、ステンレス鋼、特定のプラスチックなどであり得る。同様に、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）は、金属酸化物の表面酸化を防止する条件で任意の好適な容器内に保持される。これらの条件は、温度、圧力、または酸素レベルを含み得る。他の実施形態において、容器はＭＮＰを磁気誘引しない。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の機械は酵素ポンプを含む。酵素ポンプは、機械力または重力により１つ以上の酵素調製物を組合せで、個別に、または逐次的にＢＮＣミキサーに送る。機械力は、正圧、負圧（真空）、撹拌などを含み得る。同様に、本発明のいくつかの実施形態において、本発明の機械は、機械力または重力により前記ＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプター送るＭＮＰポンプを含む。好ましい実施形態において、本明細書に記載されるポンプは、酵素調製物またはＭＮＰ調製物に作用する正圧または負圧により機能し得る。
【０１０２】
本発明の機械は、磁気ナノ粒子の単分散均一サスペンジョンを生成するＭＮＰディスラプターを有する。いくつかの実施形態において、ＭＮＰディスラプターはソニケーターまたはウルトラソニケーターである。超音波を発生するソニケーターは当技術分野で周知である。好ましい実施形態において、ソニケーターは、ＭＮＰ調製物に接触する超音波処理ワンドまたは延長部を含み得る。より好ましい実施形態において、ソニケーターは、ソニケーターコイルと超音波処理容器とを含むかまたはオンライン処理ソニケーターである。さらにより好ましい実施形態において、機械はソニケーターを冷却するための冷却システムを含む。最も好ましい実施形態において、冷却システムは水を使用する。
【０１０３】
他の実施形態において、ＭＮＰディスラプターは、振盪処理、強力撹拌処理、加圧処理、メッシュもしくは多孔性材料に通す処理、またはスプレー処理によりＭＮＰを機械的に破砕し得る。他の実施形態において、ＭＮＰディスラプターは、高ｐＨ（例えば、１０超）に曝すことによりまたは表面を（例えば、シトレートまたは低分子線状ポリマーで）官能基化することによりＭＮＰを化学的に破砕し得る。さらに他の実施形態において、ＭＮＰは、ＭＮＰ調製物に印加される磁界を変化させることにより破砕される。さらに他の実施形態では、ＭＮＰは、加熱、冷却、または凍結により熱的に破砕される。より好ましい実施形態において、ＭＮＰは、以上で参照された技術との組合せにより破砕される。
【０１０４】
本発明の機械はＢＮＣミキサーを含む。さまざまな方法で混合を達成し得ることは、当業者であれば分かるであろう。好ましい実施形態において、ＢＮＣミキサーは、酵素調製物およびＭＮＣ調製物が供給混合されるミキシングティーを含む。代替的に、混合される流動溶液の撹乱を増加させることによりＢＮＣを形成するチャンバー内で混合を達成し得る。他の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングティー（Ｔ形管コネクター）を含む。他の実施形態において、ＢＮＣミキサーは撹乱を増加させる内側リッジまたはピラーを有する管である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本発明の機械は、レベル２骨格材材料上にまたはその材料中にＢＮＣをテンプレート化または濃縮するための骨格材集合装置をさらに含む。好ましい実施形態において、骨格材には磁気がある。レベル２構造はランダム型または秩序型であり得る。他の好ましい実施形態において、機械は、ＢＮＣで官能基化されたレベル２集合体を製造するために骨格材調製物とＢＮＣとを混合するための骨格材容器を含有する。さらに他の好ましい実施形態において、骨格材およびＢＮＣは機械的または磁気的に混合される。より好ましい実施形態において、ＢＮＣの過剰凝集を抑制するためにおよび均一固定化酵素構造の形成を促進するために、ＢＮＣは骨格材内に直に配置される。
【０１０６】
図２は、ＢＮＣを製造するための例示的機械を提供する。酵素は容器（１）内に保持され、ＭＮＰは他の容器（２）内に保持される。ポンプ（４）は、ソニケーター（６）のホーンの周りに巻かれた管で構成された超音波処理コイル（７）にＭＮＰを送る。超音波処理コイルは、コイル（７）の周りに超音波力を跳飛するステンレス鋼容器（５）内に保持される。他の実施形態において、超音波処理コイルは超音波処理浴中に浸漬される。さらに他の実施形態において、超音波処理はオンラインソニケーターを用いてオンライン方式で行われる。
【０１０７】
容器（５）は冷却水浴（８）内に保持される。冷水は、冷却システム（９）から水を送るポンプ（１０）により浴に送られる。次いで、超音波処理されたＭＮＰは、ポンプ（３）を用いて酵素が送られるミキシングティー（１１）にポンプ移送される。酵素およびＭＮＰは、ＢＮＣが作製されるミキシングコイル（１２）中で混合される。次いで、触媒使用のレベル２集合体としてＢＮＣを製造するために、ＢＮＣは磁気骨格容器（１３）から磁気骨格材が送入されたシェーカー（１４）に送られる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を十分に破壊するために、超音波処理時間を計算し、コイル（７）の管の長さおよび直径さらにはポンプ（４）流量により制御する。計算は以下の通りである。
【数３】
2018519838.tif 000004
式中、
ＬＳ＝超音波処理コイルの長さ（ｍ）
ＴＳ＝超音波処理時間（ｍｉｎ）
ＦＡ＝ＭＮＰポンプの流量（ｍｌ／ｍｉｎ）
ＤＡ＝ＭＮＰポンプの管内径（ｍｍ）
【０１０９】
いくつかの実施形態において、すでに超音波処理に曝されたナノ粒子はミキシングコイル（１２）に送られる。他の実施形態において、非意図的な超音波処理および酵素の変性を防止するために、管はソニケーターから適正距離に保持される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、酵素管およびＭＮＰ管は、ミキシングティー接続を用いてミキシングループに接続される。所要の混合時間は以下のように計算される。
【数４】
2018519838.tif 000005
式中、
ＬＭ＝混合管の長さ（ｍ）
ＴＭ＝混合時間（ｍｉｎ）
ＦＢ＝酵素ポンプの流量（ｍｌ／ｍｉｎ）
ＤＯ＝出力管内径（ｍｍ）
【０１１１】
いくつかの実施形態において、スプリッターに接続される管は空間を保つようにコイル巻きされる。他の実施形態において、スプリッターは、磁気骨格と共にＭＮＰ／酵素混合物をシェーカー（１４）内に落下させる。スプリッターは、単一管のみよりも大きい表面領域にわたり混合物を落下させ得る。容器は、ＢＮＣと骨格との十分な混合が確保されるように振盪される。
【０１１２】
本明細書に記載される本発明をより完全に理解し得るように、以下の実施例が示されている。これらの実施例は、単に例示を目的としたものにすぎず、本発明をなんら限定するものとみなすべきではないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１１３】
実施例１−酵素と酸化鉄磁気ナノ粒子との比の最適化
酵素充填率は、さまざまなｐＨ値で酵素とＭＮＰとの比を最適化することにより各酵素に対して最適化される。酸化鉄磁気ナノ粒子クラスター中に固定化された酵素の充填率は、例えば、修正ブラッドフォードタンパク質定量アッセイを間接的に利用して未結合酵素を測定することにより決定される。
【０１１４】
約４〜１１のｐＨに調整された一定濃度の超常磁性鉄ナノ粒子（５００μｇ／ｍＬ）と約５〜１０００μｇ／ｍＬの濃度の酵素とを組み合わせる。１〜１２時間の接触時間の後、酵素／ナノ粒子クラスター（レベル１）をサスペンジョン状態の過剰のマグネタイトマイクロ粒子（２０ｇマイクロ粒子／１ｇＭＮＰ）（レベル２）上に固定化する。永久磁石を用いてペレット化することにより固定化酵素をサスペンジョンから分離する。マイクロプレートＵＶ／可視分光測光器を用いてマイクロプレートでブラッドフォードアッセイにより５９５ｎｍの吸光度を読んで標準曲線を使用することにより、上澄み中に残留する未結合タンパク質を定量可能である。ブラッドフォード試薬のクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素は、塩基性アミノ酸残基に結合して５９５ｎｍ（青色）にＵＶ吸収を有する安定な複合体を形成する。この吸光度はベールの法則に従う。タンパク質濃度対Ａ５９５の標準曲線を用いて、溶液中のタンパク質濃度を決定する。全タンパク質と未結合タンパク質との差から以下のように固定化タンパク質の量を計算する。
［Ｅ］結合＝［Ｅ］全体−［Ｅ］未結合
［Ｅ］＝酵素濃度（μｇ／ｍＬ）
【０１１５】
［Ｅ］全体に対する［Ｅ］結合のプロットから結合等温線を作成し、二次形式のラングミュア吸着モデルに当てはめる。レベル１固定化の酵素充填容量は、ナノ粒子１グラム当たりの結合タンパク質のグラム数に換算してパーセントで表される。例えば、以下の通りである。
１％充填率＝（１ｇ結合タンパク質）／（１００ｇナノ粒子）
【０１１６】
酵素とナノ粒子との最適比を決定した後、固定化速度曲線（１０分間、１時間、５時間、および１８時間）を用いて、酵素の１００％捕捉に対する最小接触時間を決定する。酵素固定化手順は以下の通りである。
【０１１７】
定量のために、０、１０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００μｇ／ｍＬでＭｉｌｌｉＱ水によるストック酵素の２ｍＬ希釈液を含む標準を調製する。５ｍＬの１０００μｇ／ｍＬナノ粒子（ＭＮＰ）の入った３本の管を用意する。１Ｍ  ＨＣｌおよび１Ｍ  ＮａＯＨを用いて１つの管に対してＭＮＰのｐＨをそれぞれｐＨ４、５、９、および１１に調整する。２０％の振幅でＭＮＰを１分間超音波処理する。
【０１１８】
次のように酵素を固定化する。超音波処理されたＭＮＰの５００μＬを９本のマイクロ遠心分離管にアリコートする。各ｐＨのＭＮＰに対して合計２７本の管でこれを行う。各酵素希釈液の５００μＬを各ｐＨのＭＮＰアリコートに混合して、各ｐＨのＭＮＰで９個、合計２７個のサンプルを、０、５、２５、５０、１２５、２５０、３７５、５００、および１０００μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度ならびに５００μｇ／ｍＬの最終ＭＮＰ濃度で作製する。各サンプルをボルテックスし、次いで、タンブラー中、４℃で１２時間アジテートすることより酵素とＭＮＰとの接触時間を可能にする。
【０１１９】
５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に１００ｍｇのマグネタイトを導入して５ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイトマイクロ粒子サスペンジョンを調製する。激しく振盪することによりマグネタイトサスペンジョンを混合する。上下に１０回ピペッティングを行ってマイクロ粒子を分散させる。５００μＬの２０ｍｇ／ｍＬマイクロ粒子サスペンジョンを２７個の酵素サンプルのそれぞれに添加する。オービタルシェーカーを用いてサンプルを１０分間混合することにより、レベル２骨格上にレベル１固定化酵素を装着する。永久希土類磁石を用いてレベル２をペレット化する。上澄みを捕集し、所要により、最大濃度（すなわち、０％充填率）が５〜２０μｇ／ｍＬの範囲内に含まれるように希釈する。
【０１２０】
希釈した上澄みでブラッドフォードアッセイを行って希釈した上澄みの濃度を決定する。これらの濃度を適切な稀釈倍率によりスケール調整してレベル１固定化後に残留する未結合タンパク質の濃度を求める。初期全タンパク質と未結合タンパク質との差から以下のように結合タンパク質を計算する。
［Ｅ］結合＝［Ｅ］全体−［Ｅ］未結合
［Ｅ］＝酵素濃度（μｇ／ｍＬ）
【０１２１】
固定化効率の定量は、［Ｅ］全体／５００μｇ／ｍＬに対して［Ｅ］結合／５００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰをプロットすることにより計算される。モデリングソフトウェアを用いてデータをラングミュア吸着モデルに当てはめる。ＭＮＰに対して酵素を最適化した後、満足な酵素充填率は１〜１００％である（材料１００ｇ当たりの酵素のｇ数）。
【０１２２】
実施例２−酸化鉄磁気ナノ粒子による酵素固定化時間の最適化
最初に、以上の実施例１のように一定量のＭＮＰに対して各酵素の最大酵素充填率を最適化し決定する。酵素とナノ粒子との最適比を決定した後、固定化速度曲線（０分間、５分間、１時間、５時間、および１８時間）を用いて、酵素の１００％捕捉に対する最小接触時間を決定する。
【０１２３】
酵素固定化手順は次の通りである。酵素の１００％捕捉（［Ｅ］最大）をもたらす最も高い酵素充填率を結合等温線から選択する。選択された酵素充填条件のｐＨで６ｍＬの１０００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰを調製する。２０％の振幅でＭＮＰを１分間超音波処理する。超音波処理されたＭＮＰの１０個の５００μＬアリコートを１．５ｍＬ管中に作製する。
【０１２４】
２＊［Ｅ］ｍａｘの６ｍＬを調製する。ＭｉｌｌｉＱ水中に６ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬレベル２を調製する。５００μＬの酵素をＭＮＰアリコートの８つに添加し、［Ｅ］ｍａｘの最終酵素濃度および５００μｇ／ｍＬのＭＮＰ濃度を得る。
【０１２５】
次の時間点、すなわち、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８ｈ（一晩）で、５００μＬの十分に混合されたレベル２を酵素固定化アリコートに添加して固定化を終了する。以上のブラッドフォードアッセイ手順に従って、１：１のＭｉｌｌｉＱ水およびブラッドフォード試薬をブランクとして用いて、所与の時間後に依然として溶液中にある酵素の濃度を決定する。酵素の１００％固定化に対する最小時間は上澄みに酵素がないときである。
【０１２６】
酵素は、約５〜３０分間以内に最大充填容量（材料１００ｇ当たりの酵素のｇ数）で固定化される。
【０１２７】
実施例３−ＥＣ１．酵素：リポキシダーゼの固定化
リポキシダーゼは、脂肪酸中への分子酸素の取込みを触媒するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１３．１１．１２）である。ダイズ株グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）由来のリポキシダーゼ（ＬＰＯ）は、アンモニウムリノレエートからリノール酸ヒペルオキシドの１３−（Ｚ，Ｅ）−、９−（Ｅ，Ｚ）−、１３−（Ｅ，Ｅ）−、９−（Ｅ，Ｅ）−ＨＰＯＤＥの４種の位置異性ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）の混合物への変換により測定したとき、高い活性を有する。これらはそれぞれ、２５，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数（ε）で２３４ｎｍにピークＵＶ吸収を有する。２３４ｎｍの吸光度の増加を読み取ることにより、アンモニウムリノレエートからそのヒドロペルオキシドへの変換を評価可能である。Ａｎｔｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４９：３２−３７（２００１）、Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ３４（３）：１４７４−１４８１（２０１１）、Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１７：８２−９０（２０１３）を参照されたい。上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
一実施形態において、リポキシダーゼ固定化は最適化されて、得られるバイオ触媒活性は次のようにエンドポイント速度論で測定される。結合等温線は、ＭＮＰによるＬＰＯ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、完全固定化に対する最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＬＰＯ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＬＰＯおよび固定化に対する最良ナノ粒子濃度によりリノール酸からＨＰＯＤＥへの変換を実証する。この固定化ＬＰＯは、工業適合時間スケールの１８ｈ変換でしかも同程度のＶｍａｘを有して遊離酵素の活性に等しいかまたはそれを超えるように最適化される。
【０１２９】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＬＰＯのピーク充填率は以上に記載されたように決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＬＰＯは、活性に関して最良のＬＰＯ対ＮＰ比でスクリーニングされる。レベル２固定化ＬＰＯ活性は、リノレエートからそのヒドロペルオキシド（ＨＰＯＤＥ）への変換を用いて２３４ｎｍの吸光度の増加を読み取ることにより測定される。リノレエートおよび溶存酸素は、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＬＰＯと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でＨＰＯＤＥの濃度を測定することにより決定される。ごく短い時間でヒドロペルオキシドへの酸化が始まる。最適化固定化ＬＰＯは、基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＬＰＯと比較される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＬＰＯは再使用可能性に関して試験される。
【０１３０】
リポキシダーゼの結合等温線は、以上の実施例１〜２に記載されるように決定される。１８時間で６０％の変換に必要とされる非固定化ＬＰＯ濃度（［Ｅ］６０％）を決定する。１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中に３０ｍＭリノール酸ストック溶液を調製する。常に１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７で希釈する。次のＬＰＯ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１３１】
【表１】
2018519838.tif 000006
【０１３２】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクの２５０μＬのＡ２３４を読み取る。２３４ｎｍのＨＰＯＤＥの吸光係数を用いて上澄み中のＨＰＯＤＥの濃度を計算する。固定化ＬＰＯ（［Ｅ］６０％）のスクリーニングのために６０％の変換まで反応を完了させるのに必要とされる最低酵素濃度を決定する。
【０１３３】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＬＰＯの固定化は次のように行う。ＺＹＭ結合等温線プロトコルで見いだされた最適化固定化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＬＰＯを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＬＰＯを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（６０％リノール酸を１８ｈでＨＰＯＤＥに変換する最小ＬＰＯ濃度）と等価な濃度４［Ｅ］６０％に３ｍＬの希釈レベル２固定化ＬＰＯおよび遊離ＬＰＯを調製する。ＬＰＯ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＬＰＯに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＬＰＯの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１３４】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、Φはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中の１２ｍＬの２．４ｍＭリノール酸と２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８とを調製する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］６０％になる。
【０１３５】
【表２】
2018519838.tif 000007
【０１３６】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。ＬＰＯおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］６０％および５０ｍＭとなるように、各ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＬＰＯのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ２３４を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。２３４ｎｍの吸光係数を用いて反応管中のＨＰＯＤＥ濃度を計算する。
【０１３７】
最適化固定化ＬＰＯは、ＨＰＯＤＥに変換されたリノール酸の量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０１３８】
磁気固定化ＬＰＯの再使用可能性は次のように決定される。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＬＰＯサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＬＰＯをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１３９】
速度論的時間経過は次のように決定される。１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７中の３００μＬの２．４ｍＭリノール酸と６００μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７とを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］６０％になる。
【０１４０】
【表３】
2018519838.tif 000008
【０１４１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。ＬＰＯおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］６０％および５０ｍＭとなるように、ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。この固定化ＬＰＯリサイクル処理試験時にＨＰＯＤＥに変換されたリノール酸の量を決定する。
【０１４２】
実施例４−ＥＣ３．酵素−ニトリラーゼの固定化
ニトリラーゼ（ＮＩＴ）活性は、マンデロニチリルから（Ｒ）−マンデル酸への変換により測定される。マンデル酸が形成されるとｐＨが低下する。それは、プレートリーダーを用いてマイクロプレートでブロモチモールブルー（ＢＢ）などの色素により吸光係数１５７０３．７９Ｍ−１ｃｍ−１を有するＡ６１６の減少として分光測光法でモニターされる（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ８（５）：５５９−６５（２００３））。
【０１４３】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＮＩＴのピーク充填率は結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を使用する。最良ＮＩＴ対ＮＰ比に関して固定化ＮＩＴ活性のスクリーニングを行う。マンデロニトリルからマンデル酸へのレベル２固定化ＮＩＴ変換は、青色から黄色へのブロモチモールブルーの色変化を用いて６１６ｎｍの吸光度の減少を読み取ることにより測定される。マンデロニトリルおよびブロモチモールブルーは、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＮＩＴと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）で溶液のｐＨ変化を測定することにより比色法で決定する。１８ｈで基質の完全変換を達成するのに必要なニトリラーゼの濃度を決定する。
【０１４４】
次いで、基質の完全変換に関して１８ｈで遊離ＮＩＴの活性に等しいかまたはそれを超えるように固定化ＮＩＴを最適化する。固定化の最良条件を選択した後、再使用可能性に関して逐次アッセイでレベル２固定化ＮＩＴを試験する。次いで、実施例１および２に記載される方法を用いて結合等温線を決定する。
【０１４５】
一実施形態において、ニトリラーゼの固定化は最適化されて、得られるバイオ触媒活性は比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。最初に、１８時間で基質を完全変換するのに必要な遊離ＮＩＴ濃度（［Ｅ］１８ｈ）（参照）を以下のように決定する。
【０１４６】
１０％エタノールおよびＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの５０ｍＭマンデロニトリルストック溶液、ＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの０．０４％ＢＢ、および１２ｍＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２を調製する。次のＮＩＴ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、５０００ｎＭのそれぞれに対して、２５０μＬを２本の１．５ｍＬ遠心分離管中にそれぞれディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１４７】
【表４】
2018519838.tif 000009
【０１４８】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクのＡ６１６を読み取る。
【０１４９】
２．５％エタノール中の１２．５ｍＭマンデル酸、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０１％ブロモチモールブルーから始めて希釈系列でマンデル酸の標準曲線を作成する。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２および０．０１％ＢＢを用いて希釈する。形成されたマンデル酸の濃度を標準曲線により計算する。酵素の全ての濃度で反応が１００％変換で達成された場合、酵素の最も低い濃度を固定化ＮＩＴのスクリーニングに使用する濃度（［Ｅ］１８ｈ）として選択する。
【０１５０】
第２に、ＮＩＴをＢＮＣ中に固定化して、標準的最適化アッセイを用いて次のように固定化を最適化する。実施例１の等温線プロトコルで見いだされた固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＮＩＴを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＮＩＴを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（１００％マンデロニチリルを１８ｈでマンデル酸に変換するＮＩＴの最小濃度）と等価な濃度４＊［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＮＩＴおよび遊離ＮＩＴを調製する。ＮＩＴ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＮＩＴに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＮＩＴの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１５１】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１０％エタノールおよびＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの５０ｍＭマンデロニトリルストック溶液、ＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの０．０４％ＢＢ、および１２ｍＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２を調製する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１５２】
【表５】
2018519838.tif 000010
【０１５３】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＮＩＴ濃度で２５０μＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、２５０μＬの０．０１％ＢＢ、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＮＩＴのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ６１６を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。２．５％エタノール中の１２．５ｍＭマンデル酸、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０１％ブロモチモールブルーから始めて希釈系列でマンデル酸の標準曲線を作成する。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２および０．０１％ＢＢを用いて希釈する。形成されたマンデル酸の濃度を標準曲線により計算する。
【０１５４】
最適化固定化ＮＩＴは、マンデル酸に変換されたマンデロニトリルの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。再使用可能性は複数サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＮＩＴサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることが可能であり得る）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＮＩＴをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１５５】
速度論的時間経過：  １０％エタノール、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０４％ＢＢ中に各３００μＬの５０ｍＭマンデロニチリルを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１５６】
【表６】
2018519838.tif 000011
【０１５７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＮＩＴ濃度で２５０μＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、２５０μＬの０．０１％ＢＢ、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水をブランクに充填する。リサイクル処理は、プロトコルの繰返し、材料の回収、および後続サイクルでの使用により実証される。
【０１５８】
結合等温線を用いて、ＭＮＰによるＮＩＴ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＮＩＴ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＮＩＴによりマンデロニトリルからマンデル酸への変換を実証する。固定化に対するナノ粒子の最良濃度はこうして決定される。最適化ＮＩＴは、工業適合時間スケールの１８時間変換およびＶｍａｘに関して少なくとも遊離酵素に一致し得る。最適化ＮＩＴは、１８時間にわたり５サイクルで活性を損なわない固定化ＮＩＴの再使用可能性を決定するために再び使用される。
【０１５９】
実施例５−シトクロムオキシダーゼ（ＥＣ１．９．３．１）の固定化
動物、植物、酵母、およびいくつかの細菌の好気代謝で電子伝達鎖に関与するシトクロムｃオキシダーゼ（「ＣＣＯ」（ＥＣ１．９．３．１））。Ｅｒｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７３（１）：１１３−１１７（１９７６）。その活性は、フェロシトロクロムｃからフェリシトクロムｃへの酸化により測定される。（例えば、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２０１４：１−４を参照されたい。）上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。フェリシトクロムｃの形成は、５５０ｎｍの吸光度の減少として分光測光法でモニターされる。フェロシトクロムおよびフェリシトクロムの吸光係数の差は２１．８５ｍＭ−１ｃｍ−１である。
【０１６０】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＣＣＯの最大充填率は結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＣＣＯ活性は、最良のＣＣＯ対ＮＰ比に関してスクリーニングされる。フェロシトロクロムｃからフェリシトクロムｃへのレベル２固定化ＣＣＯ酸化は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで測定される５５０ｎｍの吸光度の変化を用いて評価される。シトクロムｃはジチオトレイトール（ＤＴＴ）により還元され、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＣＣＯにより再酸化される。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でＡ５５０の減少により測定される。
【０１６１】
一実施形態において、ＢＮＣ中へのＣＣＯ固定化の最適化およびその活性の後続測定は、次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で行われる。固定化ＣＣＯは、１８時間にわたる基質の完全変換に関して遊離ＣＣＯの活性に等しいかまたはそれを超えるように最適化される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＣＣＯは、再使用可能性に関して１ｍＬアッセイで５回の逐次１８時間反応により試験される。ＣＣＯの結合等温線は、以上の実施例１に記載されるように決定される。
【０１６２】
１８時間で基質を完全変換するのに必要な遊離ＣＣＯ濃度（［Ｅ］１８ｈ）（参照）は、次のように決定される。９２μＭ  ＤＴＴおよびＭｉｌｌｉＱ水を有する１２ｍＬの４０μＭシトクロムｃストック溶液と、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する２４ｍＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。シトロクロムｃをＤＴＴにより２０分間還元し、１０〜２０のＡ５５０／Ａ５６５により確認する。次のＣＣＯ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１６３】
【表７】
2018519838.tif 000012
【０１６４】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクのＡ５５０を読み取る。ＤＴＴを有していない１０μＭ酸化型シトクロムｃ（室温で一晩放置）および１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７から始めて希釈系列で酸化型シトクロムｃの標準曲線を形成する。１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７を用いて希釈する。標準曲線を用いて酸化型シトクロムＣの濃度を計算する。酵素の全ての濃度で反応が１００％変換で達成された場合、酵素の最も低い濃度を固定化ＣＣＯのスクリーニングに使用する濃度（［Ｅ］１８ｈ）として選択する。
【０１６５】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＣＣＯ固定化：  実施例１に記載される固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＣＣＯを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＣＣＯを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（１００％シトクロムｃを１８ｈで酸化するＣＣＯの最小濃度）と等価な濃度４＊［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＣＣＯおよび遊離ＣＣＯを調製する。ＣＣＯ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＣＣＯに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＣＣＯの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１６６】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。９２μＭ  ＤＴＴおよびＭｉｌｌｉＱ水を有する１２ｍＬの４０μＭシトクロムｃストック溶液と、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する２４ｍＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。シトクロムｃをＤＴＴにより２０分間還元し、１０〜２０のＡ５５０／Ａ５６５により確認する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１６７】
【表８】
2018519838.tif 000013
【０１６８】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＣＣＯ濃度で、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する５００μＬの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水と、を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＣＣＯのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ５５０を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。
【０１６９】
ＤＴＴを有していない１０μＭ酸化型シトクロムｃ（室温で一晩放置）および１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７から始めて希釈系列で酸化型シトクロムｃの標準曲線を形成する。１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７を用いて希釈する。標準曲線を用いて酸化型シトクロムＣの濃度を計算する。
【０１７０】
酸化型シトクロムｃの量を時間に対してプロットすることにより最適化固定化ＣＣＯを決定する。線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定する。
【０１７１】
再使用可能性は次のように５サイクルでアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＣＣＯサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＣＣＯをペレット化する。上澄みを除去する。次のように速度論的時間経過を計算する。９２μＭ  ＤＴＴを有する３００μＬの４０μＭシトクロムｃと、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する６００μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１７２】
【表９】
2018519838.tif 000014
【０１７３】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＣＣＯ濃度で、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する５００μＬの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水と、を各ブランクに充填する。手順を複数回繰り返して再使用可能性を実証する。
【０１７４】
結合は、ＭＮＰによるＣＣＯ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＣＣＯ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＣＣＯによりフェロシトクロムからフェリシトクロムへの変換を実証し、固定化に対する最良ナノ粒子濃度を決定する。この最適化ＣＣＯは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して少なくとも遊離酵素に一致し得るとともに同程度のＶｍａｘを有し得る。最適化ＣＣＯを見いだしたら、再びそれを用いて固定化ＣＣＯの再使用可能性を実証する。
【０１７５】
実施例６−グルコースイソメラーゼの固定化
グルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）は、高い立体選択性を有してβ−Ｄ−グルコースからフルクトースへの異性化を触媒する。Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９１：２３０−２３４（１９６０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ７：１６５−１８５（１９９２）（両方ともその全体が参照により援用される）。その固定化は遊離酵素と比較して高い活性になるように最適化される。活性はグルコースからフルクトースへの変換により測定される。グルコースの消失は、グルコースオキシダーゼ／ホースラディッシュペルオキシダーゼ系（ＧＯＸ／ＨＲＰ）を用いて分光測光法でモニターされる。ＧＯＸは、グルコースおよび溶存酸素を過酸化水素に変換し、この過酸化水素は、次いで、フェノールを酸化するためにＨＲＰにより使用される。次いで、フェノールラジカルは４−アンチアミノピレン（４−ＡＡＰ）比色剤に結合する。フェノール−４−ＡＡＰ複合体の形成に基づく５５０ｎｍの吸光度の増加は、溶液中の残留グルコースの量に直接対応する。したがって、５５０ｎｍの吸光度が低いほど、より多くのグルコースがグルコースイソメラーゼによりフルクトースに変換されたことを示唆する。
【０１７６】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＧＩのピーク充填率は等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＧＩ活性は、最良のＧＩ対ＮＰ比に関してスクリーニングされる。グルコースからフルクトースへのレベル２固定化変換は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで測定される５５０ｎｍの吸光度の変化を用いて評価される。グルコースおよびレベル２固定化ＧＩは１ｍＬバッチ反応で反応する。所望の継続時間にわたり反応させた後、反応上澄みをＧＯＸ／ＨＲＰミックス中に希釈し、さらには最終体積１ｍＬでフェノール、緩衝液、および４−ＡＡＰ色素を加えて、残留グルコースを定量する。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）で増加したＡ５５０を測定することにより決定する。
【０１７７】
一実施形態において、グルコースイソメラーゼの固定化は最適化されて、後続の活性は次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。最適化固定化ＧＩは、基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＧＩと一致する。固定化の最良条件を選択した後、再使用可能性に関して１ｍＬの体積で５回の逐次１８ｈ反応によりレベル２固定化ＧＩを試験する。
【０１７８】
ＧＩの結合等温線は、以上に記載されるように決定する。
【０１７９】
１８ｈ１００％反応完了に対する遊離ＧＩ濃度（［Ｅ］１８ｈ）を次のように決定する。１２ｍＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する１２ｍＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する１２ｍＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。次のＧＩ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１８０】
【表１０】
2018519838.tif 000015
【０１８１】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。全てのサンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。
【０１８２】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＧＩの固定化：  ＺＹＭ結合等温線プロトコルで見いだされた固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＧＩを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＧＩを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。
【０１８３】
４＊（１００％グルコースを１８ｈでフルクトースに変換するＧＩの最小濃度）と等価な濃度４［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＧＩおよび遊離ＧＩを調製する。ＧＩ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＧＩに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＧＩの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１８４】
次のように速度論的時間経過を決定する。各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、Φはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１２ｍＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する１２ｍＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する１２ｍＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。
【０１８５】
１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１８６】
【表１１】
2018519838.tif 000016
【０１８７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＧＩ濃度で２５０μＬの２００ｍＭ  ＰＢ  ｐＨ６、２５０μＬの２００ｍＭグルコース、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。各サンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。最適化固定化ＧＩは、フルクトースの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０１８８】
再使用可能性は５サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＧＩサンプル（これはまた、１８時間で反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＧＩをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１８９】
次のように速度論的時間経過を決定する。３００μＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、６００μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する３００μＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する３００μＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１９０】
【表１２】
2018519838.tif 000017
【０１９１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＧＩ濃度で２５０μＬの２００ｍＭ  ＰＢ  ｐＨ６、２５０μＬの２００ｍＭグルコース、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。各サンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。
【０１９２】
結合等温線は、ＭＮＰによるＧＩ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＧＩ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＧＩによりグルコースからフルクトースへの変換を実証する。固定化に対するナノ粒子の最良濃度を決定する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、５５〜６０℃で高い基質濃度で磁気固定化ＧＩを用いて、炭酸ナトリウムによりｐＨを７．５〜８．０に調整する。酵素活性を維持するために硫酸マグネシウムを添加した（Ｍｇ２＋が補因子であるため）。Ｃｏ２＋を補因子として使用してもよい。この最適化ＧＩは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して遊離酵素に少なくともマッチし、同程度のＶｍａｘを有し得る。
【０１９４】
実施例７−トランスアミナーゼの固定化
ω−トランスアミナーゼは、キラルアミンまたはケトンを形成するアミン基の転移を触媒するトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。ω−トランスアミナーゼまたはアミントランスアミナーゼ（ＡＴＡ）は、遊離酵素と比較して高い活性となるように固定化される。それはアセトフェノンおよびアリニンを形成するα−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）からピルベートへのアミン転移により測定される。アセトフェノン（ＡＰ）の形成は２４５ｎｍのＵＶ吸収の増加により判断される。ＡＰの吸光係数は１２Ｍ−１ｃｍ−１である。（Ｋａｒｉｍ  Ｅｎｇｅｌｍａｒｋ  Ｃａｓｓｉｍｊｅｅ  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，ＫＴＨ  Ｒｏｙａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（２０１２）、Ｗａｔｓｏｎ  Ｎｅｔｏ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋを参照されたい。）上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１９５】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＡＴＡのピーク充填率は、以上に記載される結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＡＴＡは、酵素活性に関して最良のＡＴＡ対ＮＰ比でスクリーニングされる。レベル２固定化ＡＴＡ活性は、２４５ｎｍの吸光度の増加により判断されるアセトフェノンへのＭＢＡの変換を用いて評価される。ＭＢＡおよび共基質ピルベートは、１ｍＬバッチ反応でレベル２ＡＴＡと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でアセトフェノンの濃度を測定することにより決定される。
【０１９６】
一実施形態において、ＡＴＡの固定化は最適化されて、後続の活性は次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。固定化ＡＴＡは最大Ｖｍａｘになるようにおよび基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＡＴＡの活性に一致するように最適化される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＡＴＡは再使用可能性に関して試験される。
【０１９７】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＡＴＡの固定化：  実施例１に示される固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＡＴＡを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＡＴＡを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。
【０１９８】
１００％ＭＢＡを１８ｈでＡＰに変換するのに必要な最小ＡＴＡ濃度の４倍と等価な濃度［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＡＴＡおよび遊離ＡＴＡを調製する。ＡＴＡ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＡＴＡに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＡＴＡの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１９９】
次のように速度論的時間経過を決定する。各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。４ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌを調製する。１％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  ＭＢＡ、１０ｍＭナトリウムピルベート、および２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８をそれぞれ１２ｍＬ調製する。７５０μＬの反応ミックスを各管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。
これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０２００】
【表１３】
2018519838.tif 000018
【０２０１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。熱変性（例えば、沸騰水中５分間）により適切な管中の反応を停止する。ＡＴＡおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］１８ｈおよび５０ｍＭとなるように、各ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８中の１５６．２５ｍＭを最大濃度として希釈系列でＡ２４５に対するアセトフェノン濃度の標準曲線を作成する。希釈剤は、標準曲線に対するブランクとなる５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８とする。
【０２０２】
永久希土類磁石を用いて全ての固定化酵素をペレット化する。各管の上澄み６２．５μＬを９３７．５μＬのＭｉｌｌｉＱ水中に希釈する。トリプリケートで、各希釈反応サンプルおよび希釈酵素ブランクを有するブランクのＡ２４５を読み取る。アセトフェノン標準を用いて希釈上澄み中のアセトフェノンの濃度を計算する。上澄み中のＡＰ濃度に稀釈倍率（１０００／６２．５）を乗算することにより反応管中の最終ＡＰ濃度を計算する。
【０２０３】
最適化固定化ＡＴＡは、アセトフェノンに変換されたＭＢＡの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０２０４】
再使用可能性は５サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１０８００ｍｉｎ（１８ｈ）固定化ＡＴＡサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＡＴＡをペレット化する。上澄みを除去する。
【０２０５】
次のように速度論的時間経過を決定する。１５０μＬの６Ｍ  ＨＣｌを調製する。１％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  ＭＢＡ、１０ｍＭナトリウムピルベート、および２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８をそれぞれ３００μＬ調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０２０６】
【表１４】
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【０２０７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。１８時間後、１００μＬの６Ｍ  ＨＣｌで停止する。ＡＴＡおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］１８ｈおよび５０ｍＭとなるように、ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。この固定化ＡＴＡリサイクル処理試験時にアセトフェノンに変換されたＭＢＡの量を決定する。再使用可能性の試験を行う。
【０２０８】
結合等温線は、ＭＮＰによるＡＴＡ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＡＴＡ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＡＴＡによりＭＢＡからＡＰへの変換を実証し、固定化に対する最良ナノ粒子濃度を決定する。この最適化ＡＴＡは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して遊離酵素に少なくともマッチし、同程度のＶｍａｘを有し得る。最適化ＡＴＡを見いだしたら、それを取り出して１８時間にわたり５サイクルで活性を損なうことなく再使用する。
【０２０９】
実施例８−磁気固定化ナノ粒子の自動連続フロー製造
例示的な酵素ＨＲＰをＭＮＰクラスター中に磁気固定化するために、機械を作製して使用した。５０％充填率まで９９％超の固定化効率が実証された。固定化ＨＲＰは、阻害濃度のＨ２Ｏ２の存在下で遊離酵素よりも優れた活性を有していた。
【０２１０】
連続フロー酵素固定化を示す超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）クラスター中にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を固定するために、機械を作製して使用した。ＨＲＰは、＞９９％の固定化効率を有して２５％および５０％の充填率でＭＮＰクラスターにより封入された。固定化ＨＲＰの活性は、５００ｎｍの吸光度の増加により測定されるキノンイミン色素（４−アミノアンチピレン（４−ＡＡＰ）とフェノールとの複合体）の生成速度により評価した。０．５ｍＭフェノール、０．５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、および２ｎＭ  ＨＲＰの反応混合物を用いて、５０％充填率固定化ＨＲＰは、試験条件下で遊離ＨＲＰよりも５±０．１倍優れた初期反応速度（μＭ形成されたキノンイミン色素、／分間）を達成する。
【０２１１】
フェノール、４−ＡＡＰ、凍結乾燥ＨＲＰ、および緩衝塩はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。Ｈ２Ｏ２（３０％）はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより提供された。ＨＲＰはＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、ストック溶液濃度は１０２ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する４０４ｎｍの吸光度により決定した。他の溶液は全て、同様にＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製した。
【０２１２】
ＨＲＰの固定化：  ＨＲＰおよびＭＮＰは、ＭＮＰクラスター（レベル１）中にＨＲＰを封入するためにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００  Ｍｉｃｒｏ  ＰｕｍｐデュアルポンプＨＰＬＣシステムにより制御された流量の連続フロー内で組み合わせた。固定化酵素は、等体積の８０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰおよび２０または４０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰを用いて、４０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰ当たり１０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ（２５％充填率）および４０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰ当たり２０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ（５０％充填率）の最終濃度で、調製した。使用前、ＭＮＰサスペンジョンは、１Ｍ  ＨＣｌおよびＮａＯＨを用いてｐＨ５に設定し、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（ＦＢ−５０５）により４０％の振幅で１分間超音波処理した。両試薬は、０．８３３ｍＬ／ｍｉｎの速度で内径０．７６２ｍｍのステンレス鋼管を介してポンプ操作してＴミキサーで組み合わせ、１．６７ｍＬ／ｍｉｎの組合せ出力とした。試薬がＴミキサーに達した後、出力を内径１．０１６ｍｍのステンレス鋼管に通して貫流させた。ＭＮＰの均一性および分散性を確保するために、コイルの中心に位置するソニケータープローブを備えて冷水中に配置されたステンレス鋼管のコイルにＭＮＰ溶液を通して、４０％の振幅で２秒間のインターバルでパルスのオン・オフを行った。また、ＭＮＰの分散性を維持するためにソニケータープローブに近接してＭＮＰ貯蔵槽を配置した。こうして、２５％および５０％の酵素充填率のそれぞれに対して、レベル１の５つの１ｍＬバッチを遠心分離管内に捕集した。固定化ＨＲＰを８００μｇのマグネタイト粉末（レベル２）上に直接捕集し、次いで、オービタルシェーカーを用いてレベル１およびレベル２を１０分間にわたり十分に混合することにより、連続フローの外側の未結合酵素のさらなる固定化を停止した。永久磁石を用いてレベル２をペレット化し、タンパク質定量のために上澄みを捕集した。次いで、ペレットを１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【０２１３】
固定化酵素の定量：  以上に記載された修正ブラッドフォードアッセイを用いてレベル２上に捕捉された固定化ＨＲＰの量を測定し、レベル１溶液で検出された全タンパク質と比較した。
【０２１４】
ＨＲＰ活性アッセイ：  固定化ＨＲＰの活性は、桃色キノンイミン色素の形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加を用いて決定した（図３）。フェノールと４−アミノアンチピレン（４−ＡＡＰ）との複合体は、１３．７８ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する。反応混合物は、０．５ｍＭフェノール、０．５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、過剰のＨ２Ｏ２（２．５ｍＭ）、および２ｎＭ  ＨＲＰを含有し、オービタルシェーカーでアジテートしながら室温の遠心分離管内で達成した。１〜６０ｍｉｎの接触時間で、１ｃｍに経路長補正するＢｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてＵＶ透過性マイクロプレートを読み取って、エンドポイント吸光度読取りを行った。遊離ＨＲＰおよび５０％充填固定化ＨＲＰの活性は、１分当たり形成されたキノンイミン色素のμＭ数に基づく初期反応速度の比較により評価した。
【０２１５】
固定化効率：  ２５％および５０％充填サンプルの両方で酵素の９９％超がＭＮＰに封入されることが、ＨＲＰ濃度のブラッドフォードアッセイにより判明した。図４は、レベル１固定化ＨＲＰとして溶液中で測定されたタンパク質の量およびレベル２固定化ＨＲＰに結合されて溶液から取り出された量を示す。レベル２の酵素の量は、溶液中の全タンパク質および未結合タンパク質の差として計算した。
【０２１６】
固定化ＨＲＰの活性：  レベル２固定化ＨＲＰにより触媒される４−ＡＡＰ：フェノール反応の初期速度は、時間に対するキノンイミン色素濃度のプロットの線形領域の傾きにより決定した（図３）。固定化ＨＲＰは、１．５８±０．０３μＭ／ｍｉｎの初期速度を有していた。０．３１±０．０４μＭ／ｍｉｎの初期速度を有していた遊離ＨＲＰと比較して、固定化ＨＲＰは５倍の初期速度を有していた。ペルオキシダーゼは過酸化水素による基質阻害を受けるが、その感度はナノ粒子中への封入により得られる保護により低減される。
【０２１７】
実施例９：自動ＢＮＣ合成のための超音波処理および流量最適化
マグネタイトナノ粒子（ＭＮＰ）クラスター内へのホースラディッシュペルオキシダーゼの固定化は、連続フローアセンブリーを用いて最適化した。連続フローシステムは、非常に正確な濃度比で酵素と単分散ナノ粒子とを混合した。得られたＢＮＣは、磁性材料上に直接テンプレート化された。アセンブリーシステムは、０．０６２５インチＯＤ×０．０４３インチＩＤの３１６ステンレス鋼管を備えた２つのＨＰＬＣポンプ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｍｐ）を含んでいた。ＡおよびＢのラベル付きポンプは、それぞれ鋼管の個別のセグメント（ＡおよびＢとも称される）を介してＭＮＰおよび酵素を移動させた。それらは、混合チャンバーとして作用する鋼ティー備品により下流で組み合わされた。ＭＮＰの単分散サスペンジョンを達成するために、管Ａは、直径３．１８ｃｍの「超音波処理ループ」として３回コイル巻きされ、超音波水浴内に配置された（Ｂｒａｎｓｏｎ  １８００）。ＭＮＰ−酵素混合を促進するために、ティー備品から下流の管もまた、捕集ポートで終端する７．６ｃｍ「温置ループ」として１０回コイル巻きされた。
【０２１８】
毎日最初のランの前に、３．００ｍＬ／ｍｉｎで３５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを流し、続いて５０ｍＬの脱イオン水を流すことにより、ポンプを清浄化した。次に、５ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液および５ｍＬのＭＮＰ溶液（両方とも所望の濃度では調製した）を個別の貯蔵槽に移した。次いで、ＭＮＰを２５％の振幅で連続的に６０秒間超音波処理した（１／４インチプローブチップを備えた５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ，Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ）。これは約１２〜１４Ｗの超音波処理パワーに対応する。ラン時に４０ｋＨｚの超音波処理が維持されたＢｒａｎｓｏｎ浴中の所定の位置にＭＮＰ管を取り付けた。次いで、空気の取込みを防止するために液体の表面から下方にできる限り離して、２つのポンプのプラスチック吸入管をそれぞれのサンプルリザーバー内にと取り付けた。次いで、両方のポンプを所望の流量（すなわち、０．８３ｍＬ／ｍｉｎの整数倍および整数分の一）に設定し、ポンプＡのポンプ操作を初期化した。ポンプＡ始動の２０秒後、ポンプＢを始動させた。捕集ポートでは、溶出液中のＭＮＰが凝集を停止した時、最初の１ｍＬの溶出液を捕集した。１０個の１ｍＬサンプル画分が得られるまで捕集を継続した。次いで、それに続く試験に備えて５０ｍＬの脱イオン水でポンプをパージした。０．２１（１／４倍）、０．４２（１／２倍）、０．８３（１倍）、１．６６（２倍）、および３．３２（４倍）ｍＬ／ｍｉｎの流量では、この捕集プロトコルに従った。
【０２１９】
各ポンプスピードに対して５個の１ｍｌサンプルを室温で連続的にアジテートし、ＭＮＰが酵素を固定化する過剰の時間を確保した。８個のサンプルを１５，０００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、各遠心分離サンプルの上澄みでブラッドフォードアッセイを行った。
【０２２０】
各試験の残りの２ｍＬを固定化ＨＲＰの活性の測定に使用し、アッセイを行う準備ができるまで２５℃でアジテートし続けた。２５ｍＭの過酸化水素を基質としてアッセイに使用した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水と共に１０ｍＭフェノールおよび１０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）を１０ｍＬの溶液中で組み合わせて反応混合物として使用した。酵素を含有する全てのサンプルを２５ｎＭに希釈し、次いで、反応混合物および過酸化物を反応ウェルに添加した後、２．５ｎＭにさらに希釈した。
【０２２１】
Ｅｐｏｃｈ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ内で進行するＨＲＰ−過酸化物反応を５００ｎｍで走査して、吸光度を１０分間にわたりリアルタイムに決定した。図５は、遊離ＨＲＰと比較して試験された各ポンプスピードに対して１００：１  ＭＮＰ：ＨＲＰ濃度比のＭＮＰ固定化ＨＲＰの初期反応速度を示す。速度は、２．５ｎＭの濃度でＨＲＰを用いて反応の最初の３１５秒間で得られたものである。アッセイ濃度は、２５μｇ／ｍＬ  ＨＲＰおよび２，５００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰを含有する元の溶出液を希釈することにより得た。ε＝１３．７８ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数および０．７１７ｃｍの平均経路長を仮定して生成物の形成を計算した。
【０２２２】
ＭＮＰに固定化されたＨＲＰは、ＨＲＰ単独の５〜９倍の酵素活性を呈した（図５）。唯一の例外は３．３２ｍＬ／ｍｉｎサンプルであった。これはおそらくあまりにも急速に溶出させたのでＭＮＰとＨＲＰとが相互作用して所望のクラスターを形成できなかったためであろう。捕集時、水のみが溶出した。０．８３ｍＬ／ｍｉｎのポンプスピードで最も高い活性が達成されたが（遊離ＨＲＰと比較して反応速度が９倍に増加した）、この最適点を基準にしてポンプスピードを増加または減少させると活性が低下したことは、注目に値する。したがって、ポンプスピードは酵素活性に影響を及ぼす。すなわち、流量を多くすると混合乱流が改善されるだけでなく、ＭＮＰ−酵素接触時間が低減される。
【０２２３】
実施例１０：磁気支持体上への自動ニトリラーゼ固定化
材料および方法。ニトリラーゼ（ＭＷ＝４１ｋＤａ、ｐＩ＝８．１を有する１４個の同一のサブユニット）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でバイオマイクロ触媒（ＢＭＣ）を得た。最適化固定化条件は、ニコチン酸の合成に関して遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２２４】
組換えニトリラーゼはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたものであり、３−シアノピラジン、ｏ−フタルジアルデヒド、２−メルカプトエタノール、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、およびエタノールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウム、および水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子および磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されたように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。蛍光強度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダーを用いてＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５ブラックボトム蛍光マイクロプレートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２２５】
凍結乾燥ニトリラーゼを水に溶解させた。ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）ストック溶液（７５ｍＭ）を１００％エタノール中に調製し、氷上に保持するかまたは４℃で貯蔵した。また、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）ストック溶液（７２ｍＭ）は、使用直前に１００％エタノール中に調製した。緩衝ＯＰＡ／２−ＭＥ試薬は、４５０ｍＬの以上の溶液を９．１ｍＬの２００ｍＭ  ｐＨ９．０  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝液に添加することにより調製した。緩衝試薬は使用直前まで氷上に保持され、その時点で室温（２１℃）に平衡化可能である。
【０２２６】
固定化間の一貫性を向上させるために、および遊離酵素とＭＮＰとの混合を向上させて制御されたＢＮＣ直径を有するより均一な生成物を達成するために、ＢＮＣ調製用の連続フローシステムを使用した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４”のステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、７ポートＰＥＥＫマニホールドインラインミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集可能にした。
【０２２７】
遊離ニトリラーゼストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ８．７５に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ニトリラーゼ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのニトリラーゼストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ニトリラーゼＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを５９４μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ニトリラーゼＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ニトリラーゼの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２２８】
ニトリラーゼ反応および活性決定。ニトリラーゼ反応および活性定量法は両方とも、Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７（３）：２８９−２９３（２００３）に記載される方法の修正に基づく。簡潔に述べると、ニトリラーゼは、３−シアノピリジンをニコチン酸に加水分解してアンモニアを遊離する反応を触媒した。ニトリラーゼ反応は、５０ｍＭ  ３−シアノピリジン、８７．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ｐＨ９．０、および２１８ｎＭ遊離または固定化ニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含有する１ｍＬの全反応体積で５０℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管中で２０時間行った。等体積のニトリラーゼ反応ミックスに１３．３５μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌを添加することにより反応を停止した。固定化ＮＩＴを磁気的にピペッティングし、上澄みをＨＣｌで処理した。
【０２２９】
イソインドール蛍光色素中へのアンモニアの取込みを検出することにより蛍光測定法で酵素活性を測定した。緩衝試薬（６２４μＬ）を上澄みに添加し、室温で穏やかに２０分間混合した。温置後、１５０μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌをこの溶液に添加し、蛍光シグナルを増加させた。最高強度のウェルを基準にしてゲインを自動調整し、４１２ｎｍ励起および４６７ｎｍ発光を用いて蛍光強度を測定した。各蛍光読取りは、内部線形ＮＨ４Ｃｌ標準曲線を含んでいた（Ｒ２＞０．９９）。ニトリラーゼ活性の単位（Ｕ）は、８７．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ（ｐＨ９．０）中、５０℃で１分当たり１μｍｏｌのＮＨ３遊離するものとして定義された。
【０２３０】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ニトリラーゼ標準曲線を含めて決定した（Ｒ２＞０．９９）。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１−２）：２４８−２５４（１９７６）。
【０２３１】
結果
対照は、非触媒アンモニア遊離がないことを示した。自動および手動で調製されたニトリラーゼＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への１％の有効充填率に対して＞９９％の固定化収率が得られた（表１５）。自動ニトリラーゼＢＭＣの活性は遊離ニトリラーゼと比べて概ね保持されたが（＞９９％）、手動ニトリラーゼＢＭＣはより低い活性（約３８％）を有していた。
【０２３２】
【表１５】
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【０２３３】
実施例１１：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのトランスアミナーゼ固定化
ω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８、ＭＷ＝１９５ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミンからのアセトフェノンの合成に関して遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２３４】
材料および装置。組換えω−トランスアミナーゼ（ωＴＡ）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたマイコバクテリウム・バンバアレニ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉ）由来のものであった。（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）、ナトリウムピルベート、およびアセトフェノン（ＡＰ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から得た。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。
【０２３５】
試薬。凍結乾燥ωＴＡを水に溶解させた。１２．７８μＬのＭＢＡを１００μＬのＤＭＳＯに溶解させることにより（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）ストック溶液を調製し、次いで、１０ｍＭの最終濃度になるように全体積を１０ｍＬにした。ナトリウムピルベート粉末を水に溶解させることによりナトリウムピルベートの４５ｍＭストックを調製した。１２μＬのＡＰを水に溶解させることによりアセトフェノンストック溶液を調製した。ストック溶液は全て、氷上に保持した。アッセイに使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）に平衡化させた。
【０２３６】
自動ＢＮＣアセンブリー。固定化間の一貫性を向上させるために、および遊離酵素とＭＮＰとの混合を向上させて制御されたＢＮＣ直径を有するより均一な生成物を達成するために、ＢＮＣ調製用の連続フローシステムを構築した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理を提供した。ティーの前で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、ＢＮＣを捕集するために第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置した。
【０２３７】
固定化。遊離ωＴＡストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ７．１５に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ωＴＡ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのωＴＡストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ωＴＡ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを５９４μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ωＴＡＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ωＴＡの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２３８】
ω−トランスアミナーゼ活性アッセイ。ωＴＡ活性定量法は、以上で引用したＳｃｈａｔｚｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）に記載される方法に基づくものであったが、マイクロプレートに適合化された。簡潔に述べると、ωＴＡは、ＭＢＡ（アミンドナー）からピルベートにアミノ基を転移してそれぞれＡＰおよびアラニンを形成する反応を触媒した。酵素活性は、以上で引用したＡＰ  Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ（２０１２）の形成に基づく２４５ｎｍの吸光度の増加により測定した。ωＴＡ反応は、５０ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１ｍＭ  ＭＢＡ、１ｍＭピルベート、および３４９ｎＭ  ω−トランスアミナーゼを含有する１ｍＬの全反応体積で、２ｍＬのマイクロ遠心分離管中、２１℃で１時間行った。固定化ωＴＡを磁気的にペレット化し、その上澄みの吸光度を読み取った。０〜０．１ｍＭ  ＡＰおよび０〜０．１ｍＭアラニンを含む線形標準曲線を用いてＡＰを定量した（Ｒ２＞０．９９）。ω−トランスアミナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中、２１℃で１分当たり１μｍｏｌのＡＰを生成するものとして定義された。
【０２３９】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ωＴＡ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２４０】
結果
対照は、非触媒アセトフェノン形成がないことを示した。自動および手動で調製されたωＴＡ  ＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への１％の有効充填率に対して＞９９％の固定化収率が得られた（表１５）。自動および手動ωＴＡ  ＢＭＣの活性は、遊離ニトリラーゼと比べて概ね保持された（＞９９％）。
【０２４１】
実施例１２：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのカルボニックアンヒドラーゼ固定化
ウシカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＮ）（ＭＷ＝３０ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で形成し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して９％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、二酸化炭素へのビカーボネートの脱水に関して遊離酵素と比べて９５±８％保持された活性をもたらした。
【０２４２】
材料および装置。ウシ赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＮ）、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、および８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホネート（ピラニン）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウム、および水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットに記載されるように合成し、さらに磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格も、以上に記載したように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。蛍光強度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作される試薬注入システムを備えたＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダーを用いてＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５ブラックボトム蛍光マイクロプレートで測定した。
【数５】
2018519838.tif 000021
プローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２４３】
試薬。凍結乾燥ＣＡＮを水に溶解させた。試薬Ａは、２ｍＭ  ＫＨＣＯ３および０．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８）を含有していた。試薬Ｂは、５００ｐＭカルボニックアンヒドラーゼ、１００ｎＭピラニン、および０．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ６を含有していた。
【０２４４】
自動ＢＮＣアセンブリー。連続フローシステムを用いてＢＮＣを調製した。それは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集可能にした。
【０２４５】
固定化。遊離ＣＡＮストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ６に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを１１に調整した。遊離ＣＡＮ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＣＡＮストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＣＡＮ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを６２．５μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＣＡＮ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ωＴＡの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２４６】
カルボニックアンヒドラーゼ活性アッセイ：  ＣＡＮは、以下のように炭酸の脱水を可逆的に触媒する。
ＨＣＯ３−  ＋  Ｈ＋  ⇔  ＣＯ２  ＋  Ｈ２Ｏ
【０２４７】
標準的カルボニックアンヒドラーゼ活性アッセイはＷｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ法である。Ｗｉｌｂｕｒ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６：１４７−１５４（１９４８）。緩衝ＣＯ２飽和溶液中で８．３から６．３へのｐＨ低下速度を測定する。これは二酸化炭素からのビカーボネートの形成により引き起こされる。Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５２（１）：１９０−１９７（１９９７）にすでに記載されるように代替的蛍光測定ｐＨベースアッセイを使用した。簡潔に述べると、蛍光ｐＨ指示薬としてピラニンを使用した。ビカーボネートの脱水に基づくｐＨの増加は、蛍光強度の増加となって現れる。等体積の試薬ＡおよびＢを混合することにより反応を開始させた。サンプル注入システムを用いて試薬Ａをマイクロプレートの試薬Ｂに添加し、直ちに蛍光読取りを開始した。反応速度が速いので、サンプル読取りは全て、一度に１ウェルずつトリプリケートで行った。蛍光は、ｐＨ感受性（Ｆｓ）およびｐＨ非感受性（Ｆｉｓ）の励起波長（それぞれ４６６ｎｍおよび４１３ｎｍ）を用いて５１２ｎｍの発光波長で測定した。各プレートに含まれる緩衝標準（ｐＨ６〜１０）に対してＦｓ／Ｆｉｓ対ｐＨの線形検量線を用いて蛍光強度をｐＨに変換した。Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  ＭｃＣａｒｔｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（２）：７３１−７３７（１９９４）。ＣＡＮ活性の１単位（Ｕ）は、以上に記載される条件下で測定の最初の１０秒間における１秒当たりのｐＨ変化として定義された。
【０２４８】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＣＡＮ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２４９】
結果
対照は、非触媒ｐＨ変化がないことを示した。ＣＡＮ  ＢＮＣを自動および手動でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への９％の有効充填率に対して＞９５％の固定化収率が得られた（表１５）。カルボニックアンヒドラーゼのハイブリッド骨格ＢＭＣおよびマグネタイト粉末ＢＭＣの活性は、遊離カルボニックアンヒドラーゼと比べて概ね保持された（＞９５％）。
【０２５０】
実施例１３：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのカタラーゼ固定化
カタラーゼ（ＭＷ＝２４０ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて３０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して０．８３％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２５１】
材料および装置。ウシ肝臓カタラーゼ（ＣＡＴ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。
【数６】
2018519838.tif 000022
プローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２５２】
試薬。凍結乾燥ＣＡＴを水に溶解させ、ウシ血清アルブミン標準を用いてブラッドフォード法により定量した。ストック溶液は全て、氷上に保持した。アッセイに使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）に平衡化させた。
【０２５３】
自動ＢＮＣアセンブリー。連続フローシステムを用いてＢＮＣを調製した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集を可能にした。
【０２５４】
固定化。遊離ＣＡＴストック（３００μｇ／ｍＬ）はｐＨ７に調整し、５ｍＬの１０００μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ＣＡＴ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＣＡＴストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＣＡＴ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを７２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＣＡＴ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＣＡＴの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２５５】
カタラーゼ活性アッセイ。ＣＡＴは、水および酸素への過酸化水素の分解を触媒する。過酸化物の減少に基づく２４０ｎｍの吸光度の減少により酵素活性を測定した  Ｌｉ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌｈｏｒｎ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（４）：１８５−１８７（２００７）。ＣＡＴ反応は、１００ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および５ｎＭカタラーゼを含有する１ｍＬの全反応体積で、２ｍＬのマイクロ遠心分離管中、２１℃で２分間行った。固定化ＣＡＴを磁気的にペレット化し、その上澄みの吸光度を読み取った。１０〜１００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む線形標準曲線を用いて過酸化水素を定量した（Ｒ２＞０．９９）。カタラーゼ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中、２１℃で１分当たり１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を分解するものとして定義された。
【０２５６】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＣＡＴ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２５７】
結果
対照は、Ｈ２Ｏ２の非触媒分解がないことを示した。自動で調製されたＣＡＴ  ＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への０．７９％の有効充填率に対して＞７９％の固定化収率が得られた（表１５）。手動で調製されたＣＡＴ  ＢＮＣを同一のタイプの骨格上に固定化したところ、７０％の固定化収率および０．７％の有効充填率が得られた。ＣＡＴ  ＢＭＣの活性は、遊離カタラーゼと比べて概ね保持され、自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣでそれぞれ９６％および７８％の残存活性であった。
【０２５８】
実施例１４：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのグルコースイソメラーゼ固定化
ＤｕＰｏｎｔ製のＧｅｎｓｗｅｅｔ（商標）は可溶性ＧＩＳである。その活性は、フルクトースからグルコースへの変換を用いて評価した。グルコースイソメラーゼ（ＭＷ＝１７３ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて８０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して８．１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞１２１％保持された活性をもたらした。
【０２５９】
材料および装置。可溶性グルコースイソメラーゼ（ＧＩＳ）のＧｅｎｓｗｅｅｔ（商標）は、ＤｕＰｏｎｔ（Ｃｅｄａｒ  Ｒａｐｉｄｓ，ＩＡ）により提供された。Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）由来のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、フェノール、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）、５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末、Ｄ−（＋）−フルクトースおよびＤ−（＋）−グルコースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。硫酸マグネシウム、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、以上に記載したようにＺＹＭｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）（ＰＣＴ１および２）でインハウスで合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべて、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであった。ＰＥＥＫおよびステンレス鋼備品は、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２６０】
試薬。フルクトースストック溶液（５Ｍ）は、メスフラスコで定量的に調製した。フェノール（１０ｍＭ）、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ、１０ｍＭ）、ｐＨ７．４  ＰＢＳ（５００ｍＭ）、グルコース（１００ｍＭ）、および硫酸マグネシウム（１Ｍ）は、調製して４℃で貯蔵した。使用前、試薬（２１℃）を室温に平衡化させた。ＧＩＳストックは溶液形態にあり、一方、ＨＲＰおよびＧＯＸの溶液は凍結乾燥粉末から調製した。
【０２６１】
グルコースイソメラーゼ反応および活性決定。ＧＩＳイソメラーゼ活性はグルコースレポーティング反応を用いて決定した。一次反応（フルクトースからグルコースへのＧＩＳ触媒異性化）は、３９０ｍＭフルクトース、５０ｍＭ  ｐＨ７．８  ＰＢＳ、および１．２７〜１．４５μＭ  ＧＩＳを含有する１ｍＬの反応体積で、６５℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管で行った。反応を３０分間行い、ローテーター上で穏やかに混合し、５０μＬ  ０．１Ｍ  ＨＣｌで停止した。ＧＩＳ  ＢＭＣは磁気的にペレット化した。
【０２６２】
二次レポーター反応は、グルコース濃度と、フェノールラジカルと４−ＡＡＰとの複合体化から形成される比色指標と、ＨＲＰ酸化活性により触媒されるフェノールラジカルの形成と、を相関付けるために使用した。簡潔に述べると、レポーター反応は、０．２５ｍＭフェノール、０．２５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、５０ｍＭ  ｐＨ７．４  ＰＢＳ、３０ｎＭ  ＨＲＰ、３０ｎＭ  ＧＯＸ、および一次反応の上澄みを１００倍希釈した２５μＬを含有する２５０μＬの全体積で、マイクロプレート中、室温で行った。レポーター反応は３０分間行った。グルコース濃度は、希釈一次反応上澄みの代わりに２５μＬのグルコース標準（０．１２５〜１．２５  ｍＭ）を用いて色素形成に基づく吸光度とグルコース濃度との線形回帰（Ｒ２＞０．９９）により計算した。ＧＩＳ活性の１単位は、６５℃の３０ｍｉｎ温置で１ｍｉｎ当たりのフルクトースからグルコースへの１μｍｏｌ異性化として定義された。
【０２６３】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＧＩＳ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２６４】
結果
対照は、反応条件下で形成される検出可能な非触媒グルコースがないことを示した。自動で調製されたＧＩＳ  ＢＮＣをＢＭＣ上への８．１％の有効充填率でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化した（表１５）。手動で調製されたＧＩＳ  ＢＮＣは、９．６％の有効充填率で同一の骨格上に固定化した。手動で固定化されたＧＩＳ  ＢＭＣの活性は、遊離ＧＩＳと比べて低減し、６５％の残存活性であった。自動で固定化されたＧＩＳ  ＢＭＣは、活性の増加を示し、１２１％の残存活性であった。
【０２６５】
実施例１５：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのグルタミンシンテターゼ固定化
グルタミンシンテターゼ（ＭＷ＝５８８ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて１６％充填率で調製した。次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２６６】
材料および装置。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のグルタミンシンテターゼ（ＧｌｕＳ）、５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末、モノナトリウムグルタメート、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、ホスホ（エノール）ピルビン酸（ＰＥＰ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドジナトリウム水和物（ＮＡＤＨ）、およびウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ（ｐＫ／ＬＤＨ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マクロ多孔性マグネタイトナノ粒子および磁性体は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されるように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２６７】
試薬。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１  ＰＢＳ、２５０ｍＭ）、グルタメート（３Ｍ）、ＡＴＰ（９０ｍＭ）、ＰＥＰ（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１Ｍ）、塩化カリウム（５００ｍＭ）、塩化アンモニウム（１Ｍ）、ＮＡＤＨ（５０ｍＭ）、およびＰＫ／ＬＤＨ（６０００／９００  ＰＫ／ＬＤＨ活性単位（Ｕ）、１単位ＰＫは３７℃、ｐＨ７．６で１分当たり１μｍｏｌのＰＥＰをピルベートに変換し、１単位のＬＤＨは３７℃、ｐＨ７．５で１分当たり１μｍｏｌのピルベートをＬ−ラクテートに変換する）ストックは、調製して４℃で貯蔵した。使用前、試薬（２１℃）を室温に平衡化させた。ＧｌｕＳストックは凍結乾燥粉末から調製した。
【０２６８】
固定化。遊離ＧｌｕＳストック（２００μｇ／ｍＬ）はｐＨ７．１に調整し、５ｍＬの１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ＧｌｕＳ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＧｌｕＳストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＧｌｕＳ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを４３８μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＧｌｕＳ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＧｌｕＳの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２６９】
グルタミンシンテターゼ反応および活性決定。ＧｌｕＳ活性は、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）レポーティング反応を用いて決定した。ＧｌｕＳは、グルタメートおよびアンモニウムからのＡＴＰ触媒Ｌ−グルタミン合成により活性化と。反応はまたＡＤＰおよびホスフェートを生成した。ＡＴＰはＰＥＰをピルベートに変換するＰＫ触媒反応で再生された。最後に、ピルベートは、補因子としてＮＡＤＨを用いてＬＤＨによりＬ−ラクテートに変換され、ＮＡＤを生じる。反応進行はＮＡＤＨ濃度の減少に基づく３４０ｎｍの吸光度の減少によりモニターした。反応は、３０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．１、１００ｍＭグルタメート、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＰＥＰ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、３００μＭ  ＮＡＤＨ、８／１２０  Ｕ  ＰＫ／ＬＤＨ、８１．７ｎＭ  ＧｌｕＳを含有する１ｍＬの反応体積で、３７℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管中で行った。反応を６０分間行い、ローテーター上で穏やかに混合し、５０μＬ  ０．１Ｍ  ＨＣｌで停止した。ＧｌｕＳ  ＢＭＣは磁気的にペレットした。ＮＡＤＨ濃度は、ＮＡＤＨ標準（３〜３００μＭ）の吸光度対濃度の線形回帰により計算した（Ｒ２＞０．９９）。ＮＡＤＨ消費は、化学量論的にＬ−グルタミンの形成に相関付けた。ＧｌｕＳ活性の１単位は、３７℃の６０ｍｉｎ温置で１ｍｉｎ当たり１μｍｏｌのＬ−グルタミンが合成されるものとして定義された。
【０２７０】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＧｌｕＳ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２７１】
結果
対照は、反応条件下で形成される検出可能な非触媒グルコースがないことを示した。自動で調製されたＧｌｕＳ  ＢＮＣをＢＭＣ上への１％の有効充填率でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化した（表１５）。手動で調製されたＧｌｕＳ  ＢＮＣは、０．９４％の有効充填率で同一の骨格上に固定化した。手動で自動で固定化ＧｌｕＳ  ＢＭＣの活性は遊離酵素（＞９９％）のものと等価であった。
【０２７２】
実施例１６磁気支持体上へのホースラディッシュペルオキシダーゼ固定化
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＭＷ＝４４ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、４０％の公称充填率で調製し、次いで、純粋マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）上にテンプレート化して、約５．６％有効充填率のＢＭＣを形成した。最適化固定化条件は、フェノールの酸化に関して遊離酵素と比べて活性が３倍に増加した。
【０２７３】
材料および装置。Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に由来するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェノール、および４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入された。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されるように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。
【数７】
2018519838.tif 000023
インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ステンレス鋼ミキシングティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２７４】
試薬。凍結乾燥ＨＲＰを水に溶解させてストック溶液を形成した。新鮮なＨＲＰ試薬は使用直前に次のように調製した。水中の５００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、ｐＨ７．４、１０ｍＭフェノール、および１０ｍＭ  ４−ＡＡＰ。この溶液は４℃で貯蔵し、使用直前まで暗所で保存し、その時点で室温に平衡化させた。
【０２７５】
固定化。遊離ＨＲＰストック（５００μｇ／ｍＬ）はｐＨ６に調整し、５ｍＬの１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを１１に調整した。遊離ＨＲＰ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。追加の固定化は、１０、２０、および４０ｍＬ／ｍｉｎ有効流量を用いて行った。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＨＲＰストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＨＲＰ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを３１．３μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＨＲＰ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＨＲＰの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２７６】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ活性アッセイ。ＨＲＰは、フェノールラジカルへのフェノールの酸化を不可逆的に触媒する。フェノール酸化は、フェノールラジカルと４−ＡＡＰとで構成される着色複合体の形成によりモニターされる。得られる生成物は、λ＝５００ｎｍに有意な吸光度を有する明るい帯桃赤色のキノンイミン色素である。Ｅｍｅｒｓｏｎ−Ｔｒｉｎｄｅｒ法のバイオ触媒方式である標準的ホースラディッシュ活性アッセイは、形成されるフェノール系色素生成物に基づくλ＝５００ｎｍの吸光度の増加率と酵素活性とを相関付ける。Ｗｕｋａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．４８ｔｈ  Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，４２３−４３０（１９９３）。固定化ＨＲＰおよび遊離ＨＲＰの両方のＨＲＰバッチ反応は、最初に反応を開始するために５０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．２５ｍＭフェノール、０．２５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１５ｎＭ  ＨＲＰ、および１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有する１ｍＬの全反応体積を用いて、２１℃の２ｍＬ遠心分離管中で３０分間行った。バッチ反応は穏やかにアジテートした。固定化酵素は磁気的にペレット化した。上澄みの吸光度は、各サンプルに対して２５０μＬのトリプリケートを用いてマイクロプレート中で読み取った。バックグラウンド吸光度を減算するために、対応する量の遊離酵素を含有するブランクも調製した。製品色素は５００ｎｍでの（１２ｍＭ−１ｃｍ−１）吸光係数を用いて定量された。ＨＲＰ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２１℃で１分当たり１ｍｍｏｌキノンイミン色素が形成されるものとして定義された。
【０２７７】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＨＲＰ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２７８】
結果。対照は、非触媒色素形成がないことを示した。ＨＲＰ  ＢＮＣは、マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化した。得られたＢＭＣは、手動および自動固定化ＨＲＰ  ＢＭＣの両方で約５．６％の有効充填率であった（表１５）。しかしながら、活性は流量によって変化した。自動固定化の流量における遊離酵素基準の活性は、次の通りである。１０ｍＬ／ｍｉｎは１００％の活性を有し、２０ｍＬ／ｍｉｎは１２０％の活性を有し、４０ｍＬ／ｍｉｎは１６０％の活性を有し、６０ｍＬ／ｍｉｎは手動固定化ＢＭＣと同様に３２０％の活性を有していた。こうした活性の向上はＢＮＣ中への事前ＨＲＰ固定化と一致する（図６）。
【０２７９】
本明細書に開示され、または言及される全ての刊行物および特許文献は、全体が参照により援用される。上記の説明は、例示および説明の目的で示されているに過ぎない。本明細書は、本発明を、開示される正確な形態に限定することは意図されていない。本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によって規定されることが意図される。
【図１】
2018519838.tif 000024
【図２】
2018519838.tif 000025
【図３】
2018519838.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６】
2018519838.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月31日(2016.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範にわたる工業的および医学的に重要な酵素から選択される１種以上の酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための機械、組成物、および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
磁気酵素固定化は、酵素の周りに自己集合するメソ多孔性磁気クラスター中への酵素の封入を含む。固定化効率は、酵素およびナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面、ならびに接触時間をはじめとするいくつかの因子に依存する。バイオ触媒プロセスで工業目的に使用される酵素は、きわめて効率的、プロセス前およびプロセス中に安定、数回のバイオ触媒サイクルに再使用可能、かつ経済的でなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、広範にわたる工業的および医学的に重要な酵素から選択される１種以上の酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための機械、組成物、および方法を提供する。ＢＮＣは、自己集合されて磁気ナノ粒子中に酵素を磁気固定化する。方法は、固定化時の酵素活性の損失を防止し得るとともに酵素充填を最大化し得る。機械、組成物、および方法は、卓上製造から工業製造まで分量および数量を十分に拡張可能である。
【０００４】
したがって、本発明は、酵素容器と、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）容器と、酵素ポンプと、ＭＮＰポンプと、ＭＮＰディスラプターと、ＢＮＣミキサーと、を含む、バイオナノ触媒（ＢＮＣ）の自動製造機械であって、酵素容器が酵素調製物を保持するように操作可能であり、酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒し、ＭＮＰ容器がＭＮＰ調製物を保持するように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプがＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプターに送るように操作可能であり、ＭＮＰポンプが複数の破砕ＭＮＰをＭＮＰディスラプターから前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、酵素ポンプが酵素調製物をＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、ミキサーが破砕ＭＮＰと酵素調製物とを混合して前記ＢＮＣを形成するように操作可能である、機械を提供する。
【０００５】
一実施形態において、ＭＮＰディスラプターはソニケーターである。好ましい実施形態において、ソニケーターはソニケーターコイルと超音波処理容器とをさらに含み、ソニケーターコイルは前記超音波処理容器内でＭＮＰを超音波処理するように操作可能である。他の実施形態において、ソニケーターはインラインソニケーターである。
【０００６】
別の実施形態において、機械は前記ソニケーターを冷却するように操作可能な冷却システムを含む。好ましい実施形態において、冷却システムは水冷システムである。
【０００７】
別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを機械的に破砕するように操作可能である。別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを磁気的に破砕するように操作可能である。別の実施形態において、ＭＮＰディスラプターはＭＮＰを熱的に破砕するように操作可能である。
【０００８】
別の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングティーを含む。別の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングコイルを含む。
【０００９】
別の実施形態において、酵素ポンプは機械力または重力により酵素調製物をＢＮＣミキサーに送る。別の実施形態において、ＭＮＰポンプは機械力または重力によりＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプターに送る。
【００１０】
別の実施形態において、機械は、骨格材容器内で磁気骨格材調製物とＢＮＣとを混合してレベル２集合体としてＢＮＣを製造するように操作可能な磁気骨格材容器をさらに含む。好ましい実施形態において、磁気骨格材容器はＢＮＣと骨格材とを機械的に混合するように操作可能である。別の好ましい実施形態において、磁気骨格材容器はＢＮＣと骨格材とを磁気的に混合するように操作可能である。
【００１１】
別の実施形態において、機械は、安定化レベル２集合体としてＢＮＣを集合させるためのテンプレーターをさらに含む。好ましい実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。より好ましい実施形態において、磁気レベル２集合体は磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載される機械を用いてＭＮＰ調製物と酵素調製物とを組み合わせる工程を含む、ＢＮＣの製造方法であって、酵素調製物が、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、イソメラーゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、ＢＮＣは約１ｍｌ未満の量で製造される。好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１ｍｌ〜１０ｍｌの量で製造される。別の好ましい実施形態において、前記ＢＮＣは約１０ｍｌ〜１００ｍｌの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１００ｍｌ〜１リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１リットル〜１０リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１０リットル〜１００リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１００リットル〜１０００リットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１キロリットル〜１０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約１０キロリットル〜２０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約２０キロリットル〜５０キロリットルの量で製造される。別の好ましい実施形態において、ＢＮＣは約５０キロリットル超の量で製造される。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣをテンプレート化する工程をさらに含む。
【００１５】
本発明は、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）と、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素と、を含む自己集合バイオナノ触媒（ＢＮＣ）組成物であって、酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒する、組成物を提供する。
【００１６】
ＢＮＣ組成物のいくつかの実施形態において、酵素は約５〜２，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度であり、かつＭＮＰは約５０〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。好ましい実施形態において、酵素は約５〜１５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約５〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約５〜５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、酵素は約１００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約１，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約１０，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。別の好ましい実施形態において、ＭＮＰは約５，０００〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である。
【００１７】
別の実施形態において、ＢＮＣ組成物は安定化レベル２集合体をさらに含む。好ましい実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。より好ましい実施形態において、磁気レベル２集合体は磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。
【００１８】
本発明は、ＢＮＣと拡散性基質とを接触させる工程と拡散性生成物を捕集する工程とを含む、本明細書に記載されるＢＮＣ組成物の使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】例示的な自動ＢＮＣ製造機械の概略図。
【図２】例示的な自動ＢＮＣ製造機械の絵図。
【図３】自動ＢＮＣ製造機械で生成された固定化ＨＲＰの活性。活性は桃色キノンイミン色素の形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加により測定した。
【図４】自動ＢＮＣ製造機械を用いてＢＮＣ中に充填された酵素の量。グラフはＭＮＰ中に固定されたＨＲＰタンパク質の濃度を示す（レベル１）。また、磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）中にさらに含有されるＢＮＣ中のＨＲＰタンパク質の濃度も示す（レベル２）。
【図５】さまざまなポンプスピードで自動ＢＮＣ製造機械から得られた溶出サンプルの反応速度。図は遊離ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と磁気固定化ＨＲＰとを比較する。示された速度は２．５ｎＭ  ＨＲＰを用いた反応の最初の３１５秒間から導出される。
【図６】キノンイミン色素形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加により分光測光法で測定された固定化ＨＲＰのフェノール酸化活性。遊離ＨＲＰ（白）。バイオマイクロ触媒（ＢＭＣ）は、磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）と、ｐＨ６のＨＲＰとｐＨ１１の磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）とを自動混合することにより作製されたバイオナノ触媒（ＢＮＣ）と、で構成された。ＢＮＣは４０％の酵素充填率（酵素／ＭＮＰ）を有し、ＢＭＣは５．６％の酵素充填率（酵素／（ＭＮＰ＋ＭＭＰ））を有していた。これらの「自動」ＢＭＣは、さまざまな流量（１０〜６０ｍＬ／ｍｉｎ、ハッチング）を用いて連続フローで集合させた。ＢＭＣは、ｐＨ６のＨＲＰとｐＨ１１のマグネタイトナノ粒子とを手動で組み合わせて構成された。手動ＢＮＣは、４０％の酵素充填率を有し、５．６％の酵素充填率でＢＭＣを形成するようにＭＭＰ上にテンプレート化された（黒）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、非常に高レベルの磁気固定化酵素を有するナノクラスターを製造するための組成物および方法を提供する。ナノクラスターは自己集合により形成され、ナノ粒子１グラム当たり５〜２０，０００マイクログラムの酵素を含有する。組成物および方法は、低減された方法工程および化学試薬を有し、工業目的のスケールアップに理想的である。
【００２１】
本発明は、使用前および使用中にきわめて活性かつ安定な磁気固定化酵素を含む自己集合メソ多孔性ナノクラスターを提供する。この技術は、３つの統合組織化レベルでの生化学とナノテクノロジーと生物工学とのブレンドであり、レベル１は、磁気メソ多孔性ナノクラスター合成用の磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）による酵素の自己集合である。このレベルは、酵素を固定化するために分子自己封入機構を使用する。自己集合磁気ナノ粒子中に固定化された酵素は、本明細書では「バイオナノ触媒」（ＢＮＣ）と呼ばれる。レベル２は、磁気マトリックスなどの他の集合体中へのＢＮＣの安定化である。特定の実施形態において、ＢＮＣは、商業用途または他の用途でマイクロまたはマクロ構造上または構造中に「テンプレート化」される。一実施形態において、レベル２テンプレートは磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。レベル３は、レベル１＋２固定化酵素を使用するための製品調整である。
【００２２】
ＭＮＰは、温度、イオン強度、ｐＨ、溶媒など、バイオ触媒プロセスで酵素を使用するためのより広範にわたる操作条件を可能にする。ＭＮＰのサイズおよび磁化は、ＢＮＣの形成および構造に影響を及ぼす。これは封入酵素の活性に有意な影響を及ぼす。自己集合ＭＮＰクラスターは、種々の反応条件下で驚くべき回復力を示すため、高分子樹脂、架橋ゲル、架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）、架橋磁気ビーズなどに取って代わる優れた酵素固定化材料として使用可能である。さらに、拡散性基質上への酵素の任意の適用に使用可能である。
【００２３】
ＢＮＣは、クラスター化磁気ナノ粒子間の格子間の隙間であるメソ細孔を含有する。酵素は、磁気ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部中に固定される。本明細書において使用される際、「磁気」という用語は、永久磁性、超常磁性、常磁性、および強磁性挙動を含むあらゆるタイプの有用な磁気特性を包含する。
【００２４】
磁気ナノ粒子またはＢＮＣは、ナノスケール、すなわち、一般に５００ｎｍ以下のサイズを有する。本明細書において使用される際、「サイズ」という用語は、磁気ナノ粒子が大体またはほぼ球形であるとき、磁気ナノ粒子の直径を指し得る。磁気ナノ粒子が、大体またはほぼ球形でない（例えば、ほぼ卵形または不規則である）場合、「サイズ」という用語は、最も長い寸法または磁気ナノ粒子の３次元の平均のいずれかを指し得る。「サイズ」という用語はまた、磁気ナノ粒子の集団におけるクラスター化平均サイズを指し得る。
【００２５】
異なる実施形態において、磁気ナノ粒子は、正確に、約、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、もしくは１ｎｍ以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。
【００２６】
ＢＮＣにおいて、個別の磁気ナノ粒子は、上に示されるサイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、初晶）であり得る。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体は、ナノ粒子よりサイズが大きく、一般に、少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。異なる実施形態において、凝集体は、正確に、約、少なくとも、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、もしくは８００ｎｍ超、以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。
【００２７】
典型的に、一次および／または凝集磁気ナノ粒子またはそのＢＮＣは、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、一次または凝集体サイズの任意の範囲が、一次または凝集体サイズの全範囲の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍおよび約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ以下）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約５、１０、１５、もしくは２０ｎｍおよび約５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ以下）は、一次粒径の全範囲の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍ未満、または約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約２０、１０、もしくは５ｎｍ未満、または約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００２８】
磁気ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）またはそのＢＮＣは、それらを構成する個々の初晶の量に応じて、多孔性の相当の欠如を含む任意の多孔度を有し得る。特定の実施形態において、凝集体は、格子間のメソ細孔（すなわち、充填配置によって形成される、一次磁気ナノ粒子間に位置するメソ細孔）を含有することによってメソ多孔性である。メソ細孔は、一般に、少なくとも２ｎｍかつ５０ｎｍ以下のサイズである。異なる実施形態において、メソ細孔は、正確にまたは約、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍの細孔径、または上記の例示的な細孔径のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔径を有し得る。粒径の場合と同様に、メソ細孔は、典型的に、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、メソ細孔径の任意の範囲が、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、少なくとも約２、３、もしくは５、および８、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｎｍ以下）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４、もしくは５ｎｍ未満、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００２９】
磁気ナノ粒子は、当該技術分野において公知の組成物のいずれかを有し得る。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、磁性であるゼロ価の金属部分であるかまたはそれを含む。このようなゼロ価の金属のいくつかの例としては、コバルト、ニッケル、および鉄、ならびにそれらの混合物および合金が挙げられる。他の実施形態において、磁気ナノ粒子は、コバルト、ニッケル、もしくは鉄、またはそれらの混合物の酸化物などの、磁性金属の酸化物であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、明確なコアおよび表面部分を有する。例えば、磁気ナノ粒子は、鉄、コバルト、またはニッケル元素で構成されるコア部分および金、白金、パラジウム、または銀の層などの、金属酸化物または貴金属コーティングなどの、不動態化層で構成される表面部分を有し得る。他の実施形態において、金属酸化物磁気ナノ粒子またはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁気ナノ粒子表面上の電荷数を減少させ得、それにより、溶液中の分散性を有益に高め、ＢＮＣのサイズを良好に制御し得る。貴金属コーティングは、酸化、浸出によるかまたはシトレート、マロネート、もしくはタートレートなどの有機酸をキレートするときはキレートによる可溶化から磁気ナノ粒子を保護し、生化学反応または過程に使用される。不動態化層は、任意の好適な厚さ、特に、少なくとも、約、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、または１０ｎｍ以下、または未満、またはこれらの値のいずれか２つによって境界される範囲内の厚さを有し得る。
【００３０】
本発明に有用な磁性材料は、当該技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイトまたは磁鉄鉱）、コバルト、およびニッケルなどの鉱石を含む強磁性体および強磁性材料を含む。他の実施形態において、希土類磁石が使用される。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素などが挙げられる。さらに他の実施形態において、磁石は、複合材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト、およびアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態において、磁気ナノ粒子は、酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当該技術分野において公知の磁性または超常磁性酸化鉄組成物、例えば、マグネタイト（ＦｅｓＯ／Ｏ、赤鉄鉱（α−Ｆｅ２θ  ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｃ＞３）、または式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａが二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、またはそれらの組合せ）であり、Ｂが三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋、またはそれらの組合せ）である）で表されるスピネルフェライトのいずれかであり得る。
【００３１】
特定の実施形態において、磁気ナノ粒子の以上のメソ多孔性凝集体（ＢＮＣ）は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２のレベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１のレベルの集合体はＢＮＣに見いだされる。第２のレベルの集合体は連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの取込みに見いだされる。いくつかの実施形態において、レベル２集合体には磁気がある。
【００３２】
マクロ多孔性磁気骨格に対して本明細書で用いられる「連続」という用語は、微粒子集合体でない材料、すなわち、互いに集合して巨視的構造を形成する粒子や離散物で構築されてない材料を意味する。微粒子集合体とは対照的に、連続構造は、シームレスかつ均一な構造を周期的に中断するマクロ細孔の周りで実質的にシームレスかつ均一である。したがって、連続骨格中のマクロ細孔は、凝集粒子間の間隙空間ではない。それにもかかわらず、一次連続骨格の集合または凝集が一次連続骨格間の間隙空間により形成されたマクロ細孔（例えば、約５０ｎｍ超かつ約１００まで）を含んでいない限り、より小さい一次連続骨格の集合または凝集から連続骨格を構築可能である。特にセラミック材料や元素材料などの無機材料の場合、連続骨格は結晶ドメインまたは相境界を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００３３】
「パーセント固定化収率」または「％固定化収率」という用語は、固定化前のサンプル中の酵素の初期量と比較して固定化物またはナノ粒子調製物中に取り込まれた酵素のパーセント（質量または活性により測定される）を意味する。
【００３４】
特定の実施形態において、磁気ナノ粒子の以上のメソ多孔性凝集体（ＢＮＣ）は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２のレベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１のレベルの集合体はＢＮＣに見いだされる。第２のレベルの集合体は連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの取込みに見いだされる。少なくともＢＮＣの存在により全階層的触媒集合体には磁気がある。
【００３５】
マクロ多孔性骨格は、５０ｎｍ超のサイズを有するマクロ細孔（すなわち、マクロスケールサイズの細孔）を含有する。異なる実施形態において、マクロ細孔は、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１ミクロン（１μｍ）、１．２μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、もしくは１００μｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズを有する。
【００３６】
マクロ多孔性骨格は、マクロ細孔を収容可能である限り、任意の好適なサイズを有し得る。典型的な実施形態において、マクロ多孔性骨格は、少なくとも１つのマクロスケールのサイズ寸法を有する。少なくとも１つのマクロスケールの寸法は５０ｎｍ超であり、以上に提供されたマクロ細孔の値のいずれかであり得るとともに特に、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、もしくは１ｃｍの寸法、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズであり得る。サイズ寸法の１つのみまたは２つがマクロスケールである場合、残りの１つまたは２つの寸法は、ナノスケール、例えば、以上に提供された磁気ナノ粒子の値のいずれか（例えば、独立して、正確に〜、約〜、少なくとも〜、〜超、〜まで、または〜未満として表したとき、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｎｍ、または上記の値の任意の２つよって境界される範囲内の値）であり得る。いくつかの実施形態において、マクロ多孔性骨格のサイズ寸法の少なくとも２つまたは全てがマクロスケールである。
【００３７】
実施形態の第１のセットにおいて、ＢＮＣが取り込まれる連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。すなわち、ＢＮＣの不在下でさえも磁気がある。例えば、磁気ポリマー組成物で構成することにより連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。磁気ポリマーの例は、当技術分野で周知のようにテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）とエメラルジン系ポリアニリン（ＰＡＮｉ）との組合せでのＰＡＮｉＣＮＱである。代替的または追加的に、ＢＮＣに属さない磁気粒子を埋め込むことにより連続マクロ多孔性骨格には磁気がある。ＢＮＣに属さない磁気粒子は、例えば、ＦＲＰ酵素やいずれの酵素にも一体化されていない磁気ナノまたはマイクロ粒子であり得る。磁気マイクロ粒子は、以上に提供されたマクロ細孔サイズまたはサイズ分布を有し得るが、マクロ細孔サイズに依存するわけではない。特定の実施形態において、磁気マイクロ粒子は、約、正確に、または少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つよって境界される範囲内のサイズを有する。いくつかの実施形態において、連続マクロ多孔性骨格は、ＢＮＣの少なくとも一部分に吸着された磁気マイクロ粒子が埋め込まれているか、または磁気マイクロ粒子がＢＮＣに一体化も吸着もされていない。
【００３８】
実施形態の第２のセットにおいて、ＢＮＣが取り込まれる連続骨格には磁気がない。それにもかかわらず、少なくとも取り込まれたＢＮＣの存在により非磁気骨格を含有する全階層的触媒集合体には磁気が残留する。
【００３９】
一実施形態において、連続マクロ多孔性骨格（またはその前駆体）はポリマー組成物を有する。ポリマー組成物は、当技術分野で公知の有機、無機、またはハイブリッド有機−無機の固体ポリマー組成物のいずれかであり得るとともに、バインダーとして作用する合成ポリマーまたはバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロ多孔性骨格は、水または階層的触媒の使用が意図される他の媒体への溶解もその中での分解もしない。合成有機ポリマーのいくつかの例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸またはポリメタクリレート塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコールなど）、フルオロポリマー（例えば、ポリビニルフルオリド、ポリビニリデンフルオリド、ポリテトラフルオロエチレンなど）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、およびそれらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーのいくつかの例としては、多糖（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、およびアルギン酸）、ポリ乳酸、ならびにポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定例において、セルロースは微生物または藻類に由来するセルロースであり得る。無機またはハイブリッド有機−無機のポリマーのいくつかの例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成により調製されるもの）およびポリホスファゼンが挙げられる。いくつかの実施形態において、以上に提供されたいずれか１つ以上のクラスまたは特定のタイプのポリマー組成物は、マクロ多孔性骨格として除外される。
【００４０】
別の実施形態において、連続マクロ多孔性骨格（またはその前駆体）は非ポリマー組成物を有する。非ポリマー組成物は、例えば、セラミック組成物または元素組成物を有し得る。セラミック組成物は、結晶、多結晶、またはアモルファスであり得るとともに、酸化物組成物（例えば、アルミナ、ベリリア、セリア、イットリア、またはジルコニア）および非酸化物組成物（例えば、炭化物、ケイ化物、窒化物、ホウ化物、または硫化物の組成物）をはじめとする当技術分野で公知の組成物のいずれかを有し得る。元素組成物もまた、結晶、多結晶、またはアモルファスであり得るとともに、炭素、アルミニウム、ケイ素などの任意の好適な元素組成物を有し得る。
【００４１】
他の実施形態において、ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子間の間隙空間としてマクロ細孔を含む磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）の集合（すなわち凝集）を含む（またはそれにより構築される）非連続マクロ多孔性支持体中に存在する。磁気マイクロ粒子は典型的には強磁性であり、マグネタイトまたは他の強磁性材料で作製可能である。ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子の凝集のマクロ細孔の少なくとも一部分に埋め込まれ、磁気マイクロ粒子の表面上に存在し得る。ＢＮＣは、磁気的相互作用により磁気マイクロ粒子の表面に一体化可能である。磁気マイクロ粒子は、金属酸化物または貴金属のコーティング層で被覆してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＢＮＣ−ＭＭＰ集合体は、階層的触媒集合体を提供するように以上に記載される連続マクロ多孔性骨格中に取り込まれる（すなわち、埋め込まれる）。
【００４２】
個別の磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な磁性度を有する。例えば、磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ骨格集合体は、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｅｍｕ／ｇ以下の飽和磁化（Ｍｓ）を有し得る。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体は、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（ｎｏ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）（すなわち、以下（ｕｐ  ｔｏ））または未満、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ、もしくは０．１ｅｍｕ／ｇ以下または未満の残留磁化（Ｍｒ）を有する。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体の表面磁場は、約または少なくとも、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ガウス（Ｇ）、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の磁場であり得る。微粒子が含まれる場合、微粒子はまた、上記の磁気強度のいずれかを有し得る。
【００４３】
磁気ナノ粒子またはその凝集体は、得られるＢＮＣを生成するために、用途に応じて、飽和レベル以下または未満の好適な量の酵素を吸着するように作製され得る。異なる実施形態において、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｐｍｏｌ／ｍ２以下、または未満の酵素を吸着し得る。あるいは、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、飽和レベルの約、少なくとも、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％以下、または未満である量の酵素を吸着し得る。
【００４４】
磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な細孔容積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、もしくは１ｃｍ３／ｇ以下、または未満の細孔容積、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔容積を有し得る。磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍ２／ｇ以下、または未満の比表面積を有し得る。
【００４５】
ＭＮＰ、それらの構造、組織、好適な酵素、および使用が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットおよび米国仮特許出願第６２／１６３，０３２号明細書に記載されている。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態はヒドロラーゼを含む。ヒドロラーゼは、基質として水を用いて多くのタイプの化学結合の加水分解を触媒する。基質は、典型的には、破壊された結合の部位に水素基とヒドロキシル基とを有する。ヒドロラーゼは、酵素のＥＣ番号分類でＥＣ３として分類される。ヒドロラーゼは、作用を受ける結合に基づいてさらにいくつかのサブクラスに分類可能である。例示的なヒドロラーゼおよび加水分解される結合としては、ＥＣ３．１：エステル結合（エステラーゼ：ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ）、ＥＣ３．２：糖（ＤＮＡグリコシラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．３：エーテル結合、ＥＣ３．４：ペプチド結合（プロテアーゼ／ペプチダーゼ）、ＥＣ３．５：ペプチド結合以外の炭素−窒素結合、ＥＣ３．６  酸無水物（ヘリカーゼおよびＧＴＰアーゼをはじめとする酸無水物ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．７  炭素−炭素結合、ＥＣ３．８  ハロゲン化物結合、ＥＣ３．９：リン−窒素結合、ＥＣ３．１０：硫黄−窒素結合、ＥＣ３．１１：炭素−リン結合、ＥＣ３．１２：硫黄−硫黄結合、およびＥＣ３．１３：炭素−硫黄結合が挙げられる。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはグリコシドヒドロラーゼである。この酵素は、植物材料の分解（例えば、セルロースをエタノール製造に使用されるグルコースに分解するためのセルラーゼ）、食品製造（たとえば、糖転化、マルトデキストリン製造）、および紙製造（紙パルプからのヘミセルロースの除去）をはじめとするさまざまな用途を有する。
【００４８】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはリポラーゼ１００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）である。それは神経因性疼痛、不安障害、および癲癇に使用される抗痙攣薬剤プレガバリン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｙｒｉｃａ（登録商標）として市販されているものなど）を合成するために使用される。これらの病態に世界人口の約１％が罹患している。リポラーゼ１００Ｌは、所要の出発材料を３９％低減しかつ１単位当たり廃棄物を８０％削減することが判明した。
【００４９】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはγ−ラクタマーゼ（例えば、ＥＣ３．１．５．４９）である。それはアバカビル製造の中間体ビンスラクタムを製造するために使用される（ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療するための抗レトロウイルス薬剤）。化学量論プロセスから触媒フロープロセスへの変更により単位操作数が１７から１２に低減されかつ廃棄物が３５％低減されることが判明した。そのほかに毒性物質の塩化シアノゲンの使用が最小限に抑えられる。
【００５０】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはラクターゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．１０８）である。この酵素は、ラクトースフリー乳を製造するために乳中のラクトースを単糖に分解する。この重要な製品は、乳糖不耐症である世界人口の約１５％に役立つ。
【００５１】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはペニシリンアミダーゼ（例えば、ＥＣ３．５．１．１１）である。この酵素は、ペニシリンをカルボン酸および６−アミノペニシラネート（６−ＡＰＡ）に開裂する。６−ＡＰＡは、天然および合成のペニシリン誘導体のコア構造である。この酵素は、特定の感染症に対処するように調整された半合成ペニシリンを製造するために使用される。
【００５２】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはニトリラーゼ（例えば、ＥＣ３．５．５．１）である。この酵素は、ニトリルをカルボキシル基に開裂してアンモニアを遊離する。それは、さまざまな脂肪族および芳香族ニトリル化合物（対応するカルボン酸の中には工業的に重要なものがある）に対して活性である。Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １１（１）：１４２（２０１２）。ニトリラーゼは、３−シアノピリジンからニコチン酸（ビタミンＢ３またはナイアシンとしても知られる）を製造するために利用される。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ３４５（４）：４２５−４３５（２００３）。ニコチン酸は、食品の栄養サプリメントおよび医薬の中間体としての用途を有する。例えば、ニトリラーゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）を製造するために使用される。それはｍｅｓｏ−３−ヒドロキシグルタロニトリルからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへの反応を触媒し、後者はアトルバスタチンのコアを形成する。
【００５３】
ヒドロラーゼは次の参照文献で考察されており、その全体が参照により本明細書に援用される。Ａｎａｓｔａｓ，Ｐ．Ｔ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，２００９、Ｄｕｎｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗ  Ｗｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｄｓ．Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１０、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（１２）：１４７０−９０（２０１０）、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６（１２）：１９８６−１９９３（２０１２）。
【００５４】
ある実施形態において、本発明は、過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素を提供する。特定の実施形態において、ＨＰＰ酵素は、ＥＸ  １．１．３亜属のものであり得るオキシダーゼである。特定の実施形態において、オキシダーゼは、ＥＣ  １．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．８（Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１５（２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１８（第二級アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２２、ＥＣ  １．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２５、ＥＣ  １．１．３．２６、ＥＣ  １．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２９（Ｎアシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３１、ＥＣ  １．１．３．３２、ＥＣ  １．１．３．３３、ＥＣ  １．１．３．３４、ＥＣ  １．１．３．３５、ＥＣ  １．１．３．３６、ＥＣ  １．１．３．３７  Ｄ−アラビノノ−ｌ，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成性）、ＥＣ  １．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）であり得る。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態はヒドロキシラーゼを含み得る。ヒドロキシル化は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有機化合物に導入する化学プロセスである。ヒドロキシル化は、空気中での有機化合物の酸化分解の第１の工程である。ヒドロキシル化は、親油性化合物をより容易に排出される親水性生成物に変換することにより解毒の役割を果たす。いくつかの薬剤（例えば、ステロイド）は、ヒドロキシル化により活性化または脱活性化される。ヒドロキシラーゼは当技術分野で周知である。例示的なヒドロキシラーゼとしては、プロリンヒドロキシラーゼ、リシンヒドロキシラーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態はニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含む。それは、ニトリルから高エナンチオ純度のキラルカルボン酸およびアンモニアへの加水分解を触媒する加水分解酵素（ＥＣ３．５．５．１）である。ＮＩＴ活性は、マンデロニチリルから（Ｒ）−マンデル酸への変換をモニターすることにより測定し得る。この結果、分光測光法でモニターし得るｐＨ低下を生じる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態はヒドラターゼを含む。それは水の元素の付加または除去を触媒する酵素である。ヒドロリアーゼまたはヒドラーゼとしても知られるヒドラターゼは、Ｃ−Ｏ結合の水和または脱水を触媒し得る。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態はオキシドレダクターゼを含む。この酵素は、一方の分子から他方の分子への電子の移動を触媒する。これは、一方の物質から他方の物質へのＨおよびＯ原子または電子の移動を含む。それは、典型的には補因子としてＮＡＤＰまたはＮＡＤ＋を利用する。
【００５９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、ポリ塩化ビフェニルやフェノール化合物などの汚染物質の分解、石炭の分解、および木材加水分解物の発酵増強に使用される。本発明はさらに、バイオセンサーおよび疾患診断での使用を含む。
【００６０】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯ）である。このグループのオキシドレダクターゼは、１つ以上のヒドリド（Ｈ−）を電子受容体（通常はＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋またはＦＡＤやＦＭＮなどのフラビン補酵素）に移動する還元反応により基質を酸化する。例示的なデヒドロゲナーゼとしては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００６１】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒによりＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の製造に使用されるオキシドレダクターゼのケトレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１８４）である。このバイオ触媒プロセスは、出発材料を実質的に低減し、有機溶媒の使用を制限し、かつ廃棄物ストリームの生分解性を増加させるので、商業的に重要である。
【００６２】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ１．１．９９．１０）である。それは薬剤製造に使用される補因子をリサイクルするために製薬会社により使用される。それはグルコースからグルコネートへの変換を触媒する。ＮＡＤＰ＋はＮＡＤＰＨに還元される。これはＡｖａｓｔａｎ製造に使用される。
【００６３】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＰ４５０（ＥＣ１．１４．１４．１）である。それは医薬品工業で酸化が困難な場合に使用される。いくつかの実施形態において、Ｐ４５０は化学代謝物および薬剤代謝物の製造に使用される。好ましい実施形態において、ｐ４５０のコスト、一貫性、および効率は、グルコースデヒドログレンナーゼ（ＧＤＨ）またはギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を含む補因子再生系（例えば、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋）を併用した場合、改善される。
【００６４】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＥＣ１．１１．１．６などのカタラーゼである。カタラーゼは全ての真核生物および多くの原核生物で観測される。それは過酸化水素を水および酸素に分解することにより過酸化ストレスを調節する統合的役割を果たす。カタラーゼは、ヘム系活性部位をそれぞれ含有する４つの同一のサブユニットを有する高活性テトラマーである。Ｇａｅｔａｎｉｔ  ＆  Ｋｉｒｋｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１（１４）：４３４３−７（１９８４）。カタラーゼは、過酸化水素の排出または調節のための多くの工業用途を有する。例としては、テキスタイル漂白での残留過酸化物の除去、グルコン酸などの酸性度調整剤の製造、またはチーズ製造などのオキシダーゼを利用するプロセスでの阻害濃度の過酸化物の蓄積の防止が挙げられる。Ｂｅｔａｎｃｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ１９（３）：７６３−７６７（２００３）。
【００６５】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースオキシダーゼ（例えば、ノタチン、ＥＣ１．１．３．４）である。グルコースオキシダーゼは、グルコースから過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。それは、例えば、ペルオキシダーゼなどの過酸化水素消費酵素のための酸化剤として過酸化水素を発生するために使用される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明はフリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素を包含する。いくつかの実施形態において、ＦＲＰはペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは生体系に広範に見いだされ、フェノールから芳香族アミンに至るまで多種多様な芳香族化合物を酸化するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水に還元するオキシドレダクターゼのサブセットを形成する。ペルオキシダーゼは非常に強力な酵素であるとはいえ、過剰の過酸化物の存在下での強い阻害が原因で工業環境での活用が困難なことで有名である。本発明は、反応ターンオーバーの増加および阻害の低減を提供する。したがって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を工業スケールで使用し得る。
【００６７】
ペルオキシダーゼは、亜属ＥＣ  １．１１．１に属する。特定の実施形態において、ＥＣ  １．１１．１酵素は、ＥＣ  １．１１．１酵素は、より詳細には、例えば、ＥＣ  １．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．４、ＥＣ  １．１１．１．５（シトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．８（ヨウ化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１０（塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）であり得る。
【００６８】
他の実施形態において、ペルオキシダーゼはまた、機能によってさらに特定されてもよく、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、または万能ペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼはまた、真菌、微生物、動物、または植物ペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ピーナッツペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、オオムギペルオキシダーゼ、またはペルオキシダシンとして特定され得る。特定の実施形態において、ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【００６９】
ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ（ＬＰ／ＧＯＸ）抗菌系は、乳汁、唾液、涙液、および粘液などの体液中に天然に存在する（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。この系は、哺乳動物および高等生物に無害な２つの天然化合物であるチオシアネート（ＳＣＮ−）およびヨウ化物（Ｉ−）を用いる（Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））。ＬＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、それぞれ次亜チオシアン酸塩（ＯＳＣＮ−）および次亜ヨウ素酸塩（ＯＩ−）へのチオシアネートおよびヨウ化物イオンの酸化を触媒する。この系中のＨ２Ｏ２は、酸素の存在下で、β−Ｄ−グルコースに対するＧＯＸの活性によって提供される。これらのフリーラジカル化合物は、ひいては、微生物の細胞膜中のスルフヒドリル基を酸化し（Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），１１８７（１９８３）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）、これは、膜透過性の低下（Ｗａｎ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６２，３５５−３６２（２００１））および最終的に微生物細胞死につながる。
【００７０】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、ホースラディッシュ植物Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に見いだされるヘム含有オキシドレダクターゼ酵素である。それは通常は過酸化水素と一緒に色素原基質に作用して、標的分子の分光測光検出性を向上させる光輝着色生成物複合体を生成するので、通常は生化学シグナルアンプリファイヤーおよびトレーサーとして使用される。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のこの特性は、齧歯動物神経系毛細血管の透過性研究に適用されてきた。より最近では、ＨＲＰは、種々の芳香族化合物を分解する能力があるため、フェノール廃水の可能なレメディエーション戦略の一部として提案されている。Ｃｈａｕ  ＆  Ｌｕ，Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，１９４（３）：２５９−２６９  （１９９６）、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１５（５）：９７４−９８０（２０１４）。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態はトランスフェラーゼを含む。「トランスフェラーゼ」とは、特定の官能基を一方の分子から他方の分子に移動する酵素のクラスを意味する。移動される基の例としては、メチル基およびグリコシル基が挙げられる。トランスフェラーゼは、化学発癌性物質や環境汚染物質などの物質を処理するために使用される。そのほかに、人体に見いだされる毒性化学物質および代謝物に対処するためにまたはそれらを中和するために使用される。
【００７２】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはトランスアミナーゼである。トランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸との間の反応を触媒する。それはアミノ酸の合成に重要である。それは肝損傷の重要な指標である。アミノ基転移において、一方の分子上のＮＨ２基は他方の分子上の他の基（例えば、ケト基）の＝Ｏと交換される。
【００７３】
より好ましい実施形態において、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。それは、アミノアクセプターのカルボキシル基の位置へのアミノドナー分子のアミノ基の移動を触媒する  Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２（６）：９９３−１００１（２０１２）。この酵素は全ての生物で観測され、アミノ酸合成および窒素代謝で重要な役割を担う。ω−トランスアミナーゼは、基質の立体選択性および生成物の立体特異性が高いので、非天然アミノ酸および光学的に純粋なキラルアミンまたはケト酸の製造に利用される。ω−トランスアミナーゼはまた、従来の化学的方法よりもプロセスが単純化された活性医薬中間体のバイオ触媒キラル分割の用途も有する。Ｓｃｈａｅｔｚｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１（１９）：８２４４−８２４８（２００９）。それは特にシタグリプチン（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．によりＪａｎｕｖｉａ（登録商標）（抗糖尿病薬剤）として市販されている）の合成に使用される。工学操作されたω−トランスアミナーゼは、バイオ触媒活性を例えば２５，０００倍に向上させ、結果的にシタグリプチン収率を全体で１３％増加させかつ全プロセス廃棄物を１９％低減することが判明した。
【００７４】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはチミジル酸シンテターゼ（例えば、ＥＣ２．１．１．４５）である。この酵素は糖ヌクレオチドおよびオリゴ糖の製造に使用される。それは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数１】
2018519838.tif 000030
【００７５】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．５．１．１８）である。この酵素は他のトリペプチドへのグルタチオンの導入を触媒する。それは食品工業で酸化剤として使用されるほか、医薬品工業で抗老化薬剤および皮膚製剤の製造にも使用される。
【００７６】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルコキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２）である。この酵素はグルコース−６−リン酸へのグルコースのリン酸化を促進する。それは食品工業で製造ストリーム中のグルコース濃度の低減および医薬品工業で糖尿病薬剤の製造などに使用される。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはリボフラビンキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２６）である。より好ましい実施形態において、リボフラビンキナーゼは食品工業でフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の製造に使用される。ＦＭＮは、橙色〜赤色の食品着色添加剤および過剰のリボフラビン（ビタミンＢ２）の分解剤である。リボフラビンキナーゼは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数２】
2018519838.tif 000031
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態はエンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）を含む。この酵素はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存的にアルケン還元を触媒する。エンレダクターゼの例としては、ＦＭＮ含有旧黄色酵素（ＯＹＥ）ファミリーのオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．６．９９）、クロストリジウムエン酸レダクターゼ（ＥｎｏＲｓ、Ｃ１．３．１．３１）、フラビン非依存中鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ、ＥＣ１．３．１）、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ、ＥＣ１．１．１．２０７−８）、ロイコトリエンＢ４デヒドロゲナーゼ（ＬＴＤ）、キノン（ＱＯＲ）、プロゲステロン５ｂ−レダクターゼ、ラットプレゴンレダクターゼ（ＰＧＲ）、タバコ二重結合レダクターゼ（ＮｔＤＢＲ）、シアノバクテリアＯＹＥ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来ＬａｃＥＲ、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）種ＪＡ８１由来Ａｃｈｒ−ＯＹＥ４、および酵母ＯＹＥが挙げられる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態はイミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）を含む。イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）は光学的に純粋な第２級環状アミンの合成を触媒する。それは第２級または第３級アミン生成物化合物を形成するようにケトンまたはアルデヒド基質および第１級または第２級アミン基質を変換し得る。例示的なＩＲＥＤは、パエニバチルス・エルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）Ｂ６９、ストレプトマイセス・イポモエアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｉｐｏｍｏｅａｅ）９１−０３、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０、およびアセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）に由来するものである。ＩＲＥＤは、国際公開第２０１３／１７００５０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）で詳細に考察されている。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はリアーゼである。それは加水分解や酸化以外のプロセスにより基質から原子団が除去される脱離反応を触媒する。新しい二重結合または環構造が得られることが多い。リアーゼには７つのサブクラスが存在する。好ましい実施形態において、高エステル化ペクチン（例えば、果実中のもの）を低分子に分解するためにペクチンリアーゼが使用される。本発明の他の好ましい実施形態は、オキシニトリラーゼ（マンデロニトリルリアーゼまたは脂肪族（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとも呼ばれる）を含む。それはマンデロニトリルをシアン化水素＋ベンズアルデヒドに開裂させる。
【００８１】
好ましい実施形態において、リアーゼはヒドロキシニトリルリアーゼ（例えば、ＥＣ４．１．２、プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）リアーゼの突然変異）である。ヒドロキシニトリルリアーゼは、広範にわたる化学反応および酵素反応に対する汎用ビルディングブロックとして機能し得るシアノヒドリンの形成を触媒する。それはより低ｐＨで酵素のスループットおよび安定性を向上させるために使用され、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））の製造に使用可能である。反応プロセスは、Ｇｌｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４８１５（２００３）（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、リアーゼは２−デオキシ−Ｄ−リボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。それは、例えば、Ｌｉｐｉｔｏｒ製造でスタチン側鎖を形成するために使用される。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、リアーゼは（Ｒ）−マンデロニトリルリアーゼ（ＨＮＬ、ＥＣ４．１．２．１０）である。それはジルチアゼム製造に使用される前駆体シアノヒドリンのｔｈｒｅｏ−３−アリール−２，３−ジヒドロキシプロパン酸を合成するために使用される。ジルチアゼムは、高血圧および胸痛（アンギナ）を治療する心臓治療薬剤である。血圧の低下は、卒中および心臓発作のリスクを低減する。それはカルシウムチャネルブロッカーである。ジチアゼムおよびその製造は、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．１：１１２１−４９（２０１１）およびＡｅｈｌｅ  Ｗ．２００８．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｗｅｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，ＧｍｂＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（両方ともその全体が参照により援用される）に記載されている。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、リアーゼはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１）である。それは３−シアノピリジンをニコチンアミド（ビタミンＢ３、ナイアシンアミド）に変換するために商業的に使用される。それはまた、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）の活性医薬成分レベチラセタムの調製にも使用される。
【００８５】
別の好ましい実施形態において、リアーゼはフェニルリン酸カルボキシラーゼである。それは、たとえば、室温かつ大気圧未満のＣＯ２圧の下でフェノールのリン酸化に使用される。この酵素は、１００％の選択率でフェノールおよびＣＯ２からの４−ＯＨ安息香酸の合成を触媒する。４−ＯＨ安息香酸はそのエステルの調製に使用される。より好ましい実施形態において、酵素は、化粧品および点眼液で保存剤として使用されるパラベンの製造に使用される。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はカルボニックアンヒドラーゼである。カルボニックアンヒドラーゼ（ＥＣ４．２．１．１）は全ての生物に存在するユビキタス金属酵素である。それはきわめて有効な公知の酵素の１つであり（Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  ＆  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７：１７５−９５（２０００））、ＣＯ２交換、ｐＨ調整、およびＨＣＯ３−分泌をはじめとする多くの生理学的役割を果たす（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３０（５Ｓ  Ｓｕｐｐｌ）：１４３７Ｓ−４６Ｓ（２０００））。カルボニックアンヒドラーゼはまた、ＣＯ２隔離およびカルサイト製造で潜在的工業用途を有する（Ｂｏｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．２０１３：２２−２７（２０１３））。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はイソメラーゼである。イソメラーゼは、分子の異性化、すなわち、一方の異性体から他方の異性体に変換する反応を触媒する。それは結合の破壊および形成が行われる分子内転位を促進可能であるか、またはコンホメーション変化を触媒可能である。イソメラーゼは当技術分野で周知である。
【００８８】
好ましい実施形態において、イソメラーゼは糖製造に使用される。より好ましい実施形態において、イソメラーゼはグルコースイソメラーゼのＥＣ５．３．１．１８である。他の実施形態において、グルコースイソメラーゼは、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種により製造される。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルコースをＤ−キシルロースおよびＤ−フルクトースに変換する。この変換は、高フルクトースコーンシロップの製造およびバイオ燃料の分野で重要な反応である。
【００８９】
グルコースイソメラーゼ（ＧＩＳ）（ＥＣ５．３．１．５）は、最も広く使用されている工業用酵素の１つである。それはグルコースから高フルクトースコーンシロップを製造するために使用される  ＧＩＳは、Ｄ−（＋）−フルクトースおよびＤ−（＋）−グルコースの可逆的異性化を触媒する（Ｂｈｏｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０（２）：２８０−３００（１９９６））。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、イソメラーゼはマレイン酸シス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）である。それはマレイン酸からフマル酸への変換を触媒する。フマル酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、ポリエステル樹脂、食品・飲料添加剤、および染料媒染剤のバイオ触媒的製造に重要である。
【００９１】
別の好ましい実施形態において、イソメラーゼはリノール酸シス−トランスイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．５）である。それは共役リノール酸（ＣＬＡ）の異性化を触媒する。ＣＬＡは、肥満、糖尿病、癌、炎症、およびアテローム形成を治療するうえで多くの潜在的な健康上の有益性を有することが報告されている。ＣＬＡの異なる異性体は、示差的な生理学的作用を発揮し得る。したがって、酵素は単一の異性体を調製するために使用される。
【００９２】
本発明の他の好ましい実施形態では、イソメラーゼはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１）である。それはＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸の相互変換を触媒する。トランスケトラーゼまたはアルドラーゼと組み合わせて、トリオースリン酸イソメラーゼは種々の糖または糖アナログの立体選択的多酵素的合成に使用される。好ましい実施形態は、Ｄ−キシルロース５−リン酸のワンポット酵素的調製である。この合成は、Ｄ−フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）によりフルクトース１，６−二リン酸のレトロアルドール開裂から開始される。続くラセミ化でトリオースリン酸イソメラーゼは、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）によりキシルロース５−リン酸に変換される２当量のＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の生成を促進する。
【００９３】
本発明の他の実施形態において、酵素はリガーゼである。この酵素は、ヌクレオシド三リン酸の加水分解と組み合わせて２つの分子を連結一体化する共有結合の形成を触媒する。リガーゼは当技術分野で周知であり、通常は組換え核酸用途に使用される。好ましい実施形態において、ＤＮＡリガーゼはＥＣ６．５．１．１である。
【００９４】
好ましい実施形態において、リガーゼはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２、ＡＣＣ）である。ＡＣＣは、脂質合成および酸化経路の接合の役割を担い得る。それは、抗生物質の製造、糖尿病、肥満、およびメタボリック症候群の他の病変の治療など、臨床目的で本明細書に開示される本発明と併用される。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、リガーゼはプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ、ＥＣ６．４．１．３）である。それは、ミトコンドリアマトリックス中でＤ−メチルマロニル−ＣｏＡを生成するプロピオニル−ＣｏＡのビオチン依存カルボキシル化を触媒する。メチルマリル−ＣｏＡは、多くの有機化合物の生合成さらには炭素同化のプロセスの重要な中間体である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、グルタミンシンテターゼ（ＧｌｕＳ）（ＥＣ６．３．１．２）は磁気固定化される。それは、脳、肝臓、および腎臓をはじめとする人体の種々の部分に見いだされる。グルタミンシンテターゼは、グルタメートからグルタミンを形成するためにＡＴＰおよびＮＨ３（アンモニア）を使用する。グルタミンは、医薬および健康食品で使用するために製造される重要なアミノ酸である。２００１年では、Ｌ−グルタミンの全世界年間製造量は約２０００メートルトンであった。］Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２１（Ａｐｒｉｌ  ２００２）：１−９（２００３）およびＫｕｓｕｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３１：２５５２Ｓ−２５５５Ｓ（２００１）。
【００９７】
ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、本発明に使用される酵素を発現する組み換え細胞を使用する。組み換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。ある実施形態において、細胞は、酵素を発現するプラスミドなどの発現ベクターにより形質転換される。他の実施形態において、ベクターは、例えば、転写開始、転写終結、翻訳開始および翻訳終結のための、１つまたは複数の遺伝子シグナル（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）を有する。本明細書において、酵素をコードする核酸は、好適な宿主生物へと適切に形質転換されるときにそれが発現されるようにベクター中でクローン化され得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において周知であるように、細菌、真菌、植物、または動物に由来し得る。
【００９８】
本発明はＢＮＣの自動連続製造プロセスを提供する。いくつかの実施形態において、機械は酵素固定化のために連続フロー製造を提供する。さらなる実施形態では、機械は工業スケールで使用される。
【００９９】
図１は、プロセスの例示的フロー図を示す。ナノ粒子は単分散状態を達成するために超音波処理される。それは制御された比およびｐＨで酵素と混合される。いくつかの実施形態において、超音波処理後、ナノ粒子は酵素が個別にポンプ送入される混合ループに送られる。好ましい実施形態において、ＢＮＣは温置ループ内で製造される。他の好ましい実施形態は、連続フロー製造技術分野で公知のように流量、チューブの長さおよび直径を変化させる。他の実施形態において、温置直後、ＢＮＣは、最終的に触媒が使用されるまで貯蔵し得る安定レベル２構造を形成するように磁気骨格と混合される。好ましい実施形態において、ＢＮＣは連続撹拌下で磁気骨格と混合される。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素調製物は単分散ＭＮＰとの混合前に酵素容器内に保持される。それは、適正な温度およびｐＨ条件下での貯蔵を可能にする任意の材料から作製可能である。いくつかの実施形態において、容器は、容器の壁への酵素調製物の非特異的結合を抑制する。したがって、それはガラス、ステンレス鋼、特定のプラスチックなどであり得る。同様に、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）は、金属酸化物の表面酸化を防止する条件で任意の好適な容器内に保持される。これらの条件は、温度、圧力、または酸素レベルを含み得る。他の実施形態において、容器はＭＮＰを磁気誘引しない。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の機械は酵素ポンプを含む。酵素ポンプは、機械力または重力により１つ以上の酵素調製物を組合せで、個別に、または逐次的にＢＮＣミキサーに送る。機械力は、正圧、負圧（真空）、撹拌などを含み得る。同様に、本発明のいくつかの実施形態において、本発明の機械は、機械力または重力により前記ＭＮＰ調製物をＭＮＰディスラプター送るＭＮＰポンプを含む。好ましい実施形態において、本明細書に記載されるポンプは、酵素調製物またはＭＮＰ調製物に作用する正圧または負圧により機能し得る。
【０１０２】
本発明の機械は、磁気ナノ粒子の単分散均一サスペンジョンを生成するＭＮＰディスラプターを有する。いくつかの実施形態において、ＭＮＰディスラプターはソニケーターまたはウルトラソニケーターである。超音波を発生するソニケーターは当技術分野で周知である。好ましい実施形態において、ソニケーターは、ＭＮＰ調製物に接触する超音波処理ワンドまたは延長部を含み得る。より好ましい実施形態において、ソニケーターは、ソニケーターコイルと超音波処理容器とを含むかまたはオンライン処理ソニケーターである。さらにより好ましい実施形態において、機械はソニケーターを冷却するための冷却システムを含む。最も好ましい実施形態において、冷却システムは水を使用する。
【０１０３】
他の実施形態において、ＭＮＰディスラプターは、振盪処理、強力撹拌処理、加圧処理、メッシュもしくは多孔性材料に通す処理、またはスプレー処理によりＭＮＰを機械的に破砕し得る。他の実施形態において、ＭＮＰディスラプターは、高ｐＨ（例えば、１０超）に曝すことによりまたは表面を（例えば、シトレートまたは低分子線状ポリマーで）官能基化することによりＭＮＰを化学的に破砕し得る。さらに他の実施形態において、ＭＮＰは、ＭＮＰ調製物に印加される磁界を変化させることにより破砕される。さらに他の実施形態では、ＭＮＰは、加熱、冷却、または凍結により熱的に破砕される。より好ましい実施形態において、ＭＮＰは、以上で参照された技術との組合せにより破砕される。
【０１０４】
本発明の機械はＢＮＣミキサーを含む。さまざまな方法で混合を達成し得ることは、当業者であれば分かるであろう。好ましい実施形態において、ＢＮＣミキサーは、酵素調製物およびＭＮＣ調製物が供給混合されるミキシングティーを含む。代替的に、混合される流動溶液の撹乱を増加させることによりＢＮＣを形成するチャンバー内で混合を達成し得る。他の実施形態において、ＢＮＣミキサーはミキシングティー（Ｔ形管コネクター）を含む。他の実施形態において、ＢＮＣミキサーは撹乱を増加させる内側リッジまたはピラーを有する管である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本発明の機械は、レベル２骨格材材料上にまたはその材料中にＢＮＣをテンプレート化または濃縮するための骨格材集合装置をさらに含む。好ましい実施形態において、骨格材には磁気がある。レベル２構造はランダム型または秩序型であり得る。他の好ましい実施形態において、機械は、ＢＮＣで官能基化されたレベル２集合体を製造するために骨格材調製物とＢＮＣとを混合するための骨格材容器を含有する。さらに他の好ましい実施形態において、骨格材およびＢＮＣは機械的または磁気的に混合される。より好ましい実施形態において、ＢＮＣの過剰凝集を抑制するためにおよび均一固定化酵素構造の形成を促進するために、ＢＮＣは骨格材内に直に配置される。
【０１０６】
図２は、ＢＮＣを製造するための例示的機械を提供する。酵素は容器（１）内に保持され、ＭＮＰは他の容器（２）内に保持される。ポンプ（４）は、ソニケーター（６）のホーンの周りに巻かれた管で構成された超音波処理コイル（７）にＭＮＰを送る。超音波処理コイルは、コイル（７）の周りに超音波力を跳飛するステンレス鋼容器（５）内に保持される。他の実施形態において、超音波処理コイルは超音波処理浴中に浸漬される。さらに他の実施形態において、超音波処理はオンラインソニケーターを用いてオンライン方式で行われる。
【０１０７】
容器（５）は冷却水浴（８）内に保持される。冷水は、冷却システム（９）から水を送るポンプ（１０）により浴に送られる。次いで、超音波処理されたＭＮＰは、ポンプ（３）を用いて酵素が送られるミキシングティー（１１）にポンプ移送される。酵素およびＭＮＰは、ＢＮＣが作製されるミキシングコイル（１２）中で混合される。次いで、触媒使用のレベル２集合体としてＢＮＣを製造するために、ＢＮＣは磁気骨格容器（１３）から磁気骨格材が送入されたシェーカー（１４）に送られる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を十分に破壊するために、超音波処理時間を計算し、コイル（７）の管の長さおよび直径さらにはポンプ（４）流量により制御する。計算は以下の通りである。
【数３】
2018519838.tif 000032
式中、
ＬＳ＝超音波処理コイルの長さ（ｍ）
ＴＳ＝超音波処理時間（ｍｉｎ）
ＦＡ＝ＭＮＰポンプの流量（ｍｌ／ｍｉｎ）
ＤＡ＝ＭＮＰポンプの管内径（ｍｍ）
【０１０９】
いくつかの実施形態において、すでに超音波処理に曝されたナノ粒子はミキシングコイル（１２）に送られる。他の実施形態において、非意図的な超音波処理および酵素の変性を防止するために、管はソニケーターから適正距離に保持される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、酵素管およびＭＮＰ管は、ミキシングティー接続を用いてミキシングループに接続される。所要の混合時間は以下のように計算される。
【数４】
2018519838.tif 000033
式中、
ＬＭ＝混合管の長さ（ｍ）
ＴＭ＝混合時間（ｍｉｎ）
ＦＢ＝酵素ポンプの流量（ｍｌ／ｍｉｎ）
ＤＯ＝出力管内径（ｍｍ）
【０１１１】
いくつかの実施形態において、スプリッターに接続される管は空間を保つようにコイル巻きされる。他の実施形態において、スプリッターは、磁気骨格と共にＭＮＰ／酵素混合物をシェーカー（１４）内に落下させる。スプリッターは、単一管のみよりも大きい表面領域にわたり混合物を落下させ得る。容器は、ＢＮＣと骨格との十分な混合が確保されるように振盪される。
【０１１２】
本明細書に記載される本発明をより完全に理解し得るように、以下の実施例が示されている。これらの実施例は、単に例示を目的としたものにすぎず、本発明をなんら限定するものとみなすべきではないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１１３】
実施例１−酵素と酸化鉄磁気ナノ粒子との比の最適化
酵素充填率は、さまざまなｐＨ値で酵素とＭＮＰとの比を最適化することにより各酵素に対して最適化される。酸化鉄磁気ナノ粒子クラスター中に固定化された酵素の充填率は、例えば、修正ブラッドフォードタンパク質定量アッセイを間接的に利用して未結合酵素を測定することにより決定される。
【０１１４】
約４〜１１のｐＨに調整された一定濃度の超常磁性鉄ナノ粒子（５００μｇ／ｍＬ）と約５〜１０００μｇ／ｍＬの濃度の酵素とを組み合わせる。１〜１２時間の接触時間の後、酵素／ナノ粒子クラスター（レベル１）をサスペンジョン状態の過剰のマグネタイトマイクロ粒子（２０ｇマイクロ粒子／１ｇＭＮＰ）（レベル２）上に固定化する。永久磁石を用いてペレット化することにより固定化酵素をサスペンジョンから分離する。マイクロプレートＵＶ／可視分光測光器を用いてマイクロプレートでブラッドフォードアッセイにより５９５ｎｍの吸光度を読んで標準曲線を使用することにより、上澄み中に残留する未結合タンパク質を定量可能である。ブラッドフォード試薬のクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素は、塩基性アミノ酸残基に結合して５９５ｎｍ（青色）にＵＶ吸収を有する安定な複合体を形成する。この吸光度はベールの法則に従う。タンパク質濃度対Ａ５９５の標準曲線を用いて、溶液中のタンパク質濃度を決定する。全タンパク質と未結合タンパク質との差から以下のように固定化タンパク質の量を計算する。
［Ｅ］結合＝［Ｅ］全体−［Ｅ］未結合
［Ｅ］＝酵素濃度（μｇ／ｍＬ）
【０１１５】
［Ｅ］全体に対する［Ｅ］結合のプロットから結合等温線を作成し、二次形式のラングミュア吸着モデルに当てはめる。レベル１固定化の酵素充填容量は、ナノ粒子１グラム当たりの結合タンパク質のグラム数に換算してパーセントで表される。例えば、以下の通りである。
１％充填率＝（１ｇ結合タンパク質）／（１００ｇナノ粒子）
【０１１６】
酵素とナノ粒子との最適比を決定した後、固定化速度曲線（１０分間、１時間、５時間、および１８時間）を用いて、酵素の１００％捕捉に対する最小接触時間を決定する。酵素固定化手順は以下の通りである。
【０１１７】
定量のために、０、１０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００μｇ／ｍＬでＭｉｌｌｉＱ水によるストック酵素の２ｍＬ希釈液を含む標準を調製する。５ｍＬの１０００μｇ／ｍＬナノ粒子（ＭＮＰ）の入った３本の管を用意する。１Ｍ  ＨＣｌおよび１Ｍ  ＮａＯＨを用いて１つの管に対してＭＮＰのｐＨをそれぞれｐＨ４、５、９、および１１に調整する。２０％の振幅でＭＮＰを１分間超音波処理する。
【０１１８】
次のように酵素を固定化する。超音波処理されたＭＮＰの５００μＬを９本のマイクロ遠心分離管にアリコートする。各ｐＨのＭＮＰに対して合計２７本の管でこれを行う。各酵素希釈液の５００μＬを各ｐＨのＭＮＰアリコートに混合して、各ｐＨのＭＮＰで９個、合計２７個のサンプルを、０、５、２５、５０、１２５、２５０、３７５、５００、および１０００μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度ならびに５００μｇ／ｍＬの最終ＭＮＰ濃度で作製する。各サンプルをボルテックスし、次いで、タンブラー中、４℃で１２時間アジテートすることより酵素とＭＮＰとの接触時間を可能にする。
【０１１９】
５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に１００ｍｇのマグネタイトを導入して５ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイトマイクロ粒子サスペンジョンを調製する。激しく振盪することによりマグネタイトサスペンジョンを混合する。上下に１０回ピペッティングを行ってマイクロ粒子を分散させる。５００μＬの２０ｍｇ／ｍＬマイクロ粒子サスペンジョンを２７個の酵素サンプルのそれぞれに添加する。オービタルシェーカーを用いてサンプルを１０分間混合することにより、レベル２骨格上にレベル１固定化酵素を装着する。永久希土類磁石を用いてレベル２をペレット化する。上澄みを捕集し、所要により、最大濃度（すなわち、０％充填率）が５〜２０μｇ／ｍＬの範囲内に含まれるように希釈する。
【０１２０】
希釈した上澄みでブラッドフォードアッセイを行って希釈した上澄みの濃度を決定する。これらの濃度を適切な稀釈倍率によりスケール調整してレベル１固定化後に残留する未結合タンパク質の濃度を求める。初期全タンパク質と未結合タンパク質との差から以下のように結合タンパク質を計算する。
［Ｅ］結合＝［Ｅ］全体−［Ｅ］未結合
［Ｅ］＝酵素濃度（μｇ／ｍＬ）
【０１２１】
固定化効率の定量は、［Ｅ］全体／５００μｇ／ｍＬに対して［Ｅ］結合／５００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰをプロットすることにより計算される。モデリングソフトウェアを用いてデータをラングミュア吸着モデルに当てはめる。ＭＮＰに対して酵素を最適化した後、満足な酵素充填率は１〜１００％である（材料１００ｇ当たりの酵素のｇ数）。
【０１２２】
実施例２−酸化鉄磁気ナノ粒子による酵素固定化時間の最適化
最初に、以上の実施例１のように一定量のＭＮＰに対して各酵素の最大酵素充填率を最適化し決定する。酵素とナノ粒子との最適比を決定した後、固定化速度曲線（０分間、５分間、１時間、５時間、および１８時間）を用いて、酵素の１００％捕捉に対する最小接触時間を決定する。
【０１２３】
酵素固定化手順は次の通りである。酵素の１００％捕捉（［Ｅ］最大）をもたらす最も高い酵素充填率を結合等温線から選択する。選択された酵素充填条件のｐＨで６ｍＬの１０００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰを調製する。２０％の振幅でＭＮＰを１分間超音波処理する。超音波処理されたＭＮＰの１０個の５００μＬアリコートを１．５ｍＬ管中に作製する。
【０１２４】
２＊［Ｅ］ｍａｘの６ｍＬを調製する。ＭｉｌｌｉＱ水中に６ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬレベル２を調製する。５００μＬの酵素をＭＮＰアリコートの８つに添加し、［Ｅ］ｍａｘの最終酵素濃度および５００μｇ／ｍＬのＭＮＰ濃度を得る。
【０１２５】
次の時間点、すなわち、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８ｈ（一晩）で、５００μＬの十分に混合されたレベル２を酵素固定化アリコートに添加して固定化を終了する。以上のブラッドフォードアッセイ手順に従って、１：１のＭｉｌｌｉＱ水およびブラッドフォード試薬をブランクとして用いて、所与の時間後に依然として溶液中にある酵素の濃度を決定する。酵素の１００％固定化に対する最小時間は上澄みに酵素がないときである。
【０１２６】
酵素は、約５〜３０分間以内に最大充填容量（材料１００ｇ当たりの酵素のｇ数）で固定化される。
【０１２７】
実施例３−ＥＣ１．酵素：リポキシダーゼの固定化
リポキシダーゼは、脂肪酸中への分子酸素の取込みを触媒するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１３．１１．１２）である。ダイズ株グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）由来のリポキシダーゼ（ＬＰＯ）は、アンモニウムリノレエートからリノール酸ヒペルオキシドの１３−（Ｚ，Ｅ）−、９−（Ｅ，Ｚ）−、１３−（Ｅ，Ｅ）−、９−（Ｅ，Ｅ）−ＨＰＯＤＥの４種の位置異性ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）の混合物への変換により測定したとき、高い活性を有する。これらはそれぞれ、２５，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数（ε）で２３４ｎｍにピークＵＶ吸収を有する。２３４ｎｍの吸光度の増加を読み取ることにより、アンモニウムリノレエートからそのヒドロペルオキシドへの変換を評価可能である。Ａｎｔｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４９：３２−３７（２００１）、Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ３４（３）：１４７４−１４８１（２０１１）、Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１７：８２−９０（２０１３）を参照されたい。上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
一実施形態において、リポキシダーゼ固定化は最適化されて、得られるバイオ触媒活性は次のようにエンドポイント速度論で測定される。結合等温線は、ＭＮＰによるＬＰＯ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、完全固定化に対する最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＬＰＯ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＬＰＯおよび固定化に対する最良ナノ粒子濃度によりリノール酸からＨＰＯＤＥへの変換を実証する。この固定化ＬＰＯは、工業適合時間スケールの１８ｈ変換でしかも同程度のＶｍａｘを有して遊離酵素の活性に等しいかまたはそれを超えるように最適化される。
【０１２９】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＬＰＯのピーク充填率は以上に記載されたように決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＬＰＯは、活性に関して最良のＬＰＯ対ＮＰ比でスクリーニングされる。レベル２固定化ＬＰＯ活性は、リノレエートからそのヒドロペルオキシド（ＨＰＯＤＥ）への変換を用いて２３４ｎｍの吸光度の増加を読み取ることにより測定される。リノレエートおよび溶存酸素は、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＬＰＯと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でＨＰＯＤＥの濃度を測定することにより決定される。ごく短い時間でヒドロペルオキシドへの酸化が始まる。最適化固定化ＬＰＯは、基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＬＰＯと比較される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＬＰＯは再使用可能性に関して試験される。
【０１３０】
リポキシダーゼの結合等温線は、以上の実施例１〜２に記載されるように決定される。１８時間で６０％の変換に必要とされる非固定化ＬＰＯ濃度（［Ｅ］６０％）を決定する。１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中に３０ｍＭリノール酸ストック溶液を調製する。常に１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７で希釈する。次のＬＰＯ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１３１】
【表１】
2018519838.tif 000034
【０１３２】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクの２５０μＬのＡ２３４を読み取る。２３４ｎｍのＨＰＯＤＥの吸光係数を用いて上澄み中のＨＰＯＤＥの濃度を計算する。固定化ＬＰＯ（［Ｅ］６０％）のスクリーニングのために６０％の変換まで反応を完了させるのに必要とされる最低酵素濃度を決定する。
【０１３３】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＬＰＯの固定化は次のように行う。ＺＹＭ結合等温線プロトコルで見いだされた最適化固定化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＬＰＯを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＬＰＯを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（６０％リノール酸を１８ｈでＨＰＯＤＥに変換する最小ＬＰＯ濃度）と等価な濃度４［Ｅ］６０％に３ｍＬの希釈レベル２固定化ＬＰＯおよび遊離ＬＰＯを調製する。ＬＰＯ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＬＰＯに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＬＰＯの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１３４】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、Φはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中の１２ｍＬの２．４ｍＭリノール酸と２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８とを調製する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］６０％になる。
【０１３５】
【表２】
2018519838.tif 000035
【０１３６】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。ＬＰＯおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］６０％および５０ｍＭとなるように、各ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＬＰＯのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ２３４を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。２３４ｎｍの吸光係数を用いて反応管中のＨＰＯＤＥ濃度を計算する。
【０１３７】
最適化固定化ＬＰＯは、ＨＰＯＤＥに変換されたリノール酸の量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０１３８】
磁気固定化ＬＰＯの再使用可能性は次のように決定される。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＬＰＯサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＬＰＯをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１３９】
速度論的時間経過は次のように決定される。１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７中の３００μＬの２．４ｍＭリノール酸と６００μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７とを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］６０％になる。
【０１４０】
【表３】
2018519838.tif 000036
【０１４１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。ＬＰＯおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］６０％および５０ｍＭとなるように、ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。この固定化ＬＰＯリサイクル処理試験時にＨＰＯＤＥに変換されたリノール酸の量を決定する。
【０１４２】
実施例４−ＥＣ３．酵素−ニトリラーゼの固定化
ニトリラーゼ（ＮＩＴ）活性は、マンデロニチリルから（Ｒ）−マンデル酸への変換により測定される。マンデル酸が形成されるとｐＨが低下する。それは、プレートリーダーを用いてマイクロプレートでブロモチモールブルー（ＢＢ）などの色素により吸光係数１５７０３．７９Ｍ−１ｃｍ−１を有するＡ６１６の減少として分光測光法でモニターされる（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ８（５）：５５９−６５（２００３））。
【０１４３】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＮＩＴのピーク充填率は結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を使用する。最良ＮＩＴ対ＮＰ比に関して固定化ＮＩＴ活性のスクリーニングを行う。マンデロニトリルからマンデル酸へのレベル２固定化ＮＩＴ変換は、青色から黄色へのブロモチモールブルーの色変化を用いて６１６ｎｍの吸光度の減少を読み取ることにより測定される。マンデロニトリルおよびブロモチモールブルーは、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＮＩＴと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）で溶液のｐＨ変化を測定することにより比色法で決定する。１８ｈで基質の完全変換を達成するのに必要なニトリラーゼの濃度を決定する。
【０１４４】
次いで、基質の完全変換に関して１８ｈで遊離ＮＩＴの活性に等しいかまたはそれを超えるように固定化ＮＩＴを最適化する。固定化の最良条件を選択した後、再使用可能性に関して逐次アッセイでレベル２固定化ＮＩＴを試験する。次いで、実施例１および２に記載される方法を用いて結合等温線を決定する。
【０１４５】
一実施形態において、ニトリラーゼの固定化は最適化されて、得られるバイオ触媒活性は比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。最初に、１８時間で基質を完全変換するのに必要な遊離ＮＩＴ濃度（［Ｅ］１８ｈ）（参照）を以下のように決定する。
【０１４６】
１０％エタノールおよびＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの５０ｍＭマンデロニトリルストック溶液、ＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの０．０４％ＢＢ、および１２ｍＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２を調製する。次のＮＩＴ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、５０００ｎＭのそれぞれに対して、２５０μＬを２本の１．５ｍＬ遠心分離管中にそれぞれディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１４７】
【表４】
2018519838.tif 000037
【０１４８】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクのＡ６１６を読み取る。
【０１４９】
２．５％エタノール中の１２．５ｍＭマンデル酸、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０１％ブロモチモールブルーから始めて希釈系列でマンデル酸の標準曲線を作成する。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２および０．０１％ＢＢを用いて希釈する。形成されたマンデル酸の濃度を標準曲線により計算する。酵素の全ての濃度で反応が１００％変換で達成された場合、酵素の最も低い濃度を固定化ＮＩＴのスクリーニングに使用する濃度（［Ｅ］１８ｈ）として選択する。
【０１５０】
第２に、ＮＩＴをＢＮＣ中に固定化して、標準的最適化アッセイを用いて次のように固定化を最適化する。実施例１の等温線プロトコルで見いだされた固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＮＩＴを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＮＩＴを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（１００％マンデロニチリルを１８ｈでマンデル酸に変換するＮＩＴの最小濃度）と等価な濃度４＊［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＮＩＴおよび遊離ＮＩＴを調製する。ＮＩＴ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＮＩＴに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＮＩＴの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１５１】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１０％エタノールおよびＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの５０ｍＭマンデロニトリルストック溶液、ＭｉｌｌｉＱ水中の１２ｍＬの０．０４％ＢＢ、および１２ｍＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２を調製する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１５２】
【表５】
2018519838.tif 000038
【０１５３】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＮＩＴ濃度で２５０μＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、２５０μＬの０．０１％ＢＢ、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＮＩＴのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ６１６を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。２．５％エタノール中の１２．５ｍＭマンデル酸、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０１％ブロモチモールブルーから始めて希釈系列でマンデル酸の標準曲線を作成する。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２および０．０１％ＢＢを用いて希釈する。形成されたマンデル酸の濃度を標準曲線により計算する。
【０１５４】
最適化固定化ＮＩＴは、マンデル酸に変換されたマンデロニトリルの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。再使用可能性は複数サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＮＩＴサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることが可能であり得る）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＮＩＴをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１５５】
速度論的時間経過：  １０％エタノール、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、および０．０４％ＢＢ中に各３００μＬの５０ｍＭマンデロニチリルを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１５６】
【表６】
2018519838.tif 000039
【０１５７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＮＩＴ濃度で２５０μＬの４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、２５０μＬの０．０１％ＢＢ、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水をブランクに充填する。リサイクル処理は、プロトコルの繰返し、材料の回収、および後続サイクルでの使用により実証される。
【０１５８】
結合等温線を用いて、ＭＮＰによるＮＩＴ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＮＩＴ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＮＩＴによりマンデロニトリルからマンデル酸への変換を実証する。固定化に対するナノ粒子の最良濃度はこうして決定される。最適化ＮＩＴは、工業適合時間スケールの１８時間変換およびＶｍａｘに関して少なくとも遊離酵素に一致し得る。最適化ＮＩＴは、１８時間にわたり５サイクルで活性を損なわない固定化ＮＩＴの再使用可能性を決定するために再び使用される。
【０１５９】
実施例５−シトクロムオキシダーゼ（ＥＣ１．９．３．１）の固定化
動物、植物、酵母、およびいくつかの細菌の好気代謝で電子伝達鎖に関与するシトクロムｃオキシダーゼ（「ＣＣＯ」（ＥＣ１．９．３．１））。Ｅｒｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７３（１）：１１３−１１７（１９７６）。その活性は、フェロシトロクロムｃからフェリシトクロムｃへの酸化により測定される。（例えば、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２０１４：１−４を参照されたい。）上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。フェリシトクロムｃの形成は、５５０ｎｍの吸光度の減少として分光測光法でモニターされる。フェロシトクロムおよびフェリシトクロムの吸光係数の差は２１．８５ｍＭ−１ｃｍ−１である。
【０１６０】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＣＣＯの最大充填率は結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＣＣＯ活性は、最良のＣＣＯ対ＮＰ比に関してスクリーニングされる。フェロシトロクロムｃからフェリシトクロムｃへのレベル２固定化ＣＣＯ酸化は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで測定される５５０ｎｍの吸光度の変化を用いて評価される。シトクロムｃはジチオトレイトール（ＤＴＴ）により還元され、１ｍＬのバッチ反応でレベル２固定化ＣＣＯにより再酸化される。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でＡ５５０の減少により測定される。
【０１６１】
一実施形態において、ＢＮＣ中へのＣＣＯ固定化の最適化およびその活性の後続測定は、次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で行われる。固定化ＣＣＯは、１８時間にわたる基質の完全変換に関して遊離ＣＣＯの活性に等しいかまたはそれを超えるように最適化される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＣＣＯは、再使用可能性に関して１ｍＬアッセイで５回の逐次１８時間反応により試験される。ＣＣＯの結合等温線は、以上の実施例１に記載されるように決定される。
【０１６２】
１８時間で基質を完全変換するのに必要な遊離ＣＣＯ濃度（［Ｅ］１８ｈ）（参照）は、次のように決定される。９２μＭ  ＤＴＴおよびＭｉｌｌｉＱ水を有する１２ｍＬの４０μＭシトクロムｃストック溶液と、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する２４ｍＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。シトロクロムｃをＤＴＴにより２０分間還元し、１０〜２０のＡ５５０／Ａ５６５により確認する。次のＣＣＯ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１６３】
【表７】
2018519838.tif 000040
【０１６４】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。トリプリケートで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで反応サンプルおよび酵素ブランクを有するブランクのＡ５５０を読み取る。ＤＴＴを有していない１０μＭ酸化型シトクロムｃ（室温で一晩放置）および１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７から始めて希釈系列で酸化型シトクロムｃの標準曲線を形成する。１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７を用いて希釈する。標準曲線を用いて酸化型シトクロムＣの濃度を計算する。酵素の全ての濃度で反応が１００％変換で達成された場合、酵素の最も低い濃度を固定化ＣＣＯのスクリーニングに使用する濃度（［Ｅ］１８ｈ）として選択する。
【０１６５】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＣＣＯ固定化：  実施例１に記載される固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＣＣＯを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＣＣＯを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。４＊（１００％シトクロムｃを１８ｈで酸化するＣＣＯの最小濃度）と等価な濃度４＊［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＣＣＯおよび遊離ＣＣＯを調製する。ＣＣＯ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＣＣＯに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＣＣＯの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１６６】
速度論的時間経過：  各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。９２μＭ  ＤＴＴおよびＭｉｌｌｉＱ水を有する１２ｍＬの４０μＭシトクロムｃストック溶液と、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する２４ｍＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。シトクロムｃをＤＴＴにより２０分間還元し、１０〜２０のＡ５５０／Ａ５６５により確認する。１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１６７】
【表８】
2018519838.tif 000041
【０１６８】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＣＣＯ濃度で、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する５００μＬの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水と、を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。トリプリケートで、固定化ＣＣＯのピペッティングの直後、各サンプルの２５０μＬのＡ５５０を読み取り、希釈酵素ブランクでブランクを読み取る。
【０１６９】
ＤＴＴを有していない１０μＭ酸化型シトクロムｃ（室温で一晩放置）および１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７から始めて希釈系列で酸化型シトクロムｃの標準曲線を形成する。１２０ｍＭ  ＫＣｌを有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７を用いて希釈する。標準曲線を用いて酸化型シトクロムＣの濃度を計算する。
【０１７０】
酸化型シトクロムｃの量を時間に対してプロットすることにより最適化固定化ＣＣＯを決定する。線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定する。
【０１７１】
再使用可能性は次のように５サイクルでアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＣＣＯサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＣＣＯをペレット化する。上澄みを除去する。次のように速度論的時間経過を計算する。９２μＭ  ＤＴＴを有する３００μＬの４０μＭシトクロムｃと、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する６００μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、を調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１７２】
【表９】
2018519838.tif 000042
【０１７３】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＣＣＯ濃度で、２４０ｍＭ  ＫＣｌを有する５００μＬの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７と、２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水と、を各ブランクに充填する。手順を複数回繰り返して再使用可能性を実証する。
【０１７４】
結合は、ＭＮＰによるＣＣＯ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＣＣＯ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＣＣＯによりフェロシトクロムからフェリシトクロムへの変換を実証し、固定化に対する最良ナノ粒子濃度を決定する。この最適化ＣＣＯは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して少なくとも遊離酵素に一致し得るとともに同程度のＶｍａｘを有し得る。最適化ＣＣＯを見いだしたら、再びそれを用いて固定化ＣＣＯの再使用可能性を実証する。
【０１７５】
実施例６−グルコースイソメラーゼの固定化
グルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）は、高い立体選択性を有してβ−Ｄ−グルコースからフルクトースへの異性化を触媒する。Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９１：２３０−２３４（１９６０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ７：１６５−１８５（１９９２）（両方ともその全体が参照により援用される）。その固定化は遊離酵素と比較して高い活性になるように最適化される。活性はグルコースからフルクトースへの変換により測定される。グルコースの消失は、グルコースオキシダーゼ／ホースラディッシュペルオキシダーゼ系（ＧＯＸ／ＨＲＰ）を用いて分光測光法でモニターされる。ＧＯＸは、グルコースおよび溶存酸素を過酸化水素に変換し、この過酸化水素は、次いで、フェノールを酸化するためにＨＲＰにより使用される。次いで、フェノールラジカルは４−アンチアミノピレン（４−ＡＡＰ）比色剤に結合する。フェノール−４−ＡＡＰ複合体の形成に基づく５５０ｎｍの吸光度の増加は、溶液中の残留グルコースの量に直接対応する。したがって、５５０ｎｍの吸光度が低いほど、より多くのグルコースがグルコースイソメラーゼによりフルクトースに変換されたことを示唆する。
【０１７６】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＧＩのピーク充填率は等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＧＩ活性は、最良のＧＩ対ＮＰ比に関してスクリーニングされる。グルコースからフルクトースへのレベル２固定化変換は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてマイクロプレートで測定される５５０ｎｍの吸光度の変化を用いて評価される。グルコースおよびレベル２固定化ＧＩは１ｍＬバッチ反応で反応する。所望の継続時間にわたり反応させた後、反応上澄みをＧＯＸ／ＨＲＰミックス中に希釈し、さらには最終体積１ｍＬでフェノール、緩衝液、および４−ＡＡＰ色素を加えて、残留グルコースを定量する。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）で増加したＡ５５０を測定することにより決定する。
【０１７７】
一実施形態において、グルコースイソメラーゼの固定化は最適化されて、後続の活性は次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。最適化固定化ＧＩは、基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＧＩと一致する。固定化の最良条件を選択した後、再使用可能性に関して１ｍＬの体積で５回の逐次１８ｈ反応によりレベル２固定化ＧＩを試験する。
【０１７８】
ＧＩの結合等温線は、以上に記載されるように決定する。
【０１７９】
１８ｈ１００％反応完了に対する遊離ＧＩ濃度（［Ｅ］１８ｈ）を次のように決定する。１２ｍＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する１２ｍＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する１２ｍＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。次のＧＩ濃度、すなわち、必要に応じて４、２０、４０、２００、４００、５００、１０００、または５０００ｎＭのそれぞれに対して、それぞれ２本の１．５ｍＬ遠心分離管中に２５０μＬをディスペンスする。ＭｉｌｌｉＱ水で酵素を希釈する。以上の各酵素濃度に対する１本の管において、基質および緩衝液は以下の割合で組み合わされる。
【０１８０】
【表１０】
2018519838.tif 000043
【０１８１】
反応管およびブランク管をパラフィルムでシールし、オービタルシェーカーを用いて室温の暗所でアジテートする。１８時間の接触時間後、全ての反応管および酵素ブランク管を１２０００ｇで１０分間遠心分離する。全てのサンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。
【０１８２】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＧＩの固定化：  ＺＹＭ結合等温線プロトコルで見いだされた固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＧＩを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＧＩを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。
【０１８３】
４＊（１００％グルコースを１８ｈでフルクトースに変換するＧＩの最小濃度）と等価な濃度４［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＧＩおよび遊離ＧＩを調製する。ＧＩ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＧＩに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＧＩの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１８４】
次のように速度論的時間経過を決定する。各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１０８００ｍｉｎ（１８時間）のラベルを付けて（ただし、Φはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。１２ｍＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、２４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する１２ｍＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する１２ｍＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。
【０１８５】
１ｍｉｎ〜１０８００ｍｉｎのラベル付の各管に７５０μＬの反応ミックスをピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１８６】
【表１１】
2018519838.tif 000044
【０１８７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＧＩ濃度で２５０μＬの２００ｍＭ  ＰＢ  ｐＨ６、２５０μＬの２００ｍＭグルコース、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。永久希土類磁石を用いて１倍、５倍、および１０倍のそれぞれに対して固定化酵素の１つのサンプルをペレット化する。各サンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。最適化固定化ＧＩは、フルクトースの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０１８８】
再使用可能性は５サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１８時間固定化ＧＩサンプル（これはまた、１８時間で反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＧＩをペレット化する。上澄みを除去する。
【０１８９】
次のように速度論的時間経過を決定する。３００μＬの２００ｍＭグルコースストック溶液、６００μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ６、４０ｎＭ  ＨＲＰを有する３００μＬの４０ｎＭ  ＧＯＸ、および８０ｍＭフェノールを有する３００μＬの７ｍＭ  ４−ＡＡＰを調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０１９０】
【表１２】
2018519838.tif 000045
【０１９１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。［Ｅ］１８ｈの最終ＧＩ濃度で２５０μＬの２００ｍＭ  ＰＢ  ｐＨ６、２５０μＬの２００ｍＭグルコース、および２５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を各ブランクに充填する。各サンプルおよびブランクをグルコース分割反応ミックス中に希釈する。
【０１９２】
結合等温線は、ＭＮＰによるＧＩ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＧＩ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＧＩによりグルコースからフルクトースへの変換を実証する。固定化に対するナノ粒子の最良濃度を決定する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、５５〜６０℃で高い基質濃度で磁気固定化ＧＩを用いて、炭酸ナトリウムによりｐＨを７．５〜８．０に調整する。酵素活性を維持するために硫酸マグネシウムを添加した（Ｍｇ２＋が補因子であるため）。Ｃｏ２＋を補因子として使用してもよい。この最適化ＧＩは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して遊離酵素に少なくともマッチし、同程度のＶｍａｘを有し得る。
【０１９４】
実施例７−トランスアミナーゼの固定化
ω−トランスアミナーゼは、キラルアミンまたはケトンを形成するアミン基の転移を触媒するトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。ω−トランスアミナーゼまたはアミントランスアミナーゼ（ＡＴＡ）は、遊離酵素と比較して高い活性となるように固定化される。それはアセトフェノンおよびアリニンを形成するα−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）からピルベートへのアミン転移により測定される。アセトフェノン（ＡＰ）の形成は２４５ｎｍのＵＶ吸収の増加により判断される。ＡＰの吸光係数は１２Ｍ−１ｃｍ−１である。（Ｋａｒｉｍ  Ｅｎｇｅｌｍａｒｋ  Ｃａｓｓｉｍｊｅｅ  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，ＫＴＨ  Ｒｏｙａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（２０１２）、Ｗａｔｓｏｎ  Ｎｅｔｏ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋを参照されたい。）上記のものはその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１９５】
超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）上へのＡＴＡのピーク充填率は、以上に記載される結合等温線プロトコルを用いて決定される。最小ナノ粒子濃度、ｐＨ、および接触時間に対するベースラインとしてピーク充填率を用いて、固定化ＡＴＡは、酵素活性に関して最良のＡＴＡ対ＮＰ比でスクリーニングされる。レベル２固定化ＡＴＡ活性は、２４５ｎｍの吸光度の増加により判断されるアセトフェノンへのＭＢＡの変換を用いて評価される。ＭＢＡおよび共基質ピルベートは、１ｍＬバッチ反応でレベル２ＡＴＡと組み合わされる。反応速度は、速度論的時間経過（１ｍｉｎ〜１８ｈ）でアセトフェノンの濃度を測定することにより決定される。
【０１９６】
一実施形態において、ＡＴＡの固定化は最適化されて、後続の活性は次のように比色アッセイを用いてエンドポイント速度論で測定される。固定化ＡＴＡは最大Ｖｍａｘになるようにおよび基質の１８ｈ完全変換に関して遊離ＡＴＡの活性に一致するように最適化される。固定化の最良条件を選択した後、レベル２固定化ＡＴＡは再使用可能性に関して試験される。
【０１９７】
ＭＮＰ濃度スクリーニングアッセイのためのＡＴＡの固定化：  実施例１に示される固定化の最適化条件を用いて、２０ｇのレベル２骨格／１ｇのＭＮＰにより３ｍＬのレベル２固定化ＡＴＡを調製する。また、他の全ての条件を一定に保って５倍および１０倍のＭＮＰを用いてＡＴＡを固定化する。使用前、激しく振盪して混合する。同様に同一の濃度で遊離酵素を調製する。
【０１９８】
１００％ＭＢＡを１８ｈでＡＰに変換するのに必要な最小ＡＴＡ濃度の４倍と等価な濃度［Ｅ］１８ｈに３ｍＬの希釈レベル２固定化ＡＴＡおよび遊離ＡＴＡを調製する。ＡＴＡ固定化用のＭＮＰの各濃度（１倍、５倍、１０倍）さらには遊離ＡＴＡに対して、合計３６個のサンプルで十分に混合された固定化ＡＴＡの９×２５０μＬアリコートをディスペンスする。
【０１９９】
次のように速度論的時間経過を決定する。各ＭＮＰ濃度の管にブランク、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のラベルを付けて（ただし、ブランクはタンパク質・緩衝液ブランクである）、必要に応じてそれらに「１倍」、「５倍」、「１０倍」、または「遊離」のマークを付した。４ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌを調製する。１％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  ＭＢＡ、１０ｍＭナトリウムピルベート、および２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８をそれぞれ１２ｍＬ調製する。７５０μＬの反応ミックスを各管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。
これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０２００】
【表１３】
2018519838.tif 000046
【０２０１】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、および１８時間のそれぞれで停止する。熱変性（例えば、沸騰水中５分間）により適切な管中の反応を停止する。ＡＴＡおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］１８ｈおよび５０ｍＭとなるように、各ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８中の１５６．２５ｍＭを最大濃度として希釈系列でＡ２４５に対するアセトフェノン濃度の標準曲線を作成する。希釈剤は、標準曲線に対するブランクとなる５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８とする。
【０２０２】
永久希土類磁石を用いて全ての固定化酵素をペレット化する。各管の上澄み６２．５μＬを９３７．５μＬのＭｉｌｌｉＱ水中に希釈する。トリプリケートで、各希釈反応サンプルおよび希釈酵素ブランクを有するブランクのＡ２４５を読み取る。アセトフェノン標準を用いて希釈上澄み中のアセトフェノンの濃度を計算する。上澄み中のＡＰ濃度に稀釈倍率（１０００／６２．５）を乗算することにより反応管中の最終ＡＰ濃度を計算する。
【０２０３】
最適化固定化ＡＴＡは、アセトフェノンに変換されたＭＢＡの量を時間に対してプロットして線形領域で速度論的グラフの傾きからＶｍａｘを決定することにより選択される。
【０２０４】
再使用可能性は５サイクルで次のようにアッセイされる。最も高いＶｍａｘを有する１０８００ｍｉｎ（１８ｈ）固定化ＡＴＡサンプル（これはまた、１８ｈで反応を完了させることができるはずである）さらにはそのブランクを選択する。永久希土類磁石を用いて固定化ＡＴＡをペレット化する。上澄みを除去する。
【０２０５】
次のように速度論的時間経過を決定する。１５０μＬの６Ｍ  ＨＣｌを調製する。１％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  ＭＢＡ、１０ｍＭナトリウムピルベート、および２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８をそれぞれ３００μＬ調製する。７５０μＬの反応ミックスを反応管中にピペッティングすることにより、反応を開始させる。これにより酵素濃度は［Ｅ］１８ｈになる。
【０２０６】
【表１４】
2018519838.tif 000047
【０２０７】
パラフィルムで管をシールして、室温の暗所でオービタルシェーカーによりアジテートする。１８時間後、１００μＬの６Ｍ  ＨＣｌで停止する。ＡＴＡおよびリン酸緩衝液の最終濃度がそれぞれ［Ｅ］１８ｈおよび５０ｍＭとなるように、ブランクに２５０μＬの２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８および５００μＬのＭｉｌｌｉＱ水を充填する。この固定化ＡＴＡリサイクル処理試験時にアセトフェノンに変換されたＭＢＡの量を決定する。再使用可能性の試験を行う。
【０２０８】
結合等温線は、ＭＮＰによるＡＴＡ固定化の基本条件、すなわち、最適ｐＨ、最小ナノ粒子：酵素比、および完全固定化に対する最小接触時間を決定する。ＡＴＡ固定化に関するナノ粒子濃度のスクリーニングを介して、固定化ＡＴＡによりＭＢＡからＡＰへの変換を実証し、固定化に対する最良ナノ粒子濃度を決定する。この最適化ＡＴＡは、工業適合時間スケールの１８時間変換に関して遊離酵素に少なくともマッチし、同程度のＶｍａｘを有し得る。最適化ＡＴＡを見いだしたら、それを取り出して１８時間にわたり５サイクルで活性を損なうことなく再使用する。
【０２０９】
実施例８−磁気固定化ナノ粒子の自動連続フロー製造
例示的な酵素ＨＲＰをＭＮＰクラスター中に磁気固定化するために、機械を作製して使用した。５０％充填率まで９９％超の固定化効率が実証された。固定化ＨＲＰは、阻害濃度のＨ２Ｏ２の存在下で遊離酵素よりも優れた活性を有していた。
【０２１０】
連続フロー酵素固定化を示す超常磁性鉄ナノ粒子（ＮＰ）クラスター中にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を固定するために、機械を作製して使用した。ＨＲＰは、＞９９％の固定化効率を有して２５％および５０％の充填率でＭＮＰクラスターにより封入された。固定化ＨＲＰの活性は、５００ｎｍの吸光度の増加により測定されるキノンイミン色素（４−アミノアンチピレン（４−ＡＡＰ）とフェノールとの複合体）の生成速度により評価した。０．５ｍＭフェノール、０．５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、および２ｎＭ  ＨＲＰの反応混合物を用いて、５０％充填率固定化ＨＲＰは、試験条件下で遊離ＨＲＰよりも５±０．１倍優れた初期反応速度（μＭ形成されたキノンイミン色素、／分間）を達成する。
【０２１１】
フェノール、４−ＡＡＰ、凍結乾燥ＨＲＰ、および緩衝塩はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。Ｈ２Ｏ２（３０％）はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより提供された。ＨＲＰはＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、ストック溶液濃度は１０２ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する４０４ｎｍの吸光度により決定した。他の溶液は全て、同様にＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製した。
【０２１２】
ＨＲＰの固定化：  ＨＲＰおよびＭＮＰは、ＭＮＰクラスター（レベル１）中にＨＲＰを封入するためにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００  Ｍｉｃｒｏ  ＰｕｍｐデュアルポンプＨＰＬＣシステムにより制御された流量の連続フロー内で組み合わせた。固定化酵素は、等体積の８０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰおよび２０または４０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰを用いて、４０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰ当たり１０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ（２５％充填率）および４０μｇ／ｍＬ  ＭＮＰ当たり２０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ（５０％充填率）の最終濃度で、調製した。使用前、ＭＮＰサスペンジョンは、１Ｍ  ＨＣｌおよびＮａＯＨを用いてｐＨ５に設定し、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（ＦＢ−５０５）により４０％の振幅で１分間超音波処理した。両試薬は、０．８３３ｍＬ／ｍｉｎの速度で内径０．７６２ｍｍのステンレス鋼管を介してポンプ操作してＴミキサーで組み合わせ、１．６７ｍＬ／ｍｉｎの組合せ出力とした。試薬がＴミキサーに達した後、出力を内径１．０１６ｍｍのステンレス鋼管に通して貫流させた。ＭＮＰの均一性および分散性を確保するために、コイルの中心に位置するソニケータープローブを備えて冷水中に配置されたステンレス鋼管のコイルにＭＮＰ溶液を通して、４０％の振幅で２秒間のインターバルでパルスのオン・オフを行った。また、ＭＮＰの分散性を維持するためにソニケータープローブに近接してＭＮＰ貯蔵槽を配置した。こうして、２５％および５０％の酵素充填率のそれぞれに対して、レベル１の５つの１ｍＬバッチを遠心分離管内に捕集した。固定化ＨＲＰを８００μｇのマグネタイト粉末（レベル２）上に直接捕集し、次いで、オービタルシェーカーを用いてレベル１およびレベル２を１０分間にわたり十分に混合することにより、連続フローの外側の未結合酵素のさらなる固定化を停止した。永久磁石を用いてレベル２をペレット化し、タンパク質定量のために上澄みを捕集した。次いで、ペレットを１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【０２１３】
固定化酵素の定量：  以上に記載された修正ブラッドフォードアッセイを用いてレベル２上に捕捉された固定化ＨＲＰの量を測定し、レベル１溶液で検出された全タンパク質と比較した。
【０２１４】
ＨＲＰ活性アッセイ：  固定化ＨＲＰの活性は、桃色キノンイミン色素の形成に基づく５００ｎｍの吸光度の増加を用いて決定した（図３）。フェノールと４−アミノアンチピレン（４−ＡＡＰ）との複合体は、１３．７８ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する。反応混合物は、０．５ｍＭフェノール、０．５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、過剰のＨ２Ｏ２（２．５ｍＭ）、および２ｎＭ  ＨＲＰを含有し、オービタルシェーカーでアジテートしながら室温の遠心分離管内で達成した。１〜６０ｍｉｎの接触時間で、１ｃｍに経路長補正するＢｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈプレートリーダーを用いてＵＶ透過性マイクロプレートを読み取って、エンドポイント吸光度読取りを行った。遊離ＨＲＰおよび５０％充填固定化ＨＲＰの活性は、１分当たり形成されたキノンイミン色素のμＭ数に基づく初期反応速度の比較により評価した。
【０２１５】
固定化効率：  ２５％および５０％充填サンプルの両方で酵素の９９％超がＭＮＰに封入されることが、ＨＲＰ濃度のブラッドフォードアッセイにより判明した。図４は、レベル１固定化ＨＲＰとして溶液中で測定されたタンパク質の量およびレベル２固定化ＨＲＰに結合されて溶液から取り出された量を示す。レベル２の酵素の量は、溶液中の全タンパク質および未結合タンパク質の差として計算した。
【０２１６】
固定化ＨＲＰの活性：  レベル２固定化ＨＲＰにより触媒される４−ＡＡＰ：フェノール反応の初期速度は、時間に対するキノンイミン色素濃度のプロットの線形領域の傾きにより決定した（図３）。固定化ＨＲＰは、１．５８±０．０３μＭ／ｍｉｎの初期速度を有していた。０．３１±０．０４μＭ／ｍｉｎの初期速度を有していた遊離ＨＲＰと比較して、固定化ＨＲＰは５倍の初期速度を有していた。ペルオキシダーゼは過酸化水素による基質阻害を受けるが、その感度はナノ粒子中への封入により得られる保護により低減される。
【０２１７】
実施例９：自動ＢＮＣ合成のための超音波処理および流量最適化
マグネタイトナノ粒子（ＭＮＰ）クラスター内へのホースラディッシュペルオキシダーゼの固定化は、連続フローアセンブリーを用いて最適化した。連続フローシステムは、非常に正確な濃度比で酵素と単分散ナノ粒子とを混合した。得られたＢＮＣは、磁性材料上に直接テンプレート化された。アセンブリーシステムは、０．０６２５インチＯＤ×０．０４３インチＩＤの３１６ステンレス鋼管を備えた２つのＨＰＬＣポンプ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｍｐ）を含んでいた。ＡおよびＢのラベル付きポンプは、それぞれ鋼管の個別のセグメント（ＡおよびＢとも称される）を介してＭＮＰおよび酵素を移動させた。それらは、混合チャンバーとして作用する鋼ティー備品により下流で組み合わされた。ＭＮＰの単分散サスペンジョンを達成するために、管Ａは、直径３．１８ｃｍの「超音波処理ループ」として３回コイル巻きされ、超音波水浴内に配置された（Ｂｒａｎｓｏｎ  １８００）。ＭＮＰ−酵素混合を促進するために、ティー備品から下流の管もまた、捕集ポートで終端する７．６ｃｍ「温置ループ」として１０回コイル巻きされた。
【０２１８】
毎日最初のランの前に、３．００ｍＬ／ｍｉｎで３５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを流し、続いて５０ｍＬの脱イオン水を流すことにより、ポンプを清浄化した。次に、５ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液および５ｍＬのＭＮＰ溶液（両方とも所望の濃度では調製した）を個別の貯蔵槽に移した。次いで、ＭＮＰを２５％の振幅で連続的に６０秒間超音波処理した（１／４インチプローブチップを備えた５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ，Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ）。これは約１２〜１４Ｗの超音波処理パワーに対応する。ラン時に４０ｋＨｚの超音波処理が維持されたＢｒａｎｓｏｎ浴中の所定の位置にＭＮＰ管を取り付けた。次いで、空気の取込みを防止するために液体の表面から下方にできる限り離して、２つのポンプのプラスチック吸入管をそれぞれのサンプルリザーバー内にと取り付けた。次いで、両方のポンプを所望の流量（すなわち、０．８３ｍＬ／ｍｉｎの整数倍および整数分の一）に設定し、ポンプＡのポンプ操作を初期化した。ポンプＡ始動の２０秒後、ポンプＢを始動させた。捕集ポートでは、溶出液中のＭＮＰが凝集を停止した時、最初の１ｍＬの溶出液を捕集した。１０個の１ｍＬサンプル画分が得られるまで捕集を継続した。次いで、それに続く試験に備えて５０ｍＬの脱イオン水でポンプをパージした。０．２１（１／４倍）、０．４２（１／２倍）、０．８３（１倍）、１．６６（２倍）、および３．３２（４倍）ｍＬ／ｍｉｎの流量では、この捕集プロトコルに従った。
【０２１９】
各ポンプスピードに対して５個の１ｍｌサンプルを室温で連続的にアジテートし、ＭＮＰが酵素を固定化する過剰の時間を確保した。８個のサンプルを１５，０００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、各遠心分離サンプルの上澄みでブラッドフォードアッセイを行った。
【０２２０】
各試験の残りの２ｍＬを固定化ＨＲＰの活性の測定に使用し、アッセイを行う準備ができるまで２５℃でアジテートし続けた。２５ｍＭの過酸化水素を基質としてアッセイに使用した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水と共に１０ｍＭフェノールおよび１０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）を１０ｍＬの溶液中で組み合わせて反応混合物として使用した。酵素を含有する全てのサンプルを２５ｎＭに希釈し、次いで、反応混合物および過酸化物を反応ウェルに添加した後、２．５ｎＭにさらに希釈した。
【０２２１】
Ｅｐｏｃｈ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ内で進行するＨＲＰ−過酸化物反応を５００ｎｍで走査して、吸光度を１０分間にわたりリアルタイムに決定した。図５は、遊離ＨＲＰと比較して試験された各ポンプスピードに対して１００：１  ＭＮＰ：ＨＲＰ濃度比のＭＮＰ固定化ＨＲＰの初期反応速度を示す。速度は、２．５ｎＭの濃度でＨＲＰを用いて反応の最初の３１５秒間で得られたものである。アッセイ濃度は、２５μｇ／ｍＬ  ＨＲＰおよび２，５００μｇ／ｍＬ  ＭＮＰを含有する元の溶出液を希釈することにより得た。ε＝１３．７８ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数および０．７１７ｃｍの平均経路長を仮定して生成物の形成を計算した。
【０２２２】
ＭＮＰに固定化されたＨＲＰは、ＨＲＰ単独の５〜９倍の酵素活性を呈した（図５）。唯一の例外は３．３２ｍＬ／ｍｉｎサンプルであった。これはおそらくあまりにも急速に溶出させたのでＭＮＰとＨＲＰとが相互作用して所望のクラスターを形成できなかったためであろう。捕集時、水のみが溶出した。０．８３ｍＬ／ｍｉｎのポンプスピードで最も高い活性が達成されたが（遊離ＨＲＰと比較して反応速度が９倍に増加した）、この最適点を基準にしてポンプスピードを増加または減少させると活性が低下したことは、注目に値する。したがって、ポンプスピードは酵素活性に影響を及ぼす。すなわち、流量を多くすると混合乱流が改善されるだけでなく、ＭＮＰ−酵素接触時間が低減される。
【０２２３】
実施例１０：磁気支持体上への自動ニトリラーゼ固定化
材料および方法。ニトリラーゼ（ＭＷ＝４１ｋＤａ、ｐＩ＝８．１を有する１４個の同一のサブユニット）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でバイオマイクロ触媒（ＢＭＣ）を得た。最適化固定化条件は、ニコチン酸の合成に関して遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２２４】
組換えニトリラーゼはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたものであり、３−シアノピラジン、ｏ−フタルジアルデヒド、２−メルカプトエタノール、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、およびエタノールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウム、および水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子および磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されたように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。蛍光強度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダーを用いてＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５ブラックボトム蛍光マイクロプレートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２２５】
凍結乾燥ニトリラーゼを水に溶解させた。ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）ストック溶液（７５ｍＭ）を１００％エタノール中に調製し、氷上に保持するかまたは４℃で貯蔵した。また、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）ストック溶液（７２ｍＭ）は、使用直前に１００％エタノール中に調製した。緩衝ＯＰＡ／２−ＭＥ試薬は、４５０ｍＬの以上の溶液を９．１ｍＬの２００ｍＭ  ｐＨ９．０  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝液に添加することにより調製した。緩衝試薬は使用直前まで氷上に保持され、その時点で室温（２１℃）に平衡化可能である。
【０２２６】
固定化間の一貫性を向上させるために、および遊離酵素とＭＮＰとの混合を向上させて制御されたＢＮＣ直径を有するより均一な生成物を達成するために、ＢＮＣ調製用の連続フローシステムを使用した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４”のステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、７ポートＰＥＥＫマニホールドインラインミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集可能にした。
【０２２７】
遊離ニトリラーゼストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ８．７５に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ニトリラーゼ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのニトリラーゼストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ニトリラーゼＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを５９４μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ニトリラーゼＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ニトリラーゼの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２２８】
ニトリラーゼ反応および活性決定。ニトリラーゼ反応および活性定量法は両方とも、Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７（３）：２８９−２９３（２００３）に記載される方法の修正に基づく。簡潔に述べると、ニトリラーゼは、３−シアノピリジンをニコチン酸に加水分解してアンモニアを遊離する反応を触媒した。ニトリラーゼ反応は、５０ｍＭ  ３−シアノピリジン、８７．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ｐＨ９．０、および２１８ｎＭ遊離または固定化ニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含有する１ｍＬの全反応体積で５０℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管中で２０時間行った。等体積のニトリラーゼ反応ミックスに１３．３５μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌを添加することにより反応を停止した。固定化ＮＩＴを磁気的にピペッティングし、上澄みをＨＣｌで処理した。
【０２２９】
イソインドール蛍光色素中へのアンモニアの取込みを検出することにより蛍光測定法で酵素活性を測定した。緩衝試薬（６２４μＬ）を上澄みに添加し、室温で穏やかに２０分間混合した。温置後、１５０μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌをこの溶液に添加し、蛍光シグナルを増加させた。最高強度のウェルを基準にしてゲインを自動調整し、４１２ｎｍ励起および４６７ｎｍ発光を用いて蛍光強度を測定した。各蛍光読取りは、内部線形ＮＨ４Ｃｌ標準曲線を含んでいた（Ｒ２＞０．９９）。ニトリラーゼ活性の単位（Ｕ）は、８７．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ（ｐＨ９．０）中、５０℃で１分当たり１μｍｏｌのＮＨ３遊離するものとして定義された。
【０２３０】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ニトリラーゼ標準曲線を含めて決定した（Ｒ２＞０．９９）。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１−２）：２４８−２５４（１９７６）。
【０２３１】
結果
対照は、非触媒アンモニア遊離がないことを示した。自動および手動で調製されたニトリラーゼＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への１％の有効充填率に対して＞９９％の固定化収率が得られた（表１５）。自動ニトリラーゼＢＭＣの活性は遊離ニトリラーゼと比べて概ね保持されたが（＞９９％）、手動ニトリラーゼＢＭＣはより低い活性（約３８％）を有していた。
【０２３２】
【表１５】
2018519838.tif 000048
【０２３３】
実施例１１：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのトランスアミナーゼ固定化
ω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８、ＭＷ＝１９５ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミンからのアセトフェノンの合成に関して遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２３４】
材料および装置。組換えω−トランスアミナーゼ（ωＴＡ）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたマイコバクテリウム・バンバアレニ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉ）由来のものであった。（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）、ナトリウムピルベート、およびアセトフェノン（ＡＰ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から得た。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。
【０２３５】
試薬。凍結乾燥ωＴＡを水に溶解させた。１２．７８μＬのＭＢＡを１００μＬのＤＭＳＯに溶解させることにより（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）ストック溶液を調製し、次いで、１０ｍＭの最終濃度になるように全体積を１０ｍＬにした。ナトリウムピルベート粉末を水に溶解させることによりナトリウムピルベートの４５ｍＭストックを調製した。１２μＬのＡＰを水に溶解させることによりアセトフェノンストック溶液を調製した。ストック溶液は全て、氷上に保持した。アッセイに使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）に平衡化させた。
【０２３６】
自動ＢＮＣアセンブリー。固定化間の一貫性を向上させるために、および遊離酵素とＭＮＰとの混合を向上させて制御されたＢＮＣ直径を有するより均一な生成物を達成するために、ＢＮＣ調製用の連続フローシステムを構築した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理を提供した。ティーの前で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、ＢＮＣを捕集するために第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置した。
【０２３７】
固定化。遊離ωＴＡストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ７．１５に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ωＴＡ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのωＴＡストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ωＴＡ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを５９４μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ωＴＡＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ωＴＡの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２３８】
ω−トランスアミナーゼ活性アッセイ。ωＴＡ活性定量法は、以上で引用したＳｃｈａｔｚｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）に記載される方法に基づくものであったが、マイクロプレートに適合化された。簡潔に述べると、ωＴＡは、ＭＢＡ（アミンドナー）からピルベートにアミノ基を転移してそれぞれＡＰおよびアラニンを形成する反応を触媒した。酵素活性は、以上で引用したＡＰ  Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ（２０１２）の形成に基づく２４５ｎｍの吸光度の増加により測定した。ωＴＡ反応は、５０ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１ｍＭ  ＭＢＡ、１ｍＭピルベート、および３４９ｎＭ  ω−トランスアミナーゼを含有する１ｍＬの全反応体積で、２ｍＬのマイクロ遠心分離管中、２１℃で１時間行った。固定化ωＴＡを磁気的にペレット化し、その上澄みの吸光度を読み取った。０〜０．１ｍＭ  ＡＰおよび０〜０．１ｍＭアラニンを含む線形標準曲線を用いてＡＰを定量した（Ｒ２＞０．９９）。ω−トランスアミナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中、２１℃で１分当たり１μｍｏｌのＡＰを生成するものとして定義された。
【０２３９】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ωＴＡ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２４０】
結果
対照は、非触媒アセトフェノン形成がないことを示した。自動および手動で調製されたωＴＡ  ＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への１％の有効充填率に対して＞９９％の固定化収率が得られた（表１５）。自動および手動ωＴＡ  ＢＭＣの活性は、遊離ニトリラーゼと比べて概ね保持された（＞９９％）。
【０２４１】
実施例１２：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのカルボニックアンヒドラーゼ固定化
ウシカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＮ）（ＭＷ＝３０ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて２０％充填率で形成し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して９％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、二酸化炭素へのビカーボネートの脱水に関して遊離酵素と比べて９５±８％保持された活性をもたらした。
【０２４２】
材料および装置。ウシ赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＮ）、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、および８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホネート（ピラニン）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウム、および水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットに記載されるように合成し、さらに磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格も、以上に記載したように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。蛍光強度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作される試薬注入システムを備えたＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダーを用いてＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５ブラックボトム蛍光マイクロプレートで測定した。
【数５】
2018519838.tif 000049
プローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２４３】
試薬。凍結乾燥ＣＡＮを水に溶解させた。試薬Ａは、２ｍＭ  ＫＨＣＯ３および０．５ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８）を含有していた。試薬Ｂは、５００ｐＭカルボニックアンヒドラーゼ、１００ｎＭピラニン、および０．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ６を含有していた。
【０２４４】
自動ＢＮＣアセンブリー。連続フローシステムを用いてＢＮＣを調製した。それは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集可能にした。
【０２４５】
固定化。遊離ＣＡＮストック（２５０μｇ／ｍＬ）はｐＨ６に調整し、５ｍＬの１２５０μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを１１に調整した。遊離ＣＡＮ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＣＡＮストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＣＡＮ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを６２．５μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＣＡＮ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ωＴＡの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２４６】
カルボニックアンヒドラーゼ活性アッセイ：  ＣＡＮは、以下のように炭酸の脱水を可逆的に触媒する。
ＨＣＯ３−  ＋  Ｈ＋  ⇔  ＣＯ２  ＋  Ｈ２Ｏ
【０２４７】
標準的カルボニックアンヒドラーゼ活性アッセイはＷｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ法である。Ｗｉｌｂｕｒ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６：１４７−１５４（１９４８）。緩衝ＣＯ２飽和溶液中で８．３から６．３へのｐＨ低下速度を測定する。これは二酸化炭素からのビカーボネートの形成により引き起こされる。Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５２（１）：１９０−１９７（１９９７）にすでに記載されるように代替的蛍光測定ｐＨベースアッセイを使用した。簡潔に述べると、蛍光ｐＨ指示薬としてピラニンを使用した。ビカーボネートの脱水に基づくｐＨの増加は、蛍光強度の増加となって現れる。等体積の試薬ＡおよびＢを混合することにより反応を開始させた。サンプル注入システムを用いて試薬Ａをマイクロプレートの試薬Ｂに添加し、直ちに蛍光読取りを開始した。反応速度が速いので、サンプル読取りは全て、一度に１ウェルずつトリプリケートで行った。蛍光は、ｐＨ感受性（Ｆｓ）およびｐＨ非感受性（Ｆｉｓ）の励起波長（それぞれ４６６ｎｍおよび４１３ｎｍ）を用いて５１２ｎｍの発光波長で測定した。各プレートに含まれる緩衝標準（ｐＨ６〜１０）に対してＦｓ／Ｆｉｓ対ｐＨの線形検量線を用いて蛍光強度をｐＨに変換した。Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  ＭｃＣａｒｔｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（２）：７３１−７３７（１９９４）。ＣＡＮ活性の１単位（Ｕ）は、以上に記載される条件下で測定の最初の１０秒間における１秒当たりのｐＨ変化として定義された。
【０２４８】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＣＡＮ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２４９】
結果
対照は、非触媒ｐＨ変化がないことを示した。ＣＡＮ  ＢＮＣを自動および手動でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への９％の有効充填率に対して＞９５％の固定化収率が得られた（表１５）。カルボニックアンヒドラーゼのハイブリッド骨格ＢＭＣおよびマグネタイト粉末ＢＭＣの活性は、遊離カルボニックアンヒドラーゼと比べて概ね保持された（＞９５％）。
【０２５０】
実施例１３：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのカタラーゼ固定化
カタラーゼ（ＭＷ＝２４０ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて３０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して０．８３％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２５１】
材料および装置。ウシ肝臓カタラーゼ（ＣＡＴ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。
【数６】
2018519838.tif 000050
プローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２５２】
試薬。凍結乾燥ＣＡＴを水に溶解させ、ウシ血清アルブミン標準を用いてブラッドフォード法により定量した。ストック溶液は全て、氷上に保持した。アッセイに使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）に平衡化させた。
【０２５３】
自動ＢＮＣアセンブリー。連続フローシステムを用いてＢＮＣを調製した。システムは、２つのシリンジポンプを含み、それぞれ、遊離酵素または超音波処理ナノ粒子のリザーバーとして機能する６０ｍＬのシリンジを有していた。酵素およびＭＮＰは、内径０．０４インチのステンレス鋼管内を貫流してステンレス鋼ミキシングティーで合流する。ティーの前で、ＭＮＰラインをコイル巻きして水中に浸漬させた。このコイルの中心に超音波プローブを配置し、ＭＮＰを管に通して流動させながら４０％の振幅でプローブをアクティブにした。このコイル／ソニケーター構成はインライン超音波処理の目的に役立った。ティーの後で、インライン７ポートＰＥＥＫマニホールドミキサーによりフローを６チャネルにスプリットした。これらのチャネルのそれぞれは第２のマニホールドに供給され、そこで単一出力となるように組み合わされた。最後に、第２のマニホールドの後に追加の長さの管を配置してＢＮＣの捕集を可能にした。
【０２５４】
固定化。遊離ＣＡＴストック（３００μｇ／ｍＬ）はｐＨ７に調整し、５ｍＬの１０００μｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ＣＡＴ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＣＡＴストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＣＡＴ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを７２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＣＡＴ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＣＡＴの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２５５】
カタラーゼ活性アッセイ。ＣＡＴは、水および酸素への過酸化水素の分解を触媒する。過酸化物の減少に基づく２４０ｎｍの吸光度の減少により酵素活性を測定した  Ｌｉ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌｈｏｒｎ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（４）：１８５−１８７（２００７）。ＣＡＴ反応は、１００ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および５ｎＭカタラーゼを含有する１ｍＬの全反応体積で、２ｍＬのマイクロ遠心分離管中、２１℃で２分間行った。固定化ＣＡＴを磁気的にペレット化し、その上澄みの吸光度を読み取った。１０〜１００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む線形標準曲線を用いて過酸化水素を定量した（Ｒ２＞０．９９）。カタラーゼ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中、２１℃で１分当たり１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を分解するものとして定義された。
【０２５６】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＣＡＴ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２５７】
結果
対照は、Ｈ２Ｏ２の非触媒分解がないことを示した。自動で調製されたＣＡＴ  ＢＮＣをマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化したところ、ＢＭＣ上への０．７９％の有効充填率に対して＞７９％の固定化収率が得られた（表１５）。手動で調製されたＣＡＴ  ＢＮＣを同一のタイプの骨格上に固定化したところ、７０％の固定化収率および０．７％の有効充填率が得られた。ＣＡＴ  ＢＭＣの活性は、遊離カタラーゼと比べて概ね保持され、自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣでそれぞれ９６％および７８％の残存活性であった。
【０２５８】
実施例１４：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのグルコースイソメラーゼ固定化
ＤｕＰｏｎｔ製のＧｅｎｓｗｅｅｔ（商標）は可溶性ＧＩＳである。その活性は、フルクトースからグルコースへの変換を用いて評価した。グルコースイソメラーゼ（ＭＷ＝１７３ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて８０％充填率で調製し、次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して８．１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞１２１％保持された活性をもたらした。
【０２５９】
材料および装置。可溶性グルコースイソメラーゼ（ＧＩＳ）のＧｅｎｓｗｅｅｔ（商標）は、ＤｕＰｏｎｔ（Ｃｅｄａｒ  Ｒａｐｉｄｓ，ＩＡ）により提供された。Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）由来のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、フェノール、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）、５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末、Ｄ−（＋）−フルクトースおよびＤ−（＋）−グルコースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。硫酸マグネシウム、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、以上に記載したようにＺＹＭｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）（ＰＣＴ１および２）でインハウスで合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべて、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであった。ＰＥＥＫおよびステンレス鋼備品は、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２６０】
試薬。フルクトースストック溶液（５Ｍ）は、メスフラスコで定量的に調製した。フェノール（１０ｍＭ）、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ、１０ｍＭ）、ｐＨ７．４  ＰＢＳ（５００ｍＭ）、グルコース（１００ｍＭ）、および硫酸マグネシウム（１Ｍ）は、調製して４℃で貯蔵した。使用前、試薬（２１℃）を室温に平衡化させた。ＧＩＳストックは溶液形態にあり、一方、ＨＲＰおよびＧＯＸの溶液は凍結乾燥粉末から調製した。
【０２６１】
グルコースイソメラーゼ反応および活性決定。ＧＩＳイソメラーゼ活性はグルコースレポーティング反応を用いて決定した。一次反応（フルクトースからグルコースへのＧＩＳ触媒異性化）は、３９０ｍＭフルクトース、５０ｍＭ  ｐＨ７．８  ＰＢＳ、および１．２７〜１．４５μＭ  ＧＩＳを含有する１ｍＬの反応体積で、６５℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管で行った。反応を３０分間行い、ローテーター上で穏やかに混合し、５０μＬ  ０．１Ｍ  ＨＣｌで停止した。ＧＩＳ  ＢＭＣは磁気的にペレット化した。
【０２６２】
二次レポーター反応は、グルコース濃度と、フェノールラジカルと４−ＡＡＰとの複合体化から形成される比色指標と、ＨＲＰ酸化活性により触媒されるフェノールラジカルの形成と、を相関付けるために使用した。簡潔に述べると、レポーター反応は、０．２５ｍＭフェノール、０．２５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、５０ｍＭ  ｐＨ７．４  ＰＢＳ、３０ｎＭ  ＨＲＰ、３０ｎＭ  ＧＯＸ、および一次反応の上澄みを１００倍希釈した２５μＬを含有する２５０μＬの全体積で、マイクロプレート中、室温で行った。レポーター反応は３０分間行った。グルコース濃度は、希釈一次反応上澄みの代わりに２５μＬのグルコース標準（０．１２５〜１．２５  ｍＭ）を用いて色素形成に基づく吸光度とグルコース濃度との線形回帰（Ｒ２＞０．９９）により計算した。ＧＩＳ活性の１単位は、６５℃の３０ｍｉｎ温置で１ｍｉｎ当たりのフルクトースからグルコースへの１μｍｏｌ異性化として定義された。
【０２６３】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＧＩＳ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２６４】
結果
対照は、反応条件下で形成される検出可能な非触媒グルコースがないことを示した。自動で調製されたＧＩＳ  ＢＮＣをＢＭＣ上への８．１％の有効充填率でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化した（表１５）。手動で調製されたＧＩＳ  ＢＮＣは、９．６％の有効充填率で同一の骨格上に固定化した。手動で固定化されたＧＩＳ  ＢＭＣの活性は、遊離ＧＩＳと比べて低減し、６５％の残存活性であった。自動で固定化されたＧＩＳ  ＢＭＣは、活性の増加を示し、１２１％の残存活性であった。
【０２６５】
実施例１５：バイオ触媒作用のための磁気支持体上へのグルタミンシンテターゼ固定化
グルタミンシンテターゼ（ＭＷ＝５８８ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、自動ＢＮＣアセンブリーシステムを用いて１６％充填率で調製した。次いで、微細マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化して１％の全充填率でＢＭＣを得た。最適化固定化条件は、遊離酵素と比べて＞９９％保持された活性をもたらした。
【０２６６】
材料および装置。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のグルタミンシンテターゼ（ＧｌｕＳ）、５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末、モノナトリウムグルタメート、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、ホスホ（エノール）ピルビン酸（ＰＥＰ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドジナトリウム水和物（ＮＡＤＨ）、およびウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ（ｐＫ／ＬＤＨ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マクロ多孔性マグネタイトナノ粒子および磁性体は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されるように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。１／８インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ミキシングステンレス鋼ティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２６７】
試薬。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１  ＰＢＳ、２５０ｍＭ）、グルタメート（３Ｍ）、ＡＴＰ（９０ｍＭ）、ＰＥＰ（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１Ｍ）、塩化カリウム（５００ｍＭ）、塩化アンモニウム（１Ｍ）、ＮＡＤＨ（５０ｍＭ）、およびＰＫ／ＬＤＨ（６０００／９００  ＰＫ／ＬＤＨ活性単位（Ｕ）、１単位ＰＫは３７℃、ｐＨ７．６で１分当たり１μｍｏｌのＰＥＰをピルベートに変換し、１単位のＬＤＨは３７℃、ｐＨ７．５で１分当たり１μｍｏｌのピルベートをＬ−ラクテートに変換する）ストックは、調製して４℃で貯蔵した。使用前、試薬（２１℃）を室温に平衡化させた。ＧｌｕＳストックは凍結乾燥粉末から調製した。
【０２６８】
固定化。遊離ＧｌｕＳストック（２００μｇ／ｍＬ）はｐＨ７．１に調整し、５ｍＬの１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを３に調整した。遊離ＧｌｕＳ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＧｌｕＳストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＧｌｕＳ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを４３８μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＧｌｕＳ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＧｌｕＳの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２６９】
グルタミンシンテターゼ反応および活性決定。ＧｌｕＳ活性は、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）レポーティング反応を用いて決定した。ＧｌｕＳは、グルタメートおよびアンモニウムからのＡＴＰ触媒Ｌ−グルタミン合成により活性化と。反応はまたＡＤＰおよびホスフェートを生成した。ＡＴＰはＰＥＰをピルベートに変換するＰＫ触媒反応で再生された。最後に、ピルベートは、補因子としてＮＡＤＨを用いてＬＤＨによりＬ−ラクテートに変換され、ＮＡＤを生じる。反応進行はＮＡＤＨ濃度の減少に基づく３４０ｎｍの吸光度の減少によりモニターした。反応は、３０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．１、１００ｍＭグルタメート、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＰＥＰ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、３００μＭ  ＮＡＤＨ、８／１２０  Ｕ  ＰＫ／ＬＤＨ、８１．７ｎＭ  ＧｌｕＳを含有する１ｍＬの反応体積で、３７℃の２ｍＬマイクロ遠心分離管中で行った。反応を６０分間行い、ローテーター上で穏やかに混合し、５０μＬ  ０．１Ｍ  ＨＣｌで停止した。ＧｌｕＳ  ＢＭＣは磁気的にペレットした。ＮＡＤＨ濃度は、ＮＡＤＨ標準（３〜３００μＭ）の吸光度対濃度の線形回帰により計算した（Ｒ２＞０．９９）。ＮＡＤＨ消費は、化学量論的にＬ−グルタミンの形成に相関付けた。ＧｌｕＳ活性の１単位は、３７℃の６０ｍｉｎ温置で１ｍｉｎ当たり１μｍｏｌのＬ−グルタミンが合成されるものとして定義された。
【０２７０】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＧｌｕＳ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２７１】
結果
対照は、反応条件下で形成される検出可能な非触媒グルコースがないことを示した。自動で調製されたＧｌｕＳ  ＢＮＣをＢＭＣ上への１％の有効充填率でマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上に固定化した（表１５）。手動で調製されたＧｌｕＳ  ＢＮＣは、０．９４％の有効充填率で同一の骨格上に固定化した。手動で自動で固定化ＧｌｕＳ  ＢＭＣの活性は遊離酵素（＞９９％）のものと等価であった。
【０２７２】
実施例１６磁気支持体上へのホースラディッシュペルオキシダーゼ固定化
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＭＷ＝４４ｋＤａ）とマグネタイトナノ粒子とを含有するＢＮＣは、４０％の公称充填率で調製し、次いで、純粋マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）上にテンプレート化して、約５．６％有効充填率のＢＭＣを形成した。最適化固定化条件は、フェノールの酸化に関して遊離酵素と比べて活性が３倍に増加した。
【０２７３】
材料および装置。Ａ．ルスティカーナ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に由来するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェノール、および４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入された。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウム、およびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）にすでに記載されるように合成した。ストック溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍの水で作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作されるＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダーを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５ＵＶ透過性マイクロプレートでトリプリケートで測定した。
【数７】
2018519838.tif 000051
インチプローブを備えたソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。自動ＢＮＣアセンブラーは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製の２つの結合されたＮＥ−１０００シリンジポンプを使用した。ステンレス鋼管、ステンレス鋼ミキシングティー、および２つのＰＥＥＫ  ７ポートラジアルマニホールドすべては、内径０．０４ｉｎおよび外径０．１２５ｉｎであり、必要なＰＥＥＫ備品またはステンレス鋼備品と共にＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。
【０２７４】
試薬。凍結乾燥ＨＲＰを水に溶解させてストック溶液を形成した。新鮮なＨＲＰ試薬は使用直前に次のように調製した。水中の５００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、ｐＨ７．４、１０ｍＭフェノール、および１０ｍＭ  ４−ＡＡＰ。この溶液は４℃で貯蔵し、使用直前まで暗所で保存し、その時点で室温に平衡化させた。
【０２７５】
固定化。遊離ＨＲＰストック（５００μｇ／ｍＬ）はｐＨ６に調整し、５ｍＬの１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＮＰストックは４０％の振幅で１分間超音波処理し、水浴を用いて室温に平衡化し、次いで、そのｐＨを１１に調整した。遊離ＨＲＰ（２ｍＬ）を酵素ポンプシリンジに充填し、等体積のＭＮＰをＭＮＰポンプに充填した。Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ＰｒｏＶ１ポンプ制御ソフトウェアを用いて両方のポンプを同時に始動させ、それぞれ３０ｍＬ／ｍｉｎに設定して６０ｍＬ／ｍｉｎの有効流量とした。追加の固定化は、１０、２０、および４０ｍＬ／ｍｉｎ有効流量を用いて行った。１ｍＬの超音波処理ＭＮＰストックを１ｍＬのＨＲＰストックに添加してからピペット混合を１０回行うことにより、手動集合ＨＲＰ  ＢＮＣを調製した。１ｍＬの自動集合ＢＮＣまたは手動集合ＢＮＣを３１．３μＬの２０ｍｇ／ｍＬマグネタイト粉末に添加してからピペット混合を１０回行うことにより、ＨＲＰ  ＢＭＣを調製した。これらのＢＭＣをローテーター上で穏やかに１時間混合してから磁気的にピペッティングした。それらの上澄みを固定化ＨＲＰの定量のために保存した。これらのＢＭＣはそれぞれ自動ＢＭＣおよび手動ＢＭＣと呼ばれる。
【０２７６】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ活性アッセイ。ＨＲＰは、フェノールラジカルへのフェノールの酸化を不可逆的に触媒する。フェノール酸化は、フェノールラジカルと４−ＡＡＰとで構成される着色複合体の形成によりモニターされる。得られる生成物は、λ＝５００ｎｍに有意な吸光度を有する明るい帯桃赤色のキノンイミン色素である。Ｅｍｅｒｓｏｎ−Ｔｒｉｎｄｅｒ法のバイオ触媒方式である標準的ホースラディッシュ活性アッセイは、形成されるフェノール系色素生成物に基づくλ＝５００ｎｍの吸光度の増加率と酵素活性とを相関付ける。Ｗｕｋａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．４８ｔｈ  Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，４２３−４３０（１９９３）。固定化ＨＲＰおよび遊離ＨＲＰの両方のＨＲＰバッチ反応は、最初に反応を開始するために５０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．２５ｍＭフェノール、０．２５ｍＭ  ４−ＡＡＰ、１５ｎＭ  ＨＲＰ、および１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有する１ｍＬの全反応体積を用いて、２１℃の２ｍＬ遠心分離管中で３０分間行った。バッチ反応は穏やかにアジテートした。固定化酵素は磁気的にペレット化した。上澄みの吸光度は、各サンプルに対して２５０μＬのトリプリケートを用いてマイクロプレート中で読み取った。バックグラウンド吸光度を減算するために、対応する量の遊離酵素を含有するブランクも調製した。製品色素は５００ｎｍでの（１２ｍＭ−１ｃｍ−１）吸光係数を用いて定量された。ＨＲＰ活性の１単位（Ｕ）は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２１℃で１分当たり１ｍｍｏｌキノンイミン色素が形成されるものとして定義された。
【０２７７】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有率を線形ＨＲＰ標準曲線を含めてブラッドフォード法を用いて決定した（Ｒ２＞０．９９）。
【０２７８】
結果。対照は、非触媒色素形成がないことを示した。ＨＲＰ  ＢＮＣは、マグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）骨格上にテンプレート化した。得られたＢＭＣは、手動および自動固定化ＨＲＰ  ＢＭＣの両方で約５．６％の有効充填率であった（表１５）。しかしながら、活性は流量によって変化した。自動固定化の流量における遊離酵素基準の活性は、次の通りである。１０ｍＬ／ｍｉｎは１００％の活性を有し、２０ｍＬ／ｍｉｎは１２０％の活性を有し、４０ｍＬ／ｍｉｎは１６０％の活性を有し、６０ｍＬ／ｍｉｎは手動固定化ＢＭＣと同様に３２０％の活性を有していた。こうした活性の向上はＢＮＣ中への事前ＨＲＰ固定化と一致する（図６）。
【０２７９】
本明細書に開示され、または言及される全ての刊行物および特許文献は、全体が参照により援用される。上記の説明は、例示および説明の目的で示されているに過ぎない。本明細書は、本発明を、開示される正確な形態に限定することは意図されていない。本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によって規定されることが意図される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．酵素容器と、
ｂ．磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）容器と、
ｃ．酵素ポンプと、
ｄ．ＭＮＰポンプと、
ｅ．ＭＮＰディスラプターと、
ｆ．ＢＮＣミキサーと、
を含む、バイオナノ触媒（ＢＮＣ）の自動製造機械であって、
前記酵素容器が酵素調製物を保持するように操作可能であり、前記酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒し、前記ＭＮＰ容器がＭＮＰ調製物を保持するように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプが前記ＭＮＰ調製物を前記ＭＮＰディスラプターに送るように操作可能であり、前記ＭＮＰポンプが複数の破砕ＭＮＰを前記ＭＮＰディスラプターから前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、前記酵素ポンプが酵素調製物を前記ＢＮＣミキサーに送るように操作可能であり、前記ミキサーが前記破砕ＭＮＰと酵素調製物とを混合して前記ＢＮＣを形成するように操作可能である、機械。
【請求項２】
前記ＭＮＰディスラプターがソニケーターである、請求項１に記載の機械。
【請求項３】
前記ソニケーターがソニケーターコイルと超音波処理容器とをさらに含み、前記ソニケーターコイルが、前記超音波処理容器内で前記ＭＮＰを超音波処理するように操作可能である、請求項２に記載の機械。
【請求項４】
前記ソニケーターがインラインソニケーターである、請求項２に記載の機械。
【請求項５】
前記ソニケーターを冷却するように操作可能な冷却システムをさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の機械。
【請求項６】
前記冷却システムが水冷システムである、請求項５に記載の機械。
【請求項７】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを機械的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項８】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを磁気的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項９】
前記ＭＮＰディスラプターが前記ＭＮＰを熱的に破砕するように操作可能である、請求項１に記載の機械。
【請求項１０】
前記ＢＮＣミキサーがミキシングティーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１１】
前記ＢＮＣミキサーがミキシングコイルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１２】
前記酵素ポンプが機械力または重力により前記酵素調製物を前記ＢＮＣミキサーに送る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１３】
前記ＭＮＰポンプが機械力または重力により前記ＭＮＰ調製物を前記ＭＮＰディスラプターに送る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１４】
骨格材容器内で磁気骨格材調製物と前記ＢＮＣとを混合してレベル２集合体中のＢＮＣを製造するように操作可能な磁気骨格材容器をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１５】
前記磁気骨格材容器が前記ＢＮＣと前記骨格材とを機械的に混合するように操作可能である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１６】
前記磁気骨格材容器が前記ＢＮＣと前記骨格材とを磁気的に混合するように操作可能である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１７】
前記磁気レベル２集合体が磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である、請求項１４に記載の機械。
【請求項１８】
安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣを集合させるためのテンプレーターをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の機械。
【請求項１９】
前記レベル２集合体に磁気がある、請求項１８に記載の機械。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の前記機械を用いて前記ＭＮＰ調製物と前記酵素調製物とを組み合わせる工程を含む、ＢＮＣの製造方法であって、前記酵素調製物が、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、イソメラーゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、方法。
【請求項２１】
前記ＢＮＣが約１ｍｌ未満の量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＮＣが約１ｍｌ〜１０ｍｌの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＢＮＣが約１０ｍｌ〜１００ｍｌの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＣが約１００ｍｌ〜１リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＮＣが約１リットル〜１０リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＢＮＣが約１０リットル〜１００リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢＮＣが約１００リットル〜１０００リットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＢＮＣが約１キロリットル〜１０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＮＣが約１０キロリットル〜２０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＢＮＣが約２０キロリットル〜５０キロリットルの量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＢＮＣが約５０キロリットル超の量で製造される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
安定化レベル２集合体として前記ＢＮＣをテンプレート化する工程をさらに含む、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）と、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ニトリラーゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシニトリラーゼ、およびイソメラーゼからなる群から選択される酵素と、を含む自己集合バイオナノ触媒（ＢＮＣ）組成物であって、前記酵素調製物が拡散性基質から拡散性生成物への変換を触媒する、ＢＮＣ組成物。
【請求項３４】
前記酵素が約５〜２，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度であり、かつ前記ＭＮＰが約５０〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３３に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３５】
前記酵素が約５〜１５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３６】
前記酵素が約５〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３５に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３７】
前記酵素が約５〜５，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３６に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３８】
前記酵素が約１００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項３９】
前記ＭＮＰが約５００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３８に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４０】
前記ＭＮＰが約１０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３９に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４１】
前記ＭＮＰが約５０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項４０に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４２】
前記ＭＮＰが約１０，０００〜２０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項４１に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４３】
前記ＭＮＰが約５０００〜１０，０００μｇ／ｍｌ全溶液の濃度である、請求項３４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４４】
安定化レベル２集合体をさらに含む、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４５】
前記レベル２集合体に磁気がある、請求項４４に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４６】
前記磁気レベル２集合体が磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である、請求項４５に記載のＢＮＣ組成物。
【請求項４７】
前記ＢＮＣと前記拡散性基質とを接触させる工程と、前記拡散性生成物を捕集する工程と、を含む、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のＢＮＣ組成物の使用方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2018519838.tif 000052
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
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【国際調査報告】
2018519838.tif 000054
2018519838.tif 000055