(57)【要約】  哺乳動物対象における創傷の処置のための方法および組成物が本明細書中で提供される。特に、創傷治癒および創傷閉鎖の活性化／刺激を含む、組織修復および再生を促進し、角化細胞および内皮細胞の運動性および／または増殖を刺激する、新規生理活性ポリペプチドが提供される。
2018502566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００、９５、９０、８５、８０  ７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０未満のアミノ酸を含む、配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記ペプチドが由来した全長タンパク質を含まない、単離ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが由来したタンパク質の５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０以下の連続アミノ酸残基を含む、請求項２に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
基本的に配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３の何れかに記載の単離ペプチド。
【請求項５】
第二のペプチドまたはポリペプチドに複合化されているかまたは融合されている請求項１〜４の何れかに記載の単離ペプチドを含む、コンビナトリアルペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４の何れかに記載の単離ペプチドの１つ以上または請求項５に記載のコンビナトリアルペプチドの１つ以上および担体または賦形剤を含む、組成物または製造品。
【請求項７】
前記担体または賦形剤が薬学的に許容可能な担体または賦形剤である、請求項６に記載の組成物または製造品。
【請求項８】
前記単離ペプチドの１つ以上または前記コンビナトリアルペプチドの１つ以上がプロテアーゼ切断部位を含み、任意選択により前記プロテアーゼ切断部位が、ペプチドまたはコンビナトリアルペプチドよって異なる、請求項６または請求項７に記載の組成物または製造品。
【請求項９】
前記１つ以上の単離ペプチドまたは１つ以上のコンビナトリアルペプチドが、任意選択により生体浸食性および非免疫原性の足場である足場にアンカーされている、請求項６〜８の何れかに記載の組成物または製造品。
【請求項１０】
創傷治癒を必要とする対象において創傷治癒を促進するための方法であって、請求項１〜４の何れかに記載の単離ペプチドの１つ以上、請求項Ａ５に記載のコンビナトリアルペプチドの１つ以上または請求項６〜９の何れかに記載の組成物または製造品の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが基本的に配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、創傷縁部への、角化細胞もしくは内皮細胞または角化細胞および内皮細胞の組み合わせの遊走速度を促進するのに有効な量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドの投与の結果、前記創傷の再上皮化が増加する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドの投与の結果、前記創傷におけるかまたはその付近での血管形成が増加する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが創傷部位に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記創傷が、熱傷、慢性、急性または手術創である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に第２の薬剤を投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の薬剤がポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の薬剤が、増殖因子、サイトカインまたは酵素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の薬剤が非ヒトコラゲナーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ヒトコラゲナーゼが細菌性コラゲナーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が哺乳動物対象である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、２０１４年１２月１２日提出の米国特許仮出願第６２／０９１，４４４号明細書の優先権を主張し、この開示全体がその全体において本明細書中に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒は、組織リモデリングで開始され、完了する複雑で高度に協調した過程である。細胞外マトリクスおよびその関連増殖制御物質は、動的に中心的な役割を果たし、細胞反応および創傷治癒を相互に制御する。最初に、暫定の初期構成要素として専ら重要であると考えられるが、血液由来のマトリクス、酵素および細胞外マトリクスの構造巨大分子は、サイトカインおよび増殖因子と協調し、治癒を組織化する動態が得られる（１−７）。
【０００３】
コラーゲンのコラゲナーゼ消化により得られるペプチドの創傷治癒および走化特性は、１９７０年代後半から知られている。Ｐｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７５：８７１−８７５（１９７８）を参照のこと。
【０００４】
正常な状況下で、急性創傷治癒の過程は、３つのフェーズに分けられ得る。最初に炎症期があり、これに次いでロバストな組織リモデリングおよび増殖（増殖期）が続き、再上皮化、皮膚血管形成および創傷閉鎖が結果として生じる「成熟期」に引き継がれる。再上皮化は、上皮組織、主に角化細胞の遊走および増殖を含む。血管形成は、既存の導管からの新しい血管の成長であり、増殖因子ポリペプチドならびに細胞−細胞および細胞マトリクス相互作用を含む多数の可溶性サイトカインによって制御される。慢性的な創傷は、それらが一般に長期間にわたり炎症性の状態のままであるという点で、正常な急性創傷とは異なる治癒プロファイルを示す。非治癒創傷は通常、糖尿病、静脈うっ血疾患がある者の間で、および固定されている患者において観察され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前述のことを考慮すると、急性および慢性両方の創傷治癒状況において安全かつ効率的に上皮および血管創傷治癒機序を促進する新しい生理活性生体分子を提供することが所望される。
【０００６】
創傷治癒ペプチド、このようなペプチドを含有する組成物および創傷治癒の促進のための方法が本明細書中で提供される。本ペプチドは、非治癒創傷を典型的に表す「不適な」環境の劣化作用および支障をきたす作用に耐性がある。高度なタンパク質ベースの創傷治癒治療薬を開発しようとする以前の試みは大きな失敗に終わっているが、これは、創傷床の強固なプロテアーゼプロファイルが、送達されるあらゆる生理活性タンパク質実体を劣化させるからである。これらの理由のために、プロテアーゼ作用に耐性がある生理活性創傷治癒ペプチドは、創傷内に存在するプロテアーゼプロファイルの上昇にもかかわらず、組織リモデリング、血管形成および上皮化を促進するので、非常に有利である。同時に、治癒の活性化は、創傷床を「再平衡化する」のに役立ち、したがって、プロテアーゼ阻害剤を上方制御するか、宿主プロテアーゼを下方制御するかまたはその両方を引き起こす可能性がある。
【０００７】
ある態様において、配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、１００、９５、９０、８５、８０  ７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０個未満のアミノ酸を含む。
【０００８】
別の態様によれば、配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドが提供され、本ペプチドは、本ペプチドが由来した全長タンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、本ペプチドが由来したタンパク質の５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０個を超えない連続アミノ酸残基を含む。
【０００９】
他の実施形態において、本ペプチドは、基本的に配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００１０】
別の態様によれば、第２のペプチドまたはポリペプチドと複合化されるかまたは融合される本明細書中で開示される単離ペプチドを含む、コンビナトリアルペプチドが提供される。
【００１１】
別の態様によれば、本明細書中で開示される単離ペプチドの１つ以上または本明細書中で開示されるコンビナトリアルペプチドの１つ以上および担体または賦形剤を含む組成物または製造品が提供される。いくつかの実施形態において、担体または賦形剤は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤である。いくつかの実施形態において、単離ペプチドの１つ以上またはコンビナトリアルペプチドの１つ以上は、プロテアーゼ切断部位を含み；任意選択によりプロテアーゼ切断部位はペプチドまたはコンビナトリアルペプチドによって異なる。いくつかの実施形態において、１つ以上の単離ペプチドまたは１つ以上のコンビナトリアルペプチドは足場にアンカーされるが、この足場は任意選択により生体浸食性および非免疫原性足場である。
【００１２】
別の態様によれば、創傷治癒を必要とする対象において創傷治癒を促進するための方法が提供される。本方法は、本明細書中で開示される単離ペプチドの１つ以上、本明細書中で開示されるコンビナトリアルペプチドの１つ以上または本明細書中で開示される組成物または製造品の有効量を対象に投与することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本ペプチドは、基本的に配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、創傷縁部への、角化細胞もしくは内皮細胞または角化細胞および内皮細胞の組み合わせの遊走速度を向上させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、本ペプチドの投与の結果、創傷の再上皮化が増加する。いくつかの実施形態において、本ペプチドの投与の結果、創傷における、または創傷の付近での血管形成が増加する。いくつかの実施形態において、本ペプチドは創傷部位で投与される。いくつかの実施形態において、創傷は熱傷、慢性、急性または手術創である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象に第２の薬剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の薬剤はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、増殖因子、サイトカインまたは酵素である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、非ヒトコラゲナーゼである。いくつかの実施形態において、非ヒトコラゲナーゼは細菌性コラゲナーゼである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象はヒトである。
【００１６】
本明細書中に記載の様々な実施形態は、形式的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）であり得、本明細書中に含有される教示を考慮して当業者により理解されるように一緒に合わせられ得るかまたは使用され得る。別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本明細書中で提供される技術が属する技術分野の通常の技術者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で提供される技術の態様の実施または試験において本明細書中に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用し得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及される刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は全て、それらの全体において参照により組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩが、ヒト内皮ＥＣＭおよびヒト線維芽細胞由来のマトリクス（示される）から固有の断片を放出させることを示す。マトリクスを調製し、参考文献５、８〜１０に記載のように処理した。緩衝液不溶性および可溶性ＥＣＭ分画ならびに自己分解酵素由来の試料をＳＤＳ含有ＰＡＧＥに載せ、電気泳動を行った。消化マトリクスの可溶性分画内に存在する固有のタンパク質バンド（矢じり）を質量分析によって分析した。レーン中の試料の正体：１−分子量標準物質（ｋＤａ）；２−無処置ＥＣＭ；３、４−２または２４時間、照射コラゲナーゼで消化されたＥＣＭ；５、６−２または２４時間、非照射コラゲナーゼで消化されたＥＣＭ；７、８−２または２４時間、照射コラゲナーゼで消化されたＥＣＭ；９、１０−２または２４時間、非照射コラゲナーゼで消化されたＥＣＭ。レーン２〜６−可溶性分画、レーン７〜１０−可溶性分画。
【図２】図２は、ヒト内皮ＥＣＭ由来のペプチドがヒト内皮細胞の増殖を刺激することを示す。マルチウェルプレートにおいてヒト微小血管内皮細胞を低密度で播種し、１日おきに１００ｎＭペプチドで処理した。播種後第５日に、コールターカウンターを使用して細胞数を数えた。対照に対する細胞増殖を示す。＊統計学的有意性（ｐ＜０．０５）。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ヒト内皮ＥＣＭ由来のペプチドが用量依存的に成人ヒト角化細胞の増殖を刺激することを示す。成人ヒト角化細胞をマルチウェルプレートにおいて低密度で播種し、１０ｎＭペプチド（図３Ａ）または１〜１００ｎＭペプチド（図３Ｂ）で１日おきに処理した。播種後第７日に、コールターカウンターを使用して細胞数を数えた。対照に対する細胞増殖（図３Ａ）または増殖させた絶対細胞数（図３Ｂ）を示す。＊統計学的有意性（ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、細菌性コラゲナーゼにより分解されたＥＣＭ由来のペプチドが、インビトロで血管形成を刺激することを示す。１００ｎＭで増殖因子減少マトリゲル中で、ＥＣＭ由来ペプチドを溶解させ、マトリクスをポリマー化させ、対照低血清含有培地または１００ｎＭペプチド含有培地の何れかにおいてヒト微小血管内皮細胞を播種した。内皮ＥＣＭ由来ペプチドで処理した細胞の代表的画像を示す。
【図５】図５は、ＥＣＭ由来ペプチドがインビトロで上皮創傷治癒を刺激することを示す。ガラス底ウェルプレートに成人ヒト角化細胞を高密度で播種した。播種から２４時間後、細胞単層において擦過傷を作製した。角化細胞増殖培地中で溶解させたペプチド（１０ｎＭ）を創傷の直後に適用した。損傷から０、１、３および５時間後に創傷閉鎖を監視した。破線は創傷の輪郭を描く。ＴＳＮ２およびＴＳＮ６で処理した創傷の代表的画像を示す。
【図６】図６は、ペプチドのインビボ試験のための実験計画を示す。損傷３日前にＢａｌｂ／ｃマウスを１５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドで、および損傷の１日前に１００ｍｇ／ｋｇシクロホスファミドで前処理した。４ｍｍパンチ生検ツールを使用して頭蓋皮膚に創傷を作製し、透明な粘着性ドレッシング材（ＴＥＧＡＤＥＲＭ（商標））ですぐに被覆した。新鮮なペプチドを毎日調製し、受傷後第１〜５日にドレッシング材下に注入した。Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＬＡＭ）により承認された手順に従い、創傷作製後第６日に動物を屠殺した。周囲の健康な組織と一緒に創傷部を切り取り、正中線に沿って半分に切り、４％リン酸緩衝ホルムアルデヒド中で固定するか、またはさらなる過程のためにＯＣＴ中で凍結させた。
【図７】図７Ａ〜７Ｌは、ＥＣＭ由来ペプチドが、治癒に障害があるマウスモデルにおける損傷に対する細胞反応を刺激することを示す。以前に記載のように、シクロホスファミド処理マウスにおいて頭蓋皮膚創傷を作製した（参考文献５）。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中で溶解されたペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）を毎日適用した。受傷後第６日にマウスを屠殺した。創傷を切除し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、切片にしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＣＭＣ（Ａ、Ｂ）、照射細菌性コラゲナーゼ（Ｃ、Ｄ）、０．１ｍｇ／ｍＬのＴＳＮ６（Ｅ、Ｆ）、１ｍｇ／ｍＬのＴＳＮ６（Ｇ、Ｈ）、０．１ｍｇ／ｍＬのＴＳＮ１８（Ｉ、Ｊ）または１ｍｇ／ｍＬのＴＳＮ１８（Ｋ、Ｌ）で処理した創傷の代表的画像。スケールバー１ｍｍ。
【図８】図８は、ＥＣＭ由来ペプチドが、マウスにおいて創傷治癒を刺激することを示す。創傷を作製し、図６に記載のように処理し、表２に記載の段階分けに従い盲検的にスコア化した。＊は、知見の統計学的有意性を示す（ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ＥＣＭ由来ペプチドがマウスにおいて創傷上皮化を刺激することを示す。創傷を生成させ、図１に記載のように処理した。創傷後第６日に創傷上皮を測定した。＊＊は所見の統計学的有意性を示す（ｐ＜０．０５）。左から右の処理：対照；ＴＳＮ６、０．１ｍｇ／ｍＬ；ＴＳＮ６、１ｍｇ／ｍＬ；ＴＳＮ１８、０．１ｍｇ／ｍＬ；ＴＳＮ１８、１ｍｇ／ｍＬ；ＰＫコラゲナーゼ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中で提供される技術の他の目的、特性および長所が次の詳細な記述から明らかになる。しかし、本明細書中で提供される技術の好ましい実施形態を示す一方で、本明細書中で提供される技術の精神および範囲内の様々な変化および変更がこの詳細な記述から当業者にとって明らかになるので、詳細な記述および具体的な例は単なる例示のために与えられることが理解されるべきである。
【００１９】
創傷治癒は、創傷縁部でまたはその付近での細胞の遊走および増殖および、新しい、または既存の血管の創傷部位への動員に基づいている。角化細胞および／または内皮細胞運動性および／または増殖を刺激する創傷治癒ペプチドが本明細書中で提供される。本創傷治癒ペプチドの１つ以上を含むキットおよび製造品も本明細書中で提供される。
【００２０】
創傷治癒ペプチドおよび創傷治癒ペプチドをコードする核酸
本明細書中に記載のように、クロストリジウム細菌から単離される細菌性コラゲナーゼである、ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼ軟膏中の活性医薬成分（ＡＰＩ）での細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の処理の結果、天然のものなどとして見出されていることが知られていないいくつかのペプチドの遊離が起こる。これらのペプチドは、ヒトコラゲナーゼでのＥＣＭの処理では形成されないと考えられる。これらのペプチドは、消化ＥＣＭから単離され得るか、これらのペプチドをコードする組み換え核酸の発現により細胞中で産生され得るか、または当技術分野で周知の従来のペプチド合成方法を使用して合成され得る。さらに、コンビナトリアルペプチドは、２つ以上の創傷治癒ペプチドの全てまたは一部を組み合わせることによって作製され得る。代表的なペプチドおよびコンビナトリアルペプチド（配列番号１〜１９）を表１で提供する。
【００２１】
本明細書中で提供される方法、キットおよび製造品は、２つ以上のペプチドを含み得、ここで本ペプチドの少なくとも１つが配列番号１〜１９、または配列番号１〜１９を含むかまたは基本的にそれらからなるペプチドから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、創傷治癒ペプチドは配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、本ペプチドは、１００、９５、９０、８５、８０  ７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０個以下のアミノ酸を含む。したがって、創傷治癒ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のアミノ酸を含み得る。
【００２３】
他の実施形態において、創傷治癒ペプチドは配列番号１〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、本ペプチドは、本ペプチドが由来した全長タンパク質を含まない。このような実施形態の一部において、本ペプチドは、本ペプチドが由来したタンパク質の、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９または８個以下の連続アミノ酸残基を含む。
【００２４】
ある一定の創傷治癒ペプチドは、本明細書中で開示されるペプチドの少なくとも１つを含むペプチドの組み合わせであるコンビナトリアルペプチドである。このようなペプチドは天然ではなく、インサイチュー切断によって作製できない。代わりに、コンビナトリアルペプチドは、化学合成によって、または本明細書中の他所に記載のようなタンパク質発現ベクターなど、コンビナトリアルペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって作製される。コンビナトリアルペプチドの非限定例としては、配列番号１〜８、１１、１２、１４〜１７の１つ以上を含むペプチドが挙げられる。例えば本明細書中で開示されるペプチド、ペプチドＴＳＮ９、ＴＳＮ１０、ＴＳＮ１３、ＴＳＮ１８およびＴＳＮ１９（配列番号９、１０、１３、１８および１９）がコンビナトリアルペプチドの例であり；表１を参照のこと。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本ペプチドは、あるペプチドのＣ末端が別のペプチドのＮ末端アミノ酸とペプチド結合を介して連結されることで連続的に連結され得る。他の実施形態において、本ペプチドは、コンビナトリアルペプチドにおいて連結されるペプチドの一部ではない１つ以上のアミノ酸を含み得る１つ以上のリンカーによって連結される。
【００２６】
特徴がよく分かっているインビトロおよびインビボ法および創傷治癒アッセイを使用して、開示される創傷治癒ペプチドの創傷−治癒特性が本明細書中で明らかになった。アッセイの結果を本明細書中に記載する。本明細書中で提供される創傷治癒ペプチドはまた、毛細血管形態形成の促進においても、および内皮細胞増殖を誘導するためにも有用である。本明細書中で提供される創傷治癒ペプチドにより影響を受け得る細胞タイプとしては、角化細胞、内皮細胞、例えば微小血管内皮細胞、線維芽細胞および周辺細胞が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で提供される創傷治癒ペプチドはまた、生体適合性の創傷製品と合わせて使用することもできる。本明細書中に記載のように、創傷製品は、例えば、哺乳動物組織由来の生体材料であり得る。創傷製品は精製または未精製形態で提供され得る。さらに、創傷製品は、官能性の架橋剤（例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ））として作用する１つ以上の化合物の添加によって改変され得る。例えば、１つ以上の官能性架橋剤の存在または非存在下で、市販の創傷製品（例えば、ＯＡＳＩＳ（登録商標）Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ、Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘ．により販売）を創傷治癒ペプチドと組み合わせ得る。
【００２８】
本明細書中に記載のように、切断部位を保持するようにペプチドが操作され得、それらが、時間的および空間的に特異的な方式で作用するために足場から、邪魔されず、または生物学的活性の損失なく、定量的に放出され得るようになる。例えば、足場にアンカーすることによって、上皮化を促進する生理活性ペプチドの制御放出前に血管形成の面で活性のある生理活性ペプチドが放出されるようになる。このようにして、上皮化前に血管形成が活性化され、上皮化活性化因子に先行して血管形成ペプチド活性化因子による上皮化過程を支援して栄養が局所的に送達され得るようになる。
【００２９】
開示される創傷治癒ペプチドおよびコンビナトリアルペプチドをコードする核酸分子もまた本明細書中で提供される。このような核酸の配列は、１つ以上の３ヌクレオチドコドンが創傷治癒ペプチドまたはコンビナトリアルペプチドのアミノ酸をコードする標準的な遺伝子コードに従い、決定される。
【００３０】
キット、製造品および吸収性製品
１つ以上の創傷治癒ペプチドを含有する、対象における創傷の処置のためのキットが本明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、本キットは、対象において創傷または複数の創傷を処置するために本ペプチドを使用するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、本キットは、創傷治癒を促進する１つ以上の他の物質を含む。例えば、本キットは、生体適合性の創傷製品、増殖因子、サイトカインまたは酵素を含有し得る。適切な対象としては、例えば創傷がある患者が挙げられる。いくつかの実施形態において、患者は糖尿病を有する。他の実施形態において、対象は熱傷患者である。いくつかの実施形態において、創傷は慢性的な創傷である。非ヒト（例えば細菌性）コラゲナーゼも本キット中に含まれ得る。
【００３１】
製造品も提供される。例えば、製造品は、１つ以上の創傷治癒ペプチド（例えば、配列番号１〜１９の何れか１つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド）および任意選択により１つ以上の増殖因子、サイトカインまたは酵素を含む。本物品は、哺乳動物対象の医療処置での使用に適切である。例えば、本物品は、皮膚または組織同等物であり得るかまたはこれを含み得る。いくつかの実施形態において、本物品は、１つ以上の増殖因子、サイトカインまたは酵素を含む。非ヒト（例えば細菌性）コラゲナーゼもまた本物品中にまたは物品上に含まれ得る。
【００３２】
吸収性製品が本明細書中で提供される。適切な吸収性製品は、例えば、創傷部位で適用される場合、創傷液を吸収可能である。いくつかの実施形態において、吸収性製品は、液体および創傷治癒ペプチドを吸収可能である構造を含む。代表的な構造としては、例えば、絆創膏、ガーゼ、創傷または傷口（ｓｏｒｅ）用ドレッシング材、皮膚パッチおよび粘着テープが挙げられる。「液体吸収性構造」という用語は、広く、保護、吸収、排液などのために創傷に適用されるあらゆる材料を指す。したがって、固形支持体として吸着性および吸収性材料が具体的に目論まれる。多くのタイプのドレッシング材が市販されており、それには、フィルム（例えばポリウレタンフィルム）、親水コロイド（ポリウレタンフォームに結合される親水性コロイド粒子）、ハイドロゲル（少なくとも約６０％の水を含有する架橋ポリマー）、フォーム（親水性または疎水性）、アルギン酸カルシウム（アルギン酸カルシウムからの繊維の不織複合材料）およびセロファン（可塑剤入りのセルロース）が含まれる。具体的に目論まれるのは、１つ以上の創傷治癒ペプチドが構造の表面内に浸透させられるかまたは構造の表面に（共有結合またはその他により）連結される液体吸収性構造の使用である。
【００３３】
創傷治癒ペプチド合成、発現および精製
本明細書中に記載の創傷治癒ペプチドは、合成によるか、または１つ以上の酵素、例えばコラゲナーゼなどによる適切な生物材料のタンパク質分解性消化によって、作製され得る。あるいは、創傷治癒ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質発現ベクターに導入され、適切な宿主生物（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞など）において作製され得る。本ペプチドを作製する起源または方法にかかわらず、作製後、ペプチドを単離し、任意選択により精製し得る。時間および空間調節とともに局所的に生理活性創傷治癒ペプチドまたは血管形成活性化ペプチドを放出させるため、既知の創傷プロテアーゼ切断部位を保持させるためにペプチドを操作し得る。
【００３４】
修飾創傷治癒ペプチド
本明細書中で提供される創傷治癒ペプチドは当技術分野で周知であるように修飾され得る。例えば、創傷治癒ペプチドは、リン酸基、酢酸基などの１つ以上の官能基または様々な脂質および炭水化物の付加によって修飾される。創傷治癒ペプチドはまたペプチド誘導体としても存在し得る。「ペプチド誘導体」という用語は、イミノ基（−ＮＨ−）およびより具体的にはペプチド結合を有する化合物を指す。ペプチドは置換アミドとみなされ得る。アミド基のように、ペプチド結合は、高度な共鳴安定化を示す。ペプチド連結におけるＣ−Ｎ単結合は一般的には約４０パーセントの二重結合の特徴を有し、Ｃ＝Ｏ二重結合は約４０パーセントの単結合の特徴を有する。「保護基」は、非保護官能基を含む望ましくない反応（タンパク質分解など）を阻止する基である。ある実施形態において、保護基はアシルまたはアミドである。ある実施形態において、アシルはアセテートである。別の実施形態において、保護基はベンジル基である。別の実施形態において、保護基はベンゾイル基である。本明細書中で提供される技術は、このような保護基の組み合わせを含む。
【００３５】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、モノマーがアミド結合を通じて一緒に連結されるアルファアミノ酸であるポリマーを指す。ペプチドは、２個であるか、またはより多くのアミノ酸モノマー長であることが多い。「二量体」という用語は、「ペプチド二量体」において使用される場合、２本のペプチド鎖が連結される化合物を指し；一般に、必ずではないが、この２本のペプチド鎖は同一であり、各鎖のカルボキシル末端に共有結合される連結部分を通じて連結される。ペプチド中のアミノ酸残基は次のように略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；スレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｉｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リジンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；グリシンはＧｌｙまたはＧである。１２個の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸、例えばａ，ａ−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸など、および他の非定型の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も、本明細書中で提供される技術の化合物に対する適切な構成要素であり得る。非定型のアミノ酸の例としては：ベータ−アラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノル−ロイシンおよび他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。
【００３６】
創傷治癒ペプチドを精製するかまたは同定するかまたは精製する目的のために、さらなるポリペプチド（「タグ」）を付加し得る。タンパク質タグによって、例えばポリペプチドが、高い親和性でマトリクスに吸着できるようになり、殆ど複合体が溶出されることなく適切な緩衝液でストリンジェントに洗浄できるようになり、吸着複合体が続いて選択的に溶出され得るようになる。当業者にとって公知のタンパク質タグの例は、（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、アフィニティーキチン結合タグを有するインテインまたはマルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）タグである。これらのタンパク質タグは、ペプチド配列において、またはペプチド配列に対して、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部に配置され得る。
【００３７】
使用および処置の方法
創傷治癒反応を促進するかまたは増強させる他の生物学的物質と組み合わせて創傷治癒ペプチドを使用した、創傷の処置のための方法も本明細書中で提供される。このような生物学的物質としては、増殖因子、サイトカイン、酵素およびＥＣＭ構成要素が挙げられるが限定されない。例えば、創傷治癒ペプチド非存在下でのコラゲナーゼ処置の誘導的影響より高いレベルまで内皮遊走および増殖を加速させるために、創傷治癒ペプチド処置と組み合わせて内皮下の細胞外マトリクスのコラゲナーゼ処置を使用し得る。
【００３８】
創傷治癒ペプチドは、経口、局所投与または、皮下および筋肉内注射、持続放出デポーの植え込み、静脈内注射、鼻腔内投与などを含む非経口手段により投与される。創傷治癒ペプチドは、薬学的にまたは治療的に有効である量または用量で投与される。薬学的または治療的有効用量または量は、創傷治癒ペプチドまたは所望の生物学的結果を誘導するのに十分な創傷治癒ペプチドを含有する組成物の用量または量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状または原因の緩和または生体系の何らかの他の所望の変更であり得る。好ましくはこの用量または量は、上皮および／または内皮創傷治癒反応を刺激するかまたは増強する、したがって創傷治癒を誘導または増強するのに十分である。
【００３９】
組成物および医薬組成物
本明細書中で開示される創傷治癒ペプチドは、当技術分野で公知であるような、ペプチドと適合性がある様々な組成物中で提供される。このような組成物は、１つ以上の創傷治癒ペプチドおよび１つ以上の担体または賦形剤を含み得る。創傷治癒ペプチドは、１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせて１つ以上の創傷治癒ペプチドを含む医薬組成物として投与され得る。このような組成物は、水溶液、エマルジョン、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。適切な担体（賦形剤）は、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、植物油などの溶液を含む。適切な保存剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどをさらに含み得る。処方において有用なクリームまたは軟膏基剤としては、ラノリン、ＳＩＬＶＡＤＥＮＥ（登録商標）、ＡＱＵＡＰＨＯＲ（登録商標）などが含まれる。他の局所処方物としては、エアロゾル、絆創膏および他の創傷用ドレッシング材が挙げられる。あるいは、創傷治癒ペプチドを適切なポリマーマトリクスまたは膜中に組み込むかまたはカプセル化し得、したがって、局所的に処置しようとする部位の付近への埋め込みに適切な持続放出送達装置を提供する。本明細書中で提供される組成物を送達または投与するための他の適切な装置としては、留置カテーテルおよび装置、例えばＡＬＺＥＴ（登録商標）ミニポンプなどが挙げられる。眼用製剤は、市販のビヒクル、例えばＳＯＲＢＩ−ＣＡＲＥ（登録商標）、ＮＥＯＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標）、ＬＡＣＲＩＬＵＢＥ（登録商標）などを用いて処方され得るか、または参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，１２４，１５５号明細書に記載のものなどの局所製剤を使用し得る。
【００４０】
「薬学的に許容可能な塩」は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムおよびプロタミン亜鉛塩を含め、製薬業界で一般的に使用される無毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩を指し、これらは当技術分野で周知の方法によって調製される。この用語は無毒性の酸付加塩も含み、これらは、一般に本明細書中で提供される化合物を適切な有機または無機酸と反応させることによって調製される。代表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げられる。
【００４１】
「薬学的に許容可能な」という用語は、過度の毒性なく哺乳動物に投与され得る化合物および組成物を指す。代表的な薬学的に許容可能な塩としては、鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが挙げられる。
【００４２】
さらに、１つ以上の創傷治癒ペプチドは、冷蔵を必要としない送達および使用のための、熱安定性の形態で、例えば粉末状またはカプセル化処方物の形態で提供され得る。このような形態の例としては、固形形態、特に凍結乾燥粉末としての形態が挙げられる。凍結乾燥処方物は、一般的には、安定化剤および増量剤、例えばヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトールなどを含有する。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）で利用可能である。
【００４３】
本明細書中で提供される技術は、記載される、特定の方法論、プロトコール、コンストラクト、処方および試薬に限定されないが、熟練者にとって公知であるものをさらに含む。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態の記載のみを目的とするものであり、本明細書中で提供される技術の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
【００４４】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本明細書中で提供される技術が属する技術分野の通常の技術者にとって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等のあらゆる方法、材料およびキットも、本明細書中で提供される技術の実施または試験において使用し得る。
【実施例】
【００４５】
ここで本発明を一般的に記載しているが、単に本発明のある一定の実施形態および実施形態の例示の目的のために含まれ、本発明を限定するものではない、次の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。
【００４６】
実施例１：ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩの生化学的特徴およびその細胞外マトリクス由来ペプチド産生活性：革新的な生理活性ＥＣＭ由来創傷治癒ペプチドの同定および作製
インビトロで生きているヒト表皮および皮膚細胞培養物由来の明確に定義された生合成細胞外マトリクスからペプチドを作製するために、ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼ軟膏内に存在する活性医薬成分（ＡＰＩ）酵素を使用した。限定的なコラゲナーゼ依存性ＥＣＭ消化に続いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および質量分析を行った。ヒト毛細血管および皮膚由来内皮およびヒト皮膚線維芽細胞由来マトリクスのＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩ介在性ＥＣＭ分解によって、いくつかの固有の断片の放出に至った。
【００４７】
８〜２１アミノ酸長の１５種類のコラーゲン性およびコラーゲン関連ＥＣＭペプチドを今回同定し、配列決定し、合成した。放出物の質量分析同定から、コラゲナーゼ感受性であり、内皮ＥＣＭから放出される、細胞外マトリクス結合およびコラーゲン関連巨大分子（ｉ）トロンボスポンジン、（ｉｉ）マルチメリンおよび（ｉｉｉ）フィブロネクチン由来のキーとなるペプチドを含む、細胞型特異的な数々のペプチドが明らかになる。さらに、コラゲナーゼは、（ｉ）ＴＧＦ−β誘導性タンパク質および（ｉｉ）コラーゲンＶＩからペプチドを生じさせたが、これらは、ヒト皮膚線維芽細胞により合成され、組織化されるＥＣＭ由来である。ペプチドは、疎水性および親水性プロファイルを有するこれらの元来の構造から合成されており、これによって各ペプチドが水中で可溶性であることが保証される。
【００４８】
合成内皮または線維芽細胞性マトリクスのコラゲナーゼ切断により作製されたこれらのペプチドに加えて、４種類のペプチドを「再操作」した。これらの再操作ペプチドはコラゲナーゼ消化を介して天然に産生されず；創傷治癒能を最適化および最大化するために、コラゲナーゼにより産生される「親」ペプチドを再操作した。これらには、ペプチドＴＳＮ９、ＴＳＮ１０、ＴＳＮ１８、ＴＳＮ１９が含まれ、これらは、質量分析により同定される少なくとも２つの別個のコラゲナーゼにより放出されるペプチドに対してアミノ酸配列同一性を保持する（図１、表１参照）。Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙでペプチドを合成し、インビトロおよびインビボで、（ｉ）細胞特異的増殖の刺激能、（ｉｉ）血管形成の活性化および（ｉｉｉ）創傷治癒を含め、それらの生物学的活性を一連の試験で評価した。
【００４９】
ＴＳＮペプチド１〜９はヒト皮膚内皮細胞の細胞外マトリクス由来である。ＴＳＮペプチド１０〜１９はヒト皮膚線維芽細胞の細胞外マトリクス由来である）。細胞外マトリクスを生成させるための手順は、Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｔｅｌｌｏｔ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１９８７  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：４６３−９からのものである。
【００５０】
【表１】
2018502566.tif 000003
【００５１】
【表２】
2018502566.tif 000004
【００５２】
実施例２：ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩにより作製され、細胞外マトリクス由来であるペプチドは、インビトロで損傷に対する細胞反応を顕著に刺激する。
細胞増殖、受傷後遊走および血管形成。
ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼ軟膏において組み入れられる、成長促進性、遊走促進性および血管形成誘導性の活性の特徴を評価することを目的とした発明者らの取り組みにおいて、およびコラゲナーゼ対新規発見ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩ由来生理活性創傷治癒ペプチドの有効性を対比することに焦点を当てた取り組みにおいて、発明者らは、ここ、Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて、損傷および修復発現の、確立したモデルを用いて一連の前臨床試験および検査を行い続ける。これらの目的で、発明者らは、損傷に対する細胞反応を定量するために開発された２Ｄおよび３Ｄ損傷／修復モデルを利用した。これらの試験の結果から、最終的に、新規発見ペプチドが細胞創傷治癒反応を促進することが可能であることが明らかになった。
【００５３】
図２で示されるように、いくつかのＴＳＮペプチドは、角化細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含むヒト細胞培養に送達された場合に大規模な増殖促進特性を保持する。図２は、ＴＳＮ１およびＴＳＮ２が、他の新たに同定され、合成されたＥＣＭ由来ペプチドの中でも代表例として、インビトロでのヒト皮膚由来微小血管内皮細胞増殖を刺激することを示す。実際に、ＴＳＮ１およびＴＳＮ２は、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）で組み入れられる増殖促進活性を超え、これはおそらく、既知の殆どの分裂促進性および血管形成誘導因子活性の中でもそうである。さらにこれらの生理活性ペプチドは、１〜１０ｎＭ範囲で成人ヒト角化細胞増殖を促進し、例えば、ＰＫ  ＳＡＮＴＹＬコラゲナーゼＡＰＩ内に存在する角化細胞増殖促進活性を完全に説明する図３Ｂを参照のこと（図３Ｂ、ＰＫ対ＴＳＮ１、ＴＳＮ２、ＴＳＮ１０を参照）。これは特に顕著であるが、それは、これらのペプチドが血管内皮増殖を促進するだけでなく、成人ヒト角化細胞増殖を促進するからである。
【００５４】
文献で明らかにされているように、細胞が増殖因子減少マトリゲル上に播種されるかまたはその中に包埋されるかの何れかである場合、開存している微小血管内皮が裏打ちしている「管」をインビトロで作製し得る。新たに同定され、合成されたＥＣＭ由来および「再操作」ペプチドが、既に明らかにされている微小血管内皮増殖促進活性に加えて、創傷治癒血管形成を刺激することが可能か否かを解明するために、集団密度に合致した細胞数を対照またはペプチド処理培養において播種し、ペプチドの血管形成活性を培養における時間の関数として定量した。代表例で見ることができるように（図４）、血管内皮細胞外マトリクス由来ペプチドの一部を皮膚毛細血管から単離されたヒト微小血管内皮細胞に適用した場合、インビトロで血管形成活性化および管形成を生じさせる著しく顕著な形態形成事象があった（図４）。毛細血管様および管様アレイを与えることができなかった試験対照または細胞集団とは異なり、ＴＳＮ１、ＴＳＮ８およびＴＳＮ１０はインビトロで血管形成を著しく促進した。ＴＳＮ１／２内に存在する機能特異的ドメインおよびＴＳＮ１０内に存在する新たに操作された「コンビナトリアル」ペプチドは、インビトロ血管形成を促進することが可能である。ＴＳＮペプチドは、遊走、増殖および管形成を刺激することによって形態形成および血管形成活性化を促進し；ペプチド刺激性内皮管はより多く、より長く、より多くの分岐点を有し、処理された内皮細胞培養を制御する。
【００５５】
受傷後遊走が同様に刺激されるか否かを判定するために、一連の試験を行って、生理活性ペプチドの１つまたは別のものが損傷に対する移動反応を促進し得るか否かまたはそれがどの程度かを明らかにした。生理活性創傷治癒ペプチドまたは対照実体の存在下または非存在下での機械的な受傷前に、ポストコンフルエント（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）密度でヒト表皮由来角化細胞を播種した。図５から、ＴＳＮ２およびＴＳＮ６を含むペプチド内で組み入れられる著しい遊走促進活性が明らかになる。同様に、血管形成誘導性活性を有するＴＳＮ２が損傷に反応して角化細胞遊走も促進するので、これらのデータから、このトロンボスポンジン−１ドメインにおいて組み入れられる遊走促進活性が同じように、または同じ分子機序を通じて、角化細胞および内皮細胞上で作用し得ることが示唆される。
【００５６】
実施例３：ＳＡＮＴＹＬ（登録商標）コラゲナーゼＡＰＩにより作製され、細胞外マトリクス由来であるペプチドは、インビボで損傷および創傷治癒に対する細胞反応を顕著に刺激する。
インビトロで顕著な遊走促進、増殖促進および血管形成誘導性活性を有する本明細書中に記載のペプチドは、同様にインビボで創傷治癒活性を保持する。インビボでの創傷治癒試験のために、治癒障害、シクロホスファミド誘導性好中球減少症のモデルを使用した。頭蓋全体にわたる皮膚組織の全層切除創傷作製を行った。８ｍｍ直径の全層切除創傷をマウス１匹あたり１個しか作製し得ない一方で、治癒が起こる手段はヒト皮膚創傷治癒と、すなわち遊走および増殖対収縮を介して密接に同調する（げっ歯類の側腹部のケースのように）。これらの目的で、実験動物のケアおよび福祉に対するＮＩＨ指針に従って動物を処置し、完全な麻酔下で損傷を与え、次いで術後に苦痛の軽減を行った。
【００５７】
シクロホスファミド処置後、動物に損傷を与え、次いで創傷を処置し／被覆した。試験実体をコード化して、実験物の性質が実験者に分からないようにし；各検体を評価し、実験コードを明らかにする前に、表２で示される創傷治癒システムに従い盲検的にスコア化した。現在まで、いくつかの実験を行っており、各試験実体は四つ組で送達し；投薬試験はナノモル濃度（ｎＭ）〜マイクロモル濃度（μＭ）の範囲の本ペプチドの用量を使用して進行中である。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
前臨床インビトロモデル実験で有効であることが証明されているペプチドのいくつかは、損傷に対する細胞および組織反応を同様におよび著しく刺激し、これらは全て、未処置対照またはコラゲナーゼ処置群と比較した場合、創傷閉鎖の加速を助長した（図７Ａ〜７Ｌ、８および９を参照）。実際に、未処置対照またはコラゲナーゼ、単独もしくは他のペプチドでの処置群と比較して、創傷を治癒させるために、ペプチド処置群（および特にＴＳＮ６で処置したもの、これはマルチメリン内に含有されるコイル状ドメインから構成される）を著しく刺激した。
【００６０】
引用参考文献
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７．  Ｆａｌａｎｇａ  Ｖ．２００５．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ．Ｌａｎｃｅｔ．  ３６６：１７３６-１７４３．［ＰｕｂＭｅｄ］
８．  Ｈｅｒｍａｎ  ＩＭ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ，ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅｐａｒｉｎ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１９９０；２０  Ｓｕｐｐｌ  １：１６６−７７．
９．  Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＰＭ，Ｈｅｒｍａｎ  ＩＭ．Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３  Ｍａｙ；１５５（２）：３８５−９３．ＰＭＩＤ：８４８２７３０．
１０．  Ｈｅｒｍａｎ  ＩＭ，Ｃａｓｔｅｌｌｏｔ  ＪＪ  Ｊｒ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１９８７  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：４６３−９．ＰＭＩＤ：３６７５３０５
【００６１】
参照による組み込み
本明細書中で言及される刊行物および特許は全て、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書中のあらゆる定義を含め、本願が優先される。
【００６２】
同等物
本発明の具体的な実施形態が明確に本明細書中で開示される一方で、上記の明細書は例示的なものであり、限定するものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を再検討すれば、本発明の多くの変形物が当業者にとって明らかとなろう。本発明の完全な範囲は、かかる変形物とともに、同等物および明細書のそれらの完全な範囲とともに、特許請求の範囲を参照することによって決定されるべきである。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018502566.tif 000013
【図７Ｃ】
2018502566.tif 000014
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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