(57)【要約】  本開示は、分裂終了細胞の細胞周期再進入を誘発するための方法を提供する。本開示は、さらに、心臓血管疾患、神経疾患、聴力損失、及び糖尿病等の疾患を処置するための細胞及び組成物を提供する。【選択図】図１
2018512179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、前記分裂終了細胞を、有効量の少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を含む組成物と接触させ、それにより前記分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発することを含む方法。
【請求項２】
前記接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を、有効量のＣＤＫ活性化剤、形質転換成長因子β阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤＫ活性化剤は、ＣＤＫ１活性化剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び／または前記サイクリンは、核酸によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸は、改質ｍＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は、構成的に発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記サイクリンは、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、及びサイクリンＥからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイクリンＢは、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイクリンＤは、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤＫは、ＣＤＫ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤＫは、ＣＤＫ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤＫは、構成的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤＫは、ＣＤＫ１であり、前記サイクリンは、ＣＣＮＢ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのＣＤＫ及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞。
【請求項１９】
ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞。
【請求項２０】
ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方を過剰発現するようにさらに改質されている、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の細胞。
【請求項２２】
心臓血管疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
心臓血管疾患を処置するための方法であって、有効量の請求項１８に記載の増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記増殖性分裂終了細胞は、増殖性心筋細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１。またはその両方を過剰発現するように改質されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
神経疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２９】
ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
神経疾患を処置するための方法であって、有効量の請求項１８に記載の増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記増殖性分裂終了細胞は、増殖性神経細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖性神経細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増殖性神経細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方を過剰発現するように改質されている、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１４４，２４４号、及び２０１５年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，３２１号の優先権を主張し、これらは参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、正常な細胞機能を獲得または復元するための、細胞、組織及び器官の置換、操作及び再生である。再生医療分野の多くは、細胞置換療法、特に幹細胞ベースの療法に集中している。自らを細胞ベースの用途に比類なく好適としている幹細胞の１つの特性は、長期間培養物中で増殖するその能力である。この増殖能力は、細胞ベースの用途における使用のためにそこから十分な数の細胞を誘導する出発材料源を提供する。しかしながら、細胞が古くなるにつれて、培養物中で多くの幹細胞が成長したとしても、その増殖能力は減少する傾向がある。
【０００３】
さらに、心筋細胞、ニューロン、及び骨格筋を含む多くの成体細胞は、過形成ではなく肥大により成長を達成する分裂終了細胞と考えられる。分裂終了細胞は、分裂または再生することができない、またはその能力が極めて制限されている。したがって、これらの分裂終了細胞を含有する多くの器官は、任意の重篤な損傷の後に機能を適切に修復または復元する能力が著しく制約されている。
【０００４】
細胞を再生する、及び／または損傷細胞を置換するために、分裂終了細胞分裂を再開させるための方法を提供することが有益である。そのような能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養及びスクリーニング、ならびに数々の疾患及び障害の処置のためのｉｎ  ｖｉｖｏ用途の両方に有用である。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、ある特定の薬剤が分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発し得るという発見に基づき、少なくとも部分的に、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、分裂終了細胞を、有効量の少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を含む組成物と接触させ、それにより分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発することを含む方法に関する。
【０００６】
本開示の一態様は、少なくとも１つのＣＤＫ及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞を提供する。本開示の別の態様は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞を提供する。
【０００７】
本開示の一態様は、心臓血管疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本開示の別の態様は、神経疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、方法は、細胞を、有効量のＣＤＫ活性化剤、形質転換成長因子β阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ活性化剤は、ＣＤＫ１活性化剤である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される。１つの好ましい実施形態において、増殖性分裂終了細胞は、増殖性心筋細胞である。いくつかの実施形態において、増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。別の好ましい実施形態において、増殖性分裂終了細胞は、増殖性神経細胞である。いくつかの実施形態において、増殖性神経細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性神経細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの核酸を含む。いくつかの実施形態において、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び／またはサイクリンは、核酸によりコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸は、改質ｍＲＮＡである。他の実施形態において、少なくとも１つの核酸は、構成的に発現される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、サイクリンは、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、及びサイクリンＥからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、サイクリンＢは、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）である。いくつかの実施形態において、サイクリンＤは、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６からなる群から選択される。１つの好ましい実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１である。別の好ましい実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ４である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、構成的に発現される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１であり、サイクリンは、ＣＣＮＢ１である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方をさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するようにさらに改質されている。
【００１８】
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することを含む。
【００１９】
別の態様は、心臓血管疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
さらなる態様は、心臓血管疾患を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示及び記載される増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様は、神経疾患を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示及び記載される増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、神経疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】新生仔（新生Ｐ０）マウス心臓細胞と成体（６週齢）マウス心臓細胞との間の細胞周期調整に関連した、差次的に発現した遺伝子を示す選択されたマイクロアレイデータを示す図である。データは、ｌｏｇ２として表現され、成体及び新生仔心臓細胞を比較している。
【００２４】
【図２】増殖性（新生仔）心臓細胞と非増殖性（成体）心臓細胞との間の上位の差次的調整遺伝子のいくつかの過剰発現が、マウス心筋細胞（パネルＡ）における心臓細胞増殖を促進することを示す図である。対照、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、またはＡＵＲＫＢ発現アデノウイルスで形質導入された心筋細胞を、ＥＤＵ増殖マーカー、トロポニンＴ心臓マーカー及びＤＡＰＩ核染色法により染色した。３つ全ての遺伝子が、心臓細胞増殖を向上させた（パネルＢ）。
【００２５】
【図３】ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現が、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）誘導心筋細胞における心筋細胞増殖を促進することを示す図である。ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現するヒトｉＰＳＣ誘導心筋細胞は、増殖マーカーホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）の発現の増加を示している。
【００２６】
【図４】心筋細胞数を定量するための３つの異なる技術を使用した、ｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞中での７２時間のＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現後の心筋細胞数の増加を示す図である。パネルＡは、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現に応じた核の総数における細胞倍加を示し、全核の約３０％がＰＨＨ３に対して染色陽性であった。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）もまた、ｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞におけるＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢの過剰発現後の全細胞数の増加を示した（パネルＢ）。ＡＴＰ細胞内含有量分析は、ｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞におけるＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現後の細胞数の２倍の増加を示した（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）（パネルＣ）。
【００２７】
【図５】ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現するｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞における細胞分裂の経時的画像化を示す図である。パネル１〜１５は、４日間の間１時間毎に収集された代表的画像である。パネル１６は、細胞が、画像化期間の最後に、心臓細胞マーカートロポニンＴに対して染色陽性であることを示している。矢印は、２つの分裂細胞、及びそれらの子孫を示す。
【００２８】
【図６】構成的に活性なＣＤＫ１（ＣＤＫ１ＡＦ）、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現するα−ＭＨＣ−ＧＦＰマウスから単離された成体マウス心筋細胞における細胞分裂の経時的画像化を示す図である。パネル１〜８は、４日間の間１時間毎に収集された代表的画像であり、心筋細胞の細胞分裂を示している。
【００２９】
【図７】構成的に活性なＣＤＫ１（ＣＤＫ１ＡＦ）、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現が、マウス初代心筋細胞における心臓細胞増殖を促進することを示す図である。画像は、対照ベクター（パネルＡ）またはＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ（パネルＢ）で形質導入され、ホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）で染色された成体マウス心筋細胞の代表的画像である。矢印は、分裂細胞を示す。
【００３０】
【図８】マウスにおける原理証明試験の結果を示す図である。ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはＧＦＰアデノウイルスを、ｃ５７ｂｌ６／Ｎ心臓における心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷部位に注射した。心臓は、細胞増殖を評価（ＰＨＨ３染色）するために梗塞から５日後（パネルＡ）に、または心臓機能及び組織構造を評価するために梗塞から６週間後（パネルＢ）に回収した。ＭＩから６週間後に回収した心臓を固定し、マッソントリクローム染色法を使用して線維症に関して染色した。
【００３１】
【図９】マウスにおける原理証明試験のための心臓機能評価の結果を示す図である。ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはＧＦＰ対照アデノウイルスを、ｃ５７ｂｌ６／Ｎ心臓における心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷部位に注射した。続いて、動物を心エコー検査し、％駆出率（パネルＡ）、及び経時的な駆出率の低下（パネルＢ）を測定することにより、ＭＩから３日後、１０日後、２４日後及び４０日後の心臓機能を評価した。
【００３２】
【図１０】細胞増殖（ＰＨＨ３染色）（パネルＡ）及び全核カウント（パネルＢ）による生存により評価されるような、ヒト心筋細胞の細胞周期再進入を誘発する因子の様々な組み合わせの能力を示す図である。処置から４日後、８日後及び１２日後に細胞を評価した。
【００３３】
【図１１】ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ、及びＡｕｒｏｒａの第１のカクテル（パネルＡ）、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤのカクテル（パネルＢ）、ならびにＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ及びＣＣＮＤのカクテル（パネルＣ）の間の、細胞周期分布の差を示す図である。
【００３４】
【図１２】心エコー検査によって測定される駆出率（ＥＦ）により示されるような、心筋梗塞の時点での心筋へのＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ（Ｇ１／Ｇ２カクテル）アデノウイルスの注射後の心臓機能の改善を示す図である。
【００３５】
【図１３】処置された動物におけるより厚い筋肉（パネルＡ）及び低減された瘢痕サイズ（パネルＢ）を示す、対照及び処置された動物から採取された組織学的断面を示す図である。
【００３６】
【図１４】二重マーカー（ＭＡＤＭ）分析のモザイク解析を使用した、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤカクテルで処置された分裂心筋細胞を示す図である。
【００３７】
【図１５】ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤカクテルで処置された場合の、５日以内に３連続で細胞分裂したニューロンの経時的画像を示す図である。
【００３８】
【図１６】ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤカクテルで処置された細胞が、感染から６０〜９０時間後にほとんどの分裂を生じ、いくつかの細胞分裂は、感染から１２０時間後という遅い時期に生じることを示す図である。柱の高さは、分裂を生じた細胞の数を表し、柱の上の数字は、各細胞により行われた分裂の平均数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変動し得ることが理解されるべきである。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図しないことが理解されるべきである。
【００４０】
本開示の詳細な説明は、読者の利便性のためだけに様々なセクションに分けられ、任意のセクションにおいて見出される開示は、別のセクションにおける開示と組み合わされてもよい。別段に定義されていない限り、本明細書において使用されている技術的及び科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。また、本明細書において説明されているのと同様または等価のいかなる方法及び材料も、本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料がここで説明される。本明細書において言及される全ての出版物は、出版物がそれに関連して引用される方法及び／または材料を開示及び説明するように、参照により組み込まれる。
【００４１】
本開示の実行は、別段の指定がない限り、当技術分野の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び組み換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙのシリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）のシリーズ、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｉｔ  ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｏｈａｉｌ（２００４）Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｓｅｌｌ（２０１３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照されたい。
【００４２】
範囲を含む全ての数字表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、適切な場合には、０．１または１．０の増分で（＋）または（−）に変動する概数である。必ずしも明示的に述べられていないが、全ての数字表示は、「約」という用語が前にあるものとして理解されるべきである。また、必ずしも明示的に述べられていないが、本明細書に記載の試薬は、例示のみを目的とし、そのようなものの等価物は当技術分野において知られていることが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上異なる定義が明示されていない限り、単数形は複数形の呼称も含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「心筋細胞」への言及は、複数の心筋細胞を含む。
Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【００４４】
「約」という用語は、範囲を含む数字表示、例えば温度、時間、量、濃度、及び他のそのようなものの前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％または１％だけ変動し得る概数を指す。
【００４５】
「投与」、「投与する」等は、本開示の組成物と関連して使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心臓細胞への投与、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心臓細胞への投与、医療専門家もしくは自己投与による対象への投与であってもよい直接投与、及び／または本開示の組成物を処方する行為であってもよい間接的投与の両方を指す。本明細書において細胞に関連して使用される場合、細胞への組成物の導入を指す。典型的には、有効量が投与され、この量は、当業者により決定され得る。任意の投与方法が使用され得る。例えば、核酸またはポリペプチドの組成物が分裂終了細胞に投与される場合、当業者は、形質導入、トランスフェクション等を使用して、核酸またはポリペプチドを細胞に投与することができる。さらに、例えば、細胞培養培地への小分子の添加、または心臓損傷部位へのｉｎ  ｖｉｖｏでの注射により、小分子が細胞に投与されてもよい。「投与」、「投与する」等は、本明細書においてそれを必要とする対象に関連して使用される場合、増殖及び／もしくは細胞周期再進入因子の組成物または増殖性分裂終了細胞を、それを必要とする対象に導入することを指す。対象への投与は、例えば、血管内注射、心筋内送達、頭蓋内送達等により達成され得る。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「細胞周期再進入」という用語は、細胞周期の少なくとも１つの段階、例えばＤＮＡ合成、有糸分裂、核分裂及び細胞質分裂を再開する分裂終了心臓細胞のプロセスを指す。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「心臓細胞」という用語は、心収縮もしくは血液供給等の心臓機能を提供する、または別様に心臓の構造を維持するように機能する、心臓内に存在する任意の細胞を指す。心臓細胞は、本明細書において使用される場合、心臓の心外膜、心筋または心内膜内に存在する細胞を包含する。心臓細胞はまた、例えば、心臓筋肉細胞または心筋細胞、及び心臓血管の細胞、例えば冠状動脈または静脈の細胞を含む。心臓細胞の他の限定されない例は、心筋、血管及び心臓細胞支持構造を構成する、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、伝導心筋細胞及び心臓ペースメーカー細胞を含む。心臓細胞は、例えば胚幹細胞または人工多能性幹細胞を含む幹細胞から誘導されてもよい。細胞は、任意の適切な種、例えば、イヌ、ウマ、ネコまたはヒト細胞等の哺乳動物等の動物の細胞であってもよい。
【００４８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味する。「本質的に〜からなる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のために、組み合わせに対して任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものである。したがって、本質的に本明細書で定義される要素からなる組成物は、請求される発明の基本的及び新規な特性（複数可）に実質的に影響しない他の材料またはステップを除外しない。「〜からなる」は、微量を超える他の成分の要素及び実質的な方法ステップを除外することを意味するものである。これらの移行句のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「誘導」という用語は、分化、再プログラム、単離または別様に精製されることを意味する。例えば、線維芽細胞から誘導された心筋細胞は、例えば因子のＧＭＴカクテルを過剰発現することにより線維芽細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで再プログラムされた心筋細胞である。
【００５０】
本明細書において使用される場合、増殖及び／または細胞周期再進入因子の組成物の量に関連する「有効量」等の用語は、心臓細胞（例えば心筋細胞）の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するのに十分な量を指す。細胞は、細胞周期再進入及び／または増殖を誘発するのに十分な量の、増殖及び／または細胞周期再進入因子の組成物と接触させられる。本明細書において、それを必要とする対象への投与に関連して使用される場合、「有効量」という用語は、増殖する、及び／または細胞周期に再進入するように誘発された増殖及び／または細胞周期再進入因子または分裂終了細胞の組成物の、疾患を処置する量を意味する。有効量は、１回以上の投与、塗布または投薬で投与され得る。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、組成物のバイオアベイラビリティ、投与経路等を含むいくつかの変数に依存する。しかしながら、任意の具体的対象に対する組成物（例えば、増殖及び／もしくは細胞周期再進入因子または増殖性心臓細胞）の特定の量は、使用される特定の薬剤の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食生活、投与時間、排泄速度、組成物の組み合わせ、処置されている具体的な疾患の重症度、ならびに投与形態を含む様々な因子に依存することが理解される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「その等価物」という用語は、参照ポリペプチドまたは核酸配列（すなわち、本開示の実施形態に一致するサイクリンタンパク質またはその断片）とは異なるが、本質的な特性（すなわち生物活性）を保持するポリペプチドまたは核酸配列を指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変しても、または改変しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、参照配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、付加、融合及び切断をもたらし得る。一般に、差異は、参照ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に極めて類似しており、多くの領域において同一であるように限定される。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「誘発する（ｉｎｄｕｃｅ）」、「誘発する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）」等は、増殖及び／または細胞周期再進入に関連して使用される場合、分裂終了細胞がより速い速度で、及び／またはより頻繁に複製することを意味する。この態様、及び本明細書に記載の他の態様のいくつかの実施形態において、分裂終了細胞増殖は、未処理対照に比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上増加される。分裂終了細胞増殖の％または倍数での増加は、分裂終了細胞が組成物と接触しない対照に比べて、本明細書に記載のような増殖及び／または細胞周期再進入を刺激することができる組成物の投与後に、複製分裂終了細胞の数を測定することにより決定され得る。増殖の増加はまた、各処置及び未処置対照における細胞の総数に対する複製細胞の比に基づいてもよい。いくつかの実施形態において、処置及び未処置対照における細胞の総数を使用して、増殖が決定される。細胞増殖は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれるＹａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２３９：１９０−２０３に記載のＢｒｄＵ組み込み法（及び同様の方法、例えばＥｄＵ組み込み）を使用して決定され得る。細胞増殖を検出する他の方法は、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２及びＭ期におけるＫｉ６７に対する抗体の使用、ならびにＭ期におけるホスホヒストン３（ＰＨＨ３）の使用を含む。
【００５３】
本明細書において使用される場合、細胞に関連する「単離」という用語は、細胞が自然に発生する環境とは異なる環境における細胞を指し、例えば、細胞が多細胞生物中で自然に発生し、細胞が多細胞生物から取り出された場合、細胞は「単離」されている。単離された改質分裂終了細胞は、遺伝子改質分裂終了細胞の混合集団内、または遺伝子改質分裂終了細胞及び遺伝子改質されていない分裂終了細胞の混合集団内に存在し得る。例えば、単離された遺伝子改質分裂終了細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子改質分裂終了細胞の混合集団内、または遺伝子改質分裂終了細胞及び遺伝子改質されていない分裂終了細胞の混合ｉｎ  ｖｉｔｒｏ集団内に存在し得る。「単離」という用語は、本明細書において、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関連して使用される場合、それぞれ、巨大分子の自然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として自然に発生せず、自然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意図する。「単離」という用語はまた、本明細書において、ポリペプチド、他の細胞タンパク質から単離されたタンパク質を指すように使用され、精製及び組み換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。他の実施形態において、「単離」という用語は、細胞及び別様の構成物質から分離されていることを意味し、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片（複数可）は、自然においては通常関連している。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の分離された形態の組織または細胞である。当業者に明らかなように、非自然発生的な  ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質は、その自然発生的な対応物から区別するために「単離」を必要としない。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体にかかわらず、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの限定されない例は、直鎖及び環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、ならびにプライマーを含む。
【００５５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子的にコードされた、及び非遺伝子的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に改質または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改質ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語は、これらに限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種及び同種リーダー配列を有し、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない融合物、免疫学的に標識化されたタンパク質等を含む、融合タンパク質を含む。
【００５６】
「増殖」という用語は、本明細書において使用される場合、分裂終了細胞の成長及び分裂を指す。いくつかの実施形態において、本明細書において分裂終了細胞に関連して使用される「増殖」という用語は、ある期間にわたり数が増加する分裂終了細胞の群を指す。「増殖及び／または細胞周期再進入因子」という用語は、単独で、または追加の薬剤と組み合わせて、分裂終了細胞にＤＮＡ合成、有糸分裂、核分裂及び細胞質分裂を生じさせるように誘発し得る任意の薬剤を指す。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」という用語は、特定の種類の細胞に分化するように、または特定の種類の組織を形成するように傾倒した細胞を指す。幹細胞等の前駆細胞は、１種類以上の細胞にさらに分化し得るが、より限定された／制約された分化能力を有するように、幹細胞よりも成熟している。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指すが、非ヒト霊長類、ネズミ（すなわちマウス及びラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等を含み、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト対象である。
【００５９】
「処置」、「処置すること」及び「処置する」は、疾患、障害もしくは状態、及び／またはその症状の有害または任意の他の望ましくない効果を低減または寛解するための薬剤により、疾患、障害または状態に作用することとして定義される。「処置」は、本明細書において使用される場合、それを必要とする対象の処置を包含し、心臓血管疾患（例えば、心不全、心筋虚血、低酸素症、脳卒中、心筋梗塞及び慢性虚血性心疾患）、神経疾患（例えば、癲癇、アルツハイマー病及び他の認知症、脳卒中、偏頭痛及び他の頭痛障害を含む脳血管疾患、多発性硬化症、パーキンソン病、神経感染症、脳腫瘍、外傷性疾患）、糖尿病、または聴覚障害もしくは聴力損失の処置を含む。状態またはそれを必要とする対象を「処置すること」、またはその「処置」は、（１）症状の低減等の臨床結果を含む有益もしくは望ましい結果を得るためのステップをとること、（２）疾患を防止すること、例えば、疾患の傾向を有し得るがまだ疾患の症状を経験もしくは示していない患者において、疾患の臨床症状を発症させないようにすること、（３）疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の発症を停止もしくは低減すること、（４）疾患を緩和すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の後退をもたらすこと、または（５）疾患を遅延させることを指す。本発明の１つの目的において、有益または所望の臨床結果は、これらに限定されないが、心臓細胞の増殖を誘発すること、細胞周期再進入を誘発すること、及び／または心筋再生を促進することを含む。本発明の別の目的において、有益または所望の臨床結果は、これらに限定されないが、ニューロンの増殖を誘発すること、細胞周期再進入を誘発すること、及び／または神経再生を促進することを含む。
【００６０】
「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように使用される。移入された核酸は、一般に、例えばベクター核酸分子に連結される。ベクターは、細胞における自己複製を導く配列を含んでもよく、または、心臓細胞ＤＮＡ内への統合を可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターは、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌または酵母人工染色体、及びウイルスベクターを含む。有用なウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、特に複製欠損レトロウイルス、及びレンチウイルスを含む。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の移入もしくは細胞のゲノム内への統合を容易化するウイルス誘導核酸要素を含む核酸分子、または、核酸移入を媒介するウイルス粒子を指す。ウイルス粒子は、典型的には、核酸（複数可）に加えて様々なウイルス成分を、また時折細胞成分を含む。「ウイルスベクター」という用語はまた、核酸を細胞内に移入することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移入された核酸自体を指し得る。ウイルスベクター及びトランスファープラスミドは、主にウイルスから誘導される構造的及び／または機能遺伝要素を含有する。ウイルスベクターは、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）配列及び非レトロウイルスウイルス配列の両方を含有するハイブリッドベクター、ＬＴＲまたは他の核酸であってもよい。ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、統合及び／またはパッケージングのためのレトロウイルス（例えばレンチウイルス）配列を含むベクターまたはトランスファープラスミドを指し得る。
【００６２】
「アデノウイルスベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、ゲノム内に挿入されたポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを含む任意のアデノウイルスベクターを指す。ベクターは、任意の欠損必須遺伝子がトランスで提供される場合、複製及びパッケージング可能でなければならない。アデノウイルスベクターは、望ましくは、好ましくは全ＩＴＲ配列の少なくとも約９０％のウイルスＤＮＡの複製を補助するために必要な各末端反復の少なくとも一部、及びウイルスカプシド内にゲノムを包み込むために必要なＤＮＡを含有する。多くの好適なアデノウイルスベクターは、当技術分野において説明されている。米国特許第６，４４０，９４４号；米国特許第６，０４０，１７４号（複製欠損Ｅ１欠失ベクター及び特化されたパッケージング細胞株）を参照されたい。いくつかの実施形態において、アデノウイルス発現ベクターは、正常細胞において複製欠損であるベクターである。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＶＶ）ベクターを指す。いくつかの実施形態において、アデノウイルス発現ベクターは、標的化を向上させるための偽型である。
【００６３】
「レトロウイルスベクター」という用語は、レトロウイルスから主に誘導された構造的及び機能的遺伝要素を含有するするウイルスベクターもしくはプラスミド、またはその一部を指す。
【００６４】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスから主に誘導された構造的及び機能的遺伝要素を含有するするウイルスベクターもしくはプラスミド、またはその一部を指す。
【００６５】
「レンチウイルスベクター」または「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルストランスファープラスミド及び／または感染性レンチウイルス粒子を指すように使用され得る。クローニング部位等の核酸配列要素、プロモーター、調整要素、異種核酸等は、本発明のレンチウイルス粒子内にＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミド内にＤＮＡ形態で存在することが理解される。
【００６６】
「遺伝子改質」という用語は、新たな核酸（すなわち、細胞外の核酸）の導入後に細胞内で誘発される永久的または一時的遺伝子変化を指す。遺伝子変化は、心臓細胞のゲノム内への新たな核酸の組み込みにより、または染色体外要素としての新たな核酸の一時的もしくは安定な維持により達成され得る。細胞が真核細胞である場合、永久的遺伝子変化は、細胞のゲノム内への核酸の導入により達成され得る。遺伝子改質の好適な方法は、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等を含む。
【００６７】
「再生する」、「再生」等の用語は、本明細書において傷害細胞または組織に関して使用される場合、その通常の意味が与えられるものであり、また、傷害を受けた、例えば虚血、梗塞、再かん流または他の疾患に起因して傷害を受けた組織における新たな細胞または組織（例えば心臓）の成長及び／または発達のプロセスを指すものである。いくつかの実施形態において、組織再生は、細胞増殖の活性化及び／または向上を含む。いくつかの実施形態において、組織再生は、細胞移動の活性化及び／または向上を含む。
【００６８】
「幹細胞」という用語は、自己新生する、及び分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。「多能性幹細胞」という用語は、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の全ての細胞を生成することができるが、完全な生物を生成する能力を有さない幹細胞を指す。いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するための組成物は、増殖速度を増加させるために、幹細胞の集団に対して使用され得る。他の実施形態において、組成物は、幹細胞の増殖速度を増加させない。
【００６９】
「誘発された多能性幹細胞」という用語は、その通常の意味が与えられるものであり、また、多能性の少なくとも１つの特性を示すように再プログラムされた分化哺乳動物体細胞（例えば、成体体細胞、例えば皮膚）を指すものである。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８（１９）：７８３８−７８４３、Ｓｅｌｌ（２０１３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照されたい。
【００７０】
「分裂終了細胞」という用語は、有糸分裂または細胞分裂を示さない細胞である。分裂終了細胞の限定されない例は、脳（例えばニューロン）、心臓（例えば心筋細胞）及び骨格筋を構成する分化細胞を含む。本明細書において使用される場合、「増殖性分裂終了細胞」という用語は、増殖する、及び／または細胞周期に再進入するように誘発された分裂終了細胞を指す。例えば、増殖性心筋細胞は、増殖する、及び／または細胞周期に再進入するように誘発された、増殖能力を有さない、または増殖能力が制限された心筋細胞である。増殖性分裂終了細胞（例えば増殖性心筋細胞）は、任意の回数の細胞分裂、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、またはそれ以上の細胞分裂を生じた後に、再び細胞周期を出て分裂終了状態に戻ってもよい。
【００７１】
ＩＩ．分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法
本開示を読めば当業者に明らかとなるように、本開示は、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、分裂終了細胞を、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量で有効量の組成物（例えば、１つ以上の増殖及び／または細胞周期再進入因子）と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる方法を提供する。細胞は、任意の種、動物、哺乳動物からの細胞、例えばイヌ、ネコ、ネズミ、ラット、またはヒト細胞であってもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００７３】
一態様において、本開示は、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するために、分裂終了細胞を有効量の組成物と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる方法を提供する。組成物は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、サイクリン、オーロラキナーゼ、アクチン結合タンパク質アニリン（ＡＮＬＮ）、細胞分裂周期（ＣＤＣ）タンパク質、カドヘリン、ＣＯＰ９シグナロソーム複合体サブユニット、カリン、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質、細胞質分裂のタンパク質調整因子及び／もしくはＷＮＴ１誘発性シグナル伝達経路タンパク質またはそれらの等価物をコードする、少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させることができる。細胞は、任意の種、動物、哺乳動物からの細胞、例えばイヌ、ネコ、ネズミ、ラット、またはヒト細胞であってもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される。
【００７５】
心臓細胞
本開示の心臓細胞は、心臓機能を提供する、心臓に存在する任意の細胞を含む。心臓細胞は、心臓の心外膜、心筋または心内膜内に存在する細胞を包含する。心臓細胞はまた、例えば、心臓筋肉細胞または心筋細胞、及び心臓血管の細胞、例えば冠状動脈または静脈の細胞を含む。心臓細胞の他の限定されない例は、心筋、血管及び心臓細胞支持構造を構成する、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、伝導心筋細胞及び心臓ペースメーカー細胞を含む。
【００７６】
心臓細胞は、心臓または非心臓細胞から誘導され得る。心臓細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。心臓細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後（例えば成体）心臓細胞であってもよい。好ましい実施形態において、心臓細胞は、成体心臓細胞である。いくつかの実施形態において、心臓細胞は、幹細胞から誘導される。
【００７７】
非心臓細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで心臓細胞に分化され得る。例えば、Ｉｅｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４２（３）：３７５−３８６及びＫｗｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００７）１０４（２６）：１０８９４−１０８９９に記載の方法を参照されたい。
【００７８】
ある特定の実施形態において、心臓細胞は、心筋細胞である。ある特定の実施形態において、心筋細胞は、成体分裂終了心筋細胞である。別の態様において、成体分裂終了心筋細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。いくつかの実施形態において、心筋細胞は、単核細胞である。他の実施形態において、心筋細胞は、多核細胞である。
【００７９】
改質のための細胞が、心臓細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約６０％の心臓細胞、少なくとも約６５％の心臓細胞、少なくとも約７０％の心臓細胞、少なくとも約７５％の心臓細胞、少なくとも約８０％の心臓細胞、少なくとも約８５％の心臓細胞、少なくとも約９０％の心臓細胞、少なくとも約９５％の心臓細胞、少なくとも約９８％の心臓細胞、少なくとも約９９％の心臓細胞、または９９％超の心臓細胞で構成される。
【００８０】
神経細胞
本開示の神経細胞は、神経機能を提供する、神経系に存在する任意の細胞を含む。神経細胞は、脳（例えば、大脳、小脳及び脳幹）及び脊髄に存在する細胞、ならびに感覚ニューロンを含む末梢神経系の細胞を包含する。神経細胞はまた、例えば、ニューロン、乏突起膠細胞、及び星状膠細胞を含む。ニューロンの限定されない例は、運動ニューロン、錐体ニューロン、プルキンエ細胞、網膜神経細胞、嗅覚ニューロン、触覚及び痛覚ニューロン、ならびに無軸索細胞を含む。
【００８１】
神経細胞は、神経または非神経細胞から誘導され得る。神経細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。神経細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後（例えば成体）神経細胞であってもよい。好ましい実施形態において、神経細胞は、成体神経細胞である。いくつかの実施形態において、神経細胞は、幹細胞（例えば神経幹細胞）から誘導される。
【００８２】
非神経細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで神経細胞に分化され得る。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４（２）：１８８−２０２、Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（１９）：４６９４−４７０５、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２２（５）：７７８−７８４に記載の方法を参照されたい。
【００８３】
ある特定の実施形態において、神経細胞は、ニューロンである。ある特定の実施形態において、ニューロンは、成体分裂終了ニューロンである。好ましい実施形態において、成体分裂終了ニューロンは、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
【００８４】
改質のための細胞が、神経細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約６０％の神経細胞、少なくとも約６５％の神経細胞、少なくとも約７０％の神経細胞、少なくとも約７５％の神経細胞、少なくとも約８０％の神経細胞、少なくとも約８５％の神経細胞、少なくとも約９０％の神経細胞、少なくとも約９５％の神経細胞、少なくとも約９８％の神経細胞、少なくとも約９９％の神経細胞、または９９％超の神経細胞で構成される。
【００８５】
膵臓細胞
本開示の膵臓細胞は、膵臓機能を提供する、膵臓に存在する任意の細胞を含む。膵臓細胞の例は、ランゲルハンス島内の細胞（例えば、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞及びイプシロン細胞）ならびに腺房細胞を含む。いくつかの実施形態において、膵臓細胞は、膵臓前駆細胞である。
【００８６】
膵臓細胞は、膵臓または非膵臓細胞から誘導され得る。膵臓細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。膵臓細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後（例えば成体）膵臓細胞であってもよい。好ましい実施形態において、膵臓細胞は、成体膵臓細胞である。いくつかの実施形態において、膵臓細胞は、幹細胞から誘導される。
【００８７】
非膵臓細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓細胞に分化され得る。例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１５３４−１５４１及び米国特許第８，６３３，０２４号に記載の方法を参照されたい。
【００８８】
ある特定の実施形態において、膵臓細胞は、ベータ細胞またはベータ細胞前駆体である。ある特定の実施形態において、ベータ細胞は、成体ベータ細胞である。好ましい実施形態において、成体分裂終了膵臓細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
【００８９】
改質のための細胞が、膵臓細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約６０％の膵臓細胞、少なくとも約６５％の膵臓細胞、少なくとも約７０％の膵臓細胞、少なくとも約７５％の膵臓細胞、少なくとも約８０％の膵臓細胞、少なくとも約８５％の膵臓細胞、少なくとも約９０％の膵臓細胞、少なくとも約９５％の膵臓細胞、少なくとも約９８％の膵臓細胞、少なくとも約９９％の膵臓細胞、または９９％超の膵臓細胞で構成される。
【００９０】
有毛細胞
本開示の有毛細胞は、内有毛細胞（不動毛）及び外有毛細胞を含む。有毛細胞は、有毛または非有毛細胞から誘導され得る。有毛細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。有毛細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後（例えば成体）有毛細胞であってもよい。好ましい実施形態において、有毛細胞は、成体有毛細胞である。いくつかの実施形態において、有毛細胞は、幹細胞から誘導される。非有毛細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有毛細胞に分化され得る。例えば、Ｍｏｈａｍｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．２３（１１）：１２７５−１２８４に記載の方法を参照されたい。好ましい実施形態において、成体分裂終了有毛細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
【００９１】
改質のための細胞が、有毛細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約６０％の有毛細胞、少なくとも約６５％の有毛細胞、少なくとも約７０％の有毛細胞、少なくとも約７５％の有毛細胞、少なくとも約８０％の有毛細胞、少なくとも約８５％の有毛細胞、少なくとも約９０％の有毛細胞、少なくとも約９５％の有毛細胞、少なくとも約９８％の有毛細胞、少なくとも約９９％の有毛細胞、または９９％超の有毛細胞で構成される。
【００９２】
骨格筋細胞
本開示の骨格筋細胞は、筋線維の細胞を指す。骨格筋細胞は、骨格筋細胞または非骨格筋細胞から誘導され得る。骨格筋細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。骨格筋細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後（例えば成体）骨格筋細胞であってもよい。好ましい実施形態において、骨格筋細胞は、成体骨格筋細胞である。いくつかの実施形態において、骨格筋細胞は、幹細胞から誘導される。非骨格筋細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで骨格筋細胞に分化され得る。例えば、Ｓａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１６（７）：１３５３−１３６４に記載の方法を参照されたい。好ましい実施形態において、成体分裂終了骨格筋細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
【００９３】
改質のための細胞が、骨格筋細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約６０％の骨格筋細胞、少なくとも約６５％の骨格筋細胞、少なくとも約７０％の骨格筋細胞、少なくとも約７５％の骨格筋細胞、少なくとも約８０％の骨格筋細胞、少なくとも約８５％の骨格筋細胞、少なくとも約９０％の骨格筋細胞、少なくとも約９５％の骨格筋細胞、少なくとも約９８％の骨格筋細胞、少なくとも約９９％の骨格筋細胞、または９９％超の骨格筋細胞で構成される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、細胞が対象内にあり、増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法がｉｎ  ｖｉｖｏ改質によるものであるように、内生分裂終了細胞である。他の実施形態において、分裂終了細胞は外生であり、分裂終了細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで改質される。
【００９５】
増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される分裂終了細胞は、様々な源のいずれかからの細胞であってもよい。哺乳動物分裂終了細胞（例えば、ヒト、イヌ、ネコまたはネズミ）が使用され得る。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、哺乳動物心筋細胞である。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、幹細胞（例えば、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、再プログラム心臓細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞）から誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、胚幹細胞は明示的に除外される。
【００９６】
分裂終了細胞は、生きている対象から得られてもよい。細胞は、生きている対象から採取された組織から得られてもよい。細胞は、好適な組織ドナーと考えられる最近死亡した対象から得られてもよい。いくつかの実施形態において、対象が好適な細胞源であるかどうかを決定するために、対象は、様々な遺伝子障害、ウイルス感染等に関してスクリーニングされる。一般に、本発明における使用に好適な細胞は、形質転換されておらず（例えば、正常な細胞増殖を示す）、さもなければ正常である（例えば、正常核型を示す）。
【００９７】
分裂終了細胞は、非胎児対象、新生児、小児または成人の組織から誘導されてもよい。分裂終了細胞は、帝王切開分娩を含む出生から死亡までの期間内の対象から収集された、新生児または出生後組織から誘導されてもよい。例えば、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される分裂終了細胞は、約１０分齢超、約１時間齢超、約１日齢超、約１ヶ月齢超、約２ヶ月齢超、約６ヶ月齢超、約１歳超、約２歳超、約５歳超、約１０歳超、約１５歳超、約１８歳超、約２５歳超、約３５歳超、＞４５歳、＞５５歳、＞６５歳、＞８０歳、＜８０歳、＜７０歳、＜６０歳、＜５０歳、＜４０歳、＜３０歳、＜２０歳、または＜１０歳である対象からのものであってもよい。
【００９８】
組織から分裂終了細胞を単離する方法は、当技術分野において知られており、任意の知られている方法が使用され得る。限定されない例として、成体心臓細胞は、心臓手術を受けている患者から得られたヒト心房生検標本から得られてもよい。心臓組織を切り刻んでコラゲナーゼで分解させ、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ４５：４２０−４２６の方法を使用して、心臓幹／前駆細胞をｃ−ｋｉｔ＋前駆体細胞増加培地内で増加させることができる。さらに、Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １６（２）：２３３−２４４の方法を使用して、心臓線維芽細胞を得ることができる。男性の個人の包皮組織から、包皮線維芽細胞を得ることができる。線維芽細胞は、包皮組織を切り刻み、次いで組織を単一細胞まで分離させることにより得ることができる。包皮細胞塊は、物理的な脱集塊化、または例えばトリプシンを使用した酵素分解を含む、当技術分野において知られている任意の手段により分離され得る。
【００９９】
分裂終了細胞（例えば、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、骨格筋細胞）は、細胞周期調整遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸、例えば、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン及び／もしくはオーロラキナーゼで遺伝子的もしくは非遺伝子的に改質されてもよく、または、ポリペプチドを導入することにより改質されてもよい。以下で議論されるように、分裂終了細胞は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン及び／もしくはオーロラキナーゼ（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を過剰発現することにより、または、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン及び／もしくはオーロラキナーゼアミノ酸配列（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ）を含むポリペプチドを導入することにより、増殖または細胞周期に再進入するように誘発されてもよく、あるいは、内生サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及び／またはオーロラキナーゼ（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ）の発現を誘発するために化学物質（例えば小分子）を導入することにより、さらに改質されてもよい。サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン及びオーロラキナーゼのアミノ酸配列は、当技術分野において知られている。サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン及びオーロラキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている。
【０１００】
さらに、分裂終了細胞は、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び少なくとも１つのサイクリン、もしくはそのそれぞれの等価物（例えば、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を過剰発現することにより、または、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ及び少なくとも１つのサイクリンアミノ酸配列（例えば、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１）を含むポリペプチドを導入することにより、増殖または細胞周期に再進入するように誘発されてもよく、あるいは、内生サイクリン依存性キナーゼ及び／またはサイクリンの発現を誘発するために化学物質（例えば小分子）を導入することにより、さらに改質されてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、有効量のＣＤＫ活性化剤、形質転換成長因子β阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させられる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ活性化剤は、ＣＤＫ１活性化剤である。ＣＤＫ１活性化剤の例は、Ｗｅｅ１阻害剤ＭＫ１７７５である。ＭＫ１７７５は、ＣＤＫ１発現を間接的に誘発することが知られている。形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナル伝達系経路を構成する因子、例えばＴＧＦ−βリガンド、ＴＧＦ−β  Ｉ型受容体、ＴＧＦ−β  ＩＩ型受容体、ＴＧＦ−β  ＩＩＩ型受容体（β−グリカン及びエンドグリン）、ＴＧＦ−β受容体の可溶形態、Ｓｍａｄタンパク質、シグナル伝達経路に関与する受容体及びリガンドに対する抗体、経路メンバーを標的化する核酸ベース分子（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー及びリボザイム）、またはそれらの組み合わせのいずれかを阻害することによりＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する化合物である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＬＤＮ−１９３１８９、デキサメタゾン及びＬＹ３６４９４７からなる群から選択される。ＴＧＦ−β阻害剤はまた、当技術分野において、抗ＴＧＦ−β化合物と呼ぶことができる。抗ＴＧＦ−β化合物の限定されない例は、抗体（例えば、フレソルミマブ（Ｆｒｅｓｏｌｕｍｉｍａｂ）／ＧＣ１００８（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＰＦ−０３４４６９６２（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ））、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（例えばトラベデルセン（ＡＰ１２００９）（Ｉｓａｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ））、受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＬＹ２１５７２９９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）、及びＴＧＦ−β  ＡＳＯのワクチンとの組み合わせ（例えばＬｕｃａｎｉｘ（商標）（Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ−Ｌ）（Ｎｏｖａ  Ｒｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、及びＴＧＦ−β２  ＡＳＯ＋ＧＭＣＳＦ発現ベクター（Ｍａｒｙ  Ｃｒｏｗｌｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ））を含む。組成物へのＴＧＦ−β阻害剤の添加は、細胞生存を改善するように作用することが企図される。
【０１０３】
培養条件
本開示の細胞は、当業者に知られている任意の条件下で培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、１〜２０％の酸素（Ｏ２）及び５％の二酸化炭素（ＣＯ２）の条件下で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、低酸素条件下（例えば、１０％未満のＯ２の存在下）で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃、５％のＣＯ２及び１０〜２０％のＯ２で培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ある期間低酸素条件下で培養される。例えば、細胞は、ある期間低酸素条件（約２０％のＯ２）下で培養され、次いで低酸素条件、例えば約５％のＯ２に切り替えられてもよい。
【０１０４】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ改質
一態様において、本開示の方法及び組成物は、分裂終了細胞を、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を含む有効量の組成物と接触させ、それにより分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発することにより、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する。
【０１０５】
一態様において、本開示の方法及び組成物は、分裂終了細胞に、増殖及び／または細胞周期再進入を刺激することができる組成物（例えば、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及び／またはオーロラキナーゼの発現を増加させることができる組成物）を投与することにより、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、組成物は、分裂終了細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、または少なくとも９日の期間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂するように誘発する。一実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約０．１％が、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される。別の実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、５％、１０％、１５％が、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するための組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで分裂終了細胞に投与される。分裂終了細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するように（遺伝子的または非遺伝子的に）改質される。分裂終了細胞の少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで少なくとも増殖及び／または細胞周期再進入を開始したら、分裂終了細胞は、対象に導入され得る。いくつかの実施形態において、本開示の分裂終了細胞は、研究及び薬剤開発において役立つものとして使用され得る。分裂終了細胞は、当業者に一般的に知られている様々な方法により培養され得る。
【０１０８】
分裂終了細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ改質の利点は、損傷した、または増殖及び／もしくは細胞周期に再進入していない細胞の移植または区別に好適な細胞を容易に特定することができることである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ改質によって、改質された分裂終了細胞は、改質されていない分裂終了細胞から精製または単離され得る。
【０１０９】
分裂終了細胞は、当業者に一般的に知られている様々な機序により改質され得る。ウイルスコンストラクトは、好適な宿主におけるウイルスの生成により送達され得る。次いで、ウイルスを宿主細胞から採取し、分裂終了細胞と接触させる。対象となる遺伝子を発現することができるウイルス及び非ウイルスベクターは、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル、及び標的化ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を介して、分裂終了細胞に送達され得る。標的抗体またはその断片も含むリポソームを、本発明の方法において使用することができる。分裂終了細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、分裂終了細胞または細胞集団への本明細書に記載のタンパク質の直接導入は、タンパク質トランスフェクションの限定されない技術により行うことができ、代替として、本発明のタンパク質の発現を向上させる、及び／またはその活性を促進することができる培養条件が、他の限定されない技術である。
【０１１０】
本発明の遺伝子をコードするベクターを送達する他の方法は、これらに限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、原形質融合、またはリポソーム媒介トランスフェクションを含む。本開示のベクターによりトランスフェクトされる宿主細胞は、これらに限定されないが、大腸菌もしくは他の細菌、酵母、真菌、またはマウス、ヒト、もしくは他の動物（例えば哺乳動物）から誘導された細胞を含み得る。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質、融合物、ポリペプチド断片または突然変異のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現もまた使用され得る。分子生物学の当業者には、広範な発現システム及び精製システムを使用して、組み換えタンパク質及びその断片を生成することができることが理解される。
【０１１１】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ改質
いくつかの実施形態において、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、分裂終了細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、または少なくとも９日の期間、ｉｎ  ｖｉｖｏで分裂するように誘発する。一実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約０．１％が、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される。別の実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、５％、１０％、１５％が、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞は、分裂終了細胞（例えば心筋細胞）の増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するために、有効量の組成物でｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば遺伝子的または非遺伝子的に）改質され、組成物は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼ、またはそれらの等価物の発現を増加させることができ、組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与される。他の実施形態において、分裂終了細胞は、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）及び少なくとも１つのサイクリン、またそれらのそれぞれの等価物を含む有効量の組成物とｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば遺伝子的または非遺伝子的に）改質され、それにより、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発する。本明細書に記載の組成物は、核酸、ポリペプチド、及び／またはそれらの組み合わせを含有し得る。
【０１１３】
分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）の増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するための組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、組成物は、当業者に一般的に知られている任意の機序により、それを必要とする対象に投与され得る。限定されない例は、経口、全身（例えば、経皮、鼻腔内もしくは坐剤による）、または非経口（例えば、筋肉内、静脈内もしくは皮下）投与を含む。
【０１１４】
本開示は、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激する方法であって、増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量を、それを必要とする対象に投与することを概して含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる方法を提供し、前記組成物は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼ、またはそれらの等価物の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態において、方法は、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）を、増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量の組成物と接触させることを概して含む。組成物は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及び／もしくはオーロラキナーゼ、またはそれらの等価物の発現を増加させるために、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つの化学物質、またはそれらの混合物を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子を含んでもよい。組成物は、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらの等価物の発現を増加させるために、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つの化学物質、またはそれらの混合物を含む、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢポリペプチドを含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１ポリペプチドを含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４、及びＣＣＮＤ１ポリペプチドを含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。別の実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ核酸を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。別の実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１核酸を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。別の実施形態において、組成物は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４、及びＣＣＮＤ１核酸を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。他の実施形態において、組成物は、内生ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの発現を増加させる化学物質を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。他の実施形態において、組成物は、内生ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１の発現を増加させる化学物質を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらにそれらからなる。さらに他の実施形態において、組成物は、内生ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４、及びＣＣＮＤ１の発現を増加させる化学物質を含む、または代替として本質的にそれらからなる、またはさらに���れらからなる。いくつかの実施形態において、オーロラキナーゼは、組成物から明示的に除外される。
【０１１５】
組成物は、固体組成物、半固体組成物、または液体組成物であってもよい。いくつかの場合において、組成物は、固体組成物、半固体組成物、または液体組成物であってもよい制御放出組成物である。例えば、組成物は、持続放出マトリックスであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、組成物は、それを必要とする対象の処置部位またはその近傍に、例えば心臓または脳内またはその周囲に投与される。組成物の投与は、血管内注射、心筋内送達、及び頭蓋内送達を含む様々な手段により達成され得る。例えば、心筋内送達は、カテーテルを使用して（例えば経心内膜カテーテルシステムを介して）行うことができる。カテーテルを介した心筋内または頭蓋内送達は、全体的、限局的または拡散的であってもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、増殖または細胞周期に再進入するように誘発された分裂終了細胞は、それを必要とする対象に、移植可能なデバイスと関連して投与される。本明細書により企図される好適な移植可能なデバイスは、血管内ステント（例えば、自己拡張ステント、バルーン拡張ステント、及びステントグラフト）、スキャフォールド、グラフト等を含む。
【０１１８】
増殖及び／または細胞周期再進入を刺激する因子
議論されたように、分裂終了細胞（例えば心筋細胞）は、細胞周期調整遺伝子の発現を増加させるように改質され得る。細胞周期調整遺伝子、例えばサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、サイクリン、及び／またはオーロラキナーゼは、核酸によりコードされてもよく、またはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、細胞周期調整遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、オーロラキナーゼ、またはそれらの等価物を含む。他の実施形態において、細胞周期調整遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ及びサイクリンまたはそれらのそれぞれの等価物を含む。分裂終了細胞は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、オーロラキナーゼ、アクチン結合タンパク質アニリン（ＡＮＬＮ）、細胞分裂周期（ＣＤＣ）タンパク質、カドヘリン、ＣＯＰ９シグナロソーム複合体サブユニット、カリン、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質、細胞質分裂のタンパク質調整因子及び／もしくはＷＮＴ１誘発性シグナル伝達経路タンパク質またはそれらの等価物の少なくとも１つ等の増殖及び／または細胞周期再進入因子を含む組成物の導入により改質され得る。分裂終了細胞は、（１）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及び周期依存性キナーゼ  １（ＣＤＫ１）；（２）ＣＣＮＢ１及びＣＤＫ１；（３）サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、周期依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）；（４）ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ１、ＣＣＮＤ１及びＣＤＫ４；（５）ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１及びＣＤＫ４；またはそれらの任意の組み合わせ等の増殖及び／または細胞周期再進入因子を含む組成物の導入により改質され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸は、構成的に発現される。
【０１２０】
サイクリン依存性キナーゼ
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、その調整サイクリンとの複合化により細胞周期の進行を調整するように機能する。例えば、ＣＤＫ１は、Ｍ期の間サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）に結合して機能し、一方ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体は、Ｓ期及びＳ／Ｇ２移行における進行を確実にし、ＣＤＫ２／サイクリンＥは、Ｇ１／Ｓ期の間の進行を促進する。Ｇｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３（４１３）：１−１８。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１である。他の実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ４である。さらに他の実施形態において、ＣＤＫ１及びＣＤＫ４の両方が使用される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、構成的に発現される。
【０１２２】
様々な種からのＣＤＫ（例えばＣＤＫ１）のアミノ酸配列及びＣＤＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている。例えば、（１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７７．１（ホモサピエンス２９７アミノ酸サイクリン依存性キナーゼ１アイソフォーム１）；（２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ１４５６３．１（ホモサピエンス２９７アミノ酸細胞分裂周期２、Ｇ１からＳ及びＧ２からＭ）；（３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７８６．４（ホモサピエンスサイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）をコードするヌクレオチド配列、転写変異体１）；（４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３３７９．４（ホモサピエンスサイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）をコードするヌクレオチド配列、転写変異体１）；（５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３１６８５．２（ハツカネズミ２９７サイクリン依存性キナーゼ１）；（６）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７６５９．３（ハツカネズミサイクリン依存性キナーゼ１をコードするヌクレオチド配列）を参照されたい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ１核酸は、配列番号１または配列番号７の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ１核酸は、ＣＤＫ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号８の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ４核酸は、配列番号１３または配列番号１７の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ４核酸は、ＣＤＫ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態において、好適なＣＤＫ４ポリペプチドは、配列番号１４または配列番号１８の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
サイクリン
サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を活性化することにより、細胞周期を通した細胞の進行を制御するように機能する。Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（３３）：５２０８−５２１９。サイクリン−ＣＤＫ複合体は、リン酸化により他のタンパク質を活性化し、これは一方で、細胞周期における特定のイベントの原因となる。サイクリンは、十分に特性決定されており、ファミリーに分類されている。例えば、サイクリンＡファミリーは、ＣＣＮＡ１及びＣＣＮＡ２の２つのメンバーからなり、一方、サイクリンＢファミリーは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２及びＣＣＮＢ３の３つのメンバーからなる。細胞周期の異なる期の間は、異なるサイクリンが活性である。例えば、サイクリンＡは、合成期（Ｓ期）において活性であり、その間、ＤＮＡが複製され、Ｇ１期とＧ２期との間で生じる。一方、サイクリンＤは、Ｇ１期からＳ期への移行を調整する。サイクリンＢは、Ｇ２期からＭ期への進行を調整する。特に、サイクリンＢ１は、ＣＤＫ１に結合する有糸分裂サイクリンとして機能し、細胞周期のＭ期における、及びＭ期外への細胞の進行に必要である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、サイクリンは、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、及びサイクリンＥからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、サイクリンＢは、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）である。他の実施形態において、サイクリンＤは、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）である。さらに他の実施形態において、ＣＣＮＢ１及びＣＣＮＤ１の両方が使用される。
【０１２９】
様々な種からのサイクリンポリペプチド（例えばサイクリンＢ１、ＣＣＮＢ１）のアミノ酸配列及びサイクリンポリペプチド（例えばサイクリンＢ１、ＣＣＮＢ１）をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている。例えば、（１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１４１７２（ホモサピエンス４３３アミノ酸サイクリンＢ１）；（２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０６５１０．１（ホモサピエンス４３３アミノ酸サイクリンＢ１）；（３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＷ５１３０６．１（ホモサピエンス４３３アミノ酸サイクリンＢ１）；（４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１９６６．３（ホモサピエンスサイクリンＢ１をコードするヌクレオチド配列）；（５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７５８５０５．２（ハツカネズミ４３０アミノ酸サイシンＢ１）；（６）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７２３０１．３（ハツカネズミサイクリンＢ１をコードするヌクレオチド配列）を参照されたい。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＢ１核酸は、配列番号３または配列番号９の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＢ１核酸配列は、ＣＣＮＢ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＢ１ポリペプチドは、配列番号４または配列番号１０の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＤ１核酸は、配列番号１５または配列番号１９の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＢ１核酸配列は、ＣＣＮＢ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、好適なＣＣＮＢ１ポリペプチドは、配列番号１６または配列番号２０の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
オーロラキナーゼ
オーロラキナーゼは、細胞周期制御に重要なセリン／トレオニン  キナーゼである。Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５（１）：１−１０。これらのキナーゼは、細胞分裂中の染色分体の分離を制御するように機能する。現在まで、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びオーロラキナーゼＣ（ＡＵＲＫＣ）の３つの哺乳動物オーロラキナーゼが特定されている。特に、ＡＵＲＫＢは、部分的に、動原体への有糸分裂紡錘体の付着において特異的に機能する。
【０１３５】
様々な種からのオーロラキナーゼポリペプチド（例えばＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列及びオーロラキナーゼ  ポリペプチド（例えばＡＵＲＫＢ）をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている。例えば、（１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４２０８．２（ホモサピエンス３４４アミノ酸オーロラキナーゼＢアイソフォーム１）；（２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２４３７６３．１（ホモサピエンス３０３アミノ酸オーロラキナーゼＢアイソフォーム２）；（３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２７１４５５．１（ホモサピエンス３４５アミノ酸オーロラキナーゼＢアイソフォーム３）；（４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ００４４２．３（ホモサピエンス３４４アミノ酸オーロラキナーゼＢ）；（５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４２１７．３（ホモサピエンスＡＵＲＫＢをコードするヌクレオチド配列、転写変異体１）；（６）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２５６８３４．１（ホモサピエンスＡＵＲＫＢをコードするヌクレオチド配列、転写変異体２）；（７）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８４５２６．１（ホモサピエンスＡＵＲＫＢをコードするヌクレオチド配列、転写変異体３）；（８）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３５６２６．１（ハツカネズミ３４５アミノ酸オーロラキナーゼＢ）；（９）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０３２６１．１（ハツカネズミ３４５アミノ酸オーロラキナーゼＢ）；（１０）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１１４９６．１（ハツカネズミオーロラキナーゼＢをコードするヌクレオチド配列）を参照されたい。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、好適なＡＵＲＫＢ核酸は、配列番号５または配列番号１１の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、好適なＡＵＲＫＢ核酸配列は、ＡＵＲＫＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態において、好適なＡＵＲＫＢポリペプチドは、配列番号６または配列番号１２の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
さらに、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１をコードする核酸配列の導入は、分裂終了細胞（例えば心筋細胞及びニューロン）の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するのに十分であることが発見されている。いくつかの実施形態において、ＣＤＫは、ＣＤＫ１であり、サイクリンは、ＣＣＮＢ１である。
【０１３９】
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢをコードする核酸配列の導入は、心臓細胞（例えば分裂終了心筋細胞）の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するのに十分であることが発見されている。
【０１４０】
増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された分裂終了細胞を特定するために、数多くのマーカー及び方法が使用され得る。例えば、増殖細胞は、増殖マーカー（例えば、Ｋｉ６７、ＰＨＨ３、ＥｄＵ）及び細胞特異的マーカーの両方を発現する細胞に対する免疫細胞化学分析により特定され得る。増殖能力を有さない、または増殖能力が低い細胞は、増殖マーカーの発現が低い、またはないものとして特定され得る。低い発現は、増殖対照試料（例えば、幹細胞または前駆細胞）と比較して、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または発現なしであってもよい。心臓マーカーの限定されない例は、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、ミオシン重鎖（ＭＹＨ）、アルファアクチニン及び／またはコネキシン４３を含む。神経マーカーの限定されない例は、ネスチン、神経核（ＮｅｕＮ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、乏突起膠細胞系統（Ｏｌｉｇ１／２）、及びグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を含む。膵臓マーカーの限定されない例は、Ｐａｘ４、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンを含む。
【０１４１】
様々な細胞マーカーの発現は、従来の生化学的または免疫化学的方法（例えば、酵素免疫測定法、免疫組織化学的アッセイ等）により検出され得る。代替として、細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現が評価されてもよい。細胞内の細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、過去に任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出及び分析するために一般的に使用されていた分子生物学的方法により確認され得る。心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースにより利用可能である。したがって、プライマーまたはプローブとしての使用に必要なマーカー特異的配列は、容易に決定される。
【０１４２】
遺伝子改質
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、分裂終了細胞を遺伝子的に改質する組成物を分裂終了細胞に投与することにより、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発される。組成物は、細胞周期調整ポリペプチド、例えば、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を含んでもよい（概して「少なくとも１つの核酸」と呼ばれる）。いくつかの実施形態において、オーロラキナーゼは、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する組成物及び／または方法から明示的に除外される。
【０１４３】
増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸は、組み換え発現ベクターであってもよく、好適なベクターは、例えば、組み換えレトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、核酸発現ベクター、ならびにプラスミド発現ベクターを含む。いくつかの場合において、少なくとも１つの核酸は、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）及びその子孫のゲノム内に統合される。他の場合において、少なくとも１つの核酸は、分裂終了細胞及びその子孫内でエピソーム状態を維持する。いくつかの場合において、内生の自然型の少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子は、すでに分裂終了細胞内に存在し得るが、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するために、追加的な外生因子（例えば少なくとも１つの核酸）が分裂終了細胞に追加される。他の場合において、少なくとも１つの核酸は、分裂終了細胞内の内生増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸によりコードされるポリペプチドと１つ以上のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードする。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、別個の発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、各発現コンストラクトは、１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、複数の発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、各発現コンストラクトは、１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、３つの別個の発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、各発現コンストラクトは、１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、２つの別個の発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、各発現コンストラクトは、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、１つの発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、発現コンストラクトは、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、１つ発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、発現コンストラクトは、いくつかの細胞周期調整因子の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、１つの発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、発現コンストラクトは、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１の全ての配列をコードし、また任意選択でＣＤＫ４及び／またはＣＣＮＤ１を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１をコードし、また任意選択でＣＤＫ４及び／またはＣＣＮＤ１を含む配列は、１つの発現ベクター、２つの発現ベクター（例えば、ＣＤＫ１は、ＣＣＮＢ１として別個のベクターから発現される）、または４つの発現ベクター（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１は、全て別個のベクターから発現される）内にある。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、１つ発現コンストラクトで遺伝子的に改質され、発現コンストラクトは、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの３つ全ての配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢをコードする配列は、１つの発現ベクター、２つの発現ベクター（例えば、ＣＤＫ１は、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢとして別個のベクターから発現される）、または３つの発現ベクター（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢは、全て別個のベクターから発現される）内にある。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸は、単一の分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）内に導入される。他の実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸は、分裂終了細胞の集団（例えば分裂終了心筋細胞の集団）内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入される。いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸は、分裂終了細胞（例えば、単一の分裂終了心筋細胞または分裂終了心筋細胞の集団）内にｉｎ  ｖｉｖｏで導入される。
【０１４７】
心臓細胞の集団が、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）遺伝子的に改質される場合、１つ以上の外生核酸は、分裂終了細胞の全集団の０．１％超、例えば０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または０．１％を超える他のパーセントの細胞内に導入され得る。
【０１４８】
他の実施形態において、分裂終了細胞の集団が、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）遺伝子的に改質される場合、１つ以上の外生核酸は、心臓細胞の全集団の１％超、例えば２％、３％、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、または１％を超える他のパーセントの細胞内に導入され得る。
【０１４９】
他の実施形態において、分裂終了細胞の集団が、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外生核酸で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）遺伝子的に改質される場合、１つ以上の外生核酸は、分裂終了細胞の全集団の２０％超、例えば２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または２０％を超える他のパーセントの細胞内に導入され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸は、遺伝子的に改質された分裂終了細胞における１つ以上の増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドの生成を提供する発現コンストラクト内にある。いくつかの実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスコンストラクト、例えば、組み換えアデノ関連ウイルスコンストラクト（例えば米国特許第７，０７８，３８７号）、組み換えアデノウイルスコンストラクト、組み換えレンチウイルスコンストラクト等である。
【０１５１】
好適な発現ベクターは、これらに限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクチニアウイルスをベースとしたウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３−２５４９、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５−５２４、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：７７００−７７０４、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８−１０９７、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５）；アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（１）：８１−８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：６９１６−６９２１、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７−２８６３、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３−６９０、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１−６４８、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．５：５９１−５９４、ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１０３１９−１０３２３、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２−７８１６）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び哺乳動物腫瘍ウイルスから誘導されたベクター）等を含む。
【０１５２】
数多くの好適な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。以下のベクターが、例として挙げられる：真核細胞の場合、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及びｐＡｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。しかしながら、本開示の細胞と適合する限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０１５３】
利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的及び誘発性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４）。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＣＣＮＢ１をコードするヌクレオチド配列、ＡＵＲＫＢをコードするヌクレオチド配列、ＣＤＫ１をコードするヌクレオチド配列、ＣＣＮＤ１をコードするヌクレオチド配列、またはＣＤＫ４をコードするヌクレオチド配列）は、制御要素、例えばプロモーター等の転写制御要素に作用可能に連結される。転写制御要素は、真核細胞、例えば哺乳動物心臓細胞において機能的である。好適な転写制御要素は、プロモーター及びエンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的に活性である。他の実施形態において、プロモーターは、誘発性である。
【０１５５】
好適な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的であるプロモーター）の限定されない例は、ＣＭＶ、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。いくつかの実施形態において、心臓特異的発現を付与し得るプロモーターが使用される。好適な心臓特異的プロモーターの限定されない例は、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ−２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）を含む。好適なニューロン特異的プロモーターの限定されない例は、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、ニューロン特異的エノラーゼ及び血小板誘導成長因子ベータ鎖プロモーター、ならびにサイトメガロウイルスエンハンサー（Ｅ）をそれらのニューロン特異的プロモーターに融合することによるハイブリッドプロモーターを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードするヌクレオチド配列は、細胞型特異的転写調整要素（ＴＲＥ）に作用可能に連結され、ＴＲＥは、プロモーター及びエンハンサーを含む。好適なＴＲＥは、これらに限定されないが、ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、及び心臓アクチンの遺伝子から誘導されたＴＲＥを含む。Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２−５０５、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４−５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０−１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２：６０８−６１７、及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４０４７−４０５１。
【０１５７】
適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者レベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有してもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。
【０１５８】
好適な哺乳動物発現ベクター（哺乳動物分裂終了細胞における使用に好適な発現ベクター）の例は、これらに限定されないが、組み換えウイルス、核酸ベクター、例えばプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物発現カセットを含む。増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動する好適なプロモーターの例は、これらに限定されないが、レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）要素；構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ１−ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ−１α、β−アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）；誘発性プロモーター、例えばＴｅｔ−オペレーター要素を含有するもの；心臓特異的プロモーター、例えばデスミン（Ｄｅｓ）、アルファ−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ−２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）；神経特異的プロモーター、例えばネスチン、神経核（ＮｅｕＮ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、乏突起膠細胞系統（Ｏｌｉｇ１／２）、及びグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ならびに膵臓特異的プロモーター、例えばＰａｘ４、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンを含む。
【０１５９】
いくつかの場合において、哺乳動物発現ベクター（複数可）は、外生増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドに加えて、トランスフェクトされた、形質導入された、または感染された細胞の特定または選択を容易化するマーカー遺伝子をコードする。マーカー遺伝子の例は、これらに限定されないが、蛍光タンパク質、例えば高感度緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ−Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：イソギンチャクモドキ種（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；Ｂｅｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１１）：８３−８７）、黄色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びシアノ蛍光（ｃｙａｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）タンパク質をコードする遺伝子；ならびに、選択薬剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等を含む。
【０１６０】
一実施形態において、発現ベクターは、自殺遺伝子をさらに含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる。自殺遺伝子の発現は、少なくとも１つの増殖及び／または細胞周期再進入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチドを発現するものと同じ、または異なるプロモーターにより調整され得る。自殺遺伝子は、細胞の負の選択を可能にする遺伝子である。本明細書に記載の方法において、自殺遺伝子は、安全システムとして使用され、遺伝子を発現する細胞が、選択薬剤の導入により死滅されることを可能にする。これは、組み換え遺伝子が制御不能な細胞成長をもたらす突然変異を引き起こす場合に望ましい。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋまたはＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロ還元酵素遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌Ｄｅｏ遺伝子を含む、いくつかの自殺遺伝子系が特定されている（例えば、Ｙａｚａｗａ  Ｋ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｗ  Ｅ，Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ  Ｆ  Ｃ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．（２００２）２６（７）：７８３−９もまた参照されたい）。一実施形態において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。一態様において、ＴＫ遺伝子は、野生型ＴＫ遺伝子である。他の態様において、ＴＫ遺伝子は、遺伝子の突然変異形態、例えばｓｒ２３ｔｋである。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを使用して死滅させることができる。別の実施形態において、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸及び自殺遺伝子が、１つのプロモーターにより調整される。
【０１６１】
好適なウイルスベクターの例は、これらに限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）；アデノウイルス；アデノ関連ウイルスをベースとするウイルスベクター、及びエピソームベクターを含む。好適なレトロウイルス系ベクターの一例は、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）をベースとするベクターであるが、他の組み換えレトロウイルス、例えばトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス誘発ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｂｅ）白血病ウイルス、マソン−ファイザーサルウイルス、またはラウス肉腫ウイルスもまた使用され得る（例えば、米国特許第６，３３３，１９５号）。
【０１６２】
他の場合において、レトロウイルス系ベクターは、レンチウイルス系ベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））である。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（６）：４９９１−５０００（ＦＩＶ）、Ｎｅｇｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６１：５３−７４（ＳＩＶ）、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（ＨＩＶ）。
【０１６３】
組み換えレトロウイルスは、標的細胞への進入を補助するために、ウイルスポリペプチド（例えばレトロウイルスｅｎｖ）を含んでもよい。そのようなウイルスポリペプチドは、当技術分野、例えば米国特許第５，４４９，６１４号において十分に確立されている。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種外の細胞を含む複数の種から誘導された細胞への進入を補助する両種性ウイルスポリペプチド、例えば両種性ｅｎｖであってもよい。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種外の細胞内への進入を補助する異種指向性ウイルスポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスポリペプチドは、元の宿主種の細胞内への進入を補助する同種指向性ウイルスポリペプチド、例えば同種指向性ｅｎｖである。
【０１６４】
細胞内へのレトロウイルスの進入を補助することができるウイルスポリペプチドの例は、これらに限定されないが、ＭＭＬＶ両種性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ同種指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種指向性ｅｎｖ、水疱性口内炎ウイルス−ｇタンパク質（ＶＳＶ−ｇ）、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ−Ｃ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＭＬＶ  １０Ａ１  ｅｎｖ遺伝子、及びキメラを含むそれらの変異体を含む。Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｐｔ  Ａ：９９−１１２（ＶＳＶ−Ｇ）；米国特許第５，４４９，６１４号。いくつかの場合において、ウイルスポリペプチドは、発現または受容体への向上した結合を促進するように遺伝子的に改質される。
【０１６５】
一般に、組み換えウイルスは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを生成細胞内に導入することにより生成される。いくつかの場合において、生成細胞は、外生遺伝子を発現しない。他の場合において、生成細胞は、１つ以上の外生遺伝子、例えば１つ以上のｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖポリペプチド、及び／または１つ以上のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウイルスパッケージング細胞は、標的細胞内への進入を補助するウイルスポリペプチド、例えばＶＳＶ−ｇをコードする遺伝子を含んでもよい。いくつかの場合において、パッケージング細胞は、１つ以上のレンチウイルスタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはｎｅｆを含む。いくつかの場合において、パッケージング細胞は、アデノウイルスタンパク質、例えばＥ１ＡもしくはＥ１Ｂまたは他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞により供給されるタンパク質は、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ等のレトロウイルス誘導タンパク質；ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆ等のレンチウイルス誘導タンパク質；ならびにＥ１Ａ及びＥ１Ｂ等のアデノウイルス誘導タンパク質であってもよい。多くの例において、パッケージング細胞は、ウイルスベクターが誘導されるウイルスとは異なるウイルスから誘導されたタンパク質を供給する。
【０１６６】
パッケージング細胞株は、これに限定されないが、任意の容易にトランスフェクション可能な細胞株を含む。パッケージング細胞株は、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳまたはＨｅＬａ細胞株をベースとしてもよい。パッケージング細胞は、ウイルスパッケージングに必要なタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠損したウイルスベクタープラスミドをパッケージするためにしばしば使用される。そのようなウイルスベクタープラスミドによりコードされたタンパク質から欠損したタンパク質またはポリペプチドを供給することができる任意の細胞が、パッケージング細胞として使用され得る。パッケージング細胞株の例は、これらに限定されないが、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｐｌａｔ−Ｅ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）、ＢＯＳＣ  ２３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１５５４）及びＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２７０）を含む。Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（１２）：１０６３−１０６６、Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９、米国特許第６，９９５，００９号。市販のパッケージング株、例えば、Ａｍｐｈｏ−Ｐａｋ  ２９３細胞株、Ｅｃｏ−Ｐａｋ  ２−２９３細胞株、ＲｅｔｒｏＰａｃｋ  ＰＴ６７細胞株、及びＲｅｔｒｏ−Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（全てＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）もまた有用である。
【０１６７】
レトロウイルスコンストラクトは、一連のレトロウイルス、例えばＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、または本明細書に記載の他のレトロウイルスから誘導され得る。レトロウイルスコンストラクトは、特定ウイルスの２回以上の複製サイクルに必要な全てのウイルスポリペプチドをコードし得る。いくつかの場合において、ウイルス進入の効率は、他の因子または他のウイルスポリペプチドの添加により改善される。他の場合において、レトロウイルスコンストラクトによりコードされるウイルスポリペプチドは、２回以上の複製サイクルを支援しない（例えば米国特許第６，８７２，５２８号）。そのような状況において、他の因子または他のウイルスポリペプチドの添加が、ウイルス進入の容易化を補助し得る。例示的実施形態において、組み換えレトロウイルスは、ＶＳＶ−ｇポリペプチドを含むがＨＩＶ−１  ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ−１ウイルスである。
【０１６８】
レトロウイルスコンストラクトは、プロモーター、複数のクローニング部位、及び／または耐性遺伝子を含んでもよい。プロモーターの例は、これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ１α、β−アクチン；レトロウイルスＬＴＲプロモーター、及び誘発性プロモーターを含む。レトロウイルスコンストラクトはまた、パッケージングシグナル（例えば、ＭＦＧベクターから誘導されたパッケージングシグナル；ｐｓｉパッケージングシグナル）を含んでもよい。当技術分野において知られているいくつかのレトロウイルスコンストラクトの例は、これらに限定されないが、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸまたはそれらの誘導体を含む。Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９。いくつかの場合において、レトロウイルスコンストラクトは、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）ベクターである。Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０−８１５７。いくつかの場合において、レトロウイルスコンストラクトは、ＬＬ−ＣＧ、ＬＳ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧまたはＭＦＧである。Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０−８１５７、Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９、Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：６７３３−６７３７。ウイルスベクタープラスミド（またはコンストラクト）は、レトロウイルス系としてｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ−ＩＢ、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ−ｎｅｏ（ｐＭＸｓ−ＩＢは、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストサイジン耐性遺伝子を担持するベクターである）（Ｋｉｍａｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３１：１００７−１０１４、ＭＦＧ  Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：６７３３−６７３７）、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：３５８７−３５９６）、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ（Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ．７２：８１５０−８１５７）等を、またアデノウイルス系としてｐＡｄｅｘｌ（Ｋａｎｅｇａｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：３８１６−３８２１）等を含む。例示的実施形態において、レトロウイルスコンストラクトは、ブラストサイジン（例えばｐＭＸｓ−ＩＢ）、ピューロマイシン（例えばｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）、またはネオマイシン（例えばｐＭＸｓ−ｎｅｏ）を含む。Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：３５８７−３５９６。
【０１６９】
パッケージング細胞から組み換えウイルスを生成する方法、及びその使用は、十分確立されており、例えば、米国特許第５，８３４，２５６号、米国特許第６，９１０，４３４号、米国特許第５，５９１，６２４号、米国特許第５，８１７，４９１号、米国特許第７，０７０，９９４号、及び米国特許第６，９９５，００９号を参照されたい。多くの方法は、パッケージング細胞株内へのウイルスコンストラクトの導入から始まる。ウイルスコンストラクトは、これらに限定されないが、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（例えばＦｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７４１３−７４１７）、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、ヌクレオフェクション等、及び本明細書に記載の任意の方法を含む、当技術分野において知られている任意の方法により、宿主線維芽細胞内に導入され得る。
【０１７０】
細胞の非ウイルスベースのトランスフェクション等の様々な周知の技術を使用して、増殖及び／または細胞周期再進入因子をコードする１つ以上の核酸が、分裂終了細胞内に導入されてもよい。例示的態様において、コンストラクトは、ベクター内に組み込まれ、心臓細胞内に導入される。心臓細胞への導入は、当技術分野において知られている任意の非ウイルスベースのトランスフェクション法、例えば、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱衝撃、マグネトフェクション、リポソーム媒介移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等、または細胞融合等により行われてもよい。トランスフェクションの他の方法は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｈｉｌｙｍａｘ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、及びＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）等のトランスフェクション試薬を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸は、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。合成ｍＲＮＡは、対象となるタンパク質を作製するための遺伝子情報を提供し、免疫反応の惹起を回避するように化学的に改質されてもよい。Ｚａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３１：８９８−９０７。ｍＲＮＡは、宿主細胞ゲノム内に統合しないため、合成ＲＮＡは、ある期間作用し、次いで細胞が分裂する際に消失する。いくつかの実施形態において、合成ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡに対する自然の抗ウイルス反応を低減するように、例えばプソイドウリジン及び／または５−メチル−シチジンで改質される。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢまたはそれらの組み合わせ及び／もしくはそれらのそれぞれの等価物をコードする。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、ＣＤＫ１をコードする好適な合成ＲＮＡは、配列番号１または配列番号７の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＣＮＢ１をコードする好適な合成ＲＮＡは、配列番号３または配列番号９の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＵＲＫＢをコードする好適な合成ＲＮＡは、配列番号５または配列番号１１の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ４をコードする好適な合成ＲＮＡは、配列番号１３または配列番号１７の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＣＮＤ１をコードする好適な合成ＲＮＡは、配列番号１５または配列番号１９の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
タンパク質改質
別の態様において、ポリペプチドは、当技術分野において知られている任意の方法を使用して分裂終了細胞内に導入され得る。タンパク質送達（すなわちタンパク質形質導入）は、ペプチドまたはタンパク質モチーフが細胞原形質膜を通過するプロセスである。ペプチドを細胞内に導入する方法は、例えば、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢまたはそれらの組み合わせ及び／もしくはそれらのそれぞれの等価物である。
【０１７４】
化学的改質
別の態様において、本開示は、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量の少なくとも１つの化学物質を含む組成物を細胞に投与することを含む方法を提供し、上記化学組成物は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼ、またはそれらの等価物の発現を増加させることができる。他の実施形態において、方法は、細胞を、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ、少なくとも１つのサイクリン、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の少なくとも１つの化学物質と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、化学物質は、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、それらの組み合わせ及び／またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる。
【０１７５】
サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、もしくはオーロラキナーゼ（例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、もしくはＡＵＲＫＢ）、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させることができる、現在知られている、または後に発見される任意の化合物が、本開示の範囲内である。化合物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体に関連して使用され得る全ての薬学的に許容される誘導体も包含することが理解されるべきである。
【０１７６】
他の態様において、本開示は、分裂終了細胞の増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する方法であって、増殖及び／または細胞周期再進入を刺激するために、細胞を有効量の化学組成物と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる方法を提供し、上記化学組成物は、細胞増殖及び／または細胞周期再進入の負の調整因子の発現を阻害することができる。例えば、Ｗｅｅ１阻害剤を使用して、ＣＤＫ１の発現を誘発することができる。いくつかの実施形態において、小分子ＭＫ１７７５（Ｗｅｅ１阻害剤）によるＣＤＫ１の活性化は、カクテルからＣＤＫ１及び／またはＣＣＮＢを置き換えることができる。
【０１７７】
追加の薬剤及び細胞周期調整因子
分裂終了細胞（例えば分裂終了心筋細胞）は、上述のように（遺伝子的または非遺伝子的に）改質されてもよく、また、組成物に添加され得る１つ以上の追加の薬剤及び／または因子と接触させられてもよく、例えば、１つ以上の追加の薬剤及び／または因子は、培養培地または組成物への添加剤として含まれてもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、他の細胞周期調整遺伝子、例えば、アクチン結合タンパク質アニリン（ＡＮＬＮ）、細胞分裂周期−５（ＣＤＣ５）、カドヘリン−６（ＣＤＨ６）、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリン依存性キナーゼ３（ＣＤＫ３）、動原体タンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）、ＣＯＰ９シグナロソームサブユニット５（ＣＯＰＳ５）、カリン３（ＣＵＬ３）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＣＹＫ４）、細胞質分裂のタンパク質調整因子１（ＰＲＣ１）及び／またはＷＮＴ１誘発性シグナル伝達経路タンパク質１（ＷＩＳＰ１）が、組成物に含まれてもよい。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞における細胞周期の阻害を解放する化合物、例えばｐ３８阻害剤、ｐ２１阻害剤、ｐ５７阻害剤、またはそれらの薬学的に許容される誘導体の使用が、増殖及び／または細胞周期再進入における増加を容易化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、小分子阻害剤が使用され得る。他の実施形態において、発現を減少させるために、ｓｉＲＮＡが使用され得る。ｐ３８、ｐ２１、ｐ５７等の小分子阻害剤及びｓｉＲＮＡの両方が、市販されている。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、１つ以上の増殖及び／または細胞周期再進入因子の第１の組成物が、ある期間分裂終了細胞に添加され、続いて１つ以上の増殖及び／または細胞周期再進入因子の第２の組成物が添加される。例えば、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１の組み合わせは、Ｇ１及びＳにおける細胞の数を上昇させるように作用し得、本明細書において「Ｇ１カクテル」と呼ばれる。他の因子の組み合わせ、例えばＣＤＫ１及びＣＣＮＢは、「Ｇ２カクテル」として作用し、Ｇ１またはＳではなく、Ｇ２における細胞の数を上昇させ得る。ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１の組み合わせは、Ｇ１／Ｇ２細胞のバランスの取れた分布を誘発し得る。いくつかの実施形態において、Ｇ１カクテルがある期間添加され、続いてＧ２カクテルが添加される。Ｇ２カクテルは、Ｇ１カクテルに添加されてもよく、またはＧ２カクテルと置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｇ２カクテルがある期間分裂終了細胞に添加された後、Ｇ１カクテルが細胞に添加されてもよい。Ｇ１カクテルは、Ｇ２カクテルに加えて添加されてもよく、または、Ｇ１カクテルは、Ｇ２カクテルと置き換えられてもよい。１つの好ましい実施形態において、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１改質ｍＲＮＡのＧ１カクテルが、ある期間分裂終了細胞の集団に添加されてもよく、次いで、Ｇ１カクテルが除去されてもよく、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１改質ｍＲＮＡのＧ２カクテルが、ある期間分裂終了細胞の集団に添加されてもよい。Ｇ１及びＧ２カクテルは、分裂終了細胞の増殖を誘発するために、同様のパターンで交互に添加されてもよい。Ｇ１及びＧ２カクテルに対する分裂終了細胞の交互の曝露は、細胞周期を通してより効率的に細胞を駆動するのに役立ち得る。
【０１８１】
ＩＩＩ．組成物
本開示はまた、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞を提供する。
【０１８２】
一態様において、本開示はまた、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１及び／もしくはＡＵＲＫＢ、またはそれらの組み合わせ及び／もしくはそれらのそれぞれの等価物）を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞を含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる組成物を提供する。
【０１８３】
いくつかの態様において、少なくとも１つのＣＤＫ及び少なくとも１つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞が提供される。他の態様において、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するようにさらに改質されている。
【０１８４】
別の態様において、実質的に均質な集団の分裂終了細胞が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載の増殖性分裂終了細胞の集団と、担体と、任意選択で薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、安定剤及び／または保存剤をさらに含む。
【０１８５】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、健全な医学的決定の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なしに人間及び動物の組織に接触する使用に適し、妥当な利益／リスク比に相応する化合物、材料、組成物及び／または剤形を指すように使用される。
【０１８６】
組成物は、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、及びそのような他の不活性薬剤を含んでもよい。薬学的調製物において一般的に使用されるビヒクル及び賦形剤は、例えば、タルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコール等を含む。溶液は、水または生理学的に適合する有機溶媒、例えばエタノール、１，２−プロピレン  グリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステル等を使用して調製され得る。非経口組成物は、無菌等張食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合されたポリグリコール、リンゲル液等を含み得る従来の技術を使用して調製され得る。一態様において、意図される処置部位に組成物を位置付け、適切に配置するのを容易化するために、着色剤が添加されてもよい。
【０１８７】
組成物は、保存剤及び／または安定剤を含んでもよい。保存剤の限定されない例は、メチル−、エチル−、プロピル−パラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀塩、クロルヘキシジン、フェノール、３−クレゾール、四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロルブタノール、２−エトキシエタノール、及びイミド尿素を含む。
【０１８８】
張性を制御するために、組成物は、生理学的な塩、例えばナトリウム塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１から２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む。
【０１８９】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含んでもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲内の濃度で含まれる。組成物のｐＨは、一般に５から８の間であり、より典型的には６から８の間であり、例えば６．５から７．５、または７．０から７．８の間である。
【０１９０】
組成物は、処置される疾患または状態に依存して当業者に明らかである任意の適切な経路により投与され得る。典型的な投与経路は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、鼻腔内または腹腔内を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、組成物は、抗凍結剤を含んでもよい。抗凍結剤の限定されない例は、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９２】
組成物は、移植可能なデバイス内に含まれてもよい。本明細書により企図される好適な移植可能なデバイスは、血管内ステント（例えば、自己拡張ステント、バルーン拡張ステント、及びステントグラフト）、スキャフォールド、グラフト等を含む。そのような移植可能なデバイスは、分裂終了細胞の細胞周期再進入を誘発することができる組成物で、少なくとも１つの表面上をコーティングまたは含浸されてもよい。組成物はまた、移植可能なデバイス内の貯蔵部内に含有されてもよい。組成物が移植可能なデバイス内の貯蔵部内に含有される場合、貯蔵部は、組成物をデバイスから溶出させるように構造化される。組成物は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、及びＡＵＲＫＢポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせもしくはそれらのそれぞれの等価物を含んでもよい。本開示は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、及びＡＵＲＫＢポリペプチド、またはそれらの任意の組成物もしくはそれらのそれぞれの等価物をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を備える移植可能なデバイスをさらに提供する。
【０１９３】
組成物は、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、及びそのような他の不活性薬剤を含んでもよい。薬学的調製物において一般的に使用されるビヒクル及び賦形剤は、例えば、タルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコール等を含む。溶液は、水または生理学的に適合する有機溶媒、例えばエタノール、１，２−プロピレン  グリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステル等を使用して調製され得る。非経口組成物は、無菌等張食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合されたポリグリコール、リンゲル液等を含み得る従来の技術を使用して調製され得る。一態様において、意図される処置部位に組成物を位置付け、適切に配置するのを容易化するために、着色剤が添加されてもよい。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、製剤は、制御放出製剤である。「制御放出製剤」という用語は、持続放出及び徐放製剤を含む。制御放出製剤は、当技術分野において周知である。これらは、組成物の持続的、周期的、パルス、または遅延放出を可能にする賦形剤を含む。制御放出製剤は、これらに限定されないが、マトリックスへの組成物（細胞ならびに／または少なくとも１つの増殖及び／もしくは細胞周期再進入因子）の埋め込み、腸溶性コーティング、マイクロカプセル化、ゲル及びヒドロゲル、インプラント、ならびに組成物の制御放出を可能にする任意の他の製剤を含む。
【０１９５】
一態様において、上述の製剤（細胞ならびに／または少なくとも１つの増殖及び／もしくは細胞周期再進入因子）と、試薬と、培養培地とを備える部品のキットが提供される。キットは、培養において細胞を成長させるため、またはそれを必要とする対象に投与するためのプロトコルを説明する文書または指示書をさらに備えてもよい。
【０１９６】
ＩＶ．処置方法
心臓血管疾患
一態様において、心臓血管疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
【０１９７】
別の態様において、心臓血管疾患を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示される増殖性分裂終了心臓細胞（例えば心筋細胞）の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性心筋細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【０１９８】
別の態様において、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、心臓血管疾患を処置する方法が提供される。
【０１９９】
いくつかの態様において、本開示の増殖性心臓細胞（例えば心筋細胞）は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、増殖性心臓細胞は、それを必要とする対象に投与され得、対象への増殖性心臓細胞の投与は、対象における心臓血管疾患を処置する。したがって、いくつかの実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された心臓細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、またはそれらの組み合わせ及び／もしくは等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２００】
本開示の組成物、細胞及び方法を使用した処置を必要とする対象は、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個人、変性筋肉疾患に罹患した個人、虚血心組織をもたらす状態に罹患した個人（例えば冠動脈疾患を有する個人）等を含む。いくつかの例において、方法は、変性筋肉疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または最終的に虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患）を処置するのに有用である。いくつかの例において、主題の方法は、心臓または心臓血管疾患または障害、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、鬱血性心不全、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、最終的に虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個人を処置するのに有用である。
【０２０１】
本開示の組成物、細胞及び方法を使用した処置に好適な対象は、これらに限定されないが、虚血心組織をもたらす状態を含む心臓状態を有する個人（例えば、哺乳動物対照、例えばヒト、非ヒト霊長類、実験用非ヒト哺乳動物対象、例えばマウス、ラット等）（例えば冠動脈疾患を有する個人）等を含む。いくつかの例において、処置に好適な個人は、心臓または心臓血管疾患または障害、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、鬱血性心不全、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、最終的に虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症に罹患している。いくつかの例において、主題の方法による処置に好適な個人は、変性筋肉疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または最終的に虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を有する個人を含む。
【０２０２】
神経疾患
一態様において、神経疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
【０２０３】
別の態様において、神経疾患を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示される増殖性分裂終了神経細胞（例えばニューロン）の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性神経細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性神経は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【０２０４】
別の態様において、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、神経疾患を処置する方法が提供される。
【０２０５】
いくつかの態様において、本開示の増殖性神経細胞（例えばニューロン）は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、増殖性神経細胞は、それを必要とする対象に投与され得、対象への増殖性神経細胞の投与は、対象における神経疾患を処置する。したがって、いくつかの実施形態において、神経疾患を処置する方法は、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された神経細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、神経疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、神経疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、またはそれらの組み合わせ及び／もしくは等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２０６】
本開示の組成物、細胞及び方法を使用した処置を必要とする、またはそれに好適な対象は、これらに限定されないが、脊髄損傷（ＳＣＩ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、硬膜動静脈瘻、癲癇、記憶障害、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、末梢神経障害、アルツハイマー病、帯状疱疹後神経痛、脊髄腫瘍、及び脳卒中を含む。
【０２０７】
膵臓疾患
一態様において、膵臓疾患を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
【０２０８】
別の態様において、膵臓疾患を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示される増殖性分裂終了膵臓細胞（例えばベータ細胞）の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性膵臓細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性膵臓細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【０２０９】
別の態様において、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、膵臓疾患を処置する方法が提供される。
【０２１０】
いくつかの態様において、本開示の増殖性膵臓細胞（例えばベータ細胞）は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、増殖性膵臓細胞は、それを必要とする対象に投与され得、対象への増殖性膵臓細胞の投与は、対象における膵臓疾患を処置する。したがって、いくつかの実施形態において、膵臓疾患を処置する方法は、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された膵臓細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、膵臓疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、膵臓疾患を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、またはそれらの組み合わせ及び／もしくは等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２１１】
本開示の組成物、細胞及び方法を使用した処置を必要とする、またはそれに好適な対象は、これらに限定されないが、糖尿病（例えば、１型糖尿病または２型糖尿病）、急性膵炎、慢性膵炎、遺伝性膵炎、膵臓がん、嚢胞性線維症、及び先天性奇形を有する個人を含む。
【０２１２】
聴力損失
一態様において、聴力損失を処置するための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
【０２１３】
別の態様において、聴力損失を処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示される耳の増殖性分裂終了有毛細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性有毛細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、増殖性有毛細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【０２１４】
別の態様において、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、聴力損失を処置する方法が提供される。
【０２１５】
いくつかの態様において、本開示の増殖性有毛細胞（例えば内耳の有毛細胞）は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、増殖性有毛細胞は、それを必要とする対象に投与され得、対象への増殖性有毛細胞の投与は、対象における聴力損失を処置する。したがって、いくつかの実施形態において、聴力損失を処置する方法は、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された有毛細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、聴力損失を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、聴力損失を処置する方法は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、またはそれらの組み合わせ及び／もしくは等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２１６】
本開示の組成物、細胞及び方法を使用した処置を必要とする、またはそれに好適な対象は、これらに限定されないが、頭部外傷、ウイルスまたは疾患、大音量の騒音への曝露、自己免疫性内耳疾患、遺伝性障害、加齢（老年性難聴）、内耳の奇形、及びメニエール病により引き起こされた聴力損失を含む。
【０２１７】
骨格筋
一態様において、筋肉量を増加させるための方法であって、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
【０２１８】
別の態様において、筋肉量を増加させるための方法であって、有効量の本明細書に開示される増殖性分裂終了骨格筋細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性骨格筋細胞は、ＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている。他の実施形態において、骨格筋細胞は、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１またはその両方を過剰発現するように改質されている。
【０２１９】
別の態様において、増殖及び／または細胞周期再進入因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物）を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、筋肉量を増加させる方法が提供される。
【０２２０】
いくつかの態様において、本開示の増殖性骨格筋細胞は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、増殖性骨格筋細胞は、それを必要とする対象に投与され得、骨格筋細胞の対象への投与は、骨格筋細胞の数を増加させることにより、対象における筋肉量を増大させる。したがって、いくつかの実施形態において、筋肉量を増大させる方法は、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された骨格筋細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、筋肉量を増大させる方法は、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはそれらの等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態において、筋肉量を増大させる方法は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、またはそれらの組み合わせ及び／もしくは等価物を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２２１】
本開示の組成物、細胞及び方法の使用を必要とする、またはそれに好適な対象は、これらに限定されないが、筋ジストロフィー、脳性まひ、筋萎縮性側索硬化症、及び重症筋無力症等の骨格筋疾患を有する個人、または重量挙げ選手及びボディビルダー等の筋肉量の増加を求める個人を含む。
【０２２２】
別段に指定されない限り、本明細書全体にわたり使用される略語は、以下の意味を有する。
Ａａ ＝ アミノ酸（複数可）
Ｂｐ ＝ 塩基対（複数可）
Ｈ ＝ 時間
Ｇ ＝ グラム
Ｋｂ ＝ キロベース
ｋＤａ ＝ キロダルトン
Ｋｇ ＝ キログラム
Ｌ ＝ リットル
ＬＣ ＝ 液体クロマトグラフィー
Ｍｇ ＝ ミリグラム
Ｍｉｎ ＝ 分
ｍＬ ＝ ミリリットル
ｍＭ ＝ ミリモル
ｎＭ ＝ ナノモル
ｎＴ ＝ ヌクレオチド（複数可）
ｐＭ ＝ ピコモル
ｓ．ｄ． ＝ 標準偏差
μＣｉ ＝ マイクロキュリー
Μｇ ＝ マイクログラム
μＬ ＝ マイクロリットル
μΜ ＝ マイクロモル
Μｍ ＝ マイクロメートル
℃ ＝ セ氏温度
【０２２３】
以下の１文字の記号は、アミノ酸を表す場合、以下の意味を有する。
Ａ ＝ アラニン
Ｒ ＝ アルギニン
Ｎ ＝ アスパラギン
Ｄ ＝ アスパラギン酸
Ｃ ＝ システイン
Ｅ ＝ グルタミン酸
Ｑ ＝ グルタミン
Ｇ ＝ グリシン
Ｈ ＝ ヒスチジン
Ｉ ＝ イソロイシン
Ｌ ＝ ロイシン
Ｋ ＝ リシン
Ｍ ＝ メチオニン
Ｆ ＝ フェニルアラニン
Ｐ ＝ プロリン
Ｓ ＝ セリン
Ｔ ＝ トレオニン
Ｗ ＝ トリプトファン
Ｙ ＝ チロシン
Ｖ ＝ バリン
【実施例】
【０２２４】
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態をさらに例示することを意図する。実施例は、当技術分野における通常の技術の１つを提供するために提示され、その範囲を限定することを意図しない。
【０２２５】
実施例１．非増殖性心筋細胞における増殖の誘発
心筋細胞の細胞培養：
マウス心筋細胞を、Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １６（２）：２３３−２４４に記載のように新生仔マウス（新生Ｐ０）及び成体（６週齢）から単離した。心筋細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地中で培養した。
【０２２６】
マイクロアレイプロトコル：
マウスのゲノム規模での遺伝子発現分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙを使用して行った。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、新生仔マウス（新生Ｐ０）及び成体（６週齢）の心筋細胞からＲＮＡを抽出した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐプロトコルに従い、独立した生体試料から３回マイクロアレイ分析を行った。データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌ（ＡＰＴ、バージョン１．８．５）を使用して分析した。統計／閾値の組み合わせを使用して、差次的遺伝子発現を決定した。
【０２２７】
過剰発現：
Ｍｏｈａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｊｕｌ  １；１０３（１）：４７−５９に従い、アデノウイルスを構築した。簡潔に説明すると、ＥＧＦＰ、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢのコード領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯシャトルベクターにサブクローニングした。アデノウイルスは、製造者の推奨方法に従ってＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステムを使用したｐＥＮＴＲ（商標）／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯシャトルベクターとｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との間のホモログ組み換えにより生成した。アデノウイルス粒子は、アデノウイルスコードプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより生成し、塩化セシウムカラムを使用して精製し、滴定した。心筋細胞を感染させるために、２５多重度（ＭＯＩ）のアデノウイルスを２４時間インキュベートし、次いで培地を新鮮な培地で置き換えた。
【０２２８】
免疫細胞化学：
細胞を、室温で４％パラホルムアルデヒド中に１５ｍｉｎ固定し、サポニンで透過処理し、ブロックし、トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する一次抗体と、次いでＡｌｅｘａ  ４８８（緑）または５９４（赤）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化した二次抗体と共にインキュベートした。
【０２２９】
組織学：
マッソントリクローム染色法のために、心筋梗塞から６週間後に心臓を採取し、パラフィン内に包理し、横方向に断面化した。脱パラフィン化した断面を、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン希釈標準溶液中に１０ｍｉｎ、ビーブリッヒ赤−酸性フクシン溶液中に１５ｍｉｎ、リンモリブデン−リンタングステン酸溶液中に１５ｍｉｎ、アニリンブルー溶液中に５〜１０ｍｉｎ、及び１％酢酸溶液中に２〜５ｍｉｎ順次浸漬した。細胞注入心臓における免疫組織化学的試験のために、心臓を０．４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、ＯＣＴ化合物内に包理し、液体窒素中で凍結させた（Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。心臓を、両方の心室を示すように７μｍの断面に垂直に切断した。断面をＰＨＨ３（Ｓ１０）及びトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する一次抗体で、Ａｌｅｘａ  ４８８または５９４、及びＤＡＰＩと複合化した二次抗体で染色した。
【０２３０】
増殖及び細胞数アッセイ：
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ、または対照アデノウイルスベクターを過剰発現する２ヶ月齢のｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞を、培養物中で成長させた。ＥｄＵ（５−エチニル−２´−デオキシウリジン；１０μＭ）を、培養培地に３０分間投与した。ＥｄＵの組み込みは、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用して検出され、顕微鏡法により分析された。
【０２３１】
対照またはＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ  アデノウイルスで形質導入された２ヶ月齢のｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞の心筋細胞増殖核の数を、ＤＡＰＩ陽性細胞に対する免疫蛍光を使用して、画像当たりの全核数を評価することにより定量した。
【０２３２】
対照またはＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢで形質導入されたｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞の集団における全細胞数を、ＦＡＣＳ分析により決定した。培養皿から細胞を採取し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【０２３３】
また、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）を使用して、細胞数及び生存率を分析した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏは、ＦＡＣＳにおいて必要とされるように培養プレートから細胞を分離する必要のない、ＡＴＰ代謝の測定による細胞数及び生存率の極めて高感度の指示薬である。対照細胞またはＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢで形質導入された細胞の、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬とのインキュベーション後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏを含有するウェルのルミネセンス強度を記録したが、強度は、ウェル内の生存代謝細胞の数に比例していた。
【０２３４】
経時的画像化：
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現するようにアデノウイルスで形質導入された心筋細胞を、２４ウェルプレート内に４通りで播種し（ウェル当たり１０，０００細胞）、ＩｎｃｕＣｙｔｅ撮像装置（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）を使用して細胞増殖について分析した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅにおいて１時間間隔で４日間走査した。データをＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアで分析した。
【０２３５】
動物試験：
ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢまたはＧＦＰ対照アデノウイルスを、Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ４８５（７４００）：５９３−８、Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７：２２２４−２２３１に記載のように、Ｃ５７ｂｌ６／Ｎ心臓の心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷部位に注射した。細胞増殖を評価するために梗塞から５日後に、または心臓機能を評価するため、及び組織学用に梗塞から６週間後に心臓を採取した。
【０２３６】
心エコー検査：
ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢまたはＧＦＰ対照アデノウイルスに感染させたマウスにおける駆出率（ＥＦ）を測定するために、２次元測定を使用して収縮機能を評価した。マウスを、１．７５％イソフルランで麻酔した。コア温度を３７〜３８℃に維持し、無作為盲検的に走査を行った。パーセント駆出率（％ＥＦ）及び経時的なＥＦの低下が測定された。各マウスに対し、梗塞後３日目、１０日目、２４日目及び４０日目に別個の走査を行った。
【０２３７】
結果
細胞周期遺伝子は、新生仔心筋細胞と成体心筋細胞との間で異なるように調整される
心臓細胞増殖及び／または細胞周期再進入を誘発する潜在的因子を選択するために、マイクロアレイ分析を行って、新生仔（新生Ｐ０）マウス心筋細胞と成体（６週齢）マウス心筋細胞との間で異なるように発現した細胞周期遺伝子を特定した。増殖（新生仔）心筋細胞と非増殖（成体）心筋細胞との間で異なるように発現した代表的な細胞周期遺伝子を、図１に示す。
【０２３８】
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢは、マウス及びヒト心筋細胞における心臓細胞増殖を促進する
いずれか１つの遺伝子の過剰発現が、ＥｄＵ組み込みにより検出される増殖及び／または細胞周期再進入を増加し得るかどうかを決定するために、成体心筋細胞における上から１５の下方調整細胞周期遺伝子を試験した。ＡＵＲＫＢ（Ａｕｒｏｒａ）、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ５、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＥＮＰＡ、ＣＯＰＳ５、ＣＵＬ３、ＣＹＫ４、及びＰＲＣ１を過剰発現する心筋細胞は、ＥｄＵ組み込みの増加を示した（図２、パネルＡ）。一方で、ＡＮＬＮ、ＣＤＨ６及びＷＩＳＰ１の過剰発現は、対照と比較して、ＥｄＵ組み込みの減少を示した（図２、パネルＡ）。増殖性細胞（ＥｄＵ＋）はまた、心臓細胞マーカーである心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対して染色陽性であった（図２、パネルＢ）。
【０２３９】
次に、組み合わせて使用された３つの因子（ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ）が、非増殖性ｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞の増殖を誘発するのに十分であるかどうかを試験した。ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを、アデノウイルスによりｈｉＰＳＣ誘導心筋細胞に導入した。ホスホヒストンＨ３（Ｓ１０）陽性細胞は、対照細胞において観察されなかった。一方、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを７２時間過剰発現する細胞は、ホスホヒストンＨ３発現の増加を示した（図３）。同様に、７日齢マウスから単離された増殖能力を有さない心筋細胞に構成的に活性なＣＤＫ１（ＣＤＫ１ＡＦ）ならびにＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを導入した場合、対照アデノウイルスで形質導入された細胞と比較して、ホスホヒストンＨ３発現の増加が見られた（図７）。
【０２４０】
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現は、心筋細胞の細胞数を増加させる
次に、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現する心筋細胞の集団の細胞数の定量を行った。３つの独立した方法を使用した。増殖心筋細胞の定量では、７２時間のＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現に応じて核数が倍加することが示された（図４、パネルＡ）。さらに、全核の３０％がＰＨＨ３に対して染色陽性であった。ＦＡＣＳ分析では、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現する心筋細胞の集団における細胞数が、対照と比較して２倍増加することが示された（図４、パネルＢ）。ＦＡＣＳにより必要とされるような培養皿からの細胞の分離を必要とすることなく細胞数及び細胞生存率を試験するために、ＡＴＰ  Ｇｌｏアッセイを行った。この方法を使用して、７２時間のＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現後の細胞数の２倍の増加が、ＦＡＣＳ分析において報告されたものと同様に観察された（図４、パネルＣ）。
【０２４１】
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現による心筋細胞増殖の誘発をさらに評価するために、経時的画像化を行った。４日間にわたり、１時間毎に画像を収集した。ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢを過剰発現するマウス及びヒト心筋細胞の両方において、細胞分裂が観察された（図５及び６）。
【０２４２】
これらのデータは総合して、非増殖性成体心筋細胞が、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ等の細胞周期遺伝子を過剰発現することにより、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発され得ることを実証した。
【０２４３】
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢは、心筋梗塞後の心臓機能及び構造を改善する
ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢの過剰発現による心筋細胞増殖の誘発が、心筋損傷後に有益であるかどうかを決定するために、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢアデノウイルスまたは対照ＧＦＰアデノウイルスを、マウスの心筋梗塞後の損傷部位に注射した。梗塞から５日後、心臓は、対照ＧＦＰ注射心臓と比較して、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢ注射心臓における損傷部位で増殖の増加を示した（図８、パネルＡ）。さらに、梗塞から６週間後、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢが注射された５つの心臓のうち３つが、ＧＦＰ対照と比較して、梗塞領域内の著しい量の心筋細胞を示した（図８、パネルＢ）。
【０２４４】
心臓機能を評価するために、動物にＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢまたはＧＦＰ対照アデノウイルスを注射した。続いて、動物に心エコー検査を行い、梗塞から３日後、１０日後、２４日後及び４０日後の心臓機能を評価した。５匹の対照のうち１匹のみが生存した。一方、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢが注射された７匹のマウスのうち５匹が生存した（図９、パネルＡ）。さらに、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＣＮＢ１及びＡＵＲＫＢが注射された５匹のマウスのうち４匹が、唯一の生存対象と比較して、より少ない経時的な心臓機能の低下を示した（図９、パネルＢ）。
【０２４５】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏデータは、増殖及び／または細胞周期に再進入するように誘発された成体心筋細胞が、心筋梗塞後の心臓機能及び構造を改善し得ることを実証した。
【０２４６】
実施例２．分裂終了ヒト心筋細胞における増殖の誘発
ヒト分裂終了心筋細胞の細胞増殖及び／または細胞周期再進入を誘発するための因子の最適なカクテルを決定するために、因子の組み合わせをスクリーニングした。ヒト胚幹細胞誘導心筋細胞を、以前に説明されたように（Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ８（１）：１６２−１７５）生成した。細胞を、ＴＧＦ−βｉ（ＳＢ４３１５４２、「ＳＢ」）、ＣＤＫ活性化剤（ＭＫ１７７５、「ＭＫ」）、及びＩＧＦ１の組み合わせあり、またはなしで、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＡＵＲＫＢまたはＧＦＰ対照アデノウイルスの組み合わせで処置した。因子カクテルでの処置から４日後、８日後及び１２日後の増加したホスホ−ヒストンＨ３染色により評価されるように、有糸分裂を生じる細胞の数を増加させた因子のカクテルを特定するために、分析を行った。図１０、パネルＡ。また、核の総数の増加により評価されるように、どの因子のカクテルが最も高い細胞生存率を有していたかを特定するために、分析を行った。図１０、パネルＢ。
【０２４７】
これらのデータは、ＣＤＫ１ＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１、及びＣＣＮＤ１の組み合わせが、最善の生存率及び増殖性分裂終了心筋細胞の増加をもたらしたスクリーニング後の因子のカクテルであることを実証した。また、ＳＢ４３１５４２を使用したＴＧＦβシグナル伝達の阻害が、生存率を向上させることが観察された。さらに、小分子ＭＫ１７７５によるＣＤＫ１の活性化が、カクテルからＣＤＫ１及びＣＣＮＢ１を置き換えることができた。
【０２４８】
実施例３．カクテルは細胞周期の異なる段階を標的化する
因子の異なるカクテルが分裂終了細胞の細胞増殖及び／または細胞周期再進入を促進する作用機序をより良く理解するために、蛍光ユビキチン細胞増殖インジケータ（ＦＵＣＣＩ）技術を使用して細胞の細胞周期挙動を可視化した。Ｚｉｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＷＩＲＥｓ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４：４６９−４８７。このシステムを使用すると、Ｍ／Ｇ１期における細胞は赤色蛍光を発し（ｍＣｈｅｒｒｙ）、Ｓ／Ｇ２における細胞は緑色蛍光を発し（ＧＦＰ）、Ｓにおける細胞は赤色及び緑色の蛍光を発する。ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢのカクテルの組み合わせ（パネルＡ）と、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤのカクテル（パネルＢ）ならびにＣＤＫ１、ＣＣＮＢ、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤのカクテル（パネルＣ）との比較では、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、及びＡＵＲＫＢの組み合わせがＧ２カクテルとして作用し、Ｇ１またはＳではなく、Ｇ２における細胞の数を上昇させることを示した。ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１の組み合わせは、Ｇ１カクテルとして作用し、Ｇ２ではなくＧ１及びＳにおける細胞の数を上昇させた。一方、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ１の組み合わせは、Ｇ１／Ｇ２細胞のバランスの取れた分布を誘発した。バランスの取れた分布は、細胞生存に役立つと考えられる。
【０２４９】
実施例４．ＣＤＫ１／ＣＣＮＢ１／ＣＤＫ４／ＣＣＮＤ１カクテルは心筋梗塞後の心臓機能を改善する
ＣＤＫ１／ＣＣＮＢ１／ＣＤＫ４／ＣＣＮＤ１のＧ１／Ｇ２カクテルが心筋梗塞後の心臓機能を改善し得るかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を行った。手術のための動物プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。全ての手術は、以前に説明されたように行われた。Ｑｉａｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：５９３−５９８。簡潔に説明すると、マウスを２．４％イソフルラン／９７．６％酸素で麻酔し、仰臥位で加熱パッド（３７℃）上に設置した。動物に１９Ｇスタンプ針を挿管し、ＭｉｎｉＶｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  ８４５マウスベンチレータ（Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ；１回拍出量、２５０μｌ；呼吸速度、毎分１２０呼吸）を使用して、室内空気で通気した。Ｑｉａｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：５９３−５９８に記載のように、７−０プロレン縫合糸での左前下行（ＬＡＤ）枝の永久的な結紮により心筋梗塞（ＭＩ）を誘発した。偽手術動物は手術対照として役立ち、ＬＡＤが結紮されていないことを除いて、実験動物と同じ手順に供した。ＭＩの時点で、動物の心筋にＧ１／Ｇ２カクテルを注射した。
【０２５０】
ＭＩ前、及びＭＩから１週間後、２週間後、４週間後、８週間後及び１２週間後に、一連の心エコー検査を行い、心臓機能を評価した。心エコー検査は、１５ＭＨｚリニアアレイ超音波振動子を有するＶｅｖｏ  ７７０  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を用いて行った。１２０Ｈｚのフレームレートでの胸骨傍長軸及び短軸像の両方において、左心室を評価した。収縮末期または拡張末期を、左心室がそれぞれ最小及び最大であるように見える期として定義し、駆出率測定に使用した。収縮率を計算するために、乳頭筋における５０ｍｍ／ｓの掃引速度での左心室Ｍモードトレーシングから、左心室収縮末期及び拡張末期径を測定した。収縮末期及び拡張末期径の２次元測定には、Ｂモードを使用した。
【０２５１】
標準マッソントリクローム染色法を、ウイルス送達及び冠動脈結紮から１２週間後の心臓に対して行った。瘢痕サイズを決定するために、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用して、ＭＩ心臓の左心室内の４つのレベルにわたる横断面上の瘢痕領域（青）及び健康領域（赤）を測定した。
【０２５２】
結果は、Ｇ１／Ｇ２カクテルによる処置が、心エコー検査により評価される駆出率（ＥＦ）の変化により反映されるように、偽処置動物と比較して心臓機能を著しく向上させたことを示している（図１２）。改善された機能は、ＭＩ後１週間という早さで生じた。瘢痕サイズを定量し、処置された心臓の梗塞領域内の筋肉の存在を検出するために、組織学的分析を行った。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化観察と一致して、Ｇ１／Ｇ２カクテルで処置された動物から取り出した心臓において、より厚い筋細胞帯が梗塞ゾーン内に観察されることが判明した（図１３、パネルＡ）。さらに、処置された動物において、瘢痕サイズは著しく低減された（図１３、パネルＢ）。
【０２５３】
この再筋肉化がｉｎ  ｖｉｖｏでの心筋細胞増殖に起因することを確認するために、二重マーカーのモザイク解析（ＭＡＤＭ）マウスを使用して系列追跡を行った。これらのマウスから取り出された細胞において、細胞が分裂する際に緑色及び赤色細胞が生じ、分裂がない場合は黄色を維持し、したがって分裂細胞と非分裂細胞との間が区別される。梗塞領域付近の再筋肉化は、少なくとも部分的に、内生細胞の増殖をによる新たな心筋細胞の生成に起因することが判明した（図１４）。
【０２５４】
実施例５．分裂終了ニューロンにおける増殖の誘発
Ｇ１／Ｇ２カクテルがまた分裂終了ニューロンの細胞増殖及び／または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、Ａｒｒａｓａｔｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（１０）：３８４０−３８４５において報告されているように、新生仔ラット（Ｐ１６〜１８）から皮質ニューロンの一次培養物を調製した。大脳皮質を切除し、パパインで、次いでトリプシン阻害剤で処置し、穏やかに研和して、Ｏｐｔｉｍｅｍ＿ｇｌｕｃｏｓｅ培地内で単一ニューロンを分離させた。９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、細胞（約１５０，０００）を播種した。２時間後、播種培地を、血清を含む成長培地で置き換えた。細胞が成熟ニューロンであることを示すために、形態マーカーとしてのｐＧＷ１−ＧＦＰ及び神経特異的プロモーターＭＡＰ２−ＤｓＲｅｄでそれらの細胞を標識化した。分裂細胞を特定するために、経時的顕微鏡法を行った。図１５に示されるように、Ｇ１／Ｇ２カクテルは、分裂終了ニューロンの細胞分裂を誘発した。さらに、Ｇ１／Ｇ２カクテルにより感染後６０〜９０時間の間でほとんどの分裂が生じ、一方いくつかの分裂は、感染後１２０時間という遅い時期に生じることが決定された。図１６。
【０２５５】
実施例６．分裂終了膵臓ベータ細胞における増殖の誘発
Ｇ１／Ｇ２カクテルが分裂終了膵臓β細胞の細胞増殖及び／または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、例えばＣｌａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：１３６８１に記載の方法により、他の非β細胞部分集団からβ細胞を精製する。精製β細胞を組織培養プレート内に播種し、Ｇ１／Ｇ２アデノウイルスカクテルまたは偽アデノウイルス対照で処置する。Ｇ１／Ｇ２カクテルで処置されたβ細胞は、感染から４８時間後、７２時間後及び９６時間後に細胞分裂の増加を示す。偽カクテルで処置されたβ細胞は、細胞分裂の増加を示さない。
【０２５６】
実施例７．分裂終了有毛細胞における増殖の誘発
Ｇ１／Ｇ２カクテルがまた内耳の分裂終了有毛細胞の細胞増殖及び／または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、Ｒｏｎａｇｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  ２３（１１）１２７５−１２８４に記載のものに類似した方法を使用して、人工多能性幹細胞からｎ  ｖｉｔｒｏで内耳細胞を誘導する。分化内耳細胞を組織培養プレート内に播種し、Ｇ１／Ｇ２アデノウイルスカクテルまたは偽アデノウイルス対照で処置する。Ｇ１／Ｇ２カクテルで処置された細胞は、感染から４８時間後、７２時間後及び９６時間後に細胞分裂の増加を示す。偽カクテルで処置された細胞は、細胞分裂の増加を示さない。
【０２５７】
上記の実施形態と併せて本発明を説明したが、上記の説明及び実施例は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を制限する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点及び本発明の範囲内の修正は、本発明が関連する技術分野の当業者に明らかである。
【０２５８】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して説明されている場合、当業者には、それによって本発明がまたマーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の下位群に関しても説明されることが認識される。
【０２５９】
本明細書において言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それぞれが参照により個々に組み込まれるのと同等に、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。不一致が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
配列番号１
ヒトＣＤＫ１
遺伝子ＩＤ：９８３
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００１７８６（転写変異体１）、ＣＤＳ（１４３．．１０３６）
【化１】
2018512179.tif 000003
配列番号２
ヒトＣＤＫ１
【化２】
2018512179.tif 000004
配列番号３
ヒトサイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
遺伝子ＩＤ：８９１
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０３１９６６．３、ＣＤＳ（２５４．．１５５５）
【化３】
2018512179.tif 000005
配列番号４
ヒトサイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
【化４】
2018512179.tif 000006
配列番号５
ヒトオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）
遺伝子ＩＤ：９２１２
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００４２１７．３（転写変異体１）、ＣＤＳ（１２３．．１１５７）
【化５】
2018512179.tif 000007
配列番号６
ヒトオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）
【化６】
2018512179.tif 000008
配列番号７
マウスＣＤＫ１
遺伝子ＩＤ：１２５３４
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００７６５９．３、ＣＤＳ（１０４．．９９７）
【化７】
2018512179.tif 000009
配列番号８
マウスＣＤＫ１
アミノ酸配列
【化８】
2018512179.tif 000010
配列番号９
マウスサイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
遺伝子ＩＤ：２６８６９７
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿１７２３０１．３、ＣＤＳ（８５．．１３７７）
【化９】
2018512179.tif 000011
配列番号１０
マウスサイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
アミノ酸配列
【化１０】
2018512179.tif 000012
配列番号１１
マウスオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）
遺伝子ＩＤ：２０８７７
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０１１４９６．１、ＣＤＳ（３１９．．１３５６）
【化１１】
2018512179.tif 000013
配列番号１２
マウスオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）
アミノ酸配列
【化１２】
2018512179.tif 000014
配列番号１３
ヒトＣＤＫ４
ｍＲＮＡ：ＫＲ７０９９１１
【化１３】
2018512179.tif 000015
配列番号１４
ヒトＣＤＫ４
アミノ酸配列
【化１４】
2018512179.tif 000016
配列番号１５
ヒトＣＣＮＤ１
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０５３０５６
【化１５】
2018512179.tif 000017
2018512179.tif 000018
2018512179.tif 000019
配列番号１６
ヒトＣＣＮＤ１
アミノ酸配列
【化１６】
2018512179.tif 000020
配列番号１７
マウスＣＤＫ４
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００９８７０
【化１７】
2018512179.tif 000021
配列番号１８
マウスＣＤＫ４
アミノ酸配列
【化１８】
2018512179.tif 000022
配列番号１９
マウスＣＣＤＮ１
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００７６３１．２
【化１９】
2018512179.tif 000023
2018512179.tif 000024
配列番号２０
マウスＣＣＮＤ１
アミノ酸配列
【化２０】
2018512179.tif 000025
【図１】
2018512179.tif 000026
【図２】
2018512179.tif 000027
【図３】
2018512179.tif 000028
【図４】
2018512179.tif 000029
【図５】
2018512179.tif 000030
【図６】
2018512179.tif 000031
【図７】
2018512179.tif 000032
【図８】
2018512179.tif 000033
【図９】
2018512179.tif 000034
【図１０】
2018512179.tif 000035
【図１１】
2018512179.tif 000036
【図１２】
2018512179.tif 000037
【図１３】
2018512179.tif 000038
【図１４】
2018512179.tif 000039
【図１５】
2018512179.tif 000040
【図１６】
2018512179.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月21日(2017.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018512179000001.app
【国際調査報告】
2018512179.tif 000042