(57)【要約】  本開示は、ＮＫ細胞に関与する操作された化合物、及びその化合物の使用方法を記載する。一般的に、その化合物は、ＮＫ係ドメイン、標的細胞に選択的に結合する標的化ドメイン、及びＮＫ係ドメイン及び標的化ドメインを操作可能的に連結するＮＫ活性化ドメインを含む。【選択図】図１Ａ
2018531939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ係ドメイン；
前記ＮＫ係ドメインに操作可能的に連結されるＮＫ活性化ドメイン；及び
標的細胞に選択的に結合し、そして前記ＮＫ活性化ドメイン及び前記ＮＫ係ドメインに操作可能的に連結される標的ドメイン、
を含む化合物。
【請求項２】
前記ＮＫ活性化ドメインが、サイトカイン又はその機能的フラグメントを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記サイトカインがＩＬ−１５を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＩＬ−１５の部分が、配列番号１５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＮＫ係ドメインが、ＮＫ細胞に選択的に結合する部分を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＮＫ係ドメインが、ＮＫ細胞を活性化する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＮＫ係ドメイン部分が、ＣＤ１６の一部に選択的に結合する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＣＤ１６がＣＤ１６ａを含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記ＮＫ係ドメインが、ＮＫ細胞の阻害をブロックする、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＮＫ係ドメイン部分が、抗体又はその結合フラグメントを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２又はＦａｂを含む、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記標的化ドメインが、腫瘍細胞に選択的に結合する部分を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記標的化ドメイン部分が、ＣＤ３３の一部に選択的に結合する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記標的化ドメイン部分が、ＥｐＣＡＭの一部に選択的に結合する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記標的化ドメイン部分が、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、インテグリンαＶβ３、ＣＤ５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１２５、ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、メソセリン、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１又はＩＧＦＲ１、ＨＩＶ癌の一部に選択的に結合する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
前記標的化ドメインが、ウィルスにより感染された細胞に選択的に結合する部分を含む、請求項１〜１５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記ウィルスが、アデノウィルス、ＨＩＣ、ＣＭＶ又はＨＰＶを含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記標的化ドメイン部分が、抗体又はそのフラグメントを含む、請求項１２〜１７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖを含む、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
前記２つのドメインを連結する少なくとも１つのフランキング配列を含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記第３ドメインと共に前記２つの連結されたドメインを連結する第２フランキング配列をさらに含む、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記フランキング配列が、前記ＮＫ活性化ドメインに隣接している、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
第１フランキング配列が、抗−ＮＫ  ｓｃＦｖに対してＣ末端側であり、そして第２フランキング配列が、抗−癌ｓｃＦｖ配列に対してＮ末端側である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
第２標的化ドメインをさらに含む、請求項１〜２３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
第２ＮＫ係ドメインをさらに含む、請求項１〜２３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
第２ＮＫ活性化ドメインをさらに含む、請求項１〜２３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｔ細胞係ドメイン；
前記Ｔ細胞係ドメインに操作可能的に連結されるＴ細胞活性化ドメイン；及び
標的細胞に選択的に結合し、そしてＴ細胞活性化ドメイン及びＴ細胞係ドメインに操作可能的に連結される標的化ドメイン、
を含む化合物。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞活性化ドメインが、サイトカイン又はその機能的フラグメントを含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記サイトカインがＩＬ−２を含む、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
ＩＬ−２が配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞係ドメインが、Ｔ細胞に選択的に結合する部分を含む、請求項２７〜３０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞係ドメインが、Ｔ細胞を活性化する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞係ドメイン部分が、ＣＤ３に選択的に結合する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞係ドメインが、Ｔ細胞の阻害をブロックする、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞係ドメイン部分が、抗体又はその結合フラグメントを含む、請求項２７〜３４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２又はＦａｂを含む、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記標的化ドメインが、腫瘍細胞に選択的に結合する部分を含む、請求項２７〜３６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３８】
前記標的化ドメイン部分が、腫瘍マーカーに選択的に結合する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記腫瘍マーカーが、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＨＥＲｅｒ２、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、インテグリンαＶβ３、ＣＤ５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１２５、ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、メソテリン、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１又はＩＧＦＲ１である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記２つのドメインを連結する少なくとも１つのフランキング配列を含む、請求項２７〜３９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４１】
前記第３ドメインと共に前記２つの連結されたドメインを連結する第２フランキング配列をさらに含む、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
前記フランキング配列が、前記Ｔ細胞係ドメインに隣接している、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
第２標的化ドメインをさらに含む、請求項２７〜４２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４４】
第２Ｔ細胞係ドメインをさらに含む、請求項２７〜４２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
第２Ｔ細胞活性化ドメインをさらに含む、請求項２７〜４２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物。
【請求項４７】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む化合物。
【請求項４８】
請求項１〜４７の何れか１項に記載の化合物；及び
医薬的に許容できる担体、
を含む組成物。
【請求項４９】
標的細胞のＮＫ介在性死滅を誘発するのに有効な量で、請求項１〜２６の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５０】
前記化合物が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
インビボでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法であって、
対象においてＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な量の請求項１〜２６の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５３】
前記化合物が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象における癌の治療方法であって、
癌の治療のために有効な量の請求項１〜２６の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５５】
前記化合物が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、子宮頸癌、卵巣癌、又は造血癌を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
化学療法、腫瘍の外科的切除、又は放射線療法の前、それらと同時に、又はそれらに続いて、前記組成物を投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記化学療法が、アルテレタミン、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、コラスパーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シトホスファイン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テンポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
標的細胞のＴ細胞介在性死滅を誘発するのに有効な量で、請求項２７〜４７の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項６０】
前記化合物が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
インビボでＴ細胞の増殖を刺激するための方法であって、
対象においてＴ細胞の増殖を刺激するのに有効な量の請求項２７〜４７の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項６３】
前記化合物が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
対象における癌の治療方法であって、
癌の治療のために有効な量の請求項２７〜４７の何れか１項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項６５】
前記化合物が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、子宮頸癌、卵巣癌、又は造血癌を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
化学療法、腫瘍の外科的切除、又は放射線療法の前、それらと同時に、又はそれらに続いて、前記組成物を投与することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記化学療法が、アルテレタミン、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、コラスパーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シトホスファイン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テンポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＩＬ−１５の機能的変異体が、配列番号１５と比較して、Ｎ７２Ｄ又はＮ７２Ａアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２３７，８３５号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に完全に組込まれる。
【０００２】
政府資金
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１１１４１２及びＣＡ６５４９３、並びに国立癌研究所により授与されたＣＡ３６７２５、ＣＡ７２６６９及びＣＡ１９７２９２の下での政府支援によってなされた。 政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願は、２０１６年１０月６日に作成された、８５キロバイトのサイズの「2016-10-06-SequenceListing_ST25.txt」と称するＡＳＶＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で米国特許商標庁に電子ファイル形式で提出された配列表を含む。配列表に情報は、参照により本明細書に組込まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、三重特異的キラー係（ＴｒｉＫＥ）分子の企画、構築及び使用に関する。
【０００５】
１つの側面によれば、本開示は、  ＮＫ係ドメイン、前記ＮＫ係ドメインに操作可能的に連結されるＮＫ活性化ドメイン、及び標的細胞に選択的に結合し、そして前記ＮＫ活性化ドメイン及び前記ＮＫ係ドメインに操作可能的に連結される標的ドメインを有するように操作された分子を記載する。
【０００６】
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ活性化ドメインは、サイトカインの少なくとも一部を含むことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞に選択的に結合する部分を含むことができる。ＮＫ細胞に選択的に結合する部分は、ＮＫ細胞を活性化でき、そして／又はＮＫ細胞の阻害をブロックできる。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、抗体又はそのフラグメントを含むことができる。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、腫瘍細胞、又はウィルスにより感染された細胞であり得る。いくつかの実施形態によれば、標的ドメインは、抗体又はそのフラグメントを包含することができる。他の実施形態によれば、標的ドメインは、リガンド、又は標的細胞に選択的に結合する小分子を含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、分子は、第２標的ドメイン、第２ＮＫ活性化ドメイン、又は第２ＮＫ係ドメインを含むよう企画され得る。
【００１０】
別の側面によれば、この開示は、Ｔ細胞係ドメイン、前記Ｔ細胞係ドメインに操作可能的に連結されるＴ細胞活性化ドメイン、及び標的細胞に選択的に結合し、そしてＴ細胞活性化ドメイン及びＴ細胞係ドメインに操作可能的に連結される標的化ドメインを含むよう操作された分子を記載する。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞活性化ドメインは、サイトカインの少なくとも一部を含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞に選択的に結合する部分を含むことができる。Ｔ細胞に選択的に結合する部分は、Ｔ細胞を活性化でき、そして／又はＴ細胞の阻害をブロックできる。いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、抗体又はそのフラグメントを含むことができる。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、腫瘍細胞、又はウィルスにより感染された細胞であり得る。いくつかの実施形態によれば、標的ドメインは、抗体又はそのフラグメントを包含することができる。他の実施形態によれば、標的ドメインは、リガンド、又は標的細胞に選択的に結合する小分子を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、分子は、第２標的ドメイン、第２Ｔ細胞活性化ドメイン、又は第２Ｔ細胞係ドメインを含むよう企画され得る。
【００１５】
何れかの側面のいくつかの実施形態によれば、分子は、直前に要約された任意の２つのドメイン間のフランキング配列を含むことができる。場合によっては、分子は、複数のフランキング配列を有することができる。
【００１６】
別の実施形態によれば、本開示は、投与される特定分子に適切であり得る場合、標的細胞のＮＫ介在性死滅、又は標的細胞のＴ細胞介在性死滅を誘発するのに有効な量で、上記で要約された、任意の実施形態の操作された分子を対象に投与することを含むことを記載する。
【００１７】
本発明の上記概要は、本発明の各開示された実施形態又はすべての実施形態を記載することを意図するものではない。以下の記載は、例示的な実施形態を、より特定に例示する。本出願を通してのいくつかの場所に、種々の組合せで使用され得る例のリストを通してガイダンスが提供される。各場合、列挙されたリストは代表的グループとしてのみ機能し、そして排他的リストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】１６１５３３三重特異的キラー（ＴｒｉＫＥ）（配列番号１）は、１６３３二重特異的キラー係り（ＢｉＫＥ）（配列番号２）より卓越した精製特性を誘発する。（Ａ）ｐＥＴ発現ベクターにおけるＢｉＫＥ（左）及びＴｒｉＫＥ（右）ドメインのコード領域配置の略図。（Ｂ）三段階溶出プロトコルを用いての薬物精製における第１段階としての、イオン交換カラムから溶出された１６３３ＢｉＫＥ（左）においての吸光度追跡。カラムから溶出された第１ピークは、生成物を表す。１６１５３３ＴｒｉＫＥ（右）の場合、ピーク１の吸光度はほぼ倍増し、卓越した収率を示す。類似する量の封入体をリフォールディングし、そして精製する。すべてのタンパク質をカラムから除いた。
【図１−Ａ】（Ｃ）サイズ排除カラム上での第２段階精製の後でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びクーマシーブルー染色。デンシトメトリー分析は、生成物が９５％以上の純度であることを示唆する。
【００１９】
【図２】１６１５３３ＴｒｉＫＥは、標的に対して卓越したＮＫ細胞機能を誘発する。同位体クロム−５１（５１Ｃｒ）の放出は、しばしば、ＮＫ細胞機能（死滅）を測定するために使用される。（Ａ）新たに単離されたＰＢＭＣは、クロム負荷されたＨＬ−６０細胞と共に、Ｅ：Ｔ比２０：１、６．６：１及び２：１で４時間培養された。注目の試薬が、共培養の開始で、２０ｎＭの濃度で添加された。データは、％ＮＫ細胞の細胞溶解活性として示される。条件の数を考えると、優位性は１６３３〜１６１５３３分子間にのみ見られた。ｎ＝３．（Ｂ）１６５３３ＴｒｉＫＥの特異性を評価するために、５１Ｃｒ放出アッセイが、ＣＤ３３−ＥｐＣＡＭ＋ＨＴ２９標準に対して実施された。ＥｐＣＡＭ１５３３ＴｒｉＫＥが陽性対照として使用された。ｎ＝２。（Ｃ）ＮＫ細胞が、磁気ビーズを用いて正常ドナーＰＢＭＣから富化され、そしてＨＬ−６０標的（１０：１）単独で又は１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥの存在下で２４時間、培養された。インキュベーションの最後で、上清液が各培養物から採取され、そしてＬｕｍｉｎｅｘ多重アッセイ（ｎ＝５）により、分泌されたＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭＩＰ１ａの後での評価のために凍結された。点及びバーは、平均±ＳＥＭを示す。
【００２０】
【図３】１６１５３３ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞の増殖及び拡大を媒介する。移植後の患者ＰＢＭＣが、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ増殖色素（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）により富化され、そして５：１（Ｅ：Ｔ）比でＨＬ−６０標的と共に７日間、６０ｎＭの１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥの存在下で共培養された。インキュベーションの最後で、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞が、生存／死亡近赤外線染色により生存率について評価された。（Ａ）個々のヒストグラム、及び（Ｂ）１６３３ＢｉＫＥ（灰色）又は１６１５３３ＴｒｉＫＥ（黒色）により処理されたＮＫ細胞集団における生存率のプール分析。（Ｃ）次に、増殖が、ＴｒｉＫＥグループ内の生存ＣＤ５６−ＣＤ３＋Ｔ細胞（灰色）及びＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞（黒色）におけるＣＥＬＬＴＲＡＣＥ希釈により評価された。（Ｄ）％細胞分裂（上）及び増殖指数（下）を示すプール分析、これは、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ希釈の量を考慮して集団内の倍率の拡大の計算である。個々のドットは、移植後の別個のサンプル（ｎ＝８）を表す。
【００２１】
【図４】１６１５３３ＴｒｉＫＥは、移植後のサンプルにおけるＮＫ細胞機能を強く救済する。移植後の患者ＰＢＭＣが融解され、そして一晩放置された。次の夜、それらは、薬物なしで、１６３３ＢｉＫＥ（５０ｎＭ）又は１６１５３３ＴｒｉＫＥ（５０ｎＭ）と共にインキュベートされた。翌朝、それらは洗浄され、そして前の夜と同じ処置が与えられた（分子内在化に問題がないことを保証するために）。（Ａ）注目される処置グループを有するＰＢＭＣがクロム負荷ＨＬ−６０と共に４時間インキュベートされ、そして％細胞溶解活性が計算された。ドット及びバーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝ａ）を表す。（Ｂ）ＨＬ−６０標的との４時間のインキュベーション後のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞上でのＣＤ１０７ａ（左パネル）、ＩＦＮγ（中央パネル）及びＴＮＦα（右パネル）の代表的ヒストグラム及び（Ｃ）プールデータ。ドットは、個々の患者サンプル（ｎ＝１０）を示す。
【００２２】
【図５】１６１５３３ＴｒｉＫＥは、ＢｉＫＥと比較して、原発性ＡＭＬ芽球に対するＮＫ細胞機能を増強する。移植後の患者ＰＢＭＣが融解され、そして一晩放置された。次の夜、それらは、１６３３ＢｉＫＥ（５０ｎＭ）又は１６１５３３ＴｒｉＫＥ（５０ｎＭ）と共にインキュベートされた。翌朝、それらは洗浄され、そして前夜と同じ処置を受けた（分子内在化に問題がないことを保証するために）。２人の別々の患者のアフェレーシス産物からの原発性ＡＭＬ芽球が融解され、そして一晩放置された。処置された移植後の患者ＰＢＭＣ（ｎ＝６）が、２つの異なった原発性ＡＭＬ芽球（ｎ＝合計１２）と共に４時間インキュベートされ、そしてＮＫ細胞機能がフローサイトメトリーにより評価された。ＮＫ機能は、ＣＤ１０７ａの形で溶解脱顆粒化を測定することにより評価され得る。（Ａ）原発性ＡＭＬ芽球との４時間のインキュベーション後、１６３３ＢｉＫＥ（灰色）又は１６１５３３ＴｒｉＫＥ（黒色）により処理された移植後の患者のＮＫ細胞上でのＣＰ１０７ａ（左）、ＩＦＮγ（中央）及びＴＮＦα（右）発現を示す代表的ヒストグラム。（Ｂ）１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥにより処理され、そして原発性ＡＭＬ芽球と共にインキュベートされた移植後のＮＫ細胞上でのＣＤ１０７ａ（左）、ＩＦＮγ（中央）及びＴＮＦα（右）発現についてのプールデータ。各ボックスは、塗りつぶされた及びオープンのボックス（ｎ＝合計１２）により示される２つの別個の患者のＡＭＬ芽球標的に対してインキュベートされた移植後の別々の患者サンプルを表す。
【００２３】
【図６】１６１５３３ＴｒｉＫＥは、１６３３ＢｉＫＥよりもインビボでのＨＬ−６０腫瘍増殖をより制限する。ＨＬ−６０ｌｕｃ細胞が、ＮＳＧマウスに静脈注射し（７．５×１０５個の細胞／マウス）、そして３日後、ＩＬ−１５により一晩活性化された１００万個のヒトＮＫ細胞が注入された。１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥグループはＨＬ−６０−ｌｕｃ及びＮＫ細胞を受けたが、対照グループはＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞のみを受けた。薬物（５０μｇ／Ｋｇ）が、研究中、ＭＷＦで投与された。（Ａ）２分間の暴露（ｎ＝処置当たり５（マウスが死亡しない限り）、２回の別々の実験の代表）における研究の１４日目（上）及び２１日目（下）での個々のマウスフォトルミネセンス。（Ｂ）１４日目（左）及び２１日目（右）での３つの処置グループからのマウスにおける発光の定量化。各ドットは、異なるマウスを表し、そしてバーは平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝５、２つの別個の実験の代表）。（Ｃ）血液が、各実験処置グループにおけるマウスから、２０日目に集められた。循環ＣＤ５６＋ＣＤ３−ヒトＮＫ細胞がフローサイトメトリーにより定量化された。イベントが６０秒間にわたって収集され、そしてヒトＮＫ細胞イベントの数が計算された。ＣＤ４５＋ゲート内のＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）細胞イベントの数を示す代表的ドットブロットが示される。（Ｄ）２０日目に各処置グループにおけるヒト細胞イベントの数を実証する集計データ。個々のドットは異なるマウスを表し、そしてバーは平均ＳＥＭを示す（ＨＬ−６０−ｌｕｃグループ（２匹のマウスは死亡）についてはｎ−３、１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥグループについてはｎ＝５）。
【００２４】
【図７】ＴｒｉＫＥ分子のフランキング配列及び配向は、両者とも、その機能に影響を及ぼす。フランキング配列の影響を試験するために、１６１５３３コンストラクトのＩＬ−１５ドメインの何れかの側上のフランキング配列（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ、配列番号３; 及び ＥＡＳＧＧＰＥ、 配列番号４）を欠いている１６１５３３（１６１５３３ＮＬ、配列番号５）の変異体が構築された。２つオン独立したドナー（ＰＢ１及びＰＢ２）からの新たに単離されたＰＢＭＣ（この例に関しては、３．５％ＮＫ細胞を含む）が、クロム負荷されたＨＬ−６０細胞と共にＥ：Ｔ比２０：１で４時間、培養された。注目される試薬が、共培養の開始で、２０ｎＭの濃度で添加された。データは、％ＮＫ細胞の細胞溶解活性として示される。１６１５３３は、損なわれていないフランキング配列を有する修飾されたＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインを含むコンストラクトに反映している。データは、フランキング配列を有するＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインがＴｒｉＫＥ機能を増強することを示唆する。配向の効果を試験するために、コンストラクトが、Ｎ末端（１５１６３３；配列番号６）又はＣ末端（１６３３１５；配列番号７）の何れか上にＩＬ−１５により合成され、そして架橋剤としてＩＬ−１５を用いての野生型１６１５３３と比較された。分子の中心にＩＬ−１５を生成したデータは、ＮＫ細胞溶解活性を最適化する。
【００２５】
【図８】１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ (配列番号８)は、ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥよりも卓越した精製特性を誘発する。（Ａ）ｐＥＴ発現ベクターにおけるＴｒｉＫＥ（１６１５ＥｐＣＡＭ）ドメインについてのコード領域の配置の略図。（Ｂ）ｐＥＴ発現ベクターにおけるＢｉＫＥ（１６ＥｐＣＡＭ）ドメインについてのコード領域の配置の略図。（Ｃ）３段階溶出プロトコルを用いての薬物精製の第１段階としてのイオン交換カラムから溶出されたＴｒｉＫＥ（１６１５ＥｐＣＡＭ）の吸光度追跡。カラムから溶出された最初のピークが、生成物を表す。（Ｄ）３段階溶出プロトコルを用いての薬物精製の第１段階としてのイオン交換カラムから溶出されたＴｒｉＫＥ（１６１５ＥｐＣＡＭ）の吸光度追跡。カラムから溶出された最初のピークが生成物を表し、ＴｒｉＫＥよりも低い収率で回収された。（Ｆ）サイズ排除カラム上での第２段階精製（Ｅ）の後でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びクーマシーブルー染色。デンシトメトリー分析は、生成物が９５％以上の純度であることを示唆する。
【００２６】
【図９】クロム放出アッセイにおける１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ (配列番号８)の活性の評価。新たに単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）−細胞が、示されるようなそれぞれのエフェクター：標的比を有するＨＴ−２９細胞（ヒト結腸直腸癌細胞係）に添加された。ドナーは、天然の異なるレベルの循環ＮＫ細胞（Ａ）３．８％のＮＫ細胞を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、（Ｂ）６．４％のＮＫ細胞を有するＰＢＭＣ、（Ｃ）ＰＢＭＣから富化された１５％及び（Ｄ）８０％以上のＮＫ細胞により選択された。（Ｅ）１６１５ＥｐＣＡＭによる高レベルの死滅は、天然の高レベルのＮＫ死滅を有するドナーと相関した。（Ｅ）においては、４つのドナーについての１６１５ＥｐＣＡＭの曲線のみが比較され、ＮＫ存在と、薬物により誘発された細胞溶解活性との間の直接的相関を強調した。（Ｆ）は、１６ＥｐＣＡＭの場合、そのような相関は存在しないことを示す。
【００２７】
【図１０】標的癌細胞系を発現する異なるＥｐＣＡＭにおける溶解性脱顆粒化。上記のように、ＮＫ機能が、溶解性脱顆粒化の尺度としてＣＤ１０７ａ発現を定量化することにより測定され得る。ＣＤ１０７ａ発現細胞が、ゲートされたＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞集団内で評価された。エフェクターＰＢＭが、（Ａ） ＢＴ−４７４、（Ｂ） ＳＫ−ＢＲ−３、（Ｃ） ＰＣ−３、（Ｄ） ＤＵ１４５、（Ｅ） ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ、（Ｆ） ＮＡ、及び （Ｇ） ＳＫＯＶ−１を含む異なるＥｐＣＡＭ担持標的細胞系と共にインキュベートされた。エフェクター及び標的細胞に添加されたＴｒｉＫＥは、対照に比較して、より高い割合のＣＤ１０７ａ発現細胞を誘発し、そしてまた、二重特異的１６ＥｐＣＡＭにも比較した。Ｐ値は、ワン−ウェイＡＮＯＶＡにより評価され、そしてＳＤで示された。＊：対照に対する評価；＃：ＥｐＣＡＭ１６に対する１６１５ＥｐＣＡＭの評価。
【００２８】
【図１１】１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥの増殖能力。（Ａ）ＮＫ細胞増殖を評価するために、末梢血単核細胞が、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ又はＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥにより処理された。ヒストグラムにおける不連続なピークは、細胞分裂後のＮＫ細胞の連続的世代を示し、蛍光強度の反復したわずかな低下をもたらす。ＮＫ細胞は典型的な増殖パターンを示すが、Ｔ細胞はそうではない。示されたのは、５つの独立した実験の代表である。（Ｂ）ＰＢＭＣ細胞が、ＴｒｉＫＥ及びＢｉＫＥと共に共培養され、そしてＮＫ細胞増殖が評価された。示されたのは、５つの独立した実験の代表である。（Ｃ）ＰＢＭＣ細胞が、ＴｒｉＫＥ、ＢｉＫＥ、抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖ ［ＣＤ１６］、インターロイキン （ＩＬ）−１５、抗−ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ ［ＥｐＣＡＭ］及び  ＤＴ２２１９（抗ーＣＤ３２及び抗−ＣＤ１９ｓｃＦｖに連結されたジフテリアエンテロトキシンから成る標的毒素）と共に共培養された。ＮＫ細胞拡大指数の評価は、１６１５ＥｐＣＡＭコンストラクトにおいて、及びＩＬ−１５単独において、有意に（ｐ＜０．００１）増強された指数を示した、＊により示された、（ｎ＝５）。（Ｄ）精製されたＮＫ細胞が、ＴｒｉＫＥ及びＢｉＫＥに暴露された。７日後、反応性色素を用いて、生存及び死亡細胞を区別した。反応性色素は、死亡細胞の損傷膜に浸透し、より強い染色（右のピーク）をもたらし、ところが生存細胞の膜への浸透の失敗はより弱い染色（左のピーク）をもたらす。
【００２９】
【図１２】ＨＴ−２９細胞における溶解性脱顆粒化及びＩＦＮ−γ発現。ＮＫ細胞活性を研究するために、ＣＤ１０７ａ発現細胞が、ゲートされたＣＤ５６＋／ＣＤ３−ＮＫ細胞集団内で評価された。（Ａ）１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ (配列番号８)により処理された細胞は、ＥｐＣＡＭ発現ＨＴ−２９標的細胞の急速な脱顆粒化を示したが、対照はそうではなかった。。Ｅ：Ｔ単独、Ｅ：Ｔ＋１６１５を欠いている抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ、Ｅ：Ｔ＋抗−ＣＤ１６単独、及びＥ：Ｔ＋ＩＬ−１２及びＩＬ−８の組合せ（溶解性脱顆粒化を増強しない）は、何れの効果も有さなかった。（Ｂ）同じＣＤ５６＋／ＣＤ３−ＮＫ細胞集団からのＩＦＮ−γ生成が分析された。１６１５ＥｐＣＡＭのみが、ＩＦＮ−γ発現細胞の割合の増加を示した。値は、超生理学的レベルでサイトカイン生成を刺激することが知られているＩＬ１２＋ＩＬ１８の組合せで見られる値には近づかなかった。（Ｃ）ＥｐＣＡＭ−ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞標的と共にインキュベートされたＮＫ細胞が研究される場合、、ＣＤ１０７ａ発現細胞は観察されなかった。（Ｄ）ＩＬ１２＋ＩＬ１８により処理されたＥ：Ｔ対照のみが、ＩＦＮ−γの急速な発現を示した。
【００３０】
【図１３】ｐＥＴ発現ベクターにおける１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ (配列番号９)ドメインをコードするポリヌクレオチドの配置の略図。１６１５ＥｐＣＡＭ１３３をコードするハイブリッドポリヌクレオチドの合成及びアセンブリーは、ＤＮＡシャフリング及びＤＮＡ連結技法を用いて達成された。完全にアセンブリーされたコード領域は、５′末端から、３′末端まで、以下を有する：ＮｃｏＩ制限部位；ＡＴＧ開始コドン；ファージディスプレーライブラリー由来のヒトＣＤ１６（ＮＭ３Ｅ２）のＶＨ及びＶＬ領域、２０個のアミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ; 配列番号３）、修飾されたＩＬ−１５；７個のアミノ酸セグメント（ＥＡＳＧＧＰＥ; 配列番号４）、抗体ＭＯＣ−３１からのヒト化抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ、１５個のアミノ酸の変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、及びクローン７からの抗−ＣＤ１３３ｓｃＦｖをコードするコード領域；及び最後に、ＮｏｔＩ制限部位。得られた２７１５ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントポリペプチドが、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（FischerBiotech, Fair Lawn, NJ）誘発性Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ２９ｃ発現ベクターにスプライシングされた。ＤＮＡ配列決定分析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota, MN, USA）を用いて、ポリヌクレオチドが配列において正しく、そしてフレームにクローン化されたことを確認した。
【００３１】
【図１４】１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の活性。癌幹細胞上に発現されたＣＤ１３３を認識する追加のｓｃＦｖが１６１５ＥｐＣＡＭに付加され、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ＴｅｔｒａＫＥが製造された。（Ａ）及び（Ｂ）は、５１Ｃｒ放出アッセイにより評価された１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の活性を示す。２つのドナー（ＰＴ１及びＰＴ２）からの新たに単離されたＮＫ細胞が、ヒト結腸直腸癌細胞系Ｃａｃｏ−２（ＣＤ１３３＋、ＥｐＣＡＭ＋）に添加された。示されるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間、細胞と標的とを共培養し、そして５１Ｃｒ放出を評価した。（Ｃ）及び（Ｄ）においては、２つのドナーからのＮＫ細胞が、ヒト結腸直腸癌細胞系ＨＴ−２９（ＥｐＣＡＭ＋、ＣＤ１３３−）に暴露され、そして５１Ｃｒ放出が上記と同じ態様で測定された。
【００３２】
【図１５】１６１５ＥｐＣＡＭのように、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３は、ＩＬ−１５の存在のために増強された拡大を示す。（Ａ）ＨＴ−２９細胞及び（Ｂ）Ｃａｃｏ−２細胞に対する結合アッセイが、過剰の非標識の注目のｓｃＦｖ（１０００ｎＭ）と競争して、ＦＩＴＣ標識された１６１５ＥｐＣＡＭ１３３  ＴｅｔｒａＫＥ（２００ｎＭ）を用いて行われた。実験が、２００ｎＭの１６１５ＥｐＣＡＭ１３３、及び５００ｎＭのｓｃＦｖを有するより低いブロックを用いて反復された。結果は再現性があった。（Ｃ）精製されたＮＫ細胞が、増殖を測定するためにＣＥＬＬＴＲＡＣＥ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)により染色され、そして抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ［ＣＤ１６］、抗−ＣＤ１３３ ｓｃＦｖ ［ＣＤ１３３］、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ ＴｅｔｒａＫＥ、ＤＴ２２１９ (抗−ＣＤ２２及び抗−ＣＤ１９ ｓｃＦｖに連結された変異型ジフテリア毒素)、抗−ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ ［ＥｐＣＡＭ］、ＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥ又は ＩＬ−１５ ［ＩＬ１５］と共に７日間、共培養された（ｎ＝５）。グラフは、各グループについての拡張指数のプールされたデータを示す。（Ｄ）ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ色素により染色され、そして３０ｎＭの１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ＴｅｔｒａＫＥ又はＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥと共に７日間、共培養されたＰＢＭＣの代表的ヒストグラム。（Ｅ）ＣＤ５６−ＣＤ３＋Ｔ細胞とのＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の増殖を比較する代表的ヒストグラム。（Ｆ）１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ＴｅｔｒａＫＥ又はＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥに７日間、暴露された、精製ＮＫ細胞の生存（生存／死滅染色除外による）を示す代表的ヒストグラム。死滅細胞は染料の包含を示すが（高いピーク）、生存細胞はそれを除外する（低いピーク）。Ｐ値はワン−ウェイＡＮＯＶＡにより推定され、そして標準偏差と共に提供された。
【００３３】
【図１６】ｐＥＴ発現ベクターにおける１６１５１３３（配列番号１０）についてのコード領域の配列の略図。１６１５１３３をコードするハイブリッドポリヌクレオチドが、ＤＮＡシャフリング及びＤＮＡ連結技法を用いて合成された。完全にアセンブリーされたポリヌクレオチドは、５′末端から３′に、以下を有する：ＮｃｏＩ制限部位；ＡＴＧ開始コドン；抗−ヒトＣＤ１６ｓｃＦｖ、２０個のアミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ;配列番号３）、変異ヒトＩＬ−１５、７個のアミノ酸リンカー（ＥＡＳＧＧＰＥ;配列番号４）及び抗−ＣＤ１３３ｓｃＦｖをコードするコード領域；及びＮｏｔＩ制限部位。得られる１８８４塩基対のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントポリヌクレオチドが、イソプロピル−β−Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発性Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ２８９ｃ発現ベクター中にスプライシングされた。
【００３４】
【図１７】ＴｒｉＫＥ１６１５１３３の５１Ｃｒ放出及び結合。（Ａ，Ｂ）活性の評価のために、２つのドナーを用いての５１Ｃｒ放出アッセイが実施された。１６１５１３３ ＴｒｉＫＥ、１６１３３ ＢｉＫＥ、抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ ［ＣＤ１６］、又は抗−ＣＤ１３３ ｓｃＦｖ ［ＣＤ１３３］が、標識Ｅ：Ｔ比で、ＣＤ１３３＋Ｃａｃｏ−２細胞及びＰＢＭＣと共に共培養された。（Ｃ）ＰＢＭＣ及びＣａｃｏ−２細胞が、異なるＴｒｉＫＥ濃度（１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ）に暴露され、そしてそれらのＥ：Ｔ比（２０：１、６．６：１、２．２：１、０．７５：１、０．２３：１、０．０８：１）で力価測定された。（Ｄ）ＦＩＴＣ標識された１６１５１３３ＴｒｉＫＥが、Ｃａｃｏ−２細胞と共に、標識された濃度でインキュベートされた。同じ実験において、同量のＦＩＴＣ標識された１６１５１３３が、２００ｎＭのモノマーＣＤ１３３ｓｃＦｖと共にブロッキングのために添加された。
【００３５】
【図１８】拡張及び生存。（Ａ）精製されたＮＫ細胞が、抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ （ＣＤ１６）、 抗−ＣＤ１３３ ｓｃＦｖ （ＣＤ１３３）、１６１３３ ＢｉＫＥ、１６１５１３３ ＴｒｉＫＥ、ＤＴ２２１９（ジフテリア毒素に連結された抗−ＣＤ２２及び抗−ＣＤ１９ｓｃＦｖから成る標的毒素）、又はＮＣＩ由来のＩＬ−１５に暴露された。ＴｒｉＫＥ及びＩＬ−１５のみが増殖を有意に高めた（ｎ＝５）。グラフは、各グループについて、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで計算された拡張指数のプールデータを示す。（Ｂ）精製されたＮＫ細胞が、１６１５１３３ＴｒｉＫＥ及び１６１３３ＢｉＫＥに暴露され、そして７日間インキュベートされた。代表的ヒストグラムは、ＩＬ−１５部分を有さないＢｉＫＥコンストラクトに比較して、ＴｉＫＥを有する、高い量の生存細胞を示す。有意性がワンーウェイＡＮＯＶＡにより推定され、そして標準偏差と共に提供された。
【００３６】
【図１９】５１Ｃｒ放出アッセイが、いくつかの異なる新しいＴｒｉＫＥを用いて実施され、癌細胞を標的とする任意のｓｃＦｖが機能的ＴｒｉＫＥに製造され得ることが示された。（Ａ）ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ１３３＋ＮＧ２＋非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞＋ＮＫ細胞が、１６１５ＥＰＣＡＭ１３３ＴｒｉＫＥ又は１６１５ＮＧ２  ＴｒｉＫＥ（ニューロングリア抗原２又はＣＳＰＧ４）と共にインキュベートされた。１６１５ＮＧ２及び１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の両者は、いくつかの異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１及び５：１）で活性を有した。（Ｂ）メソセリン＋ ＥｐＣＡＭ−ＣＤ１３３−ＮＧ２ ＭＤＡ−４３５Ａメラノーマ細胞が、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ（配列番号８）又は１６１５Ｍｅｓｏ  ＴｒｉＫＥ（配列番号１１）と共にインキュベートされた。１６１５Ｍｅｓｏのみが活性を有した。（Ｃ）メソテリン＋卵巣癌細胞（Ｏｖｃａｒ３細胞）が、１６１５ＮＧ２  ＴｒｉＫＥ又は１６１５ＳＳ１  ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた。１６１５Ｍｅｓｏ及び１６１５ＮＧ２が活性を有した。（Ｄ）Ｒａｊｉ細胞がＮＫ細胞と共に培養され、そして５１Ｃｒ放出アッセイ下で研究された。ＴｒｉＫＥ１６１５２２１９（配列番号１２）は、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９及びＣＤ２２を同時に標的とする。１６１５２２１９、１６２２１９及びリツキシマブのみが、ＣＤ２２＋ＣＤ１９＋標的を殺した。対照はそうではなかった。
【００３７】
【図２０】ＩＬ−２と作用し、そしてＮＫ細胞ではなくＴ細胞の拡張を刺激するＴｒｉＫＥが合成されている。他のサイトカインがＩＬ−１５の代わりに作用するかどうかを決定するために、ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭ（配列番号１３）が、ＮＫ活性化ＴｒｉＫＥコンストラクトにおけるＩＬ−１５ドメインの何れか側で使用された、ＩＬ−２の何れかの側上の同じフランキング配列を用いて構築された。ＰＢＭＣは、標識され、そして処置ナシで（真の対照）、１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ (陽性対照)、ＣＤ３ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ、１０ ｎｇ/ｍｌ のＩＬ−２又は １００ ｎｇ/ｍｌ のＩＬ−２と共に培養物中に配置されたＣＥＬＬＴＲＡＣＥ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)であた。ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥは、１０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌｂの何れかで1６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ、ＣＤ３ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、又はＩＬ−２よりもより強くｃＤ３＋Ｔ細胞を刺激した。
【００３８】
【図２１】ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭのＣＤ３部分が試験され、そしてそのままであった。（Ａ）及び（Ｂ）：同じ抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖが、ジフテリア毒素にスプライシングされ、そしてＣＤ３＋ＨＰＢＭＬＴ標的細胞と共にインキュベートされた。ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭが、それが、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を殺すＤＴ３（ＣＤ３標的化された毒素）の能力をブロックするかどうかを見るために、添加された。ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭのブロッキング活性は、０．１ｎＭのＤＴ３（Ａ）及び１．０ｎＭのＤＴ３（Ｂ）の存在下で用量依存性であり、このことは、ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭのＣＤ３部分が損なわれていないことを示唆する。（Ｃ）及び（Ｄ）：ＤＴ２２１９（抗−ＣＤ２２及びＣＤ１９標的化毒素）による負の対照のＣＤ３−Ｒａｊｉ細胞の殺害をブロックするＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭの能力。
【００３９】
【図２２】ＣＤ１６ナノボディは、公開されたラマナノボディ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１）に由来した。ＣＤ１６ナノボディが、ＮＫ細胞殺害を引起すＣＤ１６エンゲージャーの能力を試験するためにＣＤ１９にスプライシングされた。（Ａ）ＣＤ１６ナノボディは、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ標的を用いてクロム放出アッセイにおいてリツキシマブ介在性殺害に類似する細胞溶解性ＮＫ活性を示した。（Ｂ）ＣＤ１６ＣＤＲが、ＨｕＥＦ９１、すなわちヒト化ＣＤ１６エンゲージャーを精製するために、ヒト化ラクダスカフォールド中にクローン化された。ＨｕＥＦ９１結合は、ＣＤ１６ｓｃＦｖ結合と同等であり、このことは、ヒト化ＨｕＥＦ９１が分子の特異性を妨げなかったことを示唆する。
【図２２−Ａ】（Ｃ）ラマ１６１５３３ＴｒｉＫＥ（配列番号１４）は、ＮＫ細胞を拡張することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫監視が可能な先天的免疫系の細胞毒性リンパ球である。細胞毒性Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は、膜透過性及びアポトーシス誘発性グランザイム及びパーフォリン顆粒の貯蔵物を送達する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、抗原プライミングを必要とせず、そしてＭＨＣ認識の非存在下で活性化受容体に関与することにより標的を認識する。
【００４１】
ＮＫ細胞は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、そして抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与する活性化受容体であるＣＤ１６を発現する。ＮＫ細胞は、高められた抗原依存性細胞毒性、リンホカイン活性化キラー活性を誘発し、そして／又はインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍開始因子（ＴＮＦ）及び／又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＨ−ＣＳＦ）応答を仲介することができるＩＬ−１５により調節される。それらのＩｌ−１５活性化機能のすべては、改善された癌防御に寄与する。
【００４２】
治療的には、ＮＫ細胞の養子移入は例えば、ＮＫ細胞の生存及びインビボ増殖を刺激するために、リンパ枯渇化学療法及びＩＬ−２と組合される場合、難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の寛解を誘発することができる。この療法は、ＮＫ細胞増殖及び機能を抑制する調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の抗原特異性及びＩＬ−２介在性誘発の欠如により制限され得る。Ｔｒｅｇ阻害の負の効果を回避しながら、ＮＫ細胞抗原特異性、増殖及び／又は持続性を駆動する試薬の生成が、ＮＫ細胞ベースの免疫療法を増強することができる。
【００４３】
この開示は、腫瘍細胞（例えば、ＣＤ３３＋腫瘍細胞及び／又はＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞）のＮＫ細胞介在性殺害を駆動できる２つのドメイン、及びＮＫ細胞自立シグナルを生成できる分子内ＮＫ活性化ドメインを含む三重特異的分子の生成を記載する。三重特異的分子は、例えばＨＬ−６０標的、癌細胞又は癌細胞由来の細胞系に対するＮＫ細胞増殖を駆動し、そしてＮＫ細胞由来の細胞毒性を増強することができる。
【００４４】
ヒトファージディスプレイライブラリー技法（McCall et al., 1999. Mol Immunol. 36:433-445）由来の抗―ヒト抗―ＣＤ１６ｓｃＦｖを組込む二重特異的融合体が製造されている。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６（ＦｃγＲIII）受容体を通して抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介する。ＣＤ１６受容体を通してのシグナル伝達は、カルシウムフラックス及びＩＴＡＭのリン酸化を誘発し、溶解性顆粒及びサイトカイン、例えばインターフェロン（ＩＦＮγ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の放出を誘発する。二重特異的分子は、いわゆる二重特異的キラー係（ＢｉＫＥ）である他の標的分子（Gleason et al. Blood. 2014 (19):3016-26）と組合してＣＤ１６受容体を誘発するよう企画されている。ＮＫ細胞を認識する１つのｓｃＦｖ及び腫瘍抗原を認識する第２のｓｃＦｖにより、ＢｉＫＥは、種々のヒト癌における細胞毒性殺害を著しく増強することができる。１つの典型的なＢｉＫＥは、ＣＤ３３を標的とし、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄形成不全症候群（ＭＤＳ）に対するＮＫ細胞応答を増強した。ＭＤＳは、末梢血液（ＰＢ）血球減少を伴う正常又は高細胞骨髄（ＢＭ）、及びＡＭＬに進行する高められたリストにより特徴付けられるクローン異種幹細胞障害である。
【００４５】
ＮＫ細胞は、例えばＮＫ細胞恒常性、増殖、生存、活性化及び／又は発達に関与するＩＬ−１５を含む種々のサイトカインに対して応答性である。ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（ＣＤ１２２）及び共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を含むＩＬ−１５及びＩＬ−２は、いくつかのシグナル伝達成分を共有する。ＩＬ−２とは異なって、ＩＬ−１５はＴｒｅｇを刺激せず、免疫応答のＴｒｅｇ阻害を回避しながら、ＮＫ細胞活性化を可能にする。ＮＫ細胞恒常性及び増殖を促進するのに加えて、ＩＬ−１５は、移植後の設定で起こり得るＮＫ細胞の機能的欠陥を救済することができる。ＩＬ−１５はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を刺激し、その免疫療法の可能性をさらに増強することができる。さらに、前臨床研究に基いて、ＩＬ−１５の毒性プロフィールは、低用量でＩＬ−２よりも有利であり得る。
【００４６】
ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の増殖恒常性、増殖、生存、及び活性化において役割を果たす。ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（ＣＤ１２２）及び共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を含むいくつかのシグナル伝達成分を共有する。ＩＬ−１５はまた、ＮＫ細胞を活性化し、そして造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のＮＫ細胞の生着における機能的欠陥を回復することができる。
【００４７】
この開示は、１つの側面によれば、１又は２以上のＮＫ細胞係ドメイン（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６＋ＣＤ２、ＣＤ１６＋ＤＮＡＭ、ＣＤ１６＋ＮＫｐ４６）、１又は２以上の標的ドメイン（例えば、腫瘍細胞又はウィルス感染された細胞を標的にする）、及び１又は２以上のサイトカインＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２，ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、又は他のＮＫ細胞増強サイトカイン、ケモカイン及び／又は活性化分子）（各ドメインは、他のドメインに操作可能的に連結されている）を一般的に含む三重特異的キラー係（ＴｒｉＫＥ）分子を記載している。本明細書において使用される場合、用語「操作可能的に連結される（operably Linked）」とは、直接的又は間接的な共有結合を言及する。従って、操作可能的に連結される２つのドメインは、互いに直接的に共有結合され得る。逆に、それらの２つの操作可能的に連結されたドメインは、介在部分（例えば、及びフランキング配列）への相互共存結合により連結され得る。２つのドメインは、例えば、それらが第３のドメインにより分離されている場合、１又は２以上の介在性フランキング配列の有無に関係なく、操作可能的に連結され得る。
【００４８】
ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞に結合し、そして／又はそれを活性化する任意の部分、及び／又はＮＫ細胞の阻害をブロックする任意の部分を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合する抗体を含むことができる。他の実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合するリガンド又は小分子を含むことができる。本明細書において使用される場合、用語「選択的に結合する（selectively binds）」とは、例えば特定の標的に対して任意の程度まで、異なる親和性を有するなどの複数の選択肢間を区別する能力を言及する。本明細書において使用される場合、「抗体（antibody）」とは一般的に、免疫グロブリン又はそのフラグメントを言及し、そして従って、モノクローナル抗体、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ab’）２、Ｆｖ又は他の修飾形）、モノクローナル抗体及び／又はそのフラグメントの組合せ、及び／又はポリクローナル抗体の組合せを包含する。従って、簡約にするために、ＮＫ細部の表面の成分に選択的に結合する抗体への言及は、記載された結合特性を示す任意の抗体フラグメントを含む。同様に、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合するリガンドへの言及は、記載された結合特性を示すリガンドの任意のフラグメントを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞の表面に少なくとも部分的に位置する受容体に選択的に結合することができる。特定の実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞を結合する機能を果たし、そしてそれにより、ＮＫを、以下により詳細に記載される標的ドメインが選択的に結合する標的と空間的に近接させる。しかしながら、特定の実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する受容体に選択的に結合することができ、そして従って、また活性化機能も有する。上記のように、ＣＤ１６受容体の活性化は、抗体依存性細胞介在性細胞毒性を誘発できる。従って、特定の実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合するのに有効な抗−ＣＤ１６受容体抗体の少なくとも一部を含むことができる。他の実施形態によれば、ＮＫ係細胞ドメインは、ＮＫ細胞を阻害する機構を中断することができる。そのような実施形態によれば、ＮＫ係ドメインは、例えば抗−ＰＤ１／ＰＤＬ１、抗−ＮＫＧ２、抗−ＴＩＧＩＴ、抗−キラー−免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、及び／又は任意の他の阻害ブロックドメインを含むことができる。
【００５０】
所望する程度のＮＫ選択性を有し、そして従って、所望の免疫関与特性を有するようＮＫ係ドメインを企画することができる。例えば、ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ） 及び ＦｃγＲＩＩＩｂ (ＣＤ１６ｂ)として同定されている。それらの受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、そして次に、抗体依存性細胞介在性細胞毒性のためにＮＫ細胞を活性化する。抗−ＣＤ１６抗体はＮＫ細胞に選択的に結合するが、しかしまた、好中球にも結合することができる。抗−ＣＤ１６ａ抗体はＮＫ細胞に選択的に結合するが、しかし好中球には結合しない。抗−ＣＤ１ａ抗体を含むＮＫ係ドメインを含むＴｒｉＫＥ実施形態は、ＮＫ細胞に結合するが、しかし好中球には結合しない。従って、ＮＫ細胞に関与するが、好中球には関与しないことが望まれる状況においては、抗−ＣＤ１６ａ抗体を含むようＴｉＫＥのＮＫ係ドメインを企画することができる。
【００５１】
ＮＫ係ドメインが抗−ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖを含む種々の実施形態に関して本明細書に記載されているが、ＮＫ係ドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合する任意の抗体又は他のリガンドを含むことができる。さらに、ＮＫ係ドメインは、任意のＮＫ細胞受容体、例えば細胞毒性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＲ−１、及び/又はＤＮＡＭ−１に選択的に結合する抗体又はリガンドを含むことができる。
【００５２】
標的化ドメインは、意図された標的、例えば腫瘍細胞、癌間質中の標的、阻害性細胞、例えばＣＤ３３＋である骨髄由来のサプレッサー細胞上の標的、又はウィルス感染された細胞上の標的に選択的に結合する任意の部分を含むことができる。従って、標的化ドメインは、例えば、抗腫瘍抗体、例えば以下を含むことができる：リツキシマブ（抗−ＣＤ２０）、アフツズマブ（抗−ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗−ＨＥＲ２ / ｎｅｕ）、ペルツズマブ（抗−ＨＥＲ２ / ｎｅｕ）、ラベツズマブ（抗−ＣＥＡ）、デカトムマブ（抗−ＥｐＣＡＭ）、シタツズマブボガトキシン（抗−ＥｐＣＡＭ）、エドレコロマブ（抗−ＥｐＣＡＭ）、アシチモマブ（抗−ＣＥＡ）、ベバシズマブ（抗−ＶＥＧＦ−Ａ）、セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗−ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗−ＥＧＦＲ）、ザルツムマブ（抗−ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗−ＣＤ３３）、リンツズマブ（抗−ＣＤ３３）、エタラシズマブ（抗−インテグリンαｖβ３）、イントセムマブ（抗−ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗−ＣＤ１５２）、オレゴボアブ（抗−ＣＡ−１２５）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、又はペムツマブ（抗−ＭＵＣ１）、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ１３３、抗−ＣＤ３８抗メソセリン、抗−ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１、又はＩＧＦＲ１。
【００５３】
他の実施形態によれば、標的化ドメインは、ウィルス、例えばアデノウィルス、ＨＩＶ、ＣＭＶ及び／又はＨＰＶにより感染された細胞上の標的に選択的に結合することができる。
【００５４】
特定の実施形態によれば、標的化ドメインは、抗−ＣＤ３３抗体を含むことができる。他の特定の実施形態によれば、標的化ドメインは、抗−上皮細胞接着分子（ＥｐＣＭ）抗体を含むことができる。
【００５５】
ＮＫ活性ドメインは、ＮＫ細胞を活性化し、ＮＫ細胞の維持を促進するか、又は他方では、ＮＫ細胞活性を促進するアミノ酸配列を含むことができる。ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化し、そして／又は維持することができる１又は２以上のサイトカインであり得るか、又はそれに由来され得る。本明細書において使用される場合、用語「〜に由来される（derived from）」とは、ＮＫ細胞活性化及び／又は維持活性を提供するのに十分であるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）のアミノ酸フラグメントを言及する。２つ以上のＮＫ活性化ドメインを含む実施形態によれば、ＮＫ活性化ドメインは、直列に、又は任意の他の組合せで提供され得る。さらに、各サイトカインに基くＮＫ活性化ドメインは、サイトカインの完全アミノ酸配列を含むことができるか、又はＴｒｉＫＥ分子に含まれる他のＮＫ活性化ドメインの性質に関係なく、アミノ酸フラグメントであり得る。ＮＫ活性化ドメインが基づかれ得る典型的なサイトカインは、例えばＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２及びＩＬ−２１を含む。従って、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ−１５に由来する典型的なモデルの実施形態に関連して本明細書に詳細に記載されているが、ＴｉＫＥは、任意の適切なサイトカインであるか、又はそれに由来するＮＫ活性化ドメインを用いて企画され得る。
【００５６】
この記載を簡約にするために、それが基かれるサイトカインを同定することによるＮＫ活性化ドメインへの言及は、サイトカインの完全アミノ酸配列、サイトカインの任意の適切なアミノ酸フラグメント、及び／又は１又は２以上のアミノ酸置換を含むサイトカインの修飾されたバージョンを含む。従って、「ＩＬ−１５」ＮＫ活性化ドメインへの言及は、ＩＬ−１５の完全アミノ酸配列を含むＮＫ活性化ドメイン、ＩＬ−１５のフラグメントを含むＮＫ活性化ドメイン、又は野生型ＩＬ−１５アミノ酸配列に比較して、アミノ酸置換を含む、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５Ｎ７２ＡなどのＮＫ活性化ドメインを包含する。
【００５７】
ＴｒｉＫＥ中のＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインの使用は、３週間後でさえ、ヒトＮＫ細胞が劇的に高められ、そして癌が減少することを示すマウスモデルにおいて証明されるように、持続的なＮＫ細胞活性を提供することができる。ＮＫ細胞は、マウスにおいて活性化され、抗癌因子及びサイトカインのアレイが生成される。さらに、図１は、ＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインが、それらの分子の化学的性質を何らかの形で変更し、それらがより容易にリフォールドし、そして／又はより高い収率で回収でき、従って、ＴｒｉＫＥ分子を、臨床的スケールアップのためにさらに適切にすることを示す。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、分子はさらに、上記ドメインの２つを連結できるフランキング配列を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、フランキング配列の存在は、ＮＫ細胞活性化をさらに高めることができる。１つの典型的なフランキング配列は、配列番号３の２０のアミノ酸を含む。別の典型的なフランキング配列は、配列番号４の７つのアミノ酸を含む。特定の実施形態（例えば、１６１５３３ＴｒｉＫＥ、配列番号１）は、２つ以上のフランキング配列を含むことができる。１つの例として、配列番号１は、ＮＫ係ドメイン（例えば、抗−ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖ）を、ＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ−１５）に連結するために配列番号３のフランキング配列を含む。配列番号１はまた、ＮＫ活性化ドメインを、標的化ドメイン（例えば、抗−ＣＤ３３ｓｃＦｖ）に連結するために配列番号４のフランキング配列を含む。図７は、フランキング配列を欠くコンストラクトが、フランキング配列を有するコンストラクトと比較して、低められた活性を示すことを証明するデータを示す。
【００５９】
１６１５３３ＴｒｉＫＥの合成及び純度：
抗原特異的であり、そして白血病に対するＮＫ細胞応答を自立させる典型的なモデルの治療用ＴｉＫＥを創造するために、ヒト修飾ＩＬ−１５架橋剤が、１６３３ＢｉＫＥ中に導入され、１６１５３３ＴｒｉＫＥ（図１Ａ）が創造された。ＴｒｉＫＥのＦＰＬＣプロフィールは、リフォールディングを必要とする細菌発現系からの高収率生成物を示した（図１Ｂ）。ＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインは、２ｐＨ単位、等電点を低め、精製のためのより好ましい条件を創造し、そして収率を高めた。用量の封入体で始まる精製にもかかわらず、１６１５３３ＴｒｉＫＥの最終収量は、同等のＢｉＫＥ（１６３３、ＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインを有さない）の収量の２倍であり、より好ましい精製ダイナミックスを示している。生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析及びクーマシーブルー染色によれば、９５％以上の純度であった（図１Ｃ）。結合性及び特異性が新しいＴｒｉＫＥ分子にそのまま残っていることを確認するために、選択性が、ＣＤ３３ ＋ ＥｐＣＡＭ−ＨＬ−６０細胞及びＣＤ３３−ＥｐＣＡＭ ＋ ＨＴ−２９細胞に対する直接的結合及びブロッキングフローサイトメトリーアッセイにより測定された（表１及び表２）。
【００６０】
【表１】
2018531939.tif 000003
【００６１】
【表２】
2018531939.tif 000004
【００６２】
１６１５３３ＴｒｉＫＥはＮＫ細胞機能を高める：
ＩＬ−１５の包含が、ＡＤＣＣを媒介する生体工学的１６３３の能力を保持するかどうかを決定するために、１６３３及び１６１５３３が４時間のクロム放出アッセイにおいて比較され、アッセイにおいては、健康なドナーからのＰＢＭＣが、ＣＤ３３＋ＨＬ−６０標的を死滅させるそれらの能力について試験された（図２Ａ）。１６１５３３ＴｒｉＫＥは、特に２０：１の比（５８．３ ± ２．３％対３３ ± ４％、 Ｐ ＝ ０．０１８４）で、ＢｉＫＥよりも高いＮＫ細胞介在性死滅を誘発した。抗−ＣＤ１６及び抗−ＣＤ３３の対照サンプルは、それらの成分のみの活性を示さない未処置の対照と比較して、応答を増大させなかった。細胞毒性アッセイにおける特異性を試験するために、１６１５３３ＴｒｉＫＥが、ＮＫ細胞及びＣＤ３３−ＨＴ−２９標的細胞と共にインキュベートされた（図２Ｂ）。１６１５３３ＴｒｉＫＥは、無処置の対照に比較された場合、ＨＴ２９細胞の死滅において有意な増加を示さなかった。ＨＴ−２９標的細胞が特異性についての説明として単により耐性でないことを確実にするために、ＨＴ−２９細胞が、抗−ＣＤ３３の代わりに抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む新しいＩｌ−１５  ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた。このＴｒｉＫＥは、ＥｐＣＡＭ＋ＨＴ−２９細胞を強く死滅し、血液悪性腫瘍及び固形悪性腫瘍の両方に対するＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインＴｒｉＫＥプラットフォームの多様性を強調した。
【００６３】
向け直された細胞毒性に加えて、ＮＫ細胞の別の機能は、標的細胞認識に基いてサイトカイン、及びケモカインを生成することである。ＴｒｉＫＥがこの工程を増強するかどうかを試験するために、ＮＫ細胞及びＮＬ−６０標的が、分子なしで、１６３３ＢｉＫＥと共に、又は１６１５３３ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされ、そして上清液が２４時間後に収集され、そして炎症性サイトカイン及びケモカインについて分析された（図２Ｃ）。ＴｒｉＫＥは、薬物なし又はＢｉＫＥと比較して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＭ−ＣＳＦ及びＨＩＰ−１α分泌を有意に誘発した。それらのデータは、ＴｒｉＫＥにおけるＩＬ−１５分子が、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を高めることができる前炎症性サイトカイン及びケモカイン分泌を誘発できることを示唆する。
【００６４】
１６１５３３は移植後のＮＫ細胞の生存性及び拡張を誘発する：
ＩＬ−１５の１つの治療上の利点は、それがＮＫ細胞の恒常性及び増殖に関与していることである。従って、１６１５３３ＴｒｉＫＥが、それらの生物学的機能がＴｒｉＫＥ分子内で活性を維持するかどうかを評価するために、試験された。生理学的に関連した状態でこれを試験するために、移植後早期の患者サンプルが使用された。それらのサンプルは、ＮＫ細胞再構成が抗腫瘍移植片対白血病（ＧｖＬ）応答を媒介するのに必要とされる状況を提供する。移植後早期の時点での評価は、ＮＫ細胞の欠損が、それらの同じ時点で標的細胞誘発性サイトカイン生成を媒介し、それは早期再発を説明できるので、特に興味あるものである（Foley et al., 2014. Immunol Rev 258(1):45-63）。移植後の患者ＰＢＭＣ（移植後、１００日目（ｎ＝５）又は２０−４４日目（ｎ＝５）の何れか）が、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ 色素 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)により標識され、増殖が測定され、ＨＬ−６０標的、及び１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥの何れかと共に７日間インキュベートされ、そして次に、ＮＫ細胞生存性を測定するために生存／死滅色素により標識された。１６３３ＢｉＫＥと共にインキュベートされたＰＢＭＣ内では、ほとんどのＮＫ細胞は生存／死滅色素を取り込み、このことは生存率が低いことを示唆する。対照的に、１６１５３３ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた患者ＰＢＭＣは、卓越したＮＫ細胞生存性を支持した（図３Ａ及び３Ｂ；９６．９±０．５％対２１±５．４％；Ｐ＜０．０００１）。１６５３３ＴｒｉＫＥ中のＩＬ−１５部分がまた増殖を促進するかどうかを理解するために、生存性ＮＫ細胞集団におけるＣＥＬＬＴＲＡＣＥ色素希釈が評価された。予想外に、１６１５３３ＴｒｉＫＥは、移植後の患者サンプルにおいては、強く且つ特異的なＮＫ細胞増殖を誘発し、そして同じサンプル（分裂されたＮＫ細胞の７９．１±２．５％対Ｔ細胞の２．３±１．１％、Ｐ＜０．０００１）においてＴ細胞の最小の増殖を伴った（図３Ｃ及び３Ｄ）。ＮＫ細胞はまた、総Ｔ細胞よりも有意に高い拡張指数を有し（７．２±０．８％対１．１±０．１％、Ｐ＜０．０００１）、これは総倍増を表す。これは、１６１５３３ＴｒｉＫＥにおけるＩＬ−１５の活性が、コンストラクトにおけるフランキングｓｃＦｖ分子の結果としてよりＮＫ細胞特異的であり得ることを示唆する。さらに、１６１５３３ＴｒｉＫＥとＮＫ細胞とのインキュベーションは、飽和濃度のＩＬ−１５により媒介される拡張を反映する強い増殖をもたらした。従って、ＴｒｉＫＥ中のＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインは、機能的に活性であり、そして健康なドナーＮＫ細胞に自立シグナルを送達することができ、そして／又はＮＫ細胞再構成に欠陥がある状況下で、移植後の患者のＮＫ細胞の生存性及び増殖を促進することができる。
【００６５】
１６１５３３ＴｒｉＫＥは移植後早期に欠陥ＮＫ細胞機能を救済する：
同種異系造血幹細胞移植後、ＮＫ細胞は数が増加され、そしてＩＬ−１２及びＩＬ−１８刺激に対して応答するが、しかし癌細胞系標的に暴露される場合、６ヶ月以上にわたって低反応性を示す。この設定においては、ＩＬ−１５との一晩のインキュベーションへの短期間の暴露は、Ｋ５６２標的に対するＮＫ細胞機能を救済することができる（Foley et al., 2011, Blood 118(10):2784-2792）。移植後免疫療法としての典型的なＴｒｉＫＥ１６１５３３分子の潜在的な臨床開発が与えられると、ＴｒｉＫＥ及び匹敵するＢｉＫＥ（１６３３）分子が、同種異系造血幹細胞移植受容体由来の移植後ＰＢＭＣに対して試験された（図４）。１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥが、機能的回復を可能にするために、ＮＫ細胞と共に一晩インキュベートされ、そして細胞が翌朝、ＨＬ−６０標的と共にインキュベートされ、そして機能について分析された。１６３３ＢｉＫＥとのインキュベーションは、ＨＬ−６０標的に対するＮＫ細胞に比較した場合、ＨＬ−６０標的の死滅の倍増をもたらすが（１８．９±２．１％対９±１．５％、Ｐ＜０．０００１）、１６１５３３ＴｒｉＫＥとのインキュベーションは、ＢｉＫＥによってよりもかなり高い程度（５２．１±３．５％）ＮＫ細胞介在性細胞毒性機能を救済した（図４Ａ）。細胞毒性の増加は、ＣＤ１０７ａ発現により測定された高められた脱顆粒化と良好に相関した（図４Ｂ及び図４Ｃ左パネル）。ＢｉＫＥと比較して、ＴｒｉＫＥは、ＩＦＮγ（ＢｉＫＥ＝２．６±０．５％対ＴｒｉＫＥ＝２１．７±４．４％、Ｐ＝０．００１２）及びＴＮＦα（ＢｉＫＥ＝６．１±１％対ＴｒｉＫＥ＝２９．９±３．８％、Ｐ＜０．０００１）生成を強く救済した（図４Ｂ及び４Ｃ中央及び右パネル）。すべてのアッセイにおいて、ＴｒｉＫＥは、ＢｉＫＥと比較して、高められた機能性を誘発した。それらの変化の大きさは、移植後設定の初期での１６１５３３ＴｒｉＫＥの免疫療法の可能性を明確に示している。
【００６６】
１６１５３３ＴｒｉＫＥは原発性ＡＭＬ芽球に対するＮＫ細胞機能を高める：
原発性ＡＭＬ芽球に対する１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥの活性を比較するために、移植後の患者由来のＰＢＭＣが、２人の異なる患者（ＡＭＬ１及びＡＭＬ２）由来の原発ＡＭＬ芽球と共にインキュベートされた。ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα誘発は、ＨＬ−６０標的に比較して、一次芽球に対して低められた（図５対図４）。機能の低下は、一次芽球上のＣＤ３３の低められた発現に一部起因するが、しかし阻害性リガンドの発現又は活性化受容体リガンドの不在もまた、機能低下に寄与し得る。同じ条件下でＡＭＬ１とＡＭＬ２との間でＮＫ細胞活性化に有意な差は見られなかったが、１６１５３３ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた移植後の患者サンプル由来のＰＢＭＣは、１６３３ＢｉＫＥと共にインキュベートされたＰＢＭＣよりも高い脱顆粒化（ＣＤ１０７ａ）及びサイトカイン生成（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を有意に（ｐ＜０．０５）誘発し（図５Ａ及び図５Ｂ）、このことは、ＩＬ−１５と組合わされた活性化の組合せが原発性ＡＭＬ標的に対して強力であることを示唆する。まとめると、それらのインビトロデータは、１６１５３３ＴｒｉＫＥが原発性腫瘍細胞に対してＮＫ細胞抗原を特異的にすることができることを示している。
【００６７】
１６１５３３ＴｒｉＫＥは高められたインビボＮＫ細胞生存性及び機能を誘発する：
ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥのインビボ活性の比較は、ＣＤ３３＋白血球及びヒトＮＫ細胞の進行を同時に調節するネズミ異種移植モデルの開発を必要とした。ルシフェラーゼレポーターを含むＨＬ−６０細胞が、静脈内注射され（７．５×１０５個の細胞／マウス）、そして３日後、ＩＬ−１５により一晩活性化された１００万個のヒトＮＫ細胞が注入された。図６は、各処置グループにおけるＨＬ−６０−ｌｕｃ腫瘍負荷を示す画像データを示す。対照グループはＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞のみを受け、薬物又はＮＫ細胞は受けなかったが、１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥグループは、ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞及びＮＫ細胞を受けた。研究中、薬物（５０μｇ／ｋｇ）がＭＴＷＴｈＦに投与された。１４日目（図６Ｂ）、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥグループは、対照グループと有意には（ｐ＜０．０５）お互い異なっておらず、初期時点で、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥの両者が同様に腫瘍の進行に影響を及ぼすことを示している。しかしながら、２１日目、非薬物グループ由来の２匹のマウスはこの時点までに死亡したが、生存中の非薬物グループとＢｉＫＥグループとの間に有意な差異は見出されなかった。一方、ＴｒｉＫＥグループは対照グループと有意に（ｐ＜０．０５）異なり、そしてこの時点で、またＢｉＫＥグループとも異なっており、このことは、１６１５３３ＴｒｉＫＥ療法を用いた後期段階でのＨＬ−６０腫瘍負荷の卓越した制御を示す。
【００６８】
図３からのインビトロ実験で示されたＮＫ細胞生存性及び増殖の結果を考慮すると、インビボでＴｒｉＫＥにより生成されたＨＬ−６０−  ｌｕｃ腫瘍の高められた制御は、１６１５３３ＴｒｉＫＥ分子中のＩＬ−１５部分を介してのトランスファーされたＮＫ細胞集団の高められた維持及び拡張により少なくとも部分的に媒介され得る。従って、マウスは２０日目に採血され（２０μｌ）、そして一定の獲得時間（６０秒）の間に得られるＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）事象の数が評価された。対照及び１６３３ＢｉＫＥ処置動物の何れも、循環ＣＤ５６＋ＣＤ３−ヒトＮＫ細胞の有意な証拠を示さず、それらの条件下で生存率及び拡張の低下を示した（図６Ｃ及び６Ｄ）。著しく対照的に、１６１５３３ＴｒｉＫＥ処置動物の全ては、高レベルのヒトＮＫ細胞（４２６１±４１０．６事象）を示した。１６１５３３ＴｒｉＫＥにより処置されたマウスは、ＢｉＫＥ  ＮＫレベルよりも約２００倍高いＮＫ細胞レベルを有し、このことは、ＴｒｉＫＥ分子内のＮＫ活性化ドメインとしてのＩＬ−１５分子の強力な生物学的寄与を示している。従って、ＴｒｉＫＥ中のＩＬ−１５ＮＫ活性ドメインの使用は、ＮＫ細胞数を維持するために外因性ＩＬ−１５の提供を含む治療の必要性を低めることができる。
【００６９】
フランキング配列及び配向はＴｒｉＫＥ活性に影響を及ぼす：
分子の機能性に対するフランキング配列の影響を試験するために、１６１５３３コンストラクトの変異体が、ＩＬ−５の何れかの側にフランキング配列なしで企画された。本明細書において１６１５３３ＮＬ（配列番号５）として同定された新しい変異体が、クロム放出死滅アッセイにおいて１６１５３３コンストラクト（配列番号１）と比較された。図７は、２つの独立したドナー（ＰＢ−１及びＰＢ２）において、フランキング配列がＴｒｉＫＥの活性に影響を及ぼすことを示す。配向変異体はまた、Ｎ末端（１５１６３３；配列番号６）及びＣ末端（１６３３１５；配列番号７）の位置にＩＬ−１５を有するよう構築された。図７はまた、架橋剤として中心位置にＩＬ−１５を含み、そしてフランキング配列を有する１６１５３３コンストラクトがより大きなＮＫ細胞の細胞毒性活性をもたらすことを示す。フランキング配列がなければ、１６１５３３ＮＬは、親野生型１６１５３３（５７％）と比較して、２０：１のＥ：Ｔ比で２５％の細胞毒性を示し、このことは、フランキング配列が一般的に、ＴｒｉＫＥコンストラクトから誘発されたＮＫ細胞の細胞毒性を高めることを確認する。
【００７０】
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ：
自己維持ハイブリッド免疫係を構築するために、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ（図８Ａ、配列番号８）が、ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥ中にヒトＩＬ−１５を組み込むことによりアセンブリーされた（図８Ｂ）。ＴｒｉＫＥコンストラクトは、ＩＬ−１５に、及び次ぎに抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦＶのＶＨ及びＶＬ領域にスプライシングされた、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡフラグメントを含む。ＩＬ−１５ＤＮＡフラグメントは、２０個のアミノ酸（ａａ）セグメント（配列番号３）及びＥＡＳＧＧＰＥ（配列番号４）により何れかの側にフランキングされる。三段階溶出プロトコルを用いた薬物精製における第１段階としてＦＦＱイオン交換カラムから溶出された１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ及びＥｐＣＡＭ１６  ＢｉＫＥの吸光度追跡が、それぞれ、図８Ｃ及び８Ｄに示されている。カラムから溶出された第１ピークは、目的の生成物を表す。類似する量の封入体がリフォールディングされ、そして精製される場合、収率が予想外に、ＩＬ−１５架橋剤の添加により改善された。ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥに比較される場合、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥにおいて、吸光度がほぼ３倍になり、卓越した収率を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びクーマーシーブルー染色は、約６８８６０ｋＤａのサイズで９０％の以上の純度である生成物をもたらすイオン交換及びサイズ排除カラム精製（図８Ｅ及び８Ｆ）の両者の後の純度を示す。従って、１６１５３３ＴｒｉＫＥ（配列番号１）について観察されるように、ハイブリッドＴｒｉＫＥ中に直接的にＩＬ−１５を組込むことで、対応するＢｉＫＥ（この場合、ＩＬ−１５を欠いているＥｐＣＡＭ１６）と比較して、卓越した精製特性が得られる。
【００７１】
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥはクロム−５１放出を誘発する：
１６１５ＥｐＣＡＭの機能的活性を決定するために、その死滅化能力が、標準の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定された（図９）。ＥｐＣＡＭ１６スカフォールドへのＩＬ−１５の組込みの効果を決定するために、ＮＫ細胞介在性細胞毒性が、異なるＮＫ細胞含有量を有する広範囲のドナーにおいて評価された。新たに単離されたＰＢＭＣが、エフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比２０：１、６．６：１及び２．２：１でＨＴ−２９細胞に添加され、細胞溶解曲線が生成された。操作された試薬が、３０ｎｍの濃度で添加された（滴定実験後の最大有効量）。３．８％、６．４％、１５％及び８０％以上の富化されたＮＫ細胞（フローサイトメリリーにより決定される）を有するドナーは、ＩＬ−１５成分が一般的に、ＮＫ細胞の死滅化能力を改善することを示した（それぞれ、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄ）。図９Ｅにおいては、１６１５ＥｐＣＡＭのドナー曲線のみがグラフ化され、上昇するＮＫ存在と細胞溶解活性との間の直接的相関を強調している。図９Ｆは、ＥｐＣＡＭ１６については、そのような相互性が存在しないことを示す。ベースラインの変動のために、再現性が、異なるドナーを用いての反復により確保された。一緒にすると、データは、アッセイにおけるＮＫ細胞の数が多いほど、観察されるＮＫ細胞溶解活性が高くなることを示唆する。
【００７２】
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥは種々の細胞係において溶解性脱顆粒化及びＩＦＮγ発現を誘発する：
他のＥｐＣＡＭ発現標的細胞系がＨＴ−２９標的系と類似する１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ媒介性ＮＫ細胞活性化を誘発するかどうかを決定するために、ＮＫ細胞機能が異なる薬物処置と組合して種々の標的について試験された。乳癌（図１０Ａ及び１０Ｂ）、前立腺癌（図１０Ｃ及び１０Ｄ）、頭頸部癌（図１０Ｅ及び１０Ｆ）及び卵巣癌細胞係（図１０Ｇ）が研究された。１６１５ＥｐＣＡＭ（配列番号８）により処理された全てのＥｐＣＡＭ＋癌腫系は、Ｅ：Ｔ単独、Ｅ：Ｔ＋ＩＬ−１５、Ｅ：Ｔ＋ＣＤ１６ＣＤ１３３（無関係なＢｉＫＥ）、及びＥ＋ＩＬ−１２／ＩＬ−１８を含む種々の対照に比較される場合、有意に高められたＮＫ細胞脱顆粒化を誘発した（ｐ＜０．００１）。Ｅ：Ｔ＋ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥはまた、ＢｉＫＥが細胞毒性活性を有するが、しかし増殖能力を欠いているので、ＣＤ１０７ａを発現する細胞及び細胞毒性活性の著しい割合を示した。従って、すべての場合、ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥを用いて観察された値は、１６１５ＥｐＣＡＭについて観察された値よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。
【００７３】
１６１５ＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ細胞増殖を誘発する：
ＮＫ細胞における増殖を誘発する１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ（配列番号８）の能力が図１１に示される。ドナーＰＢＭＣがＴｒｉＫＥに暴露される場合、Ｔ細胞でなくＮＫ細胞は、フローサイトメトリーにより測定されるような増幅特異的パターンを示した（図１１Ａ）。結果は、４人のドナーのうちの３人において同一であった。ＴｒｉＫＥに暴露される場合、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞よりもより強い増幅を受ける。図１１Ｂは、ＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥ 及び１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥにより誘発されたＮＫ増殖の直接的比較を示す。ＴｒｉＫＥは、増殖及び拡張を誘発するが、しかしＢｉＫＥはそうではない。ＮＫ細胞増殖を誘発し得る他の因子の可能性を排除するために、ＰＢＭＣが、ＴｒｉＫＥ、ＢｉＫＥ、抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖのみ、ＩＬ−１５のみ、抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖのみ、又はＤＴ２２１９（ジフテリア毒素を含む標的毒素、抗−ＣＤ２２ｓｃＦｖ及び抗−ＣＤ１９ｓｃＦｖに連結される）に暴露された。ＴｒｉＫＥ処置グループ及びＩＬ−１５処置グループのみが、細胞の倍率の拡大を反映する拡張指数の変化により示されるように、有意なＮＫ細胞増殖を示した（図１１Ｃ）。ＴｒｉＫＥにより刺激されたグループは、より高いＮＫ細胞生存性を示し、一方、ＢｉＫＥに暴露されたグループは、前方／側方散乱フローサイトメトリー（図１１Ｄ）及びトリパンブルー染色により確認されるように、主に死亡細胞を含んだ。それらのデータは、細胞のプライミングの増加に加えて、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ中のＩＬ−１５部分もまた、ＮＫ細胞の拡張及び維持を誘発することを示唆する。
【００７４】
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥはＨＴ−２９標的細胞に対する溶解性脱顆粒化及びＩＦＮγ発現を誘発する：
ＮＫ細胞活性のパラメーターとして溶解性脱顆粒化を研究するために、ＣＤ１０７ａ発現が、ＥｐＣＡＭ発現ＨＴ−２９標的と共にインキュベートされたＣＤ５６＋／ＣＤ３−ＮＫ細胞集団内で測定された。ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥと共にインキュベートされた細胞は、エフェクター単独、エフェクター＋薬物なしでの標的、又はエフェクター＋抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖと共に標的と比較される場合、高められたＣＤ１０７ａ発現を示した。１６１５ＥｐＣＡＭ、ＴｒｉＫＥは、ＢｉＫＥより有意に多くのＣＤ１０７ａ発現を誘発した（図１２Ａ）。１６１５ＥｐＣＡＭはまた、何れの効果も有さなかった広範囲の対照パネル（Ｅ：Ｔ単独、Ｅ：Ｔ＋１６１５を欠く抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ、Ｅ：Ｔ＋抗ＣＤ１６ｓｃＦｖのみ、ＣＤ２２１９、及びＥ：Ｔ＋ＩＬ−１２及びＩＬ−１８の組合せを含む）に比較して、有意に高められた脱顆粒かを誘発した。独立したＩＬ−１５の２つの異なる源は、Ｅ：Ｔと組合される場合、溶解性脱顆粒化（ＩＬ−１５自己、リンカータンパク質；ＩＬ−１５ＮＣＩ、ＮＣＩ由来）を増強することができなかった。ＩＦＮγ生成はまた、ＢiＫＥ単独、又はＢｉＫＥ＋ＩＬ−１５により処置されたＮＫ細胞に比較した場合、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ処置ＮＫ細胞においても増強され、このことは、サイトカイン分泌のためのプライミングを誘発するＴｒｉＫＥ内のＩＬ−１５部分の生物学的能力を示す（図１２Ｂ）。前のように、広範囲の対照パネルが、ＴｒｉＫＥに対して試験され、ここでＩＬ−１２／ＩＬ−１８超生理学的刺激のみがＴｒｉＫＥを上回った。
【００７５】
図１２Ｃにおいては、ＮＫ細胞が対照ＥｐＣＡＭ−ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞と共にインキュベートされる場合、ＣＤ１０７a発現は観察されなかった。ＩＬ−１２／ＩＬ−１８により処置された対照細胞を除いて、ＩＦＮγ発現の上昇は、陰性対照ＨＬ−６０標的では予想通り観察されず、このことは、ＩＦＮγアッセイが作用していることを示す（図１Ｄ）。
【００７６】
１６１５ＥｐＣＡＭ１３３はクロム−５１放出を誘発する：
操作された四重特異的１６１５ＥｐＣＡＭ１３３（配列番号９）の企画が、図１３に示されている。１６１５ＥｐＣＡＭ１３３活性が、ＮＫ細胞死滅化を測定するためにクロム放出アッセイより評価された。アッセイは、抗体を有さない（Ａｂなし）各癌細胞系について、Ｃａｃｏ−２（ＣＤ１３３＋、ＥｐＣＡＭ−）及びＨＴ−２９（ＣＤ１３３−、ＥｐＣＡＭ＋）標的、及び２人のドナー（ＰＴ１及びＰＴ２）の新たに単離されたＮＫ細胞、抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖ、抗−ＣＤ１３３ｓｃＦｖ、抗−ＥｐＣＡＭ、ｓｃＦｖ、ＩＬ−１５単独、及び対照としてのＥｐｃＡＭ１６ＢｉＫＥを用いて実施された。全てのドナー及び両方の癌細型において、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３は、Ｅ：Ｔ比の上昇で卓越した死滅化を示した（図１４Ａ−Ｄ）。対照は最小の活性を示した。それらのデータは、腫瘍細胞上の２つの異なる部分の標的化が可能であることを示す。この場合、１つはより広い上皮マーカー標的（ＥｐＣＡＭ）であり、そして他の１つはより特異的な抗癌幹細胞標的ＣＤ１３３である。
【００７７】
１６１５ＥｐＣＡＭ１３３はＮＫ細胞増殖を誘発する：
選択的に結合する１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の能力が図１５Ａ及び１５Ｂに示されている。増殖及び生存性を誘発する分子内のＩＬ−１５部分の能力が図１５Ｃ−Ｆに示される。精製されたＮＫ細胞が、抗−ＣＤ１６ ｓｃＦｖ、抗−ＣＤ１３３ ｓｃＦｖ、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３、ＤＴ２２１９（抗−ＣＤ２２及び抗−ＣＤ１９ ｓｃＦｖに連結された変異したジフテリア毒素）、抗−ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ、ＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥ、又はＩＬ−１５単独（ＮＣＩ）に暴露された。培養の全体的な拡張を決定する拡張指数は、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３及びＩＬ−１５グループにおいて有意に増強された拡張を示した（ｐ＜０．０１）（図１５Ｃ）。増殖を誘発するＩＬ−１５リンカーの能力を比較するために、ＰＢＭＣ又は精製されたＮＫ細胞が、反応性色素により染色した後、培養され、そしてＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥ又は１６１５ＥｐＣＡＭ１３３四重特異的分子に暴露された。インキュベーションの後、フローサイトメトリーが、ゲートされたＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞に対して行われ、Ｔ細胞が評価された。図１５Ｄにおいては、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３により処理されたＮＫ細胞のみが実質的な増殖を示した。ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥによる処理は、そうではなかった。ＮＫ細胞への特異的増殖を誘発する能力が図１５Ｅに示されており；Ｔ細胞は、１６１５ＥＰＣＡＭ１３３への暴露の後、増殖しなかった。
【００７８】
ＮＫ細胞の生存性を増強する１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の能力を研究するために、精製されたＮＫ細胞が７日間、共培養され、そして１６１５ＥｐＣＡＭ１３３又はＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥにより処理された。フローサイトメトリーによる生死染色の後、より高い割合の生存ＮＫ細胞が１６１５ＥｐＣＡＭ１３３グループに見られた（図１５Ｆ）。
【００７９】
１６１５１３３はクロム−１５放出を誘発する：
操作された１６１５１３３の企画が図１６に示される。１６１５１３３ＴｒｉＫＥの機能的活性を評価するために、標準の５１Ｃｒ放出アッセイが実施された。１６１３３スキャホールド中へのＩＬ−１５の組込みの効果を決定するために、細胞毒性が異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１及び５：１）で２つの別個のドナー及びＣａｃｏ−２腫瘍標的のＮＫ細胞を用いて評価され、そして１６１５１３３ＴｒｉＫＥ、１６１３３ＢｉＫＥ、抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖ及び薬物処置なしの間の活性が比較された（図１７Ａ及び１７Ｂ）。Ｃａｃｏ−２標的の死滅は、対象と比較して、ＴｒｉＫＥにおいては高められた。より広い範囲のＥ：Ｔ比（２０：１、６．６：１、２．２：１、０．７：１、０．２３：１及び０．０８：１）を有する１６１５１３３ＴｒｉＫＥ（１ｎM、５ｎＭ及び１０ｎM）の用量依存性滴定は、より高い用量で薬物活性の最も高い影響を示した（図１７Ｃ）。結合の特異性を評価するために、フローサイトメトリーに基く蛍光強度が、Ｃａｃｏ−２細胞を、ＦＩＴＣ標識された１６１５１３３ＴｒｉＫＥと共に異なった濃度（１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ又は５００ｎＭ）でインキュベートした後に測定した。非標識抗−ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（２００ｎM）が１６１５１３３ＴｒｉＫＥと共に添加される場合、結合が強く低められ（図１７Ｄ）、このことは、１６１５１３３ＴｒｉＫＥがＣＤ１３３との相互作用を通して標的細胞に特異的に結合することを示唆する。一緒にすると、それらのデータは、ＴｒｉＫＥにより介在されるＡＤＣＣが抗原指向性であることを示唆する。
【００８０】
１６１５１３３はＮＫ細胞増殖を誘発する：
１６１５１３３（配列番号１０）により誘発された増殖が、生存ＮＫ及びＴ細胞集団におけるＣＥＬＬＴＲＡＣＥ色素希釈により測定された。ドナーＰＢＭＣが１６１５１３３ＴｒｉＫＥ又は１６１３３ＢｉＫＥに暴露される場合、ＴｒｉＫＥグループのみが増殖を誘発した（図１８Ａ）。重要なことは、抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖ、抗−ＣＤ１３３ｓｃＦｖ、ＤＴ２２１９（ジフテリア毒素に連結された抗−ＣＤ２２及び抗−ＣＤ１９  ｓｃＦｖから成る標的毒素）、及びＮＣＩ由来のＩＬ−１５を含む他の制御剤との比較は、１６１５１３３ＴｒｉＫＥ及びＮＣＩ  ＩＬ−１５のみが増殖を誘発したことを示した。長期生存を誘発する１６１５１３３ＴｒｉＫＥの能力を示すために、精製されたＮＫ細胞が、１６１５１３３又は１６１３３ＢｉＫＥと共に７日間インキュベートされた。反応性色素が、異なる処置グループにおける細胞死滅を定量化するために使用された。ＴｉＫＥグループは、ＢｉＫＥに比較して、反応性色素を組込まない、より多くの生存細胞を示した（図１８Ｂ）。一緒にすると、その結果は、１６１５１３３ＴｒｉＫＥに存在するＩＬ−１５がＮＫ細胞増殖及び延長されたそれらの生存性を誘発することを示唆する。
【００８１】
ＴｒｉＫＥは一般的にＣｒ−５１放出を誘発する：
５１Ｃｒ放出アッセイが、癌細胞を標的とする任意のｓｃＦｖが機能的ＴｒｉＫＥ中に組込まれ得ることを示すために、いくつかの異なるＴｒｉＫＥにより実施された。非小細胞肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）が、１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ＴｒｉＫＥ（配列番号９）又は１０１５ＮＧ２  ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた。１６１５ＮＧ２及び１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の両者は、いくつかの異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１及び５：１）で活性を有した。図１９Ｂは、メラノーマ細胞が１６１５ＥＰＣＡＭ１３３ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされたことを示す。メソセリン＋ＥｐＣＡＭ−ＨＧ２  ＭＤＡ−４３５Ａメラノーマ細胞が、１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ、又は１６１５Ｍｅｓｏ  ＴｒｉＫＥ（配列番号１１）と共にインキュベートされた。１６１５Ｍｅｓｏのみが活性を有した。卵巣癌細胞（Ｏｖｃａｒ３細胞）が、１６１５ＮＧ２  ＴｒｉＫＥ又は１６１５Ｍｅｓｏ  ＴｒｉＫＥと共にインキュベートされた。両ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞溶解活性を誘発した。また、抗−白血病ＴｒｉＫＥが、白血病マーカーＣＤ１９及びＣＤ２２を認識するようにされた。１６１５２２１９ＴｒｉＫＥが、ＣＤ２２＋ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞に対して試験され、そしてそれらを非常に良く死滅せしめた（リツキシマブと同様に）。一緒にすると、それらのデータは、何れかのｓｃＦｖが１６１５Ｘの一般化されたＴｒｉＫＥ構造プラットフォームに挿入され得、そして得られるＴｒｉＫＥがｓｃＦｃ標的に対して応答し、そして拡張するようＮＫ細胞を指図することができることを示す。追加の典型的なＴｒｉＫＥ分子が表３に列挙される。
【００８２】
【表３】
2018531939.tif 000005
【００８３】
＊：ＡＤＣＣ又は細胞毒性活性がＴｒｉＫＥプラットフォームにより３０％以上、増強された。
＊＊：拡張：ＴｒｉＫＥはＮＫ細胞の拡張を増強したが、ＢｉＫＥはそうではなかった。
＊＊＊：活性化：ＴｒｉＫＥは、ＩＮＦγ及びＴＮＦαを含む種々の抗癌サイトカインの生成を増強する。
【００８４】
いくつかのＴｒｉＫＥが同一の方法で生成され、そして試験されているが、しかし異なる癌マーカーを標的とする。ＣＤ３３又はＳｉｇｌｅｃ−３（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ−３、ｇｐ６７、ｐ６７）は、骨髄系の細胞上に発現されるトランスメンブラン受容体である。それは通常、骨髄特異的であると思われる。ＥｐＣＡＭ、すなわち上皮細胞接着分子は、上皮におけるＣａ２＋非依存性同型細胞−細胞接着を媒介するトランスメンブラン糖タンパク質である。また、プロミニン−１としても知られているＣＤ１３３は、ヒトにおいて、ＰＲＯＭ１遺伝子、及び細胞突起に特異的に局在するペンタスパントランスメンブラン糖タンパク質（５−トランスメンブラン、５−ＴＭ）のメンバーによりコードされる糖タンパク質である。ＮＧ２は、コンドロイド硫酸プロテオグリカン４であり、また、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）又はニューロン−グリア抗原２（Ｎｇ２）としても知られている。それは、ヒト悪性メラノーマ細胞により発現される内膜コンドロイチン硫酸プロテオクリカンを表す。メソセリンは、正常中皮細胞上に存在し、そして中皮腫、及び卵巣及び膵臓腺癌を含むいくつかのヒト腫瘍において過剰発現される４０ＫＤａのタンパク質である。ＲＯＲ−１は、神経突起伸長を調節する受容体チロシンキナーゼである。それは、細胞表面受容体のＲＯＲサブファミリーに属するＩ型膜タンパク質であり、そして現在、癌細胞の転移におけるその役割について研究中である。ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られているＣＤ３８（分化３８のクラスター）は、多くの免疫細胞の表面上に見出される糖タンパク質である。ＩＧＦ−１は、ソマトスタチンＣとも呼ばれるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）である。ＩＧＦ−１は、ヒトにおいて、ＩＧＦ１遺伝子によりコードされ、そして乳癌と関連するタンパク質である。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、ＨＩＶ感染を引起し、そして時間の経過と共に免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びカポジ肉腫を引起すレンチウィルス（レトロウィルスの亜群）である。
【００８５】
ＣＤ３−ＩＬ２−ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥはＴ細胞の増殖を選択的に促進する：
同じフランキング配列を有するＩＬ−１５の代わりにＩＬ−２と作用するＴｒｉＫＥは、合成されている。それらは、ＮＫ細胞よりもむしろＴ細胞の増殖を刺激する。Ｔ細胞指向ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭ（配列番号１３）が合成され、そしてＮＫ細胞よりもむしろＴ細胞を刺激するその能力について試験された（図２０）。ＩＬ−２は、ＩＬ−１５よりもＴ細胞増殖のより良好な刺激物質であることが知られている。ＰＢＭＣは、標識され、そして培養下に置かれたＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）であった。このヒストグラムは、ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭがＮＫ細胞ではなく、Ｔ細胞の強い増殖を促進することを示している。ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭは、１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ（陽性対照）、ＣＤ３ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、ＣＤ３−ＩＬ−２−ＥｐＣＡＭ、ＩＬ−２、又は無処置を含む、試験された他の何れの剤よりも良好な刺激を示した。それらのデータは、ＩＬ−２が、このプラットフォーム上で架橋剤として使用される場合、ＩＬ−１５と同じ様式で機能することを示唆する。
【００８６】
従って、本開示は、ＨＫ細胞と標的との間に免疫シナプスを創造できる三重特異的キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）の企画及び使用を記載する。ＣＤ３３＋骨髄標的は、モデルＮＫ係ドメインとしての抗ＣＤ１５抗体、ＣＤ３３＋骨髄標的を標的とするモデル標的ドメインとしての抗ＣＤ３３抗体、モデルＩＬ−１５ベースのＮＫ活性化ドメイン、及びＮＫ活性化ドメインを、残りのドメインに連結するＮＫ活性化ドメインの何れか側上のフランキング配列を含むモデルＴｒｉＫＥのためのモデル標的としても使用された。フランキング配列は、ＮＫ活性化ドメインの上流のＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ (配列番号3)、及びＮＫ活性化ドメインの下流のＥＡＳＧＧＰＥ (配列番号4)である。フランキング配列は、ＴｒｉＫＥ分子の機能的活性に影響を及ぼし、そして全く予想外の発現を示す。
【００８７】
１つの典型的なモデルＴｒｉＫＥ（１６１５３３、配列番号１）は、細胞毒性、ＣＤ１０７a 脱顆粒化、及びＨＬ−６０標的に対するＮＫ細胞媒介性応答のサイトカイン生成アッセイにおいて、匹敵する二重特異的キラーエンゲージャー（１６３３ＢｉＫＥ、配列番号２）に対して高められた機能を示した。生理学的状況における典型的なモデルＴｒｉＫＥの活性は、同種異系幹細胞移植後早期に収集された患者ＮＫ細胞を用いて評価され、この状況においては、ＮＫ細胞機能は欠損している。１６３３ＢｉＫＥと比較して、ＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメインを含むＴｒｉＫＥは、Ｔ細胞ではなく、ＮＫ細胞生存性及び増殖を誘発した。典型的モデルのＴｒｉＫＥ分子はまた、低反応性患者ＮＫ細胞を、原発性急性骨髄性白血病標的に対する強力な応答を媒介するよう誘発した。最後に、典型的なモデルＴｒｉＫＥ分子は、同等のＢｉＫＥ比較して、卓越した抗腫瘍活性を示し、そしてＨＬ−６０−Ｌｕｃ及びヒトＮＫ細胞を用いての異種モデルにおいて少なくとも３週間、ヒトＮＫ細胞のインビボ持続性を誘発した。
【００８８】
本明細書に提供されるデータは、典型的なＴｒｉＫＥ分子の有用性を確立し、そしてだい代替のＴｒｉＫＥ分子の企画及び構築のための基礎を提供する。上記に詳細に記載されたように、ＴｒｉＫＥ分子は、任意の適切なＮＫ係ドメイン及び／又は任意の適切な標的化ドメインを用いて企画され得る。
【００８９】
典型的な１６１５３３ＴｒｉＫＥ（配列番号１）が、ＣＤ１６はＮＫ細胞の表面上で発現されるので、モデルとして使用された。従って、ＮＫ細胞に選択的に結合するｓｃＦｖは、ＮＫ細胞係ドメインとして使用され得る。ＣＤ３３は、ＡＭＬ急性骨髄性白血病細胞（一般的な形の成人白血病）上に発現されるが、しかしまた、ＡＭＬへの素因を示す骨髄異形成細胞上にも見出される。従って、抗−ＣＤ３３ｓｃＦｖは標的化ドメインとして使用され得る。
【００９０】
しかしながら、別の実施形態によれば、抗−ＥｐＣＡＭ抗体は、ＴｒｉＫＥの標的ドメインに使用され得る。ＥｐＣＡＭは、例えば肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、ＧＩ癌、腎癌及び卵巣癌を含むほとんどの型の癌腫瘍に対して発現される上皮癌マーカーである。抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを含むＴｒｉＫＥ（１６１５ＥｐＣＡＭ、配列番号８）が結腸直腸癌細胞の死滅を増強することを示すデータは、任意の適切な標的化ドメイン（例えば、任意の適切なｓｃＦｖ）が類似する好結果を収めた抗ＣＤ１６／ＩＬ１５プラットフォームに基づいてＴｒｉＫＥに含まれ得ることを示す。１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥは、ＮＫ係ドメインとしての抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、及び標的化ドメインとしてのＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメイン及び抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む。
【００９１】
さらに別の代替の実施形態によれば、ＣＤ３８は、多発性骨髄腫細胞上で発現することが知られている。抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含むＴｒｉＫＥ（１６ａ１５３８、配列番号１６）がインビトロで多発性骨髄腫細胞の死滅を増強することを示すデータはさらに、ＴｒｉＫＥプラットフォームの一般的なモジュール性を示す。１６ａ１５３８ＴｒｉＫＥは、ＮＫ係ドメインとしてＣＤ１６ａ  ｓｃＦｖ、標的ドメインとしてＩＬ−１５ＮＫ活性化ドメイン及び抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。最終的に、第２の標的化ドメインを含むよう分子を企画することにより、ＴｅｔｒａＫＥ（テトラマー）を創造することができる。例えば、典型的なＴｅｒａＫＥ（１６１５ＥｐＣＡＭ１３３、配列番号９）を形成するために、例えば１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ（配列番号８）に抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（配列番号１７）を含むようＴｅｔｒａＫＥを企画することができる。ＣＤ１３３は、癌幹細胞上の確立されたマーカーである。癌幹細胞は、腫瘍の開始、再生及び化学療法耐性を担当する腫瘍中の幹細胞の小集団を示す。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＡＤＣＣを同時に媒介し、そしてＮＫエフェクター細胞拡張及び維持を誘発する自立シグナルを提供する免疫エンゲージャーを記載する。抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖにスプライシングされた抗ＣＤ１６ｓｃＦｖを含むＢｉＫＥは、ＮＫエフェクター細胞と、標的細胞のＡＤＣＣにおいて最高点に達する細胞毒性脱顆粒化をもたらしたＥｐＣＡＭ発現癌腫細胞との間の免疫シナプス形成を促進するが、細胞毒性活性及びＮＫ寿命の両者は、免疫エンゲージャーの部位でエフェクター細胞を直接的に増強する共刺激シグナルの付加により利益を得ることができる。いくつかの実施形態によれば、この共刺激シグナルは、ＮＫ細胞を拡張するために適した剤を添加することにより提供される。例えば、選択的ＮＫ拡張を促進するために、ＩＬ−１５ＥｐＣＡＭ１６ＢｉＫＥ中ｎｉ架橋された。実施例２に示されるように、免疫ンゲージャーへのＩＬ−１５の分子付加は、ＮＫ増殖を媒介し、持続的なＡＤＣＣ活性を生成し、そして免疫ンゲージャーの溶解性脱顆粒化及びサイトカイン分泌を改善することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞係は、動物ナノボディー由来のヒト化ＣＤ１６係の使用を含むことができる。ｓｃＦｖはＨ鎖可変成分及びリンカーにより結合されるＬ鎖可変成分を有するが、ナノボディーは単一のモノマー可変鎖、すなわち可変Ｈ鎖又は可変Ｌ鎖から成り、これは標的と特的に関与することできる。ナノボディーは、何れかの適切な動物、例えばラクダ科動物（例えば、ラマ又はラクダ）又は軟骨魚の抗体に由来することができる。ナノボディーは、より大きな抗体フラグメントに比較して、卓越した物理的安定性、深い溝を結合する能力、及び高められた生成収率を提供することができる。
【００９４】
１つの典型的な実施形態によれば、ナノボディーに基くＮＫ係分子は、ＥＦ９１と称する、公開されたラマナノボディー（GeneBank配列EF561291; Behar et al., 2008. Protein Eng Des Sel. 21(1):1-10）に由来するヒト化ＣＤ１６ナノボディーを含むことができる。ラマＥＦ９１は、ＮＫ細胞活性化を促進するこのＣＤ１６係の能力を試験するために、ＣＤ１９を含むＢｉＫＥに最初に構築された。それは、Ｒａｊｉ標的を用いてのクロム放出アッセイにおけるリツキシマブ媒介性死滅に類似する機能性を示した（図２２Ａ）。分子の機能性を確認すると、ＣＤＲが、現在ＣＤ１６係とも呼ばれる、ＣＤ１６係をヒト化するために、ヒト化ラクダスカフォールド（Vincke et al., 2009. J Biol Chem. 284(5):3273-3284）中にクローン化された。ＨｕＥＦ９１の結合が、図２２Ｂに示されており、そして標準ＣＤ１６ｓｃＦｖを用いて観察された結合と同等であり、このことは、ラマナノボディー可変Ｈ鎖を、ヒト化骨格に組込むことが分子の特異性を防げないことを示唆している。本明細書に記載されるＴｒｉＫＥ分子においてＮＫ係としてのＨｕＥＦ９１の使用は、薬物収率を高め、安定性を高める、そして／又はＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ効力を高めることができる。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される免疫エンゲイジャーは、腫瘍細胞を排除するために、患者自身の免疫系を刺激するために使用され得る。研究は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう遺伝子修飾されたＴ細胞が抗腫瘍活性の強力な臨床メディエーターであることを示すが、Ｔ−ＣＡＲの生成は高価で且つ複雑である。他の欠点は、サイトカイン毒性のリスク及び健康組織又は新生物形質転換との相互作用をもたらすＴ−ＣＡＲの長期持続性の危険性を含む。本明細書に記載されるように、三重特異的キラーエンゲイジャーは、ＡＤＣＣのメディエーターとして作用し、そして体外遺伝子修飾及び遺伝子治療を必要としないでＮＫ細胞を拡張でき、Ｔ−ＣＡＲシステムに対して潜在的利点を提供する。免疫エンゲイジャーは急速にクリアランスされるので、応答は無期限に持続され得ず、多分Ｔ−ＣＡＲに比較して、免疫エンゲイジャーのサイトカイン毒性のリスクを低める。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、三重特異的キラーエンゲージャーは、サイトカインを含む。いくつかの実施形態によれば、三重特異的キラーエンゲージャーは好ましくは、ＩＬ−１５を含む。ＩＬ−１５はＴｒｅｇｓを含まず、そしてＩＬ−１５はＮＫ細胞の調節因子である。ＩＬ−１５は、活性化及び細胞毒性の改善に加えて、ＮＫ細胞上の抗アポトーシス及び増殖シグナルを調節し、そして開始することができ、増強されたＮＫ細胞拡張及び生存性を導く。それらの特徴は、癌に対する治療における三重特異的キラーエンゲージャーの使用の間、有益であり得る。いくつかの実施形態によれば、三重特異的キラーエンゲージャーにおけるＩＬ−１５の包含は、ＮＫ／標的細胞シナプスへのＴｒｉＫＥの意図された送達を媒介し、全身性ＩＬ−１５よりもより効果的に腫瘍部位でのＩＬ−１５の蓄積を潜在的に引起すことができる。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、三重特異的キラーエンゲージャーは好ましくは、ＩＬ−１５、抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ及び抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ（１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ−１５は、抗ＣＤ１６ｓｃＦｖと抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖとの間で架橋剤として作用する。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、免疫エンゲージャーは、免疫細胞介在性サイトカインの分泌を高める。いくつかの実施形態によれば、サイトカイン分泌は好ましくは、抗原特異的である。いくつかの実施形態によれば、このサイトカインは、ＩＦＮ−γ、 ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８及び/又はＴＮＦ−αを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、このサイトカイン生成は好ましくは、生理学的レベルで存在する。いくつかの実施形態によれば、このサイトカイン生成は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８刺激されたＮＫ細胞において観察されるレベルよりも低いレベルで存在する（Papadakis et al., 2004. J Immunol. 172:7002-7007）。実施例２に示されるように、サイトカインＬｕｍｉｎｅｘ分析を用いてのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αを含む顕著な炎症性サイトカインの測定は、ＢｉＫＥとＴｒｉＫＥとの間のＧＭ−ＣＳＦ分泌の統計学的有意差を示すが、しかし他のサイトカインの分泌のいては差を示さない。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、免疫エンゲージャーは、リンパ球の増殖を高める。リンパ球は例えば、ＮＫ細胞、γδ−Ｔ細胞 及び/又は ＣＤ８ Ｔ細胞を含むことができる。
【０１００】
１６１５ＥｐＣＡＭ１３３ＴｅｔｒａＫＥ分子が２つ以上の標的ドメインを含むので、２以上のＮＫ細胞係ドメイン及び／又は２つ以上のＮＫ活性ドメインを含む、ＴｅｔｒａＫＥ又は大きな分子を企画することができる。
【０１０１】
別の側面によれば、本開示は、対象における標的細胞の死滅化方法を記載している。一般的に、この方法は、標的明細のＮＫ媒介性死滅を誘発するのに有効な量のＴｒｉＫＥ分子を対象に投与することを含む。「治療する（ｔｒｅａｔ）」又はその変形は、状態に関連する症状又は徴候を、何れかの程度、低め、限定進行し、改善し又は解決することを示す。本明細書において使用される場合、「改善する(ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ)」とは、特定の状態に特徴的な症状又は臨床学的徴候の程度、重症度、頻度及び／又は傾向の任意の減少を示し；「症状（sympton）」とは、疾患又は患者の状態の任意の主観的証拠を示し；そして［徴候（sign）］又は「臨床学的徴候（clinical sign）とは、患者以外の患者により見出され得る特定の状態に関する客観的身体的所見を言及する。
【０１０２】
「治療（treatment）」とは、治療的又は予防的であり得る。「治療的（Therapeutic）」及びその変形は、状態に関連する１又は２以上の既存の症状又は臨床学的徴候を改善する治療を言及する。「予防的（Prophylactic）」及びその変形は、状態の症状又は臨床学的徴候の発症及び／又は出現を、ある程度、制限する治療を言及する。一般的に「治療的」処置は、対象における状態の出現の後、開始されるが、ところが「予防的」処置は、対象における出現の前、開始される。従って、特定の実施形態によれば、前記方法は、状態を発症する危険のある対象の予防的治療を含むことができる。「危険のある（at risk）」とは、記載された危険性を実際に有していても良く、又は有さなくても良い。従って、例えば、特定の状態を発症する「危険のある」対象は、対象が状態を有するか又は発症している任意の症状又は臨床学的徴候を発症しているかどうかに係わらず、１又は２以上の印を欠いている個人に比較して、特定の状態を有するか又は発症する、高められた危険性の１又は２以上の印を有する対象である。状態の典型的な印は例えば、以下を含むことができる：遺伝的素因、祖先、年齢、性別、地理的位置、生活習慣、又は病歴。治療は、再発を予防し、又は遅延するために、症状が改善した後も続けられ得る。
【０１０３】
場合によっては、治療は、ＴｒｉＫＥ分子がインビボで内因性ＮＫ細胞を刺激できるように、ＴｒｉＫＥ分子を対象に投与することを含むことができる。インビボの一部としてのＴｒｉＫＥ分子の使用は、抗原特異的であり得る、同時共刺激、生存性の増強及び拡張を伴ってＮＫ細胞抗原特異的にすることができる。他の場合、ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞養子移入療法へのアジュバントとしてインビトロで使用され得る。
【０１０４】
別の側面によれば、ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞よりもむしろＴ細胞を活性化するよう企画され得る。この側面によれば、ＴｒｉＫＥは一般的に、１又は２以上のＴ細胞係ドメイン、１又は２以上のＴ細胞活性化ドメイン、及び１又は２以上の標的化ドメイン（例えば、腫瘍細胞又はウィルス感染された細胞を標的とする）、並びに１又は２以上のＴ細胞活性化ドメイン（例えば、ＩＬ−２又は他のＴ細胞増強サイトカイン、ケモカイン及び／又は活性化分子）を含むことができ、ここで各ドメインは他のドメインに操作可能的に連結されている。
【０１０５】
Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞に結合し、そして／又はそれを活性化する任意の部分、及び／又はＴ細胞の阻害をブロックする任意の部分を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞の表面の成分に選択的に結合する抗体又はそのフラグメントを含むことができる。他の実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞の表面の成分に選択的に結合するリガント又は小分子を含むことができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞の表面に少なくとも部分的に位置する受容体に選択的に結合することができる。特定の実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞を結合する機能を果たし得、そしてそれにより、Ｔ細胞を、以下でより詳細に記載される標的化ドメインが選択的に結合する標的と空間的に近接させる。しかしながら、特定の実施形態によれば、Ｔ細胞係ドメインは、Ｔ細胞を活性化し、そして従ってまた、活性化機能を有する受容体に選択的に結合することができる。
【０１０７】
Ｔ細胞係ドメインが抗ＣＤ３受容体ｓｃＦｖを含む種々の実施形態において本明細書に記載されるが、Ｔ細胞係ドメインは、ＣＤ３受容体に選択的に結合する任意の抗体又は他のリガンドも含むことができる。さらに、Ｔ細胞係ドメインは、任意のＴ細胞受容体に選択的に結合する抗体又はリガンド、例えば以下を含むことができる：抗−ＣＤ４抗体、抗−ＣＤ８抗体、抗−ＬＦＡ−１抗体、抗−ＬＦＡ−２抗体、抗−ＣＴＬＡ４抗体、抗−ＴＣＲ抗体、抗−ＣＤ２８抗体、抗−ＣＤ２５抗体、抗−ＰＤ１抗体、ＰＤ−１Ｌ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＭＨＣ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ、抗−ＳＬＡＭ抗体、又は抗−ＢＴＬＡ抗体。
【０１０８】
標的化ドメインは、任意の意図された標的、例えば腫瘍細胞、癌間質における標的、阻害細胞、例えばＣＤ３３＋である骨髄由来のサプレッサー細胞上の標的、又はウィルス感染された細胞上の標的に選択的に結合する任意の部分を含むことができる。従って、標的化ドメインは、例えばＮＫ活性化ＴｒｉＫＥ分子において上記の標的化ドメインの何れか１つを含むことができる。
【０１０９】
Ｔ細胞活性化ドメインは、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞の維持を促進し、又はそうでなければ、Ｔ細胞活性を促進するアミノ酸配列を含むことができる。Ｔ細胞活性化ドメインは、Ｔ細胞を活性化し、そして／又は維持することができる１又は２以上のサイトカインであり得るか、又はそれに由来することができる。本明細書において使用される場合、用語［〜に由来する（derived from）］とは、Ｔ細胞活性化及び／又は維持活性を提供するのに十分であるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）のアミノ酸フラグメントを言及する。２つ以上のＴ活性化ドメインを含む実施形態によれば、Ｔ活性化ドメインは、直列に又は任意に他の組合せで提供され得る。さらに、各サイトカインに基くＴ活性化ドメインは、ＴｒｉＫＥ分子に含まれる他のＴ細胞活性化ドメインの性質に無関係に、サイトカインの完全アミノ酸を含むことができるか、又はアミノ酸フラグメントであり得る。Ｔ細胞活性化ドメインが基くことができる典型的なサイトカインは、例えばＩＬ−２、又はＩＬ−２受容体と鎖を共有するＩＬ−２ファミリーの任意のサイトカイン、例えばＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−２１及びＩＬ−１３を含む。従って、Ｔ細胞活性化ドメインがＩＬ−２に由来する典型的なモデルの実施形態に関連して本明細書に詳細に記載されているが、ＴｒｉＫＥは、任意の適切なサイトカインであるか、又はそれに由来するＴ細胞活性化ドメインを用いて企画され得る。
【０１１０】
この説明を簡単にするために、それが基づかれているサイトカインを同定することによるＴ細胞活性化ドメインへの言及は、サイトカインの完全なアミノ酸配列及びサイトカインの任意の適切なアミノ酸フラグメントの両者を含む。従って、「ＩＬ−２」Ｔ細胞活性化ドメインへの言及は、ＩＬ−２の完全アミノ酸配列を含むＴ細胞活性化ドメイン、又はＩＬ−２のフラグメントを含むＴ細胞活性化ドメインを含む。従って、いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞活性化ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１１】
別の側面によれば、本開示は、対象における標的細胞を死滅する方法を記載する。一般的に、その方法は、標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘発する有効な量でＴｒｉＫＥ分子を対象に投与することを含む。ここでまた、治療は、ＮＫ活性化ＴｒｉＫＥの使用を包含する方法において上記のような治療的又は予防的であり得る。
【０１１２】
従って、ＴｒｉＫＥ分子（ＮＫ活性化ＴｒｉＫＥ又はＴ細胞活性化ＴｒｉＫＥの何れであろうと）は、対象が状態の症状又は臨床学的徴候を最初に示す前、その間、又はその後、投与され得る。対象が状態に関連する症状又は臨床学的徴候を最初に示す前に開始される治療は、ＴｒｉＫＥ分子が投与されていない対象に比較して、対象が状態の臨床学的証拠を経験する可能性の低下、状態の症状及び／又は臨床学的徴候の重症度の低下、及び／又は状態の完全な解決をもたらすことができる。対象が状態に関連する症状又は臨床学的徴候を最初に示した後、開始される治療は、組成物が投与されていない対象に比較して、状態の症状及び／又は臨床学的徴候の重症度の低下、及び／又は状態の完全な解決をもたらすことができる。
【０１１３】
ＴｒｉＫＥ分子は、適切な標的細胞集団に選択的に結合する標的化ドメインを有する、上記ＴｒｉＫＥ分子の任意の実施形態であり得る。場合によっては、標的細胞は、腫瘍細胞を含むことができ、結果的に、この方法は、腫瘍細胞に関連する癌の治療を包含することができる。従って、いくつかの実施形態によれば、この方法は、腫瘍の少なくとも１つの症状又は臨床学的徴候を改善することを含むことができる。
【０１１４】
標的細胞が腫瘍細胞を含む実施形態によれば、その方法はさらに、腫瘍を外科的に切除し、そして／又は化学（例えば、化学療法）及び／又は放射線治療を介して腫瘍のサイズを縮小することを包含することができる。治療され得る典型的な腫瘍は、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、子宮頸癌、卵巣癌、又は造血癌に関連する腫瘍を含む。
【０１１５】
種々の実施形態によれば、ＴｒｉＫＥ標的化ドメインは、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２/ｎｅｕ ＥｐＣＡＭ、ＣＳＰＧ４、ＨＳＰＧ２、ＩＧＦ−１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＲＯＲ−１、ＵＰＡＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＬＩＶ−１、ＳＧＮ−ＣＤ７０Ａ、ＣＤ７０、ＩＬ−３、ＩＬ−４Ｒ、ＣＤ１３３、 メソセリン、上皮間葉移行（ＥＭＴ）、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３８、 ＣＤ４５、 ＣＤ７４、ＣＤ２３、又はＨＩＶなどの癌ウイルスマーカーに選択的に結合するポリペプチドを含むことができる。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「対象（subject）」とは、任意の動物、例えば哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サルなど）であり得る。特定の実施形態によれば、対象はヒトであり得る。
【０１１７】
本明細書に記載されるＴｒｉＫＥ分子は、医薬的に許容できる担体と共に処方され得る。本明細書において使用される場合、「担体（carrier）」とは、任意の溶媒、分散媒、ビークル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、及び/又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド、及び同様のものを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体及び／又は剤の使用は、当業界において周知である。任意の従来の媒体成分もまた、組成物に組込まれ得る。本明細書において使用される場合、「医薬的に許容できる（pharmaceutically acceptable）」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものでない物質を言及し、すなわち、その物質は、何れか望ましくない生物学的効果を引起すことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の任意の他の成分と、有害な態様で相互作用することなく、ＴｒｉＫＥ分子と共に個人に投与され得る。
【０１１８】
従って、ＴｒｉＫＥ分子は、医薬組成物中に処方され得る。医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した種々の形で製剤化され得る。従って、組成物は、例えば経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、又は局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む既知の経路を介して投与され得る。組成物はまた、持続又は遅延放出を介しても投与され得る。
【０１１９】
従って、ＴｒｉＫＥ分子は、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル又は任意の形の混合物（但し、それらだけには制限されない）を含む任意の適切な形で提供され得る。組成物は、任意の医薬的に許容できる賦形剤、担体又はビークルを含む製剤で送達され得る。例えば、製剤は、例えば、従来の局所剤形、例えばクリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローション等で送達され得る。製剤はさらに、１又は２以上の添加剤、例えばアジュバント、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、風味剤、モイスチャライザー、増粘剤、などを含むことができる。
【０１２０】
製剤は、単位投薬形で便利に提供され得、そして薬学の分野で周知の方法により調製され得る。医薬的に許容される担体を有する組成物の調製方法は、ＴｒｉＫＥ分子を、１又は２以上の付属成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又は両者と活性分子とを、均等に及び／又は緊密に会合され、そして次に、必要な場合、所望する製剤に生成物を成形する工程を包含する。
【０１２１】
投与されるＴｒｉＫＥ分子の量は、使用される特定のＴｒｉＫＥ分子、対象の体重、身体状態及び／又は年齢、及び／又は投与経路（但し、それらだけには制限されない）を含む種々の要因に依存して変化することができる。従って、所定の単位投薬形で含まれるＴｒｉＫＥ分子の絶対重量は、広く変化することができ、そして対象の種、年齢、体重及び体調、及び／又は投与方法などの要因に依存する。従って、全ての可能な用途のために有効なＴｒｉＫＥ分子の量を構成する量を、一般的に示すことは現実的ではない。しかしながら、当業者は、そのような要因を考慮して適切な量を容易に決定することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、対象に約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含むことができるが、いくつかの実施形態によれば、この方法法は、ＴｒｉＫＥ分子を、この範囲外の用量で投与することより実施され得る。それらの実施形態のいくつかによれば、この方法は、対象に、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含む。
【０１２３】
他方では、用量は、治療経過の開始直前に得られた実際の体重を用いて計算され得る。このようにして計算された投薬量に関して、体表面積（ｍ２）は、Ｄｕｂｏｉｓ法を用いて治療経過の開始前に計算される：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×高さｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、例えば約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の用量を提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含むことができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、ＴｒｉＫＥ分子は、例えば週１回の用量〜複数回の用量で投与され得るが、いくつかの実施形態によれば、その方法は、この範囲外の頻度でＴｒｉＫＥ分子を投与することにより実施され得る。特定の実施形態によれば、ＴｒｉＫＥ分子は、月に約１回〜週に約５回、投与され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、１又は２以上の追加の治療剤を投与することを含む。それらの１又は２以上の追加の治療剤は、ＴｒｉＫＥ分子の投与前、後、及び／又は同時に投与され得る。ＴｒｉＫＥ分子及び追加の治療剤は同時投与され得る。本明細書において使用される場合、「同時投与される（co-administered）」とは、投与される組合せの複数成分を言及し、結果的に、その組合せの治療又は予防効果が、単独で投与されるいずれかの成分の治療又は予防効果よりも大きくなる。２つの成分は、同時又は連続的に共投与され得る。同時に共投与される成分は、１又は２以上の医薬組成物に提供され得る。複数の成分の連続的共投与は、各成分が治療部位で同時に存在するよう、成分が投与される場合を含む。他方では、２つの成分の連続的共投与は、少なくとも１つの成分が、治療部位からクリアランスされるが、しかし成分を投与する少なくとも１つの細胞効果（例えば、サイトカイン生成、特定細胞集団の活性化、等）が、１又は２以上の追加の成分が治療部位で持続する場合を含むことができる。従って、共投与される組合せは、特定の状況において、互いに化学的混合物に決して存在しない成分を含むことができる。他の実施形態によれば、ＴｒｉＫＥ分子及び追加の治療剤は、混合物又はカクテルの一部として投与され得る。いくつかの側面によれば、ＴｒｉＫＥ分子の投与は、他の治療剤又は剤単独の投与に比較した場合、より低い用量の他の治療様式の有効性を可能にし、それにより、より高い用量の他の治療剤が投与される場合に観察される毒性の可能性、重症度及び／又は程度を低める。
【０１２７】
典型的な追加の治療剤は、以下を含む：アルテレタミン、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、コラスパーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シトホスファイン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テンポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、本明細書に記載されるような十分なＴｒｉＫＥ分子を投与し、そして少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを含み、そして治療上の相乗作用を実証することができる。本発明の方法のいくつかの側面によれば、本明細書に記載のようなＴｒｉＫＥ分子及び追加の治療剤の両者の投与の後に観察される治療に対する応答の測定値は、ＴｒｉＫＥ分子又は追加の治療剤の何れかを単独で投与した後に観察される治療に対する応答の同じ測定値よりも改善される。いくつかの実施形態によれば、追加の治療剤は、例えばＥｐＣＡＭ特異的モノクローナル抗体、例えば、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３を標的とするモノクローナルハイブリッド抗体のカツマキソマブ（Catumaxomab）を標的とする追加の剤を含むことができる。
【０１２９】
前述の記載及び続く特許請求の範囲において、用語「及び／又は」とは、列挙された要素の１つ又はすべて、又は列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味し；用語「含む（coprises）」、「含む（comprising）」及びそれらの変形は、オープンエンド（open ended）として解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素及び工程は任意であり、そして存在してもなくても良く：特にことわらない限り、「a」「an」、「the」及び「少なくとも（at least one）」は、交換可能的に使用され、そして１つ又は１つ以上を意味し；そして端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、等を含む）。
【０１３０】
前述の説明においては、特定の実施形態が、明確にするために独立して記載され得る。特定の実施形態の特徴が別実験形態の特徴と互換性がないことが特に記載されない限り、特定の実施形態は、１又は２以上の実施形態に関連して本明細書に記載される相互性のある特徴の組合せを含むことができる。
【０１３１】
離散的工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、その工程は任意の実行可能な順序で実行され得る。そして、適切な場合、２つ以上の工程の任意の組合せが同時に行われ得る。
【０１３２】
本発明は、以下の実施例により説明される。特定の実施例、材料、量及び手順は、本明細書に記載される本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１３３】
実施例１
細胞単離、患者及びサンプル：
年齢が一致する正常なドナーからのＰＢＭＣを、Histopaque勾配（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いての遠心分離により、Memorial Blood Center (Minneapolis, MN)から得られた成人血液から単離し、そして凍結保存した。移植後の患者サンプル研究のために、免疫再構成組織バンクからの適合した兄弟ドナー同種造血細胞移植サンプルを使用した。受容体ＰＢＭＣを、移植後１００日目（ｎ＝５）又はそれ以前（２０−４４日目）（ｎ＝５）のいずれかで採取し、そして後での使用のために、凍結保存した。すべてのサンプルを、インフォームドコンセントの後、ヘルシンキ宣言に従って、ミネソタ大学の研究におけるヒト対象に関する委員会（Committee on the use of Human Subjects in Research）により承認されたガイドラインを用いて得た。
【０１３４】
細胞系：
ＨＬ−６０、すなわちＣＤ３３＋ヒト急性前骨髄球性白血病細胞系（ATCC, Manassas, VA）を、２０％ＦＢＳ（Gibro-Invitrogen）、１０００／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）により補充されたＩｓｃｏｖｅ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）において、３７℃で、５％ＣＯ２下で培養した。対照のヒト結腸直腸癌細胞系ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンにより補充された高グルコース（Invitrogen, Carlsbad, CA）ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃で５％ＣＯ２下で培養した。
【０１３５】
ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥの構築、発現及び精製：
１６１５３３（配列番号１）をコードするハイブリッドポリヌクレオチドを、ＤＮＡシャフリング及びＤＮＡ連結技法（Vallera et al., 2013 Cancer Biother Radiopharm 4:274-482; Vallera et al., 2009. Leuk Res 33(9):1233-1242）を用いて合成した。各ｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨのためのコード領域を、Ｇ４Ｓリンカーをコードするフラグメントにより連結した。その最終的な構成においては、１６１５３３ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩポリヌクレオチドは、開始コドン、続いて以下のためのコード領域を有する：最初に、抗ヒトＤ１６ｓｃＦｖ（McCall et al., 1999. Mol Immunol. 7:433-445）、２０個のアミノ酸のフランキングポリペップチド（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ;配列番号３）、ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、７個のアミノ酸のフランキングポリペプチド（ＥＡＳＧＧＰＥ; 配列番号４）及び次に、抗−ＣＤ３３ｓｃＦｖ。ポリヌクレオチドを、ｐＥＴ２８ｃ発現ベクターにスプライシングし、そして封入体を発現した。ＤＮＡ配列決定分析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota）を用いて、ポリヌクレオチドが配列において正しく、そしてフレーム内にクローン化されたことを確認した。
【０１３６】
同じ成分を用いて、１６３３１５（配列番号７）をコードするハイブリッドポリヌクレオチドを構築し、但し成分の順序はＣＤ１６ｓｃＦｖ、フランキングポリペップチドＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ (配列番号３)、抗−ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、フランキングポリペップチドＥＡＳＧＧＰＥ (配列番号４)、次にヒトＩＬ−１５であることを除く。
【０１３７】
プラスミドを用いて、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）(EMD, Madison WI)を形質転換した。細菌を、２Ｌのフラスコ中、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンにより補充された６００ｍｌのＬｕｒｉａブイヨンにおいて、３７℃で振盪下で増殖した。ハイブリッドポリヌクレオチドの発現を、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ, FisherBiotech Fair Lawn, NJ）の添加により誘発した。誘発に２時間後、細菌を遠心分離により収穫した。細胞ペレットを、ポリトロンホモナイザーを用いて懸濁し、そして均質化した。音波処理及び遠心分離の後、ペレットを、０．３％デオキシコール酸ナトリウム、５％トリトンＸ−１００、１０％グリセリン、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭ のＮａＣｌ、５ｍＭの ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０により抽出し、そして封入体を、広範囲に洗浄し、エンドトキシンを除去した。
【０１３８】
タンパク質を、ｓｃＦｖを単離するための前に報告された手順（Vallera et al., 2005. Leuk Res 29(3):331-341）から改変されたナトリウムＮ−ラウロイル−サルコシン（ＳＬＳ）空気酸化方法を用いてリフォールディングした。リフォールディングされた１６１５３３を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中、０．２Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの段階的勾配を用いてＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィー（Q Sepharose Fast Flow, Sigma, St. Louis, MO）により、４カラム体積にわたって精製した。
【０１３９】
フローサイトメトリー：
細胞を、以下に対する蛍光標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により免疫表現型分析した：ＰＥ−Ｃｙ７接合ＣＤ５６（ＨＣＤ５６; BioLegend、Inc.、San Diego、CA）、Ｄ / ＰＥ−ＣＦ５９４接合ＣＤ３（ＵＣＨＴ１; Beckman Coulter、Brea、CA）、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合ＣＤ１６（３Ｇ８; BioLegend、Inc.）、Pacific Blue-接合 ＣＤ４５（ＨＩ３０; BioLegend、Inc.）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ / ＦＩＴＣ接合抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）（Ｈ４Ａ３; BioLegend、Inc.）、Pacific Blue / ＢＶ４２１接合抗ヒトＩＦＮ−γ（４Ｓ.Ｂ３; BioLegend、Inc.）、ＦＩＴＣ / Alexa Fluor ６４接合ＴＮＦ−α（ＭＡｂ１１; BioLegend、Inc.）、ＦＩＴＣ/ＰＥ−接合ＣＤ３３ （Ｐ６７．６; BD Biosciences)、及びＡＰＣ−接合 ＣＤ４５ (ＨＩ３０; BioLegend, Inc.)、ＦＩＴＣ−接合ＥｐＣＡＭ; (BioLegend, Inc.)。細胞の表現型獲得はＬＳＲＩＩ (BD Biosciences)上で行い、そしてFlowJo ソフトウェア (Tree Star Inc., Ashland, OR)により分析した。
【０１４０】
ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ/ＴＮＦα機能的フローアッセイ：
移植後の患者のＰＢＭＣ又は原発性ＡＭＬ芽球を融解し、そしてＲＰＭＩ−１０に一晩、置いた。翌晩、ＰＢＭＣを、５０ｎＭの１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥと共にインキュベートした。翌朝、細胞を洗浄し、そして別のラウンドの５０ｎＭの１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥを添加し、分子内在化の可能性のある問題に対処した。ＨＬ−６０標的又は原発性ＡＭＬ芽球を、直ちに添加し、５：１のエフェクター：標的比を生成した。ＰＢＭＣ、ＨＬ−６０標的又は原発性ＡＭＬ芽球、及びＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ分子を４時間、共培養し、そしてＣＤ１０７ａ発現及び細胞内ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α生成を、前に記載されたようにして評価した（Vallera et al., 2013 Cancer Biother Radiopharm 4:274-282）。
【０１４１】
増殖アッセイ：
移植後の患者（１００日目又はそれ以前（２０−４４日目））からのＰＢＭＣを、製造業者のプロトコルに従って、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥバイオレット細胞増殖色素(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)により標識し、５：１（Ｅ：Ｔ）比でのＨＬ−６０標的細胞を含む培養培地に置き、そして５０ｎＭの１６３３ＢｉＫＥ又は１６１５３３ＴｒｉＫＥにより処理された。次に、細胞を７日目後に収穫し、そしてＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）集団における、生存／死滅染色を介しての生存率、及びＣＥＬＬＴＲＡＣＥの希釈を介しての増殖について分析した。
【０１４２】
５１−クロム放出細胞毒性アッセイ：
細胞毒性を、４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイにより評価した。手短に言及すると、１６３３ＢｉＫＥ（１０μｇ／ｍｌ）、ｓｃＦｖＣＤ１６対照試薬（１０μｇ／ｍｌ）、又は無試薬により処置された正常ドナーからの休止ＰＢＭＣを、種々のＥ：Ｔ比で、５１Ｃｒ−標識された又はＨＬ−６０標識と共に４時間、共培養した。移植後の研究のために、ＰＢＭＣ細胞を、５０ｎＭの１６３３ＢｉＫＥ又は５０ｎＭの１６１５３３ＴｒｉＫＥの存在下で２０：１（Ｅ：Ｔ）比でのＨＬ−６０標的と共に共培養した。５１Ｃｒ放出を、ガンマシンチレーションカウンター（Perkin Elmer, Walthman, MA）により測定し、そして特異的標的溶解を測定した（Vallera et al., 2013. Cancer Biother Radiopharm 4:274-282）。
【０１４３】
インビボマウス研究及びイメージング：
ＮＳＧマウス（ｎ＝５／グループ）を、２７５ｃＧＹによりコンディショニングし、そして腫瘍浸潤性のために継代培養された、０．７５×１０５個のＨｌ−６０−ｌｕｃＳ４をＩＶ注射した。薬物処置は、３日目で開始した。１回の治療コースは、１週間毎日投与される２０μｇの薬物（ＭＴＷＴｈＦ）の腹腔内（ＩＰ）注射から成り、そしてマウスは３週間治療された。対照グループはＮＫ細胞を受けなかったが、１６３３ＢｉＫＥ及び１６１５３３ＴｒｉＫＥグループは、ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞の注射の３日後、ＣＤ３／ＣＤ１９磁気枯渇生成物から計算して、１×１０６個の細胞を受けた。ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞は、それらの生物発光活性を測定し、そして前に記載されたように癌白血病の進行をモニターするために、毎週のマウスのイメージングを可能にするルシフェラーゼレポーターを含む（Waldron et al., 2011. Mol Cancer Ther 10(10):1829-1838.）。簡単に説明すると、イメージングの１０分前、マウスに３０ｍｇ／ｍｌのルシフェリン基質１００μｌを注射し、そしてイソフルランガスの吸入により麻酔した。次に、マウスを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｖｉｓ１００イメージングシステムを用いてイメージングし、そしてLiving Image ２．５ソフトウェア(Xenogen Corporation, Hopkington MA)により分析した。２０日目、すべての動物から採血し、そして２０分間の暴露を行い、そして目的の領域（ＲＯＩ）についての単位を、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして表した。血液を、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の存在についてフローサイトメトリーにより分析した。第２の実験を、データの再現性を検証するために実施した。
【０１４４】
統計学的分析：
グループ化されたデータは、平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）として表された。２つのグループ間の差異を、スチューデントｔ検定により分析した。複数の比較は、ＴｕＫｅｙ補正を用いてペアーワン−ウェイＡＮＯＶＡにより分析された。分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより行われた。
【０１４５】
実施例２
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥの構築：
１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ（配列番号８）をコードするハイブリッドポリヌクレオチドの合成及びアセンブリーを、ＤＮＡシャフリング及び連結技法を用いて達成した。完全にアセンブルされた１６１5ＥｐＣＡＭポリヌクレオチドは、５′末端から３′末端まで、以下を有する：ＮｃｏＩ  制限部位；ＡＴＧ開始コドン；McCall et al. (Mol Immunol., 1999, 36:433-445)により生成されたファージディプレーライブラリー由来のヒトＣＤ１６（ＮＭ３Ｅ２）のＶＨ及びＶＬ領域、２０個のアミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ；配列番号３）、修飾ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、７個のアミノ酸リンカー（ＥＡＳＧＧＰＥ；配列番号４）、及び抗体ＭＯＣ−３１からのヒト化抗−ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖをコードするコード領域；及びＸｈｏＩ制限部位。得られる１９１４ｂｐのＮｃｏＩ／Ｘｈｏｌポリヌクレオチドを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発性Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ２１発現ベクターにスプライシングした。ＤＮＡ配列決定分析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota, MN, USA）を用いて、ポリヌクレオチドが配列的に正しく、そしてフレーム内にクローン化されたことを確認した。この研究に使用される他のコンストラクトを、単一特異的抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖ及び抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖのためのコード領域を含むが、類似する方法で創造した。
【０１４６】
封入体単離：
細菌タンパク質発現を、プラスミド形成転換により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen, Madison, WI, USA）を用いて行った。一晩の培養の後、細菌を、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含む８００ｍｌのＬｕｒｉａブイヨンにおいて増強した。培養培地がＩＰＴＧ（FischerBiotech, Fair Lawn, NJ, USA）の添加により０．６５の光学密度（ＯＤ）６００に達した場合、遺伝子発現の誘発が起こった。誘発の２時間後、細菌を収穫した（５Ｌの培養された培地から、４３ｇの細菌ペレットを単離した）。次に、ペレットを、緩衝溶液（５０ｍＭのトリス、５０ｍＭの ＮａＣｌ及び ５ｍＭのＥＤＴＡ 、ｐＨ ８．０）において均質化し、音波処理し、そして遠心分離した。ペレットを、０．３％デオキシコール酸ナトリウム、５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％グリセリン、５０ｍｍｏｌ / Ｌのトリス、５０ｍｍｏｌ / Ｌの ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ / Ｌの ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）により抽出し、そして洗浄した（最終ペレット重量：１２．５）。
【０１４７】
リフォールディング及び精製：
リフォールディング及び精製を、前に記載のようにして実施した（Schmohl et al., 2016. Target Oncol. 11(3):353-361）。手短に言及すれば、リフォールディングするために、封入体からのタンパク質を、可溶化緩衝液（７ Ｍの グアニジン塩酸塩、５０  ｍＭ のトリス、５０ｍＭの ＮａＣｌ、 ５ｍＭの ＥＤＴＡ及び５０ｍＭのＤＴＴ、 ｐＨ ８．０）中に２０：１（ｍｇ湿重量／ｍｌ）で溶解した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、ペレットを遠心分離により除いた。上清液を、リフォールディング緩衝液（５０ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ のＮａＣｌ、０．８ｍＭ のＬ−アルギニン、２０％グリセリン、５ｍＭ のＥＤＴＡ及び１ｍＭの ＧＳＳＧ、ｐＨ ８．０）により、４℃で２日間、希釈した。緩衝液を、４カラム体積にわたって、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に対する１０倍透析により除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、純度を評価した。融合タンパク質を、Simply Blue life Stain (Invitrogen, Carlsbad, CA)により染色した。ＴｒｉＫＥのサイズは、約６８８６０Ｄａであった。
【０１４８】
ＮＫ細胞の単離及び精製：
ヒストパーク勾配（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）及びＳＥＰＭＡＴＥ管（Stemcell Technologies, Inc., Vancouver, Canada）を用いて、健康なボランティアの成人血液Memorial Blood Center, Minneapolis, MN, USA）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、そして製造業者のプロトコール（Stemcell Technologies, Inc., Vancouver, Canada）に従って磁気ビーズを用いて負の選択を介しての富化されたＮＫ細胞を得た。インフォームドコンセントの後、及びミネソタ大学の人体組織検査委員会及びヘルシンキ宣言に従って、サンプルを入手した。
【０１４９】
組織培養：
以下の細胞系を、American Type Culture Collectionから入手した：乳癌細胞株BT-474、SK-BR-3; 前立腺癌細胞株PC-3、DU145; 頭頸部癌細胞株MSCC-11B、NA; 卵巣癌細胞株SKOV-1; 結腸癌細胞株HT-29; 肺癌細胞株Calu-3; Burkittsリンパ腫細胞株Daudi; 急性骨髄性白血病細胞株HL-60; ヒトグリア芽腫細胞株U87。癌腫及びグリア芽腫細胞系を、組織フラスコを用いて単層で増殖し（Fogh et al., 1977. J Natl Cancer Inst 59:221-226）、ＨＬ−６０Ａ及びＤａｕｄｉ細胞系（Klein et al., 1968. Cancer Res 28:1300-1310）を、懸濁培養した。細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍモル／ＬのＬ−グルタミンにより補充された、ＲＰＭＩ １６４０ （ＢＴ−４７４、 ＳＫ−ＢＲ−３、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＨＴ−２９、Ｄａｕｄｉ、ＨＬ６０、Ｃａｌｕ−３)又はＤＭＥＭ（ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ、ＮＡ、ＳＫ−ＯＶ−３、Ｕ８７）の何れかに維持した。前述のサプリメントに加えて、ＢＴ−４７４培地は、１０ＩＵ／ｍｌのインスリンを含んだ、細胞を、５％ＣＯ２を含む、加湿された一定の３７℃の雰囲気下でインキュベートした。細胞が９０％集密性になると、それらを、剥離のためにトリプシン−ＥＤＴＡを用いて継代した。標準赤血球計を用いて、細胞数を測定した。トリパンブルー排除により決定される場合、９５％以上の生存率を有する細胞のみを、実験のために使用した。
【０１５０】
結合／ブロッキングアッセイ：
結合を評価するために、４×１０５個のそれぞれの癌細胞（ＢＴ−４７４、ＰＣ−３、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ、Ｃａｌｕ−３、Ｄａｕｄｉ、Ｕ８７）を洗浄し、そして１０ｎＭのフルオレセインイソチオシアネーチ（ＦＩＴＣ）標識抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖと共に４℃で３０分間インキュベートした。ブロッキングアッセイのために、２００ｎＭのＦＩＴＣ標識１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥを、５００ｎＭの抗−ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｃ又は抗−ＣＤ２２−ＣＤ１９  ｓｃＦｖコンストラクトの何れかに添加し、そしてＨＴ−２９結腸癌細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄の後、染色強度を、ＬＳＲＩＩフローサイトメトリー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）により評価した。
【０１５１】
ＣＤ１０７ａ脱顆粒化アッセイ：
ＣＤ１０７ａ発現及びＩＦＮ−γ存在による細胞溶解性脱顆粒化を測定するフローサイトメトリーアッセイを、以前に報告されているようにして実施した（Gleason et al., 2012. Mol Cancer Ther 11:2674-2684）。ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎児血清、及び１０７ng／ｍｌの組換えＩＬ−１２（PeproTech, Rocky Hill, NJ）及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA）により補充されたＲＰＭＩ１６４０において、陽性対照として、一晩（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベートした。細胞を、１×ＰＢＳにより洗浄し、３０ｎＭの１６１５ＥｐＣＡＭ  ＴｒｉＫＥ又は他の薬物により処理し、そして３７℃で、５％ＣＯ２下で１０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ接合抗−ヒトＣＤ１０７ａモノクローナル抗体(ｍＡｂ) （ＬＡＭＰ−１) (BD Biosciences, San Jose, CA)を添加し、そしてさらに、それぞれの標的細胞（ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、 ＨＴ−２９、ＨＬ６０、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ、ＮＡ、ＳＫ−ＯＶ−３）と共に１時間インキュベートした。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ (１：１５００) (BD Biosciences, San Jose, CA) 及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇ (１：１０００) (BD Biosciences, San Jose, CA)を添加し、そして細胞をさらに３時間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳにより洗浄し、そしてＰＥ/Ｃｙ７−接合抗−ＣＤ５６ ｍＡｂ、 ＡＰＣ/Ｃｙ ７−接合抗−ＣＤ１６ ｍＡｂ 及び ＰＥ−ＣＦ５９４−接合 抗−ＣＤ３ ｍＡｂ (BioLegend, Inc., San Diego, CA)により染色し、１５分間インキュベートし、そして次に、２％パラホルムアルデヒドにおいて固定した。次に、細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−接合抗−ヒトＩＦＮ−γ (BioLegend, Inc., San Diego, CA)と共に２０分間インキュベートし、洗浄し、そしてＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ分析(BD Biosciences, San Jose, CA)により評価した。補償のために、ＣｏｍｐＢｅａｄ＋抗−マウスＩｇ、κ／陰性対照（ＢＳＡ）補償＋（７．５μｍ）粒子（ＢＤ  Biosciences, San Jose, CA）を使用した。
【０１５２】
クロム−５１放出細胞毒性アッセイ：
ＨＴ−２９標的細胞を、１μＣｉの５１Ｃｒ／１×１０５個の標的細胞により、３７℃で５％ＣＯ２下で１時間、標識した。洗浄手順を実施し、過剰の５１Ｃｒを除去した。標識された標的細胞を、９６ウェルの丸底プレートのウェルに添加した（５×１０３個の細胞）。１６１５ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＫＥ、ＥｐＣＡＭ１６ ＢｉＫＥ、又は陰性対照により処理された休止エフェクターＮＫ歳オブを、プレートに添加した。Ｅ：Ｔ比は、２０：１〜０．０８：１の範囲であった。標的細胞死に応答する５１Ｃｒ放出量を、ガンマシンチレーションカウンターにより測定し、そして標的細胞溶解度（％）を、次の通りに計算した：［（実験的溶解−自発的溶解）／（最大溶解−自発的溶解）］×１００。最大溶解を決定するために、５１Ｃｒ標識標的細胞を、３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘにより４時間、処理した。
【０１５３】
ルミネックス：
ケモカイン及びサイトカインの分析のために、６人の健康なボランティアからの精製されたＮＫ細胞を、２：１のＥ：Ｔ比でＨＴ−２９結腸癌腫細胞及び５０ｎＭの濃度でのそれぞれの薬物と共に３７℃で５％ＣＯ２下で、２４時間、９６ウェルプレートにおいて共培養した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し、そして上清液を集め、そして分析まで、−８０℃で貯蔵した。ＧＭ−ＣＳＦ, ＩＬ−６, ＩＬ−８ 及び ＴＮＦ−α (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を、ルミネックスシステム（MAGPIX, Luminex, Austin, TX）を用いて決定した。値はｐｇ／ｍｌを表し、そしてXponent  ４．２ソフトウェア（luminex, Austin, TX）を用いることにより、組換えヒトタンパク質の標準曲線から補間した。
【０１５４】
増殖及び生存率アッセイ：
健康なドナーからのＰＢＭＣ又は富化されたＮＫ細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥバイオレット細胞増殖色素(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)により、その製造業者のプロトコルに従って標識した。標識の後、細胞を、５０ｎＭの濃度のそれぞれの薬物と共に培養した。細胞を、７日後に収穫した。生／死試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）により生存性について染色し、そして生存ＣＤ３−ＣＤ５６＋集団をゲートするために、抗−ＣＤ５６ ＰＥ/Ｃｙ７ (BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA)について表面染色した。データを、ＦｌｏｗＪｏ ソフトウェアバージョン7.6.5. (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA)により分析した。
【０１５５】
統計学的分析：
データは、平均±標準偏差として示されている。２つのグループ間の差異を、スチューデントｔ検定又はワン−ウェイＡＮＯＶＡにより分析した。データの分析及び提示は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)により行われた。
【０１５６】
実施例３
ＥＦ９１（ラマ抗−ヒトＩＬ１６）−ＩＬ１５−ＣＤ３３の構築：
ＴｒｉＫＥ ＥＦ９１(ラマ抗−ヒト ＩＬ１６)−ＩＬ１５−ＣＤ３３ ；配列番号１４)をコードするハイブリッドポリヌクレオチドの合成及びアセンブリーを、ＤＮＡシャフリング及び連結技法を用いて達成した。完全にアセンブリーされたポリヌクレオチドは、５′末端から３′末端に、以下を有する：ＮｏｃＩ制限部位；ＡＴＧ開始コドン；ＥＦ９１（ラマ抗−ヒトＩＬ１６）のＶＨ及びＶＬ領域、２０個のアミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ; 配列番号３）、修飾されたＩＬ−１５、７個のアミノ酸のリンカー（ＥＡＳＧＧＰＥ; 配列番号４）、及びヒト化抗−ＣＤ３３ｓｃＦｖをコードするコード領域；及び最後に、ＸｈｏＩ制限部位。得られるＮｃｏＩ／ＸｈｏＩポリヌクレオチドを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発性Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ２１ｄ発現ベクター中にスプライシングした。
【０１５７】
実施例４
１６１５抗ＨＩＶの構築：
１６１５ｘはプラットフォーム技法であるので、癌発生に関連しているか、又は関連していない抗ウィルスｓｃＦｖを使用することも可能である。ＴｒｉＫＥ１６１５抗ＨＩＶ（配列番号１９）をコードするハイブリッドポリヌクレオチドの合成及びアセンブリーを、ＤＮＡシャフリング及び連結技法を用いて達成した。完全にアセンブリーされたポリヌクレオチドは、５′末端から３′末端に、以下を有する：ＮｃｏＩ制限部位；ＡＴＧ開始コドン；抗−ＣＤ１６ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域、20個のアミノ酸のセグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ; 配列番号３）、修飾されたＩＬ＝１５、７個のアミノ酸のリンカー（ＥＡＳＧＧＰＥ; 配列番号４）及び抗−ＨＥＶｓｃＦｖ；及び最後に、ＸｈｏＩ制限部位。
【０１５８】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物、並びに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｇにおけるヌクレオチド配列提出、及び例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｏ、ＰＩＲ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｇにおける注釈付きのコード領域からの翻訳）の完全な開示は、その全体の参照により本明細書に組込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組込まれる任意の文献の開示との間に矛盾が存在する場合、本願の開示が適用される。前述の詳細な記載及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。それから不必要な制限が理解されるべきでない。本発明は、図示され、そして説明された正確な詳細に限定されず、当業者に明白な変形が特許請求の範囲により定義される本発明内に含まれるであろう。
【０１５９】
特にことわらない限り、本明細書及び特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量などを表すすべての数字は、全ての場合、用語「約（about）」により修飾されるものとして理解されるべきである。従って、特にことわらない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明により得られることが求められる所望の性質に依存して変化しえる近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に等価物の教えを限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め（rounding）技法の適用により解釈されるべきである。
【０１６０】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、すべての数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差に必然的に起因する範囲を本質的に含む。
【０１６１】
特にことわらない限り、全ての見出しは、読者の便宜のためであり、そして見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。
【０１６２】
配列表
配列番号1
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EQVQLVQSGA EVKKPGSSVK VSCKASGYTF TDYNMHWVRQ
APGQGLEWIG YIYPYNGGTG YNQKFKSKAT ITADESTNTA YMELSSLRSE DTAVYYCARG
RPAMDYWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASES
VDNYGISFMN WFQQKPGKAP KLLIYAASNQ GSGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPDDFA
TYYCQQSKEV PWTFGQGTKV EIK
【０１６３】
配列番号2
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA
PGQGLEWIGY IYPYNGGTGY NQKFKSKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAVYYCARGR
PAMDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASESV
DNYGISFMNW FQQKPGKAPK LLIYAASNQG SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPDDFAT
YYCQQSKEVP WTFGQGTKVE IK
【０１６４】
配列番号3
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY
【０１６５】
配列番号4
EASGGPE
【０１６６】
配列番号5
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSQVQLVQ
SGAEVKKPGS SVKVSCKASG YTFTDYNMHW VRQAPGQGLE WIGYIYPYNG GTGYNQKFKS
KATITADEST NTAYMELSSL RSEDTAVYYC ARGRPAMDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS
GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SESVDNYGIS FMNWFQQKPG KAPKLLIYAA
SNQGSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPD DFATYYCQQS KEVPWTFGQG TKVEIK
【０１６７】
配列番号6
MENWVNVISD LKKIEDLIQS MHIDATLYTE SDVHPSCKVT AMKCFLLELQ VISLESGDAS
IHDTVENLII LANDSLSSNG NVTESGCKEC EELEEKNIKE FLQSFVHIVQ MFINTSPSGQ
AGAAASESLF VSNHAYEVQL VESGGGVVRP GGSLRLSCAA SGFTFDDYGM SWVRQAPGKG
LEWVSGINWN GGSTGYADSV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARGRSLLF
DYWGQGTLVT VSRGGGGSGG GGSGGGGSSE LTQDPAVSVA LGQTVRITCQ GDSLRSYYAS
WYQQKPGQAP VLVIYGKNNR PSGIPDRFSG SSSGNTASLT ITGAQAEDEA DYYCNSRDSS
GNHVVFGGGT KLTVLEASGG PEQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGYT FTDYNMHWVR
QAPGQGLEWI GYIYPYNGGT GYNQKFKSKA TITADESTNT AYMELSSLRS EDTAVYYCAR
GRPAMDYWGQ GTLVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCRASE
SVDNYGISFM NWFQQKPGKA PKLLIYAASN QGSGVPSRFS GSGSGTDFTL TISSLQPDDF
ATYYCQQSKE VPWTFGQGTK VEIK
【０１６８】
配列番号7
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA
PGQGLEWIGY IYPYNGGTGY NQKFKSKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAVYYCARGR
PAMDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASESV
DNYGISFMNW FQQKPGKAPK LLIYAASNQG SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPDDFAT
YYCQQSKEVP WTFGQGTKVE IKEASGGPEN WVNVISDLKK IEDLIQSMHI DATLYTESDV
HPSCKVTAMK CFLLELQVIS LESGDASIHD TVENLIILAN DSLSSNGNVT ESGCKECEEL
EEKNIKEFLQ SFVHIVQMFI NTS
【０１６９】
配列番号8
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRSTKSL LHSNGITYLY
WYQQKPGKAP KLLIYQMSNL ASGVPSRFSS SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCAQNLEI
PRTFGQGTKV ELKRATPSHN SHQVPSAGGP TANSGTSGEV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC
AASGYTFTNY GMNWVKQAPG KGLEWMGWIN TYTGESTYAD SFKGRFTFSL DTSASAAYLQ
INSLRAEDTA VYYCARFAIK GDYWGQGTLL TVSS
【０１７０】
配列番号9
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRSTKSL LHSNGITYLY
WYQQKPGKAP KLLIYQMSNL ASGVPSRFSS SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCAQNLEI
PRTFGQGTKV ELKRATPSHN SHQVPSAGGP TANSGTSGEV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC
AASGYTFTNY GMNWVKQAPG KGLEWMGWIN TYTGESTYAD SFKGRFTFSL DTSASAAYLQ
INSLRAEDTA VYYCARFAIK GDYWGQGTLL TVSSEPKSSD KTHTSPPSPD IVLSQSPAIM
SASPGEKVTI SCSASSSVSY MYWYQQKPGS SPKPWIYRTS NLASGVPARF SGSGSGTSYS
LTISSMEAED AATYYCQQYH SYPPTFGAGT KLELKSSGGG GSGGGGGGSS RSSLEVKLVE
SGPELKKPGE TVKISCKASG YTFTDYSMHW VNQAPGKGLK WMGWINTETG EPSYADDFKG
RFAFSLETSA STAYLQINNL KNEDTATYFC ATDYGDYFDY WGQGTTLTVS SAKTTPPSVT
S
【０１７１】
配列番号10
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIVLSQSPA IMSASPGEKV TISCSASSSV SYMYWYQQKP
GSSPKPWIYR TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ YHSYPPTFGA
GTKLELKSSG GGGSGGGGGG SSRSSLEVKL VESGPELKKP GETVKISCKA SGYTFTDYSM
HWVNQAPGKG LKWMGWINTE TGEPSYADDF KGRFAFSLET SASTAYLQIN NLKNEDTATY
FCATDYGDYF DYWGQGTTLT VSS
【０１７２】
配列番号11
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EQVQLVQSGA EVKKPGASVK VSCKASGYSF TGYTMNWVRQ
APGQGLEWMG LITPYNGASS YNQKFRGKAT MTVDTSTSTV YMELSSLRSE DTAVYYCARG
GYDGRGFDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS SGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCSA
SSSVSYMHWY QQKSGKAPKL LIYDTSKLAS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY
YCQQWSKHPL TFGQGTKLEI K
【０１７３】
配列番号12
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
EPKSSDKTHT SPPSPNWVNV ISDLKKIEDL IQSMHIDATL YTESDVHPSC KVTAMKCFLL
ELQVISLESG DASIHDTVEN LIILANDSLS SNGNVTESGC KECEELEEKN IKEFLQSFVH
IVQMFINTSP SGQAGAAASE SLFVSNHAYD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRSTKSLLH
SNGITYLYWY QQKPGKAPKL LIYQMSNLAS GVPSRFSSSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY
YCAQNLEIPR TFGQGTKVEL KRATPSHNSH QVPSAGGPTA NSGTSGEASG GPEDIQMTQT
TSSLSASLGD RVTISCRASQ DISNYLNWYQ QKPDGTVKLL IYYTSILHSG VPSRFSGSGS
GTDYSLTISN LEQEDFATYF CQQGNTLPWT FGGGTKLEIK GSTSGSGKPG SGEGSTKGEV
QLVESGGGLV KPGGSLKLSC AASGFAFSIY DMSWVRQTPE KRLEWVAYIS SGGGTTYYPD
TVKGRFTISR DNAKNTLYLQ MSSLKSEDTA MYYCARHSGY GTHWGVLFAY WGQGTLVTVS
AGGGGSDILL TQTPASLAVS LGQRATISCK ASQSVDYDGD SYLNWYQQIP GQPPKLLIYD
ASNLVSGIPP RFSGSGSGTD FTLNIHPVEK VDAATYHCQQ STEDPWTFGG GTKLEIKRGS
TSGSGKPGSG EGSTKGQVQL QQSGAELVRP GSSVKISCKA SGYAFSSYWM NWVKQRPGQG
LEWIGQIWPG DGDTNYNGKF KGKATLTADE SSSTAYMQLS SLASEDSAVY FCARRETTTV
GRYYYAMDYW GQGTSVTVSS
【０１７４】
配列番号13
MDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQDI RNYLNWYQQK PDGTVKLLIY YTSRLHSGVP
SKFSGSGSGT DYTLTISNLE QEDIATYFCQ QGNTLPWTFA GGTKLEIKRG GGGSGGGGSG
GGGSGGREVQ LVQSGAELVK PGATMKISCK ASGYSFTGYT MNWVKQSHGK NLEWMGLINP
YKGVSTYNQK FKDKATLTVD TSTDTAYMEL LSLTSEDSAV YYCARSGYYG DSDWYFDVWG
AGTTVTVSSP SGQAGAAASE SLFVSNHAYP TSSSTKKTQL QLEHLLLDLQ MILNGINNYK
NPKLTRMLTF KFYMPKKATE LKHLQCLEEE LKPLEEVLNL AQSKNFHLRP RDLISNINVI
VLELKGSETT FMCEYADETA TIVEFLNRWI TFCQSIISTL TEASGGPEDI QMTQSPSSLS
ASVGDRVTIT CRSTKSLLHS NGITYLYWYQ QKPGKAPKLL IYQMSNLASG VPSRFSSSGS
GTDFTLTISS LQPEDFATYY CAQNLEIPRT FGQGTKVELK RATPSHNSHQ VPSAGGPTAN
SGTSGEVQLV QSGPGLVQPG GSVRISCAAS GYTFTNYGMN WVKQAPGKGL EWMGWINTYT
GESTYADSFK GRFTFSLDTS ASAAYLQINS LRAEDTAVYY CARFAIKGDY WGQGTLLTVS
S
【０１７５】
配列番号14
MKWVTFISLL FLFSSAYSQV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGLTFSSY NMGWFRQAPG
QGLEAVASIT WSGRDTFYAD SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAANPWP
VAAPRSGTYW GQGTLVTVSS SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGNWVNVISD LKKIEDLIQS
MHIDATLYTE SDVHPSCKVT AMKCFLLELQ VISLESGDAS IHDTVENLII LANNSLSSNG
NVTESGCKEC EELEEKNIKE FLQSFVHIVQ MFINTSGSTS GSGKPGSGEG STKGQVQLVQ
SGAEVKKPGS SVKVSCKASG YTFTDYNMHW VRQAPGQGLE WIGYIYPYNG GTGYNQKFKS
KATITADEST NTAYMELSSL RSEDTAVYYC ARGRPAMDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS
GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SESVDNYGIS FMNWFQQKPG KAPKLLIYAA
SNQGSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPD DFATYYCQQS KEVPWTFGQG TKVEIKVDE
【０１７６】
配列番号15
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
【０１７７】
配列番号16
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EAKVQLQESG PSLVQPSQRL SITCTVSGFS LISYGVHWVR
QSPGKGLEWL GVIWRGGSTD YNAAFMSRLS ITKDNSKSQV FFKMNSLQAD DTAIYFCAKT
LITTGYAMDY WGQGTTVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSDIEL TQSPSSFSVS LGDRVTITCK
ASEDIYNRLA WYQQKPGNAP RLLISGATSL ETGVPSRFSG SGSGKDYTLS ITSLQTEDVA
TYYCQQYWST PTFGGGTKLE IKR
【０１７８】
配列番号17
MDIVLSQSPA IMSASPGEKV TISCSASSSV SYMYWYQQKP GSSPKPWIYR TSNLASGVPA
RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ YHSYPPTFGA GTKLELKSSG GGGSGGGGGG
SSRSSLEVKL VESGPELKKP GETVKISCKA SGYTFTDYSM HWVNQAPGKG LKWMGWINTE
TGEPSYADDF KGRFAFSLET SASTAYLQIN NLKNEDTATY FCATDYGDYF DYWGQGTTLT
VSS
【０１７９】
配列番号18
PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE
ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFCQSIIST LT
【０１８０】
配列番号19
MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG
YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG
GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY
GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL
PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM
KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL
QSFVHIVQMF INTSEASGGP EMGWSCIILF LVATATGVHS QVRLSQSGGQ MKKPGDSMRI
SCRASGYEFI NCPINWIRLA PGKRPEWMGW MKPRHGAVSY ARQLQGRVTM TRDMYSETAF
LELRSLTSDD TAVYFCTRGK YCTARDYYNW DFEHWGQGTP VTVSSASTKG PSVFPLAPSS
KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS
LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK
【０１８１】
配列番号20
MKWVTFISLL FLFSSAYSQV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGLTFSSY NMGWFRQAPG
QGLEAVASIT WSGRDTFYAD SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAANPWP
VAAPRSGTYW GQGTLVTVSS
【図１】
2018531939.tif 000006
【図１−Ａ】
2018531939.tif 000007
【図２】
2018531939.tif 000008
【図３】
2018531939.tif 000009
【図４】
2018531939.tif 000010
【図５】
2018531939.tif 000011
【図６】
2018531939.tif 000012
【図７】
2018531939.tif 000013
【図８】
2018531939.tif 000014
【図９】
2018531939.tif 000015
【図１０】
2018531939.tif 000016
【図１１】
2018531939.tif 000017
【図１２】
2018531939.tif 000018
【図１３】
2018531939.tif 000019
【図１４】
2018531939.tif 000020
【図１５】
2018531939.tif 000021
【図１６】
2018531939.tif 000022
【図１７】
2018531939.tif 000023
【図１８】
2018531939.tif 000024
【図１９】
2018531939.tif 000025
【図２０】
2018531939.tif 000026
【図２１】
2018531939.tif 000027
【図２２】
2018531939.tif 000028
【図２２−Ａ】
2018531939.tif 000029
【配列表】
2018531939000001.app
【国際調査報告】
2018531939.tif 000030
2018531939.tif 000031
2018531939.tif 000032