(57)【要約】  本発明は、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンおよびそのような修飾コラーゲンの製造方法を提供する。そのような修飾コラーゲンを含む創傷被覆材、特に、そのような修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む創傷被覆材も提供される。【選択図】図２
2018512441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
−  Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数等のコラーゲン等、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップと、
−  Ｓ−Ｓ結合の還元により、Ｓ−Ｓ結合を含む前記コラーゲンに−ＳＨ基を導入して−ＳＨ基を含むコラーゲンチオールを提供するステップと、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基をニトロソ化して修飾コラーゲンを提供するステップであって、前記修飾コラーゲンがＳ−ニトロソ基を含むステップと
を含む、修飾コラーゲンを生成する方法。
【請求項２】
Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップが、少なくとも、
−  リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数等、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むコラーゲン供給源を提供するステップと、
−  コラーゲン供給源を、ジスルフィド基を含む活性化されたジカルボン酸誘導体と反応させて、活性化されたジカルボン酸誘導体のカルボニル官能基と、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方のε−ＮＨ２基との間にアミド結合を形成し、それにより、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性化されたジカルボン酸誘導体が、式：
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＺ  （Ｉ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、二価の連結基を表し、
ＺＮは、一体的に、窒素含有ヘテロ環式基を表す］
の化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
活性化されたジカルボン酸誘導体が、化合物：
【化１】
2018512441.tif 000014
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ−Ｓ結合の還元により、Ｓ−Ｓ結合を含む前記コラーゲンに−ＳＨ基を導入して−ＳＨ基を有するコラーゲンチオールを提供するステップが、
−  Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを、ジチオスレイトールと反応させること
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
−ＳＨ基のニトロソ化が、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、酸性化亜硝酸塩の溶液と反応させること、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、ガス状のＮＯと反応させること、および
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、Ｓ−ニトロソチオールと反応させること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
−  修飾コラーゲンを、ＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つもしくは複数に組み込むステップ、または
−  修飾コラーゲンをポリマーに組み込むステップ
をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等のコラーゲンが、天然もしくはＧＭＯ供給源等の哺乳動物または非哺乳動物供給源に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
非哺乳動物供給源が、クラゲ、海洋無脊椎動物および魚類から選択される１つまたは複数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、修飾コラーゲン。
【請求項１１】
Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲン、特に、Ｓ−ニトロソ基を含むリシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸ型のうちの１つまたは複数の修飾コラーゲン等、Ｓ−ニトロソ基を含むリシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む修飾コラーゲン。
【請求項１２】
修飾コラーゲンが、天然もしくはＧＭＯ供給源等の哺乳動物または非哺乳動物供給源に由来する、請求項１１に記載の修飾コラーゲン。
【請求項１３】
非哺乳動物供給源が、クラゲ、海洋無脊椎動物および魚類から選択される１つまたは複数である、請求項１２に記載の修飾コラーゲン。
【請求項１４】
式（ＩＸ）：
【化２】
2018512441.tif 000015
［式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して、二価の連結基であり、好ましくは、独立して、エタンジイルまたはプロパンジイル基、最も好ましくは、エタンジイル、すなわち−ＣＨ２ＣＨ２−を表し、
Ｒ５は、ＨまたはＯＨであり、
Ｘは、ＯＨ基 または化学結合から選択され、Ｙは、Ｈまたは化学結合から選択され、但し、ＸおよびＹのうちの一方または両方は、修飾コラーゲン内でペプチド結合を形成する化学結合である］
のリシンまたはヒドロキシリシン残基を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の修飾コラーゲン。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の修飾コラーゲン。
【請求項１６】
創傷治癒において使用するための、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の修飾コラーゲン。
【請求項１７】
クラゲに由来するＩＩ型コラーゲン、クラゲに由来するＶ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つまたは複数に組み込まれた、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む、創傷被覆材。
【請求項１８】
任意のポリマー・マトリックスに組み込まれた、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む、創傷被覆材。
【請求項１９】
前記配合組成物が、フィルム、膜またはヒドロゲル複合物である、請求項１８に記載の創傷被覆材。
【請求項２０】
前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物が、５から１０００マイクロメートルまでの範囲内の厚さを有する、請求項１９に記載の創傷被覆材。
【請求項２１】
前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物が、好ましくは創傷被覆材の形成中に滅菌される、請求項１９または請求項２０に記載の創傷被覆材。
【請求項２２】
前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物が、多孔質構造を有する、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の創傷被覆材。
【請求項２３】
クラゲに由来する前記コラーゲンが、Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ  ｐｕｌｍｏクラゲ組織を含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の創傷被覆材。
【請求項２４】
食品グレードの作用物質をさらに含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の創傷被覆材。
【請求項２５】
医療グレードの作用物質をさらに含む、請求項１７から２３に記載の創傷被覆材。
【請求項２６】
血管拡張剤として使用するための、請求項１７から２５に記載の創傷被覆材。
【請求項２７】
消毒剤として使用するための、請求項１７から２５に記載の創傷被覆材。
【請求項２８】
細菌、酵母、真菌およびウイルスに対して抗菌特性を有する、請求項２７に記載の創傷被覆材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管拡張、抗炎症および消毒効果のうちの１つまたは複数を有する、修飾コラーゲン分子の製造のための方法を提供する。より具体的には、本発明は、他のコラーゲン種および他のポリマーのうちの一方または両方と配合されて、フィルム、膜、ヒドロゲル、および創傷治癒医療用デバイスとして適用するための安定なゲルまたは膜ベースの足場を生成できる他の構築物を製作することができる、修飾コラーゲンに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要タンパク質であり、総タンパク質含有量の２５％および皮膚の７０％から８０％（乾燥重量）を構成する、哺乳動物において見いだされる最も豊富なタンパク質である。すべてのコラーゲン分子の中心的な特色は、それらの堅固な三重鎖らせん構造である。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型は、結合組織において見られるコラーゲンの主な型であり、体内のすべてのコラーゲンの９０％を構成する。
【０００３】
以前、コラーゲンは、構造支持体としてのみ機能すると考えられていたが、現在は、コラーゲンおよびコラーゲン由来フラグメントが、細胞の形状および分化、移動、ならびに若干数のタンパク質の合成を含む多くの細胞機能を制御することが明白である。所見は、正確な細胞外マトリックス分子との細胞接触が、マトリックス沈着の分量および質を調節することにより、細胞挙動に影響を及ぼすことを示唆している。
【０００４】
創傷治癒は、多様な免疫と生物システムとの間の協調的な相互作用を伴う複雑なプロセスである。長期創傷は、年間およそ６百万人の患者を冒し、高い経済的影響がある、依然として困難な臨床的問題のままである。
【０００５】
創傷治癒は、皮膚（または別の臓器組織）が傷害後に自ら回復するプロセスである。正常な皮膚において、表皮（最外層）および真皮（内または深層）は、定常状態の均衡のなかに存在し、外部環境から遮蔽されている。皮膚が破壊されると、創傷治癒の正常な（生理的な）プロセスが始まる。創傷治癒の古典的なモデルは、３または４つの連続的であるが重複している段階を含む：
第１段階：止血。
第２段階：炎症。
第３段階：増殖。
第４段階：リモデリング。
【０００６】
皮膚への傷害時、一連の複雑な生化学的事象が緊密に組織化されたカスケードで起こって、損傷を修復する。若干数の潜在的な刺激（局所組織虚血、バイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）、壊死組織、反復性外傷等）により、創傷は、創傷の慢性化に寄与する炎症段階で立往生することがある。慢性創傷の１つの主要成分は、上昇したレベルのマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）である。上昇したレベルにおいて、ＭＭＰは、生育不能なコラーゲンだけでなく、生育可能なコラーゲンも分解する。加えて、慢性創傷内の線維芽細胞は、ＭＭＰの活性を制御するために十分なレベルでＭＭＰの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を分泌しない可能性がある。これらの事象は、細胞移動に必要とされる足場の形成を防ぎ、最終的に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および肉芽組織の形成を防ぐ。
【０００７】
コラーゲンベースの創傷被覆材は、創傷内で「犠牲基質（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」として作用することにより、上昇したレベルのＭＭＰの問題に対処するのに比類なく適している。コラーゲン分解産物は、肉芽組織の形成に必要とされる様々な細胞型に対して走化性であることも実証されている。加えて、コラーゲンベースの被覆材は、創傷滲出液を吸収し、湿った創傷環境を維持する能力を有する。
【０００８】
たくさんの異なるコラーゲン被覆材が利用可能であり、これらは、ゲル、ペースト、ポリマー、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の様々な担体／組合せ剤を用いる。これらの生成物内のコラーゲンは、ウシ、ブタ、ウマまたは鳥類供給源に由来する傾向にあり、非抗原性にするために精製される。所与のコラーゲン被覆材中のコラーゲンは、濃度および種類が異なり得る。ある特定のコラーゲン被覆材は、Ｉ型（ネイティブ）コラーゲンから構成されるのに対して、他のコラーゲン被覆材は、変性コラーゲン（ゼラチン）も含有する。所与のコラーゲン被覆材は、吸収性、柔軟性および快適さを強化し、湿った創傷環境を維持するのを助けることができる、アルギン酸塩およびセルロース誘導体等の原料を含有してよい。
【０００９】
研究は、いくつかのコラーゲンベースの被覆材が、線維芽細胞の生成における有意な増大を生じ；線維芽細胞透過を促す際に重要となり得る親水性特性を有し；線維芽細胞を誘引し、細胞の定方向性移動（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を引き起こすことによって、配向し、組織化されたコラーゲン繊維の沈着を強化し；フィブロネクチンの取り込みおよびバイオアベイラビリティを補助し；白血球、マクロファージ、線維芽細胞および上皮細胞を保存するのを助け；創傷の化学的および恒温性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃ）の微小環境の維持を援助することを示した。数種のコラーゲン被覆材の作用機序には、過剰なＭＭＰ阻害または失活が含まれる。言及した通り、過剰ＭＭＰは、創傷慢性化の主要誘因である。
【００１０】
コラーゲン被覆材は、様々な細孔径および表面積も有する。これらの属性のすべては、被覆材の創傷管理態様を強化するように設計される。多くのコラーゲン被覆材は、創傷内の病原体を制御するために、抗菌剤を含有する。コラーゲン被覆材は、典型的には、二次被覆材を必要とする。
【００１１】
ＮＯは、体の多くの組織および臓器において生成される揮発性ガスであり、細胞間のシグナル伝達機構として作用する。ＮＯは、
・  血管拡張
・  血管新生の刺激
・  免疫応答の調節
・  強力な抗菌活性
を含む数種の効果を発揮する。
【００１２】
近年、ＮＯは、創傷治癒における絶対不可欠な分子として台頭してきたものであり、ＮＯレベルは、皮膚損傷後に急速に増大し、治癒プロセスが進むにつれて次第に減少する。Ｈａｎ  Ｇらによる、「Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ」と題された、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２；第１８０巻、第４号、４月の研究において、著者らは、マウスにおける創傷治癒に対する新規ＮＯ放出ナノ粒子技術の効果を実証した。結果は、ＮＯナノ粒子（ＮＯ−ｎｐ）が、創傷治癒を有意に加速できることを示した。ＮＯ−ｎｐは、白血球移動を修飾し、創傷エリアにおける腫瘍成長因子−βの生成を増大させ、これが、その後、血管新生（血流）を促進して治癒プロセスを強化できることも分かった。著者らは、ヒト皮膚線維芽細胞を使用して、ＮＯ−ｎｐが、負傷した組織における線維芽細胞移動およびコラーゲン沈着を増大させることも実証した。このデータは、ＮＯ放出ナノ粒子が、創傷治癒を多面的な様式で変調し加速する能力を有することを示す。
【００１３】
ＮＯナノ粒子は、局在化ＮＯ効果を実現させることが可能なはずであることを実証したが、創傷ケア・デバイスを開発する方法として、コラーゲン−ＮＯ足場を作製する能力は実証されていない。
【００１４】
ＮＯの臨床使用は、主に、それを標的組織に有効に送達し、材料中にＮＯを安定な形態で保存することも可能にするという技術的な課題により、現在まで最小限であった。ＮＯの追加の技術的な課題は、医療用デバイスから分子を、その特定の使用のために正しい速度（反応速度論）で放出させることを可能にすることを含む。
【００１５】
糖尿病性足部潰瘍創傷において、関連する慢性微生物感染および炎症の組合せは、毛細血管劣化（血流の低減）および切断術につながり得る。糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を標的とする医療用デバイスは、
・  関連する感染症を低減させる際の臨床的有用性を提供すること
・  病変領域への血流を刺激する能力を提供すること
・  創傷治癒を促進すること
・  ＤＦＵの治療のための、より安全でより効果的な製品への高まる市場の需要を満たすこと
が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、外因性ＮＯ、特に、哺乳動物または海洋供給源のいずれかに、より好ましくはクラゲに由来する、Ｓ−ニトロソコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩベースの足場等のＳ−ニトロソコラーゲンベースの足場を送達するためのＳ−ニトロソコラーゲンの開発を介して、上記で概説した問題を満たすことを求める。この技術の有用性は、血流を刺激するのを助けるための一酸化窒素（ＮＯ）の局在化および制御放出の生成、ならびにまた、ＤＦＵに関連する微生物感染の治療である。現在の治療戦略は、ＤＦＵの治療において次善であると証明されており、新たな治療的アプローチならびに短期および長期両方の創傷管理のための技術の開発に焦点を合わせることが必須である。
【００１７】
本発明は、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンの合成を伴う創傷ケアのためのＮＯ放出システムを提供する。
【００１８】
チオ亜硝酸とも呼ばれるＳ−ニトロソチオールは、活性酸素種による不活性化からの不安定なＮＯラジカルを安定させ、それにより、一酸化窒素を創傷損傷部位に送達して、血流の増大および微生物感染の有効な治療を生じさせることによって、内皮弛緩因子（ＥＤＲＦ）の作用機構において担体として役立ち得る。
【００１９】
外因性ＮＯを供給する能力は、体の自然防御およびシグナル伝達システムを修復するため、有利である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の態様において、少なくとも、
−  Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップと、
−  Ｓ−Ｓ結合の還元により、Ｓ−Ｓ結合を含む前記コラーゲンに−ＳＨ基を導入して−ＳＨ基を含むコラーゲンチオールを提供するステップと、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基をニトロソ化して修飾コラーゲンを提供するステップであって、前記修飾コラーゲンがＳ−ニトロソ基を含むステップと
を含む、修飾コラーゲンを生成する方法が提供される。
【００２１】
一実施形態において、コラーゲンは、好ましくは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンである。別の実施形態において、コラーゲンは、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン以外のコラーゲンである。
【００２２】
一実施形態において、コラーゲンは、好ましくは、Ｉ、ＩＩおよびＶ型のうちの１つまたは複数である。別の実施形態において、コラーゲンは、好ましくは、ＩＶおよびＸＩ型様材料のうちの１つまたは複数である。
【００２３】
一実施形態において、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲン提供するステップは、少なくとも、
−  リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むコラーゲン供給源を提供するステップと、
−  コラーゲン供給源を、ジスルフィド基を含む活性化されたジカルボン酸誘導体と反応させて、活性化されたジカルボン酸誘導体のカルボニル官能基と、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方のε−ＮＨ２基との間にアミド結合を形成し、それにより、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップと
を含む。
【００２４】
別の実施形態において、コラーゲン供給源は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数であり、前記コラーゲン供給源は、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含み、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数である。
【００２５】
別の実施形態において、コラーゲン供給源は、ペプシン可溶化コラーゲンおよび酸可溶化コラーゲンのうちの一方または両方から選択され、好ましくは、ペプシン可溶化コラーゲンである。
【００２６】
別の実施形態において、活性化されたジカルボン酸誘導体は、式：
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＺ  （Ｉ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、二価の連結基を表し、
ＺＮは、一緒に、窒素含有ヘテロ環式基を表す］
の化合物である。
【００２７】
別の実施形態において、活性化されたジカルボン酸誘導体は、化合物：
【００２８】
【化１】
2018512441.tif 000003
を含む。
【００２９】
別の実施形態において、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップは、少なくとも、
−  −ＳＨ基を含むシステイン残基を含むコラーゲン結合タンパク質を提供するステップと、
−  コラーゲン結合タンパク質のシステイン残基−ＳＨ基を、光反応性架橋剤と反応させて、Ｓ−Ｓ基を含む光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質を提供するステップと、
−  光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質を、コラーゲンと組み合わせて、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質およびコラーゲンの複合体を提供するステップと、
−  複合体に電磁放射を照射し、光反応性架橋剤をコラーゲンと架橋させて、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供するステップと
を含む。
【００３０】
別の実施形態において、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数である。
【００３１】
別の実施形態において、システイン残基を含むコラーゲン結合タンパク質を提供するステップは、コラーゲン結合タンパク質の部位特異的突然変異誘発によって行われる。
【００３２】
別の実施形態において、光反応性架橋剤は、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）であり、電磁放射は、紫外線放射である。
【００３３】
別の実施形態において、Ｓ−ニトロソ基は、修飾コラーゲン上のタンパク質結合部位の付近にある。
【００３４】
別の実施形態において、Ｓ−Ｓ結合の還元により、Ｓ−Ｓ結合を含む前記コラーゲンに−ＳＨ基を導入して−ＳＨ基を有するコラーゲンチオールを提供するステップは、
−  Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを、ジチオスレイトールと反応させること
を含む。
【００３５】
別の実施形態において、−ＳＨ基のニトロソ化は、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、酸性化亜硝酸塩の溶液と反応させること、
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、ガス状のＮＯと反応させること、および
−  コラーゲンチオールの−ＳＨ基を、Ｓ−ニトロソチオールと反応させること
のうちの１つまたは複数を含む。
【００３６】
別の実施形態において、−ＳＨ基のニトロソ化は、ＥＤＴＡ等のキレート化剤の存在下で行われる。
【００３７】
別の実施形態において、−ＳＨ基のニトロソ化は、５℃未満の温度、好ましくは０℃未満の温度等の室温未満で行われる。
【００３８】
別の実施形態において、方法は、
−  修飾コラーゲンを、ＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つもしくは複数に組み込むステップ、または
−  修飾コラーゲンを、ポリマー、好ましくは、フィルム形成ポリマー、膜形成ポリマー、ヒドロゲル形成ポリマー、もしくはフィルム、膜、ヒドロゲル、および安定なゲルもしくは膜ベースの足場を生成できる他の構築物を製作することができるポリマーに組み込むステップ
をさらに含む。
【００３９】
別の実施形態において、コラーゲン、特に、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンは、天然もしくはＧＭＯ供給源等の哺乳動物または非哺乳動物供給源に由来する。
【００４０】
別の実施形態において、非哺乳動物供給源は、クラゲ、海洋無脊椎動物および魚類から選択される１つまたは複数である。
【００４１】
別の実施形態において、非哺乳動物供給源に由来するコラーゲン等のコラーゲンは、アテロコラーゲンである。
【００４２】
第２の態様において、第１の態様の方法またはその実施形態によって取得可能な修飾コラーゲンが提供される。
【００４３】
第３の態様において、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンが提供される。
【００４４】
一実施形態において、修飾コラーゲンは、好ましくは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンに由来する。別の実施形態において、コラーゲンは、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン以外のコラーゲンである。
【００４５】
一実施形態において、修飾コラーゲンは、天然もしくはＧＭＯ供給源等の哺乳動物または非哺乳動物供給源に由来する。
【００４６】
別の実施形態において、修飾コラーゲンの由来源である非哺乳動物供給源は、クラゲ、海洋無脊椎動物および魚類から選択される１つまたは複数である。
【００４７】
別の実施形態において、修飾コラーゲンは、アテロコラーゲンに由来する。アテロコラーゲンは、コラーゲン供給源のペプシン酵素消化によって生成され得る。
【００４８】
別の実施形態において、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンは、式（ＩＸ）：
【００４９】
【化２】
2018512441.tif 000004
［式中、Ｒ１およびＲ３は、上記で定義した通りであり、好ましくは、独立して、エタンジイルまたはプロパンジイル基、最も好ましくは、エタンジイル、すなわち−ＣＨ２ＣＨ２−を表し、
Ｒ５は、ＨまたはＯＨであり、
Ｘは、ＯＨ基 または化学結合から選択され、Ｙは、Ｈまたは化学結合から選択され、但し、ＸおよびＹのうちの一方または両方は、修飾コラーゲン内でペプチド結合を形成する化学結合である］
のリシンまたはヒドロキシリシン残基を含む。
【００５０】
第４の態様において、修飾コラーゲンは、医薬として使用するためのものである。
【００５１】
一実施形態において、修飾コラーゲンは、創傷治癒において使用するためのものである。
【００５２】
別の実施形態において、創傷治癒は、創傷、好ましくは潰瘍、より好ましくは糖尿病性潰瘍、特に糖尿病性足部潰瘍の治療である。
【００５３】
第５の態様において、クラゲに由来するＩＩ型コラーゲン、クラゲに由来するＶ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つまたは複数に組み込まれた、修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む、創傷被覆材が提供される。
【００５４】
第６の態様において、コンドロイチン、ヒアルロン酸、ケイ素、または創傷用途に適用可能ないくつかの他のポリマーベースの技術のいずれかを含むポリマーベースのマトリックス足場に組み込まれた、修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む、創傷被覆材が提供される。
【００５５】
創傷被覆材の一実施形態において、配合組成物は、フィルム、膜またはヒドロゲル複合物である。
【００５６】
創傷被覆材の別の実施形態において、前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物は、５から２００マイクロメートルまでの範囲内の厚さを有する。
【００５７】
創傷被覆材の別の実施形態において、前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物は、好ましくは創傷被覆材の形成中に滅菌される。
【００５８】
創傷被覆材の別の実施形態において、前記フィルム、膜またはヒドロゲル複合物は、多孔質構造を有する。
【００５９】
創傷被覆材の別の実施形態において、クラゲに由来する前記コラーゲンは、Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ  ｐｕｌｍｏクラゲ組織を含む。
【００６０】
創傷被覆材の別の実施形態において、これは、食品グレードの作用物質をさらに含む。
【００６１】
創傷被覆材の別の実施形態において、これは、医療グレードの作用物質をさらに含む。
【００６２】
創傷被覆材の別の実施形態において、これは、特に血流制御に関して、強化された血管拡張効果を有する。
【００６３】
創傷被覆材の別の実施形態において、これは、消毒剤として作用する。
【００６４】
創傷被覆材の別の実施形態において、これは、特に、細菌、酵母、真菌およびウイルスに対して抗菌特性を有する。
【００６５】
第７の態様において、酸性化亜硝酸塩に由来する一酸化窒素（ＮＯ）への曝露、ＮＯガスへの曝露およびＳ−ニトロソチオールとの反応のうちの１つまたは複数を含む、コラーゲンチオール内の−ＳＨ含有基のＳ−ニトロソ化の方法が提供される。
【００６６】
一実施形態において、修飾コラーゲンは、過剰のＳ−ニトロソチオールで処理される。
【００６７】
別の実施形態において、Ｓ−ニトロソチオールは、Ｓ−ニトロソ−グルタチオン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンおよびＳ−ニトロソ−システインを含む群から選択される１つまたは複数である。
【００６８】
ここで、例示する事のみを目的として、添付の図を参照し、本発明の実施形態について記述する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１ａ】本明細書において開示されている方法において使用することができる、光反応性架橋剤、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）の構造を示す図である。
【図１ｂ】スルフヒドリル基を、本明細書において開示されている通りのコラーゲンに導入する１つの方法のためのスキームを示す図である。
【図２】以下の実施例において詳述される通り、ニトロソ化剤で１０分処理後の、Ｓ−Ｈ基を含む修飾コラーゲンの２９０から３６５ｎｍの波長範囲における吸収スペクトルを、ニトロソ化剤が添加されなかった対照試料と一緒に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
下記の詳細な記述において、本発明の徹底的な理解を提供するために、多数の具体的詳細が説明される。本発明の実施形態は、特許請求の範囲の趣旨内に依然としてありながら、これらの具体的詳細なしに実践され得ることが、当業者には理解されるであろう。
【００７１】
Ｉ型コラーゲンは、真皮マトリックスの最も豊富な構造成分であり、ケラチノサイトを移動させることにより、このタンパク質と相互作用する可能性が高い。コラゲナーゼは（ゼラチンの形成を介して）、コラーゲンリッチ・マトリックスからケラチノサイトを解離するのを補助し、それにより、真皮および仮マトリックスにわたる効率的な移動を促進することができる。
【００７２】
細胞機能は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって調節される。ＥＣＭ巨大分子によって提供された情報は、加工され、特殊な細胞表面受容体によって細胞内へ形質導入される。その受容体が、創傷の収縮、上皮細胞の移動、コラーゲン沈着、およびマトリックス分解性コラゲナーゼの誘導において主要な機能を果たすことを証拠は実証している。ケラチノサイトは、変性コラーゲン（ゼラチン）に粘着することになるが、この基質に応答してコラゲナーゼ産生が起きることはない。ケラチノサイトは、Ｉ型コラーゲン基層を識別しその上に移動して、コラゲナーゼ産生の強化をもたらすことが公知である。したがって、コラーゲンは、創傷治癒の各段階において主要な役割を果たす。
【００７３】
本発明は、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンを生成する方法に関する。タンパク質中のスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、生理的条件下で容易に形成するＮＯおよびＳ−ニトロソ−タンパク質との相互作用のための還元されたチオールの豊富な供給源を表す。コラーゲン上のタンパク質結合部位を決定することに対する主要な制限は、そのようなスルフヒドリル基を導入するための有用な方法の欠如であるとされてきた。
【００７４】
本明細書において記述されている修飾コラーゲンは、本明細書において「供給源」コラーゲンとも称される、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸおよびＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンから生成され得る。修飾コラーゲンは、哺乳動物または非哺乳動物供給源に由来するコラーゲンから生成され得る。好ましくは、コラーゲンが哺乳動物供給源に由来する場合、これは、非ヒト哺乳動物供給源に由来する。非哺乳動物供給源は、クラゲ、海洋無脊椎動物および魚類から選択される１つまたは複数の供給源であってよい。修飾コラーゲンは、天然または遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）供給源に由来するコラーゲンから生成され得る。
【００７５】
本明細書において記述されている方法の第１のステップは、コラーゲンを提供することを含み、ここで、コラーゲンは、Ｓ−Ｓ結合を含む。好ましくは、コラーゲンは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数である。代替として、コラーゲンは、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数以外のコラーゲンである。
【００７６】
天然のコラーゲンは、典型的には、Ｓ−Ｓ結合を含まない。ジスルフィド基は、若干数のルートによってコラーゲンに組み込まれ得る。好ましい実施形態において、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、コラーゲン供給源を提供することによって取得可能であり、ここで、コラーゲンは、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む。例えば、コラーゲン供給源は、リシンおよびヒドロキシリシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎ）残基のうちの一方または両方を有するＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンであってよい。
【００７７】
リシンおよびヒドロキシリシンは、ε−アミノ基を有するα−アミノ酸である。本明細書において使用される場合、用語「残基」は、例えば化学反応および結合形成によって、別の物質への組み込み後に残っている化学化合物の部分を指す。故に、アミノ酸「残基」は、ポリペプチド中に存在するアミノ酸モノマーの重合形態を指す。コラーゲンは、ポリペプチド鎖の三重らせんで形成され、そのうちの１つまたは複数は、一般に、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む。リシンは、哺乳動物および魚類コラーゲンの両方において、１０の最も豊富なアミノ酸残基のうちの１つとして存在する。コラーゲン中にリシン残基よりも４〜５倍少ないが、ヒドロキシリシン残基も、本明細書において開示されている方法において使用するのに十分な量で存在する。故に、リシンまたはヒドロキシリシン残基を含むコラーゲンは、本明細書において記述されている通りの処理の前に、式（ＸＩ）：
【００７８】
【化３】
2018512441.tif 000005
［式中、Ｒ５は、ＨまたはＯＨである。Ｒ５がＨである場合、リシン残基が存在する。Ｒ５がＯＨである場合、ヒドロキシリシン残基が存在し、
Ｘは、ＯＨ基 および化学結合から選択され、Ｙは、Ｈおよび化学結合から選択され、但し、ＸおよびＹのうちの一方または両方は、コラーゲン内でペプチド結合を形成する化学結合である。修飾コラーゲンのペプチド鎖形成部は、式（ＸＩ）において「［］」によって括弧で囲んで示されている。残基は、例えばＸおよびＹのうちの一方または他方がそれぞれＯＨおよびＨであるならば、ペプチドの末端位置にあり得る。ＸおよびＹの両方がペプチド結合であるならば、リシン残基は、コラーゲンのペプチド鎖形成部内の非末端である］
の残基を含み得る。
【００７９】
リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むコラーゲン供給源は、好ましくは、リシンおよびヒドロキシリシンのうちの一方または両方を含む可溶化コラーゲン供給源である。可溶化は、リシンおよびヒドロキシリシンのうちの一方もしくは両方を含むペプシン可溶化コラーゲン供給源を提供するためのペプシン消化もしくは酸消化によって、またはリシンおよびヒドロキシリシンのうちの一方もしくは両方を含む酸可溶化コラーゲン供給源を提供するための酸消化によって、実現され得る。
【００８０】
リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む、ペプシン可溶化または酸可溶化コラーゲン供給源等のコラーゲン供給源を、ジスルフィド（すなわち、Ｓ−Ｓ）基を含む活性化されたジカルボン酸誘導体と反応させて、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供することができる。この反応において、活性化されたジカルボン酸誘導体のカルボニル基を、コラーゲン中に存在するリシンまたはヒドロキシリシン残基のε−アミノ基と反応させて、アミド結合を形成することができる。
【００８１】
活性化されたジカルボン酸誘導体は、好ましくは、式：
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＺ  （Ｉ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、二価の連結基、好ましくは二価の有機連結基、より好ましくは、１から６個までの炭素原子を有するアルカンジイル基または２から６個までの炭素原子を有するアルケンジイル（ａｌｋｅｎｄｉｙｌ）もしくはアルキンジイル（ａｌｋｙｎｄｉｙｌ）基等の二価の炭化水素連結基を表す。なお一層好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、エタンジイルまたはプロパンジイル基、最も好ましくはエタンジイル、すなわち−ＣＨ２ＣＨ２−を表す。基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、１から４個の水素原子をヒドロキシル基またはＦもしくはＣｌ等のハロゲンで置き換えることによって場合により置換されていてよい。好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、同一であり、
ＺＮは、一緒に、窒素含有ヘテロ環式基、好ましくは、Ｎ原子が式（Ｉ）の化合物のカルボニル基と直接結合している、ヘテロ環式環中に５〜６個の原子を有する窒素含有ヘテロ環式基を表し、そのため、Ｚは、２つの原子価が窒素と結合している二価の連結基を表す。ヘテロ環式基は飽和または不飽和であってよく、そのため、Ｚは、特に２から４個の炭素原子を有する、アルカンジイル、アルケンジイルまたはアルキンジイルを表し得る。Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１または２個のヘテロ原子を場合により含み得る］
の化合物である。
【００８２】
より好ましくは、ＺＮは、アリール環中に５〜６個の原子を有し、そのうちの１〜３個までの原子は、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子であり、そのうちの少なくとも１個は、式（Ｉ）の化合物のカルボニル基と直接結合しているＮである、窒素含有ヘテロアリール基である。なお一層好ましくは、ヘテロアリール基は、アリール環中に５〜６個の原子を有し、そのうちの２個の原子は、Ｎである。代替として、ＺＮは、式（Ｉ）の化合物のカルボニル基と直接結合している１個のＮ原子を有するヘテロ環式環中に５〜６個の原子を有する窒素含有ヘテロ環式基であり、Ｚは、α，ω−オルガノジオンジイル（ｏｒｇａｎｏｄｉｏｎｅｄｉｙｌ）である。例えば、α，ω−オルガノジオンジイルは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として表されてよく、ここで、Ｒ４は、２または３個の炭素原子を有するアルカンジイルまたはアルケンジイルである。
【００８３】
基ＺＮは、１から４個までの水素原子を、ヒドロキシル基またはＦ、ＢｒもしくはＣｌ等のハロゲンで置き換えることにより、あるいは同じ炭素と結合している２個の水素原子を、酸素原子で置き換えることにより、場合により置換されて、カルボニル基を形成してよく、ここで、後者の置換は、１回または２回発生し得る。
【００８４】
最も好ましくは、基ＺＮは、
１−イミダゾール、すなわち
【００８５】
【化４】
2018512441.tif 000006
または１−ピロリジン−２，５−ジオン、すなわち
【００８６】
【化５】
2018512441.tif 000007
である。
【００８７】
好ましい活性化されたジカルボン酸誘導体は、
【００８８】
【化６】
2018512441.tif 000008
から選択されてよい。
【００８９】
活性化されたジカルボン酸誘導体（Ｉ）は、２ステップで合成され得る。最初に、式（ＩＶ）のジアミノジスルフィドを、少なくとも２モル当量の式（Ｖ）のジカルボン酸無水物と反応させて、式（ＶＩ）：
【００９０】
【化７】
2018512441.tif 000009
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義した通りである。Ｒ１およびＲ２が同一である場合、式（ＩＶ）のジアミノジスルフィドは対称分子であり、これは、対称な活性化されたジカルボン酸誘導体（Ｉ）をもたらすことが明らかであろう］
のジカルボン酸ジアミドを提供することができる。
【００９１】
第１の反応ステップは、式（ＩＶ）のジアミノジスルフィドを水等の溶媒に溶解し、式（Ｖ）のジカルボン酸無水物を添加することによって行われ得る。反応は、塩基性条件下で行うことが好ましく、そのため、酸無水物の添加前に、塩基を添加することができる。例えば、水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１０に調整することができる。ジカルボン酸無水物の添加後、ｐＨは減少することがあり、さらなる塩基の添加による反応中、ｐＨを７から１０までの範囲内に維持することが好ましい。反応は、撹拌しながら室温で行ってよく、３０分から２時間以内に完了し得る。式（ＶＩ）のジカルボン酸ジアミド生成物は、塩酸水溶液等の酸の添加により、ｐＨを例えば１のｐＨまで低下させることにより、沈殿し得る。沈殿したジカルボン酸ジアミド（ＶＩ）を、濾過によって単離し、水で洗浄し、次いで、減圧下で乾燥させることができる。
【００９２】
合成の第２のステップにおいて、ジカルボン酸ジアミド（ＶＩ）は、窒素含有ヘテロ環式化合物の添加によって活性化されて、活性化されたジカルボン酸誘導体（Ｉ）を提供する：
ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ  （ＶＩ）→
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＺ  （Ｉ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＮＺは、上記で定義した通りである］。
【００９３】
一実施形態において、窒素含有ヘテロ環式化合物は、式（ＶＩＩ）：
【００９４】
【化８】
2018512441.tif 000010
［式中、Ｚは、上記で定義した通りである。好ましくは、ＺＮは、一緒に、アリール環中に５〜６個の原子を有し、そのうちの１〜３個までの原子は、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子であり、そのうちの少なくとも１個はＮである、窒素含有ヘテロアリール基である。カルボジイミド（ＶＩＩ）は、より好ましくは、１，１’−カルボニル−ジイミダゾール等である］
の化合物等のカルボジイミドであってよい。
【００９５】
ジカルボン酸ジアミド（ＶＩ）１モル当たり、少なくとも２モル当量のカルボジイミドを使用すべきである。理論上、反応は、ジカルボン酸ジアミド（ＶＩ）１モル当たり、２モル当量の二酸化炭素および２モル当量のイミダゾールを生成することになる。二酸化炭素ガスの発生は、反応が進行していることを示す。反応は、減圧下で行われ得る。
【００９６】
別の実施形態において、窒素含有ヘテロ環式化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
【００９７】
【化９】
2018512441.tif 000011
［式中、ＺＮは、一緒に、ヘテロ環式環中に５〜６個の原子を有し、そのうちの１個はＮであり、Ｚは、α，ω−オルガノジオンジイルである、窒素含有ヘテロ環式基である。例えば、α，ω−オルガノジオンジイルは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として表されてよく、ここで、Ｒ４は、２または３個の炭素原子を有するアルカンジイルまたはアルケンジイルである。Ｎ−ヒドロキシヘテロ環式化合物（ＶＩＩＩ）は、最も好ましくは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドである］
のＮ−ヒドロキシヘテロ環式化合物であってよい。
【００９８】
第２の反応ステップは、ジカルボン酸ジアミド（ＶＩ）を無水ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、次いで、窒素含有ヘテロ環式化合物（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）を添加することによって行われ得る。活性化されたジカルボン酸誘導体（Ｉ）が溶液から沈殿する。生成物を、濾過によって収集し、無水酢酸エチルで洗浄し、減圧下で乾燥させることができる。
【００９９】
本発明の方法の第１のステップに戻って、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含むコラーゲン供給源を、式（Ｉ）の活性化されたジカルボン酸誘導体等のジスルフィド基を含む活性化されたジカルボン酸誘導体と反応させて、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供することができる。この反応において、活性化されたジカルボン酸誘導体のカルボニル基を、コラーゲン中に存在するリシンまたはヒドロキシリシン残基のε−アミノ基と反応させて、アミド結合を形成し、それにより、ジスルフィド基を組み込むことができる。反応は、
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＺ（Ｉ）＋コラーゲン−ＮＨ２→
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−コラーゲン＋ＨＮＺ
によって表すことができる。
【０１００】
この反応を続けて、活性化されたジカルボン酸誘導体の両方の活性化されたカルボキシル基が、コラーゲン、特に異なるコラーゲン三重らせんまたは線維と反応した場合、架橋コラーゲンを提供することができる。
ＺＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−コラーゲン＋コラーゲン−ＮＨ２→
コラーゲン−ＨＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−コラーゲン＋ＨＮＺ
【０１０１】
反応は、コラーゲン供給源を溶媒に溶解することによって行われ得る。コラーゲン供給源の溶解は、２ステップ・プロセスで行われ得る。第１のステップにおいて、コラーゲン供給源をメタノールと混合してよい。第２のステップにおいて、極性非プロトン性溶媒を添加する。例えば、コラーゲン供給源を、メタノールおよびジメチルスルホキシドの混合物に添加して、膨張させることができる。追加のジメチルスルホキシドを、撹拌しながら、コラーゲン供給源の溶解が完了するまで添加することができる。次いで、メタノールを、減圧下で蒸発させることによって、溶液から除去することができる。この可溶化プロセスを、アテロコラーゲンおよびテロコラーゲンの両方を用いて使用することができる。
【０１０２】
次いで、活性化されたジカルボン酸誘導体を、溶媒、特にジメチルスルホキシド等の無水極性非プロトン性溶媒に溶解することができる。式（Ｉ）の活性化されたジカルボン酸誘導体は水に感受性があるため、コラーゲンとの反応は、好ましくは、ジメチルスルホキシド等の無水極性非プロトン性溶媒中で行う。次いで、溶媒に溶解した活性化されたジカルボン酸誘導体を、コラーゲン供給源溶液に添加する。活性化されたジカルボン酸誘導体のカルボニル基は、コラーゲン供給源中に存在するリシンまたはヒドロキシリシン残基のε−アミノ基と反応して、アミド結合を形成することができる。
【０１０３】
混合物を、室温、例えば２２℃で、ゲルが形成されるまで撹拌することができる。次いで、ゲルを含有する混合物を、例えば１２〜１８時間にわたって静置しておくことができる。次いで、ジメチルスルホキシドを、過剰のアセトンと混和し、デカンテーションによってコラーゲン・ゲルを収集し、次いで、さらなるアセトンと再混和することにより、ゲルから抽出することができる。次いで、混合物を、例えば０．５から１時間にわたって撹拌し、その後、コラーゲンを濾過によって単離し、アセトンで洗浄し、次いで、水−エタノール（３０：７０ｖ／ｖ）で洗浄し、エタノールで脱水することができる。それにより、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸおよびＸ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンが提供される。
【０１０４】
代替的な実施形態において、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、コラーゲン結合タンパク質を、ジスルフィド基を含む光反応性架橋剤を含むように修飾し、これをコラーゲン供給源と組み合わせて、複合体を提供し、複合体を照射して光反応性架橋剤を架橋して、ジスルフィド基をコラーゲンに組み込むことによって提供され得る。例えば、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、Ｓ−Ｓ結合を含むＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲンであってよく、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン供給源から生成され得る。
【０１０５】
このルートは、コラーゲン中におけるチオール基の作製を可能にする部位特異的光架橋戦略を使用することによって、コラーゲン上にタンパク質結合部位を作製する。これは、部位特異的突然変異誘発によるコラーゲン結合タンパク質へのシステイン残基の導入を伴う。光反応性架橋剤、好ましくはＡＰＤＰを、タンパク質上のシステイン−ＳＨ基に導入することができる。ＡＰＤＰ修飾タンパク質およびコラーゲンの複合体は、紫外線（ｕｖ）照射によって架橋することができる。次いで、ジスルフィド架橋を還元によって切断することができ、−ＳＨ基がコラーゲン上に生じて、その後のＳ−ニトロソ化を可能にする。
【０１０６】
第１のステップにおいて、システイン残基を含むコラーゲン結合タンパク質は、図１ｂ）、ステップａに示されている通りに提供される。システイン残基は、架橋剤との反応に必要なスルフヒドリル基を含むため、必要である。コラーゲン結合タンパク質は、例えば、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であってよい。ＰＥＤＦは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、４２、３１６０〜３１６７頁において開示されている通り、Ｙａｓｕｉらによって同定されたコラーゲン結合部位を有する公知の抗血管新生／神経栄養因子である。
【０１０７】
既に存在するのでなければ、またはコラーゲン結合タンパク質が十分なシステインを含有しなければ、必要に応じて、システインをコラーゲン結合タンパク質に組み込んでよい。システイン置換は、部位特異的突然変異誘発を介して為され得、例えば、コラーゲン結合部位が局在化（Ｆ３８３）されている場合には、その部位の反対面（Ｙ２１１）になる。そのような部位特異的突然変異誘発を行うための方法は、Ｊ．Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、４２２３〜４２３１およびＲ．Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２、３１、９５２６〜９５３２において見られる。
【０１０８】
システイン置換の結果として導入されたスルフヒドリル基を、次いで、図１ｂ）、ステップｂに示されている通り、光反応性架橋剤と反応させることができる。光反応性架橋剤は、二官能性であるべきである。特に、光反応性架橋剤は、スルフヒドリル基と反応してジスルフィド結合を生成することができる、官能基を含むべきである。１つのそのような好適な官能基は、ピリジル−ジチオ基、すなわちＣ５ＮＨ５−Ｓ−Ｓ−、特に２−ピリジルジチオである。光反応性架橋剤は、光照射下でコラーゲンと架橋することができる官能基も含むべきである。１つのそのような好適な官能基は、アジド基、特にフェニルアジド等のアリールアジド基、とりわけパラ−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３である。
【０１０９】
Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）は、好ましい光反応性架橋剤の一例であり、その構造は、図１ａ）に示されている。ＡＰＤＰのジスルフィド基は、システインのスルフヒドリル基と反応して、システインと光反応性架橋剤との間にジスルフィド結合を生成し、それにより、Ｓ−Ｓ基を含む光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質を提供することができる。２−ピリジルチオンは、この反応の一部として、脱離基として解放される。
【０１１０】
次いで、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質を、図１ｂ）、ステップｃに示されている通り、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ型のうちの１つまたは複数のコラーゲン等のコラーゲンと組み合わせて、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質およびコラーゲンの複合体を提供することができる。このステップにおいて、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質は、コラーゲンのタンパク質結合部位と結合して、複合体を形成する。次いで、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質およびコラーゲンの複合体に、例えばｕｖ光を照射することができる。照射は、図１ｂ）、ステップｄに示されている通り、光反応性架橋剤上に存在する架橋できる官能基に、複合体中の隣接するコラーゲンと共有結合を形成させる。例えば、架橋できる官能基がフェニルアジドである場合、２５０から２８０ｎｍまでの範囲内の波長における照射は、ナイトレンを生じさせるであろうし、次いで、これが、コラーゲン上のＣ−ＨまたはＣ−ＮＨ２等の求核または活性水素基を攻撃して、Ｃ−ＨまたはＮ−Ｈ結合への挿入によって架橋を生じさせることができる。このようにして、Ｓ−Ｓ基を含む光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質をコラーゲンに組み込んで、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを提供する。ジスルフィド基は、このルートによってコラーゲンタンパク質結合部位の付近に提供されることが明らかであろう。
【０１１１】
次いで、上記で論じた方法のいずれかによって、すなわち、活性化されたジカルボン酸誘導体または光反応性架橋剤の方法を使用して提供され得るＳ−Ｓ結合を含むコラーゲンに、スルフヒドリル基を導入することができる。Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを、例えば図１ｂ）、ステップｅに示されている通り、好適な還元剤と反応させることができる。還元剤は、２つのスルフヒドリル基とのジスルフィド結合を還元し、それにより、ジスルフィド基が位置している活性化されたジカルボン酸誘導体残基または光反応性架橋剤残基を切断する。そのような還元は、２つの連続的なチオール・ジスルフィド交換反応によって進行し、ジスルフィド基の還元をもたらして、スルフヒドリル（−ＳＨ）基を含むコラーゲンを生成する。
【０１１２】
好適な還元剤は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、（２Ｓ）−２−アミノ−１，４−ジメルカプトブタン（ＤＴＢＡ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ塩酸塩）を含む。ジチオスレイトールは、好ましい還元剤である。
【０１１３】
還元ステップは、Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンを、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝溶液等の緩衝溶液に、７．５から９．５、より好ましくは約８から９．５までの範囲内、好ましくは約８．０のｐＨで添加することによって行われ得る。Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンは、本質的に酸性であってよく、そうであれば、水酸化ナトリウム等の塩基による中和が必要とされ得る。
【０１１４】
好ましくは、ジスルフィド基１モル当たり少なくとも２モル当量のＤＴＴ還元剤を同じ緩衝液中に添加し、反応を、３０℃で２〜６時間にわたって進行させることができる。反応の完了後、例えばＨＣｌを使用して、液体のｐＨを２に減少させてよい。次いで、混合物を、希ＨＣｌ溶液で透析し、遠心分離し、フリーズドライして、−ＳＨ基を有するコラーゲンチオールを提供することができる。
【０１１５】
還元は、コラーゲン鎖のわずかな劣化を引き起こし得る。結果として、より短い反応時間、より低いｐＨおよびより低い温度をすべて使用して、あらゆる劣化を最小化することができる。
【０１１６】
Ｓ−Ｓ結合を含むコラーゲンが、光反応性架橋剤修飾コラーゲン結合タンパク質を使用して提供される場合、修飾コラーゲン結合タンパク質は、コラーゲンチオールを形成するステップの前に、図１ｂ）、ステップｄに示されている通り、光反応性架橋剤を介してコラーゲンに依然として付着していることが明らかであろう。Ｓ−Ｓ結合の還元は、光反応性架橋剤のＳ−Ｓ結合を切断することになる。
【０１１７】
コラーゲン供給源が、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む場合、式（Ｘ）のリシンまたはヒドロキシリシン残基を含むコラーゲンチオールが提供される：
【０１１８】
【化１０】
2018512441.tif 000012
［式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、上記で定義した通りである。例えば、Ｒ１およびＲ３は、二価の連結基、好ましくは二価の有機連結基、より好ましくは、１から６個までの炭素原子を有するアルカンジイル基または２から６個までの炭素原子を有するアルケンジイルもしくはアルキンジイル基等の二価の炭化水素連結基から独立して選択される。なお一層好ましくは、Ｒ１およびＲ３は、独立して、エタンジイルまたはプロパンジイル基、最も好ましくは、エタンジイル、すなわち−ＣＨ２ＣＨ２−を表す。アミノ酸残基がリシン残基である場合、Ｒ５は、Ｈである。アミノ酸残基がヒドロキシリシン残基である場合、Ｒ５は、ＯＨであり、
Ｘは、ＯＨ基 および化学結合から選択され、Ｙは、Ｈおよび化学結合から選択され、但し、ＸおよびＹのうちの一方または両方は、コラーゲン内でペプチド結合を形成する化学結合である。修飾コラーゲンのペプチド鎖形成部は、式（Ｘ）において「［］」によって括弧で囲んで示されている。残基は、例えばＸおよびＹのうちの一方または他方がそれぞれＯＨおよびＨであるならば、ペプチドの末端位置にあり得る。ＸおよびＹの両方がペプチド結合であるならば、リシン残基は、コラーゲンのペプチド鎖形成部内の非末端である］。
【０１１９】
次いで、図１ｂ）、ステップｆに示されている通り、−ＳＨ基を有するコラーゲンチオールをニトロソ化して、Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンを提供することができる。Ｓ−ニトロソ化は、タンパク質のＳ−ニトロソ化のための当技術分野において公知である任意の技術によって、行われ得る。ニトロソ化は、Ｓ−ニトロソ基生成物を含むコラーゲンの安定性を改善するために、ＥＤＴＡ等のキレート化剤の存在下で、例えば、Ｓ−ニトロソ基の分解を触媒する遷移金属イオンが存在しないようにすることによって行われることが好ましい。ニトロソ化は、Ｓ−ニトロソ生成物のあらゆる劣化を最小化するために、５℃未満の温度、より好ましくは０℃未満の温度等の室温未満で行われることがさらに好ましい。
【０１２０】
例えば、コラーゲンチオールを、酸性化亜硝酸塩の水溶液と反応させてよい。亜硝酸塩は、亜硝酸ナトリウムまたはカリウム等のアルカリ金属亜硝酸塩、好ましくは亜硝酸ナトリウムであってよい。酸性化は、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液を使用して行われ得る。ニトロソ化反応が進むにつれて、水素イオンが解放され、緩衝液によって安定する溶液の酸性度における増大につながる。亜硝酸塩の希薄溶液は、酸性化すると、遊離亜硝酸を生成することができ、これは、スルフヒドリル基と反応して、コラーゲン上にＳ−ニトロソ基を形成し、副産物として水を産出する。そのような反応は、Ｂｙｌｅｒ  Ｄ  Ｍ、Ｇｏｓｓｅｒ  Ｄ  Ｋ、Ｓｕｓｉ  Ｈによって、「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｓ−Ｎｉｔｒｏｓｏｔｈｉｏｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｉｔｒｉｔｅ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｇｒｏｕｐｓ」と題された１９８３年の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：５２３〜５２７、Ｗｉｎｋ  Ｄ  Ａ、Ｎｉｍｓ  Ｒ  Ｗ、Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅ  Ｊ  Ｆら、１９９４年の調査「Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｎｉｔｒｉｃ−Ｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ−Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｆａｔｅ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＯ／Ｏ−２  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ７：５１９〜５２５において開示されている。
【０１２１】
代替として、コラーゲンチオールを、ガス状のＮＯと反応させてよい。これは、ガス状のＮＯを、溶媒中のコラーゲンチオールに通して発泡させることによって実現され得る。コラーゲンチオールを、Ｓ−ニトロソチオールと反応させてもよい。好ましくは、Ｓ−ニトロソチオールは、比較的不安定であり、ガス状化合物等、低分子量のものである。より好ましくは、Ｓ−ニトロソチオールは、Ｓ−ニトロソ−グルタチオン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンおよびＳ−ニトロソ−システインを含む群から選択される１つまたは複数の化合物である。Ｓ−ニトロソチオールとの反応は、透析バッグ内で行われてよく、低分子量の試薬および生成物が透析されて、Ｓ−ニトロソ化コラーゲンを残す。
【０１２２】
ニトロソ化反応は、３３９ｎｍ等の３３０〜３４０ｎｍの範囲内およびｕｖ−可視スペクトルにおける５４５ｎｍ等の５４０〜６００ｎｍの範囲内のＳ−ＮＯ特異的な吸収ピークの存在により、分光光度的にモニターすることができる。吸収ピークは、Ｓ−ニトロソチオールからＮＯを放出することが公知であるＣｕ＋イオンの存在下および非存在下で、モニターすることができる。（ＮＯ電極による）ＮＯの生成およびλ＝３３９ｎｍ等の３３０〜３４０ｎｍまでの範囲内の波長における吸光度の低減の両方が、Ｓ−ニトロソコラーゲンからのＮＯ放出の生成成功を示すものである。
【０１２３】
同様に、１４８０〜１５３０ｃｍ−１の範囲内の特異的な吸収ピークは、赤外スペクトルにおけるＳ−ニトロソチオールのＮ＝Ｏ結合の伸縮振動を示すものである。６００〜７３０ｃｍ−１の範囲内の第２の吸収ピークは、Ｓ−ニトロソチオールにおけるＣ−Ｓ結合の振動の特徴である。コラーゲン供給源が、リシンおよびヒドロキシリシン残基のうちの一方または両方を含む場合、式（ＩＸ）のリシンまたはヒドロキシリシン残基を含む修飾コラーゲンが提供される：
【０１２４】
【化１１】
2018512441.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、上記で定義した通りである。例えば、Ｒ１およびＲ３は、二価の連結基、好ましくは二価の有機連結基、より好ましくは、１から６個までの炭素原子を有するアルカンジイル基または２から６個までの炭素原子を有するアルケンジイルもしくはアルキンジイル基等の二価の炭化水素連結基から独立して選択される。なお一層好ましくは、Ｒ１およびＲ３は、独立して、エタンジイルまたはプロパンジイル基、最も好ましくはエタンジイル、すなわち−ＣＨ２ＣＨ２−を表す。アミノ酸残基がリシン残基である場合、Ｒ５は、Ｈである。アミノ酸残基がヒドロキシリシン残基である場合、Ｒ５は、ＯＨであり、
Ｘは、ＯＨ基 および化学結合から選択され、Ｙは、Ｈおよび化学結合から選択され、但し、ＸおよびＹのうちの一方または両方は、コラーゲン内でペプチド結合を形成する化学結合である。修飾コラーゲンのペプチド鎖形成部は、式（Ｘ）において「［］」によって括弧で囲んで示されている。残基は、例えばＸおよびＹのうちの一方または他方がそれぞれＯＨおよびＨであるならば、ペプチドの末端位置にあり得る。ＸおよびＹの両方がペプチド結合であるならば、リシン残基は、修飾コラーゲンのペプチド鎖形成部内の非末端である］。
【０１２５】
修飾コラーゲンが、上記で論じたもの、例えば、式（ＩＸ）の残基を含む修飾コラーゲン等、Ｓ−ニトロソ基を含むリシンまたはヒドロキシリシン残基を含む場合、分解に対するＳ−ニトロソ基の安定性改善が観察される。例えば、Ｓ−ニトロソ基を含むリシンまたはヒドロキシリシン残基を含む修飾コラーゲンは、Ｓ−ニトロソ基を含むシステイン残基と比較して、安定性におけるおよそ１０倍の増大を呈する。
【０１２６】
Ｓ−ニトロソ基生成物を含む修飾コラーゲンは、例えば透析によって精製され得る。修飾コラーゲンを、水中のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝液に対して透析することが好ましい。
【０１２７】
別の実施形態において、本明細書において記述されている修飾コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つまたは複数に組み込まれてよい。好ましくは、コラーゲンは、Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ  ｐｕｌｍｏクラゲ組織、すなわちバレルクラゲ等のクラゲに由来する。
【０１２８】
本明細書において記述されている修飾コラーゲンは、医薬として使用するためのものであってよい。
【０１２９】
一実施形態において、修飾コラーゲンは、創傷治癒において使用するためのものである。故に、少なくとも本明細書において記述されている通りの修飾コラーゲンを創傷に付着させるステップを含む、個体における創傷の治療方法も、本明細書において開示されている。修飾コラーゲンは、例えば創傷被覆材の一部として結合すること、接着させること、縫合すること等、任意の従来の手段によって、付着させることができる。創傷は、糖尿病性潰瘍、例えば糖尿病性足部潰瘍等の潰瘍であってよい。
【０１３０】
有益な臨床効果を支持する、ＮＯの局在化および制御放出の最大送達のための修飾コラーゲンの配合は、ゲル・マトリックス（例えば、細胞外マトリックス）形態で送達することもでき、またはより好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリメチルセルロース、アルギン酸塩、アルギン酸およびシリコーン・ベースの材料のうちの１つまたは複数から作製または構成される、任意の好適なポリマー材料足場に配合することもできる。
【０１３１】
クラゲに由来するＩＩ型コラーゲン、クラゲに由来するＶ型コラーゲンおよびゼラチン・マトリックスを含む群のうちの１つまたは複数に組み込まれた、本明細書において記述されている修飾コラーゲンを含む配合組成物を含む、創傷被覆材も提供される。好ましくは、コラーゲンがクラゲに由来する場合、これは、Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ  ｐｕｌｍｏクラゲ組織、すなわちバレルクラゲに由来する。
【０１３２】
創傷被覆材の配合組成物は、フィルム、膜またはヒドロゲル複合物であってよい。好ましくは、創傷被覆材は、５から２００マイクロメートルまでの範囲内の厚さを有する。本明細書において使用される場合、用語「厚さ」は、創傷被覆材の最小寸法を指す。
【０１３３】
創傷被覆材は、食品グレードの作用物質をさらに含んでよい。
【０１３４】
創傷被覆材は、医療グレードの作用物質をさらに含んでよい。
【０１３５】
フィルム、膜またはヒドロゲル複合物は、好ましくは創傷被覆材の形成中に滅菌されることが好ましい。滅菌は、０．２２μｍから０．４５μｍまでの範囲内のフィルターを用いる等のフィルター滅菌を使用して、またはエチレンオキシド（ＥｔＯ）による処理によって、またはガンマ線照射によって、実現され得る。
【０１３６】
創傷被覆材は、好ましくは、室温未満、好ましくは４℃未満の温度で保存される。創傷被覆材は、好ましくは、無水条件下で保存される。創傷被覆材は、好ましくは、窒素下等の不活性雰囲気下で保存される。これらのステップは、Ｓ−ニトロソ基の分解を最小化する。
【０１３７】
本明細書において開示されている創傷被覆材は、修飾コラーゲンのＳ−ニトロソ基の存在により、血流制御に関して、血管拡張効果の強化を提供する。Ｓ−ニトロソ基は、生理的条件下で一酸化窒素を放出することができる。一酸化窒素は、血管拡張効果を提供することが公知である。
【０１３８】
別の実施形態において、創傷被覆材は、有効な消毒剤として作用する。内因的に生成された一酸化窒素は、体の自然防御機構の重要な成分である。その濃度に応じて、ＮＯは、２つの手法で抗菌効果を発揮する。低濃度では、ＮＯは、免疫細胞の成長および活性を促進するシグナル伝達分子として作用する。好中球の呼吸バースト中等の高濃度では、ＮＯは、ＤＮＡ、タンパク質および脂質を共有結合し、それにより、標的病原体を阻害するまたは死滅させる。ＮＯが、宿主免疫応答の不可欠で高度に保存された部分であることを考慮すれば、わずかな細菌しかＮＯの抗菌効果を免れることができないことは、驚くに当たらない。
【０１３９】
別の実施形態において、創傷被覆材は、抗菌性である。特に、創傷被覆材は、細菌、酵母、真菌およびウイルスに対して抗菌特性を呈する。これは、修飾コラーゲンのＳ−ニトロソ基によって放出された一酸化窒素が、抗菌活性を発揮するからである。
【０１４０】
本発明の種々のさらなる態様および実施形態が、本開示を考慮して、当業者に明らかとなるであろう。
【０１４１】
本発明の他の態様および実施形態は、用語「を含む」が用語「からなる」によって置き換えられた、上述した態様および実施形態、ならびに用語「を含む」が用語「から本質的になる」によって置き換えられた、上述した態様および実施形態を提供する。
【０１４２】
実験
下記の実験例は、クラゲ供給源からのＳ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンの合成を記述するものである。Ｓ−ニトロソ基を含む修飾コラーゲンの半減期についても調査する。
【０１４３】
コラーゲン供給源は、バレルクラゲ、ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａ  ｐｕｌｍｏから入手した。１．００３ｇのクラゲコラーゲンの試料（中膠および口腕に由来するコラーゲンを含む）を、最初に０．１％から０．００１％ｖ／ｖまでのペプシン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって酵素消化して、アテロコラーゲンを提供した。最初に、１０ｍｇ／ｍｌのペプシン酵素ストック溶液を０．１Ｍ酢酸中で作製し、ボルテックスで混合し、次いで、４℃で保存した。この酵素ストック溶液を、０．１％から０．００１％ｖ／ｖまでの最終濃度、より好ましくは、０．０１％ｖ／ｖペプシンの最終濃度に達するまで添加した。すべての酵素コラーゲン消化試料を、４℃で保存した。
【０１４４】
次いで、アテロコラーゲンを、２００〜４００ｍＬのメタノール（Ｒａｔｈｂｕｒｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．）中で膨張させた。膨張したアテロコラーゲンは、１時間にわたって撹拌した後、溶解しなかった。
【０１４５】
膨張したアテロコラーゲンを溶解するために、４０ｍＬのジメチルスルホキシド（Ｒａｔｈｂｕｒｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．）を添加し、混合物を、１分間の音波処理をしながら、２０分間にわたって撹拌した。さらなる２００〜４５０ｍＬのジメチルスルホキシドを添加し、混合物を、３０秒間にわたる間欠的な音波処理をしながら、１時間にわたって撹拌して、ジメチルスルホキシド中アテロコラーゲン溶液を提供した。
【０１４６】
メタノールを、減圧下、３５℃の温度で、アテロコラーゲン溶液から除去した。
【０１４７】
１６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した４００ｍｇのＮ，Ｎ’−ジスクシノイルシスタミンの試料を、アテロコラーゲン溶液に添加し、次いでこれにカバーを掛け、２．５時間撹拌した。
【０１４８】
次いで、混合物を１６時間にわたって放置し、その後、劇臭を伴う黄色液体が取得された。粘度には変化がなかった。
【０１４９】
次いで、Ｓ−Ｓ結合を含むアテロコラーゲンを、アセトン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と、２：１ｖ／ｖ  アセトン：アテロコラーゲン混合物の比で混和した。第１の混和の３０秒後に、オフホワイトのフレーク状沈殿物が形成された。混和物を、１０℃未満の温度、好ましくは２〜５℃の温度で１時間にわたって放置しておき、その後、一部の沈殿物の沈降が観察され、粒子の残りは依然として懸濁液中のままであった。
【０１５０】
Ｓ−Ｓ結合を含むアテロコラーゲンを、遠心分離および上清の除去によって収集した。沈殿を完了させるために、アセトンとの混和、沈降および遠心分離をさらに２回繰り返した。
【０１５１】
次いで、Ｓ−Ｓ結合沈殿物を含むアテロコラーゲンを、濾過し、アセトンで洗浄した。１．６μｍの細孔径を有するガラス繊維濾紙を使用する重力式濾過によって、沈殿物を収集した。沈殿物を１００ｍＬのアセトンで５回洗浄して、濃黄褐色のゲル様材料を産出した。
【０１５２】
次いで、Ｓ−Ｓ結合沈殿物を含むアテロコラーゲンを、１００ｍＬの７０：３０ｖ／ｖ変性エタノール（Ｓｉｇｍａ）／水ですすぎ、これにより、沈殿物を一緒に合体させて、弾性様、灰褐色の材料を形成した。
【０１５３】
変性エタノール洗浄の後、合体した沈殿物をフリーズドライして、Ｓ−Ｓ結合を含む３７５ｍｇのオフホワイトの（ｏｆｆ−ｗｈｉｃｈ）チョーク様アテロコラーゲンを提供した。
【０１５４】
Ｓ−Ｓ結合を含むフリーズドライしたアテロコラーゲンを、９．５のｐＨを有する５０ｍＬの０．１Ｍグリシン／ＮａＯＨ緩衝液と混合した。ボルテックスし、激しく振とうした後、黄褐色のゲル様材料が形成された。
【０１５５】
このコラーゲン混合物に、ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ）を添加すると、ｐＨは８．０４まで低下した。アテロコラーゲンは、４時間にわたって撹拌した後、完全に溶解して、Ｓ−Ｈ基を含むアテロコラーゲン（式（Ｘ）の化合物［式中、Ｒ１およびＲ３は、−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ５は、Ｈである］）の、より粘性の高い淡桃色の溶液を産出した。
【０１５６】
次いで、Ｓ−Ｈ基を含むアテロコラーゲンを、１８ｍＭのＨＣｌ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透析した。新鮮な透析培地を用いて透析を１回繰り返した。２４．５時間後、液体の稠度には変化がなかった。
【０１５７】
次いで、Ｓ−Ｈ基を含む透析したアテロコラーゲンを、遠心分離して、固体修飾コラーゲンのペレットおよび淡黄色の繊維状上清を提供した。
【０１５８】
次いで、Ｓ−Ｈ基を含む３４３ｍｇのアテロコラーゲンの試料を、５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加して、５．３４ｇの総重量を有するゼラチン状ボールを形成した。０．４３１３ｇのゼラチン状ボールの試料を切り取り、ガラスの汎用バイアル中に細断し、次いで、３７℃の水浴内、２ｍｌのキレックスで処理したＨ２Ｏに溶解した。溶液は、２．１９のｐＨを有していた。
【０１５９】
ニトロソ化の前に、４０μＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【０１６０】
次いで、試料を２つのアリコートに分割して、１つ目を室温に保ち、２つ目を氷で冷やした。
【０１６１】
０．００３ｇの４０ｍＭ亜硝酸ナトリウムの試料（Ｓｉｇｍａ）を各アリコートに添加して、ニトロソ化プロセスを開始した。混合物をホイルで包んで、光を遮断した。２．５分以内に両方のアリコートが目に見えて薄バラ色になった。
【０１６２】
アリコートａ）を、５、１０、２０、３０、６０および９０分において、２９０から４５０ｎｍの範囲波長にわたり、バリオスカン（Ｖａｒｉｓｋａｎ）・プレート・リーダーで検査した。図２は、１０分における試料についての吸収スペクトルを示す。亜硝酸ナトリウムが添加されていない対照プレートも検査し、スペクトルを同じく図２に示す。１０分における亜硝酸塩で処理した試料についてのスペクトルは、３３５ｎｍ前後における有意な吸収ピークを示し、これは、Ｓ−ニトロソ形成を示すものであることが明らかである。
【０１６３】
氷上のアリコートｂ）は、極めて粘性が高くなったため、試料をウェル・プレートにピペットで取ることができなかった。しかしながら、色は依然として鮮やかなままであり、６０分において、試料を水浴内で加温すると、その流体状態に再度戻った。
【０１６４】
本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、上記の態様および上述した実施形態のいずれかの、互いのすべての組合せを開示していることを理解されたい。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、単独でまたは他の態様のいずれかと一緒に、好ましいおよび／または任意選択の特色のすべての組合せを開示している。
【図１ａ】
2018512441.tif 000016
【図１ｂ】
2018512441.tif 000017
【図２】
2018512441.tif 000018
【国際調査報告】
2018512441.tif 000019
2018512441.tif 000020
2018512441.tif 000021