(57)【要約】  本開示は、鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫を含む、害虫の標的コード配列及び標的転写非コード配列のRNA干渉介在性阻害を介した、害虫の制御のための核酸分子、及びその使用方法に関する。本開示はまた、害虫の制御に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法、ならびに当該方法により得られる植物細胞及び植物に関する。【選択図】図１
2018533356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する単離核酸であって、前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、配列番号１の相補配列、配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列、配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列、配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号３の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号３の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号５、配列番号５の相補配列、配列番号５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号５の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列、配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列、配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号８９、配列番号８９の相補配列、配列番号８９の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号８９の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号８９を含有するユースキスツス（Euschistus）生物体の天然コード配列、配列番号８９を含有するユースキスツス（Euschistus）生物体の天然コード配列の相補配列、配列番号８９を含有するユースキスツス（Euschistus）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号８９を含有するユースキスツス（Euschistus）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１１２；配列番号１１２の相補配列；配列番号１１２の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１２の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１１４；配列番号１１４の相補配列；配列番号１１４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１４の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１１６；配列番号１１６の相補配列；配列番号１１６の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１６の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１１８；配列番号１１８の相補配列；配列番号１１８の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１８の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１２０；配列番号１２０の相補配列；配列番号１２０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１２０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；からなる群から選択される、単離核酸。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号８９、配列番号９１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び前記いずれかの相補配列からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項４】
前記生物体が、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte）、ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith and Lawrence）、サザンコーンルートワーム（D. u. howardi）、メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae）、D.バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）、D.u.テネラ（D. u. tenella）、ジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）、D.スペシオサ（D. speciosa）、メリゲテス・アエネウス  ファブリシウス（Meligethes aeneus Fabricius）（花粉カブトムシ）、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros (Fabr.)）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula (L.)）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii (Westwood)）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys (Stal)）、アオカメムシ（Chinavia hilare (Say)）、茶色カメムシ（Euschistus. servus (Say)）、ディケロプス・メラカンツス（ダラス）（Dichelops melacanthus (Dallas)）、ディケロプス. フルカツス（Ｆ．）（Dichelops. furcatus (F.)）、エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．）（Edessa meditabunda (F.)）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor (F.)）、チナビア・マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ）（Chinavia. marginatum (Palisot de Beauvois)）、ワタムシ（Horcias nobilellus (Berg) ）、タエディア・スティグモサ（バーグ）（Taedia stigmosa (Berg)）、ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル）（Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)）、ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド）（Neomegalotomus parvus (Westwood)）、レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス）（Leptoglossus zonatus (Dallas)）、ニエストレア・シデ（Ｆ．）（Niesthrea sidae (F.)）、サビイロカスミカメムシ（Lygus hesperus (Knight)）、及び リグス・リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ）（Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois)）からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されたリボ核酸（RNA）分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生された二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列と、鞘翅目又は半翅目害虫との接触が、前記ポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性核酸配列の発現を阻害する、請求項６に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
前記リボ核酸分子と、鞘翅目又は半翅目害虫との接触が、前記害虫を殺す、又は前記害虫の成長及び／又は摂食を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
前記第一のRNAセグメントが前記ポリヌクレオチドを含有し、前記第三のRNAセグメントが、前記第二のポリヌクレオチド配列により前記第一のRNAセグメントに連結され、かつ前記第三のRNAセグメントが、実質的に前記第一のRNAセグメントの逆相補配列であり、それによって、リボ核酸に転写されて前記二本鎖RNAを形成するときに、前記第一及び第三のRNAセグメントがハイブリダイズする、第一、第二、及び第三のRNAセグメントを含有する、請求項６に記載の二本鎖RNA。
【請求項１０】
約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドの長さの、二本鎖リボ核酸分子及び一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項５に記載のRNA。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、植物細胞内で機能する、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された細胞。
【請求項１３】
前記細胞が原核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が真核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物。
【請求項１７】
種子が、前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物の種子。
【請求項１８】
商品生産物が、検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物から製造された商品生産物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、二本鎖リボ核酸分子として前記植物において発現される、請求項１６に記載の植物。
【請求項２０】
前記細胞が、トウモロコシ（Zea mays）、ダイズ（Glycine max）、又はアブラナ(Brassica napus）の細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
前記植物が、トウモロコシ（Zea mays）、ダイズ（Glycine max）、またはセイヨウアブラナ（Brassica napus）である、請求項１６に記載の植物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸分子として前記植物中で発現され、及び前記リボ核酸分子は、鞘翅目又は半翅目害虫が前記植物の一部を摂取したときに、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２３】
内因性の害虫遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする追加のポリヌクレオチドを少なくとも１つ、さらに含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記追加のポリヌクレオチドが、植物細胞内で機能する異種プロモーターに各々操作可能に連結されている、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項２５】
害虫群を制御する方法であって、前記方法が、前記害虫との接触で機能し、前記害虫内の生物学的機能を阻害するリボ核酸（RNA）分子を含有する剤を提供することであって、前記RNAは、配列番号９８〜１１１のいずれか；配列番号９８〜１１１のいずれかの相補配列；配列番号９８〜１１１のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号９８〜１１１のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの転写物；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの転写物の相補配列、及び配列番号１２５〜１３０からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能である、提供すること、とを含む、方法。
【請求項２６】
前記剤が、二本鎖RNA分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記害虫が、鞘翅目又は半翅目害虫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
鞘翅目害虫群を制御する方法であって、前記方法が、
前記鞘翅目害虫との接触で機能し、前記鞘翅目害虫内の生物学的機能を阻害する第一及び第二のポリヌクレオチド配列を含有する剤を提供することであって、前記第一のポリヌクレオチド配列が、配列番号９８、９９，１００、１１０、及び１２５〜１３０からなる群から選択される配列の約１５個〜約３０個の連続したヌクレオチドに対し、約９０％〜約１００％の配列同一性を示す領域を含有し、及び前記第一のポリヌクレオチド配列が、前記第二のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、提供すること、を含む、方法。
【請求項２９】
鞘翅目又は半翅目害虫群を制御する方法であって、前記方法が、
鞘翅目又は半翅目害虫の宿主植物において、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する形質転換植物細胞を提供することであって、前記ポリヌクレオチドが発現され、前記群に属する鞘翅目又は半翅目害虫との接触で機能するリボ核酸分子を生成し、前記鞘翅目又は半翅目害虫内の標的配列の発現を阻害し、その結果、前記ポリヌクレオチドを含有しない同一宿主植物種の植物上の同一害虫種の発達と比較し、前記鞘翅目又は半翅目害虫又は害虫群の成長及び／もしくは生存の低下がもたらされる、提供すること、を含む、方法。
【請求項３０】
前記リボ核酸分子が、二本鎖リボ核酸分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記鞘翅目又は半翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一宿主植物種の宿主植物に寄生する同一害虫種の群と比較して減少している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記リボ核酸分子が、二本鎖リボ核酸分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記鞘翅目又は半翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一種の宿主植物に寄生する鞘翅目又は半翅目害虫群と比較して減少している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
植物において前記害虫の寄生を制御する方法であって、前記方法は、以下からなる群：
配列番号９８〜１１１及び１２５〜１３０；
配列番号９８〜１１１及び１２５〜１３０のいずれかの相補配列；
配列番号９８〜１１１及び１２５〜１３０のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；
配列番号９８〜１１１及び１２５〜１３０のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの転写物；
配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの転写物の相補配列；
配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８及び１２０のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；
配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であるリボ核酸（RNA）を前記害虫の飼料中に提供することを含む、方法。
【請求項３５】
前記飼料が、前記ポリヌクレオチドを発現するよう形質転換された植物細胞を含有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記特異的にハイブリダイズ可能なRNAが、二本鎖RNA分子中に含有されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
植物作物の生産量を改善する方法であって、前記方法が、
請求項１に記載の前記核酸を、植物内に導入し、トランスジェニック植物を作製することと、
前記植物を栽培し、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、鞘翅目及び／又は半翅目害虫の発達又は成長を阻害する、並びに鞘翅目及び／又は半翅目害虫寄生による生産量の減少を阻害する、発現すること、とを含む、方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記植物の一部に接触した鞘翅目及び／又は半翅目害虫において少なくとも第一の標的遺伝子を抑制するRNA分子を生成する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物作物が、トウモロコシ（Zea mays)、大豆(Glycine max)、および菜種(Brassica napus)からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
植物細胞を、請求項１に記載の核酸を含有するベクターを用いて形質転換することと、
前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の発達を可能とさせるために充分な条件下で培養することと、
少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされたリボ核酸（RNA）分子の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
前記RNAを発現する植物細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項４１】
前記RNA分子が、二本鎖RNA分子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
鞘翅目及び／又は半翅目害虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製する方法であって、前記方法が、
請求項４０の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸分子の発現が、前記形質転換された植物に接触する鞘翅目及び／又は半翅目害虫の標的遺伝子の前記発現を調節するために充分である、再生することと、を含む、方法。
【請求項４３】
トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
鞘翅目害虫抵抗性を植物に提供するための手段を含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換することと、
前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の発達を可能とさせるために充分な条件下で培養することと、
鞘翅目害虫抵抗性を植物に提供するための前記手段をそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択することと、
鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項４４】
鞘翅目害虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製する方法であって、前記方法が、
請求項４３に記載の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現が、前記形質転換された植物に接触する鞘翅目害虫の標的遺伝子の発現を調節するために充分であることと、を含む方法。
【請求項４５】
トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
半翅目害虫抵抗性を植物に提供するための手段を含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換することと、
前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の発達を可能とさせるために充分な条件下で培養することと、
半翅目害虫抵抗性を植物に提供するための前記手段がそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択することと、
半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現する植物細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項４６】
半翅目害虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製する方法であって、前記方法が、
請求項４５の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現が、前記形質転換された植物に接触する半翅目害虫の標的遺伝子の発現を調節するために充分であること、とを含む、方法。
【請求項４７】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４８】
Ｂ．チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３５、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、及びＣｙｔ２Ｃを含有する群から選択される、請求項４７に記載の核酸。
【請求項４９】
前記細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項５０】
Ｂ．チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cｒｙ３５、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、及びＣｙｔ２Ｃを含有する群から選択される、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記植物が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物。
【請求項５２】
Ｂ．チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３５、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、及びＣｙｔ２Ｃを含有する群から選択される、請求項５１に記載の植物。
【請求項５３】
前記形質転換植物細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
Ｂ．チューリンゲンシス（B．thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３５、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、及びＣｙｔ２Ｃを含有する群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
植物作物の生産量を改善する方法であって、前記方法が、
トウモロコシ植物に核酸を導入し、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製することであって、前記核酸が、
shi/dynamin遺伝子を標的とするsiRNAを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドと、
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）又はPIP-1ポリペプチドに由来する殺虫性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、のうちの少なくとも２つ以上を含む核酸である、作製することと、
前記トウモロコシ植物を栽培し、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、鞘翅目及び／又は半翅目害虫の発達又は成長を阻害する、鞘翅目及び／又は半翅目害虫寄生による生産量の減少を阻害すること、とを含む、方法。
【請求項５６】
前記植物が、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、トウモロコシ（Zea mays）、または大豆（Glycine max）である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１５年９月２５日に出願した「shibire/dynamin NUCLEIC ACID MOLECULES TO CONTROL COLEOPTERAN AND HEMIPTERAN PESTS」米国仮特許出願第62/233,061号明細書の出願日の利益を主張するものであり、当該出願はその全体で本明細書に援用される。
【０００２】
米国特許法施行細則第１．８２１条（ｃ）または（ｅ）項に従う、テキストファイルとして提出される配列表の宣言
米国特許法施行細則第１．８２１条（ｃ）または（ｅ）項に従い、ＴＸＴ版の配列表を含むファイルが本出願と同時に提出されており、その内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、概して、害虫（例えば鞘翅目の害虫及び半翅目の害虫）を起因とする植物被害を遺伝的に制御することに関する。特定の実施形態において、本発明は、植物防御作用を提供するための、標的コードポリヌクレオチド及び標的非コードポリヌクレオチドの特定に関するものであり、ならびに害虫の細胞内で標的コードポリヌクレオチド及び非コードポリヌクレオチドの発現を転写後に抑制又は阻害するための組み換えＤＮＡおよび組み換えＲＮＡ技術の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
ウェスタンコーンルートワーム（WCR：western corn rootworm）、（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）は、北米で最も破壊的なコーンルートワーム種のうちの１種であり、米国中西部のトウモロコシを栽培している地域において特に懸案事項となっている。ノーザンコーンルートワーム（NCR：northern corn rootworm）、（Diabrotica barberi Smith 及び Lawrence）は、WCRとほぼ同じ地域に共に生息する近縁の種である。米国で多大な影響を与えているジアブロティカ（Diabrotica）の関連亜種は他に数種ある：メキシカンコーンルートワーム（MCR：Mexican corn rootworm）（D.D. virgifera zeaeKrysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（SCR：southern corn rootworm）（D. undecimpunctata howardiBarber）；D.バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.ウンデシムプンクタタ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；D.スペシオサ・ゲルマール（D. speciosaGermar）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）。米国農務省は、コーンルートワームによって毎年１０億ドルの収入減が生じていると推測しており、そのうち８億ドルが収穫高の損失、２億ドルが処置のためのコストである。
【０００５】
ＷＣＲおよびＮＣＲの両方の卵が、夏季に土壌中に産卵される。昆虫は卵期のままで越冬する。卵は楕円形、白色であり、０．００４インチ（約０．１ミリ）未満の長さである。幼虫は５月下旬又は６月上旬に孵化し、正確な孵化のタイミングは、温度変化及び位置によって毎年変化する。新たに孵化した幼虫は、０．１２５インチ（約３．２ミリ）未満の長さの白色の芋虫である。孵化するとすぐに幼虫はトウモロコシの根を食べ始める。コーンルートワームは３つの幼虫齢を経る。数週間、摂食をした後、幼虫は蛹へと脱皮する。コーンルートワームは土壌中で蛹となり、その後、７月と８月に成虫として土壌から出てくる。成虫のルートワームは約０．２５インチ（約６．４ミリ）の長さである。
【０００６】
コーンルートワームの幼虫はトウモロコシと、他の数種の草の上で完全に発育する。キンエノコロ（yellow foxtail）の上で育った幼虫はもっと遅くに現れ、トウモロコシの上で育った幼虫よりも、成虫の頭蓋の大きさが小さい。Ellsburyら（2005）Environ.Entomol.34:627-34。ＷＣＲの成虫はトウモロコシの毛、花粉、及び露出した穂先の穀粒を餌とする。もしトウモロコシの生殖組織が現れる前にＷＣＲの成虫が出てきた場合、成虫は葉組織を餌とする場合もあり、そのために植物の生長が遅くなり、さらには、宿主植物が死んでしまう場合もある。しかしながら成虫はすばやく望ましい毛及び花粉へと、それらが利用可能になり次第、移動してしまう。ＮＣＲの成虫もまたトウモロコシ植物の生殖組織を餌とするが、対照的にトウモロコシの葉は滅多に食べない。
【０００７】
トウモロコシのルートワーム被害の大部分は幼虫の摂食によるものである。新たに孵化したルートワームはトウモロコシの細根を最初に食べ始め、根端へと潜り込む。幼虫が大きく成長するにつれ、一次根を食べ、そして潜り込む。コーンルートワームが多くなると、幼虫の摂食によって頻繁に、トウモロコシの茎の根本にまで幅広く根の削り込みが生じる。深刻な根の損傷により、水と栄養素を植物へと移送する根の能力が損なわれ、植物の生育が低下し、穀物生産高の低下が生じ、多くの場合、その結果として全生産高の劇的な低下が生じる。また深刻な根の損傷は多くの場合、トウモロコシ植物の倒伏が生じ、そのために収穫がより困難となり、さらには生産高の低下も生じる。また、成虫がトウモロコシの生殖組織を食べることにより、穂先の絹糸の削り込みが生じる場合もある。もし花粉飛散期間にこの「毛の刈り取り」が充分に深刻なものであった場合、受粉が妨害されてしまう可能性がある。
【０００８】
輪作、化学殺虫剤、バイオ農薬（例えば芽胞形成グラム陽性菌のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、Ｂｔ毒素を発現するトランスジェニック植物、又はそれらの組み合わせによりコーンルートワームの制御が試みられ得る。輪作は、農地用途に望ましくない制限をかけるという顕著な不利益に悩まされる。さらに、一部のルートワーム種はトウモロコシ農地以外でも産卵し、また休耕の拡張は複数年にわたる卵の孵化をもたらすため、トウモロコシと大豆で輪作を行った場合の効果は低くなる。
【０００９】
化学殺虫剤がコーンルートワームの制御の実現に関し、最も信頼されている戦略である。しかしながら、化学殺虫剤の使用は不完全なコーンルートワーム制御戦略である。化学殺虫剤のコストを、殺虫剤の使用にもかかわらず発生し得るルートワーム損害のコストに加えた場合、コーンルートワームにより米国において毎年１０憶ドルを超える損失となる可能性がある。高密度の幼虫、多雨、及び不適切な殺虫剤の塗布はすべて、不十分なコーンルートワームの制御を生じさせる場合がある。さらに、殺虫剤の継続的な使用によって殺虫剤耐性のルートワーム株が選択され、ならびに非標的種に対する毒性が原因となり深刻な環境問題が生じる場合がある。
【００１０】
カメムシと他の半翅目昆虫（異翅目）は、もう１つの重要な農業病害虫複合系である。世界中で、５０を超えるカメムシ関連種が作物被害を引き起こすことが知られている。McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, CRC Press。半翅目昆虫は、トウモロコシ、大豆、果物、野菜、及び穀物をはじめとする多くの重要作物中に存在している。
【００１１】
カメムシは複数の若虫期を経て、その後に成虫期に到達する。これらの昆虫は卵から成虫まで、約３０〜４０日で発育する。若虫と成虫の両方が軟組織から樹液を吸い、またその中に消化酵素を注入し、余剰な口腔組織消化とネクローシスを引き起こす。次いで、消化された植物物質と栄養素が摂取される。植物の維管束系から水と栄養素が枯渇すると、植物組織の損傷が生じる。発育中の穀物と種子への損傷が、収率として最も重要であり、発芽は著しく低下する。温暖な気候では複数世代が発生し、多大な昆虫の圧力が生じる。カメムシの現時点の管理法は、個々の農地を基準とした殺虫剤処置に依っている。それゆえ、現在進行中の作物損害を最小化する別の管理戦略が緊急に必要とされている。
【００１２】
ヨーロッパ花粉カブトムシ（PB：European pollen beetles）は菜種の重要な害虫であり、幼虫と成虫の両方が花と花粉を餌としている。農作物に対する花粉カブトムシ（pollen beetle）の損害は、２０〜４０％の収穫高の損失を生じさせる。主な害虫種は、メリゲテス・アエネウス(Meligethes aeneus)である。現在のところ、菜種における花粉カブトムシの制御は主にピレスロイド系に依っているが、これは環境及び規制プロファイルを理由として、まもなく段階的に廃止されると予測されている。さらに、既存の化学殺虫剤に対する花粉カブトムシの抵抗性が報告されている。したがって、環境的に扱いやすい、新規の作用様式の花粉カブトムシの制御解決策が緊急に必要とされている。
【００１３】
自然界では、花粉カブトムシは成虫として土壌中、又は落葉落枝の下で越冬する。春に成虫は冬眠から覚め、雑草の花を食べ始め、そして花期の菜種植物へと移動する。卵は、菜種の花のつぼみの中に産卵される。幼虫はつぼみと花を食べ、発育する。後期幼虫は、土壌中で蛹化する。第二世代の成虫は７月と８月に現れ、様々な開花植物を摂食し、その後に越冬用の場所を見つける。
【００１４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、内因性の細胞経路を利用するプロセスであり、これによって標的遺伝子のすべて、または適切なサイズの任意の位置に特異的な干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えばｄｓＲＮＡ分子など）が、それらにコードされたｍＲＮＡの分解を生じさせる。近年、ＲＮＡｉを使用し、多くの種及び実験系、例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、植物、昆虫胚、及び組織培養の細胞で遺伝子を「ノックダウン」させることが行われている。例えば、Fireら（1998) Nature 391:806-11; Martinezら（2002) Cell 110:563-74; McManus 及び Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.を参照のこと。
【００１５】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を含む内因性経路を介してｍＲＮＡの分解を行う。ＤＩＣＥＲは長いｄｓＲＮＡ分子を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と名付けられている、およそ２０ヌクレオチドの短い断片へと分解する。このｓｉＲＮＡが、２つの一本鎖ＲＮＡの、パッセンジャーストランドとガイドストランドへとほどかれる。パッセンジャーストランドは分解され、ガイドストランドはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれる。
【００１６】
米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545は、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte）の蛹から単離された９１１２個の発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリを開示している。米国特許第7,612,194号及び米国特許出願公開2007/0050860において、植物細胞でのアンチセンスＲＮＡの発現のために、その中に開示されているウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera）液胞型Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）のいくつかの固有部分配列のうちの１つに相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することについて提唱している。米国特許出願公開2010/0192265は、植物細胞でのアンチセンスRNAの発現のために、未知及び非公開の機能のウェスタンコーンルートワーム（ D. v. virgifera ）遺伝子の固有部分配列（この部分配列は、Ｃ．エレガンス（ C. elegans ）のＣ５６Ｃ１０．３遺伝子産物に対し５８％同一であると述べられている）に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。米国特許出願公開2011/0154545は、植物細胞でのアンチセンスRNAの発現のために、ウェスタンコーンルートワーム（ D. v. virgifera ）のコートマーベータサブユニット遺伝子の２個の固有部分配列に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。さらに米国特許第7,943,819号は、ウェスタンコーンルートワーム（ D. v. virgifera  LeConte）の幼虫、蛹、及び切断中腸から単離された９０６個の発現配列タグ（ＥＳＴ）のライブラリを開示しており、植物細胞での二本鎖ＲＮＡの発現のために、ウェスタンコーンルートワーム（ D. v. virgifera ）の荷電多胞体４ｂ遺伝子の固有部分配列に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。
米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545には、Ｖ−ＡＴＰａｓｅのいくつかの固有部分配列と機能未知の固有部分配列を除き、ＲＮＡ干渉のために、その中に列記される９千個超の配列のいずれか特定配列を使用することについて、さらなる提唱は提示されていない。さらに、米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545は、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとして使用される場合に、コーンルートワーム種において、提示される九千を超える配列のその他のどれが致死的であるか、又は別の点で有用であるかについては何の示唆も提示していない。米国特許第7,943,819号は、荷電多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の固有部分配列以外に、その中に列記される九百を超える配列のいずれか固有の配列のＲＮＡ干渉のための使用に関し、何も提唱していない。さらに、米国特許第7,943,819号も、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとして使用される場合にコーンルートワーム種において、提示される九百を超える配列のその他でどれが致死的であるか、又は別の点で有用であるかについては何の示唆も提示していない。米国特許出願公開2013/040173及びＰＣＴ国際特許出願公開WO 2013/169923は、トウモロコシにおけるRNA干渉に関し、Diabrotica virgifera Snf7遺伝子から誘導された配列の使用を記載している。（また、Bolognesi ら (2012) PLOS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534にも開示されている)。
【００１７】
コーンルートワームDNA（例えば前述のDNA）に相補的な配列の大多数は、dsRNA又はsiRNAとして使用された際、植物に対し、コーンルートワーム種からの防御作用をもたらさない。例えば、Baumら（2007）Nature Biotechnology 25:1322-1326において、数種のＷＣＲ遺伝子標的のＲＮＡｉによる阻害効果が記載されている。これら著者らは、検証した８〜２６個の標的遺伝子が、５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える非常に高いｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）濃度でも、鞘翅目害虫に、実験的に有意な死亡率をもたらすことができなかったと報告している。
【００１８】
米国特許第7,612,194号、及び米国特許公開2007/0050860の著者らは、ウェスタンコーンルートワームを標的とする、トウモロコシ植物におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉを最初に報告している。Baum ら (2007) Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。これらの著者らは、トランスジェニックＲＮＡｉトウモロコシ開発に対する、標的遺伝子候補をスクリーニングするための、ハイスループットｉｎ  ｖｉｖｏ食事性ＲＮＡｉシステムを記載している。２９０個の遺伝子の初期遺伝子プールのうち、１４個のみが、幼虫制御の可能性を示した。最も高い効果のあった二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のうちの１つは、遺伝子コード液胞ＡＴＰａｓｅサブユニットＡ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）を標的としており、対応する内因性ｍＲＮＡの急速な抑制をもたらし、低濃度のｄｓＲＮＡで特異的ＲＮＡｉ反応を誘発した。したがって、これらの著者らが、害虫制御ツール候補としてのｉｎ  ｐｌａｎｔａＲＮＡｉの可能性を最初に報告した一方で、比較的小さな候補遺伝子セットからも有効な標的を先験的に正確に特定することはできなかったことも同時に報告している。
【００１９】
情報開示
本明細書において、害虫制御を目的とした核酸分子（例えば、標的遺伝子、ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡなど）、及びその使用方法が開示される。当該害虫としては、例えば、鞘翅目害虫、例えばD. v. virgifera LeConte（ウェスタンコーンルートワーム、「ＷＣＲ」）；D. barberi Smith and Lawrence（ノーザンコーンルートワーム、「NCR」）；D. u. howardi Barber （サザンコーンルートワーム、「SCR」）；D. v. zeae Krysan and Smith（メキシカンコーンルートワーム、「ＭＣＲ」）； D. balteata LeConte（D.バルテアタ・ルコンテ）； D. u. tenella（D.u.テネラ）；D. speciosa Germar（Ｄ．ゲルマール）； D. u. undecimpunctata  Mannerheim（ジュウイチホシウリハムシ）、Meligethes aeneus  Fabricius（メリゲテス・アエネウス  ファブリシウス）（花粉カブトムシ（pollen beetle）、「ＰＢ」）；及びならびに半翅目害虫、例えばEuschistus heros (Fabr.)  (新熱帯茶色カメムシ（Neotropical Brown Stink Bug）、「BSB」)； E. servus  (Say)（茶色カメムシ（Brown Stink Bug））； Nezara viridula  (L.)（ミナミアオカメムシ（Southern Green Stink Bug））； Piezodorus guildinii  (Westwood) （アカオビカメムシ（Red-banded Stink Bug））； Halyomorpha halys(Stal)   （クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug））； Chinavia hilare  (Say)（アオカメムシ（Green Stink Bug））； C. marginatum (Palisot de Beauvois) （C. マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ））； Dichelops melacanthus (Dallas)  （ディケロプス・メラカンツス（ダラス））；D. furcatus (F.)（D. フルカツス（Ｆ．））;   Edessa meditabunda   (F.) （エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．））；  Thyanta perditor  (F.) (新熱帯カタアカカメムシ（Neotropical Red Shouldered Stink Bug）)；Horcias nobilellus (Berg) （ワタムシ（Cotton Bug））； Taedia stigmosa  (Berg)（タエディア・スティグモサ（バーグ））；  Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)（ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル））；  Neomegalotomus parvus (Westwood)（ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド）） ；  Leptoglossus zonatus  (Dallas) （レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス））； Niesthrea sidae  (F.) （ニエストレア・シデ（Ｆ．））；  Lygus hesperus  (Knight)（サビイロカスミカメムシ（Western Tarnished Plant Bug））；  及び  L. lineolaris(Palisot de Beauvois)（L. リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ））が挙げられる。特定の例において、害虫の１つ以上の天然核酸の少なくとも一部に対して相補的であり得る例示的な核酸分子が開示される。
【００２０】
これら、及びさらなる例において、天然核酸配列が標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、又は幼虫／若虫の発達に関与してもよい。一部の例において、標的遺伝子発現の、それに相補的なポリヌクレオチドを含む核酸分子による転写後阻害は、害虫に対し致命的であってもよく、又は害虫の成長及び／又は発達の低下をもたらすものであってもよい。特定の例において、ｓｈｉｂｉｒｅ（本明細書において、ｓｈｉとも呼称される）またはｓｈｉホモログは、ダイナミンをコードしており、転写後サイレンシングの標的遺伝子として選択され得る。個別の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８９、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、および配列番号１２０からなる群から選択されるｓｈｉｂｉｒｅ遺伝子である。したがって、配列番号１のポリヌクレオチド；配列番号１の相補物；配列番号３のポリヌクレオチド；配列番号３の相補物；配列番号５のポリヌクレオチド；配列番号５の相補物；配列番号８９のポリヌクレオチド；配列番号８９の相補物；配列番号１１２のポリヌクレオチド；配列番号１１２の相補物；配列番号１１４のポリヌクレオチド；配列番号１１４の相補物；配列番号１１６のポリヌクレオチド；配列番号１１６の相補物；配列番号１１８のポリヌクレオチド；配列番号１１８の相補物；配列番号１２０のポリヌクレオチド；配列番号１２０の相補物；及び／又は前述のポリヌクレオチドのいずれかの断片（例えば、配列番号７〜１２、９１、及び１２２）を含有する単離された核酸分子が本明細書に開示される。
【００２１】
また、標的遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸分子が開示される（例えば、ｓｈｉ遺伝子の産物）。たとえば、核酸分子は、配列番号２（ジアブロティカ（Diabrotica)SHI-1)；配列番号４(ジアブロティカ（Diabrotica）SHI-2)；配列番号６(ジアブロティカ( Diabrotica ) SHI-3)；配列番号９０；(新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros ）SHI)；配列番号１１３ (メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）SHI)；配列番号１１５(メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）SHI)；配列番号１１７(メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）SHI)；配列番号１１９(メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）SHI)；配列番号１２１(メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）SHI)；および／またはｓｈｉ遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。さらに、標的遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの逆相補であるポリヌクレオチドを含有する核酸分子が開示される。
【００２２】
また、例えばｓｈｉ遺伝子などの害虫標的遺伝子のすべて、又は一部に相補的なｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｈｐＲＮＡ）分子の製造に使用することができるｃＤＮＡポリヌクレオチドが開示される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｈｐＲＮＡは、例えば植物又は細菌などの遺伝子改変生物体により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで製造されてもよい。特定の例において、ｓｈｉ遺伝子（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８９、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、及び配列番号１２０）のすべて、又は一部に対し相補的なｉＲＮＡ分子を製造するために使用することができるｃＤＮＡ分子、またはその断片が開示される。
【００２３】
さらに、鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段、及び植物に対して鞘翅目害虫からの防御を提供する手段が開示される。鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号７〜１２及び１２２、ならびにそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡ分子である。鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の機能的均等物としては、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５を含有するＷＣＲ遺伝子のすべて又は一部に対し実質的に相同な一本鎖ＲＮＡ分子及び二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の機能的均等物としては、ｓｈｉ（例えば、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、又は配列番号１２０を含有するＰＢ遺伝子）のすべて又は一部に対し実質的に相同な一本鎖ＲＮＡ分子又は二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。鞘翅目害虫からの防御を植物に提供するための手段は、プロモーターに操作可能に連結された鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子であり、当該ＤＮＡ分子は、例えばトウモロコシなどの植物ゲノムに組み込まれることができる。
【００２４】
さらに、半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段、及び半翅目害虫からの防御を植物に提供する手段が開示される。半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号９１；及びその相補配列のポリヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡ分子である。半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の機能的均等物としては、配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）遺伝子のすべて、又は一部に対し実質的に相同な一本鎖ＲＮＡ分子及び二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。半翅目害虫からの防御を植物に提供するための手段は、プロモーターに操作可能に連結された半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子であり、当該ＤＮＡ分子は、例えばトウモロコシなどの植物ゲノムに組み込まれることができる。
【００２５】
害虫群（例えば、鞘翅目又は半翅目害虫）を制御するための方法が開示され、当該方法は、害虫により取り込まれることで、害虫内の生物学的機能を阻害するよう機能する、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｈｐＲＮＡ）分子を害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目害虫）に提供することを含み、当該ｉＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有する：配列番号９８；配列番号９８の相補配列；配列番号９９；配列番号９９の相補配列；配列番号１００；配列番号１００の相補配列；配列番号１０１；配列番号１０１の相補配列；配列番号１０２；配列番号１０２の相補配列；配列番号１０３；配列番号１０３の相補配列；配列番号１０４；配列番号１０４の相補配列；配列番号１０５；配列番号１０５の相補配列；配列番号１０６；配列番号１０６の相補配列；配列番号１０７；配列番号１０７の相補配列；配列番号１０８；配列番号１０８の相補配列；配列番号１０９；配列番号１０９の相補配列；配列番号１１０；配列番号１１０の相補配列；配列番号１１１；配列番号１１１の相補配列；配列番号１、３、５及び７〜１２のいずれかのすべて、又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；配列番号１、３、５及び７〜１２のいずれかのすべて、又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補配列；配列番号８９および９１のいずれかのすべて、又は一部を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；配列番号８９および９１のいずれかのすべて、又は一部を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１１２，１１４，１１６，１１８，１２０、および１２２のいずれかのすべて、又は一部を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体（例えば、ＰＢ）の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；及び配列番号１１２，１１４，１１６，１１８，１２０、および１２２のいずれかのすべて又は一部を含有するメリゲテス（Meligethes）生物体の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補配列；および配列番号１２５〜１３０のいずれかのすべて、又は一部。
【００２６】
特定の実施形態において、害虫に取り込まれることで機能し、害虫内の生物学的機能を阻害するｉＲＮＡは、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有するＤＮＡから転写される：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号５；配列番号５の相補配列；配列番号７；配列番号７の相補配列；配列番号８；配列番号８の相補配列；配列番号９；配列番号９の相補配列；配列番号１０；配列番号１０の相補配列；配列番号１１；配列番号１１の相補配列；配列番号１２；配列番号１２の相補配列；配列番号８９；配列番号８９の相補配列；配列番号９１；配列番号９１の相補配列；配列番号１１２；配列番号１１２の相補配列；配列番号１１４；配列番号１１４の相補配列；配列番号１１６；配列番号１１６の相補配列；配列番号１１８；配列番号１１８の相補配列；配列番号１２０；配列番号１２０の相補配列；配列番号１２２；配列番号１２２の相補配列；配列番号１、３、５及び７〜１２のいずれかのすべて又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、３、５及び７〜１２のいずれかのすべて又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号８９または９１のいずれかのすべて又は一部を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号８９または９１のいずれかのすべて又は一部を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１１２，１１４，１１６、１１８，１２０，および１２２のいずれかのすべて又は一部を含有するメリゲテス(Meligethes )生物体（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１１２，１１４，１１６、１１８，１２０，および１２２のいずれかのすべて又は一部を含有するメリゲテス(Meligethes)生物体（例えば、WCR）の天然コードポリヌクレオチドの相補配列。
【００２７】
また、本明細書において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡが、食物をベースとしたアッセイにおいて害虫に提供され得る、又はｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／もしくはｈｐＲＮＡを発現する遺伝子改変植物細胞において害虫に提供され得る方法が開示される。これらの例、及びさらなる例において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡは、害虫に摂取されてもよい。本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡの摂取によってその後、害虫においてＲＮＡｉが生じてもよく、次いで害虫の活性に必須な遺伝子のサイレンシングが生じ、最終的には死がもたらされてもよい。特定の例において、本発明の核酸分子を使用することにより制御される鞘翅目および／又は半翅目害虫は、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、茶色カメムシ（E. servus）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridul）、アオカメムシ（Chinavia hilare）、Ｃ．マルギナツム（C. marginatum）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、Ｄ．フルカツス（Dichelops furcatus）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）、ワタムシ（Horcias nobilellus）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）、及び／又はリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）であってもよい。
【００２８】
前述の、及び他の特性は、添付の図１〜２に関連して進展する以下のいくつかの実施形態の詳細な記述からより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、一対のプライマーと一つの転写鋳型からｄｓＲＮＡを提供するために使用された戦略の描写を含む。
【図２】図２は、二つの転写鋳型からｄｓＲＮＡを提供するために使用された戦略の描写を含む。
【００３０】
配列表
添付の配列表に列記される核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §１．８２２に規定されるヌクレオチド塩基に対する標準的な略号を使用して示されている。列記される核酸配列及びアミノ酸配列は、記載される様式で配置されたヌクレオチド及びアミノ酸のモノマーを有する分子（すなわち、それぞれポリヌクレオチド及びポリペプチド）を定義する。列記される核酸配列及びアミノ酸配列はまた、記載される様式で配置されたヌクレオチド及びアミノ酸のモノマーを含有するポリヌクレオチド又はポリペプチドの遺伝子を各々定義する。遺伝子コードの冗長性の考慮し、コード配列を含むヌクレオチド配列は、その参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド類も記載していると理解されたい。さらに、アミノ酸配列は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドＯＲＦ類も記載していると理解されたい。
【００３１】
各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、提示されている鎖を任意に参照することにより相補鎖も含まれるものと理解される。一次核酸配列の相補配列及び逆相補配列は、当該一次配列により必然的に開示されており、別段の記載が明示されていない限り（又は、当該配列がある文脈から別であることが明らかではないかぎり）、核酸配列の相補配列及び逆相補配列は、当該核酸配列に対する任意の参照により含まれている。さらに、当分野において理解されているように、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されるＤＮＡ配列により決定されるものであり（ウラシル（Ｕ）核酸塩基がチミン（Ｔ）に置き換えられることを除く）、ＲＮＡ配列は、当該配列をコードするＤＮＡ配列に対する任意の参照により含まれる。添付の配列表において：
【００３２】
配列番号１は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−１ＤＮＡを示す：
CGGCCATGTTCGTAGAAGTACCTCCGAGGTGGTGAATAGAATTTGTTGATTTTTCACTAGTTTATGTAAAATTCCGGCCTAAAAATGGCAGGGAATTTGGGAATGGAGCAGCTTATTCCCATAGTGAATAAGTTGCAAGATGCCTTCACACAGCTGGGCGTTCATATGACTCTTGATCTGCCTCAAATCGCTGTGGTGGGCGGACAATCCGCAGGGAAAAGTTCAGTTTTGGAGAATTTCGTCGGAAAAGACTTCCTTCCTAGAGGCTCCGGAATCGTCACAAGAAGACCGCTCATATTGCAACTCATCAATGCCATATCTGAACATGCGGAGTTTTTGCATTGTAAAGGAAAGAAATTTGTTGATTTCAATGAAGTCCGTTTGGAGATTGAAGCAGAAACTGACAGAGTCACCGGAAGCAATAAGGGAATATCAAATATACCCATTAACCTAAGGGTATATTCTCCAAATGTACTAAATCTAACTCTTATCGATTTACCTGGCTTAACAAAGGTTCCGATTGGAGACCAACCGATCGACATCGAACAGCAAATCAGAGGTATGATCATGCAATTCATAAAGAGGGAATCATGCCTCATCTTAGCCGTTACACCTGCCAATACAGATTTGGCAAACTCAGTGCTCTGAAACTGGCCAAAGAGGTAGATCCCCAAGGTATAAGAACTATTGGTGTCATCACCAAGCTGGATCTCATGGACGAAGGTACTGATGCTCGTGATATATTAGAGAATAAACTGTTACCTTTAAGACGAGGGTATATCGGTGTTGTTAATCGATCTCAGAAAGATATAGACGGCCGGAAAGACATAAACGCTGCTTTGAATGCCGAGAAGAAGTTTTTCTTTAGCCATCCATCGTATCGTCACATAGCAGAACGCCTAGGTACTCCCTACCTACAACGAGTTCTCAACCAACAACTCACCAACCACATCAGAGACACCCTACCCAGTTTGAGAGATAAACTACAAAAGCAACTGTTACAATTGGAGAAAGATGTGGACCAGTTCAAACACTTCCGACCTGACGATCCCTCTATCAAGACTAAGGCGATGTTACAGATGATCCAGCAATTGCAAGTGGACTTCGACAGAACTATTGAAGGTTCCGGCTCGGCACAAATCAACACGAACGAACTGTCAGGCGGTGCTAAAATCAACAGGCTATTCCACGAAAGGTTCCCCTTCGAAATTGTCAAGATGGAATTCGATGAGAAGGAGCTCCGCAGGGAGATCGCCTTCGCTATTAGAAACATTCATGGTATTAGGGTTGGTTTGTTTACTCCAGATATGGCTTTTGAGGCTATAGTAAAAAAGCAAATATCTCGGCTGAAGGAACCTTCTTTGAAGTGCGTCGATTTGGTCGTGCAGGAGCTGTCAAACGTTGTTAGGATGTGCAGTGACAGGATGGCCCGCTATCCTCGATTACGAGAAGAAGTAGAACGAATCGTTACTACGCATATTAGGAGCAGAGAGCAAAACTGCAAAGAGCAGTTGTGCCTACTTATCGACTGTGAATTAGCATACATGAATACTAACCACGAAGACTTCATTGGATTTGCAAATGCACAAAGCCAGTCCGAGAGCGCGACAGCCAAAGGCACCAGAGGCACTCTCGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGCTACATGTGTATCCACAATTTGGGTATAATGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAGAGCATCTCCTGGTACAAGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTTTCAATCCGGACGGAAGAAATGTATATAAGGACTACAAACAACTTGAATTGAGCTGTGAAACATTGGACGAGGTCGATTCGTGGAAAGCGTCGTTCCTTCGGGCCGGCGTCTATCCCGAAAAGCAGACGGAAACATTGAACGGCGAAGATGGTGGTGATCAGTCTTCCGGCGAAAGCGTAACCAGCTCTATGGATCCTCAACTGGAACGACAAGTGGAAACCATCAGGAACTTGGTCGACAGCTACATGCGCATCGTCACGAAAACCACCAGAGACTTGGTGCCCAAAACCATCATGTACATGATCATCAACCATACCAAAGACTTCATCAACGGAGAACTGTTGGCCCATATCTACGCCAGCGGGGATCAGTCACAAATGATGGAAGAGGCTCCCGAAGAGGCTCAGAAACGTGAAGAGATGTTACGGATGTACCACGCCTGCAAAGAGGCGTTGAATATCATCGGCGATGTTTCGATGGCTACCGTTTCTACACCGGTTCCTCCACCTGTCAAAAATGACTGGCTGGCCAGTGGGCTGGAGAATCCCAGACTGTCCCCACCTAGTCCCGGAGGACCTCGGAAGACCACACCGCAGATGAGTGCAGTAGGATCCAGCGGTTCGTTGGGTTCTCGAGCTCCTCCTCCGCCACCAAGCAGCGGCAGACCCGCACCGGCGATTCCCAATAGACCTGGAGGTGGAGCCCCTCCGATGCCTCCGGGTAGACCACAAGGACAGGCTCTTCCCGCACCTCTCATTCCGACTCGAGTCGGAGGCCAGCAGGGTCAGGGGGGTATTCAAGTACCCCAGCAAGTGCAGATGGCCGTAGGAAGAGCAGTCACCAATGCCGCTATCAACGAACTATCCAACGCCTTCAAATTCCATAAGTAAATCTTTATTTATTTATTTTTTGTTTGAGTTTATACATTCTCTTTCGTTCTTCTTAGCGCGTCTAGTAGAAAACCAGGTTTTATATAATATAATATTTAAAGCTGGTAAATGAGATATTTTGTAGTTTAGACTGAATATGGGCTTTCTATTGGACCTAAGGAGATCTTACTAACACTAACCTTTCAATGCCAGTATACTAACTGTTCTTTTTGTTGTTAAGATTGTTATTATTACTATTAAAGAAGTAATGTTATCACAGATCAGTACCAGGGGAATTGTAGTAATAAAAGCAAGCGTAATTTACTAATAAACTAAAAATATACACATAATGTAGGTGTATGCGGTAGTATTACGTTGCTCCGTTTTTGTTTGACTTTTTATTGGTCAAAACACGTCTTAAAGTGACTAGGTCGTTTTTCAGACTTACTTGTTACTAAATCAGCTGCTGTACTGTATTTCACGTGACATTTTACCTGCTTTTTGCAATATTGACCTCTGTGGTGTAGTTGTCATATGTCAATTCTGTGATACGATTGGCTCTATGGCAGTTACATCATAGTGCAAATGACAGTTGTGCACGTCAAATGTCAAAACATTTGCGACAAAATTACTCGTTTTTTTAGTCAAACAAAAATTGTTTATTTTTACCGTAAAAATTCGAACAAAAACAAAGCGAGTATGTACAGGCTTAGACGTAAACTACCGTGTACTAGTAAAAAGACAAAACAACACGCATCGTAGTGCTTGTATCTAAATTAATTGAATGTACATATACACAGAGAAAAACAAAACAAAAAAATGCCTTAGAGAAATAAACCATACGACACATTCCAGATTTAGATTAAAGGAAAACTAAAAGTGATAGGTTATTAGTACAGGTATGAATCTATACTTAGGCGGTCTCACGACTTGGAAAACCTTAAGAATCGAGTTTGTATAGAATGTCCCCGTAGGCGTTTGACGCTAGACTAAATAGATAAATTATGTATTAGATAACGTGACAAGACATATTGTAACGCGACAGTTCGTAACCC
【００３３】
配列番号２は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−１ＤＮＡによりコードされるジアブロティカ（Diabrotica）ＳＨＩ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
MDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIDGRKDINAALNAEKKFFFSHPSYRHIAERLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPSLRDKLQKQLLQLEKDVDQFKHFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQVDFDRTIEGSGSAQINTNELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQISRLKEPSLKCVDLVVQELSNVVRMCSDRMARYPRLREEVERIVTTHIRSREQNCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQSQSESATAKGTRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSESISWYKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQSFMSRRHMFAIFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDEVDSWKASFLRAGVYPEKQTETLNGEDSSGESVTSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMRIVTKTTRDLVPKTIMYMIINHTKDFINGELLAHIYASGDQSQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKEALNIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTTPQMSAVGSSGSLGSRAPPPPPSSGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRPVPNVPPRIPDRPHPGRPN
【００３４】
配列番号３は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−２ＤＮＡを示す：
ATCATGCCTCATCTTAGCCGTTACACCTGCCAATACAGATTTGGCAAACTCAGATGCTCTGAAACTGGCCAAAGAGGTAGATCCCCAAGGTATAAGAACTATTGGTGTCATCACCAAGCTGGATCTCATGGACGAAGGTACTGATGCTCGTGATATATTAGAGAATAAACTGTTACCTTTAAGACGAGGGTATATCGGTGTTGTTAATCGATCTCAGAAAGATATAGACGGCCGGAAAGACATAAACGCTGCTTTGAATGCCGAGAAGAAGTTTTTCTTTAGCCATCCATCGTATCGTCACATAGCAGAACGCCTAGGTACTCCCTACCTACAACGAGTTCTCAACCAACAACTCACCAACCACATCAGAGACACCCTACCCAGTTTGAGAGATAAACTACAAAAGCAACTGTTACAATTGGAGAAAGATGTGGACCAGTTCAAACACTTCCGACCTGACGATCCCTCTATCAAGACTAAGGCGATGTTACAGATGATCCAGCAATTGCAAGTGGACTTCGACAGAACTATTGAAGGTTCCGGCTCGGCACAAATCAACACGAACGAACTGTCAGGCGGTGCTAAAATCAACAGGCTATTCCACGAAAGGTTCCCCTTCGAAATTGTCAAGATGGAATTCGATGAGAAGGAGCTCCGCAGGGAGATCGCCTTCGCTATTAGAAACATTCATGGTATTAGGGTTGGTTTGTTTACTCCAGATATGGCTTTTGAGGCTATAGTAAAAAAGCAAATATCTCGGCTGAAGGAACCTTCTTTGAAGTGCGTCGATTTGGTCGTGCAGGAGCTGTCAAACGTTGTTAGGATGTGCAGTGACAGGATGGCCCGCTATCCTCGATTACGAGAAGAAGTAGAACGAATCGTTACTACGCATATTAGGAGCAGAGAGCAAAACTGCAAAGAGCAGTTGTGCCTACTTATCGACTGTGAATTAGCATACATGAATACTAACCACGAAGACTTCATTGGATTTGCAAATGCACAAAGCCAGTCCGAGAGCGCGACAGCCAAAGGCACCAGAGGCACTCTCGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGCTACATGTGTATCCACAATTTGGGTATAATGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAGAGCATCTCCTGGTACAAGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTTTCAATCCGGACGGAAGAAATGTATATAAGGACTACAAACAACTTGAATTGAGCTGTGAAACATTGGACGAGGTCGATTCGTGGAAAGCGTCGTTCCTTCGGGCCGGCGTCTATCCCGAAAAGCAGACGGAAACATTGAACGGCGAAGATTCTTCCGGCGAAAGCGTAACCAGCTCTATGGATCCTCAACTGGAACGACAAGTGGAAACCATCAGGAACTTGGTCGACAGCTACATGCGCATCGTCACGAAAACCACCAGAGACTTGGTGCCCAAAACCATCATGTACATGATCATCAACCATACCAAAGACTTCATCAACGGAGAACTGTTGGCCCATATCTACGCCAGCGGGGATCAGTCACAAATGATGGAAGAGGCTCCCGAAGAGGCTCAGAAACGTGAAGAGATGTTACGGATGTACCACGCCTGCAAAGAGGCGTTGAATATCATCGGCGATGTTTCGATGGCTACCGTTTCTACACCGGTTCCTCCACCTGTCAAAAACGACTGGCTGGCCAGTGGGCTGGAGAATCCCAGACTGTCCCCACCTAGTCCCGGAGGACCTCGGAAGACCACACCGCAGATGAGTGCAGTAGGATCCAGCGGTTCGTTGGGTTCTCGAGCTCCTCCTCCGCCACCAAGCAGCGGCAGACCCGCACCGGCGATTCCCAATAGACCTGGAGGTGGAGCCCCTCCGATGCCTCCGGGTAGACCACAAGGACAGGCTCTTCCCGCACCTCTCATTCCGACTCGACCAGTACCTAACGTTCCGCCCAGAATTCCGGACCGACCTCATCCCGGGAGACCCAATTAGTTAGAAAATGGAGCTCTAGTCAATAATCCTTAAGCCACTCACGCACATACACAAAACATAACAACACTCGCTAGCTAGGGGACCAGAAACGAGGGCGAAGATACGAGAAGAGGTCCGTGGGACCGTACGTATCATTATGTTGTTCTCCAGTGAGAATCAACCTACTGAGAT
【００３５】
配列番号４は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−２ＤＮＡによりコードされるジアブロティカ（ Diabrotica  ）ＳＨＩ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を示す：
MDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIDGRKDINAALNAEKKFFFSHPSYRHIAERLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPSLRDKLQKQLLQLEKDVDQFKHFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQVDFDRTIEGSGSAQINTNELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQISRLKEPSLKCVDLVVQELSNVVRMCSDRMARYPRLREEVERIVTTHIRSREQNCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQSQSESATAKGTRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSESISWYKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQSFMSRRHMFAIFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDEVDSWKASFLRAGVYPEKQTETLNGEDGGDQSSGESVTSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMRIVTKTTRDLVPKTIMYMIINHTKDFINGELLAHIYASGDQSQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKEALNIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTTPQMSAVGSSGSLGSRAPPPPPSSGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRVGGQQGQGGIQVPQQVQMAVGRAVTNAAINELSNAFKFHK
【００３６】
配列番号５は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−３ＤＮＡを示す：
CATTCGAGAGCAAGTCGTCGATCAAGAAGCATCGTTCGCGCGATTCAAATCAAAATCAAAAGTGATAAAAGTGCCTTGAACTTTCAAAAAGTGATAGTGATGGCGGGGAATTCAGGCATGGAACAGCTGATCCCGGTGGTAAACAAACTCCAAGATGCGTTTACTCAACTGGGAGTGCACTTAAGCCTCGATTTACCACAGATCGCGGTGGTGGGGGGACAATCAGCTGGGAAGAGTTCCGTTTTGGAGAATTTTGTAGGAAGAGACTTTTTACCGAGAGGAGCTGGTATTGTTACCAGGCGGCCGTTAATTCTACAACTGATCAACTCAAAATTTGAGTATGGGGAATTTTTGCACAAGAAGGGCAACAAATATAGCGATTTTGATGAGATCAGAAAGGAAATTGAAGCGGAGACAGATCGAGTTACTGGTAGTAACAAGGGCATCTCCACCATACCCATCAATCTCAAAATATATTCACCTCATGTTCTTAACCTGACTCTGATAGATCTGCCGGGTATGACCAAGGTGCCCATAGGAGACCAACCCGTTGACATCGAACAGCAGATAAGGAACATGATTATGCAGTTCATCAATAGAGATTCCTGCCTTATCTTGGCGGTCACGCCAGCAAACACAGATCTGGCCAACTCGGATGCTTTACAGATCGCCAGAGAAGTGGATCCTCAAGGATATCGCACCATAGGTGTCATAACCAAATTAGATATAATGGACGAAGGGACGGATGCTAAGTATATTCTTGAGAACAAACTGTTGCCCTTAAGAAGAGGTTATGTAGGTGTCATAAACCGTTCACAAAGAGATATTGATGGACAAAAGGATATAAAATTAGCGCTGGAAGCTGAAAGAAAATATTTCTTGGGGCATCCGTCCTATACACATATAGCCGACAAATTGGGTACTCCATACCTACAAAAAGTGTTAAACGAGCAACTAACCAATCACATACGAAATACTCTTCCTTCTTTACGAGATAATTTACAGAAACAGGTGATTATTCTGGAAAAGGAGCTTGGCGATTTCAAGAACTTCTCTCCTGATGATCCAAGTATGAAATCAAAGGCTATGCTTCAGATGATCCAGCAGTTCGCTCTAAGTTTCGAAAAAGTTCTCGAAGGCTCCAGATCGGACGATGTGAACACAACTGAGCTGTCGGGAGGCGCTAGAATCAACTGTGTCTTTCACGAAAGATTCCCGTTTGAAGTTGTCAAAATGGAGTTCGACGAAAGCGAGCTGAGAAAGGAAATAGCAATCGCCATTGCGAACATTCATGGAATTAGGATAGGTCTTTTTACGCCTGATTTAGCATTTGATGCCATAGTAAAAAAGCAAATCTCTAGATTGAAAGACCCTTGCTTGAAGTGTGTGGATCTAGTCTCAACCGAGTTGTTGAATGTTGTACACAACTGCTCAGAACAGATGTCGAGGTTTCCGAGATTAAGAGAAATCGTTGAACGAGTTATAACGAATCACGTGAGAAAAAGAGAGCAAGAATGTAGGGATCAACTATCGGTATACATTAACTGCCAACTTTCTTATATGAATACAAATCATGAAGACTTTATAGGATTTGCCAATGCTGAATCACAAGCCAAGAAGACCATACCTACCCACAACAATCATTTAGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGGTACATGACGCTGCATAATCTCAGTATAATTAAGGGTAGGAGCTTCTGGTACGTGTTGTCCTCGGATAGTTTAGCTTGGTACCGAGACGAGACTGAAAAGGAGATCCAGTACATCCTACCCCTCAATAAATTGAAGTTAAGGGATGTTGAGACTGGGTTTATAAATCGGAAACCGACTTTTGCGTTGTTCTACCCGCATGGTTCTAATGTTTATAAGGATTATAAACAGCTAGAACTGAGCTGTAACTCTGTGGACGACATGGATTCCTGGAAAGCTTCTTTTTTGAGAGCGGGTGTCTATCCTCAGAAACTTTTGAATAACAACGAAGAATCTGATGACGAAAGTGTAAGTTTTTTAATAATATTCACTACTACAAGTTATTGCGAAAAAAATACACTCTCTTGCGAGATCTTGCATATTCCGTTATGTCATTTGCGCTTTACAGATCGATATTCAAGAAGATGTAGACCCTCAGCTTAAAAGACAAGTTGAAGTGATAAGGAATCTAGTAGAGAGCTACATGTCTATAGTAACCAAGGCCACCAAAGACTTAGTACCAAAGATTATTACACATATGATCATTAAGAACACCAAAAAGTATGTTTTTGAAGAACTTCTAGTCAGCGTATATGCCCAAGATGACCAGGTTGAATTGTTAGAAGAATCTCCAGAGGAAGTAAGGAAGCGAGAAGAGAAGATGGCGACGTTCCAAGCATGTAGAATGGCTTTGGATATCATAGGAGACTGTTCAATGAAATTTTCCGGTAGCGCTACCAGTACAGAAGAAGAAGCGGTTCATTACAAACCAGCAGTGCCTAACAGGCCCACCGCCACCACCAAAAAAAGTTACAGACTGTCTACGCCCCCTCCAGTGTTCTCCAGGCCCGCCCCACCACCTCCTCCAGGAAAAATGAGAAAATTTATGAGTGAGAAAAACATTTCTGAACAACAGCCTATAGCAAACTCAAATCTTATACCGACCTTTTATGTTCTGTCTATTCCTTAGTAATCCTCAAAGAAACCACGAGGTATTCTACAAGTCAGTCCGATTTTGAGATATGTACATATTTCAAAATTTGCGTAACTATTTCTAAATTGCATTTACTATAGGCATTGCTGCTTTTTGTACATTTGTAGCCTATTGTATATATATCTTCGAATTGTTCTAGTGTTGCTTATTGCTAGAAATATAATAGTTTGAATGTGAACATTATTTATTTCAGATAGGATTGTATATACATGTCTCAGACCACTAGAGCTGACAAAAATAAGGATAAAACAAACAAAAATCACTCTATATTGAGATTAAAATGAAAATTCATGACGAAGGTAGACCAAACGGTTCGATATGTGGACATTTTGTGTTATAAGCCAAGTGACCGTTGACTGAATTTCCTGTTGATAGTTGAAAAGCCTTCAACACGTAGCTCTGCCAGCTGTCACTTGTCATTAAAAAAGGGGTTACAAGCATAGATATATTAACAATAGAACAGGCTAGTTTTAGGCCGCTCAATGCATATATAGGTCGAGGTGTAACGCCAATATCAAGTACATAGGTCTAGCTATCTTTGTCTGTAGTAGAAGTGTGAGCGTA
【００３７】
配列番号６は、例示的なジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−３ＤＮＡによりコードされるジアブロティカ（ Diabrotica  ）ＳＨＩ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す：
MAGNSGMEQLIPVVNKLQDAFTQLGVHLSLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGAGIVTRRPLILQLINSKFEYGEFLHKKGNKYSDFDEIRKEIEAETDRVTGSNKGISTIPINLKIYSPHVLNLTLIDLPGMTKVPIGDQPVDIEQQIRNMIMQFINRDSCLILAVTPANTDLANSDALQIAREVDPQGYRTIGVITKLDIMDEGTDAKYILENKLLPLRRGYVGVINRSQRDIDGQKDIKLALEAERKYFLGHPSYTHIADKLGTPYLQKVLNEQLTNHIRNTLPSLRDNLQKQVIILEKELGDFKNFSPDDPSMKSKAMLQMIQQFALSFEKVLEGSRSDDVNTTELSGGARINCVFHERFPFEVVKMEFDESELRKEIAIAIANIHGIRIGLFTPDLAFDAIVKKQISRLKDPCLKCVDLVSTELLNVVHNCSEQMSRFPRLREIVERVITNHVRKREQECRDQLSVYINCQLSYMNTNHEDFIGFANAESQAKKTIPTHNNHLGNQVIRKGYMTLHNLSIIKGRSFWYVLSSDSLAWYRDETEKEIQYILPLNKLKLRDVETGFINRKPTFALFYPHGSNVYKDYKQLELSCNSVDDMDSWKASFLRAGVYPQKLLNNNEESDDESVSFLIIFTTTSYCEKNTLSCEILHIPLCHLRFTDRYSRRCRPSA
【００３８】
配列番号７は、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１（領域１）とも呼称される、例示的なDiabrotica  shi-1ＤＮＡを示しており、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
GAGCGCGACAGCCAAAGGCACCAGAGGCACTCTCGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGCTACATGTGTATCCACAATTTGGGTATAATGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAGAGCATCTCCTGGTACAAGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTTTCAATCCGGACGGAAGAAATGTATATAAGGACTACAAACAACTTGAATTGAGCTGTGAAACATTGGACGAGGTCGATTCGTGGAAAGCGTCGTTCCTTCGGGCCGGCGTCTATCCCGAAAAGCAGACGGAAACATTGAACGGCGAAG
【００３９】
配列番号８は、さらなる例示的なDiabrotica  ｓｈｉ−１ＤＮＡを示しており、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−１  ｖ１（バージョン１）とも呼称され、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
AGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTTTCAATCCGGACGGAAGAAATGTATATAAGGACTACAAACAACTTGAATTGAGCTGTGAAACATTGGACGAGGTCGATTCGTGGAAAGCGTCGTTCC
【００４０】
配列番号９は、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−２  ｒｅｇ１（領域１）とも呼称される、例示的なDiabrotica  ｓｈｉ−２ＤＮＡを示しており、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
TAGGAGCAGAGAGCAAAACTGCAAAGAGCAGTTGTGCCTACTTATCGACTGTGAATTAGCATACATGAATACTAACCACGAAGACTTCATTGGATTTGCAAATGCACAAAGCCAGTCCGAGAGCGCGACAGCCAAAGGCACCAGAGGCACTCTCGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGCTACATGTGTATCCACAATTTGGGTATAATGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAGAGCATCTCCTGGTACAAGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTT
【００４１】
配列番号１０は、さらなる例示的なDiabrotica  ｓｈｉ−２ＤＮＡを示しており、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−２  ｖ１（バージョン１）とも呼称され、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
CATTGGATTTGCAAATGCACAAAGCCAGTCCGAGAGCGCGACAGCCAAAGGCACCAGAGGCACTCTCGGCAACCAAGTGATCCGAAAGGGCTACATGTGTATCCACAATTTGGGTATAATGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAG
【００４２】
配列番号１１は、さらなる例示的なDiabrotica  ｓｈｉ−２ＤＮＡを示しており、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−２  ｖ２（バージョン２）とも呼称され、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
TGAAAGGTGGTTCGCGAGATTACTGGTTCGTACTCACGTCGGAGAGCATCTCCTGGTACAAGGACGAAGAGGAGAGGGAGAAGAAGTACATGTTGCCTTTGGACGGTCTGAAACTGAGGGATATCGAACAGAGTTTTATGTCGAGAAGGCATATGTTCGCCATTT
【００４３】
配列番号１２は、本明細書の一部の場合においては、ｓｈｉ−３  ｒｅｇ１（領域１）とも呼称される、例示的なWDiabrotica  ｓｈｉ−３ＤＮＡを示しており、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
CTGATAGATCTGCCGGGTATGACCAAGGTGCCCATAGGAGACCAACCCGTTGACATCGAACAGCAGATAAGGAACATGATTATGCAGTTCATCAATAGAGATTCCTGCCTTATCTTGGCGGTCACGCCAGCAAACACAGATCTGGCCAACTCGGATGCTTTACAGATCGCCAGAGAAGTGGATCCTCAAGGATATCGCACCATAGGTGTCATAACCAAATTAGATATAATGGACGAAGGGACGGATGCTAAGTATATTCTTGAGAACAAACTGTTGCCCTTAAGAAGAGGTTATGTAGGTGTCATAAACCGTTCACAAAGAGATATTGATGGACAAAAGGATATAAAATTAGCGCTGGAAGCTGAAAGAAAATATTTCTTGGGGCATCCGTCCTATACACATATAGCCGACAAATTGGGTACTCCATACCTACAAAAAGTGTTAAACGAGCAACTAACCAATCACATACGAAATACTCTTCCTTCTTTACGAG
【００４４】
配列番号１３は、Ｔ７ファージプロモーターのヌクレオチド配列を示している。
【００４５】
配列番号１４は、例示的なＹＦＰ遺伝子を示している。
【００４６】
配列番号１５−２６は、ｄｓＲＮＡ生成に関する一部の実施例において使用される、ｓｈｉ  配列  ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１、ｓｈｉ−１  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｒｅｇ１、ｓｈｉ−２  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｖ２、およびｓｈｉ−３のＰＣＲ増幅用プライマーを示す。
【００４７】
配列番号２７は、センスポリヌクレオチド、イントロン（下線）を含むループ配列、及びアンチセンスポリヌクレオチド（太字）を含有するDiabrotica  ｓｈｉ−１  ｖ１ヘアピン形状ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示す。
2018533356.tif 000003
【００４８】
配列番号２８は、センスポリヌクレオチド、イントロン（下線）を含むループ配列、及びアンチセンスポリヌクレオチド（太字）を含有するDiabrotica  ｓｈｉ−２  ｖ１ヘアピン形状ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示す。
2018533356.tif 000004
【００４９】
配列番号２９は、センスポリヌクレオチド、イントロン（下線）を含むループ配列、及びアンチセンスポリヌクレオチド（太字）を含有するDiabrotica  ｓｈｉ−２  ｖ２ヘアピン形状ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示す。
2018533356.tif 000005
【００５０】
配列番号３０は、センスポリヌクレオチド、イントロン（下線）を含むループ配列、及びアンチセンスポリヌクレオチド（太字）を含有するＹＦＰ  ｖ２ヘアピン形状ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示す。
2018533356.tif 000006
【００５１】
配列番号３１は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含有する例示的なＤＮＡを示す。
【００５２】
配列番号３２は、例示的なＹＦＰ遺伝子を示している。
【００５３】
配列番号３３は、アネキシン領域１のＤＮＡ配列を示している。
【００５４】
配列番号３４は、アネキシン領域２のＤＮＡ配列を示している。
【００５５】
配列番号３５は、ベータ  スペクトリン２領域１のＤＮＡ配列を示している。
【００５６】
配列番号３６は、ベータ  スペクトリン２領域２のＤＮＡ配列を示している。
【００５７】
配列番号３７は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列を示している。
【００５８】
配列番号３８は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列を示している。
【００５９】
配列番号３９〜６６は、ｄｓＲＮＡ合成のために、アネキシン、ベータ  スペクトリン２、ｍｔＲＰ−Ｌ４、及びＹＦＰの遺伝子領域を増幅するために使用されたプライマーを示している。
【００６０】
配列番号６７は、ＴＩＰ４１様タンパク質をコードするトウモロコシＤＮＡ配列を示す。
【００６１】
配列番号６８は、Ｔ２０ＶＮプライマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【００６２】
配列番号６９〜７３は、ｄｓＲＮＡ転写物トウモロコシ発現解析に使用されたプライマーとプローブとを示す。
【００６３】
配列番号７４は、バイナリーベクター主鎖検出に使用されたＳｐｅｃＲコード領域の一部のヌクレオチド配列を示す。
【００６４】
配列番号７５は、ゲノムコピー数解析に使用されたＡＡＤ１コード領域のヌクレオチド配列を示す。
【００６５】
配列番号７６は、トウモロコシのインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００６６】
配列番号７７〜８５は、遺伝子コピー数決定、及びバイナリーベクター主鎖検出に使用されたＤＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
配列番号８６〜８８は、ｄｓＲＮＡ転写物トウモロコシ発現解析に使用されたプライマーとプローブとを示す。
【００６８】
配列番号８９は、例示的な新熱帯茶色カメムシ(Euschistus heros)ＤＮＡ（本明細書の一部においては、ＢＳＢ  ｓｈｉと呼称される）を示す。
AGATACTAAAGTACTTTACATTCATTAATAGATTTAAGCTAGAATAAAGTACTAAAATTCATTATACAATTATAATTTATTATTTCTTATCAATCTTCAAGGCATACAAGATTACTAATTCTTGAAATCATTACATTTATTTGAGGAAACCAACAAATTAATAGGAATGTATTTGTAATATTTACAATTCATTGGTAACTAGATTTAATTAAAATGTACATTGATTCGGTAGTATGTTTTAATATATACATGTAAGTGATGTTAAATATTTACATGGATATAGAGAAGATATCATTGGTTTTAGATTTTTAATTTTACTTAATAATACCATCCATACATTTTCAAATCATTCATTATCGAAGGGTTTTCAGGCAAGCAAGGAATACTTTGGTATACATAAGGCAAGTATGTCAATCTTTATGACATTAAAAATAAATTATCATCATAACTATAAAAAATCTATATTCTAACAGCATCTGGAAACTGTTACTAGCTTATTTGCAAAAATAAGTCAATAGTTTCATCATATAGTCTCTTTAACTCTCATCTAGCATGTGCAATTATACACAAGAAAATAAATATTTCTCAACTTCAAAATTTAACTAATATGATAAGAAATAAGTACCATTAATATTCACCATTTAAAAACACTTCTCTTCAATGACCATATTTGAAAAATGATTTAAGTTTTAGTTATTGTATTAAAATATTCTGTCAAACAACATTCACAACTAATGCAGTTTTCCAAAATACTGGCTGTTCGGCCTTTCAGGAAGTTTAGGTTTAGCCAAGGAAACTGGGCGTTTGAAGCGTGAAGAAAAAGCGTTGGCAAGTTCGTTCACTGCAGCTTGAGTAACCATTTTCCCAACCTCCTGCTGAACTCTTTGAGGGATCTGTATTTGCTGCCCACTACCGCGCGATGGAATAAGAGGAGGTGGCAAAGCACCCTGAGCAGGCCTTCCAGCAGGTGCTCCAGGGCCAGGGCGAGAGGGAATCGCTGGAGCAGGTCTATTAGATGCTGGAAGTGGAGGCGGCGCTCTCGATCCTCCTCCGCTACCTTGGGAAGGTACACCTCGCCGAGGACCTCCTGGCGAAGGTGGAGAAAGCCTCGGATTATCCATGCCTGAAGCCAGCCAATCATTTTTAACAGGAGGAGGAACTGGTGTTGAAACTGTTGCCATGGAAACGTCACCAATTATTCTCAAAGCTTCTTTGCAGGCTTGATACATCCTAAGCATTTCTTCTCTCTTCATGGCTTCCTCTTGACTTTCTTCCATCATAGAGGTCTGATCACCAGACGCGTAAAGATGAGCTAGTAGTTCTCCGTTAATGAACTCTTTCGCCTGATTAATAATTAAGAACATGATTGTCTTTGGTACCAAATCACGTGTTGTTTTTGTAACGATCTTCATGTAGGAATCAACGAGATTTCTGATCGTTTCGACCTGCCTCTCCAACATAGGATCCATAGAAGCAGTACCCTCACTTGCCCCCTCATAACCGTCCTCATCTCCATTAGCGGCATCGGTGGATTTTTCTGGATAGACTCCTGCTCTGAGGAAAGAAGCTTTCCAAGAATCAACGTCATCTTGAGTTTCGCAGCTCAATTCAAGCTGCTTGAAGTCCTTGTAAACATTTCGTCCATCAGGATTAAATAAAGCAAACATATGGCGCCTTGACATGAAGCCTTGTTCAATATCTCTCAGCTTCAGGCCATCAAGAGGTAGCATATATTTTTTCTCTCTTTCCTCCTCATCCTTAAACCAAGAAATGCTTTCTGATGCCAGAACAAACCAATAATCGCGACTTCCACCTTTCATAATACCCAAGTTGTGAATGCACATCCAACCTTTCCTTATAACTTGATTACCAAGTTTACGACCAGCTTTATTAGAGTTTTCTGATTGATTTTGAGCATTGGCAAAACCAATGAAGTCCTCATGATTTGTGTTCATGTAAGCGAGTTCACAATCAACTAACATCGTCAATTGTTTTTTGCACATTTGTTCTTTTTCTCTTACATAGGTGGTAATAATTCTTTCTGTCTCTTCTCGAAGACGAGGATACCTGGCCATCTTGTCAGTACAAATACGAACAACATTACAAAGCTCAGCTACGACCAGGTCCACGCATTTAAGACATGGTTCTTTAAGTCTCTCAATCTGCTTTTTGACGATAGCTTCAAATGCCATATCAGGTGTAAATAAGCCAACTCTTATACCATGAATGTTTCTTATAGCAAAAGCTATTTCCCTTCTTAGTTCCTTTTCGTCAAATTCCATTTTGACTAGTTCAAAAGGAAACCTCTCATGAAATAACCTGTTAATCTTAGCACCACCTGACAACTCCATAGTGTTAATTTGGGCCGAACCACTGCCTTCAATGGTTCTTTCAAAATCCGACTGTAACTGTTGTATCATCTGTAACATTGCTTTTGTTTTGATAGAAGGATCATCAGGTCTAAAATATTTGTACTGTTCAACATCCTTTTCTAAAGCAAGCATTTGTTTCTGCAGTTTATCACGCAATCCTGGAAGCGTGTCTCTGATATGATTGGTAAGTTGTTGATTCAGAACTCTCTGAAGATATGGAGTTCCTAACCTATCTGCCATATGGCGGTAAGCCTGATGACTTAAGAAAAATTTTCTTTCAGCGGCTAAAGCTGCTTTGATATCCTTCCTACCATCAATGTCTTTCTGGCTTCTATTTACTACACCTATATAACCTCTTCGAAGAGGGAGAAGTTTATTTTCAAGAATATCACGAGCATCAGTTCCCTCGTCCATTAAATCTAGTTTAGTAATAACACCTATGGTTCGAACACCTTGAGGATCTACTTCCTTTGCCATTTTGAGAGCATCACTGTTAGCCAAATCTGTATTGGCCGGGGTGATGGCAAGGATAAGGGCGGATTCTCTTTTTATGTACTGCATGATCATACTATGTATTTGATGTTCAATATCTGGAGGCTGGTCCCCTACCGGGACTTTTGTCATTCCAGGCAAGTCTATGAGTGTCAGGTTCAATACATTAGGAGAATAAACCCTCAGATTAATGGGAATATTGGAAATGCCTTTATTTGAACCAGTAACCCTGTCTGTCTCAGCTTCAATTTCTCTGCGTATTTCATCAAAGTCAGTGAACTTTTTCCCCTTACAATGAAGAAACTCTCCATATTCAGTTATACTATTGATAAGCTGAAGTATCAGTGGTCTACGTGTAACTATTCCAGAACCTCTTGGTAAAAAATCCCTTCCAACAAAGTTTTCCAATACAGAACTTTTACCAGCACTTTGTCCTCCAACAACGGCAATTTGAGGTAAATCAAGTTGCATATGCACTCCAAGTTGCGTGAATGCATCTTGGAGTTTATTTACGACGGGGATAAGCTGCTCCAACCCCGGATTCCCTGCCATTTCTATTATCTTACGTCCACCCTAAACTACCACTGTTTCGTGACACAAGCTGGAGGGTGGCAAAACAAAATGGCGAGGGAACCGTTGCTGCGCCATCTAGCTGATCGAAGTGTAGTGGCGTACGATCAAT
【００６９】
配列番号９０は、例示的なＢＳＢ  ｓｈｉＤＮＡによりコードされる新熱帯茶色カメムシ（E. heros）ＳＨＩポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
MAGNPGLEQLIPVVNKLQDAFTQLGVHMQLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSITEYGEFLHCKGKKFTDFDEIRREIEAETDRVTGSNKGISNIPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGMTKVPVGDQPPDIEHQIHSMIMQYIKRESALILAITPANTDLANSDALKMAKEVDPQGVRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIDGRKDIKAALAAERKFFLSHQAYRHMADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQMLALEKDVEQYKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQSDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFELVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIERLKEPCLKCVDLVVAELCNVVRICTDKMARYPRLREETERIITTYVREKEQMCKKQLTMLVDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENSNKAGRKLGNQVIRKGWMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLASESISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDFKQLELSCETQDDVDSWKASFLRAGVYPEKSTDAANGDEDGYEGASEGTASMDPMLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMFLIINQAKEFINGELLAHLYASGDQTSMMEESQEEAMKREEMLRMYQACKEALRIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGMDNPRLSPPSPGGPRRGVPSQGSGGGSRAPPPLPASNRPAPAIPSRPGPGAPAGRPAQGALPPPLIPSRGSGQQIQIPQRVQQEVGKMVTQAAVNELANAFSSRFKRPVSLAKPKLPERPNSQYFGKLH
【００７０】
配列番号９１は、例示的なＢＳＢ  ｓｈｉＤＮＡを示しており、本明細書の一部の場合においては、ＢＳＢ＿ｓｈｉ−１とも呼称され、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
CTCTCAGCTTCAGGCCATCAAGAGGTAGCATATATTTTTTCTCTCTTTCCTCCTCATCCTTAAACCAAGAAATGCTTTCTGATGCCAGAACAAACCAATAATCGCGACTTCCACCTTTCATAATACCCAAGTTGTGAATGCACATCCAACCTTTCCTTATAACTTGATTACCAAGTTTACGACCAGCTTTATTAGAGTTTTCTGATTGATTTTGAGCATTGGCAAAACCAATGAAGTCCTCATGATTTGTGTTCATGTAAGCGAGTTCACAATCAACTAACATCGTCAATTGTTTTTTGCACATTTGTTCTTTTTCTCTTACATAGGTGGTAATAATTCTTTCTGTCTCTTCTCGAAGACGAGGATACCTGGCCATCTTGTCAGTACAAATACGAACAACATTACAAAGCTCAGCTACGACCAGGTCCACGCATTTAAGACATGGTTCTTTAAGTCTCTCAATCTGCTTTTTGACGATAGCTTC
【００７１】
配列番号９２及び９３は、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されているｓｈｉ配列ＢＳＢ＿ｓｈｉ−１のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーを示している。
【００７２】
配列番号９４は、例示的なＹＦＰｖ２  ＤＮＡを示しており、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されている。
【００７３】
配列番号９５及び９６は、ｄｓＲＮＡの産生に関する一部の例において使用されているＹＦＰ配列ＹＦＰｖ２のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーを示している。
【００７４】
配列番号９７は、センスポリヌクレオチド、イントロン（下線）を含むループ配列、及びアンチセンスポリヌクレオチド（太字）を含有するＹＦＰ  ｖ２−１ヘアピン形状ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示す。
2018533356.tif 000007
【００７５】
配列番号９８〜１１１は、例示的なｓｈｉポリヌクレオチド及びその断片を含有する核酸から転写された例示的なＲＮＡを示す。
【００７６】
配列番号１１２は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉを含有するＤＮＡコンティグ配列を示す。
actcagttattattcagccatgttcgttggtatacattcgtagaactgtaaactttaattgttgtttttaaggcagatttataaagtctcggcctaaaaatgtcagggaacgtggggatggaacaacttattcccattgtaaataaattgcaggatgcctttacgcaactgggggtgcatttgacattggatttaccacaaattgcagtagtgggcggacaatccgctggaaaaagctcagttttggaaaacttcgttggcagagacttccttcctagaggatctggcattgtaactcgtaggccacttatcttacagctgattaattcacctactgaacatgctgagtttttgcactgcaaaggaaaaaagtttgtggattttgatgaagtcaggagggagatcgaaggtgaaactgatagagtcacaggaagtaataaaggcatttccaatgtgccaattaacctgagagtgtattcgccaaatgtactgaatttgacattaattgatttacctggtctaacgaaggtgccaatcggcgaccagcctatagacattgaggctcaaataaaagctatgattatgcagtttattaaacgagaatcctgccttattttggcagtaactcctgcaaactcagatttagccaattctgatgctttaaaattggccaaagaagttgatcctcagggtattcgtaccattggtgtaataactaagttggatttgatggatgaaggtacagatgcacgggatatattagaaaataaattattgcctttaagaaggggttacattggtgttgtaaaccgttctcaaaaagatattgaaggaaaaaaagacataaatgctgccctagctgctgaacgaaaattttttattagccatacttcctatcgacacttagcagacagattgggaacaccttatctacagagagtattaaaccagcaacttaccaaccatatcagggacacgttgccaggcttgagggacaaattacaaaagcaactattaacactggagaaggatgttgaacaatttaaatattttagaccagatgatccctctataaaaacgaaagcaatgttgcaaatgattcaacagctgcaaaccgatttcgaaagaaccatcgaaggttccggttctgcgcagattaacacgatggaattatctggtggtgccaaaattaacaggttgttccatgaacgtttcccatttgaaattgttaaaatggaatttgatgaaaaagaattacgcagagaaatcgcatttgctattcgaaatatacatggtattagggttggtttgtttactcccgatatggcatttgaagccatcgtgaaaaagcaaatatttaggcttaaggaaccctccttaaaatgtgtagacctggttgtgaatgaattatccaacgtggtccgtttctgtacagacaagatgaatagatatccaaggttaagggaagaagctgaacgaatcattaccactcacatccgccaaagggaacagtactgtaaagagcagttatgtttgctgattgattgtgaattggcatatatgaatacgaatcatgaagattttatcggatttgccaacgctcaaaatcagtcagaaaacgcaatgaaaacgagctcacgaggcactttgggtaatcaggtgattcgaaaaggttacatgtgcattcataatttgggcataatgaaagggggctccagagattattggtttgttctaacctcagaaaacatatcttggttcaaagatgaagaagagcgcgaaaagaaatacatgttaccgctggacggtctcaagttaagggatattgaacaaggatttatgtcaagaaggcatatgtttgcgctttttaatccagatggaagaaatgtatataaggattataaacaacttgaattaagttgtgagacattagatgatgtggactcctggaaagcttcatttttaagggccggggtatatccagaaaagcaaacagaacaacttaatggagaagagagcagcggagaaaaccaaaacagctcaatggatccacaattggaaaggcaagtggaaactatcagaaacttagtggacagctacatgaaaatcgttacgaaaacgaccagagacttagtgcccaaaacaattatgatgatgattattaatcatactaaggagttcatcaatggagaactattagcacacatttatgccagtggcgaccaggctcaaatgatggaagaagcaccagaggaggctcaaaagcgagaagaaatgttaagaatgtaccatgcttgcaaagagtcccttcacattattggcgacgtatcaatggccacagtttctactccggtacctccgccagtcaaaaatgattggttggcaagcggcttggaaaacccgagattgtccccaccaagccccggaggtccgagaaaaacagctccaaatatgggaaccgtgggatctagcggttcgttgggctcccgagcgcctccgctaccgcccgctacaggtagaccggctcccgcaattccaaatagacctggaggcggcgcgccacccatgccgcccggtagaccccaaggacaagccctgcccgccccgctaattcccacgaggcgttagggatatcctatacaccatcattactataaaatactagttcactaatattacctaaacctacttgtttgaaagaaaaggtagagtctgatttttgttttaatattttgtttttaattaattcaatattttaggaatgtaataatttttaaaaatcactttctaccctgtttcaagtcaagttgaatgttaaaaattattgacatgcttgattttatctaataaataaataaattgtatagaacattgcacattccaatagaatatttattattctcttaaatccttaaaaac
【００７７】
配列番号１１３は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のＳＨＩタンパク質のアミノ酸配列を示す。
MSGNVGMEQLIPIVNKLQDAFTQLGVHLTLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSPTEHAEFLHCKGKKFVDFDEVRREIEGETDRVTGSNKGISNVPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGLTKVPIGDQPIDIEAQIKAMIMQFIKRESCLILAVTPANSDLANSDALKLAKEVDPQGIRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIEGKKDINAALAAERKFFISHTSYRHLADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQLLTLEKDVEQFKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQTDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIFRLKEPSLKCVDLVVNELSNVVRFCTDKMNRYPRLREEAERIITTHIRQREQYCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENAMKTSSRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSENISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDDVDSWKASFLRAGVYPEKQTEQLNGEESSGENQNSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMMMIINHTKEFINGELLAHIYASGDQAQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKESLHIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTAPNMGTVGSSGSLGSRAPPLPPATGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRR
【００７８】
配列番号１１４は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉを含有するＤＮＡ配列を示す。
actcagttattattcagccatgttcgttggtatacattcgtagaactgtaaactttaattgttgtttttaaggcagatttataaagtctcggcctaaaaatgtcagggaacgtggggatggaacaacttattcccattgtaaataaattgcaggatgcctttacgcaactgggggtgcatttgacattggatttaccacaaattgcagtagtgggcggacaatccgctggaaaaagctcagttttggaaaacttcgttggcagagacttccttcctagaggatctggcattgtaactcgtaggccacttatcttacagctgattaattcacctactgaacatgctgagtttttgcactgcaaaggaaaaaagtttgtggattttgatgaagtcaggagggagatcgaaggtgaaactgatagagtcacaggaagtaataaaggcatttccaatgtgccaattaacctgagagtgtattcgccaaatgtactgaatttgacattaattgatttacctggtctaacgaaggtgccaatcggcgaccagcctatagacattgaggctcaaataaaagctatgattatgcagtttattaaacgagaatcctgccttattttggcagtaactcctgcaaactcagatttagccaattctgatgctttaaaattggccaaagaagttgatcctcagggtattcgtaccattggtgtaataactaagttggatttgatggatgaaggtacagatgcacgggatatattagaaaataaattattgcctttaagaaggggttacattggtgttgtaaaccgttctcaaaaagatattgaaggaaaaaaagacataaatgctgccctagctgctgaacgaaaattttttattagccatacttcctatcgacacttagcagacagattgggaacaccttatctacagagagtattaaaccagcaacttaccaaccatatcagggacacgttgccaggcttgagggacaaattacaaaagcaactattaacactggagaaggatgttgaacaatttaaatattttagaccagatgatccctctataaaaacgaaagcaatgttgcaaatgattcaacagctgcaaaccgatttcgaaagaaccatcgaaggttccggttctgcgcagattaacacgatggaattatctggtggtgccaaaattaacaggttgttccatgaacgtttcccatttgaaattgttaaaatggaatttgatgaaaaagaattacgcagagaaatcgcatttgctattcgaaatatacatggtattagggttggtttgtttactcccgatatggcatttgaagccatcgtgaaaaagcaaatatttaggcttaaggaaccctccttaaaatgtgtagacctggttgtgaatgaattatccaacgtggtccgtttctgtacagacaagatgaatagatatccaaggttaagggaagaagctgaacgaatcattaccactcacatccgccaaagggaacagtactgtaaagagcagttatgtttgctgattgattgtgaattggcatatatgaatacgaatcatgaagattttatcggatttgccaacgctcaaaatcagtcagaaaacgcaatgaaaacgagctcacgaggcactttgggtaatcaggtgattcgaaaaggttacatgtgcattcataatttgggcataatgaaagggggctccagagattattggtttgttctaacctcagaaaacatatcttggttcaaagatgaagaagagcgcgaaaagaaatacatgttaccgctggacggtctcaagttaagggatattgaacaaggatttatgtcaagaaggcatatgtttgcgctttttaatccagatggaagaaatgtatataaggattataaacaacttgaattaagttgtgagacattagatgatgtggactcctggaaagcttcatttttaagggccggggtatatccagaaaagcaaacagaacaacttaatggagaagagagcagcggagaaaaccaaaacagctcaatggatccacaattggaaaggcaagtggaaactatcagaaacttagtggacagctacatgaaaatcgttacgaaaacgaccagagacttagtgcccaaaacaattatgatgatgattattaatcatactaaggagttcatcaatggagaactattagcacacatttatgccagtggcgaccaggctcaaatgatggaagaagcaccagaggaggctcaaaagcgagaagaaatgttaagaatgtaccatgcttgcaaagagtcccttcacattattggcgacgtatcaatggccacagtttctactccggtacctccgccagtcaaaaatgattggttggcaagcggcttggaaaacccgagattgtccccaccaagccccggaggtccgagaaaaacagctccaaatatgggaaccgtgggatctagcggttcgttgggctcccgagcgcctccgctaccgcccgctacaggtagaccggctcccgcaattccaaatagacctggaggcggcgcgccacccatgccgcccggtagaccccaaggacaagccctgcccgccccgctaattcccacgaggcgttagggatatcctatacaccatcattactataaaatactagttcactaatattacctaaacctacttgtttgaaagaaaaggtagagtctgatttttgttttaatattttgtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt
【００７９】
配列番号１１５は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のＳＨＩタンパク質のアミノ酸配列を示す。
MSGNVGMEQLIPIVNKLQDAFTQLGVHLTLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSPTEHAEFLHCKGKKFVDFDEVRREIEGETDRVTGSNKGISNVPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGLTKVPIGDQPIDIEAQIKAMIMQFIKRESCLILAVTPANSDLANSDALKLAKEVDPQGIRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIEGKKDINAALAAERKFFISHTSYRHLADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQLLTLEKDVEQFKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQTDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIFRLKEPSLKCVDLVVNELSNVVRFCTDKMNRYPRLREEAERIITTHIRQREQYCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENAMKTSSRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSENISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDDVDSWKASFLRAGVYPEKQTEQLNGEESSGENQNSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMMMIINHTKEFINGELLAHIYASGDQAQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKESLHIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTAPNMGTVGSSGSLGSRAPPLPPATGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRR
【００８０】
配列番号１１６は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉを含有するＤＮＡ配列を示す。
actcagttattattcagccatgttcgttggtatacattcgtagaactgtaaactttaattgttgtttttaaggcagatttataaagtctcggcctaaaaatgtcagggaacgtggggatggaacaacttattcccattgtaaataaattgcaggatgcctttacgcaactgggggtgcatttgacattggatttaccacaaattgcagtagtgggcggacaatccgctggaaaaagctcagttttggaaaacttcgttggcagagacttccttcctagaggatctggcattgtaactcgtaggccacttatcttacagctgattaattcacctactgaacatgctgagtttttgcactgcaaaggaaaaaagtttgtggattttgatgaagtcaggagggagatcgaaggtgaaactgatagagtcacaggaagtaataaaggcatttccaatgtgccaattaacctgagagtgtattcgccaaatgtactgaatttgacattaattgatttacctggtctaacgaaggtgccaatcggcgaccagcctatagacattgaggctcaaataaaagctatgattatgcagtttattaaacgagaatcctgccttattttggcagtaactcctgcaaactcagatttagccaattctgatgctttaaaattggccaaagaagttgatcctcagggtattcgtaccattggtgtaataactaagttggatttgatggatgaaggtacagatgcacgggatatattagaaaataaattattgcctttaagaaggggttacattggtgttgtaaaccgttctcaaaaagatattgaaggaaaaaaagacataaatgctgccctagctgctgaacgaaaattttttattagccatacttcctatcgacacttagcagacagattgggaacaccttatctacagagagtattaaaccagcaacttaccaaccatatcagggacacgttgccaggcttgagggacaaattacaaaagcaactattaacactggagaaggatgttgaacaatttaaatattttagaccagatgatccctctataaaaacgaaagcaatgttgcaaatgattcaacagctgcaaaccgatttcgaaagaaccatcgaaggttccggttctgcgcagattaacacgatggaattatctggtggtgccaaaattaacaggttgttccatgaacgtttcccatttgaaattgttaaaatggaatttgatgaaaaagaattacgcagagaaatcgcatttgctattcgaaatatacatggtattagggttggtttgtttactcccgatatggcatttgaagccatcgtgaaaaagcaaatatttaggcttaaggaaccctccttaaaatgtgtagacctggttgtgaatgaattatccaacgtggtccgtttctgtacagacaagatgaatagatatccaaggttaagggaagaagctgaacgaatcattaccactcacatccgccaaagggaacagtactgtaaagagcagttatgtttgctgattgattgtgaattggcatatatgaatacgaatcatgaagattttatcggatttgccaacgctcaaaatcagtcagaaaacgcaatgaaaacgagctcacgaggcactttgggtaatcaggtgattcgaaaaggttacatgtgcattcataatttgggcataatgaaagggggctccagagattattggtttgttctaacctcagaaaacatatcttggttcaaagatgaagaagagcgcgaaaagaaatacatgttaccgctggacggtctcaagttaagggatattgaacaaggatttatgtcaagaaggcatatgtttgcgctttttaatccagatggaagaaatgtatataaggattataaacaacttgaattaagttgtgagacattagatgatgtggactcctggaaagcttcatttttaagggccggggtatatccagaaaagcaaacagaacaacttaatggagaagagagcagcggagaaaaccaaaacagctcaatggatccacaattggaaaggcaagtggaaactatcagaaacttagtggacagctacatgaaaatcgttacgaaaacgaccagagacttagtgcccaaaacaattatgatgatgattattaatcatactaaggagttcatcaatggagaactattagcacacatttatgccagtggcgaccaggctcaaatgatggaagaagcaccagaggaggctcaaaagcgagaagaaatgttaagaatgtaccatgcttgcaaagagtcccttcacattattggcgacgtatcaatggccacagtttctactccggtacctccgccagtcaaaaatgattggttggcaagcggcttggaaaacccgagattgtccccaccaagccccggaggtccgagaaaaacagctccaaatatgggaaccgtgggatctagcggttcgttgggctcccgagcgcctccgctaccgcccgctacaggtagaccggctcccgcaattccaaatagacctggaggcggcgcgccacccatgccgcccggtagaccccaaggacaagccctgcccgccccgctaattcccactcgagtggccggtcaggcgggaggcgtccaaataccccagcaagttcagatggccgtcggcaaggctgtaaccaacgctgcaatcaacgaactttccaatgccttcaagttccacaatcgtccagttccgaatattccacctaggataccagaaagaccaggacagcaacattaaaagtactagtcaaaattttttttgggaccaaccaataaggtgcaacttactcagtgaaatagatattttagctagcaatacagcagaatataactattttatttgatatgaactgtatacatgtattatgtttgaaattatttaaagtaaattttgatgtatagattttaggatattagaaaatatccaaaattgaaaagtgaatctgtgattgtgttaatataactgtattaaaaaaaattcacatttttg
【００８１】
配列番号１１７は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のＳＨＩタンパク質のアミノ酸配列を示す。
MSGNVGMEQLIPIVNKLQDAFTQLGVHLTLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSPTEHAEFLHCKGKKFVDFDEVRREIEGETDRVTGSNKGISNVPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGLTKVPIGDQPIDIEAQIKAMIMQFIKRESCLILAVTPANSDLANSDALKLAKEVDPQGIRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIEGKKDINAALAAERKFFISHTSYRHLADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQLLTLEKDVEQFKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQTDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIFRLKEPSLKCVDLVVNELSNVVRFCTDKMNRYPRLREEAERIITTHIRQREQYCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENAMKTSSRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSENISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDDVDSWKASFLRAGVYPEKQTEQLNGEESSGENQNSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMMMIINHTKEFINGELLAHIYASGDQAQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKESLHIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTAPNMGTVGSSGSLGSRAPPLPPATGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRVAGQAGGVQIPQQVQMAVGKAVTNAAINELSNAFKFHNRPVPNIPPRIPERPGQQH
【００８２】
配列番号１１８は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉを含有するＤＮＡ配列を示す。
actcagttattattcagccatgttcgttggtatacattcgtagaactgtaaactttaattgttgtttttaaggcagatttataaagtctcggcctaaaaatgtcagggaacgtggggatggaacaacttattcccattgtaaataaattgcaggatgcctttacgcaactgggggtgcatttgacattggatttaccacaaattgcagtagtgggcggacaatccgctggaaaaagctcagttttggaaaacttcgttggcagagacttccttcctagaggatctggcattgtaactcgtaggccacttatcttacagctgattaattcacctactgaacatgctgagtttttgcactgcaaaggaaaaaagtttgtggattttgatgaagtcaggagggagatcgaaggtgaaactgatagagtcacaggaagtaataaaggcatttccaatgtgccaattaacctgagagtgtattcgccaaatgtactgaatttgacattaattgatttacctggtctaacgaaggtgccaatcggcgaccagcctatagacattgaggctcaaataaaagctatgattatgcagtttattaaacgagaatcctgccttattttggcagtaactcctgcaaactcagatttagccaattctgatgctttaaaattggccaaagaagttgatcctcagggtattcgtaccattggtgtaataactaagttggatttgatggatgaaggtacagatgcacgggatatattagaaaataaattattgcctttaagaaggggttacattggtgttgtaaaccgttctcaaaaagatattgaaggaaaaaaagacataaatgctgccctagctgctgaacgaaaattttttattagccatacttcctatcgacacttagcagacagattgggaacaccttatctacagagagtattaaaccagcaacttaccaaccatatcagggacacgttgccaggcttgagggacaaattacaaaagcaactattaacactggagaaggatgttgaacaatttaaatattttagaccagatgatccctctataaaaacgaaagcaatgttgcaaatgattcaacagctgcaaaccgatttcgaaagaaccatcgaaggttccggttctgcgcagattaacacgatggaattatctggtggtgccaaaattaacaggttgttccatgaacgtttcccatttgaaattgttaaaatggaatttgatgaaaaagaattacgcagagaaatcgcatttgctattcgaaatatacatggtattagggttggtttgtttactcccgatatggcatttgaagccatcgtgaaaaagcaaatatttaggcttaaggaaccctccttaaaatgtgtagacctggttgtgaatgaattatccaacgtggtccgtttctgtacagacaagatgaatagatatccaaggttaagggaagaagctgaacgaatcattaccactcacatccgccaaagggaacagtactgtaaagagcagttatgtttgctgattgattgtgaattggcatatatgaatacgaatcatgaagattttatcggatttgccaacgctcaaaatcagtcagaaaacgcaatgaaaacgagctcacgaggcactttgggtaatcaggtgattcgaaaaggttacatgtgcattcataatttgggcataatgaaagggggctccagagattattggtttgttctaacctcagaaaacatatcttggttcaaagatgaagaagagcgcgaaaagaaatacatgttaccgctggacggtctcaagttaagggatattgaacaaggatttatgtcaagaaggcatatgtttgcgctttttaatccagatggaagaaatgtatataaggattataaacaacttgaattaagttgtgagacattagatgatgtggactcctggaaagcttcatttttaagggccggggtatatccagaaaagcaaacagaacaacttaatggagaagagagcagcggagaaaaccaaaacagctcaatggatccacaattggaaaggcaagtggaaactatcagaaacttagtggacagctacatgaaaatcgttacgaaaacgaccagagacttagtgcccaaaacaattatgatgatgattattaatcatactaaggagttcatcaatggagaactattagcacacatttatgccagtggcgaccaggctcaaatgatggaagaagcaccagaggaggctcaaaagcgagaagaaatgttaagaatgtaccatgcttgcaaagagtcccttcacattattggcgacgtatcaatggccacagtttctactccggtacctccgccagtcaaaaatgattggttggcaagcggcttggaaaacccgagattgtccccaccaagccccggaggtccgagaaaaacagctccaaatatgggaaccgtgggatctagcggttcgttgggctcccgagcgcctccgctaccgcccgctacaggtagaccggctcccgcaattccaaatagacctggaggcggcgcgccacccatgccgcccggtagaccccaaggacaagccctgcccgccccgctaattcccactcgagtggccggtcaggcgggaggcgtccaaataccccagcaagttcagatggccgtcggcaaggctgtaaccaacgctgcaatcaacgaactttccaatgccttcaagttccacaagtaaattttatttaatttattttaaaccataacaaactttgtttgcttactaatcaagttttacccccaatggacaggttatatttttttgaaacttggtaccattcctaaagagtaataacttatatattacattaatatgttctactctaggagcgtcaccgttttagttgtttgatgtttatagatgcaataaatttgtatattatacgcaaatcttaatcacattccttaaagagttttttatttaaatttgccaggattttttaagaaactagaagtaaaaactttacgatttacgataatataaaaatattgcaaataaaatagaaatcgtaaaaattcgctattaaatgcttaaaaagatcctttgttaaatacagtcgtaaacataatataaggtttgttccacgatataactttgtcctatcgagcatttggacgtcagggatatgcgcattaccaaaatcgcatgcgcagtacgaaaatatggttgcgatttttcgattgcgcatgttcctgtcgtccttttgacgtcttttatgtatgcatttaacattccaaatgctcagtaggaagaagcctattactaaatttgcatcaaagatttgttgtcttatcactaattattagtgatgagacaacgaatttttcaacatttttatagcgaattttttatgttttatgggttttcgagtgtatatcgtttctttttcgtatttttttacttgacgtttcttaaagaatgaagaaagcatggtataaggaagacaaagtatgttcttgggcgggtgtcagatataagtagcgcccgctcttgtatccatatttccatatgtctcgccgtatttgtattaataatcacctcagaaaaatcttccaaaaagctgctggtatttaattgttacagatcgtacaatgtaagtatggcggcaagttttgaaaacaagcacgtcggaagaatatgctttgtcttatttgtaccatgtaaaaaagactggataaaatctcaacaaatttaaaataacattttctaattaaaaaaccttttaataactaaatatctggttaaagctctattcgctgcgtctctattatttatatatccttttatctaaagaataaaatttatatccattatagcatattttattcagagatcaagtattttctttacctacccatatcaatgtacttattgaaaaaatagcacttggctttttacgattttaaacttattttttagattttaaatataattcggcatcaaaaaagtttatttaaatgaaaatcacgatgtccataaattaaccttgcaaaacaatattgttttaatttaaaaaaagtaatttgtggatgattaaaaatgtttataaaaatacataccgcatccataggtcattagtttaaaaactaaataaataagcctgattttattgcacatttttattaagcctttgtaagtgtactattttgcagtttataataacacacataactagatcttccttgtagaataccaacgtaacgtgtatctaaatatctcattttaatgtcaaataaacgcatatggtagtgaatctggttgaggactaaatgaaaaatttaggccacatcatcaagtttaataagaaaatattgaccctacataattttgtacttgtacaaattttcgcggaggcggtttttgctgtccaataaaagttataatatattttaatttaaagaatacaaagttcggtggggtctcgtagcaaaataaataaaatcacgacaaaaaacaaaaatatattttgggcttggacggtgcgtcgggctttgcctattacaagtacacttaattatctagatactacacatagataagcctttctagcataaattaaagctaaaccttatttgcatatcatctaaatataaattagatctagatattgtcgatttaaaaatgttaccgtaatgatgtgtgtagaataagcaaggtataaaagacattgtagcgtttattgtatttgaaataaccgtcaattattaaaagtttataatgtctggttttaacaggatacctaaattttaactatttataattaaatgttaattttgtataaataatttggtgctctctacaaagattacttttgggattaaaaaatgcatttgaaaacattattttgatctatttgttatgcactgatttgtataagttatctttttccatataagtacatataactatctaaaaagtaaagtttgtatagaaaatctcaaataataatgaaacaatcaggttaatatggaatacttacatagttgtagattttgaagtataagtcaatccaataataatacgtttagattccaaaatttgcacaaatggtattttaaaaattattgctaatgttatttattcattattttaaaagctaacatgttaaatttgatttagcttcatatcctataaactaataatacaggctaagtatgaggtattatgttccacgtcgggtaccactttaacatttggatggttgaggttgtgtatctgtcagttaaacgcttatttcgtttatttttgaaaatagtacattcaggccaattcactagcatgagtcgttaacgttaaccactagaatcagtgtttatcgggcaatccggcaaatcgggccgtttaatatgatttgactggttctggtggct
【００８３】
配列番号１１９は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のＳＨＩタンパク質のアミノ酸配列を示す。
MSGNVGMEQLIPIVNKLQDAFTQLGVHLTLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSPTEHAEFLHCKGKKFVDFDEVRREIEGETDRVTGSNKGISNVPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGLTKVPIGDQPIDIEAQIKAMIMQFIKRESCLILAVTPANSDLANSDALKLAKEVDPQGIRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIEGKKDINAALAAERKFFISHTSYRHLADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQLLTLEKDVEQFKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQTDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIFRLKEPSLKCVDLVVNELSNVVRFCTDKMNRYPRLREEAERIITTHIRQREQYCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENAMKTSSRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSENISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDDVDSWKASFLRAGVYPEKQTEQLNGEESSGENQNSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMMMIINHTKEFINGELLAHIYASGDQAQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKESLHIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTAPNMGTVGSSGSLGSRAPPLPPATGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRVAGQAGGVQIPQQVQMAVGKAVTNAAINELSNAFKFHK
【００８４】
配列番号１２０は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉを含有するＤＮＡ配列を示す。
GTGGGGATGGAACAACTTATTCCCAAGGTTATTATTCAGCCATGTTCGTTGGTATACATTCGTAGAACTGTAAACTTTAATTGTTGTTTTTAAGGCAGATTTATAAAGTCTCGGCCTAAAAATGTCAGGGAACGTGGGGATGGAACAACTTATTCCCATTGTAAATAAATTGCAGGATGCCTTTACGCAACTGGGGGTGCATTTGACATTGGATTTACCACAAATTGCAGTAGTGGGCGGACAATCCGCTGGAAAAAGCTCAGTTTTGGAAAACTTCGTTGGCAGAGACTTCCTTCCTAGAGGATCTGGCATTGTAACTCGTAGGCCACTTATCTTACAGCTGATTAATTCACCTACTGAACATGCTGAGTTTTTGCACTGCAAAGGAAAAAAGTTTGTGGATTTTGATGAAGTCAGGAGGGAGATCGAAGGTGAAACTGATAGAGTCACAGGAAGTAATAAAGGCATTTCCAATGTGCCAATTAACCTGAGAGTGTATTCGCCAAATGTACTGAATTTGACATTAATTGATTTACCTGGTCTAACGAAGGTGCCAATCGGCGACCAGCCTATAGACATTGAGGCTCAAATAAAAGCTATGATTATGCAGTTTATTAAACGAGAATCCTGCCTTATTTTGGCAGTAACTCCTGCAAACTCAGATTTAGCCAATTCTGATGCTTTAAAATTGGCCAAAGAAGTTGATCCTCAGGGTATTCGTACCATTGGTGTAATAACTAAGTTGGATTTGATGGATGAAGGTACAGATGCACGGGATATATTAGAAAATAAATTATTGCCTTTAAGAAGGGGTTACATTGGTGTTGTAAACCGTTCTCAAAAAGATATTGAAGGAAAAAAAGACATAAATGCTGCCCTAGCTGCTGAACGAAAATTTTTTATTAGCCATACTTCCTATCGACACTTAGCAGACAGATTGGGAACACCTTATCTACAGAGAGTATTAAACCAGCAACTTACCAACCATATCAGGGACACGTTGCCAGGCTTGAGGGACAAATTACAAAAGCAACTATTAACACTGGAGAAGGATGTTGAACAATTTAAATATTTTAGACCAGATGATCCCTCTATAAAAACGAAAGCAATGTTGCAAATGATTCAACAGCTGCAAACCGATTTCGAAAGAACCATCGAAGGTTCCGGTTCTGCGCAGATTAACACGATGGAATTATCTGGTGGTGCCAAAATTAACAGGTTGTTCCATGAACGTTTCCCATTTGAAATTGTTAAAATGGAATTTGATGAAAAAGAATTACGCAGAGAAATCGCATTTGCTATTCGAAATATACATGGTATTAGGGTTGGTTTGTTTACTCCCGATATGGCATTTGAAGCCATCGTGAAAAAGCAAATATTTAGGCTTAAGGAACCCTCCTTAAAATGTGTAGACCTGGTTGTGAATGAATTATCCAACGTGGTCCGTTTCTGTACAGACAAGATGAATAGATATCCAAGGTTAAGGGAAGAAGCTGAACGAATCATTACCACTCACATCCGCCAAAGGGAACAGTACTGTAAAGAGCAGTTATGTTTGCTGATTGATTGTGAATTGGCATATATGAATACGAATCATGAAGATTTTATCGGATTTGCCAACGCTCAAAATCAGTCAGAAAACGCAATGAAAACGAGCTCACGAGGCACTTTGGGTAATCAGGTGATTCGAAAAGGTTACATGTGCATTCATAATTTGGGCATAATGAAAGGGGGCTCCAGAGATTATTGGTTTGTTCTAACCTCAGAAAACATATCTTGGTTCAAAGATGAAGAAGAGCGCGAAAAGAAATACATGTTACCGCTGGACGGTCTCAAGTTAAGGGATATTGAACAAGGATTTATGTCAAGAAGGCATATGTTTGCGCTTTTTAATCCAGATGGAAGAAATGTATATAAGGATTATAAACAACTTGAATTAAGTTGTGAGACATTAGATGATGTGGACTCCTGGAAAGCTTCATTTTTAAGGGCCGGGGTATATCCAGAAAAGCAAACAGAACAACTTAATGGAGAAGAGAGCAGCGGAGAAAACCAAAACAGCTCAATGGATCCACAATTGGAAAGGCAAGTGGAAACTATCAGAAACTTAGTGGACAGCTACATGAAAATCGTTACGAAAACGACCAGAGACTTAGTGCCCAAAACAATTATGATGATGATTATTAATCATACTAAGGAGTTCATCAATGGAGAACTATTAGCACACATTTATGCCAGTGGCGACCAGGCTCAAATGATGGAAGAAGCACCAGAGGAGGCTCAAAAGCGAGAAGAAATGTTAAGAATGTACCATGCTTGCAAAGAGTCCCTTCACATTATTGGCGACGTATCAATGGCCACAGTTTCTACTCCGGTACCTCCGCCAGTCAAAAATGATTGGTTGGCAAGCGGCTTGGAAAACCCGAGATTGTCCCCACCAAGCCCCGGAGGTCCGAGAAAAACAGCTCCAAATATGGGAACCGTGGGATCTAGCGGTTCGTTGGGCTCCCGAGCGCCTCCGCTACCGCCCGCTACAGGTAGACCGGCTCCCGCAATTCCAAATAGACCTGGAGGCGGCGCGCCACCCATGCCGCCCGGTAGACCCCAAGGACAAGCCCTGCCCGCCCCGCTAATTCCCACTCGAGTGGCCGGTCAGGCGGGAGGCGTCCAAATACCCCAGCAAGTTCAGATGGCCGTCGGCAAGGCTGTAACCAACGCTGCAATCAACGAACTTTCCAATGCCTTCAAGTTCCACAATCGTCCAGTTCCGAATATTCCACCTAGGATACCAGAAAGACCAGGACAGCAACATTAAAAGTACTAGTCAAAATTTTTTTTGGGACCAACCAATAAGGTGCAACTTACTCAGTGAAATAGATATTTTAGCTAGCAATACAGCAGAATATAACTATTTTATTTGATATGAACTGTATACATGTATTATGTTTGAAATTATTTAAAGTAAATTTTGATGTATAGATTTTAGGATATTAGAAAATATCCAAAATTGAAAAGTGAATCTGTGATTGTGTTAATATAACTGTATTAAAAAAAATTCACATTTTTGTATATGTATTTTTATTTAACA
【００８５】
配列番号１２１は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉタンパク質のアミノ酸配列を示す。
MSGNVGMEQLIPIVNKLQDAFTQLGVHLTLDLPQIAVVGGQSAGKSSVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLILQLINSPTEHAEFLHCKGKKFVDFDEVRREIEGETDRVTGSNKGISNVPINLRVYSPNVLNLTLIDLPGLTKVPIGDQPIDIEAQIKAMIMQFIKRESCLILAVTPANSDLANSDALKLAKEVDPQGIRTIGVITKLDLMDEGTDARDILENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIEGKKDINAALAAERKFFISHTSYRHLADRLGTPYLQRVLNQQLTNHIRDTLPGLRDKLQKQLLTLEKDVEQFKYFRPDDPSIKTKAMLQMIQQLQTDFERTIEGSGSAQINTMELSGGAKINRLFHERFPFEIVKMEFDEKELRREIAFAIRNIHGIRVGLFTPDMAFEAIVKKQIFRLKEPSLKCVDLVVNELSNVVRFCTDKMNRYPRLREEAERIITTHIRQREQYCKEQLCLLIDCELAYMNTNHEDFIGFANAQNQSENAMKTSSRGTLGNQVIRKGYMCIHNLGIMKGGSRDYWFVLTSENISWFKDEEEREKKYMLPLDGLKLRDIEQGFMSRRHMFALFNPDGRNVYKDYKQLELSCETLDDVDSWKASFLRAGVYPEKQTEQLNGEESSGENQNSSMDPQLERQVETIRNLVDSYMKIVTKTTRDLVPKTIMMMIINHTKEFINGELLAHIYASGDQAQMMEEAPEEAQKREEMLRMYHACKESLHIIGDVSMATVSTPVPPPVKNDWLASGLENPRLSPPSPGGPRKTAPNMGTVGSSGSLGSRAPPLPPATGRPAPAIPNRPGGGAPPMPPGRPQGQALPAPLIPTRVAGQAGGVQIPQQVQMAVGKAVTNAAINELSNAFKFHNRPVPNIPPRIPERPGQQH
【００８６】
配列番号１２２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成に使用された、（Meligethes aeneus）由来のｓｈｉ  ｖ１（バージョン１）のＤＮＡ配列を示す（５’末端及び３’末端のＴ７プロモーター配列は示していない）。
TACCACTCACATCCGCCAAAGGGAACAGTACTGTAAAGAGCAGTTATGTTTGCTGATTGATTGTGAATTGGCATATATGAATACGAATCATGAAGATTTTATCGGATTTGCCAACGCTCAAAATCAGTCAGAAAACGCAATGAAAACGAGCTCACGAGGCACTTTGGGTAATCAGGTGATTCGAAAAGGTTACATGTGCATTCATAATTTGGGCATAATGAAAGGGGGCTCCAGAGATTATTGGTTTGTTCTAACCTCAGAAAACATATCTTGGTTCAAAGATGAAGAAGAGCGCGAAAAGAAATACATGTTACCGCTGGACGGTCTCAAGTTAAGGGATATTGAACAAGGATTTATGTCAAGAAGGCATATGTTTGCGCTTTTTAATCCAGATGGAAGAAATGTATATAAGGATTATAAACAACTTGAATTAAGTTGTGAGACATTAGATGATGTGGACTCCTGGAAAGCTTCATTTTTAAGGGCCGGGGTAT
【００８７】
配列番号１２３および１２４は、ｓｈｉ  ｒｅｇ１（領域１）を含有するメリゲテス（Meligethes）ｓｈｉ配列の一部を増幅するために使用されるプライマーを示す。
【００８８】
配列番号１２３：TAATACGACTCACTATAGGGAGATACCACTCACATCCGCCAAAG
【００８９】
配列番号１２４：TAATACGACTCACTATAGGGAGAATACCCCGGCCCTTAAAAATG
配列番号１２５〜１３０は、例示的なｓｈｉポリヌクレオチド及びその断片を含有する核酸から転写された例示的なＲＮＡを示す。
【００９０】
本発明実行のための方法
Ｉ．  いくつかの実施形態の概要
本発明者らは、ｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物に対し最もふさわしい標的害虫種のうちの１種；ウェスタンコーンルートワームを使用し、害虫管理用ツールとしてのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を開発した。これまでのところ、ルートワーム幼虫におけるＲＮＡｉの標的として提唱されているほとんどの遺伝子は、実際にはその目的を達していない。本明細書において、本発明者らは、例示的な害虫である、ウェスタンコーンルートワーム、花粉カブトムシ、及び新熱帯茶色カメムシ（Neotropical brown stink bug）における、shibire (shi) のＲＮＡｉ介在性ノックダウンを記載し、それは、たとえば摂取された又は注入されたｓｈｉ  ｄｓＲＮＡを介してｉＲＮＡ分子が送達されたときに、致死性の表現型を有することが示されている。本明細書の実施形態において、昆虫への給餌によりｓｈｉＲＮＡを送達する能力によって、害虫（例えば、鞘翅目及び半翅目）管理に非常に有用なＲＮＡｉ効果がもたらされる。ｓｈｉ介在性ＲＮＡｉと、他の有用なＲＮＡｉ標的を組み合わせることにより、たとえば複数の作用様式で複数の標的配列に影響を与えることができ、ＲＮＡｉ技術を含む持続的な害虫管理方法開発の機会を増すことができる。
【００９１】
本明細書において、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）の寄生を遺伝的に制御するための方法及び組成物が開示される。害虫群のＲＮＡｉ介在性制御を目的とした標的遺伝子としての使用のための、害虫のライフサイクルに必須な１つ以上の遺伝子を特定する方法もまた提供される。成長、生存、及び／又は発達に必須な１つ以上の標的遺伝子を抑制するように、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡプラスミドベクターを設計してもよい。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができてもよい。一部の実施形態において、害虫の標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に対し相補的な核酸分子を介して、標的遺伝子発現の転写後抑制、又は標的遺伝子阻害の転写後抑制のための方法が提供される。これら、及びさらなる実施形態において、害虫に、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に相補的な核酸分子のすべて又は一部から転写されたｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、及び／又はｈｐＲＮＡ分子を１つ以上摂取させ、それにより植物防御作用をもたらしてもよい。
【００９２】
したがって、一部の実施形態は、標的遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列に相補的なｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡを使用し、標的遺伝子産物の発現を配列特異的に阻害し、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）の少なくとも部分的な制御を達成することを含む。例えば、配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０、ならびにそれらの断片のうちの１つに明記されているポリヌクレオチドを含有する単離及び精製された核酸分子のセットが開示される。一部の実施形態において、標的遺伝子の転写後サイレンシング又は阻害を目的として、これらのポリヌクレオチド、それらの断片、又はこれらのポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含む遺伝子から、安定化されたｄｓＲＮＡ分子が発現されてもよい。ある実施形態において、単離及び精製された核酸分子は、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、及び１２２のうちのいずれかのすべて又は一部を含有する。
【００９３】
一部の実施形態は、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）分子をコードする組み換えＤＮＡを少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞（例えば植物細胞）を含む。特定の実施形態において、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目）により摂取されたときに、当該害虫の標的遺伝子の発現を転写後にサイレンシングする、又は阻害する、ｄｓＲＮＡ分子が提供される。組み換えＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２のうちのいずれか、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２のうちのいずれかの断片、ならびに配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２のうちの１つを含有する遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチド、ならびに／又はそれらの相補配列、を含有してもよい。
【００９４】
一部の実施形態は、配列番号９８もしくは配列番号１１０（例えば、配列番号９８〜１１１を含有する群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド）又は配列番号１２５〜１３０のすべて、又は一部を含有するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を少なくとも１つコードする組み換えＤＮＡをそのゲノム中に有する組み換え宿主細胞を含む。害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）により摂取されたときに、ｉＲＮＡ分子は、標的ｓｈｉＤＮＡ（例えば、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、及び１２２からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有するＤＮＡ）の発現を、当該害虫又は当該害虫の子孫においてサイレンシング、又は阻害し、それにより当該害虫の成長、発生及び／又は発達の停止をもたらしてもよい。
【００９５】
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子を少なくとも１つコードする組み換えＤＮＡを少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞は、形質転換された植物細胞であってもよい。一部の実施形態は、かかる形質転換植物細胞を含有するトランスジェニック植物を含む。かかるトランスジェニック植物に加え、いずれかトランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子、及びトランスジェニック植物の産物がすべて提供され、それら各々が組み換えＤＮＡを含有する。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞において発現されてもよい。したがって、これら及び他の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞から単離されてもよい。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ（Zea mays)、ダイズ(Glycine max)、綿花、アブラナ（Brassica napus）、及びイネ（Poaceae）科の植物を含有する群から選択される植物である。
【００９６】
一部の実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）の細胞において、標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これら、及び他の実施形態において、核酸分子が提供されてもよく、この場合において、当該核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結されてもよく、及び転写終結配列に操作可能に連結されていてもよい。特定の実施形態において、害虫細胞において標的遺伝子の発現を調節する方法は、以下を含む：（ａ）ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること；（ｂ）当該形質転換植物細胞を、複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の進行が可能となるために充分な条件下で培養すること；（ｃ）当該ベクターがそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；及び（ｄ）選択された形質転換植物細胞が、当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされているｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子を含有することを決定すること。ベクターがそのゲノム中に組み込まれており、及び当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされるｄｓＲＮＡ分子を含有する植物細胞から、植物を再生させてもよい。
【００９７】
したがって、そのゲノム中に組み込まれたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含有する植物細胞もまた開示され、この場合において当該トランスジェニック植物は、当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされるｄｓＲＮＡ分子を含有している。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子の植物における発現は、当該形質転換植物又は当該形質転換植物細胞に（例えば、当該形質転換植物、当該植物の一部（例えば、根）、又は植物細胞を餌とすることにより）接触している害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目）の細胞における標的遺伝子の発現を調節するのに充分であり、それにより、当該害虫の成長及び／又は生存が阻害される。本明細書に開示されるトランスジェニック植物は、害虫の寄生に対する抵抗性を示すことができ、及び／又は耐性の増強を示すことができる。特定のトランスジェニック植物は、以下からなる群から選択される鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の１つ以上に対する抵抗性及び／又は強化された防御を示してもよい：ＷＣＲ；ＢＳＢ；ＮＣＲ；ＳＣＲ；ＭＣＲ；Ｄ．バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ｕ.テネラ（D. u. tenella）;メリゲテス  アエネウス  ファブリシウス Meligethes aeneus Fabricius）;ジュウイチウリホシハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）;アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）;クサギカメムシ（Halyomorpha halys）;ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）;アオカメムシ（Chinavia hilare）;茶色カメムシ（Euschistus servus）;ディケロプス  メラカンツス（Dichelops melacanthus）;ディケロプス  フルカツス（Dichelops furcatus）;エデッサ  メディタブンダ（ Edessa meditabunda）;新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）;チナビア  マルギナツム（Chinavia marginatum）;ワタムシ（Horcias nobilellus）;タエディア  スティグモサ（Taedia stigmosa）;ディスデルクス  ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）; ネオメガロトムス  パルブス（Neomegalotomus parvus）;レプトグロッサス  ゾナツス（Leptoglossus zonatus）;ニエストレア  シデ（Niesthrea sidae）;サビイロカスミカメムシ（Lygus hesperus）; およびリグス  リネオラリス（Lygus lineolaris）。
【００９８】
また本明細書において、例えばｉＲＮＡ分子などの制御剤を、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）へと送達する方法が開示される。かかる制御剤は、害虫群の摂食、成長又はさもなければ宿主において損害を生じさせる能力に機能的障害を直接又は間接的に生じさせることができる。一部の実施形態において、安定化されたｄｓＲＮＡ分子を害虫に送達させ、当該害虫において少なくとも１つの標的遺伝子を抑制し、それによって、ＲＮＡｉを生じさせ、当該害虫の宿主において植物被害を減少させる、又は取り除くことを含む方法が提供される。一部の実施形態において、害虫において標的遺伝子の発現を阻害する方法は、当該害虫の成長、生存、及び／又は発達の停止を生じさせることができる。
【００９９】
一部の実施形態において、植物、動物、及び／又は植物もしくは動物の周囲環境での使用のためのｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）を含有し、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）寄生の撲滅又は減少を実現する組成物（例えば、局所用組成物）が提供される。特定の実施形態において、組成物は、害虫に食べられる栄養組成物又は食物源であってもよい。一部の実施形態は、害虫が利用可能な栄養組成物又は食物源を作製することを含む。ｉＲＮＡ分子を含有する組成物の摂取は、害虫の１つ以上の細胞による分子の取り込みを発生させることができ、それによって次いで、当該害虫の細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害を発生させることができる。害虫寄生による植物又は植物細胞への損害、又は摂取は、当該害虫の宿主に、ｉＲＮＡ分子を含有する組成物を１つ以上提供することによって、当該害虫が存在している任意の宿主組織もしくは環境の中又は上で、限定され、よく又は除外されていてもよい。
【０１００】
本明細書に開示される組成物及び方法は、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）による損害を制御するための他の方法及び組成物と一緒に組み合わせて使用されてもよい。例えば、害虫から植物を防御するための本明細書に記載されるｉＲＮＡ分子は、害虫に対し有効な化学物質、かかる害虫に対して有効な農薬、輪作、ＲＮＡｉ介在法及びＲＮＡｉ組成物の特性とは異なる特性を示す組み換え遺伝子法（例えば、植物における、害虫に対して有害なタンパク質（例えば、Ｂｔ毒素及びＰＩＰ−１ポリペプチド（米国特許出願公開2014/0007292 A1を参照のこと））の組み換え生成）、及び／又は他のｉＲＮＡ分子の組み換え発現の１つ以上の追加の使用を含む方法において使用されてもよい。
【０１０１】
ＩＩ．  略語
ＢＳＢ  新熱帯茶色カメムシ（Neotropical brown stink bug）(Euschistus heros)
ｄｓＲＮＡ  二本鎖リボ核酸
ＥＳＴ  発現配列タグ
ＧＩ  成長阻害
ＮＣＢＩ  全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）
ｇＤＮＡ  ゲノムＤＮＡ
ｉＲＮＡ  阻害性リボ核酸（inhibitory ribonucleic acid）
ＯＲＦ  オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ  リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡマイクロリボ核酸
ｓｈＲＮＡ  短ヘアピンリボ核酸
ｓｉＲＮＡ  低分子阻害的リボ核酸
ｈｐＲＮＡ  ヘアピンリボ核酸
ＵＴＲ  非翻訳領域
ＷＣＲ  ウェスタンコーンルートワーム（Western corn rootworm）(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)
ＮＣＲ  ノーザンコーンルートワーム（Northern corn rootworm）(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)
ＭＣＲ  メキシカンコーンルートワーム（Mexican corn rootworm）(Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)
ＰＢ  花粉カブトムシ（Pollen beetle）（メリゲテス・アエネウス  ファブリシウス(Meligethes aeneus Fabricius)）
ＰＣＲ  ポリメラーゼ鎖反応
ｑＰＣＲ  定量的ポリメラーゼ鎖反応
ＲＩＳＣ  ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体
ＳＣＲ  サザンコーンルートワーム（Southern corn rootworm）(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)
ＹＦＰ  黄色蛍光タンパク質
ＳＥＭ  平均標準誤差
【０１０２】
ＩＩＩ．  用語
以下の記載及び表において、多くの用語が使用されている。所与のかかる用語の範囲を含む、明細書及び請求項の明白で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
【０１０３】
鞘翅目害虫：本明細書において使用される場合、「鞘翅目害虫」という用語は、鞘翅目の害虫を指し、ジアブロティカ（Diabrotica）属の害虫を含み、それらはトウモロコシ及び他のイネ科植物を含む農作物及び農産物を餌とする。特定の例において、鞘翅目害虫は、ウェスタンコーンルートワーム（D.v.virgifera LeConte (ＷＣＲ)）；ノーザンコーンルートワーム（D.barberi Smith and Lawrence (ＮＣＲ)）；サザンコーンルートワーム（D.u.howardi (SCR)）；メキシカンコーンルートワーム（D.v.zeae (ＭＣＲ)）；D.バルテアタ・ルコンテ（D.balteata LeConte）；Ｄ．ｕ．テネラ（D.u.tenella）；ジュウイチホシウリハムシ（D.u.undecimpunctata Mannerheim）；及びメリゲテス・アエネウス  ファブリシウス（Meligethes aeneus Fabricius）を含むリストから選択される。
【０１０４】
（生物体との）接触：本明細書において使用される場合、生物体（例えば、鞘翅目害虫又は半翅目害虫）「との接触」又は「による取り込み」という用語は、核酸分子に関しては、当該生物体への核酸分子の内面化を含み、例えば限定されないが：当該生物体による（例えば、摂食による）分子の摂取；当該生物体と、核酸分子を含む組成物との接触；及び核酸分子を含有する溶液に生物体が浸ることを含む。
【０１０５】
コンティグ：本明細書において使用される場合、「コンティグ」（ｃｏｎｔｉｇ）という用語は、単一の遺伝源に由来する重複ＤＮＡセグメントのセットから再構築されたＤＮＡ配列を指す。
【０１０６】
トウモロコシ植物：本明細書において使用される場合、「トウモロコシ植物」という用語は、Zea mays（トウモロコシ）の種の植物を指す。
【０１０７】
発現：本明細書において使用される場合、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子又は導入遺伝子）の「発現」とは、核酸転写ユニット（例えば、ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡを含む）のコード化情報が、細胞の使用可能な部分、使用不可能な部分、又は構造部分へと転換されるプロセスを指し、多くの場合、タンパク質の合成を含んでいる。遺伝子発現は、遺伝子発現を増加又は低下させる剤への、例えば細胞、組織、又は生物体の曝露などの外部シグナルにより影響され得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、蛋白質への経路のいずれかで制御され得る。遺伝子発現の制御は、例えば転写、翻訳、ＲＮＡの輸送及びプロセッシング、例えばｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する作用を制御することにより発生するか、又はそれらが生成された後の特定の蛋白質分子の活性化、不活化、区画化、又は分解を介して発生するか、又はそれらの組み合わせにより発生する。遺伝子発現は、当分野に公知の任意の方法によりＲＮＡレベルで、又はタンパク質レベルで測定することができ、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク質活性のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０８】
遺伝物質：本明細書において使用される場合、「遺伝物質」という用語は、全ての遺伝子、ならびに例えばＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸分子を含む。
【０１０９】
半翅目害虫：本明細書において使用される場合、「半翅目害虫」という用語は、半翅目の害虫を指し、例えば限定されないが、カメムシ科（Pentatomidae）、カスミカメムシ科（Miridae）、ホシカメムシ科（Pyrrhocoridae）、ヘリカメムシ科（Coreidae）、ホソヘリカメムシ科（Alydidae）、及びヒメヘリカメムシ科（Rhopalidae）の昆虫が含まれ、それらは広範な宿主植物を餌とし、貫通口部分及び吸汁口部分を有している。特定の例において、半翅目害虫は、Euschistus heros (Fabr.) （新熱帯茶色カメムシ（Neotropical Brown Stink Bug））、Nezara viridula (L.) （ミナミアオカメムシ（Southern Green Stink Bug））、Piezodorus guildinii (Westwood) （アカオビカメムシ（Red-banded Stink Bug））、Halyomorpha halys (Stal) （クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug））、Chinavia hilare (Say) （アオカメムシ（Green Stink Bug））、Euschistus servus (Say) （茶色カメムシ（Brown Stink Bug））、Dichelops melacanthus(Dallas)（ディケロプス・メラカンツス（ダラス））、Dichelops furcatus (F.)（ディケロプス・フルカツス（Ｆ．））、 Edessa meditabunda (F.)（エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．））、Thyanta perditor (F.)（新熱帯カタアカカメムシ（Neotropical Red Shouldered Stink Bug））、Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois)（チナビア・マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ））、Horcias nobilellus (Berg) （ワタムシ（Cotton Bug））、Taedia stigmosa (Berg)（タエディア・スティグモサ（バーグ））、Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)（ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル））、Neomegalotomus parvus (Westwood)（ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド））、Leptoglossus zonatus (Dallas)（レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス））、Niesthrea sidae (F.)（ニエストレア・シデ（Ｆ．））、Lygus hesperus (Knight)（サビイロカスミカメムシ（Western Tarnished Plant Bug））、及びLygus lineolaris (Palisot de Beauvois)（リグス・リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ））を含むリストから選択される。
【０１１０】
阻害：本明細書において使用される場合、「阻害」という用語は、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に対する作用を記載するために使用される場合、当該コードポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡの細胞レベルにおける測定可能な低下を指し、及び／又はコードポリヌクレオチドのペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質産物の細胞レベルにおける測定可能な低下を指す。一部の例において、発現がほぼ消失するよう、コードポリヌクレオチドの発現が阻害される場合がある。「特異的阻害」とは、特異的阻害が行われる細胞において、他のコードポリヌクレオチド（例えば遺伝子）の発現に影響を与えることなく、標的コードポリヌクレオチドを阻害することを指す。
【０１１１】
昆虫：本明細書において有害生物に関連して使用される場合、「害虫」という用語は、鞘翅目害虫を具体的に含む。一部の実施形態において、当該用語はまた、一部の他の害虫、例えば、半翅目害虫などを含む。
【０１１２】
単離した：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸又はタンパク質）は、当該構成要素が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的構成要素（すなわち、他の染色体及び余剰染色体のＤＮＡならびにＲＮＡ、及びタンパク質）から、当該構成要素において化学的変化又は機能的変化に影響を与えながら、実質的に分離され、から離れて生成され、又はから精製されている（例えば、核酸は、染色体中の残りのＤＮＡと当該核酸を繋ぐ化学的結合を破壊することにより、染色体から単離することができる）。「単離されている」核酸分子及びタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子及びタンパク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸及びタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、及びペプチドを包含する。
【０１１３】
核酸分子：本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、多量体型のヌクレオチドを指す場合があり、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み、ならびにそれらの合成型及び混合型ポリマーを含む場合がある。ヌクレオチド及び核酸塩基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指す場合がある。本明細書において使用される場合、「核酸分子」は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の言及がない限り、核酸分子は通常、少なくとも１０塩基の長さである。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、その分子の５’末端から３’末端へと読まれる。核酸分子の「相補配列」とは、その核酸分子の核酸塩基と塩基対を形成することができる核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す（すなわち、Ａ−Ｔ／Ｕ、及びＧ−Ｃ）。
【０１１４】
一部の実施形態は、ｍＲＮＡ分子の相補配列であるＲＮＡ分子へと転写される鋳型ＤＮＡを含有する核酸を含む。これらの実施形態において、ｍＲＮＡ分子に転写される核酸の相補配列は、５’から３’の方向で存在しており、ＲＮＡポリメラーゼ（５’から３’の方向にＤＮＡを転写する）は、ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる相補配列から核酸を転写する。別段の記載がない限り、又は文脈から別段であることが明白でない限り、「相補配列」という用語は、参照核酸の核酸塩基と対を形成することができる、５’から３’の核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す。同様に、別段であることが明白に記載されていない限り（又は文脈から別段であることが明白でない限り）、核酸の「逆相補配列」とは、逆方向の相補配列を指す。前述を、以下の解説において説明する：
ATGATGATG  ポリヌクレオチド
TACTACTAC  ポリヌクレオチドの「相補配列」
CATCATCAT  ポリヌクレオチドの「逆相補配列」
GUAGUAGUA  転写されたＲＮＡ
本発明の一部の実施形態は、ヘアピンＲＮＡ形成ＲＮＡｉ分子を含む場合がある。これらのＲＮＡｉ分子において、ＲＮＡ干渉により標的とされている核酸の相補配列、及び逆相補配列の両方が、同じ分子中に存在していてもよく、それにより、一本鎖ＲＮＡ分子が「折り重なる」ことができ、及び相補配列を含む領域上にそれ自身をハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチドを反転させることができる。
【０１１５】
「核酸分子」には、例えば一本鎖型及び二本鎖型のＤＮＡ、一本鎖型のＲＮＡ、ならびに二本鎖型のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの全てのポリヌクレオチドが含まれる。「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖又は二本鎖のいずれかとしての核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸（ＲＮＡ）」という用語は、ｉＲＮＡ（阻害的ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ、対応するアシル化アミノ酸での荷電、又は非荷電いずれも）、及びｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」ならびにそれらの「断片」という用語は、ｇＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、オペロン、ならびにペプチド、ポリペプチド又はタンパク質コードする、又はコードするよう適合され得る低分子化改変ポリヌクレオチドのすべてを含む用語として当分野の当業者に理解されている。
【０１１６】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの開裂により形成されてもよく、又は個々のヌクレオチド前駆体の重合により形成されてもよい。自動合成により、最大で数百塩基の長さのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補核酸に結合することができるため、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）から構成されるオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ増幅技術であるＰＣＲで使用してもよい。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドは多くの場合、「プライマー」と呼称され、これによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することができる。
【０１１７】
核酸分子は、天然型、及び／又は非天然型のヌクレオチド結合によって、共に連結された天然型ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのいずれか、又は両方を含んでもよい。核酸分子は化学的に、又は生化学的に修飾されてもよく、又は非天然型ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよいことが、当分野の当業者には容易に認識されるであろう。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然型ヌクレオチドとアナログの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えばホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバマートなど；荷電結合：例えばチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルなど；ペンデント部分（pendent moieties）：例えば、ペプチド；挿入剤：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレーター；アルキレーター；及び修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン化、環状、及び南京錠構造をはじめとするトポロジー構造の全てを含む。
【０１１８】
本明細書においてＤＮＡに関して使用される場合、「コードポリヌクレオチド」、「構造的ポリヌクレオチド」、又は「構造的核酸分子」という用語は、適切な制御エレメントの制御下に置かれたときに、転写及びｍＲＮＡを介してポリペプチドへと最終的に翻訳されるポリヌクレオチドを指す。ＲＮＡに関しては、「コードポリヌクレオチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へと翻訳されるポリヌクレオチドを指す。コードポリヌクレオチドの境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コードポリヌクレオチドとしては、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、及び組み換えポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、例えば５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及びイントロン部分などの、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されないｍＲＮＡ分子の部分を指す。さらに「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、例えば構造的ＲＮＡ（例えば、５Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、及び２８Ｓ  ｒＲＮＡなどにより例示されるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）；トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び例えばＵ４、Ｕ５、Ｕ６などのｓｎＲＮＡといった、細胞内で機能するＲＮＡへ転写される核酸を指す。転写された非コードポリヌクレオチドとしてはまた、例えば限定されないが、低分子細菌性非コードＲＮＡを記載するためにしばしば使用される低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、及び長い非コードＲＮＡが挙げられる。さらには、「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ分子へと転写される、核酸中に遺伝子内「スペーサー」として天然に存在し得るポリヌクレオチドを指す。
【０１２０】
致死的ＲＮＡ干渉：本明細書において使用される場合、「致死的ＲＮＡ干渉」という用語は、例えばｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡが送達される対象個体の死、又は活性の低下をもたらすＲＮＡ干渉を指す。
【０１２１】
ゲノム：本明細書において使用される場合、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に存在する染色体ＤＮＡを指し、また細胞の細胞内成分内に存在する細胞小器官ＤＮＡも指す。本発明の一部の実施形態において、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムへと組み込まれるように、ＤＮＡ分子は植物細胞に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ＤＮＡに組み込まれてもよく、又は植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのＤＮＡへと組み込まれてもよい。「ゲノム」という用語は、細菌に適用される場合、細菌細胞内の染色体及びプラスミドの両方を指す。本発明の一部の実施形態において、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムへと組み込まれるように、ＤＮＡ分子は細菌に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込まれていてもよく、又は安定プラスミドとして存在してもよく、又は安定プラスミド内に存在してもよい。
【０１２２】
配列の同一性：２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの文脈において本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、規定の比較ウィンドウ上で最大一致で並べられたとき、２つの分子の配列中の同一である残基を指す。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「配列同一性の割合」という用語は、最適に並べられた２つの配列（例えば核酸配列又はポリペプチド配列）を、比較ウィンドウ上で比較することにより決定される値を指す場合があり、この場合において比較ウィンドウの配列部分は、２配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加又は欠失を含んでいない）と比較し、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含有する場合がある。割合は、比較ウィンドウにおいて、同一のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定し、合致した位置の数を出し、合致した位置の数を位置の総数で割り、１００を掛けて配列同一性の割合を出すことにより算出される。参照配列に対する比較において、各位置で同一である配列は、当該参照配列に対し１００％同一であるとされ、逆もまた同じとなる。
【０１２４】
比較のための配列アライメントの方法は当分野において公知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが記載されており、例えば以下がある：Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang ら (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson ら  (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana ら (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50。配列アライメント法及び相同性算出に関する詳細な検討については、例えば、下記に見出される:Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10。The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST（商標）; Altschul ら（1990）は、いくつかの配列解析プログラムと関連した用途に対し、National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD)、及びインターネットをはじめとするいくつかの源から利用可能である。このプログラムを使用し、どのように配列同一性を決定するかについての説明は、インターネットのＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」の項で入手可能である。核酸配列の比較に関しては、ＢＬＡＳＴ「商標」（Ｂｌａｓｔｎ）の「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」機能を、デフォルトのパラメーターに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、用いることができる。この方法で評価する場合、参照ポリヌクレオチド配列に対して高い配列類似性を有する核酸は、高い同一性割合を示す。
【０１２５】
特異的ハイブリダイズの可能性／特異的相補性：本明細書において使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「特異的相補性」という用語は、核酸分子と標的核酸分子の間に安定で特異的な結合が発生するのに充分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションは、当該２つの核酸分子の核酸塩基の間の逆平行のアライメントの形成を含む。その後この２つの分子は逆鎖上の対応する塩基と水素結合を形成し、そしてもしこれが充分に安定であった場合には、当分野に公知の方法を使用して検出することが可能な二重鎖分子を形成することができる。ポリヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と１００％相補的であることは必ずしも必要ではない。しかしながら、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【０１２６】
特有のストリンジェンシーを生じさせるハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質、及びハイブリダイズする核酸の組成と長さに応じて変化する。概して、ハイブリダイゼーションの温度、及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。特定のストリンジェンシーの程度を得るために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する算定は当分野の当業者に公知であり、例えば、Sambrook ら（編） Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9及び11；ならびにHames 及び Higgins（編） Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985.に検討されている。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な説明及びガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；及びAusubel ら編 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.に見出され得る。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション分子の配列と、標的核酸分子内の相同ポリヌクレオチド配列の間のミスマッチが２０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが発生する条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって本明細書において使用される場合、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、２０％を超える配列ミスマッチを伴う分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、１０％を超えるミスマッチを伴う配列がハイブリダイズしない条件であり、及び「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、５％を超えるミスマッチを伴う配列がハイブリダイズしない条件である。
【０１２８】
以下は代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
【０１２９】
高いストリンジェンシー条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：５ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃、１６時間のハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ緩衝液、室温で各々１５分間の洗浄を２回；及び０．５ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃で各々２０分の洗浄を２回。
【０１３０】
中程度のストリンジェンシー条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃〜７０℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ緩衝液、室温で各々５〜２０分間の洗浄を２回；及び１ｘＳＳＣ緩衝液、５５℃〜７０℃で各々３０分の洗浄を２回。
【０１３１】
非ストリンジェントな対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする）：６ｘＳＳＣ緩衝液、室温〜５５℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ〜３ｘＳＳＣ緩衝液、室温〜５５℃で各々２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、「実質的に相同」又は「実質的な相同性」という用語は、核酸に関し、ストリンジェントな条件下で、参照核酸にハイブリダイズする連続核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す。例えば、配列番号１、３、５、７〜１２、２７〜２９、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２のいずれかの参照核酸に対し、実質的に相同である核酸は、ストリンジェントな条件（例えば、上記に示される中程度のストリンジェントな条件）下で、配列番号１、３、５、７〜１２、２７〜２９、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２のいずれかの参照核酸にハイブリダイズする核酸である。実質的に相同なポリヌクレオチドは、少なくとも８０％の配列同一性を有していてもよい。例えば、実質的に相同なポリヌクレオチドは、例えば、７９％；８０％；約８１％；約８２％；約８３％；約８４％；約８５％；約８６％；約８７％；約８８％；約８９％；約９０％；約９１％；約９２％；約９３％；約９４％；約９５％；約９６％；約９７％；約９８％；約９８．５％；約９９％；約９９．５％；及び約１００％などの８０％〜１００％の配列同一性を有していてもよい。実質的な相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関係している。例えば、特異的結合が望ましい条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的ポリヌクレオチドへの核酸の非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性がある場合、核酸分子は特異的にはハイブリダイズする。
【０１３３】
本明細書において使用される場合、「オルソログ」という用語は、共通の先祖核酸から進化した、２以上の種の遺伝子を指し、当該２以上の種において同じ機能を保持している場合がある。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、５’から３’の方向で読まれたポリヌクレオチドの各ヌクレオチドが、３’から５’の方向で読まれたときに、他のポリヌクレオチドの各ヌクレオチドに対し相補的である場合、２つの核酸分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの逆相補配列に対し、配列同一性を示す。これらの用語及び記載は当分野においてよく定義されており、当分野の当業者には容易に理解される。
【０１３５】
操作可能に連結された：第一のポリヌクレオチドは、当該第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチドと機能的関係がある場合、第二のポリヌクレオチドに操作可能に連結されている。組み換えで生成された場合、操作可能に連結されたポリヌクレオチドは多くの場合連続的であり、及び２つのタンパク質コード領域を繋げる必要がある場合、同一のリーディングフレームにおいて連続的である（例えば翻訳的に融合されたＯＲＦ。）しかしながら、核酸は、操作可能に連結されるために必ずしも連続ではない。
【０１３６】
調節性遺伝子エレメント及びコードポリヌクレオチドに関し使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、当該調節性エレメントが、連結されたコードポリヌクレオチドの発現に作用することを意味する。「調節エレメント」又は「制御エレメント」とは、関連するコードポリヌクレオチドの転写、ＲＮＡのプロセッシングもしくは安定性、又は翻訳のタイミング、及びレベル／量に影響を与えるポリヌクレオチドを指す。調節性エレメントとしては、プロモーター、翻訳リーダー、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合ポリヌクレオチド、終結配列を伴うポリヌクレオチド、ポリアデニル化認識配列を伴うポリヌクレオチドなどが挙げられる。特定の調節性エレメントは、自身に操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に位置している場合がある。また、コードポリヌクレオチドに操作可能に連結された特定の調節性エレメントは、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置する場合もある。
【０１３７】
プロモーター：本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、転写の開始部分から上流にある場合があるＤＮＡの領域、ならびにＲＮＡポリメラーゼ及び転写を開始させる他のタンパク質の認識及び結合に関与する場合があるＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のためにコードポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよく、又はプロモーターは、細胞における発現のためにコードポリヌクレオチドに操作可能に連結され得るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよい。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターであってもよい。発生制御下のプロモーターの例としては、例えば葉、根、種、繊維、導管、仮道管、又は厚膜組織などの特定の組織において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。かかるプロモーターは、「組織優先的」と呼称される。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターは、「組織特異的」と呼称される。「細胞型特異的」プロモーターは主に、例えば根又は葉の管細胞などの１つ以上の器官の特定の細胞型における発現を誘導する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである場合がある。誘導性プロモーターによる転写を開始させることができる環境条件の例としては、嫌気的条件、及び光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、及び誘導性のプロモーターは、「非構造性」プロモーターに分類を構成する。「構造性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であり得、又はほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【０１３８】
任意の誘導性プロモーターを本発明の一部の実施形態に使用することができる。誘導性プロモーターに関しては、Ｗａｒｄら (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照のこと。転写率は、誘導剤に応じて増加する。例示的な誘導性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：銅に反応するＡＣＥＩ系由来のプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に反応する、トウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー；及びステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター。その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモンによる誘導され得る（Schena ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）。
【０１３９】
例示的な構造性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV:Cauliflower Mosaic Virus)由来の３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター；イネのアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；及びＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子に対して５’のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（又は前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片に類似のポリヌクレオチド）（国際PCT出願公開WO96/30530)。
【０１４０】
さらに、任意の組織特異的プロモーター、又は組織優先的プロモーターを、本発明の一部の実施形態に使用することができる。組織特異的プロモーターに操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドを含有する核酸分子で形質転換された植物は、特定の組織において限局的に、又は優先的にコードポリヌクレオチドの産物を産生することができる。例示的な組織特異的プロモーター又は組織優先的プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えばファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）遺伝子由来のプロモーターなどの種子優先的プロモーター；例えばｃａｂ又はｒｕｂｉｓｃｏ由来のプロモーターなどの、葉特異的プロモーター及び光誘導性プロモーター；例えばＬＡＴ５２由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーター；例えばＺｍ１３由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター；及び例えばａｐｇ由来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーター。
【０１４１】
ダイズ植物：本明細書において使用される場合、「ダイズ植物」という用語は、例えばダイズ（G. max）などのダイズ（Glycine）種の植物を指す。
【０１４２】
菜種／アブラナ植物  本明細書に使用される場合、「菜種（rapeseed）」または「アブラナ（oilseed rape）」という用語は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）種の植物を指す。
【０１４３】
形質転換：本明細書において使用される場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、１つ以上の核酸分子を細胞内へと移送させることを指す。細胞ゲノムへの核酸分子の組み込み、又はエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞により安定的に複製されるようになったとき、細胞内に導入された核酸分子により細胞は「形質転換」されている。本明細書において使用される場合、「形質転換」という用語は、かかる細胞内に核酸分子を導入することができる全ての技術を包含している。例としては限定されないが、以下が挙げられる：ウイルスベクターを用いたトランスフェクション法；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション法(Frommら (1986) Nature 319:791-3)；リポフェクション法(Felgner ら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7)；マイクロインジェクション法(Mueller ら (1978) Cell 15:579-85)；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入(Fraley ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)；直接的なＤＮＡ取り込み；及び微粒子銃 (Klein ら (1987) Nature 327:70)。
【０１４４】
導入遺伝子：外因性核酸。一部の例において、導入遺伝子は、鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫に存在する核酸分子に相補的なポリヌクレオチドを含有するｄｓＲＮＡを形成することができるＲＮＡの１つの鎖又は両方の鎖をコードするＤＮＡであってもよい。さらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子（例えば除草剤耐性遺伝子、産業的又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、又は所望される農学的形質をコードする遺伝子）であってもよい。これら、及び他の例において、導入遺伝子は、当該導入遺伝子のコードポリヌクレオチドに操作可能に連結されている制御エレメントを含有してもよい（例えば、プロモーター）。
【０１４５】
ベクター：核酸分子が細胞に導入されると、例えば形質転換細胞が生成される。ベクターは、例えば複製起源などの、宿主細胞で自身を複製することができるようになる遺伝子エレメントを含有してもよい。ベクターの例としては、細胞内に外因性ＤＮＡを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、アンチセンス分子を産生する遺伝子、及び／又は選択マーカー遺伝子、ならびに当分野に公知の他の遺伝子エレメントをはじめとする１つ以上の遺伝子を含んでもよい。ベクターが、細胞に形質導入し、形質転換し、又は感染することにより、当該細胞が、ベクターにコードされた核酸分子及び／又は蛋白質を発現してもよい。ベクターは任意で、細胞内への核酸分子の侵入の実現を補助するための物質を含む（例えば、リポソーム、タンパク質、コーティングなど）。
【０１４６】
収率：同条件下、同じ増殖場所で同じ時間で増殖した基準型の収率と比較した、約１００％以上の安定した収率。特定の実施形態において、「改善された収率」又は「収率を改善する」とは、同条件下、同じ時間で増殖した作物に対して有害であるために充分な鞘翅目害虫及び又は半翅目害虫の密度を含有する、同じ増殖場所での基準型の収率に対し、１０５％以上の安定化した収率を有する栽培品種を意味する。
【０１４７】
具体的に指示、又は暗示されたことを除き、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも１つ」を示す。
【０１４８】
具体的に別段の説明がなされない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者により普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学の普遍的な用語の定義については、例えば、以下に見出される：Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs ら （編）、The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びMeyers R.A.（編）、Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。全ての割合は重量によるものであり、すべての溶媒混合物の比率は、別段の記載がない限り体積によるものである。全ての温度はセ氏である。
【０１４９】
ＩＶ．    害虫の配列を含有する核酸分子
Ａ．    概要
本明細書において、害虫の制御に有用な核酸分子が開示される。一部の例において、害虫は、鞘翅目または半翅目の害虫である。記載される核酸分子は、標的ポリヌクレオチド（例えば、天然遺伝子、及び非コードポリヌクレオチド）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを含む。例えば、一部の実施形態において、鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫の天然核酸の１つ以上のすべて、又は一部に対し特異的に相補的であり得るｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はｈｐＲＮＡ分子が記載される。これら、及びさらなる例において、天然核酸は、１つ以上の標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、又は幼虫又は若虫の発達に関与してもよい。本明細書に記載される核酸分子は、当該核酸分子が特異的に相補的である天然核酸を少なくとも１つ含有する細胞へと導入される場合、当該細胞においてＲＮＡｉを開始させ、その後に当該天然核酸の発現を低下又は消失させることができる。一部の例において、特異的に相補的な核酸分子による標的遺伝子の発現低下又は発現消失は、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の成長、発達、及び／もしくは摂食の低下又は停止を生じさせ得る。
【０１５０】
一部の実施形態において、害虫において少なくとも１つの標的遺伝子が選択されてもよく、この場合において当該標的遺伝子は、ｓｈｉ  ポリヌクレオチドを含有する。一部の例において、鞘翅目害虫の標的遺伝子が選択され、この場合において当該標的遺伝子は、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、及び１２２から選択されるポリヌクレオチドを含有する。
【０１５１】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、ｓｈｉ  ポリヌクレオチドのタンパク質産物のアミノ酸配列に対し、少なくとも約８５％同一（例えば、少なくとも８４％、８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又は１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドへとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳されることができるポリヌクレオチドを含む核酸分子であってもよい。標的遺伝子は、害虫のいずれかのｓｈｉ  ポリヌクレオチドであってもよく、その転写後阻害は、害虫の成長及び／又は生存に有害な影響を与え、例えば植物に対し、害虫に対する防御利益をもたらす。特定の例において、標的遺伝子は、配列番号２、４、６、９０、１１３、１１５、１１７、１１９及び１２１からなる群から選択されるのアミノ酸配列に対し、少なくとも約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％同一、又は１００％同一である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドに、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳され得るポリヌクレオチドを含有する核酸分子である。
【０１５２】
本発明によりＤＮＡが提供され、その発現は、害虫（例えば、鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫）のコードポリヌクレオチドによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生じさせる。一部の実施形態において、害虫による発現ＲＮＡ分子の摂取後、当該害虫の細胞内において、コードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態において、害虫の細胞におけるコード配列の下方制御により、当該害虫の成長発達及び／又は生存に対し有害な作用が生じ得る。
【０１５３】
一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドとしては、例えば５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、スプライスリーダー、イントロン、アウトロン（例えば、トランススプライシングにおいてその後に改変される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）、ドナトロン（ｄｏｎａｔｒｏｎｓ）（例えば、トランススプライシングにドナー配列を提供するために必要とされる非コードＲＮＡ）、及び標的害虫遺伝子の他の非コード転写ＲＮＡなどの転写非コードＲＮＡが挙げられる。かかるポリヌクレオチドは、モノシストロニックな遺伝子、及びポリシストロニックな遺伝子の両方から誘導することができる。
【０１５４】
したがって、本明細書において、一部の実施形態に関連し、害虫（例えば鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫）の標的核酸のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有するｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）が記載される。一部の実施形態において、ｉＲＮＡ分子は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の標的核酸などの複数の標的核酸のすべて又は一部に相補的なポリヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態において、ｉＲＮＡ分子は、例えば植物又は細菌などの遺伝子改変生物体によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで生成されてもよい。害虫の標的核酸のすべて又は一部に特異的に相補的な、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、及び／又はｈｐＲＮＡ分子の生成に有用であり得るｃＤＮＡが開示される。さらに、特定の宿主標的の安定な形質転換の実現における使用のための組み換えＤＮＡ構築物が開示される。形質転換された宿主標的は、組み換えＤＮＡ構築物から、有効レベルのｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、及び／又はｈｐＲＮＡ分子を発現することができる。したがって、植物細胞において機能する異種プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する植物形質転換ベクターが記載され、この場合において当該ポリヌクレオチドの発現により、害虫の標的核酸のすべて又は一部に対し特異的に相補的な連続した一連の核酸塩基を含有するＲＮＡ分子が生じる。
【０１５５】
特定の例において、害虫（たとえば、鞘翅目および／または半翅目）の制御に有用な核酸分子としては以下が挙げられる：ｓｈｉポリヌクレオチドを含有するジアブロティカ（Diabrotica）から単離された天然核酸のすべてまたは一部（たとえば配列番号１、３および５のいずれか）；発現したときにジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するＤＮＡ；ジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有するｉＲＮＡ分子（たとえば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；ジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子の生成に使用され得るｃＤＮＡ；ｓｈｉポリヌクレオチドを含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）から単離された天然核酸のすべてまたは一部（たとえば配列番号８９）；発現したときに新熱帯茶色カメムシ（E. heros ）ｓｈｉによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するＤＮＡ；新熱帯茶色カメムシ（E. heros ）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有するｉＲＮＡ分子（たとえば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；新熱帯茶色カメムシ（E. heros）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子の生成に使用され得るｃＤＮＡ；ｓｈｉポリヌクレオチドを含有するメリゲテス（Meligethes ）から単離された天然核酸のすべてまたは一部（たとえば配列番号１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のいずれか）；発現したときにメリゲテス（Meligethes）ｓｈｉによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するＤＮＡ；メリゲテス（Meligethes）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有するｉＲＮＡ分子（たとえば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；メリゲテス（Meligethes）ｓｈｉのすべてまたは一部に対し特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子の生成に使用され得るｃＤＮＡ；および特定の宿主標的の安定的な形質転換の実行に使用するための組み換えＤＮＡ構築体であって、この場合において形質転換された宿主標的は、前述の核酸分子のうちの１つ以上を含有している。
【０１５６】
Ｂ．  核酸分子
本発明は、害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）を特に提供するものであり；及び害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害する、細胞又は微生物においてｉＲＮＡ分子として発現されることができるＤＮＡ分子を提供するものである。
【０１５７】
本発明の一部の実施形態は、以下からなる群から選択される少なくとも１つ（たとえば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のポリヌクレオチドを含有する単離核酸分子を提供する：配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のうちのいずれか；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のうちのいずれかの相補配列；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のうちのいずれかの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片（たとえば、配列番号７〜１２、９１および１２２のいずれか）；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のうちのいずれかの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１、３または５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（たとえば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、３または５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１、３または５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；配列番号１、３または５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；および配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８および１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体（たとえば、PB）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８および１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８および１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８および１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列。特定の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）による、単離ポリヌクレオチドから転写されたｉＲＮＡとの接触、又は取り込みは、当該害虫の成長、発達、及び／又は摂食を阻害する。
【０１５８】
一部の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又はそれ以上）含有してもよい：配列番号９８；配列番号９８の相補配列；配列番号９９；配列番号９９の相補配列；配列番号１００；配列番号１００の相補配列；配列番号１０１；配列番号１０１の相補配列；配列番号１０２；配列番号１０２の相補配列；配列番号１０３；配列番号１０３の相補配列；配列番号１０４；配列番号１０４の相補配列；配列番号１０５；配列番号１０５の相補配列；配列番号１０６；配列番号１０６の相補配列；配列番号１１０；配列番号１１０の相補配列；配列番号１１１；配列番号１１１の相補配列；配列番号９８〜１０６、１１０および１１１のいずれかの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；配列番号９８〜１０６、１１０および１１１および配列番号１２５〜１３０のいずれかの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１、配列番号３または配列番号５を含有する遺伝子からジアブロティカ（Diabrotica）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチド；配列番号１、配列番号３または配列番号５を含有する遺伝子からジアブロティカ（Diabrotica）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの相補配列；配列番号１、配列番号３または配列番号５を含有する遺伝子からジアブロティカ（Diabrotica）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；配列番号１、配列番号３または配列番号５を含有する遺伝子からジアブロティカ（Diabrotica）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号８９を含有する遺伝子から新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）中で転写された天然ポリリボヌクレオチド；配列番号８９を含有する遺伝子から新熱帯茶色カメムシ（E. heros）中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの相補配列；配列番号８９を含有する遺伝子から新熱帯茶色カメムシ（E. heros）中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；および配列番号８９を含有する遺伝子から新熱帯茶色カメムシ（E. heros）中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８または１２０を含有する遺伝子からメリゲテス（Meligethes ）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチド；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８または１２０を含有する遺伝子からメリゲテス（Meligethes ）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８または１２０を含有する遺伝子からメリゲテス（Meligethes ）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８または１２０を含有する遺伝子からメリゲテス（Meligethes ）生物体中で転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの断片の相補配列。特定の実施形態において、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫による、単離ポリヌクレオチドとの接触、又��取り込みは、当該害虫の成長、発達、及び／又は摂食を阻害する。一部の実施形態において、ｉＲＮＡを含有する植物物質又は餌の摂食を介して、昆虫との接触又は取り込みが発生する。一部の実施形態において、ｉＲＮＡを含有する組成物を用いて、昆虫を含む植物に散布することを介して、昆虫との接触又は取り込みが発生する。
【０１５９】
ある実施形態において、本発明により提供されるdsRNA分子は、配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０ならびにそれらの断片の内のいずれかを含有する標的遺伝子からの転写物に相補的なポリヌクレオチドを含有し、その標的遺伝子の害虫における阻害により、当該害虫の成長、発達、又は他の生物学的機能に必須なポリペプチド又はポリヌクレオチド物質の減少又は除去が生じる。選択されたポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０のいずれかの連続した断片；ならびに前述のいずれかの相補配列のいずれかに対し、約８０％〜約１００％の配列同一性を示してもよい。例えば、選択されたポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８，１２０、１２２；配列番号１、３、５、７〜１２、８９、９１、１１２、１１４、１１６、１１８，１２０、１２２のいずれかの連続した断片；ならびに前述のいずれかの相補配列のいずれかに対し、７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％  約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％の配列同一性を示してもよい。
【０１６０】
一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を阻害する、細胞又は微生物中でｉＲＮＡ分子として発現されることができるＤＮＡ分子は、１つ以上の標的害虫種（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）に存在する天然ポリヌクレオチドのすべて又は一部に対し特異的に相補的な単一のポリヌクレオチドを含有してもよく、又は当該ＤＮＡ分子は、複数のかかる特異的に相補的なポリヌクレオチドからキメラとして構築されることができる。
【０１６１】
一部の実施形態において、核酸分子は、「スペーサー」により分離された第一及び第二のポリヌクレオチドを含有してもよい。スペーサーは、それが望ましい場合に、第一及び第二のポリヌクレオチドの間の二次構造の形成を促進する任意のヌクレオチド配列を含有する領域であってもよい。１つの実施形態において、スペーサーは、ｍＲＮＡに対するセンス、又はアンチセンスのコードポリヌクレオチドの一部である。あるいはスペーサーは、核酸分子に共有結合されることができるヌクレオチド又はそのホモログの任意の組み合わせを含有してもよい。一部の例において、スペーサーは、（例えば、ＳＴ−ＬＳ１イントロンまたはＲＴＭ１イントロンのような）イントロンであってもよい。
【０１６２】
例えば、一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、１つ以上の異なるｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有してもよく、この場合において当該異なるｉＲＮＡ分子の各々は、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドを含有し、この場合において当該第一及び第二のポリヌクレオチドは互いに相補的である。第一及び第二のポリヌクレオチドは、スペーサーによりＲＮＡ分子内で繋がれていてもよい。スペーサーは、第一のポリヌクレオチド、又は第二のポリヌクレオチドの一部を構成してもよい。第一及び第二のヌクレオチドポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子の発現は、第一と第二のヌクレオチドポリヌクレオチドの特異的な分子内塩基対形成により、ｄｓＲＮＡ分子の形成を誘導してもよい。第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドは、害虫（例えば、鞘翅目の害虫又は半翅目の害虫）に由来するポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子又は転写された非コードポリヌクレオチド）、その誘導体、又はその相補的ポリヌクレオチドに対し、実質的に同一であってもよい。
【０１６３】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、多量体化リボヌクレオチドの二本鎖を含有し、及びリン酸−糖の主鎖又はヌクレオシドのいずれかに対し修飾を含んでもよい。ＲＮＡ構造における修飾を調節し、特異的阻害を可能にしてもよい。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子が生成されるよう、ユビキタスな酵素プロセスを経て修飾されてもよい。この酵素プロセスは、例えば真核生物のＤＩＣＥＲなどのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで利用してもよい。Elbashir ら (2001) Nature 411:494-8; and Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2を参照のこと。ＤＩＣＥＲ又は機能的に同等のＲＮａｓｅＩＩＩ酵素は、大きなｄｓＲＮＡ鎖及び／又はｈｐＲＮＡ分子を、小さなオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）へと開裂し、小さな各ヌクレオチドは約１９〜２５ヌクレオチドの長さである。これらの酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３個のヌクレオチド３’オーバーハング、ならびに５’リン酸末端、及び３’ヒドロキシル末端を有している。ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子はほどかれ、細胞中で一本鎖ＲＮＡへと分離される。次いでｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子から転写されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、両ＲＮＡ分子はその後、固有の細胞性ＲＮＡ分解メカニズムにより分解される。このプロセスによって、標的生物において、標的遺伝子によりコードされたＲＮＡの効果的な分解又は除去がもたらされ得る。この結末は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。一部の実施形態において、異種核酸分子から内因性ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、害虫において標的分子の下方制御を効率的に調節することができる。
【０１６４】
一部の実施形態において、核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、分子間ハイブリダイゼーションを介したｄｓＲＮＡ分子を形成することができる一本鎖ＲＮＡ分子へと転写されることができる非天然型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有してもよい。かかるｄｓＲＮＡは多くの場合、自己アセンブリし、害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目）の栄養源中で提供され、標的遺伝子の転写後阻害を実現することができる。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、２つの異なる非天然型ポリヌクレオチドを含有してもよく、それら各々は、害虫中の異なる標的遺伝子に対し特異的に相補的である。かかる核酸分子がｄｓＲＮＡ分子として、例えば鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫にもたらされる場合、当該ｄｓＲＮＡ分子は、害虫中の少なくとも２つの異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１６５】
Ｃ．  核酸分子の取得
害虫（例えば、鞘翅目及び半翅目）の様々なポリヌクレオチドを、例えばｉＲＮＡ及びｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子などの核酸分子の設計に対する標的として使用してもよい。しかしながら天然ポリヌクレオチドの選択は、容易な道ではない。例えば、鞘翅目及び半翅目において、ごく少数の天然ポリヌクレオチドのみが有効な標的である。特定の天然ポリヌクレオチドが本発明の核酸分子により有効に下方制御され得るか否かを確信をもって予測することはできず、又は特定の天然ポリヌクレオチドの下方制御が害虫の成長、発達、及び／又は生存に対し有害な作用を有しているか否かを確信をもって予測することはできない。鞘翅目及び半翅目の害虫の天然ポリヌクレオチドの大部分、例えばそれらから単離されたＥＳＴ（例えば、米国特許第7,612,194号に列記される鞘翅目害虫のポリヌクレオチド）は、当該害虫の成長、発達、及び／又は生存に有害な作用を有していない。害虫に対し有害な作用を有する天然ポリヌクレオチドであって、宿主植物中でかかる天然ポリヌクレオチドに対し相補的な核酸分子を発現させ、当該宿主植物に対し害を及ぼすことなく摂食で害虫に対し有害作用をもたらすための組み換え技術に使用することができることが予測可能なものはない。
【０１６６】
一部の実施形態において、核酸分子（害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目の害虫）の宿主植物に提供されるｄｓＲＮＡ分子）は、害虫の発達及び／又は生存に必須なタンパク質又はタンパク質部分、例えば代謝又は触媒の生化学的経路、細胞分割、エネルギー代謝、消化、宿主植物認識などに関与するポリペプチドなどをコードするｃＤＮＡを標的化するために選択される。本明細書に記載されるように、標的害虫生物体による、１つ以上のｄｓＲＮＡを含有する組成物の摂取によって、当該標的の死又は他の阻害がもたらされ得、当該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのセグメントは、標的害虫生物体の細胞中で産生される少なくとも実質的に同一のＲＮＡセグメントに対し特異的に相補的である。害虫由来の、ＤＮＡ又はＲＮＡいずれかのポリヌクレオチドを使用し、当該害虫の蔓延に対して抵抗性の植物細胞を構築するために使用されることができる。鞘翅目害虫及び／又は半翅目害虫の宿主植物（例えば、トウモロコシ（Z. mays）、セイヨウアブラナ（B. napus）、又はダイズ（G. max）を形質転換し、本明細書に提示される鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫に由来する１つ以上のポリヌクレオチドを含有してもよい。宿主へと形質転換されるポリヌクレオチドは、形質転換宿主内の細胞又は生物学的液体中でｄｓＲＮＡ構造を形成するＲＮＡを１つ以上コードしてもよく、それによって、害虫がトランスジェニック宿主と栄養学的関係性を形成するとき／形成した場合に、ｄｓＲＮＡを利用可能な状態とすることができる。これによって、害虫の細胞内で１つ以上の遺伝子の発現の抑制が生じ、最終的には死、又はその成長もしくは発達の阻害がもたらされ得る。
【０１６７】
したがって、一部の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目の害虫）の成長及び／又は発達に原則的に関与する遺伝子が標的とされる。本発明の使用に対する他の標的遺伝子としては、例えば、害虫の活性、動作、移動、成長、発達、感染性、及び餌場の確立に重要な役割を果たす遺伝子が挙げられる。ゆえに標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子又は転写因子であってもよい。さらに、本発明の使用に対する害虫の天然ポリヌクレオチドはまた、植物、ウイスル、細菌、又は昆虫の遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から誘導されてもよく、その機能は当分野の当業者に公知であり、そのポリヌクレオチドは標的害虫のゲノム中の標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションによって、既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを特定する方法は、当分野の当業者に公知である。
【０１６８】
一部の実施形態において、本発明は、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）分子を生成するためのポリヌクレオチドを含有する核酸分子を取得する方法を提供するものである。かかる実施形態の１つは以下を含有する：（ａ）害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目）におけるｄｓＲＮＡ介在性遺伝子抑制で、その発現、機能、及び表現型に関し、１つ以上の標的遺伝子を解析すること；（ｂ）ｄｓＲＮＡ介在性抑制解析において、成長又は発達の表現型の改変（例えば、低下）を示す、標的害虫由来のポリヌクレオチドもしくはそのホモログのすべて又は一部を含有するプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡライブラリーをプロービングすること；（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを特定すること；（ｄ）工程（ｂ）で特定されたＤＮＡクローンを単離すること；（ｅ）工程（ｄ）で単離されたクローンを含有するｃＤＮＡ断片又はｇＤＮＡ断片を配列解析することであって、配列解析された核酸分子がＲＮＡ又はそのホモログのすべて又は実質的な部分を含有していること；及び（ｆ）遺伝子、又はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｄｓＲＮＡのすべて又は実質的な部分を化学合成すること。
【０１６９】
さらなる実施形態において、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）分子の実質的な部分を生成するためのポリヌクレオチドを含有する核酸断片を取得する方法は以下を含む：（ａ）標的害虫（例えば、鞘翅目又は半翅目）由来の天然ポリヌクレオチドの部分に特異的に相補的な第一及び第二のオリゴヌクレオチドを合成すること；及び（ｂ）工程（ａ）の第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するｃＤＮＡ挿入又はｇＤＮＡ挿入を増幅させることであって、増幅された核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｄｓＲＮＡ分子の実質的な部分を含有する。
【０１７０】
核酸は、多くの方法により単離、増幅、又は生成することができる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから誘導された標的ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子、又は標的転写非コードポリヌクレオチド）、又はその一部のＰＣＲ増幅により取得されてもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、標的生物体から抽出されてもよく、及び核酸ライブラリーは、当分野の当業者に公知の方法を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡから調製されてもよい。標的生物体から作製されたｇＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーは、標的遺伝子のＰＣＲ増幅及び配列解析に使用されてもよい。確認されたＰＣＲ産物は、最小プロモーターを用いてセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用されてもよい。あるいは、核酸分子は、例えばホスホラミダイト化学などの標準的化学法を使用するなどの多くの技術のうちのいずれかにより合成されてもよい（例えばOzaki ら (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 並びに Agrawal ら (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423)、自動DNA合成装置（例えばP.E. Biosystems, Inc.（カリフォルニア州フォスターシティ）のモデル392又は394 DNA/RNA合成装置）の使用を含む、を参照のこと）。例えば、Beaucageら. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第4,980,460号、第4,725,677号、第4,415,732号、第4,458,066号、及び第4,973,679号を参照のこと。例えばホスホロチオアート、ホスホラミダートなどの非天然主鎖基を生じさせる別の化学法を使用することもできる。
【０１７１】
本発明のＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｈｐＲＮＡ分子は、手動又は自動化された反応を介して、又は当該ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｈｐＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸分子を含有する細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで、当分野の当業者により化学的に又は酵素的に作製することができる。ＲＮＡはまた、部分的に、又はすべて有機合成により作製することもでき、任意の修飾リボヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素合成法又は有機合成法により導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞性ＲＮＡポリメラーゼ又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することができる。ポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な発現構築物は当分野に公知である。例えば、国際特許PCT出願公開WO97/32016；及び米国特許第5,593,874号、第5,698,425号、第5,712,135号、第5,789,214号、及び第5,804,693号を参照のこと。化学的に合成されたＲＮＡ分子、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素合成により合成されたＲＮＡ分子は、精製された後に細胞に導入されてもよい。例えば、ＲＮＡ分子は溶媒又は樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせにより、混合物から精製されることができる。あるいは、化学的に合成されたＲＮＡ分子、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素合成により合成されたＲＮＡ分子は、サンプル処理を原因とするロスを回避するために、例えば、精製無しで、又は最低限の精製で使用されてもよい。ＲＮＡ分子は、保管のために乾燥されてもよく、又は水溶液に溶解されてもよい。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子の二重鎖のアニーリング、及び／又は安定化を促進させる緩衝液又は塩を含有してもよい。
【０１７２】
複数の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖により形成されてもよく、又は２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成されてもよい。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで合成されてもよい。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つ又は２つのＲＮＡ鎖の転写を調節することができ、又はクローン化ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写を調節することができる。害虫の標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織、又は細胞における特異的転写により（例えば組織特異的プロモーターにより）；宿主の環境条件の刺激により（例えば、感染、ストレス、温度、及び／又は化学的誘導物質に反応性の誘導性プロモーターを使用することにより）；及び／又は宿主の発達段階又は齢で転写を操作することにより（例えば、発達段階特異的プロモーターを使用することにより）、宿主−標的化されてもよい。ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれで転写されていてもよく、ポリアデニル化されても、されなくてもよく、及び細胞の翻訳機構によりポリペプチドへと翻訳されることができても、できなくてもよい。
【０１７３】
Ｄ．  組み換えベクター及び宿主細胞の形質転換
一部の実施形態において、本発明はまた、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、又は植物細胞）への導入のためのＤＮＡ分子を提供するものであり、当該ＤＮＡ分子はＲＮＡへと発現され、害虫（例えば、鞘翅目の害虫又は半翅目の害虫）により摂取されることで当該害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の抑制を実現させるポリヌクレオチドを含有する。したがって、一部の実施形態は、植物細胞においてｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）分子として発現されることができ、害虫の標的遺伝子発現を阻害するポリヌクレオチドを含有する組み換え核酸分子を提供するものである。発現を開始させ、又は増強させるために、かかる組み換え核酸分子は、１つ以上の制御エレメントを含有してもよく、その制御エレメントはｉＲＮＡとして発現されることができるポリヌクレオチドに操作可能に連結されていてもよい。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は公知であり、その方法を用いて本発明のポリヌクレオチドを発現させることができる。例えば、国際特許ＰＣＴ出願公開WO06/073727、及び米国特許出願公開2006/0200878 Alを参照のこと。
【０１７４】
特定の実施形態において、本発明の組み換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含有することができる。かかる組み換えＤＮＡ分子は、摂食することで、害虫（例えば、鞘翅目の害虫又は半翅目の害虫）の細胞において内因性標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードしてもよい。多くの実施形態において、転写されたＲＮＡは、安定化した形態、例えば、ヘアピンアンドステムアンドループ構造として提供され得るｄｓＲＮＡ分子を形成してもよい。
【０１７５】
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖は、配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８及び１２０；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８及び１２０のいずれかの相補配列；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８及び１２０のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片（例えば、配列番号７〜１２、９１、及び１２２）；配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８及び１２０のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１，３，５、及び７〜１２のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）（例えば、ＷＣＲ）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１，３，５、及び７〜１２のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１、３，５及び７〜１２のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１，３，５，及び７〜１２のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros ）生物体（例えば、BSB）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号８９及び９１を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片：配列番号８９及び９１を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２を含有するメリゲテス（Meligethes ）（例えば、PB）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し実質的に相同なポリヌクレオチドからの転写により形成されることができる。
【０１７６】
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖は、配列番号７〜１２、９１、及び１２２；配列番号７〜１２、９１、及び１２２のいずれかの相補配列；配列番号７〜１２、９１、及び１２２のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号７〜１２，９１、及び１２２のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し実質的に相同なポリヌクレオチドからの転写により形成されてもよい。
【０１７７】
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードする組み換えＤＮＡ分子は、コード領域を含有してもよく、この場合において少なくとも２つのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプロモーターに対して、１つのポリヌクレオチドはセンス方向に、他方のポリヌクレオチドがアンチセンス方向になるよう配置され、この場合においてセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば約５（〜５）〜約千（〜１０００）のヌクレオチドのスペーサーにより連結され、又は繋がれる。スペーサーは、センスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドの間にループを形成してもよい。センスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、実質的に、標的遺伝子（たとえば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８９、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８または配列番号１２０を含有するｓｈｉ遺伝子）またはその断片に対し、相同であってもよい。しかしながら一部の実施形態において、組み換えＤＮＡ分子は、スペーサー無しでｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードしてもよい。複数の実施形態において、センスコードポリヌクレオチド、及びアンチセンスコードポリヌクレオチドは異なる長さであってもよい。
【０１７８】
害虫に対し有害な作用を有するとして特定されたポリヌクレオチド、又は害虫に関し植物防御的効果を有するとして特定されたポリヌクレオチドは、本発明の組み換え核酸分子中の適切な発現カセットの生成を通して、容易に発現ｄｓＲＮＡ分子へと組み込まれ得る。例えば、かかるポリヌクレオチドは、標的遺伝子ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８９、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、又は配列番号１２０、ならびに前述のいずれかの断片のいずれかを含有するｓｈｉ遺伝子）に対応する第一のセグメントを取り込み；このポリヌクレオチドを、第一のセグメントに対し相同ではない、又は相補的ではない第二のセグメントスペーサー領域に連結させ；及び第三のセグメントにこれを連結させることであって、第三のセグメントの少なくとも一部は第一のセグメントに対し実質的に相補的である、ことにより、ステムアンドループ構造を伴うヘアピンとして発現され得る。かかる構築物は、第一のセグメントと第三のセグメントの分子内塩基対形成によってステムアンドループ構造を形成し、当該ループ構造は第二のセグメントを含有して形成される。例えば、米国特許出願公開2002/0048814及び2003/0018993、ならびに国際特許PCT出願公開WO94/01550及びWO98/05770を参照のこと。ｄｓＲＮＡ分子は、例えばステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）などの二本鎖構造の形態で生成されてもよく、それによって、害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）の天然ポリヌクレオチドに対し標的化されたｓｉＲＮＡの作製が、例えばｓｉＲＮＡ生成の増強をもたらす、又はｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写後遺伝子サイレンシングを阻むメチル化を低下させる、追加の植物発現可能なカセット上での、当該標的化遺伝子断片の共発現により増強される。
【０１７９】
本発明の実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）阻害性レベルの１つ以上のｉＲＮＡ分子の発現を実現させるための、植物への本発明の組み換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組み換えＤＮＡ分子は、例えば直線状プラスミド又は閉環状プラスミドなどのベクターであってもよい。ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、又は宿主ゲノムへと導入される総ＤＮＡを共に含有している２以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。さらに、ベクターは、発現ベクターであってもよい。本発明の核酸は例えば、１つ以上の宿主において、連結されたコードポリヌクレオチド又は他のＤＮＡエレメントの発現を誘導するよう機能する適切なプロモーターの制御下で、ベクターへと適切に挿入されてもよい。この目的に対して多くのベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は主に、ベクターへと挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存している。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡ増幅又はＤＮＡ発現）、及び適合性のある特定の宿主細胞に依存して、様々な構成要素を含有している。
【０１８０】
害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）からの防御をトランスジェニック植物に付与するために、組み換えＤＮＡは、例えば、組み換え植物の組織又は体液内でｉＲＮＡ分子（例えばｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）へと転写されてもよい。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物種に対し損害を与え得る害虫内で、対応する転写ポリヌクレオチドに対し実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有してもよい。害虫は、トランスジェニック宿主植物の細胞において転写されるｉＲＮＡ分子と、ｉＲＮＡ分子を含有するトランスジェニック宿主植物の細胞又は体積を摂取することにより、接触してもよい。したがって特定の例において、標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に寄生する鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫内で、ｉＲＮＡ分子により抑制される。一部の実施形態において、標的の鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫における標的遺伝子発現の抑制は、害虫による攻撃から防御される植物をもたらし得る。
【０１８１】
本発明の組み換え核酸を形質転換された植物細胞と栄養学的関係性にある害虫へのｉＲＮＡ分子の送達を可能とするためには、植物細胞中でのｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が必要とされる。したがって、組み換え核酸分子は、例えば細菌細胞などの宿主細胞中で機能する異種プロモーターエレメントなどの１つ以上の制御エレメントに操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含有してもよく、細菌細胞は当該核酸分子が増幅される場所であり、植物分子は核酸分子が発現される場所である。
【０１８２】
本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとしては、誘導性、ウイルス性、合成、又は構造性のプロモーターが挙げられ、それらはすべて当分野に公知である。かかるプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第6,437,217号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；米国特許第5,641,876号（イネアクチンプロモーター）；米国特許第6,426,446号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；米国特許第6,429,362号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；米国特許第6,232,526号（トウモロコシＡ３プロモーター）；米国特許第6,177,611号（構造性トウモロコシプロモーター）；米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）；米国特許第6,433,252号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；米国特許第6,429,357号（イネアクチン２プロモーター、及びイネアクチン２イントロン）；米国特許第6,294,714号（光誘導性プロモーター）；米国特許第6,140,078号（塩誘導性プロモーター）；米国特許第6,252,138号（病原体誘導性プロモーター）；米国特許第6,175,060号（リン欠乏誘導性プロモーター）；米国特許第6,388,170号（二方向性プロモーター）；米国特許第6,635,806号（ガンマ−コイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）プロモーター）；及び米国特許出願公開第2009/757,089号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が挙げられる。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター(Ebertら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9)、及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導性プラスミド上に担持されている）；カリモウイルスのプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター(Lawtonら(1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24)；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター(Odellら (1985) Nature 313:810-2；ゴマノハモザイクウイルス３５Ｓプロモーター(Walkerら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8)；スクロースシンターゼプロモーター (Yang 及びRussell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8)；Ｒ遺伝子複合体プロモーター(Chandlerら(1989) Plant Cell 1:1175-83)；クロロフィルII a/b結合タンパク質遺伝子プロモーター； ＣａＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号）；ＦＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第6,051,753号及び第5,378,619号）；PC1SVプロモーター（米国特許第5,850,019号）ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第6,677,503号）；及びＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（GenBank（商標）アクセッション番号V00087；Depickerら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevanら(1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
【０１８３】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、例えば根特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターを含有する。根特異的プロモーターは、根組織で限局的又は優先的に、操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドの発現を誘導する。根特異的プロモーターの例は、当分野に公知である。例えば、米国特許第5,110,732号、第5,459,252号、及び第5,837,848号、ならびにOpperman ら. (1994) Science 263:221-3、及びHirel ら (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18を参照のこと。一部の実施形態において、本発明に従う鞘翅目及び／又は半翅目害虫の制御のためのポリヌクレオチド又は断片は、当該ポリヌクレオチド又は断片に対し反対の転写方向を向いた２つの根特異的プロモーターの間でクローニングされてもよく、及びそれらはトランスジェニック植物細胞において操作可能であり、その中で発現され、トランスジェニック植物細胞中でＲＮＡ分子を産生し、その後、上記に記載されるようにｄｓＲＮＡ分子を形成してもよい。植物組織中で発現されるｉＲＮＡ分子は、害虫に接触されてもよく、それにより標的遺伝子発現の抑制が実現される。
【０１８４】
核酸に操作可能に任意で連結され得る追加の制御エレメントとしては、翻訳リーダーエレメントとして機能する、プロモーターエレメントとコードポリヌクレオチドの間に位置する５’ＵＴＲが挙げられる。翻訳リーダーエレメントは、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡで存在し、一次転写物のプロセッシング、及び／又はＲＮＡの安定性に影響を与えうる。翻訳リーダーエレメントの例としては、トウモロコシ及びペチュニアのヒートショックプロテインリーダー（米国特許第5,362,865号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、及びその他が挙げられる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの非限定的な例としては、ＧｍＨｓｐ（米国特許第5,659,122号）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第5,362,865号）、ＡｔＡｎｔ１、ＴＥＶ (Carrington 及び Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7)、及びＡＧＲｔｕｎｏｓ (GenBank（商標）アクセッション番号V00087、及びBevanら(1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
【０１８５】
核酸に操作可能に任意で連結され得る追加の制御エレメントとしては、３’非翻訳エレメント、３’転写終結領域、又はポリアデニル化領域が挙げられる。これらはポリヌクレオチドの下流に位置する遺伝的エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、及び／又は転写もしくはｍＲＮＡのプロセッシングに影響を与え得る他の制御シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは植物においいて機能し、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸ヌクレオチドの付加をもたらす。ポリアデニル化エレメントは、様々な植物遺伝子から誘導することができ、又はＴ−ＤＮＡ遺伝子から誘導することができる。３’翻訳終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（nos 3'；Fraley ら(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht ら (1989) Plant Cell 1:671-80に提示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウマメ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ps.RbcS2-E9；Coruzzi ら (1984) EMBO J. 3:1671-9）及びAGRtu.nos（GenBank（商標）アクセッション番号E01312）からのものが挙げられる。
【０１８６】
一部の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上に操作可能に連結された、上記の制御エレメントのうちの少なくとも１つを含有する、単離され、生成されたＤＮＡ分子を含有する植物形質転換ベクターを含み得る。発現されたとき、１つ以上のポリヌクレオチドは、害虫（例えば、鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）の天然ＲＮＡ分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するｉＲＮＡ分子を１つ以上生じさせる。したがって、ポリヌクレオチドは、標的とされた鞘翅目及び／又は半翅目の害虫のＲＮＡ転写物内に存在するポリリボヌクレオチドのすべて又は一部をコードするセグメントを含有してもよく、及び標的とされた害虫転写物のすべて又は一部の反転されたリピートを含有してもよい。植物形質転換ベクターは、２つ以上の標的ポリヌクレオチドに対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有してもよく、それによって、標的害虫の１つ以上の群れ、又は種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害する２つ以上のｄｓＲＮＡの生成が可能となる。異なる遺伝子中に存在するポリヌクレオチドに対し特異的に相補的なポリヌクレオチドのセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一混成核酸分子へと組み合わされることができる。かかるセグメントは連続的であってもよく、又はスペーサーにより分離されていてもよい。
【０１８７】
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ、すでに含有している本発明のプラスミドは、同じプラスミド内に追加ポリヌクレオチドを連続挿入することにより改変されていてもよく、当該追加のポリヌクレオチドは、当該元の少なくとも１つのポリヌクレオチドと同じ制御エレメントに操作可能に連結されている。一部の実施形態において、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害用に設計されていてもよい。一部の実施形態において、阻害される複数の遺伝子は、同じ害虫種（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目）から取得されてもよく、それらは核酸分子の有効性を増強させるものであってもよい。他の実施形態において、遺伝子は異なる害虫から誘導されてもよく、それによって、その剤が有効である害虫の範囲を広げることができる。複数の遺伝子が、抑制の標的とされた場合、又は発現と抑制の組み合わせの標的とされた場合、ポリシストロニックなＤＮＡエレメントが操作されてもよい。
【０１８８】
本発明の組み換え核酸分子又はベクターは、例えば植物細胞などの形質転換細胞に選択可能な表現型を寄与する選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーを使用し、本発明の組み換え核酸分子を含有する植物又は植物細胞を選択してもよい。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、など）又は除草剤抵抗性（例えばグリホサートなど）をコードしてもよい。選択マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などを使用し選択されることができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するｎｉｔｒｉｌａｓｅ遺伝子；イミダゾリノン又はスルホニルウレアの抵抗性を寄与する変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子；及びメトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、及びテトラサイクリンなどに対する抵抗性を寄与する選択マーカーが複数、利用可能である。かかる選択マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号、及び第6,118,047号に解説されている。
【０１８９】
本発明の組み換え核酸分子又はベクターは、スクリーンマーカーを含有してもよい。スクリーンマーカーを使用し、発現を監視してもよい。例示的なスクリーンマーカーとしては、様々な発色性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ又はｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson ら (1987) Plant Mol.Biol. Rep.5:387-405）；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードするＲ‐ｌｏｃｕｓ遺伝子(Dellaporta ら  (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18thStadler Genetics Symposium, P. Gustafson 及び R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82)；β−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe ら (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41)；様々な発色性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子(Ow ら (1986) Science 234:856-9)；発色性カテコール類を転換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子(Zukowski ら (1983) Gene 46(2-3):247-55)；アミラーゼ遺伝子(Ikatu ら (1990) Bio/Technol. 8:241-2)；チロシンをＤＯＰＡ及びドーパキノン（次にメラニンへと濃縮される）へと酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katz ら (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14)；及びα-ガラクトシダーゼ、が挙げられる。 
一部の実施形態において、上記に記載される組み換え核酸分子は、トランスジェニック植物の作製方法、及び植物中で異種核酸を発現させ、害虫（例えば鞘翅目の害虫及び／又は半翅目の害虫）に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製する方法において使用されてもよい。植物形質転換ベクターは、例えばｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターへと挿入し、これらを植物へと導入することにより調製することができる。
【０１９０】
宿主細胞の適切な形質転換方法としては、細胞へＤＮＡを導入することができる任意の方法が挙げられるが、例えばプロトプラストの形質転換による方法（例えば米国特許第5,508,184号を参照のこと)、乾燥／阻害介在性ＤＮＡ取り込みによる方法（例えば、Potrykus ら (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照のこと)、エレクトロポレーションによる方法（例えば、米国特許第5,384,253号を参照のこと）、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌による方法（例えば、米国特許第5,302,523号及び第5,464,765号を参照のこと）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換による方法（例えば、米国特許第5,563,055号、第5,591,616号、第5,693,512号、第5,824,877号、第5,981,840号、及び第6,384,301号を参照のこと）、及びDNAコート化粒子の加速による方法（例えば、米国特許第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号、及び第6,403,865号を参照のこと）などが挙げられる。トウモロコシの形質転換に特に有用な技術は、例えば米国特許第7,060,876号及び第5,591,616号、ならびに国際特許PCT出願公開WO95/06722に記載されている。例えばこれらの技術を適用することにより、事実上すべての種の細胞を安定的に形質転換することができる。一部の実施形態において、形質転換DNAは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞の種の場合には、トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物体へと再生することができる。これらの技術のいずれかを使用して、例えばトランスジェニック植物のゲノム中に、１つ以上のｉＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸を含有するトランスジェニック植物を作製してもよい。
【０１９１】
植物への発現ベクターの導入に最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然形質転換系に基づく方法である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のそれぞれＴｉプラスミドとＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持している。Ｔｉ（腫瘍誘導性）プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含有しており、形質転換植物へと移送される。Ｔｉプラスミドの他のセグメントであるＶｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの移送に寄与している。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端リピートに隣接している。改変バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導性遺伝子は削除され、Ｖｉｒ領域の機能が利用され、Ｔ−ＤＮＡ境界エレメントに隣接する外来性ＤＮＡが移送される。Ｔ−領域はまた、トランスジェニック細胞及び植物の効率的な回収のための選択マーカーを含有してもよく、及び例えばｄｓＲＮＡコード核酸などの移送のためのポリヌクレオチド挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含有してもよい。
【０１９２】
従って一部の実施形態において、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミドから誘導され（例えば、米国特許第4,536,475号、第4,693,977号、第4,886,937号、及び第5,501,967号、ならびに欧州特許第EP 0 122 791号を参照のこと）、又はA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のRiプラスミドから誘導される。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば限定されないが、Herrera-Estrellaら (1983) Nature 303:209-13；Bevanら . (1983) Nature 304:184-7；Kleeら . (1985) Bio/Technol. 3:637-42、及び欧州特許第EP 0 120 516号に記載されるもの、ならびに前述のいずれかから誘導されるものが挙げられる。例えばシノリゾビウム（Sinorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）、及びメソリゾビウム（Mesorhizobium）などの植物と自然に相互作用する他の細菌を改変し、多くの多様な植物への遺伝子移送を介在してもよい。これらの植物関連共生細菌は、不活性化Ｔｉプラスミド及び適切なバイナリーベクターの両方を獲得することにより、遺伝子移送の能力を有することができる。
【０１９３】
レシピエント細胞に外因性DNAをもたらした後、形質転換細胞は多くの場合、さらなる培養及び植物再生に関して特定される。形質転換細胞を特定する能力を改善するために、形質転換体を作製するために使用された形質転換ベクターと共に、前述の選択マーカー又はスクリーンマーカー遺伝子を利用することを所望してもよい。選択マーカーが使用された場合、形質転換細胞は、当該細胞を選択剤へと曝露させることにより、形質転換された可能性のある細胞群内で特定される。スクリーンマーカーが使用された場合、細胞は、所望のマーカー遺伝子の形質に対しスクリーニングされてもよい。
【０１９４】
選択剤への曝露を生き残った細胞、又はスクリーニングアッセイにおいて陽性を記録した細胞を、植物再生を支持する培地中で培養してもよい。一部の実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳ及びＮ６培地）を、例えば成長調節因子などのさらなる物質を含ませることにより改変してもよい。組織は、植物再生の試みを開始するのに充分な組織が利用可能となるまで、成長調節因子を有する基礎培地上で維持されてもよく、又は組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、手動選択ラウンドを反復した後、発芽形成に寄与する培地へ組織を移送してもよい。培養物は、充分な発芽形成が発生するまで、定期的に移送される。発芽が形成されたら、それらを、根形成に寄与する培地へと移送する。充分な根が形成されたら、さらなる成長と成熟のために植物を土壌へと移してもよい。
【０１９５】
対象の核酸分子（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫において標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ分子を１つ以上コードするＤＮＡなど）が再生植物中に存在していることを確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。かかるアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸配列解析などの分子生物学的アッセイ；例えばタンパク質産物の存在を検出するための、例えば免疫学的手法（ＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロット）による、又は酵素機能による生化学的アッセイ；例えば葉又は根のアッセイなどの植物部分のアッセイ；及び再生植物全体の表現型の解析などが挙げられる。
【０１９６】
例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅により、組み込みイベントを解析してもよい。ＰＣＲ遺伝子型決定は、限定されないが、ゲノム内に組み込まれた対象核酸分子を含有することが予測されている単離宿主植物カルス組織由来のｇＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行った後、ＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングと配列解析を含むものと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型決定法は詳細に記載されており（例えば、Rios, G. ら (2002) Plant J. 32:243-53)、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）、又はダイズ（G. max)）由来のｇＤＮＡ、又は細胞培養物を含む組織型由来のゲノムＤＮＡへと適用することができる。
【０１９７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は通常、１つの染色体に挿入された単一組み換えＤＮＡを含有する。単一組み換えＤＮＡのポリヌクレオチドは、「トランスジェニックイベント」又は「組み込みイベント」と呼称される。かかるトランスジェニック植物は、挿入された外因性ポリヌクレオチドに関し、ヘテロ接合体である。一部の実施形態において、導入遺伝子に関してホモ接合体のトランスジェニック植物は、単一外因性遺伝子を含有する、独立分離トランスジェニック植物、例えばＴ０植物を、自身と性的交配（自殖）させ、Ｔ１種子を産生することにより取得することができる。産生されたＴ１種子のうちの４分の１が、導入遺伝子に関しホモ接合体である。Ｔ１種子を発芽させることにより、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能とするＳＮＰアッセイ又はサーマル増幅アッセイを通常は使用して、ヘテロ接合性に関し検証することができる植物が生じる（すなわち、接合性アッセイ）。
【０１９８】
特定の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なるｉＲＮＡ分子が、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）阻害効果を有する植物細胞において産生されている。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸から発現されてもよく、又は１つの形質転換イベントで導入された１つの核酸から発現されてもよい。一部の実施形態において、複数のｉＲＮＡ分子は、単一のプロモーターの制御下で発現される。他の実施形態において、複数のｉＲＮＡ分子は、複数のプロモーターの制御下で発現される。１つ以上の害虫内の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０により規定される遺伝子座）に対し各々相同な複数のポリヌクレオチドを含有する単一のｉＲＮＡ分子が、同一種の害虫の異なる群において、又は別種の害虫においての両方で発現されてもよい。
【０１９９】
組み換え核酸分子を用いた植物の直接的な形質転換に加え、トランスジェニック植物は、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第一の植物と、かかるイベントを欠く第二の植物を交配させることにより作製することもできる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換え核酸分子を、トランスジェニック植物を産生するための形質転換を受入可能な第一の植物系統へと導入し、そのトランスジェニック植物を第二の植物系統と交配させ、ｉＲＮＡ分子コードするポリヌクレオチドを第二の植物系統に遺伝子移入してもよい。
【０２００】
一部の態様において、形質転換植物細胞に由来するトランスジェニック植物から産生された種子及び商品生産物が含まれ、当該種子及び商品生産物は、検出可能な量の本発明核酸を含有している。一部の実施形態において、かかる商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を取得し、それらから食物又は餌を作製することにより製造されてもよい。本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含有する商品生産物としては、例えば限定されないが、以下が挙げられる：植物種子の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子、及び本発明核酸を１つ以上含有する組み換え植物又は種子の任意の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子を含有する任意の食品。１つ以上の農産物又は商品生産物中において、本発明ポリヌクレオチドを１つ以上検出することは、当該一次産品又は商品生産物が、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の制御を目的とした本発明ｉＲＮＡ分子を１つ以上発現するよう設計されたトランスジェニック植物から作製されたことの事実上の証拠である。
【０２０１】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子を含有するトランスジェニック植物または種子は、そのゲノム中に、限定されないが以下を含む、他のトランスジェニックイベントを少なくとも１つさらに含有してもよい：配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０により規定されるもの以外の鞘翅目害虫中の座位を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント。たとえば座位は、Ｃａｆ１−１８０ (米国特許出願公開2012/0174258)、ＶａｔｐａｓｅＣ(米国特許出願公開2012/0174259)、Ｒｈｏ１ (米国特許出願公開2012/0174260)、ＶａｔｐａｓｅＨ(米国特許出願公開2012/0198586)、PPI-87B (米国特許出願公開2013/0091600)、ＲＰＡ７０ (米国特許出願公開2013/0091601)、およびＲＰＳ６(米国特許出願公開2013/0097730)からなる群から選択される１つ以上の座位である；鞘翅目害虫および／または半翅目害虫以外の生物体（たとえば植物寄生性線虫）中の遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫性タンパク質（たとえば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫性タンパク質およびＰＩＰ−１ポリペプチド）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（たとえば、グリホサートに対する耐性をもたらす遺伝子）；およびたとえば生産量の増加、脂肪酸代謝の変化、または細胞質雄性不稔の回復など、トランスジェニック植物中の望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、植物における他の昆虫制御及び疾病の形質と組み合わされて、植物疾病及び昆虫ダメージの制御を増強するための所望される形質を得てもよい。異なる作用機序を用いる昆虫制御形質を組み合わせることによって、単一の制御形質を有する植物よりも優れた耐久性を有する防御トランスジェニック植物がもたらされ得、例えばその理由は、当該形質に対する抵抗性が野外で発現する可能性が低下するためである。
【０２０２】
Ｖ．    害虫における標的遺伝子抑制
Ａ．    概要
本発明の一部の実施形態において、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の制御に有用な少なくとも１つの核酸分子が害虫にもたらされ、当該核酸分子は、当該害虫においてＲＮＡｉ介在性遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態において、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）が、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫にもたらされてもよい。一部の実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、当該核酸分子と害虫が接触することにより、害虫へともたらされてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、例えば栄養性組成物などの害虫の給餌基質中に提供されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、害虫により摂食される、核酸分子を含有する植物性物質の摂食を介して提供されてもよい。ある実施形態において、核酸分子は、例えば組み換え核酸を含有するベクターを用いた植物細胞の形質転換ならびに形質転換された植物細胞からの植物物質及び植物全体の再生により、植物物質へと導入された組み換え核酸の発現を介して植物物質中に存在する。
【０２０３】
Ｂ．  ＲＮＡｉ介在性標的遺伝子の抑制
実施形態において、本発明は、例えば標的ポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有する鎖を少なくとも１つ含有するｉＲＮＡ分子を設計することにより、害虫（例えば、鞘翅目（例えば、ＷＣＲ、ＮＣＲ、又はＰＢ）又は半翅目（例えば、ＢＳＢ）の害虫）のトランスクリプトームにおいて必須の天然ポリヌクレオチド（例えば、必須遺伝子）を標的とするよう設計され得るｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｈｐＲＮＡ）を提供するものである。そのように設計されたｉＲＮＡ分子の配列は、標的ポリヌクレオチドの配列と同一であってもよく、又はｉＲＮＡ分子とその標的ポリヌクレオチドの間の特異的ハイブリダイゼーションを阻害しないミスマッチを組み込んでもよい。
【０２０４】
本発明のｉＲＮＡ分子は、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）において遺伝子抑制を行うための方法に使用されてもよく、それによって、害虫により生じる植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含有する防御された形質転換植物）への損害のレベル又は発生率を低下させてもよい。本明細書において使用される場合、「遺伝子抑制」という用語は、ｍＲＮＡへの遺伝子転写及び引き続くｍＲＮＡの翻訳の結果として生成されるタンパク質のレベルを低下させるための公知の方法のいずれかを指し、遺伝子又はコードポリヌクレオチドからタンパク質発現の低下を含み、発現の転写後阻害及び転写抑制を含む。転写後阻害は、抑制の標的とされた遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべて、又は一部と、抑制に使用される対応するｉＲＮＡ分子の間の特異的相同性により介在される。さらに、転写後阻害とは、リボソームによる結合に関して細胞内で利用可能なｍＲＮＡの量の実質的な低下、及び計測可能な低下を指す。
【０２０５】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、酵素のＤＩＣＥＲにより短いｓｉＲＮＡ分子（およそ２０ヌクレオチドの長さ）へと開裂されてもよい。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲの活性により生成された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡの「パッセンジャーストランド」と「ガイドストランド」へと分離され得る。パッセンジャーストランドは分解されてもよく、ガイドストランドはＲＩＳＣへと組み込まれてもよい。ガイドストランドが特異的に相補的なｍＲＮＡ分子のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションし、引き続き酵素のアルゴノート（ＲＩＳＣ複合体の触媒要素）により開裂されることによって、転写後阻害が発生する。
【０２０６】
本発明の複数の実施形態において、任意の形態のｉＲＮＡ分子を使用してもよい。当分野の当業者であれば、ｄｓＲＮＡ分子は、通常、一本鎖ＲＮＡ分子よりも、調製の間、及びｉＲＮＡ分子を細胞に提供する工程の間でさらに安定しており、及び通常、細胞内においてもさらに安定である。したがって、ｓｉＲＮＡ分子及びｍｉＲＮＡ分子がたとえば一部の実施形態においては等しく効果的である場合がある一方で、安定性を理由としてｄｓＲＮＡ分子が選択される場合もある。
【０２０７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを含有する核酸分子が提供され、当該ポリヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）のゲノム内のポリヌクレオチドによりコードされる核酸分子に対して実質的に相同なｉＲＮＡ分子を産生してもよい。ある実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｉＲＮＡ分子は、ステムループ構造を有する安定化ｄｓＲＮＡ分子であってもよい。害虫が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｉＲＮＡ分子と接触した後、害虫の標的遺伝子（例えば必須遺伝子）の転写後阻害が発生してもよい。
【０２０８】
本発明の一部の実施形態において、ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）を含有する核酸分子の発現は、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の標的遺伝子の転写後阻害のための方法において使用され、当該ポリヌクレオチドは、以下からなる群から選択される：配列番号９８；配列番号９８の相補配列；配列番号９９；配列番号９９の相補配列；配列番号１００；配列番号１００の相補配列；配列番号１１０；配列番号１１０の相補配列；配列番号１２５〜１３０；配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号３を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号５を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；および配列番号８９を含有する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１１２を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１１４を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１１６を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１１８を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡ；配列番号１２０を含有するメリゲテス（Meligethes ）生物体の天然コードポリヌクレオチドから発現されたＲＮＡの相補配列。前述のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含有する核酸分子としては、たとえば配列番号１０１〜１０６および１１１および配列番号１２５〜１３０からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含有する断片が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において���前述のいずれかと少なくとも約８０％同一（例えば、７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％及び１００％）である核酸分子の発現が使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の少なくとも１つの細胞に存在するＲＮＡ分子に対し特異的にハイブリダイズする核酸分子が発現されてもよい。
【０２０９】
ＲＮＡｉ転写後阻害系は、遺伝子変異、系統ポリモルフィズム、又は進化的多様性によるものと予測され得る標的遺伝子間の配列変動を許容することができるという点が、本明細書の一部の実施形態の重要な特性である。導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたｍＲＮＡのいずれかに対し、特異的にハイブリダイズ可能である限りは、当該導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたｍＲＮＡのいずれかに対し完全に相同性である必要性はない。さらに、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたｍＲＮＡのいずれかに対し、完全超である必要はない。
【０２１０】
本発明のｉＲＮＡ技術を使用した標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、ｉＲＮＡ分子に対し実質的に相同的なポリヌクレオチドが、遺伝子阻害の標的となる。一部の実施形態において、標的遺伝子の一部の配列に対して同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子が、阻害に使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、標的ポリヌクレオチドに対し、１つ以上の挿入、欠失、及び／又は点変異を有するポリヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を使用してもよい。特定の実施形態において、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部は、例えば少なくとも約８０％〜、少なくとも約８１％〜、少なくとも約８２％〜、少なくとも約８３％〜、少なくとも約８４％〜、少なくとも約８５％〜、少なくとも約８６％〜、少なくとも約８７％〜、少なくとも約８８％〜、少なくとも約８９％〜、少なくとも約９０％〜、少なくとも約９１％〜、少なくとも約９２％〜、少なくとも約９３％〜、少なくとも約９４％〜、少なくとも約９５％〜、少なくとも約９６％〜、少なくとも約９７％〜、少なくとも約９８％〜、少なくとも約９９％〜、少なくとも約１００％〜、及び１００％の配列同一性を共有してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の二重鎖領域が、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズしてもよい。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、高い相同性を示す全長未満の長さのポリヌクレオチドが、より長いが相同性は低いポリヌクレオチドを相殺する。標的遺伝子転写物の一部と同一であるｄｓＲＮＡ分子の二重鎖領域のポリヌクレオチドの長さは、少なくとも約２５、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基又は少なくとも約１０００塩基であってもよい。一部の実施形態において、２０〜１００ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。特定の実施形態において、約２００〜３００ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子のサイズにより、約５００〜１０００ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。
【０２１１】
ある実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の標的遺伝子の発現は、重大な阻害が発生するよう、当該害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％まで阻害されてもよい。重大な阻害とは、検出可能な表現型（例えば、成長の停止、摂食の停止、発達の停止、死の誘導など）、又は阻害される標的遺伝子に対応するＲＮＡ及び／又は遺伝子産物の検出可能な低下を生じさせる閾値を超える阻害を指す。本発明のある実施形態においては、害虫の実質的に全ての細胞で阻害が発生するが、他の実施形態では、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ阻害が発生する。
【０２１２】
一部の実施形態において、転写抑制は、プロモーターＤＮＡ、又はその相補配列に対して実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ分子が細胞中に存在することにより調節され、「プロモータートランス抑制」と呼ばれる効果をもたらす。遺伝子抑制は、例えばｄｓＲＮＡ分子を含有する植物物質を摂取又は接触することにより、かかるｄｓＲＮＡ分子を摂取又は接触し得る害虫の標的遺伝子に対して有効であってもよい。プロモータートランス抑制における使用のためのｄｓＲＮＡ分子は、害虫の細胞における、１つ以上の相同な、又は相補的なポリヌクレオチドの発現を阻害又は抑制するよう特異的に設計されてもよい。植物細胞で遺伝子発現を制御する、アンチセンス方向又はセンス方向のＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号、第5,759,829号、第5,283,184号、及び第5,231,020号に開示されている。
【０２１３】
Ｃ．  害虫にもたらされたｉＲＮＡ分子の発現
害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）におけるＲＮＡｉ介在性遺伝子阻害のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ様式のうちのいずれか１つで行うことができる。次いで、例えば害虫とｉＲＮＡ分子を接触させることにより、又は害虫に摂取させることにより、もしくはさもなければ、ｉＲＮＡ分子を内在化させることにより、害虫にｉＲＮＡ分子がもたらされてもよい。一部の実施形態は、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の形質転換された宿主植物、形質転換された宿主細胞、及び形質転換された植物の子孫を含む。形質転換された植物細胞、及び形質転換された植物を、たとえば異種プロモーターの制御下でｉＲＮＡ分子のうちの１つ以上を発現するよう操作し、害虫防御効果をもたらしてもよい。したがって、トランスジェニック植物又は植物細胞が、摂食の間に害虫により摂取された場合、当該害虫は、当該トランスジェニック植物又は細胞に発現されたｉＲＮＡ分子を摂取し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、ｉＲＮＡ分子を産生する広範な種類の原核細胞微生物宿主及び真核細胞微生物宿主へと導入されてもよい。「微生物」という用語は、例えば細菌及び真菌などの原核細胞種及び真核細胞種を含む。
【０２１４】
遺伝子発現の調節は、かかる発現の部分抑制又は完全抑制を含み得る。他の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）における遺伝子発現の抑制方法は、害虫の宿主の組織に、本明細書に記載されるようにポリヌクレオチドの転写後に形成されたｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つの遺伝子抑制量をもたらすこと、を含み、その少なくとも１つのセグメントは、害虫細胞内のｍＲＮＡに相補的である。害虫により摂取される、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｈｐＲＮＡ分子などの、その改変型を含むｄｓＲＮＡ分子は、例えば配列番号１、３、５、８９、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、ｓｈｉ  ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子に対し、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％同一であってもよい。したがって限定されないが、非天然型ポリヌクレオチド、及びｄｓＲＮＡ分子を提供するための組み換えＤＮＡ構築物を含む、単離され、実質的に精製された核酸分子が提供され、当該核酸分子は導入されたとき、害虫の内因性コードポリヌクレオチド又は標的コードポリヌクレオチドの発現を抑制又は阻害する。
【０２１５】
特定の実施形態は、植物害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の１つ以上の標的遺伝子の転写後阻害、及び植物害虫群の制御のためのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムを提供するものである。一部の実施形態において、送達システムは、トランスジェニック宿主植物細胞、又は宿主細胞中で転写されたＲＮＡ分子を含有する宿主細胞の内容物の摂取を含む。これら、及びさらなる実施形態において、本発明の安定化ｄｓＲＮＡ分子をもたらす組み換えＤＮＡ構築物を含有するトランスジェニック植物細胞、又はトランスジェニック植物が作製される。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含有するトランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物は、本発明のｉＲＮＡ分子（例えば、安定化ｄｓＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクターを構築する；植物細胞又は植物を形質転換する；及び転写されたｉＲＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物細胞又はトランスジェニック植物を生成する、組み換えＤＮＡ技術（その基礎技術は当分野に公知である）を用いることにより作製されることができる。
【０２１６】
トランスジェニック植物に害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）からの防御を与えるため、組み換えＤＮＡ分子は例えばｉＲＮＡ分子、例えばｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、又はｈｐＲＮＡ分子に転写されてもよい。一部の実施形態において、組み換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子は、組み換え植物の組織又は液体内でｄｓＲＮＡ分子を形成してもよい。かかるｄｓＲＮＡ分子は、宿主植物に寄生し得るタイプの害虫内でＤＮＡから転写された対応するポリヌクレオチドに対し同一なポリヌクレオチドの一部に含まれてもよい。害虫内の標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ分子により抑制され、害虫における標的遺伝子の発現抑制によって、トランスジェニック植物に害虫に対する抵抗性が生じる。ｄｓＲＮＡ分子の修飾効果は、例えばハウスキーピング遺伝子をはじめとする細胞代謝又は細胞形質転換に寄与する内因性遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；及び細胞代謝又は正常な成長と発達に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、害虫で発現されている様々な遺伝子に適用可能であることが示されている。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子からの転写、又は発現構築物からの転写のために、一部の実施形態において、ＲＮＡ鎖を転写するための制御領域（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、及びポリアデニル化シグナル）を使用してもよい。したがって、一部の実施形態において、上記に説明されるように、ｉＲＮＡ分子作製における使用のためのポリヌクレオチドは、植物宿主細胞において機能する１つ以上のプロモーターエレメントに操作可能に連結されていてもよい。プロモーターは、宿主ゲノム中に通常に内在する内因性プロモーターであってもよい。操作可能に連結されたプロモーターエレメントの制御下にある本発明のポリヌクレオチドは、その転写及び／又は得られた転写物の安定性に有益な影響を与える追加のエレメントにさらに隣接していてもよい。かかるエレメントは、操作可能に連結されたプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置してもよく、及びプロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方にあってもよい。
【０２１８】
一部の実施形態は、植物を餌とする害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）により引き起こされた宿主植物（例えば、トウモロコシ植物）に対する損害を減少させるための方法を提供するものであり、当該方法は、宿主植物に、本発明の核酸分子を少なくとも１つ発現する形質転換植物細胞を提供することを含み、当該核酸分子は、害虫に取り込まれると機能し、当該害虫内の標的ポリヌクレオチドの発現を阻害し、その発現阻害により、害虫の死、及び／又は成長の低下がもたらされ、それによって、害虫により引き起こされた宿主植物の損害が減少する。一部の実施形態において、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子を含有する。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子を含有し、そのｄｓＲＮＡ分子は各々、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする１つのポリヌクレオチドからなる。
【０２１９】
一部の実施形態において、トウモロコシ作物の収率を増加させる方法が提供され、当該方法は、本発明の核酸分子を少なくとも１つ、トウモロコシ植物に導入すること；植物を栽培し、当該核酸を含有するｉＲＮＡ分子を発現させること、を含み、当該核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現が、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の損害及び／又は成長を阻害し、それによって、害虫寄生による生産量の減少が低下し、又は無くなる。一部の実施形態において、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子を含有し、そのｄｓＲＮＡ分子は各々、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、ポリヌクレオチドを含有し、そのポリヌクレオチドは、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする。
【０２２０】
別の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）の標的遺伝子の発現を調節する方法が提供され、当該方法は、本発明のｉＲＮＡ分子を少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換することであって、当該ポリヌクレオチドは、プロモーター及び転写終結エレメントに操作可能に連結されており；複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の発展が充分に可能な条件下で、形質転換植物細胞を培養すること；そのゲノム内にポリヌクレオチドが組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされるｉＲＮＡ分子の発現に関し、形質転換植物細胞をスクリーニングすること；ｉＲＮＡ分子を発現しているトランスジェニック植物細胞を選択すること；及び害虫に、選択されたトランスジェニック植物細胞を飼料として与えること、を含む。また、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現する形質転換植物細胞から植物が再生されてもよい。一部の実施形態において、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子を含有し、そのｄｓＲＮＡ分子は各々、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、ポリヌクレオチドを含有し、そのポリヌクレオチドは、鞘翅目及び／又は半翅目の害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする。
【０２２１】
本発明のｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノム内に組み込まれた組み換え遺伝子からの発現産物として、又は植え付け前に種子に適用されるコーティング処理又は種子処理への組み込みとして、のいずれかで、植物種（例えば、トウモロコシ）の種子内に組み込まれることができる。組み換え遺伝子を含有する植物細胞は、トランスジェニックイベントであるとみなされる。また、本発明の複数の実施形態に、害虫（例えば鞘翅目及び／又は半翅目の害虫）へｉＲＮＡ分子を送達するための送達システムが含まれる。例えば、本発明のｉＲＮＡ分子は、害虫の細胞内に直接導入されてもよい。導入方法には、ｉＲＮＡと、害虫の宿主由来の植物組織を直接混合すること、ならびに本発明のｉＲＮＡ分子を含有する組成物を宿主植物組織に適用すること、が含まれる。例えば、ｉＲＮＡ分子は、植物表面上に噴霧されてもよい。あるいは、ｉＲＮＡ分子は、微生物により発現されてもよく、当該微生物は植物表面上に適用されてもよく、又は例えば注入などの物理的手段により根又は茎に導入されてもよい。上記に検討されているように、トランスジェニック植物は遺伝子操作して、植物に寄生することが知られている害虫を殺傷するために充分な量のｉＲＮＡ分子を少なくとも１つ発現させてもよい。化学合成又は酵素合成により作製されたｉＲＮＡ分子を、一般的な農学的実務に合致する方法で製剤化してもよく、及び害虫による植物損害を制御するためのスプレー式製品又はおとり製品として使用してもよい。製剤は、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）をＵＶダメージから守るための効果的な葉の覆い、ならびにＵＶ保護剤に必要とされる適切なアジュバント（例えば、ステッカー及び湿潤剤）を含んでもよい。かかる添加物はバイオ殺虫剤産業において普遍的に使用されており、当分野の当業者に公知である。かかるアプリケーションは、害虫からの植物防御を増強させるために、他のスプレー式殺虫アプリケーション（生物ベース又はそれ以外）と組み合わされてもよい。
【０２２２】
本明細に引用される、公表文献、特許、及び特許出願を含むすべての参照文献は、本開示の明白な詳細と一致する範囲で参照により本明細書に援用され、各参照文献が個々に、及び具体的に、参照により援用されると示され、本明細書にその全体が明記された場合と同程度に援用される。本明細書において検討された参照文献は、本出願の出願日の前のその開示内容に対してのみ提供される。本明細書はいずれも、先行発明を理由としたかかる開示の先行のために本発明者らが権利付与されないことの同意とはみなされない。
【０２２３】
以下の実施例は、ある特定の特性及び／又は態様の解説のために提供される。これらの実施例によって、記載される特定の特性又は態様に本開示が限定されるとみなされるべきではない。
【実施例】
【０２２４】
実施例１：材料及び方法
サンプル調製及びバイオアッセイ    
多くのｄｓＲＮＡ分子（ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１  （配列番号７）、  ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１  （配列番号８）、  ｓｈｉ−２  ｒｅｇ１  （配列番号９）、ｓｈｉ−２  ｖ１  （配列番号１０）、ｓｈｉ−２  ｖｅｒ２  （配列番号１１）、及びｓｈｉ−３  ｒｅｇ１（配列番号１２）に相当する分子を含む）が、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７  ＲＮＡｉ  キット（カリフォルニア州カールスバッドLIFE TECHNOLOGIES社）又はT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit （英国オンタリオ ウィットビー NEW ENGLAND BIOLABS社）を使用して合成及び精製された。精製されたｄｓＲＮＡ分子はＴＥ緩衝液中で調製され、すべてのバイオアッセイは、この緩衝液からなる対照処理を含み、対照はＷＣＲ（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の死又は成長阻害に対するバックグラウンド検証として供された。バイオアッセイ緩衝液中のｄｓＲＮＡ分子の濃度は、NANODROP（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社、)を使用して測定された。
【０２２５】
サンプルは、生まれたばかりの幼虫を用いて行われた人工昆虫飼料に対するバイオアッセイにおける昆虫の活性に関し検証された。ＷＣＲの卵は、Crop Characteristics, Inc. (ミネソタ州ファーミントン)から取得された。
【０２２６】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレイ（ニュージャージー州ピットマン C-D International社、)中で行われた。各ウェルは、鞘翅目昆虫の成長用に設計された人工飼料をおよそ１．０ｍＬ含有した。ｄｓＲＮＡサンプルの６０μＬのアリコートを、ピペットにより各ウェルの飼料の表面上に運んだ（４０μＬ／ｃｍ２）。ｄｓＲＮＡサンプルの濃度は、ウェル中の表面積（１．５ｃｍ２）の平方センチメートル当たりのｄｓＲＮＡの量（ｎｇ／ｃｍ２）として算出された。処置されたトレイは、飼料の表面上の液体が蒸発するか、又は飼料の中に吸収されるまでドラフト内に保持された。
【０２２７】
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を、湿ったラクダ毛のブラシを用いてピックアップし、処置済みの飼料の上に置いた（ウェル当たり、１〜２匹の幼虫）。１２８ウェルのプラスチックトレイのうち、寄生ウェルを、透明プラスチックの接着シートで密封し、通気口をつけてガス交換を行わせた。バイオアッセイトレイは、９日間、制御された環境条件（２８℃、約４０％相対湿度、１６：８（明：暗））下に置かれ、その後、各サンプルに曝露された昆虫の総数、死亡した昆虫の数、生き残った害虫の重量を記録した。平均死亡率及び平均成長阻害率が、各処置に対して算出された。成長阻害（ＧＩ：Growth inhibition）は以下のように算出された：
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]、
ＴＷＩＴは、処置における、生きている昆虫の総重量である；
ＴＮＩＴは、処置における、昆虫の総数である；
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンド検証（緩衝液対照）における、生きている昆虫の総重量である；及び
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンド検証（緩衝液対照）における、生きている昆虫の総数である。
【０２２８】
Ｔｈｅ  ＬＣ５０（致死濃度）は、検証昆虫の５０％が殺された投与量と定義される。Ｔｈｅ  ＧＩ５０（成長阻害）は、検証昆虫の平均成長（例えば、生重量）が、バックグラウンド検証サンプルで認められた平均値の５０％である投与量と定義される。統計解析は、ＪＭＰ（商標）ソフトウェア（ノースカロライナ州ケーリーＳＡＳ）を使用して行われた。
【０２２９】
バイオアッセイを繰り返すことにより、特定のサンプルの摂取によって、コーンルートワームの幼虫に驚くべき予想外の死亡及び成長阻害がもたらされたことが示された。
【０２３０】
実施例２：ジアブロティカ（Diabrotica）由来候補標的遺伝子の特定
ＷＣＲ（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の複数の発達段階にある昆虫を、ＲＮＡｉトランスジェニック植物昆虫防御技術による制御の候補標的遺伝子配列を提供するための、統合トランスクリプトーム解析に選択した。
【０２３１】
１つの例において、約０．９ｇｍの初齢ＷＣＲ全幼虫（孵化後４〜５日、１６℃で保持）から、総ＲＮＡが単離され、以下のフェノール／ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）をベースとした方法（オハイオ州シンシナティ Molecular Research Center)を使用して精製した。
【０２３２】
幼虫を室温、１５ｍＬのホモジナイザー中、１０ｍＬのＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を使用してホモジナイズし、ホモジナイズ懸濁液を得た。５分間、室温でインキュベーションした後、ホモジネートを１．５ｍＬの微量遠心管（１管当たり１ｍＬ）に分注し、２００μＬのクロロホルムを加え、混合物を１５秒間しっかりと振とうした。１０分間、室温において抽出させた後、４℃、１２，０００ｘｇで遠心することにより層を分離させた。上層（約０．６ｍＬ含有）を注意深く、別の滅菌１．５ｍＬチューブへと移し、等量の室温のイソプロパノールを加えた。室温で５〜１０分間インキュベーションした後、混合物を８分間、１２，０００ｘｇ（４℃又は２５℃）で遠心した。
【０２３３】
上清を注意深く取り除いて捨て、ＲＮＡペレットを、７５％エタノールを用いてボルテックスすることにより２回洗浄し、各洗浄後、７，５００ｘｇ（４℃又は２５℃）で５分間遠心することにより回収した。エタノールを注意深く取り除き、ペレットを３〜５分間空気乾燥させ、その後、ヌクレアーゼフリーの滅菌水中に溶解させた。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍと２８０ｎｍで吸光度（Ａ）を測定することにより決定した。約０．９ｇｍの幼虫からの典型的な抽出で、１ｍｇを超える総ＲＮＡが得られ、Ａ２６０／Ａ２８０の比率は１．９であった。その後、抽出されたＲＮＡは、さらなる処置が行われるまで−８０℃で保存された。
【０２３４】
ＲＮＡの質は、１％アガロースゲルでアリコートを泳動することにより決定した。アガロースゲル溶液は、ＤＥＰＣ（ピロ炭酸ジエチル）処置水を用いてオートクレーブ処理された容器内で希釈された、オートクレーブ処理された１０ｘＴＡＥ緩衝液（トリス酢酸ＥＤＴＡ；１ｘ濃度は、０．０４Ｍトリス酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）を使用して作製された。１ｘＴＡＥは、ランニング緩衝液として使用された。使用前に、電気泳動タンク及びウェル形成コームは、ＲＮＡｓｅＡｗａｙ（商標）（Invitrogen Inc、カリフォルニア州カールスバッド）で洗浄された。２μＬのＲＮＡサンプルを、８μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ７．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び１０μＬのＲＮＡサンプル緩衝液（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）カタログ番号７０６０６；ＥＭＤ４  ニュージャージー州ギブスタウン  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）と混合した。サンプルを３分間、７０℃で加熱し、室温まで冷却して、ウェル当たり５μＬ（１μｇ〜２μｇのＲＮＡを含有）をロードした。分子サイズ比較のために、別のウェルで市販のＲＮＡ分子量マーカーを同時に泳動した。２時間、６０ボルトでゲルを泳動した。
【０２３５】
標準化ｃＤＮＡライブラリーは、市販のサービスプロバイダー（アラバマ州ハンツビルEurofins MWG Operon)により、ランダムプライミングヲ使用シテ、幼虫総ＲＮＡカラ調製サレタ。標準化幼虫ｃＤＮＡライブラリーハ、Eurofins MWG Operonで、GS FLX 454 Titanium（商標）シリーズ化学法により、１／２プレートのスケールで配列解析され、その結果、平均リード長は３４８ｂｐで、６００，０００を超えるリードが得られた。３５０，０００リードが、５０，０００超のコンティグへとアセンブリされた。アセンブリされなかったリードとコンティグの両方が、公的に利用可能なプログラムのFORMATDB(NCBIから利用可能）を使用し、ＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースへと転換された。
【０２３６】
他のＷＣＲ発達段階で採取された物質から、総ＲＮＡ及び標準化ｃＤＮＡライブラリーが同様に調製された。標的遺伝子スクリーニング用の統合トランスクリプトームライブラリーは、様々な発達段階を表すｃＤＮＡライブラリーのメンバーを組み合わせることにより構築された。
【０２３７】
ＲＮＡｉ標的の候補遺伝子は、害虫の生存及び成長に必須であると仮定された。選択された標的遺伝子のホモログは、以下に記載されるようにトランスクリプトーム配列データベース中で特定された。標的遺伝子の全長配列又は部分配列はＰＣＲによって増幅され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産生のための鋳型を作製した。
【０２３８】
候補タンパク質コード配列を使用したＴＢＬＡＳＴＮサーチを、未アセンブリ化ジアブロティカ（Diabrotica）配列リード、又はアセンブリ化コンティグを含有するＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに対して行った。ジアブロティカ（Diabrotica）配列に対する重大ヒット（コンティグホモロジーに関しては、ｅ−２０よりも良いと定義され、未アセンブリ化配列リードのホモロジーに関しては、ｅ−１０よりも良いと定義される）は、ＮＣＢＩの非冗長データベースに対するＢＬＡＳＴＸを使用して確認された。このＢＬＡＳＴＸサーチの結果から、ＴＢＬＡＳＴＮサーチで特定されたジアブロティカ（Diabrotica）ホモログ候補遺伝子配列が、実際にジアブロティカ（Diabrotica）遺伝子を含有していたこと、又はジアブロティカ（Diabrotica）中に存在する非−ジアブロティカ（Diabrotica）候補遺伝子配列に対するベストヒットであったことが確認された。ほとんどの場合において、タンパク質をコードしているとしてアノテーションされたトリボリウム（Tribolium）の候補遺伝子は、ジアブロティカ（Diabrotica）トランスクリプトーム配列の配列に対し、明白な配列相同性を示した。数例で、一部のジアブロティカ（Diabrotica）コンティグ、又は非−ジアブロティカ（Diabrotica）候補遺伝子に対する相同性により選択された非アセンブリ化配列リードが重複していたこと、及びコンティグのアセンブリは、これら重複を結びつけることに失敗したことが明らかとなった。それらの例では、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ４．９(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)を使用して、その配列を、より長いコンティグへとアセンブリした。
【０２３９】
ジアブロティカ（Diabrotica）のｓｈｉ（配列番号１、配列番号３、及び配列番号５）をコードする候補標的遺伝子は、鞘翅目害虫の死、ＷＣＲにおける成長阻害、発達阻害、又は摂食阻害をもたらし得る遺伝子として特定された。ショウジョウバエ（Drosophila）ｓｈｉｂｉｒｅ  （ｓｈｉ）遺伝子は、メカノケミカル酵素であり、ユビキタスＧＴＰａｓｅスーパーファミリーのメンバーである、ダイナミン（dynamin）のホモログをコードする。ダイナミンは、四量体へと組み立てられ、陥入したクラスリン被覆ピットの首部分でリング様構造を形成することが判明している。リング中の構造変化は、ＧＴＰ加水分解と相関しており、細胞膜からの小胞分裂を介在していると提唱されている（van der Bliek 1999に概要がある）。温度感受性ｓｈｉ変異体により、これら酵素が、エンドサイトーシスの初期に必須であることが明らかとなった。Ｓｈｉ変異体は、シナプス小胞のリサイクル阻害により急速に無力化される。クラスリン被覆ピットは蓄積し始め、深い陥入が細胞膜に現れる。
【０２４０】
本明細書の結果から、ダイナミンスーパーファミリーのタンパク質（たとえば、ウェスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera ）タンパク質）をコードする遺伝子は、たとえば鞘翅目害虫などにおいて、害虫の死、成長阻害、発達阻害、または摂食阻害をもたらし得る候補標的遺伝子であることが示唆された。
【０２４１】
配列番号１、配列番号３、及び配列番号５が新規である。この配列は公共のデータベースで提供されておらず、国際特許WO/2011/025860、米国特許出願20070124836、米国特許出願20090306189、米国特許出願US20070050860、米国特許出願20100192265、米国特許第7,612,194号又は米国特許出願2013192256においても開示されていない。ＧＥＮＢＡＮＫには、ジアブロティカ（Diabrotica）ｓｈｉ−３（配列番号５）に有意に相同なヌクレオチド配列は存在しなかった。
【０２４２】
Ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子を、他のｄｓＲＮＡ分子と組み合わせて、冗長なＲＮＡｉ標的化及び相乗的なＲＮＡｉ効果をもたらすことができる。ｓｈｉを標的とするｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニックトウモロコシイベントは、コーンルートワームによる根食害の防御に有用である。Ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子は、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術との組み合わせに対し、新たな作用機序を提示し、これらルートワーム制御技術のいずれかに対し抵抗性のルートワーム群の発生を軽減する。
【０２４３】
実施例３：ジアブロティカ（Diabrotica）からの標的遺伝子の増幅
ｓｈｉ候補遺伝子の配列の全長クローン又は部分クローンを使用して、ｄｓＲＮＡ合成のためのＰＣＲアンプリコンを作製した。プライマーは、各標的遺伝子のコード領域の一部がＰＣＲにより増幅されるよう設計された。表１を参照のこと。適切である場合には、Ｔ７ファージプロモーター配列（TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；配列番号１３）を、増幅されたセンス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端に組み込んだ。表１を参照のこと。総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） (ニューヨーク州グランドアイランド Life Technologies社)を使用してＷＣＲから抽出され、その後、それを使用し、SuperScriptIII（登録商標） First-Strand Synthesis System、及びＯｌｉｇｏ  ｄＴプライム化製品の説明書(ニューヨーク州グランドアイランド Life Technologies社)を用いて第一鎖ｃＤＮＡを作製した。第一鎖ｃＤＮＡは、天然標的遺伝子配列のすべて又は一部を増幅するよう位置づけられた反対プライマーを使用したＰＣＲ反応の鋳型として使用した。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）（配列番号８；Shagin ら (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50）のコード領域を含有するＤＮＡクローンからもｄｓＲＮＡを増幅させた。
【表１】
2018533356.tif 000008
【０２４４】
実施例４：ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲによる鋳型調製及びｄｓＲＮＡ合成
sｈｉ  ｄｓＲＮＡ及びＹＦＰ  ｄｓＲＮＡ作製のための特異的鋳型を提供するために使用される戦略を図１及び図２に示す。ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ合成における使用を意図された鋳型ＤＮＡは、表１のプライマー対、及びＷＣＲの初齢幼虫から単離された総ＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡを（ＰＣＲ鋳型として）使用したＰＣＲにより調製された。各選択されたｓｈｉ及びＹＦＰ標的遺伝子領域に対し、ＰＣＲ増幅によって、増幅センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された（ＹＦＰセグメントは、ＹＦＰコード領域のＤＮＡクローンから増幅された）。次いで、標的遺伝子の各領域に対する２つのＰＣＲ増幅断片を、およそ等量で混合し、その混合物をｄｓＲＮＡ作製のための転写鋳型として使用した。図１を参照のこと。特定のプライマー対で増幅されたｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、以下であった：配列番号７（ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１）、配列番号８（ｓｈｉ−１  ｖｅｒ１）、配列番号９（ｓｈｉ−２  ｒｅｇ１）、配列番号１０（ｓｈｉ−２  ｖｅｒ１）、配列番号１１（ｓｈｉ−２  ｖｅｒ２）、配列番号１２（ｓｈｉ−３  ｒｅｇ１）、およびＹＦＰ（配列番号１４）。昆虫バイオアッセイ用の二本鎖ＲＮＡは、メーカーの説明書に従い、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＮＡＩキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を使用して、又はメーカーの説明書に従い、HiScribe（登録商標）T7 In Vitro Transcription Kit(マサチューセッツ州イプスウィッチ New England Biolabs社)を使用して合成及び精製された。dsRNA分子の濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社)を使用して測定された。
【０２４５】
植物形質転換ベクターの構築
ｓｈｉ（配列番号１又は配列番号３）のセグメントを含有するヘアピン構造のための標的遺伝子構築物を有するエントリーベクターは、化学合成された断片（カリフォルニア州メンロパーク  ＤＮＡ２．０）の組み合わせと、標準的な分子クローニング法を使用してアセンブリされる。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン構造は、ｓｈｉ標的遺伝子配列セグメントの２つのコピーを互いに反対方向に（単一転写ユニット内で）配置することにより促進され、この２つのセグメントはループ構造を形成するランダム配列（Vancanneyt ら（1990）Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)）により分離される。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、リンカー配列により分離され、互いの大きな反転リピートとして、２つのｓｈｉ遺伝子セグメント配列を含有している。プロモーター（例えば、トウモロコシユビキチン１、米国特許第5,510,474号；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ；イネアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；ＡＬＳプロモーター：ファセオリン遺伝子プロモーター；cab;rubisco;LAT52;Zm13；及び／又はapg）のコピーを使用して、一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の産生を誘導し、３’非翻訳領域を含有する断片、限定するものではないが例えば、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（ZmPer5 3'UTR v2；米国特許第6,699,984号）、ＡｔＵｂｉ１０、ＡｔＥｆ１、又はＳｔＰｉｎＩＩ、を使用して、ヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終了させる。
【０２４６】
エントリーベクターのｐＤＡＢ１１４５９１は、ｓｈｉ−１（配列番号１）のセグメントを含有するｓｈｉ−１ヘアピンｖ１−ＲＮＡ構築物（配列番号２７）を含有する。エントリーベクターのｐＤＡＢ１１４５９２は、ｐＤＡＢ１１４５９１に見出されるものとは異なるｓｈｉ−２（配列番号３）のセグメントを含有するｓｈｉ−２ヘアピンｖ１−ＲＮＡ構築物（配列番号２８）を含有する。エントリーベクターのpDAB114593は、pDAB114591及びpDAB114592に見出されるものとは異なるｓｈｉ−２（配列番号３）のセグメントを含有するｓｈｉ−２  ヘアピンｖ２−ＲＮＡ構築物（配列番号２９）を含有する。上記に記載されるエントリーベクターpDAB114591、pDAB114592、及びpDAB114593は、典型的なバイナリーデスティネーションベクター（pDAB115765）との標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応に使用され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性トウモロコシ胚形質転換のためのshiヘアピンRNA発現形質転換ベクターを生成した（それぞれ、pDAB119700、pDAB119701、及びDAB119702）。
【０２４７】
ＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを発現する遺伝子を含有する陰性対照のバイナリーベクターは、典型的なバイナリーデスティネーションベクター (pDAB109805)とエントリーベクター（pDAB101670）を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築される。エントリーベクターのpDAB101670は、トウモロコシユビキチン１プロモーター（上述）の発現制御下にあるＹＦＰヘアピン配列（配列番号３０）、及びトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
【０２４８】
このバイナリーデスティネーションベクターは、植物操作可能プロモーター（例えば、サトウキビ桿状型バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk ら (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-1230)又はZmUbi1(米国特許第5,510,474号)）の制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3)（米国特許第7838733(B2)号、及びWright ら (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245）を含有している。これらのプロモーター由来の５’UTR及びイントロンは、プロモーターセグメントの３’末端と、AAD-1コード領域のスタートコドンの間に位置付けられる。トウモロコシのリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；米国特許第7,179,902号）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を使用し、ＡＡＤ−１ｍＲＮＡの転写を終結させる。
【０２４９】
さらなる陰性対照のバイナリーベクターであるpDAB101556は、ＹＦＰタンパク質を発現する遺伝子を含有しており、典型的なバイナリーデスティネーションベクター(pDAB9989)とエントリーベクター（pDAB100287）を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築される。バイナリーデスティネーションベクターpDAB9989は、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3）、及びトウモロコシリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。エントリーベクターのpDAB100287は、トウモロコシユビキチン１プロモーター（上述）の発現制御下にあるＹＦＰコード領域（配列番号３２）、及びトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
【０２５０】
実施例５：ジアブロティカ（Diabrotica）幼虫における候補標的遺伝子のスクリーニング
実施例２で特定された標的遺伝子の発現を阻害するよう設計された合成ｄｓＲＮＡは、飼料ベースのアッセイにおいて、ＷＣＲに投与された際に、死亡、及び成長阻害をもたらした。
【０２５１】
バイオアッセイを繰り返すことにより、ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１、ｓｈｉ−１  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｖ２、及びｓｈｉ−２  ｒｅｇ１由来のｄｓＲＮＡ調製物の摂取が、ウェスタンコーンルートワームの幼虫の死亡及び成長阻害をもたらすことが示された。表２及び表３は、これらｄｓＲＮＡへの９日の曝露を行った後のＷＣＲの幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果、ならびに黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）コード領域（配列番号１４）から調製された陰性対照ｄｓＲＮＡサンプルを用いて得られた結果を示す。
【表２】
2018533356.tif 000009
【表３】
2018533356.tif 000010
【０２５２】
ジアブロティカ（Diabrotica）種のある遺伝子は、ＲＮＡｉ介在性昆虫制御に活用できることが従前から提唱されている。米国特許公開2007/0124836は、９０６個の配列を開示しており、及び米国特許第7,612,194号は、９，１１２個の配列を開示している。それらを参照のこと。しかしながら、ＲＮＡｉ介在性昆虫制御に対する有用性を有すると提唱されている多くの遺伝子が、ジアブロティカ（Diabrotica）の制御には有効ではないことが究明されている。また、ｓｈｉ−１  ｒｅｇ１、ｓｈｉ−１  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｖ１、ｓｈｉ−２  ｖ２、及びｓｈｉ−２  ｒｅｇ１の配列は、それぞれ、ＲＮＡｉ介在性昆虫制御に関する有用性を有すると提唱されている他の遺伝子と比較し、ジアブロティカ（Diabrotica）に関し、驚くべき、予想外の優れた制御をもたらすことも明らかとなった。
【０２５３】
例えば、アネキシン、ベータ  スペクトリン2、及びmtRP-L4はそれぞれ、米国特許第7,612,194号において、RNAi介在性昆虫制御に有効であると提唱されていた。配列番号３３は、アネキシン領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号３４は、アネキシン領域２（Reg2）のDNA配列である。配列番号３５は、ベータ  スペクトリン２領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号３６は、ベータ  スペクトリン２領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。配列番号３７は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号３８は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。ＹＦＰ配列（配列番号１４）を使用して、陰性対照としてのｄｓＲＮＡも作製した。
【０２５４】
前述の配列をそれぞれ使用して、実施例３の方法によりｄｓＲＮＡを製造した。ｄｓＲＮＡ作製のための特異的鋳型を提供するために使用された戦略を図２に示す。ｄｓＲＮＡ合成における使用を意図された鋳型ＤＮＡは、表４のプライマー対、及びＷＣＲの初齢幼虫から単離された総ＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡを（ＰＣＲ鋳型として）使用したＰＣＲにより調製された。（ＹＦＰは、ＤＮＡクローンから増幅された。）選択された各標的遺伝子領域に対し、２つの別々のＰＣＲ増幅が行われた。第一のＰＣＲ増幅で、増幅されたセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。第二の反応で、アンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が組み込まれた。次いで、標的遺伝子の各領域に対する２つのＰＣＲ増幅断片を、およそ等量で混合し、その混合物をｄｓＲＮＡ作製のための転写鋳型として使用した。図２を参照のこと。二本鎖ＲＮＡを合成し、メーカーの説明書に従いAmbion（登録商標）MEGAscript（登録商標）RNAiキット（Invitrogen）を使用して合成及び精製した。ｄｓＲＮＡの濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社)を使用して測定し、ｄｓＲＮＡは各々、上述と同じ食餌ベースのバイオアッセイ法により検証された。表４は、アネキシン  Ｒｅｇ１、アネキシン  Ｒｅｇ２、ベータ  スペクトリン  ２    Ｒｅｇ１、ベータ  スペクトリン  ２  Ｒｅｇ２、ｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ１、ｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ２、及びＹＦＰのｄｓＲＮＡ分子を作製するために使用されたプライマーの配列を列記する。表５は、これらｄｓＲＮＡ分子への９日の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果を示す。バイオアッセイを繰り返すことにより、これらｄｓＲＮＡの摂取によるウェスタンコーンルートワームの幼虫の死亡又は成長阻害は、対照サンプルのＴＥ緩衝液、水、又はＹＦＰタンパク質で観察された結果を上回っていなかったことが示された。
【表４−１】
2018533356.tif 000011
【表４−２】
2018533356.tif 000012
【表４−３】
2018533356.tif 000013
【表５】
2018533356.tif 000014
【０２５５】
実施例６：殺虫性dsRNAを含有するトランスジェニックトウモロコシ組織の作製
アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換  植物ゲノムへ安定的に組み込まれたキメラ遺伝子の発現を介して、１つ以上の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子（ｓｈｉ（例えば配列番号１、配列番号３、及び配列番号５）を含有する遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシの細胞、組織、及び植物が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換に従い作製される。スーパーバイナリー形質転換ベクター、又はバイナリー形質転換ベクターを利用する、トウモロコシの形質転換方法は当分野に公知であり、例えば、その全体で参照より本明細書に援用される米国特許第8,304,604号に記載されている。形質転換された組織は、ハロキシホップ含有培地上での増殖能力により選択され、適切な場合には、ｄｓＲＮＡ産生に対しスクリーニングされる。かかる形質転換された組織培養の一部は、原則的に実施例１に記載されるように、バイオアッセイのために生まれたばかりのコーンルートワーム幼虫に提示されてもよい。
【０２５６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養の開始  上述（実施例４）のバイナリー形質転換ベクターpDAB114515、pDAB115770、pDAB110853又はpDAB110556を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株のDAt13192細胞（国際特許2012/016222A2）のグリセロールストックを、適切な抗生物質を含有するＡＢ最小培地プレート(Watsonら（1975） J. Bacteriol. 123:255-264)上に画線培養し、３日間、２０℃で増殖させる。次いで、培養物を、同じ抗生物質を含有するＹＥＰプレート(gm/L：酵母抽出物、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）上に画線培養し、１日間、２０℃でインキュベートする。
【０２５７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium ）培養. 実験当日、接種培地のストック溶液、及びアセトシリンゴンを、実験における構築物数に対して適切な量で調製し、滅菌されたディスポーザブルの２５０ｍＬフラスコへとピペッティングで入れる。接種培地(Frameら（2011） Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe 及び E. C. Yeung,（編）、Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)は、以下を含有した：２．２ｇｍ／ＬＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類（Ｆｒａｍｅら、前掲誌）６８．４ｇｍ／Ｌスクロース；３６ｇｍ／Ｌグルコース；１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌ  ｍｙｏ−イノシトール；ｐＨ５．４）アセトシリンゴンを、接種培地が入ったフラスコに加え、１００％ジメチルスルホキシドの１Ｍストック溶液から最終濃度２００μＭとし、その溶液を完全に混合させる。
【０２５８】
各構築物に対し、ＹＥＰプレートからアグロバクテリウム（Agrobacterium）の１つ又は２つの接種ループ−フルを、滅菌ディスポーザブルの５０ｍＬ遠心管中で１５ｍＬの接種培地／アセトシリンゴンのストック溶液に懸濁させ、５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での溶液の光学密度を分光光度計で計測する。その後、懸濁液を、０．３〜０．４のＯＤ５５０にまで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合液を使用して希釈する。その後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、７５ｒｐｍ、室温に設定されたプラットフォーム型振とう器上に水平に置き、胚を解体させながら、１〜４時間、振とうさせる。
【０２５９】
穂の滅菌および胚の単離  トウモロコシの未熟胚を、トウモロコシ（Zea mays）近交系B104(Hallauer ら (1997) Crop Science 37:1405-1406）の植物から得て、温室で成長させ、自己受粉又は同胞受粉させ、穂を作らせる。受粉後およそ１０〜１２日後に穂を収穫する。実験当日、皮をむいた穂を、市販の漂白剤(Ultra Clorox（登録商標）Germicidal Bleach、6.15%次亜塩素酸ナトリウム；TWEEN20を２滴）の２０％溶液の中にひたすことにより表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうさせた後、Laminarフローフード内で滅菌脱イオン水で３回リンスする。未成熟な接合胚（１．８〜２．２ｍｍの長さ）を、各穂から無菌で分け、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium ）細胞の、２００μＭアセトシリンゴンを有する接種培地液の懸濁液２．０ｍＬを含有する微小遠心管に無作為に分配し、そこに２μＬの１０％  BREAK-THRU（登録商標）S233界面活性剤 (ドイツエッセン Evonik Industries社； )を加えられた。実験の所与の設定に対し、プールされた穂からの胚を各形質転換に使用する。
【０２６０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養  単離後、胚を５分間、ロッカープラットフォーム上に置く。その後、管の中身を共培養培地のプレート上に流しいれる。当該培地は、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類；３０ｇｍ／Ｌ  スクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；３．３ｍｇ／Ｌ  ＤｉｃａｍｂａのＫＯＨ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸又は３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）溶液；１００ｍｇ／Ｌ  ｍｙｏ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；２００μＭ  アセトシリンゴンのＤＭＳＯ溶液；及び３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）、ｐＨ  ５．８を含有する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を、滅菌ディスポーザブルの移送ピペットを使用して除去する。次いで、胚を、顕微鏡下で滅菌ハサミを使用し、胚盤を仰向けにさせながら置く。プレートを閉じ、3M（商標）MICROPORE（商標）医療用テープで密封し、２５℃のインキュベーター内に置き、６０μモルｍ−２ｓ−１で光合成有効放射（ＰＡＲ）の連続光を当てた。
【０２６１】
カルス選択、およびトランスジェニックイベントの再生  共培養期間後、胚を休眠培地へと移す。当該培地は、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類；３０ｇｍ／Ｌ  スクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；３．３ｍｇ／Ｌ  ＤｉｃａｍｂａのＫＯＨ溶液；１００ｍｇ／Ｌ  ｍｙｏ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；PhytoTechnologies Labr、；Lenexa, KS)；２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン；及び２．３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）；ｐＨ  ５．８から構成される。３６個以下の胚を各プレートへと移動させる。このプレートを透明なプラスチックボックス内に置き、２７℃で７〜１０日間、およそ５０μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲの連続光と共にインキュベートする。次いで、カルス化した胚を選択培地Ｉ上に移す（＜１８／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、１００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ；ＡＡＤ−１遺伝子を保有するカルスの選択用）から構成される。このプレートを透明なプラスチックボックス内に戻し、２７℃で７日間、およそ５０μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲの連続光と共にインキュベートする。次いで、カルス化した胚を選択培地ＩＩ上に移す（＜１２／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）から構成される。このプレートを透明なプラスチックボックス内に戻し、２７℃で１４日間、およそ５０μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲの連続光と共にインキュベートする。この選択工程により、トランスジェニックカルスをさらに増殖させ、分化させることが可能となる。
【０２６２】
増殖胚発生カルスを、再生前培地へと移す（＜９／プレート）。再生前培地は、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類；４５ｇｍ／Ｌ  スクロース；３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ  ｍｙｏ−イノシトール；５０ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．２５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ；０．５ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸のＮａＯＨ溶液；２．５ｍｇ／Ｌ  アブシジン酸のエタノール溶液；１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン；２．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）；及び０．１８１ｍｇ／Ｌ  ハロキシホップ酸；ｐＨ５．８を含有する。このプレートを透明なプラスチックボックス内で保存し、２７℃で７日間、およそ５０μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲの連続光と共にインキュベートする。その後、再生カルスを、Phytatrays（商標）(sigma-aldrich社)中の再生培地へと移し（＜６／プレート）、２８℃で１日当たり、１６時間の明／８時間の暗（およそ１６０μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲ）で１４日間、根と茎が発生するまでインキュベートする。再生培地は、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類；６０ｇｍ／Ｌ  スクロース；１００ｍｇ／Ｌ  ｍｙｏ−イノシトール；１２５ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン；３ｇｍ／Ｌ  GELLAN（商標）ガム；及び０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸；ｐＨ  ５．８を含有する。その後、一次根とともに小さい根を単離し、選択せずに伸長培地へと移す。伸長培地は、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ改変ＭＳビタミン類；３０ｇｍ／Ｌ  スクロース；及び３．５ｇｍ／Ｌ Gelrite（商標）、pH 5.8を含有する。
【０２６３】
形質転換された植物の根は、ハロキシホップを含有する培地上で増殖する能力により選択され、増殖培地（ProMix BX；Premier Tech Horticulture)で満たされた小さなポットへと、Phytatrays（商標）から移植され、カップ又はHUMI-DOMES (ARCO PLASTICS)で覆われ、その後、Conviron 増殖チャンバー（２７℃昼間／２４℃夜間、１６時間の光周期、  ５０〜７０％  ＲＨ、２００μモル  ｍ−２ｓ−１  ＰＡＲ）内で寒冷馴化させる。一部の例において、トウモロコシゲノム内に組み込まれたＡＡＤ１除草剤耐性遺伝子を検出するよう設計されたプライマーを使用した定量リアルタイムＰＣＲアッセイにより、導入遺伝子の相対コピー数に対し、推定トランスジェニック未発達植物を解析する。さらに、ＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイを使用して、推定形質転換体中で発現されたｄｓＲＮＡ中のリンカー配列の存在を検出する。次いで、選択された形質転換未発達植物を温室内に移動させ、さらに成長させて検証する。
【０２６４】
バイオアッセイ及び種子形成を目的とした、温室内の移送、及びＴ０植物の確立    植物がＶ３〜Ｖ４段階に達したとき、IE Custom Blend (PROFILE/METRO MIX 160)土壌混合物へと移植させ、温室内で成長させて開花させる（光露出型；フォト又は同化；ハイライト限界：1200PAR；１６時間の昼の長さ；２７℃昼間／２４℃夜間）。
【０２６５】
昆虫バイオアッセイに使用される植物は、小さなポットからTinus（商標）350-4 Rootrainers（登録商標） (カナダアルバータ州アチソン Spencer-Lemaire Industries)へと移植する(１本の植物／イベント／Rootrainer（登録商標）)。Rootrainers（登録商標）へと移植したおよそ４日後、バイオアッセイを行うために植物に寄生させる。
【０２６６】
Ｔ１世代の植物は、非トランスジェニック選良近交系Ｂ１０４の植物から採取された花粉、又は他の適切な花粉ドナーから採取された花粉と、Ｔ０のトランスジェニック植物の毛を受粉させ、得られた種子を植えることにより取得される。可能な場合には、逆交雑も行われる。
【０２６７】
実施例７：トランスジェニックトウモロコシ組織の分子学的解析
トウモロコシ組織の分子学的解析（例えば、ＲＮＡ−ｑＰＣＲ）は、根の食害が分析される当日に、温室で育った植物から採取された葉及び根からのサンプルに対して行われる。
【０２６８】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲに対するＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果を使用し、ヘアピン導入遺伝子発現を確認する。非形質転換トウモロコシ植物において、低レベルのＰｅｒ５  ３’ＵＴＲの検出が予測される。その理由は、トウモロコシ組織において通常、内因性Ｐｅｒ５遺伝子が発現されているためである。発現されたＲＮＡ中のリピート配列の間の介在配列（ｄｓＲＮＡヘアピン分子の形成に不可欠である）に関するＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果を使用して、ヘアピン転写物の存在を確認する。導入遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のＲＮＡレベルと比較して測定される。
【０２６９】
ゲノムＤＮＡ中のＡＡＤ１コード領域の一部を検出するＤＮＡ  ｑＰＣＲ解析を使用して、導入遺伝子の挿入コピー数を推定する。これらの解析のためのサンプルは、環境チャンバーで成長した植物から採取される。結果を、単一コピーの天然遺伝子の一部を検出するよう設計されたアッセイのＤＮＡ  ｑＰＣＲの結果と比較し、単一イベント（ｓｈｉ  導入遺伝子を１コピー又は２コピー有する）を、温室内でのさらなる実験へと進める。
【０２７０】
さらに、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳｐｅｃＲ；Ｔ−ＤＮＡの外側のバイナリーベクタープラスミド上に保有されている）の一部を検出するよう設計されたｑＰＣＲアッセイを使用して、トランスジェニック植物が、外来性に取込まれたプラスミドの主鎖配列を含有しているか否かを決定する。
【０２７１】
ヘアピンRNA転写物の発現レベル：Ｐｅｒ  ５  ３’ＵＴＲ  ｑＰＣＲ。カルス細胞イベント又はトランスジェニック植物を、Ｐｅｒ  ５  ３’ＵＴＲ配列のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析し、固有トウモロコシ遺伝子（配列番号６７；GENBANKアクセッション番号BT069734）の転写レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定する。当該配列は、ＴＩＰ４１様タンパク質（すなわち、GENBANKアクセッション番号AT4G34270のトウモロコシホモログであり、７４％同一性のtBLASTXスコアを有する）をコードする。ＲＮＡは、RNAeasy（商標）９６キット (Qiagen社、Valencia, CA)を使用して単離される。溶出後、総ＲＮＡを、キット推奨プロトコールに従い、ＤＮａｓｅ１処置に供する。次いで、ＲＮＡを、NanoDrop 8000 分光光度計(Thermo Scientific社)上で定量し、濃度を２５ｎｇ／μＬに標準化する。第一鎖ｃＤＮＡは、High Capacity ｃＤＮＡ合成キット(INVITROGEN社)を使用し、実質的にメーカー推奨プロトコールに従い、５μＬの変性ＲＮＡを用いて１０μLの反応量で調製する。プロトコールを若干改変し、１０μＬのＴ２０ＶＮオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）（１００μＭ） (配列番号６８、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN、式中、ＶはＡ、Ｃ、又はＧであり、及びＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ／Ｕである）を、ランダムプライマーストックミックスの１ｍＬ管へと加えるようにして、ランダムプライマーとオリゴｄＴが混合されたワーキングストックを作製する。
【０２７２】
ｃＤＮＡ合成後、サンプルを、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１：３に希釈し、解析を行うまで−２０℃で保存する。
【０２７３】
Ｐｅｒ５  ３’  ＵＴＲ及びＴＩＰ４１様転写物に対し、別々のリアルタイムＰＣＲアッセイを、１０μＬの反応量で、LightCycler（商標） 480 (Roche diagnostics社、Indianapolis, IN)上で行う。Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのアッセイに関しては、プライマーのP5U76S (F) （配列番号６９）と、P5U76A (R) （配列番号７０）、及びRoche Universal Probe（商標）(UPL76；カタログ番号4889960001；FAMで標識）を用いて反応を行う。ＴＩＰ４１様参照遺伝子のアッセイに関しては、プライマーのＴＩＰｍｘＦ（配列番号７１）とＴＩＰｍｘＲ（配列番号７２)、及びＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）で標識されたプローブＨＸＴＩＰ（配列番号７３）を使用する。
【０２７４】
すべてのアッセイに、鋳型無しの陰性対照が含まれる（ミックスのみ）。標準曲線のために、ブランク（ソースウェルに水）も、ソースプレートに含ませ、サンプルのクロスコンタミネーションをチェックする。プライマーとプローブの配列は、表６に記載される。様々な転写物の検出のための反応成分のレシピは、表７に開示されており、ＰＣＲの反応条件は、表８に要約されている。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分は４６５ｎｍで励起し、蛍光は５１０ｎｍで測定される。ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光部分の対応する値は、５３３ｎｍと５８０ｎｍである。
【表６】
2018533356.tif 000015
【表７】
2018533356.tif 000016
【表８】
2018533356.tif 000017
【０２７５】
データは、メーカーの推奨に従い、Ｃｑ値算出のための二次導関数ｍａｘアルゴリズムを使用した相対定量により、LightCycler（商標）ソフトウェア  ｖ１．５を使用して解析される。発現解析に関し、発現レベルは、ΔΔＣｔ法（すなわち、2-(Cq TARGET - Cq REF)）を使用して算出される。当該方法は、２つのターゲットの間のＣｑ値の差の比較に依っており、最適化ＰＣＲ反応に関し、産物はサイクルごとに２倍になるという仮定のもと、基準値２が選択される。
【０２７６】
ヘアピン転写物のサイズと完全性  ノーザンブロットアッセイ  一部の例において、トランスジェニック植物の追加の分子学的特徴解析が、ノーザンブロット（ＲＮＡブロット）解析の使用により行われ、ｓｈｉヘアピンｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物における、ｓｈｉヘアピンＲＮＡの分子量が決定される。
【０２７７】
すべての材料と装置は、RNase zap（商標） (AMBION/INVITROGEN社)を用いて使用前に処置される。組織サンプル（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）は、２ｍＬのsafelock Eppendorf管で採取され、Klecko（商標）組織粉砕機(カリフォルニア州バイセイリア Garcia Manufacturing)で、1mLのTRIzol (INVITROGEN社)中、３個のタングステンビーズを用いて５分間破壊され、その後、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートされる。任意で、サンプルを１０分間、４℃、１１，０００ｒｐｍで遠心し、上清を新しい2mLsafelock Eppendorf管へと移す。ホモジネートに２００μＬのクロロホルムを加えた後、管を２〜５分間、転倒混和し、ＲＴで１０分間インキュベートして、４℃で１５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。上層を滅菌１．５ｍ LEppendorf管へと移し、６００μＬの１００％イソプロパノールを加え、その後、１０分間〜２時間、ＲＴでインキュベートし、次いで、４〜２５℃で１０分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。上清を捨て、ＲＮＡペレットを２回、１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、洗浄と洗浄の間に、１０分間、４〜２５℃、７，５００ｘｇで遠心分離する。エタノールを捨て、ペレットを３〜５分間、簡単に空気乾燥させ、その後、ヌクレアーゼフリーの水５０μL中に再懸濁する。
【０２７８】
総ＲＮＡを、Nanodrop 8000（登録商標）(Thermo-Fisher社)を使用して定量し、サンプルを５μｇ／１０μＬに標準化する。次いで、１０μＬのグリオキサル（AMBION/INVITROGEN社）を各サンプルに加える。５〜１４ｎｇのＤＩＧ  ＲＮＡ標準マーカーミックス（インディアナ州インディアナポリス Roche Applied Science社）を調製し、等量のグリオキサルに加える。サンプルとマーカーＲＮＡを４５分間、５０℃で変性させ、NorthernMax 10 X グリオキサル泳動緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中、１．２５％  ＳＥＡＫＥＭ  ゴールドアガロース (ニュージャージー州アレンデール Lonza社)ゲルにローディングするまで氷上で保管する。２時間１５分間、６５ボルト／３０ｍＡでの電気泳動によりＲＮＡを分離させる。
【０２７９】
電気泳動後、ゲルを５分間、２Ｘ  ＳＳＣ中でリンスして、ＧＥＬ  ＤＯＣステーション(BioRad社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)上で画像化する。その後、ＲＮＡを、トランスファー緩衝液として１０ｘＳＳＣを使用して、ＲＴで一晩、ナイロン膜（Millipore）へ受動的にトランスファーする（２０ｘＳＳＣは、３Ｍ  塩化ナトリウムと３００ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０からなる）。トランスファー後、膜を２ｘＳＳＣで５分間リンスして、ＲＮＡを膜（Agilent/Stratagene社）にＵＶ架橋し、その膜を室温で最大２日乾燥させる。
【０２８０】
膜を１〜2時間、UltraHyb（商標）緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中でプレ−ハイブリダイズする。プローブは、Roche Applied ScienceのＤＩＧ法によりジゴキシゲニンで標識された、対象配列を含有するＰＣＲ増幅産物（例えば、必要に応じて、配列番号２７のアンチセンス配列部分）からなる。推奨緩衝液中でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中、６０℃の温度で一晩である。ハイブリダイゼーション後、ブロットをＤＩＧ洗浄に供し、ラップして、１〜３０分間、フィルムに曝露し、その後、そのフィルムを現像させる。すべてＤＩＧキットのサプライヤーの推奨する方法によるものである。
【０２８１】
導入遺伝子のコピー数決定  おおよそ２葉パンチ分と等しいトウモロコシの葉片を９６ウェルコレクションプレート（Qiagen社（商標））に集める。組織破壊は、１つのステンレススチールビーズを用いて、Biosprint96（商標）AP1溶解緩衝液（Biosprint96（商標） PLANT KITと共に提供される；Qiagen（商標）) 中、Klecko（商標）組織粉砕機（カリフォルニア州バイセイリア Garcia Manufacturing)を使用して行われる。組織を浸軟させた後、ゲノムDNA（gDNA）を、Biosprint96（商標） PLANT KIT 及びBiosprint96（商標）抽出ロボットを使用し、ハイスループットフォーマット中で単離する。ゲノムＤＮＡは、ｑＰＣＲ反応をセットアップする前に、２：３のＤＮＡ：水に希釈される。
【０２８２】
ｑＰＣＲ解析    加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子の検出は、LightCycler（登録商標）４８０システムを使用したリアルタイムＰＣＲにより行われる。リンカー配列（例えば、ST-LS1、配列番号３１）、を検出するため、又はＳｐｅｃＲ遺伝子（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上に担持されているスペクチノマイシン耐性遺伝子；配列番号７４；表９のＳＰＣ１オリゴヌクレオチド）を検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、LightCycler（登録商標）プローブ設計ソフトウェア  ２．０を使用して設計される。さらに、ＡＡＤ−１除草剤耐性遺伝子（配列番号７５；表９のＧＡＡＤ１オリゴヌクレオチド）のセグメントを検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、Primer Expressソフトウェア（Applied Biosystems社）を使用して設計される。表９は、プライマーとプローブの配列を示す。アッセイは、固有トウモロコシ染色体遺伝子（インベルターゼ（配列番号７６）；GENBANKアクセッション番号U16123；本明細書においてＩＶＲ１と呼称される）に対する試薬を用いてマルチプレックス化され、それを各アッセイ中にｇＤＮＡが存在していることを確認するための内部標準配列として使用する。増幅のために、LightCycler（登録商標）480 Probes Masterミックス(Roche Applied Science社)を、各プライマーを０．４μＭ、各プローブを０．２μＭ含有する、１０μＬ量のマルチプレックス反応液中、１ｘの最終濃度で調製する（表１０）。表１１に概要されるように、２工程の増幅反応を行う。ＦＡＭ標識プローブとＨＥＸ標識プローブに対する蛍光活性化と発光は上述のとおりであり、ＣＹ５結合体は６５０ｎｍで最大励起し、６７０ｎｍで最大蛍光発光する。
【０２８３】
Ｃｐスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値と交差するポイント）は、適合点アルゴリズム（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５）と相対Ｑｕａｎｔモジュール（Ｃｔ法に基づく）を使用したリアルタイムＰＣＲデータから決定される。ΔΔデータは、上記前述のように（ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）扱われる。
【表９】
2018533356.tif 000018
【表１０】
2018533356.tif 000019
【表１１】
2018533356.tif 000020
【０２８４】
実施例８：トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ
昆虫バイオアッセイ
植物細胞中で産生された対象発明ｄｓＲＮＡの生物活性は、バイオアッセイ法により示される。例えば、Baum ら (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326を参照のこと。制御された給餌環境下、殺虫性ｄｓＲＮＡを産生する植物から誘導された様々な植物組織又は組織片を、標的昆虫に給餌することにより、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫性ｄｓＲＮＡを産生する植物から誘導された様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を、本明細書に前述されるように、バイオアッセイ用の人工飼料の上に施す。かかる給餌アッセイの結果は、殺虫性ｄｓＲＮＡを産生しない宿主植物由来の適切な対照組織、又は他の対照サンプルを使用し、同様に行われたバイオアッセイに対して比較される。標的昆虫の検証飼料上での成長と生存は、対照群と比較して低下する。
【０２８５】
トランスジェニックトウモロコシイベントを用いた昆虫バイオアッセイ 
洗浄された卵から孵化した２匹のウェスタンコーンルートワームの幼虫（１〜３日齢）を選択し、バイオアッセイトレイの各ウェル内に置く。次いで、ウェルを「PULL N' PEEL」タブカバー(BIO-CV-16、BIO-SERV) を用いて覆い、１８時間／６時間の明暗サイクルで２８℃のインキュベーター内に置く。最初の寄生から９日後、幼虫を死亡に関して評価する。各処置の昆虫の総数に対する死亡した昆虫の割合として算出される。昆虫サンプルは２日間、−２０℃で凍結され、その後、各処置の幼虫をプールし、重量計測する。成長阻害の割合は、実験処置の平均重量を２つの対照ウェル処置の平均重量の平均により割ることにより算出される。データは、（陰性対照の）成長阻害割合として表される。対照平均重量を上回る平均重量は、ゼロと標準化される。著しい成長阻害が観察される。
【０２８６】
温室内の昆虫バイオアッセイ
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の卵は、CROP CHARACTERISTICS (ミネソタ州ファーミントン)の土壌から受領する。ＷＣＲの卵を、１０〜１１日間、２８℃でインキュベートする。土壌から卵を洗い出し、０．１５％のアガー溶液内に置き、濃度をおよそ７５〜１００個の卵／０．２５ｍＬアリコートに調節する。孵化プレートは、ペトリ皿にて卵懸濁液のアリコートと共にセットアップし、孵化率を監視する。
【０２８７】
ROOTRANERS（登録商標）で成長するトウモロコシ植物の周囲の土壌に、１５０〜２００個のＷＣＲの卵を寄生させる。昆虫を２週間飼育し、その後、「根評価（Root Rating）」を各植物に与える。Oleson ら（2005） J. Econ.Entomol.98:1-8.に原則的に従い、結節−損傷スケールを等級付けに利用する。このバイオアッセイを経た植物は損傷の低下を示しており、種子形成のために５ガロンのポットへと移植される。移植物を殺虫剤で処置し、さらなるルートワームのダメージを予防し、昆虫を温室内に放出する。種子形成のために植物を手で受粉させる。これら植物から産生された種子は、Ｔ１及び次世代の植物の評価のために保存される。
【０２８８】
温室でのバイオアッセイには、２種類の陰性対照植物が含まれる。トランスジェニック陰性対照植物は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はＹＦＰヘアピン型ｄｓＲＮＡを産生するよう設計された遺伝子を有するベクターを用いた形質転換により作製される（実施例４を参照のこと）。非形質転換陰性対照植物は、トランスジェニック植物が作製された親トウモロコシ種の種から成長させる。バイオアッセイは、別の異なる２日に、各設定の植物材料に含ませた陰性対照と共に行われる。
【０２８９】
実施例９：鞘翅目害虫配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
１０〜２０のトランスジェニックＴ０トウモロコシ（Zea mays）植物を、実施例６に記載されるように作製する。さらに、ＲＮＡｉ構築物用のヘアピンｄｓＲＮＡを発現する、１０〜２０のＴ１トウモロコシ（Zea mays）独立系統を、コーンルートワームチャレンジのために取得する。配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９に明記されるヘアピンｄｓＲＮＡが誘導されてもよく、または別の手段でさらに配列番号１、配列番号３、または配列番号５を含有するヘアピンｄｓＲＮＡが誘導されてもよい。追加的ヘアピンｄｓＲＮＡは、たとえばＣａｆ１−１８０ (米国特許出願公開2012/0174258)、ＶａｔｐａｓｅＣ(米国特許出願公開2012/0174259)、Ｒｈｏ１(米国特許出願公開2012/0174260)、ＶａｔｐａｓｅＨ(米国特許出願公開2012/0198586)、ＰＰＩ−８７Ｂ(米国特許出願公開2013/0091600)、ＲＰＡ７０(米国特許出願公開2013/0091601)、またはＲＰＳ６(米国特許出願公開2013/0097730)などの鞘翅目害虫配列から誘導される。これらは、ＲＴ−ＰＣＲ又は他の分子学的解析法を介して確認される。
【０２９０】
選択された独立Ｔ１系統からの総ＲＮＡ調製物を任意で、各ＲＮＡｉ構築物においてヘアピン発現カセットのリンカーに結合するよう設計されたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに使用する。さらに、ＲＮＡｉ構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでのｓｉＲＮＡの産生に必要とされるプロセッシング前ｍＲＮＡを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックトウモロコシ（Zea Mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセッシングは、任意で、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
【０２９１】
さらに、標的遺伝子に対し８０％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子に対し１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子で見られるものとある程度類似した影響をコーンルートワームに与える。同じＲＮＡｉ構築物中でヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列の対形成は、摂食している鞘翅目害虫の成長、発達及び活性に影響を与えることができる、植物−処理化ｓｉＲＮＡを送達する。
【０２９２】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのｉｎ  ｐｌａｎｔａ送達、及び摂食を介した鞘翅目害虫による取込は、ＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングを介した鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、鞘翅目害虫の成長及び／又は発達は影響を受け、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）、及びジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）のうちの少なくとも１つの場合において、鞘翅目害虫の寄生、摂食、発達が失敗に導かれ、及び／又は鞘翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びＲＮＡｉ適用の成功で、鞘翅目害虫が制御される。
【０２９３】
トランスジェニックＲＮＡｉ系統及び非形質転換トウモロコシ（Zea mays)の表現型比較
ヘアピンｄｓＲＮＡ生成を目的として選択された標的鞘翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら鞘翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）ＲＮＡｉの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する。植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物の根の長さ、及び成長パターンに差異は観察されない。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観は類似している。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的ｉＲＮＡ分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
【０２９４】
実施例１０：鞘翅目害虫配列、及び追加のRNAi構築物を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
鞘翅目害虫以外の生物体を標的とするｉＲＮＡ分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標））技術を介して二次的に形質転換させ（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67を参照のこと）、１つ以上の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子を産生させる（例えば、配列番号１、配列番号３、及び／又は配列番号５を含有する遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子をはじめとする、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）。原則的に実施例４に記載されるように調製された植物形質転換プラスミドベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標）介在性形質転換法を介して、鞘翅目害虫以外の生物体を標的とするｉＲＮＡ分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するＨｉ  ＩＩ又はＢ１０４のトウモロコシ（Zea mays）植物から取得されたトウモロコシ懸濁細胞又は未成熟トウモロコシ胚へと送達させる。
【０２９５】
実施例１１：RNAi構築物、及び追加の鞘翅目害虫制御配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
鞘翅目害虫生物体を標的とするｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５を含有する遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子をはじめとする少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標））技術を介して二次的に形質転換させ（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67を参照のこと）、例えばＣｒｙ３、Ｃｒｙ３４、及びＣｒｙ３５殺虫性タンパク質などの殺虫性タンパク質分子を１つ以上産生させる。原則的に実施例４に記載されるように調製された植物形質転換プラスミドベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標）介在性形質転換法を介して、鞘翅目害虫生物体を標的とするｉＲＮＡ分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックＢ１０４トウモロコシ（Zea mays）植物から取得されたトウモロコシ懸濁細胞又は未成熟トウモロコシ胚へと送達させる。鞘翅目害虫の制御を目的としたｉＲＮＡ分子及び殺虫性タンパク質を産生する、二重に形質転換された植物が取得される。
【０２９６】
実施例１２：新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）の候補標的遺伝子のスクリーニング
新熱帯茶色カメムシ（BSB；Neotropical brown stink bug）(Euschistus heros)コロニー。BＳＢを、２７℃、相対湿度６５％のインキュベーターにおいて、１６：８時間の明暗サイクルで、飼育する。２〜３日にわたり採取された１グラムの卵を、底にろ紙ディスクを敷いた５Ｌの容器中に播種し、この容器を通気のために＃１８メッシュで覆った。各飼育容器から、およそ３００〜４００匹の成虫ＢＳＢが得られた。すべての段階で、昆虫は、週に３回、新鮮なサヤマメを与えられ、ひまわりの種、ダイズ、及びピーナッツ（３：１：１の重量比）が日あった種混合物の小袋が週に１回置き換えられた。水は、芯として綿栓を用いたバイアルにて供給された。最初の２週間の後、昆虫は、週に１回、新しい容器へと移された。
【０２９７】
BSBの人工飼料  ＢＳＢの人工飼料は以下のように調製された。凍結乾燥されたサヤマメを、MAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で微粉末まで混合し、一方で生（有機）ピーナッツは、別のMAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で混合した。混合された乾燥成分を、大きなMAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で混合し（重量割合：サヤマメ、３５％；ピーナッツ、３５％；スクロース、５％；ビタミン複合体（例えば昆虫用のVanderzant Vitamin Mixture、SIGMA-ALDRICH社、カタログ番号V1007)、０．９％）；ブレンダーは蓋を閉められ、よく振とうさせて、成分を混合した。次いで、混合された乾燥成分を、混合ボウルへと加えた。別の容器において、水、及びベノミル抗真菌剤（５０ｐｐｍ；２５μLの２０，０００ｐｐｍ溶液／５０ｍL飼料溶液）を良く混合し、その後、乾燥成分混合物へと加えた。全ての成分を、溶液が完全に混合されるまで、手でよく混ぜた。飼料を所望の大きさに形作り、アルミニウムホイルで緩く包み、４時間、６０℃で加熱し、その後、冷却して４℃で保存した。人工飼料は、調製から２週以内に使用した。
【０２９８】
BSBトランスクリプトームアセンブリ。BSBの６つの発達段階を、ｍＲＮＡライブラリー調製に選択した。総ＲＮＡは、‐７０℃に凍結させた昆虫から抽出し、 FastPrep（登録商標）-24 機器(MP BIOMEDICALS社)上のLysing MATRIX A 2mL管(MP BIOMEDICALS社、Santa Ana, CA)において、１０体積の溶解／結合緩衝液中でホモジナイズした。総ｍＲＮＡは、メーカーのプロトコールに従い、mirVana（商標）miRNA Isolation Kit (AMBION;INVITROGEN)を使用して抽出した。イルミナ（登録商標）HiSeq（商標）システム (San Diego, CA)を使用したＲＮＡ配列解析により、ＲＮＡｉ昆虫制御技術における使用のための候補標的遺伝子配列が提示された。HiSeq（商標）は、６サンプルに対し、全部で約３億７８００万のリードを生成した。TRINITY（商標）アセンブラーソフトウェア(Grabherr ら （2011）Nature Biotech. 29:644-652)を使用して、各サンプルに対し個々にリードをアセンブリした。アセンブリされた転写物を組み合わせ、統合トランスクリプトームを生成した。このＢＳＢ統合トランスクリプトームは、３７８，４５７の配列を含有した。
【０２９９】
BSB shiオルソログの同定。ＢＳＢ統合トランスクリプトームのｔＢＬＡＳＴｎサーチは、クエリとして、ショウジョウバエ（Drosophila）ｓｈｉ（タンパク質配列GENBANKアクセッション番号ABI30983)を使用して行われた。ＢＳＢのｓｈｉ（配列番号８９）は、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）候補標的遺伝子産物として同定され、予測ペプチド配列は、配列番号９０である。
【０３００】
鋳型調製及びｄｓＲＮＡ合成。ｃＤＮＡは、TRIzol（登録商標）試薬(LIFE TECHNOLOGIES社)を使用し、１匹の若い成虫（約９０ｍｇ）から抽出された総ＢＳＢ  ＲＮＡから調製された。昆虫は、ペレットペッスル(FISHERBRAND社、カタログ番号12-141-363)及びペッスルモーターミキサー(COLE-PARMER社、Vernon Hills, IL)を使用し、２００μLのTRIzol（登録商標）と共に１．５ｍL微小遠心管中、室温でホモジナイズされた。ホモジナイズ後、追加の８００μLのTRIzol（登録商標）を加え、ホモジネートをボルテックスし、その後、室温で５分間インキュベートした。細胞残渣を遠心で取り除き、上清を新しい管に移した。メーカー推奨の１ｍLのTRIzol（登録商標）用TRIzol（登録商標）抽出プロトコールに従い、ＲＮＡペレットを室温で乾燥させ、GFX PCR DNA AND Gel Extraction kit (illustra（商標）；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES社)からの２００μLのTris緩衝液に、溶出緩衝液タイプ４（すなわち、10mM  Tris-HCl、pH8.0）を使用して再懸濁させた。ＲＮＡの濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(Thermo Scientific社、Wilmington, DE)を使用して測定された。
【０３０１】
ｃＤＮＡ増幅。  ｃＤＮＡは、メーカー推奨のプロトコールに従い、ＲＴ−ＰＣＲ用のSUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM（商標）(INVITROGEN社)を使用して、５μｇのＢＳＢ総ＲＮＡ鋳型とオリゴｄＴプライマーから逆転写された。転写反応の最終量は、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１００μＬとした。
【０３０２】
プライマー  BSB_shi-dsRNA1_For (配列番号９２)、及びBSB_th-dsRNA1_Rev （配列番号９３）を使用して、ＢＳＢ＿ｓｈｉ領域１（表１２）、又はＢＳＢ＿ｓｈｉ−１とも呼称される鋳型を増幅した。ＤＮＡ鋳型は、タッチダウンＰＣＲ（１℃／１サイクルの低下でアニーリング温度を６０℃から５０℃に下げる）により鋳型として１μＬのｃＤＮＡ（上述）を用いて増幅させた。４８４ｂｐのＢＳＢ＿ｓｈｉ−１セグメント（配列番号９１）を含有する断片を、３５サイクルのＰＣＲの間に作製した。上述の手段を再度使用して、３０１ｂｐの陰性対照鋳型ＹＦＰｖ２（配列番号９４）を、ＹＦＰｖ２−Ｆ（配列番号９５）とＹＦＰｖ２−Ｒ（配列番号９６）のプライマーを使用して増幅させた。ＢＳＢ＿ｓｈｉ、及びＹＦＰｖ２のプライマーは、Ｔ７ファージプロモーター配列（配列番号１３）をその５’末端に含有し、それによって、ｄｓＲＮＡ転写のためのＹＦＰｖ２及びＢＳＢ＿ｓｈｉのＤＮＡ断片の使用が可能となった。
【表１２】
2018533356.tif 000021
【０３０３】
ｄｓＲＮＡ合成。  ｄｓＲＮＡは、２μＬのＰＣＲ産物（上述）を鋳型として使用し、MEGAscript（商標） T7 RNAi キット (AMBION社)をメーカーの説明書に従い使用して合成させた。図１を参照のこと。dsRNAは、NANODROP（商標）8000分光光度計上で定量され、ヌクレアーゼフリーの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液  （１ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、５００ｎｇ／μＬに希釈された。
【０３０４】
BSB血体腔へのdsRNAの注入。BSBは、２７℃のインキュベーター中、６５％の相対湿度、１６：８時間の明暗光周期で、サヤマメと種飼料上でコロニーとして飼育された。二齢若虫（各々１〜１．５ｍｇの重量）を、小さなブラシで穏やかに触れて傷を防ぎ、氷上のペトリディッシュに置き、昆虫を冷却し、静止させた。各昆虫に、５５．２ｎＬ  ５００  ｎｇ／μＬ  ｄｓＲＮＡ溶液（すなわち、２７．６ｎｇ  ｄｓＲＮＡ；投与量は１８．４〜２７．６  μｇ／ｇ体重）で注入した。Drummond 3.5インチ #3-000-203-G/Xガラスキャピラリーから引き抜かれた注射針を備え付けたNANOJECT（商標） IIインジェクター(DRUMMOND SCIENTIFIC社、Broomhall, PA)を使用し、注入が行われた。針先を破壊し、キャピラリーは、軽油で埋め戻され、次いで、２〜３μＬのｄｓＲＮＡで満たされた。ｄｓＲＮＡは、若虫の腹部に注入され（１０匹の昆虫に注入／ｄｓＲＮＡ／試験）、試験は３つの別々の日に繰り返された。注入された昆虫（５匹／ウェル）を、人工ＢＳＢ飼料を含有する３２ウェルトレイ(Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV社、Frenchtown, NJ)へと移し、Pull-N- Peel（商標）タブ(BIO-CV-4; BIO-SERV)で覆った。湿気は、綿栓をした１．５ｍＬの微小遠心管中の１．２５ｍＬの水により供給された。トレイを２６．５℃、湿度６０％、及び１６：８の明暗光周期でインキュベートした。活性と重量の計測は、注入後、７日目に行われた。
【０３０５】
BＳＢ  ｓｈｉは、致死的なｄｓＲＮＡ標的である。表１３に要約されるように、各レプリケートに対し少なくとも１０匹の２齢のＢＳＢ若虫（各々１〜１．５ｍｇ）に、およそ１８．４〜２７．６μｇ  ｄｓＲＮＡ／昆虫ｇの最終濃度に対し、５５．２ｎＬのＢＳＢ＿ｓｈｉ−１  ｄｓＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）を用いて体腔内に注入した。ＢＳＢ＿ｓｈｉ−１  ｄｓＲＮＡに対し測定された死亡率は、同量を注入されたＹＦＰｖ２  ｄｓＲＮＡ（陰性対照）で見られた死亡率とは有意に異なっていた。ｐ＝０．００４ (スチューデントｔ検定)。
【表１３】
2018533356.tif 000022
【０３０６】
実施例１３：半翅目害虫配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
配列番号９１及び／又は配列番号８９を含有する核酸に対する発現ベクターを有する、１０〜２０のトランスジェニックＴ０トウモロコシ（Zea mays）植物を、実施例４に記載されるように作製する。さらに、ＲＮＡｉ構築物用のヘアピンｄｓＲＮＡを発現する、１０〜２０のＴ１トウモロコシ（Zea mays）独立系統を、ＢＳＢチャレンジのために取得する。配列番号８９、又はその断片（例えば、配列番号９１）を含有するヘアピンｄｓＲＮＡが誘導される。これらは、ＲＴ−ＰＣＲ又は他の分子学的解析法を介して確認される。選択された独立Ｔ１系統からの総ＲＮＡ調製物を任意で、各ＲＮＡｉ構築物においてヘアピン発現カセットのリンカーイントロンに結合するよう設計されたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに使用する。さらに、ＲＮＡｉ構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでのｓｉＲＮＡの産生に必要とされるプロセッシング前ｍＲＮＡを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックトウモロコシ（Zea Mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセッシングは、任意で、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
【０３０７】
さらに、標的遺伝子に対し８０％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子に対し１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子で見られるものとある程度類似した影響を半翅目に与える。同じＲＮＡｉ構築物中でヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列の対形成は、摂食している半翅目害虫の成長、発達、及び活性に影響を与えることができる植物−処理化ｓｉＲＮＡを送達する。
【０３０８】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡのｉｎ  ｐｌａｎｔａ送達、及びその結果としての摂食を介した半翅目害虫による取込は、ＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングを介した半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、半翅目害虫の成長、発達及び／又は生存は影響を受け、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、ミドリカメムシ（Acrosternum hilare）、及び茶色カメムシ（Euschistus servus）のうちの少なくとも１つの場合において、半翅目害虫の寄生、摂食、発達が失敗に導かれ、及び／又は半翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びＲＮＡｉ適用の成功で、半翅目害虫が制御される。
【０３０９】
トランスジェニックＲＮＡｉ系統及び非形質転換トウモロコシ（Zea mays)の表現型比較    ヘアピンｄｓＲＮＡ生成を目的として選択された標的半翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら半翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）ＲＮＡｉの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する。植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物の根の長さ、及び成長パターンに差異は観察されない。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観は類似している。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的ｉＲＮＡ分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
【０３１０】
実施例１４：半翅目害虫配列を含有するトランスジェニックダイズ（Glycine max）
配列番号８９、又はそのセグメントを含有する核酸（例えば、配列番号９１）に対する発現ベクターを有する、１０〜２０のトランスジェニックＴ０ダイズ（Glycine max）植物を、例えば以下のような、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換をはじめとする当分野に公知のように作製する。成熟ダイズ（Glycine max）の種子を、塩素ガスで一晩、１６時間滅菌する。塩素ガスでの滅菌後、Laminar（商標）フローフード内の蓋の開いた容器に置き、塩素ガスを消散させる。次に、ブラックボックスを用いて１６時間、暗所、２４℃にて滅菌Ｈ２Ｏを滅菌した種に吸収させる。
【０３１１】
分割ダイズ種の調製    胚軸の一部を含有する分割ダイズ種子のプロトコールは、外科用メスに装着された＃１０刃を使用し、種のへそに沿って長軸に切り、種の覆いを分離及び除去し、２つの子葉部分に種を割る、ダイズ種材料の調製を必要とする。注意深く胚軸を部分的に除去し、胚軸の約１／２〜１／３は子葉の節の末端に付着したままにする。
【０３１２】
接種    胚軸の一部分を含有する分割ダイズ種子を、次いで、配列番号８９及び／又は配列番号９１を含有するバイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えば、ＥＨＡ１０１株又はＥＨＡ１０５株）の溶液に約３０分間、浸す。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）溶液は、λ＝０．６  ＯＤ６５０の最終濃度に希釈され、その後、胚軸を含有する子葉を浸す。
【０３１３】
共培養  接種後、分割ダイズ種子を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）系統と５日間、一片のろ紙で覆われたペトリディッシュ中、共培養培地(Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2ndEd., Wang, K.（編）、Humana Press, New Jersey, 2006)上で、共培養させる。
【０３１４】
発芽誘導  共培養の５日後、分割ダイズ種を、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン類、２８ｍｇ／Ｌ  第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌ  スクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム、及び５０ｍｇ／Ｌ  バンコマイシン（ｐＨ  ５．７）からなる発芽誘導（ＳＩ）培地液中で洗浄する。次いで、分割ダイズ種子を、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン類、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅアガー、２８ｍｇ／Ｌ  第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌ  スクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム、及び５０ｍｇ／Ｌ  バンコマイシン（ｐＨ５．７）からなる発芽誘導Ｉ（ＳＩ  Ｉ）培地上で培養し、子葉の平らな面を仰向けにさせ、子葉の節末端を培地中に埋め込む。培養の２週間後、形質転換された分割ダイズ種からの外植片を、６ｍｇ／Ｌ  グルホシナート（ＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標））を補充されたＳＩ  Ｉ培地を含有する発芽誘導ＩＩ（ＳＩ  ＩＩ）培地に移す。
【０３１５】
芽の伸長    ＳＩ  ＩＩ培地上での培養の２週間後、子葉を外植片から取り除き、胚軸を含有する新しい芽の浮葉（ｐａｄ）を、子葉の底で切断することにより切除する。子葉から単離された芽の浮葉を、芽伸長（ＳＥ）培地へと移す。ＳＥ培地は、ＭＳ塩、２８ｍｇ／Ｌ  第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌ  スクロース、及び０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌ  アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸、０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ３、１ｍｇ／Ｌ  ゼアチンリボシド、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌ  バンコマイシン、６ｍｇ／Ｌ  グルホシナート、及び７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅアガー（ｐＨ５．７）からなる。培養物を新鮮なＳＥ培地へと２週間毎に移す。培養物を、Conviron（商標）増殖チャンバー内で、２４℃、８０〜９０μモル／ｍ２秒の光密度、１８時間の光周期で増殖させる。
【０３１６】
発根    子葉の芽浮葉から発達した伸長根を、子葉の芽浮葉の底で伸長根を切断することにより単離し、発根を促進するために１〜３分間、１ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ（３−酪酸インドール）中に伸長根を浸す。次に、伸長した根を、フィタントレイ中、発根培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌ  第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、２０ｇ／Ｌ  スクロース及び０．５９ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌ  アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅアガー、ｐＨ５．６）に移した。
【０３１７】
栽培  Conviron（商標）増殖チャンバーでの２４℃、１８時間の光周期の１〜２週間の培養後、根が発達した芽を、覆いをしたサンデーカップ中、土壌ミックスへと移し、未発達植物の順応を目的として、長日条件（１６時間の明／８時間の暗）下、１２０〜１５０Μモル／Ｍ２秒の光密度、一定温度（２２℃）と湿度（４０〜５０％）で、Conviron（商標）増殖チャンバー(モデルＣＭＰ４０３０及びＣＭＰ３２４４、Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada)に置く。発根した未発達植物を、数週間、サンデーカップ中で順応させ、その後、さらなる順応と、しっかりしたトランスジェニックダイズ植物の確立のために温室へと移す。
【０３１８】
さらに、ＲＮＡｉ構築物用のヘアピンｄｓＲＮＡを発現する、１０〜２０のＴ１ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）独立系統を、ＢＳＢチャレンジのために取得する。配列番号８９、又はその断片（例えば、配列番号９１）を含有するヘアピンｄｓＲＮＡが誘導されてもよい。これらは、ＲＴ−ＰＣＲ又は当分野に公知の他の分子学的解析法を介して確認される。選択された独立Ｔ１系統からの総ＲＮＡ調製物を任意で、各ＲＮＡｉ構築物においてヘアピン発現カセットのリンカーイントロンに結合するよう設計されたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに使用する。さらに、ＲＮＡｉ構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでのｓｉＲＮＡの産生に必要とされるプロセッシング前ｍＲＮＡを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックダイズ（Glycine max）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセッシングは、任意で、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
【０３１９】
標的遺伝子に対し８０％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子に対し１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子で見られるものとある程度類似した影響をＢＳＢに与える。同じＲＮＡｉ構築物中でヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列の対形成は、摂食している半翅目害虫の成長、発達、及び活性に影響を与えることができる植物−処理化ｓｉＲＮＡを送達する。
【０３２０】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡのｉｎ  ｐｌａｎｔａ送達、及びその結果としての摂食を介した半翅目害虫による取込は、ＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングを介した半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、半翅目害虫の成長、発達及び／又は活性は影響を受け、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、アオカメムシ（Chinavia hilare）、茶色カメムシ（Euschistus servus）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）、ワタムシ（Horcias nobilellus）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）、及びリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）のうちの少なくとも１つの場合において、半翅目害虫の寄生、摂食、発達が失敗に導かれ、及び／又は半翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びRNAi適用の成功で、半翅目害虫が制御される。
【０３２１】
トランスジェニックRNAi系統、及び非形質転換ダイズ（Glycine max）の表現型比較。ヘアピンｄｓＲＮＡ生成を目的として選択された標的半翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら半翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）ＲＮＡｉの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する。植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物の根の長さ、及び成長パターンに差異は観察されない。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観は類似している。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的ｉＲＮＡ分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
【０３２２】
実施例１５：人工飼料に対する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）のバイオアッセイ  
人工飼料に対するｄｓＲＮＡ摂食アッセイにおいて、注入実験にあるように、３２ウェルのトレイを、約１８ｍｇの人工飼料のペレットと水でセットアップする（実施例１２を参照のこと）。２００ｎｇ／μＬの濃度のｄｓＲＮＡを飼料ペレットと水サンプルに加える；２つのウェル各々に対し、１００μＬ。５匹の２齢の新熱帯茶色カメムシ（E. heros）若虫を、各ウェルに入れる。水サンプルと、ＹＦＰ転写物を標的とするｄｓＲＮＡを陰性対照として使用する。実験は、３回、別の日に繰り返される。処置の８日後に生き残った昆虫の重量を計測し、死亡率を決定する。ＢＳＢ＿ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡがもたらされたウェルで、対照ウェルと比較し、有意な死亡率及び／又は成長阻害が観察される。
【０３２３】
実施１６：鞘翅目害虫配列を含有するトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
ｓｈｉ（配列番号８９）のセグメントを含有するヘアピン構造用標的遺伝子構築物を含有するシロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターを、実施例４に類似した標準的な分子学的方法を使用して作製する。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の形質転換は、標準的なアグロバクテリウム（Agrobacterium）をベースとした手順を使用して行われる。グルホシナート耐性選択マーカーを有するＴ１種子を選択する。トランスジェニックＴ１シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を作製し、ホモ接合性単一コピーＴ２トランスジェニック植物を昆虫実験のために作製する。花序を付けた生長中のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物に対しバイオアッセイを行う。５〜１０匹の昆虫を各植物上に置き、１４日以内の生存を監視する。
【０３２４】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターの構築  ｓｈｉ（配列番号８９）のセグメントを含有するヘアピン構造用標的遺伝子構築物を有するエントリーベクターｐＤＡＢ３９１６に基づいたエントリークローンは、化学合成された断片(DNA2.0, Menlo Park, CA)の組み合わせと、標準的な分子クローニング法を使用してアセンブリされる。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン構造は、標的遺伝子セグメントの２つのコピーを反対方向に（単一転写ユニット内で）配置することにより促進され、この２つのセグメントはリンカー配列（例えば、ＳＴ−ＬＳ１イントロン；配列番号３１）により分離される（Vancanneytら (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50))。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、リンカー配列により分離され、互いの大きな反転リピートとして、２つのｓｈｉ遺伝子セグメント配列を含有している。プロモーター（例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター(Callis ら (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493)）のコピーを使用して、一次mRNAヘアピン転写物の産生を誘導し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム２３由来の３’非翻訳領域を含有する断片(AtuORF23 3' UTR v1；米国特許第5,428,147号)を使用して、ヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させる。
【０３２５】
エントリーベクター内のヘアピンクローンは、典型的なバイナリーデスティネーションベクター（pDAB101836）との標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応に使用され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換のためのヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクターを作製する。
【０３２６】
バイナリーデスティネーションベクターのpDAB101836は、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV Promoter v2、米国特許第7,601,885号； Verdaguerら（1996）Plant Mol. Biol. 31:1129-39）の制御下の除草剤耐性遺伝子のDSM-2v2 (米国特許出願2011/0107455)を含有する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム１の３’非翻訳領域を含有する断片(AtuORF1 3' UTR v6；Huang ら (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22)を使用して、ＤＳＭ２ｖ２  ｍＲＮＡの転写を終結させる。
【０３２７】
ＹＦＰヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子を含有する陰性対照のバイナリー構築物であるpDAB114507は、典型的なバイナリーデスティネーションベクター (pDAB101836) とエントリーベクターのppDAB3916を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築される。エントリー構築物のpDAB112644は、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ユビキチン１０プロモーター（上述）の発現制御下のＹＦＰヘアピン配列(hpYFP v2-1、配列番号９３）、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（上述）由来のＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
【０３２８】
殺虫性ヘアピンRNAを含有するトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis ）の産生 アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換。ヘアピン配列を含有するバイナリーベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＧＶ３１０１株（pMP90RK)へとエレクトロポレーションする。組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）クローンは、組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーのプラスミド調製物の制限酵素解析に確認される。Qiagen Plasmid Max Kit (Qiagen社、カタログ番号12162)を使用して、メーカー推奨のプロトコールに従い、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物からプラスミドを抽出する。
【０３２９】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換、及びT1選択  １２〜１５のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物（栽培品種Columbia）を、2５０μモル／ｍ２の光密度、２５℃、及び１８：６時間の明暗条件で、温室内の４インチポットで成長させる。最初の花の茎を、形質転換の１週間前に切り取る。アグロバクテリウム（Agrobacterium）接種物はＬＢブロス(Sigma社 L3022)中の組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）グリセロールストック１０μＬ＋１００ｍｇ／Ｌ  スペクチノマイシン＋５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン１００ｍＬを２８℃でインキュベートし、７２時間、２２５ｒｐｍで振とうすることにより調製される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を回収し、５％スクロース  ＋  ０．０４％  Ｓｉｌｗｅｔ−Ｌ７７  (Lehle Seeds カタログ番号 VIS-02) ＋１０  μｇ／Ｌ  ベンズアミノプリン (BA)溶液に、ＯＤ６００  ０．８〜１．０まで懸濁し、その後、花を浸漬する。植物の地上部分をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液に穏やかに攪拌しながら５〜１０分間浸漬する。次いで、結実するまで、定期的な水やりと施肥を行いながら、正常に成長させるために植物を温室に移す。
【０３３０】
実施例１７：トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の成長及びバイオアッセイ
ヘアピンＲＮＡｉ構築物で形質転換されたＴ１シロイヌナズナ属（ Arabidopsis）の選択  各形質転換に対し、２００ｍｇ以下のＴ１種子を、０．１％アガロース溶液中で階層化させる。＃５サンシャインメディア（#5 sunshine media）を有する発芽トレイ（１０．５インチ  ｘ  ２１インチｘ１インチ；T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.）に種を植える。種植え後６日目及び９日目で、２８０ｇ／ｈａのIgnite（登録商標）(グルホシナート)に対する耐性に対し選択する。選択されたイベントを、４インチ直径のポットへと移植する。挿入コピー解析を、Roche LightCycler480（商標）を使用した加水分解定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を介して、移植から１週以内に行う。ＰＣＲプライマーと加水分解プローブは、LightCycler（商標） Probe Design Software 2.0 (Roche社)を使用し、ＤＳＭ２ｖ２選択マーカーに対して設計される。植物は、２４℃、１６：８の明暗光周期、１００〜１５０  ｍＥ／ｍ２ｓの強度の蛍光及び白熱光の下、維持される。
【０３３１】
新熱帯茶色カメムシ（E. heros）植物摂食バイオアッセイ. 少なくとも４個の低頻度コピー（１〜２個の挿入）、４個の中頻度コピー（２〜３個の挿入）、及び４個の高頻度コピー（≧４個の挿入）のイベントを、各構築物に対し選択する。植物を、繁殖期まで成長させる（植物は花と長角果を含有している）。昆虫を簡単に確認するために、土壌表面を、約50mL体積の白砂で覆う。５〜１０匹の２齢の新熱帯茶色カメムシ（E. heros）の若虫を、各植物の上に置く。直径３インチ、高さ１６インチ、壁の厚さは０．０３インチのプラスチック管(製品番号484485, Visipack Fenton MO)で植物を覆う。管をナイロンメッシュで覆い、昆虫から隔離する。植物を、コンビロン（conviron）において、通常の温度、光、及び水やりの条件下で維持する。１４日目に、昆虫を集め、重量を測定し、死亡率ならびに成長阻害（１−重量処置／重量対照）を算出する。ＹＦＰヘアピン発現植物を対照として使用する。対照植物と比較し、トランスジェニックＢＳＢ＿ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ植物を餌とした若虫において、有意な死亡率及び／又は成長の阻害が観察される。
【０３３２】
T2シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の種の産生、及びT2バイオアッセイ  Ｔ２種子は、各構築物に対し選択された低頻度コピー（１〜２個の挿入）イベントから産生される。植物（ホモ接合体及び／又はヘテロ接合体）を、上述のように新熱帯茶色カメムシ（E. heros）の摂食バイオアッセイに供する。Ｔ３種子をホモ接合体から採取し、さらなる解析のために保存する。
【０３３３】
実施例１８：追加の作物種の形質転換
綿花を、当分野に公知の方法、例えば米国特許第7,838,733号の実施例１４、又はＰＣＴ国際特許出願公開WO 2007/053482の実施例１２に従前に記載されているものと同じ技術を使用して、（葉緑体輸送ペプチドを含み、又は含まない）ｓｈｉで形質転換し、半翅目昆虫の制御を提供する。
【０３３４】
実施例１９：昆虫管理におけるｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ
Ｓｈｉ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子を、トランスジェニック植物中の他のｄｓＲＮＡ分子と組み合わせて、冗長なＲＮＡｉ標的化及び相乗的なＲＮＡｉ効果をもたらす。たとえば限定されないが、トウモロコシ、ダイズ、及び綿花などをはじめとする、ｓｈｉを標的とするｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物は、鞘翅目害虫及び半翅目害虫による食害の防御に有用である。またＳｈｉ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子を、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術、及び／又はＰＩＰ−１殺虫ポリペプチドを有する植物と組み合わせ、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドに新たな作用機序をもたらす。トランスジェニック植物において、害虫を標的とする他のｄｓＲＮＡ分子、及び／又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫性タンパク質と組み合わせる場合、抵抗性昆虫群の発現もまた軽減するという相乗的な殺虫効果が観察される。
【０３３５】
実施例２０：花粉カブトムシのトランスクリプトーム
昆虫：幼虫及び成虫の花粉カブトムシを、開花期のアブラナ植物がある野外(Giessen、Germany)から採取した。若い成虫のカブトムシ（各処置群当たり、ｎ＝２０、３重反復試験）に、２つの異なる細菌（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）と、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）)、１つの酵母 (サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及び細菌LPSの混合物を注入することによりチャレンジを行った。細菌培養物は攪拌しながら３７℃で増殖させ、光学密度を600nm（OD600）で監視した。細胞をＯＤ６００〜１で遠心により回収し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。1０ｍｇ／ｍｌ  ＬＰＳ (精製大腸菌（E. coli）エンドトキシン；Sigma社、Taufkirchen, Germany) 、ならびに細菌培養物及び酵母培養物の水性溶液に浸漬した解剖用針を使用して、花粉カブトムシ成体の腹部を刺すことにより、この混合物を腹部外側に導入した。免疫チャレンジしたカブトムシと共に、ナイーブなカブトムシ及び幼虫も同時点で採取した（各々ｎ＝２０、及び３重反復試験）。
【０３３６】
RNA単離：総ＲＮＡは、各ケースにおいてメーカーのガイドラインに従い、凍結したカブトムシ及び幼虫から、TriReagent (Molecular Research Centre、Cincinnati、OH、USA)を使用して免疫後８時間で抽出し、RNeasy Micro Kit (Qiagen社、Hilden、Germany)を使用して精製した。ＲＮＡの完全性は、 Agilent 2100 Bioanalyzer、及びRNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を使用して実証した。ＲＮＡの量は、Nanodrop ND-1000分光光度計を使用して決定した。ＲＮＡは、成虫の免疫誘導処置群、成虫の対照群、及び幼虫群のそれぞれから個々に抽出され、その後、配列解析を行うために、等量の総ＲＮＡがサンプル（免疫チャレンジ成虫、対照成虫、及び幼虫）当たり１つのプールで混合された。
【０３３７】
トランスクリプトーム情報：免疫チャレンジした成虫カブトムシ、ナイーブ（対照）成虫カブトムシ、及び未処置幼虫から単離された５μｇの総ＲＮＡに対し、ＲＮＡ−ｓｅｑデータ作成、及びシングルリード１００−ｂｐアセンブリＲＮＡ−Ｓｅｑを別々に行った。配列解析は、Illumina HiSeq-2000を使用し、Eurofins MWG Operonにより行われた。これにより２０８０万個のリードが成虫対照カブトムシサンプルから得られ、２１５０万個のリードがＬＰＳチャレンジ成虫カブトムシサンプルから得られ、２５１０万個のリードが幼虫サンプルから得られた。統合リード（６７５０万個）を、Velvet/Oasesアセンブリソフトウェア(M.H. Schulz ら（2012） Bioinformatics. 28:1086-92; Zerbino & E. Birney (2008) Genome Research. 18:821-9)を使用してアセンブリした。このトランスクリプトームは、５５６４８個の配列を含有した。
【０３３８】
花粉カブトムシ（Pollen beetle）ｓｈｉの特定：このトランスクリプトームのｔｂｌａｓｔｎサーチを使用し、合致コンティグを同定した。クエリとして、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）由来のｓｈｉのペプチド配列を使用した（Genbank XP_969020.2)。１つのコンティグが特定された(RGK_contig2759)。
【０３３９】
実施例２１：ｓｈｉ  ＲＮＡｉによる処置後の花粉カブトムシ（Meligethes aeneus）の死亡率
５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーター配列を含有する遺伝子特異的プライマーを使用し、ＰＣＲによっておよそ５００ｂｐのＰＣＲ産物が生成された（配列番号１２２）。メーカーのプロトコールに従い、ｐGEM TeasyベクターにＰＣＲ断片をクローニングし、配列を確かめるために配列解析企業へと送付した。次いで、メーカーのプロトコールに従い、配列解析されたプラスミドから生成されたＰＣＲ構築物から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｄｓＲＮＡを作製した(MEGAscript（登録商標） RNAi Kit, Applied Biosystems社)。
【０３４０】
解剖用実体顕微鏡の下、マイクロマニピュレーターを用いて、幼虫及び成虫カブトムシに約１００ｎＬのｄｓＲＮＡ（１  ｕｇ／ｕｌ）を注入した（ｎ＝１０、生物的三重反復試験）。動物を氷上で麻酔し、両面テープに張り付けた。対照には等量の水を与えた。ＩＭＰＩ（鱗翅目ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）の昆虫メタロプロテアーゼ阻害遺伝子）の陰性対照ｄｓＲＮＡを使用した。全ステージのすべての対照が、動物不足のために検証できなかった。
【０３４１】
花粉カブトムシは、乾燥させた花粉と、湿った組織と共に、ペトリディッシュ内に維持された。幼虫は、アガー／水の培地中、プラスチック容器内で、セイヨウアブラナの花序上で飼育された。
【表１４】
2018533356.tif 000023
【表１５】
2018533356.tif 000024
【０３４２】
摂食バイオアッセイ：カブトムシは、空のファルコンチューブ内に、水を与えずに２４時間維持され、その後に処置された。ｄｓＲＮＡの液滴（約５μｌ）を小さなペトリディッシュ内に置き、５〜８匹のカブトムシをこのペトリディッシュに加える。動物を実体顕微鏡下で観察し、ｄｓＲＮＡ含有飼料溶液を摂取したカブトムシをバイオアッセイに選択した。花粉カブトムシを、乾燥させた花粉と、湿った組織を入れたペトリディッシュ内に移した。対照には等量の水を与えた。ＩＭＰＩ（鱗翅目ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）の昆虫メタロプロテアーゼ阻害遺伝子）の陰性対照ｄｓＲＮＡを使用した。全ステージのすべての対照が、動物不足のために検証できなかった。
【０３４３】
【表１６】
2018533356.tif 000025
【０３４４】
実施例２２：セイヨウアブラナ (Brassica napus) 胚軸のアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の調製
バイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＹＥＰ培地(Bacto Peptone（商標）２０．０ｇｍ／Ｌ及び酵母抽出物１０．０ｇｍ／Ｌ）プレート上に画線培養し、2日間、２８℃でインキュベートする。バイナリープラスミドを含有する増殖アグロバクテリウム（Agrobacterium）株を、滅菌接種ループを使用し、２日目の画線培養プレートからかきとる。次いで、バイナリープラスミドを含有する、かきとったアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を、滅菌５００ｍＬバッフルフラスコに入ったストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）とスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含有する１５０ｍＬの改変ＹＥＰ液に接種し、２８℃、２００ｒｐｍで振とうする。培養物を遠心し、Ｍ培地（ＬＳ塩、３％グルコース、改変Ｂ５ビタミン、１μＭ  キネチン、１μＭ  ２，４−Ｄ、ｐＨ５．８）に再懸濁し、適切な密度（分光光度計を使用して計測。５０Ｋｌｅｔｔ単位）に希釈し、その後、セイヨウアブラナ胚軸の形質転換を行う。
【０３４５】
セイヨウアブラナの形質転換
種子の発芽    セイヨウアブラナの種子（変種Nexera 710（商標））の表面を、1０分間、１０％Ｃｌｏｒｏｘ（商標）中で滅菌し、滅菌蒸留水で３回リンスする（この処理の間、種子はスチールのざるに入れられる）。発芽させるために種子を、Phytatrays（商標） (Phytatray（商標）当たり、２５個の種子）に入った１／２  ＭＳセイヨウアブラナ培地（１／２  ＭＳ、２％スクロース、０．８％アガー）上に植え、発芽の５日間、１６時間の明、８時間の暗の光周期、２５℃に設定された成長レジームを用いて、Percival（商標）成長チャンバーに置かれる。
【０３４６】
前処置  5日目、約３ｍｍの長さの胚軸セグメントを無菌で切り出し、残った根と芽の部分を廃棄する（この切り出し処理の間、胚軸セグメントを１０ｍＬの滅菌milliQ（商標）水に浸漬することにより、胚軸セグメントの乾燥を防ぐ）。胚軸セグメントを、Percival（商標）成長チャンバー中、２２〜２３℃、１６時間の明、８時間の暗の光周期の成長レジームを用いて、カルス誘導培地のＭＳＫ１Ｄ１（ＭＳ、１ｍｇ／Ｌ  キネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３．０％スクロース、０．７％  ｐｈｙｔａｇａｒ）上の滅菌ろ紙上に、３日の前処置の間、水平に置く。
【０３４７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）との共培養  アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との共培養の前日、適切な抗生物質を含有するＹＥＰ培地のフラスコに、バイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を接種する。胚軸セグメントをろ紙カルス誘導培地、ＭＳＫ１Ｄ１から、１０ｍＬのＭ培地液を含有する、空の１００ｘ２５ｍmペトリ（商標）ディッシュに移し、胚軸セグメントを乾燥から防ぐ。この段階でへらを使用し、セグメントをかき集め、新しい培地にセグメントを移す。Ｍ培地液をピペッティングで取り除き、４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液をこのペトリ（商標）ディッシュに加える（４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で５００個のセグメント）。胚軸セグメントを３０分間、周期的にペトリ（商標）ディッシュをかき混ぜながら処置し、胚軸セグメントがアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中に浸漬されるようにした。処置期間の最後に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を排液ビーカーへとピペッティングで移し、オートクレーブ処理し、廃棄する（アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液は完全に除去され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が過剰に増殖することを防ぐ）。処置された胚軸を、ＭＳＫ１Ｄ１培地を含有し、ろ紙がかぶせられたオリジナルプレートへ鉗子を用いて戻す（セグメントが乾燥しないように注意する）。形質転換胚軸セグメント、及び非形質転換対照胚軸セグメントを、（アルミニウムホイルを用いてプレートを覆うことにより）光密度を低下させたPercival（商標）成長チャンバーに戻し、処置された胚軸セグメントを、アグロバクテリウム（Agrogacterium）と3日間共培養する。
【０３４８】
選択培地上でのカルス誘導 ３日間の共培養後、胚軸セグメントを、２２〜２６℃に設定された成長レジームを用いたカルス誘導培地、ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ１（ＭＳ、１ｍｇ／Ｌ  キネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、１ｍｇ／Ｌ Herbiace（商標）、3％スクロース、０．７％  ｐｈｙｔａｇａｒ）上へ鉗子を用いて個々に移す。胚軸セグメントを培地上に固定するが、培地内に深くは埋め込まない。
【０３４９】
選択及び芽の再生  カルス誘導培地上で７日後、カルス化胚軸セグメントを、選択を伴う芽再生培地１、ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ１（ＭＳ、３  ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、１ｍｇ／Ｌ Herbiace（商標）、３％スクロース、０．７％  phytagar）に移す。１４日後、芽が出た胚軸セグメントを、２２〜２６℃に設定された成長レジームを用いた選択増加を伴う再生培地２、ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ３（ＭＳ、３ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、２００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、３ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％  ｐｈｙｔａｇａｒ）に移す。
【０３５０】
芽の伸長  １４日後、芽が出た胚軸セグメントを、再生培地２から、２２〜２６℃に設定された成長レジームを用いた芽伸長培地ＭＳＭＥＳＨ５（ＭＳ、３００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、５ｍｇ／ｌ Herbiace（商標）、２％スクロース、０．７％  ＴＣ  Ａｇａｒ）へと移す。すでに伸長していた芽は、胚軸セグメントから単離し、ＭＳＭＥＳＨ５へと移す。１４日後、芽伸長培地上での最初の培養ラウンドで伸長しなかった残りの芽を、新しい芽伸長培地のＭＳＭＥＳＨ５へと移す。この段階で、芽が出ていないすべての残りの胚軸セグメントは廃棄される。
【０３５１】
根の誘導    芽伸長培地上での培養の１４日後、単離された芽を、根誘導のために、２２〜２６℃で、ＭＳＭＥＳＴ培地（ＭＳ、０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、３００ｍｇ／Ｌ Timentin（商標）、２％スクロース、０．７％  ＴＣ  Ａｇａｒ）に移す。最初のＭＳＭＥＳＴ培地への移送でのインキュベーション後に根が出なかった芽はすべて、芽が根を出すまで、ＭＳＭＥＳＴ培地上の２回目、又は３回目のインキュベーションラウンドに移す。
【０３５２】
本開示は、様々な改変及び別形態を受容可能であるが、本明細書においては、詳細な例示を目的として特定の実施形態を記載する。しかしながら、本開示は、開示される特定の形態に限定されることを意図していないことを理解されたい。さらに、本開示は、以下に添付される請求項により定義される本開示の範囲内にある全ての改変、均等、及び代替、ならびにそれらの法的均等を含有するものである。
【図１】
2018533356.tif 000026
【図２】
2018533356.tif 000027
【配列表】
2018533356000001.app
【国際調査報告】
2018533356.tif 000028
2018533356.tif 000029
2018533356.tif 000030
2018533356.tif 000031