(57)【要約】本発明は、第1のタンク(104;106)の第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために構成された比較ユニット(130)に関し、比較ユニットは、- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信するために構成され、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が、第1のタンク内の培地が第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にあり、かつ該平衡状態が第1のタンク内の細胞培養物の代謝によって変更される前の第1の時間で測定され、第1のpH値は、第1のタンク(102)に動作可能に結合された第1のpH測定装置によって提供された測定値であり;- 第2のCO2濃度および第2のpH値を受信するために構成され、第2のCO2濃度は、第2のタンク内の培地上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が、第2のタンク内の培地が第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にあり、かつ該平衡状態が細胞培養物の代謝によって変更される前の第2の時間で測定され、第2のpH値は、第2のpH測定装置によって提供された測定値であり;- 判定のために第1および第2のpH値およびCO2濃度を比較するために構成され、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、比較ユニットによって第1のpH値および第2のpH値を比較し(206)、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度を比較する。2018534560.tif 000014
2018534560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1のタンク(104;106)に動作可能に結合された第1のpH測定装置(108;146)がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するための方法であって、該問題は、第1のpH測定装置が、第2のタンク(102)に動作可能に結合された第2のpH測定装置(142)とは異なって較正されているということであり、該方法が、
- 比較ユニット(130)によって第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する工程(202)であって、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置(108;146)によって提供された測定値である、工程;
- 比較ユニット(130)によって第2のCO2濃度および第2のpH値を受信する工程(202)であって、第2のCO2濃度は、第2のタンク内に含まれる同じタイプの培地(M1)上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第2のpH値は第2のpH測定装置(142)によって提供された測定値である、工程;
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、比較ユニットによって、第1のpH値および第2のpH値を比較し(206)、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度を比較する工程
を含む、方法。
【請求項２】
第1のpH測定装置がpH測定問題を有しているという判定が、
- 第1のCO2濃度および第2のCO2濃度が同一であり、かつ第1のpH値および第2のpH値が閾値を超えて互いに異なる場合に、または
- 第1のpH値および第2のpH値が同一であり、かつ第1のCO2濃度および第2のCO2濃度がさらなる閾値を超えて互いに異なる場合に、または
- 第1のデータ値がさらなる閾値を超えて第2のデータ値と異なる場合であって、第1のデータ値が第1のpH値および第1のCO2濃度から導き出され、第2のデータ値が第2のpH値および第2のCO2濃度から導き出される、場合に、
なされる、請求項記載の方法。
【請求項３】
- 第1のタンクがバイオリアクターもしくは収集タンクであり、かつ/または
- 第2のタンクが、バイオリアクター、特に参照バイオリアクター、もしくは収集タンク、特に参照収集タンクである、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
第1のタンク(104;106)に動作可能に結合された第1のpH測定装置(108;146;160)がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するための方法であって、該問題は、第1のpH測定装置が誤って較正されているということであり、該方法が、
- 比較ユニット(130)によって第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する工程(202)であって、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置(108;146)によって提供された測定値である、工程;
- 比較ユニットによって、第1のCO2濃度の関数として第2のpH値を算出する工程(204)であって、第2のpH値は、培地(M1)が予め規定された温度および圧力で該培地(M1)上方の第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時の、該培地タイプ(M1)について予測されたpH値であり、該平衡にある第2のガス体積が第1のCO2濃度と同一の第2のCO2濃度を有し、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けていない、工程;
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、比較ユニットによって第1のpH値および第2のpH値を比較する工程(206)
を含む、方法。
【請求項５】
第2のpH値の算出が、
- 比較ユニット(130)によってデータ記憶媒体(114)から培地固有関係式(136)を読み取る工程であって、培地固有関係式が培地(M1)に固有であり、培地(M1)がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、工程;
- 予め規定された温度および圧力でpH-CO2平衡にありかつ細胞培養物の非存在下での培地について予想される絶対pH値を計算するために、第1のCO2濃度を培地固有関係式に入力する工程であって、絶対pH値が、算出された第2のpH値として用いられる、工程
を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
培地固有関係式が、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれ測定されたCO2ガス分率との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)であり、式中、
- PPHM1(CO2)は、培地(M1)が細胞培養物を欠きかつ該培地上方のガス体積とpH-CO2平衡にある時の、培地(M1)におけるpH予測値であり、該ガス体積が、インプットパラメーターとして用いられるCO2濃度を含み;
- CO2はインプットパラメーター値であり、細胞培養物の非存在下でpH-CO2平衡状態にある培地(M1)上方のガス体積中のCO2濃度を表し;
- REL-M1は、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターのセット(a1、a2、b1、b2、b3)であり、該パラメーターが、
■細胞培養物を欠く培地(M1)の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料を、それぞれの試料中の培地上方のガス体積とのpH-CO2平衡に到達させること、
■試料中の培地とph-CO2平衡にあるそれぞれのガス体積中のCO2ガス分率を求めること、
■求められたCO2ガス分率を試料のそれぞれの平衡pH値に対してプロットすること、
■プロットされた値に曲線(502)をフィットさせ、フィットされた曲線から培地固有関係式のパラメーター(a1、a2またはb1、b2、b3)を導き出すこと
によって得られたものである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
第1のpH測定装置がpH測定問題を有しているという判定が、
- 第1のpH値および第2のpH値が閾値を超えて互いに異なる場合に、または
- 第1のデータ値がさらなる閾値を超えて第2のデータ値と異なる場合であって、第1のデータ値が第1のpH値から導き出され、第2のデータ値が第2のpH値から導き出される、場合に、
なされる、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
第1のタンクがバイオリアクターまたは収集タンクまたは較正ボックスである、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第1のpH測定装置(108;146)を較正または再較正するための方法であって、
(a)第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定するために請求項1〜3のいずれか一項記載の方法を実行し、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度が同一である場合に第1のpH測定装置が第2のpH測定装置と同じpH値を出力するように第1のpH測定装置を較正する工程;または
(b)第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定するために請求項4〜8のいずれか一項記載の方法を実行し、第1のpH測定装置が第1のCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように第1のpH測定装置を較正する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
オンライン測定装置である第1のpH測定装置(108;146)を備えるタンクを操作する方法であって、
- 増殖培地を含む該タンク内で細胞培養物を増殖させ、それによって、増殖培地のpHを第1のpH測定装置によって繰り返し測定する工程;
- 該タンク内の増殖培地およびその中に含まれる細胞培養物を、平衡状態でのpHとCO2との関係式が分かっている培地(M1)と交換する工程;
- 増殖培地を交換した後に、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために請求項4〜9のいずれか一項記載の方法を実行する工程;
- pH測定問題が検出された場合に、第1のpH測定装置が培地(M1)について第1のCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように、第1のpH測定装置を較正する工程;
- 第1のpH測定装置を較正した後に、該タンク内の該培地を該増殖培地と交換する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
第1のタンクから培地試料を採取することによって引き起こされるpHオフセット作用を決定する方法であって、
タンク外部オフラインpH測定装置(160)を提供し、第1のタンク(104、106)を提供する工程であって、第1のタンクが第1のpH測定装置(108、146)を備え、第1のpH測定装置が、第1のタンク内に配置されたオンラインpH測定装置であり、かつ第1のタンク内で少なくとも部分的に培地(M1)によって取り囲まれている、工程
を含み、
- 第1のpH測定装置を較正するために請求項9(b)記載の方法を実行する工程;
- タンク外部オフラインpH測定装置(160)を、第1のタンクと同じタイプの培地(M1)を含む較正ボックス内に移し;較正ボックスを、較正しようとするpH測定装置(160)を備えるタンクとして使用し、それによって、較正ボックスを、第1のCO2濃度を測定するためにCO2オフガスセンサーが用いられる容器として使用し、かつ、第1のpH測定装置を較正するために用いられたものと同じ関数を、第2のpH値を算出するために使用して、請求項9(b)記載の方法を実行する工程;
- 第1のpH測定装置(108、146)およびタンク外部pH測定装置(160)を較正した後に、
■第1のpH測定装置によって第1のタンク内の培地の第1の現在のpH値を測定する工程であって、第1の現在のpH値がオンライン測定値である、工程、
■第1のタンクの培地の試料を採取し、該試料を携帯型容器(162)に充填する工程、
■タンク外部pH測定装置が該試料容器内で少なくとも部分的に該培地に取り囲まれるように、タンク外部pH測定装置を位置づける工程、
■タンク外部pH測定装置によって該試料容器内の該培地の第2の現在のpH値を測定する工程であって、第2の現在のpH値がオフライン測定値である、工程、
■第1の現在のpH値および第2の現在のpH値が閾値を超えて異なる場合、サンプリングプロセスがpHオフセット作用を引き起こしたと判定し、任意で、第1の現在のpH値と第2の現在のpH値との差としてオフセット作用の強さを決定する工程
をさらに含む、方法。
【請求項１２】
- 第3のCO2濃度および第3のpH値を受信する工程(202)であって、第3のCO2濃度は、第1のタンク内の培地上方の第3のガス体積のCO2濃度であり、第3のCO2濃度および第3のpH値は第3の時間で測定され、第3の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第3のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ該平衡状態が第1のタンク内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間であり、第3のpH値は第1のpH測定装置(142)によって提供された測定値である、工程;
- 第4のCO2濃度および第4のpH値を受信する工程(204)であって、第4のCO2濃度は、第2のタンク内の培地上方の第4のガス体積のCO2濃度であり、第4のCO2濃度および第4のpH値は第4の時間で測定され、第4の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ該平衡状態が第2のタンク内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間であり、第4のpH値は第2のpH測定装置(108、146)によって提供された測定値であり、第3の時間と第1のタンクへの接種との間の経過時間が、第4の時間と第2のタンクへの接種との間の経過時間と同一である、工程;
- 第3の時間での、第1のタンク内の細胞培養物の第1の酸素取り込み速度測定値を受信する工程;
- 第4の時間での、第2のタンク内の細胞培養物の第2の酸素取り込み速度測定値を受信する工程;
- 第1の酸素取り込み速度および第2の酸素取り込み速度が同一である場合、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために第3および第4のpH値およびCO2濃度を比較する工程(206)
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
第1のpH測定装置が第1のタンク内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれており、
- 第1のタンクには、第2のタンク内の培地の試料を手動でもしくは自動的に採取するための手段が無いか、または
- 第1のタンクが、第1のタンク内の培地の試料を手動でもしくは自動的に採取するための手段を備え、前記方法が、
第1のタンク内への培地の充填後から、第1のタンク内の該培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、該サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
第2のpH測定装置が第2のタンク内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれており、
- 第2のタンクには、第2のタンク内の培地の試料を手動でもしくは自動的に採取するための手段が無いか、または
- 第2のタンクが、第2のタンク内の培地の試料を手動でもしくは自動的に採取するための手段を備え、前記方法が、
第2のタンク内への培地の充填後から、第2のタンク内の該培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、該サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、第2のpH測定装置が第1のpH測定装置とは異なって較正されているかどうか判定するために用いられ、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なって較正されているかどうかの判定が、第2のpH測定装置が第2のタンク内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている間に行われ、かつ該判定を行うために第2のタンクの培地の試料を採取することなく行われる、請求項1〜3、11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうかの判定が、第1および第2のCO2濃度ならびに第1および第2のpH値だけを該判定のためのデータインプットとして用いることによって行われる、請求項1〜3、11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
- 第1のpH値を測定するために第1のpH測定装置を用いてオンライン測定を実行する工程であって、第1のpH測定装置が第1のタンク内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている、工程;および/または
- 第1のCO2濃度を提供するために、第1のタンクのオフガス内で第1のCO2センサー(124、126)によってオンライン測定を実行する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
- 第2のpH値を測定するために第2のpH測定装置を用いてオンライン測定を実行する工程であって、第2のpH測定装置が第2のタンク内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている、工程;および/または
- 第2のCO2濃度を提供するために、第2のタンクのオフガス内で第2のCO2センサー(122)によってオンライン測定を実行する工程
をさらに含む、請求項1〜3、11〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定された場合に、比較ユニットによって、以下の工程:
- 警告メッセージを出力する工程;
- 自動的に、第1のpH測定装置の再較正を実行する、または第1のpH測定装置の再較正の実行を始動させる工程;
- 自動的に、第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換を実行する、または第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換の実行を始動させる工程
のうちの1つまたは複数を実行する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
第1のタンク(104、106)が、以下の特徴:
(a)タンク内のガス体積、
(b)タンク内の培地体積、
(c)タンクのレイノルズ数、
(d)タンクのニュートン数、
(e)タンクの寸法、
(f)タンクおよび/またはタンクバッフルの幾何学的特徴、
(g)スターラー構成、
(h)撹拌速度、
(i)タンクの酸素の物質移動容量係数(kLa)、
(j)全ガス流入速度および/またはO2流入速度および/またはN2流入速度および/またはCO2流入速度、
(k)動力投入量、
(l)タンク内の圧力、
(m)培地中でのガスバブル保持時間、
(n)培地中でのガスバブルサイズおよび分布、
(o)表面速度、
(p)パラメーター(a)〜(o)のうちの1つまたは複数から導き出されるものとして計算されたパラメーター
(q)2つのタンクの地理的位置
のうちの1つまたは複数の点で第2のタンク(102)と異なる、請求項1〜3、11〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する(202)ために構成され、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置(108;146)によって提供された測定値であり、
- 第2のCO2濃度および第2のpH値を受信する(202)ために構成され、第2のCO2濃度は、第2のタンク内に含まれる同じタイプの培地(M1)上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第2のpH値は第2のpH測定装置(142)によって提供された測定値であり、
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、第1のpH値および第2のpH値を比較し(206)、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度を比較するために構成された、
比較ユニット(130)。
【請求項２２】
- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する(202)ために構成され、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置(108;146)によって提供された測定値であり、
- 第1のCO2濃度の関数として第2のpH値を算出する(204)ために構成され、第2のpH値は、培地(M1)が予め規定された温度および圧力で該培地(M1)上方の第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時の、該培地タイプ(M1)について予測されたpH値であり、該平衡にある第2のガス体積が第1のCO2濃度と同一の第2のCO2濃度を有し、該平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、第1のpH値および第2のpH値を比較する(206)ために構成された、
比較ユニット(130)。
【請求項２３】
第1のタンクの状態をモニタリングおよび/または制御するために構成されたシステム(100)であって、該システムが、
- 請求項21または22記載の比較ユニット(130)と;
- 比較ユニット(130)に動作可能に結合された制御ユニット(132)と;
- 第1のタンク(104、106)および第1のpH測定装置
を備え、
- 制御ユニットが、第1のタンク内にある細胞培養物の状態をモニタリングおよび/または制御するように構成されており、それによって、第1のpH測定装置によって繰り返し測定されたpH値をインプットとして使用する、
システム(100)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、pH測定装置を使用および較正する分野に関し、特に、較正エラー、および/またはサンプリングプロセスに起因するpHオフセット作用の特定に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景および関連分野
正確に較正されたpH測定装置を使用することは、バイオリアクターの操作、収集リアクターのモニタリングなどのために、化学実験研究または生物実験研究を含む非常に多くの状況において有用であり、かつ不可欠である。
【０００３】
バイオリアクターは、例えば、化合物、例えば、特定のペプチド、タンパク質、または他の種類の化学物質を得るために、化学プロセス、特に、生物が行うプロセスを制御された形で実施するためによく用いられる。共通の目標は、少ない不純物生産量で、ならびに/または時間対効果および費用対効果が大きなやり方で微生物または細胞が望ましい機能を果たすことができるようにバイオリアクターを操作することである。典型的に、バイオリアクター内の環境条件、例えば、パラメーターの中でも特に、温度、栄養分濃度、pH、および溶解ガスは、生物の増殖および生産性が最適化されるように選択される。
【０００４】
バイオリアクターの状態および/またはバイオリアクターの中にある細胞培養物の状態が望ましい状態、例えば、細胞培養プロジェクトを行った時の、所与の時点での参照バイオリアクターの状態に対応する状態であるかどうか判定するために、pH値が繰り返し測定される。pH値が望ましいpH値範囲の外にある場合、培地のpH測定値が望ましいpH値範囲内にあるように、バイオリアクターの状態を変えるようにバイオリアクターの様々なパラメーター(例えば、供給速度、エアレーション速度、温度、撹拌速度など)が合わせられる場合がある。
【０００５】
バイオリアクターの様々な制御パラメーターがバイオリアクターの培地の現在測定されているpH値に依存して設定される場合がある。前記パラメーターの正しい設定によって、特定の細胞培養物が、別のバイオリアクター内の参照培養物と非常に似た/ほぼ同一の条件下で培養されるかどうかが決定される。従って、バイオリアクターの状態を別の(参照)バイオリアクターの状態と一致させるためには、pH値が同じ培地について、2つの比較されたバイオリアクターのpH測定装置が同じpH値を出力することが極めて重要である。
【０００６】
正しいpH値を決定することが極めて重要な多くの他の使用事例シナリオが存在する。例えば、細胞培養プロジェクトが終わったら、望ましい細胞培養製品を抽出するようにさらに処理する前に、細胞培養物および/またはその製品を収集タンクに入れて保存することができる。収集タンクは、内容物の分解の原因となり得る、収集タンク内でのどんな感染または他の状態変更も阻止するかまたは少なくとも速やかに特定するために厳重にモニタリングされる必要がある。従って、試料を採取し、試料のpH値を測定することによって、収集タンク内のpH値は繰り返し測定される。
【０００７】
多くの場合、タンク、例えば、バイオリアクターまたは収集タンクに含まれる培地の試料のpH値を測定するためにタンク外部pH測定装置が用いられる。しかしながら、培地試料を抜き取るプロセスにはタンクを感染させるリスクがある。さらに、試料中で測定されたpH値は、いわゆる「オフセット作用」が原因で、タンク内にある培地の実際のpH値からずれる場合がある。オフセット作用は、例えば、試料を抜き取り、pH測定装置に運ぶプロセスの間に引き起こされることがある。なぜなら、試料の温度、環境圧力、または環境空気組成がタンク内のそれぞれのパラメーターと異なることがあるからである。これにより、オフセット作用が原因で、タンク内にある培地の実際のpH値と大きく異なる試料のpH測定値が生じる場合がある。結果として、試料中で測定されたpH値はタンク内の現在の状態を正確に反映していない。
【０００８】
さらに可能性のあるエラー発生源は、誤って較正されたpH測定装置である。典型的に、pH測定装置は、規定されたpH値を有する市販の基準溶液を用いて較正される。このアプローチでは、典型的に、タンクからpH測定装置を抜き取り、再導入することが必要である。pH測定装置を再導入した後に、タンクとその中に含まれるpH測定装置をオートクレーブする必要がある。このプロセスは、既に較正されているpH測定装置に影響を及ぼす可能性があり、その結果、基準溶液について、オートクレーブ(autoclavation)前とは異なるpH値を示し得るpH測定装置がタンク内にあるようになる。pH測定装置がオートクレーブプロセスの影響を受けなかった場合でも、pH測定装置がオートクレーブの影響を受けなかったという保証はない。結果として、pH測定値が信頼するに足るとみなされない場合があり、タンク内部pHメーターを較正するために、タンクの培地の試料のpHを測定するタンク外部参照pHメーターを用いることによってタンク内部pHメーターの再較正が行われる場合がある。しかしながら、サンプリングプロセス中にオフセット作用があるために、これも、タンク内部pHメーターが正しく較正されるという保証ではない。
【０００９】
オフラインpH測定を実行するために定期的に試料を採取することは煩わしく、かつバイオリアクターを望ましくない病原菌に感染させるリスクを増大させる。
【発明の概要】
【００１０】
概要
本発明の目的は、独立請求項に明記したように、pH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するための、およびpHメーターを再較正するための、改善したシステムおよび方法を提供することである。本発明の態様は従属請求項に示される。本発明の態様は相互に排他的でなければ互いに自由に組み合わせることができる。本発明の態様は、pH測定問題および較正問題の特定を改善および容易にするために、タンク内にある空気体積中のCO2濃度を簡単に測定できることを利用する場合がある。有益な一局面によれば、2つ以上の異なるタンクに動作可能に結合されたpH測定装置のpH測定ずれを特定するために、異なるタンク内で測定されたCO2濃度が用いられる場合がある。
【００１１】
一局面において、本発明は、第1のタンクに動作可能に結合された第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するための方法に関する。pH測定問題は、第1のpH測定装置が、第2のタンクに動作可能に結合された第2のpH測定装置とは異なって較正されているということである。例えば、この状況は、第2のタンクが参照バイオリアクターであり、第1のタンクが、状態を参照バイオリアクターの状態と比較し一致させることになっている別のバイオリアクターである場合に問題となることがある。前記方法は、
- 比較ユニットによって第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する工程であって、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置(108;146)によって提供された測定値である、工程;
- 比較ユニットによって第2のCO2濃度および第2のpH値を受信する工程であって、第2のCO2濃度は、第2のタンク内に含まれる同じタイプの培地(M1)上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第2のpH値は第2のpH測定装置によって提供された測定値である、工程;
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、比較ユニットによって、第1のpH値および第2のpH値を比較し、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度を比較する工程
を含む。
【００１２】
態様によれば、第1のpH測定装置がpH測定問題を有しているという判定は、
- 第1のCO2濃度および第2のCO2濃度が同一であり、かつ第1のpH値および第2のpH値が閾値を超えて互いに異なる場合に、または
- 第1のpH値および第2のpH値が同一であり、かつ第1のCO2濃度および第2のCO2濃度がさらなる閾値を超えて互いに異なる場合に、または
- 第1のデータ値がさらなる閾値を超えて第2のデータ値と異なる場合であって、第1のデータ値が第1のpH値および第1のCO2濃度から導き出され、第2のデータ値が第2のpH値および第2のCO2濃度から導き出される、場合に、
なされる。
【００１３】
第1のタンクは、例えば、バイオリアクターまたは収集タンクでもよい。第2のタンクは、例えば、バイオリアクター、特に参照バイオリアクター、または収集タンク、特に参照収集タンクでもよい。
【００１４】
本発明の態様は、2つ以上のタンク、例えば、参照タンクと、1つまたは複数のモニタリングまたは制御されているタンクの中にある培地のpH値をもっと正確に比較することができるので有利な場合がある。参照タンクの参照pHプロファイルは、モニタリングしようとするタンクの測定値を得る数日前、数週間前、または数年前に得られてもよい。または、第1のタンクおよび第2のタンクは基本的に同時に操作されてもよい。さらに有益な局面では、pHのオフライン測定は省略することができ、それによって、タンクの汚染が避けられ、サンプリング作用によってpH測定値の大きなばらつきが生じる可能性がある時にpH値の不正確な比較が避けられる。
【００１５】
さらに有益な局面によれば、特定のタンクにおいて測定されたCO2濃度は、予想された絶対pH値を算出するために用いられる場合があり、pH予想値からの、実際に測定されたpH値の任意のずれの特定を可能にする場合がある。前記ずれは、pH測定問題、例えば、較正問題の指標となり得る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、第1のタンクに動作可能に結合された第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するための方法に関する。前記問題は、第1のpH測定装置が誤って較正されている(従って、参照pH測定装置によって提供されるpH値と比べて誤ったpH値を生じるだけでなく、絶対性の点で誤ったpH値も生じる)ということである。前記方法は、
- 比較ユニットによって第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する工程であって、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置によって提供された測定値である、工程;
- 比較ユニットによって、第1のCO2濃度の関数として第2のpH値を算出する工程であって、第2のpH値は、培地(M1)が予め規定された温度および圧力で前記培地(M1)上方の第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時の、前記培地タイプ(M1)について予測されたpH値であり、前記平衡にある第2のガス体積が第1のCO2濃度と同一の第2のCO2濃度を有し、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けていない、工程;
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、比較ユニットによって第1のpH値および第2のpH値を比較する工程
を含む。
【００１７】
このことは有利な場合がある。なぜなら、この方法は、培地のいくつかの特性が分かっていれば、オフガス中で測定され得るタンクの空気体積中のCO2濃度をインプットとして用いて培地の正しい絶対pH値を決定することができるからである。CO2濃度から導き出された算出された正確なpH値と、実際に測定されたpH値を比較することによって、較正エラーを検出することが可能である。
【００１８】
態様によれば、比較ユニットは、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定された場合に警告信号を出力する。これにより、オペレーターは適切な措置、例えば、pH測定装置の再較正、pH測定装置の交換などをとることが可能になる場合がある。
【００１９】
オフガスCO2濃度を用いたpH予想値の算出
「ミニマリスト(minimalistic)」培地、例えば、緩衝剤として作用する物質を基本的に含まない塩溶液の使用に関連する、いくつかの例によれば、以下のように、炭酸塩で緩衝化された系における気相中の二酸化炭素に基づいてpH値の計算を行うことができる。
【００２０】
液体に溶解している二酸化炭素の濃度は、気相中の二酸化炭素分圧(pCO2)に比例し、それぞれの比例係数(proportional factor)を用いて計算することができる。比例係数は液体と温度と圧力によって異なる。
【００２１】
例えば、様々な液体中でのCO2の溶解度係数は分かっており、文献から導き出すことができるか、または実験によって求めることができる。血中、37℃での溶解度係数は約0.0304mmolxL-1xmmHg-1である[Loffler, G., Petrides, P.E., Physiologische Chemie, Springer-Verlag, 2013]。SazonovおよびShawによって、ブンゼン係数は、測定温度および1バールの分圧で単位体積の純粋な溶媒に吸収される、低(reduced)273.15および1バールでの飽和気体の体積だと定義されている。従って、次元は体積/体積であるか、または無次元である。この係数は、平衡にある時、気体の分圧は、相関関係にある溶液に溶解している、この気体の濃度に正比例するというヘンリーの法則に基づいている。溶解度係数はそれぞれの溶液によって異なる[Gros, J.B., Dussap, C.G., Catte, M., Estimation of O2 and CO2 solubility in microbial culture media. Biotechnology Progress 1999, 15, 923-927]。
【００２２】
培地の溶解度係数が分かっている場合、溶解している二酸化炭素の濃度は気相中の二酸化炭素濃度によって計算することができる。気相中の濃度、例えば、バイオリアクター内の気相中の濃度はオフガス分析器を用いて直接測定することができる。
【００２３】
二酸化炭素および炭酸-塩基平衡:
式1  CO2(g)→CO2(aq)
【００２４】
溶解CO2(aq)は水(H2O)中では炭酸(H2CO3)に水和している。
式2  CO2(aq)+H2O←→H2CO3
【００２５】
水溶液中で、中性pHおよび37℃では水和種である炭酸はほとんど無い。従って、両種が合わさってH2CO3*(CO2(aq)+H2CO3=H2CO3)になる。約7.00の典型的な発酵pHでは、H2CO3*は炭酸水素イオン(HCO3-)およびプロトン(H+)に解離する。中性pH値では、脱プロトン種である炭酸イオン(CO32-)はほとんど無い。
【００２６】
CO2水溶液(aq)は石灰石を溶解することができ、
CaCO3+CO2(aq)+H2O←→Ca2+(aq)+2HCO3-(aq)
水と反応して炭酸を形成することができる。
CO2(aq)+H2O←→H2CO3(aq)
ごく一部だけが酸として存在し、そのため、解離定数Kは、
2018534560.tif 000003
になる。
【００２７】
二酸化炭素および炭酸-塩基平衡
H2CO3の形をとる溶解したCO2は酸平衡によってプロトンを2個まで放出することができる。
式3  H2CO3＊←→HCO3-+H+  KS1=10-6.35
式4  HCO3-←→CO32-+H+  KS2=10-10.33
【００２８】
ここでは、標準状態(298,15K、イオン強度Ic=0M)の解離定数KS1およびKS2を示した[Goudar, C.T.C., Matanguihan, R., Long, E., Cruz, C., et al., Decreased pCO2 accumulation by eliminating bicarbonate addition to high cell-density cultures. Biotechnology and Bioengineering 2007, 96, 1107-1117]。
【００２９】
細胞培養条件については、37℃の温度と0.1Mのイオン強度を使用することができる。これにより、それぞれの解離定数は、それぞれ、10-6.07および10-10.04に変わる。
【００３０】
ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式を用いて、二酸化炭素(H2CO3*)、炭酸水素イオンHCO3-、および炭酸イオンCO32-の全ての種の比を計算することができる。
【００３１】
平衡式:
式5
2018534560.tif 000004
式6
2018534560.tif 000005
【００３２】
酸平衡式を解いて、プロトン濃度、ここではpHの関数として、それぞれの炭酸イオンの比αを得ることができる。
式7
2018534560.tif 000006
式8
2018534560.tif 000007
式9
2018534560.tif 000008
【００３３】
H2CO3相対濃度は、実質的に、水と平衡にあるCO2(aq)である。
【００３４】
pHの算出
以下では、摂氏37度、水中での二酸化炭素濃度に基づいたpH予想値の例示的な算出を説明する。
【００３５】
気相中の二酸化炭素濃度が分かっている場合、ブンゼン係数を用いて、37℃、大気圧で有効な溶解二酸化炭素濃度を計算することができる[Loffler, G., Petrides, P.E., Physiologische Chemie, Springer-Verlag, 2013]。
CO2aq=0.0304[mmol/L*mmHg]*圧力*二酸化炭素濃度気相/100
【００３６】
この場合、圧力は750.06mmHgの大気圧である。
【００３７】
タンクの気相中の二酸化炭素が10％になる場合がある。二酸化炭素は[％]の単位で示される。この場合、mmol/Lの単位で示したCO2分圧(CO2aq[mmol/L])は、750.06mmHg*10％/100=75,006mmHgに従って算出される。次いで、mmol/L CO2aqが得られる。
【００３８】
次いで、式5および式6によって、第1の式H2CO3=>H++HCO3-のプロトン濃度を算出する。
H+濃度式5=1,01468E-06mmol/L
H+濃度式6=1,06941E-10mmol/L
【００３９】
従って、全H+濃度は、1,01468E-06mmol/L+1,06941E-10mmol/L=1,01479E-06mmol/Lである。
【００４０】
全H+濃度への式5の寄与は式6より大きい。
【００４１】
次いで、pHをpH=-log(1,01479E-06)=5,99に従って算出する。
【００４２】
気相中のCO2濃度は、
2018534560.tif 000009
に従って、炭酸水素イオン濃度とpHに基づいて算出することができる。
【００４３】
bは、750,06mmHgの標準大気圧で0.0304mmol/L*mmHgのブンゼン係数であり、pHは溶液のpH値であり、Cは[mmol/L]の単位で示した炭酸水素イオンの濃度である。
【００４４】
最初に、ヘンリーの法則を用いて、標準大気圧で水(aq)に溶解しているCO2の量を算出する。
式10:[CO2(aq)]=KCO2*H
式中、KCO2は、気相/オフガス中で測定されたCO2濃度であり、Hはヘンリー溶解度である。
【００４５】
[CO2(aq)](式10)およびKS1(式5)を求めた後、
2018534560.tif 000010
としてpHを算出するために、式11:
2018534560.tif 000011
を解くことができる。
【００４６】
培地固有関係式を用いたpH予想値の算出
態様によれば、第2のpH値を算出するための比較ユニットはデータ記憶媒体から培地固有関係式を読み取る。培地固有関係式は第1のタンクの培地M1に固有であり、前記培地が前記ガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地M1のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す。予め規定された温度および圧力でpH-CO2平衡にありかつ細胞培養物の非存在下での培地について予想される絶対pH値を計算するために、比較ユニットは第1のCO2濃度を培地固有関係式に入力する。絶対pH値は、算出された第2のpH値として用いられる。
【００４７】
このことは有利な場合がある。なぜなら、pH-CO2平衡に影響を及ぼす複数種の物質を含む培地を含む、あらゆる種類の培地について、培地のpH値を、CO2-pH平衡状態にあるオフガス中のCO2濃度と相関させる培地固有関係式を経験的に得ることができるからである。
【００４８】
態様によれば、培地固有関係式は、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれ測定されたCO2ガス分率との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)である。PPHM1(CO2)は、前記培地が細胞培養物を欠きかつ前記培地上方のガス体積とpH-CO2平衡にある時の、培地(M1)におけるpH予測値であり、前記ガス体積は、インプットパラメーターとして用いられるCO2濃度を含む。CO2はインプットパラメーター値であり、細胞培養物の非存在下でpH-CO2平衡状態にある培地(M1)上方のガス体積中のCO2濃度を表す。REL-M1は、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターのセット(a1、a2、b1、b2、b3)である。これらのパラメーターは、
●細胞培養物を欠く培地(M1)の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料を、それぞれの試料中の培地上方のガス体積とのpH-CO2平衡に到達させる工程、
●試料中の培地とph-CO2平衡にあるそれぞれのガス体積中のCO2ガス分率を求める工程、
●求められたCO2ガス分率を試料のそれぞれの平衡pH値に対してプロットする工程、
●プロットされた値に曲線をフィットさせ、フィットされた曲線から培地固有関係式のパラメーター(a1、a2またはb1、b2、b3)を導き出す工程
を含む方法によって経験的に得られている。
【００４９】
例えば、培地固有関係式は、CO2オフガスセンサーおよびオンラインpH測定装置を備える特殊な容器またはバイオリアクターにおいて求めることができる。培地固有関係式を求めるのに用いられる条件、例えば、温度および圧力は、優先的に、第1のpH値を測定した時の温度および圧力と同じであるか、または非常に似ている。
【００５０】
態様によれば、pH値が測定される、タンク内の培地M1は、培地固有関係式を経験的に作成するのに用いられた培地と同じ組成をもつことが分かっている、組成が明らかな培地である。例えば、タンク内の培地および培地固有関係式を作成するのに用いられた培地はタンクのオペレーターによって調製されてもよく、培地の全成分および各濃度を開示している提供業者から取得されてもよい。従って、本明細書で使用する「同じタイプの培地」または「同じ培地」という表現は両方とも、少なくとも、pH-CO2平衡に影響を及ぼす全成分の点で組成が同じ培地を指す。
【００５１】
例えば、培地は、(炭酸水素塩を除いて)pH-CO2平衡に影響を及ぼす他のいかなる物質も含まない炭酸水素緩衝液でもよい。市販培地の提供業者の中には、完全な成分リストを開示していないものもいる。規定され限られた成分のセットを有する緩衝液を調製することによって、タンクのオペレーターは、タンク内にある培地が、培地固有関係式の作成に用いられた培地とぴったり同じ組成になることを確かなものにすることができる。これは、pH測定問題の間違った検出を防ぐ可能性がある、または真のpH測定問題の見落としを防ぐことができるかもしれない。
【００５２】
態様によれば、第1のpH測定装置がpH測定問題を有しているという判定は、第1のpH値および第2のpH値が閾値を超えて互いに異なる場合になされる。同様に、第1のpH測定装置がpH測定問題を有しているという判定は、第1のデータ値がさらなる閾値を超えて第2のデータ値と異なる場合になされ、第1のデータ値は第1のpH値から導き出され、第2のデータ値は第2のpH値から導き出される。例えば、閾値は、第1のpH測定装置が結合しているタンクのオペレーターによって設定されてもよく、オペレーター、またはタンクおよび培地が用いられるプロジェクトの精度の要求に左右される場合がある。
【００５３】
態様によれば、第1のタンクはバイオリアクターまたは収集タンクまたは較正ボックスである。
【００５４】
さらに有益な局面によれば、特定のタンク内で測定されたCO2濃度は、間違って較正されたpH測定装置を較正または再較正するのに用いられる場合がある。
【００５５】
さらなる局面において、本発明は、第1のpH測定装置を較正または再較正するための方法に関する。前記方法は、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定するために、本発明の態様について前述したように、第1のタンクおよび第2のタンクの中で測定されたpH値およびCO2濃度を比較する工程;ならびに、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度が同一である場合に第1のpH測定装置が第2のpH測定装置と同じpH値を出力するように、第1のpH測定装置を較正する工程を含む。または、前記方法は、第1のタンク内の第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定するために、本発明の態様について前述したように、第1のタンクのオフガス中で測定された第1のCO2濃度から第2のpH予想値を算出する工程;ならびに、第1のpH測定装置が第1のCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように、第1のpH測定装置を較正する工程を含む。
【００５６】
さらに有益な局面によれば、pH測定装置がタンクから取り出されタンクに再挿入されることなく、間違って較正されたpH測定装置を較正または再較正するために、特定のタンク内で測定されたCO2濃度が用いられる可能性がある。
【００５７】
さらなる局面において、本発明は、第1のpH測定装置を備えるタンクを操作する方法に関する。第1のpH測定装置はオンライン測定装置であり、前記方法は、
- 増殖培地を含むタンク内で細胞培養物を増殖させ、それによって、増殖培地のpHを第1のpH測定装置によって繰り返し測定する工程;
- タンク内の増殖培地およびその中に含まれる細胞培養物を、平衡状態でのpHとCO2との関係式が分かっている培地(M1)と交換する工程であって、例えば、前記培地M1は、pH測定問題が存在するかどうかの判定を行う比較ユニットがアクセス可能なデータ記憶媒体に、対応する培地固有関係式が保存されている培地でもよく、または培地M1は、pH-CO2平衡にあるCO2オフガス濃度から絶対pH値を算出することができる炭酸水素塩だけで緩衝化された培地でもよい、工程;
- 増殖培地を交換した後に、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定するために、本発明の態様について前述したように、CO2オフガス濃度測定値から第2のpH予想値を算出する工程;
- pH測定問題が検出された場合に、第1のpH測定装置が培地(M1)について第1のCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように、第1のpH測定装置を較正する工程;
- 第1のpH測定装置を較正した後に、タンク内の培地を増殖培地と交換する工程
を含む。
【００５８】
前記特徴は有利な場合がある。なぜなら、pH測定装置をタンクから引き抜き、いくつかの較正試験を行い、任意で、pH測定装置を再較正し、pHメーターをオートクレーブし、オートクレーブされたpHメーターをタンクに再導入することがもはや必要でないからである。もっと正確に言うと、pH測定装置は、タンク内に配置されたオンラインpH測定装置でもよく、タンク内でチェックおよび再較正することができる。これにより汚染リスクが小さくなり、時間が節約される可能性がある。
【００５９】
さらに有益な局面によれば、タンク内の培地の試料を採取することによって引き起こされるpHオフセット作用を特定するのに、特定のタンク内で測定されたCO2濃度が用いられる可能性がある。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、第1のタンクから培地試料を採取することによって引き起こされるpHオフセット作用を決定する方法に関する。前記方法は、タンク外部オフラインpH測定装置を提供し、第1のタンクを提供する工程を含む。第1のタンクは第1のpH測定装置を備える。第1のpH測定装置は、第1のタンク内に配置されたオンラインpH測定装置であり、かつ第1のタンク内で少なくとも部分的に培地(M1)によって取り囲まれている。前記方法は、
- 第1の(タンク内部)pH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために第1のタンクのCO2オフガス濃度測定値から、予測される絶対pH値を算出することによって、第1の(タンク内部)pH測定装置を較正し;(pH測定問題が検出された場合に)第1の(タンク内部)pH測定装置が第1のCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように、第1の(タンク内部)pH測定装置を較正する工程;
- タンク外部オフラインpH測定装置を、第1のタンクと同じタイプの培地(M1)を含む較正ボックス内に移し;タンク外部オフラインpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために較正ボックスのCO2オフガス濃度測定値から、予測される絶対pH値を算出することによって、タンク外部オフラインpH測定装置を(pH測定問題が検出された場合に)較正し;および、タンク外部オフラインpH測定装置が較正ボックスのオフガス中で測定されたCO2濃度の関数として算出されたpH値と同じpH値を出力するように、タンク外部オフラインpH測定装置を(pH測定問題が検出された場合に)較正する工程であって;従って、較正ボックスは、較正しようとするpH測定装置を備えるタンクとして用いられ、かつタンク外部オフラインpH測定装置を較正するのに用いられる第2のpH値を算出するためのインプットとして用いられるCO2濃度を測定するのにCO2オフガスセンサーが用いられる容器として用いられる、工程
をさらに含む。
【００６１】
第1のpH測定装置およびタンク外部pH測定装置を較正した後に、前記方法は、
- 第1のpH測定装置によって第1のタンク内の培地の第1の現在のpH値を測定する工程であって、第1の現在のpH値がオンライン測定値である、工程;
- 第1のタンクの培地の試料を採取し、試料を携帯型容器に充填する工程;
- タンク外部pH測定装置が試料容器内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれるように、タンク外部pH測定装置を位置づける工程;
- タンク外部pH測定装置によって試料容器内の培地の第2の現在のpH値を測定する工程であって、第2の現在のpH値がオフライン測定値である、工程;
- 第1の現在のpH値および第2の現在のpH値が閾値を超えて異なる場合、サンプリングプロセスがpHオフセット作用を引き起こしたと判定する工程
を含む。
【００６２】
態様によれば、前記方法は、
- 第3のCO2濃度および第3のpH値を受信する工程であって、第3のCO2濃度は、第1のタンク内の培地上方の第3のガス体積のCO2濃度であり、第3のCO2濃度および第3のpH値が第3の時間で測定され、第3の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第3のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第1のタンク内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間であり、第3のpH値は第1のpH測定装置によって提供された測定値である、工程;
- 第4のCO2濃度および第4のpH値を受信する工程であって、第4のCO2濃度は、第2のタンク内の培地上方の第4のガス体積のCO2濃度であり、第4のCO2濃度および第4のpH値が第4の時間で測定され、第4の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第2のタンク内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間であり、第4のpH値は、第2のpH測定装置によって提供された測定値であり、第3の時間と第1のタンクへの接種との間の経過時間が、第4の時間と第2のタンクへの接種との間の経過時間と同一である、工程;
- 第3の時間での、第1のタンク内の細胞培養物の第1の酸素取り込み速度(oxygen uptake rate)測定値を受信する工程;
- 第4の時間での、第2のタンク内の細胞培養物の第2の酸素取り込み速度測定値を受信する工程;
- 第1の酸素取り込み速度および第2の酸素取り込み速度が同一である場合、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために第3および第4のpH値およびCO2濃度を比較する工程
をさらに含む。
【００６３】
例えば、前記工程は、比較ユニットによって、例えば、1つまたは複数のpH測定装置のpH測定および較正状態をモニタリングおよび/または制御する一点のプログラムロジックによって行われてもよい。さらに、比較ユニットまたは比較ユニットに結合された制御ユニットは1つまたは複数のタンクの状態をモニタリングおよび/または制御してもよい。
【００６４】
バイオリアクターの重要な制御パラメーターとして、試料中に測定されたpH値を使用できることが多いので、サンプリングプロセスのオフセット作用を正確に測定および最小化することは極めて有利な場合がある。バイオリアクターの培地の試料中に測定されたpH値は、多くの場合、修正措置をとるための、例えば、塩基性物質を添加するための基盤となる可能性があり、温度または供給速度の上昇または低下が行われてもよい。CO2濃度測定値に基づいてタンク内部pH測定装置ならびにタンク外部pH測定装置を比較することによって、CO2濃度から厳密に導き出すことができる極めて正確な絶対pH値を基準にして両pH測定装置とも較正することができる。従って、較正差を最小にすることができる。結果として、タンクを操作し、培地試料を定期的に採取する時には、タンク内部pH測定装置およびタンク外部pH測定装置のどんなpH値差も、はっきりと、較正差ではなくサンプリング作用が原因だとすることができる。従って、サンプリングプロセスの作用をもっと正確に確かめることができ、(例えば、サンプリングプロセスによって引き起こされたpH差を計算によって加えるか、または差し引くことによって)タンク外部pH測定装置によって測定されたpH値から取り除くことができる。
【００６５】
態様によれば、第1のpH測定装置は第1のタンク内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれている。第1のタンクには、第2のタンク内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段が無い。あるいは、第1のタンクは、第1のタンク内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段を備えるが、第1のタンク内への培地の充填後から、第1のタンク内の培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする。これにより、微生物によってタンクが汚染されるリスクが小さくなる可能性がある。
【００６６】
態様によれば、第2のpH測定装置は第2のタンク内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれている。第2のタンクには、第2のタンク内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段が無い。あるいは、第2のタンクは、第2のタンク内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段を備えるが、第2のタンク内への培地の充填後から、第2のタンク内の培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする。
【００６７】
態様によれば、本発明の態様について本明細書中で述べたpH測定問題を判定するための方法は、第2のpH測定装置が第1のpH測定装置とは異なって較正されているかどうか判定するために用いられ、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なって較正されているかどうかの判定は、第2のpH測定装置が第2のタンク内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている間に行われ、かつ判定を行うために第2のタンクの培地の試料を採取することなく行われる。
【００６８】
2つ以上の異なるpH測定装置によって測定されたpH値を比較する態様によれば、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうかの判定は、第1および第2のCO2濃度ならびに第1および第2のpH値だけを判定のためのデータインプットとして用いることによって行われる。
【００６９】
特定のpH測定装置によって測定されたpH値と、CO2濃度測定値から算出されたpH予想値を比較する態様によれば、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうかの判定は、前記pH測定装置を備えるタンクのpH測定値およびCO2濃度測定値だけを判定のためのデータインプットとして用いることによって行われる。
【００７０】
前記特徴は有利な場合がある。なぜなら、pH測定問題を判定するためにオフライン測定がもはや必要とされない場合があるからである。
【００７１】
態様によれば、第1のpH値の測定はオンライン測定として行われ、第1のpH測定装置は、第1のタンク内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている。この場合、第1のタンクに動作可能に結合された第1のpH測定装置は第1のタンクのタンク内部pH測定装置である。
【００７２】
さらに、もしくはまたは、第2のpH値の測定はオンライン測定として行われ、第2のpH測定装置は、第2のタンク内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれている。この場合、第2のタンクに動作可能に結合された第2のpH測定装置は第2のタンクのタンク内部pH測定装置である。
【００７３】
態様によれば、第1のCO2濃度の測定は、第1のCO2濃度を提供するための、第1のタンクのオフガス中での第1のCO2センサーによるオンライン測定として行われる。
【００７４】
態様によれば、第2のCO2濃度の測定は、第2のCO2濃度を提供するための、第2のタンクのオフガス中での第2のCO2センサーによるオンライン測定として行われる。
【００７５】
態様によれば、比較ユニットは、第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けていると判定した場合、以下の工程:警告メッセージを出力する工程;自動的に、第1のpH測定装置の再較正を実行する、もしくは第1のpH測定装置の再較正の実行を始動させる工程;または自動的に、第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換を実行する、もしくは第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換の実行を始動させる工程、のうちの1つまたは複数を実行する。
【００７６】
態様によれば、第1のタンクは、以下の特徴:
(a)タンク内のガス体積、
(b)タンク内の培地体積、
(c)タンクのレイノルズ数、
(d)タンクのニュートン数、
(e)タンクの寸法、
(f)タンクおよび/またはタンクバッフルの幾何学的特徴、
(g)スターラー構成、
(h)撹拌速度、
(i)タンクの酸素の物質移動容量係数(kLa)、
(j)全ガス流入速度および/またはO2流入速度および/またはN2流入速度および/またはCO2流入速度、
(k)動力投入量、
(l)タンク内の圧力、
(m)培地中でのガスバブル保持時間、
(n)培地中でのガスバブルサイズおよび分布、
(o)表面速度、
(p)パラメーター(a)〜(o)のうちの1つまたは複数から導き出されるものとして計算されたパラメーター
(q)2つのタンクの地理的位置
のうちの1つまたは複数の点で第2のタンクと異なる。
【００７７】
さらなる局面において、本発明は、
- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信するために構成され、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置によって提供された測定値であり、
- 第2のCO2濃度および第2のpH値を受信するために構成され、第2のCO2濃度は、第2のタンク内に含まれる同じタイプの培地(M1)上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第2のpH値は第2のpH測定装置によって提供された測定値であり、
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、第1のpH値および第2のpH値を比較し、第1のCO2濃度および第2のCO2濃度を比較するために構成された、
比較ユニットに関する。
【００７８】
さらなる局面において、本発明は、
- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信するために構成され、第1のCO2濃度は、第1のタンク内の培地(M1)上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のタンク内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間であり、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、第1のpH値は第1のpH測定装置によって提供された測定値であり、
- 第1のCO2濃度の関数として第2のpH値を算出するために構成され、第2のpH値は、培地(M1)が予め規定された温度および圧力で前記培地(M1)上方の第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時の、前記培地タイプ(M1)について予測されたpH値であり、前記平衡にある第2のガス体積が第1のCO2濃度と同一の第2のCO2濃度を有し、前記平衡状態がいかなる細胞培養物の代謝の影響も受けておらず、
- 第1のpH測定装置がpH測定問題の影響を受けているかどうか判定するために、第1のpH値および第2のpH値を比較するために構成された、
比較ユニットに関する。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、第1のタンクの状態をモニタリングおよび/または制御するために構成されたシステムに関する。システムは、
- 本発明の態様に従う比較ユニットと;
- 比較ユニットに動作可能に結合された制御ユニットと;
- 第1のタンクおよび第1のpH測定装置
を備え、
- 制御ユニットは、第1のタンク内の細胞培養物の状態をモニタリングおよび/または制御するように構成されており、それによって、第1のpH測定装置によって繰り返し測定されたpH値をインプットとして使用する。
【００８０】
態様によれば、システムは、少なくともインプットパラメーターを分析することによって第2のタンクの状態からの第1のタンクの状態のずれをモニタリングおよび/または最小化するために、第1および第2のpH測定装置のpH値ならびに第1および第2のCO2濃度をインプットパラメーターとして使用するために構成されている。
【００８１】
以下では、バイオリアクターを参照することによって態様および実施例が説明される。しかしながら、バイオリアクターは、本発明の態様が適用され得るタンクの1タイプにすぎない。他の例は収集タンクおよび較正ボックスである。
【００８２】
一局面において、本発明は、
- 比較ユニットによって第1のCO2濃度および第1のpH値を受信する工程であって、第1のCO2濃度は、第1のバイオリアクター内の培地上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第1のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間であり、第1のpH値は、第1のバイオリアクターに動作可能に結合された第1のpH測定装置によって提供された測定値である、工程;
- 比較ユニットによって第2のCO2濃度および第2のpH値を受信する工程であって、第2のCO2濃度は、第2のバイオリアクター内の培地上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第2のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間であり、第2のpH値は、第2のバイオリアクターに動作可能に結合された第2のpH測定装置によって提供された測定値であり、第1のバイオリアクター内にある培地は第2のバイオリアクター内にある培地と同じである、工程;
- 第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために、または第1のバイオリアクターおよび第2のバイオリアクターそれぞれの培地の試料中での第1のpH値もしくは第2のpH値を測定するために行われたサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が異なるpH値を出力しているかどうか判定するために、比較ユニットによって第1のpH値および第2のpH値ならびに第2のCO2濃度を比較する工程
を含む、方法に関する。
【００８３】
例えば、第2のバイオリアクターは参照バイオリアクターとして用いられてもよく、第1のバイオリアクターは、以前に参照バイオリアクター内で培養されたことがある参照細胞培養物と基本的に同じように細胞培養プロジェクトを行うことになっている別のバイオリアクターとして用いられてもよい。これはまた、第1のバイオリアクターおよび第2のバイオリアクターを同時に操作することになっており、バイオリアクターの状態を比較するために、それぞれのpH値が繰り返し測定される場合でもよい。パラメーター比較は、例えば、前記2つのバイオリアクターの状態ずれを阻止する目的で、適切な措置を自動的に、半自動的に、または手動で始めるために行われてもよい。
【００８４】
第1のpH測定装置または第2のpH測定装置の較正エラーは、2つのバイオリアクターの状態を正確に比較できなくする、および/また第2のバイオリアクターから導き出された状態プロファイルを第1のバイオリアクターにおいて正確に再現できなくする共通のエラー原因であることが観察されている。較正エラーは、オフラインpH測定アプローチとオンラインpH測定アプローチ両方に共通するエラー原因である。
【００８５】
さらに、オフラインpH測定が第1のバイオリアクターおよび/または第2のバイオリアクターにおいて行われる場合、得られるオフラインpH値はバイオリアクター内にある培地の現在のpH値を正確に反映していない場合があることが観察されている。例えば、培地試料においてオフラインpH測定を定期的に行うために、培地試料はバイオリアクターから定期的に抜き取られることがある。培地試料においてpH値を測定することができる前のサンプリングプロセスは時間がかかる。その間に、試料が抜き取られたバイオリアクターのpH値は大幅に変化している可能性がある。さらに、偶然に、サンプリングプロセス中に試料の温度が低下することがあるか、またはバイオリアクター内の培地上方のガス体積と比較して試料の培地上方のガス体積中のCO2濃度が変化したために試料のpH値が変わることがある。前記の要因は全て培地試料のpH値に影響を及ぼし、いわゆる「オフセット作用」をまねくことがある。
【００８６】
本明細書で使用する「オフセット作用」とは、特定の時間でバイオリアクターの培地試料中で測定されたpH値が、前記特定の時間でバイオリアクターの培地中で直接測定されたpH値と差異が生じる原因であるpH値オフセットである。従って、第1のpH測定装置もしくは第2のpH測定装置の較正エラーならびに/またはオフセット作用(第1のpH測定装置および/もしくは第2のpH測定装置がオフライン測定装置である場合)があると、pH測定値に基づいて2つのバイオリアクターの状態を正確に比較するおよび/または一致させることができない場合がある。
【００８７】
本発明の態様は、2つの同一の溶液/培地が、所与の温度および圧力で、かつ所与のpH値でpH-CO2平衡状態にある場合に、前記培地上方の体積が同じCO2濃度を有するという事実を利用する。同様に、平衡状態にある前記2つの培地上方の体積中の特定のCO2濃度が与えられたとすると、2つの培地がpH-CO2平衡にある結果として、前記2つの培地のpH値は同一である。2つの培地には、pH-CO2平衡状態を変えることができる代謝をもつ細胞が全く無いので、CO2濃度測定値が同一であれば、第1のpH値および第2のpH値の任意のずれは、2つのpH測定装置が異なって較正されていることを指し示すものとして、および/またはこの差がオフラインpH測定のオフセット作用によって引き起こされることを指し示すものとして用いられる。
【００８８】
例えば、第2のバイオリアクターの「予め規定された」または「所与の」温度は、第2のバイオリアクターを起動および/または操作するのに適した任意の温度および圧力でよい。例えば、第2の温度は20℃でもよく、第2の圧力は標準大気圧でもよい。第2の温度および第2の圧力は測定されてもよく、第1の温度および第2の温度が同一またはほぼ同一になるように、かつ第1の圧力および第2の圧力が同一またはほぼ同一になるように、第1のバイオリアクターの温度および圧力(本明細書では「第1の温度」および「第1の圧力」と呼ばれる)を制御する、および合わせることができる。
【００８９】
本発明の態様は多くの理由から有利な場合がある。
【００９０】
培地のpH値が細胞培養物の代謝活動の影響を受ける前の時間で、CO2濃度およびpH値を比較すると、第1のpH測定装置が第2のpH測定装置とは異なって較正されているかどうかチェックすることが可能になり、前記pH測定装置の一方または両方がオフライン装置である場合、pH測定値の一方または両方がオフセット作用によって台無しになっている可能性があると判定することが可能になる。
【００９１】
較正差および/またはオフセット作用を早期に検出すると、培地に細胞培養物を接種する前に、pH測定装置を再較正する、修復する、または交換することができる可能性がある。再較正は、どんなオフセット作用も補償するように、第1のpH測定装置を較正するための選択肢を含んでもよい。従って、参照バイオリアクターのpH測定装置とは異なって較正されているpH測定装置を有する(またはオフセット作用で台無しになっているpH測定値を示す)バイオリアクター内で細胞培養物を増殖させることが最初から回避および/または修正される。それによって、pH測定装置の較正エラーが、参照(「第2の」)バイオリアクターの環境条件を他の(「第1の」)バイオリアクターにおいて再現しない場合に失われるであろう時間と金が節約される。
【００９２】
さらに有益な局面によれば、本発明の態様を用いると、2つの比較されたバイオリアクターとそれぞれのpH測定装置が互いにずっと離れた場所にある場合でさえ、例えば、異なる建物または異なる都市または異なる国にさえある場合でも、異なるバイオリアクターのpH値を比較することが可能になる。規定されたpH値をもつ、標準化された市販の較正溶液に頼るのではなく、(容易に、かつ高精度で求めることができる)CO2値が、pH測定値を比較するための、ならびにpH測定において較正差および/またはオフセット作用を特定するための基盤として用いられる。第1のCO2濃度測定値および第1のpH測定値は、容易に、例えば、インターネット接続を介して比較ユニットに伝えることができる。第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が同じ時間で較正および比較されることは必要でない。絶対pH値が正しく求められることさえ必要でない。前記のように、pH-CO2平衡状態にある第1のバイオリアクター内の第1のpH測定装置によって測定した第1のpH値および第1のCO2値が与えられたとすると、第1のpH値および第2のCO2値が観察される数週間前または数年前に第2のpH値および第2のCO2値が求められた場合でも、前記のようにpH-CO2平衡状態にある第2のバイオリアクター内の第2のpH測定装置で第2のpH値および第2のCO2値を測定することによって、第1のpH測定装置および第2のpH測定装置が全く同じに較正されているかどうか判定することが可能である。
【００９３】
さらなる局面において、第1のバイオリアクターを、基本的に、第2のバイオリアクターと同じ環境パラメーターを用いて操作することになっている場合、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置の較正差が存在しないと判定することと、pH測定においてオフセット作用が存在しないと判定することには、絶対pH値を正しく測定することよりかなり重要な場合がある。そのため、(第1のバイオリアクターを操作するための一種の「参照プロファイル」となり得る操作パラメーターを示す)第2のバイオリアクターが、誤って較正されたpH測定装置を用いて操作された場合でも、および/または第2のpH値がオフセット作用の影響を受けているが、これに対して、(「参照プロファイル」に明記されたように操作することになっている第1のバイオリアクターの)第1のpH測定装置が正しく較正されている/オフセット作用を有さない場合でも、本発明の態様は、第2のpH測定装置を測定する時に較正差および/またはオフセット作用の存在を特定することができる。第2のpH値または第1のpH値を測定する時に較正差および/またはオフセット作用が特定されたら、オペレーターまたは自動制御システムは第2の/参照バイオリアクターの細胞とは異なる環境パラメーターの下で(特に、培地の異なるpH値の下で)第1のバイオリアクターにおいて細胞培養物を増殖させないように適切な措置をとることができる。
【００９４】
従って、本発明の態様は、バイオリアクターの初期化段階で既にあるpH測定装置の較正差および/またはオフセット作用を特定することによって、バイオリアクターの状態を正確にモニタリングおよび/または制御することができる可能性がある。
【００９５】
他の態様によれば、第1のバイオリアクターは、第1のバイオリアクター内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段を備える。第1のバイオリアクター内への培地の充填後から、第1のバイオリアクター内の培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、前記方法は、サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする工程を含む。
【００９６】
第1のバイオリアクターの培地の汚染が回避されるので、このことは有益な場合がある。pH値が既知の基準溶液中でpH値を決定するためのサンプリング手段の開口部はもはや必要でない。較正差はCO2値によって特定され、pH値は、本発明の態様に従って、バイオリアクター内にあるpH測定装置によって測定される。サンプリングプロセス中にバイオリアクターが不要な微生物に感染するリスクが小さくなり、サンプリングプロセスによってオフセット作用が引き起こされなくなるので、このことは有益な場合がある。
【００９７】
態様によれば、それぞれのバイオリアクターのオフガスの第2のCO2濃度および第1のCO2濃度ならびに全ガス流入速度は、第2のバイオリアクターの第2のCO2オフガス速度の計算および第1のバイオリアクターの第1のCO2オフガス速度の計算に用いられる。次いで、第2のCO2濃度および第1のCO2濃度の代わりに、第2のCO2オフガス速度および第1のCO2オフガス速度が比較される。このアプローチは、第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターにおける全オフガス速度が同一である場合に適用されることがある。CO2オフガス分析器の中には、CO2濃度ではなくCO2オフガス速度を測定し、CO2オフガス速度を比較ユニットに戻すことができるものもある。2つの比較されたバイオリアクターの全オフガス速度が同一であれば、2つのCO2値ではなく2つのバイオリアクターのCO2オフガス速度(「ACO」)を比較することができる。全オフガス速度が同一で、かつpH値測定値が同一であれば、2つのバイオリアクターのCO2オフガス速度測定値が異なる場合に、pHメーターオフセットまたは較正差が検出される。
【００９８】
態様によれば、前記方法は、第1のpH測定装置が第2のpH測定装置とは異なって較正されているかどうか判定するために用いられる。第1のpH測定装置は、第1のバイオリアクター内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれている。例えば、第1のpH測定装置は、第1のバイオリアクターの培地に沈められたpH測定装置でもよい。第1のバイオリアクターには、第1のバイオリアクター内にある培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段が無い。
【００９９】
これには、オフライン測定値としてpH値を測定する目的で試料を採取することによる培地の汚染および/またはオフセット作用の発生を防ぐバイオリアクタータイプの使用を可能にするという利点がある場合がある。
【０１００】
他の態様によれば、第1のバイオリアクターは、第1のバイオリアクター内の培地の試料を手動でまたは自動的に採取するための手段を備える。前記手段は、例えば、バイオリアクターから培地試料を手動で採取するための開口部からなってもよく、試料を自動的または半自動的に抜き取るためのロボットアームまたはドレインからなってもよい。前記方法は、第1のバイオリアクター内への培地の充填後から、第1のバイオリアクター内の培地への細胞培養物の添加前までの時間間隔の間、サンプリング手段の全ての開口部を閉じたままにする工程をさらに含む。これは、バイオリアクター内にある培地の汚染を防ぐ可能性がある。前記方法は、試料を採取することなく容易に測定することができる、培地上方のガス体積のCO2濃度と組み合わせて、バイオリアクターの内部にある第1のpH測定装置を使用するので、本発明の態様は、バイオリアクターの試料を採取することなく、従って、感染する危険を冒すことなく較正差を検出することができる。
【０１０１】
態様によれば、前記方法は、第1のpH測定装置が第2のpH測定装置とは異なって較正されているかどうか判定するために用いられる。第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されているかどうかの判定は、第1のpH測定装置が第1のバイオリアクター内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている間に(従って、完全に、または少なくとも部分的にバイオリアクター内にあるpH測定装置によって)行われ、かつ判定を行うために第1のバイオリアクターの培地の試料を採取することなく行われる。
【０１０２】
態様によれば、判定は、第2のCO2濃度および第1のCO2濃度ならびに第2のpH値および第1のpH値だけを判定のためのデータインプットとして用いることによって行われる。このことは有利な場合がある。なぜなら、前記パラメーター値は、オンラインでpH値およびCO2濃度を測定することによって容易に入手できるからである。
【０１０３】
態様によれば、前記方法は、第1のpH値を測定するために第1のpH測定装置を用いてオンライン測定を実行する工程であって、第1のpH測定装置が第1のバイオリアクター内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている、工程をさらに含む。
【０１０４】
さらに、もしくはまたは、前記方法は、第1のCO2濃度を提供するために、第1のバイオリアクターのオフガス中にある第1のCO2センサーによってオンライン測定を実行する工程を含む。
【０１０５】
この方法は、特に、第1のpH測定装置が第2のpH測定装置とは異なって較正されているかどうか判定するために用いられる可能性がある(第1のpH測定装置がオンライン測定を実行することができる時には、典型的にオフセット作用は無く、第2のpH測定装置の結果からの任意のずれは較正差によって引き起こされるか、または第2のpH測定装置がオフライン測定装置である場合には第2のpH測定装置のオフセット作用によって引き起こされる)。
【０１０６】
現在用いられている多くのバイオリアクタータイプには、それぞれのCO2濃度測定装置およびpH測定装置が既に存在し、バイオリアクター状態をモニタリングおよび制御する目的だけでなく、較正差およびオフセット作用を特定する目的にも容易に用いられる可能性がある。pH測定のために培地試料を抜き取ることも必要でなく、pH測定装置をバイオリアクターから引き抜くか、またはバイオリアクターに再導入することも必要でない。従って、バイオリアクターを望ましくない微生物に感染させるリスクが小さくなる。前記方法を用いると、2つのバイオリアクターのいずれか1つからの培地から試料を採取することなく、2つのバイオリアクターの2つのpHメーターの較正差を特定できる可能性がある。
【０１０７】
バイオリアクターのオフガス中のCO2濃度を測定するCO2センサーを使用することには有利な場合がある。なぜなら、CO2オフガスメーター(「CO2オフガス分析器」、「CO2オフガスセンサー」)が非侵襲的であり、サンプリングを必要とせず、リアルタイムで容易に入手することができ、オフガス中のCO2濃度および/またはCO2オフガス速度の値を送ることができるからである。従って、CO2オフガス分析器は、(例えば、細胞密度または細胞数とは対照的に)バイオリアクターの意図的な、または意図的でないプロセス変化に速やかに応答する可能性がある。さらに、オフガス分析器はいつでも較正することができ、オートクレーブする必要がない。
【０１０８】
態様によれば、前記方法は、第2のpH値を測定するために第2のpH測定装置を用いてオンライン測定を実行する工程を含む。第2のpH測定装置は第2のバイオリアクター内で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている。さらに、もしくはまたは、前記方法は、第2のCO2濃度を提供するために、第2のバイオリアクターのオフガス中にある第2のCO2センサーによってオンライン測定を実行する工程を含む。これには、第2の(または「参照」)バイオリアクターのpH値およびCO2濃度値もオンライン測定によって、例えば、沈められた連続pHメーターによって集めることができ、それによって、pHオフセット作用が回避され、サンプリングプロセスによって引き起こされる感染のリスクが小さくなるという利点がある場合がある。
【０１０９】
態様によれば、前記方法は、第1のpH測定装置が、第1のバイオリアクターの培地の試料において第1のpH値を測定するために行われたサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、第2のpH測定装置とは異なるpH値を出力しているかどうか判定するために用いられる。前記方法は、第1のpH値を測定するために第1のpH測定装置を用いてオフライン測定を実行する工程をさらに含む。第1のpH測定装置は第1のバイオリアクターの外側にあり、第1のバイオリアクターの培地試料中で少なくとも部分的に培地に取り囲まれている。
【０１１０】
オフライン測定装置、特に、オフラインpH測定装置が技術的に備え付けられているバイオリアクタータイプが用いられるのであれば、前記特徴は有益な場合がある。この状況では、警告を出力するために、および/またはサンプリングプロセスによって引き起こされたオフセット作用が補償されるように第1のpH測定装置の出力を変更するために、第2のpH値および第1のpH値ならびに第2のCO2濃度および第1のCO2濃度の比較によって決定された、どんなオフセット作用も用いることができる。
【０１１１】
態様によれば、前記方法は、以下の状況:
- 第2のCO2濃度および第1のCO2濃度が同一であり、かつ第2のpH値および第1のpH値が閾値を超えて互いに異なる状況、または
- 第2のpH値および第1のpH値が同一であり、かつ第2のCO2濃度および第1のCO2濃度がさらなる閾値を超えて互いに異なる状況、または
- 第2のデータ値がさらなる閾値を超えて第1のデータ値と異なる状況であって、第2のデータ値が第2のpH値および第2のCO2濃度から導き出され、第1のデータ値が第1のpH値および第1のCO2濃度から導き出される、状況、
の1つが起こる場合に、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されていると判定する工程、またはサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なるpH値を出力していると判定する工程を含む。例えば、2つのバイオリアクター内の培地のpH値を比較するために較正することになっているpH測定装置を備える両バイオリアクターについて全オフガス速度が同一である場合、CO2濃度の代わりにCO2オフガス速度が比較されてもよい。
【０１１２】
態様によれば、pH値もCO2濃度も同一でない場合、バイオリアクターモニタリングおよび/または制御システムの制御ユニットはCO2ガス流入速度を変更する場合がある。それによって、気相中のCO2濃度と、培地のpH値が両方とも影響を受ける可能性がある。第1のpH値が第2のpH値と同一になったらすぐに、または第1のCO2濃度が第2のCO2濃度と同一になったらすぐに、上記の判定が行われる。
【０１１３】
態様によれば、前記方法は、第2のCO2濃度および第1のCO2濃度が同一であることを観察する工程、および第1のpH測定装置が第2のpH測定装置と同じpH値を示すように第1のpH測定装置を較正する工程をさらに含む。
【０１１４】
例えば、第2のCO2濃度および第1のCO2濃度が同一であり、第2のpH値および第1のpH値が量「Δ」分だけ互いに異なる場合、前記「Δ」pHオフセット値を、将来(すなわち、第1の時間より後の時間で)第1のpH測定装置によって測定される各pH値に加えることができる。従って、第1のpH測定装置によって出力された、結果として生じたpH値は、第2のpH値もしくは第1のpH値を測定するためのサンプリングプロセスによって引き起こされたpHオフセットを補償する、および/または第2のpH測定装置と第1のpH測定装置の間のどんな較正差も補償する。
【０１１５】
態様によれば、第2のバイオリアクターの状態からの、第1のバイオリアクターの状態のずれをモニタリングおよび/または最小化するために構成されたシステムの制御ユニットは、第1のpH測定装置のpH値をインプットとして使用する。2つのバイオリアクターの状態差の最小化および/または状態の比較は、少なくとも前記インプットパラメーターを分析する比較ユニットによって行われる。比較ユニットは、ソフトウェア、ファームウェア、および/またはハードウェアで実行される一点のプログラムロジック、例えば、電子データ処理システム上で動作するアプリケーションプログラムでもよい。態様によれば、比較ユニットは制御ユニットに動作可能に結合される。例えば、比較ユニットは制御ユニットに一体化している部分でもよく、制御ユニットと相互運用するように構成されたアプリケーションプログラムでもよい。制御ユニットおよびモニタリングユニットは同じ電子データ処理機器で動作してもよく、異なる電子データ処理機器で動作してもよい。
【０１１６】
このことは有利な場合がある。なぜなら、第2のpH測定装置とは異なって較正されている、および/またはサンプリングプロセスが原因でオフセット作用を有するpH値を示す第1のpH測定装置の使用を回避できるからである。
【０１１７】
態様によれば、第2のpH値および第1のpH値の受信、第2のCO2濃度および第1のCO2濃度の受信、ならびに前記pHおよびCO2濃度値の比較は比較ユニットによって行われる。第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されていると判定された場合、比較ユニットは、以下の工程:
- 警告メッセージを出力する工程;
- 自動的に、第1のpH測定装置の再較正を実行する、または第1のpH測定装置の再較正の実行を始動させる工程;
- 自動的に、第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換を実行する、または第1のpH測定装置の新しい第1のpH測定装置との交換の実行を始動させる工程
のうちの1つまたは複数を実行してもよい。
【０１１８】
従って、オペレーターまたは第1のバイオリアクターの自動化部品は適切な措置をとることができ、例えば、第1のpH測定装置を交換または再較正することができ、問題が解決するまで第1のバイオリアクターへの接種を遅らすことができる。
【０１１９】
比較ユニットは、例えば、電子データ処理装置またはその一部によって提供されてもよく、電子データ処理装置またはその一部によって実行されてもよい。この装置は、プロセッサ、メモリ、およびそれに保存された電子的命令を備える。プロセッサによって命令を処理する際に、本発明の態様の方法は比較ユニットによって行われる。一部の態様において、比較ユニットは、1つまたは複数のバイオリアクターモニタリングおよび/または制御アプリケーションプログラムに動作可能に結合される。比較ユニットは、第1のバイオリアクターを備え、任意で、第2のバイオリアクターも備えるシステムに一体化している部分でもよい。システムは、一部の態様によれば、状態をモニタリングし、第2のバイオリアクターの状態と比較することになっている、さらなるバイオリアクターを備える。
【０１２０】
態様によれば、比較ユニットはデータ記憶媒体から培地固有関係式を読み取る。培地固有関係式は、第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクター内にある培地に固有であり、前記培地が前記ガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す。次いで、予め規定された温度および圧力でpH-CO2平衡にありかつ細胞培養物の非存在下での第1のバイオリアクター内の培地について予想される絶対pH値を計算するために、比較ユニットは培地固有関係式のインプットとして第1のCO2濃度を使用する。次いで、比較ユニット(または培地固有関係式の計算結果を用いたオペレーター)は、計算された絶対pH値が前記第1のpH測定装置によって出力されるように第1のpH測定装置を構成する。例えば、第1のpH測定装置は、将来のpH測定において第1のpH測定値とΔpHの合計を出力するように較正される。ΔpHとは、第1のpH測定値と、培地固有関係式を用いることによって計算されたpH予想値との間の差である。
【０１２１】
培地固有関係式は、例えば、培地(M1)のpH値と前記培地上方のガス体積中のそれぞれ測定されたCO2ガス分率との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることことによって得られた式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)でもよい。それによって、
- PPHM1(CO2)は、前記培地が細胞培養物を欠きかつ前記培地上方のガス体積とpH-CO2平衡にある時の、培地(M1)におけるpH予測値であり、前記ガス体積は、インプットパラメーターとして用いられるCO2濃度を含む。
- CO2はインプットパラメーター値であり、細胞培養物の非存在下でph-CO2平衡状態にある培地(M1)上方のガス体積中のCO2濃度を表す。
- REL-M1は、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターのセットである。
【０１２２】
パラメーターは、例えば、以下の工程:
- 細胞培養物を欠く培地M1の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料を、それぞれの試料中の培地上方のガス体積とのpH-CO2平衡に到達させる工程;
- 試料中の培地とph-CO2平衡にあるそれぞれのガス体積中のCO2ガス分率を求める工程;
- 求められたCO2ガス分率を試料のそれぞれの平衡pH値に対してプロットする工程;
- プロットされた値に曲線をフィットさせ、フィットされた曲線から培地固有関係式のパラメーターを導き出す工程
を手動で、自動的に、または半自動的に行うことによって得られる。
【０１２３】
従って、培地固有関係式は、経験的に、例えば、第2のバイオリアクターまたは第1のバイオリアクターに参照細胞培養物が接種される前に突き止められる可能性がある。
【０１２４】
一部の態様によれば、培地固有関係式は、バイオリアクター、例えば、第2のバイオリアクターに、細胞培養細胞を含まない培地を充填し、第2のバイオリアクターの温度および圧力を、予め規定された値、例えば、20℃および標準大気圧に設定することによって得られる。培地固有関係式を経験的に求めるために用いられるバイオリアクター内の培地は、本明細書では、pH値を設定しようとする試料の1つとも呼ばれる。
【０１２５】
次いで、培地は、CO2ガス流入速度を変更することで、培地上方のガス体積中のCO2濃度を増加または減少させることによって異なるpH値に設定されてもよく、培地が平衡化して(所与のpHで、予め規定された温度および圧力でpH-CO2平衡状態に到達して)しばらくして(典型的には数分後または数時間に)、(前記平衡状態にあるCO2分圧と相関関係にある)培地上方のガス体積中のCO2濃度が測定される。前記測定は、例えば、培地上方のガス体積中のCO2濃度を分析することによって、またはオフガス中のCO2体積分率を介して行われる。試料(バイオリアクターまたはアリコート)において測定された平衡pH値と平衡CO2濃度(またはCO2オフガス値)の取得されたペアはプロットされる、すなわち、座標系に表される。プロッティングは、紙ベースの印字出力の形をとるプロットおよび/またはディスプレイスクリーン上に表示されたプロットをさらに出力し得る電子データ処理システムによって自動的に行われてもよい。プロッティングはまた手作業で行われてもよい。曲線は、自動的に、または手作業で前記プロットにフィットされ、前記フィットされた曲線を記述するパラメーターが算出される。パラメーターは、前記培地が特定のpH値でpH-CO2平衡にある時に、pH値と、前記培地上方のガス体積中のCO2濃度との培地固有関係式を規定する。pH値は、好ましくは、培地の組成の変更を回避するために、塩基性物質または酸性物質を添加するのではなく、CO2流入速度を調整することによって設定される。
【０１２６】
パラメーターを算出した後に、培地固有関係式は、例えば、ユーザーが関係式を手入力するのを可能にするグラフィカルユーザーインターフェースを介して、携帯型記憶媒体を介して、またはネットワーク接続を介して比較ユニットに転送されてもよい。
【０１２７】
他の態様によれば、培地固有関係式は、前記培地のアリコートの形で複数の試料を作製することによって得られ、それぞれの試料は異なるpH値を有する。試料は、それぞれの試料においてガスと液体培地との間でpH-CO2が平衡になるように、ある時間にわたって、予め規定された温度と圧力で放置される。
【０１２８】
試料は、例えば、1種類の試料のpH値を変え、連続して測定することによって連続して得られてもよく、前記培地の複数の試料を並行して作製することによって得られてもよく、それぞれのアリコートは、培地上方のガス体積のCO2濃度を変更することによって異なるpH値に設定される。試料は、現在のpH値の設定および測定を可能にし、CO2濃度の変更と、平衡状態でのCO2濃度またはCO2オフガス速度の測定を可能にする任意の容器に充填することができる。優先的に、それぞれの試料のpH値は、バイオリアクターのCO2流入速度を変え、従って、気相中のCO2濃度を変えることによって、pH値がそれに応じて変わるように設定される。このことは有利な場合がある。なぜなら、pHを変えるために酸または塩基ではなくCO2を使用した時に、(溶解CO2の解離生成物を除いて)培地の組成の変更が変わらないからである。
【０１２９】
一部の態様によれば、式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)は、PPHM1(CO2)=a1xpH+a2に従う1次方程式である。この場合、パラメーターa1およびa2は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。PPHM1(CO2)は、前記式へのインプットとして用いられる特定のCO2濃度を有するガス体積と平衡状態にある培地のpH予測値を示す。
【０１３０】
他の態様によれば、式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)は、PPHM1(CO2)=b1xpH2+b2xpH+b3に従う多項式である。この場合、パラメーターb1、b2、およびb3は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。
【０１３１】
培地固有関係式および対応する培地に固有のパラメーターを経験的に求めることには、培地の正確な組成が分かっていない場合でも(一般的に、販売されている多くの培地に当てはまる)、前記培地とpH-CO2平衡にある空気体積中の平衡CO2濃度に及ぼす特定のpH値の影響を実験によって決定することができるという有益な効果がある場合がある。従って、絶対pH値は、組成が分かっていない培地タイプを用いた時も計算することができ、pH測定装置を較正するのに使用することができる。
【０１３２】
態様によれば、細胞培養物の細胞は原核細胞または真核細胞、特に、哺乳動物細胞培養細胞である。
【０１３３】
態様によれば、第2のバイオリアクターは、以下の特徴:
(a)バイオリアクター内のガス体積、
(b)バイオリアクター内の培地体積、
(c)バイオリアクターのレイノルズ数、
(d)バイオリアクターのニュートン数、
(e)バイオリアクターの寸法、
(f)バイオリアクターおよび/またはバイオリアクターバッフルの幾何学的特徴、
(g)スターラー構成、
(h)撹拌速度、
(i)バイオリアクターの酸素の物質移動容量係数(kLa)、
(j)全ガス流入速度および/またはO2流入速度および/またはN2流入速度および/またはCO2流入速度、
(k)動力投入量、
(l)バイオリアクター内の圧力、
(m)培地中でのガスバブル保持時間、
(n)培地中でのガスバブルサイズおよび分布、
(o)表面速度、
(p)パラメーター(a)〜(o)のうちの1つまたは複数から導き出されるものとして計算されたパラメーター
(q)2つのバイオリアクターの地理的位置(例えば、異なる国、都市、または建物)
のうちの1つまたは複数の点で第1のバイオリアクターと異なる。
【０１３４】
本明細書で使用する「動力投入量」パラメーターは、バイオリアクターのスターラーの動力投入の量を指定する。スターラー構成が異なると、同一の撹拌速度または同一の先端速度でも動力投入量が異なることがある。同一のスターラー速度で、動力投入量は培地の粘性に依存することがある。
【０１３５】
CO2オフガス濃度を比較することによって、2つのバイオリアクターのpH測定装置の較正状態を容易に比較することができる。オフガス中のCO2濃度が同一であることは、前記バイオリアクターのレイノルズ数および/またはニュートン数が異なる場合であっても、スターラーの速度または構成が異なる場合であっても、異なるバイオリアクターのpH測定装置の較正が同一であることを示す。
【０１３６】
態様によれば、比較ユニットは第3のCO2濃度および第3のpH値を受信する。第3のCO2濃度は、第2のバイオリアクター内の培地上方の第3のガス体積のCO2濃度である。第3のCO2濃度および第3のpH値は第3の時間で測定される。第3の時間は、第2のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第3のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第2のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間である。第3のpH値は、第2のpH測定装置によって提供された測定値である。
【０１３７】
次いで、比較ユニットは第4のCO2濃度および第4のpH値を受信する。第4のCO2濃度は、第1のバイオリアクター内の培地上方の第4のガス体積のCO2濃度である。第4のCO2濃度および第4のpH値は第4の時間で測定される。第4の時間は、第1のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第1のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更された後の時間である。例えば、一部の細胞が、培地のpHおよび/または組成を変える物質、例えば、乳酸塩を培地に排出し始めて数時間たった後、または数日たった後でも、第4のpH値は、第1のpH測定装置によって提供された測定値である。第3の時間と、第2のバイオリアクターへの接種との間の経過時間は、第4の時間と、第1のバイオリアクターへの接種との間の経過時間と同一である。
【０１３８】
さらに、比較ユニットは、第3の時間での、第2のバイオリアクター内の細胞培養物の第2の酸素取り込み速度測定値を受信し、第4の時間での、第1のバイオリアクター内の細胞培養物の第1の酸素取り込み速度測定値を受信する。
【０１３９】
第2の酸素取り込み速度および第1の酸素取り込み速度が同一である場合、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために、または第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターそれぞれの培地の試料中での第3のpH値または第4のpH値を測定するために行われたサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なるpH値を出力しているかどうか判定するために、比較ユニットは第3のpH値および第4のpH値を比較し、第3のCO2濃度および第4のCO2濃度を比較する。
【０１４０】
以下の状況:
- 第3のCO2濃度および第4のCO2濃度が同一であり、かつ第3のpH値および第4のpH値が閾値を超えて互いに異なる状況、または
- 第3のpH値および第4のpH値が同一であり、かつ第3のCO2濃度および第4のCO2濃度がさらなる閾値を超えて互いに異なる状況
の1つが起こる場合に、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置は異なって較正されていると判定されるか、またはサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、異なるpH値を出力していると判定される。
【０１４１】
本発明の態様では、第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターにおいて温度および圧力が同一である場合には、さらに、酸素取り込み速度が同一の場合には、pH測定値の差は較正エラーまたはpH値を測定するためのサンプリングプロセスのオフセット作用に起因するとみなされる。
【０１４２】
前記特徴は特に有利な場合がある。なぜなら、細胞の代謝が、例えば、乳酸塩の排出によってバイオリアクターのpH-CO2平衡状態を変更し始めている場合でも(オフラインpH測定のために試料が採取されることなく)、前記特徴は、2つのpH測定装置が異なって較正されているかどうか、またはサンプリングオフセット作用を示すかどうか判定することができるからである。多くの場合、細胞の酸素取り込み速度は特定の細胞培養物の状態と相関関係にあり、そのため、2つのバイオリアクター内の細胞培養物のOURが同一である場合、また、オフガス中のCO2濃度、温度および圧力が同一である場合も、較正エラーまたはサンプリングに基づくオフセット作用によってpH差の観察が引き起こされることが観察された。
【０１４３】
さらなる局面において、本発明は、
- 第2のCO2濃度および第2のpH値を受信するために構成され、第2のCO2濃度は、第2のバイオリアクター内の培地上方の第2のガス体積のCO2濃度であり、第2のCO2濃度および第2のpH値が第2の時間で測定され、第2の時間は、第2のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第2のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間であり、第2のpH値は、第2のバイオリアクターに動作可能に結合された第2のpH測定装置によって提供された測定値であり、
- 第1のCO2濃度および第1のpH値を受信するために構成され、第1のCO2濃度は、第1のバイオリアクター内の培地上方の第1のガス体積のCO2濃度であり、第1のCO2濃度および第1のpH値が第1の時間で測定され、第1の時間は、第1のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第1のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間であり、第1のpH値は、第1のバイオリアクターに動作可能に結合された第1のpH測定装置によって提供された測定値であり、
- 第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために、または第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターそれぞれの培地の試料中での第2のpH値もしくは第1のpH値を測定するために行われたサンプリングプロセスのオフセット作用が原因で、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なるpH値を出力しているかどうか判定するために、第2および第1のpH値およびCO2濃度を比較するために構成された、
比較ユニットに関する。
【０１４４】
さらなる局面において、本発明は、第2のバイオリアクターの状態からの、第1のバイオリアクターの状態のずれをモニタリングおよび/または最小化するために構成されたシステムに関する。システムは、少なくとも、第1のバイオリアクターを、任意で、第2のバイオリアクターおよび1つまたは複数のさらなるバイオリアクターもモニタリングおよび/または制御するための制御ユニットを備え、本明細書に記載の態様のいずれか1つに従う比較ユニットを備える。システムは、少なくとも、第1のバイオリアクターおよび第1のpH測定装置をさらに備える。制御ユニットは、少なくとも、第1のバイオリアクターにおいて細胞培養物の状態をモニタリングおよび/または制御し、それによって、第1のpH測定装置によって繰り返し測定されたpH値を使用するように構成されている。
【０１４５】
態様によれば、システムは第2のバイオリアクターをさらに備える。第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターは異なる地理区域に配置され、任意で、CO2濃度およびpH値を伝達するためにネットワーク、例えば、インターネットを介して比較ユニットに結合される。
【０１４６】
態様によれば、第2の時間とは、第2のバイオリアクターに細胞培養物を接種する前の時間である。第2の時間はまた、第2のバイオリアクターに細胞培養物を接種する時か、または第2のバイオリアクターに細胞培養物を接種した後であり、かつ前記細胞培養物の代謝が第2のバイオリアクター内の培地のpH値を変更する前の時間でもよい。
【０１４７】
第1の時間とは、第1のバイオリアクターに細胞培養物を接種する前の時間である。または、第1の時間とは、第1のバイオリアクターに細胞培養物を接種する時か、または第1のバイオリアクターに細胞培養物を接種した後であり、かつ前記細胞培養物の代謝が第1のバイオリアクター内の培地のpH値を変更する前の時間である。
【０１４８】
本明細書で使用する「プロファイル」とは時間に対するパラメーター値の変動を表現したものである。
【０１４９】
本明細書で使用する「タンク」とは、液体を保持、輸送、または保存するための容器である。タンクは、例えば、バイオリアクター、またはバイオリアクターの培地、細胞培養物、および反応産物を含む収集タンクもしくは輸送タンクでもよい。タンクはまた、無細胞培地が充填され、pH測定装置を較正するのに用いられる較正ボックスでもよい。
【０１５０】
本明細書で使用する「較正ボックス」とは、既知の培地を含むタンクであり、このタンクは、CO2センサーに動作可能に結合され、センサーによって測定されたCO2オフガス濃度を用いてpH測定装置を較正するために1つまたは複数のpH測定装置を一時的に収納するために構成されている。例えば、較正ボックスは、細胞培養物の増殖のために現在用いられていないが、pH測定装置の較正のためだけに用いられているか、主に、pH測定装置の較正のために用いられているバイオリアクターでもよい。または、較正ボックスは、特殊用途の容器、特に、異なる研究所内にある、pHメーターを較正するための異なる場所に運ぶことができる携帯型容器でもよい。較正ボックスは、既知の特性(現在の温度、圧力、既知の培地固有関係式、または純粋に炭酸水素塩で緩衝化された培地の場合には既知の組成)を有する培地を備え、培地上方のガス体積中または較正ボックスのオフガス中にCO2センサーを備える。較正ボックスは、pH測定装置を容易に挿入および取り外すための開口部をさらに備え、1つまたは複数のpH測定装置が較正ボックス内で少なくとも部分的に培地によって取り囲まれるように、較正ボックスに1つまたは複数のpH測定装置を一時的に固定するための1つまたは複数の固定装置を備えてもよい。
【０１５１】
本明細書で使用する「予め規定された」温度および圧力は、第1および/もしくは第2のタンクのオペレーターによって制御されたか、または少なくともオペレーターが「分かっている」温度および圧力、あるいは第1のタンクおよび/もしくは第2のタンクまたはその中に含まれるpH測定装置を操作するように構成されているプログラムロジックによって制御されたか、または少なくともプログラムロジックが「分かっている」温度および圧力を指定する。従って、「予め規定された」温度および圧力はまた「所与の」温度および圧力とも呼ばれることがある。第1のpH値および第2のpH値ならびに第1のCO2値および第2のCO2値が同じ所与の温度および圧力で測定されることを確実にすることが必要な場合がある。
【０１５２】
本明細書で使用する「比較ユニット」は、一点のプログラムロジック、例えば、アプリケーションプログラムもしくはモジュール、コンピュータチップ、またはpH測定エラーが発生したかどうか判定するために、タンクのオフガスの1つもしくは複数のpH測定値および1つもしくは複数のCO2濃度測定値を受信および処理するために構成された別の一点のハードウェアもしくはファームウェアである。例えば、比較ユニットは、較正ソフトウェアまたはバイオリアクターモニタリングソフトウェアもしくは制御ソフトウェアの一部であるか、あるいはこれと相互運用するプログラムモジュールでもよい。
【０１５３】
タンクに「動作可能に結合された」pH測定装置は、例えば、タンク内に恒久的または一時的に配置され、オンラインpH測定を行うように構成されているpH測定装置でもよい。
【０１５４】
本明細書で使用する「バイオリアクター」とは、生物またはこのような生物に由来する生化学的に活性な物質が関与する化学プロセスが行われる容器である。このプロセスは、例えば、好気性でもよく、嫌気性でもよい。形状(例えば、円筒形または他の形状)、サイズ(例えば、ミリリットル、リットル〜立方メートル)、および材料(ステンレス鋼、ガラス、プラスチックなど)が異なる複数の異なるバイオリアクタータイプが存在する。態様によれば、バイオリアクターは、細胞培養中の細胞を増殖させるか、または組織を成長させるように合わせられる。態様および/または操作方式に応じて、バイオリアクターは、バッチバイオリアクター、フェドバッチバイオリアクター、または連続バイオリアクター(例えば、連続撹拌タンクリアクターモデル)でもよい。連続バイオリアクターの一例はケモスタットである。
【０１５５】
本明細書で使用する「オンライン測定」とは、バイオリアクターまたはその中に含まれる細胞培養物の状態特徴を記述する測定値を得るプロセスであって、測定を行うのに必要な期間が、前記特徴が大きく変化する時間より短いプロセスである。大きく変化するとは、予め規定された閾値を超えて変化することでもよい。例えば、5％を超えて変化すると大きく変化したとみなされることがある。異なる特徴について閾値が異なることがある。オンライン測定を用いるとバイオリアクターをリアルタイムで制御することが可能になる可能性がある。
【０１５６】
「オフライン測定」とは、バイオリアクターまたはその中に含まれる細胞培養物の状態特徴を記述する測定値を得るプロセスであって、測定を行うのに必要な期間が、前記特徴が大きく変化する時間より長いプロセスである。大きく変化するとは、予め規定された閾値を超えて変化することでもよい。オフライン測定の代表例は、例えば、現在のpH値を測定するための、培地の自動サンプリング、半自動サンプリング、または手動サンプリングである。オフライン測定は不連続なサンプリングプロセスに基づいている。試料を採取してから、その間に、バイオリアクター特徴が変化している可能性があるので、測定時間と、それぞれの制御操作を行う時間との間には、かなりの待ち時間があるために、オフライン測定データに基づくバイオリアクターの制御は低品質になる傾向がある。
【０１５７】
大きく変化するとは、それぞれの状態特徴に応じて、予め規定された閾値、例えば2％または他の任意のパーセント値を超えて変化することでもよい。オフライン測定の代表例は、例えば、バイオリアクターを起動した時にpH測定装置を較正するために、現在のpH値を測定するための、培地のプローブの自動サンプリング、半自動サンプリング、または手動サンプリングである。
【０１５８】
試料から測定値を得るための不連続なサンプリングプロセスには、その間に、バイオリアクター特徴が変化している可能性があるという欠点がある場合がある。従って、測定時間と、それぞれの制御操作を行う時間との間には、かなりの待ち時間があるために、オフライン測定データに基づくバイオリアクターの制御は低品質になる傾向がある。
【０１５９】
本明細書で使用する「pH測定装置」または「pHメーター」は、培地中の現在のpH値を測定するのに用いられる装置および/または物質である。pHメーターは、例えば、溶液もしくはpHストリップの形をとる(フェノールフタレインのような)pH指示薬でもよく、電位差計でもよい。好ましい態様によれば、pHメーターは、連続pHメーター、すなわち、それぞれの個々の測定のために試料を取り出す必要はなく、かつ前記pHメーターを培地に挿入する必要はなく、バイオリアクターの培地のpHを連続して繰り返し測定することができるpHメーターである。例えば、pHメーターは、培地および参照電極に接続され、かつ電位測定値を表示せず、即座にpH値を表示するようにスケール変更された高精度の電圧計でもよい。優先的に、pHメーターは培地に沈められ、バイオリアクター中で細胞を培養している間ずっと、培地の現在のpH値を繰り返し測定するのに用いられる。例えば、pHメーターは現在のpH値を数分ごとに、または30分ごとに、または数時間ごとに測定してもよい。代表的な今日のpHメーターでは参照電極がpH電極に組み込まれ、このため装置はコンパクトになっている。
【０１６０】
本明細書で使用する「CO2測定装置」、「CO2センサー」、「CO2メーター」、または「CO2分析器」は、ガス体積中の、例えば、バイオリアクターの培地上方のガス体積中またはバイオリアクターのオフガス中の現在のCO2濃度を測定するのに用いられる装置である。
【０１６１】
態様によれば、第2のバイオリアクターおよび/または第1のバイオリアクターの現在のCO2濃度は、連続CO2オフガスメーターによって、すなわち、ハードウェアモジュールをバイオリアクターまたはその接続されたオフガスパイプまたはそれぞれのCO2濃度測定用のパイプに繰り返し挿入することも、交換することも必要なく、バイオリアクターのオフガス中の現在のCO2濃度を測定することができる装置によって測定される。連続pH測定装置および/または連続CO2オフガスメーターを使用することは有利な場合がある。なぜなら、オフセット作用を引き起こすことなく、および/または培地の試料を採取する必要なく、容易に、かつ繰り返し、それぞれの測定を行うことができるからである。多くの既存のバイオリアクターが1つもしくは複数の沈められたpHメーターを既に備える、ならびに/またはCO2濃度および/もしくはCO2オフガス速度を測定することができる測定装置を備えるか、もしくはこれと結合されている。
【０１６２】
態様に応じて、バイオリアクター(または参照バイオリアクター)は1本のガス流入ラインもしくはパイプまたは複数本のガス流入ラインもしくはパイプを備える。例えば、特別な供給業者からの環境空気または(既に膨張されている)圧縮空気をバイオリアクター(参照バイオリアクター)に送達するのに1本のガス流入ラインまたはパイプが用いられることがある。前記の環境空気または圧縮空気は、地球の大気によくあるガス、特にN2、O2、およびCO2の混合物からなってもよいか、異なる組成を有する。さらに、もしくはまたは、例えば、細胞増殖を制御するために、N2、O2、およびCO2などの個々のガスをバイオリアクターに送達するのに、1本のガス流入ラインもしくはパイプが用いられてもよく、他のどのガス流入ラインもしくはパイプも用いられてもよい。
【０１６３】
態様によれば、2つのバイオリアクターのうちの1つまたは2つのバイオリアクターのそれぞれは、それぞれ、バイオリアクター内にある培地とガス体積の間のpH-CO2平衡の確立を加速するために、流入しているガスから非常に細かく分散されたガスバブルを生じさせるためのマイクロスパージャー(microsparger)を備える。例えば、マイクロスパージャーは流入ガス混合物に用いられてもよく、それぞれの個々の流入ガス成分に別々に用いられてもよい。さらに、もしくはまたは、2つのバイオリアクターのうちの1つ、または2つのバイオリアクターのそれぞれは、二酸化炭素と、1種類または複数種の他のガス(例えば、窒素、酸素、および/または空気)とが一緒になってガス混合物としてバイオリアクターに同時に添加されるように構成および操作される。例えば、全流入ガスが、ガス混合物として、例えば、液内にあるパイプ開口部またはマイクロスパージャーを介してバイオリアクターに投入されてもよい。
【０１６４】
優先的に、バイオリアクターの体積が、例えば、400リットル、または、例えば、200リットルの閾値体積より少ない場合、全プロセスガスが、マイクロスパージャーを介して、および/またはガス混合物の形でバイオリアクターに投入される。
【０１６５】
態様によれば、バイオリアクターの培地内にある流入ガスのエアレーション速度およびバブルサイズは、全てのガスバブルがバイオリアクターを離れる前に培地とpH-CO2平衡に到達するか、または培地に完全に溶解するように選択される。
【０１６６】
前記特徴は有利な場合がある。なぜなら、前記特徴は、ガスバブルのガス内容物がバイオリアクターを離れる前にガスバブルが平衡状態に到達することを確かなものにするからである。マイクロスパージャーから、流入しているガスの非常に細かく分散されたガスバブルが生じ、それによって、バイオリアクター内にある培地とガス体積の間のpH-CO2平衡の確立が加速される。ガス混合物としてCO2ガスを投入すると、CO2が純粋なCO2ガスバブルから培地に移行する速度が、CO2が培地から、例えば、空気またはN2バブルに移行する速度より速くなる状況が回避される(移行速度は、培地と種々のタイプのバブルとのCO2濃度差の量に依存する場合がある)。従って、前記測定は、例えば、400リットルより少ない体積を含む、広範囲のバイオリアクター体積にわたるバイオリアクター状態の比較を確かなものにする。
【０１６７】
本明細書で使用する「プロファイル」とは時間に対するパラメーター値の変動を表現したものである。
【０１６８】
「pH-CO2平衡」とは、pH値とCO2分圧がヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従う化学平衡にある、水溶液(例えば、細胞培養培地)と、前記溶液上方の空気体積(例えば、バイオリアクター内のガス体積)を含む系の状態を示す。CO2分圧は、培地上方の全ガス体積中のCO2ガスの割合に対応する。ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式は、生物系および化学系における酸性度の尺度であるpHと酸解離定数(pKa)との関係を表している。CO2を含むガスが水性液体、例えば、培養培地と接触していれば、少なくとも、わずかな割合のCO2が前記液体に溶解する。例えば、室温では、二酸化炭素の溶解度は、水100mlあたり約90cm3のCO2(cl/cg=0.8)である。温度が下がるにつれて、どんな水溶性ガスもよく溶けるようになる。わずかな割合(約0.2〜1％)の溶解CO2がH2CO3に変換される。CO2のほとんどが溶媒和分子CO2としてとどまる。このプロセスは、以下の式:
炭酸(H2CO3)平衡:
[CO2]x[H2O]←→[H2CO3]←→[H+]x[HCO3-]
[H+]x[HCO3-]=Kx[CO2]x[H2O]、式中、K=平衡定数
pH=pK+log([HCO3-]/[CO2])
で説明することができる。
【０１６９】
本明細書で使用する「CO2体積分率」とは全ガス体積中のCO2ガスの割合である。単位は、例えば、Vol.％になることがある。これはガス体積の「CO2濃度」とも呼ばれ、濃度はVol.％の単位で明記される。
【０１７０】
「培地」または「細胞培養培地」とは、微生物もしくは細胞、または蘚類であるニセツリガネゴケ(Physcomitrella)のような小さな植物の培養、典型的には、増殖を支持するように設計された液体またはゲルである。異なるタイプの細胞を増殖させるために異なる培地がある。典型的に、培地は、1種類または複数種の物質、例えば、塩、炭水化物、微量元素、ペプチドおよび/またはタンパク質の混合物を含む、水ベースの溶液である。例えば、植物または動物に由来する特定の細胞タイプの細胞培養用に、および細菌または酵母などの微生物を増殖させるための微生物学的培養用に複数の異なる培地が販売されている。培地は、例えば、栄養培地、例えば、LB培地(Lysogeny Broth)、最小培地、選択培地、鑑別培地、または強化倍地でもよい。一部の培地は、生理学的pH維持するために、例えば、5〜10％CO2のCO2環境を必要とする場合がある。
【０１７１】
一部の態様によれば、「2種類の培地は同じである」という表現は、特定の圧力、温度、および前記培地上方のガス体積中のCO2濃度が与えられたとすると、2種類の培地(例えば、一方では、参照バイオリアクター内にある培地、他方では、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター内にある培地)が、同じ組成および濃度の有機化合物および無機化合物ならびに溶媒を含む、ならびに/または測定精度の文脈で同じ製造プロトコールおよび条件を用いて製造されていることを意味する。
【０１７２】
一部の態様によれば、この表現は、(所与の温度、圧力、および前記培地上方のガス体積中のCO2濃度での)前記の差が、複数の異なるpH値の前記培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼさないか、またはほぼ影響を及ぼさない限り、ならびに前記2種類の培地それぞれから経験的に導き出された培地固有関係式が同一である限り、2種類の培地が前記のどの判断基準(組成、濃度、製造プロトコール)の点でも異なってもよいことを意味する。
【０１７３】
本明細書で使用する「細胞培養物を培養する」とは、典型的には、細胞培養物が増殖する、すなわち、細胞培養物の細胞の数が増えることを意味する。しかしながら、場合によっては、細胞数は伸び悩むこともあり、さらには減少することもある。
【０１７４】
以下において、一例にすぎないが、図面を参照することによって本発明の態様をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】pH測定装置の較正ずれまたはpH測定オフセット作用を検出するように構成された、1つまたは複数のバイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するためのシステムのブロック図を示す。
【図２】pH測定装置の較正ずれまたはpH測定オフセット作用を検出するための方法のフローチャートを示す。
【図３】バイオリアクターの部品を示す。
【図４】バイオリアクターのオフガス中のCO2濃度がpH値に依存することを図示した図表を示す。
【図５】培地に固有のpH-CO2濃度関係式を得るのに用いられたプロットを示す。
【図６】4つの異なるバイオリアクター内で細胞培養物を増殖させている間に、それぞれのpHメーターによって測定された4つの異なるバイオリアクターのpH値を示す。
【図７】4つのバイオリアクターそれぞれの、オフガス中で測定されたCO2分率を示す。
【図８】図8aは、2つのバイオリアクターおよび参照バイオリアクターのCO2オフガスから導き出された状態プロファイルを示した図表である。図8bは、図8aの2つのバイオリアクターと前記参照バイオリアクターの状態プロファイル差を示した図表である。
【図９】サンプリングプロセスが、タンク内のpH値からの、試料中で測定されたpH値のずれの原因となり、pH測定装置を較正する手法もpH測定値に影響を及ぼすことを示したプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
詳細な説明
図1は、1つまたは複数のバイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するための制御ユニット132を備えるシステム100のブロック図を示す。システム100は、インターフェイス128を介して2つ以上のバイオリアクターから受信したpH測定値およびCO2濃度測定値を比較するための比較ユニット130を備える。以下では、図2のフローチャートに示したように、較正差およびpH測定サンプリングオフセット作用を特定するための対応する方法を参照することによって本発明の態様を説明する。
【０１７７】
図1は、2つの比較されたバイオリアクターにおける較正差およびオフセット作用をすぐに特定するために、バイオリアクターのうちの一方の培地試料を採取する必要なく、かつ較正エラーまたはオフセット作用を判定するためにpH値が既知の「標準」溶液を使用する必要なく、2つ以上のバイオリアクターのpH測定装置によって測定されたpH値およびそれぞれのバイオリアクターのオフガス分析器によって測定されたCO2濃度をリアルタイムでかつ正確に比較するのを可能にするシステム100を示す。
【０１７８】
システム100は、プロセッサ110、主メモリ112、および非一時的記憶媒体114を備える。記憶媒体は、プロセッサ110によって実行された時に、本発明の態様について述べたように1つまたは複数のバイオリアクター102、104、106を自動的にモニタリングおよび/または制御するための方法をプロセッサが行うようにする、コンピュータ読取可能な命令を含む。
【０１７９】
記憶媒体114は、バイオリアクター102、104、106のいずれかに含まれる培地M1に特有のpH-CO2-濃度関係を示す、少なくとも1つのデータ構造136、例えば、ファイルまたはデータベース記録を含む。
【０１８０】
さらに、記憶媒体は他の細胞培養培地M2の培地固有関係式138を含んでもよい。培地固有関係式136、138は、データ通信インターフェイス120、例えば、ネットワークインターフェイス、USBポート、CDROMドライブなどを介して受信されてもよい。
【０１８１】
システム100は、1つまたは複数のモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター102、104、106から、現在の測定値を動的に受信するためのインターフェイス126をさらに備えてもよい。インターフェイス126はまた、ネットワークインターフェイス、例えば、インターネット、またはイントラネットでもよい。測定値は、特に、それぞれのバイオリアクターのオフガス中で測定された現在のpH値および現在のCO2オフガス速度である。比較ユニット130は、それぞれのpH測定装置が同じように較正されており、異なるバイオリアクターから受信したpH測定値の正しい比較を妨げるオフセット作用が無いかどうか判定するために、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター102、104、106から受信した受信した測定値を使用する。任意で、pH測定装置が正しい絶対pH値を出力するかどうか判定するために、比較ユニット130は培地M1の培地固有関係式136もインプットとして使用する。
【０１８２】
第1のバイオリアクター104は、第1のバイオリアクターに無細胞培地M1を充填し、ガスの連続添加を開始することによって、例えば、環境空気ならびに/またはその個々の成分(N2、O2、および/もしくはCO2)をバイオリアクターに輸送することによって、および任意で、液体(無細胞培地、任意で、供給材料などのさらなる液体など)の連続添加を開始することによっても初期化される。さらに、スターラーが開始されてもよい。第1のバイオリアクターは、第2のバイオリアクターを起動するために用いられた温度および圧力と同一の温度および圧力で操作される。
【０１８３】
しばらくして(典型的には数分後または数時間に)、第1のバイオリアクター内の培地と、第1のバイオリアクター内の培地上方の空気体積はpH-CO2平衡状態に到達し、第1のバイオリアクターの培地中およびオフガス中で第1のpHおよびCO2濃度値が測定される。第1のバイオリアクター内の培地を特定のpH値に設定するために、第1のバイオリアクターへのCO2流入速度は相応に変更される場合がある。なぜなら、ガス体積中のCO2濃度は培地のpH値に影響を及ぼすからである。
【０１８４】
第2の工程202では、比較ユニット130は第2のCO2濃度CO2-R-M-tiおよび第2のpH値pHR-M-tiを受信する。第2のCO2濃度とは、第2のバイオリアクター102中の培地上方の第2のガス体積のCO2濃度である。第2のCO2濃度および第2のpH値は第2の時間tiで測定される。第2の時間とは、第2のバイオリアクター内の培地が予め規定された温度および圧力(例えば、20℃および標準大気圧)で第2のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第2のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間である。例えば、第2の時間tiとは、バイオリアクター102に細胞培養物が接種される前の時間、または細胞の代謝がバイオリアクター102内のpH-CO2平衡にまだ影響を及ぼさないような接種直後の時間である。第2のpH値は、第2のバイオリアクター102に動作可能に結合された第2のオフラインまたはオンラインpH測定装置142によって提供された測定値である。図示した例では、第2のpH測定装置は、第2のバイオリアクター102の培地M1に沈められたオンラインpHメーターである。
【０１８５】
次の工程204では、比較ユニットは第1のCO2濃度CO2B1-M-tiおよび第1のpH値pHB1-M-tiを受信する。第1のCO2濃度とは、例えば、第1のバイオリアクター104のオフガス中で測定され得る、第1のバイオリアクター中の培地上方の第1のガス体積のCO2濃度である。第1のCO2濃度および第1のpH値は第1の時間で測定される。第1の時間とは、第1のバイオリアクター104内の培地が予め規定された温度および圧力で第1のガス体積とpH-CO2平衡状態にある時間かつ前記平衡状態が第1のバイオリアクター内にある細胞培養物の代謝によって変更される前の時間である。
【０１８６】
例えば、CO2分析装置122は「二酸化炭素センサー」とも呼ばれ、オフガス中のCO2濃度を繰り返し測定するために用いられることがある。CO2センサーの一般的な例は赤外線ガスセンサー(NDIR)および化学ガスセンサーである。NDIRセンサーは、特徴的な吸収によって気体環境中のCO2を検出する分光センサーである。または、CO2センサーはマイクロエレクトロメカニカルセンサーでもよい。
【０１８７】
第1のpH値とは、第1のバイオリアクター104に動作可能に結合された第1のpH測定装置108によって提供された測定値である。第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターの中にある培地は同じである。
【０１８８】
一部の態様において、第2のバイオリアクター102は「参照バイオリアクター」とも呼ばれ、参照バイオリアクターと基本的に同じ条件下で細胞培養物を増殖させるために第1のバイオリアクター104に接種する数日前、数週間前、さらには数年前に細胞培養物を増殖させるのに用いられる。この場合、第2の時間および第1の時間は数年離れていてもよく、それぞれ、それぞれのバイオリアクターが初期化され、pH-CO2平衡に影響を及ぼす細胞培養物を(まだ)含んでいない時間を表す。この場合、第1のpH値および第1のCO2濃度が測定される前に、第2のpH値および第2のCO2濃度は測定される。他の態様において、第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターは並行して操作され、第2および第1のpH値およびCO2値は、ほぼ同じ時間で、比較ユニットによって測定および受信されてもよい。
【０１８９】
工程206では、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されているかどうか判定するために、比較ユニットは第2および第1のpH値およびCO2濃度を比較する。
【０１９０】
- 第2のCO2濃度および第1のCO2濃度が同一であり、かつ第2のpH値および第1のpH値が閾値を超えて互いに異なる場合;または
- 第2のpH値および第1のpH値が同一であり、かつ第2のCO2濃度および第1のCO2濃度がさらなる閾値を超えて互いに異なる場合に、
比較ユニットは、第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が異なって較正されていると判定するか、または前記装置の少なくとも1つが(サンプリング手順によって引き起こされる)オフセット作用の影響を受けていると判定する。
【０１９１】
第2のpH測定装置および第1のpH測定装置が両方ともオンライン測定装置である場合、サンプリングプロセスによって引き起こされるオフセット作用は全く存在しない。この場合、比較ユニットは、第2のpH測定装置と第1のpH測定装置との間に較正差があると判定し、警告メッセージならびに/または第2のpH値と第1のpH値のΔをディスプレイ134に出力してもよい。ディスプレイ装置は、例えば、コンピュータモニターでもよく、スマートフォンのモニターでもよい。従って、オペレーターは第1のバイオリアクターへの接種を阻止し、第1のpH測定装置の再較正または交換を行ってもよい。第2のバイオリアクターの(オフ)ガス相中の平衡CO2濃度と同一であることが確かめられた(オフ)ガス相中の平衡CO2濃度をもつ第1のバイオリアクター内の培地について、第1のpH測定装置が第2のpH値と同一の値を出力するように、モデレーターまたは比較ユニットは第1のpH測定装置を再構成することも可能である。一部の態様において、第1のバイオリアクター内にある細胞の環境状態と、第2の(参照)バイオリアクター内にある細胞の環境状態の差が最小になるように、制御ユニット132はバイオリアクター102、104、106のうちの1つまたは複数の1つまたは複数のパラメーターを制御する。制御ユニットは、例えば、比較の結果を受信するために比較ユニット130に動作可能に結合されたソフトウェアおよび/またはハードウェアモジュールでもよい。制御ユニットは、1つまたは複数の工学的プロセスおよび工学的パラメーターの構成および操作を制御することができる。例えば、制御ユニット132は、pH値に影響を及ぼす液体の流入を増やすまたは減らすように動作できてもよく、例えば、クエン酸または1M NaOH溶液の流入を増やしてもよく、減らしてもよく、および/またはバイオリアクターの培地のpH値を変更するためにCO2ガス流入を増やしてもよく、減らしてもよい。
【０１９２】
例えば、培地M1は、例えば、プトレシン、チミジン、ヒポキサンチン、亜鉛、ならびに高レベルの全アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを含む、Kaighn's Modification of Ham's F-12培地でもよい。これらを添加すると、培地には、一部の細胞タイプのための非常に低いレベルの血清または規定された成分が加えられる。Ham's F-12K(Kaighn's)培地はタンパク質も増殖因子も含有せず、従って、特定の細胞株に最適化され得る増殖因子および胎仔ウシ血清(FBS)が加えられることが多い。Ham's F-12K(Kaighn's)培地では炭酸水素ナトリウム緩衝液系(2.5g/L)を用いる。培地M2はLB培地でもよく、例えば、様々な目的で、および対応する「プロジェクト」のために細菌または植物を培養するために、他の複数の培地M3、M4について参照プロファイルが存在してもよい。
【０１９３】
システム100は、比較ユニットと、1つまたは複数のバイオリアクター104、106に動作可能に結合された制御ユニット132によってモニタリングおよび/または制御される1つまたは複数のバイオリアクター104、106とを備える。図1から推測できるように、モニタリングまたは制御されているバイオリアクターの寸法ならびに工学的パラメーター(撹拌速度および撹拌構成、バブルサイズ、寸法、培地体積など)は互いに異なってもよい、および/または参照バイオリアクターのそれぞれのパラメーターと異なってもよい。バイオリアクター102、104、106は異なる地理区域に配置されてもよい。バイオリアクターの1つまたは複数は、モニタリングデータ(現在のpHおよびオフガス中のCO2濃度ならびに/またはCO2オフガス速度)を比較ユニット130および/または制御ユニット132に送信し、任意で、制御データを制御ユニット132から受信もするか、またはpH測定装置を再構成、再較正、もしくは交換するための制御データを比較ユニットから受信もする。参照バイオリアクターをシステム100に結合させてもよいが、システム100に結合させる必要はない。第1のバイオリアクター(または第2のpH測定装置と同じように較正されることになっており、第2のpH測定装置142によって測定されたpH値についてオフセット作用が全く無いpH測定装置を有する、さらなる任意のバイオリアクター106)を起動する時に、参照バイオリアクターから集められた第2のpH値およびCO2濃度値は比較ユニット130によってアクセスできれば十分である。第2のバイオリアクター、および第1のバイオリアクター104、106のそれぞれは同じ培地M1を含み、同じタイプの細胞培養物が接種される。
【０１９４】
優先的に、少なくとも初期化の時点での、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104、106は参照バイオリアクターと同じ温度および圧力の下で操作される。しかしながら、バイオリアクター104、106の操作中には、参照バイオリアクター内の細胞培養状態について状態差を最小にするために温度および/または圧力を変更することが可能である。
【０１９５】
図3は、バイオリアクター102、104、106の態様を示す。バイオリアクターは、新鮮な培地、任意で、1つまたは複数のさらなる液体をバイオリアクターに移すために第2のパイプまたはホースに結合される。さらに、バイオリアクターは、ガス、例えば、環境空気および/またはN2ガスおよび/またはO2ガスおよび/またはCO2ガスをバイオリアクターに移すために、アウトフロー(outflow)および1本または複数本の第1のパイプまたはホースに結合される。さらに、バイオリアクターはオフガスのために第3のパイプまたはホースに結合される。第1のパイプまたはホースは、現在の全ガス流入速度を求めるためのセンサー144を備えてもよい。第3のパイプまたはホースは、オフガスCO2濃度、および第3のパイプを通って移される単位時間あたりのCO2ガス量を選択的に測定するために、センサー122、例えば、CO2オフガス分析器を備えてもよい。他の態様によれば、液体を流入および流出するためのパイプは無くてもよく、供給溶液の段階的な大量(bolus)添加によって栄養分がバイオリアクターに供給されてもよい。
【０１９６】
多くのバイオリアクタータイプでは、流入ガスは、液内にある1つまたは複数のガス取り入れ口を介してバイオリアクターに(ガス混合物として、または別々の開口部を介して)供給される。バイオリアクターが、さらなるヘッドスペースエアレーションを備える場合、ヘッドスペースエアレーションを介してバイオリアクターに供給されたガスが全て、バイオリアクターを離れる前にバイオリアクターの培地とpH-CO2平衡に到達するように、前記「ヘッドスペース」流入ガス分率および/または培地上方の気相の空気循環の流入速度は構成されなければならない。ヘッドスペースエアレーションがバイオリアクターの唯一のエアレーション機構である場合でも、バイオリアクターに供給されたガスが全て、バイオリアクターを離れる前にバイオリアクターの培地とpH-CO2平衡に到達するように、前記「ヘッドスペース」流入ガス分率の流入速度は構成されなければならない。
【０１９７】
または(例えば、遅れずに、ヘッドスペースエアレーションガスが培地とpH-CO2平衡に到達することができない場合)、pH測定装置較正またはオフセット検出を行うためにオフガス中のCO2濃度を測定する前に、さらなるヘッドスペースエアレーションはオフにされる。これにより、さらなるヘッドスペースエアレーションによって引き起こされた、バイオリアクター気相中の平衡CO2濃度からのずれに起因し得る較正エラーを回避することができる可能性がある。
【０１９８】
第2のバイオリアクターの初期化段階の間に、新鮮な培地だけでなく、さらなる液体、例えば、供給溶液および/または酸性液体もしくは塩基性液体も第2のバイオリアクターに添加される場合、第2の時間および第1の時間で、第2のバイオリアクターおよび第1のバイオリアクターの中にある培地(全てのさらなる液体および物質を含む)が同一になることを確かなものにするために、初期化中に、同じ量および組成の前記さらなる液体が第1のバイオリアクターに添加される。
【０１９９】
図4は、4つの異なるバイオリアクターI〜IVのオフガス中のCO2濃度がpH値に依存し、前記CO2濃度がそれぞれのバイオリアクターの工学的パラメーターおよびサイズパラメーターに依存しないことを図示した図表A、B、C、およびDを示す。
【０２００】
4つの異なるバイオリアクターは以下の工学的特性を有する。
2018534560.tif 000012
【０２０１】
前記バイオリアクターI〜IVにはそれぞれ、細胞を全く含まない特定の細胞培養培地M1を充填した。前記培地の元々のpH値は6.85であった(図表Bを参照されたい)。次いで、それぞれのバイオリアクターの前記培地上方のガス体積中のCO2濃度を下げることによって、それぞれのバイオリアクターのpH値を上げた。試験の初めに、かつ一組の予め規定されたpH値それぞれについて、予め規定された温度および圧力、例えば、20℃および標準大気圧で、それぞれのバイオリアクター内の培地を、培地上方のガス体積とpH-CO2平衡に到達させた。平衡に到達した後に、前記4つのバイオリアクターそれぞれについて、CO2濃度(「分率CO2ガス」、「CO2[％]」、または「FCO2」とも呼ぶ)を総オフガスのVol.％の単位で求めた(図表Bと組み合わせて、オフガス中のCO2濃度測定値に及ぼすpH値の影響を示した図表Aを参照されたい)。図表4C)は、4つのバイオリアクターそれぞれのCO2濃度測定値に及ぼすpH値の影響を棒グラフの形で示す。4つのバイオリアクターそれぞれについて得られたCO2[％]の最大のずれはバイオリアクターの全オフガスの0.4％未満であった。
【０２０２】
図表4D)は、前記バイオリアクターの培地M1がpH-CO2平衡状態に到達した時の、4つの各バイオリアクターI〜IVにおいて一組のpH値(6.85、6.95、7.05、7.15、7.25、7.35)それぞれで測定されたCO2[％]値を含むプロットである。
【０２０３】
バイオリアクター中のpH-CO2平衡が、バイオリアクターに入るおよび/またはバイオリアクターを離れるCO2ガスの速度によって脅かされる可能性があり、そのため、pH-CO2平衡は実際には動的平衡である可能性があることに留意しなければならない。それにもかかわらず、例えば、バイオリアクターにおける全CO2流入速度を変更することによって、バイオリアクター内の培地上方のガス体積中のCO2濃度を減らすかまたは増やすことによって、動的pH-CO2平衡が特定のpH値で確立されるように、バイオリアクターを制御することが可能である。または、pH値は酸性または塩基性の物質または液体の添加によって変わる可能性がある。
【０２０４】
優先的には、望ましいpH値に達するようにCO2流入速度および全ガス流出速度を制御するだけで、バイオリアクター内で特定のpH値で動的pH-CO2平衡状態が確立される。塩基性物質または酸性物質を添加するのではなくpH-CO2平衡を確立するためにCO2濃度を用いることには、(溶解CO2とその解離生成物の濃度以外には)培地の組成が変わらず、従って、異なるpH値の同じ培地から培地固有関係式を経験的に導き出すことができるという利点がある。
【０２０５】
次いで、4つのバイオリアクターに含まれる培地M1に固有の関係式316についてパラメーターを経験的に求めるために、プロットに曲線502をフィットさせる。このアプローチを用いると、特定の細胞培養培地について、前記培地が特定の圧力および温度(例えば、20℃および標準大気圧)を有し、かつ細胞を欠き、かつ気相とpH-CO2平衡にある時の、CO2オフガス濃度測定値が与えられた培地の絶対pH値を予測するために比較ユニットによってインプットとして用いられる培地固有関係式136が経験的に求められる。得られた関係式は、バイオリアクタースケール、エアレーション速度、および他の工学的パラメーターに依存しない。
【０２０６】
培地固有関係式は特定の培地M1について1回だけ求められる。この算出は、1つのバイオリアクターにおいて、例えば、第2のバイオリアクターに細胞培養物を接種する前の第2のバイオリアクター102において行われてもよい。精度を高めるために、複数のバイオリアクター、またはpH値およびCO2ガス分率(CO2濃度)を測定することができる他の容器において算出を行い、次いで、もっと正確なフィットされた曲線502を得るために、複数のバイオリアクターまたは容器において得られた情報を用いることも可能である。図4Dおよび図5に図示した例では、フィットされた曲線502、および平衡pH値と平衡CO2濃度との間の対応する培地固有関係式を経験的に求めるために4つの異なるバイオリアクターを使用した。
【０２０７】
体積が400L、100L、2L、および2Lであり、同じタイプの培地を含む4つのバイオリアクターを用いて、さらなる同様の試験(示さず)を行った。バイオリアクターは、異なるタイプのpH測定装置(例えば、KnickおよびMettlerプローブ)を備え、異なる制御器セットアップ構成(Siemens S7 対Sartorius DCU)と、同じタイプの異なるオフガス分析器(Dasgip/Eppendorf GA4)を備えた。pH測定装置をそれぞれ、それぞれのバイオリアクターの培地中に入れる前に、2つの既知のpH点(4および7)の従来の較正用緩衝液を用いて較正した。次の工程では、4つのpH測定装置をそれぞれ、第5の予め較正されたpH測定装置を用いて再較正した。第5の予め較正されたpH測定装置を、4つの比較されるバイオリアクターの培地に連続して挿入した。4つ全てのpH測定装置を第5のpH測定装置の値に再較正した。再較正後に、4つ全てのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度(「FCO2」値)を測定した。得られた4つのFCO2測定値は、4つ全ての値の最大値と、4つ全ての値の最小値の差(「Δ」)が約0.75％であることを示した。
【０２０８】
次いで、4つ全てのバイオリアクターにおいて、比較可能な実際のpH値を確立するために、4つのバイオリアクターの制御器のずれを最小化した。この最小化の後に、4つ全てのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度(「FCO2」または「CO2[％])を測定した。4つの得られたFCO2測定値は、4つ全ての値の最大値と、4つ全ての値の最小値の差(「Δ」)が約0.27％であることを示した。この結果から、培地体積、全体積、エアレーション速度、およびエアレーション速度に依存するパラメーター、スターラー速度、およびスターラー速度に依存するパラメーター、ならびにスケール、バイオリアクター寸法などに依存するさらなるパラメーターに関係なく、pH-CO2平衡状態にある培地を含むバイオリアクターは同じpH値で同じCO2濃度を有することが確かめられた。
【０２０９】
従って、この試験シナリオにおいて、前記の平衡状態では、0.27％のばらつきで、0.02pHスケール単位未満のpHオフセットを検出することができた。従って、pH測定装置を較正するための極めて正確な方法が提供される。
【０２１０】
図5は、図4D)の図表の変換バージョンである。培地M1の培地固有関係式136は、pH値と、前記培地上方の気相中のそれぞれのCO2濃度[％]との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式PPH(pH)=REL-M1(CO2)であり、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従って、気相中のCO2濃度は前記培地とpH-CO2平衡にある。
【０２１１】
1次曲線または多項式曲線を図5のプロットにフィットさせることによって経験的に導き出された式を用いると、前記培地上方のガス体積が前記培地とpH-CO2平衡状態にあり、特定のCO2濃度を有する場合に、予め規定された温度および予め規定された圧力で培地のpH値を予測することが可能になる。この予測は、関係式が経験的に得られた培地M1に固有のものである。
【０２１２】
「CO2」パラメーターとは、バイオリアクターの培地とpH-CO2平衡状態にある気相中で測定されたCO2濃度を入力するための前記式のインプットパラメーターである。
【０２１３】
「REL-M1」とは、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターa1、a2、b1、b2、b3のセットである。これらのパラメーターは、前記のように、細胞培養物を欠く培地M1の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料を予め規定された圧力および温度でpH-CO2平衡に到達させ、試料中の培地と接しているそれぞれのガス体積中の平衡CO2濃度を求め、図5に図示したプロットを作成するために、試料のそれぞれの平衡pH値に対して平衡CO2濃度測定値をプロットし、プロットされた値に曲線502をフィットさせ、フィットされた曲線からパラメーターa1、a2またはb1、b2、b3を導き出すことによって得られている。
【０２１４】
一部の態様によれば、式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)は、PPHM1(CO2)[％]=a1xCO2[％]+a2に従う1次方程式である。この場合、パラメーターa1およびa2は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。図示した例では、線形フィット(linear fit)から、以下の式:PPHM1(CO2)=-0,046xCO2[％]+7.45が得られる。この例では、a1=-0,046およびa2=7.45。
【０２１５】
他の態様によれば、式PPHM1(CO2)=REL-M1(CO2)は、PPHM1(CO2)=b1xCO2[％]2+b2xCO2[％]+b3に従う多項式である。
【０２１６】
多項式フィットを使用することには、線形フィットより精度が高いという利点があるが、培地固有関係式136と、CO2濃度、例えば、バイオリアクターのオフガス中で測定されたCO2濃度CO2R-M-tiのみをインプットとして用いることによって絶対pH値を計算するには、線形フィットで既に十分な精度がある。
【０２１７】
図6は、特定の細胞培養プロジェクトのために数日間にわたって特定の培地M1の中で細胞培養物を増殖させている間の、4つの異なるバイオリアクターI〜IVにおいて測定されたpH値の変動を示す。優先的に、それぞれのpH値は、前記培地のpH-CO2平衡にあるバイオリアクターの培地M1に沈められたpH測定装置、例えば、電位差pHメーターを用いて測定される。それぞれのバイオリアクターにおいて、接種の前後およびプロジェクト全体の間に、少なくとも現在のpH値および現在のオフガス中のCO2濃度が繰り返し測定される。
【０２１８】
例えば、プロジェクトは、約100x105細胞/ミリリットルの細胞密度に達するまで、最適な、または最適に近い細胞増殖条件下で、細胞培養培地M1の中でCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)を14日間にわたって増殖させることでもよい。
【０２１９】
図7は、pH値プロファイルを図6に示した4つのバイオリアクターそれぞれのオフガス中で測定されたCO2分率(「CO2濃度」)を示す。特定の時点で、特定のバイオリアクターについて測定されたpH値およびCO2オフガス濃度は互いに依存している。なぜなら、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従って、培地上方のガス体積中のCO2濃度がpH値に影響を及ぼすからである。さらに、細胞代謝が、(乳酸塩などの代謝産物の排出によって)pH値に影響を及ぼし、(基質の好気性分解によって)気相中のCO2濃度に影響を及ぼす可能性がある。
【０２２０】
バイオリアクターの1つ、例えば、参照バイオリアクター102の中で細胞を増殖させている間に、参照バイオリアクター102における現在のpH値および現在のCO2オフガス濃度は繰り返し求められてもよく、少なくとも前記2つのインプットパラメーター値から誘導パラメーター値が計算され、参照バイオリアクター内にある細胞培養物の現在の状況を示すパラメーターとして用いられる。前記誘導パラメーター値のプロファイルが作成される。プロファイルとは、時間に対する前記パラメーター値の変動を表現したものである。
【０２２１】
図8aは、参照バイオリアクター102の参照状態プロファイル402、第1のモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104の状態プロファイル802、ならびに第1のモニタリング/および制御されているバイオリアクター106のさらなる状態プロファイル804を示した図表である。それぞれの状態プロファイルは、バイオリアクターおよびその細胞培養物の状態を示し、特定の時間tiでの状態が、少なくとも、バイオリアクターの現在測定されているpH値とオフガス中の現在測定されているCO2濃度とから導き出されるものとして計算される。バイオリアクターR、B1、およびB2は全て同じ培地M1を含み、同じ温度および圧力で操作され、時間t0で、それぞれのガス体積とpH-平衡に到達する。時間t0は、それぞれのバイオリアクターに細胞培養物を接種する直前の時点を表す。
【０２２２】
時間t0では、「第2のバイオリアクター」とも呼ばれる参照バイオリアクターR、第1のバイオリアクターB1、および第3のバイオリアクターB2は、オフガス中のCO2濃度が同じになるように構成および操作される。それぞれのバイオリアクターRおよびB2のpHメーターは、時間t0で、ほぼ同じpH値を測定する可能性がある。しかしながら、バイオリアクターB1のpH測定装置が、t0で、参照バイオリアクターのpH測定装置によって測定されたものとは異なるpH値を測定する場合がある(示さず)。3つのバイオリアクターのpH測定装置は、それぞれのバイオリアクターの培地に沈められたオンラインpHメーターでもよい。この場合、比較ユニットは、第2の/参照バイオリアクターRのpHメーターと第1のバイオリアクターB2のpHメーター間の較正差が無いが、参照バイオリアクターRのpHメーターとバイオリアクターB1のpHメーターの間の較正ずれが存在すると判定する可能性がある。
【０２２３】
図示した例では、時間t0での、モニタリングされているバイオリアクター106(「B2」)の状態プロファイル804のプロファイル値は、時間t0での参照プロファイル402の参照値と同一である。時間t0での、モニタリングされているバイオリアクター104(「B4」)のプロファイル802の値は、時間t0での参照プロファイル402の参照値と大きな差がある。
【０２２４】
または、プロファイル値の代わりに、図7に図示したように、2つのバイオリアクターのオフガスのCO2濃度を比較して、2つの比較されたバイオリアクターのpH測定装置が等しく較正されたかどうか判定することができる。2つのバイオリアクターは起動され、同じ圧力および温度で同じ無細胞培地が充填され、2つのバイオリアクターがpH-CO2平衡に到達した時に、2つのバイオリアクター内にある培地の現在のpH値および現在のCO2濃度が測定および比較される。2つのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度が同一であるが、pH値が同一でなければ、または2つのバイオリアクターのpH値が同一であるが、オフガス中のCO2濃度が同一でなければ、比較ユニットは、2つのバイオリアクターが異なって較正されたと判定する。
【０２２５】
誤って較正されたpH測定装置を用いると、pH値だけから導き出された細胞培養物プロファイル、または他のパラメーターに加えてpH値から導き出された細胞培養物プロファイルに基づいて2つの細胞培養物の細胞培養状態を比較した時に不正確な結果が得られる可能性がある。結果として、状態差を最小化するために制御器がとる措置はどれも失敗する可能性がある(この作用は図8aおよび図8bに示されなかった。なぜなら、バイオリアクターB2内での細胞培養物の増殖中に、塩基の添加および全ガス流入速度の上昇によってpH-CO2平衡が変わったからである。従って、B2のプロファイルは参照プロファイルと大きな差があるが、参照バイオリアクターおよびバイオリアクターB2のpHメーターは同じように較正された)。
【０２２６】
誤って較正されたpHメーターを用いると、それぞれのバイオリアクターのpH値または前記pH値から導き出されるものである他の任意のモニタリングパラメーターもしくは制御パラメーターに基づいて2つの細胞培養物の細胞培養状態を比較した時に不正確な結果が得られる可能性がある。結果として、pH差を最小化するために制御器がとる措置はどれも失敗する可能性があるか、または2つの比較されたバイオリアクターのさらに大きな状態ずれをもたらす可能性がある(この作用は図8aおよび図8bに示されなかった。なぜなら、バイオリアクターB2内での細胞培養物の増殖中に、塩基の添加および全ガス流入速度の上昇によってpH-CO2平衡が変わったからである。従って、B2の細胞培養物状態プロファイルは参照状態プロファイルと大きな差があるが、参照バイオリアクターおよびバイオリアクターB2のpHメーターは同じように較正された)。
【０２２７】
例えば、細胞培養物を接種する前および細胞培養物を接種した後のバイオリアクターの状態プロファイルはPACOプロファイルとして計算されてもよい。PACO値PACOB1-ti、PACOB2-tiは、CO2オフガス速度予測値ACOB1-EXP-ti、ACOB2-EXP-tiからの、バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度ACOB1-M-ti、ACOB2-M-tiのずれを示す。CO2オフガス速度予測値とは、細胞培養物の非存在下での、かつ平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクターにおいてCO2オフガス速度を測定した時のバイオリアクター104、106のpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の前記培地のオフガス速度である。PACO値は、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する。PACO値PACOB1-ti、PACOB2-tiの算出では、インプットとして、
○受信した現在のCO2オフガス速度ACOB1-M-ti、ACOB2-M-ti;
○受信した現在のpH値pHB1-ti、pHB2-ti;
○現在のCO2-オフガス速度を受信した時間tiでのバイオリアクターの全ガス流入速度TGIB1、TGIB2;および
○培地固有関係式136
を使用する。
【０２２８】
現在の時間におけるモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターのPACO値の算出は、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの受信した現在のCO2オフガス速度およびpH値のそれぞれについて、
- FCO2B1-EXP-ti=REL-M1(pHB1-ti)に従ってバイオリアクター104の現在のアウトガス体積のCO2オフガス分率予想値FCO2B1-EXP-tiを算出する工程であって、式中、FCO2B1-EXP-tiは、現在の時間tiでの、％の単位のバイオリアクター104の総オフガス体積(TGOB1)に対するCO2オフガス分率予測値であり、予測が、受信した現在のpH値pHB1-tiをREL-M1(pHB1-ti)のインプットとして用いることによって計算され、REL-M1は、プロット、例えば、図4Dに図示したプロットを経験的にフィッティングすることによって導き出された培地M1の培地固有関係式であり、パラメーターpHB1-tiは、時間tiでのバイオリアクター104、106の培地における受信した現在のpH値であり、従って、バイオリアクターの培地が細胞培養物を欠き、かつ培地固有関係式のインプットとして用いられたpH値を有し、かつ前記培地上方のバイオリアクター中の気相とpH-CO2平衡状態にあり、従って、前記バイオリアクターの総オフガス体積とも平衡にあると仮定して、バイオリアクターにおけるCO2オフガス分率予想値が算出される、工程;
-
2018534560.tif 000013
に従ってCO2オフガス速度予想値ACOB1-EXP-ti[mol/min]を算出する工程であって、式中、ACOB1-EXP-ti値は、バイオリアクターの培地が、現在測定されているpH値を有し、かつ前記培地上方の気相とpH-CO2平衡にある時の、バイオリアクター(104)のCO2オフガス速度予想値であり、TGIB1は、現在の時間(ti)でのバイオリアクター104のガス流入の総量であり、バイオリアクターのガス流入の総量がガス流出の総量とほぼ同一である、工程;
- PACOB1-ti=ACOB1-EXP-ti-ACOB1-M-tiに従ってPACOB1-ti値を算出する工程であって、式中、ACOB1-M-tiは、バイオリアクター104において時間tiで測定されたCO2オフガス速度である、工程
を含む。
【０２２９】
参照バイオリアクター102の参照PACOB1-ti値は、PACOR-ti=ACOR-EXP-ti-ACOR-M-tiに従って算出することができる。式中、ACOR-M-tiは、バイオリアクター102において時間tiで測定されたCO2オフガス速度である。
【０２３０】
一部の態様によれば、参照バイオリアクター102内にある、対応する細胞培養状態と比較して、バイオリアクター104内にある細胞培養物の状態ずれを特定するために、細胞培養物を接種した後に、上記で述べたPACO値の比較が繰り返し行われる。
【０２３１】
「PACO値」値はデータ値である。「FCO2値」はデータ値である。「ACO値」はデータ値である。「FCO2」または「CO2[％]」は「CO2濃度」とも呼ばれ、ガス体積中の、例えば、バイオリアクターのオフガス中の「CO2ガス分率」である。
【０２３２】
「プロファイル」とは、ある期間にわたるパラメーター値の変動を示す一組のデータ値または数学的関係である。このパラメーター値は、例えば、バイオリアクターから得られた、PACO値、オフガス中のCO2濃度(「FCO2」)、CO2オフガス速度(「ACO値」)、またはpH値でもよい。
【０２３３】
図8bは、2つのバイオリアクター104、106の細胞培養状態プロファイル802、804と、参照バイオリアクター102の参照プロファイル402とのプロファイル差を示した図表である。曲線810は、バイオリアクター104と参照バイオリアクターのプロファイル差を表し、曲線808は、バイオリアクター106と参照バイオリアクターのプロファイル差を表す。バイオリアクター106と参照プロファイル402とのプロファイル差はバイオリアクター104の差よりかなり大きい。なぜなら、B2中での細胞培養物の増殖中にpH-CO2平衡が変わったからである。PACOプロファイルと参照PACOプロファイルを比較すると、2つの比較されたバイオリアクターにおける細胞培養状態のずれを特定し、プロファイル差を最小にするために適切な措置を自動的に、半自動的に、または手動でとることが可能になる。pH測定装置間の較正差は、かなり大きな制御パラメータープロファイル差、例えば、かなり大きなPACOプロファイル差の原因となる場合があることが観察されている。従って、バイオリアクター初期化段階において本発明の態様に従う較正方法を使用すると、もっと後の時点でバイオリアクターおよび細胞培養状態を比較するおよび一致させる精度が大幅に上がる可能性がある。
【０２３４】
図9は、サンプリングプロセスがpH測定値に影響を及ぼすことを示した2つの箱型箱髭図を図示する。
【０２３５】
第1の細胞培養プロジェクトP1を実行している間に、細胞培養物を含むバイオリアクターの培地のpH値を、バイオリアクター内部pHメーターを用いて繰り返し測定した。複数の時点t1、t2、…、tnでバイオリアクター内部pHメーターによって測定したpH値と、前記の各時点t1、…、tnで抜き取った培地試料中で第2のバイオリアクター外部pHメーターによって測定したpH値を比較した。従って、プロジェクトP1の箱型箱髭図で表したデータ値はそれぞれ、それぞれの時間t1、…、tnでの、バイオリアクター内部pHメーターによって測定したpH値と、バイオリアクター外部pHメーターによって測定したpH値の差を表している。従って、プロジェクトP1の箱型箱髭図は、サンプリングプロセスによって発生したpH差(「pHオフセット作用」)のばらつきおよび分布を図示している。全測定についてpH測定温度が一定になることを確かなものにするために、試料を32℃で調合(temper)した。
【０２３６】
プロジェクトP1のバイオリアクター内部pHメーターを、最先端の方法に従って、すなわち、バイオリアクターからバイオリアクター内部pHメーターを取り出し、バイオリアクターの外側で、pHが既知の基準溶液を用いてpHメーターを較正し、較正されたpHメーターをバイオリアクターに再導入し、バイオリアクターをオートクレーブすることによって較正した。
【０２３７】
さらに、プロジェクトP1では、バイオリアクター内部pHメーターによって測定したpH値を、バイオリアクターの培地の試料中でバイオリアクター外部pHメーターによって測定したpH値と繰り返し比較した。比較によって、2つの比較されたpH値間の差(すなわち、「オフセット」)が所与の閾値より大きいことが明らかになった場合、バイオリアクター内部pHメーターを再較正した。接種前には、どんなオフセットでもバイオリアクター内部pHメーターの再較正を行った(「フォーカス較正(focus calibration)」)。プロジェクトP1のpHオフセットの平均は約「-0.01」であり、従って、0に極めて近い。このことは、バイオリアクター外部pHメーターによって得たpH測定値がバイオリアクター内部pHメーターを較正するための基準として用いられ、それによって、オフセット作用が大きく均一化(level out)されたので驚くべきことではない。しかしながら、この較正アプローチの欠点は、バイオリアクター内にある培地の「真の」絶対pH値とオフセット作用の強さが依然として分かっていないことである。ばらつきは非常に大きく、+/-0.05pH内にあるのは全データポイントの50％しかなく、これに対して、全てのオフセットの25％超が0.07pHスケール単位より大きい。
【０２３８】
(バイオリアクター内部pHメーターおよびバイオリアクター外部pHメーターによって行った)オンラインpH測定値とオフラインpH測定値が一致しないことは、例えば、Heather Evans et al.:「Dealing with Disparity in On-line and Off-line pH Measurements Genentech found pH drift in its on-line measurements for a cell culture process, and continues to investigate its cause」によって、プロジェクトP1について述べたのと同様のpH測定試験およびpHメーター較正試験を行った時にも観察および確認された。Heather Evansらは、+/-0.10pH単位の範囲内にpHを制御できることは、生産性と製品品質の両方の点で一貫した、かつ頑強なプロセス性能を確かなものにするのに重要だと考えた。
【０２３９】
プロジェクトP1について述べたように、第2のプロジェクトP2の箱型箱髭図を得た。しかしながら、最先端のアプローチに従ってバイオリアクター内部pHメーターを較正する代わりに、本発明の態様に従って、バイオリアクターのオフガス中のCO2濃度測定値をインプットとして選ぶことによって使用培地ならびに現在の温度および圧力について算出された、算出されたCO2オフガス速度予想値を用いてバイオリアクター内部pHメーターを較正する。従って、本発明の態様について述べたようにpH値とCO2オフガス速度との培地固有関係式を用いて、バイオリアクター内部pHメーターの較正を繰り返し(培地を充填し、pH-CO2平衡を確立した後であり、細胞代謝産物が平衡を変えるので細胞培養物を接種する前に)行った。
【０２４０】
観察されたバイオリアクター外部pHメーターとバイオリアクター内部pHメーターの間のpHオフセットの平均は約+0.11である。このことから、オフセット作用の強さは0.1pH単位より大きいことが明らかになった。P1と同様に、試料を32℃で採取した。使用したpHメーターはガラス電極であった。P1およびP2でのサンプリング手順およびオフラインpH測定方法は同じなので、オフラインpH測定のばらつきは比較可能なままである。
【０２４１】
概して言うと、図9では、プロジェクトP1、P2について2つの箱型箱髭図を作成するために1070個のデータ値を入手した(P1:N=607およびP2:N=463)。両プロジェクトとも、バイオリアクター内部pHメーターおよびバイオリアクター外部pHメーターとしてガラス電極を、規定された温度で使用した。
【０２４２】
2つのプロットから推測できるように、プロジェクトP1、P2において確かめられたpHオフセットのばらつきは似ている。これらのpH値オフセットは、どちらの場合でもサンプリングプロセスによって引き起こされる。
【０２４３】
しかしながら、図9からも推測できるように、プロジェクトP1のpHオフセットの平均は、プロジェクトP2について得られたオフセットの平均と、ほぼ0,1スケール単位分だけ異なる。この「pHオフセット平均の差」は、プロジェクトP1およびP2においてバイオリアクター内部pHメーターを較正するために用いられた異なる方法によって引き起こされる。平均pH値の差はまた、サンプリング方法を変えることでも、例えば、試料を採取する時間と、試料中でのpH測定を実際に行う時間の間を延ばすことによっても引き起こされるだろう。
【０２４４】
図9から推測できるように、オフラインpH測定はpHばらつきの根本原因だと考えることができる。平均オフセットの変化は、サンプリングによって加えられる一般的なオフセット、試料保持時間、温度低下、サンプリング中およびオフライン測定中の二酸化炭素脱ガス、ならびに使用したオフライン測定方法の固有のオフセットが原因である。血液ガス分析器データ(示さず)は異なるオフセットを与える。他のオフラインpH測定方法(示さず)は異なるオフセットを再度与える。
【０２４５】
符番の説明
100  バイオリアクター内の細胞培養物状態をモニタリングおよび/または制御するためのシステム
102  第1の(「参照」)バイオリアクター
104  第2のバイオリアクターB1
106  さらなるバイオリアクターB2
108  pH測定装置
110  プロセッサ
112  メモリ
114  記憶媒体
120  1つまたは複数の培地固有関係式を受信するためのインターフェイス
122  CO2オフガス分析器
124  CO2オフガス分析器
126  CO2オフガス分析器
128  2つ以上のバイオリアクターから測定パラメーターを受信するためのインターフェイス
130  比較ユニット
132  制御ユニット
134  ディスプレイ
136  M1の培地固有関係式
138  M2の培地固有関係式
140  全ガス流入量用のセンサー
142  pH測定装置
144  全ガス流入量用のセンサー
146  pH測定装置
202〜206  工程
402  参照バイオリアクター102の状態プロファイル
502  4つのバイオリアクターについてプロットされた培地固有関係式
802  バイオリアクターの状態プロファイル
804  バイオリアクターの状態プロファイル
808  参照プロファイルとの状態プロファイル差
810  参照プロファイルとの状態プロファイル差
M1  細胞培養培地
TGIB1  バイオリアクターB1への全ガス流入量
TGIB2  バイオリアクターB2への全ガス流入量
TGIR  参照バイオリアクターへの全ガス流入量
TGOB1  バイオリアクターB1の総オフガス
TGOB2  バイオリアクターB2の総オフガス
TGOR  参照バイオリアクターの総オフガス
TLIB1  バイオリアクターB1への総液体流入量
TLIB2  バイオリアクターB2への総液体流入量
TLIR  参照バイオリアクターへの総液体流入量
TLOB1  バイオリアクターB1の総(液体)流出量
TLOB2  バイオリアクターB2の総(液体)流出量
TLOR  参照バイオリアクターの総(液体)流出量
【図１】
2018534560.tif 000015
【図２】
2018534560.tif 000016
【図３】
2018534560.tif 000017
【図４】
2018534560.tif 000018
【図５】
2018534560.tif 000019
【図６】
2018534560.tif 000020
【図７】
2018534560.tif 000021
【図８】
2018534560.tif 000022
【図９】
2018534560.tif 000023
【国際調査報告】
2018534560.tif 000024
2018534560.tif 000025
2018534560.tif 000026