(57)【要約】  本開示は、対象において腹膜癌を治療するための組成物及び方法を提供する。該方法は、キメラＴ細胞受容体タンパク質を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を投与することを含む。該キメラＴ細胞受容体タンパク質は、抗体の腫瘍関連抗原結合断片に融合されたＴ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、または腫瘍細胞表面タンパク質に特異的に結合する天然に存在するリガンドに融合されたＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含み得る。本明細書に開示した組成物及び方法は、例えば、腫瘍組織量、腹水、腹膜ムチン、または血清腫瘍マーカーレベルを低減させるのに治療上有効である。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腹膜癌を治療する方法であって、
前記対象の腹腔内に、キメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質またはキメラリガンドＴ細胞受容体タンパク質を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の実質的に純粋な集団を含む組成物を注入することであって、前記キメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質またはキメラリガンドＴ細胞受容体タンパク質が、悪性細胞に発現した抗原に結合する、前記注入することを含む、方法。
【請求項２】
前記悪性細胞が、前記腹腔内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記悪性細胞が、前記腹腔の外側に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２の治療剤を、前記対象の腹腔内に注入することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の治療剤を前記注入することが、前記遺伝子操作されたＴ細胞を含む前記組成物の前記注入の前、前記注入の間、または前記注入の後に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の治療剤が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＴＡＴ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ１０、またはＴＧＦβの活性の阻害剤である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、前記対象の腹腔内に、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回注入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象の腹腔内に前記組成物を前記注入することが、１０６個〜１０１１個の遺伝子操作されたＴ細胞を注入することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を前記注入することが、腹膜腫瘍の数、腹膜腫瘍のサイズ、腹水、腹膜ムチン、及び血清腫瘍マーカーレベルのうちの少なくとも１つの減少をもたらす、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／１９３，２１７号、及び２０１６年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／２９８，９８０号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の参照
配列表は、２０１６年７月１３日に作成された、「０９６２０１０１２５ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１３，９５７バイト）という名称のテキストファイルの形式で、ＥＦＳを通して電子的に提出されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本明細書に記載の主題は、Ｔ細胞であって、その表面に、腫瘍抗原を結合させ、かつＴ細胞活性を活性化させる受容体タンパク質を発現するように操作された、該Ｔ細胞の設計及び使用に関する。方法は、腹膜腔における腫瘍細胞の増殖及び／または生存を阻害するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の腹腔内投与を含む。
【背景技術】
【０００４】
腹膜偽粘液腫（ＰＭＰ）及び腹膜癌腫症（ＰＣ）は、世界で毎年百万人あたり１人〜２人の推定罹患率を有するまれな疾患である。初発時に壊滅的な影響を伴っている全大腸癌患者の１５％がＰＣを発症している（非特許文献１）。これらの患者は予後が極めて不良であり、進行性腸閉塞を含めた、疾患の種々の合併症を患う。至適な治療には、温熱腹腔内化学療法と併用した腫瘍縮小手術（ＣＲＳ−ＨＩＰＥＣ）があり、これは、限定された疾病負荷を持つごく限られた患者に使用され、ある程度の効果をもたらしてきた。ＣＲＳ−ＨＩＰＥＣ中に、肉眼で見える全ての腹腔内腫瘍を減量し、顕微鏡的残存病変を局所送達化学療法で治療する。ＣＲＳ−ＨＩＰＥＣは、２．５ｍｍよりも大きい任意の腫瘍結節を除去するＣＲＳの後に、腫瘍組織量が少ない場合に最も効果的である。結果は腫瘍悪性度に依存し、低悪性度疾患に対しては６３％〜１００％、高悪性度疾患に対しては０％〜６５％の５年生存率となる（非特許文献２）。無作為化対照試験により、大腸癌ＰＣ患者に対するＣＲＳ−ＨＩＰＥＣが、全身化学療法に比べて生存時間の有意な改善をもたらすことが示された（非特許文献３、非特許文献４）。残念なことに、ほとんどのＰＣ患者はＣＲＳ−ＨＩＰＥＣの対象にはならず、最終的に進行し、病死することになる（非特許文献１；非特許文献５）。たとえそうであっても、ＰＣに対してＣＲＳ−ＨＩＰＥＣを用いた結果は、局所送達治療法が、この未だ対処されていない高い臨床的必要性に取り組むための有望なアプローチであることを示唆するものである。
【０００５】
進行性固形腫瘍に対する免疫療法は、近年多くの注目を集めている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。数種類の免疫療法があり、ワクチン、抗体、及び免疫細胞注入が含まれる。固形腫瘍に対する細胞免疫療法は、概してキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の適用により進歩してきた。ＣＡＲ−Ｔは、ほとんどどの患者に対しても作製でき、また主要組織適合性複合体の型により制限されないため（非特許文献１０）、一つにはその適用範囲が広いということに基づき特に関心が持たれている。
【０００６】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とするＣＡＲ−Ｔが、近年第Ｉ相の転移の肝免疫療法（ＨＩＴＭ）臨床試験（ＮＣＴ０１３７３０４７、ＮＣＴ０２４１６４６６）で評価され、安全性、及びこれらの細胞の大腸癌ＬＭに対する臨床活性が調べられた（非特許文献１１）。腹膜腔は、ステージＩＶのＣＲＣ患者における不全のもう１つの好発部位であり、ＰＣに対する局所的なＣＡＲ−Ｔ送達を評価するのに値していた。局所送達はＣＡＲ−Ｔの抗腫瘍効果を増強し得る一方で、腫瘍内免疫抑制にはさらなる課題があると考えられている。転移性固形腫瘍の微小環境には、ＣＡＲ−Ｔを抑制する多くの免疫抑制細胞型が含まれ、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）等がある（非特許文献１２）。ＭＤＳＣはＣＡＲ−Ｔ細胞を抑制し、肝Ｂ細胞の抗原提示機能を阻害することが以前に示されている（非特許文献１３）。ＭＤＳＣは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸及びＩＤＯを介してこの免疫抑制機能を果たす（非特許文献１４）。また、Ｔｒｅｇは腫瘍微小環境において十分に研究されており、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ４を介してＣＡＲ−Ｔを抑制することが示されている（非特許文献１５）。
【０００７】
それゆえに、本明細書では、ＰＭＰ／ＰＣと診断された対象を治療するために、キメラＴ細胞受容体を発現する免疫応答性細胞を注入する方法が提供される。これらの遺伝的にプログラムされた細胞が、特定の抗原（ＰＭＰまたはＰＣに見られる腺癌細胞に発現または特異的に発現した抗原等）を発現する腫瘍を攻撃することを示すデータが提示される。さらに、そのデータは、ＰＣに対するＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ療法の有効性が、免疫抑制細胞集団を抑制することによってさらに高められるはずであるという考えを支持する。
従来技術の前述の例、及びそれらに関連する制限は、例示的であり、排他的なものではないことが意図される。従来技術の他の制限は、本明細書を読み、図面の検討を行い次第、当業者に明らかとなるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｏｃｃｏｌｉｎｉら、２０１３，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，  １９：６９７９−６９９４
【非特許文献２】Ｓｕｇａｒｂａｋｅｒら、１９９９，  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，  ６：７２７−７３１
【非特許文献３】Ｖｅｒｗａａｌら、２００３，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２１  ：３７３７−３７４３
【非特許文献４】Ｖｅｒｗａａｌら、２００８，  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，  １５：２４２６−２４３２
【非特許文献５】Ｃａｏら、２００９，  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，  １６：２１５２−２１６５
【非特許文献６】Ｈｏｄｉら、２０１０，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６３：７１１−７２３
【非特許文献７】Ｋａｎｔｏｆｆら、２０１０，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６３：４１１−４２２
【非特許文献８】Ｋｈａｎら、２０１４，  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ，  １９１：１８９−１９５
【非特許文献９】Ｓａｉｅｄら、２０１４，  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ，  １８７：５２５−５３５
【非特許文献１０】Ｅｓｈｈａｒ，  ２０１０，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １２：５５−６３
【非特許文献１１】Ｋａｔｚら、２０１５，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２１  ：３１４９−３１５９
【非特許文献１２】Ｋｅｒｓｈａｗら、２０１３，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  １３：５２５−５４１
【非特許文献１３】Ｔｈｏｒｎら、２０１４，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，  ９６：８８３−８９４
【非特許文献１４】Ｂｕｒｇａら、２０１５，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，  ６４：８１７−８２９
【非特許文献１５】Ｌｅｅら、２０１１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ７１  ：２８７１−２８８１
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物の概略図を提供する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物の概略図を提供する。
【図２】図２は、非形質導入脾細胞及びキメラ受容体形質導入リンパ球による溶解を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、腫瘍を保有し、キメラ受容体形質導入リンパ球を腹腔内（ＩＰ）注射または尾静脈（ＴＶ）注射によって投与された動物におけるルミネッセンスを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、腫瘍を保有し、キメラ受容体形質導入リンパ球を腹腔内（ＩＰ）注射または尾静脈（ＴＶ）注射によって投与された動物における腫瘍体積の減少を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、腫瘍を保有し、キメラ受容体形質導入リンパ球を腹腔内（ＩＰ）注射または尾静脈（ＴＶ）注射によって処置され、かつ腫瘍細胞で再負荷された動物におけるルミネッセンスを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、キメラ受容体タンパク質を発現する白血球による（図４Ｂ）、またはエフェクターメモリー表現型を持つ白血球による（図４Ｃ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、キメラ受容体タンパク質を発現する白血球による（図４Ｂ）、またはエフェクターメモリー表現型を持つ白血球による（図４Ｃ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、腹膜腔外側の腫瘍におけるＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入の治療有効性を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、キメラ受容体Ｔ細胞のＴＶ投与後対ＩＰ投与後におけるバイオルミネッセンスで測定したＩＰ腫瘍の減少を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、キメラ受容体Ｔ細胞のＴＶ投与後対ＩＰ投与後におけるノギスで測定した側腹部の腫瘍組織量の減少を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、キメラ受容体Ｔ細胞のＩＰ投与後の全身ＩＦＮγレベルを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＣＤ１１ｂ＋細胞及びＭＤＳＣ（Ｌｙ６Ｇ＋）細胞の存在を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＣＤ１１ｂ＋細胞及びＭＤＳＣ（Ｌｙ６Ｇ＋）細胞の存在を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＭＤＳＣ  Ｌｙ６Ｇ＋細胞及びＭＤＳＣ  ＰＤ−Ｌ１＋細胞の存在を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＭＤＳＣ  Ｌｙ６Ｇ＋細胞及びＭＤＳＣ  ＰＤ−Ｌ１＋細胞の存在を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ３＋）及びＣＤ４Ｔ細胞の存在を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＩＰ腫瘍及び脾臓内のＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ３＋）及びＣＤ４Ｔ細胞の存在を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＴＶ及びＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入が、腫瘍組織量に及ぼす注入後８日目における影響を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＰＤ−Ｌ１、Ｇｒ−１、またはＧＩＴＲを結合させる抗体の投与が、ＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入の有効性に及ぼす注入後８日目における影響を示す。
【図１０Ａ】図１０ＡはＴＶ及びＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入が、腫瘍組織量に及ぼす注入後１４日目における影響を示す。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＰＤ−Ｌ１、Ｇｒ−１、またはＧＩＴＲを結合させる抗体の投与が、ＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入の有効性に及ぼす注入後１４日目における影響を示す。
【図１１】図１１はＰＤ−Ｌ１、Ｇｒ−１、またはＧＩＴＲを結合させる抗体の投与が、ＩＰキメラ受容体Ｔ細胞注入の有効性に及ぼす注入後１４日間にわたる影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に説明及び図示される下記の態様及びその実施形態は、典型的及び例示的なものであることを意味し、範囲の限定を意味するものではない。
【００１１】
一態様では、対象における腹腔内腫瘍または腹腔内癌の治療方法であって、該対象の腹腔内に、腹腔内悪性細胞の腫瘍関連抗原に結合するキメラＴ細胞受容体を発現する遺伝子操作されたリンパ球の集団を注入することを含む方法が提供されている。
【００１２】
一部の実施形態では、リンパ球の集団には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはＮＫ細胞が含まれる。他の実施形態では、Ｔ細胞には、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、ＮＫＴ細胞、及び／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が含まれる。
【００１３】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとで構成されている。他の実施形態では、キメラ受容体は、悪性細胞の細胞表面に発現したタンパク質に対する天然リガンドと、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとで構成されている。
【００１４】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子操作されたリンパ球を、対象の腹腔内の悪性細胞数を減少させるのに有効な量で投与することを含む。他の実施形態では、方法は、遺伝子操作されたリンパ球を、対象の腹腔内の悪性細胞の質量を減少させるのに有効な量で投与することを含む。さらに他の実施形態では、腹腔内の悪性細胞の数及び／または質量が、イメージングにより測定される。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、遺伝子操作されたリンパ球を、対象の腹腔外側の悪性細胞数を減少させるのに有効な量で投与することを含む。他の実施形態では、方法は、遺伝子操作されたリンパ球を、対象の腹腔外側の悪性細胞の質量を減少させるのに有効な量で投与することを含む。さらに他の実施形態では、腹腔外側の悪性細胞の数及び／または質量が、イメージングにより測定される。
【００１６】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球を注入することを含む方法により、腹膜腫瘍細胞の数が減少する。他の実施形態では、該方法により、遺伝子操作されたリンパ球の初回投与時または該初回投与前の腫瘍サイズの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が減少する。
【００１７】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球を注入することを含む方法により、腹膜腫瘍のサイズが減少する。他の実施形態では、該方法により、キメラ受容体Ｔ細胞の初回投与時または該初回投与前の腹膜腫瘍サイズの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が減少する。
【００１８】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球を注入することを含む方法により、遺伝子操作されたリンパ球の初回投与時または該初回投与前に測定された腹膜体積の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が減少する。
【００１９】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球は、対象の腹腔内に１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回注入される。
【００２０】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球は、対象に対して自己由来である。他の実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球は、対象に対して自己由来ではない。
【００２１】
一部の実施形態では、対象の腹腔に遺伝子操作されたリンパ球を注入することは、１０６個〜１０１１個の遺伝子操作されたリンパ球を注入することを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、方法は、１０％ＤＭＳＯ含有または非含有生理食塩水中のキメラ受容体Ｔ細胞を含む、遺伝子操作されたリンパ球と薬学的適合溶液との組成物を注入することを含んでおり、該組成物の全容量は約１００ｍＬ〜５００ｍＬの範囲である。
【００２３】
一部の実施形態では、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、腺癌細胞、肉腫細胞、または神経内分泌腫瘍細胞の表面に発現した腫瘍関連抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、腺癌細胞、肉腫細胞、または神経内分泌腫瘍細胞は、対象の腹膜腔内に存在する。他の実施形態では、腺癌細胞、肉腫細胞、または神経内分泌腫瘍細胞は、対象の腹膜腔の外側に存在する。
【００２４】
一部の実施形態では、方法は、第２の治療剤を対象の腹腔内に注入することをさらに含む。他の実施形態では、第２の治療剤は、抑制細胞内の免疫抑制経路を遮断する免疫抑制細胞阻害剤である。さらに他の実施形態では、抑制細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一部の実施形態では、第２の治療剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＤＯ、ＳＴＡＴ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１０、またはＴＧＦβによって媒介される免疫抑制を阻害する。さらに他の実施形態では、第２の治療剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＤＯ、ＳＴＡＴ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１０、またはＴＧＦβを結合させる抗体またはその断片である。
【００２５】
一部の実施形態では、第２の治療剤を注入することは、キメラ受容体タンパク質を発現するリンパ球の注入の前、該注入の間、または該注入の後に行われる。他の実施形態では、第２の治療剤は腹腔内または静脈内に注入される。
【００２６】
ここで以下に、種々の態様をさらに詳しく説明する。しかしながら、こうした態様は、様々な異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載した実施形態に制限されるものと解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的かつ完全なものにし、当業者に本開示の範囲を十分に伝えるように提供されるものである。
【００２７】
定義
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈で明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含むものである。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマーだけではなく、２つ以上の同一または異なるポリマーをも含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤だけではなく、２つ以上の同一または異なる賦形剤をも含む等となる。
【００２８】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各中間値、及び明記された範囲における任意の他の明記された値または中間値は、本開示の範囲内に包含されることを意図する。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が明記された場合、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、及び７μｍも明示的に開示されるのと同様に、１μｍ以上の値の範囲かつ８μｍ以下の値の範囲も明示的に開示される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に純粋」または「実質的に精製」とは、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、本発明が属する技術分野における当業者に周知の標準技術及び方法によって得ることができるのと同等に純粋であることを意味するものである。しかしながら、単球が実質的に純粋であるためには、７０％、８０％、９０％、またはそれより高い純度を要する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「腹膜腔」とは、壁側腹膜と内臓腹膜の間の凹窩、または空隙もしくは潜在空隙を意味するものである。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「腹腔内癌」、「腹腔内腫瘍」、「腹腔内悪性腫瘍」またはそれに類するものとは、腹膜腔内に位置する、例えば腫瘤または１つ以上の腫瘍細胞を含む悪性腫瘍を意味するものである。腹膜癌、腹膜悪性腫瘍、または腹膜腫瘍は、腹膜または腹膜腔に源を発する悪性腫瘍である。
【００３２】
用語「患者」、「対象」、「個体」及びそれに類するものは本明細書で交換可能に使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであるかｉｎ  ｓｉｔｕであるかにかかわらず、本明細書に記載した方法の対象となる任意の動物またはその細胞を意味する。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体は、ヒトである。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用量または量に適用される用語「治療有効」とは、化合物の量、または本開示のキメラ受容体を含み、かつ薬剤耐性ポリペプチドをさらに含む医薬組成物（例えば、Ｔリンパ球及び／またはＮＫ細胞等の免疫細胞を含む組成物）の量であって、それを必要とする対象に投与する場合、所望の活性をもたらすのに十分な量を意味するものである。本開示の文脈の範囲内では、用語「治療有効」とは、本開示の方法により治療される障害の発現を遅らせるか、進行を阻止するか、または少なくとも１つの症状を軽減もしくは緩和するのに十分な化合物または医薬組成物の量を意味するものである。各活性成分の組み合わせが投与された場合、その組み合わせの有効量は、成分が個々に投与された場合に有効であったと考えられる量を含んでいても含んでいなくてもよいことに留意されたい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ受容体」とは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞質共刺激シグナル伝達ドメインを、天然には単一のタンパク質に纏めて備わることのない組み合わせの状態で含む、細胞表面受容体として定義されるものである。これは、特に、受容体であって、その細胞外ドメイン及び細胞質ドメインが天然には単一の受容体タンパク質に纏めて備わることのない受容体を含んでいる。本開示のキメラ受容体は、主としてＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と共に使用することが意図される。本明細書に記載したキメラ受容体は、本明細書で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラリガンド受容体、またはキメラＴ細胞受容体とも称される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍関連抗原」または「抗原」とは、腫瘍細胞によって特異的に発現されるか、または同じ組織型の非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞によってより高頻度またはより高密度に発現される抗原を意味するものである。腫瘍関連抗原は、通常では宿主によって発現されることのない抗原であってもよく、該抗原は突然変異、切断、もしくはミスフォールドされていても、または宿主により通常発現される分子の異常発現であってもよく、該抗原は通常発現される分子だが異常に高いレベルで発現される分子と同一であってもよく、あるいは該抗原は異常である状況または環境で発現されていてもよい。例えば、腫瘍関連抗原は、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合糖質、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはこれらの生体分子もしくは他の生体分子の任意の組み合わせであってもよい。
【００３６】
用語「免疫抑制細胞阻害剤」とは、哺乳動物の免疫抑制細胞の数または機能を低減させるか、または抑制することができる物質を意味するものである。免疫抑制細胞の例として、制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、及び腫瘍関連マクロファージが挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味するものである。抗体は、天然源由来または組み換え源由来のインタクトな免疫グロブリンであり得、またインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含めた種々の形態で存在していてもよい（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９，  Ｉｎ：  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９，  Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  Ｂｉｒｄら、１９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００３８】
用語「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部分を意味し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を意味するものである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体由来標的ドメイン」または「抗原結合ドメイン」とは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片を意味するものである。また、「Ｆｖ」ドメインは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含み、かつ１本の重鎖と１本の軽鎖の可変ドメインとが強固に非共有結合性会合した二量体からなる、最小の抗体断片を意味する。この構成の際には、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定している。全体として、６つの超可変領域が、その抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、ある抗原に特異的な３つの超可変領域のみを備えたＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるものの、抗原を認識し結合させる能力を有する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「天然リガンド」とは、別の天然に存在するタンパク質に特異的に結合する天然に存在するタンパク質を意味するものである。「天然リガンド」は、同一の天然に存在するタンパク質に特異的に結合する完全長タンパク質とその断片の両方を包含する。本明細書で使用される天然リガンドは、組み換えで作製されるか、または合成され得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方を含んでもよい。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含めた任意の高分子が、抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えＤＮＡ由来またはゲノムＤＮＡ由来であり得る。したがって、当業者は、免疫応答を引き出すタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を備えた任意のＤＮＡが、本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。
【００４２】
本明細書で使用される場合、キメラＴ細胞受容体に関する語句「特異的に結合」とは、キメラＴ細胞受容体が、その標的タンパク質に、構造的に異なるタンパク質に結合する際の親和力よりも大きい親和力で結合することを意味するものである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、語句「腫瘍負荷」または「腫瘍組織量」とは、癌細胞の数、腫瘍のサイズ、または対象の身体における癌の量を意味するものである。
【００４４】
キメラ受容体免疫細胞の腹腔内投与
腹腔内腫瘍等の播種性腫瘍を治療するための治療法を開発する際には、腫瘍選択的治療を利用するのが有利である。腫瘍関連抗原を認識し結合するキメラ受容体（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現するように操作された免疫療法用の細胞が、癌治療に対する有望なアプローチであることが一層わかってきている。しかし、腫瘍細胞を標的にすることを目的に操作された細胞の能力にもかかわらず、全身血管内投与によって、腫瘍細胞のＣＡＲ−Ｔ細胞への不適切な曝露や、ＣＡＲ−Ｔ細胞が正常細胞に結合することに伴う有害な副作用が生じ得る。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、腫瘍を含む臓器または解剖学的空間に直接投与するための方法を提供することが有利である。本開示の一部の態様において、本明細書に記載したキメラ受容体リンパ球の腹腔内投与を含む方法が提供されている。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。
【００４５】
現行のＣＡＲ−Ｔ治療法は、操作された細胞の患者への全身注入を必要とする。しかし、こうした投与方法では、疾患部位におけるその細胞の濃度減少、または細胞の活性に伴う有害な副作用の発現に見舞われる恐れがある。本明細書には、腹腔内癌と診断された患者を治療することを目的に操作された免疫細胞を、腹腔内（ＩＰ）注入するための組成物及び方法が提供されており、以下に説明する実験には、その細胞の局所的なＩＰ注入が、細胞の全身注入に比べて、腹膜腫瘍に対して優れた防御をもたらしたことが示されている。さらに、ＩＰ細胞（ＩＰＣ）療法を受けた患者に免疫経路阻害剤を投与することで、腹膜転移治療の治療有効性がさらに改善された。
【００４６】
キメラ受容体免疫細胞療法
癌研究では、悪性腫瘍疾患と闘う免疫系成分の使用にますます重点を置いている。例えば、多くの治療用の抗体が癌の治療に有効であることが実証されており、目下世界中で市販されている。さらに最近では、細胞に基づく免疫療法が、癌治療への有望なアプローチとして台頭してきており、そこでは、患者自身の免疫細胞が、患者の身体内の腫瘍を認識し攻撃するように操作される。悪性腫瘍を有する対象の診断は、どの腫瘍抗原タンパク質（腫瘍関連抗原）が腫瘍細胞表面に発現するかを判定することを含み得る。続いて、その対象を、腫瘍関連抗原を標的とし、かつ該抗原に結合するように操作された抗腫瘍免疫細胞で治療し、最終的には、その免疫細胞と、場合によっては同時投与された細胞または治療剤とで腫瘍細胞を致死させることができる。本明細書には、腹腔内の腫瘍を、操作された免疫細胞の腹腔内注入により治療するための組成物及び方法が開示されている。
【００４７】
キメラ受容体を発現するように操作されたリンパ球が、一態様で示される。本方法による使用のためのリンパ球集団には、以下に限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、ＮＫＴ細胞、及び／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む。キメラ受容体を発現するＴ細胞（「キメラ受容体Ｔ細胞」）は、特に関心が持たれている。キメラ受容体免疫細胞は、細胞表面タンパク質を発現する罹病細胞または悪性細胞に、キメラ受容体タンパク質を介して結合するように設計される。例えば、腹腔内における悪性細胞は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０４３５４及びその関連アイソフォーム）、ＫＩＴチロシンキナーゼ受容体タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１０７２１）、上皮細胞接着分子タンパク質（ＥｐＣＡＭ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２３４５及びその関連アイソフォーム）、またはムチン１タンパク質（ＭＵＣ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１０１８０１６及びその関連アイソフォーム）を発現し得る（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、  ２０１４，  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １４０：６０７−６１２；Ｊｏｅｎｓｕｕ，  ２００６，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １７：ｘ２８０−ｘ２８６；Ｃｈａｕｈａｎら、２００９，  Ｊ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｒｅｓ，  ２：２１−２９；Ｆｌａｔｍａｒｋら、２０１３，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  １３３：  １４９７−１５０６）。癌細胞に発現し、かつ現在ＣＡＲ−Ｔ細胞療法用に研究されている抗原標的の他の例として、ＣＤ２０またはＧＤ２（濾胞性リンパ腫）、ＣＤ１７１（神経芽細胞腫）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ１９（リンパ腫）、ＩＬ１３Ｒα２（膠芽細胞腫）、及びＣＤ１９（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ））が挙げられる。また、ウイルス特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＨＩＶ等のウイルスを保有する細胞を攻撃するために開発されている。例えば、臨床試験が、ＨＩＶの治療向けにＧｐ１００に特異的なＣＡＲを用いて開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍら、（２０１１）  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：２９４−３１１）。本方法及び組成物は、限定されないが、上記に列挙した抗原標的を含むと理解される。
【００４８】
キメラ受容体タンパク質及びこれらのタンパク質を発現する免疫細胞の産生は、当該技術分野で周知であり、リガンド、または抗体もしくはその断片の標的機能及び特異性を、免疫細胞の抗腫瘍活性と組み合わせるものである。例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎら、２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，  ３：３８８−３９８を参照されたい。キメラ受容体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、罹病標的細胞（例えば、腹膜腔内に存する癌細胞または悪性細胞）の表面に発現したタンパク質を特異的に結合させる標的結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、免疫調節性シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、構築物は、標的結合ドメインのＮ末端に融合された単一のペプチドをさらに含む。
【００４９】
一部の実施形態では、キメラ受容体タンパク質の標的結合ドメインは、罹病細胞の表面にあるタンパク質を結合させる免疫グロブリンの抗原結合部分を含む。あるいは、この構築物が本明細書でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの断片を含むが、これらに限定されない細胞表面抗原に結合する任意のドメインであってもよい。好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＡＲ構築物の一部分である場合に抗原に特異的に結合することができる抗体の断片である。一部の例では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に用いられる種と同一の種由来であることが有利である。例えば、ヒトに使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒト抗体またはヒト化抗体の断片を含むことが有利である場合がある。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、ヒト抗体またはヒト化抗体の腫瘍抗原結合断片を含む。これらの実施形態のそれぞれにおいて、一本鎖可変断片（ｓｃＦＶまたはＦａｂ）等の抗体の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体の膜貫通ドメイン及びシグナル伝達細胞内ドメイン（エンドドメイン）に融合されている。多くの場合、スペーサーまたはヒンジを細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に導入して、抗原認識や結合を促すために、抗原結合ドメインを様々な方向に指向させることができる可撓性を付与している。
【００５０】
一部の実施形態では、キメラ抗原Ｔ細胞受容体の抗原結合部分の一部分が、ＣＥＡ抗原を標的とし、細胞表面に発現したＣＥＡを結合させるとわかっている抗体のＣＥＡ結合ドメインを含む。キメラ受容体構築物は、当業者に既知の方法及び組成物によって産生され得る。例えば、以下の実施例で使用されるＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、ヒト化ＭＮ１４抗体の可変ドメインの一部分を含むものである（米国特許第５，８７４，５４０号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。Ｆａｂ構築物またはｓｃＦｖ構築物は、Ｎｏｌａｎら（１９９９，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｅ  Ｒｅｓ，  ５：３９２８−３９４１）の方法により、ＣＥＡ抗体から産生されて、ＣＥＡ抗体のＣＥＡ結合ドメインを備えることができる。一部の実施形態では、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、以下に示す配列番号 １のアミノ酸配列を含む：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＴＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＬＹＲＳＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＷＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１）。
【００５１】
一部の実施形態では、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、配列番号１のＮ末端にシグナル配列をさらに含むが、これはＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ発現の後に、その構築物から切断される。他の実施形態では、シグナル配列は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号２）を有する。そして、ＦａｂドメインまたはｓｃＦｖドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１７５９を参照）由来等のヒンジドメインに融合され得る。続いて、ヒンジドメインは、そのＣ末端で膜貫通ドメインに融合され得る。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＮＰ＿０００７２５）由来であるか、またはＣＤ２８タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００６１３０）由来である。キメラ構築物の膜貫通ドメインは、次いで、そのＣ末端でＣＤ３ゼータ鎖（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００７２５）のシグナル伝達ドメインに融合され得る。
【００５２】
一部の実施形態では、ＣＥＡ結合ドメインは、ＣＥＡを結合させる抗体由来のｓｃＦｖドメインまたはＦａｂドメインであり、キメラ受容体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＥＡ結合ドメイン（例えば、配列番号１）と、ＣＤ８ヒンジドメインと、ゼータ膜貫通ドメインと、ゼータ細胞質シグナル伝達ドメインとを含んでいる。他の実施形態では、キメラ受容体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＥＡ結合ドメイン（例えば、配列番号１）と、ＣＤ８ヒンジドメインと、ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８細胞質共刺激ドメインの各一部分を（Ｎ末端からＣ末端の方向に）備えたドメインと、ゼータ細胞質シグナル伝達ドメインとを含んでいる。
【００５３】
代替的な実施形態では、腫瘍細胞の表面に発現したタンパク質に対する既知のリガンドを、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインに融合して、本明細書で代替的に「キメラリガンドＴ細胞受容体」または「キメラリガンド受容体」と称されるものを産生する。ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に、キメラリガンドＴ細胞受容体タンパク質を発現するＴ細胞は、標的リガンド受容体タンパク質を発現する細胞の存在下で活性化され、その活性化されたＴ細胞によって、ＭＨＣに依存することなく標的細胞を攻撃するようになる。一部の実施形態では、キメラリガンド受容体は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）細胞の表面に発現したチロシンプロテインキナーゼＫＩＴタンパク質（ｃＫＩＴ受容体またはＣＤ１１７）に結合するサイトカインであるＫＩＴリガンドの細胞外ドメインを含むように、特別に設計されたものである。キメラＴ細胞受容体は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１２１２６４号（Ｋａｔｚら、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，  ２０１３，  １１  ：４６も参照）に記載のとおりに操作された。抗ＫＩＴキメラ受容体がＴ細胞の表面に発現し、その操作された細胞は、ＫＩＴ＋腫瘍細胞と共に共培養された際に増殖し、ＩＦＮγを産生することが可能であった。さらに、既定のＧＩＳＴ異種移植片を有し、かつ抗ＫＩＴキメラリガンド受容体Ｔ細胞で処置されたマウスでは、腫瘍増殖速度の有意な減少が示された。したがって、こうしたキメラリガンド受容体Ｔ細胞を、本明細書に記載した方法に従って腹腔内癌を治療するのに使用することができると理解される。本明細書に記載した方法で用いるための２つの代替的なＣＡＲ−Ｔ構築物の模式図を、図１Ａ及び図１Ｂに提供する。
【００５４】
キメラ受容体細胞内ドメイン
キメラＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、標的抗原がＣＡＲの抗原結合ドメインまたはキメラリガンド受容体のリガンド部分によって結合すると、活性化される。一般的に、内因性ＣＤ３Ｔ細胞受容体のζドメインは、シグナル伝達ドメインとして用いられる。一方、最近になって、第２世代のＣＡＲ分子が、共刺激受容体（ＣＤ２８、４１ＢＢ、またはＩＣＯＳ等）由来の別の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むように設計されて、操作されたＴ細胞へのさらなるシグナルを提供し、その効力及び／または生存度を改善させることが可能になっている。第３世代のキメラＴ細胞受容体は、複数のシグナル伝達ドメインまたはアクセサリー領域を組み合わせて、新規な機能性をもたらしている。さらに、一部の実施形態では、細胞質ドメインが、ＯＸ−４０共刺激ドメイン、ＨＶＥＭ共刺激ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、及びＣＤ２７共刺激ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激ドメインをさらに含んでいる。一実施形態では、さらなる共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインの間に位置する。
【００５５】
ＩＰ注入用のキメラ受容体リンパ球
極めて特異的な腫瘍認識と腫瘍致死とを可能にするようにキメラ受容体で改変されたリンパ球は、大きな注目を集めており、次に示す有望な臨床結果を得ている（Ｇｒｕｐｐら、２０１３，  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６８：  １５０９−１５１８；Ｐｏｒｔｅｒら、２０１１，  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６５：７２５−７３３；Ｓａｄｅｌａｉｎら、２００９，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２１  ：２１５−２２３）。本開示の方法で使用することができるリンパ球の種類として、以下に限定されないが、キメラ受容体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．ら、２００３，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３５−４５）、腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）由来のリンパ球培養液（Ｐａｎｅｌｌｉ，  Ｍ．  Ｃら、２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４９５−５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ，  Ｍ．  Ｃら、２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４３８２−４３９２）、及び人口抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を用いて選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた抗原特異的末梢血白血球（Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｊ．ら、２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：５４１７−５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，  Ｇ．  Ａ．ら、２００３  Ｂｌｏｏｄ  １０２：２４９８−２５０５）が挙げられる。Ｔ細胞は、自己由来であっても、非自己由来（例えば同種異系）であってもよく、または改変された前駆体もしくは幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られてもよい。Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いて通常実施されるように塊状で調製され、例えばＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌを用いることによって精製され得る。
【００５６】
免疫応答性細胞（Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、実質的に同種の細胞組成物を、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を用いて形質導入することによって成し遂げることができる。好ましくは、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのいずれか）を、ＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物を宿主細胞ゲノムに導入するのに用いる。例えば、抗原（例えば、腫瘍抗原、またはその変異体もしくは断片）を結合させる受容体をコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、その内因性プロモーター、レトロウイルスの末端長反復、または代替的な内部プロモーターから発現が駆動され得る。非ウイルスベクターまたはＲＮＡも同様に使用することができる。ランダム染色体組み込み、もしくは標的組み込み（例えば、ヌクレアーゼである転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）を用いる等）、または導入遺伝子発現（例えば、天然または化学修飾ＲＮＡを用いる等）を利用することができる。
【００５７】
キメラ受容体発現細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子改変として、一般的にレトロウイルスベクターが形質導入に用いられるが、任意の他のウイルスベクターまたは非ウイルス送達系を用いることもできる。少なくとも２つの共刺激リガンドを備えた抗原提示複合体を含む細胞を提供するための、細胞の次の遺伝子改変として、レトロウイルス遺伝子導入（形質導入）が有効であることが同様にわかっている。また、レトロウイルスベクターと適正なパッケージング系統との組み合わせも好適であり、ヒト細胞を感染させるのにはカプシドタンパク質が機能的であると考えられる。
【００５８】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞を、必要とする対象に投与することを容易にする医薬組成物を対象とする。本開示の形質導入されたＴ細胞は、適正な担体または希釈剤を用いて、医薬組成物か、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した移植片に加工することができ、これらはなおも薬学的に許容可能であり得る。こうした組成物または移植片を作製する手段は、当該技術分野で説明されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ，  ｅｄ．  （１９８０）を参照）。必要に応じて、形質導入されたＴ細胞は、半固体または液体の形態（カプセル剤、溶液、注射剤、吸入剤、またはエアロゾル等）で、それぞれの投与経路に適した通常の方法により製剤化され得る。当該技術分野で既知の手段を利用して、組成物が標的の組織または臓器に到達するまで、組成物の放出や吸収を防ぐか、もしくは最小化することができ、または該組成物の徐放性を確保することができる。しかしながら、望ましくは、キメラ受容体を発現する細胞を損なうことのない薬学的に許容可能な形態が用いられる。したがって、望ましくは、形質導入されたＴ細胞は、緩衝塩類溶液、好ましくはハンクス液または生理食塩水を含有する医薬組成物に加工され得る。例えば、組成物は、生理学的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化されて、医薬組成物を調製することができる。担体及び組成物は、無菌であり得る。製剤は、投与様式に適したものであるべきである。
【００５９】
適切な薬学的に許容可能な担体として、以下に限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース等の炭水化物、アミロースまたはデンプン、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、所望に応じて、活性化合物と有害な反応を起こすことのない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香味料、及び／または芳香剤等と混合され得る。
【００６０】
所望に応じて、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物は、従来の結合剤及び担体（トリグリセリド等）を用いて座薬として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。
【００６１】
組成物は、ヒトに対する投与に適した医薬組成物として、慣行的な手順に従って製剤化され得る。例えば静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液の溶液であるのが典型的である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬を含んでもよい。一般的に、成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性化合物の量を提示するアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）等の密封容器に、別々に、または単位剤形の形態で混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌医薬品グレードの水、食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入ビンを用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用の無菌水または食塩水のアンプルを供給でき、投与に先立って成分を混合できるようにする。
【００６２】
遺伝子改変された免疫応答性細胞を含む本発明の組成物を、選択されたｐＨに緩衝され得る無菌液体製剤（例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物）として適宜提供することができる。液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、投与するのに、特に注射で投与するのに幾分高い利便性がある。一方で、粘性組成物は、特定の組織とより長い期間接触させるのに適正な粘度範囲以内で製剤化され得る。液体組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、該担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。
【００６３】
当業者は、組成物の成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本発明に記載した遺伝子改変免疫応答性細胞の生存度または効力に影響を与えるものではないことを認識するであろう。これは化学分野及び薬学分野の当業者にいかなる問題を提示するものではなく、または、本開示と本明細書に引用される文献とに基づく標準テキストの参照、もしくは簡易実験（過度の実験作業を要さない）により、問題が容易に回避され得る。
【００６４】
治療法
本開示は、キメラ受容体Ｔ細胞を発現し、かつそれにより腹膜腔内の悪性細胞を標的とし、該悪性細胞に結合して、腫瘍細胞増殖の抑制または腫瘍細胞の死をもたらす、リンパ球の腹腔内注入のための組成物及び方法を説明するものである。腹腔内投与は、高濃度の治療剤を腫瘍部位に供給して、治療有効性を最大化し、治療用細胞の全身毒性を最小化する。本明細書に記載のデータは、遺伝子操作されたリンパ球が、ＩＰ注入を介して投与された場合、全身注入に比べて有意に高い有効性を有することを示している。これらの細胞の治療有効性は、免疫サプレッサー細胞の阻害剤を使用することにより高められる。
【００６５】
キメラ受容体リンパ球の治療的使用は、癌と診断された対象から白血球を採取することと、リンパ球を単離し培養することと、リンパ球をキメラ受容体遺伝子を含むベクターで形質転換することと、得られた改変リンパ球を該対象に投与することと、を含む。対象への投与用に調製された細胞は、精製された細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を含み得る。当業者は、種々の周知の方法（蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等）を用いて、集団における遺伝子改変されたリンパ球の割合を容易に測定することができる。
【００６６】
キメラ受容体Ｔ細胞は、任意の生理学的に許容可能な媒体で投与され得る。一部の実施形態では、約１×１０６個〜１×１０１１個、１×１０６個〜１×１０１０個、１×１０６個〜１×１０９個、１×１０７個〜１×１０１１個、１×１０７個〜１×１０１０個、１×１０７個〜１×１０９個、または１×１０８個〜１×１０９個の細胞の用量が投与される。他の実施形態では、約１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、または１×１０１１個の細胞の用量が投与される。有効量とみなされる量は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、及び状態を含めた、それぞれの対象に対する個々の要因に基づいて、正確に決定され得る。投与量は、本開示及び当該技術の知識から、当業者に容易に確認され、かつ容易に調整され得る。キメラ受容体Ｔ細胞を含む集団における純度の好ましい範囲は、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％であり、さらにより好ましくは、純度は約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％である。細胞は、例えば注射またはカテーテルによって投与され得る。また、細胞は低侵襲外科技術により投与され得る。
【００６７】
キメラ受容体Ｔ細胞は、腹腔内注入を介して、ある一定の期間にわたって１回、２回、３回、４回、または５回患者に投与される。一定の期間は約１か月、２か月、３か月、４か月、または５か月であり得る。例えば、キメラ受容体Ｔ細胞の用量は、１週間の期間に１回、２回、３回、または４回投与される。さらに、１週間の投与計画が毎週、隔週、もしくは３週間毎、または毎月実行される。あるいは、１週間の投与計画は、隔週実行される。一実施形態では、キメラ受容体Ｔ細胞の用量は、１週間に３回、隔週で投与される。投与計画は、腫瘍負荷が、キメラ受容体Ｔ細胞の初回用量投与前の腫瘍負荷に比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少するまで続けられる。
【００６８】
一部の実施形態では、キメラ受容体Ｔ細胞は、減量手術を受けた患者を、外科的に可能であるのと同等の無症候状態にするように、該患者に投与される。外科手術の直後に、または外科手術後の１日、２日、もしくは５日以内に、患者はＣＡＲ−Ｔ細胞の腹腔内注入を受ける。
【００６９】
有効なキメラ受容体Ｔ細胞治療は、一つにはキメラ受容体Ｔ細胞の至適用量を決定することにより実現される。キメラ受容体Ｔ細胞治療の治療有効量は、例えば、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、またはＭＲＩイメージングによって患者の腹部をイメージングすることによって決定され得る。治療有効量は、イメージングにより決定される悪性腫瘍の体積及び／または数を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％、または１００％減少させるものである。治療有効量は、腹部における悪性腫瘍の体積及び／または数を、キメラ受容体Ｔ細胞の初回用量投与後約５日、１週、２週、４週、６週、または１０週以内に減少させることが予想される。あるいは、治療有効量は、悪性腹水及び／または腹腔内ムチンの量または体積を、投与期間にわたり少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させるものである。治療有効量はまた、血清腫瘍マーカー値（標的の腫瘍の種類に利用できる場合）を、投与期間にわたって少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させるものである。
【００７０】
ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の腹腔内注入
キメラ受容体リンパ球のＩＰ注入によるキメラ受容体Ｔ細胞の有効性を、本明細書に記載の方法を用いて明らかにした。未改変のＴ細胞または抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＰ注入で処置されたマウスにおいて、未処置の動物または未改変のＴ細胞で処置された動物と比べて、腫瘍負荷に有意な減少が見られた。腫瘍細胞の表面に発現した標的タンパク質または抗原に、キメラＴ細胞受容体を介して特異的に結合するように操作された任意のキメラ受容体Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはキメラリガンド受容体Ｔ細胞）を用いる、本明細書に記載した方法が、腫瘍負荷を低減させるのに有用であることを、当業者は理解するであろう。
【００７１】
以下の実施例に示されるように、ＰＣを有するマウスにおけるＣＡＲ−Ｔの直接ＩＰ注入は、全身注入よりも腫瘍を制御するのに有効であった。腹膜腫瘍内のＣＡＲ−Ｔは、ＩＰ注入後には検出される一方で、全身注射の後には、腹膜腫瘍内に見られなかった。本明細書に記載したＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入法を使用して悪性腫瘍を治療することにより、有害な副作用も低減する。
【００７２】
本明細書に記載の組成物及び方法は、腹腔内腫瘍と診断された患者を治療するために使用される。患者は、ＣＡＲ−ＴのＩＰ注入の後にＣＡＲ−Ｔの分布が確実に最適化されるように、最初に診断的腹腔鏡検査を受けて、いかなる腹膜癒着をも溶解させる。この診断的腹腔鏡検査はまた、疾患をアセスメントし、処置前の細胞または組織検体を得るのに使用され、及び／または腹膜透析カテーテルの設置のために使用され得る。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入は、その後、同一の日か、または次の日に実施され得る。
【００７３】
ＣＡＲ−ＴのＩＰ注入は、腹膜腔内に約１×１０９個〜１×１０１１個、または約１×１０１０個の細胞の初回量を注入することを含む。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、生理食塩水等の生理溶液に懸濁される。一部の実施形態では、溶液は、約５％〜１５％または約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。一部の実施形態では、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入の直前に、腹水が腹膜腔から排出される。他の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量を注射する前に吸引が行われて、血液及び／または腸の内容物がないことを確認する。
【００７４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量のＩＰ注入は、手作業で室温にて行われ得る。一部の実施形態では、用量が、約５分〜６０分、約３０分〜１２０分、約５分〜３０分、約５分〜２０分、または約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、もしくは６０分の間にわたり注入される。注入は、外来診療で行われ得る。
【００７５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の１回以上の追加用量が、初回ＩＰ注入の後に投与され得る。例えば、追加用量を、毎週、３日毎、または５日毎に投与することができ、該追加用量は、１回、２回、または３回投与される。他の実施形態では、追加用量は、注入後の評価により悪性腫瘍が腹膜腔内で検出されなくなるまで、毎週、３日毎、または５日毎に投与される。一部の実施形態では、追加用量は初回量と等しい。他の実施形態では、追加用量の各々は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の数に関して、初回量の約７５％、９０％、１２０％、または１５０％である。好ましい実施形態では、約１×１０１０個の追加用量を、週に１回、２〜３週間の間、患者にＩＰで投与する。
【００７６】
一部の実施形態では、腫瘍細胞が腹膜腔の外側に位置する場合の悪性腫瘍の治療方法が提供される。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入が、同時性ＰＣのマウスにおける側腹部腫瘍の増殖を減じるか、または抑制することができるかどうかを判定するための試験を行った。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入は、顕著なＩＰ応答を誘発しながら、遠隔側腹部腫瘍の増殖を有意に制限することができた（実施例６を参照）。ＣＡＲ−Ｔは側腹部腫瘍内では検出されず、このことから、この側腹部腫瘍応答が、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ処置の４日後に検出されたＩＦＮγの急増に起因していることが示唆された（図７Ｄ）。腹膜腫瘍の甚大な破壊を伴うＣＡＲ−ＴのＩＰ注入は、放射線療法で見られるアブスコパル効果と同様な現象を誘発した可能性がある（Ｐａｒｋら、２０１５，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，  ３：６１０−６１９）。あるいは、ＣＡＲ−Ｔは、早い時点で側腹部腫瘍に浸潤した可能性がある。驚くべきことに、全身注入も、おそらく細胞のほとんどが結節、肺、及び脾臓に移行するために、有意な側腹部腫瘍応答をもたらさず、この経路による不適当なＣＡＲ−Ｔ投与を反映している可能性がある。重要なことには、血清ＩＦＮγレベルの急増に付随して、遠隔皮下腫瘍の応答は、ＩＰ腫瘍の応答よりも持続性がなかった。逐次的な局所療法及び全身療法が、腹部外疾患という観点で、ＰＣに対する有効性を改善する可能性がある。したがって、一部の実施形態では、腹膜悪性腫瘍と診断された対象が、キメラ受容体リンパ球のＩＰ注入により処置され、続いてキメラ受容体リンパ球の全身注入により処置される治療方法が提供されている。
【００７７】
ＰＣは、長期の自然経過を有する場合があるので、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入後のＩＰ腫瘍増殖からの防御持続性を調べた（実施例４を参照）。反復ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ投与を行った後、マウスが、さらなる１０日までの間、複数回のＩＰ腫瘍負荷から防御された。ＣＡＲ−Ｔは、最長２８日後にＰＣ内で検出可能であった。この所見から、可能性として、ＣＡＲ−Ｔがエフェクターメモリーの特徴を獲得した状態で、腹膜空間内でＣＡＲ−Ｔ持続性を持つことが示唆される。エフェクターメモリー表現型（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−）を備えたＣＡＲ−Ｔは、１０日目に比べて２８日目において、より高い割合でＩＰ腫瘍内で検出された。これらのデータは、初回ＩＰ注入の後、ＣＡＲ−Ｔがエフェクターメモリープログラミングされることを示唆し、このことは、腹膜空間内での長期の抗腫瘍防御を説明し得る。
【００７８】
免疫抑制剤
キメラ受容体Ｔ細胞注入の治療有効性は、おそらく免疫抑制（例えば、殺腫瘍細胞の抑制または抗腫瘍サイトカインの発現減少等）を引き起こす要因により影響されると考えられる。癌腫の存在下における腹腔内空間の免疫環境の影響を考慮すること、またそれに応じてキメラ受容体Ｔ細胞療法を受けている患者を治療することが重要である。
【００７９】
腫瘍微小環境内の免疫抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の蓄積は、有効な抗腫瘍免疫療法の開発に対して大きな支障となる可能性をはらんでいる（Ｗｅｉｓｓら、２０１４，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９２：５８２１−５８２９）。ＭＤＳＣを除去することにより、担癌マウス及び癌患者における免疫応答が有意に改善することが示されている（Ｏｓｔｒｏｎｇ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２００９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １８２：４４９９−４５０６；Ｔａｌｍａｄｇｅ，  ２００７，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｒｅｓ，  １３：５２４３−５２４８）。キメラ受容体Ｔ細胞療法を受けている患者において、例えばＴｒｅｇ及びＭＤＳＣによる免疫抑制を阻害するための方法であって、該患者に免疫抑制細胞の機能を阻害する薬剤をさらに投与する方法が、本明細書に提示されている。
【００８０】
キメラ受容体Ｔ細胞による治療の際の免疫抑制活性の度合いを調べることを目的に、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣを、ＭＣ３８腫瘍細胞を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて特性決定した。具体的には、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣは、抑制活性で重要な役割を果たすと考えられている、それらの細胞表面マーカー、サイトカイン、及び酵素に関して特性決定される。以下の実施例７に示すように、試験により、ＭＤＳＣとＴｒｅｇの両方がＩＰ腫瘍内で検出され得ることが示された。ＭＤＳＣとＴｒｅｇのどちらも、内因性Ｔ細胞及びＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍応答の阻害剤として詳しく記載されている（Ｋｈａｌｅｄら、２０１３，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ９１  ：４９３−５０２；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら、２０１４，  Ｂｉｏｃｈｉｍ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １８４５：  １８２−２０１）。また、ＩＰ  ＭＤＳＣは、ＣＡＲ−Ｔ抑制の主要なメディエータであるとして前もって示されていた（Ｂｕｒｇａら、２０１５，  ６４：８１７−８２９）高レベルのＰＤ−Ｌ１（プログラム死−１受容体リガンド）を発現した。Ｇｒ１（顆粒球性骨髄マーカータンパク質）を結合させるＭＤＳＣ除去抗体、またはＰＤ−Ｌ１遮断抗体を用いた治療を追加することによって、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔの腫瘍致死という点での性能を高めた。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ及びサプレッサー細胞標的の有望な相加効果により、固形腫瘍免疫療法を開発する際のコンビナトリアル戦略が正当化される。したがって、一部の実施形態では、腹膜癌と診断された対象を治療するための方法であって、該対象に、本明細書に記載したキメラ受容体を発現するリンパ球の集団をＩＰ注入を介して投与し、かつ該対象に、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇ等のサプレッサーＴ細胞の活性を抑制する免疫抑制剤をも投与する方法が、提供されている。
【００８１】
一部の実施形態では、免疫抑制剤は、ＩＬ１０、ＰＤ−１（プログラム死−１受容体）、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死−１受容体リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム死−１受容体リガンド２）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達転写活性化因子３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）、ＴＧＦ−β、またはＣＴＬＡ４を結合させる抗体である。他の実施形態では、免疫抑制剤は、キメラ受容体リンパ球のＩＰ投与の前に対象に投与される。さらに他の実施形態では、免疫抑制剤は、キメラ受容体リンパ球のＩＰ投与の後に対象に投与される。免疫抑制剤は、キメラ受容体リンパ球のＩＰ投与後に複数回（例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、または１週間に１回（７日毎））投与され得る。免疫抑制剤は、キメラ受容体リンパ球のＩＰ投与と同日に投与され得る。免疫抑制剤は、キメラ受容体リンパ球のＩＰ投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上前に投与され得る。１つ以上の免疫抑制剤が患者に投与される場合があり、例えば対象は、ＣＤ２５を結合させる抗体と、ＧＲ１を結合させる抗体とを同時投与され得るか、または逐次投与され得る。
【００８２】
追加治療剤
本開示のキメラ受容体Ｔ細胞は、単独で、または他の治療法と組み合わせて使用され得る。免疫調節剤として、以下に限定されないが、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１及びその他の１０種類のインターロイキン）と、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子と、γ−インターフェロン及びエリスロポエチン等のインターフェロンとが挙げられ得る。他の免疫調節剤として、モノクローナル抗体、または免疫阻害経路を標的とするように設計された小分子（ＴＧＦβまたはＩＬ１０を結合させ、それによりＴＧＦβまたはＩＬ１０の機能をそれぞれ阻害する抗体またはその断片等）が挙げられ得る。
【００８３】
好ましい実施形態では、キメラ受容体Ｔ細胞の投与は、キメラ受容体Ｔ細胞サプレッサー経路を阻害する上記に列挙した１つ以上の薬剤の投与と併用される。例えば、それらを必要とする患者は、キメラ受容体Ｔ細胞と、腹腔内注入後のキメラ受容体Ｔ細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ生存率を増加させる薬剤の両方を腹腔内注入される。好ましい実施形態では、患者はキメラ受容体Ｔ細胞とＩＬ２の用量とを投与される。キメラ受容体Ｔ細胞の生存率を増加させる薬剤との投与は、キメラ受容体Ｔ細胞の投与前、投与間、または投与後に行われ得る。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は本質的に例示であり、何ら限定を意図するものではない。
【００８５】
実施例１
ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製
本明細書に記載の実施例で使用される抗ＣＥＡｓｃｆｖ−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ（タンデム）キメラ抗原受容体を、Ｅｍｔａｇｅら（２００８，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １４：  ８１１２−８１２２）の方法に従って事前に作製した。簡単に言うと、タンデム分子は、ヒトＣＤ２８細胞外ドメインと、ＣＤ２８細胞質ドメインと、ζ細胞質ドメインとをＮ末端からＣ末端の方向に備える細胞質ドメインをコードする構築物の上流で、ＣＥＡを特異的に結合させるモノクローナル抗体のｈＭＮ１４ｓＦｖ−ＣＤ８ヒンジ部分を分子的に融合することによって作製された。得られたキメラ構築物を、レトロウイルスベクターにクローニングし、制限消化及び配列決定により確認した。
【００８６】
本試験には、ｅｘ  ｖｉｖｏで組織から単離された際に識別可能なＣＡＲ−Ｔを産生する目的で、６〜８週齢のＢ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１）マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスは、ロジャーウィリアムズメディカルセンターの動物施設に、ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って無菌状態で収容された。ＣＤ４５．１マウスの脾臓を、無菌方式で採取した後に粉砕した。赤血球を溶解し、Ｔ細胞をＭＡＣＳ免疫磁気ビーズ分離（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）社）を用いて単離した。Ｔ細胞を、ＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍＬ）と、抗ＣＤ３／ＣＤ２８用のＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共に完全培地で４８時間培養して、活性化させた。ｈＭＮ１４ｓＦｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζＣＡＲを保有するＰｈｏｅｎｉｘ  ＥＣＯ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）細胞（Ｅｍｔａｇｅら、２００８，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １４：８１１２−８１２２）を使用して、形質導入用の上清を産生した。活性化Ｔ細胞をレトロウイルス上清で培養し、スピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を２回行った。形質導入Ｔ細胞を培養し、ＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＡＲ発現レベルを形質導入の４８時間後に調べた。
【００８７】
ＣＤ３＋細胞のＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーとＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ分子のｓＦｖ部分を特異的に結合させる抗体とを用いて測定することによって、マウスの脾細胞の形質導入が、形質導入の４８時間後に確認された。標準ゲーティング戦略を用いて、ＣＤ３とキメラ抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔとを発現する生存単一細胞を識別した。その結果、ウイルス形質導入効率は約７３％であることがわかった（データは示さず）。
【００８８】
実施例２
腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ致死
ヒトＣＥＡとホタルルシフェラーゼとをコードする遺伝子で安定形質移入された標的細胞であるＭＣ３８細胞を用いて、形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞による致死についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。最初に、ＭＣ３８細胞をヒトＣＥＡ遺伝子で安定形質移入することにより、ＭＣ３８ＣＥＡ＋細胞を産生した。ＭＣ３８ＣＥＡ＋細胞をｐＬｅｎｔｉ−ＩＩＩ−ＵｂＣ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社、カナダのブリティッシュコロンビア州リッチモンド）で形質移入することにより、ＭＣ３８−ｌｕｃを産生した。エフェクター細胞は、実施例１に記載のとおりに作製したＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞であるか、または、該エフェクター細胞の陰性対照として用いられる非形質導入脾臓Ｔ細胞であるかのどちらかとした。バイオルミネッセンスアッセイを行い、ＣＡＲ−Ｔまたは非形質導入Ｔ細胞を、ＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃと、種々のエフェクター：標的比で共培養した。アッセイに先立って、エフェクターをＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍＬ）を含む完全培地で培養した。９６ウェルの光学プレート内の完全培地に、種々のエフェクター：標的比で細胞を蒔き、一晩インキュベートした。インキュベートした後、培地を廃棄し、そのウェルにルシフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を加えた。プレートをＩＶＩＳ１００で分析した。上清を採取し、ルミネッセンス活性に関して測定し、溶解率（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）％を１００×［（実験上の致死−自発発光）／（最大致死−自発発光）］として計算した。図２に見られるように、形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞は、非形質導入細胞よりも有意に高い割合で溶解をもたらした。エフェクター：標的比が０．０３：１と低い場合でも、溶解率は４０％であり、活性化された非形質導入Ｔ細胞よりも有意に高かった（ｐ＝０．０２）。
【００８９】
実施例３
ＣＡＲ−Ｔ細胞送達及び腫瘍細胞の致死
ＩＰ送達は、全身尾静脈（ＴＶ）注入と比べて、腹膜癌（ＰＣ）を有するマウスにおいてＣＡＲ−Ｔ有効性を改善させることを明らかにするために、両方の注入方法を定着ＩＰ腫瘍を有するマウスにおいて試験した。ＣＥＡ＋ＰＣを保有するマウスを、ＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃ細胞のＩＰ注射により作製した。
【００９０】
６〜８週齢のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスをジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から購入し、全てｉｎ  ｖｉｖｏモデルで使用した。マウスは、０日目に２．５×１０６個のＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃ細胞を、１ｍｌのシリンジに取り付けられた２６ゲージ×１／２インチの針を用いて腹腔内注射された。細胞は注射用の生理食塩水に再懸濁されており、注射は室温で行った。針は恥骨結合の２〜３ｍｍ上方の正中筋膜を貫通しており、また注射の前に吸引を行って、血液または腸の内容物がないことを確認した。ｉｎ  ｖｉｖｏ作業を１４日間にわたって行った。３日目と６日目とに、担癌マウスを、ＣＡＲ−Ｔ（２．５×１０６個の細胞）を用いて、ＩＰ注入またはＴＶ注入を介して処置した。全マウスには毎日ＩＬ−２（１０００ＩＵ／注射）が投与されたが、これは３日目の初回ＣＡＲ−Ｔ注射と共に開始した。対照マウスを、非形質導入脾細胞で３日目と６日目とに処置するか、またはＩＬ−２のみで処置した。マウスは、バイオルミネッセンス用に１５ｍｇ／ｍＬのルシフェリン２００μＬを注射された後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の間、ＩＶＩＳ１００イメージングステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で偶数日にイメージングされた。
【００９１】
データを図３Ａと図３Ｂとに示す。図３Ａでは、プロットの各ラインが４匹のマウスの平均値を表している。腫瘍のルミネッセンスの減少倍数を、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の４日目と１４日目の間で計算し、ＴＶとＩＰのＣＡＲ−Ｔ送達を比較した。その結果を図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂにおけるエラーバーは、ＳＥＭ値を表す。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて計算された。
【００９２】
局所送達ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔの単一治療により、腫瘍組織量が有意に減少し（ｐ＜０．０１）、連続する各時点で、未処置の動物と比べた場合のこの有意性が維持された。ＣＡＲ−ＴのＩＰ注入は、２回目のＣＡＲ−Ｔ処置後８日までの間、全身ＴＶ  ＣＡＲ−Ｔよりも有効性が高いままであった。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔとは対照的に、ＴＶ  ＣＡＲ−Ｔは、未処置の動物と比較した場合に、１４日目まで腫瘍増殖に対する有意な影響を及ぼさなかった（ｐ＝０．０４）。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ処置マウスは、４日目と１４日目の間、腫瘍組織量が１／３７に減少したのに対し、ＴＶ  ＣＡＲ−Ｔ処置マウスは、同一期間の間、腫瘍組織量がわずか１／３に減少しただけであった（ｐ＝０．０５）（図３Ｂ）。局所送達ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔで処置した４匹のマウスにおいて、１４日目の剖検の際に検出可能な腫瘍は存在しなかった。しかしながら、同日のバイオルミネッセンスモニタリングにより、微小腫瘍は未だ検出可能であった。一方、ＴＶで処置した全ての動物には、剖検の際に、肉眼で見えるＩＰ腫瘍が全体的に見られた。
【００９３】
実施例４
ＣＡＲ−Ｔ細胞による持続的防御
ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入が全身投与よりも優れていることを確認したので、ＩＰ腫瘍負荷に対する防御の持続性を評価する試験を行った。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入処置の後、マウスをＩＰ腫瘍注射を用いて再負荷し、腫瘍の進行をバイオルミネッセンスでモニタリングした。この試験では、マウスは、２日目、４日目、６日目、及び８日目に、ＣＡＲ−Ｔを受け、１０日目にＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃを２．５×１０６個の用量で再負荷された。実施例３で説明したように、腫瘍増殖をバイオルミネッセンスで測定した。
【００９４】
事前にＣＡＲ−Ｔ  ＩＰ注入を受けたマウスは、事前にＣＡＲ−Ｔ処置を受けていないマウスに比べて、腫瘍増殖が有意に減少していた（ｐ＝０．０２）。ＩＰ腫瘍増殖からの防御は、腫瘍再負荷の後１０日までの間に及んだ（ｐ＝０．０１）（図４Ａ）。１０日目（ｎ＝５）と２８日目（ｎ＝３）の両時点におけるＩＰ腫瘍組織から回復したＣＡＲ＋リンパ球の発生頻度を比較した。少量の肉眼で見える腫瘍が採取され、ＣＡＲ−Ｔが１０日目に腫瘍内白血球の６９％を占め、２８日目に４７％を占めることがわかった（図４Ｂ）。ＣＡＲ＋表現型のうちのメモリー表現型を、１０日目（ｎ＝５）と２８日目（ｎ＝３）の両時点でフローサイトメトリーを用いて調べ、そこで腫瘍内ＣＡＲ−Ｔを免疫表現型検査した。標準ゲーティング戦略を、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＣＲ７（４Ｂ１２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、及びＣＤ４４（ＩＭ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に対する抗体と共に使用した。エフェクターメモリー表現型（ＣＡＲ＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−）を有するＣＡＲ−Ｔの割合の増加が腫瘍内ＣＡＲ−Ｔ細胞で検出され（図４Ｃ）、このことは、初回ＩＰ注入後、ＣＡＲ−Ｔ細胞がエフェクターメモリープログラミングされていることを示唆するものである。
【００９５】
実施例５
ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入による腹部外腫瘍増殖に対する防御
ＩＰ腫瘍の患者が他の解剖学的部位に疾患を有し得ることを考慮して、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入が皮下側腹部腫瘍増殖に対して防御するかどうかを判定するための試験を行った。マウスは、１．０×１０６個のＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃ細胞を、ＩＰと左側腹部とに同時に注射された。側腹部腫瘍のサイズを、ノギスを用いて二次元（ｍｍ２）で測定した。マウスは、実施例３で説明したように１５ｍｇ／ｍＬのルシフェリン２００μＬを注射された後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の間、ＩＶＩＳ１００で偶数日にイメージングされた。
【００９６】
３日目及び６日目に２回の処置を行った後、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔは、ＩＰ及び側腹部の腫瘍組織量を、未処置の動物に比べて（ｐ＜０．０５）、ならびに非形質導入脾臓Ｔ細胞を受けた動物に比べて（データは示さず）減少させた。腫瘍はまた、ＴＶを介してＣＡＲ−Ｔを受けたマウス及びＩＬ−２の補助のみを受けたマウスと比べて、優位に減少する傾向にあった。このことは、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ処置マウスにおける側腹部腫瘍面積が、同日の未処置の動物に比べて有意に小さいことに符合した（ｐ＝０．０３、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃ）。ＣＡＲ−Ｔは、全血液、側腹部腫瘍組織、または左鼠径リンパ節内輸送用のフローサイトメトリー染色の後、回復しなかった。しかしながら、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入は、処置後４日で高レベルの全身ＩＦＮγをもたらした。（図５Ｄ）
【００９７】
実施例６
免疫抑制細胞によるＩＰ腫瘍浸潤
ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入は、ＰＣを有するマウスにおいて持続的応答を媒介したが、免疫抑制細胞がＣＡＲ−Ｔの機能を制限し得ることは考慮に値した。大腸癌ＬＭモデルにおいてＣＡＲ−Ｔを抑制するとして先に示したＭＤＳＣ及びＴｒｅｇ（非特許文献１４）は、ＩＰ腫瘍内で検出されていた。
【００９８】
腫瘍白血球内容物を実施例３で説明したようにフローサイトメトリーを用いて免疫表現型検査して、抑制細胞集団の存在を検出した。これらの表面マーカーに対して以下の抗体を使用した：ＣＤ４（ＲＭ４−５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／１７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｌｙ６Ｃ（ＡＬ−２１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｌｙ６Ｇ（１ＡＢ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。細胞内ＦｏｘＰ３染色を、Ｍｏｕｓｅ  ＦｏｘＰ３  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。単一の染料及びアイソタイプ対照を各実験に用いた。得られたフロー試料の分析をＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ株式会社、オレゴン州アッシュランド）を用いて行った。
【００９９】
腫瘍白血球内容物を免疫表現型検査して、抑制細胞集団の存在を検出した。ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、及びＬｙ６Ｇに対して染色した後の腫瘍内で見つけられた。代表的な点図は、ＩＰ腫瘍由来のＭＤＳＣを示し、腫瘍由来のＭＤＳＣ集団と、同一の未処置動物の脾臓由来のＭＤＳＣ集団とを比較する棒グラフと併記されている。全生細胞中のＣＤ１１ｂ＋細胞の割合と、ＣＤ１１ｂ＋細胞中のＭＤＳＣ（Ｇｒ−１＋）の割合とを図６Ａ及び図６Ｂに示す。ＭＤＳＣはまた、免疫抑制マーカーＰＤ−Ｌ１の発現に関して免疫表現型検査された（図７Ａ及び図７Ｂ）。代表的な腫瘍点図では、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３＋細胞の割合として表示）がＩＰ腫瘍内でも見つけられたことが示されている。同様の集団が、同一動物の脾臓内で見つけられた（図８Ａ及び図８Ｂ）。棒は、１グループあたり３匹のマウスを反映している。エラーバーは、ＳＥＭ値を表す。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて計算された。
【０１００】
ＣＤ１１ｂ＋細胞は、平均して、ＩＰ腫瘍における白血球のうちの５７％を占め、これは同一動物の脾臓由来の１１％と比較された（ｐ＜０．０１）。Ｌｙ６Ｇ＋顆粒球性ＭＤＳＣ（ｇＭＤＳＣ）と、Ｌｙ６Ｃ＋単球ＭＤＳＣ（ｍＭＤＳＣ）の両方が、ＩＰ腫瘍内（４３％）及び脾臓内（４１％）で見つけられた（図６Ａ及び図６Ｂ）。免疫抑制マーカーＰＤ−Ｌ１が、腫瘍由来か脾臓由来かにかかわらず、両ＭＤＳＣサブセットに発現し、かつ同等の高レベルで発現されていた（図７Ａ及び図７Ｂ）。Ｔｒｅｇ（ＦｏｘＰ３＋）は、腫瘍内のＣＤ４Ｔ細胞のうちの８２％を占めることがわかり、これは同一の動物由来の脾臓内の７％と比較された（ｐ＜０．０１）（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【０１０１】
実施例７
サプレッサー細胞除去と併用したＣＡＲ−Ｔの投与
サプレッサー細胞除去、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫抑制経路の遮断と併用した、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入の予想される治療有効性を調べるための試験を行った。ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔが、ＭＤＳＣ及びＴｒｅｇに対する除去抗体またはＰＤ−Ｌ１経路の遮断抗体と組み合わせられ、ＭＣ３８ＣＥＡ−ｌｕｃを注射済みのマウスに投与された。投与された除去抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１及び抗Ｇｒ１抗体（ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びＧｒ１タンパク質をＭＤＳＣの表面で結合させる抗体）、ならびに抗ＧＩＴＲ抗体（ＧＩＴＲタンパク質をＴｒｅｇ細胞の表面で結合させる抗体）とした。腫瘍の減少を、実施例３で説明したように１４日間にわたってバイオルミネッセンスによりモニタリングした。
【０１０２】
棒グラフは、処置後８日目における局所的ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔの有効性を全身ＴＶ  ＣＡＲ−Ｔと比較し（図９Ａ）、処置後８日目におけるＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ単体を抗体併用のＩＰ  ＣＡＲ−Ｔと比較し（図９Ｂ）、１４日目の試験終了時における局所的ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔの有効性を全身ＴＶ  ＣＡＲ−Ｔと比較し（図１０Ａ）、１４日目の試験終了時におけるＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ単体を抗体併用のＩＰ  ＣＡＲ−Ｔと比較している（図１０Ｂ）。棒は、１グループあたり４体の動物を反映している。エラーバーは、ＳＥＭ値を表す。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて計算された。肉眼検査画像とバイオルミネッセンス画像とが同様に分析された（データは示さず）。
【０１０３】
ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ単体により、またそれを抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗Ｇｒ１抗体、または抗ＧＩＴＲ抗体と併用して用いた場合により、未処置の動物と比べて腫瘍組織量が有意に減少した。１４日目において、ＣＡＲ−Ｔ単体では、未処置のマウス、非形質導入Ｔ細胞を受けたマウス、及びＩＬ−２単体の１日用量を受けたマウスと比べて腫瘍組織量が有意に減じた（図１０Ａ、ｐ＜０．０５）。Ｔｒｅｇ除去と併用したＣＡＲ−Ｔでは、ＣＡＲ−Ｔ単体よりも腫瘍組織量がさらに減少し（図１０Ｂ、ｐ＜０．０１）、同様にＣＡＲ−ＴとＭＤＳＣ除去との併用でもさらに減少する（ｐ＝０．０１７）（図１０Ａ及び図１０Ｂ）ことが示された。腫瘍組織量を、１４日まで測定し、その結果を図１１に示している。ＣＡＲ−Ｔと抗Ｇｒ−１との併用は全体として最も効果が高く、８日目と１０日目にはバイオルミネッセンスが検出不可となることを示した。１４日目に、ＩＰ  ＣＡＲ−Ｔを受けたどのマウスにおいても、肉眼による検査では、いかなる検出可能な腫瘍も見られなかった（データは示さず）。
【０１０４】
実施例８
患者のＣＡＲ−Ｔ細胞産生
白血球除去輸血を、認可された血液センターで行う。ＣＡＲ−Ｔは、医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従う施設で、処理、製造、増殖、用量採取、ラベリング、保管、及び分配に関して標準操作手順（ＳＯＰ）を用いて調製される。簡潔に述べると、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、白血球除去製剤からフィコールを用いて単離する。次に、５％無菌ヒトＡＢ血清と、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体と、３００〜３０００Ｕ／ｍＬのＩＬ２とを添加した、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を入れた組織培養フラスコで、ＰＢＭＣを４８時間〜７２時間活性化する。
【０１０５】
スピノキュレーション法（例えば、Ｑｕｉｎｔａｓ−Ｃａｒｄａｍａら、２００７，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １８：  １２５３−１２６０）を用いて、７．２×１０８個〜１４．４×１０８個のＴ細胞を、レトロネクチンがコーティングされた６ウェルプレートにて、５％ヒトＡＢ血清と、３０００Ｕ／ｍＬのＩＬ２と、プロタミンとを含有するＡＩＭ  Ｖ培地で、室温での低速遠心分離により１時間形質導入する。形質導入工程は、２４時間にわたって合計２回〜３回行う。形質導入の後、細胞を培養液で洗浄し、３７℃で４８時間〜７２時間インキュベートする。ＣＡＲ−Ｔを、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ組織培養バッグ（Ｂａｘｔｅｒ社、イリノイ州ディアフィールド）内で１０日間〜１４日間さらに増殖させる。ＣＡＲ−Ｔ増殖曲線及び細胞生存率を定期的に調べ、細胞増殖培地を必要に応じて交換する。ＣＡＲ−Ｔを、フローサイトメトリーにより、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、及び抗ＣＡＲ抗体に対して特異的な蛍光標識抗体を用いて調べる。フローサイトメトリーを、ＣｙＡｎ（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア）装置またはＬＳＲ−ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）装置で行う。患者産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をバイオルミネッセンス細胞毒性アッセイにより測定する。適正な標的を備えたルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、特異的ＣＡＲ−Ｔと、種々の割合で９６ウェル丸底プレートにて混合し、各ウェルからのバイオルミネッセンスの減少を測定する（Ｋａｒｉｍｉら、２０１４，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９：ｅ８９３５７）。
【０１０６】
臨床用量を、Ｆｅｎｗａｌセルハーベスターシステム（Ｂａｘｔｅｒ社、イリノイ州ディアフィールド）を用いて、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ社）、２０％ヒトウシアルブミン、１０％ＤＭＳＯ、及びＩＬ２を含む凍結培地で調製する。細菌培養及び真菌培養を、それぞれ１４日間及び２８日間モニタリングする。細菌内毒素に関するアッセイを、ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（ロンザ社、メリーランド州ウォーカーズビル）を用いて行う。臨床用量を液体窒素中に保管し、注入の直前に解凍する。
【０１０７】
実施例９
マウスモデルにおける用量の決定
動物試験を行って、ＩＰ腫瘍細胞の致死を達成するのに必要なＣＡＲ−Ｔ細胞の最小量を特定する。癌腫症のマウスモデルを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍抗原発現腫瘍細胞を注射することによって作製する。抗原発現腫瘍細胞を、初代マウスの大腸癌由来の結腸直腸癌細胞株であるＭＣ３８細胞株から作製する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３３：  １３１８−１３２１）。ＭＣ３８細胞を、レトロウイルス発現ベクターを用いて完全長ヒト抗原ｃＤＮＡで形質導入する。また、ＭＣ３８細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子で安定形質移入する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．５×１０６個のマウス結腸直腸癌細胞を腹腔内注射する。腫瘍細胞の注射の７日後、マウスに、２．５×１０６個、２．５×１０７個、または２．５×１０８個の特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、腹膜腔に直接挿入される針を用いて注入する。各マウスは、ＣＡＲ−Ｔ注入の後、毎日ＩＬ２（１．５μｇ／ｍＬの２００μｌ）の皮下注射を受ける。
【０１０８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入後、例えば、ＩＶＩＳシステム（パーキンエルマー社）を用いてバイオルミネッセンスを測定することにより、腫瘍増殖及び処置応答に関してマウスをモニタリングする。腹腔外またはオフターゲットのＣＡＲ−Ｔ送達を評価するために、フローサイトメトリーを、末梢血、肝臓、肺、腎臓、結腸、及び胃で行い、これらの部位でのＣＡＲ＋Ｔ細胞の頻度を測定する。さらに、動物の生存時間を慎重にモニタリングし、チャートに表す。
【０１０９】
実施例１０
ＣＡＲ−Ｔ持続期間及び複数回ＣＡＲ−Ｔ注入
実施例３で説明した試験に従って処置されたマウスが、単回のＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ注入に対して完全寛解を達成できない場合、単回ＩＰ注入後のＩＰ腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ持続期間を算出し、かつ複数回のＣＡＲ−Ｔ注入の治療効果を調べるための試験を行う。
【０１１０】
単回ＩＰ注入後のＩＰ腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ持続期間を、実施例３で説明したマウスモデルを用いて算出する。実施例３で算出した至適用量を用いて、定着ＭＣ３８ＩＰ腫瘍を有する１０匹のマウスを、特異的ＣＡＲ−ＴのＩＰ注入で処置する。フローサイトメトリーにより、ＣＡＲに特異的なモノクローナル抗体を用いて、処置後１日目、２日目、４日目、７日目、１４日目、及び２１日目に腫瘍及び腹水を分析する。
【０１１１】
ＣＡＲ−Ｔ持続期間と、実施例３で明らかにした抗ＣＡＲ−Ｔの単回投与が腫瘍進行に及ぼす影響とに基づいて、複数回ＣＡＲ−Ｔ注入の投与計画を設定し、複数回注入治療レジメンで用いる。
【０１１２】
ＩＰ腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ持続性が特に短期（２日〜３日以内）である場合、全身照射プレコンディショニング戦略を利用して、宿主動物でのＣＡＲ−Ｔ生着を促進する。
【０１１３】
実施例１１
化学療法剤を併用したＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ治療
患者へのＣＡＲ−ＴのＩＰ送達は、医薬品の臨床試験の実施に関する基準（ＧＣＰ）ガイドラインに従って行われる。患者は最初に、腹膜癒着の溶解、疾患アセスメント、処置前の生物検体の取得、及び腹膜透析カテーテルの設置のために、手術室で診断的腹腔鏡検査を受ける。手術後１日目に、約１×１０１０個のＣＡＲ−Ｔを、１０％のメチルスルホキシドを含む２００ｍｌの生理食塩水（ＮＳ）で注入する。この注入は、ベッドサイドで、バイタルサインを継続的にモニタリングしながら、１５分間にわたる手動注射により行われる。追加のＣＡＲ−Ｔ用量である１×１０１０個の細胞を、１週間間隔で２回投与する。
【０１１４】
初回ＣＡＲ−Ｔ投与の６週後、患者を診断的腹腔鏡検査のために手術室に戻して、疾患応答をアセスメントし、治療後の生物検体を得る。
【０１１５】
実施例１２
化学療法剤を併用したＩＰ  ＣＡＲ−Ｔ処置
マウスモデルにおいて、化学療法剤であるシクロホスファミドがＣＡＲ−Ｔ細胞の治療有効性に及ぼす影響を、上述と同様の方法を用いて調べる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．５×１０６個の腫瘍細胞を腹腔内注射する。この注射の７日後、マウスは、実施例１で説明したとおりに作製したＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＰ注射を受ける。マウスはまた、シクロホスファミドのＩＰ注射を受ける。シクロホスファミドは、ＣＡＲ−Ｔ注入の１日前に投与され、次いで、総計４回の抗体投与向けにＣＡＲ−Ｔ投与後２日毎に投与される。マウスの対照群は、ＣＡＲ−Ｔ注入に対して、同一の投与計画を用いて食塩水の注射を受ける。各処置の有効性は、バイオルミネッセンス及びマウスの生存時間を測定することにより評価する。
【０１１６】
多くの典型的な態様及び実施形態を上記に論じてきたが、当業者は、その特定の変更、置換、付加、及びサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲及び以下に記載される特許請求の範囲は、こうした変更、置換、付加、及びサブコンビネーションの全てを、その真の趣旨及び範囲内にあるものとして含むと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
2018521069.tif 000003
【図１Ｂ】
2018521069.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
2018521069.tif 000006
【図３Ｂ】
2018521069.tif 000007
【図４Ａ】
2018521069.tif 000008
【図４Ｂ】
2018521069.tif 000009
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2018521069.tif 000011
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2018521069.tif 000021
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2018521069.tif 000023
【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
2018521069000001.app
【国際調査報告】
2018521069.tif 000026
2018521069.tif 000027