(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルス、特に、系統発生第１群のＡ型インフルエンザウイルスに結合し、かつ／または中和することができる新規なペプチド模倣化合物、およびそのような化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、インフルエンザウイルス感染の診断、予防および／または治療におけるペプチド模倣化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｃａｐ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃａｐ２
（ここで、
Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含むアミノ酸配列である）
を有するペプチド模倣化合物であって、
系統発生第１群の２つの異なる亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡに特異的に結合することができる化合物。
【請求項２】
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有し、直鎖状側鎖またはＣ−ガンマ分岐側鎖を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｔｙｒ、またはチロシンの水酸基を置換する水素結合供与体および／または水素結合受容体を有するＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、Ｐｈｅ、または、フェニル環のオルトおよび／またはメタ位に水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１-Ｃ４アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、フェニル環のパラ位にハロゲン原子を有するＬ−フェニルアラニンアナログ、Ｌ−３−ナフタレン−１−イル−アラニン、およびＬ−３−ナフタレン−２−イル−アラニンであり；かつ
Ｘ８は、Ｔｒｐ、またはインドール環のＣ５、Ｃ６および／もしくはＣ７にハロゲン置換基を有し、かつ／またはインドール環のＣ２に低級脂肪族置換基を有するＬ−トリプトファンアナログである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
環化されている請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ２および／またはＸ４は、環化に使用可能な官能基を有する任意のＬ−アミノ酸であって、前記官能基は前記Ｌ−アミノ酸のＣ−アルファ原子から２〜５原子離れており；かつ
Ｘ１０は、環化に使用することができる官能基を有する任意のＬ−アミノ酸であって、前記官能基は前記Ｌ−アミノ酸のＣ−アルファ原子から２〜５原子離れている請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ２残基とＸ１０残基との間の化学架橋によって環化されている請求項３または４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ２残基とＸ１０残基を含むアミド結合の形成によって環化されている請求項３または４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ２は、ＬｙｓまたはＬ−オルニチンであり、Ｘ１０は、ベータ−アラニン、３−アミノプロピオン酸、３−アミノ−２，２−ジメチル−プロピオン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、またはＰｒｏである請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ１０はＬｙｓまたはＬ−オルニチンである請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ４残基とＸ１０残基との間の化学架橋によって環化されている請求項３または４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ４残基とＸ１０残基を含むアミド結合の形成によって環化されている請求項３または４に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ４は、ＬｙｓまたはＬ−オルニチンであり、Ｘ１０は、ベータ−アラニン、３−アミノプロピオン酸、３−アミノ−２，２−ジメチル−プロピオン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、またはＰｒｏである請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ４はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ１０はＬｙｓまたはＬ−オルニチンである請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ２残基とＸ１０残基、Ｘ４残基とＸ１０残基との間の化学架橋によって環化されている請求項３に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ２、Ｘ４およびＸ１０の残基で導入された遊離アミン基のトリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）による分子内架橋によって環化されている請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物を２つ以上含む多量体ペプチド模倣化合物。
【請求項１６】
前記化合物は２量体である請求項１５に記載の多量体化合物。
【請求項１７】
前記化合物がＸ４残基で導入された反応基の分子間架橋によって多量体化されている請求項１５または１６に記載の多量体化合物。
【請求項１８】
Ｃａｐ１は、アセチルまたはスクシニルである請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘ１は、（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸、（２Ｓ）−３，３−ジメチル−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸、またはＡｒｇである請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘ２は、Ｌｙｓ、Ｌ−オルニチン、Ｃｙｓ、Ｌ−ホモ−システイン、またはＳｅｒである請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−シクロペンチルアラニン、Ｌ−シクロブチルアラニン、Ｌ−シクロプロピルアラニン、（２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−４−メチルヘキサン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−メチルヘキサン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−４−メチルヘプタン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−メチルヘプタン酸、（Ｓ）−２−アミノ−４−エチルヘキサン酸、およびそれらの全てのＮ−メチル化誘導体である請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン、システイン、ホモシステイン、Ｎ６−（４−カルボキシブタノイル）リシン、またはＮ５−（４−カルボキシブタノイル）オルニチンである請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｘ５はＴｙｒである請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｘ６は、Ｐｈｅ、Ｌ−２−クロロフェニルアラニン、Ｌ−３−クロロフェニルアラニン、Ｌ−４−クロロフェニルアラニンまたはＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンである請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓである請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−２−メチル−トリプトファンである請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｘ９はＳｅｒまたはＧｌｎである請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｘ１０は、４−アミノブタン酸、ベータ−アラニン、（（２Ｒ）−３−アミノ−２−（３−アミノプロパノイルアミノ）ベータ−アラニン、Ｌｙｓ、Ｌ−オルニチン、Ｃｙｓまたはホモシステインである請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｃａｐ２は、存在しないか、またはカルボキサミドである請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の化合物、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３１】
インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための請求項１〜２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
インフルエンザの診断、予防および／または治療用薬剤の製造における請求項１〜２９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学の分野に関する。本発明は、インフルエンザウイルス、特に、系統発生第１群のＡ型インフルエンザウイルスに結合し、かつ／または中和することができる新規なペプチド模倣化合物、およびそのような化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、インフルエンザウイルス感染の診断、予防および／または治療におけるペプチド模倣化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
季節性Ａ型インフルエンザは、主要な公衆衛生上の問題であり、毎年、世界で２５０，０００人を超える人々が死亡し、同時に多額の経済的負担を創出している。新しいウイルスが出現し、免疫の殆どない人々に感染すると生じる新型インフルエンザは人々の健康の大きな脅威とさえなり、例えば、１９１８年に世界的に流行した「スペイン風邪」では、推定５千万人が死亡した。感染者の５０％を超える死亡率を示した高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）の懸念が続いている。Ｈ５およびＨ７インフルエンザウイルスが世界の特定の地域の鳥で流行している。今のところ、これらのウイルスがヒトからヒトへ容易に感染することはないようであるが、Ｈ５型鳥インフルエンザに関する最近のデータは、僅かに数個のアミノ酸が変化するだけで、このウイルスが、ビボモデル系の哺乳動物で、空気感染によって広がり得ることを示している。
【０００３】
最近、ＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットにおいて開示）、ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットにおいて開示）、ＦＩ６（Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３，８５０−８５６（２０１１）において記載）など、Ａ型および／またはＢ型インフルエンザウイルスを広く中和することができる抗体が報告されている。これらの抗体は多種多様のヘマグルチニンタンパク質と相互に作用し、インフルエンザ株を広範囲にわたって中和することが示された。それらの効能および幅広さの結果として、今日、症状の重い患者の治療、および高リスク群に属する人々の予防に適用するために、そうした抗体の開発が進められている。しかし、製品の価格がかなり高いことや非経口投与であることにより、より多くの人々におけるモノクローナル抗体の使用が制限されると予想される。
【０００４】
現在、インフルエンザ感染の予防および／または治療に利用できる他の薬剤もまた厳しい制限がある。ノイラミニダーゼ阻害剤のオセルタミビルおよびザナミビル、ならびにＭ２阻害剤のアマンタジンおよびリマンタジンなどの抗ウイルス薬は、感染後遅く投与されると効果が小さく、また広範な使用により耐性ウイルス株が出現する可能性がある。さらに、大人のオセルタミビルの使用には、吐き気、嘔吐、精神的作用および腎臓イベントなどの副作用を伴う。
【０００５】
さらに、インフルエンザワクチンの効果は、（高齢の）高リスク患者には次善のものであって、循環インフルエンザウイルスの恒久的な抗原性の変化のために、インフルエンザワクチン株と循環インフルエンザ株間の最も近い候補を確保するために、インフルエンザワクチンの生成を毎年適応させる必要がある。
【０００６】
代替の対策としての、ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する新規の抗インフルエンザウイルス作用の発見もまた、このタンパク質の膨大な配列多様性によって妨げられている。したがって、報告されているヘマグルチニンリガンドは、今のところ、少数の関連性の高いインフルエンザ株に対してのみ活性を示している。
【０００７】
季節的流行の高い経済的インパクトや世界的流行の継続するリスクだけでなく、Ａ型インフルエンザウイルスに起因する呼吸器疾患の過酷さを考慮すると、Ａ型インフルエンザウイルスに対し広範な活性を有し、インフルエンザ感染を予防または治療するための薬剤として使用することができる新しい阻害剤が依然として要望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、系統発生第１群の、異なる亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡに特異的に結合することができる新規なペプチド模倣化合物を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、およびＨ５亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。少なくともいくつかの化合物は、系統発生第１群の、異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、およびＨ５亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株を特異的に中和することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、化合物は以下の配列を有する：
Ｃａｐ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃａｐ２
ここで、Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列である。
【００１０】
本発明はさらに、環化ペプチド模倣化合物を提供する。いくつかの実施形態では、したがって、化合物は以下から選択される配列を有する：
【化１】
2018522819.tif 000002
ここで、Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列である。
【００１１】
さらに他の態様では、本発明は、多量体、特に二量体のペプチド模倣化合物を提供する。いくつかの実施形態では、したがって、化合物は以下の配列を有する：
【化２】
2018522819.tif 000003
ここで、Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列である。
【００１２】
本発明はさらに、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための、本明細書に記載の化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】３種のインフルエンザ株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（左）、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（中央）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（右））に由来するＨＡに対するＣＰ１４１０３７、ＣＰ１４１０１９およびＣＰ１４１０９９の結合曲線を示す。レスポンスユニット（ＲＵ）を、化合物を増量注入した際の時間の関数としてプロットする。曲線はＳＰＲ実験から得られたトレースであり、重なった黒の細い線は、データに対する１：１ラングミュア結合モデルのベストフィットである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に導いた研究では、ＨＡの、特にモノクローナル抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＦＩ６との複合体の構造データによって導かれた新規なペプチド模倣化合物が開発された。ペプチド模倣化合物（「ペプチド模倣薬」とも呼ばれる）は、通常、天然のペプチドまたはタンパク質を模倣して設計された小さなタンパク質様分子である。ペプチド模倣薬は、天然ペプチドと同様の方法でそれらの天然のターゲットに結合する能力を有し、したがって、同じ生物学的作用を有していることが望ましい。さらに、それらが天然ペプチドと同じ生物学的作用を示すが、タンパク質分解に対する安定性、バイオアベイラビリティ、選択性および／または有効性などにより優れるなど、高い特性を有するようにこれらの分子を設計することができる。
【００１６】
本発明のペプチド模倣化合物が、少なくとも、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ａｎｄＡ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡ、およびＨ５Ｎ１インフルエンザ株のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４などのＨ５亜型のＨＡに対し、競合的な結合活性を有することが示された。本発明の化合物の少なくともいくつかはまた、系統発生第１群の異なるＨＡ亜型のＨＡをそれぞれ含む少なくとも２種の異なるＡ型インフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ａｎｄＡ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、およびＨ５Ｎ１インフルエンザ株のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４などのＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスに対し、中和活性を有することが示された。本発明の化合物には、小サイズ（１．５ｋＤａ）である、低コストの化学製品である、多重体型の変更が容易である、注射に依らない投与経路を可能にすることができるだけの高い安定性を有するなど、抗インフルエンザ抗体に比べていくつかの利点がある。
【００１７】
したがって、第１の態様では、本発明は以下の配列を有する新規なペプチド模倣化合物を提供する：
Ｃａｐ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃａｐ２
ここで、Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列である。
【００１８】
上に示したように、本発明の化合物は、系統発生第１群の、異なる亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を含む少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルスのＨＡに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、およびＨ５亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、およびＨ５亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ５亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株を中和することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、化合物は、系統発生第１群の他の亜型、例えば、Ｈ２および／またはＨ９亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルスに結合することができる。
【００２１】
本明細書中で使用する「特異的に結合する」という用語は、抗原性生体物質の混合物を含む試料中の対象のタンパク質、すなわちＨＡのエピトープには結合するが、他の分子にはそれを実質的に認識し結合することはない化合物を指す。通常、本発明の化合物は、第１群のＡ型インフルエンザウイルスのＨＡに、１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、より一層好ましくは１０ｎＭ未満、さらに好ましくは１ｎＭの親和性定数（Ｋｄ値）で結合する。
【００２２】
Ａ型インフルエンザウイルスに関連した「インフルエンザウイルス亜型」という用語は、ウイルス表面タンパク質のヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミダーゼ（Ｎ）の様々な組み合わせによって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルス株を指す。Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、そのＨの数、例えば、「Ｈ１もしくはＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、または「Ｈ１インフルエンザウイルス」もしくは「Ｈ５インフルエンザウイルス」などによって、あるいはＨの数とＮの数の組み合わせ、例えば、「インフルエンザウイルス「Ｈ１Ｎ１」または「Ｈ５Ｎ１」亜型として表すことができる。インフルエンザウイルス「亜型」という用語には、具体的には、そのような亜型内の個々の全てのインフルエンザウイルス「株」が含まれ、それらは、通常、ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼの変異の結果として相違していて、異なる病原性プロファイルを示し、自然分離株、および人工の変異体または再集合体などを含む。このような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称することもできる。したがって、本明細書では、「株」および「分離株」という用語は、互換的に使用され得る。Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、それらの系統発生群を参照することによりさらに分類することができる。それ故、系統分析により、インフルエンザヘマグルチニンの２つの主要グループへの再分類、とりわけ系統発生第１群におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型（「グループ１」インフルエンザウイルス）、およびとりわけ系統発生第２群におけるＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）への細分類が示された。
【００２３】
本発明のアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、または、例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらの変異体のいずれであってもよく、あるいは、タンパク質中に天然には見出されない変異体のいずれであってもよい。表５は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有し、直鎖状側鎖またはＣ−ガンマ分岐側鎖を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；Ｘ５は、Ｔｙｒ、またはチロシンの水酸基を置換する水素結合供与体または水素結合受容体を有するＬ−チロシンアナログであり；Ｘ６は、Ｐｈｅ、または、フェニル環のオルトおよび／またはメタ位に水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、フェニル環のパラ位にハロゲン原子を有するＬ−フェニルアラニンアナログ、Ｌ−３−ナフタレン−１−イル−アラニン、およびＬ−３−ナフタレン−２−イル−アラニンであり；そして、Ｘ８は、Ｔｒｐ、またはインドール環のＣ５、Ｃ６および／もしくはＣ７にハロゲン置換基を有し、かつ／またはインドール環のＣ２に低級脂肪族置換基を有するＬ−トリプトファンアナログである。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は環状化合物を提供する。環化は化合物の柔軟性を低下させ、親和性および有効性を高めるとともに、タンパク質分解に対する安定性、バイオアベイラビリティ、および／または選択性などの特性を改善する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は環化される。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ２残基とＸ１０残基との間、および／またはＸ４残基とＸ１０残基と間を化学架橋することによって環化される。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ２残基およびＸ１０残基を含むアミド結合の形成によって環化される。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ４残基およびＸ１０残基を含むアミド結合の形成によって環化される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、したがって、化合物は以下からなる群から選択される配列を有する：
【化３】
2018522819.tif 000004
ここで、Ｃａｐ１は、Ｎ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であり；
Ｘ２は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ３は、２００Ｄａ未満の分子量を有するＬ−脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ４は、任意のＬ−アミノ酸であり；
Ｘ５は、ＴｙｒまたはＬ−チロシンアナログであり；
Ｘ６は、ＰｈｅまたはＬ−フェニルアラニンアナログであり；
Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−トリプトファンアナログであり；
Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であり；かつ
Ｃａｐ２は、Ｃ−末端ブロッキング基を有し、０〜１０個の残基を含む任意のアミノ酸配列である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｘ２および／またはＸ４は環化に使用することができる官能基を有する任意のＬ−アミノ酸であって、その官能基はそのＬ−アミノ酸のＣ−アルファ原子から２〜５原子離れており；かつＸ１０は、環化に使用することができる官能基を有する任意のＬ−アミノ酸であって、その官能基はそのＬ−アミノ酸のＣ−アルファ原子から２〜５原子離れている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、ＬｙｓまたはＬ−オルニチンであり、Ｘ１０は、ベータ−アラニン、３−アミノプロピオン酸、３−アミノ−２，２−ジメチル−プロピオン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、またはＰｒｏである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｘ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ１０はＬｙｓまたはＬ−オルニチンである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、ＬｙｓまたはＬ−オルニチンであり、Ｘ１０は、ベータ−アラニン、３−アミノプロピオン酸、３−アミノ−２，２−ジメチル−プロピオン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、またはＰｒｏである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｘ４はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ１０はＬｙｓまたはＬ−オルニチンである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ２残基とＸ１０残基との間、および／またはＸ４残基とＸ１０残基との間を化学架橋することによって環化される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ２、Ｘ４およびＸ１０の残基で導入された遊離アミン基のトリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）による分子内架橋によって環化される。
【００３４】
さらに他の態様においては、本発明は、多量体のペプチド模倣化合物を提供するが、その多量体ペプチド模倣化合物は、本明細書に記載の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物は二量体である。いくつかの実施形態では、単量体の結合に関与している残基は、Ｘ４位にある。したがって、いくつかの実施形態では、化合物は、Ｘ４残基で導入された反応基の分子間架橋によって多量体化される。本発明の化合物は、ホモ二量体（すなわち、２つの同じ単量体化合物を含む）であっても、ヘテロ二量体であってもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は以下の配列を有する：
【化４】
2018522819.tif 000005
ここで、Ｃａｐ１、Ｘ１〜Ｘ１０およびＣａｐ２は、上で定義された通りである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、化合物は、２〜２０個のエチレングリコール単位の繰返しからなるリンカーによる、Ｘ４残基で導入された反応基の分子間架橋によって二量体化される。
【００３７】
上で定義したように、本発明の直鎖状、環状および／または多量体の化合物においては、Ｃａｐ１および／またはＣａｐ２は、０〜１０個の追加の残基を含むアミノ酸配列であってよい。したがって、本発明においては、Ｃａｐ１および／またはＣａｐ２は存在しなくてもよく、あるいは、本明細書に示すようなコア配列のＮ末端側に最大で１０個までの追加の残基（天然または非天然アミノ酸）からなるアミノ酸配列が存在し、かつ／またはＣ末端側に最大で１０個までの追加の残基（天然または非天然アミノ酸）からなるアミノ酸配列が存在してもよい。Ｃ−およびＮ−末端ブロッキング基は、当該技術分野で知られている任意のブロッキング基であってよい。Ｎ−末端ブロッキング基は、例えば、アセチル基またはスクシニル基である。Ｃ−末端ブロッキング基は、例えば、カルボキサミドである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１は、アセチル基またはスクシニル基である。
【００３９】
上で定義したように、本発明においては、Ｘ１は、任意のＬまたはＤ−アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸、（２Ｓ）−３，３−ジメチル−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸、またはＡｒｇである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、Ｌｙｓ、Ｌ−オルニチン、Ｃｙｓ、Ｌ−ホモ−システイン、またはＳｅｒである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−シクロペンチルアラニン、Ｌ−シクロブチルアラニン、Ｌ−シクロプロピルアラニン、（２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−４−メチルヘキサン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−メチルヘキサン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−４−メチルヘプタン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−メチルヘプタン酸、（Ｓ）−２−アミノ−４−エチルヘキサン酸、またはそのＮ−メチル化誘導体である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン、システイン、ホモシステイン、Ｎ６−（４−カルボキシブタノイル）リシン、またはＮ５−（４−カルボキシブタノイル）オルニチンである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｘ５はＴｙｒである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｘ６は、Ｐｈｅ、Ｌ−２−クロロフェニルアラニン、Ｌ−３−クロロフェニルアラニン、Ｌ−４−クロロフェニルアラニンまたはＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンである。
【００４５】
上で定義したように、Ｘ７は、任意の荷電または中性の親水性Ｌ−アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｘ８は、ＴｒｐまたはＬ−２−メチル−トリプトファンである。
【００４７】
上で定義したように、本発明においては、Ｘ９は、存在しないか、または任意の親水性Ｌ−アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ９は、ＳｅｒまたはＧｌｎである。
【００４８】
上で定義したように、本発明においては、Ｘ１０は、任意のＬ−アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ１０は、４−アミノブタン酸、ベータ−アラニン、（（２Ｒ）−３−アミノ−２−（３−アミノプロパノイルアミノ）ベータ−アラニン、Ｌｙｓ、Ｌ−オルニチン、Ｃｙｓまたはホモシステインである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｐ２は存在しない。
【００５０】
少なくともいくつかの実施形態では、化合物は、系統発生第１群の、異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、およびＨ５亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株を特異的に中和することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株を中和することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｈ５亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株を中和することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、化合物は、系統発生第１群の他の亜型、例えば、Ｈ２および／またはＨ９亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルスを中和することができる。本発明のいくつかの実施形態では、したがって、交差中和化合物が提供される。
【００５３】
本発明の化合物に関連して、本明細書中で使用する「中和する」または「中和」という用語は、その中和のメカニズムにかかわらず、インビトロで、および／または対象のインビボで、インフルエンザウイルスの複製を阻害する化合物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ウイルスと細胞膜が融合した後、ウイルスがターゲット細胞に結合するのを阻害することによって、インフルエンザウイルスを中和する。本発明の化合物に関連して、本明細書中で使用する「交差中和する」または「交差中和」という用語は、Ａ型インフルエンザの異なる亜型のインフルエンザウイルス株を中和する能力を指す。中和活性は、例えば、本明細書中に記載のように測定することができる。中和活性の代替の測定法は、例えば、ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ、２００５、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００２．５に記載されている。通常、本発明の化合物は、例えば、実施例で記載するような、インビトロでのウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）による測定で、１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下の中和活性を有する。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はアルギニンであり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０は−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２残基およびＸ１０残基間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はグルタミン酸であり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はＬ−シクロペンチルアラニンであり；Ｘ４はグルタミン酸であり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はＬ−Ｎ−メチル−ロイシンであり；Ｘ４はグルタミン酸であり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はＮ６−（４−カルボキシブタノイル）リシンであり；Ｘ５はチロシンであり、；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はグルタミン酸であり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はグルタミンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はＮ６−（４−カルボキシブタノイル）リシンであり；Ｘ５はチロシンであり、；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２の側鎖と末端との分子内結合の形成により環化されるとともに、１３個のエチレン単位を含むポリエチレングリコールスペーサ（ＰＥＧ１３）にＸ４のアミド基が結合することにより二量体化される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はグルタミン酸であり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０は（（２Ｒ）−３−アミノ−２−（３−アミノプロパノイルアミノ）ベータ−アラニンであり；かつＣａｐ２は存在せず、但し、化合物はＸ２およびＸ１０間のアミド結合により環化される（Ｘ２側鎖と末端との結合によるラクタム環の形成）。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐ１はアセチルであり；Ｘ１は（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸であり；Ｘ２はＬ−オルニチンであり；Ｘ３はロイシンであり；Ｘ４はＬ−オルニチンであり；Ｘ５はチロシンであり；Ｘ６はフェニルアラニンであり；Ｘ７はグルタミン酸であり；Ｘ８はトリプトファンであり；Ｘ９はセリンであり；Ｘ１０はＬ−オルニチンであり；かつＣａｐ２はカルボキサミドであり、但し、化合物はＴＳＡＴ（トリス−スクシンイミジル）アミノトリアセテートを介したＸ２、Ｘ４およびＸ１０の結合により環化される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、化合物は、以下からなる群から選択される配列を有する：
【化５】
2018522819.tif 000006
【化６】
2018522819.tif 000007
【００６４】
本発明のペプチド模倣化合物は、当該技術分野でよく知られた手順のいずれかで、特に、例えば、下記の実施例で記載するような、自動固相ペプチド合成装置を用いて行う確立された化学的合成手順の後、クロマトグラフィーによる精製を行うことによって製造することができる。
【００６５】
本発明はさらに、本明細書に記載の１つ以上の化合物、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される賦形剤」は、好適な組成物を調製するため、本発明の化合物などの活性分子と組み合わされる不活性な物質であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合性がある賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野に広く適用され、知られている。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療薬、予防薬および／または診断薬をさらに含み得る。前記の他の治療薬および／または予防薬は、例えば、インフルエンザウイルス感染を予防および／または治療することもできる薬剤、例えば、Ｍ２阻害剤（例えば、アマンタジン、リマンタジン）および／またはノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）であってもよい。これらは、本発明の化合物と併用することができる。本明細書中の「併用」は、別個の製剤としての、もしくは１つの組み合わせ製剤としての同時投与、または別個の製剤としての連続投与計画に従った任意の順序での投与を意味する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための、本明細書に記載の化合物を提供する。本発明はさらに、インフルエンザの診断、予防および／または治療用の薬剤の製造における、本明細書に記載の化合物の使用を提供する。本明細書で使用される「インフルエンザ」または「インフルエンザウイルス疾患」という用語は、インフルエンザウイルスにより細胞または対象が感染することによってもたらされる病態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患を指す。本明細書で使用される「インフルエンザウイルス感染」という用語は、細胞または対象におけるインフルエンザウイルスの増殖および／または存在による侵襲を意味する。インフルエンザウイルス感染は、小さな集団で起こり得るが、季節的流行で世界中に広がり、悪くすれば、数百万の人々が危険になる世界的流行に至るおそれもある。本発明は、このような季節的流行および潜在的な大流行を引き起こすインフルエンザ株の感染を中和することができる結合分子を提供する。
【００６７】
本発明はさらに、本明細書に記載の化合物を治療有効量、それを必要としている対象に投与することを含む、対象におけるインフルエンザの予防および／または治療方法を提供する。「治療有効量」という用語は、インフルエンザウイルスの感染から生じる状態を予防、緩和、および／または治療するのに有効な、本明細書で定義される化合物の量を指す。予防および／または治療は、インフルエンザに感染しやすい患者群を対象とすることができる。このような患者群として、限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、若者（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者、および抗ウイルス化合物で治療されたが十分な抗ウイルス反応を示さない既に感染している患者が挙げられる。
【００６８】
本発明の化合物は、例えば、静脈内投与、鼻腔内投与、経口吸入、肺内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、筋肉内投与などにより患者に投与することができる。最適な投与経路は、活性分子の物理化学的特性、臨床症状の緊急性、活性成分の血漿濃度と必要な治療効果との関係などのいくつかの要因に影響されるであろう。
【００６９】
本発明はさらに、試料におけるＡ型インフルエンザウイルスの検出方法であって、ａ）本発明の化合物の診断有効量を前記試料と接触させる工程、およびｂ）その化合物が試料中の分子に特異的に結合するか否かを決定する工程とを含む方法を提供する。試料は、限定はされないが、（潜在的に）感染した対象からの血液、血清、組織または他の生物物質などの生物試料であり得る。（潜在的に）感染した対象は、ヒト対象であり得るが、インフルエンザウイルスのキャリアーとして疑われる動物も、本発明の化合物を用いてインフルエンザウイルスの存在を検査することができる。
【００７０】
以下の非限定的実施例において本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１：ＣＰ１３２０７０の合成
【化７】
2018522819.tif 000008
ベータアラニンで予め修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂（０．６８５ｍｍｏｌ／ｇ）を用い、０．５ｍｍｏｌの規模で手作業による固相Ｆｍｏｃペプチド合成を行い、直鎖ペプチド前駆体を調製した。Ｎ−Ｂｏｃ（Ｗ）、Ｏ−ｔ−Ｂｕ（Ｅ、Ｓ、Ｙ）およびＮ−Ｐｂｆ（Ｒ）基としてアミノ酸側鎖の官能性を保護した。オルニチン側鎖アミン官能性の直交保護には、Ｎ−Ｄｄｅ基を使用した（Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル、ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ．ブチル、Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキサシクロヘキシリデン）エチル、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）。第１のアミノ酸を付着させる前に、樹脂をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で１時間膨潤させた。ＤＭＦ（４ｍＬ）中の３当量の各Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ならびにＤＭＦ（４ｍＬ）中にＨＢＴＵ（（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、２．８５当量）およびＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、６当量）を含有する活性化混合物を用いるカップリングプロトコルを使用した。反応混合物を１．５〜２時間振盪した。ピペリジンの２０％ＤＭＦ溶液によりＦｍｏｃ基を離脱させた（２×１５ｍｉｎ）。無水酢酸と４−メチルモルホリンとＤＭＦとの混合物（２：１：１７、体積／体積／体積、２０ｍＬ）により、ペプチド−樹脂を室温で１時間処理して、ペプチドアセンブリの末端でＮ末端のアセチル化を行った。最後に、ヒドラジン水和物の３％ＤＭＦ溶液によりペプチド−樹脂を処理して（３×１０ｍｉｎ）、Ｎ−Ｄｄｅ保護基を選択的に除去した。
【００７２】
６５％（体積）ＤＣＭ（ジクロロメタン）、２０％（体積）ヘキサフルオロイソプロパノール、１０％（体積）トリフルオロエタノールおよび５％（体積）トリエチルシランの混合物（１０ｍＬ／ｇペプチド−樹脂）中で、ペプチド−樹脂を６０分間撹拌することにより、オルニチン側鎖を脱保護したペプチドを樹脂から切り出した。樹脂をろ別し、ＤＣＭで洗浄した。冷イソプロピルエーテルの添加により、ろ液からペプチドを沈殿させ、真空乾燥させた。次のラクタム環化工程で、この粗製ペプチドをそのまま使用した。
【００７３】
オルニチン側鎖を脱保護したＣ末端カルボン酸ペプチドを１５０ｍＬのＤＭＦに溶解させることにより、高希釈度でラクタム環化を行い、これにＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、２当量）およびＮ−メチルモルホリン（６当量）のＤＭＦ（９０ｍＬ）溶液を滴下した。完全転化が観察されるまで、反応混合物を室温で撹拌した。溶媒を減圧除去して環化ペプチドを得、これを９０％（体積）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、５％（体積）チオアニソール、２．５％（体積）Ｈ２Ｏおよび２．５％（体積）ＥＤＴ（エタンジチオール）の混合物により室温で３時間処理して完全に脱保護した。沈殿およびその後の氷冷ジエチルエーテルによる洗浄によって、粗製ペプチドを得、これを、ＧｅｍｉｎｉＣ１８分取ＨＰＬＣカラム（３０×１５０ｍｍ、５０μｍ、１００Å）と連結したＬｕｎａＣ１８分取ＨＰＬＣカラム（２５×２００ｍｍ、１０μｍ、１００Å）の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、２０ｍＬ／ｍｉｎの移動相流量で精製した（移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ／水、移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、直線勾配を使用）。純粋画分を凍結乾燥させ、トリフルオロ酢酸塩として３２８ｍｇ（収率：５３％、純度：９７％）のラクタム環化ペプチドを得た。
【００７４】
ＣＰ１３２０７０と同様にして、以下の化合物を調製した。
【化８】
2018522819.tif 000009
【００７５】
実施例２：ＣＰ１４１０３２の合成
【化９】
2018522819.tif 000010
Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．６９ｍｍｏｌ／ｇ）を用い、０．２５ｍｍｏｌの規模で手作業による固相Ｆｍｏｃペプチド合成を行い、直鎖ペプチド前駆体を調製した。Ｎ−Ｂｏｃ（Ｗ）、Ｏ−ｔ−Ｂｕ（Ｅ、Ｓ、Ｙ）およびＮ−Ｐｂｆ（Ｒ）基としてアミノ酸側鎖の官能性を保護した。オルニチン側鎖アミン官能性の直交保護には、Ｎ−Ｄｄｅ基を使用した（Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル、ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ．ブチル、Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキサシクロヘキシリデン）エチル、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）。第１のアミノ酸を付着させる前に、樹脂をＤＭＦ中で１時間膨潤させた。ＤＭＦ（４ｍＬ）中の３当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、ならびにＤＭＦ（４ｍＬ）中に２．８５当量のＨＢＴＵおよび６当量のＤＩＰＥＡを含有する活性化混合物を用いるカップリングプロトコルを使用した；各カップリング工程で１．５〜２時間、反応混合物を振盪した。ピペリジンの２０％ＤＭＦ溶液によりＦｍｏｃ基を離脱させた（２×１５ｍｉｎ）。無水酢酸と４−メチルモルホリンとＤＭＦとの混合物（２：１：１７、体積／体積／体積、２０ｍＬ）により、ペプチド−樹脂を室温で１時間処理して、ペプチドアセンブリの末端でＮ末端アセチル化を行った。最後に、ヒドラジン水和物の３％ＤＭＦ溶液によりペプチド−樹脂を処理して（３×１０ｍｉｎ）、Ｎ−Ｄｄｅ保護基を選択的に除去し、その後、ペプチド−樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【００７６】
引き続き、１％のＴＦＡを含有するＤＣＭ溶液中で、ペプチド−樹脂を６０分間撹拌することにより、樹脂からペプチドを切り出した。樹脂をろ別し、ＤＣＭで洗浄した。ろ液を冷イソプロピルエーテルに注ぎ、ペプチドを沈殿させた。遠心分離により単離し、冷イソプロピルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて３４８ｍｇ（収率：５５％、純度：８０％）の粗製直鎖ペプチドを得、これを次のＴＳＡＴ（トリス−（スクシンイミジル）アミノトリアセテート）仲介環化工程でそのまま使用した。
【００７７】
オルニチン側鎖を脱保護したペプチド（１５０ｍｇ  ８０％純度、０．０５９５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に溶解させ、続いてｐＨ＝８〜９となるまでＤＩＰＥＡを添加した。この混合物に、ＴＳＡＴ架橋試薬（１．０当量）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液を滴下し、完全転化が観察されるまで、得られた反応混合物を室温で撹拌した。溶媒を減圧除去して２環のペプチドを得、これを９０％（体積）ＴＦＡ、５％（体積）チオアニソール、２．５％（体積）Ｈ２Ｏおよび２．５％（体積）ＥＤＴの混合物により室温で３時間処理して完全に脱保護した。沈殿および氷冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルによる洗浄によって、粗製の環状ペプチドを得、これを、実施例１に記載のように、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。純粋画分を凍結乾燥させ、トリフルオロ酢酸塩として４０ｍｇ（収率：３４％、純度９４％）の２環ペプチドＣＰ１４１０３２を得た。
【００７８】
実施例３：ホモ二量体型ペプチドＣＰ１４１１００の合成。
【化１０】
2018522819.tif 000011
ベータアラニンで修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂（０．２９ｍｍｏｌ／ｇ）を用い、０．５ｍｍｏｌの規模で自動固相Ｆｍｏｃペプチド合成を行い、直鎖単量体型ペプチド前駆体を調製した。Ｎ−Ｂｏｃ（Ｗ）およびＯ−ｔ−Ｂｕ（Ｅ、Ｓ、Ｙ）基としてアミノ酸側鎖の官能性を保護した。オルニチン側鎖アミン官能性の直交保護には、Ｎ−Ｍｔｔ基を使用した（Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル、ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ．ブチル、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｍｔｔ：メチルトリチル）。第１のアミノ酸を付着させる前に、樹脂をＮＭＰ中で膨潤させた（２×１５ｍｉｎ）。全アミノ酸カップリング工程で、１０当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、９当量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中、０．４５ＭのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および１０当量のＤＩＰＥＡ（ＮＭＰ中２Ｍ）を用いるカップリングプロトコルを使用した（カップリング時間：３０分）。Ｎ末端アミノ酸が２つの場合には、ダブルカップリングの方法を取った。ピペリジンの２０％ＮＭＰ溶液によりＦｍｏｃを除去し、ＵＶ検知により監視した。ＤＩＰＥＡ（２Ｍ  ＮＭＰ溶液１０当量）の存在下で３０分間、過剰の無水酢酸により処理して、ペプチドアセンブリの末端でＮ末端アセチル化を行った。
【００７９】
６５％（体積）ＤＣＭ（ジクロロメタン）、２０％（体積）ヘキサフルオロイソプロパノール、１０％（体積）トリフルオロエタノールおよび５％（体積）トリエチルシランの混合物（１０ｍＬ／ｇペプチド−樹脂）中で、ペプチド−樹脂を６０分間撹拌することにより、ペプチドを樹脂から切り出し、Ｍｔｔ側鎖の選択的脱保護を行った。樹脂をろ別し、ＤＣＭで洗浄した。冷ジメチルエーテルを添加することにより、ろ液からペプチドを沈殿させ、粗生成物を真空乾燥させて、そのまま次の工程で使用した。
【００８０】
オルニチン側鎖を脱保護したＣ末端カルボン酸ペプチドの粗製物を２００ｍＬのＤＭＦに溶解させることにより、高希釈度でラクタム環化を行い、続いてこれにＰｙＢＯＰ（２当量）およびＮ−メチルモルホリン（６当量）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液を滴下した。完全転化が観察されるまで、反応混合物を室温で撹拌した（２時間）。溶媒を減圧除去し、残留物を酢酸エチルに再溶解させた。有機層を５％ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄し、減圧濃縮した。８７．５％（体積）ＴＦＡ、５％（体積）チオアニソール、５％（体積）Ｈ２Ｏおよび２．５％（体積）ＥＤＴの混合物により、室温で２時間処理して、環化ペプチドを完全に脱保護した。沈殿およびその後の氷冷ジエチルエーテルによる洗浄によって、粗製ペプチドを得、これを、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ＯＢＤ分取ＨＰＬＣカラム（３０×２５０ｍｍ、５μｍ、１４０Å）の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、３０ｍＬ／ｍｉｎの移動相流量で精製した（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水＋ＣＨ３ＣＮ、溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、直線勾配を使用）。純粋画分を凍結乾燥させ、トリフルオロ酢酸塩として２５０ｍｇ（収率：３１％、純度：８３％）の側鎖を完全に脱保護したラクタム環化ペプチドを得た。
【００８１】
結合試薬として市販のビス−ＰＥＧ１３−ＮＨＳエステル（ビス−スクシンイミジル活性化ビス−ＰＥＧ１３−酸）を使用し、二量体化を行った。これは、ラクタム環化ペプチド（７５ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５当量）の乾燥ＤＭＦ溶液に、結合試薬（０．４当量）を加えることにより行い、転化の進行が観察されなくなるまで反応混合物を室温で撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残留物を上記のように逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で直接精製した。純粋画分を凍結乾燥させて１９ｍｇ（収率：１１％、純度９６％）の二量体ペプチドＣＰ１４１１００を得た。
【００８２】
実施例４：ＣＰ１４１０６６の合成
【化１１】
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実施例３の、側鎖を完全に脱保護したラクタム環化ペプチドの中間体（５０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させた。Ｅｔ３Ｎ（５当量）およびジスクシンイミジルグルタレート（１．０当量）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残留物を、実施例３に記載のように、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。純粋画分を凍結乾燥させて２８ｍｇ（収率：５６％、純度９９％）のペプチドＣＰ１４１０６６を得た。
【００８３】
実施例５：ラクタム環化ペプチドＣＰ１４１０９９の合成
【化１２】
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Ｌ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）（Ｄａｐ：２，３−ジアミノプロピオン酸）で予め修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ）を用い、０．３ｍｍｏｌの規模で自動Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を行い、直鎖ペプチドを合成した。ＤＩＰＥＡ（２．６当量）の存在下、２−クロロトリチルクロリド樹脂（５ｇ、１．４ｍｍｏｌ／ｇ、７ｍｍｏｌ）をＤｄｅ−Ｌ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（０．６６当量）のＤＭＦ溶液で処理することにより、Ｌ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）で予め修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂を手作業で調製した。得られた反応混合物を９０分間振盪し、メタノール（２．５ｍｌ）を加え、さらに５分間、振盪を続けた。ろ過により溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦで洗浄した（５×）。最後に、２％ヒドラジン水和物のＤＭＦ溶液との反応により（５×２ｍｉｎ）、Ｎ−Ｄｄｅ保護基を除去し、０．１５ｍｍｏｌ／ｇの置換率でＬ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）で修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂を得た（置換率は、樹脂をピペリジンのＤＭＦ溶液で処理すると放出される、Ｆｍｏｃ発色団の量から測光により決定した。）。その後の、実施例３に記載のように自動合成により、アミノ酸カップリングおよびＮ末端アセチル化を行った。Ｌ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）で予め修飾した２−クロロトリチルクロリド樹脂のＦｍｏｃ脱保護の前に、Ｂｏｃ−ベータ−アラニンをカップリングさせたことに注意しなければならない。
【００８４】
６５％（体積）ＤＣＭ、２０％（体積）ヘキサフルオロイソプロパノール、１０％（体積）トリフルオロエタノールおよび５％（体積）トリエチルシランの混合物（１０ｍＬ／ｇペプチド−樹脂）中でペプチド−樹脂を６０分間撹拌することにより、ペプチドを樹脂から切り出し、Ｍｔｔ側鎖の選択的脱保護を行った。樹脂をろ別し、ＤＣＭで洗浄した。冷ジメチルエーテルを添加することにより、ろ液からペプチドを沈殿させ、粗生成物を真空乾燥させて、そのまま次の工程で使用した。
【００８５】
オルニチン側鎖を脱保護したペプチドの粗製物を１２０ｍＬのＤＭＦに溶解させることにより、高希釈度でラクタム環化を行い、続いてこれにＰｙＢＯＰ（２当量）およびＮ−メチルモルホリン（６当量）のＤＭＦ（３６ｍＬ）溶液を滴下した。転化が完了するまで、反応混合物を室温で撹拌した（２時間）。溶媒を減圧除去し、残留物を酢酸エチルに再溶解させた。有機層を５％ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄し、減圧濃縮した。８７．５％（体積）ＴＦＡ、５％（体積）チオアニソール、５％（体積）Ｈ２Ｏおよび２．５％（体積）ＥＤＴの混合物により室温で２時間処理して、側鎖を完全に脱保護した。沈殿およびその後の氷冷ジエチルエーテルによる洗浄によって、粗製ペプチドを得、これを、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ＯＢＤ分取ＨＰＬＣカラム（３０×２５０ｍｍ、５μｍ、１４０Å）の逆相高速液体クロマトグラフィーにより、２０ｍＬ／ｍｉｎの移動相流量で精製した（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水＋ＣＨ３ＣＮ、溶媒Ｂ：ＭｅＯＨ、直線勾配を使用）。純粋画分を凍結乾燥させ、トリフルオロ酢酸塩として３６ｍｇ（収率：７％、純度：９５％）のラクタム環化ペプチドＣＰ１４１０９９を得た。
【００８６】
実施例６：ペプチドの解析
ＬＣポンプ、ダイオードアレイ（ＤＡＤ）またはＵＶ検出器、およびそれぞれの方法で明記されるカラムを使用して、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）（ＨＰＬＣ）による測定を行った。必要があれば、追加の検出器を含めた（下の方法の表を参照）。カラムからの流れを、大気圧イオン源を配置した質量分析計（ＭＳ）に導入した。化合物の分子量（ＭＷ）の同定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、スキャニング範囲、保圧時間など）を設定することは、当業者の知識の範囲内である。データ取得は、適切なソフトウェアを用いて行った。
ペプチドは、それらの実験的保持時間（Ｒｔ）およびそれらの分子量によって説明される。得られた結果にはすべて、使用した方法に通常付随する実験による不確かさを伴った。本明細書で使用する場合：「ＭＳＤ」：質量選択検出器、「ＤＡＤ」：ダイオードアレイ検出器、「ＳＱＤ」：シングル四重極検出器。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
【表２】
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【００８９】
実施例７：インフルエンザＨＡへの化合物の結合および他のＨＡバインダーとの化合物の競合
結合の競合の研究は、ＨＡの既知のエピトープへの、特性が明らかにされている他のＨＡ結合タンパク質（例えば、ＣＲ９１１４を含む）との競合について、化合物を試験するよう計画した。エピトープは、ＨＡの幹領域（ＨＡのウイルス膜中心部）、または、対照の目的で、ＨＡの球状部領域（ＨＡのウイルス膜末端部）のいずれかに位置した。競合が観察された場合、両分子は、ＨＡ表面の類似した、または少なくとも重なり合ったエピトープに結合すると見なす。ＨＡ球状部領域および幹領域−バインダーとの競合は、非特異的結合であると判断した。
【００９０】
本明細書では、ＨＡ−特異的バインダーが結合した、完全長のビオチン化三量体ＨＡタンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅｓ、１０μＬ、０．５ｎＭ  ５０μＬ中の最終濃度）に依る、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ競合アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を採用した。室温（ＲＴ）で１時間のインキュベーション後、ＨＡを認識するストレプトアビジンドナービーズ（１０μｇ／ｍＬの１０μＬ）と、用いたＩｇＧを認識する抗Ｆｃビーズ（１０μｇ／ｍＬ）の２種のビーズにより、ＨＡとバインダーの相互作用を検出した。室温でさらに１時間のインキュベーションを行えば、活性化したドナービーズ（６８０ｎｍ）とアクセプタービーズが非常に接近し、アクセプタービーズの発光信号としてエネルギー移動（一重項酸素）を測定することができる（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）。このホモジニアスアッセイフォーマットの信号強度は、両結合パートナー間の結合強度（親和性／結合力）に正比例する。競合種（化合物）は、親和性と濃度（通常、１００ｎＭ〜０．５ｐＭの範囲で試験する）によっては、ＡｌｐｈａＬＩＳＡの信号を攪乱させることがあり、ＳＰＳＳの標準４パラメータロジスティック非線形回帰モデルによりフィッティングされるシグモイド状の阻害剤曲線をもたらす。算出されたｐＩＣ５０値の平均値を表３に示す。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
結論として、本発明によれば、本発明の化合物はグループ１のＡ型インフルエンザウイルスに広く結合し、ＨＡ幹領域−結合分子と特異的に競合するが、対照のＨＡ球状部領域−結合分子とは競合しないことが示された。
【００９３】
実施例８：化合物のインフルエンザウイルス中和活性および細胞毒性
哺乳類細胞のインフルエンザウイルス感染を予防する能力について、ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）により化合物を解析した。この目的のために、ヒトの肺上皮由来のＣａｌｕ−３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−５５）を９６ウェルプレートに播種し（４Ｅ＋０４細胞／ウェル）、完全ＤＭＥＭ（１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１０％ＦＢＳＨＩｏｒｉｇｉｎ：Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２で少なくとも７日間インキュベートした。密集度約９０％でＣａｌｕ−３細胞が極性化され、密着結合が構築されればＶＮＡを行う準備が整う。分析日に、化合物ストック（ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ５％ＤＭＳＯに溶解、初期濃度５００ｎＭ）から、不完全ＤＭＥＭ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）中、２倍希釈で試料希釈プレートを調製する。試料希釈プレートを遠心分離（１０００ｇで１５分間）して潜在凝集物を除去する。その後、不完全ＤＭＥＭ中の５ＴＣＩＤ５０／５０μＬインフルエンザウイルス（Ｃａｌｕ−３細胞で予め用量設定）を、試料希釈プレートに添加し、３７℃および１０％ＣＯ２で１時間インキュベートする。細胞から培地を除去し、３％ＦＢＳを添加した５０μＬの不完全ＤＭＥＭで置き換える。その後、１００μＬウイルス／化合物混合物を細胞に添加し、ＦＢＳの最終濃度が１％の、総量１５０μＬの分析容量を得る。３７℃および１０％ＣＯ２で４日間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μＬ／ウェルの８０％アセトンにより室温（ＲＴ）で１５分間処理して固定する。インフルエンザの感染レベルを、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）ＥＬＩＳＡで決定する。一次抗体、抗インフルエンザ−Ａ−ＮＰ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｃｌｏｎｅ  ５Ｄ８）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０００に希釈して使用し、３００ｒｐｍで振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。洗浄用−緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で細胞を３回洗浄した後、二次抗体（抗マウスＨＲＰ、１：２０００）を添加し、３００ｒｐｍで振盪しながらＲＴで１時間インキュベートする。細胞を３回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＰＯＤ化学発光基質を添加し、２〜５分間インキュベートし、その後Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＮｅｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより発光を読み取る。ＳＰＳＳソフトウェアを使用し、化合物のｐＩＣ５０を算出した。中和の適用範囲を評価するために複数のインフルエンザ株を繰り返し試験した（表４を参照）。
【００９４】
細胞毒性レベルを決定するために、ウイルス不在下でのＶＮＡも実施した。ＡＴＰ  Ｌｉｔｅ試薬により、製造業者のプロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にしたがって細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定し、同じ方法でデータを解析した（表４を参照）。
【００９５】
【表４】
2018522819.tif 000017
【００９６】
結論として、本発明の化合物は、検出可能な細胞毒性を示すことなく、インフルエンザウイルスのグループ１株を広く中和する。
【００９７】
【表５】
2018522819.tif 000018
【００９８】
実施例９：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＨＡの直接結合実験
全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、２５℃で操作して行った。三量体ＨＡタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をランダムにビオチン化し、ストレプトアビジンをコーティングしたカルボキシメチル化デキストラン検出器表面（ＳＡｃｈｉｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合で固定した。試験化合物をランニングバッファー（２０ｍＭ  ＰＢＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｐ−２０界面活性剤、ｐＨ７．４（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２％ＤＭＳＯ添加）に再懸濁させ、流量３０μｌ／ｍｉｎで、濃度範囲０．１ｎＭ〜１０μＭの一連の化合物を注入することによって結合定数を得た。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、シングルサイクルカイネティックスからのデータを解析した。全ての曲線について、ベースラインをゼロに調節し、注入開始時刻を一列に揃えた。レファレンスのセンサーグラムを実験のセンサーグラムから減じて、特定の結合を表す曲線を得、その後、バックグラウンドの減算を行った（すなわち、二重レファレンス）。１：１結合モデル（ラングミュア）を用いて結合カイネティックスを評価して、結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を得た。観察された定常状態応答の濃度依存性から結合親和性（ＫＤ）を推定した。再現性を確実にするために、実験は３回行った。
【００９９】
３種のインフルエンザ株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（Ｈ１）、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５））のＨＡに結合する３種の化合物について、代表的な実験の結合曲線を図１に示す。３種の化合物の全てで、１０から１００ｎＭの間の結合親和性が検出され、解離速度は表６に示すようにＨＡ株に依存して５ｓ−１〜２０ｓ−１であった。
【０１００】
【表６】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018522819.tif 000022
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