(57)【要約】  対象における異常なインテグリンαｖβ３の活性に関連付けられる疾患を治療するための組成物及び方法が開示される。本方法は、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）がインテグリンαｖβ３に結合することを阻害するＰＫＭ２アンタゴニストを含む有効量の組成物を対象に投与することを伴う。
2018512445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における異常なインテグリンανβ３発現に関連付けられる疾患を治療するための方法であって、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）アンタゴニストを含む有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記ＰＫＭ２アンタゴニストが、ＰＫＭ２がインテグリンανβ３に結合することを阻害する、方法。
【請求項２】
前記ＰＫＭ２アンタゴニストが、ＰＫＭ２に選択的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＫＭ２アンタゴニストが、抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＭ２アンタゴニストが、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＡでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＫＭ２のドメインＡの配列が、ＡＲＧＤＬＧＩＥＩＰＡＥＫＶＦＬＡＱＫＭＭＩＧＲＣＮＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＫＭ２のドメインＡの配列が、ＱＭＬＥＳＭＩＫＫＰである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＢでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＫＭ２のドメインＢの配列が、ＥＶＥＬＫＫＧＡＴである、請求項１〜５及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＫＭ２のドメインＢの配列が、ＩＳＬＱＶＫＱＫＧＡである、請求項１〜５及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＣでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＫＭ２のドメインＣの配列が、ＤＶＤＬＲＶＮＦＡＭＮＶＧＫＡである、請求項１〜５及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＫＭ２のドメインＣの配列が、ＫＫＧＤＶＶＩＶＬＴＧＷＲである、請求項１〜５及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＫＭ２アンタゴニストが、ＰＫＭ２に選択的に結合するペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が、線維性疾患である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記線維症疾患が、アテローム性動脈硬化症、喘息、心筋線維症、移植臓器線維症、コロイド及び肥厚性瘢痕、筋線維症、膵線維症、腎障害、骨髄線維症、間質性肝線維症、肝硬変及び胆嚢硬変、強皮症、肺線維症、びまん性実質性肺疾患、特発性間質性線維症、間質性肺臓炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎、間質性肺疾患、急性間質性肺臓炎、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、リンパ球性間質性肺炎、腎線維症、ならびに慢性腎臓疾患からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が、骨粗鬆症である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が、リウマチ性疾患である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）に特異的に結合し、ＰＫＭ２がインテグリンαｖβ３に結合することを阻害する分子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
分子薬が、中和抗体を含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
中和抗体が、ヒト化抗体である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記中和抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＡでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項２４または２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
ＰＫＭ２のドメインＡの配列が、ＡＲＧＤＬＧＩＥＩＰＡＥＫＶＦＬＡＱＫＭＭＩＧＲＣＮＲである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
ＰＫＭ２のドメインＡの配列が、ＱＭＬＥＳＭＩＫＫＰである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＢでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項２４または２５に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ＰＫＭ２のドメインＢの配列が、ＥＶＥＬＫＫＧＡＴである、請求項２４、２５、及び２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
ＰＫＭ２のドメインＢの配列が、ＩＳＬＱＶＫＱＫＧＡである、請求項２４、２５、及び２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記モノクローナル抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記抗体が、ドメインＣでＰＫＭ２に特異的に結合する、請求項２４または２５に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
ＰＫＭ２のドメインＣの配列が、ＤＶＤＬＲＶＮＦＡＭＮＶＧＫＡである、請求項２４、２５、及び３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
ＰＫＭ２のドメインＣの配列が、ＫＫＧＤＶＶＩＶＬＴＧＷＲである、請求項２４、２５、及び３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体であって、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年２月２６に申請された米国仮特許出願第６２／１２１，３３８号の利益を主張し、これは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
本開示の主題は概して、対象における異常なインテグリンαｖβ３発現に関連付けられる疾患を治療するための組成物及び方法に関する。より具体的に、本方法は、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）がインテグリンαｖβ３に結合することを阻害するＰＫＭ２アンタゴニストを含む有効量の組成物を対象に投与することを伴う。
【背景技術】
【０００３】
ここで、インテグリンαｖβ３が、活性化マクロファージ依存性炎症、破骨細胞形成、遊走、及び骨吸収、ならびに炎症性血管新生において、重大な役割を担うという観点を支持する、データの実質的及び説得力のある本論が存在する。これらのプロセスの全てが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）及び関連する関節症の発病において重要な役割を担う。よって、異常なインテグリンαｖβ３活性を特異的に阻害する薬剤が必要とされる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で開示されるように、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）は、インテグリンαｖβ３上で作用することにより筋線維芽細胞分化を助長する。よって、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との相互作用を撹乱または防止するための方法が開示される。本方法は、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との結合／相互作用を阻害するＰＫＭ２アンタゴニストを含む有効量の組成物を対象に投与することを伴う。ＰＫＭ２アンタゴニストは、インテグリン相互作用部位でまたはその付近でＰＫＭ２に結合することによりこの相互作用を効果的に阻害する任意の分子であり得る。例えば、ＰＫＭ２アンタゴニストは、抗体（例えば、ヒト化抗体またはフラグメント）、小分子、ペプチド、またはペプチド模倣物であり得る。
【０００５】
開示される組成物及び方法は、異常なインテグリンαｖβ３発現を伴う任意の疾患または状態を治療するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、アテローム性動脈硬化症、喘息、心筋線維症、、筋線維症、膵線維症、骨髄線維症、間質性肝線維症、肝硬変及び胆嚢硬変、強皮症、肺線維症、びまん性実質性肺疾患、特発性間質性線維症、間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎、間質性肺疾患、急性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、リンパ球性間質性肺炎、腎線維症、または慢性腎臓疾患などの線維性疾患を治療する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象における線維症及び／または病変の瘢痕化を阻害または予防する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本方法は、骨粗鬆症を治療する。骨粗鬆症は、活性化破骨細胞活性による過剰に活性な骨吸収により引き起こされる。活性化破骨細胞は、高レベルのインテグリンαｖβ３を発現する。細胞外ＰＫＭ２は、破骨細胞活性化及びアポトーシス抵抗性における役割を担う可能性が高い。したがって、開示されるＰＫＭ２アンタゴニストは、骨粗鬆症治療に効果的であり得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本方法は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、関連するリウマチ性疾患及び関節症、または自己免疫疾患を治療する。これらの疾患は全て、インテグリンαｖβ３シグナル伝達の活性化によるマクロファージの活性化を伴う。
【０００８】
ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）がインテグリンαｖβ３に結合することを特異的に撹乱する中和抗体（例えば、ヒト化抗体またはフラグメント）と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物も開示される。
【０００９】
本開示の主題の１つ以上の実施形態の詳細が、付随の図面及び以下の発明を実施するための形態に記載される。本開示の主題の他の特徴、目的、及び利点は、発明を実施するための形態及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＤＦａ細胞内のα−−ＳＭＡの細胞レベルをα−ＳＭＡの免疫ブロット（ＩＢ：α−ＳＭＡ）により分析した図１Ａ、抗α−ＳＭＡ（緑）、ローダミンファロイジン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）を含むＨＤＦａ細胞のＩＦ染色の代表的な画像の図１Ｂ、左に示す表示の薬剤で細胞を処理した図１Ｃ、表示の薬剤により処理したＨＤＦａ細胞内のリン酸化Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、及びα−ＳＭＡの細胞レベルを免疫ブロット（ＩＢ：ｐ−Ｓｍａｄ２、ＩＢ：Ｓｍａｄ２／３、及びＩＢ：α−ＳＭＡ）により分析した図１Ｄを含む、筋線維芽細胞分化を助長するＰＫＭ２の画像を示す。
【図２】細胞外ＰＫＭ２がインテグリンαｖβ３シグナル伝達を活性化することを示すグラフ及び画像を含む。ｒＰＫＭ２−ＨＤＦａのＨｉｓタグプルダウン架橋バンドのトリプシン消化からのペプチドフラグメント（下線）が架橋し、インテグリンβ３及びＰＫＭ２のアミノ酸配列に一致するＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ／ｔｏｆにより分析される。
【図３】５μｇ／ｍｌのＬＭ６０９（塗り潰し無しの棒）またはＢＳＡ（塗り潰された棒）の存在下で、バッファ、ｒＰＫＭ１、及びｒＰＫＭ２コーティングプレートへのＨＤＦａ細胞の接着を示す棒グラフを含む。接着は、観測視野毎のプレートに接着した細胞の総数として提示される。誤差棒は、５回の独立した実験の測定からの標準偏差である。
【図４】ＨＤＦａ細胞内のα−ＳＭＡの細胞レベルを、α−ＳＭＡの免疫ブロット（ＩＢ：α−ＳＭＡ）により分析したことを示す画像を含む。細胞を、表示の薬剤により処理した。
【図５】ＨＤＦａ細胞内のリン酸化ＦＡＫの細胞レベルを、リン酸化ＦＡＫ（ＩＢ：ｐ−ＦＡＫ）に対する抗体を使用して調査したことを示す画像を含む。細胞を、表示の薬剤により処理した。ＦＡＫの免疫ブロット（ＩＢ：ＦＡＫ）は、総ＦＡＫのレベルを表示する。（Ｃ）及び（Ｄ）において、ＧＡＰＤＨの免疫ブロットは、ローディングコントロールである。
【図６】創傷部位の血管新生に対するＰＫＭ２抗体の効果を例示する画像を含む。（左）タンパク質Ｇ／Ａビーズによりモノクローナル抗体ＩｇＧＰＫまたはウサギ免疫前血清（ＩｇＧＣｏｎ）から精製されたＩｇＧ。（右）ＳＷ６２０細胞抽出物中のＩｇＧＰＫの精製されたＩｇＧによるＰＫＭ２の特異的認識。
【図７】α−ＳＭＡ染色が線維芽細胞ＥＲ−ＴＲ７染色と共存することを示す画像を含む。マウスα−ＳＭＡ（緑）、マウス平滑筋ミオシン重鎖（上、赤）、及びＥＲ−ＴＲ７（下、赤）に対する抗体を含む創傷組織切片の免疫染色の代表的な画像。青は、ＤＡＰＩ染色である。組み合わせは、３つの色染色の重なりである。組織切片を、創傷誘発の３日後の創傷の組織試料から調製した。
【図８】ＰＫＭ２が、インテグリンαｖβ３との相互作用により作用することを示す画像を含む。図８Ａは、ｒＰＫＭ２とＨＤＦａ細胞表面タンパク質との架橋が、ＰＫＭ２の免疫ブロット（ＩＢ：ＰＫＭ２）により明らかになったことを示す。ｒＰＫＭ２を、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｈｙｄｅ）によりＨＤＦａ細胞に架橋した。抽出物を、架橋細胞から調製した。ＨｉｓタグｒＰＫＭ２を、Ｎｉビーズにより調製抽出物からプルダウンした。Ｎｉビーズ沈降物を、免疫ブロットにより分析した。図８Ｂは、インテグリンβ３とＰＫＭ２（ＩＰ：ＩｇＧＰＫ）との共免疫沈降であり、インテグリンβ３の免疫ブロット（ＩＢ：β３）により調査した。ＰＫＭ２の免疫ブロット（ＩＢ：ＰＫＭ２）は、沈降するＰＫＭ２の量を表示する。免疫前血清から精製したＩｇＧ（ＩＰ：ＩｇＧＣｏｎ）を使用する免疫沈降は、コントロールの免疫沈降である。ＩｇＧヒーブ鎖の免疫ブロット（ＩｇＧ  ＨＣ）は、各免疫沈降で使用されたＩｇＧの量を表示した。
【図９】ＰＫＭ２がＰＩ３Ｋの活性化により作用することを例示する画像を含む。図９Ａは、表示の薬剤の存在下で、ＨＤＦａ細胞内のｐ２１−依存性キナーゼ２（ＰＡＫ２）の活性化を、リン酸化ＰＡＫ２の免疫ブロット（ＩＢ：Ｐ−ＰＡＫ２）により分析したことを例示する。総細胞ＰＡＫ２の免疫ブロット（ＩＢ：ＰＡＫ２）は、ＰＡＫ２の総細胞レベルを表示するコントロールである。図９Ｂは、表示の処理におけるＨＤＦａ細胞内のα−ＳＭＡの発現を、α−ＳＭＡの免疫ブロット（ＩＢ：Ｄ−ＳＭＡ）により分析したことを示す。ＧＡＰＤＨの免疫ブロット（ＩＢ：ＧＰＤＨ）は、ローディングコントロールである。
【図１０】Ｂｉａｃｏｒｅチップ上で不動化されたインテグリンを用いてＢｉａｃｏｒｅにより監視された、ＦＢＰの存在下で、インテグリンαｖβ３へのｒＰＫＭ２、ｒＰＫＭ１、ＢＳＡ、及びｒＰＫＭ２の結合の代表的な結合曲線を示すグラフである。
【図１１】インテグリンαｖβ３ヘッドピースへのＰＫＭ２二量体の合体を例示する図である。合体モデルを、ｒＰＫＭ２と組み換えインテグリンαｖβ３との間の化学架橋に基づいて算定した。
【図１２】ｒＰＫＭ２二量体とインテグリンαｖβ３ヘッドピースとの間の化学架橋マップを例示する図を含む。同じ色に塗られた残基は、インテグリンとＰＫＭ２との間の各々対応する架橋の対を表す。
【図１３】ＰＫＭ２（塗り潰された棒）及びウサギＩｇＧ（塗り潰し無しの棒）に対するモノクローナル抗体の存在下で、ｒＰＫＭ２へのインテグリンαｖβ３の結合のＥＬＩＳＡ分析を示す棒グラフを含む。まず、３μＭのｒＰＫＭ２を、プレート上にコーティングした。様々な濃度の抗体またはＩｇＧを、インテグリンαｖβ３と混合し、プレートに添加した。広範囲に洗浄後、コーティングされたｒＰＫＭ２へのインテグリンαｖβ３の結合を、ＥＬＩＳＡの読み出しとしてインテグリンに対する第２の抗体により決定し、１００％の抗体またはＩｇＧの不在下で結合インテグリンを定義することにより相対結合インテグリンとして提示した。誤差棒は、５回の反復実験による標準偏差を表す。
【図１４】ＰＫＭ２（塗り潰された棒）及びウサギＩｇＧ（塗り潰し無しの棒）に対するモノクローナル抗体の存在下で、ｒＰＫＭ２へのインテグリンαｖβ３の結合のＥＬＩＳＡ分析を示す棒グラフを含む。まず、３μＭの組み換えインテグリンαｖβ３を、プレート上にコーティングした。様々な濃度の抗体またはＩｇＧを、ｒＰＫＭ２と混合し、プレートに添加した。広範囲に洗浄後、コーティングされたインテグリンαｖβ３へのｒＰＫＭ２の結合を、ＥＬＩＳＡの読み出しとしてＰＫＭ２に対する第２の抗体により決定し、１００％の抗体またはＩｇＧの不在下で結合ｒＰＫＭ２を定義することにより相対結合ｒＰＫＭ２として提示した。誤差棒は、５回の反復実験による標準偏差を表す。
【図１５】抗ＰＫＭ２抗体（塗り潰された棒）またはウサギＩｇＧ（塗り潰し無しの棒）の存在下で、ＰＫＭ２（３μＭ）コーティングプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の接着を、広範囲に洗浄した後に細胞を数えることにより分析したことを示す棒グラフを含む。顕微鏡視野（平均、４つの視野）毎の接着細胞を数えた。誤差棒は、５回の反復実験による標準偏差を表す。
【図１６】ＰＫＭ２が肝線維症の進行を促進することを示すグラフを含む。
【図１７】ＰＫＭ２抗体からなる処理が、肝線維症を後進させたことを示すグラフを含む。
【図１８】ＰＫＭ２抗体は、ブレオマイシン誘発肺線維症を後進させた。肺線維症は、ブレオマイシンにより誘発される。
【００１１】
定義
用語「線維症」は、臓器または組織内の過剰な線維性結合組織を伴う任意の疾患または状態を指す。
【００１２】
用語「中和する」は、抗体などの薬剤がリガンドに特異的に結合して、リガンドの生物活性を遮断または阻害する能力を指す。中和抗体は、その標的抗原のいくつかの生物学的活性を阻害または破壊する抗体である。
【００１３】
用語「抗体」は、標的抗原に結合または選択的に結合する天然または合成抗体を指す。この用語には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれる。完全免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、及び標的抗原に選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化形態も含まれる。
【００１４】
「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均質な集団から得ることができ、すなわち、集団内の個別の抗体は、ごく一部の抗体分子中に存在し得る自然発生の可能性がある突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体には、一部の重鎖及び／または軽鎖が、特定の種を由来とするか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中で対応する配列と同一または相同性があるが、残りの鎖（複数可）は、別の種を由来とするか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中で対応する配列と同一または相同性がある「キメラ」抗体、ならびに、かかる抗体のフラグメントが、それらが所望の拮抗的活性を示す限り含まれる。モノクローナル抗体は、ウサギ及びマウスが含まれるが、それらに限定されない種を由来とし得る。
【００１５】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基により別のアルファアミノ基に結合される２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を指すために互換的に使用される。
【００１６】
タンパク質の「活性」には、例えば、キナーゼによる転写、翻訳、細胞内転座、分泌、リン酸化、プロテアーゼによる切断、他のタンパク質への同種親和性及びヘテロ親和性結合、ユビキチン化が含まれる。
【００１７】
用語「ペプチド模倣物」は、通常のペプチド化学のいくつかの変化を含むペプチドの模倣物を指す。ペプチド模倣物は典型的に、増加する安定性、増加した有効性、高まった送達、増加した半減期などの元のペプチドのいくつかの特性を高める。既知のポリペプチド配列に基づくペプチド模倣物の作製方法は、例えば、米国特許第５，６３１，２８０号、同第５，６１２，８９５号、及び同第５，５７９，２５０号に記載される。ペプチド模倣物の使用は、所定の位置で非アミド連鎖を有する非アミノ酸残基の組み込みを伴い得る。
【００１８】
用語「特異的に結合する」は、タンパク質及び他のバイオロジーの不均質集団内で抗原または受容体の存在が確定的である結合反応を指す。概して、第２の分子（例えば、抗原）に「特異的に結合する」第１の分子（例えば、抗体）は、その第２の分子に対して、約１０５Ｍ−１超の親和定数（Ｋａ）（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、及び１０１２Ｍ−１以上）を有する。
【００１９】
用語「対象」は、投与または治療の標的である任意の個人を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは動物の患者であり得る。用語「患者」は、臨床医、例えば、内科医の治療を受けている対象を指す。
【００２０】
用語「治療上有効な」は、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を緩和するのに十分である組成物の量を指す。かかる緩和は、低減または変化のみを必要とし、疾患または障害の排除は必要ではない。
【００２１】
用語「薬学的に許容される」は、安全な医療判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を起こすことなく、人間及び動物の組織と接触して使用するのに好適であるそれらの化合物、材料、組成物、及び／または投薬形態を指す。
【００２２】
用語「治療」は、疾患、病的状態、または障害を、治癒、緩和、安定、または予防する目的で患者を医療管理することを指す。この用語には、積極的治療、つまり、特に疾患、病的状態、または障害の改善に向けて進められる治療が含まれ、また、原因治療、つまり、関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けて進められる治療も含まれる。加えて、この用語には、緩和医療、つまり、疾患、病的状態、または障害の治癒よりもむしろ症状の軽減のために考案された治療；予防治療、つまり、関連する疾患、病的状態、または障害の形成を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に阻害することに向けて進められる治療；及び補助的治療、つまり、関連する疾患、病的状態、または障害の改善に向けて進められる別の特異的な治療法に対して補助的に用いられる治療が含まれる。
【００２３】
用語「阻害する」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの減少を指す。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な切除が含まれ得るが、これらに限定されない。これには、例えば、天然型またはコントロールのレベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％の低減も含まれ得る。または、コントロールレベル。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１〜１８に関して、特定の実施形態は、開示される組成物及び方法を使用するためのＰＫＭ２アンタゴニストを含む。ある特定の実施形態は、対象においてＰＫＭ２がインテグリンαｖβ３に結合する能力を阻害する、（集合的及び個別に「ＰＫＭ２結合部位」と称されるドメインＡ（α−ヘリックス６′〜α−ヘリックス６、及びα−ヘリックス７′）、ドメインＢ：（β−シート１及びβ−シート５）、及び／またはドメインＣ（α−ヘリックス５〜β−シート４）でＰＫＭ２に特異的に結合するＰＫＭ２アンタゴニストを含む。これらの構造的特徴またはドメインは詳しく特徴付けられ、例えば、Ｍａｔｔｅｖｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，７２９−７４１（１９９５）で見ることができる。
【００２５】
抗体／ＰＫＭ２アンタゴニスト
１つの特定の実施形態において、ＰＫＭ２またはＰＫＭ２結合部位アンタゴニストは、抗体である。開示される組成物及び方法で使用され得る抗体には、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、完全抗体）、それらのフラグメント、及び抗体の抗原結合可変ドメインを少なくとも含有する合成タンパク質が含まれる。可変ドメインは、抗体の配列で異なり、各々の特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性で使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均等には分配され得ず、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中され得、両方とも、軽鎖及び重鎖可変ドメインにある。可変ドメインのより高く守られた部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然型重及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータ−シート構成を大幅に取り入れ、３つのＣＤＲにより連接され、環連接を形成し、いくつかの場合、ベータ−シート構造の部分を形成する４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接近で、他の鎖からのＣＤＲと一つにされ、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。よって、開示される抗体は、ＰＫＭ２に結合するために必要なＣＤＲを少なくとも含有し、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との結合／相互作用を阻害する。
【００２６】
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法が、当技術分野で知られている。任意のかかる既知の方法が、本出願との関連で、ＰＫＭ２またはＰＫＭ２結合部位に特異的に結合するヒト抗体を作製するために使用され得る。モノクローナル抗体を生成するための既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ＰＫＭ２またはＰＫＭ２結合部位に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションにあるように、抗体は特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特質に関して選択される。マウス定常領域は、所望のヒトの定常領域と置き換えられて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４が生成される。選択された定常領域は、具体的な使用に従って変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性特質は、可変領域に存在する。
【００２７】
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥがその高親和性受容体に結合するのを遮断するもの）を選別するために、上記のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９０）上に記載されるものなどの慣例的な交差遮断アッセイが行われ得る。他の方法には、アラニン走査変異、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）（その全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、またはペプチド切断分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学修飾などの方法が用いられ得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）（その全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＰＫＭ２アンタゴニストは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ドメインＡ（α−ヘリックス６′〜α−ヘリックス６、及びα−ヘリックス７′）でＰＫＭ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、ドメインＢ：（β−シート１及びβ−シート５）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、ドメインＣ（α−ヘリックス５〜β−シート４）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、インテグリンａｖｂ３と相互作用するのに伴われるＰＫＭ２の例示的な配列要素及び他の配列を特異的に認識する。特異的な配列の非限定的な例には、ドメインＡ、ａ−ヘリックス６、ＡＲＧＤＬＧＩＥＩＰＡＥＫＶＦＬＡＱＫＭＭＩＧＲＣＮＲ及びａ−ヘリックス７′ＱＭＬＥＳＭＩＫＫＰ、ドメインＢ、ベータ−シート１、ＥＶＥＬＫＫＧＡＴ及びベータ−シート５、ＩＳＬＱＶＫＱＫＧＡ、ならびにドメインＣ、ａ−ヘリックス５、ＤＶＤＬＲＶＮＦＡＭＮＶＧＫＡ及びベータ−シート４、ＫＫＧＤＶＶＩＶＬＴＧＷＲが含まれる。
【００２９】
１つの特定の実施形態において、ＰＫＭ２アンタゴニストは、ＰＫＭ２の以下の配列に結合することができる：ドメインＡ、ヘリックス６（ＡＲＧＤＬＧＩＥＩＰＡＥＫＶＦＬＡＱＫＭＭＩＧＲＣＮＲ）及びα−ヘリックス７′（ＱＭＬＥＳＭＩＫＫＰ）、ドメインＢ、β−シート１（ＥＶＥＬＫＫＧＡＴ）及びβ−シート５（ＩＳＬＱＶＫＱＫＧＡ）、ドメインＣ、α−ヘリックス５（ＤＶＤＬＲＶＮＦＡＭＮＶＧＫＡ）及びβ−シート４（ＫＫＧＤＶＶＩＶＬＴＧＷＲ）。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体に関し、ここで、該抗体は、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する。
【００３１】
生物活性を有する抗体のフラグメントも開示される。フラグメントは、他の配列に付着してようとなかろうと、特定の領域の挿入、欠失、代用、もしくは他の選択される修飾、または特異的なアミノ酸残基を含むが、但し、フラグメントの活性は、非改変抗体または抗体フラグメントと比較して著しく変化していないか、または損なわれていないことを条件とする。
【００３２】
技法は、ＰＫＭ２に特異的な単鎖抗体の産生のためにも適合され得る。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して、重及び軽鎖の可変ドメインを一つに融合することにより作出され得、それにより、単一分子上の抗原結合部位を再構成する。１つの可変ドメインのＣ末端が１５〜２５個のアミノ酸ペプチドまたはリンカーを介して他の可変ドメインのＮ末端に繋がる単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）が、抗原結合または結合の特異性を著しく撹乱することなく開発されてきた。リンカーは、重鎖及び軽鎖がそれらの適切な立体構造の配向性で一つに結合することを可能にするために選ばれる。
【００３３】
二価の単鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖｓ）は、２つのｓｃＦｖｓを結合することによりもたらされ得る。これは、２つのＶＨ及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を産生することにより行われ得、直列のｓｃＦｖｓをもたらす。ＳｃＦｖｓは、２つの可変領域が重なり合うには短すぎるリンカーペプチドを用いても考案され得（約５つのアミノ酸）、ｓｃＦｖｓは二量体になる。ダイアボディは、対応するｓｃＦｖｓより最大４０倍低い解離定数を有すると示され、それらが、それらの標的に対して非常により高い親和性を有することを意味する。さらに、より短いリンカー（１または２つのアミノ酸）は、三量体（トリアボディまたはトリボディー）の形成をもたらす。テトラボディも、産生されている。それらは、ダイアボディよりもそれらの標的に対してさらにより高い親和性を示す。
【００３４】
任意に、抗体は、他の種において生成され、ヒトへの投与のために「ヒト化」される。抗体は、抗原に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しながらヒト化され得る。このゴールを達成するために、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的なヒト化産生物の分析のプロセスにより調製され得る。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体構造を例示及び表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示を調べることが、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、すなわち候補免疫グログリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの、所望の抗体特質が達成されるように、ＦＲ残基は、共通及び移入配列から選択され、組み合わされ得る。概して、ＣＤＲ残基は、抗原結合性に直接的かつ最も実質的に影響を及ぼしている。
【００３５】
抗体の標的機能が、抗体またはそれらのフラグメントを治療薬剤と結合することにより治療に使用され得る。抗体またはフラグメント（例えば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部）と治療薬剤とのかかる結合は、抗体または抗体フラグメントと治療薬剤とを含む、免疫複合体を作製することまたは融合タンパク質を作製することにより達成し得る。
【００３６】
ペプチド
いくつかの実施形態において、ＰＫＭ２アンタゴニストは、ペプチドである。ＰＫＭ２、ＰＫＭ２結合部位、またはインテグリンαｖβ３に特異的に結合するペプチドは、ファージ表示及び酵母ツーハイブリッドアッセイなどの慣例的な方法を使用して特定され得る。
【００３７】
開示されるペプチドは概して、ＰＫＭ２に選択的に結合する少なくとも１つのセグメントを含有する。開示される結合ペプチドは、本明細書に記載されるような多様な長さ及び構造を有し得る。概して、長さは、ペプチドからポリペプチドの長さの範囲であり得、全てのかかる長さは、本明細書に記載されるように包含される。単に便宜上、開示されるペプチド及びポリペプチドは概して、本明細書で、「ポリペプチド」と称されるが、この用語の使用は、別途文脈が明白に表示しない限り、ペプチドと考えられ得るかかる組成物を包含することが意図される。。
【００３８】
いくつかの実施形態において、結合ペプチドは、例えば、ＰＫＭ２に対する結合／相互作用部位（複数可）を含有するが、インテグリンαｖβ３の活性化に必要な他のドメインを含有しないインテグリンαｖβ３の非活性フラグメントである。
【００３９】
医薬製剤
薬学的に許容される担体中の、治療上有効な量の開示されるＰＫＭ２またはＰＫＭ２結合部位アンタゴニストのうちの１つ以上を含有する薬学的組成物が、開示される。開示されるＰＫＭ２またはＰＫＭ２結合部位アンタゴニストの投与に好適である薬学的担体には、特定の様式の投与に好適である、当業者に既知の任意のかかる担体が含まれる。一実施形態において、薬学的組成物は、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）に特異的に結合し、ＰＫＭ２がインテグリンαｖβ３に結合することを阻害する分子と、薬学的に許容される担体と、を含む。分子薬には、中和抗体、ヒト化抗体、及びモノクローナル抗体が含まれ得る。モノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し得、ここで、該抗体は、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する。
【００４０】
加えて、本化合物は、本組成物中の単独の薬学的活性成分として製剤化され得るか、または他の活性成分と組み合わされ得る。例えば、本化合物は、既知のＮＳＡＩＤ、抗炎症性化合物、ステロイド、及び／または抗生物質と製剤化または組み合わされ得る。
【００４１】
ＰＫＭ２アンタゴニストは、溶液、混濁液、タブレット、分散性タブレット、ピル、カプセル、粉末、または徐放性製剤などの好適な医薬品に製剤化され得る。
【００４２】
１つの特定の実施形態において、本組成物は、単回用量投与のために製剤化される。組成物を製剤化するために、化合物の重量画分が、治療される状態が軽減されるか、または１つ以上の症状が緩和されるような有効濃度で、選択された担体中で溶解されるか、懸濁されるか、分散されるか、あるいは混合される。
【００４３】
活性化合物は、治療される患者に不要な副作用が無い状態で、治療上有用な効果を及ぼすのに十分な量で薬学的に許容される担体中に含まれる。治療上有効な濃度が、インビトロ、エクスビボ、及びビボ系で化合物を試験することにより実証的に決定され得、次いで、ヒトへの投薬のためにそこから外挿される。
【００４４】
薬学的組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、及び排出速度、本化合物の物理化学特質、投薬スケジュール、及び投与量、ならびに当業者に既知の他の要因に応じるであろう。
【００４５】
開示される方法で使用される治療用抗体の投与のための用量及びスケジュールは、当業者により決定され得る。例えば、抗体の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、典型的に約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。特定の実施形態において、４つの抗体の用量は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇである。抗体の投与のための投薬スケジュールは、当業者により決定される場合、治療法の所望の攻撃性に応じて変化し得る。
【００４６】
例となる治療レジメンは、２週間に１度、または１ヶ月に１度、または３〜６ヶ月に１回の投与を必然的に伴う。抗体は通常、複数の機会で投与される。単回用量の間隔は、週毎、月毎、または年毎であり得る。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与され得、この場合、より頻度の少ない投与が必要とされる。用量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。概して、ヒト抗体が、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与の用量及び頻度は、治療が、予防的または治療的かどうかに応じて変化し得る。予防的用途において、相対的に低い用量が、長時間にわたって相対的に不定期な間隔で投与される。中には、残りの人生の間治療を受け続ける患者がいる。治療的用途において、疾患の進行が低減または停止されるまで、かつ患者が疾患の症状の部分的または完全な緩和を示すまで、相対的に短い間隔で相対的に高い用量が時に必要とされる。その後、患者には、予防的レジメンが投与され得る。
【００４７】
方法
異常なインテグリンαｖβ３に関連付けられる疾患を阻害または予防するための方法が開示され、これは、薬学的に許容されるレシピエントで有効量のＰＫＭ２アンタゴニストを含有する組成物を対象に投与することを伴う。特定の実施形態において、ＰＫＭ２アンタゴニストは、対象において、ＰＫＭ２に特異的に結合し、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との結合／相互作用を阻害する。これらの実施形態のいくつかにおいて、本組成物は、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との結合／相互作用を、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含む少なくとも１０％〜１００％阻害するための有効量のＰＫＭ２アンタゴニストを含有する。
【００４８】
特定の実施形態で、ピルビン酸キナーゼイソ型Ｍ２（ＰＫＭ２）アンタゴニストを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における異常なインテグリンαｖβ３発現に関連付けられる疾患を治療するための方法を含み、ここで、ＰＫＭ２アンタゴニストは、ＰＫＭ２がインテグリンαｖβ３に結合することを阻害する。ＰＫＭ２アンタゴニストは、ＰＫＭ２に選択的に結合する抗体であり得る。ＰＫＭ２アンタゴニストは、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、該抗体は、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣからなる群から選択される少なくとも１つのＰＫＭ２ドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＰＫＭ２アンタゴニストは、ＰＫＭ２に選択的に結合するペプチドまたはペプチド模倣物である。
【００４９】
投与
ＰＫＭ２結合分子を含有する開示される薬学的組成物は、対象の血液循環においてＰＫＭ２結合分子の治療有効量を達成するためにいくつかの方法で投与され得る。例えば、開示される組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、または経皮的に投与され得る。本組成物は、非経口、眼胞的、経膣的、直腸的、鼻腔内に、または吸入により投与され得る。
【００５０】
本組成物の非経口投与が使用される場合、概して、注入を特徴とする。注入可能物質は、液体溶液もしくは混濁液、注入前の液体中の混濁液の溶液に好適である固体形態、または乳化剤として従来の形態で調製され得る。非経口投与のために改定された手法は、定常用量が維持されるように、持続放出または徐放系の使用を伴う。
【００５１】
開示される組成物は、異常なインテグリンαｖβ３に関連付けられる疾患のリスクがある患者または対象に予防的に投与され得る。したがって、本方法は、開示される組成物の投与の前に線維症のリスクがある対象を特定することをさらに含み得る。
【００５２】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、重量、及び全身状態、治療されているアレルギー障害の重度、使用される特定の組成物、その投与の様式などに応じて、対象により変化するであろう。したがって、全ての組成物の正確な量を定めることは可能ではない。しかし、適切な量は、本明細書の教示で与えられる慣例的な実験のみを使用して、当業者により決定され得る。例えば、本組成物を投与するための効果的な用量及びスケジュールは、実証的に決定され得、かかる決定を下すことは、当業者が備えている技能の範囲内である。本組成物の投与のための用量範囲は、症状性障害に効果的である、所望の効果を生み出すのに十分に多い量である。用量は、不要な交差反応、アナフィラキシー反応などの不利な副作用を引き起こすほど多くするべきではない。概して、用量は、患者の年齢、状態、性別、及び疾患の程度、投与の経路、または他の薬剤がレジメンに含まれるかどうかで変化し、当業者により決定され得る。用量は、任意の反対の兆候がある場合、個別の内科医により調整され得る。用量は変化し得、１日または数日の間、毎日１回以上の投薬量投与で投与され得る。所定のクラスの医薬製品の適切な用量に関する指針は、文献で見ることができる。単独で使用される典型的な抗体の１日の用量は、上述の要因に応じて、１日当たり、体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるであろう。
【００５３】
投薬の頻度は、分子の半減期及びその効果の期間に応じるであろう。分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日当たり、１回以上の投薬量を与えることが必要になり得る。あるいは、分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日当たり１回、１週間当たり１回、またはさらに１ヶ月もしくは２ヶ月に１回の用量のみ与えることが必要になり得る。
【００５４】
本開示の主題のいくつかの実施形態が、記載される。それにもかかわらず、本開示の主題の真意及び範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示すことを意図する。それらは、本発明の例であり、それを限定していると解釈されるべきではない。したがって、実施例に記載される組成物は、本開示の主題の具体化された組成物の非限定的な例である。
【００５６】
実施例１：湿潤好中球により創傷部位で放出されたピルビン酸キナーゼＭ２が、創傷の治癒を促進する。
細胞外ＰＫＭ２が、筋線維芽細胞分化を助長する。
ｒＰＫＭ２が培養された線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を誘発し得るかどうかを決定するために実験を行った。ｒＰＫＭ２を、ＨＤＦａ細胞の培養媒体に添加した。細胞のＩＦ染色は、細胞外ＰＫＭ２が、典型的なパターンの筋線維芽細胞を有する＿α−ＳＭＡのストレスファイバーの束の形成を助長することを明らかにした（図１Ｂ）。さらに、ＨＤＦの培養菌へのｒＰＫＭ２の添加は、コラーゲンＩの分泌を増加させた（図１Ｃ）。ＴＧＦＥ  ＴＧＦβは、創傷部位での筋線維芽細胞形成を促す主な可溶性因子である。皮膚創傷の直後、ＴＧＦＥ  ＴＧＦβが蓄積血小板により分泌され、線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換を促進する（Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００１  ６９（４）：５１３−２１；Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００３  ８３（３）：８３５−７０）。ＴＧＦＥ  ＴＧＦβが筋線維芽細胞分化を促進する効果をｒＰＫＭ２が増加させるどうかを決定するために、ｒＰＫＭ２を、ＴＧＦＥＴＧＦβに加えてＨＤＦａの媒体に添加した。明らかに、ｒＰＫＭ２は、筋線維芽細胞形成の誘発おいてＴＧＦＥの効果を強化した（図１Ａ）。筋線維芽細胞分化に対するｒＰＫＭ２の効果が残基ＴＧＦＥの存在またはＴＧＦＥ受容体の活性化に因るものであるという可能性を排除するために、ＴＧＦＥを中和する抗体及びＴＧＦＥ受容体の活性化を阻害する阻害剤を使用した。抗体及び阻害剤の両方は、Ｄα−ＳＭＡのアップレギュレーション中に対するｒＰＫＭ２の機能に効果を有さなかった（図１Ｄ）。さらに、Ｓｍａｄパスウェイの活性化により、ＴＧＦＥＴＧＦβ／ＴＧＦＥ  ＴＧＦβ受容体が筋線維芽細胞分化を促進することが知られている。よって、ＨＤＦａ細胞の培養菌へのｒＰＫＭ２の添加がＳｍａｄの活性化をもたらしたかどうかを決定するために、実験を実施した。免疫ブロットは、ＳｍａｄがｒＰＫＭ２により活性化されなかったことを示した（図１Ｄ）。結果は、筋線維芽細胞分化に対する細胞外ＰＫＭ２の効果はＴＧＦＥシグナル伝達に依存しないことを提示する。
【００５７】
ＰＫＭ２は、インテグリンαｖβ３上で作用することにより筋線維芽細胞分化を助長する。
ｒＰＫＭ２架橋細胞から抽出物を調製した。架橋タンパク質をＨｉｓタグプルダウンにより分離した。ＰＫＭ２の免疫ブロットは、ｒＰＫＭ２架橋タンパク質を明らかにした。ｒＰＫＭ２架橋タンパク質のバンドを切り取り、トリプシンにより消化し、その後ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ／ｔｏｆにより分析した。ＭＳ分析は、ｒＰＫＭ２がインテグリンβ３に架橋したことを示した（図２）。ＰＫＭ２とインテグリンとの相互作用を、ＨＤＦａ細胞抽出物中のｒＰＫＭ２とβ３との共免疫沈降により実証した（図２）。インテグリンαｖは通常、β３と対になることが知られている。ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との相互作用を実証するために、細胞接着アッセイを使用した。ＨＤＦａ細胞をｒＰＫＭ２でコーティングした培養菌プレートに接着させた。抗体がインテグリンαｖβ３を認識し、インテグリンの活性化を遮断する、ＬＭ６０９により接着を完全に遮断した（図３）。さらに、抗体ＬＭ６０９は、ＨＤＦａ細胞移動（図８Ｂ）及び細胞内のα−ＳＭＡアップレギュレーションの両方に対するｒＰＫＭ２の効果を破壊した。コントロールとして、抗体は、α−ＳＭＡ発現の調節において、ＴＧＦＥの活性に対して非常により低い効果を有した（図４）。ｒＰＫＭ２の活性に対するＬＭ６０９の効果は、細胞外ＰＫＭ２が細胞表面インテグリンαｖβ３により作用したという考えを支持した。インテグリンαｖβ３シグナル伝達は、筋線維芽細胞分化、及び真皮線維芽細胞発現高レベルのインテグリンαｖβ３において重要な役割を担う（Ｇａｉｌｉｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．  １９９７  ２３２（１）：１１８−２６；Ｈｉｎｚ  Ｂ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０００．  ２０１３  ６３（１）：１４−２８）。ＰＫＭ２が、インテグリンαｖβ３シグナル伝達の活性化により筋線維芽細胞分化を促進するであろうと推論した。確かに、ＨＤＦａ細胞の培養菌へのｒＰＫＭ２の添加は、強いＦＡＫ活性化をもたらした（図５）。ＦＡＫ阻害剤は、α−ＳＭＡのアップレギュレーションにおけるＰＫＭ２の効果を抑止した（図５）。
【００５８】
未解決問題は、インテグリンαｖβ３上で作用する細胞外ＰＫＭ２が、どのようにしてα−ＳＭＡ発現をアップレギュレーションするかということであった。制御効果は、Ｓｍａｄパスウェイにより媒介されなかった。ＴＧＦβは、ＰＩ３Ｋの活性化を介して、Ｓｍａｄ独立パスウェイにより筋線維芽細胞分化を助長し得る（Ｗｉｌｋｅｓ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５  ６５（２２）：１０４３１−４０）。対照的に、インテグリンシグナル伝達の活性化は、ＰＩ３Ｋの活性化をもたらす（Ｗｅｇｅｎｅｒ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．  ２００８  ２５（５）：３７６−８７）。
【００５９】
実施例２：ＰＫＭ２に対する抗体及び抗体の使用
抗体は、ＰＫＭ２とインテグリンαｖβ３との間の相互作用を阻止する。
ＰＫＭ２は、インテグリンαｖβ３と相互作用し、インテグリンシグナル伝達を活性化する（図１１及び１２）。合体モデルを、ｒＰＫＭ２と組み換えインテグリンαｖβ３との間の化学架橋に基づいて算定した。図１３及び１４で示されるように、ＰＫＭ２は、（１）ＦＢＰ結合部位に近接する、同じモノマーからの２つのＢドメイン、ならびにＡ及びＣドメイン、かつ（２）二量体−二量体界面により形成されたその表面により、インテグリンαｖβ３と相互作用する。加えて、図１５は、ｒＰＫＭ２結合が有る／無いインテグリンαｖβ３の電子顕微鏡画像を示す。
【００６０】
ＰＫＭ２及びインテグリンαｖβ３相互作用の阻止に効果的な抗体の分析のためのアッセイ。
ＥＬＩＳＡアッセイ。組み換えＰＫＭ２をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。組み換えインテグリンαｖβ３を、試験抗体またはＩｇＧ（コントロールとして）に加えてＰＫＭ２コーティングプレート中に添加した。プレートを複数回洗浄した。ＰＫＭ２へのインテグリンαｖβ３の結合を、インテグリンαｖβ３に対する抗体を使用して測定した（図１３）。
【００６１】
組み換えインテグリンαｖβ３を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。組み換えＰＫＭ２を、試験抗体またはＩｇＧ（コントロールとして）に加えてインテグリンαｖβ３コーティングプレート中に添加した。プレートを複数回洗浄した。インテグリンαｖβ３へのＰＫＭ２の結合を、ＰＫＭ２に対する抗体を使用して測定した（図１４）。
【００６２】
細胞接着アッセイ。細胞培養菌プレートを、組み換えＰＫＭ２でコーティングした。ＨＵＶＥＣまたはＣＯＳ−７細胞を、約２〜５μＭのＩｇＧ（コントロールとして）の試験抗体に加えてプレートに添加した。５０分の温置後。プレートに接着する細胞を数えた（図１８）。
【００６３】
実施例３：細胞外ＰＫＭ２は、肝線維症進行を促進する。
図１６Ａ及び図１６Ｂは、ＰＫＭ２が肝線維症進行を促進すること、及び抗体を用いた処理が、線維症を低減できることを示す。図１６Ａは、ＴＡＡ／アルコール肝線維症誘発及び後のｒＰＫＭ２／ｒＰＫＭ１処理の概スケジュールを例示する。図１６Ａ及び１６Ｂは、肝線維症がＴＡＡ／アルコールにより誘発されたことを示し、続いて、動物を図１６Ａで示されるような表示の薬剤で処理した。図１６Ｂは、体重が処理の間変化すること、（Ｃ）終点における動物の肝臓重量、（Ｄ）表面特徴を示すための拡大されたコールアウトを含む代表的な肝臓画像を示す。（Ｅ）表示の薬剤で処理されたマウスの肝臓組織のシリウスレッド染色の代表的な画像。コールアウトは、シリウスレッド染色特徴を示す拡大された画像である。（Ｆ）表示の薬剤で処理されたマウスの肝臓組織の切片のシリウスレッド染色の定量化。１０匹のマウスの測定値から計算して数量化した。動物１匹につき４つの無作為に選択した組織切片及び各切片の３つの無作為に選択した観測視野を数量化した。シリウスレッド染色の量を、総領域の％として提示する。
【００６４】
肝線維症を、飲み水中のＴＡＡ及び１０％のエタノールの腹腔投与によりＢａｌｂ／Ｃマウスで誘発した。組み換え細菌性発現ＰＫＭ２（ｒＰＫＭ２）、ＰＫＭ１（ｒＰＫＭ１）、またはバッファを、ＴＡＡの第１の投薬量投与の１５日後に線維症誘発中に添加した（図１６Ａ）。実験の最後に、動物を屠殺した。動物の体重、肝臓重量、及び肝臓の外表面を綿密に調査した。明らかに、ＴＡＡ−アルコール線維症誘発へのｒＰＫＭ２の添加は、マウスの体重を著しく低減させ、肝臓のサイズ及び重量を増加させた（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ｒＰＫＭ２を添加した動物群の肝臓表面上の線維特徴は、ｒＰＫＭ２を添加していないもの及びｒＰＫＭ１を添加したものと比較してより明らかであった。肝臓組織切片のシリウスレッド染色は、ｒＰＫＭ２の添加により処理した動物群の肝臓内で、より多く及びより厚いコラーゲン蓄積を示した。ｒＰＫＭ２の添加により処理した動物の肝臓内の高密度のコラーゲンの歪み及びクロスネットワークは、より強い肝硬変を表示した。
【００６５】
実施例４−ＰＫＭ２に対する抗体は肝線維症を後進させる。
１つは活性であり、他方は活性ではなかった１対のウサギモノクローナルＰＫＭ２抗体を、ＰＫＭ２−インテグリン相互作用を撹乱するために用いた（１６−２）。他方（２１−３）は、活性ではなかった（図１７Ａ）。Ｂａｌｂ／Ｃマウスの肝線維症を、ＴＡＡ−アルコールを用いた処理により誘発した。線維症誘発の最後に、両方のハイブリドーマ株からの精製した抗体を、１０回の投薬、４ｍｇ／ｋｇで腹腔投与した。処理の最後に、動物を屠殺した。動物の体重、肝臓重量、及び肝臓の外表面を調査した。抗体１６−２の処理は、マウスの体重を増加させ、ＩｇＧ及び２１−３で処理した群のものと比較して肝臓サイズ及び重量を減少させた（図１７Ｂ）。肝臓組織切片のシリウスレッド染色は、コラーゲン含有量及び密度の実質的な減少を明らかにし、これは、ＰＫＭ２抗体処理による線維性肝臓内のコラーゲン蓄積の分解を表示する。
【００６６】
図１７は、ＰＫＭ２抗体が、（Ａ）バッファ、ＰＫＭ２抗体クローン１６（ＩｇＧＰＫ１６）、ＰＫＭ２抗体クローン２１（ＩｇＧＰＫ２１）、及びＬＭ６０９（ａｖｂ３Ａｂ）の存在下で、ｒＰＫＭ２コーティングプレートへのＬＸ−２細胞の接着、肝線維症を後進させたことを示す。接着は、観測視野毎のプレートに接着した細胞の総数として提示される。コントロールは、ｒＰＫＭ２がコーティングされていないプレートである。図１７Ｂ、肝線維症をＴＡＡ／アルコールにより誘発し、続いて動物を、表示の薬剤で処理した。図１７Ｂ、体重は、処理の間変化し、（Ｃ）終点における動物の肝臓重量、（Ｄ）表示の薬剤で処理されたマウスの肝臓組織のシリウスレッド染色の代表的な画像。コールアウトは、シリウスレッド染色特徴を示す拡大された画像である。
【００６７】
実施例５、ＰＫＭ２に対する抗体は、ブレオマイシン誘発肺線維症を後進させる。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの肺線維症を、ブレオマイシン処理により誘発した。線維症誘発の最後（５週間）に、ハイブリドーマ株からの精製したＰＫＭ２抗体を、１０回の投薬、４ｍｇ／ｋｇで腹腔投与した。処理の最後に、動物を屠殺した。処理された動物からの肺を収集し、描写した（非表示）。ブレオマイシンが強い肺線維症を誘発したことは明白である。ＰＫＭ２抗体で処理した群の肺表面上の線維症特徴は、ＩｇＧ、バッファ、及びピルフェニドンで処理された群のものと比較して明らかに少なかった。肺組織切片のシリウスレッド染色は、コラーゲン含有量及び密度の実質的な減少（総領域のパーセント）を明らかにし、これは、ＰＫＭ２抗体処理による線維性肺内のコラーゲン蓄積の分解を示す（図１８）。
【００６８】
図１８、ＰＫＭ２抗体は、ブレオマイシン誘発肺線維症を後進させた。
肺線維症を、ブレオマイシンにより誘発し、続いて動物を、表示の薬剤で処理した。表示の薬剤で処理されたマウスの肺組織の切片のシリウスレッド染色の定量化。１０匹のマウスの測定値から計算して数量化した。動物１匹につき４つの無作為に選択した組織切片及び各切片の３つの無作為に選択した観測視野を数量化した。シリウスレッド染色の量を、総領域の％として提示する。正常は、線維症を誘発せず、また、後の処理も行ってないマウスの試料である。処理前は、後の処理を行わずに線維症誘発の直後に屠殺したマウスの試料である。ＩｇＧＰＫは、ＰＫＭ２に対する抗体である。ＩｇＧは、精製したウサギＩｇＧである。ピルフェニドンは、ＦＤＡにより承認された肺線維症治療のための薬剤である。
【００６９】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示の主題が属する分野の業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用された刊行物及び引用された刊行物に関連するマテリアルが、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００７０】
当業者は、慣例的な実験を使用して、本明細書に記載されるような本開示の主題の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる同等物が、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【００７１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に指示しない限り、複数形の参照物を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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