(57)【要約】肺がん試料の分子サブタイピングのための方法および組成物が提供されている。具体的には、患者の腺癌の肺がんサブタイプが、終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位炎症性（ＰＩ）、または近位増殖性（ＰＰ）であるか否かを評価する方法が、本明細書に提供されている。本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで、表１〜表６のクラシファイヤーバイオマーカーまたはこれらのサブセットのレベルを検出することを必要とする。クラシファイヤーバイオマーカーのレベルに部分的に基づいて、肺がん試料は、ＴＲＵ、ＰＩ、またはＰＰ試料として分類される。
2018512160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腺癌の肺がんサブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）前記患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーの少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、
（ｉ）前記試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、前記５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドのこれらの相補体または実質的な相補体へのハイブリダイゼーションに適した条件下で混合すること；
（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが、前記５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること；
（ｉｉｉ）前記検出するステップに基づいて前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ること
を含むステップと；
（ｂ）前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの前記ハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較するステップであって、前記少なくとも１つの試料訓練セットは、（ｉ）前記少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現する試料、もしくは前記少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの前記少なくとも５種のバイオマーカーのハイブリダイゼーション値（単数または複数）、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からのハイブリダイゼーション値、または（ｉｉｉ）無腺癌肺試料から得たハイブリダイゼーション値を含む、ステップと；
（ｃ）前記比較するステップの結果に基づいて前記腺癌試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの前記ハイブリダイゼーション値と、前記参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、前記平均発現比を、前記試料訓練セットにおける前記参照値から得られる前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブするステップが、前記混合するステップの前に前記核酸またはその部分を単離することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブへのｃＤＮＡバイオマーカーのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブのｍＲＮＡバイオマーカーへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブするステップが、前記試料中の前記核酸を増幅することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表４の６種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表５の６種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の約５〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、パラフィン中に包埋された肺細胞を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、新鮮凍結試料である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
肺組織試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮および凍結組織試料から選択される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｂに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
肺がんに罹患している患者について疾患アウトカムを決定するための方法であって、前記患者から得た第１の試料の遺伝子発現分析を介して前記肺がんのサブタイプを決定して、遺伝子発現ベースサブタイプを生成するステップと；前記患者から得た第２の試料の形態学的分析を介して前記肺がんのサブタイプを決定して、形態学ベースサブタイプを生成するステップと；前記遺伝子発現ベースサブタイプを前記形態学ベースサブタイプと比較するステップであって、前記遺伝子発現ベースサブタイプと前記形態学ベースサブタイプとの間の一致の存在または非存在は、前記疾患アウトカムを予測する、ステップとを含む方法。
【請求項２９】
前記遺伝子発現ベースサブタイプと前記形態学ベースサブタイプとの間の不一致が、不良な疾患アウトカムを予測する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患アウトカムが全生存である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子発現ベースサブタイプおよび／または前記形態学ベースサブタイプが、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫腫である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経内分泌癌腫腫が、小細胞癌腫およびカルチノイドを包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の試料および／または前記第２の試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮または凍結組織試料である、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の試料および前記第２の試料が、同一の試料の部分である、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子発現分析が、ＲＮＡ配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションベース分析を実施することによって、前記第１の試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーを用いて実施され；前記方法が、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現の検出されたレベルを、少なくとも１つの試料訓練セット（単数または複数）における前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料の、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、参照扁平上皮細胞癌腫試料の、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、参照神経内分泌癌腫腫試料の、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、またはこれらの組合せを含む、ステップと；前記比較するステップの結果に基づいて前記第１の試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類するステップとを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記比較するステップが、前記第１の試料から得た発現データと、前記少なくとも１つの訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含む統計的アルゴリズムを適用することと；前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記第１の試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類することとを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的な前記プライマーが、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に列挙された順方向プライマーおよび逆方向プライマーである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ハイブリダイゼーションベース分析が、
（ａ）前記患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、
（ｉ）前記試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、前記５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体のハイブリダゼーションに適した条件下で混合すること；
（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが、前記５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること；
（ｉｉｉ）前記検出するステップに基づいて前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ること
を含むステップと；
（ｂ）前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの前記ハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較するステップであって、前記少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照扁平上皮細胞癌腫試料からのハイブリダイゼーション値、参照神経内分泌癌腫試料からのハイブリダイゼーション値、またはこれらの組合せを含む、ステップと；
（ｃ）前記比較するステップの結果に基づいて前記肺がん試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類するステップと
を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの前記ハイブリダイゼーション値と、前記参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、前記平均発現比を、前記試料訓練セットにおける前記参照値から得られる前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブするステップが、前記混合するステップの前に前記核酸またはその部分を単離することを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブのＤＮＡバイオマーカーへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブのｍＲＮＡバイオマーカーへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表４の６種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表５の６種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の約５〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｂに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２の試料の前記形態学的分析が、組織学的分析である、請求項２８から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ヒト患者からの肺組織試料が、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）腺癌の肺がんサブタイプであるか否かを評価する方法であって、
クラシファイヤーバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイによって、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；
表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現の検出されたレベルを、少なくとも１つの試料訓練セットからの前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルと比較するステップであって、前記少なくとも１つの試料訓練セットは、（ｉ）前記少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現する試料、もしくは前記少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの前記少なくとも５種のバイオマーカーの発現レベル（単数または複数）、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からの発現レベル、または（ｉｉｉ）無腺癌肺試料からの発現レベルを含む、ステップと；
前記比較するステップの結果に基づいて前記肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
前記比較するステップが、前記肺組織試料から得た発現データと、前記少なくとも１つの訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含む統計的アルゴリズムを適用することと；前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類することとを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記肺組織試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮および凍結組織試料から選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、前記平均発現比を、前記試料訓練セットにおける前記参照値から得られる前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表４の６種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表５の６種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の約５〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｂに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
仮出願でない米国出願への相互参照
本出願は、２０１５年４月１４日に出願された米国仮出願番号第６２／１４７，５４７号からの優先権を主張しており、この仮出願は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表に関する陳述
本願と関連した配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、本明細書に参照により組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＧＮＣＮ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、１７ＫＢであり、２０１６年４月１４日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺がんは、米国におけるがん死の主要原因であり、２２０，０００を超える新しい肺がん症例が毎年同定されている。肺がんは、組織診断によって一般に決定されるサブタイプ（小細胞癌、非小細胞癌、カルチノイド、腺癌、および扁平上皮細胞癌腫）を有する異種疾患である。肺がんの様々な形態的サブタイプの区別が患者管理の指導において必須であり、追加の分子検査が特異的な治療標的マーカーを同定するのに使用される。形態のばらつき、限られた組織試料、および治療的に標的とされるマーカーの、長くなる一方のリストの評価の必要性は、現在の診断基準にとっての難題となっている。組織学的診断再現性の試験は、病理学者間の合致および病理学者間の合致が限定的であることを示している。
新しい療法が肺がんの特定のサブタイプにますます向けられている一方（ベバシズマブおよびペメトレキセド）、組織学的診断再現性の試験は、病理学者間の合致が限定的であること、および病理学者間ではさらに合致することが少ないことを示している。低分化型腫瘍、矛盾する免疫組織化学検査結果、およびほんの限られた数の染色しか実施することができない小体積生検は依然として、現在の診断基準にとっての難題である（TravisおよびRekhtman、Sem  Resp  and  Crit  Care  Med、２０１１年；３２巻（１号）：２２〜３１頁；Travisら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻（５号）：６６８〜８４頁；Tangら、J  Thorac  Dis、２０１４年；６巻（Ｓ５号）：Ｓ４８９〜Ｓ５０１頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】TravisおよびRekhtman、Sem  Resp  and  Crit  Care  Med、２０１１年；３２巻（１号）：２２〜３１頁
【非特許文献２】Travisら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻（５号）：６６８〜８４頁；
【非特許文献３】Tangら、J  Thorac  Dis、２０１４年；６巻（Ｓ５号）：Ｓ４８９〜Ｓ５０１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＣＧＡ肺がんゲノムプロジェクトに提出された肺がん試料の専門的な病理学的再レビューを伴う最近の例では、提出された肺腫瘍の１５〜２０％が再分類されており、このことから、形態に基づく診断が難題であり続けていることが確認される。（Cancer  Genome  Atlas  Research  Network、「Comprehensive  genomic  characterization  of  squamous  cell  lung  cancers.」、Nature、４８９巻、７４１７号（２０１２年）：５１９〜５２５頁；Cancer  Genome  Atlas  Research  Network、Comprehensive  molecular  profiling  of  lung  adenocarcinoma、Nature、５１１巻、７５１１号（２０１４年）：５４３〜５５０頁、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている）。したがって、肺がんサブタイプを決定するためのより信頼できる手段の必要性が存在する。本発明は、この必要性および他の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
一態様では、患者の腺癌の肺がんサブタイプが、スクアモイド（squamoid）（近位炎症性（proximal  inflammatory））、ブロンコイド（bronchoid）（終末呼吸単位（terminal  respiratory  unit））、またはマグノイド（magnoid）（近位増殖性（proximal  proliferative））であるか否かを評価する方法。一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーの少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのｃＤＮＡ分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドのこれらの相補体または実質的な相補体へのハイブリダイゼーションに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること；検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較し、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、（ｉ）少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現する試料、もしくは少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの少なくとも５種のバイオマーカーのハイブリダイゼーション値（単数または複数）、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からのハイブリダイゼーション値、または（ｉｉｉ）無腺癌肺試料からのハイブリダイゼーション値を含む。比較するステップの結果に基づいて腺癌の肺がん試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類する。一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値と、参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む。一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、この平均発現比を、試料訓練セットにおける参照値から得られる少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む。一実施形態では、プローブするステップは、混合するステップの前に核酸またはその部分を単離することを含む。さらなる実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡのｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成すること、またはｃＤＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む。なおさらなる実施形態では、プローブするステップは、試料中の核酸を増幅することを含む。一実施形態では、肺がん試料は、パラフィン中に包埋された肺細胞を含む。一実施形態では、肺がん試料は、新鮮凍結試料である。一実施形態では、肺がん試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮および凍結組織試料から選択される。
【０００７】
別の態様では、ヒト患者からの肺組織試料が、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）腺癌の肺がんサブタイプであるか否かを評価するための方法が、本明細書に提供されている。一実施形態では、本方法は、クラシファイヤーバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイによって、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現の検出されたレベルを、少なくとも１つの試料訓練セットからの少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含む。一実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、（ｉ）少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現する試料、もしくは少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの少なくとも５種のバイオマーカーの発現レベル（単数または複数）、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からの発現レベル、または（ｉｉｉ）無腺癌肺試料からの発現レベルを含み；そして比較するステップの結果に基づいて肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類するステップを含む。一実施形態では、比較するステップは、肺組織試料から得た発現データと、少なくとも１つの訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含む統計的アルゴリズムを適用することと；統計的アルゴリズムの結果に基づいて肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類することとを含む。一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、この平均発現比を、試料訓練セットからの参照値から得られる少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む。一実施形態では、肺組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮および凍結組織試料から選択される。
【０００８】
さらに別の態様では、肺がんに罹患している患者について疾患アウトカムを決定するための方法が、本明細書に提供されており、本方法は、患者から得た第１の試料の遺伝子発現分析を介して肺がんのサブタイプを決定して、遺伝子発現ベースサブタイプを生成するステップと；患者から得た第２の試料の形態学的分析を介して肺がんのサブタイプを決定して、形態学ベースサブタイプを生成するステップと；遺伝子発現ベースサブタイプを形態学ベースサブタイプと比較するステップであって、遺伝子発現ベースサブタイプと形態学ベースサブタイプとの間の一致の存在または非存在は、疾患アウトカムを予測する、ステップとを含む。一実施形態では、遺伝子発現ベースサブタイプと形態学ベースサブタイプとの間の不一致は、不良な疾患アウトカムを予測する。一実施形態では、疾患アウトカムは、全生存である。一実施形態では、遺伝子発現ベースサブタイプおよび／または形態学ベースサブタイプは、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫である。一実施形態では、神経内分泌癌腫は、小細胞癌腫およびカルチノイドを包含する。一実施形態では、第１の試料および／または第２の試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮または凍結組織試料である。一実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同一の試料の部分である。一実施形態では、遺伝子発現分析は、ＲＮＡ配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションベース分析を実施することによって、第１の試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む。一実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲは、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲは、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーを用いて実施され；本方法は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現の検出されたレベルを、少なくとも１つの試料訓練セット（単数または複数）における少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現と比較するステップであって、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料から得た、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、参照扁平上皮細胞癌腫試料から得た、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、参照神経内分泌癌腫試料から得た、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、もしくは表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現データ、またはこれらの組合せを含む、ステップと；比較するステップの結果に基づいて第１の試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類するステップとを含む。一実施形態では、比較するステップは、第１の試料から得た発現データと、少なくとも１つの訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含む統計的アルゴリズムを適用することと；統計的アルゴリズムの結果に基づいて第１の試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類することとを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に列挙された順方向プライマーおよび逆方向プライマーである。一実施形態では、ハイブリダイゼーション分析は、（ａ）患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、（ｉ）試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドのこれらの相補体または実質的な相補体へのハイブリダイゼーションに適した条件下で混合すること；（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが、５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること；（ｉｉｉ）検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含むステップと；（ｂ）少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較するステップであって、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照扁平上皮細胞癌腫試料からのハイブリダイゼーション値、参照神経内分泌癌腫試料からのハイブリダイゼーション値、またはこれらの組合せを含む、ステップと；（ｃ）比較するステップの結果に基づいて肺がん試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプとして分類するステップとを含む。一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値と、参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む。一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、この平均発現比を、試料訓練セットにおける参照値から得られる少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む。一実施形態では、プローブするステップは、混合するステップの前に核酸またはその部分を単離することを含む。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡプローブのｃＤＮＡバイオマーカーへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡプローブのｍＲＮＡバイオマーカーへのハイブリダイゼーション、それによって非天然複合体を形成することを含む。一実施形態では、第２の試料の形態学的分析は、組織学的分析である。
【０００９】
一実施形態では、上記に示した態様のいずれかの少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表２の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表３の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表４の６種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表５の６種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表６の少なくとも１０種のバイオマーカー、少なくとも２０種のバイオマーカー、または少なくとも３０種のバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表２の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表３の約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１５〜約４０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表６の約５〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカー、または約１０〜約３０種のクラシファイヤーバイオマーカーを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表２に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表３に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表６に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ａに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ｂに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、腺癌（図１Ａ）、扁平上皮細胞癌腫（図１Ｂ）、小細胞癌腫（図１Ｃ）、およびカルチノイド（図１Ｄ）についての例示的な遺伝子発現ヒートマップを例示する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、腺癌（図１Ａ）、扁平上皮細胞癌腫（図１Ｂ）、小細胞癌腫（図１Ｃ）、およびカルチノイド（図１Ｄ）についての例示的な遺伝子発現ヒートマップを例示する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、腺癌（図１Ａ）、扁平上皮細胞癌腫（図１Ｂ）、小細胞癌腫（図１Ｃ）、およびカルチノイド（図１Ｄ）についての例示的な遺伝子発現ヒートマップを例示する。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、腺癌（図１Ａ）、扁平上皮細胞癌腫（図１Ｂ）、小細胞癌腫（図１Ｃ）、およびカルチノイド（図１Ｄ）についての例示的な遺伝子発現ヒートマップを例示する。
【００１１】
【図２】図２は、ＦＦＰＥ  ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データセットについての遺伝子発現階層的クラスタリングのヒートマップを例示する。
【００１２】
【図３】図３は、７７のＦＦＰＥ試料についての病理学的レビューおよびＬＳＰ予測の比較を例示する。各矩形は、試料数によって並べられた単一試料を表す。矢印は、病理学的レビューおよび遺伝子発現の両方によって元の診断と合致しなかった６つの試料を示す（試料の詳細については表１８を参照）。
【００１３】
【図４】図４〜７は、３つの独立したＡＤデータセット：すべての病期にわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図４）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図５）、Tomidaらのアレイデータ（図６）またはプールされた（図７）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図５】図４〜７は、３つの独立したＡＤデータセット：すべての病期にわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図４）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図５）、Tomidaらのアレイデータ（図６）またはプールされた（図７）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図６】図４〜７は、３つの独立したＡＤデータセット：すべての病期にわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図４）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図５）、Tomidaらのアレイデータ（図６）またはプールされた（図７）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図７】図４〜７は、３つの独立したＡＤデータセット：すべての病期にわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図４）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図５）、Tomidaらのアレイデータ（図６）またはプールされた（図７）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【００１４】
【図８】図８〜１１は、３つの独立したＡＤデータセット：病期ＩおよびＩＩにわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図８）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図９）、Tomidaらのアレイデータ（図１０）、プールされた（図１１）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図９】図８〜１１は、３つの独立したＡＤデータセット：病期ＩおよびＩＩにわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図８）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図９）、Tomidaらのアレイデータ（図１０）、プールされた（図１１）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図１０】図８〜１１は、３つの独立したＡＤデータセット：病期ＩおよびＩＩにわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図８）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図９）、Tomidaらのアレイデータ（図１０）、プールされた（図１１）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【図１１】図８〜１１は、３つの独立したＡＤデータセット：病期ＩおよびＩＩにわたる、ＬＳＰ遺伝子発現サブタイプを割り当てられたディレクターズチャレンジ（Sheddenら；図８）、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータ（図９）、Tomidaらのアレイデータ（図１０）、プールされた（図１１）についての５年間にわたる全生存の関数としての、予測された肺がんサブタイプＡＤ、ＳＱ、またはＮＥを示すカプラン・マイヤープロットを例示する。
【００１５】
【図１２】図１２は、増殖スコア（１１の遺伝子ＰＡＭ５０シグネチャー）が、図４〜６に示される３つすべてのデータセットにおいて、ＡＤ−ＡＤと比較してＡＤ−ＮＥ／ＳＱにおいてより高いことを例示する。
【００１６】
【図１３】図１３は、フィッシャー正確検定を使用した、一致しない（ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ）試料と比較した、組織学−遺伝子発現が一致する（ＡＤ−ＡＤ）試料における遺伝子変異の普及率を例示する。
【００１７】
【図１４】図１４は、ＬＳＰ遺伝子発現によってＮＥまたはＳＱ（ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ）である組織学的に定義された腺癌試料の除外後の肺腺癌予後強度（prognostic  strength）における低減を例示する。
【００１８】
【図１５】図１５は、全生存（ＯＳ）のＣｏｘ比例ハザードモデルを例示する。図１５のハザード比の表におけるモデルは、試料の３分の１を高リスクとする二値化リスクスコア（０．６７分位数における）を使用した。表のｐ値部分におけるモデルでは、すべてのリスクスコアは連続的なままであった。すべてのモデルは（Ｔ、Ｎ、年齢）について調整した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
遺伝子発現ベース腺癌サブタイピングは、腺癌の腫瘍を３つの生物学的に別個のサブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ；以前にはブロンキオイド（Bronchioid）と呼ばれた）、近位炎症性（ＰＩ；以前にはスクアモイドと呼ばれた）、および近位増殖性（ＰＰ；以前にはマグノイドと呼ばれた））へと分類することが示されている。これら３つのサブタイプは、それらの予後、それらの喫煙者対非喫煙者の分布、それらのＥＧＦＲ変更の普及率、ＡＬＫ再編成、ＴＰ５３変異、およびそれらの血管新生特徴が変動する。本発明は、患者の腺癌サブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位炎症性（ＰＩ）、近位増殖性（ＰＰ））に部分的に基づいて、腺癌患者集団について予後または疾患アウトカムを決定するための、当技術分野における必要性に対処する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「発現プロファイル」は、弁別的遺伝子（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）の相対存在量、レベル、発現の存在または非存在の測定に対応する１つまたは複数の値を含む。発現プロファイルは、肺がんの診断の前もしくは後の対象に由来するものであってもよく、処置もしくは療法の前もしくは後の１つもしくは複数の時点で対象から収集される生体試料に由来するものであってもよく、処置もしくは療法がない（例えば、肺がんと診断され、もしくは肺がんのリスクにあると診断された対象における疾患の進行をモニターし、もしくは疾患の発生を評価するために）間の１つもしくは複数の時点で対象から収集される生体試料に由来するものであってもよく、または健康な対象から収集してもよい。用語「対象」は、患者と相互交換可能に使用され得る。患者は、ヒト患者であり得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、バイオマーカーまたはクラシファイヤーに言及して使用される用語「発現レベルを決定する」または「発現プロファイルを決定する」または「発現レベルを検出する」または「発現プロファイルを検出する」は、１つまたは複数のバイオマーカーの量、例えば、バイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡ（またはそれらに由来するｃＤＮＡ）の量を定量的、半定量的、または定性的に確認または測定するための、試料、例えば、対象もしくは患者の試料および／または対照試料への、バイオマーカー特異的作用物質、例えば、プローブ、プライマー、もしくは抗体および／または方法の適用を意味する。例えば、バイオマーカーのレベルは、バイオマーカー検出剤、例えば抗体、例えば標識された抗体が、バイオマーカーに特異的に結合し、例えば、ポリペプチドバイオマーカーの量の相対的または絶対的確認を可能にする、例えば、免疫組織化学検査、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降などを含むイムノアッセイ、プローブまたはプライマーもしくはプライマーセットが、核酸バイオマーカーの量を確認するために使用される、例えば、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ノーザンブロット、デジタル分子ビーコンテクノロジー、例えば、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｅｒ分析、およびＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲアッセイを含むプローブベース方法および増幅ベース方法などを含むハイブリダイゼーションおよびＰＣＲプロトコールなどを含むいくつかの方法によって決定され得る。ｍＲＮＡの検出および定量化の他の方法、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料または細胞におけるｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが適用され得る。このテクノロジーは、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅するために増幅システムに特異的に結合する各ｍＲＮＡに対するプローブセットを使用する、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって現在提供されている；これらの増幅されたシグナルは、標準的な蛍光顕微鏡または画像化システムを使用して可視化され得る。例えば、試料が、同じ組織切片中に存在する正常細胞および腫瘍細胞を有する場合、このシステムは、例えば、不均一な試料中の転写物レベルを検出および測定できる。述べたように、ＴａｑＭａｎプローブベース遺伝子発現分析（ＰＣＲベース）もまた、組織試料における遺伝子発現レベルを測定するために使用され得、このテクノロジーは、ＦＦＰＥ試料におけるｍＲＮＡレベルを測定するために有用であることが示されている。簡潔に述べると、ＴａｑＭａｎプローブベースアッセイは、ｍＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズするプローブを利用する。このプローブは、各末端に結合されたクエンチャー色素およびレポーター色素（蛍光分子）を含み、蛍光は、ｍＲＮＡ標的への特異的ハイブリダイゼーションが起こる場合にのみ発光される。増幅ステップの間に、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性は、クエンチャー色素およびレポーター色素をプローブから脱離させ、蛍光発光が起こり得る。この蛍光発光は記録され、シグナルは、検出シス���ムによって測定される；これらのシグナル強度は、試料中の所与の転写物（遺伝子発現）の存在量を計算するために使用される。
【００２２】
本発明の「バイオマーカー」または「クラシファイヤーバイオマーカー」には、遺伝子およびタンパク質、ならびにこれらのバリアントおよび断片が含まれる。このようなバイオマーカーには、バイオマーカーをコードする核酸配列の全体的もしくは部分的配列、またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡが含まれる。バイオマーカー核酸には、目的の核酸配列の任意の発現産物またはこれらの部分もまた含まれる。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーによってコードされるタンパク質、または本発明のＤＮＡバイオマーカーに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドのいずれかの全体的または部分的アミノ酸配列を含む。
【００２３】
「バイオマーカー」は、組織または細胞におけるそれらの発現レベルが、正常または健康な細胞または組織のものと比較して変更される、任意の遺伝子またはタンパク質である。本発明のバイオマーカーの検出、および一部の場合ではレベルは、試料の区別を可能にする。
【００２４】
本明細書に提供するバイオマーカーパネルおよび方法は、様々な態様では、（ｉ）患者のＮＳＣＬＣサブタイプが、腺癌もしくは扁平上皮細胞癌腫であるか否か、（ｉｉ）患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、もしくは神経内分泌癌腫（小細胞癌腫、およびカルチノイドの両方を包含する）であるか否か、かつ／または（ｉｉｉ）患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、もしくは小細胞癌腫であるか否かを評価するのに使用される。一実施形態では、本明細書で記載するように、本明細書に提供する方法は、患者の肺がん（腺癌）試料を近位炎症性（スクアモイド）、近位増殖性（マグノイド）、または終末呼吸単位（ブロンキオイド）として特徴付けるステップをさらに含む。
【００２５】
信頼できる分類を行うことができるバイオマーカーは、対照と比較して、上方調節（例えば、発現が増加される）または下方調節（例えば、発現が減少される）されるバイオマーカーであり得る。対照は、本明細書に提供する任意の対照であり得る。例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したバイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、様々な実施形態では、患者の肺がんサブタイプを評価および分類するのに使用される。
【００２６】
一般に、本明細書に提供する方法は、特定の肺がんサブタイプ（例えば、腺癌のサブタイプ）として肺がん試料を分類するのに使用される。一実施形態では、本方法は、患者または対象から得られる肺がん試料において、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを検出または決定するステップを含む。一実施形態では、検出するステップは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーションに適した条件下で、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのｃＤＮＡ分子の部分に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイを実施することと、検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを得ることとによる、核酸レベルにおけるものである。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルは、少なくとも１つの試料訓練セットからの表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの参照発現レベルと比較される。少なくとも１つの試料訓練セットは、（ｉ）少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現する試料、もしくは少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの少なくとも５種のバイオマーカーの発現レベル（単数または複数）、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からの発現レベル、または（ｉｉｉ）無腺癌肺試料からの発現レベル；および肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類するステップを含み得る。次いで、肺がん試料は、比較するステップの結果に基づいて、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、神経内分泌癌腫、もしくは小細胞癌腫、またはさらにはブロンキオイド、スクアモイド、もしくはマグノイドサブタイプの腺癌として分類され得る。一実施形態では、比較するステップは、肺組織またはがん試料から得た発現データと、少なくとも１つの訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含む統計的アルゴリズムを適用することと；統計的アルゴリズムの結果に基づいて肺組織またはがん試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプとして分類することとを含み得る。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのｃＤＮＡ分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドのこれらの相補体または実質的な相補体へのハイブリダイゼヘションに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること；検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較する。例えば、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌、扁平上皮細胞癌腫、神経内分泌癌腫試料、小細胞癌腫試料から得たハイブリダイゼーション値を含む。例えば、比較するステップの結果に基づいて肺がん試料を腺癌、扁平上皮細胞癌腫、神経内分泌癌腫、または小細胞癌腫として分類する。
【００２８】
肺組織試料は、ヒト対象または患者から単離される任意の試料であり得る。例えば、一実施形態では、分析は、パラフィンワックスに包埋された肺生検で実施される。本発明のこの態様は、小さい生検からでも主要な組織型を正確に同定することによって現在の診断を改善する手段を提供する。ＲＴ−ＰＣＲ法を含む本発明の方法は、感度がよく、正確であり、パラフィン包埋試料を用いて使用するためのマルチアナライト能力を有する。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Croninら（２００４年）、Am.  J  Pathol.、１６４巻（１号）：３５〜４２頁を参照。
【００２９】
ホルマリン固定およびパラフィンワックス中の組織包埋は、光学顕微鏡評価の前に組織を処理するためのユニバーサル手法である。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本によって与えられる主要な利点は、組織切片における細胞形態学的詳細および構成的形態学的詳細の保存である。（Foxら（１９８５年）、J  Histochem  Cytochem、３３巻：８４５〜８５３頁）。生検標本が処理される標準的な緩衝ホルマリン固定液は、典型的には、３７％ホルムアルデヒドおよび１０〜１５％メチルアルコールを含有する水溶液である。ホルムアルデヒドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質−核酸架橋およびタンパク質−タンパク質架橋の形成をもたらす高度に反応性の双極性化合物である（Clarkら（１９８６年）、J  Histochem  Cytochem、３４巻：１５０９〜１５１２頁；McGheeおよびvon  Hippel（１９７５年）、Biochemistry、１４巻：１２８１〜１２９６頁、それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。
【００３０】
一実施形態では、本明細書で使用される試料は、個体から得られ、新鮮凍結パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む。しかし、他の組織および試料タイプも本明細書で使用するのに適用できる（例えば、新鮮組織、または凍結組織）。
【００３１】
ＦＦＰＥ組織からＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、トータルＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれているBibikovaら（２００４年）、American  Journal  of  Pathology、１６５巻：１７９９〜１８０７頁によって記載されているようにＦＦＰＥ組織から単離することができる。同様に、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用することができる。パラフィンは、キシレン抽出、その後のエタノール洗浄によって除去される。ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ  Ｉ処置ステップが含めて、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、切片にされた組織ブロックから単離することができる。ＲＮＡは、供給業者のインストラクションに従ってトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して凍結試料から抽出することができる。測定可能な残留するゲノムＤＮＡを有する試料を、ＤＮａｓｅＩ処置に再び付し、ＤＮＡ混入についてアッセイすることができる。すべての精製、ＤＮａｓｅ処置、および他のステップは、製造者のプロトコールに従って実施され得る。トータルＲＮＡを単離した後、試料を、使用するまで−８０℃で貯蔵することができる。
【００３２】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当技術分野で周知であり、Ausubelら編、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７〜１９９９年を含めた分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出するための方法は、例えば、RuppおよびLocker（Lab  Invest.、５６巻：Ａ６７頁、１９８７年）ならびにDe  Andresら（Biotechniques、１８巻：４２〜４４頁、１９９５年）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、製造者のインストラクションに従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの商業的製造者製の精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを使用して実施され得る。例えば、培養液中の細胞に由来するトータルＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）がある。組織試料からのトータルＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘ．）を使用して単離することができる。腫瘍から調製されるＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。さらに、多数の組織試料を、例えば、Chomczynskiの単一ステップＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている）などの当業者に周知の技法を使用して容易に処理することができる。
【００３３】
一実施形態では、試料は、肺組織試料、例えば、腺癌試料から回収される細胞を含む。細胞は、当技術分野で公知の標準技法を使用して生体試料から回収され得る。例えば、一実施形態では、細胞は、細胞試料を遠心分離し、ペレット化された細胞を再懸濁することによって回収される。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に再懸濁することができる。細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得た後、細胞を溶解させて、核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡを抽出することができる。任意の種類のさらなる処理に付されたものを含めて、対象から得られるすべての試料は、対象から得られていると見なされる。
【００３４】
試料は、一実施形態では、本明細書に示したバイオマーカーの組合せのバイオマーカーレベルを検出する前にさらに処理される。例えば、細胞試料または組織試料中のｍＲＮＡは、試料の他の成分から分離され得る。試料を濃縮および／または精製してｍＲＮＡをその非天然状態で単離することができ、その理由は、ｍＲＮＡは、その天然環境にないためである。例えば、研究により、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの高次構造は、同じ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ構造と異なることが示されている（例えば、すべての目的に関してその全体が本明細書に組み込まれている、Rouskinら（２０１４年）、Nature、５０５巻、７０１〜７０５頁を参照）。
【００３５】
試料に由来するｍＲＮＡは、一実施形態では、合成ＤＮＡプローブにハイブリダイズされ、このプローブは、一部の実施形態では、検出部分（例えば、検出可能標識、捕捉配列、バーコード報告配列）を含む。したがって、これらの実施形態では、非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体が、バイオマーカーを検出するために最終的に作製および使用される。別の実施形態では、試料に由来するｍＲＮＡは、検出可能標識、例えば、フルオロフォアで直接標識される。さらなる実施形態では、非天然標識ｍＲＮＡ分子は、ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズされ、複合体が検出される。
【００３６】
一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、それは、ハイブリダイゼーション反応において相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換され、または１種または複数のｃＤＮＡプローブと一緒にハイブリダイゼーション反応において使用される。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって、非天然分子である。さらに、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドは、合成のものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない。ｃＤＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないことに加えて、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡと必然的に異なり、その理由は、それがデオキシリボ核酸を含み、リボ核酸を含まないためである。次いでｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅法によって増幅される。例えば、採用され得る他の増幅法としては、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、WuおよびWallace、Genomics、４巻：５６０頁（１９８９年）、Landegrenら、Science、２４１巻：１０７７頁（１９８８年））、転写増幅（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Kwohら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：１１７３頁（１９８９年））、自己持続配列複製（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Guatelliら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：１８７４頁（１９９０年））、ならびに核酸ベース配列増幅（ＮＡＳＢＡ）がある。ＰＣＲ増幅のためのプライマーを選択するためのガイドラインは、当業者に公知である。例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、McPhersonら、PCR  Basics:  From  Background  to  Bench、Springer-Verlag、２０００年を参照。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡは、必然的に非天然産物である。第１に、上述したように、ｃＤＮＡは、非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合では、増幅プロセスは、出発材料のあらゆる個々のｃＤＮＡ分子について数億のｃＤＮＡコピーを創製する機能を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数からはるかにかけ離れている。
【００３７】
一実施形態では、ｃＤＮＡは、断片に追加のＤＮＡ配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列もしくは部分、バーコード）を導入するプライマーで増幅され（例えば、アダプター特異的プライマーを使用して）、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡバイオマーカー配列は、追加の配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列もしくは部分、バーコード）を含むｃＤＮＡプローブに直接ハイブリダイズされる。したがって、増幅および／またはｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、追加の配列を導入し、非天然ハイブリッドを形成することによって、非天然一本鎖ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡから非天然二本鎖分子を創製する機能を果たす。さらに、当業者に公知であるように、増幅手順は、これらと関連した誤り率を有する。したがって、増幅により、ｃＤＮＡ分子にさらなる修飾が導入される。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中に、検出可能標識、例えば、フルオロフォアが一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅はまた、少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないこと、（ｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の両端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作製されること、（ｉｉ）増幅と関連した誤り率により、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列がさらに創製されること、（ｉｉｉ）自然において存在するものと比較した場合のｃＤＮＡ分子の異種構造、および（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子への検出可能標識の化学的付加のために、自然において存在しないＤＮＡ複合体を創製する機能を果たす。
【００３８】
一部の実施形態では、目的のバイオマーカーの発現は、非天然ｃＤＮＡ分子の検出を介して核酸レベルで検出される。
【００３９】
一部の実施形態では、肺がんサブタイピングのための方法は、クラシファイヤーバイオマーカーセットの発現レベルを検出することを含む。一部の実施形態では、検出することは、核酸レベルまたはタンパク質レベルでの表１（肺がんサブタイプ遺伝子パネルとしても特徴付けられる）、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのすべてを含む。別の実施形態では、表１の単一のクラシファイヤーバイオマーカーまたはクラシファイヤーバイオマーカーのサブセット、例えば、約５〜約２０種が検出される。検出することは、それだけに限らないが、ＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、または別のハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、クラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーおよび／もしくはプローブを用いた、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイなどを含めた任意の適当な技法によって実施することができる。一部の場合では、増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）に有用なプライマーは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に提供された順方向プライマーおよび逆方向プライマーである。しかし、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に提供されたプライマーは、単に例示的な目的のためであり、本発明を限定すると解釈されるべきでないことが留意されるべきである。
【００４０】
本明細書に記載のバイオマーカーは、目的の核酸配列、または逆転写反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成により得られるこれらの非天然ｃＤＮＡ産物のいずれかの全配列または部分配列を含むＲＮＡを含む。用語「断片」は、一般に、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，２００、もしくは１，５００の連続したヌクレオチド、または最大で、本明細書に開示の全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの数を含むポリヌクレオチドの部分を指すように意図されている。バイオマーカーポリヌクレオチドの断片は、一般に、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、もしくは２５０の連続したアミノ酸、または最大で、本発明の全長バイオマーカータンパク質中に存在するアミノ酸の総数をコードすし得る。
【００４１】
一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物またはその発現産物などの過剰発現は、試料中のすべての測定される転写物（もしくはこれらの産物）であり得る参照ＲＮＡ転写物もしくはこれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物（もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ産物）の特定の参照セットのレベルに正規化することによって決定される。正規化は、アッセイされるＲＮＡまたはｃＤＮＡの量、および使用されるＲＮＡまたはｃＤＮＡの品質のばらつきの両方の差異を補正し、または正規化するために実施される。したがって、アッセイは、典型的には、周知のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨおよび／またはβ−アクチンなどを含めたある特定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み込む。代わりに、正規化は、アッセイされるバイオマーカーのすべて、またはその大きいサブセットの平均シグナルまたは中央値シグナルに基づくことができる（グローバル正規化手法）。
【００４２】
例えば、一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６のいずれかにおけるバイオマーカーのうちの約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約５〜約５０種が、肺がんサブタイプを決定する方法において検出される。別の実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５のうちのいずれか１つからの、または表６からのバイオマーカーのそれぞれが、肺がんサブタイプを決定する方法において検出される。
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【表１Ｂ−３】
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【表１Ｂ−４】
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【表１Ｃ−１】
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【表１Ｃ−２】
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【表１Ｃ−３】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表４】
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【表５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【００４３】
単離ｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション、またはそれだけに限らないが、サザン分析もしくはノーザン分析、ＰＣＲ分析、およびプローブアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを含む増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための一方法では、単離ｍＲＮＡまたは合成ｃＤＮＡを、検出されている遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させる。核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドなどのｃＤＮＡまたはその部分であり、本発明の非天然ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡバイオマーカーにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分であり得る。
【００４４】
上記に説明したように、一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、それは、ハイブリダイゼーション反応で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、特異的ｍＲＮＡの部分に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて実施され得る。ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて実施され得る。ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルに相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて実施され得る。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって非天然分子である。さらなる実施形態では、次いでｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅法によって増幅される。ＰＣＲは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に提供された順方向プライマーおよび／または逆方向プライマーを用いて実施され得る。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡは、必然的に非天然産物である。上述したように、ｃＤＮＡは、非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合では、増幅プロセスは、出発材料のあらゆる個々のｃＤＮＡ分子について数億のｃＤＮＡコピーを創製する機能を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数からはるかにかけ離れている。
【００４５】
一実施形態では、ｃＤＮＡは、断片に追加のＤＮＡ配列（アダプター配列）を導入するプライマーで増幅される（アダプター特異的プライマーを使用して）。アダプター配列は、テイルであり得、このテイル配列は、ｃＤＮＡに相補的ではない。例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に提供された順方向プライマーおよび／または逆方向プライマーは、テイル配列を含み得る。したがって増幅は、既に非天然のｃＤＮＡにバーコード、アダプター、および／またはレポーター配列を導入することによって、非天然一本鎖ｃＤＮＡから非天然二本鎖分子を創製する機能を果たす。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中に、検出可能標識、例えば、フルオロフォアが、一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅はまた、少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないこと、（ｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の両端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作製されること、（ｉｉ）増幅と関連した誤り率により、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列がさらに創製されること、（ｉｉｉ）自然において存在するものと比較した場合のｃＤＮＡ分子の異種構造、および（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子への検出可能標識の化学的付加のために、自然において存在しないＤＮＡ複合体を創製する機能を果たす。
【００４６】
一実施形態では、合成ｃＤＮＡ（例えば、増幅されたｃＤＮＡ）は、例えば、マイクロアレイを介して、プローブを用いたハイブリダイゼーションを介して固体表面に固定化される。別の実施形態では、ｃＤＮＡ産物は、ｃＤＮＡ産物とハイブリダイズする蛍光プローブの導入を介するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して検出される。例えば、一実施形態では、バイオマーカー検出は、定量的蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた）によって評価される。ＰＣＲ分析については、周知の方法が、分析で使用するためのプライマー配列の決定について当技術分野で利用可能である。
【００４７】
本明細書に提供されるバイオマーカーは、一実施形態では、捕捉プローブおよび／またはレポータープローブを使用するハイブリダイゼーション反応を介して検出される。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、ビーズ、ガラス、またはシリコン基板などの固体表面に誘導体化されたプローブである。別の実施形態では、捕捉プローブが溶液中に存在し、患者の試料と混合され、その後、例えば、ビオチン−アビジン相互作用（例えば、ビオチンが捕捉プローブの一部であり、アビジンが表面上にある場合）を介した表面へのハイブリダイゼーション産物の付着が続く。ハイブリダイゼーションアッセイは、一実施形態では、捕捉プローブおよびレポータープローブの両方を採用する。レポータープローブは、捕捉プローブまたはバイオマーカー核酸にハイブリダイズすることができる。次いで例えばレポータープローブは、試料中のバイオマーカー（単数または複数）のレベルを決定するためにカウントおよび検出される。捕捉プローブおよび／またはレポータープローブは、一実施形態では、検出可能標識、および／または表面への官能化を可能にする基を含有する。
【００４８】
例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子分析システム（例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Geissら（２００８年）、Nat.  Biotechnol.、２６巻、３１７〜３２５頁を参照）を、本明細書に提供する方法とともに使用するのに適用できる。
【００４９】
その開示全体がすべての目的に関して参照により組み込まれている米国特許第７，４７３，７６７号および同第８，４９２，０９４号に記載されたハイブリダイゼーションアッセイを、本明細書に提供する方法で使用するのに、すなわち、本明細書に記載のバイオマーカーおよびバイオマーカー組合せを検出するのに適用できる。
【００５０】
バイオマーカーレベルは、膜ブロット（ハイブリダイゼーション分析、例えば、ノーザン、サザン、ドットなどで使用されるものなど）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ、または繊維（もしくは結合した核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニターすることができる。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、おおび同第５，４４５，９３４号を参照。
【００５１】
一実施形態では、マイクロアレイがバイオマーカーレベルを検出するのに使用される。マイクロアレイは、異なる実験間の再現性のためにこの目的に特に非常に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するための一方法をもたらす。各アレイは、固体支持体に付着された捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズされ、次いでレーザースキャニングによって検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的値に変換される。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡについての遺伝子発現プロファイルを決定するのに特に有用である。
【００５２】
機械的合成法を使用してこれらのアレイを合成するための技法は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面アレイ表面が一般に使用されるが、アレイは、実質的に任意の形状の表面、またはさらには多数の表面上に製作することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、繊維（光ファイバーなど）、ガラス、または任意の他の適切な基板上の核酸（またはペプチド）であり得る。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照。アレイは、診断またはすべてを含むデバイスの他の操作を可能にする様式で包装され得る。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号を参照。
【００５３】
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）が、一実施形態では、本明細書に記載の方法において採用される。ＳＡＧＥは、各転写物のために個々のハイブリダイゼーションプローブを準備する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時のかつ定量的な分析を可能にする方法である。最初に、転写物をユニークに同定するのに十分な情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が生成され、ただし、タグは、各転写物内のユニークな位置から得られる。次いで、多くの転写物が一緒に連結されて長い連続分子が形成され、それを配列決定し、同時に複数のタグの素性を明らかにすることができる。転写物の任意の集団の発現パターンを、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。その全体が参照により組み込まれている、Velculescuら、Science、２７０巻：４８４〜８７頁、１９９５年；Cell、８８巻：２４３〜５１頁、１９９７年を参照。
【００５４】
核酸レベルでのバイオマーカーレベル分析の追加の方法は、Brennerら（その全体が参照により組み込まれている、Nat.  Biotech.、１８巻：６３０〜３４頁、２０００年）によって記載されているような、配列決定法、例えば、ＲＮＡｓｅｑ、次世代配列決定、および超並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）の使用である。これは、非ゲルベースシグネチャー配列決定を、別個の直径５μｍのマイクロビーズ上の数百万の鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングと組み合わせる配列決定手法である。最初に、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングによって構築される。この後に、高密度で（典型的には３．０×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２超）、フローセル内で鋳型含有マイクロビーズの平面アレイがアセンブルされる。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離端が、ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースシグネチャー配列決定法を使用して同時に分析される。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子シグネチャー配列を単一のオペレーションで同時かつ正確にもたらすことを示した。
【００５５】
バイオマーカーレベル分析が核酸レベルである場合の別の方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅法の使用である。試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７年、米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Barany（１９９１年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８８巻：１８９〜１９３頁）、自己持続配列複製（Guatelliら（１９９０年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅システム（Kwohら（１９８９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら（１９８８年）Bio/Technology  ６巻：１１９７頁）、ローリングサークル型複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅のプロセスと、その後の、当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出とを伴い得る。多数の異なるＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールが、当技術分野で公知であり、試料中の弁別的遺伝子の発現の検出および／または定量化のために本発明に記載される組成物を使用する使用のために直接適用または適応され得る。例えば、本明細書に参照により組み込まれている、Fanら（２００４年）Genome  Res.  １４巻：８７８〜８８５頁を参照。一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの対を用いた反応によって増幅される。プライマー（単数または複数）は、標的核酸の相補的領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼが、標的配列を増幅するようにプライマー（単数または複数）を伸長させる。ポリメラーゼベース核酸増幅産物を提供するのに十分な条件下で、１つのサイズの核酸断片が、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）を支配する。増幅サイクルが、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させるために反復される。反応は、ＰＣＲに一般的に使用される任意のサーモサイクラーにおいて実施され得る。
【００５６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとも呼ぶ）は、定量的測定値を提供するだけでなく、低減された時間および混入を提供するので、一部の状況下で好ましい。本明細書で使用される場合、「定量的ＰＣＲ（または「リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ」）は、反応産物のサンプリングの繰り返しの必要なしにＰＣＲ増幅が起きているときの、ＰＣＲ増幅の進行の直接的モニタリングを指す。定量的ＰＣＲでは、反応産物は、それらが生成され、シグナルがバックグラウンドレベルを上回って上昇した後、反応がプラトーに達する前に追跡されるように、シグナリング機構（例えば、蛍光）を介してモニターされ得る。検出可能なレベルまたは「閾値」レベルの蛍光を達成するために必要とされるサイクルの数は、ＰＣＲプロセスの開始時における増幅可能な標的の濃度に伴って直接変動し、試料中の標的核酸の量のリアルタイムでの測定を提供するためのシグナル強度の測定を可能にする。ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ緑色）または標識されたプローブが、ＰＣＲ増幅によって生成された伸長産物を検出するために使用され得る。本発明の配列を含む標識されたプローブを利用する任意のプローブ形式が使用され得る。
【００５７】
免疫組織化学検査法も本発明のバイオマーカーのレベルを検出するのに適している。試料を後の調製のために凍結させ、または固定液中に直ちに入れることができる。組織試料を、試薬、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド（gluteraldehyde）、メタノールなどで処置することによって固定し、パラフィン中に包埋することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から免疫組織化学的分析のためのスライドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【００５８】
一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のバイオマーカー（またはそのサブセット、例えば、５〜２０、５〜３０、５〜４０種のバイオマーカー）のレベルは、試料中のすべてのＲＮＡ転写物、もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物、もしくはタンパク質産物、または試料中のＲＮＡ転写物の参照セット、もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物の参照セット、もしくはこれらのタンパク質産物の参照セットの発現レベルに対して正規化される。
【００５９】
全体にわたって示されているように、本明細書に示した方法は、患者の肺がんサブタイプを決定するための方法を提供する。バイオマーカーレベルが、例えば、非天然ｃＤＮＡバイオマーカーレベルまたは非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡバイオマーカー複合体を測定することによって決定されると、バイオマーカーレベルを、例えば、検出されたレベルの統計的方法または直接比較を使用して参照値または参照試料と比較することで、肺がん分子サブタイプの決定が行われる。比較に基づいて、患者の肺がん試料は、例えば、神経内分泌癌腫、扁平上皮細胞癌腫、腺癌として分類される。別の実施形態では、比較に基づいて、患者の肺がん試料は、扁平上皮細胞癌腫、腺癌、または小細胞癌腫として分類される。さらに別の実施形態では、比較に基づいて、患者の肺がん試料は、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）として分類される。
【００６０】
一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベル値は、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照発現レベル値（単数または複数）と比較され、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照試料（単数または複数）からの発現レベル値を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、腺癌試料、扁平上皮細胞癌腫試料、神経内分泌癌腫試料、小細胞肺癌試料、近位炎症性（スクアモイド）、近位増殖性（マグノイド）、終末呼吸単位（ブロンキオイド）試料、またはこれらの組合せから得た、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベル値を含む。
【００６１】
別々の実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値は、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（単数または複数）と比較され、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照試料（単数または複数）からのハイブリダイゼーション値を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、腺癌試料、扁平上皮細胞癌腫試料、神経内分泌癌腫試料、小細胞肺癌試料、近位炎症性（スクアモイド）、近位増殖性（マグノイド）、終末呼吸単位（ブロンキオイド）試料、またはこれらの組合せからの、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、以下の表Ａに提供した参照試料からの、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。
【表Ａ】
2018512160.tif 000025
【００６２】
バイオマーカーの検出されたレベルを参照値および／または参照試料と比較するための方法が、本明細書に提供されている。この比較に基づいて、一実施形態では、対象の試料から得たバイオマーカーレベルと参照値との間の相関が得られる。次いで肺がんサブタイプの評価が行われる。
【００６３】
様々な統計的方法を、患者から得られるバイオマーカーレベルと、例えば、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照バイオマーカーレベルとの比較を助けるのに使用することができる。
【００６４】
一実施形態では、教師あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）パターン認識法が採用される。教師ありパターン認識法の例として、それだけに限らないが、最短重心法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（Dabney（２００５年）、Bioinformatics、２１巻（２２号）：４１４８〜４１５４頁、およびTibshiraniら（２００２年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９９巻（１０号）：６５７６〜６５７２頁）；クラス分析のソフト独立型モデリング（ＳＩＭＣＡ）（例えば、Wold、１９７６年を参照）；部分最小二乗分析（ＰＬＳ）（例えば、Wold、１９６６年；Joreskog、１９８２年；Frank、１９８４年；Bro,  R.、１９９７年を参照）；線形判別分析（ＬＤＡ）（例えば、Nillson、１９６５年を参照）；Ｋ−最近接分析（ＫＮＮ）（例えば、Brownら、１９９６年を参照）；人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）（例えば、Wasserman、１９８９年；Ankerら、１９９２年；Hare、１９９４年を参照）；確率的ニューラルネットワーク（ＰＮＮ）（例えば、Parzen、１９６２年；Bishop、１９９５年；Speckt、１９９０年；Broomheadら、１９８８年；Patterson、１９９６年を参照）；規則誘導（ＲＩ）（例えば、Quinlan、１９８６年を参照）；およびベイジアン法（例えば、Bretthorst、１９９０年ａ、１９９０年ｂ、１９８８年を参照）を挙げることができる。一実施形態では、遺伝子発現データに基づいて腫瘍サブタイプを同定するためのクラシファイヤーは、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載された重心ベース法である。
【００６５】
他の実施形態では、教師なし訓練手法が採用され、したがって、訓練セットは使用されない。
【００６６】
再び教師あり学習手法について試料訓練セットに言及すると、一部の実施形態では、試料訓練セット（単数または複数）は、腺癌試料からのクラシファイヤーバイオマーカーのすべて（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６のいずれかのすべてのクラシファイヤーバイオマーカー）の発現データを含むことができる。一部の実施形態では、試料訓練セット（単数または複数）は、扁平上皮細胞癌腫試料、腺癌試料、および／または神経内分泌癌腫試料からのクラシファイヤーバイオマーカーのすべて（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６のいずれかのすべてのクラシファイヤーバイオマーカー）の発現データを含むことができる。一部の実施形態では、試料訓練セット（単数または複数）は、試料間変動を除去するために正規化される。
【００６７】
一部の実施形態では、比較することは、パラメトリックであってもノンパラメトリックであってもよい、例えば任意の適当な多変量統計分析モデルなどの統計的アルゴリズムを適用することを含み得る。一部の実施形態では、統計的なアルゴリズムを適用することは、ヒト肺組織試料から得た発現データと、腺癌および扁平上皮細胞癌腫訓練セット（単数または複数）からの発現データとの間の相関を決定することを含むことができる。一部の実施形態では、（例えば）、リーブワンアウトクロスバリデーション（ＬＯＯＣＶ）などのクロスバリデーションが実施される。一部の実施形態では、積分相関が実施される。一部の実施形態では、スピアマン相関が実施される。一部の実施形態では、重心ベース法が、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載されているように、かつ遺伝子発現データに基づいて統計的アルゴリズムのために採用される。
【００６８】
対象に由来する試料（検査試料）に対して実施された遺伝子発現の結果は、生体試料（単数または複数）、または正常であると分かっている、もしくは疑われる生体試料（単数または複数）（「参照試料」もしくは「正常試料」、例えば、非腺癌試料）に由来するデータと比較することができる。一部の実施形態では、参照試料または参照遺伝子発現データは、特定の分子サブタイプの腺癌（adenocarcimona）、即ち、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）を有することが既知の個体から得られるまたはそれに由来する。別の実施形態では、参照試料または参照バイオマーカーレベルデータは、肺がんサブタイプ、例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌腫、神経内分泌癌腫、または小細胞癌腫を有することが分かっている個体から得られ、またはそれに由来する。
【００６９】
参照試料は、検査試料と同じ時間または異なる時間にアッセイされ得る。代わりに、参照試料からのバイオマーカーレベル情報を、後日アクセスするためにデータベースまたは他の手段に保管してもよい。
【００７０】
検査試料に対するアッセイのバイオマーカーレベル結果を、参照試料に対する同じアッセイの結果と比較することができる。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、データベースまたは参照値（単数または複数）からのものである。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、当業者によって公知の、または一般に認められている値または値の範囲である。一部の場合では、比較は定性的である。他の場合では、比較は定量的である。一部の場合では、定性的比較または定量的比較は、それだけに限らないが、以下の１つまたは複数を伴い得る：蛍光値、スポット強度、吸光度値、化学発光シグナル、ヒストグラム、臨界閾値、統計的有意性値、本明細書に記載の遺伝子の発現レベル、ｍＲＮＡコピー数を比較すること。
【００７１】
一実施形態では、オッズ比（ＯＲ）が、各バイオマーカーレベルパネル測定値について計算される。ここで、ＯＲは、患者の測定されたバイオマーカー値とアウトカム、例えば、肺がんサブタイプとの間の関連性の尺度である。例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、J.  Can.  Acad.  Child  Adolesc.  Psychiatry、２０１０年；１９巻（３号）：２２７〜２２９頁を参照。
【００７２】
一実施形態では、指定された統計的信頼水準が、肺がんサブタイプに関する信頼水準をもたらすために決定され得る。例えば、９０％超の信頼水準が、肺がんサブタイプの有用な予測因子であり得ると決定される場合がある。他の実施形態では、ある程度ストリンジェントな信頼水準が選択され得る。例えば、約または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、または９９．９％の信頼水準が選択され得る。もたらされる信頼水準は、一部の場合では、試料の品質、データの品質、分析の品質、使用される具体的な方法、および／または分析される遺伝子発現値の数（すなわち、遺伝子の数）に関連している場合がある。応答の可能性をもたらすための指定された信頼水準は、偽陽性または偽陰性の予期された数に基づいて選択され得る。指定された信頼水準を実現し、または診断力を伴ったマーカーを同定するためにパラメーターを選択するための方法は、それだけに限らないが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析、バイノーマルＲＯＣ、主成分分析、オッズ比分析、部分最小二乗分析、特異値分解、最小絶対収縮および選択演算子分析、最小角回帰、および閾値勾配による正則化（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）法がある。
【００７３】
肺がんサブタイプの決定は、一部の場合では、遺伝子発現データの信頼性を正規化および／または改善するように設計されたアルゴリズムの適用によって改善され得る。本発明の一部の実施形態では、データ分析は、処理される個々のデータ点が多数であることに起因して、本明細書に記載の様々なアルゴリズムを適用するために、コンピューターまたは他のデバイス、機械または装置を利用する。「機械学習アルゴリズム」は、例えば、肺がんサブタイプを決定するために１つまたは複数の遺伝子発現プロファイルを特徴付けるのに採用される、「クラシファイヤー」としても当業者に公知の計算ベースの予測方法を指す。例えば、マイクロアレイベースハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイなどによって決定されるバイオマーカーレベルは、一実施形態では、プロファイルを分類するためにアルゴリズムにかけられる。教師あり学習では、一般に、クラスの中の相違（例えば、腺癌陽性、腺癌陰性、扁平上皮細胞癌腫（squamous）陽性、扁平上皮細胞癌腫（squamous）陰性、神経内分泌癌腫陽性、神経内分泌癌腫陰性、小細胞陽性、小細胞陰性、スクアモイド（近位炎症性）陽性、ブロンコイド（終末呼吸単位）陽性、またはマグノイド（近位増殖性）陽性）を認識するためにクラシファイヤーを「訓練し」、次いで独立した検査セットでクラシファイヤーの精度を「検査する」。新しい未知の試料について、クラシファイヤーを使用して、例えば、試料が属するクラス（例えば、腺癌対扁平上皮細胞癌腫対神経内分泌癌腫）を予測することができる。
【００７４】
一部の実施形態では、ロバストなマルチアレイ平均（ＲＭＡ）法が、未処理データを正規化するのに使用される場合がある。ＲＭＡ法は、いくつかのマイクロアレイ上のそれぞれのマッチしたセルについてバックグラウンド補正した強度を計算することによって始まる。一実施形態では、バックグラウンド補正値は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Irizarryら（２００３年）、Biostatistics、４月、４巻（２号）：２４９〜６４頁によって記載されているように正の値に制限される。バックグラウンド補正後、次いで、それぞれのバックグラウンド補正されたマッチしたセルの強度の底２の対数が得られる。次いで、各マイクロアレイについてバックグラウンド補正され、対数変換され、マッチした強度は、分位数正規化法を使用して正規化される。分位数正規化法では、各入力アレイおよび各プローブ値について、アレイパーセンタイルプローブ値が、すべてのアレイパーセンタイル点の平均と置き換えられる。この方法は、その全体が参照により組み込まれている、Bolstadら、Bioinformatics、２００３年によってより完全に記載されている。分位数正規化の後、次いで正規化されたデータを線形モデルにフィッティングして、各マイクロアレイの各プローブについての強度尺度を得ることができる。次いで、Ｔｕｋｅｙのメディアンポリッシュアルゴリズム（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Tukey,  J.  W.、Exploratory  Data  Analysis、１９７７年）を使用して、正規化されたプローブセットデータについて対数スケール強度レベルを決定することができる。
【００７５】
様々な他のソフトウェアプログラムを実装することができる。ある特定の方法では、特徴選択およびモデル推定を、ｇｌｍｎｅｔを使用してｌａｓｓｏペナルティを用いてロジスティック回帰によって実施することができる（その全体が参照により組み込まれている、Friedmanら（２０１０年）、Journal  of  statistical  software、３３巻（１号）：１〜２２頁）。未処理の読みは、ＴｏｐＨａｔを使用してアラインできる（その全体が参照により組み込まれている、Trapnellら（２００９年）、Bioinformatics、２５巻（９号）：１１０５〜１１頁）。諸方法では、上位の特徴（１０〜２００の範囲のＮ）が、ｅ１０７１ライブラリー（その全体が参照により組み込まれている、Meyer  D.、Support  vector  machines:  the  interface  to  libsvm  in  package  e1071.、２０１４年）を使用して線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）（その全体が参照により組み込まれている、Suykens  JAK、Vandewalle  J.、Least  Squares  Support  Vector  Machine  Classifiers、Neural  Processing  Letters、１９９９年；９巻（３号）：２９３〜３００頁）を訓練するのに使用される。信頼区間は、一実施形態では、ｐＲＯＣパッケージ（その全体が参照により組み込まれている、Robin  X、Turck  N、Hainard  Aら、pROC:  an  open-source  package  for  R  and  S+  to  analyze  and  compare  ROC  curves、BMC  bioinformatics、２０１１年；１２巻：７７頁）を使用して計算される。
【００７６】
さらに、データをフィルタリングして、疑わしいと見なされ得るデータを除去してもよい。一実施形態では、約４、５、６、７、または８未満のグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、これらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造問題に起因して信頼できないと見なされる場合がある。同様に、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２超のグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、これらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造問題に起因して信頼できないと一実施形態では見なされる場合がある。
【００７７】
本発明の一部の実施形態では、プローブセットからのデータは、これらが検出可能なレベル（バックグラウンドより上）で同定されない場合、分析から除外され得る。
【００７８】
本開示の一部の実施形態では、分散を呈さない、または低い分散を呈するプローブセットは、さらなる分析から除外され得る。低分散プローブセットは、カイ二乗検定を介して分析から除外される。一実施形態では、プローブセットは、その変換された分散が、（Ｎ−ｌ）自由度を有するカイ二乗分布の９９パーセント信頼区間の左にある場合、低分散であると見なされる。（Ｎ−ｌ）＊プローブセット分散／（遺伝子プローブセット分散）。Ｃｈｉ−Ｓｑ（Ｎ−ｌ）について、Ｎが、入力ＣＥＬファイルの数である場合、（Ｎ−ｌ）は、カイ二乗分布の自由度であり、「遺伝子についてのプローブセット分散」は、遺伝子にわたるプローブセット分散の平均である。本発明の一部の実施形態では、所与のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの群についてのプローブセットは、これらが、ＧＣ含有量、信頼性、分散などについて以前に記載したフィルターステップを通過する最小数未満のプローブを含有する場合、さらなる分析から除外される場合がある。例えば、一部の実施形態では、所与の遺伝子または転写物クラスターについてのプローブセットは、これらが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５未満、または約２０未満のプローブを含有する場合、さらなる分析から除外され得る。
【００７９】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、本明細書に提供される特徴選択アルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一部の実施形態では、特徴選択は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Smyth,  G.  K.（２００５年）、Limma:linear  models  for  microarray  data.  In:  Bioinformatics  and  Computational  Biology  Solutions  using  R  and  Bioconductor、R.  Gentleman、V.  Carey、S.  Dudoit、R.  Irizarry、W.  Huber(編)、Springer、New  York、３９７〜４２０頁）を使用することによってもたらされる。
【００８０】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、プレクラシファイヤーアルゴリズムの使用を含む。例えば、アルゴリズムは、特異的分子フィンガープリントを使用して、試料をこれらの組成に従って予め分類し、次いで補正／正規化因子を適用することができる。次いでこのデータ／情報を、最終的な分類アルゴリズムに送ることができ、このアルゴリズムは、その情報を組み込んで最終的な診断を助ける。
【００８１】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、本明細書に提供されるクラシファイヤーアルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一実施形態では、対角線形判別分析、ｋ−最近隣アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形サポートベクターマシン、ランダムフォレストアルゴリズム、もしくは確率モデルベース法、またはこれらの組合せが、マイクロアレイデータを分類するために提供される。一部の実施形態では、試料（例えば、様々なバイオマーカーレベルプロファイルの、様々な肺がんサブタイプの、および／または腺癌の様々な分子サブタイプ（例えば、スクアモイド、ブロンコイド、マグノイド）の）を区別する同定されたマーカーは、目的のクラス間のバイオマーカーレベルの差異の統計的有意性に基づいて選択される。一部の場合では、統計的有意性は、偽発見率（ＦＤＲ）についてのＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇまたは別の補正を適用することによって調整される。
【００８２】
一部の場合では、クラシファイヤーアルゴリズムは、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、FishelおよびKaufmanら、２００７年、Bioinformatics、２３巻（１３号）：１５９９〜６０６頁に記載されたものなどのメタ分析手法を追加されている場合がある。一部の場合では、クラシファイヤーアルゴリズムは、再現性分析などのメタ分析手法を追加されている場合がある。
【００８３】
バイオマーカーレベルデータの分析に事後確率を導出および適用するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Smyth,  G.  K.、２００４年、Stat.  Appl.  Genet.  Mol.  Biol.、３巻：論文３に記載されている。一部の場合では、事後確率を本発明の方法において使用して、クラシファイヤーアルゴリズムによって提供されるマーカーをランク付けすることができる。
【００８４】
バイオマーカーレベルプロファイリングの結果の統計的評価は、肺がんサブタイプ（腺癌、扁平上皮細胞癌腫、神経内分泌癌腫）；腺癌の分子サブタイプ（スクアモイド、ブロンコイド、またはマグノイド）；特定の治療的介入、例えば、血管新生阻害剤療法または化学療法の成功の可能性のうちの１つまたは複数を示す１つまたは複数の定量的な値を提供し得る。一実施形態では、データは、患者ケアを指導するのにその最も有用な形式で医師に直接提示され、または臨床試験における患者集団もしくは所与の薬物投与についての患者集団を定義するのに使用される。分子プロファイリングの結果は、それだけに限らないが、スチューデントＴ検定、両側Ｔ検定、ピアソン順位和分析、隠れマルコフモデル分析、ｑ−ｑプロットの分析、主成分分析、一元配置ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ、ＬＩＭＭＡなどを含めた当技術分野で公知のいくつかの方法を使用して統計的に評価することができる。
【００８５】
一部の場合では、精度は、元の診断の精度を決定するために経時的に対象を追跡することによって決定され得る。他の場合では、精度は、確定的な様式で、または統計的方法を使用して確立され得る。例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用することによって、最適なアッセイパラメーターを決定して、具体的なレベルの精度、特異性、正の予測値、負の予測値、および／または偽発見率を実現することができる。
【００８６】
一部の場合では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、分子プロファイリング企業、個人、医療提供者、または保険会社の代表またはエージェントによるアクセスのためにデータベースに入力される。一部の場合では、アッセイ結果は、医療専門家などの企業の代表、エージェント、またはコンサルタントによる試料分類、同定、または診断を含む。他の場合では、データのコンピューター分析またはアルゴリズム分析は、自動的に提供される。一部の場合では、分子プロファイリング企業は、個人、保険会社、医療提供者、研究者、または政府機関に、実施される分子プロファイリングアッセイ、コンサルティングサービス、データ分析、結果の報告、またはデータベースアクセスのうちの１つまたは複数について対価請求する場合がある。
【００８７】
本発明の一部の実施形態では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、コンピュータースクリーンでの報告として、または紙の記録として提示される。一部の実施形態では、報告は、それだけに限らないが、参照試料または参照値（単数または複数）と比較したバイオマーカーのレベル（例えば、コピー数または蛍光強度などによって報告される）；バイオマーカーレベル値および肺がんサブタイプに基づいた、対象が特定の療法に応答する可能性、ならびに提案される療法のうちの１つまたは複数などの情報を含み得る。
【００８８】
一実施形態では、遺伝子発現プロファイリングの結果は、腺癌陽性、腺癌陰性、扁平上皮細胞癌腫陽性、扁平上皮細胞癌腫陰性、神経内分泌癌腫陽性、神経内分泌癌腫陰性、小細胞癌腫陽性、小細胞癌腫陰性、スクアモイド（近位炎症性）陽性、ブロンコイド（終末呼吸単位）陽性、マグノイド（近位増殖性）陽性、スクアモイド（近位炎症性）陰性、ブロンコイド（終末呼吸単位）陰性、マグノイド（近位増殖性）陰性；血管新生阻害剤もしくは化学療法への応答のしやすさ；血管新生阻害剤もしくは化学療法への応答のしにくさ；またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数に分類することができる。
【００８９】
本発明の一部の実施形態では、結果は、訓練されたアルゴリズムを使用して分類される。本発明の訓練されたアルゴリズムには、既知の遺伝子発現値および／または正常試料、例えば、腺癌の特定の分子サブタイプと診断された個体からの試料の参照セットを使用して開発されたアルゴリズムが含まれる。一部の場合では、公知の遺伝子発現値の参照セットは、特定の分子サブタイプの腺癌を有すると診断された個体から得られ、血管新生阻害剤療法に応答する（または応答しない）こともまた公知である。
【００９０】
試料のカテゴリー化に適したアルゴリズムとしては、それだけに限らないが、ｋ−最近隣アルゴリズム、サポートベクターマシン、線形判別分析、対角線形判別分析、アップダウン、ナイーブベイジアンアルゴリズム、ニューラルネットワークアルゴリズム、隠れマルコフモデルアルゴリズム、遺伝的アルゴリズム、またはこれらの任意の組合せがある。
【００９１】
バイナリークラシファイヤーが実際の真の値（例えば、生体試料からの値）と比較されるとき、典型的には４つの可能なアウトカムがある。予測からのアウトカムが、ｐ（「ｐ」は、欠失症候群または重複症候群の存在などの陽性のクラシファイヤー出力である）であり、実際の値もｐである場合、それは、真の陽性（ＴＰ）と呼ばれるが、実際の値がｎである場合、それは、偽陽性（ＦＰ）と言われる。反対に、予測アウトカムおよび実際の値の両方がｎ（「ｎ」は、欠失症候群または重複症候群なしなどの陰性のクラシファイヤー出力である）であるとき、真の陰性が起こっており、偽陰性は、予測アウトカムがｎであり、一方、実際の値がｐであるときである。一実施形態では、人が血管新生阻害剤療法に応答しやすいかしにくいかを決定しようとする検査を考慮されたい。この場合において偽陽性は、実際には応答しないのに、人が陽性の試験結果を得るときに起こる。他方において偽陰性は、彼らが実際には応答しやすいのに、人が陰性の検査結果を得、彼らが応答しにくいと示唆されるときに起こる。同じことが、肺がんサブタイプを分類するのに当てはまる。
【００９２】
陽性予測値（ＰＰＶ）、または精度率、または疾患の検査後確率は、応答しやすいもしくはしにくいと正しく診断される、または正しい肺がんサブタイプと診断される、あるいはこれらの組合せである、陽性試験結果を有する対象の割合である。これは、陽性の検査が、検査されている基礎状態を反映する確率を反映する。しかしその値は、変動し得る疾患の有病率に依存する。一例では、以下の特性が提供される：ＦＰ（偽陽性）；ＴＮ（真の陰性）；ＴＰ（真の陽性）；ＦＮ（偽陰性）。偽陽性率（α）＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）−特異性；偽陰性率（β）＝ＦＮ／（ＴＰ＋ＦＮ）−感度；仕事率＝感度＝１−β；尤度比陽性＝感度／（ｌ−特異性）；尤度比陰性＝（１−感度）／特異性。陰性予測値（ＮＰＶ）は、正しく診断されている陰性試験結果を有する対象の割合である。
【００９３】
一部の実施形態では、主題方法のバイオマーカーレベル分析の結果は、所与の診断が正しい統計的信頼水準をもたらす。一部の実施形態では、このような統計的信頼水準は、少なくとも約、または約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％超、またはそれ超である。
【００９４】
一部の実施形態では、本方法は、試料中のバイオマーカーレベルと、例えば、少なくとも１つの訓練セット中に存在する参照バイオマーカーレベルとの比較に基づいて特定の肺がんサブタイプとして肺組織試料を分類することをさらに含む。一部の実施形態では、肺組織試料は、比較の結果が、１つまたは複数の判断基準、例えば、最小パーセント合致、（例えば）カッパ統計量などのパーセンテージ合致に基づいて計算される統計量の値、最小相関（例えば、ピアソン相関）などを満たす場合、特定のサブタイプとして分類される。
【００９５】
本明細書に記載の方法は、ソフトウェア（メモリーに記憶され、かつ／もしくはハードウェアで実行される）、ハードウェア、またはこれらの組合せによって実施され得ることが意図されている。ハードウェアモジュールは、例えば、汎用プロセッサー、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含み得る。ソフトウェアモジュール（ハードウェアで実行される）は、Ｕｎｉｘ（登録商標）ユーティリティ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、ビジュアルベーシック（商標）、ならびに他のオブジェクト指向の、手続型の、または他のプログラミング言語および開発ツールを含めた様々なソフトウェア言語（例えば、コンピューターコード）で表現することができる。コンピューターコードの例としては、それだけに限らないが、コンパイラーによって生成されるものなどの、マイクロコードまたはマイクロインストラクション、マシンインストラクション、ウェブサービスを作製するのに使用されるコード、およびインタープリターを使用してコンピューターによって実行されるより高いレベルのインストラクションを含有するファイルがある。コンピューターコードの追加の例としては、それだけに限らないが、制御信号、暗号化されたコード、および圧縮コードがある。
【００９６】
本明細書に記載の一部の実施形態は、本明細書に開示の様々なコンピューターで実装される操作および／または方法を実施するためにインストラクションまたはコンピューターコードを有する非一時的なコンピューター可読媒体（非一時的プロセッサー可読媒体またはメモリーと呼ぶこともできる）を伴ったデバイスに関する。コンピューター可読媒体（またはプロセッサー可読媒体）は、それがそれ自体で一時的伝搬信号（例えば、空間またはケーブルなどの伝送媒体で情報を搬送する伝搬電磁波）を含まないという意味で非一時的である。媒体およびコンピューターコード（コードと呼ぶこともできる）は、１つまたは複数の具体的な目的のために設計および構築されたものであり得る。非一時的コンピューター可読媒体の例としては、それだけに限らないが、磁気記憶媒体、例えば、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および磁気テープなど；コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）などの光記憶媒体、コンパクトディスク−リードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、およびホログラフィックデバイスなど；光ディスクなどの光磁気記憶媒体；搬送波信号処理モジュール；ならびにプログラムコードを記憶および実行するように特別に構成されているハードウェアデバイス、例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、およびランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）デバイスなどがある。本明細書に記載の他の実施形態は、例えば、本明細書に論じたインストラクションおよび／またはコンピューターコードを含むことができるコンピュータープログラム製品に関する。
【００９７】
一部の実施形態では、単一のバイオマーカー、または約５〜約１０種、約５〜約１５種、約５〜約２０種、約５〜約２５種、約５〜約３０種、約５〜約３５種、約５〜約４０種、約５〜約４５種、約５〜約５０種のバイオマーカー（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したような）は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の予測成功率で肺がんのタイプおよび／またはサブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示のバイオマーカーの任意の組合せ（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６、ならびにこれらのサブコンビネーションにおける）を使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の予測成功率を得ることができる。
【００９８】
一部の実施形態では、単一のバイオマーカー、または約５〜約１０種、約５〜約１５種、約５〜約２０種、約５〜約２５種、約５〜約３０種、約５〜約３５種、約５〜約４０種、約５〜約４５種、約５〜約５０種のバイオマーカー（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したような）は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の感度または特異性で肺がんタイプおよび／またはサブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示のバイオマーカーの任意の組合せを使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の感度または特異性を得ることができる。
【００９９】
一部の実施形態では、本発明の方法を実践するための１つまたは複数のキットがさらに提供されている。キットは、クラシファイヤーバイオマーカーのバイオマーカーレベルを検出するための少なくとも１種の試薬、例えば、抗体、核酸プローブまたはプライマーなどを含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）を包含することができる。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして販売促進し、流通させ、または販売することができる。さらに、キットは、キットおよびその使用のための方法を記載している添付文書を含有することができる。
【０１００】
一実施形態では、がんに罹患している患者について疾患アウトカムまたは予後を決定するための方法が、本明細書に提供されている。一部の場合では、がんは肺がんである。本方法は、患者のがんの分子サブタイプを患者のがんの形態学的サブタイプと比較することによって、患者について疾患アウトカムまたは予後を決定するステップであって、分子サブタイプと形態学的サブタイプとの間の一致の存在または非存在は、患者の疾患アウトカムまたは予後を予測する、ステップを含み得る。一実施形態では、分子サブタイプと形態学的サブタイプとの間の不一致は、不良な予後または不良な疾患アウトカムを示す。不良な予後または疾患アウトカムは、その分子サブタイプおよび形態学的サブタイプの決定が一致する、同じタイプのがん（例えば、肺がん）に罹患している患者との比較であり得る。疾患アウトカムまたは予後は、ある期間または間隔（例えば、０〜３６カ月または０〜６０カ月）にわたって全生存を試験することによって測定され得る。一実施形態では、生存は、サブタイプ（例えば、肺がん、腺癌（ＴＲＵ、ＰＩ、およびＰＰ）、神経内分泌癌腫（小細胞癌腫およびカルチノイド）、または扁平上皮細胞癌腫（squamous）について）の関数として分析される。無再発生存および全生存は、標準的なカプラン・マイヤープロット（図４〜１１を参照）ならびにＣｏｘ比例ハザードモデリングを使用して評価され得る。
【０１０１】
一実施形態では、分子サブタイプは、クラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを検出し、それによって発現プロファイルを得ることによって決定される。発現プロファイルは、本明細書に提供する方法のいずれかを使用して決定され得る。一部の場合では、患者は、肺がんに罹患しており、患者から得られる肺組織試料の分子サブタイプは、発現レベルを検出するための本明細書に提供する方法（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイなど）のいずれかを使用して、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の単一のバイオマーカー、または約５〜約１０種、約５〜約１５種、約５〜約２０種、約５〜約２５種、約５〜約３０種、約５〜約３５種、約５〜約４０種、約５〜約４５種、約５〜約５０種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルを検出することによって決定される。
【０１０２】
一実施形態では、分子サブタイプは、ＲＴ−ＰＣＲ（またはｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、肺組織試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの発現レベルを検出し、患者から得られる肺組織試料の分子サブタイプが腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプであるかを決定するために、検出された発現レベルを本明細書で記載するような参照試料または訓練セットのものと比較することによって決定される。神経内分泌癌腫サブタイプは、小細胞癌腫およびカルチノイドを包含し得る。腺癌サブタイプは、ＴＲＵ、ＰＩ、またはＰＰとしてさらに分類され得る。ＲＴ−ＰＣＲは、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーを用いて実施され得る。少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６に列挙された順方向プライマーおよび逆方向プライマーである。
【０１０３】
一実施形態では、分子サブタイプは、肺組織試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドのこれらの相補体または実質的な相補体へのハイブリダイゼーションに適した条件下で混合すること、ハイブリダイゼーションが、５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるか否かを検出すること、検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることによるステップと、患者から得られる肺組織試料の分子サブタイプが腺癌、扁平上皮細胞癌腫、または神経内分泌癌腫サブタイプであるかを決定するために、検出されたハイブリダイゼーション値を本明細書で記載するような参照試料または訓練セットのものと比較するステップとによって決定される。神経内分泌癌腫サブタイプは、小細胞癌腫およびカルチノイドを包含し得る。腺癌サブタイプは、ＴＲＵ、ＰＩ、またはＰＰとしてさらに分類され得る。
【０１０４】
一実施形態では、組織試料（例えば、肺組織試料）の形態学的サブタイプは、組織学的分析である。組織学的分析は、当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して実施され得る。一実施形態では、肺組織試料には、組織学的分析に基づいて腺癌、扁平上皮細胞癌腫（squamous）、または神経内分泌癌腫の組織学的サブタイプが割り当てられる。一実施形態では、肺がんに罹患している患者から得られる肺組織試料の組織学的サブタイプは、肺組織試料の分子サブタイプと比較され、分子サブタイプは、クラシファイヤー遺伝子（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６からの）の遺伝子発現レベルを試験することによって決定される。一実施形態では、組織学的サブタイプと分子サブタイプとが一致し、患者の全生存（例えば、標準的なカプラン・マイヤープロットならびにＣｏｘ比例ハザードモデリングを使用することによって決定されるような）は、同じサブタイプのがんを有する他の患者の全生存と実質的に類似している。一実施形態では、組織学的サブタイプと分子サブタイプとは一致せず、患者の全生存（例えば、標準的なカプラン・マイヤープロットならびにＣｏｘ比例ハザードモデリングを使用することによって決定されるような）は、がんの一致する分子サブタイプおよび組織学的サブタイプの決定を有する他の患者の全生存と実質的に非類似である。一致しないサブタイプを有する患者の全生存確率は、一致するサブタイプのがん（例えば、肺がん）を有する患者の全生存確率よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％少ないまたはそれよりも低くてもよい。
【０１０５】
一実施形態では、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、適当な療法、例えば、血管新生阻害剤を用いた化学療法または薬物療法について選択される。一実施形態では、療法は、血管新生阻害剤療法であり、血管新生阻害剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）阻害剤、またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である。
【０１０６】
別の実施形態では、血管新生阻害剤は、インテグリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、接着分子アンタゴニスト（例えば、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、血小板内皮接着分子（ＰＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）のアンタゴニスト）、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子アンタゴニスト、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）モジュレーター、または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）モジュレーター（例えば、ＰＤＧＦアンタゴニスト）である。対象がインテグリンアンタゴニストに応答しやすいか否かを決定する一実施形態では、インテグリンアンタゴニストは、小分子インテグリンアンタゴニスト、例えば、Paolilloら（Mini  Rev  Med  Chem、２００９年、１２巻、１４３９〜１４４６頁、その全体が参照により組み込まれている）によって記載されるアンタゴニスト、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，５２４，５８１号に記載されるような白血球接着誘導性サイトカインもしくは増殖因子アンタゴニスト（例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））である。
【０１０７】
本明細書に提供する方法は、対象が以下の血管新生阻害剤のうちの１種または複数に応答しやすいか否かを決定するためにも有用である：インターフェロンガンマ１β、ピルフェニドンを伴ったインターフェロンガンマ１β（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、ｓａｌｖｉａおよびｓｃｈｉｓａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓを伴ったａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ抽出物、アテローム硬化性プラークブロッカー、アゾル、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織増殖因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、エスブリエット、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン（Fibrocorin）、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロン（Heberon）アルファＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を伴ったＰＹＮ２２、レリベルゲン（Relivergen）、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング増殖因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、またはこれらの組合せ。
【０１０８】
別の実施形態では、対象が１種または複数の内因性血管新生阻害剤に応答しやすいか否かを決定するための方法が提供されている。さらなる実施形態では、内因性血管新生阻害剤は、エンドスタチン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａ  Ｃ末端断片、アンギオスタチン（プラスミンの３８ｋＤａ断片）、またはタンパク質のトロンボスポンジン（ＴＳＰ）ファミリーのメンバーである。さらなる実施形態では、血管新生阻害剤は、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５である。以下の血管新生阻害剤：可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−１およびニューロピリン１（ＮＰＲ１）、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子−４、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４）、軟骨由来血管新生阻害剤（例えば、ペプチドトロポニンＩおよびコンドロモジュリンＩ（chrondomodulin  I））、トロンボスポンジンモチーフ１を伴ったディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン、例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを有するケモカイン（例えば、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０または小誘導性サイトカインＢ１０としても公知のＣＸＣＬ１０）、インターロイキンサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、プロトロンビン、抗トロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子によってコードされるタンパク質、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質のうちの１種または複数への応答の可能性を決定するための方法もまた提供されている。
【０１０９】
一実施形態では、以下の血管新生阻害剤：アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、アンギオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、トロンボスポンジン、カルレティキュリン、血小板因子−４、ＴＩＭＰ、ＣＤＡＩ、インターフェロンα、インターフェロンβ、血管内皮増殖因子阻害剤（ＶＥＧＩ）メタ−１、メタ−２、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レスチン、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、インターフェロンガンマ１β、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、ｓａｌｖｉａおよびｓｃｈｉｓａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓを伴ったａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ抽出物、アテローム硬化性プラークブロッカー、アゾル、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織増殖因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、エスブリエット、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロンアルファＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を伴ったＰＹＮ２２、レリベルゲン、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング増殖因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、またはこれらの組合せのうちの１種または複数への応答の可能性を決定するための方法が提供されている。
【０１１０】
さらに別の実施形態では、以下の血管新生阻害剤：パゾパニブ（ヴォトリエント）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブ（インライタ）、ポナチニブ（アイクルシグ）、バンデタニブ（カプレルサ）、カボザンチニブ（コメトリグ（Cometrig））、ラムシルマブ（サイラムザ）、レゴラフェニブ（スチバーガ）、ジブ−アフリベルセプト（ザルトラップ）、またはこれらの組合せのうちの１種または複数への応答の可能性を決定するための方法が提供されている。さらに別の実施形態では、血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ阻害剤である。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはモテサニブである。なおさらなる実施形態では、血管新生阻害剤は、モテサニブである。
【０１１１】
一実施形態では、本明細書に提供する方法は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーのアンタゴニスト、例えば、ＰＤＧＦ−受容体（ＰＤＧＦＲ）のシグナル伝達および／または活性を阻害、低減、またはモジュレートする薬物への応答の、対象の可能性を決定することに関する。例えば、ＰＤＧＦアンタゴニストは、一実施形態では、抗ＰＤＧＦアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその断片、抗ＰＤＧＦＲ抗体もしくはその断片、または低分子アンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βのアンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦ−βアプタマーＥ１００３０、スニチニブ、アキシチニブ、ソラフェニブ（sorefenib）、イマチニブ、イマチニブメシル酸塩、ニンテダニブ、パゾパニブＨＣｌ、ポナチニブ、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ、パゾパニブ、クレノラニブ、ＰＰ−１２１、テラチニブ、イマチニブ、ＫＲＮ６３３、ＣＰ６７３４５１、ＴＳＵ−６８、Ｋｉ８７５１、アムバチニブ、チボザニブ、マシチニブ、モテサニブ二リン酸塩、ドビチニブ二乳酸、リニファニブ（ＡＢＴ−８６９）である。
【実施例】
【０１１２】
本発明を、以下の実施例を参照することによってさらに例示する。しかし、これらの実施例は、上述した実施形態のように、例示的であり、本発明の範囲を制限すると決して解釈されるべきでないことに留意されるべきである。
（実施例１）
５７の遺伝子発現肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）をバリデートするための方法
【０１１３】
２，１６８の肺がん試料を含むいくつかの公的に利用可能な肺がん遺伝子発現データセット（ＴＣＧＡ、ＮＣＩ、ＵＮＣ、Ｄｕｋｅ、Ｅｘｐｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｔｏｋｙｏ、およびＦｒａｎｃｅ）をアセンブルして、肺腫瘍の形態学的分類を補完するように開発された５７の遺伝子発現肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）をバリデートした。ＬＳＰは、５２の肺腫瘍分類遺伝子＋５つのハウスキーピング遺伝子を含んでいた。遺伝子発現データおよび肺腫瘍形態学的分類の両方を有するデータセットを選択した。ゲノムデータの３つのカテゴリーを、データセット：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３＋２（ｎ＝８８３）（「Ａ−８３３」とも呼ばれる）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ（ｎ＝３３４）（「Ａ−３３４」とも呼ばれる）、およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝９５１）（「Ｉ−９５１」とも呼ばれる）で表した。データソースを表７に提供し、正規化法を表８に提供する。腺癌、カルチノイド、小細胞癌腫、および扁平上皮細胞癌腫の確定診断を有する試料を、分析で使用した。
【表７】
2018512160.tif 000026
【表８】
2018512160.tif 000027
【０１１４】
Ａ−８３３データセットを、以前に記載した方法に従って、腺癌、カルチノイド、小細胞癌腫、および扁平上皮細胞癌腫遺伝子重心（ｇｅｎｅ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）を計算するための訓練として使用した。次いで、Ａ−８３３データで訓練された遺伝子重心を正規化されたＴＣＧＡおよびＡ−３３４データセットに適用して、公的に利用可能な遺伝子発現データを使用して肺腫瘍を分類するＬＳＰの能力を調査した。Ａ−８３３訓練重心（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）をＡ−８３３データセットに適用するために、評価を、リーブワンアウト（ＬＯＯ）クロスバリデーションを使用して実施した。スピアマン相関を、Ａ−８３３遺伝子発現訓練重心に対する腫瘍試料遺伝子発現結果について計算した。腫瘍に、最大に相関した重心に対応するゲノム定義の組織学的型（カルチノイド、小細胞癌腫、腺癌、および扁平上皮細胞癌腫）を割り当てた。２クラス、３クラス、および４クラス予測を探索した。正しい予測を、腫瘍の組織学的診断にマッチするＬＳＰコールとして定義した。パーセント合致を、すべての予測の数によって除した正しい予測の数として定義し、合致カッパ統計量を計算した。
【０１１５】
１０の肺腫瘍ＲＮＡ発現データセットを組み合わせて、３つのプラットフォーム特異的データセット（Ａ−８３３、Ａ−３３４、およびＩ−９５１）にした。患者集団は、多様であり、病期１〜病期ＩＶの範囲の腫瘍を有する喫煙者および非喫煙者を含んでいた。３つのデータセットの試料特性および肺がん診断は、表９に含まれている。
【表９−１】
2018512160.tif 000028
【表９−２】
2018512160.tif 000029
【０１１６】
２クラス、３クラス、および４クラス予測因子について予測された腫瘍型を、腫瘍形態学的分類およびパーセント合致と比較し、Ｆｌｅｉｓｓカッパを各予測因子について計算した（表１０ａ〜ｃ）。
【表１０ａ】
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【表１０ｂ】
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【表１０ｃ】
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【０１１７】
形態学的分類単独に基づく肺がん診断の観察者間再現性の評価は、以前に公開されている。全体的な観察者間合致は、タイピングスキームの単純化で改善した。包括的な２００４世界保健機関分類システムを使用して、観察者間合致は低かった（ｋ＝０．２５）。合致は、治療上意味がある扁平上皮／非扁平上皮の２タイプ区別に診断を単純化すると改善した（ｋ＝０．５５）。観察者間診断の合致を、本バリデーション試験における２、３、および４クラスＬＳＰ診断の合致と比較する（表１１）。
【表１１】
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【０１１８】
肺がんの様々な形態学的なサブタイプの間の区別は、ますます重要になっており、その理由は、治療剤開発および患者管理が、各腫瘍のユニークな特徴により特異的に標的化された状態になっているためである。組織学的診断は、挑戦的であり得、いくつかの試験は、形態学的な診断の再現性が限定的であることを実証している。ｐ６３およびＴＴＦ−１などのいくつかの免疫組織化学検査マーカーを加えると、診断上の精度が改善されるが、多くの肺がん生検は、サイズおよび／または細胞充実度が限られており、複数のＩＨＣマーカーを使用する完全な特徴付けを妨げている。合致は、組織学的診断のより大きい精度および／またはＲＮＡ発現結果のより大きい精度におそらく起因して、他のデータセットと比較してＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータセットにおけるすべてのクラシファイヤー（２、３、および４タイプ）について著しくより良好であった（％合致範囲９１％〜９４％）。以下に記載するいくつかの限定事項にもかかわらず、本試験は、ＬＳＰが肺腫瘍のタイピングにおける組織診断の貴重な補助となるものであり得ることを実証する。
【０１１９】
数百の肺がん試料を有する複数のデータセットでは、肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）を使用する分子プロファイリングは、光学顕微鏡で得られる診断と有利には匹敵し、病理学者の再評価より高いレベルの合致を示した。ＲＮＡベース腫瘍サブタイピングは、特に、組織が限定的であり、形態学的診断が不明確なままであるとき、診療所において貴重な情報を提供することができる。
【０１２０】
以下の参考文献の開示は、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【化１】
2018512160.tif 000034
（実施例２）
複数の新鮮凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋肺腫瘍遺伝子発現データセットの肺がんサブタイピング
【０１２１】
２，１７７の試料を含む複数のデータセットをアセンブルして、肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）遺伝子発現クラシファイヤーを評価した。データセットは、２，０９９の新鮮凍結肺がん試料を含むいくつかの公的に利用可能な肺がん遺伝子発現データセット（ＴＣＧＡ、ＮＣＩ、ＵＮＣ、Ｄｕｋｅ、Ｅｘｐｏ、Ｓｅｏｕｌ、およびＦｒａｎｃｅ）、ならびに７８のＦＦＰＥ試料から新しく収集された遺伝子発現データを含んでいた。データソースを以下の表１２に提供する。７８のＦＦＰＥ試料は、ＩＲＢ承認プロトコールを使用してノースカロライナ大学チャペルヒル校（ＵＮＣ−ＣＨ）で収集された、アーカイブされた残留する肺腫瘍試料であった。ＡＤ、カルチノイド、小細胞癌腫（ＳＣＣ）、またはＳＱＣの確定診断を有する試料のみを、分析で使用した。ゲノムデータの合計４カテゴリーが分析に利用可能であった：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３＋２（ｎ＝６９３）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ（ｎ＝３４４）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝１，０６２）、および新しく収集されたｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝７８）データ。
【０１２２】
アーカイブされたＦＦＰＥ肺腫瘍試料（ｎ＝７８）を、以下の改変とともに、以前に記載されたｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ（すべての目的に関してその全体が本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を使用して分析した。ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、ＦＦＰＥ組織の１つの１０μｍの切片から抽出した。抽出したＲＮＡを５ｎｇ／μＬに希釈し、第１の鎖のｃＤＮＡを、ランダム六量体（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と組み合わせて遺伝子特異的３’プライマーを使用して合成した。ＡＢＩ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＳＹＢＲ緑色蛍光（５３０ｎｍ）を連続的にモニターしながらｑＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＡＢＩ７９００定量化ソフトウェアは、増幅曲線および関連した閾値サイクル（Ｃｔ）値を生成した。試料とともに集めた元の臨床診断は、表１３にある。
【表１２−１】
2018512160.tif 000035
【表１２−２】
2018512160.tif 000036
【表１３−１】
2018512160.tif 000037
【表１３−２】
2018512160.tif 000038
【０１２３】
病理学的レビューは、追加の切片を収集および画像化したＦＦＰＥ肺腫瘍コホートについてのみ可能であった。各試料からの２つの連続した切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色し、Ａｐｅｒｉｏ（商標）ＳｃａｎＳｃｏｐｅ（登録商標）スライドスキャナー（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用してスキャンした。バーチャルスライドは、３２〜３２０対物レンズ（３４０拡大レンズ）に等価な拡大率で見ることができた。病理学者レビューを元の臨床診断および遺伝子発現ベースサブタイプ分類に対して盲検化した。病理学的レビューベース組織学的サブタイプコールを元の診断と比較した（ｎ＝７８）。病理学的レビューの合致は、両方のスライドが元の診断と同じサブタイプに割り当てられた試料として定義した。
【０１２４】
すべての統計分析は、Ｒ３．０．２ソフトウェア（http://cran.R-project.org）を使用して行った。データ分析は、ＦＦについて、およびＦＦＰＥ腫瘍試料について別個に行った。
【０１２５】
新鮮凍結データセット分析：データセットを表１２に記載したように正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットは、以前に記載された方法（Wilkersonら、PLoS  ONE.、２０１２年；７巻（５号）ｅ３６５３０頁、Doi:10.1371/journal.pone.0036530；Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁、そのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が本明細書に参照により組み込まれている）に従ってＡＤ、カルチノイド、ＳＣＣ、およびＳＱＣ遺伝子重心を計算するための訓練セットとして機能を果たした。
【０１２６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ訓練遺伝子重心を表１４に提供する。訓練セット遺伝子重心を、正規化されたＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑ遺伝子発現データセットおよびＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ遺伝子発現データセットにおいて検査した。公共のＡｇｉｌｅｎｔデータセットからの欠損したデータに起因して、Ａｇｉｌｅｎｔ評価は、ＣＩＢ１、ＦＯＸＨ１、ＬＩＰＥ、ＰＣＡＭ１、ＴＵＢＡ１の遺伝子を除外して５２の遺伝子パネルではなく、４７の遺伝子クラシファイヤーを用いて実施した。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０１２７】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータの評価を、リーブワンアウト（ＬＯＯ）クロスバリデーションを使用して実施した。スピアマン相関を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現訓練重心に対する腫瘍検査試料について計算した。腫瘍に、最大に相関した重心に対応するゲノム定義の組織学的型（ＡＤ、ＳＱＣ、またはＮＥ）を割り当てた。正しい予測を、腫瘍の元の組織学的診断にマッチするＬＳＰコールとして定義した。パーセント合致を、全予測の数によって除した正しい予測の数として定義し、合致カッパ統計量を計算した。
【０１２８】
ＦＦＰＥ試料分析からのｑＲＴ−ＰＣＲ：ＦＦＰＥ肺腫瘍試料のｑＲＴ−ＰＣＲデータから計算された、以前に公開された訓練重心（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を、ＦＦＰＥ肺腫瘍組織からのｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のこの新しい試料セットにおいてクロスバリデートした。ＷｉｌｋｅｒｓｏｎらのＡＤおよびＳＱＣ重心を、公開された通り使用した（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）。神経内分泌癌腫遺伝子重心を、公開された遺伝子発現データ（ｎ＝１３０）（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を使用して同様に計算した。ＦＦＰＥ組織評価についてのＷｉｌｋｅｒｓｏｎらの遺伝子重心（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）は、表１５に含まれている。ＦＦＰＥ試料遺伝子発現データをスケール変更して、遺伝子分散をＷｉｌｋｅｒｓｏｎらのデータとアラインした。データセット間の標識頻度の差異を考慮に入れた遺伝子特異的な倍率を計算した。次いで遺伝子発現データを、中央値中心化、符号反転し（高いＣｔ＝低い存在量）、遺伝子特異的な倍率を使用してスケール変更した。サブタイプは、各試料を３つのサブタイプ重心と相関させ、最高の相関重心（スピアマン相関）を有するサブタイプを割り当てることによって予測した。
【０１２９】
９つのＦＦ＋１つの新しいＦＦＰＥ  ｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データセットを含む１０の肺腫瘍遺伝子発現データセットを組み合わせて、４つのプラットフォーム特異的データセットにした（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ、およびｑＲＴ−ＰＣＲ）。臨床情報が利用可能であったデータセットについては、患者集団は、多様であり、病期１〜病期ＩＶの範囲の腫瘍を有する喫煙者および非喫煙者を含んでいた。本試験で使用したデータセットの試料特性および肺がん診断は、表１６に含まれている。ＡＤ、ＳＱＣ、ＳＣＣ、またはカルチノイドの確定診断を伴わない試料を除外し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に失敗した１つのＦＦＰＥ試料を除外した後、以下の試料がさらなるデータ分析に利用可能であった：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ｎ＝５３８）、Ａｇｉｌｅｎｔ（ｎ＝３２２）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝９５１）、およびｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝７７）。
【表１６】
2018512160.tif 000043
【０１３０】
新しいＦＦＰＥデータセットの新規の評価の手段として、本発明者らは、ＦＦＰＥアーカイブ試料（ｎ＝７７）からのＬＳＰ遺伝子発現の階層的クラスタリングを実施した。予期されたように、この分析は、ＡＤ、ＳＱＣ、およびＮＥに対応する３つのクラスター／サブタイプを実証した（図２）。次いで、所定のＬＳＰ  ３−サブタイプ重心予測因子を４つすべてのデータセットに適用し、結果を腫瘍形態学的分類と比較した。パーセント合致およびＦｌｅｉｓｓカッパを各データセットについて計算した（表１７）。パーセント合致は、７８％〜９１％の範囲であり、カッパは、０．５７〜０．８５の範囲であった。
【０１３１】
独立した病理合致を評価する別の手段として、７７のＦＦＰＥ肺腫瘍の盲検化された病理学的レビューの元の形態学的診断との合致は、８２％（６３／７７）であることが判明した。１２／７７の場合では、盲検化された重複するスライドは、矛盾する結果をもたらし、１０／７７の場合では、重複物の少なくとも一方は、「腺扁平上皮」、「大細胞」、または「高悪性度低分化癌」という非明示的な病理学的サブタイプ分類を有していた。７７の試料のそれぞれについての元の形態学的な診断、盲検化された病理学的レビュー、および遺伝子発現ＬＳＰサブタイプコールの比較を図３に示す。一致しない試料のオーバーラップ（すなわち、腫瘍サブタイプが病理学的レビューおよび遺伝子発現ＬＳＰコールの両方によって元の形態診断と合致しなかった６つの試料）の詳細を表１８に提供する。全体的に、元の病理学的コールに対するＬＳＰのこれらの一致値は、任意の２人の病理学者との間の一致と少なくとも同じぐらい大きく（Grilleyら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻：３２〜４０頁；Thunnissenら、Virchows  Arch、２０１２年；４６１巻（６号）：６２９〜３８頁、Doi:10.1007/s00428-012-1234-x.、２０１２年１０月１２日電子出版；Thunnissenら、Mod  Pathol、２０１２年；２５巻（１２号）：１５７４〜８３頁、Doi:10.1038/modpathol.2012.106；そのそれぞれは、すべての目的に関して本明細書に参照により組み込まれている）、したがって、本明細書に記載のアッセイは、訓練された病理学者と少なくとも同じぐらいよく機能することを示唆した。
【０１３２】
本試験では、ＬＳＰは、信頼できるサブタイプ分類をもたらし、複数の遺伝子発現プラットフォームにわたって、かつＦＦＰＥ標本を使用するときでもその性能をバリデートした。新しくアッセイしたＦＦＰＥ試料の階層的クラスタリングは、５２のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルに基づいて３つのサブタイプ（ＡＣ、ＳＱＣ、およびＮＥ）の良好な分離を実証した。ＬＳＰ重心を使用するときの形態診断との一致は、他のデータセットと比較してＴＣＧＡ試料と関連した非常に広範な病理学的レビューおよび組織学的診断の精度におそらく起因して、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて最大であった（合致＝９１％）。合致は、Ａｇｉｌｅｎｔデータセットにおいて最低であった（７８％）。このデータセットは、その分析について利用可能であった遺伝子の数が少なかったことによって影響された可能性がある。全体的に、ＬＳＰアッセイは、５２ではなく４７のみの遺伝子が分析のために存在したＡｇｉｌｅｎｔデータセットを除いてすべてのデータセットにおいて病理学的レビューより元の形態診断とのより高い一致を示した。
【０１３３】
盲検化された病理学的再レビューが可能であったＦＦＰＥ試料では、結果は、病理学的コールが、元の診断と常に一貫しているとは限らず、これらは、各試料から提供される重複スライドにおいて必ずしも一貫していないことを示唆した。試料のサブセット（ｎ＝６）について、病理学的再レビューおよびＬＳＰ遺伝子発現分析の両方は、同じ代替の診断を示唆し、これから、現状における「ゴールドスタンダード」であった元の形態学的診断の精度が疑問視された。
【０１３４】
本試験では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットにおける少数のＮＥ腫瘍試料があり、ＡｇｉｌｅｎｔデータセットおよびＴＣＧＡデータセットの両方においてＮＥ試料が存在しなかった。これは、ＦＦＰＥ試料セット中の相対的に高い数のＮＥ試料（３１／７７）によって部分的に克服されたため、ＮＥ試料を同定するＬＳＰシグネチャーの能力の良好な検査がもたらされた。本試験の別の限定事項は、盲検化された病理学的再レビューに関する。盲検化された病理学的レビューは、２つの画像化された切片に基づき、複数の切片／ブロック、および潜在的にＩＨＣ染色剤が診断を行うのに利用可能である通常の組織診断の標準プラクティスを反映しなかった。
参照による組み込み
【０１３５】
以下の参考文献は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。
【化２−１】
2018512160.tif 000044
【化２−２】
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【化２−３】
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【化２−４】
2018512160.tif 000047
【表１７】
2018512160.tif 000048
【表１８】
2018512160.tif 000049
（実施例３）
遺伝子発現サブタイピングによる扁平上皮細胞癌腫または神経内分泌癌腫プロファイルを有する腺癌肺腫瘍の生存差。
【０１３６】
図４〜７に示されるように、アレイデータにおいて開発されたおよび本明細書に記載される肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）３−クラス（腺癌（ＡＤ）、扁平上皮細胞癌腫（ＳＱ）、および神経内分泌癌腫（ＮＥ））最短重心（nearest  centroid）予測因子を、ディレクターズチャレンジ（Sheddenら、Ａｆｆｙアレイ、ｎ＝４４２、図４）、ＴＣＧＡ（ＲＮＡｓｅｑ、ｎ＝４９２、図５）、およびTomidaら（Ａｇｉｌｅｎｔアレイ、ｎ＝１１７、図６）データセットにおいて、すべての病期の組織診断定義のＡＤ試料に適用した。各組織診断定義のＡＤ試料は、ＬＳＰ最短重心予測因子に基づいて、ＡＤ、ＳＱ、またはＮＥと予測された。各データセット（図４〜６）およびプールされたデータセット（図７）についてのカプラン・マイヤープロット（図４〜７）およびログランク検定を使用して、２つの群、組織学的に一致したおよび遺伝子発現（ＧＥ）一致したもの（ＡＤ−ＡＤ）、ならびに組織学的に一致しなかったおよびＧＥ一致しなかったもの（ＡＤ予測されたＳＱまたはＮＥ（ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ））において、５年間の全生存を評価および比較した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、Ｔ病期、Ｎ病期、および増殖について制御しつつ、生存差を評価した（ＰＡＭ  ５０スコアによって測定したような；図１２）。ＡＤサブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位増殖性（ＰＰ）、および近位炎症性（ＰＩ））間の試料の分布を調査した。
【０１３７】
すべての病期の組織診断定義のＡＤ試料に対して実施した分析について、予測因子は、組織学的ＡＤ試料の８０％においてＧＥによるＡＤサブタイプを確認したが、組織学的ＡＤ試料は、症例のそれぞれ１２％および８％において、ＳＱおよびＮＥのＧＥサブタイプとコールされた。ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ群（組織診断によってＡＤかつ遺伝子発現ＬＳＰによってＳＱまたはＮＥ）は、各データセットにおいて、ＡＤ−ＡＤ群（組織診断およびＬＳＰの両方によってＡＤ）よりも不良な生存を有した（ＲＮＡｓｅｑ、ディレクターズ、およびTomidaにおけるログランクｐ値は、それぞれ１．１７ｅ−０６、０．０００９、および０．０００１であった）。３つのデータセットをプールし、各試験における異なるベースラインハザードを考慮に入れた層別化ｃｏｘモデルを使用すると、ＡＤ−ＮＥ／ＳＱをＡＤ−ＡＤと比較するハザード比は、１．８４（９５％  ＣＩ  １．４８〜２．３０）であった。Ｔ病期、Ｎ病期、および増殖スコアについて調整するモデルをフィットさせた場合、ＨＲは１．５８（９５％  ＣＩ  １．２２〜２．０４）であった。ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ試料のアデノサブタイプ（Adenosubtype）プロファイリングは、腫瘍が圧倒的にＰＰまたはＰＩのＡＤサブタイプのものであったことを示した（２０９／２１３）。
【０１３８】
全体的に、約２０％の組織学定義の肺腺癌（ＡＤ）は、遺伝子発現プロファイルが異なっている。組織診断−ＧＥが一致しないＡＤ腫瘍は、一致する症例よりも悪い生存を示す。生存差は、上昇した増殖スコアによって部分的に説明され得る（図１２を参照）。生存差は、腫瘍生物学および／または標準的なＡＤ管理レジメンに対する多様な応答に起因し得る。さらに、遺伝子発現腫瘍サブタイピングは、不良な予後を有するＡＤ試料のサブセットを同定する貴重な臨床情報を提供し得る。不良な予後の腺癌試料は、ＰＩおよびＰＰの腺癌サブタイプに属し、上昇した増殖スコアを実証する。ＡＤ腫瘍のこのサブセットは、標準的な腺癌管理に対してあまり応答しない可能性がある。
参照による組み込み
【０１３９】
以下の参考文献は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。
【化３】
2018512160.tif 000050
（実施例４）
遺伝子発現サブタイピングによる扁平上皮細胞癌腫または神経内分泌癌腫プロファイルを有する腺癌肺腫瘍の生存差
【０１４０】
図８〜１１に示されるように、アレイデータにおいて開発されたおよび本明細書に記載される肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）３−クラス（腺癌（ＡＤ）、扁平上皮細胞癌腫（ＳＱ）、および神経内分泌癌腫（ＮＥ））最短重心予測因子を、ディレクターズチャレンジ（Sheddenら、Ａｆｆｙアレイ、ｎ＝３７１、図８）、ＴＣＧＡ（ＲＮＡｓｅｑ、ｎ＝３８４、図９）、およびTomidaら（Ａｇｉｌｅｎｔアレイ、ｎ＝９２、図１０）データセットにおいて、病期ＩおよびＩＩの組織診断定義のＡＤ試料に適用した。各組織診断定義のＡＤ試料は、ＬＳＰ最短重心予測因子に基づいて、ＡＤ、ＳＱ、またはＮＥと予測された。各データセット（図８〜１０）およびプールされたデータセット（図１１）についてのカプラン・マイヤープロット（図８〜１１）およびログランク検定を使用して、２つの群、組織学的に一致したおよび遺伝子発現（ＧＥ）一致したもの（ＡＤ−ＡＤ）、ならびに組織学的に一致しなかったおよびＧＥ一致しなかったもの（ＡＤ予測されたＳＱまたはＮＥ（ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ））において、５年間の全生存を評価および比較した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、ＬＳＰハザード比を試験し、それを、いくつかの他の予後パネル、Wilkersonら（５０６の遺伝子）、Wistubaら（３１の遺伝子）、Kratzら（１１の遺伝子）およびZhuら（１５の遺伝子）と比較した。Wistubaらについては、遺伝子に均等に重みづけした。Kratzらについては、遺伝子に、刊行物中の係数に従って重みづけした。Zhuらについては、遺伝子に、ＴＣＧＡ  ＡＤデータセットにおけるＯＳに対する影響の方向に従って、−１〜＋１の重みづけを行った。Wilkersonらについては、リスクスコアを、ＴＲＵ（ブロンキオイド）重心までの距離として計算した。遺伝子変異の普及率を、肺ＡＤおよびＳＱの顕著に関連した変異について試験した。予測因子は、組織学的ＡＤ試料の８１％においてＧＥによるＡＤサブタイプを確認したが、組織学的ＡＤ試料は、症例のそれぞれ１２％および７％において、ＳＱおよびＮＥのＧＥサブタイプとコールされた。ＡＤ−ＮＥ／ＳＱ群（組織診断によってＡＤかつ遺伝子発現ＬＳＰによってＳＱまたはＮＥ）は、各データセットにおいて、ＡＤ−ＡＤ群（組織診断およびＬＳＰの両方によってＡＤ）よりも不良な生存を有した（図８〜１０中のログランクｐ値を参照）。３つのデータセットをプールし、各試験における異なるベースラインハザードを考慮に入れた層別化ｃｏｘモデルを使用すると、ＡＤ−ＮＥ／ＳＱをＡＤ−ＡＤと比較するハザード比は、図１１に示されるように、２．２７（９５％  ＣＩ  １．７１〜３）であった。
【０１４１】
実施例３からの結論と合致して、この分析は、組織学的に定義された肺ＡＤの約２０％が、遺伝子発現サブタイプによって異なることを示した。さらに、組織診断−ＧＥが一致しないＡＤ腫瘍は、図１４および１５に示されるように、より悪い生存を実証し、複数の予後遺伝子シグネチャーにおける予後リスクの多くの原因である。図１３に示されるように、組織診断−ＧＥが一致しない試料における変異頻度は、評価した９／４８の遺伝子について、一致する試料とは顕著に異なる。最後に、生存差は、腫瘍生物学および／または標準的なＡＤ管理に対する多様な応答に帰せられ得る。
参照による組み込み
【０１４２】
以下の参考文献は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。
【化４】
2018512160.tif 000051
【０１４３】
上述した様々な実施形態は、さらなる実施形態をもたらすように組み合わせることができる。本明細書に参照され、かつ／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。実施形態の態様は、必要であれば、様々な特許、出願、および刊行物の概念を採用してなおさらなる実施形態をもたらすように改変することができる。
【０１４４】
これらの変更および他の変更を、上記詳細な説明を踏まえると実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用した用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示した具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきでないが、このような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲とともにすべての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2018512160.tif 000070
2018512160.tif 000071