(57)【要約】  ＭａＳＰ由来のタンパク質の混合物を含む組成物、このタンパク質をコードする核酸および合成ドラグラインスパイダーシルクの調製のための方法が提供される。本発明の組成物は異なる分子量のタンパク質の混合物を含み、上記混合物の各タンパク質が、独立して、ＭａＳＰ（大瓶状腺スピドロイン）タンパク質またはその機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片の反復領域のマルチプルリピートを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる分子量のｍタイプのタンパク質を含むタンパク質の混合物を含む組成物であって、前記混合物中の各タンパク質が、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳＰ）タンパク質、またはその機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片の反復領域のｎリピートを含み、ｍおよびｎが、独立して、２〜７０の間の整数である、組成物。
【請求項２】
前記ｎが、前記混合物中のタンパク質の各タイプについて同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各リピートが、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
各リピートが、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの分子量増分を有する前記混合物の２種以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの分子量増分を有する前記混合物の２種以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ｎが、４および３２に等しい整数または４〜３２の間の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ｍが、４および３２に等しい整数または４〜３２の間の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
「ｎ」対「ｍ」の比率が、２：１〜１：２の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
「ｎ」と「ｍ」が、等しい、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リピートが、ＡＤＦ−４もしくはＭａＳＰ１タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記反復領域が、第一の部分とそれに連続する第二の部分とを有し、前記第一の部分がアラニン残基を少なくとも５０％含む５〜３０アミノ酸のアミノ酸配列であり、前記第二の部分がグリシン、セリン、プロリンおよびチロシンからなる群から選択される残基を少なくとも８０％含む２０〜６０アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記反復領域の第二の部分が、最大で２つのグルタミン残基を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記反復領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
（Ｘ１）ＺＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、ＳまたはＧであり；Ｘ３は、ＧまたはＥであり；Ｘ４は、Ｇ、ＳまたはＮであり；Ｘ５は、ＱまたはＹであり；Ｘ６は、ＧまたはＳであり；Ｘ７は、ＰまたはＲであり；Ｘ８は、ＹまたはＱであり；Ｘ９は、ＧまたはＳであり；Ｘ１０は、ＳまたはＧである）で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記反復領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３
（Ｘ１）ＺＸ２ＳＧＰＸ３ＧＧＹＧＸ４ＰＸ５ＱＧＰＸ６ＧＧＹＧＰ
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚはが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、Ｓ−Ｇまたは非存在であり；Ｘ３は、Ｇ−Ｑまたは非存在であり；Ｘ４は、Ｇまたは非存在であり；Ｘ５は、ＳまたはＧであり；Ｘ６は、Ｓ−Ｐ、Ｇ−Ｒまたは非存在である）で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記反復領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４および３５〜４４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記反復領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記反復領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記相同体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３、３３および３５〜４４のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記混合物の各タンパク質が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶ）；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＲＰＬＳＮＬＤＮＡ）；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＤＰＰＧＣＲＮＳＡＲＡＧＳＳ）
からなる群から選択される単一Ｎ末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、もしくは断片をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｎ末端領域の前記相同体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜７のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記混合物の各タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳＶＡＡＳＲＬＳＳＰＡＡＳＳＲＶＳＳＡＶＳＳＬＶＳＳＧＰＴＮＧＡＡＶＳＧＡＬＮＳＬＶＳＱＩＳＡＳＮＰＧＬＳＧＣＤＡＬＶＱＡＬＬＥＬＶＳＡＬＶＡＩＬＳＳＡＳＩＧＱＶＮＶＳＳＶＳＱＳＴＱＭＩＳＱＡＬＳ）からなる群から選択される単一Ｃ末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｃ末端領域の前記相同体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と少なくとも７０％の相同性を共有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記混合物の１つまたは複数のタンパク質が、少なくとも１つのタグ配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
タンパク質の前記混合物が、ＡＤＦ−３またはＭＡＳＰ−２タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
２５０〜３３０℃の範囲の少なくとも１つの吸熱ピークを示すＤＳＣパターンによって特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＤＳＣパターンが、２２０〜２５０℃の範囲の吸熱ピークをさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を含む物品。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を含む繊維。
【請求項３１】
請求項１に記載のタンパク質の前記混合物の２種以上のタンパク質をコードする単離された核酸配列。
【請求項３２】
請求項３１の核酸配列を含む発現ベクターであって、前記核酸配列が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により、調節配列との発現制御下にある、発現ベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年８月１０日出願の米国特許仮出願第６２／２０３，１０２号、２０１６年２月１１日出願の同第６２／２９３，８８０号、および２０１６年４月３日出願の同第６２／３１７，５７２号の優先権を主張するものである。上記文書の内容は、全てが本明細書に示されるかの如く、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、合成ドラグラインスパイダーシルクの調製のためのＭａＳＰ（大瓶状腺スピドロイン）タンパク質に由来するタンパク質の混合物を含む組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ドラグラインスパイダーシルクは、クモの巣の枠および半径、ならびにクモが降下または危険回避する際の命綱を構築するために、巣をかけるクモによって用いられるシルクとして当該技術分野で知られている。これらの労作の実践を可能にするために、ドラグライン繊維は、高い弾性および強度の組み合わせにより著しく高い靭性を示し、そのことで天然または人工にかかわらずドラグライン繊維は靭性繊維と見なされている。例えばドラグラインは、その直径で高張力鋼の６倍強く、これまで作製された最強の合成繊維の１種であるＫｅｖｌａｒよりも３倍強靭である。
【０００４】
ドラグラインシルクは、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１および２と主に呼ばれ、ニワオニグモではＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４とも呼ばれる２つの主なポリペプチドからなる。これらのタンパク質は、試料の年代および分析条件に応じて２００〜７２０ｋＤａの範囲内の見かけ分子量を有する。公知のドラグラインシルクスピドロインは、繊維中で結晶性βシートを形成する高アラニンセグメントと、より可撓性で大部分は秩序構造を欠く高グリシンセグメントと、が交互になった高度に繰り返されるブロックで構成されている。Ｃ末端領域は、非反復性で、種の間で高度に保存されており、αらせんコンフォメーションを取る。ドラグラインシルクタンパク質のＮ末端領域もまた、異なるスピドロイン間で、そして異なるクモ種の間でも高度に保存されていることが見出された。
【０００５】
スパイダーシルクを合成で生成する試みが、細菌、酵母、組織培養での植物および哺乳動物細胞ならびにトランスジェニックのヤギを用いる遺伝子操作によってなど、数多く行われてきた。
【０００６】
中でも米国特許第８，４６１，３０１号は、半合成スパイダーシルクタンパク質ドメイン、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、断片もしくは突然変異体のマルチプルリピートを含む単離されたアミノ酸配列に関する。この発行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００７】
ドラグラインスパイダーシルクに関するさらなる発行物としては、Ｉｔｔａｈ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ９３  （５），  ４５８−４６８，  ２０１０；  Ｉｔｔａｈ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ８  （９），  ２７６８  −２７７３，  ２００７；Ｉｔｔａｈ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ７  （６），  １７９０  −１７９５，  ２００６；およびＨｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，  Ｄ．，  Ｉｔｔａｈ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４，  ２０７０−２０７４，  ２００４が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。 
【０００８】
天然スパイダーシルクと類似の機械的性質を備えた繊維を製造するための改善された組成物および方法へのアンメットニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明は、合成ドラグラインスパイダーシルクの製作のためなどの、異なる分子量を有しＭａＳＰタンパク質に由来するタンパク質の混合物を含む組成物を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
幾つかの態様によれば、異なる分子量のｍタイプのタンパク質を含むタンパク質の混合物を含む組成物であって、上記混合物中の各タンパク質が、独立して、ＭａＳＰタンパク質、またはその機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片に由来する反復領域のｎリピートを含み、ｍおよびｎが、独立して、２〜７０の間の整数である、組成物が提供される。
【００１１】
幾つかの実施形態において、上記ＭａＳＰタンパク質は、ＭａＳＰ−１、ＭａＳＰ−２、ＡＤＦ−４およびＡＤＦ−３からなる群から選択されるタンパク質である。幾つかの実施形態において、上記ＭａＳＰタンパク質は、ＭａＳＰ−１およびＭａＳＰ−４から選択されるタンパク質である。
【００１２】
幾つかの実施形態において、上記ｎは、上記混合物中のタンパク質の各タイプについて同一である。別の実施形態において、ｎは、４および３２に等しい整数、または４〜３２の間の整数である。別の実施形態において、ｍは、４および３２に等しい整数、または４〜３２の間の整数である。別の実施形態において、「ｎ」と「ｍ」の比率は、２：１〜１：２の範囲である。別の実施形態において、「ｎ」と「ｍ」は、等しい。
【００１３】
別の実施形態において、各リピートは、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの範囲の分子量を有する。別の実施形態において、各リピートは、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲の分子量を有する。
【００１４】
別の実施形態において、組成物は、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの分子量増分を有する上記混合物の２種以上のタンパク質を含む。別の実施形態において、組成物は、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの分子量増分を有する上記混合物の２種以上のタンパク質を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、上記リピートは、ＭａＳＰタンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである。幾つかの実施形態において、上記リピートは、ＭａＳＰ１タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである。幾つかの実施形態において、上記リピートは、ＡＤＦ−４タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである。
【００１６】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、第一の部分と、それに連続する第二の部分と、を有し、第一の部分は、アラニン残基を少なくとも５０％含む５〜３０アミノ酸のアミノ酸配列であり、第二の部分は、グリシン、セリン、プロリンおよびチロシンからなる群から選択される残基を少なくとも８０％含む２０〜６０アミノ酸のアミノ酸配列である。
【００１７】
幾つかの実施形態において、上記反復領域の第二の部分は、多くとも２つのグルタミン残基を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
（Ｘ１）ＺＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、ＳまたはＧであり；Ｘ３は、ＧまたはＥであり；Ｘ４は、Ｇ、ＳまたはＮであり；Ｘ５は、ＱまたはＹであり；Ｘ６は、ＧまたはＳであり；Ｘ７は、ＰまたはＲであり；Ｘ８は、ＹまたはＱであり；Ｘ９は、ＧまたはＳであり；Ｘ１０は、ＳまたはＧである）で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３
（Ｘ１）ＺＸ２ＳＧＰＸ３ＧＧＹＧＸ４ＰＸ５ＱＧＰＸ６ＧＧＹＧＰ
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚはが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、Ｓ−Ｇまたは非存在であり；Ｘ３は、Ｇ−Ｑまたは非存在であり；Ｘ４は、Ｇまたは非存在であり；Ｘ５は、ＳまたはＧであり；Ｘ６は、Ｓ−Ｐ、Ｇ−Ｒまたは非存在である）で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（ＰＧＧＹＧＰ）で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００２２】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４および３５〜４４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３、３３および３５〜４４のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００２３】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＧＡＧＡＧＡＡＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＧＡＧＡＧＡＧＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＧＡＧＡＧＡＡＡ）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＧＡＧＡＧＡＧＡ）の間の１：２〜１：１６、１：２〜１：８または１：４の比率を含む。
【００２４】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（ＳＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（ＳＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＡＡＡＡＡＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（ＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（ＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＡＡＡＡＡＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（ＳＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＡＡＡＡＡＡ）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（ＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＡＡＡＡＡＡ）の間の１：２〜１：１６、１：２〜１：８または１：４の比率を含む。
【００２５】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（ＳＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（ＳＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（ＧＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４（ＧＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（ＳＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４（ＧＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）の間の１：２〜１：１６、１：２〜１：８または１：４の比率を含む。
【００２６】
別の実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
別の実施形態において、上記混合物の各タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶ）；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＲＰＬＳＮＬＤＮＡ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＤＰＰＧＣＲＮＳＡＲＡＧＳＳ）からなる群から選択される単一Ｎ末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、もしくは断片をさらに含む。別の実施形態において、上記Ｎ末端領域の上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜７のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００２８】
別の実施形態において、上記混合物の各タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳＶＡＡＳＲＬＳＳＰＡＡＳＳＲＶＳＳＡＶＳＳＬＶＳＳＧＰＴＮＧＡＡＶＳＧＡＬＮＳＬＶＳＱＩＳＡＳＮＰＧＬＳＧＣＤＡＬＶＱＡＬＬＥＬＶＳＡＬＶＡＩＬＳＳＡＳＩＧＱＶＮＶＳＳＶＳＱＳＴＱＭＩＳＱＡＬＳ）からなる群から選択される単一Ｃ末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、断片もしくは突然変異体をさらに含む。別の実施形態において、上記Ｃ末端領域の上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００２９】
幾つかの実施形態において、上記混合物の１つまたは複数のタンパク質は、少なくとも１つのタグ配列をさらに含む。
【００３０】
幾つかの実施形態において、タンパク質の上記混合物は、ＡＤＦ−３もしくはＭＡＳＰ−２タンパク質、それらの機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片をさらに含む。幾つかの実施形態において、上記ＡＤＦ−３またはＭＡＳＰ−２タンパク質は、タンパク質の上記混合物の分子量の約１〜５０％、またはその間の任意整数を構成する。一実施形態において、上記ＡＤＦ−３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＣ４７０１０．１を有する。
【００３１】
幾つかの実施形態において、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。
【００３２】
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質の上記混合物の２種以上のタンパク質をコードする単離された核酸配列を提供する。幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列を含む発現ベクターであって、上記核酸配列が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により調節配列と、の発現制御下にある、発現ベクターを提供する。幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３３】
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の組成物を含む繊維を提供する。幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の組成物および／または繊維を含む物品を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態、および適用性の完全な範囲は、本明細書の以後に示される詳細な説明から明白となろう。しかし、その詳細な説明および具体的実施例が、本発明の好ましい実施形態を示し、例示に過ぎず、本発明の主旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明白となることが、理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ａ〜Ｉ。ＩＭＭＵＮＯ−ＴＥＭ（透過電子顕微鏡測定）の特徴づけ（図１Ａ〜Ｃ）、３つの種々の構築物：Ｃ１、Ｃ２およびＣ３を用いて組織化された繊維の光学顕微鏡測定（それぞれ図１Ｄ〜Ｆ）、ならびに共焦点顕微鏡測定（図１Ｇ〜Ｉ）を用いて、本発明のナノ繊維を示す。
【図２】Ａ〜Ｃ。クーマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析を利用してタンパク質反復単位のラダリングパターンを示す。
【図３Ａ】電界紡糸繊維の高解像度走査電子顕微鏡測定（ＨＲ−ＳＥＭ）（３Ａ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（３Ｂ）である。
【図３Ｂ】電界紡糸繊維の高解像度走査電子顕微鏡測定（ＨＲ−ＳＥＭ）（３Ａ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（３Ｂ）である。
【図４Ａ】透明な基盤の中に埋め込まれた凍結乾燥繊維（４Ａ）、および対応するＤＳＣ曲線（４Ｂ）を示す。
【図４Ｂ】透明な基盤の中に埋め込まれた凍結乾燥繊維（４Ａ）、および対応するＤＳＣ曲線（４Ｂ）を示す。
【図５】Ａ〜Ｃ。本発明の繊維上での多層ＨＥＫ２９３細胞の成長を示す。
【図６】本発明の繊維のフィンガープリントを表すＤＳＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は、幾つかの実施形態において、合成ドラグラインスパイダーシルクの調製に有用な、異なる分子量を有するタンパク質の混合物を含む組成物、このタンパク質をコードする核酸配列、発現ベクターおよび細胞を提供する。本発明はさらに、上記組成物を含む物品および繊維を提供する。
【００３７】
本発明は一部には、異なる分子量のタンパク質の混合物を用いて合成されＭａＳＰタンパク質に由来する、人工ドラグラインスパイダーシルクが、天然のドラグラインスパイダーシルクに類似の、および幾つかの特性において天然のドラグラインスパイダーシルクより好ましい非凡な機械的性質を有する、という予測されなかった知見に基づく。
【００３８】
本明細書の以下に実証される通り、本発明の人工ドラグラインスパイダーシルクは、予測されなかった熱特性を示した（図６参照）。具体的には本発明の繊維は、約２６５℃〜３２０±５℃でＤＳＣピークを示し、ネイティブのドラグラインスパイダーシルクに比べて有益な熱特性を示した。
【００３９】
幾つかの態様によれば、異なる分子量のｍタイプのタンパク質を含むタンパク質の混合物を含む組成物であって、上記混合物中の各タンパク質が、独立して、ＭａＳＰタンパク質またはその機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片の反復領域のｎリピートを含み、ｍおよびｎが、独立して、２〜７０の間の整数である、組成物が提供される。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「タンパク質の混合物」または「タンパク質混合物」は、少なくとも２タイプ、少なくとも３タイプ、少なくとも４タイプ、少なくとも５タイプ、少なくとも６タイプ、少なくとも７タイプ、少なくとも８タイプ、少なくとも９タイプまたは少なくとも１０タイプのタンパク質など、複数のタンパク質を指し、ここでタンパク質の各タイプは相対的に特有で均一な分子量を有する。本明細書で用いられる用語「特有の」は、上記タンパク質混合物中のタンパク質の各タイプの分子量が上記混合物中の他のタイプのタンパク質と異なっていることを指す。本明細書で用いられる用語「均一な」は、上記タンパク質混合物中のタンパク質の各タイプの分子量が上記混合物中の同じタイプのタンパク質と少なくとも９５％同一であることを指す。本明細書で用いられる用語「相対的に」は、各タイプのタンパク質内の最高で１つのアミノ酸残基の変化を指す。
【００４１】
用語「大瓶状腺スピドロインタンパク質」および「スピドロインタンパク質」は、本明細書全体で互換的に用いられ、全ての公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質を包含し、典型的には「ＭａＳＰ」と略され、またはニワオニグモの場合には「ＡＤＦ」と略される。これらの大瓶状腺スピドロインタンパク質は、一般には２つのタイプ１および２のものである。これらの用語は、公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質の少なくとも反復領域と高い度合いの同一性および／または類似性を有する、本明細書に開示されるような、非天然タンパク質をさらに包含する。さらなる適切なスパイダーシルクタンパク質としては、ＭａＳＰ２、ＭｉＳＰ、ＭｉＳｐ２、ＡｃＳＰ、ＦＬＹＳ、ＦＬＡＳ、および梨型（ｐｉｒｉｆｏｒｍ）が挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「反復領域」、「反復配列」または「リピート」は、スパイダーシルクアミノ酸配列中に（例えば、ＭａＳＰ−１ペプチド中に）天然に複数回生じるリピート単位に由来する組換えタンパク質配列を指す。当業者は、スパイダーシルクタンパク質の一次構造が、単位リピートの小さな変形の一連から主になると見なされることを、当業者は理解するであろう。天然に起こるタンパク質中の単位リピートは多くの場合、互いに異なる。即ち、タンパク質の長さに沿って単位リピートの厳密な重複はほとんど、または全く存在しない。
【００４３】
幾つかの実施形態において、タンパク質の一次構造が単一の単位リピートまたは直接のリピートの複数の厳密な反復を含む、本発明の合成スパイダーシルクが作製される。本明細書で用いられる用語「直接のリピート」は、類似のリピートを有するタンデムの（頭−尾配置）リピートである。別の実施形態において、本発明の合成スパイダーシルクを形成するために用いられる上記リピートは、直接のリピートである。幾つかの実施形態において、上記リピートは、天然に見出されない（即ち、天然に起こるアミノ酸配列ではない）。幾つかの実施形態において、上記単一の単位リピート（あるいは直接のリピート）は、そのアミノ酸配列内に最高で１つの変化を含む。
【００４４】
追加的実施形態において、本発明の合成スパイダーシルクは、第二の単位リピートの多数の反復と共に１つの単位リピートの多数の反復を含む。そのような構造は、典型的なブロックコポリマーと類似している。複数の異なる配列の単位リピートは、個々の適用に適した特性を有する合成スパイダーシルクタンパク質を提供するように組み合され得る。
【００４５】
反復配列を含む模範的配列は、ＡＤＦ−４：ＡＡＡＡＡＡＡＳＧＳＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＶＡＹＧＰＧＧＰＶＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＶＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＲＧＹＧＰＧＳＱＧＰＧＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＹＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）である。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本発明の合成反復配列は、ＡＤＦ−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）に由来する１つまたは複数の反復配列に基づく（例えば、本明細書の以下に定義される通り、高い割合％の同一性を有する）。幾つかの実施形態において、本発明の合成反復配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８〜３２の任意の１つに由来する１つまたは複数の反復配列に基づく（例えば、高い割合％の同一性を有する）。本明細書で用いられる用語「〜に基づく」は、反復配列と高い割合％の相同性を有する配列を指す。本明細書で用いられる高い割合％の相同性は、ＡＤＦ−４配列の特定の領域について、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性のいずれか１つを含む。
【００４７】
幾つかの実施形態において、各反復配列は、６０までのアミノ酸、５５までのアミノ酸、５０までのアミノ酸、４９までのアミノ酸、４８までのアミノ酸、４７までのアミノ酸、４６までのアミノ酸、４５までのアミノ酸、４４までのアミノ酸、４３までのアミノ酸、４２までのアミノ酸、４１までのアミノ酸、４０までのアミノ酸、３９までのアミノ酸、３８までのアミノ酸、３７までのアミノ酸、３６までのアミノ酸または３５までのアミノ酸を含み、ここで可能性は、本発明の別の実施形態を表す。幾つかの実施形態において、各反復配列は、５〜６０のアミノ酸、１０〜５５のアミノ酸、１５〜５０のアミノ酸、２０〜４５のアミノ酸、２５〜４０のアミノ酸、２５〜３９のアミノ酸、または２８〜３６のアミノ酸を含み、この場合の可能性は、本発明の別の実施形態を表す。幾つかの実施形態において、各反復配列は、３０〜４０のアミノ酸、３１〜３９のアミノ酸、３２〜３８のアミノ酸、３３〜３７のアミノ酸、３４〜３６のアミノ酸を含み、ここで可能性は、本発明の別の実施形態を表す。追加的実施形態において、各反復配列は、３５のアミノ酸を含む。
【００４８】
幾つかの実施形態において、ｎは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９および７０のいずれか１つに等しい整数である。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ｍは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９および７０のいずれか１つに等しい整数である。
【００５０】
別の実施形態において、「ｎ」と「ｍ」の比率は、２：１〜１：２の範囲である。別の実施形態において、「ｎ」と「ｍ」は、等しい。
【００５１】
幾つかの実施形態において、上記「ｎ」は、上記混合物中の各タイプのタンパク質について同一である。本明細書で用いられる用語「ｎは上記混合物中の各タイプのタンパク質について同一である」は、各タイプのタンパク質についての、即ち同一分子量を有する１つまたは複数のタンパク質についての、反復配列の数に関する。非限定的例として、異なる分子量の１６タイプのタンパク質を有するタンパク質の混合物について、タンパク質の各群は、異なる数の反復配列を有する。
【００５２】
幾つかの実施形態において、上記混合物中のタンパク質の様々な群は、各タイプのタンパク質に関する反復配列の数と上記群のモル比との間に反比例を有する。幾つかの実施形態において、タンパク質の各群について（例えば、同一数のリピートを有する）、上記タンパク質の分子量が低い程、上記群のモル比が高くなる。
【００５３】
別の実施形態において、各リピートは、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの範囲、２．１ｋＤａ〜３．４ｋＤａの範囲、２．２ｋＤａ〜３．３ｋＤａの範囲、２．４ｋＤａ〜３．２ｋＤａの範囲、２．５ｋＤａ〜３．１ｋＤａの範囲、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲、または２．７ｋＤａ〜２．９ｋＤａの範囲の分子量を有し、ここで各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。別の実施形態において、各リピートは、約２．８ｋＤａの範囲の分子量を有する。
【００５４】
別の実施形態において、組成物は、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａの、２．１ｋＤａ〜３．４ｋＤａの、２．２ｋＤａ〜３．３ｋＤａの、２．４ｋＤａ〜３．２ｋＤａの、２．５ｋＤａ〜３．１ｋＤａの、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａの、または２．７ｋＤａ〜２．９ｋＤａの分子量増分を有する上記混合物の２種以上のタンパク質を含み、ここで各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。別の実施形態において、組成物は、約２．８ｋＤａの分子量増分を有する上記混合物の２種以上のタンパク質を含む。
【００５５】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、第一の部分および第二の部分を有し、第一の部分および第二の部分は連続している（即ち、互いに直接隣接する）。典型的には第一の部分および第二の部分は、ペプチド結合によって連結される。
【００５６】
幾つかの実施形態において、上記反復領域の第一の部分は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％のアラニン残基を含む５〜３０のアミノ酸のアミノ酸配列である。
【００５７】
幾つかの実施形態において、第一の部分は、１つまたは複数のグリシン残基を含み得る。幾つかの実施形態において、第一の部分は、５％まで、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、４５％まで、または５０％までのグリシン残基を含む。 
【００５８】
幾つかの実施形態において、第一の部分は、（ＡＧ）１−１５の式のような、アラニン−グリシン・ジペプチドの１〜１５の間のリピートを含む。
【００５９】
幾つかの実施形態において、第一の部分は、（ＧＡ）１−１５の式のような、グリシン−アラニン・ジペプチドの１〜１５の間のリピートを含む。
【００６０】
幾つかの実施形態において、上記反復領域の第二の部分は、グリシン、セリン、プロリンおよびチロシンからなる群から選択される少なくとも８０％の残基を含む２０〜６０のアミノ酸のアミノ酸配列である。
【００６１】
幾つかの実施形態において、上記反復領域の第二の部分は、グリシン、セリン、プロリンおよびチロシンからなる群から選択される少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の残基を含む２０〜６０のアミノ酸のアミノ酸配列である。幾つかの実施形態において、上記反復領域の第二の部分は、最高で１または２個のグルタミン残基を含む。配列が自己組織化繊維を形成する限りにおいて、反復領域中のグリシン、セリン、プロリンおよびチロシン残基の厳密な量および順序は異なり得ることを、当業者は認識するであろう。
【００６２】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、
（ｉ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％もしくは５０％のアラニン残基、またはそれらの間の任意の範囲；
（ｉｉ）２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％もしく５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％のグリシン残基、またはそれらの間の任意の範囲；
（ｉｉｉ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％のセリン残基、またはそれらの間の任意の範囲；
（ｉｖ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしく３０％のプロリン残基、またはそれらの間の任意の範囲；
（ｖ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％もしく１０％のチロシン残基、またはそれらの間の任意の範囲；
（ｖｉ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％もしくは１０％のグルタミン残基、またはそれらの間の任意の範囲；および 
（ｖｉｉ）０％、１％、２％、３％、４％、５％のアルギニン残基、またはそれらの間の任意の範囲、
を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、１３〜４２％のアラニン残基、２５〜５５％のグリシン残基、１０〜１８％のセリン残基、１２〜２１％のプロリン残基、４〜７％のチロシン残基、４〜７％のグルタミン残基、および０〜３％のアルギニン残基を含む。
【００６４】
幾つかの実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
（Ｘ１）ＺＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、ＳまたはＧであり；Ｘ３は、ＧまたはＥであり；Ｘ４は、Ｇ、ＳまたはＮであり；Ｘ５は、ＱまたはＹであり；Ｘ６は、ＧまたはＳであり；Ｘ７は、ＰまたはＲであり；Ｘ８は、ＹまたはＱであり；Ｘ９は、ＧまたはＳであり；Ｘ１０は、ＳまたはＧである）で示されるアミノ酸配列を有する。
【００６５】
幾つかの実施形態において、上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
（Ｘ１）ＺＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＧＸ３Ｘ４ＧＰＸ５ＧＸ６ＧＧＸ７ＧＰＧＧＰＧＸ８Ｘ９
（ここでＸ１は、独立して、各例でＡまたはＧであり（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚが５〜３０の間の整数であり；Ｘ２は、ＳまたはＧであり；Ｘ３は、ＧまたはＳであり；Ｘ４は、ＱまたはＹであり；Ｘ５は、ＧまたはＳであり；Ｘ６は、ＰまたはＲであり；Ｘ７は、ＹまたはＱであり；Ｘ８は、ＧまたはＳであり；Ｘ９は、ＳまたはＧである）で示されるアミノ酸配列を有する。
【００６６】
幾つかの実施形態において、Ｚ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または８の）は、６〜１１の間の整数、６〜１０の間の整数または７〜９の間の整数である。一実施形態において、Ｚは、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２から選択される整数である。別の実施形態において、Ｚは、８である。
【００６７】
別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）で示されるアミノ酸配列を含む。 
【００６８】
別の実施形態において、上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を共有する。
【００６９】
別の実施形態において、上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を共有する。
【００７０】
別の実施形態において、上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を共有する。
【００７１】
別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の上記反復領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有する。
【００７２】
別の実施形態において、上記混合物の各タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶ）；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＲＰＬＳＮＬＤＮＡ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＤＰＰＧＣＲＮＳＡＲＡＧＳＳ）からなる群から選択される単一Ｎ末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、もしくは断片をさらに含む。別の実施形態において、上記Ｃ末端領域の上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜７のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００７３】
別の実施形態において、上記混合物の各タンパク質は、単一Ｃ末端領域ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳＶＡＡＳＲＬＳＳＰＡＡＳＳＲＶＳＳＡＶＳＳＬＶＳＳＧＰＴＮＧＡＡＶＳＧＡＬＮＳＬＶＳＱＩＳＡＳＮＰＧＬＳＧＣＤＡＬＶＱＡＬＬＥＬＶＳＡＬＶＡＩＬＳＳＡＳＩＧＱＶＮＶＳＳＶＳＱＳＴＱＭＩＳＱＡＬＳ）、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片をさらに含む。別の実施形態において、上記Ｎ末端領域の上記相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と少なくとも７０％の相同性を共有する。
【００７４】
幾つかの実施形態において、上記混合物の１つまたは複数のタンパク質は、少なくとも１つのタグ配列をさらに含む。本発明で用いられ得るタグの非限定的例としては、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｔ７タグなどが挙げられる。模範的なＨｉｓタグは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＨＨＨＨＨＨ）で示されるような６つのＨｉｓ残基を含む、または６つのＨｉｓ残基からなる。別の実施形態において、タグは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）で示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＡタグである。別の実施形態において、タグは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）で示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＴ７タグである。当業者は、代わりの適切なタグまたは他の融合パートナーを十分に認識している。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、天然に起こるおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に起こるアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に起こるアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に起こるアミノ酸と同じ基本的化学構造、即ち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合するアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に起こるアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に起こるアミノ酸に類似の様式で機能する化学物質を指す。アミノ酸は本明細書では、それらの一般に知られる三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字の記号のいずれかにより称され得る。
【００７６】
「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基がペプチドおよびタンパク質中の鎖において位置する順序である。配列は一般に、遊離アミノ基を含むＮ末端から遊離カルボキシル基を含むＣ末端へと報告される。アミノ酸配列は、それがタンパク質の一次構造を表す場合には多くの場合ペプチド、タンパク質配列と呼ばれるが、タンパク質は、特定の三次元構成へとフォールディングされ典型的にはリン酸化、アセチル化、グリコシル化、スルフヒドリル結合形成、切断などの翻訳後修飾を受けたアミノ酸配列と定義されるため、用語「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」と「タンパク質」を区別しなければならない。
【００７７】
本発明により示されるように、合成スパイダーシルクアミノ酸配列、またはそれをコードする核酸分子に関連して本明細書で用いられる「単離された」または「実質的に精製された」は、アミノ酸配列またはポリヌクレオチドが自然環境から取り出されていること、またはそれらの自然な状態から改変されていることを意味する。そのため「単離された」は、アミノ酸配列または核酸分子が精製されている程度を必ずしも反映しない。しかし、ある程度に精製されているそのような分子が「単離され」ていることは、理解されよう。上記分子が、自然環境に存在しない場合、即ちそれが天然に存在しない場合、その分子は、どこに存在するかにかかわらず「単離され」ている。例として、ヒト中に自然には存在しないアミノ酸配列またはポリヌクレオチドは、それらがヒト中に存在する場合であっても「単離され」ている。
【００７８】
アミノ酸配列または核酸に適用される場合、用語「単離された」または「実質的に精製された」は、アミノ酸配列または核酸が、自然な状態でそれらが関連する他の細胞成分を本質的に含まないことを表す。それは、均質状態であり得、あるいはドライソリューションまたは水溶液のいずれかであり得る。純度および均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を利用して典型的に決定される。調製物中に存在する主な化学種であるアミノ酸配列または核酸は、実質的に精製されている。
【００７９】
幾つかの実施形態において、上記リピートは、ＭａＳＰ１タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである。幾つかの実施形態において、上記リピートは、ＡＤＦ−４タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである。１つの模範的実施形態において、上記リピートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５〜４７の任意の１つで示されるポリヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【００８０】
本明細書で用いられる用語「機能的相同体、変異体、誘導体または断片」の中の「機能的」は、定義された機能的アッセイを通して同定される生物学的機能または活性を有するアミノ酸配列を指す。より具体的には、定義された機能的アッセイは、上記機能的相同体、変異体、誘導体または断片を発現する細胞における自己組織化繊維の形成である。
【００８１】
アミノ酸配列または核酸配列は、相同性が少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であると決定される場合、対応するアミノ酸配列または核酸の相同体であると言われる。
【００８２】
本明細書で用いられる相同性は、２つのアミノ酸（ペプチド）またはＤＮＡ配列の間の同一性％に基づいて決定され得る。一般に、比較される２つの配列は、配列間の最大相関を与えるように並べられる。２つの配列のアライメントを検査し、決定された２つの配列間の厳密なアミノ酸（またはヌクレオチド）一致を与える位置の数を、アライメントの全長で割り、１００を掛けて、同一性％値を与える。この同一性％値は比較される配列の全長について決定されてよく、これは同じもしくは非常に類似した長さの配列であり高い相同性がある配列に特に適しており、またはより短い画定された長さについて決定されてよく、これは等しくない長さの配列もしくはより低レベルの相同性を有する配列により適する。２つ以上の配列の同一性を比較する方法は、当該技術分野で周知である。したがって、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１で入手されるプログラム、例えばＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性％、および２つのポリヌクレオチド配列間の同一性％を決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「ローカルホモロジー」アルゴリズムを用い、２つの配列間の類似性の最良な単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが類似していない２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列を比較するのにより適しており、このプログラムは、より短い方の配列がより長い配列の部分を表すと仮定している。比較の際、ＧＡＰは、２つの配列を並べて、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムに従って「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さである配列を比較するのにより適しており、アライメントは、全長に対して予測される。好ましくは各プログラムで用いられるパラメータ「ギャップウェイト」および「レングスウェイト」は、それぞれポリヌクレオチド配列では５０および３、ならびにポリペプチド配列では１２および４である。好ましくは、同一性％および類似性％は、比較される２つの配列が最適に並べられる時に決定される。
【００８３】
２つ以上のアミノ酸または核酸配列に関連する用語「同一の」、「実質的な同一性」、「実質的な相同性」または「同一性」％は、以下に記載されるデフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアライメントおよび視覚的精査により測定される場合に、同じである２つ以上の配列もしくは部分配列を指すか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定された割合％ (即ち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大一致になるように比較して並べると、特定の領域（例えば、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）で約６０％同一性、または少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％の同一性）を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。そのような配列は、その場合、「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、テスト配列のコンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を指す、またはそれに適用され得る。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を包含する。好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明できる。
【００８４】
配列比較の場合、典型的には１つの配列が参照配列として働き、それに対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを利用する場合、テストおよび参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムのパラメータが用いられ得る、または代わりのパラメータが指定され得る。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性％を計算する。
【００８５】
本発明がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、または３のいずれか１つの変異体のｎリピートを含むアミノ酸配列をさらに包含することが、理解されなければならない。本明細書で用いられる用語「変異体」または「実質的に類似の」は、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または２５）のアミノ酸残基またはヌクレオチドが欠失、置換または付加されている、具体的に同定された配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチドの配列を含む。変異体は、天然に起こる対立遺伝子変異体または非天然起源の変異体であり得る。変異体または実質的に類似の配列は、最先端技術で用いられる一般的アルゴリズムによる決定されるような、それらのアミノ酸またはヌクレオチド配列と、本明細書に記載されたアミノ酸またはヌクレオチド配列との同一性の割合％により特徴づけられ得るアミノ酸配列または核酸の断片を指す。アミノ酸または核酸の好ましい断片は、参照の配列と比較した場合に、少なくともおよそ４０または４５％の配列同一性、優先的にはおよそ５０％または５５％の配列同一性、より優先的にはおよそ６０％または６５％の配列同一性、より優先的にはおよそ７０％または７５％の配列同一性、より優先的にはおよそ８０％または８５％の配列同一性、さらにより優先的にはおよそ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチドの配列を有するものである。
【００８６】
本明細書で用いられる誘導体および機能的誘導体という用語は、任意の挿入、欠失、置換および修飾を有する本発明のアミノ酸配列を意味する。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「挿入」は１〜５０の間のアミノ酸残基、具体的には２０〜１の間のアミノ酸残基、より具体的には１〜１０の間のアミノ酸残基の、本発明の配列へのアミノ酸残基の任意の付加を意味することが、理解されなければならない。最も具体的には１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０のアミノ酸残基。さらに、本発明のアミノ酸配列は、様々な同一のまたは異なるアミノ酸残基によりそのＮ末端および／またはＣ末端で伸長され得る。
【００８８】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸と置換した結果であり、即ち保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正電荷の（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；負電荷の(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００８９】
別の実施形態において、本発明のリピート配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３の任意の１つの配列への１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、または７以下のアミノ酸置換を有する。一実施形態において、本発明のリピート配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３の任意の１つの配列への少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３のアミノ酸置換を有する。
【００９０】
アミノ酸配列に関連して、コードされた配列中の単一アミノ酸またはごく一部のアミノ酸を改変、付加または欠失する、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、改変があるアミノ酸の、化学的に類似のアミノ酸での置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。
【００９１】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）がその群の別のメンバーで置換される置換、または１つの極性残基の別の残基での置換、例えばアルギニンをリジンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、またはグルタミンをアスパラギンでなどの置換が行われ得る。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的置換である他の模範的アミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【００９２】
保存的核酸置換は、先に定義されたような保存的アミノ酸置換をもたらす核酸置換である。
【００９３】
本発明のアミノ酸配列の変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３の任意の（ａｂｙ）１つにより表されるリピート単位を有し、アミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列類似性、少なくとも８５％の配列類似性、少なくとも９０％の配列類似性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列類似性を有し得る。
【００９４】
本発明のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の、またはその任意の断片のｎリピートを含み得る。「断片」は、特定の領域のアミノ酸またはＤＮＡ配列の小部分を構成する。ペプチド配列の断片は、特定の領域よりも短い少なくとも１つのアミノ酸であり、ＤＮＡ配列の断片は、特定の領域よりも短い少なくとも１つの塩基対である。断片は、Ｃ末端側またはＮ末端側、またはその両方で切り詰められ得る。アミノ酸断片は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３または少なくとも３４の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３のアミノ酸を含み得る。 
【００９５】
本発明のアミノ酸配列の突然変異体は、別のアミノ酸の１つまたは複数に対してそのアミノ酸の１つ（点突然変異体）または複数、約１０までの交換において特徴づけられる。それらは、異なるコドンを導く、ＤＮＡレベルでの対応する突然変異の結果である。
【００９６】
さらに本発明は、本発明のアミノ酸配列の誘導体に関係する。本発明のアミノ酸配列の誘導体は、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基またはカルボキシル基などの官能基が誘導体化、例えばそれぞれグリコシル化、アシル化、アミド化またはエステル化されている。グリコシル化誘導体において、オリゴ糖は通常、アスパラギン、セリン、トレオニンおよび／またはリジンに連結される。アシル化誘導体は、特に天然に起こる有機酸または無機酸、例えば酢酸、リン酸または硫酸によってアシル化されており、それは通常、Ｎ末端アミノ基で、またはヒドロキシ基で生じ、特にチロシンまたはセリンのそれぞれアミノ基またはヒドロキシ基で生じる。エステルは、天然に起こるアルコール、例えばメタノールまたはエタノールのものである。さらなる誘導体は、塩、特に医薬的に許容し得る塩、例えばアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩などの金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩もしくは亜鉛塩、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンなどの適切な有機アミン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミンなどを用いて形成されるアンモニウム塩である。
【００９７】
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質の上記混合物の２種以上のタンパク質をコードする単離された核酸配列を提供する。幾つかの実施形態によれば、本発明は、本発明のタンパク質混合物をコードする単離された核酸配列を提供する。
【００９８】
「核酸」は、糖、リン酸塩およびプリンまたはピリミジンのいずれかを含有するモノマー（ヌクレオチド）で構成された一本鎖または二本鎖であり得る分子を指す。細菌、下等真核生物、ならびに高等動物および植物において、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は、遺伝子材料を指すが、「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与する。
【００９９】
遺伝子コードの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒｅ）により、複数の異なる核酸配列を用いて本発明のアミノ酸配列をコードし得ることが明らかである。本発明の核酸配列に含まれるコドンはＳｆ９宿主細胞での発現のために最適化され得ることが、理解されなければならない。
【０１００】
様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合の用語「コドン最適化された」は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを改変せずに宿主生物体の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域でのコドンの改変を指す。本発明の関連において、遺伝子およびＤＮＡコード領域は、宿主細胞、具体的な例ではＳｆ９スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞での最適な発現のためにコドン最適化される。
【０１０１】
本明細書で用いられる用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳を意味すると意図される。その発現において、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖は最初、メッセンジャーＲＮＡであることが多い相補性ＲＮＡに転写され、その後、こうして転写されたメッセンジャーＲＮＡは、遺伝子産物がタンパク質であれば、上述の遺伝子産物へと翻訳される。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質混合物をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の発現ベクターに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質混合物（例えば、異なる分子量を有するタンパク質の２つ以上の群）の少なくとも一部をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の発現ベクターに関する。本発明の発現ベクター内に含まれる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、場合によりＣ末端領域（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示される）およびＮ末端領域（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜７から選択される）のうちの少なくとも１つをさらに含み得る。核酸配列は、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により調節配列と、の発現制御下にあることが留意されなければならない。
【０１０３】
本明細書で用いられる通り、本明細書で称される「ベクター」、「発現ベクター」または「プラスミド」は、細胞の重要な代謝の一部ではない遺伝子を運搬することの多い染色体外要素であり、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。それは、異なる遺伝子環境の間での運搬のために、または宿主での発現のために、制限およびライゲーションによって所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれかであり得る。ベクターは典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターとしては、プラスミドおよびファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞で複製できるものであり、新たな組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するように、そこで特定できる方式でベクターが切断され得、所望のＤＮＡ配列がライゲートされ得る１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によって、さらに特徴づけることができる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増加させるにつれ何回も、または宿主が有糸分裂により複製される前に宿主あたり１回、起こり得る。ファージの場合、溶解相では能動的に、または溶原相では受動的に複製が起こり得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が制限およびライゲーションによって挿入され得、それにより所望のＤＮＡ配列が調節配列に動作可能に結合されて、ＲＮＡ転写産物として発現され得るものである。ベクターは、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定および選択での使用に適した１つまたは複数のマーカー配列をさらに含有し得る。本明細書で用いられる「形質転換」または「トランスフェクション」は、核酸の取り込みによる細胞中の新しい遺伝子の獲得である。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物への耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該技術分野で公知の標準的アッセイによって検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響を及ぼす遺伝子が挙げられる。好ましいベクターは、動作可能に結合されたＤＮＡセグメントに存在する構造的遺伝子産物の自律複製および発現、即ち合成スパイダーシルクタンパク質の発現が可能なベクターである。
【０１０４】
具体的な実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、最も具体的にはバキュロウイルスベクター系またはワクシニアウイルスベクター系である。そのような市販されるバキュロウイルス系の例は、Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（登録商標）、Ｆｌａｓｈ−Ｂａｃ（登録商標）およびＢａｃ  ｔｏ  Ｂａｃ系である。さらなるウイルスベクター系もまた、本発明で用いられ得る。場合により、ベクターの修飾が必要になり得る。さらなるウイルスベクターの例は、アデノウイルスおよび全てのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば狂犬病ウイルス、はしかウイルス、ＲＳＶなどである。
【０１０５】
一実施形態において、本発明の合成シルクタンパク質を発現するのに用いられるバキュロウイルス系。バキュロウイルスは、２つの属：ヌクレオポリヘドロウイルスおよびグラニュロウイルスに分別され得る大きな桿状ウイルスのファミリーである。それらは、影響を及ぼし得る宿主の限定された範囲を有し、その範囲は、典型的には限定的数の密接に関連する昆虫種に制限される。バキュロウイルスは、ヒトに有害でないため、研究および商業または工業用途での使用のための安全な選択肢である。昆虫細胞でのバキュロウイルス発現は、グリコシル化を欠き、その結果適当なタンパク質フォールディングを欠く原核生物発現よりも著しく有利である、組換え体糖タンパク質を生成するための安定な方法である。
【０１０６】
先に示された通り、本発明の発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結される。用語「プロモーター」および「プロモーター領域」は、通常は構造遺伝子のタンパク質コード配列の上流（５’側）にあるＤＮＡの配列を指し、これは転写を正しい部位で開始するのに必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子の認識を提供することによりコード領域の発現を制御する。プロモーター配列は、遺伝子の発現を駆動するのに必須であるが、必ずしも十分ではない。用語「適切なプロモーター」は、合成スパイダーシルク変異体遺伝子の発現を駆動できる任意の真核生物または原核生物プロモーターを指すであろう。
【０１０７】
Ｓｆ９で異種のＤＮＡ断片の発現を駆動するのに有用なプロモーターは、数多くあり、当業者に熟知されている。シルク変異体タンパク質をコードする遺伝子を駆動できる事実上あらゆるプロモーターが、本発明に適する。例えば、ポリヘドリン、塩基性タンパク質、ｐ１０、ＯｐＩＥ２およびｇｐ４プロモーターは、上記発現に適したプロモーターであり得る。
【０１０８】
コード配列および調節配列は、それらが調節配列の影響または制御下でコード配列の発現または転写を行うような方法で共有結合される場合に、「動作可能に連結され」ているまたは「動作可能に結合され」ていると言われる。調節配列が生成される遺伝子産物の量に及ぼす測定可能な影響を発揮し得るように、調節配列が遺伝子に相対的に位置する場合、この調節配列は遺伝子に動作可能に連結されている。コード配列が機能的タンパク質へと翻訳されることが望ましい場合、５’調節配列中のプロモーターの導入がコード配列の転写をもたらすならば、および２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の誘導をもたらさない、（２）コード配列の転写を指揮するプロモーター領域の能力を妨害しない、または（３）タンパク質へと翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力を妨害しないならば、２つのＤＮＡ配列は動作可能に結合されていると言われる。したがって、得られた転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼすことができる場合に、プロモーター領域は、コード配列に動作可能に結合されている。
【０１０９】
遺伝子発現に必要とされる調節配列の正確な性質は、種または細胞型の間で様々であろうが、一般には必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含み得る。特に、そのような５’非転写調節配列は、動作可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまた、所望されるように、エンハンサー配列または上流の活性化配列を含み得る。
【０１１０】
「調節」および「調節する」は、排他的ではないが主に、遺伝子の転写開始点の上流（５’側）に位置するＤＮＡ配列エレメントによって制御される遺伝子発現の調整を指す。調節は、刺激への全か無かの応答を生じ得るか、または遺伝子発現のレベルの変動を生じ得る。
【０１１１】
さらなる態様において、本発明は、本発明による発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１１２】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に用いられる用語である。そのような用語が、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すことを、理解されたい。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって次の世代で起こり得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書で用いられるこの用語の範囲内に含まれる。
【０１１３】
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、裸のＤＮＡまたは組換えＤＮＡ技術を用いて構築された発現ベクターで組換え的に形質転換され得る細胞を指す。薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーは、一部には形質転換体の選択を促進することを意図される。加えて、薬物耐性マーカーなどの選択マーカーの存在は、混入した微生物が培地中で増幅しないようにするのに有用であり得る。形質転換された宿主細胞のそのような純粋培養は、誘導される表現型を生存のために必要とする条件下で細胞を培養することにより得られる。
【０１１４】
本発明の宿主細胞は、本発明の合成スパイダーシルクタンパク質を発現するために、本明細書に記載された発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。本明細書で用いられる「形質転換」は、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞内取込みの結果として細胞の遺伝子型が変化する過程を指し、例えば、形質転換された細胞は所望の合成スパイダーシルクタンパク質の組換え形態を発現する。用語「トランスフェクション」は、核酸、例えば裸のＤＮＡまたは発現ベクターを、核酸介在性遺伝子移入によりレシピエント細胞内に誘導することを意味する。
【０１１５】
１つの具体的実施形態において、本発明により発現ベクターで形質転換される宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫細胞として、鱗翅目の昆虫細胞、より具体的にはスポドプテラ・フルギペルダおよびイラクサギンウワバ由来の細胞が用いられ得る。最も具体的には該昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１またはＨｉｇｈ  ５細胞である。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、本発明のシルクタンパク質は、翻訳後修飾を有さない。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、本発明のシルクタンパク質は、生分解性である。この特徴は、例えば医薬の分野で、生体分解が望まれるインビボ使用にシルクタンパク質が意図される場合には必ず、重要であり得る。この特徴は、特に縫合糸材料、ならびに創傷の閉合および被覆システムにおいて用途を見出し得る。
【０１１８】
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列を含む発現ベクターであって、上記核酸配列が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により調節配列と、の発現制御下にある、発現ベクターを提供する。
【０１１９】
繊維
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の組成物を含む繊維を提供する。
【０１２０】
本明細書で用いられる「繊維」は、互いに撚られた２本以上の細糸で構成される繊維性材料の微細なひもを意味する。「細糸」は、微視的長さ〜１マイル以上の長さの範囲の不確定な長さの細長い縫い糸状の物体または構造を意味する。具体的には、合成スパイダーシルク細糸は、微視的であり、タンパク質性である。「バイオフィラメント」は、組換え生成スパイダーシルクタンパク質を含む、タンパク質から生成された細糸を意味する。用語「繊維」は、構造化されていない凝集体または沈殿物を包含しない。
【０１２１】
幾つかの実施形態において、繊維は、少なくとも５０ｎｍの厚み径（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を有する。幾つかの実施形態において、繊維は、最大で３５０ｎｍの厚み径を有する。幾つかの実施形態において、繊維は、少なくとも５０〜３５０ｎｍ、またはそれらの間の任意数値の厚み径を有する。本明細書で実証される通り（図１参照）、微細繊維は、５〜１０ｎｍの直径のナノ繊維で構成される。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、繊維は、その厚さに比較して長さにおいてかなりの伸長を有し、好ましくは２０μｍを超える。
【０１２３】
「マイクロ繊維」は、１デニール未満の細さを有する細糸を意味する（デニールは９，０００メーターあたりのグラム量と定義される）。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、タンパク質の繊維は、その少なくとも１つの寸法（例えば、直径、長さ）のサイズにより特徴づけられる。
【０１２５】
例であり限定ではないが、繊維の直径は、１０ｎｍ〜１μｍ、２０〜１００ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの間である。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、繊維は、ナノフィブリルで構成される。幾つかの実施形態において、ナノフィブリルは、例えば１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２１ｎｍ、約２２ｎｍ、約２３ｎｍ、約２４ｎｍ、約２５ｎｍ、約２６ｎｍ、約２７ｎｍ、約２８ｎｍ、約２９ｎｍ、約３０ｎｍ、約３１ｎｍ、約３２ｎｍ、約３３ｎｍ、約３４ｎｍ、約３５ｎｍ、約３６ｎｍ、約３７ｎｍ、約３８ｎｍ、約４０ｎｍ、約４２ｎｍ、約４４ｎｍ、約４６ｎｍ、約４８ｎｍ、または５０ｎｍ（それらの間の任意値または範囲を含む）の直径を有する。一実施形態において、ナノフィブリルは、３〜７ｎｍの直径を有する。一実施形態において、ナノフィブリルは、４〜６ｎｍの直径を有する。
【０１２７】
幾つかの実施形態において、開示される繊維の長さは、１〜２００μｍ、１０〜１００μｍ、１００〜５００μｍまたは２００〜５００μｍの間である。
【０１２８】
一実施形態において、本発明の繊維は、自己組織化によって組織化する。「自己組織化」は、上記繊維、即ち本発明の合成スパイダーシルクタンパク質のモノマーが、通常の生理学的条件、または室温で、エネルギー的に好適な様式で、互いに自然に結合して、本明細書に記載される特性を有する高分子繊維構造を作り出すことを意味する。さらに、本発明の繊維は、極めて弾力があり、組織化すると、１０％ＳＤＳ中の可溶化および少なくとも１時間の煮沸などの極端な化学的攻撃に耐え得る。
【０１２９】
「強靭性」または「引張り強さ」は、細糸が破壊の前に耐え得る重量を指す。発生される最大比応力は通常、材料を破壊する引張り試験により細糸、紡績糸または布に存在する。具体的実施形態によれば、本発明の繊維は、約１００〜３０００ＭＰａ（ＭＰａ＝Ｎ／ｍｍ２）、約３００〜３０００ＭＰａ、約５００〜２７００ＭＰａ、約７００〜２５００ＭＰａ、約９００〜２３００ＭＰａ、約１１００〜２０００ＭＰａ、約１２００〜１８００ＭＰａ、約１３００〜１７００ＭＰａまたは約１４００〜１６００ＭＰａの引張り強さを有する。より具体的には約１５００ＭＰａ。
【０１３０】
「靭性」は、繊維を破壊するのに必要とされるエネルギーを指す。これは応力ひずみ曲線下面積であり、時として「破壊エネルギー」または破断仕事と呼ばれる。特別な実施形態によれば、本発明の繊維は、約２０〜１０００ＭＪ／ｍ３、約５０〜９５０ＭＪ／ｍ３、約１００〜９００ＭＪ／ｍ３、約１２０〜８５０ＭＪ／ｍ３、約１５０〜８００ＭＪ／ｍ３、約１８０〜７００ＭＪ／ｍ３、約１８０〜７５０ＭＪ／ｍ３、約２５０〜７００ＭＪ／ｍ３、約２８０〜６００ＭＪ／ｍ３、約３００〜５８０ＭＪ／ｍ３、約３１０〜５６０ＭＪ／ｍ３、約３２０〜５４０ＭＪ／ｍ３または約３５０〜５２０ＭＪ／ｍ３、最も具体的には約３５０〜５２０ＭＪ／ｍ３の靭性。
【０１３１】
「弾性」は、変形後にその本来のサイズおよび形状を回復する傾向がある本体の特性を指す。回復しない変形である可塑性は、弾性の反対である。繊維の分子構成では、回復可能なまたは弾性的な変形は、原子間および分子間の構造的結合の伸長（再配向）により可能である。逆に、破壊と、新たな安定化位置への分子間結合の再形成は、非回復性のまたは可塑性の変形を引き起こす。
【０１３２】
「伸長性」は、初期の長さに対する割合または分率として表される長さの増加を指す。
【０１３３】
「微細さ」は、繊維または細糸（例えば、バイオフィラメント）の平均径を意味し、通常はミクロン（マイクロメーター）で表される。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、定義された示差走査熱量測定（ＤＳＣ）パターンによって特徴づけられる。幾つかの実施形態において、「ＤＳＣパターン」は、ピークの位置を指すことを意味する。幾つかの実施形態において、「ピーク」は、発熱ピークを指すことを意味する。本明細書全体で、「ピークの位置」または「ピーク位置」は、サーモグラムパターンにおける温度軸に沿ったピークを指し、幾つかの実施形態において、任意のピーク強度でのピーク位置を指し得る。ＤＳＣ測定で得られたデータが一部には、用いられる機器および測定が実施される時点の環境条件（例えば、湿度）に依存することを、当業者は認識するであろう。
【０１３５】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、２５０〜３３０℃の範囲で少なくとも１つの吸熱ピークを示すＤＳＣパターンによって特徴づけられる。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、２９０〜３１０℃の範囲で少なくとも１つの吸熱ピークを示すＤＳＣパターンによって特徴づけられる。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、２９５〜３０５℃の範囲で少なくとも１つの吸熱ピークを示すＤＳＣパターンによって特徴づけられる。
【０１３６】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、少なくとも２６０〜３２０℃および２２０〜２５０℃の範囲で吸熱ピークを示すＤＳＣパターンによって特徴づけられる。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、１２０〜１６０℃の範囲での追加的ＤＳＣ発熱ピークによってさらに特徴づけられる。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約−１００〜約２２０℃の範囲でＤＳＣピークを有さない。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約−１００〜約２５℃の範囲でＤＳＣピークを有さない。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約４０〜約７０℃の範囲で発熱ピークを有さないことを示す少なくとも１つのＤＳＣパターンによって特徴づけられる。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約−１００〜約５０℃の範囲でＤＳＣピークを有さない。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約−５０〜約０℃の範囲でＤＳＣピークを有さない。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、約−０〜約−２５℃の範囲でＤＳＣピークを有さない。
【０１３９】
組成物
特別な実施形態によれば、組成物は、ゲル、フォーム、もしくはステントおよびインプラントをコートするのに用いられるコーティングの形態で、または組織エンジニアリング目的のために有用な形態で提供され得る。別の実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物である。
【０１４０】
本発明の医薬組成物が、本発明のアミノ酸配列、組換えタンパク質および繊維の少なくとも１つを含み得、処置される対象に直接投与され得ることが、留意されなければならない。配合剤は、先に定義されたように、少なくとも１種の有効成分を、その１種または複数の許容し得る担体と共に典型的に含む。
【０１４１】
配合剤は、局所投与に、または侵襲性医療装置のコーティングとしての使用に、または組織エンジニアリングの足場として特に適するが、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内およびさらに経口、経直腸、経鼻、または非経口投与経路も見落としてはならない。
【０１４２】
局所投与用の医薬組成物および配合剤としては、経皮貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性ベース、増粘剤などが、必要であるか好ましいであろう。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は一般に、当該技術分野で公知の緩衝剤、浸透圧を調整する薬剤、そして場合により１種または複数の医薬的に許容し得る担体、賦形剤および／または添加剤を含む。補助的有効成分もまた、組成物中に組み入れられ得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。
【０１４４】
本明細書で用いられる「医薬的に許容し得る担体」は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤などを包含する。医薬的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物中でのその使用が企図される。
【０１４５】
本発明のアミノ酸配列、組換えタンパク質および繊維の少なくとも１つを含む本発明の医薬組成物は、弾力、弾性、強靭性を必要とし非毒性である経皮貼付剤、即ち経皮送達システム、弾性包帯、縫合糸、コーティングまたは医療用布の製造に特に適し得る。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、化粧組成物であり得る。用語「化粧組成物」は、皮膚の色調および色、髪の色および輝きを改善もしくは増強すること、傷および瘢痕などの表層組織の欠陥を隠すこと、または日光による損傷および皮膚加齢などの将来の、もしくは蓄積性の損傷を予防することなど、有益な皮膚または他の表層組織の審美的特性を有する組成物に関する。
【０１４７】
本発明による処置のための皮膚科学的組成物または化粧組成物は、軟膏ポマード、ローション、クリームおよびゲルとして表皮へ、およびクリーム、ローションまたはゲルなどの水エマルジョンとして粘膜へ、局所塗布される。そのような組成物を用いて製造され得る化粧製品としては、髭剃りクリーム、ハンドクリーム、シャンプー、石鹸、コンディショナー、ボディークリーム、日焼け止め、フェースクリーム、またはボディーローションなどの製品が挙げられる。本発明による化粧組成物中の成分の比率は、化粧組成物の予定される適用により調整され得る。
【０１４８】
組織足場
別の態様において、本発明は、（ｉ）細胞と、（ｉｉ）本発明の少なくとも１種の繊維を含む細胞足場材料と、を含む組成物を提供する。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、
培養される細胞の試料を用意すること；
上記試料を、本発明の少なくとも１種の繊維を含む細胞足場材料に適用すること；および
細胞培養に適した条件下で適用された細胞を有する上記細胞足場材料を維持すること、
を含む、細胞の育成（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）の方法を提供する。
【０１５０】
本発明の文脈において、細胞の「育成」、「細胞培養」という用語は、細胞が分化および／または増殖する状況、自然環境に存在する時の細胞型によって示される少なくとも１つの機能的特徴を保持しながら細胞が分化された状態で維持される状況、ならびに幹細胞が未分化状態で維持される状況を包含するように、広範囲に解釈されなければならない。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、育成方法または細胞組成物は、細胞培養物および／または特異的な増殖因子もしくは細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を含有する培地を含む条件で実施され得る。他の実施形態において、育成または調製方法は、無血清培地中で適用される細胞を有する細胞足場材料を維持することを含む条件で実施され得る。無血清培地中で細胞を培養する可能性は、血清含有培地および／または特異的な増殖因子もしくは細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を含有する培地の使用に代わる、費用効率が高く制御された方法を提供する。
【０１５２】
本明細書に記載される方法および細胞組成物の幾つかの実施形態において、細胞は、真核生物細胞である。本明細書に記載される方法および細胞組成物の幾つかの実施形態において、真核生物細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。別の実施形態において、真核生物細胞は、昆虫または酵母細胞などの非哺乳動物細胞である。
【０１５３】
本発明による方法によって育成もしくは調製され得る、または本発明による細胞組成物中に含まれ得る、哺乳動物細胞の非限定的例。幾つかの実施形態において上記細胞は、肝細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、および内皮細胞である。幾つかの実施形態において、上記細胞は、幹細胞およびベータ細胞を含むランゲルハンス島由来の細胞である。幾つかの実施形態において、上記細胞は、神経前駆細胞、間葉前駆細胞、および造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である。幾つかの実施形態において、上記細胞は、造血、神経、間葉、哺乳動物、内皮、上皮および嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経および間葉幹細胞からなる群から選択される成人幹細胞である。
【０１５４】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、組織接着剤として用いられる。本明細書で用いられる「組織接着剤（組織シーラントまたは組織グルーとも称される）」は、組織層、例えば少なくとも２つの組織層を、互いに連結させる、特に再連結させる。特に、組織接着剤は、組織層の間の閉合、特にフォームフィット、連結を提供でき、または組織層が互いから離れている場合には、組織接着剤は組織層の間の間隙を充填し、失った組織層を置換しおよび／または失った組織層を埋めることができる。
【０１５５】
本発明による方法により、または本発明による細胞組成物を用いて、育成もしくは調製され得る組織の非限定的例としては、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織、およびそれらの組み合わせ、例えば複数の（異なる）組織、または任意の臓器、例えば胃、小腸、大腸、腸、直腸、食道、肺、脾臓、脳、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、リンパおよび甲状腺などの腺、眼、または膵臓が挙げられる。
【０１５６】
幾つかの実施形態において、組成物は、細胞結合モチーフをさらに含む。特定の条件での特定の細胞の育成に関連して、細胞結合モチーフの存在は、細胞生存率を改善または維持し得る。幾つかの実施形態において、細胞結合モチーフは、少なくとも１つのペプチド結合を介して本発明の繊維にカップリングされたオリゴペプチドである。例えばそれは、本発明の繊維内のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に、または本明細書に記載されるタンパク質の混合物の残りのアミノ酸配列内の任意の位置で、カップリングされ得る。オリゴペプチド細胞結合モチーフの選択に関して、当業者は、複数の代替法を知っている。上記オリゴペプチドは、例えばＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶおよびＹＩＧＳＲは一般的な細胞結合モチーフであるが、ＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬは、ケラチノサイトの育成に関連して特に有用であり得るケラチノサイト特異性モチーフとして公知である。繊維内のタンパク質へのオリゴペプチド細胞結合モチーフのカップリングは、標準的な遺伝子操作または化学的カップリング技術を用いて当業者により容易に完遂される。したがって幾つかの実施形態において、細胞結合モチーフは、遺伝子操作を介して導入され、即ち「野生型」タンパク質をコードする核酸と細胞結合モチーフとの間の遺伝子融合の部分を形成する。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、本発明の繊維と接触する細胞は、多層形態である。多層細胞培養または３Ｄ細胞培養は、少なくとも２層の細胞を含み、例えば１層中の細胞の少なくとも１０％が、別の層中の細胞の少なくとも１０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養は、少なくとも３層の細胞を含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも１０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも１０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも２０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも２０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも３０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも３０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも４０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも４０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも５０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも５０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の１層中の細胞の少なくとも６０％が、同じ多層細胞培養または３Ｄ細胞培養内の別の層中の細胞の少なくとも６０％と接触している。別の実施形態において、語句「接触している」は、物理的接触にてである。別の実施形態において、語句「接触している」は、細胞間相互作用にてである。
【０１５９】
別の実施形態において、語句「３Ｄ培養（三次元培養）」は、１相よりも多い層で細胞を成長させながら、細胞の成長に適合する条件に細胞を配置する培養を指す。
【０１６０】
物品
さらなる態様において、本発明は、本発明による組換えタンパク質で構成された少なくとも１種の繊維を含む物品を提供する。
【０１６１】
用語「物品」または「製造品」は、実体があり、可動性で独立した物体である製造物を包含する。より具体的には、本明細書で用いられる用語「物品」は、本発明のアミノ酸配列、組換えタンパク質および繊維の少なくとも１つを含む、または組み込んでいるそのような製造物を指す。そのような物品の非限定的例としては、合成スパイダーシルクがコートされたステントおよび縫合糸、皮膚貼付剤、組織足場材料、布、チョッキ、防弾チョッキ、ロープ、糸、化粧品などが挙げられる。
【０１６２】
そのような物品の例は、手術用縫合糸に用いられる糸、または衣類の製織に用いられる糸であり、または物品は様々な組織エンジニアリング態様に用いられる足場であり得る。
【０１６３】
本発明による物品の他の例としては、医療接着片、皮膚移植片、靱帯の代用材料、および手術用メッシュなどの医療装置；ならびに広範囲の工業および商業製品では、織布、防弾チョッキの裏地、布の容器、バッグもしくは財布のストラップ、ケーブル、ロープ、釣り糸、接着剤結合材料、非接着剤結合材料、ストラップ材料、自動車用カバーおよび部品、航空機構築材料、耐候性材料、可撓性仕切り材、運動器具など；そして実際には、高引張り強さおよび高弾性を所望の特徴とする繊維または布のほぼあらゆる使用が挙げられる。乾燥噴霧コーティング、ビーズ様粒子などの他の形態での安定な繊維製品の適応性および使用、または他の組成物との混合物中での使用もまた、本発明により企図される。
【０１６４】
本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質は、セルロースおよびケラチンおよびコラーゲン製品に添加され得、そのため本発明は、セルロースおよび／またはケラチンおよび／またはコラーゲンと、本発明のスパイダーシルクタンパク質と、を含む紙製品またはスキンケアおよびヘアケア製品も対象とする。本発明のタンパク質が組み込まれる紙製品、ならびにスキンケアおよびヘアケア製品は、改善された特徴、特に改善された引張り強さまたは引裂き強さを示す。
【０１６５】
複合材料
本発明は、幾つかの実施形態において、（ａ）合成ドラグラインスパイダーシルクの調製に有用な異なる分子量を有するタンパク質の混合物と、（ｂ）ポリマーと、を含む複合材料を提供する。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、用語「複合材料」は、異なる特徴を有する２つ以上の物質で構成されていて、各物質が所望の特性を全体に与えながらその同一性を保持している材料を指す。
【０１６７】
幾つかの実施形態において、用語「材料」は、固形材料を指す。幾つかの実施形態において、用語「材料」は、半固形材料（例えば、ゲル）を指す。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、開示される複合材料は、優れた機械的性質を示す。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、タンパク質の混合物を含む繊維が提供される。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、複数の繊維が、リンカーを介して互いに付着される。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、本明細書全体で用いられる用語「ポリマー」は、互いに共有結合されポリマーのポリマー骨格を形成する複数の反復構造単位（互換的に骨格単位またはモノマー単位と称される）で構成される物質、例えば有機物質、あるいは無機物質を説明する。本明細書で用いられる用語「ポリマー」は、有機および無機ポリマーを包含し、ホモポリマー、コポリマーまたはそれらの混合物（例えば、ブレンド）の１つまたは複数をさらに包含する。本明細書で用いられる用語「ホモポリマー」は、１つのタイプのモノマー単位で仕上げられており、したがってめ同種の骨格単位で構成されるポリマーを説明する。本明細書で用いられる用語「コポリマー」は、１つより多いタイプのモノマー単位で仕上げられており、したがって異種の骨格単位で構成されるポリマーを説明する。異種の骨格単位は、その側鎖基によって互いに異なり得る。
【０１７２】
簡潔にするために、本明細書全体で互換的に用いられる用語「ポリマー」および「ポリマー骨格」は、ホモポリマー、コポリマーの両方およびそれらの混合物に関する。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、ポリマーは、疎水性である。幾つかの実施形態において、ポリマーは、ＵＶ硬化されている。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、開示される複合材料は、生物学的に安定である。幾つかの実施形態において、開示される複合材料は、生物学的に切断可能（ｂｉｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）である。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、用語「生物学的に安定な」は、生理学的条件下で無傷のままである（例えば、インビボで分解されない、つまり非生体分解性または非生物学的切断性である）化合物またはポリマーを説明する。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、用語「生体分解性の」は、生理学的条件および／または環境条件（複数可）下で破壊産物へと分解し得る物質を説明する。そのような生理学的条件および／または環境条件としては、例えば、加水分解（加水分解切断を介した分解）、酵素的触媒（酵素的分解）、および機械的相互作用が挙げられる。この用語は、典型的には物質の５０重量％が１年未満の期間内に分解するような、これらの条件下で分解する物質を指す。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、本発明の実施形態に関連して用いられる用語「生体分解性の」は、生理学的条件下で破壊産物に分解し、それが宿主生物体中への生体吸収を受ける、即ち宿主生物体の生化学系の代謝産物になる物質を説明する用語「生体吸収性」も包含する。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、ポリマーは、合成ポリマーである、またはそれを含む。幾つかの実施形態において、ポリマーは、天然ポリマーである、またはそれを含む。天然ポリマーは、非限定的に植物、動物および鉱物供給源などの天然供給源で作られるポリマー、または綿、リネン、ジュート、亜麻、ラミー、サイザル麻およびヘンプ、毛、および羊毛などの天然繊維から製織され得るポリマーを指し得る。
【０１７９】
さらなる模範的な天然ポリマーは、ポリラクチド、コラーゲンケラチン、セルロース、アクチン、ミオシン、キチン、家蚕絹を含む。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、ポリマーは、熱可塑性ポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリマーは、熱硬化性である。幾つかの実施形態において、ポリマーは、エポキシである。幾つかの実施形態において、ポリマーは、ポリエステル（例えば、脂肪族ポリエステル）である。幾つかの実施形態において、ポリマーは、ポリアミド、ポリウレタン、およびナイロンからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、ポリマーは、架橋性ポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリマーは、コポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリマーは、ヒドロゲルの形態である。
【０１８１】
幾つかの実施形態において、ポリマー材料は、２種以上の成分の材料（例えば、コポリマー）である。以下の実施例の節で実証される通り、成分（部分とも称される）Ａは、主な（基本の）ポリマーであり得、部分Ｂは、例えば硬化剤または触媒であり得る。
【０１８２】
硬化剤化学薬品の群は、ポリマーの基剤により異なるが、アミン、イソシアナート、ペルオキシドなどを含む。
【０１８３】
コポリマーは、ラジカル重合工程（例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮと略される）を用いる）、逐次重合および連鎖重合から選択されるメカニズムにより生成され得る。
【０１８４】
本明細書で用いられる用語「エポキシ」は、−Ｃ２Ｈ３Ｏの分子式を有する、１つの酸素および２つのメチレン基を含む３員複素環分子である反応基を指す。
【０１８５】
生成方法
幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質混合物を生成する方法が提供される。具体的な実施形態において、本発明の方法は、
ａ．上記アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用意するステップであって、上記核酸が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により調節配列と、の発現制御下にある、用意するステップと；
ｂ．宿主細胞を（ａ）の発現ベクターで形質転換するステップと；
ｃ．（ｂ）の宿主細胞による異種タンパク質の発現のための条件を提供するステップと；
ｄ．発現されたタンパク質を単離し、それにより本発明の合成アミノ酸配列を得るステップと、
を含む。
【０１８６】
本発明は概ね、ニワオニグモのドラグラインシルクに由来する合成スパイダーシルクタンパク質またはその任意の断片もしくは部分に関するが、多くの他のクモ種を用いて、類似の手法で合成スパイダーシルクを得られることが、理解されよう。より好ましくはドラグラインタンパク質は、以下のクモの１つまたは複数に由来する：アラチヌラ・ヒッギンシ（Ａｒａｃｈｎｕｒａ  ｈｉｇｇｉｎｓｉ）、アラネウス・サークリスパルサス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｃｉｒｃｕｌｉｓｓｐａｒｓｕｓ）、ニワオニグモ、アルギオープ・ピクタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｐｉｃｔａ）、シマニワオニグモ（アルギオープ・トリファシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ））、マダラジョロウグモ（Ｂａｔｉｋ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ））、ベッカリズテントスパイダー（Ｂｅｃｃａｒｉ’ｓ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（シルトホラ・ベッカリ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｂｅｃｃａｒｉｉ））、トリノフンダマシ（Ｂｉｒｄ−ｄｒｏｐｐｉｎｇ  Ｓｐｉｄｅｒ）（セラエニア・エクスカバタ（Ｃｅｌａｅｎｉａ  ｅｘｃａｖａｔａ））、トゲグモ（Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ＷｈｉｔｅＳｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ガステラカンタ・クフリイ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｋｕｈｌｉｉ））、キマダラコガネグモ（Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アルギオープ・アウランチア（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ））、ナゲナワグモ（オルダリウス・フルカツス（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ））、イセキグモ（Ｂｏｌａｓ  Ｓｐｉｄｅｒｓ  Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（オルガリウス・マグニフィカス（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃｕｓ））、イエオニグモ（Ｂｒｏｗｎ  Ｓａｉｌｏｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ネオスコナ・ナウチカ（Ｎｅｏｓｃｏｎａｎａｕｔｉｃａ））、チャアシグモ（Ｂｒｏｗｎ−Ｌｅｇｇｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ネオスコナ・ルホフェモラタ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｒｕｆｏｆｅｍｏｒａｔａ））、キャップドブラックヘッディドスパイダー（Ｃａｐｐｅｄ  Ｂｌａｃｋ−Ｈｅａｄｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ジギエラ・カリプトラタ（Ｚｙｇｉｅｌｌａ  ｃａｌｙｐｔｒａｔａ））、ミツカドオニグモ（パラウィキア・デハアニ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｄｅｈａａｎｉ））、キタドヨウグモ（ネオスコナ・オキサンセンシス（Ｎｅｏｓｃｏｎａｏｘａｎｃｅｎｓｉｓ））、クラブライクスパイニーオーブウェーバー（Ｃｒａｂ−ｌｉｋｅ  Ｓｐｉｎｙ  ＯｒｂＷｅａｖｅｒ）（ガステラカンタ・カンクリホルミス（エリプソイデス）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ（ｅｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）））、オオナガトゲトゲグモ（ガステラカンタ・アルクアタ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ａｒｃｕａｔａ））、シルトホラ・モルセンシス（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｍｏｌｕｃｃｅｎｓｉｓ）、シルトホラ・パルナシア（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｐａｒｎａｓｉａ）、ドロホンス・コニフェラ（Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓｃｏｎｉｆｅｒａ）、ドロホンス・ツリゲラ（Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ ｔｕｒｒｉｇｅｒａ）、ドリアズスパイニースパイダー（Ｄｏｒｉａ'��  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ガステラカンタ・ドリアエ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａｄｏｒｉａｅ））、チブサトゲグモ（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ガステラカンタ・マモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ））、キヌアミグモ（Ｄｏｕｂｌｅ−ＴａｉｌｅｄＴｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（シルトホラ・エキサンテマチカ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｅｘａｎｔｈｅｍａｔｉｃａ））、アクレペリア・セロペギア（Ａｃｕｌｅｐｅｒｉａ  ｃｅｒｏｐｅｇｉａ）、エリオホラ・プスツロサ（Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ  ｐｕｓｔｕｌｏｓａ）、フラットアネプション（Ｆｌａｔ  Ａｎｅｐｓｉｏｎ）（アネプション・デプレシウム（Ａｎｅｐｓｉｏｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｕｍ））、フォースパインドジュエルスパイダー（Ｆｏｕｒ−ｓｐｉｎｅｄ  Ｊｅｗｅｌ Ｓｐｉｄｅｒ）（ガステラカンタ・クアドリスピノーサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｑｕａｄｒｉｓｐｉｎｏｓａ））、ガーデンオーブウェブスパイダー（Ｇａｒｄｅｎ  ＯｒｂＷｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ）（エリオホラ・トランスマリナ（Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ  ｔｒａｎｓｍａｒｉｎａ））、ジャイアントライケンオーブウェーバー（Ｇｉａｎｔ  Ｌｉｃｈｅｎ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（アラネウス・ビセンテナリウス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ））、ジョロウグモ（ネフィラ・マクラタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ））、ハッセルツスパイニースパイダー（Ｈａｓｓｅｌｔ’ｓ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ガステラカンタ・ハッセルティ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｈａｓｓｅｌｔｉｉ））、テゲナリア・アトリカ（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ  ａｔｒｉｃａ）、ヘウロデス・ツリタ（Ｈｅｕｒｏｄｅｓ  ｔｕｒｒｉｔａ）、アイランドサイクローサスパイダー（Ｉｓｌａｎｄ  Ｃｙｃｌｏｓａ  Ｓｐｉｄｅｒ）（サイクローサ・インスラナ（Ｃｙｃｌｏｓａ  ｉｎｓｕｌａｎａ））、ジュエルスパイダーまたはスパイニースパイダー（アストラカンタ・マイナックス（Ａｓｔｒａｃａｎｔｈａ  ｍｉｎａｘ））、キドニーガーデンスパイダー（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アラネウス・ミチフィカス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｍｉｔｉｆｉｃｕｓ））、ラグライジズガーデンスパイダー（Ｌａｇｌａｉｓｅ’ｓ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（エリオビキシア・ラグライセイ（Ｅｒｉｏｖｉｘｉａ  ｌａｇｌａｉｓｅｉ））、ロングベリードサイクローサスパイダー（Ｌｏｎｇ−Ｂｅｌｌｉｅｄ  Ｃｙｃｌｏｓａ  Ｓｐｉｄｅｒ）（サイクローサ・ビフィダ（Ｃｙｃｌｏｓａ  ｂｉｆｉｄａ））、マラバルジョロウグモモドキ（ネフィレンギス・マラバレンシス（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓｍａｌａｂａｒｅｎｓｉｓ））、マルチカラードセントアンドリュースクロススパイダー（Ｍｕｌｔｉ−ＣｏｌｏｕｒｅｄＳｔ  Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アルギオープ・ベルシカラー（Ａｒｇｉｏｐｅｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ））、ケハイグモ（Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｅｅ−Ｔｒｕｎｋ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ヘレンニア・オルナチシマ（Ｈｅｒｅｎｎｉａ  ｏｒｎａｔｉｓｓｉｍａ））、ナガマルコガネグモ（Ｏｖａｌ  Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アルギオープ・アエムラ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｍｕｌａ））、ハラビロスズミグモ（Ｒｅｄ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（シルトホラ・ユニカラー（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ））、ロシアンテントスパイダー（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（シルトホラ・ヒルタ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｈｉｒｔａ））、カラフトオニグモ（Ｓａｉｎｔ  Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アルギオープ・ケイセルリンギ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ））、ハツリグモ（Ｓｃａｒｌｅｔ  Ａｃｕｓｉｌａｓ）（アクシラス・コシネウス（Ａｃｕｓｉｌａｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ））、ギンコガネグモ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ａｒｇｉｏｐｅ）（アルギオープ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ））、スパイニーバックドオーブウェーバー（Ｓｐｉｎｙｂａｃｋｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（ガステラカンタ・カンクリホルミス（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ））、スポッテドオーブウェーバー（Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（ネオスコナ・ドミシリオルム（Ｎｅｏｓｃｏｎａｄｏｍｉｃｉｌｉｏｒｕｍ））、セントアンドリュースクロス（Ｓｔ．  Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃｒｏｓｓ）（アルギオープ・アエテリア（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｔｈｅｒｉａ））、カラフトオニグモ（アルギオープ・ケイセルリンギ）、ゲホウグモ（Ｔｒｅｅ−Ｓｔｕｍｐ  Ｓｐｉｄｅｒ）（ポルチス・イレピヅス（Ｐｏｌｔｙｓ  ｉｌｌｅｐｉｄｕｓ））、サンカクグモ（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（アルキス・クラバツス（Ａｒｋｙｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ））、サンカクグモ（アルキス・ランセアリウス（Ａｒｋｙｓｌａｎｃｅａｒｉｕｓ））、フタトゲグモ（Ｔｗｏ−ｓｐｉｎｅｄＳｐｉｄｅｒ）（ポエシロパキス・アウストララシア（Ｐｏｅｃｉｌｏｐａｃｈｙｓ  ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ））、ジョロウグモ種、例えばアメリカジョロウグモ、アフリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）およびマダガスカルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）など。
【０１８７】
さらに、合成スパイダーシルクは、由来する異なるクモ種の選択によってのみならず、タンパク質以外の様々な化合物の使用によっても強化され得る。ピロリドンは、吸湿性を有し、糸の水分保持を支援する。それは、グルースレッド（ｇｌｕｅ  ｔｈｒｅａｄｓ）中で特に高い濃度で存在する。リン酸水素カリウムは、水溶液中に陽イオンを放出し、ｐＨを約４にしてシルクを酸性にし、これにより、さもなければタンパク質を消化する真菌および細菌からシルクを防御する。硝酸カリウムは、酸性環境でタンパク質が変性するのを防ぐと考えられている。
【０１８８】
本明細書で用いられる用語「約」は、±１０％を指す。
【０１８９】
「模範的」という語は、「例、事例または例示として働くこと」を意味するために本明細書で用いられる。「模範的」と記載される任意の実施形態は、他の実施形態よりも好ましいもしくは有利であると必ずしも解釈されず、および／または他の実施形態からの特色の取り込みを必ずしも除外しない。「場合により」という語は、「幾つかの実施形態において提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味するために本明細書で用いられる。本発明の任意の特別な実施形態は、そのような特色が矛盾しない限り、複数の「場合による」特色を含み得る。
【０１９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、他に明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ＭａＳｐ」への言及は、複数のそのような遺伝子および変異体を含み、「ペプチド」への言及は、当業者に公知の１種または複数のペプチドへの言及を含むなどである。
【０１９１】
同じく「または」の使用は、他に断りがなければ、「および／または」を意味する。同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｒｉｓｅｓ）、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定的であるとは意図されない。様々な実施形態の記載が用語「含んでいる」を使用する場合、幾つかの具体的事例において、実施形態は言語「から本質的になる」または「からなる」を用いて代わりに記載され得ると当業者が理解するであろうことが、さらに理解されなければならない。
【０１９２】
この出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が、範囲形式で表され得る。範囲形式の記載は単に簡便さおよび明瞭さのためのもので、本発明の範囲の柔軟性のない限定であると解釈すべきでないことが、理解されなければならない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲ならびに、その範囲内の個々の数値を有すると見なされなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲ならびに、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５、および６を有すると見なされなければならない。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１９３】
「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」と類似の慣例が用いられるそれらの事例において、一般にそのような構成は、当業者がその慣例を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、および／またはＡとＢとＣを一緒に、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどの少なくとも１つ」と類似の慣例が用いられるそれらの事例において、一般にそのような構成は、当業者がその慣例を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、および／またはＡとＢとＣを一緒に、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。本明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにしろ、２つ以上の代わりの用語を表す事実上あらゆる分離した語および／または語句が、それらの用語の１つ、それらの用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されなければならないことは、当業者にさらに理解されよう。例えば、語句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡとＢ」の可能性を含むと理解されよう。
【０１９４】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同一の方法および材料が、開示される方法および組成物の実践において用いられ得るが、その模範的方法、装置および材料が、本明細書に開示される。
【０１９５】
実施例
材料と方法
プラスミド：Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ、レゲンスブルグ）から得られたＰＣＲ-ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（+）プラスミド中のＤＮＡ配列。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られたｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ。
【０１９６】
制限酵素：(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州所在)から得られたＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩ。
【０１９７】
トランスフェクションおよび形質転換：バクミドおよびヘルパープラスミドを含有するコンピーテント大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ＥＳＣＯＲＴトランスフェクション試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０１９８】
培地：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られたタンパク質不含ＥＳＦ  ９２１昆虫細胞培地。
【０１９９】
細胞：懸濁液中で成長させたＳＦ９−スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞(ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１７１１)。
【０２００】
抗体：Ｒｏｃｈｅから得られたマウス抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られたテキサスレッドコンジュゲート化抗マウス二次ＩｇＧ。
【０２０１】
染色剤：ＮａｎｏＶａｎ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、米国ニューヨーク州所在）。
【０２０２】
画像：Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡。Ｍａｇｎａｆｉｒｅ  ＳＰカメラは、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓから得た。
【０２０３】
実験手順
ドラグラインシルクタンパク質のシングルリピート単位をコードする配列の合成：ＡＤＦ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４７８５６）の反復領域を構成する１５リピートの平均コンセンサス配列を表す３５アミノ酸長配列を設計した。平均コンセンサス配列のペプチド配列は、１０５のＤＮＡ塩基対配列：５’−ＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）によってコードされるＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）である。上記の合成ＤＮＡは、ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）プラスミドで得られた。この配列をスポドプテラ・フルギペルダのコドン使用に従って発現のために最適化し、その細胞をスパイダーシルクおよび繊維の合成に用いた。
【０２０４】
特定の実施形態において、種々のアミノ酸配列を有する３つの構築物を実施し、それぞれは、以下の特有のアミノ酸配列を有する：
Ｃ１(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６）：ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＧＡＧＡＧＡＸａａＡ（ＸａａはＡｌａまたはＧｌｙのいずれかを表す）
Ｃ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８および４０）：ＸａａＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＡＡＡＡＡＡ（ＸａａはＳｅｒまたはＧｌｙのいずれかを表す）
Ｃ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２および４４）：ＸａａＧＰＧＱＧＧＹＧＧＰＧＧＱＧＰＧＲＧＧＹＧＰＧＡＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（ＸａａはＳｅｒまたはＧｌｙのいずれかを表す）。
この３つ（Ｃ１〜Ｃ３）の構築物のシングルリピートをコードするポリヌクレオチド配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５〜４７として示す。
【０２０５】
ドナープラスミドの構築：ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）プラスミドをＸｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで切断し、Ｎｓｉ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉ制限部位が隣接する基本のリピート配列を含む１３６ｂｐの配列を単離して、バキュロウイルス系ドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中にクローニングした。したがって、人工４９アミノ酸Ｎ末端ドメインおよび３５アミノ酸コアドメインをコードする基本のドナープラスミドを作製した。
【０２０６】
シングルリピートの多重体化：スパイダーシルクタンパク質の１リピート（モノマー）をコードする基本モジュールに、適合性のある制限酵素部位ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩを隣接させる。最初のステップでは、モノマーを二重制限により放出させて、ＰｓｔＩで切断した同じドナープラスミド中にインフレームで挿入する。挿入部が、正しいセンス方向でライゲートされる場合にのみ、ダブルカット（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｕｔ）がダイマーを放出する（２つのリピートの間の制限部位をライゲーションにより消した）。第二のステップにおいて、ダイマーを放出し、その後、同じ方式で再挿入して、４つのリピートを有するベクターを得た。後のステップにおいて、この手順を繰り返し、複数の合成リピートを含むドナープラスミドを得た。用いた分子生物学的ツールおよび配列の反復性から生じた制約が、同一リピートの最大実現可能数を限定する。
【０２０７】
合成リピートの下流のネイティブＣ末端ドメインのライゲーション：ＡＤＦ１１４アミノ酸のＣ末端ドメインの挿入は、以下のプライマーでのＰＣＲを利用して行った：ＰｓｔＩ制限部位（下線）を含む配列５’−ＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有するセンスプライマー、および３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線）をコードする配列５’−ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有するアンチセンスプライマー。異なる数のリピートを有するドナープラスミドベクターおよびＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出して、精製およびライゲートし、人工Ｎ末端ドメインの一部であるＨｉｓ６タグと、それに続く様々な数の同一リピート（本発明者らは、核酸配列の１、２、４、８、１２、１６、２０、２４、３２リピートを含む構築物を得た）およびネイティブＣ末端ドメインをコードするｐＦａｓｔＢａｃＨＴａドナープラスミドを得た。
【０２０８】
細胞培養：Ｓｆ９細胞をＥＳＦ９２１無血清昆虫細胞培地中にて、２７℃で増殖させた。Ｓｆ９細胞を、６ウェルプレート中のカバースリップ上の単層として、または１３０ｒｐｍで撹拌しながら振とうフラスコ中で、成長させた。
【０２０９】
組換えバキュロウイルスの生成：バクミド（バキュロウイルスシャトルベクタープラスミド）およびヘルパープラスミドを含有するコンピーテント大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ細胞を用いて、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って組換えバクミドを作製した。バクミド中への遺伝子の挿入を、ＰＣＲによって検証した。６ウェルプレート中でＥＳＣＯＲＴトランスフェクション試薬を用いて、Ｓｆ９細胞を組換えバクミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を２７℃で５時間インキュベートし、すすいで、さらに７２時間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離して、ウイルスを含む上清を２〜３回の逐次感染に用いて、ウイルス粒子の力価を増幅させた。
【０２１０】
合成ＡＤＦ−４を基にしたタンパク質の発現：Ｓｆ９細胞（３×１０６細胞／ｍｌ）を、０．１〜１０の範囲の様々なＭＯＩ（感染多重度）で組換えウイルスに感染させた。感染の４日後に、細胞を１６０００ｇで１０分間の遠心分離により回収した。
【０２１１】
合成繊維の精製：感染細胞を感染の４日後に回収して、１６０００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを０．２５％ＳＤＳ溶液中に再懸濁させて、室温で３０分間インキュベートし、タンパク質の集合体を先の通り沈降させた。精製された繊維の典型的収量は、Ｓｆ９昆虫細胞培養物１Ｌあたり約１５０ｍｇであった。精製された繊維を、所望の溶液および容量で再懸濁させた。
【０２１２】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）測定：熱分析を、不活性窒素雰囲気下にて、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２２ｅサーモアナライザーおよびアルミニウム試料パンを用いて３〜６ｍｇのフィブロイン試料で実施した。サーモグラムは、５℃／分の加熱速度で１０℃〜４００℃の範囲であった。
【０２１３】
免疫細胞化学測定：カバースリップ上で５０％コンフルエントに成長させた細胞を、ＭＯＩ＝１０で組換えウイルスに感染させた。感染の３日後に、細胞を−２０℃のメタノールで固定した。カバースリップを１：３００希釈でマウス抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体と共に、その後、１：５００希釈でテキサスレッドコンジュゲート化抗マウス二次ＩｇＧと共にインキュベートした。細胞をＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察して、画像をＭａｇｎａｆｉｒｅ  ＳＰカメラで撮影するか、または共焦点顕微鏡測定により分析した。
【０２１４】
走査電子顕微鏡（ＴＥＭ）：超微細構造解析では、精製された細糸をそのままの状態で３００メッシュの銅製ホーリーカーボングリッドに吸着させるか、またはバナジウム（ＮａｎｏＶａｎ１、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）で陰性染色し、１２０ｋＶで操作されるＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２顕微鏡で観察および撮像した。
【０２１５】
実施例１
ミクロ繊維を構成するナノ繊維の特徴づけ
１．８ナノメーターの直径を有する金粒子（Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）を、本発明のモノマーそれぞれのＮ末端Ｈｉｓ６タグに結合させた。免疫ＴＥＭの観察により、モノマーが最初に頭−尾結合方式で互いに相互作用し、このように最初のステージとしておよそ５ナノメーターの直径のナノフィブリルを作り出す、二段階組立工程が明らかとなった（図１Ａ）。結論として、ナノフィブリルは、非配向方式で互いに相互作用し（図１Ｂ）、このようにおよそ１５０ナノメーターの直径を有する繊維を作り出す（図１Ｃ）。
【０２１６】
さらに、３つの独立した構築物（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）を基にした様々な組織化繊維の表現型を、光学顕微鏡を用いて検査し、蛍光標識繊維を、共焦点顕微鏡を用いて検査した。図１Ｄ〜Ｉに示される通り、構築物Ｃ１のモノマーは自己組織化して、発現細胞の細胞質の内側でコイル状繊維を作り出した。この繊維の直径は、１００〜２００ｎｍの範囲であり、長さは、１０〜１５０μｍの範囲であった。構築物Ｃ２のモノマーは、自己組織化して、１００〜２００ｎｍの範囲の直径を有する繊維を作り出したが、それらの長さは１０〜５０μｍの範囲である。構築物Ｃ３のモノマーは、様々な表現型：（ｉ）平均直径１μｍの球状凝集体；（ｉｉ）平均直径５００ｎｍの凝集体で覆われた繊維；（ｉｉｉ）構築物Ｃ１およびＣ２と類似の平滑面を有する繊維、に自己組織化した。
【０２１７】
実施例２
特有のラダリング現象が本発明の繊維を特徴づける
非反復性Ｎ末端およびＣ末端ドメインが隣接した様々な数のリピート（０、１、２、３，４、５、８、１２、１６、２０、２４、３２）を含むモノマーは、自己組織化して不溶性になる傾向がある。それゆえ、モノマーの分子量（ＭＷ）を決定するために、繊維を精製して、６ＭグアニジンＳＣＮで分解した。引き続き、グアニジン溶液を８Ｍ尿素に対し透析し（１０ＫＤａのＭＷカットオフのＰｉｅｒｃｅ透析カセットを用いて）、試料緩衝液を添加し、試料を変性１０％アクリルアミドゲルで分析した。
【０２１８】
クーマシーブルー染色を、３種の異なる供給源からの分解された繊維で実施した：
（１）Ｎ末端ドメイン、２４の同一リピート（２．７ｋＤａ）、Ｃ末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー；
（２）Ｎ末端ドメイン、１６の同一リピート（２．７ｋＤａ）、Ｃ末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー；および
（３）Ｎ末端ドメイン、１５の非同一リピート（アラネウス・ジアデマタスのネイティブ配列から採取）、Ｃ末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー。
【０２１９】
観察される通り（図２Ａ）、人工構築物の場合（１、２）、異なるバンドのモル比に関する一定の勾配があり、これはより軽いバージョンのバンドを優先するが、ネイティブ配列（３）のラダーではそうではない。例えば、ネイティブ配列から生じたラダーの３８ＫＤａに相関するバンドは、周囲のバンド（上および下）よりもかなり濃い。
【０２２０】
この観察から、異なる反復ゾーンの供給源の重要性が強く示される。人工配列の場合リピートは同一であるが、ネイティブ配列の場合、リピートは、少なくともそれらの全体のサイズおよびポリアラニンストレッチの長さが異なる。さらに、記載された差は、ネイティブ反復配列から生じた繊維と、本明細書に開示された人工反復配列から生じた繊維との間に存在する異なる会合特性、異なる熱安定性および異なる機械的性質と相関する。
【０２２１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
先に記載された通り、Ｓｆ９細胞を、バクミドＤＮＡの構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に回収した。
【０２２２】
細胞ペレットを、１０％ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、セミドライブロッティングによりニトロセルロースに移した。ブロッキングを、ＰＢＳ×１中の粉乳、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０と共に１時間実施した。膜をマウス抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（１：２０００）および二次抗体としてコンジュゲートされた抗マウスＨＲＰ（１：５０００）と共にインキュベートした。ＥＣＬを用いて、ＨＩＳタグ構築物を直接検出した。
【０２２３】
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグに対する一次抗体を用いたウェスタンブロットは、観察されたバンドそれぞれにおけるＮ末端ドメインの存在を検証した（図２Ｂ）。全ての３つのタンパク質（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３として示す）が、ラダリング現象を起こした。全ての３つのタンパク質の最も強いバンド（矢印で示す）は、構築物１、２および３から生じたタンパク質の計算されたＭ．Ｗ．に対応する（それぞれ６１．４１、６２．８４、および６２．１６ＫＤａ）。
【０２２４】
ジスルフィド結合によりシステイン（本発明者らのタンパク質中にはただ１つのシステインが存在し、Ｃ末端ドメインに位置する）に特異的に結合するフルオロフォアを用いて、ラダーの観察されたバンドの全てで、Ｃ末端ドメインの存在を検証した（図２Ｃ）。
【０２２５】
ポリヘドリンプロモーターの下で完全長タンパク質をコードするバキュロウイルスで感染されたＳｆ９細胞から抽出されたｍＲＮＡのノーザンブロットは、完全長タンパク質サイズに相関するサイズのｍＲＮＡを明らかにした。抽出されたｍＲＮＡを次にＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして用い、ｃＤＮＡを得て、それを今度はＰＣＲのテンプレートにしてＤＮＡバンドのラダーを得た。上記のラダーから単離されたＤＮＡバンドの配列決定を、完全長タンパク質の全配列の最初のおよび最後の１８塩基に相補的な配列を有するプライマーを用いて実施した。配列決定は、全Ｎ末端およびＣ末端ドメイン配列が隣接する様々な数のリピートの存在を明らかにした。
【０２２６】
ＲＮＡの二次構造とまとめた上の知見は、ｍＲＮＡのリピートエリアがヘアピン構造を取り、リボソームがこのヘアピンの上を滑る、新規なタンパク質合成制御の驚くべき発見を導いた。このヘアピンの代わりのサイズの結果として、タンパク質のアレイが１つのｍＲＮＡにより合成される。これらのタンパク質は、それらが含むリピートの数でのみ互いに異なり、したがって１つの遺伝子に基づくフィブロインモノマーのアレイを雌グモが発現することを可能にする。
【０２２７】
実施例３
溶解された精製繊維は連続繊維へと電界紡糸され得る
ＳＦ９感染細胞から単離された合成繊維を、脱水した（摂氏５５度（℃）の条件下で一晩）。ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を、ドープの最終濃度が２３％ｗ／ｖになるように乾燥繊維に添加した。電界紡糸のプロトコルを以下の通り実施した：注入速度：０．５ｍｌ／時間、電圧：１８キロボルト、ノズルの先端とコレクターとの間の距離：１６センチメートル、湿度：４０％、温度：２８℃。
【０２２８】
上記プロトコルは、平均径１００ナノメートルの連続繊維のメッシュをもたらした（図３Ａ）。この繊維のＤＳＣ検査は、２８９℃での吸熱ピークを明らかにし、合成繊維と同様にポリアラニンストレッチに基づくナノ結晶の存在を示した（図３Ｂ）。
【０２２９】
実施例４
精製された繊維の凍結乾燥および直線状特徴の決定
精製された繊維を、二段蒸留水（ＤＤＷ）中に０．５％ｗ／ｖで懸濁させて、液体窒素により凍結させた後（−２００℃の温度で）、およそ２４時間、凍結乾燥させた。上記手順から、乾燥繊維を含む白色粉末が得られた。この繊維のより深い検査は、それらは、それらの直径を保ちつつ直線化され、直線構造を取り（図４Ａ）かつそれらの機械的性質を保持しながら、種々のマトリクスで容易に分散されたことを明らかにした。
【０２３０】
特に、ネイティブドラグラインの融点（２３０℃）と比較して、本明細書に開示された合成繊維の融点は、約２３５℃の高さであると測定された（図４Ｂ）。
【０２３１】
実施例５
本発明の繊維上での多層細胞成長
本発明の繊維（ＰＢＳ中に１：２５）を滅菌９６ウェル組織培養プレートのウェルに添加した。インキュベーション（４℃）および洗浄ステップに続いて、ＨＥＫ２９３細胞を各繊維コーティングウェル中に入れた後、インキュベーションステップに供した（３７℃、５％ＣＯ２で７２時間）。
【０２３２】
図５Ａ〜Ｃで認められる通り、ＨＥＫ２９３細胞は、組織培養プレートよりむしろ本発明の繊維に好ましく接着することが見出された。さらに、本発明の繊維は、細胞好適性を層成長から３Ｄ成長へ改変した。
【０２３３】
実施例６
本発明の繊維の熱フィンガープリント
本発明の繊維の熱フィンガープリントを特徴づけるために、複数のテストを実施した。
【０２３４】
繊維を、テストごとに５〜１０ｍｇ量り取った。各テストを、液体窒素冷却タンクを具備したＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ  ２システムにて、容量４０μＬの穿通されたアルミニウムパンで実施した。テストを、１００℃に加熱しその温度を５分間維持する水除去工程の後で、５℃／分の加熱速度にて２５〜３５０℃で実施した。
【０２３５】
結果は、予測に反して、熱フィンガープリントが２６５±５℃で始まる３２０±５℃までの１つのピークを示し、約３００℃にピークがあることを示す。
【０２３６】
追加のテストは、３つのピーク：
１．−１２０℃〜１６０℃での発熱ピーク
２．２３０〜２６０℃での吸熱ピーク
３．２６５±５℃から３２０±５℃までの分解ピーク
を有する熱フィンガープリントを示した。
【０２３７】
本発明を具体的実施形態と共に記載したが、多くの改変、修正および変更が当業者に自明になることは、明らかである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲の主旨および広い範囲に含まれるそのような全ての改変、修正および変更を包含するものとする。
【０２３８】
本明細書で言及された全ての発行物、特許および特許出願は、各発行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられることを示すかの如く、全体として参照により本出願に組み入れられる。加えて、本出願内の任意の参考資料の引用または同認は、そのような参考資料が本発明の先行技術として入手可能であることの承認と解釈されるべきではない。節の見出しが用いられるという点で、それらは必ずしも限定と解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018531040000001.app
【国際調査報告】
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2018531040.tif 000021