(57)【要約】  本発明は、遺伝子の一過性発現により植物において部位特異的改変を行うための方法であって、以下：対象の植物の細胞または組織において標的断片に特異的な配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップを含み、前記配列特異的ヌクレアーゼが標的部位に特異的であり、かつ前記標的部位が前記ヌクレアーゼにより切断され、その結果、前記植物のＤＮＡ修復により前記標的部位の部位特異的改変が達成される方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行うための、一過性発現系の使用。
【請求項２】
植物において標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行うための方法であって、以下：
対象の植物の細胞または組織を一過性発現の被検体として使用し、前記植物の前記細胞または前記組織において配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップ
を含み、
前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的部位に特異的であり、かつ前記標的部位が前記ヌクレアーゼにより切断され、その結果、前記植物のＤＮＡ修復により前記標的部位の部位特異的改変が達成される方法。
【請求項３】
前記植物の細胞または組織において前記配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるためのプロセスが、以下：
ａ）前記植物の前記細胞または前記組織に、前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を導入するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた前記細胞または前記組織を選択圧の非存在下で培養し、それにより前記対象の植物の前記細胞または前記組織において前記配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させ、かつ前記植物のゲノムに組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含むことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝物質が、組換えベクター、例えばＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはＲＮＡである、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集を達成しうる任意のヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記配列特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記標的断片遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための前記遺伝物質が、
ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）から構成されるか、あるいは
ガイドＲＮＡを転写するための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写するための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成されるか、あるいは
ガイドＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの双方）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成され、
その際、前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記標的部位に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記配列特異的ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮヌクレアーゼであり、前記標的断片に特異的なヌクレアーゼを発現させるための前記遺伝物質が、対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現する組換えベクターまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであり、前記ＴＡＬＥＮタンパク質が、前記標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記標的部位に特異的なヌクレアーゼを発現させるための前記遺伝物質が、対を成すＺＦＮタンパク質を発現する組換えベクターまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであり、前記ＺＦＮタンパク質が、前記標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、一過性発現のレシピエントとして作用できかつ組織培養により完全な植物へと再生しうる任意の細胞であり、前記組織が、一過性発現のレシピエントとして作用できかつ組織培養により完全な植物へと再生しうる任意の組織であることを特徴とする、請求項２から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、前記組織が、カルス組織、未熟胚、成熟胚、葉、茎頂、胚軸または若い花穂である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝物質を送達するための手法が、パーティクルボンバードメント、アグロバクテリウム媒介型形質転換、ＰＥＧ媒介型プロトプラスト形質転換、電極形質転換、炭化ケイ素繊維媒介型形質転換、バキュームインフィルトレーション形質転換、または他の任意の遺伝的形質転換手法であることを特徴とする、請求項２から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記部位特異的改変が、前記標的部位における挿入変異、欠失変異および／または置換変異であることを特徴とする、請求項２から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項２から１２までのいずれか１項記載の方法を用いて対象の植物において標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行って、前記標的遺伝子にその機能を喪失させるかまたは機能を獲得させることにより得られることを特徴とする、細胞または組織。
【請求項１４】
請求項１３記載の細胞または組織を培養することにより得られることを特徴とする改変植物、または
前記改変植物から得られ、かつ組み込まれた外来遺伝子をゲノム内に含まず、かつ遺伝的に安定であることを特徴とする、導入遺伝子を含まない改変植物。
【請求項１５】
導入遺伝子を含まない改変植物の育種方法であって、以下：
（ａ）請求項２から１２までのいずれか１項記載の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行うことにより、改変植物を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記改変植物から、植物をスクリーニングするステップであって、ここで、該植物中の前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まず、かつ該植物が遺伝的に安定である、ステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属し、一過性遺伝子発現により植物を正確に改変するための方法に関する。詳細には本発明は、比較的高い生物学的安全性を有する一過性発現系により植物ゲノムの部位特異的改変を達成するための方法に関する。
【０００２】
技術的背景
植物ゲノムにおいて改変を行うことは、植物ゲノム機能を探索しかつ作物を遺伝学的に改良するための主要な手段である。現在、植物ゲノムを改変するための方法では主に、伝統的な交雑育種および変異誘発育種に重点が置かれている。伝統的な交雑育種は数世代にわたって行われる必要があるため時間がかかり、また過度の作業を必要とする。これはまた、種間の生殖的隔離によって制限されることがあり、また望ましくない遺伝子連鎖に影響を受ける場合がある。物理的または化学的な変異誘発法、例えば放射線変異誘発法、ＥＭＳ変異誘発法などでは、ゲノムにおいて多数の変異部位が無秩序に導入されることがあり、変異部位の同定が極めて困難であるものと考えられる。伝統的な遺伝子ターゲティング法は、極めて低い効率（通常は１０−６〜１０−５の範囲である）を有し、また例えば酵母、マウスなどのわずかな種に限定される。ＲＮＡｉ法では通常は、標的遺伝子を十分にダウンレギュレートすることができず、また遺伝子サイレンシング効果は子孫において減少するかまたさらには完全に消失する。したがって、ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングは、遺伝子的に安定していない。
【０００３】
近年現れた新規な技術である部位特異的ゲノム改変ツールは主に、配列特異的ヌクレアーゼ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＳＳＮ）の３つのカテゴリ：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）、および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ）に関与する系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を含む。それらの共通の特徴は、それらがエンドヌクレアーゼとして作用して特定のＤＮＡ配列を切断して、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらしうる点にある。ＤＳＢにより、細胞の固有の修復機構である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）を活性化することができ、それによりＤＮＡ損傷が修復される。破壊された染色体をＮＨＥＪにより再結合させることができるが、この修復は通常はそれほど正確ではなく、破壊部位で少数の塩基の挿入または欠失が起こる場合があり、これによって重要なアミノ酸のフレームシフトまたは欠失が生じることがあり、それによって遺伝子ノックアウト変異体が生成されることがある。ＨＲにより、人工的な相同配列が導入されると、この相同配列が合成修復を行うためのテンプレートとして使用され、その結果、部位特異的な遺伝子（またはＤＮＡ断片）の置換変異体または挿入変異体が生成される。現在、遺伝子編集技術による植物ゲノムの改変が一部の植物（例えばイネ、シロイヌナズナ、トウモロコシおよびコムギなど）に徐々に適用されてきてはいるが、効果は満足のいくものではない。主な制限要因は、植物の遺伝的形質転換である。
【０００４】
植物細胞への配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）の導入は、遺伝子編集を達成するための基礎である。現在、植物細胞に配列特異的ヌクレアーゼを導入するための方法は主に、従来の遺伝子導入技術である。従来の遺伝子導入技術を用いて配列特異的ヌクレアーゼ遺伝子を植物染色体に組み込むことにより、該植物において部位特異的改変を達成することができる。その場合、改変ツールを用いずに子孫における分離によって変異体を得ることができる。そのような方法は、導入遺伝子を有しない部位特異的変異体を得るための十分に認識された重要な方法である。この方法は、植物ゲノムへの外来遺伝子の組込みを伴い、また形質転換手法は選択マーカー（選択圧）を必要とするが、この選択マーカー（選択圧）により植物の再生が比較的困難となる。栄養繁殖作物、例えばジャガイモ、キャッサバおよびバナナの遺伝子の改変に関しては、配列特異的ヌクレアーゼ導入遺伝子の分離除去が困難であるかまたは不可能である。形質転換が困難ないくつかの植物、例えばコムギ、トウモロコシ、大豆およびジャガイモなどに関しては、ゲノムの改変はより困難であるものと考えられる。したがって遺伝子編集技術は、植物ゲノムの改変において広範に用いられているわけではない。さらに生物学的安全性に関して、米国農務省は、最終生成物の特性によってのみ生成物を評価する。このことは、配列特異的ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなどを用いた従来の遺伝子導入技術により得られた遺伝子改変生成物がＧＭＯ規則では規制を受けないことを意味する。しかし、ＧＭＯ規則が比較的厳格である欧州連合では、そのような生成物はなおも遺伝子導入のカテゴリに挙げられて規制を受けるはずである。したがって、植物ゲノム改変のためのより効率的で実用的でかつ安全な方法を開発する必要がある。
【０００５】
一過性発現系とは、次のような系を指す：遺伝子送達手段、例えばアグロバクテリウム、パーティクルボンバードメントおよびＰＥＧ媒介型プロトプラスト形質転換を用いて外来遺伝子（配列特異的ヌクレアーゼ）を（染色体に組み込まずに）細胞に送達し、かつこの外来遺伝子の一過性発現により植物のゲノムを改変し、その際、該植物の再生プロセスの間に、該植物の再生の効率を効率的に増加させるいかなる選択圧も用いずに、組織培養を行う。この染色体に組み込まれない外来遺伝子は、植物細胞により分解されるものと考えられ、それにより比較的高い生物学的安全性がもたらされる。したがって、植物への遺伝子編集技術の適用を容易にしうる一過性発現系を使用して植物ゲノムの改変を達成することが、より簡便でかつより適切である。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、一過性遺伝子発現により植物のゲノムを正確に改変するための方法を提供することである。
【０００７】
植物において標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行うための一過性発現系の使用は、本発明の保護範囲に含まれる。
【０００８】
本発明において提供される、植物において標的遺伝子の標的部位に対して部位特異的改変を行うための方法は、具体的には以下：
対象の植物の細胞または組織を一過性発現の被検体として使用し、前記対象の植物の細胞または組織において配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップ
を含み、
その際、前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的部位に特異的であり、かつ前記標的部位が前記ヌクレアーゼにより切断され、その結果、前記植物におけるＤＮＡ修復により前記標的部位の部位特異的改変が達成される。
【０００９】
前記方法において、対象の植物の細胞または組織において配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現を達成するためのプロセスは、以下：
ａ）前記対象の植物の細胞または組織に、前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を導入するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた前記細胞または前記組織を選択圧の非存在下で培養し、それにより前記対象の植物の前記細胞または前記組織において前記配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させ、かつ前記植物のゲノムに組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含みうる。
【００１０】
前記「遺伝物質」は、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片またはＲＮＡである。
【００１１】
前記「選択圧」とは、遺伝子導入植物の生長には有益であるが導入遺伝子を含まない植物にとっては致死的である薬物または試薬を指す。本明細書では、遺伝子導入植物とは、そのゲノムに外来遺伝子が組み込まれている植物を指す。導入遺伝子を含まない植物とは、そのゲノムに外来遺伝子が組み込まれていない植物を指す。
【００１２】
選択圧の非存在下では、植物の防御系により外来遺伝子の侵入が阻害され、かつ既に該植物に送達された外来遺伝子が分解されるものと考えられる。したがって、ステップａ）で得られた細胞または組織を選択圧の非存在下で培養する場合、外来遺伝子（標的部位に特異的なヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質のあらゆる断片を含む）は植物のゲノムには組み込まれないものと考えられ、また最終的に得られる植物は、導入遺伝子を含まずかつ部位特異的改変を有する植物である。
【００１３】
前記方法において、標的部位に特異的な配列特異的ヌクレアーゼは、ゲノム編集を達成しうるいずれのヌクレアーゼであってもよく、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどであってよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、「配列特異的ヌクレアーゼ」とは具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態において、標的部位に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は特に、
ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）から構成されるか、あるいは特に、
ガイドＲＮＡを転写するための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写するための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成されるか、あるいは特に、
ガイドＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成される。前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、標的部位に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む。
【００１５】
さらに、ガイドＲＮＡを転写するための組換えベクターまたはＤＮＡ断片において、該ガイドＲＮＡのコードヌクレオチド配列の転写を開始するためのプロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＵ３プロモーターである。
【００１６】
より具体的には、ガイドＲＮＡを発現させるための組換えベクターは、「標的部位に相補的に結合しうるＲＮＡ断片」のコードヌクレオチド配列をプラスミドｐＴａＵ６−ｇＲＮＡまたはｐＴａＵ３−ｇＲＮＡの２つのＢｂｓＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための組換えベクターは、ベクターｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９またはｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９である。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、「配列特異的ヌクレアーゼ」は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。標的部位に特異的な配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は、対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現する組換えプラスミドまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであってよく、その際、前記ＴＡＬＥＮタンパク質は、標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【００１８】
さらに、「対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現するプラスミドである、配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための組換えプラスミドまたはＤＮＡ断片」において、前記ＴＡＬＥＮタンパク質のコードヌクレオチド配列の転写を開始するプロモーターは、トウモロコシプロモーターＵｂｉ−１である。
【００１９】
より具体的には、対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を同時に発現する組換えプラスミドは、Ｔ−ＭＬＯベクターである。
【００２０】
配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である場合には、標的部位に特異的な配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は、対を成すＺＦＮタンパク質を発現する組換えプラスミドまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであってよく、その際、前記ＺＦＮタンパク質は、標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【００２１】
前記方法において、細胞は、一過性発現のレシピエントとして作用できかつ組織培養により完全な植物へと再生しうる任意の細胞であり、組織は、一過性発現のレシピエントとして作用できかつ組織培養により完全な植物へと再生しうる任意の組織である。細胞は具体的には、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、組織は具体的には、カルス、未熟胚、成熟胚、葉、茎頂、胚軸、若い花穂などである。
【００２２】
前記方法において、植物の細胞または組織に遺伝物質を導入するための手法は、パーティクルボンバードメント、アグロバクテリウム媒介型形質転換、ＰＥＧ媒介型プロトプラスト形質転換、電極形質転換、炭化ケイ素繊維媒介型形質転換、バキュームインフィルトレーション形質転換、または他の任意の遺伝子送達手法である。
【００２３】
前記方法において、部位特異的改変は具体的には、植物ゲノム中の標的部位（配列特異的ヌクレアーゼが認識する標的断片）における挿入、欠失および／または置換である。いくつかの実施形態において、標的部位は、標的遺伝子のコード領域内に存在する。いくつかの実施形態において、標的部位は、標的遺伝子の転写調節領域内に存在し、例えばプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、構造遺伝子であっても非構造遺伝子であってもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記改変によって、標的遺伝子の機能喪失が生じる。いくつかの実施形態において、前記改変によって、標的遺伝子の機能の獲得（または変更）が生じる。
【００２５】
植物は、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよく、例えばイネ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、大豆、モロコシ、ジャガイモ、カラスムギ、綿花、キャッサバ、バナナなどであってよい。
【００２６】
本発明の一実施形態（実施例１）において、植物はコムギであり；ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、標的遺伝子はコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７であり、標的部位は５’−ＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ−３’であり、ガイドＲＮＡを発現させるための組換えベクターは、５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧ−３’で示されるＤＮＡ断片をプラスミドｐＴａＵ６−ｇＲＮＡの２つのＢｂｓＩ制限部位の間に順方向に挿入することによって得られる組換えプラスミドであり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターは具体的には、ベクターｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９である。
【００２７】
本発明の他の実施形態（実施例２）において、植物はコムギであり、標的遺伝子はコムギ内在性遺伝子ＴａＭＬＯであり、ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼであり、標的部位は
【化１】
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であり、その際、下線を付した領域は、制限エンドヌクレアーゼＡｖａＩＩの認識配列である。
【００２８】
ＴＡＬＥＮヌクレアーゼのための組換えベクターは、Ｔ−ＭＬＯである。
【００２９】
対象の植物の標的遺伝子における標的部位の部位特異的改変を行って該標的遺伝子にその機能を喪失させるかまたは機能を獲得させることにより得られる細胞または組織も、本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明の細胞または組織から再生された改変植物も、本発明の保護範囲に含まれる。
【００３１】
さらに、前記改変植物からスクリーニングにより得られた、導入遺伝子を含まない植物であって、組み込まれた外来遺伝子をゲノム内に含まずかつ遺伝的に安定である植物も、本発明の保護範囲に含まれる。
【００３２】
本発明はまた、導入遺伝子を含まない改変植物の育種方法を提供する。
【００３３】
具体的には、前記方法は以下：
（ａ）上記の方法を用いて対象の植物の標的遺伝子における標的部位に対して部位特異的改変を行うことにより、改変植物を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記改変植物から、植物を得るステップであって、ここで、該植物中の前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まず、かつ該植物が遺伝的に安定である、ステップ
を含みうる。
【００３４】
配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現により、本発明は、植物の再生能力を高めるだけでなく、生じた変異を子孫に安定的に伝達することもできる。さらに重要なことに、生じた変異体植物は組み込まれた外来遺伝子を含まず、したがって比較的高い生物学的安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７の部位特異的変異誘発（ＰＥＧ４０００媒介型プロトプラスト形質転換）を示す。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２およびレーン３は、プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＢｃｎＩ制限消化の結果であり、その際、前記プロトプラストはｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いて形質転換されたものであり、レーン４は、野生型プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＢｃｎＩ消化の結果であり、レーン５は、野生型プロトプラストのＰＣＲ産物である。
【図２】図２は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７の部位特異的変異誘発（パーティクルボンバードメントにより一過性発現系から得られた植物）を示す。図２ａは、電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン９までは、変異体を検出するためのＢｃｎＩ消化の結果であり、レーン５およびレーン６はホモ接合型変異を示し、レーン１０は、野生型対照に関するＢｃｎＩ消化の結果である。図２ｂは、切断されなかった図２ａからのバンドに関するシーケンシング結果であり、これはＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことを示す。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数（配列内の小文字は、挿入されたヌクレオチドを表す）を表し、左側の数字２〜８は、７つの変異体を表す。
【図３】図３は、ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５ベクター上でのプライマーを用いたコムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子変異体の増幅を示すゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン２４までは試験した変異体であり、レーン２５は陽性対照（プラスミドｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５）である。
【図４】図４は、導入遺伝子を含まないコムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子変異体を、ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター上の２つのプライマーセットを用いて検出するためのゲル電気泳動図である。図４ａは、プライマー対Ｃａｓ９−１Ｆ／Ｃａｓ９−１Ｒを用いた増幅結果であり、図４ｂは、プライマー対Ｃａｓ９−２Ｆ／Ｃａｓ９−２Ｒを用いた増幅結果である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン２４までは試験した変異体であり、レーン２５は陽性対照（プラスミドｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９）である。
【図５】図５は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたパーティクルボンバードメントによる一過性発現により得られたＴａＧＡＳＲ７変異体のＴ１世代における変異を示す。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２、レーン３、レーン４、レーン９およびレーン１０は、分離により生じたホモ接合型植物であり、レーン５は、分離により生じた野生型であり、かつレーン６、レーン７およびレーン８は、分離により生じたヘテロ接合型植物である。
【図６】図６は、ＴＡＬＥＮ系を用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＭＬＯの部位特異的変異誘発（パーティクルボンバードメントにより一過性発現系から得られた植物）を示す。図６ａは、電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン１３までは試験した変異体であり、レーン１４は陽性対照であり、レーン１５は陰性対照である。図６ｂは、図６ａから回収された切断されなかったバンドに関するシーケンシング結果であり、これはＴａＭＬＯ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことを示す。
【図７】図７は、一過性発現系を用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＭＬＯの部位特異的変異誘発により得られたＴ０−２１世代における変異体の消化の結果を示すゲル電気泳動図である。レーン１からレーン４８までは、それぞれＡ群およびＤ群における４８個のＴ１植物に関する消化の結果であり、レーン４９はマーカーである。ＡはＴａＭＬＯ−Ａ１遺伝子を表し、ＤはＴａＭＬＯ−Ｄ１遺伝子を表す。
【図８】図８は、導入遺伝子を含まないコムギＴａＭＬＯ遺伝子変異体を、Ｔ−ＭＬＯベクターにおいてトウモロコシプロモーターＵｂｉ−１に特異的なプライマーを用いて検出するためのゲル電気泳動図である。図８ａはＴ０植物を表す。レーン１はマーカーであり、レーン２からレーン１３までは１２個のＴ０変異体のＰＣＲ増幅の結果であり、レーン１４は陽性対照である。図８ｂはＴ１植物を表す。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン４９までは、Ｔ０−２１変異体の４８個の子孫のＰＣＲに関するゲル電気泳動図であり、レーン５０は陽性対照（プラスミドＴ−ＭＬＯ）である。
【図９】図９は、配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現による、コムギにおける導入遺伝子を用いないゲノム編集を示す。図９ａ：本方法の概略。配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）プラスミドは、パーティクルボンバードメントによりコムギ未熟胚に送達される。一過性発現後にこのプラスミドは分解され、一方でこの胚はカルスを生成し、このカルスは変異体実生を再生しうる。図９ｂ：ＴａＧＡＳＲ７同祖体（ｈｏｍｏｅｏｌｏｇ）のエクソン３の保存された領域内の部位を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡの配列。１２個の代表的なＴａＧＡＳＲ７変異体を解析するＰＣＲ−ＲＥアッセイの結果を示す。レーンＴ０−１からレーンＴ０−１２までは、ＢｃｎＩで消化された個々のコムギ植物から増幅されたＰＣＲ断片のブロットを示す。ＷＴ１およびＷＴ２の名称が付されたレーンはそれぞれ、ＢｃｎＩ消化を行った野生型植物から増幅されたＰＣＲ断片、およびＢｃｎＩ消化を行っていない野生型植物から増幅されたＰＣＲ断片である。赤色矢印で印付けられたバンドは、ＣＲＩＳＰＲ誘導変異により生じたものである。図９ｃ：シーケンシングにより特定された１２個の代表的な変異体植物の遺伝子型。図９ｄ：導入遺伝子を含まない変異体の検出に使用されるｐＧＥ−ｓｇＲＮＡベクターおよび５個のプライマーセットの構造の模式図。ｓｇＲＮＡとは、それぞれＴａＧＡＳＲ７、ＴａＮＡＣ２、ＴａＰＩＮ１、ＴａＬＯＸ２およびＴｄＧＡＳＲ７を標的とするｓｇＲＮＡを指す。図９ｅ：導入遺伝子を含まない変異体に関する、１２個の代表的なＴａＧＡＳＲ７変異体植物において５個のプライマーセットを用いた試験の成果。バンドなしのレーンは、導入遺伝子を含まない変異体を特定する。ＷＴ１およびＷＴ２の名称が付されたレーンはそれぞれ、野生型植物から増幅されたＰＣＲ断片およびｐＧＥ−ＴａＧＡＳＲ７ベクターを示す。
【図１０】図１０は、コムギプロトプラストにおけるＴａＧＡＳＲ７遺伝子、ＴａＮＡＣ２遺伝子、ＴａＰＩＮ１遺伝子、ＴａＬＯＸ２遺伝子における目的の変異を示す。レーン１およびレーン２：消化されたＳＳＮ形質転換プロトプラスト、レーン３およびレーン４：消化された野生型対照および未消化の野生型対照、Ｍ：マーカー。ＳＳＮ誘導変異の配列を、右側に示す。野生型配列を、各配列群の上部に示す。側方の数字は、変異の種類、および関与するヌクレオチドの数を示す。
【図１１】図１１は、ＴａＮＡＣ２変異体（図１１ａ）、ＴａＰＩＮ１変異体（図１１ｂ）およびＴａＬＯＸ２変異体（図１１ｃ）に関するＰＣＲ／ＲＥアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、特定のプライマーを用いたＳｈｉｍａｉ１１（図１２ａ）およびＹｕｍａｉ４（図１２ｂ）における４倍体ＴｄＧＡＳＲ７ｓ変異体のＰＣＲ／ＲＥ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な実施形態
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
【００３７】
以下の実施例において使用した材料、試薬は、別段の記載がない限りいずれも市販されている。
【００３８】
発現ベクターｐＴａＵ６−ｇＲＮＡおよびｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９は、“Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：６８６−６８８，（２０１３”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００３９】
発現ベクターｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９は、“Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ３２，  ９４７−９５１（２０１４）”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００４０】
コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅは、“Ｗｅｅｋｓ，  Ｊ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｗｈｅａｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０２：１０７７−１０８４，（１９９３）”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００４１】
コムギＴａＭＬＯ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮベクターＴ−ＭＬＯは、“Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｓｈａｎ，  Ｑ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｇａｏ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｑｉｕ，  Ｊ．Ｌ．（２０１４）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ３２，  ９４７−９５１”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００４２】
コムギプロトプラストの調製および形質転換に使用した溶液を、表１から表４までに示す。
【００４３】
表１：酵素分解溶液５０ｍｌ
【表１】
2018502590.tif 000003
【００４４】
表２：Ｗ５  ５００ｍｌ
【表２】
2018502590.tif 000004
【００４５】
表３：ＭＭＧ溶液１０ｍｌ
【表３】
2018502590.tif 000005
【００４６】
表４：ＰＥＧ溶液４ｍｌ
【表４】
2018502590.tif 000006
【００４７】
上記表１から表４までにおいて、％は、質量／体積百分率、ｇ／１００ｍｌ、を示す。
【００４８】
コムギ組織の培養に使用した培地は、以下のものを含む：
高張培地：ＭＳ最少培地、９０ｇ／Ｌ  マンニトール、５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ  スクロース、および３ｇ／Ｌ  フィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
誘導培地：ＭＳ最少培地、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．６ｍｇ／Ｌ  硫酸銅、０．５ｍｇ／Ｌ  カゼイン加水分解物、３０ｇ／Ｌ  スクロース、および３ｇ／Ｌ  フィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
分化培地：ＭＳ最少培地、０．２ｍｇ／Ｌ  カイネチン、３０ｇ／Ｌ  スクロース、および３ｇ／Ｌ  フィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
発根培地：１／２ＭＳ最少培地、０．５ｍｇ／Ｌ  エタンスルホン酸、０．５ｍｇ／Ｌ  α−ナフチル酢酸、３０ｇ／Ｌ  スクロース、および３ｇ／Ｌ  フィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
【００４９】
実施例
実施例１  パーティクルボンバードメントによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの一過性発現による、導入遺伝子を含まないｔａｇａｓｒ変異体の取得
【００５０】
Ｉ．標的部位：標的Ｃ５の設計
標的Ｃ５：（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ０９５３３２、２４８〜２６８位に示されるＴａＧＡＳＲ７遺伝子における）５’−ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ−３’。
【００５１】
ＩＩ．Ｃ５部位を含むｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミドの調製
Ｃ５は、標的Ｃ５に相補的に結合しうるＲＮＡのＤＮＡ配列である。
【００５２】
以下の粘着末端（下線）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ５Ｆ：５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧ−３’；
Ｃ５Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡ−３’
オリゴヌクレオチドのアニーリング処理により粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミド中の２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ５部位を含むｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミドのＢｂｓＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５と命名した。
【００５３】
ＩＩＩ．コムギプロトプラストへのｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の送達
ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９ベクターと、ステップＩＩで得られたｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５プラスミドとを、コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅのプロトプラストに導入した。具体的なプロセスは、以下のものを含む。
【００５４】
１．コムギ実生の生長
コムギ種子を、培養室内で、２５±２℃、照度１０００Ｌｘ、明所１４〜１６ｈ／日で約１〜２週間生長させた。
【００５５】
２．プロトプラストの単離
１）コムギの柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用してこの葉の中央部分を切断して０．５〜１ｍｍの糸状物とし、これらを暗所で（溶媒として水を使用した）０．６Ｍマンニトール溶液中に１０分間置いた。次いで、フィルターを用いてこの混合物をろ過し、次いで酵素分解溶液５０ｍｌ中に入れて５時間消化した（酵素分解を真空中で０．５時間行い、次いで１０ｒｍｐでゆっくりと４．５時間振盪した）。
注釈：酵素分解時の温度を２０〜２５℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
２）Ｗ５  １０ｍｌを加えることによりこの酵素分解物を希釈し、７５μｍのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、５０ｍｌ丸底遠沈管に入れた。
注釈：ナイロンろ過膜を７５％（体積％）エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にＷ５中に２分間浸漬させることが望ましい。
３）２３℃で１００×ｇの遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
４）このペレットをＷ５  １０ｍｌで懸濁させ、これを氷上に３０分間置いた。これらのプロトプラストは、最終的に沈降物を形成した。そして上清を廃棄した。
５）適量のＭＭＧ溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
注釈：これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査（×１００）により測定する必要がある。プロトプラストの量は、２×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌであった。
【００５６】
３．コムギプロトプラストの形質転換
１）ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター１０μｇと、ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５プラスミド１０μｇとを、２ｍｌ遠沈管に加えた。ピペットを用いて、上記ステップ２で得られたプロトプラスト２００μｌを加え、次いで穏やかに叩くことにより混合し、３〜５分間静置した。次いでＰＥＧ４０００  ２５０μｌを加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で３０分間行った。
２）Ｗ５（室温）９００μｌを加え、反転により混合し、１００×ｇの遠心分離を３分間行い、かつ上清を廃棄した。
３）Ｗ５  １ｍｌを加え、反転により混合し、内容物を（予めＷ５  １ｍｌを加えておいた）６ウェルプレートに穏やかに移し、次いで２３℃で一晩培養した。
【００５７】
ＩＶ．ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７の変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
コムギプロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅのプロトプラストを対照として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。コムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ０９５３３２）の標的部位（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ０９５３３２の２４８〜２６８位）は、制限エンドヌクレアーゼＢｃｎＩの認識配列（５’−ＣＣＳＧＧ−３’、ＳはＣまたはＧを表す）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼＢｃｎＩを使用した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった：
ＴａＧＡＳＲ７−Ｆ：５’−ＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’；
ＴａＧＡＳＲ７−Ｒ：５’−ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＡ−３’
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果を図１に示す。これらの結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図中の未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【００５８】
Ｖ．パーティクルボンバードメントを用いたコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７の部位特異的編集
１）コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅの未熟胚を採取し、高張培地を用いて４時間処理した。
２）ステップ１）で高張培養したコムギ未熟胚への撃込みを行うためにパーティクルボンバードメント装置を使用し、このコムギ未熟胚の細胞に、ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５プラスミドおよびｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクターを導入した。各撃込みの撃込み間隔は６ｃｍであり、撃込み圧力は１１００ｐｓｉであり、撃込み直径は２ｃｍであり、送達すべきＤＮＡを分散させるために撃込みにおいて金粉末を使用し、この金粉末の使用量は各撃込みにおいて２００μｇであり、送達すべきＤＮＡは０．１μｇ（ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５プラスミドおよびｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター、各０．０５μｇ）であり、かつ金粉末の粒径は０．６μｍであった。
３）ステップ２）で撃込みを行ったコムギ未熟胚を、１６時間高張培養した。
４）次いで、ステップ３）で高張培養したコムギ未熟胚を順次、１４日間のカルス組織誘導培養、２８日間の分化培養および１４〜２８日間の発根培養に供して、コムギ植物を得た。
５）ステップ４）で生成させた４００×４のコムギ実生からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ／ＲＥ試験により遺伝子ノックアウト（部位特異的）を伴う８０個の変異体を得た（詳細な試験方法および使用したプライマーに関しては、ステップＩＶを参照）。野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅを対照として使用した。
変異体のうちいくつかに関する試験結果を図２に示す。これらの結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図中の未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（シーケンシング結果を、図２ｂに示す）。
６）ステップ５）で得られた８０個の変異体をＰＣＲ増幅に使用して、これらの変異体がｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系プラスミドの断片を含むか否かを検出した。３対のプライマーを設計し、その際、１対をｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５ベクター内に配置し、２対をｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター内に配置した。８０個の変異体のＤＮＡをテンプレートとして用い、これら３対のプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行った。これらの実験において、プラスミド陽性対照（ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５ベクターまたはｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター）も準備した。
【００５９】
ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５ベクター中のプライマー：
Ｕ６Ｆ：５’−ＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡ−３’；
Ｃ５Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡ−３’
理論的には、増幅される断片は約３８２ｂｐであるはずであり、配列は配列番号１の１〜３８２位に存在するはずである。
【００６０】
ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター中のプライマー：
Ｃａｓ９−１Ｆ：５’−ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＡＧＡ−３’；
Ｃａｓ９−１Ｒ：５’−ＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＣＣ−３’
理論的には、増幅される断片は１２００ｂｐであるはずであり、配列は配列番号２の３０９５〜４２６４位に存在するはずである。配列番号２は、ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクターの全長配列である。
【００６１】
Ｃａｓ９−２Ｆ：５’−ＡＣＣＡＡＣＧＧＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣ−３’；
Ｃａｓ９−２Ｒ：５’−ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧ−３
理論的には、増幅される断片は７５０ｂｐであるはずであり、配列は配列番号２の４２３７〜４９８０位に存在するはずである。
【００６２】
ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ５ベクター中のプライマーを使用して、コムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子変異体を増幅した。ゲル電気泳動図を図３に示す。ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター中のプライマーを使用して、コムギＴａＧＡＳＲ７変異体を増幅した。ゲル電気泳動図を図４ａ（プライマー対Ｃａｓ９−１Ｆ／Ｃａｓ９−１Ｒに相当）および図４ｂ（プライマー対Ｃａｓ９−２Ｆ／Ｃａｓ９−２Ｒに相当）に示す。図３および図４の結果から明らかである通り、ステップ５）で得られたコムギＴａＧＡＳＲ７変異体のいずれも、増幅された標的断片を含んでいなかった。このことは、これらの変異体がｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系プラスミドの断片を含んでいなかったことを実証している。したがって本発明によって、植物において部位特異的改変が行われる際には導入遺伝子の挿入も保有も阻止され、それにより導入遺伝子の安全性の問題および周知の懸念が回避される。
【００６３】
ＶＩ．パーティクルボンバードメントを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の一過性発現により得られた変異体を、子孫に安定的に伝達することができる。
パーティクルボンバードメントを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の一過性発現により得られたＴ０変異体の自家受精により、Ｔ１植物を得た。プライマーを用いたＰＣＲにより、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子を増幅した。次いで、これらのＰＣＲ産物を単一の酵素ＢｃｎＩにより消化した（ＩＶステップを参照）。Ｔ１植物の変異を調べた。図５は、ランダムに選択された９個のＴ１植物に関するＰＣＲ／ＲＥの結果である。
【００６４】
実施例２  パーティクルボンバードメントによるＴＡＬＥＮヌクレアーゼの一過性発現による、導入遺伝子を含まない遺伝性Ｔａｍｌｏ変異体の取得
Ｉ．Ｔ−ＭＬＯベクターを一過的に送達してコムギＭＬＯ遺伝子の部位特異的編集を行うための、パーティクルボンバードメントの使用
ＴＥＬＥＮプラスミドは、対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現しうるＴ−ＭＬＯベクターであり、このＴＡＬＥＮタンパク質は、標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。標的部位は、以下の通りである：
【化２】
2018502590.tif 000007
下線部は、制限エンドヌクレアーゼＡｖａＩＩの認識配列である。
（１）コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅの未熟胚を採取し、高張培地を用いて４時間高張処理した。
（２）ステップ（１）で高張培養したコムギ未熟胚への撃込みを行うためにパーティクルボンバードメント装置を使用し、このコムギ未熟胚の細胞にＴ−ＭＬＯベクターを導入した。それぞれの撃込みの撃込み間隔は６ｃｍであり、撃込み圧力は１１００ｐｓｉであり、撃込み直径は２ｃｍであり、送達すべきＤＮＡを分散させるために撃込みにおいて金粉末を使用し、この金粉末の使用量は各撃込みにおいて２００μｇであり、送達すべきＤＮＡは０．１μｇ（Ｔ−ＭＬＯ）であり、かつ金粉末の粒径は０．６μｍであった。
（３）ステップ（２）で撃込みを行ったコムギ未熟胚を、１６時間高張培養した。
（４）次いで、ステップ（３）で高張培養したコムギ未熟胚を順次、１４日間のカルス組織誘導培養、２８日間の分化培養および１４〜２８日間の発根培養に供して、コムギ植物を得た。
（５）ステップ（４）で生成されたコムギ実生からＤＮＡを抽出した。特定のプライマーを用いてＰＣＲによりそれぞれＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子（配列番号３）、ＴａＭＬＯ−Ｂ遺伝子（配列番号４）およびＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子（配列番号５）を増幅し、これらのＰＣＲ増幅産物を単一の酵素ＡｖａＩＩにより消化した（対を成すＴＡＬＥＮタンパク質により切断されたこれら３つのＭＬＯ遺伝子の標的部位はいずれもＡｖａＩＩ認識配列を含み、したがってＰＣＲ産物を切断できない場合には、このことはその部位で変異が生じたことを示す）。野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅを対照として使用した。
【００６５】
ＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子を増幅するために使用したプライマー対は、以下のものである：
フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣ−３’；
リバースプライマー：５’−ＴＡＣＧＡＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡ−３’。
【００６６】
ＴａＭＬＯ−Ｂ遺伝子を増幅するために使用したプライマー対は、以下のものである：
フォワードプライマー：５’−ＡＴＡＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＧ−３’；
リバースプライマー：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴ−３’。
【００６７】
ＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子を増幅するために使用したプライマー対は、以下のものである：
フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴ−３’；
リバースプライマー：５’−ＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＴＴ−３’。
【００６８】
これらの結果から、ＴＡＬＥＮプラスミドＴ−ＭＬＯをコムギ未熟胚に導入して一過的に発現させた後に、この未熟胚から再生されたＴ０植物においてコムギ由来ＭＬＯ遺伝子の部位特異的改変が生じ、これには、ＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子の部位特異的改変をほとんど有しないヘテロ接合型植物、ＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子の部位特異的改変をほとんど有しないヘテロ接合型植物、ＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子とＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子の双方の部位特異的改変を有するヘテロ接合型植物が含まれることが判明した（これらのヘテロ接合型植物のうちいくつかからゲノムＤＮＡを抽出し、これをさらにＡｖａＩＩ酵素により消化した。結果を図６に示す。シーケンシング結果のうちのいくつかを、図６ｂに示す）。
【００６９】
ＩＩ．パーティクルボンバードメントを用いたＴＡＬＥＮの一過性発現により得られた変異体を、子孫に安定的に伝達することができる。
上記パーティクルボンバードメントを用いたＴ−ＭＬＯの導入による一過性発現により得られたＴ０変異体の自家受精により、Ｔ１植物を得た。特定のプライマーを使用して、ＰＣＲによりそれぞれＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子、ＴａＭＬＯ−Ｂ遺伝子およびＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子を増幅し、これらのＰＣＲ産物を単一の酵素ＡｖａＩＩにより消化した（具体的なステップに関しては、ステップＩを参照）。Ｔ１植物の変異を調べた。例えば、Ｔ０−２１の遺伝子型はＡａＢＢＤｄであり、Ｔ１世代から４８個の子孫を得た。Ａに関しては、１３個の植物がＡＡであり、２６個の植物がＡａであり、９個の植物がａａであり、Ｄに関しては、９個の植物がＤＤであり、２４個の植物がＤｄであり、１５個の植物がｄｄであり、これらは実質的にメンデル性遺伝にしたがっていた（図７）。このことは、パーティクルボンバードメントを用いたＴＡＬＥＮの導入により一過性形質転換を行うことによって得られた変異体が、子孫に変異を安定的に伝達できることを示している。
【００７０】
ＩＩＩ．Ｔ０植物およびＴ１植物がベクターＴ−ＭＬＯを含むか否かを検出するためのＰＣＲ法の使用
Ｔ−ＭＬＯベクターにおいて、トウモロコシプロモーターＵｂｉ−１によりＴＡＬＥＮを開始する。Ｕｂｉ−１に応じてプライマー対を設計し、これを使用してＴ０植物およびＴ１植物を増幅することにより、パーティクルボンバードメントを用いた一過性形質転換により得られた変異体のゲノムが、組み込まれたＴＡＬＥＮベクターを含むか否かを検出した。
【００７１】
Ｕｂｉ−Ｆ：５’−ＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＡＧ−３’；
Ｕｂｉ−Ｒ：５’−ＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡ−３’
理論的には、増幅される断片は約１３８７ｂｐであるはずであり、配列は配列番号６の１９１〜１５７７の位置に存在するはずである。配列番号６は、ＴＡＬＥＮ（Ｔ−ＭＬＯ）の全配列である。
【００７２】
これらの結果から、Ｔ０植物のいずれも標的バンドを増幅しえないことが判明した（図８ａ）。Ｔ１集団に関しても同様にＴ０−１４の子孫を選択して増幅したところ、４８個の子孫植物のいずれも標的バンドを増幅しえないことが明らかとなった（図８ｂ）。このことは、本発明によって、植物において部位特異的改変が行われる際には導入遺伝子の挿入も保有も阻止され、また得られた変異体は比較的高い生物学的安全性を有するとともに、この変異体を安定的に伝達できることを示している。
【００７３】
実施例３  一過性発現に基づく遺伝子編集手法のさらなる検証
標的として５つの異なるコムギ遺伝子を用いて、本発明のゲノム編集手法をさらに試験した。
【００７４】
まず、ＴａＧＡＳＲ７の３つの同祖体（ＴａＧＡＳＲ７−Ａ１、ＴａＧＡＳＲ７−Ｂ１およびＴａＧＡＳＲ７−Ｄ１）を編集した。これらの同祖体は、穀粒の長さおよび質量の決定に関与することが知られている１。これら３つの同祖体はそれぞれ、３つのエクソンおよび２つのイントロンを有する（図９ｂ）。エクソン３は高度に保存されているため、このエクソン３を標的とするｓｇＲＮＡｓを設計した。プロトプラストにおけるヌクレアーゼ活性の初期試験を行った後に２、最も効率の高いｓｇＲＮＡ発現カセット（表５）を、単一の構築物においてＣａｓ９と組み合わせた（ｐＧＥ−ＴａＧＡＳＲ７、図９ｄ）。これを、２つの一般的なコムギ変種（ＢｏｂｗｈｉｔｅおよびＫｅｎｏｎｇ１９９）の未熟胚にパーティクルボンバードメントにより導入した。２週間で胚発生カルスが生じ、このカルスから４〜６週間で多数の実生（高さ２〜３ｃｍ）が再生された。大半の植物ゲノム編集実験とは対照的に、遺伝子導入植物を選択するための培地には、除草剤も抗生物質も加えなかった（図９ａ）。選択的でない条件下で、実生の再生に要する合計時間は６〜８週間であった。これは以前の研究において発表されたものよりも２〜４週間短い３。
【００７５】
再生されたＴ０実生におけるｓｇＲＮＡ標的部位をＰＣＲ−ＲＥにより解析し、その際、まず３つのＴａＧＡＳＲ７同祖体すべてを認識する保存されたプライマーセット（表６）を使用し、次いでこれら３つの各同祖体に特異的な３つのプライマー対（表６）を使用した。１００５個のＢｏｂｗｈｉｔｅ実生のうち、標的とする領域においてインデルを伴う合計８０個（８．０％）のＴａＧＡＳＲ７変異体を特定し、かつ２８３個のＫｅｎｏｎｇ１９９実生のうち、そのような２１個（７．４％）の変異体のさらなるセットを特定した（表７）。３つすべての同祖体において、目的の変異が観察された（図９ｂ、図９ｃ）。８０個のＢｏｂｗｈｉｔｅ変異体実生のうち、ＴａＧＡＳＲ７−Ａ１変異体、ＴａＧＡＳＲ７−Ｂ１変異体およびＴａＧＡＳＲ７−Ｄ１変異体のほぼすべての組み合わせが特定され、これらには、３つすべてのゲノムが改変された少なくとも１つの対立遺伝子を有する５１個の変異体が含まれていた（表８）。これら５１個の変異体のうち８個は、同時にノックアウトされた６つすべての対立遺伝子を有していた（表８）。これらのデータは、Ｔ０集団におけるＴａＧＡＳＲ７の目的の変異の生成に際して本発明の方法が極めて効率的であることを示唆している。
【００７６】
次に、この手法が広く適用可能であるか否かを調べるため、他のコムギ遺伝子を標的とした。イネのコムギ相同体ＮＡＣ２およびＰＩＮ１ならびにコムギリポキシゲナーゼ遺伝子（ＴａＬＯＸ２）を標的とした。イネにおいて、ＮＡＣ２は苗条の分枝を調節することが判明しており４、ＰＩＮ１は、オーキシン依存性の不定根の出現および分げつに必要である５。ＴａＬＯＸ２は穀粒発育時に高度に発現され、コムギ穀粒の保存性に影響を与えうる６。４つの遺伝子のそれぞれについてＣＲＩＳＰＲ構築物を生成し（図１０および表５）、かつ一過性発現手法により多数のＴ０実生を得た（図９ａ、表７）。簡単にするため、保存されたプライマー（表６）のみを設計してＴａＮＡＣ２、ＴａＰＩＮ１およびＴａＬＯＸ２における変異を検出し、その際、これらのうち最後に記載したものは、単一コピーとして存在する（ＤゲノムにおけるＴａＬＯＸ２−Ｄ１）。ＰＣＲ−ＲＥ解析により、Ｔ０実生において３つすべての遺伝子における目的の変異を容易に特定した（図１１）。変異頻度は２．５％から９．２％まで変動し、我々は７６個の変異体植物のうち３４個（４４．７％）のｔａｌｏｘ２−ｄｄホモ接合型変異体を特定した（表７）。一般的なコムギの他に、デュラムコムギ（ＴｒｉｔｉｃｕｍｔｕｒｇｉｄｕｍＬ．  ｖａｒ．  ｄｕｒｕｍ、ＡＡＢＢ、２ｎ＝４ｘ＝２８）も、パスタ食品に広く使用されている重要な作物である。ＧＡＳＲ７は４倍体コムギおよび６倍体コムギにおいて高度に保存されているため、我々は２つの異なるデュラムコムギ変種にベクターｐＧＥ−ＴａＧＡＳＲ７を導入した。これらの４倍体コムギ系統のＴ０実生における目的の変異の頻度は３％を上回り、４つすべての対立遺伝子の同時編集により生じるホモ接合型変異体を得ることができた（表７および図１２）。これらの結果から、本発明のゲノム編集手法があらゆるコムギ遺伝子およびあらゆるコムギ変種に有効である可能性が高いことが判明した。
【００７７】
これらのＴ０実生を選択の非存在下で再生させたため、ＣＲＩＳＰＲ構築物がコムギゲノムに組み込まれない確率が高かった。このことを、Ｔ０実生におけるＣＲＩＳＰＲ構築物を保有するプラスミドＤＮＡの存在についてＰＣＲを用いて試験することにより調べた。各構築物の５つの別個の領域に特異的なプライマーセット（表６）を設計した。これらは、それらのすべての主要な構成要素を表す（図９ｄ）。この種のＰＣＲ解析に基づき、ＴａＧＡＳＲ７に関してＴ０変異体の４３．８％（栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）（図９ｅ）および６１．９％（栽培品種Ｋｅｎｏｎｇ１９９）において、ＣＲＩＳＰＲ構築物が存在しないことが判明した（表７）。他の３つの遺伝子に関しては、導入遺伝子を含まない実生の頻度は７５．０％（ＴａＮＡＣ２）、６２．５％（ＴａＰＩＮ１）および８６．８％（ＴａＬＯＸ２）であった（表７）。同様に、２つのデュラムコムギ変種のＴ０変異体実生の５４．５％〜５８．３％において、ＣＲＩＳＰＲ構築物が組み込まれていないことが判明した（表７）。したがって、このゲノム編集手法を用いることで、ＣＲＩＳＰＲ構築物を含まない目的の変異体が得られる。
【００７８】
また本系を、他の配列特異的ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと共に使用できることが判明した。本発明者らはすでに、一般的なコムギにおけるＭＬＯ遺伝子座を標的とする一対のＴＡＬＥＮについて記載し、かつＴＡＬＥＮ構築物が存在するよう選択するために除草剤ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を含む培地上で再生された実生に関して３．４％の編集効率を報告している３。本研究では、同一のＴＡＬＥＮ対を未熟胚に送達して、実生を選択なしで再生することができる。再生された２００個のＴ０実生のうち１３個（６．５％）が目的の変異を保有しており、ＰＣＲにより評価した場合にこれらはいずれも導入遺伝子を含んでいなかった（表５および表７）。
【００７９】
本発明の方法により生成された変異を次の世代に伝達しうるか否かを調べるために、代表的なＴ０のＴａＧＡＳＲ７変異体、ＴａＭＬＯ変異体およびＴａＬＯＸ２変異体を自家受粉させ、Ｔ１子孫をＰＣＲ−ＲＥにより解析した。Ｔ０において検出されたホモ接合型変異（６つすべての対立遺伝子の同時編集を伴うものを含む）に関して、伝達率は１００％であり、大部分のヘテロ接合型変異体に関してメンデル分離が生じた（ホモ接合型／ヘテロ接合型／野生型：１：２：１）（表９）。予想通り、導入遺伝子を含まないＴ０親のＴ１子孫においては、組込みが行われていないＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮ構築物が検出された（表９）。
【００８０】
要約すると、本発明のＳＳＮ一過性発現方法は、遺伝子導入中間体を伴う一般に使用されるゲノム編集手法に対して複数の利点を提供する。第１に、標的遺伝子の編集が高頻度で生じるとともに、導入遺伝子を含まないホモ接合型変異体を迅速に得ることができる。以前の研究では、植物ゲノムに組み込まれたｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９カセットおよびＴＡＬＥＮがそれらの活性を保持するとともに、それらが子において新たな変異を生じうることを報告した７、３。導入遺伝子を含まない変異体によって、後続の解析の煩雑性およびオフターゲットのリスクが低減するはずである。また、導入遺伝子を含まない変異体は、規制の監視下に置かれにくくなるはずである。第２に、カルス細胞からの植物再生は大半の種において可能であるため、本発明の手法により、形質転換が困難である植物から変異体を容易に得ることができる。本発明の方法は、導入遺伝子の分離除去が困難または不可能である栄養繁殖作物、例えばジャガイモ、キャッサバおよびバナナにおける遺伝子改変にも有用でありうる。本明細書において説明した手法により、植物遺伝子機能の解明が進むとともに、価値ある新規な作物の栽培品種の生産が可能となる。
【００８１】
表５  ＳＳＮ標的遺伝子座および配列
【表５】
2018502590.tif 000008
【００８２】
表６  ＰＣＲプライマーおよびそれらの適用
【表６】
2018502590.tif 000009
【００８３】
表７  配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現による、コムギにおける導入遺伝子を用いないゲノム編集
【表７】
2018502590.tif 000010
【００８４】
表８  ＴａＧＡＳＲ７−Ａ１ホモ接合型対立遺伝子、ＴａＧＡＳＲ７−Ｂ１ホモ接合型対立遺伝子およびＴａＧＡＳＲ７−Ｄ１ホモ接合型対立遺伝子における変異に関する、８０個のＴ０のｔａｇａｓｒ７変異体の遺伝子型
【表８】
2018502590.tif 000011
Ｎ．Ａ．：入手不能。これらの変異体種は、実験により得られなかった；
Ｎ．Ｄ．：不検出
ａ「−」は、示された数のヌクレオチドが欠失していることを示し、「＋」は、示された数のヌクレオチドが挿入されていることを示し、「−／＋」は、示された数のヌクレオチドが同一部位で同時に欠失および挿入されていることを示す。
【００８５】
表９  ＴａＧＡＳＲ７同祖体、ＴａＭＬＯ同祖体およびＴａＬＯＸ２同祖体におけるＳＳＮ誘導変異ならびにＴ１世代への該変異の伝達の、分子学的な遺伝子解析
【表９−１】
2018502590.tif 000012
【表９−２】
2018502590.tif 000013
ヘテロ：ヘテロ接合型；ホモ：ホモ接合型。
ａ「−」は、示された数のヌクレオチドが欠失していることを示し、「＋」は、示された数のヌクレオチドが挿入されていることを示し、「−／＋」は、示された数のヌクレオチドが同一部位で同時に欠失および挿入されていることを示す。ｂ試験した植物の合計数に対する、観察された変異を保有する植物の数に基づく。ｃ試験した変異植物の合計数に対する、インタクトなＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮの構築物を有しない変異体植物の数に基づく。ｄχ２検定（Ｐ＞０．５）によれば、ヘテロ接合型系統の分離は１：２：１のメンデル比にしたがう。
【００８６】
全般的方法
ｓｇＲＮＡ標的の選択
コムギのＡゲノム、ＢゲノムおよびＤゲノムの保存されたドメインにおいて、各遺伝子に関する複数のｓｇＲＮＡ標的を設計した。ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９プラスミド３およびＴａＵ６−ｓｇＲＮＡプラスミド８をコムギプロトプラストに導入して形質転換することにより、これらのｓｇＲＮＡの活性を評価した。形質転換されたプロトプラストから全ゲノムＤＮＡを抽出し、標的配列の周囲の断片をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ−ＲＥ消化スクリーンアッセイを用いてｓｇＲＮＡ活性を検出した７（図９）。
【００８７】
プロトプラストアッセイ
春コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅおよび冬コムギ変種Ｋｅｎｏｎｇ１９９を、本研究において使用した。コムギプロトプラストの形質転換を、記載８の通りに行った。
【００８８】
ｐＧＥ−ｓｇＲＮＡベクターの構築
ＳｐｅＩ制限部位を有するプライマーセットＵ６−ＳｐｅＩ−Ｆ／ｓｇＲＮＡ−ＳｐｅＩ−Ｒ（表６）を用いて、ＴａＵ６−ｓｇＲＮＡプラスミド８から活性ＴａＵ６−ｓｇＲＮＡの断片（表５）を増幅した。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩで消化し、これらを、ＳｐｅＩで消化したｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９（文献３）に挿入して、融合発現ベクターｐＧＥ−ｓｇＲＮＡを得た（図９ｄ）。
【００８９】
一過性発現系によるコムギのバイオリステック形質転換
バイオリステック形質転換を、以前に記載した通りに行った９。プラスミドＤＮＡ（ｐＧＥ−ｓｇＲＮＡまたはＴ−ＭＬＯ３）（図９ｄ）を使用して、コムギ胚に撃込んだ。撃込んだ後、これらの胚をカルス誘導培地に移した。第３週目にすべてのカルスを再生培地に移した。３〜５週間後にこれらのカルスの表面で発芽した。これらを発根培地に移し、約１週間後に多数のＴ０実生を得た。組織培養プロセス（図９ａ）のいずれの部分においても、選択剤を使用しなかった。
【００９０】
アクセッションコード
配列データは、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋでアクセッション番号ＫＪ００００５２（ＴａＧＡＳＲ７−Ａ１）、ＫＪ００００５３（ＴａＧＡＳＲ７−Ｂ１）、ＫＪ００００５４（ＴａＧＡＳＲ７−Ｄ１）、ＡＹ６２５６８３（ＴａＮＡＣ２）、ＡＹ４９６０５８（ＴａＰＩＮ１）およびＧＵ１６７９２１（ＴａＬＯＸ２）で入手可能である。
【００９１】
【化３】
2018502590.tif 000014
【図１】
2018502590.tif 000015
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
2018502590.tif 000020
【図５】
2018502590.tif 000021
【図６ａ】
2018502590.tif 000022
【図６ｂ】
2018502590.tif 000023
【図７】
2018502590.tif 000024
【図８ａ】
2018502590.tif 000025
【図８ｂ】
2018502590.tif 000026
【図９】
2018502590.tif 000027
【図１０】
2018502590.tif 000028
【図１１ａ】
2018502590.tif 000029
【図１１ｂ】
2018502590.tif 000030
【図１１ｃ】
2018502590.tif 000031
【図１２ａ】
2018502590.tif 000032
【図１２ｂ】
2018502590.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
2018502590.tif 000034
2018502590.tif 000035
2018502590.tif 000036