(57)【要約】  ゲルアミン緩衝剤、一次ゲル両性電解質、及び共役ゲル両性電解質を含むゲル緩衝剤を有する電気泳動ゲルが本明細書に開示される。共役ゲル両性電解質は、トレオニン及びセリンから選択され得る。【選択図】図１Ｆ
2018530758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル緩衝剤を含むゲル電気泳動用ポリアクリルアミドゲルであって、前記ゲル緩衝剤が、
ゲルアミン緩衝剤と、
一次ゲル両性電解質と、
トレオニン及びセリンから選択される共役ゲル両性電解質と、を含む、ポリアクリルアミドゲル。
【請求項２】
前記ゲルアミン緩衝剤が、ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、及びトリエタニオールアミンから選択される、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項３】
前記ゲルアミン緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項４】
前記一次ゲル両性電解質が、グリシン及びトリシンから選択される、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項５】
前記一次ゲル両性電解質が、グリシンである、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項６】
前記共役ゲル両性電解質が、トレオニンである、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項７】
前記共役ゲル両性電解質が、セリンである、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項８】
前記ゲルアミン緩衝剤の濃度が、約１５０ｍＭ未満である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項９】
前記ゲルアミン緩衝剤の濃度が、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１０】
前記ゲルアミン緩衝剤の濃度が、約７０ｍＭ〜約１４０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１１】
前記ゲルアミン緩衝剤の濃度が、約７０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１２】
前記一次ゲル両性電解質の濃度が、約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１３】
前記一次ゲル両性電解質の濃度が、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１４】
前記共役ゲル両性電解質の濃度が、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１５】
前記共役ゲル両性電解質の濃度が、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１６】
前記ゲル緩衝剤のｐＨが、約６．５〜約７．５、もしくは約６．７５〜約７．２５の範囲である、または約７．０である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１７】
前記ゲル緩衝剤のｐＨが、約６．５〜約７．５、もしくは約６．９〜約７．５、もしくは約７．０〜約７．２の範囲である、または約７．１である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１８】
少なくとも約６ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、または約４℃で保存される場合、少なくとも約１２ヶ月、もしくは最大約２４ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも約１６ヶ月、少なくとも約１４ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約８ヶ月、もしくは最大約６ヶ月、の保存寿命を有するように配合される、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１９】
前記ゲルアミン緩衝剤のｐＫａが、約５〜約１０、もしくは約５．５〜約１０、もしくは約６〜約９、もしくは約７〜約８．５、もしくは約７．９〜約８．２、もしくは約８〜約８．１、もしくは約７．９〜約９．８の範囲であるか、または前記ゲルアミン緩衝剤のｐＫａが、約８．１である、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項２０】
電気泳動によりサンプル中の分子を分離する方法であって、前記方法が、
ポリアクリルアミドゲルを形成することと、
前記ポリアクリルアミドゲルに前記サンプルを装填することと、
質量及び／または電荷に応じて変化する移動速度で前記ゲルを通って前記分子を移動させるために、前記ゲルにわたって電圧差を課すことと、を含み、
前記ポリアクリルアミドゲルが、
ゲルアミン緩衝剤と、
一次ゲル両性電解質と、
トレオニン及びセリンから選択される共役ゲル両性電解質と、を含む、方法。
【請求項２１】
前記ゲルアミン緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり、前記一次ゲル両性電解質が、グリシンであり、前記共役ゲル両性電解質が、トレオニン及びセリンから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリアクリルアミドゲル中の前記ゲルアミン緩衝剤の濃度が、約１５０ｍＭ未満である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が、タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記形成工程後かつ前記装填工程前に最大約２４ヶ月、最大約１８ヶ月、最大約１６ヶ月、最大約１４ヶ月、最大約１２ヶ月、最大約１０ヶ月、最大約８ヶ月、または最大約６ヶ月の期間の間、冷蔵下で前記ポリアクリルアミドゲルを保存することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ゲルアミン緩衝剤と、
一次ゲル両性電解質と、
トレオニン及びセリンから選択される共役ゲル両性電解質と、を含む、ポリアクリルアミドゲル緩衝剤であって、前記ゲルアミン緩衝剤のｐＨが、約６．５〜約７．５の範囲である、ポリアクリルアミドゲル緩衝剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）条に基づき、２０１５年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２４１，６４２号に対する優先権を主張し、これは本出願と同一所有者であり、本明細書に完全に記載されているかのようにその全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ゲル電気泳動における使用のための配合物、系、及び技術に関する。より具体的には、本開示は、ほぼ中性のｐＨを呈するポリアクリルアミドゲルの配合物、ならびに関連する系及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ポリペプチド、及びタンパク質などの生体分子の分離のための一般的な手順である。ゲル電気泳動では、課された電場により巨大分子が濾過ゲルを介して移動する速度に従って、それらがバンドに分離される。
【０００４】
この技術で使用される装置は、ガラス管に封入されたゲルまたはガラスもしくはプラスチックプレートの間にスラブとして挟まれたゲルを含み得、それはゲルカセットと称されることもある。ゲルは、塩の導電性緩衝溶液で飽和された細孔を画定する開放分子ネットワーク構造を有する。ゲルを通るこれらの細孔は、移動する巨大分子の通過を許容するのに十分な大きさである。
【０００５】
ゲルカセットまたは他の装置は、ゲルと電源のカソードまたはアノードとの間の電気的接触を提供する緩衝溶液と接触しているチャンバ内に配置される。巨大分子及び追跡色素を含有するサンプルをゲルの上部に置く。電位をゲルに印加して、サンプル巨大分子及び追跡色素をゲルの底部へ移動させる。電気泳動は、追跡色素がゲルの末端に達する直前に停止される。次いで、分離された巨大分子のバンドの位置が決定される。追跡色素及び既知のサイズの巨大分子と比較して特定のバンドが移動した距離を比較することによって、他の巨大分子のサイズが決定され得る。
【０００６】
ゲルを通る巨大分子の移動速度は、４つの主な要因に依存する：支持マトリックス（すなわち、ゲルの多孔性）、巨大分子のサイズ及び形状、巨大分子の電荷密度、ならびに印加された電界強度。電気泳動系は概して、ゲルからゲルへ、及びサンプルからサンプルへの間で再現性を持たせるために、これらの因子を制御しようとする。しかしながら、これらの因子の各々がゲル系の化学種における多くの変数に敏感であるため、ゲル間の均一性を維持することは困難である。
【０００７】
電気泳動において一般的に使用される２種類の支持マトリックスは、ポリアクリルアミド及びアガロースである。支持マトリックスは多孔質媒体として作用し、モレキュラーシーブのように挙動する。アガロースは比較的大きな細孔サイズを有し、概して核酸及びタンパク質複合体の分離に使用される。ポリアクリルアミドは比較的小さな細孔サイズを有し、ほとんどのタンパク質及びより小さな核酸を分離するために一般的に使用される。
【０００８】
ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドモノマーの重合によって生成される。これらのモノマーは、鎖末端の遊離官能基と反応するＮ，Ｎ，−メチレンビスアクリルアミド（「ビスアクリルアミド」）のような二官能性化合物の添加によって長鎖に架橋される。アクリルアミド及びビスアクリルアミド（％Ｔ＝Ｘ％で表され、ここで、Ｘはゲル中の全アクリルアミド濃度である）の合計濃度は、ゲルの細孔サイズに影響を及ぼす。例えば、所定の架橋剤濃度（％Ｃ）では、増加したアクリルアミド濃度（％Ｔ）は、細孔サイズの減少をもたらし、その結果低分子量分子の分解がもたらされ、逆もまた同様である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、ゲルが光学的に透明であり、電気的に中性であり、ある範囲の細孔サイズで作製され得るので、望ましい電気泳動特性を提供する。
【０００９】
電気泳動は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなアニオン性界面活性剤を用いた変性条件下で行なわれ得る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動がドデシル硫酸ナトリウム、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥとして使用される場合、巨大分子の電荷密度はＳＤＳを系に加えることによって制御される。ＳＤＳ分子は、巨大分子と会合し、それらに均一な電荷密度を付与し、本来の分子電荷の影響を実質的に拒絶する。得られたＳＤＳ−巨大分子複合体は、負に帯電しており、そのサイズに基づいてゲル中で分解される。
【００１０】
歴史的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、通常、塩基性ｐＨで注入され、泳動されていた。タンパク質の分離に使用される最も一般的なＰＡＧＥ緩衝系は、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ及びＤａｖｉｓによって開発されたものであり（Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：３２１及びＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：４０４）、ＬａｅｍｍｌｉによってＳＤＳと共に使用するために改変された（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８６）。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝系は、分離ゲル中でＨＣｌを用いてｐＨ８．８に滴定された０．３７５Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（「トリス」）からなる。スタッキングゲルは、ｐＨ６．８に滴定された０．１２５Ｍのトリスからなる。アノード及びカソード泳動緩衝剤は、０．０２４Ｍのトリス、０．１９２Ｍのグリシン、０．１％のＳＤＳ（すなわち、「トリス−グリシン緩衝剤」として）を含有する。
【００１１】
様々な緩衝系が開発されているが、トリス−グリシンは、比較的安価であり、広く使用されているため産業界の実務者に親しみやすく、定性的な差異を有する巨大分子バンド及びレーン形状を提供する。さらに、銀染色などの下流のアプリケーションは、トリス−グリシン緩衝系と適合性がある。銀染色に関して、トリス−グリシンゲルは、トリシンまたはビシンで緩衝されたゲルよりも低いバックグラウンド染色を提供することが報告されている（Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：５７−７５（１９９４））。
【００１２】
上記のような塩基性ｐＨ値を有する伝統的な（例えば、トリス−グリシン）緩衝剤でのポリアクリルアミドゲルの使用の欠点は、ゲルが経時的にポリアクリレートアニオン及びアンモニウムカチオンに加水分解する傾向があることである。ポリアクリレートアニオンの負電荷は、ゲル中の巨大分子の移動距離が減少した巨大分子（例えば、サンプルの負に帯電したタンパク質）の適切な移動を妨げる。この移動の干渉は、望ましくない「スマイリング効果」を引き起こし得、ゲルエッジ付近の低分子量タンパク質バンドが上方に湾曲する傾向があり、分離の正確な決定が困難になる。加水分解はまた、巨大分子バンドの分解能を低下させ得る。冷蔵されていない高ｐＨ緩衝剤を含むゲルは、加水分解により数日で分解し得る。しかしながら、４℃程度の温度に保たれたこの種の冷蔵ゲルでさえ、製造の２〜３ヶ月以内に劣化し始め得る。
【００１３】
したがって、中性のｐＨを有する電気泳動ゲル緩衝配合物が必要とされ、それにより、延長された保存寿命を有するポリアクリルアミドゲルを提供する。さらに、分離された分子の分解能のシャープネスが許容可能なレベルに維持され、比較的大きな緩衝能を呈するように、電気泳動の間に巨大分子の有効な分離を提供し得るそのような配合物の必要性が存在する。経済的なトリス−グリシン泳動緩衝剤及びサンプル緩衝剤、ならびに業界がある程度の親しみを有するような泳動及びサンプル緩衝剤と適合する電気泳動ゲル緩衝剤の必要性もまた存在する。さらに、トリス−グリシンゲルに共通する下流のアプリケーションとの適合性を有するそのような中性ｐＨ緩衝配合物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１４】
本明細書に開示されるものは、上で特定される１つ以上の問題に対処するゲル組成物及びゲル緩衝剤である。本開示の様々な例示的な実施形態によるゲル電気泳動用ポリアクリルアミドは、ゲルアミン緩衝剤と、一次ゲル両性電解質と、トレオニン及びセリンから選択され得る共役ゲル両性電解質と、を含むゲル緩衝剤を有する。
【００１５】
本発明の別の態様によると、電気泳動によりサンプル中の分子を分離する方法が開示される。方法は、ポリアクリルアミドゲルを形成する工程と、ポリアクリルアミドゲルにサンプルを装填する工程と、質量及び／または電荷に応じて変化する移動速度で前記ゲルを通って分子を移動させるために、ゲルにわたって電圧差を課す工程と、を含む。本明細書に開示される電気泳動によってサンプル中の分子を分離する方法のポリアクリルアミドゲルは、ゲルアミン緩衝剤と、一次ゲル両性電解質と、共役ゲル両性電解質と、を含み得る。共役ゲル両性電解質は、トレオニン及びセリンから選択され得る。
【００１６】
本開示のさらなる態様によると、ポリアクリルアミドゲル緩衝剤は、ゲルアミン緩衝剤と、一次ゲル両性電解質と、トレオニン及びセリンから選択され得る共役ゲル両性電解質と、を含む。ゲル緩衝剤のｐＨは、約６．５〜約７．５の範囲であり得る。
【００１７】
さらなる目的及び利点は、部分的には以下の説明に記載され、部分的には説明から明白になるか、または本教示の実施によって習得され得る。本開示の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素及び組み合わせ、ならびにそれらの等価物によって実現及び達成されるであろう。
【００１８】
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求される主題を限定するものではないことを理解されたい。添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本開示の例示的な実施形態を説明し、説明と共に、本開示の様々な原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本開示の少なくともいくつかの特徴及び利点は、添付の図面を参照して考慮すべき例示的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００２０】
【図１Ａ】８．７のｐＨを有する対照ポリアクリルアミドゲル配合物を有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した４００ｍＭのトリス及び０ｍＭのグリシンを含む、市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｂ】６．３のｐＨを有するポリアクリルアミドゲル配合物を有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのトリシンを含み、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｃ】、７．５のｐＨを有するポリアクリルアミドゲル配合物を有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのトリシンを含み、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｄ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び５０ｍＭのアスパラギンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を有し、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｅ】７．３のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び５０ｍＭのタウリンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を含み、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｆ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び７５ｍＭのトレオニンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を有し、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｇ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び２５ｍＭのセリンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を有し、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図１Ｈ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び５０ｍＭのセリンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を有し、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図２Ａ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した７５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び１０ｍＭのトレオニンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を有し、非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図２Ｂ】約６．５のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した未知の濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのポリアクリルアミドゲル配合物を含むと考えられる市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図２Ｃ】約６．３のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した未知の濃度のトリス、グリシン、及びグリセロールのポリアクリルアミドゲル配合物を含むと考えられる市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＰｒｅｃｉｓｅ（商標）トリス−グリシンゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図３Ａ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した７５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び１０ｍＭのトレオニンを含む、ポリアクリルアミドゲル配合物を有する、勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝４〜２０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図３Ｂ】６．５のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した未知の濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのポリアクリルアミドゲル配合物を含むと考えられる市販の勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル（％Ｔ＝４〜２０％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図３Ｃ】約６．３のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した未知の濃度のトリス、グリシン、及びグリセロールのポリアクリルアミドゲル配合物を含むと考えられる市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＰｒｅｃｉｓｅ（商標）トリス−グリシンゲル（％Ｔ＝４〜２０％）ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図４Ａ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１１７ｍＭのトリス、１９５ｍＭのグリシン、及び１５．６ｍＭのトレオニンを含むポリアクリルアミドゲル配合物を含む、非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝８〜１６％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図４Ｂ】約６．５のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した未知の濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのポリアクリルアミドゲル配合物を含むと考えられる市販の勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル（Ｔ＝８〜１６％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図５】ゲルを使用して電気泳動を行った後に採取した６つの非勾配ポリアクリルアミドゲルのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの横並びの注釈グレースケール写真を示し、ここで、１つのゲルは、ｐＨが８．７であり、４００ｍＭのトリス及び０ｍＭのグリシンを含む対照ポリアクリルアミドゲル配合物を有する、市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）であり、ならびに５つのゲルは、７．１のｐＨ及びトレオニンの可変濃度を有する非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態である。
【図６Ａ】７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した７８．５ｍＭのトリス、１３１ｍＭのグリシン、及び１０．５ｍＭのトレオニンを含む、ポリアクリルアミドゲル配合物を有する、非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝６％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示す。
【図６Ｂ】非勾配ポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝６％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示し、７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１５０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのグリシン、及び２０ｍＭのトレオニンを含む、ポリアクリルアミドゲル配合物を有する。
【図６Ｃ】非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝４〜２０％）の例示的な実施形態の注釈付きグレースケール写真を示し、７．１のｐＨを有し、かつゲルを用いて電気泳動分離を行った後に採取した１３５ｍＭのトリス、２１７ｍＭのグリシン、及び１７．３ｍＭのトレオニンを含む、ポリアクリルアミドゲル配合物を有する。
【図７】ゲルを使用して電気泳動を行った後に採取した６つの非勾配ポリアクリルアミドゲルのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの横並びの注釈グレースケール写真を示し、ここで、１つのゲルは、ｐＨが８．７であり、４００ｍＭのトリス及び０ｍＭのグリシンを含む対照ポリアクリルアミドゲル配合物を有する、市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）であり、ならびに５つのゲルは、７．１のｐＨ及びグリシンの可変濃度を有する非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態である。
【図８】ゲルを使用して電気泳動を行った後に採取した６つの非勾配ポリアクリルアミドゲルのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの横並びの注釈グレースケール写真を示し、ここで、１つのゲルは、ｐＨが８．７であり、４００ｍＭのトリス及び０ｍＭのグリシンを含む対照ポリアクリルアミドゲル配合物を有する、市販の非勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）であり、ならびに５つのゲルは、７．１のｐＨ及びトレオニンの可変濃度を有する非勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）の例示的な実施形態である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の詳細な説明は、例示的な具体的実施形態を参照するが、多くの代替形態、改変形態、及び変形形態が当業者には明らかであろう。したがって、特許請求の範囲に記載された主題は、広く見られることが意図されている。
【００２２】
本明細書全体を通して使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、かつ各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、本開示の配合物、系、及び方法、ならびにそれらを作製及び使用する方法を記述する際に実務者に追加の指針を提供するために、以下または本明細書の他の箇所で論じられる。同じことが複数の方法で言えることは理解されよう。したがって、代替の言語及び同義語は、本明細書で論じられる用語のいずれか１つ以上に使用されてもよく、また、用語が本明細書でより詳細に精緻化または議論されているか否かにかかわらず特別な意味を持たない。特定の用語の同義語が提供されている。１つ以上の同義語のリサイタルは、他の同義語の使用を排除するものではない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む、本明細書中のどこかの実施例の使用は、例示的なものに過ぎず、決して本明細書に示される実施形態のいずれかまたは例示されるいずれかの用語の範囲及び意味を限定するものではない。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「不連続緩衝剤」、「不連続系」及び「不連続緩衝剤系」は概して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動系で使用される２つの水性緩衝系のうちの１つを指す。不連続緩衝系は、連続緩衝系と機能的及び化学的に区別される。典型的には、連続系は、単一の分離ゲルのみを有し、タンク及びゲルにおいて同じ緩衝剤を使用する。不連続系では、スタッキングゲルと呼ばれる非制限的な大きな細孔ゲルが、しばしば分離ゲルの上に積層される（「分解ゲル」と称されることもある）。各ゲルは、同一または異なる緩衝剤で作製することができ、タンク緩衝剤はゲル緩衝剤とは異なる。不連続性は、より速い移動先導イオン（例えば、塩化物）及びより遅い移動後続イオン（複数可）（グリシン、トレオニン、及び／またはセリン）のイオン移動度の差によって生じる。不連続系で得られる分解能は、分析対象分子の鋭い開始領域を生成するための不連続系の濃縮効果により、分析対象物の希釈溶液を含むサンプルの連続系で得られる分解能よりもはるかに大きい。連続バッファ系と不連続バッファ系との間の相違点は、本発明が関係する当業者には周知である。
【００２４】
用語「バンドシャープネス」は、様々なゲル配合物に現れる移動したバンドのシャープネスを比較するために使用される相対的な用語である。この用語は、２つ以上の様々なゲル配合物の間の相対的バンドシャープネスを比較する場合に特に使用される。バンドシャープネスを決定するために、様々な方法が使用され得る。例えば、得られる解像度の程度、バンドシャープネス、またはバンドシャープネスが改善される程度に応じて、目視検査によって決定され得る。バンドシャープネスのより定量的な評価を得るために、ゲルイメージング及び分析ソフトウェアが用いられ得る。例示的に、限定されないが、当該技術分野で使用されるゲルイメージング及び分析ソフトウェアは典型的に、例えば、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）、ＧＥＬ−ＰＲＯＴＭ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）またはＬＡＢＩＭＡＧＥ（登録商標）１Ｄ  Ｌ３００  Ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｂｌｍａｇｅ，Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。バンドシャープネスは、ゲル中の分解された各バンドの面積を測定し、その面積を各ウェルの幅（一般に一定である）で割ることによって決定され得る。バンドシャープネスを決定する別の方法は、ゲルイメージ及び分析ソフトウェアによって検出される個々のピークの幅を直接測定することであり得る。よりシャープなバンドは、タンパク質質量がより小さな領域に分布するため、対象のタンパク質を検出する可能性を高める。
【００２５】
例示的な実施形態では、本開示は、ゲル及び緩衝系を含む電気泳動系を企図し、ここで、分離はほぼ中性のｐＨで生じる。本明細書中で使用される場合、ほぼ中性のｐＨは概して、約６．５〜約７．５の範囲のｐＨ、例えば約６．９〜約７．５の範囲のｐＨ、または例えば約７．０〜約７．２の範囲のｐＨであり得る。いかなる特定の理論またはメカニズムにも縛られることなく、ほぼ中性のｐＨ電気泳動システムの使用により、電気泳動（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物など）に供されるサンプル中の生体分子が完全にまたは実質的に還元され、加水分解されないままであることが保証されると考えられる。有利には、ほぼ中性のｐＨで、タンパク質の第一級アミノ基は、未重合のアクリルアミドとの反応性が低く、それにより、より高い分解能及び改善されたバンドシャープネスが可能になる。さらに、チオール基は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが従来行われているよりアルカリ性の条件下よりも、酸化の影響を受けにくい。
【００２６】
均一なアクリルアミド濃度を有するゲルは、概してパーセンテージとして表され、非勾配ゲルと称される。非勾配ゲルにおいて、均一なアクリルアミド濃度は、ゲル全体にわたって均一なモレキュラーシーブを提供する。あるいは、ゲルの長さにわたって不均一なアクリルアミド濃度を有するゲルが、勾配ゲルと称される。一般に、勾配ゲルでは、アクリルアミド濃度は、ゲルの下向きの長さに沿って徐々にまたは段階的に増加する。したがって、勾配ゲルでは、段階的なアクリルアミド濃度は、ゲル全体にわたってますます高密度のモレキュラーシーブを提供し、それにより同じサイズの非勾配ゲルが提供できるよりも広い範囲の巨大分子のゲル内での分離を提供する。
【００２７】
ゲルは、スタッキング部分を含んでも含まなくてもよい。スタッキング部分を有さないゲルは、電気泳動ゲル装置全体例えば、ゲルカセットにおいて単一のアクリルアミド溶液から形成されたゲルであり、それに対して、スタッキング部分を有するゲルは、少なくとも２つのアクリルアミド溶液から形成される：（１）巨大分子が溜まる小濃度の低濃度スタッキングゲル、及び（２）タンパク質分離が起こるゲルのより大きな部分。従来のトリス−グリシン電気泳動ゲルシステムでは、巨大分子は、（ゲル緩衝剤中の）高度に可動性の先導塩化物イオンと（泳動緩衝剤中の）より遅いトレーリンググリシンイオンとの間のスタッキングゲル中にスタックされる。スタッキングゲルを使用する理由は、ゲル中のバンドの分解能を向上させるためである。スタックされた巨大分子バンドは、分離ゲルに到達するとふるい分けされる。分離ゲルは、上述したように、非勾配ゲルまたは勾配ゲルであり得る。
【００２８】
本開示の基礎を形成するゲル配合物は、いくつかの実施形態では、不連続緩衝系の一部として使用される場合に望ましい性能特性を提供し得る。不連続緩衝系は、ゲル中に存在する緩衝剤からアノードチャンバー、カソードチャンバー、またはアノード及びカソードチャンバーの両方で異なる水性緩衝剤を使用するものである。水性泳動緩衝剤の濃度は、電気泳動ゲルの緩衝剤濃度と異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、本開示によるゲル配合物は、スタッキングゲル及び分解ゲルを含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ゲル配合物は、スタッキングゲル及び分解ゲル（すなわち、分離ゲル）を含み得る。スタッキングゲル対分解ゲル比（Ｓ：Ｒとも示される）の非限定的な例は、約０．５：９．５、約１：９、約１．５：８．５、約２：８、約２．５：７．５、約３：７、約３．５：６．５、約４：６、約４．５：５．５、または約１：１であり得る。一般的に、スタッキング対分解ゲルの比は、例えば分離及びサンプル要件のような様々な要因に依存して可変し得る。不連続ゲル電気泳動系の文脈で使用される場合、用語スタッキング及び分解ゲルの用語の意味は、当業者に周知である。典型的には、スタッキングゲル中に存在するポリアクリルアミド及び／または架橋剤（例えば、ビスアクリルアミド）のパーセンテージは、分解ゲル中に存在するポリアクリルアミド及び／または架橋剤のパーセンテージ未満であり得る。いくつかの実施形態では、スタッキングゲル中に存在するポリアクリルアミドのパーセンテージは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満であろう。いくつかの実施形態では、スタッキングゲル中に存在するポリアクリルアミドのパーセンテージは、約２．５％以下であり得る。
【００３０】
電気泳動系及び配合物の一実施形態では、約１％〜約６％の適切な架橋剤（％Ｃ）例えば、ビスアクリルアミドを用いて、約２．５％〜約２５％のアクリルアミド（％Ｔ）の範囲の分解ポリアクリルアミドゲルは、重合される。一実施形態では、ゲル緩衝剤の存在下で約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を用いて、ゲルは、重合される。一実施形態では、ポリアクリルアミドゲルは、２５％のアクリルアミド、２４％のアクリルアミド、２３％のアクリルアミド、２２％のアクリルアミド、２１％のアクリルアミド、２０％のアクリルアミド、１９％のアクリルアミド、１８％のアクリルアミド、１７％のアクリルアミド、１６％のアクリルアミド、１５％のアクリルアミド、１４％のアクリルアミド、１３％のアクリルアミド、１２％のアクリルアミド、１１％のアクリルアミド、１０％のアクリルアミド、９％のアクリルアミド、８％のアクリルアミド、７％のアクリルアミド、６％のアクリルアミド、５％のアクリルアミド、４％のアクリルアミド、３％のアクリルアミド、または２．５％のアクリルアミドを含み得る。
【００３１】
特定の非限定的な実施形態では、ＳＤＳは、電気泳動ゲル配合物に実質的に存在しなくてもよい。代わりに、ＳＤＳは、泳動緩衝剤及び／または装填緩衝剤に提供され得る。
【００３２】
種々の例示的な実施形態によるポリアクリルアミドゲルは、第一級有機アミンまたは一もしくは二置換アミン緩衝剤を含み得る。ゲルアミン緩衝剤のｐＫａ範囲はまた、ほぼ中性、典型的には約５〜約１０の範囲、約５．５〜約１０の範囲、約６〜約９の範囲、約７〜約８．５の範囲、約７．９〜約８．２の範囲、または約８．０〜約８．１の範囲であり得る。本明細書に記載の電気泳動系及び方法と共に使用するのに適した例示的、非限定的なゲルアミン緩衝剤は、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（以下「ビス−トリス」）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（以下「ビス−トリスプロパン」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下「トリス」）、トリエタニオールアミン、または約５．５〜約１０．０の範囲のｐＫａ値を有するその任意の誘導体もしくは塩を含み得る。しかし、少なくとも１つの第一級アミンまたは置換アミンを有し、さらに約７．９〜約９．８の範囲のｐＫａを有する任意のゲルアミン緩衝剤を、本明細書に記載の実施形態の実施中に、その精神及び範囲から逸脱することなく使用し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝剤の濃度は、約１５０ｍＭ未満、例えば約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約７０ｍＭ〜約１４０ｍＭの範囲であり得る。一般に、非勾配ゲルに対しては、より低い濃度レベルのゲルアミン緩衝剤、例えば約８０ｍＭ以下が適用可能であり得る。非勾配ゲルに対しては、より高い濃度レベルのゲルアミン緩衝剤、例えば約８０ｍＭ以上が適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、ゲルは１５０ｍＭ未満の濃度のゲルアミン緩衝剤を有し、ゲルアミン緩衝剤はトリスである。一般に、より低いトリス濃度、例えば１５０ｍＭ未満を有するゲル配合物は、電気泳動分離の泳動時間を短縮し、電気泳動中に生成される熱を減少し得る。
【００３４】
様々な例示的な実施形態では、他の水性構成成分を合わせる際かつ重合反応の開始前に、ゲルアミン緩衝剤は、分解ゲル、スタッキングゲル、または水溶液としての分解ゲル及びスタッキングゲルの両方に直接添加され得る。あるいは、ゲルアミン緩衝剤は、例えば、所望の濃度のゲルアミン緩衝剤を含有する水溶液中に重合ゲルを浸漬し、ゲルアミン緩衝剤を重合ゲルマトリックスに浸透させることによって、ゲルマトリックスに組み込まれ得る。
【００３５】
電気泳動系の基礎を形成するポリアクリルアミドゲルは、上記のようなゲルアミン緩衝剤と組み合わせた一次ゲル両性電解質を含み得る。本開示の例示的な実施形態によるゲル配合物と共に使用するのに適した一次ゲル両性電解質は、限定されないが、アミン基を有する任意の生物学的緩衝剤を含み、水溶液中に両性イオンを形成することができる。いくつかの実施形態では、対象となるゲル配合物と共に使用に適した一次ゲル両性電解質は、ゲルアミンのｐＫａ値よりも最大約２．０ｐＨ単位大きいｐＫ値を有するであろう。非限定的な例として、以下の例示的なゲル両性電解質が、一次ゲル両性電解質として本明細書に記載の実施形態と共に使用されるために企図される：２−アミノ酢酸（以下「グリシン」）、Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン（以下「トリシン」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；ジエチレングリシン（以下「ビシン」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下「ＰＩＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以下「ＭＯＰＳＯ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以下「ＡＣＥＳ」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下「ＢＥＳ」）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以下「ＴＥＳ」）、−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンエタンスルホン酸（以下「ＨＥＰＥＳ」）、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（以下「ＨＥＰＰＳ」）、及びＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下「ＴＡＰＳ」）である。当然のことながら、当業者には、少なくとも１つのアミンまたは置換アミンを有し、ゲル中での使用のために選択されたゲルアミンよりも約１〜約２ｐＨ単位の範囲にあるｐＫａをさらに有する任意のゲル両性電解質は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている実施形態の実施において使用され得る。一次両性電解質は、ゲル配合物中に、約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。
【００３６】
種々の例示的な実施形態では、電気泳動系に使用するためのポリアクリルアミドゲル配合物は、上記のゲルアミン及び一次ゲル両性電解質と組み合わせた共役ゲル両性電解質を含み得る。非限定的な例として、以下の例示的な共役ゲル両性電解質が、本明細書に記載の実施形態と共に使用されるために企図される：（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸（以下「トレオニン」）、（２Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパン酸（以下「セリン」）、２−アミノエタンスルホン酸（以下「タウリン」）、及び（２Ｓ）−２，４−ジアミノ−４−オキソブタン酸（以下「アスパラギン」）。共役両性電解質は、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲内、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の濃度で、ゲル配合物中に存在し得る。いくつかの例示的な実施形態では、ゲルアミン緩衝剤は、塩基及び緩衝剤として作用し、一次両性電解質は、トレーリングイオンとして作用し、共役両性電解質は、追加のトレーリングイオンとして作用する。一次両性電解質は、以下の追加のトレーリングイオンと共に、ＨＣｌによって提供されるＣｌ−後にトレーリングする先導トレーリングイオンである。本開示の範囲内で、緩衝剤配合物中で使用される特定の共役両性電解質を同定することに関して、トレオニン及びセリンは、質的に優れたタンパク質バンド分離及び分解を予想外に提供した。
【００３７】
いくつかの実施形態では、例えば、他の水性構成成分を合わせる際かつ重合反応の開始前に、ゲル両性電解質（複数可）は、分解ゲル、スタッキングゲル、または水溶液としての分解ゲル及びスタッキングゲルの両方に直接添加され得る。あるいは、ゲル両性電解質（複数可）は、所望の濃度のゲル両性電解質（複数可）を含有する水溶液中に重合ゲルを浸漬し、ゲル両性電解質（複数可）を重合ゲルマトリックスに浸透させることによって、ゲルマトリックスに組み込まれ得る。
【００３８】
１つの非限定的な例示的な実施形態では、ゲルアミン緩衝剤は、トリスであり、一次両性電解質／トレーリングイオンは、グリシンであり、共役両性電解質／二次トレーリングイオンは、トレオニンであり得る。別の非限定的な例示的な実施形態では、ゲルアミン緩衝剤は、トリスであり、一次両性電解質／トレーリングイオンは、グリシンであり、共役両性電解質／二次トレーリングイオンは、セリンであり得る。これらの配合物中のトリスの濃度は、約１５０ｍＭ未満、例えば約７０ｍＭ〜約１４０ｍＭの範囲、グリシンは、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲、トレオニンまたはセリンは、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲であり得る。これらの配合物のｐＨは、約６．５〜約７．５の範囲であり得、約６．９〜約７．５の範囲、または約７．０〜約７．２の範囲であり得、あるいはこれらの配合物のｐＨは約７．１であり得る。
【００３９】
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態による様々な有効な配合物を示すために含まれる。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において１つ以上の変更を行うことができ、また本明細書に記載の実施形態の精神及び範囲から逸脱することなく、同様のまたは同様の結果を得ることができることを理解する。
【００４０】
実施例１
この実施例は、それぞれ本開示の範囲内の異なるトリス系ゲル緩衝剤で調製されたポリアクリルアミドゲルの性能を示す。図１Ａのゲルは、４００ｍＭ及び０ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を含み、かつ８．７のｐＨを有する、対照ゲル１００、すなわち市販のＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃによる）である。それぞれ図１Ｂ〜１Ｈに示す一連のポリアクリルアミドゲル配合物１０１〜１０７を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の１０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。生成されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。各ゲルカセットは、１０個の平行なレーン１〜１０を有するように形成された。対照ゲル１００及び調製された各ゲル配合物１０１〜１０７はまた、３．３％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル部分を有する。ゲル１００〜１０７は、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。
【００４１】
各ゲル緩衝剤を、以下の説明に示されるｐＨに６ＮのＨＣｌで調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリスＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物１００〜１０７と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳからなる泳動緩衝剤を各ゲル配合物１００〜１０７と共に使用した。
【００４２】
各ゲルについて、全ての１０個のレーン１〜１０にサンプルタンパク質混合物を装填した。それぞれの各レーンに装填されたサンプルタンパク質混合物は、対照ゲル１００及び調製された各ゲル配合物１０１〜１０７について同じであった。各レーン１〜１０に装填されたサンプルタンパク質混合物を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2018530758.tif 000003
【００４４】
電気泳動分離を、２２５Ｖの定電圧で４９分〜５８分の範囲の泳動時間で行い、特定の泳動時間を図１Ａ〜１Ｈのそれぞれに反映させた。結果は、以下の通りであった。
【００４５】
図１Ａに示されるように、対照ゲル配合物１００は、本開示の範囲内で形成されたゲルの性能が比較される許容可能なタンパク質バンド分離及び分解能の例を提供した。注目すべきは、対照ゲル配合物１００は、８．７という比較的高いｐＨを有し、したがって、本開示に従って、ほぼ中性であると考えられる範囲外である。
【００４６】
図１Ｂに示すように、ゲル配合物１０１は、６．３のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのトリシンを一次両性電解質として含むゲル緩衝剤を含んだ。図１Ｃに示すように、ゲル１０２は、７．５のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのトリシンを一次両性電解質として含むゲル緩衝剤を含んだ。ゲル１０１及び１０２の両方は、図１Ａの同じ領域と比較して、図１Ｂ及び１Ｃの同定された領域で見られるように、望ましくないタンパク質分離圧縮を示した。
【００４７】
図１Ｄに示すように、ゲル配合物１０３は、７．１のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として５０ｍＭのアスパラギンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル１０３は、図１Ａの同じ領域と比較して、図１Ｄの同定された領域、特にレーン４、５、及び６において見られるように、望ましくないタンパク質分離圧縮を示した。
【００４８】
ゲル配合物１０４は、図１Ｅに示すように、７．３のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭのグリシン、及び共役両性電解質として５０ｍＭのタウリンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル１０４は、図１Ａの同一の領域と比較して、図１Ｅの同定された領域、特にレーン４及び７において見られるように、望ましくないタンパク質分離圧縮を示した。
【００４９】
図１Ｆに示すように、ゲル配合物１０５は、７．１のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として７５ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル１０５は、図１Ａと比較して図１Ｅに見られるように、望ましくないタンパク質分離圧縮を示さなかった。したがって、得られた結果に基づいて、追加のトレーリングイオンとしてトレオニンを含むトリス−グリシン緩衝剤を使用したこのゲル配合物はまた、ほぼ中性のｐＨを有する一方、ＰＡＧＥの質的に優れたゲル緩衝剤を予想外に生じた。
【００５０】
図１Ｇに示すように、ゲル配合物１０６は、７．１のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として１２５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として２５ｍＭのセリンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル配合物１０７は、図１Ｈに示すように、７．１のｐＨを有し、１２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのグリシン、及び５０ｍＭのセリンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル配合物１０６及び１０７の両方は、図１Ａと比較して、図１Ｇ及び１Ｈに見られるように、望ましくないタンパク質分離圧縮を示さなかった。したがって、得られた結果に基づいて、追加のトレーリングイオンとしてトレオニンに代わりセリンを有するトリス−グリシン緩衝剤はまた、ほぼ中性のｐＨを有する一方、ＰＡＧＥの質的に優れたゲル緩衝剤を予想外に生じた。
【００５１】
実施例２
この実施例は、本開示の範囲内の非勾配ポリアクリルアミドゲルの性能と２つの市販の非勾配ポリアクリルアミドゲルの性能との比較を示す。それぞれ図２Ａに示すポリアクリルアミドゲル配合物２００を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の１０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。生成されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。調製されたゲル配合物２００は、３．３％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル部分をさらに有していた。ゲル配合物２００は、７．１のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として７５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として１０ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル緩衝剤を６ＮのＨＣｌでｐＨ７．１に調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物２００と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を各ゲル配合物２００と共に使用した。
【００５２】
図２Ｂに示すゲル配合物２０１は、６．５のｐＨを有する、未知濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのゲル緩衝剤を含むと考えられる、市販のゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）（Ｔ＝１０％）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）である。６５．８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．１％ＳＤＳ、及び０．０１％ブロモフェノールブルーの製造業者によって提供され、６．８のｐＨを有するサンプル緩衝剤をゲル配合物２０１と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの製造業者によって提供される泳動緩衝剤を各ゲル配合物２０１と共に使用した。
【００５３】
図２Ｃに示すゲル配合物２０２は、未知濃度のトリス、グリシン、及びグリセロールならびに約６．３のｐＨの緩衝剤を含むと考えられる、別の市販のゲル、すなわちＰｒｅｃｉｓｅ（商標）トリス−グリシン（Ｔ＝１０％）ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）である。７．６のｐＨを有する、０．２Ｍのトリエタノールアミン−ＣＩ、１％のＬＤＳ、１０％のグリセロール、１％のＦｉｃｏｌｌ（商標）４００、０．００６％のフェノールレッド、０．００６％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０、及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムの製造業者によって提供されたサンプル緩衝剤をゲル配合物２０２と共に使用した。８．５のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの製造業者によって提供される泳動緩衝剤を各ゲル配合物２０２と共に使用した。
【００５４】
ゲル配合物２００〜２０２を含有する各ゲルカセットは、１０本の平行なレーン１〜１０を有した。各ゲルカセットについて、１０個のレーン１〜１０の全てに、サンプルタンパク質混合物を装填し、各レーンは、上記の表１において同定されたサンプルを有した。ゲル２００〜２０２は、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。電気泳動分離は、図２Ａ〜２Ｃに示すように、１８５Ｖまたは２２５Ｖのいずれかの一定電圧で、２９分〜７８分の範囲の泳動時間で行った。結果は、以下の通りであった。
【００５５】
３つのゲル配合物２００〜２０２のうち、ゲル２００は、最もよく観察されるタンパク質分離及びバンドシャープネスを提供した。同様に、ゲル配合物２０１のより高い装填バンドはより弓なりになり、これは望ましくない。例えば、図２Ｂに示すように、ゲル２０１のレーン３は、ゲルの左端に向かって望ましくないほど曲がったりまたは湾曲したりする。同様に、ゲル２０２のレーン７及び８は、ゲルの右端に向かって望ましくないほど曲がったりまたは湾曲したりする。図２Ａに示すように、ゲル２００のレーン３、７及び８は、比較的直線状であり、望ましくないほど曲がったりまたは湾曲したりを呈しない。ゲル配合物２０２に関しては、図２Ｃに示すように、望ましくない「スマイリング効果」がレーン１、２、９、及び１０に呈され、ここでは、ゲル２０２の左端及び右端付近の低分子量タンパク質バンドが上方に湾曲または傾斜する。図２Ａに示すように、ゲル２００のレーン１、２、９、及び１０は、比較的直線状であり、望ましくないほど湾曲したりまたは傾斜したりを呈しない。さらに、ゲル２００〜２０２のレーン３、４、７、及び８と比較した場合、特に明らかなように、ゲル２００は、ゲル２０１及び２０２よりもよりシャープなバンドを生成した。
【００５６】
実施例３
この実施例は、本開示の範囲内の勾配ポリアクリルアミドゲルの性能と２つの市販の勾配ポリアクリルアミドゲルの性能との比較を示す。それぞれ図３Ａに示すポリアクリルアミドゲル３００を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の４〜２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝４〜２０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。調製されたゲル配合物３００は、３％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル部分をさらに有していた。生成されたゲル３００は、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。ゲル３００は、７．１のｐＨを有し、ゲルアミン緩衝剤として７５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として１０ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。勾配ゲルにおいて、ゲル内のゲル緩衝剤濃度は、アクリルアミドの異なる濃度によって変化し得、したがって、本明細書で提供されるゲル緩衝剤の値は平均値であることに留意されたい。ゲル緩衝剤を６ＮのＨＣｌでｐＨ７．１に調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物３００と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を各ゲル配合物３００と共に使用した。
【００５７】
図３Ｂに示すゲル３０１は、６．５のｐＨを有する、未知濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのゲル緩衝剤を含むと考えられる、市販の勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）（Ｔ＝４〜２０％）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）である。６５．８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．１％ＳＤＳ、及び０．０１％ブロモフェノールブルーの製造業者によって提供され、６．８のｐＨを有するサンプル緩衝剤をゲル配合物２０１と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの製造業者によって提供される泳動緩衝剤を各ゲル配合物２０１と共に使用した。
【００５８】
図３Ｃに示すゲル３０２は、未知濃度のトリス、グリシン、及びグリセロールならびに約６．３のｐＨの緩衝剤を含むと考えられる、別の市販の勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＰｒｅｃｉｓｅトリス−グリシン（Ｔ＝１０％）ゲル（ＮｕＳｅｐ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ  Ｌｔｄ．製）である。７．６のｐＨを有する、０．２Ｍのトリエタノールアミン−ＣＩ、１％のＬＤＳ、１０％のグリセロール、１％のＦｉｃｏｌｌ（商標）４００、０．００６％のフェノールレッド、０．００６％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０、及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムの製造業者によって提供されたサンプル緩衝剤をゲル配合物３０２と共に使用した。８．５のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの製造業者によって提供される泳動緩衝剤をゲル配合物３０２（標識したゲル３０２について確認）と共に使用した。
【００５９】
異なるゲル配合物３００〜３０２を含有する各ゲルカセットは、１０本の平行なレーン１〜１０を有した。各ゲルについて、１０個のレーン１〜１０の全てに、サンプルタンパク質混合物を装填し、各レーンは、上記の表１において同定されたサンプルを有する。ゲル３００〜３０２は、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。電気泳動分離は、図３Ａ〜３Ｃに反映されるように、１８５または２２５Ｖのいずれかの一定電圧で、２８分〜６８分の範囲の泳動時間で行った。結果は、以下の通りであった。
【００６０】
３つのゲル３００〜３０２のうち、ゲル３００は、最もよく観察されるタンパク質分離及びバンドシャープネスを提供した。ゲル３００〜３０２のレーン３、４、７、及び８と比較した場合、特に明らかなように、ゲル３００は、ゲル３０１及び３０２よりもよりシャープなバンドを生成した。さらに、ゲル３０１のレーン１及びレーン１０ならびにゲル３０２のレーン３及び４に特に示されているように、ゲル３０１及び３０２の両方は、望ましくないスマイリング効果を呈するレーンを有するが、ゲル３００の全てのレーン１〜１０は、比較的平坦であった。
【００６１】
実施例４
この実施例は、本開示の範囲内の勾配ポリアクリルアミドゲルの性能と１つの市販の勾配ポリアクリルアミドゲルの性能との比較を示す。それぞれ図４Ａに示すポリアクリルアミドゲル４００を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の８〜１６％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝８〜１６％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。調製されたゲル配合物４００は、３．５％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル部分をさらに有していた。ゲル４００は、７．１のｐＨを有し、１１７ｍＭのトリス、１９５ｍＭのグリシン、及び１５．６ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。勾配ゲルにおいて、ゲル内のゲル緩衝剤濃度は、アクリルアミドの濃度によって変化し、したがって、提供されるゲル緩衝剤の値は平均値であることに留意されたい。ゲル緩衝剤を６ＮのＨＣｌでｐＨ７．１に調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物４００と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を各ゲル配合物４００と共に使用した。
【００６２】
図４Ｂに示すゲル４０１は、約６．５のｐＨを有する、未知濃度のトリス、グリシン、及びタウリンのゲル緩衝剤を含むと考えられる、市販の勾配ポリアクリルアミドゲル、すなわちＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）（Ｔ＝８〜１６％）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．製）である。６５．８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．１％のＳＤＳ、及び０．０１％のブロモフェノールブルーの製造業者によって提供され、６．８のｐＨを有するサンプル緩衝剤をゲル配合物２０１と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの製造業者によって提供される泳動緩衝剤を各ゲル配合物２０１と共に使用した。
【００６３】
ゲル配合物４００〜４０１を装填した各ゲルカセットは、１０本の平行なレーン１〜１０を有した。各ゲルについて、ゲル４００のレーン８に（１０μｇではなく）２０μｇのＥ．Ｃｏｌｉのサンプルを装填した以外は、全ての１０個のレーン１〜１０には、サンプルタンパク質混合物が装填されており、各レーンは、上記の表１において同定されたサンプルを有する。ゲル４００〜４０１は、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。電気泳動分離は、図４Ａ及び４Ｂに反映されるように、２７分〜４５分の範囲の泳動時間で２２５Ｖの一定電圧で行われた。結果は、以下の通りであった。
【００６４】
ゲル４００は、ゲル４０１よりも優れたタンパク質分離及びバンドシャープネスを呈した。ゲル４００〜４０１のレーン２、３、４、及び７と比較した場合、特に明らかなように、ゲル４００は、ゲル４０１よりもよりシャープなバンドを生成した。さらに、ゲル４０１のレーン１及びレーン１０に特に示されているように、ゲル４０１は、望ましくないスマイリング効果を呈するレーンを有するが、ゲル４００の全てのレーン１〜１０は、比較的平坦であった。
【００６５】
実施例５
図５に示すように、この実施例は、本開示の範囲内で５つのポリアクリルアミドゲルの性能を示し、ここでは、様々な濃度のトリスを有するゲル緩衝剤を含み、本開示のゲル緩衝剤について所望のトリス濃度範囲を同定した。各ゲルの性能はまた、４００ｍＭ及び０ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を含み、かつ８．７のｐＨを有する、対照ゲル、すなわち市販のＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃによる）と比較された。
【００６６】
５つの調製されたポリアクリルアミドゲルを、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の１０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。５つの調製されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。調製されたゲルは、３．３％のＴ、２．６％のＣスタッキングゲル部分をさらに有していた。調製された５つのゲルはそれぞれ、一次両性電解質として１２５ｍＭのグリシン及び共役両性電解質として７５ｍＭのトレオニンを含む７．１のｐＨを有するゲル緩衝剤配合物を有した。また、調製された５つのゲルのそれぞれは、ゲルアミン緩衝剤として４０ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の異なるトリス濃度を有するゲル緩衝剤を有した。ゲル緩衝剤を６ＮのＨＣｌでｐＨ７．１に調整した。
【００６７】
各ゲルカセットは、サンプルタンパク質混合物を個々に装填した複数の平行レーンを有するように形成された。対照ゲル及び調整されたゲルのそれぞれは、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。調製されたゲル及び対照ゲルのそれぞれのレーンの４つに、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、１０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ、６μｇのＢＳＡ、及び６μｇのヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をそれぞれ装填した。
【００６８】
６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を図５に示す各ゲル配合物と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を図５に示す各ゲル配合物と共に使用した。電気泳動分離を、図５に反映される特定の泳動時間と共に、２２５Ｖの定電圧で３４分〜５９分の範囲の泳動時間で行った。図５及び表２に示すように、結果は以下の通りであった。
【００６９】
【表２】
2018530758.tif 000004
【００７０】
比較を容易にするために、図５は、６つのゲルの各々のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの画像を並べて示す。全ての４つのサンプルで見られ得るように、タンパク質バンドはトリス−グリシン−トレオニン（ＴＧＴ）ゲルにおいて上方にシフトし、ゲル緩衝剤中のトリスの濃度が減少するにつれてより平らに広がるようになる。また、トリス濃度が低いほど、電気泳動中の泳動時間が短くなり、電流が低くなり、かつ温度が低くなった。ＢＳＡを装填したレーンの比較において最も明白に見られ得るように、７０ｍＭ〜８０ｍＭの範囲のトリス濃度を有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、対照ゲルよりも低い泳動時間、電流、及び温度でシャープなタンパク質バンドを生成した。さらに、７０ｍＭ〜８０ｍＭのトリスを有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、４０ｍＭのトリス緩衝剤ゲルのものほど遠くまでゲルシフトしていないタンパク質バンドを生成した。さらに、７０ｍＭ〜８０ｍＭのトリスを有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、１２５ｍＭのトリス及び１５０ｍＭのトリス緩衝剤ゲルよりもよりはるかにシャープなタンパク質バンドを生成した。
【００７１】
したがって、これらの結果は、約７０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲のトリス濃度は、非勾配ポリアクリルアミドゲル中のゲル緩衝剤について望ましい分離特性を生じ、ここで、ゲル緩衝剤はまた、一次両性電解質としてグリシン及び共役両性電解質としてトレオニンを含む
【００７２】
実施例６
この実施例は、図６Ａ〜６Ｃに示すように、本開示の範囲内で３つのポリアクリルアミドゲルの性能を示す。それぞれ図６Ａ及び６Ｂに示す非勾配ポリアクリルアミドゲル配合物６００〜６０１を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の６％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。調製されたゲル配合物６００及び６０１は、４％のＴ、２．６％のＣスタッキングゲル部分をさらに有していた。それぞれ図６Ｃに示す勾配ポリアクリルアミドゲル６０２を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の４〜２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝４〜２０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。調製されたゲル配合物６０２は、３％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル部分をさらに有していた。生成されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。ゲル配合物６００〜６０２を含有する各ゲルカセットは、１０本の平行なレーン１〜１０を有するように形成された。
【００７３】
ゲル緩衝剤を６ＮのＨＣｌでｐＨ７．１に調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物６００〜６０２と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を各ゲル配合物６００〜６０２と共に使用した。ゲル６００〜６０２のそれぞれは、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。各ゲル６００〜６０２について、１０個のレーン１〜１０の全てに、サンプルタンパク質混合物を装填し、各レーンは、上記の表１において同定されたサンプルを有した。
【００７４】
図６Ａに示すように、ゲル６００は、７．１のｐＨを有し、７８．５ｍＭのトリス、１３１ｍＭのグリシン、及び１０．５ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。ゲル６０１は、図６Ｂに示すように、７．１のｐＨを有し、１５０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのグリシン、及び２０ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。各ゲル６００及び６０１のレーン１０の吹き上がった部分を比較すると、ゲル６０１の少なくとも１つのタンパク質バンドがスカーティング（ｓｋｉｒｔｉｎｇ）していたが、ゲル６００の同じバンドはスカーティングしていなかった。スカーティングは、ゲルとカセットとの間の界面領域を泳動するバンドの先導縁の観察された現象であり、主要バンドのわずかに先を泳動するタンパク質の低密度部分を生成する。スカーティングは効果的に、より広い領域にわたってタンパク質を広げ、バンド内のその密度及びバンドのシャープネスを低下させ、潜在的にタンパク質の検出能力を低下させる。したがって、ゲル６００及び６０１の比較は、約７０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲のトリス濃度が、本開示の範囲内の非勾配ポリアクリルアミドゲルの望ましい電気泳動分離特性を生じさせることを示し、ここで、％Ｔ＝６％であり、ゲル緩衝剤はまた、一次両性電解質としてグリシン及び共役両性電解質としてトレオニンを含んだ。
【００７５】
ゲル６０２は、図６Ｃに示すように、７．１のｐＨを有し、１３５ｍＭのトリス、２１７ｍＭのグリシン、及び１７．３ｍＭのトレオニンのゲル緩衝剤を含んだ。図６Ｃは、勾配ゲル６０２が許容できるタンパク質バンドのシャープネス及び分解能を提供したことを示す。したがって、ゲル６０２は、本開示の範囲内の勾配ポリアクリルアミドゲルに対して約１２５ｍＭ〜約１５０ｍＭのより高いトリス濃度が許容可能であることを示し、ここで、ゲル緩衝剤はまた、両性電解質／トレーリングイオンとしてグリシン及び二次両性電解質／トレーリングイオンとしてトレオニンを含んだ。
【００７６】
実施例７
図７に示すように、この実施例は、本開示の範囲内で５つのポリアクリルアミドゲルの性能を示し、ここでは、様々な濃度のグリシンを有するゲル緩衝剤を含み、本開示のゲル緩衝剤について適切なグリシン濃度範囲を同定した。各ゲルの性能はまた、４００ｍＭ及び０ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を含み、かつ８．７のｐＨを有する、対照ゲル、すなわち市販のＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（％Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃによる）と比較された。
【００７７】
５つの調製されたポリアクリルアミドゲルを、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の１０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。調製された５つのゲルはそれぞれ、７．１のｐＨを有するゲル緩衝剤配合物を有していた。５つの調製されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。第１の調製されたゲルは、７５ｍＭのトリス及び２００ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を有していた。第２の調製されたゲルは、７５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を有していた。第３の調製されたゲルは、７５ｍＭのトリス及び５０ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を有していた。第４の調製されたゲルは、７５ｍＭのトリス、２５ｍＭのトレオニン、及び２００ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を有していた。第５の調製されたゲルは、７５ｍＭのトリス、２５ｍＭのトレオニン、及び１２５ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を有していた。したがって、調製された５つのゲルのそれぞれは、５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の可変のグリシン濃度を有するゲル緩衝剤を有していた。対照ゲル及び調整されたゲルのそれぞれは、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。
【００７８】
各ゲルは、サンプルタンパク質混合物を個々に装填した複数の平行レーンを有するように形成された。調製されたゲル及び対照ゲルのそれぞれのレーンの４つに、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、１０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ、６μｇのＢＳＡ、及び６μｇのＩｇＧをそれぞれ装填した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を図７に示す各ゲル配合物と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を図７に示す各ゲル配合物と共に使用した。電気泳動分離を、図７に反映される特定の泳動時間と共に、２２５Ｖの定電圧で３４分〜５９分の範囲の泳動時間で行った。図７及び表３に示すように、結果は以下の通りであった。
【００７９】
【表３】
2018530758.tif 000005
【００８０】
比較を容易にするために、図７は、６つのゲルの各々のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの画像を並べて示す。全ての４つのサンプルで見られ得るように、タンパク質バンドはトリス−グリシン−トレオニン（ＴＧＴ）ゲルにおいて上方にシフトし、ゲル緩衝剤中のグリシンの濃度が増加するにつれてより平らに広がるようになる。より高いグリシン濃度はまた、より短い泳動時間を提供した。ＢＳＡを装填したレーンの比較において最も明白に見られ得るように、より高いグリシン濃度を有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、対照ゲルよりも低い泳動時間、電流、及び温度でシャープなタンパク質バンドを生成した。したがって、これらの結果は、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲のグリシン濃度は、ポリアクリルアミドゲル中のゲル緩衝剤について望ましい分離特性を生じ、ここで、ゲル緩衝剤はまた、ゲルアミン緩衝剤としてトリス及び共役両性電解質としてトレオニンを含む。
【００８１】
実施例８
図８に示すように、この実施例は、本開示の範囲内で５つのポリアクリルアミドゲルの性能を示し、ここでは、様々な濃度のトレオニンを有するゲル緩衝剤を含み、本開示のゲル緩衝剤について適切なトレオニン濃度範囲を同定した。各ゲルの性能はまた、４００ｍＭ及び０ｍＭのグリシンのゲル緩衝剤配合物を含み、かつ８．７のｐＨを有する、対照ゲル、すなわち市販のＮｏｖｅｘ（商標）トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｔ＝１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃによる）と比較された。５つの調製されたポリアクリルアミドゲルを、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の１０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液（％Ｔ＝１０％）を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。５つの調製されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。調整された５つのゲルはそれぞれ、７５ｍＭのトリス及び１２５ｍＭのグリシンを含む７．１ｐＨのゲル緩衝剤配合物を有した。また、調製された５つのゲルのそれぞれは、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の異なるトレオニン濃度を有するゲル緩衝剤を有した。対照ゲル及び調整されたゲルのそれぞれは、様々なゲル緩衝剤配合物を有していたが、個々のゲルの分解ゲル部分及びスタッキングゲル部分内で使用されたゲル緩衝剤は同じであった。
【００８２】
各ゲルは、サンプルタンパク質混合物を個々に装填した複数の平行レーンを有するように形成された。調製されたゲル及び対照ゲルのそれぞれのレーンの４つに、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、１０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ、６μｇのＢＳＡ、及び６μｇのＩｇＧをそれぞれ装填した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を図８に示す各ゲル配合物と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳの泳動緩衝剤を図８に示す各ゲル配合物と共に使用した。電気泳動分離を、図７に反映される特定の泳動時間と共に、２２５Ｖの定電圧で４０分〜５４分の範囲の泳動時間で行った。図８及び表４に示すように、結果は以下の通りであった。
【００８３】
【表４】
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【００８４】
比較を容易にするために、図８は、６つのゲルの各々のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ装填、Ｅ．Ｃｏｌｉ装填、ＢＳＡ装填、及びＩｇＧ装填レーンの画像を並べて示す。全ての４つのサンプルで見られ得るように、ゲル緩衝剤中のトレオニンの濃度が増加するにつれて、タンパク質バンドはトリス−グリシン−トレオニン（ＴＧＴ）ゲルにおいて上方にシフトする。トレオニン濃度の増加はまた、泳動時間が短くなり、電流が低下した。さらに、トレオニンの増加は、全てのタンパク質バンドではなく、一部のシャープネスの増加と相関した。ＢＳＡ及びＥ．Ｃｏｉｌを装填したレーンの比較において最も明白に見られ得るように、１０ｍＭのトレオニン濃度を有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、対照ゲル及び緩衝剤中にトレオニンを有しない調製されたゲルよりも低い泳動時間、電流、及び温度でシャープなタンパク質バンドを生成した。さらに、１０ｍＭ〜５０ｍＭのトレオニンを有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、ゲル緩衝剤中に２００ｍＭのトレオニンを有するものと同じほど遠くまでゲルシフトしていないタンパク質バンドを生成した。さらに、図８に重ねられた矢印によって示されるように、１０ｍＭのトレオニンを有する緩衝剤を有する調製されたゲルは、緩衝剤中にトレオニンを有しない調製されたゲルよりもよりシャープなタンパク質バンドを生成した。したがって、これらの結果は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のトレオニン濃度が、非勾配ポリアクリルアミドゲル中のゲル緩衝剤について改善された結果を達成し、ここで、ゲル緩衝剤はまた、アミンゲル緩衝剤としてトリス及び両性電解質／トレーリングイオンとしてグリシンを含む。
【００８５】
実施例９
この実施例は、本開示の範囲内で４つのポリアクリルアミドゲルの延長された保存寿命性能を説明する。一連の４つの調製されたポリアクリルアミドゲル配合物を、その内ビスアクリルアミドがモノマー混合物の２．６％（％Ｃ＝２．６％）を構成する、分解ゲル部分用の可変ポリアクリルアミド濃度を有するアクリルアミド／ビスアクリルアミド水溶液を用いてスラブゲル電気泳動カセットに入れた。ゲルは、８％ポリアクリルアミド濃度（％Ｔ＝８％）を有する非勾配ポリアクリルアミドゲル、１０％ポリアクリルアミド濃度（％Ｔ＝１０％）を有する非勾配ポリアクリルアミドゲル、４〜１２％ポリアクリルアミド濃度（％Ｔ＝４〜１２％）を有する勾配ポリアクリルアミドゲル、及び４〜２０％ポリアクリルアミド濃度（％Ｔ＝４〜２０％）を有する勾配ポリアクリルアミドゲルを含んだ。４つのゲルのそれぞれは、ゲルアミン緩衝剤として７５ｍＭのトリス、一次両性電解質として１２５ｍＭグリシン、及び共役両性電解質として１０ｍＭのトレオニンのゲル配合物を有した。生成されたゲルは、厚さ１ｍｍ、長さ約８ｃｍ、幅約８ｃｍであった。各ゲルカセットは、１０個の平行なレーンを有するように形成された。
【００８６】
各ゲル緩衝剤を、以下の説明に示されるｐＨに６ＮのＨＣｌで調整した。６．８のｐＨを有する６３ｍＭのトリスＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、及び０．００２５％のブロモフェノールブルーのサンプル緩衝剤を各ゲル配合物１００〜１０７と共に使用した。８．３のｐＨを有する２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、及び０．１％のＳＤＳからなる泳動緩衝剤を４つのゲル配合物のそれぞれと共に使用した。
【００８７】
各ゲルについて、全ての１０個のレーンにサンプルタンパク質混合物を装填した。各それぞれのレーンに装填されたサンプルタンパク質混合物は、調製された各ゲル配合物について同じであった。高タンパク質装填がゲル同定の目的で各ゲルの異なるレーンに装填されたことを除いて、サンプルタンパク質混合物は、表５に同定されるようにレーン１〜１０に装填された。
【００８８】
【表５】
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【００８９】
４つの調製されたゲル配合物のそれぞれ１０個が調製された。ゲルが作製された日に、４つの調製されたゲル配合物のそれぞれの１つに、上記の同定されたサンプルと共に電気泳動分離を行った。さらに、ゲル作製後最大７０日の間、毎週、４つの調製されたゲル配合物のそれぞれの１つに、上記同定されたサンプルと共に電気泳動分離を行い、ここで、ゲルは、ゲルが作製されたときとゲル上で電気泳動分離が行われたときとの間の期間、周囲の室温条件で保存された。保存されたゲルの分離性能を、それらが作製された日に試験されたゲルの性能と比較することによって、保存されたゲルが十分なタンパク質分離を提供できなかった場合を評価するために定性的及び定量的分析を使用した。全ての電気泳動分離は、２２５Ｖの定電圧で行った。結果を表６に示す。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
３つのゲル配合物で見られるように、室温で７０日間保存した後、室温で保存したトリス−グリシン−トレオニン（ＴＧＴ）ゲルでは、十分な電気泳動分離が行われていないことは観察されなかった。この実験では、以下に基づいて破損が発生したと評価された。（１）電気泳動の設定時間後のバンド移動の有意な変化（すなわち、移動）、（２）ゲルの幅にわたる等バンド移動の損失（すなわち、真直度）、（３）バンドシャープネスの損失（すなわち、分割）、及び／または（４）低分子量バンドの著しい傾きまたは傾斜（すなわち、曲率）。４〜２０％のポリアクリルアミドを有する調製されたゲルは、５６日で破損を示した。同様のポリアクリルアミドゲル配合物の室温保存と４℃保存との間の既知の相関を、４つの調製されたゲル配合物の室温結果に適用すると、そのようなゲル配合物が冷蔵条件下で保存された場合に機能しなくなる予測値に到達する。これらの推定に基づき、４つの調製されたゲル配合物のいずれも、それらが作製された後約４℃で保存された場合、少なくとも約１２ヶ月間は破損しないと予想される。
【００９２】
上記の実施例は、ゲルアミン緩衝剤としてトリス、一次両性電解質としてグリシン、及び共役両性電解質としてトレオニンまたはセリンを含むゲル配合物を有するポリアクリルアミドゲルが、タンパク質などの巨大分子の望ましい電気泳動分離を提供し得ることを示す。実施例は、約１５０ｍＭ未満、または７０ｍＭ〜１４０ｍＭの範囲、または約７０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲のトリス濃度が望まれ得、約２５ｍＭ〜約２５０の範囲、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲のグリシン濃度が望まれ得、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のトレオニンもしくはセリン濃度、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲、または約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲のトレオニンもしくはセリン濃度が望まれ得、約６．５〜約７．５の範囲のほぼ中性のｐＨ、約６．９〜約７．５の範囲のほぼ中性のｐＨ、約７．０〜約７．２の範囲のほぼ中性のｐＨ、または約７．１のｐＨが望まれ得ることを示す。さらに、実施例は、ゲルが製造されてから約１２ヶ月後に、ゲルが約４℃の冷蔵条件下で保存される上記のゲル配合物を有するゲルに電気泳動を行うことができることを示す。
【００９３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、特に断りのない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用されるパーセンテージまたは比率、及び他の数値を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らし、かつ通常の端数切り捨て技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
【００９４】
本教示の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含有する。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に包含される任意の及び全ての下位範囲を包含するものと理解されるべきである。
【００９５】
この明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、明示的かつ明白に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」及びその文法上の改変体は、リスト内のアイテムの列挙が、リストされたアイテムに置換または追加され得る他の同様のアイテムを除外しないような、非限定を意図する。
【００９６】
当業者には、その教示の範囲から逸脱することなく、本開示の組成物及び方法に対して様々な改変及び変形が可能であることが明らかであろう。本開示の他の実施形態は、明細書の考察及び本明細書に開示された教示の実施から当業者に明らかになるであろう。明細書及び本明細書に記載された実施形態は単なる例示としてみなされることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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