(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞、Ｂリンパ球または形質細胞が関与する疾患の治療に関する。具体的には、本発明は、Ｂ細胞が関与する疾患の治療において使用するための、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のＲＮＡでのエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞が関与する疾患の治療において使用するための、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のＲＮＡレベルでエクソンスキッピングを誘導することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項２】
前記軽鎖のＶＪ可変領域または前記重鎖のＶＤＪにおいてエクソンスキッピングを誘導することができることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記重鎖の定常領域においてエクソンスキッピングを誘導することができることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、または前記免疫グロブリン鎖の前記可変領域または前記定常領域のイントロン領域またはエクソン領域に位置するスプライシング調節配列、を含む配列とハイブリダイズすることによって、エクソンスキッピングを誘導することができることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記Ｂ細胞が関与する疾患は、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレーム病及び、Ｂ細胞に影響を与え及びモノクローナルＩｇの産生に関与する任意の他のタイプの癌から選択される、請求項２に記載の使用のための、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ｂ細胞が関与する疾患が、（ｉ）ＩｇＥ産生Ｂ細胞を標的とすることによる即時アレルギー、（ｉｉ）ＩｇＡが関与する免疫学的病態、（ｉｉｉ）自己抗体が関与する自己免疫疾患（ｉｖ）モノクローナル免疫グロブリン鎖の組織沈着に関連する病態、（ｖ）移植、から選択される、請求項３に記載の使用のための、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のＲＮＡにおいて、エクソンスキッピングを誘導することができる、ＡＯＮ混合物。
【請求項８】
プロテアソーム経路の阻害剤と組み合わせた多発性骨髄腫の治療において使用するための、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ系統の細胞、Ｂ細胞または形質細胞が関与する疾患の治療に関する。具体的には、本発明は、Ｂ細胞が関与する疾患の治療のための、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域または定常領域におけるエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、及びそのようなＡＯＮの混合物の使用に関する。最後に、本発明は、多発性骨髄腫の治療におけるプロテアソーム阻害剤による治療に対する認識を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、形質細胞の腫瘍クローンの骨髄中に存在することを特徴とする、治療不可能な癌である。ＭＭは、癌の約１％及び悪性の血液疾患の１０％を占め、この新生物Ｂを、リンパ腫に次ぐ造血起源の２番目の癌とする（Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒａｊｋｕｍａｒ、２００９）。ＭＭの発生率は１０万人あたり０．４〜６．３件の事例の範囲の大きな変動を示す。ＭＭ発症のリスクは年齢とともに増加し、診断時の年齢の中央値は６５を超える。ＭＭの発生率はまた、女性よりも男性の方が高い。高レベルの放射線（電離放射線、核放射線）及び農薬に暴露された人もまた、ＭＭを発症するリスクが高いようである。ほとんどのＭＭ患者において、この疾患は、骨髄腫に進行する前に、ＭＧＵＳ（意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症）と呼ばれる無症状期から始まる（Ｌａｎｄｇｒｅｎ、２０１３）。
【０００３】
ＭＭ患者に一般的に見られる臨床症状は、高カルシウム血症、腎不全、貧血及び骨病変である。骨の痛み、大きな疲労性、再発性の感染症及び体重減少などの他の症状が頻繁に観察される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１１、Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１１）。これらの臨床症状は、形質細胞クローンによるモノクローナルＩｇ（歴史的にＭタンパク質と呼ばれる）の異常な産生によって引き起こされる。
【０００４】
ＭＭは治癒不可能な疾患であるが、癌学の最近の進歩及び新しい治療薬の出現は、患者の全生存を改善している（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。
【０００５】
ＭＭの診断は、患者の血清及び／または尿の電気泳動及び免疫固定によるモノクローナル成分（Ｍタンパク質）の検出及び評価、Ｉｇの特性決定及び定量化（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇκまたはＩｇλ軽鎖、「遊離」軽鎖レベルなど）に基づく。骨髄生検が、形質細胞浸潤をこの疾患の進行及び攻撃性のマーカーとして評価するために実施する。骨病変は、画像化（Ｘ線、ＮＭＲ、断層撮影）によって評価される。他の生物学的因子（２−ミクログロブリン、アルブミン、Ｃ反応性タンパク質、クレアチニン、ヘモグロビン、カルシウム、乳酸脱水素酵素）の血清濃度は、この疾患の病期を分類し、その展開を予測することを可能にする。染色体異常（転座、欠失、低二倍性／高二倍性）の探索はまた、疾患の進行のリスクを分類することも可能にする。これらの基準の大部分は、ＭＭの国際分類システム「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＩＳＳ」（Ｇｒｅｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）及び「Ｔｈｅ  Ｍａｙｏ  Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ−Ａｄａｐｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ｍＳＭＡＲＴ」（Ｍｉｋｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）で用いられる。
【０００６】
骨髄腫患者の治療は、しばしば３つの段階を含む：
−誘導期：自家幹細胞移植前の腫瘍量を減少させることを目的とする。この化学療法には、一般に、免疫調節剤（例えば、サリドマイド）、プロテアソーム阻害剤（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）として市販されているボルテゾミブ）及びデキサメタゾンが含まれる。
−誘導期に十分に応答した適格な患者で実施される可能な自己幹細胞移植。
−維持期：化学療法剤と、アルキル化剤及びレナリドマイドを含み得る免疫調節剤との組み合わせからなる。この治療は、該患者において再発するまで維持される。
【０００７】
再発したときには、再発患者に異なる治療が施され得る（Ｄｉｓｐｅｎｚｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００８】
ＭＭの治療に使用される薬剤は、５つの主なクラスに分類される：アルキル化剤、アントラサイクリン、コルチコステロイド、免疫調節剤及びプロテアソーム阻害剤。
【０００９】
体液性免疫応答
体液性免疫応答は、まず、膜形態の免疫グロブリン（Ｉｇ）に関与し、次に可溶性Ｉｇ：抗体の分泌に依存する。Ｉｇは、可変数のジスルフィド架橋によって一緒に結合された２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む４つのポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体タンパク質である。Ｉｇは、抗原特異性を有する可変領域、及び重鎖については、分泌型抗体のエフェクター機能を決定する定常領域を有する。定常領域の構造によれば、Ｉｇのクラスを規定する２つのタイプの軽鎖（カッパまたはラムダ）及び５つの主要なタイプの重鎖（μ、δ、γ、εまたはα）が存在する。それらが機能的であることが判明した場合、可変領域（軽鎖についてはＶＪ、重鎖についてはＤＪ、次にＶ（Ｄ）Ｊ）をコードする遺伝子の連続的な再編成は、定常領域をコードする遺伝子上に転写されスプライシングされ得る可変エクソンを形成する。重鎖遺伝子座のレベルでは、このエクソンは最初に発現され、定常遺伝子Ｃμはすぐ下流に位置する。次に、「クラススイッチング」または「アイソタイプスイッチング」と呼ばれる第２のタイプの再編成が介入することができる。それはＣμ遺伝子の欠失を引き起こし、同じ再編成された可変領域を有する新しい定常遺伝子（例えばＣγ）の発現を可能にする。Ｉｇ遺伝子の組換えのこれらの複数の段階は、Ｂリンパ球前駆細胞の段階から抗体分泌形質細胞の段階までの範囲のＢ細胞の成熟の間に細かく調節される。
【００１０】
Ｉｇ遺伝子の機構
異なる免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子は、別々の染色体上に位置する３つの遺伝子座を占める。それらは一般的な共通構造を有し、Ｂ細胞株において特異的に発現される。各々は、抗原に対する受容体の可変部分をコードする複数の遺伝子セグメントと、定常部分をコードする１つ以上の遺伝子とからなる。それらの初期の配列において、Ｉｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は直接機能的ではない。完全に機能的になるためには、これらの遺伝子は内部組み換えまたは遺伝子内再編成が起こらなければならない。これらの再編成は、重鎖及び軽鎖の可変部分をコードするセグメント間でＢ個体発生の初期段階に起こり、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる。
【００１１】
−Ｉｇ重鎖のヒト遺伝子座（第１４染色体）：重鎖遺伝子は多数のＶ（可変）セグメント及びＤセグメント（これらのいわゆる「多様性」セグメントは重鎖遺伝子座に特異的である）及び６個のＪセグメントを含み、定常領域をコードする９個の遺伝子も存在する。各定常遺伝子は、各重鎖に特異的な構造ドメインをコードする複数のエクソンから構成される。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの間、セグメントは６個のＪセグメントのうちの１つをランダムに伴い、このＤ−ＪＨ結合の再編成はＶセグメントで行われる。可変部分は、メッセンジャーＲＮＡをスプライシングすることによって定常領域と関連する。Ｉｇの膜形態の分泌された形態への通過は、同じ一次重鎖転写物の選択的スプライシングによって行われる。
【００１２】
−Ｋａｐｐａ軽鎖遺伝子座（第２染色体）：κ軽鎖遺伝子は、多数のＶセグメント及び５つの機能的なＪセグメントを含み、単一のＣκ定常遺伝子が存在する。軽鎖遺伝子の再編成中、Ｖセグメントは５つのＪセグメントのうちの１つにランダムに結合する。
【００１３】
−ラムダ軽鎖遺伝子座（第２２染色体）：λ軽鎖遺伝子は、他の２つのいわゆるグループ化された遺伝子座とは比較的異なる構造を有する。多くのＶセグメント（２９〜３３）及び４〜５個の機能的Ｊセグメント及びＣセグメントが存在する。
【００１４】
Ｂ細胞の形質細胞への分化
形質細胞クローンの起源は、ｐｏｓｔ胚中心のＢ細胞（ｐｏｓｔ−ｃｅｎｔｅｒ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ）である。Ｂ細胞の分化は、骨髄中の抗原の非依存性過程及び二次リンパ器官（脾臓、リンパ節など）における抗原活性化に依存する過程の２つの過程で行われる。抗原の非依存性過程の間、Ｂ前駆体はそれらのＩｇ遺伝子の再編成を受ける。これらの組換えは、Ｉｇ重鎖のＶ（可変）、Ｄ（多様性）及びＪ（接合）セグメント、及び軽鎖遺伝子座のＶ及びＪセグメントの順序付けられたアセンブリによって行われる。これらのＶ（Ｄ）Ｊ接合は非常に多様化しており、ほとんど無数の抗原を認識することができる多数のＩｇの発現を可能にする。単一のＩｇを合成する各Ｂ細胞は、通常、自己抗原に対する反応性を欠いており、積極的に選択される。増殖の異なる段階の後、このＢ細胞は同じＩｇを発現するクローンを生じる。
【００１５】
次に表面免疫グロブリンによる抗原の認識により、いくつかの遺伝子改変プロセスが起こる胚中心に活性化Ｂ細胞が入る。活性Ｂ細胞は、特に、定常重鎖遺伝子のレベルで再編成を受けることができる。これらの遺伝子組換えは、多くのサイトカインの影響を受け、ＩｇＭ以外の新しいクラスの免疫グロブリンの発現を可能にする。クラススイッチ機構は、定常セグメントの５’側に位置するスイッチ領域の結合と、染色体外環状ＤＮＡの形態の介在領域の排除に基づく。胚中心において、本質的に可変セグメントに位置する特定のヌクレオチド改変または短い挿入または欠失に対応する体細胞突然変異は、抗原に対するＢ細胞受容体の親和性の増加を可能にし、高親和性記憶Ｂ細胞のプールを構成することを可能にする。活性化されたＢ細胞はまた、血清中で非常に大量の免疫グロブリンを合成及び分泌する形質細胞に分化することができる。次いで、形質細胞は、間質細胞によって産生されるインターロイキン−６などの生存シグナルを受ける骨髄に到達することができる。これらの長寿命の形質細胞は、体内で数ヶ月または数年間生存できる。それらのｐｏｓｔ中心胚状態と一致して、骨髄腫細胞はＩｇＧ及びＩｇＡを産生し、ＩｇＤ及びＩｇＥはまれにしか生成せず、免疫グロブリン遺伝子において高い体細胞超変異率を有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｒａｓｃｏ，２０１１）。
【００１６】
形質細胞による大量のＩｇ合成は、形質細胞の生存に有害な小胞体（ＥＲ）の過負荷を避けるために細かく調節する必要がある。
【００１７】
本発明者らは、形質細胞の生理学的分化の間にトランケートしたＩｇの毒性を強調する革新的な結果を得た（Ｓｒｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１５，出版が容認されている）。興味深いことに、形質細胞によるトランケート型Ｉｇの産生は、細胞ストレスを誘導し、これらの形質細胞のアポトーシスを引き起こす。
【００１８】
これらの結果に基づいて、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いてトランケート型Ｉｇの産生を誘導することに関与して病態の形質細胞を除去する新規な治療アプローチを開発した。これらのＡＯＮは、Ｉｇ重鎖または軽鎖のＲＮＡでエクソンをスキップさせ、トランケート型Ｉｇの発現を引き起こし得る。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の１つの可変領域または定常領域の１つにおいてエクソンスキッピングを誘導することができる少なくとも１つのＡＯＮを患者に投与することを含む、Ｂ細胞が関与する疾患の治療方法に関する。
【００２０】
「Ｂ細胞」は、Ｂ細胞及び形質細胞を意味する。
【００２１】
第１の実施形態において、本発明は、Ｉｇ軽鎖または重鎖の可変領域の排除のためのＡＯＮの使用に関する。
【００２２】
実験部分の結果は、具体的には実施例３において、そのようなアプローチを示す。具体的には、本発明者らは、このクローンによって発現される軽鎖エクソンＶＪのスプライスドナー部位の配列と特異的にハイブリダイズすることができるＡＯＮで骨髄系統をトランスフェクトすることにより、細胞は、アポトーシスによって死滅するトランケート型Ｉｇを産生することを示した。この結果は、本発明のコンセプトの証明となる。本発明者らはまた、トランスフェクションの存在しない場合にＡＯＮ処理の有効性を研究するための方法論を検証した。したがって、本発明は、Ｉｇ軽鎖の可変部ＶＪを標的とするＡＯＮを使用してＢ系統のクローンを排除することに関する。このようなアプローチは実施例４．１に示されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は、λ軽鎖上に位置する可変エクソンのスプライスドナー部位に対して指向されたＡＯＮを使用することからなる。この使用のための好ましいＡＯＮは、配列番号５の配列のＡＯＮである。
【００２４】
同様に、本発明は、産生されたＩｇが重鎖のＶＤＪ可変部分を欠くようにエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮを用いて実施することができる。このような戦略を実施例４．２．２に示す。
【００２５】
「エクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮ」とは、スプライシング後に得られた成熟ｍＲＮＡが除去される必要があるタンパク質ドメインの翻訳を可能にしないように、標的領域に特異的に結合する任意のＡＯＮを意味する。「排除されるべきドメイン」は、重鎖または軽鎖の可変領域、または重鎖の定常領域の少なくとも一部を意味する。ＡＯＮによって標的とされる配列は、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、またはスプライシング調節配列、例えばイントロンまたはエクソン領域に位置するエンハンサーを含み得る。さらに、本発明によるＡＯＮは、免疫グロブリン鎖の可変領域または定常領域の、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはイントロンまたはエクソン領域に位置するスプライシング調節配列を含む配列とハイブリダイズすることによってエクソンスキッピングを誘導することができる。このＡＯＮは、Ｂ細胞が関与する疾患の治療に使用することができる。
【００２６】
Ｂ細胞に可変ドメインを欠いたＩｇを産生させることを目的とする治療アプローチは、個別化医療の枠組みの中で実施することができる。疾患の要因であるＢクローンが同定されると、可変領域の配列決定が行われ、その配列に特異的にハイブリダイズすることができるＡＯＮを選択して薬剤として投与することができる。
【００２７】
例えば、ＭＭの場合、腫瘍クローンによって産生されたモノクローナルＩｇ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇκまたはＩｇλ軽鎖）は、患者の血清についての電気泳動及び免疫固定によって求められる。次いで、骨髄生検は、形質細胞浸潤の評価を可能にし、Ｉｇ転写物の特異的増幅によって腫瘍クローンのＶ（Ｄ）Ｊ再編成を特徴付けることができる（Ｖａｎ  Ｄａｇｅｎ  ＪＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００３，Ｂｒｉｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２００５）。腫瘍クローンによって運ばれるＶ（Ｄ）Ｊ再編成の同定後、標的化された再編成の特異的ＡＯＮを用いて、可変ドメインを欠くトランケート型Ｉｇを産生する。
【００２８】
Ｉｇ転写物の増幅による同様の予備的アプローチは、任意の腫瘍Ｂ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ再編成の特徴付けに適用可能である。
【００２９】
したがって、一般に、病態クローンによって産生されるＩｇのタイプは、患者の血液サンプルまたはリンパ組織から決定することができる。それで、関与するクローンの軽鎖または重鎖のタイプを決定することが必要である。さらに、骨髄性癌の治療に対する個人化医療のアプローチの一部として、腫瘍クローンの特異的な可変配列は、患者の脊髄生検から得ることができる。腫瘍クローンのＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子によって運ばれるＶ（Ｄ）Ｊ再配列の同定の後、可変エクソンの排除は、例えば、再編成に関与するＪセグメントのスプライスドナー部位に対して向けられたＡＯＮによって行われる。
【００３０】
したがって、個人化医療アプローチの文脈において、本発明によるＡＯＮの使用は、以下の工程を含む：
ａ．患者試料からの疾患の要因となるＢ細胞クローンの同定：このクローンによって産生されたモノクローナルＩｇの重鎖及び軽鎖アイソタイプの同定、
ｂ．前記Ｂ細胞クローンによって発現される重鎖または軽鎖の可変領域の特定の再編成の特徴付け、
ｃ．前記クローンの免疫グロブリン鎖の１つの可変領域の１つにおいてエクソンスキッピングを誘導することができる少なくとも１つのＡＯＮを提供すること、
ｄ．前記ＡＯＮ又はＡＯＮ混合物の患者への投与。
【００３１】
可変ドメインの排除を可能にする個人化医療のこれらの治療アプローチは、腫瘍細胞のＶ（Ｄ）Ｊ再編成の同定に基づいている。したがって、これらの戦略は、Ｉｇ親和性成熟プロセス中に可変エクソンに導入される最終的な体細胞突然変異を考慮に入れる。
【００３２】
したがって、Ｉｇ軽鎖または重鎖の可変領域におけるエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮの投与からなる治療アプローチは、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレーム病、及びモノクローナルＩｇの産生に関与する任意の他のタイプのＢ細胞癌が含まれる。
【００３３】
この個人化アプローチは、健康なＢ細胞を温存し、したがって患者の免疫防御を保存しながら、腫瘍クローンを特異的に排除することを可能にする利点を提供する。したがって、この標的化された治療アプローチは、Ｂ細胞癌において現在使用されている「過酷な」療法とは対照的に、大きな革新である。
【００３４】
第２の実施形態では、本発明は、Ｂ細に関与する疾患を治療するために、Ｉｇ重鎖の定常領域からの少なくとも１つのエクソンの排除のためのＡＯＮの使用に関する。
【００３５】
本発明者らは、Ｂ細胞によるトランケート型Ｉｇの産生が、アポトーシスによる前記細胞の死をもたらすＥＲにストレスを引き起こすことを実証した。したがって、これらのトランケート型Ｉｇの毒性を説明する仮説の１つは、細胞がミスフォールドタンパク質（特定のドメインが存在しないため）の産生に対して敏感であり得ることである。この文脈において、それらの定常ドメインの少なくとも一部を欠くＩｇを産生するＢ細胞は、それらの可変ドメインを欠くＩｇを発現する細胞と同じ表現型を提示することが予測され得る。
【００３６】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、重鎖の定常領域でのエクソンスキッピングを誘導して、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３エクソンの少なくとも１つを排除できるＡＯＮに関する。それらの定常ドメインの少なくとも一部を欠くＩｇを産生するアプローチは、実施例４．２．３に示されている。
【００３７】
Ｉｇ重鎖からの定常のエクソンの排除を可能にするこの治療戦略は、腫瘍細胞のＶ（Ｄ）Ｊ転位の同定に基づいて、可変ドメインの排除のための以前に記載された個別化医療よりも広い作用スペクトルを有する。実際、定常のエクソンの排除は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥのいずれかを発現するＢ細胞を特異的に標的とすることを可能にする。
【００３８】
「個別化医療」アプローチと区別するために、「ジェネリック医薬品」という用語は、可変領域の再構成とは独立した基準に従って病態を治療するアプローチを説明するために使用される。標的化される領域の選択は、病態Ｂ細胞によって産生されるＩｇ重鎖または軽鎖のアイソタイプに依存する。
【００３９】
この一般的な戦略は、Ｂ細胞リンパ系統の癌の治療（上記の個人化医療のアプローチの代替として）に適用できるが、非癌性Ｂ細胞に関与する多数の病態の治療にも適用できる。
【００４０】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、Ｉｇ重鎖定常遺伝子を標的とするＡＯＮ薬剤の使用に関与し、この治療アプローチは、以下のような多くの病態に適用することができる：
−ＩｇＥを産生するＢ細胞を標的とすることによる即時性アレルギー、
−ＩｇＡが関与する免疫学的病態、
−ＩｇＡを産生するＢ細胞を標的とすることによりＩｇＡ（ＩｇＡ腎症、慢性関節リウマチなど）の沈着またはＩｇＡに特異的な免疫学的病態特性（疱疹状皮膚炎、ＩｇＡの線状沈着を伴う皮膚疾患など）に関与する特定の免疫アレルギー病態、
−実証された直接病原性（例えば、自己免疫甲状腺炎、Ｂｉｅｒｍｅｒ病、自己免疫血球減少症など）を有する一群の自己抗体を産生する細胞を標的とすることによって自己抗体及び／または組織特異的抗体に関与する自己免疫疾患、
−モノクローナル免疫グロブリン鎖（アミラーゼ、ファンコニ症候群、ランドール症候群、クリオグロブリン血症など）の組織沈着（腎臓、心臓、肝臓など）に関連する病態、
−移植（ＩｇＧクラス同種抗体が関与する急性拒絶反応）。
【００４１】
本発明のもう１つの主題は、Ｂ細胞が関与する疾患の治療に使用するための、免疫グロブリン重鎖または軽鎖ＲＮＡにおいてエクソンスキッピング誘導することができるＡＯＮである。したがって、本発明によるＡＯＮは、Ｂ細胞が関与する疾患の治療に使用するための、重鎖または軽鎖可変領域または、重鎖上のその定常領域の少なくとも一部、を欠く免疫グロブリンの産生を誘導することができる。
【００４２】
本発明はまた、Ｂ細胞が関与する疾患の治療を意図した薬物の調製のための、重鎖または軽鎖上の可変領域、または重鎖上のその定常領域の少なくとも一部、を欠く免疫グロブリンの産生を誘導することができるＡＯＮの使用に関する。
【００４３】
前述の点から、エクソンのスキッピング及びトランケート型Ｉｇ産生を誘導するＩｇ転写物を標的とするＡＯＮの治療的適用は、Ｂ細胞に影響を及ぼすほとんどすべての疾患をカバーすることができる。
【００４４】
上記で定義したような一般的なアプローチの文脈において、本発明は、薬剤としてのＡＯＮの混合物を提案することによって実施することができる。
【００４５】
したがって、本発明の別の目的は、トランケート型Ｉｇの産生を特異的に誘導することができるＡＯＮ混合物である。
【００４６】
ＡＯＮ混合物は、作用スペクトルを広げ、及び／またはこれらの治療アプローチの毒性を増加させるために提供され得る。組み合わせは複数であり、以下では、「治療可能な」ジェネリック医薬品として大きな治療上の関心及び／または高い可能性を示すいくつかの混合物の提示がある。
【００４７】
−  Ｂクローンの重鎖及び軽鎖のＶ（Ｄ）Ｊ再編成に関与するＪセグメントを標的とするＡＯＮ混合物。
【００４８】
そのような混合物は、治療毒性を高めるための個人化医療アプローチの文脈、すなわちその有効性に関して、特に興味深い。
【００４９】
−  カッパ軽鎖のすべてのＪセグメントを標的とするＡＯＮ混合物
【００５０】
このような混合物は、Ｂ細胞の約６０％に相当するＩｇκ集団を選択的に破壊することを可能にする。このような一般的なアプローチの利点は、Ｉｇλを発現するＢ細胞（全Ｂ集団の約４０％）を保存しながら、腫瘍クローンの排除を可能にすることである。原因とみなすＩｇがＩｇκである疾患の治療に有用である。
【００５１】
−ラムダ軽鎖のすべてのＪセグメントを標的とするＡＯＮ混合物
【００５２】
そのような混合物は、Ｂ細胞の約４０％に相当するＩｇλ集団を選択的に破壊することを可能にする。このような一般的なアプローチの利点は、Ｉｇκを発現するＢ細胞（全Ｂ集団の約６０％）を保存しながら、腫瘍クローンの排除を可能にすることである。原因とみなすＩｇがＩｇλである疾患の治療に有用である。
【００５３】
−  重鎖のすべてのＪセグメントを標的とするＡＯＮブレンド
【００５４】
そのようなアプローチは、すべてのＢ細胞の破壊、すなわち免疫抑制を達成することを可能にする。
【００５５】
したがって、本発明の文脈において、「ＡＯＮ」という用語は、記載されている使用及び方法に影響を及ぼすことなく、「ＡＯＮ混合物」に置き換えることができることに留意すべきである。
【００５６】
前述の配列を標的とするためのＡＯＮの選択は、当業者が扱う範囲内である。このようなＡＯＮは、要求に応じてＡＯＮの調製を専門とする商事会社から入手可能である。
【００５７】
本発明はまた、プロテアソーム阻害剤によるＭＭの治療の増感方法であって、ＭＭの原因となるＢクローン中の、重鎖または軽鎖上の可変領域、または重鎖上のその定常領域の少なくとも一部分、を欠く免疫グロブリンの産生を誘導することができるＡＯＮを投与することを含む方法に関する。
【００５８】
本発明はまた、プロテアソーム経路の阻害剤と組み合わせる多発性骨髄腫の治療におけるその使用のための、重鎖または軽鎖上の可変領域、または重鎖上のその定常領域の一部、を欠く免疫グロブリンの産生を誘導することができるＡＯＮに関する。
【００５９】
ＭＭに対する一般的な治療法は現在、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、Ｂｚ）である。しかし、この治療法は重大な副作用を伴い、そして一部の患者はそれに耐性を示しているか、または耐性になっている。
【００６０】
ｈｓｐ９０及びボルテゾミブ（Ｂｚ）の阻害剤の併用使用は、ミスフォールドタンパク質の割合の増加及びプロテアソームによるそれらの分解の減少をそれぞれ引き起こす相乗効果を有することに留意すべきである（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＤＧ  ａｎｄ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０１１）。したがって、Ｂｚ治療に細胞を感作させるために細胞ストレスを増加させることを目的とした治療プロトコルは非常に有望であり、Ｂｚ耐性の患者に特に適しているようである。これらの組み合わせ療法は、ＭＭ患者を低用量のＢｚで治療する、または治療期間の間隔をあけるためにも使用することができる。「組み合わせ治療」とは、プロテアソーム阻害剤及び本発明によるＡＯＮまたはＡＯＮ混合物の同時投与、またはこれらの薬物の逐次投与を意味する。
【００６１】
これに関連して、本発明者らは、ＭＭ患者のＢｚ治療と組み合わせて、本発明に記載のＡＯＮの使用に基づく治療アプローチを使用することを提案する。
【００６２】
この組み合わせたアプローチは、Ｂｚを用いて行うことができるが、他のプロテアソーム阻害剤とでも行うことができる。
【００６３】
本発明のＡＯＮまたはＡＯＮ混合物と組み合わせて使用することができる他のプロテアソーム阻害剤の中には、カーフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（商標））及び現在開発中の他の分子、例えばマリゾミブ、イキサゾミブ（ＭＬＮ−９７８）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）及びＯＮＸ−９１２が挙げられる。
【００６４】
本発明の利点は、これらの実施形態及びその用途の説明から明らかになる。特に、提案された治療アプローチは非侵襲性であり、破壊されるＢ細胞集団の正確な標的化を可能にする。したがって、副作用が限定されるべきである。さらに、有効性は、ＡＯＮ混合物を投与することによって調整することができる。これらの特徴は、患者が一般に十分に耐えられず、治療的に不十分である現在の治療と比較して、このアプローチを非常に魅力的にする。
【００６５】
本発明の文脈において有用なＡＯＮは、任意の適切なガレヌス形態で投与され得る。現在、ＡＯＮを用いた多くの治療法が前臨床及び／または臨床試験を受けている（Ｍｏｒｅｎｏ  ａｎｄ  Ｐｅｇｏ，２０１４）。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示することを意図しており、その範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】：マウスＢ細胞のトランケート型Ｉｇの影響のエクソンスキッピング及び分析の提示。Ａ）マウスＢ細胞のトランスフェクションに使用される構築物（Ｓ１９４、Ｓｐ２／０）。異なる構築物は、機能的（Ｆ）または非機能的（Ｖ終止＊、Ｃ終止＊）Ｉｇκ軽鎖の転写物の発現を可能にする。Ｂ）可変エクソンの正常または欠損（「ΔＶ−κＬＣ：Ｖドメインレスκ軽鎖」）のＩｇκメッセンジャーＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｃ）トランスフェクションされたまたはされていない（ＮＴ）、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２：１μＭ、８時間）を用いた治療を伴うかまたは伴わないかに関わらない、ＳＰ２／０細胞上で行われた正常Ｉｇκ軽鎖（κＬＣ：約２５ＫＤ）及びトランケート型（ΔＶκＬＣ：約１２ＫＤ）のタンパク質分析（ウェスタンブロットマウス抗Ｉｇκ）。Ｄ）ＭＧ１３２（１μＭ、５時間）処理後の陽性Ｓ１９４アネキシンＶ細胞（％）の増加を表すＳ１９４細胞のアポトーシス指数。Ｅ）ＣＨＯＰの相対的発現を、ＭＧ１３２（１μＭ、５時間）で処理したかまたは処理しなかったＳ１９４細胞の定量的ＰＣＲによって分析した。「終止＊：ＶセグメントとＪセグメントの接合部におけるオープンリーディングフレームのオフセットに連続する未成熟終止コドン」。
【図２】：トランケート型Ｉｇの誘導発現を可能にするマウスモデルｉＴＩＥ（「誘導性トランケート型−Ｉｇ発現」）の生成及び分析。Ａ）トランケート型Ｉｇ（Ｌ：リーダーエクソン、Ｃκ：Ｃκ定常エクソン）を産生することを可能にするモデルの代表的な図。ｉＴＩＥ／＋動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配させ、ＮｅｏＲ遺伝子を排除し、可変エクソンを含まないＬ−Ｃκ短転写物の発現を可能にした。Ｂ）Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅｐｏｓ）を発現するマウスにおいてのみトランケート型Ｉｇ（「ΔＶ−κＬＣ：Ｖドメインなしκ軽鎖」）の実証。ウェスタンブロット（マウス抗Ｉｇκ）により正常Ｉｇκ軽鎖（κＬＣ：約２５ＫＤ）及びトランケート（ΔＶκＬＣ：約１２ＫＤ）のタンパク質分析（ウェスタンブロットマウス抗Ｉｇκ）。ボルテゾミブ（Ｂｚ）の投与は、「方法」の項に示すように、ｉＴＩＥマウスにおいて腹腔内で行った。Ｃ）ヒツジ赤血球による免疫化の７日後に、ホモ接合動物ｉＴＩＥ／ｉＴＩＥの脾臓細胞上で行われたＢ細胞集団（Ｂ２２０ｐｏｓ）及び形質細胞（Ｂ２２０ｎｅｇＣＤ１３８ｐｏｓ）のフローサイトメトリー分析。Ｄ）「方法」の項に示すように、ＥＬＩＳＡによって実施された８〜１２週齢のマウスの血清で達成されたＩｇレベルの分析。Ｅ）形質細胞をパネルＣに示すように選別し、ＧＡＰＤＨ発現に対する標準化後に定量ＰＣＲにより転写物分析を行った。
【図３】：Ｊλ２セグメントのスプライスドナー部位を標的とするＡＯＮの開発。ＲＰＭ１８２２６系統（大文字：Ｊλ２セグメントの配列、小文字：Ｊλ２の３’に位置するイントロン配列）で同定されたＩｇλ転写物のＤＮＡ配列を表す図。Ｊλ２セグメントのスプライスドナー部位（下線で示した配列）で一次転写物にハイブリダイズすることができるＡＯＮ（太字）を合成した。（Ｌ：「リーダー」エクソン、ＶＪ：可変エクソンＣ：定常エクソン）。このＡＯＮの配列は、配列番号５に対応する。
【図４】：ＲＰＭ１８２２６骨髄腫細胞におけるＡＯＮの投与。Ａ）Ｊλ２セグメントのスプライスドナー部位を標的とすることにより、一次Ｉｇλ転写物にハイブリダイズすることができるＡＯＮの投与を表す図。ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ型ＡＯＮ（対照及びＪλ２特異的）は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣによって合成された。ＰＣＲプライマーの位置は、矢印によって示されている。（Ｌ：「リーダー」エクソン、ＶＪ：可変エクソン、Ｃ：定常エクソン）。Ｂ−Ｄ）ＡＯＮによるＲＰＭ１８２２６細胞（３×１０６個）のトランスフェクションの４８時間後に実験を行った。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）及びウェスタンブロットタンパク質分析（Ｃ、抗ｈＩｇλ）は、エクソンスキッピングによるエクソンの可変排除を示す。Ｄ）正規化ＣＨＯＰ及びＧＡＰＤＨ発現に対して正規化されたＢｉＰ転写物の定量的ＰＣＲ分析。Ｅ）トランスフェクションの非存在下で、ＡＯＮの受動投与による可変エクソンの排除。Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣから市販されている「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」（対照及びＪλ２特異的）ＡＯＮ（１０μＭ）を用いて、ＲＰＭ１８２２６細胞（１×１０６個）を４時間インキュベートした。洗浄後、細胞を４８時間培養し、培養の２４時間後及び４８時間後にＲＴ−ＰＣＲによりエクソンスキッピング分析を行う。可変エクソンの排除は、パネルＢに示されるように２５３ｂｐバンドの出現によって視覚化される。
【図５】：エクソンをスキッピングさせて形質細胞中の有毒なトランケート型Ｉｇを産生させる。Ｊκ５セグメントのスプライスドナー部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の投与を示す図。初代Ｉｇκ転写物上のＡＯＮのハイブリダイゼーションは、スプライシング中のＶＪ可変エクソンの排除を引き起こす。短い転写物は、Ｂリンパ系統において有毒な可変ドメインを欠くＩｇ鎖の大量合成を可能にする。
【図６】：μ重鎖の発現及び分泌型形態への膜型形態の通過。Ｂ細胞及び形質細胞では、Ｉｇ（ここではμ重鎖）は、それぞれ膜型及び分泌型で産生される。膜型Ｉｇは、第１の膜エクソン（Ｍ１）にスプライスされたＣＨ４内部スプライス部位、第２の膜エクソン（Ｍ２）の後に位置するポリアデニル化（ポリＡ）部位の使用により産生される。形質細胞は本質的に分泌型のＩｇを産生する。分泌されたμ重鎖の場合、ＣＨ４内部スプライス部位は使用されず、転写物はこのエクソンの３’部分（黄色で表される）を含み、直接下流に位置するポリＡ部位を用いる（出典Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【図７】：エクソンをスキッピングさせて、Ｖドメインを欠くトランケート型重鎖を産生する。Ｊ−セグメントスプライスドナー部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の投与を表す図。一次転写物上のＡＯＮのハイブリダイゼーションは、スプライシングの間のＶＤＪ可変エクソンの排除を引き起こす。短い転写物は、可変ドメインを欠くＩｇ鎖の大量合成を可能にする。
【図８】：エクソンをスキッピングさせて、定常ドメインエクソンにトランケート型重鎖を産生させる。図は定常エクソン（ＣＨ１）のスプライスドナー部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の投与を表す。一次転写物上のＡＯＮのハイブリダイゼーションは、スプライシング中の定常エクソン（ＣＨ１）の排除を引き起こす。短い転写物は、定常ドメイン（ＣＨ１）の１つを欠くＩｇ鎖の大量合成を可能にする。
【００６８】
材料及び方法
トランスジェニックｉＴＩＥマウスの入手及び分析
誘導性トランケート型Ｉｇ発現（ｉＴＩＥ）マウスモデルは、前述の相同組換えによって得られたＩｇκ軽鎖遺伝子座での遺伝子改変を示す（Ｓｉｒａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。マウスＪκセグメントを、ＩｏｘＰ部位に囲まれた、プロモーター（ｐＶＨ）、リーダーエクソン（Ｌ１−３３）及びネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を含むカセットで置換した。逆向きのＮｅｏＲ遺伝子の転写は、リーダーエクソンの転写及び／またはスプライシングをブロックすることを可能にする（図２Ａ）。
【００６９】
すべての実験に２−３ヶ月齢のマウスを使用し、Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｍｏｕｓｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（番号Ｃ２ＥＡ−３３の下にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって登録された）に従って実施され、番号ＣＲＥＥＡＬ  ６−０７−２０１２に登録されたプロトコルの一部として承認された。ヘテロ接合変異マウス（ｉＴＩＥ／＋）を少なくとも３世代にわたりＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスと交配させ、次いでＣｒｅ発現マウスと交配させてＮｅｏＲカセットの欠失を誘導した。Ｂ６  ＣＭＶ−ＣｒｅマウスはＭｏｕｓｅ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）からのものである。
【００７０】
Ｂ細胞の後期発生を分析するために、ヒツジ赤血球（ＧＲ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（登録商標）ＳＡ−Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内注射（２００μｌ／マウス）による免疫化の７日後に、ｉＴＩＥマウス脾臓から細胞を単離した。図２Ｂに示すように、マウスは、５及び６日目にボルテゾミブ（Ｓｉｌｌａｇ）の皮下注射（０．５ｍｇ／ｋｇ）の追加投与を受けた。Ｂ細胞及び形質細胞の分析は、抗ＧＬ７、抗Ｂ２２０及び抗ＣＤ１３８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した後、フローサイトメトリーによって行われた。
【００７１】
ＡＯＮの細胞トランスフェクション及び受動的投与
１０％ウシ胎仔血清（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地で、マウス系統（Ａ２０、Ｓ１９４及びＳｐ２／０））を培養した（１０６細胞／ｍＬ）。
細胞（２×１０６個）は、メーカー（Ａｍａｘａ）の使用説明書に従ってエレクトロポレーションにより安定にトランスフェクトされた。ＶκＪκ５再編成は、セグメントＶκ１−１３５及びＪκ５を連結することによって作製される。接合の間、ヌクレオチドは、非機能的再編成を模倣するリーディングフレームのオフセットを作成するために統合される。トランスフェクションを、リーディングフレーム（Ｆ）及び非生産的ＶＰＴＣ及びＣＰＴＣ構築物に関するプラスミド構築物を用いて以前に記載されたように（Ｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＦとＶＰＴＣまたはＣＰＴＣの等モル混合物で、または別々に行った。トランスフェクトした細胞（１×１０６個／ｍＬ）をプロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１μＭ）で処理した。
【００７２】
メーカー（Ａｍａｘａ）の使用説明書に従ってエレクトロポレーションによって、異なる濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド（１，５または１０μＭのＡＯＮ−Ｊλ２：５’ＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＣＧＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣ））で骨髄腫細胞（３×１０６個）（ＲＰＭ１８２２６系統）をトランスフェクトした。次いでトランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に分析を行った。
【００７３】
ＡＯＮの受動的投与は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣによって市販されている「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」（対照及びＪλ２特異的）ＡＯＮで行った。これらのＡＯＮは、細胞に受動的に入る能力を与える化学修飾を有する。患者細胞に適用可能なこの方法の開発は、前臨床試験の実現のための大きな前進を意味する。ＲＰＭ１８２２６細胞（１×１０６個）をＡＯＮ（ＰＢＳ中１０μＭ）とともに４時間インキュベートした。洗浄後、細胞を完全培地で培養し、培養の２４時間後及び４８時間後にＲＴ−ＰＣＲによりエクソンスキッピング分析を行う。
【００７４】
「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮの受動的投与実験もまた、ＬＰＳによってインビトロで刺激されたマウス初代Ｂ細胞で行われた。
【００７５】
タンパク質分析
ウエスタンブロット分析のために、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。次いで、各試料を、ローディング前に９４℃で３分間変性させた。ゲルをＴｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）装置を用いてポリフッ化ビニリデン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）膜に移した。膜ブロッキングは、５％スキムミルク粉末を含有するＰＢＳＴ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）中で行われた。シグナルは化学発光（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって測定された。ウサギ抗体は、マウスＨＥＲＰタンパク質（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＩＲＥ１α（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギ抗Ｉｇκ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びマウス抗ＧＡＰＤＨ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して向けられた。サンプル間の正規化にはＧＡＰＤＨ信号強度を用いた。
【００７６】
上述したように（Ｐｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｓｉｒａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ｉｇレベルを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを、マウスＩｇ（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ｂ、Ｉｇκ、Ｉｇλ及び総ＩｇＧ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するヒツジ抗体を用いて、血清または培養上清から実施した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して酵素顕色を可能させた後、プレートを４０５ｎｍの波長で読み取った。
【００７７】
ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ
ＶＪ再編成を分析するために、特異的なヒトＩｇλの特異的対（Ｓｅｎｓ  Ｌｅａｄｅｒ−ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ：５’−ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＤＹＹＶＹＤＣＴＶＹＴＹＣＴ（配列番号１）Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧである、及びＣλ−ＡＳアンチセンス：５’−ＣＴＣＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＴ（配列番号２））またはマウスＩｇκ（Ｌ１−１３５−Ｓ：５’−ＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣ（配列番号３）及びＣκ−ＡＳ：５’−ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣ（配列番号４））に特異的のもの、を用いて増幅を行った。増幅物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、シークエンシングした後、ＶＪ接合部は、Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｌｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））を用いて分析した。
【００７８】
定量的ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎプライマー及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されている各遺伝子に特異的なプローブを用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００装置で実施した。異なる転写物の相対数を、ＧＡＰＤＨ発現の標準化後の標準的な２−ΔΔＣｔ法によって決定した。
【００７９】
統計分析
平均の平均及び標準偏差が表される。値間の差異の統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＳｔｕｄｅｎｔ試験を用いて計算した。
【００８０】
結果
実施例１：正常な形質細胞におけるトランケート型Ｉｇ発現の影響
１．１トランケート型Ｉｇのインビトロ産生
エクソンスキッピングの条件を分析するために、マウスＢ細胞系統（Ｓ１９４及びＳｐ２／０）に異なるタイプのＩｇκ軽鎖転写物の発現を可能にする構築物をトランスフェクトした（図１Ａ）。
−段階的なＶＪ再編成による機能性Ｉｇκ転写物
−ＶＪエクソンの３’末端で（Ｖ終止＊構築物）またはＣエクソン（Ｃ終止＊）中のいずれかで、ＶセグメントとＪセグメントの接合部間のリーディングフレームのオフセットから誘導された、ナンセンスコドンを有する非機能性Ｉｇκ転写物。
【００８１】
転写レベル（図１Ｂ）及びタンパク質レベル（図１Ｃ）における分析は、スプライシング中のＶＪエクソンの「スキッピング」に続く、Ｖ領域の欠失は、主にＶエクソン自体がナンセンスコドン（構築Ｖ終止＊）を含む場合に有効であることを示す。
【００８２】
形質細胞の生存は、大量のＩｇ合成に関連するＥＲレベルでのストレス応答に耐える能力に依存することが知られている（Ｃｅｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。結果として、本発明者らは、トランケート型Ｉｇ、すなわち異常な構造及び折り畳みを伴うものの産生が、形質細胞生存に影響を及ぼし得るかどうかを確かめようとした。この目的のために、彼らは、トランケート型Ｉｇκ鎖（「ΔＶ−κＬＣ：Ｖドメインの少ないκ軽鎖」）の存在量に関してアポトーシス指数を分析した。したがって、それらは、ＶＰＴＣ構築物を発現する細胞が、非トランスフェクト（ＮＴ）細胞またはＣ終止＊構築物を発現するそれよりも高いレベルのアポトーシスを有することを示した（図１Ｄ）。さらに、ＥＲ誘導性ストレスアポトーシス（図１Ｅ）に関与する転写因子である、ＣＨＯＰ  ｍＲＮＡ（Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質）の定量化により、トランスフェクションされていない細胞に存在する量に関してこのｍＲＮＡの発現が２倍以上増加することが明らかになる。したがって、ΔＶ−κＬＣの存在は、形質細胞をＣＨＯＰ依存性アポトーシスに感作するＥＲストレスの増加を引き起こすようである。
【００８３】
１．２  ｉＴＩＥマウスモデルにおけるトランケート型Ｉｇの産生
Ｂ細胞発生及び体液性応答に対するトランケート型Ｉｇ産生の影響を研究するために、Ｉｇκ軽鎖遺伝子座における遺伝子改変を有する動物モデルを使用した。それは、トランケート型Ｉｇの合成を設計によって誘導することを可能にする。このｉＴＩＥ（誘導性トランケート型Ｉｇ発現）動物モデルを構築するために使用された戦略を図２Ａに示す。Ｃｒｅリコンビナーゼを用いた改変Ｉｇκ遺伝子座の転写の活性化は、Ｖ領域を欠くｍＲＮＡ（図２Ａ）ならびに対応するトランケートされたタンパク質の発現を可能にする（図２Ｂ）。このモデルは、トランケート型Ｉｇ（ΔＶ−κＬＣｓ）の発現が正常形質細胞（図２Ｃ）の生存及び体液性応答（図２Ｄ）に影響することを示すことを可能にした。ＤＨ−ＬＭＰ２ＡマウスとのｉＴＩＥモデルの交配も、トランケート型Ｉｇκ鎖のみを発現するＢ細胞及び形質細胞を生成するために行われた（Ｃａｓｏｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４、Ｂｏｎａｕｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１５）。この新しいモデルは、トランケート型Ｉｇκの単純な発現が形質細胞にストレスを引き起こし、ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＩＲＥ１α及びＨＥＲＰタンパク質の発現を増加させるのに十分であることを示し（結果は示していない）、したがってＶドメインを欠くＩｇκ鎖の本質的な毒性を明らかにした。図２Ｅに示すように、この毒性は、ＥＲ、特にＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＨＥＲＰ及びＸｂｐ１ｓに存在するストレスマーカーの発現と関連している可能性がある。これらのインビボ結果は、トランケート型Ｉｇの発現が形質細胞アポトーシスをもたらすＥＲストレスを引き起こすことを確認する。
【００８４】
実施例２：トランケート型Ｉｇを発現する形質細胞系のＢｚ処理に対する感受性の増加
Ｄｒ．Ｓｉｒａｃのチームが行った研究は、トランケート型Ｉｇ重鎖を発現する形質細胞Ｂｚに対する高い感受性を示した（Ｂｏｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１５）。
【００８５】
本発明者らは、可変エクソンを有さないカッパ軽鎖の短い転写物によりコードされる可変ドメインを欠くトランケートＩｇの存在が、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で処理した形質系統のアポトーシスを増加させることを示した（図１Ｃ）。これらの結果と一致して、トランケート型Ｉｇはプロテアソームによって活発に分解され、その数はｉＴＩＥマウスにおいてＢｚ投与後（腹腔内）に有意に増加する（図２Ｂ）。
【００８６】
実施例３：腫瘍形質細胞におけるトランケート型Ｉｇの合成を増加させるためのエクソンスキッピングによる戦略の実現可能性試験。
トランケート型Ｉｇの産生を誘導する１  ＡＯＮの投与のコンセプトを検証するために、細胞モデルを使用した。この実験は、ＶＪ可変エクソンを排除し、骨髄腫系統（ＲＰＭＩ  ８２２６）における異常なＩｇの合成を強制させることからなっていた。この骨髄腫系統はＩｇλを発現する。我々は、ＶＪ再編成を同定するためにＲＴ−ＰＣＲを用いてＩｇλ転写物を増幅した。増幅物のクローニング及び配列決定の後、ＶＪ再編成をＩＭＧＴ部位で分析した。ＲＰＭ１−８２２６系統は、ＶＪλ２再編成（ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＪ２）を発現する。これらの細胞を、Ｊλ２セグメント（図４Ａ）のスプライスドナー部位に対して向けられ、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣによって商品化された「ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮでトランスフェクトした。一次転写物上のＡＯＮハイブリダイゼーションの詳細な描写を図３に示し、使用されるＡＯＮの配列は配列番号５の配列に対応する。興味深いことに、ＡＯＮはスプライシングを効果的に中断させ、ＶＪ可変エクソンを欠く短い転写物（２５３塩基対バンド、図４Ｂ）を大幅に増加させる。タンパク質に関して、ＡＯＮの投与は、可変ドメインを有さないトランケート型Ｉｇの産生を誘導する（図４Ｃ）。ＡＯＮでトランスフェクトした細胞は高レベルのアポトーシス促進因子ＣＨＯＰ及びＢｉＰシャペロンタンパク質を示し、異常なＩｇの産生に続く細胞ストレスを強調した（図４Ｄ）。
【００８７】
トランスフェクションの非存在下でＡＯＮを受動的に投与する研究も行われた。ＲＰＭ１８２２６細胞を、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣによって市販されている「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮとともにインキュベートした。これらの「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮは、細胞に受動的に入る能力を与える化学修飾を有する。結果が示すように（図４Ｅ）、エクソンスキッピングは、「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮの受動的投与後に有意である。インビトロでＬＰＳにより刺激された、初代マウスＢ細胞への「ｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ」型ＡＯＮの受動的投与後のエクソンスキッピングの増加も示された（結果は示さず）。患者細胞に適用可能なこの方法論の検証は、前臨床試験の実施のための大きな進歩を構成する。
【００８８】
実施例４：治療目的でトランケート型Ｉｇを得るための戦略
４．１可変ドメインを有さないトランケート型ＩｇκまたはＩｇλ軽鎖を産生することを目的とするエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮの供給。
【００８９】
Ｉｇ軽鎖転写物は、Ｌ（リーダー）、ＶＪ（可変）及びＣ（定常）の３つのエクソンから構成される。
【００９０】
可変ドメインを欠くトランケート型軽鎖を産生するために、ＶＪエクソンスプライスドナー部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いて、スプライシング中のＶＪエクソンを排除することができる。機械的な観点から、本発明者らは、これらの異常なＩｇを発現する形質細胞がアポトーシスによって死ぬことを示した（Ｓｒｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，出版が容認されている）。この戦略は図５に示されている。
【００９１】
４．２トランケート型重鎖の産生を目的とするエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮの供給。
【００９２】
同じ戦略を重鎖の標的化に適用することができる。この場合、ＡＯＮは、ＶＤＪ可変エクソンまたは定常エクソン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）のいずれかを標的とすることができる。
【００９３】
４．２．１  Ｂ細胞及び形質細胞におけるμ重鎖の産生機構の想起。
【００９４】
Ｂ細胞における膜型形態または形質細胞における分泌型形態のμ重鎖の発現のプロセスは、図６に示されるように、ｍＲＮＡの選択的スプライシングに基づく。
【００９５】
４．２．２．可変ドメインを含まない、トランケート型重鎖の産生を目的とするエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮの供給。
【００９６】
トランケート型Ｉｇの産生は、重鎖の可変ドメインの排除を強制することによっても誘導することができる。
【００９７】
可変エクソンの排除は、腫瘍クローンによって運ばれるＶＤＪ再編成を同定した後、再編成に関与するＪセグメントのスプライス供与部位に対して向けられたＡＯＮを用いることによって達成することができる。したがって、成熟ｍＲＮＡは可変ドメインを含まない。この戦略を図７に示す。
【００９８】
４．２．３．定常ドメインの１つを欠く、トランケート型重鎖の産生を目的とするエクソンスキッピングを誘導することができるＡＯＮの供給。
【００９９】
トランケート型Ｉｇの生成は、図８に示すように、Ｉｇ重鎖の定常ドメインの１つを除去することによっても達成することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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