(57)【要約】  コンポジット材料、及びそれを作製する方法が開示される。本コンポジット材料は、支持部材及び架橋ゲルを含み、架橋ゲルは、チオール-エン又はチオール-イン重合及び架橋によって合成されたポリマーである。架橋ゲルは、重合により同時に、又は2工程手順における第2の工程としてのどちらかで、チオール-エン又はチオール-イングラフト反応により官能基化され得る。本コンポジット材料は、クロマトグラフィー分離媒体として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、2つのチオール官能基を含み、
第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、
コンポジット材料。
【請求項２】
第1のモノマーが2つの末端チオール官能基を含む、請求項1に記載のコンポジット材料。
【請求項３】
第1のモノマーが、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)、1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオール、PEGジチオール(直鎖PEGジチオールなど)、1,6-ヘキサンジチオール、2,2'-チオジエタンジオール、エタン-1,2-ジイルビス(3-メルカプトプロパノエート)、ヘキサ(エチレングリコール)ジチオール、テトラ(エチレングリコール)ジチオール、1,16-ヘキサデカンジチオール、ベンゼン-1,2-ジチオール、ベンゼン-1,3-ジチオール、ベンゼン-1,4-ジチオール、ビフェニル-4,4'-ジチオール、p-ターフェニル-4,4''-ジチオール、(S)-2-アミノブタン-1,4-ジチオール塩酸塩、4-フェニル-4H-(1,2,4)トリアゾール-3,5-ジチオール、5-(4-クロロフェニル)-ピリミジン-4,6-ジチオール、1,4-ベンゼンジメタンチオール、2-メルカプトエチルエーテル又はL-(-)-ジチオトレイトールである、請求項1に記載のコンポジット材料。
【請求項４】
第2のモノマーをさらに含み、第2のモノマーが、2つの末端炭素-炭素二重結合を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項５】
第2のモノマーが、トリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)、1,9-デカジエン、1,4-ビス(ビニルオキシ)ブタン、ジアリルフタレート、ジアリルジグリコールカーボネート、ポリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル、ジビニルグリコール、ジビニルベンゼン、ジビニルスルホン、1,4-ブタンジオールジビニルエーテル、アリルエーテル、アリルスルフィド、1,4-ビス(4-ビニルフェノキシ)ブタン、1,5-ヘキサジエン、ジペンテン、(R)-(+)-リモネン、(S)-(-)-リモネン、N,N'-メチレンビス(アクリルアミド)又はN,N'-エチレンビス(アクリルアミド)である、請求項4に記載のコンポジット材料。
【請求項６】
コンポジット材料が第3のモノマーをさらに含み、第3のモノマーが2つの炭素-炭素二重結合を含む、請求項4又は5に記載のコンポジット材料。
【請求項７】
第3のモノマーが2つの末端炭素-炭素二重結合を含む、請求項6に記載のコンポジット材料。
【請求項８】
第3のモノマーが、(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)、ジアリルジスルフィド、炭酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、コハク酸ジアリル、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、1,1-ジアリル-1-ドコサノール、1,1-ジアリル-3-(1-ナフチル)ウレア、1,1-ジアリル-3-(2-エチルフェニル)ウレア、1,2-ジアリル-1,2-シクロヘキサンジオール、2,6-ジアリル-メタ-クレゾール、N,N-ジアリル-2-ヒドロキシプロパンアミド、1,4-ペンタジエン-3-オール、トリメチル(プロパルギル)シラン又はプロパルギルアミンである、請求項6又は7に記載のコンポジット材料。
【請求項９】
第1の架橋剤が、少なくとも3つの炭素-炭素二重結合を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１０】
第1の架橋剤が、3つの炭素-炭素二重結合を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１１】
第1の架橋剤が、3つの末端炭素-炭素二重結合を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１２】
第1の架橋剤が、2つの炭素-炭素三重結合を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１３】
第1の架橋剤が、2つの末端炭素-炭素三重結合を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１４】
第1の架橋剤が、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)、1,6-ヘプタジイン、1,7-オクタジイン、1,8-ノナジイン、1,9-デカジイン、プロパルギルアクリレート、4-アームPEGノルボルネン、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラ-アルキンポリ(エチレングリコール)、2,4,6-トリアリルオキシ-1,3,5-トリアジン、トリアリルアミン、ホウ酸トリアリル、トリアリルホスフィン、フマル酸ジアリル、3-(アリルオキシ)-1-プロピン、グリオキサールビス(ジアリルアセタール)、テトラアリルシラン、プロパルギルエーテル又はスクワレンである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１５】
第2の架橋剤をさらに含み、第2の架橋剤が、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項１６】
第2の架橋剤が、少なくとも2つの炭素-炭素三重結合を含む、請求項15に記載のコンポジット材料。
【請求項１７】
第2の架橋剤が、2つの炭素-炭素三重結合を含む、請求項15に記載のコンポジット材料。
【請求項１８】
第2の架橋剤が、2つの末端炭素-炭素三重結合を含む、請求項15に記載のコンポジット材料。
【請求項１９】
第2の架橋剤が第1の架橋剤とは異なる、請求項15〜18のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項２０】
第2の架橋剤が、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)、1,6-ヘプタジイン、1,7-オクタジイン、1,8-ノナジイン、1,9-デカジイン、プロパルギルアクリレート、2,4,6-トリアリルオキシ-1,3,5-トリアジン、トリアリルアミン、ホウ酸トリアリル、トリアリルホスフィン、フマル酸ジアリル、3-(アリルオキシ)-1-プロピン、ジプロパルギルアミン、5,6-ジメチル-5-デセン-1,9-ジイン、グリオキサールビス(ジアリルアセタール)、テトラアリルシラン、プロパルギルエーテル、スクワレン、トリメチロールプロパントリ(3-メルカプトプロピオネート)、ペンタエリスリトールテトラ(3-メルカプトプロピオネート)、ポリ(エチレングリコール)テトラチオール、トリス[2(3-メルカプトプロピオニルオキシ)エチル]イソシアヌレート、ペンタエリスリトールテトラキス(2-メルカプトアセテート)トリチオシアヌル酸又は1-チオヘキシトールである、請求項19に記載のコンポジット材料。
【請求項２１】
架橋ゲルが複数のグラフト末端基をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項２２】
グラフト末端基が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子から誘導される、請求項21に記載のコンポジット材料。
【請求項２３】
グラフト末端基が、チオール官能基を有する分子から誘導される、請求項21に記載のコンポジット材料。
【請求項２４】
チオール官能基を有する分子が、3-メルカプトプロピオン酸、1-メルカプトコハク酸、システイン残基を有するペプチド、システイン残基を有するタンパク質、システアミン、1-チオヘキシトール、ポリ(エチレングリコール)2-メルカプトエチルエーテル酢酸、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルチオール、1-チオグリセロール、2-ナフタレンチオール、ビフェニル-4-チオール、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール-5-チオール、5-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-チオール、1-[2-(ジメチルアミノ)エチル]-1H-テトラゾール-5-チオール、1-プロパンチオール、1-ブタンチオール、1-ペンタンチオール、1-ヘキサンチオール、1-オクタンチオール、8-アミノ-1-オクタンチオール塩酸塩、3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロ-1-オクタンチオール、8-メルカプト-1-オクタノール又はγ-Glu-Cysである、請求項23に記載のコンポジット材料。
【請求項２５】
コンポジット材料が膜である、請求項1〜24のいずれか一項に記載のコンポジット材料。
【請求項２６】
コンポジット材料を作製する方法であって、
第1のモノマー、第1の架橋剤、光開始剤及び溶媒を一緒にし、それによりモノマー混合物を形成するステップであって、第1のモノマーが、2つのチオール官能基を含み、第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、ステップ、
支持部材をモノマー混合物に接触させ、それにより、修飾支持部材を形成するステップであって、支持部材が、その支持部材を貫通する複数の細細孔を有し、細孔の平均細孔径が約0.1〜約25μmである、ステップ、
修飾支持部材をポリマーシートにより被覆し、それにより被覆支持部材を形成するステップ、並びに
被覆支持部材にある時間、照射を行い、それにより、コンポジット材料を形成するステップ
を含む方法。
【請求項２７】
コンポジット材料が、請求項1〜25のいずれか一項に記載のコンポジット材料である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
コンポジット材料を、光開始剤、及び複数の末端基前駆体を含む混合物に接触させ、それによりグラフト混合物を形成するステップであって、末端基前駆体が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子である、ステップ、並びに
グラフト混合物にある時間、照射を行いそれにより、修飾コンポジット材料を形成するステップ
をさらに含む、請求項26又は27に記載の方法。
【請求項２９】
光開始剤が、ベンゾイン又はベンゾインエーテル、ベンゾフェノン、ジアルコキシアセトフェノン、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン、ジフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィンオキシド、ヒドロキシアルキルフェノン、1-ヒドロキシ-シクロヘキシル-フェニル-ケトン、4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン、1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)-フェニル]-2-ヒドロキシ-2-メチル-1-プロパン-1-オン、2-ヒドロキシ-1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル]-2-メチル-1-プロパノン、α-ヒドロキシメチルベンゾインスルホン酸エステル、2-ヒドロキシ-2-メチルプロピオフェノン、リチウムアシルホスフィネート又は2-メチル-1-[4-(メチルチオ)フェニル]-2-(4-モルホリニル)-1-プロパノン、4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(ACVA)、又はそれらの混合物である、請求項26から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
溶媒が、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、水、ジ(プロピレングリコール)ジメチルエーテル(DPM)、ジ(プロピレングリコール)プロピルエーテル(DPGPE)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテル(DPGME)、トリ(プロピレングリコール)ブチルエーテル(TPGBE)、3-メチル-1,3-ブタンジオール、3,3-ジメチル-1,2-ブタンジオール、3-メトキシ-1-ブタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、エチレングリコール、ジ(エチレングリコール)、トリ(エチレングリコール)、テトラ(エチレングリコール)、ヘキシレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム又はそれらの混合物を含む、請求項26から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ある時間が、約1分間、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約30分間、約45分間又は約1時間である、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
第1の流速で、ある物質を含む第1の流体を、請求項1〜25のいずれか一項に記載のコンポジット材料に接触させ、それにより、コンポジット材料上に前記物質の一部を吸着又は吸収させるステップを含む方法。
【請求項３３】
第1の流体が、断片化抗体、凝集抗体、宿主細胞由来タンパク質、ポリヌクレオチド、内毒素又はウイルスをさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
第1の流体の流体流通経路が、実質的に、コンポジット材料のマクロ細孔を通る、請求項32又は33に記載の方法。
【請求項３５】
第1の流体の流体流通経路が、コンボジット材料のマクロ細孔に実質的に垂直である、請求項32又は33に記載の方法。
【請求項３６】
前記物質の実質的にすべてが、第1の流体に接触した後、コンポジット材料上に吸着又は吸収される、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
第2の流速で、第2の流体をコンポジット材料上に吸着又は吸収された物質に接触させ、それにより、コンポジット材料から前記物質の一部を放出させるステップ
をさらに含む、請求項32〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
第2の流体の流体流通経路が、実質的に、コンポジット材料のマクロ細孔を通る、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
第2の流体の流体流通経路が、コンボジット材料のマクロ細孔に実質的に垂直である、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
前記物質が、生体分子、生体イオン、ウイルス又はウイルス粒子である、請求項32〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
生体分子又は生体イオンが、アルブミン、リゾチーム、ウイルス、細胞、ヒト及び動物起源のγ-グロブリン、ヒト及び動物起源の免疫グロブリン、組換え及び天然起源のタンパク質、合成及び天然起源のポリペプチド、インターロイキン-2及びその受容体、酵素、モノクローナル抗体、トリプシン及びその阻害剤、シトクロムC、ミオグロビン、ミオグロブリン、α-キモトリプシノーゲン、組換えヒトインターロイキン、組換え融合タンパク質、核酸由来生成物、合成及び天然起源のDNA、及び合成及び天然起源のRNAからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
生体分子又は生体イオンが、リゾチーム、hIgG、ミオグロビン、ヒト血清アルブミン、ダイズトリプシンインヒビター、トランスフェリング、エノラーゼ、オボアルブミン、リボヌクレアーゼ、卵トリプシンインヒビター、シトクロムc、アネキシンV又はα-キモトリプシノーゲンである、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
第1の流体中の物質の濃度が、約0.2mg/mL〜約10mg/mLである、請求項32〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
第1の流速が、約3膜容量(MV)/分〜約70MV/分である、請求項32〜43のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、2015年2月20日出願の、米国仮特許出願第62/118,577号への優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
「クリックケミストリー」は、以下の属性を有する、自然の生化学反応に似ている反応のクラスである:高収率になるまで迅速に進行する、非常に効率的な、「バネ仕掛け(spring-loaded)」反応である、副生成物をまったく(又はほとんど)生成せず、かつ多官能基を許容する、非常に選択的な反応である、及び低温(又は周囲)などの温和な反応条件下、又は水溶液中で進行する反応である。
【０００３】
クリックケミストリーは、ディールス-アルダー反応、銅を触媒とするアルケン-アジド環化付加(CuAAC)、チオール-マレイミド付加反応、並びにチオール-アルケン及びチオール-アルキン付加反応などの化学反応の範囲を包含するよう発展してきた。
【０００４】
用語「チオール-エン」は、非活性化炭素-炭素二重結合に加えて、マレイミド、アクリレート及びノルボルネンなどの幅広い不飽和官能基のいずれかへのチオールのヒドロチオレーション付加を説明するために一般に使用される。一部の場合、この反応は、古典的なラジカル付加機構により行われるだけではなく、マイケル型求核付加により行うこともできる。用語「チオール-イン」は、アルケンの代わりに、アルキンを使用する対応するヒドロチオレーション法を記載するために使用される。一般に、チオール-エン及びチオール-イン反応は、光開始ラジカル条件下で行われ、開始工程、連鎖工程及び停止工程を伴う典型的な鎖成長過程を経て進行する。
【０００５】
チオール-エン及びチオール-インクリック反応は、ポリマー合成のための多くの魅力的な特徴を有する。この反応は迅速で、立体特異的であり、水に対して感受性ではなく、様々なチオール及び/又はアルケン/アルキン官能基化モノマーの使用により、様々なポリマー官能基をもたらすことができる。二、三及び四官能基化チオール及びアルケン/アルキンモノマーを使用することにより、チオール-エン及びチオール-インクリック反応を行い、様々な化学官能基を有する新規物質を構築することが可能である。これらの反応はまた、類似したアクリレートポリマーと比べ、一層高度に組織化されたポリマー網目構造をもたらすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
迅速、効率的及び容易に制御可能な重合反応によって容易に作製することができ、かつ容易に修飾することが可能な、分離用又はクロマトグラフィー用媒体が必要とされている。これらの媒体はまた、高い選択性及び高い流速、低い背圧を示さなければならず、安価でなければならず、かつカラム寿命が長いこと、処理時間が短いこと、及び総合的な操作上の適用柔軟性が可能とならなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある種の実施形態では、本発明は、
それを貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、2つのチオール官能基を含み、
第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、
コンポジット材料に関する。
【０００８】
ある種の実施形態では、本発明は、
それを貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー、第2のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、2つのチオール官能基を含み、
第2のモノマーは、2つの炭素-炭素二重結合を含み、
第1の架橋剤は、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、
コンポジット材料に関する。
【０００９】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料を作製する方法であって、
第1のモノマー、第1の架橋剤、光開始剤及び溶媒を一緒にするステップであって、第1のモノマーが、2つのチオール官能基を含み、第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含み、それによりモノマー混合物を形成する、ステップ、
支持部材をモノマー混合物に接触させ、それにより、修飾支持部材を形成するステップであって、支持部材が、それを貫通する複数の細細孔を有し、細孔の平均細孔径が約0.1〜約25μmである、ステップ、
修飾支持部材をポリマーシートにより被覆し、それにより被覆支持部材を形成するステップ、並びに
被覆支持部材にある時間、照射を行い、それにより、コンポジット材料を形成するステップ
を含む方法に関する。
【００１０】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料を作製する方法であって、
第1のモノマー、第2のモノマー、第1の架橋剤、光開始剤及び溶媒を一緒にするステップであって、第1のモノマーが、2つのチオール官能基を含み、第2のモノマーが、2つの炭素-炭素二重結合を含み、第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含み、それによりモノマー混合物を形成する、ステップ、
支持部材をモノマー混合物に接触させ、それにより、修飾支持部材を形成するステップであって、支持部材が、それを貫通する複数の細細孔を有し、細孔の平均細孔径が約0.1〜約25μmである、ステップ、
修飾支持部材をポリマーシートにより被覆し、それにより被覆支持部材を形成するステップ、並びに
被覆支持部材にある時間、照射を行い、それにより、コンポジット材料を形成するステップ
を含む方法に関する。
【００１１】
ある種の実施形態では、本発明は、モノマー混合物が、複数の末端基前駆体をさらに含み、この末端基前駆体は、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【００１２】
ある種の実施形態では、本発明は、
コンポジット材料を、光開始剤、及び複数の末端基前駆体を含む混合物に接触させるステップであって、末端基前駆体が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子であり、それにより、グラフト混合物を形成するステップ、並びに
グラフト混合物にある時間、照射を行い、それにより、修飾コンポジット材料を形成するステップ
をさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【００１３】
ある種の実施形態では、本発明は、
第1の流速で、ある物質を含む第1の流体を、本明細書に記載されているコンポジット材料のいずれかに接触させ、それにより、コンポジット材料上に上記物質の一部を吸着又は吸収させるステップ
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コモノマーとしてTEGDVを使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図２】コモノマーとしてTEGDV、及び様々な量の開始剤を使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図３】コモノマーとしてTEGDV及びDATAを使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図４Ａ】コモノマーとしてDATAを使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用された反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図４Ｂ】コモノマーとしてDATAを、図4Aを対象とする実験よりも高い濃度で使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図５Ａ】0.96のアルケン対チオール比(存在する反応性官能基の数によって算出しており、各アルキンが2つのチオールと反応し得るので、1つのアルキンが2つのアルケンと等価となる)で配合されたコモノマーとして、DATAを用いて配合されたコンポジット膜のESEM画像の図である(EN-149)。
【図５Ｂ】1.05のアルケン対チオール比(存在する反応性官能基の数によって算出しており、各アルキンが2つのチオールと反応し得るので、1つのアルキンが2つのアルケンと等価となる)で配合されたコモノマーとして、DATAを用いて配合されたコンポジット膜のESEM画像の図である(EN-151)。
【図６】コモノマーとしてDATAを用いて配合されたコンポジット膜(EN-124)のESEM画像を示す図である。この膜を作製するための重合混合物中のアルケン対チオール比は、1.27とした。
【図７】追加の架橋剤としてオクタジインを用いるクリックアルケン反応によって形成された膜の場合の反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図８Ａ】アルケン対チオール比が1.074で調製された、追加の架橋剤としてオクタジインを用いて調製されたコンポジット膜のESEM画像の図である(EN-134)。
【図８Ｂ】アルケン対チオール比が1.18で調製された、追加の架橋剤としてオクタジインを用いて調製されたコンポジット膜のESEM画像の図である(EN-120)。
【図９】クリックアルケン反応によって形成され、重合後に第2のクリック反応によりカルボキシレート部分によりグラフトされた、膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図１０】カルボキシレート部分によりグラフトされる前(左のバー)、及びカルボキシレート部分によりグラフトされた後(左から2番目のバー)の、本発明の様々なコンポジット膜の水流束のグラフである。pH5に曝露すると、流束は増加する(右から2番目のバー)。0.1M  NaOHに曝露すると、流束は、再び(右側のバー)低下する。
【図１１】カルボキシレート部分によりグラフトする前(左のバー)、カルボキシレート部分により水中でグラフトした後(中央のバー)、及びカルボキシレート部分によりDMAc中でグラフトした後(右のバー)の、本発明の様々なコンポジット膜の水流束のグラフである。
【図１２】チオール官能基化添加物(A)の非存在下、及びチオール官能基化添加物(B及びC)の存在下で、プロテインAにより修飾された3種の膜の結合能力の表である。
【図１３】コモノマーとしてDATA、及び例えば、トリエチレングリコール又はテトラエチレングリコールを含む溶媒系を用いたクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図１４】CLK-EN-298膜のSEM画像の図である。
【図１５】共架橋剤としてPETMを使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図１６】テトラチオール(PETM)架橋剤を使用して作製したEN-325膜のSEM画像の図である。
【図１７】共架橋剤としてオクタジインを使用するクリックアルケン反応によって形成された膜の調製において使用された反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図１８】CLK-EN-361膜のSEM画像の図である。
【図１９】1工程重合及び官能基化によって形成されたHIC膜の調製において使用した反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図２０】アルケン官能基化膜から始めた2工程グラフト伸長法の概略図である。
【図２１】二重重合反応において使用した、反応の構成成分(重量%)及び溶媒(重量%)の表である。
【図２２】二重重合反応において使用した反応の構成成分(mol.%)、及び得られた膜の特性の表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
全体
最近の研究は、チオール-エン及びチオール-インクリックケミストリーを使用して、主にフィルム、コーティング剤及びデンドリマー用途向けの様々な官能基化ポリマー網目構造を生成することに重点が置かれてきたが、この手法は、液体の分離方法に有用なマクロ多孔性網目構造のポリマー膜の生成には適用されてこなかった。ある種の実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィー用途に好適な架橋ポリマー膜を生成するためのチオール-エン及びチオール-インクリックケミストリーの使用に関する。ある種の実施形態では、架橋膜は、化学官能基又は分子種によりさらにグラフトされる。ある種の実施形態では、重合による架橋膜の生成、及びグラフトによる架橋膜の修飾は、非常に効率的なチオール-エン及び/又はチオール-インクリック反応(1工程又は2工程手順)により行われる。
【００１６】
ある種の実施形態では、チオール-エン及びチオール-インクリックケミストリーは、繊維基材により支持される架橋ポリマーを作製するために使用され、それによりコンポジット膜を形成する。ある種の実施形態では、コンポジット膜中の架橋ポリマーは、さらなるクリック反応により、様々な化学化合物又は分子種を結合させるために使用することができる、チオール又は炭素-炭素不飽和結合などの残存反応性基を含有する。
【００１７】
ある種の実施形態では、架橋ポリマーはマクロ多孔性である。ポリマー内の多孔性は、架橋度、ポリマー網目構造が形成される間のポリマー鎖からの溶媒の排除、又はそれらの両方のある組合せによって、重合の間に促進され得る。
【００１８】
ポリマー中の架橋度は、モノマー比の調節により調整することができる。具体的には、アルケン対チオール比が、適切な多孔性を確実なものとすると考えられる。ポリマー網目構造中のポリマーの鎖長、したがって架橋度は、最終ポリマー及び膜に特定の物理学的特性を付与する特定のモノマーを使用することによって、やはり制御することができる。これらの「調節」モノマーは、ポリマー鎖と溶媒系との相互作用に影響を及ぼすことができる。さらに、これらのモノマーの親水性/疎水性は、得られたゲルの最終的な水性膨潤特性、及びポリマー網目構造の親水性/疎水性表面特性に影響を及ぼすことができる。
【００１９】
チオール-エン反応が非常に速いので、クリックケミストリーを使用する場合、ポリマー網目構造の多孔性を制御するには注意が必要である。その結果、成長している鎖の動きが細孔の形成を制限する可能性がある。この望ましくない結果を最小限にするために、溶媒系及びモノマーは、ある点において溶液から成長中のポリマー鎖を排除するように適切な推進力が存在し、それにより、マクロ細孔を形成することが確実となるよう選択される。具体的には、最初は反応剤のすべてを溶解することができるが、架橋ポリマー鎖が成長して、ある分子量より大きくなるにつれて、架橋ポリマー鎖にとって貧溶媒として働く、好適な反応系をもたらすように溶媒と非溶媒との混合物を調節する。貧溶媒(ポリマー鎖にとっての)の割合が高すぎる溶媒系では、成長中のポリマー鎖の迅速な沈殿がもたらされることがあり、これにより多孔性が低下する。
【００２０】
一般に、多孔性が高く非剛直な多くのポリマー物質は比較的弱く、典型的な膜分離過程(例えば、液体クロマトグラフィー)の間に発生する圧力に耐えることができない。したがって、機械的に好適な膜を作製するために、ある種の実施形態では、多孔性基材(化学的に不活性なポリプロピレンから作製される織基材など)と多孔性架橋ポリマーの両方を含むコンポジット材料は、基材の細孔内に直接、ポリマーを合成することにより生成される。
【００２１】
ある種の実施形態では、環境制御走査型電子顕微鏡法(ESEM)を使用して試験した場合、コンポジット材料は、基材繊維内に取り込まれた、良好に結合したゲルの網目構造を示した。
【００２２】
ある種の実施形態では、本発明のコンポジット材料は、「結合-溶出」と「通過」モードの両方に効果的に使用することができる。
【００２３】
「結合-溶出モード」は、本明細書で使用する場合、標的タンパク質と望ましくない汚染物質の両方がクロマトグラフィー支持材料又はコンポジット材料に結合するようにバッファーの条件が確立される、クロマトグラフィーへの操作上の手法を指す。続いて、他の構成成分からの標的タンパク質の分画化は、標的タンパク質及び汚染物質が、個々に溶出されるよう、条件を変更することにより達成される。ある種の実施形態では、本明細書に記載されている膜は、高い導電性、大容量スループット及び選択性における高い速度論的結合能力を特徴とする「結合-溶出モード」で使用することができる。ある種の実施形態では、溶離液中の標的タンパク質の量は、約50%〜約99%低下する。ある種の実施形態では、溶離液は、標的タンパク質の凝集を、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%低下させる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「通過モード」とは、不活性な標的タンパク質は、適用時に膜を通過する一方、汚染物質は選択的に保持されるようにバッファー条件が確立される、クロマトグラフィーに対する操作上の手法を指す。ある種の実施形態では、本明細書に記載されている膜は、プロテインA精製工程後における「通過モード」において使用され、単一工程で、DNA、宿主細胞由来タンパク質(HCP)、溶出プロテインA、望ましくない凝集体及びウイルスなどの重要な汚染物質を除去することができる。
【００２５】
例示的なコンポジット材料の様々な特徴
ゲルの組成
ある種の実施形態では、架橋ポリマーは、ジチオールモノマーと、架橋剤として働くトリ-ビニルモノマー又はアルキンモノマーとの間の反応によって形成することができる。スキーム1A及びスキーム1Bを参照されたい。ある種の実施形態では、追加のモノマーを加えて、ポリマーの最終的な化学的、物理的及び機械特性を調節することができる。ある種の実施形態では、架橋ポリマーは、ジエンモノマーと、架橋剤として働くトリ-チオールモノマーとの間の反応によって形成することができる。
【００２６】
【化１】
2018511667.tif 000002
【００２７】
【化２】
2018511667.tif 000003
【００２８】
ある種の実施形態では、架橋ポリマーは、グラフト部分により架橋鎖をグラフトすることによりさらに官能基化することができる。ある種の実施形態では、グラフト部分は、さらなる化学的な官能基をやはり有するチオール又はアルケンである。ある種の実施形態では、架橋ポリマーは、単一工程(「ワンポット」手法、スキーム2)で形成及びグラフトされる。例えば、重合混合物中にメルカプトコハク酸が含まれていると、カルボン酸官能基を有するポリマーとなる。システアミン(又はあるいは、アリルアミン)が含まれると、アミン官能基を有するポリマーとなる。メルカプトエタンスルホン酸(又はあるいは、アリルスルホン酸ナトリウム)の使用により、ポリマー網目構造にスルホン酸基及び負電荷が組み込まれる。
【００２９】
【化３】
2018511667.tif 000004
【００３０】
ある種の実施形態では、架橋ポリマーは、重合後の修飾により官能基化することができる。この2工程方法では、チオール-アルケン重合中に生成した過剰のチオール又はアルケン基は、個別のグラフト工程の間に修飾される(スキーム3)。チオール対アルケンモノマーのフィード比を制御することによって、最終ポリマーは、アルケン又はチオール基のどちらかを過剰に有することができる。続いて、一方の官能基は、クリック反応などのグラフト反応に使用されて、最終的なポリマー化学又は官能基をさらに修飾することができる。ある種の実施形態では、この手法は、バイオ分子(例えば、タンパク質)のクロマトグラフィー分離に有用な、様々なリガンドを含有するポリマー膜の作製に有用である。例えば、この手法を使用して、膜イオン交換官能基(カルボキシレート、スルホネート、四級アンモニウム、アミン)、疎水性相互作用部分(1-オクタンチオール又は1-オクテンの使用によるオクチル基など)、及びバイオ-アフィニティークロマトグラフィー(モノクローナル抗体精製用のシステイン-プロテインAなど)用のバイオ分子に導入することができる。
【００３１】
【化４】
2018511667.tif 000005
【００３２】
ある種の実施形態では、チオール-エングラフト化は、バイオ分子を膜の架橋ポリマーに結合させる魅力的な選択肢である。この反応は迅速で、水性媒体中で効率よく行うことが可能であり、室温で良好に働き、かつタンパク質の生物活性に非常に限定的な影響しか及ぼさない、比較的長波長の光(365nm)を使用して光により開始することができる。さらに、この反応は、バイオ分子の結合を制御することが可能であり、このことは、バイオ分子の生物活性及び3D構造を保存する点で、利点となり得る。
【００３３】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されているコンポジット材料上に、遊離チオール官能基を有するいかなるバイオ分子であっても固定化することが可能である。これは、バイオ分離又はバイオ触媒作用膜(酵素の固定化による)用のバイオアフィニティー膜を作製するのに非常に有用となり得る。ある種の実施形態では、コンポジット材料は、DNA検出用のオリゴヌクレオチドプローブにより官能基化することができる。
【００３４】
多孔性支持部材
一部の実施形態では、多孔性支持部材は、約0.1〜約50μmの平均直径の細孔を有する。
【００３５】
一部の実施形態では、多孔性支持部材は、約40%〜約90%の気孔率(volume porosity)を有する。
【００３６】
ある種の実施形態では、多孔性支持体は平坦である。
【００３７】
ある種の実施形態では、多孔性支持体はディスク形状である。
【００３８】
多数の多孔性基材又は膜を、支持部材として使用することができる。一部の実施形態では、多孔性支持部材は、ポリマー物質から作製される。ある種の実施形態では、支持体は、低コストで入手可能なポリオレフィンとなり得る。ある種の実施形態では、ポリオレフィンは、ポリ(エチレン)、ポリ(プロピレン)又はポリ(ビニリデンジフルオリド)とすることができる。熱的に誘発される相分離(TIPS)又は非溶媒誘発性相分離により作製される、伸長されたポリオレフィン膜が述べられている。ある種の実施形態では、支持部材は、セルロース又はその誘導体などの天然ポリマーから作製され得る。ある種の実施形態では、好適な支持体には、ポリエーテルスルホン膜、ポリ(テトラフルオロエチレン)膜、ナイロン膜、セルロースエステル膜、繊維ガラス又はろ紙を含む。
【００３９】
ある種の実施形態では、多孔性支持体は、織繊維材料又は不織繊維材料、例えば、ポリプロピレンなどのポリオレフィンからなる。このような織繊維又は不織繊維支持材料は、TIPS支持材料よりも大きな細孔サイズを有することができ、一部の例では、最大約75μmの細孔サイズを有することができる。支持部材中のより大きな細孔により、マクロ細孔ゲル中で、より大きなマクロ細孔を有するコンポジット材料の形成が可能になる。セラミックをベースとする支持体などの非ポリマー支持部材も使用することができる。多孔性支持部材は、様々な形状及びサイズを採ることができる。
【００４０】
一部の実施形態では、支持部材は、膜の形態にある。
【００４１】
一部の実施形態では、支持部材は、約10〜約2000μm、約10〜約1000μm又は約10〜約500μmの厚さを有する。
【００４２】
他の実施形態では、複数の多孔性支持体ユニットを、例えば、積層により一緒にすることができる。一実施形態では、例えば2〜10個の膜である多孔性支持体膜の積層体を、ゲルが多孔性支持体の空隙内に形成される前に、組み立てることができる。別の実施形態では、単一支持部材ユニットを使用して、コンポジット材料膜が形成され、次に、これらの膜が使用前に積層される。
【００４３】
ゲルと支持部材との間の関係
ゲルは、支持部材内に固定されてもよい。用語「固定された(anchored)」は、ゲルが支持部材の細孔内に保持されていることを意味することが意図されているが、この用語は、ゲルが支持部材の細孔に化学的に結合していることを意味するよう、必ずしも限定されている訳ではない。ゲルは、支持部材の構造要素と絡み合う及び結び付くことにより、支持部材に実際に化学的にグラフトすることなく、ゲルに強いられる物理的制約によって保持され得るが、一部の実施形態では、このゲルは、支持部材の細孔の表面にグラフトされ得る。
【００４４】
ある種の実施形態では、架橋ゲルはマクロ多孔性である。これらの場合、マクロ細孔は、支持部材の細孔を占有するゲル中に存在するので、これらのゲルのマクロ細孔は、支持部材の細孔より小さくなければならない。したがって、支持部材中に存在している細孔のサイズがゲルのマクロ細孔のサイズよりも大きい条件で、コンポジット材料の流動特徴及び分離特徴は、ゲルの特徴に依存するが、多孔性支持部材の特徴からは概ね独立である。コンポジット材料の多孔性は、支持部材をゲルで充填することにより調節することができ、ゲルの多孔性は、モノマー又はポリマーの性質及び量、架橋剤、反応溶媒並びに使用される場合、ポロゲン(porogen)によって、一部又は完全に影響を受ける。コンポジット材料の特性は、ゲルの特性によって、一部、そうでない場合、完全に決定される。正味の結果は、本発明は、コンポジット材料のマクロ細孔サイズ、透過度及び表面積への制御を実現する。
【００４５】
コンポジット材料のマクロ細孔の数は、存在する場合、支持材料の細孔数によって影響を受けない。コンポジット材料のマクロ細孔は支持部材中の細孔よりも小さいので、コンポジット材料のマクロ細孔の数は、支持部材の細孔の数よりもはるかに大きいものとなり得る。上記の通り、マクロ細孔ゲルの細孔サイズに及ぼす支持材料の細孔サイズの影響は、一般に、無視できるものである。例外は、支持部材が細孔サイズ及び細孔サイズ分布に大きな差異を有する場合、及び非常に小さな細孔サイズ及び細孔サイズが狭い分布範囲を有するマクロ細孔ゲルが求められる場合に見られる。これらの場合では、支持部材の細孔サイズ分布の大きなばらつきは、マクロ細孔ゲルの細孔サイズ分布に弱くしか反映されない。ある種の実施形態では、やや狭い細孔サイズ範囲を有する支持部材が、このような状況において使用され得る。
【００４６】
ある種の実施形態では、本発明は、比較的、非毒性な、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００４７】
コンポジット材料の調製
ある種の実施形態では、本発明のコンポジット材料は、単一工程法により調製することができる。ある種の実施形態では、これらの方法は、反応溶媒として、水、又は他の環境に優しい溶媒を使用することができる。ある種の実施形態では、本方法は、迅速であり得、したがって、単純かつ/又は迅速な製造方法となり得る。ある種の実施形態では、コンポジット材料の調製は安価とすることができる。
【００４８】
ある種の実施形態では、コンポジット材料は、モノマー(単数又は複数)、架橋剤(単数又は複数)、開始剤(単数又は複数)、及び場合により1種以上のポロゲンを1種以上の適切な溶媒中で混合することにより調製することができる。ある種の実施形態では、得られた混合物は、均一であってもよい。ある種の実施形態では、この混合物は不均一とすることができる。ある種の実施形態では、次に、この混合物は好適な多孔性支持体に導入されてもよく、ここでゲル形成反応を行うことができる。
【００４９】
ある種の実施形態では、ポロゲンが反応剤混合物に添加されてもよく、ポロゲンは、細孔形成性添加物として幅広く記載され得る。ある種の実施形態では、ポロゲンは、熱力学的な貧溶媒及び抽出可能なポリマー(例えば、ポリ(エチレングリコール))、界面活性剤、並びに塩からなる群から選択することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、ゲル成形反応が開始されなければならない。ある種の実施形態では、ゲル成形反応は、任意の公知の方法によって、例えば、熱的活性化又はUV照射への曝露により、開始することができる。ある種の実施形態では、この反応は、光開始剤の存在下で、UV照射により開始することができる。ある種の実施形態では、光開始剤は、2-ヒドロキシ-1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル]-2-メチル-1-プロパノン(Irgacure 2959)、4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(ACVA)、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン(DMPA)、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びベンゾインエーテル(ベンゾインエチルエーテル及びベンゾインメチルエーテルなど)、ジアルコキシアセトフェノン、ヒドロキシアルキルフェノン及びα-ヒドロキシメチルベンゾインスルホン酸エステルからなる群から選択することができる。熱活性化には、熱開始剤の添加が必要なことがある。ある種の実施形態では、熱開始剤は、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)(VAZO(登録商標)触媒88)、アゾビス(イソブチロニトリル)(AIBN)、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム及び過酸化ベンゾイルからなる群から選択することができる。
【００５１】
ある種の実施形態では、ゲル形成反応は、UV照射により開始することができる。ある種の実施形態では、ゲル形成反応の反応剤に光開始剤を添加することができ、モノマー、架橋剤及び光開始剤からなる混合物を含有する支持部材は、数秒から数時間、約250nm〜約400nmの波長のUV照射に曝露され得る。ある種の実施形態では、モノマー、架橋剤及び光開始剤からなる混合物を含有する支持部材は、数秒から数時間、約350nmのUV照射に曝露することができる。ある種の実施形態では、モノマー、架橋剤及び光開始剤からなる混合物を含有する支持部材は、約10分間、約350nmのUV照射に曝露することができる。ある種の実施形態では、可視波長光を使用して、重合を開始することができる。ある種の実施形態では、エネルギーが支持部材を透過できるように、支持部材は、使用される波長で低い吸光度を有していなければならない。
【００５２】
ある種の実施形態では、重合が行われる速度は、マクロ細孔ゲル中で得られるマクロ細孔のサイズに影響を及ぼすことがある。ある種の実施形態では、ゲル中の架橋剤の濃度が十分な濃度まで上昇すると、ゲルの構成物は凝集を始め、高いポリマー密度の領域、及びポリマーをほとんど含まないか又はポリマーをまったく含まない領域を生成し、後者の領域は、本明細書では「マクロ細孔」と称される。この機構は、重合速度によって影響を受ける。
【００５３】
ある種の実施形態では、コンポジット材料が一旦、調製されると、これらのコンポジット材料を様々な溶媒を用いて洗浄することにより、未反応構成成分、及び支持体内に固定されていないポリマー又はオリゴマーを除去することができる。ある種の実施形態では、コンポジット材料の洗浄に好適な溶媒には、水、酸性(例えば、HCl)又は塩基性(例えば、NaOH)水溶液、塩水溶液(例えば、NaCl)、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール及びDMFが含まれる。
【００５４】
コンポジット材料の例示的な使用
ある種の実施形態では、本発明は、流体を上述のコンポジット材料のいずれか1つの架橋ゲルに通過させる方法に関する。結合又は分画化の条件を調節することにより、良好な選択性を得ることができる。
【００５５】
ある種の実施形態では、本発明は、溶液からタンパク質又は免疫グロブリンなどのバイオ分子を分離する方法に関する。ある種の実施形態では、本発明は、タンパク質又は免疫グロブリンなどのバイオ分子を精製する方法に関する。ある種の実施形態では、本発明は、高い選択性を有するタンパク質又はモノクローナル抗体を精製する方法に関する。ある種の実施形態では、本発明は、生体分子又は生体イオンが、その三級又は四級構造を保持し、これらの構造が生物活性を保持するのに重要となり得る、方法に関する。ある種の実施形態では、分離又は精製され得る、生体分子又は生体イオンには、アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン、及びリゾチームなどのタンパク質が含まれる。ある種の実施形態では、分離することができる生体分子又は生体イオンには、ヒト及び動物を起源とするγ-グロブリン、ヒト及び動物を起源とするIgG、IgM又はIgEなどの免疫グロブリン、プロテインA、フィトクロム、好塩性プロテアーゼ、ポリ(3-ヒドロキシブチレート)デポリメラーゼ、アクラエシン(aculaecin)-Aアシラーゼ、合成及び天然起源のポリペプチド、インターロイキン-2及びその受容体を含めた組換え及び天然起源のタンパク質、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼAなどの酵素、モノクローナル抗体、抗体の断片、トリプシン及びその阻害剤、様々な起源のアルブミン、例えば、αーラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、鶏卵アルブミン、オボアルブミンなど、シトクロムC、免疫グロブリン、ミオグロブリン、組換えヒトインターロイキン、組換え融合タンパク質、核酸由来生成物、合成及び天然起源のDNA並びにRNA、DNAプラスミド、レクチン、α-キモトリプシノーゲン、並びに低分子を含めた天然生成物が含まれる。ある種の実施形態では、本発明は、変異体、不純物、又はそれらに伴う汚染物質から抗体断片を回収する方法に関する。ある種の実施形態では、バイオ分子の分離又は精製は、架橋ゲルにおいて実質的に行うことができる。ある種の実施形態では、バイオ分子の分離又は精製は、架橋ゲルがマクロ細孔を有する場合に、架橋ゲルのマクロ細孔において実質的に行うことができる。
【００５６】
ある種の実施形態では、本発明は、物質の可逆的な吸着方法に関する。ある種の実施形態では、吸着された物質は、ゲルを通過させる液体を変更することにより放出され得る。ある種の実施形態では、物質の取込み及び放出は、架橋ゲルの組成を変化させることによって制御することができる
【００５７】
ある種の実施形態では、本発明は、上記物質がバッファー溶液からコンポジット材料に適用され得る、方法に関する。
【００５８】
ある種の実施形態では、本発明は、塩水溶液の様々な濃度及びpHを使用して上記物質を溶出することができる、方法に関する。
【００５９】
ある種の実施形態では、本発明は、高い結合能力を示す、方法に関する。ある種の実施形態では、本発明は、結合能力が、10%ブレークスルー (breakthrough)において、約1mg/mLmembrane、約2mg/mLmembrane、約3mg/mLmembrane、約4mg/mLmembrane、約5mg/mLmembrane、約6mg/mLmembrane、約7mg/mLmembrane、約8mg/mLmembrane、約9mg/mLmembrane、約10mg/mLmembrane、約12mg/mLmembrane、約14mg/mLmembrane、約16mg/mLmembrane、約18mg/mLmembrane、約20mg/mLmembrane、約30mg/mLmembrane、約40mg/mLmembrane、約50mg/mLmembrane、約60mg/mLmembrane、約70mg/mLmembrane、約80mg/mLmembrane、約90mg/mLmembrane、約100mg/mLmembrane、約110mg/mLmembrane、約120mg/mLmembrane、約130mg/mLmembrane、約140mg/mLmembrane、約150mg/mLmembrane、約160mg/mLmembrane、約170mg/mLmembrane、約180mg/mLmembrane、約190mg/mLmembrane、約200mg/mLmembrane、約210mg/mLmembrane、約220mg/mLmembrane、約230mg/mLmembrane、約240mg/mLmembrane、約250mg/mLmembrane、約260mg/mLmembrane、約270mg/mLmembrane、約280mg/mLmembrane、約290mg/mLmembrane、約300mg/mLmembrane、約320mg/mLmembrane、約340mg/mLmembranemg/mLmembrane、約360mg/mLmembrane、約380mg/mLmembrane又は約400mg/mLmembraneの結合能力を示す、方法に関する。
【００６０】
水流束QH2O(kg/m2h)は、以下の式:
【００６１】
【数１】
2018511667.tif 000006
(式中、m1は、t1における膜を移送される水の質量であり、m2は、t2における膜を移送される水の質量であり、Aは、膜の断面積であり、tは、時間(t1>t2)である)を使用して算出した。
【００６２】
ある種の実施形態では、溶出塩溶液に添加物を添加してもよい(第2の流体又は第3の流体、又はそれ以降の流体)。ある種の実施形態では、添加物は、低濃度(例えば、約2M未満、約1M、約0.5M又は約0.2M)で添加される。ある種の実施形態では、添加物は、水混和性アルコール、洗剤、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド又はカオトロピック塩の水溶液である。
【００６３】
ある種の実施形態では、pHの変更は、移動相の導電率の変化を伴い又は伴わずに、タンパク質溶出を行うための効果的な溶出手段である。
【００６４】
細孔サイズの決定
SEM及びESEM
上記の通り、ある種の実施形態では、架橋ゲルはマクロ多孔性架橋ゲルである。マクロ多孔性架橋ゲル中のマクロ細孔の平均直径は、多くの方法の1つによって推定することができる。使用することができる方法の1つは、走査型電子顕微鏡法(SEM)である。SEMは、一般には、細孔サイズ及び孔隙率を決定するため、特に膜を特徴づけるため十分に確立されている方法である。Basic Principles of Membrane Technology by MarcelMulder(著作権1996年)(「Mulder」)(とりわけ第IV章)という書物を参照する。Mulderは、膜を特徴づける方法の総説を提供している。多孔性膜の場合、言及されている第1の方法は、電子顕微鏡法である。SEMは、マイクロろ過膜を特徴づけるための非常に単純かつ有用な技法である。膜の明確かつ簡潔な写真は、上部層、断面及び底部層に関して得ることができる。さらに、多孔性及び細孔サイズ分布は、写真から推定することができる。
【００６５】
環境制御SEM(ESEM)は、試験片チャンバにガス環境を可能にすることにより、湿潤試験片の非破壊的画像化を可能にする技法である。環境制御二次検出器(ESD)は、約3torr〜約20torrで働いて運転するために、ガスのバックグラウンドを必要とする。これらの圧力制限により、試料チャンバ内を様々な湿度にする能力が制限される。例えば、10torrでは、特定の温度における相対湿度は、以下の通りとなる:
【００６６】
【表１−１】
2018511667.tif 000007
【００６７】
これは、様々な温度における試料チャンバ中の相対湿度の有用な指針となる。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の相対湿度は、約1%〜約99%である。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の相対湿度は、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約99%である。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の相対湿度は、約45%である。
【００６８】
ある種の実施形態では、顕微鏡は、ナノメートルの分解能、及び最大約100,000Xの拡大を有する。
【００６９】
ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の温度は、約1℃〜約95℃である。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の温度は、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃、約10℃、約12℃、約14℃、約16℃、約18℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃又は約85℃である。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の温度は、約5℃である。
【００７０】
ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の圧力は、約0.5torr〜約20torrである。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の圧力は、は、約4torr、約6torr、約8torr、約10torr、約12torr、約14torr、約16torr、約18torr又は約20torrである。ある種の実施形態では、画像化中の試料チャンバ中の圧力は、約3torrである。
【００７１】
ある種の実施形態では、電子ビーム源から試料までの作業距離は、約6mm〜約15mmである。ある種の実施形態では、電子ビーム源から試料までの作業距離は、約6mm、約7mm、約8mm、約9mm、約10mm、約11mm、約12mm、約13mm、約14mm又は約15mmである。ある種の実施形態では、電子ビーム源から試料までの作業距離は、約10mmである。
【００７２】
ある種の実施形態では、電圧は、約1kV〜約30kVである。ある種の実施形態では、電圧は、約2kV、約4kV、約6kV、約8kV、約10kV、約12kV、約14kV、約16kV、約18kV、約20kV、約22kV、約24kV、約26kV、約28kV又は約30kVである。ある種の実施形態では、電圧は、約20kVである。
【００７３】
ある種の実施形態では、平均細孔径は、画像の代表的な試料において、コンポジット材料の上部又は底部からの細孔径を推定することにより測定することができる。当業者は、湿潤膜のESEM画像を得ることに伴う、様々な実験変数を認識かつ熟知しており、したがって、実験を設計することができよう。
【００７４】
キャピラリーフローポロメトリー
キャピラリーフローポロメトリーは、多孔性物質の細孔サイズを測定するために使用される分析的技法である。この分析的な技法では、湿潤用液体が試験試料の細孔を充填するために使用され、非反応性ガスの圧力を使用して、細孔から液体を除去する。試料によるガス圧及び流速は正確に測定され、細孔径は、以下の式を使用して決定される:細孔から液体を除去するために必要なガス圧は、以下の式による細孔サイズに関連する:
D=4×γ×cosθ/P
D=細孔径
γ=液体の表面張力
θ=液体の接触角度
P=ガス圧の差
【００７５】
この式は、湿潤試料から液体を除去するのに必要な圧が細孔サイズに反比例の関係にあることを示している。この技法は、加圧下で試験試料の細孔からの液体の流れを含むので、「細孔通過」を特徴づけるのに有用である(相互に連結した細孔が、試料の一方の側から他方の側に液体が流れるのを可能にする)。他の細孔タイプ(独立気孔及び閉塞気孔)は、この方法によって検出できない。
【００７６】
キャピラリーフローポロメトリーは、ガスがその細孔を流れ始めると、細孔の存在を検知する。これは、ガスの圧力が細孔の最も狭窄している部分から液体を除去するのに十分に高い場合にしか起こらない。したがって、この方法を使用して算出される細孔径は、最も狭窄している部分における細孔径であり、各細孔は、この狭窄した直径の単一細孔として検知される。最大の細孔径(泡立ち点と呼ばれる)は、湿潤試料への流れを開始するのに必要な最低ガス圧によって決定され、平均細孔径は、平均流動圧から算出される。さらに、狭窄した細孔径の範囲及び細孔サイズ分布はどちらも、この技法を使用して決定することができる。
【００７７】
この方法は、試験流体(例えば、水、バッファー、アルコール)に浸漬される小さな膜試料(例えば、直径が約2.5cm)で行うことができる。適用されるガス圧の範囲は、約0〜約500psiから選択することができる。
【００７８】
細孔径を決定する他の方法
Mulderは、原子間力顕微鏡法(AFM)(164頁)、透過度計算(169頁)、ガス吸着脱着(173頁)、サーモポロメトリー(176頁)、パームポロメトリー(179頁)、及び液体置換(181頁)を含めた、多孔性膜の平均細孔サイズを特徴づける他の方法を記載している。Mulder、及びそのなかに引用されている参照は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７９】
例示的なコンポジット材料
ある種の実施形態では、本発明は、
それを貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、2つのチオール官能基を含み、
第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む
コンポジット材料に関する。
【００８０】
ある種の実施形態では、本発明は、
それを貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー、第2のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、2つのチオール官能基を含み、
第2のモノマーは、2つの炭素-炭素二重結合を含み、
第1の架橋剤は、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、
コンポジット材料に関する。
【００８１】
ある種の実施形態では、本発明は、架橋ゲルがマクロ多孔性である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８２】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが2つの末端チオール官能基を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８３】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８４】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)、1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオール、PEGジチオール(直鎖PEGジチオールなど)、1,6-ヘキサンジチオール、2,2'-チオジエタンチオール、エタン-1,2-ジイルビス(3-メルカプトプロパノエート)、ヘキサ(エチレングリコール)ジチオール、テトラ(エチレングリコール)ジチオール、1,16-ヘキサデカンジチオール、ベンゼン-1,2-ジチオール、ベンゼン-1,3-ジチオール、ベンゼン-1,4-ジチオール、ビフェニル-4,4'-ジチオール、p-ターフェニル-4,4''-ジチオール、(S)-2-アミノブタン-1,4-ジチオール塩酸塩、4-フェニル-4H-(1,2,4)トリアゾール-3,5-ジチオール、5-(4-クロロフェニル)-ピリミジン-4,6-ジチオール、1,4-ベンゼンジメタンチオール、2-メルカプトエチルエーテル又はL-(-)-ジチオトレイトールである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８５】
ある種の実施形態では、本発明は、第2のモノマーが2つの末端炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８６】
ある種の実施形態では、本発明は、第2のモノマーが、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８７】
ある種の実施形態では、本発明は、第2のモノマーが、トリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)、1,9-デカジエン、1,4-ビス(ビニルオキシ)ブタン、ジアリルフタレート、ジアリルジグリコールカーボネート、ポリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル、ジビニルグリコール又はジビニルベンゼン、ジビニルスルホン、1,4-ブタンジオールジビニルエーテル、アリルエーテル、アリルスルフィド、1,4-ビス(4-ビニルフェノキシ)ブタン、1,5-ヘキサジエン、ジペンテン、(R)-(+)-リモネン、(S)-(-)-リモネン、N,N'-メチレンビス(アクリルアミド)又はN,N'-エチレンビス(アクリルアミド)である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８８】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマー対第2のモノマーのモル比が、1:1超、例えば約1.5:1、約2:1、約2.5:1、約3:1、約3.5:1、約4:1、約4.5:1又は約5:1である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００８９】
ある種の実施形態では、コンポジット材料が第3のモノマーをさらに含み、第3のモノマーが2つの炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９０】
ある種の実施形態では、本発明は、第3のモノマーが2つの末端炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９１】
ある種の実施形態では、本発明は、第3のモノマーが、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９２】
ある種の実施形態では、本発明は、(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド((+)-N,N'-diallyltartramide, DATA)、ジアリルジスルフィド、炭酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、コハク酸ジアリル、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、1,1-ジアリル-1-ドコサノール、1,1-ジアリル-3-(1-ナフチル)ウレア、1,1-ジアリル-3-(2-エチルフェニル)ウレア、1,2-ジアリル-1,2-シクロヘキサンジオール、2,6-ジアリル-メタ-クレゾール、N,N-ジアリル-2-ヒドロキシプロパンアミド、1,4-ペンタジエン-3-オール、トリメチル(プロパルギル)シラン又はプロパルギルアミンである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９３】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマー対第3のモノマーのモル比は、1:1超、例えば約1.5:1、約2:1、約2.5:1、約3:1、約3.5:1、約4:1、約4.5:1又は約5:1である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９４】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が少なくとも3つの炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９５】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が3つの炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が3つの末端炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９６】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が2つの炭素-炭素三重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が2つの末端炭素-炭素三重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９７】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９８】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)、1,6-ヘプタジイン、1,7-オクタジイン、1,8-ノナジイン、1,9-デカジイン、プロパルギルアクリレート、4-アームPEGノルボルネン(Fairbanks, B. D.ら、Adv. Mater. 2009年、21巻(48号)、5005〜5010頁)、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラ-アルキンポリ(エチレングリコール)(例えば、Daniele, M. A.ら、Biomaterials 2014年、35巻、1845〜1856頁)、2,4,6-トリアリルオキシ-1,3,5-トリアジン、トリアリルアミン、ホウ酸トリアリル、トリアリルホスフィン、フマル酸ジアリル、3-(アリルオキシ)-1-プロピン、グリオキサールビス(ジアリルアセタール)、テトラアリルシラン、プロパルギルエーテル又はスクワレンである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【００９９】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、トリメチロールプロパントリ(3-メルカプトプロピオネート)、ペンタエリスリトールテトラ(3-メルカプトプロピオネート)、ポリ(エチレングリコール)テトラチオール(例えば、Daniele, M. A.ら、Biomaterials  2014年、35巻、1845〜1856頁)、トリス[2(3-メルカプトプロピオニルオキシ)エチル]イソシアヌレート、ペンタエリスリトールテトラキス(2-メルカプトアセテート)、トリチオシアヌル酸又は1-チオヘキシトールである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１００】
ある種の実施形態では、本発明は、上述のコンポジット材料のいずれか1つであって、コンポジット材料が、第2の架橋剤をさらに含み、第2の架橋剤が、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０１】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が少なくとも2つの炭素-炭素三重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０２】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が2つの炭素-炭素三重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が2つの末端炭素-炭素三重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０３】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が第1の架橋剤と異なる、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０４】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０５】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の架橋剤が、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)、1,6-ヘプタジイン、1,7-オクタジイン、1,8-ノナジイン、1,9-デカジイン、プロパルギルアクリレート、2,4,6-トリアリルオキシ-1,3,5-トリアジン、トリアリルアミン、ホウ酸トリアリル、トリアリルホスフィン、フマル酸ジアリル、3-(アリルオキシ)-1-プロピン、ジプロパルギルアミン、5,6-ジメチル-5-デセン-1,9-ジイン、グリオキサールビス(ジアリルアセタール)、テトラアリルシラン、プロパルギルエーテル、スクワレン、トリメチロールプロパントリ(3-メルカプトプロピオネート)、ペンタエリスリトールテトラ(3-メルカプトプロピオネート)、ポリ(エチレングリコール)テトラチオール、トリス[2(3-メルカプトプロピオニルオキシ)エチル]イソシアヌレート、ペンタエリスリトールテトラキス(2-メルカプトアセテート)トリチオシアヌル酸又は1-チオヘキシトールである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０６】
ある種の実施形態では、本発明は、
それを貫通する複数の細孔を有する支持部材、並びに
第1のモノマー及び第1の架橋剤から誘導されたポリマーを含む架橋ゲル
を含むコンポジット材料であって、
架橋ゲルは、支持部材の細孔内に位置しており、
第1のモノマーは、(i)2つの炭素-炭素二重結合、又は(ii)炭素-炭素三重結合を含み、
第1の架橋剤は、少なくとも3つのチオール官能基を含む、
コンポジット材料に関する。
【０１０７】
ある種の実施形態では、本発明は、架橋ゲルがマクロ多孔性である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０８】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが2つの末端炭素-炭素二重結合を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１０９】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１０】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、トリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)、1,9-デカジエン、1,4-ビス(ビニルオキシ)ブタン、ジアリルフタレート、ジアリルジグリコールカーボネート、ポリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル、ジビニルグリコール又はジビニルベンゼン、ジビニルスルホン、1,4-ブタンジオールジビニルエーテル、アリルエーテル、アリルスルフィド、1,4-ビス(4-ビニルフェノキシ)ブタン、1,5-ヘキサジエン、ジペンテン、(R)-(+)-リモネン又は(S)-(-)-リモネンである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１１】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマー対第2のモノマーのモル比が、1:1超、例えば約1.5:1、約2:1、約2.5:1、約3:1、約3.5:1、約4:1、約4.5:1又は約5:1である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１２】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１３】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、トリメチロールプロパントリ(3-メルカプトプロピオネート)、ペンタエリスリトールテトラ(3-メルカプトプロピオネート)、ポリ(エチレングリコール)テトラチオール(例えば、Daniele, M. A.ら、Biomaterials  2014年、35巻、1845〜1856頁)、トリス[2(3-メルカプトプロピオニルオキシ)エチル]イソシアヌレート、ペンタエリスリトールテトラキス(2-メルカプトアセテート)、トリチオシアヌル酸又は1-チオヘキシトールである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１４】
ある種の実施形態では、本発明は、架橋ゲルが複数のグラフト末端基をさらに含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、グラフト末端基が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子から誘導される、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１５】
ある種の実施形態では、本発明は、グラフト末端基が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子から誘導され、チオール官能基を有する上記分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する上記分子が約0.5〜約8.0のLogPを有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、グラフト疎水性末端基を有するコンポジット材料は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに有用である。
【０１１６】
ある種の実施形態では、本発明は、チオール官能基を有する分子及び炭素-炭素不飽和結合を有する分子が、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１７】
ある種の実施形態では、本発明は、グラフト末端基が、チオール官能基を有する分子から誘導され、チオール官能基を有する上記分子が、3-メルカプトプロピオン酸、1-メルカプトコハク酸、システイン残基を有するペプチド、システイン残基を有するタンパク質(天然のシステイン残基又は遺伝子操作されているシステイン残基、例えばプロテインA)、システアミン、1-チオヘキシトール、ポリ(エチレングリコール)2-メルカプトエチルエーテル酢酸、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルチオール、1-チオグリセロール、2-ナフタレンチオール、ビフェニル-4-チオール、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール-5-チオール、5-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-チオール、1-[2-(ジメチルアミノ)エチル]-1H-テトラゾール-5-チオール、1-プロパンチオール、1-ブタンチオール、1-ペンタンチオール、1-ヘキサンチオール、1-オクタンチオール、8-アミノ-1-オクタンチオール塩酸塩、3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロ-1-オクタンチオール、8-メルカプト-1-オクタノール又はγ-Glu-Cysである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１８】
ある種の実施形態では、本発明は、グラフト末端基が、炭素-炭素不飽和結合を有する分子から誘導され、炭素-炭素不飽和結合を有する上記分子が、1-オクテン、1-ヘキシン、4-ブロモ-1-ブテン、アリルジフェニルホスフィン、アリルアミン、アリルアルコール、3,4-ジヒドロキシ-1-ブテン、7-オクテン-1,2-ジオール、3-アリルオキシ-1,2-プロパンジオール、3-ブテン酸、3,4-デヒドロ-L-プロリン、ラウリン酸ビニル、1-ビニル-2-ピロリジノン、ケイ皮酸ビニル、アシルアミド又はアクリレートである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１１９】
ある種の実施形態では、本発明は、架橋ゲルがマクロ細細孔を有し、マクロ細孔が、約10nm〜約3000nmの平均細孔径を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、マクロ細孔の直径は、本明細書に記載されている技法の1つによって推定される。ある種の実施形態では、マクロ細孔の直径は、キャピラリーフローポロメトリーにより計算される。
【０１２０】
ある種の実施形態では、本発明は、マクロ細孔の平均細孔径が、約25nm〜約1500nmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２１】
ある種の実施形態では、本発明は、マクロ細孔の平均細孔径が、約50nm〜約1000nmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、マクロ細孔の平均細孔径が、約50nm、約100nm、約150nm、約200nm、約250nm、約300nm、約350nm、約400nm、約450nm、約500nm、約550nm、約600nm、約650nm又は約700nmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２２】
ある種の実施形態では、本発明は、マクロ細孔の平均細孔径が、約300nm〜約400nmの平均細孔径である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２３】
ある種の実施形態では、本発明は、膜である、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２４】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材が、空隙容積を有しており、支持部材の空隙容積が、マクロ多孔性架橋ゲルで実質的に満たされている、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２５】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材がポリマーを含み、約10μm〜約1000μmの厚さであり、支持部材の細孔が、約0.1μm〜約25μmの平均細孔径を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。一部の実施形態では、支持部材は、約40%〜約90%の気孔率を有する。
【０１２６】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の厚さが、約10μm〜約1000μmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の厚さが、約10μm〜約500μmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の厚さが、約30μm〜約300μmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の厚さが、約30μm、約50μm、約100μm、約150μm、約200μm、約250μm又は約300μmである、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２７】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の細孔が、約0.1μm〜約25μmの平均細孔径を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の細孔が、約0.5μm〜約15μmの平均細孔径を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材の細孔が、約0.5μm、約1μm、約2μm、約3μm、約4μm、約5μm、約6μm、約7μm、約8μm、約9μm、約10μm、約11μm、約12μm、約13μm、約14μm又は約15μmの平均細孔径を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２８】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材が、約40%〜約90%の気孔率を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材が、約50%〜約80%の気孔率を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、支持部材が、約50%、約60%、約70%又は約80%の気孔率を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１２９】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材がポリオレフィンを含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１３０】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンオキシド、ポリカーボネート、ポリエステル、セルロース及びセルロース誘導体からなる群から選択されるポリマー物質を含む、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１３１】
ある種の実施形態では、本発明は、支持部材がポリマーを含む繊維性織布又は繊維性不織布を含み、約10μm〜約2000μmの厚さであり、支持部材の細孔が、約0.1μm〜約25μmの平均細孔径を有しており、支持部材が、約40%〜約90%の気孔率を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１３２】
ある種の実施形態では、本発明は、約50°〜約120°の水接触角度を有する、上述のコンポジット材料のいずれか1つに関する。
【０１３３】
例示的な使用方法
ある種の実施形態では、本発明は、
第1の流速で、ある物質を含む第1の流体を、上述のコンポジット材料のいずれか1つに接触させ、それにより、コンポジット材料上に上記物質の一部を吸着又は吸収させるステップ
を含む方法に関する。
【０１３４】
ある種の実施形態では、第1の流体は、断片化抗体、凝集抗体、宿主細胞由来タンパク質、ポリヌクレオチド、内毒素又はウイルスをさらに含む。
【０１３５】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体の流体流通経路が、実質的に、コンポジット材料のマクロ細孔を通る、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１３６】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体の流体流通経路が、コンボジット材料のマクロ細孔に実質的に垂直である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１３７】
ある種の実施形態では、本発明は、
第2の流速で、第2の流体をコンポジット材料上に吸着又は吸収された物質に接触させ、それにより、コンポジット材料から上記物質の第1の部分を放出させるステップ
をさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１３８】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体の流体流通経路が、実質的に、コンポジット材料のマクロ細孔を通る、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１３９】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体の流体流通経路が、コンボジット材料のマクロ細孔に実質的に垂直である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４０】
ある種の実施形態では、本発明は、
第3の流速で、第3の流体をコンポジット材料上に吸着又は吸収された物質に接触させ、それにより、コンポジット材料から上記物質の第2の部分を放出させるステップ
をさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４１】
ある種の実施形態では、本発明は、物質が、生体分子、生体イオン、ウイルス又はウイルス粒子である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４２】
ある種の実施形態では、本発明は、物質が、アルブミン、リゾチーム、ウイルス、細胞、ヒト及び動物起源のγ-グロブリン、ヒト及び動物起源の免疫グロブリン、組換え及び天然起源のタンパク質、合成及び天然起源のポリペプチド、インターロイキン-2及びその受容体、酵素、モノクローナル抗体、トリプシン及びその阻害剤、シトクロムC、ミオグロビン、ミオグロブリン、α-キモトリプシノーゲン、組換えヒトインターロイキン、組換え融合タンパク質、核酸由来生成物、合成及び天然起源のDNA、及び合成及び天然起源のRNAからなる群から選択される生体分子又は生体イオンである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４３】
ある種の実施形態では、本発明は、生体分子又は生体イオンが、リゾチーム、hIgG、ミオグロビン、ヒト血清アルブミン、ダイズトリプシンインヒビター、トランスフェリング(transferring)、エノラーゼ、オボアルブミン、リボヌクレアーゼ、卵トリプシンインヒビター、シトクロムc、アネキシンV又はα-キモトリプシノーゲンである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４４】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体がバッファーである、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体中のバッファーの濃度が、約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM、約0.1M、約0.11M、約0.12M、約0.13M、約0.14M、約0.15M、約0.16M、約0.17M、約0.18M、約0.19M又は約0.2Mである、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体のpHが、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5又は約9である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４５】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体がリン酸ナトリウムを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４６】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体が塩を含む、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体中の塩の濃度が、約50mM、約60mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM、約0.1M、約0.11M、約0.12M、約0.13M、約0.14M、約0.15M、約0.16M、約0.17M、約0.18M、約0.19M、約0.2M、約0.25M又は約0.3Mである、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、塩が塩化ナトリウムである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４７】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体中の物質の濃度が、約0.2mg/mL〜約10mg/mLである、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体中の物質の濃度が、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/L、約1mg/mL、約1.2mg/mL、約1.4mg/mL、約1.6mg/mL、約1.8mg/mL、約2mg/mL、約3mg/mL、約4mg/mL、約5mg/mL、約6mg/mL、約7mg/mL、約8mg/mL、約mg/mL又は約10mg/mLである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４８】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約3膜容量(MV)/分〜約70MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約5MV/分〜約30MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約10MV/分〜約20MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約10MV/分、約11MV/分、約12MV/分、約13MV/分、約14MV/分、約15MV/分、約16MV/分、約17MV/分、約18MV/分、約19MV/分又は約20MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１４９】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約50L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約25L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約10L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約1L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約0.5L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約100mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約10mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分〜約2mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1の流速が、約0.5mL/分、約0.6mL/分、約0.7mL/分、約0.8mL/分、約0.9mL/分、約1mL/分、約1.1mL/分、約1.2mL/分、約1.3mL/分、約1.4mL/分、約1.5mL/分、約1.6mL/分、約1.7mL/分又は約1.8mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５０】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体がバッファーである、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体がグリシン-HCl又はクエン酸ナトリウムを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体が約5mM〜約2Mの濃度でグリシン-HCl又はクエン酸ナトリウムを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体が、約5mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約125mM、約150mM、約200mM、約300mM又は約400mMで、グリシン-HCl又はクエン酸ナトリウムを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５１】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体のpHが約2〜約8である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流体のpHが、約2、約2.2、約2.4、約2.6、約2.8、約3、約3.2、約3.4、約3.6、約3.8、約4、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9又は約8.0である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５２】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約3膜容量(MV)/分〜約70MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約5MV/分〜約30MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約10MV/分〜約20MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約10MV/分、約11MV/分、約12MV/分、約13MV/分、約14MV/分、約15MV/分、約16MV/分、約17MV/分、約18MV/分、約19MV/分又は約20MV/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５３】
ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約50L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約25L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約10L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約1L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約0.5L/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約100mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約10mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分〜約2mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第2の流速が、約0.5mL/分、約0.6mL/分、約0.7mL/分、約0.8mL/分、約0.9mL/分、約1mL/分、約1.1mL/分、約1.2mL/分、約1.3mL/分、約1.4mL/分、約1.5mL/分、約1.6mL/分、約1.7mL/分又は約1.8mL/分である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５４】
ある種の実施形態では、本発明は、
コンポジット材料を清浄するステップ、及び
上述のステップを繰り返すステップ
をさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５５】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料が、塩基性溶液により清浄される、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料が、第4の流体により清浄され、第4の流体が水酸化ナトリウムを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５６】
ある種の実施形態では、本発明は、上記物質の実質的にすべてが、コンポジット材料上に吸着又は吸収される、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５７】
ある種の実施形態では、本発明は、
第1の流速で、ある物質及びある望まない物質を含む第1の流体を、上述のコンポジット材料のいずれか1つに接触させ、それにより、コンポジット材料上に望まない物質の一部を吸着又は吸収させるステップ
を含む方法に関する。
【０１５８】
ある種の実施形態では、本発明は、望まない物質が、断片化抗体、凝集抗体、宿主細胞由来タンパク質、ポリヌクレオチド、内毒素又はウイルスを含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１５９】
ある種の実施形態では、本発明は、望まない物質の実質的にすべてが、コンポジット材料上に吸着又は吸収される、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６０】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体の流体流通経路が、実質的に、コンポジット材料のマクロ細孔を通る、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６１】
ある種の実施形態では、本発明は、物質が、生体分子又は生体イオンである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６２】
ある種の実施形態では、本発明は、生体分子又は生体イオンが、アルブミン、リゾチーム、ウイルス、細胞、ヒト及び動物起源のγ-グロブリン、ヒト及び動物起源の免疫グロブリン、組換え及び天然起源のタンパク質、合成及び天然起源のポリペプチド、インターロイキン-2及びその受容体、酵素、モノクローナル抗体、トリプシン及びその阻害剤、シトクロムC、ミオグロビン、ミオグロブリン、α-キモトリプシノーゲン、組換えヒトインターロイキン、組換え融合タンパク質、核酸由来生成物、合成及び天然起源のDNA、及び合成及び天然起源のRNAからなる群から選択される、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６３】
ある種の実施形態では、本発明は、生体分子又は生体イオンが、リゾチーム、hIgG、ミオグロビン、ヒト血清アルブミン、ダイズトリプシンインヒビター、トランスフェリング、エノラーゼ、オボアルブミン、リボヌクレアーゼ、卵トリプシンインヒビター、シトクロムc、アネキシンV又はα-キモトリプシノーゲンである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６４】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の流体が浄化済み細胞培養上澄み液である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６５】
例示的な作製方法
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料を作製する方法であって、
第1のモノマー、第1の架橋剤、光開始剤及び第1の溶媒を一緒にするステップであって、第1のモノマーが、2つのチオール官能基を含み、第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(ii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iii)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含み、それによりモノマー混合物を形成する、ステップ、
支持部材をモノマー混合物に接触させ、それにより、修飾支持部材を形成するステップであって、支持部材が、それを貫通する複数の細細孔を有し、細孔の平均細孔径が約0.1〜約25μmである、ステップ、
修飾支持部材をポリマーシートにより被覆し、それにより被覆支持部材を形成するステップ、並びに
被覆支持部材にある時間、照射を行い、それにより、コンポジット材料を形成するステップ
を含む方法に関する。
【０１６６】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料を作製する方法であって
第1のモノマー、第2のモノマー、第1の架橋剤、光開始剤及び第1の溶媒を一緒にし、それによりモノマー混合物を形成するステップであって、第1のモノマーが、2つのチオール官能基を含み、第2のモノマーが、2つの炭素-炭素二重結合を含み、第1の架橋剤が、(i)少なくとも3つのチオール官能基、(ii)少なくとも3つの炭素-炭素二重結合、(iii)少なくとも2つの炭素-炭素三重結合、又は(iv)少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、ステップ、
支持部材をモノマー混合物に接触させ、それにより、修飾支持部材を形成するステップであって、支持部材が、それを貫通する複数の細細孔を有し、細孔の平均細孔径が約0.1〜約25μmである、ステップ、
修飾支持部材をポリマーシートにより被覆し、それにより被覆支持部材を形成するステップ、並びに
被覆支持部材にある時間、照射を行い、それにより、コンポジット材料を形成するステップ
を含む方法に関する。
【０１６７】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料を第2の溶媒により洗浄し、それにより、洗浄済みコンポジット材料を形成するステップをさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、第2の溶媒は水である。
【０１６８】
ある種の実施形態では、本発明は、被覆した支持部材から過剰のモノマー混合物を除去するステップをさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１６９】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料が上述のコンポジット材料のいずれか1つである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７０】
ある種の実施形態では、本発明は、モノマー混合物が、複数の末端基前駆体をさらに含み、この末端基前駆体が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７１】
ある種の実施形態では、本発明は、
コンポジット材料を、光開始剤、及び複数の末端基前駆体を含む混合物に接触させ、それによりグラフト混合物を形成するステップであって、末端基前駆体が、チオール官能基を有する分子又は炭素-炭素不飽和結合を有する分子である、ステップ、並びに
グラフト混合物にある時間、照射を行い、それにより、修飾コンポジット材料を形成するステップ
をさらに含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７２】
ある種の実施形態では、本発明は、末端基前駆体が約0.5〜約8.0のlogPを有する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７３】
ある種の実施形態では、本発明は、末端基前駆体が、DMAc若しくはDPMA、又はそれらの混合物に実質的に可溶である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７４】
ある種の実施形態では、本発明は、末端基前駆体が、チオール官能基を有する分子であり、チオール官能基を有する上記分子が、3-メルカプトプロピオン酸、1-メルカプトコハク酸、システイン残基を有するペプチド、システイン残基を有するタンパク質、システアミン、1-チオヘキシトール、ポリ(エチレングリコール)2-メルカプトエチルエーテル酢酸、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルチオール、1-チオグリセロール、2-ナフタレンチオール、ビフェニル-4-チオール、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール-5-チオール、5-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-チオール、1-[2-(ジメチルアミノ)エチル]-1H-テトラゾール-5-チオール、1-プロパンチオール、1-ブタンチオール、1-ペンタンチオール、1-ヘキサンチオール、1-オクタンチオール、8-アミノ-1-オクタンチオール塩酸塩、3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロ-1-オクタンチオール、8-メルカプト-1-オクタノール又はγ-Glu-Cysである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７５】
ある種の実施形態では、本発明は、末端基前駆体が、炭素-炭素不飽和結合を有する分子から誘導され、炭素-炭素不飽和結合を有する上記分子が、1-オクテン、1-ヘキシン、4-ブロモ-1-ブテン、アリルジフェニルホスフィン、アリルアミン、アリルアルコール、3,4-ジヒドロキシ-1-ブテン、7-オクテン-1,2-ジオール、3-アリルオキシ-1,2-プロパンジオール、3-ブテン酸、3,4-デヒドロ-L-プロリン、ラウリン酸ビニル、1-ビニル-2-ピロリジノン、ケイ皮酸ビニル、アシルアミド又はアクリレートである、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７６】
ある種の実施形態では、本発明は、モノマー混合物中の反応性チオール基対反応性アルケン基の比(アルキン基は、2つのアルケン基と等価である)が、約1:10〜約2:1、例えば、約1:10、約1:9、約1:8、約1:7、約1:6、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1又は約2:1である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７７】
ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、モノマー混合物中にその約5重量%〜約25重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、第1のモノマーが、モノマー混合物中にその約5重量%〜約20重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７８】
ある種の実施形態では、本発明は、第2のモノマーが、モノマー混合物中にその約0.1重量%〜約20重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１７９】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の架橋剤が、モノマー混合物中にその約1重量%〜約20重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８０】
ある種の実施形態では、本発明は、光開始剤が、モノマー混合物中にその約0.1重量%〜約2重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８１】
ある種の実施形態では、本発明は、光開始剤が、ベンゾイン又はベンゾインエーテル、ベンゾフェノン、ジアルコキシアセトフェノン、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン、ジフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィンオキシド、ヒドロキシアルキルフェノン、1-ヒドロキシ-シクロヘキシル-フェニル-ケトン、4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン、1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)-フェニル]-2-ヒドロキシ-2-メチル-1-プロパン-1-オン、2-ヒドロキシ-1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル]-2-メチル-1-プロパノン、α-ヒドロキシメチルベンゾインスルホン酸エステル、2-ヒドロキシ-2-メチルプロピオフェノン、リチウムアシルホスフィネート又は2-メチル-1-[4-(メチルチオ)フェニル]-2-(4-モルホリニル)-1-プロパノン、4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(ACVA)、又はそれらの混合物である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８２】
ある種の実施形態では、本発明は、第1の溶媒が、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、水、ジ(プロピレングリコール)ジメチルエーテル(DPM)、ジ(プロピレングリコール)プロピルエーテル(DPGPE)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテル(DPGME)、トリ(プロピレングリコール)ブチルエーテル(TPGBE)、3-メチル-1,3-ブタンジオール、3,3-ジメチル-1,2-ブタンジオール、3-メトキシ-1-ブタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール、ジ(エチレングリコール)、トリ(エチレングリコール)、テトラ(エチレングリコール)、ヘキシレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム、又はN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、又はそれらの混合物を含む、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８３】
ある種の実施形態では、本発明は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約70重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約50重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)が、モノマー混合物中に、溶媒の合計の約0重量%〜約70重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)が、モノマー混合物中に、溶媒の合計の約0重量%〜約50重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８４】
ある種の実施形態では、本発明は、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約50重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)が、モノマー混合物中に、溶媒の合計の約0重量%〜約50重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８５】
ある種の実施形態では、本発明は、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約60重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)が、モノマー混合物中に、溶媒の合計の約0重量%〜約60重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８６】
ある種の実施形態では、本発明は、水が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約50重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、水が、モノマー混合物中にその約0重量%〜約30重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。ある種の実施形態では、本発明は、水が、モノマー混合物中に、溶媒の合計の約0重量%〜約30重量%の量で存在する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８７】
ある種の実施形態では、本発明は、被覆支持部材が約350nmで照射を受ける、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８８】
ある種の実施形態では、本発明は、時間が、約1分間、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約30分間、約45分間又は約1時間である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１８９】
ある種の実施形態では、本発明は、コンポジット材料がマクロ細孔を有する、上述の方法のいずれか1つに関する。
【０１９０】
ある種の実施形態では、本発明は、マクロ細孔の平均細孔径が細孔の平均細孔径未満である、上述の方法のいずれか1つに関する。
【実施例】
【０１９１】
以下の実施例が、例示として提示される。しかし、各実施例において示されている具体的な詳細は、例示目的で選択されたものであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されよう。一般に、明記しない限り、同様の条件下で実験を行った。
【０１９２】
一般物質及び方法
化学物質:
2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)、1,4-ジチオエリスリトール(DTT)、ペンタエリスリトールテトラキス(3-メルカプトプロピオネート)(PETM)、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)、トリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)、1,7-オクタジイン(OctDi)、(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド((+)-N,N'-diallyltartramide)(DATA)、1-チオグリセロール(TG)、1-オクタンチオール、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、エチレングリコール(EG)、ジエチレングリコール(DEG)、トリエチレングリコール(TEG)、テトラエチレングリコール(TetEG)、ヘキシレングリコール、イソプロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)、4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(ACVA)、システアミン塩酸塩、2-メルカプトエタノール、メルカプトコハク酸、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、酢酸ナトリウム三水和物、氷酢酸、水酸化ナトリウムペレット、グリシン、クエン酸及びD-(+)-トレハロース無水物は、Aldrichから得た。
【０１９３】
タンパク質:
rプロテインA-cysは、Biomedal S. L(Seville、スペイン)から得た。ポリクローナルイムノγ-グロブリンIgGは、Equitech-Bio Inc.(Kerrville、TX、米国)から得られた。
【０１９４】
膜の調製:
架橋剤及びモノマー(キャストする10分前に添加した、チオール官能基化モノマーを除く)は、溶媒混合物に光開始剤(Irgacure2959)と一緒に加え、この混合物を十分に長く撹拌し、すべての構成成分を溶解した。予め秤量した7”×8”の多孔性支持基材シート(不織ポリプロピレンメッシュ)をポリエチレンシート上に配置し、次に、約15gのポリマー溶液をこの基材シートに注ぎ入れた。続いて、浸漬した基材を別のポリエチレンシートにより被覆した。余分な溶液及び捕捉されている気泡を除去するため、このシートを手で円を描くように穏やかにプレスした。重合過程は、10分間、閉チャンバ中、ポリエチレンシート間に挟まれたポリマー溶液/基材に、UV光(約350nm)を用いて照射を行うことにより開始した。次に、得られた膜を、ポリエチレンシートの間から取り出し、撹拌しながら、この膜に精製(RO)水中(2〜3回)、20〜30分間の浸漬期間を含む、徹底的な洗浄サイクルを施した。清浄膜を、約16時間、室温で空気中、自由吊下することにより乾燥した。
【０１９５】
コンポジット膜の質量増加、ぬれ及び透過度
乾燥膜の重量を測定して、質量増加を計算するために使用した。膜のぬれは、膜表面に蒸留水50μLの液滴を供給して(dispensing)、膜内に液滴が吸収されるのに必要な時間を測定することにより決定した。膜透過度を見積もるため、100kPaの適用圧を使用し、RO水(又はアセテートバッファーpH5)及び直径7.7cmの膜試料を使用して、膜それぞれの流束を決定した。
【０１９６】
膜透過度を見積もるため、各々の膜を流れる移動相としてのRO水(又は132mMアセテートバッファーpH5)の流束を決定した。膜は、試験前に、少なくとも10分間、試験流体中に予め浸漬し、試験液体約300mLで洗い流し、次に、100kPaの加圧下で、直径7.7cmの円状膜試片(coupon)(実際は7.3cmの有効直径)を通過する試験液の量を決定した。流束は、1時間あたりの表面積あたりの液体の量(kg/m2h)で表される。
【０１９７】
多孔性構造のイメージング:
ゲル構造及び多孔性を調査するため、環境制御走査型電子顕微鏡法(ESEM)を使用して、湿潤状態の膜を画像化した。小さな試片(約7×5mm)を10〜15分間、蒸留水中に浸漬することにより濡らし、次に、ESEM機器(FEI Quanta FEG 250 ESEM)を使用して試験した。試料は、温度を5℃に調節するために、冷却用ステージの上に置き、画像は、低圧レベル(4.5〜5.5torr)及び50〜55%の相対湿度で試験した。
【０１９８】
乾燥状態の膜構造を調査するため、Tescan Vega II LSU走査型電子顕微鏡(SEM)(Tescan、PA、米国)を使用して、10〜20kVに設定した電圧を用いて、金をコーティングした膜を画像化した。
【０１９９】
細孔サイズの測定:
膜の細孔サイズ(直径)は、CapWin  ソフトウェア(V.6)で操作される、CFP-1500-AEキャピラリーフローポリメーター(PorousMaterials Inc.、Ithaca、NY)を使用した測定した。
【０２００】
小さな膜ディスク(2.5cm直径)をGalwick(登録商標)湿潤用液体(Porous Materials Inc.、表面張力=15.9ダイン/cm)に10分間、浸漬し、次に、予め湿潤させたろ紙ディスク(Whatman5〜70mm)2枚の間で優しく絞って余分な溶液を除去し、湿潤膜の厚さを、マイクロメーターを使用して決定した。次に、この膜ディスクを、2.5cmのステンレス鋼製メッシュの支持ディスク上に置いた。試験膜をロードした支持ディスクは、膜の面を上にして、指定されているホルダーに置いた。次に、金属製カバーを上記のホルダーの上に優しく置き、0〜200psiの圧力範囲内でこの試験を実施した。
【０２０１】
クリックアルケン膜にプロテイン-Aリガンドをコンジュゲートするためのカップリングプロトコル:
ヒドロチオレーションクリック反応によりバイオ分子(チオール官能性基により)がアルケン膜に化学的に結合する実現可能性を検討するため、システイン残基を含有する遺伝子工学操作されているプロテインAリガンドをアルケン膜(複数可)(様々な化学処方である)にカップリングし、固定化したリガンドの生物活性を試験した。
【０２０２】
プロテインAリガンドを凍結乾燥した粉末(r-プロテインA-cys)をPBS(20mMリン酸ナトリウム、0.15M  NaCl、pH7.4)に溶解し、50mg/mLの保存液を作製した。それぞれの膜のカップリング用溶液を作製するため、リガンド保存溶液の0.4mLを小さなziplockのプラスチック製バッグ(5×8cm)に移し、ここに、1.6mLの2M ホスフェートバッファー(pH7.2)を加え、次いでDMAc中の開始剤(4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)、ACVA) (150mg/mL)50μLを加えた。この反応溶液を十分に混合した。最終反応溶液は、約2.0mLの容量を有しており、約20mgのリガンド及び約7.5mgの開始剤を含んでいた。
【０２０３】
あるいは、ACVAは、DMAcの使用を回避するために、5mg/mLの濃度の反応用バッファー(2Mホスフェートン酸塩、pH7.2)に溶解した。塩の低い実験の場合、開始剤を7.5mg/mLの濃度の0.5Mホスフェート中に溶解した。
【０２０４】
カップリング用反応剤をロードしたバッグに、4×7cmの膜試片(水中に予め湿潤させた)を加えた。このバッグを1分間、振とうし、次にUV光(約365nm)を10分間、照射した。照射を完了した後、カップリング用溶液をデカンテーションし、次に、洗浄用バッファー溶液(0.1Mホスフェート、pH7.2)15〜20mLを加え、この膜を10〜15分間、シェーカーに置いた。この洗浄サイクルを3回繰り返し、この後、膜を(i)トレハロース溶液(10重量%)8mLに移送し、10〜15分間、振とうしてオーブン(50℃)中で20〜30分間、乾燥するか、又は(ii)0.1Mホスフェートバッファー中に保管した。
【０２０５】
添加物の存在下でのカップリングの場合、ACVAを0.5Mリン酸カリウム(pH7.2)に溶解し、7.5mg/mLの濃度を有する溶液を作製した。プロテインAリガンドは、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)に溶解し、50mg/mLの保存溶液を作製した。これらの3つのバッグ(5×8cm)のそれぞれにおいて、リガンドの保存溶液0.25mLを開始剤溶液0.25mLと混合し、添加物50μLを加えた(反応Bのバッグにはシステアミン-HCl、及び反応Cのバッグには1-メルカプトエタノール)。
【０２０６】
反応溶液を十分に混合した後、直径が25mmディスク状の膜を、各バッグに入れ、反応用バッグを十分に振とうし、次に、UV光により10分間、照射した。この反応溶液をデカンテーションし、次に、膜試片を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)を使用して3回、洗浄し、10〜15分間、振とうした。コンポジット膜試片をバッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.2)中で保管し、既に概説したIgGタンパク質へのバイオアフィニティーを試験した。
【０２０７】
コンポジット膜上のプロテインAリガンドの密度:
結合膜上のプロテインAリガンドの密度を測定するため、カップリング反応後に留まった結合していないタンパク質の量を決定し、この量を全リガンド量から減算して、結合したリガンド量を得て、次に、この量を膜体積(mL)により除算して、膜1mLあたりのリガンドmgで密度を表した。
【０２０８】
溶液中のプロテインAの量を決定するため、0.1Mホスフェートバッファー(pH7.2)中の一連のタンパク質溶液を作製し、280nmにおける吸光度をそれぞれについて測定して検量線を構築し、この検量線から傾きを決定した。
【０２０９】
選択した膜配合物について、4cm×7cmの試片に裁断し、その厚さを測定し、厚さから体積を算出した。カップリング反応は、既に概説した通り実施し、20mgをそれぞれ、各膜のカップリング反応にロードした。UV反応が完了すると、この反応溶液を管に集め、次に、反応用バッグに0.1Mホスフェートバッファーを3〜5mL加え、これを使用して、20〜25分間、振とうすることにより膜を洗浄し、次に、得られた溶液をコレクションチューブに加えた。
【０２１０】
洗浄サイクルをさらに2回、繰り返し、次に、最終的な溶液の吸光度を測定して、検量線の傾きを使用して、結合していないタンパク質の量を算出した。結合したリガンド量は、全反応量と結合していない量との差異を採ることにより決定した。
【０２１１】
カルボキシレート基による重合後の化学修飾:
さらなる膜を合成し、次に、ポリマー主鎖にカルボキシレート基を導入するため、クリック反応を利用して、アルケン膜に1-メルカプトコハク酸をグラフトすることにより修飾した。
【０２１２】
例えば、直径7.7cmを有する試片を複数のアルケン官能基を含む膜から裁断し、その流束を測定した(初期流束)。次に、試片をプラスチック製バッグに移した。
【０２１３】
これらの膜について、水性条件中でグラフト反応を行った。メルカプトコハク酸を6mL脱イオン水に溶解し、次に、ACVA開始剤溶液(DMAc中、150mg/mL)を0.3mL加えた。この反応溶液を十分に混合して、次に、バッグに加え、膜試片と混合した。次に、UVチャンバ(約350nm)中でこの混合物を10分間、照射した。
【０２１４】
UV光への曝露の後、膜試片をバッグから取り出し、各試片を20mLの水により2回、次に、0.1M  NaOH溶液20mLにより2回、ゆすいで、最後に水20mLにより2回、ゆすいだ。膜のRO水流束及び酢酸バッファー溶液の流束を決定し、次に、小さなディスク(直径25mm)に裁断して使用し、陽イオン交換(CEX)IgG結合能力を決定した。
【０２１５】
重合後の、疎水性リガンドでの化学修飾による、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)膜の生成
代表的なアルケン含有膜を上記で概説した通り作製し、次に、小さな試片(それぞれ、4×7cm)を小さなプラスチック製zip-バッグに個別に入れて、それぞれに、1-オクタンチオール120mg及び光開始剤(ACVA)10mgを含むジメチルアセトアミド(DMAc)3mLをロードした。反応用バッグ(膜試片を含む)を閉UVチャンバに移し、UV光を10分間、照射した。膜をDMAc10mLにより2回、ゆすぎ、次に、水中の30%イソプロパノール10mLにより1回、ゆすぎ、次に、水10mLにより2回、ゆすいだ。膜試片を取り出し、オーブン(40℃)中で10〜15分間、乾燥した。
【０２１６】
結合能力の測定:
バイオアフィニティーIgG結合能力
直径25mmのディスク状膜を、25mm  Natrix-Stainless Steel(SS)ホルダーに入れた。結合用バッファー(20mMリン酸ナトリウム、150mM  NaCl、pH7.4)20mLを平衡になるまで流した(約160〜200ベッドボリューム(bed volume)/分)。結合工程では、結合用バッファー中のポリクローナルIgG0.5mg/mLを、流出液のUV吸光度がフィード溶液の10%を超えるまで、1mL/分の流速で流し、次に、バッファー10〜15mLを流して、流速2mL/分で結合しなかったタンパク質を除去した。溶出工程では、溶出バッファー(0.1Mグリシン-HCl、又は0.1Mクエン酸ナトリウム、どちらもpH3)10〜14mLを流速2mL/分で流すことにより、結合したIgGを溶出した。
【０２１７】
陽イオン交換IgG結合能力
25mmのディスク状膜を25-mmのNatrix-SSホルダーに入れ、結合用バッファー(132mM酢酸ナトリウム、pH5.0)20mLを流して、平衡にした。次に、タンパク質溶液(結合用バッファー中、0.5mg/mLヒトポリクローナルIgG(Equitech-Bio Inc.))を、流出液のUV吸光度がフィード溶液の10%を超えるまで流し、次に、バッファー10〜15mLをセルに流して、結合されていないタンパク質を洗浄した。溶出工程では、10mL溶出バッファー(132mM酢酸ナトリウム、1M  NaCl、pH5.0、又は50mM Tris、0.5M  NaCl、pH8.5)を流すことにより、結合したIgGを溶出した。
【０２１８】
疎水性相互作用モードのIgG結合能力
25mmのディスク状膜を25-mm  Natrix-SSホルダーに入れ、結合用バッファー(50mMリン酸ナトリウム、1M硫酸アンモニウム、pH6.5)20mLを流して、平衡にした。次に、タンパク質溶液(結合用バッファー中、0.5mg/mLヒトポリクローナルIgG(Equitech-Bio Inc.))を、流出液のUV吸光度がフィード溶液の10%を超えるまで流した。続いて、バッファー15〜20mLをセルに流して、結合されていないタンパク質を洗浄した。溶出工程では、溶出バッファー(50mMリン酸ナトリウム、pH7.0)10mLを流すことにより、結合したIgGを溶出した。
【０２１９】
カルボキシレート基による重合後の化学修飾:
ポリマー主鎖にカルボキシレート基を導入するため、クリック反応を利用して、アルケン膜に1-メルカプトコハク酸をグラフトすることにより選択膜を修飾した。それぞれの膜について、直径7.7cmを有する試片に裁断し、その流束を測定した(初期流束)。次に、この試片をプラスチック製バッグに移した。
【０２２０】
N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)中の修飾に関すると、DMAc6mL中の1-メルカプトコハク酸0.3gを溶解することにより反応溶液を作製した。次に、ACVA開始剤溶液(DMAc中の150mg/mL)0.3mLをチオール溶液に加えた。最後に、膜を含有する反応用バッグに反応溶液を全部加えた。
【０２２１】
水性反応条件に関すると、DMAcの代わりに脱イオン水6mLを使用して、メルカプトコハク酸を溶解し、そこにACVA開始剤溶液(DMAc中、150mg/mL)0.3mLを加えた。
【０２２２】
このバッグを十分に振とうし、反応溶液内に膜が完全に浸漬するのを確実とし、次に、光(約365nm)により10分間、照射を行い、その後、この反応溶液を廃棄した。水20mLをバッグに加え、この膜を10分間、撹拌しながら洗浄した。洗浄溶液を廃棄し、水をさらに20mL加え、このサイクルを繰り返した。膜を0.1M  NaOH(それぞれ20mLで10分間)によりさらに2回、洗浄した。最後に、膜を水でさらに2回、洗浄し、膜の流束を決定した(流束後)。
【０２２３】
[実施例1]
TEGDVコモノマーを含む配合物
ある種の実施形態では、親水性コモノマーを含ませて、膜透過度を調節する一助とする。
【０２２４】
この膜配合物クラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー、及びコモノマーとしてトリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)を、ビルディングモノマーとして使用し1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)を架橋剤として使用した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、及び水を様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用し、ラジカル反応の重合を開始した。
【０２２５】
これらの成分に基づく反応混合物を、作表されているデータに従って配合し、構成成分のすべてを加えて十分に混合した。ただしジチオールはキャストする10〜15分前に添加した(周囲光による早期重合の開始を回避するため)。膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。質量増加及びぬれ時間を決定し、RO水を使用して、各膜の試片(直径が7.7cm)の初期流束を測定した。
【０２２６】
結果(図1中に示されている)により、水流束によって示されている通り、様々なアルケン/チオール比及び多様な透過度の膜を作製することが可能であることが示されている。これらの結果により、この溶媒系を使用して、膜多孔性、及びその結果、膜透過度を調節する一助となり得ることも示されている。例えば、配合物中のジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)含有率を低下させながら、1,3-ブタンジオール含有率を上昇させると、膜流束(配合物CLK-EN-12対CLK-EN-17及びCLK-EN-90対CLK-EN-81)が上昇した。これらの結果により、架橋剤(TATATO)をジビニルトリエチレングリコール鎖伸長剤に置きかえると、膜流束が低下(配合物CLK-EN-12対CLK-EN-16)することも示されている。
【０２２７】
任意の特定の理論によって拘泥されることを望むものではないが、1,3-ブタンジオールは、ポリマー鎖にとっての非溶媒と見なすことができ、したがって、重合工程中、ゲルの多孔性を高める傾向がある。その結果、透過度(水流束で表される)が上昇する。DPMAは、同じ役割を果たすことができる。
【０２２８】
[実施例2]
TEGDVコモノマーを含む配合物  -  開始剤濃度の効果
この実施例では、重合法及び得られた膜特性に及ぼす光開始剤の濃度の影響を試験した。先のクラスと同様に、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー及びトリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)コモノマー及び1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)架橋剤を使用した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、及び水を様々な量で含んでいた。
【０２２９】
4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)光開始剤の量は、2組の重合反応(一方は10分間の重合時間(CLK-EN-27及びCLK-EN-45)及びもう一方(CLK-EN-137〜140)は6分間の重合時間)について、図2に従って様々な量とした。ヒドロチオレーションクリック反応は迅速な反応なので、より短い重合時間を試験して、開始剤量に対する、得られた膜特性の良好な区別が可能であった。
【０２３０】
図2に示されている結果により、開始剤量は膜透過度に影響を及ぼすことが示唆される。流束は、開始剤量が増加につれて低下する傾向がある。この影響は、10分間と6分間の重合時間のどちらでも実証された。任意の特定の理論によって拘泥されることを望むものではないが、より多量の開始剤は、重合が一層高い転化率で進行することを意味しており、その結果は、より密なポリマー網目構造となる可能性が高い。
【０２３１】
[実施例3]
コモノマーとしてTEGDV及びDATAを含む配合物
この実施例において、別の親水性コモノマー(N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA))を試験した。任意の特定の理論によって拘泥されることを望むものではないが、上記分子中の2つのヒドロキシル基によりこのポリマーの両親性性質が増大し、これにより、ポリマー鎖が成長するにつれて、相分離が高まり、それにより、最終ゲルの多孔性が改善され得る。
【０２３２】
この膜配合物のクラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー及びトリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)及び(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)コモノマーをビルディングモノマーとして使用し、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)を架橋剤として使用した。
【０２３３】
この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)及び水を様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用し、重合反応を開始した。
【０２３４】
反応の構成成分は、十分に混合した。ただしジチオールはキャストする10〜15分前に添加した。この膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。質量増加及びぬれ時間を決定し、次に、RO水を使用して、各膜試片(直径が7.7cm)の初期流束を測定した。
【０２３５】
この実施例に関する結果は、膜透過度に及ぼす溶媒系の影響をやはり実証している。配合物CLK-EN-99とCLK-EN-104とを比較した場合に見られるように(図3)、1,3-ブタンジオールの量の低下、及びN,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)の量の増加により、透過度の驚くべき低下をもたらす(水流束は約10,000〜約1700kg/m2hに低下した)。
【０２３６】
一般に、1,3-ブタンジオール及び水は、ポリマー鎖に対する非溶媒又は貧溶媒と見なされ、したがって、これらの溶媒中で形成された膜の多孔性が上昇する。対照的に、DMAcは、ポリマー鎖が形成されるにつれて、ポリマー鎖を溶媒和する一助となる良好な溶媒と見なされ、その結果、多孔性及び透過度が低下する。
【０２３７】
[実施例4]
コモノマーとしてDATAを含む配合物
この実施例では、唯一のコモノマーとしてN,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)の使用を検討した。DATA分子は、内部アミド結合を有している(TEGDV分子は有していない)。これらにより、得られた膜にある程度の機械的強度が付与されることがある。
【０２３８】
この膜配合物のクラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー、(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)をコモノマーとして、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)を架橋剤として使用し、膜を作製した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、及び水を様々な量で含んだ。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用した。
【０２３９】
反応の構成成分(図4)は一緒に十分に混合した。ただしジチオールはキャストする10〜15分前にを添加した。この膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。乾燥膜の質量増加及びぬれ時間を決定し、次に、RO水を使用して、各膜の試片(直径が7.7cm)の初期流束を測定した。
【０２４０】
結果(図4)により、架橋剤の含有率(16.3%から9.9%)の低下を伴う、DATA含有率(3.3%から7.6%)の増加により、膜流束が低下したことが示されている。
【０２４１】
この系においてジチオール(EDDET)含有率を減量すると、膜流束(CLK-EN-149 -151)が上昇する。任意の特定の理論によって拘泥されることを望むものではないが、ジチオール含有率が高いほど、より小さな成長ポリマー鎖を連結する一助となり、より高い質量増加及びより小さな流束を有する一層密なゲルを得ることが可能である。
【０２４２】
これらの膜は、環境制御走査型電子顕微鏡法(ESEM)により試験し、この方法によりゲルの多孔性が示されている(図6)。
【０２４３】
[実施例5]
ジアルキン架橋剤を含む配合物
この実施例において、ジアルキン分子(1,7-オクタジイン)を、配合した膜内の炭素-炭素不飽和結合の数団を高めることが可能な追加の架橋剤として試験した。これは、チオール官能性(バイオ)分子にゲルをグラフトできる可能性を高めるので、有益であり得る。
【０２４４】
この膜配合物クラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー及びトリ(エチレングリコール)ジビニルエーテル(TEGDV)コモノマーをビルディングモノマーとして使用する一方、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)及び1,7-オクタジイン(OctDi)を架橋剤として使用した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)、及び水を、すべて様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用した。
【０２４５】
ジチオール(EDDET)を除き、すべてが溶解するまで、反応の構成成分(図7)を混合した。次に、キャストする10〜15分前に、EDDETを加えた。膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。各膜試片(直径7.7cmで、R.O.水を使用)の質量増加、ぬれ時間、及び初期流束を決定した。
【０２４６】
図7に示されている結果により、共架橋剤としてオクタジインを用いて膜を配合することが可能であることが実証される。架橋剤(TATATO及びOctDi)を減量すると、より低い透過度を有するコンポジット膜となる。ESEMにより、これらの膜が多孔性構造であることが示されている(図8)。
【０２４７】
[実施例6]
重合後の、ヒドロチオレーションによる、カルボン酸イオン基によるアルケン/イン膜のグラフト化
カルボン酸イオン基は、イオン化形態(例えば、ポリメタクリル酸イオン)が強く水和するので、性質が親水性であり、ゲル膨潤性を高めることが知られている。ゲル中のカルボン酸イオン基の含有率を高めると、ゲルの膨潤性が高まり、ひいては、流束が低下する。一方、カルボン酸基(すなわち、酸形態)は、比較的疎水性と考えられ、その非イオン形態にあるカルボン酸部分を有するゲルは、それほど膨潤せず、流束は上昇する。この現象は、ヒドロゲルのpH感受性として知られている。
【０２４８】
重合後のクリック反応を使用することによる、クリックアルケンポリマーを新しい官能基にグラフトすることができることを実証するため、水流束が高いアルケン/イン膜を作製した(図9)。これらの膜に、チオール-酸分子を用いてヒドロチオレーションによるクリック官能基化を施した。流束で表される、修飾膜の透過度を決定し、グラフト反応前の初期流束と比較した。
【０２４９】
重合後の、グラフトクリック反応は、DMAc又は水中で実施した。修飾膜のそれぞれの流束は、RO水を使用して測定した。修飾膜のpH感受性を調査するため、アセテートバッファー(132mM酢酸塩、pH5)を使用した。
【０２５０】
修飾膜の流束は、グラフト化前のそれらの流束と比べて低下した(表1)。流束をpH5のアセテートバッファーを使用して決定した場合、カルボン酸イオン基は、疎水性形態(カルボン酸)に変換されるので、流束は上昇し、これにより、ゲルの膨潤性が低下した。さらに、膜に0.1M  NaOH溶液を勢いよく流すと、R.O.流束は低下し、これにより、塩基性pHにおいてカルボン酸基が脱プロトン化されてカルボン酸イオン基を形成することによる膜のpH感受性が裏付けられる。表10も参照されたい。
【０２５１】
【表１】
2018511667.tif 000008
【０２５２】
反応媒体が修飾膜の特性に及ぼす影響を試験するため、グラフト化ヒドロチオレーション反応をDMAc中、及びこれとは別に水中の膜に対して行い、異なる媒体中の修飾膜の流束を評価した。以下(表2)に示されている通り、水中でグラフトした膜は、DMAc中で修飾した対応する膜よりも流束が低かった。このことは、ヒドロチオレーション反応が極性溶媒、特に水性水媒体中でより反応性が高いという一般的な理解と一致している。表11も参照されたい。
【０２５３】
【表２】
2018511667.tif 000009
【０２５４】
[実施例7]
重合後の、ヒドロチオレーションによる、プロテインAによるアルケン/イン膜のグラフト化
クリックアルケン膜が、生体リガンドによりグラフトされ得ることを実証するため、システイン末端官能基を有するプロテインA(rプロテインA-cys)を上記の通り、選択したクリックアルケン膜に結合した。グラフトしたプロテインAの部分との膜の結合能力は、上記の概説の通り、結合/溶出プロトコル後のIgGタンパク質に対するそのバイオアフィニティーを試験することにより決定した。
【０２５５】
結合能力の結果(表3)は、プロテインA-修飾膜は、IgGに結合することができることを実証している。このことは、リガンドがゲル膜に結合していないか、又は不活性である場合、不可能と思われる。EN-151の溶出溶液は、クエン酸バッファー溶液(0.1M、pH3)である一方、EN-134及びEN-152の場合、グリシン塩酸塩バッファー溶液(0.1M、pH3)を溶出工程に使用した。
【０２５６】
興味深いことに、アルケン対チオール比が1未満である場合でさえも、カップリング反応が起こり、このことにより、元々の重合反応は、すべてのアルケン基を消費しなかったことが示唆される。ポリマー鎖の成長は、重合反応の最終段階の間に、鎖の可動性を妨害する恐れがあるので、上記のことは予測できないことではない。したがって、過剰のチオールは、ポリマー中の残留アルケン基に結合している可能性がある。
【０２５７】
これらの結果はまた、アルケン対チオール比は、カップリング反応を制御する唯一の因子ではないことも示している。例えば、比をより高くしても、カップリング及び付随する生物活性はより高いものにはならなかった。多孔性、表面積及び表面親水的/疎水的性質などの他の要因が、アルケン基の利用可能性に寄与しており、それによりカップリング反応に影響する。
【０２５８】
【表３】
2018511667.tif 000010
【０２５９】
[実施例8]
修飾膜の特性に及ぼすグラフト反応時間及びリガンドの量の影響
アルケン膜にプロテインAをグラフトするためにラジカルヒドロチオリゼーション(hydrothiolization)(チオールエン)反応を使用するため、反応をUV照射により開始しなければならない。したがって、グラフトしたリガンド生物活性に及ぼすこの曝露の影響を検討することが必要であった。
【０２６０】
1つの膜配合に対しプロテインAのカップリング実験を行い、その間、曝露時間により定まる様々な光用量(365nm)を用い、生物活性に及ぼす影響(結合能力により反映される)を試験した(表4)。
【０２６１】
これらの結果により、10分から20分への曝露時間の変更は、反応溶液中のリガンドの量又は濃度に関わらず、最終的な修飾膜の結合能力に影響を及ぼさないことが示唆される。これらの結果はまた、タンパク質の量を増加させると、生物活性が改善されることも示している。
【０２６２】
【表４】
2018511667.tif 000011
【０２６３】
[実施例9]
修飾膜の特性に及ぼす競合添加物の存在の影響
ヒドロチオレーション反応が、cys-プロテインAリガンドのアルケン膜への結合を担っていることを実証するため、利用可能なアルケン基に対するリガンドと競合し、したがって、リガンドのカップリング反応の程度を制限することができるチオール官能基化分子の存在下及び非存在下で、同じ膜の直径25mmの小さなディスク(CLK-EN-143)にカップリング反応を行った。実際に、競合チオール分子の存在下でリガンドカップリング反応を行うと、チオール官能基化添加物の非存在下で形成される修飾膜と比べて、生物活性が低い膜となった。図12。
【０２６４】
[実施例10]
コモノマーとしてDATAを含む配合物
この実施例では、唯一のコモノマーとしてN,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)の使用を試験した。DATA分子は、内部アミド結合を有している(TEGDV分子は有していない)。これらにより、得られた膜にある程度の機械的強度が付与されることがある。
【０２６５】
この膜配合物のクラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー、(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)をコモノマーとして、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)を架橋剤として使用し、膜を作製した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(プロピレングリコール)メチルエーテルアセテート(DPMA)及び水を様々な量で、又はN,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ジ(エチレングリコール)、トリ(エチレングリコール)及び水を様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用した。
【０２６６】
反応の構成成分(図4B及び13)は一緒に十分に混合した。ただしジチオールはキャストする10〜15分前に添加した。この膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。乾燥膜の質量増加及びぬれ時間を決定し、次に、RO水を使用して、各膜の試片(直径が7.7cm)の初期流束を測定した。
【０２６７】
これらの結果(図4B及び図13)は、様々な溶媒系を使用することにより、幅広い範囲にわたるDATAコモノマーをフィードして、膜の水流束測定によって示される、幅広い範囲の膜の透過度を得ることが可能であることを示している。これらの膜をプロテインAリガンドによりグラフトした場合、これらの膜は、対応する範囲のIgG結合能力(重合後のプロテインAのグラフト化の項目を参照されたい)を示した。
【０２６８】
これらの膜は、走査型電子顕微鏡法(SEM)により試験し、これにより、均質な、高度に相互につながりのある多孔性網目構造であることが明らかになった(図14)。
【０２６９】
[実施例11]
共架橋剤としてテトラチオール分子を含む配合物
ある種の実施形態では、得られた膜構造及び透過度を修飾するために、ペンタエリスリトールテトラキス(3-メルカプトプロピオネート)(PETM)を追加の架橋剤として使用した。
【０２７０】
この一連の膜配合物では、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー及び(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)コモノマーをモノマーとして使用し、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)及びペンタエリスリトールテトラキス(3-メルカプトプロピオネート)(PETM)を追加の架橋剤として使用した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、(±)-1,3-ブタンジオール(Budiol)、ヘキシレングリコール、エチレングリコール(EG)、テトラ(エチレングリコール)(TetEG)及び水を様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用し、ラジカル重合反応を開始した。
【０２７１】
これらの成分に基づく反応混合物を配合し(図8)、構成成分のすべてを加えて十分に混合した。ただしジチオールはキャストする10〜15分前に添加した(周囲光による早期重合の開始を回避するため)、膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。質量増加及びぬれ時間を決定し、RO水を使用して、各膜の試片(直径が7.7cm)の初期流束を測定した。
【０２７２】
結果(図15中に示されている)により、水流束によって示されている通り、第2の架橋剤としてマルチアームチオール(PETM)を使用して、様々なアルケン/チオール比からなる、様々な透過度を有する膜を作製することが可能であることが示されている。表5に実証されている通り、ゲル中の架橋剤の全含有率を増加させることにより、透過度を上昇させることが可能である。SEMにより、代表的な膜配合物が多孔性構造であることが示されている(図16)。
【０２７３】
【表５】
2018511667.tif 000012
【０２７４】
[実施例12]
ジアルキン架橋剤を含むさらなる配合物
この一連の追加例では、配合物中に、追加の架橋剤としてジアルキン分子(1,7-オクタジイン)を含ませて、重合膜内の炭素-炭素不飽和結合数を増大させた。
【０２７５】
この膜配合物クラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー及び(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)コモノマーをモノマーとして使用し、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)及び1,7-オクタジイン(OctDi)を架橋剤として使用した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、エチレングリコール(EG)、テトラ(エチレングリコール)(TetEG)及び水をすべて様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用した。
【０２７６】
ジチオール(EDDET)を除き、完全に溶解するまで、反応の構成成分(図17)を溶媒混合物中で混合した。次に、キャストする10〜15分前に、EDDETを加えた。膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。各膜試片(直径7.7cmで、R.O.水を使用)の質量増加、ぬれ時間、及び初期流束を決定した。
【０２７７】
図17に示されている結果により、膜の透過度を幅広く変える共架橋剤としてオクタジインを用いて、膜を配合することが可能であることが実証される。代表的な膜(CLK-EN-361)の走査型電子顕微鏡法(SEM)の画像により、小さな細孔を有する、均質な相互につながっている多孔性構造であることが示されている(図18)。
【０２７８】
[実施例13]
カルボン酸イオン基により官能基化された膜を使用した、陽イオン交換IgG結合
カルボン酸イオン基は、イオン化形態(例えば、ポリメタクリル酸イオン)が強く水和するので、性質が親水性であり、ポリマー膨潤性を高めることが知られている。多孔性ポリマー中のカルボン酸イオン基の含有率を高めると、膨潤性が高まり、ひいては、流束が低下する。実施例6を参照されたい。
【０２７９】
グラフトした膜のそれぞれの場合のタンパク質IgG(pH5において、正味の正電荷を有する)に対する陽イオン交換結合能力を試験して、膜における電荷を帯びた陽イオン交換リガンドが取り込まれていることに対する追加のサポートを得た。IgGに対する膜の動的結合能力は、アルケン/チオール比の増加と共に上昇する。表6を参照されたい。
【０２８０】
【表６】
2018511667.tif 000013
【０２８１】
[実施例14]
重合後の、ヒドロチオレーションによる、プロテインAによるアルケン/イン膜(DATAコモノマーにより作製)のグラフト化
クリックアルケン膜が、生体リガンドによりグラフトされ得ることを実証するため、C末端システイン残基を含有する遺伝子工学操作されたプロテインAリガンド(rプロテインA-cys)を上記の通り作製した、選択したクリックアルケン膜に結合した。上記で概説されるように、グラフトしたプロテインAリガンドを有する膜のIgG結合能力を決定した。
【０２８２】
より高いDATA含有率(すなわち、重合混合物中、8重量%超)を有する膜のIgG結合能力の結果(表7)により、プロテインA修飾膜は、DATAモノマーが比較的低い濃度を有する膜(すなわち、重合混合物中、8重量%未満)よりも多くのIgGに結合することができることが実証されている。
【０２８３】
これらの結果はまた、アルケン対チオール比は、膜のIgG結合能力の性能に関連する唯一の変数ではないことも示唆している。多孔性、表面積及び表面親水的/疎水的性質などの他の要因がアルケン基の利用可能性に寄与し、それによりプロテインAリガンドのカップリング反応に影響を及ぼすので、 それらの要因は、重要な役割を果たす可能性がやはり高い。
【０２８４】
【表７】
2018511667.tif 000014
【０２８５】
[実施例15]
重合後の、ヒドロチオレーションによるプロテインAによるアルケン/イン膜(PETM共架橋剤により作製)のグラフト化
このクラスの膜では、膜の架橋度及び透過度を調節する別の手段をもたらすため、テトラチオール架橋剤PETMを追加の架橋剤として使用した。重合後のアルケン官能基の存在及び表面密度は、ラジカルヒドロチオレーション(チオール-エン)反応を使用して、プロテインAリガンドをこれらの膜に先ずグラフトすることにより検討した。次に、プロテインAをグラフトした膜のIgG結合能力を、既に記載されている通り評価した。
【０２８６】
以下に示されている通り(表8)、これらの結果より、この共架橋剤により作製された膜は、官能基であり、かつ膜表面上のrプロテインA-cysヒドロチオレーション(チオール-エン)反応に利用可能な残留アルケン基を有することが示唆される。
【０２８７】
【表８】
2018511667.tif 000015
【０２８８】
[実施例16]
重合後の、アルケン/イン膜を疎水性リガンドでグラフトすることによる疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)媒体の作製
光開始剤によるクリック(チオール-エン)ヒドロチオレーション反応を使用して、疎水性チオール末端分子を、残留アルケン官能基を含有する膜にグラフトした。その後のグラフト反応に使用するため、すなわち一般法の項目において記載されている通り、膜上に1-オクタンチオールを導入するために、3つの膜(EN-224、EN-291及びEN-301)を調製した(実験方法の項目において既に概説されている通りである)。
【０２８９】
膜への疎水性チオールの結合は、グラフトされていない膜よりも、グラフトされている膜の表面の親水性をかなり低下させることが予期された。実際に、ぬれ時間は、試験した膜配合物のすべてについて、グラフト後に一貫して増加した(表9)。
【０２９０】
疎水性リガンドにより修飾した膜は、効果的な疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)媒体として働き、高い塩濃度でIgGに結合することが期待された。この現象は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの基礎、すなわち、生物製剤の精製のためのバイオ分離法に使用される周知の技法を構成する。
【０２９１】
結果(表9)は、修飾膜が、実際に、高い塩条件中で、タンパク質に結合することができることを実証している。
【０２９２】
【表９】
2018511667.tif 000016
【０２９３】
[実施例17]
ヒドロチオレーション反応を使用する、官能基化HICクリック膜を作製するための1工程重合反応
この実施例では、疎水性リガンドにより官能基化されているクリック膜が実証されている通り、クリックケミストリーの適用柔軟性が実証される。単一重合工程により、その網目構造中に含まれている疎水性リガンド(1-オクタンチオール)を有する膜ポリマー網目構造が形成される。重合混合物中のチオール/アルケン比を制御することによって、残留アルケン集団を様々なものとすることができ、原理的に、後工程で使用され、同一の若しくは異なる化学特性又は物理特性を有する追加の分子又はリガンドを固定することができる。
【０２９４】
この膜配合物クラスでは、2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール(EDDET)モノマー、及び1,4-ジチオエリスリトール(DDT)と(+)-N,N'-ジアリルタートルアミド(DATA)コモノマーの両方をビルディングモノマーとして使用する一方、1,3,5-トリアリル-1,3,5-トリアジン-2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン(TATATO)及び1,7-オクタジイン(OctDi)を架橋剤として使用した。1-オクタンチオールを配合物に含ませ、ポリマーに疎水性ペンダント基又は末端基を付与した。この溶媒系は、N,N'-ジメチルアセトアミド(DMAc)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、エチレングリコール(EG)、テトラ(エチレングリコール)(TetEG)及び水をすべて様々な量で含んでいた。4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-ヒドロキシ-2-プロピル)ケトン(IRGACURE2959)を光開始剤として使用した。
【０２９５】
ジチオール(EDDET)を除き、完全に溶解するまで、反応の構成成分(図19)を溶媒混合物中で混合した。次に、キャストする10〜15分前に、EDDETを加えた。膜をキャストし、既に記載されている通り重合した。各膜試片(直径7.7cmで、R.O.水を使用)の質量増加、ぬれ時間、及び初期流束を決定した。
【０２９６】
図19に示されている通り、反応混合物中に疎水性リガンドを含む、単一重合工程により、様々な透過度及びIgG結合能力を有する膜を作製することが可能である。表10を参照されたい。
【０２９７】
【表１０】
2018511667.tif 000017
【０２９８】
[実施例18]
重合後の、ヒドロチオレーションによる制御又は伸長されたグラフト構築のための段階的グラフト法
ゲルを官能基化するためにヒドロチオレーションを使用する主な利点の1つは、後工程において、同じ反応の化学的性質を使用して他のモノマーを導入することができることである。さらに、クリックケミストリーを特徴づける特異性のために、多段階グラフト法を行うことが可能であり、これにより、非常に制御された形で、ペンダントビルディングブロック及び官能基を導入することができる。
【０２９９】
この能力を実証するため、残留アルケン官能基を含有する選択した膜に、段階的グラフト法を施した。この2工程グラフト法の正味の結果は、図20に示されている通り、画定された構造及び長さを有する表面から伸長しているアームを構築することである。
【０３００】
最初の工程において、ジチオールモノマー(EDDET)を過剰に使用して、ゲルの表面官能基をアルケンからチオール基に変換した。次に、7.7cmの直径の膜試片を水で濡らし、その後、この試片を、DMAc中10重量%のジチオール(EDDET)4mL及び光開始剤(ACVA)18mgをロードしたプラスチック製zipバッグに個別に移した。反応用バッグのそれぞれを撹拌し、次に、7分間、UV光に曝露して、次に、これらの試片を10mL  DMAcによりゆすいだ。
【０３０１】
第2の工程では、過剰量のジアルケンモノマー(DATA)をヒドロチオレーショングラフト反応により、チオールに富む膜と反応させて、表面から伸長しているアルケン官能基を含有する最終的な膜を作製した。膜試片を、光開始剤(ACVA)約18mgを含むDMAc中10重量%のジアルケンモノマー(DATA)4mLをロードした新しいプラスチック製zipバッグに個別に移した。この反応用バッグをさらに7分間、UV光に曝露し、次に、この膜試片をDMAcによりゆすぎ、次いで、水中で数回洗浄し、次に室温で乾燥した。最終膜の重量を記録した。
【０３０２】
表11中の以下に示されている結果により、2工程のグラフト反応の後に、膜の質量増加がわずかに高まる一方、透過度(水流束により測定される)はかなり低下することが実証される。1000kg/m2h超の透過度を有するグラフト膜を後のプロテインAリガンド結合に使用して、この方法により反応性に富むアルケン基の取込みの成功及び膜のタンパク質結合能力に及ぼす影響を検討する一助とした。実際に、測定可能なIgG結合能力により、膜表面に首尾良くリガンドがグラフトされたことを示している(表11)。同様に、グラフト後のIgG結合能力の上昇は、CLK-EN-224の場合にしか観察されず、この場合、質量増加は最大となり、このことはグラフト収率が最高であることを示唆している。
【０３０３】
この手法は、表面から伸長して、膜表面特性、反応性基の密度及び/又は透過度を改変する、明確に定義された多単位グラフト(又は分岐)を構築する効率的な手段をもたらすので、グラフト構造を改変かつ最適化する強力な可能性を有する。
【０３０４】
【表１１】
2018511667.tif 000018
【０３０５】
[実施例19]
共有結合により連結している「二層」膜を構築する二重重合法。
クリックヒドロチオレーション反応を受けるアルケン含有膜の能力を開発する別の手法は、細孔内の第2のポリマー相を形成する、モノマー/架橋剤のインシチュヒドロチオレーション重合の実施、及び同時に下層のゲルにポリマー相を共有結合させることを含む。
【０３０６】
高い透過度を有する膜の配合物(CLK-EN-224)を選択して、上記の、7”×8”の予め秤量した多孔性支持基材シート(不織ポリプロピレンメッシュ)上に、基底膜(第1の相)のシートを4枚、作製した。CLK-EN-224膜の各シートをポリエチレンシートに個々に置き、図21-A/B/C/Dに記載されている重合溶液12gに浸漬した。続いて、浸漬した膜を別のポリエチレンシートにより被覆し、余分な溶液及び捕捉されている気泡を除去するため、このシートを円を描くように手で穏やかにプレスした。この重合法は、上記の通り(一般法-膜調製の項目)、密閉チャンバ中で10分間、UV光(約350nm)を照射することにより開始し、次に、洗浄して乾燥した。
【０３０７】
各膜の最終的な重量及び質量増加を決定し、次に、グラフトした第2の相の重合による質量増加の上昇を各配合物について算出した。次に、二重の重合膜にメルカプトコハク酸をグラフトして、膜ゲルにカルボキシレート基を導入し(一般方法の項目を参照されたい)、これにより、膜は、タンパク質のバイオ分離用の陽イオン交換媒体として機能することが可能になる。さらに、膜にプロテインAリガンドをやはりグラフトし、これにより、膜は、バイオアフィニティー分離用媒体(グラフト及び試験プロトコルに関する一般法の項目を参照されたい)として機能することが可能になる。
【０３０８】
得られた膜(図22、CLK-EN-224  A/B/C/D)の質量増加、透過度(流束)及び結合能力(陽イオン交換モードとバイオアフィニティーモードのどちらにおいても)に関する試験により、第1のゲル相内に第2の相となるポリマーゲルを構築し、その結果、特有の特性を有する最終的なコンポジットを作製することが可能であることが実証される。
【０３０９】
「二相」膜の質量増加は、基底膜よりも多く、流束値はより低かった(図22)。「二相」膜の結合能力は、基底膜とは異なっていた。CEX  IgG結合能力は、質量増加と反比例関係にあるが、水流束とは直接、相関するように思われる。
【０３１０】
参照による組込み
本明細書において引用されている米国特許、特許出願公開のすべてが、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３１１】
均等物
当業者は、型通りの実験だけを使用して、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図１】
2018511667.tif 000019
【図２】
2018511667.tif 000020
【図３】
2018511667.tif 000021
【図４Ａ】
2018511667.tif 000022
【図４Ｂ】
2018511667.tif 000023
【図５Ａ】
2018511667.tif 000024
【図５Ｂ】
2018511667.tif 000025
【図６】
2018511667.tif 000026
【図７】
2018511667.tif 000027
【図８Ａ】
2018511667.tif 000028
【図８Ｂ】
2018511667.tif 000029
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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