(57)【要約】  柑橘類のグリーニング及びジャガイモゼブラチップ病（ｚｅｂｒａ  ｃｈｉｐ  ｄｉｓｅａｓｅ）の原因となる因子である導管限局性Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ．を含む数多くの植物微生物は、培養不可能である。本開示は、いくつかの実施形態により、このような生命体を培養するための組成物、方法及びシステムに関する。例えば、本開示は、毛状根システム（例えば、試験管内、植物内）を用いて、選好性の、導管にコロニー形成した微生物を培養し、増殖させ、及び特徴づけるための方法に関する。本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の植物微生物を用いてコロニー形成された毛状根の誘導を可能にする条件下で、選好性の植物微生物（例えば、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）によってコロニー形成された植物（例えば、トマト植物、ジャガイモ植物、柑橘類植物）をリゾビウム・リゾゲネス（Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）と接触させること、及びコロニー形成された微生物毛状根を増殖させることを含む、選好性の植物微生物を培養するための方法に関する。
2018534947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、選好性の植物微生物を培養するための方法：
前記選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、毛状根の誘導を可能にする条件下でＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させて、コロニー形成された毛状根を形成すること、及び
前記コロニー形成された毛状根を増殖させて、増殖した毛状根を形成すること。
【請求項２】
植物が、トマト植物、ジャガイモ植物、及び柑橘類植物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選好性の植物微生物が、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ｓｐｐ．及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．が、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ）及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることが、植物の１つ又は２つ以上の表面を損傷させて、損傷部位を形成すること、及び前記損傷部位をＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの前記懸濁液へ曝露することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることが、
植物の光合成部分を除去して、損傷部位を生じること、
前記損傷部位をロックウールマトリックスで被覆すること、及び
前記ロックウールマトリックスをＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液へ曝露することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることが、
植物の光合成部分を除去して損傷部位を生じること、
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの前記懸濁液中に前記損傷部位を浸すこと、
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの前記懸濁液の少なくとも一部を前記損傷部位中へ真空浸潤させること、及び
前記損傷部位を蛭石マトリックスで被覆することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増殖した毛状根における選好性の植物微生物の存在を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コロニー形成された毛状根を増殖させて、増殖した毛状根を形成することが、
付着した毛状根又は収穫した毛状根を、１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露すること、
前記付着した毛状根又は前記収穫した毛状根を
蛭石マトリックス、
水耕システム、
インビトロシステム、及び
バイオリアクタシステム
のうちの少なくとも１つへ転移させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓがＲｉ−ＤＮＡプラスミド及びＴ−ＤＮＡプラスミドの両方を含み、かつ前記Ｔ−ＤＮＡプラスミドは第一の外来性導入遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第一の外来性導入遺伝子が自己蛍光タンパク質をコードする、請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
植物が第一の外来性導入遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む、選好性の植物病原体に及ぼす試験組成物の作用を評価するための方法：
前記選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、前記選好性の植物微生物によってコロニー形成された毛状根の誘導を可能にする条件下でＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させて、コロニー形成された毛状根を形成すること、
前記コロニー形成された毛状根を増殖させて、増殖した毛状根を形成すること、
前記増殖した毛状根を前記試験組成物と接触させること、及び
前記選好性の植物微生物の存在又は活力度のうちの少なくとも１つの測定結果を評価すること。
【請求項１４】
植物が、トマト植物、ジャガイモ植物、及び柑橘類植物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
選好性の植物微生物が、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ｓｐｐ．及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．が、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ）及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
試験組成物が、感染した植物中に条件的に又は恒常的に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物が、外来性導入遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、及びＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つを含み、かつ試験組成物がそれぞれ、前記導入遺伝子、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、前記ＴＡＬＥＮ、及び前記ＲＮＡｉコンストラクトの遺伝子産物であるか又はそれらの遺伝子産物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験組成物がＮＲＰ１タンパク質であるか又はＮＲＰ１タンパク質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
以下を含む、毛状根を用いて選好性の植物微生物を培養する方法：
少なくとも１つの選好性微生物によってコロニー形成された植物の１つ又は２つ以上の部分から組織を選択して外植片源とすること、
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を含む培地中で前記外植片源を培養すること、
前記外植片源を複数の断片に切断すること、
前記外植片源の少なくともいくつかの断片から毛状根の増殖を誘導すること、
毛状根の増殖を確認すること、及び
前記毛状根中における選好性の植物微生物の存在を確認すること。
【請求項２１】
植物が、第一の外来性導入遺伝子及び第二の外来性導入遺伝子を含む、請求項２０に記載の選好性の植物微生物を培養する方法。
【請求項２２】
第一の外来性導入遺伝子が自己蛍光タンパク質をコードする、請求項２１に記載の選好性の植物微生物を培養する方法。
【請求項２３】
培地が、セファトキシム（ｃｅｆａｔｏｘｉｍｅ）、カルベンシリン（ｃａｒｂｅｎｃｉｌｌｉｎ）及びカナマイシンを含有しない、請求項２１に記載の選好性の植物微生物を培養する方法。
【請求項２４】
毛状根の増殖を確認することが、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  ｒｏｏｔ  ｌｏｃｕｓ（ｒｏｌ）Ｂ（ｒｏｌＢ）もしくはｒｏｌＣのマーカー遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することを含むか、又は
毛状根中の選好性の植物微生物の存在を確認することが、選好性の植物微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡマーカー遺伝子のＰＣＲ増幅を実施することを含む、請求項２０に記載の選好性の植物微生物を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願についての相互参照
本願は、その全体的な内容が参照により本開示において本明細書により組み込まれる２０１５年１１月１６日出願の米国出願Ｎｏ．６２／２５５，８２３についての優先権を主張する。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の植物微生物を培養し及び特徴づけるための方法、組成物、及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
本開示の背景
食品及び農業の組織の見積もりでは、地球規模での食物生産が、増加している世界人口の需要を満たすために、２０５０年までに６０％増大しなければならないと予想している。増大している需要に加えて、植物病原体に起因する年間の農作物収穫量損失は、期せずして４０％以上になり得る。選好性かつ偏性の植物病原体は単独で、いくつかの食物及び商品作物農産物を荒廃させつつあり得る。例えば、木部限局性のＸｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａは、ブドウのつる、柑橘類、コーヒー及びアーモンドを含む１００種類を超える植物に感染する。同様に、師部限局性のＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ（ジャガイモ、トマト、コショウ及びタバコ）、Ａｐｉａｃｅａｅ（ニンジン及びセロリ）、Ｒｏｓａｃｅａｅ（セイヨウナシ、リンゴ及びリンボク（ｂｌａｃｋｔｈｏｒｎ））、及びＲｕｔａｃｅａｅ（ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）を含む、多岐にわたる植物ファミリーにおいて収穫の損失（例えば、重度の損失）を生じる、明らかになりつつある破壊性病原体である。ジャガイモにおけるゼブラチップ病（ｚｅｂｒａ  ｃｈｉｐ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ジャガイモ、コショウ及びタバコにも感染するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ）によって発症し得る。Ｌｓｏは、昆虫媒介動物であるジャガイモキジラミ（Ｂａｃｔｅｒｉｃｅｒａ  ｃｏｃｋｅｒｅｌｌｉ）によって伝染する。２００４年に明らかになりつつある疾患として指定されて以来、ゼブラチップ病は、米国、メキシコ、中米、及びニュージーランドのいくつかの商業用ジャガイモ生育の分野において文書化されてきた。テキサス州だけで、ゼブラチップ病は、栽培ジャガイモ地積の３５％に影響すると概算されており、およそ２５００万米ドルの年間穀物喪失を生じる。同様に、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ）によって生じるカンキツグリーニング病又は黄龍病（ＨＬＢ）は今日、柑橘類を最も荒廃させる疾患であり得、世界中で柑橘類の生産を脅かしている。ＨＬＢは、昆虫媒介動物である、アジア型ミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ）によって伝染する。２００６〜２０１１年において、フロリダ州だけで、ＨＬＢは、４５億米ドル以上の損失を生じた。選好性の植物病原体によって生じるこれらの疾患及び他の疾患は、米国及び地球規模での農業生産に対する主たる脅威である。切迫した地球規模での食物セキュリティの挑戦を克服するために、これらの農業上の損失を削減することが喫緊である。
【発明の概要】
【０００４】
要約
選好性の導管限局性微生物を培養することができないことは、Ｌｓｏ及びＬａｓなどのいくつかの破壊性農業病原体に関連する研究における大きな支障である。したがって、選好性の、導管にコロニー形成した微生物の、改良された（例えば、容易な、迅速な、及び／又は規模拡大可能な）培養及び機能的特徴づけについての必要性が生じている。
【０００５】
本開示は、いくつかの実施形態において、毛状根（例えば、感染した植物又は植物組織から直接誘導されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ仲介性毛状根）を用いて選好性の微生物を培養し及び特徴づけるための方法、組成物、及びシステムに関する。感染した植物又は植物組織から直接誘導されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ仲介性毛状根は、選好性の、導管にコロニー形成した微生物を培養し及び特徴づけるための容易な、迅速な及び規模拡大可能なプラットフォームを提供する。例えば、Ｌｓｏ及びＬａｓは、Ｌｓｏ及びＬａｓに感染したトマト、ジャガイモ及び柑橘類の植物又は植物組織から直接誘導された毛状根において培養され得る。毛状根は、組織化されかつ安定した組織であるので、微生物がコロニー形成した毛状根組織は、数多くの適用（例えば、選好性微生物の特徴づけ）のためにクローン形成で増殖され得る。
【０００６】
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の植物微生物（例えば、選好性の植物病原体）を培養するための方法に関する。例えば、方法は、選好性の植物微生物がコロニー形成した毛状根の誘導を可能にする条件下で、選好性の植物微生物（例えば、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）によってコロニー形成された植物（例えば、トマト植物、ジャガイモ植物、柑橘類植物）を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることを含み得る。次に、選好性の植物微生物を、コロニー形成された微生物毛状根を増殖させることによって培養し得る。いくつかの実施形態において、培養した植物微生物は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ）及び／又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ））であり得る。いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド及びＴ−ＤＮＡプラスミドの両方を含み得、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、第一の外来性導入遺伝子（例えば、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子）をコードし得る。いくつかの実施形態によると、植物は、第一の外来性導入遺伝子を含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、選好性の微生物によってコロニー形成された植物を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることは、植物の１つ又は２つ以上の表面を損傷させること、及び当該損傷部位をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液へ曝露することを含み得る。選好性の植物微生物によってコロニー形成された植物を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させることは、いくつかの実施形態において、当該植物の光合成部分を除去して、損傷部位を生じることを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、損傷部位をロックウールマトリックスで被覆すること、及び当該ロックウールマトリックスをＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液へ曝露することを含み得る。いくつかの実施形態によると、方法は、損傷部位をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液中に浸すこと、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液の少なくとも一部を当該損傷部位中へと真空浸潤させること、及び当該損傷部位を蛭石マトリックスで被覆することを含み得る。方法は、いくつかの実施形態において、選好性の植物微生物でコロニー形成された植物の、例えば、子葉、胚軸、未熟苗条、未熟根、成熟苗条、又は成熟根を含む何らかの所望の部分を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと接触させることを含み得る。
【０００８】
コロニー形成された毛状根を増殖させることは、いくつかの実施形態によると、付着した毛状根又は収穫した毛状根を、１つ又は２つ以上の選択的条件（ｃｏｎｓｉｔｉｏｎ）へ曝露することを含み得る。いくつかの実施形態において、増殖させることは、付着した毛状根又は収穫した毛状根を、蛭石マトリックス、水耕システム、インビトロシステム、及びバイオリアクタシステムのうちの少なくとも１つへ転移させることを含み得る。方法は、いくつかの実施形態によると、増殖した微生物毛状根における選好性の植物病原体の存在を評価することを含み得る。
【０００９】
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の植物微生物に及ぼす試験組成物の作用を評価するための方法に関する。方法は、例えば、選好性の植物微生物（例えば、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）に感染した植物（例えば、トマト植物、ジャガイモ植物、柑橘類植物）を、選好性の植物微生物によってコロニー形成された毛状根の誘導を可能にする条件下で、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと接触させること、コロニー形成された微生物毛状根を増殖させること、当該増殖したコロニー形成された微生物毛状根を試験組成物と接触させること、ならびに／又は選好性の植物微生物の存在及び／もしくは活力度のうちの少なくとも１つの測定基準を評価することを含み得る。いくつかの実施形態において、培養した植物微生物は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ）及び／又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ））であり得る。
【００１０】
方法は、いくつかの実施形態において、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを、選好性の植物微生物でコロニー形成された植物の、例えば、子葉、胚軸、未熟苗条、未熟根、成熟苗条、又は成熟根を含む何らかの所望の部分と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、試験組成物は、感染した微生物毛状根へ適用され得及び／又は当該毛状根へ注射され得る。試験組成物は、いくつかの実施形態において、感染した植物（例えば、増殖した感染済み毛状根）中に条件的に又は恒常的に存在し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態によると、コロニー形成された植物（例えば、増殖したコロニー形成済み毛状根）は、外来性導入遺伝子（例えば、ＮＰＲ１、ＧＦＰ）を含み得、試験組成物は、当該導入遺伝子の遺伝子産物であり得又は当該遺伝子産物を含み得る。いくつかの実施形態において、コロニー形成された植物（例えば、増殖した、コロニー形成済み微生物毛状根）は、外来性導入遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ．Ａ  ＴＡＬＥＮ、及びＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つを含み得、したがって、試験組成物は、当該導入遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、及びＲＮＡｉコンストラクトの遺伝子産物であり得又は当該遺伝子産物を含み得る。いくつかの実施形態において、試験組成物は、ＮＲＰ１タンパク質を含み得る。
【００１２】
本開示は、いくつかの実施形態において、毛状根を用いて選好性の植物微生物を培養するための方法に関する。方法は、例えば、外植片源としての植物の１つ又は２つ以上の部分から組織を選択すること、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を含むインビトロ培地の中で当該外植片源を切断すること、当該外植片源の少なくともいくつかの部分からある時間にわたって毛状根の増殖を誘導すること、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  ｒｏｏｔ  ｌｏｃｕｓ  Ｂ（ｒｏｌＢ）及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  ｒｏｏｔ  ｌｏｃｕｓ  Ｃ（ｒｏｌＣ）のマーカー遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、毛状根の誘導を確実にすること、ならびに／又は１６Ｓ  ｒＤＮＡマーカー遺伝子のＰＣＲ増幅を実施して、１つ又は２つ以上の選好性微生物の存在を判定することを含み得る。いくつかの実施形態において、感染した植物は、第一の外来性導入遺伝子及び第二の外来性導入遺伝子を含み得る。第一の外来性導入遺伝子は、例えば、自己蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、及びこれらに類するもの）をコードし得る。いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを含む培地の中で当該外植片源を培養することは、抗生物質を含有しない培地（例えば、少なくともセファトキシム（ｃｅｆａｔｏｘｉｍｅ）、カルベンシリン（ｃａｒｂｅｎｃｉｌｌｉｎ）及びカナマイシンを含有しない）の中で当該外植片源を培養することを含み得る。
【００１３】
本開示のファイルは、有色で描かれた少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面（複数可）を有する本特許の複写は、必要な料金の請求及び支払いの際に、特許庁によって提供されるであろう。本開示のいくつかの実施形態は、一部、本開示及び添付の図面に対して参照することによって理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＦＩＧＵＲＥ  １は、本開示の例となる実施形態によると、下流の試験及び適用のために微生物毛状根を生じるための流れ図を示す。
【図２Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ａは、本開示の実施形態によると、ナスを宿主植物として用いて、含有されるトラップの中で増殖中のキジラミ成虫を示す。
【図２Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｂは、本開示の実施形態によると、ナスを宿主植物として用いて、含有されるトラップの中で増殖中の、Ｌｓｏ保有キジラミ成虫を示す。
【図２Ｃ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｃは、本開示の実施形態によると、キジラミ曝露４週間後の健常なトマト葉を示す。
【図２Ｄ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｄは、本開示の実施形態によると、キジラミ曝露４週間後のＬｓｏ感染したトマト葉を示す。
【図２Ｅ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｅは、本開示の実施形態によると、キジラミ曝露４週間後の健常なトマト葉を示す。
【図２Ｆ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｆは、本開示の実施形態によると、キジラミ曝露４週間後のＬｓｏ感染したトマト葉を示す。
【図２Ｇ】ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｇは、感染したトマト葉及びジャガイモ葉におけるＬｓｏのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく確認を示す。
【図３Ａ−Ｅ】ＦＩＧＵＲＥ  ３Ａ〜ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｅは、本開示の具体例となる実施形態によると、インビトロでの微生物毛状根プラットフォームの概略図を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ａは、本開示の実施形態によると、細いピンセットを用いて、表面を滅菌した植物組織をより小さな断片へと切断し、穏やかに損傷させることを示す。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｂは、本開示の実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液中に外植片を浸漬することを示す。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｃは、本開示の実施形態によると、栄養培地上で植物組織の３日間の同時培養の後の外植片を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｄは、本開示の例となる実施形態によると、外植片の浸透圧ストレス処理を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｅは、本開示の実施形態によると、ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｄの処理後の栄養選択培地中での外植片のインキュベーションを示す。
【図４Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ４Ａは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換したトマト外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。
【図４Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ４Ｂは、本開示の実施形態によると、トマト外植片における毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図５Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ５Ａは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いて形質転換したジャガイモ外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。
【図５Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ５Ｂは、本開示の実施形態によると、ジャガイモ外植片における毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図６Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ６Ａは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換した柑橘類（ユーレカレモン）外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。
【図６Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ６Ｂは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換した柑橘類（ユーレカレモン）外植片における毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図７Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ７Ａは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって健常なトマトに誘導された空中の毛状根を示す。
【図７Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｂは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって、Ｌｓｏがコロニー形成したトマトに誘導された空中の毛状根を示す。
【図７Ｃ】ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃは、本開示の実施形態によると、トマトにおける空中の毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図８Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ８Ａは、本開示の実施形態によると、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって、Ｌｓｏがコロニー形成したジャガイモに誘導された空中の毛状根を示す。
【図８Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ８Ｂは、本開示の実施形態によると、ジャガイモにおける空中の毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図８Ｃ】ＦＩＧＵＲＥ  ８Ｃは、本開示の実施形態によると、ジャガイモにおける空中の、微生物毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図９Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  ９Ａは、本開示の実施形態によると、Ｌｓｏがコロニー形成したトマトにおいてロックウール法を用いて誘導された、微生物毛状根を示す。
【図９Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  ９Ｂは、本開示の実施形態によると、ロックウール法を用いて誘導されたトマトにおける、微生物毛状根のＰＣＲ検証結果を示す。
【図１０Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  １０Ａは、本開示の実施形態によると、蛭石法を用いてトマト植物において誘導された、微生物毛状根を示す。
【図１０Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  １０Ｂは、本開示の実施形態によると、蛭石法を用いて誘導されたトマトにおける、微生物毛状根のＰＣＲの検証結果を示す。
【図１１】ＦＩＧＵＲＥ  １１は、本開示の実施形態によると、蛭石法を用いて、Ｌａｓが感染した柑橘類（サワーオレンジ）において誘導された、微生物毛状根を示す。
【図１２】ＦＩＧＵＲＥ  １２は、本開示の実施形態によると、蛭石マトリックス中で生育している増殖した毛状根を示す。
【図１３】ＦＩＧＵＲＥ  １３は、本開示の実施形態によると、水耕栽培において生育している増殖した毛状根を示す。
【図１４】ＦＩＧＵＲＥ  １４は、本開示の実施形態によると、インビトロ培養において生育している増殖した毛状根を示す。
【図１５】ＦＩＧＵＲＥ  １５は、本開示の実施形態によると、バイオリアクタシステムにおいて生育している増殖した毛状根を示す。
【図１６Ａ】ＦＩＧＵＲＥ  １６Ａは、本開示の実施形態によると、インビトロシステム又は植物内でのシステムから収穫した、健常な及びＬｓｏがコロニー形成した毛状根を示す。
【図１６Ｂ】ＦＩＧＵＲＥ  １６Ｂは、本開示の実施形態によると、複数ウェルプレートへと分配した、健常な及びＬｓｏがコロニー形成した、微生物毛状根を示す。
【図１６Ｃ】ＦＩＧＵＲＥ  １６Ｃは、ペニシリンを用いた毛状根の処理２日後のＬｓｏ力価の定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図１６Ｄ】ＦＩＧＵＲＥ  １６Ｄは、ペニシリンを用いた毛状根の処理７日後のＬｓｏ力価の定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【００１５】
詳細な説明
選好性微生物（例えば、植物病原体）の莫大な経済的有意性にもかかわらず、当該選好性微生物の生物学的特徴、遺伝学的特徴、及びベクター−病原体−植物の相互作用はほとんど知られていない。この知識は、有効な疾患及び害虫駆除戦略の開発が、収量損失（おびただしい量の損失）を制限することを可能にし得る。これらの選好性微生物を特徴づける上での１つの支障（例えば、主な支障）は、当該選好性微生物が植物偏性寄生虫であるので、当該選好性微生物の天然の宿主以外で生育することができないことである。いかなる環境由来の微生物も９９％超は実験室において培養することができないと概算されている。選好性微生物を培養するのに適した人工生育培地及び培養条件をつくるために数多くの試みがなされてきたが、今日まで、これらのアプローチは制限つきの成功しか収めていない。
【００１６】
植物毛状根は、土壌細菌であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓから近年改定）による感染の際に、多様な植物組織から容易に誘導されることができる。その関連の同類であるＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅと類似の様式で、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、ｒｏｏｔ  ｌｏｃｕｓ（ｒｏｌ）遺伝子（例えば、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ）を植物ゲノムへとコードする、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの根誘導（Ｒｉ）転移ＤＮＡ（Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド）を導入する。植物内でのｒｏｌ遺伝子の発現は、植物ホルモンであるオーキシンを過剰生成し、毛状根の発芽及び増殖を導入する。
【００１７】
ふわふわした毛状根は、正常な根と解剖学的に、形態学的に、及び代謝上同様である。毛状根は、未処置の木部構造及び師部構造によって生じる植物組織へ結合して、それにより水、栄養物質、細胞シグナル伝達の持続的な輸送を、当該構造を通じて、本明細書で示される選好性微生物として可能にする。Ｃｉｔｒｕｓ（例えば、レモン）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ（例えば、ジャガイモ、トマト）、Ｄａｕｃｕｓ（例えば、ニンジン）、Ｔａｘｕｓ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｇｍｅｌｉｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ（例えば、ダイズ）、Ｒｕｔａｃｅａｅ（例えば、バエルツリー（Ｂａｅｌ  ｔｒｅｅ））、Ｎｙｃｔａｇｉｎａｃｅａｅ、及びＲｏｓａｃｅａｅ（例えば、リンゴ）を含むがこれらに限定されない多数の植物の属は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって形質転換され得、毛状根を生じ得る。
【００１８】
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性微生物を（例えば、インビトロ、植物内で）培養する方法に関する。本開示は、いくつかの実施形態において、選好性微生物を培養及び特徴づけるために直接使用され得る毛状根システムに関する。本開示は、いくつかの実施形態において、選好性微生物−植物相互作用に関する高処理量の機能的な遺伝子研究及びゲノム研究に使用され得る毛状根システムに関する。いくつかの実施形態において、毛状根システムは、荒廃させる植物病を撲滅するための化学的遺伝子スクリーニング（例えば、抗生物質スクリーニング、エッセンシャルオイル、オキシリピン）に使用され得る。いくつかの実施形態によると、毛状根システムは、遺伝的に改変された植物を含み得、植物種における選好性微生物に対する、遺伝子関連の易罹患性及び／又は耐性を識別する上で有益であり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態によると、宿主植物（例えば、トマト、ジャガイモ、コショウ、柑橘類）のＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ仲介性毛状根培養は、選好性微生物（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）に感染し得る。最適な源は、複数の感染した植物組織を試験することによって特定のセットの条件に対して識別され得る。毛状根培養技術（例えば、規模拡大及び／又は増殖するための技術）は、いくつかの実施形態によると、高処理量診断及び／又は分子レベルの特徴づけのために含まれ得る。毛状根システムに対する機能的特徴づけは、いくつかの実施形態において、候補植物及び病原体をコードする遺伝子の、遺伝的な機能獲得（例えば、過剰発現）及び機能損失（例えば、クラスター化した、規則的に空間の空いた、短鎖パリンドロミック反復関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン）の試験を含み得る。遺伝子コンストラクト（例えば、代表的な遺伝子コンストラクト）又は遺伝子ライブラリは、例えば、真空浸潤を含む方法及び／又はＤＮＡ照射による何らかの所望の方法によって、確証された毛状根へと一過性に送達され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子コンストラクトは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓＴ−ＤＮＡへと挿入された後に、毛状根導入が実施され得、したがって、単一の工程において当該過程を完了し得る。
【００２０】
いくつかの実施形態によると、毛状根システムは、ウイルス（例えば、トマト黄化壊疽ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、カブ黄斑モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ））、ウイロイド（例えば、ジャガイモやせいもウイロイド（Ｐｏｔａｔｏ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｔｕｂｅｒ  ｖｉｒｏｉｄ）、トマト根端発育阻止ウイロイド（Ｔｏｍａｔｏ  ａｐｉｃａｌ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｏｉｄ）、柑橘類エクソコルティスウイロイド（Ｃｉｔｒｕｓ  ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ  ｖｉｒｏｉｄ））、及び内部寄生性微生物（例えば、アシドボラクス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）、アゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）種ＢＨ７２、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）種Ｂ５１０、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）  ｓｐｐ．、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）  ｓｐｐ．、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）  ｓｐｐ．、ボーベリア・バシアーナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、レカニシリウム（Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）  ｓｐｐ．、ピシウム・オリガンドラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ））を含む、何らかの所望の植物−微生物関係（例えば、導管越境コロニー形成植物細菌）に関する増殖試験及び機能試験に使用され得る。
【００２１】
先行研究は、選好性の植物微生物を培養するための毛状根の適用又は当該植物微生物の研究への毛状根の適用を報告していない。したがって、毛状根が選好性微生物の増殖を支持することができることを示す本開示は、高処理量適用のための微生物毛状根の大規模増殖に及ぼす有意な影響を有し得る。開示された毛状根システムは、選好性植物病原体を培養及び増殖する上での有意な支障を解決し、選好性植物病原体の数多くの生物学的研究の開始を結果的に生じ得る。このような研究は概して、植物疾患、害虫駆除、及び農業における新たな発展変化を約束することを提唱する。
【００２２】
本開示は、いくつかの実施形態において、ジャガイモ、トマト及び柑橘類などの何らかの適切な植物におけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．微生物の毛状根培養物を確立し最適化するのを支援し得、研究者らが、開示された微生物毛状根システムを用いて遺伝的及び／又は化学的分析を実施することを可能にし得る。
【００２３】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態によると、感染した植物から直接誘導される毛状根は、選好性の導管にコロニー形成する植物病原体を培養及び特徴づけるための容易な、迅速な、かつ規模拡大可能なプラットフォームを提供し得る。例えば、Ｌｓｏ及びＬａｓは、テキサス州南部において蔓延しており、ジャガイモ、トマト、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．を含むいくつかのナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅｏｕｓ）作物に感染する。したがって、テキサス州南部におけるＬａｓ感染柑橘類の樹木は、Ｌａｓ感染植物材料を得るために使用され得る。Ｌａｓ感染柑橘類樹木由来の植物組織は、Ｌａｓを検出するための確立されたＤＮＡマーカーである１６Ｓ  ｒＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってＬａｓの存在について収集及び試験され得る。Ｌａｓ陽性柑橘類の組織は、微生物毛状根誘導についての外植片源としてさらに使用され得る。
【００２４】
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の導管にコロニー形成する微生物（例えば、植物病原体）の迅速な培養、増殖及び機能的試験のための生物学的模倣性毛状根プラットフォームに関する。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ．などの選好性の導管にコロニー形成する植物病原体、ウイルス、フィトプラズマ及びスピロプラズマは結果的に、年間何十億ドルもの作付け損失を生じる。これらの及び他の導管に限定された微生物（例えば、病原体）を培養することができないことは、これらの生命体を研究しようとする研究者に対する多大なる挑戦を表す。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって誘導される植物毛状根は、根と解剖学的に及び代謝上同様に組織化された安定した組織であり、当該植物毛状根は、未処置の木部構造及び師部構造を有する。いくつかの実施形態によると、感染した植物から直接誘導される微生物含有毛状根は、選好性の導管限局性植物病原体を（例えば、実験室において）培養し、増殖させ、及び特徴付けるための容易な、迅速な、及び規模拡大可能なプラットフォームを提供し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態によると、植物（例えば、ジャガイモ、トマト、柑橘類）におけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．の微生物毛根培養物は、微生物の毛状根システムを用いて遺伝的解析を可能にし得る。選好性の導管限局性植物病原体を培養する先の挑戦を楽にすることに加えて、毛状根プラットフォームは、新規の抗微生物薬及び殺虫薬についての遺伝的及び化学的スクリーニングを含むがこれらに限定されない変化性の高処理量機能的試験のために容易に探索され得る。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが、多様な単子葉植物及び双子葉植物において毛状根を有効に誘導し得るので、微生物培養のための微生物毛状根のシステム、方法、及び組成物は、真菌、ウイルス、ウイロイド、及び内部寄生性微生物などの導管にコロニー形成する植物病原体に限らない、他の農業作物と植物微生物との関係へ適用され得る。
【００２６】
外植片及び／又は接種源の発生
昆虫ベクターは、植物から植物へと選好性微生物を拡大させ得る。選好性微生物によってコロニー形成された植物材料（例えば、外植片）は、いくつかの実施形態によると、選好性微生物を保有する昆虫ベクターを植物に供給することを可能にすること又は導入することによって発生し得、それにより選好性微生物を植物組織へ転移させ得る。植物導管系へいったん転移すると、選好性微生物はコロニー形成することができ及び複製することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態によると、選好性微生物を保有する昆虫ベクターは、環境（例えば、農場）から収集され得、当該昆虫ベクターが選好性微生物を保有しているかどうかを判定するために試験され得る（例えば、１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ）。昆虫ベクター（例えば、選好性微生物を保有する昆虫ベクター、非保有昆虫ベクター）は、いくつかの実施形態において維持され得（例えば、昆虫ケージにおいて）、及び増殖され得る。選好性微生物を保有する昆虫ベクターは、いくつかの実施形態において、実験室設定において、例えば、選好性微生物に感染した植物組織に関して非保有昆虫ベクターを供給することができることによって生成され得る。選好性微生物を昆虫ベクターへ遺伝させ、ならびに昆虫ベクター集団を維持し及び増殖するための数多くの方法が既知であり、当該方法はすべて、本開示の範囲内である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、昆虫ベクター集団は、選好性微生物によるコロニー形成の存在又は非存在について試験され得る。何らかの適切な技術、例えば、１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲを用いて、選好性微生物によるコロニー形成の存在又は非存在について昆虫ベクターを試験し得る。
少なくとも１つの選好性微生物を保有する昆虫ベクターは、感染していない植物に一定期間（例えば、７日間）、供給することが可能となり得、それにより少なくとも１つの選好性微生物を植物導管へと移し得る。このような方法は少なくとも、昆虫ベクターの種及び発生期、昆虫ベクター内での選好性微生物のレベル、選好性微生物が昆虫ベクター内で複製する速度、ならびに感染していない植物の種及び発生期によって変わり得る。いくつかの実施形態によると、指定の供給期間（例えば、７日間）後、微生物を保有する昆虫ベクターは、植物から取り出され得、当該植物は、コロニー形成及び／又は発症についてモニターされ得る。いくつかの実施形態において、疾患の症状は、選好性微生物によるコロニー形成を示し得る。任意の数の標準的な実験手順を用いて、植物組織内での選好性微生物の存在又は非存在を識別し得る。いくつかの実施形態によると、１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲを用いて、選好性微生物集団の存在又は非存在について植物組織を試験し得る。選好性微生物の存在について陽性（例えば、ＰＣＲ陽性）であることを試験する植物又は植物組織（例えば、子葉）は、いくつかの実施形態によると、微生物毛状根誘導のための外植片源として使用され得る。いくつかの実施形態によると、選好性微生物を培養するための方法は、植物に選好性微生物をコロニー形成させて外植片源を発生させることを含み得る。いくつかの実施形態において、植物に選好性微生物をコロニー形成させることには、当該植物の１つ又は２つ以上の表面を、少なくとも１つの選好性微生物を保有する昆虫ベクター（例えば、Ｌｓｏ保有キジラミ）へ曝露することを含み得る。外植片は、いくつかの実施形態において、子葉、胚軸、未熟苗条、未熟根、成熟苗条、成熟根、又はこれらの何らかの組み合わせなどの植物組織を含み得る。
【００２９】
微生物毛状根プラットフォーム
ＦＩＧＵＲＥ  １は、本開示の例となる実施形態によると、１つ又は２つ以上の植物組織において選好性微生物を増殖させること１０２、感染した植物組織から微生物毛状根の発生を誘導すること１１０、微生物毛状根を増殖させること１２０、及び微生物毛状根を下流の試験及び応用へ適用すること１３０を含む、微生物毛状根プラットフォームの作業の流れ１００を示す。
【００３０】
ＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、いくつかの実施形態によると、選好性微生物は、１つ又は２つ以上の植物組織において増殖し得る１０２。子葉１０４、胚軸１０６、葉１０８、未熟苗条、未熟根、成熟苗条、成熟根、又はこれらの何らかの組み合わせを含む、感染した植物の１つ又は２つ以上の植物組織は、選好性微生物によってコロニー形成され得る。いくつかの実施形態によると、１つ又は２つ以上の植物組織における選好性微生物（例えば、Ｌｓｏ、Ｌａｓ）の増殖は、選好性微生物によってコロニー形成され、かつ植物組織において局給されることが公知である１つ又は２つ以上のベクター種（例えば、キジラミ）へ健常植物を曝露することを含み得る。いくつかの実施形態によると、選好性微生物を増殖させることは、無性生殖的な植物増殖の種々の方法を含み得る。いくつかの実施形態によると、選好性微生物を増殖させることは、感染した植物を環境から識別すること、及び当該識別した植物を維持することを含み得る。
【００３１】
微生物毛状根プラットフォームの作業の流れ１００は、微生物毛状根の発生を、感染した植物又は植物組織から誘導すること１１０を含み得る。いくつかの実施形態によると、微生物毛状根の発生を誘導することは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを培養することを含み得る。数多くの方法は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを培養するのに適しており、本開示によって包含されている。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを培養することは、何らかの適切な培地（例えば、ルリア・ベルターニ培地（ＬＢ））中で何らかの適切な光学密度（例えば、０．３）まで増殖することを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物は、約０．２、又は約０．３、又は約０．４、又は約０．５、又は約０．６の光学密度まで増殖し得る。いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物は、０．２〜０．６、又は０．３〜０．６、又は０．２〜０．４の光学密度まで増殖し得る。上昇した光学密度へ到達した際、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物は、培地から（例えば、遠心分離を介して）取り出され得、ある容積の植物培地（例えば、１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース）又は水（例えば、滅菌水）中に所望の濃度へと再懸濁し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物は、約０．２、又は約０．３、又は約０．４、又は約０．５、又は約０．６の光学密度で再懸濁され得る。いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物は、０．２〜０．６、又は０．３〜０．６、又は０．２〜０．４の光学密度で再懸濁され得る。
【００３２】
いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの株は、具体的な特長に基づいて選択され得る。例えば、異なるＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株は、植物から毛状根を誘導するための異なる能力を有し得る。植物又は外植片（例えば、トマト、ジャガイモ、柑橘類）において微生物毛状根を増殖させるのに適した株は、いくつかの実施形態において、例えば、選択された外植片組織タイプ及び／又は植物種（例えば、トマト、ジャガイモ、柑橘類）における毛状根の誘導百分率に基づいて演繹的に判断され得る。評価及び／又は使用に適したＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株は、いくつかの実施形態において、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）１５８３４、ＡＴＣＣ４３０５６、ＡＴＣＣ４３０５７、ＡＴＣＣ１３３３、Ｋ５９９、又はこれらの何らかの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態によると、外植片組織及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株の各組み合わせについて、誘導効率は、次の（ａ）外植片全体当たりの毛状根誘導百分率、（ｂ）外植片全体当たりの毛状根発生日数、（ｃ）単一外植片当たりの毛状根誘導頻度、及び（ｄ）毛状根における選好性微生物（例えば、Ｌａｓ及びＬｓｏ）個体数などのパラメータを測定することによって決定され得る。異なる試料（例えば、外植片組織タイプ、植物種タイプ）のうちでの微生物力価の正確な比較のために、いくつかの実施形態によると、定量的ＰＣＲ技術（例えば、ｑ−ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ）を使用し得る。分散分析及びＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定などの統計分析を採用して、異なる試料間の個体数の有意差を決定し得る。
【００３３】
ＦＩＧＵＲＥ  １において示すように、植物内１１０、１１２、１１４及びインビトロ１１６の両アプローチを使用して、１つ又は２つ以上の感染した植物組織から直接、微生物毛状根の発生を誘導し得る。微生物毛状根の発生を誘導するための植物内アプローチは、微生物毛状根の空中誘導１１０、微生物毛状根のロックウール誘導１１２、及び微生物毛状根の蛭石誘導１１４を含み得る。
【００３４】
微生物毛状根を誘導する植物内方法
微生物毛状根の発生を誘導すること１１０は、いくつかの実施形態において、感染した植物（例えば、Ｌｓｏ）を選択すること、及び当該感染した植物の１つ又は２つ以上の表面を調製することを含み得る（例えば、表面滅菌、創傷形成）。感染した植物を調製することは、当該感染した植物の１つ又は２つ以上の表演の表面滅菌を含み得る。いくつかの実施形態において、感染した植物の１つ又は２つ以上の表面を指定の期間（例えば、１〜１０分間）、アルコール（例えば、７０％エタノール）、ＮａＣｌＯ（漂白剤）（例えば、２％、１０％）、非植物毒性抗真菌薬（例えば、アンホテリシンＢ）、抗菌（例えば、２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン）化合物、又はこれらの何らかの組み合わせを含む、何らかの適切な表面滅菌技術を使用し得る。
【００３５】
いくつかの実施形態によると、感染した植物を調製すること（例えば、Ｌｓｏ又はＬａｓによってコロニー形成）は、当該感染した植物の１つ又は２つ以上の表面を損傷させることを含み得る。はさみ、メス、ピンセット（例えば、細いゲージ）、注射器、針、又はこれらの何らかの組み合わせを含む何らかの適切なツールを用いて、感染した植物の１つ又は２つ以上の表面を損傷させ得る。感染した植物の損傷しかつ曝露された表面は、いくつかの実施形態において、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ形質転換及び毛状根誘導のための活性部位として機能し得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、微生物毛状根の発生を誘導すること１１０は、１１２、１１４、及び１１６においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、感染した植物又は感染した植物の部分を少なくとも１つのＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞と接触させること（植物内アプローチ）を含み得る。感染した植物を少なくとも１つのＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと接触させることは、いくつかの実施形態によると、感染した植物の１つもしくは２つ以上の部分（例えば、損傷部位）をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁液（例えば、光学密度０．３）へ（例えば、空中の毛状根を発生させるために）直接曝露すること、又は感染した植物の１つもしくは２つ以上の部分をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁液で真空浸潤させることを含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態によると、感染した植物の１つ又は２つ以上の部分は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液（例えば、光学密度０．３）によって直接接触し得る。種々の方法を使用して、感染した植物の１つ又は２つ以上の部分を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１個の細胞を含有する懸濁液と接触させ得る。いくつかの実施形態によると、感染した植物の１つ又は２つ以上の部分を接触させることは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液を損傷部位へ（例えば、滴下装置を用いて）適用すること、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液中に細い針を浸漬すること、及び当該細い針を用いて、感染した植物の１つ又は２つ以上の箇所を損傷させること、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液を、感染した植物中に注射器を用いて注射することを含み得る。ＦＩＧＵＲＥ  １に示すように１１２、土壌レベルを上回る位置において、感染した植物を接触させることは、１つ又は２つ以上の空中の微生物毛状根を発生させ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態によると、感染した植物の１つ又は２つ以上の部分をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞（例えば、露出した損傷部位）と接触させることは、接触部位を包むこと又は覆うこと（例えば、アルミホイルを使用）を含み得る。接触部位を包むこと又は覆うことは、いくつかの実施形態において、光への曝露を低下させ得、及び／又は所望の湿度レベルを維持し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、感染した植物の１つ又は２つ以上の部分をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞と接触させることは、真空圧を用いて当該感染した植物の１つ又は２つ以上の部分を浸潤させることを含み得る。ＦＩＧＵＲＥ  １に示すように１１６、微生物毛状根の発生を誘導することは、感染した植物（例えば、苗条）の一部を取り出して損傷部位を形成すること、及び当該損傷部位をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液（例えば、光学密度０．３）と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、感染した植物の一部をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液（例えば、光学密度０．３）と接触させることは、当該溶液中に損傷部位を浸漬すること、及び当該感染した植物の一部を真空環境へ一定の期間曝露することを含み得る。少なくとも１つの植物細胞をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞で浸潤することを可能にする何らかの真空環境が使用され得る。いくつかの実施形態において、真空環境は、約２０ｉｎＨｇ、又は約２５ｉｎＨｇ、又は約３０ｉｎＨｇであり得る。いくつかの実施形態によると、真空環境が保持され得る何らかの適切な長さの時間は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞で少なくとも１つの植物細胞の浸潤を可能にする何らかの適切な長さの時間であり得る。真空が保持され得る期間は、何らかの長さの時間であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、真空は、少なくとも約３０秒間、又は少なくとも約１分間、又は少なくとも約５分間、又は少なくとも約１０分間、又は少なくとも約３０分間、又は少なくとも約６０分間、又は少なくとも約３時間、又は少なくとも約６時間、又は少なくとも約１２時間保持され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態によると、ＦＩＧＵＲＥ  １の１１４に示すように、真空浸潤の後、損傷部位をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの溶液から取り出して、蛭石マトリックスに挿入することによって被覆し得る（例えば、完全に被覆、部分的に被覆）。いくつかの実施形態において、微生物毛状根の発生を誘導することは、感染した植物（例えば、根）の一部を取り出して、損傷部位を形成すること、損傷部位をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液（例えば、光学密度０．３）と接触させること、損傷部位を溶液から取り出すこと、及び損傷部位を蛭石マトリックスで被覆することを含み得る。いくつかの実施形態において、蛭石マトリックスによって被覆された感染した植物の一部は、１つ又は２つ以上の微生物毛状根の形成に適した条件において維持され得る。蛭石マトリックスは、いくつかの実施形態において、周期的に交換され得る。
【００４１】
１１４においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、微生物毛状根の発生を誘導することは、感染した植物の一部（例えば、苗条）を取り出して、損傷部位を形成すること、損傷部位をロックウールマトリックス中で被覆すること、及びロックウールマトリックスをＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液へ曝露することを含み得る。ロックウールマトリックスをＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液（光学密度０．３）へ曝露することは、十分な容積の当該溶液を提供して、ロックウールマトリックスを部分的に飽和又は完全に飽和させることを含み得る。いくつかの実施形態によると、ロックウールマトリックスによって被覆された感染した植物の一部は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと１つ又は２つ以上の植物細胞との共培養に適した条件下で共培養期間維持され得る。いくつかの実施形態によると、共培養期間は、少なくとも約１２時間、又は少なくとも約２４時間、又は少なくとも約４８時間、又は少なくとも約７２時間であり得る。共培養期間の後、いくつかの実施形態において、ロックウールマトリックスは、乾燥させられて（例えば、空気乾燥、真空乾燥）、乾燥したロックウールマトリックスを形成し得る。乾燥したロックウールマトリックスは、いくつかの実施形態によると、水分を幾分保有し得る。いくつかの実施形態において、乾燥したロックウールマトリックスは、乾燥前の同じロックウールマトリックスと比較したとき、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ数の減少を有し得る。いくつかの実施形態によると、ロックウールマトリックスを乾燥させることは、ロックウールマトリックスを１つ又は２つ以上の乾燥条件（例えば、温度、空気流）へ少なくとも６時間、又は少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間、又は少なくとも３６時間、又は少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間の期間曝露することによって実施され得る。いくつかの実施形態において、乾燥したロックウールマトリックスは、再水和され得る。
【００４２】
感染した植物（例えば、１１２、１１４、１１６）の１つ又は２つ以上の部分をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞と接触させることは、微生物毛状根の形成に適した条件（例えば、インキュベータ、増殖チャンバー、温室）において接触した植物を少なくとも１つの毛状根が発生するまで維持することを含み得る。１つ又は２つ以上の微生物毛状根の発生に適した条件は、感染した植物の種、接触した感染した根の一部、感染した植物を接触させる方法、選択されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株、接触溶液中のＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度、又はこれらの何らかの組み合わせを含む因子によって変化し得る。いくつかの実施形態によると、感染した植物は、約２１℃〜約２５℃の温度で維持され得る。いくつかの実施形態において、感染した植物は、いくつかの実施形態によると、２４時間の期間あたり約８時間の明期〜約１６時間の明期の明暗臭気を有する条件において維持され得る。いくつかの実施形態において、微生物毛状根は、感染した植物をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触した約１０〜２１日後に現れ得る。
【００４３】
微生物毛状根を誘導するインビトロでの方法
１１８においてＦＩＧＵＲＥ  １において示すように、微生物毛状根を誘導することは、本開示のいくつかの実施形態によると、インビトロで実施され得る。微生物毛状根のインビトロでの誘導は、いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養物を調製すること、外植片を調製すること、外植片を少なくとも１つのＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞を含有する溶液と接触させること（例えば、共培養）、及び外植片を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することを含み得る。
【００４４】
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根の発生１１０を誘導するインビトロ法１１８は、選好性微生物によってコロニー形成された植物から１つ又は２つ以上の感染した組織（例えば、葉、子葉、胚軸、及び／又は根）を外植片として機能するよう選択することを含み得る。いくつかの実施形態において、微生物毛状根の発生を誘導することは、外植片を調製すること（例えば、表面滅菌、創傷形成）を含み得る。外植片を調製することは、当該外植片（例えば、子葉）の１つ又は２つ以上の表面の表面滅菌を含み得る。いくつかの実施形態において、感染した植物又は外植片の１つ又は２つ以上の表面の、アルコール（例えば、７０％エタノール）、ＮａＣｌＯ（漂白剤）（例えば、２．５％、１０％溶液）、非植物毒性抗真菌薬（例えば、アンホテリシンＢ）、抗菌（例えば、セフォタキシム又はカルベニシリン）化合物、又はこれらの何らかの組み合わせを含有する溶液への曝露を含む何らかの適切な表面滅菌技術が、指定された期間（例えば、１〜１０分間）使用され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、外植片（例えば、子葉）を調製することは、外植片をより小さな断片（例えば、約２センチメートル（ｃｍ）長）へと切断すること、外植片の少なくとも一部を損傷させること（例えば、ピンセットを使用）、又はこれらの何らかの組み合わせを含み得る。はさみ、メス、ピンセット（例えば、細いゲージ）、注射器、針、又はこれらの何らかの組み合わせを含む何らかの適切なツールは、外植片を調製するために使用され得る。外植片（例えば、子葉）の損傷しかつ曝露された表面は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの形質転換及び毛状根誘導のための活性部位として機能し得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、微生物毛状根の発生を誘導することは、外植片（例えば、表面滅菌しかつ損傷した子葉）を少なくとも１つのＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞と接触させること（例えば、共培養すること）を含み得る（インビトロアプローチ）１１６。外植片（例えば、調製した外植片）をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞と接触させることは、いくつかの実施形態において、当該外植片又は調製した外植片を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する溶液（例えば、光学密度０．３）中にある期間（例えば、２０分間）浸漬することを含み得る。外植片は、いくつかの実施形態によると、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液中に、何らかの期間、例えば、少なくとも１分間、又は少なくとも５分間、又は少なくとも１０分間、又は少なくとも１５分間、又は少なくとも２０分間、又は少なくとも２５分間、又は少なくとも３０分間浸漬され得る。いくつかの実施形態において、外植片を接触させること（例えば、共培養すること）は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液中に外植片（例えば、調製された外植片）を約１分間〜約３０分間、又は約５分間〜約２５分間、又は約１０分間〜約２５分間、又は約１５分間〜約２５分間、又は約１５分間〜約２０分間の期間、浸漬することを含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、外植片を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞と接触させることは、外植片を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液（例えば、光学密度０．３）から共培養培地（例えば、１／２  ＭＳ、１／２  Ｂ５＋３％スクロース）へ転移させること、及び当該外植片を少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間、又は少なくとも３６時間、又は少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間という期間、インキュベートすることを含み得る。外植片又は調製された外植片をインキュベートすることは、外植片及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの両方の生き残りのための何らかの適切な条件下で実施され得る。いくつかの実施形態において、外植片をインキュベートすることは、約２１℃、又は約２２℃、又は約２３℃、又は約２４℃、又は約２５℃の温度で実施され得る。いくつかの実施形態によると、外植片をインキュベートすることは、約２１℃〜約２５℃の温度で実施され得る。共培養培地は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの増殖を可能にする何らかの培地、例えば、１／２  ＭＳ培地、１／２  Ｂ５＋３％スクロース培地を含み得る。
【００４８】
いくつかの実施形態によると、外植片を接触させることは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの少なくとも１つの細胞を含有する懸濁液中に当該外植片を２０分という期間浸漬すること、当該外植片を１／２  ＭＳ、１／２  Ｂ５＋３％スクロースの共培養培地へ転移させること、及び当該外植片を２１℃〜２５℃の温度で７２時間という期間インキュベートすることを含み得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、接触させること及びインキュベーション後、外植片は、１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露され得る。いくつかの実施形態によると、外植片又は調製した外植片は、共培養培地から選択培地へと転移され得る。選択培地は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、形質転換していない組織、形質転換していない根、又はこれらの何らかの組み合わせを抑止する（例えば、これらの濃度又は増殖を低下させる）何らかの培地であり得る。いくつかの実施形態によると、選択培地は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ数を抑止し得るが、選好性微生物（例えば、Ｌｓｏ）を抑止し得ない。いくつかの実施形態によると、種々の測定基準は、一般的な抗生物質（例えば、セファトキシム（ｃｅｆａｔｏｘｉｍｅ）、カルベンシリン（ｃａｒｂｅｎｃｉｌｌｉｎ）及びカナマイシン）を用いた潜在的な落とし穴を回避するために使用され得る。例えば、いくつかの抗生物質は、外植片の内側に存在する選好性微生物を抑止し得る。それゆえ、いくつかの実施形態において、師部に静止性の及び／又は非植物毒性のストレプトマイシン（例えば、２００ｍｇ／Ｌ濃度の）、ネオマイシン（例えば、１００ｍｇ／Ｌの）、ペニシリン（例えば、１００ｍｇ／Ｌの）及びハイグロマイシン（約１００ｍｇ／Ｌの）が使用され得る。外植片は、共培養培地（例えば、約１／２  ＭＳ、１／２  Ｂ５＋３％スクロース）から、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを抑止し得る（例えば、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度又は増殖を低下させ得る）選択培地（例えば、約１／２  ＭＳ、１／２  Ｂ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン）へと転移され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態によると、接触させること及びインキュベーション後、外植片は、浸透圧ストレスへ曝露され得る。外植片を浸透圧ストレスへ曝露することは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを抑止する（例えば、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度を低下させる）上で有効であり得る。種々の方法が、外植片を浸透圧ストレスへ曝露するために存在する。例えば、外植片は、滅菌した脱イオン水中である期間（例えば、約３０分間）反復してすすぐことによって、浸透圧ストレスへ曝露され得る。いくつかの実施形態において、外植片を浸透圧ストレスへ曝露するために使用される脱イオン水は、抗生物質化合物、例えば、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含み得る。
【００５１】
外植片を１つ又は２つ以上の選択的条件へ接触させかつ曝露した後、外植片は、適切な増殖環境（例えば、インキュベータ、増殖チャンバー、温室）中に、少なくとも１つの毛状根が発生するまで配置され得る。外植片は、毛状根誘導のためにその後モニターされ得る。使用される植物種、外植片源、及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって、毛状根は、いくつかの実施形態によると、２〜４週間以内で生じ得る。
【００５２】
微生物毛状根誘導効率
いくつかの実施形態において、毛状根誘導効率は、植物品種、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株、及び／又は外植片源（例えば、子葉、胚軸、未熟苗条、未熟根、成熟苗条、及び成熟根）を含む種々の因子に基づいて変化し得る（例えば、有意に変化し得る）。演繹的なデータは、毛状根誘導効率を最適化するために使用され得る。異なる試料（例えば、外植片組織タイプ、植物種タイプ）間での微生物数の正確な比較のために、定量的ＰＣＲ技術（例えば、ｑ−ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ）が、いくつかの実施形態によると、使用され得る。分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定などの統計分析を採用して、異なる試料の間の数の有意な差を判定し得る。
【００５３】
いくつかの実施形態によると、毛状根誘導効率は、使用される植物品種、外植片組織、及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株によって約１０％から約９０％まで及び得る。好ましい外植片組織及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株は、柑橘類、トマト、及びジャガイモなどの種々の植物における微生物毛状根誘導効率を最大化し得る。
【００５４】
毛状根の確認
１２０においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、微生物毛状根プラットフォームの作業の流れ１００は、微生物毛状根（例えば、植物又はインビトロで発生した）が、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによる形質転換によって誘導されたことを確認することを含み得る。種々の分子レベルの方法は、微生物毛状根（例えば、植物又はインビトロで発生した）をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによる形質転換によって誘導されたことを確認する上で使用され得る。例えば、いくつかの実施形態によると、公知の根誘導（Ｒｉ）ＤＮＡ遺伝子（例えば、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ）のＰＣＲ増幅は、微生物毛状根（例えば、植物内又はインビトロで発生した）が、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによる形質転換によって誘導されたことを確認するために実施され得る。
【００５５】
選好性微生物による毛状根のコロニー形成の確認
微生物毛状根プラットフォームの作業の流れ１００は、感染した植物から発生した微生物毛状根が、１２０においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、選好性微生物（例えば、Ｌｓｏ、Ｌａｓ）によってコロニー形成されていることを確認することを含み得る。ＰＣＲ、ｑ−ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、逆転写ｑＰＣＲ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、又はこれらの何らかの組み合わせを含むがそれらに限定されない数多くの化学的方法は、外植片又は感染した植物に由来する微生物毛状根が、選好性微生物によって、本開示から逸脱することなくコロニー形成されていることを確認するために使用され得る。
【００５６】
選好性微生物によってコロニー形成された微生物毛状根の増殖
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根プラットフォームの作業の流れ１００は、顆粒の試験及び応用のために微生物毛状根を増殖させることを含み得る。高処理量生物学的試験のために微生物毛状根をうまく利用するために、いくつかの実施形態によると、十分に多量の微生物毛状根種菌を増殖させることが望ましくあり得る。毛状根システムは、大規模増殖を受け入れられる。いくつかの実施形態によると、収集した毛状根は、クローン増殖され得る。収集した毛状根のクローン増殖は、収集した毛状根内に含有される選好性微生物源（例えば、微生物毛状根種菌）の増加を提供し得る。本開示のいくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させることは、蛭石法１２２、水耕法１２４、インビトロ培地法１２６、バイオリアクタ法１２８、又はこれらの何らかの組み合わせを用いて実施され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させることは、感染した植物又は外植片に付着した、微生物毛状根が、所望の長さに到達したときに実施され得る。いくつかの実施形態において、微生物毛状根を増殖させることは、感染した植物又は外植片へ付着した、微生物毛状根が、少なくとも約１ｃｍ、又は少なくとも約１．５ｃｍ、又は少なくとも約２ｃｍ、又は少なくとも約２．５ｃｍ、又は少なくとも約３ｃｍ、又は少なくとも約３．５ｃｍ、又は少なくとも約４ｃｍ、又は少なくとも約４．５ｃｍ、又は少なくとも約５ｃｍの長さに到達したときに実施される。
【００５８】
先に説明したように、１つ又は２つ以上の微生物毛状根を生じるために使用され得る複数の植物内アプローチがある。このような植物内で生じた微生物毛状根は、光合成活動の可能な感染した植物の少なくとも一部へなおも付着し得る（すなわち、付着した毛状根）。いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させること１２１は、１つ又は２つ以上の選択的条件へ（例えば、増殖することの前に）付着した毛状根を曝露することを含み得る。いくつかの実施形態によると、付着した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、付着した毛状根の１つ又は２つ以上の表面を、アルコール（例えば、７０％エタノール）、ＮａＣｌＯ（漂白剤）（例えば、２．５％、１０％）、非植物毒性抗真菌薬（例えば、アンホテリシンＢ）、抗菌薬（例えば、セフォタキシム、カルベニシリン）化合物、又はこれらの何らかの組み合わせを含有する溶液へ、指定された期間（例えば、１〜１０分間）曝露することを含み得る。いくつかの実施形態において、付着した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、付着した毛状根を浸透圧ストレスへ曝露することを含み得る。付着した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、いくつかの実施形態において、付着した毛状根を選択培地（例えば、約１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン）へ転移させて、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを抑止する（例えば、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度を低下させる）ことを含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させること１２１は、外植片、感染した植物、感染した植物の一部、又は付着した毛状根から１つ又は２つ以上の微生物毛状根を収集して、収集した毛状根を形成することを含み得る。微生物毛状根１２１を増殖させることは、いくつかの実施形態においてＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度を低下させ得る選択的条件へ、収集した毛状根を曝露することを含み得る。いくつかの実施形態によると、収集した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、収集した毛状根の１つ又は２つ以上の表面を、アルコール（例えば、７０％エタノール）、ＮａＣｌＯ（漂白剤）（例えば、２．５％、１０％）、非植物毒性抗真菌薬（例えば、アンホテリシンＢ）、抗菌薬（例えば、セフォタキシム又はカルベニシリン）化合物、又はこれらの何らかの組み合わせを含有する溶液へ、指定された期間（例えば、１〜１０分間）曝露することを含み得る。いくつかの実施形態において、収集した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、収集した毛状根を選択培地（例えば、約１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン）へ転移させることを含み得る。いくつかの実施形態において、収集した毛状根を１つ又は２つ以上の選択的条件へ曝露することは、収集した毛状根を浸透圧ストレスへ曝露することを含み得る。例えば、収集した毛状根は、滅菌済み脱イオン水中でのすすぎをある期間（例えば、約３０分間）反復させることによって、浸透圧ストレスへ曝露され得る。
【００６０】
１２２においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、微生物毛状根を増殖させることは、蛭石法１１２２を用いて実施され得る。蛭石法１２２は、いくつかの実施形態において、付着した毛状根（例えば、表面滅菌済みの、付着した毛状根）を蛭石マトリックスへ移植することを含み得る。いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させる蛭石法１２２は、付着した毛状根を新鮮な蛭石マトリックスへ周期的に転移させることを含み得る。蛭石マトリックスに移植された付着した毛状根は、付着した毛状根の光合成部分の維持に適した条件に置かれ得る。例えば、蛭石毛状根は、１４時間明期（強度：１００μｍｏｌ・ｍ−２・秒−１）、１０時間暗期、及び２１℃〜約２５℃の日周性周期を備えた増殖チャンバーの中で増殖し得る。
【００６１】
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させることは、水耕法２１４を用いて実施され得る。水耕法１２４は、いくつかの実施形態によると、付着した毛状根（）又は収集した毛状根（たとえ亜ｂ、表面滅菌済み）を栄養素の豊富な培地（例えば、１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース培地）中に置き、水耕栽培を生じることを含み得る。いくつかの実施形態において、栄養素の豊富な培地は、抗生物質又は抗真菌成分を含み得る。水耕栽培は、付着した毛状根又は収集した毛状根の増殖のための何らかの適切な条件で維持され得る。いくつかの実施形態において、水耕栽培は、撹拌され得る。いくつかの実施形態によると、水耕栽培は、追加の栄養源が周期的に補充され得る（例えば、新鮮培地供給）。水耕栽培は、いくつかの実施形態において、約２１℃〜約２５℃の温度で維持され得る。いくつかの実施形態によると、外部光源を供給することは、水耕栽培物の生育に不必要である。１２６においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、微生物毛状根を増殖させることは、インビトロ培地法１２６を用いて実施され得る。インビトロ培地法１２６は、いくつかの実施形態によると、付着した毛状根（例えば、浸透圧ストレスへ曝露）又は収集した毛状根（例えば、表面滅菌済み）を栄養素の豊富な培地（例えば、１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース培地）のプレートへ置き、インビトロ培養物を生じることを含み得る。いくつかの実施形態において、栄養素の豊富な培地は、抗生物質又は抗真菌成分を含み得る。インビトロ培養は、付着した毛状根又は収集した毛状根の生育のための何らかの適切な条件で維持され得る。いくつかの実施形態によると、インビトロ培地法１２６は、付着した毛状根又は収集した毛状根を栄養素の豊富な培地の新鮮なプレートへ周期的に移植することを含み得る。インビトロ培養は、いくつかの実施形態において、約２１℃〜約２５℃の温度で維持され得る。いくつかの実施形態によると、外部光源を供給することは、インビトロ培養物の生育に不必要である。
【００６２】
１２８においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させることは、バイオリアクタ法１２８を用いて実施され得る。バイオリアクタ法１２８は、いくつかの実施形態によると、付着した毛状根（例えば、浸透圧ストレスへ曝露）又は収集した毛状根（例えば、表面滅菌済み）を栄養素の豊富な培地（例えば、１／２のＭＳ、１／２のＢ５＋３％スクロース培地）を含有するバイオリアクタの中に置いて、バイオリアクタ培養物を生じることを含み得る。いくつかの実施形態において、栄養素の豊富な培地は、抗生物質又は抗真菌成分を含み得る。
【００６３】
種々のバイオリアクタシステムは、本開示から逸脱することなく使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、液相及び／又は気相のバイオリアクタは、微生物毛状根を増殖させるバイオリアクタ法において使用され得る。いくつかの実施形態によると、浸潤システムのバイオリアクタ又は一時的浸潤システムのバイオリアクタ（例えば、ＳＥＴＩＳシステム）は、微生物毛状根を増殖させるバイオリアクタ法において使用され得る。いくつかの実施形態において、付着した毛状根又は収集した毛状根は、栄養素の十分な取り込みを可能にするよう算出された期間、栄養素の豊富な培地中に周期的に浸漬され得る（例えば、一時的浸潤システムのバイオリアクタ）。いくつかの実施形態において、一時的浸潤システムは、植物組織が栄養素培地中に永続的に浸漬される浸潤システムと比較すると、気体交換の改良及び低酸素／通気の問題の回避に貢献し得る。一時的浸潤システム（例えば、ＳＥＴＩＳシステム）は、高価ではなく、設立するのが簡単で、及び／又は規模拡大可能（例えば、高度に規模拡大可能）であり得る。一時的浸潤システムの個々のユニットは、いくつかの実施形態において、独立して機能するよう設計され得る。いくつかの実施形態によると、バイオリアクタの個々のユニットは、第一のバイオリアクタユニットが少なくとも第二のバイオリアクタユニットへ付着しているように積層され得る。積層したバイオリアクタセットアップは、単一のバイオリアクタユニットと比較すると、汚染がユニットからユニットへと広がるのを防止することができるので、損失を低下させ得る。
【００６４】
バイオリアクタ培養物は、付着した毛状根又は収集した毛状根の生育のための何らかの適切な条件で維持され得る。いくつかの実施形態において、バイオリアクタ培養物は通気され得る。いくつかの実施形態によると、バイオリアクタ培養物は、追加の栄養源を周期的に補充され得る（例えば、新鮮培地の供給）。バイオリアクタ培養物は、いくつかの実施形態において、約２１℃〜約２５℃の温度で維持され得る。いくつかの実施形態によると、外部光源を供給することは、バイオリアクタ毛状根培養物の生育に不必要である。
【００６５】
いくつかの実施形態によると、微生物毛状根を増殖させることは、比較的短期間で達成され得る。いくつかの実施形態において、微生物毛状根の集団は、感染した植物又は外植片から微生物毛状根の増殖した塊へと約６〜１０週間で生じ得る。
【００６６】
毛状根遺伝的スクリーニングシステム
１３０において、ＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、選好性の小胞限局性植物微生物を培養する先の挑戦を楽にすることに加えて、毛状根プラットフォームは、新規の抗菌薬及び殺菌薬のための遺伝的及び化学的スクリーニングを含むがこれらに限定されない、主な変化を生じさせる高処理量の機能的研究のために容易に開発され得る。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが多様な単子葉植物及び双子葉植物において毛状根を有効に誘導し得るので、微生物培養のための微生物毛状根のシステム、方法、及び組成物は、真菌、ウイルス、ウイロイド、及び内部寄生性微生物などの導管にコロニー形成する植物性細菌に限らない、他の農業作物と植物微生物との関係へ適用され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態によると、アッセイは、１３２においてＦＩＧＵＲＥ  １に示す空中毛状根又は１３４においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すロックウール法もしくは蛭石法を用いて生じる微生物毛状根など、植物組織へ付着したままである微生物毛状根を用いて実施され得る。いくつかの実施形態において、アッセイは、多重ウェルアッセイが示されている１３６においてＦＩＧＵＲＥ  １に示すように、収集した微生物毛状根を用いて実施され得る。
【００６８】
微生物毛状根のシステム、方法、及び組成物は、いくつかの実施形態によると、選好性微生物を培養するために、及び／又は選好性微生物の主な変化を生じさせる生物学的及び遺伝的研究を可能にするために、植物病理学において長く存在している問題を解決し得る。例えば、微生物毛状根のシステムは、新規の耐性遺伝子、抗菌化合物、殺菌薬などの迅速なスクリーニングのために展開され得る。このようなスクリーニングは、ＺＣ及びＨＬＢなどの荒廃させる疾患と戦うのに役立ち得る。微生物毛状根は、宿主−病原体−ベクター間で生じる相互作用をより良好に理解するために活用されることもできる。それゆえ、本明細書に開示される微生物毛状根のシステム、方法、及び組成物は、潜在的に交配させる選好性の植物病原体の駆除戦略を開発する上で助力することによって、米国の農業及び植物疾患管理を進行させ得る。
【００６９】
本明細書に開示される微生物毛状根のプラットフォーム及びシステムは、新規の耐性遺伝子及び抗菌化合物の識別に対するプログラムへと統合され得る。例えば、当該システムは、植物（例えば、トマト、ジャガイモ、柑橘類）の微生物毛状根システムにおける候補疾患の耐性遺伝子及び抗菌分子（例えば、抗生物質、エッセンシャルオイル、オキシリピン）の迅速な機能的及び化学的遺伝的スクリーニングを達成するのに役立ち得る。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが多様な双子葉植物及び単子葉植物において毛状根を有効に誘導し得るので、開示された原理は、真菌、ウイルス、ウイロイド、及び有益な内部寄生菌などの導管限局性植物性細菌に限らない、他の作物と植物微生物との関係のための微生物毛状根システムも確立し得る。いくつかの実施形態において、毛状根システムは、植物病原体（例えば、経済的に重要な植物病原体）及びこれらの対応する疾患（例えば、ゼブラチップ（ＺＣ）、ＨＬＢ）を研究するために使用され得る。
【００７０】
本開示は、いくつかの実施形態において、選好性の導管にコロニー形成する植物微生物（例えば、病原体）の迅速な培養、増殖、及び機能的研究のための微生物毛状根プラットフォームに関する。いくつかの実施形態によると、コロニー形成された植物から直接誘導される、微生物によりコロニー形成された毛状根は、選好性の導管限局性植物微生物を培養し、増殖させ、及び特徴づけるための容易な、迅速な、及び規模拡大可能なプラットフォームを提供し得る（例えば、実験室における）。
【００７１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態によると、遺伝的解析（例えば、導入遺伝子の機能の解析）は、微生物毛状根システムを用いて実施され得る。いくつかの実施形態において、毛状根システムは、遺伝子修飾された植物をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いて形質転換することによって、遺伝子修飾された植物から毛状根を培養することを含み得る。例えば、植物の広範な複合体、トラムトラック及びがらくた（ＢＴＢ）ドメインファミリータンパク質、ＮＲＰ１、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を過剰発現するよう遺伝子修飾された植物は、毛状根の産生を誘導するために、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの株を用いて形質転換され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって遺伝子修飾された植物は、選好性微生物（例えば、Ｌａｓ、Ｌｓｏ）によってコロニー形成され得る。
【００７２】
毛状根システムは、いくつかの実施形態において、植物を、１つ又は２つ以上の修飾されたＴ−ＤＮＡプラスミドを有するＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株を用いて形質転換することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、修飾されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが形成され得る。修飾されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、いくつかの実施形態において、各々、標的遺伝子（例えば、ＮＲＰ１、ＧＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は２つ以上のＴ−ＤＮＡプラスミドを含み得る。いくつかの実施形態によると、毛状根システムは、各々が標的遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つをコードする第一の修飾されたＴ−ＤＮＡプラスミド及び第二の修飾されたＴ−ＤＮＡプラスミドを有するＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株を用いて植物を形質転換することを含み得る。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、Ｔ−ＤＮＡ及びＲｉ−ＤＮＡを植物細胞へ同時に転移させることができるので、修飾されたＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いた植物の形質転換は、標的遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つを発現する（例えば、過剰発現する）毛状根産生植物の作出を結果的に生じ得る。
【００７３】
いくつかの実施形態によると、標的遺伝子（例えば、ＮＰＲ１、ＧＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つをコードする１つ又は２つ以上のＴ−ＤＮＡプラスミドは、緩徐な真空浸潤又はＤＮＡ照射を用いて毛状根へと一過性に送達され得、それにより遺伝子修飾された毛状根を形成し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子（例えば、ＮＰＲ１、ＧＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つをコードするＴ−ＤＮＡプラスミドは、レポーター遺伝子／マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ、β−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、抗生物質耐性遺伝子）をさらに含み得る。微生物毛状根の誘導及び選択のための標準的な抗生物質の使用が制御されているので、修飾されたＴ−ＤＮＡコンストラクトを保有する微生物毛状根を識別するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）系又はＧＵＳ系のスクリーニングが使用され得る（例えば、任意に、排他的に）。
【００７５】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子（）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つを用いた毛状根の形質転換は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、サザンブロット分析、ノザンブロット分析、及び／又はウェスタンブロット分析を用いて確認され得る。空のベクター又はＧＦＰ含有二進法Ｔ−ＤＮＡベクターを用いて同時に形質転換した又は浸潤させた毛状根は、陰性対照として使用され得る。当業者は、標的遺伝子を用いた形質転換に関する他の確認方法が、本開示から逸脱することなく使用され得ることを理解するであろう。
【００７６】
標的遺伝子（）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つの評価は、選好性の植物微生物をコロニー形成された毛状根システムの力価の定量的な分析を含み得る。例えば、耐性機序に関与する標的遺伝子は、標的遺伝子を含有していないコロニー形成されたと比較すると、選好性の植物微生物の力価が低くあり得る。選好性の植物微生物の力価の評価は、定性的又は定量的な評価を含み得る。
【００７７】
例として、毛状根システムは、ＮＰＲ１、ＧＦＰ遺伝子の遺伝的解析を実施するために使用され得る。広範な複合体、トラムトラック及びがらくた（ＢＴＢ）ドメインファミリーのタンパク質は、植物において十分に保存されており、多様な植物シグナル伝達経路に関与している。例えば、植物ＢＴＢタンパク質であるＮＰＲ１は、サリチル酸メチル−ジャスモン酸エステル、活性酸素種、及びシロイヌナズナにおける創傷形成を含む、多様な無生物性及び生物性ストレスシグナルによって調節され得る。それゆえ、選好性植物微生物（例えば、Ｌｓｏ、Ｌａｓ）に対する応答におけるＮＰＲ１遺伝子の潜在的な役割を評価するために、毛状根システムが使用され得る。例えば、ジャガイモ、トマト、及び柑橘類植物の個々のＬｓｏ病原体又はＬａｓ病原体が培養されたジャガイモ、トマト、及び柑橘類植物は、ＮＰＲ１遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡプラスミドを有するＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ下部を用いて形質転換され得る。Ｌｓｏ及びＬａｓに及ぼすＮＰＲ１の効果を判定するために、ＮＰＲ１を過剰発現する毛状根における細菌力価を定量化し、ＧＦＰのみを発現する対照毛状根と比較し得る。例えば、結果的に生じる力価は、ＮＰＲ１遺伝子の発現（例えば、過剰発現）が、毛状根におけるＬｓｏ及びＬａｓに対する耐性（又は許容性）を促進したことを示し得る。総合的に、これらの試験は、開示した微生物毛状根を用いた迅速な機能的応用を提供し得る。
【００７８】
本開示の利益を享受する当業者によって理解されるであろうように、選好性の植物病原体を培養するための他の等価の又は代替的な組成物、装置、方法、及びシステムは、本明細書に含有される説明から逸脱することなく想起されることができる。したがって、本開示を示され及び説明されているように実施する様式は、実例となるのみであるものとして解釈されることになっている。
【００７９】
当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、工程の性質、数、及び／又は配置の種々の変更を行い得る。開示された各方法及び方法工程は、いくつかの実施形態によると、その他の開示された方法又は方法工程とともに、及びいかなる順序においても実施され得る。動詞「し得る」が現れている場合、任意の及び／又は許容的な条件を伝えることが企図されているが、当該動詞の使用は、別段の記載がない限り、操作性のいかなる欠如も示唆するものとして企図されることはない。「を有する」又は「を含む」などのオープンタームが使用されている場合、本開示の利益を享受する当業者は、開示された特長又は工程が、さらなる特長又は工程と任意に組み合わされ得ることを認識するであろう。このような選択肢は、作用されない場合があり、実際、いくつかの実施形態において、開示されたシステム、組成物、装置、及び／又は方法は、本明細書に開示される特長又は工程を越えたその他の特長又は工程を排除し得る。列挙されていない要素、組成物、装置、システム、方法、及び方法工程は、所望のように又は必要なように、含まれ得又は排除され得る。当業者は、本開示の組成物、装置、及び／又はシステムを調製し及び使用する方法において種々の変更を行ってもよい。
【００８０】
また、範囲が提供された場合、本開示の終了点は、詳細な実施形態によって所望の又は要求されるような正確な値及び／又は概算値として処理され得る。終了点が概算値である場合、自由度の程度は、範囲の桁に比例して変化し得る。例えば、一方で、約５〜約５０の範囲の脈絡における約５０の範囲終了点は、５０．５を含み得るが、５２．５も５５も含み得ず、もう一方で、約０．５〜約５０の範囲の脈絡における約５０の範囲終了点は、５５を含み得るが、６０も７５も含み得ない。さらに、いくつかの実施形態において、範囲終了点を混合及び合致させることは望ましくあり得る。また、いくつかの実施形態において、開示された各形象（例えば、実施例、表、及び／又は図面のうちの1つ又は２つ以上における）は、範囲（例えば、示された値±約１０％、示された値±約５０％、示された値±約１００％）及び／又は範囲終了点の基礎を形成し得る。前者に関して、実施例、表、及び／又は図面において示される５０という値は、例えば、約４５〜約５５、約２５〜約１００、及び／又は約０〜約１００の範囲の基礎を形成し得る。
【００８１】
選好性微生物を培養するための装置及び／又はシステムの全部又は部分は、使い捨て可能、使用可能、相互交換可能、及び／又は置き換え可能であるよう構成及び配置され得る。明白な変更及び改変を伴うこれらの等価物及び代替物は、本開示の範囲内に含まれるよう企図される。したがって、上述の開示は、添付の特許請求によって説明されるような本開示の範囲を説明する目的であるよう企図されているが、これに限定されない。
【００８２】
発明の名称、要約、背景技術、及び見出しは、規制に準拠して及び／又は読者の簡便性のために提供されている。これらは、従来技術の範囲及び内容に関する許可を含まず、開示された実施形態すべてに対して適用可能な制限を含んでいない。
【００８３】
実施例
実施例１：外植片及び／又は接種源の作出
ＦＩＧＵＲＥ  ２Ａ〜ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｇは、毛状根方法及びシステムにおける外植片としての使用のための選好性微生物によってコロニー形成された植物を作出するための昆虫ベクターを保有する選好性微生物を使用する例を示す。具体的には、ＦＩＧＵＲＥ  ２Ａ及びＦＩＧＵＲＥ  ２Ｂは、Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  ＡｇｒｉＬｉｆｅ  Ｃｅｎｔｅｒ−Ｗｅｓｌａｃｏの昆虫ケージに維持された、Ｌｓｏ保有ジャガイモ及びＬｓｏ非含有ジャガイモのキジラミコロニー（Ｃｅｎｔｒａｌハプロタイプ）を示す。キジラミは、２００７年にテキサス州ダルハート市近郊の商用ジャガイモ畑から元来収集した。ＦＩＧＵＲＥ  ２Ａ及びＦＩＧＵＲＥ  ２Ｂに示すように、キジラミに卵黄を給餌し、制御された生育チャンバー中で２５℃で、１２：１２の明暗（Ｌ：Ｄ）時間の照明期間で、かつ約５０％の相対湿度で維持した。周期的に、キジラミコロニー（例えば、Ｌｓｏ保有、Ｌｓｏ非含有）を、１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲを用いて、Ｌｓｏコロニー形成の有無について試験した。
【００８４】
外植片材料を作製するために、１０匹のＬｓｏ保有成キジラミを、２〜３か月齢のジャガイモ植物及びトマト植物を含有するケージへと放出し、給餌させておいた。対照として、１０匹のＬｓｏ非含有キジラミを、２〜３か月齢のジャガイモ植物及びトマト植物を含有する別個のセットのケージへと放出し、給餌させておいた。３日間の期間後、キジラミを除去し、感染したジャガイモ植物及びトマト植物における葉の症状（黄化病及び壊死）をモニターした。ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｄ及び２Ｆにおいてそれぞれ示されるように、典型的な疾患症状は、Ｌｓｏ保有キジラミの給餌へ曝露されたトマト植物及びジャガイモ植物に給餌後２〜４週間以内に現れ始めた。対照的に、Ｌｓｏ非含有キジラミ給餌へ曝露されたトマト植物（ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｃ）及びジャガイモ植物（ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｅ）は、疾患症状を呈しなかった（それぞれ、ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｃ及びＦＩＧＵＲＥ  ２Ｅ）。
【００８５】
ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｇに示されるように、感染した植物（例えば、ＦＩＧＵＲＥ  ２Ｄにおけるトマト及びＦＩＧＵＲＥ  ２Ｆにおけるジャガイモ）におけるＬｓｏの存在は、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認された。Ｌｓｏ感染に対して陽性であると試験された植物材料を外植片源（インビトロでのアプローチ用）として、及び微生物毛状根誘導のためのコロニー形成された植物（植物内でのアプローチ用）として使用した。
【００８６】
実施例２：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの培養
Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの新鮮な培養物を約０．３の光学密度（ＯＤ）になるまで培養した。この培養物を遠心分離によってペレット化し、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞を滅菌済み１／２  ＭＳ培地又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース培地中で０．３のＯ．Ｄ．になるまで再懸濁した。
【００８７】
実施例３：微生物毛状根のインビトロでの誘導
子葉、胚軸、未熟苗条、及び未熟根の領域を含む、健常植物及びＬｓｏがコロニー形成した植物の一部を収穫した。当該植物部分を、７０％エタノール、２．５％又は１０％ＮａＣｌＯ、及び水を含有する溶液を用いて表面滅菌した。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ａに示されるように、表面滅菌済み植物の一部を、メスを用いて各々約２ｃｍの長さを有する断片へと切断した。さらに、断片の各々を滅菌した１本の細いピンセットを用いて緩徐に損傷させ、調製された外植片を作製した。
【００８８】
ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｂに示されるように、調製された外植片を実施例２に説明したように調製された懸濁液中への浸漬によって、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液と接触させた。浸漬した外植片を２０分間という時間撹拌した。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｃに示されるように、次に、外植片をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液から取り出し、１／２  ＭＳ培地又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース培地のプレート上へ置いた。この外植片を約２１〜２５℃で７２時間プレート上でインキュベートし、それにより、当該外植片及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを共培養させておいた。
【００８９】
共培養後、この外植片を浸透圧ストレスへ供し、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの濃度を低下させた。ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｄにおいて示されるように、この外植片を１／２  ＭＳ培地又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース培地のプレートから取り出し、ある容積の滅菌済み脱イオン水中に入れた。この滅菌済み脱イオン水中の外植片の懸濁液を約３０分間撹拌した。次に、ＦＩＧＵＲＥ  ３Ｅに示されるように、この外植片を取り出し、１／２  ＭＳ又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンの選択培地へと移した。
【００９０】
次に、この外植片を含有する選択培地のプレートを２５℃のインキュベータ中に置き、毛状根誘導をモニターした。使用した植物種、外植片源、及びＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株によって、毛状根は、２〜６週間以内に生じた。
【００９１】
ＦＩＧＵＲＥ  ４Ａは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換したトマト外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ５Ａは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いて形質転換したジャガイモ外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ６は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換した柑橘類（ユーレカレモン）外植片における毛状根のインビトロでの誘導を示す。
【００９２】
これらの構造は、公知の根誘導（Ｒｉ）ＤＮＡ遺伝子ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣのＰＣＲ増幅を用いて毛状根と確認された。
【００９３】
ＦＩＧＵＲＥ  ４Ｂは、ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣが、形質点した毛状根についてのマーカー遺伝子である、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いてインビトロで誘導されたトマト毛状根のＰＣＲ確認結果を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ４Ｂに示されるように、レーンＷＴは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓで形質転換されていなかった野生型トマトに由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅を示し（陰性対照）、レーン１は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＣａｓｔｌｅｍａｒｔ株によって形質転換された外植片の毛状根に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅を示し、レーン２は、カリフォルニア大学８２（ＵＣ８２）製のＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによって形質転換された外植片の毛状根に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅を示し、レーン３は、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＵＣ８２株によって形質転換された第二の外植片の毛状根に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅を示し、レーンＲｈは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す（陽性対照）。
【００９４】
ＦＩＧＵＲＥ  ５Ｂは、ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣが、形質転換された毛状根についてのマーカー遺伝子である、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５８３４株）を用いて形質転換した外植片に由来するジャガイモ（アトランチック）毛状根のＰＣＲ確認を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ５Ｂにおいて示される５つのレーンのうち、レーンＷＴは、野生型ジャガイモに由来するＤＮＡを表し（陰性対照）、レーン１は、ジャガイモ毛状根試料１を表し、レーン２は、ジャガイモ毛状根試料２を表し、レーン３は、ジャガイモ毛状根試料３を表し、レーンＲｈは、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ細胞を表す（陽性対照）。
【００９５】
ＦＩＧＵＲＥ  ６Ｂは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１５３８４株）を用いて形質転換した外植片に由来する柑橘類（ユーレカレモン）の毛状根のＰＣＲ確認を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ６Ｂに示されるｒｏｌＢ及びｒｏｌＣの各々についての２つのレーンのうち、ＨＲ（毛状根）と標識されたレーンは、毛状根に由来するＤＮＡを表し、レーンＷＴは、野生型柑橘類に由来するＤＮＡを表す（陰性対照）。
【００９６】
実施例４：空中の微生物毛状根の植物内導入及び導入遺伝子送達
健常植物（対照）及びＬｓｏ感染した植物を選択し、選択植物表面を７０％エタノール、２．５％又は１０％ＮａＣｌＯ（漂白剤）、及び水を含有する溶液を用いて表面滅菌した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液を、実施例２において説明した通り調製した。
【００９７】
空中の微生物毛状根の誘導は、Ｌｓｏによってコロニー形成された植物の表面滅菌済み領域の茎組織及び／又は葉組織を、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ溶液中に浸漬した針を用いて緩徐に損傷させることによって実施した。使用したＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株は、Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド及びＴ−ＤＮＡプラスミドを両方とも含有しており、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしていた。健常植物も実験対照としての使用のために、先に説明した方法を用いて空中の毛状根形成について誘導した。露出した損傷部位をアルミホイルに巻き、光への曝露を低下させ、露出領域における所望の湿潤レベルを維持するのを助けた。これらの植物を各植物種について適切な温度、光、及び湿度の条件を有する生育チャンバーの中で維持した。植物を微生物毛状根の形成についてモニターした。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ａは、健常トマト植物における空中の毛状根の形成を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｂは、Ｌｓｏによってコロニー形成されたトマト植物における空中の微生物毛状根の形成を示す。ＦＩＧＵＲＥ  ８Ａは、Ｌｓｏによってコロニー形成されたジャガイモ植物における空中の微生物毛状根の形成を示す。
【００９８】
この構造は、公知の根誘導（Ｒｉ）ＤＮＡ遺伝子ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣのＰＣＲ増幅を用いて微生物毛状根と確認された。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃにおいて示されるように、空中の微生物毛状根組織のＰＣＲ確認は、ＦＩＧＵＲＥ  ７Ａ及びＦＩＧＵＲＥ  ７Ｂにおいて示される微生物毛状根に由来するＤＮＡ試料を用いて実施した。プライマーは、Ｌｓｏの１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡと記された行において標識）、毛状根形質転換に由来するｒｏｌＢ及びｒｏｌＣのマーカー遺伝子、内在性トマト遺伝子ＲＰＬ（対照）、及びＴ−ＤＮＡプラスミドにおいてコードされたＧＦＰ遺伝子を増幅するよう設計した。健常植物ＤＮＡを表すＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃのレーンは、次のとおりである。ＷＴは、野生型トマト植物に由来するＤＮＡを表し（陰性対照）、ＣＬは、健常トマト葉に由来するＤＮＡを表し（陰性対照）、ＣＨＲは、健常毛状根に由来するＤＮＡを表す（１６ＳｒＤＮＡプライマーについての陰性対照）。ＤＮＡを、Ｌｓｏ感染したトマトの上部葉（ＴＬ）、Ｌｓｏ感染したトマトの中部葉（ＭＬ）、及びＬｓｏ感染したトマトに由来する空中の微生物毛状根（ＨＲ）を含む、Ｌｓｏ感染した植物組織からも抽出した。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃにおいて示されるように、ＣＨＲ試料及びＨＲ試料は、ｒｏｌＢ遺伝子及びｒｏｌＣ遺伝子を複製し、したがって、これらが実際に毛状根であることを示した。ＨＲは、１６Ｓ  ｒＤＮＡセグメントを増幅したが、ＣＨＲは増幅せず、ＨＲがＬｓｏによりコロニー形成されていることを確立した。
【００９９】
Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド（ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣをコード）及びＴ−ＤＮＡプラスミド（ＧＦＰをコード）の両方の同時形質転換を確認するために、別個のＰＣＲゲルを電気泳動した。このゲルについて、Ｔ−ＤＮＡベクターを含むプラスミドＤＮＡ（Ｖと標識）を、ＧＦＰプライマーセットを用いて抽出し及び増幅した。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃにおいて示されるように、このことは、ＧＦＰの増幅についての陽性対照として機能した。ＦＩＧＵＲＥ  ７Ｃは、ＣＨＲ試料及びＨＲ試料において、ＧＦＰ遺伝子が増幅されたことを示しており、Ｒｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡが空中の毛状根の発生中に同時形質転換されたことを確立している。
【０１００】
ＦＩＧＵＲＥ  ８Ｂは、ＦＩＧＵＲＥ  ８Ａにおいて示されるＬｓｏ感染したジャガイモから採取した２１日齢のＬｓｏ感染した空中の微生物毛状根の試料における１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。ＲＰＬ遺伝子の増幅は、陽性対照として機能した。ＦＩＧＵＲＥ  ８Ｃは、健常（「Ｈ」）ジャガイモ植物及びＬｓｏ感染した（「Ｌ」）ジャガイモ植物に由来する毛状根組織におけるｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、及びＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅を示し、したがって、Ｒｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡが空中の毛状根の発生中に同時形質転換されたことを確立している。
【０１０１】
実施例５：ロックウール法を用いた微生物毛状根の植物内誘導及び導入遺伝子送達
健常トマト植物（対照）及びＬｓｏ感染したトマト植物を選択し、選択植物表面を７０％エタノール、２．５％又は１０％ＮａＣｌＯ（漂白剤）、及び水を含有する溶液を用いて表面滅菌した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液を実施例２において説明した通り調製した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド（ｒｏｌＢ遺伝子及びｒｏｌＣ遺伝子を含んでいる）及びＧＦＰをコードするＴ−ＤＮＡプラスミドを両方とも含有していた。
【０１０２】
選択されたトマト植物の苗条部分を、メスを用いて取り出し、この苗条の損傷した部分をロックウールマトリックス中に挿入した。ある容積のＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁液を用いてロックウールマトリックスを飽和させ、このマトリックスを培養容器中に置き、高湿レベルを維持した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを健常トマト植物及びＬｓｏ感染したトマト植物の損傷した部位とともに７２時間共培養させておいた。７２時間後、ロックウールマトリックスを取り出し、ロックウールを乾燥させておき、それによりＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのほとんどを殺滅した。ロックウールマトリックスを雰囲気環境へおよそ２４時間曝露した後、再水和させた。この処理された苗条及びロックウールマトリックスを、栄養溶液（１／２  ＭＳ又は１／２  Ｂ５）を有する新たなプラスチック製のマジェンタ色の箱型培養容器へと移し、日周性の生育チャンバー中に置き、微生物毛状根の発生についてモニターした。
【０１０３】
ＦＩＧＵＲＥ  ９Ａは、Ｌｓｏ感染したトマト植物における微生物毛状根の発生を示す。
【０１０４】
ＰＣＲ確認を実施して、微生物毛状根コンストラクト、Ｌｓｏによる微生物根コロニー形成、ならびにＲｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡの両プラスミドを用いた同時形質転換を確認した。ＦＩＧＵＲＥ  ９Ｂは、健常（「Ｈ」）ジャガイモ植物及びＬｓｏ感染した（「Ｌ」）ジャガイモ植物に由来する毛状根組織におけるｒｏｌＢ遺伝子、ｒｏｌＣ遺伝子、及びＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅を示し、したがって、Ｒｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡが、Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓとの共培養の間に同時形質転換されたことを確立している。予期した通り、１６ＳｒＤＮＡは、Ｌｓｏ感染した微生物毛状根においてのみ増幅された。
【０１０５】
実施例６：蛭石法を用いた微生物毛状根の植物内誘導及び導入遺伝子送達
健常植物（対照）及びＬｓｏ感染した植物を選択し、選択植物表面を７０％エタノール、２．５％又は１０％ＮａＣｌＯ（漂白剤）、及び水を含有する溶液を用いて表面滅菌した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの懸濁液を実施例２において説明した通り調製した。Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、Ｒｉ−ＤＮＡプラスミド（ｒｏｌＢ遺伝子及びｒｏｌＣ遺伝子を含んでいる）及びＧＦＰをコードするＴ−ＤＮＡプラスミドを両方とも含有していた。
【０１０６】
選択された植物の苗条部分を、メスを用いて取り出し、当該苗条の損傷した部分をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁液中に浸漬した。約３０ｉｎＨｇの真空環境を発生させ、３０分間保持した。真空放出後、苗条をＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁系から取り出し、蛭石マトリックスの中に置いた。この苗条を２５℃で明期１４時間後の暗期１０時間の明暗周期の生育チャンバー中の被覆したトレイ中に置いた。この苗条を微生物毛状根の発生についてモニターした。
【０１０７】
ＦＩＧＵＲＥ  １０Ａは、蛭石法を用いて誘導されたトマト植物からの微生物毛状根の生育を示した。ＰＣＲ確認を実施して、微生物毛状根コンストラクト、Ｌｓｏによる微生物根コロニー形成、ならびにＲｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡの両プラスミドを用いた同時形質転換を確認した。ＦＩＧＵＲＥ  １０Ｂは、健常（「Ｈ」）トマト植物及びＬｓｏ感染した（「Ｌ」）トマト植物に由来する毛状根組織におけるｒｏｌＢ遺伝子、ｒｏｌＣ遺伝子、及びＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅を示し、したがって、Ｒｉ−ＤＮＡ及びＴ−ＤＮＡをＲ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓとの共培養中に同時形質転換したことを確立している。予期した通り、１６Ｓ  ｒＤＮＡは、Ｌｓｏ感染した微生物毛状根においてのみ増幅された。
【０１０８】
ＦＩＧＵＲＥ  １１は、蛭石法を用いた柑橘類（サワーオレンジ）の苗条からの微生物毛状根の発生を示す。
【０１０９】
実施例７：毛状根の増殖−蛭石法
収集した毛状根は、クローン増殖され得る。収集した毛状根のクローン増殖は、収集した毛状根内に含有される選好性微生物源（例えば、微生物毛状根接種源）の増加を提供し得る。
【０１１０】
実施例４において先に説明した通り、健常トマト植物及びＬｓｏ感染したトマト植物の両方から発生した毛状根を増殖のために選択した。トマト植物を空中の毛状根が発生した部位のすぐ下で切断し、当該植物の下部茎及び根部分を廃棄した。空中の毛状根へ付着した苗条部分を維持した（すなわち、付着済み毛状根）。
【０１１１】
空中の毛状根を７０％エタノール溶液、２．５％又は１０％漂白剤溶液中に浸漬した後、脱イオン水ですすぐことによって、当該根を表面滅菌した。次に、付着済み毛状根を蛭石マトリックス中へと移植した。移植した付着済み毛状根を２５℃で１４時間明期後の１０時間暗期の明暗周期を有する生育チャンバー中に置いた。この苗条を毛状根の増殖についてモニターした。ＦＩＧＵＲＥ  １２は、蛭石含有ポットの底部から生育する増殖した毛状根を示す。
【０１１２】
実施例８：微生物毛状根の増殖−水耕法
実施例４において先に説明したように、健常トマト植物及びＬｓｏ感染したトマト植物の両方から発生した毛状根を増殖のために選択した。トマト植物の空中の毛状根が少なくとも３ｃｍの長さに到達したとき、当該毛状根を収集した。収集した空中の毛状根を、７０％エタノール溶液、２．５％又は１０％漂白剤溶液中に浸漬した後、脱イオン水ですすぐことによって表面滅菌した。次に、収集した毛状根を、１／２  ＭＳ又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、及び２．５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢを含有するビーカーの中に置いた。水耕栽培物を２５℃で、５０ｒｐｍ又は１００ｒｐｍで緩徐に撹拌しながら維持した。ＦＩＧＵＲＥ  １３は、水耕栽培において生育している増殖した毛状根を示す。
【０１１３】
実施例９：微生物毛状根の増殖−インビトロ法
実施例４において先に説明した通り、健常トマト植物及びＬｓｏ感染したトマト植物の両方から発生した毛状根を増殖のために選択した。当該トマト植物の空中の毛状根が少なくとも３ｃｍの長さに到達したとき、当該毛状根を収集した。収集した空中の毛状根を、７０％エタノール溶液、２．５％又は１０％漂白剤溶液中に浸漬した後、脱イオン水ですすぐことによって表面滅菌した。次に、収集した毛状根を、１／２  ＭＳ又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、及び２．５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢを含有するプレート上に置いた。このインビトロ培養物を２５℃で維持した。ＦＩＧＵＲＥ  １４は、水耕栽培において生育している増殖した毛状根を示す。栄養培地は、毎週、新鮮培地と交換した。
【０１１４】
実施例１０：微生物毛状根の増殖−バイオリアクタ法
健常トマト植物及びＬｓｏ感染したトマト植物の両方から発生した毛状根を、実施例９において先に説明した通り、バイオリアクタ法を用いた増殖のために選択した。この毛状根をインビトロ培養物又は植物内法から収集し、収集した根を７０％エタノール溶液、２．５％又は１０％漂白剤溶液中に浸漬した後、脱イオン水ですすぐことによって表面滅菌し、１／２  ＭＳ又は１／２  Ｂ５＋３％スクロース＋２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム又は１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、及び２．５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢを含有するＳＥＴＩＳシステムの中に置いた。このバイオリアクタ培養物を２５℃で維持した。ＦＩＧＵＲＥ  １５は、バイオリアクタシステムにおいて生育している増殖した毛状根を示す。栄養培地は、３〜４週間ごとに新鮮培地と交換した。
【０１１５】
実施例１１：高処理量抗菌アッセイ
微生物毛状根を用いて、Ｌｓｏがペニシリンなどの抗菌薬によって抑止されるかどうかを分析した。ＦＩＧＵＲＥ  １６Ａにおいて示されるように、健常毛状根及びＬｓｏによりコロニー形成された微生物毛状根をインビトロ増殖物又は植物内増殖物のいずれかから収集した。毛状根を、構造上の完全性を損なうことなく、等量に分離し及び秤量した（例えば、５０ｍｇ／ウェルあたり又は１００ｍｇ／ウェルあたり）。健常毛状根及びＬｓｏによりコロニー形成された微生物毛状根をＦＩＧＵＲＥ  １６Ｂにおいて示されるように、複数ウェルプレート中へ３つ又は４つ以上の生物学的複製物へと同様に分配した。２ミリリットルの１／２  ＭＳ培地又は１／２  Ｂ５培地を複数ウェルプレートの対照ウェルの各々の中へと置き、毛状根を浸漬し、これは陰性対照として機能した。２ミリリットルの１／２  ＭＳ培地又は１／２  Ｂ５＋１００ｍｇ／Ｌペニシリン培地を複数ウェルプレートの各実験ウェル中へと置き、毛状根を浸漬した。複数ウェルプレートを真空環境に置き、２５ｉｎＨｇの圧力を１５〜３０分間という期間、抜去した。毛状根を有する複数ウェルプレートをアルミホイルで被覆して、光への曝露及び抗生物質の起こり得る分解を防止した。次に、毛状根の個々の処理物を有する複数ウェルプレートを２５℃の温度で振盪器の緩徐な振盪（５０ｒｐｍ）で２日間及び７日間という期間インキュベートした。
【０１１６】
定量的リアルタイムＰＣＦを用いて、１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を増幅するプライマーを用いてＬｓｏ力価を評価した。ＦＩＧＵＲＥ  １６Ｃ及びＦＩＧＵＲＥ  １６Ｄにおいて示されるように、ペニシリンへ曝露したＬｓｏによりコロニー形成された微生物毛状根は、２日間及び７日間の曝露後にいずれもペニシリンへ曝露されていない、Ｌｓｏによりコロニー形成された微生物毛状根よりも有意に低いＬｓｏ力価を示した。
【図１】
2018534947.tif 000003
【図２Ａ】
2018534947.tif 000004
【図２Ｂ】
2018534947.tif 000005
【図２Ｃ】
2018534947.tif 000006
【図２Ｄ】
2018534947.tif 000007
【図２Ｅ】
2018534947.tif 000008
【図２Ｆ】
2018534947.tif 000009
【図２Ｇ】
2018534947.tif 000010
【図３Ａ】
2018534947.tif 000011
【図３Ｂ】
2018534947.tif 000012
【図３Ｃ】
2018534947.tif 000013
【図３Ｄ】
2018534947.tif 000014
【図３Ｅ】
2018534947.tif 000015
【図４Ａ】
2018534947.tif 000016
【図４Ｂ】
2018534947.tif 000017
【図５Ａ】
2018534947.tif 000018
【図５Ｂ】
2018534947.tif 000019
【図６Ａ】
2018534947.tif 000020
【図６Ｂ】
2018534947.tif 000021
【図７Ａ】
2018534947.tif 000022
【図７Ｂ】
2018534947.tif 000023
【図７Ｃ】
2018534947.tif 000024
【図８Ａ】
2018534947.tif 000025
【図８Ｂ】
2018534947.tif 000026
【図８Ｃ】
2018534947.tif 000027
【図９Ａ】
2018534947.tif 000028
【図９Ｂ】
2018534947.tif 000029
【図１０Ａ】
2018534947.tif 000030
【図１０Ｂ】
2018534947.tif 000031
【図１１】
2018534947.tif 000032
【図１２】
2018534947.tif 000033
【図１３】
2018534947.tif 000034
【図１４】
2018534947.tif 000035
【図１５】
2018534947.tif 000036
【図１６Ａ】
2018534947.tif 000037
【図１６Ｂ】
2018534947.tif 000038
【図１６Ｃ】
2018534947.tif 000039
【図１６Ｄ】
2018534947.tif 000040
【国際調査報告】
2018534947.tif 000041
2018534947.tif 000042
2018534947.tif 000043