(57)【要約】本発明は、GCRAペプチドと、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、および標識剤などの1つまたは複数の構成成分とを含む結合体を用いて、結腸がんを検出および処置する方法を提供する。2018534317.tif 000024
2018534317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）GCRAペプチドと
（b）該GCRAペプチドが結合されている1つまたは複数の構成成分と
を含む結合体であって、該1つまたは複数の構成成分が、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、および標識剤からなる群より選択される、結合体。
【請求項２】
前記ペプチドと前記1つまたは複数の構成成分とが、直接またはリンカーを介して共有結合している、請求項1に記載の結合体。
【請求項３】
リンカーが、4〜10炭素長である、請求項2に記載の結合体。
【請求項４】
GCRAペプチドが、生物学的活性を維持している、請求項2に記載の結合体。
【請求項５】
薬物送達ビヒクルが、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体、ナノ粒子薬物担体、およびデンドリマーからなる群より選択される、請求項1に記載の結合体。
【請求項６】
前記構成成分が薬物送達ビヒクルであり、前記結合体が、該薬物送達ビヒクル中に封入された少なくとも1つの化学療法剤をさらに含む、請求項1に記載の結合体。
【請求項７】
少なくとも1つの化学療法剤が、タキサン、アントラサイクリン、プラチン、または5-フルオロウラシル、およびそれらの任意の組み合わせである、請求項6に記載の結合体。
【請求項８】
薬物送達ビヒクルがナノ粒子である、請求項6に記載の結合体。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、PLAベースまたはPLGAベースのナノ粒子である、請求項8に記載の結合体。
【請求項１０】
構成成分がGCRAペプチドのN末端に結合されている、請求項1に記載の結合体。
【請求項１１】
構成成分がイメージング剤である、請求項1に記載の結合体。
【請求項１２】
イメージング剤が、蛍光色素または放射性部分である、請求項1に記載の結合体。
【請求項１３】
構成成分が標識剤である、請求項1に記載の結合体。
【請求項１４】
標識剤がビオチンである、請求項13に記載の結合体。
【請求項１５】
ビオチン結合体が、蛍光色素に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンでの検出によって追跡される、請求項14に記載の結合体。
【請求項１６】
GCRAペプチドが、表1〜8のいずれか1つのアミノ酸配列から本質的になるペプチドである、請求項1に記載の結合体。
【請求項１７】
GCRAペプチドが、SEQ ID NO: 1（SP-304）、SEQ ID NO: 8（SP-326）、SEQ ID NO: 9（SP-333）、SP364（SEQ ID NO: 100）、またはSP366（SEQ ID NO: 102）である、請求項16に記載の結合体。
【請求項１８】
GCRAペプチドが、N末端にD-アミノ酸を含有しない、請求項16に記載の結合体。
【請求項１９】
GCRAペプチドが、C末端にD-アミノ酸を含有する、請求項16に記載の結合体。
【請求項２０】
GCRAペプチドが、N末端にD-アミノ酸を含有せず、かつC末端にD-アミノ酸を含有する、請求項16に記載の結合体。
【請求項２１】
GCRAペプチドが、2つの構成成分と結合している、請求項1に記載の結合体。
【請求項２２】
GCRAペプチドが、ナノ粒子およびイメージング剤と結合している、請求項21に記載の結合体。
【請求項２３】
GCRAペプチドが、ナノ粒子および化学療法剤と結合している、請求項21に記載の結合体。
【請求項２４】
ナノ粒子が、GCRAペプチドのC末端に結合されている、請求項21〜23に記載の結合体。
【請求項２５】
イメージング剤が、GCRAペプチドのN末端に結合されており、かつナノ粒子が、GCRAペプチドのC末端に結合されている、請求項22に記載の結合体。
【請求項２６】
化学療法剤が、GCRAペプチドのN末端に結合されており、かつナノ粒子が、GCRAペプチドのC末端に結合されている、請求項23に記載の結合体。
【請求項２７】
前記請求項のいずれか一項に記載の結合体および薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
【請求項２８】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象における結腸腺腫および結腸微小腺腫の発生率の低減のための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である、方法。
【請求項２９】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象において結腸がんの発生率を低減させるための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である、方法。
【請求項３０】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象において結腸がん転移の発生率を低減させるための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である、方法。
【請求項３１】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象において腺腫発生のリスクを低下させる方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である、方法。
【請求項３２】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象において結腸がん転移を処置する方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である、方法。
【請求項３３】
対象が、そのような腺腫または微小腺腫を発生するリスクを有する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
対象が、結腸がん、結腸腺腫、結腸微小腺腫、もしくは結腸ポリープと診断されているか、または、結腸がん、結腸腺腫、結腸微小腺腫、もしくは結腸ポリープと診断された近い血縁関係を有する、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
結腸組織を請求項27に記載の組成物と接触させる工程を含む、結腸微小腺腫または平坦結腸直腸異形成を検出する方法であって、構成成分が、イメージング剤または標識剤である、方法。
【請求項３６】
請求項27に記載の組成物を対象に投与する工程であって、構成成分がイメージング剤である、工程、および対象において該イメージング剤を検出する工程による、結腸直腸がん転移または平坦結腸直腸異形成を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、結腸がんおよびその転移の早期の検出および処置のための組成物および方法に関する。
【０００２】
政府の利益
本発明は、国立癌研究所（National Cancer Institute）により授与されたCA165207-01の下、政府の支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
結腸のがんは、西洋世界において一般的かつ致命的な疾患である。遺伝的素因が重要な役割を果たすが、悪性腫瘍が発生するのには、がんを開始および促進する物質に対する曝露が必須である。
【０００４】
正常な結腸粘膜において、粘膜壁に沿って腺窩の上部2/3に並ぶ上皮細胞は、通常、非増殖性であるが、腺窩の下部1/3に並ぶものは増殖性である。増殖性細胞は、腺窩の上部に向かって遊走するにつれて、形質転換してその増殖能力を失う。最終的に、最も古い細胞は、結腸の正常な機能において結腸表面から落ちる。しかし、増殖性上皮細胞が、腺窩の上部1/3に到達した後にその増殖能力を保持するように誘導されると、正常なプロセスがうまくいかなくなる場合があり、微小腺腫が形成する。今や結腸の表面にある増殖性細胞が、増殖し続けて、ポリープが発生する。
【０００５】
ポリープは、良性またはがん性のいずれかでありうる。いくつかは決してがん性にならないが、腺腫性ポリープが結腸がんの主な前駆体であること、および結腸がんの約90％が腺腫性ポリープから発生することが確信されている。大部分の腺腫は、サイズが成長し続けないが、成長する腺腫は、悪性変化を発生する可能性がより高い。特に、平坦結腸直腸異形成は、しばしば、結腸がんスクリーニングの内視鏡検査中に見落とされるが、結腸および直腸の裏打ち内の平坦病変は、ポリープよりもがん性である可能性が高いことが実証されている。このように、結腸および直腸におけるポリープ状不確定物および平坦異形成病変を含む、異形成症の特異的検出のための診断法を開発する、まだ対処されていない必要性がある。したがって、腺腫の数を低減させること、および／またはそれらの成長を防止することは、将来起こる可能性のある結腸がんの数を実質的に低減させる。
【０００６】
したがって、結腸直腸がんの早期検出、処置、および防止のための方法について、必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
種々の局面において、本発明は、GCRAペプチドと少なくとも1つの構成成分との結合体であって、該構成成分が任意でスペーサーによって付着されている結合体を提供する。構成成分は、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、または標識剤である。GCRAペプチドは、表1〜8のいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチドである。好ましくは、GCRAペプチドは、SEQ ID NO: 1（SP-304）、SP332（SEQ ID NO: 8）、SEQ ID NO: 9（SP-333）、SP364（SEQ ID NO: 100）、またはSP366（SEQ ID NO: 102）である。ペプチドと構成成分とは、直接またはリンカーを介して共有結合している。好ましくは、リンカーは、4〜10炭素長である。構成成分は、GCRAペプチドのN末端に結合されている。
【０００８】
薬物送達ビヒクルは、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体、ナノ粒子薬物担体、またはデンドリマーである。好ましくは、ナノ粒子は、PLAベースまたはPLGAベースのナノ粒子である。薬物送達ビヒクルは、薬物送達ビヒクル中に封入された少なくとも1つの化学療法剤をさらに含む。化学療法剤は、例えば、タキサン、アントラサイクリン、プラチン、もしくは5-フルオロウラシル、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０００９】
イメージング剤は、蛍光色素または放射性部分である。標識剤はまた、蛍光色素に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンでの検出によって追跡されるビオチンであることもできる。
【００１０】
GCRAペプチドは、N末端にD-アミノ酸を含有しないペプチドであってもよい。GCRAペプチドは、C末端にD-アミノ酸を含有するペプチドであってもよい。GCRAペプチドは、N末端にD-アミノ酸を含有せず、かつC末端にD-アミノ酸を含有するペプチドであってもよい。
【００１１】
GCRAペプチドは、2つの構成成分と結合していてもよい。GCRAペプチドは、ナノ粒子およびイメージング剤と結合していてもよい。GCRAペプチドは、ナノ粒子および化学療法剤と結合していてもよい。ナノ粒子は、GCRAペプチドのC末端に結合されていてもよい。イメージング剤は、GCRAペプチドのN末端に結合されていてもよく、かつナノ粒子は、GCRAペプチドのC末端に結合されていてもよい。化学療法剤は、GCRAペプチドのN末端に結合されていてもよく、かつナノ粒子は、GCRAペプチドのC末端に結合されていてもよい。
【００１２】
また、本発明による結合体および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も、本発明に含まれる。
【００１３】
他の局面において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程による、対象における結腸腺腫および結腸微小腺腫の発生率の低減のための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である方法を提供する。
【００１４】
またさらなる局面において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程による、対象において結腸がんの発生率を低減させるための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である方法を提供する。
【００１５】
他の局面において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程を含む、対象において結腸がん転移の発生率を低減させるための方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である方法を提供する。
【００１６】
またさらなる局面において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程による、対象において腺腫発生のリスクを低下させる方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である方法を提供する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程による、対象において結腸がん転移を処置する方法であって、構成成分が、化学療法剤、または、中に少なくとも1つの化学療法剤が封入されている薬物送達ビヒクル、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質である方法を提供する。
【００１８】
対象は、そのような腺腫または微小腺腫を発生するリスクを有する。対象は、結腸がん、結腸腺腫、結腸微小腺腫、もしくは結腸ポリープと診断されているか、または、結腸がん、結腸腺腫、結腸微小腺腫、もしくは結腸ポリープと診断された近い血縁関係を有する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、結腸組織を本発明による組成物と接触させる工程による、結腸微小腺腫または平坦結腸直腸異形成を検出する方法であって、構成成分が、イメージング剤または標識剤である方法を提供する。
【００２０】
他の態様において、本発明は、本発明による組成物を対象に投与する工程であって、構成成分がイメージング剤である、工程、および対象において該イメージング剤を検出する工程により、結腸直腸がん転移または平坦結腸直腸異形成を検出する方法を提供する。
【００２１】
別の様式で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を、本発明の実施において使用することができるが、適している方法および材料を下記で説明する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により明白に組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書が、定義を含んで支配することになる。加えて、本明細書に記載される材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかであり、かつそれらによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】APi578 IIRDye680LT-SP-333）についての合成スクリーンを図示する略図である。
【図２Ａ】図2A〜Bは、本開示の例示的な治療薬を示す。パネルAは、10炭素スペーサーアームによって化学療法薬に連結されたGCRAペプチドを示す。GCRAペプチドのC末端は、任意のD-アミノ酸であることができ、スペーサーアームの長さは、4〜10炭素長であることができ、10炭素長が好ましい。パネルBは、ナノ粒子上に積載されたGCRAペプチド-薬物結合体を示す。
【図２Ｂ】図2A〜Bは、本開示の例示的な治療薬を示す。パネルAは、10炭素スペーサーアームによって化学療法薬に連結されたGCRAペプチドを示す。GCRAペプチドのC末端は、任意のD-アミノ酸であることができ、スペーサーアームの長さは、4〜10炭素長であることができ、10炭素長が好ましい。パネルBは、ナノ粒子上に積載されたGCRAペプチド-薬物結合体を示す。
【図３】IR680LT SP333を用いた結合アッセイについての用量曲線を示す。
【図４】様々な細胞密度での、IR680LT SP333を用いた結合アッセイを示す。
【図５】GC-C受容体に対するIR680LT SP333の特異性を図示する。
【図６】T84 cGMPバイオアッセイにおける、非結合SP-333（SEQ ID NO: 9）およびIR680またはビオチンに結合されたSP-333の効力を示す。IR680 NHSエステル（約5〜6炭素当量）は、SP-333に直接結合され、一方、ビオチンは、2アミノエトキシエトキシ酢酸（AEEA；各々約9〜10炭素鎖当量）を介してSP-333に結合される。結合体は両方とも、非結合SP-333と比較した際にわずかに低いレベルであるが、T84細胞においてcGMP産生を刺激するそれらの能力によって証明されるように、活性を有する。
【図７】図7A〜Bは、Apc+/Min-FCCCマウスにおけるSP-333-IR680プローブのエクスビボ解析を示す。2か月齢（パネルA）および3か月齢（パネルB）のマウスから結腸を摘出し、0.1μM SP-333-IR680プローブと30分間、エクスビボでインキュベートして、IVIS Spectrumシステムにおいて画像化した。各パネルは、同じ完全長結腸の白色光画像（左）および対応する蛍光画像（右）を含有する。丸は、結腸腫瘍の場所を表す。青色の矢印は、同じ腫瘍の対応する画像を示す。
【図８】図8A〜Bは、より高齢のApc+/Min-FCCCマウス由来の結腸腫瘍におけるSP-333-IR680結合親和性の喪失を示す。4か月齢（パネルA）および6か月齢（パネルB）のApc+/Min-FCCCマウスから結腸を摘出し、0.1μM SP-333-IR680プローブと30分間、エクスビボでインキュベートした。結腸腫瘍を丸で囲んでいる。青色の矢印は、肉眼的腫瘍の対応する白色光（左）および蛍光（右）の画像を示す。シグナルは、より若い動物において観察されたものよりも弱い。
【図９】図9A〜Cは、異なる用量のIR680-SP-333を強制経口投与し、処置後に間隔をおいた時間に画像化した、Apc+/Min-FCCCマウス由来の画像を示す。A）0.05 mg/kg体重のIR680-SP-333プローブを強制経口投与したマウスの画像。B）プローブ用量の0.5 mg/kg体重への増加は、新生物性粘膜と非新生物性粘膜との間のシグナルの差を有意には改善できなかった。しかし、結腸の近位端および遠位端の両方での非特異的シグナルは、有意に増加した。C）0.5 mg/kg体重のIR680-SP-333の投与の90分後に獲得された画像。
【図１０】IR680LT SP333を強制経口投与したマウス結腸を示す画像である。マウス12281の結腸の最強のプローブシグナルが、過剰増殖（HP）の区域において観察され、中間のシグナル強度を有する腺腫がそれに続いた。シグナルのわずかな増大が、周囲の正常な結腸粘膜と比較した際に、微小腺腫において観察された。
【図１１】IR680LT SP333を強制経口投与したマウス結腸を示す画像である。マウスID 12276の結腸は、小さな肉眼的病変（1-mmのサイズ）において非常に強いプローブシグナルを呈し、平坦／不確定な腺腫においてより弱いシグナルを呈する。
【図１２】IR680LT SP333を強制経口投与したマウス結腸を示す画像である。強いシグナルが、過形成性ポリープ（HP）；高い増殖の区域に局在化しており、プローブシグナルの強度と結腸病変のサイズ／タイプとの間の相関の欠如に対して追加的な支持を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
グアニル酸シクラーゼC（GC-C）は、腸管上皮細胞の刷子縁膜上、およびT-84細胞株などの形質転換されたヒト結腸癌細胞上に発現しているI型膜貫通糖タンパク質である。GC-Cは、組織学的に確認されたヒト初代結腸直腸腫瘍および転移物が選択的に発現する受容体であり、一方、正常組織および他のタイプのがんは、GC-C受容体を欠如しているか、または非常に低いレベルのGC-C受容体を発現するかのいずれかである。結腸直腸癌によるその持続的な発現および上部胃腸（GI）管の腺癌による異所性の発現により、GI悪性腫瘍についてのバイオマーカーとしてのその用途が示唆され、結腸直腸がんの検出のためのGC-Cアゴニストベースのインビボイメージングプローブの開発について強い原理が提供される。GC-Cの生理学的リガンドであるウログアニリンは、2つのジスルフィド結合、およびGC-C受容体に対するナノモルの親和性を有する16アミノ酸ペプチドである。プレカナチド（以前はSP-304として公知）およびドルカナチド（dolcanatide）（以前はSP-333として公知）は、ウログアニリンのより安定なアナログである。これらのペプチドは、GC-Cに特異的に結合し、したがって、結腸直腸ポリープ、腫瘍、種々のタイプの異形成病変、および結腸直腸転移の特異的検出のために使用することができる。
【００２５】
本発明は、蛍光色素に結合されたグアニル酸シクラーゼC受容体アゴニストペプチドが、結腸腫瘍を検出することができたという発見に一部基づく。重要なことに、プローブは、すべての結腸腫瘍を検出しなかったが、新しい、かつ依然として成長している腫瘍を検出した。したがって、検出可能な標識に結合されたグアニル酸シクラーゼC受容体アゴニストペプチドは、早期の結腸がん、特に結腸腺腫、微小腺腫、および転移の検出において有用である。
【００２６】
したがって、本発明は、GCRAペプチドと、該GCRAペプチドが結合されている1つまたは複数の構成成分とを含有する結合体を提供する。構成成分は、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、および標識剤である。ペプチドと構成成分とは、直接またはリンカーを介して共有結合している。結合体は、結腸腺腫および結腸微小腺腫の発生率の低減の方法、結腸がんの発生率を低減させる方法、対象において結腸がん転移の発生率を低減させるか、またはそれを処置する方法において有用である。結合体はまた、結腸微小腺腫または結腸直腸がん転移を検出するためのスクリーニング法においても有用である。
【００２７】
GCRAペプチド
本発明のGCRAペプチドは、ウログアニリン、グアニリン、リンホグアニリン、およびSTペプチドのアナログである。「ペプチド」という用語は、特定の長さを含意しない。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、25アミノ酸長未満、例えば、20、15、14、13、12、11、10、または5アミノ酸長以下である。
【００２８】
GCRAペプチドは、L-アミノ酸、D-アミノ酸、またはその両方の組み合わせのポリマーであることができる。例えば、種々の態様において、ペプチドは、D-レトロ-インベルソペプチドである。「レトロ-インベルソ異性体」という用語は、配列の向きが逆で、各アミノ酸残基のキラリティーが逆転している線状ペプチドの異性体を指す。例えば、Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994)；Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)を参照されたい。D-鏡像異性体と逆合成との組み合わせの最終結果は、各アミド結合におけるカルボニル基の位置とアミノ基の位置が入れ替わっており、一方、各α炭素における側鎖基の位置は保存されていることである。別の様式で具体的に述べない限り、本発明の任意の所与のL-アミノ酸配列は、対応するネイティブなL-アミノ酸配列についての配列の逆を合成することによってD-レトロ-インベルソペプチドを生成しうることが推定される。例えば、GCRAペプチドには、式I〜XXによって定義される配列および表2〜8に列挙される配列が含まれる。
【００２９】
cGMP産生の誘導は、GCRAペプチドが細胞内cGMPの産生を誘導することを意味している。細胞内cGMPは、当技術分野において公知の方法によって測定される。例えば、本発明のGCRAペプチドは、天然に存在するGC-Cアゴニストと比較して、5％、10％、20％、30％、40％、50％ 、75％、90％、またはそれより多く、細胞内cGMPを刺激する。さらなる態様において、GCRAペプチドは、アポトーシス、例えば、プログラム細胞死を刺激するか、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）を活性化する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、PEG3、3PEGは、例えばアミノエチルオキシ-エチルオキシ-酢酸（AeeA）を含む、ポリエチレングリコールを表すように意味している。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「アミド」という用語は、末端カルボン酸がアミド基で置き換えられている、すなわち、末端COOHがCONH2で置き換えられていることを表すように意味している。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「pyGlu」という用語は、ピログルタミン酸を指す。
【００３３】
本明細書において（例えば、式I〜XXにおいて）使用される場合、Xaaは、任意の天然、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり；Maaは、システイン（Cys）、ペニシラミン（Pen）、ホモシステイン、または3-メルカプトプロリンである。Xaan1は、1、2、または3残基長である任意の天然、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログのアミノ酸配列を表すように意味し；Xaan2は、0または1残基長である任意の天然、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログのアミノ酸配列を表すように意味し；Xaan3は、0、1、2、3、4、5、または6残基長である任意の天然、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログのアミノ酸配列を表すように意味している。追加的に、Xaaによって表示される任意のアミノ酸は、L-アミノ酸、D-アミノ酸、メチル化アミノ酸、フッ化アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。好ましくは、N末端、C末端、またはその両方のアミノ酸はD-アミノ酸である。任意で、式I〜XXによって表示される任意のGCRAペプチドは、N末端、C末端、またはその両方に1つまたは複数のポリエチレングリコール残基を含有してもよい。例示的なポリエチレングリコールには、アミノエチルオキシ-エチルオキシ-酢酸およびそのポリマーが含まれる。
【００３４】
本発明の方法および製剤において使用することができるGCCアゴニストペプチドの具体例には、表2〜8より選択されるペプチドが含まれる。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、SEQ ID NO: 1（SP-304）である。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、SEQ ID NO: 9（SP-333）である。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、SEQ ID NO: 8（SP-332）である。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、N末端にD-アミノ酸を含有する。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、C末端にD-アミノ酸を含有する。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、N末端およびC末端の両方にD-アミノ酸を含有する。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、N末端およびC末端の両方にD-アミノ酸を含有しない。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、C末端にD-アミノ酸を含有せず、かつN末端にD-アミノ酸を含有する。いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドは、N末端にD-アミノ酸を含有せず、かつC末端にD-アミノ酸を含有する。
【００３５】
いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドには、式Iのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、式Iの少なくとも1つのアミノ酸は、D-アミノ酸もしくはメチル化アミノ酸であり、かつ／または位置16のアミノ酸は、セリンである。好ましくは、式Iの位置16のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。例えば、式Iの位置16のアミノ酸は、d-ロイシンまたはd-セリンである。任意で、式Iの位置1〜3のアミノ酸の1つまたは複数は、D-アミノ酸、またはメチル化アミノ酸、またはD-アミノ酸もしくはメチル化アミノ酸の組み合わせである。例えば、式IのAsn1、Asp2、またはGlu3（またはそれらの組み合わせ）は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式Iの位置Xaa6のアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。
【００３６】
代替的な態様において、GCCアゴニストペプチドには、式IIのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、式IIの少なくとも1つのアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式IIのXaan2によって表されるアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。いくつかの態様において、式IIのXaan2によって表されるアミノ酸は、ロイシン、d-ロイシン、セリン、またはd-セリンである。好ましくは、式IIのXaan1によって表される1つまたは複数のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式IIの位置Xaa6のアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。
【００３７】
いくつかの態様において、GCCアゴニストペプチドには、式IIIのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、式IIIの少なくとも1つのアミノ酸は、D-アミノ酸もしくはメチル化アミノ酸であり、かつ／またはMaaは、システインではない。好ましくは、式IIIのXaan2によって表されるアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。いくつかの態様において、式IIIのXaan2によって表されるアミノ酸は、ロイシン、d-ロイシン、セリン、またはd-セリンである。好ましくは、式IIIのXaan1によって表される1つまたは複数のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式IIIの位置Xaa6のアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。
【００３８】
他の態様において、GCCアゴニストペプチドには、式IVのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、式IVの少なくとも1つのアミノ酸は、D-アミノ酸もしくはメチル化アミノ酸であり、かつ／またはMaaは、システインではない。好ましくは、式IVのXaan2は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。いくつかの態様において、式IVのXaan2によって表されるアミノ酸は、ロイシン、d-ロイシン、セリン、またはd-セリンである。好ましくは、式IVのXaan1によって表されるアミノ酸の1つまたは複数は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式IVのXaa6で表されるアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。
【００３９】
さらなる態様において、GCCアゴニストペプチドには、式Vのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、式Vの少なくとも1つのアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式Vの位置16のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。例えば、式Vの位置16のアミノ酸（すなわちXaa16）は、d-ロイシンまたはd-セリンである。任意で、式Vの位置1〜3のアミノ酸の1つまたは複数は、D-アミノ酸、またはメチル化アミノ酸、またはD-アミノ酸もしくはメチル化アミノ酸の組み合わせである。例えば、式VのAsn1、Asp2、またはGlu3（またはそれらの組み合わせ）は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式VのXaa6で表されるアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。
【００４０】
追加的な態様において、GCRAペプチドには、式VI、VII-a、VII-b、VIII、またはIXのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。好ましくは、式VI、VII-a、VII-b、VIII、またはIXの位置6のアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはチロシンである。いくつかの局面において、式VI、VII-a、VII-b、VIII、またはIXの位置16のアミノ酸は、ロイシンまたはセリンである。好ましくは、式VI、VII-a、VII-b、VIII、またはIXの位置16のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。
【００４１】
追加的な態様において、GCRAペプチドには、式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、またはXVIIのアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。任意で、式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、またはXVIIの1つまたは複数のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。好ましくは、式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、またはXVIIによるペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸は、D-アミノ酸またはメチル化アミノ酸である。例えば、式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、またはXVIIによるペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸は、D-チロシンである。
【００４２】
好ましくは、式XIVのXaa6によって表されるアミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、またはセリンである。最も好ましくは、式XIVのXaa6によって表されるアミノ酸は、フェニルアラニンまたはセリンである。好ましくは、式XV、XVI、またはXVIIのXaa4によって表されるアミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、またはセリンである。最も好ましくは、式XV、XVI、またはXVIIの位置Xaa4のアミノ酸は、フェニルアラニンまたはセリンである。
【００４３】
いくつかの態様において、GCRAペプチドには、式XVIIIのアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。好ましくは、式XVIIIの位置1のアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、またはリジンである。好ましくは、式XVIIIの位置2および3のアミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。好ましくは、位置5のアミノ酸は、グルタミン酸である。好ましくは、式XVIIIの位置6のアミノ酸は、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、またはチロシンである。好ましくは、式XVIIIの位置8のアミノ酸は、バリンまたはイソロイシンである。好ましくは、式XVIIIの位置9のアミノ酸は、アスパラギンである。好ましくは、式XVIIIの位置10のアミノ酸は、バリンまたはメチオニンである。好ましくは、式XVIIIの位置11のアミノ酸は、アラニンである。好ましくは、式XVIIIの位置13のアミノ酸は、トレオニンである。好ましくは、式XVIIIの位置14のアミノ酸は、グリシンである。好ましくは、式XVIIIの位置16のアミノ酸は、ロイシン、セリン、またはトレオニンである。
【００４４】
代替的な態様において、GCRAペプチドには、式XIXのアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。好ましくは、式XIXの位置1のアミノ酸は、セリンまたはアスパラギンである。好ましくは、式XIXの位置2のアミノ酸は、ヒスチジンまたはアスパラギン酸である。好ましくは、式XIXの位置3のアミノ酸は、トレオニンまたはグルタミン酸である。好ましくは、式XIXの位置5のアミノ酸は、グルタミン酸である。好ましくは、式XIXの位置6のアミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、バリン、またはチロシンである。好ましくは、式XIXの位置8、10、11、または13のアミノ酸は、アラニンである。好ましくは、式XIXの位置9のアミノ酸は、アスパラギンまたはフェニルアラニンである。好ましくは、式XIXの位置14のアミノ酸は、グリシンである。
【００４５】
さらなる態様において、GCRAペプチドには、式XXのアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。好ましくは、式XXの位置1のアミノ酸は、グルタミンである。好ましくは、式XXの位置2または3のアミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。好ましくは、式XXの位置5のアミノ酸は、グルタミン酸である。好ましくは、式XXの位置6のアミノ酸は、トレオニン、グルタミン、チロシン、イソロイシン、またはロイシンである。好ましくは、式XXの位置8のアミノ酸は、イソロイシンまたはバリンである。好ましくは、式XXの位置9のアミノ酸は、アスパラギンである。好ましくは、式XXの位置10のアミノ酸は、メチオニンまたはバリンである。好ましくは、式XXの位置11のアミノ酸は、アラニンである。好ましくは、式XXの位置13のアミノ酸は、トレオニンである。好ましくは、式XXの位置1のアミノ酸は、グリシンである。好ましくは、式XXの位置15のアミノ酸は、チロシンである。任意で、式XXの位置15のアミノ酸は、2アミノ酸長であり、システイン（Cys）、ペニシラミン（Pen）、ホモシステイン、または3-メルカプトプロリンと、セリン、ロイシン、またはトレオニンとである。
【００４６】
ある特定の態様において、GCRAペプチドの1つまたは複数のアミノ酸は、非天然のアミノ酸または天然もしくは非天然のアミノ酸アナログによって置き換えられうる。標準的な20種（Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびVal）以外に多くのアミノ酸がある。天然に存在するものもあれば、存在しないものもある。（例えば、Hunt, The Non-Protein Amino Acids: In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barrett, Chapman and Hall, 1985を参照されたい）。例えば、芳香族アミノ酸は、3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン、3-ヨード-L-チロシン、トリヨードチロニン、L-チロキシン、フェニルグリシン（Phg）、またはノル-チロシン（norTyr）によって置き換えられうる。PhgおよびnorTyr、ならびにPheおよびTyrを含む他のアミノ酸は、例えば、ハロゲン、-CH3、-OH、-CH2NH3、-C(O)H、-CH2CH3、-CN、-CH2CH2CH3、-SH、または別の基によって置換されうる。任意のアミノ酸が、D型アミノ酸によって置換されうる。
【００４７】
非天然のアミノ酸または天然および非天然のアミノ酸アナログに関して、本明細書に記載されるポリペプチドおよびアゴニストにおけるいくつかの置換は、単独でまたは組み合わせで可能である。
【００４８】
例えば、グルタミン残基は、γ-ヒドロキシ-Gluまたはγ-カルボキシ-Gluで置換されうる。チロシン残基は、L-α-メチルフェニルアラニンなどのα置換アミノ酸で、または、3-アミノ-Tyr；Tyr（CH3）；Tyr（PO3(CH3)2）；Tyr（SO3H）；β-シクロヘキシル-Ala；β-(1-シクロペンテニル)-Ala；β-シクロペンチル-Ala；β-シクロプロピル-Ala；β-キノリル-Ala；β-(2-チアゾリル)-Ala；β-(トリアゾール-1-イル)-Ala；β-(2-ピリジル)-Ala；β-(3-ピリジル)-Ala；アミノ-Phe；フルオロ-Phe；シクロヘキシル-Gly；tBu-Gly；β-(3-ベンゾチエニル)-Ala；β-(2-チエニル)-Ala；5-メチル-Trp；およびA-メチル-Trpなどのアナログによって置換されうる。プロリン残基は、ホモプロ(L-ピペコリン酸)；ヒドロキシ-Pro；3,4-デヒドロ-Pro；4-フルオロ-Pro；もしくはα-メチル-Pro、または構造：n＝0、1、2、3を有するN(α)-C(α)環化アミノ酸アナログで置換されうる。アラニン残基は、α-アミノイソ酪酸（aib）、L/D-α-エチルアラニン（L/D-イソバリン）、L/D-メチルバリン、もしくはL/D-α-メチルロイシンなどのα-置換アミノ酸もしくはN-メチル化アミノ酸、またはβ-フルオロ-Alaなどの非天然アミノ酸で置換されうる。アラニンはまた、n＝0、1、2、3で置換されうる。グリシン残基は、α-アミノイソ酪酸（aib）またはL/D-α-エチルアラニン（L/D-イソバリン）で置換されうる。
【００４９】
非天然アミノ酸のさらなる例には、以下が含まれる：アラニンの非天然型アナログ（例えば、L-1-NalまたはL-2-Nal）；チロシンの非天然型アナログ；グルタミンの非天然型アナログ；フェニルアラニンの非天然型アナログ；セリンの非天然型アナログ；トレオニンの非天然型アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ；光で活性化可能な架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識されたアミノ酸；蛍光アミノ酸；新規の官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；天然ではアミド化されていない部位でアミド化されているアミノ酸、金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化（photocaged）および／または光異性化アミノ酸；ビオチンまたはビオチンアナログ含有アミノ酸；グリコシル化されたまたは糖質改変されたアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸（例えば、重水素、トリチウム、13C、15N、または18Oを含有するアミノ酸）；化学的に切断可能または光切断可能なアミノ酸；伸長した側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性を有するアミノ酸；α-ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α、α-二置換アミノ酸；β-アミノ酸；プロリン以外の環状アミノ酸；O-メチル-L-チロシン；L-3-(2-ナフチル)アラニン；3-メチル-フェニルアラニン；p-アセチル-L-フェニルアラニン；O-4-アリル-L-チロシン；4-プロピル-L-チロシン；トリ-O-アセチル-GlcNAcβ-セリン；L-ドーパ；フッ化フェニルアラニン；イソプロピル-L-フェニルアラニン；p-アジド-L-フェニルアラニン；p-アシル-L-フェニルアラニン；p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン；L-ホスホセリン；ホスホノセリン；ホスホノチロシン；p-ヨード-フェニルアラニン；4-フルオロフェニルグリシン；p-ブロモフェニルアラニン；p-アミノ-L-フェニルアラニン；イソプロピル-L-フェニルアラニン；L-3-(2-ナフチル)アラニン；D-3-(2-ナフチル)アラニン（dNal）；アミノ-、イソプロピル-、またはO-アリル含有フェニルアラニンアナログ；ドーパ、O-メチル-L-チロシン；グリコシル化アミノ酸；p-(プロパルギルオキシ)フェニルアラニン；ジメチル-リジン；ヒドロキシ-プロリン；メルカプトプロピオン酸；メチル-リジン；3-ニトロ-チロシン；ノルロイシン；ピログルタミン酸；Z（カルボベンゾキシル）；ε-アセチル-リジン；β-アラニン；β-アスパラギン酸；β-シクロヘキシルアラニン；アミノベンゾイル誘導体；アミノ酪酸（Abu）；シトルリン；アミノヘキサン酸（Ahx）；アミノイソ酪酸（AIB）；シクロヘキシルアラニン；d-シクロヘキシルアラニン；シクロヘキシルグリシン；ヒドロキシプロリン；ニトロ-アルギニン；ニトロ-フェニルアラニン；ニトロ-チロシン；ノルバリン；オクタヒドロインドールカルボ���シラート；オルニチン（Orn）；ペニシラミン（PEN）；テトラヒドロイソキノリン；ジアミノ酪酸；ジアミノピメリン酸；ピログルタミン酸；ホモシステイン；ホモセリン；N-ε-ジニトロフェニルリジン；N-ε-メチルリジン；N-ε-ジメチルリジン；N,N,N-ε-トリメチルリジン；アセトアミドメチル保護アミノ酸、ならびにペグ化アミノ酸。非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログのさらなる例は、US20030108885、US20030082575、US20060019347（段落410〜418）、およびそれらに引用されている参考文献において見出すことができる。本発明のポリペプチドは、US20060019347、段落589に記載されている改変を含む、さらなる改変を含むことができる。
【００５０】
本明細書において使用される「Nal」は、L-1-ナフチルアラニン（L-1-Nal）およびL-2-ナフチルアラニン（L-2-Nal）の両方を指す。
【００５１】
いくつかの態様において、アミノ酸は、天然に存在する非必須アミノ酸、例えば、タウリンによって置き換えられうる。
【００５２】
あるいは、GCRAペプチドは環状ペプチドである。GCRA環状ペプチドは、当技術分野において公知の方法によって調製される。例えば、大環状化は、多くの場合に、ペプチドのN末端とC末端との間、側鎖とN末端もしくはC末端との間［例えば、pH8.5でK3Fe(CN)6を用いる］（Samson et al., Endocrinology, 137: 5182-5185 (1996)）、または、システインなどの2つのアミノ酸側鎖の間でアミド結合を形成することによって達成される。例えば、DeGrado, Adv Protein Chem, 39: 51-124 (1988)を参照されたい。いくつかの態様において、本発明のGCRAペプチドは、二環式ペプチドである。種々の局面において、GCRAペプチドは、[4,12; 7,15]二環である。
【００５３】
いくつかのGCRAペプチドにおいて、通常ジスルフィド結合を形成するCys残基の1対または両方の対の1方または両方のメンバーは、ホモシステイン、ペニシラミン、3-メルカプトプロリン（Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274）；β,β-ジメチルシステイン（Hunt et al. 1993 Int JPept Protein Res 42:249）またはジアミノプロピオン酸（Smith et al. 1978 J Med Chem 2 1:117）によって置き換えられて、通常のジスルフィド結合の位置に代替的な内部架橋を形成することができる。
【００５４】
加えて、1つまたは複数のジスルフィド結合は、代替的な共有結合性架橋、例えば、アミド結合（-CH2CH(O)NHCH2-もしくは-CH2NHCH(O)CH2-）、エステル結合、チオエステル結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、ホスホン酸エステル結合、アルキル結合（-CH2CH2CH2CH2-）、アルケニル結合（-CH2CH=CHCH2-）、エーテル結合（-CH2CH2OCH2-もしくは-CH2OCH2CH2-）、チオエーテル結合（-CH2CH2SCH2-もしくは-CH2SCH2CH2-）、アミン結合（-CH2CH2NHCH2-もしくは-CH2NHCH2CH2-）、またはチオアミド結合（-CH2CH(S)HNHCH2-もしくは-CH2NHCH(S)CH2-）によって置き換えられうる。例えば、Ledu et al.（Proc Nat'l Acad. Sci. 100:11263-78, 2003）は、ラクタム架橋およびアミド架橋を調製するための方法を記載している。ラクタム架橋を含む例示的なGCRAペプチドには、例えば、SP-370が含まれる。
【００５５】
GCRAペプチドは、代替的な結合によって置き換えられた、1つまたは複数の従来のポリペプチド結合を有することができる。そのような置き換えは、ポリペプチドの安定性を増大させることができる。例えば、アミノ末端残基と芳香族残基（例えば、Tyr、Phe、Trp）との間のポリペプチド結合の代替的な結合での置き換えにより、カルボキシペプチダーゼによる切断を減少させることができ、消化管における半減期を延長しうる。ポリペプチド結合に取って代わることができる結合には、レトロ-インベルソ結合（NH-C(O)の代わりにC(O)-NH）；還元アミド結合（NH-CH2）；チオメチレン結合（S-CH2またはCH2-S）；オキソメチレン結合（O-CH2またはCH2-O）；エチレン結合（CH2-CH2）；チオアミド結合（C(S)-NH）；トランス-オレフィン結合（CH=CH）；フルオロ置換トランス-オレフィン結合（CF=CH）；ケトメチレン結合（C(O)-CHRまたはCHR-C(O)［式中、RはHまたはCH3である］）；およびフルオロ-ケトメチレン結合（C(O)-CFRまたはCFR-C(O)［式中、RはHまたはFまたはCH3である］）が含まれる。
【００５６】
GCRAペプチドは、標準的な改変を用いて改変することができる。改変は、アミノ（N-）末端、カルボキシ（C-）末端、内部、または前記のいずれかの組み合わせで起こってもよい。本明細書に記載される1つの局面において、ポリペプチド上に1種類よりも多い改変があってもよい。改変には、非限定的に、アセチル化、アミド化、ビオチニル化、シンナモイル化、ファルネシル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ser、Tyr、またはThr）、ステアロイル化、スクシニル化、スルフリル化、および環化（ジスルフィド架橋またはアミド環化を介する）、ならびにCys3またはCys5による改変が含まれる。本明細書に記載されるGCRAペプチドはまた、2,4-ジニトロフェニル（DNP）、DNP-リジン、7-アミノ-4-メチル-クマリン（AMC）による改変、フルオレセイン、NBD（7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール）、p-ニトロ-アニリド、ローダミンB、EDANS（5-((2-アミノエチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸）、ダブシル（dabcyl）、ダブシル（dabsyl）、ダンシル、テキサスレッド、FMOC、およびTamra（テトラメチルローダミン）によって改変されてもよい。本明細書に記載されるGCRAペプチドはまた、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）；アルキル基（例えば、C1〜C20直鎖または分岐アルキル基）；脂肪酸ラジカル；PEG、アルキル基、および脂肪酸ラジカルの組み合わせ（米国特許第6,309,633号；Soltero et al., 2001 Innovations in Pharmaceutical Technology 106-110を参照されたい）；BSAおよびKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合されてもよい。本発明のポリペプチドを改変するために使用することができるPEGおよび他のポリマーの付加は、US2006019347の第IX節に記載されている。
【００５７】
1つの局面において、本発明は、例えば、その全体がすべての目的で参照により本明細書に組み入れられるWO20140151206において教示されているようなAad-GCRAペプチドを提供する。WO20140151206の表1には、GCRAペプチドの種々のα-アミノアジピン酸誘導体の例が開示されている。Aad-GCRAペプチドは、ウログアニリン、グアニリン、リンホグアニリン、およびSTペプチドのアナログである。特に、これらのアナログは、好ましくは、各ペプチドのN末端から3番目の位置に、または最初のシステイン（「Cys」）残基に隣接するN末端側の位置に、α-アミノアジピン酸（Ad）を含有する。例えば、Aad-GCRAペプチドには、α-アミノアジピン酸を含むことができる、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VII、VIII、IX、XVIII、またはXXIによって定義される配列が含まれる。
【００５８】
いくつかの態様において、Aad-GCRAペプチドは、
2018534317.tif 000003
である。
【００５９】
また、本明細書に記載されるペプチドと生物学的または機能的に等価のペプチドも、本発明に含まれる。「生物学的に等価」または「機能的に等価」という用語は、本発明の組成物がcGMP産生調節効果のいくらかまたはすべてを示しうることを意味するように意図される。
【００６０】
GCRAペプチドにはまた、ある特定のアミノ酸が欠失しているかまたは置き換えられているGCRAペプチドの延長形態、短縮形態、置換形態、ハイブリッド形態、および改変形態、ならびに1つまたは複数のアミノ酸が改変アミノ酸または異常アミノ酸に変更されているような改変、ならびにグリコシル化などの改変を、該改変形態がGCRAペプチドの生物学的活性を保持する限り含むように意図される、GCRAペプチドの誘導体も含まれうる。生物学的活性を保持するとは、天然に存在するGCRAペプチドのレベルとは必ずしも同じ効力のレベルで特定されないが、cGMPおよび／またはアポトーシスがGCRAペプチドによって誘導されることを意味する。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、1〜10個のアミノ酸が欠失しており、短縮形態がGCRAペプチドの生物学的活性を保持している、短縮型ペプチドである。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、または約10個のアミノ酸分が短縮している。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、N末端が短縮している。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、C末端が短縮している。いくつかの態様において、GCRAペプチドは、N末端およびC末端の両方が短縮している。
【００６１】
好ましいバリアントは、1つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基で行われた保存的アミノ酸置換を有するものである。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、GCRAポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、別の態様において、変異を、例えば、飽和変異誘発によって、GCRAコード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じた変異体をスクリーニングして、活性を保持する変異体を特定することができる。
【００６２】
（表１）GCRAペプチド（SP-304および誘導体）
2018534317.tif 000004
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【００６３】
（表２）リナクロチドおよび誘導体
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【００６４】
（表３）GCRAペプチド
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【００６５】
（表４）SP-304アナログ、ウログアニリン、およびウログアニリンアナログ
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【００６６】
（表５）グアニリンおよびアナログ
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【００６７】
（表６）リンホグアニリンおよびアナログ
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【００６８】
（表７）STペプチドおよびアナログ
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【００６９】
（表８）GCRAペプチドのα-アミノアジピン酸誘導体
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【００７０】
リンカー
本明細書において使用される場合、「リンカー」または「スペーサー」とは、GCRAペプチドを、本発明による構成成分などの別の部分に連結することができる、任意の化学的部分である。いくつかの態様において、リンカーは、GCRAペプチドのN末端に付着される。いくつかの態様において、リンカーは、GCRAペプチドのC末端に付着される。いくつかの態様において、リンカーは、N末端およびC末端の両方に付着される。リンカーは、任意の適切なサイズであってもよい。いくつかの態様において、リンカーサイズは、GCRAペプチドの活性に影響を及ぼす。いくつかの態様において、リンカーは、10炭素以下の長さであり、GCRAペプチドは、活性を保持している。いくつかの態様において、リンカーは、10炭素、9炭素、8炭素、7炭素、6炭素、5炭素、4炭素、3炭素、2炭素、または1炭素である。
【００７１】
リンカーは、化合物または抗体が活性を有するままである条件で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断などの切断に対して感受性であることができる（切断可能なリンカー）。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に抵抗性であることができる（例えば、安定なリンカーまたは切断不可能なリンカー）。いくつかの局面において、リンカーは、プロチャージ（procharged）リンカー、親水性リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーである。
【００７２】
1つの局面において、使用されるリンカーは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート（SPDP）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート（SPP）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート（SPDB）、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)-2-スルホ-ブタノアート（スルホ-SPDB）、N-スクシンイミジルヨードアセタート（SIA）、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート（SIAB）、マレイミドPEG NHS、N-スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシラート（SMCC）、N-スルホスクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシラート（スルホ-SMCC）、または2,5-ジオキソピロリジン-1-イル17-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5,8,11,14-テトラオキソ-4,7,10,13-テトラアザヘプタデカン-1-オアート（CX1-1）などの架橋試薬に由来する。別の局面において、使用されるリンカーは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート（SPDP）、N-スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシラート（SMCC）、N-スルホスクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシラート（スルホ-SMCC）、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)-2-スルホ-ブタノアート（スルホ-SPDB）、または2,5-ジオキソピロリジン-1-イル17-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5,8,11,14-テトラオキソ-4,7,10,13-テトラアザヘプタデカン-1-オアート（CX1-1）などの架橋剤に由来する。
【００７３】
切断不可能なリンカーは、メイタンシノイドなどの薬物を、安定な共有結合性様式で抗体に連結することができる任意の化学的部分であり、切断可能なリンカーについて上記に列挙されたカテゴリーから離れない。したがって、切断不可能なリンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断に対して実質的に抵抗性である。さらに、切断不可能とは、メイタンシノイドなどの薬物または抗体がその活性を失わない条件で、酸、感光性切断作用物質、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐える、リンカーにおけるまたはリンカーに隣接する化学結合の能力を指す。
【００７４】
酸に不安定なリンカーは、酸性pHで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどのある特定の細胞内区画は、酸性pH（pH 4〜5）を有し、酸に不安定なリンカーを切断するのに適している条件を提供する。
【００７５】
光に不安定なリンカーは、体表で、および光に接触可能である多くの体腔において有用なリンカーである。さらに、赤外光は組織を貫通することができる。
【００７６】
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼによって切断することができ、すなわち、ペプチダーゼで切断可能なリンカーである。ある特定のペプチドのみが、細胞の内側または外側で容易に切断され、例えば、Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらに、ペプチドは、α-アミノ酸、および、化学的に1つのアミノ酸のカルボキシラートと第2のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合から構成されている。カルボキシラートとリジンのε-アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合とは理解されず、切断不可能と考えられる。
【００７７】
いくつかのリンカーは、エステラーゼによって切断することができ、すなわち、エステラーゼで切断可能なリンカーである。再び、ある特定のエステルのみが、細胞の内側または外側に存在するエステラーゼによって切断されうる。エステルは、カルボン酸とアルコールとの縮合によって形成される。単純エステルは、脂肪族アルコールなどの単純なアルコール、ならびに低分子環式アルコールおよび低分子芳香族アルコールで産生されたエステルである。
【００７８】
プロチャージリンカーは、抗体薬物結合体中への組み込み後にそれらの電荷を保持している、荷電架橋試薬に由来する。プロチャージリンカーの例は、US 2009/0274713において見出すことができる。
【００７９】
構成成分
GCRAペプチドは、構成成分に連結されてもよい。構成成分は、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、および標識剤である。いくつかの態様において、構成成分は、ビオチンであり、蛍光色素に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンでの検出によって追跡される。
【００８０】
化学療法剤は、がんを処置することが公知の任意の化合物である。例えば、化学療法剤は、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、非糖含有クロロエチルニトロソウレア、5-フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（fragyline）、Meglamine GLA、バルルビシン、カルムスチン（carmustaine）およびポリフェルポサン（poliferposan）、MM1270、BAY 12-9566、RASファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメトレキソール（Lometexol）、Glamolec、CI-994、TNP-470、Hycamtin/トポテカン、PKC412、バルスポダール/PSC833、Novantrone/ミトキサントロン（Mitroxantrone）、Metaret/スラミン、バチマスタット、E7070、BCH4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、InceWX-710、VX-853、ZDO101、IS1641、ODN 698、TA 2516/マルミスタット（Marmistat）、BB2516/マルミスタット（Marmistat）、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナールDP 2202、FK 317、ピシバニール/OK-432、AD 32Nalrubicin、Metastron/ストロンチウム誘導体、Temodal/テモゾロミド、Evacet/リポソームドキソルビシン、Yewtaxan/パクリタキセル（Placlitaxel）、Taxol/パクリタキセル、Xeload/カペシタビン、Furtulon/ドキシフルリジン、Cyclopax/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU-077/シスプラチン、HMR 1275/フラボピリドール、CP-358 (774)/EGFR、CP-609 (754)/RAS癌遺伝子阻害剤、BMS-182751/経口白金、UFT(テガフール/ウラシル)、Ergamisol/レバミソール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサー、Campto/レバミソール、Camptosar/イリノテカン、Tumodex/ラリトレキセド、Leustatin/クラドリビン、Paxex/パクリタキセル、Doxil/リポソームドキソルビシン、Caelyx/リポソームドキソルビシン、Fludara/フルダラビン、Pharmarubicin/エピルビシン、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/ビス-ナフタルイミド、LU 103793/ドラスタチン（Dolastain）、Caetyx/リポソームドキソルビシン、Gemzar/ゲムシタビン、ZD 0473/Anormed、YM 116、ヨウ素シード、CDK4およびCDK2阻害剤、PARP阻害剤、D4809/デキシフォサミド（Dexifosamide）、Ifes/Mesnex/イホスファミド（lfosamide）、Vumon/テニポシド、Paraplatin/カルボプラチン、Plantinol/シスプラチン、Vepeside/エトポシド、ZD 9331、Taxotere/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソウレア、メルファラン（melphelan）およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル（Chlorombucil）、シタラビンHCl、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCl、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（VP16-213）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（5-FU）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド)、イホスファミド、インターフェロンα-2a、α-2b、酢酸ロイプロリド（LHRH放出因子アナログ）、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミンHCl（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（o.p'-DDD）、ミトキサントロンHCl、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（m-AMSA）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（HMM）、インターロイキン2、ミトグアゾン（メチル-GAG；メチルグリオキサルビスグアニルヒドラゾン；MGBG)、ペントスタチン（2'デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル-CCNU）、テニポシド（VM-26）、および硫酸ビンデシンであることができる。さらに、化学療法剤は、米国特許第6,482,843号の表3、13〜18列において言及されている化学療法剤のいずれかであってもよい。
【００８１】
好ましくは、化学療法剤は、タキサン、アントラサイクリン、プラチン、または5-フルオロウラシル、およびそれらの任意の組み合わせである。
【００８２】
イメージング剤または標識剤は、例えば、ガドリニウムキレートなどの磁気トレーサー、または、例えば、鉄、酸化マンガン、もしくは鉄-白金（Fe-Pt）のナノ結晶などの磁気ナノ結晶；放射性核種など、例えば、123I、18F、11C、または99mTcもしくは111Inのキレート、または金属カチオン68Ga、64Cuのキレートなどの放射性トレーサー、または蛍光体である。
【００８３】
好ましくは、使用される蛍光体は、可視または近赤外範囲で吸収および放射する。選択される蛍光体は、インビボまたはインビトロの方法の適用のタイプに適合している。インビボ適用の場合は、インビボ蛍光イメージングを用いることが可能である。この非侵襲性イメージングについて、好ましい蛍光体は、近赤外で吸収および放射する。実際に、励起光および蛍光体により放射される光がより良好に組織を通過しうるように、近赤外で、すなわち640〜900 nmを含む波長で吸収および放射する蛍光体が使用されるべきである。蛍光顕微鏡またはFACS（蛍光活性化細胞選別）タイプのサイトメトリーなどの、イメージング法が適用されるインビトロ適用の最中には、典型的には450 nm〜650 nmを含む可視波長で励起される蛍光体が、概して適用される。これらは、特に、親水性シアニンまたはFITC（フルオレセインイソチオシアナート）である。これらの蛍光体は、ナノ粒子の脂質コアに封入されてもよく、または、親水性である場合にはそれらの表面に局在化してもよい。
【００８４】
親油性蛍光体として、例えば、InVitrogenカタログ（The Molecular Probes（登録商標） Handbook, a guide to fluorescent probes and labeling technologies, 11.sup.th Edition, 2010）の13章（「Probes for Lipids and Membranes」）に記載されている化合物に言及されてもよい。より具体的には、特に、蛍光体として、インドシアニングリーン（ICG）、脂肪酸のアナログ、および、蛍光基で官能化されたリン脂質、例えば、Bodipy（登録商標）665/676（励起／放射）などのBodipy（登録商標）の取引名で販売されている蛍光製品；例えば参照番号D-307で販売されている1.1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンペルクロラート（DiD）、例えば参照番号D1125で販売されている3,3'-ジヘキサデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（DiO）、例えば参照番号D384で販売されている1,1'-ジヘキサデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（Dil）などのカルボシアニンの親油性誘導体；BODIPY（登録商標）TRセラミド、BODIPY（登録商標）FL C5-ラクトシルセラミド、BODIPY（登録商標）FL C5-ガングリオシド、BODIPY（登録商標）FLセレブロシドの取引名で販売されている製品などの、スフィンゴ脂質、ステロイドまたはリポ多糖に由来する蛍光プローブ；オクタデシルローダミンB、オクタデシルフルオレセインエステル、および4-ヘプタデシル-7-ヒドロキシクマリンなどの、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、またはクマリンの両親媒性誘導体；ならびにジフェニルヘキサトリエン（DPH）およびその誘導体に言及されてもよく、これらの製品の全部は、Invitrogenによって販売されている。
【００８５】
薬物送達ビヒクルは、例えば、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体、ナノ粒子薬物担体、およびデンドリマーである。
【００８６】
開示されるナノ粒子は、実質的に球形の形状を有してもよく（すなわち、粒子が概して球形に見える）、または非球形の形状を有してもよい。例として、粒子は、膨潤時または収縮時に、非球形の形状をとってもよい。いくつかの場合に、粒子は、ポリマーブレンドを含んでもよい。例として、ポリマーブレンドは、ポリエチレングリコールを含む第1のコポリマーおよび第2のポリマーを含んでもよい。
【００８７】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、PLAベースまたはPLGAベースのナノ粒子である。いくつかの態様において、ナノ粒子は、ACCURIN（商標）ポリマーナノ粒子である。いくつかの態様において、本明細書において開示される結合体は、GCRAペプチドの生物学的活性を維持している。いくつかの態様において、本明細書において開示される結合体は、ナノ粒子などの1つまたは複数の構成成分に結合されたGCRAペプチドを含み、GCRAペプチドの生物学的活性を維持している。
【００８８】
開示されるナノ粒子は、約1マイクロメートル未満の特徴的な寸法を有してもよく、ここで粒子の該特徴的な寸法とは、粒子と同じ体積を有する完全な球形の直径である。例えば、粒子の特徴的な寸法は、いくつかの場合に、約300 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、約50 nm未満、約30 nm未満、約10 nm未満、約3 nm未満、または約1 nm未満であることができる。特定の態様において、開示されるナノ粒子は、約70 nm〜200 nm、または約70 nm〜約180 nm、約80 nm〜約130 nm、約80 nm〜約120 nmの直径を有してもよい。いくつかの態様において、粒子は、約100 nm未満である粒子の特徴的な寸法を有する。いくつかの態様において、治療薬は、静脈内投与のために製剤化され、ナノ粒子は、好ましくは100 nm未満の特徴的な寸法を有する。いくつかの態様において、治療薬は、経口投与（例えば、胃腸管に対する）のために製剤化され、ナノ粒子は、最大で5μmの特徴的な寸法を有する。
【００８９】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、長いPEG、脂肪酸、または他の部分（例えば、30より多い側鎖）でカバーされていない。いくつかの態様において、長いPEG、脂肪酸、または他の部分（例えば、30より多い側鎖）は、細胞（例えば、転移細胞、ポリープ、腫瘍、および他の異形成病変）上に発現しているGC-C受容体に対するGCRAペプチドの結合を干渉し、したがってGCRAペプチド活性を阻害する。
【００９０】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、GCRAペプチドのN末端に結合されている。いくつかの態様において、ナノ粒子は、GCRAペプチドのC末端に結合されている。いくつかの態様において、ナノ粒子は、GCRAペプチドのN末端およびC末端の両方に結合されている。いくつかの態様において、ナノ粒子および別の構成成分が、GCRAペプチドに結合されている。いくつかの態様において、ナノ粒子は、GCRAペプチドのC末端で結合されており、かつ別の構成成分は、GCRAペプチドのN末端で結合されている。いくつかの態様において、ナノ粒子は、GCRAペプチドのN末端で結合されており、かつ別の構成成分は、C末端で結合されている。いくつかの態様において、他の構成成分は、化学療法剤である。1つの態様のセットにおいて、粒子は、内部および表面を有することができ、該表面は、該内部とは異なる組成を有し、すなわち、内部に存在するが表面上には存在しない（またはその逆の）少なくとも1つの化合物があってもよく、かつ／または少なくとも1つの化合物は、内部におよび表面上に異なる濃度で存在する。例えば、1つの態様において、本発明のポリマー結合体のターゲッティング部分（すなわち、低分子量リガンド）などの化合物は、粒子の内部および表面の両方に存在してもよいが、粒子の内部よりも表面上により高い濃度で存在しており、いくつかの場合に、粒子の内部における濃度は、本質的にゼロでなくてもよく、すなわち、粒子の内部に検出可能な量の化合物が存在する。
【００９１】
いくつかの場合に、粒子の内部は、粒子の表面よりも疎水性である。例として、粒子の内部は、粒子の表面に対して相対的に疎水性である場合があり、薬物または他のペイロードは、疎水性である場合があって、粒子の相対的に疎水性の中心と容易に会合する。したがって、薬物または他のペイロードを、粒子の内部の中に含有することができ、これにより、粒子の周囲の外部環境から避難させることができる（またはその逆も真である）。例として、対象に投与される粒子の中に含有された薬物または他のペイロードは、対象の身体から保護されることになり、身体もまた、少なくともある期間、薬物から実質的に隔離されうる。
【００９２】
例えば、第1の非官能化ポリマー；任意の第2の非官能化ポリマー；ターゲティング部分を含む任意の官能化ポリマー；および治療剤を含む治療用ポリマーナノ粒子が、本明細書において開示される。特定の態様において、第1の非官能化ポリマーは、PLAベース、PLGAベース、PEGベース、またはそれらのコポリマー、例えば、ジブロックコポリマーPLA-PEGである。例えば、例示的なナノ粒子は、約0.065 g/cm3、または約0.01〜約0.10 g/cm3の密度を有するPEGコロナを有しうる。
【００９３】
開示されるナノ粒子は、例えば、糖類を含有しうる溶液において、少なくとも約3日間、約4日間、または少なくとも約5日間、室温でまたは25℃で安定でありうる（例えば、実質的にすべての活性剤を保持している）。
【００９４】
いくつかの態様において、開示されるナノ粒子はまた、薬物放出の速度を増大させうる脂肪アルコールを含んでもよい。例えば、開示されるナノ粒子は、セチルアルコール、オクタノール、ステアリルアルコール、アラキジルアルコール、ドコソナール（docosonal）、またはオクタソナール（octasonal）などのC8-C30アルコールを含んでもよい。
【００９５】
ナノ粒子は、制御放出特性を有してもよく、例えば、ある量の活性剤を患者へ、例えば、患者における特異的な部位へ、長期の期間にわたって、例えば、1日、1週間、またはそれより長くにわたって送達することができうる。いくつかの態様において、開示されるナノ粒子は、例えば、リン酸緩衝溶液中に室温でおよび／または37℃で置いた場合に、約2％未満、約4％未満、約5％未満、または約10％未満の活性剤（例えば、タキサン）を実質的に直ちに（例えば、約1分〜約30分にわたって）放出する。
【００９６】
1つの態様において、本発明は、1）ポリマーマトリックスと、2）ポリマーマトリックスを囲むかまたはその中に分散されていて、粒子のための連続的な殻または不連続の殻を形成する両親媒性の化合物または層とを含むナノ粒子を含む。両親媒性の層は、ナノ粒子中への水の貫通を低減させることができ、それにより、薬物封入効率を増強して、薬物放出を遅くする。さらに、これらの両親媒性の層により保護されたナノ粒子は、封入された薬物およびポリマーを適切な時に放出することによって治療的利点を提供することができる。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「両親媒性」という用語は、分子が、極性部分および非極性部分の両方を有する特性を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に付着された極性頭部を有する。いくつかの態様において、極性部分は水溶性であり、一方、非極性部分は水に不溶性である。加えて、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれかを有してもよい。あるいは、極性部分は、形式正電荷および負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内塩であってもよい。例示的な両親媒性化合物には、例えば、天然に由来する脂質、界面活性剤、または親水性部分および疎水性部分の両方を有する合成化合物のうちの1つまたは複数が含まれる。
【００９８】
両親媒性化合物の具体例には、非限定的に、0.01〜60（脂質重量／ポリマー重量）、最も好ましくは0.1〜30（脂質重量／ポリマー重量）の比で組み入れられる、1,2 ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC)、ジアラキドイルホスファチジルコリン（DAPC)、ジベヘノイルホスファチジルコリン（DBPC)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（DTPC）、およびジリグノセロイルファチジルコリン（DLPC）などのリン脂質が含まれる。使用されうるリン脂質には、非限定的に、ホスファチジン酸、飽和脂質および不飽和脂質の両方を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジル誘導体、カルジオリピン、およびβ-アシル-y-アルキルリン脂質が含まれる。リン脂質の例には、非限定的に、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC)、ジアラキドイルホスファチジルコリン（DAPC)、ジベヘノイルホスファチジルコリン（DBPC)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（DTPC）、ジリグノセロイルファチジルコリン（DLPC）などのホスファチジルコリン；および、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたは1-ヘキサデシル-2-パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミンが含まれる。非対称性のアシル鎖を有する（例えば、6炭素の1つのアシル鎖および12炭素のもう1つのアシル鎖を有する）合成リン脂質がまた、使用されてもよい。
【００９９】
特定の態様において、両親媒性構成成分は、レシチン、および／または特に、ホスファチジルコリンを含んでもよい。
【０１００】
本発明の別の局面は、開示されるナノ粒子を作製するシステムおよび方法を対象とする。いくつかの態様において、2種類以上の異なるポリマー（例えば、ジブロックコポリマーなどのコポリマーおよびホモポリマー）を用いて、粒子の特性が制御されてもよい。
【０１０１】
特定の態様において、本明細書に記載される方法は、大量の封入された治療剤を有する、例えば、約1〜約40重量パーセント、または約1〜約30重量パーセント、例えば、約10〜約25重量パーセント、または約5〜約20重量パーセントの治療剤を含みうるナノ粒子を形成する。
【０１０２】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、最大で10μMの構成成分（例えば、薬物送達ビヒクル、化学療法剤、ミセル、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、脂質、イメージング剤、または標識剤）を含有するナノ粒子を作製するために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、100 nm〜10μMの構成成分を含有するナノ粒子を作製するために使用することができる。いくつかの態様において、構成成分は化学療法剤である。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、最大で10μMの本明細書において開示されるGCRAペプチドを含有するナノ粒子を作製するために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、100 nm〜10μMの本明細書において開示されるGCRAペプチドを含有するナノ粒子を作製するために使用することができる。
【０１０３】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、構成成分対GCRAペプチドのさまざまな比を含有するナノ粒子を作製するために使用することができる。いくつかの態様において、構成成分対GCRAペプチドの比は、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、または10：1である。いくつかの態様において、構成成分対GCRAペプチドの比は、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、または1：10である。いくつかの態様において、構成成分は化学療法剤であり、化学療法剤対GCRAペプチドの比は、10：1である。
【０１０４】
リポソームおよび制御放出
薬物送達システムを設計する目的で、種々の種類の高性能担体材料が、必要量の薬物を標的部位へ、必要な期間にわたって効率的にかつ正確に送達するために開発されている。
【０１０５】
シクロデキストリン、生分解性または非生分解性のポリマー、リポソーム、エマルジョン。複数のエマルジョンは、ゲスト分子の物理的、化学的、および生物学的特性を変更するその能力のために、そのような役割についての潜在的な候補である。ポリマーマイクロカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、およびエマルジョンを非限定的に含む、多数の薬物送達システムがある。これらの多くは、ポリ酸無水物およびポリヒドロキシ酸などの合成生分解性ポリマーから調製される。これらのシステムにおいて、薬物は、ポリマーマイクロスフェアに組み入れられ、それが、生物の内部で小さな制御された日用量で、数日、数か月の間、または数年に至るまで薬物を放出する。
【０１０６】
いくつかのポリマーは、制御放出システムにおいて既に試験された。例えば、ポリウレタンはその弾力性について、ポリシロキサンまたはシリコンは絶縁に良好なものであることについて、ポリメチル-メタクリラートはその物理的形態について；ポリビニルアルコールはその疎水性および抵抗性について、ポリエチレンはその硬度および不透過性について（Gilding, D. K. Biodegradable polymers. Biocompat. Clin. Impl. Mater. 2:209-232, 1981）。生分解性ポリマーおよび生体適合性ポリマーは、表面分解を受けるそれらの能力のために、制御放出システムのためのビヒクルとして大々的に研究されている。これらの種類のポリマーは、Tamada and Langer, J. Biomater. Sci. Polym. Edn, 3(4):315-353により記載されているように、ポリ(2-ヒドロキシ-エチルメタクリラート)、ポリアクリルアミド、乳酸由来ポリマー（PLA）、グリコール酸由来ポリマー（PGA）、およびそれぞれのもののコポリマー（PLGA）、ならびにポリ(アニドリド)から選択することができる。
【０１０７】
適している制御放出ビヒクルには、非限定的に、埋め込み可能または不可能な、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア、および経皮送達システムが含まれる。
【０１０８】
制御放出の満足のいくシステムには、非限定的に、シクロデキストリン、生体適合性ポリマー、生分解性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア、および経皮投与のシステムが含まれる。制御放出の他の組成物には、温度変化を受けた場合に、インサイチュで固体またはゲルを形成する液体が含まれる。
【０１０９】
リポソームは、分子、例えば薬物が、個体において投与後に薬物の制御放出に達する目的でその中に封入されている、水性の内部区画を含む脂質小胞である。多くの異なる技法が、リポソームの調製のために提唱されており［米国特許第4,552,803号, Lenk；米国特許第4,310,506号, Baldeschwieler；米国特許第4,235,871号, Papahadjopoulos；米国特許第4,224,179号, Schneider；米国特許第4,078,052号, Papahadjopoulos；米国特許第4,394,372号, Tailor；米国特許第4,308,166号, Marchetti；米国特許第4,485,054号, Mezei；および米国特許第4,508,703号, Redziniak；Woodle and Papahadjopoulos, Methods Enzymol. 171:193-215 (1989］；単層小胞は、単一の膜を提示し［Huang, Biochemistry 8:334-352 (1969］、一方、多重層小胞（MLV）は、多数の同心膜を有する［Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238-252 (1965］。Bangham［J. Mol. Biol. 13:238-252 (1965］の手順は、水性区画の間で不均等な溶質分布、およびその結果、浸透圧の違いを示す「普通のMLV」を作製する。Lenk et al.（米国特許第4,522,803号；米国特許第5,030,453号、および米国特許第5,169,637号）、Fountain et al.（米国特許第4,588,578号）、Cullis et al.（米国特許第4,975,282号）、およびGregoriadis et al.（特許W.O. 99/65465）は、区画の間で実質的に均等な溶質分布を示すMLVの調製のための方法を導入した。異なる区画の間での類似した溶質分布は、より大きな薬物封入効率、および、これらのMLVを普通のMLVよりも安定にする、より小さな浸透圧の違いを意味する。単層小胞は、MLVの超音波処理によって［Papahadjopoulos et al. (1968)］、またはポリカーボネート膜を通した押出し成形によって［Cullis et al.（米国特許第5,008,050号）およびLoughrey et al.（米国特許第5,059,421号）］作製することができる。
【０１１０】
満足のいく脂質には、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、コレステロール、ホスファチジン酸、スフィンゴ脂質、糖脂質、脂肪酸、ステロール、ホスファチジルエタノールアミン、重合形態または非重合形態における重合可能な脂質、これらの脂質の混合物が含まれる。
【０１１１】
リポソームの組成は、それらを器官または細胞タイプに特異的にするように操作することができる。リポソームのターゲティングは、解剖学的要因に基づいて、またはそれらと環境との相互作用の機序に基づいて分類されている。解剖学的分類は、例えば、器官特異的または細胞特異的な、それらの選択性のレベルに基づく。機序の観点から、ターゲティングは、受動的または能動的と考えることができる。
【０１１２】
受動的ターゲティングは、細網内皮系の細胞、すなわち、主として、肝臓、脾臓、および骨髄における固定マクロファージによって捕捉される従来のリポソームの天然の傾向を活用する。
【０１１３】
立体的に安定化されたリポソーム（「PEG-リポソーム」としても周知である）は、血液循環からの排出速度の低減を特徴とする［Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995)］。
【０１１４】
PEG-リポソームは、それらとオプソニンなどの血漿タンパク質との相互作用を低減させ、細胞によるそれらの摂取速度を低減させる、いくつかのリン脂質の頭部基に結合されたポリエチレングリコールポリマーをもたらす。結果として生じた立体障壁により、これらのリポソームは、従来のリポソームよりも長い期間、循環中にとどまることが可能になる［Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995)；Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105:193-200 (1992)；Litzinger et al., Biochim. Biophys. Acta 1190:99-107 (1994)；Bedu Addo, et al., Pharm. Res. 13:718-724 (1996］。PEG-リポソーム中の薬物封入は、多くの化学療法剤［Lasic and Martin, Stealth liposomes, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995)］および生理活性ペプチド［Allen T. M. In: Liposomes, New Systems, New Trends in their Applications (F. Puisieux, P. Couvreur, J. Delattre, J.-P. Devissaguet Ed.), Editions de la Sante, France, 1995, pp. 125］の有効性の改善を結果としてもたらした。
【０１１５】
この領域における研究により、さまざまな要因が、PEG-リポソームの有効性に影響を及ぼすことが実証された。理想的には、小胞の直径は200 nmよりも小さく、PEGにおける単位の数はおよそ2.000であり、かつペグ化脂質の比率は3〜5 mol％であるべきである［Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995)；Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105:193-200 (1992)；Litzinger et al., Biochim. Biophys. Acta 1190:99-107(1994)；Bedu Addo et al., Pharm. Res. 13:718-724(1996)］。
【０１１６】
能動的ターゲティングは、リポソームと、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、タンパク質、ポリマーなどのリガンドとの会合を通した、または、リポソームを従来のリポソームを蓄積するものとは異なる器官および細胞にターゲティングするために脂質組成またはリポソームサイズを変化させることによる、リポソームの変更を伴う。
【０１１７】
ペプチドが結合されたミセル（Layek et al. "Cell Penetrating Peptide Conjugated Polymeric Micelles as a High Performance Versatile Nonviral Gene Carrier" Biomacromolecules 2013, 14, 4071-4081）。
【０１１８】
ペプチド-薬物結合体：ペプチド-薬物-結合体（Arap et al. "Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model" Science 1998, 279(5349):377-80；Forner et al. "Peptide-drug conjugates: types, utility & Manufacturing" Specialty Chemicals Magazine May 2012, p 46-47；Firer et al. "Targeted drug delivery for cancer therapy: the other side of antibodies" Journal of Hematology & Oncology 2012, 5:70；Majumdar et al. "Peptide-Mediated Targeted Drug Delivery" Medicinal Research Reviews 32, No. 3, 637-658, 2012；Zhang et al. "Cellular Uptake and Cytotoxicity of Drug-Peptide Conjugates Regulated by Conjugation Site" Bioconjugate Chemistry 2013, 24, 604-613；Lelle et a. "Novel cleavable cell-penetrating peptide-drug conjugates: synthesis and characterization" J. of Peptide science 2014; 20: 323-333）。
【０１１９】
ペプチド-ポリマー結合体：Annu Rev Phys Chem. 2013; 64:631-57；がんワクチン：（Arens et al. "Prospects of combinatorial synthetic peptide vaccine-based immunotherapy against cancer" Seminars in Immunology 25 (2013) 182-190）。
【０１２０】
磁気ナノ粒子に結合されたペプチド：（Xie et al. "Surface-engineered magnetic nanoparticle platforms for cancer imaging and therapy" Accounts of Chemical Research 44(10) 883-892, 2011）。
【０１２１】
ペプチド-デンドリマー結合体：（Liu et al. "Novel peptide-dendrimer conjugates as drug carriers for targeting non-small cell lung cancer" International J. of Nanomedicine 2011:6 59-69）。
【０１２２】
放射標識ペプチド：（Fani et al. "Radiolabeled Peptides: Valuable Tools for the Detection and Treatment of Cancer" Theranostics 2012, 2(5): 481-501）。
【０１２３】
Fe3O4などのがん分子イメージングのためのペプチド結合体：Anticancer Agents Med Chem. 2012。
【０１２４】
処置法
本発明のGRCAペプチド結合体は、概して、がんの治療薬または予防薬として有用であり、インビボで投与される。それらは、単独で、または他の薬物および／もしくは放射線療法と併せて哺乳動物対象（例えば、ヒト結腸がん患者）に投与することができる。化合物はまた、遺伝学的におよび／または環境的に（例えば、生理学的要因および／または環境要因のために）がんになりやすい対象、例えば、がん（例えば、結腸がん）の家族歴を有する対象、慢性炎症を有するかもしくは慢性ストレスに供されている対象、または天然もしくは非天然の環境的発がん条件（例えば、日光、産業用発がん物質、またはタバコの煙に対する過剰な曝露）に曝されている対象に投与することもできる。
【０１２５】
本発明の方法を適用することができるがん細胞は、概して、グアニル酸シクラーゼC受容体を発現する任意の細胞を含む。適切な細胞は、例えば、結腸がん細胞、転移性結腸がん細胞、結腸ポリープ、結腸腺腫、または結腸微小腺腫である。本発明の目的で、処置されるべき哺乳動物の1つまたは複数のリスクにある集団は、（1）結腸がん、結腸腺腫、および／もしくは結腸微小腺腫と診断されている；ならびに／または（2）結腸がん、結腸腺腫、および／もしくは結腸微小腺腫と診断されている近い血縁関係を有するものを含む。加えて、本発明の方法は、広範な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、およびマウスに適用することができる。
【０１２６】
必要とされる投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾病の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬物；ならびに主治医の判断に依存する。適している投薬量は、0.0001 mg/kg〜100 mg/kgの範囲である。利用可能なさまざまな化合物、および種々の投与経路の異なる効率を考慮して、必要とされる投薬量において幅広い変動が予想されるべきである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも多い投薬量を必要とすることが予想されるであろう。これらの投薬量レベルにおける変動は、当技術分野においてよく理解されるように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調整することができる。投与は、単回または複数回（例えば、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回、50回、100回、150回、またはそれより多い回）であることができる。適している送達ビヒクル（例えば、ポリマーマイクロ粒子または埋め込み可能な装置）におけるポリペプチドの封入は、特に経口送達のために、送達の効率を増大させる可能性がある。いくつかの態様において、投与経路は、治療薬の用途または検出／処置されるがんのタイプに依存する。例えば、いくつかの態様において、治療薬は、GI管におけるポリープ、腫瘍、および他の異形成病変の検出のために使用され、経口投与のために製剤化される。いくつかの態様において、治療薬は、結腸直腸転移の検出（例えば、血液および身体の他の器官における）のために使用され、静脈内投与のために製剤化される。
【０１２７】
治療的投与および製剤
本開示に従う治療用実体の投与は、適している担体、賦形剤、および、改善された移入、送達、耐容などを提供するために製剤中に組み入れられる他の作用物質と共に施されるであろうことが、認識されるであろう。数多くの適切な製剤を、すべての製薬化学者に知られている処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特に、その中のBlaug, Seymourによる87章において見出することができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（Lipofection（商標）など）、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョン、エマルジョンcarbowax（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびcarbowaxを含有する半固体混合物が含まれる。前述の混合物のいずれかは、製剤中の活性成分が製剤化によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合性であり、かつ投与経路で耐容性があるという条件で、本開示に従う処置および治療において適切でありうる。製薬化学者によく知られている製剤、賦形剤、および担体に関連する追加的な情報については、Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)、Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)、Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)、Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、およびそれらにおける引用もまた参照されたい。
【０１２８】
いくつかの態様において、本発明による結合体（本明細書において治療薬と総称される）は、1つもしくは複数の追加的作用物質、または追加的作用物質の組み合わせと併せて投与される。適している追加的作用物質には、意図される適用のための、現在の薬学的療法および／または外科的療法が含まれる。例えば、治療薬は、追加的な化学療法剤または抗新生物剤と併せて使用することができる。例えば、治療薬および追加的作用物質は、単一の治療用組成物中に製剤化され、治療薬と追加的作用物質とが同時に投与される。いくつかの態様において、治療薬および追加的作用物質は、互いに分離され、例えば、各々は別々の治療用組成物中に製剤化され、治療薬と追加的作用物質とが同時に投与されるか、または治療薬と追加的作用物質とが処置レジメンの最中の異なる時に投与される。例えば、治療薬が追加的作用物質の投与の前に投与されるか、治療薬が追加的作用物質の投与の後に投与されるか、または治療薬と追加的作用物質とが交互の様式で投与される。本明細書に記載されるように、治療薬および追加的作用物質は、単一用量でまたは複数用量で投与される。
【０１２９】
いくつかの態様において、追加的作用物質は、治療薬にカップリングされているか、または別の様式で治療薬に付着されている。
【０１３０】
適している追加的作用物質は、意図される適用（すなわち、殺傷、細胞増殖の防止、ホルモン療法、または遺伝子治療）の目的に従って選択される。そのような作用物質には、非限定的に、例えば、薬学的作用物質、毒素、毒素の断片、アルキル化剤、酵素、抗生物質、抗代謝薬、抗増殖性作用物質、ホルモン、神経伝達物質、DNA、RNA、siRNA、オリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、アプタマー、診断薬、放射線不透過性色素、放射性同位体、蛍光発生化合物、磁気標識、ナノ粒子、マーカー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変更する化合物、光化学化合物、小分子、リポソーム、ミセル、遺伝子治療ベクター、ウイルスベクターなどが含まれうる。最終的に、作用物質の組み合わせまたは異なるクラスの作用物質の組み合わせが使用されてもよい。
【０１３１】
本開示の結合体（本明細書において「治療薬」または「活性化合物」とも称される）、ならびにその誘導体、断片、アナログ、およびホモログは、投与に適している薬学的組成物中に組み入れることができる。そのような組成物の調製に関わる原理および考察、ならびに構成成分の選択における手引きは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995；Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；およびPeptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkにおいて提供されている。
【０１３２】
そのような組成物は、典型的に、本開示の結合体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性である、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むように意図される。適している担体は、参照により本明細書に組み入れられる、本分野における標準的な参照文書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の適している例には、非限定的に、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれる。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルがまた、使用されてもよい。薬学的に活性を有する物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である限りを除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。
【０１３３】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１３４】
本開示の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含むことができる：注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための作用物質。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジ、複数用量バイアルの中に封入することができる。
【０１３５】
注射可能な用途に適している薬学的組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、または無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与について、適している担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。すべての場合において、組成物は、無菌でなければならず、かつ、シリンジ通過が容易である程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適している混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが適していると考えられる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされることができる。
【０１３６】
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙された成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に組み入れ、その後濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記に列挙された成分由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末が、それらの事前に濾過滅菌された溶液から生じる。
【０１３７】
経口組成物は、概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入することができるか、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療投与の目的で、活性化合物を、賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製することもでき、該液体担体中の化合物を経口適用して、口をすすぎ、吐き出すかまたは飲み込む。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有することができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；または、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの着香剤。
【０１３８】
吸入による投与のために、化合物は、適している噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１３９】
全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によることができる。経粘膜投与または経皮投与のために、透過されるべき障壁に適切な浸透剤を、製剤において使用する。そのような浸透剤は、概して、当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、概して当技術分野において公知であるように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム中に製剤化される。
【０１４０】
化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を伴う）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１４１】
1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む持続／制御放出製剤などの、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者に明らかであろう。
【０１４２】
例えば、活性成分を、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）においてまたはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセルに閉じ込めることができる。
【０１４３】
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適している例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、形状を有する物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態であるマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタマートとのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
【０１４４】
材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４５】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、経口組成物または非経口組成物を単位剤形で製剤化することが、特に有利である。単位剤形は、本明細書において使用される場合、処置されるべき対象のための単位投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じると計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形についての明細は、活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにそのような活性化合物を調合する当技術分野に内在する限界によって決定づけられ、かつそれらに直接依存する。
【０１４６】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
【０１４７】
製剤はまた、処置される特定の適応症に必要な場合、1種類よりも多い活性化合物、例えば、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有することもできる。いくつかの態様において、または加えて、組成物は、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤などの、その機能を増強する作用物質を含むことができる。そのような分子は、意図される目的で有効である量において、組み合わせで適切に存在する。
【０１４８】
1つの態様において、活性化合物は、併用療法において、すなわち、他の作用物質、例えば、結腸腺腫、ポリープ、結腸がん、およびその転移を処置するのに有用である治療剤と組み合わせて投与される。本文脈における「組み合わせで」という用語は、作用物質が実質的に同時発生的に、同時にまたは逐次的にのいずれかで与えられることを意味する。逐次的に与えられるならば、第2の化合物の投与の開始時に、2種類の化合物のうちの第1は、依然として処置の部位で有効な濃度で検出可能である。
【０１４９】
そのような併用療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に利用し、したがって、種々の単独療法と関連する可能性のある毒性または合併症を回避しうる。
【０１５０】
定義
本明細書において使用される場合、「およそ」、「約」、または「ほぼ」とは、概して、所与の値または範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、およびより好ましくは5パーセント以内を意味することになる。本明細書において与えられる数量は近似であり、明白に述べられないならば、「およそ」、「約」、または「ほぼ」という用語が推論されうることを意味する。
【０１５１】
「薬物送達ビヒクル」という用語は、薬剤を患者に、身体のいくつかの部分における薬剤の濃度を他の部分と比べて増大させる様式で送達することができるビヒクルを指す。薬物送達ビヒクルには、非限定的に、ポリマーミセル、リポソーム、リポタンパク質ベースの薬物担体、ナノ粒子薬物担体、デンドリマー、細胞、ポリペプチドなどが含まれる。理想的な薬物送達ビヒクルは、非毒性、生体適合性、非免疫原性、生分解性でなければならず、宿主の防御機構による認識を回避しなければならない。「処置する」または「処置」という用語は、有効量の化合物の、がん、またはそのような疾患に向かう症状もしくは素因を有する、それを必要とする対象への、疾患、その症状、またはそれに向かう素因を治癒する、緩和する、軽減する、治す、改善する、または防止する目的での投与を指す。そのような対象は、任意の適している診断法からの結果に基づいて、医療従事者が特定することができる。
【０１５２】
「有効量」とは、処置される対象に対して治療効果を与えるために必要とされる活性化合物の量を指す。有効用量は、当業者により認識されているように、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療的処置との同時使用の可能性に依存して変動するであろう。
【０１５３】
米国保健福祉省食品医薬品局（U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration）によって刊行されている「Guidance for industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」により、「治療的有効量」は、以下の式：HED＝mg/kgの動物用量×（動物のkg体重／ヒトのkg体重）0.33からの計算値によって得られうることが開示されている。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射標識アミノ酸の組み入れ、またはマークされたアビジン（例えば、光学的または熱量測定の方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着による、検出可能なマーカーの組み入れを指す。ある特定の状況において、標識またはマーカーもまた、治療的であることができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が、当技術分野において公知であり、使用されうる。ポリペプチドに対する標識の例には、非限定的に、以下が含まれる：放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、蛍光体、ローダミン、ランタニドリン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、p-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ。いくつかの態様において、標識は、可能性のある立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームによって付着される。「薬学的作用物質または薬物」という用語は、本明細書において使用される場合、患者に妥当に投与された時に所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。
【０１５５】
本明細書において引用されるすべての刊行物および特許文献は、あたかも各々のそのような刊行物または文献が参照により本明細書に組み入れられるように具体的にかつ個々に指示されるかのように、参照により本明細書に組み入れられる。刊行物および特許文献の引用は、いずれかが該当する先行技術であることの承認として意図されないし、同一物の内容または日付についてのいずれの承認も構成しない。本発明が、書面による説明として現在説明されているが、当業者は、本発明が様々な態様において実施できること、ならびに、前述の説明および下記の実施例は、例証の目的であり、添付の特許請求の範囲の限定ではないことを認識しているであろう。
【実施例】
【０１５６】
実施例1：SP-333-IR680プローブの合成
SP-333を、インビボイメージングの目的で、適切な赤外（IR）蛍光色素で標識した。ペプチドを、N-ヒドロキシスクシンアミジル（NHS）活性化エステルとペプチドのアミン基との反応を通して、適切なIR色素で標識することにした。PerkinElmer, Incによって供給されているVivoTag680 NHSエステルでの本発明者らの最初の試験は、成功しなかった。したがって、蛍光色素のCy3-NHSエステルおよびCy5.5 NHSエステルとSP-333とのコンジュゲーションを試してみた。Cy3でのSP-333の標識およびその後のHPLC精製は成功し、30％の全標識効率が達成された。Cy5.5の分光学的特性は、VivoTag680のものに匹敵していた。Cy3およびCy5.5は両方とも、バイオイメージング適用において使用されるシアニン蛍光色素のファミリーに属する。本発明者らは、多数の実験を行って、これらの色素が、SP-333のN末端に、GC-C受容体に対するその結合をはっきりと喪失することなく結合されうることを決定した。SP-333に対する色素のいずれかのコンジュゲーションおよびその後の精製は成功したが、生成されたCy3-SP-333およびCy5.5-SP-333は、T84細胞の表面上に発現したGC-C受容体に対する特異的結合を呈することができなかった。本発明者らは、T84細胞およびラット腸組織から単離した細胞膜で、同様の結合実験を行った。再び、これらのプローブは両方とも、いかなる特異的結合も示さなかった。特異的結合の欠如を示す同様の結果がまた、ラット腸断片でのエクスビボ結合においても観察された。したがって、SP-333-IR680蛍光をカスタム合成した。
【０１５７】
カスタム合成プロセスの説明
緩衝液調製
Sorensonのリン酸緩衝液（pH8.0-8.5）を、下記の比に従って調製した：
溶液A：Na2HPO4.12H2O（71.64g）を秤量し、DI水に溶解して、DI水で1000mLに合わせる；
溶液B：NaH2PO4.2H2O（31.21g）を秤量し、DI水に溶解して、DI水で1000mLに合わせる；
溶液A（47.35mL）と溶液B（2.65mL）とを完全に混合し、DI水で希釈して100mLにする。溶液のpHは、pHメーターで測定して8.09であった。
【０１５８】
IPC HPLC法
2018534317.tif 000023
【０１５９】
コンジュゲーション
Api 1251（SP-333）酢酸塩（49.6mg、0.0285mmol、1.0eq）を、1.5mLの上記のSorensonのリン酸緩衝液（pH 8.09）に超音波処理で溶解した。上記の透明なペプチド溶液に、IRDye-680LT NHSエステル（40mg、0.0285mol、1.0eq）を添加した。瓶中の残りの色素材料を、1.05mLのSorensonのリン酸緩衝液（pH 8.09）でリンスして、反応混合物に添加した。反応を、室温（20〜28℃）で一晩、光から保護して継続させた。反応を、HPLCでモニタリングした。反応の完了後、反応混合物を濾過して、濾過物を直接、HPLCカラム上に添加した（図1）。
【０１６０】
RP-HPLC精製
ペプチド溶液を、1.2 um膜を通して濾過し、次いで、Kromasil 10μm、C18固相媒体を25 cmのベッド高まで充填した直径5cmのカラムに添加して、溶媒送達システムによって稼働させた。調製用RP-HPLC精製を、水中10mM NaOH、pH＝6.5（H3PO4でpH調整）の緩衝液システムにおいて、80分で11-35％の有機成分の勾配溶出で、90mL/分の流速で行った。関心対象のペプチドを、画分において収集し、HPLCを介して分析して全純度を評価した。
【０１６１】
透析および凍結乾燥
収集した精製画分を、1L容器において脱イオン水に対して2日間、水を4〜8時間毎に交換して、（300 MWCO膜を用いて）透析した。透析したペプチド溶液を、次いで、72時間の凍結乾燥によって単離し、APi1578の最終産物を生じた。
【０１６２】
アプローチにより、生理活性を有するIR680-SP-333プローブが作製された。下記のインビトロ、エクスビボ、およびインビボの研究のすべては、このプローブを用いて行った。
【０１６３】
実施例2：T84細胞上のGC-Cに対するIR680-SP-333の特異的結合
バックグラウンドを低減させ、特異的結合を増強する結合条件を確立するために、実験を行った。これらの実験により、T84単層の齢は、細胞表面上のGC-Cの最大発現の可能にするために播種後7〜9日の間であるべきことが結論づけられた。次に、本発明者らは、最適な結合緩衝液、T84細胞に対するプローブの結合を可能にするインキュベーション時間、およびエンドサイトーシスを最小化する結合インキュベーションの温度を確立した。T84細胞に対するプローブの特異的結合のための最適な条件を、簡潔にここに説明する。ヒトT84細胞を、96黒色透明底プレートにおいてコンフルエントになるまで成長させた。培地を吸引して、プレートを、200ul/ウェルのブロッキング緩衝液（DMEM/F12 + 150mM NaCl + 20mMリン酸水素二ナトリウム、pHを1N HClで6.0に調整）で2時間、細胞培養インキュベーター中、37℃でブロッキングした。ブロッキング緩衝液を吸引して、50ul/ウェルの結合緩衝液（DMEM/F12 + 150mM NaCl + 20mMリン酸水素二ナトリウム、pHを1N HClで6.0に調整）を10分間添加して、細胞をあらかじめ調整した。この後、50ul/ウェルのIR680-SP333を添加した。プレートを、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、200ul/ウェルの冷却した結合緩衝液で2回洗浄し、100ul/ウェルの冷却したPBS、pH7.2を添加して、Tecan F200を用いてex680、em715でプレートを読み取り、結果を、iControlソフトウェアを用いてプロットした。図3に示されるように、プローブは、T84細胞上に発現したGC-Cに、用量依存様式で特異的に結合した。プローブの結合は、100倍過剰量の非標識SP-333の存在下で大幅に低減し、プローブの結合がGC-C受容体に対して特異的であることが示唆された。
【０１６４】
次に、本発明者らは、T84細胞の浮遊液に対するプローブの結合を行った。この実験のセットにおいては、9日間T75フラスコにおいて培養した細胞を、スクレイピングによって採集し、予冷した結合培地に懸濁した。様々な密度の細胞を、予冷した結合緩衝液中の200 mL IR680-SP-333（最終濃度0.5μM）と4℃で30分間インキュベートした。IR680-SP-333を非標識SP-333で希釈して、0.5μMの最終濃度のプローブを調整した。この希釈は、40,000細胞上の利用可能なGC-C結合部位を飽和させるために必要であった。図4に示されるように、結合のための最適な結合密度は、0.5μMのプローブに対して40,000細胞であることが決定された。細胞浮遊液に対するプローブの結合は、100倍過剰量のSP-333の存在下で消滅し、結合の特異性が実証された。
【０１６５】
実施例3：IR680-SP-333の結合特異性の実証
T84細胞に対するIR680-SP-333結合の特異性は、増大する濃度の非標識SP-333との競合によってさらに実証された。図5に示されるように、プローブの結合は、非標識SP-333によって用量依存様式で阻害され、IC50値はおよそ1.6μMであった。この実験を、2つの異なるバッチで数回反復して、プローブがT84細胞表面上のGC-Cに特異的に結合することを確認した。さらに、図6に示されるように、T84 cGMPバイオアッセイにおいて、非結合SP-333、およびIR680またはビオチンに結合されたSP-333の効力。IR680 NHSエステル（約5〜6炭素当量）は、SP-333に直接結合され、一方、ビオチンは、2アミノエトキシエトキシ酢酸（AEEA；各々約9〜10炭素鎖当量）を介してSP-333に結合される。結合体は両方とも、非結合SP-333と比較した際にわずかに低いレベルであるが、T84細胞においてcGMP産生を刺激するそれらの能力によって証明されるように、活性を有する。
【０１６６】
実施例4：結腸腺腫のエクスビボおよびインビボの検出
エクスビボおよびインビボの研究を行って、Apc+/Min-FCCCマウスにおいて結腸腺腫に対するIR680-SP-333プローブの特異性を評定した。IR680-SP-333を、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液および3％ BSAを含有するDMEM/F-12培地、pH 6において調製し；同じ培地をインビトロ実験に使用した。最初の予備的研究からのデータに基づいて、組織と0.1μM IR680-SP-333との30分間、37℃でのインキュベーションを、エクスビボ研究のための最適な条件として選択した。落射蛍光画像を、以下のように獲得した：励起波長＝640 nm、検出波長＝700 nm、曝露時間＝オート-3分、F-ストップ＝1、ビニング＝1（「小」設定）、視野＝0.3 cm（設定「C」）。IR680-SP-333プローブは、周囲の正常な結腸粘膜に対するよりも強い結合を、結腸直腸ポリープに対して呈したが、IR680-SP-333プローブは、すべての結腸直腸ポリープには結合しなかった。プローブ結合において観察された不均一性に対するマウスの齢の寄与を排除するために、徹底的なイメージング研究を、種々の齢（2、3、4、5、および6か月）のマウスにおいて行った。このエクスビボ研究においては、マウスを安楽死させ、結腸を摘出して、縦方向に切開し、PBSで洗浄した。結腸組織を、0.1μM IR680-SP-333と37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、組織をPBSで洗浄し（4回）、上記の設定を用いて、IVIS Spectrumにおいて画像化した。結果として生じた画像の慎重な調査により、3つの主要な結論がもたらされる：1）結腸直腸ポリープに対するIR680-SP-333プローブの結合は、サイズ依存的である。プローブシグナルは、直径が≦3 mmのポリープにおいて、直径が＞4 mmのポリープにおいてよりも強かった（図7）。2）シグナルがポリープサイズで変動したため、結合は、結腸直腸ポリープの大部分がより小さい（直径が≦3 mm）、2〜3か月齢のマウスにおいて増強されていた（図7）。マウスが高齢になるにつれて、結腸直腸ポリープはサイズが増大し、ポリープを検出するプローブの能力が減少した（図8）。これらのデータは、GC-C発現が結腸腺腫において常に検出可能ではなかったことを明らかにしたQ-PCR解析によって支持された。結腸直腸ポリープの発生率は、2か月齢のマウス（45％）に対して3か月齢のマウス（70％）においてより高いため、すべてのその後のインビボIR680-SP-333解析において10〜12週齢のマウスを使用して、腫瘍をスクリーニングすることが必要である動物の数を最小化する決定をした。3）IR680-SP-333プローブのシグナルは、ポリープの非存在下であっても、結腸の近位端および遠位端で高かった。同様の未知の起源の非特異的結合が、これらの同じ先端領域で、独立したプローブでの以前の実験において観察されている。
【０１６７】
エクスビボの結合研究に続いて、プローブがGI管を通過する際に無傷のままであり、結腸病変に結合するプローブの能力を評価するために、実験を行った。このインビボ実験において、Apc+/Min-FCCCマウス（10〜12週齢）を、以前に確立されたプロトコール（Hensley, Gastrointestinal Endoscopy group）に従って、プローブ投与の前に結腸鏡検査に供した。結腸ポリープが確認されたマウスを、ランダム化して、0.5または0.05 mg/kg体重のIR680-SP-333を強制経口投与により受けさせた。プローブ投与の前に、マウスを、腸洗浄のために一晩絶食させて、Pedialyteを制約なしで提供した。マウスにIR680-SP-333を強制経口投与し、処置の30、60、90、および120分後に安楽死させた。安楽死の時に、結腸を摘出し、その全長を切開して、食塩水でリンスした。次いで、各結腸を、プラスチック定規の上に置き、エクスビボ実験についての上記の設定を用いて、IVIS Spectrumシステムにおいて画像化した。画像獲得の直後に、全結腸を、プラスチック定規上で無傷のまま10％通常緩衝ホルマリン中に置き、プローブシグナルについて陽性および陰性の区域を、組織病理学的評定のために収集した。異なる時間の間隔から得られた画像の比較により、IR680-SP-333 0.05 mg/kg体重を強制経口投与し、処置の30分後に画像化したマウスにおける、結腸直腸ポリープのシグナル強度と隣接する正常な結腸粘膜のバックグラウンドシグナルとの間の良好な差が明らかになった（図9A）。注目すべきことに、より高い用量のSP-333-IR680プローブは、腫瘍と正常組織との間の差を改善することができなかった（図9B）。投薬と画像化との間のより長い時間の間隔（?90分）の使用により、非特異的結合の増大がもたらされる（図9C）。IR680-SP-333プローブの追加的な用量（0.0158および0.158 mg/kg体重）の評定によって、0.05 mg/kg体重のIR680-SP-333のマウスへの強制経口投与および処置の30分後の画像化により、非新生物性結腸粘膜と新生物性結腸粘膜との間のシグナルにおける最高の差が生じたことが確認された。
【０１６８】
強いシグナル（腫瘍）および対応するバックグラウンドシグナル（非新生物性対照）を有する結腸組織を、組織病理学評定のために加工処理し、盲検様式でビンを調査した。2つの主要な結論が得られた：1）正常な結腸粘膜におけるIR680-SP-333のバックグラウンドシグナルは、同じ処置レジメン（例えば、同じ用量のIR680-SP-333、および画像化の前の同じ処置後時間の間隔）を受けたマウスの間で変動していた。この不均一性により、単に落射蛍光値に基づいて、落射蛍光スケールを標準化し、陽性シグナルと陰性シグナルとを分類することが不可能になる。第2に、IR680-SP-333プローブシグナルの強度は、腫瘍サイズまたは病変の組織学的サブタイプ（ポリープ、不確定、または平坦）のいずれとも相関しなかった。図10（マウスID 12281）に示されるように、最強のプローブシグナルが、過剰増殖（HP）の区域において観察され、中間のシグナル強度を有する腺腫がそれに続いた。シグナルのわずかな増大が、周囲の正常な結腸粘膜と比較した際に、微小腺腫において観察された。図11に提示された結腸（マウスID 12276）は、小さな肉眼的病変（1-mmのサイズ）において非常に強いプローブシグナルを呈し、平坦／不確定な腺腫においてより弱いシグナルを呈する。図12（マウスID 12201）において、強いシグナルが、過形成性ポリープ（HP）；高い増殖の区域に局在化しており、プローブシグナルの強度と結腸病変のサイズ／タイプとの間の相関の欠如に対して追加的な支持を提供する。しかし、高い増殖の区域（例えば、小さな病変および過形成性ポリープ）におけるプローブシグナルの蓄積により、IR-680-SP-333が早期結腸直腸病変の検出において有用でありうることが示唆される。プローブIR-680-SP-333はまた、肝臓および他の器官における結腸直腸転移の検出においても有用でありうる。
【０１６９】
他の態様
本発明が、それらの詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、例証となるように、かつ添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないように意図されている。他の局面、利点、および改変が、添付の特許請求の範囲内である。
【図１】
2018534317.tif 000025
【図２Ａ】
2018534317.tif 000026
【図２Ｂ】
2018534317.tif 000027
【図３】
2018534317.tif 000028
【図４】
2018534317.tif 000029
【図５】
2018534317.tif 000030
【図６】
2018534317.tif 000031
【図７】
2018534317.tif 000032
【図８】
2018534317.tif 000033
【図９】
2018534317.tif 000034
【図１０】
2018534317.tif 000035
【図１１】
2018534317.tif 000036
【図１２】
2018534317.tif 000037
【配列表】
2018534317000001.app
【国際調査報告】
2018534317.tif 000038
2018534317.tif 000039