(57)【要約】本発明は、血液脳関門上で発現される受容体に結合する抗体、及びその使用方法に関する。【選択図】図６Ｎ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門を越える薬剤の輸送方法であって、前記方法が、前記血液脳関門を、（ｉ）血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合し、かつ（ｉｉ）前記薬剤にカップリングされた抗体に曝露することを含み、
前記抗体が、前記ＢＢＢ−Ｒに結合すると、それにカップリングされた前記薬剤を、前記血液脳関門を越えて輸送し、
前記ＢＢＢ−Ｒが、ＣＤ９８重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）、ベイシジン、及びグルコース輸送体１型（Ｇｌｕｔ１）からなる群から選択されるメンバーである、前記方法。
【請求項２】
前記血液脳関門が、哺乳動物にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物が、神経疾患または障害を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物における神経疾患または障害の治療方法であって、（ｉ）ＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、及びＧｌｕｔ１からなる群から選択されるＢＢＢ−Ｒに結合し、かつ（ｉｉ）前記神経疾患または障害を治療するために有効な治療剤にカップリングされた抗体を、前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記神経疾患または障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が、造影剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、神経障害薬である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体の、前記ＢＢＢ−Ｒへの結合が、前記ＢＢＢ−Ｒの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱しない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＢＢ−Ｒの、前記抗体の存在下におけるその天然リガンドのうちの１つ以上への結合が、前記抗体の非存在下における結合の量の少なくとも８０％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体の、前記ＢＢＢ−Ｒへの結合が、前記血液脳関門を越える、前記ＢＢＢ−Ｒの前記天然リガンドのうちの１つ以上の輸送を減弱しない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液脳関門を越える、前記ＢＢＢ−Ｒの前記天然リガンドのうちの１つ以上の輸送が、前記抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも８０％である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、低い結合親和性を有するように操作されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、細胞増殖及び／または細胞分裂及び／または細胞接着を阻害しない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、細胞死を誘導しない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約１００μＭの前記ＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＣ５０が、約１ｎＭ〜約１０ｎＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＣ５０が、約５ｎＭ〜約１００μＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＣ５０が、約５０ｎＭ〜約１００μＭである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＣ５０が、約１００ｎＭ〜約１００μＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約１０μＭの前記ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約１μＭの前記ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約５００ｎＭの前記ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約５０ｎＭの前記ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、約１ｎＭ〜約１００μＭの前記ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、治療用量で前記哺乳動物に投与される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用量が、ＢＢＢ−Ｒを飽和させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、多重特異性であり、それにカップリングされた前記薬剤が、脳抗原に結合する前記多重特異性抗体の抗原結合部位を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記多重特異性抗体が、二重特異性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記脳抗原が、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４））、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記多重特異性抗体が、ＣＤ９８ｈｃ及びＢＡＣＥＩの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記多重特異性抗体が、ＣＤ９８ｈｃ及びＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記多重特異性抗体が、ベイシジン及びＢＡＣＥＩの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記多重特異性抗体が、ベイシジン及びＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記多重特異性抗体が、Ｇｌｕｔ１及びＢＡＣＥＩの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記多重特異性抗体が、Ｇｌｕｔ１及びＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＢＢＢ−Ｒが、ＣＤ９８ｈｃである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＢＢＢ−Ｒが、ベイシジンである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、
（ａ）配列番号６、７、及び８それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号３、４、及び５それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、
（ａ）配列番号９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号１２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、
（ａ）配列番号１３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号１６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、配列番号２のＶＨ配列及び配列番号１のＶＬ配列を含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号２２、２３、及び２４それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号１９、２０、及び２１それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、
（ａ）配列番号２５の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２６の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２７の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号２８の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が、
（ａ）配列番号２９の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３０の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３１の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号３２の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項３８及び４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号１７のＶＬ配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、
（ａ）配列番号３８、３９、及び４０それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号３５、３６、及び３７それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、
（ａ）配列番号４１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４３の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号４４の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、
（ａ）配列番号４５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４７の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号４８の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が、
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項３８及び４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が、配列番号３４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む、請求項３８及び４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号５４、５５、及び５６それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号５１、５２、及び５３それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が、
（ａ）配列番号５７の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５８の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号６０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、
（ａ）配列番号６１の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６２の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号６４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項３８及び５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、配列番号５０のＶＨ配列及び配列番号４９のＶＬ配列を含む、請求項３８及び５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、
（ａ）配列番号７０、７１、及び７２それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号６７、６８、及び６９それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体が、
（ａ）配列番号７３の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７４の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７５の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号７６の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が、
（ａ）配列番号７７の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７８の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７９の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号８０の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体が、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項３８及び５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が、配列番号６６のＶＨ配列及び配列番号６５のＶＬ配列を含む、請求項３８及び５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＢＢＢ−Ｒが、Ｇｌｕｔ１である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体が、
（ａ）配列番号８６、８７、及び８８それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号８３、８４、及び８５それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体が、
（ａ）配列番号８９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号９１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号９２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体が、
（ａ）配列番号９３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号９５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号９６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列を含む、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体が、
（ａ）配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
（ｂ）配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体が、配列番号８２のＶＨ配列及び配列番号８１のＶＬ配列を含む、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
ベイシジンに結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号６、７、及び８それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号３、４、及び５それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項７１】
（ａ）配列番号９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号１２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７０に記載の抗体。
【請求項７２】
（ａ）配列番号１３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号１６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７０または７１に記載の抗体。
【請求項７３】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７４】
配列番号２のＶＨ配列及び配列番号１のＶＬ配列を含む、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７５】
ベイシジンに結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号２２、２３、及び２４それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号１９、２０、及び２１それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項７６】
（ａ）配列番号２５の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２６の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２７の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号２８の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７７】
（ａ）配列番号２９の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３０の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３１の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号３２の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７５または７６に記載の抗体。
【請求項７８】
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７９】
配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号１７のＶＬ配列を含む、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８０】
ベイシジンに結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号３８、３９、及び４０それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号３５、３６、及び３７それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項８１】
（ａ）配列番号４１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４３の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号４４の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項８０に記載の抗体。
【請求項８２】
（ａ）配列番号４５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４７の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号４８の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項８０または８１に記載の抗体。
【請求項８３】
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８４】
配列番号３４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８５】
ベイシジンに結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号５４、５５、及び５６それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号５１、５２、及び５３それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項８６】
（ａ）配列番号５７の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５８の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号６０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項８５に記載の抗体。
【請求項８７】
（ａ）配列番号６１の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６２の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号６４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項８５または８６に記載の抗体。
【請求項８８】
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８９】
配列番号５０のＶＨ配列及び配列番号４９のＶＬ配列を含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９０】
ベイシジンに結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号７０、７１、及び７２それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号６７、６８、及び６９それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項９１】
（ａ）配列番号７３の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７４の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７５の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号７６の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項９０に記載の抗体。
【請求項９２】
（ａ）配列番号７７の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７８の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７９の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び／または
（ｄ）配列番号８０の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列をさらに含む、請求項９０または９１に記載の抗体。
【請求項９３】
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９４】
配列番号６６のＶＨ配列及び配列番号６５のＶＬ配列を含む、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９５】
Ｇｌｕｔ１に結合する、単離された抗体であって、
（ａ）配列番号８６、８７、及び８８それぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上、ならびに／または
（ｂ）配列番号８３、８４、及び８５それぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３配列のうちの１つ以上を含む、前記抗体。
【請求項９６】
（ａ）配列番号８９の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９０の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号９１の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号９２の軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項９５に記載の抗体。
【請求項９７】
（ａ）配列番号９３の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９４の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号９５の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号９６の重鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項９５または９６に記載の抗体。
【請求項９８】
（ａ）配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
（ｂ）配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ配列及び（ｂ）にあるようなＶＬ配列を含む、請求項９５〜９７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９９】
配列番号８２のＶＨ配列及び配列番号８１のＶＬ配列を含む、請求項９５〜９７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１００】
モノクローナル抗体である、請求項１〜９９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０１】
ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０２】
全長ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０３】
Ｆａｂ断片である、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０４】
請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１０６】
前記抗体が産生されるように、請求項１０５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法。
【請求項１０７】
請求項７０〜１０３のいずれか１項に記載の抗体と、細胞傷害性薬剤と、を含む、免疫複合体。
【請求項１０８】
請求項７０〜１０３のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合部位を含む第１のアームを含む、多重特異性抗体。
【請求項１０９】
脳抗原に結合する抗原結合部位を含む第２のアームをさらに含む、請求項１０８に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１０】
前記脳抗原が、ＢＡＣＥ１、Ａｂｅｔａ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｔａｕ、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、ＰｒＰ、ＬＲＲＫ２、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、ＤＲ６、ＡＰＰ、ｐ７５ＮＴＲ、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項１０９に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１１】
前記脳抗原が、ＢＡＣＥ１である、請求項１１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１２】
前記脳抗原が、Ａｂｅｔａである、請求項１１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１３】
請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
【請求項１１４】
追加の治療剤をさらに含む、請求項１１３に記載の薬学的製剤。
【請求項１１５】
医薬品として使用するための、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１６】
神経疾患または障害の治療に使用するための、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１７】
前記血液脳関門を越える薬剤の輸送における使用であって、前記血液脳関門を前記抗体に曝露することを含む、前記使用のための、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１８】
神経疾患または障害の治療用の医薬品の製造における、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１１９】
前記神経疾患または障害が、ＡＤ、脳卒中、認知症、ＭＤ、ＭＳ、ＡＬＳ、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２０】
ＢＢＢ−Ｒへの結合を介した、前記血液脳関門を越える薬剤の輸送に使用するための、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２１】
前記ＢＢＢ−Ｒが、ヒトＢＢＢ−Ｒである、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２２】
神経障害薬とカップリングされた、請求項７０〜１１２のいずれか１項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年１２月１０日に出願された米国仮出願第６２／０９０２９５号、及び２０１５年１１月６日に出願された仮出願第６２／２５１９８３号の利益を主張し、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、血液脳関門上で発現される受容体に結合する抗体、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大分子薬の脳浸透は、主に不透過性の血液脳関門（ＢＢＢ）によって厳しく制限される。この難関を克服するための１つの戦略は、脳毛細血管内皮において発現された内在性受容体のトランスサイトーシス輸送経路を用いることである。モノクローナル抗体等の組み換えタンパク質は、脳への大分子の受容体介在型送達を可能にするように、これらの受容体に対して設計されてきた。これらの受容体は、必須アミノ酸、グルコース、及び脳内で必要とされる他の資源の輸送等の重要な生物機能を実行するため、それらの分子の輸送は、かかる標的抗体によって遮断されないことが重要である。さらに、ＢＢＢ上で発現される受容体は、多くの場合、他の区画内でも発現されるため、かかる抗体が、危険なオフターゲット効果を有しないことも重要である。
【発明の概要】
【０００４】
受容体介在型輸送（ＲＭＴ）に基づく二重特異性標的技術は、ＣＮＳ疾患のための広範囲の潜在的治療法に関して扉を開く可能性を有する。過去の研究は、トランスフェリン受容体に対する抗体が、抗体及び小分子を含む治療薬を、ＢＢＢを越えて、微小用量及び治療上関連する用量の両方で、マウスにおける単一全身注入後に送達できることを示してきた（例えば、ＷＯ２０１２／０７５０３７を参照されたい）。上述されるように、これらの技術を設計するときに重要な考慮には、標的ＢＢＢ受容体(ＢＢＢ−Ｒ)の輸送機能の保存、及び安全性プロファイルが含まれる。本開示は、ＲＭＴに基づく標的技術の新たな標的、ならびにそれらの標的に特異的な抗体を提供する。
【０００５】
例えば、以下の実施例に実証されるように、ＢＢＢにおける高レベルの発現、及び標的に特異的な抗体を、ＢＢＢを越えて輸送する能力に基づいて新規のＢＢＢ−Ｒ標的が特定された。さらに、これらのＢＢＢ−Ｒ標的に対する単一特異性抗体及び多重特異性抗体が生成された。それらの抗体、ベイシジン、Ｇｌｕｔ１、及びＣＤ９８ｈｃは、薬剤（例えば、治療剤及び／または造影剤）を、ＢＢＢを越えて輸送するためのＢＢＢ上の候補標的であることが示された。
【０００６】
本開示の一態様において、血液脳関門を越える薬剤の輸送方法が本明細書に提供される。この方法は、血液脳関門を、（ｉ）血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合し、かつ（ｉｉ）薬剤にカップリングされた抗体に曝露することを含み得、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合すると、それにカップリングされた薬剤を、血液脳関門を越えて輸送する。一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ＣＤ９８重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）である。一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ベイシジンである。本方法の一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、グルコース輸送体１型（Ｇｌｕｔ１）である。本方法の一部の態様において、血液脳関門は、哺乳動物にある。本方法の一部の態様において、哺乳動物は、神経疾患または障害を有する。
【０００７】
本開示の別の態様において、哺乳動物における神経疾患または障害の治療方法が本明細書に提供される。この方法は、（ｉ）ＢＢＢ−Ｒに結合し、かつ（ｉｉ）神経疾患または障害を治療するために有効な治療剤にカップリングされた抗体を、哺乳動物に投与することを含み得る。治療方法の一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ＣＤ９８ｈｃである。治療方法の一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ベイシジンである。治療方法の一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、Ｇｌｕｔ１である。治療方法の一部の態様において、神経疾患または障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。
【０００８】
上記方法のある特定の態様において、哺乳動物は、ヒトであり得る。上記方法のある特定の態様において、薬剤は、造影剤であり得る。上記態様のうちのいずれかにおいて、薬剤は、神経障害薬である。上記方法のある特定の態様において、抗体の、ＢＢＢ−Ｒへの結合は、ＢＢＢ−Ｒの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱しない。上記方法のある特定の態様において、抗体の存在下における、ＢＢＢ−Ｒの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合は、抗体の非存在下における結合の量の少なくとも８０％である。上記方法のある特定の態様において、抗体の、ＢＢＢ−Ｒへの結合は、血液脳関門を越える、ＢＢＢ−Ｒの天然リガンドのうちのいずれの輸送も減弱しない。上記方法のある特定の態様において、血液脳関門を越える、ＢＢＢ−Ｒの天然リガンドのうちのいずれかの輸送は、抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも８０％である。
【０００９】
上記方法のある特定の態様において、抗体は、低い結合親和性を有するように操作されている。
【００１０】
上記方法のある特定の態様において、抗体は、細胞増殖、細胞分裂、及び／または細胞接着を阻害しない。上記方法のある特定の態様において、抗体は、細胞死を誘導しない。上記方法のある特定の態様において、抗体は、約１ｎＭ〜約１００μＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１００μＭ、約５０ｎＭ〜約１００μＭ、または約１００ｎＭ〜約１００μＭのＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０を有する。
【００１１】
上記方法のある特定の態様において、抗体は、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００μＭのＢＢＢ−Ｒへの親和性を有する。
【００１２】
上記方法のある特定の態様において、抗体は、治療用量で哺乳動物に投与される。一部の態様において、治療用量は、ＢＢＢ−Ｒを飽和させる。
【００１３】
上記方法のある特定の態様において、抗体は、多重特異性であり、それにカップリングされた薬剤は、脳抗原に結合する多重特異性抗体の抗原結合部位を含む。一部の態様において、多重特異性抗体は、二重特異性である。一部の態様において、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４））、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。一部の態様において、多重特異性抗体は、ＣＤ９８ｈｃ及びＢＡＣＥＩの両方に結合する。一部の態様において、多重特異性抗体は、ＣＤ９８ｈｃ及びＡｂｅｔａの両方に結合する。一部の態様において、多重特異性抗体は、ベイシジン及びＢＡＣＥＩの両方に結合する。一部の態様において、多重特異性抗体は、ベイシジン及びＡｂｅｔａの両方に結合する。一部の態様において、多重特異性抗体は、Ｇｌｕｔ１及びＢＡＣＥＩの両方に結合する。一部の態様において、多重特異性抗体は、Ｇｌｕｔ１及びＡｂｅｔａの両方に結合する。一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ＣＤ９８ｈｃである。一部の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、ベイシジンである。
【００１４】
一態様において、本開示は、本明細書に提供される血液脳関門を越える薬剤の輸送方法での使用に適した抗ベイシジン（抗Ｂｓｇ）抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体の、Ｂｓｇへの結合が、ベイシジンの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱しない、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｂｓｇの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合の量が、抗体の非存在下における、Ｂｓｇの、１つ以上の天然リガンドへの結合の量の少なくとも８０％である、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。
【００１５】
一部の実施形態において、抗体の、Ｂｓｇへの結合が、Ｂｓｇの天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送を減弱しない、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｂｓｇの天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送の量が、抗体の非存在下における、天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送の量の少なくとも８０％である、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。
【００１６】
一部の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、１つ以上の種からのベイシジンに特異的である。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｂｓｇ抗体は、マウスＢｓｇ（ｍＢｓｇ）に特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｂｓｇ抗体は、ヒトＢｓｇ（ｈＢｓｇ）に特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｂｓｇ抗体は、ｈＢｓｇ及びｍＢｓｇに特異的に結合することができる。
【００１７】
さらに後述されるように、既知のＢｓｇの複数のアイソフォームが存在する。したがって、一部の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、アイソフォーム特異的である。一部の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、ｈＢｓｇのアイソフォーム、例えば、ｈＢｓｇアイソフォーム１（ｈＢｓｇ１）、ｈＢｓｇアイソフォーム２（ｈＢｓｇ２）に特異的に結合する。例えば、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、抗ｈＢｓｇ２抗体である。一部の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、ｍＢｓｇのアイソフォームに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、Ｂｓｇの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する。
【００１８】
一部の態様において、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域（ＦＲ）、ならびに／または本明細書に記載されるアミノ酸を有する軽鎖及び重鎖可変ドメインを含む抗Ｂｓｇ抗体を提供する。一部の実施形態において、
【００１９】
ある特定の実施形態において、本開示の抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３、１９、３５、５１、及び６７から選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号４、２０、３６、５２、及び６８から選択される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号５、２１、３７、５３、及び６９から選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号６、２２、３８、５４、及び７０から選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号７、２３、３９、５５、及び７１から選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号８、２４、４０、５６、及び７２から選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、ＦＲ１に関して配列番号９、２５、４１、５７、及び７３から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ２に関して配列番号１０、２６、４２、５８、及び７４から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ３に関して配列番号１１、２７、４３、５９、及び７５から選択されるアミノ酸配列、ならびにＦＲ４に関して配列番号１２、２８、４４、６０、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインフレームワーク領域をさらに含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、ＦＲ１に関して配列番号１３、２９、４５、６１、及び７７から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ２に関して配列番号１４、３０、４６、６２、及び７８から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ３に関して配列番号１５、３１、４７、６３、及び７９から選択されるアミノ酸配列、ならびにＦＲ４に関して配列番号１６、３２、４８、６４、及び８０から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインフレームワーク領域をさらに含む。
【００２３】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む軽鎖を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、及び６６から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む重鎖を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、及び６６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００２７】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号２、１８、３４、５０、及び６６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む。
【００２８】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＡである。
【００２９】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１７に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１８に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＢである。
【００３０】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３３に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＣである。
【００３１】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号４９に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５０に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＤである。
【００３２】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号６５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号６６に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＥである。
【００３３】
一態様において、本開示は、本明細書に提供される血液脳関門を越える薬剤の輸送方法での使用に適した抗Ｇｌｕｔ１抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体の、Ｇｌｕｔ１への結合が、Ｇｌｕｔ１の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱しない、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｇｌｕｔ１の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合の量が、抗体の非存在下における、Ｇｌｕｔ１の、１つ以上の天然リガンドへの結合の量の少なくとも８０％である、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。
【００３４】
一部の実施形態において、抗体の、Ｇｌｕｔ１への結合が、Ｇｌｕｔ１の天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送を減弱しない、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｇｌｕｔ１の天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送の量が、抗体の非存在下における、天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送の量の少なくとも８０％である、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。
【００３５】
一部の実施形態において、本開示の抗Ｇｌｕｔ１抗体は、１つ以上の種からのベイシジンに特異的である。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｇｌｕｔ１抗体は、マウスＧｌｕｔ１（ｍＧｌｕｔ１）に特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ヒトＧｌｕｔ１（ｈＧｌｕｔ１）に特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ｈＧｌｕｔ１及びｍＧｌｕｔ１に特異的に結合することができる。
【００３６】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８３を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８５を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに／または配列番号８６を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８７を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８８を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ＦＲ１に関して配列番号８９、ＦＲ２に関して配列番号９０、ＦＲ３に関して配列番号９１、及びＦＲ４に関して配列番号９２に対応するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域を含む、軽鎖可変ドメインを含む。
【００３８】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ＦＲ１に関して配列番号９３、ＦＲ２に関して配列番号９４、ＦＲ３に関して配列番号９５、及びＦＲ４に関して配列番号９６に対応するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域を含む、重鎖可変ドメインを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８１に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号８２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００４０】
ある特定の態様において、本開示は、ＢＢＢ−Ｒに結合することができる多重特異性抗体を提供する。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、本明細書に開示される抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のうちのいずれかからの第１の抗原結合部位を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される多重特異性抗体は、本明細書に開示されるように、脳抗原に結合することができる第２の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の実施形態において、脳抗原は、ＢＡＳＣＥ１、Ａｂｅｔａ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｔａｕ、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、ＰｒＰ、ＬＲＲＫ２、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、ＤＲ６、ＡＰＰ、ｐ７５ＮＴＲ、及びカスパーゼからなる群から選択される。
【００４１】
別の態様において、本開示は、提供される抗体のうちのいずれかを含む、本明細書に開示されるポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸を提供する。
【００４２】
別の態様において、本開示は、かかる核酸を含む宿主細胞、及び本明細書に開示される抗体の産生方法を提供する。したがって、本開示の抗体を産生するように宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法が本明細書に提供される。
【００４３】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される抗体のうちの１つ以上を含む薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】潜在的な受容体介在性輸送標的の成功を決定するために使用されるスクリーニングカスケードを描く。
【図１Ｂ】ナイーブファージライブラリ由来の抗Ｌｒｐ１及び抗インスリン受容体（ＩｎｓＲ）抗体の、フローサイトメトリーによりＨＥＫ２９３細胞内で形質移入されたそれらの対応するマウス受容体への結合を描く（各ヒストグラムの左側のピークは、対照抗体（「第２のＡｂ−ＰＥ」）であり、右側のピークは、抗Ｌｒｐ１（左ヒストグラム）または抗ＩｎｓＲ（右ヒストグラム）抗体である）。
【図１Ｃ】脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとして定量化された（ｎ＝３／群及び時点）、野生型マウスにおける静脈内投与後の投薬後の様々な時点での微小用量のＩ１２５標識抗体（抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲＡ）、抗Ｌｒｐ１、及び抗ＩｎｓＲ）の、脳取り込みを定量化する線グラフである。
【図１Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内抗体濃度を定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図１Ｅ】免疫組織化学染色に続くマウス皮質組織切片の写真を含み、示された抗体の５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の１時間後の抗体局在化を描く。スケールバー、５０μｍ。
【図２Ａ】野生型マウスからのＦＡＣＳ精製されたＢＢＢ及び肝臓／肺内皮細胞のマイクロアレイ発現プロファイリングを使用して決定される、ＢＢＢにおいて富化された遺伝子を描く（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２０１２  Ｆｅｂ  １４；２２（２）：４０３−１７に記載される）。
【図２Ｂ】抗Ｌｒｐ８、抗Ｌｄｌｒａｄ３、及び抗ＣＤ３２０抗体のフローサイトメトリー解析を描き、抗体の、ＨＥＫ２９３細胞内で発現されたそれらの対応する抗原への結合を示す。各ヒストグラムの左側のピークは、対照抗体に対応し、右側のピークは、抗Ｌｒｐ８、抗Ｌｄｌｒａｄ３、及び抗ＣＤ３２０抗体に対応する（ヒストグラムの左から右）。
【図２Ｃ】示された抗体の、野生型マウスにおける静脈内投与後の投薬後の様々な時点での微小用量のＩ１２５標識抗体の脳取り込みを定量化する線グラフである。脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとしてデータを定量化する（ｎ＝３／群及び時点）。
【図２Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内抗体濃度を定量化する棒グラフを示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊Ｐ≦０．０５）；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図２Ｅ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内抗体濃度を定量化する棒グラフを示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊Ｐ≦０．０５）；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図２Ｆ】免疫組織化学染色に続くマウス皮質組織切片の写真を含み、示された抗体の５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の１時間後の抗体局在化を描く。スケールバー、５０μｍ。
【図２Ｇ】ＲＭＴ（すなわち、Ｔｆｒｃ、Ｌｒｐ１、Ｉｎｓｒ）及びマイクロアレイにより特定されたＢＢＢ富化遺伝子（すなわち、Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、ＣＤ３２０）の一般に研究されている受容体に関して、精製された内皮細胞のＲＮＡ配列データから生成された平均ＲＰＫＭ値（遺伝子発現）を定量化する棒グラフである。データセットは、脳内皮細胞上のＬｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０の低い絶対ｍＲＮＡ発現を明らかにした。
【図３Ａ】ＣＤ３１陽性及びＣＤ４５陰性脳内皮細胞（ＢＥＣ）を、前述されるように、ＦＡＣＳによって野生型マウスから単離するために使用される方法を描く（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。単離されたＢＥＣを、質量分光法（ＭＳ）によって解析し、結果を図３Ｂ及び３Ｃに示す。
【図３Ｂ】非ＢＥＣと比較して、脳内皮細胞（ＢＥＣ）内の他の脳細胞特異性タンパク質（Ｆａｓｎ、Ａｌｄｏｃ、Ｇｌｕｌ、Ｐｌｐ１）と比較して、各内皮細胞タンパク質（ＰｇＰ、Ｇｌｕｔ１、ＺＯ−１、Ｅｓａｍ、Ｃｌａｕｄｉｎ５）に関してＭＳにより決定される、上位３つの最も豊富なペプチドヒットの統合強度を定量化する棒グラフである。
【図３Ｃ】示されたＲＭＴ標的に関する上位３つの最も豊富なペプチドヒットの統合強度を定量化する棒グラフである。
【図３Ｄ】文献、マイクロアレイ、ＲＮＡ配列、及び質量分光法によって特定された潜在的ＲＭＴ標的を要約する表である。
【図４Ａ】マウスベイシジンで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞への抗ＢｓｇＡ及び抗ＢｓｇＢ結合のフローサイトメトリー解析によって決定される、結合を定量化するヒストグラムを含む。各ヒストグラムにおいて、左ピークは、対照抗体に対応し、右ピークは、抗ベイシジン抗体に対応する。
【図４Ｂ】免疫組織化学染色に続くマウス皮質組織の写真を含み、抗ＢｓｇＡまたは抗ＢｓｇＢの５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の１時間後の抗体局在化を描く。スケールバー、５０μｍ。
【図４Ｃ】脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとして定量化された（ｎ＝３／群及び時点）、静脈内投与後の投薬後の示された時点（時間（ｈｒ））での微小用量の示されたＩ１２５標識抗ベイシジン抗体の、脳取り込みを定量化する線グラフである。
【図４Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内及び血漿内それぞれの示された抗体のレベルを定量化する棒グラフを示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図４Ｅ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内及び血漿内それぞれの示された抗体のレベルを定量化する棒グラフを示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図４Ｆ】マウスベイシジンへの二価（単一特異性）抗Ｂｓｇ（実線）対二重特異性（一価抗Ｂｓｇ）抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体（破線）結合の競合ＥＬＩＳＡ比較の結果を描く（ＩＣ５０：抗ＢｓｇＡ−７．１ｎＭ、抗ＢｓｇＡ／ＢＡＣＥ１−１０５．５ｎＭ、抗ＢｓｇＢ−１７．５ｎＭ、抗ＢｓｇＢ／ＢＡＣＥ１−１２６．６ｎＭ）。
【図４Ｇ】抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の２４時間後の、脳抗体濃度（ｎＭ）、脳Ａβ濃度（ｐｇ／ｇ）、及び血漿抗体濃度（μＭ）をそれぞれ定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）、「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図４Ｈ】抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の２４時間後の、脳抗体濃度（ｎＭ）、脳Ａβ濃度（ｐｇ／ｇ）、及び血漿抗体濃度（μＭ）をそれぞれ定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）、「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図４Ｉ】抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の２４時間後の、脳抗体濃度（ｎＭ）、脳Ａβ濃度（ｐｇ／ｇ）、及び血漿抗体濃度（μＭ）をそれぞれ定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）、「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図５Ａ】Ｇｌｕｔ１を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に結合する抗Ｇｌｕｔ１の結合を描くフローサイトメトリーヒストグラムである。左端のピークは、対照抗体に対応する。
【図５Ｂ】免疫組織化学染色に続くマウス皮質組織切片の写真であり、抗Ｇｌｕｔ１抗体の５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の１時間後の抗体局在化を描く。スケールバー、５０μｍ。
【図５Ｃ】脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとして定量化された（ｎ＝３／群及び時点）、野生型マウスにおける静脈内投与後の投薬後の様々な時点での微小用量のＩ１２５標識抗Ｇｌｕｔ１の、脳取り込みを定量化する線グラフである。
【図５Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の数日後の、脳内及び血漿内それぞれの抗体レベルを定量化する線グラフである。
【図５Ｅ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の数日後の、脳内及び血漿内それぞれの抗体レベルを定量化する線グラフである。
【図５Ｆ】Ｇｌｕｔ１を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に結合する二価（単一特異的）抗Ｇｌｕｔ１（実線）対二重特異性（一価抗Ｇｌｕｔ１）抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１（破線）のフローサイトメトリー解析によって決定される、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量化する線グラフである。（ＥＣ５０：抗Ｇｌｕｔ１−０．６μｇ／ｍＬ、抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１−＞１０μｇ／ｍＬ）。
【図５Ｇ】抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の数日後に、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化する線グラフである。
【図５Ｈ】抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の数日後に、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化する線グラフである。
【図５Ｉ】抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の数日後に、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化する線グラフである。
【図５Ｊ】抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の数日後に、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化する線グラフである。
【図５Ｋ】示された抗体の２０ｍｇ／ｋｇ用量の１時間及び２４時間後の脳における脳１グラム当たりの注入用量のパーセント（％）（図５Ｋ）、または脳抗体濃度（図５Ｌ）として表された抗体の量を定量化する棒グラフを含む。同時点における対照ＩｇＧと比較して＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図５Ｌ】示された抗体の２０ｍｇ／ｋｇ用量の１時間及び２４時間後の脳における脳１グラム当たりの注入用量のパーセント（％）（図５Ｋ）、または脳抗体濃度（図５Ｌ）として表された抗体の量を定量化する棒グラフを含む。同時点における対照ＩｇＧと比較して＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図６Ａ】ＣＤ９８ｈｃを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に結合する抗ＣＤ９８ｈｃ抗体のフローサイトメトリー解析である。各ヒストグラムにおいて、対照抗体（第２のＡｂ−ＰＥ）は、左端のピークに対応し、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、右端のピークに対応する。
【図６Ｂ】免疫組織化学染色に続くマウス皮質組織の写真を含み、抗ＣＤ９８ｈｃＡまたは抗ＣＤ９８ｈｃＢの５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の１時間後の抗体局在化を描く。スケールバー、５０μｍ。
【図６Ｃ】脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとして定量化された（ｎ＝３／群及び時点）、野生型マウスにおける静脈内投与後の投薬後の様々な時点での微小用量のＩ１２５標識抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の、脳取り込み（脳１グラム当たりの注入用量％）を定量化する線グラフである。
【図６Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内抗体レベル（脳１グラム当たりの注入用量％）及び脳対血漿比をそれぞれ定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）、「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図６Ｅ】２０ｍｇ／ｋｇ用量の示された抗体の１時間後及び２４時間後の、脳内抗体レベル（脳１グラム当たりの注入用量％）及び脳対血漿比をそれぞれ定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６／群及び時点；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）、「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない。
【図６Ｆ】マウスＣＤ９８ｈｃを発現するＨＥＫ２９３細胞を用いるＨＥＫ２９３細胞を用いてフローサイトメトリーによって測定される、抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体と比較して、親二価（単一特異性）抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の親和性（正規化されたＯＤ６５０として表される）を定量化する線グラフである（ＩＣ５０：抗体ＣＤ９８ｈｃＡ−１．５ｎＭ、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１−４．０ｎＭ、抗ＣＤ９８ｈｃＢ−４．６ｎＭ、抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１−１６４．４ｎＭ）。
【図６Ｇ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化するグラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない）。
【図６Ｈ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化するグラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない）。
【図６Ｉ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化するグラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない）。図６Ｉにおいて、各時点における列（投与後１日及び４日）は、左から右の順に、対照ＩｇＧ、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１、及び抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１に対応する。
【図６Ｊ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度、脳抗体濃度、脳Ａβレベル、及び血漿Ａβレベルをそれぞれ定量化するグラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない）。
【図６Ｋ】脳組織の１グラム当たりの注入用量の平均±ＳＥＭパーセントとして定量化された（ｎ＝３／群及び時点）、野生型マウスにおける静脈内投与後の投薬後の様々な時点（時間（ｈｒ））での微小用量の示されたＩ１２５標識抗体の、脳取り込みを示す線グラフである。
【図６Ｌ】抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体、抗ＴｆＲＡ抗体、または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された時点（１時間または２４時間）における脳抗体濃度を定量化する棒グラフである。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；「ｎ．ｓ．」統計的に有意でない）。
【図６Ｍ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数において、対照ＩｇＧ（図６Ｍ）及び脳内のＡβｘ−４０濃度（図６Ｎ）と比較して、Ａβｘ−４０低下のパーセント（％）を定量化するグラフである。
【図６Ｎ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの単一５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の投薬後の示された日数において、対照ＩｇＧ（図６Ｍ）及び脳内のＡβｘ−４０濃度（図６Ｎ）と比較して、Ａβｘ−４０低下のパーセント（％）を定量化するグラフである。
【図６Ｏ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度（図６Ｏ）及び脳抗体濃度（図６Ｐ）を定量化するグラフである。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点）。
【図６Ｐ】示された抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体または対照ＩｇＧの５０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後の投薬後の示された日数における、血漿抗体濃度（図６Ｏ）及び脳抗体濃度（図６Ｐ）を定量化するグラフである。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ａ】ウェスタンブロットの写真である。野生型ＩＭＣＤ３細胞を、示された抗体及び濃度（μＭ）で２４時間処置した。溶解物を、負荷対照としての内在性ＣＤ９８ｈｃ及びアクチンに関して調べた。
【図７Ｂ】図７Ａに表されるウェスタンブロットデータを定量化する棒グラフである。ウェスタンブロットデータは、各々が３回行われる、３つの独立した実験から平均される。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図７Ｃ】１μＭの示された抗体で１時間、３７ｏＣで処置されたマウスＣＤ９８ｈｃを安定して過剰発現するＩＭＣＤ３細胞の写真を含む。細胞を固定し、ヒトＩｇＧ、マウスＣＤ９８ｈｃ、及びリソソームマーカー、Ｌａｍｐ１に関して染色した。これらの画像は、対照ＩｇＧ、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１、及びＬａｍｐ１で共染色された抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１の細胞取り込みの典型である。スケールバー＝５μｍ。
【図７Ｄ】ＣＤ９８ｈｃ斑点を定量化する棒グラフである。これらの斑点を解析し、Ｌａｍｐ１との共局在化に関して定量化した。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）を表す。
【図７Ｅ】ウェスタンブロット結果の写真である。これらのブロットを、投薬後の様々な日数における、示された抗体の単一５０ｍｇ／ｋｇ投与後の脳溶解物中のＣＤ９８ｈｃ発現に関して解析した（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ｆ】ウェスタンブロット結果の写真である。これらのブロットを、投薬後の様々な日数における、示された抗体の単一５０ｍｇ／ｋｇ投与後の脳溶解物中のＣＤ９８ｈｃ発現に関して解析した（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ｇ】ウェスタンブロット結果の写真である。これらのブロットを、投薬後の様々な日数における、示された抗体の単一５０ｍｇ／ｋｇ投与後の脳溶解物中のＣＤ９８ｈｃ発現に関して解析した（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ｈ】ウェスタンブロット結果の写真である。これらのブロットを、投薬後の様々な日数における、示された抗体の単一５０ｍｇ／ｋｇ投与後の脳溶解物中のＣＤ９８ｈｃ発現に関して解析した（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ｉ】図７Ｅ〜７Ｈに示されるウェスタンブロットにおけるＣＤ９８ｈｃレベルを定量化する棒グラフである。全てのグラフは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５／群及び時点）。
【図７Ｊ】アミノ酸取り込み活性のパーセント（％）を定量化する棒グラフである。マウスＣＤ９８ｈｃ細胞を安定して過剰発現するＩＭＣＤ３細胞を、１μＭの示された抗体で２４時間処置し、内在化ＨＰＧ、メチオニン類似体の総量によってアミノ酸取り込み活性を評価した。ＢＣＨ（２−アミノ−２−ノルボルナン−カルボン酸）、Ｌ系アミノ酸輸送体の阻害剤を、正の対照として使用した。メチオニン取り込みを、対照ＩｇＧのパーセンテージとして表し、各データ点に対してプロットした。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１２）を表す。
【図８】示された抗体を注入したマウスの脳内の総タンパク質の１ｍｇ当たりの実質抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を定量化する棒グラフである。実質溶解物からの抗体濃度を、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって評価し、総タンパク質濃度に正規化した。ｎ＝５／群、示される棒グラフは、平均±ＳＥＭである。対照ＩｇＧに対するＡＮＯＶＡにより（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定により）＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図９】示されたＲＭＴ抗体の親和性を要約する表である。全ての親和性は、抗Ｇｌｕｔ１抗体を除いてＢｉａｃｏｒｅにより決定し、これをＦＡＣＳ解析を使用して評価した。
【図１０】ＣＤ９８ｈｃ細胞下局在化及び輸送を評価するために撮られた顕微鏡画像を含む。マウス一次脳内皮細胞を固定し、細胞下小胞性マーカー（左パネル）及び抗マウスＣＤ９８ｈｃ（中央パネル）で染色した。内在性ＣＤ９８ｈｃは、形質膜（矢印）に局在化され、細胞内斑点においても認められた（矢印の先）。抗カベオリン１（Ａ）、抗ＴｆＲ（Ｂ）、または抗ＥＥＡ１（Ｃ）での共染色による共局在化を調べた。形質膜上で、ＣＤ９８ｈｃのサブセットが、カベオリン１で共局在化される（マージしたパネルＡ中の矢印）。いくつかの細胞内斑点が、カベオリン１で共局在化される（パネルＡ中の矢印の先）。（Ｂ）及びマージした画像に示されるように、極わずかな斑点がＴｆＲで共局在化される。いくつかのＣＤ９８ｈｃ細胞内斑点が、ＥＥＡ１で共局在化される（マージしたパネルＣ中の矢印の先）。スケールバー＝５μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
Ｉ．定義
「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、末梢循環と、脳及び脊髄（すなわち、ＣＮＳ）との間の生理学的関門を指す。この関門は脳毛細血管内皮形質膜内の密着結合によって形成され、尿素等の非常に小さい分子（６０ダルトン）でさえも脳内への分子の輸送が制限される厳しい関門を作る。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、ＣＮＳ内の近接した毛細血管関門であり、集団的に血液脳関門またはＢＢＢと称される。ＢＢＢは、血液ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含し、この関門は、毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞で構成される。
【００４６】
「血液脳関門受容体」（本明細書では「ＢＢＢ−Ｒ」と省略される）は、血液脳関門を越えて分子を輸送することができる、脳内皮細胞上で発現される膜貫通受容体タンパク質である。上述の通り、大分子薬の脳浸透を増加させる１つの戦略は、ＢＢＢ−Ｒのトランスサイトーシス輸送経路を用いること、例えば、それらの受容体を標的とする抗体を使用することである。本開示は、新規のＢＢＢ−Ｒ標的、及びそれらのＢＢＢ−Ｒに対してモノクローナル抗体を使用する、ＢＢＢを越える脳内への薬剤の輸送方法を提供する。かかるＢＢＢ−Ｒには、ＣＤ９８重鎖（ＣＤ９８９ｈｃ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）、及びベイシジン（Ｂｓｇ）が含まれる。
【００４７】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体を投与され得る、及び／またはそれで処置され得る個体は、癌と診断されていない個体である。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体を投与され得る、及び／またはそれで処置され得る個体は、脳癌と診断されていない個体である。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体を投与され得る、及び／またはそれで処置され得る個体は、癌を有していない個体である。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体で処置され得る、及び／またはそれを投与され得る個体は、脳癌を有していない個体である。「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、身体機能を制御する神経組織の複合体を指し、脳及び脊髄が含まれる。
【００４８】
本明細書で互換的に使用される「アミロイドベータ」、「ベータ−アミロイド」、「Ａｂｅｔａ」、「アミロイドβ」、及び「Ａβ」という用語は、ＡＰＰのβ−セクレターゼ１（「ＢＡＣＥ１」）切断時に産生される、アミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）の断片、ならびにその修飾、断片、及び任意の機能的等価物を指し、Ａβ１〜４０及びＡβ１〜４２を含むが、これらに限定されない。Ａβは、モノマー形態で存在すること、ならびにオリゴマー及びフィブリル構造を形成するように連係することが知られ、アミロイド斑の構成部材として見出され得る。かかるＡβペプチドの構造及び配列は、当業者には周知であり、当該ペプチドを産生する、または脳及び他の組織からそれらを抽出する方法は、例えば、Ｇｌｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２９：８８５−８９０（１９８４）に記載されている。さらに、Ａβペプチドはまた、様々な形態で商業的に入手可能である。
【００４９】
「脳血管原性浮腫」という用語は、脳の細胞内または細胞外空間内の血管内液またはタンパク質の過剰蓄積を指す。脳血管原性浮腫は、例えば、ＦＬＡＩＲ  ＭＲＩが含まれるが、これに限定されない脳ＭＲＩによって検出可能であり、無症候性であり得るか（「無症候性血管原性浮腫」）、または混乱、眩暈、嘔吐、及び無気力等の神経学的症状と関連付けられ得る（「症候性血管原性浮腫」）（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔｉａ，７：３６７，２０１１を参照されたい）。
【００５０】
「脳微小出血」という用語は、頭蓋内出血、または脳内の、直径約１ｃｍ未満の領域の出血を指す。脳微小出血は、例えば、Ｔ２＊重み付けＧＲＥ  ＭＲＩが含まれるが、これに限定されない脳ＭＲＩによって検出可能であり、無症候性であり得るか（「無症候性微小出血」）、または一過性もしくは永続性限局性運動もしくは感覚障害、運動失調症、失語症、及び構音障害等の神経学的症状と関連付けられ得る（「症候性微小出血」）。例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．８：１６５−７４を参照されたい。
【００５１】
「溝滲出」という用語は、脳の畝または溝内の液体の滲出を指す。溝滲出は、例えば、ＦＬＡＩＲ  ＭＲＩが含まれるが、これに限定されない脳ＭＲＩによって検出可能である。Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔｉａ，７：３６７，２０１１を参照されたい。
【００５２】
「中枢神経系の表面鉄沈着」という用語は、脳のクモ膜下腔への出血または血液流出を指し、例えば、Ｔ２＊重み付けＧＲＥ  ＭＲＩが含まれるが、これに限定されない脳ＭＲＩによって検出可能である。中枢神経系の表面鉄沈着を示す症状には、感音性難聴、小脳性運動失調症、及び錐体路徴候が含まれる。Ｋｕｍａｒａ−Ｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．３１：５，２０１０を参照されたい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「アミロイドーシス」という用語は、アミロイドまたはアミロイド様タンパク質によって引き起こされるか、または関連付けられる疾患及び障害の群を指し、モノマー、フィブリル、もしくはポリマー状態、またはそれら３つの任意の組み合わせの、アミロイド様タンパク質の存在または活性によって引き起こされる疾患及び障害が含まれるが、これらに限定されず、アミロイド斑によるものを含む。かかる疾患には、続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病（「ＡＤ」）等の神経障害が含まれるが、これらに限定されない疾患、例えば、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レヴィー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ダッチ型）、グアムパーキンソン認知症複合等の認知記憶能力の喪失によって特徴付けられる疾患または病態、及びアミロイド様タンパク質に基づく、または関連付けられる他の疾患、例えば、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルド・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症性糖尿病、内分泌腫瘍及び老人性心臓アミロイド、ならびに黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、緑内障、及びベータ−アミロイド沈着に起因する白内障等の様々な眼疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
緑内障は、特徴的パターンの視神経症における、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の喪失を伴う視神経の疾患の群である。ＲＧＣは、視覚シグナルを眼から脳へと伝達する神経細胞である。アポトーシス過程における２つの主要酵素である、カスパーゼ３及びカスパーゼ８は、その過程において活性化され、ＲＧＣのアポトーシスにつながる。カスパーゼ３は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断して、Ａｂｅｔａを含む神経傷害性断片を産生する。ＡＰＰの保護効果がなければ、網膜神経節細胞層内のＡｂｅｔａ蓄積は、ＲＧＣの死及び不可逆的視力喪失をもたらす。
【００５５】
緑内障は、常にではないが、多くの場合、増加した眼圧を付随し、これは、水の循環またはその排水の遮断の結果であり得る。上昇した眼圧は、緑内障を発達させる重要な危険因子であるが、緑内障を確定的に引き起こし得るような眼圧の閾値を定義することはできない。重大な視神経線維への血液供給不足、神経構造の脆弱性、及び／または神経線維自体の健康問題によっても損傷が引き起こされ得る。未治療の緑内障は、視神経の永久損傷につながり、結果として視野喪失をもたらし、全盲へと進行し得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「軽度アルツハイマー病」または「軽度ＡＤ」という用語（例えば、「軽度ＡＤと診断された患者」）は、２０〜２６のＭＭＳＥスコアによって特徴付けられるＡＤの段階を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「軽度から中度のアルツハイマー病」または「軽度から中度のＡＤ」という用語は、軽度ＡＤ及び中度ＡＤの両方を包含し、１８〜２６のＭＭＳＥスコアによって特徴付けられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「中度アルツハイマー病」または「中度ＡＤ」という用語（例えば、「中度ＡＤと診断された患者」）は、１８〜１９のＭＭＳＥスコアによって特徴付けられるＡＤの段階を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「神経障害」は、ＣＮＳに影響を及ぼす、及び／またはＣＮＳに病因を有する疾患または障害を指す。例示的なＣＮＳ疾患または障害には、ニューロパシー、アミロイドーシス、癌、眼疾患または障害、ウイルスまたは細菌感染、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が含まれるが、これらに限定されない。本出願の目的のために、ＣＮＳは、血液網膜関門によって身体の残りから正常に隔離される、眼を含むことが理解されるであろう。神経障害の特定の例には、神経変性疾患（レヴィー小体病が含まれるが、これに限定されない）、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパシー（アルツハイマー病及び核上性麻痺が含まれるが、これらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、及び致死性家族性不眠症が含まれるが、これらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン病、及び神経系ヘテロ変性障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレクサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群が含まれるが、これらに限定されない）、認知症（ピック病、及び脊髄小脳失調症が含まれるが、これらに限定されない）、癌（例えば、体内の他の場所から生じる脳転移を含む、ＣＮＳの癌）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
「神経障害薬」は、１つ以上の神経障害（複数可）を治療する薬物または治療剤である。本発明の神経障害薬には、抗体、ペプチド、タンパク質、１つ以上のＣＮＳ標的（複数可）の天然リガンド、１つ以上のＣＮＳ標的（複数可）の天然リガンドの修飾バージョン、アプタマー、干渉核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、及び小分子、または前述のうちのいずれかの活性断片が含まれるが、これらに限定されない。本発明の例示的な神経障害薬が本明細書に記載され、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、干渉核酸及び小分子、ならびにそれ自体であるか、またはＣＮＳ抗原または標的分子（アミロイド前駆体タンパク質もしくはその部分、アミロイドベータ、ベータ−セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、タウ、アルファ−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、グリオーマ、もしくは他のＣＮＳ癌マーカー、及びニュートロフィンであるが、これらに限定されない）を特異的に認識及び／または作用（例えば、阻害、活性化、もしくは検出）する、前述のうちのいずれかの活性断片が挙げられるが、これらに限定されない。神経障害薬及びそれらが治療に使用され得る障害の非限定例が、以下の表Ａに提供される。
表Ａ：神経障害薬及びそれらが治療に使用され得る対応する障害の非限定例
2018502840.tif 000003
【００６１】
本明細書で使用される場合、「薬剤」、例えば、本明細書に開示されるＢＢＢ−Ｒ特異性抗体（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体）によって血液脳関門を越えて送達される薬剤は、治療剤または造影剤である。ある特定の態様において、治療剤は、抗体（例えば、ＣＮＳまたは脳抗原に特異的）である。ある特定の態様において、治療剤は、例えば上記の通り、薬物、例えば、神経障害薬である。ある特定の態様において、治療剤は、細胞傷害性薬剤である。ある特定の態様において、治療剤は、抗体である（例えば、薬剤（抗体）は、多重特異性抗体の１つのアームである）。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「造影剤」は、その存在及び／または場所が直接または間接的に検出されるのを可能にする１つ以上の特性を有する化合物である。かかる造影剤の例には、検出を許容する標識部分を組み込むタンパク質及び小分子化合物が含まれる。
【００６３】
「ＣＮＳ抗原」または「脳抗原」は、脳を含むＣＮＳ内で発現される抗原であり、抗体または小分子で標的とされ得る。かかる抗原の例には、制限なく、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質、例えば、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６が含まれる。特定の実施形態において、抗原は、ＢＡＣＥ１である。
【００６４】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」は、選択的または優先的に抗原に結合する抗体を指す。結合親和性は、一般に、スキャチャード解析等の標準アッセイまたは表面プラズモン共鳴技法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する）を使用して決定される。
【００６６】
「抗体断片」は、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体の一部を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，ＭＡｂｓ（２０１０）２（１）：７７−８３を参照されたい）、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、リンカーの有無を問わない（かつ任意選択で縦列の）軽鎖及び／または重鎖抗原結合ドメインの融合、が含まれるが、これらに限定されない一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される単一特異性または多重特異性抗原結合分子（Ｆｃ領域を欠いている複数の可変ドメインから構成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体の産生中に生じ得る、可能性のある変異形抗体は例外であり、かかる変異形は、通常少量で存在している。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、多様な技法によって作製されてもよく、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）を参照されたい）、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージ提示法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を使用する）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を用いる方法、本明細書に記載されるモノクローナル抗体を作製するための、このような方法及び他の例示的な方法が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書におけるモノクローナル抗体の特定例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が含まれ、それらの抗原結合断片を含む。
【００６８】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であり、一方で鎖（複数可）の残りが別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片が含まれるが、これは、それらが所望される生物学的活性を呈する限りにおいてである（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００６９】
「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物分子上の２つもしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つもしくはそれ以上の異なる分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に包含する。
【００７０】
「二重特異性抗体」という用語は、１つの生物分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合可能であるか、または２つの異なる生物分子上のエピトープに特異的に結合可能である抗原結合ドメインを含む、多重特異性抗体である。本明細書において、二重特異性抗体はまた、「デュアル特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」を有するもの、または「デュアル特異性である（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」とも称される場合がある。
【００７１】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗体、また逆に、競合アッセイにおいて、抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供されている。
【００７２】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００７３】
本明細書における目的では、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはそれはアミノ酸配列変化を含有してもよい。一部の実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。一部の実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免役グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【００７４】
本明細書で使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害するもしくは阻止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす、物質を指す。細胞傷害性薬剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、もしくは他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素等の酵素及びそれらの断片；抗生物質；細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片及び／もしくは変異形を含む）等の毒素；ならびに下に開示される種々の抗腫瘍または抗癌薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより多様である抗体のＦｃ領域に帰属する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７６】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、必要な投薬量及び期間で、所望される治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【００７７】
本明細書における「天然配列」タンパク質は、タンパク質の天然に存在する変異形を含む、天然に見出されるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本明細書で使用される用語は、タンパク質を、その天然源から単離されたもの、または組み換え的に産生されたものとして含む。
【００７８】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義して使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ付番方式に従う。
【００７９】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ受容体」または「ＦｃＲｎ」という用語は、ヒトもしくは霊長類胎盤、または卵黄嚢（ウサギ）を通じた胎児への、及び小腸を通じた初乳から新生児への母体ＩｇＧの輸送に関与することが知られているＦｃ受容体を指す（「ｎ」は新生児を示す）。ＦｃＲｎが、ＩｇＧ分子に結合すること、及びそれらを血清中に再循環させることによって、一定の血清ＩｇＧレベルの維持に関与することも知られている。「ＦｃＲｎ結合領域」または「ＦｃＲｎ受容体結合領域」は、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する抗体の当該部分を指す。抗体のＦｃＲｎ結合領域内のある特定の修飾は、ＦｃＲｎに関して、抗体またはその断片の親和性を増加させ、分子のインビボ半減期も増加させる。以下のアミノ酸位置２５１、２５６、２８５、２９０、３０８、３１４、３８５、４２８、４３４、及び４３６のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換は、抗体の、ＦｃＲｎ受容体との相互作用を増加させる。以下の位置、２３８、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４における置換、例えば、（米国特許第７，３７１，８２６号）の置換もまた、抗体の、ＦｃＲｎ受容体との相互作用を増加させる。
【００８０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲの配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）では次の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８１】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように互換的に使用される。
【００８２】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外来性の核酸が導入された細胞を指し、これにはかかる細胞の子孫が含まれる。宿主細胞には、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫の核酸含量は、親細胞と完全に同一でない場合があるが、変異を含有し得る。元々形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。組み換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例には、（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えば、タバコ属に属する植物（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）；（４）酵母細胞、例えば、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはコウジカビ属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に属するもの；（５）細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞等が含まれる。
【００８３】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する、抗体のアミノ酸配列、または他のヒト抗体コード配列に対応する、アミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。
【００８４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を代表する、フレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群から行われる。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１〜３にあるような下位群である。一実施形態において、ＶＬについて、下位群は、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるような下位群カッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、下位群は、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるような下位群ＩＩＩである。
【００８５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を経た抗体を指す。
【００８６】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、概ねヒト抗体（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望される特異性、親和性、及び機能性を有するマウス、ラット、ウサギ、もしくは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられている。例えば、ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そのフレームワーク領域（ＦＲ）の全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中で見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾を行って、抗体の性能をさらに改良する。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、その超可変領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、上記のＦＲ置換（複数可）を除いて、そのＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によっては、抗体定常領域の少なくとも一部分、典型的にはヒト抗体のものも含まれるであろう。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を経た抗体を指す。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００８７】
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する、抗体のアミノ酸配列構造に対応する、アミノ酸配列を含む抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。かかる抗体は、免疫付与時に、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）による産生（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、及び米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、及び同第５，５４５，８０７号を参照されたい）；ヒト抗体またはヒト抗体断片を発現するファージ提示ライブラリからの選択（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）、米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号を参照されたい）；インビトロ活性化Ｂ細胞を介した生成（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）；ならびにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離が含まれるが、これらに限定されない種々の技法によって特定または作製され得る。
【００８８】
本明細書における抗体には、変化した抗原結合または生物活性を持つ「アミノ酸配列変異形」が含まれる。かかるアミノ酸変化の例には、抗原に対する強化された親和性を持つ抗体（例えば、「親和性成熟」抗体）、及び存在する場合、変化したＦｃ領域を持つ、例えば、変化した（増加もしくは減少した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を持つ抗体（例えば、ＷＯ００／４２０７２、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．、及びＷＯ９９／５１６４２、Ｉｄｕｏｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）、ならびに／または増加もしくは減少した血清半減期を持つ抗体（例えば、ＷＯ００／４２０７２、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．を参照されたい）が含まれる。
【００８９】
「親和性修飾変異形」は、親和性を変化（増加または低下）する親抗体（例えば、親キメラ、ヒト化、またはヒト抗体）の１つ以上の置換超可変領域またはフレームワーク残基を有する。かかる置換型変異形を生成するための便利な方法は、ファージ提示を使用する。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させ、各部位において全ての可能なアミノ置換を生成する。そのようにして生成された抗体変異形は、各粒子内で被包されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合として、繊維状ファージ粒子から一価様式で提示される。次いで、ファージ提示された変異形を、それらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補となる超可変領域部位を特定するために、アラニン走査突然変異誘発を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。代替的に、または追加的に、抗体とその標的との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造を解析することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接する残基は、本明細書で詳述される技法に従う置換の候補である。一旦かかる変異形が生成されると、変異形の集団は、スクリーニングに供され、変化した親和性を持つ抗体は、さらなる発達のために選択され得る。
【００９０】
本明細書における抗体は、「異種性分子」と複合され、例えば、半減期もしくは安定性を増加させるか、または他の方法で抗体を改善することができる。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーに結合され得る。１つ以上のＰＥＧ分子に結合されるＦａｂ′等の抗体断片は、本発明の例示的な実施形態である。別の実施例において、異種性分子は、治療化合物または可視化剤（例えば、検出可能な標識）であり、抗体は、かかる異種性分子を、ＢＢＢを越えて輸送するために使用されている。異種性分子の例には、化学化合物、ペプチド、ポリマー、脂質、核酸、及びタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書における抗体は、「グリコシル化変異形」であってもよく、それにより、Ｆｃ領域に結合した任意の炭水化物は、存在する場合、変化し、存在／非存在が修飾されるか、またはタイプが修飾されるかのいずれかである。例えば、抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠いている成熟炭水化物構造を持つ抗体は、米国特許出願第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物中に二等分Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）を持つ抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）において参照されている。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体は、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）において報告されている。そのＦｃ領域に結合した炭水化物が変化した抗体に関しては、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。修飾されたグリコシル化を持つ抗体を説明しているＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。例えば、この配列のＡｓｎを任意の他のアミノ酸に突然変異させることによるか、Ｐｒｏを２９８位に配置することによるか、または２９９位をＳｅｒまたはＴｈｒ以外の任意のアミノ酸に修飾することによる、Ｆｃ領域内のコンセンサスグリコシル化配列の突然変異（２９７〜２９９位におけるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘはプロリンではあり得ない）は、その位置でのグリコシル化を廃止するはずである（例えば、Ｆａｒｅｓ  Ａｌ−Ｅｊｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００７）１３：５５１９ｓ−５５２７ｓ、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０（１８）：４３７４−４３８０、Ｋａｔｓｕｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９９７）３２３（Ｐｔ  ２）：４１５−４１９、Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：６３６３−６３６６を参照されたい。）
【００９２】
用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書で使用される場合、配列中で超可変（「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／もしくは抗原接触残基（「抗原接触体」）を含有する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。概して、抗体は、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある、６つのＨＶＲを含む。本明細書における例示的なＨＶＲには、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において起こる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）において起こるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）において起こる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））、ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の組み合わせが含まれる。
【００９３】
一部の実施形態において、ＨＶＲ残基は、下記の表Ｂにおいて配列番号により特定されるものを含む（各列は、別個のクローンである）。
表Ｂ：ＨＶＲ配列
2018502840.tif 000004
「ＬＣ」、軽鎖；「ＨＣ」、重鎖；「ＢＳＧ」、ベイシジン
【００９４】
別途指定されない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において上記のＫａｂａｔらに従って付番される。
【００９５】
「免疫複合体」は、標識または細胞傷害性薬剤を含むが、これらに限定されない１個以上の異種性分子（複数可）に複合される抗体である。場合によっては、かかる複合は、リンカーを介してである。
【００９６】
本明細書で使用される「リンカー」は、抗体を異種性分子に共役的または非共役的に接続する構造である。ある特定の実施形態において、リンカーは、ペプチドである。他の実施形態において、リンカーは、化学リンカーである。
【００９７】
「標識」は、本明細書における抗体とカップリングされたマーカーであり、検出または撮像に使用される。かかる標識の例には、放射標識、発蛍光団、発色団、または親和性タグが含まれる。一実施形態において、標識は、医療用撮像に使用される放射標識、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、もしくはＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、限定されないが、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、及び鉄である。
【００９８】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離されているものである。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ＢＡＣＥ１」という用語は、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然β−セクレターゼ１（β部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、膜関連アスパラギン酸プロテアーゼ２、メマプシン２、アスパルチルプロテアーゼ２またはＡｓｐ２）とも呼ばれる）を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＢＡＣＥ１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じるＢＡＣＥ１の任意の形態を包含する。この用語は、ＢＡＣＥ１の天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。例示的なＢＡＣＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、下記の配列番号１１１に示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：７３５−７４１（１９９９）において報告されている、ヒトＢＡＣＥ１、アイソフォームＡの配列である：
ＭＡＱＡＬＰＷＬＬＬＷＭＧＡＧＶＬＰＡＨＧＴＱＨＧＩＲＬＰＬＲＳＧＬＧＧＡＰＬＧＬＲＬＰＲＥＴＤＥＥＰＥＥＰＧＲＲＧＳＦＶＥＭＶＤＮＬＲＧＫＳＧＱＧＹＹＶＥＭＴＶＧＳＰＰＱＴＬＮＩＬＶＤＴＧＳＳＮＦＡＶＧＡＡＰＨＰＦＬＨＲＹＹＱＲＱＬＳＳＴＹＲＤＬＲＫＧＶＹＶＰＹＴＱＧＫＷＥＧＥＬＧＴＤＬＶＳＩＰＨＧＰＮＶＴＶＲＡＮＩＡＡＩＴＥＳＤＫＦＦＩＮＧＳＮＷＥＧＩＬＧＬＡＹＡＥＩＡＲＰＤＤＳＬＥＰＦＦＤＳＬＶＫＱＴＨＶＰＮＬＦＳＬＱＬＣＧＡＧＦＰＬＮＱＳＥＶＬＡＳＶＧＧＳＭＩＩＧＧＩＤＨＳＬＹＴＧＳＬＷＹＴＰＩＲＲＥＷＹＹＥＶＩＩＶＲＶＥＩＮＧＱＤＬＫＭＤＣＫＥＹＮＹＤＫＳＩＶＤＳＧＴＴＮＬＲＬＰＫＫＶＦＥＡＡＶＫＳＩＫＡＡＳＳＴＥＫＦＰＤＧＦＷＬＧＥＱＬＶＣＷＱＡＧＴＴＰＷＮＩＦＰＶＩＳＬＹＬＭＧＥＶＴＮＱＳＦＲＩＴＩＬＰＱＱＹＬＲＰＶＥＤＶＡＴＳＱＤＤＣＹＫＦＡＩＳＱＳＳＴＧＴＶＭＧＡＶＩＭＥＧＦＹＶＶＦＤＲＡＲＫＲＩＧＦＡＶＳＡＣＨＶＨＤＥＦＲＴＡＡＶＥＧＰＦＶＴＬＤＭＥＤＣＧＹＮＩＰＱＴＤＥＳＴＬＭＴＩＡＹＶＭＡＡＩＣＡＬＦＭＬＰＬＣＬＭＶＣＱＷＣＣＬＲＣＬＲＱＱＨＤＤＦＡＤＤＩＳＬＬＫ（配列番号１１１）。
【０１００】
アイソフォームＢ、Ｃ、及びＤを含む、ヒトＢＡＣＥ１のいくつかの他のアイソフォームが存在する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｐ５６８１７を参照されたい。アイソフォームＢは、それがアミノ酸１９０〜２１４を欠失しているという点で（すなわち、配列番号１１１のアミノ酸１９０〜２１４の欠失）、アイソフォームＡとは異なる。アイソフォームＣは、それがアミノ酸１４６〜１８９を欠失しているという点で（すなわち、配列番号１１１のアミノ酸１４６〜１８９の欠失）、アイソフォームＡとは異なる。アイソフォームＤは、それがアミノ酸１４６〜１８９及び１９０〜２１４を欠失しているという点で（すなわち、配列番号１１１のアミノ酸１４６〜１８９及び１９０〜２１４の欠失）、アイソフォームＡとは異なる。
【０１０１】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、共有結合ではない相互作用の強度の総計を指す。別途示されない限り、本明細書に使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、本来の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹへの親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的及び例示的な実施形態が、以下に説明される。
【０１０２】
「親和性成熟」抗体は、変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有し、かかる変化によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
【０１０３】
「抗Ｂｓｇ抗体」、「抗ベイシジン抗体」、「ベイシジンに結合する抗体」、及び「Ｂｓｇに結合する抗体」という用語は、ベイシジンの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱することなく、ベイシジンに結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体が無関係の非Ｂｓｇタンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＢｓｇへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、Ｂｓｇに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、異なる種からのＢｓｇ（例えば、ヒトＢｓｇ及びマウスＢｓｇ）間で保存されているＢｓｇのエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、異なるＢｓｇアイソフォーム（例えば、２つ以上のヒトＢｓｇアイソフォーム）間で保存されているＢｓｇのエピトープに結合する。
【０１０４】
「抗Ｇｌｕｔ１抗体」及び「Ｇｌｕｔ１に結合する抗体」という用語は、Ｇｌｕｔ１の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱することなく、Ｇｌｕｔ１に結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体が無関係の非Ｇｌｕｔ１タンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＧｌｕｔ１への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、Ｇｌｕｔ１に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、異なる種からのＧｌｕｔ１（例えば、ヒトＧｌｕｔ１及びマウスＧｌｕｔ１）間で保存されているＧｌｕｔ１のエピトープに結合する。
【０１０５】
本発明に従い、「低親和性」抗ＢＢＢ−Ｒ（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１）抗体は、抗体親和性を測定するための様々なアッセイ、例えば、制限なく、スキャチャードアッセイ及び表面プラズモン共鳴技法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する）によって特定され得る。本発明の一実施形態に従い、抗体は、約５ｎＭ〜、または約２０ｎＭ〜、または約１００ｎＭ〜、約１０μＭまで、または約１μＭまで、または約５００ｎＭまでの、ＢＢＢ−Ｒ抗原（例えば、ＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、またはＧｌｕｔ１）への親和性を有する。故に、親和性は、例えば、スキャチャード解析またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定した場合に、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内、または約２０ｎＭ〜約１μΜの範囲内、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲内であり得る。
【０１０６】
「単離された核酸」は、核酸分子がその天然環境の構成成分から分離されたものを指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「抗体をコードする単離された核酸」（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体）は、抗体の重鎖及び軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１個以上の核酸分子を指し、それには単一のベクターまたは別個のベクターにおけるかかる核酸分子（複数可）が含まれ、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【０１０８】
「裸の抗体」とは、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分または放射標識）に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
【０１０９】
抗体「エフェクター機能」は、補体経路の活性化以外の免疫系の活性化をもたらす抗体のそのような生物活性を指す。かかる活性は、主に抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異形Ｆｃ領域）内で見出される。抗体エフェクター機能の例には、例えば、Ｆｃ受容体結合及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が含まれる。一実施形態において、本明細書における抗体は、本質的にエフェクター機能を欠いている。別の実施形態において、本明細書における抗体は、最小のエフェクター機能を保持する。エフェクター機能の修飾または排除方法は、当該技術分野において周知であり、エフェクター機能に関与するＦｃ領域の全てまたは一部を排除すること（例えば、限定されないが、本明細書に記載される、及び当該技術分野において既知である、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体等のＦｃ領域の全てまたは一部を欠いている形態で抗体または抗体断片を使用して）；１つ以上のアミノ酸位置においてＦｃ領域を修飾し、エフェクター機能を排除すること（２３４、２３５、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５６、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３１１、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、及び４３９位に影響を及ぼすＦｃ結合）；ならびに抗体のグリコシル化を修飾すること（野生型哺乳動物グリコシル化を可能にしない環境内で抗体を産生すること、１つ以上の炭水化物基を、既にグリコシル化された抗体から除去すること、及び１つ以上のアミノ酸位置において抗体を修飾し、その抗体がそれらの位置（Ｎ２９７Ｇ及びＮ２９７Ａ及びＤ２６５Ａが含まれるが、これらに限定されない）でグリコシル化される能力を排除することが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
抗体「補体活性化」機能または「補体経路の活性化」を可能にするか、または誘起する抗体の特性は、互換的に使用され、対象における免疫系の補体経路に従事するか、または刺激する抗体の生物活性を指す。かかる活性には、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が含まれ、抗体のＦｃ部分及び非Ｆｃ部分の両方によって媒介され得る。補体活性化機能の修飾または排除方法は、当該技術分野において周知であり、補体活性化に関与するＦｃ領域の全てまたは一部を排除すること（例えば、限定されないが、本明細書に記載される、及び当該技術分野において既知である、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体等のＦｃ領域の全てまたは一部を欠いている形態の抗体または抗体断片を使用すること、またはＣｌｑ結合に関与することが知られている２７０、３２２、３２９、及び３２１位等の１つ以上のアミノ酸位置においてＦｃ領域を修飾し、補体成分との相互作用もしくは補体成分を活性化する能力を排除もしくは軽減すること）、ならびに補体活性化に関与する非Ｆｃ領域の一部を修飾もしくは排除すること（例えば、１３２位においてＣＨ１領域を修飾することが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｖｉｄａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４１）：３８２１７−３８２２３）を参照されたい）。
【０１１１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、全長抗体には、異なる「クラス」が割り当てられ得る。全長抗体にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのうちいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、当該技術分野において周知である。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「組み換え抗体」という用語は、抗体をコードする核酸を含む組み換え宿主細胞によって発現される抗体（例えば、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体、またはそれらの抗原結合断片）を指す。
【０１１３】
「天然抗体」は、様々な構造を有する、自然発生免役グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り付けられ得る。
【０１１４】
「添付文書」という用語は、治療用製品の商用パッケージに内に通例含まれている指示書を指して使用され、かかる治療用製品の適応症、試料法、投薬量、投与法、併用療法、禁忌症、及び／またはその使用に関する警告を含んでいる。
【０１１５】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るのに必要な場合はギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野における技術の範囲内の種々の方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。本明細書における目的では、しかしながら、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であるか、またはソースコードから編集されてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム（デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む）で使用するにはコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変更はない。
【０１１６】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に用いる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、それと、またはそれと対比して、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する、またはそれを含む、所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、次のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡとＢとのアライメントにおいて完全一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂに含まれるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくならないことが理解されよう。別途具体的に示されない限り、本明細書に使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、直前の段落に記載されるように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られたものである。
【０１１７】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【０１１８】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書に使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等、その文法上の変化形）は、治療されている個体の自然経過を変化させることを目的として臨床介入を指し、これは、予防目的または臨床病理過程で行われ得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の寛解または緩和、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。
【０１２０】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合することに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）  抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、特定の抗原に結合する抗体を単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【０１２１】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【０１２２】
ＣＤ９８重鎖
本明細書で使用される「ＣＤ９８重鎖」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のＣＤ９８ｈｃを指す。ＣＤ９８ｈｃは、特に、ＳＬＣ３Ａ２、４Ｆ２、４Ｆ２ｈｃ、Ｍｄｕ１、Ｌｙ１０、Ｍｄｖ１、Ｆｒｐ１、Ｍｇｐ２、Ｍｇｐ２ｈｃ、ＮＡＣＡＥ、４Ｔ２、４Ｔ２ｈｃ、及びＴＲＯＰ４という名称でも知られている。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＣＤ９８ｈｃ、ならびに細胞内でのプロセシングから生じるＣＤ９８ｈｃの任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ９８ｈｃの天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。ＣＤ９８ｈｃは、８０ｋＤａのＩＩ型膜貫通タンパク質であり、約４０ｋＤａのＬ型アミノ輸送体ファミリーの６つの異なる軽鎖（「ｌｃ」）メンバーまたは「結合パートナー」（ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、Ａｓｃ）と、ジスルフィド結合によって対合し、ヘテロ二量体複合体を形成する（Ｙａｎａｇｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５１４：２９１−３０２（２００１）、Ｔｏｒｒｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２４３７−３２４４５（１９９８）、Ｂｒｏｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４９：７８７−７９５（２０００）、Ｂｒｏｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：７２５−７３１（２００１）、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．２０００  Ｗｉｎｔｅｒ；２（４）：６６５−７１を参照されたい）。故に、本明細書で使用される場合、「ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体」は、ＣＤ９８重鎖を含むタンパク質複合体を指す（例えば、ＬＡＴ１／ＣＤ９８ｈｃ、ＬＡＴ２／ＣＤ９８ｈｃ、ｙ＋ＬＡＴ１／ＣＤ９８ｈｃ、ｙ＋ＬＡＴ２／ＣＤ９８ｈｃ、ｘＣＴ／ＣＤ９８ｈｃ、及び／またはＡｓｃ／ＣＤ９８ｈｃ）。ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体は、アミノ酸輸送体として機能する。ＣＤ９８ｈｃは、分極された上皮細胞内のアミノ酸輸送体複合体の表面発現及び基底外側局在化に必要とされる（Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ（２０１０）９９：２１７−２２５、Ｐａｌａｃｉｎ  ａｎｄ  Ｋａｎａｉ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ；Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４，４４７（５）：４９０−４９４）。ＣＤ９８ｈｃはまた、β１インテグリンと相互作用し、細胞質ドメイン及び膜貫通領域を通じてそれらの活性化を規制する。研究は、ＣＤ９８ｈｃの過剰発現が、インテグリンシグナル伝達を規制することによって、細胞成長及び生存に寄与し得るため、腫瘍発生において重要な役割を果たし得ることを示唆している。研究は、ＣＤ９８ｈｃ発現が、細胞増殖と密接に関連しており、ＣＤ９８ｈｃに対するある特定の抗体は、特定の細胞型において、細胞成長を阻害し得るか、またはアポトーシスを誘導し得ることを示した（Ｙａｇｉｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：１４７８−１４８４、Ｗａｒｒｅｎ  Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：３６７６−３６８７）。
【０１２３】
ヒトＣＤ９８ｈｃの外部ドメインの構造は、単斜（タンパク質データバンクコード２ＤＨ２）及び斜方晶（タンパク質データバンクコード２ＤＨ３）結晶形を、２．１Å及び２．８Åそれぞれで使用して解明された。重要な触媒残基及び結果として触媒活性を欠いているが、細菌アルファ−グリコシダーゼに関連する（ベータアルファ）（８）バレル及び逆平行ベータ（８）サンドイッチで構成される。２ＤＨ３は、界面においてＺｎ（２＋）配位を持つ二量体である。ＣＤ９８ｈｃは、表面において重要な疎水性パッチを有しない。ＣＤ９８ｈｃモノマー及びホモ二量体は、分極された荷電表面を有する。４つの残基が膜貫通ドメインから離れて位置しているＣｙｓ１０９残基の位置を含む、解明された構造のＮ末端は、外部ドメインの正極面に隣接している。Ｎ末端及びＣｙｓ（１０９）介在性ジスルフィド架橋のこの位置は、ＣＤ９８ｈｃ外部ドメインの、膜リン脂質との静電的相互作用のモデルを支持するのに十分な空間制限を課する（Ｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｏｃｔ  ２６；２８２（４３）：３１４４４−５２を参照されたい）。Ｃｙｓ１０９は、ＣＤ９８ｈｃの膜貫通ドメインに近く、膜貫通ドメイン３と４との間の軽鎖の細胞外ループ内でシステインとのジスルフィド架橋をもたらす。Ｃｙｓ１０９及びＣｙｓ３３０の突然変異は、軽鎖との共有会合を崩壊させたが、インテグリンとの相互作用またはそれに対する効果を減弱しなかった。しかしながら、Ｃ１０９Ｓ突然変異体は、軽鎖の表面発現を依然として支持し、低下された速度での輸送特徴を提示することが報告されている（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３９：１５７−１６２）。
【０１２４】
一部の実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ９８ｈｃは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１０１２６８０．１（アイソフォームｂ）、ＮＰ＿００２３８５．３（アイソフォームｃ）、ＮＰ＿００１０１２６８２．１（ｅ）、及びＮＰ＿００１０１３２６９．１（アイソフォームｆ）にそれぞれ対応する、配列番号９７、９９、１０１、または１０３に記載されるアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ９８ｈｃ（「ｈＣＤ９８ｈｃ」）である。アイソフォームｂ、ｃ、ｅ、及びｆは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＭ＿００１０１２６６２．２（配列番号９８）、ＮＭ＿００２３９４．５（配列番号１００）、ＮＭ＿００１０１２６６４．２（配列番号１０２）、及びＮＭ＿００１０１３２５１．２（配列番号１０４）をそれぞれ有する核酸によってコードされる。別の実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ９８ｈｃは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＰ＿００１２７２１７１．１（配列番号１０９）に記載されるアミノ酸配列を含む、霊長類ＣＤ９８ｈｃ（「ｐＣＤ９８ｈｃ」）であり、これはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＭ＿００１２８５２４２．１（配列番号１１０）に記載される核酸配列によってコードされる。別の実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ９８ｈｃは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＰ＿００１１５４８８５．１（アイソフォームａ）（配列番号１０５）に記載されるアミノ酸配列を含む、マウスＣＤ９８ｈｃ（「ｍＣＤ９８ｈｃ」）であり、これはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＭ＿００１１６１４１３．１（配列番号１０６）に記載される核酸配列によってコードされる。別の実施形態において、本明細書に開示されるマウスＣＤ９８ｈｃは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＰ＿０３２６０３．３（アイソフォームｂ）（配列番号１０７）に記載されるアミノ酸配列を含み、これはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号：ＮＭ＿００８５７７．４（配列番号１０８）に記載される核酸配列によってコードされる。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃは、グリコシル化される。ある特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃは、ホスホリル化される。
【０１２６】
ある特定の実施形態において、配列番号９７のアミノ酸残基１８５〜２０５（アイソフォームｂ）からなり、ｈＣＤ９８ｈｃの細胞外ドメインは、配列番号９７のアミノ酸残基２０６〜６３０（アイソフォームｂ）からなり、ＣＤ９８ｈｃの細胞質ドメインは、配列番号９７のアミノ酸残基１０２〜１８４（アイソフォームｂ）からなる。ある特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの細胞外ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸残基１０５〜５２９（アイソフォームｆ）からなる。
【０１２７】
「抗ＣＤ９８ｈｃ抗体」及び「ＣＤ９８ｈｃに結合する抗体」という用語は、ＣＤ９８ｈｃに結合することができる抗体を指す。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体が無関係の非ＣＤ９８ｈｃタンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＣＤ９８ｈｃへの結合の約１０％未満である。
【０１２８】
ベイシジン
本明細書に使用される「Ｂｓｇ」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のベイシジン（ＣＤ１４７またはＥＭＭＰＲＩＮとしても知られる）を指す。Ｂｓｇの他の同義語には、５Ｆ７、ＯＫ、ＴＣＳＦ、ＨＴ７、５Ａ１１、ｇｐ４２、ニューロセリン、ＯＸ−４７、及びＨＡｂ１８が含まれる。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＢｓｇ、ならびに細胞内でのプロセシングから生じるＢｓｇの任意の形態を包含する。この用語は、Ｂｓｇの天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。天然に存在する変異形の例には、ヒトＢｓｇ１（１７６アミノ酸）、Ｂｓｇ２（２６９アミノ酸）、Ｂｓｇ３（３８５アミノ酸）、及びＢｓｇ４（２０５アミノ酸）が含まれ、それらのうちのＢｓｇ２は、ヒトにおいて見出される主な形態である。例示的なヒトＢｓｇ２のアミノ酸配列は、配列番号１１２に示される。例示的なマウスＢｓｇのアミノ酸配列は、配列番号１１３に示される。
【０１２９】
Ｇｌｕｔ１
本明細書で使用される「Ｇｌｕｔ１」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のグルコース輸送体１を指す。Ｇｌｕｔ１の他の同義語には、グルコース輸送体１型、溶質輸送体ファミリー２、メンバー１、ＳＬＣ２Ａ１、ＨＴＬＶＲ、及びヒトＴ細胞白血病ウイルス受容体が含まれる。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＧｌｕｔ１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じるＧｌｕｔ１の任意の形態を包含する。この用語は、Ｇｌｕｔ１の天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。例示的なヒトＧｌｕｔ１のアミノ酸配列は、配列番号１１４に示される。
【０１３０】
ＩＩ．組成物及び方法
ある特定の態様において、本発明は、血液脳関門を越える薬剤の輸送のための組成物及び／または方法を提供する。一部の態様において、薬剤は、ＣＤ９８ｈｃ、Ｇｌｕｔ１、またはベイシジンに対する抗体を使用し、血液脳関門を越えて輸送される。一部の実施形態において、抗ベイシジン／ＢＡＣＥ１抗体が提供される。一部の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、血液脳関門を越える薬剤の輸送方法において使用するための抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、本明細書において企図される抗体は、ヒト及び／または霊長類ＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１に結合する。本発明の抗体は、例えば、ＣＮＳ（例えば、脳）に影響を及ぼす疾患または障害の治療にも有用である。
【０１３１】
Ａ．抗ＢＢＢ−Ｒ抗体及びその複合体の産生
本発明の方法及び製品は、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体を使用するか、または組み込む。抗体の産生またはスクリーニングに使用されるＢＢＢ−Ｒ抗原は、例えば、所望のエピトープを含有する、可溶性形態またはその一部（例えば、細胞外ドメイン）であり得る。代替的に、または追加的に、それらの細胞表面でＢＢＢ−Ｒを発現する細胞を使用して、抗体を生成またはスクリーニングすることができる。抗体を生成するために有用なＢＢＢ−Ｒの他の形態は、当業者には明らかとなるであろう。本明細書におけるＢＢＢ−Ｒの例には、ＣＤ９８ｈｃ、Ｇｌｕｔ１、及びベイシジンが含まれる。
【０１３２】
一態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、細胞成長を阻害しないという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、アポトーシスを誘導しないという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、ＢＢＢ−Ｒの１つ以上の既知の機能を阻害しないという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、ＢＢＢ−Ｒの１つ以上の既知の機能を阻害しないという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。特定の実施形態において、抗体は、ＣＤ９８ｈｃに結合し、ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体によるアミノ酸輸送を阻害しない。ＣＤ９８ｈｃによるアミノ酸輸送（（例えば、ＣＤ９８軽鎖とのヘテロ二量体複合体内（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、及びａｓｃ−１））を検出するために使用され得るインビトロアッセイは既知であり、当該技術分野において説明されている。例えば、Ｆｅｎｃｚｉｋ，Ｃ．Ａｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，８７４６−８７５２を参照されたい。ＵＳ２０１３／００５２１９７も参照されたい。別の態様において、本発明は、血液脳関門を越えて薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、ＢＢＢ−Ｒの、その結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を阻害しない（例えば、ＣＤ９８ｈｃの、軽鎖結合パートナー（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、及びＡｓｃ−１））との相互作用を阻害しない）という理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、血液脳関門を越えて薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、抗体の存在下における、ＢＢＢ−Ｒの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合が、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の非存在下における結合の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）であるという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、ＣＤ９８ｈｃである。別の特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、Ｇｌｕｔ１である。別の特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、ベイシジンである。天然リガンドへの結合の決定方法は、当該技術分野において既知である（例えば、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡ等）。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、抗体の存在下における、ＢＢＢ−Ｒの、血液脳関門を越えるその天然リガンドのうちの１つ以上の輸送が、抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）であるという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。別の特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、ＣＤ９８ｈｃである。別の特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、Ｇｌｕｔ１である。別の特定の実施形態において、ＢＢＢ−Ｒは、ベイシジンである。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の作製方法を提供し、抗体の存在下における、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナー（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、またはＡｓｃ−１）への結合が、抗体の非存在下における結合の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）であるという理由で、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、少なくとも８０％である。特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、少なくとも９０％である。特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、少なくとも９５％である。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の作製方法を提供し、抗体の存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量が、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）であるという理由で、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。特定の実施形態において、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量が、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の少なくとも８０％である。別の実施形態において、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量が、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の少なくとも９０％である。別の特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の少なくとも９５％である。別の特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の少なくとも９９％である。別の特定の実施形態において、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナーへの結合の量は、抗体の非存在下における、ＢＢＢを越えるアミノ酸輸送の量の１００％である。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、約５ｎＭ〜、または約２０ｎＭ〜、または約１００ｎＭ〜、約１０μΜまで、または約１μΜまで、または約５００ｍＭまでの範囲内である、ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有するという理由で、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。故に、親和性は、例えば、スキャチャード解析またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定した場合に、約５ｎＭ〜約１０μΜの範囲内、または約２０ｎＭ〜約１μΜの範囲内、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲内であり得る。当業者には理解されることになるように、異種性分子／化合物を抗体に複合することは、多くの場合、例えば、抗体が、その抗体の元の標的とは異なる抗原に結合する１つ以上のアームにより多重特異性になる場合、立体障害またはさらには１つの結合アームの排除に起因して、抗体の、その標的への親和性を減少させることになる。
【０１３８】
Ｂ．治療方法及び組成物
抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、及び抗Ｇｌｕｔ１抗体は、例えば、本明細書に記載されるように、治療方法において使用され得る。例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、医薬品として有用である。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、例えば、治療剤（例えば、治療薬、例えば、抗体）を、ＣＮＳ部位（例えば、脳）に送達することによって、神経疾患または障害を治療するために有用である。本明細書に開示される用途及び方法によって包含される神経疾患または障害の非限定例には、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌（例えば、脳癌、例えば、グリオーマ、例えば、多形性神経膠芽腫）、及び外傷性脳損傷が含まれる。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、本発明は、神経疾患または障害を有する個体の治療方法を提供し、この方法は、有効量の抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体を個体に投与することを含み、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、治療剤を血液脳関門を越えて送達する。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の有効量は、治療剤を、ＢＢＢを越えて輸送するために有効な量である。１つのかかる実施形態において、本方法は、例えば以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態において、対象は、癌と診断されていない。一部の実施形態において、対象は、脳癌と診断されていない。一部の実施形態において、対象は、癌を有していない。一部の実施形態において、対象は、脳癌を有していない。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＢＢＢを越えて薬剤を輸送する際に使用するための抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、個体において、ＢＢＢを越える薬剤の輸送方法に使用するための抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体を提供し、薬剤をＢＢＢを越えて輸送するために、有効量の抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体を個体に投与することを含む。例として、制限なく、本明細書における抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得、目的の脳抗原（例えば、標的）に特異的な治療アームを含み得る。いずれかの１つの特定理論または作用機序によっても限定されることを意図しないが、多重特異性抗体の抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体部分が、ＢＢＢ上の標的受容体に結合し、ＢＢＢの反管腔側に輸送されると予想される。次いで、抗体の治療アーム（例えば、脳抗原に特異的な部分）は、標的嚢抗原に結合することができる。
【０１４１】
特定の実施例において、ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、ＢＢＢ上のＣＤ９８ｈｃに結合し、次いで、ＢＢＢの反管腔側に輸送され、その後ＢＡＣＥ１抗体部分が、脳内のＢＡＣＥ１に結合する。別の特定の実施例において、ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、ＢＢＢ上のＣＤ９８ｈｃに結合し、次いで、ＣＤ９８アミノ酸輸送体を介してＢＢＢの反管腔側に輸送され、その後ＢＡＣＥ１抗体部分が、ＢＡＣＥ１に結合する。これは、例えば、ＢＡＣＥ１を阻害するために有用となり、これが可溶性Ａｂｅｔａレベルの減少につながる。
【０１４２】
別の特定実施例において、ベイシジン／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、ＢＢＢ上のベイシジンに結合し、次いで、ベイシジンを介してＢＢＢの反管腔側に輸送され、その後ＢＡＣＥ１抗体部分が、ＢＡＣＥ１に結合する。これは、例えば、ＢＡＣＥ１を阻害するために有用となり、これが可溶性Ａｂｅｔａレベルの減少につながる。
【０１４３】
別の特定実施例において、Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、ＢＢＢ上のＧｌｕｔ１に結合し、次いで、Ｇｌｕｔ１を介してＢＢＢの反管腔側に輸送され、その後ＢＡＣＥ１抗体部分が、ＢＡＣＥ１に結合する。これは、例えば、ＢＡＣＥ１を阻害するために有用となり、これが可溶性Ａｂｅｔａレベルの減少につながる。一部の実施形態において、抗体のＧｌｕｔ１特異性部分は、Ｇｌｕｔ１による脳へのグルコース輸送を阻害しない。
【０１４４】
さらなる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製における抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、この医薬品は、神経疾患または障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌（例えば、脳癌、例えば、グリオーマ、例えば、多形性神経膠芽腫）、及び外傷性脳損傷）の治療のためのものである。さらなる実施形態において、医薬品は、神経疾患または障害の治療方法において使用するためのものであり、この方法は、神経疾患または障害を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのかかる実施形態において、この方法は、例えば下記の通り、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、医薬品は、例えば、ＢＡＣＥ１、Ａｂｅｔａ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｔａｕ、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、ＰｒＰ、ＬＲＲＫ２、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、ＤＲ６、ＡＰＰ、ｐ７５ＮＴＲ、及びカスパーゼ６等のタンパク質のレベルを減少させるためのものである。さらなる実施形態において、医薬品は、個体における、ＢＢＢを越える薬剤の輸送方法において使用するためのものであり、この方法は、ＢＢＢを越えて薬剤を輸送するために有効な量の医薬品を個体に投与することを含む。
【０１４５】
上記の治療方法及び用途の一部の態様において、この方法において使用される抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ＣＤ９８ｈｃ（例えば、アミノ酸輸送体）の正常かつ／または報告された機能を減弱しない。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ＣＤ９８ｈｃの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱しない。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体（例えば、ＣＤ９８ｈｃ及び軽鎖結合パートナー（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、及びＡｓｃ−１）で構成される）の、ヘテロ二量体複合体の１つ以上の天然リガンドへの結合を減弱しない。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ＣＤ９８ｈｃの、その軽鎖結合パートナー（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、及びＡｓｃ−１）との対合を阻害しない。
【０１４６】
治療方法の一部の態様において、ＣＤ９８ｈｃ抗体の存在下における、ＣＤ９８ｈｃ及び／またはＣＤ９８ヘテロ二量体複合体の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合は、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の非存在下における結合の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である。
【０１４７】
治療方法の一部の態様において、ＣＤ９８ｈｃ抗体の存在下における、ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体の天然リガンドのうちの１つ以上の、血液脳関門を越える輸送は、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である。
【０１４８】
治療方法の一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞死及び／またはアポトーシスを誘導しない。別の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞増殖を阻害しない。別の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞分裂を阻害しない。別の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞接着を阻害しない。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞死またはアポトーシスを誘導せず、かつ細胞増殖を阻害しない。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞死またはアポトーシスを誘導せず、かつ細胞増殖、細胞分裂、または細胞接着を阻害しない。
【０１４９】
治療方法の一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ＣＤ９８ｈｃの細胞外ドメイン内の領域に結合する（例えば、配列番号１０３のアミノ酸残基１０５〜５２９にわたる領域内のエピトープに結合する）。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞外システインＣｙｓ１０９を含まないエピトープに結合する。一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、細胞外システインＣｙｓ２１０を含まないエピトープに結合する。一部の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、カノニカル６３０アミノ酸ＣＤ９８ｈｃ配列（アイソフォームｃ、配列番号９９）の細胞外システインＣｙｓ３３０を含まないエピトープに結合する。
【０１５０】
一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、抗体が、治療剤を、ＢＢＢを越えて輸送するために有用であるように、十分な親和性を持つＣＤ９８ｈｃに結合する。ある特定の実施形態において、これらの方法における使用のための抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、異なる種に由来するＣＤ９８ｈｃ間で保存されているＣＤ９８ｈｃのエピトープに結合する。
【０１５１】
上記態様のうちのいずれかにおいて、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、ヒト化抗体であり得る。
【０１５２】
治療方法の一部の態様において、本明細書に開示される抗Ｂｓｇ抗体の存在下における、血液脳関門を越えるベイシジンの天然リガンドのうちの１つ以上の輸送は、抗Ｂｓｇ抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である。
【０１５３】
上記実施形態のうちのいずれかにおいて、抗Ｂｓｇ抗体は、ヒト化抗体であり得る。
【０１５４】
治療方法の一部の態様において、本明細書に開示される抗Ｇｌｕｔ１抗体の存在下における、血液脳関門を越えるＧｌｕｔ１の天然リガンドのうちの１つ以上の輸送は、抗Ｇｌｕｔ１抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である。
【０１５５】
上記実施形態のうちのいずれかにおいて、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ヒト化抗体であり得る。
【０１５６】
上記に開示されるように、本明細書に開示される方法は、脳及び／またはＣＮＳの疾患及び障害の治療方法を含む。
【０１５７】
例えば、制限なく、ニューロパシー障害は、本明細書に開示される治療方法に従い、組成物を用いて治療され得る。ニューロパシー障害は、不適切なもしくは制御されない神経シグナル伝達、またはその欠失によって特徴付けられる神経系の疾患または異常であり、慢性疼痛（侵害受容性疼痛を含む）、体組織への傷害によって引き起こされる疼痛（癌関連疼痛、神経障害性疼痛（神経、脊髄、または脳における異常によって引き起こされる疼痛）、及び心因性疼痛（全体的または大部分が精神的疾患に関連する）を含む）、頭痛、偏頭痛、ニューロパシー、ならびに眩暈または吐き気等のかかるニューロパシー障害に付随することの多い症状及び症候群が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
ニューロパシー障害の場合、麻薬性／オピオイド鎮痛薬（例えば、モルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、メペリジン、メタドン、オキシモルホン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、トラマドール、コデイン、及びオキシコドン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、及びトルメチン）、コルチコステロイド（例えば、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアミシノロン）、抗片頭痛剤（例えば、スマトリプチン、アルモトリプタン、フロバトリプタン、スマトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、ゾルミトリプタン、ジヒドロエルゴタミン、エレトリプタン、及びエルゴタミン）、アセトアミノフェン、サリチル酸塩（例えば、アスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、ジフルニサル、及びサルサラート）、抗痙攣薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、ガバペンチン、ラモトリジン、プレガバリン、チアガビン、及びトピラメート）、鎮痛薬（例えば、イソフルラン、トリクロロエチレン、ハロタン、セボフルラン、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、ノボカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、カルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、サキシトキシン、及びテトロドトキシン）、ならびにｃｏｘ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ）が含まれるが、これらに限定されない鎮痛薬である神経薬が選択され得る。眩暈を伴うニューロパシー障害の場合、メクリジン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、及びジアゼパムが含まれるが、これらに限定されない抗眩暈剤である神経薬が選択され得る。吐き気を伴うニューロパシー障害の場合、プロメタジン、クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、及びメトクロプラミドが含まれるが、これらに限定されない制吐剤である神経薬が選択され得る。
【０１５９】
例えば、制限なく、アミロイドーシスは、本明細書に開示される治療方法に従い、本明細書に開示される組成物を用いて治療され得る。アミロイドーシスは、ＣＮＳ内の細胞外タンパク質性沈着に関連した疾患及び障害の群であり、二次アミロイドーシス、加齢性アミロイドーシス、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レヴィー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ダッチ型）；グアムパーキンソン−認知症複合体、脳アミロイド血管障害、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症；クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、ＨＩＶ関連認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、及びβ−アミロイド沈着に関連する眼疾患（例えば、黄斑変性症、ドルーゼン関連視神経症、及び白内障）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
アミロイドーシスの場合、ベータセクレターゼ、タウ、プレゼニリン、アミロイド前駆体タンパク質もしくはその部分、アミロイドベータペプチドまたはそのオリゴマーもしくはフィブリル、死受容体６（ＤＲ６）、最終糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）、パーキン、及びハンチンチンから選択される標的に特異的に結合する抗体または他の結合分子（小分子、ペプチド、アプタマー、もしくは他のタンパク質結合体が含まれるが、これらに限定されない）；コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ガランタミン、ドネペジル、リバスチグミン、及びタクリン）；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、モノアミン枯渇薬（例えば、テトラベナジン）；メシル酸エルゴロイド；抗コリン性抗パーキンソン病薬（例えば、プロシクリジン、ジフェンヒドラミン、トリヘキシルフェニジル、ベンズトロピン、ビペリデン、及びトリヘキシフェニジル）；ドーパミン性抗パーキンソン病薬（例えば、エンタカポン、セレギリン、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ロチゴチン、セレギリン、ロピニロール、ラサギリン、アポモルフィン、カルビドーパ、レボドーパ、ペルゴリド、トルカポン、及びアマンタジン）；テトラベナジン；抗炎症薬（非ステロイド系抗炎症薬（例えば、インドメタシン及び上に列挙される他の化合物）が含まれるが、これらに限定されない）；ホルモン（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、及びロイプロリド）；ビタミン（例えば、葉酸及びニコチンアミド）；ジメボリン；ホモタウリン（例えば、３−アミノプロパンスルホン酸；３ＡＰＳ）；セロトニン受容体活性調節剤（例えば、キサリプロデン）；インターフェロン、及び糖コルチコイドが含まれるが、これらに限定されない神経薬が選択され得る。
【０１６１】
例えば、制限なく、癌は、本明細書に開示される治療方法に従い、組成物を用いて治療され得る。ＣＮＳの癌は、１つ以上のＣＮＳ細胞（例えば、神経細胞）の異常増殖によって特徴付けられ、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨種、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、及び硬膜外、髄内、または硬膜内腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
癌の場合、化学療法剤である神経薬が選択され得る（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、Ｇｌｕｔ１、またはＢｓｇ抗体と複合または同時投与される）。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）等のアルキル化薬剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン等のアルキルスルホネ−ト；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒ−ａｍｉｄｅ）、及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノ−ル（ドロナビノ−ル、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベ−タ−ラパコン；ラパコ−ル；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタ−ド等の窒素マスタ−ド；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）等のニトロスレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１Ｉ及びカリケアミシンω１Ｉ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））等の抗生物質；ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミドマイシンＣ等のミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗代謝物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フロリン酸等の葉酸補液（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシン等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール（ｍｏｐｉｄａｍｎｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド（２−ｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ）；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２′，２′′−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ不含、アルブミン操作されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの複合療法の省略形）、及びＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボビンと複合されたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）による治療レジメンの省略形）が含まれる。
【０１６３】
この化学療法剤の定義には、癌の成長を促進し得るホルモンの効果を制御、低下、遮断、または阻害するように作用し、かつ、全身性、すなわち身体全体の治療の形態であることが多い、抗ホルモン剤も含まれる。それら自体がホルモンであってもよい。例には、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方調節薬（ＥＲＤ）；卵巣を抑制するかまたは閉鎖させるように機能する薬剤、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）ロイプロリド酢酸塩、ゴセレリン酢酸塩、ブセレリン酢酸塩、ならびにトリプテレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト；フルタミド、ニルタミド、及びビカルタミド等の他の抗アンドロゲン；さらに例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロール酢酸塩、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタイン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール等の、副腎内のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤が含まれる。加えて、化学療法剤のかかる定義には、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標）、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート等のビスホスホネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）等の異所（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関係があるとされるシグナル伝達系路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン等のワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ジトシル酸ラパチニブ（別名ＧＷ５７２０１６、ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；さらに上記のうちのいずれかの薬学上許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
【０１６４】
癌の治療または予防のための神経薬として選択され得る化合物の別の群は、抗癌免疫グロブリン（トラスツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、アレムツキシマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、イブリツモマブ、チウキセタン、パニツムマブ、及びリツキシマブが含まれるが、これらに限定されない）である。場合によっては、抗体を、傷害性標識または複合体と複合して使用し、１３１Ｉ放射標識を有するトシツモマブ、またはトラスツズマブエムタンシンを含むが、これらに限定されない所望の細胞（例えば、癌細胞）を標的とし、死滅させることができる）。
【０１６５】
例えば、制限なく、眼疾患及び障害は、本明細書に開示される治療方法に従い、組成物を用いて治療され得る。眼疾患または障害は、本明細書における目的で、ＢＢＢによって分離されたＣＮＳ器官であると見なされる、眼の疾患または障害である。眼疾患または障害には、強膜、隔膜、虹彩、及び毛様体の障害（例えば、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷、雪盲、紋眼、タイゲソン表層点状角膜炎、角膜血管新生、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎、及びブドウ膜炎）、レンズの障害（例えば、白内障）、脈絡膜及び網膜の障害（例えば、網膜剥離、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症、黄斑変性症（ウェット型またはドライ型）、網膜上膜、網膜色素変性症、及び黄斑浮腫）、緑内障、浮遊物、視神経及び視覚経路の障害（例えば、レーバー遺伝性視神経症及び視神経乳頭ドルーゼン）、眼筋の障害／両眼運動連携／屈折（例えば、斜視、眼麻痺、進行性外眼筋麻痺症候群、内斜視、外斜視、遠視、近視、乱視、不同視、老眼、及び眼筋麻痺）、視覚障害及び盲目（例えば、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、色盲（ｃｏｌｏｒ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）、色盲（ａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ）、夜盲症、盲目、河川盲目症、及び小眼球症／コロボーム）、レッドアイ、アーガイル・ロバートソン瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症、及び無虹彩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
眼疾患または障害の場合、抗血管新生眼科用剤（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びペガプタニブ）、眼科用緑内障剤（例えば、カルバコール、エピネフリン、臭化デメカリウム、アプラクロニジン、ブリモニジン、ブリンゾールアミド、レボブノロール、チモロール、ベタキソロール、ドルゾルアミド、ビマトプロスト、カルテオロール、メチプラノロール、ジピヴェフリン、トラボプロスト、及びラタノプロスト）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えば、メタゾールアミド及びアセタゾールアミド）、眼科用抗ヒスタミン（例えば、ナファゾリン、フェニルエフリン、及びテトラヒドロゾリン）、眼潤滑剤、眼科用ステロイド（例えば、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デキサメタゾン、ジフルプレドナート、リメキソロン、フルオシノロン、メドリゾン、及びトリアムシノロン）、眼科用麻酔剤（例えば、リドカイン、プロパラカイン、及びテトラカイン）、眼科用抗感染症薬（例えば、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、クロラムフェニコール、バシトラシン／ポリミキシンｂ、スルファセタミド、トブラマイシン、アジスロマイシン、ベシフロキサシン、ノルフロキサシン、スルフィソキサゾール、ゲンタミシン、イドキシウリジン、エリスロマイシン、ナタマイシン、グラミシジン、ネオマイシン、オフロキサシン、トリフルリジン、ガンシクロビル、ビダラビン）、眼科用抗炎症剤（例えば、ネパフェナク、ケトロラク、フルルビプロフェン、スプロフェン、シクロスポリン、トリアムシノロン、ジクロフェナク、及びブロムフェナク）、ならびに眼科用抗ヒスタミンまたは充血除去剤（例えば、ケトチフェン、オロパタジン、エピナスチン、ナファゾリン、クロモリン、テトラヒドロゾリン、ペミロラスト、ベポタスチン、ナファゾリン、フェニルエフリン、ネドクロミル、ロドキサミド、フェニルエフリン、エメダスチン、及びアゼラスチン）である、神経薬が選択され得る。
【０１６７】
ＣＮＳのウイルスまたは微生物感染には、ウイルスによる感染（例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹）、細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及び真菌（例えば、酵母、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、寄生虫（例えば、ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、またはＣＮＳ病態生理学をもたらすアメーバ（急性または慢性であり得る、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脈管炎、及び膿瘍が含まれるが、これらに限定されない）等の他の微生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ウイルスまたは微生物疾患の場合、抗ウイルス化合物（アダマンタン抗ウイルス薬（例えば、リマンタジン及びアマンタジン）、抗ウイルスインターフェロン（例えば、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、マラビロク）、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（例えば、ラルテグラビル）、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビル及びザナミビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、エファビレンズ、エトラビリン、デラビルジン、及びネビラピン）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（テノホビル、アバカビル、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、エンテカビル、エムトリシタビン、アデホビル、ザルシタビン、テルビブジン、及びジダノシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ダルナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル、及びサキナビル）、プリンヌクレオシド（例えば、バラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、リバビリン、ガンシクロビル、バルガニシクロビル、及びシドホビル）、ならびに雑多抗ウイルス薬（例えば、エンフビルチド、ホスカルネット、パリビズマブ、及びホミビルセン）が含まれるが、これらに限定されない）、抗生物質（アミノペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルコキサシリン、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン、及びバカムピシリン）、セファロスポリン（例えば、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、及びセフォキシチン）、カルバペネム／ペネム（例えば、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム、及びドリペネム）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノルカルジシンＡ、及びタブトキシニン−ベータ−ラクタム、別のβ−ラクタム抗生物質と複合したベータ−ラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸、タゾバクタム、及びスルバクタム）、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、ゲンタミシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、及びパロモマイシン）、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン及びヘルビマイシン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、糖ペプチド（例えば、テイコプラニン及びバンコマイシン）、マクロリド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、及びスペクチノマイシン）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、及びテマフロキサシン）、スルホンアミド（例えば���マフェニド、スルホンアミドクリソイジン、スルファセトアミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム、及びスルファメトキサゾール）、テトラシクリン（例えば、テトラシクリン、デメクロシクリン、ドキシシクリン、ミノシクリン、及びオキシテトラシクリン）、抗悪性腫瘍薬または細胞傷害性抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ミトマイシン、ペントスタチン、及びバルルビシン）、ならびに雑多抗細菌性化合物（例えば、バシトラシン、コリスチン、及びポリミキシンＢ）が含まれるが、これらに限定されない）、抗真菌薬（例えば、メトロニダゾール、ニタゾキサニド、チニダゾール、クロロキン、ヨードキノール、及びパラモマイシン）、ならびに抗寄生虫薬（キニン、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテメシニン、ハロファントリン、トキシシクリン、クリンダマイシン、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、リファンピン、アンホテリシンＢ、メラルソプロール、エホニチン、及びアルベンダゾールが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない神経薬が選択され得る。
【０１６９】
ＣＮＳ炎症もまた、本明細書に開示される方法に従って治療され得る。ＣＮＳの炎症には、身体的傷害であり得る、ＣＮＳへの傷害によって引き起こされる炎症（例えば、事故、手術、脳外傷、脊髄損傷、脳浸透に起因する）、及びＣＮＳの１つ以上の他の疾患または障害に起因するか、または関連する傷害（例えば、膿瘍、癌、ウイルスもしくは微生物感染）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
ＣＮＳ炎症の場合、炎症自体に対応する神経薬（例えば、イブプロフェンもしくはナプロキセン等の非ステロイド系抗炎症剤）、または炎症の根本原因を治療するもの（例えば、抗ウイルス剤もしくは抗癌剤）が選択され得る。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、ＣＮＳの虚血は、脳内の異常な血流もしくは血管挙動、またはその原因に関連する疾患の群を指し、局所性脳虚血、全脳虚血、脳卒中（例えば、くも膜下出血及び頭蓋内出血）、ならびに動脈瘤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
虚血の場合、血栓溶解薬（例えば、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、及びテネクテプラーゼ）、血小板凝固阻害剤（例えば、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、プラスグレル、及びジピリダモール）、スラチン（例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチン、シムバスタチン、セリバスタチン、及びピタバスタチン）、ならびに血流または血管柔軟性を改善する化合物（例えば、血圧薬を含む）が含まれるが、これらに限定されない神経薬が選択され得る。
【０１７３】
神経変性疾患は、ＣＮＳ内の神経細胞の機能喪失または死に関連した疾患及び障害の群であり、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパーズ病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、アミロイドーシスによって引き起こされるか、またはそれに関連した変性、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭葉変性症、ケネディ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、横断性脊髄炎、レフサム病、及び脊髄小脳失調症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
神経変性疾患の場合、成長ホルモンまたは神経栄養因子である神経薬が選択されてもよく、例には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体遮断薬（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、パーセフィン、インターロイキン、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
ＣＮＳの発作疾患及び傷害は、ＣＮＳ内の不適切かつ／または異常な電気伝導を伴い、癲癇（例えば、アブサンス発作、脱力発作、良性ローランド癲癇、小児アブサンス、間代発作、複雑部分発作、前頭葉癲癇、熱性痙攣、幼児痙攣、若年性ミオクローヌス癲癇、若年性アブサンス癲癇、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群、オオタハラ症候群、ウェスト症候群、ミオクローヌス発作、ミトコンドリア病、進行性ミオクローヌス癲癇、心因性発作、反射癲癇、ラスムッセン脳炎、単純部分発作、二次全身性発作、側頭葉癲癇、トニック間代発作、トニック発作、精神運動発作、辺縁系癲癇、部分発作、全般発作、癲癇発作重積状態、腹部癲癇、無動発作、自律神経発作、両側汎発性、月経随伴性癲癇、失立発作、ストレス発作、局所性発作、笑い発作、ジャクソン・マーチ、ラフォラ病、運動発作、多焦点性発作、夜間発作、光過敏性発作、偽発作、感覚発作、微細発作、シルヴァン発作、離脱性痙攣、及び視覚性反射発作）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
発作障害の場合、バルビツール抗痙攣薬（例えば、プリミドン、メタルビタール、メホバルビタール、アロバルビタール、アモバルビタール、アプロバルビタール、アルフェナール、バルビタール、ブラロバルビタール、及びフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン抗痙攣薬（例えば、ジアゼパム、クロナゼパム、及びロラゼパム）、カルバメート抗痙攣薬（例えば、フェルバメート）、カルボン酸脱水酵素阻害剤抗痙攣薬（例えば、アセトアゾラミド、トピラメート、及びゾニサミド）、ジベンザゼピン抗痙攣薬（例えば、ルフィンアミド、カルバマゼピン、及びオキシカルバゼピン）、脂肪酸誘導体抗痙攣薬（例えば、ジバルプロエックス及びバルプロ酸）、ガンマ−アミノブチル酸類似体（例えば、プレガバリン、ガバペンチン、及びビガバトリン）、ガンマ−アミノブチル酸再取り込み阻害剤（例えば、チアガビン）、ガンマ−アミノブチル酸トランスアミナーゼ阻害剤（例えば、ビガバトリン）、ヒダントイン抗痙攣薬（例えば、フェニトイン、エトトイン、ホスフェニトイン、及びメフェニトイン）、雑多抗痙攣薬（例えば、ラコサミド及び硫酸マグネシウム）、プロゲスチン（例えば、プロゲステロン）、オキサゾリジンジオン抗痙攣薬（例えば、パラメタジオン及びトリメタンジオン）、ピロリジン抗痙攣薬（例えば、レベチラセタム）、スクシンイミド抗痙攣薬（例えば、エトスキシミド及びメトスキシミド）、トリアジン抗痙攣薬（例えば、ラモトリギン）、ならびに尿素抗痙攣薬（例えば、フェナセミド及びフェネツリド）が含まれるが、これらに限定されない抗痙攣薬または抗癲癇薬である神経薬が選択され得る。
【０１７７】
行動障害は、罹患した対象の側の異常行動を特徴とするＣＮＳの障害であり、睡眠障害（例えば、不眠症、睡眠時随伴症、夜驚症、概日リズム睡眠障害、及び睡眠発作）、気分障害（例えば、鬱病、自殺的鬱病、不安症、慢性感情障害、恐怖症、パニック発作、強迫性障害、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、注意血管障害（ＡＤＤ）、慢性疲労症候群、広場恐怖症、外傷後ストレス障害、双極性障害）、摂食障害（例えば、拒食症または過食症）、精神病、発達性行動障害（例えば、自閉症、レット症候群、アスペルガー症候群）、人格障害、及び精神障害（例えば、統合失調症、妄想性障害等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
行動障害の場合、神経薬は、非定型抗精神病薬（例えば、リスペリドン、オランザピン、アプリピプラゾール、クエチアピン、パリペリドン、アセナピン、クロザピン、イロペリドン、及びジプラシドン）、フェノチアジン系精神安定剤（例えば、プロクロルペラジン、クロプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、トリフルオペラジン、チオリダジン、及びメソリダジン）、チオキサンテン（例えば、チオチキセン）、雑多な抗精神病薬（例えば、ピモジド、リチウム、モリンドン、ハロペリドール、及びロキサピン）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチン、及びセルトラリン）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（例えば、ズロキセチン、ベンラファキシン、デスヴェンラファキシン、三環系抗鬱薬（例えば、ドキセピン、クロミプラミン、アモキサピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、トリミプラミン、イミプラミン、プロトリプチリン、及びデシプラミン）、四環系抗鬱薬（例えば、ミルタザピン及びマプロチリン）、フェニルピペラジン抗鬱薬（例えば、トラゾドン及びネファゾドン）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（例えば、イソカルボキサジド、フェネルジン、セレギリン、及びトラニルシプロミン）、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、エスタゾラム、フルラゼプタム、クロナゼパム、ロラゼパム、及びジアゼパム）、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（例えば、ブプロピオン）、ＣＮＳ刺激薬（例えば、フェンテルミン、ジエチルプロピロン、メタムフェタミン、デキストロアンフェタミン、アンフェタミン、メチルフェニデート、デキシメチルフェニデート、リスデキシアンフェタミン、モダフィニル、ペモリン、フェンジメトラジン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン、アルモダフィニル、ジエチルプロピオン、カフェイン、アトモキセチン、ドキサプラム、及びマジンドール）、抗不安剤／鎮静剤／催眠剤（バルビツレート（例えば、セコバルビタール、フェノバルビタール、及びメフォバルビタール）が含まれるが、これらに限定されない）、ベンゾジアゼピン（上記の通り）、及び雑多抗不安剤／鎮静剤／催眠剤（例えば、ジフェンヒドラミン、ナトリウムオキシベート、ザレプロン、ヒドロキシジン、抱水クロラール、アオルピデム、ブスピロン、ドキセピン、エスゾピクロン、ラメルテオン、メプロバメート、及びエトクロルビノール））、セクレチン（例えば、Ｒａｔｌｉｆｆ−Ｓｃｈａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｉｓｍ  ９：２５６−２６５（２００５）を参照されたい）、オピオイドペプチド（例えば、Ｃｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８９：２７３−２８５（２００４）を参照されたい）、及びニューロペプチド（例えば、Ｈｅｔｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｅ３０１−３０５（２００５）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない、行動修正化合物から選択され得る。
【０１７９】
リソソーム蓄積症は、場合によっては、ＣＮＳに関連するか、またはＣＮＳ特異的症状を有する代謝障害であり、かかる障害には、タイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩ型）、グリコーゲン蓄積症、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質萎縮症及び神経セロイドリポフスチン症１型及び２型、ニーマン・ピック病、ポンペ病、ならびにクラッベ病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
リソソーム蓄積症の場合、それ自体であるか、またはそうでなければ、疾患において減弱される酵素の活性を模倣する神経薬が選択され得る。リソソーム蓄積症の治療のための例示的な組み換え酵素には、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２１４１号に記載されるもの（例えば、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−スルファターゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータ−グルクロニダーゼ、酸アルファ−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ベータ−ガラクトセレブロシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸セラミダーゼ、アスパルトアシラーゼ、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ１、及びトリペプチジルアミノペプチダーゼ１）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
一態様において、本発明の抗体を使用して、症状の発症前に神経障害を検出し、かつ／またはその疾患もしくは障害の重症度もしくは期間を評価する。一態様において、この抗体は、神経障害の検出及び／または撮像を可能にし、Ｘ線撮影法、断層撮影法、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による撮像を含む。
【０１８２】
本発明の抗体は、治療法において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、化学療法剤である。別の実施形態において、抗体は、上記の通り、１つ以上の神経障害薬と共に投与される。
【０１８３】
かかる併用療法には、組み合わせ投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与が含まれ、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤（複数可）の投与の前、それと同時、及び／またはその後に行うことができる。一実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、または約１週間、２週間、もしくは３週間以内、または約１日、２日、３日、４日、５日、もしくは６日以内に生じる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて用いることもできる。
【０１８４】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、ならびに局所治療で所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段による投与を含むことができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内または皮下注射等の注射によるものであり得る。単回または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
【０１８５】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一貫した様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈における考慮の要因には、治療されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に知られている他の要因が含まれる。必然的にではなく任意で、抗体は、問題の障害を予防または治療するために現在使用される１つ以上の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、配合物中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び上記に考察された他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量で、本明細書に記載される投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路によって、使用される。
【０１８６】
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量は（単独でまたは１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への反応、ならびに主治医の裁量によって決定されることになる。抗体は、患者に、１回で、または一連の治療わたって好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、１回以上の別個の投与によってであれ連続注入によってであれ、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための初回候補投薬量となり得る。１つの典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲に及び得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続されることが一般的であろう。本抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。故に、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（もしくはこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば毎週または３週間毎（例えば、患者が約２〜約２０回、または例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。より高い初回負荷用量を投与し、続いてより低い用量を１回以上投与してもよい。典型的な投薬レジメンは、例えば、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を投与し、続いて毎週の維持用量の約２ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投薬レジメンも有用な場合がある。この治療の経過は、従来的な技法及びアッセイによって容易に監視される。
【０１８７】
上記製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して行われ得ることが理解される。
【０１８８】
Ｃ．例示的な抗体
１．例示的な抗ベイシジン抗体
一部の実施形態において、血液脳関門を越えて薬剤を輸送するための本明細書に提供される方法は、血液脳関門を、ベイシジン（Ｂｓｇ）に結合する抗体に曝露することを含み得る。抗体、例えば、ベイシジンに結合する抗体の生成方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書に詳述される。したがって、一態様において、本発明は、Ｂｓｇに結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態において、ベイシジンの細胞外ドメイン内の領域に結合する抗Ｂｓｇ抗体が提供される。ある特定の実施形態において、マウスＢｓｇ及び／またはヒトＢｓｇに結合する抗Ｂｓｇが提供される。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、抗体の、ベイシジンへの結合が、ベイシジンの、その天然リガンド、例えば、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、シクロフィリンＡ、シクロフィリンＢ、アネキシンＩＩ、及びカベオリン１のうちの１つ以上への結合を減弱せず、かつ／またはＢＢＢ−Ｒの天然リガンドのうちのいずれも、血液脳関門を越える輸送を減弱しない、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。本明細書で使用される場合、「減弱しない」とは、１つ以上の天然リガンドが結合し、かつ／または抗体が存在しない（すなわち、いかなる結合特性の変化もない）場合と同様に（例えば、量、速度等）、ＢＢＢを越えて輸送されることを意味する。
【０１９０】
ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｂｓｇの、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合が、抗体の非存在下における結合の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。
【０１９１】
ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｂｓｇの天然リガンドのうちのいずれかの、血液脳関門を越える輸送が、抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である、抗Ｂｓｇ抗体が提供される。
【０１９２】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３、１９、３５、５１、及び６７から選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号４、２０、３６、５２、及び６８から選択される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号５、２１、３７、５３、及び６９から選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【０１９３】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号６、２２、３８、５４、及び７０から選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号７、２３、３９、５５、及び７１から選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号８、２４、４０、５６、及び７２から選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【０１９４】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号５を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１９５】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１９を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２０を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号２１を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１９６】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３６を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３７を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号３８を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３９を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４０を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１９７】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号５１を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５２を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５３を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号５４を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５５を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５６を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号６７を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６８を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６９を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号７０を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７１を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７２を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１９９】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、ＦＲ１に関して配列番号９、２５、４１、５７、及び７３から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ２に関して配列番号１０、２６、４２、５８、及び７４から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ３に関して配列番号１１、２７、４３、５９、及び７５から選択されるアミノ酸配列、ならびにＦＲ４に関して配列番号１２、２８、４４、６０、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインフレームワーク領域をさらに含む。
【０２００】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、ＦＲ１に関して配列番号１３、２９、４５、６１、及び７７から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ２に関して配列番号１４、３０、４６、６２、及び７８から選択されるアミノ酸配列、ＦＲ３に関して配列番号１５、３１、４７、６３、及び７９から選択されるアミノ酸配列、ならびにＦＲ４に関して配列番号１６、３２、４８、６４、及び８０から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインフレームワーク領域をさらに含む。
【０２０１】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【０２０２】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、及び６６から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む重鎖を含む。一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、及び６６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、及び６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号２、１８、３４、５０、及び６６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む。
【０２０４】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＡである。
【０２０５】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号１７に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１８に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体、抗ＢｓｇＢである。
【０２０６】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号３３に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＣである。
【０２０７】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号４９に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５０に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＤである。
【０２０８】
一部の実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、配列番号６５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号６６に対応するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態において、抗Ｂｓｇ抗体は、抗ＢｓｇＥである。
【０２０９】
２．例示的な抗Ｇｌｕｔ抗体
一部の実施形態において、血液脳関門を越えて薬剤を輸送するための本明細書に提供される方法は、血液脳関門を、Ｇｌｕｔ１に結合する抗体に曝露することを含み得る。抗体、例えば、Ｇｌｕｔ１に結合する抗体の生成方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書で詳述される（例えば、以下の節Ｃを参照されたい）。一態様において、本発明は、Ｇｌｕｔ１に結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態において、ヒトＧｌｕｔ１に結合する抗Ｇｌｕｔ１が提供される。ある特定の実施形態において、マウスＧｌｕｔ１（ｍＧｌｕｔ１）に結合する抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、ヒトＧｌｕｔ１（ｈＧｌｕｔ１）に結合する抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、ｈＧｌｕｔ１及びｍＧｌｕｔ１に結合する抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。
【０２１０】
ある特定の実施形態において、抗体の、Ｇｌｕｔ１への結合が、Ｇｌｕｔ１の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合を減弱せず、かつ／またはＢＢＢ−Ｒの天然リガンドのうちのいずれも、血液脳関門を越える輸送を減弱しない、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。本明細書で使用される場合、「減弱しない」とは、１つ以上の天然リガンドが結合し、かつ／または抗体が存在しない（すなわち、いかなる結合特性の変化もない）場合と同様に（例えば、量、速度等）、ＢＢＢを越えて輸送されることを意味する。
【０２１１】
ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、Ｇｌｕｔ１の、その天然リガンドのうちの１つ以上への結合が、抗体の非存在下における結合の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。
【０２１２】
ある特定の実施形態において、抗体の存在下における、ＢＢＢ−Ｒの天然リガンドのうちのいずれかの、血液脳関門を越える輸送が、抗体の非存在下における輸送の量の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）である、抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。
【０２１３】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８３を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８５を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０２１４】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８６を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８７を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８８を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０２１５】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８３を含む軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４を含む軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８５を含む軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号８６を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８７を含む重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８８を含む重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０２１６】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ＦＲ１に関して配列番号８９、ＦＲ２に関して配列番号９０、ＦＲ３に関して配列番号９１、及びＦＲ４に関して配列番号９２に対応するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域を含む、軽鎖可変ドメインを含む。
【０２１７】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、ＦＲ１に関して配列番号９３、ＦＲ２に関して配列番号９４、ＦＲ３に関して配列番号９５、及びＦＲ４に関して配列番号９６に対応するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域を含む、重鎖可変ドメインを含む。
【０２１８】
ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８１に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号８２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、抗Ｇｌｕｔ１抗体は、配列番号８２に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０２１９】
Ｄ．抗体の特徴
本発明のさらなる態様において、上記の実施形態のうちのいずれかによる抗ＣＤ９８ｈｃ、抗ベイシジン、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗ベイシジン、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ′）２断片である。別の実施形態において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０２２０】
さらなる態様において、上記の実施形態のうちのいずれかによる抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇまたは抗Ｇｌｕｔ１抗体は、以下の節１〜７に記載される特徴のうちのいずれかを、単独または組み合わせで組み込み得る。
【０２２１】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０２２２】
一実施形態において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョンとその抗原を用いて行われる。例えば、抗原に対するＦａｂの結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆａｂを最低濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、その後、室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで遮断される。非吸着性のプレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、確実に平衡に到達するように、インキュベーションはより長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温での（例えば、１時間にわたる）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を付加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選定する。
【０２２３】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアッセイは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化した抗体ＣＭ５チップを用いて２５℃で行われる。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の使用説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するように、５μＬ／分の流量で注入する。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃で、およそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによって、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計において測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃でのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、決定することができる。
【０２２４】
２．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有する、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０２２５】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ（Ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）及びテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）もまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載される。
【０２２６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。
【０２２７】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｉｌまたはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、種々の技法によって作製することができる。
【０２２８】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）、及びヒト定常領域を含む。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
【０２２９】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下するためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、かつＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。一部の実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元するまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体由来）の対応する残基で置換される。
【０２３０】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、また例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植について説明する）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」について説明する）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について説明する）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）、及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて説明する）にさらに記載されている。
【０２３１】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載される。
【０２３３】
ヒト抗体は、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を含むインタクトな抗体を産生するように変化したトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製されてもよい。かかる動物は典型的に、内在性免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含む。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、概して、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について説明する）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について説明する）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について説明する）、ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について説明する）を参照されたい。かかる動物によって生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾されてもよい。
【０２３４】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株が説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について説明する）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて説明する）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）、及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０２３５】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成されてもよい。かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法が、以下に記載される。
【０２３６】
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリを、所望の活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体について、かかるライブラリをスクリーニングするための多様な方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、またさらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
【０２３７】
ある特定のファージ提示法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中で無作為に組み換えられ、それを次いで、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫された源のライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、広範な非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、かつインビトロで再配列を遂行することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載している特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０２３８】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０２３９】
６．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、ＣＤ９８ｈｃに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、ベイシジンに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、Ｇｌｕｔ１に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０２４０】
一部の実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体等）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。かかる多重特異性抗体には、全長抗体、２つ以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディ、共有結合または非共有結合で連結されている抗体断片等が含まれるが、これらに限定されない。重鎖可変領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖可変領域の少なくとも一部分をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、「アーム」または「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。一部の実施形態において、ヘミマーは、第２のヘミマーと分子内ジスルフィド結合が形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の部分を含む。一部の実施形態において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール突然変異またはノブ突然変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ突然変異またはホール突然変異を含む。ノブ突然変異及びホール突然変異が、以下でさらに考察される。
【０２４１】
多重特異性抗体の作製技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ  ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ノブ・イン・ホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することにより、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８を参照されたい）。一部の実施形態において、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合することが促進される。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含むことができるか、または同様のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、または異なる標的認識配列を含む（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合を含む）、任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。
【０２４２】
本明細書で使用される「ノブ突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、突起（ノブ）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。一部の実施形態において、他のポリペプチドは、ホール突然変異を有する。
【０２４３】
本明細書で使用される「ホール突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、空洞（ホール）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。一部の実施形態において、他のポリペプチドは、ノブ突然変異を有する。
【０２４４】
多重特異性抗体はまた、静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ  ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体を調製することによって、作製されてもよい。
【０２４５】
「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２４６】
本明細書における抗体または断片にはまた、ＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１、及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
【０２４７】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体、例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、「ＣＮＳ抗原」または「脳抗原」に特異的な治療アームを含む多重特異性抗体である。例えば、本明細書に開示される多重特異性抗体は、ＣＤ９８ｈｃ、またはＢｓｇ、またはＧｌｕｔ１に特異的な第１のアーム、及び脳抗原に特異的な第２のアームを有する。かかる抗原の例には、制限なく、ＢＡＣＥ１、Ａｂｅｔａ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、タウ、Ａｐｏ、例えば、ＡｐｏＥ４、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、ＰｒＰ、ＬＲＲＫ２、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、ＤＲ６、ＡＰＰ、ｐ７５ＮＴＲ、ＩＬ６Ｒ、ＴＮＦＲ１、ＩＬ１β、及びカスパーゼ６が含まれる。一実施形態において、抗原は、ＢＡＣＥ１である。別の実施形態において、抗原は、Ａｂｅｔａである。
【０２４８】
故に、ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、ＣＤ９８ｈｃに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、ベイシジンに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、Ｇｌｕｔ１に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ９８ｈｃの２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ベイシジンの２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、Ｇｌｕｔ１の２つの異なるエピトープに結合し得る。さらに、多重特異性抗体を使用して、細胞傷害性薬剤を、ＣＤ９８ｈｃ、Ｇｌｕｔ１、及び／またはベイシジンを発現する細胞に限局させてもよい。
【０２４９】
脳抗原に特異的な抗体、例えば、上で例示されるものは、当該技術分野において既知である。例として、抗ＢＡＣＥ１抗体が既知であり、例示的な抗体配列は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０７５０３７号に記載されている。一実施形態において、抗ＢＡＣＥ１抗体が無関係の非ＢＡＣＥ１タンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＢＡＣＥ１への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、ＢＡＣＥ１に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＢＡＣＥ１抗体は、異なる種及びアイソフォームに由来するＢＡＣＥ１間で保存されているＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。
【０２５０】
一実施形態において、抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１によって結合されるＢＡＣＥ１上のエピトープに結合する抗体が提供される。他の実施形態において、ＢＡＣＥ１の触媒ドメインに位置するＢＡＣＥ１内のエキソサイトに結合する抗体が提供される。一実施形態において、ＢＡＣＥ１に結合するために、Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１１５６７−１１５７３（２００５）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において特定されたペプチド（すなわち、１、２、３、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、２〜１２、３〜１２、４〜１２、５〜１２、６〜１２、７〜１２、８〜１２、９〜１２、１０〜１２、４、５、６、５〜１０、５〜９、スクランブル、Ｙ５Ａ、Ｐ６Ａ、Ｙ７Ａ、Ｆ８Ａ、Ｉ９Ａ、Ｐ１０Ａ、及びＬ１１Ａ）と競合する抗体が提供される。
【０２５１】
さらなる例として、ヒトＡｂｅｔａに特異的に結合する抗Ａｂｅｔａ抗体が知られている。抗Ａｂｅｔａ抗体の非限定例は、クレネズマブである。抗Ａｂｅｔａ抗体の他の非限定例は、ソラネズマブ、バピネオズマブ、ガンテネルマブ、アズカヌマブ、ポネズマブ、及び以下の公報、ＷＯ２０００１６２８０１、ＷＯ２００２０４６２３７、ＷＯ２００２００３９１１、ＷＯ２００３０１６４６６、ＷＯ２００３０１６４６７、ＷＯ２００３０７７８５８、ＷＯ２００４０２９６２９、ＷＯ２００４０３２８６８、ＷＯ２００４０３２８６８、ＷＯ２００４１０８８９５、ＷＯ２００５０２８５１１、ＷＯ２００６０３９４７０、ＷＯ２００６０３６２９１、ＷＯ２００６０６６０８９、ＷＯ２００６０６６１７１、ＷＯ２００６０６６０４９、ＷＯ２００６０９５０４１、ＷＯ２００９０２７１０５に開示される任意の抗Ａｂｅｔａ抗体である。
【０２５２】
７．抗体変異形
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製することができる。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／またはそこへの残基の挿入、及び／またはその中での残基の置換が含まれる。最終構築物に到達するように、欠失、挿入、及び置換を任意で組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が、所望の特性、例えば、抗原結合性を保有することを条件とする。
【０２５３】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型突然変異生成のための目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表Ｃにおいて、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表Ｃにおいて、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され、生成物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされてもよい。
表Ｃ：保存的アミノ酸置換
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【０２５４】
アミノ酸は、次の一般的な側鎖特性に従って分類されてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５５】
非保存的置換には、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
【０２５６】
置換型変異形の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される、結果として生じる変異形（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）を有することになり、かつ／または親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持することになる。例示的な置換型変異形は、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージ提示ベースの親和性成熟技法を使用して便宜的に生成され得る、親和性成熟抗体である。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異形抗体をファージ上で提示させて、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２５７】
変化（例えば、置換）をＨＶＲにおいて行って、例えば、抗体親和性を改善してもよい。かかる変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を経るコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／または抗原に接触する残基に行われてもよく、結果として生じる変異形ＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、かつそこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ′Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）。）に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態において、多様性が、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異生成）のうちのいずれかによって、成熟のために選定された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリが作成される。次いで、このライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異形を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、１回に４〜６つの残基）がランダム化される、ＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成またはモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、標的とされることが多い。
【０２５８】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる変化が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われてもよい。かかる変化は、例えば、ＨＶＲの抗原接触残基以外であってもよい。上記の変異形ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０２５９】
突然変異生成のための標的とされ得る抗体の残基または領域を特定するための有用な方法の１つは、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載される「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれるものである。この方法において、残基または標的残基の群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）が特定され、かつ中性または負に荷電されたアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）により交換されて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを決定する。さらなる置換が、初回置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の場所に導入されてもよい。代替的に、または追加的に、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされるか、または排除されてもよい。変異形をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定してもよい。
【０２６０】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基〜１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さである、アミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは多数のアミノ酸残基の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異形には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
【０２６１】
ｂ）グリコシル化変異形
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化する。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を変化させることによって、簡便に遂行され得る。
【０２６２】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合した炭水化物を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的に、概してＮ連結によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖類には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖類構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれる。一部の実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある特定の改善された特性を有する抗体変異形を作り出すために行われてもよい。
【０２６３】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠いている炭水化物構造を有する、抗体変異形が提供される。例えば、かかる抗体内のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定した場合に、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖鎖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計と比べた、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異形は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異形に関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１（Ａｄａｍｓら）（特に実施例１１））、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が含まれる。
【０２６４】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖類がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分されたオリゴ糖類を有する抗体変異形がさらに提供される。かかる抗体変異形は、低下したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する、抗体変異形も提供される。かかる抗体変異形は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載される。
【０２６５】
ｃ）Ｆｃ領域変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域変異形を生成してもよい。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０２６６】
ある特定の実施形態において、本発明は、全部ではなく一部のエフェクター機能を保有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不必要または有害である用途に関して望ましい候補となる、抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボの細胞傷害性アッセイを実行して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、抗体が確実に、ＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）がＦｃＲｎ結合能力を保持するように、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて、評価されてもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイをまた行って、抗体がＣ１ｑに結合不可能であり、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビトロクリアランス／半減期決定もまた、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ′ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０２６７】
低下したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上における置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。
【０２６８】
ＦｃＲへの結合が改善または減少した、ある特定の抗体変異形が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）
【０２６９】
ある特定の実施形態において、抗体変異形は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）における置換を有する、Ｆｃ領域を含む。
【０２７０】
一部の実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（改善または減少のいずれか）をもたらす変化が、Ｆｃ領域においてなされる。
【０２７１】
母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する、半減期が増加しかつ新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異形には、Ｆｃ領域残基２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。ＦｃＲｎ結合ドメイン突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）は、ＦｃＲｎ結合を増加させ、故に抗体の半減期を増加させることが記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号及びＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２３５２４（２００６）を参照されたい。追加的に、ＦｃＲｎ結合ドメイン突然変異Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ（ＡＩ）もまた、ＦｃＲｎ結合を増加させることが記載されている。Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：７６６３−７６７１（２００９）も参照されたい。また、Ｆｃ領域変異形の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０２７２】
ｄ）システイン操作された抗体変異形
ある特定の実施形態において、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオマブ（ｔｈｉｏＭＡｂ）」を作り出すことが望ましい場合がある。具体的な実施形態において、置換残基は、抗体の接触しやすい部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の接触しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分またはリンカー−薬物部分等の他の部分に抗体を複合して、本明細書にさらに記載される免疫複合体を作り出してもよい。ある特定の実施形態において、次の残基のうちのいずれか１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成してもよい。
【０２７３】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性があるため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても非分岐であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は、様々であってもよく、１つを超えるポリマーが結合される場合、それらは、同じ分子であっても、または異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善対象の抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法において使用されるかどうか等を含むが、これらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
【０２７４】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい、抗体と非タンパク質性部分との複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってよく、これには、一般の細胞を害さないが、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７５】
Ｅ．組み換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換え法及び組成物を使用して産生されてもよい。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのかかる実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の作製方法が提供され、この方法は、上記のように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【０２７６】
抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の組み換え産生のために、例えば、上述のもの等の、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能である、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２７７】
抗体コードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌内で産生されてもよい。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について説明するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分において細菌細胞ペーストから単離されてもよく、またさらに精製されてもよい。
【０２７８】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【０２７９】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入のために使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２８０】
植物細胞培養物を、宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について説明している）を参照されたい。
【０２８１】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０）を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０２８２】
Ｆ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され、スクリーニングされ、または特徴付けられてもよい。
【０２８３】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ等の既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
【０２８４】
別の態様において、競合アッセイを使用して、Ｂｓｇに結合するために、本明細書に開示される抗ベイシジン抗体（例えば、抗ＢｓｇＡｃ、抗ＢｓｇＢ、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥ）と競合する抗体を特定することができる。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＡと競合する。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＢと競合する。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＣと競合する。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＤと競合する。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＣ及び抗ＢｓｇＤと競合する。一部の実施形態において、本開示による抗体は、抗ＢｓｇＥと競合する。
【０２８５】
ある特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本明細書に開示される抗ＢｓｇＡ、抗ＢｓｇＢ、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥのうちの１つによって結合される同じエピトープ（例えば、直鎖または立体構造エピトープ）に結合する。
【０２８６】
別の態様において、競合アッセイを使用して、Ｇｌｕｔ１に結合するために、本明細書に開示される抗Ｇｌｕｔ１抗体（例えば、配列番号８１の軽鎖可変領域配列及び配列番号８２の重鎖可変領域配列を有する抗Ｇｌｕｔ１抗体）と競合する抗体を特定することができる。
【０２８７】
ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に開示されるＧｌｕｔ１抗体（例えば、配列番号８１の軽鎖可変領域配列及び配列番号８２の重鎖可変領域配列を有する抗Ｇｌｕｔ１抗体）によって結合される同じエピトープ（例えば、直鎖または立体構造エピトープ）に結合する。
【０２８８】
抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）″Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，″ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供される。
【０２８９】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＢｓｇを、Ｂｓｇ（例えば、本明細書に開示される抗ＢｓｇＡ、抗ＢｓｇＢ、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥのうちのいずれか）に結合する第１の標識抗体、及びＢｓｇに結合するために第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＢｓｇを、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の、Ｂｓｇへの結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたＢｓｇに関連する標識の量を測定する。固定化されたＢｓｇに関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低下した場合、それは、第２の抗体がＢｓｇへの結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０２９０】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＧｌｕｔ１を、本明細書におけるＧｌｕｔ１（例えば、配列番号８１の軽鎖可変領域配列及び配列番号８２の重鎖可変領域配列を有する抗Ｇｌｕｔ１抗体）に結合する第１の標識抗体、及びＧｌｕｔ１に結合ために第１の抗体と競合する抗体の能力について試験されている第２の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＧｌｕｔ１を、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の、Ｇｌｕｔ１への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたＧｌｕｔ１に関連する標識の量を測定する。固定化されたＧｌｕｔ１に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低下した場合、それは、第２の抗体がＧｌｕｔ１への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０２９１】
２．活性アッセイ
一態様において、生物活性を有する抗ＣＤ９８ｈｃ抗体を特定するためのアッセイが提供される。一態様において、生物活性を有する抗Ｂｓｇ抗体を特定するためのアッセイが提供される。一態様において、生物活性を有する抗Ｇｌｕｔ１抗体を特定するためのアッセイが提供される。
【０２９２】
ＣＤ９８ｈｃ活性アッセイ
生物活性には、例えば、ＣＤ９８ｈｃのアミノ酸輸送が含まれ得る。インビボ及び／またはインビトロでかかる生物活性を有する抗体も提供される。
【０２９３】
ある特定の実施形態において、本発明に開示される抗体は、かかる生物活性に関して試験され得る。
【０２９４】
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法に従う使用のための抗体（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体を使用する）は、細胞増殖または分裂を阻害しない。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法に従う使用のための抗体（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体）は、細胞接着を阻害しない。細胞増殖、細胞分裂、アポトーシス、及び細胞接着に対するＣＤ９８ｈｃ結合抗体の効果を測定するためのアッセイは、例として、制限なく、米国特許出願公開第２０１３／００５２１９７号に記載される方法に従って行うことができる。Ｙａｇｉｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：１４７８−１４８４、及びＷａｒｒｅｎ  Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：３６７６−３６８７も参照されたい。当該技術分野において既知の任意の他の好適な方法を使用して、ＣＤ９８ｈｃ結合抗体の活性を試験することもできる。
【０２９５】
一部の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、アミノ酸輸送を阻害しない。ＣＤ９８ｈｃによるアミノ酸輸送（（例えば、ＣＤ９８軽鎖とのヘテロ二量体複合体内（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ、及びＡｓｃ−１））を検出するために使用され得るインビトロアッセイは既知であり、当該技術分野において説明されている。例えば、Ｆｅｎｃｚｉｋ，Ｃ．Ａｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，８７４６−８７５２を参照されたい。ＵＳ２０１３／００５２１９７も参照されたい。
【０２９６】
特定の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の存在下における、ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体の天然リガンドのうちのいずれかの、血液脳関門を越えるアミノ酸輸送の動態が、抗体の非存在下における輸送動態の少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）であり、抗体の非存在下における動態は、
グルタミンの場合（ＮａＣｌの存在下）、ＫＭ＝２９５μＭ、
ロイシンの場合（ＮａＣｌの存在下）、ＫＭ＝２３６μＭ、
アルギニンの場合（ＮａＣｌの存在下）、ＫＭ＝１２０μＭ、
アルギニンの場合（ＮａＣｌの非存在下）、ＫＭ＝１３８μＭのうちの１つである。
【０２９７】
ＣＤ９８アミノ酸交換輸送体のアミノ酸輸送動態は、例えば、Ｂｒｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０００  Ａｕｇ  １；３４９  Ｐｔ  ３：７８７−９５によって記載されるアッセイにおいて測定され得る。
【０２９８】
一態様において、生物活性を有する抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。別の態様において、生物活性を有する抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。別の態様において、生物活性を有する抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ＢＡＣＥ１アスパルチルプロテアーゼ活性の阻害が含まれ得る。例えば、同種時間分解蛍光法ＨＴＲＦアッセイもしくは合成基質ペプチドを使用する微少流体キャピラリ電気泳動（ＭＣＥ）アッセイによって、またはＡＰＰ等のＢＡＣＥ１基質を発現する細胞株内でインビボで評価した場合に、インビボ及び／またはインビトロでかかる生物活性を有する抗体も提供される。
【０２９９】
別の態様において、本明細書に開示される抗体（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、またはＧｌｕｔ１抗体）の脳取り込みを測定するためのアッセイが提供される。かかるアッセイは、例えば、以下の実施例に記載される。
【０３００】
別の態様において、脳及び血漿中のアミロイドベータを測定するためのアッセイが提供され、脳アミロイドベータの増加または低下、及び血漿アミロイドベータの増加または低下を決定するためのアッセイを含む。かかるアッセイは、本明細書において、例えば、以下の実施例に記載される。
【０３０１】
例として、本明細書に開示される抗体は、造影剤に複合されてもよい。抗体複合体の投与に続いて、例えば、単離された脳組織内で、及び／またはインビボ脳撮像技法を使用して（例えば、生物発光もしくは蛍光を使用して）造影剤が検出され得る（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ．２００８；２２（３）：２８５−３０７を参照されたい）。
【０３０２】
３．親和性アッセイ
ある特定の態様において、本発明は、薬剤（例えば、神経障害薬または造影剤）を、血液脳関門を越えて輸送するために有用な抗体の作製方法を提供し、約５ｎＭ〜、または約２０ｎＭ〜、または約１００ｎＭ〜、約１０μＭまで、または約１μＭまで、または約５００ｍＭまでの範囲内である、ＢＢＢ−Ｒへの親和性を有するという理由で、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の一団から抗体を選択することを含む。故に、親和性は、例えば、スキャチャード解析またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定した場合に、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内、または約２０ｎＭ〜約１μＭの範囲内、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲内であり得る。当業者には理解されることになるように、異種性分子／化合物を抗体に複合することは、例えば、抗体が、その抗体の元の標的とは異なる抗原に結合する１つ以上のアームにより多重特異的になる場合、立体障害またはさらには１つの結合アームの排除に起因して、抗体の、その標的への親和性を減少させ得る。一実施形態において、ＢＡＣＥ１に複合されたＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１に特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定した場合に、ＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１に対して約３０ｎＭのＫｄを有する。別の実施形態において、ＢＡＣＥ１に複合されたＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１に特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定した場合に、ＣＤ９８ｈｃ、ベイシジン、またはＧｌｕｔ１に対して約６００ｎＭのＫｄを有する。
【０３０３】
抗体親和性を評価するための１つの例示的なアッセイは、スキャチャード解析によるものである。例えば、目的の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を、ラクトペルオキシダーゼ法を使用してヨウ素化することができる（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｒｕｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２８８  ｐｇ．１３４−１４８（１９９７））。放射標識抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を、ＮＡＰ−５カラムを使用するゲル濾過によって遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製し、その特異的活性を測定する。一定濃度のヨウ素化抗体及び減少した濃度の連続希釈された非標識抗体を含有する５０μＬの競合反応混合物を、９６ウェルプレートに入れる。ＢＢＢ−Ｒを一時的に発現する細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１×ペニシリン−ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からなる成長培地において、５％  ＣＯ２中３７℃で培養する。Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して細胞を皿から分離し、結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、及び０．２％アジ化ナトリウムを有するＤＭＥＭ）で洗浄する。洗浄した細胞を、０．２ｍＬの結合緩衝液中におよそ２００，０００個の細胞の密度で、５０μＬ競合反応混合物を含有する９６ウェルプレートに付加する。細胞との競合反応における非標識抗体の最終濃度は異なり、１０００ｎＭで開始し、次いで１０濃度に対して１：２倍希釈により減少し、ゼロ付加、緩衝液のみの試料を含む。各濃度の非標識抗体に対する細胞との競合反応物を、３回測定する。細胞との競合反応物を、室温で２時間インキュベートする。２時間のインキュベーション後に、競合反応物をフィルタープレートに移し、結合緩衝液で４回洗浄して、結合していない（ｆｒｅｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｕｎｄ）ヨウ素化抗体を分離する。ガンマ計数器によってフィルターを計数し、Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ（１９８０）の適合アルゴリズムを使用して結合データを評価し、抗体の結合親和性を決定する。
【０３０４】
別の実施形態に従い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００デバイス（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用し、２５℃で抗ヒトＦｃキット（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、Ｋｄを測定する。簡潔に述べると、供給業者の指示に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性化する。抗ヒトＦｃ抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で５０μｇ／ｍＬまで希釈した後、およそ１００００応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成するように、５μＬ／分の流量で注入する。抗体の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基を遮断する。動態測定の場合、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体変異形をＨＢＳ−Ｐに注入して、約２２０ＲＵに到達させた後、ＢＢＢ−Ｒ−Ｈｉｓの２倍連続希釈（０．６１ｎＭ〜１５７ｎＭ）を、２５℃で、およそ３０μＬ／分の流量でＨＢＳ−Ｐに注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９））を参照されたい。
【０３０５】
ＢＢＢ−Ｒに対する１つ以上の抗体の親和性についての代替測定は、その最大半減阻害濃度（ＩＣ５０）、既知のＢＢＢ−Ｒリガンドの、ＢＢＢ−Ｒへの結合を５０％阻害するために、どれだけの抗体が必要とされるかの尺度である。所与の化合物に対するＩＣ５０を決定するいくつかの方法は、当該技術分野において既知であり、一般的なアプローチは、競合結合アッセイを行うことである。一般に、高いＩＣ５０は、より多くの抗体が既知のリガンドの結合を阻害するために必要であること、故にそのリガンドに対する抗体の親和性が比較的低いことを示す。逆に、低いＩＣ５０は、より少ない抗体が既知のリガンドの結合を阻害するために必要であること、故にそのリガンドに対する抗体の親和性が比較的高いことを示す。
【０３０６】
ＩＣ５０を測定するための例示的な競合ＥＬＩＳＡアッセイは、増加濃度の抗ＣＤ９８ｈｃまたは抗ＣＤ９８ｈｃ／脳抗原（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥｌ、抗ＣＤ９８ｈｃ／Ａｂｅｔａ等）変異形抗体を使用して、ＣＤ９８ｈｃに結合するために、ビオチニル化抗ＣＤ９８ｈｃ抗体に対して競合するものである。抗ＣＤ９８ｈｃ競合ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍＬの精製されたマウスＣＤ９８ｈｃ細胞外ドメインにより４℃で終夜コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ，Ｎ．Ｊ．）内で行う。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％＞Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ遮断緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）を使用して遮断する。各個々の抗ＣＤ９８ｈｃまたは抗ＣＤ９８ｈｃ／脳抗原（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥｌもしくは抗ＣＤ９８ｈｃ／Ａｂｅｔａ）の滴定（１：３連続希釈）を、ビオチニル化抗ＣＤ９８ｈｃ（０．５ｎＭ最終濃度）と複合し、室温で１時間プレートに付加することができる。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）をプレートに付加して、室温で１時間インキュベートする。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートに結合されたビオチニル化抗ＣＤ９８ｈｃを、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用して検出する。同種のアッセイを、例えば、抗Ｇｌｕｔ１及び抗ベイシジン抗体について行うことができる。
【０３０７】
Ｇ．免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合された、本明細書における抗ＣＤ９８ｈｃ抗体、または抗Ｂｓｇ抗体、または抗Ｇｌｕｔ１抗体を含む、免疫複合体を提供する。
【０３０８】
一実施形態において、本明細書における抗体は、薬物、化学療法剤、及び／または造影剤を、ＢＢＢを越えてより効率的に輸送するために、神経障害薬、化学療法剤、及び／または造影剤とカップリングされる。
【０３０９】
共有結合は、直接またはリンカーを介してのいずれかであり得る。ある特定の実施形態において、直接複合は、タンパク質融合の構成によるものである（例えば、抗体をコードする２つの遺伝子の遺伝的融合による、例えば、単一タンパク質としての神経障害薬及び発現）。ある特定の実施形態において、直接複合は、抗体の２つの部分のうちの１つの反応基と、例えば、神経薬上の対応する基または受容体との間の共有結合の形成によるものである。ある特定の実施形態において、直接複合は、適切な条件下で複合される他の分子への共有結合を形成する反応基（非限定例として、スルフヒドリル基またはカルボキシル基）を含めるように複合される２つの分子のうちの１つの修飾（例えば、遺伝子修飾）によるものである。１つの非限定例として、所望の反応基（例えば、システイン残基）を持つ分子（例えば、アミノ酸）は、例えば、抗体に導入されてもよく、ジスルフィド結合が神経薬により形成される。タンパク質への核酸の共有結合方法もまた、当該技術分野において既知である（例えば、光架橋、例えば、Ｚａｔｓｅｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７４：７７−９５（２００５）を参照されたい）。
【０３１０】
非共有結合は、当業者によって容易に理解されることになるように、疎水性結合、イオン結合、静電相互作用等を含む任意の非共有結合手段によるものであり得る
【０３１１】
複合は、多様なリンカーを使用して行われてもよい。例えば、抗体及び細胞傷害性薬は、多様な二官能性タンパク質結合剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＩ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して複合されてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合させるための、例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。ペプチド結合により接合された１〜２０個のアミノ酸で構成されるペプチドリンカーを使用してもよい。ある特定のかかる実施形態において、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。ある特定のかかる実施形態において、これらのアミノ酸のうちの１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時に神経薬の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用されてもよい。
【０３１２】
本明細書における発明は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬（これらは、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）商業的に入手可能である）を用いて調製された複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
【０３１３】
一実施形態において、免疫複合体は、抗体が１つ以上の薬物に複合された抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、この薬物としては、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦを含むオーリスタチン（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン：カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）、ならびにＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３１４】
別の実施形態において、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含むがこれらに限定されない酵素活性毒素またはその断片に複合された、本明細書に記載される抗体を含む。
【０３１５】
別の実施形態において、免疫複合体は、放射性原子に複合されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。多様な放射性同位体が、放射性複合体の産生のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体が検出のために使用されるとき、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含んでもよい。
【０３１６】
Ｈ．検出方法及び組成物
一部の態様において、血液脳関門上のＣＤ９８ｈｃの検出方法が提供される。故に、一部の態様において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、抗体が、治療剤を、ＣＤ９８ｈｃを標的とする際に検出剤として有用であるように、十分な親和性を持つＣＤ９８ｈｃに結合する。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、生体試料中のＣＤ９８ｈｃの存在の検出に有用である。ある特定の態様において、本明細書に提供される抗Ｂｓｇ抗体のいずれも、生体試料中のＢｓｇの存在の検出に有用である。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｇｌｕｔ１抗体のいずれも、生体試料中のＧｌｕｔ１の存在の検出に有用である。本明細書に使用される「検出する」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態において、生体試料は、脳細胞等の細胞または組織、例えば、脳毛細血管内皮細胞を含む。
【０３１７】
一実施形態において、検出方法における使用のための抗ＣＤ９８ｈｃ抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＣＤ９８ｈｃの存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、この方法は、生体試料と本明細書に記載される抗ＣＤ９８ｈｃ抗体とを、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体のＣＤ９８ｈｃへの結合を許容する条件下で接触させること、及び抗ＣＤ９８ｈｃ抗体とＣＤ９８ｈｃとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。
【０３１８】
一実施形態において、検出方法における使用のための抗Ｂｓｇ抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＢｓｇの存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、この方法は、生体試料と本明細書に記載される抗Ｂｓｇ抗体とを、抗Ｂｓｇ抗体のＢｓｇへの結合を許容する条件下で接触させること、及び抗Ｂｓｇ抗体とＢｓｇとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。かかる方法は、インビトロ法またはインビボ法であり得る。
【０３１９】
一実施形態において、検出方法における使用のための抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＧｌｕｔ１の存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、この方法は、生体試料と本明細書に記載される抗Ｇｌｕｔ１抗体とを、抗Ｇｌｕｔ１抗体のＧｌｕｔ１への結合を許容する条件下で接触させること、及び抗Ｇｌｕｔ１抗体とＧｌｕｔ１との間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。かかる方法は、インビトロ法またはインビボ法であり得る。
【０３２０】
一実施形態において、インタクトな抗体は、エフェクター機能を欠いている。別の実施形態において、インタクトな抗体は、低下したエフェクター機能を有する。別の実施形態において、インタクトな抗体は、低下したエフェクター機能を有するように操作される。一態様において、抗体は、Ｆａｂである。別の態様において、抗体は、エフェクター機能を低下または排除する１つ以上のＦｃ突然変異を有する。別の態様において、抗体は、例えば、正常なヒトグリコシル化酵素を欠いている系における抗体の産生に起因する、修飾されたグリコシル化を有する。別の態様において、Ｉｇ骨格は、制限されたエフェクター機能を天然に保有するか、またはエフェクター機能を保有しないものに修飾される。
【０３２１】
抗体のＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、及び／またはＧｌｕｔ１への結合を決定するために、様々な技法が利用可能である。かかるアッセイの１つは、ヒトＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、及び／またはＧｌｕｔ１に結合する能力を確認するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイに従い、抗原（例えば、組み換えＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、またはＧｌｕｔ１）でコーティングされたプレートを、抗体を含む試料でインキュベートし、抗体の、目的の抗原への結合が決定される。
【０３２２】
全身投与された抗体の取り込み、及び抗体の他の生物活性を評価するためのアッセイは、実施例に開示されるように、目的の抗ＣＮＳ抗原抗体に関して知られているように行うことができる。
【０３２３】
一態様において、生物活性を有する抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。別の態様において、生物活性を有する抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。別の態様において、生物活性を有する抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１多重特異性抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ＢＡＣＥ１アスパルチルプロテアーゼ活性の阻害が含まれ得る。例えば、同種時間分解蛍光法ＨＴＲＦアッセイもしくは合成基質ペプチドを使用する微少流体キャピラリ電気泳動（ＭＣＥ）アッセイによって、またはＡＰＰ等のＢＡＣＥ１基質を発現する細胞株内でインビボで評価した場合に、インビボ及び／またはインビトロでかかる生物活性を有する抗体も提供される。
【０３２４】
別の態様において、本明細書に開示される抗体（例えば、抗ＣＤ９８ｈｃ、Ｂｓｇ、またはＧｌｕｔ１抗体）の脳取り込みを測定するためのアッセイが提供される。かかるアッセイは、以下の実施例に記載される。
【０３２５】
ある特定の実施形態において、標識された抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、本明細書に開示される方法で使用され得る。ある特定の実施形態において、標識された抗Ｂｓｇ抗体が提供される。ある特定の実施形態において、標識された抗Ｇｌｕｔ１抗体が提供される。標識には、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素またはリガンド等の部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体等のフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングされた、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等の複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離ラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２６】
Ｉ．薬学的製剤
さらなる態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載の治療方法のうちのいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体のうちのいずれかを含む、薬学的製剤を提供する。一実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体（例えば、本明細書に開示される治療方法において使用するための）とを含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体と、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗Ｂｓｇまたは抗Ｇｌｕｔ１抗体と、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０３２７】
本明細書に記載される抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｇｌｕｔ１、または抗Ｂｓｇ抗体（例えば、多重特異性抗体または抗体複合体）の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するかかる抗体と、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、一般に、用いられる投薬量及び濃度で、レシピエントに対して非傷害性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム等、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免役グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート薬剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わされる。
【０３２８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
【０３２９】
本明細書における製剤はまた、必要に応じて、治療されている特定の適応症に対する１つを超える活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する成分を含有してもよい。例えば、ニューロパシー障害、神経変性疾患、癌、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルスもしくは微生物病、虚血、行動障害、またはＣＮＳ炎症を治療するための１つ以上の活性成分をさらに提供することが望ましい場合がある。例示的なかかる医薬品は、本明細書において以下に考察される。かかる活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在することが好適である。
【０３３０】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製される、マイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）中またはマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に封入されてもよい。かかる技法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。１つ以上の活性成分は、本明細書に記載される抗体にカップリングされたリポソームに被包され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）。
【０３３１】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリクスは、成形品、例えばフイルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリクスの非限定例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０３３２】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、一般に滅菌されている。無菌状態は、例えば、無菌濾過膜を介する濾過によって、容易に達成され得る。
【０３３３】
Ｊ．製品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品には、容器と、容器の上または容器に関連するラベルまたは添付文書とが含まれる。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等、様々な材料から形成されていてもよい。容器は、ある組成物を、それ自体、または状態を治療、予防、及び／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、また滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、選定された病態を治療するために組成物が使用されることを示す。さらに、本製品は、（ａ）組成物が中に含有された第１の容器（この組成物は本発明の抗体を含む）、及び（ｂ）組成物が中に含有された第２の容器（この組成物はさらなる細胞傷害性剤または治療剤を含む）を含んでもよい。本発明のこの実施形態の製品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に、または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸干渉食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を備える第２（または第３）の容器をさらに備えてもよい。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的立場及びユーザの立場から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
【０３３４】
上述の製品のいずれも、抗ＣＤ９８ｈｃ、抗Ｂｓｇ、または抗Ｇｌｕｔ１抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。
【０３３５】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供される一般的説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３３６】
Ａ．材料及び方法
以下の実施例において使用される材料及び方法は、以下に記載される。
【０３３７】
１．抗体生成
Ｌｒｐ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＨｉｓ標識組み換えタンパク質として発現された。Ｈｉｓタグ付きＣＤ３２０  ＥＣＤ及びＣＤ９８ｈｃ  ＥＣＤは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現され、マウスベイシジン（ｍＢｓｇ）のＥＣＤは、ＣＨＯ細胞内でマウスＦｃ標識タンパク質として発現された。次いで、全てのこれらの組み換えタンパク質を、ニッケルまたはタンパク質Ａカラム上で精製した。組み換えＬｒｐ８及びＩｎｓＲは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）から購入した（（それぞれ、カタログ番号３５２０−ＡＲ−０５０及び番号１５４４−ＩＲ−０５０）。また組み換えＬｄｌｒａｄ３は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＬＬＣ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）から購入した（カタログ番号Ｈ００１４３４５８−Ｐ０１）。抗Ｌｒｐ１、抗ＩｎｓＲ、抗Ｌｒｐ８、及び抗Ｌｄｌｒａｄ３抗体は、ナイーブファージライブラリ分類法（下記）を通じて生成した。抗ＣＤ３２０、抗Ｂｓｇ、及び抗ＣＤ９８ｈｃ抗体を、対応するタンパク質のマウス細胞外ドメインを使用して生成し、標準プロトコルを使用してマウス、ラット、またはハムスターに免疫付与した。抗Ｇｌｕｔ１抗体は、全長Ｇｌｕｔに対するプラスミドコーディングを使用し、マウスのＤＮＡ免疫付与によって生成した。精製されたハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡによって抗原結合について、及びフローサイトメトリーによってＨＥＫ細胞上で一時的に発現された抗原の認識についてスクリーニングした。全ての抗体を、全研究に対してヒトＦｃを含有するキメラとして再フォーマットした。親和性を図９に列挙する。抗Ｂｓｇ抗体Ａ〜Ｅを実施例に記載する。
【０３３８】
２．ナイーブファージライブラリ分類
１０μｇ／ｍＬの組み換え抗原を、ＮＵＮＣ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート上で終夜コーティングし、ＰＢＳＴ［ＰＢＳ及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０］で事前遮断した。ＰＢＳＴで事前遮断された天然合成多様性ファージ抗体ライブラリ（Ｃ．Ｖ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，１０７３−１０９３（２００４）、及びＷ．Ｃ．Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６６，８１５−８２９（２００７）を参照されたい）を、後次にプレートに付加し、室温で終夜インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、結合されたファージを、５０ｍＭ  ＨＣｌ及び５００ｍＭ  ＮａＣｌで３０分間溶出し、１Ｍのトリス塩基で中和した。回収されたファージ粒子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）内で増殖させた。後次のセレクションラウンド中に、インキュベーション時間を２〜３時間に低下し、洗浄の厳重度を徐々に増加させた。抗原に特異的に結合する固有のファージ抗体を選定し、個々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域を、それぞれＬＰＧ３及びＬＰＧ４ベクターにクローニングすることによって全長ＩｇＧに再フォーマットして、哺乳動物ＣＨＯ細胞内で一時的に発現させた。
【０３３９】
３．ＲＭＴ標的に対する抗体の開発
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、ルイスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、またはアルメニアンハムスター（Ｃｙｔｏｇｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｒｏｘｂｕｒｙ，ＭＡ）に対して、精製された抗原細胞外ドメイン、またはＧｌｕｔ１の場合は、ヒト抗原をコードするＤＮＡにより、足蹠または腹腔内を介して、３〜４日間隔で、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ）または全長抗原をコードするプラスミドＤＮＡ中、リンガー液中に希釈されたＧＭ−ＣＳＦの存在下において、流体力学的微静脈送達（ＨＴＶ）、週１回注入を介して免疫付与した。６〜１２回の注入に続いて、一時的に形質移入された２９３個の細胞に結合する直接ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって免疫血清滴定を評価した。ＦＡＣＳ結合を示す動物から得た脾臓細胞及び／またはリンパ球を、マウスミエローマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標）），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）と、電気融合（Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）によって融合した。１０〜１４日後に、ハイブリドーマ上清を採取し、直接ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによってＩｇＧ分泌についてスクリーニングした。ＦＡＣＳ結合を示す最終ハイブリドーマクローンを、ヒトＩｇＧ１またはエフェクターのないカッパ骨格に再フォーマットした。再フォーマットした抗体を発現させ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する親和性クロマトグラフィーによって上清を精製し、５０ｍＭリン酸（ｐＨ３．０）＋２０倍ＰＢＳ（ｐＨ１１）中に溶出して４℃で保管する。
【０３４０】
４．フローサイトメトリー解析
精製された抗体を、対応する抗原で形質移入された２９３個の細胞上でスクリーニングした。細胞をフラスコ／皿から収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０７７，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に、１ウェル当たり１，０００，０００個の細胞を付加した。試料を細胞に付加し（１００μＬ／ウェル）４℃で３０〜６０分間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し（１２００ｒｐｍ、５分、４℃）、ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。Ｒ−フィコエリトリン複合Ｚｉｅｇｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）；１０９−１１６−０９８；ＰＢＳ中に希釈した１００μＬ）を、次いで付加し、プレートを４℃で（コーティングして）３０分間インキュベートした。最終洗浄後、１％ホルマリンを含有するＰＢＳ中で細胞を固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して読み取った。次いで、各試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して測定した。
【０３４１】
５．競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ  ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートを、抗原（２μｇ／ｍＬ）で終夜４℃でコーティングし、遮断緩衝液ＰＢＳＴにより室温で１時間遮断した。二価または二重特異性抗体の連続希釈を、後次に、亜飽和濃度のビオチニル化二重特異性抗体と共に、室温で１時間にわたってプレートに付加した。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ストレプトアビジンで３０分間インキュベートして、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で現像した。吸光度を、６５０ｎｍで分光光度的に測定した。
【０３４２】
６．放射標識微量投薬
放射ヨウ素標識研究において使用される全ての抗体を、前述の通り（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７（５）：１５４８−５６）、間接的ヨードゲン付加法を使用して、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）で放射ヨウ素標識した。放射標識したタンパク質を、ＰＢＳ中で前平衡されたＮＡＰ５（商標）カラムを使用して精製した。それらは、サイズ排除ＨＰＬＣによってインタクトであることが示された。
【０３４３】
７．Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにおけるインビボ体内分布
全てのインビボプロトコル、ハウジング、及び麻酔は、国際実験動物ケア評価認証協会の規定に従い、施設内動物実験委員会によって承認された。約６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１７〜２２ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から入手した。それらに５μＣｉの放射ヨウ素標識抗体を、ＩＶボーラスを介して投与した。投薬後１時間、４時間、２４時間、及び４８時間において、血液（血漿のために処理した）、脳、肝臓、肺、脾臓、骨髄、及び筋肉（腓腹筋）を収集し（ｎ＝３／抗体）、ガンマ計数器（２４８０  Ｗｉｚａｒｄ２（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で総放射活性について解析されるまで冷凍保存した。各試料中の放射活性レベルを計算し、試料１グラムまたは１ミリリットル当たりの注入用量のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／ｇまたは％ＩＤ／ｍＬ）。％ＩＤ／ｇ−時間データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（バージョン６．０５）を使用してプロットし、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。ＡＵＣ推定値の標準偏差（ＳＤ）を、Ｂａｉｌｅｒによって記載される方法を使用して計算した（Ｂａｉｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１９８８；１６（３）：３０３−３０９）。
【０３４４】
８．免疫組織化学
野生型マウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗体を静脈内注射し、続いて投与後１時間、ＰＢＳ灌流させた。脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＨＡ）中に終夜４℃で、続いて３０％スクロース中に終夜４℃で下垂固定した。脳組織試料を、滑走式ミクロトーム上で３５μｍ厚に切片化し、５％  ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ中で１〜３時間遮断し、１％  ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ中の１：２００  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒト二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で２時間、室温でインキュベートした。載置したスライドを、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）によって後次に解析した。
【０３４５】
９．脳及び血漿中の抗体濃度及びマウスＡβｘ−４０の測定
動物の管理は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＩＡＣＵＣガイドラインに従った。治療投薬研究において使用された全てのマウスは、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスであった。マウスに、抗体を静脈内注入し、注入後の指示された時間に取り除いた。ＰＢＳでの灌流前に、全血をｐｌａｓｍａ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に収集し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿させた。該当する場合、抗体及びマウスＡβｘ−４０測定のために血漿上清を単離した。脳を抽出し、組織を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有するＰＢＳ中の１％  ＮＰ−４０（Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中で均質化した。均質化した脳試料を、４℃で１時間スピンした後、１４０００ｒｐｍで２０分間スピンした。上清を、脳抗体測定のために単離した。ＰＫ／ＰＤ研究の場合、Ａβｘ−４０測定のために１つの半脳を単離し、５Ｍグアニジン塩酸緩衝液中で均質化した。試料を３時間室温で回転させた後、新たに付加されたアプロチニン（２０μｇ／ｍＬ）及びロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ中の０．２５％カゼイン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で希釈した（１：１０）。希釈したホモジネートを１４０００ｒｐｍで２０分間スピンし、マウスＡβｘ−４０測定のために上清を単離した。
【０３４６】
１０．ＰＫアッセイ
マウス血清及び脳試料中の抗体濃度を、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＮＵＮＣ  ３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫プレート（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）を、ロバ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ′）２断片、Ｆｃ断片特異性ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でコーティングした。プレートを遮断した後、各抗体を標準として使用し、それぞれの抗体濃度を定量化した。標準及び試料を、プレート上で２時間、室温で軽度の撹拌によりインキュベートした。結合された抗体を、ＨＲＰ複合Ｆ（ａｂ′）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異性ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）で検出した。４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して、標準曲線から濃度を決定した。このアッセイは、血清中で３．１２ｎｇ／ｍＬ及び脳内で１．５６ｎｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）値を有していた。抗ＣＤ９８ｈｃ脳試料の場合、マウス血清及び脳試料中の抗体濃度は、ＧＹＲＯＳプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ  Ａｂ，Ｓｗｅｄｅｎ）上でＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｇｙｒｏｓビーズを、ロバ抗ヒトＩｇＧのビオチン複合Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｆｃ断片特異性ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）で最初にコーティングした。各抗体を標準として使用し、それぞれの抗体濃度を定量化した。標準及び試料を、製造業者が提案したプロトコルに従い、ビーズ上で室温でインキュベートした。結合された抗体を、Ａｌｅｘａ  ６４７複合Ｆ（ａｂ′）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異性ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して、標準曲線から濃度を決定した。このアッセイは、血清中で５ｎｇ／ｍＬ及び脳内で５ｎｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）値を有していた。
【０３４７】
１１．ＰＤアッセイ
マウスニューロン培養上清、血漿、及び脳試料中のＡβｘ−４０濃度を、上記のＰＫ解析方法と同様のＥＬＩＳＡを使用して測定した。簡潔に述べると、Ａβ４０のＣ末端に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、プレートの上にコーティングし、ビオチニル化抗マウスＡβモノクローナル抗体Ｍ３．２（Ｃｏｖａｎｃｅ（登録商標）、Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を検出に使用した。アッセイは、血漿中で１．９６ｐｇ／ｍＬ、脳中で３９．１ｐｇ／ｇのＬＬＯＱ値を有していた。
【０３４８】
１２．一次マウス脳内皮細胞の単離
脳内皮細胞（ＢＥＣ、ＣＤ３１＋／ＣＤ４５−）を、ＦＡＣＳによって４０匹の成体雌Ｃ５７Ｂｌ６マウス（６〜８週齢）から単離した。負に分類された集団（ＣＤ３１−／ＣＤ４５−）を、比較のために平行して収集した。総じて、およそ５×１０５個の細胞を分類して、約９２％の純度を持つＢＥＣ集団を獲得した。単離されたＢＥＣ及び負に選択された対照細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下においてＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＢＥＣ溶解物の１０％を銀染色したゲルに、１０％をトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するウェスタンブロットに使用し、残りを単一レーンに負荷して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。ＢＥＣ溶解物に隣接した平行レーンにおいて、負に選択された集団からの約５０００ＣＤ３１＋／ＣＤ４５−及び約４００００ＣＤ３１−／ＣＤ４５−細胞に由来する溶解物を、銀染色、抗ＴｆＲウェスタンブロット、及びクマシー（登録商標）染色それぞれのために流した。
【０３４９】
１３．質量分析
質量分析解析の場合、ＢＥＣ溶解物（ＣＤ３１＋／ＣＤ４５−）及び負の対照（ＣＤ３１−／ＣＤ４５−）溶解物に対応するＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色したゲルレーンを、各々上から下へと１５切片に切断した。各ゲルレーンを、本質的に、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ３４（３６）：１１９２９−１１９４７、及びＰｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０（５）：Ｍ１１０に記載されるように、標準方法を使用してゲル内トリプシン消化に供した。ゲルスライスを、１ｍｍ立方体に刻み、１０倍ゲル量の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０％アセトニトリル（ｐＨ８．０）、次いで１０倍ゲル量の１００％  ＡＣＮによる各々１５分間の連続洗浄によって脱染した。ゲル内還元及びアルキル化を、それぞれ２５ｍＭのジチオトレイトール／１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（３０分、５０℃）、及び５０ｍＭのヨードアセトアミド／１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（２０分、暗所で室温）により行った。後次にゲル断片を洗浄し、追加の１０倍ゲル量の１００％アセトニトリルで脱水した。トリプシン溶液を、５％アセトニトリルを含む５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中、１０ｎｇ／μＬトリプシンの濃度で調製し、氷上のゲル断片に付加した。ゲル断片をトリプシン溶液に１時間氷上で浸し、ゲル内消化を終夜３７℃で行った。消化されたペプチドを収集し、ゲル断片を追加の時間に５０％アセトニトリル／５％ギ酸で抽出した。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）内で完了まで乾燥させた後、解析のために３％アセトニトリル／５％ギ酸中に再懸濁した。
【０３５０】
ペプチドを、１．５μＬ／分の流量で１０分間、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、１．７μＭのＢＥＨ−１３０樹脂（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）で充填された０．１ｍｍ×１００ｃｍのＣ１８カラムの上に注入した。２段階線形勾配を使用して、ペプチドを分離し、溶媒Ｂ（９８％アセトニトリル／２％水／０．１％ギ酸）は、２０分間にわたって５％から２５％に、次いで２分間にわたって２５％から５０％に上昇した。緩衝液Ａは、９８％水／２％アセトニトリル／０．１％ギ酸で構成された。ペプチドを、ＡＤＶＡＮＣＥキャプティブスプレーイオン化ソース（Ｍｉｃｒｏｍ−Ｂｒｕｋｅｒ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＶｅｌｏｓハイブリッドイオントラップＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に導入した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ｆｕｌｌ−ＭＳ（ＭＳ１）スペクトルを、６０，０００解像度で収集し、それを使用して、上位８つの最も強度の高いイオン上の線形イオントラップ内でデータ依存性ＭＳ２操作を誘起した。ＵｎｉＰｒｏｔからのマウスタンパク質の連結標的−デコイデータベースに対してＭａｓｃｏｔを使用して、ＭＳ２スペクトルを検索した。ペプチドスペクトルマッチを、線形判別解析を使用して５％ペプチド偽発見率（ｐｅｐＦＤＲ）まで、後次に２％タンパク質偽発見率（最終ｐｅｐＦＤＲ＜０．５％）まで連続的に濾過した。ＡＵＣ（曲線下面積）は、前述の通り、上位３つの最も豊富なペプチドヒットの統合強度について、２つの技術的複製の平均を表す（Ａｈｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１７，２５６７−２５７８）。
【０３５１】
１４．インビボでの２光子顕微鏡
２〜４ヶ月齢の混合性別の野生型マウスに、前述の通り、右半球上に頭蓋窓を埋め込み（Ｈｏｌｔｍａａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（８）：１１２８−４４）、術後２週間以降に撮像した。撮像中、セボフルラン（０．７Ｌ／分で２．５〜３％）でマウスに麻酔をかけた。１００μＬのＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＩＶＭ  ６８０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、尾静脈カテーテルを介して注入して血管を可視化し、前抗体画像を２光子顕微鏡によって獲得した。５０ｍｇ／ｋｇのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体を、尾静脈カテーテルを介して注入し、画像を即時（時間０）、ならびに６時間、２４時間、及び４８時間後に獲得した。２光子レーザー走査顕微鏡システム（Ｕｌｔｉｍａ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、約１５ｍＷを、６０×ＮＡ１．１水浸型対物レンズの後焦点面に送達する、８６０ｎｍに調整されたＴｉ：サファイヤレーザー（ＭａｉＴａｉ（登録商標）ＤｅｅｐＳｅｅ（商標）Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）を使用する。レーザーパワーは、各動物の撮像日にわたって一定に保持した。１μｍ  ｚステップサイズの、３５〜６５μｍ体積の５１２×５１２画素解像度スタックを、各領域について収集した。
【０３５２】
１５．バキュロウイルス（ＢＶ）ＥＬＩＳＡ
詳述される方法は、以前に記載されている（Ｉ．Ｈｏｔｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｍＡｂｓ，４：６，７５３−７６０（２０１２）を参照されたい）。簡潔に述べると、精製されたＢＶ粒子を、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標））において、終夜４℃で固定化した。ウェルを、遮断緩衝液（０．５％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で１時間、室温で遮断した。プレートをＰＢＳで洗浄した後、精製された抗体を、遮断緩衝液中で連続希釈し、２５μＬ分量を２回ＥＬＩＳＡウェルに付加して、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に複合された１０ｎｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ、（Ｆｃγ断片特異的）を各ウェルに付加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄した後、ＴＭＢ基質を各ウェルに付加した。１５分後、１Ｍリン酸を各ウェルに付加することによって反応を停止した。吸光度を、４５０ｎｍで測定し、基準を６２０ｎｍとした。各々が非コーティングウェルについて観察された平均シグナルで割ることによって正規化されている、６つの光学密度決定の平均からＢＶスコアを算出した。
【０３５３】
１６．免疫細胞化学
マウスＣＤ９８ｈｃを安定して過剰発現するＩＭＣＤ３細胞を、３８４ウェル光学プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標））に置き、合流後１〜２日間成長させた。抗ＣＤ９８ｈｃ二重特異性抗体により、１μＭで１時間、細胞を処置し、ＰＢＳで洗浄して、４％  ＰＦＡ／４％スクロース／ＰＢＳで５〜１０分間室温（ＲＴ）で固定し、続いて氷冷により２０分間１００％メタノール固定した。細胞を、ＰＢＳ中の１％ロバ血清、２％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により、３０分間室温（ＲＴ）で遮断した。使用した一次抗体は、マウス抗Ｌａｍｐ１（ＢＤ，１：２００）及びヤギ抗ＣＤ９８ｈｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  １：２００）であり、ブロックで希釈し、４℃で終夜インキュベートした。以下の二次抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ロバ抗ヤギＣｙ３、及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
【０３５４】
１７．画像取得及び共局在解析
４０倍ＮＡ１．１水レンズを共焦点モードで用いて、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（商標）ハイコンテンツシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標））上で画像を撮影した。レーザーライン３７５、４８８、５５０、及び６４０を使用した。１ウェル当たり４枚の画像、各画像に１５０〜２００個の細胞を撮影した。１条件当たり５つのウェルを撮像し、故に１処置当たり３０００個超の細胞を解析する。解析のために、画像をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（登録商標）５．１に転送した。解析される各個々のチャネルの場合、ＴｏｐＨａｔ機能を使用して背景を取り除いた後、「適合閾値」機能を使用して、解析のために、元のチャネル画像の上に染色されたオブジェクトマスクを作成した。染色された細胞内斑点のみを定量化するために、ＣＤ９８ｈｃ膜染色は、サイズに基づいて解析から排除した。ＣＤ９８ｈｃ斑点の総数を、約１５０〜２００個の細胞からなる画像全体から定量化した。Ｌａｍｐ１により共局在化した内在化ＣＤ９８ｈｃ染色を特定するために、「マークされたオブジェクトを保持する」機能を使用して、２つの異なるチャネルから重なり合うオブジェクトを特定した。共局在化したＣＤ９８ｈｃ斑点の総数を、画像全体から定量化し、各ウェルの合計をプログラムによって報告して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。共局在化したＣＤ９８ｈｃ斑点のパーセントを、Ｌａｍｐ１による共局在化ＣＤ９８ｈｃ斑点の数を、ＣＤ９８ｈｃ斑点の総数で割ったものとして算出した。５つのウェルからの平均を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）においてグラフ化した。
【０３５５】
１８．アミノ酸取り込みアッセイ
ＣＤ９８ｈｃを安定して過剰発現するＩＭＣＤ３細胞を、前日に３８４ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）に置いた。翌朝、抗体を細胞に付加し、成長培地中１μＭで２４時間インキュベートした。１条件当たり４つのウェルを使用し、実験を３回繰り返した。２４時間後、細胞をＭｅｔ不含ＤＭＥＭにより、３７℃で３０分間平衡させた。細胞によるアミノ酸取り込みを測定するために、アミノ酸メチオニン類似体、ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ  Ｃ１０１８６）を、５０μＭ最終濃度で細胞に付加した。１０ｍＭ  ＢＣＨ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、ＨＰＧと同時に付加した。３７℃で３０分のインキュベーション後に、追加の成長培地をさらに３０分間付加した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液中に、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）と共に溶解した。全ての液体処理は、３８４チップヘッドを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｒａｖｏ自動化システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて行った。細胞溶解物を３８４ウェルプレートに移し、４℃で終夜インキュベートした。輸送されたメチオニンは、ＨＰＧ上のクリックタグを介するビオチニル化によって検出した。プレートを３回洗浄し、製造業者の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，Ｂ１０１８４）に従ってクリック反応を行った。ビオチニル化されたメチオニンの総量は、ＥＬＣ検出を使用して検出した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）においてプロットした。
【０３５６】
１９．ウェスタンブロット解析
マウス脳組織を、上記の通り、ＰＢＳ灌流後に単離し、プロテアーゼ阻害剤と共に１％  ＮＰ−４０中で均質化した（脳及び血漿中の抗体濃度及びマウスＡβｘ−４０の測定を参照されたい）。およそ２０μｇのタンパク質を、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の上に負荷した。ゲルを、ｉＢｌｏｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロース膜の上に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）遮断緩衝液試薬及び二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用して、ウェスタンブロッティングを行った。マウス相互反応ヤギ抗ＣＤ９８ｈｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、Ｍ−２０、１：２００）を使用して、脳溶解物中のＣＤ９８ｈｃを検出した。ウサギ抗βアクチン（ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂｃａｍ８２２７、１：２０００）は、負荷対照として役立った。ウェスタン膜を撮像し、製造業者により供給されたソフトウェア及びシステム（Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）／ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標））を使用して定量化した。
【０３５７】
野生型ＩＭＣＤ３細胞を、４８ウェルプレートに終夜置き、抗体で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充されたＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。１条件当たり３つのウェルを使用し、実験を３回繰り返した。溶解物を、上記の通り、ヤギ抗ＣＤ９８ｈｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）及びアクチン（ａｂｃａｍ（登録商標）を用い、ウェスタンブロットによってＣＤ９８ｈｃについてプローブした。
【０３５８】
２０．統計解析
全ての値は、別途指示されない限り、平均±ＳＥＭとして表され、ｐ値を通常の一元配置ＡＮＯＶＡによって、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定で評価した。脳ＴｆＲと抗体レベルとの間の相関解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）バージョン６を使用して行った。
【０３５９】
Ｂ．Ｌｒｐ１及びＩｎｓＲの受容体媒介型経細胞輸送スクリーニングは著しい脳取り込みの欠失を明らかにした
この実施例は、ＢＢＢを越える抗体の受容体媒介型輸送（ＴｆＲ、Ｌｒｐ１、及びＩｎｓＲ）について、より広く研究された受容体の中で、ＴｆＲに対する抗体のみが著しい脳取り込みを示したことを実証する。
【０３６０】
ＢＢＢを越えるための潜在的なＲＭＴ標的に対する抗体を体系的にスクリーニングするために、全身インビボ投薬薬物動態研究の前に、マウス抗原結合のインビトロ確認を伴う、一般的なスクリーニングカスケードを設計した（図１Ａ）。この方法を最初に使用して、２つの一般に研究されたＲＭＴ標的、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、及びインスリン受容体（ＩｎｓＲ）に対する抗体が、ＢＢＢを越え、マウス脳内に著しく蓄積し得るかどうかを確認した。Ｌｒｐ１及びＩｎｓＲに対するモノクローナルヒト抗マウス抗体を、ナイーブ抗体ファージライブラリから生成した。マウスＬｒｐ１またはマウスＩｎｓＲを発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するフローサイトメトリー解析は、これらの抗体の、膜提示された標的への陽性結合を確認した（図１Ｂ）。
【０３６１】
全身投与された抗Ｌｒｐ１及び抗ＩｎｓＲが、脳に輸送され得るかどうかを決定するために、微小用量及び治療用量を使用して、抗体の脳濃度を評価した。微小用量及び治療用量と、ＢＢＢ−ＲＴｆＲへの結合親和性との間の逆相関が以前に実証されているため、微小用量及び治療用量の両方を調査した。具体的に、ＴｆＲへの高親和性結合は、微小用量を介して頑強な取り込みを示したが、治療投薬を介して低下した取り込みを示した。低親和性ＴｆＲ抗体については、逆が実証された。そのようにして、ＲＭＴ標的に対する抗体が、微小用量または治療用量を介して作用しなければならず、そうでなければ、標的は、ＢＢＢを越える輸送体として恐らく生存可能ではない。
【０３６２】
ＴｆＲは、頑強なＲＭＴ標的であり、ＴｆＲに対する抗体は、全身投与後にＢＢＢを越え、脳内に蓄積し得る。故に、高親和性抗ＴｆＲ抗体（抗ＴｆＲＡ）を、後次微量投薬及び治療投薬研究の脳取り込みの陽性対照として使用した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｍａｙ  ２５；３（８４）：８４ｒａ４４、Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｙ  １；５（１８３）：１８３ｒａ５７，１−１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｎｏｖ  ５；６（２６１）：２６１ｒａ１５４を参照されたい）。単一放射標識微小用量のＩ１２５−対照ＩｇＧ、Ｉ１２５−抗ＴｆＲＡ、Ｉ１２５−抗Ｌｒｐ１、またはＩ１２５−抗ＩｎｓＲを、野生型マウスに静脈内注入し、脳内の放射活性を、投薬後の様々な時点で測定した。脳組織１グラム当たりの注入用量のパーセントによって測定した場合に、脳取り込みの著しい増加が、Ｉ１２５−抗ＴｆＲＡについて観察されたが、Ｉ１２５−抗Ｌｒｐ１及びＩ１２５−抗ＩｎｓＲ両方の脳取り込みは、Ｉ１２５−対照ＩｇＧと同様であった（図１Ｃ）。
【０３６３】
次に、治療用量のこれらの抗体が、脳取り込みをもたらすことになるかどうかを求めた。野生型マウスに、２０ｍｇ／ｋｇ（より高い治療関連用量）の、対照ＩｇＧ、抗ＴｆＲＡ、抗Ｌｒｐ１、または抗ＩｎｓＲのいずれかを注入し、ＰＢＳでの灌流に続いて投与後１時間及び２４時間に抗体の脳濃度を測定した。以前の観察と一貫して、抗ＴｆＲＡの場合に、対照ＩｇＧと比較して、投薬後１時間及び２４時間の両方において、わずかであるが脳内の抗体取り込みが観察された（図１Ｄ）。対照的に、抗Ｌｒｐ１の脳蓄積は観察されなかった。抗ＩｎｓＲは、わずかであるが、両方の時点において有意な脳取り込みの増加を呈した。
【０３６４】
５ｍｇ／ｋｇ投薬後１時間のマウス皮質組織の免疫組織化学染色は、抗ＴｆＲＡの顕著な血管局在化を明らかにしたが、抗Ｌｒｐ１または抗ＩｎｓＲについては抗体局在化が観察されず、脳内皮細胞上でＬｒｐ１及びＩｎｓＲを標的とする全身投与された抗体の局在化の欠失を示す（図１Ｅ）。これらの結果は、これらの広く研究された受容体のうち、ＴｆＲに対する抗体のみが、頑強な脳取り込みを呈したことを示した。
【０３６５】
Ｃ．ＢＢＢにおける遺伝子（ｍＲＮＡ）富化は、ＣＮＳへの抗体輸送に十分でない
この実施例は、ＢＢＢにおける遺伝子（ｍＲＮＡ）富化が、脳内皮細胞上で発現された形質膜受容体が、ＢＢＢを越える抗体輸送のための良好なＲＭＴ標的であるかどうかを決定するために十分な基準でないことを実証する。
【０３６６】
理想的に、ＲＭＴ標的は、ＢＢＢにおいて高度に発現されるが、末梢臓器内での発現はより低くなる。この特性は、脳以外の臓器内の標的媒介性クリアランスを低下させることにより、安全性及び抗体薬物動態を改善し得る。以前に、野生型マウスからの肝臓及び肺内皮細胞と比較して、ＦＡＣＳ精製された内皮細胞のマイクロアレイ発現プロファイリングを使用して、ＢＢＢにおいて富化された遺伝子が特定された（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｄｅｖｔ．Ｃｅｌｌ  ２２：４０３−４１７）。単一パス膜貫通受容体をコードするいくつかの候補遺伝子、Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０が、ＢＢＢにおけるそれらの高富化に基づいて、潜在的なＲＭＴ標的として特定された（図２Ａ）。興味深いことに、ＢＢＢにおけるより高いｍＲＮＡ発現が、Ｔｆｒｃに関して観察されたが、Ｌｒｐ１もＩｎｓｒも、肝臓及び肺内皮細胞と比較してより高いＢＢＢ発現を示さず、これらの一般に研究されたＲＭＴ標的が、ＢＢＢにおける富化を欠いていることを示唆する。
【０３６７】
ＢＢＢにおいて富化される遺伝子の産物を標的とする抗体が、著しい抗体取り込みをもたらすかどうかを決定するために、Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０に対するモノクローナル抗マウス抗体を生成した。マウス抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するフローサイトメトリー解析は、３つの抗体全てについて陽性結合を確認した（図２Ｂ）。単一放射標識微小用量のＩ１２５−対照ＩｇＧ、Ｉ１２５−抗ＴｆＲＡ、Ｉ１２５−抗Ｌｒｐ８、Ｉ１２５−抗Ｌｄｌｒａｄ３、またはＩ１２５−抗ＣＤ３２０を、野生型マウスに静脈内注入した。注入した抗体のうち、Ｉ１２５−抗ＴｆＲＡのみが、脳内の著しい取り込みを呈したが、Ｉ１２５−抗Ｌｒｐ８、Ｉ１２５−抗Ｌｄｌｒａｄ３、及びＩ１２５−抗ＣＤ３２０は、Ｉ１２５−対照ＩｇＧと同様の脳レベルを示した（図２Ｃ）。野生型マウスに、治療関連用量の２０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与された場合に、同様の結果が観察された（図２Ｄ及び２Ｅ）。５ｍｇ／ｋｇ投与の１時間後の皮質脳組織の免疫組織化学染色は、抗Ｌｒｐ８及び抗ＣＤ３２０に対して、ＢＢＢにおける抗体局在化の欠失を明らかにするが、抗Ｌｄｌｒａｄ３は、中度の免疫活性を示した（図２Ｆ）。
【０３６８】
マイクロアレイ解析は、Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０  ｍＲＮＡ発現が、脳内皮細胞上で高度に富化されることを特定したが、これらの膜貫通受容体に対する抗体は、いかなる明らかな量もＢＢＢを越えることができなかった。最近では、Ｚｈａｎｇら（２０１４、上記）が、定量的ｍＲＮＡ発現データを提供する脳血管内皮細胞を含む、マウス脳内の別個の細胞集団の包括的なＲＮＡ配列トランスクリプトーム解析を用いてデータセットを入手可能にした（ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｂａｒｒｅｓ＿ｌａｂ／ｂｒａｉｎ＿ｒｎａｓｅｑ．ｈｍｔｌにおいてアクセス可能）。このデータセット内の失敗したＲＭＴ標的に関する出願人の審査は、脳内皮細胞上のＬｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０の低い絶対ｍＲＮＡ発現を明らかにし（図２Ｇ）、Ｌｒｐ１及びＩｎｓｒは、この細胞集団内で非常に低いｍＲＮＡ発現を示した。対照的に、Ｔｆｒｃの転写レベルは、脳内細胞内の他の候補遺伝子よりも約１２倍（Ｌｒｐ８と比較して）〜約５００倍（Ｌｒｐ１と比較して）高かった（図２Ｇ）。この解析は、抗体脳取り込み実験の非存在下で、ｍＲＮＡ発現データ単独では、好適なＲＭＴ標的を特定するのに不十分であったことを示す。
【０３６９】
Ｄ．ＢＢＢにおける高度に発現した膜貫通タンパク質のプロテオーム特定
この実施例は、プロテオームアプローチを使用する、ＢＢＢにおいて高度に発現され、潜在的な新規ＲＭＴ標的であり得る、形質膜タンパク質の特定を説明する。
【０３７０】
Ｌｄｌｒａｄ３及びＣＤ３２０の相対転写レベルは、脳内皮細胞（ＢＥＣ）内で選択的に富化されたが、不良な脳免疫組織化学染色によって示唆されるように、ＢＢＢにおけるそれらの絶対タンパク質発現レベルが、ＢＢＢを越えるいかなる潜在的抗体取り込みをも防ぐ制限因子であり得ると仮定した。絶対タンパク質レベルが、潜在的ＲＭＴ受容体をより良く予測するかどうかを調べるために、プロテオームアプローチを用いて、脳内皮細胞内で高度に発現される膜貫通タンパク質を特定した。
【０３７１】
ＢＢＢ脈管構造の遺伝子発現プロファイリングについて以前に記載された方法と同様に（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、上記）、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３１陽性及びＣＤ４５陰性脳内皮細胞（ＢＥＣ）を野生型マウスから単離した（図３Ａ）。フローサイトメトリー精製ＢＥＣの質量分析（ＭＳ）解析は、Ｐｇ−ｐ、Ｇｌｕｔ１、ＺＯ−１、及びＥｓａｍ等の以前に特徴付けられた内皮細胞特異性タンパク質の特定によって検証された（図３Ｂ）。負に選択された非ＢＥＣ溶解物（すなわち、ＣＤ３１陰性／ＣＤ４５陰性）からのペプチド計数は、豊富なグリア特異性タンパク質（Ｆａｓｎ、Ａｌｄｏｃ、Ｇｌｕｌ、Ｐｌｐ１）を明らかにした。
【０３７２】
その頑強なＲＭＴ特性と一貫して、ＴｆＲは、ＢＥＣ集団内で豊富に発現されることが見出された（図３Ｃ）。実際に、ペプチド計数は、ＴｆＲが、ＢＥＣ集団内で最高の単一パス膜貫通タンパク質であることを明らかにした。ｍＲＮＡ発現と一貫して、Ｌｒｐ１、ＩｎｓＲ、Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０のタンパク質レベルは、検出以下であったが、Ｌｒｐ１の一部のペプチド計数は、非ＢＥＣ集団内で検出された（図３Ｃ）。
【０３７３】
したがって、これらの結果は、前述のＲＭＴ標的（Ｌｒｐ１及びＩｎｓＲ）、ならびに肝臓／肺ｍＲＮＡと比較して脳内皮細胞内に優先的遺伝子発現を有する標的（Ｌｒｐ８、Ｌｄｌｒａｄ３、及びＣＤ３２０）を標的とする抗体の著しい取り込みの欠失を実証する上記の結果と一貫した。
【０３７４】
重要なことに、このプロテオーム解析は、ＢＢＢを越えるＲＭＴの抗体標的として以前に研究されていない、いくつかの非常に豊富な膜貫通タンパク質を明らかにした。これらには、グルコース輸送体Ｇｌｕｌ（図３Ｂ）、細胞外マトリクスメタロプロテイナーゼ誘導体ベイシジン（ＣＤ１４７）（図３Ｃ）、及び溶質担体ＣＤ９８重鎖（図３Ｃ）が含まれる。これらのＲＭＴ標的はまた、マイクロアレイ発現及びＲＮＡ配列決定プロファイリングデータ（図３Ｄ）に基づいて、ＢＢＢにおいて富化され、故に、さらなる調査のための潜在的に新しいＲＭＴ候補標的として選定された。
【０３７５】
Ｅ．ベイシジンに対する抗体の脳取り込み
この実施例は、野生型マウスの脳への抗ベイシジン抗体取り込みの特徴付けについて説明する。
【０３７６】
ベイシジンに対するモノクローナル抗体は、マウスベイシジンタンパク質の細胞外ドメインによるマウス免疫付与を介して生成され、一連の抗体クローンが精製され、本明細書において抗ＢｓｇＡ、抗ＢｓｇＢ、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥとして特定された。抗ＢｓｇＡ及び抗ＢｓｇＢの、標的への結合は、マウスベイシジンを一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、フローサイトメトリーによって確認された（図４Ａ）。これらの抗体がインビボでベイシジンに結合するかどうかを決定するために、野生型マウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗ＢｓｇＡまたは抗ＢｓｇＢのいずれかを静脈内注入した。投薬後１時間のマウス皮質組織の免疫組織化学染色は、抗ＴｆＲＡにより以前に観察されたものと同様に、抗ＢｓｇＡ及び抗ＢｓｇＢ両方の顕著な血管局在化を明らかにした（図４Ｂ、図１Ｅと比較）。また３つの追加のクローン、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥを試験したところ、抗ＢｓｇＡ及び抗ＢｓｇＢと同様の結果をもたらした。
【０３７７】
次に、これらの抗体が、微量投薬及び治療投薬パラダイムの両方を試験することによって、脳に取り込まれ得るかどうかを調べた。単一放射標識微小用量のＩ１２５−対照ＩｇＧ、Ｉ１２５−抗ＢｓｇＡ、またはＩ１２５−抗ＢｓｇＢを、野生型マウスに全身投与した。Ｉ１２５−抗ＢｓｇＡの著しい増加は、研究期間にわたって脳内で観察されたが、Ｉ１２５−抗ＢｓｇＢの中度の増加が、Ｉ１２５−対照ＩｇＧと比較して存在した（図４Ｃ）。３つの追加のクローン、ＢｓｇＣ、ＢｓｇＤ、及びＢｓｇＥも試験した。微量投薬による著しい脳取り込みは、追加のクローンに関して観察されなかった。
【０３７８】
次に、治療関連用量の２０ｍｇ／ｋｇを使用して、ベイシジン抗体が脳内で蓄積し得るかどうかを試験した。野生型マウスに、２０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ、抗ＴｆＲＡ、抗ＢｓｇＡ、または抗ＢｓｇＢを静脈内注入し、血漿及び脳内の抗体濃度を、投薬後１時間及び２４時間に決定した。対照ＩｇＧと比較して、両方のＢｓｇ抗体の脳濃度は、両方の時点において著しく高かった（図４Ｄ）。抗Ｂｓｇの脳取り込みを、抗ＴｆＲＡのものと比較した。抗ＢｓｇＢの脳濃度は、抗ＴｆＲＡと同様であったが、抗ＢｓｇＡの濃度は、抗ＴｆＲＡの脳濃度と比較して、投薬後２４時間で著しく高かった。
【０３７９】
ＢＢＢを越える、抗Ｂｓｇの脳実質への輸送をさらに調べるために、Ｂｓｇ及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素ベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）の両方に結合する、二重特異性抗体Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体を生成した（Ａｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｍａｙ  ２５；３（８４）：８４ｒａ４３）。ＢＡＣＥ１は、アルツハイマー病患者の脳内のプラークにおいて見出されるアミロイドベータ（Ａβ）の主要寄与因子であると見なされる（Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９  Ｏｃｔ  ２２；２８６（５４４０）：７３５−４１）。抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１による出願人の以前のアプローチと同様に、二重特異性抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１は、ＢＢＢを越えて脳実質に入る抗体の薬物動態的読み出しを可能にする（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，上記、Ａｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１，上記）。二価（単一特異性）抗Ｂｓｇ及び二重特異性（一価抗Ｂｓｇ）抗Ｂｓｇ／ＢＡＣＥ１抗体に対する親和性は、競合ＥＬＩＳＡによって決定した。全ての抗体は、二重特異性（一価）フォーマットでのベイシジン結合親和性の減少を示した。図４Ｆを参照されたい。
【０３８０】
これらの二重特異性抗体の脳取り込みを評価するために、野生型マウスに、単一５０ｍｇ／ｋｇ用量の対照ＩｇＧ、抗ＢｓｇＡＡ／ＢＡＣＥ１、または抗ＢｓｇＢ／ＢＡＣＥ１を静脈内注入した。投薬後２４時間において、対照ＩｇＧと比較して、抗ＢｓｇＡ／ＢＡＣＥ１を注入したマウスの脳内の抗体濃度に著しい増加があった（図４Ｇ）。抗ＢｓｇＡ／ＢＡＣＥ１の脳濃度のこの増加は、脳Ａβレベルの約２３％の低下と相関した（図４Ｈ）。対照的に、抗ＢｓｇＢ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスは、脳内の抗体濃度の増加を示さず、予想通り、Ａβの低下は観察されなかった。抗ＢｓｇＤ／ＢＡＣＥ１はまた、著しい取り込みを示したが、ＢｓｇＣ／ＢＡＣＥ１及びＢｓｇＥ／ＢＡＣＥ１の著しい取り込みは観察されなかった。
【０３８１】
抗ＢｓｇＡ／ＢＡＣＥ１及び抗ＢｓｇＢ／ＢＡＣＥ１は、同様の一価結合親和性を有するが、二価（単一特異性）Ｂｓｇ抗体は、微量投薬及び治療投薬パラダイムの両方において、脳取り込みの程度が異なっていた（図４Ｃ及び４Ｄ）。これらの抗体は、競合データに基づいて別個のエピトープに結合し、これがＢｓｇ輸送及びＢＢＢにおける輸送において役割を果たし得、観察された脳取り込みの差異を説明し得る。抗体のうちのいずれかが、標的依存性組織取り込みに寄与し得る細胞膜への非特異性結合を示すかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、バキュロウイルス（ＢＶ）粒子へのオフターゲット結合を決定した（Ｈｏｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；４（６）：７５３−６０）。抗ＢｓｇＢは、抗ＢｓｇＣ、抗ＢｓｇＤ、及び抗ＢｓｇＥと同様に、正常範囲内のＢＶスコアを有していたが、抗ＢｓｇＡは、高ＢＶ粒子結合を呈した。さらに、抗ＢｓｇＢと比較して、二価及び二重特異性抗ＢｓｇＢ両方のはるかに速いクリアランスが観察された（図４Ｅ及び４Ｉ）。
【０３８２】
Ｆ．Ｇｌｕｔ１に対する抗体の脳取り込み
この実施例は、一価及び二重特異性抗体としての、ＢＢＢにおける抗Ｇｌｕｔ抗体取り込みの特徴付けを説明する。
【０３８３】
マルチパス受容体は、ＲＭＴに対して一般に考慮されないが、ＢＢＢにおけるグルコース輸送体Ｇｌｕｔ１の高富化及びタンパク質発現の両方（図３Ｂ及び３Ｄを参照されたい）は、潜在的輸送標的としてこの形質膜タンパク質の評価に値する。Ｇｌｕｔ１に対するモノクローナル抗体は、ｈＧｌｕｔ１  ｃＤＮＡによる免疫付与を介して生成された。陽性抗原結合は、マウスＧｌｕｔ１を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するフローサイトメトリーによって確認した（図５Ａ）。
【０３８４】
この抗体がインビボでＧｌｕｔ１に結合するかどうかを決定するために、野生型マウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗Ｇｌｕｔ１を静脈内注入した。投薬後１時間のマウス皮質組織の免疫組織化学染色は、抗Ｇｌｕｔ１の血管局在化を明らかにした（図５Ｂ）。
【０３８５】
次に、抗Ｇｌｕｔ１が、微量投薬及び治療投薬パラダイムの両方において、脳に取り込まれ得るかどうかを調べた。単一放射標識微小用量のＩ１２５−対照ＩｇＧまたはＩ１２５−抗Ｇｌｕｔ１のいずれかを、野生型マウスに静脈内注入した。投薬後の全ての時点において、Ｉ１２５−対照ＩｇＧと比較して、脳内でＩ１２５−抗Ｇｌｕｔ１の著しい増加が観察された（図５Ｃ）。Ｉ１２５−抗Ｇｌｕｔ１の脳濃度は、微量投薬研究において経時的に安定して増加すると思われたため、治療投薬研究の時間経過を延長して、投薬後２日及び４日の時点を含めることとした。２０ｍｇ／ｋｇで投薬した場合、抗Ｇｌｕｔ１の脳濃度は、投薬後１日及び２日において抗ＴｆＲＡに相当したが、投薬後４日目に、はるかに高い脳濃度に到達した（図５Ｄ）。２０ｍｇ／ｋｇ用量の抗Ｇｌｕｔ１を使用する同様の実験において、抗Ｇｌｕｔ１の脳濃度は、両方の時点において、対照ＩｇＧより約１．５〜３倍高く、抗ＴｆＲＡに相当した（図５Ｋ及び図５Ｌ）。
【０３８６】
微量投薬及び治療投薬パラダイムの両方において、抗ＴｆＲＡと比較して、脳内の抗Ｇｌｕｔ１取り込みの薬物動態の明らかな差異が観察された。抗ＴｆＲＡの濃度は、投薬後数時間（微小用量で、図１Ｃ及び図２Ｃを参照されたい）または約１日（治療用量で）でピークに達したが、抗Ｇｌｕｔ１の脳濃度は、経時的に増加した（図５Ｃ及び５Ｄ）。これは、少なくとも部分的に、抗ＴｆＲＡと比較して、末梢における抗Ｇｌｕｔ１のはるかに遅いクリアランス速度に寄与し得（図５Ｅ）、末梢組織と比較して、ＢＢＢにおけるＧｌｕｔ１の発現の富化と一貫する（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、全身注入後に抗Ｇｌｕｔ１の著しい脳取り込みがあるだけでなく、望ましい薬物動態特性も有することを示唆する。
【０３８７】
抗Ｇｌｕｔ１が、ＢＢＢを越えて脳実質に輸送されるかどうかを決定するために、二重特異性抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１抗体を生成した。Ｇｌｕｔ１結合親和性は、フローサイトメトリーによって評価した場合に、一価／二重特異性抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１抗体において著しく低下した（図５Ｆ）。一価抗Ｇｌｕｔ１は、対照ＩｇＧのものと同様の末梢薬物動態を示したため（図５Ｅ）、二重特異性抗体を用いて、より包括的なＰＫ／ＰＤ研究を行った。
【０３８８】
野生型マウスに、単一５０ｍｇ／ｋｇ用量の対照ＩｇＧまたは抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１のいずれかを静脈内注入し、抗体の脳及び血漿濃度を、投薬後１日、２日、４日、及び７日目に決定した。抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１は、対照ＩｇＧと比較して相当する薬物動態を示し、二価抗体により観察されたものと同様であった（図５Ｇ）。抗Ｇｌｕｔ１／ＢＡＣＥ１の脳取り込みの中度の増加は、投薬後の全ての時点で観察された（図５Ｈ）。
【０３８９】
脳内の抗体蓄積の限定された程度と一貫して、Ａｂｅｔａのわずかな低下が観察された（図５Ｉ）。抗ＢＡＣＥ１アームの全機能は、血漿Ａｂｅｔａの著しい低下によって確認された（図５Ｊ）。まとめると、これらのデータは、二価抗Ｇｌｕｔ１が、ＢＢＢを越え、脳内で著しく蓄積するという証拠を提供する。
【０３９０】
Ｇ．ＣＤ９８ｈｃに対する抗体の脳取り込み
この実施例は、二価（単一特異性）抗体として、及び二重特異性抗体としての、ＢＢＢにおける抗ＣＤ９８ｈｃ抗体取り込みの特徴付けを説明する。
【０３９１】
プロテオームデータセットからの最高単一パス膜貫通タンパク質ヒットのうちの１つは、溶質担体ＣＤ９８ｈｃであった。ＢＢＢにおけるＣＤ９８ｈｃの高発現が、大分子輸送を可能にするかどうかを決定するために、２つのＣＤ９８ｈｃ抗体（抗ＣＤ９８ｈｃＡ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢ）を生成した。
【０３９２】
マウスＣＤ９８ｈｃを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するフローサイトメトリー解析は、両方の抗体がマウスＣＤ９８ｈｃに結合されることを確認した（図６Ａ）。抗ＣＤ９８ｈｃＡ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢ両方の５ｍｇ／ｋｇ静脈内注入は、マウスの脳組織内で顕著な血管染色をもたらした（図６Ｂ）。ＣＤ９８ｈｃ抗体の結合親和性を図９に示す。
【０３９３】
次に、これらの抗体が、脳に取り込まれ得るかどうかを調べた。単一放射標識微小用量のＩ１２５−対照ＩｇＧ、Ｉ１２５−抗ＴｆＲＡ、Ｉ１２５−抗ＣＤ９８ｈｃＡ、またはＩ１２５−抗ＣＤ９８ｈｃＢを、野生型マウスに静脈内注入した。対照ＩｇＧ及びＩ１２５−抗ＴｆＲＡ両方と比較して、Ｉ１２５−抗ＣＤ９８ｈｃＡ及びＩ１２５−抗ＣＤ９８ｈｃＢの両方に関して、著しく高い脳レベルが観察された（図６Ｃ）。顕著に、微小用量のＩ１２５−抗ＣＤ９８ｈｃでの脳取り込みの程度は、ピーク濃度においてＩ１２５−抗ＴｆＲＡより約４〜５倍高かった。治療用量の２０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、抗ＣＤ９８ｈｃＡ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢの両方に対して、投薬後２４時間に著しい脳取り込みが観察され、抗ＴｆＲＡにより観察されたものに相当する（図６Ｄ）。
【０３９４】
抗体の血漿濃度は、投薬後２４時間に、抗ＣＤ９８ｈｃＡの強化されたクリアランス、及び抗ＣＤ９８ｈｃＢの中度のクリアランスを示した（図６Ｅ）。標的依存性クリアランスは、バキュロウイルス粒子結合によって評価した場合に、より速いクリアランスに寄与すると思われなかったが、代わりに、末梢細胞上のＣＤ９８ｈｃの発現に起因する可能性がある（Ｐａｒｍａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９  Ｍａｒ  １１；１７（５）：１９１５−３１、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊａｎ  ２９；２７４（５）：３００９−１６を参照されたい）。
【０３９５】
３つのＲＭＴ候補（ＣＤ９８ｈｃ、Ｇｌｕｔ１、及びＢｓｇ）のうち、ＣＤ９８ｈｃ抗体の全身注入は、最高の脳濃度を明らかにした。抗ＣＤ９８ｈｃＡ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢの脳濃度は、投薬後２４時間に、対照ＩｇＧの脳濃度よりそれぞれ約９倍及び１１倍高かった（図６Ｄ及び６Ｌ）。さらに、２４時間目に、抗ＣＤ９８ｈｃＡの脳濃度は、抗ＴｆＲＡの脳濃度より著しく高かった。３つのＲＭＴ候補は全て、微量投薬及び治療投薬によって脳取り込みを示したが、これらのインビボ研究は、微量投薬及び治療投薬パラダイムの両方において達成された高い脳濃度に基づいて、ＣＤ９８ｈｃが、Ｂｓｇ及びＧｌｕｔ１に対する最も頑強なＲＭＴ候補であることを明らかにする。
【０３９６】
投与された抗体が、明らかにＢＢＢを越え、実質を貫通することをさらに確認するために、脳ホモジネートの微小血管枯渇がＥＬＩＳＡによって評価された後、抗体の量を実質断片内で保持した。投与された抗体は、対照抗体と比較して、３つの標的全てに対して明らかに検出され、実質単離体に結合されたＢＢＢを越える抗体の著しい通過があったことを示唆する（図８）。微量投薬及び治療投薬研究と一貫して、実質断片内の抗ＣＤ９８ｈｃ抗体は、最大脳濃度を示した（図８）。抗Ｇｌｕｔ１の最小取り込みは、脳内皮細胞内のＧｌｕｔ１（Ｓｌｃ２ａ１）の特異的発現の結果であり得る。ミクログリア及び星状細胞内でも発現されるＣＤ９８ｈｃ（Ｓｌｃ３ａ２）とは異なり、微小血管を枯渇させるプロトコルは、抗原が発現されない実質断片内の残りの抗体の正確な定量化を可能にしない場合がある。それにもかかわらず、脳内の最も頑強な取り込みを示す複数の証拠の結果として、二重特異性抗体としてのさらなるインビボ検証のために、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体を選択した。
【０３９７】
Ｈ．二重特異性抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体の生成
この実施例は、ＣＤ９８ｈｃ及びＢＡＣＥ１に結合する二重特異性抗体の生成及び特徴付けを説明する。
【０３９８】
抗ＣＤ９８ｈｃが、ＢＢＢを越えて脳実質に輸送されるかどうかを決定するために、２つの二重特異性抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体を生成した。二重特異性抗体は、一方のアーム上でＣＤ９８ｈｃに、もう一方でアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素βセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）に結合した。ＢＡＣＥ１は、アルツハイマー病患者の脳内のプラークに見出される脳β−アミロイド（Ａβ）の主要な生成因子であると見なされる酵素である。ＢＡＣＥ１に対する抗体は、酵素活性を阻害し、それによりＡβ産生を低下させるように設計されてきた（Ａｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、この抗体は、不良なＢＢＢ浸透を有し、故に、非常に高い濃度で投与されるか、二重特異性抗体として抗ＴｆＲと対合されるかのいずれかでない限り、脳Ａβを低下させることにおいて効果的でない。抗ＣＤ９８ｈｃＡ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢの両方を、二重特異性抗体として再フォーマットして、脳Ａβレベルの測定による、ＢＢＢを越える実質へのＣＤ９８ｈｃ媒介型輸送の結果として、脳内の抗体蓄積の直接薬物動態測定を可能にする。二価抗ＣＤ９８ｈｃ及び二重特異性抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１抗体に対する親和性は、競合ＥＬＩＳＡによって決定した。抗ＣＤ９８ｈｃＡ結合親和性の中度の喪失が、一価（すなわち、二重特異性）フォーマットで観察されたが、親和性のより著しい移行が、抗ＣＤ９８ｈｃＢに関して観察された（図６Ｆ）。抗ＣＤ９８ｈｃＡの親和性は、わずかに約２倍低下したが、抗ＣＤ９８ｈｃＢの親和性は、約１００倍低下し、結合活性が、この特定の抗体の二価結合において重要な役割を果たすことを示す。放射標識微量投薬は、対照ＩｇＧ及び抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１の両方と比較して、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１の投薬後１時間に、著しく高いピーク脳取り込みを明らかにした（図６Ｋ、Ｐ＜０．０００１）。抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１が呈した親和性が低いほど、対照ＩｇＧと比較して脳取り込みを増加させたが、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１のそれより低く、恐らくは二重特異性抗体としてのＣＤ９８ｈｃへの結合親和性の大幅な低下に起因する。抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１脳取り込み及び薬物動態応答の程度及び期間を決定するために、対照ＩｇＧまたは抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１のいずれかの単一５０ｍｇ／ｋｇの静脈内注入を、野生型マウスに投与した。標的媒介型クリアランスの結果として、より高い親和性の抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１の薬物動態は、血漿中の低い親和性の抗ＣＤ９８Ｂ／ＢＡＣＥ１と比較して速かった（図６Ｇ及び６Ｏ）。
【０３９９】
脳内で、投薬後１日、２日、及び４日目に、対照ＩｇＧと比較して、両方のＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１の取り込みの著しい増加があった（図６Ｈ及び図６Ｐ）。投与後７日目に、より低い親和性の抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１の脳濃度は、上昇したままであったが、より高い親和性の抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１の濃度は、対照ＩｇＧに相当し、恐らく末梢における曝露の喪失に起因する。まとめると、より低い親和性の抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１は、より高い親和性の抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１と比較して、より良好な末梢及び脳曝露を経時的にもたらした（図６Ｇ及び６Ｈ）。興味深いことに、抗体親和性と脳曝露の期間との間のこの逆相関は、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体についても以前に観察された（Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，上記）。両方のＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、投薬後１日に脳Ａβレベルを著しく低下し、抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１治療により、投薬後４日目も低下したままであった（図６Ｉ）。これは、脳実質へのこれらの抗体の良好な輸送を示していた（図６Ｍ及び６Ｎも参照されたい）。血漿Ａβは、全ての時点で著しく低下したままであった（図６Ｊ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ９８ｈｃについて、ＢＢＢを越える抗体治療薬の脳取り込みのための新規のＲＭＴ標的として、頑強な証拠を提供する。
【０４００】
インビボ２光子顕微鏡も行い、治療投薬されたマウスの実質及び皮質下脈管構造内の蛍光標識されたＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１二重特異性変異形の輸送をリアルタイムで可視化した。対照ＩｇＧ及び抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１を投与したマウスと比較して、より高い親和性の変異形のより速い血漿薬物動態によって予測されるように、抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１の血管クリアランスの明らかな差異が検出された。加えて、蛍光標識された抗ＣＤ９８ｈｃＢ／ＢＡＣＥ１を４８時間までに投与されたマウスの実質において、より優れた拡散シグナル、及び抗ＣＤ９８ｈｃＡ／ＢＡＣＥ１ではより低い程度の拡散シグナルが観察され、ＢＢＢを通る抗体の横断の強化を示す。
【０４０１】
Ｉ．抗体治療は内在性ＣＤ９８ｈｃの発現及び機能を変化させない
この実施例は、ＣＤ９８ｈｃが、ＣＤ９８ｈｃの生物学を混乱させることなく、ＢＢＢを越えて抗体治療薬を送達することができる、新規の高容量ＲＭＴ経路であることを実証する。
【０４０２】
一次マウス脳内皮細胞上の免疫細胞化学は、ＣＤ９８ｈｃの大部分が、形質膜に局在化し、カベオリン−１及びＥＥＡ１−陽性斑点を有するいくらかの共局在化を伴うことを明らかにした（図１０）。再循環エンドソームのマーカーであるＴｆＲと共局在化した斑点はほとんどなかった。ＴｆＲに対する抗体が、ＴｆＲのリソソーム分解を、親和性依存的に駆動し、インビトロ及びインビボの両方で減少したＴｆＲレベルにつながることが以前に観察された。故に、内在性レベルのＣＤ９８ｈｃを、対照抗体または抗ＣＤ９８ｈｃ二重特異性変異形で処置されたＩＭＣＤ３細胞（均一なＣＤ９８ｈｃ発現レベルを有する関門形成マウス腎臓上皮）内で調べた。増加濃度の抗ＣＤ９８ｈｃ二重特異性抗体によるインキュベーションは、ＣＤ９８ｈｃの発現レベルまたは安定性を変えなかった（図７Ａ及び７Ｂ）。さらに、抗体治療が、ＣＤ９８ｈｃの細胞下局在化の変化を誘導したかどうかも調べた。ウェスタンブロット結果と一貫して、ＣＤ９８ｈｃの大部分は、形質膜上に残り、ＣＤ９８ｈｃの、Ｌａｍｐ１陽性リソソームへの輸送の増加は観察されなかった（図７Ｃ及び７Ｄ）。さらに、いずれのＣＤ９８ｈｃ二重特異性親和性変異形も、１日目と７日目の間に５０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ９８ｈｃ／ＢＡＣＥ１を投与したマウスからの脳溶解物における総脳ＣＤ９８ｈｃ発現に影響を及ぼさなかった（図７Ｅ〜７Ｉ）。
【０４０３】
抗ＣＤ９８ｈｃ抗体の存在下または非存在下におけるＣＤ９８ｈｃアミノ酸輸送レベルも評価した。正の対照として、システム−Ｌ特異的基質ＢＣＨ（２−アミノ−２−ノルボルナン−カルボン酸）による輸送の損害が観察された。抗ＣＤ９８ｈｃ抗体治療による阻害は観察されなかった（図７Ｊ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ９８ｈｃが、ＣＤ９８ｈｃの生物学を混乱させることなく、ＢＢＢを越えて抗体治療薬を送達することができる、新規の高能力ＲＭＴ経路であることを示す。血漿Ａβは、全ての時点で著しく低下したままであった（図７Ｊ）。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【０４０４】
以下の表は、本明細書において参照される配列を提供する。
2018502840.tif 000006
2018502840.tif 000007
2018502840.tif 000008
2018502840.tif 000009
2018502840.tif 000010
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2018502840.tif 000031
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2018502840.tif 000035
2018502840.tif 000036
2018502840.tif 000037
【０４０５】
上述の発明は、明確な理解のための例示説明及び例としてある程度詳細に記載されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれら全体が明示的に組み込まれる。
【図１Ａ】
2018502840.tif 000038
【図１Ｂ】
2018502840.tif 000039
【図１Ｃ】
2018502840.tif 000040
【図１Ｄ】
2018502840.tif 000041
【図１Ｅ】
2018502840.tif 000042
【図２Ａ】
2018502840.tif 000043
【図２Ｂ】
2018502840.tif 000044
【図２Ｃ】
2018502840.tif 000045
【図２Ｄ】
2018502840.tif 000046
【図２Ｅ】
2018502840.tif 000047
【図２Ｆ】
2018502840.tif 000048
【図２Ｇ】
2018502840.tif 000049
【図３Ａ】
2018502840.tif 000050
【図３Ｂ】
2018502840.tif 000051
【図３Ｃ】
2018502840.tif 000052
【図３Ｄ】
2018502840.tif 000053
【図４Ａ】
2018502840.tif 000054
【図４Ｂ】
2018502840.tif 000055
【図４Ｃ】
2018502840.tif 000056
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
2018502840.tif 000063
【図５Ｂ】
2018502840.tif 000064
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
2018502840.tif 000072
【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
2018502840.tif 000074
【図６Ａ】
2018502840.tif 000075
【図６Ｂ】
2018502840.tif 000076
【図６Ｃ】
2018502840.tif 000077
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2018502840.tif 000079
【図６Ｆ】
2018502840.tif 000080
【図６Ｇ】
2018502840.tif 000081
【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
2018502840.tif 000085
【図６Ｌ】
2018502840.tif 000086
【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018502840.tif 000092
【図７Ｃ】
2018502840.tif 000093
【図７Ｄ】
2018502840.tif 000094
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
2018502840.tif 000096
【図７Ｇ】
2018502840.tif 000097
【図７Ｈ】
2018502840.tif 000098
【図７Ｉ】
2018502840.tif 000099
【図７Ｊ】
2018502840.tif 000100
【図８】
2018502840.tif 000101
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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