(57)【要約】選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変するための組成物および方法を提供する。本方法および本組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用してヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行い、選択マーカーを使用せずに植物細胞を得、そして、植物体、植物細胞または種子のゲノム内の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。また、選択マーカーを使用せずに、ゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物細胞、カルス組織または植物体を作製するための組成物および方法を提供する。
2018531024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法であって、
少なくとも１つの植物細胞に、前記ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；
前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程であって、前記選択は選択マーカーの使用なしで生じる工程と
を含む方法。
【請求項２】
選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、
少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；
前記植物細胞から植物体を得る工程と；
前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程であって、前記選択は選択マーカーの使用なしで生じる工程と
を含む方法。
【請求項３】
選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物カルス組織を作製する方法であって、
少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；
前記植物細胞からカルス組織を得る工程と；
前記ヌクレオチド配列に改変を有するカルス組織を選択する工程であって、前記選択は選択マーカーの使用なしで生じる工程と
を含む方法。
【請求項４】
前記改変は、前記標的部位での、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、または少なくとも１つのヌクレオチドの置換からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチド改変鋳型を前記植物細胞へ導入する工程であって、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド改変鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞にドナーＤＮＡを導入する工程であって、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位に挿入すべき少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記導入は、前記細胞への選択マーカーの導入を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記導入は、破壊された選択マーカー遺伝子の、機能的選択マーカータンパク質をコードする非破壊選択マーカー遺伝子への修復を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入は、前記細胞内に選択マーカーを生成しない請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択は、選択マーカーの同定または使用を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択は、前記植物体のＤＮＡのシークエンシングによって生じる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、リボヌクレオチド−タンパク質として導入される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成可能な、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質として導入される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、前記ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとして、およびガイドＲＮＡを含むＲＮＡとして導入される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子として導入される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、細胞の内部で構築される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記リボヌクレオチド−タンパク質は、粒子送達マトリックスに被覆されるか、または粒子送達マトリックスと組み合わされて、リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を形成し、前記リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体が前記細胞に導入される請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物細胞は、体細胞胚細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物細胞は、プロトプラストではない請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物細胞は、単子葉植物細胞および双子葉植物細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物細胞は、トウモロコシ、イネ、ソルガム、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、スイッチグラス、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、トマト、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、およびベニバナ細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物細胞から植物体を再生することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって作製された植物体。
【請求項２５】
請求項２４に記載の植物体の子孫植物であって、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド改変鋳型およびドナーＤＮＡからなる群から選択される構成要素のいくつかを持たない子孫植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４３７１９号、２０１６年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３０９０３３号、および２０１６年７月７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５９２５４号の利益を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は分子生物学に関し、特に細胞のゲノムを変更する方法に関する。
電子的手段によって提出された配列表の参照
【０００３】
配列表の正式な写しは、２０１６年１０月１１日作成の２０１６１０１１＿７１５８ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｓ．ｔｘｔのファイル名を備え、１８５キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
組み換えＤＮＡ技術により、標的のゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入し、かつ／または特定の内因性染色体配列を改変（編集）することが可能になり、それにより、生命体の表現型を変えることが可能になった。部位特異的組み換えシステムを使用する部位特異的組み込み技術は、他の組み換え技術と同様、様々な生命体における目的遺伝子の標的挿入の生成に使用されてきた。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技術は、標的ゲノムパータベーションの生成に利用可能であるが、これらのシステムは、特異性が低く、各標的部位用に再設計することが必要であり、そのために作製に多額の費用と時間を要する設計ヌクレアーゼを使用する傾向がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生命体のゲノムの改変に特異的な部位を標的とするいくつかの方法が開発されてきているが、安価で、構築しやすく、拡張性があり、かつ、生命体のゲノム内の多くの位置をターゲティングするのに適した新しいゲノム工学技術が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変するための組成物および方法を提供する。本方法および本組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用してヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行い、選択マーカーを使用せずに植物細胞を得、そして、植物体、植物細胞または種子のゲノム内の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。また、選択マーカーを使用せずに、ゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物細胞、カルス組織または植物体を作製するための組成物および方法を提供する。
【０００７】
本開示の一実施形態においては、本方法は、選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、前記ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と、前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法を含む。
【０００８】
本開示の一実施形態においては、本方法は、選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法を含む。
【０００９】
本開示の一実施形態においては、本方法は、選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法を含む。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であり得る。
【００１０】
本開示の方法は、ポリヌクレオチド鋳型を導入する工程（ここで、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記細胞のゲノムに標的部位を含むヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含み、前記ポリヌクレオチド改変鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される）をさらに含むことができる。本方法はまた、ドナーＤＮＡを導入する工程（ここで、前記ドナーＤＮＡは少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む）をさらに含むことができる。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の細胞への導入は、限定はされないが、粒子媒介送達、ウィスカー媒介送達、膜透過性ペプチド媒介送達、エレクトロポレーション、ＰＥＰ媒介トランスフェクションおよびナノ粒子媒介送達からなる群から選択される送達システムなどの当該技術分野で知られた方法により行うことができる。
【００１１】
本開示の方法は、表現型マーカーまたは選択マーカーを使用せず、かつ選択剤を適用せずに用いることができる。本方法は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を植物細胞へ、選択マーカーを前記植物細胞へ導入することなく、導入する工程、または、その場合に、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の導入が、破壊された選択マーカー遺伝子の、機能的選択マーカータンパク質をコードする非破壊選択マーカー遺伝子への修復を伴わない工程、もしくは前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の導入が、前記細胞内に選択マーカーを生成しない工程を含む。本開示の方法は、さらに、そのゲノム中に改変ヌクレオチド配列を含む植物細胞、カルス組織または植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）を含み得る。
【００１２】
本明細書に記載の方法によって作製された核酸コンストラクト、細胞、植物体、子孫植物体、微生物、外植体、種子および穀類もまた提供する。本開示の方法および組成物のさらなる実施形態を本明細書中に示す。
【００１３】
図面の簡単な説明および配列表
下記の詳細な説明、および本出願の一部を形成する添付図面および配列表から、本開示をより完全に理解することができる。配列の記載および本明細書に添付した配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５に規定されている特許出願におけるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の開示に適用される規則に適合している。配列の記載は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（これは参照により本明細書に組み込まれる）で定義されるアミノ酸の３文字コードを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本明細書に記載のトウモロコシ最適化ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより導入された最も頻度の多いＮＨＥＪ変異の上位１０の配列のアライメントとその数を示す。変異はディープシークエンシングによって同定した。参照配列（配列番号４８）は、改変されていない遺伝子座を示し、各標的部位はボールド体で示してある。また、ＰＡＭ配列（灰色）および切断予測部位（矢印）を示す。不完全なＮＨＥＪの結果として生じた欠失または挿入をそれぞれ、「−」または「斜字体表記で下線を付したヌクレオチドで示す。標的部位の参照および１〜１０位の変異はそれぞれ、配列番号４９〜５８に対応する。トウモロコシでは、標的部位の大半で、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムで最も高頻度に生じる変異は、単一ヌクレオチド挿入（≧６０％）（１６，８６１として示された数）。
【図２】図２は、ＡＬＳ２遺伝子の部分ヌクレオチド配列（（配列番号５９、６１、６３）および部分アミノ酸配列（配列番号６０、６２、６４）、ならびに、２つの編集修復鋳型（Ｏｌｉｇｏ１およびＯｌｉｇｏ２）を示す。改変ヌクレオチドには下線を引き、遺伝子編集（ＰｒｏからＳｅｒへ）の標的のコドン配列は四角で囲んである。
【図３】図３は、クロルスルフロン耐性を付与するＡＬＳ２アレルを有するトウモロコシ植物体（左）および野生型植物体（右）を示す。４週齢の植物体にクロルスルフロン（１００ｍｇ／Ｌ）を噴霧した。処理３週後の植物体を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、改変およびＡＬＳ２の選択マーカーとしての使用のために選択されたＡＬＳ２遺伝子の断片（配列番号６５、６７、６９）の概略図を示す。各ヌクレオチド配列の下にコードされるアミノ酸配列を示す。（配列番号６６、６８）。図４Ａ：クロルスルフロン耐性のために編集されたＡＬＳ２遺伝子の特定のノックアウト型を生成するために、１６５の位置の１つのヌクレオチド（Ｇ）（ボールド体で、かつ下線が付されている）を取り除くことができる。図４Ｂは、１つのヌクレオチドが欠失した（Ｇの削除）新しいヌクレオチド配列が、翻訳フレームシフトおよびＡＬＳ２遺伝子ノックアウトをもたらすことを示している。図４Ｃ：ＡＬＳ２遺伝子機能とクロルスルフロン耐性は、ＮＨＥＪ経路によるＤＳＢ修復の過程で１つのヌクレオチド（Ｎ、ボールド体で、かつ下線が付されている）を挿入することによって回復する。
【図５】不活化ＡＬＳ２Ｐ１６５Ｓの選択マーカーとしての再活性化。図５Ａ（配列番号７０）。ＰＡＭの５’側の３つのヌクレオチドのところに位置する上流アウトフレーム翻訳開始コドンを含むＡＬＳ２Ｐ１６５Ｓの設計。最初のＡＵＧ（配列下の矢印で示す）における翻訳の開始は、ＡＬＳ２の翻訳開始コドン（灰色文字）の開始を妨害する４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。図５Ｂ（配列番号７１）。上流ＡＵＧの欠損をもたらす単一のヌクレオチドの挿入（Ｃ、ＡもしくはＴ）または欠失（あるいは、任意の組み合わせ）は、ＡＬＳ２の開始コドンでの翻訳の開始を許容し、完全長のＡＬＳ２Ｐ１６５Ｓ除草剤耐性遺伝子の翻訳を復元する。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、改変のために選択された内因性標的部位を含む目的ポリヌクレオチド断片（配列番号７２）の概略図を示す。各ヌクレオチド配列の下に、コードされるアミノ酸配列を示す。（配列番号７３、７５、７７）。図６Ａは、エンドヌクレアーゼ切断部位（矢印で示す）に隣接する単一ヌクレオチド（この例ではＣ、ボールド体および下線で示す）がＮＨＥＪによって除かれ得ることを示している。図６Ｂは、１つの塩基を欠失させた生成目的ポリヌクレオチド（配列番号７４）では、新しい切断部位（矢印で示す）が作られ、翻訳フレームシフトが起きることを示している。図４Ｃ：エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する単一ヌクレオチド（この例ではＴ、ボールド体および下線で示す）を、ポリヌクレオチド改変（修復）鋳型を使用せずに、ＮＨＥＪによって挿入することができ、目的ポリヌクレオチドの１つのヌクレオチドの編集を行うことできる（配列番号７６）。ＰＡＭ配列を灰色で強調表示する。
【図７】上：ＵＢＩ：Ｃａｓ９のトウモロコシゲノムへの安定した組み込みを行うためのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター。下：ＭＤＨ：Ｃａｓ９のトウモロコシゲノムへの安定した組み込みを行うためのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター。ＭＤＨは、Ｃａｓ９の発現を調節する温度調節プロモーターである。これらのベクターはまた、視認マーカー遺伝子（ＥＮＤ２：ＡｍＣＹＡＮ）を含み、それは、安定に形質転換されたカルスセクターを選択するために使用された。赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲＥＤ）の配列は、３４３ｂｐのスペーサーによって分離され、順方向に複製された３６９ｂｐの断片を含み、それは、２つのｇＲＮＡとＬＩＧ３：４メガヌクレアーゼによる認識とターゲッティングの配列を含んだ。Ｈ２Ｂは、ヒストンＨ２Ｂ遺伝子プロモーターを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【表１−１】
2018531024.tif 000003
【００１６】
【表１−２】
2018531024.tif 000004
【００１７】
選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変するための組成物および方法を提供する。本方法および本組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用して、改変すべきヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行い、選択マーカーを使用せずに植物細胞を得る。また、ゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物細胞、カルス組織または植物体を選択マーカーを使用せずに作製するための組成物および方法を提供する。
【００１８】
本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの植物細胞に、前記ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と、前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とをさらに含むことができる。本方法はさらに、その植物細胞からカルス組織または植物体を得る工程と、前記ヌクレオチド配列中に改変を有するカルス組織または植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とをさらに含むことができる。
【００１９】
当業者は、従来のゲノム改変方法および植物形質転換方法が主に、選択マーカー遺伝子を改変すべき細胞に導入することによって、例えば、抗生物質または除草剤（選択剤）を、選択マーカー遺伝子を含まない細胞または組織を阻害または死滅させるために使用し、選択マーカー遺伝子を含む細胞または組織を、選択マーカー（耐性）遺伝子を発現させることにより増殖させる選択スキームを可能にすることに依存したものであったことを理解することができる。対照的に、本開示の方法は、選択マーカーを使用せず、かつ選択剤を適用せずに用いることができる。
【００２０】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ―スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても知られる）はＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く、かつ高度に保存されたＤＮＡリピート（通常２４〜４０ｂｐ、１〜１４０回の繰り返し―ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）間は一定の長さの可変配列（通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座により２０〜５８ｂｐ）がスペーサーとして存在している（国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット、２００７年３月１日公開）。細菌および古細菌は、外来核酸の分解に短鎖ＲＮＡを使用する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を発展させた（国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット、２００７年３月１日公開）。マルチサブユニットエフェクター複合体を用いるクラス１システムと、単一タンパク質エフェクター（例えば、限定はされないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）を用いるクラス２システムを含む、多重ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが報告されている。（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  １６３，１−１３；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿Ｃｅｌｌ  ６０、１−１３；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３：１−１５、２０１３年１１月２３日に公開され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号パンフレット）。
【００２１】
細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的に誘導するために、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を使用する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の１本鎖に相補的なスペーサー領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）と塩基対合し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを反復領域に導き、ＤＮＡ配列を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成する領域とを含む。スペーサーは、Ｃａｓ１およびＣａｓ２タンパク質を伴う十分解明されていないプロセスによって得られる。全てのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子に加えてｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を有する（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３：１−１５）。Ｃａｓ遺伝子は、一般に、フランキングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合するか、関連するか、近接するか、近くに存在する遺伝子を含む。
【００２２】
用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書中で互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に示されている。そこに記載されているように、以前から知られている４つの遺伝子ファミリーに加えて、４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが記載されている。これは、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なる繰り返しパターン、異なる遺伝子群および異なる種の範囲を持つ異なるクラスに属することを示している。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって異なり得る（Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３：１−１５；２０１３年１１月２３日に公開され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号パンフレット）。
【００２３】
本明細書中の用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、適切なポリヌクレオチド構成要素と複合体を形成すると、特定のＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、それに結合し、かつ場合によりニッキングまたは切断をすることができる。本明細書中に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するものが挙げられる（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３：１−１５）。Ｃａｓとしては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３−ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、またはこれらの複合体が挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム」、「誘導型Ｃａｓシステム」、「ＰＧＥＮ」は、本明細書中で互換的に使用され、ポリヌクレオチド−タンパク質複合体を形成することができる、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を指し、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書におけるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、４つの既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかのＣａｓタンパク質および好適なポリヌクレオチド構成要素を含んでよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＡＳタンパク質と複合化したポリヌクレオチド（例えば、限定はされないが、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡ）により標的配列を認識して、標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、場合により、少なくとも１本のＤＮＡ鎖を切断する。正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置するか、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接するなら、そのようなＣａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列の認識および切断は、通常、起こる。これ以外にも、Ｃａｓタンパク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００２５】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的配列の一方または双方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、通常、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインまたはその変異体）を含む。したがって、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓエンドヌクレアーゼの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。ＤＮＡ標的配列の一方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書において、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。Ｃａｓニッカーゼは、通常、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一方の鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば、野生型ＨＮＨドメイン）を含み得る。他の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。本明細書での使用に好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的例は、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１）、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２７５−９２８２）、および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００２６】
ＤＮＡターゲティングの特異性を高めるのに、一対のＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。一般に、これは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを導入することによってなされ得、これらが、異なるガイド配列を有するＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲティング領域における反対側の鎖の近接するＤＮＡ配列を標的とし、そこにニックを入れる。そのような各ＤＮＡ鎖の近くの切断は、二本鎖切断（すなわち、単鎖オーバーハングを有するＤＳＢ）を引き起こし、これは、その後、非相同性末端結合ＮＨＥＪ（変異につながる不完全な修復になりやすい）、または相同組み換えＨＲの基質として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００（または５〜１００の任意の整数）塩基、離れていてよい。本明細書においては、１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、変異したＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）が使用されるであろう（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれることになる。
【００２７】
Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部であってよい。そのような融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、そして、任意選択により、任意の２つのドメイン間、例えばＣａｓと第１の異種ドメインとの間にリンカー配列を含み得る。本明細書において、Ｃａｓタンパク質に融合し得るタンパク質ドメインの例としては、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つ以上を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性。
【００２８】
Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。
【００２９】
本明細書中のＣａｓタンパク質は以下の属のいずれか由来であり得る：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーキオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）ミロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）またはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。あるいは、本明細書中のＣａｓタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号４６２〜４６５、４６７〜４７２、４７４〜４７７、４７９〜４８７、４８９〜４９２、４９４〜４９７、４９９〜５０３、５０５〜５０８、５１０〜５１６、または５１７〜５２１のいずれでコードされてもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列ではいかなる鎖も切断しない。そのような複合体は、全ヌクレアーゼドメインが、変異した、機能不全のＣａｓタンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列でいかなる鎖も切断しない本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いることができ、例えば、その場合、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（または、その一部）（例えば、リプレッサーまたは活性化因子、例えば本明細書中に開示されるもののいずれか）と融合し得る。
【００３１】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、限定はされないが、２００７年３月１日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレットの配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５および５１８に記載のＣａｓ９遺伝子であり得る。他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシまたはダイズ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子である。本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物体または微生物のコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子であり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、任意選択により、Ｃａｓコドン領域のＳＶ４０核標的シグナル上流、およびＣａｓコドン領域の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７４４２−６）下流に作動可能に結合することができる。
【００３２】
「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドと、または単一のガイドポリヌクレオチドと複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列で一本鎖ＤＮＡを切断することができる（両ドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置し、サブドメインＩＩおよびＩＩＩは、タンパク質の中央に位置し、ＨＮＨドメインにフランキングしている（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムとしては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを少なくとも１つのポリヌクレオチド構成要素と複合させて使用するＤＮＡ切断システムが挙げられる。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。他の例では、Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡと複合させることができる。
【００３３】
本明細書中に記載のＣａｓ９タンパク質、および本明細書中の他のいくつかのＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えば、リステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属種（例えば、スピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えば、ポルフィロモナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属種（例えば、プレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えば、フィネゴルディア・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科種（例えば、Ｃ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えば、オルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えば、パスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、オリビバクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えば、エピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えば、メソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えば、アクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、クリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えば、バクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバクテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来のものであってよい。他の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる））に開示されるＣａｓ９タンパク質のいずれかであり得る。
【００３４】
したがって、本明細書中のＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらの文献は参照により組み込まれる）に開示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかを含み得る。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によってはエンドヌクレアーゼ活性を有さなければならない。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００３５】
あるいは、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている、配列番号４６２（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４７４（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４８９（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９４（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９９（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、５０５（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、または５１８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））のいずれによってコードされてもよい。００３６あるいは、さらに、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質変異体は、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有さなければならない。
【００３６】
本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、異種の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の酵母細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んでよく、また、タンパク質表面に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列のどこに位置してもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に作動可能に結合してもよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に結合してもよい。本明細書中の適切なＮＬＳ配列の非限定的な例としては、米国特許第６６６０８３０号明細書および同第７３０９５７６号明細書（例えば、その中の表１）に開示されるものが挙げられる（これらの文献はいずれも参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変された形態を含み得る。Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態としては、Ｃａｓ９タンパク質の自然発生のヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入または置換）を挙げることができる。例えば、いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質の改変形態が有するヌクレアーゼ活性は、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満である（２０１４年３月６日公開の米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。いくつかの例では、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態はヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、触媒的に「不活化されたＣａｓ９」または「失活したｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」と呼ばれる。触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体としては、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに変異を有するＣａｓ９変異体が挙げられる。これらの触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体は、ｓｇＲＮＡと相互作用し、インビボで標的部位に結合することができるが、標的ＤＮＡの鎖はいずれも切断することができない。
【００３８】
触媒的に不活性なＣａｓ９は、異種配列に融合することができる（２０１４年３月６日公開の米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的ＤＮＡ、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストンまたは他のＤＮＡ結合性タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増加させる活性を示すポリペプチドが挙げられる。さらなる好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホフファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。さらに他の好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的核酸の転写増加を直接引き起こすポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはその断片、転写活性化因子、小分子／薬剤反応性転写調節因子などを誘導するタンパク質またはその断片）が挙げられる。触媒的に不活性なＣａｓ９はまた、二本鎖切断を生成するＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することができる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ  ３２、ｎｕｍｂｅｒ６、Ｊｕｎｅ  ２０１４）。
【００３９】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認識し、結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖切断を入れる）能力が保持されているＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部分またはサブ配列を指す。
【００４０】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」および「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認識し、結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖切断を入れる）能力が保持されているＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体を指す。断片および変異体は、部位特異的変異誘発法および合成構築法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）により得ることができる。
【００４１】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子としては、原則として標的とされ得るＮ（１２−３０）ＮＧＧ形態のゲノム配列を認識することができる植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子、またはブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）Ｍｌｃ３、ラクトバチルス・ロシアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ）ＤＳＭ１５８１４、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＳＬ４、ラクトバチルス・ノデンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｄｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ１４９３２、スルフロスピリラム（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属種ＳＣＡＤＣ、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ２０２１０、ロクタネラ・ベストフォルデンシス（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ）、スフィンゴモナス・サンキサニゲネンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓａｎｘａｎｉｇｅｎｅｎｓ）ＮＸ０２、エピリソニモナス・テナックス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ  ｔｅｎａｘ）ＤＳＭ１６８１１、スポロサイトファガ・ミクソコッコイデス（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｍｙｘｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）およびサイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ）ＡＴＣＣ７００７５５からなる群から選択される生物に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼが挙げられ、この場合、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、それに結合し、かつ場合によりニッキングまたは切断をすることができる他のＣａｓエンドヌクレアーゼシステムは、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２，３７７号明細書、および２０１５年５月１５日出願の同第６２／１６２，３５３号明細書（両文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４２】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的ゲノム編集（単一および多重の二本鎖切断およびニックにより）、および標的ゲノム調節（Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡにエピジェネティックエフェクタードメインを結合することにより）に使用することができる。Ｃａｓ９はまた、ＲＮＡ誘導型リコンビナーゼとして機能するように設計することができ、また、ＲＮＡ結合により、多タンパク質および核酸複合体のアセンブリ用足場として機能し得る（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．１０：９５７−９６３）。
【００４３】
本明細書で使用される用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、かつ場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連する。ガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列（ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡと呼ばれる）、ＤＮＡ配列、またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。任意選択により、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾、例えば、限定はされないが、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結を含み得る。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドはまた、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書、（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４４】
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。ｃｒヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）、およびＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）を含む。ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒヌクレオチドに相補性領域に沿ってハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、すなわちＣＥＲドメインを共に形成することができる。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用することができる。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在することができる、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、限定はされないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチド長の範囲をとることができる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチドは、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。一実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）は、５’から３’の方向に（ｉ）ＣＲＩＳＰＲＩＩ型ｃｒＲＮＡの反復領域とアニールする配列と、（ｉｉ）ステムループ含有部とを有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７）。二本鎖ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４５】
ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に結合したｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。単一ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）、およびＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。「ドメイン」は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。Ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。単一ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４６】
用語「可変標的ドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書中で互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズすることができる（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、可変標的ドメインは１２〜３０ヌクレオチドの連続するストレッチを含む。可変標的ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４７】
（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒヌクレオチドメイト配列に続いてｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４８】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド長であり得る。他の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
【００４９】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、限定はされないが、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内部位に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴がもたらされ得、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用またはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、および細胞透過性の増加からなる群から選択される。
【００５０】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、それぞれガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの一部分またはサブ配列を指す。
【００５１】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ（それぞれ）の「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」および「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、それぞれガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡそれぞれの変異体を指す。
【００５２】
用語「単一ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書中で互換的に使用され、２つのＲＮＡ分子の合成融合体、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）に融合した、（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結した）可変標的ドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を指す。単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み得、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。
【００５３】
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書中で互換的に使用され、複合体を形成することができる、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素、および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を指し、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書中のガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムなどの、既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  １６３，１−１３；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿Ｃｅｌｌ６０，１−１３；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３：１−１５；Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）のいずれかのＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を含み得る。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも１つのＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含み得る（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
【００５４】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、一過性導入法、トランスフェクション、マイクロインジェクションおよび／もしくは局所アプリケーションにより、または組み換えコンストラクトにより間接的に細胞に導入（細胞に供給）することができる。植物細胞は、植物細胞へのＣａｓ９エンドヌクレアーゼの直接送達のバリアとして作用し得る植物細胞壁を有している点でヒトおよび動物の細胞と異なっている。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする組み換えＤＮＡコンストラクトの植物細胞への導入が成功し（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１５、Ｖｏｌ．１６９、ｐｐ．９３１−９４５）標的部位におけるゲノムの編集が可能になった。植物細胞へ組み換えＤＮＡコンストラクトを安定して導入することであり得る１つの欠点は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが継続して存在することにより、オフターゲット効果が増大することである。
【００５５】
本明細書に記載するように、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの植物細胞への直接送達は、粒子媒介送達法によって行うことができる。本明細書に記載の実験に基づき、熟練した技術者は今や、他の直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、ウィスカー媒介送達、エレクトロポレーション、粒子撃ち込み、細胞貫通ペプチドまたはメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達の使用によって、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ  の植物細胞への直接送達を成功させることができると想定することができる。
【００５６】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの直接送達（ＣａｓエンドヌクレアーゼのＤＮＡフリー送達とも称する）は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いて、Ｃａｓタンパク質、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および／またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＧＥＮ）自体（リボヌクレオチド−タンパク質複合体として）を細胞に導入することによって行うことができる。ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡによる、またはポリペプチド分子によるＣａｓエンドヌクレアーゼの直接送達は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質の産生にＤＮＡ分子が関与しないため、本明細書中では、ＣａｓエンドヌクレアーゼのＤＮＡフリー送達とも称する。同様に、ＲＮＡ分子としてのガイドＲＮＡの直接送達は、本明細書中では、ガイドＲＮＡのＤＮＡフリー送達とも称する。同様に、リボヌクレオチド−タンパク質複合体としてのガイドＲＮＡ／エンドヌクレアーゼ複合体自体（ＲＧＥＮ）の直接送達は、本明細書中では、ＲＧＥＮのＤＮＡフリー送達とも称する。
【００５７】
ｇＲＮＡとともに、タンパク質として、もしくはｍＲＮＡ分子として、またはＲＧＥＮリボヌクレオチド−タンパク質自体としてのＣａｓエンドヌクレアーゼの直接導入は、標的部位でのゲノム編集を可能にし、その後、ＲＧＥＮ複合体は急速に分解され、複合体は一時的に存在するだけである。このことにより、（実施例１２に示すように）、オフターゲット効果が低減される。
【００５８】
これらの構成要素の直接送達は、ＲＧＥＮ構成要素を受け取る細胞の富化および／または可視化を促進する他のｍＲＮＡの直接送達を伴い得る（共送達）。例えば、蛍光タンパク質（例えば、限定はされないが、赤色、緑色、黄色、青色またはこれらの組み合わせ）などのスクリーニング可能な可視マーカーをコードするｍＲＮＡの送達もまた、修復された非機能破壊遺伝子産物に代えて、または併用して使用することができる。
【００５９】
本明細書には、破壊された遺伝子のヌクレオチド配列を、修復後のヌクレオチド配列が機能遺伝子産物をコードするように修復することによって、非機能遺伝子産物の機能を回復させる方法が記載される。
【００６０】
破壊された遺伝子とは、その遺伝子産物がその機能を喪失する（非機能遺伝子産物と称する）か、または、破壊されていない対応する遺伝子（非破壊遺伝子とも称する）の産物と比較して機能が低下するように改変（破壊）された遺伝子を指す。例えば、機能ポリペプチドまたは機能タンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子の翻訳産物が、機能を失った、または機能が低下したポリペプチドを生成するように破壊（改変）され得る。
【００６１】
機能遺伝子産物としては、生物学的機能または非生物学的機能を有する機能タンパク質または機能ポリペプチドが挙げられる。
【００６２】
非機能遺伝子産物には、破壊された遺伝子の遺伝子産物が含まれる。非機能遺伝子産物には、その機能を失った（機能が存在しない）、または、対応する非破壊遺伝子の遺伝子産物と比較して機能が低下したポリペプチドが含まれる。
【００６３】
（例えば、ＲＧＥＮ構成要素またはＲＧＥＮ複合体自体の細胞への送達による）ＮＨＥＪによる遺伝子機能の修復と同期して、他のガイドポリヌクレオチドを同時に加えることにより、他の標的を改変することができる。そのような他の標的（ＮＨＥＪにより遺伝子機能を回復するための標的と異なる標的）は、トランスジェニック遺伝子座などのゲノム中の任意の標的であり得る。１つのｇＲＮＡがＮＨＥＪにより選択マーカーを標的とし、かつ活性化し（例えば、限定はされないが、除草剤耐性を付与するため、他のｇＲＮＡが選択マーカー（または、他の破壊遺伝子設計）とは異なる標的部位でＤＳＢを促進し、目標とした変異、欠失、遺伝子編集または部位特異的形質遺伝子挿入を促進することができる場合の２つ以上のｇＲＮＡを同時送達するアプローチは、他の必要な構成要素（Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ）は全てタンパク質および／またはインビトロ転写ＲＮＡ分子の形態で送達され得るので、完全に一過性の標的ゲノムの改変を可能にする。
【００６４】
破壊遺伝子には、その遺伝子産物がその機能を失う（例えば、破壊された除草剤選択マーカー遺伝子の場合、破壊遺伝子はもはや除草剤耐性を付与しない）ように改変（破壊）されたマーカー遺伝子（限定はされないが、表現型マーカー遺伝子および選択マーカー遺伝子など）が含まれる。
【００６５】
選択マーカーおよびスクリーニングマーカーは、本明細書中で互換的に使用され、それには、多くの場合、特定の条件下で、それを含む分子もしくは細胞を求めるために、または排除するために、特定または選択することを可能にするＤＮＡセグメント（選択マーカー遺伝子など）が含まれる。これらのマーカーは活性（限定はされないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生など）をコードする、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物もしくは組成物などの結合部位を提供することができる。選択マーカーとしては、さらに、改変またはノックアウトされると、その特性を含む細胞を求めるために（または、細胞を排除するために）特定または選択することを可能にする特性を細胞中に生成する遺伝子が挙げられる。
【００６６】
一態様では、選択マーカーは、例えば、選択剤（限定はされないが、抗生物質または除草剤など）を、選択マーカーを含まない細胞または組織を阻害または死滅させるために使用し、選択マーカーを含む細胞または組織を、選択マーカー遺伝子を発現させることにより継続して増殖させる選択スキームを適用することによって細胞の選択を可能にする。
【００６７】
一態様では、選択マーカーは、例えば、視認マーカー（蛍光分子など）を使用して、その視認マーカーを含む細胞を選択する選択スキームを適用することによって細胞の視覚選択を可能にする。
【００６８】
選択マーカー遺伝子としては、限定はされないが、クロロスルフロン耐性遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（ＰＭＩ）、ビアラホス耐性遺伝子（ＢＡＲ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、グリホサート耐性遺伝子、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；抗生物質などの本来毒性を有する化合物に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント、例えば、スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）；本来はレシピエント細胞を欠く産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）など、容易に同定可能な産物をコードするＤＮＡセグメント（視認マーカー遺伝子と称される）が挙げられる。視認マーカー遺伝子には、蛍光マーカー遺伝子（赤色蛍光マーカー遺伝子、青色蛍光マーカー遺伝子、緑色蛍光マーカー遺伝子、黄色蛍光マーカー遺伝子など）、ＤｓＲＥＤ、ＲＦＰ、赤色蛍光タンパク質、ＣＦＰ、ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ならびに、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳなどの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質、および細胞表面タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。選択マーカー遺伝子は、さらに、ＰＣＲ用の新しいプライマー部位の生成（例えば、予め並べられていない２つのＤＮＡ配列の並列）、制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ改変酵素の作用、化学的作用などを受けていない、または受けたＤＮＡ配列の組み込み、および同定を可能とする特異的修飾（例えば、メチル化）に必要なＤＮＡ配列の組み込みを含む。
【００６９】
選択マーカーのさらなる例としては、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）などの除草化合物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３：５０６−１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６３１４−８；Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：２４１９−２２；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−６６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−１２；Ｆｉｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４００−４；Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９−５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−３；Ｇｏｓｓｅｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−２１；Ｌａｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：３３４３−５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−６；Ｂａｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１９：４６４７−５３；Ｈｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃ  Ｂｉｏｌ  １０：１４３−６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３５：１５９１−５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１０４；Ｂｏｎｉｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５１；Ｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３６：９１３−９；Ｈｌａｖｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−４．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７）を参照されたい。ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。
【００７０】
表現型マーカー遺伝子としては、ポジティブマーカーであるかネガティブマーカーであるかにかかわらず、可視マーカーを含むスクリーニングマーカーまたは選択マーカーを含む遺伝子が挙げられる。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。
【００７１】
本明細書に記載のように、表現型および選択マーカー遺伝子は、非機能遺伝子産物をコードする破壊遺伝子として、植物細胞に導入され、ガイドＲＮＡ導入およびＤＮＡ修復により、機能遺伝子産物をコードする非破壊遺伝子に戻すため、二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼの標的として使用されるように改変することができる。
【００７２】
破壊される表現型マーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子は、細胞に予め導入され、細胞のゲノムに安定に組み込まれているマーカー遺伝子であってよい。そのような予め組み込まれた選択マーカー遺伝子はまた、他の遺伝子、例えば、細胞の成長を増強する遺伝子（ＺｍＯＤＰ２およびＺｍＷＵＳ、例えば、２０１６年８月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ１６／４９１４４号明細書および同２０１６年８月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ１６／４９１２８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）であってよい。
【００７３】
当業者は、従来のゲノム改変方法が主に、選択マーカー遺伝子を改変すべき細胞に導入することによって、例えば、抗生物質または除草剤（選択剤）を、選択マーカー遺伝子を含まない細胞または組織を阻害または死滅させるために使用し、選択マーカー遺伝子を含む細胞または組織を、選択マーカー（耐性）遺伝子を発現させることにより増殖させる選択スキームを可能にすることに依存したものであったことを理解することができる。対照的に、本開示の方法は、選択マーカーを使用せず、かつ選択剤を適用せずに用いることができる。
【００７４】
本開示の一実施形態においては、本方法は、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入し；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）方法を含む。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であり得る。
【００７５】
本開示の一実施形態においては、本方法は、選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法を含む。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であり得る。
【００７６】
本開示の一実施形態においては、本方法は、選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物カルス組織を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞からカルス組織を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有するカルス組織を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法を含む。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であり得る。
【００７７】
本明細書に記載の方法における選択工程は、当業者に知られた、選択マーカーに基づかない、任意の選択（識別、獲得）、例えば、ゲノム中に所望の改変を含む植物細胞、カルスまたは植物体を遺伝子型手段（限定はされないが、ＤＮＡシークエンシングなど）または表現型手段（植物体の形態学的特徴、もしくはゲノム中の所望の改変に関連する選択可能な表現型など）によって選択することを含むことができる。
【００７８】
一態様において、本方法は、選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、前記ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程（ここで、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は組み換えＤＮＡコンストラクトの使用なしで細胞に導入される）と；（ａ）の植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（ここで、その選択は前記植物体のＤＮＡのシークエンシングによって生じる）とを含む方法を含む。
【００７９】
本明細書に記載の方法は、さらに、ポリヌクレオチド鋳型を導入する工程（ここで、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記細胞のゲノムにヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含み、前記ポリヌクレオチド改変鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される）を含むことができる。本方法はまた、ドナーＤＮＡを導入する工程（ここで、前記ドナーＤＮＡは少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む）をさらに含むことができる。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の細胞への導入は、粒子媒介送達、ウィスカー媒介送達、膜透過性ペプチド媒介送達、エレクトロポレーション、ＰＥＰ媒介トランスフェクションおよびナノ粒子媒介送達からなる群から選択される送達システムにより行うことができる。
【００８０】
本開示の方法は、表現型マーカーまたは選択マーカーを使用せず、かつ選択剤を適用せずに用いることができる。本方法は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を植物細胞へ、選択マーカーもまた前記植物細胞へ導入することなく、導入する工程、または、その場合に、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の導入が、破壊された選択マーカー遺伝子の、機能的選択マーカータンパク質をコードする非破壊選択マーカー遺伝子への修復を伴わない工程、もしくは前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の導入が、前記細胞内に選択マーカーを生成しない工程を含む。本方法は、そのゲノム中に改変ヌクレオチド配列を含む植物細胞、カルス組織または植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）を含む。
【００８１】
本明細書に開示の方法では、任意の誘導型エンドヌクレアーゼを使用することができる。そのようなエンドヌクレアーゼとしては、限定はされないが、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが挙げられる。これまでに、特定のＰＡＭ配列を認識し、特定の位置で標的ＤＮＡを切断することができる多くのエンドヌクレアーゼが報告されている（例えば、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書および５月１５日出願の同第６２／１６２３５３号明細書、ならびにＺｅｔｓｃｈｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ  １６３，１０１３を参照されたい）。当然のことながら、誘導型Ｃａｓシステムを使用する本明細書に記載の方法および実施形態に基づき、任意の誘導型エンドヌクレアーゼシステムを使用することができるように、これらの方法を適合させることができる。例えば、本明細書に記載されている、選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法を、誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体に代えて、誘導型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体を導入することを含む方法に適合させることが想定される。本明細書に開示の方法で使用される、他の誘導型エンドヌクレアーゼおよびヌクレオチド−タンパク質複合体としては、国際公開第２０１３／０８８４４６号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【００８２】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素であり、特定部位のＤＮＡを、塩基を損傷せずに切断する制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、それらはさらにサブタイプを含む。Ｉ型システムおよびＩＩＩ型システムでは、単一複合体にメチル化酵素活性と制限活性の両方が含まれる。エンドヌクレアーゼとしては、また、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅ）としても知られるメガヌクレアーゼが挙げられ、それは、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合し切断するが、メガヌクレアーゼの認識部位は、一般に長く、約１８ｂｐ以上である（２０１２年３月２２日出願の特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）．メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づき４つのファミリーに分類されており、それらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈ−Ｎ−ＨファミリーおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびリン酸ジエステル結合の加水分解に参加する。ＨＥａｓｅは、その認識部位の長さとＤＮＡ基質のいくつかの配列多型を許容することで知られている。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、フリースタンディングのＯＲＦ、イントロンおよびインテインによってコードされる酵素に対し、それぞれ接頭語Ｆ−、Ｉ−またはＰＩ−によって特徴付けられる。組み換えプロセスの一工程は、認識部位またはその近傍におけるポリヌクレオチド切断を含む。この切断活性は、二本鎖切断を行うために使用することができる。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位については、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５２１−７；およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７のレビューを参照されたい。いくつかの例では、リコンビナーゼはインテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリー由来である。
【００８３】
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、植物体または他の生命体のゲノム中の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる部位特異的ヌクレアーゼの新しいクラスである。（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘発剤ドメインで構成される人工的な二本鎖切断誘発剤である。認識部位特異性は、ジンクフィンガードメインによって与えられ、そのドメインは、例えば、Ｃ２Ｈ２構造を有する、通常、２，３または４個のジンクフィンガーを含むが、他のジンクフィンガー構造も知られており、人工的に作られている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドの設計に適している。ＺＦＮとしては、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに連結した人工的なＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋＩなどのＩＩ型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインが挙げられる。転写活性化因子ドメイン、転写リプレッサードメインおよびメチル化酵素などのさらなる機能性を、ジンクフィンガー結合ドメインに融合することができる。いくつかの例では、切断活性にヌクレアーゼドメインの二量化が要求される。各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡ中の３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは９個の連続するヌクレオチドからなる配列を認識し、ヌクレアーゼの二量化要求によって、２組の３ジンクフィンガーが１８個のヌクレオチドからなる認識配列に結合するために使用される。
【００８４】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）技術（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）は学術研究、遺伝子治療、ならびに動物および植物の育種計画に幅広く用いることができる。これらの技術は、多くの植物、例えばトウモロコシ、コムギ、ダイズおよびイネなどの主要作物におけるゲノムの改変に使用され成功を収めている。植物ゲノムの編集は、現在の形質転換方法および遺伝子改変方法、ＤＮＡの送達効率、ならびに植物体の再生頻度の低さに制限されている。ヒトおよび動物のシステムと対照的に、全ての植物細胞は周りに厚い壁があり、それが植物の形質転換および植物遺伝子改変のプロトコルに根本的な影響を及ぼしている。この細胞壁が、哺乳動物のゲノム編集実験において核酸および／またはタンパク質の送達に広く使用されているトランスフェクションおよびエレクトロポレーションの使用を不可能なものにしている。この理由のため、植物の形質転換および植物の遺伝子改変は、主に、ＤＮＡベクターへのガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ試薬のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介とした送達および微粒子銃送達（衝撃送達）により行っている。その結果、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現カセットは多くの場合ゲノムに組み込まれ、遺伝子破壊、植物モザイク現象および潜在的オフサイト切断に繋がる可能性がある。これらの望ましくない二次変化は、野生型親植物への戻し交配を数回行うことにより取り除くことができるが、このプロセスは、特に複雑な倍数体ゲノムを有し、かつ育種サイクルが長い作物、例えば、限定はされないが、ダイズおよびコムギなどでは、時間の浪費となり得る。本明細書に記載のように、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをＲＧＥＮ複合体の形態で植物細胞へ送達することにより、これらの副作用の多くを軽減することができる（実施例１１〜１２）。植物体へのＲＧＥＮ複合体の送達により促進されるＮＨＥＪ媒介変異が予想を超えて多く発生することが、実施例１０に記載されている。このＲＧＥＮ複合体を用いた高頻度の変異発生を考慮すると、ＤＮＡフリーおよび選択マーカーフリーの遺伝子改変は、遺伝子ノックアウト生成に対する実用的な方法になり得る。植物の体細胞においてはＨＤＲ経路の頻度が低いため、このＤＮＡフリーおよび選択マーカーフリーの方法は、遺伝子編集および遺伝子挿入用途に対しては（ＮＨＥＪによる遺伝子変異と比較すると）実用性は低い。さらに、ＤＮＡ分子は、標的ＤＳＢ部位にしばしば組み込まれ、遺伝子編集効率、特に、遺伝子挿入効率を低下させる。植物細胞に送達された遺伝子（例えば、Ｃａｓ９遺伝子、ｇＲＮＡ遺伝子、選択マーカー遺伝子および形質遺伝子）をコードするＤＮＡベクターが、同じＤＳＢ部位に共組み込みされ、部位特異的形質遺伝子挿入を有する使用可能なイベントの頻度を劇的に減少させる傾向があることが示された。ドナーＤＮＡ（例えば、相同腕を有する形質遺伝子）へのＤＮＡ分子の送達を制限することにより、所望の遺伝子型を有するイベントの可能性を増大させることができる。したがって、本明細書に記載の、ＲＧＥＮが送達されると活性化され得る、破壊された（不活性な）内因性の、または予め組み込まれた選択マーカー遺伝子の概念により、遺伝子編集および遺伝子挿入のためのＤＮＡフリーおよび選択マーカーフリーの方法は非常に実用的なものになり得る。
【００８５】
ガイドポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、粒子撃ち込み法、ウィスカー媒介形質転換法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換法または局所導入法を用いて、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドとして直接細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、前記細胞中のガイドＲＮＡを転写することができる特定のプロモーターに作動可能に連結している、ガイドＲＮＡをコードする異種核酸断片を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することにより（限定はされないが、粒子撃ち込み法、またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換法により）細胞に間接的に導入することができる。特定のプロ―モーターは、限定はされないが、厳密に定義され、改変されていない５’末端および３’末端を有するＲＮＡの転写を可能にする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり得る（ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３：ｅ１６１）。本明細書に記載するように、ｓｇＲＮＡ  の植物細胞への直接送達は、粒子媒介送達法によって行うことができる。本明細書に記載の実験に基づき、熟練した技術者は、他の直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション法、ウィスカー媒介形質転換法、エレクトロポレーション、粒子撃ち込み法、細胞貫通ペプチドまたはメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達法などの使用によって、ｇＲＮＡの植物細胞への送達を成功させることができると今や想定することができる。
【００８６】
化学的合成ガイドポリヌクレオチド（例えば、限定はされないが、Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３、９８５−９８９など）、インビトロ生成ガイドポリヌクレオチド、および／または自己スプライシングガイドＲＮＡ（例えば、限定はされないが、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，ＰＮＡＳ  １１２：３５７０−３５７５など）など、ガイドポリヌクレオチドは、当該技術分などの野で知られた任意の方法で作製することができる。
【００８７】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」および「プロトスペーサー」は、本明細書中で互換的に使用され、限定はされないが、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、結合し、かつ場合によりニッキングまたは切断をすることができる、細胞の、染色体、エピソーム、トランスジェニック遺伝子座、またはゲノム中のあらゆる他のＤＮＡ分子（例えば、染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）上のヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は細胞ゲノム中の内因性部位であり得、あるいは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり、そのため細胞のゲノム中に天然には存在していないか、または天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置に見出すことができる。本明細書で使用される場合、用語「内因性標的配列」および「天然標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに内在するか、または細胞のゲノムで生じ、細胞のゲノム中のその標的配列の内在位置または発生位置に存在する標的配列を指す。細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母および植物の細胞、ならびに本明細書に記載の方法によって作製された植物体および種子が挙げられる。「人工標的部位」または「人工標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内因性標的配列または天然標的配列と配列は同一であるが、細胞のゲノム中の異なる位置（すなわち、非内在位置または非発生位置）に位置し得る。
【００８８】
「変更標的部位」、「変更標的配列」、「改変標的部位」、「改変標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、非変更標的配列と比較して少なくとも１つの変更を含む、本明細書に開示の標的配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【００８９】
標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは様々であってよく、例えば、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチド長の標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であり得る、すなわち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることがさらに可能である。ニッキング／切断部位は標的配列内に存在することができる、またはニッキング／切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別の変形では、切断は互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みがジグザグ状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングであり得る一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。ゲノム標的部位の活性変異体もまた使用することができる。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生物学的活性を保持しており、したがってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識され切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖または二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。
【００９０】
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ））は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより認識される（標的とされる）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭがなければ、その標的ＤＮＡ配列を正しく認識することはできない。本明細書におけるＰＡＭの配列および長さは、用いるＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、一般には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
【００９１】
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」および「ＤＮＡターゲティング」は、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中のＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体またはプラスミド中の、特定のＤＮＡ配列でのノックアウト、編集、またはノックインの特異的な導入であってよい。本明細書においては、ＤＮＡターゲティングは、一般に、適切なポリヌクレオチド構成要素を伴ったＣａｓタンパク質が、細胞中の特定のＤＮＡ配列にて一方の鎖または双方の鎖を切断することによって実行され得る。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位での改変に繋がり得るＮＨＥＪまたはＨＤＲプロセスを引き起こすことができる。
【００９２】
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に、または完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードすることができたか、または、調節機能（例えば、プロモーター）を有していたはずである。ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入または欠失）、または標的部位もしくはその近傍の配列の機能を低下もしくは喪失させる配列の特異的除去により産生し得る。
【００９３】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、共送達されるポリヌクレオチド改変鋳型と組み合わせて使用することができ、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集（改変）を可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
「改変ヌクレオチド」または「編集ヌクレオチド」は、その非改変ヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つの変更を含む目的のヌクレオチド配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【００９５】
用語「ポリヌクレオチド改変鋳型」には、編集されるべきヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加または欠失であり得る。場合により、ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド改変にフランキングする相同ヌクレオチド配列を含み得、そのフランキング相同ヌクレオチド配列は、編集されるべき所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。
【００９６】
ポリヌクレオチド改変鋳型は、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、一過性導入法（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子媒介送達法、局所アプリケーション、ウィスカー媒介送達、細胞貫通ペプチドによる送達、またはメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接送達によって細胞に導入することができる。
【００９７】
ポリヌクレオチド改変鋳型は、一本鎖ポリヌクレオチド分子、二本鎖ポリヌクレオチド分子、または環状ＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）の一部として細胞に導入することができる。ポリヌクレオチド改変鋳型はまた、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓエンドヌクレアーゼに連結することができる。連結されたＤＮＡは、ゲノムの編集および標的ゲノムの調節に有用な標的および鋳型の共局在化を可能にし得、また、内因性のＨＲ機構の機能が大きく低下していると考えられる分裂終了細胞のターゲティングに有用であり得る（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．１０：９５７−９６３）。ポリヌクレオチド改変鋳型は、細胞内に一時的に存在してもよく、あるいはウイルスレプリコンにより導入されてもよい。
【００９８】
編集されるべきヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識され切断される標的部位の中に位置しても外に位置してもよい。一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識され切断される標的部位での改編ではない。他の一実地形態では、編集されるべき少なくとも１つのヌクレオチドとゲノム標的部位間には、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、９００個または１０００個のヌクレオチドが存在する。
【００９９】
ゲノム編集は利用可能な任意の遺伝子編集方法によって行うことができる。例えば、遺伝子編集は、宿主細胞に、その宿主細胞のゲノム内の遺伝子に対する標的改変を含むポリヌクレオチド改変鋳型（遺伝子修復オリゴヌクレオチドと呼ばれることもある）を導入することによって行うことができる。そのような方法に使用するポリヌクレオチド改変鋳型は、一本鎖または二本鎖であり得る。そのような方法の例は、広く、例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書などに記載れている。
【０１００】
本明細書に記載の実験に基づき、熟練した技術者は、他の直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、ウィスカー媒介形質転換法、エレクトロポレーション、粒子撃ち込み法、細胞貫通ペプチドまたはメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達法の使用によって、ポリヌクレオチド改変鋳型の植物細胞への送達を成功させることができると今や想定することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、所望の変更部近傍のゲノムの所定の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって促進され得る。ＤＳＢは、利用可能な任意のＤＳＢ導入剤、例えば、限定はされないが、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、核酸誘導型エンドヌクレアーゼシステム、例えば、（細菌性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの基づく）などを使用して導入することができる。いくつかの実施形態では、ＤＳＢの導入は、ポリヌクレオチド改変鋳型の導入と組み合わせることができる。
【０１０２】
ＤＳＢと改変鋳型を組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入することができる、ＤＳＢ誘発物質、またはＤＳＢ誘発物質をコードする核酸、および、編集されるべきヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの変更を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド改変鋳型を、宿主細胞へ導入することを含む。ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド変更部にフランキングするヌクレオチド配列を含み得る。そのフランキング配列は、ＤＳＢにフランキングする染色体領域に実質的に相同である。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体などのＤＳＢ誘発物質を使用するゲノムの編集は、例えば、２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１４年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月１３日出願の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１０３】
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」および「遺伝的ノックイン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、（適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列もまた使用される場合、ＨＲによる）Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによる、細胞中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノックインの例としては、遺伝子のコード領域中の異種アミノ酸コード配列の特異的な挿入、または遺伝子座中への転写調節要素の特異的な挿入がある。
【０１０４】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを有する細胞または生命体を得るために、様々な方法および組成物を使用することができる。そのような方法は、標的部位に目的ポリヌクレオチドを組み込む相同組み換えを用いることができる。提示された１つの方法では、目的ポリヌクレオチドがドナーＤＮＡコンストラクトとして生命体細胞に供給される。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトが含まれる。ドナーＤＮＡコンストラクトは、さらに、目的ポリヌクレオチドにフランキングする第１および第２の領域を含むことができる。ドナーＤＮＡの相同の第１および第２の領域はそれぞれ、細胞または生命体ゲノムの標的部位に存在するかまたはフランキングする第１および第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。ドナーＤＮＡは、ガイドポリヌクレオチドおよび／またはＣａｓエンドヌクレアーゼに連結することができる。連結されたドナーＤＮＡは、ゲノムの編集および標的ゲノムの調節に有用な標的およびドナーＤＮＡの共局在化を可能にし得、また、内因性のＨＲ機構の機能が大きく低下していると考えられる分裂終了細胞のターゲティングに有用であり得る（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．１０：９５７−９６３）。
【０１０６】
「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」とは、細胞または生命体ゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡ領域のことである。相同領域は、切断される標的部位での相同組み換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００、またはそれ以上の塩基長を含むことができる。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が相同組み換え反応用の基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一性パーセント、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局在化した類似性を含む保存領域、および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
【０１０７】
標的およびドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性または配列同一性の量は多様であり得、約１〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、７５〜１５０ｂｐ、１００〜２５０ｂｐ、１５０〜３００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、３５０〜７５０ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４５０〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、６００〜１２５０ｂｐ、７００〜１５００ｂｐ、８００〜１７５０ｂｐ、９００〜２０００ｂｐ、１〜２．５ｋｂ、１．５〜３ｋｂ、２〜４ｋｂ、２．５〜５ｋｂ、３〜６ｋｂ、３．５〜７ｋｂ、４〜８ｋｂ、５〜１０ｋｂの範囲で単位整数値を有する全長および／もしくは全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これらの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１〜２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量はまた、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性パーセントを含む２つのポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択で連続ヌクレオチドの保存領域または局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として説明することができる。十分な相同性はまた、高ストレンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測能力によって説明することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；および、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」とは、標的部位のいずれかの側上に存在する、細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことであるか、または標的部位の一部も含むセグメントのことである。このゲノム領域は、このゲノム領域は、対応する相同領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００個、またはそれ以上の塩基を含むことができる。
【０１０９】
目的ポリヌクレオチドおよび／または形質は、２０１３年１０月３日公開の米国特許出願公開第２０１３／０２６３３２４−Ａ１号明細書および２０１３年１０月３日公開のＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（両出願は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、複合形質遺伝子座に共にスタッキングすることができる。本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムは、二重鎖切断を効率よく生成するシステムを提供し、複合形質遺伝子座における形質のスタッキングを可能にする。
【０１１０】
（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８−Ａ１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように）、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、１つ以上のガイドポリヌクレオチドと、１つのＣａｓエンドヌクレアーゼと、任意選択により１つ以上のドナーＤＮＡとを植物細胞に導入することによって、目的ポリヌクレオチド、または１つ以上の目的形質を、１つ以上の標的部位に導入するために使用することができる。稔性植物は、前記１つ以上の標的部位に変更を含む植物細胞から作製することができ、その変更は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される。これらの変更標的部位を含む植物は、少なくとも１つの目的遺伝子または目的形質を同じ複合形質遺伝子座に含む植物と交配することができ、さらにそれによって前記複合形質遺伝子座に形質をスタッキングすることができる（２０１３年１０月３日公開の米国特許出願公開第２０１３／０２６３３２４Ａ１号明細書および２０１３年１月２４日公開のＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【０１１１】
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上に見出される対応する相同領域との間の構造類似性は、相同組み換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および生命体ゲノムの「ゲノム領域」により共有される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であることができる。
【０１１２】
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位にフランキングする任意の配列に対する相同性を有することができる。いくつかの実施形態では、相同領域は、標的部位に直接フランキングするゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対してさらに５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。さらに他の実施形態では、相同領域はまた、下流のゲノム領域に沿った標的部位の断片とも相同性を有し得る。一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片をさらに含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。
【０１１３】
ＤＮＡで二本鎖切断が誘発されると直ちに、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化されて切断を修復する。非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路は、切断された末端を接合する最も一般的な修復機構である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は、通常、修復によって保存されるが、欠失、挿入またはその他の再配置は起こり得る。１つの二本鎖切断の２末端は、ＮＨＥＪの最も一般的な基質である（Ｋｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ  １９：５５６２−６）が、２つの異なる二本鎖切断が起きる場合、異なる切断のフリー端でライゲーションが起こり、染色体の欠失（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ、（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１）、または異なる染色体間の染色体転座転移（Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）が生じる。エラーが起きやすいＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で変異を起こし得る。非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路は、切断された末端を接合する最も一般的な修復機構である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。
【０１１４】
あるいは、二本鎖切断は、相同性ＤＮＡ配列間の相同組み換え（ＨＲ）によって修復することができる。二本鎖切断部分近傍の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌクレアーゼ活性によって変わると、非分裂体細胞中の相同染色体、またはＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列が利用できるなら、遺伝子変換経路が、元の構造に修復することができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：３４２−５２）。異所性および／または後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換えのＤＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１１７３−８１）。エピソームＤＮＡ分子もまた、二本鎖切断へのライゲート、例えば、染色体二本鎖切断へのＴ−ＤＮＡへの組み込みがされ得る（Ｃｈｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３３：９５６−６５；Ｓａｌｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：６０８６−９５）。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「相同組み換え（ＨＲ）」は、相同部位の２つのＤＮＡ分子間でのＤＮＡ断片の交換を含む。相同組み換えの頻度は、多くの因子に影響される。相同組み換え量、および相同組み換えと非相同組み換えとの相対的比率は、異なる生命体間で変わる。一般に、相同領域の長さは、相同組み換えイベントの頻度に影響し、相同領域が長いほど頻度は高くなる。相同組み換えの観察に必要な相同領域の長さはまた、種により変動する。多くの例で少なくとも５ｋｂの相同が使用されるが、２５−５０ｂｐの相同で相同組み換えが観察されている。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ３１：２５−３３；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ、（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１２：４４１−５７；Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４７６８−７２、Ｓｕｇａｗａｒａ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：５６３−７５、Ｒｕｂｎｉｔｚ  ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：２２５３−８；Ａｙａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５１９９−２０３；Ｌｉｓｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５：１６１−７を参照されたい。
【０１１６】
相同配向型修復（ＨＤＲ）は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ切断の細胞における修復機構である。相同配向型修復としては、相同組み換え（ＨＲ）および一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１−２１１）が挙げられる。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組み換え（ＨＲ）と呼ばれ、それは、ドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡ間に最も長い配列相同性を要求する。ＨＤＲの他の形態として、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）および切断誘導複製が挙げられ、これらはＨＲと比べて短い配列相同性を要求する。ニッキング（一本鎖切断）に対する相同配向型修復は、二本鎖切断に対するＨＤＲと異なる機構で起こり得る（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｉｚｅｌｓ．ＰＮＡＳ（００２７−８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４−Ｅ９３２）．
【０１１７】
例えば、相同性の相同配向型修復（ＨＤＲ）による植物細胞のゲノムの変更は、遺伝子工学の強力なツールである。高等植物では相同組み換えの頻度が低いにもかかわらず、植物内因性遺伝子の相同組み換えが成功した例がある。植物における相同組み換えのパラメータは、主に、導入された切断選択マーカー遺伝子をレスキューすることによって調べられているこれらの実験では、相同ＤＮＡ断片は通常０．３ｋｂ〜２ｋｂであった。観察された相同組み換えの頻度は、１０−４〜１０−５のオーダーであった。例えば、Ｈａｌｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３１：１８６−９３；Ｏｆｆｒｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ  ９：３０７７−８４；Ｏｆｆｒｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７３４６−５０；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：４０２１−６；Ｈｏｕｒｄａ  ａｎｄ  Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，（１９９４）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４３：１０６−１１；およびＲｉｓｓｅｅｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ７：１０９−１９を参照されたい。
【０１１８】
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組み換え経路を刺激する有効な因子のようである（Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８：２８１−９２；Ｔｚｆｉｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：５６７−９；Ｐｕｃｈｔａ、（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ５６：１−１４）。ＤＮＡ−切断物質の使用により、植物の人工的に構築された相同ＤＮＡ反復配列間の相同組み換えの２〜９倍の増加が観察された（Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８：２８１−９２）。トウモロコシのプロトプラストにおける線状ＤＮＡ分子による実験で、プラスミド間の相同組み換えの増進が示された（Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３０：２０９−１８）。
【０１１９】
ドナーＤＮＡは、当該技術分野で知られた任意の手段で導入することができる。例えば、標的部位を有する植物体が供給される。ドナーＤＮＡは、当該技術分野で知られた任意の送達方法、例えば、アグロバクリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法、ウィスカー媒介形質転換法、または遺伝子銃粒子撃ち込み法によって、供給し得る。ドナーＤＮＡは、細胞内に一時的に存在してもよく、あるいはウイルスレプリコンにより導入されてもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび標的部位の存在下に、ドナーＤＮＡは植物ゲノムに挿入される。
【０１２０】
本明細書に記載するように、ドナーＤＮＡの植物細胞への直接送達は、粒子媒介送達法によって行うことができる。本明細書に記載の実験に基づき、熟練した技術者は、他の直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子撃ち込み法、ウィスカー媒介送達法、細胞貫通ペプチドまたはメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達法の使用によって、ドナーＤＮＡの植物細胞への送達を成功させることができると今や想定することができる。
【０１２１】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのさらなる使用が報告されており（２０１５年３月１５日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５−００５９０１０Ａ１、２０１４年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月１３日公開の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、限定はされないが、目的ヌクレオチド配列（調節要素など）の改変または置換、目的ポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変および／または代替スプライシング部位の導入、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸および／またはタンパク質の融合、ならびに目的遺伝子への逆方向反復配列の発現による遺伝子サイレンシングが挙げられる。
【０１２２】
目的ポリヌクレオチドはさらに本明細書中に記載されており、商業市場、および作物の開発に関係するそれらの関心を反映したポリヌクレオチドが挙げられる。目的の作物および市場は変化し、開発途上国が世界市場を広げるにつれ、新しい作物や技術もまた出現してくるであろう。さらに、農業形質、ならびに収穫量およびヘテロシスなどの特性の理解が増すにつれ、それに応じて遺伝子操作のための遺伝子の選択も変わるであろう。
【０１２３】
さらに、そのゲノム中の標的部位に組み込まれた目的ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種の植物細胞を同定する方法が提供される。スクリーニングマーカー表現型を使用せずにゲノムの標的部位またはその近傍への挿入がなされた植物細胞の同定に様々な方法を用いることができる。そのような方法は、標的配列の変化を検出する、標的配列の直接的解析と見なすことができ、限定はされないが、ＰＣＲ法、シークエンス法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、米国特許出願第１２／１４７，８３４号明細書されたい（この文献は本明細書に記載の方法に必要な範囲で本明細書に組み込まれる）。方法はまた、ゲノムに組み込まれた目的ポリヌクレオチドを含む植物細胞から植物体を回収することを含む。植物体は、不稔性であっても稔性であってもよい。任意の目的ポリヌクレオチドが提供され、植物体のゲノムの標的部位に組み込まれ、植物体で発現し得ることが確認された。
【０１２４】
目的ポリヌクレオチド／目的ポリペプチドとしては、限定はされないが、除草剤耐性コード配列、殺虫物質コード配列、殺線虫物質コード配列、抗真菌性物質コード配列、抗ウイルス物質コード配列、ならびに非生物的ストレスおよび生物的ストレス耐性コード配列、あるいは収穫量、穀粒品質、栄養分、デンプンの品質もしくは量、窒素固定および／もしくは窒素利用、脂肪酸および油分、ならびに／または組成などの植物形質を改変する配列が挙げられる。より具体的な目的ポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、作物収穫量を改善する遺伝子、作物の望ましさを向上させるポリペプチド、非生物的ストレス、例えば、乾燥、窒素、温度、塩分、有毒な金属もしくは微量元素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、あるいは殺虫剤および除草剤などの毒性物質に耐性を付与する、または生物的ストレス、例えば、真菌、ウイルス、細菌、昆虫および線虫による攻撃、ならびに、これらの生命体と関連する病気の発生に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。目的遺伝子の一般的な分類としては、例えばジンクフィンガーなどの情報に関わる遺伝子類、例えばキナーゼなどの伝達に関わる遺伝子類、および熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関わる遺伝子類が挙げられる。トランス遺伝子のより具体的な分類としては、例えば、作物栽培学、昆虫耐性、病気耐性、除草剤耐性、稔性または不稔性、穀類特性および市販製品に重要な形質をコードする遺伝子が挙げられる。目的遺伝子としては、一般に、油、デンプン、炭水化物または栄養素の代謝に関与している遺伝子、ならびに、他の形質、例えば、限定はされないが、本明細書に記載の、除草剤耐性などと組み合わせてスタッキングまたは使用され得る穀粒の大きさ、スクロースローディングなどに影響する遺伝子が挙げられる。
【０１２５】
油、デンプンおよびタンパク質量成などの作物栽培学的に重要な形質は、従来の育種方法の使用に加えて、遺伝子学的に変えることができる。改変としては、オレイン酸、飽和油および不飽和油量の増加、リシンおよび硫黄濃度の増加、必須アミノ酸の導入、およびまたデンプンの改質が挙げられる。ホリドチオニンタンパク質の改質が、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同５，８８５，８０１号明細書、同５，８８５，８０２号明細書、および同５，９９０，３８９明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２６】
目的ポリヌクレオチド配列は、病気耐性または有害生物耐性の導入に関与するタンパク質をコードしてもよい。「病気耐性」または「有害生物耐性」は、植物と病原体との相互作用の結果である有害な症状を回避することを意味する。有害生物耐性遺伝子は、ネキリムシ、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガなどの、高収量を阻害する有害生物に対する耐性をコードし得る。抗菌性を保護するリゾチームもしくはセクロピンなどの病気耐性および昆虫耐性遺伝子、抗真菌性を保護するデフェンシン、グルカナーゼもしくはキチナーゼなどのタンパク質、または線虫もしくは昆虫を制御する、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）エンドトキシン、プロテアーゼ阻害剤、コラゲナーゼ、レクチンもしくはグルコシダーゼは、いずれも遺伝子産物の有用な例である。病気耐性形質をコードする遺伝子としては、フモニシンに対するなどの解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）、非病原性（ａｖｒ）遺伝子および病気耐性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）などが挙げられる。昆虫耐性遺伝子は、ネキリムシ、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガなどの、高収量を阻害する有害生物に対する耐性をコードし得る。そのような遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書；同第５，７４７，４５０号明細書；同第５，７３６，５１４号明細書；同第５，７２３，７５６号明細書；同第５，５９３，８８１号明細書；およびＧｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９）などが挙げられる。
【０１２７】
「除草剤耐性タンパク質」、または「除草剤耐性をコードする核酸分子」の発現により得られるタンパク質としては、そのタンパク質を発現しない細胞より、より高濃度の除草剤に耐える能力、またはそのタンパク質を発現しない細胞より、より長期間ある特定の濃度の除草剤に耐える能力を細胞に付与するタンパク質が挙げられる。除草剤耐性形質は、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳとも呼ばれる）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）型−（ＵＫ：スルホニル尿素（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｕｒｅａ））除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノトリシンもしくはｂａｓｔａに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子およびＧＡＴ遺伝子）、ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＨＰＰＤ遺伝子）、または当該技術分野で知られている他のそのような遺伝子によって植物体に導入することができる。例えば、米国特許第７，６２６，０７７号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４号明細書、同第第６，２４８，８７６号明細書、同第７，１６９，９７０号明細書、同第６，８６７，２９３号明細書、および米国仮特許出願６１／４０１，４５６号明細書（これらの各文献は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ｂａｒ遺伝子は、除草剤ｂａｓｔａに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は、抗生物質カナマイシンおよびｇｅｎｅｔｉｃｉｎに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は、除草剤クロルスルフロンに対する耐性をコードする。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「スルホニル尿素耐性ポリペプチド」は、植物体で発現すると、少なくとも１種のスルホニル尿素に対する耐性を付与する任意のポリペプチドを含む。スルホニル尿素除草剤は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）としても知られるアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを遮断することによって高等植物の成長を阻害する。ＡＬＳの特定の変異（例えば、Ｓ４および／またはＨＲＡ変異）を含む植物体は、スルホニル尿素除草剤に対する耐性を有する。スルホニル尿素耐性植物体の作製については、米国特許第５，６０５，０１１号明細書、同第５，０１３，６５９号明細書、同第５，１４１，８７０号明細書、同第５，７６７，３６１号明細書、同第５，７３１，１８０号明細書、同第５，３０４，７３２号明細書、同第４，７６１，３７３号明細書、同第５，３３１，１０７号明細書、同第５，９２８，９３７号明細書、同第５，３７８，８２４、および国際公開第９６／３３２７０号パンフレット（これらはあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびに、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｒｏｐｓ：ｈｉｓｔｏｒｙ、ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ  ６１：２４６−２５７により詳しく記載されている。スルホニル尿素耐性ポリペプチドは、例えば、ＡＬＳのＳｕＲＡまたはＳｕＲＢ遺伝子座によってコードされ得る。特定の実施形態では、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドは、Ｃ３  ＡＬＳ変異、ＨＲＡ  ＡＬＳ変異、Ｓ４変異もしくはＳ４／ＨＲＡ変異、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＡＬＳ中の異なる変異が、異なる除草剤、ならびに除草剤のグループ（および／またはサブグループ）に対する耐性を付与することが知られている。例えば、Ｔｒａｎｅｌ  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ（２００２）Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０：７００−７１２を参照されたい。米国特許第５，６０５，０１１号明細書、同第５，３７８，８２４号明細書、同第５，１４１，８７０号明細書および同第５，０１３，６５９（これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。一実施形態においては、ＡＬＳ中のＨＲＡ変異が特に使用されている。この変異は、野生型タンパク質と比較して、少なくとも１種のスルホニル尿素化合物に対し耐性を有するアセト乳酸合成酵素ポリペプチドを生成する。
【０１２９】
スルホニル尿素耐性ポリペプチドをコードする遺伝子は、スルホニル耐性（ｔｏｌｅｒａｎｔ）遺伝子、またはスルホニル耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子と呼ばれる。スルホニル耐性（ｔｏｌｅｒａｎｔ）遺伝子、またはスルホニル耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子という用語は、本明細書で互換的に使用される
【０１３０】
破壊されたスルホニル尿素耐性（ＡＬＳ）遺伝子とは、その遺伝子産物がもはや機能的スルホニル尿素耐性ポリペプチドをコードしないように改変されている破壊遺伝子（その対応する破壊されていない遺伝子はスルホニル尿素耐性ポリペプチドをコードする）を指す。
【０１３１】
（２０１２年９月４日発行の米国特許第８，２５７，９５６号明細書に記載されているような）スルホニル尿素反応性リプレッサーシステムの構成要素をまた植物ゲノムに導入して、前記植物にリプレッサー／オペレーター／インデューサーシステムを生成することができ、そこでは、ポリペプチドがオペレーターに特異的に結合することができ、この特異的結合はスルホニル尿素化合物によって調節される。
【０１３２】
不稔性遺伝子もまた発現カセットにおいてコードされ得、物理的雄穂除去の代替を提供する。そのような方法で使用される遺伝子の例としては、ＭＳ２６（例えば、米国特許第７，０９８，３８８号明細書、同第７，５１７，９７５号明細書、同第７，６１２，２５１を参照されたい）、ＭＳ４５（例えば、米国特許第５，４７８，３６９号明細書、同第６，２６５，６４０号明細書を参照されたい）、またはＭＳＣＡ１（例えば、米国特許第７，９１９，６７６号明細書を参照されたい）などの雄性稔性遺伝子が挙げられる。トウモロコシ植物体（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．））は自家受粉および異花受粉の両技術によって育種することができるトウモロコシは、同じ植物体の雄穂に位置する雄花と、雌穂に位置する雌花とを有する。それは、自家受粉（「自殖」）または異花受粉することができる。トウモロコシでは、風により花粉が雄穂から初期の雌穂の頂部から伸びた毛に飛ばされると、自然受粉が起こる。受粉は、当業者に知られた手法で容易に制御することができる。トウモロコシのハイブリッドの開発には、ホモ接合性の近交系、これらの系統の交雑、および交雑種の評価が必要である。系統育種および循環選抜は、集団からの近交系の開発に使用される育種法の２つである。育種プログラムは、２以上の近交系または種々の広範囲にわたるソースから、自殖および所望の表現型の選択によって新しい近交系を開発する育種プールへ、所望の形質を組み合わせる。トウモロコシの交雑品種は、それぞれが他方に欠けている１つ以上の所望の特性を有するか、または他方を補完し得る２種のそのような近交系の交雑種である。新しい近交系を他の近交系と交雑し、これらの交雑種のハイブリッドを評価して、どのハイブリッドが商業的可能性を有するかを決定する。第一世代のハイブリッド子孫をＦ１と称する。Ｆ１ハイブリッドはその近交系の親より丈夫である。このハイブリッド強勢またはヘテロシスは、多くの方法、例えば、栄養成長の増大および収量の増加などで示すことができる。
【０１３３】
トウモロコシのハイブリッド種子は、手作業による雄穂除去を組み込んだ雄性不稔性システムにより作製することができる。ハイブリッド種子を作製するために、成長する雌性の近交系親から雄穂を除き、それを雄性の近交系親と共に種々の交互列パターンで植え付けることができる。その結果、外来のトウモロコシ花粉源から十分に分離され、雌性近交系の穂は雄性近交系の花粉のみを受粉するであろう。したがって、得られる種子はハイブリッド（Ｆ１）であり、ハイブリッド植物体を形成するであろう。
【０１３４】
植物体の開発に影響する畑地の変化は、手による雌性親の手作業による雄穂除去が終わった後、植物体に雄穂を付けさせることがある。あるいは、雌性近交系植物の雄穂が、雄穂除去プロセスにより完全には除かれないことがある。いずれにしても、雌性植物から花粉が落ち、いくつかの雌性植物体が自家受粉することになろう。これにより、雌性近交系の種子が、正常に作製されたハイブリッド種子と共に収穫されるであろう。雌性近交系の種子は、ヘテロシスを示さず、したがって、Ｆ１種子ほど生産性は高くない。さらに、雌性近交系の種子の存在は、ハイブリッドを生産する会社に、生殖質のセキュリティリスクを示すことになり得る。
【０１３５】
あるいは、雌性近交系は、機械によって機械的に雄穂除去することができる。機械による雄穂除去は、人の手による雄穂除去と信頼性はほぼ同じであるが、作業は速く費用も少なくて済む。しかしながら、雄穂除去機の殆どは、人の手による雄穂除去より植物体にダメージを与える。したがって、今のところ、完全に満足できる雄穂除去の形態はなく、ハイブリッド種子の作製において、生産コストをさらに抑える代替に対するニーズ、および雌性親の自家受粉をなくすニーズが依然存在している。
【０１３６】
トウモロコシなどの作物では、植物体に雄性不稔性を引き起こす変異が、ハイブリッド種子の作製方法に有用である可能性があり、多くの人手を要する、ハイブリッド親として使用される母系親株から（雄穂除去としても知られる）雄花除去の必要性をなくすことによって、生産コストを低下させることができる。トウモロコシにおいて雄性不稔性を引き起こす変異は、Ｘ線もしくは紫外線照射、化学的処理、または転位因子挿入（ｍｓ２３、ｍｓ２５、ｍｓ２６、ｍｓ３２）などの種々の方法で作られている（Ｃｈａｕｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｂｏｔ  ８７：１１９３−１２０１）。稔性／不稔性「分子スイッチ」による稔性遺伝子の条件付き調節は、作物改良のための新しい雄性不稔性システムの設計に対する選択肢を増やすであろう（Ｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １１：４５５−４６５）。
【０１３７】
さらに、目的ポリヌクレオチドがまた、目的の標的遺伝子配列のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス配列を含み得ることが確認されている。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構成されている。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を妨げるなら、改変されていてもよい。このように、対応するアンチセンス配列と７０％、８０％、または８５％の配列同一性を有するアンチセンス構成が使用され得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上からなる配列が使用され得る。
【０１３８】
さらに、目的ポリヌクレオチドはまた、植物体の内因性遺伝子の発現を抑制するセンス配向で使用され得る。センス配向のポリヌクレオチドによって植物体の遺伝子の発現を抑制する方法は、当該技術分野で知られている。この方法には、一般に、内因性の遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に結合した、植物体内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで植物体を形質転換することが含まれる。通常、そのようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写配列に対し相当の配列同一性を、一般に、約６５％を超える配列同一性を、約８５％を超える配列同一性を、または約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書および同第５，０３４，３２３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３９】
目的ポリヌクレオチドはまた、表現型マーカーであり得る。
【０１４０】
組み換えＤＮＡ分子、目的ＤＮＡ配列および目的ポリヌクレオチドは、遺伝子サイレンシングのための１種以上のＤＮＡ配列を含みことができる。植物体中のＤＮＡ配列の発現に関与する遺伝子サイレンシングの方法は、当該技術分野で知られており、例えば、限定はされないが、コサプレッション、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉、イントロン含有ＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉、転写遺伝子サイレンシング、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）干渉が挙げられる。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドを含んでよい。したがって、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖で、場合により合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、５’−一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：アデノシンまたはデオキシアデノシンに対し（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡに対し）「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンに対し「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンに対し「Ｇ」、ウリジンに対し「Ｕ」、デオキシチミジンに対し「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対し「Ｙ」、ＧまたはＴに対し「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対し「Ｎ」。
【０１４２】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略される。
【０１４３】
用語「機能的に等価である小断片」および「機能的に等価な小断片」は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、断片または小断片が活性酵素をコードしているか否かに関わらず、遺伝子発現を変更し得る能力、またはある特定の表現型を生成する能力が保持されている、単離核酸断片の一部またはサブ配列を指す。例えば、断片または小断片は、形質転換植物に所望の表現型を生じさせる遺伝子の設計に使用することができる。遺伝子は、その核酸断片または小断片を、それが活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス配向で結合させることにより、抑制的に使用されるように設計することができる。
【０１４４】
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的に関連したタンパク質のアラインされた配列に沿って特定の位置に保存される一連のアミノ酸を意味する。他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変動し得るが、一方、特定の位置に高度に保存されるアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または活性に必須のアミノ酸を意味する。それらは、そのタンパク質相同体ファミリーのアラインされた配列の高い保存度によって同定されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定する識別子または「シグネチャー」として使用することができる。
【０１４５】
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、その変異体、ならびにこれらの配列の構造的関係は、「相同」、「相同の」、「実質的に同一の」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語によって記載され、これらの用語は本明細書で互換的に使用される。これらは、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の変化が、分子の機能、例えば、遺伝子の発現を仲介し、ある特定の表現型を生じさせる能力に影響することのないポリペプチド断片または核酸断片を指す。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能特性が、所期の改変されていない断片と比較して実質的に変わらない核酸断片の改変を指す。これらの改変には、核酸断片中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入が含まれる。
【０１４６】
実質的に類似の核酸配列に包含されるものは、（中度のストリンジェンシー条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で）本明細書に例示した配列と、または本明細書に開示したヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によって規定することができ、それらは本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的に等価である。ストリンジェンシー条件を調節して、中度の類似性を有する断片、例えば遠縁の生命体由来の相同配列を、高い類似性を有する断片、例えば近縁の生命体由来の機能酵素を複製する遺伝子などに対しスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。
【０１４７】
用語「選択的にハイブリダイズする」には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の特定の核酸標的配列への、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションより高い検出度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除が含まれる。選択的にハイブリダイズする配列は、通常、互いに少なくとも８０％または９０％、最大で１００％の（すなわち、完全相補の）の配列同一性を有する。
【０１４８】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、インビトロのハイブリダイゼーション分析において、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、また、環境が変わると異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対し１００％相補的な標的配列を特定することができる（相同プロービング）。あるいは、配列の不一致を許容し、より低い類似性が検出されるように配列の不一致を認めるように、ストリンジェンシー条件を調節することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により５００ヌクレオチド未満である。
【０１４９】
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃において、また、長いプローブ（例えば、５０超のヌクレオチド）の場合、少なくとも約６０℃の温度において、塩濃度が、約１．５Ｍ  Ｎａイオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により形成することができる。低ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなる緩衝液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸酸ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中度ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、４０〜４５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃での０．５〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、５０％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。
【０１５０】
核酸配列またはポリペプチド配列と関連する「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較窓全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【０１５１】
用語「配列同一性パーセンテージ」は、比較窓全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を指し、比較窓内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定してマッチ位置数を得、このマッチ位置数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。配列同一性パーセントの有用な例としてが、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。これらの同一性は、本明細書に記載のプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
【０１５２】
配列アラインメント、および同一性または類似性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（これに限定されない）などの、相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることは理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化したとき、ソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味する。
【０１５３】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント用の、および同一性パーセント算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【０１５４】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【０１５５】
別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、以下のパラメータを用いるＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の同一性％および類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト８、ギャップ長伸長ペナルティ２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化し、ギャップ数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
【０１５６】
「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されている、生物学的配列の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムである。このプログラムでは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースと比較し、一致の統計学的有意性を計算して、問い合わせ配列に十分類似した配列を、類似性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは特定された配列およびそれらの問い合わせ配列に対するローカルアライメントを報告する。
【０１５７】
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の特定に有用であることは当業者によく理解されるであろう。同一性パーセントの有用な例としては、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。
【０１５８】
「遺伝子」は、機能分子、例えば、限定はされないが、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列などの特定のタンパク質などを発現する核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出される遺伝子を指す。
【０１５９】
「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変された遺伝子である。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、対応する非変異遺伝子と異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異植物体は、変異遺伝子を含む植物体である。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示する、または当該技術分野で知られる標的配列のＤＮＡに二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することによりなされた天然遺伝子中の変異のことである。
【０１６１】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導標的型変異は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識され切断されるゲノム標的部位の中または外に位置するヌクレオチド配列で起こり得る。
【０１６２】
用語「ゲノム」は、植物細胞に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリアまたはプラスチド）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【０１６３】
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。
【０１６４】
［アレル」は、染色体の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つである。染色体の所与の遺伝子座に存在する全てのアレルが同じである場合、その植物体はその遺伝子座でホモ接合性である。染色体の所与の遺伝子座に存在するアレルが異なっているなら、その植物体はその遺伝子座でヘテロ接合性である。
【０１６５】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’−非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’−非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができる。
【０１６６】
「植物最適化ヌクレオチド配列」とは、植物体における発現が増大するように最適化されているヌクレオチド配列のことである。例えば、植物最適化ヌクレオチド配列は、例えば、本明細書に開示する二本鎖切断誘導物質（例えば、エンドヌクレアーゼ）などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、発現を改善するための１つ以上の植物優先コドンを用いて改変することにより、合成することができる。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。
【０１６７】
植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書および同第５，４３６，３９１号明細書、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物宿主において遺伝子発現を高めるためのさらなる配列の改変は知られている。これらの改変としては、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ以上の配列の除去、１つ以上のエクソン−イントロンスプライス部位シグナル、１つ以上のトランスポゾン様反復、および遺伝子発現に有害なおそれのあるそうしたよく特徴付けられた他の配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所与の植物宿主の平均レベル（その宿主植物細胞で発現する既知の遺伝子を参照して計算される）に調整することができる。可能であれば、１つ以上のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造を避けるために配列を改変する。したがって、本開示の「植物最適化ヌクレオチド配列」は、そのような配列の改変を１つ以上含む。
【０１６８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写開始タンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ領域である。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーター固有のエレメントであってもよいし、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され、かつ／または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導し得ることは当業者に理解されている。さらに、殆どの場合に調節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることは認識されている。殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成型プロモーター」と呼ばれている。
【０１６９】
ある特定のプロモーターが他のものよりより高率でＲＮＡの合成を誘導することができることが示された。これらは「強力なプロモーター」と呼ばれている。ある特定の他のプロモーターが、特定の細胞型または組織型でのみ高いレベルでＲＮＡの合成を誘導することが示され、プロモーターがある特定の組織で好適にＲＮＡ合成を誘導し、他の組織では低いレベルでＲＮＡ合成を誘導するなら、「組織特異性プロモーター」または「組織優勢プロモーター」としばしば呼ばれている。植物体に導入されたキメラ遺伝子（または、遺伝子群）の発現パターンはプロモーターによって制御され、特定の組織型または特定の植物成長段階においてある特定のレベルでキメラ遺伝子または（遺伝子群）の発現を制御することができる新規なプロモーターを単離することへの関心が依然存在している。
【０１７０】
植物プロモーターとしては、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターを挙げることができ、植物プロモーターについては、Ｐｏｔｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４０：１−２２を参照されたい。構成型プロモーターとしては、例えば、国際公開第９９／４３８３８号パンフレットおよび米国特許第６，０７２，０５０号明細書に開示のＲｓｙｎ７プロモーターおよび他の構成型プロモーターのコアプロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２：６１９−３２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８：６７５−８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８１：５８１−８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７２３−３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）などが挙げられる。他の構成型プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号明細書、同第５，６０８，１４４号明細書、同第５，６０４，１２１号明細書、同第５，５６９，５９７号明細書、同第５，４６６，７８５号明細書、同第５，３９９，６８０号明細書、同第５，２６８，４６３号明細書、同第５，６０８，１４２号明細書および同第６，１７７，６１１号明細書に記載されている。いくつかの例では、誘導性プロモーターが使用され得る。病原体の感染後に誘導される病原体誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ＰＲタンパク質、ＳＡタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなどの発現を調節するものが挙げられる。
【０１７１】
外因性の化学調節剤の適用によって植物体の遺伝子発現を調節するために、化学調節プロモーターを使用することができる。このプロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーターであっても、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであってもよい。化学誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター（Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：５６８−７７）、発芽前除草剤として使用されている疎水性親電性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ−ＩＩ−２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：８０３−７）が挙げられる。他の化学調節プロモーターとして、ステロイド応答性プロモーター（例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０４２１−５；ＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １４：２４７−２５７）；テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２７：２２９−３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同第５，７８９，１５６号明細書）を参照されたい）が挙げられる。
【０１７２】
特定の植物組織内での発現増強のため、組織優先プロモーターを使用することができる。組織優先プロモーターとしては、例えば、Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５４：３３７−４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ６：１５７−６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２：１３３１−４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２：５２５−３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２：５１３−５２４；Ｌａｍ，（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０：１８１−９６；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４：４９５−５０５が挙げられる。葉優先プロモーターとしては、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２：２５５−６５；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３５：７７３−８；Ｇｏｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：１１２９−３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９５８６−９０；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２７２３−９；Ｔｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７−８が挙げられる。根優先プロモーターとしては、例えば、Ｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：２０７−１８（ダイズ根特異的グルタミン合成酵素遺伝子）；Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１１−２２（サイトゾルグルタミン合成酵素（ＧＳ））；Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１０５１−６１（サヤインゲンのＧＲＰ  １．８遺伝子における根特異的調節エレメント）；Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４：４３３−４３（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）マンノピン合成酵素（ＭＡＳ）の根特異的プロモーター）；Ｂｏｇｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６３３−４１（パラスポニア・アンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）およびトレマ・トメントサ（Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）から単離された根特異的プロモーター）；Ｌｅａｃｈ  ａｎｄ  Ａｏｙａｇｉ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７９：６９−７６（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根誘導遺伝子）；Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：３４３−  ５０（アグロバク���リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）創傷誘導ＴＲ１’およびＴＲ２’遺伝子）；ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９：７５９−７２）；およびｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：６８１−９１；ファゼオリン遺伝子（Ｍｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６−８２；Ｓｅｎｇｏｐｔａ−Ｇｏｐａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３３２０−４）が挙げられる。米国特許第５，８３７，８７６号明細書、同第５，７５０，３８６号明細書、同第５，６３３，３６３号明細書、同第５，４５９，２５２号明細書、同第５，４０１，８３６号明細書、同第５，１１０，７３２号明細書および同第５，０２３，１７９号明細書も参照されたい。
【０１７３】
種子優先プロモーターとしては、種子発育中活性な種子特異的プロモーター、および種子発芽中活性な種子発芽プロモーターの両プロモーターが挙げられる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８を参照されたい。種子優先プロモーターとしては、限定はされないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）およびｍｉｌｐｓ（ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素）（国際公開第００／１１１７７号パンフレットおよび米国特許第６，２２５，５２９号明細書）が挙げられる。双子葉植物の種子優先プロモーターとしては、限定はされないが、マメ−β−ファセオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物の種子優先プロモーターとしては、限定はされないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａガンマゼイン、ワキシー（ｗａｘｙ）、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）２、グロブリン１、オレオシンおよびｎｕｃ１が挙げられる。国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照されたい。この文献には、ＥＮＤ１およびＥＮＤ２遺伝子由来の種子優先プロモーターが開示されている。
【０１７４】
用語「誘導性プロモーター」は、例えば化学物質（化学誘導剤）による内因性または外因性刺激に応じて、あるいは、環境シグナル、ホルモンシグナル、化学物質シグナルおよび／または発生シグナルに応じて、コード配列または機能性ＲＮＡを選択的に発現するプロモーターを指す。誘導性または調節プロモーターとしては、例えば、光、熱、ストレス、フラッディングもしくは乾燥、塩ストレス、浸透圧ストレス、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモネート、サリチル酸もしくは毒性緩和剤などの化学物質によって誘導または調節されるプロモーターが挙げられる。
【０１７５】
ストレス誘導性プロモーターの例は、ＲＤ２９Ａプロモーター（Ｋａｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２８７−９１）である。当業者は、乾燥条件をシミュレーションするためのプロトコル、および、シミュレーションした、または天然に発生した乾燥条件に置かれた植物体の乾燥耐性を評価するためのプロトコルに精通している。例えば、植物体に、ある期間にわたって、通常必要とする量より少ない量の水を与えるか、または水を全く与えないことによって、乾燥条件をシミュレートすることができ、また、生理学的および／または物理的条件、例えば、活力、成長、大きさもしくは根の長さ、または、特に、葉の色もしくは葉の面積（これらに限定されない）の相違を見出すことによって、乾燥耐性を評価することができる。乾燥耐性を評価する他の技術としては、クロロフィル蛍光、光合成速度およびガス交換速度の測定が挙げられる。また、当業者は、浸透圧ストレス、塩ストレスおよび温度ストレスなどのストレス条件をシミュレーションするためのプロトコル、および、シミュレーションした、または天然に発生したストレス条件に置かれた植物体の乾燥耐性を評価するためのプロトコルに精通している。
【０１７６】
植物細胞に有用な誘導性プロモーターの他の例は、２０１３年１１月２１日公開の米国特許出願公開第２０１３／０３１２１３７Ａ１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。米国特許出願公開第２０１３−０３１２１３７Ａ１号明細書には、トウモロコシおよびその機能的断片由来のマンニトール脱水素酵素をコードするＣＢＳＵ−葯サブトラクションライブラリー（ＣＡＳ１）遺伝子のＺｍＣＡＳ１プロモーターが記載されている。ＺｍＣＡＳ１プロモーター（「ＣＡＳ１プロモーター」、「マンニトール脱水素酵素プロモーター」、「ｍｄｈプロモーター」とも呼ばれる）は、化学処理またはストレス処理によって誘導することができる。化学物質は、限定はされないが、Ｎ−（アミノカルボニル）−２−クロロベンゼンスルホンアミド（２−ＣＢＳＵ）などの毒性緩和剤であり得る。ストレス処理は、限定はされないが、熱ショック処理などの熱処理であり得る（２０１５年２月２５日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／１２０４２１号明細書も参照されたい。
【０１７７】
植物細胞に有用な様々な種類の新しいプロモーターが絶えず発見されており、多くの例が、ＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ編集（１９８９）のＴｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．１１５、Ｓｔｕｍｐｆ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ、ｅｄｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ．１−８２）中に見出すことができる。
【０１７８】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列間のポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、報告されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ、（１９９５）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：２２５−２３６）。
【０１７９】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」または「終止配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる、調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１−６８０に例示されている。
【０１８０】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写によりえられる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物またはプレｍＲＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物プレＲＮＡの転写後のプロセシングで得られたＲＮＡである場合、成熟ＲＮＡまたはｍＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃｒＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、かつ逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは単鎖であってよく、あるいはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、二本鎖形態に変換することができる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳され得る。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であり、かつ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち５’末端非コーディング配列、３’末端非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列との相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【０１８１】
本明細書で使用する場合、「作動可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方により調節されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することができる場合には、このコード配列に作動可能に連結されている（すなわち、このコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に、作動可能に調節配列と結合することができる。別の例では、相補的ＲＮＡ領域は、直接または間接的に、標的ｍＲＮＡの５’末端、もしくは標的ｍＲＮＡの３’末端と、または標的ｍＲＮＡ内で作動可能に結合することができるか、あるいは最初の相補的領域は５’末端であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’末端である。
【０１８２】
本明細書で使用される、標準の遺伝子組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野ではよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に、より詳しく説明されている。形質転換法は当業者にはよく知られており、以下で説明する。
【０１８３】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなる。通常、二本鎖ＤＮＡは熱変性を起こし、標的セグメントの３’末端バウンダリーに相補的な２つのプライマーが低い温度でＤＮＡにアニーリングされ、その後、中間温度で伸長する。これら３つの連続した工程の１セットを「サイクル」と呼ぶ。
【０１８４】
用語「組み換え」は、例えば化学合成による、または、遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの、通常であれば分離しているセグメントの人工的な結合を指す。
【０１８５】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子をしばしば運ぶ、追加の染色体要素を指し、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。そのような要素は、多くのヌクレオチド配列が、目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に連結されている、または組み換えられている任意の起源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状のまたは環状の、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。「形質転換カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、宿主にその遺伝子を発現させることのできる要素を有する特定のベクターを指す。
【０１８６】
用語「組み換えＤＮＡ分子」、「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「コンストラクト」、「コンストラクト」および「組み換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書では互換的に使用される。組み換えコンストラクトは、自然界では一緒に見出されるとは限らない、核酸断片、例えば、調節配列およびコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、コンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列を含み得るか、または同一起源に由来するが、自然界に見出されるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、それだけで使用し得るか、またはベクターと共に使用し得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者にはよく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えばプラスミドベクターを使用することができる。熟練した職人は、宿主細胞を成功裡に形質転換し、選択し、そして増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。熟練した職人は、また、異なる、独立した形質転換イベントは、異なる発現レベルとパターンをもたらすこと（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルとパターンを示す系統を得るためには、多重イベントは通常スクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素もしくは活性分析、および／または表現型分析を含む、標準の分子生物学的、生化学的および他の分析法により行い得る。
【０１８７】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかの形態の機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を指す。
【０１８８】
用語「導入」は、化合物、例えば、限定はされないが、核酸（例えば発現コンストラクト）またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を細胞内へ導入、提供すること、それらを細胞と接触させることを含む。導入は、ポリヌクレオチドの直接送達（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチド、直鎖もしくは環状ポリヌクレオチドなどの）を含み、かつ／またはタンパク質（ポリペプチド）の直接送達を含む。導入は、核酸またはポリペプチドを真核または原核細胞（ここで核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る）へ組み込むことへの言及を含み、かつ、核酸またはタンパク質を細胞へ一過性に導入することを含む。導入は、安定なまたは一過性の形質転換法、軽質移入、形質導入法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換、弾道粒子加速法、ウィスカー媒介形質転換および有性交雑を含む。このように、核酸断片（例えば、組み換えＤＮＡコンストラクト／発現コンストラクト、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、鋳型ＤＮＡ、ドナーＤＮＡ）を細胞に挿入するという文脈での「導入」は、「軽質移入」、「形質転換」または「形質導入」を含み、真核または原核細胞（ここで核酸断片は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自律性レプリコンに変換されるか、または一過性に発現し得る（例えば、軽質移入ｍＲＮＡ））へ核酸を組み込むことを含む。
【０１８９】
生命体への組成物の導入、接触および／または提供のために、安定形質転換法、一過性形質転換法、ウイルス法、有性交雑および有性育種を含む、多様な方法が知られている。安定形質転換は、導入されたポリヌクレオチドは、生命体のゲノムに組み込まれ、その子孫によって継承され得ることを意味する。一過性形質転換は、導入された組成物は、生命体の中で一時的にのみ発現または存在することを意味する。
【０１９０】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞または生命体への接触、提供、導入のためのプロトコルは知られており、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３４および米国特許第６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換法（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション法（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−６、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換法（米国特許第５，５６３，０５５号明細書および同第５，９８１，８４０号明細書）、ウィスカー媒介形質転換法（Ａｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：１１２６−１１３４；Ｓｈａｈｅｅｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ａｒｓｈａｄ  ２０１１  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ（２０１１），３４５−３５８  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒｏｓａｒｉｏ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：ＩｎＴｅｃｈ、Ｒｉｊｅｋａ、Ｃｒｏａｔｉａ．ＣＯＤＥＮ：６９ＰＱＢＰ；ＩＳＢＮ：９７８−９５３−３０７−２０１−２）遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯＪ３：２７１７−２２）および弾道粒子加速法（米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）”Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ”  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ＆  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：４２１−７７；Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（ｏｎｉｏｎ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８７：６７１−４（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７Ｐ：１７５−８２（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９６：３１９−２４（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−４０（ｒｉｃｅ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書および同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１：４４０−４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀草類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））；Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ９：４１５−８）およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８４：５６０−６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ４：１４９５−５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １２：２５０−５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−１３（コメ）ならびにＯｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：７４５−５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）経由トウモロコシ）が含まれる。
【０１９１】
あるいは、ポリヌクレオチドは、細胞または生命体とウイルスまたはウイルス性核酸とを接触させることにより、細胞または生命体に導入され得る。一般に、そうした方法は、ポリヌクレオチドをウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。いくつかの実施例では、目的のポリペプチドは、最初、ウイルス性ポリタンパク質の一部として合成され、これは、後でインビボまたはインビトロのタンパク質分解処理を受けて、所望の組み換えタンパク質を生成し得る。ウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを植物体に導入し、そこにコードされているタンパク質を発現させる方法は知られており、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書および同第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。一過性形質転換法は、限定はされないが、二本鎖切断誘発剤などのポリペプチドの生命体への直接導入、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入、および二本鎖切断誘発剤をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物の生命体への導入を含む。そのような方法は、例えば、マイクロインジェクション法または粒子撃ち込み法を含む。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０２：１７９−８５；Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ４４：５３−８；Ｈｅｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１７６−８０；およびＨｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０７：７７５−８４を参照されたい。
【０１９２】
ガイドされたＣａｓシステムの、いずれかのまたは全ての構成要素（タンパク質および／または核酸）の摂取を容易にする分子を使用する方法、例えば細胞貫通ペプチドおよびナノキャリアを含む任意の方法で、核酸およびタンパク質を、細胞に提供することができる。米国特許出願公開第２０１１／００３５８３６号明細書  Ｎａｎｏｃａｒｉｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、および欧州特許出願公開第２８２１４８６Ａ１号明細書Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１９３】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを複合体の細胞への導入は、前記複合体の個々の構成要素を別々に、もしくは化学結合させて、または直接（ガイド用ＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼ用タンパク質の直接送達）もしくは構成要素（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）を発現する組み換えコンストラクト経由で、細胞へ導入することを含む。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の細胞への導入は、リボヌクレオチド−タンパク質としてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞へ導入することを含む。リボヌクレオチド−タンパク質は、本明細書に記載のように、細胞に導入する前に組み立てることができる。
【０１９４】
植物細胞はヒトおよび動物細胞とは、植物細胞が、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の直接送達および／またはＲＧＥＮ構成要素の直接送達に障壁として作用する、植物細胞壁を有する点で異なる。
【０１９５】
本明細書に記載のように、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の植物細胞への直接送達は、微粒子銃法（粒子撃ち込み法により達成することができる。本明細書に記載の実験に基づき、熟練職人は今では、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の植物細胞への送達に、他の如何なる直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション法、細胞貫通ペプチド法またはメタ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介タンパク質直接送達法などを成功裡に使用できると想像することができる。
【０１９６】
本明細書に記載のように、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の直接送達は、その後、複合体が急速に分解し、細胞内での複合体の存在が一時的となるような形での、細胞ゲノムの標的部位におけるゲノム編集を可能にする。このＲＧＥＮ複合体の一時的存在は、オフターゲットになる結果を減少させることに繋がり得る。対照的に、プラスミドＤＮＡ配列によるＲＧＥＮ構成要素（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）の送達は、これらのプラスミドからのＲＧＥＮのコンスタントな発現をもたらし、これはオフターゲットになる結果を増強する（Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１：９５８４−９５９２；Ｆｕ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８２２−８２６を参照されたい。
【０１９７】
直接送達は、ＲＮＡにガイドされたエンドヌクレアーゼの任意の１構成要素（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、ｇＲＮＡまたはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ）またはＲＧＥＮ複合体それ自身と、限定はされないが、金粒子、タングステン粒子および炭化ケイ素ウィスカー粒子などの微粒子を含む送達マトリックスとを化学結合させることにより達成することができる。微粒子をプラスミドＤＮＡおよび目的ＤＮＡに化学結合させるために、本明細書で説明した結合法の例は、ガイドＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、Ｃａｓタンパク質およびＲＧＥＮ複合体の微粒子へのコーティングにも使用することができる。
【０１９８】
これらのコーティングされた微粒子は、実施例８に記載の粒子撃ち込み法などの、当該技術分野で知られている任意の直説法により細胞に導入することができる。ＲＧＥＮ構成要素をマイクロ粒子にコーティングするために、微粒子とＲＧＥＮ構成要素またはＲＧＥＮ複合体とを任意の物質中で化学結合させる（混合する）ことができる。例えば、ＲＧＥＮ構成要素は、任意の適切なバッファー（例えば、比限定的に水溶性カチオン性脂質、例えば、限定はされないが、ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０トランスフェクション試薬など（カタログ番号ＭＩＲ  ５４０４、Ｍｉｒｕｓ、ＵＳＡ））を使用して、直径が少なくとも０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ，０．５μｍ，０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍまたは１．０μｍの範囲の金ペレット上に沈殿させることができる。ＲＧＥＮ構成要素の溶液は、少なくとも、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ、６．０μｇ、７．０μｇ、８．０μｇ、９．０μｇまたは１０μｇのＲＮＡ（ガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡ）またはＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を使用して、氷上で（または、微粒子への結合に適切な任意の温度で）調製することができる。予め混合したＲＧＥＮ複合体のＲＧＥＮ構成要素に、少なくとも１μｌ〜２０μｌの調製した微粒子を加え、注意深く混合することができる。
【０１９９】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入する方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ分子と少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を化学結合させて、リボヌクレオチド−タンパク質を生成させ、前記リボヌクレオチド−タンパク質を粒子送達マトリックスと化学結合させて、前記リボヌクレオチド−タンパク質とマトリックスとを結合させ、リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を生成させ；前記リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を前記細胞に導入することを含む方法を含む。粒子送達マトリックスは、カチオン性脂質と化学結合した微粒子を含むことができる。
【０２００】
用語「カチオン性脂質」は、水溶性カチオン性脂質、例えば、限定はされないが、ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０など、またはカチオン性脂質溶液、例えば、限定はされないが、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジ（オレオイルオキシ）−１、４−ブタンジアンモニウムヨウ素およびＬ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（２００７年８月２日に公開された米国特許出願公開第２００７／０１７８５９３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）などを含むカチオン性脂質溶液を含む。
【０２０１】
粒子送達マトリックスは、金粒子、タングステン粒子および炭化ケイ素ウィスカー粒子からなる群から選択された偽粒子を含むことができる。
【０２０２】
粒子送達マトリックスは、Ｔｆｘ−１０（商標）、Ｔｆｘ−２０（商標）、Ｔｆｘ−５０（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  ＧＳＶ（商標）、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｌｉｐｉｄｓ（商標）、ＤＯＴＡＰ（商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）、ＦｕＧＥＮＥ−６（商標）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）、Ｐｏｌｙｆｅｅｔ（商標）、ポリエチレンイミン、キトサン、プロタミンＣｌ、ヒストンＨ１、ヒストンＣＥＮＨ３、ポリ−ＬリシンおよびＤＭＳＡ（２００７年８月２日公開の米国特許出願公開第２００７／０１７８５９３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択された化合物をさらに含むことができる。
【０２０３】
ＲＧＥＮ構成要素は、また、微粒子にコーティングされる前に、少なくとも０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ、６．０μｇ、７．０μｇ、８．０μｇ９．０μｇまたは１０μｇのガイドＲＮＡと少なくとも０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ，０．５μｇ，０．６μｇ，０．７μｇ，０．８μｇ，０．９μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ、６．０μｇ、７．０μｇ、８．０μｇ、９．０μｇまたは１０μｇのＣａｓエンドヌクレアーゼを、複合体の生成に適した溶液（限定はされないが、Ｃａｓ９バッファー（ＮＥＢ）など）中、複合体の生成に適した任意の温度、例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３．０℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３．０℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃および４０℃の範囲の温度などで化学結合させることにより、化学結合させることができる。
【０２０４】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入する方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ分子と、少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とを細胞に導入し、かつ適切な条件下で前記細胞を培養して、前記細胞内で、前記ガイドＲＮＡと前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質との複合体を形成させる方法を含む。
【０２０５】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入する方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ分子と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする少なくとも１種のｍＲＮＡとを細胞に導入し、かつ適切な条件下で前記細胞を培養し、前記ｍＲＮＡに前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を翻訳させて前記ガイドＲＮＡと複合体を形成させる方法を含む。
【０２０６】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入する方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ分子と、少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とを化学結合させてリボヌクレオチド−タンパク質を生成させ、前記リボヌクレオチド−タンパク質と粒子送達マトリックスとを化学結合させて、前記リボヌクレオチド−タンパク質とマトリクスとを結合させてリボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を形成させ；かつ前記リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を少なくとも１種のポリヌクレオチド鋳型と共に前記細胞に導入する（ここで、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記細胞のゲノム内ヌクレオチド配列に少なくとも１つのヌクレオチドの改変を含み、前記ポリヌクレオチド改変鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される）方法を含む。
【０２０７】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入する方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ分子と、少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とを化学結合させて、リボヌクレオチド−タンパク質を生成させ、前記リボヌクレオチド−タンパク質を粒子送達マトリックスと化学結合させ、前記リボヌクレオチド−タンパク質とマトリックスとを結合させてリボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を形成させ；かつ前記リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体をドナーＤＮＡと共に前記細胞に導入する（ここで、前記ドナーＤＮＡは少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドを含む）方法を含む。
【０２０８】
細胞を培養する適切な条件は、当該技術分野でよく知られており、熟練職人は、細胞の種類に基づき任意の培養条件（植物細胞に適した条件など）を使用することができる。実施例８に記載のように、植物の胚または細胞は、当該技術分野で知られている任意の植物体メンテナンス培地（限定はされないが、５６０Ｐなど、実施例８）中、２６℃〜３７℃の温度範囲で、１２〜４８時間インキュベートすることができ、その後、２６℃の場所に置くことができる。５〜７日後、胚／細胞を当該技術分野で知られている任意の選択培地（限定はされないが、５６０Ｒ、実施例８）に移し、その後継代培養する。
【０２０９】
ＲＧＥＮ構成要素（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む）は、微粒子にコーティングする（微粒子と化学結合させる）前に、少なくとも０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ、６．０μｇ、７．０μｇ、８．０μｇ、９．０μｇまたは１０μｇのガイドＲＮＡを、少なくとも０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、３．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ、６．０μｇ、７．０μｇ、８．０μｇ、９．０μｇまたは１０μｇのＣａｓエンドヌクレアーゼと、複合体を形成させるのに適した溶液（限定はされないが、Ｃａｓ９バッファー（ＮＥＢ）など）中で、複合体を形成させるのに適した温度、例えば１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃および４０℃の範囲の温度などで化学結合させることにより、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成させるために化学結合させることができる。
【０２１０】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチド）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在している）を指す。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るが、これに限定はされない。
【０２１１】
「安定な形質転換」は、核酸断片が、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両者を含む、宿主生命体のゲノムへ移動し、遺伝子的に安定な継承をもたらすことを指す。対照的に「一過性形質転換」は、核酸断片が、宿主生命体の核または他のＤＮＡ含有細胞小器官へ移動し、組み込まれることなく、あるいは安定に継承されずに発現することを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生命体を「トランスジェニック」生命体と称する。
【０２１２】
遺伝子的に改良された生殖質の商業的開発も、複数の形質を作物に導入する段階にまで進んできており、しばしばこれを遺伝子スタッキングアプローチという。このアプローチでは、目的の異なる特性を付与する、複数の遺伝子を植物体に導入することができる。遺伝子スタッキングは、限定はされないが、共形質転換、再形質転換および目的の異なる遺伝子を有する系統の交雑を含む、多くの手段で達成される。
【０２１３】
細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、および植物の細胞ならびに本明細書に記載の方法によって産出された植物および種子の細胞が挙げられる。植物細胞としては、トウモロコシ、コメ、ソルガム、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草またはスイッチグラス、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、トマト、タバコ、シロイロナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびベニバナの細胞からなる群から選択された細胞が挙げられる。
【０２１４】
用語「植物体」は、植物体全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞およびその子孫を含む。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子の細胞が挙げられる。植物体の部分には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物体中に、または植物器官、組織、もしくは細胞培養物中に存在し得る。用語「植物器官」は、形態的にも機能的にも区別された植物体の部分を構成する、植物組織または組織群を指す。用語「ゲノム」は、生命体の各細胞、またはウイルスもしくは細胞小器官に存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の相補体の全体；ならびに／あるいは１つの親から１つの（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を指す。「子孫」は、植物体のその後の世代を含む。
【０２１５】
トランスジェニック植物体としては、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物体が挙げられる。異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが後代に継承されるよう、ゲノムに安定に組み込むことができる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で、または組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込んでもよい。トランスジェニック植物体はまた、ゲノム内に複数の異種ポリヌクレオチドを含むことができる。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物体に異なる形質を付与してもよい。異種ポリヌクレオチドとして、外来種を起源とする配列を挙げることができ、あるいは、同種からの配列であれば、その天然形態から大幅に改変することができる。トランスジェニック体としては、異種の核酸の存在によってその遺伝子型を変化させた、任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物体の部分または植物体（初めからそのように変更されたトランスジェニック体、および初めのトランスジェニック体から有性交雑または無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の植物育種方法による、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集手順による、または自然に発生するイベント（ランダム交雑受精、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え転位もしくは自然変異など）による、ゲノム（染色体または染色体外の）の変化を、トランスジェニックと見なすことは意図されていない。
【０２１６】
本開示のある特定の実施形態では、稔性植物は、生存可能な雄性および雌性配偶子を生み出す植物であり、自家稔性植物である。そのような自家稔性植物は、他の植物の配偶子や、それに含まれる遺伝物質の貢献によらずに子孫の植物体を作ることができる。本開示の他の実施形態は、植物が生存可能な、またはそうでなければ受精可能な雄性配偶子もしくは雌性配偶子または両者を作らないことから、自家稔性でない植物を使用することがある。本明細書で使用する場合、「雄性不稔植物」は生存可能な、またはそうでなければ受精可能な雄性配偶子を作らない植物である。本明細書で使用する場合、「雌性不稔植物」は生存可能な、またはそうでなければ受精可能な雌性配偶子を作らない植物である。雄性不稔植物および雌性不稔植物はそれぞれ、雌性稔性および雄性捻性であり得ることが認められている。さらに、雄性稔性（雌性捻性以外）植物は、雌性稔性植物と交雑されると、生存可能な子孫を産生することができ、また、雌性稔性（雄性捻性以外）植物は、雄性稔性植物と交配されると、生存可能な子孫を産生することができことが認められている。
【０２１７】
本明細書では、非従来型酵母は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種でない任意の酵母を指す。非従来型酵母は、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ、Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載がある。ある特定の実施形態では、非従来型酵母は、さらに（または代替的に）相同組み換え（ＨＲ）に媒介される修復プロセスよりも、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母であり得る。この線―ＨＲよりもＮＨＥＪを好む―に沿った非従来型酵母の定義は、さらにＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ８：ｅ５７９５２）により開示されている（これは参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書中で好ましい非従来型酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のもの（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））である。本明細書中の用語「酵母」は、主に単細胞の形態で存在する真菌種を指す。本明細書では、酵母は代替的に「酵母細胞」と呼ぶことがある（２０１４年８月１３日に出願された米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これは参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
【０２１８】
「センチモルガン」（ｃＭ）または「地図単位」は、２つの連結遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座またはこれらの任意のペア間の距離であり、減数分裂の産物の１％が組み換え体である。したがって、センチモルガンは、二つの連結遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座またはこれらの任意のペアの間の、１％の平均組み換え頻度に等しい距離と等価である。
【０２１９】
本開示では、１種またはそれより多くの導入された形質を含む植物の育種で使用している。最も一般的には、トランスジェニック形質は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、微粒子銃または他の一般に使用される手順に基づく形質転換システムの結果、植物ゲノムの至る所でランダムに挿入される。つい最近、部位指定導入遺伝子の挿入を可能にする、遺伝子標的プロトコルが開発された。１つの重要な技術、部位特異的組み込み（ＳＳＩ）は、導入遺伝子が、前に挿入された導入遺伝子と同じ染色体位置を標的とすることを可能にする。カスタム設計のメガヌクレアーゼおよびカスタム設計の亜鉛フィンガーメガヌクレアーゼにより、研究者は特異的な染色体の位置を標的とするヌクレアーゼを設計することができ、これらの試薬により導入遺伝子は、これらの試薬により切断された染色体部位を標的とすることができる。
【０２２０】
真核ゲノム、例えば植物ゲノムの精密遺伝子工学で現在使用しているシステムは、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような転写活性化因子を誘導することを頼りにしており、これはそれぞれの新しい標的遺伝子座に対するデノボタンパク質工学を必要とする。本明細書に記載の、高度に特異的な、ＲＮＡ指定ＤＮＡヌクレアーゼであるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムは、多くの異なる標的配列の改変を目的とするときには、より容易にカスタム化でき、したがって、より有用である。
【０２２１】
ヌクレアーゼのオフターゲット切断が標的細胞に有毒となる場合、本明細書に記載のガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムは、ゲノム工学、特に植物ゲノム工学にとって特に有用である。本明細書に記載のガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムのある実施形態では、発現最適化Ｃａｓ９遺伝子が、安定に標的ゲノム、例えば植物ゲノムに組み込まれる。Ｃａｓ９遺伝子の発現は、プロモーター、例えば植物プロモーター（これは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、温度誘導性、ストレス誘導性、発生段階誘導性または化学的誘導プロモーターであり得る）の制御下にある。ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが存在しない場合、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡを切断できず、したがって、植物細胞中のその存在は殆どまたは全く影響しないであろう。したがって、本明細書に記載のガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムの重要な利点は、細胞の生存に殆どまたは全く影響せずに、Ｃａｓ９タンパク質を効率的に発現することができる、細胞系統またはトランスジェニック生命体を生み出し、維持する能力にある。標的遺伝子の改変を行うために所望のゲノム部位で切断を誘発するには、安定に組み込まれ、発現したＣａｓ９遺伝子を含有する細胞に、様々な方法でガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、化学合成または酵素合成することができ、粒子衝突法またはエレクトロポレーション法などの直接送達法によりＣａｓ９発現細胞に導入することができる。あるいは、標的細胞中でガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを効率的に発現できる遺伝子は、化学的に、酵素的にまたは生物学的システム中で合成でき、これらの遺伝子は粒子衝突法、エレクトロポレーション法または生物学的送達法、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介ＤＮＡ送達などの直接送達法により、Ｃａｓ９発現細胞に導入することができる。
【０２２２】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムによる遺伝子の標的化は、導入遺伝子の挿入を指示するための方法および／または複数の導入遺伝子を含む、複雑なトランスジェニック形質の遺伝子座を作り出す方法で、国際公開第２０１３／０１９８８８８号パンフレット（２０１３年８月１日公開）で開示されているのと類似の仕方、すなわち目的遺伝子の導入に二本鎖切断誘発剤を使用する代わりに、本明細書で開示のガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムを用いる仕方で使用することができる。複雑な形質遺伝子座は、遺伝子的に互いに関連した複数の導入遺伝子を有するゲノムの遺伝子座を含む。独立した導入遺伝子を、互いに０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２、または５センチモルガン（ｃＭ）以内に挿入することにより、単一の遺伝子座として導入遺伝子を繁殖させることができる（例えば、米国特許出願第１３／４２７，１３８号明細書、またはＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３００６１号明細書を参照されたい）。１つの導入遺伝子を含む植物体を選択後、（少なくとも）１つの導入遺伝子を含有する植物体を交雑させ、両導入遺伝子を含有するＦ１を形成することができる。これらのＦ１（Ｆ２またはＢＣ１）からの子孫のうち、１／５００の子孫は、同一の染色体上に組み換えられた２つの異なる導入遺伝子を有するであろう。その後、複雑な遺伝子座は、単一遺伝子座として両導入形質とともに繁殖することができる。この過程は繰り返すことができ、所望する形質を幾らでも積み上げることができる。
【０２２３】
目的の表現型または形質と関係する染色体間隔を同定することができる。染色体間隔を同定するには、当該技術分野でよく知られている様々な方法を利用できる。そのような染色体間隔の境界は、目的の形質を制御する遺伝子に関連するマーカーを包含するよう引かれる。言い換えれば、染色体間隔はその間隔（間隔の境界を定義するターミナルマーカーを含む）内に存在する任意のマーカーが、すす紋病耐性のマーカーとして使用できるように決められる。ある実施形態では、染色体間隔は、少なくとも１つのＱＴＬを含み、さらには、実際１つより多くのＱＴＬを含み得る。同じ間隔内に複数のＱＴＬが非常に近接していると、１つのマーカーが１つより多くのＱＴＬと連結するので、特定のマーカーの特定のＱＴＬとの関連が不明確になる。逆に、例えば、非常に近接している２つのマーカーが目的の表現型形質と共分離しているならば、これらのマーカーのそれぞれが同じＱＴＬを、または２つの異なるＱＴＬを特定しているのかどうか、しばしば不明確になる。用語「量的形質遺伝子座」または「ＱＴＬ］は、少なくとも１つの遺伝的背景、例えば、少なくとも１つの育種集団の中における、量的表現型形質の発現差異に関連するＤＮＡの領域を指す。ＱＴＬ領域は、問題の形質に影響する遺伝子を包含するか、またはそうした遺伝子と緊密に関連している。「ＱＴＬのアレル」は、ハプロタイプなどの、連続したゲノム領域内または連鎖群内に、複数の遺伝子または他の遺伝因子を含むことができるＱＴＬのアレルは、特定のウィンドウ内のハプロタイプを意味することができ、前記ウィンドウは、１つまたはそれより多くの多型マーカーのセットで定義し、かつ追跡ができる連続したゲノム領域である。ハプロタイプは、特定のウィンドウ内の各マーカー位置で、アレルの固有の指紋によって定義することができる。
【０２２４】
標的部位またはその近傍に変更されたゲノムを有する、それらの細胞を、スクリーンマーカー表現型を使用せずに同定するには、様々な方法が利用できる。そうした方法は、標的配列中の変化を検出するための、標的配列の直接分析と見なすことができ、限定はされないが、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２２５】
タンパク質は各種の方法で変更でき、アミノ酸の置換、削除、トランケーションおよび挿入が挙げられる。そうした操作法は、一般に知られている。例えば、タンパク質のアミノ酸配列変異体をＤＮＡの変異により作製することができる。変異誘発法およびヌクレオチド配列の変更法として、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７−８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそこで引用された文献が挙げられる。タンパク質の生物学的活性に影響を与えそうにないアミノ酸置換についてのガイダンスとして、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．のモデル、（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）がある。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が好ましいかもしれない。保存的な削除、挿入およびアミノ酸置換は、タンパク質の特性に過激な変化を引き起こさないことが期待され、置換、削除、挿入またはこれらの組み合わせの影響は、ルーチンのスクリーニング分析で評価することができる。二本鎖切断誘発活性の分析法は知られており、一般に、標的部位を含有するＤＮＡ基質上における、試薬の全体の活性と特異性を測定する。
【０２２６】
用語「双子葉植物」は、「ジコチルドネアエ（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）類」としても知られる、被子植物のサブクラスを指し、それには植物体の全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞およびその子孫が含まれる。本明細書で使用するとき、植物細胞は、制限なしに、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む。
【０２２７】
本開示において用語「交雑した」、「交雑する」または「交雑」は、子孫（すなわち、細胞、種子または植物体）を残すための、授粉による配偶子の融合を意味する。この用語は、有性交雑（別の植物体による１つの植物体への授粉）および自殖（自家授粉、すなわち花粉および胚珠（小胞体および大胞子）が同じ植物のものか、または遺伝子的に同じ植物体のもの）の両者を包含する。
【０２２８】
用語「遺伝子移入」は、１つの遺伝的背景から別のものへ、遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。例えば、所望のアレルの特定の座位への遺伝子移入は、２つの親植物体の間の有性交雑により、少なくとも１つの子孫植物体へ伝達することができるが、その場合、少なくとも一方の親植物体は所望のアレルをそのゲノム中に有している。あるいは、例えばアレルの伝達は、例えば融合したプロトプラスト中の２つのドナーゲノムの間の組み換えにより、行うことができるが、その場合、少なくとも一方のドナープロトプラストは所望のアレルをそのゲノム中に有している。所望のアレルは、例えば導入遺伝子、改変した（変異した、または編集した）野生型のアレルまたはマーカーもしくはＱＴＬの選択されたアレルであり得る。
【０２２９】
標準のＤＮＡ分離、精製、分子クローニング、ベクターコンストラクションおよび検証／キャラクタリゼーションの方法は十分に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。ベクターおよびコンストラクトには、環状プラスミドおよび線形ポリヌクレオチドが含まれ、これらには目的のポリヌクレオチド、および場合によりリンカー、アダプター、調節要素または分析要素を含む、他の構成要素が含まれる。いくつかの実施例では、認識部位および／または標的部位は、イントロン、コード配列、５’末端ＵＴＲ、３’末端ＵＴＲおよび／または調節領域内に含有させることができる。
【０２３０】
本開示は、植物体、植物細胞または植物の一部分に、標的部位に結合でき、その部位を二本鎖切断することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムを発現させるためのコンストラクトをさらに提供する。ある実施形態では、本開示の発現コンストラクトは、Ｃａｓ遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターおよび本開示のガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、植物細胞で作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現を駆動することができる。
【０２３１】
単子葉植物および双子葉植物を含む、あらゆる植物を使用することができる。使用可能な単子葉植物の例としては、限定はされないがトウモロコシ（ゼアマイズ（Ｚｅａ・ｍａｙｓ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、トウジンビエ（例えばトウジンビエ、ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、コムギ（トリティクム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、サトウキビ（サッカルム属の種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．））、カラスムギ（アヴィーナ属（Ａｖｅｎａ））、オオムギ（ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、バナナ（ムサ属の種（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物および芝草が挙げられる。使用可能な双子葉植物の例として、限定はされないが、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））、キャノーラ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓおよびブラシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アラビドプシス（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアントゥス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ））、ワタ（ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ））およびラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ））、トマト（ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラナム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））などが挙げられる。
【０２３２】
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」マイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」ミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、そして「ｋｂ」キロベースを意味する。
【０２３３】
本明細書で開示する組成物および方法の非限定的な例は下記の通りである。
１．選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；
前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程（ここで、前記選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法。
１ｂ．選択マーカーを使用せずに植物細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、前記ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物細胞を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法。
２．選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法。
２ｂ．選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物体を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞から植物体を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有する植物体を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法。
３．選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物カルス組織を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞からカルス組織を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有するカルス組織を選択する工程（ここで、その選択は選択マーカーの使用なしで生じる）とを含む方法。
３ｂ．選択マーカーを使用せずにゲノム中に改変されたヌクレオチド配列を有する植物カルス組織を作製する方法であって、少なくとも１つの植物細胞に、ヌクレオチド配列に位置する標的部位で二本鎖切断を行うことができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を導入する工程と；前記植物細胞からカルス組織を得る工程と；前記ヌクレオチド配列に改変を有するカルス組織を選択する工程（ここで、前記選択は選択マーカーの使用なしで生じる）と
を含む方法。
４．改変は、前記標的部位での、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、または少なくとも１つのヌクレオチドの置換からなる群から選択される実施形態１〜３ｂの方法。
５．ポリヌクレオチド改変鋳型を前記植物細胞へ導入する工程（ここで、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む）をさらに含む実施形態１〜３ｂの方法。
６．前記ポリヌクレオチド改変鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される実施形態５の方法。
７．（ａ）の植物細胞にドナーＤＮＡを導入する工程（ここで、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位に挿入すべき少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む）をさらに含む実施形態１〜３ｂの方法。
８．導入は、前記細胞への選択マーカーの導入を含まない実施形態１〜３ｂの方法。
９．導入は、破壊された選択マーカー遺伝子の、機能的選択マーカータンパク質をコードする非破壊選択マーカー遺伝子への修復を含まない実施形態１〜３ｂの方法。
１０．導入は、前記細胞内に選択マーカーを生成しない実施形態１〜３ｂの方法。
１１．選択は、選択マーカーの同定または使用を含まない実施形態１〜３ｂの方法。
１２．選択は、前記植物体の単離されたＤＮＡのシークエンシングによって生じる実施形態１〜３ｂの方法。
１３．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、インビトロで構築され、リボヌクレオチド−タンパク質複合体として導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１３ｂ．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、インビトロで構築され、リボヌクレオチド−タンパク質複合体として導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１３ｃ．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、組み換えＲＮＡコンストラクトを使用せずに細胞に導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１４．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成可能な、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質として導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１５．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、前記ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとして、およびガイドＲＮＡを含むＲＮＡとして導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１６．
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の構成要素は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子として導入される実施形態１〜３ｂの方法。
１７．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、細胞の内部で構築される実施形態１〜３ｂの方法。
１８．前記リボヌクレオチド−タンパク質複合体は、粒子送達マトリックスに被覆されるか、または粒子送達マトリックスと組み合わされて、リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体を形成し、前記リボヌクレオチド−タンパク質−マトリックス複合体が前記細胞に導入される実施形態１３の方法。
１８ｂ．前記粒子送達マトリックスは、少なくとも１種の微粒子を含む実施形態１８の方法。
１８ｃ．粒子送達マトリックスは、陽イオン性脂質と組み合わされた少なくとも１種の微粒子を含む実施形態１８の方法。
１８ｄ．前記微粒子は、金粒子、タングステン粒子および炭化ケイ素ウィスカー粒子からなる群から選択される実施形態１８ｃ〜１８ｃの方法。
１８ｅ．植物細胞は、体細胞胚細胞である実施形態１〜３ｂの方法。
１９．植物細胞は、プロトプラストではない実施形態１〜３ｂの方法。
２０．植物細胞は、単子葉植物細胞および双子葉植物細胞からなる群から選択される実施形態１〜３ｂの方法。
２１．植物細胞は、トウモロコシ、イネ、ソルガム、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、またはスイッチグラス、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、トマト、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、およびベニバナ細胞からなる群から選択される実施形態２１の方法。
２２．植物細胞から植物体を再生することをさらに含む実施形態１〜３ｂの方法。
２３．実施形態２２の方法によって作製された植物体。
２４．実施形態２３の植物体の子孫植物であって、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド改変鋳型およびドナーＤＮＡからなる群から選択される構成要素のいくつかを持たない子孫植物。
【実施例】
【０２３４】
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本開示の実施形態を示すものであるが、例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させることができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０２３５】
実施例１
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ発現カセットの送達による、植物細胞ゲノムの標的ＤＮＡ配列の改変
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１  ＧＡＳ（ＳＦ３７０）株のＣａｓ９遺伝子（配列番号１）は、当該技術分野における標準の手法を用いて最適化されたトウモロコシのコドンであり、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）中でのその発現を抑えるために、ジャガイモのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号２）が導入された。トウモロコシ細胞中のＣａｓ９タンパク質の核局在化を容易にするために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）単節型アミノ末端核局在化シグナル（ＭＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号３）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の双節型ＶｉｒＤ２  Ｔ−ＤＮＡ端部エンドヌクレアーゼカルボキシル末端核局在化シグナル（ＫＲＰＲＤＲＨＤＧＥＬＧＧＲＫＲＡＲ、配列番号４）を、それぞれＣａｓ９のオープンリーディングフレームのアミノおよびカルボキシル末端に組み込んだ。標準的な分子生物学的手法により、トウモロコシに最適化されたＣａｓ９遺伝子を、トウモロコシの構成的プロモーター（ユビキチン）に作動可能に連結した。ジャガイモのタンパク質分解酵素阻害ＩＩ遺伝子（ＰｉｎＩＩ）の３’末端配列を加えることで、転写を終了させ、ＵＢＩ：Ｃａｓ９：ＰｉｎＩＩベクターを作製する。ユビキチン駆動トウモロコシ最適化Ｃａｓ９発現カセットの配列を配列番号５に示す。
【０２３６】
単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−２６）に記載の方法を用いて設計した。トウモロコシＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよびターミナーターを単離し、それぞれｇＲＮＡの開始および終了を指示するために使用した。トウモロコシゲノムＤＮＡ標的配列のｇＲＮＡ発現コンストラクトへの急速導入を容易にするために、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−２３）に記載のように、２つのＢｂｓＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、切断部を外側に向けて逆方向に縦列で導入した。ｇＲＮＡの好ましいポリメラーゼＩＩＩ発現を促進するために、Ｇヌクレオチドで始まる標的配列のみを使用した。ｇＲＮＡ発現カセットをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（配列番号６）にサブクローン化した。
【０２３７】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介して、トウモロコシ最適化Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体がトウモロコシ染色体ＤＮＡの標的変異を認識し、切断し、かつ促進するか否かを試験するために、５つのトウモロコシ遺伝子座（各遺伝子座に３つの異なるゲノム配列）を切断標的とし（表２）、アンプリコンディープシーケンシングにより変異の存在を調べた。
【０２３８】
【表２】
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【０２３９】
トウモロコシ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび特定のトウモロコシ可変標的ドメインを含有するｇＲＮＡ発現カセットを、選択および視認マーカー（ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ：ＤｓＲＥＤ融合体）ならびに発生遺伝子ＺｍＯＤＰ−２（ＢＢＭ）およびＺｍＷＵＳ２（ＷＵＳ）（実施例９を参照）と共に粒子撃ち込み（実施例８を参照）を行うことよって、６０−９０Ｈｉ−ＩＩ未成熟トウモロコシ胚へ共送達した。Ｃａｓ９またはｇＲＮＡ発現カセットのみで形質転換した、Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ胚を負の対照とした。７日後、２０〜３０個の最も均一に形質転換した、各処理からの胚を（ＤｓＲＥＤ蛍光タンパク質の一過性発現に基づき）プールし、ゲノムＤＮＡの全体を抽出した。意図した標的部位を囲む領域を、２ラウンドのＰＣＲを通して「テール配列を付加した」プライマーを用いる、アンプリコン特異的バーコードおよびＩｌｌｕｍｎｉａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのために必要な配列を加える、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５３１Ｌ）とともにＰＣＲ増幅した。プライマリーＰＣＲ反応で使用したプライマーを表３に示す。
【０２４０】
【表３−１】
2018531024.tif 000006
【０２４１】
【表３−２】
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【０２４２】
【表３−３】
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【０２４３】
セカンダリーＰＣＲ反応で使用したプライマーは、ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧ（順方向、配列番号３７）およびＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡ（逆方向、配列番号３８）であった。
【０２４４】
得られたＰＣＲ増幅産物をＱｉａｇｅｎ製ＰＣＲ精製スピンカラムで精製し、濃度は等モル比で混合したＨｏｅｃｈｓｔ製染料ベースの蛍光分析により測定し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製ＭｉＳｅｑ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより、ＰｈｉＸ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＦＣ−１１０−３００１）の３０〜４０％（体積／体積）のスパイク濃度からオフセット配列バイアスまでの濃度で、単一の読み取りが１００ヌクレオチド長のディープシーケンシングを実施した。予期される切断部位を中央にした１０ヌクレオチドのウィンドウ内で生じた、≧１ヌクレオチドのインデルが読み取られもので、かつ、負の対照には類似のレベルで見出されないもののみを変異に分類した。同一の変異が読み取られた変異体を数え、単一のグループに纏め、最も高頻度の変異トップ１０は、予期された切断部位内で生じるものとして視覚的に確認された。続いて、変異の全数は、バーコードおよび順方向プライマーに対して完全一致を含む適当な長さの全読み取り数を基準として、変異体読み取りの百分率を計算するのに使用した。
【０２４５】
１５部位の全てを標的としたＣａｓ９−ｇＲＮＡシステムに対する、アンプリコンのディープシーケンシングよって明らかにされた変異の頻度を表４に示す。
【０２４６】
【表４】
2018531024.tif 000009
【０２４７】
さらなる分析によって、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムによって促進された最も一般的なタイプの変異は、単一ヌクレオチド挿入（例えば、図１、配列番号４９−５８を参照）であることが示された。試験したｇＲＮＡの大半で、類似の結果が観察された（表５）。
【０２４８】
【表５】
2018531024.tif 000010
【０２４９】
この実施例は、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９により二本鎖が切断され、高頻度の変異がもたらされることを示す。複数の標的部位における変異の分析により、各種の大きさの欠失および／または挿入が観察されたものの、トウモロコシで試験した大半の標的部位において、単一ヌクレオチド挿入および単一ヌクレオチド欠失が、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ技術で引き起こされる最も高頻度タイプの変異であることが示された。
【０２５０】
実施例２
編集したアセト乳酸シンターゼ遺伝子はクロルスルフロン耐性を付与する
この実施例では、野生トウモロコシのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の特定の変異が、スルホニル尿素クラスの除草剤、具体的にはクロルスルフロンに対する耐性をもたらすことを示す。
【０２５１】
トウモロコシには、２つのＡＬＳ遺伝子、ＡＬＳ１（配列番号３９）およびＡＬＳ２（配列番号４０）があり、それぞれ染色体４と５に位置しており、ＤＮＡレベルで９４％の配列同一性を有している。
【０２５２】
ＡＬＳタンパク質はＮ末端トランジットを含有しており、葉緑体へ移行し、その後トランジットペプチドが切断された後、成熟タンパク質が形成される。成熟タンパク質は、残基Ｓ４１から始まり、推定分子量６５ｋＤａの５９８個のアミノ酸からなる成熟タンパク質を与える（配列番号４１）。
【０２５３】
内因性トウモロコシアセト乳酸シンターゼタンパク質と比べて、単一アミノ酸残基（Ｐ１６５ＡまたはＰ１６５Ｓ、灰色で囲まれている）の変異をもたらすような、ＡＬＳ１またはＡＬＳ２のいずれかのヌクレオチド配列の改変は、トウモロコシに除草剤耐性を与える。
【０２５４】
アセト乳酸シンターゼは、植物の細胞機能にとって極めて重要な酵素であるから、ＡＬＳ１およびＡＬＳ２遺伝子の２アレルの同時ノックアウトは、生き残りを困難にするであろう。したがって、ＡＬＳ１とＡＬＳ２ヌクレオチド配列間の多型に基づき、ＡＬＳ２−特異的ＡＬＳＣａｓ−４標的部位を同定し試験した。対照として、ＡＬＳ１およびＡＬＳ２の両遺伝を標的とする、ＡＬＳＣａｓ−１ガイドＲＮＡ発現コンストラクトを使用した。表６にＡＬＳＣａｓ−１およびＡＬＳＣａｓ−４標的部位に関する情報を示す。
【０２５５】
【表６】
2018531024.tif 000011
【０２５６】
実施例１に記載のようにして、アンプリコンのディープシーケンシングを行い、ＡＬＳＣａｓ−１およびＡＬＳＣａｓ−４における変異の頻度を決定し、表７に示した。
【０２５７】
【表７】
2018531024.tif 000012
【０２５８】
これらの結果は、ＡＬＳＣａｓ−４ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９システムはＡＬＳ１遺伝子よりも約９０倍高い効率でＡＬＳ２遺伝子を変異させることを示している。したがって、ＡＬＳ遺伝子編集実験には、ＡＬＳＣａｓ−４標的部位および対応するＡＬＳ−ＣＲ４  ｇＲＮＡを使用した。
【０２５９】
ＡＬＳ２編集アレルを作製するには、相同断片（配列番号４３）を含む、７９４ｂｐのポリヌクレオチド改変鋳型をプラスミドベクターにクローニングし、２つの１２７ｎｔ一本鎖ポリヌクレオチド改変鋳型（ＤＮＡオリゴとも呼ぶ、Ｏｌｉｇｏ１、配列番号４４、およびＯｌｉｇｏ２、配列番号４５）をポリヌクレオチド改変鋳型として試験した（図２）。７９４ｂｐの断片は、Ｏｌｉｇｏ１と同一の配列の改変を有した。ポリヌクレオチド改変鋳型（修復鋳型）は、野生型配列と比べると数個のヌクレオチドに変異があった。一本鎖Ｏｌｉｇｏ１および７９４ｂｐ修復鋳型には、アミノ酸位置１６５のプロリンに対応するＤＮＡ配列からセリン（Ｐ１６５Ｓ）への編集を指示する単一ヌクレオチド変異、ならびにＡＬＳ−ＣＲ４標的部位およびＰＡＭ配列内に３つの追加の変異があった。修復鋳型内でのＰＡＭ配列の改変は、メチオニンコドン（ＡＵＧ）をイソロイシン（ＡＵＵ）に変えたが、これはＡＬＳ１遺伝子では自然に起こることである。第２の１２７ｎｔ一本鎖オリゴ修復鋳型（Ｏｌｉｇｏ２）は、１５７の位置にメチオニンを保持しているものの、配列中に、ＡＬＳ−ＣＲ４  ｇＲＮＡとの塩基ペアリングに影響を及ぼすであろう３つの追加の単一ヌクレオチド変異を含有するものであるが、これについても試験した（図２）。
【０２６０】
１回の処理当たり約１，０００個の未成熟の胚に２つのオリゴまたは単一プラスミド修復鋳型、Ｃａｓ９、ＡＬＳ−ＣＲ４  ｇＲＮＡおよびＭｏＰＡＴ−ＤｓＲＥＤを入れたＤＮＡ発現カセットを撃ち込み、ＰＡＴにより付与されたビアラホス耐性物を選択するために培地上に置いた。形質転換から５週後、選択培地で生長している、２００個（１回の処理当たり）のランダムに選択した、独立した若いカルスセクターを胚から分離し、新鮮なビアラホスプレートに移した。生長中のカルスイベントを有する残りの胚（１回の処理当たり＞８００）を、編集されたＡＬＳ２遺伝子の直接選択用として、１００ｐｐｍのクロロスルフロンを含有するプレートに移した。一ヶ月後、全部で３８４個のランダムに採取した、ビアラホス上で生長中のカルスセクター（各修復鋳型当たり約１３０イベント）、およびクロルスルフロンを含む培地上で生長を続ける７つのカルスセクターをＰＣＲ増幅および配列を決定することにより分析した。編集したＡＬＳ２アレルは、９つのカルスセクターで検出された：２つは、ビアラホス上で生長中の、７９４ｂｐの修復ＤＮＡ鋳型を使用して生成させたカルスセクターから得られたものであり、残りの７つは１２７ｎｔの一本鎖オリゴを使用して編集（３つはＯｌｉｇｏ１により、４つはＯｌｉｇｏ２により）された、クロロスルフロン耐性カルスセクターから得られたものである。これらのカルスセクターの第２のＡＬＳ２アレルは、ＮＨＥＪ修復の結果変異した。ＡＬＳ１遺伝子の分析を行ったところ、野生型配列のみが示され、ＡＬＳ−ＣＲ４  ｇＲＮＡの高い特異性が確認された。
【０２６１】
追加の分子分析および後代検定では、編集されたＡＬＳ２アレルを含有する、９つのカルスセクターのうち７つで植物体が再生した。ＡＬＳ２アレルのＤＮＡ配列分析により、Ｐ１６５Ｓの改変（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ）の存在、およびそれぞれの修復鋳型に関連する他のヌクレオチドの変異を確認した。異なるカルスイベント（７９４ｂｐ修復ＤＮＡおよびＯｌｉｇｏ２）から生じた、２つのＴ０植物体のＴ１およびＴ２子孫を分析し、編集されたＡＬＳ２アレルの継承を評価した。野生型Ｈｉ−ＩＩ植物体の花粉を使用した交雑から得られた子孫の植物体を、配列を決定することにより分析し、親植物体では期待値として１：１（それぞれ５７：５６および４７：４９）で観察される分離比が、編集したアレルの交雑継承で示された。編集したＡＬＳ配列による除草剤耐性の付与を試験するために、編集したＡＬＳ２アレルと野生型のＡＬＳ２アレルを有する４週齢の分離Ｔ１植物体を選んで、４種の異なる濃度（５０、１００（１×）、２００、および４００ｍｇ／ｌｉｔｅｒ）のクロルスルフロンをスプレーした。処理してから３週後、編集したアレルを有する植物体は、通常の表現型を示した（図３−左）が、野生型アレルのみを有する植物体は老化の兆候を強く示した（図３−右）。
【０２６２】
スルホニル尿素クラスの除草剤（具体的にはクロルスルフロン）に対する耐性に加えて、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルチオベンゾエートおよびイミダゾリノン除草剤を含む、他のクラスのＡＨＡＳ阻害剤耐性が付与されるようＡＬＳ遺伝子を改変することができる（ＴａｎＳ，Ｅｖａｎｓ  ＲＲ，Ｄａｈｍｅｒ  ＭＬ，Ｓｉｎｇｈ  ＢＫ，Ｓｈａｎｅｒ  ＤＬ（２００５）「Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｒｏｐｓ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１：２４６−２５７）。このように、ＡＬＳ遺伝子の改変は、本明細書に記載の変異およびクロルスルフロン耐性の付与に限定されるべきでない。
【０２６３】
これらの実験により、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡは、トウモロコシ内でＨＤＲ依存標的配列の改変を刺激することができ、次世代に適切に継承される、編集された内因性遺伝子を有する植物体をもたらすことが示された。このデータはまた、編集した単一のＡＬＳ２アレルは、内因性プロモーターの下で、トウモロコシに除草剤耐性を付与することを示すものである。
【０２６４】
実施例３
内因性選択マーカー遺伝子としてのＡＬＳ２
この実施例では、植物体の形質転換で現在使用されている外因性マーカー遺伝子の送達を置き換える、選択マーカーを細胞内に作製するために、特異的に編集したＡＬＳ２遺伝子をどのように使用することができるかを示す。
【０２６５】
植物体の比較的低い形質転換頻度（トランスジェニックイベントの回収）のために、各種除草剤耐性を付与する選択マーカー遺伝子は、通常、形質遺伝子と共に送達される。耐性を付与するために、これらの選択マーカー遺伝子は、植物体のゲノムに安定に組み込まれる必要があり、次の世代では切除または退化されなければならない。いくつかの自生植物体遺伝子を特異的に改変（編集）し、除草剤耐性を付与することができる。実施例２に記載のように、単一アミノ酸変異を有するＡＬＳ２遺伝子は、クロルスルフロン耐性を付与する。したがって、外部から供給されるマーカー遺伝子が無くとも、遺伝子の変異誘発、遺伝子編集または形質遺伝子の共送達およびＡＬＳ２遺伝子の同時編集を使用することができるものと推測し得る。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムによって作製された、ＤＳＢのＮＨＥＪ修復の結果、高頻度の変異が生じたのであるから（実施例１）、このアプローチは、遺伝子の変異誘発に有用であろう。この場合、変異イベントの頻度は、ＨＤＲ媒介ＡＬＳ遺伝子の編集に依存するものと予想されるであろう。遺伝子編集に関して、植物細胞における２つの低頻度ＨＤＲ依存性ゲノム編集プロセスの組み合わせ（１つは選択のためのＡＬＳ遺伝子修復用、他は内因性遺伝子編集または形質遺伝子の組み込み用）は、ＡＬＳ２遺伝子の同時編集を使用するアプローチの実現を幾分困難にすることがあり得る。
【０２６６】
以下の実施例では、この低効率（そして非実際性）を克服し、選択試薬に耐性を有する植物細胞を選択する可能性を改善する方法を説明する。この方法はＨＤＲ依存性遺伝子編集に頼らず、むしろＮＨＥＪのＤＮＡ修復を通した標的変異誘発による遺伝子機能の回復に頼る方法であって、これは植物の体細胞ではより一般的（ＨＤＲより）である。実施例２に記載したように、トウモロコシには、それぞれ染色体４および５の上に存在する、２種のＡＬＳ遺伝子、ＡＬＳ１とＡＬＳ２がある。２つのＡＬＳ遺伝子のいずれか一方への特異的編集により、除草剤耐性が付与されるであろう。これらの遺伝子は、植物代謝で基本的な役割を果たしており、したがって、同時に両者を標的とし変異を起こさせることことは細胞死に繋がる。したがって、この実施例では、ＡＬＳ１遺伝子を標的としないで、したがってＡＬＳ１は野生型のままとし、改変は、ＡＬＳ２特異的ｇＲＮＡを使用することにより、ＡＬＳ２遺伝子のみとする。具体的には、ＡＬＳ２遺伝子に２つの改変が導入される；第１は、特定のヌクレオチドの変異、例えば、クロルスルフロン耐性が付与されるよう、１６５のアミノ酸位置（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓと命名）でプロリンからセリンへ変更するために、４９３のヌクレオチド位置でＣからＴ（図２、ｏｌｉｇｏ１）または４９３および４９５のヌクレオチド位置で、それぞれＣからＴおよびＣからＧ（図２、ｏｌｉｇｏ２）への変更（詳しくは実施例２を参照されたい）。第２は、単一ヌクレオチドの削除、例えば、翻訳フレームシフト（図４Ｂ）をもたらす１６５の位置のＧ（図４Ａ〜４Ｂ）の削除、したがって、ＡＬＳ２媒介クロルスルフロン耐性の喪失（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔと命名）をもたらす。ＡＬＳ２遺伝子修復の最高頻度を目指す多くの設計が予想されるが、単一ヌクレオチドの位置（図４Ａ〜４Ｃに示す例）は好ましくは：ｉ）ｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ標的部位のＰＡＭ配列から上流（５’）側、４番目のヌクレオチド、およびｉｉ）コドン中の３番目のヌクレオチド（図４Ａ）とすべきである。この３番目の位置は、殆どのアミノ酸に対して柔軟性があり、２０種のアミノ酸のうち８種で、任意の４種のヌクレオチドが占めることができる（表８）。１番目または２番目の位置と比較すると、３番目の位置は、そのような柔軟性があるため、より高頻度の適切な修復が期待される。
【０２６７】
【表８】
2018531024.tif 000013
【０２６８】
上の基準を満たす４つの異なる標的部位および対応するｇＲＮＡｓを選択した。上で述べた好ましい単一ヌクレオチドの位置に加えて、対応するｇＲＮＡも、切断部位での単一ヌクレオチド挿入を表す高割合の変異を伴う高頻度の変異を促進しているはずである。試験した４つの標的部位の中の１つのみが、説明した全ての好ましい点を満たし、したがってこの実験に適していることが判明した（ＡＬＳＣａｓ−７と呼ばれる；表９）。
【０２６９】
【表９】
2018531024.tif 000014
【０２７０】
その後、クロルスルフロン耐性を付与するＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ遺伝子をさらに改変した（遺伝子の破壊をもたらした）：ＡＬＳＣａｓ−７標的部位のＣＣＧ（表９でアンダーライン部分）によってコードされるプロリンのコドンが、不安定位置（コドン中で３番目のヌクレオチド位置）でＧヌクレオチドの削除によって変更され、これによって翻訳フレームシフトおよび遺伝子の破壊がもたらされた（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔと呼ばれる；図４Ａ〜４Ｂ）。実施例１で示したように、トウモロコシにおいてＣａｓ９−ｇＲＮＡシステムにより作製され、ＮＨＥＪを通して修復されたＤＳＢの修復は、しばしば、切断部位に単一ヌクレオチド挿入をもたらす。したがって、ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔ遺伝子の機能は、そして連続していることだが、細胞のクロルスルフロン耐性は、ＡＬＳＣａｓ−７−１と呼ばれる、改変されたＡＬＳＣａｓ−７部位（ＧＣＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣ；配列番号８０）で、二本鎖切断（ＤＳＢ）およびＮＨＥＪを通した修復（図４Ｂ〜４Ｃを参照）を行うことによって修復することができる。
【０２７１】
１つのｇＲＮＡが、ＮＨＥＪを通して、破壊されたＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔ遺伝子を標的とし、活性化させ（こうして除草剤耐性が付与される）、他のｇＲＮＡがＡＬＳ２とは異なる部位でＤＳＢを促進し、所望のゲノム改変、例えば、標的の変異誘発、削除、遺伝子編集または部位特異的形質遺伝子の挿入を容易にするとき、本開示に基づき、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡの同時送達が考えられる。このアプローチは、他の必要な全ての構成要素（Ｃａｓ９、ｇＲＮＡｓ）をタンパク質の形態および／またはインビトロ転写ＲＮＡ分子の形態で送達することができるから、完全に一時的な標的ゲノムの改変を可能にする。
【０２７２】
このアプローチを試験するために、上記の特異的に改変したＡＬＳ２遺伝子を有するトウモロコシ植物体（Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型）を作製した。最初に、実施例２に記載のように、クロルスルフロン耐性を付与するために、ＡＬＳ２配列を１６５のアミノ酸位置で改変した。その後、編集に対して同型接合植物体の未成熟の胚に、ＡＬＳＣａｓ−７標的部位を標的とするＣａｓ９およびＡＬＳ−ＣＲ７  ｇＲＮＡ、選択マーカー（ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＤＳＲＥＤ融合体）ならびに細胞増殖促進遺伝子（詳しくは、実施例８および９を参照）を撃ち込んだ。ビアラホス耐性カルスセクターからの再生体を配列の決定により分析した。単一ヌクレオチド欠失（ヌクレオチド位置１６５のＧ）の数種のＴ０植物を同定した（図４Ａ〜４Ｂ）。この欠失は翻訳フレームシフトをもたらし（図４Ｂ）、したがって、ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ媒介クロルスルフロン耐性の喪失をもたらす。両編集（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔ）に対して同型接合植物体を再生させ、配列決定により確認し、クロルスルフロンをスプレーして除草剤耐性の喪失を試験した。
【０２７３】
コンセプト立証実験では、特異的に改変した内因性ＡＬＳ２遺伝子（ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔ）を有する同型接合植物体からの胚を使用した。編集し、破壊したＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ−ＣＣΔ遺伝子が上記のように修復でき（機能性タンパク質をコードできるよう）、かつ選択マーカーとして働けることを示すために、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡベクター、ＡＬＳＣａｓ−７−１部位を標的とするｇＲＮＡ（ＡＬＳ−ＣＲ７−１と呼ぶ）、細胞増殖促進遺伝子（ＺｍＯＤＰ２およびＺｍＷＵＳ）およびＭＳ４５−ＣＲ２  ｇＲＮＡをトウモロコシ（Ｈｉ−ＩＩ）の未成熟胚細胞に共送達した。撃ち込みの１週後、選択のために胚を１００ｐｐｍクロルスルフロンを含む培地に移した。約３０％の胚（２９０のうち８４）が、除草剤耐性カルスイベントへと発育し、これを配列決定により分析した。イベントの大多数（７９イベント）は、予想されたＡＬＳＣａｓ−７−１のＤＳＢ部位（図４Ｃ）に単一ヌクレオチド挿入があること、およびＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ遺伝子が完全に修復されていることを示した。４つのイベントには挿入がなく、遺伝子をフレーム内に戻す、２または５ｂｐのいずれかの欠失があり、１つのイベントはエスケープしたと思われるものであった。８３イベントのうち５０（６０％）もまたＭＳ４５Ｃａｓ−２標的部位に変異を示した。
【０２７４】
この実施例は、コンセプトを立証し、かつ、誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用することにより、特異的に改変した不活性ＡＬＳ２が、内因性選択マーカー遺伝子として有用であることを示すものである。本明細書で説明した結果に基づき、当業者は説明されたアプローチを使用し、かつ任意の同様に改変された内因性遺伝子または予め組み込んだ外因性遺伝子へと拡張することができ、この拡張は、植物ゲノム編集実験で現在使用している選択マーカーの共送達を置き換えることになる。
【０２７５】
実施例４
破壊された遺伝子によりコードされる、非機能性タンパク質の機能復元のための代替設計
先の実施例では、配列の変更は、コード領域またはＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ内で行われた。破壊遺伝子（これは機能性タンパク質をコードしない）を生み出す他の配列の変更もまた、再活性化配列として使用されるよう設計できるものと考えられる。この実施例では、コード配列内のコドンの復元に依存せず、むしろ最初のＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ翻訳開始コドンの上流でアウトフレームにある、開始コドンの削除による再活性化配列の作製を説明する。
【０２７６】
真核生物の翻訳開始のスキャンモデルによれば、ｍＲＮＡの５’末端キャップ構造から最初のＡＵＧコドンが、タンパク質合成の開始に使用される（Ｋｏｚａｋ  Ｍ．１９８９．Ｔｈｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０８：２２９−２４１）。このように、１５ＲＮＡ転写産物の非コードリーダー内ＡＵＧコドンが、最初の開始コドンの上流でアウトフレームにあるならば、ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドのタンパク質合成は無効にされる。このルールを利用し、遺伝子の発現または機能の再活性化戦略に適用するために、上流のアウトフレームの翻訳開始コドンを含有する、内因性ＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓアレルを作ることができる（図５Ａ〜５Ｂ）。このアレルは、Ｃａｓ９  ＰＡＭ認識部位およびＡＬＳ−ＣＲＸ標的スペーサーを含有する。この実施例では、５’末端のＰＡＭ部位に位置する、ヌクレオチド３と４の間をＣａｓ９で切断することにより、ＡＴＧコドンの喪失をもたらすことができる、ヌクレオチドの削除または追加を促進することができる。ＮＨＥＪの修復による削除と追加の任意の組み合わせによる、この上流のアウトフレームＡＴＧの喪失は、最初のＡＬＳ２−Ｐ１６５Ｓ開始コドンの位置での翻訳の開始をもたらすことができ、除草剤耐性を付与する。
【０２７７】
上流のアウトフレームＡＴＧを使用する再活性化戦略は、図５Ａ〜５Ｂの設計に限定されるものではないと考えられる。Ｃａｓ９による標的切断が、この上流の開始コドンの喪失をもたらす限り、ＰＡＭおよび標的スペーサーもまた、この上流のアウトフレームＡＴＧに対していろいろの場所に置くことができる。例えば、ＰＡＭは開始コドンの５’末端側のアンチセンス鎖上に存在することができる。他の設計も考えられる；アウトフレームのＡＴＧ開始コドンはまた、５’末端リーダー配列内の異なる位置に置くことができる。ＰＡＭ配列は、ｎＧＧ  ＰＡＭまたは非ｎＧＧ  ＰＡＭ配列を認識する、例えば、ストレプトコッカス・テルモフィレス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＣＲ１（ＰＡＭ配列認識ｎｎＡＧＡＡｎ）およびＰＡＭ配列を有する他のものを認識する、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のような他のＣａｓ９タンパク質によって認識されることができる。他のＣａｓ９タンパク質の有用性は、この実施例および上述の実施例３の再活性化設計の要求を満たすことにあるであろう。
【０２７８】
遺伝子活性化の他の設計も考えられる。先に言及したように、クロロスルフロン耐性に加え、他の除草剤への耐性を付与するＡＬＳ遺伝子の改変を再活性化のために使用することができる。さらに、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（ＰＭＩ）、ビアラホス耐性遺伝子（ＢＡＲ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、ヒグロマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、選択マーカー遺伝子、蛍光マーカー遺伝子（ＲＦＰ、赤色蛍光タンパク質、ＣＦＰ、ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質などであるが、これらに限定されない）およびグリホサート耐性遺伝子が、実施例３に記載のように、不活性形態の植物細胞へ導入されるように、かつ、ガイドＲＮＡの導入およびＮＨＥＪの修復による再活性化のための標的として使用されるように改変することができる。複数の不活性遺伝子を有することが複数の標的として働くことも考えられる。例えば、ガイドＲＮＡの多重化により、１回の実験で、同時に複数の遺伝子が改変されることが示され、したがって、このアプローチ用に、クロルスルフロンおよびビアラホス耐性の標的再活性化をさらに設計できるが、このことはこれらの遺伝子に限定されるものではない。上述のように、他のガイドポリヌクレオチドを加えることにより、ＮＨＥＪによる遺伝子機能の復元と同期して、他の標的の改変が同時に達成されるであろう。
【０２７９】
さらに、生来のまたは導入された遺伝子配列に対して類似のアプローチを適用でき、高効率の遺伝子スイッチ機構として使用できると考えられる。
【０２８０】
実施例５
相同組み換え修復用ポリヌクレオチド改変鋳型を導入しない特異的遺伝子編集
実施例２では、特異的に設計したポリヌクレオチド改変鋳型（修復鋳型）を使用して、ＡＬＳ２遺伝子（Ｐ１６５Ｓ）のコード領域内配列を変更することについて説明した。次の実施例では、ＨＤＲ機構ではなく、ＮＨＥＪに依存する、編集された目的遺伝子の作製に対する異なるアプローチを説明する。
【０２８１】
実施例１に記載のように、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって引き起こされたＤＳＢのＮＨＥＪ修復によって促進された、２つの最も一般的なタイプの変異は、１ｂｐの挿入と１ｂｐの欠失（表４）である。本明細書に記載のこれらの観察に基づき、以下に説明するような、２つの連続した工程または単一工程で達成できる遺伝子編集方法が開発された。
【０２８２】
第１の工程は、切断されたＤＮＡのＮＨＥＪ修復により、特定のヌクレオチドが欠失した細胞または生命体の作成をもたらすような、本明細書で説明したＲＮＡ誘導型Ｃａｓヌクレアーゼシステムを使用して、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識される標的部位を含有する、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドを標的化することである（図６Ａに図解）。第２の工程は、変異した部位の再標的化および所望のヌクレオチドが挿入されたイベントの選択（ポリヌクレオチド改変鋳型（修復鋳型）を使用せずに、したがって対応するアミノ酸をおよび遺伝子機能を特異的に変更する）を必要とする。一般的には、このアイデアは図６Ａ〜６Ｃに図解されている。この方法はまた、非コードＤＮＡ断片を編集するのに使用することができる。
【０２８３】
あるいは、両工程は単一工程に統合することができる。２つの異なるｇＲＮＡ、すなわち一方は元の標的部位を認識し、他方は同一部位ではあるが、１ｂｐが欠失した部位を認識するものを使用することができる。この場合、連続切断および１ｂｐ欠失をもたらす内因性部位の修復、その後の、変更された部位の切断および１ｂｐの挿入によるその修復が想定される。その後、所望のヌクレオチドが挿入されたイベントを選択することができる。コーディングＤＮＡ配列を編集する場合、このプロセスは２つの目標を達成する―翻訳読み取りフレームの復元と目的のアミノ酸の置換。この２工程または１工程システムで、異なるエンドヌクレアーゼの組み合わせを使用することが考えられよう。例えば、目的のポリヌクレオチドの単一塩基欠失に繋がる、第１の二本鎖切断の導入は、第１のエンドヌクレアーゼにより達成することができ、単一塩基挿入に繋がる、第２の二本鎖切断の導入（および目的のポリヌクレオチドの編集）は、第１のエンドヌクレアーゼとは異なる、第２のエンドヌクレアーゼにより達成することができる。これらのエンドヌクレアーゼの違いは、限定はされないが、ＰＡＭ認識配列の違い、標的認識配列の違い、切断活性の違い（平滑末端、５’または３’末端オーバーハング、一本鎖、二本鎖）、異なる生命体に由来するＤＮＡもしくはアミノ酸配列の違い、またはこれらの任意の１つの組み合わせを挙げ得る。
【０２８４】
目的ゲノム中の特定のヌクレオチドを編集する能力は、エンドヌクレアーゼシステムの選択ならびにその特定の標的部位の認識能力および切断能力に依存し得る。新規の誘導型エンドヌクレアーゼの発見（例えば、２０１５年５月１５日出願、米国仮特許出願第６２／１６２３７７号明細書を参照）および／または各種ＰＡＭ配列による誘導型エンドヌクレアーゼの改変は、これらのエンドヌクレアーゼにより認識されかつ／または切断される、標的部位の密度をさらに増加させ、本明細書で説明した方法を使用して、最終的にゲノム中の任意の所与のヌクレオチド位置を標的とする能力をもたらすであろう。
【０２８５】
実施例６
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを安定に組み込んだトウモロコシの系統
この実施例では、Ｃａｓ９発現カセットを安定に組み込んだトウモロコシの系統の作製と検証について説明する。
【０２８６】
構成的（トウモロコシＵＢＩ、配列番号４６）プロモーターまたは温度調節（トウモロコシＭＤＨ、配列番号４７）プロモーターの転写制御下で、Ｃａｓ９に最適化されたトウモロコシコドンを含有する、２種のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター（図７）をＨｉ−ＩＩ胚細胞へ導入し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが予め組み込まれたゲノムのコピーを含有する系統を確立した。これらのベクターはまた、視認マーカーとして青色蛍光遺伝子（ＡｍＣＹＡＮ）の発現を調節する、胚選考ＥＮＤ２プロモーターと、トウモロコシのヒストン２Ｂプロモーターにより転写的に調節されたＤｓＲＥＤ遺伝子の中断コピーとを含有した。ＤｓＲＥＤ配列の一部を順方向に複製（３６９ｂｐ断片）したが、これはｇＲＮＡにより標的とされ得る３４７ｂｐのスペーサーによって隔てられている、ＤｓＲＥＤ（ＲＦ−ＦＰ）遺伝子の２つの断片からなるものであった。スペーサー領域内のＤＳＢは、破壊された、赤色蛍光細胞をもたらすＤｓＲＥＤ遺伝子の機能を復元する、分子内組み換えを促進する未成熟の胚の供給源として、ＵＢＩ：Ｃａｓ９かまたはＭＤＨ：Ｃａｓ９のいずれかを含有する、単一コピーのＴ−ＤＮＡが挿入されたトウモロコシ植物体を使用した。予め組み込んだＣａｓ９を含有する、青色蛍光胚を切除し、２８℃（ＵＢＩ：Ｃａｓ９）または３７℃（ＭＤＨ：Ｃａｓ９）で２４時間インキュベートした。撃ち込み後、ＭＤＨ：Ｃａｓ９を有する胚は３７℃で２４時間インキュベートし、その後２８℃とした。対照（ｇＲＮＡなし）とは対照的に、３４７ｂｐのスペーサー内配列を標的とする、２つのＤＮＡが発現されたｇＲＮＡが撃ち込まれた、ＵＢＩ：Ｃａｓ９およびＭＤＨ：Ｃａｓ９含有胚は、容易に赤色蛍光フォーカスを生成した。
【０２８７】
これらの結果は、上述のトウモロコシ系統が、機能性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの単一コピーを与えることを示すものである。
【０２８８】
実施例７
予めＣａｓ９を組み込んだ胚細胞への一過性のｇＲＮＡ送達は、トウモロコシに変異を引き起こす
この実施例では、予めＣＡｓ９を組み込んだトウモロコシ未成熟胚細胞への、インビトロ転写ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡの送達により、標的部位に変異が引き起こされることを示す。
【０２８９】
インビトロ転写ＲＮＡとして、または対照用のＤＮＡ発現カセットとしてｇＲＮＡを送達するための未成熟胚の供給源として、ＵＢＩ：Ｃａｓ９かまたはＭＤＨ：Ｃａｓ９のいずれかを含有する、実施例６に記載のトウモロコシ植物体を使用した。ＬＩＧおよびＭＳ２６内因性標的部位で変異の頻度を測定するために、ＲＮＡ分子（１００ｎｇ／ショット）として、またはＤＮＡベクター（２５ｎｇ／ショット）として、ＬＩＧ−ＣＲ３およびＭＳ２６−ＣＲ２  ｇＲＮＡをＵＢＩ：Ｃａｓ９およびＭＤＨ：Ｃａｓ９を含有する胚細胞へ送達し、実施例６に記載の熱処理を施した。これらの実施例では、撃ち込んでから２日後に胚を回収し、アンプリコンディープシーケンシングにより分析した。ＤＮＡベクターとして送達したｇＲＮＡと、ＲＮＡ分子として送達したものとでは、特に、ユビキチンプロモーターによって調節されたＣａｓ９の場合に、類似の頻度が検出された（表１０）。
【０２９０】
【表１０】
2018531024.tif 000015
【０２９１】
以上から、植物細胞に変異を引き起こすために、予め組み込んだＣａｓ９を含有するトウモロコシ細胞へ、ＲＮＡの形態のｇＲＮＡを直接送達することは、ＤＮＡ送達の実行可能な代替法であることをこれらのデータは示している。
【０２９２】
実施例８
トウモロコシの未成熟胚の形質転換
形質転換は植物に有効であることが知られている、各種方法で実施でき、これには、粒子媒介送達法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法、ＰＥＧ媒介送達法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２９３】
ａ．粒子媒介送達法
粒子送達法を使用したトウモロコシ未成熟胚の形質転換は以下のように行う。培地のレシピは下記の通りである。
【０２９４】
穂の殻を剥き、３０％Ｃｌｏｒｏｘ漂白剤プラス０．５％Ｍｉｃｒｏ洗剤中で２０分間表面を殺菌し、滅菌水で２回濯ぐ。未成熟胚を分離し、プレート当たり２５の胚を胚軸側を下にして（胚盤側を上にして）、５６０Ｙ培地上に４時間置き、その後、撃ち込みの準備として２．５ｃｍの標的ゾーンに整列させる。あるいは、分離した胚を５６０Ｌ（開始培地）上に置き、２６℃〜３７℃の範囲の温度で８〜２４時間暗所に置き、その後、２６℃で５６０Ｙ上に４時間置き、次いで上述のように撃ち込みを行う。
【０２９５】
標準の分子生物学的手法を用いて、二本鎖切断誘発剤および鋳型またはドナーＤＮＡを含むプラスミドを構築し、発生遺伝子ＯＤＰ２（ＡＰ２ドメイン転写因子ＯＤＰ２（胚珠発達タンパク質２）；米国特許出願公開第２００９／０３２８２５２Ａ１号明細書）およびＷＵＳＣＨＥＬ（米国特許出願公開第２０１１／０１６７５１６号明細書）を含有するプラスミドと共撃ち込みを行う。
【０２９６】
目的のプラスミドおよびＤＮＡは、以下のように、水溶性のカチオン性脂質ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０トランスフェクション試薬（カタログ番号ＭＩＲ５４０４、Ｍｉｒｕｓ、ＵＳＡ）を使用し、０．６μｍ（平均直径）の金ペレット上に沈殿させるトータルで１μｇのＤＮＡおよび／またはＲＮＡコンストラクト（１０ショット）を使用し、ＤＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡ溶液を氷上で調製する。予め混合したＤＮＡに、２０μｌの調製した金粒子（１５ｍｇ／ｍｌ）および１μｌのＴｒａｎｓＩＴ−２０２０を加え、注意深く混合する。Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅにより１０，０００ｒｐｍで１分間処理して金粒子をペレットにし、上清を除去する。１０５μｌの１００％ＥｔＯＨを加え、短時間の超音波処理により粒子を再懸濁させるその後、各マクロキャリアーの中心に１０μｌで染みを付け、撃ち込みの前に乾燥させる。Ｂｉｏｒａｄ  Ｈｅｌｉｕｍ  Ｇｕｎ（ｓｈｅｌｆ＃３）を４２５ＰＳＩで使用して、試料プレートに撃ち込む。
【０２９７】
撃ち込み後、５６０Ｐ（メンテナンス培地）上、２６℃〜３７℃の温度範囲で１２〜４８時間、胚をインキュベートし、その後、２６℃の場所に置く。５〜７日後、３ｍｇ／リットルのビアラホスを含有する５６０Ｒ選択培地へ胚を移し、２６℃で２週間ごとに継代培養を行う。選択してから約１０週後、選択剤耐性カルスクローンを２８８Ｊ培地へ移し、植物体の再生を開始する。体細胞胚の成熟（２〜４週）後、よく生長した体細胞胚を発芽用培地に移し、照明のある培養室へ移す。約７〜１０日後、生長中の小植物を管に入れた２７２Ｖホルモン不含培地に移し、７〜１０日間、小植物を十分に定着させる。その後、植物を鉢植え用土が入った木箱の挿入物（２．５”のポットと同等）中に移し、栽培室で１週間栽培し、引き続き温室でさらに１〜２週間栽培し、その後、Ｃｌａｓｓｉｃ６００ポット（１．６ガロン）に移し、成熟するまで栽培する。形質転換効率および／または再生能力の変化について植物を監視し採点する。
【０２９８】
開始培地（５６０Ｌ）は４．０ｇ／ｌのＮ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、２０．０ｇ／ｌのスクロース、１．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２．８８ｇ／ｌのＬ−プロリン（ＫＯＨでｐＨを５．８に調節後、Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；２．０ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）；および８．５ｍｇ／ｌの硝酸銀（培地を滅菌し、室温にまで冷却後加える）を含む。
【０２９９】
メンテナンス培地（５６０Ｐ）は４．０ｇ／ｌのＮ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、３０．０ｇ／ｌのスクロース、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．６９ｇ／ｌのＬ−プロリン（ＫＯＨでｐＨを５．８に調節後、Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；３．０ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）；および０．８５ｍｇ／ｌの硝酸銀（培地を滅菌し、室温にまで冷却後加える）を含む。
【０３００】
撃ち込み培地（５６０Ｙ）は、４．０ｇ／ｌのＮ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、１２０．０ｇ／ｌのスクロース、１．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２．８８ｇ／ｌのＬ−プロリン（ＫＯＨでｐＨを５．８に調節後、Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；２．０ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）；および８．５ｍｇ／ｌの硝酸銀（培地を滅菌し、室温にまで冷却後加える）を含む。
【０３０１】
選択培地（５６０Ｒ）は、４．０ｇ／ｌのＮ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、３０．０ｇ／ｌのスクロース、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（ＫＯＨでｐＨを５．８に調節後、Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；３．０ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）；０．８５ｍｇ／ｌの硝酸銀および３．０ｍｇ／ｌのビアラホス（両者とも、培地を滅菌し、室温にまで冷却後加える）を含む。
【０３０２】
植物体再生培地（２８８Ｊ）は４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌのＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇのニコチン酸、０．０２ｇ／ｌのチアミンＨＣＬ、０．１０ｇ／ｌのピリドキシンＨＣＬ、および０．４０ｇ／ｌのグリシンを完全なＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ．１５：４７３）、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、０．５ｍｇ／ｌのゼアチン、６０ｇ／ｌのスクロース、１．０ｍｌ／ｌの０．１ｍＭアブシジン酸（ｐＨを５．６に調節後、完全なＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；３．０ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）；１．０ｍｇ／ｌのインドール酢酸および３．０ｍｇ／ｌのビアラホス（培地を滅菌し、６０℃にまで冷却後加える）を含む。
【０３０３】
ホルモン不含培地（２７２Ｖ）は４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ１１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌのＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇ／ｌのニコチン酸、０．０２ｇ／ｌのチアミンＨＣＬ、０．１０ｇ／ｌのピリドキシンＨＣＬ、０．４０ｇ／ｌのグリシンを完全なＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）、０．１ｇ／ｌのミオイノシトール、および４０．０ｇ／ｌのスクロース（ｐＨを５．６に調節後、完全なＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量）；および滅菌し、６０℃に冷却した６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒ（完全なＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで所定の体積まで増量後加える）を含む。
【０３０４】
ｂ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換
基本的には、Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｊ  ４：３４５−５７に記載のようにして、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を行った。手短に言えば、１０〜１２日齢の未成熟胚（大きさ０．８〜２．５ｍｍ）を滅菌した穀粒から切り取り、液体培地（４．０ｇ／ＬのＮ６基礎塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ＬのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１５１１）、１．０ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ、１．５ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄ、０．６９０ｇ／ＬのＬ−プロリン、６８．５ｇ／Ｌのスクロース、３６．０ｇ／Ｌのグルコース、ｐＨ５．２）上に置いた。胚の回収後、ＯＤ５５０が０．３５〜０．４５濃度の、１ｍｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で培地を置換した。トウモロコシの胚をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と共に室温で５分間インキュベートし、その後、４．０ｇ／ＬのＮ６基礎塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ＬのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１５１１）、１．０ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ、１．５ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄ、０．６９０ｇ／ＬのＬ−プロリン、３０．０ｇ／Ｌのスクロース、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、０．１ｎＭのアセトシリンゴンおよび３．０ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを含有するｐＨ５．８の培地プレートに混合物を注いだ。２０℃の暗所で３日間、軸を下側にして胚をインキュベートし、その後、２８℃の暗所で４日間インキュベートし、その後、４．０ｇ／ＬのＮ６基礎塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ＬのＥｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１５１１）、１．０ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ、１．５ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄ、０．６９ｇ／ＬのＬ−プロリン、３０．０ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｇ／ＬのＭＥＳバッファー、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、３．０ｍｇ／Ｌのビアラホス、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび６．０ｇ／Ｌの寒天を含有する、ｐＨ５．８の新しい培地プレートに移した。トランスジェニックイベントが同定されるまで、３週間ごとに胚を継代培養した。少量の組織を再生培地（４．３ｇ／ＬのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ  １１１１７）、５．０ｍｌ／ＬのＭＳビタミンストック溶液、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、０．１μＭのＡＢＡ、１ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌのゼアチン、６０．０ｇ／Ｌのスクロース、１．５ｍｇ／Ｌのビアラホス、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、３．０ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．６）に移し、２８℃で２週間、暗所でインキュベーションすることにより、体細胞胚の発生を誘導した。目で見えるシュートおよび根を有する全てのものを４．３ｇ／ＬのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ  １１１１７）、５．０ｍｌ／ＬのＭＳビタミンストック溶液、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、４０．０ｇ／Ｌのスクロース、１．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを含有するｐＨ５．６の培地に移し、人工光の下、２８℃でインキュベートした。１週間後、小植物を同じ培地を含有するガラスチューブに移動させ、サンプルにするまで、かつ／または土壌に移植するまで栽培��た。
【０３０５】
実施例９
ＺｍＯＤＰ−２およびＺｍＷＵＳの一過性発現は形質転換を促進する
ＢＢＭ活性が一過性であることを確かにするために、形質転換プロトコルのパラメータを修正することができる。そのような方法の一つに、転写および発現はさせるが、その後のＤＮＡの放出を起こさせない方法、例えば化学的なＰＥＩを使用する方法で行う、ＢＢＭ含有プラスミドの沈殿が含まれる。
【０３０６】
ある実施例では、ＰＥＩによりＢＢＭプラスミドを金粒子上に沈殿させるが、組み込まれるべきトランスジェニック発現カセット、（ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＧＦＰｍ：ＰｉｎＩＩ；ＭｏＰＡＴはトウモロコシに最適化したＰＡＴ遺伝子である）は標準の塩化カルシウム法を使用して金粒子上に沈殿させる。
【０３０７】
手短に言えば、以下のようにして金粒子をＰＥＩでコーティングした。最初、金粒子を洗浄した。平均直径１．０μｍの３５ｍｇの金粒子（Ａ．Ｓ．Ｉ．＃１６２−００１０）を秤量してマイクロ遠心管に入れ、１．２ｍｌの純粋のＥｔＯＨを加え、１分間ボルテックスした。室温で１５分間、管をインキュベートし、その後、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅを使用し、４℃で１５分間高速遠心分離を行った。上清を捨て、エタノール（ＥｔＯＨ）の新鮮な１．２ｍｌのアリコートを加え、１分間ボルテックスし、１分間遠心分離し、上清を再度捨てた（これを２回繰り返した）。ＥｔＯＨの新鮮な１．２ｍｌのアリコートを加え、この懸濁液（ＥｔＯＨ中の金粒子）を−２０℃で数週間保管した。ポリエチルイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ３１４３）で粒子をコーティングするには、２５０μｌの洗浄した金粒子／ＥｔＯＨ混合物を遠心分離し、ＥｔＯＨを捨てた。１００μｌのｄｄＨ２Ｏ中で粒子を１回洗浄して残留エタノールを除去し、２５０μｌの０．２５ｍＭ  ＰＥＩを加えた後、パルス超音波洗浄を行って粒子を懸濁させ、その後、管をドライアイス／ＥｔＯＨ浴に浸漬して懸濁液を急速冷凍し、続いてこれを終夜凍結乾燥させた。この時点で、乾燥コーティング粒子を−８０℃で少なくとも３週間は保管することができたであろう。使用前に、２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーの２５０μｌアリコート、ｐＨ７．１で粒子を３回濯ぎ、１×パルス超音波洗浄、そして迅速なボルテックスを行った後、それぞれ遠心分離した。その後粒子を最終容積２５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーに懸濁させた。２５μｌの粒子のアリコートを新鮮な管に加え、その後ＤＮＡを付着させた。無コーティングＤＮＡを付着させるには、粒子をパルス超音波洗浄し、その後、１μｇのＤＮＡ（５μｌの水中の）を加え、その後Ｐｉｐｅｔｔｅｍａｎにより吸引と吐出を数回行って混合し、１０分間インキュベートした。粒子を短時間回転（すなわち、１０秒間）させ上清を除き、６０μｌのＥｔＯＨを加えた。ＰＥＩ沈殿ＤＮＡ−１を有する粒子を６０μｌのＥｔＯＨ中で２回洗浄した。粒子を遠心分離し、上清を捨て、粒子を４５μｌの水に再懸濁させた。第２のＤＮＡ（ＤＮＡ−２）を付着させるには、ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０を用いた沈殿を行った。４５μｌの粒子／ＤＮＡ−１懸濁液を短時間超音波洗浄し、その後５μｌの１００ｎｇ／μｌ  ＤＮＡ−２および１μｌのＴｒａｎｓＩＴ−２０２０を加えた。溶液をロータリー振盪機の上に１０分間置き、１０，０００Ｇで１分間遠心分離した。上清を除き、粒子を６０μｌのＥｔＯＨに再懸濁させた。マクロキャリアーに溶液で染みを付け、ＰＤＳ−１０００の標準プロトコルを使用して、ＤＮＡ−１およびＤＮＡ−２を逐次付着させた金粒子を１０  ＤＡＰ  Ｈｉ−ＩＩ未成熟胚の胚盤細胞に送達した。この実験では、ＤＮＡ−１プラスミドはＵＢＩ：ＲＦＰ：ＰｉｎＩＩ発現カセットを含有し、ＤＮＡ−２はＵＢＩ：ＣＦＰ：ＰｉｎＩＩ発現カセットを含有した。撃ち込みから２日後、ＣＦＰおよびＲＦＰの両蛍光マーカーの一過性発現が、多数の赤色および青色細胞として未成熟胚の表面に観察された。その後、胚を非選択性培養培地に置き、３週間生長させ、その後、安定したコロニーについて採点した。この３週間の期間の後、僅かに１個の赤色コロニーと比較すると、多細胞の安定発現青色コロニーは１０個観察された。これは、一過性発現のためにＤＮＡを有効に導入するのに、ＰＥＩ沈殿を使用し得るが、ＰＥＩ導入ＤＮＡの組み込みが顕著に低下し、したがって、ＲＦＰ発現トランスジェニックイベントの回収を減少させることを示すものであった。このようにして、ＰＥＩ沈殿はＢＢＭおよび／またはＷＵＳ２の一過性発現を送達するために使用することができる。
【０３０８】
例えば、最初にＰＥＩを使用してＵＢＩ：ＢＢＭ：ＰｉｎＩＩで粒子をコーティングし、その後、ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０を使用してＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＹＦＰでコーティングし、その後、未成熟胚表面の胚盤細胞に撃ち込むＰＥＩ媒介沈殿は、未成熟胚表面に高頻度の一過性発現細胞を、安定な形質転換体の回収の極めて低い頻度（ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０法と比較して）をもたらした。したがって、ＰＥＩ沈殿ＢＢＭカセットは一時的に発現し、撃ち込まれた組織表面（すなわち、胚盤表面）で爆発的な胚形成の進展を刺激するが、このプラスミドは組み込まれないと考えられる。Ｃａ＋＋／金粒子から放出されたＭｏＰＡＴ−ＧＦＰプラスミドは、組み込まれ、トランスジェニックイベントの回収に大幅な改善をもたらすような頻度で、選択マーカーを発現させることが期待される。対照の処理として、ＵＢＩ：ＧＵＳ：ＰｉｎＩＩ（ＢＢＭの代わりに）を含有するＰＥＩ沈殿粒子をＭｏＰＡＴ−ＧＦＰ／Ｃａ＋＋粒子と混合する。両処理した未成熟胚を、３ｍｇ／ｌのビアラホスを含有する培養培地に移動させる。６〜８週間後には、対照処理（ＰＥＩ／ＧＵＳ）と比べてＰＥＩ／ＢＢＭ処理で、ＧＦＰ陽性、ビアラホス耐性カルスがはるかに高頻度で観察されるであろうと期待される。
【０３０９】
代替法として、ＢＢＭプラスミドをＰＥＩとともに金粒子上に沈殿させ、その後、未成熟胚表面の胚盤細胞に導入し、続くＢＢＭ遺伝子の一過性発現により胚形成の急激な進展が誘発される。誘導生長のこの期間に、ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＧＦＰｍ：ＰｉｎＩＩなどのトランスジェニック発現カセットを導入する、細胞へのＴ−ＤＮＡ送達とともに、トウモロコシに対する標準法（実施例１を参照）を使用し、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により外植体を処理する。共培養後、外植体を通常の培養培地上で回収し、その後、３ｍｇ／ｌのビアラホスを含有する培養培地に移動させる。６〜８週間後には、対照処理（ＰＥＩ／ＧＵＳ）に比べて、ＰＥＩ／ＢＢＭ処理で、ＧＦＰ陽性、ビアラホス耐性カルスがはるかに高頻度で観察されるであろうと期待される。
【０３１０】
ＢＢＭおよび／またはＷＵＳ２ポリヌクレオチド産物を一過性に発現させることにより、カルスを「キック・スタート」で生長させることが望ましいのかもしれない。これは、ＢＢＭおよびＷＵＳ２ＤＮＡまたはＢＢＭおよび／もしくはＷＵＳ２タンパク質を含む、ＢＢＭおよびＷＵＳ２の５’末端がキャップされたポリアデニル化ＲＮＡ発現カセットを送達することにより行うことができる。これらの分子は全て微粒子銃を使用して送達することができる。例えば、５’がキャップされたポリアデニル化ＢＢＭおよび／またはＷＵＳ２  ＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキットを使用して、インビトロで容易に作製することができる。ＲＮＡは、目的のポリヌクレオチドと、ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＧＦＰｍ：ＰｉｎＩＩなどの選択／スクリーニングに使用されるマーカーとを含有するＤＮＡと共送達される。ＲＮＡを受け取った細胞は、直ちにより速く分裂を開始するであろうこと、また、これらの大部分は農学的遺伝子を組み込んでいるであろうことが予期される。これらのイベントは、またＰＡＴ〜ＧＦＰ融合タンパク質を発現するであろうから（したがって適切な照明の下では緑色蛍光を発するであろうから）、トランスジェニッククローンコロニーとしてさらに確認することができる。その後、目的のポリヌクレオチドが存在するものについて、これらの胚から再生した植物をスクリーニングすることができる。
【０３１１】
実施例１０
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＧＥＮ）としてのｇＲＮＡおよびＣａｓ９を胚細胞へ直接送達することにより、トウモロコシに変異が引き起こされる
この実施例では、タンパク質形態のＣａｓ９と、インビトロ転写または化学合成ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡとのトウモロコシ未成熟胚細胞への直接送達により、対応する標的部位に引き起こされることを示す。
【０３１２】
ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡを作製するために、これもまたＴ７ポリメラーゼプロモーター配列、および遺伝子に対して５’末端側のスペーサーの転写開始シグナルを含有する、５’末端オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、トウモロコシ最適化Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩ  ｇＲＮＡ発現カセットをＰＣＲにより増幅させた。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）により、製造者の推奨にしたがって、Ｔ７のインビトロ転写を行い、ＮｕｃＡｗａｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を使用して生成物を精製し、その後、エタノール沈殿を行った。
【０３１３】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質複合体（ＲＧＥＮ）（ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質とも呼ばれる）を作製するために、７μｇのＣａｓ９（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）タンパク質および３μｇのｇＲＮＡ分子（モル比１：２）を、全体積が２０μｌの１×Ｃａｓ９バッファー（ＮＥＢ）中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。ＲＧＥＮとともに、ユビキチンプロモーター調節選択および視認マーカー（ＭｏＰＡＴ−ＤｓＲｅｄ融合体）、ユビキチンプロモーター調節トウモロコシ胚珠発達タンパク質２、ＺｍＯＤＰ２（２００９年１２月３１日公開の米国特許出願公開第２００９／０３２８２５２号明細書を参照されたい）およびトウモロコシＩＮ２プロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １７：６７９〜６９０）調節ＷＵＳＣＨＥＬ、ＺｍＷＵＳ（２０１１年７月７日公開の米国特許出願公開第２０１１／０１６７５１６号明細書を参照されたい）を含有するプラスミドを、市販の金粒子（０．６μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および水溶性のカチオン性脂質ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０（Ｍｉｒｕｓ、ＵＳＡ）を含有する、粒子送達マトリックスと混合した。いくらかの修正を加えた粒子媒介送達法（実施例８に記載の粒子媒介送達法を参照）を使用して、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体を含む、粒子送達マトリックスをトウモロコシ胚細胞へ送達した。具体的には、金粒子を１０，０００ｒｐｍで１分間、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅでペレット化し、上清を除去した後、１００％エタノールの代わりに、１０５μｌの滅菌水中で粒子を再懸濁させた。その後、各マイクロキャリアーの中心に１０μｌで染みを付け、乾燥させてから撃ち込んだ。
【０３１４】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＧＥＮ）形態のＣａｓ９およびｇＲＮＡを、選択および視認マーカー（ＵＢＩ：ＭｏＰＡＴ−ＤｓＲＥＤ）ならびに発生遺伝子（ＵＢＩ：ＺｍＯＤＰ２およびＩＮ２：ＺｍＷＵＳ）と共に共送達するための、未成熟胚の供給源として、野生型トウモロコシ植物を使用した。ＬＩＧＣａｓ−３、ＭＳ２６Ｃａｓ−２、ＭＳ４５Ｃａｓ−２およびＡＬＳＣａｓ−４の内因性標的部位における変異の頻度を測定するために、撃ち込みの２日後に胚を収穫し、アンプリコンディープシーケンシングにより分析した。無処理の胚およびＣａｓ９タンパク質のみを撃ち込んだ胚は負の対照の役割を担い、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを撃ち込んだ胚は正の対照として使用した。ＤＮＡベクターとして送達したＣａｓ９−ｇＲＮＡ構成要素と、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体として送達したＣａｓ９−ｇＲＮＡ構成要素とで、類似の頻度が検出された（表１１）。
【０３１５】
【表１１】
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【０３１６】
植物体のレベルで変異の頻度を測定するために、Ｃａｓ９−ＭＳ４５−ｇＲＮＡ複合体、ＺｍＯＤＰ２、ＺｍＷＵＳおよびＭＯＰＡＴ−ＤＳＲＥＤを共撃ち込みした６０個の胚を、選択剤としてビアラホスを含有する培地に置いた。３６の除草剤耐性カルスセクターのそれぞれから、複数の植物が再生され、変異体をスクリーニングした。３６個のイベントのうち、１７個（４７％）は、変異アレル（１０個は単一、７個は２アレル）を含んだが、１９個（５３％）は野生型ＭＳ４５アレルのみを示した。変異した植物体の中で、各アレルについての読み取り配列の数は同程度であり、植物体はキメラでないことが示された。
【０３１７】
ＲＧＥＮの直接送達もまた植物体の内因性遺伝子内で特定の編集を行うのに十分であることを示すために、実施例２に記載のように、トウモロコシＡＬＳ２遺伝子を標的にした（ＡＬＳ２特異的ＡＬＳＣａｓ−４標的部位）。修復鋳型としての１２７ｎｔの一本鎖ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏ２、（配列番号４５）とＣａｓ９／ＡＬＳ−ＣＲ４ＲＧＥＮ複合体とを、上記と同様の方法で共送達した。撃ち込みの２日後、胚を回収し、アンプリコンディープシーケンシングにより分析した（表１２）。
【０３１８】
【表１２】
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【０３１９】
さらに、２つの独立した実験で、４０〜５０個の撃ち込み済みの胚を、編集したＡＬＳ２遺伝子の直接選択として、１００ｐｐｍのクロルスルフロンを含有するプレートに移した。６週間後、クロルスルフロンを含む培地上で生長を続けている、２つのカルスセクター（各実験から１つ）を配列の決定により分析した。両イベントで、１つのＡＬＳ２アレルは特異的に編集されていたが、第２のアレルは野生型のままであった。これらのカルスセクターから再生された植物体は、編集されたＡＬＳ２アレルを含有し、除草剤を散布した時、クロルスルフロン耐性を示した。
【０３２０】
これらのデータは、植物体の標的変異誘発および遺伝子編集のために、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体（ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡを含むまたは不含）形態のＣａｓ９およびｇＲＮＡの、トウモロコシ未成熟胚細胞への直接送達は、ＤＮＡ送達（組み換えＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）の代替として実行可能であることを示すものである。
【０３２１】
実施例１１
ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ形態Ｃａｓ９の胚細胞への直接送達はトウモロコシに変異を引き起こす
この実施例では、ｍＲＮＡ分子の形態のＣａｓ９およびインビトロ転写または化学合成ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡの、トウモロコシ未成熟胚細胞への直接送達により、対応する標的部位に変異が引き起こされることを示す。
【０３２２】
我々の先の実験（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１５、Ｖｏｌ．１６９、ｐｐ．９３１−９４５）で、インビトロ合成ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡ分子とＤＮＡベクターを発現するＣａｓ９との共送達によって、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡともにＤＮＡベクターで送達した実験に比べて、変異は約１００倍低い頻度であった。この違いについての可能な一つの説明は、ｇＲＮＡがＲＮＡとして送達され、Ｃａｓ９がＤＮＡベクターとして送達されるときには、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡで同時に起こる機能に対する要件が満たされないということかもしれない。この問題を解決するために、Ｃａｓ９を、送達の瞬間から機能性Ｃａｓ９タンパク質の発現までの時間を短縮するであろうｍＲＮＡ分子として送達することがでる。この実験では、市販のＣａｓ９ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【０３２３】
この考えを試験するために、トウモロコシ胚細胞に、１ショット当たりＣａｓ９  ｍＲＮＡ（２００ｎｇ）、インビトロ合成ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡ（１００ｎｇ）、ユビキチン調節ＭｏＰＡＴ−ＤｓＲＥＤ融合体（２５ｎｇ）および発生遺伝子を含有するＤＮＡベクター、ユビキチンプロモーター調節ＯＤＰ２およびＩＮ２プロモーター調節ＷＵＳ（各１２ｎｇ）の共撃ち込みを行った。この実験では、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および上述のようにインビトロで合成したＲＮＡ分子を使用した。形質転換から２日後に回収した胚に対して、アンプリコンディープシーケンシングにより、変異の頻度分析を行った。（表１３）。
【０３２４】
【表１３】
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【０３２５】
これらのデータにより、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ両者のＲＮＡ分子形態での送達は、標的変異の頻度を向上させ、ＲＧＥＮ複合体としてのＣａｓ９−ｇＲＮＡと共に行う送達は、植物体の標的変異誘発および遺伝子編集のためのＤＮＡ送達の代替として実行可能であることが示された。
【０３２６】
実施例１２
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＧＥＮ）としてのＣａｓ９およびｇＲＮＡの、選択マーカーを使用しない胚細胞への直接送達は、トウモロコシに変異を引き起こす
この実施例では、タンパク質形態のＣａｓ９およびインビトロ転写または化学合成ＲＮＡ分子形態のｇＲＮＡの、トウモロコシ未成熟胚細胞への、選択マーカー遺伝子の共送達を行わない送達は、対応する標的部位で実際的な頻度の変異を有する植物体を再生させるのに十分であることを示す。
【０３２７】
形質転換または改変細胞に、生長の優位性を与えるための選択マーカーの必要性は、植物体の形質転換およびゲノム改変プロトコルにおいて、長く続いてきたパラダイムである。したがって、全ての変異、遺伝子編集および遺伝子組み込み実験において、ゲノム編集イベントを選択するために選択マーカーが使用される。実施例１０に記載の実験においてＲＧＥＮ複合体の予期しない高活性（変異の頻度）を考慮して、選択マーカーを使用しない、完全にＤＮＡフリー（ベクターフリー）のゲノム編集を試みた。トウモロコシの胚細胞に、３つの異なる遺伝子：ｌｉｇｕｌｅｌｅｓｓ１（ＬＩＧ）、ＭＳ２６およびＭＳ４５を標的とするガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチド−タンパク質（ＲＧＥＮ）複合体を撃ち込んだ。対照の役割を担う平行実験では、ＤＮＡベクター上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＭＳ４５−ｇＲＮＡを送達した。植物体を再生させ、標的変異の配列決定により分析した。全ての実験で、２．４〜９．７％の範囲の驚くべき高頻度で、変異植物体を回収した（表１４）。
【０３２８】
【表１４】
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【０３２９】
さらに、再生Ｔ０植物体を野生型Ｈｉ−ＩＩ植物体と交雑し、分離比分析のために子孫の植物体を使用した。分析した全ての子孫植物体で、変異したＭＳ４５アレルの交雑伝達は、期待されたメンデルの分離比（１：１）であることが示された。
【０３３０】
ＲＧＥＮの送達がトウモロコシのオフターゲット切断を減少させる可能性を評価するために、ＤＮＡベクターおよびＲＧＥＮ送達を使用して、ＭＳ４５オフサイトの変異の頻度を評価した。ＭＳ４５Ｃａｓ−２標的部位のプロトスペーサー領域（塩基がガイドＲＮＡスペーサーと対をなす標的部位の領域）を、トウモロコシＢ７３レファレンスゲノム（Ｂ７３ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ３、Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ）と、オンターゲット配列に対して２つまでのミスマッチを認めるＢｏｗｔｉｅ配列アライナー（Ｌａｎｇｍｅａｄ、Ｂ．、Ｔｒａｐｎｅｌｌ、Ｃ．、Ｐｏｐ、Ｍ．＆  Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓ．Ｌ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１０：Ｒ２５、２００９）を使用してアライメントすることにより、オンターゲット部位と高い相同性を有する部位の探索を行った。その後、同定されたプロトスペーサーオフターゲットの３’側に隣接する、ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在に関し、可能性があるオフターゲット部位を調べた。これらの探索基準を使用して、単一のオフターゲット部位（５’−ＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＧＧＣ−３’、配列番号８１）のみが同定された。それは、ＭＳ４５プロトスペーサー標的およびＡＧＧ  ＰＡＭとは２ｂｐのミスマッチを含んだ（表１５）．この部位がインビボで切断されたことを確認するため、Ｃａｓ９およびＭＳ４５−ＣＲ２  ｇＲＮＡ発現ＤＮＡベクターで形質転換した、トウモロコシ胚中の変異の存在に関するディープシーケンシングにより分析した。表１５に示すように、オフターゲット部位の変異活性は、オンターゲット部位で観察された頻度４％と比べて頻度２％であった。表１５に示すように、ＲＧＥＮオフターゲット活性は、ＤＮＡのベクターに乗せてＣａｓ９およびｇＲＮＡを送達する場合に比べて大幅に低下した（２％から０％）。
【０３３１】
【表１５】
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【０３３２】
この実施例で、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用した、標的変異を有する植物体の作製には、選択またはスクリーニングマーカーの共送達の必要がないこと、したがって、導入する改変の特異性および正確性が向上することが示された。再生植物体は、ＤＮＡベクターをランダムに組み込むことなく、標的変異または標的遺伝子編集（ＤＮＡ配列を改変する修復鋳型が含まれるならば）のみを含有した。この送達方法は、限定されないが、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、コメ、キビ、ソルガムおよびキャノーラなどの主要な作物種植物の体細胞における、遺伝子変異誘発に対して、完全にＤＮＡフリーのアプローチを提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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