(57)【要約】  発明者は、生体模倣型のコラーゲンに基づくマトリクス組成物を作製するためにシクロデキストリンをプロテオグリカンの代替物として使用した。本発明のコラーゲン組成物において生じたシクロデキストリンの組み入れにより、コラーゲンの熱安定性が増加し、コラーゲンの線維形成が低減した。結果として、厚く透明で機械的に強度なコラーゲンに基づく組成物が形成された。これらのシクロデキストリンーコラーゲン組成物は角膜修復のための治療的な眼のインプラントとして使用することができる大きな可能性を有している。さらに、前記組成物は、様々な生物学的特性を促進する異なる層を有する、多層構造の開発を支援する。これらの発明性のある組成物の製造方法、およびそれらの使用も提供される。
2018512893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン及びシクロデキストリンを含む、整列した原線維を含有する組成物。
【請求項２】
コラーゲン及びシクロデキストリンを含む、ガラス化されたマトリクスゲルから成る整列した原線維を含有する組成物。
【請求項３】
コラーゲン及びシクロデキストリンを含む、ガラス化されたマトリクスゲルから成る整列した原線維を含有する組成物であって、前記組成物が多層状である、組成物。
【請求項４】
前記組成物が１型、２型、３型及び／又は４型コラーゲンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物がα−ＣＤ、β−ＣＤ及び／又はγ−ＣＤを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記α−ＣＤ、β−ＣＤ及び／又はγ−ＣＤが、異なる官能基又は部分と化学的に置換することができる複数の水酸基を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記異なる官能基又は部分が、疎水性基、親水性基、ペプチド、水酸基、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６  ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミノＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６チオアルキル、Ｃ２−Ｃ６チオアルケニル、Ｃ２−Ｃ６チオアルキニル、Ｃ６−Ｃ２２アリールオキシ、Ｃ２−Ｃ６アシルオキシ、Ｃ２−Ｃ６チオアシル、Ｃ１−Ｃ６アミド、Ｃ１−Ｃ６スルホンアミド、Ｃ１−Ｃ６カルボキシル及びそれらの誘導体から成る群より選択されて、ホスホン酸及びスルホンを含むこともできる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が１型コラーゲンを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物がα−シクロデキストリンを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物のコラーゲン含有量の実質的部分が１型コラーゲンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物のシクロデキストリン含有量の実質的部分がα−ＣＤである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
１型コラーゲン及びα−シクロデキストリンを含むガラス化マトリクスゲルを含有する、組成物。
【請求項１３】
前記組成物がさらに少なくとも１つの生理活性物質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物がインドメタシンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記層状組成物の厚さが１０−５００ミクロンの間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
生物学的作用を増強するための表面コーティングをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が人工角膜としての使用に適した形状に形成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が角膜代替品、パッチ又はグラフトである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が使用前に水和される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が５５０ｎｍで９０％を超える光透過性を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物の組織を修復するためのマトリクスとしての、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
前記組成物が水和された後、目に外科的に移植される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
患者に請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、前記患者の治療方法。
【請求項２４】
患者の目を治療するステップを含む、請求項２３の方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権主張】
【０００１】
関連出願に対する参照
本出願は、２０１５年４月２４日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７５０３及び２０１５年５月４日に出願された米国仮特許出願番号６２／１５６，８３３の利益を主張し、その両者は本明細書に完全に記載されたように全ての目的のために参照により援用する。
【技術分野】
【０００２】
角膜炎、円錐角膜、他の疾患及び外傷により、今日では世界中の多くの人々が角膜失明に陥っている。しかし、特にアジアやアフリカの開発地域においては、ドナー角膜の利用可能性に制限があるので、全ての個人が治療を受けられるわけではなかった。
【背景技術】
【０００３】
以下は現在の標準の概要である。従来の治療基準は、現在利用可能な最良の角膜ドナー角膜置換術である、ドナー角膜を含む。しかしながら、入手可能性、保管、流通の問題がある。Ｂｏｓｔｏｎ  Ｋｐｒｏ又はＡｌｐｈａＣｏｒなどの合成角膜又は人工角膜もまたその治療標準に存在する。しかしながら、それらの治療は損傷を受けた角膜の屈折特性を是正するのには成功したが、合成ポリマーに基づいており、組織の再構築や生物学的統合を支援せず、合併症につながる。カルボジイミドで架橋したＲＨＣＩＩＩなどの、臨床試験中の生物工学により作製された角膜がある。これらは大いに期待されている。しかしながら、これらの材料は縫合可能性が低く、角膜のものと不一致なコラーゲンの組織化された超微細構造を有する（図８）。
【０００４】
角膜中で見られる通常のコラーゲンアセンブリにおいて、三重らせん形成、原線維アラインメント及び組織化を支援するデコリン及びルミカンなどの多数のプロテオグリカンがある。私たちは、これを人工シャペロンとして振る舞うことができる分子及びこれらと同様の機能を提供しうる分子を使用して研究室環境において再現したいと考えた。そのような分子として、発明者の初期の焦点はシクロデキストリン−ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７５０３及び本明細書に参照により援用される文献において詳述される環内のグルコースモノマーの数に依存して分類される環状小オリゴ糖−にあった（図１２）。これらは以前から癌治療及び薬剤供給のための他の応用において使用されており、非常に安全で生体適合性が高いと考えられている。
【０００５】
シクロデキストリン（ＣＤ）は、６個から８個のグルコース分子から構成される環状オリゴマーファミリーである。これらの環状分子は、小分子又は大分子の一部と複合体を形成しうる内側疎水性コア及び外側親水性環を特徴とする。天然シクロデキストリンの溶解度は極めて乏しく、当初はこれが効果的な錯化剤となることの妨げとなっていた。１９６０年代後半、２、３及び６位の水酸基部位で化学的置換を行うと溶解度が大きく向上することが見出された。化学的置換の程度と置換に使用される基の特質とにより、水媒体におけるシクロデキストリンの最終最大濃度が決まる。最も化学的に修飾されたシクロデキストリンは、水中で５０％（重量／体積）濃度に達することができる。さらに、その基を例えば酸、アミン又は他の官能基へ変換することなどの水酸基での置換及び反応を行うことで、追加の官能性を提供することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞外基質（ＥＣＭ）は、タンパク質、プロテオグリカン及び他の可溶性分子から構成される高分子の混合物である。動物においてもっとも豊富なタンパク質であるコラーゲンは、種々の生物学的応用において広く利用されている。しかしながら、大量の精製プロテオグリカンを抽出することが困難なことから、コラーゲンとプロテオグリカンとから構成されるＥＣＭ骨格の作製はほとんど試みられてこなかった。天然の角膜において、プロテオグリカンはコラーゲン原線維の直径と間隔とを制御することにより角膜の透明度に重要な役割を果たす。したがって、プロテオグリカン代替物には、角膜再生などの臨床的な応用に関連する挑戦的問題を解決するために、生体模倣型のコラーゲンに基づくＥＣＭを開発するための必要性が依然として存在する。
【０００７】
発明の要約
開示された実施態様に従って、本発明は真の角膜模倣構造を調製するための組成物及び方法を提供する。角膜は、最も厚い領域が主に１型コラーゲンに基づく細胞外マトリクスでわずかに角膜実質細胞が存在する角膜実質である、上皮層と内皮層とから構成される透明な多層状組織である。ある実施態様において、可能な戦略は、角膜実質を再現することに焦点をおいた角膜生体模倣物を開発することであり、それに続いて他の層を加えることができる。その後、この再現された角膜実質は、角膜模倣構造へと自己組織化するよう変化するコラーゲンに基づく角膜インプラントを製作するための基礎として使用される。その目的は、天然の健常な角膜の超微細構造及び物理的特性を模倣することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施態様に従って、本発明はコラーゲン及びシクロデキストリンを含む整列した原線維を含有する組成物又は膜を提供する。この組成物又は膜はコラーゲン及びシクロデキストリンを含むガラス化されたマトリクスゲルから成る整列した原線維を含有してもよい。
【０００９】
整列した原線維は、よりランダムな配向と区別され、よりランダムな配置よりもむしろ整列した配向を検出するために試料を透過電子顕微鏡で評価するような方法によって評価されうる。
【００１０】
本発明の組成物又は膜において、１型、２型、３型及び４型コラーゲンを利用することを含む、各種コラーゲンを適切に利用してもよい。特定の組成物又は膜に対して、１型コラーゲンを利用してもよい。特定の組成物又は膜において、前記組成物のコラーゲン含有量の実質的部分が１型コラーゲンであることが好ましく、例えば、前記組成物又は膜の全コラーゲン含有量の４０、５０、６０、７０、８、９０、９５又は１００重量％が１型コラーゲンであってもよい。
【００１１】
α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）及びγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）を含む、各シクロデキストリンもまた利用しうる。特定の組成物又は膜に対して、１型コラーゲンとの組み合わせも含む、α−ＣＤが好ましいことがある。特定の組成物又は膜において、前記組成物又は膜のシクロデキストリン含有量の実質的部分がα−ＣＤであることが好ましく、例えば、前記組成物又は膜の全シクロデキストリン含有量の４０、５０、６０、７０、８、９０，９５又は１００重量％が、１型コラーゲンとの組み合わせも含む、α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）であってもよい。
【００１２】
本発明の組成物又は膜はまた、例えばインドメタシンなどの、１つ又は複数の追加の生理活性又は治療薬を含んでもよい。
【００１３】
本発明の組成物又は膜は、患者へ薬剤を徐放するための薬剤リザーバーとして特に有用である。
【００１４】
本発明の組成物又は膜は、適切な多層であってもよい。前記組成物又は膜は、人工角膜としての使用に適した形状及び／又は角膜代替物、パッチ又はグラフトとしての使用に適した形状を含む、各種構造に形成されてもよい。本発明の組成物及び膜は、他の各種生物学的材料としての追加の用途を有するだろう。
【００１５】
１つ又は複数の実施態様に従って、発明者は天然組織におけるプロテオグリカンと同様に、コラーゲンマトリクス中にシクロデキストリンを組み入れることによりコラーゲンの三重らせん構造を保存しつつ、コラーゲンの線維形成を制御することができると仮定した。無定形なコラーゲンネットワークから構成される透明ゲルが機械的強度に乏しい一方、線維状構造物を有する従来の生物工学により作製された１型コラーゲンマトリクスは不透明である。シクロデキストリンはコラーゲンマトリクスにプロテオグリカンの代替物として加えられることができ、角膜再生のための光学的及び機械的特性の両方の最適化を補助することが期待される。
【００１６】
実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み前記第二構成成分がシクロデキストリンを含む、組成物を提供する。
【００１７】
他の実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み前記第二構成成分がシクロデキストリンを含み、さらに少なくとも１つの生理活性物質を含む、組成物を提供する。
【００１８】
さらなる実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルの製造方法であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み前記第二構成成分がシクロデキストリンを含み、ａ）コラーゲンの水溶液を得るステップ、ｂ）シクロデキストリンの水溶液を得るステップ、ｃ）前記ａ）の溶液と前記ｂ）の溶液とを混合するステップ、及びｄ）前記ｃ）の混合溶液がガラス化するのに十分な時間、前記ｃ）の混合溶液を脱水するステップ、を含む製造方法を提供する。
【００１９】
さらに他の実施態様に従って、本発明は上述した組成物を哺乳類の組織を修復するためのマトリクスとして使用することを提供する。
【００２０】
他の実施態様に従って、本発明は上述した組成物を哺乳類の目の角膜を修復するためのマトリクスとして使用することを提供する。
【００２１】
さらなる実施態様に従って、本発明は角膜をよりよく模倣するために層ごとに異なる機能を有する、層状に構築されうる眼の組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、通常のコラーゲンビトリゲル（ＣＶ）、本発明のα―ＣＤ−ｃｏｌ組成物、及び架橋ＣＶを含む３つのコラーゲンに基づく膜を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）した第一加熱曲線を図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、α−ＣＤにより各種コラーゲンの超微細構造が誘導されることを示している（断面図）。
【図２】図２は、本発明のα―ＣＤ−ｃｏｌ組成物が５５０ｎｍで９６％もの透過率で表される優れた透明度を示すことを図示するグラフである。図中の挿入図は、印刷された文字「ｅｙｅ」上に配置された湿潤な膜の写真を示す。
【図３】図３は、５２０μｍと１７０μｍとの厚さである本発明の２つのα―ＣＤ−ｃｏｌ組成物それぞれに対する荷重対変形の縫合可能性試験を図示するグラフである。図中の挿入図は、５．６ｍｍを超えて伸長した後の厚い方の膜の写真を示す。
【図４】図４は、本発明の組成物に対する負荷試験で使用した装置の写真である。
【図５】図５は、ウシの角膜実質細胞を初代培養したときの細胞突起解析及び異なるビトリゲル組成物中のコラーゲン密度の効果を表した図表を示す。
【図６】図６は、ウシの角膜実質細胞を初代培養したときの３個の異なる遺伝子マーカーの遺伝子発現度が、本発明のビトリゲル組成物の原線維のナノ構造により影響を受けることを図示する。
【図７】図７は、種々のシクロデキストリンの構造及びそれらがどのように溶液中のコラーゲン原線維と相互作用するかを示した図表である。シクロデキストリン分子内の空間は、水不溶性薬剤と生理活性物質との薬剤リザーバーとして使用されうる。
【図８】図８は、角膜修復及びグラフトに対する標準治療オプションを表す図である。
【図９】図９は、本発明の角膜模倣生体材料の１つ又は複数の実施態様の開発を表す図である。前記図は、本発明のコラーゲンに基づく生体材料がどのように天然の健常な角膜の超微細構造及び物理的特性を模倣するかを表す図である。
【図１０】図１０は、ガラス化が、どのようにコラーゲン密度が高くて強度及び透明性に優れたコラーゲンビトリゲルの形成につながるのかを示す、生体材料３４：９３６５−９３７２（２０１３）の画像である。
【図１１】図１１ａ―１１ｂは、コラーゲンアセンブリに対する従来技術の方法と本発明の一つ又は複数の実施態様との間の相違を表す図である。１１ａ）生体内での１型コラーゲンの秩序だった線維状超微細構造への自己組織化には、デコリンなどのプロテオグリカン小分子が関与する。１１ｂ）生体外での同様の超微細構造は、コラーゲン三重らせん構造に対する分子シャペロンとしてシクロデキストリンを使用することで得られる。
【図１２】図１２は、シクロデキストリンの構造を表す従来技術の画像である。シクロデキストリンは、アミロース（デンプンの断片）と同様に１−＞４により結合した５個以上のα−Ｄグルコピラノシドユニットである。５員環を有する大員環は非天然である。最近では、よく特徴付けられた最大のシクロデキストリンは、３２個の１，４−無水グルコピラノシドユニットを含み、一方十分に特徴付けられていない混合物として、少なくとも１５０−員環環状オリゴサッカライドもまた知られている。一般的なシクロデキストリンは、環内に６〜８ユニットに及ぶグルコースモノマーを含み、円錐形状を創造する。
【図１３】図１３は、本発明のＣＤ  Ｃｏｌインプラントの実施態様の透明度を示す。
【図１４】図１４は、本発明のＣＤ  Ｃｏｌインプラントの実施態様の角膜模倣超微細構造を表す。
【図１５】図１５は、本発明のβＣＤ−ＣＯＯＨ  Ｃｏｌインプラントの生体模倣超微細構造の拡大顕微鏡写真を示す。
【図１６】図１６は、本発明のインプラント組成物の生体適合性を示す角膜実質細胞及び上皮細胞の顕微鏡写真を表す。
【図１７】図１７は、本発明のインプラント組成物の生体適合性を示すＨ＆Ｅ染色切片を表す。
【図１８】図１８は、本発明のβＣＤ  ＣＶインプラントの生体内角膜移植の写真を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
１つ又は複数の実施態様に従って、発明者は生体模倣型のコラーゲンに基づくマトリクス組成物を作製するためにシクロデキストリンをプロテオグリカンの代替物として使用した。本発明のコラーゲン組成物において生じたシクロデキストリンの組み入れによりコラーゲンの熱安定性が増加し、コラーゲンの線維形成が低減した。結果として、厚く透明で機械的に強度なコラーゲンに基づく組成物が形成された。これらのシクロデキストリン−コラーゲン組成物は角膜修復のための治療用の眼のインプラントとして使用できる大きな可能性を有している。
【００２４】
実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含む、組成物を提供する。
【００２５】
他の実施態様に従って、コラーゲンとシクロデキストリンの組成物は、多層状又はマルチ−ラメラ構造に形成することができ、各層の厚さを制御することができる。例えば、ヒトの角膜の厚さは１０−５００マイクロメートルである。本発明は、１０−５００、２５−５００、５０−５００、１００−５００、２５０−５００の厚さ（マイクロメートル）としうる。従って、多層構造及びそれが支持する多機能性により、この組成物は現在の人工角膜、グラフト、パッチよりもより角膜に類似した機能を有する。さらに、前記組成物は生物学的作用を増強するために表面を被覆されうる。
【００２６】
１つ又は複数の本発明の組成物の実施態様に従って、発明者は、コラーゲンビトリゲルの技術を使用した。コラーゲンゲルのガラス化は、透明度及び強度が高いコラーゲン膜又はシートの形成に至る制御された温度及び制御された湿度での低速脱水工程である。コラーゲンから結合水が遊離することにより、高密度の線維形成を推進するエントロピーの増大をもたらす。コラーゲンゲルのガラス化により、コラーゲン密度が高く、強度に優れ、透明度がより高いビトリゲル膜が形成できる。（３つのステップ：ゲル化、ガラス化、再水和）以前の、より厚みのある（５００μｍ）ＣＶ膜は透明度が非常に低かった（図９，１０、及び１１を参照）。
【００２７】
本明細書において使用されるように、用語「ガラス化」又は「ビトリゲル」は、組成物が１つ又は複数のコラーゲンと１つ又は複数のシクロデキストリンとの混合物の水溶液から構成され、ヒドロゲルを形成できることを意味する。ある実施態様においては、組成物のゲル化は３７度でなされる。ヒドロゲルが形成された後、例えばガラス化が起こりうる特定の期間、特定の温度と湿度とで加熱することなどの脱水により、そのヒドロゲルはガラス化される。ある実施態様においては、ガラス化は３５〜４５℃、相対湿度３０％〜５０％でなされる。実施態様においては、ガラス化は４０℃、相対湿度４０％でなされる。組成物のガラス化に必要な時間は数日から数週間で変動しうる。実施態様において、組成物のガラス化時間は約１〜２週間である。
【００２８】
「ゲル」は、液体と固体との間の物質の状態を指し、一般的に液状媒体中で膨張した架橋ポリマーネットワークとして定義される。通常、ゲルは固体と液体とを両方含有する２相コロイド分散であり、そこでの固体の量は、「ゾル」として定義される２相コロイド分散中の固体の量よりも多い。そのように、「ゲル」は幾らかの液体特性（すなわち、形状が弾性を有し変形可能である）及び幾らかの固体特性（すなわち、形状が二次元表面上で三次元を維持するのに十分離散的である）を有する。
【００２９】
「ヒドロゲル」は、水を吸収して弾性ゲルを形成しうる水膨張性ポリマーマトリクスを意味し、「マトリクス」は共有結合性又は非共有結合性の架橋により結合した高分子の三次元ネットワークである。水性環境に配置すると、乾燥したヒドロゲルは液体を吸収することによって、架橋度によって許容される程度に膨張する。
【００３０】
本発明の組成物はコラーゲンを含む。第一構成成分であるコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンからなる群より選択される。実施態様においては、前記組成物の前記第一構成成分として使用されるコラーゲンはＩ型コラーゲンである。当業者は、前記組成物及び方法において使用されるコラーゲンが複数の型のコラーゲンを含みうることを理解するだろう。
【００３１】
本発明の組成物は、シクロデキストリンも含む。第二構成成分であるシクロデキストリンは、α―シクロデキストリン、β―シクロデキストリン及びγシクロデキストリンからなる群より選択される。実施態様において、前記組成物の前記第二構成成分として使用されるシクロデキストリンは、α―シクロデキストリンである。当業者は、前記組成物及び方法において使用されるシクロデキストリンが複数の型のシクロデキストリンを含みうることを理解するだろう。
【００３２】
１つ又は複数の実施態様に従って、本発明の組成物及び方法において使用されるシクロデキストリンは、他の官能基又は部分と化学的に置換することができる複数の水酸基を有する。前記官能基又は部分の例は、限定されるものではないが、疎水性基、親水性基、ペプチド、水酸基、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミノＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６チオアルキル、Ｃ２−Ｃ６チオアルケニル、Ｃ２−Ｃ６チオアルキニル、Ｃ６−Ｃ２２アリールオキシ、Ｃ２−Ｃ６アシルオキシ、Ｃ２−Ｃ６チオアシル、Ｃ１−Ｃ６アミド、Ｃ１−Ｃ６スルホンアミド、Ｃ１−Ｃ６カルボキシル及びそれらの誘導体を含み、ホスホン酸及びスルホンを含むこともできる。
【００３３】
本明細書において使用されるように、本発明のガラス化組成物は使用前に水和される。
【００３４】
本発明のガラス化組成物は、光学的に透明であり各種用途に適している。実施態様において、このガラス化組成物は５５０ｎｍで約９６％の光透過性を有する。
【００３５】
本発明のガラス化組成物は、組織の代替物又は組織の充填剤としての使用に適したいかなる特定の形状にも成型又は形成されうることが理解されるだろう。本発明は、組織欠損を望みの形状に成型でき、生来の細胞修復を刺激することによって組織の成長を促進するように成型でき、低侵襲性注入による移植の可能性がある、スキャフォールドなどを形成するための生体外での重合技術を提供する。
【００３６】
１つ又は複数の実施態様において、本発明のガラス化組成物は、患者の人工角膜としての使用のために成形されうる。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物を提供し、ここで前記第一構成成分はコラーゲンを含み、前記第二構成成分はシクロデキストリンを含み、さらに少なくとも１つの生理活性物質を含む。
【００３８】
本明細書において、「活性物質」及び「生理活性物質」は区別しないで使用され、望みの薬理学的及び／又は生理学的効果を誘発する化学的又は生物学的物質を指すものであり、ここでその効果は予防的であっても治療的であってもよい。この用語は、本明細書において具体的に言及された活性物質の薬学的に許容されうる薬理学的に活性な誘導体を含み、限定されるものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝生成物、類縁体などを含む。用語「活性物質」、「薬理学的に活性な物質」及び「薬剤」を使用するとき、本発明は薬学的に許容されうる、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝生成物、類縁体などと同様に、活性物質自体を含むことが理解されるべきである。
【００３９】
「組み入れた」、「被包された」及び「封入された」は、治療薬、色素又は他の物質及び本発明の組成物のようなポリマー組成物に関して使用するときに、当該技術分野において承認される。ある実施態様においては、これらの用語は、所望の応用において前記薬剤を徐放可能にする組成物内に前記薬剤を組み込むこと、処方すること又はそうでなければ含有することを含む。この用語は、前記マトリクス全体に分散する、（インターカレーション又は他の結合性相互作用によって）マトリクスの表面に付加する、マトリクス内部に被包されるなどを含む、治療薬又は他の物質をマトリクス内に組み込むいかなる方法を意図してもよい。用語「同時取り込み」又は「同時被包化」は、治療薬又は他の物質と少なくとも１つの他の治療薬又は他の物質を対象となる組成物中に組み込むことを指す。
【００４０】
本発明の一側面において、ガラス化組成物と１つ又は複数の生理活性物質とを含む組成物を調製してもよい。生理活性物質は、組成物に意図される目的によって幅広く変化してもよい。用語「活性の」は、当該技術分野において承認され、被験者において局所的に又は全身的に作用する、生物学的に、生理学的に、又は薬理学的に活性な物質である全ての部分を指す。「薬剤」として言及されうる、生理活性物質の例は、「メルクインデックス」、「医師用卓上参考書」、及び「治療薬の薬理学的基礎」などの周知の文献参照に記載され、制限なく、薬剤、ビタミン、ミネラルサプリメント、病又は疾病の治療、予防、診断、治癒又は軽減のために使用される物質、身体の構造又は機能に影響する物質、又は生理的環境に配置された後生物学的に活性になるかより活性になるプロドラッグを含む。被験者に投与した時、ガラス化組成物により、例えば隣接する組織又は流体へ、放出可能な各種形状の生理活性物質が使用されてもよい。ある実施態様において、生理活性物質は例えば目と併せて、例えば疾病や症状を治療、回復、抑制、又は防止するために使用されうる。
【００４１】
生理活性物質の非限定的な例は以下、アドレナリン受容体遮断薬、同化剤、アンドロゲンステロイド、抗アレルギー材料、抗コリン作用及び交感神経作動薬、抗高血圧剤、抗感染薬、ステロイドなどの抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、解熱剤及び鎮痛剤、抗ヒスタミン薬、生物製剤、うっ血除去薬、診断薬、エストロゲン、イオン交換樹脂、有糸分裂阻害剤、粘液溶解薬、成長因子、神経筋薬、栄養物質、末梢血管拡張薬、プロゲステロン作用薬、プロスタグランジン、ビタミン、抗原性物質及びプロドラッグを含む。
【００４２】
本発明の組成物において使用されるＮＳＡＩＤＳの例は、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサラート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、Ｄｅａｃｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、ｅｌｅｃｏｘｉｂ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、Ｓｕｌｐｈｏｎａｎｉｌｉｄｅｓ、ニメスリド、ニフルム酸及びリコフェロンを含む。
【００４３】
各種形態の生理活性物質が使用されうる。これらは、制限なく、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミド、プロドラッグ形態などであり、被験者に移植、注入又はそうでなければ配置されたときに生物学的に活性化される。
【００４４】
ビトリゲル組成物は、良好な医療行為と合致した方法で処方、服用、投与される。この状況で考慮すべき要因は、治療されるべき特定の疾患、治療されるべき特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師により知られている他の要因を含む。投与されるべきビトリゲル組成物の「治療上有効な量」は、上記検討事項により影響され、関心のある疾患を防止、回復又は治療するのに必要な最小量とすることができる。本明細書において、用語「有効量」は治療（例えば予防薬又は治療薬）の総量を示すフレーズと等価であり、その総量は疾患の重症度及び／又は持続期間を低減し、その１つ又は複数の症状を回復し、疾患の進行を防止するか疾患の退縮を引き起こすのに十分であるか、疾患やその１つ又は複数の症状が発生、再発、開始または進行するのを予防するか、疾患を治療するのに有用な他の療法（例えば他の治療薬）の予防的及び／又は治療的効果を増強するか改善するのに十分である。
【００４５】
ある実施態様において、損傷組織の修復は、開腹手術及び腹腔鏡技法を含む、組織への接近と組織の修復を可能とするいかなる標準的な外科的プロセスの工程内でなされてもよい。損傷組織へ接近したら、必要であれば、外科的に許容しうる全てのパッチやインプラントに沿って本発明のビトリゲル組成物を損傷組織に接触して配置する。
【００４６】
さらなる実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルであって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含む、ガラス化マトリクスゲルの製造方法であって、ａ）コラーゲン水溶液を得るステップ、ｂ）シクロデキストリン水溶液を得るステップ、ｃ）ａ）の溶液及びｂ）の溶液を混合するステップ、ｄ）ｃ）の混合溶液をガラス化するのに十分な時間脱水するステップ、を含む製造方法を提供する。
【００４７】
本明細書において使用されるように、コラーゲンの水溶液は適切な緩衝液に溶解された全てのコラーゲン溶液である。コラーゲンの濃度は可変であるが、本発明の方法では１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するコラーゲン溶液を使用することができる。実施態様において、水溶液中のコラーゲン濃度は約５ｍｇ／ｍｌである。
【００４８】
本明細書において使用されるように、シクロデキストリンの水溶液は適切な緩衝液に溶解された全てのシクロデキストリン溶液である。シクロデキストリンの濃度は可変であるが、本発明の方法では２．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するシクロデキストリン溶液を使用することができる。
【００４９】
本発明の方法に従って、本発明の組成物の脱水及びガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を約５〜４０℃で約３０〜５０％間の相対湿度で約３〜２８日間乾燥させるステップを含む。実施態様において、本発明の組成物のガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を３９°Ｃで約７日間加熱するステップ、を含む。他の実施態様においては、本発明の組成物のガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を３９°Ｃで１４日間加熱するステップ、を含む。
【００５０】
用語「キャリア」は、治療薬が本発明のビトリゲル組成物を伴って供給される希釈液、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような生理的キャリアは水並びにピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油及び同様のものなどの石油、動物、植物又は合成起源のものを含む、油などの無菌液体とすることができる。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるとき、適切なキャリアである。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液のための、液体キャリアとして利用することができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。必要であれば、この組成物は少量の湿潤剤或いは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
【００５１】
緩衝液、酸及び塩基がｐＨを調製するためにこの組成物に包含されてもよい。この組成物から放出される薬剤の拡散距離を増加するための薬剤を含むこともできる。
【００５２】
緩衝剤によりｐＨを生理的条件に近付けた範囲に維持することができる。緩衝液は、好ましくは約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度範囲である。本発明で使用するための適切な緩衝剤は、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−１ナトリウムクエン酸塩の混合物等）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸１ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などの、有機及び無機酸の両方並びにその塩を含む。Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及び他の公知の緩衝液などのリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、トリメチルアミン塩緩衝液を使用することができる。
【００５３】
微生物の増殖を遅らせるために防腐剤を添加してもよく、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加してもよい。本発明での使用に適した防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、塩化アンモニウムオクタデシルジメチルベンジル、ｂｅｎｚｙａｃｏｎｉｕｍ  ｈａｌｉｄｅｓ（例えば、塩化物、臭化物及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールを含む。
【００５４】
本発明の液体組成物の生理的等張性を保証する等張化剤が存在し、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの、三価又はより高価な糖アルコールである、多価糖アルコール（ｐｏｌｈｙｄｒｉｃ  ｓｕｇａｒ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）を含む。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、重量で約０．１％〜２５％間、好ましくは１％〜５％の量で存在することができる。
【００５５】
生体内投与のために使用される製剤は、滅菌される必要がある。それは、例えば滅菌濾過膜でろ過することにより達成することができる。例えば、本発明の製剤は、ろ過により滅菌されてもよい。
【００５６】
１つ又は複数の実施態様に従って、本発明の組成物を含む提供された眼科用製剤があり、前記製剤は、患者の目に投与するのに適している。眼科用製剤は、５．５と７との間のｐＨを有してもよい。ある実施態様において、前記眼科用製剤は水性製剤である。ある実施態様において、前記眼科用製剤は単一容量ユニットの形である。ある実施態様において、前記眼科用製剤は防腐剤を含まない。前記眼科用製剤は、さらに抗酸化剤のような一つ又は複数の追加の薬剤を含んでもよい。前記眼科用製剤は、さらに一つ又は複数の涙代用品を含んでもよい。ある実施態様において、涙代用品の少なくとも一つは眼科用潤滑剤を含んでもよい（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）。
【００５７】
各種涙代用品が当該技術分野において公知となっており、グリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールなどのモノマーポリオール、ポリエチレングリコールなどのポリマーポリオール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロースエステル、デキストラン７０などのデキストラン、ゼラチンなどの水溶性タンパク質、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン及びポビドンなどのビニルポリマー、カルボマー９３４Ｐ，カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７４Ｐなどのカルボマーを含むが、これらに限定されるものではない。多くの上記涙代用品は市販されており、それらはＢｉｏｎ  Ｔｅａｒｓ（登録商標）、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ（登録商標）、Ｇｅｎｔｅａｌ（登録商標）、ＯｃｃｕＣｏａｔ（登録商標）、Ｒｅｆｒｅｓｈ（登録商標）、Ｔｅａｒｇｅｎ  ＩＩ（登録商標）、Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ（登録商標）、Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  ＩＩ（登録商標）、Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ  Ｆｒｅｅ（登録商標）及びＴｈｅｒａＴｅａｒｓ（登録商標）などのセルロースエステル、Ａｋｗａ  Ｔｅａｒｓ（登録商標）、ＨｙｐｏＴｅａｒｓ（登録商標）、Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｅｙｅｓ（登録商標）、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ（登録商標）及びＶｉｓｉｎｅ  Ｔｅａｒｓ（登録商標）などのポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されるものではない。涙代用品は、市販のＬａｃｒｉ−Ｌｕｂｅ（登録商標）軟膏などのパラフィンから構成されていてもよい。他の涙代用品として使用される市販の軟膏は、Ｌｕｂｒｉｆｒｅｓｈ  ＰＭ（登録商標）、Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｅｙｅｓ  ＰＭ（登録商標）及びＲｅｆｒｅｓｈ  ＰＭ（登録商標）を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加材があってもよい。
【実施例】
【００５８】
異なるシクロデキストリンが組み込まれたＩ型コラーゲンに基づく膜を以下のゲル化、ガラス化、及び再水和の３段階の順序で調製した。３種類のシクロデキストリン、すなわちα−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤを試験して比較した。
【００５９】
ＣＤ溶液の調製。各種ＣＤ（例えば、α、β及び官能基、ＣＯＯＨ、ｔ−ｂｕｔｙｌ、ＳＨ、ＮＨ２）溶液の全てを本明細書において記載した手順に従って調製した。例えば、ｄＨ２Ｏ中に２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳを伴うβ−ＣＤの溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し（５０ｍｌ  ｆａｌｃｏｎ  チューブに１ｍＬ  ＨＥＰＥＳ、４９ｍＬ  Ｈ２Ｏ及び１２５ｍｇ  β−ＣＤ）、完全に溶解するまで徹底的にボルテックスした。続いて、水酸化ナトリウム溶液（２Ｎ）を使用してこの溶液のｐＨを１１に増加させ、０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過し、そして１〜４℃で貯蔵した。
【００６０】
β−ＣＤコラーゲンゲルの調製。コラーゲンとＣＤとからなる各種ゲルを、本明細書に記載の手順により調製した。例えば、当量のβ−ＣＤ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬで、上述した通り調製した）及びコラーゲン酢酸溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を混ぜ合わせ、調製期間を通して４℃未満に維持した。混合に起因する気泡の形成を防止することに特に注意を払った。その後、その混合物をゲルモールドに移し、３７℃、１００％相対湿度のインキュベータで２時間維持した。
【００６１】
β−ＣＤコラーゲンのガラス化及び後処理。３７℃で２時間のインキュベーション後、ゲルを１８時間５℃（４０％相対湿度）のガラス化チャンバーへ移した。次に、ゲルを１週間４０℃のガラス化チャンバー（４０％相対湿度）に移した。１週間後、脱水したβ−ＣＤコラーゲン膜（ビトリゲル）をｄＨ２Ｏで３０分間再水和した。必要であれば、ビトリゲルを３７℃３０分間ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＥＤＡＣ及び０．１％ＮＨＳを使用して架橋し、微量のＥＤＡＣ及びＮＨＳを除去するために少なくとも５回ｄＨ２Ｏを使用してビトリゲルを洗浄した。図１Ｂに示すように、前記親水性官能基はラメラ構造を誘導する。
【００６２】
２つのコラーゲン膜、すなわちコラーゲンビトリゲル及び架橋ビトリゲルを、前述した手順（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４（２０１３）９３６５−９３７２）に従って対照として調製した。通常のビトリゲルと比較して、架橋ビトリゲルはゲル化工程の前にコラーゲン媒体混合物中に０．６％の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．６％のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加して製作した。コラーゲンとＣＤとの間の特異的な相互作用は示差走査熱量測定（ＤＳＣ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して評価された。ＣＤ−ｃｏｌ膜の吸収は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して測定された。膜の縫合可能性は、１０−０ナイロン縫合糸によりＥｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ  ３２００試験装置（Ｂｏｓｅ、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）を使用して試験した。
【００６３】
角膜実質細胞を、連続的なコラーゲン分解酵素（２型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）による消化を使用して全層角膜から分離した。消化した細胞を、回収し、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞のペレットを再懸濁し、通常の組織培養プレート（ＴＣＰ）又はＣＶ被覆プレート上で３７°Ｃ、５％ＣＯ２で培養した。無血清培地か血清ベースの培地を使用した。無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１％の１０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．５％の１．２５ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からなる。血清ベースの培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、１％の１０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．５％の１．２５ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢを含む。細胞を、無血清培地を使用して５０００細胞／ｃｍ２の濃度で、一方血清に基づく培地を使用して１０００細胞／ｃｍ２の濃度でプレーティングした。画像解析及び遺伝子発現解析の前に、角膜実質細胞を無血清培地中で３週間を超えて又は血清に基づく培地中で６日を超えて培養した。角膜実質細胞の形態は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色することにより試験した。インドメタシンは、一定期間０．１％インドメタシン点眼薬にガラス化膜を浸漬することによりビトリゲル内に被包された。ビトリゲルからのインドメタシンの溶出は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定した。遊離溶液は、５１：４９（ｖ／ｖ）のアセトニトリル：水の移動相、Ｃ１８カラム及び３１８ｎｍに設定したＵＶ／ＶＩＳ検出器を用いて試験した。
【００６４】
実施例１
全ての３つのシクロデキストリン、特にα−ＣＤは、透明で機械的強度のあるＣＤ−ｃｏｌ膜の形成につながる、Ｉ型コラーゲントリプルへリックスとの強い相互作用を示した。図１Ａに示されるように、通常のビトリゲルは熱流中５５°Ｃで大きく幅の広い吸熱ピークを示し、このことによりコラーゲン膜は４０．８Ｊ／ｇのエンタルピーで熱変性を引き起こすことが示された。対照的に、架橋ビトリゲルの対照試料においては認識可能なピークが見られず、架橋反応によるコラーゲン膜の熱変性が示唆された。通常のビトリゲルと比較して、コラーゲン膜にα‐ＣＤを加えることにより、増強された熱安定性を示す、熱変性温度の増加が引き起こされた。α−ＣＤ−ｃｏｌにおいては、単独のより狭いピークのみが観察され、これはマトリクスが均質な構造を有することを意味する。もしエンタルピーの全てがコラーゲントリプルへリックスの熱転移に由来すると仮定すると、α−ＣＤ−ｃｏｌの変性エンタルピーは通常のビトリゲル由来のエンタルピーの７０．１％であり、コラーゲン線維形成の減少を示唆している。同様の結果はβ−ＣＤ−ｃｏｌ及びγ−ＣＤ−ｃｏｌでも観察された。
【００６５】
実施例２
従来のコラーゲン膜と比較して、ＣＤ−ｃｏｌ膜は非常に増強された透明度を示し（図２）、これはコラーゲン線維形成の減少により説明されうる。
【００６６】
１型コラーゲンＣＤ膜は、角膜再生のための最適化された光学的及び機械的特性を備えるように開発された。ＣＤは、内側疎水性コアと外側親水性環とを有する６個から８個のグルコース分子から成る環である。３個の全てのＣＤ，特にα−ＣＤは、コラーゲン三重らせんと強い相互作用を示し、機械的強度の強いコラーゲンＣＤ膜の形成につながる。コラーゲンＣＤ膜は、従来のコラーゲン膜より著しく高い透明度を示し、それは従来のコラーゲン膜（〜８０ｎｍ）と比較してコラーゲンＣＤ膜のコラーゲン原線維直径（〜２０ｎｍ）が非常に低減したことにより説明されうる。さらに、従来のコラーゲン膜が無秩序な原線維の組織化を示すのと異なり、おそらくＣＤによるコラーゲン三重らせん構造の再構築によりコラーゲン−ＣＤ膜はある領域で整列した原線維を示した。さらに、コラーゲン−ＣＤ膜は眼科用薬剤、インドメタシンを点眼薬から吸収し、その後その薬剤を５時間までゆっくりと放出することができることが見出された。
【００６７】
１型コラーゲン膜中へのシクロデキストリンの組み込みにより、コラーゲンの線維形成及び整列が制御され、膜の光学的、機械的及び薬剤放出特性が改善された。
【００６８】
実施例３
本発明の組成物は優れた機械的特性を実証した。その厚さがヒトの角膜の厚さと比較可能な時（すなわち、〜５００μｍ）、縫合のために十分な強度になった。図３に示すように、ナイロン縫合糸を、厚さが５２０μｍであるα−ＣＤ−ｃｏｌ膜における穴を通して引っ張った。縫合糸の応力の元、その厚みのある膜における穴は、厚さが１７０μｍである薄い膜において観察されたような膜を通しての引き裂き（図４）ではなく、引き延ばされただけだった。
【００６９】
実施例４
コラーゲンのナノ構造は、細胞応答を特徴づける。ウシ角膜実質細胞の初代培養は、低密度及び高密度のコラーゲンを有するビトリゲル組成物上でなされた。図５に示されるように、本発明の組成物のコラーゲン密度により、通常のビトリゲル対照と比較したとき、角膜実質細胞は培地中でより大きな突起領域を有した。さらに、本発明のビトリゲル組成物のコラーゲン密度の関数が増加することに応じて、角膜実質細胞の細胞突起の総数は著しく増加した（図５）。
【００７０】
実施例５
角膜実質細胞の遺伝子発現は、原線維の構造に依存する。角膜実質細胞を、対照ビトリゲル上で又は５℃又は３９℃で脱水された本発明のビトリゲル組成物と共に培養した。血清に基づく培地中での６日間の増殖後、細胞は回収され、ケラトカン、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）及びビグリカンの遺伝子発現を解析した。これらの遺伝子の発現は、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して培養した角膜実質細胞から全ＲＮＡを分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡへ逆転写し、それからＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でリアルタイムＰＣＲ反応を使用してｃＤＮＡを試験することにより解析した。図６に示されるように、対照と比較した時、細胞を高温で脱水したビトリゲル組成物で増殖した時、ケラトカン及びＡＬＤＨの遺伝子発現は大いに増加した。低温と高温との両方で対照と比較した時、ビグリカンの発現はビトリゲル組成物において減少した。
【００７１】
実施例６
本発明のビトリゲル組成物は、生理活性物質を送達するために使用されうる。ビトリゲル組成物は上述のように調製され、ビトリゲルを水和した後市販の点眼薬製剤の０．１％インドメタシンエタノール溶液を２滴使用して１０分間又は１ｍＬの点眼薬に浸漬させて一晩のいずれかでこの組成物に添加し、ＨＰＬＣを用いて遊離速度式を試験した。ビトリゲル組成物が５時間を超えて、ビトリゲル組成物からインドメタシンを遊離することが見出された。
【００７２】
角膜再生のための最適化した光学的及び機械的特性を備えた本発明のＩ型コラーゲン−ＣＤ組成物が、開発された。いかなる特定の理論に限定されるものではないが、これらの特性はおそらくシクロデキストリンが組み込まれたコラーゲン組成物における制御されたコラーゲン線維形成に起因する（図７）。これらの本発明の組成物は、角膜修復及び角膜治療のための治療的アイパッチとして使用されうる大きな可能性がある。本明細書において開示された組成物及び方法は軟骨組織、皮膚及び血管などの線維形成コラーゲン由来の他の結合組織の再生にも有用である可能性がある。
【００７３】
実施例７
コラーゲン原線維が組織化する時のコラーゲンとシクロデキストリンの相互作用の効果を調べた。酸性溶液中の１型コラーゲンを各種組成物から成るシクロデキストリン溶液と混合する。その後、この溶液を中和してゲルを形成するようｐＨを上げることができる。これらのゲルは、それから一週間以上ガラス化され、続けてＣＤ−Ｃｏｌのドライシートを再水和した。治療の際の上記インプラントの要件を満たすため、試料の各種特性評価がなされた。
【００７４】
材料を以下のように調製した。ヒドロゲルを適切なバッファー中の１型コラーゲン及びシクロデキストリン溶液を使用して形成した。ガラス化工程は制御された温度及び相対湿度で一週間以上なされた。シクロデキストリンコラーゲンガラス化インプラントは再水和された。
【００７５】
試料は、以下の臨床特性／試験を要求された：光透過率、透過型電子顕微鏡、機械的試験、生体外生体適合性試験、予備的生体内試験。
【００７６】
これらの調製されたシクロデキストリン／コラーゲンマトリクスは、特にシクロデキストリンを含まない従来のビトリゲルと比較して、５００ミクロンの厚さでさえ、透明だった。さらに、シクロデキストリンの型及び官能基に依存して、透明度の変化が見られた。これらのインプラントの多くは、ヒトの角膜に匹敵する透明度、すなわち可視光領域で９０％を超える透明度を示した。驚くべきことに、これらの厚いシートは、十分な力で、薄いシートに層ごとに分離されることが観察された（図１３）。このことは、これらをＴＥＭで可視化し、これらの層の由来は何かを解明することを促した。各種の超微細構造が見られた。特に興味深かったのは、ＣＯＯＨ官能基を有するＣＤであり、それは天然の角膜実質のラメラと同様の自己組織化ラメラを示した（図１４を参照）。これらはラメラへ自己組織化するだけでなく、断面図で見られるように、各ラメラのコラーゲンは線維の整列を示し、隣接するラメラの線維は各々直交していた（図１５を参照）。機械的試験は個別のＣＤ化学成分を有するインプラントの強度を測定し、ＣＤの型間の幅広い差異を見るためになされた。興味深いことには、β−ＣＤコラーゲンインプラントは最も高いヤング率を有しており、下方のグラフに見られるように、ＣＤを備える全てのインプラントは破断時に非常に高いひずみを示した−これは、これらの材料が、直接破壊抵抗又はこの場合は縫合可能性に置き換えられる、高い伸縮性を有することを示唆しているということである。このインプラントが生体適合性であることを確証するために、生体外でインプラントと共に角膜実質細胞と上皮細胞の両者の細胞培養が試験された。見られるように、このインプラントはこれらの表面で成長するのに何の問題も見られなかった（図１７）。さらに、幾分異例だが、皮下での生体適合性も試験した。もし皮下インプラントによりいかなる有害な免疫反応も生じなければ、これらのインプラントは免疫に特権を有する角膜に負の効果を与えない可能性が最も高いと言える（図１８）。加えて、これらのインプラントは眼の曲率に一致するように特殊な金型で開発することができた。右に見られるように、このインプラントは角膜表面にうまく位置している。
【００７７】
予備的研究がウサギの目にこれらの角膜を移植することによってなされた。通常の断続縫合により、この材料をうまく保持することができた（図１９）。ＣＤ分子は人工シャペロンとして働くと結論付けられ、天然の角膜の組織化を模倣するコラーゲン原線維の集合へ誘導する。ＣＤコラーゲンインプラントは、生体適合性及び角膜模倣特性を有する。ＣＤコラーゲンインプラントは、高い透明度、縫合可能性の容易さ、及び生体模倣性超微細構造により角膜代替物としての可能性を示す。
【００７８】
本明細書において引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照は、各参考文献が個々にかつ具体的に参照により組み入れられることが示されて、その全体が本明細書に記載されているように同程度に参照により組み込まれる。
【００７９】
本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）使用は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を含めると解釈されるべきである。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、特に断りのない限り開放用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」の意味）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略な方法として機能することを意図するだけであり、各個別の値は本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、いかなる適切な順序で実施されてもよい。本明細書において提供される任意の及び全ての実施例又は例示的文言（「ｓｕｃｈ  ａｓ」など）の使用は、単に本発明を容易に理解させることを意図したものであり、特に断らない限り本発明の範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であると主張されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様は、発明者に知られている最良の実施態様を含め、本明細書において記載されている。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読めば当業者に明らかになるだろう。発明者は、当業者がこのような変形を適切に利用することを期待し、発明者は本発明が本明細書において具体的に記載されたのとは異なる方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、関連法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および等価物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、それらのすべての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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