(57)【要約】  本発明は、皮膚移植のために美容医療で使用するための、特に自家線維芽細胞を培養するための、細胞培養培地に関するものであって、前述の培養培地は、血清を含んでおらず、かつ、従来の培養培地に比べて、はるかに少量しかグルコースを含まないことを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムから成る、生物学的に許容され得る無機塩類の混合物、
ｂ）Ｄ−グルコース、および
ｃ）少なくとも１種類の水溶性ビタミン、
を含んでなり、
ここで、前記ｂ）グルコースの濃度が、＜６ｍＭである、
生理的食塩水溶液。
【請求項２】
前記ｂ）グルコースの濃度が、５．５ｍＭである、請求項１に記載の生理的食塩水溶液。
【請求項３】
前記水溶性ビタミンが、次の：ビタミンＣ、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ５、ビオチン、ニコチンアミド、α−リポ酸の塩形態、のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１または２に記載の生理的食塩水溶液。
【請求項４】
少なくともビタミンＣおよびビタミンＢ１２を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生理的食塩水溶液。
【請求項５】
前記ビタミンＣが、０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度で存在し、かつ、前記ビタミンＢ６が、５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で存在する、請求項４に記載の生理的食塩水溶液。
【請求項６】
前記溶液が、改良タイロード液であり、かつ、各々のミリモル濃度で次の成分：
ＮａＣｌ            １３０    ｍＭ、
ＫＣｌ              ２．６８  ｍＭ、
Ｄ−グルコース      ５．５    ｍＭ、
ＮａＨＣＯ3         １１．９  ｍＭ、
ＮａＨ2ＰＯ4        ０．４６  ｍＭ、
ＭｇＣｌ2           １．０５  ｍＭ、
ＣａＣｌ2           １．８    ｍＭ、
ビタミンＣ          ０．１〜１ｍＭ、
ビタミンＢ６        １０      ｍＭ、
から成ることを特徴とする、請求項４または５に記載の生理的食塩水溶液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生理的食塩水溶液から成る無血清細胞培養培地。
【請求項８】
請求項７に記載の無血清細胞培養培地中で増殖させた線維芽細胞の細胞培養物。
【請求項９】
前記線維芽細胞が、美容医療において皮膚移植に使用するためのヒト自家線維芽細胞である、請求項８に記載の細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、美容または再生医療の分野における皮膚移植を目的したヒト自家線維芽細胞を培養するための、細胞培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容および再生医療では、専門用語で「自家移植」とも呼ばれる自家線維芽細胞移植の使用は、長い間利用されてきた技術である。
加齢により、皮膚中の活性線維芽細胞の数、ならびにその代謝能力は、減少する傾向がある。細胞外マトリックスを合成する能力を有する自家線維芽細胞の移植による細胞の増加は、皮膚老化の影響を解消することを可能にさせる。
【０００３】
実際に、その患者の外植片由来の、生体外にて培養された自家線維芽細胞の培養物を注射した患者において、例えば光学プロフィロメトリーや、真空キュトメトリー（vacuum cutometry）や、ＶＩＳＩＡ（登録商標）光分析などの様々な臨床試験で実証されたように、それらが、上記患者の皮膚の生体力学的性質を改善したことが臨床的に実証された。
実際に、注射された線維芽細胞は、少なくとも１２カ月間にわたり細胞外マトリックスを合成できた。
【０００４】
実際に処置を受けた患者の皮膚部分では、真皮のコラーゲンおよび全体的な肥厚の増大（１２カ月で最大６０％）、皮膚の弾性の増大（眼窩周囲部分において２５％）、ならびに５０％に相当するシワの全体的な減少が認められた（V.Zorin et al “Clinical-instrumental and morphological evaluation of the effect of autologous dermal fibroblasts administration” Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Articleオンライン創刊版: 19 DEC 2014b DOI: 10.1002/term.1976）。
【０００５】
この技術を用いて良好な結果が得られたが、まず第一に細胞培養培地の多くの臨界を把握するのが難しいことがわかる。
実際には、例えば、線維芽細胞など細胞を培養する培養培地が、必ずしもヒトに注射するのに好適であるとは限らないことは周知である。
【０００６】
実際には、細胞は、血清の存在下で優れた細胞生存率および増殖を呈し、そして、一般的に利用される血清は、ウシ胎仔血清（ＰＢＳ）であることが知られている。こういった物質は、免疫原になり得るので、そのため、対象によってはアレルギー反応の原因となる。例えば、ＤＭＥＭなどの他のタイプの細胞培養培地は、顕性糖尿病を患っているか、または糖尿病の傾向を有する対象にとって危険な可能性がある非常に多量のグルコースを含んでいる。
【０００７】
前述の欠点が存在しない細胞培養培地、すなわち、無血清であると同時に、例えば、ＤＭＥＭなどの細胞培養培地と比較して、低いグルコース含有量を含む細胞培養培地を手に入れる必要性を感じた。
その一方で、タイロード液と呼ばれる生理的食塩水が、低温にて１０〜１２時間の間、移植用臓器の保存を可能にすることが知られている。
【０００８】
この水溶液は、それぞれの濃度の以下の成分から成る。
標準的なタイロード液
【０００９】
【表１】
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【発明の概要】
【００１０】
本出願人は、生理的食塩溶液が、特に線維芽細胞を培養するための、細胞培養培地として利用されるとき、上述の液体中における２４時間のインキュベーション期間の間、生存細胞の最大３０％を維持することが、その時わかった。また、このタイプの生理的食塩溶液は、ＰＢＳのみを含む培養培地に比べて、極めて高い細胞増殖も可能にする。
【００１１】
そのため、本発明の対象は、
ａ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムから成る無機塩類の混合物、
ｂ）Ｄ−グルコース、および
ｃ）少なくとも１種類の水溶性ビタミン、
を含有し、
ここで、前記ｂ）Ｄ−グルコースの濃度が、＜６ｍＭである、
生理的食塩水溶液である。
【００１２】
本発明の更なる対象は、上記の生理溶液から成る無血清細胞培養培地である。
最後に、本発明の更なる対象は、美容または再生医療における皮膚移植に使用するための、本発明による培養培地中でのヒト自家線維芽細胞の細胞培養物である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、それぞれＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ＋ＰＢＳ、ＰＢＳのみ、従来のタイロード液、ビタミンＣ（０．１ｍＭ）およびビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液、ならびにビタミンＣ（１ｍＭ）およびビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液中での２４時間のインキュベーション後の線維芽細胞の細胞生存率（％）に関するＭＴＴ試験結果を図面表示で示す。
【図２】図２は、次の培養培地：ＤＭＥＭのみ、ＤＭＥＭ＋ＰＢＳ、ＰＢＳのみ、従来のタイロード液、ビタミンＣ（０．１ｍＭ）、ビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液、およびビタミンＣ（１ｍＭ）、ビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液中での２４時間のインキュベーション後のヒト線維芽細胞の増殖（細胞計数）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の詳細な説明
好ましくは、本発明の生理的食塩溶液は、５．５ｍＭの成分ｂ）、すなわちＤ−グルコース、の濃度を有する。
好ましくは、本発明の水溶性ビタミンは、次の：ビタミンＣ、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ５もしくはパントテン酸、ビオチン、ニコチンアミドもしくはビタミンＢ３のアミド形態、α−リポ酸の塩形態またはビタミンＮ、のうちの少なくとも１つから選択される。
好ましくは、本発明の生理的食塩溶液は、少なくともビタミンＣとビタミンＢ６の組み合わせを含有する。
【００１５】
好ましくは、本発明の対象に関して、ビタミンＢ６によって、ピリドキシン、ピリドキサミンヒドロクロリド、ピリドキサールｏピリドキサールホスフェートを表す。
好ましくは、ビタミンＣは、０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度で存在し、そして、ビタミンＢ６は、５ｍＭ〜２０ｍＭに及ぶ濃度で存在する。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態によると、本発明の生理的食塩溶液は、それらの各々のミリモル濃度にて次の成分：
ＮａＣｌ            １３０    ｍＭ、
ＫＣｌ              ２．６８  ｍＭ、
Ｄ−グルコース      ５．５    ｍＭ、
ＮａＨＣＯ3         １１．９  ｍＭ、
ＮａＨ2ＰＯ4        ０．４６  ｍＭ、
ＭｇＣｌ2           １．０５  ｍＭ、
ＣａＣｌ2           １．８    ｍＭ、
ビタミンＣ          ０．１〜１ｍＭ、
ビタミンＢ６        １０      ｍＭ、
から成る。
【００１７】
それぞれＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ＋ＰＢＳ、ＰＢＳのみ、従来のタイロード液、ビタミンＣ（０．１ｍＭ）およびビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液、ならびにビタミンＣ（１ｍＭ）およびビタミンＢ６（１０ｍＭ）存在下での本発明による溶液中での細胞培養に対して実施した線維芽細胞の細胞生存率および細胞増殖の実験的証拠が、本明細書中の以下で例証のために報告される。
【実施例】
【００１８】
方法
細胞（初代ヒト皮膚線維芽細胞）を、次の培養液：
・ＤＭＥＭ
・ＰＢＳ血清（１０％）含有培養液中、抗生物質および１０％の血清を補充したＤＭＥＭ
・標準的なタイロード
・本発明に従って改良し、かつ、１０ｍＭの濃度の各ビタミンＢ６、ならびにそれぞれ、０．１ｍＭおよび１ｍＭの濃度のビタミンＣを含有する二種類のタイロード液、
の中、標準的な増幅条件（インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ2、９５％の湿度）で培養した。
【００１９】
従来の、または、標準的なタイロードの処方、ならびに本発明に従い、かつ、本実施例において検討した改良タイロード処方を、以下の本明細書中の以下の表中に示す。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
実験時に、トリプシン処理によって剥離し、遠心分離後に、無菌バッファー（ＰＢＳ）で洗浄した細胞を、調製した様々な溶液中に懸濁し、次に、自動血球計数器でカウントした。
２４時間のインキュベーション中、細胞を、増幅ステップのようにインキュベーター内に保持した。
次に、細胞培養物を、生存率（ＭＴＴアッセイ）および増殖（細胞計数）に関して評価した。
上記の試験の結果を、それぞれ図１および２で報告する。
【００２２】
無血清培養培地（ＰＢＳおよびタイロードの標準）中での２４時間のインキュベーション後に見られるように、実際には、細胞は、彼らの生存率を完全に失った。血清を含む培養培地ＤＭＥＭの場合では、細胞は９０％超の生存率を有し、そしてそれは、血清を含まないが、しかしながら、高用量のアミノ酸、ビタミン、および標準濃度の５倍である２５ｍＭのグルコースの存在下のＤＭＥＭ中では、６０％をちょうど超えるまで低下する。本発明による改良タイロード液は、２４時間後の細胞の生存を最大３０％維持するよりむしろ、標準的なタイロード液に比べてだけでなく、ＰＢＳのみを含有する培養液に比べても、はるかに良好な結果を得る。
【００２３】
本発明の対象であり、かつ、検討した２種類の改良タイロード液は、ＰＢＳのみを含有する標準的な処方および標準的なタイロードと比較して有意に良好な増殖を示したが、アミノ酸および微量栄養素が著しくより一層豊富なＤＭＥＭ処方に比べて、明らかに低かった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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