(57)【要約】  本発明は、重鎖アミノカルボン酸の生産方法に関し、より詳しくは、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養することで、脂肪酸から重鎖アミノカルボン酸を生産する方法に関する。本発明の組換え微生物は、脂肪アルデヒドの追加的な酸化及びβ−酸化代謝を防止し、また、末端にアミン基を導入することで、脂肪酸のような基質から重鎖アミノカルボン酸、例えば、ナイロン１２の原料になる１２−アミノドデカン酸を高い収率で生産することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物。
【請求項２】
前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子は、微生物内に存在する全ての相同型遺伝子が除去された請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子は、当該微生物内に存在する一部の相同型遺伝子が除去された請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３及びＦＡＬＤＨ４遺伝子でなる群より選択される請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３及びＦＡＬＤＨ４遺伝子は、それぞれ配列番号１及び配列番号４でなる塩基配列を含む請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記β−酸化代謝経路関連の遺伝子はアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子である請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、ＡＣＯ１、ＡＣＯ２、ＡＣＯ３、ＡＣＯ４、ＡＣＯ５及びＡＣＯ６遺伝子でなる群より選択される請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ＡＣＯ１、ＡＣＯ２、ＡＣＯ３、ＡＣＯ４、ＡＣＯ５及びＡＣＯ６遺伝子は、それぞれ配列番号５及び配列番号１０でなる塩基配列を含む請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ω−トランスアミナーゼ遺伝子は、配列番号１１でなる塩基配列を含む請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記微生物は、酵母または大腸菌である請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記酵母は、ヤロウィア属、サッカロマイセス属、ピチア属及びカンジダ属でなる群より選択される酵母である請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記ヤロウィア属の酵母はヤロウィア・リポリティカである請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
（１）請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の組換え微生物を製造するステップと、
（２）前記組換え微生物に基質を処理して培養するステップとを含む重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【請求項１４】
前記基質は脂肪酸である請求項１３に記載の重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【請求項１５】
前記脂肪酸は、炭素数５から３０を有する脂肪酸である請求項１４に記載の重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【請求項１６】
前記脂肪酸はドデカン酸である請求項１５に記載の重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【請求項１７】
前記重鎖アミノカルボン酸は、炭素数５から３０を有する重鎖アミノカルボン酸化合物である請求項１３に記載の重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【請求項１８】
前記重鎖アミノカルボン酸は１２−アミノドデカン酸である請求項１７に記載の重鎖アミノカルボン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重鎖アミノカルボン酸の生産方法に関し、より詳しくは、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）遺伝子が組み込まれた組換え微生物を培養することで、脂肪酸から重鎖アミノカルボン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプラットフォーム化合物は、バイオマス由来の原料を基盤として生物学的または化学的転換を介して生産されたものであって、高分子モノマー、新素材などの合成に用いられている。
【０００３】
バイオプラットフォーム化合物のうち重鎖アミノカルボン酸は、ポリアミドの単量体として用いられる物質であって、前記ポリアミドは、脂肪族ポリアミド、芳香族ポリアミド、脂肪族環ポリアミドに分類される。脂肪族ポリアミドの代表的なものには、ナイロン１２、ナイロン６及びナイロン６６などがあり、芳香族ポリアミドは、耐熱性をさらに向上させるために芳香族骨格を取り入れたものであって、アラミド（ａｒａｍｉｄ）という名として知られている。
【０００４】
ナイロンは、代表的なエンジニアリングプラスチック素材であって、１９４０年以後から高い結晶性と機械的強度、熱的安定性、優れた耐摩耗／耐摩擦特性などによってその需要と用途が絶え間なく増加している傾向であり、ナイロンの熱的、機械的性質を向上させるための多様な分野の研究が持続的に進められてきた。その中で、ナイロンの耐磨耗性の向上のためにワックス、黒鉛を含浸させる研究があり、その外にも高分子架橋による物性向上の研究が進められている。ナイロンの中でも、１２−アミノドデカン酸（ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｉｃ  ａｃｉｄ）の重縮合方式で合成されるナイロン１２は比重が小さく、低温特性及び耐磨耗性に優れ、紫外線の影響が少ないため耐候性が強く、また、他のナイロン樹脂（ナイロン６、６６）に比べて−ＣＨ２−鎖の長さが非常に長いため、同一重量でアミド官能基とＨ２Ｏの水素結合を有する確率が低いことから、ナイロン樹脂の最大の欠点である、水分吸湿による機械的強度の低下を防止することができるので、自動車用部品材料、航空機材料、耐熱性特殊繊維などに多様に適用されている（シン・ボムシク外、ポリマー、３５（１）：３０−３４、２０１１）。
【０００５】
１２−アミノドデカン酸のような重鎖アミノカルボン酸の生産は、化学的合成や微生物発酵による生物学的方法で行われ得るところ、このような生物学的方法を利用する場合は、代謝工学技術を利用した新規の菌株開発及び発酵工程の最適化が求められる。
【０００６】
従来、重鎖アミノカルボン酸を生産することができる菌株には、β−酸化代謝経路とω−酸化代謝経路を共に有している微生物が利用可能であって、例えば、大腸菌からω−アミノドデカン酸を生産する方法が知られている（ＵＳ２０１０／０３２４２５７  Ａ１）。しかし、重鎖アミノカルボン酸は、重鎖アルデヒドカルボン酸にアミン基を伝達する過程を更に取り入れて製造されるため、前記微生物を利用した重鎖アミノカルボン酸の生産においては、その収率が高くないという問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養することで、脂肪酸から重鎖アミノカルボン酸を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記技術的課題を達成するため、本発明は、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を提供する。
【０００９】
本発明の一具現例によれば、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子は、微生物内に存在する全ての相同型遺伝子が除去されたものが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の他の具現例によれば、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子は、当該微生物内に存在する一部の相同型遺伝子が除去されたものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１０】
本発明の一具現例によれば、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３及びＦＡＬＤＨ４遺伝子でなる群より選択される遺伝子であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の一具現例によれば、前記β−酸化代謝経路関連の遺伝子はアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子であってよいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、ＡＣＯ１、ＡＣＯ２、ＡＣＯ３、ＡＣＯ４、ＡＣＯ５及びＡＣＯ６遺伝子でなる群より選択されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明の一具現例によれば、前記微生物は酵母または大腸菌であってよいが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記酵母は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）でなる群より選択される酵母であってよいが、これらに限定されるものではない。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記ヤロウィア属の酵母はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【００１３】
さらに、本発明は、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を製造するステップと、（２）前記組換え微生物に基質を処理して培養するステップとを含む重鎖アミノカルボン酸の生産方法を提供する。
【００１４】
本発明の一具現例によれば、前記基質は脂肪酸であってよいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記脂肪酸及び重鎖アミノカルボン酸は、炭素数５から３０、好ましくは炭素数６から２０、より好ましくは炭素数８から１６を有していてよいが、これらに限定されるものではない。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記脂肪酸はドデカン酸であってよいが、これに限定されるものではない。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記重鎖アミノカルボン酸は１２−アミノドデカン酸であってよいが、これに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る組換え微生物は、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれることにより、脂肪酸のような基質から重鎖アミノカルボン酸、例えば、ナイロン１２の原料になる１２−アミノドデカン酸を高い収率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ω−酸化及びβ−酸化代謝反応と関連した生成物及び関連酵素の種類を示す図である。
【図２】ω−酸化と関連した脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物の製造過程を概略的に示した図である。
【図３】菌株改良のための遺伝子ノックアウトのために選別マーカーとして用いられるｕｒａ３遺伝子と、ノックアウトカセットを挿入した後にｕｒａ３遺伝子を除去するためのポップアウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）とを有するベクターを概略的に示した図である。
【図４】本発明の形質転換微生物の製造に用いられたノックアウトカセットの製作過程を示す概路図である。
【図５】菌株改良のためにω−トランスアミナーゼ遺伝子が含まれている形質転換ベクターを概略的に示した図である。
【図６】本発明の形質転換微生物において、ノックアウト及び形質導入された遺伝子の種類を示すグラフである。
【図７】本発明の形質転換微生物が、基質であるドデカン酸から生成した重鎖アミノカルボン酸の量を示すグラフである。
【図８】本発明のＹ２−３６菌株をフラスコで培養した時、基質であるドデカン酸から生成した重鎖アミノカルボン酸の量を示すグラフである。
【図９】本発明のＹ２−３６菌株において、基質であるドデカン酸から重鎖アミノカルボン酸が生成されたことを示すＧＣ／ＭＳデータである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記目的を達成するため、本発明は、ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を提供する。
【００１８】
本発明において、前記『ω−酸化』という用語は、脂肪酸のメチル基末端が酸化してジカルボン酸が形成される代謝過程を意味し、『β−酸化』という用語は、カルボキシ基でβ位の炭素原子が酸化してアセチルＣｏＡを放出しながら、その都度、炭素原子数が２個少ない脂肪酸になるに伴って漸次分解されていく代謝過程を意味する。前記ω−酸化及びβ−酸化の概念と、このような代謝過程に関与している酵素等とに対しては、生化学分野の通常の技術者において広く知られている。例えば、ω−酸化において、脂肪酸が基質に利用される場合は、先ずシトクロムＰ４５０及びＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の作用によってω−ヒドロキシ脂肪酸が生成され、前記ω−ヒドロキシ脂肪酸は、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ及び脂肪アルコールオキシダーゼの作用によってω−アルデヒド脂肪酸が生成され、前記ω−アルデヒド脂肪酸は、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用によってジカルボン酸が製造される。また、β−酸化においては、アシル−ＣｏＡオキシダーゼによって炭素原子数が２個少ない脂肪酸が生成される（図１を参照）。
【００１９】
トランスアミナーゼ（ＴＡ、ＥＣ  ２．６．１．Ｘ）は自然界に広く存在し、生物の窒素代謝でアミン基の転移に関与する酵素である。一般に、トランスアミナーゼは、一アミノ酸のアミノ基を除去して他のα−ケト酸（ｋｅｔｏ  ａｃｉｄ）に転移する役割を担う。トランスアミナーゼは、広い基質特異性、高い光学選択性、速い反応速度、優れた安定性、そして補酵素の再生産が不要な点等の様々な優れた利点のため、光学的に純粋な非天然アミノ酸及びアミン化合物の生産のためにトランスアミナーゼが用いられている。トランスアミナーゼは、Ｐｆａｍデータベースに出るタンパク質の構造と多重配列整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）に基づいて５個のグループに分けることができるところ、この中、ω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）トランスアミナーゼ、４−アミノブチル酸トランスアミナーゼなどを含んでいるグループIIIに属するトランスアミナーゼをω−トランスアミナーゼという。一般的なトランスアミナーゼとは違って、ω−トランスアミナーゼは、アルファでない位置にアミン基があるアミノ酸またはカルボキシ基がないアミン化合物のアミン基を、２−ケトグルタル酸またはピルビン酸のようなアミン受容体に伝達する反応を行う。よって、ω−トランスアミナーゼは、光学活性アミン化合物の生産に非常に有用な酵素として用いられ得る。例えば、ω−トランスアミナーゼは、１９９０年に米国のセルジーン社（Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏ．）がキラルアミンの最初合成に使用し、最近はキラルアミンの非対称合成（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）研究と動的分割（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）向上関連の研究で重要に扱われており、２０１２年にドイツのエボニック社（Ｅｖｏｎｉｋ）でクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＤＳＭ３０１９１菌株のω−トランスアミナーゼを利用して、１２−オキソラウリン酸メチルエステルを１２−アミノラウリン酸メチルエステルに転換させた例も知られている。
【００２０】
本発明の一具現例によれば、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、当該微生物内に存在する全ての相同型遺伝子が除去されたものが好ましいが、場合によって、これらのうち一部の遺伝子が除去された組換え微生物も本発明において適用可能である。
【００２１】
本発明の一具現例によれば、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３及びＦＡＬＤＨ４遺伝子でなる群より選択されてよいが、これらに限定されるものではない。前記ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３及びＦＡＬＤＨ４遺伝子は、それぞれ配列番号１及び配列番号４でなる塩基配列を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の他の具現例によれば、前記β−酸化代謝経路関連の遺伝子は、当該微生物内に存在する全ての相同型遺伝子が除去されたものが好ましいが、場合によって、これらのうち一部の遺伝子が除去された組換え微生物も本発明において適用可能である。前記β−酸化代謝経路関連の遺伝子は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子であるのが好ましく、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、ＡＣＯ１、ＡＣＯ２、ＡＣＯ３、ＡＣＯ４、ＡＣＯ５及びＡＣＯ６遺伝子でなる群より選択されてよいが、これらに限定されるものではない（図２参照）。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記ＡＣＯ１、ＡＣＯ２、ＡＣＯ３、ＡＣＯ４、ＡＣＯ５及びＡＣＯ６遺伝子は、それぞれ配列番号５及び配列番号１０でなる塩基配列を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の他の具現例によれば、前記ω−トランスアミナーゼ遺伝子は配列番号１１でなる塩基配列を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明において、本技術分野に公知の通常の遺伝子組換え技術を利用して、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を製造することができる。本発明において、前記『除去』という用語は、当該遺伝子の一部または全部が物理的に除去されたことだけでなく、当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡからタンパク質が作られない状態、及び当該遺伝子から発現されたタンパク質が機能できない状態なども包括的に含む意味として用いられる。また、前記『導入』という用語は、微生物のゲノム内に遺伝子が挿入されるか、または、微生物のゲノム内に遺伝子が挿入されていないまま当該遺伝子が発現される場合の全てを包括的に含む意味として用いられる。使用可能な遺伝子組換え技術には、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）などの方法を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明において、使用可能な微生物は、ω−酸化及びβ−酸化代謝の過程を全て有している任意の微生物が制限なく用いられてよく、例えば、酵母を含む真核生物及び大腸菌を含む原核生物などが用いられてよい。本発明の具現例によれば、前記微生物は酵母を用いるのが好ましく、前記酵母には、ヤロウィア属、サッカロマイセス属、ピチア属、カンジダ属などの酵母が制限なく用いられてよく、この中でもヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・インファンチコラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｆａｎｔｉｃｏｌａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・アルコーロフィア（Ｐｉｃｈｉａ  ａｌｃｏｈｏｌｏｐｈｉａ）またはカンジダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｙｃｏｄｅｒｍａ）を用いるのが好ましく、ヤロウィア・リポリティカを用いるのがさらに好ましい。
【００２６】
前記のように、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた微生物の場合、脂肪酸が基質に供給されると、シトクロムＰ４５０及びＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼの作用によりカルボキシ基の反対側の末端が酸化してアルコールが形成された後、前記アルコールは、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ及び脂肪アルコールオキシダーゼの作用によりヒドロキシ基が酸化してアルデヒドが形成されるが、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼが除去されているため、これ以上の酸化が起こることができなくなる。そして、前記のように形成された脂肪酸アルデヒドは、ω−トランスアミナーゼの作用によりアミン化されてアミノカルボン酸が形成される。
【００２７】
また、本発明は、
（１）ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を製造するステップと、
（２）前記組換え微生物に基質を処理して培養するステップとを含む重鎖アミノカルボン酸の生産方法を提供する。
【００２８】
本発明において、前記ω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を利用して脂肪酸アルデヒドの追加的な酸化及びβ−酸化代謝を防止し、さらに、重鎖アルデヒド脂肪酸にアミン基を導入することで重鎖アミノカルボン酸を高い収率で生産することができる。前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子は、当該微生物内に存在する全ての相同型遺伝子が除去されているものが好ましいが、場合によって、これらのうち一部の遺伝子が除去された組換え微生物も本発明において適用可能である。
【００２９】
本発明において、使用可能な微生物は、ω−酸化及びβ−酸化代謝の過程を全て有している任意の微生物が制限なく用いられてよく、例えば、酵母を含む真核生物及び大腸菌を含む原核生物などが用いられてよい。本発明の具現例によれば、前記微生物は酵母を用いるのが好ましく、前記酵母には、ヤロウィア属、サッカロマイセス属、ピチア属、カンジダ属などの酵母が制限なく用いられてよく、この中でも、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・インファンチコラ、サッカロマイセス・セレビシエ、ピチア・アルコーロフィアまたはカンジダ・ミコデルマを用いるのが好ましく、ヤロウィア・リポリティカを用いるのがさらに好ましい。
【００３０】
本発明において、本技術分野に公知の通常の遺伝子組換え技術を利用して、前記脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた組換え微生物を製造することができる。本発明において、前記『除去』という用語は、当該遺伝子の一部または全部が物理的に除去されたことだけでなく、当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡからタンパク質が作られない状態、及び当該遺伝子から発現されたタンパク質が機能できない状態なども包括的に含む意味として用いられる。また、前記『導入』という用語は、微生物のゲノム内に遺伝子が挿入されるか、または、微生物のゲノム内に遺伝子が挿入されていないまま当該遺伝子が発現される場合の全てを包括的に含む意味として用いられる。
【００３１】
本発明において、『重鎖アミノカルボン酸』は、炭素数５から３０、好ましくは８から１６を有する重鎖アミノカルボン酸を全て含む意味として用いられる。本発明の好ましい具現例によれば、前記重鎖アミノカルボン酸は炭素数１２の１２−アミノドデカン酸であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明において、ステップ（２）の基質は脂肪酸であってよいが、これに限定されるものではない。本発明の具現例によれば、前記脂肪酸には、炭素数５から３０、好ましくは８から１６を有する脂肪酸、より好ましくは炭素数１２のドデカン酸が用いられてよいが、これに限定されるものではない。
【００３３】
以下、実施例によって本発明を詳しく説明する。
【００３４】
ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
実施例１．ノックアウトカセットの製作
菌株の改良のための遺伝子ノックアウトのために選別マーカーとして用いられるｕｒａ３遺伝子と、ノックアウトカセットを挿入した後にｕｒａ３遺伝子を除去するためのポップアウトとを有するベクターを製作した（図３）。前記Ｕｒａ３遺伝子にはヤロウィア由来の遺伝子を用い、菌株の改良に用いられたポップアウト領域は全て４種の配列で２種の遺伝子から参照して、一つはバシラス由来のグルタメート生産遺伝子、他の一つはサルモネラまたはクローニングベクターｐＨＵＫＨ由来のｈｉｓオペロンに関与した遺伝子を用いた。前記ポップアウトベクターの製作のために用いられたプライマーと配列は、下記表１に示した。
【００３６】
【表１】
2018531615.tif 000003
2018531615.tif 000004
【００３７】
ノックアウトカセットの製作は、図４に示す通りに進めた。先ず、ヤロウィアのゲノムＤＮＡからノックアウトさせる相同性領域（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎ、ＨＲ）のＰＣＲと、ポップアウトベクターから５’と３’の二つの切れのＰＣＲとをそれぞれ進めた。以後、５’ＨＲと３’ＨＲのそれぞれをＰＯ−ｕｒａ３部位と整列（ａｌｉｇｎ）ＰＣＲ（２ｎｄＰＣＲ）を進めてノックアウトカセットを製作した。それぞれの相同性領域を増幅するために用いたプライマーと配列は表２に示した。
【００３８】
【表２】
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2018531615.tif 000009
【００３９】
ポップアウト領域とｕｒａ３を二つの切れにＰＣＲするために用いたプライマーは表３に示した。
【００４０】
【表３】
2018531615.tif 000010
【００４１】
実施例２．形質導入ベクターの製作
ω−トランスアミナーゼをヤロウィア菌株に挿入させるために図５に示した通りのベクターを製作し、このために用いたプライマーは表４に示した。
【００４２】
【表４】
2018531615.tif 000011
2018531615.tif 000012
【００４３】
トランスアミナーゼカセットの製作は、ベクターから２切れのＰＣＲ産物を獲得した時、プロモーターからｕｒａ３まで増幅してカセットの製作に用いたという点を除き、図４に示したものと同様の方法で進めた。カセットの製作のために用いたプライマーは、下記表５に示した。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
本発明の組換え微生物菌株の改良のために用いた遺伝子配列等はそれぞれ配列リストに記載し、表６に要約した。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
実施例３．組換え微生物菌株の製作
前記実施例１で製造されたノックアウトカセット、及び実施例２で製造された形質導入ベクターを利用して、野生型ヤロウィア菌株に存在するω−酸化代謝経路中の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びβ−酸化代謝経路関連の遺伝子の一部または全部が除去され、また、ω−トランスアミナーゼ遺伝子が組み込まれた合計８種のノックアウト菌株を製作した（図６）。具体的に、遺伝子をノックアウトするか組み込む菌株をＹＰＤプレートに塗抹して３０℃で１６〜２４時間培養した。培養された細胞をループで掻いてワンステップバッファ（４５％  ＰＥＧ４０００、１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｌ  ＬｉＡｃ、２５ｕｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ）１００ｕｌに入れてボルテックスした後、ノックアウトカセット及び形質導入ベクター（１ｎｇ以上）を添加して再びボルテックスし、３９℃で１時間培養した。培養が終わったサンプルを選択培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏアミノ酸  ６．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２０ｇ／Ｌ）にロードした後、３０℃で４８時間培養して製作されたカセットが挿入された菌株を選択した。以後、選択された菌株のゲノム上にカセット等が正確に挿入されたのかを確認するため、表２の遺伝子欠失に含まれているプライマー等を利用して、ＰＣＲを介して確認した。
【００４８】
カセットが挿入された菌株は、他のカセットの挿入を進めるためにポップアウト過程を進めた。選択培地から選択された菌株をＹＰＤ培地の２ｍｌに接種して３０℃で１６時間以上培養した後、培養液２００ｕｌを５’ＦＯＡ培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏアミノ酸  ６．７ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２０ｇ／Ｌ、５’  ＦＯＡ  ０．８ｇ／Ｌ、ｕｒａｃｉｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ｕｒｉｄｉｎｅ  ０．１ｇ／Ｌ）に塗抹して３０℃で４８時間培養した。５’ＦＯＡ培地で育った菌株等は、ＹＰＤプレートとＵＤプレートにピック（ｐｉｃｋｉｎｇ）してＹＰＤプレートで育った菌株等を選別し、再び表２のプライマー等を利用して、ＰＣＲ過程を介しｕｒａ３遺伝子が除去されたのか否かを確認した。Ｕｒａ３が除去された菌株等は、他の遺伝子のノックアウトを進めた。
【００４９】
実施例４．組換え微生物菌株の培養
培養テストする菌株を前日２ｍｌのＹＰＤ培地（Ｂａｃｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ／Ｌ、ｐｅｐｔｏｎｅ  ２０ｇ／Ｌ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ２０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃、２００ｒｐｍで一日間育てた。２４−ウェルプレートに、表７に記載された組成を有する成長期培地（ｐＨ  ６．０）２ｍｌを入れ、前培養した培養液１％を接種した後、プレート撹拌機で３０℃、４５０ｒｐｍで一日間培養した。一日間培養した菌株等を、表８に記載された転換期培地（ｐＨ  ７．６）９００ｕｌが注入された新しいプレートに９００ｕｌずつ接種しながら基質２００ｕｌを共に添加し、３０℃、４５０ｒｐｍで一日間培養した。このとき、基質には、ＤＭＳＯに溶解されたドデカン酸１０ｇ／Ｌを用いた。
【００５０】
【表７】
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【表８】
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【００５１】
その結果、β−酸化代謝関連の遺伝子のみノックアウトされたＹ１−１１菌株の場合、基質であるドデカン酸から１２−アミノドデカン酸を生産することができなかったが、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が更にノックアウトされてω−トランスアミナーゼが組み込まれたＹ２−２０、Ｙ−２−２５、Ｙ２−３０、Ｙ２−３５、Ｙ２−３６及びＹ３−１菌株は、いずれも優れた１２−アミノドデカン酸合成能力を見せた（図７）。さらに、前記Ｙ２−３６菌株は、フラスコで培養した時に８ｍｇ／Ｌ程度の１２−アミノドデカン酸合成能力を見せた（図８）。以下の実験では、Ｙ２−３６菌株を利用した試料分析実験を行った。
【００５２】
実施例５．試料の分析
実施例４で１２−アミノドデカン酸合成能力が最も優れたものと表れたＹ２−３６菌株の培養液５００ｕｌに６Ｎ硫酸１００ｕｌを入れた後、メチル化反応のためにトルエン１０％及び塩酸２．２％が含まれたメタノール５００ｕｌを添加し、１００℃で１時間メチル化反応を行った。前記反応液に１０Ｎの水酸化ナトリウム１００ｕｌ及びジエチルエーテル５００ｕｌを入れて十分ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。以後、溶媒層のみ分離して下記の分析条件でＧＣ／ＭＳ分析を行った。
【００５３】
分析の条件
（１）機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５  ＭＳＤ
（２）コラム：ＨＰ−５ＭＳ
（３）温度：オーブン（１５０℃から２３０℃）
（４）キャリアガス：Ｈｅ
（５）流速：１ｍｌ／分
【００５４】
その結果、本発明の組換えＹ２−３６菌株は、基質であるドデカン酸から１２−アミノドデカン酸を合成することができることを確認した（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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