(57)【要約】  本発明では、ＨＰＰＤポリペプチドおよび様々な化学分類に属する１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する完全耐性を示すＨＰＰＤポリペプチドを含む植物を記載する。１組の変異ＨＰＰＤポリペプチドは、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する親和性を有しないかまたは著しく低い親和性しか有しない、同時に、変異ＨＰＰＤポリペプチドのＨＰＰＤ阻害剤の解離速度は、ＨＰＰＤ阻害剤がもはや遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用しないが、この代わりに、完全に可逆的な阻害剤になる程度まで増大する。具体的には、様々な化学品分類に属するＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を付与する変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。加えて、該ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリンを含んでなるアミノ酸配列からなる４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）ポリペプチドをコードする組換え核酸分子であって、前記ＨＰＰＤポリペプチドが１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記コードされたＨＰＰＤポリペプチドが、
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２０４に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３１０に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン；および／または
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン；および／または
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３３１に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または
ｘｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３９に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン；および／または
ｘｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン；および／または
ｘｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン；および／または
ｘｉｖ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記ＨＰＰＤタンパク質が１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記コードされたＨＰＰＤタンパク質が、
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン；および／または
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記ＨＰＰＤタンパク質が１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記コードされたＨＰＰＤタンパク質が、
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてリジン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン；および／または 
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記ＨＰＰＤタンパク質が１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記コードされたＨＰＰＤタンパク質が、配列番号１に示されたアミノ酸配列と少なくとも５３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１、２、３、または４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、植物内で発現するように設計された合成配列である、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を誘導可能なプロモーターに操作可能に連結している、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、ピラゾロン類からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドからなる群から選択される、請求項８に記載の組換え核酸分子。
【請求項１０】
請求項１、２、３または４に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１１】
細菌宿主細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
植物細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１、２、３または４に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物。
【請求項１４】
前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群より選択される、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
請求項１、２、３または４に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック種子。
【請求項１６】
ＨＰＰＤポリペプチドを含んでなる組換えポリペプチドであって、前記ＨＰＰＤポリペプチドが１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記ＨＰＰＤポリペプチドが（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリンを含んでなる、組換えポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＰＰＤタンパク質が、
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２０４に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３１０に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン；および／または
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン；および／または
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３３１に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または
ｘｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３９に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン；および／または
ｘｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン；および／または
ｘｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン；および／または
ｘｉｖ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
をさらに含んでなり、前記ＨＰＰＤポリペプチドが１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＰＰＤタンパク質が、
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン；および／または
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または 
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなり、前記ＨＰＰＤポリペプチドが１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＰＰＤタンパク質が： 
ｉ．配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置においてリジン；および／または
ｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６４に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン；および／または
ｉｖ．配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸；および／または
ｖ．配列番号１のアミノ酸位置３１５に対応するアミノ酸位置においてアルギニン；および／または
ｖｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３０に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン；および／または 
ｖｉｉ．配列番号１のアミノ酸位置３３８に対応するアミノ酸位置においてバリン；および／または
ｖｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
ｉｘ．配列番号１のアミノ酸位置３４４に対応するアミノ酸位置においてグルタミン；および／または
ｘ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなり、前記ＨＰＰＤポリペプチドが１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】
ＨＰＰＤタンパク質が１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記ＨＰＰＤタンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置２６８に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン、配列番号１のアミノ酸位置２７０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリン、配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてバリン、および配列番号１のアミノ酸位置３４５に対応するアミノ酸位置においてバリンを含んでなる、前記ＨＰＰＤを含んでなる組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＨＰＰＤタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５３％の配列同一性を有する、請求項１６〜２０のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項１６〜２０のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドからなる群から選択される、請求項２２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性活性を有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸分子を発現する条件下で、請求項１０に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２５】
そのゲノム内に安定に組み込まれたＤＮＡコンストラクトを有し、前記コンストラクトが請求項１、２、３、４、または５のいずれかに記載の核酸に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、植物。
【請求項２６】
前記植物が、植物細胞、植物組織、および植物種子からなる群から選択される、請求項２５に記載の植物。
【請求項２７】
前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群から選択される、請求項２５に記載の植物。
【請求項２８】
そのゲノム内に安定に組み込まれたＤＮＡコンストラクトを有し、前記コンストラクトが請求項１、２、３、４、または５のいずれかに記載の核酸に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、請求項２５に記載の植物のトランスジェニック種子。
【請求項２９】
請求項２５に記載の植物またはその種子を圃場に植え付けること、および前記圃場に有効濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤を施用することを含む、圃場の雑草の防除方法。
【請求項３０】
前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を植物に付与するための、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項３３】
請求項１〜４のいずれかの核酸分子、または請求項１６〜２０のいずれかに記載のタンパク質を含んでなる、商品生産物であって、前記生産物が、完全または加工した種子または穀物、動物飼料、コーンミールまたはダイズミール、トウモロコシ粉またはダイズ粉、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、および、調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイル穀物からなる群から選択される、前記生産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子生物学、具体的には、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性が改善された新規ＨＰＰＤポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）は、チロシン分解産物であるパラヒドロキシフェニルピルビン酸（本明細書ではＨＰＰと略称される）を、植物におけるトコフェロールおよびプラストキノンの前駆体であるホモゲンチジン酸（本明細書ではＨＧＡと略す）へと転換する反応を触媒する酵素である（Crouch N.P. et al. (1997), Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134:1388-1400）。トコフェロールは、膜関連の抗酸化剤として作用する。プラストキノンは、最初にＰＳＩＩとチトクロムｂ６／ｆ複合体との間で電子伝達体として作用し、次にカロテノイドの生合成に関わるフィトエンデサチュラーゼに対する酸化還元補因子となる。
【０００３】
現在までに、ＮＣＢＩデータベースに収載される様々な生物由来の１０００を超える核酸配列が、ＨＰＰＤドメインを有する推定上のタンパク質をコードするものとして注釈が付けられてきた。しかしながらその多くは、インビトロアッセイでも植物体への応用においてもタンパク質がＨＰＰＤ酵素活性を有することは証明されておらず、また、このようなＨＰＰＤタンパク質を植物に発現させた際に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を獲得することも証明されていない。いくつかのＨＰＰＤタンパク質およびその一次配列は、最新技術に記載されており、具体的には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Rueetschi et al.、Eur. J. Biochem.、205、459-466、1992、国際公開第９６／３８５６７）、コルジア（Ｋｏｒｄｉａ）（国際公開第２０１１／０７６８８９号）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）（国際公開第２０１１／０７６８７７号）、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびムシラジニバクター（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ）（国際公開第２０１５／０２２６３４号）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（国際公開第２０１１／０７６８９２号）などの細菌、ブレファリスマ（Ｂｌｅｐｈａｒｉｓｍａ）（国際公開第２０１１／０７６８８２号）などの原生生物、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）（国際公開第２０１１／０７６８８５号）などのユリ古細菌門、クラミドモナス・レインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（スペイン特許第２２７５３６５号；国際公開第２０１１／１４５０１５号）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）（国際公開第２０１５／０２２６３４号）などの藻類、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（国際公開第９６／３８５６７号、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＦ０４７８３４）、ニンジン（国際公開第９６／３８５６７号、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）８７２５７）、アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）（国際公開第２００２／０４６３８７号、国際公開第２０１１／０６８５６７号）、コムギ（国際公開第２００２／０４６３８７号）、ブラキアリア・プラティフィラ（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、センクルス・エキナツス（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ  ｅｃｈｉｎａｔｕｓ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、ロリウム・リジダム（Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、フェスツカ・アルンディナケア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、セタリア・ファーベリ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｆａｂｅｒｉ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、エレウシネ・インデイカ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）（国際公開第２００２／０４６３８７号）、モロコシ（国際公開第２００２／０４６３８７号、国際公開第２０１２／０２１７８５号）、ｃｏｒｎ（国際公開第２０１２／０２１７８５号）、コプティス・ジャポニカ（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（国際公開第２００６／１３２２７０号）、レムナ（Ｌｅｍｎａ）（国際公開第２０１５／０２２６３４号）などの植物、またはマウスもし��はブタなどの哺乳類、またはコクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＣＯＩＴＲＰ）などの真菌のＨＰＰＤタンパク質である。
【０００４】
ＨＰＰＤの阻害によって光合成の脱共役および補助集光性色素の欠乏が誘導され、かつ最も重要なことには、通常はカロテノイドの作用である光防護が欠如するために、ＵＶ照射および活性酸素種によって葉緑素が破壊される（白化）（Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149）。光合成の活発な組織での白化は、成長の阻害および植物の死をもたらす。
【０００５】
酵素に特異的に結合して、ＨＰＰＤを阻害し（以後、ＨＰＰＤ阻害型除草剤と呼ぶ）、かつ、ＨＰＰのＨＧＡへの形質転換を阻害するいくつかの分子が、非常に有効な除草剤であることが証明されてきた。
【０００６】
現在最も多く市販されているＨＰＰＤ阻害型除草剤は、以下に一覧にして示すこれらの化学族のうちの一つに属する：
１）トリケトン類、例えば、ベンゾビシクロン［３−［２−クロロ−４−メチルスルホニル）ベンゾイル］−４−（フェニルスルファニル）ビシクロ［３．２．１」オクタ−３−エン−２−オン］；スルコトリオン［すなわち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［すなわち、２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］（本明細書ではＭＳＴと略す）；テンボトリオン［すなわち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２，−トリフルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］；テフリルトリオン［すなわち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［［（テトラヒドロ−２−フラニル）メトキシ］メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］］；ビシクロピロン［すなわち、４−ヒドロキシ−３−［［２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジニル］カルボニル］ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］；フェンキノトリオン［すなわち、２−［［８−クロロ−３，４−ジヒドロ−４−（４−メトキシフェニル）−３−オキソ−２−２−キノキサリニル］カルボニル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、および国際公開第２００７／０８８８７６号、国際公開第２００９／０１６８４１号、国際公開第２０１０／０８９９９３号、国際公開第２０１０／１１６１２２号、国際公開第２０１２／００２０９６号、国際公開第２０１１／３１６５８号、国際公開第２０１２／１３６７０３号、特開２０１３−０４０１４１号公報、国際公開第２０１３／０８０４８４号、国際公開第２０１４／０１４９０４号、国際公開第２０１４／０３１９７１号、米国特許出願公開第２０１４／０１０６９６８号に記載のもの；
２）ジケトニトリル類、例えば、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；
３）イソキサゾール類、例えば、イソキサフルトール［すなわち、（５−シクロプロピル−４−イソオキサゾリル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］。植物では、イソキサフルトール（本明細書中、ＩＦＴと略す）は、ＨＰＰＤ阻害剤特性を示すジケトニトリル化合物であるＤＫＮに急速に代謝される；
４）ヒドロキシピラゾール類、例えば、ピラゾキシフェン［すなわち、２−［［４−２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］オキシ］−１−フェニルエタノン］；ベンゾフェナップ［すなわち、２−［［４−（２，４−ジクロロ−３−メチルベンゾイル）−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］オキシ］−１−（４−メチルフェニル）エタノン］；ピラゾリネート［すなわち、（２，４−ジクロロフェニル）［１，３−ジメチル−５−［［（４−メチルフェニル）スルホニル］オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］メタノン］；ピラスルホトール［すなわち、（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］；トプラメゾン［すなわち、［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソオキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］；トルピラレート［すなわち、１−［［１−エチル−４−［３−（２−メトキシエトキシ）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］オキシ］エチルメチルカルボネート］；
５）国際公開第２０１１／０３５８７４号、および国際公開第２０１２／１２３４１６号、国際公開第２０１２／１２３４０９号、欧州特許出願公開第２５６２１７４号、国際公開第２０１３／０６４４５９号、国際公開第２０１３／０８７５７７号、国際公開第２０１３／１２４２３８号、国際公開第２０１３／１２４２２８号、国際公開第２０１３／１６４３３３号、国際公開第２０１３／０３７３４２号、国際公開第２０１４／０５３４７３号、国際公開第２０１４／０８６７３７号、国際公開第２０１５／００７６６２号、国際公開第２０１５／００７６３２号、国際公開第２０１５／００７６３３号に記載の、および国際公開第２０１３／０７２３００号、国際公開第２０１３／０７２４０２号、国際公開第２０１３／０７２４５０号、国際公開第２０１４／１８４０１４号、国際公開第２０１４／１８４０１９号、国際公開第２０１４／１８４０５８号、国際公開第２０１４／１９２９３６号、国際公開第２０１５／０５２１５２号、国際公開第２０１５／０５２１７８に記載のＮ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、および国際公開第２０１２／１２６９３２号、および欧州特許出願公開第２５６２１７４号、国際公開第２０１３／０６４４５９号、国際公開第２０１３／０８７５７７号、国際公開第２０１３／１２４２３８号、国際公開第２０１３／１２４２２８号、国際公開第２０１３／１２４２４５号、国際公開第２０１３／１６４３３３号、国際公開第２０１３／０３７３４２号、国際公開第２０１４／１０５３４７３号、国際公開第２０１４／０８６７３７号、国際公開第２０１５／００７６６２号、国際公開第２０１５／００７６３２号、国際公開第２０１５／００７６３３号に記載のＮ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類；例えば、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）；２−クロロ−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（エチルスルホニル）−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド；
６）国際公開第２０１２／０２８５７９、および国際公開第２０１２／１２３４０９号、国際公開第２０１３／０１７５５９号、欧州特許出願公開第２５６２１７４号、国際公開第２０１３／０６４４５９号、国際公開第２０１３／０６４４５７号、国際公開第２０１３／０８７５７７号、国際公開第２０１３／１０４７０５号、国際公開第２０１３／１２４２３８号、国際公開第２０１３／１２４２２８号、国際公開第２０１３／１２４２４５号、国際公開第２０１３／１６４３３１号、国際公開第２０１３／１６４３３３号、国際公開第２０１３／１７４８４３号、国際公開第２０１３／０３７３４２号、国際公開第２０１４／０５３４７３号、国際公開第２０１４／０８６７３７号、国際公開第２０１５／００７６６２号、国際公開第２０１５／００７６３２号、国際公開第２０１５／００７６３３号に記載のＮ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類；例えば、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、および国際公開第２０１３／０７２５２８号、国際公開第２０１３／０７６３１５号、国際公開第２０１３／０７６３１６号、国際公開第２０１３／０８３８５９号、国際公開第２０１３／０９２８３４号、国際公開第２０１３／１３９７６０号、国際公開第２０１３／１４４２３１号、国際公開第２０１４／１２６０７０号、国際公開第２０１４／１３５６５４号、国際公開第２０１４／１８４０１５号、国際公開第２０１４／１８４０１６号、国際公開第２０１４／１８４０１７号、国際公開第２０１４／１８４０７３号、国際公開第２０１４／１８４０７４号、国際公開第２０１４／１９２９３６号、国際公開第２０１５／０２２２８４号、国際公開第２０１５／０５２１５３号、国際公開第２０１５／０５２１７３号に記載のもの；
７）国際公開第２０１３／０５０４２１  および国際公開第２０１３／０８３７７４号、国際公開第２０１４／１５４８２８号、国際公開第２０１４／１５４８８２号に記載のピリダジノン誘導体；
８）国際公開第２０１３／０５４４９５号に記載のオキソピラジン（oxoprazine）誘導体；
９）国際公開第２０１３／１４４２３４号、国際公開第２０１５／００７５６４号に記載のＮ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類；
１０）国際公開第２０１４／１５４８２９号に記載のトリアジノン類；ならびに
１１）欧州特許出願公開第２８８１３８７号および欧州特許出願公開第２８８１３８８号に記載のピラゾロン類。
【０００７】
これらのＨＰＰＤ阻害型除草剤は、それらが迅速に分解されるトウモロコシ（ズィー・メイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  Ｓａｔｉｖａ））、およびコムギ（トリチカム・アエスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））など代謝耐性を示す作物の圃場における牧草および／または広葉雑草に対して使用することができる（Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133-142）。これらＨＰＰＤ阻害型除草剤の使用範囲を拡大するため、植物、特に代謝耐性をもたないかまたは代謝耐性の低い植物に対して、農業用現地条件下で許容されるレベルの耐性を付与する幾つかの試みが為されてきた。
【０００８】
ＨＰＰＤを介したホモゲンチジン酸の産生を回避する試みに加え（米国特許第６，８１２，０１０号）、除草剤に関して十分な量の植物内の標的酵素が産生されるように、感受性の酵素を過剰発現することも行われてきた（国際公開第９６／３８５６７号）。ＨＰＰＤポリペプチドを過剰発現することで、ＩＦＴのジケトニトリル誘導体（本明細書でＤＫＮと略す）に対するより良好な発芽前の耐性がもたらされたが、この耐性レベルは発芽後の処理に対する耐性として十分なものではなかった（Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61: 269-276）。
【０００９】
ＨＰＰのＨＧＡへの形質転換を触媒する特性は保持しているが、変異前の天然ＨＰＰＤポリペプチドよりもＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の低い標的酵素を得るために、３番目のストラテジーはＨＰＰＤポリペプチドを変異させることであった。
【００１０】
このストラテジーは、ジケトニトリルファミリーに属する二つのＨＰＰＤ阻害型除草剤（国際公開第９９／２４５８５号）である２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン（欧州特許第４９６６３０号）に対して耐性のある植物の産生に首尾良く応用された。Ｐｒｏ２１５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３３６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ３３６Ｉｌｅ、および特にＧｌｙ３３６Ｔｒｐ（変異アミノ酸の位置は、本発明の配列番号１に相当するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤポリペプチドを参照して示される）は、これらのジケトニトリル除草剤による処理に対する耐性が増大に寄与する変異として同定された。
【００１１】
かなり最近に、タバコおよびダイズの色素体ゲノムへのシュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤ遺伝子の導入は、ＩＦＴの発芽後の施用に対する耐性を付与する核形質転換よりも効果的であることを示した（Dufourmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5(1):118-3）。
【００１２】
国際公開第２００４／０２４９２８号では、発明者らが、これらの植物細胞内へのＨＰＰ前駆体の流量を増大させることにより、植物細胞におけるプレニルキノンの生合成（例えばプラストキノン類、トコフェロール類の合成）を増大させようとした。これは、プレフェナート脱水素酵素（ＰＤＨ）の過剰発現により、前記前駆体の合成を「シキミ酸」経路と結び付けることによって為された。彼らは、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子およびＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、前記植物のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性の増大を可能とすることにも注目した。
【００１３】
国際公開第２００９／１４４０７９号では、シュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤタンパク質の位置３３６における特異的変異を有するヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードする核酸配列、およびＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性がある植物を得るためのその使用について開示されている。
【００１４】
国際公開第２００２／０４６３８７号では、植物に由来するＨＰＰＤポリペプチドのいくつかのドメインは、様々なＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性の付与に関連し得ることが同定されたが、記載されたドメイン機能の影響を裏付ける植物体におけるデータも、生化学的データも示されていなかった。
【００１５】
国際公開第２００８／１５０４７３号では、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する改善された耐性を得るために、二つの異なる耐性機構−変異ＨＰＰＤ酵素をコードする改変アビーナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）遺伝子およびＣＹＰ４５０トウモロコシモノオキシゲナーゼ（ｎｓｆ１遺伝子）−の組み合わせが例示されていたが、両タンパク質の組み合わせに基づく相乗効果を示すデータは開示されていなかった。
【００１６】
さらに、例えば、アビーナ・サティバ（米国特許出願公開第２０１１／０１７３７１８号）またはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（国際公開第２０１３／０６４９６４号、国際公開第２０１４／１７７９９９号）からの耐性ＨＰＰＤをコードする遺伝子だけでなく、ＨＳＴ（ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ）タンパク質をコードするいくつかの植物遺伝子を組み合わせた過剰発現によるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性がある植物の産生方法について開示されている。しかしながら、いくつかの選択されたＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性レベルはどちらかといえば限られたものであった。
【００１７】
国際公開第２０１１／０９４１９９号および米国特許出願公開第２０１１／０１８５４４４号では、ＨＰＰＤ阻害剤ＩＦＴに対する数百のダイズ野生型株の耐性を評価した。わずかな数株が、除草剤に対する妥当なレベルの耐性を示した。耐性に関与する想定されるＱＴＬ（量的形質遺伝子座）が同定された。ゲノムのこの領域では、ＡＢＣ輸送体をコードする遺伝子が、観察されたＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する改良された耐性に寄与する主要な形質であるとして同定された。しかしながら、同定された遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、試験したＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性の改善を示さなかった。
【００１８】
国際公開第２０１０／０８５７０５号および米国特許出願公開第２０１４／００５３２９５号では、アビーナ・サティバＨＰＰＤポリペプチドのいくつかの変異体が開示された。いくつかの変異体（variants）は、トリケトンである「メソトリオン」に対するインビトロ耐性の改善を示したが、タバコ植物では非常にわずかな変異体しか発現されなかったことが分かった。加えて、これらの変異体を発現するタバコ植物のいずれも、野生型アビーナ・サティバＨＰＰＤ遺伝子を発現するタバコ植物に比較して、ＭＳＴまたはＩＦＴに対する耐性の改善を示さなかった。米国特許出願公開２０１４／００５３２９５号では、少数のアビーナ・サティバＨＰＰＤ変異体がダイズ植物で発現され、野生型アビーナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）ＨＰＰＤ遺伝子を発現する植物から知られているのと同様にＭＳＴに対する良好な耐性レベルを有した。しかしながら、テンボトリオンまたはＩＦＴなどの他の除草剤は、これらのダイズ植物においてずっと高い葉の損傷を引き起こした。
【００１９】
米国特許出願公開第２０１２／００４２４１３号は、ＨＰＰＤ活性を有するが、少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して特定の非感受性も示す変異トウモロコシＨＰＰＤポリペプチドについて記載しており、ＨＰＰＤポリペプチドの異なる位置における特定の組の変異を示唆し、最終的に、生化学データならびに少数のこのような変異ＨＰＰＤポリペプチドを含む植物の耐性レベルについて開示している。欧州特許第２４５３０１２号では、いくつかのＨＰＰＤポリペプチド変異体について記載されているが、記載された変異体の耐性改善は、植物体において、いくつかのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して示されなかった。
【００２０】
国際公開第２０１４／０４３４３５号には、配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン；または配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリンおよび配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてトリプトファン；または配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてセリン、配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応するアミノ酸位置においてセリン、配列番号１のアミノ酸位置３３９に対応するアミノ酸位置においてスレオニン、および配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン；または配列番号１のアミノ酸位置１８８に対応するアミノ酸位置においてトリプトファンおよび配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応するアミノ酸位置においてトリプトファン；または配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応するアミノ酸位置においてセリン、および配列番号１のアミノ酸位置３４０に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸；または配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応するアミノ酸位置においてトリプトファン、配列番号１のアミノ酸の位置３３９に対応するアミノ酸の位置においてアラニン、および配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミンを含んでなるアミノ酸配列からなるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）ＨＰＰＤポリペプチドをコードする組換え核酸分子について記載されている。
【００２１】
現在記載され、部分的に商業化されているＨＰＰＤ阻害型除草剤は、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用する（Morrison (1982) Trends Biochem. Sci. 7, 102-105参照）。これらの阻害剤は緩徐に結合する（すなわち、これらは遅い会合速度を有する、ｋｏｎ）が、ＨＰＰＤポリペプチドと共有結合せず（すなわち、これらは時間依存性阻害を起こす）、酵素とのその非常に強固な相互作用が理由で非常にゆっくりと遊離する（すなわち、これらは例外的に遅い解離速度を有する、ｋｏｆｆ）。
【００２２】
これらの阻害剤は非常に強固に結合するので、酵素を用いた化学量論的滴定が可能である。
【００２３】
遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤が桁外れに強力なＨＰＰＤ阻害剤であるだけでなく、加えて、これらを雑草防除用の魅力的な農薬にする特徴を有することを次第に認識された。理想的にＨＰＰＤポリペプチド活性部位当たり１つのみの阻害剤分子が該活性を完全に阻害し、植物細胞内に遊離阻害剤分子の非存在下でさえ長期間この阻害レベルを維持するのに十分である程度まで、遅い解離速度は阻害剤有効性を向上させる。これは、作物成長地区内の望ましくない雑草を防除するため、これらの阻害剤の低施用速度に変わる。
【００２４】
ＨＰＰＤ阻害および除草力の達成が目標である場合、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤の特性は有利である。しかしながらこれらの阻害剤に対するＨＰＰＤポリペプチド耐性が発明となる場合、これらの特性は主要なデメリットである。
【００２５】
阻害剤の結合およびＨＰＰＤポリペプチドの阻害がさらに起こることができるので、阻害剤の酵素に対する親和性（ｋｉ）を単独で低下させるＨＰＰＤポリペプチドの変異はＨＰＰＤ阻害を完全に克服せず、従って、阻害の達成レベルが植物細胞内の遊離阻害剤の非存在下でさえ長期間維持されるだろう。加えて、一部市販されているＨＰＰＤ阻害型除草剤は、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）、トリアジノン類、およびピラゾロン類などの構造的に多種多様な化学分類に属する。現在記載された最新技術のＨＰＰＤポリペプチドは、構造的に多種多様なＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性のむしろ狭い範囲を示す。
【００２６】
全ての現在記載され、一部市販のＨＰＰＤ阻害型除草剤の上記動的特性が理由で、今まで、これらを生成するための多くの努力にもかかわらず、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する完全耐性を有するＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性植物で発表されたものはない。
【発明の概要】
【００２７】
本発明では、ＨＰＰＤポリペプチドおよび様々な化学分類に属する１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する完全耐性を示すＨＰＰＤポリペプチドを含む植物を記載する。いくつかの分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する最大かつ広範な耐性を有するこのようなＨＰＰＤポリペプチドを生成するために、それぞれのＨＰＰＤ阻害型除草剤に関するＨＰＰＤポリペプチドとの親和性（ｋｉ）を低減し、かつ同時に、野生型およびいくつかの変異ＨＰＰＤポリペプチドが高レベルの阻害剤耐性を得ることから分かるように、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤の解離速度（ｋｏｆｆ）の向上を保証することは重要である。 
【００２８】
本発明では、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する親和性を有しないかまたは著しく低い親和性しか有しない、同時に、酵素のＨＰＰＤ阻害型除草剤の解離速度は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤がもはや遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用しないが、この代わりに、完全に可逆的な阻害剤になる程度まで増大する、１組のＨＰＰＤポリペプチドを開発することにより、この目的を達成した。
【００２９】
本発明では、前述の特徴（すなわち、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する親和性を有しないかまたは著しく低い親和性しか有しない、酵素のＨＰＰＤ阻害型除草剤の解離速度向上；ＨＰＰＤ阻害型除草剤がもはや遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用しないが、完全に可逆的な阻害剤になる）を有する新規な１組のＨＰＰＤポリペプチドを得る組成物および方法を提供する。組成物としては、ＨＰＰＤポリペプチドおよびこのようなＨＰＰＤポリペプチドをコードする単離した、組換えまたはキメラ核酸分子、これらの核酸分子を含んでなるベクターおよび宿主細胞が挙げられる。組成物としては、これらのポリペプチドに対する抗体も挙げられる。ヌクレオチド配列を、微生物および植物を含む生物の形質転換および発現のためのＤＮＡコンストラクトまたは発現カセットで使用することができる。ヌクレオチド配列は、これに限定されないが、微生物または植物を含む生物における発現のために設計された合成配列であってもよい。  
【００３０】
組成物としては、（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリン、ならびに、必要に応じて、配列番号３〜１０８のいずれかに記載のＨＰＰＤポリペプチドならびにそのフラグメントを含む配列番号１のアミノ酸位置２０４、２１３、２６４、２６８、２７０、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９、３４０、３４４、３４５に対応する位置において１つ以上のさらなるアミノ酸置換を有するＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸分子を含む、除草剤耐性ＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。
【００３１】
組成物は、本発明の核酸配列を植物、植物細胞、組織、および種子のゲノム内に導入することによる、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性がある形質転換植物、植物細胞、組織、および種子も含んでなる。配列の導入は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤を植物に施用して(to be applied)、ＨＰＰＤ阻害剤に感受性のある雑草または他の非形質転換植物を選択的に死滅するが、形質転換された生物を死滅しないことを可能とする。加えて、配列を、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在下で成長する植物細胞を選択するためのマーカーとしても使用することができる。
【００３２】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性活性を有するＨＰＰＤポリペプチドの同定方法をさらに提供する。
【００３３】
本発明の組成物および方法は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する増強された耐性を有する生物の産生に有用である。これらの生物および該生物を含んでなる組成物は、農業目的に望ましい。本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる植物または種子を、圃場で成長し、植物製品を得るため収穫することができる。本発明の組成物は、製品または生物中、ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチドまたは核酸の存在を検知するためにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】例示のＨＰＰＤポリペプチドの酵素活性を決定するために本発明で使用した結合ＨＰＰＤ活性アッセイの単純化した模式図を示す。
【図２】結合ＨＰＰＤ活性アッセイにおいて実施例３に従い２００μＭのＨＰＰおよび０、４または１３μＭの化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）を用いて観察された野生型およびノックアウトＨＰＰＤポリペプチドの生抽出サンプル中の３２０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ３２０）の例示の動態変化を示す。配列番号１のアミノ酸位置１６２に対応するアミノ酸位置においてヒスチジンをアラニンに交換することにより、ノックアウトＨＰＰＤポリペプチドを得た。ＨＰＰＤポリペプチドの活性部位における鉄原子の配位結合へのその関与が理由でこの位置の重要性は周知である（Serre et al. (1999), Structure, 7, 977-988）。
【図３】結合ＨＰＰＤ活性アッセイにおいて高基質濃度および０、４８、２４０または１２００μＭの化合物２（２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）で観察された実施例３に従い配列番号１７に相当する精製変異ＨＰＰＤポリペプチドの３２０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ３２０）の例示の動態変化を示す。見かけの速度定数（ｋａｐｐ）を、箱型時間枠（boxed timeframe）内の経時的なシグナル変化(singal change over time)（ΔＡｂｓ３２０／分）(delta_Abs320/min)として決定した。
【図４】競合阻害モデルに従ってフィッティングすることにより、異なる阻害剤および基質（ＨＰＰ）濃度を有する配列番号１７に相当する精製変異ＨＰＰＤポリペプチドを用いて例示のｋｉの決定から得られたデータを図示する：  ａ）実施例３に従った所与の基質濃度における０〜０．００１２Ｍの化合物２の存在下、３２０ｎｍにおける吸光度の経時的な動態変化（ΔＡｂｓ３２０／分）；  ｂ）実施例３に従った所与の基質濃度における０〜０．００１２Ｍの化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）の存在下、３２０ｎｍにおける吸光度の経時的な動態変化（ΔＡｂｓ３２０／分）；  ｃ）実施例３に従った所与の基質濃度における０〜０．００１２ＭのＭＳＴの存在下、３２０ｎｍにおける吸光度の経時的な動態変化（ΔＡｂｓ３２０／分）；  ｄ）実施例３に従った所与の基質濃度における０〜０．００１２ＭのＤＫＮの存在下、３２０ｎｍにおける吸光度の経時的な動態変化（ΔＡｂｓ３２０／分）。
【００３５】
図３および４中に、例えば、配列番号１７で示すように、表２、３、４、および５に纏めた全例示のＨＰＰＤポリペプチドを測定し、解析した。
【発明の具体的説明】
【００３６】
全てではないがいくつかの本発明の実施態様を示す添付の図面を参照して、以後、本発明をより完全に説明する。実際に、これらの発明は多くの異なる形態で具体化され得るものであり、本明細書に記載された実施態様に限定されると解釈するべきではなく；むしろこれらの実施態様は本開示が適応可能な法的要件を満たすように提供される。同様の数字は全体にわたって同様の要素を表す。
【００３７】
これらの発明に関係し、前述の記載および添付の図面中に示された教示の利益を享受する当業者は、本明細書に記載された本発明の多くの改変および他の実施態様を思いつくであろう。従って、本発明は開示された特定の実施態様に限定されるものではなく、改変および他の実施態様が添付のクレームの範囲内に包含されることを意図していることを理解するべきである。本明細書中、特定の用語を使用しているが、これらは限定する目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用されるものである。
【００３８】
概要
ＨＰＰＤを介したホモゲンチジン酸の産生を迂回すること（米国特許第６，８１２，０１０号）、除草剤に関して十分である量の植物内の標的酵素を産生するように、感受性のある酵素を過剰発現すること（国際公開第９６／３８５６７号）、およびＨＰＰのホモゲンチジン酸への転換を触媒するその特性は保持しながら、変異前の天然ＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の低い標的酵素を得るためにＨＰＰＤを変異させることを含む、広範囲のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する農学的に許容されるレベルの耐性を植物に付与するために、いくつかの試みが為されてきた。
【００３９】
上記いくつかのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を示す植物の開発のために得られたこれらの成功にもかかわらず、様々な化学分類に属するより新規またはいくつかの異なるＨＰＰＤ阻害型除草剤、具体的には、トリケトン類（例えば、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（例えば、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（例えば、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（例えば、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（例えば、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、トリケトン類、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類に属するＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する植物耐性を開発および／または改善する必要性がいまだにある。
【００４０】
従って、本発明は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を調節するための改善された組成物および方法を提供する。トリケトン類（例えば、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（例えば、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（例えば、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（例えば、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（例えば、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のものなどのＨＰＰＤ阻害型除草剤は、広範囲の経済的に重要な単子葉植物および双子葉植物の有毒な一年生植物に対する極めて優れた除草剤活性を有する。活性物質は、根茎からの新芽、貯蔵木材、または他の多年生器官を産生し、かつ、制御が困難である多年生有害植物に対しても効率的に作用する。本発明の意味の範囲内で、「除草剤」は、それ自体で除草剤として活性物質であるか、または、例えば、その活性を増強する薬剤（効力増強剤）またはその活性を制限する薬剤（緩和剤）など、その有効性を変化させる添加物と組み合わせた物質として理解される。除草剤は、固体もしくは液体アジュバントまたは製剤技術において通常用いられる担体（例えば、天然または再生鉱物性物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、乳化剤、成長促進剤等）、ならびに１つ以上のさらなる除草剤および／または１つ以上の農薬（例えば殺虫剤、抗ウイルス剤、殺微生物剤、抗アメーバ剤、農薬、抗真菌剤、殺菌剤、抗線虫剤、軟体動物駆除剤等）をさらに含んでもよい。
【００４１】
方法は、本発明のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を用いて生物を形質転換すること、さもなければ、このようなＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性遺伝子を、それを含まない生物に導入すること（例えば交配、細胞融合、または導入された本発明のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性遺伝子を含む生物を、それを含まない生物と交配して、このような遺伝子を含む子孫を得ることにより）を含む。本発明のヌクレオチド配列は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性向上、具体的には、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、またはフェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、またはトルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性向上を示す植物の製造に有用である。
【００４２】
本発明のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性遺伝子の発現は、「クマロン誘導体除草剤」に対しても耐性をもたらし得る（国際公開第２００９／０９０４０１号、国際公開第２００９／０９０４０２号、国際公開第２００８／０７１９１８号、国際公開第２００８／００９９０８号に記載されている）。これに関して、本発明のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性遺伝子のうちのいずれか１つを、国際公開第２０１１／１４５０１５号、国際公開第２０１３／０６４９８７号、国際公開第２０１３／０６４９６４号、または国際公開第２０１０／０２９３１１号に記載されているように、キメラホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ（ＨＳＴ）遺伝子または変異ＨＳＴ遺伝子も発現する植物中で、発現することもできる。本明細書で使用するとき、「クマロン誘導体除草剤」または「ＨＳＴ阻害除草剤」は、５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｂ］ピリジン−８−オール、５Ｈ−チオピラノ［３，４−ｂ］ピラジン−８−オール、オキサチイノ［５，６−ｂ］ピリジン−４−オール、およびオキサチイノ［５、６−ｂ］ピラジン−４−オールのＩＵＰＡＣ命名法に該当する化合物を包含する。
【００４３】
従って、本発明の「ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性」遺伝子は、該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を示す、もしくは該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも長時間特定の濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を示す能力を細胞もしくは生物に付与する、または光合成を行う、成長する、および／またはこのようなタンパク質を発現しない細胞もしくは生物より少ない観察された損傷または成長阻害で再生する能力を細胞もしくは生物に付与するポリペプチドをコードする遺伝子を表す。
【００４４】
「ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチド」は、該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を示す、もしくは該ポリペプチドを発現しない細胞もしくは生物よりも長時間特定の濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を示す能力を細胞もしくは生物に付与する、または光合成を行う、成長する、および／またはこのようなタンパク質を発現しない細胞もしくは生物より少ない観察された損傷または成長阻害で再生する能力を細胞もしくは生物に付与するポリペプチドを含んでなる。
【００４５】
「ポリペプチド」という語は、酵素、抗体および中鎖ポリペプチドおよび１０個未満のアミノ酸配列長まで減った短鎖ペプチドなどのタンパク質を含む。
【００４６】
「酵素」という語は、本発明において、パラヒドロキシフェニルピルビン酸をホモゲンチジン酸へ転換する反応を触媒する任意のポリペプチドを意味する。これらとしては、天然酵素、ならびに酵素変異体およびその誘導体が挙げられる。これは、このような酵素の任意のフラグメント、および挿入、欠失、組換えおよび／またはこのアミノ酸配列において天然酵素または酵素変異体と異なる酵素をもたらす他の方法により操作した変異体も含む。これは、翻訳後修飾および／または化学修飾、例えば、グリコシル化、γ−カルボキシル化およびアセチル化したタンパク質分子、前述のタンパク質の１つを含んでなる任意の分子複合体または融合タンパク質も含む。
【００４７】
「ポリペプチド変異体」または「変異ポリペプチド」という語は、変異誘発、好ましくは、それぞれの野生型配列と比較して変更されたアミノ酸配列を部位特異的またはランダム変異誘発により得られた任意のポリペプチド分子を意味する。「耐性を示す」、「耐性」または「耐性の」は、特定のＨＰＰＤ阻害型除草剤の施用下で生存すること、または未処理細胞または生物から容易に識別できない方法で光合成、タンパク質合成、または呼吸、および再生などの必須の細胞機能を行う能力、またはこのような除草剤で処理しない植物と比較して、ＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理した植物の収穫量の有意差がないかもしくはなお改善された収穫量を有する能力（しかし、例えば、国際公開第２０１１／１００３０２号（その全文を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に記載される方法など、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の施用以外の機構により、雑草を除去または抑制した場合）のいずれかを表す。
【００４８】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を細胞に付与することに加えて、本発明のＨＰＰＤ核酸配列は、ＨＰＰＤ活性、すなわちパラヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）をホモゲンチジン酸へ転換する反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする。ＨＰＰＤポリペプチドの触媒活性を、当技術分野において周知の様々な方法により決定してもよい。国際公開第２００９／１４４０７９号および国際公開第２０１４／０４３４３５号は、様々な適切なスクリーニング法について記載している。
【００４９】
ＨＰＰＤポリペプチドの酵素活性を、ＨＰＰまたはＯ２基質の量の減少の測定、または酵素反応に由来するいずれかの生成物、すなわちホモゲンチジン酸またはＣＯ２の蓄積の測定のどちらかを可能とするいずれかの方法により測定することができる。特に、ＨＰＰＤ活性は、国際公開第２００９／１４４０７９号；Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769；Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516；または国際公開第２０１２／０２１７８５号（これらは参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載の方法によって測定することができる。
【００５０】
本発明の目的のため、「参照」ＨＰＰＤポリペプチド（またはこのようなポリペプチドをコードするＨＰＰＤ遺伝子）は、それに対して本発明のＨＰＰＤポリペプチドまたはＨＰＰＤ核酸に比較されるいずれかのＨＰＰＤポリペプチドまたは核酸である。本発明のＨＰＰＤポリペプチドを記述する目的のため、「タンパク質」および「ポリペプチド」という語を互換的に使用する。この参照ＨＰＰＤポリペプチドは、天然植物、細菌、または動物ＨＰＰＤであり得、または国際公開第２００９／１４４０７９号に記載されたＰｆＰ２１５ＬおよびＰｆＧ３３６Ｆ変異体などの当業者に公知の変異ＨＰＰＤポリペプチドであり得、または国際公開第２００４／０４３４３５号に記載のＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３３、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３６、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３７、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ４０、またはＰｆＨＰＰＤｅｖｏ４１タンパク質（ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ４１は配列番号２として本願に記載している）のいずれかであり得る。このような参照ＨＰＰＤポリペプチドを使用して、本発明のどのＨＰＰＤポリペプチドまたは核酸が、対象の特定の特性（例えば改善された、同等な、または減少したＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性またはＨＰＰＤポリペプチド酵素活性；改善された、同等な、または減少した宿主細胞における発現；改善された、同等な、または減少したタンパク質安定性）を有するかを決定することができる。
【００５１】
本発明において様々な実施態様では、核酸によりコードされたＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチド（その単離、組換えおよびキメラ遺伝子、核酸、核酸によりコードされたＨＰＰＤポリペプチドおよびその組成物を含んでなるベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子、ならびにＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する植物の耐性向上、具体的には、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性向上のために核酸によりコードされたポリペプチドを使用する方法を含む）は、（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリン、（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリン、ならびに、必要に応じて、配列番号３〜１０８のいずれかに記載のＨＰＰＤタンパク質を含む配列番号１のアミノ酸位置２０４、２１３、２６４、２６８、２７０、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９、３４０、３４４、３４５に対応する位置において１つ以上のさらなるアミノ酸置換を有する。「対応する(corresponding to)」は、標準的な整列アルゴリズムを用いて２つの（または２つ以上の）配列を整列させた場合、配列番号１の位置と比べたヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を表す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける「位置」という語は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の特定の１つの塩基またはアミノ酸を表す。ポリヌクレ��チドまたはポリペプチドにおける「部位」という語は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列中の特定の位置または領域を表す。「ポリヌクレオチド」という語は、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子群、プラスミド、遺伝子全部、およびそのフラグメントを含む一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなる任意の長さの任意の配列の任意の遺伝子材料に相当する。
【００５２】
１つの実施態様では、本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は：
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなるアミノ酸配列からなり、前記ＨＰＰＤポリペプチドは１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有する。
【００５３】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２０４に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２１３に対応するアミノ酸の位置においてリジンまたはロイシン；および／または
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６４に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン；および／または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン；および／または
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３１０に対応するアミノ酸の位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン；および／または
（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３１５に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン；および／または
（ｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３０に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン；および／または
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３３１に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン；および／または
（ｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３３８に対応するアミノ酸の位置においてバリン；および／または
（ｘｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３９に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン；および／または
（ｘｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン；および／または
（ｘｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４４に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン；および／または
（ｘｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５４】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２１３に対応するアミノ酸の位置においてロイシンまたはリジン；および／または
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６４に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン；および／または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸またはセリン；および／または
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３１５に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはメチオニン；および／または
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３０に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン；および／または
（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３８に対応するアミノ酸の位置においてバリン；および／または
（ｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３４４に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン；および／または
（ｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５５】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２１３に対応するアミノ酸の位置においてリジン；および／または
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６４に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン；および／または
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン；および／または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸；および／または
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３１５に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン；および／または
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３０に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン；および／または
（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３３８に対応するアミノ酸の位置においてバリン；および／または
（ｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン；および／または
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３４４に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン；および／または
（ｘ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５６】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてバリン；および
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５７】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２１３に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてバリン；および
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５８】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２１３に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６４に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてバリンまたはアルギニン；
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４４に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
（Ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００５９】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６４に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２６８に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置２７０に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３１５に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
（ｖ）配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応するアミノ酸の位置においてバリン；
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４４に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００６０】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
ａ．配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、および 
ｂ．配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または
ｃ．配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応する位置においてアスパラギン酸、および
ｄ．配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００６１】
別の実施態様では、本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
ａ．配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン；
ｂ．配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸；
ｃ．配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン；および
ｄ．配列番号１のアミノ酸の位置３３０に対応する位置においてヒスチジン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００６２】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
ａ．配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン；
ｂ．配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸；
ｃ．配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン；および
ｄ．配列番号１のアミノ酸の位置３４０に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００６３】
別の実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のＨＰＰＤポリペプチド（これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む）は、
ａ．配列番号１のアミノ酸の位置３３５に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
ｂ．配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号１のアミノ酸の位置３３６に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸；
ｃ．配列番号１のアミノ酸の位置３３７に対応する位置においてセリン；および
ｄ．配列番号１のアミノ酸の位置３４５に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
【００６４】
表１に、本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチド変異体が３個以上のアミノ酸置換を含んでなる、参照野生型シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤポリペプチド（配列番号１）と比較したそれぞれのアミノ酸位置を纏めている。特に明白に指定しない限り、関連したアミノ酸位置における交換は、配列番号１に相当する参照野生型シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤポリペプチドを常に表す。
【００６５】
【表１】
2018534911.tif 000002
【００６６】
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、３文字の略号または１文字略号を用いて表す。下表は、その略号と共に標準アミノ酸の一覧を示す。
【００６７】
【表２】
2018534911.tif 000003
【００６８】
遺伝コードが縮重している、すなわち、１つより多いコドントリプレットは同じアミノ酸をコードすることができることは、当業者に周知である。従って、本明細書で提供したアミノ酸配列を、同じアミノ酸配列をコードする異なるコドンを使用する代替の配列により生成することができる。
【００６９】
別の実施態様では、本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドは、配列番号１として本明細書に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５３％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％，または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７０】
本発明に従って修飾することができる例示のＨＰＰＤ配列としては、細菌由来のもの、具体的には、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）型、より具体的には、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・テストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ））由来のものが挙げられる。
【００７１】
本発明の目的のために、本発明のＨＰＰＤポリペプチドはさらなる修飾を含んでもよく、例えば、クローニング目的や輸送ペプチド融合の製造などのために、いくつかのアミノ酸（例えば１〜１７個のアミノ酸）を置換、付加または欠失していてもよく、これは、ＨＰＰＤ活性、すなわちパラヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持するか、またはさらに改善することができるＨＰＰＤポリペプチドであり得る。例えば、本明細書に記載した修飾によりさらに改良することができるＨＰＰＤポリペプチドは、本明細書において配列番号３〜１０８のいずれかに記載のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来の変異体ＨＰＰＤであり得る。
【００７２】
好ましい実施態様では、本発明に従い、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有するＨＰＰＤポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号１（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））と均等である、すなわち、
それぞれのＨＰＰＤポリペプチドは、配列番号１と同一であるが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸の位置３３５においてプロリン、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸の位置３３６においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸の位置３３７においてセリン
を有する。
【００７３】
さらなる好ましい実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号１（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））と均等であり、すなわち、それぞれのＨＰＰＤポリペプチドは、配列番号１と同一であるが、上表１に従ったそれぞれのアミノ酸位置において１つ以上のアミノ酸交換を有するが、但し、プロリンは配列番号１の位置３３５に存在し、ヒスチジンまたはアスパラギン酸は配列番号１の位置３３６に存在し、セリンは配列番号１の位置３３７に存在する。
【００７４】
さらなる好ましい実施態様では、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号１（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））と均等であり、すなわち、それぞれのＨＰＰＤポリペプチドは、配列番号１と同一であるが、行、配列番号７〜配列番号１９および配列番号２１〜配列番号１０８において、表２（下記）で定義されたそれぞれのアミノ酸位置におけるアミノ酸交換を有する。
【００７５】
いくつかの実施態様では、本発明のヌクレオチド配列（その単離、組換えおよびキメラ遺伝子、核酸によりコードされた核酸配列、アミノ酸配列およびその組成物を含んでなるベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子、ならびにＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する植物の耐性向上、具体的には、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性向上のために核酸配列を使用する方法を含む）は、配列番号３〜１０８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、ならびにＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチドをコードするそのフラグメントおよび変異体をコードする。
【００７６】
Ａ．ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性の測定方法
ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を測定する任意の適切な方法を使用して、本発明のＨＰＰＤポリペプチドを評価することができる。細胞または生物が特定のＨＰＰＤ阻害型除草剤の施用下で生存する能力、または未処理細胞または生物から容易に識別できないように、光合成、タンパク質合成または呼吸および再生などの必須の細胞機能を行う能力、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理した植物の収穫またはさらに改善された収穫において、このような除草剤で処理していない植物と比較して、有意差を有しない能力（しかし、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の用途以外の機構により雑草を除去または抑制する場合）をモニターすることにより、耐性を測定することができる。いくつかの実施態様では、それぞれのＨＰＰＤポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる核酸で形質転換された細胞または生物の可視指標となる表現型に従って、または異なる濃度の様々なＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在下、ＨＰＰＤポリペプチドのインビトロアッセイにおいて、耐性を測定することができる。用量反応、およびこれらの指標となる表現型（茶色の形成、成長阻害、白化、除草効果など）に関連する用量反応における相対的シフトを、例えばＧＲ５０（成長を５０％減少させる濃度）またはＭＩＣ（最小阻止濃度）値に関して都合良く発現するが、これらの値の増加は、除草剤の異なる濃度範囲における植物の損傷、成長点の白化症状などに基づいて通常の方法で、発現したＨＰＰＤポリペプチドの固有の耐性の増強に対応する。例えばｘ軸にプロットされた「用量」およびｙ軸にプロットされた「死滅パーセンテージ」、「除草効果」、「新生緑色植物数」などの用量／反応曲線に由来するＧＲ５０値に関して、これらのデータを表すことができ、ＧＲ５０値の増加は、発現したＨＰＰＤポリペプチドの固有耐性のレベル向上に対応する。除草剤を、発芽前または発芽後に、好適に施用することができる。
【００７７】
様々な実施態様では、本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチド、または本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸または遺伝子の耐性レベルを、タバコなどの試験植物、またはダイズ、トウモロコシもしくはワタなどの作物の遺伝子組換え、再生、育種およびスプレー試験によりスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングにより得た結果と一致して、このような植物は、ＨＰＰＤポリペプチドをコードするいずれかの外来遺伝子を含まない植物、またはＤＮＡ、例えば、本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸と同じプロモーターの制御下、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤをコードするＤＮＡをコードする参照ＨＰＰＤポリペプチドを含んでなる遺伝子を含む植物より、ＨＰＰＤ阻害型除草剤（例えば、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤）に対して耐性を有し、圃場施用に推奨される通常投与量の少なくとも２倍まで望ましく耐性を有し、さらにより好ましくは、圃場施用に推奨される通常投与量の最大４倍まで耐性を有する。従って、「ＨＰＰＤに作用する少なくとも１つの除草剤に対する植物の耐性を増強可能」という語は、その内在的ＨＰＰＤを発現するだけの植物または参照ＨＰＰＤポリペプチドを発現する植物と比較して、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の通常圃場用量の少なくとも１×、２×、または３×、または４×、またはそれより多くの用量に対して、本発明のＨＰＰＤを発現する植物による耐性を示す。これに関���て、「ＨＰＰＤに作用する除草剤」という語は、公知および／または除草剤として使用された物質に限定されず、ＨＰＰＤポリペプチドの触媒活性を阻害するいずれの物質も表す。
【００７８】
「除草剤耐性」、「阻害剤耐性」、または「阻害剤非感受性」という語は、阻害剤／除草剤の存在下または阻害剤／除草剤暴露後にそのそれぞれの触媒反応を行う酵素の能力も意味する。酵素の除草剤耐性、すなわち、除草剤の阻害効果に抵抗するその能力を、定性的および定量的に表現することができる。定性的には、阻害剤の異なる実体または異なる分類でさえ耐える酵素は、高い耐性を有し、逆もまた同じである。定量的観点では、１つの除草剤と比較した酵素の耐性を、阻害剤の非存在下および存在下で活性比（ｋａｐｐ、反応速度測定）または総基質代謝回転（シグナル変化、エンドポイント測定）として算出したこの酵素の１つのサンプルで観察されたそれぞれの「残効性」または「残存代謝回転（residual turnover）」として表すことができる（Bergmeyer, H.U.: “Methods of enzymatic analysis”, 1974）。様々な実施態様では、残効性の決定のため、決定された基質変換の見かけ速度定数（ｋａｐｐ）を、ＨＰＰ由来ＨＰＰＤにより生成されたホモゲンチシン酸（ＨＧＡ）が第二酵素ホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＧＤ）により良好に吸収する分子マレイルアセト酢酸（ＭＡＡ）に直接変換される結合アッセイにおいて３２０ｎｍにおける吸光度の動態変化として測定し、全てのアッセイにおいて過度に同様に施用することができる。酵素活性のｋｃａｔ／ｋＭ比は、見かけの速度定数ｋａｐｐに比例し、ｋｃａｔ／ｋＭ＊［Ｅ］（［Ｅ］＝酵素濃度）に比例する。競合的阻害剤は、非飽和基質濃度において、ｋＭが見かけ増加して、それによりｋａｐｐが逆に減少することを示す。阻害剤の存在および非存在下でのｋａｐｐ双方の測定を、生でまたは精製し、それにより同じ濃度における同じ酵素サンプルの使用により行う際、酵素濃度は、残効性の計算から除かれ、ｋａｐｐ双方の比は阻害によるｋＭの変化を直接示す。注目すべきは、この概念は、「競合的阻害」で相互作用する酵素／阻害剤対に当てはまり、おそらく、記載されたほとんど全てのポリペプチド変異体および阻害剤に対して正しい。酵素に対する阻害定数ｋｉおよびそれぞれの阻害剤は、この酵素に対する阻害剤の結合活性を言い表している。耐性向上は、１．５、２、３、４、５、７、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００またはそれより大きい比で与えられ、いずれかのそれぞれのＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在または非存在下参照ＨＰＰＤ配列と比較される。
【００７９】
限定はされないが、本発明のＨＰＰＤポリペプチド配列を評価するために使用することのできる特定の種類のアッセイは、比色アッセイである（例えば、米国特許第６，７６８，０４４号参照、記載されているように）。このアッセイでは、例えば、ベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘ（ＨＰＰＤｘは推定ＨＰＰＤポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を意味する；ベーシックベクター「ｐＳＥ４２０」をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ドイツ、カールスルーエ）から得た）またはｐＳＥ４２０（ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ）−ＨＰＰＤｘの修飾バージョンを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、過剰発現されたＨＰＰＤポリペプチドが活性である場合にチロシン異化から可溶性メラニン様色素を産生する。これらのメラニン様色素を、液体培養液中、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養をＬＢ培地型固形寒天上に適用することにより評価する。２０〜３０℃、１６時間〜８日後、空のベクターｐＳＥ４２０を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養液を接種した培養培地または寒天ウェルは培地の色の変化はなく、または、不活性ＨＰＰＤをコードする遺伝子を含むベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養液を播種したものも培地の色の変化はないが、活性ＨＰＰＤをコードするベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養液を接種したウェルは茶色がかっている。ＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在下、この色素産生を阻害することができ、ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ＨＰＰＤポリペプチドが発現されず活性でない限り、培養液は培地の色を変化させないだろう。この活性の起源がどんなものでも、本試験はＨＰＰＤ活性およびＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を反映し、ＨＰＰＤ活性の同定を、すなわち定性的レベルで可能にすることが、これまでに示された（米国特許第６，７６８，０４４号）。
【００８０】
Ｂ．ＨＰＰＤ配列への変異の導入方法
本発明の核酸によりコードされた変異ＨＰＰＤポリペプチドでは、上記定義したように、少なくとも３個のアミノ酸が置換されている。
【００８１】
上記定義の参照ＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸配列では、前記配列において、前記コドンは文献に広く記載されており当業者に周知であり、それを置換することになるアミノ酸に対応するコドンで置換されるアミノ酸をコードするコドンを広く文献に記載され、当業者に周知である前記コドンで置換するのに適したいずれの方法によっても置換することができる。
【００８２】
この置換を行うため、いくつかの分子生物学的方法を使用することができる。本発明に従った変異核酸配列および対応するタンパク質の製造に有用な方法は、予め選択した１つ以上のアミノ酸をコードするコドンに対して部位特異的な変異誘発を行うことを含む。これらの部位特異的変異を得るための方法は当業者に周知であり、広く文献に記載されており（具体的には：Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, Edited by M.J. McPHERSON, IRL PRESS）、または、市販のキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ社またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）を使用可能である方法である。部位特異的変異誘発後、適切なスクリーニング補助を用いてＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の低い変異ＨＰＰＤを含む細胞を選択することが有用である。これを達成するための適切なスクリーニング方法は上記に記載している。
【００８３】
あるいは、参照ＨＰＰＤをコードするＤＮＡ配列をコンピュータシミュレーションで修飾して、本明細書で記載した１つ以上の置換を有するＨＰＰＤポリペプチドをコードし、それから新規に合成することができる。この方法は当技術分野で周知であり、文献に記載されている。変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本明細書の他所に記載したように、宿主細胞内へ導入することができる。
【００８４】
Ｃ．単離されたポリヌクレオチド、ならびにその変異体およびフラグメント
幾つかの実施態様にでは、本発明は、単離または組換えたポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」という語は、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子群、プラスミド、遺伝子全部、およびそのフラグメントを含む一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなる任意の長さの任意の配列の任意の遺伝子材料に相当する。本明細書で定義される「組換え」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド／タンパク質、またはその生物活性部分は、それらが異種宿主細胞内、またはトランスジェニック植物細胞、種子、または植物内に含まれる場合など、その起源、天然生物内にもはや存在しない。１つの実施態様では、組換えポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ内の核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を自然に隣接する配列（例えば、コードするタンパク質または制御配列）を含まない。「組換え」という語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然にあるものと異なる（例えば、化学組成または構造において）ように、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して操作したポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。別の実施態様では、「組換え」ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ内に天然で存在する内部配列（すなわち、イントロン）を含まない。このようなポリヌクレオチドの典型例は、いわゆる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。例えば、様々な実施態様では、単離されたＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチドに自然に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂよりも小さいヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の核酸分子としては、本発明のＨＰＰＤをコードするものが挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、宿主細胞（例えば、植物宿主細胞または細菌宿主細胞）内の核酸分子の発現を指示可能なプロモーターに操作可能に連結している。
【００８５】
本発明は、配列番号３〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするいずれかの核酸配列の例示となる変異体およびフラグメントをさらに企図している。ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、ポリペプチドの生物活性部分をコードしてもよいか、または本明細書の他所に開示した方法を使用してハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用することができるフラグメントであってもよい。ポリヌクレオチドのフラグメントであるポリヌクレオチドは、少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０の隣接するヌクレオチド、または意図された使用（例えば本明細書に記載のＨＰＰＤ核酸）に応じて、本明細書に開示の完全長ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの数までを含んでなる。「隣接する」ヌクレオチドとは、互いがすぐ近隣にあるヌクレオチド残基を表す。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、概して、完全長ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性タンパク質の生物活性、すなわち、除草剤耐性活性を保持するポリペプチドフラグメントをコードするだろう。「除草剤耐性活性を保持する」とは、フラグメントが、配列番号３〜１０８として本明細書に開示の完全長ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性タンパク質の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、少なくとも約３００％、またはそれを大きい除草剤耐性活性を有することを表す。  除草剤耐性活性の測定方法は、当該技術分野において周知であり、実例となる方法を本明細書に記載さしている。非限定的な例では、本発明のフラグメントは、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の同用量に対して耐性であるか、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤の１×、２×、３×、４×、もしくはそれよりも多い用量に対して耐性であり、またはフラグメントは、該フラグメントと配列番号３〜１０８との間のｋｉに基づいて、同じまたはそれより耐性であるだろう。
【００８７】
本発明のポリペプチドの生物活性部分をコードするポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも約１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０の隣接するアミノ酸、または本発明の完全長ポリペプチドに存在するアミノ酸の総数までをコードするだろう。非限定的例では、（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３３５に対応するアミノ酸位置においてプロリンおよび（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３３６に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸および（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置３３７に対応する位置においてセリンならびに、必要に応じて、配列番号３〜１０８のいずれかに記載のＨＰＰＤタンパク質を含む配列番号１のアミノ酸位置２０４、２１３、２６４、２６８、２７０、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９、３４０、３４４、３４５に対応する位置において１つ以上のさらなるアミノ酸置換を有するＨＰＰＤポリペプチドの生物活性部分をコードするポリヌクレオチドのフラグメントがある。
【００８８】
本発明は、上記の変異体ポリヌクレオチドも包含する。
ポリヌクレオチドの「変異体」としては、本発明のＨＰＰＤをコードするが、遺伝コードの縮重が理由で保存的に異なる配列、ならびに十分に同一である配列も挙げられる。
本発明の変異体は、ＨＰＰＤポリペプチド活性およびＨＰＰＤ除草剤阻害剤耐性を保持するだろう。「十分に同一」という語は、標準的なパラメーターを使用するアラインメントプログラムの１つを用いて、参照配列と比較した、少なくとも約５３％、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を表す。これらの値を適切に調節して、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮して、２つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの対応する同一性を決定することができることを当業者は認識するであろう。
【００８９】
細菌遺伝子は、オープンリーディングフレーム開始の近傍に複数のメチオニン開始コドンを頻繁に有する。しばしば、１つ以上のこれらの開始コドンにおける翻訳開始は、機能的タンパク質の生成をもたらす。これらの開始コドンとしては、ＡＴＧコドンを挙げることができる。しかしながら、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などの細菌は、開始コドンとしてコドンＧＴＧも認識し、ＧＴＧコドンにおいて翻訳を開始するタンパク質は、第一アミノ酸においてメチオニンを含む。さらに、これは、細菌においてこれらのコドンが自然に使用される決定されたアプリオリではないことも多い。従って、代替のメチオニンコドンの１つを使用することで、除草剤耐性を付与する変異体が生成する可能性がることが理解される。これらの除草剤耐性タンパク質は本発明に包含され、本発明の方法において使用してもよい。天然アレル変異体を、以下に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技術の使用で同定することができる。変異体ポリヌクレオチドとしては、例えば、部位特異的または他の変異誘発ストラテジーを用いて生成したが、所望の生物活性を有するポリペプチドをなおコードする、合成的に誘導されたポリヌクレオチドも挙げられる。
【００９０】
当業者は、変更が本発明のポリヌクレオチドのさらなる変異により導入されることにより、該ポリペプチドの生物活性を変化させることなく、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列中にさらなる変更が得られることをさらに認識するだろう。  従って、単離された変異体ポリヌクレオチドは、３〜５、１〜７、１〜９、１〜１１、１〜１３、１〜１５、もしくは１〜１７個のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７個のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失をコードされたポリペプチドに導入するように、本発明のＨＰＰＤをコードする対応するポリヌクレオチド中に、１つ以上の追加のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することにより作製することができる。  部位特異的変異誘発およびＰＣＲを介した変異誘発、または遺伝子シャッフリングなどの技術標準技術により、さらなる変異を導入することができる。このような変異体ポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【００９１】
変異体ポリヌクレオチドは、飽和変異誘発または置換変異誘発（permutational mutagenesis）などによるコード配列の全部または部分に沿ったランダムに変異を導入することにより製造することができ、得られた変異体を、除草剤耐性活性を付与する能力についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。
【００９２】
変異体を生成するさらなる方法としては、本明細書に開示するタンパク質を発現する細胞（またはそのライブラリー）を、タンパク質活性にストレスを与える特定の条件下に付することが挙げられる。特定条件としては、（これに限定されないが）温度変化、ｐＨの変化、基質または阻害剤の濃度変化、および緩衝液組成物またはその濃度の変化を挙げることができる。タンパク質ライブラリーは、タンパク質発現の時間中（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の宿主において）、またはタンパク質抽出物の作製後、もしくはタンパク質の精製後、これらの条件に付することができる。
【００９３】
それから、ストレス条件に付したタンパク質ライブラリーの機能的または酵素的活性を、参照タンパク質と比較して、改善された特性を有するタンパク質を同定することができる。成長スクリーニングの一部として、あるいはタンパク質の活性を定量する酵素アッセイの一部としてこの活性比較を行うことができる。改善されたものとして同定することができる特性としては、ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性、速度定数（ＫＭ、Ｋｉ、ｋｃａｔを含む）変化、タンパク質安定性、タンパク質熱安定性、またはタンパク質温度およびｐＨ最適条件を挙げることができる。
【００９４】
Ｄ．単離されたタンパク質ならびにその変異体およびフラグメント
除草剤耐性ポリペプチドも本発明内に包含される。除草剤耐性ポリペプチドとしては、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量）より少ない除草剤耐性でないポリペプチド（本明細書では、「汚染（contaminating）タンパク質」とも呼ぶ）を有するポリペプチドの製剤（preparations）が挙げられる。本発明では、「除草剤耐性タンパク質」は、本明細書に開示のＨＰＰＤポリペプチドを表す。  そのフラグメント、生物活性部分、および変異体も準備して、本発明の方法を実施するために使用してもよい。
【００９５】
「フラグメント」または「生物活性部分」としては、除草剤耐性タンパク質をコードし、除草剤耐性活性を保持するアミノ酸配列の一部を含んでなるポリペプチドフラグメントが挙げられる。除草剤耐性タンパク質の生物活性部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。このような生物活性部分を、組換え技術により製造し、除草剤耐性活性について評価することができる。
【００９６】
「変異体」は、例示の配列番号３〜１０８のいずれかと少なくとも約５３％、６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを表し、前記変異体はＨＰＰＤポリペプチド活性およびＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を有する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めなどを考慮して、２つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの対応する同一性を決定さするように適切に調節することができることを認識するであろう。
【００９７】
例えば、保存的なアミノ酸置換を、１つ以上の非必須アミノ酸残基において行ってもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく、ポリペプチドの参照配列から変更することができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において明らかにされた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。アミノ酸置換を、機能を保持する非保存領域において行ってもよい。概して、このような置換は、保存アミノ酸残基、または保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対して行われず、このような残基はポリペプチド活性に必須である。しかしながら、当業者は、機能的変異体が、保存された残基において、少数の保存または非保存の変更を有してもよいことを理解するだろう。 
【００９８】
本発明のＨＰＰＤ、またはその変異体もしくはフラグメントに対する抗体も包含される。抗体を産生するための方法は当該技術分野において公知である（例えば、Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY、米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。
【００９９】
従って、本発明の１つの面は、本発明の１つ以上のタンパク質もしくはペプチド分子と特異的に結合する抗体、単鎖抗原結合性分子、または他のタンパク質、およびそれらのホモログ、融合体、またはフラグメントに関する。特に好ましい実施態様では、抗体は、配列番号１〜１０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合する。
【０１００】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出、またはタンパク質の翻訳後修飾を検出するために使用してもよい。本明細書で使用するとき、抗体またはペプチドは、このような結合が関連しない分子の存在により競合的に阻害されない場合、本発明のタンパク質またはペプチド分子と「特異的に結合」すると言われる。
【０１０１】
Ｅ．遺伝子スタッキング
農作物の商業的生産において、信頼のおける駆除剤管理下、作物の圃場から不要な植物（すなわち、「雑草」）を除去することが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に施用可能であるが、作物は影響されないままで不要な植物のみを除去することであろう。このような処理システムの１つは、除草剤耐性作物の圃場に除草剤を散布する場合、作物は成長し続けるが、除草剤耐性をもたない雑草は死滅するかまたは大幅に被害を受けるように、除草剤に対して耐性である作物の使用を含むだろう。理想的には、このような処理システムは、雑草防除によって柔軟性と経済性との可能な最良の組み合わせが提供され得るように、除草剤の特性を変化させることの利点を享受し得る。例えば、圃場において個別の除草剤の持続性は様々であり、幾つかの除草剤は圃場に散布された後、比較的長期間有効であるが、その他の除草剤は、他の化合物および／または無効な化合物へと迅速に分解される。理想的な処理システムにおいては、栽培者が特定の状況に応じて除草剤を選択できるように、異なる除草剤の使用が許容され得る。
【０１０２】
いくつかの除草剤耐性作物が現在市販されているが、多くの市販の除草剤および除草剤／作物の組み合わせに生じる問題は、個々の除草剤が、通常、一般的な雑草種に対して不完全な活性スペクトルを有することである。しばらくの間使用されてきた個々の除草剤の多くに対して、除草剤抵抗性雑草種および生物型の集団はさらに蔓延してきている（例えば、Tranel and Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen and Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311参照）。１つより多い除草剤に対する耐性を有するトランスジェニック植物は記載されている（例えば、国際公開第２００５／０１２５１５号参照）。しかしながら、作物生産、雑草防除オプション、残雑草防除の拡張、および収穫量向上の全手の面における改善は持続的に需要がある。
【０１０３】
本発明のＨＰＰＤタンパク質またはヌクレオチド配列を、このような植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする他の遺伝子と植物内で有利に組み合わさす。形質転換された植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする遺伝子の中で、その化学構造に従って、ＨＰＰＤ阻害型除草剤と異なる１つ以上の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質、特定の昆虫に対する耐性を付与する他のタンパク質、特定の疾病に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、線虫または昆虫防除等を提供するＲＮＡをコードするＤＮＡなどについて言及することができる。
【０１０４】
このような遺伝子については特に、ＰＣＴ特許出願の国際公開第９１／０２０７１号および国際公開第９５／０６１２８号、ならびに米国特許第７，９２３，６０２号および米国特許出願公開第２０１０／０１６６７２３号（これら各々はその全文を参照することにより本明細書に取り込まれるものとする）に記載されている。
【０１０５】
形質転換された植物細胞および植物上の特定の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、グルホシネート除草剤に対する耐性を付与する、国際公開第２００９／１５２３５９号に記載されるｂａｒもしくはＰＡＴ遺伝子またはストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）遺伝子、グリホサートおよびその塩などのＥＰＳＰＳが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（米国特許第４，５３５，０６０号、米国特許第４，７６９，０６１号、米国特許第５，０９４，９４５号、米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第４，９７１，９０８号、米国特許第５，１４５，７８３号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，３１２，９１０号、米国特許第５，６２７，０６１号、米国特許第５，６３３，４３５号）、グリホサート−ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、米国特許第８，２２２，４８９号、米国特許第８，０８８，９７２号、米国特許第８，０４４，２６１号、米国特許第８，０２１，８５７号、米国特許第８，００８，５４７号、米国特許第７，９９９，１５２号、米国特許第７，９９８，７０３号、米国特許第７，８６３，５０３号、米国特許第７，７１４，１８８号、米国特許第７，７０９，７０２号、米国特許第７，６６６，６４４号、米国特許第７，６６６，６４３号、米国特許第７，５３１，３３９号、米国特許第７，５２７，９５５号、および米国特許第７，４０５，０７４号）、またはグリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子（例えば、米国特許第５，４６３，１７５号）について言及することができる。
【０１０６】
ＥＰＳＰＳが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、植物ＥＰＳＰＳ、特に、トウモロコシＥＰＳＰＳ、具体的には、２つの変異、具体的には、アミノ酸位置１０２における変異およびアミノ酸位置１０６における変異（国際公開第２００４／０７４４４３号）であって、以後二重変異トウモロコシＥＰＳＰＳまたは２ｍＥＰＳＰＳと称される米国特許出願第６５６６５８７号に記載される変異を含んでなるトウモロコシＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、またはアグロバクテリウムから単離され、米国特許第５，６３３，４３５号の配列番号２および配列番号３に記載され、ＣＰ４とも称されるＥＰＳＰＳをコードする遺伝子についてさらに詳細に言及されるだろう。
【０１０７】
ＥＰＳＰＳが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＥＰＳＰＳ  ＧＲＧ２３をコードする遺伝子だけでなく、国際公開第２００８／１００３５３号に記載される変異体ＧＲＧ２３  ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３  ＡＣＥ２、またはＧＲＧ２３  ＡＣＥ３、特に、国際公開第２００８／１００３５３号の配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋなどの変異体または変異体ＧＲＧ２３についてさらに詳細に言及されるだろう。
【０１０８】
ＥＰＳＰＳをコードする、さらに具体的には上記の遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合に、これらの酵素をコードする配列は、輸送ペプチド、具体的には米国特許第５，５１０，４７１号または第５，６３３，４４８号に記載される「最適輸送ペプチド」をコードする配列より有利に始まる。
【０１０９】
本発明の核酸配列と組み合わすことができる例示の除草剤耐性形質としては、少なくとも１つのＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）阻害剤（国際公開第２００７／０２４７８２号）；変異アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子（米国特許第６，８５５，５３３号）；代謝により２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）に対する耐性を付与する２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（米国特許第６，１５３，４０１号）；および代謝によりジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）に対する耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がさらに挙げられる（米国特許出願公開２００８／０１１９３６１号および米国特許出願公開２００８／０１２０７３９号）。
【０１１０】
様々な実施態様では、本発明のＨＰＰＤは、１つ以上のさらなるＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性遺伝子を含む１つ以上の除草剤耐性遺伝子、および／または１つ以上のグリホサートおよび／またはグルホシネートに耐性がある遺伝子でスタックする。１つの実施態様では、本発明のＨＰＰＤを、２ｍＥＰＳＰＳおよびｂａｒと組み合わす。
【０１１１】
昆虫に対する耐性の特性に関わるタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、文献に広く記載され、当業者に周知のＢｔタンパク質についてさらに詳細に言及されるだろう。フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）などの細菌から抽出したタンパク質についても言及されるだろう（国際公開第９７／１７４３２号および国際公開第９８／０８９３２号）。
【０１１２】
昆虫に対する耐性の新規特性を付与する対象のタンパク質をコードするこのようなＤＮＡ配列の中で、文献に広く記載され、当業者に周知のＢｔ  ＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質についてさらに詳細に言及されるだろう。これらとしては、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質由来ハイブリッド（例えば米国特許第６，３２６，１６９号；米国特許第６，２８１，０１６号；米国特許第６，２１８，１８８号に記載されるハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、またはその毒性フラグメント）、Ｃｒｙ１Ａ型タンパク質またはその毒性フラグメント、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質またはＣｒｙ１Ａｃタンパク質由来ハイブリッド（例えば米国特許第５，８８０，２７５号に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）または欧州特許第４５１８７８号に記載されるＣｒｙ１ＡｂもしくはＢｔ２タンパク質またはその殺虫性フラグメント、国際公開第２００２／０５７６６４号に記載されるＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ、もしくはＣｒｙ２Ａｇタンパク質またはその毒性フラグメント、国際公開第２００７／１４０２５６号（配列番号７）に記載されるＣｒｙｌＡ．１０５タンパク質またはその毒性フラグメント、ＮＣＢＩ受託番ＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩ受託番号ＡＢＧ２０４２９（国際公開第２００７／１４２８４０号の配列番号２）のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質、ＣＯＴ２０２またはＣＯＴ２０３ワタイベント(event)（それぞれ国際公開第２００５／０５４４７９号および国際公開第２００５／０５４４８０号）において産生されたＶＩＰ３Ａタンパク質、国際公開第２００１／４７９５２号に記載されるＣｒｙタンパク質、Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11):5389-94および米国特許第６，２９１，１５６号に記載されるＶＩＰ３Ａａタンパク質またはその毒性フラグメント、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）（国際公開第号９８／５０４２７号に記載）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（具体的には、Ｓ．エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）由来）または国際公開第９８／０８９３２号に記載されるフォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）由来のＴｃタンパク質などのフォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）の株に由来する殺虫性タンパク質（例えば、Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33）が挙げられる。上記配列のいずれかに由来するいくつかの（１〜１０個、好ましくは１〜５個）アミノ酸の点で異なるこれらのタンパク質のいずれか１つのいずれかの変異体または変異体、具体的には、その毒性フラグメントの配列、または色素体輸送ペプチドなどの輸送ペプチド、または別のタンパク質もしくはペプチドとの融合する配列も、本明細書に含まれる。
【０１１３】
様々な実施態様では、本発明のＨＰＰＤ配列を、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養値、疾病抵抗性、改善された光合成、改善された繊維質、ストレス耐性、改善された再生などの望ましい形質を付与する１つ以上の遺伝子と植物内で組み合わせることができる。
【０１１４】
同種の植物の本発明の遺伝子と組み合わせてもよい（例えば、交配または別のトランスジェニックイベンを含む植物を本発明のキメラ遺伝子で再形質転換することにより）特に有用なトランスジェニックイベントとしては、イベント５３１／ＰＶ−ＧＨＢＫ０４（ワタ、昆虫防除、国際公開第２００２／０４０６７７号に記載）、イベント１１４３−１４Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５６９号に記載）；イベント１１４３−５１Ｂ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７０号に記載）；イベント１４４５（ワタ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第２００２／１２０９６４号または国際公開第２００２／０３４９４６号に記載）；イベント１７０５３（コメ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４３として寄託、国際公開第２０１０／１１７７３７号に記載）；イベント１７３１４（コメ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４４として寄託、国際公開第２０１０／１１７７３５号に記載）；イベント２８１−２４−２３６（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託、国際公開第２００５／１０３２６６号または米国特許出願公開第２００５／２１６９６９号に記載）；イベント３００６−２１０−２３（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託、米国特許出願公開第２００７／１４３８７６号または国際公開第２００５／１０３２６６号に記載）；イベント３２７２（トウモロコシ、品質形質、ＰＴＡ−９９７２として寄託、国際公開第２００６／０９８９５２号または米国特許出願第２００６／２３０４７３号に記載）；イベント３３３９１（コムギ、除草剤耐性、ＰＴＡ−２３４７として寄託、国際公開第２００２／０２７００４号に記載）、イベント４０４１６（トウモロコシ、昆虫防除−
除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０８として寄託、国際公開第１１／０７５５９３号に記載）；イベント４３Ａ４７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０９として寄託、国際公開第２０１１／０７５５９５号に記載）；イベント５３０７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９５６１、国際公開第２０１０／０７７８１６号に記載）；イベントＡＳＲ−３６８（ベントグラス、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡー４８１６、米国特許出願公開第２００６／１６２００７号または国際公開第２００４／０５３０６２号に記載）；イベントＢ１６（トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第２００３／１２６６３４号に記載）；イベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．４１６０３として寄託、国際公開第２０１０／０８０８２９号に記載）；イベントＢＬＲ１（アブラナ、雄性不稔性回復、ＮＣＩＭＢ４１１９３として寄託、国際公開第２００５／０７４６７１号に記載）；イベントＣＥ４３−６７Ｂ（ワタ、昆虫防除、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７２４として寄託、米国特許出願公開第２００９／２１７４２３号または国際公開第２００６／１２８５７３号に記載）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第２０１０／００２４０７７号に記載）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７１号に記載）；イベントＣＥ４６−０２Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７２号に記載）；イベントＣＯＴ１０２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第２００６／１３０１７５号または国際公開第２００４／０３９９８６号に記載）；イベントＣＯＴ２０２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第２００７／０６７８６８号または国際公開第２００５／０５４４７９号に記載）；イベントＣＯＴ２０３（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００５／０５４４８０号に記載）；イベントＤＡＳ２１６０６−３／１６０６（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０２８として寄託、国際公開第２０１２／０３３７９４号に記載）、イベントＤＡＳ４０２７８（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−１０２４４として寄託、国際公開第２０１１／０２２４６９号に記載）；イベントＤＡＳ−４４４０６−６／ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３６として寄託、国際公開第２０１２／０７５４２６号に記載）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７／ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３５として寄託、国際公開第２０１２／０７５４２９号に記載）、イベントＤＡＳ−５９１２２−７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ１１３８４として寄託、米国特許出願公開第２００６／０７０１３９号に記載）；イベントＤＡＳ−５９１３２（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００９／１００１８８号に記載）；イベントＤＡＳ６８４１６（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０４４２として寄託、国際公開第２０１１／０６６３８４号または国際公開第２０１１／０６６３６０号に記載）；イベントＤＰ−０９８１４０−６（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２９６として寄託、米国特許出願公開第２００９−１３７３９５号または国際公開第０８／１１２０１９号に記載）；イベントＤＰ−
３０５４２３−１（ダイズ、品質形質、寄託なし、米国特許出願公開第２００８−３１２０８２号または国際公開第２００８／０５４７４７号に記載）；イベントＤＰ−３２１３８−１（トウモロコシ、ハイブリダイゼーションシステム、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９１５８として寄託、米国特許出願公開第２００９／０２１０９７０号または国際公開第２００９／１０３０４９号に記載）；イベントＤＰ−３５６０４３−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２８７として寄託、米国特許出願公開第２０１０−０１８４０７９号または国際公開第２００８／００２８７２号に記載）；イベントＥＥ−１（ナス、昆虫防除、寄託なし、国際公開第０７／０９１２７７号に記載）；イベントＦＩ１１７（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３１として寄託、米国特許出願公開第２００６／０５９５８１号または国際公開第  ９８／０４４１４０号に記載）；イベントＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０４１として寄託、国際公開第２０１１／０６３４１３号に記載）、イベントＧＡ２１（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３３として寄託、米国特許出願公開第２００５／０８６７１９号または国際公開第９８／０４４１４０号に記載）；イベントＧＧ２５（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３２として寄託、米国特許出願公開第２００５／１８８４３４号または国際公開第９８／０４４１４０号に記載）；イベントＧＨＢ１１９（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３９８として寄託、国際公開第２００８／１５１７８０号に記載）；
イベントＧＨＢ６１４（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６８７８として寄託、米国特許出願公開第２０１０／０５０２８２号または国際公開第２００７／０１７１８６号に記載）；イベントＧＪ１１（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３０として寄託、米国特許出願公開第２００５／１８８４３４号または国際公開第９８／０４４１４０号に記載）；イベントＧＭ  ＲＺ１３（サトウダイコン、ウイルス抵抗性、ＮＣＩＭＢ−４１６０１として寄託、国際公開第２０１０／０７６２１２号に記載）；イベントＨ７−１（サトウダイコン、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１１５８またはＮＣＩＭＢ４１１５９として寄託、米国特許出願公開第２００４／１７２６６９号または国際公開第２００４／０７４４９２号に記載）；イベントＪＯＰＬＩＮ１（コムギ、耐病性、寄託なし、米国特許出願公開第２００８／０６４０３２号に記載）；イベントＬＬ２７（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１６５８として寄託、国際公開第２００６／１０８６７４または米国特許出願公開第２００８／３２０６１６号に記載）；イベントＬＬ５５（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ  ４１６６０として寄託、国際公開第２００６／１０８６７５号または米国特許出願公開第２００８／１９６１２７号に記載）；イベントＬＬワタ２５（ワタ、
除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３４３として寄託、国際公開第２００３／０１３２２４または米国特許出願公開第２００３／０９７６８７号に記載）；イベントＬＬコメ０６（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５３として寄託、米国特許第６，４６８，７４７号または国際公開第２０００／０２６３４５号に記載）；イベントＬＬコメ６２（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５２として寄託、国際公開第２０００／０２６３４５号に記載）、イベントＬＬコメ６０１（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６００として寄託、米国特許出願公開第２００８／２２８９０６０号または国際公開第２０００／０２６３５６号に記載）；イベントＬＹ０３８（トウモロコシ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５６２３として寄託、米国特許出願公開第２００７／０２８３２２号または国際公開第２００５／０６１７２０号に記載）；イベントＭＩＲ１６２（トウモロコシ、昆虫防除、ＰＴＡ−８１６６として寄託、米国特許出願公開第２００９／３００７８４号または国際公開第２００７／１４２８４０号に記載）；イベントＭＩＲ６０４（トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第２００８／１６７４５６号または国際公開第２００５／１０３３０１号に記載）；イベントＭＯＮ１５９８５（ワタ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５１６として寄託、米国特許出願公開第２００４／２５０３１７号または国際公開第２００２／１００１６３号に記載）；イベントＭＯＮ８１０（トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第２００２／１０２５８２号に記載）；イベントＭＯＮ８６３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６０５として寄託、国際公開第２００４／０１１６０１または米国特許出願公開第２００６／０９５９８６号に記載）；イベントＭＯＮ８７４２７（トウモロコシ、受粉制御、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８９９として寄託、国際公開第２０１１／０６２９０４号に記載）；イベントＭＯＮ８７４６０（トウモロコシ、ストレス耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９１０として寄託、国際公開第２００９／１１１２６３号または米国特許出願公開第２０１１／０１３８５０４号に記載）；イベントＭＯＮ８７７０１（ダイズ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１９４として寄託、米国特許出願公開第２００９／１３００７１号または国際公開第２００９／０６４６５２号に記載）；イベントＭＯＮ８７７０５（ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９２４１として寄託、米国特許出願公開第２０１０／００８０８８７号または国際公開第２０１０／０３７０１６号に記載）；イベントＭＯＮ８７７０８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９６７０として寄託、国際公開第２０１１／０３４７０４号に記載）；イベントＭＯＮ８７７１２（ダイズ、収穫高、ＰＴＡ−１０２９６として寄託、国際公開第２０１２／０５１１９９号に記載）、イベントＭＯＮ８７７５４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９３８５として寄託、国際公開第２０１０／０２４９７６号に記載）；イベントＭＯＮ８７７６９（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−
８９１１として寄託、米国特許出願公開第２０１１／００６７１４１号または国際公開第２００９／１０２８７３号に記載）；イベントＭＯＮ８８０１７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５５８２として寄託、米国特許出願公開第２００８／０２８４８２号または国際公開第２００５／０５９１０３号に記載）；イベントＭＯＮ８８９１３（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８５４として寄託、国際公開第２００４／０７２２３５または米国特許出願公開第２００６／０５９５９０号に記載）；イベントＭＯＮ８８３０２（アブラナ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１０９５５として寄託、国際公開第２０１１／１５３１８６号に記載）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１７５４として寄託、国際公開第２０１２／１３４８０８号に記載）、イベントＭＯＮ８９０３４（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７４５５として寄託、国際公開第０７／１４０２５６または米国特許出願公開第２００８／２６０９３２号に記載）；イベントＭＯＮ８９７８８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６７０８として寄託、米国特許出願公開第２００６／２８２９１５号または国際公開第２００６／１３０４３６号に記載）；イベントＭＳ１１（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８５０またはＰＴＡ−２４８５として寄託、国際公開第２００１／０３１０４２号に記載）；イベントＭＳ８（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託、国際公開第２００１／０４１５５８または米国特許出願公開第２００３／１８８３４７号に記載）；イベントＮＫ６０３（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４７８として寄託、米国特許出願公開第２００７／２９２８５４号に記載）；イベントＰＥ−７（コメ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００８／１１４２８２号に記載）；イベントＲＦ３（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託、国際公開第２００１／０４１５５８または米国特許出願公開第２００３／１８８３４７号に記載）；イベントＲＴ７３（アブラナ、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００２／０３６８３１号または米国特許出願公開第２００８／０７０２６０号に記載）；イベントＳＹＨＴ０Ｈ２  ／  ＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１２２６として寄託、国際公開第２０１２／０８２５４８号に記載）、
イベントＴ２２７−１（サトウダイコン、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００２／４４４０７号または米国特許出願公開第２００９／２６５８１７号に記載）；イベントＴ２５（トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第２００１／０２９０１４号または国際公開第２００１／０５１６５４号に記載）；イベントＴ３０４−４０（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１７１として寄託、米国特許出願公開第２０１０／０７７５０１号または国際公開第２００８／１２２４０６号に記載）；イベントＴ３４２−１４２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５６８号に記載）；イベントＴＣ１５０７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第２００５／０３９２２６号または国際公開第２００４／０９９４４７号に記載）；イベントＶＩＰ１０３４（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９２５として寄託、国際公開第２００３／０５２０７３号に記載）、イベント３２３１６（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０７として寄託、国際公開第２０１１／０８４６３２号に記載）、イベント４１１４（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０６として寄託、国際公開第２０１１／０８４６２１号に記載）、イベント  ＥＥ−ＧＭ３／ＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  受託番号  ＰＴＡ−１１０４１号に記載）必要に応じてイベントＥＥ−ＧＭ１／ＬＬ２７またはイベントＥＥ−ＧＭ２／ＬＬ５５（国際公開第２０１１／０６３４１３Ａ２号に記載）でスタック、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０４４２、国際公開第２０１１／０６６３６０（Ａ１）号に記載）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０４４２、
国際公開第２０１１／０６６３８４（Ａ１）号に記載）、イベントＤＰ−０４０４１６−８（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５０８、国際公開第２０１１／０７５５９３（Ａ１）号に記載）、イベントＤＰ−０４３Ａ４７−３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５０９、国際公開第２０１１／０７５５９５（Ａ１）号に記載）、イベントＤＰ−００４１１４−３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５０６、国際公開第２０１１／０８４６２１（Ａ１）号に記載）、イベントＤＰ−０３２３１６−８（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５０７、国際公開第２０１１／０８４６３２Ａ１号に記載）、イベントＭＯＮ−８８３０２−９（アブラナ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０９５５、国際公開第２０１１／１５３１８６Ａ１号に記載）、イベントＤＡＳ−２１６０６−３（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１０２８、国際公開第２０１２／０３３７９４（Ａ２）号に記載）、イベントＭＯＮ−８７７１２−４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２９６、国際公開第２０１２／０５１１９９（Ａ２）号に記載）、イベントＤＡＳ−４４４０６−６（ダイズ、スタック除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２／０７５４２６（Ａ１）号に記載）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７（ダイズ、スタック除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２／０７５４２９（Ａ１）号に記載）、イベントＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８（Ａ２）号に記載）、イベントＤＰ−０６１０６１−７（アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、国際公開第２０１２／０７１０３９（Ａ１）号に記載）、イベントＤＰ−０７３４９６−４（アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、米国特許出願公開第２０１２／１３１６９２号に記載）、イベント８２６４．４４．０６．１（ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２／０７５４２６（Ａ２）号に記載）、イベント８２９１．４５．３６．２（ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２／０７５４２９（Ａ２）号に記載）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（ダイズ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８（Ａ２）号に記載）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１７５４、国際公開第２０１２／１３４８０８（Ａ１）号に記載）、イベントＫＫ１７９−２（アルファルファ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１８３３、国際公開第２０１３／００３５５８（Ａ１）号に記載）、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１（ダイズ、スタック除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１９９３、国際公開第２０１３／０１００９４（Ａ１）号に記載）、イベントＭＺＤＴ０９Ｙ（トウモロコシ、ＡＴＣＣ  受託番号ＰＴＡ−１３０２５、国際公開第２０１３／０１２７７５（Ａ１）号に記載）、イベント４１１４（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５０６）国際公開第２０１３／１４９０１号、イベントＭＯＮ８７４１１（トウモロコシ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９）国際公開第２０１３／１６９９２３号、イベントＡ２６−５（ワタ、昆虫防除）国際公開第２０１３／１７０３９８号、イベントＡ２−６（ワタ、昆虫防除）国際公開第２０１３／１７０３９９号、イベント９５８２．８１６．１５．１（ダイズ、昆虫防除、除草剤耐性号）、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２５８８号）国際公開第２０１４／００４４５８号、イベント３３１２１（トウモロコシ、昆虫防除、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３９２）国際公開第２０１４／１１６８５４号、イベント３２２１８（トウモロコシ昆虫防除、除草剤耐性、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３９１）国際公開第２０１４／１１６９８９号、イベント「ＳＰＴ−７Ｒ−９４９Ｄ  ＳＰＴ−７Ｒ−１４２５Ｄ」（コメ、雄性不稔性）国際公開第２０１４／１５４１１５号、イベントＭＯＮ８７７５１（ダイズ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＹＡ−１２０１６６）国際公開第２０１４／２０１２３５号、イベント“Ｐｐ００９−４０１  Ｐｐ００９−４１５  Ｐｐ００９−４６９”（芝草、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０３５４、ＰＴＡ−１２０３５３、ＰＴＡ−１２０３５５）国際公開第２０１５／００６７７４号、イベントＢｓ２−Ｘ５（トマト、ＡＴＣＣ）国際公開第２０１５／０１７６３７号、イベントＭＯＮ８７４０３（トウモロコシ、穀物、収穫高、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３５８４、国際公開第２０１５／０５３９９８号、イベント３２２１８（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３９１）国際公開第２０１５／１１２１８２号が挙げられる。
【０１１５】
Ｆ．ポリヌクレオチドコンストラクト
本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変し、植物細胞内での発現さを得るか、または発現を増大させてもよい。本明細書で同定するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、対象の植物内での発現のための発現カセット中に供給してもよい。「植物発現カセット」としては、組換えＤＮＡコンストラクトを含む、すなわち、植物細胞内のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができるＤＮＡコンストラクトが挙げられる。カセットは、５’−３’転写方向へ、対象の１つ以上のポリヌクレオチドに操作可能に連結する転写開始領域（すなわち、プロモーター、具体的には、異種プロモーター）、および／または植物内で機能する翻訳および転写終止領域（すなわち、終止領域）を含むことができる。カセットは、選択マーカー遺伝子など、生物に導入される少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。あるいは、複数の発現カセットに、追加のポリヌクレオチド（複数可）を供給することができる。このような発現カセットが、制御領域の転写制御下であるポリヌクレオチド（複数可）の挿入のための複数の制限酵素部位を備える。
【０１１６】
さらなる実施態様では、本発明は、植物発現可能プロモーターに操作可能に連結する本発明の異種核酸ならびに必要に応じて転写終止およびポリアデニル化領域を含んでなるコード配列を含んでなるキメラ遺伝子に関する。「異種」は、概して、細胞に内在しないかまたはそれが存在する天然のゲノムの位置に内在せず、かつ感染、トランスフェクション、微量注入法、エレクトロポレーション、顕微鏡投影法などによって細胞に加えられたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを表す。「操作可能に連結」は、二つのポリヌクレオチド間の機能連関を表す。例えば、プロモーターがＤＮＡ配列と操作可能に連結する場合、プロモーター配列はＤＮＡ配列の転写を開始および介在する。操作可能に連結したポリヌクレオチドは、連続しても連続していなくてもよく、２つのポリペプチドコード領域の連結を表すために使用する場合、該ポリペプチドは同じリーディングフレームにおいて発現すると認識される。
【０１１７】
プロモーターは、選択された植物細胞、植物部分、または植物において転写活性を示す任意のポリヌクレオチド配列であってよい。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列に対して、天然もしくは類似、または外来性もしくは異種性であってよい。プロモーターが植物宿主に対して「天然」または「類似」である場合、プロモーターを導入する天然植物内に該プロモーターが見出されることを表す。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に対して「外来性」または「異種性」である場合、該プロモーターは、操作可能に連結された本発明のＤＮＡ配列のための自然または天然のプロモーターではないことを表す。プロモーターは誘導性または恒常的であってよい。プロモーターは、天然でもよく、様々な天然プロモーターの一部からなってもよく、または部分的もしくは完全に合成されてもよい。プロモーターの設計ガイダンスは、Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361のものなど、プロモーター構造の研究により提供されている。転写開始に関連するプロモーターの配置も最適化してもよい。例えば、Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764参照。植物における用途に適した多くのプロモーターが当技術分野において周知である。
【０１１８】
例えば、植物の適切な構成的プロモーターとしては：ピーナッツ萎黄病線条カリモウイルス（ＰＣＩＳＶ）プロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812）；Kay et al. (1987) Science 236: 1299-1302に記載の３５Ｓプロモーター；クロレラウイルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子（米国特許第５，５６３，３２８号）およびｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス（ＦＭＶ）由来完全長転写プロモーター（米国特許第５，３７８，６１９号）のプロモーター；コメアクチンなどの遺伝子由来プロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 and U.S. Patent 5,641,876）；ユビキチン（Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）およびGrefen et al.(2010) Plant J, 64:355-365；ｐＥＭＵ（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；ＭＡＳ（Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730および米国特許第５，５１０，４７４号）；トウモロコシＨ３ヒストン（Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 and Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300）；ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＬＳ３（国際公開第９７／４１２２８号）；植物リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小サブユニット遺伝子；サーコウイルス（オーストラリア特許第６８９３１１号）またはキャッサバベインモザイクウィルス（ＣｓＶＭＶ、米国特許第７，０５３，２０５号）；ならびに様々なアグロバクテリウム遺伝子（米国特許第４，７７１，００２号；同第５，１０２，７９６号；同第５，１８２，２００号；および同第５，４２８，１４７号）などの植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【０１１９】
植物用途に適した誘導性プロモーターとしては、銅に反応するＡＣＥ１系由来プロモーター（Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571）、ベンゼンスルホンアミド除草剤の緩和剤に反応するトウモロコシＩｎ２遺伝子のプロモーター（Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237およびGatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38）、およびＴｎ１０由来Ｔｅｔ抑制因子のプロモーター（Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237）が挙げられる。植物における用途の別の誘導性プロモーターは、植物が通常反応しない誘導薬剤に反応するものである。この種の例示の誘導性プロモーターは、その転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導されるステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421）またはエストラジオールにより活性化されるエストロゲン受容体系誘導性植物発現系における用途のキメラ転写活性化因子であるＸＶＥの最近の応用である（Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273）。植物における用途の他の誘導性プロモーターは、欧州特許第３３２１０４号、ＰＣＴ国際公開第９３／２１３３４号、およびＰＣＴ国際公開第９７／０６２６９号（その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。他のプロモーターの一部からなるプロモーター、および部分的または完全な合成プロモーターも使用することができる。例えば、このようなプロモーターの植物における用途について記載している、Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676およびＰＣＴ国際公開第９５／１４０９８号参照。
【０１２０】
本発明の１つの実施態様では、種子特異的プロモーター（Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296）、特に、ナピンプロモーター（欧州特許出願公開第２５５３７８（Ａ１）号）、ファゼオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニン（helianthinin）プロモーター（国際公開第９２／１７５８０号）、アルブミンプロモーター（国際公開第９８／４５４６０号）、オレオシンプロモーター（国際公開第９８／４５４６１号）、ＳＡＴ１プロモーターまたはＳＡＴ３プロモーター（ＰＣＴ米国特許出願公開第９８／０６９７８号）などの植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列を使用して本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現することができる。
【０１２１】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ）、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）、ＰＲ１ファミリー遺伝子、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）およびｖｓｐＢプロモーター（米国特許第５，６７０，３４９号、表３）、ＨＭＧ２プロモーター（米国特許第５，６７０，３４９号）、リンゴベータガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）プロモーターおよびリンゴアミノシクロプロパンカルボン酸合成酵素（ＡＣＣ合成酵素）プロモーター（国際公開第９８／４５４４５号）から有利に選択される誘導性プロモーターも使用してもよい。継続的使用を含み、本発明のコンストラクトにおいて複数のプロモーターを使用することができる。
【０１２２】
プロモーターは、１つ以上のエンハンサーエレメントを含んでよく、またはこれを含むように改変されてもよい。いくつかの実施態様では、プロモーターは複数のエンハンサーエレメントを含んでもよい。エンハンサーエレメントを含むプロモーターは、これを含まないプロモーターに比較してより高いレベルの転写を提供する。植物における用途に適したエンハンサーエレメントとしては、ＰＣ１ＳＶエンハンサーエレメント（米国特許第５，８５０，０１９号）、ＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサーエレメント（米国特許第５，１０６，７３９号および同第５，１６４，３１６号）、およびＦＭＶエンハンサーエレメント（Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156）、国際公開第８７／０７６４４号に記載されたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、または例えばCarrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597に記載されるタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳活性化因子、またはトウモロコシのａｄｈ１イントロンもしくはコメアクチンのイントロン１などのイントロンが挙げられる。ＰＣＴ国際公開第９６／２３８９８号、国際公開第２０１２／０２１７９４号、国際公開第２０１２／０２１７９７号、国際公開第２０１１／０８４３７０号、および国際公開第２０１１／０２８９１４号も参照。
【０１２３】
このようなコンストラクトは、しばしば、５’および３’非翻訳領域を含むことができる。このようなコンストラクトは、対象のペプチドの、葉緑体（または他の色素体）、小胞体、もしくはゴルジ体などの特定の細胞内構造への、同時翻訳、または翻訳後輸送を促進するか、または分泌される、「シグナル配列」または「リーダー配列」を含んでもよい。例えば、コンストラクトを操作して、ペプチドの小胞体への転移を促進するシグナルペプチドを含むことができる。「シグナル配列」は、同時翻訳または細胞膜を横断する翻訳後ペプチド輸送をもたらすことが知られているか、またはもたらすと考えられている配列を表す。真核生物では、これは、通常、いくつかの得られたグリコシル化されたゴルジ体への分泌に関与する。「リーダー配列」は、翻訳する場合、ペプチド鎖を細胞内の細胞小器官へ同時翻訳輸送開始させるために十分なアミノ酸配列をもたらすいずれかの配列を表す。従って、これとしては、小胞体への通過、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどの通過による輸送および／またはグリコシル化を標的とするリーダー配列が挙げられる。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現に必要であるようなイントロンを含むように、植物発現カセットを操作することも好適であり得る。
【０１２４】
「３’非翻訳領域」は、コード配列の下流に位置するポリヌクレオチドを表す。ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸の付加経路に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナル配列および制御シグナルをコードする他の配列は、３’非翻訳領域である。「５’非翻訳領域」は、コード配列の上流に位置するポリヌクレオチドを表す。
【０１２５】
他の上流または下流の非翻訳エレメントとしては、エンハンサーが挙げられる。  エンハンサーは、プロモーター領域の発現の増大に作用するポリヌクレオチドである。エンハンサーは当技術分野において周知であり、ＳＶ４０エンハンサー領域および３５Ｓエンハンサーエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
終止領域は、転写開始領域を含む天然であってもよく、本発明の配列を含む天然であってもよく、別の源に由来してもよい。便利な終止領域は、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終止領域など、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから得られる。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639;、および欧州特許出願第０６３３３１７（Ａ１）号も参照。
【０１２７】
本発明の１つの面では、合成ＤＮＡ配列を、本発明のポリペプチドなどの所与のポリペプチドのために設計する。細胞内での合成ＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームの発現は、本発明のポリペプチドの産生をもたらす。合成ＤＮＡ配列は、単に必要のない制限エンドヌクレアーゼ部位を除去するため、ＤＮＡクローニングストラテジーを促進するため、任意の可能性あるコドンバイアスを変更または除去するため、ＧＣ内容物を変更または改善するため、代替のリーディングフレームを除去または変更するため、および／またはイントロン／エクソンスプライシング認識部位、ポリアデニル化部位、シャイン・ダルガノ配列、必要のないプロモーターエレメントおよび天然ＤＮＡ配列に存在し得る同様のものを変更または除去するために有用であり得る。合成ＤＮＡ配列は、イントロン配列の導入、葉緑体輸送ペプチド、アポプラスト／液胞標的ペプチドなどの細胞小器官標的配列にタンパク質融合として発現されたＤＮＡ配列、または小胞体内の得られたペプチドを保持するペプチド配列の創造など、ＤＮＡ配列に他の改良の導入するために利用してもよい。合成遺伝子を、発現改良のために宿主細胞優先的コドンを用いて合成することもでき、または宿主優先的コドンの利用頻度においてコドンを用いて合成してもよい。例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11；米国特許第６，３２０，１００号、同第６，０７５，１８５号；同第５，３８０，８３１号；および同第５，４３６，３９１号、米国特許出願公開第２００４／０００５６００号および同第２００１／０００３８４９号、ならびにMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498（参照することにより本明細書に組み入れられる）参照。
【０１２８】
１つの実施態様では、対象のポリヌクレオチドは、葉緑体に対し発現を標的とする。このように、対象のポリヌクレオチドを葉緑体に直接挿入しない場合、発現カセットは、対象のヌクレオチドを葉緑体へ配向するため、輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むだろう。このような輸送ペプチドは当技術分野において公知である。
例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481参照。
【０１２９】
葉緑体を標的とする対象のポリヌクレオチドを、葉緑体における発現が植物の核とこの細胞小器官との間でのコドン利用の差の主要因になるように最適化してもよい。このように、対象のポリヌクレオチドを、葉緑体優先的コドンを用いて合成してもよい。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号（参照することにより本明細書に組み入れられる）参照。
【０１３０】
この植物発現カセットを、植物形質転換ベクター中へ挿入することができる。「形質転換ベクター」は、細胞の形質転換を可能にするＤＮＡ分子を表す。このような分子は、１つ以上の発現カセットからなってもよく、かつ、１つより多いベクターＤＮＡ分子中に組織化してもよい。例えば、バイナリーベクターは、２つの隣接しないＤＮＡベクターを利用して、植物細胞の形質転換に対して全ての必須のシスおよびトランス作用機能をコードする植物形質転換ベクターである（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移動のために設計されたポリヌクレオチドコンストラクトを表す。「発現ベクター」は、外来細胞内に異種性のＤＮＡ配列またはフラグメントを取込み、組み込み、および発現する能力を有するベクターを表す。
【０１３１】
植物形質転換ベクターは、植物形質転換を行うための１つ以上のＤＮＡベクターを含んでなる。例えば、１つより多い連隣接するＤＮＡセグメントを含んでなる植物形質転換ベクターを利用することは、当技術分野において一般的な方法である。これらのベクターは、当技術分野において、バイナリーベクターと呼ぶことが多い。バイナリーベクターと同様にヘルパープラスミドを含むベクターも、効率的形質転換を達成するために必要なＤＮＡセグメントの大きさおよび複雑さが極めて大きい場合、アグロバクテリウムを介した形質転換のために最も頻繁に使用されており、別々のＤＮＡ分子上に機能を分別することが有利である。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡ移動に必要なシス作用配列（左境界および右境界など）を含むプラスミドベクター、植物細胞内で発現可能なように操作された選択マーカー、および「対象のポリヌクレオチド」（トランスジェニック植物の生成が望まれる植物細胞において発現可能なように操作されたポリヌクレオチド）を通常含む。このプラスミドベクターには、細菌複製に必要な配列も存在する。シス作用配列を、植物細胞内への効率的な移動およびその中での発現を可能とするように配置する。例えば、選択マーカー配列および対象の配列は、左境界と右境界との間に配置する。第２のプラスミドベクターには、しばしば、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移行を仲介するトランス作用因子が含まれる。当技術分野において理解されているように、このプラスミドは、しばしば、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、ならびに境界配列における切断によるＤＮＡ転移およびｖｉｒ媒介ＤＮＡ転移を可能にする毒性因子（Ｖｉｒ遺伝子）を含む（Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science,5:446-451）。いくつかの型のアグロバクテリウム株（例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を、植物の形質転換のために使用することができる。第２のプラスミドベクターは、顕微鏡投影法、微量注入法、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法によって植物内にポリヌクレオチドを導入するのに必要ではない。
【０１３２】
Ｇ．植物の形質転換
本発明の方法は、植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入することに関わる。「導入する」は、ヌクレオチドコンストラクトが植物細胞の内部へ接近可能な様式で、該コンストラクトを植物に提示することを意図する。本発明の方法では、植物にヌクレオチドコンストラクトを導入するために特別の方法を用いることは必用とされず、ヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも一つの細胞の内部へ接近可能であることのみが必要とされる。植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は当該技術分野において公知であり、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルスを介した方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，４５９，３５５号、米国特許第４，５３６，４７５号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第５、１７７，０１０号、米国特許第５，１８７，０７３号、欧州特許出願公開第２６７，１５９（Ａ１）号、欧州特許出願公開第６０４６６２（Ａ１）号、欧州特許出願公開第６７２７５２（Ａ１）号、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、米国特許第５，１００，７９２号、米国特許第５，３７１，０１４号、米国特許第５，４７８，７４４号、米国特許第５，１７９，０２２号、米国特許第５，５６５，３４６号、米国特許第５，４８４，９５６号、米国特許第５，５０８，４６８号、米国特許第５，５３８，８７７号、米国特許第５，５５４，７９８号、米国特許第５，４８９，５２０号、米国特許第５，５１０，３１８号、米国特許第５，２０４，２５３号、米国特許第５，４０５，７６５号、欧州特許出願公開第４４２１７４（Ａ１）号、欧州特許出願公開第４８６２３３（Ａ１）号、欧州特許出願公開第４８６２３４（Ａ１）号、欧州特許第出願公開５３９５６３（Ａ１）号、欧州特許第６７４７２５（Ａ１）号、国際公開第９１／０２０７１号、国際公開第９５／０６１２８号、国際公開第２０１１／０９５４６０号、国際公開第２０１２／００６４３９（Ａ２）号、国際公開第２０１２／００６４４３（Ａ２）号、国際公開第２０１２／０１５０３９（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０１９６６０（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０２１４９４（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０６４８２７（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０７５５６２（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０７７６６４（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０８３１３７（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０８４９６２（Ａ１）号、国際公開第２０１２／０９２５７７（Ａ１）号、国際公開第２０１２／１０９９４７（Ａ１）号、国際公開第２０１２／１２９４４３（Ａ２）号、国際公開第２０１２／１３８６２９（Ａ２）号、国際公開第２０１２／１３９４１６（Ａ１）号、国際公開第２０１２／１４９０１１（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０１４５８５（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０２５６７０（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０３３３０８（Ａ２）号、国際公開第２０１３／０６６００７（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０７７４２０（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０９０７３４（Ａ１）号、国際公開第２０１３／１４９７２６（Ａ１）号、国際公開第２０１３／１８０３１１（Ａ１）号、国際公開第２０１４／０２９０４４（Ａ１）号、国際公開第２０１４／０２９０４５（Ａ１）号、国際公開第２０１４／０６２０３６（Ａ１）号、国際公開第２０１４／０６５８５７（Ａ１）号、国際公開第２０１４／１００２３４（Ａ１）号、国際公開第２０１４／１００４０６（Ａ１）号、国際公開第２０１４／１２３２０８（Ａ１）号、国際公開第２０１４／１４３３０４（Ａ１）号、国際公開第２０１４／１４４５１３（Ａ２）号、国際公開第２０１４／１５７５４１（Ａ１）号、国際公開第２０１４／２００８４２（Ａ２）号、国際公開第２０１５／０５１０８３（Ａ１）号、国際公開第２０１５／０７７６２０（Ａ１）号、国際公開第２０１５／０８５９９０（Ａ１）号、国際公開第２０１５／０９９６７４（Ａ１）号、国際公開第２０１５／１１８６４０（Ａ１）号、国際公開第２０１５／１１９１６６（Ａ１）号（これら各々は、特に、その中に記載される形質転換方法に関して、参照することにより本明細書に取り入れられるものとする）に記載された植物細胞の形質転換法および植物の再生方法を参照。
【０１３３】
概して、植物の形質転換方法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未熟または成熟胚、懸濁培養液、未分化カルス、プロトプラストなど）内へ転移し、次いで、最大閾値濃度の適切な選択を行って（選択マーカー遺伝子に従って）、非形質転換細胞集団の群から形質転換植物細胞を回収することを含む。外植体を、通常、同培地の新鮮な補給に移動し、ルーチン的に培養する。その後、形質転換細胞を、最大閾値濃度の選択薬剤を加えた再生培地上に移配置した後、新芽へと分化させる。それから、根付いた新芽または小植物を回収するために、新芽を選択的発根培地に移動する。それから、トランスジェニック小植物は、成熟植物へ成長し、稔性種子を産生する（例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750）。外植体を、通常、同培地の新鮮な補給に移動し、ルーチン的に培養する。トランスジェニック植物を生成するための技術および方法についての一般的記述は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239およびBommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120に見出される。形質転換材料は多くの細胞を含むので；対象の標的カルスもしくは組織または細胞群のいずれかの一部に、形質転換および非形質転換細胞の両方が存在する。非形質転換細胞を死滅させ、かつ形質転換細胞の増殖を可能にする能力は、結果として形質転換植物培養をもたらす。しばしば、非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の継続的生成の制限となる。分子的および生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノム内に組み込まれた対象の異種遺伝子の存在を確認することができる。
【０１３４】
トランスジェニック植物の生成を、これに限定されないが、アグロバクテリウムによる植物細胞内への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム媒介形質転換）、植物細胞への粒子に付着した異種外来ＤＮＡの照射、および様々な他の非粒子性の直接法（例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120）を含む、ＤＮＡを転移させるためのいくつかの方法の１つにより行ってもよい。
【０１３５】
葉緑体の形質転換方法は、当技術分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606参照。方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達および相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、色素体形質転換を、核コード化され色素体を標的としたＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレント色素体由来トランスジーンのトランス活性化により行うことができる。このようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305で報告された。
【０１３６】
形質転換された細胞を、従来法に従って植物へと成長させてもよい。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84参照。それから、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株あるいは異なる株と授粉し、所望の表現型の特性を、恒常的発現を有するハイブリッドを同定してもよい。２世代以上を成長させて、所望の表現型特性の発現を安定的に維持し、遺伝によって受け継がせてから、所望の表現型特性の発現を保証するために収穫された種子を得たことを保証してもよい。このように、本発明は、本発明のヌクレオチドコンストラクト、例えば、そのゲノム内に安定的に取り込んだ本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ぶ）を提供する。様々な実施態様では、少なくとも１つの抗真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤、少なくとも１の除草剤、および／または少なくとも１の緩和剤、またはそのいずれかの組合せで、種子を被覆することができる。
【０１３７】
Ｈ．植物形質転換の評価
植物細胞内への異種外来ＤＮＡの導入後、形質転換または植物ゲノム内の異種遺伝子の組込みを、組込み遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の分析など様々な方法により確認する。
【０１３８】
ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前の早期段階で、形質転換細胞、組織または新芽を組込み遺伝子の存在について迅速にスクリーニングする方法である（Sambrook and Russell  (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)）。対象の遺伝子またはアグロバクテリウムベクターのバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。
【０１３９】
植物形質転換を、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析により確認してもよい（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１））。概して、形質転換体から全ＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲル中で分画し、ニトロセルロースまたはナイロン膜に転移する。それから、膜または「ブロット」を、例えば、標準的技術（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１）に従って、放射標識した３２Ｐ標的ＤＮＡフラグメントで探索して、植物ゲノム内の導入遺伝子の組込みを確認することができる。
【０１４０】
ノーザンブロット解析では、形質転換体の特定の組織からＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルにて分画し、当技術分野においてルーチン的に用いられる標準的手順に従ってナイロンフィルター上にブロットする（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１））。それから、当技術分野において公知の方法により、フィルターを放射性プローブとハイブリダイズすることにより、本発明のヌクレオチド配列によりコードされたＲＮＡの発現を試験する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）。ＲＮＡを、当技術分野で公知の逆転写酵素ＰＣＲを用いて検出および／または定量化することもできる（例えば、Green and Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY）。 
【０１４１】
除草剤耐性タンパク質に存在する１つ以上のエピトープと結合する抗体を用いた標準的手順（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１））により、トランスジェニック植物に対してウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ラテラルフロー試験、および生化学アッセイなどを行い、除草剤耐性遺伝子によりコードされたタンパク質の存在を決定してもよい。
【０１４２】
本発明の１つの面では、本明細書に記載されたＨＰＰＤ遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。
【０１４３】
Ｉ．形質転換に対するマーカーとしての使用
本発明は、植物の形質転換方法における、マーカー遺伝子として、またはＨＰＰＤ阻害剤である除草剤に対する耐性を植物に付与することを可能とするコード配列として、本発明に従ったＨＰＰＤをコードする核酸の使用、および本発明に従ったＨＰＰＤをコードする核酸配列を含んでなる植物における１つ以上のＨＰＰＤ阻害剤の使用にも関する。例えば、米国特許第６，７９１，０１４号（その全文を参照することにより本明細書に取り入れられるものとする）参照。
【０１４４】
この実施態様では、コンピテントな植物細胞内に、形質転換工程前に前記細胞を退色するように、ＨＰＰＤ阻害剤を導入することができる。それから、退色したコンピテントな細胞を、選択マーカーとしてＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性用遺伝子で形質転換し、前記選択マーカーをゲノム内に組込んだ形質転換細胞は緑化し、それらを選択可能とした。このような方法により、形質転換細胞を選択するために必要な時間が短縮することが可能となる。
【０１４５】
従って、本発明の１つの実施態様は、選択マーカーとしてＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性遺伝子と共に植物細胞内に異種遺伝子を導入することにより、前記植物細胞を形質転換する方法からなり、該方法は、適切な培地中で異種遺伝子を受けることのできるコンピテント植物細胞を調製および培養すること、およびコンピテント植物細胞の適切な培養培地中に適切な量のＨＰＰＤ阻害剤を導入することを含む。それから、コンピテント細胞を異種遺伝子および選択マーカーで形質転換し、異種遺伝子を含んでなる形質転換細胞を適切な培地中で成長させて、それから形質転換体を選択する。それから、形質転換細胞は、稔性形質転換植物へ再生することができる。
【０１４６】
Ｊ．植物および植物部分
「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚およびその子孫を表す。植物細胞は、分化していてもよく、分化していなくてもよい（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉）。これに限定されないが、単子葉植物および双子葉植物を含むいずれかの植物種にポリヌクレオチドを導入するために本発明を使用してもよい。対象の植物の例としては、トウモロコシ（corn）（トウモロコシ（maize））、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ類、野菜類、観賞植物類、および針葉樹類が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４７】
野菜類としては、トマト、レタス、サヤマメ、ライマメ、エンドウマメ、ならびにキュウリ、カンタロープ、およびマスクメロンなどのククミス属（genus Curcumis）のメンバーが挙げられるが、これに限定されない。観賞植物類としては、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられるが、これに限定されない。作物類も興味深く、例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなどが挙げられる。
【０１４８】
本発明は、これに限定されないが、トウモロコシ、コメ、オオムギ、カラスムギ類、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココナツ、およびデーツを含む単子葉植物ファミリーの任意のメンバーに好適である。
【０１４９】
Ｋ．植物の収穫高を増大させる方法
植物の収穫高を増大させる方法を提供する。方法は、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる植物を準備すること、または該ポリヌクレオチドを植物もしくは植物細胞内に導入すること、該植物またはその種子を圃場において成長させること、および前記植物または種子から収穫を得ることを含む。本明細書で定義されるとき、植物の「収穫高(yield)」は、植物により産生された生物量の品質および／または量を表す。「生物量」は、測定されたいずれかの植物産物を表す。生物量生産の増加は、測定された植物産物の収穫高におけるいずれかの改良である。植物収穫高の増加は、いくつかの商業的応用を有する。例えば、植物葉生物量の増加は、ヒトまたは動物消費用の葉菜の収穫高を増加し得る。加えて、葉生物量の増加は、植物由来医薬品または工業製品の生産を増加させるために利用可能である。収穫高の増加は、これに限定されないが、少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％、またはそれより多い増加を含むいずれかの統計的に有意な増加を含むことができる。
【０１５０】
特定の方法では、本発明のＨＰＰＤ配列を含んでなる植物を、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤からなる群から選択される１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤などのＨＰＰＤ阻害型除草剤の有効濃度で処理し、除草剤の施用により植物収穫高を向上させる。
【０１５１】
植物または植物部分に除草剤耐性を付与する方法も提供する。このような方法では、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を植物内に導入し、ポリヌクレオチドの発現がＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性をもたらす。この方法により生産した植物を、除草剤（トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤からなる群から選択される１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤など）の有効濃度で処理することができ、除草剤に対する耐性増強を示す。本願における除草剤の「有効濃度」は、除草剤に対する天然の耐性でも、与えられた耐性でもない植物または植物部分の成長を遅延または停止するために十分な量である。
【０１５２】
Ｌ．耕作地における雑草の防除方法
従って、本発明は、本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物の収穫物において望ましくない植物の防除または植物成長を調節する方法にも関し、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類から選択される１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤を、植物（例えば、単子葉または双子葉雑草などの有害植物または望ましくない作物）、種子（例えば、穀物、種子または塊茎などの野菜栄養分体または芽を含む新芽部分）または植物が成長する地区（例えば、栽培地区）に施用する。この関連で、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、
Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤からなる群から選択される１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤の有効濃度を、例えば、植え付け前（必要に応じて、土壌に取り込むことにより）、発芽前もしくは発芽後に施用することができ、作物が天然で耐性を有する、または１つ以上の他の除草剤耐性トランスジーンの発現により抵抗性を有する他の除草剤の施用と組合せてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００４／００５８４２７号および国際公開第９８／２０１４４号参照。「有効濃度」は、ＨＰＰＤ阻害剤耐性植物または植物種子に有意に影響することなく、雑草または他の非形質転換植物の成長または繁殖を制御する濃度を表す。除草剤の施用が多くの異なった形態を取ることができ、種まきおよび成長過程の前および／または全体にわたって、多くの異なる時間において起こり得ることを当業者は理解する。「発芽前」施用は、植物が土壌から目に見えるほどに発芽する前に対象の範囲（例えば、圃場または栽培区域）に施用する除草剤を表す。「発芽後」施用は、植物の土壌から見えるほどに発芽した後で範囲に施用する除草剤を表す。いくつかの例では、「発芽前」および「発芽後」という語は、対象の区域における雑草に関連して使用し、いくつかの例では、これらの用語は、対象の区域内の作物に関連して使用する。雑草に関連して使用する場合、これらの用語は、対象の区域に存在するかまたは存在すると考えられる雑草の特定の種類または種に対して施用してもよい。除草剤の「植え付け前混入」は、植え付け前の土壌に化合物を混入することを含む。
【０１５３】
従って、本発明は、本発明のＨＰＰＤポリペプチドを含んでなる植物またはその種子を圃場に植え付けること、および前記植物または前記植物の周囲の区域に、１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤の有効濃度を施用することを含む圃場における雑草の防除方法を含む。
【０１５４】
本発明の１つの実施態様では、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む植物（例えば、ダイズ、ワタ、トウモロコシ、またはコムギ植物など）を植え付けた圃場を、植物を植え付けるか、または種子をまく前に、イソキサフルトール（ＩＦＴ）などのＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理することができ、これは、ＨＰＰＤ阻害型除草剤により死滅した雑草をきれいにし、耕作しないことを可能とし、次いで、この同じ前処理圃場にあとで植物の植え付けまたは種まきを行う（ＨＰＰＤ阻害型除草剤を用いた焼き払いの応用）。ＩＦＴの残効性は、早期成長段階において発芽および成長する植物を雑草との競合から保護もするだろう。一旦、植物が特定の大きさになり、雑草が再び現れるならば、グルホシネートもしくはグリホサート、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤とグリホサートなどの別の除草剤との混合物を、このような植物が前記除草剤に対する耐性を有する場合、発芽後除草剤として植物の先端に施用することができる。
【０１５５】
本発明の別の実施態様では、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む種子を播種した圃場を、植物の発芽前だが種子を播種した後に、ＩＦＴなどのＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理することができる（圃場は、種まきの前に他の手段、典型的には、プラウイング、チセルプラウイング、または苗床準備などの従来の耕作を用いて雑草の無い状態にすることができる）が、発芽および成長する植物が雑草と競合しない（ＨＰＰＤ阻害型除草剤の発芽前施用）ように、残効性は、除草剤により死滅した雑草の圃場を維持するだろう。一旦、植物が特定の大きさになり、雑草が再び現れるならば、グルホシネートもしくはグリホサート、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤、またはＨＰＰＤ阻害型除草剤とグリホサートなどの別の除草剤との混合物を、このような植物が前記除草剤に対する耐性を有する場合、発芽後除草剤として植物の先端に施用することができる。
【０１５６】
本発明の別の実施態様では、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む植物を、まかれた種子から発芽した植物の先端にＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理することができ、これは、（例えば、スプレータンク混合して）一緒に施用することができるＨＰＰＤ阻害型除草剤により死滅した雑草の圃場をきれいにし、このような植物がこのような除草剤に対して耐性である場合、次いでまたは先行して、植物の先端に発芽後除草剤としてグリホサートまたはグルホシネートで処理する（ＨＰＰＤ阻害型除草剤（グリホサートと併用または単独）の発芽後施用）。
【０１５７】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤で防除することができる単子葉類および双子葉類の雑草の個々の代表例としては：
単子葉類有害植物の属：エギロプス属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ）、アグロピロン属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、アグロスチス属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、アロペクルス属（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ）、アペラ属（Ａｐｅｒａ）、アベナ属（Ａｖｅｎａ）、ブラキアリア属（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ）、ブロムス属（Ｂｒｏｍｕｓ）、ケンクルス属（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ）、コメリナ属（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ）、サイノドン属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、シペルス属（Ｃｙｐｅｒｕｓ）、ダクチロクテニウム属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ）、ジギタリア属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、エキノクロア属（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、エレオカリス属（Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ）、エレウシネ属（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、エラグロスチス属（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、エリオクロア属（Ｅｒｉｏｃｈｌｏａ）、フェスツカ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フィムブリスチリス属（Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｌｉｓ）、ヘテランテラ属（Ｈｅｔｅｒａｎｔｈｅｒａ）、インペラタ属（Ｉｍｐｅｒａｔａ）、イシャエムム属（Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）、レプトクロア属（Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、モノコリア属（Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ）、パニクム属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、パスパルム属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）、ファラリス属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、フレウム属（Ｐｈｌｅｕｍ）、ポア属（Ｐｏａ）、ロットボエリア属（Ｒｏｔｔｂｏｅｌｌｉａ）、サギタリア属（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）、シルプス属（Ｓｃｉｒｐｕｓ）、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）、ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）が挙げられ、
【０１５８】
双子葉類雑草の属：アブチロン属（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、アマランサス属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、アンブローシア属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、アノダ属（Ａｎｏｄａ）、アンテミス属（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）、アファネス属（Ａｐｈａｎｅｓ）、アルテミシア属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、アトリプレックス属（Ａｔｒｉｐｌｅｘ）、ベリス属（Ｂｅｌｌｉｓ）、ビデンス属（Ｂｉｄｅｎｓ）、カプセラ属（Ｃａｐｓｅｌｌａ）、カルドゥウス属（Ｃａｒｄｕｕｓ）、カシア属（Ｃａｓｓｉａ）、ケンタウレア属（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ）、ケノポディウム属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、シルシウム属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）、コンボルブルス属（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）、ダチュラ属（Ｄａｔｕｒａ）、デスモジウム属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）、エメックス属（Ｅｍｅｘ）、エリシマム属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、ユーフォルビア属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）、ガレオプシス属（Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ）、ガリンソガ属（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ）、ガリウム属（Ｇａｌｉｕｍ）、ハイビスカス属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）、イポメア属（Ｉｐｏｍｏｅａ）、コキア属（Ｋｏｃｈｉａ）、ラミウム属（Ｌａｍｉｕｍ）、レピジウム属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）、リンデルニア属（Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ）、マトリカリア属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、ムルゴ属（Ｍｕｌｌｕｇｏ）、ミオソチス属（Ｍｙｏｓｏｔｉｓ）、パパベル属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ファルビチス属（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ）、プランタゴ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）、ポリゴナム属（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ）、ポーチュラカ属（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ）、ラナンキュラス属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ラファヌス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、ロリッパ属（Ｒｏｒｉｐｐａ）、ロタラ属（Ｒｏｔａｌａ）、ルメックス属（Ｒｕｍｅｘ）、サルソラ属（Ｓａｌｓｏｌａ）、セネキオ属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、セスバニア属（Ｓｅｓｂａｎｉａ）、シダ属（Ｓｉｄａ）、シナピス属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ソラヌム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ソンクス属（Ｓｏｎｃｈｕｓ）、スフェノクレア属（Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ）、ステラリア属（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ）、タラキサクム属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、タラスピ属（Ｔｈｌａｓｐｉ）、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ウルチカ属（Ｕｒｔｉｃａ）、ベロニカ属（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）、ビオラ属（Ｖｉｏｌａ）、キサンチウム属（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）が挙げられる。
【０１５９】
これに限定されないが、トリケトン類（好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン）、ジケトニトリル類、イソキサゾール類（好ましくは、イソキサフルトール）、ヒドロキシピラゾール類（好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（好ましくは、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物２」とも呼ぶ）、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類（好ましくは、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以後、「化合物１」とも呼ぶ）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン（oxoprazine）誘導体、Ｎ−（トリアゾール−２−イル）アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のＨＰＰＤ阻害型除草剤を含む本発明において有用なＨＰＰＤ阻害型除草剤を、一般的な生物学的および／または物理化学的パラメーターに応じて、様々な方法で配合することができる。可能な処方物の例は：水和剤（ＷＰ）、水溶剤（ＳＰ）、水溶性濃縮剤、乳剤（ＥＣ）、水中油エマルションおよび油中水エマルションなどのエマルション（ＥＷ）、スプレー溶液、懸濁濃縮剤（ＳＣ）、油または水ベースの分散剤、油混和性溶液、カプセル懸濁液（ＣＳ）、粉剤（ＤＰ）、種子粉衣産製品、全面散布用途および土壌用の粒剤、微粒剤の形態の粒剤（ＧＲ）、スプレー粒剤、被覆粒剤および吸着粒剤、水分散性粒剤（ＷＧ）、水溶性粒剤（ＳＧ）、ＵＬＶ製剤、マイクロカプセル、およびワックスである。
【０１６０】
これら個々の型の処方は、原則的には公知であり、例えば、Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. Londonに記載されている。
【０１６１】
不活性材料、界面活性剤、溶媒、およびさらなる添加剤などの必要な配合助剤も公知であり、例えば、Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schoenfeldt, "Grenzflaechenaktive Aethylenoxidaddukte" [Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986に記載されている。
【０１６２】
これらの処方物に基づき、例えば成分調合済み混合物またはタンク混合物の形態で、例えば、殺虫剤、ダニ駆除剤、除草剤、抗真菌剤などの他の殺虫作用物質と、および緩和剤、肥料および／または成長制御因子との組合せを製造することも可能である。
【０１６３】
Ｍ．別の植物への本発明の遺伝子の導入方法
本明細書では、別の植物への本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列の導入方法も提供する。本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを、循環選択、戻し交配、系統育種、系統選択、集団選択、変異育種および／または高感度遺伝子マーカー選択により、第２植物に導入することができる。
【０１６４】
従って、１つの実施態様では、本発明の方法は、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含んでなる第１植物を第２植物と交配して、Ｆ１子孫植物を産出すること、およびＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性があるかまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含んでなるＦ１子孫植物を選択することを含む。方法は、選択した子孫植物を、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含んでなる第１植物と交配して、戻し交配子孫植物を産出すること、およびＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性があるかまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含んでなる戻し交配子孫植物を選択することをさらに含んでもよい。ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を評価する方法を、本明細書の他所に記載する。方法は、これらの工程を１回以上連続的に反復して、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性があるかまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含んでなる選択された第２またはそれを超える戻し交配子孫植物を産出することをさらに含んでもよい。
【０１６５】
本発明の方法では、所望の表現型のための植物の選択を含むいずれかの繁殖方法を使用することができる。いくつかの実施態様では、Ｆ１植物は自家受粉して分離Ｆ２世代を産出してもよい。それから、形質が同型接合かまたは育種集団内部で固定されるまで、各世代（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５など）において、所望の表現型（例えば、ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性）を示す個々の植物を選択してもよい。
【０１６６】
第２植物は、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養値、疾病抵抗性、改善された光合成、改善された繊維質、ストレス耐性、改善された再生などの望ましい形質を有する植物であり得る。第２植物は、本明細書の他所に記載するようにエリートイベントであってもよい。
【０１６７】
様々な実施態様では、植物部分（植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚など）を、得られた交配体から収穫し、下流の用途（例えば、食品、食餌、生物燃料、油、小麦粉、穀粉など）のために繁殖あるいは収集することができる。
【０１６８】
Ｎ．植物生成物を得る方法
本発明は、本発明のＨＰＰＤ配列を含んでなる作物由来の穀物を収穫および／または製粉して商品生産物を得ることを含む商品生産物を得るための方法にも関する。これに限定されないが、動物飼料、日用品、ならびにヒトが消費する食品としての用途または組成物およびヒトが消費する目的とした日用品中での用途を目的とした植物生成物および副産物を含む物の農学的および商業的に重要な生産物および／もしく物質組成物、具体的には、このような穀物／種子から産生された（半）処理製品を含む失活種子／穀物製品であって、前記製品は、完全もしく加工種子もしく穀物、動物飼料、コーンミールもしくダイズミール、トウモロコシ粉もしくはダイズ粉、トウモロコシ、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆（生、ロースト、または枝豆として）、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、ならびに調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイルド穀物などであるかまたは含んでなる前記失活種子／穀物製品は、これらの製品および物の組成物がこのようなヌクレオチド配列を含むいずれかの植物の特徴であるとして、本明細書に記載のヌクレオチド配列および／もしくはアミノ酸配列を検出可能な量を含む場合、本発明の範囲内であるものとする。
【０１６９】
以下の実施例を例証の目的で提供するが、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【０１７０】
概要
実施例１：部位特異的変異誘発による変異ＨＰＰＤポリペプチドの製造
実施例２：組換え野生型および変異ＨＰＰＤポリペプチドのクローニング、発現、および精製
実施例３：改良ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を有する変異ＨＰＰＤポリペプチドを分析するＨＰＰＤ酵素アッセイ
実施例４：ＨＰＰＤポリペプチドにおける残基交換により媒介された改良除草剤耐性
実施例５：ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する変異ＨＰＰＤポリペプチドを試験する茶色アッセイ（Brown Color assay）
実施例６：ダイズ形質転換およびＴ０ダイズ植物の耐性
実施例７：綿Ｔ０植物の樹立および選択
実施例８：アグロバクテリウム媒介形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
実施例９：ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対するＴ１ダイズ植物の耐性／圃場試験
【０１７１】
実施例１．部位特異的変異誘発による変異ＨＰＰＤポリペプチドの製造
配列番号１に相当するＨＰＰＤポリペプチドをコードする国際公開第２００９／１４４０７９号に記載のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤヌクレオチド配列（配列番号１０９）を、当技術分野において周知の方法および国際公開第２０１４／０４３４３５号に記載の通りに従ってクローニングした。その後、配列番号１に相当する組換えＨＰＰＤポリペプチドをコードする野生型ＰｆＨＰＰＤポリペプチドをコードする核酸の部位飽和変異誘発、部位特異的変異誘発および１つ以上の変異との組合せ変異体を、当技術分野において周知（および国際公開第２０１４／０４３４３５号に同様に記載の通り）の標準ＰＣＲベース技術を用いて行った。全設計および合成した変異クローンを、プラスミド特異的オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ塩基配列決定により確認した。表２．下記、例示の変異ＨＰＰＤポリペプチドを纏めている（配列番号２〜配列番号１０８）。
【０１７２】
【表３】
2018534911.tif 000004
2018534911.tif 000005
2018534911.tif 000006
【０１７３】
明確にするため、配列番号２〜配列番号１０８のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号１に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異ＨＰＰＤポリペプチドにおける交換のみ強調している。ここで示した変異ＨＰＰＤポリペプチドは、例証の目的のための例であって、限定することを目的としていない。
【０１７４】
実施例２：組換え野生型および変異ＨＰＰＤポリペプチドのクローニング、発現、および精製
組換えＨＰＰＤポリペプチドをコードする野生型および変異ＨＰＰＤの配列をコードする全ての得られた核酸を、当技術分野において周知の方法を用いてクローニングし、産生して精製した（Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY）。配列をコードする全ての得られた核酸を、国際公開第２０１４／０４３４３５号に記載のように、Ｎ末端Ｈｉｓタグと融合したｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ（アミノ酸配列Ｍ１−Ａ２−Ｈ３−Ｈ４−Ｈ５−Ｈ６−Ｈ７−Ｈ８−をコードする）にクローニングし、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ドイツ、フランクフルト）内で発現した。明確にするため、本発明における配列番号２〜配列番号１０８に相当する、表１〜５および表７中の変異ＨＰＰＤポリペプチドからのそれぞれのアミノ酸交換を含む全ての一覧した位置は、配列番号１に相当するＮ末端Ｈｉｓタグのない天然野生型ＨＰＰＤアミノ酸配列を表す。
【０１７５】
精製したＨＰＰＤポリペプチドサンプル作成のため、１４０ｒｐｍの５０ｍｌ振盪フラスコ内の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ培地において３７℃、３時間、細胞を増殖した。発現培養液用接種材料としてこのスターター培養液１ｍｌを使用した。１２０ｒｐｍの５００ｍｌ振盪フラスコ内の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５０ｍＭのヘペス（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）を含有する１００ｍｌのＬＢ培地において３７℃、約３時間、細胞を増殖した。約０．６のＯＤ６００において、ＩＰＴＧ（Ｒｏｔｈ社、ドイツ、カールスルーエ）を、０．４ｍＭの濃度まで添加した。３７℃、６０分間さらなる増殖の後、温度を２８℃に降下させて、１４０ｒｐｍでさらに１８時間増殖を続けた。４℃において、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内で３０分間、３２００ｇの遠心分離により、細胞を収穫して、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。細胞を溶解し、ヒスチジンタグをしたタンパク質を、収穫高増大するための次の適応を含む使用したＮｉ−ＮＴＡ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン）の製造者プロトコルに従って精製した：５０ｍｌの培養液からの細胞を４ｍｌに溶解し、ライセート上澄みを１８０００ｇ、１５分間遠心分離することにより生成した。カラム中のマトリックス量を、ＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン）各々の１ｍｌを添加することにより増加し、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）中に広範に再緩衝化した。ライセート上澄み液を適用し、４℃、１時間のインキュベートによりＨｉｓタグをつけたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡマトリックスと結合した。
【０１７６】
得られたタンパク質サンプルを、Ｚｅｂａ（商標）スピン型脱塩カラム（Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）、７Ｋ  ＭＷＣＯ、１０ｍL（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、ウォルサム）の使用により、２０ｍMトリス、２０％グリセロール（ｐH７．８）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）中に再緩衝化し、Ａｂｓ２８０（ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、ウォルサム）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質濃度および純度について分析した。精製タンパク質の濃度は、約９０％の推定純度により、概して、０．６〜４．６ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１７７】
阻害アッセイの残効性決定のためのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ)中の粗ＨＰＰＤポリペプチド抽出物作成のため、標準９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、ウォルサム）中、１％グルコース（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４０または１５０μｌのＬＢ培地中で、３７℃の湿度インキュベーター内において約１８時間インキュベートして、細胞を増殖した。
【０１７８】
このスターター培養液３０μｌを、９６ウェルプレート（２ｍｌディープウェル；ＨＪ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ社、ドイツ、エルケレンツ）内の発現培養液用接種材料として１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５０ｍＭのヘペス（MＭｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）を含有するＬＢ培地６００μｌに添加した。プレートをアルミ箔により密封し、７５０ｒｐｍのプレート振盪機で３７℃、５時間細胞をインキュベートした。１ｍＭの最終濃度においてＩＰＴＧの添加しより発現を誘発した後、７５０ｒｐｍのプレート振盪機上で３０℃、約１８時間さらに密閉インキュベートした。
【０１７９】
上澄みを捨てながら、４℃、２５００ｇ、１５分間の遠心分離により、細胞を収穫した。細胞ペレットを−８０℃で貯蔵し、４℃および１０００ｒｐｍで３０分間、再懸濁した細胞をインキュベートすることにより１：２５０００希釈ＢＮａｓｅ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン）と一緒に、１４０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）中の１ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）２５０μｌ中に溶解した。４℃、２５００ｇで１５分間、遠心分離によりライセートを清澄化し、その後の４組の試験のため、上澄み１５０μｌを標準９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、ウォルサム）中に移した。
【０１８０】
実施例３：改良ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を有する変異ＨＰＰＤポリペプチドを分析するＨＰＰＤ酵素アッセイ
ＨＰＰＤポリペプチドの活性を、結合ＨＰＰＤ活性アッセイを用いてＨＰＰＤ阻害剤の非存在または存在下において決定した（図１）。
【０１８１】
残効性の決定のため、決定された基質変換の見かけ速度定数（ｋａｐｐ）を、ＨＰＰ由来ＨＰＰＤにより生成されたホモゲンチシン酸（ＨＧＡ）が第二酵素ホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＧＤ）により良好に吸収する分子マレイルアセト酢酸（ＭＡＡ）に直接変換される結合アッセイにおいて３２０ｎｍにおける吸光度の動態変化として測定し、全てのアッセイにおいて過度に同様に適用した（図１参照）。プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００またはＭ１０００ＰＲＯ、Ｔｅｃａｎ社、スイス、メンネドルフ）により、３８４マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ、フリッケンハウゼン）で測定を行った。酵素活性のｋｃａｔ／ｋＭ比は、見かけの速度定数ｋａｐｐに比例し、ｋｃａｔ／ｋＭ＊［Ｅ］（［Ｅ］＝酵素濃度）に比例する。競合的阻害剤は、非飽和基質濃度において、ｋＭが見かけ増加して、それによりｋａｐｐが逆に減少することを示す。阻害剤の存在および非存在下でのｋａｐｐ双方の測定を、粗または精製し、それにより同じ濃度における同じ酵素サンプルの使用により行った際、酵素濃度は、残効性の計算から除かれ、ｋａｐｐ双方の比は阻害によるｋＭの変化を直接示す。注目すべき、この概念は、「競合的阻害」で相互作用する酵素／阻害剤対に当てはまり、おそらく、本明細書に記載されたほとんど全てのポリペプチド変異体および阻害剤に対して正しいが、非可逆的に阻害される野生型ポリペプチドに関しては確実にそうではない（比較のため、国際公開第２０１４／０４３４３５号、図２および３参照）。結果として、「競合的阻害」を表す野生型ＨＰＰＤポリペプチドの残効性およびｋｉ値を、正しく算出することができず、それにもかかわらず、例証の目的のため、野生型ＨＰＰＤポリペプチドについて表３に実測でない値を示すが、これは非可逆的阻害が起こる前に初期シグナル変化により算出している。
【０１８２】
生ＨＰＰＤポリペプチドサンプルにおいて残効性決定のために使用したアッセイ溶液は、２００ｍＭリン酸ナトリウム（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット、ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）、２０ｍＭアスコルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、０．１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、４０μＭ  ＦｅＳＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、約８ｍｇ／ｍｌ精製ＨＧＤおよびＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）中の１Ｍ原液からの低濃度または高濃度の基質ＨＰＰ（１００または４００μＭ）からなり、氷上で２０分間、平衡化した。全ＨＰＰＤポリペプチドサンプルについて、４組の２つのアッセイを行ったが、それにより、ＨＰＰＤポリペプチドサンプル５μｌを、それぞれ、参照および阻害アッセイにおいて緩衝液５μｌ（１ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｍｅｒｋ社、ドイツ、ダルムシュタット）；１４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８、１：２５０００希釈ＢＮａｓｅ（登録商標）；Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン））またはＤＭＳＯ中０．１Ｍ原液から同じ緩衝液で希釈した阻害剤５μｌ（３０、１００または１２０μＭは、ＨＰＰＤポリペプチド／阻害剤サンプルの１５、５０および６０μＭを得る）と最初に混合し、次いで、アッセイ溶液１０μｌと混合した。３０分間に１分の間隔で３２０ｎｍにおける吸光度変化を追跡した。動態反応の初期段階、通常、測定の最初５〜１０分間においてシグナルの経時的な勾配としてｋａｐｐ値を算出した（図３比較）。加えておよび算出した残効性に従って、全変換、すなわち、３０分の時間枠におけるシグナルの絶対変化を、代謝回転の測度としてモニターし、残存代謝回転を、阻害剤の存在下におけるシグナル変化を阻害剤なしの参照サンプルにおけるシグナル変化で割ることにより算出した。
【０１８３】
ｋｉ値決定のために使用したアッセイ溶液は、同様に、試験した４つの阻害剤濃度の各々についてＨＰＰ基質の６つの異なる濃度（０〜１３５０μＭ）を含有して成る。阻害剤を１４０ｍＭトリス、０．０５％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）中に希釈し、それぞれのＨＰＰＤポリペプチド／阻害剤対に対して選択した濃度で適用して動的データを生成した（図４ａ〜ｄ）；概して、それらのＨＰＰＤポリペプチド／阻害剤サンプル濃度は、０〜０．００１２Ｍの範囲であった。
【０１８４】
実施例４：ＨＰＰＤポリペプチドにおける残基交換により媒介された改良除草剤耐性
変異ＨＰＰＤポリペプチドの耐性をＨＰＰＤ阻害型除草剤の異なる利用可能な化学分類（トリケトン類、イソキサゾール類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、またはＮ−（テトラゾール−５−イル）アリールカルボキサミド類）に対して決定する場合、本発明の新規実施態様のいくつかは、参照野生型ＨＰＰＤ（配列番号１）と比較して有意に改良されているだけでなく、実施例として本発明の配列番号２を有する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（例えば、国際公開第２０１４／０４３４３５号に開示されているものの様な）より予想外に良好であることが明らかになった。
【０１８５】
表３の概要として、本発明の配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）は、位置３３５、３３６、３３９および３４０において残基交換を含む。
【０１８６】
３３５（Ｅ＝＞Ｐ）、３３６（Ｇ＝＞Ｄ／Ｈ）、３３７（Ｎ＝＞Ｓ）を含んでなる変異ＨＰＰＤポリペプチドに基づいて、位置２６４、２６８、２７０、３３０、３４０および／または３４５におけるさらなる残基交換の導入は、様々な化学分類に属する複数の施用されたＨＰＰＤ阻害剤に関して、強力に改良された耐性を示す変異ＨＰＰＤポリペプチド（表３）を生成した。
【０１８７】
従って、本発明者らは、残効性改良、より高い残存代謝回転、より高いｋｉ値およびそれによる有意に高い除草剤耐性を示す、位置３３５（グルタミン酸＝＞プロリン）、３３６（グリシン＝＞アスパラギン酸／ヒスチジン）、３３７（アスパラギン＝＞セリン）における組合せの残基交換および、必要に応じて、位置２０４、２１３、２６４、２６８、２７０、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９、３４０、３４４および／または３４５（表３、４および５）における交換をさらに含んでなる組合せの残基交換により新規変異ＨＰＰＤポリペプチドを生成し評価した。試験したＨＰＰＤ阻害型除草剤に依存して、配列番号２と比較して、１．５〜１１０倍のレベルで、このようなアッセイで使用したＨＰＰＤポリペプチドに関して、改良レベルは異なり得る（表４）。
【０１８８】
異なるＨＰＰＤ阻害型除草剤化学分類に対する時間経過の分析は、配列番号１に相当する野生型ＨＰＰＤポリペプチド遅く強固な結合阻害剤特性と対照的に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤は、新規変異ＨＰＰＤポリペプチドに対して可逆的阻害剤であるように思われることを明らかにした（図２および３参照）。これらの挙動は、様々なＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する作物の耐性のためのより良好で用途の広い可能性を提供する。
【０１８９】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在下の高い残効性のため、本発明の配列番号１に相当するＨＰＰＤポリペプチドのアミノ酸位置に対して、表１中に強調した、開示した位置および残基交換が重要であることが示されている。
【０１９０】
表３：多種多様な化学分類に属する異なるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する変異ＨＰＰＤポリペプチドの耐性
【０１９１】
【表４】
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【０１９２】
【表５】
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【０１９３】
【表６】
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【０１９４】
【表７】
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【０１９５】
（ａ）化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、（ｂ）化合物２（２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、（ｃ）メソトリオン（ＭＳＴ）、および（ｄ）ジケトニトリル（ＤＫＮ）の存在下および非存在下において、それぞれ、ｋａｐｐおよび総シグナル変化の測定により、残効性および残存代謝回転を実施例３に従って決定した。各変異ＨＰＰＤポリペプチドについて、ＨＰＰＤ阻害型除草剤なしでのｋａｐｐおよび総シグナル変化は、除草剤の存在下におけるｋａｐｐおよび総シグナル変化の正規化に役立った。それぞれの表３ａ）、３ｂ）、３ｃ）、および３ｄ）中の纏めて得られた「％値」は、５％の平均標準偏差を有する２つの独立した実験の平均である。１５μＭの濃度の化合物１および化合物２ならびに６０μＭの濃度の他の２つの除草剤（ＤＫＮ、ＭＳＴ）を含む高基質濃度で反応を行った。明確にするため、配列番号２〜配列番号１０８のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号１に相当するアミノ酸と同一として定義し、ＨＰＰＤポリペプチド変異体における交換のみ強調している。略語「ｎ．ｉ．」は、所与の濃度において阻害が観察されなかった、すなわち、阻害剤の存在下においてｋａｐｐおよび総シグナル変化が阻害剤の非存在下における対応する値と比較して減少しないことを意味する。
【０１９６】
配列番号１に従ったＨＰＰＤポリペプチドに関して位置３３５、３３６、３３７、３４０、および３４５におけるアミノ酸交換を含む配列番号１０および配列番号２４に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドは、試験した様々なＨＰＰＤ阻害剤の存在下残効性および残存代謝回転に関して有意な改良を示す（表３ａ〜ｄ）。表した配列番号１０の除草剤耐性は、４つ全ての異なる除草剤分類にわたって、改良対野生型ＨＰＰＤポリペプチド（配列番号１）だけでなく対本発明の配列番号２に相当する従来技術（国際公開第２０１４／０４３４３５号）変異ＨＰＰＤポリペプチドを示す。
【０１９７】
ＨＰＰＤ阻害剤耐性のさらなる改良は、開示したアミノ酸位置２６８および２７０における残基交換を有する変異体によく表れている。
【０１９８】
配列番号２４から始まって、配列番号３１は、言及した位置２６８および２７０においてのみ異なる。これらの変化は、ＨＰＰＤ阻害剤化合物１およびＭＳＴ（表３ａおよび３ｃ）の存在下において残存代謝回転を有意に増加させ、化合物２（表３ｂ）およびＤＫＮ（表３ｄ）の存在下において既に達成した高い残存代謝回転を保持する。これらの結果は、ＨＰＰＤポリペプチド（配列番号１）、および本発明における配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）と比較して、配列番号３１の有意に改良されたｋｉ値によっても見られる。
配列番号８に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドから始まって、アミノ酸３３０（配列番号１２参照）のさらなる変化は、さらに改良されたＨＰＰＤ阻害剤耐性を示す（表３参照）。
【０１９９】
配列番号１２に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドから始まって、アミノ酸位置２６４（配列番号１８参照）のさらなる変化は、化合物１および化合物２に対するさらに有意に改良されたＨＰＰＤ阻害剤耐性を示す（表３ａ、３ｂ参照）。
【０２００】
結果として配列番号１９に導く配列番号１０に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドの先端上の４つの位置２６４、２６８、２７０、３３０に全ての前述の交換を導入して、化合物１に対する６８％および７９％の残効性および残存代謝回転を有する表３ａ中の全ての示したポリペプチドの最強の耐性を検出し、開示したアミノ酸位置における組合せの残基交換の重要性を示した。配列番号２と比較した化合物１および化合物２に対する改良されたｋｉ値を有する配列番号１９に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチド。
【０２０１】
【表８】
2018534911.tif 000011
【０２０２】
明確にするため、配列番号２〜配列番号１０８のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号１に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異ＨＰＰＤポリペプチドにおける交換のみ強調している。ここで示した変異ＨＰＰＤポリペプチドは、例証の目的のための例であって、限定することを目的としていない。
実施例３に従って、化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、化合物２（２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、およびメソトリオン（ＭＳＴ）の濃度を増加して、初期反応速度を測定することにより、データを得た。概して、ＨＰＰの６つの異なる濃度（０〜１３５０μＭ）およびそれぞれの阻害剤の４つの異なる濃度を適用した（図４参照）。阻害剤濃度をそれぞれのＨＰＰＤポリペプチド／阻害剤対のために選定して動的データを生成した、すなわち、より低い耐性を有する変異体をより低い阻害剤濃度の範囲で分析し、１２００μＭ以下の濃度を最大耐性を有する変異体用に使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、カリフォルニア州ラホヤ）を競合的阻害モードに従った制限を適用してデータ解析および速度定数のフィッティングのために使用した。明らかな異常値が出現した場合、または非常に高い基質濃度で得られた活性が競合的阻害モードを基礎とする数学に従わなかった場合、それぞれの値をフィッティングから除外した。
【０２０３】
既に有意に改良された２つの変異ＨＰＰＤポリペプチド配列番号１７および配列番号１９に基づいて生成された系統的変異体のいくつかの結果を表５中に概要を示している。
【０２０４】
配列番号１７および配列番号１９は２つのアミノ酸位置において異なり、配列番号２に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドと比較して、化合物１に対して配列番号１７は約２０倍、配列番号１９は約３０倍増加したｋｉを示す（表４参照）。
【０２０５】
配列番号１７に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドは、位置２６８、２７０、３３５、３３６、３３７、３４０、および３４５において残基交換を有し、２９％の残効性を示し、基質代謝回転は５０μＭの化合物１の存在下４６％のみ減少する。位置２６８、２７０、３４０、３４５の残基のそれぞれ野生型残基（配列番号１に従った）への復帰変異は、これらの位置および変異の有利な特性を際立たせながら、それぞれ（表５；それぞれ、配列番号７１、配列番号６３、配列番号８１、配列番号８８）、１９％、２４％、１７％、および２０％の残効性への耐性低下を伴う。
【０２０６】
従って、配列番号１９の位置３４５における残基バリンのそれぞれの野生型残基イソロイシンへの復帰変異は、残効性が６７％から５７％へ低下を伴う（表５；配列番号９３）。
【０２０７】
一方、位置２０４、２１３、２６４、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９または３４４における配列番号１７へのさらなる１つの残基交換の導入は、結果として、少なくとも１つの変異体の全位置に３８％より大きい残効性のさらなる有意な増加をもたらした、例えば、Ａ２０４Ｍ（配列番号４０）、Ｒ２１３Ｌ（配列番号４４）、Ｍ２６４Ｋ（配列番号６７）、Ｑ３１０Ｋ（配列番号６５）、Ｔ３１５Ｒ（配列番号４５）、Ｄ３３０Ｖ（配列番号３８）、Ｄ３３１Ｉ（配列番号４９）、Ｆ３３８Ｖ（配列番号５３）、Ｋ３３９Ｅ（配列番号５５）およびＳ３４４Ｐ（配列番号５８）。
【０２０８】
要約すれば、ＨＰＰＤポリペプチドにおいて変異３３５（グルタミン酸（Ｅ）＝＞プロリン（Ｐ））、３３６（グリシン（Ｇ）＝＞アスパラギン酸（Ｄ）／ヒスチジン（Ｈ））、および３３７（アスパラギン（Ｎ）＝＞セリン（Ｓ））を超えた特定のさらなる残基交換は、除草剤耐性の改良をもたらし、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性の改良を付与する開示した位置２０４、２１３、２６４、２６８、２７０、３１０、３１５、３３０、３３１、３３８、３３９、３４０、３４４、３４５のさらなる重要性を示す（表５）。最終的に、これらの開示した位置の組合せは、野生型ＨＰＰＤポリペプチド（配列番号１）および本発明の配列番号２に相当する従来技術変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）と比較して、表４（例えば、配列番号９９、１００、１０５、および１０７）に示すように、異なるＨＰＰＤ阻害剤分類にわたってｋｉ改良をもたらし、化合物１に対して１００倍より大きく、化合物２に対して９０倍以下、同時に、メソトリオン（ＭＳＴ）に対して約７倍以下の改良をもたらす。
【０２０９】
【表９】
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【０２１０】
明確にするため、配列番号２〜配列番号１０８のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号１に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異ＨＰＰＤポリペプチドにおける交換のみ強調している。低基質濃度における化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）（５０μＭ）の存在下および非存在下において、それぞれ、ｋａｐｐおよび総シグナル変化の測定により、残効性および残存代謝回転を実施例３に従って決定した。各変異ＨＰＰＤポリペプチドについて、ＨＰＰＤ阻害型除草剤なしでのｋａｐｐおよび総シグナル変化は、除草剤の存在下におけるｋａｐｐおよび総シグナル変化の正規化に役立ち、得られた％値を纏める。
【０２１１】
実施例５：ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を有する変異ＨＰＰＤポリペプチドを試験する茶色アッセイ（Brown Color assay）
変異ＨＰＰＤポリペプチドを、茶色アッセイを用いて分析した（国際公開第２０１４／０４３４３５号）。本発明に従った変異ＨＰＰＤポリペプチドを発現する細菌細胞を、ＬＢ寒天、発現ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ用選択剤（国際公開第２０１４／０４３４３５号）、５ｍＭチロシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、４２ｍＭのコハク酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）、および６つの異なる濃度のＨＰＰＤ阻害型除草剤化合物１（０〜５００μＭ）を含有する固形培地上にスポッティングすることによりＨＰＰＤ阻害剤耐性について９６ウェルフォーマットで評価した。
【０２１２】
茶色アッセイでは、それぞれの変異ＨＰＰＤポリペプチドの１つを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の一夜培養液を、１および１０μｌ抽出物のＯＤ６００まで希釈し、０、２５、５０、１００、２５０、または５００μＭの化合物１を含有するプレート上に３回繰り返しスポットした。プレートを微孔性テープで被覆し、３０℃でインキュベートした。２４時間後、室温、暗所で細胞を保持し、７日後、茶色色素形成を目視で採点した。ＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在下、ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ＨＰＰＤポリペプチドが発現されて活性でない限り、この色素形成は阻害され、寒天プレートの色は変化しない。採点「＋＋＋」は、ＬＢ寒天プレート中阻害剤なしでそれぞれの変異ＨＰＰＤポリペプチドの１つを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で見られるように焦げ茶色化を意味する。「＋＋」および「＋」は、それぞれ、中程度および淡い茶色色素沈着をスコア化し、「０」はＬＢ寒天プレートに茶色色素沈着の発色が検出されなかったことを意味する。
【０２１３】
【表１０】
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【０２１４】
表６に纏めた例示の変異ＨＰＰＤポリペプチドは、本発明の配列番号１に相当するＨＰＰＤポリペプチドと比較して、化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）に対する改良された耐性を示した。既に、２５μＭの化合物１の濃度において、ＨＰＰＤポリペプチド（配列番号１に相当する）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、茶色色素沈着を生じず、いくつかの変異ＨＰＰＤポリペプチドは暗〜中程度の茶色色素沈着を示す。
本発明の配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）は、２５０μＭの化合物１において、わずかな茶色色素沈着のみ呈し、５００μＭの化合物１において茶色色素沈着は見られず、細胞内で発現されたＨＰＰＤポリペプチドが完全に阻害することを例証した。  比較すると、配列番号３１、３２、９６、および特に配列番号１０４を有する表６に示したいくつかの変異ＨＰＰＤポリペプチドは、２５、５０、１００、２５０、およびさらに５００μＭの化合物１の存在下、より強い茶色の発色を示す。
【０２１５】
追加の実験では、変異ＨＰＰＤポリペプチドを、比色茶色アッセイの原理を用いて分析した（例えば、米国特許第６，７６８，０４４号に記載されているように）。改良されたＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を有するＨＰＰＤポリペプチドについて９６ウェルプレートフォーマット（Ｎｕｎｃ（登録商標）  ９６  ＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）プレート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）中で、本発明に従ったＨＰＰＤポリペプチドを発現する細菌細胞を評価した。
【０２１６】
ＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、化合物１（１０００μＭ）、の存在下または非存在下(in the presence of absence of the HPPD inhibitor herbicide)、発現ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ（国際公開第２０１４／０４３４３５号）用選択剤および５ｍＭのパラヒドロキシフェニルピルビン酸塩（ＨＰＰ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、セントルイス）を含有する液体ＬＢ培地（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ、カールスルーエ）中で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を増殖した。
【０２１７】
本発明に従ったそれぞれのＨＰＰＤポリペプチドの１つを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養液の一夜培養液を、５００μＬの最終体積中０．３〜０．５のＯＤ６００に調製した。化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）の存在下および非存在下、茶色の生成（ＢＣＦ）を測定することにより、残りの茶色の生成を決定した。
【０２１８】
従って、９６時間後、培養液を遠心分離し、培養液の上澄み液を使用して、４４０ｎｍにおける可溶性茶色色素生成の光学密度（ＯＤ４４０ｎｍ）を測定した。
【０２１９】
【表１１】
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【０２２０】
表７に纏めた例示の変異ＨＰＰＤポリペプチドは、本発明の配列番号１に相当するＨＰＰＤポリペプチドおよび配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）と比較して、化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）に対する改良された耐性を示した。配列番号１および配列番号２に相当する両方のＨＰＰＤポリペプチドは、ＨＰＰＤ阻害剤の存在下、実質的に茶色色素沈着を生じなかった。いくつかの変異ＨＰＰＤポリペプチドは、中程度〜焦げ茶色色素沈着を示した。それぞれの表７中に纏めた得られた％値は、５％の平均標準偏差を有する少なくとも２つの独立した実験の平均値である。
【０２２１】
実施例６：ダイズ形質転換およびＴ０ダイズ植物の耐性
基本的にPaz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206に記載の方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介形質転換ダイズ半種子外植体を用いる記載の方法など当技術分野において周知の方法を使用することにより、ダイズの形質転換を行った。選択マーカーとしてＨＰＰＤ阻害型除草剤「テンボトリオン」を使用することにより、形質転換体を同定した。若芽の出現を観察し、ＨＰＰＤ阻害型除草剤テンボトリオンに対する耐性の指標として記録した。耐性トランスジェニック新芽は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤テンボトリオンで処理していない野生型ダイズ新芽と同等の正常な緑化を示したが、同量のＨＰＰＤ阻害型除草剤テンボトリオンで処理した野生型ダイズ新芽は完全に白化した。これは、それぞれのＨＰＰＤポリペプチドの存在が、テンボトリオンなどのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を可能とすることを示した。
【０２２２】
耐性若芽を、発根培地に移動するかまたは移植した。根付いた小植物を、順応期間後に温室へ移動した。それから、トランスジーンを含む植物を、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、３００〜６００ｇ  ＡＩ／ｈａの速度でメソトリオンを、または１５０ｇ〜３００ｇＡＩ（グラム有効成分）／ｈａ（ヘクタール）の速度で硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）を散布した。散布後５〜１０日目に、除草剤の施用による症状を評価し、同条件下で野生型植物に観察される症状と比較した。
【０２２３】
例えば、本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性ＨＰＰＤポリペプチドを含む、「植物発現カセット」を有するＴ０ダイズ植物を、化合物１の耐性に対して試験した。
【０２２４】
トランスジェニック植物での温室試験前に(Prior greenhouse trials with the transgenic plants)、ダイズ形質転換物を、ＥＬＩＳＡタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在についてルーチン的に分析した（項目ＤおよびＨの詳細説明参照）。選択培地で回収し、検出可能ＨＰＰＤトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみ、除草剤耐性分析に使用した。各散布前に、ＤｅＶｒｉｅｓ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｓｐｒａｙｅｒを較正した。化合物１用に使用した化学配合物に硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した。ヘクタール当たり３００グラムＡＩ（３００ｇＡＩ／ｈａ）と同じ濃度で散布試験を行った。散布後５日目に耐性を評価した。同じ除草剤配合物を散布した野生型ダイズ植物を全部白化し、先端の２つの三葉の葉が９５％より多くの葉の損傷を示した。「１」の採点は、わずかな耐性を有する植物に与えたが、すなわち、先端の２つの三葉の葉は有意な白化を示し、５０〜９５％の葉の損傷を有して回復の症状をほとんど示さない。「２」の採点は、中程度の耐性を示す植物に割り当てたが、すなわち、先端の３つの三葉の葉の葉面積の１０〜４９％が除草剤処理に対する耐性の有意な量を示す。「３」の採点は、良好な耐性を示す植物に割り当てたが、すなわち、先端の３つの三葉の葉の葉面積の１０％未満が黄化または非常にわずかな白化のみ示す。結果を表８に纏める。
【０２２５】
【表１２】
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【０２２６】
表８中の結果は、独立したダイズＴ０イベントが、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、化合物１で処理した野生型ダイズコントロール植物とも比較して、３００ｇＡＩ／ｈａの割合でＨＰＰＤ阻害型除草剤化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）に対して耐性を有することを示している。
配列番号３２、配列番号９６、および配列番号３１に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドを有するＴ０ダイズイベントの９０％より多くは、５０％未満の葉の損傷を有し、従って、本発明の配列番号２に相当する８３％の割合の従来技術のＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）Ｔ０集団より良好である。加えて、配列番号３２に相当する変異ＨＰＰＤポリペプチドを有するＴ０ダイズイベントの約７２％は、１０％未満の葉の損傷を示し、これは、また、本発明の配列番号２に相当する従来技術のＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）を過剰発現するＴ０ダイズイベント集団（５４％）と比較して改良を示している。
【０２２７】
追加の温室試験では、例示の変異ＨＰＰＤポリペプチドを含むコンストラクト当たりの２１〜９１の独立したＴ０ダイズイベントに、３００グラムＡＩ／ｈａの割合で、硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加したＨＰＰＤ阻害型除草剤化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）を散布した。散布後５日目、ＨＰＰＤ阻害型除草剤が理由である葉の損傷面積を、０（損傷なし）〜１００（完全に白化）の基準で採点する。これらの条件下、野生型植物は完全に白化したが、これらの損傷採点は９５〜１００の範囲であった。
【０２２８】
表９は、例示の変異ＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチド（配列番号）に対するパーセンタイル値として、ＨＰＰＤ阻害型除草剤損傷採点データ分布を示す。パーセンタイル値は、集団内の個々の植物から損傷スコアのランクを正規化する。２５番目のパーセンタイル値は、所与の集団内の２５％のダイズイベントがより低く、７５％がより高い損傷スコアを有した場合の損傷スコアである。メディアンは、５０番目のパーセンタイル値である。半分は、値がより高い損傷スコアであり；半分はより低い損傷スコアである。７５番目および９０番目のパーセンタイル値は、７５％および９０％のダイズイベントが、それぞれ、より低い損傷イベントを有した場合の損傷スコアである。７５番目および２５番目のパーセンタイル値間の差を、四分位範囲と呼び、集団内の散布を定量化するマーカーである。全てのコンストラクトは、ダイズゲノム内に１つの単一カセット挿入のみ有した。
【０２２９】
表９中、最小〜最大スコアの７５番目パーセンタイル値に従って損傷スコアに基づいて、コンストラクトをランク付けした。全ての例示のＨＰＰＤポリペプチド変異体は、全パーセンタイル値解析において、本発明の配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）より良好である。本発明の配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）の採点を、表９の最下行に一覧にしている。
【０２３０】
【表１３】
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【０２３１】
実施例７：綿Ｔ０植物の樹立および選択
当技術分野において周知の方法、特に好ましくは、国際公開第００／７１７３３号に記載のものにおける方法を使用することにより、ワタ形質転換を行う。再生植物を温室に移動する。順応期間後、十分に成長した植物に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した１００または２００ｇＡＩ／ｈａに相当するテンボトリオンを散布する。散布後７日目に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤での処理による症状を評価し、同条件下で同処理をした野生型ワタ植物に観察された症状と比較する。
【０２３２】
実施例８：アグロバクテリウム媒介形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
トウモロコシ植物およびトウモロコシ形質転換における安定な発現のための植物発現カセットの構築は当技術分野において周知であり、この特定の例では、国際公開第２０１４／０４３４３５号および国際公開第２００８／１００３５３号に方法は記載されており使用した。本願における変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、ＥＰＳＰＳタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列でスタックして、ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する耐性を付与する。ＥＰＳＰＳ遺伝子を単離し、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）（国際公開第２００８／１００３５３号）から変異し、輸送ペプチド配列とインフレームで結合して翻訳されたタンパク質の転座を葉緑体に導いた。それぞれ、ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローンの上流および下流である、ユビキタスプロモーター（サトウキビ由来ユビキチン４プロモーター、米国特許第６，６３８，７６６号）、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス由来３５Ｓ転写終結配列で、安定な発現が達成する。
【０２３３】
対応する変異ＨＰＰＤポリペプチドを、ＥＰＳＰＳ遺伝子発現カセットで記載したのと同じプロモーター、葉緑体輸送ペプチド、および転写終結配列でクローンするだろう。両方の遺伝子をコードする配列は、トウモロコシ発現に最適化されたコドンである。トウモロコシ形質転換のため、受粉後８〜１２日目に穂を最適な状態で収穫する。穂から胚を分離し、これらの胚は、大きさ０．８〜１．５ｍｍが、形質転換に用いるために好ましい。胚盤側を上にして、胚を適切なインキュベーション培地上にまき、暗所において２５℃で一夜インキュベートする。
【０２３４】
しかしながら本来、胚を一夜インキュベートする必要はない。Ｔｉプラスミド介在転移のため、約５〜１０分間、本発明のヌクレオチド配列を有する適切なベクターを含むアグロバクテリウム株と胚を接触させてから、共培養培地上にまいて約３日間培養する（暗所で２５℃）。共培養後、外植体を、約５日間、回復期間培地に移動する（暗所で２５℃）。使用する特定の選択方法の性質および特性に従って、外植体を選択培地中で最長８週間グリホサートと一緒にインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟した体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟用培地に移動する。それから、得られた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野において公知の再生方法を開始する。得られた新芽を、発根培地上で根付かせて、得られた植物を苗床ポットに移動して、トランスジェニック植物として繁殖させる。ＥＬＩＳＡタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在について植物をルーチン的に分析する。選択培地で回収し、検出可能ＨＰＰＤトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみ、除草剤耐性分析に使用する。
【０２３５】
実施例９．ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対するＴ１ダイズ植物の耐性／圃場試験
本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性ポリペプチドを単独、またはグリホサートに対する耐性を付与する遺伝子および／またはグルホシネートに対する耐性を付与するかまたは本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性ポリペプチドのみを含む「植物発現カセット」を有する遺伝子と共に発現するダイズ植物を、異なるＨＰＰＤ阻害型除草剤化学分類に対する耐性について試験した。ＥＬＩＳＡタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在について、トランスジェニック植物をルーチン的に分析した（項目ＤおよびＨの詳細説明参照）。選択培地で回収し、検出可能ＨＰＰＤトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみを再生し、温室に移動し、温室においてＴ０ダイズイベントのＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性分析のためにＶ２〜Ｖ４成長段階で使用した（実施例６）。ＨＰＰＤ阻害型除草剤を含む化学配合物に硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した。散布後５〜２１日目に除草剤耐性評価を行った。
【０２３６】
最良の独立したＴ０ダイズイベントを自家受粉してＴ１ダイズ種子を産生した。
【０２３７】
圃場試験では、後生的Ｔ１ダイズ種子を植えて、Ｖ２〜Ｖ４成長段階においてイソキサフルトール２１０ｇ／ｈａかあるいは化合物１（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）１５０ｇ／ｈａで処理し（表１０）、ＨＰＰＤ阻害型除草剤施用後８日葉の損傷を採点した。全ての野生型ダイズ植物またはＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチドを含まない分離されたＴ１ダイズ植物に、同じ除草剤配合物を散布し、全部白化したが、散布後８日目１００％の葉損傷を示した。
【０２３８】
表１０では、良好な耐性を示す、すなわち、全葉面積の１５％以下の損傷を示すダイズイベントの発生頻度を纏めている。
【０２３９】
ここに一覧した全ての例示のＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性ポリペプチド変異体は、１５％以下の葉損傷を含み良好な耐性を有する集団においてより高い発生頻度を有し、従って、本発明の配列番号２に相当する従来技術の変異ＨＰＰＤポリペプチド（国際公開第２０１４／０４３４３５号）より良好であった。
【０２４０】
表１０．イソキサフルトール２１０ｇ／ｈａ（表１０ａ）または化合物１の１５０ｇ／ｈａ（表１０ｂ）のいずれかで処理した異なるＨＰＰＤポリペプチド変異体を発現する成長段階Ｖ２〜Ｖ４において例示のトランスジェニックＴ１ダイズイベントからの葉面積損傷の圃場試験評価。
【０２４１】
【表１４】
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【０２４２】
【表１５】
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【０２４３】
本明細書で言及したすべての出版物および特許出願は、本発明に関係する当業者の技術水準を示すものである。すべての出版物および特許出願は、あたかも個々の出版物または特許出願各々が、具体的かつ個別に参照することにより組み入れられるよう指示されたのと同じ程度まで、参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のため例証および実施例を用いて少し詳しく記載したが、特定の変更および修飾が添付の請求の範囲内で実施してもよいことは明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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