(57)【要約】  本発明は、細胞において一旦発現されると膜繋留型になり得るコンビナトリアルペプチドまたはポリペプチドライブラリを提供する。本発明はさらに、本発明のコンビナトリアルライブラリからＧＰＣＲのペプチド修飾因子（例えばアゴニスト）を選択するための方法を提供する。本発明はまた、新規ＧＰＣＲポリペプチド修飾因子、例えばグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の偏向型ポリペプチドアゴニストも提供する。本発明はさらに、インスリン感受性を増強し、血糖を低下させ、体重を減少させる方法、ならびに糖尿病および肥満などの様々な疾患を処置するための方法を提供する。【選択図】図１
2018511329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のランダム化ペプチドを含み、前記第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グ
ルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプ
チドに融合されている、単離または組み換えポリペプチドであって、前記ランダム化ペプ
チドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸ
ＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、ここで、Ｘは何らかのアミノ酸残基である、単離または組み換えポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１
Ｒ）を活性化する、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号４〜１
６および２２〜３１から選択される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列またはその活
性変異体もしくは断片を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ランダム化ペプチドが、１つ以上の残基
での保存的置換を除き、配列番号４〜１６および２２〜３１から選択される配列と同一で
あるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号４（Ａ
ＣＣＩＤＳＶＣＶＩ）、配列番号５（ＶＣＰＤＣＱＶ）、配列番号６（ＡＣＳＹＭＩＤＣ
ＶＬ）、配列番号８（ＥＬＶＤＮＡＶ）、配列番号２２（ＣＣＩＤＳＶＣＶＩ）または配
列番号２３（ＣＳＹＭＩＤＣＶＬ）で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる
、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドであって、グルカゴン様ペプチド１受容体に結合可能な
前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）またはヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）の少なくとも８個の連続アミノ酸残基と実質的に同一である配列を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ＧＬＰ−１Ｒに結合可能な前記第２のペプチドが、配列番号１７または配列番号１８と実質的に同一である配列を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ＧＬＰ−１Ｒに結合可能である前記第２のペプチドが、１つ以上の残基での保存的置換を除いて、配列番号１７または配列番号１８で示される配列を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドであって、グルカゴン様ペプチド１受容体に結合可能で
ある前記第２のペプチドが、ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧ
ＧＰ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号２１）で示される配列を含むかまたはそれからなる
、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドであって、配列番号３２〜３７からなる群から選択され
る配列と実質的に同一である配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドであって、配列番号３２〜３７からなる群から選択され
る配列と実質的に同一である配列を含むかまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示される配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｇタンパク質偏向型である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、そのＮ末端またはＣ末端で融合されるＦｃド
メインをさらに含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリペプチドであって、配列番号３６のＣ末端で融合されるＦｃド
メインを含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリペプチドであって、Ｎ末端でシグナルペプチドをさらに含む、
ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドであって、配列番号４５で示される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストを同定するための方法であって、
（１）前記ＧＰＣＲを発現する宿主細胞の集団に、調節下でレポーター遺伝子、ｃＡＭＰ応答エレメント（ｃＡＭＰ）を発現するベクターを導入すること、
（２）候補ポリペプチドおよび前記ＧＰＣＲを同時発現する宿主細胞の集団を作製するために、前記宿主細胞において膜繋留型の候補ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを発現させること、
（３）候補ポリペプチドを何ら発現しない対照細胞と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルが上昇している宿主細胞を同定すること、および
（４）同定された宿主細胞において発現される前記候補ポリペプチドの正体を判定し；それによって前記Ｇタンパク質共役受容体のアゴニストを同定することを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、各候補ポリペプチドがそのＣ末端で膜貫通タンパク
質ドメインに融合される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記膜貫通タンパク質ドメインがＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインである、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記ＧＰＣＲが、前記宿主細胞中の発現ベクターから発現される、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記ベクターがレンチウイルスベクターである、方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、前記レポーター遺伝子がＧＦＰタンパク質をコードする、方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法であって、前記レポーター遺伝子がレンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞に導入される、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法であって、前記宿主細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法であって、前記ＧＰＣＲがヒトＧＬＰ−１Ｒである、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、各候補ポリペプチドが、第１のランダム化ペプチド
を含み、前記第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体
（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されており、前記
ランダム化ペプチドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号
２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、ここで、Ｘは何らかのアミノ酸残基である。）方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（ＳＱ
Ｅ番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプ
チド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記膜貫通タンパク質ドメインおよび前記第２のペ
プチドがリンカーペプチドを介して連結される、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記リンカーペプチドが、ＧＧＧＧＳ（配列番号４
３）の２つ以上のタンデムリピートを含む、方法。
【請求項３１】
請求項１８に記載の方法であって、各候補ポリペプチドが、Ｎ末端でシグナルペプチド
をさらに含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記シグナルペプチドがＩＬ−２シグナル配列を含
む、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記シグナルペプチドがＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬ
ＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）を含む、方法。
【請求項３４】
細胞において前記グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）が介在するシグナル伝達経路を活性化するための方法であって、第１のランダム化ペプチドを含み、前記第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されているポリペプチドの有効量と前記細胞を接触させ、前記ランダム化ペプチドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、ここで、Ｘは何らかのアミノ酸残基であり、それによって前記細胞においてＧＬＰ−１Ｒ介在性シグナル伝達経路を活性化することを含む、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（ＳＱ
Ｅ番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプ
チド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、前記シグナル伝達経路がインスリン生合成および放出である、方法。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法であって、前記細胞が膵ベータ細胞である、方法。
【請求項４０】
請求項３４に記載の方法であって、前記細胞が、対象に存在する膵臓ベータ細胞である、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、前記対象が、２型糖尿病、肥満、非アルコール性脂
肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）またはアテローム性動
脈硬化症に罹患しているかまたは発症するリスクがある、方法。
【請求項４２】
対象において、インスリン感受性を増強し、血糖を低下させるか、または高血糖およびインスリン感受性低下を特徴とする障害を処置するための方法であって、第１のランダム化ペプチドを含み、前記第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されているポリペプチドの有効量を前記対象に投与し、前記ランダム化ペプチドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、ここで、Ｘは何らかのアミノ酸残基であり、それによって前記対象においてインスリンレベルを上昇させ、血糖を低下させることを含む、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（ＳＱ
Ｅ番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプ
チド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含む、方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法であって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法であって、前記対象が、２型糖尿病、肥満、非アルコール性脂
肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）またはアテローム性動
脈硬化症に罹患しているかまたは発症するリスクがある、方法。
【請求項４７】
糖尿病を処置するための医薬組成物の調製における、第１のランダム化ペプチドを含み、前記第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されているポリペプチドの使用であって、前記ランダム化ペプチドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、Ｘは何らかのアミノ酸残基である、使用。
【請求項４８】
請求項４７に記載の使用であって、前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（ＳＱ
Ｅ番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプ
チド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含む、使用。
【請求項４９】
請求項４７に記載の使用であって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項５０】
請求項４７に記載の使用であって、前記ポリペプチドが、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項５１】
グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドにＣ末端で融合されるランダム化ペプチドを含むポリペプチドをコードする、単離または組み換えポリヌクレオチドであって、前記ランダム化ペプチドが、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）の配列を含み、ここで、Ｘは何らかのアミノ酸残基である、単離または組み換えポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記第２のペプチドが、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ランダム化ペプチドが、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、前記第２ペプチ
ドのＣ末端で膜貫通タンパク質ドメインをさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項５５に記載のポリヌクレオチドであって、前記膜貫通タンパク質ドメインがＰＤ
ＧＦＲ膜貫通ドメインである、ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
請求項５５に記載のポリヌクレオチドであって、前記膜貫通タンパク質および前記第２
のペプチドがリンカーペプチドを介して連結される、ポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項５７に記載のポリヌクレオチドであって、前記リンカーペプチドが、ＧＧＧＧＳ
（配列番号４３）の２つ以上のタンデムリピートを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５９】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、Ｎ末端でシグナ
ルペプチドをさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６０】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドであって、前記シグナルペプチドがＩＬ−２シグ
ナル配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６１】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドであって、前記シグナルペプチドがＭＹＲＭＱＬ
ＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項５１に記載の単離または組み換えポリヌクレオチドによってコードされる、融合
ポリペプチド。
【請求項６３】
請求項５１に記載の単離または組み換えポリヌクレオチドを有する、発現ベクター。
【請求項６４】
レンチウイルスベクターである、請求項６３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は、米国仮特許出願第６２／１４１，５９８号（２０１５年４月１日出願）
に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の開示全てが、参照によりその全体におい
て、および全ての目的のために本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体は、細胞表面受容体タンパク質の最大ファミリーを構成する。
活性化時に、ＧＰＣＲは、Ｇαｓ−、Ｇαｉ／ｏ−、ＧαｑおよびＧα１２／１３の４つ
のサブクラスに分けられ得るＧＴＰ結合タンパク質に結合する。ＧｓおよびＧｉ／ｏはア
デニル酸シクラーゼを制御し、ｃＡＭＰ産生の増加（Ｇαｓ）もしくは減少（Ｇαｉ／ｏ
）、または細胞内カルシウム濃度の増加（Ｇαｑ）につながる。Ｇα（１２／１３）はＲ
ｈｏ  ＧＥＦを活性化し、次にＲｈｏを活性化する。ＧＰＣＲは、β−アレスチンにも関
与し得る。歴史的に、β−アレスチン−１およびβ−アレスチン−２は、ＧＰＣＲ脱感作
において独占的な役割を果たすと考えられていた。しかし、β−アレスチンは、シグナル
伝達カスケードを活性化するためにも機能し得ることが示された。多くのヒトの疾患は、
ＧＰＣＲの機能不全と関連がある。したがって、ＧＰＣＲは、製薬業界において最も魅力
的なある種の治療または分子標的となる。
【０００３】
インスリンは、細胞へのグルコースおよび脂質取り込みの促進を通じて、血糖濃度およ
び血中脂質レベルを調節する。２型糖尿病（Ｔ２ＤＭまたはＴ２Ｄ）は、不十分なインス
リン分泌とインスリン抵抗性の発症が組み合わさることから生じる高血糖症を特徴とする
複雑な代謝障害である。Ｔ２Ｄおよび肥満は密接に関連しており、肥満はＴ２Ｄ発症リス
クの８０〜８５％を占める。インクレチンに基づく治療剤は、Ｔ２Ｄの処置のための薬剤
の有望なクラスに相当する。グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびグルコース
依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）を含むインクレチンは、食物摂取に反応
して腸から分泌される内因性ペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１およびＧＩＰは、それ
ぞれＧタンパク質共役受容体であるＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体を通じてその作用を発
揮する。ＧＬＰ−１Ｒは、膵臓β細胞ならびに、肝臓、平滑筋、心臓、腎臓、消化管、肺
、下垂体、白色脂肪組織および中枢神経系を含む様々な組織において発現される。ＧＬＰ
−１は、膵臓β細胞からのグルコース刺激性インスリン分泌を増強することによって食後
のグルコース逸脱を低下させ、げっ歯類においてβ細胞生存を促進することが最近示され
た。さらに、ＧＬＰ−１は、末梢組織において、胃内容排出、体重減少、腸の成長を促進
し、インスリン感受性を上昇させることなどの膵外作用を発揮する。
【０００４】
当技術分野において、様々なＧＰＣＲの新規薬理学を示すアゴニストまたは活性化因子
を同定するための、より良好でよりロバストな手段が必要とされている。また、当技術分
野において、インスリン欠乏および高血糖に関連がある疾患を処置するための新しい化合
物および方法も必要とされている。本発明は、当技術分野で現在満たされていないこれら
および他の要求に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様において、本発明は、第１のランダム化ペプチドを含有し、この第１のランダ
ム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外
ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されている、単離または組み換えポリペプチ
ドを提供する。これらのポリペプチドにおいて、ランダム化ペプチドは、典型的には、Ｘ
ＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸ
ＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を有し、ここでＸは何らかのアミノ酸残基である。様
々な実施形態において、これらのポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬ
Ｐ−１Ｒ）を活性化し得る。いくつかの実施形態において、ランダム化ペプチドは、配列
番号４〜１６および２２〜３１から選択される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列ま
たはその活性変異体もしくは断片を含有する。いくつかの実施形態において、ランダム化
ペプチドは、１つ以上の残基での保存的置換を除き、配列番号４〜１６および２２〜３１
から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態において
、ランダム化ペプチドは、配列番号４（ＡＣＣＩＤＳＶＣＶＩ）、配列番号５（ＶＣＰＤ
ＣＱＶ）、配列番号６（ＡＣＳＹＭＩＤＣＶＬ）、配列番号８（ＥＬＶＤＮＡＶ）、配列
番号２２（ＣＣＩＤＳＶＣＶＩ）または配列番号２３（ＣＳＹＭＩＤＣＶＬ）で示される
アミノ酸配列を含有する。
【０００６】
本発明のいくつかのポリペプチドにおいて、グルカゴン様ペプチド１受容体に結合可能
な第２のペプチドは、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）またはヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）の少なくとも８個の連続アミノ酸残基と実質的に同一であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒに結合可能な第２のペプチドは、配列番号１７または配列番号１８と実質的に同一である配列を含有する。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒに結合可能である第２のペプチドは、１つ以上の残基での保存的置換を除いて、配列番号１７または配列番号１８で示される配列を含有する。いくつかの実施形態において、グルカゴン様ペプチド１受容体に結合可能である第２のペプチドは、ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号２１）で示される配列を含有する。本発明のポリペプチドのうち一部は、偏向型のＧタンパク質である。本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号３２〜３７からなる群から選択される配列と実質的に同一である配列を含有する。これらの実施形態の一部において、本ポリペプチドは、配列番号３２〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に融合されるＦｃドメインをさらに含有する。これらのポリペプチドのうち一部は、配列番号３６のＣ末端に融合されるＦｃドメイン、例えば配列番号４５で示されるポリペプチドを含有する。これらのポリペプチドのうち一部は、Ｎ末端にシグナルペプチドをさらに含み得る。
【０００７】
別の態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストを同
定するための方法を提供する。これらの方法は、（１）ＧＰＣＲを発現する宿主細胞の集
団に、調節下でレポーター遺伝子、ｃＡＭＰ応答エレメント（ｃＡＭＰ）を発現するベク
ターを導入すること、（２）候補ポリペプチドおよびＧＰＣＲを同時発現する宿主細胞の
集団を作製するために、宿主細胞において膜繋留型の候補ポリペプチドのコンビナトリア
ルライブラリを発現させること、（３）候補ポリペプチドを何ら発現しない対照細胞と比
較してレポーター遺伝子の発現レベルが上昇している宿主細胞を同定すること、および（
４）同定された宿主細胞において発現される候補ポリペプチドの正体を判定し；それによ
ってＧタンパク質共役受容体のアゴニストを同定することを伴う。いくつかの方法におい
て、各候補ポリペプチドは、そのＣ末端でリンカーおよび膜貫通タンパク質ドメインに融
合される。いくつかの方法において、使用される膜貫通タンパク質ドメインは、ＰＤＧＦ
Ｒ膜貫通ドメインである。いくつかの方法において、ＧＰＣＲは、宿主細胞中の発現ベク
ターから発現される。例えば、ベクターはレンチウイルスベクターであり得る。
【０００８】
本発明の方法のうち一部は、ＧＦＰタンパク質をコードするレポーター遺伝子を使用す
る。これらの方法において、レンチウイルスベクターを介してレポーター遺伝子を宿主細
胞に導入し得る。いくつかの実施形態において、使用される宿主細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細
胞である。いくつかの実施形態において、使用されるＧＰＣＲはヒトＧＬＰ−１Ｒである
。本発明のいくつかの方法において、各候補ポリペプチドは、第１のランダム化ペプチド
を含有し、この第１のランダム化ペプチドはそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容
体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されており、こ
のランダム化ペプチドは、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番
号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含有する（式中、Ｘは
何らかのアミノ酸残基である。）。これらの方法のうちいくつかにおいて、第２のペプチ
ドは、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一であるアミノ酸配列またはその活性変異体を含有する。いくつかの方法において、膜貫通タンパク質ドメインおよび第２のペプチドは、リンカーペプチドを介して連結される。例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４３）の２つ以上のタンデムリピートを含有するリンカーペプチドを本方法において使用し得る。
【０００９】
本発明の一部の方法において、各候補ポリペプチドは、Ｎ末端でシグナルペプチドをさ
らに含有する。例えば、本方法は、ＩＬ−２シグナル配列を含有するシグナルペプチドを
使用し得る。これらの方法のうちいくつかにおいて、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬ
ＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含有し得る。
【００１０】
別の態様において、本発明は、細胞においてグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−
１Ｒ）が介在するシグナル伝達経路を活性化するための方法を提供する。これらの方法は
、第１のランダム化ペプチドを含有し、この第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、
グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペ
プチドに融合されているポリペプチドの有効量と細胞を接触させることを含む。これらの
方法において、ランダム化ペプチドは、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣ
ＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含有し、
ここでＸは何らかのアミノ酸残基である。いくつかの方法において、第２のペプチドは、
Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含有する。いくつかの実施形態において、ランダム化ペプチドは、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含有する。いくつかの方法において、使用されるポリペプチドは、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１１】
いくつかの方法において、シグナル伝達経路を活性化した結果、インスリン生合成およ
び放出が起こる。いくつかの実施形態において、活性化される細胞は膵臓ベータ細胞であ
る。例えば、本方法は、対象中に存在する膵臓ベータ細胞においてインスリン生合成およ
び放出を活性化することを対象とする。これらの実施形態の一部において、対象は、高血
糖および低インスリンレベル、例えば、２型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患（
ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）およびアテローム性動脈硬化症を
特徴とする代謝障害に罹患しているかまたは発症するリスクがある。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、インスリンレベル、インスリン感受性の向上およ
び血糖低下のための、または対象における高血糖および低インスリンレベルを特徴とする
障害の処置のための方法を提供する。これらの方法は、第１のランダム化ペプチドを含有
し、この第１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（Ｇ
ＬＰ−１Ｒ）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されているポリペプチ
ドの有効量を対象に投与することを伴う。様々な実施形態において、使用されるポリペプ
チド中のランダム化ペプチドは、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（
配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含有し、ここで
Ｘは何らかのアミノ酸残基である。これらの方法のうちいくつかにおいて、第２のペプチ
ドは、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一であるアミノ酸配列またはその活性変異体を含有する。いくつかの方法において、ランダム化ペプチドは、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含有する。
いくつかの方法において、使用されるポリペプチドは、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含有する。これらの方法のうちいくつかは、糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病または薬物中毒に罹患しているかまたは発症のリスクがある対象においてインスリンレベルを上昇させ、血糖を低下させることを対象とする。
【００１３】
本発明はまた、糖尿病または高血糖および低インスリンレベルを特徴とする他の障害を
処置するための医薬組成物の調製における、第１のランダム化ペプチドを含有し、この第
１のランダム化ペプチドがそのＣ末端で、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ
）の細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドに融合されているポリペプチドの使用も
提供する。ランダム化ペプチドは、典型的に、ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸ
ＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含
有し、ここでＸは何らかのアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、第２のペ
プチドは、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一であるアミノ酸配列またはその活性変異体を含有する。いくつかの実施形態において、ランダム化ペプチドは、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態において、使用されるポリペプチドは、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１４】
関連する態様において、本発明は、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の
細胞外ドメインに結合可能な第２のペプチドにＣ末端で融合されるランダム化ペプチドを
含有するポリペプチドをコードする単離または組み換えポリヌクレオチドを提供する。コ
ードされるポリペプチドにおけるランダム化ペプチドは、典型的に、ＸＸＸＸＸＸＸ（配
列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３
）のアミノ酸配列を含有し、ここでＸは何らかのアミノ酸残基である。いくつかの実施形
態において、第２のペプチドは、Ｅｘ４（９−３９）（配列番号１７）、Ｅｘ４（９−３０）（配列番号３８）、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１８）と実質的に同一である配列またはその活性変異体を含有する。いくつかの実施形態において、ランダム化ペプチドは、配列番号２２、配列番号５または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含有する。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号３４または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは
、第２のペプチドのＣ末端で膜貫通タンパク質ドメインをさらに含有する。例えば、コー
ドされるポリペプチドはＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態に
おいて、コードされるポリペプチド中の膜貫通タンパク質および第２のペプチドは、リン
カーペプチドを介して連結される。例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４３）の２つ以上のタ
ンデムリピートを含有するリンカーペプチドを使用し得る。いくつかの実施形態において
、コードされるポリペプチドは、Ｎ末端でシグナルペプチドをさらに含有し得る。例えば
、ＩＬ−２シグナル配列を使用し得る。いくつかの具体的な実施形態において、使用され
るシグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）の
配列を含有する。
【００１６】
いくつかの関連する態様において、本発明はさらに、単離または組み換えポリヌクレオ
チドによってコードされる融合ポリペプチド、ならびに本発明の単離または組み換えポリ
ヌクレオチドを有する発現ベクターによってコードされる融合ポリペプチドを提供する。
【００１７】
明細書および特許請求の範囲の残りの部分を参照することによって、本発明の性質およ
び長所のさらなる理解が実現され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、大規模コンビナトリアルペプチドライブラリからのアゴニストの選択のための自己分泌に基づく系を示す。ａ．膜繋留エキセンディン−４の模式図；ｂ、異なるリンカーサイズを示す膜繋留エキセンディン−４を用いたＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰ細胞の形質導入の２日後のｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰ発現２のＦＡＣＳ分析；ｃ、コンビナトリアルペプチドライブラリの自己分泌に基づく選択の模式図。レンチウイルスペプチドライブラリは、レンチウイルスプラスミドから調製される（段階１）。ＣＲＥ応答性ＧＬＰ−１Ｒレポーター細胞株にレンチウイルスライブラリを形質導入する（段階２）。ＧＦＰ発現細胞を選別し（段階３）、選別した細胞のゲノムＤＮＡからペプチドコード遺伝子を増幅して、次の選択ラウンドのためのライブラリを作製する（段階４）。選択の反復ラウンド後、濃縮されたペプチド配列をディープシークエンシングによって分析する（段階５）。ｄ、３回のＦＡＣＳ選択ラウンド中のＧＦＰ陽性細胞の濃縮。
【図２】図２は、アゴニストペプチドＰ５のインビトロでの薬理学的特徴評価を示す。ａ−ｂ、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞（ａ）における、またはマウスＧＬＰ−１Ｒを発現するＨＥＫ２９３（ｂ）におけるｃＡＭＰ産生のＰ５およびＥｘ４誘導性の増加に対する濃度反応曲線。ｃ、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞におけるＰ５−およびＥｘｅ４−誘導性カルシウム動員に対する濃度反応曲線。ｄ−ｅ、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞におけるＰ５−およびＥｘｅ４−誘導性のβ−アレスチン−１（ｄ）およびβ−アレスチン−２（ｅ）動員に対する濃度反応曲線。ｆ、等活性（ｅｑｕｉａｃｔｉｖｅ）比較からの偏向因子（β）はＰ５の偏向性を示す。データは、３回実施された典型的な実験の平均±ＳＥＭである。
【図３】図３は、急性Ｐ５注射が糖尿病マウスにおいてグルコースを低下させたことを示す。ａ〜ｉ、腹腔内耐糖能（「インスリン処理」）試験；食塩水、Ｅｘ４またはＰ５の単回腹腔内注射、腹腔内グルコース負荷とともに同時注射した（ｎ＝５）。１０μｇ／ｋｇ（ａ）、１μｇ／ｋｇ（ｂ）または０．１μｇ／ｋｇペプチド（ｃ）で処置した痩せマウスにおける、１μｇ／ｋｇペプチド（ｄ）で処置したＧＬＰ−１−Ｒ  ＫＯにおける、１μｇ／ｋｇペプチド（ｅ）で処置したｏｂ／ｏｂマウスにおける、および１μｇ／ｋｇペプチド（ｆ）で処置したＤＩＯマウスにおける、耐糖能。ｇ〜ｉ、痩せマウスにおける（ｇ）、ｏｂ／ｏｂマウスにおける（ｈ）、およびＤＩＯマウスにおける（ｉ）、グルコース負荷との、食塩水、１μｇ／ｋｇのＥｘ４または１μｇ／ｋｇのＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの単回腹腔内同時注射後、血漿インスリンレベルを分析した（ｎ＝５）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較；＃Ｐ＜０．０５；＃＃Ｐ＜０．０１、Ｅｘ４をＰ５注射と比較。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図４】図４は、糖尿病マウスにおけるＧタンパク質偏向型ＧＬＰ−１ＲアゴニストペプチドＰ５の長期投与が血糖状態を改善することを示す。ａ〜ｇ、Ｅｘ４およびＰ５偏向型アゴニストの１日用量でのＤＩＯ雄マウスの４週間の処置。食塩水、１μｇ／ｋｇ（薄い色合い）または１０μｇ／ｋｇ（濃い色合い）でのＥｘ４およびＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの毎日の皮膚注射後の、体重（ａ）、腹腔内耐糖能（ｂ）、自由摂餌血漿グルコースレベル（ｃ）、インスリン血漿レベル（ｄ）、ＨｂＡ１Ｃ（ｅ）、膵島形態（ｆ）およびＧＩＰ血漿レベル（ｇ）における効果。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図５】図５は、ペプチドＰ５選択性のさらなるインビトロでの薬理学的特徴評価を示す。ａ〜ｂ、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞における（ａ）、またはマウスＧＬＰ−１Ｒを発現するＨＥＫ２９３における（ｂ）、Ｅｃ９０のＰ５の存在下でのＥｘ９誘導性のｃＡＭＰ生成低下に対する濃度反応曲線。ｃ、ヒトグルカゴン受容体を発現するＣＨＯ細胞におけるグルカゴン−Ｐ５−およびＥｘ４誘導性カルシウム動員に対する濃度反応曲線。データは、３回実施された典型的な実験の平均±ＳＥＭである。
【図６】図６は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける糖血症およびインスリンレベルに対する急性Ｐ５注射の効果を示すさらなる結果を示す。ａ〜ｉ、Ｐ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストでの雄マウスの急性処置。ａ〜ｃ、食塩水、Ｅｘ４およびＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの糖負荷との単回腹腔内同時注射（ｎ＝５）後の腹腔内耐糖能および血漿インスリンレベルにおける効果。１０μｇ／ｋｇ（ａ）、０．１μｇ／ｋｇ（ｂ）で処置したｏｂ／ｏｂマウスにおける耐糖能（ｎ＝５）。ｃ、糖負荷との、食塩水、１０μｇ／ｋｇのＥｘ４または１０μｇ／ｋｇのＰ５  Ｇタンパク質偏型向アゴニストの単回腹腔内同時注射後に、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿インスリンレベルを分析した（ｎ＝５）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較；＃Ｐ＜０．０５；＃＃Ｐ＜０．０１、Ｅｘ４をＰ５注射と比較。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図７】図７は、ペプチドＰ５の長期投与が、体重および脂肪量とは独立に糖尿病マウスにおいて血糖状態を改善することを示すさらなる結果を示す。ａ〜ｂ  Ｅｘ４およびＰ５偏向型アゴニストの１日用量でのＤＩＯ雄マウスの４週間の処置。食塩水、１０μｇ／ｋｇ（ｎ＝８）のＥｘ４およびＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの毎日の皮下注射後の脂肪（ａ）および体重（ｂ）のＭＲＩ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較。
【図８】図８は、ＤＩＯマウスでの代謝ホルモンにおけるペプチドＰ５の長期投与の効果を示すさらなる結果を示す。Ｅｘ４およびＰ５偏向型アゴニストの１日用量でのＤＩＯ雄マウスの４週間の処置。食塩水、１０μｇ／ｋｇのＥｘ４およびＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの毎日の皮下注射後のｃ−ペプチド血漿レベル（ａ）およびグルカゴン血漿レベル（ｂ）における効果（ｎ＝８）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較。
【図９】図９は、ＤＩＯマウスにおけるヘパトキシシティー（ｈｅｐａｔｏｘｉｃｉｔｙ）および脂肪症におけるＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの長期投与の効果を示すさらなる結果を示す。Ｅｘ４およびＰ５偏向型アゴニストの１日用量でのＤＩＯ雄マウスの４週間の処置。食塩水（対照）、Ｅｘ４およびＰ５  Ｇタンパク質偏向型アゴニストの毎日の皮下注射後の、血漿ＡＬＰ（ａ）、血漿ＡＬＴ（ｂ）、血漿ＡＳＴ（ｃ）および脂肪肝における効果（ｎ＝８）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定による統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較。
【図１０】図１０は、ＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰレポーター細胞株の構築を概略的に示す。
【図１１】図１１は、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達を活性化する際の他のアゴニストペプチドのＧタンパク質偏向性を示す。（Ａ）ＧＰＣＲによるシグナル伝達の古典的パラダイム。受容体に結合するアゴニストは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を刺激し、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（β−アレスチンを動員して受容体を脱感作するＧＲＫ）により急速にリン酸化され；ＣＲＥ応答性ＧＬＰ−１Ｒレポーター細胞株（Ｂ）およびＴａｎｇｏ  ＧＬＰ−１Ｒ−Ｂｌａ  Ｕ２ＯＳ細胞株（Ｃ）を使用して、ＧＰＣＲ活性化後のｃＡＭＰ増加およびβ−アレスチン動員を監視する。
【図１２】図１２は、長期作用型Ｇタンパク質偏向型アゴニスト融合ポリペプチドＰ５−Ｆｃのインビトロでの特徴評価を示す。（ａ）Ｐ５−Ｆｃの概略図（ｂ）ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ産生のＰ５およびＰ５−Ｆｃ誘導性増加に対する濃度反応曲線。（ｃ）ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞におけるＰ５およびＥｘ４誘導性β−アレスチン−２動員に対する濃度反応曲線。
【図１３】図１３は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト融合ポリペプチドＰ５−Ｆｃが薬力学向上を示すことを示す。（ａ）Ｐ５（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＰ５−ｆｃ（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回注射直後（第０日）または２および７日後の何れかで耐糖能試験を実施。（ｂ）飽食時血糖値におけるＰ５−ｆｃ（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回注射の効果。
【図１４】図１４は、Ｐ５−Ｆｃが糖尿病マウスにおいて体重および脂肪量を減少させることを示す。（ａ）ＤＩＯマウスでの体重におけるＰ５−Ｆｃの週１回投与の効果。（ｂ）脂肪量、体液量および除脂肪量に対する、ＤＩＯマウスにおける、Ｐ５−Ｆｃの週１回投与の効果（６回目の注射後）。ｎ＝５；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図１５】図１５は、Ｐ５−Ｆｃによって、糖尿病マウスで摂餌量が減少することを示す。（ａ）および毎日の摂餌量（ｂ）。Ｐ５−Ｆｃによって、注射後２〜３日間、摂餌量が有意に減少する。ｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１６】図１６は、空腹マウスの再摂食の減少におけるＰ５およびＰ５−Ｆｃの効果を示す。１６〜１８時間絶食させた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２〜１４週齢；２８〜３０ｇ）に、Ｐ５、Ｐ５−ＦｃおよびＥｘ４をｉｐ注射した。累積ＦＩは、注射から１、２、４、８、２４および３１時間後に測定した。ｎ＝３；＊、ｐ＜０．０５。
【図１７】図１７は、糖尿病マウスの処置におけるＰ５−Ｆｃの抗高血糖効果を示す。（ａ）グルコース負荷に反応する耐糖能におけるＰ５−Ｆｃの週１回投与の効果（５回目の注射から１週間後および６回目の注射前）。（ｂ）摂食血漿グルコースレベル（５回目の注射から１週間後および６回目の前）における、および（ｃ）ＨｂＡｌｃ（５回目の注射後）における、Ｐ５−Ｆｃの週１回投与の効果。ｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１８】図１８は、Ｐ５−Ｆｃが糖尿病マウスにおいてインスリン感受性を増強することを示す。（ａ）インスリン注射（０．７５Ｕ／ｋｇ）に反応したグルコースレベルにおける週１回のＰ５−Ｆｃ投与の効果（４回目の注射から１週間後および５回目の注射前）。（ｂ）データは、それぞれの個々のグループに対する基底血糖値の％として表す。ｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１９】図１９は、Ｐ５−Ｆｃが腸の成長を誘導することを示す。（ａ）小腸（ＳＢ）の長さおよび（ｂ）大腸（ＬＢ）の長さにおけるＰ５−Ｆｃの週１回投与の効果、ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図２０】図２０は、Ｇタンパク質偏向型アゴニストの長期投与によって、ＤＩＯマウスにおいて脂肪肝が改善することを示す。
【図２１】図２１は、Ｇタンパク質偏向型アゴニストの長期投与によって、ＤＩＯマウスにおいて脂肪生成およびインスリン感受性が調整されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．概要
本発明は、大規模な細胞内コンビナトリアルペプチドライブラリからアゴニストを選択
するための自己分泌に基づく系の、発明者らによる開発に部分的に基づく。本明細書中で
詳述するように、この系によって、約１０８個の異なるペプチドのうちの１個と受容体と
が細胞の原形質膜に共局在することが可能になる。共局在化ペプチドが隣接受容体を活性
化するとき、各細胞がそれ自身のレポーターになるように、蛍光シグナルが生じる。この
系は、シグナル伝達経路を活性化し、マウスにおいてインスリン分泌および血糖低下を誘
導したＧＬＰ−１  ＧＰＣＲ受容体に対する非常に強力なアゴニストの選択によって検証
された。均衡のとれたアゴニストである、Ｇα−タンパク質およびβ−アレスチンシグナ
ル伝達経路の両方を活性化する内在性ＧＬＰ−１または合成ペプチドエキセンディン４と
は異なり、選択された分子は、ＧαｓおよびＧαｑの両方を活性化するがβ−アレスチン
介在性のシグナル伝達経路を活性化しないという点で偏向していた。このような研究は、
ＧＰＣＲおよび他の受容体に対する新しいアゴニストを選択するための方法を開拓する。
これらの方法によって選択されるアゴニストは、シグナル伝達経路の逆畳み込み（ｄｅ−
ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）および新しい作用機序の発見に有用である。
【００２０】
本明細書中で例示されるように、発明者らは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１
）系を試験した。ＧＬＰ−１カルボキサミドは、ＧＰＣＲ  ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−
１−Ｒ）を活性化し、その結果グルコース依存的に血糖値を低下させる、重要なインクレ
チンホルモンである。内因性ＧＬＰ−１が受容体に結合する場合、とりわけＧタンパク質
、β−アレスチンおよび様々なキナーゼを含む下流のシグナル伝達経路の複雑なネットワ
ークが活性化される。具体的には、発明者らは、コンビナトリアルペプチドライブラリを
構築し、それらをレポーター細胞で発現させ、各細胞が原形質膜上で共局在するＧＬＰ−
１Ｒおよび異なるペプチドを発現するようにした。あるライブラリにおいて、７個のラン
ダム化アミノ酸の配列をアンカー配列としてエキセンチン（Ｅｘｅｎｔｉｎ）−４Ｃ末端
（アミノ酸９−３９）にカップリングした。Ｃ末端ＧＬＰ−１ドメインのアゴニスト活性
によって混乱しないように、アンカー配列として、アメリカドクトカゲ（ヘロデルマ・サ
スペクツム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ））由来のエキセンディン−４を
選択した。エキセンディン−４のアミノ末端が最初の８個のアミノ酸残基により短縮化さ
れる場合（Ｅｘ９〜３９）、これはＧＬＰ−１Ｒのアンタゴニストとして作用する。この
自己分泌選択系は蛍光シグナルに連結され、受容体の活性化が細胞選別機において監視お
よび選択され得るようになる。
【００２１】
発明者らによって同定されたＧＬＰ−１Ｒアゴニストのうち一部は、Ｇタンパク質偏向
型である（例えばペプチドＰ５）。活性化時のＧタンパク質へのＧＬＰ−１Ｒのカップリ
ングは、細胞内３’，５’サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の増加および細胞内Ｃａ２＋
濃度の上昇につながり得、膵臓β細胞でのグルコース依存性インスリン分泌を促進するこ
とにおいて重要な事象であることが知られている。ＧＬＰ−１Ｒが介在する生理学的影響
には、インスリン分泌を制御するβ−アレスチンの関与も含まれる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニ
ストでの現在の処置は抗糖尿病効果を示していたが、様々な有害副作用および懸念も示し
た。これらのＧＬＰ−１Ｒアゴニスト療法の最適化は、Ｇタンパク質およびβ−アレスチ
ンカップリングの両方を介してシグナル伝達するＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１模倣物の半
減期の延長に重点が置かれることが多い。
【００２２】
本発明のいくつかのペプチドのＧタンパク質偏向とは、（図１１ａで例示されるように
）β−アレスチン介在経路と比較して、Ｇタンパク質共役経路を介して優先的にシグナル
伝達するペプチドの能力を指す。本明細書中（図２）で例示されるように、このような偏
向は、あるシグナル伝達状態の、別のシグナル伝達状態と比較した相対的関与を定量する
偏向因子（β）で測定され得、本明細書中に記載の式を使用して計算される。本明細書中
に記載の細胞内コンビナトリアルライブラリを用いて、発明者らは、これらの経路のうち
一部のみを選択的に活性化する偏向アゴニストを同定することができた。例えば、選択さ
れたアゴニストの機能を明確にするため、アデニルシクラーゼまたはβ−アレスチン介在
経路の何れかの活性化を測定するために２つのレポーター系を構築した。選択されたペプ
チド配列は、天然のＧＬＰ−１リガンドとは異なり、Ｇタンパク質シグナル伝達を活性化
するが、β−アレスチンを通じてシグナル伝達しないＧＬＰ−１Ｒ受容体に対する偏向ア
ゴニストであることが分かった（例えば実施例３参照）。ＧＬＰ−１類似体エキセンディ
ン−４と比較して、本発明の偏向型ＧＬＰ−１Ｒアゴニストのうち一部（例えば、本明細
書中で例示されるペプチド５）は、血糖を低下させることにおいてより良好であるかまた
は同等の活性を示した。しかし、これらの偏向ペプチド（例えばＰ５）は、インスリン分
泌反応の増強の程度がＥｘ４よりも小さかった。例えば、高脂肪餌を与えたマウスにおい
て、血漿インスリンレベルの上昇は、Ｅｘ４の同用量と比較した場合、Ｐ５への反応にお
いては顕著に少なかった。さらに、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（例えばＰ５−Ｆｃ
）は、肥満動物モデルにおいて体重を顕著に減少させ、摂餌量を減少させ、腸の成長を促
進し得ることが分かった（例えば実施例６参照）。さらに、本発明のＧタンパク質偏向型
ＧＬＰ−１ＲアゴニストＰ５は、非アルコール性脂肪性肝炎（例えば実施例７参照）など
の多くの脂肪肝疾患を明確に示す肝脂肪の改善に有効であることが分かった。本発明のＧ
タンパク質偏向型ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、インスリン分泌の負担を最小化することに
よって膵臓β細胞機能を維持しながら、血糖調節を改善するなど、長期処置との関連で評
価されない長所をもたらす。
【００２３】
本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって、本発明の性質お
よび長所のさらなる理解が実現され得る。
【００２４】
ＩＩ．定義
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有す
る。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供す
るものである：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  
Ｐｒｅｓｓ  （１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏ
ｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉ
ｔｈら（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （ｒｅｖｉｓ
ｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ
Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（Ｅｄｓ．
），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａ
ｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  （１ｓｔ
ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌ
ｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉ
ｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。さらに、本発明の実施において読者を助けるために以下
の定義を提供する。
【００２５】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有す
る。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供す
る：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈら（ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｄｉｃｔｉｏｎ
ａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  （３Ｐｒｄ
Ｐ  ｅｄ．，２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏ
ｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉ
ｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ＰｔｈＰ  ｅ
ｄ．，２０００）。さらに、本発明の実施において読者を助けるために以下の定義を提供
する。
【００２６】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確な別段の指示がない
限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈から明確な別段の指
示がない限り、「および」を含むものとする。
【００２７】
本明細書で使用される場合、ペプチドの「アミノ酸」という用語は、天然および合成ア
ミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を
指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾され
るアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホ
セリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カ
ルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合される炭素を有する化合物、例えばホモセリン
、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。この
ような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有す
るが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペ
プチドまたはその融合物は、非天然コードアミノ酸で修飾されている誘導体または類似体
を包含する。
【００２８】
β−アレスチンは、ＧＰＣＲ介在性シグナル伝達の周知の制御因子である。ＧＰＣＲ活
性化時に、β−アレスチンは細胞膜に移動し、アゴニストが占有する受容体に結合する。
これにより、これらの受容体はＧタンパク質から切り離され、それらの内在化が促進され
、したがって、脱感作が起こる。β−アレスチンはまた、受容体輸送およびシグナル伝達
、例えば受容体エンドサイトーシスおよびシグナル伝達における足場およびアダプターと
なり、受容体へエンドサイトーシスタンパク質および様々なシグナル伝達分子を動員し、
したがってＧＰＣＲを様々な経路、例えばＭＡＰＫカスケードに連結することにおいても
重要な役割を果たす。β−アレスチンのこれらの後者の活性は、β−アレスチンシグナル
伝達またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【００２９】
「接触させる」という用語は、その通常の意味を有し、２つ以上の作用物質（例えばポ
リペプチドまたはポリヌクレオチド）を組み合わせること、作用物質および細胞を組み合
わせること、または異なる細胞の２つの集団を組み合わせることを指す。接触は、インビ
トロでの、例えば、試験管または増殖培地中での、２種類のポリペプチドの混合または抗
体集団と細胞集団との混合において起こり得る。接触は、細胞でまたはインシトゥで、例
えば、２つのポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドの細胞中での同時発現
により細胞中で、または細胞溶解物中で、２つのポリペプチドを接触させることにおいて
も起こり得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、必須である
か否かに関わらず、本発明に必須であり、また非特定要素の包含に開放される、組成物、
方法およびそれらの（１または複数の）個々の構成要素に関して使用される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「本質的に〜からなる」という用語は、所与の実施形態に
必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の（１または複数の）基本
的および新規または機能的特徴に実質的に影響を与えない要素の存在を許容する。
【００３２】
「からなる」という用語は、本明細書中で記載されるような、組成物、方法およびそれ
らのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその記載において列挙されない如何なる要素
も排除する。
【００３３】
「保存的に修飾される変異体」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用さ
れる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾される変異体は、同一または本質的に同一
のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、またはこの核酸がアミノ酸配列をコードしな
い場合、基本的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の
核酸が何らかの所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ
およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンに
よって特定されるあらゆる位置で、コードされたポリペプチドを変更することなく、コド
ンを記載される対応するコドンの何れかに変更し得る。このような核酸変異は、保存的に
修飾される変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明
細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者
は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常
はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）を修飾して、機能的に同
一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコー
ドする核酸の各サイレント変異は、記載される各配列で潜在している。
【００３４】
ポリペプチド配列に関して、「保存的に修飾される変異体」とは、保存的アミノ酸置換
、同様の電荷を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸残基を有する
変異体を指す。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分
野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リ
ジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸
、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン
、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミ
ノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ
ン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオ
ニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、
フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、参照分子（例えば、本明細書中で開示されるＧＬＰ−１
Ｒアゴニストペプチド）の「誘導体」は、生物学的活性を実質的に保持しながら、参照分
子と比較して化学的に修飾されている分子である。修飾は、例えば、オリゴマー化または
重合、アミノ酸残基またはペプチド骨格の修飾、架橋、環化、複合化、さらなる異種アミ
ノ酸配列への融合、または安定性、溶解度もしくはペプチドの他の特性を実質的に変化さ
せる他の修飾であり得る。
【００３６】
「改変細胞」または「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、
組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞
だけではなく、このような細胞の子孫をも指すものとすることを理解されたい。ある一定
の修飾は、突然変異または環境の影響の何れかゆえ、続く世代で起こり得るので、このよ
うな子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書中で使用される場合
、「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
【００３７】
エキセンディン−４は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体の３９アミノ酸
アゴニストである。エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ、ヘロデルマ・サスペク
ツム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に存在する。エキセンディン
−４の半減期は、ＧＬＰ−１よりも顕著に長い。
【００３８】
「断片」という用語は、アミノ酸残基配列が本明細書中に記載されている全長ポリペプ
チドよりも短いアミノ酸残基配列を有する何らかのペプチドまたはポリペプチドを指す。
エキセンディン−４の単離ペプチドは、その親となる全長エキセンディン−４ペプチドと
比較して短縮されているかまたは切り詰められている。全長エキセンディン−４配列と比
較して、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドとの融合のためのエキセンディン−４
断片は、典型的には、Ｎ末端の最初の４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０
またはそれを超える残基が欠失している。他のエキセンディン−４断片は、代替的に、ま
たはさらに、Ｃ末端短縮化（例えば最大５、１０、２０またはそれを超えるＣ末端残基の
短縮化）および／または内部欠失も含有し得る。
【００３９】
「融合」タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチドおよび、こ
の２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチドに操作可能に連結するための連結配
列または連結から構成されるポリペプチドを指す。融合ポリペプチド中で連結された２つ
のポリペプチドは、典型的には２つの独立した起源に由来し、したがって、融合ポリペプ
チドは、天然において通常は連結することが分かっていない２つの連結されるポリペプチ
ドを含む。
【００４０】
「連結」は、組み換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合およ
び静電結合を含むが限定されない２つの生体分子（例えば、ポリペプチドまたは２つのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド）を操作可能にまたは機能的に連結する手段を
指す。「融合される」とは、共有結合による連結を指す。「リンカー」または「スペーサ
ー」は、２つの生体分子を連結する分子または分子群を指し、この２つの分子を立体障害
が最小限である好ましい立体配置で配置するために作用する。
【００４１】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来
するインクレチンである。体内のＧＬＰ−１の主な供給源は、ＧＬＰ−１を消化管ホルモ
ンとして分泌する腸管Ｌ細胞である。ＧＬＰ−１の生物学的活性形態は：ＧＬＰ−１−（
７−３７）およびＧＬＰ−１−（７−３６）−ＮＨ２である。これらのペプチドは、プロ
グルカゴン分子の選択的切断の結果生じる。ＧＬＰ−１は、グルカゴン分泌を抑制しなが
ら、インスリン分泌のグルコース依存性刺激を促進する強力な抗高血糖ホルモンである。
このようなグルコース依存性作用は、血漿グルコース濃度が正常範囲内にあるとき、ＧＬ
Ｐ−１がもはやインスリン分泌を刺激しないため、特に魅力的である。したがって、ＧＬ
Ｐ−１Ｒアゴニストは、低血糖症を引き起こさない。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞アポトー
シスを阻害し、インスリン分泌β細胞の増殖および分化を刺激することが示されている。
さらに、ＧＬＰ−１は、胃内容排出および運動性を阻害する。これは、炭水化物吸収を遅
らせ、遅延させ、満腹効果に寄与する。
【００４２】
ＧＬＰ−１Ｒは、Ｇタンパク質共役受容体のグルカゴン受容体ファミリーのメンバーで
ある。ＧＬＰ−１Ｒは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に特異的に結合し、関
連ペプチド、例えば胃抑制ポリペプチドおよびグルカゴンなどに対する親和性は、はるか
に低い。ＧＬＰ−１Ｒは、膵臓β細胞ならびに中枢神経系、末梢神経系、脂肪組織、胃、
腸および心臓を含む膵外組織において発現されることが知られている。活性化ＧＬＰ−１
Ｒは、アデニリルシクラーゼ経路を刺激し、その結果、インスリン合成の増加およびイン
スリンの放出が起こる。結果として、ＧＬＰ−１Ｒは、糖尿病の処置に対する可能性のあ
る標的として示唆されている。
【００４３】
「単離」という用語は、分子がその天然の周囲環境から除去されることを意味する。し
かし、それと共に見出される成分のうち一部は、「単離」タンパク質とともに存在し続け
得る。したがって、「単離ポリペプチド」は、天然に生じるものではなく、実質的に１０
０％未満の純粋なタンパク質であり得る。
【００４４】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」またはパーセント「
同一性」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。比較枠、また
は以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または手作業のアライメントおよ
び目視によって測定する場合の指定領域にわたり、最大一致に対して比較およびアライメ
ントするとき、２個の配列が同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定のパーセ
ンテージを有する場合（すなわち、指定の領域にわたり、または指定されない場合は全配
列にわたり、６０％同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％
または９９％同一性であってもよい。）、この２つの配列は「実質的に同一」である。少
なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さである領域にわたり、または
より好ましくは１００〜５００または１０００もしくはそれ以上のヌクレオチド（または
２０、５０、２００もしくはそれ以上のアミノ酸）の長さである領域にわたり、同一性が
存在していてもよい。
【００４５】
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のた
めの配列の最適なアライメントは、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．
Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の
相同性アライメントアルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似度検索法
によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、
ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）；または手作業のアライメントおよび目視によって（例
えばＢｒｅｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．
，２００３）を参照）、遂行され得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定す
るために適切であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アル
ゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。
【００４６】
上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質
的に同一であるという別の指標は、下記のように、第１の核酸によってコードされるポリ
ペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学
的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば２
つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一
である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、下記のように、２つの
分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリッド形成するこ
とである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというまた別の指標は、配列を増幅する
ために同じプライマーを使用し得ることである。
【００４７】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、一般的な、「無症候性」であることが多い
肝疾患である。これはアルコール性肝疾患と似ているが、アルコールを殆どまたは全く飲
まない者において起こる。ＮＡＳＨの主な特徴は、炎症および損傷を伴う肝臓の脂肪であ
る。ＮＡＳＨの者の殆どは体調が良好であり、肝臓に問題があることに気付かない。それ
にもかかわらず、ＮＡＳＨは重症であり得、肝硬変につながり得、その場合、肝臓が永久
的に損傷を受け、瘢痕が生じ、正しく機能し得なくなる。
【００４８】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、過剰なアルコール使用以外の原因により
肝臓に脂肪が蓄積する（脂肪症）場合に起こる脂肪肝の原因の１つである。肝臓に脂肪が
あるのは正常ではないが、それ自身はおそらく、有害または永久的な損傷を殆ど引き起こ
さない。血液検査結果や肝臓のスキャンに基づいて脂肪が疑われる場合、この問題は非ア
ルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる。この場合に肝生検を行うと、一部の者
はＮＡＳＨを有し、一方で他の者は単純な脂肪肝を有することが示される。したがって、
ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤの極端な形態とも考えられている。
【００４９】
特に明記しない限り、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残
基のポリマーを指すために、本明細書で交換可能に使用される。これらは、短いオリゴペ
プチド（例えば約２５残基未満のペプチド）およびより長いポリペプチド分子（例えば約
２５または３０アミノ酸残基を超えるポリマー）の両方を包含する。典型的には、本発明
のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはその融合物は、約４アミノ酸残基〜約３５０ま
たはそれを超えるアミノ酸残基の長さを含み得る。いくつかの実施形態において、本ペプ
チドまたはポリペプチドは、約６アミノ酸残基〜約６０アミノ酸残基の長さを含む。いく
つかの他の実施形態において、アゴニストは、約８アミノ酸残基〜約４０アミノ酸残基の
長さを含み得る。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはその融合物には、天然
のアミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が
対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーが含まれる。別段の断り
がない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾される変異体も暗に包含
する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ペプチドの模倣物」または「ペプチド模倣物」という用
語は、ペプチドの機能を生物学的に模倣する参照ペプチド（例えば、本明細書中で開示さ
れるＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド）の誘導体化合物を指す。典型的には、ＧＬＰ−１
Ｒアゴニストペプチドまたはその融合物のペプチド模倣誘導体は、参照ポリペプチドのＧ
ＬＰ−１Ｒ活性化活性（例えば血糖低下）の少なくとも５０％、少なくとも７５％または
少なくとも９０％を有する。
【００５１】
「操作可能に連結される」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ
）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、これは、転写制御配列と転写された配
列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主
細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調整する場合、コード配列
に操作可能に連結される。一般に、転写された配列に操作可能に連結されるプロモーター
転写制御配列は、転写された配列に物理的に隣接しており、すなわちそれらはシス作用型
である。しかし、エンハンサーなどのいくつかの転写制御配列は、それらが転写を促進す
るコード配列に物理的に隣接している必要、または近接している必要がない。
【００５２】
別段の記載がない限り、「受容体」という用語は、所与のリガンドに対して親和性を有
する分子を広く指す。受容体は、天然または人工分子であり得る。また、それらは、その
未改変状態で、または他の種との凝集体として使用され得る。受容体は、直接、または特
異的結合物質を介するかの何れかで、共有結合または非共有結合で結合メンバーに結合さ
れ得る。本発明の実施において使用され得る受容体の典型例は、ＧＰＣＲなどの細胞表面
シグナル伝達受容体である。「標的受容体」という用語は、本発明の方法で分析または研
究しようとする、関心のある受容体分子を指す。
【００５３】
「シグナル伝達経路」または「シグナリング活性」（例えばＧＬＰ−１Ｒ介在性シグナ
ル伝達）という句は、少なくとも１つの生化学的反応を指すが、より一般的には、刺激化
合物または薬剤との細胞の相互作用の結果生じる一連の生化学的反応を指す。したがって
、刺激化合物（例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド）と細胞との相互作用は、
シグナル伝達経路を通じて伝達される「シグナル」を生成させ、最終的にはその結果、細
胞応答を生じさせる。
【００５４】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物としては、全ての脊
椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、
ニワトリ、両生類および爬虫類などが挙げられる。述べられる場合を除いて、「患者」ま
たは「対象」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５５】
このようなポリヌクレオチドが細胞内部に導入されている場合、細胞は外来または異種
ポリヌクレオチドによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに
組み込まれていてもよいし、または組み込まれていなくてもよい（共有結合）。例えば、
原核生物、酵母および哺乳動物細胞において、形質転換ポリヌクレオチドは、プラスミド
などのエピソームエレメント上で維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換され
た細胞は、形質転換ポリヌクレオチドが染色体に組み込まれ、染色体複製を通じてそれが
娘細胞によって継承されるようになる、細胞である。この安定性は、形質転換ポリヌクレ
オチドを含有する娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する、真核細
胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂による単一の細胞または共通の
祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、インビトロで多くの世代にわたる安定
な増殖が可能な初代細胞のクローンである。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、疾患もしく
は状態の症状、合併症もしくは生化学的徴候の発症を予防もしくは遅延させる、症状を緩
和する、または症状もしくは状態もしくは障害のさらなる進行を停止させるかもしくは抑
制するための化合物または薬剤の投与を指す。処置は、状態の出現後の、症状の、予防的
（状態の発症を予防または遅延させるため、またはその臨床的もしくは非臨床的症状の出
現を予防するため）または治療的抑制もしくは緩和であり得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「変異体」という用語は、参照分子の配列と実質的に同
一の配列を含有する分子（例えばペプチドまたはポリペプチド）をいう。例えば、参照分
子は、本明細書中で開示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド５または２、またはその
融合物であり得る。参照分子は、本明細書中で開示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチ
ド５もしくは２またはその融合物をコードするポリヌクレオチドでもあり得る。いくつか
の実施形態において、変異体は、参照分子と少なくとも５０％、少なくとも７０％、少な
くとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを超える配列同一性を共
有し得る。いくつかの他の実施形態において、変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換
を有することによって参照分子とは異なる。いくつかの他の実施形態において、参照分子
（例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはその融合物）の変異体は、（例えば、
１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する）改変アミノ酸配列を有するが、参照分子の生物
学的活性を実質的に保持する（例えば、インスリン合成および放出を促進する。）。保存
的アミノ酸置換は当業者にとって周知である。
【００５８】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送するこ
とが可能なポリヌクレオチド分子を指すものとする。ベクターのあるタイプは「プラスミ
ド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを
指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをウ
イルスゲノムに連結し得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば
、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）において
自律的複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は
、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に
複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現
を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書中で「組み換え発現ベク
ター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００５９】
ＩＩＩ．膜繋留型のポリペプチドライブラリおよび受容体アゴニストについての選択
本発明は、細胞において発現される際に膜結合型になり得るポリペプチドまたはペプチ
ドのコンビナトリアルライブラリ、および細胞表面受容体（例えばなどのＧＬＰ−１Ｒな
どのＧＰＣＲ）のアゴニストを選択するためにこのようなコンビナトリアルライブラリを
使用する方法を提供する。ライブラリはそれぞれ、少なくとも１ｘ１０４、１ｘ１０５、
１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０またはそれを超える、
異なるポリペプチドまたはペプチド配列を含有し得る。典型的には、ライブラリの各メン
バーは、膜貫通ドメインに操作可能に連結される特異的またはランダム化ペプチドを含有
する。膜貫通ドメイン、例えば本明細書中で例示されるようなＰＤＧＦＲ膜貫通領域は、
発現されたペプチドが細胞膜につながれることを可能にする。ＰＤＧＦＲ以外に、当技術
分野で周知の多くの他の膜貫通ドメインも本発明のペプチドライブラリの構築に使用し得
る。例えば、Ｒｅｍｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１６７９−１６８９，２０００
；およびＨｕｂｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．４：３１３−３２４，２０１０
を参照のこと。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド配列は、リン
カーペプチドまたはリンカー配列を介して膜貫通ドメインと連結される。例えば、ＧＧＧ
ＧＳ（配列番号４３）のタンデムリピートを含むリンカーペプチドは、本発明のポリペプ
チドライブラリの構築において使用し得る。様々な実施形態において、リンカーは、ＧＧ
ＧＧＳ配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるタンデムリピー
トを含有し得る。
【００６０】
本発明のコンビナトリアルライブラリのメンバーは、少なくとも４、５、６、８、１０
、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００またはそれを超えるアミノ酸残基
長を含有し得る。本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリの構築において、あ
らゆるポリペプチドまたはペプチドを使用し得る。いくつかの実施形態において、ライブ
ラリのメンバーは、天然のポリペプチドまたはそれらの断片である。これらは、天然起源
、例えば、細胞または組織溶解物から得ることができる。ポリペプチド剤のライブラリは
また、例えば、市販されているかまたは常法で作製されるｃＤＮＡライブラリから調製さ
れ得る。いくつかの実施形態において、ライブラリのメンバーは、既知の配列、例えば、
受容体の既知のアゴニストの類似体または変異体由来である。いくつかの他の実施形態に
おいて、ライブラリのメンバーは、短いペプチド、例えば、約５〜約３０個のアミノ酸の
ペプチドである。ペプチドは、天然のタンパク質、ランダムペプチドまたは「偏向型」ラ
ンダムペプチドの消化物であり得る。いくつかの実施形態において、ランダム化アミノ酸
配列は、例えばＧＬＰ−１Ｒのアゴニストを選択することに対して本明細書中で例示され
るように、既知のアンカー配列に融合させ得る。いくつかの実施形態において、ペプチド
またはポリペプチドのコンビナトリアルライブラリのメンバーは、何れの位置でも配列の
優先度または定数なく、完全にランダム化される。いくつかの他の実施形態において、ラ
イブラリを偏向させ得、すなわち、配列内のいくつかの位置を一定に保つか、または限ら
れた数の可能性から選択する。例えば、いくつかの場合において、アミノ酸残基は、架橋
の場合はシステイン、ＳＨ−３ドメインの場合はプロリン、リン酸化部位の場合はセリン
、スレオニン、チロシンもしくはヒスチジンの生成に対して、またはプリンに対して、例
えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、風刺的に（ｓａｔｉｒｉｃａｌｌｙ）偏向した（小
さいまたは大きい）残基の定められたクラス内でランダム化される。
【００６１】
本発明のコンビナトリアルポリペプチドまたはペプチドライブラリは、段階的に合成さ
れ得る。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリは、国際公開第９５／１２６０８号
パンフレット、国際公開第９３／０６１２１号パンフレット、国際公開第９４／０８０５
１号パンフレット、国際公開第９５／３５５０３号パンフレットおよび国際公開第９５／
３０６４２号パンフレットに記載のコード化合成ライブラリ（ＥＳＬ）によって構築され
得る。ペプチドライブラリは、ファージディスプレイ法（例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、国際公
開第９１／１８９８０号パンフレットを参照）によっても作製され得る。それにもかかわ
らず、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドについて本明細書中で例示されるように、ポ
リペプチドのライブラリの発現のために、通常、本発明では従来の遺伝子操作技術を使用
する。本発明の組み換えポリペプチドライブラリを作製するために、ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを適切な発現系に挿入する。したがって、本発明は、本明細書中
に記載のペプチドまたはポリペプチドのコンビナトリアルライブラリのメンバーをコード
するポリヌクレオチド配列も提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド
は、シグナルペプチド、候補ポリペプチド配列、リンカーペプチドおよび膜貫通ドメイン
をコードする配列を含む。候補ポリペプチド配列は、本明細書中に記載の何らかのコンビ
ナトリアルペプチドまたはポリペプチドライブラリのメンバーであり得る。代表的な実施
形態において、発現ベクター中の適切なプロモーター、例えば本明細書中で例示されるよ
うなレンチウイルスベクター中のＥＦ１ａプロモーターの調節下にポリヌクレオチドを置
き得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｎ末端でシグナルペプチド
をコードする。例えば、ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする配列を本発明のポリヌク
レオチドおよび発現ベクターにおいて使用し得る。いくつかの実施形態において、シグナ
ルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）の配列を含
む。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターの構築は、分子生物学の日常的に実施さ
れる方法に従って容易に行われ得る。本発明の必要とされる段階を行うためのいくつかの
具体的なプロトコールも本明細書中で例示する。ポリペプチドの発現は、例えば、細菌、
ウイルス、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物の発現系を含有するベクターを含む、当技術
分野で公知の多数のタイプの適切な発現ベクターを使用し得る。本明細書中で例示される
ように、本発明のペプチドライブラリを作製するための好ましい発現系は、レンチウイル
スに基づくものである。このような発現ベクターを入手し、使用するための方法は周知で
ある。本発明の組成物または方法に対して使用されるこのおよび他の分子生物学技術の助
言については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，最新版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，最新版），Ｗｕ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，最新版），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ
，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，最新版）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（ＡｕｓａｂｅｌらＥｄｓ．，）Ｊｏｈｎ  Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（最新版）およびそこで引用される参考文献を参照のこと。
【００６３】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを選択するために、コンビナトリアルライブラリのメンバーは
、少なくとも４、５、６、７、８、１０、１５、２０またはそれを超えるアミノ酸残基長
を含有し得る。いくつかの実施形態において、ランダム化ペプチドは、ＸＸＸＸＸＸＸ（
配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号
３）の配列を含む。発現時の分泌シグナルペプチド配列の切断を促進するために、ランダ
ム化配列はＮ末端にＡｌａ残基を含有し、例えばＡＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号４１）
またはＡＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号４２）となり得る。これらの配列において、Ｘは
何らかのアミノ酸残基、例えば２０種類の天然アミノ酸残基のうち何れか１つであり得る
。
【００６４】
本発明は、大規模な細胞内コンビナトリアルポリペプチドライブラリからの細胞表面受
容体（例えばＧＰＣＲ）の修飾因子（例えばアゴニスト）の選択のための自己分泌に基づ
く方法を提供する。この方法での、標的受容体を同時発現する宿主細胞または産生細胞の
集団内で発現される候補ポリペプチドまたはペプチドのライブラリ。ライブラリおよび標
的受容体由来の異なる各候補ポリペプチドは、宿主細胞の集団の原形質膜に共局在する。
受容体が介在するシグナル伝達経路または細胞の特定の表現型の変化を引き起こす能力に
ついて細胞を調べる。受容体活性化の監視を促進するために、宿主細胞は、細胞表面受容
体が活性化されるときに検出され得る検出可能なレポーター分子（例えばレポーター遺伝
子）も有する。共局在ポリペプチドが隣接受容体を活性化する場合、レポーター分子から
の検出可能なシグナル（例えば蛍光シグナル）が生成される。したがって、各細胞はそれ
自身に対してレポーターになる。
【００６５】
典型的には、変更しようとする具体的な表現型は、細胞集団中の同時発現されるＧＰＣ
Ｒが介在する、活性、シグナル伝達経路または細胞プロセスである。関心のある表現型に
おける変化を引き起こし得るポリペプチドは、ＧＰＣＲの修飾因子（例えばアゴニスト）
として同定される。具体的な標的受容体に依存して、この方法において監視しようとする
表現型またはシグナル伝達経路は、受容体が介在する何らかの細胞活性または生理学的機
能であり得る。しかし、いくつかの好ましい実施形態において、選択方法において監視し
ようとする表現型またはシグナル伝達経路は、宿主細胞に導入されたレポーター分子の反
応（例えばレポーター遺伝子の発現）である。例えば、ＧＰＣＲアゴニストを選択するた
めに、外来レポーター分子は、ＧＰＣＲ、例えばｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）また
は複数応答エレメント（例えばＭＲＥ）の活性化に応答性である転写制御エレメントの調
節下のＧＦＰ遺伝子であり得る。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを選択するために本明細書中で
例示されるように、宿主細胞の表面上の受容体が近くの共局在化アゴニストポリペプチド
によって結合される場合、ｃＡＭＰシグナル伝達経路が活性化される。結果として、ＣＲ
Ｅの調節下でのＧＦＰレポーター遺伝子発現は上方制御され、これは、対応する蛍光シグ
ナルの監視を介して容易に検出され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、候補ポリペプチドのライブラリは、ウイルスベクター、
例えばレンチウイルスベクターから発現される。これらの方法において、ポリペプチドを
コードするウイルスのライブラリを提供するために、ポリペプチドのコンビナトリアルラ
イブラリをコードするベクター（例えばレンチウイルスベクター）のライブラリを最初に
ウイルス産生細胞株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）に導入し得る。ウイルス産生細胞株は、受
容体アゴニストの選択のために宿主細胞と同じであり得る（例えば、本明細書中で例示さ
れるようなＨＥＫ２９３Ｔ細胞）か、または異なり得る。標的受容体（例えばＧＬＰ−１
Ｒ）および検出可能なレポーター（例えば標的受容体の活性化に応答性がある制御配列の
調節下のＧＦＰ遺伝子）を発現するベクターを宿主細胞に導入し得る。標的受容体を発現
する宿主細胞にウイルスを遺伝子移入すると、ペプチドのライブラリが発現され、受容体
とともに膜に共局在するようになる。これにより、膜結合ＧＰＣＲの修飾因子（例えばア
ゴニスト）のポリペプチドライブラリからの自己分泌選択が可能になる。標的受容体を活
性化する候補ポリペプチドが同定されたら、候補ポリペプチドの濃縮ライブラリを提供す
るために、候補ポリペプチドをコードする対応するポリヌクレオチド配列を単離し、増幅
し、発現ベクターに再クローニングし得る。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの選択に対して本明
細書中で例示されるように、このような濃縮候補ライブラリをアゴニスト選択の次のラウ
ンドにおいて使用し得る。
【００６７】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを選択するためのいくつかの実施形態において、候補ポリペプ
チドライブラリは、ＧＬＰ−１受容体外部ドメインに結合可能な第２のペプチドまたはポ
リペプチドに融合されている第１のランダム化ペプチド配列を含有する融合ポリペプチド
を含み得る。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１受容体外部ドメインに結合可能な
ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書中で論じるＥｘ４配列またはＧＬＰ−１配列由
来である。例えば、本ペプチドは、Ｎ末端短縮型エキセンディン−４配列であり得る。エ
キセンディン−４配列は、そのＮ末端で短縮化される少なくとも４、６、８、１０、１５
、２０個またはそれを超える残基の欠失を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ末
端短縮型エキセンディン−４は、ランダム化ペプチドにより置換されたその８個のＮ末端
残基を有する。エキセンディン−４配列は、あるいは、またはさらに、Ｃ末端での少なく
とも１個以上の残基の欠失（例えば９個の残基の欠失）を有し得る。いくつかの実施形態
において、Ｎ末端短縮型エキセンディン−４は、Ｅｘ４の残基９〜３０（Ｅｘ４（９−３
０））に対応する配列からなる。他のＮ末端および／またはＣ末端短縮型エキセンディン
−４配列も、融合ペプチドの構築において使用され得る。エキセンディン−４配列に加え
て、ランダム化配列は、本発明のペプチドライブラリを構築する際に、他のペプチドまた
はポリペプチド（例えばＧＬＰ−１配列）に付加することもできる。
【００６８】
本ポリペプチドライブラリおよび標的受容体を発現させるために適切な宿主細胞または
細胞株としては、本明細書中で例示されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞および当技術分野で周知の
多くの他の細胞株、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＡｔＴ２０、ＢＶ２およびＮ１８細胞
株が挙げられる。いくつかの実施形態において、選定のための選ばれた宿主細胞は、標的
ＧＰＣＲ受容体を内因性に発現しない。例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを選択するため
に本明細書中で例示されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、内因性ＧＬＰ−１Ｒ発現を有するこ
とが知られていない。ＧＰＣＲシグナル伝達活性を調べるための適切な宿主細胞を選ぶこ
とにおけるさらなる指針は、当技術分野において、例えば、ＳａｉｔｏおよびＣｉｖｅｌ
ｌｉ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００５；６５：１７９−２０９；および
Ｃｈｕｎｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８；１５３（Ｓｕｐｐｌ  １）：
Ｓ３３９−Ｓ３４６で提供される。標的受容体を発現するレポーター細胞株の構築、細胞
株におけるペプチドライブラリの発現および標的受容体の修飾因子（例えばアゴニスト）
のライブラリからの選択は、当技術分野で周知の標準的な手順または本明細書に記載の具
体的な例示により行い得る。
【００６９】
ＩＶ．グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）のポリペプチドアゴニスト
本発明は、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の新規のポリペプチドまた
はペプチドアゴニストを提供する。これらのポリペプチドは、本明細書中に記載のランダ
ム化ポリペプチド配列から同定されるかまたはそれ由来であり、ＧＬＰ−１Ｒが介在する
１つ以上のシグナル伝達経路、例えばインスリン生合成および放出を特異的に活性化可能
である。典型的には、本発明のランダム化ポリペプチドは、ＧＬＰ−１Ｒの外部ドメイン
に結合可能な第２のペプチドにＣ末端で融合されるランダム化ペプチドを含有する。ラン
ダム化ペプチドは、通常、配列式ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１）、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（
配列番号２）またはＣＸＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）に該当するアミノ酸配列を有する
。本明細書中の実施例で詳述するように、ＣＸＸＸＸＸＣＸＸ（配列番号２）またはＣＸ
ＸＸＸＣＸＸＸ（配列番号３）のランダム化配列を含むランダム化ポリペプチドは、２つ
のシステイン残基の存在ゆえに環状になり得る。このようなランダム化ポリペプチドのコ
ンビナトリアルライブラリから同定されるので、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、全
て、ＧＬＰ−１Ｒ介在性のシグナル伝達活性を活性化可能である。
【００７０】
本明細書中で例示されるランダム化ペプチドの具体例としては、例えば、ＡＣＣＩＤＳ
ＶＣＶＩ（配列番号４）、ＣＣＩＤＳＶＣＶＩ（配列番号２２）、ＶＣＰＤＣＱＶ（配列
番号５）、ＡＣＳＹＭＩＤＣＶＬ（配列番号６）、ＣＳＹＭＩＤＣＶＬ（配列番号２３）
、ＡＣＹＶＫＦＰＣＤＩ（配列番号７）、ＣＹＶＫＦＰＣＤＩ（配列番号２４）、ＥＬＶ
ＤＮＡＶ（配列番号８）、ＡＣＡＬＥＶＤＣＡＩ（配列番号９）、ＣＡＬＥＶＤＣＡＩ（
配列番号２５）、ＡＣＳＨＳＧＦＣＶＬ（配列番号１０）、ＣＳＨＳＧＦＣＶＬ（配列番
号２６）、ＡＣＨＤＲＶＤＣＬＶ（配列番号１１）、ＣＨＤＲＶＤＣＬＶ（配列番号２７
）、ＡＣＳＣＹＧＹＣＡＴ（配列番号１２）、ＣＳＣＹＧＹＣＡＴ（配列番号２８）、Ａ
ＣＧＷＣＧＥＣＴＶ（配列番号１３）、ＣＧＷＣＧＥＣＴＶ（配列番号２９）、ＶＭＩＤ
ＱＲＬ（配列番号１４）、ＡＣＲＶＤＱＲＣＦＷ（配列番号１５）、ＣＲＶＤＱＲＣＦＷ
（配列番号３０）、ＡＣＣＶＣＦＴＣＶＦ（配列番号１６）およびＣＣＶＣＦＴＣＶＦ（
配列番号３１）が挙げられる。これらの具体的なペプチド配列に加えて、保存的に修飾さ
れる変異体または実質的に同一の配列も、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド
において使用され得る。
【００７１】
第２のペプチドは、ＧＬＰ−１受容体の外部ドメインに結合可能な何らかのペプチドま
たはポリペプチドであり得る。ＧＬＰ−１Ｒドメイン構造およびそのＧＬＰ−１またはＥ
ｘ４への結合は、当技術分野において十分に特徴が分かっている。例えば、Ｕｎｄｅｒｗ
ｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，２８５：７２３−７３０；Ｄｏｎｎｅｌ
ｌｙ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２，１６６：２７−４１；およびＰａｔｔ
ｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１３，２，８６−９１を参照のこと。ＧＬＰ−
１Ｒの外部ドメインに結合するペプチドまたはタンパク質（抗体を含む。）は、当技術分
野で周知の標準的なプロトコールを介して容易に改変および選択し得る。例えば、これら
は、ペプチドまたは抗体の、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイコンビナトリ
アルライブラリの選択によって同定され得る。さらに、受容体の細胞外ドメインに結合し
得る多くのペプチドまたはポリペプチド、例えばＧＬＰ−１、エキセンディン−４、グル
カゴンまたはオキシトモジュリン由来のペプチドも知られている。例えば、Ｇａｒｂｅｒ
，Ａ．Ｊ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ２０１２，２１，
４５−５７；Ｍａｄｓｂａｄら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．２０１１，
１３，３９４−４０７；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１３，２，８
６−９１；Ｇｈａｔｅｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５７：
４８８−４９５，１９８３；およびＤｒｕｃｋｅｒら、Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１：２２−３１，２００５を参照のこと。
【００７２】
これらのＧＬＰ−１Ｒ結合ペプチドまたはポリペプチドの何れかを本発明において使用
し得る。いくつかの実施形態において、第２のペプチドはＥｘ４配列に由来する。エキセ
ンディン−４は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体の３９アミノ酸のペプチ
ドアゴニスト、ＨＧＥＧＴ  ＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥ  ＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷ  ＬＫＮ
ＧＧ  ＰＳＳＧＡ  ＰＰＰＳ（配列番号４０）（Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６７：７４０２−５，１９９２）である。いくつかの実施形態において、第２のペプチド
は、ヒトオキシントモジュリン配列に由来し得る。オキシントモジュリンは、結腸で見出
される天然の３７アミノ酸のペプチドホルモンである。オキシントモジュリンは、ＧＬＰ
−１受容体およびグルカゴン受容体の両方に結合することが知られている。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、Ｎ末端で４、５、６、７、８、９またはそれ
を超える残基が欠失しているＮ末端短縮型Ｅｘ４配列を利用する。このようなＥｘ４ペプ
チドの具体例は、ＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡ
Ｐ  ＰＰＳ（配列番号１７）の配列を有するＥｘ４（９−３９）である。Ｅｘ４由来のペ
プチドは、例えば９個以下のＣ末端残基（Ｃ末端Ｔｒｐケージ）の短縮を伴う、そのＣ末
端での欠失をさらに含有し得る。Ｎ末端およびＣ末端の両方に短縮があるこのようなＥｘ
４由来ペプチドの例は、ＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧ）（配
列番号３８）の配列を有するＥｘ４（９−３０）ペプチドである。いくつかの他の実施形
態において、第２のペプチドは、ＧＬＰ−１配列由来、例えば、Ｎ末端短縮型ヒトＧＬＰ
−１配列ＤＶＳＳＹ  ＬＥＧＱＡ  ＡＫＥＦＩ  ＡＷＬＶＫ  ＧＲ（配列番号１８）また
はＤＶＳＳＹ  ＬＥＧＱＡ  ＡＫＥＦＩ  ＡＷＬＶＫ  ＧＲＧ（配列番号３９）である。
【００７４】
様々な実施形態において、融合ポリペプチドの柔軟性を促進するために、リンカー配列
を介して、Ｎ末端ランダム化または多様化された第１のペプチドをＣ末端ＧＰＬ−１Ｒに
結合している第２のペプチドに融合させ得る。例えば、配列番号３２〜３７で例示される
ように、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの２つの部分が、２つのＧｌｙ残基を
介して連結され得る。
【００７５】
以下の実施例で詳述するように、本明細書中で例示される具体的なＧＬＰ−１Ｒアゴニ
ストポリペプチド（例えば、配列番号４〜１６および２２〜３１）のＮ末端配列（「第１
のペプチド」）は、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達経路を活性化するための活性に基づき、ラ
ンダム配列から選択した。本発明のＧＬＰ−１ＲアゴニストのＮ末端配列（「第１のペプ
チド」）は、これらの具体的に例示される配列の何れかと同一または実質的に同一の配列
を含むかまたはそれからなり得る。これはまた、１つ以上のアミノ酸残基での保存的置換
を除いて、これらの例示された配列の何れかと同一である配列も含むかまたはそれからな
り得る。いくつかの他の実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ＲアゴニストのＮ末端配
列（「第１のペプチド」）は、配列番号４〜１６および２２〜３１の何れか１つで示され
る少なくとも４、５、６、７、８またはそれを超える連続アミノ酸残基を含有し得るかま
たはそれからなり得る。同様に、本発明のＧＬＰ−１ＲアゴニストのＣ末端およびＧＬＰ
−１Ｒ結合部分（「第２のペプチド」）は、本明細書中で例示されるＥｘ４−またはＧＬ
Ｐ−１由来ペプチド配列（例えば配列番号１７、１８、３８および３９）または当技術分
野で公知の他のＧＬＰ−１Ｒ結合ペプチドもしくはポリペプチドの何れかと同一または実
質的に同一である配列を含み得るかまたはそれからなり得る。これはまた、例示されるか
または既知のＧＬＰ−１Ｒ結合ペプチドの活性型変異体または機能的誘導体を含有し得る
かまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニ
ストのＣ末端部分（「第２のペプチド」）は、１つ以上の残基での保存的置換を除き、例
示されるかまたは既知のＧＬＰ−１Ｒ結合ペプチドの１つと同一である配列を含み得るか
またはそれからなり得る。
【００７６】
Ｎ末端多様化またはランダム化配列およびＣ末端アンカーまたは結合配列を含有する融
合ポリペプチドから同定されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、全てＧＬＰ−１Ｒを活性化可
能である。典型的には、本発明の融合ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、少なくとも１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００またはそれを超
えるアミノ酸残基長を含有する。一部のペプチドまたはポリペプチドは、約３０個のアミ
ノ酸残基〜約１００個のアミノ酸残基を含有する。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリ
ペプチドのいくつかの具体例としては、ＶＣＰＤＣＱＶ−ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡ
ＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号３２）の配列を有する
ペプチド２；ＧＬＰ−１  Ｃ末端配列ＶＣＰＤＣＱＶ−ＧＧＤＶＳ  ＳＹＬＥＧ  ＱＡＡ
Ｋ  ＥＦＩＡＷ  ＬＶＫＧＲ  Ｇ（配列番号３３）によって置換されたＥｘ４（９−３９
）配列を有するＧＬＰ−１テイルペプチド２；ＡＣＣＩＤ  ＳＶＣＶＩ  ＧＧＤＬＳ  Ｋ
ＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号３４）
の配列を有するペプチド１；ＡＣＳＹＭＩＤＣＶＬ−ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲ
Ｌ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号３５）の配列を有するペプ
チド３；ＥＬＶＤＮＡＶ−ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧ
Ｐ  ＳＳＧＡＰ  ＰＰＳ（配列番号３６）の配列を有するペプチド５；およびＡＣＧＷＣ
ＧＥＣＴＶ−ＧＧＤＬＳ  ＫＱＭＥＥ  ＥＡＶＲＬ  ＦＩＥＷＬ  ＫＮＧＧＰ  ＳＳＧＡ
Ｐ  ＰＰＳ（配列番号３７）の配列を有するペプチド１０が挙げられる。これらの具体的
なＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド以外に、保存的に修飾される変異体、実質的に同
一の配列を有する分子およびこれらのポリペプチドの機能的誘導体または類似体も本発明
に包含される。
【００７７】
本発明のアゴニストポリペプチドのいくつかは、偏向型ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである
。ＧＬＰ−１Ｒを通じて多数の下流シグナル伝達経路に介在し得る内因性または天然のリ
ガンドＧＬＰ−１またはエキセンディン−４とは異なり、偏向型アゴニストはこれらの経
路のうち一部のみを選択的に活性化する。例えば、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリ
ペプチドのうち一部は、Ｇタンパク質活性化を惹起し得るが、ＧＬＰ−１Ｒ活性化時にβ
−アレスチンなどの他の細胞経路を通じてシグナル伝達しない。また、本明細書で示され
るように（例えばペプチド５を用いて）、本発明の偏向型ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペ
プチドは、アゴニストであるエキセンディン−４と比較した場合、弱いインスリン分泌促
進活性を示す一方で、Ｔ２Ｄのマウスモデルにおいて同等以上のグルコース低下効果を示
し得る。
【００７８】
本発明のＧＬＰ−１ＲアゴニストポリペプチドまたはそれらのＮ末端配列はまた、例示
されるペプチドのうち１つから生成され得、ＧＬＰ−１Ｒ介在型シグナル伝達経路を活性
化することにおいて活性を保持し得る、他の類似体、ペプチド模倣物、誘導体または変異
体も含む。別段の明記がない限り、例示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまた
はそのＮ末端配列に由来し、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達を活性化することにおける活性が
同様であるかまたは向上しているこれらのペプチドは、まとめて、例示されるＧＬＰ−１
Ｒアゴニストポリペプチドの「活性変異体」と呼ばれる。このような「活性変異体」を同
定するために、例示されるペプチドのうち１つから生成される誘導体化合物を本明細書中
に記載のアッセイに供し得る。いくつかの実施形態において、誘導体化合物は、保存的ア
ミノ酸置換によって生成される例示ペプチドの修飾型である。いくつかの他の実施形態に
おいて、誘導体化合物は、それらが本ペプチドの活性を実質的に保持する程度までの非保
存的置換によって生成される変異体である。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチ
ドまたはそのＮ末端配列への修飾は、当技術分野で通常実施される標準的な技術（例えば
米国特許出願公開第２００８００９０７６０号明細書および同第２００６０２８６６３６
号明細書）を用いて行い得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、例示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまたは
そのＮ末端配列（例えば、配列番号３２および３６、または配列番号５および８）の類似
体または誘導体化合物は、２０種類の標準的アミノ酸のうち１つ以上の天然のアミノ酸誘
導体、例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、
ホモセリン、オルニチンまたはカルボキシグルタメート、を含有し得、ポリペプチド結合
によって連結されていないアミノ酸を含み得る。同様に、これらは環状ポリペプチドおよ
び他の立体構造的に制約された構造でもあり得る。類似体および誘導体を生成させるため
にポリペプチドを修飾するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ
ｓおよびＶｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．
５，ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．
Ｙ．（１９８３）；およびＢｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｄ．Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．Ｗｏｌｆｆ，Ｃ
ｈ．１５，ｐｐ．６１９−６２０，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）である。
【００８０】
例示されるＧＬＰ−１ＲアゴニストポリペプチドまたはそれらのＮ末端配列のいくつか
の他の誘導体化合物はペプチド模倣物である。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまた
はポリペプチド（例えば配列番号３２および３６または配列番号５および８）に基づくペ
プチド模倣物は、参照ポリペプチドの活性を実質的に保持する。それらは、化学修飾され
たポリペプチド、非天然アミノ酸を含有するポリペプチド様分子、ペプトイドなどを含み
、ペプチド模倣物の由来である参照ポリペプチドと実質的に同じ構造を有する（例えば、
Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ，１９９５、前出を参照）。例えば、ペプチド模倣物は、機能的な側基の
反応によって化学的に誘導体化される１つ以上の残基を有し得る。側基の誘導体化に加え
て、化学誘導体は、Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−プロピルなどのアルファ−アミノ置換
、およびチオエステル、チオアミド、グアニジノなどのアルファ−カルボニル置換を含む
１つ以上の骨格修飾を有し得る。典型的には、ペプチド模倣物は、参照ポリペプチドと比
較した場合、かなりの程度の構造的同一性を示し、参照ポリペプチドに由来するかまたは
それに関連するものとして認識可能であるかまたは知られている特徴を示す。ペプチド模
倣物は、例えば、参照ポリペプチドの電荷および電荷スペーシング（ｃｈａｒｇｅ  ｓｐ
ａｃｉｎｇ）特性などの同様の特性を示す有機構造を含む。ペプチド模倣物はまた、アミ
ノ酸官能基の最適なスペーシングおよび電荷相互作用を維持するように制約された構造を
含み得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、例示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド（例え
ばペプチド２またはペプチド５）またはそれらのＮ末端配列の誘導体化合物は、末端ＮＨ
２アシル化、例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化による、例えばアンモ
ニア、メチルアミンなどの末端修飾を用いた末端−カルボキシルアミド化による修飾など
、配列内で修飾を含有し得る。本明細書中に記載のポリペプチドのアミノおよび／または
カルボキシ末端も修飾し得る。末端修飾は、プロテイナーゼ消化および腎クリアランスに
よる感受性を低下させるために有用であり、したがって、溶液中、特にプロテアーゼが存
在し得る体液中でのポリペプチドの半減期を延長するのに役立ち得る。アミノ末端修飾に
は、メチル化（例えば、−ＮＨＣＨ３または−ＮＨ（ＣＨ３）２）、アセチル化（例えば
、酢酸またはα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸もしくはα−ヨード酢酸などのそのハロゲ
ン化誘導体による。）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を付加すること、または
ＲＣＯＯ−により定義されるカルボキシレート官能基もしくはＲ−ＳＯ２−（式中、Ｒは
、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなど、および類似の基からな
る基から選択される。）により定義されるスルホニル官能基を含有する何らかのブロッキ
ング基でアミノ末端をブロッキングすることが含まれる。プロテアーゼに対する感受性を
低下させるために、またはペプチド化合物の立体構造を制限するために、（Ｎ末端アミノ
基が存在しないように）Ｎ末端にデスアミノ酸を組み込むこともできる。いくつかの実施
形態において、Ｎ末端は、酢酸または無水酢酸でアセチル化される。いくつかの実施形態
において、例示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）ポリマーでのＰＥＧ化によって修飾され得る。
【００８２】
カルボキシ末端修飾には、遊離酸をカルボキサミド基で置換すること、または構造的制
約を導入するためにカルボキシ末端で環状ラクタムを形成させることが含まれる。また、
プロテアーゼに対する感受性を低下させるために、またはペプチドの立体構造を制限する
ために、本明細書中に記載のペプチドを環化するか、または、末端アミノ基またはカルボ
キシル基が存在しないように、ペプチドの末端にデスアミノもしくはデスカルボキシ残基
を組み込むこともできる。環状ペプチド合成の方法は、当技術分野、例えば、米国特許出
願公開第２００９００３５８１４号明細書；ＭｕｒａｌｉｄｈａｒａｎおよびＭｕｉｒ，
Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：４２９−３８，２００６で公知である。本明細書中に記載
のペプチドのＣ末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アル
キル）、低級アルコキシ、ヒドロキシおよびカルボキシおよびその低級エステル誘導体、
および薬学的に許容可能なその塩が挙げられる。
【００８３】
本発明のいくつかの他の実施形態は、例示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド
および融合パートナーから構成される融合分子を対象とする。融合パートナーは、ＧＬＰ
−１Ｒアゴニストポリペプチドの生物学的、薬物動態学的または薬力学的特性を向上また
は促進し得る何らかの分子または部分であり得る。これらの実施形態の一部において、Ｇ
ＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃドメインに融合され得る。Ｆｃドメ
インとの融合によって、多くの有益な生物学的および薬理学的特性がもたらされる。例え
ば、Ｆｃドメインの存在は、ハイブリッド分子の血漿半減期を顕著に延長させ得、これは
、Ｆｃドメインのサルベージ新生児Ｆｃ受容体との相互作用ならびに大きいサイズの分子
ほど腎クリアランスが遅いことのために、治療活性を延長させる。結合したＦｃドメイン
はまた、分子が免疫細胞上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）と相互作用することも可能
にし、この特性は腫瘍治療およびワクチンにおけるそれらの使用に特に重要である。Ｆｃ
ドメインが独立して折り畳まれる場合、これは、インビトロおよびインビボの両方で融合
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドの溶解性および安定性を改善し得る。さらに、Ｆｃ
領域によって、製造中のタンパク質−Ｇ／Ａアフィニティークロマトグラフィーによる容
易でコスト効率のよい精製が可能になる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、その
Ｎ末端またはＣ末端の何れかでＦｃドメインと融合され得る。
【００８４】
本発明のＧＬＰ−１ＲアゴニストポリペプチドおよびＦｃドメインなどの融合パートナ
ーを含有するハイブリッドまたは融合分子は、標準的な組み換え技術、日常的に実施され
るタンパク質合成方法または本明細書中に記載のプロトコールに従って容易に作製され得
る。例として、Ｃ末端でＦｃドメインに融合されたペプチド５（Ｐ５−Ｆｃ融合物）由来
の融合ポリペプチドが本明細書中で開示される。この融合ポリペプチドは、ＥＬＶＤＮＡ
ＶＧＧＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＡＳＥＰＫ
ＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ
ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳ
ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫ
ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ
ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱ
ＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４５）の配列
を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合ポリペプチドを発現させるための
ポリヌクレオチドは、移行および分泌を促進するためにシグナルペプチドをコードする配
列をさらに含有し得る。例えば、ＩＬ−２シグナルペプチド（配列番号４４）は、Ｆｃ含
有融合ポリペプチドのＮ末端に存在し得る。本明細書中で示されるように（例えば実施例
６参照）、Ｆｃ含有融合ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、糖尿病マウスにおいて
血糖値の低下、摂餌量および体重の顕著な低下、ならびにインスリン感受性の回復におい
て、薬力学の向上を示した。
【００８５】
本明細書中に記載のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド（例えばペプチド５またはペ
プチド２）またはそれらのＮ末端配列も、同様の生物学的活性を有する非ペプチド性化合
物に対する構造モデルとして役立つ。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドと同じまたは
同様の所望の生物学的活性を有するが、溶解性、安定性および加水分解およびタンパク質
分解に対する感受性に関してより好ましい活性を有する化合物を構築するために利用可能
な様々な技術がある。例えば、ＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅ
ｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３−２５２，１９８９を参照のこと。これらの技術としては、
ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、２級アミンおよびＮ−メチ
ルアミノ酸から構成される骨格でペプチド骨格を置換することが挙げられるが限定されな
い。
【００８６】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまたは、その変異体および誘導体を含む本明細書
中に記載のポリペプチドは、当技術分野で周知である標準的な化学的または生化学的方法
によって化学的に合成および精製し得る。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドの類似体
または誘導体化合物を生成させるための方法のうちいくつかを本明細書中に記載する。本
発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはポリペプチドおよびそれらの誘導体化合物
を作製するために使用され得る他の方法は、例えば固相ペプチド合成である。市販のペプ
チド合成機は、固相ペプチド合成に利用可能である。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅ
ｍｔｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３２Ａ  Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ合成装置が適切である。例えば、Ａｂｂｉｏｔｅｃ，Ａｂｇｅｎｔ，ＡｎａＳｐ
ｅｃ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎおよびｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＬＬＣ．など、注文に応じてカスタム合成ペプチドを作製
する営利会社がある。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはポリペプチド（
例えば、配列番号３４および３６または配列番号４および８）およびその誘導体は、当技
術分野で周知の分子方法によって合成および精製される。アゴニストポリペプチドの組み
換え産生は、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母、細菌および植物細胞からなる群から選
択される宿主細胞を用いて、様々なタンパク質発現系において実施され得る。これらの方
法において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはポリペプチド（例えば、配列番号４
および８で示されるペプチドまたは配列番号３２および３６で示されるポリペプチド配列
）をコードするポリヌクレオチド配列は通常、タンパク質発現ベクターまたはウイルスベ
クター中の適切なプロモーターに連結される。発現コンストラクトは、細胞培地からのペ
プチドの精製を助けるために分泌配列をさらに含み得る。ベクターが導入される宿主細胞
は、当技術分野で周知の様々な発現宿主細胞、例えば細菌（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ））、酵母細胞または哺乳動物細胞の何れかであり得る。いくつかの実施形態において
、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する組み換
えベクターは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドに対する部位特異的突然変異誘発な
どのさらなる分子修飾のために、および／またはペプチドの免疫原特性を低下させるため
に、または異種発現系におけるタンパク質発現を向上させるためにも使用され得る。いく
つかの関連する実施形態において、本発明は、本明細書中に記載のＧＬＰ−１Ｒアゴニス
トペプチドまたはポリペプチド（例えば、ペプチド５またはペプチド２）をコードする単
離または実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。発現
ベクターおよび、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのベクタ
ーを有する改変宿主細胞も、本発明において提供される。
【００８８】
Ｖ．インスリンおよびグルコースホメオスタシスを増強することによる治療的適用
本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、Ｇタンパク質偏向型のシグナル伝達特性を示す。
本明細書中でＴ２Ｄの動物モデルを用いて示されるように、このようなＧＬＰ−１Ｒアゴ
ニスト（例えばＰ５またはＰ５−Ｆｃ）の投与は、グルコースホメオスタシスの改善およ
びインスリン感受性の増強につながる。Ｐ５またはＰ５−Ｆｃでの処置もまた、糖尿病マ
ウスにおける糖化ＨｂＡ１ｃレベルを顕著に低下させた。Ｔ２Ｄ／肥満の実験モデルにお
いて、腸障壁の変化は、腸透過性上昇につながり、マイクロバイオーム由来のリポ多糖の
血流への浸潤を促進し、この現象は代謝性内毒血症（ＭＥ）とも呼ばれる。ＭＥは炎症を
惹起し、その結果、臓器損傷を引き起こし得る。Ｐ５−Ｆｃ処置肥満マウスにおいて小腸
および大腸が大きくなり（図２０）、これにより、Ｐ５−Ｆｃがインテスティノトロフィ
ック（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性を示し、Ｔ２Ｄ／肥満において損なわれ
ている「腸障壁」機能を回復させることが示される。さらに、本明細書中に記載のように
、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（例えばＰ５−Ｆｃ）による長期処置によって、処置
されたマウスの摂餌量および体重が顕著に減少し、糖尿病だけでなく肥満の処置において
もそれらの有用性が示される。
【００８９】
したがって、本発明は、対象におけるインスリン感受性を増強し、血糖値を低下させ、
および／またはインスリン分泌を促進するための方法を提供する。これらの方法のうちい
くつかは、対象におけるＴ２Ｄに関連する病態生理を処置または補正することを対象とす
る。本方法のうちいくつかは、対象における食物摂取量および体重を減少させるための本
発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの長期投与による肥満の処置に関する。いくつかの関連す
る実施形態において、本発明は、細胞においてＧＬＰ−１Ｒが介在するシグナル伝達経路
を活性化するための方法を提供する。シグナル伝達経路の例としては、インスリン生合成
および放出が挙げられる。細胞は、例えば、膵臓β細胞であり得る。典型的には、本方法
は、インビボに対して、例えば、対象の内部に存在する細胞においてシグナル伝達経路を
活性化するために使用される。したがって、本発明の一部の方法は、異常なインスリン合
成および血糖値に関連するか、またはこれらが介在する糖尿病もしくは他の代謝障害に罹
患しているかまたは発症するリスクがある対象を処置することを対象とする。本発明のこ
れらの治療的適用の全てにおいて、対象は、高血糖および低インスリンレベルを特徴とす
る疾患または障害に罹患しているかまたは発症するリスクのある者であり得る。例えば、
対象は、糖尿病（特に２型糖尿病）、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）またはアテローム性動脈硬化症を発症しているか
または発症し易い者であり得る。いくつかの実施形態において、処置しようとする対象は
、中枢神経系の障害、例えば脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、薬物中毒など
に罹患している者であり得る。
【００９０】
高血糖および低インスリンレベルに関連するかまたはこれらが介在する疾患または障害
は、異常なインスリン放出および生合成によって引き起こされるか、またはこれらを伴っ
て発症する何らかの状態であり得る。インスリン放出および生合成は、ＧＬＰ−１Ｒによ
って活性化され得る重要な生物学的経路である。一般に、炭水化物代謝は、２つのポリペ
プチドホルモン：グルカゴンおよびインスリンの拮抗作用を通じて制御される。前者は、
特に肝臓におけるグリコーゲンの分解を刺激し、その結果、血中のグルコースレベルが上
昇し、一方でインスリンは、肝臓および筋肉におけるグルコースからグリコーゲンへの変
換を増加させることによって、逆の効果を有する。血漿グルコースの増加を含め、多くの
外部シグナルは、インスリンを放出させ得る。グルコースの上昇に応答して、インスリン
の二相性の放出が存在する。予め形成された顆粒の放出ゆえの初期の急速な相があり、そ
の後、より小さいがより長い放出が続く。この後期相は、インスリンの誘導および合成の
グルコース依存性の増加に起因する。したがって、グルコースは、インスリンの放出およ
び生合成の両方を制御する。
【００９１】
血糖を低下させること、インスリンレベルおよびインスリン感受性を向上させることに
よって、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドまたはポリペプチドは、様々な治療用
途がある。高血糖、インスリン感受性の低下、および／または低インスリンレベルを特徴
とする多数の疾患および状態は、本発明の方法および組成物での処置または予防に適して
いる。このような疾患としては、糖尿病、高血糖症、遺伝性および食餌性肥満、グリコー
ゲン貯蔵疾患および心血管疾患が挙げられるが限定されない。例えば、本ペプチドは、１
型および２型糖尿病の両方を含む真性糖尿病の対象においてインスリン欠乏を処置するた
めに使用され得る。１型糖尿病では、体内でインスリンが殆ど、または全く産生されない
。これは突然の発症を特徴とする。このタイプを発症する者は毎日インスリン注射を行う
必要があるため、インスリン依存性糖尿病と呼ばれる。不安定型糖尿病は、高血糖（血中
のグルコースまたは糖が多すぎる状態）と低血糖（血中のグルコースまたは糖のレベルが
異常に低い状態）との間で患者の血糖値が頻繁かつ急激に上下する、１型のサブグループ
である。これらの患者は、血糖値をかなり正常な範囲内に保つために、１日に異なるタイ
プのインスリンを数回注射する必要があり得る。２型糖尿病は、その発症が遅い（数年間
かけて進行する場合がある。）ため、および通常は食事および経口薬で制御し得るため、
より軽度の糖尿病と考えられている。しかし、コントロール不良および未治療の２型糖尿
病がもたらす結果は、１型の場合と同様に深刻である。この形態は非インスリン依存性糖
尿病とも呼ばれ、この用語は幾分誤解を招く恐れがあるものである。２型糖尿病の者の多
くは、食事療法および経口薬で状態をコントロールし得る。しかし、食事および経口薬で
の処置がうまくいかない場合、インスリン注射が必要となることがある。様々な実施形態
において、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまたはペプチドは、対象におけ
る糖尿病（１型および２型）および高血糖の進行を処置または予防するために使用され得
る。
【００９２】
ヒトおよびげっ歯類における肥満は、一般にインスリン抵抗性とも関連する。糖尿病の
発症前に、多くの肥満患者が、インスリン作用に対する末梢性の抵抗性を発現する。イン
スリンによって通常抑制される経路の重要な酵素の活性上昇は、肥満におけるインスリン
抵抗性に寄与することが示唆された（Ｂｅｌｆｉｏｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．３：
３０１−２３，１９７９）。異化経路の酵素を抑制するインスリンのこの不全は、脂肪組
織における基礎脂肪分解の促進、筋肉からのアミノ酸放出の増加および肝臓における重要
な糖生成酵素の活性上昇という形で現れる。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは
、このような障害および状態を処置または予防するために使用され得る。
【００９３】
同様に、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドは、グリコーゲン貯蔵疾患を処
置するためにも有用である。肝臓におけるグリコーゲン代謝は、血糖値の恒常的制御にお
いて主要な役割を果たす。グリコーゲン貯蔵疾患は、グリコーゲン代謝によって必要とさ
れる酵素および輸送タンパク質群内の遺伝的欠陥の結果であることが知られている。Ｉα
型グリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤ、ヨン・ギールケ病（ｙｏｎ  Ｇｉｅｒｋｅ  ｄｉｓｅ
ａｓｅ）としても知られる。）は、肝臓、腎臓および腸に通常存在するグルコース−６−
ホスファターゼの欠乏として定義される。したがって、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト
は、これらの疾患を有する対象を治療するために使用され得る。
【００９４】
本発明のいくつかの治療用途において、循環グルコースレベルまたはインスリンレベル
を測定することによって治療効果を監視する。この測定は、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニ
ストポリペプチドの投与前および／または投与後に、対象において行い得る。血糖値およ
びインスリンレベルの監視には、日常的に実施される方法のみが含まれる。例えば、対象
におけるグルコースレベルは、当技術分野で周知の方法で測定し得る。例えば、多くの市
販の血糖検査キットを用いて、血糖値を非常に簡便かつ迅速に測定し得る。
【００９５】
ＶＩ．医薬組成物
本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、処置しようとする対象に滅菌条件下で直接投与さ
れ得る。本ポリペプチドは、単独で、または医薬組成物の有効成分として投与され得る。
本発明の治療組成物は、他の治療薬と組み合わせ得るか、または他の治療薬を伴って使用
し得る。例えば、対象は、他の従来の抗糖尿病薬と一緒に化合物で処置され得る。このよ
うな既知の抗糖尿病薬の例としては、アクトス（ピオグリチゾン（ｐｉｏｇｌｉｔｉｚｏ
ｎｅ）、武田、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、アバンディア（ロシグリタゾン、Ｓｍｉｔｈｋｌ
ｉｎｅ  Ｂｅａｃｈａｍ）、アマリール（グリメピリド、Ａｖｅｎｔｉｓ）、グリピジド
スルホニル尿素（ジェネリック）またはグルコトロール（Ｐｆｉｚｅｒ）、グルコファ
ージ（メトホルミン、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、グルコバンス（
グリブリド／メトホルミン、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、グルコト
ロールＸＬ（グリピジド徐放、Ｐｆｉｚｅｒ）、グリブリド（ミクロナス（Ｍｉｃｒｏｎ
ａｓｅ）；Ｕｐｊｏｈｎ、グリナス（Ｇｌｙｎａｓｅ）；Ｕｐｊｏｈｎ、ダイアベータ、
Ａｖｅｎｔｉｓ）、グリセット（ミグリトール、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）、
メタグリップ（グリピジド＋メトホルミン；固定配合錠（ｆｉｘｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ  ｔａｂｌｅｔ））、プランディン（レパグリニド、ＮＯＶＯ）、プレコース（ア
カルボース、Ｂａｙｅｒ）、レズリン（トログリタゾン、Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）およ
びスターリックス（ナテグリニド、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。これらの公知の抗
糖尿病薬に加えて、インスリン欠乏または抵抗性の処置において有用な化合物の他の例は
、例えば米国特許第６１１０９６２号明細書、同第６，３９９７４５号明細書、同第６５
２１６６５号明細書、同第６６８３１０７号明細書、同第６７６５０２１号明細書にも記
載されている。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、典型的には、少なくとも１つの活性成分（例えば、本明細書中
で開示されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド）を、１つ以上の許容可能なその担体
とともに含む。薬学的に、担体は、組成物を増強または安定化するか、または組成物の調
製を容易にするためのものである。薬学的に許容可能な担体は、部分的には、投与されて
いる特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によ
って決定される。それらはまた、他の成分と適合性があり、対象に対して有害でないとい
う意味において、薬学的および生理学的に許容可能でもあるべきである。この担体は、投
与のために所望される製剤の形態、例えば、経口、舌下、直腸、鼻腔または非経口、に依
存して、多岐にわたる形態をとり得る。例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、安定性また
は薬理学的特性を増強するために、その投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミンな
どの担体タンパク質と複合化し得る。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、様々な方法で処置を必要とする対象に投与し得る。これらには
、局所投与および全身投与の両方が含まれる。投与経路の具体例としては、経口、非経口
（皮下、静脈内、筋肉内および腹腔内を含む。）、直腸、膣、皮膚、経皮（局所）、経粘
膜、胸腔内、肺内および鼻腔内（呼吸器）経路が挙げられるが限定されない。投与手段は
、ポンプまたは何らかの他の適切な機構を用いた注射によるものであり得る。
【００９８】
本医薬組成物は、顆粒剤、錠剤、丸薬、坐剤、カプセル剤、懸濁液、軟膏、ローション
など、様々な形態で調製し得る。処方物中の治療的に活性のある化合物の濃度は、約０．
１〜１００重量％で変動し得る。治療処方物は、薬学の分野において周知の何らかの方法
によって調製される。治療処方物は、処置のために使用され得る何らかの有効な手段によ
って送達され得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎら
ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  （１０ｔｈ  ｅｄ．，
２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０ｔｈ  ｅｄ．，２００３）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ａｎｓｅｌら（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉ
ｌｋｉｎｓ（７ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）を参照のこと。
【００９９】
治療処方物は、好都合に単位剤形で提供され、適切な治療用量で投与され得る。適切な
治療用量は、最大耐容量を決定するための哺乳動物種における、および安全な投与量を決
定するための正常ヒト対象における臨床研究など、周知の方法の何れかによって決定され
得る。より高い投与量が必要とされ得るある種の状況下を除いて、ＧＬＰ−１Ｒアゴニス
トの好ましい投与量は通常、約０．００１〜約１０００ｍｇ、より一般的には約０．０１
〜約５００ｍｇ／日の範囲内となる。対象に投与しようとする投与量は、処置しようとす
る疾患または障害（例えば、糖尿病または肥満）に関連する少なくとも１つの症状を排除
または改善するのに適切な何らかの量であり得る。適切な投与量を決定するいくつかの要
因は、当業者にとって周知であり、日常的な実験で対処し得る。例えば、物理化学的、毒
物学的および薬物動態学的特性の決定は、標準的な化学的および生物学的アッセイを用い
て、および化学的、薬理学的および毒物学的技術において公知の数学的モデリング技術の
使用を通じてなし得る。治療的有用性および投薬計画は、このような技術の結果から、お
よび適切な薬物動態および／または薬力学モデルの使用を通じて推定し得る。他の要因は
、年齢、身体状態、サイズ、体重、治療される状態、状態の重症度および何らかの同時処
置を含む個々の患者のパラメータに依存する。投与量はまた、選択されるポリペプチド（
例えば、本明細書中で例示されるようなＰ５またはＰ５−Ｆｃ）および達成しようとする
ものが予防であるかまたは処置であるか、およびポリペプチドが化学的に修飾されている
か否かにも依存する。このような要因は、本明細書中に記載の動物モデル、または当技術
分野で利用可能な他の動物モデルまたは試験系によって容易に決定され得る。
【０１００】
本明細書中で提供されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドまたはペプチドは、例え
ば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療的であるかまたは予防的であるか、および
、熟練者にとって公知の他の要因に依存して、単回投与で、複数回用投与で、連続的また
は断続的に、投与され得る。治療剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連
続的であり得るか、または一連の間隔をあけた投与であり得る。例えば、本発明のＧＬＰ
−１Ｒアゴニストを含有する治療組成物は、１日に１回または複数回（例えば２回または
３回）、毎週または２週間ごとに１回もしくは複数回、または毎月１回または数回、投与
し得る。具体的な対象および処置しようとする状態に依存して、投与は様々な長さの時間
、例えば数日、数週間、数カ月、数年以上持続し得る。一般に、単位用量中に含まれる所
与のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの量は、広範囲に変動し得る。したがって、単位投与量で投
与しようとする薬物の量は、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００、７５
０または１０００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００〜５００ｍｇ
／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００〜３００ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも
約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、他の投与量が有益な結果
をもたらし得る。測定される、あるいは、投与しようとする単位投与量は、少なくとも約
０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２５または５０ｍｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１ｎｍｏｌ／ｋ
ｇ〜約５または１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０
０または１０００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり得る。さらに、薬物がより頻繁に投与され
る場合（例えば毎日投与）、より低い単位投与量が使用され得る。逆に、より頻度が少な
い薬物の投与（例えば毎週または隔週投与）を含む一部の長期処置において、より高い単
位投与量が使用され得る。さらに、処置計画または処置過程全体にわたる固定投与量以外
に、対象に対して、何らかの処置計画または処置過程全体の期間中に変動する投与量でも
投与し得る。例えば、処置計画は、処置計画が進行するにつれて、１日投与量または週間
投与量が次第に高くなるようにし得る。あるいは、処置計画は、開始時により高い１日ま
たは週間投与量で開始し、続く日または週に投与される投与量を徐々に減少させ得る。い
くつかの他の実施形態において、処置過程は、異なる投与量を使用する複数の処置計画を
含有し得る。
【０１０１】
本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの好ましい投与量および投与方式は、処置を行う医師
によって個別に検討され得る要因、例えば、特定のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、個々の対象
の年齢、体重および反応、対象の症状の重症度および選択される投与経路を含め、処置し
ようとする状態（単数または複数）、投与しようとする組成物の選択に依存して、対象に
よって変動し得る。一般的な規則として、投与されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストの量は、対
象の状態を効果的かつ確実に予防または最小化する最小投与量である。したがって、上記
投与量範囲は、本明細書中での教示に対する一般的な指針および裏付けを提供するもので
あるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０２】
［実施例］
次の実施例は、本発明をさらに例示するために提供されるが、その範囲を限定するもの
ではない。本発明の他の変形物は、当業者にとって容易に明らとなり、添付の特許請求の
範囲により包含される。
【０１０３】
［実施例１］ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの系の構築および選択
ＧＬＰ−１Ｒに対する潜在的Ｇタンパク質偏向型リガンドを同定するために、発明者ら
は、ＧＬＰ−１Ｒおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を同時発現するレポーター細胞株
（ＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰ）の細胞表面でペプチドライブラリを発現させた
（図１０）。ＧＬＰ−１Ｒ介在性ｃＡＭＰ産生を誘導するペプチドに対してスクリーニン
グを行うために、タンパク質発現をＣＲＥプロモーターの調節下に置いた。ＦＡＣＳ細胞
選別と連結されるこの自己分泌系によって、約１００万種類の異なるペプチド配列のスク
リーニングが可能となる。スクリーニングで使用されるペプチドライブラリは、エキセン
ディン−４（Ｅｘ４）に基づいており、これは残基１〜３９の全長を有し、ＧＬＰ−１Ｒ
アゴニストである。具体的には、３つのコンビナトリアルペプチドライブラリを作製して
、「Ｅｘ４（９−３９）」と呼ばれる残基９〜３９を含有する短縮型Ｅｘ４のＮ末端に７
〜１０個のアミノ酸を付加した。最初の２つのライブラリにおいて、ランダム化テトラペ
プチド（ＣＸ４Ｃ）またはペンタペプチド（ＣＸ５Ｃ）をＩＬ−２シグナル配列とＥｘ４
（９−３９）の間に挿入した（図１ａ）。環状ペプチドＮ末端を有するこれら２つのライ
ブラリは、多くのＧＰＣＲ天然リガンドが、カルシトニン、オキシトシンおよびソマトス
タチン（参照：リガンドに基づくペプチド設計およびＧＰＣＲを標的とするためのコンビ
ナトリアルライブラリ）などの環状ペプチドであるという事実に基づいて設計した。第３
のライブラリは、エキセンディン−４（９−３９）のＮ末端の７個のランダムアミノ酸で
構成された。
【０１０４】
Ｅｘ４配列とＰＤＧＦＲ膜貫通アンカーとの間のリンカーの最適な長さを決定するため
に、発明者らは最初に、リンカー配列の１、２または３つのリピートを含有する様々なコ
ンストラクトをＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰ細胞に感染させた（図１ａ）。さら
に、形質導入効率を調節するために、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をＰＤＧＦＲ配列の
Ｃ末端に付加した（図１ａ）。外来性Ｅｘ４および膜結合Ｅｘ４はＧＦＰ発現を刺激した
（図１ｂ）。興味深いことに、ＧＦＰ発現は、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインとペプチドライ
ブラリとの間のリンカーの長さとは無関係であることが分かった（図１ｃ）。したがって
、上記の３つのライブラリを、１個のリンカー配列の上流に挿入し、続いてＰＤＧＦＲお
よびｍＣｈｅｒｒｙ配列を挿入した。ＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰ感染後、Ｘｉ
ｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，８０９９−８１０４，
２０１３（図２ｃ）に記載のように、発明者らの標準プロトコールを用いて複数ラウンド
の濃縮後に活性ペプチドを選択した。１回目のラウンド後、顕著な濃縮は検出され得なか
った（図２ｄ）。しかし、２回目のラウンド後、濃縮が観察され（集団の０．３１％）、
選択の３回目のラウンドによって、ＧＦＰ陽性細胞が細胞集団の１０．６％となった（図
２ｄ）。ディープシークエンシングを用いて、１％より高い頻度の１３種類のペプチド配
列が、選択の３回目のラウンド後にＧＬＰ−１Ｒ活性化ヒットとして同定された。注目す
べきことに、発明者らは、直鎖ヘプタペプチド（Ｘ７）またはヘプタペプチド（ＣＸ５Ｃ
）ライブラリからの配列を同定したが、ヘキサペプチドライブラリ（ＣＸ４Ｃ）からは同
定されなかった。興味深いことに、全てのヒット配列は、親分子Ｅｘ４のＮ末端とは無関
係であった。
【０１０５】
［実施例２］同定されたＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの特徴評価
同定されたヒットを定量的に特徴評価するために、発明者らは、ｃＡＭＰ応答エレメン
トの調節下にルシフェラーゼがあるＧＬＰ−１応答性レポーター細胞株（ＨＥＫ２９３−
ＧＬＰ−１Ｒ−ルシフェラーゼ）を構築した。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ５およびＰ１０を含むいく
つかのペプチドがｃＡＭＰ産生を刺激し得ることが分かった。
【０１０６】
ＧＰＣＲリガンドは、特有の下流シグナル経路プロファイルを有する別個の活性受容体
高次構造を誘導し得ることが知られている。可能性のあるＧタンパク質偏向型アゴニスト
を同定しようと、同定されたペプチドがＧタンパク質およびβ−アレスチンを通じてシグ
ナル伝達する相対的有効性の特徴を調べるために、３種類の別個のインビトロアッセイを
使用した。各アッセイについて、濃度反応曲線を作成し、同定したＧＬＰ−１Ｒアゴニス
トペプチドのうち一部（例えば、ペプチド１、２、３、５および１０）について、最大半
量有効濃度（Ｅｃ５０）および最大有効性（参照ペプチドＥｘ４（Ｅｍａｘ（％））と比
較したＥｍａｘ（％）を決定した。データを図２ａ〜２ｄ、図５ａ〜５ｃおよび表１で示
す。データに示されるように、これらのペプチドのうちの１つであるＰ５は、完全アゴニ
ストとして挙動し、ヒト（ｈＧＬＰ−１Ｒ）およびマウス受容体（ｍＧＬＰ−１Ｒ）の両
方でＥｘ４と同様のナノモル濃度の効力を示した（図２ａ、２ｂ、表１）。重要なことに
、Ｐ５誘導型のｃＡＭＰ産生は、選択的ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストＥｘ９−３９により
濃度依存的に阻害された（図５ａ、５ｂ）。さらに、ヒトグルカゴン受容体を発現するＨ
ＥＫ２９３細胞株において、Ｐ５誘導性ｃＡＭＰ産生は無視できる量であった（図５ｃ）
。これらのデータから、Ｐ５がＧＬＰ−１Ｒと選択的に相互作用することが示された。
【０１０７】
次に、発明者らは、Ｐ５が細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させる能力について調べた。Ｐ５
は［Ｃａ２＋］ｉの濃度依存的な増加を誘導し、Ｅｘ４と比較した場合、同様の効力およ
び有効性を示したことが分かった（図２ｃ、表１）。Ｅｘ４での活性化後、ＧＬＰ−１Ｒ
もβ−アレスチン１およびβ−アレスチン２にカップリングすることが知られている。し
たがって、発明者らは、酵素断片相補性に基づく細胞ベースのアッセイを用いて、Ｐ５が
β−アレスチン１およびβ−アレスチン２を動員する能力を調べた。発明者らは、Ｐ５が
、β−アレスチン１および２について、それぞれ、Ｅｘ４（Ｅｃ５０＝２９．５７ｎＭお
よび５．６ｎＭ）と比較した場合、Ｐ５が大幅な有効性（Ｅｍａｘ＝２９％および３２％
）および効力（Ｅｃ５０＝４４７ｎＭおよび５２９ｎＭ）の減少を示したことを見出した
（図２ｄ、２ｅ）。等活性（ｅｑｕｉａｃｔｉｖｅ）比較を使用して、発明者らは、Ｅｘ
４と比較した、Ｐ５の偏向型アゴニズムをさらに定量化した。Ｐ５によって、Ｇαｓ−タ
ンパク質についての偏向因子（β）は、β−アレスチン１およびβ−アレスチン２に対し
て、それぞれ、０．９および１．４となり、Ｇαｑタンパク質については、β−アレスチ
ン１およびβ−アレスチン２に対して、それぞれ、１．７および２．４となった（図２ｆ
）。重要なことに、これらの値は天然リガンドＧＬＰ−１で得られた偏向因子とは有意に
異なり（図２ｆ）、このことから、Ｐ５がＧタンパク質活性化を優先することが確認され
た（Ｇタンパク質偏向型と呼ばれる。）。このようにして、これらの実験をまとめると、
Ｐ５が、ヒトおよびマウスＧＬＰ−１Ｒの両方で、有効かつ選択的なＧタンパク質偏向型
アゴニストであることが明らかになった。
【表１】
2018511329.tif 000003
【０１０８】
［実施例３］代表的なＧＬＰ−１ＲアゴニストペプチドＰ５のインビボ活性
Ｐ５がＧＬＰ−１−Ｒで別個のインビトロ薬理学を示したので、発明者らは次に、Ｔ２
Ｄの様々なマウスモデルにおいてその有効性を調べた。通常飼料を与えた８週齢の痩せマ
ウスにおいて、Ｐ５またはＥｘ４の単回投与注射によって、ビヒクル対照マウスと比較し
た場合、試験した全用量で耐糖能が顕著に改善した（図３ａ〜３ｃ）。興味深いことに、
１μｇ／ｋｇ−１で投与されたＰ５は、同じ用量のＥｘ４と比較して、空腹時血糖値をよ
り早くから低下させた（図３ｂ）。さらに、試験した最低用量（０．１μｇ／ｋｇ−１）
では、Ｐ５は、等価用量のＥｘ４と比較して、全時点で有効性の改善を示し、ＧＴＴの曲
線下面積（ＡＵＣ）の値が顕著に減少した（図３ｃ）。まとめると、これらのデータから
、０．１μｇ／ｋｇ−１のＰ５が、１００倍高用量のＥｘ４と同程度まで耐糖能を改善し
たことが示される。Ｐ５は、ＧＬＰ−１Ｒノックアウトマウスにおいて耐糖能を改善する
ことができず、このことから、このペプチドがそのグルコース制御活性に寄与し得る非特
異的効果を何ら示さないことが示された（図３ｄ）。総合すると、これらのデータから、
代謝的に健康な痩せマウスにおいて、ＧＬＰ−１ＲのＧタンパク質偏向型アゴニストであ
るＰ５が、参照アゴニストＥｘ４と比較して、持続的でより大きな糖調節活性を有するこ
とが示される。
【０１０９】
発明者らは、次に、８週齢のレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＰ５およびＥｘ４
の漸増用量の効果を比較した。Ｐ５またはＥｘ４の注射は、用量依存的に血糖値の低下を
誘導した（図３ｅ、図６ａおよび６ｂ）。このＴ２Ｄマウスモデルにおいて、Ｐ５処置動
物は、１μｇ／ｋｇ−１で投与した場合、Ｅｘ４と比較して、１５分の時点での糖調節活
性の顕著な改善も示した（図３ｅ）。発明者らは、前２型糖尿病の食餌性肥満（ＤＩＯ）
マウスモデルにおいてＰ５の有効性をさらに試験した。Ｐ５またはＥｘ４の単回注射（１
μｇ／ｋｇ−１）によって、グルコース負荷に応答したグルコースクリアランスが顕著に
改善した（図３ｆ）。しかし、Ｅｘ４とは対照的に、Ｐ５はＧＴＴにおいてグルコースク
リアランスの僅かな低下を示した（図３ｆ）。
【０１１０】
ＧＬＰ−１アゴニストは、膵臓β細胞からのインスリン分泌のグルコース依存性刺激を
増強することによって血糖コントロールに寄与するので、発明者らは、グルコース負荷に
応答した、血漿インスリンレベルに対するＰ５およびＥｘ４の効果をさらに比較した。正
常飼料を与えた痩せマウスにおいて、１μｇ／ｋｇ−１でのＰ５またはＥｘ４の投与によ
って、対照マウスと比較して、インスリンレベルが顕著に上昇した（図３ｇ）。驚くべき
ことに、Ｐ５は、痩せマウスにおいて、Ｅｘ４と比較して、より大きな糖調節活性を示し
たものの（図３ａ〜３ｃ）、Ｐ５が増強させたインスリン分泌反応の程度は、Ｅｘ４より
も低かった（図３ｅ）。高インスリン血症ｏｂ／ｏｂマウスおよびＤＩＯマウスにおいて
、１μｇ／ｋｇ−１でＰ５を投与すると、インスリン分泌反応は軽度にしか増強されず、
一方でＥｘ４では、対照群と比較した場合、インスリンレベルが顕著に上昇した（図３ｈ
）。高用量（１０μｇ／ｋｇ−１）で、対照群と比較した場合、Ｐ５は、ｏｂ／ｏｂマウ
スにおいて血漿インスリンレベルを顕著に上昇させた。しかし、インスリン分泌反応は、
Ｅｘ４の同様の投与と比較した場合、顕著に低かった（図６ｃ）。高脂肪餌を与えたマウ
スにおいて、Ｐ５またはＥｘ４（１μｇ／ｋｇ−１）の単回注射によって、血漿インスリ
ンレベルが顕著に上昇した一方で、血漿インスリンレベルは、Ｅｘ４の同用量と比較して
、Ｐ５に対して顕著に低い反応を示した（図３ｉ）。これらのデータから、ＧＬＰ−１Ｒ
Ｇタンパク質偏向型アゴニストペプチドであるＰ５が、参照アゴニストＥｘ４と比較し
て、低い分泌促進活性を示し、このことから、グルコース刺激型インスリン分泌（ＧＳＩ
Ｓ）を増強することにおいて、インビボで、ＧＬＰ−１Ｒ活性化の下流のβ−アレスチン
１／２シグナル伝達が重要な役割を果たすことが示唆される。β−アレスチン１は、培養
膵臓β−細胞におけるＧＳＩＳ上のＧＬＰ−１および下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化
ポリペプチドの増強作用に不可欠であることが分かった。さらに、ＧＳＩＳにおけるＧＬ
Ｐ−１の増強効果が、β−アレスチン２欠損膵島において低下したことが報告された（Ｚ
ｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４３５，３４５
−３４９，２０１３）。したがって、本明細書中に記載のＧＬＰ−１−Ｒ  Ｇタンパク質
偏向型リガンドは、インスリン分泌負荷を最小化することによって膵臓β細胞機能を維持
しながら血糖コントロールを改善することなど、長期処置に関して、新しく、真価を認め
られていない長所をもたらす。
【０１１１】
［実施例４］長期処置における例示的なＧＬＰ−１ＲアゴニストペプチドＰ５の有効性
代謝改善がＧＬＰ−１Ｒ  Ｇタンパク質偏向型アゴニストでの長期処置によって達成さ
れ得るか否かを判定するために、漸増用量でＰ５または等モル用量のＥｘ４で４週間にわ
たり毎日、ＤＩＯマウスを処置した。試験した最大用量（１０μｇ／ｋｇ）で、Ｐ５およ
びＥｘ４の両方が、処置の初期段階中に軽度の体重減少を誘発し（図４ａ）、一方で低用
量（１μｇ／ｋｇ）では、Ｐ５もＥｘ４も体重減少を誘導しなかった（図８ａ）。Ｅｘ４
とは対照的に、１０μｇ／ｋｇで投与したＰ５は、ビヒクル処置動物と比較した場合、脂
肪質量に影響を与えなかった（図７ｂ）。発明者らは、次に、グルコース恒常性において
、Ｐ５およびＥｘ４を用いたＤＩＯマウスの長期処置の結果を比較した。Ｐ５またはＥｘ
４を１０μｇ／ｋｇで４週間にわたり毎日投与することによって、空腹時血糖値が顕著に
低下した（図４ｂ）。対照的に、１μｇ／ｋｇで投与した場合、（図４ｂ）と比較して、
空腹時血糖値を顕著に低下させたのはＰ５のみであった。ＧＴＴにおいて、４週間の処置
後、Ｐ５およびＥｘ４の両方とも、１０μｇ／ｋｇで毎日投与した場合に耐糖能を改善し
た。１μｇ／ｋｇで投与した場合、Ｅｘ４ではなく、Ｐ５によって耐糖能が改善した。（
図４ｂ）。さらに、高用量および低用量のＰ５によって、自由摂餌血糖値が顕著に低下し
た（図４ｃ）。対照的に、Ｅｘ４は、試験した最大用量でのみ非空腹時血糖値を補正した
（図４ｃ）。両ペプチドは、最大用量で循環インスリンおよびｃ−ペプチドの濃度を顕著
に減少させ、これはインスリン感受性の改善を示す（図４ｄおよび図８ａ）。特に、Ｐ５
はＨｂＡ１ｃの用量依存的な低下を誘導した（図４ｅ）。対照と比較した場合、ＨｂＡ１
ｃの平均変化は、それぞれ、１μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのＰ５で処置したＤＩＯ
マウスにおいて、−０．１９％〜−０．３８％の範囲であった（図４ｅ）。ＨｂＡ１ｃレ
ベル低下におけるＰ５の効果は、Ｅｘ４と比較して優れていた（１μｇ／ｋｇおよび１０
μｇ／ｋｇで−０．０３％〜−０．２％）。膵臓の組織学的分析から、偏向型アゴニスト
が適切なインスリン免疫反応性を保持し、膵島面積を顕著に増加させたことが明らかにな
った（図４ｆ）。
【０１１２】
ペプチドＰ５の糖調節効果の改善は、グルコース恒常性の制御に関与する２つの他の腸
膵島ホルモンであるグルカゴンおよびグルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（
ＧＩＰ）の循環レベルによっても明らかになった。最大容量で、Ｐ５およびＥｘ４の両方
がグルカゴンレベルを低下させる傾向がある（図８ｂ）。興味深いことに、Ｐ５の毎日の
投与の結果、用量依存的に循環ＧＩＰレベルが顕著に上昇した（図４ｇ）。注目すべきこ
とに、ＧＩＰの循環レベルを上昇させるＰ５の有効性は、Ｅｘ４の同等の１日用量と比較
して優れていた。興味深いことに、Ｔ２Ｄでの対象における血糖コントロールを改善する
ために使用される単剤療法である、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害
剤は、ＧＬＰ−１およびＧＩＰの両方の内因性レベルを上昇させることが知られていた（
Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓら、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７７，４８９−４９
９，２０１２）。さらに、以前の研究から、ＧＬＰ−１ＲおよびＧＩＰ−Ｒの同時活性化
の結果、ヒトおよびラットにおいて血糖コントロールが促進され、同様にＨｂＡ１ｃレベ
ルが低下することが明らかになっており、このことから、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１相乗作
用が示唆される。したがって、Ｇタンパク質偏向型アゴニストで観察される優れた血糖コ
ントロールは、ＧＩＰレベルの上昇および同時に起こる受容体活性化に起因し得る。
【０１１３】
発明者らは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ
（ＡＬＰ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿レベルの変
化がないこと（図９ａ〜９ｃ）および脂肪肝の改善（図９ｄ）によって反映されるように
、Ｐ５での４週間にわたる長期処置が肝細胞毒性を誘導しなかったことをさらに観察した
。さらに、Ｇタンパク質偏向型アゴニストは、Ｅｘ４の同様の投与と比較した場合、高密
度リポタンパク質またはトリグリセリドレベルに影響を及ぼすことなく、低密度リポタン
パク質レベルを低下させることを同様に良好に遂行した（表２）。まとめると、これらの
データから、ＧＬＰ−１Ｒ  Ｇタンパク質偏向型アゴニストペプチドでの長期処置によっ
て、脂質代謝が改善され、その結果、参照アゴニストＥｘ４と比較した場合、ＤＩＯマウ
スにおける高血糖がより大きく、持続的に補正されるようになることが示唆される。さら
に、肝細胞毒性がないことから、Ｐ５のインビボでの有効性を向上させるために、さらに
より積極的な投与を使用し得ることが示唆される。
【表２】
2018511329.tif 000004
【０１１４】
［実施例５］他の同定ペプチドのＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性のさらなる研究
ペプチドＰ５について上で述べたように、ＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ルシフェラー
ゼレポーター細胞株においてｃＡＭＰ産生を刺激する能力について他の同定ペプチドも試
験した。いくつかのペプチド、例えばＰ１、Ｐ２およびＰ１０は全て、ｃＡＭＰ産生を促
進することが分かった。別の研究において、ＧＰＣＲ活性化後のｃＡＭＰ増加およびβ−
アレスチン動員をそれぞれ監視するために、ｈＧＬＰ−１Ｒ  ＣＲＥ−ＧＦＰレポーター
細胞株およびｈＧＬＰ−１Ｒ  Ｔａｎｇｏレポーター細胞株を用いて、本ペプチドのＧタ
ンパク質偏向を試験した。図１１ｂで示されるように、ペプチド１およびペプチド２も、
ＧＬＰ−１Ｒ天然リガンドＥｘ４と比較して、Ｇタンパク質シグナル伝達偏向を示すこと
が分かった。さらなる研究において、ラットＩＮＳ細胞およびＧＬＰ−１Ｒ介在性ＥＲＫ
１／２リン酸化を用いて、インスリン分泌における効果について、本発明の他のＧＬＰ−
１Ｒアゴニストポリペプチドの活性を調べた。ペプチド５およびＥｘｅ４とともに、ペプ
チド２もインスリン分泌アッセイにおいて活性であることが分かったが、これは他の研究
から得られた結果と一致する。
【０１１５】
［実施例６］ＩｇＧ  Ｆｃドメインと融合されたＧＬＰ−１Ｒアゴニストの特徴評価
本明細書中に記載の標準的なプロトコールを介して構築した発現ベクターを用いて、Ｆ
ｃドメインにＣ末端で融合されるＰ５を含有する融合ポリペプチド（配列番号４５）（図
１２ａ）を作製し、精製した。簡潔に述べると、Ｐ５配列をコードするＤＮＡをＰＣＲに
よってＦｃ断片の５’末端に融合させた。Ｐ５−Ｆｃ断片をＥＦ１ａプロモーターの調節
下で発現ベクターに挿入した。発現プラスミドを２９３Ｆ細胞に遺伝子移入し、Ｐ５−Ｆ
ｃ融合タンパク質をプロテインＧ捕捉により上清から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て品質を分析し、＞９０％の純度が示された。
【０１１６】
タンパク質の移動および分泌を助けるために、ベクター中のコード配列は、Ｐ５ペプチ
ドのＮ末端にＩＬ−２シグナルペプチド配列（配列番号４４）もコードする。次いで、シ
グナルペプチドを含有しない精製Ｐ５−Ｆｃ融合アゴニストポリペプチド（配列番号４５
）を、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性についての様々なインビトロおよびインビボ試験に供
した。
【０１１７】
図１２ｂおよび１２ｃで示されるように、Ｐ５−Ｆｃは、Ｐ５と同様のＥＣ５０で、ヒ
トＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞においてｃＡＭＰ産生を刺激した。さらに、Ｐ５と
同様に、Ｐ５−Ｆｃは、β−アレスチン動員の有効性の大幅な低下を示した。痩せマウス
での耐糖能におけるＰ５とＰ５−Ｆｃとの急性効果の直接的な比較から、Ｐ５−Ｆｃ（５
ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の単回投与によって注射後最長で７日間、耐糖能が顕著に向
上するが、一方でＰ５（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の単回投与は、注射直後（第１
日）にのみ効果があったことが明らかになった（図１３ａ）。さらに、Ｐ５−Ｆｃ（５０
ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回注射によって、ＤＩＯマウスでの自由摂餌血糖値が最長で１２日
間、顕著に低下した（図１３ｂ）。まとめると、これらのデータから、Ｐ５−Ｆｃが、Ｐ
５と比較した場合、大幅に増強された薬力学を示すことが示される。
【０１１８】
偏向型アゴニストＰ５−Ｆｃの有効性をＴ２Ｄの食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルに
おいても試験した。１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは５０ｎｍｏｌ／ｋｇの何れかのＰ５−Ｆｃ
の週１回の皮下（ｓ．ｃ．）投与量によって、ＤＩＯマウスにおいて体重が顕著に減少し
得ることがさらに観察された（図１４ａ）。Ｐ５−Ｆｃの両投与量で、ビヒクル処置対照
マウスと比較した場合、脂肪質量は顕著に減少したが、体液質量または除脂肪量は顕著に
は減少しなかった（図１４ｂ）。
【０１１９】
Ｐ５−Ｆｃ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）での週１回の注射によっ
て、ＤＩＯマウスでカロリー摂取量も減少することが分かった（図１５ａおよび１５ｂ）
。この効果は注射後３〜４日間最大であった。（図１５ｂ）。末梢投与Ｐ５−Ｆｃ、Ｐ５
およびＥｘの摂餌に対する効果も、絶食雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２〜１４週；２８〜
３０ｇ）において調べた。注射後１、２、４、８、２４および３１時間で、摂餌を監視し
た。Ｐ５またはＥｘ４の投与によって、ビヒクル処置マウスと比較した場合、比較的短時
間（１〜４時間）、摂餌量が僅かに減少する（図１６右パネル）。しかし、Ｐ５およびＥ
ｘ４処置マウスは両者とも、２４時間にわたって同様の量の餌を摂取した。対照的に、Ｐ
５−Ｆｃを与えたマウスは、８時間の時点の後に対照マウスより摂餌量が顕著に少なかっ
た（図１６、左パネル）。これらのデータから、Ｐ５−Ｆｃが、以前に観察された体重減
少と相関する、マウスにおける顕著な食欲不振効果を誘発することが示唆される（図１４
）。
【０１２０】
さらに、Ｐ５−Ｆｃで５週間にわたり週に１回処置したＤＩＯマウスにおいて、耐糖能
試験を行った。１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは５０ｎｍｏｌ／ｋｇの何れかを投与した場合、
Ｐ５−Ｆｃは、ビヒクル処置動物と比較して、空腹時血糖値を顕著に低下させ、耐糖能を
改善した（図１７ａ）。さらに、Ｐ５−Ｆｃは、対照マウスと比較した場合、自由摂餌血
糖値を顕著に低下させた（図１７ｂ）。長期血糖制御の指標として、発明者らは、１０ｎ
ｍｏｌ／ｋｇまたは５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰ５−Ｆｃの何れかで週１回、４週間にわたり
処置したＤＩＯマウスにおけるヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルをさらに調べた。試験
した最大用量で、Ｐ５−Ｆｃは、対照と比較した場合、ＨｂＡ１ｃの有意な減少を引き起
こした（図１７ｃ）。
【０１２１】
さらに、Ｐ５−Ｆｃは、糖尿病性ＤＩＯマウスにおいてインスリン感受性を回復させる
ことが分かった（図１８）。週１回、４週間にわたり、５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰ５−Ｆｃ
で処置したＤＩＯマウスで実施したインスリン負荷試験から、低血糖反応の顕著な増強が
明らかになった（図１８ａおよび１８ｂ）。
【０１２２】
最後に、Ｐ５−Ｆｃ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を５週間にわた
り週１回投与すると腸刺激性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）活性が示されることが
分かった。実際に、Ｐ５−Ｆｃは、ビヒクル処置対照マウスと比較した場合、Ｐ５−Ｆｃ
処置動物における小腸質量および長さの増加によって反映されるように、腸の成長を促進
した。結果を図１９ａおよび１９ｂで示す。
【０１２３】
［実施例７］ＤＩＯマウスでの脂肪肝におけるＰ５の治療効果
発明者らは、最初に、Ｇタンパク質偏向型アゴニストＰ５の長期投与がＤＩＯマウスに
おいて脂肪肝を改善することを観察した。重要なこととして、観察された効果は、Ｅｘ４
の効果と比較した場合、Ｇタンパク質偏向型アゴニストＰ５に特異的であった。この研究
からの結果を図２０で示す。具体的には、図２０ａは、食塩水（対照）、Ｅｘ４またはＰ
５の毎日の皮下注射後のＤＩＯマウスからの肝組織の代表的な顕微鏡画像を示す。図２０
ｂは、ＨＰＦあたりの脂肪滴数を示す。この図において、肝臓における脂質の存在を調べ
るために、オイルレッドＯで切片を染色した（ｎ＝４）。スケールバー、１００μｍ。図
２０ｃは、肝臓重量で正規化された肝臓トリグリセリド含量を示し、図２０ｄは、食塩水
（対照）、Ｅｘ４またはＰ５の毎日の皮下注射後のＤＩＯマウスにおける肝臓重量を示す
。さらに、血漿ＡＬＰ、ＡＬＴおよびＡＳＴにおけるＰ５またはＥｘ４の効果（ｎ＝８）
を図２０ｅで示す。この図において、データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。両側ｔ検定によ
る統計：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、食塩水をペプチド注射と比較。
【０１２４】
発明者らはまた、Ｇタンパク質偏向型アゴニストポリペプチドＰ５の長期投与が、ＤＩ
Ｏマウスにおいて脂肪生成およびインスリン感受性を調整し得ることも見出した。この研
究からの結果を図２１で示す。この図で示されるように、Ｐ５の治療活性は、食塩水（対
照）、Ｅｘ４またはＰ５の毎日の皮下注射後のＧＩＰ（図２１ａ）、レプチン（図２１ｂ
）およびレジスチン（図２１ｃ）血漿レベルにおける効果によって証明される（ｎ＝６）
。食塩水（対照）およびＥｘ４またはＰ５の毎日の皮下注射後の、ＰＰＡＲγをコードす
る遺伝子の発現におけるリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析（ｎ＝６）（図２１
ｄ）および精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）におけるＰＰＡＲγタンパク質発現のウェ
スタンブロット分析（図２１ｅ）もこの図で示す。本研究では、カベオリン１（Ｃａｖ１
）を負荷対照として使用した。さらに、食塩水（対照）、Ｅｘ４またはＰ５の毎日の皮下
注射後の、ＰＰＡＲγ活性、Ｇｌｕｔ４およびＣＤ３６によって制御される遺伝子のｅＷ
ＡＴ  ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析をこの図で示す（ｎ＝６）（図２１ｆ）。食塩水（対
照）、Ｅｘ４またはＰ５の毎日の皮下注射後のＤＩＯマウスからのｅＷＡＴの代表的な顕
微鏡画像を図２１ｇで示す。この図において、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて切
片を染色した（ｎ＝４）（スケールバー、１００μｍ）。最後に、図２１ｈは、食塩水（
対照）、Ｅｘ４またはＰ５の毎日の皮下注射後のＤＩＯマウスにおける脂肪細胞のサイズ
および強拡大視野（ＨＰＦ）あたりの数を示す。
【０１２５】
［実施例８］材料および方法：
この実施例は、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの製造および使用の例示にお
いて用いられたいくつかの材料および方法を記載する。
【０１２６】
エキセンディン−４に基づく膜繋留コンビナトリアルペプチドライブラリの構築。膜貫
通繋留エキセンディン−４の発現は、レンチウイルスベクター中のＥＦ１ａの調節下にあ
った。遺伝子の配置は、Ｎ末端でのインターロイキン２シグナルペプチド；エキセンディ
ン−４；ＧＧＧＧＳリンカーのタンデムリピート；ＰＤＧＦＲ膜貫通領域およびＰＤＧＦ
Ｒ膜貫通領域の細胞内側に融合されたｍＣｈｅｒｒｙの順である。エキセンディン−４に
基づくコンビナトリアルペプチドライブラリを構築するために、ＧＬＰ−１Ｒ細胞外ドメ
インへのアンカー部位としてのエキセンディン−４（残基９〜３９）アンタゴニストを一
定に保った。縮重コドンを有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって、Ｘ７、Ｃ
Ｘ５ＣＸ２およびＣＸ４ＣＸ３（Ｘ＝２０種類の天然アミノ酸）の形態のランダム化ペプ
チドをエキセンディン−４（９−３９）のＮ末端に付加した。各ライブラリの多様性は、
〜３０万メンバーである。レンチウイルスライブラリは、ライブラリプラスミドおよびパ
ッケージプラスミドとのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時遺伝子移入によって調製した。遺伝子
移入から４８時間後にウイルスを含有する上清を回収した。レンチウイルス調製物の力価
は、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて決定した。
【０１２７】
ＦＡＣＳに基づく選別。ＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰ細胞に対してレンチウイ
ルスペプチドライブラリを用いて形質導入を行った。感染２日後、細胞を解離させ、Ｍｏ
Ｆｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ蛍光活性化細胞選別機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ）
を用いてＧＦＰ陽性細胞を選別した。選別された細胞からＰＣＲによってペプチド配列を
直接回収し、レンチウイルスベクターにクローニングして、次のラウンドの選択のための
ライブラリを構築した。レンチウイルスを調製し、次のラウンドの選別のために、ＨＥＫ
２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰレポーター細胞に対して形質導入を行った。３回の選択の
反復ラウンドを行った。
【０１２８】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｅｍ
ｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：全部で８５０ヌクレオチドフローに対してＩｏｎ  
ＰＧＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ４００Ｋｉｔおよび３１８ｖ２チップを用いて、
Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｙｓｔｅｍ上で配列決定を行った。生データ処理では、標準的塩基コ
ール手順を使用した。合計７，０４２，６１１個のリードが生成され、平均リード長は４
８９ｂｐであった。ＰＧＭによって生成されたペプチドライブラリのディープシークエン
シングデータを処理および分析するために、社内バイオインフォマティクスパイプライン
を開発した。パイプライン処理は、次の４つの段階から構成される。各配列リードを：（
１）特有の指数で修正し、標識化し；（２）ペプチド配列を抽出するためにＮおよびＣ末
端フランキング領域に対してアライメントし；（３）ＣＬＵＳＴＡＬＷ２における網羅的
なアライメントモジュールを用いてヌクレオチドレベルで鋳型ペプチド配列と比較し；（
４）アミノ酸配列に翻訳して、ペプチド領域にインデルエラーが存在するか否かを判定す
る。フィルターし、注釈を付けたペプチドライブラリを、頻度分析およびクラスター分析
に使用した。
【０１２９】
細胞培養。１０％ウシ胎仔血清および１ｍｇ／ｍＬジェネテシン１００μｇ／ｍＬハイ
グロマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＨＥＫ２９３−
ＧＬＰ−１Ｒ−ＧＦＰおよびＨＥＫ２９３−ＧＬＰ−１Ｒ−ルシフェラーゼ細胞を培養し
た。１０％ウシ胎仔血清および１ｍｇ／ｍＬジェネテシンを補充したＦ１２培地（Ｇｉｂ
ｃｏ）中で、機能的ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現する安定なＣＨＯ細胞株を培養した。１０％
ウシ胎仔血清および１ｍｇ／ｍＬジェネテシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（
ＤＭＥＭ）中で、機能的マウスＧＬＰ−１Ｒを発現するＨＥＫ２９３細胞株および機能的
ヒトグルカゴン受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞株を培養した。１０％ウシ胎仔血清お
よび１ｍｇ／ｍＬジェネテシンおよび１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを補充したＦ１
２培地中で、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現する、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＥＡ−β−アレスチ
ン−１  ＣＨＯ細胞およびＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＥＡ−β−アレスチン−２  ＣＨＯ細
胞（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ）を培養した。
【０１３０】
インビトロ薬理学。技術マニュアルの説明（ｃＡＭＰ  ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ＨＴＲＦ
アッセイキット、Ｃｉｓｂｉｏ）に従って、ｃＡＭＰ産生のペプチド誘導性ＧＬＰ−１Ｒ
介在性刺激の効果を測定するためのｃＡＭＰ  ＨＴＲＦアッセイを行った。簡潔に述べる
と、細胞を３８４ウェルプレートにおいて細胞１０００個／ウェルで２０μＬでプレーテ
ィングし、一晩培養した。翌日、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５ｘ溶液として調製し
た５μＬのペプチドを指示される濃度で細胞に添加した。ＧＬＰ−１を試験した場合、Ｐ
ＢＳにＤＰＰ  ＩＶ阻害剤（Ｔｏｃｒｉｓ）を補充した。室温で５分間温置した後、ＨＴ
ＲＦ複合物を含有する界面活性剤緩衝液中で細胞を溶解させた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレー
トリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において製造者の説明に従い、溶解物試料中のｃ
ＡＭＰの量を定量した。
【０１３１】
細胞内カルシウム動員におけるペプチドの効果を測定するために、ヒトＧＬＰ−１Ｒを
安定して発現するＣＨＯ細胞を、２０μＬの増殖培地中細胞１０，０００個／ウェルの密
度で、壁が黒色の３８４ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、培地を除去し、
１：１（ｖ／ｖ）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ：ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、２．５％（ｖ
／ｖ）ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭプロベニシド（ｐｒｏｂ
ｅｎｉｃｉｄ）および蛍光指示薬２μＭ  Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）か
らなる２０μＬのローディング培地で置き換えた。ローディング培地中で細胞を６０分間
温置した後、細胞および化合物プレートをＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ）に入れた。時間＝１０ｓでペプチド（ＨＢＳＳおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．４中の５ｘ溶液として調製）を添加し、４８８ｎｍの波長での励起、５１０〜５６０
ｎｍでの検出に従い、２５０ｓの時間にわたって蛍光の変化を監視した。ベースラインに
対する相対的変化（ΔＦ／Ｆ）を決定した。
【０１３２】
技術マニュアルの説明（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒβ−アレスチン動員アッセイ、Ｄｉｓｃ
ｏｖｅＲｘ）に従って、β−アレスチン動員におけるペプチドの効果を測定するためのＰ
ａｔｈＨｕｎｔｅｒβ−アレスチン動員アッセイを実施した。簡潔に述べると、ＧＬＰ−
１Ｒを発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＥＡ−β−アレスチンＣＨＯ細胞（Ｄｉｓｃｏｖ
ｅｒｘ）を、２０μＬのＦ１２培地中、細胞１００００個／ウェルで白色３８４ウェルプ
レート中で一晩播種し、一晩温置した。翌日、培地を除去し、２０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。次いで、細胞を室温で９０分間にわたりペプチド（ＰＢＳ
中５ｘ溶液として調製）またはビヒクルで刺激した。検出試薬を添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏ
ｎプレートリーダー上で発光を読み取った。細胞に基づくアッセイ全てについて、濃度お
よび実験あたり４個のウェルで、濃度−反応曲線（ＣＲＣ）を記録した。
【０１３３】
エキセンディン−４（Ｅｘ４）の最大活性濃度で得られた刺激と比較して、ペプチドの
効果を計算した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によってＣＲＣを決定した。
リガンド偏向は、Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８０，３６７−
３７７，２０１１に記載のような等活性（ｅｑｕｉａｃｔｉｖｅ）比較を使用して判定し
た。以下の式を使用して、参照ペプチドと比較した、あるシグナル状態の、別のシグナル
状態に対する相対的な関与を定量化する偏向因子（β）を計算した：
【数１】
2018511329.tif 000005
【０１３４】
ここで、Ｅｍａｘは最大効果であり、ＥＣ５０はペプチドの最大半量濃度であり、ｌｉ
ｇは試験されるペプチド（Ｐ５またはＧＬＰ−１）であり、ｒｅｆは参照ペプチド（Ｅｘ
４）であり、１はＧタンパク質経路に対する値に対するものであり、２はβ−アレスチン
経路に対するものである。
【０１３５】
動物。マウスは、餌および水を自由に摂取できる温度制御環境下で、１２：１２の飼育
室内の明暗サイクルで群として収容した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および雄ｏｂ／ｏｂマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｌｅｐｏｂ；Ｊａｃ
ｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に標準的な固形飼料（Ｔｅｋｌａｎｄ  Ｇｌｏｂ
ａｌ  Ｄｉｅｔ  ２９２０Ｘ；Ｈａｒｌａｎ）を与えた。研究で用いたとき、マウスは８
〜１０週齢の間であった。試験開始前に最低１８週間にわたり、雄ＤＩＯマウス、（Ｃ５
７ＢＬ／６マウス；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、脂肪由来の熱量が
６０％ｋｃａｌの高脂肪餌（高脂肪餌（６０％）ｄｉｅｔ  Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）である、糖尿病誘発飼料を与え、これらのマウスは６〜７カ月齢の間
であった。ＧＬＰ−１Ｒ  ＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）および野生型同腹仔を社内で飼
育し、標準固形飼料を与えた。マウス研究は全て、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  
Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に従って承認を受け、実施した。
【０１３６】
身体組成測定。核磁気共鳴技術（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ＬＦ−５０／ｍｑ  ７．５ＮＭＲ
；Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて全身組成を測定した。
【０１３７】
血液パラメータ。ヘパリン処理されたミクロヘマトクリット管（ＳａｆｅＣｒｉｔ）ま
たはＥＤＴＡ被覆マイクロキュベット管（Ｓａｒｓｄｅｄｔ）をそれぞれ用いて、尾静脈
から、または安楽死後に採血し、４℃で５０００ｇで５分間遠心分離し、血漿を−８０℃
で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡインスリンキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）および
Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ）の何れかを用いて、血漿インスリンを定量した。Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｃ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｐａｎｅｌを用いて、血漿ｃ−ペプチド、グルカ
ゴンおよびＧＩＰを測定した。酵素アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）によって、血漿トリグ
リセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＰ、ＡＬＴおよびＡＳＴを分析した。Ａ１ＣＮｏｗキッ
ト（Ｂａｙｅｒ）を用いてＨｂＡ１Ｃ値を決定した。アッセイは全て、製造者の説明に従
って行った。
【０１３８】
耐糖能試験（ＧＴＴ）。ＧＴＴは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＧＬＰ−１Ｒ  ＫＯマ
ウスを４時間、ｏｂ／ｏｂマウスおよびＤＩＯマウスを８時間絶食させた後に行った。マ
ウスに体重１キログラムあたり２ｇのグルコースを腹腔内注射し、ＡｐｈａＴＲＡＫ２グ
ルコメータ（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて指定時点で尾部血糖値を監視した。
【０１３９】
インスリン負荷試験（ＩＩＴ）。ＤＩＯマウスを４時間絶食させた後、ＩＴＴを行った
。マウスにインスリン（０．７５Ｕ／ｋｇ）を腹腔内注射し、ＡｐｈａＴＲＡＫ２グルコ
メータ（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて指定時点で尾部血糖値を監視した。
【０１４０】
組織学および免疫組織化学。リン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド溶液中で組織
を１２時間にわたり固定し、２０％スクロース中に一晩置き、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｓ
ＡＫＵＲＡ）に包埋し、使用するまで−８０℃で保存した。免疫蛍光染色のために、膵臓
切片（４μｍ）を抗インスリン抗体（ａｂｃａｍ）と、続いて適切な二次フルオロフォア
結合抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に温置し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル
インドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。膵島形態は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  
Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｆ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて可視化した。肝臓にお
ける脂質の存在を調べるために、標準的な手順に従い、切片（８μＭ）をオイルレッドＯ
（ＬＩＦＥＬＩＮＥ）で染色した。管腔の内容物を除去するためにＰＢＳをフラッシュす
る前に、遠位端から１ｇの錘を懸垂させることによる張力下で小腸の長さを測定した。次
に、重量測定前に、ＰＢＳを除去するために小腸全体を拭った。
【０１４１】
統計分析および一般的な方法。統計学的有意性を可能にするために、５〜１０匹の年齢
適合動物および体重適合マウスコホートをランダムに処置群または対照群に割り当てた。
統計分析（両側スチューデントｔ検定）を適用し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした
。
【０１４２】
ＧＬＰ−１Ｒ  ＣＲＥレポーター細胞株の構築：ヒトユビキチンＣプロモーター（Ｕｂ
Ｃ）の調節下でｈＧＬＰ−１Ｒを発現させるためにヒトＧＬＰ−１受容体をレンチウイル
スベクターにクローニングした。Ｌｅｎｔｉ  ＣＲＥレポーターレンチウイルス（Ｓａｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、最小ＣＭＶプロモーターおよびｃＡＭＰ応答エレメント（Ｃ
ＲＥ）のタンデムリピートの調節下でＧＦＰ遺伝子をコードする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に
対してＧＬＰ−１ＲコードおよびＣＲＥレポーターレンチウイルスの両方を同時感染させ
た。ＧＬＰ−１Ｒ  ＣＲＥレポーター細胞株は、エキセンディン−４の刺激に応答性があ
るＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳによる選別を通じて作製した。
【０１４３】
ＧＬＰ−１Ｒ  Ｔａｎｇｏレポーター細胞株の構築：ヒトＧＬＰ−１受容体を、そのＣ
末端での転写因子ＧＡＬ４−ＶＰ１６への融合物として、Ｔａｎｇｏ−ｐｃＤＮＡ−Ｂａ
ｉｔベクターにクローニングした。特異的切断配列ＴＥＶをＧＬＰ−１Ｒと転写因子との
間に挿入した。転写因子およびＴＥＶプロテアーゼタグ付加β−アレスチン２プレイベク
ターに応答性があるβ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有するＵ２ＯＳ細胞にこのＢ
ａｉｔベクターを遺伝子移入し、ジェネテシンの圧力下で安定した細胞株を選択した。安
定な細胞をエキセンディン−４で１８時間刺激し、ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ  Ｂ
／Ｇ基質を負荷した。ＭｏＦｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ蛍光活性化細胞選別機（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ）を用いて、青色と緑色との蛍光比が最大であった最も応答性が
高い細胞を選別した。
【０１４４】
＊＊＊
理解を明確にするために、例示および実施例によって、本発明をある程度詳細に記載し
てきたが、当業者に対して、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神また
は範囲から逸脱することなく、ある種の変更および修正がそれらになされ得ることが容易
に明らかとなろう。
【０１４５】
本願で引用される刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は
全て、それぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるかのように、
参照により本明細書中に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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