(57)【要約】  複数のウェルの間の流体の流れを可能にする流体装置およびアセンブリが開示される。最初に分離された組織培養物を流体流によって連結して統合組織応答を測定することを可能にすることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織環境を模倣する流体装置およびアセンブリが提供される。流体装置およびアセンブリは、表面張力、重力、およびチャネルの幾何学的形状を使用するポンプレスシステムを提供する。組織間のｉｎ  ｖｉｖｏフィードバックおよび応答信号をより良好にシミュレートするためにヒト組織機能系を連結することにより、動物における試験の必要性を最小限に抑えることができる。【選択図】図２
2018512171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって、
前記試験化合物を含む動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用するステップであって、前記流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、前記動的投与ウェルの下流に配置され、前記動的投与ウェルと流体連通する、複数の動的ウェルを含む、ステップと、
前記試験化合物を含む静的流体を静的ウェルに適用するステップと、
前記複数のウェルの少なくとも１つのパラメータを測定するための動的バイオアッセイを実施し、動的値を決定するステップと、
前記静的ウェルの前記パラメータを測定するための静的バイオアッセイを実施し、静的値を決定するステップと、
前記試験化合物への前記細胞培養物の応答によって前記パラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために前記動的値を前記静的値と比較するステップと、
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法。
【請求項２】
試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって、
前記試験化合物を含む動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用するステップであって、前記流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、前記動的投与ウェルの下流に配置され、前記動的投与ウェルと流体連通する、複数の動的ウェルを含む、ステップと、
前記試験化合物を含まないコントロール流体を前記流体装置のコントロール投与ウェルに適用するステップであって、前記流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、前記コントロール投与ウェルの下流に配置され、前記コントロール投与ウェルと流体連通する、複数のコントロールウェルをさらに含む、ステップと、
前記複数の動的ウェルの少なくとも１つの前記パラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施し、動的値を決定するステップと、
前記複数のコントロールウェルの少なくとも１つの前記パラメータを測定するためにコントロールバイオアッセイを実施し、コントロール値を決定するステップと、
前記試験化合物への前記細胞培養物の応答によって前記パラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、前記動的値を前記コントロール値と比較するステップと、
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法。
【請求項３】
試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって、
第１の濃度の試験化合物を有する動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用するステップであって、前記流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、前記動的投与ウェルの下流に配置され、前記動的投与ウェルと流体連通する、複数の動的ウェルを含む、ステップと、
前記複数の動的ウェルの少なくとも２つのパラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施し、第１の動的値および第２の動的値を決定するステップと、
前記試験化合物への前記細胞培養物の応答によって前記パラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、前記第１の動的値を前記第２の動的値と比較するステップと、
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法。
【請求項４】
前記動的値は、前記パラメータとして百分率Ｘ（ＥＣｘ）での動的有効濃度を含み（０≦Ｘ≦１００）、
前記静的値は前記パラメータとして静的ＥＣｘを含み、
前記静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、前記試験化合物への前記細胞培養物の応答が前記パラメータを増強することを予測し、前記静的ＥＣｘに対する前記少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、前記試験化合物への前記細胞培養物の応答が前記パラメータを減少させることを予測する、
ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動的値は、前記パラメータとして百分率Ｘ（ＥＣｘ）での動的有効濃度を含み（０≦Ｘ≦１００）、
前記コントロール値は前記パラメータとしてコントロールＥＣｘを含み、
前記コントロールＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、前記試験化合物への前記細胞培養物の応答が前記パラメータを増強することを予測し、前記コントロールＥＣｘに対する前記少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、前記試験化合物への前記細胞培養物の応答が前記パラメータを減少させることを予測する、
ことをさらに備える、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｘが５０であり、および／または前記パラメータが細胞傷害性である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのストップウェルから前記動的流体の一部を除去するステップであって、前記ストップウェルが前記複数の動的ウェルのうちの１つである、ステップと、
前記動的バイオアッセイに備えて前記動的流体の前記流れを制御するために前記少なくとも１つのストップウェルに液体ストップを適用するステップと、
をさらに含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのストップウェルから前記動的流体を除去するステップであって、前記ストップウェルが前記複数の動的ウェルのうちの１つである、ステップと、
前記動的バイオアッセイに備えて前記動的流体の前記流れを制御するために前記少なくとも１つのストップウェルを満たすよう液体ストップを適用するステップと、
をさらに含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の動的ウェルの少なくとも１つに選択的に係合可能な物理的ストップを提供するステップと、
前記動的バイオアッセイに備えて前記動的流体の前記動的ウェルからの流れを制御するために前記物理的ストップを前記複数の動的ウェルの前記少なくとも１つと係合させるステップと、
をさらに含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物は、薬物、合法もしくは違法薬物、毒素、兵器用物質、追跡化合物、芳香剤、食物スパイス、油、ガス、代謝産物、化合物、ホルモン、溶液、溶質、複合体、栄養補給剤、栄養培地、分化培地、または様々な溶存酸素レベルを有する増殖培地の１つ以上を含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養物は、腫瘍細胞株；初代肝細胞；幹細胞；前駆細胞；幹細胞の分化した産物；肝臓、腎臓、肺、心臓、筋肉、脳、膵臓、もしくは甲状腺からの初代細胞または組織；ＨｅｐＧ２細胞株培養物；ＨｅｐａＲＧ細胞株培養物；または２次元もしくは３次元フォーマットで培養されたヒト、イヌ、非ヒト霊長類、マウス、もしくはラットの組織から直接誘導された細胞培養物、の１つ以上を含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養物の応答は、薬物動態学的応答、薬力学的応答、前記試験化合物の代謝、流体成分の代謝、細胞傷害性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞分化、または細胞再生の１つ以上を含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１３】
前記パラメータは、代謝副産物、毒性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞傷害性、細胞分化、細胞再生、濃度、放射線、光学的品質、蛍光、発光、化学成分の存在、抗原成分の存在、比色分析、画像もしくは可視化品質、電気的特性、磁気特性、または吸光度の１つ以上を含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１４】
任意の１つ以上の前記バイオアッセイを実施するステップは、１つ以上の時間間隔で前記それぞれのウェルから前記それぞれの流体のアリコートを除去するステップを含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１５】
前記動的流体および／または前記コントロール流体を適用するステップは、特定の時間にわたって所定の間隔で特定の体積を使用して繰り返される、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項１６】
前記動的流体および／または前記コントロール流体を適用するステップは、ロボット液体ハンドリング装置によって、または前記流体装置と入れ子式に係合するピストンアセンブリを使用することによって、自動的に実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記動的流体および／または前記コントロール流体を適用するステップが繰り返される場合に、前記それぞれの投与ウェルから最も遠い前記下流のウェルから前記それぞれの流体を吸い上げるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記それぞれの流体を吸い上げるステップは、ロボット液体ハンドリング装置によって自動的に実行される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
既知の濃度の検出可能な追跡化合物を有する追跡流体を前記流体装置の追跡投与ウェルに適用するステップであって、前記流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、前記追跡投与ウェルの下流に配置され、前記追跡投与ウェルと流体連通する、複数の追跡ウェルをさらに含む、ステップと、
前記複数の動的ウェルそれぞれにおける前記試験化合物の濃度を算出するために前記追跡化合物の前記濃度を標準曲線として決定するステップと、
をさらに含む、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養物を有する前記複数の動的ウェルに影響検出試薬が存在し、前記動的ＥＣｘの決定は前記影響検出試薬の検出を含む、請求項４、５、または６に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのストップウェルから前記流体を除去するステップは、ピペット、ウィック、真空、またはサイホンを使用して行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項２２】
前記動的流体、前記静的流体、および／または前記コントロール流体は、気体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／１３６，９１１号の利益を主張し、さらに本出願は、２０１６年３月１４日に出願された米国仮出願第６２／３０８，２０７号の利益を主張し、どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、投与流体を流体装置に供給し、複数のウェルの間を流体が流れることを可能にする流体装置と共に使用するための方法および関連システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
薬剤候補を市場に出すためには、１０億ドルのオーダーの費用がかかると推定されており、製薬業界は、ヒトの前臨床研究に投資することによって成功のチャンスを高めている。この資金は、ヒトベース製品の吸収、分布、代謝、排泄、および毒物学（ＡＤＭＥＴ）市場を年間５０億ドルの産業に導いている。薬物候補を試験するための現在の技術は、均質な培養技術および動物モデルに基づいている。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ（インビボ）フィードバックおよび組織間の応答信号をより良好にシミュレートし、動物での試験を最小限に抑えるために、ヒト組織機能系をリンクすることができるバイオツール装置の満たされていない必要性が存在する。Ａ．Ａ．Ｅｌｆａｒｒａ編（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年）のＡｍｉｔ  Ｓ．  Ｋａｌｇｕｔｋａｒの出版物“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０００４】
本出願は、２０１４年１２月２日に出願された米国仮出願第６２／０８６，６２３号、２０１２年９月６日に出願された米国仮出願第６１／６９７，３９５号、２０１３年９月３日に出願された米国特許出願第１４／０１６，９１３号、および２０１５年１１月３０日に出願された米国特許出願第１４／９５４，５４６号の発明の主題に関し、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの出願に記載されているいくつかの実施形態では、培地は、毛細管を相互接続することにより、細胞培養物を含む流体装置のウェルにわたって吸い上げられる。
【発明の概要】
【０００５】
薬物、毒素、および他の環境ストレス要因に対する細胞応答の評価に用いられる現在のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロ）生化学アッセイは、従来の静的ウェル培養技術が中心となっている。これらのアッセイには、個々のウェルを単離する能力を必要とする様々な生細胞または死細胞酵素アッセイを含むことができる。本発明は、隣接する下流のウェルの間を流れる培地（媒体）を有する流体装置が、流体の流れを効果的に停止させて、１つのウェルから隣接するウェルへの汚染を防止して測定を行うことを可能にすることができる。さらに、本発明は、化学的、毒性、または細胞代謝の勾配を維持しながら、測定が完了すると流体の流れを再開させることを可能にする。さらに、本発明は、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少したか増強されたかを判定するための方法を提供する。
【０００６】
したがって、本開示では、流体装置およびアセンブリならびにそれらの使用方法が提供される。
【０００７】
この発明の概要は、以下の発明を実施するための形態でさらに説明する概念の選択を簡略化した形で紹介するために提供される。この発明の概要は、特許請求された発明の主題の重要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図するものでもなく、請求される主題の範囲を限定するために使用されることも意図していない。
【０００８】
本明細書では、試験化合物への細胞培養物の応答（試験化合物に対する細胞培養物の応答）によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって：試験化合物を含む動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用する（加える）ステップであって、流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、動的投与ウェルの下流に配置され、動的投与ウェルと流体連通する複数の動的ウェルを含む、ステップと；試験化合物を含む静的流体を静的ウェルに適用するステップと；複数のウェルの少なくとも１つのパラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施し、動的値を決定するステップと；静的ウェルのパラメータを測定するために静的バイオアッセイを実施し、静的値を決定するステップと；パラメータが試験化合物への細胞培養物の応答によって減少または増強されたかどうかを判定するために動的値を静的値と比較するステップと、を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法を開示する。
【０００９】
本明細書では、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって：試験化合物を含む動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用するステップであって、流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、動的投与ウェルの下流に配置され、動的投与ウェルと流体連通する複数の動的ウェルを含む、ステップと；試験化合物を含まないコントロール流体を流体装置のコントロール投与ウェルに適用するステップであって、流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、コントロール投与ウェルの下流に配置され、コントロール投与ウェルと流体連通する複数のコントロールウェルをさらに含む、ステップと；複数の動的ウェルの少なくとも１つのパラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施し、動的値を決定するステップと；複数のコントロールウェルの少なくとも１つのパラメータを測定するためにコントロールバイオアッセイを実施し、コントロール値（対照値）を決定するステップと；試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、動的値をコントロール値と比較するステップと、を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法を開示する。
【００１０】
本明細書では、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法であって：第１の濃度の試験化合物を有する動的流体を流体装置の動的投与ウェルに適用するステップであって、流体装置は、それぞれが細胞培養物を含み、動的投与ウェルの下流に配置され、動的投与ウェルと流体連通する複数の動的ウェルを含む、ステップと；複数の動的ウェルの少なくとも２つのパラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施し、第１の動的値および第２の動的値を決定するステップと；試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、第１の動的値を第２の動的値と比較するステップと、を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法を開示する。
【００１１】
１つ以上の実施形態によれば、動的値は、パラメータとして百分率Ｘ（ＥＣｘ）での動的有効濃度を含み（０≦Ｘ≦１００）；静的値はパラメータとして静的ＥＣｘを含み；静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを増強することを予測し、静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを減少させることを予測する。
【００１２】
１つ以上の実施形態によれば、動的値は、パラメータとして百分率Ｘ（ＥＣｘ）での動的有効濃度を含み（０≦Ｘ≦１００）；コントロール値はパラメータとしてコントロールＥＣｘを含み；コントロールＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを増強することを予測し、コントロールＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを減少させることを予測する。
【００１３】
１つ以上の実施形態によれば、Ｘは５０であり、細胞培養物の応答および／またはパラメータは細胞傷害性（細胞毒性）である。
【００１４】
１つ以上の実施形態によれば、試験化合物は、薬物、合法もしくは違法薬物、毒素、兵器用物質（ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ｗａｒｆａｒｅ）、追跡化合物、芳香剤、食物スパイス、油、ガス、代謝産物、化合物、ホルモン、溶液、溶質、複合体、栄養補給剤、栄養培地、分化培地、または様々な溶存酸素レベルを有する増殖培地の１つ以上を備える。
【００１５】
１つ以上の実施形態によれば、影響は、（本明細書に記載の）細胞培養物の応答、薬物動態、薬物代謝、毒性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞傷害性、細胞分化、または細胞再生の１つ以上である。
【００１６】
１つ以上の実施形態によれば、細胞培養物は：腫瘍細胞株；初代肝細胞；幹細胞；前駆細胞；幹細胞の分化した産物；肝臓、腎臓、肺、心臓、筋肉、脳、膵臓、もしくは甲状腺からの初代細胞または組織；ＨｅｐＧ２細胞株培養物；ＨｅｐａＲＧ細胞株培養物；または２次元もしくは３次元フォーマットで培養されたヒト、イヌ、非ヒト霊長類、マウス、もしくはラットの組織から直接誘導された細胞培養物、の１つ以上を備える。
【００１７】
１つ以上の実施形態によれば、細胞培養物の応答は、薬物動態学的応答、薬力学的応答（ｐｈａｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、試験化合物の代謝、流体成分の代謝、細胞傷害性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞分化、または細胞再生の１つ以上を備える。
【００１８】
１つ以上の実施形態によれば、パラメータは、代謝副産物、毒性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞傷害性、細胞分化、細胞再生、濃度、放射線、光学的品質、蛍光、発光、化学成分の存在、抗原成分の存在、比色分析、画像もしくは可視化品質、電気的特性、磁気特性、または吸光度の１つ以上を備える。
【００１９】
１つ以上の実施形態によれば、本方法は、少なくとも１つのストップウェルから動的流体の一部を除去するステップであって、ストップウェルが複数の動的ウェルのうちの１つである、ステップと；動的バイオアッセイに備えて動的流体の流れを制御するために少なくとも１つのストップウェルに液体ストップ（液体ストッパ）を適用するステップと、をさらに含む。
【００２０】
１つ以上の実施形態によれば、本方法は、少なくとも１つのストップウェルから動的流体を除去するステップであって、ストップウェルが複数の動的ウェルのうちの１つである、ステップと；動的バイオアッセイに備えて動的流体の流れを制御するために少なくとも１つのストップウェルを満たすよう液体ストップを適用するステップと、をさらに含む。
【００２１】
１つ以上の実施形態によれば、本方法は、複数の動的ウェルの少なくとも１つに選択的に係合可能な物理的ストップ（物理的ストッパ）を提供するステップと；動的バイオアッセイに備えて動的流体の動的ウェルからの流れを制御するために物理的ストップを複数の動的ウェルの少なくとも１つと係合するステップと、をさらに含む。
【００２２】
１つ以上の実施形態によれば、任意の１つ以上のバイオアッセイの実施するステップは、１つ以上の時間間隔（時間周期）でそれぞれのウェルからそれぞれの流体のアリコート（分割量；ａｌｉｑｕｏｔ）を除去することを含む。
【００２３】
１つ以上の実施形態によれば、動的流体および／またはコントロール流体を適用するステップは、特定の時間期間にわたって所定の間隔で特定の体積を使用して繰り返される。
【００２４】
１つ以上の実施形態によれば、動的流体および／またはコントロール流体を適用するステップは、ロボット液体ハンドリング装置によって、または流体装置と入れ子式に係合するピストンアセンブリを使用することによって、自動的に実行される。
【００２５】
１つ以上の実施形態によれば、本方法は、動的流体および／またはコントロール流体を適用するステップが繰り返される場合に、それぞれの投与ウェルから最も遠い下流のウェルからそれぞれの流体を吸い上げるステップをさらに含む。
【００２６】
１つ以上の実施形態によれば、それぞれの流体を吸い上げるステップは、ロボット液体ハンドリング装置によって自動的に実行される。
【００２７】
１つ以上の実施形態によれば、本方法は、既知の濃度の検出可能な追跡化合物を有する追跡流体を流体装置の追跡投与ウェルに適用するステップであって、流体装置は、それぞれ細胞培養物を含み、追跡投与ウェルの下流に配置され、追跡投与ウェルと流体連通する複数の追跡ウェルをさらに含む、ステップと；複数の動的ウェルそれぞれにおける試験化合物の濃度を算出するために追跡化合物の濃度を標準曲線として決定するステップと、をさらに含む。
【００２８】
１つ以上の実施形態によれば、細胞培養物を有する複数の動的ウェルに影響検出試薬が存在し、動的ＥＣｘの決定は影響検出試薬の検出を含む。
【００２９】
１つ以上の実施形態によれば、少なくとも１つのストップウェルから流体を除去するステップは、ピペット、ウィック（芯；ｗｉｃｋ）、真空、またはサイホンを使用して行われる。
【００３０】
１つ以上の実施形態によれば、動的流体、静的流体、および／またはコントロール流体は、気体である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
前述の発明の概要、ならびに様々な実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面と併せて読めばより良好に理解される。例示のために、図面には例示的な実施形態が示されているが、ここに開示される発明の主題は、開示された特定の方法および手段に限定されない。
【００３２】
【図１】本開示の実施形態による流体装置の斜視図である。
【００３３】
【図２】本開示の実施形態による、投与ウェルチャネルを包囲する投与ウェルチャネルカバーおよび隣接するウェル間に延びる１つ以上のチャネルを包囲するチャネルカバーを示す、図１の流体装置の斜視図である。
【００３４】
【図３Ａ−３Ｃ】本開示の実施形態による図２の流体装置から分離されたウィックを示す図である。
【００３５】
【図４】本開示の実施形態による図２の流体装置から分離された投与ウェルチャネルカバーを示す図である。
【００３６】
【図５】本開示の実施形態による、投与ウェル、投与ウェルチャネル、隣接する下流ウェル、およびそれらの間に延びる１つ以上のチャネルの拡大図を示す、図１の流体装置の拡大上面図である。
【００３７】
【図６】本開示の実施形態によるリザーバトレイの斜視図である。
【００３８】
【図７】本開示の実施形態によるリザーバトレイの底面図である。
【００３９】
【図８】本開示の実施形態による、流体装置の上部に入れ子式に係合されるリザーバトレイと、リザーバトレイの上部に入れ子式に係合されるカバートレイとを含むアセンブリの一部としての、図１の流体装置の分解斜視図である。
【００４０】
【図９】本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置の上部に係合されるピストンアセンブリの断面図である。
【００４１】
【図１０】本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリの断面図である。
【００４２】
【図１１】本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリの側面図である。
【００４３】
【図１２】本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリのリザーバトレイの上面図である。
【００４４】
【図１３】本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリのリザーバトレイの底面図である。
【００４５】
【図１４】本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリのリザーバカバーの上面図である。
【００４６】
【図１５】本開示の１つ以上の実施形態によるクランクアセンブリを含むピストンアセンブリを示す図である。
【００４７】
【図１６】本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置の上部に係合されるピストンアセンブリの底面斜視図である。
【００４８】
【図１７】本開示の１つ以上の実施形態による流体装置の底面図である。
【００４９】
【図１８】本開示の１つ以上の実施形態による流体装置の上面図である。
【００５０】
【図１９】本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置の上部に係合されるピストンアセンブリの側面図である。
【００５１】
【図２０】本開示の１つ以上の実施形態による３つのソレノイドを含むピストンアセンブリの上面図である。
【００５２】
【図２１】本開示の１つ以上の実施形態による１つのソレノイドを含むピストンアセンブリの上側斜視図である。
【００５３】
【図２２】本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置、ピストン、ピストンバー、および１つのソレノイドの上側斜視図である。
【００５４】
【図２３】本開示の１つ以上の実施形態によるソレノイドおよび電子ユニットの上側斜視図である。
【００５５】
【図２４】本開示の１つ以上の実施形態によるソレノイドを含むピストンアセンブリの上側斜視図である。
【００５６】
【図２５】本開示の実施形態によるカバートレイ、流体装置の上部に入れ子式に係合されたリザーバトレイ、および流体装置の下に入れ子式に係合された第２のリザーバトレイを含む、アセンブリの一部としての、図１の流体装置の側面図である。
【００５７】
【図２６】本開示の実施形態による入れ子式係合状態にある２つの追加の流体装置をさらに含む図２５のアセンブリの側面図である。
【００５８】
【図２７】細胞培養物への影響を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。
【００５９】
【図２８】細胞培養物の細胞傷害性を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。
【００６０】
【図２９】実施例２で使用される流体装置の設計特徴を示す図である。
【００６１】
【図３０】実施例２で使用される流体装置の使用概要を示す図である。
【００６２】
【図３１】実施例２で使用される流体装置の例示的なウェルとの流体工学混合を示す図である。
【００６３】
【図３２】決定された最適なＺ高さ焦点を示す表である。
【００６４】
【図３３】決定されたフルオレセイン標準曲線を描いたグラフである。
【００６５】
【図３４】実験的プレート構成を示す図である。
【００６６】
【図３５】経時的なタモキシフェンＡＵＣの影響を示す図である。
【００６７】
【図３６】タモキシフェン濃度に時間ＥＣ５０を掛けたものを示す図である。
【００６８】
【図３７】ＡＰＡ濃度に時間ＥＣ５０を掛けたものを示す図である。
【００６９】
【図３８】少なくとも１つの流体ＥＣ５０が静的ＥＣ５０と比較される実施形態を示す図である。
【００７０】
【図３９】７２時間にわたってプロットされた２つのウェルにおけるフルオレセイン濃度を示す図である。
【００７１】
【図４０】タモキシフェンへのＨｅｐＧ２応答に対する流れの影響を示す図である。
【００７２】
【図４１】本発明の１つ以上の実施形態によるチャネルカバーおよびウェル行を示す図である。
【００７３】
【図４２】本発明の１つ以上の実施形態による流体装置のウェルの行を示す。
【００７４】
【図４３】本発明の１つ以上の実施形態による液体プラグイントラウェル（ｉｎｔｒａ−ｗｅｌｌ）方法を示す図である。
【００７５】
【図４４】本発明の１つ以上の実施形態による液体プラグインターウェル（ｉｎｔｅｒ−ｗｅｌｌ）方法を示す図である。
【００７６】
【図４５】本発明の１つ以上の実施形態による、流体の流れを制御するための物理的プラグを示す図である。
【００７７】
【図４６】流体装置および静止プレートにおいて７日および９日間にわたってアセトアミノフェンで処理した培養細胞の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本明細書に開示される発明の主題は、一態様において、組織間のｉｎ  ｖｉｖｏフィードバックおよび応答信号をより良好にシミュレートし、動物モデルにおける試験の必要性を最小限に抑えるために、ヒト機能系をリンクすることができる流体装置およびアセンブリを提供する。例えば、本明細書に開示される発明の主題の装置およびアセンブリは、最初に分離された組織培養物を流体流によってリンクして統合組織応答を測定することを可能にすることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織環境を模倣することができる。本開示の装置およびアセンブリは、必要に応じて活性化される細胞培養物の統合および培地の流れを可能にすることができる。本明細書で開示される発明の主題の装置およびアセンブリは、表面張力、重力、およびチャネルの幾何学的形状を使用するポンプレスシステムを提供することができる。本開示の装置およびアセンブリは、統合されたチャネルを通って時限的に調整された栄養素流を提供することができる。本開示の装置およびアセンブリは、特定の細胞部位で毒素曝露（例えば、薬物曝露）を誘導するための選択肢を提供することができる。
【００７９】
本明細書で開示する発明の主題は、法定要件を満たすために具体的に記載されている。しかしながら、説明自体は、この特許の範囲を限定するものではない。むしろ、本発明者は、特許請求の範囲に記載の発明の主題が、他の現在のまたは将来の技術と併せて、この文書に記載されたものと同様の様々なステップまたは要素を含むように、他の方法で具体化され得ることを意図している。
【００８０】
これらの説明は、広い本発明の主題事項の１つ以上の特定の実施形態の理解を提供するのに十分詳細に提示される。これらの説明は、本発明の主題事項を明示的に記載された実施形態および特徴に限定することなく、それらの特定の実施形態の特定の特徴を詳述し例示するものである。これらの記述を考慮すると、本発明の主題事項の範囲から逸脱することなく、追加の類似の実施形態および特徴が得られる可能性が高い。「ステップ」という用語は、処理または方法の特徴に関して明示的に使用または暗示することができるが、順序またはシーケンスが明示されていない限り、そのような表現または暗示されたステップの間の任意の特定の順序またはシーケンスには意味がない。
【００８１】
図面およびこれらの説明に表されているかまたは暗示されている任意の寸法は、例示のために提供される。したがって、図面およびこれらの説明の範囲内のすべての実施形態は、そのような例示的な寸法に従って行われるわけではない。図面は必ずしも縮尺通りに作られていない。したがって、図面およびこれらの説明の範囲内のすべての実施形態が、図面の相対的寸法に関する図面の見かけのスケールに従って作られるわけではない。しかしながら、各図面について、少なくとも１つの実施形態が、図面の見かけの相対的なスケールに従って作成される。
【００８２】
図１は、本開示の実施形態による流体装置１００の斜視図である。流体装置１００は、それぞれのホスト流体を収容する複数のウェル１２０の上流に配置された投与ウェル１１０と、隣接する上流および下流ウェル１２０との間に延在する１つ以上のチャネル１３０とを含み、投与ウェル１１０に沈積した投与流体１が、隣接する下流ウェル１２０のそれぞれのホスト流体にその間の流体流チャネル１３０に沿って流れ、その後、それぞれのホスト流体が、各隣接する下流ウェル１２０にその間の流体流チャネル１３０に沿って流れるよう、その間の流体流チャネル１３０を画定することができる。
【００８３】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、隣接する各下流ウェル１２０がその隣接する上流ウェル１２０に対して降下位置に向くような構造を有することができる。この降下ウェル位置決め構造を有する流体装置１００の例を図１に示す。
【００８４】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、複数のウェル１２０の少なくとも一部の下流にウィック１４０を含むことができる。ウィック１４０は、複数のウェル１２０を通る流体の流れを調整するために、流体流チャネル１３０と流体接触している。明細書および特許請求の範囲の目的のために、「ウィック」という用語は、最も広い意味で、毛管作用によって液体を運ぶことができる材料片を指すために使用されることを意味する。
【００８５】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、投与ウェル１１０の底部から流体流チャネル１３０まで延在する投与ウェルチャネル１５０を含むことができ、投与流体１が、隣接する下流ウェル１２０のそれぞれのホスト流体に、投与ウェルチャネル１５０を通って、流体流チャネル１３０に沿って流れる。投与ウェル１１０の側面は、投与ウェル１１０の底部から、隣接するウェル１２０の流体流チャネル１３０まで延在する９０°より大きい角度を画定することができる。１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、複数のウェル１２０の下流に、複数のウェル１２０を流れた後にそれぞれのホスト流体を収集するための収集ウェル１７０を含む。流体装置１００の収集ウェル１７０は、ディボット（窪み；ｄｉｖｏｔ）１８０を画定するフロアを含むことができ、フロアは、ディボット１８０がフロアの下部に画定されるように角度付け（傾斜）される。本明細書の以下に記載されるような本開示による特定の実施形態では、収集ウェル１７０のフロアの下部は、ディボット１８０の代替物としての開口部を画定することができる。別の例では、ディボット１８０は、本明細書で後述するように、流体装置１００をアセンブリで使用するための開口部に変換することができる。
【００８６】
本開示の実施形態によれば、流体装置１００の収集ウェル１７０は、流体流チャネル１３０から収集ウェル１７０の底部まで延びる１つ以上の収集ウェルチャネル２１０を含むことができ、隣接する上流ウェル１２０のそれぞれのホスト流体が、流体流チャネル１３０に沿って、収集ウェルチャネル２１０を通って、収集ウェル１７０内に流れる。収集ウェルチャネル２１０は、約１０〜３５００ミクロンの範囲の幅および約１０〜３５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。収集ウェル１７０は、収集ウェル１７０の底部から、隣接する上流ウェル１２０の流体流チャネル１３０まで延びるランプ（斜面）を画定することができる。ランプは、ランプに隣接する、１、２、３、または４個の収集ウェルチャネル２１０を含むことができる。
【００８７】
図２は、本開示の実施形態による流体装置１００の斜視図である。図２は、流体装置１００が投与ウェルチャネル１５０を囲むように構成された投与ウェルチャネルカバー１６０を含むことができることを示している。投与ウェルチャネルカバー１６０の一例が図２に示されており、８つの投与ウェル（Ａ〜Ｈ）のそれぞれが、投与ウェルチャネルカバー１６０で覆われている。図２および図４１はまた、流体装置１００が、チャネル１３０を囲むように隣接ウェル１２０の間に延びる１つ以上のチャネル１３０の上部に係合するように構成されたチャネルカバー２３０を含むことができることを示している。
【００８８】
本開示のウィックは、流体流チャネル１３０と流体接触し、複数のウェル１２０を通る流体流を調節するのに適した任意の形状を画定することができる。例えば、本明細書に開示される発明の主題のウィックは、任意の吸収性材料とすることができる。ウィックは、０．０００７ｍｌ／分〜３０ｍｌ／分の速度範囲で複数のウェル１２０を通る流体流を調節することができる。一例では、複数のウェル１２０のそれぞれを通ってウィックに流入した後のそれぞれのホスト流体を、ウィックから蒸発させることができる。
【００８９】
図２は、複数のウェル１２０の一部から下流の別々の位置でのウィックの２つの例（すなわち、ウィック１４０およびウィック１４２）を示す。図３Ａから図３Ｃは、本開示の１つ以上の実施形態によるウィックを示す。図３Ａは、円筒形状を有するウィック１４２の一例を示す。図３Ｃは、概ね平坦な形状を画定するウィック１４０の一例を示す。概ね平坦な形状を画定するウィックは、ウィックのエッジの一部のみが流体流チャネル１３０と流体接触するようなギャップを画定することができる。図３Ｃは、ギャップ１９０を画定するウィック１４４の一例を示す。
【００９０】
円筒形の形状を画定するウィック１４２が、図２および図３Ａに示されている。本開示のウィックは、複数のウェル１２０の少なくとも一部から下流の任意の場所に配置することができる。例えば、ウィック１４２が、複数の上流ウェル１２０を通る流体流を調整するために流体流チャネル１３０と流体接触するよう、図２の流体装置１００の８行目のウェル１２０に格納される、円筒状の形状を画定するウィック１４２が示される。
【００９１】
ウィックは、概ね平坦な形状を画定することができる。１つ以上の実施形態によれば、ウィック１４０または１４４が、複数のウェル１２０を通る流体流を調整するために流体流チャネル１３０と流体接触するよう、概ね平坦な形状を画定するウィック１４０または１４４は収集ウェル１７０に格納することができる。ウィックが収集ウェル１７０の底面と接触しないよう、概ね平らな形状を画定するウィックは、収集ウェル１７０によって画定される肩部によって支持され得る。概ね平らな形状を画定し、収集ウェル１７０によって画定される肩部によって支持されるウィック１４０の一例が、図２および図３Ｂに示されている。ウィックが収集ウェル１７０の底面と接触しないよう、概ね平らな形状を画定するウィックは、収集ウェル１７０によって画定される１つ以上のポスト（柱；ｐｏｓｔｓ）によって支持され得る。一実施形態では、ウィックが収集ウェル１７０の底面と接触しないよう、ウィックは概ね平らな形状を画定することができ、収集ウェル１７０によって画定される６つのポストによって支持され得る。
【００９２】
図４は、流体装置１００から分離した投与ウェルチャネルカバー１６０を示す。
【００９３】
図５は、本開示の実施形態による、投与ウェル１１０、投与ウェルチャネル１５０、隣接する下流ウェル１２０、およびそれらの間に延びる１つ以上のチャネル１３０の拡大図を示す、図１の流体装置の上面図である。投与ウェルチャネル１５０は、約１０〜３５００ミクロンの範囲の幅および約１０〜３５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。投与ウェルチャネル１５０は、投与ウェルチャネル１５０に隣接する２、３、または４個のチャネルを含むことができ、チャネルのそれぞれは、約２００〜１５００ミクロンの範囲の幅および約１０〜１５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。
【００９４】
流体装置１００の隣接する上流ウェル１２０と下流ウェル１２０との間に延びる１つ以上のチャネル１３０は、１０〜３５００ミクロンの範囲の幅および１０〜１５００ミクロンの深さを有することができる。単一チャネル１３０を有する流体装置１００の一例を図５に示す。チャネル１３０は、隣接するウェル１２０の各々の間に延びる三角形を画定することができる。三角形チャネル１３０は、三角形の形状が各隣接する下流ウェル１２０に概ね収束（合流）するように配置することができる。三角形形状が各隣接する下流ウェル１２０に概ね収束するように配置された三角形チャネル１３０を有する流体装置１００の一例を図５に示す。
【００９５】
流体装置１００は、２、３、または４個のチャネル１３０を有することができ、チャネル１３０の各々は、２００〜７５０ミクロンの範囲の幅および１０〜１５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。流体装置１００は、チャネル１３０に隣接する２、３、または４個のマイクロチャネル２００を含むことができ、マイクロチャネル２００のそれぞれは、２００〜７５０ミクロンの範囲の幅および１０〜１５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。三角形チャネル１３０に隣接する３つのマイクロチャネル２００を有する流体装置１００の例を図５に示す。
【００９６】
チャネルカバー２３０は、チャネルカバー２３０が流体装置１００のチャネル１３０の上部に係合した場合に、チャネルカバー２３０がチャネル１３０に隣接する２つ以上のマイクロチャネル２００を画定するよう、チャネルカバー２３０から延びる１つ以上の突起を含むことができる。例えば、チャネルカバー２３０は、チャネルカバー２３０が流体装置１００のチャネル１３０の上部に係合した場合に、チャネルカバー２３０がチャネル１３０に隣接する３つのマイクロチャネル２００を画定するよう２つの突起を有することができる。一実施形態では、チャネルカバー２３０によって画定されるマイクロチャネル２００の各々は、２００〜７５０ミクロンの範囲の幅および１０〜１５００ミクロンの範囲の深さを有することができる。
【００９７】
チャネル１３０、投与ウェルチャネル１５０、マイクロチャネル２００、および収集ウェルチャネル２１０のそれぞれの底面は、異なる形状を画定することができる。例えば、チャネル１３０、投与ウェルチャネル１５０、マイクロチャネル２００、および収集ウェルチャネル２１０は、弧状の底面または概ね平坦な底面を画定することができる。
【００９８】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、複数のウェル１２０が一行に整列した構造を有することができる。流体装置１００は、それぞれの行内に１２個のウェルを有し、合計８つの行を有することができる。この構造を有する流体装置１００の例を図１、図２、および図８に示す。流体装置１００は、一行に３個のウェルを有し、合計２行を有することができる。流体装置１００は、一行に６個のウェルを有し、合計４行を有することができる。流体装置１００は、一行に８個のウェルを有し、合計６行を有することができる。流体装置１００は、一行に１２個のウェルを有し、合計８行を有することができる。流体装置１００は、一行に２４個のウェルを有し、合計１６行を有することができる。流体装置１００は、一行に４８個のウェルを有し、合計３２行を有することができる。
【００９９】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００は、それぞれのホスト流体を収容するための複数のウェル１２０が、各下流ウェル１２０が各隣接上流ウェル１２０に対してより低く配置され、投与ウェル１１０が複数のウェル１２０の上流にあり、ウェル１２０と流体連通するような構成で配向される構造を有することができる。
【０１００】
本明細書に開示される発明の主題の流体装置１００は、複数のウェルの間で流体の調整された流れを必要とする任意の用途に使用することができる。１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００を使用する方法は、投与流体１を投与ウェル１１０に加えるステップ、および流体が流体流チャネル１３０と流体接触するよう複数のウェル１２０にそれぞれのホスト流体を加えるステップを含み、これにより、投与流体１は、複数のウェル１２０内の各ホスト流体のそれぞれに、調整されて流れる。本方法は、１つ以上の時間間隔でウェル１２０から各ホスト流体のアリコートを除去して、複数のウェル１２０を経て調整される投与流体１の経時的な影響を測定するステップを含むことができる。
【０１０１】
投与流体１は、例えば、これらに限定するものではないが、薬物、合法もしくは違法薬物、毒素、兵器用物質、芳香剤、食物スパイス、油、ガス、代謝産物、化合物、ホルモン、溶液、溶質、複合体、栄養培地、分化培地、または増殖培地、およびそれらの組み合わせを含むことができる。複数のウェル１２０は、それぞれの細胞培養物を含むことができ、それにより、細胞上の投与流体１への調整曝露の影響またはパラメータまたは応答を測定することができる。測定される細胞培養物上の投与流体１への調整曝露の影響またはパラメータまたは応答は、薬物動態、薬物代謝、毒性、前臨床薬学研究、細胞応答、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞死、細胞分化、または細胞再生、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上とすることができる。各細胞培養物は、例えば、幹細胞培養物または前駆細胞培養物とすることができる。
【０１０２】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００の複数のウェル１２０は、各細胞培養物を含むことができ、各細胞培養物を含む流体装置１００を使用する方法は、投与流体１を投与ウェル１１０に加えるステップと、流体が流体流チャネル１３０と流体接触するよう所望の各ホスト流体をウェル１２０に加えるステップと、を含む。続いて、複数のウェル１２０内の各ホスト流体のそれぞれに、投与流体１が調整されて流れる。本方法はさらに、細胞上の投与流体１の影響またはパラメータまたは応答を測定するために、１つ以上の時間間隔でウェル１２０から各ホスト流体のアリコートを除去するステップを含むことができる。
【０１０３】
流体装置１００は、複数のウェル１２０の間の流体移送に使用するのに適した任意の材料で作ることができる。選択される材料の種類は、流体装置１００の所望の用途によるであろう。例えば、流体装置１００の利用者は、使用される投与ウェル流体、および投与ウェル流体とその物質との予想される相互作用に基づいて、物質を選択することができる。したがって、流体装置１００は、例えば、ポリマー、合成ポリマー、ＴＯＰＡＳ（登録商標）ＣＯＣポリマー、生分解性ポリマー、プラスチック、生分解性プラスチック、熱可塑性物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ガラス、ＰＹＲＥＸ（登録商標）、もしくはホウケイ酸塩、またはそれらの組み合わせを含む、任意の適切な材料から作ることができる。さらに、投与ウェルチャネルカバー１６０、チャネルカバー２３０、およびウィック１４０、１４２、１４４はそれぞれ、流体装置１００と同じ材料から作製してもよい。一例では、利用者は、投与ウェル流体と材料との相互作用が変化しないよう、流体材料装置１００、投与ウェルカバー１６０、チャネルカバー２３０、およびウィック１４０、１４２、１４４のそれぞれを同じ材料から作製することを望む可能性がある。
【０１０４】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００の複数のウェル１２０の１つ以上の表面は、細胞培養物を支持する化学層またはタンパク質層の一方または両方で改変することができる。細胞培養物を支持するためのタンパク質層は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、ラミニン、もしくはフィブロネクチン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むことができる。
【０１０５】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００の複数のウェル１２０の間で流体が流れることを可能にするためのアセンブリが提供される。アセンブリは、流体装置１００と、流体装置１００の上部に入れ子式に係合するよう構成されたリザーバトレイ２５０とを含むことができる。図６は、本開示の実施形態によるリザーバトレイの斜視図を示す。図７は、本開示の実施形態によるリザーバトレイの底面図を示す。１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００、リザーバトレイ２５０、およびリザーバトレイ２５０または流体装置１００の上部に入れ子式に係合するように構成されたカバートレイ２６０を含むアセンブリが提供される。図８は、本開示の実施形態による、流体装置１００の上部に入れ子式に係合されたリザーバトレイと、リザーバトレイの上部に入れ子式に係合されたカバートレイ２６０とを含むアセンブリの一部としての、流体装置１００の分解斜視図を示す。
【０１０６】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００の複数のウェル１２０の間の流体流を可能にするアセンブリが提供され、アセンブリは、流体装置１００と、流体装置１００の上部に入れ子式に係合するよう構成されたリザーバトレイ２５０とを含む。図６および図７を参照すると、リザーバトレイ２５０は、各チャンバ流体を収容するための少なくとも１つのチャンバ２７０と、チャンバフロアに画定され、流体装置１００と入れ子式に係合される場合に流体装置１００の投与ウェル１１０の上方に配置されるよう構成された開口部２８０とを含むことができる。チャンバ２７０のフロアは傾斜していてもよく、開口部２８０は、リザーバトレイ２５０および流体装置１００が入れ子式に係合される場合にチャンバ流体が開口２８０を通って投与ウェル１１０に流れるようチャンバフロアの下部に画定することができる。入れ子式に係合された場合、リザーバトレイ２５０を流体装置１００の真上に配置することができ、各チャンバ流体は、リザーバトレイ２５０の各チャンバ２７０から各開口部２８０を通って流体装置１００の各投与ウェル１１０に流れる。
【０１０７】
１つ以上の実施形態によれば、アセンブリは、流体装置１００のリザーバトレイ２５０の上部に入れ子式に係合するよう構成されたカバートレイ２６０をさらに含むことができる。１つ以上の実施形態によれば、アセンブリは、流体装置１００の上部に入れ子式に係合するよう構成された１つ以上の追加のリザーバトレイ２５０を含むことができる。
【０１０８】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、リザーバトレイ２５０と流体装置１００との間の流体流を可能にするためのピストンアセンブリ３００が設けられ、ピストンアセンブリ３００は、流体装置１００と入れ子式に係合するよう構成されるリザーバトレイ２５０を含む。図９は、本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置１００の上部に係合するピストンアセンブリ３００の断面図を示す。図１０は、本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリ３００の断面図を示す。図１１は、本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリ３００の側面図を示す。図１２は、本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリ３００のリザーバトレイ２５０の上面図を示す。図１３は、本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリ３００のリザーバトレイ２５０の底面図を示す。
【０１０９】
図９から図１１を参照すると、リザーバトレイ２５０は、投与流体１を収容するためのチャンバフロア３１０を画定する液体チャンバ２７０と、リザーバトレイ２５０が流体装置１００と入れ子式に係合する場合に、チャンバフロア３１０に画定されて流体装置１００の投与ウェル１１０の上方に配置される開口２８０とを含むことができる。チャンバフロア３１０は傾斜していてもよく、開口部２８０は、リザーバトレイ２５０および流体装置１００が入れ子式に係合する場合に、投与流体１が開口部２８０を通って流体装置１００の投与ウェル１１０に流れるよう、チャンバフロア３１０の下部に画定することができる。ピストンアセンブリ３００は、ピストン３４０が、開口部２８０から距離Ｄ１である第１の位置Ｐ１と、開口部２８０に近接する第２の位置Ｐ２との間を移動することを可能にするために、ピストン３４０の少なくとも一部を受領するピストンチャンバ３３０を画定するリザーバカバー３２０をさらに含むことができる。さらに、ピストンアセンブリ３００は、ピストン３４０の第１の位置Ｐ１から第２の位置Ｐ２への移動が、リザーバトレイ２５０および流体装置１００が入れ子式に係合する場合に、開口部２８０を通って投与ウェル１１０に流れる投与流体１の一部をもたらすよう、ピストン３４０を第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間で移動させるためにピストン３４０と係合するクランク３６０を含むことができる。
【０１１０】
あるいは、本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００が、リザーバトレイ２５０と流体装置１００との間の流体流を可能にするために設けられ、ピストンアセンブリ３００は、流体装置１００と入れ子式に係合するよう構成されたリザーバトレイ２５０であって、チャンバフロア３１０及び投与流体１を収容するためのサブチャンバ３８０を生成する分割壁３７０を画定する液体チャンバ２７０を含むリザーバトレイ２５０を含む。サブチャンバ３８０のそれぞれは、チャンバフロア３１０に画定される開口部２８０であって、リザーバトレイ２５０が流体装置１００と入れ子式に係合する場合に、流体装置１００の投与ウェル１１０の上方に配置される、開口部２８０を含むことができる。投与流体１が、リザーバトレイ２５０および流体装置１００が入れ子式に係合する場合に、開口部２８０を通って、流体装置１００の投与ウェル１１０に流れるよう、チャンバフロア３１０は傾斜していてもよく、開口部２８０は、チャンバフロア３１０の下部に画定することができる。リザーバカバー３２０は、ピストン３４０が、開口部２８０から距離Ｄ１の第１の位置Ｐ１と、開口部２８０に近接する第２の位置Ｐ２との間を移動することを可能にするための各サブチャンバ３８０のピストン３４０を収容するピストンチャンバ３３０を画定することができる。さらに、リザーバトレイ２５０および流体装置１００が入れ子式に係合する場合に、投与流体１の一部が開口部２８０を通って流れるよう、ピストンアセンブリ３００は、ピストン３４０を移動させるためにピストン３４０と係合するクランクアセンブリ３９０を含むことができる。
【０１１１】
ピストンチャンバ３３０は、少なくとも２つの目的に役立つ。第１に、ピストンチャンバ３３０は、第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間の移動中にピストン３４０を誘導し位置決めする働きをする。一例では、ピストンチャンバ３３０は、５．２ｍｍの直径を有することができ、ピストン３４０は、ピストン３４０がピストンチャンバに結合しないように５．０ｍｍの直径を有することができる。第２に、ピストンチャンバ３３０は、一般に、リザーバカバー３２０とともに、滅菌部分と非滅菌部分、すなわちクランク３６０、クランクアセンブリ３９０、ソレノイド４００、および／または電子ユニット４４０との間にバリアを形成するよう働く。
【０１１２】
１つ以上の実施形態によれば、ピストン（複数を含む）３４０は、所定体積量の投与流体１が、リザーバトレイ２５０の液体チャンバ２７０から開口部２８０を通って流体装置１００の投与ウェル１１０に移動するよう、第１の位置Ｐ１から第２の位置Ｐ２まで距離Ｄ１を移動する。いくつかの実施形態では、ピストン（複数を含む）３４０は、同じ体積量の投与流体１が、リザーバトレイ２５０の液体チャンバ２７０から流体装置１００の投与ウェル１１０に繰り返し移動するよう、第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間の距離Ｄ１を繰り返し移動する。代替の実施形態では、ピストン（複数を含む）３４０は、各移動中に異なる距離Ｄ１を移動してもよく、各距離Ｄ１は、異なる開始第１位置Ｐ１を有し、したがって、各移動時に異なる量の投与液体を移動させる。一例では、ピストン（複数を含む）は、一定の所定の時間間隔で移動することができる。ピストン（複数を含む）３４０の任意の数の移動は、変化しても同じでも、任意の数の時間間隔で生じることができ、これらの移動の各々は、変化しても同じままであってもよい距離Ｄ１にわたって生じることができる。
【０１１３】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、１つ以上の開口部２８２を画定する開口部２８０を含むことができる。１つ以上の開口部２８２は、ピストン３４０が第１の位置Ｐ１から第２の位置Ｐ２に移動するまで投与流体１の表面張力が液体チャンバ２７０内の投与流体１を維持するよう、液体チャンバ２７０内の投与流体１と連通するよう構成することができる。
【０１１４】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、ピストン３４０によって画定されるピストンキャッチ３４２と係合するためのチャンバリップ３３２を画定するピストンチャンバ３３０を含むことができ、それによって、ピストン３４０が第２の位置Ｐ２から第１の位置Ｐ１に移動する場合にピストン３４０の移動を遅らせる。
【０１１５】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、クランク３６０によって画定されるクランクキャッチ３６２と係合するカバーリップ３２２を画定するリザーバカバー３２０を含むことができ、それによって、ピストン３４０が第２の位置Ｐ２から第１の位置Ｐ１に移動している場合にクランク３６０の移動を遅らせる。
【０１１６】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、第２の位置Ｐ２にあるピストン３４０および投与流体１を受け入れるための開口部２８０を含むピストンウェル３１２を画定するチャンバフロア３１０を含むことができる。
【０１１７】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間の全移動中にピストン３４０の外周の少なくとも半分に入れ子式に係合し、投与流体１をピストンウェル３１２に送達する、ピストンウェル壁３１４を有するピストンウェル３１２を含むことができる。さらに、ピストンウェル壁３１４は、液体チャンバ２７０の下部において、投与流体１がピストン３４０とサブチャンバ３８０の壁との間に集まるのを防止するのを助けることができる。
【０１１８】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、ピストンウェル３１２と、投与流体１を受け取り、投与流体１をピストンウェル３１２に送達するためのピストンウェル壁３１４とに近接するチャンバフロア３１０の下部でフロア凹部３１６を画定するチャンバフロア３１０を含むことができる。
【０１１９】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、クランク３６０をピストン３４０に係合させるためにピストン３４０に画定されたピストンチャネル３４４内に係合されたピン４２０を有するクランク３６０を含むことができる。さらに、ピストンアセンブリ３００は、ソレノイド４００と連通（連絡）するクランク３６０を含むことができる。
【０１２０】
図１４は、本開示の１つ以上の実施形態による、ピストンアセンブリ３００のリザーバカバー３２０の上面図を示す。図１４において、リザーバカバー３２０は、いくつかのピストンチャンバ３３０を画定し、各ピストンチャンバ３３０は、下にある各サブチャンバ３８０に対応するピストン３４０を収容し、各ピストン３４０が第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間を移動することを可能にする。ピストンチャンバ３３０は、ピストン３４０の第１の位置と第２の位置との間の移動を案内するために、リザーバカバー３２０の残りの部分の上方に延びるピストンガイド４３０を画定することができる。さらに、ピストンガイド４３０は、ピストン３４０、クランク３６０、および／またはクランクアセンブリ３９０の移動を制御する電子ユニット４４０（図示せず）を受領するために各端部に電子ガイド４３２を画定する。一例では、電子ユニット４４０は、ディップスイッチを介してプログラムすることができるタイマーを含み、その結果、ピストン３４０の移動サイクルを変更することを実現することができる。
【０１２１】
図１５は、本開示の１つ以上の実施形態によるピストンバー４１０を含むピストンアセンブリ３００を示す。ピストンアセンブリ３００は、１つ以上のクランク３６０を有するクランクアセンブリ３９０を含むことができる。各クランク３６０は、第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間でピストン３４０を移動させるために、サブチャンバ３８０の１つのそれぞれのピストン３４０と係合することができる。いくつかの実施形態では、各クランク３６０は、各ピストン３４０によって画定されるピストンチャネル３４４と係合するピン４２０を含むソレノイド４００と連通することができる。
【０１２２】
１つ以上の実施形態によれば、ピストンアセンブリ３００は、ピストン３４０を含むことができ、各ピストン３４０は、ピストンヘッド３４６を画定する。さらに、ピストンアセンブリは、第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間でピストン３４０を同時に移動させるために、ピストンヘッド３４６のすべてと係合するピストンバー４１０を有するクランクアセンブリ３９０を含むことができる。クランクアセンブリは、ピストンバー４１０を移動させるためにピストンバー４１０と係合する少なくとも１つのクランク３６０をさらに含むことができ、それにより、ピストン３４０を第１の位置Ｐ１と第２の位置Ｐ２との間で移動させる。少なくとも１つのクランク３６０は、ピストンバー４１０によって画定されるピストンバーチャネル４１２と係合するピン４２０を含む少なくとも１つのソレノイド４００と連通することができる。一例では、３つの１３．５ｍｍソレノイド４００をクランクアセンブリ３９０と連通させることができる。別の例では、１つの２０ｍｍソレノイド４００をピストンバー４１０と連通させることができる。代替実施形態では、電子ユニット４４０は、ピストンバー４１０、クランクアセンブリ３９０、クランク３６０、および／またはピストン３４０を移動させるための１つ以上のソレノイド４００と連通することができる。
【０１２３】
ピストンアセンブリ３００は、リザーバトレイ２５０と流体装置１００との間の流体流を可能にするのに適した任意の材料で作ることができる。選択される材料の種類は、ピストンアセンブリ３００の所望の用途によるであろう。例えば、ピストンアセンブリ３００の利用者は、使用される投与流体１、および投与流体１とその物質との予想される相互作用に基づいて、物質を選択することができる。したがって、ピストンアセンブリ３００は、例えば、ポリマー、合成ポリマー、ＴＯＰＡＳ（登録商標）ＣＯＣポリマー、生分解性ポリマー、プラスチック、生分解性プラスチック、熱可塑性物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ガラス、ＰＹＲＥＸ（登録商標）、もしくはホウケイ酸塩、またはそれらの組み合わせを含む、任意の適切な材料から作ることができる。さらに、流体装置１００、投与ウェルチャネルカバー１６０、チャネルカバー２３０、およびウィック１４０、１４２、１４４はそれぞれ、ピストンアセンブリ３００と同じ材料から作製してもよい。一例では、利用者は、投与ウェル流体と材料との相互作用が変化しないよう、ピストンアセンブリ３００、流体装置１００、投与ウェルチャネルカバー１６０、チャネルカバー２３０、およびウィック１４０、１４２、１４４のそれぞれを同じ材料から作製することを望む可能性がある。
【０１２４】
図１６は、本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置１００の上部に係合するピストンアセンブリ３００の底面斜視図を示す。図１７は、本開示の１つ以上の実施形態による流体装置１００の底面図を示す。図１８は、本開示の１つ以上の実施形態による流体装置１００の上面図を示す。図１９は、クランクアセンブリ３９０を有するピストンアセンブリ３００の側面図を示し、ピストンアセンブリ３００は、本開示の１つ以上の実施形態による流体装置１００の上部に係合する。図２０は、本開示の１つ以上の実施形態による３つのソレノイド４００を含み、クランクアセンブリ３９０を有するピストンアセンブリ３００の上面図を示す。図２１は、本開示の１つ以上の実施形態による１つのソレノイド４００を含むピストンアセンブリ３００の上方斜視図を示す。図２２は、本開示の１つ以上の実施形態による、流体装置１００、ピストン３４０、ピストンバー４１０、および１つのソレノイド４００の上方斜視図を示す。図２３は、本開示の１つ以上の実施形態によるソレノイド４００および電子ユニット４４０の上方斜視図を示す。図２４は、本開示の１つ以上の実施形態によるソレノイド４００を含むピストンアセンブリ３００の上方斜視図を示す。
【０１２５】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、全体的なアセンブリは、流体装置１００の下に入れ子式に係合するよう構成された第２のリザーバトレイ２５０をさらに含むことができる。図２５は、本開示の実施形態による第２のリザーバトレイ２５０を含むこの全体的なアセンブリの分解側面図を示す。このアセンブリの場合、流体装置１００は、複数のウェル１２０の下流にある収集ウェル１７０を含むことができ、収集ウェル１７０は、第２のリザーバトレイ２５０が流体装置１００の下に入れ子式に係合する場合、流体装置１００の収集ウェル１７０からの流体が、開口部を通って第２のリザーバトレイ２５０のチャンバ２７０に流れるよう、開口部を画定することができる。図２５を参照すると、流体は、流体装置１００の上部に入れ子式に係合しているリザーバトレイ２５０から、リザーバトレイ２５０の開口部２８０を通って流体装置１００の投与ウェル１１０に右から左へ流れることができる。流体は、投与ウェル１１０から、流体装置１００の収集ウェル１７０の開口部を通って左から右へ、流体装置１００の下に入れ子式に係合されたリザーバトレイ２５０のチャンバ２７０に流れることができる。次いで、流体は、第２のリザーバトレイ２５０内を右から左に流れることができる。
【０１２６】
１つ以上の実施形態によれば、アセンブリは、流体装置１００の下に入れ子式に係合するよう構成された１つ以上の追加のリザーバトレイ２５０を含むことができる。
【０１２７】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、アセンブリは、流体装置１００の下に入れ子式に係合するよう構成された第２の流体装置１００を含むことができる。このアセンブリでは、流体装置１００は、複数のウェル１２０の下流に収集ウェル１７０を含むことができ、収集ウェル１７０は、収集ウェル１７０からの流体が、流体装置１００が入れ子状に係合された場合に、開口部を通って、下の第２の流体装置１００の投与ウェル１１０に流れるよう開口部を画定することができる。
【０１２８】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、アセンブリは、第２の流体装置１００の下に入れ子式に係合するよう構成された１つ以上の流体装置１００を含むことができる。追加の各流体装置１００は、複数のウェル１２０の下流に収集ウェル１７０を含むことができ、各収集ウェル１７０は、収集ウェル１７０からの流体が、複数の流体装置１００が入れ子状に係合された場合に、開口部を通って、下に位置する追加の流体装置１００の投与ウェル１１０に流れるよう開口部を画定することができる。図２６は、本開示の実施形態による、入れ子式に係合された合計３つの流体装置１００と、３つの流体装置１００の上および下に係合されたリザーバトレイ２５０と、上のリザーバトレイ２５０の上部に係合されたカバートレイ２６０とを含む本アセンブリの分解側面図を示す。
【０１２９】
本明細書で開示する発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、図８および図２５から図２６に例示されるように、１つ以上の入れ子式に係合された流体装置１００と、流体装置１００の上部および／または下部に入れ子式に係合された１つ以上のリザーバトレイ２５０を含むアセンブリを使用する方法が提供される。本方法は、投与流体を投与ウェル１２０に加えるステップ、および流体が流体流チャネル１３０と流体接触するよう流体装置（複数を含む）１００の複数のウェル１２０にそれぞれのホスト流体を加えるステップを含み、これにより、投与流体は、複数のウェル１２０内の各ホスト流体のそれぞれに、調整されて流れる。本方法は、リザーバトレイ２５０および流体装置（複数を含む）１００が入れ子式に係合するよう流体装置１００の上方にリザーバトレイ２５０を配置するステップと、各チャンバ流体をリザーバトレイ２５０の各チャンバ２７０に加えるステップとを含み、それにより、各チャンバ流体は、リザーバトレイ２５０の下に入れ子式に係合される流体装置１００の投与ウェル１１０に流れる。このようにして、投与ウェル１１０のみが含むことができるよりも多くの投与流体の供給を、リザーバトレイ２５０の下に入れ子式に係合された１つ以上の流体装置１００に調整された速度（割合）で提供することができる。
【０１３０】
１つ以上の実施形態によれば、投与流体は、薬物、合法もしくは違法薬物、毒素、兵器用物質、芳香剤、食物スパイス、油、ガス、代謝産物、化合物、ホルモン、溶液、溶質、複合体、栄養培地、分化培地、または増殖培地の１つ以上を含むことができる。
【０１３１】
１つ以上の実施形態によれば、流体装置１００の複数のウェル１２０は、それぞれの細胞培養物を含むことができ、それにより、細胞上の投与流体への調整曝露の影響またはパラメータまたは応答を測定することができる。測定される細胞培養物上の投与液への調整曝露の影響またはパラメータまたは応答は、薬物動態、薬物代謝、毒性、前臨床薬学研究、細胞応答、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞死、細胞分化、または細胞再生のうちの１つ以上とすることができる。各細胞培養物は、幹細胞培養物または前駆細胞培養物とすることができる。
【０１３２】
１つ以上の実施形態によれば、アセンブリを使用する方法は、１つ以上の時間間隔で複数のウェル１２０のうちの１つ以上からそれぞれのホスト流体のアリコートを除去して、複数のウェル１２０を介して調整された投与流体の、または投与流体への、影響またはパラメータまたは細胞応答を測定するステップをさらに含むことができる。複数のウェル１２０は、それぞれの細胞培養物を含むことができ、本方法は、１つ以上の時間間隔で複数のウェル１２０のうちの１つ以上からそれぞれのホスト流体のアリコートを除去して、細胞についての投与流体（例えば、試験化合物を含む流体）の影響またはパラメータ（例えば、細胞培養物の個々のセルの細胞傷害性）、またはそれに対する細胞の応答を測定するステップを含むことができる。特に、流体は、本明細書で使用される場合、液体、気体、またはその両方を含むことができる。
【０１３３】
少なくとも１つの実施形態によると、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少したか増強されたかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法を提供する。本方法は、試験化合物を含む動的流体（例えば、「動的」投与ウェル１１０Ｄに適用される液体または気体であり、「動的」とは標識（ｌａｂｅｌ）であり、定性的記述子（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）ではない）を、流体装置１００の動的投与ウェル１１０Ｄに適用するステップを含むことができる。流体装置１００は、本明細書に記載された多くの実施形態のうちの任意のものを含むことができる。例えば、流体装置は、それぞれが細胞培養物を収容する複数の動的ウェル１２０Ｄであって、動的投与ウェル１１０Ｄの下流に配置され、動的投与ウェル１１０Ｄと流体連通する複数の動的ウェル１２０Ｄを含むことができる。さらに、流体装置１００は、それぞれが細胞培養物を含む複数の「コントロール」ウェル１２０Ｃであって、「コントロール」投与ウェル１１０Ｃの下流に配置され、「コントロール」投与ウェル１１０Ｃと流体連通する複数の「コントロール」ウェル１２０Ｃを含むことができる。流体装置１００は、それぞれの複数の下流ウェル１２０に関連する多数の異なる投与ウェル１１０を含むことができ、各投与ウェル１１０が、１つまたは別々の流体装置１００の別個の行に配置される。別の実施形態では、本方法は、流体装置１００のコントロール投与ウェル１１０Ｃに試験化合物を含まないコントロール流体を適用するステップを含むことができる。
【０１３４】
本アッセイ方法は、試験化合物を含む静的流体（「静的」という用語は標識であり、流体自体の定性的記述子ではない）を、静的ウェル１２０Ｓに適用するステップをさらに含むことができる。比較のためにウェル１２０Ｄ、１２０Ｓ内の流体について分析を行うことができる。例えば、任意の数のバイオアッセイを実施することができる。バイオアッセイには、生物学的、生化学的、顕微鏡的、視覚化技術、またはプレートイメージングバイオアッセイを含むことができる。さらに、本バイオアッセイは、流体環境または細胞培養物もしくは流体の細胞内環境のパラメータを測定する手段を含む任意の方法とすることができる。本バイオアッセイは、複数のウェルのいずれかのパラメータを一緒にまたは個別に測定するために実施することができる。パラメータの測定は、さらなる分析のためにそれに関連する値を決定することができる。少なくとも１つの実施形態において、パラメータは、代謝副産物、毒性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞傷害性、細胞分化、細胞再生、濃度、放射線、光学的品質、蛍光、発光、化学成分の存在、抗原成分の存在、比色分析、画像もしくは可視化品質、電気的特性、磁気特性、または吸光度の１つ以上を含むことができる。例えば、バイオアッセイは、副生成物または代謝産物の濃度などのパラメータを測定することができ、または細胞培養物の細胞傷害性を測定することができる。別の例では、パラメータは、質量分析バイオアッセイによる分析のためのイオン化または質量を含むことができる。
【０１３５】
一実施形態では、本方法は、複数のウェルの少なくとも１つのパラメータを測定するために「動的」バイオアッセイを実施するステップと、動的値を決定するステップとを含むことができる。本方法はまた、静的ウェル１２０Ｓのパラメータを測定するために静的バイオアッセイを実施するステップと、静的値を決定するステップとを含むことができる。さらに、本方法は、複数のコントロールウェル１２０Ｃの少なくとも１つのパラメータを測定するためにコントロールバイオアッセイを実施するステップと、コントロール値を決定するステップとを含むことができる。パラメータを測定し、それぞれの値を決定するために、任意の数のバイオアッセイを任意の数のウェル１２０に対して実施することができる。さらに別の例では、本方法は、複数の動的ウェル１２０Ｄの少なくとも２つのパラメータを測定するために動的バイオアッセイを実施するステップと、第１の動的値および第２の動的値を決定するステップとを含むことができる。
【０１３６】
少なくとも１つの実施形態では、本方法は、得られた値を比較して、静的および／または流動的環境におけるパラメータ、細胞培養物、および試験化合物の間の関係についての判定を行うステップを含むことができる。例えば、本方法は、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために動的値を静的値と比較するステップと、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、動的値をコントロール値と比較するステップと、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少または増強されたかどうかを判定するために、第１の動的値を第２の動的値と比較するステップと、の任意の１つ以上を含むことができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、動的値は、パラメータの百分率Ｘ（ＥＣｘ）での動的有効濃度を含み、０≦Ｘ≦１００である。一実施形態では、Ｘの値は５０であり、この値は、流体装置の行の流体環境におけるパラメータおよび試験化合物に関連するＥＣ５０を含むことができる。他の実施形態では、静的値は、パラメータとして静的ＥＣｘを含むことができる。動的および静的ＥＣｘを含む実施形態では、それらは比較することができ、いくつかのパラメータおよび試験化合物に対して、静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを増強することを予測し、静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを減少させることを予測する。他のパラメータおよび試験化合物に対して、逆もまた正である可能性があり、静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより低い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを減少させることを予測し、静的ＥＣｘに対する少なくとも１つの動的ＥＣｘのより高い値は、試験化合物への細胞培養物の応答がパラメータを増強することを予測する。他の実施形態では、コントロール値は、パラメータのコントロールＥＣｘを含むことができ、動的ＥＣｘと同様に比較されて、同じ予測をもたらすことができる。
【０１３８】
流体装置１００を使用するさらに別の方法では、流体装置１００の行は、内部に流体成分を捕捉するための空のウェル１２０を含むことができる。例えば、上流のウェルは、試験化合物と相互作用して代謝産物を生成する細胞培養物を含むことができる。代謝産物が下流に流れるにつれて、それらは回収されるために下流の空のウェルに捕捉され得る。一例において、薬物が毒性代謝産物を有する場合、その代謝産物のかなりの量を産生することは困難だがやりがいがあり得る。細胞を含まないウェルにおける代謝産物のかなりの量（濃度）の捕捉および蓄積は、これらの空のウェルに存在する生体分子の集団の多様性を減らすこと確実にするであろう。高濃度の代謝産物は、ＭｅｔＩＤ、精製／濃縮、または後の実験における下流投与に使用することができる。要するに、流体装置１００は、高品質で高濃度の代謝産物を製造する方法として機能することができる。
【０１３９】
例えば、以下に詳細に記載されるように、試験化合物への細胞培養物の応答によってパラメータが減少したか増強されたかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法を提供する。換言すれば、本方法は、試験化合物に応答する細胞培養物に対する影響を予測することを含むことができる。以下の開示は具体的にはＥＣ５０値の決定に関するものであるが、開示されたステップおよび方法は、一般に上記の方法に適用可能である。
【０１４０】
図２７は、細胞培養物への影響（または、パラメータに対する細胞培養物の応答の影響）を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。ステップ５００において、第１の濃度の試験化合物を有する流体が、流体装置の投与ウェルに適用される。ステップ５１０では、複数のウェルのうちの少なくとも１つの細胞培養物に対する影響として流体ＥＣ５０が決定される。続いて、ステップ５２０において、少なくとも１つの流体ＥＣ５０を、静的系において試験化合物に対して決定された細胞培養物に対する影響としての静的ＥＣ５０と比較する。ステップ５２０に続いて、少なくとも３つの判定が可能であり、すなわち、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０がより低い値であると判定される（５２２）、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０がより高い値であると判定される（５２４）、または静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０が略同様の値であると判定される（５２６）。
【０１４１】
あるいは、本開示の発明の主題の１つ以上の実施形態によれば、試験化合物に応答する細胞培養物の細胞傷害性を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法が提供される。図２８は、細胞培養の細胞傷害性を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。ステップ６００において、第１の濃度の試験化合物を有する流体が、流体装置の投与ウェルに適用される。ステップ６１０では、複数のウェルのうちの少なくとも１つの細胞傷害性として流体ＥＣ５０が決定される。続いて、ステップ６２０において、少なくとも１つの流体ＥＣ５０を、静的系において試験化合物に対して決定された細胞培養物の細胞傷害性としての静的ＥＣ５０と比較する。ステップ６２０に続いて、少なくとも３つの判定が可能であり、すなわち、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０がより低い値であると判定される（６２２）、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０がより高い値であると判定される（６２４）、または静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０が略同様の値であると判定される（６２６）。
【０１４２】
図２７は、細胞培養への影響を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。図２８は、細胞培養の細胞傷害性を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の一実施形態のステップを示すフロー図である。本明細書に記載の方法実施形態の各々において、流体装置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の少なくとも一部を実施するために使用することができる。これらの方法実施形態のいずれにおいても、上記の流体装置実施形態のいずれかを使用することができる。例えば、一実施形態では、流体装置は、流体を収容するための複数のウェルであって、各下流ウェルが各隣接する上流ウェルよりも下方に位置し、複数のウェルの各々がその中に細胞培養物を有する、複数のウェルと、それら複数のウェルの上流に存在し、それらと流体連通する投与ウェルと、を含む。別の実施形態において、代替実施形態では、流体装置は、流体を収容するための複数のウェルの上流に配置された投与ウェルであって、複数のウェルはその中に細胞培養物を有する、投与ウェルと、１つ以上のチャネルであって、投与ウェルに沈積した流体が、その間の流体流チャネルに沿って、隣接する下流ウェルの各流体に流れ、各流体は、その後、その間の流体流チャネルに沿って各隣接する下流ウェルに流れるよう、隣接する上流ウェルおよび下流ウェルの間に延びて、その間に流体流チャネルを画定する、１つ以上のチャネルと、を含む。
【０１４３】
本明細書に記載される流体装置の多くの追加の例および実施形態、ならびにこれらの実施形態の組み合わせが、本明細書に記載の方法実施形態において使用され得る。限定するものではないが、流体装置のそのような実施形態の例として、流体装置は、以下の１つ以上を含むことができる：隣接する上流ウェルに対して降下位置に配向される流体装置の各隣接する下流ウェル；行内の整列された流体装置の複数のウェル；各行内に少なくとも８つのウェルを備えて、合計で少なくとも２行を備える、流体装置の複数のウェル；複数のウェルを通る流体流を調整するために複数のウェルの少なくとも一部から下流にある、および／または複数のウェルを通る流体流を調整するために流体流チャネルと流体接触する、ウィック；投与ウェルから最も遠い下流ウェルから流体オーバーフローを収集するための、複数のウェルから下流に位置する収集ウェル；複数のウェルを通る流体流を調整するために収集ウェルに収容されるウィック；ディボットを画定するフロアを有する収集ウェルであって、フロアが、ディボットがフロアの低い部分で画定されるよう傾斜される、収集ウェル；収集ウェルチャネルであって、隣接する上流ウェルの各流体が流体流チャネルに沿って、収集ウェルチャネルを通り、収集ウェルに流れるよう、流体流チャネルから収集ウェルの底部に延びる、収集ウェルチャネル；投与ウェルチャネルであって、投与流体が、隣接する下流ウェルの各流体に、投与ウェルチャネルを通って、流体流チャネルに沿って流れるよう、投与ウェルの底部から流体流チャネルに延びる、投与ウェルチャネル；１０から３５００ミクロンの範囲の幅および１０から１５００ミクロンの深さを有する流体装置のチャネル；流体装置のチャネルが、隣接ウェルのそれぞれの間に延び、各隣接する下流ウェルで概ね収束する、三角形を画定することと；流体装置のチャネルが、三角形チャネルと隣接する２、３、または４つのマイクロチャネルを備え、マイクロチャネルのそれぞれが、２００から７５０ミクロンの範囲の幅および１０から１５００ミクロンの深さを有すること。
【０１４４】
さらに、本明細書に記載された方法実施形態では、流体装置は、カバートレイ、リザーバトレイ、追加の流体装置（複数を含む）、少なくとも１つのピストンアセンブリ、または少なくとも１つのロボット液体ハンドリング装置の少なくとも１つとともに使用することができる。例えば、図８は、本開示の実施形態による、流体装置の上部に入れ子式に係合されたリザーバトレイと、リザーバトレイの上部に入れ子式に係合されたカバートレイとを含むアセンブリの一部としての、図１の流体装置の分解斜視図である。さらに、代替実施形態において、図２５は、カバートレイ、流体装置の上部に入れ子式に係合されたリザーバトレイ、および流体装置の下に入れ子式に係合された第２のリザーバトレイを含む、アセンブリの一部としての流体装置の側面図を示す。さらに、代替実施形態において、図２６は、入れ子式係合状態にある２つの追加の流体装置をさらに含む図２５のアセンブリの側面図を示す。例えば、図１９から図２４は、ピストンアセンブリの様々な実施形態を示す。
【０１４５】
図２７に示す方法実施形態などの実施形態では、細胞培養物への影響は、薬物動態、薬物代謝、毒性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞傷害性、細胞分化、または細胞再生の１つ以上を含む可能性がある。さらなる実施形態において、細胞培養物のさらなる影響は、本明細書の開示に照らして当業者には明らかであるであろう。例えば、当業者は、因子、サイトカイン、細胞応答、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、または細胞増殖のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含む前臨床薬学研究および／または実験の間に、投与流体に対する細胞培養物の調整曝露の影響を予測することを望む可能性がある。
【０１４６】
図２８のフロー図に示される一実施形態では、細胞培養物に対する影響は、細胞培養物の細胞の細胞傷害性である。別の実施形態では、複数のウェルはそれぞれの細胞培養物を含み、それにより、細胞培養物上の第１の濃度の試験化合物を有する流体に対する調整暴露の影響を分析することができる。
【０１４７】
本明細書中に記載される実施形態では、細胞培養物は、上記の細胞培養物のいずれかを含むことができ、および／または以下の１つ以上を含むことができる：腫瘍細胞株（例えば、腫瘍に由来する不死化細胞株）；初代肝細胞；幹細胞；前駆細胞；幹細胞の分化した産物；肝臓、腎臓、肺、心臓、筋肉、脳、膵臓、もしくは甲状腺からの初代細胞または組織；ＨｅｐＧ２細胞株培養物；ＨｅｐａＲＧ細胞株培養物；または２次元もしくは３次元フォーマットで培養されたヒト、イヌ、非ヒト霊長類、マウス、もしくはラットの組織に直接由来する細胞培養物。例えば、細胞培養物は、（例えば、回転楕円体などの２次元または３次元のフォーマットの）ＨｅｐＧ２細胞株培養物を含むことができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、流体装置の任意の行のウェル１２０は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境または暴露を模倣するための異なる細胞培養物を含むことができる。上流の細胞培養物の流体環境との相互作用に応答して１つの細胞培養物の下流のパラメータおよび影響を評価する能力は、本発明の非常に大きな利点である。本明細書に記載の方法および装置のいずれも、流体装置１００の行内に配置された異なる細胞培養物に使用され適用され得る。静的系は、ヒトの細胞および組織に対する化学的曝露の影響を正確に予測することができない。本明細書に記載された流体装置１００は、複数の産業における人間のシステムに対する腐食性／苛性の化学物質の影響をより良好に評価するよう構成することができる。本明細書に記載の方法は、低暴露限界（ＬＥＬ）、高暴露限界（ＵＥＬ）、推奨暴露限界（ＲＥＬ）、および労働安全衛生許容暴露限界（ＰＥＬ）の確立を助けるために用いることができる。有利には、本明細書で提供される耐腐食性流体装置１００の重要性は、現在の技術に比べて少なくとも３つの大きな進歩に由来する：１）流体および非線形暴露勾配（ｆｌｕｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）に起因する劇的に改善された生物学的関連性；２）組織培養プレートを劣化させずに細胞をプラスチック分解生成物に曝露することなく、より長い時間、より高い投与量で腐食性化学物質を試験する能力；３）ガラス様プラスチックポリマーおよびＳＢＳ準拠プレートフォーマットの光学的特性のための、ハイコンテンツイメージャおよびプレートリーダなどのバイオアッセイとの適合性。
【０１４９】
図２７のステップ５００および図２８のステップ６００において、第１の濃度の試験化合物を有する流体は、流体装置の投与ウェルに適用される。代替実施形態では、流体を、ソース（供給源；ｓｏｕｒｃｅ）ウェル、別の流体装置、ピストンアセンブリ、またはロボット液体ハンドリング装置に適用することができる。流体は、上記の投与流体のいずれかを含むことができ、投与流体は、ある濃度の試験化合物を含む。試験化合物は、薬物、合法もしくは違法薬物、毒素、兵器用物質、追跡化合物、芳香剤、食物スパイス、油、ガス、代謝産物、化合物、ホルモン、溶液、溶質、複合体、栄養補給剤、栄養培地、分化培地、または様々な溶存酸素レベルを有する増殖培地の１つ以上を含むことができる。
【０１５０】
第１の濃度の試験化合物を有する流体を投与ウェルに適用するステップ５００、６００は、特定の時間にわたって所定の間隔で特定の体積を使用して繰り返すことができる。特定の体積は、各ウェル内、全体としての流体装置内、または流体装置の一部内の全流体転換が生じる速度を規定するために使用することができる。例えば、流体装置が１４００μＬの総体積を保持する場合、各適用ステップ５００、６００の間に５０μＬの特定の体積を加えることは、３００μＬの特定の体積を加えるよりも遅い転換速度という結果になる。測定される影響、使用される試験化合物、使用される細胞培養物または所望される予測に依存して、特定の体積、したがって、転換速度（転換率）が変化する。一実施形態では、特定の体積は、１μＬと１５００μＬとの間の値である。さらに、所望される特定の体積は、決められた間隔および／または特定の期間と相関していてもよく、さらに、そのどちらも、測定される影響、使用される試験化合物、使用される細胞培養物、または所望の予測に依存していてもよい。例えば、上記の例において、同様の流体転換結果を達成するために、各適用ステップ５００、６００の間に５０μＬの特定の体積を加えることは、追加の決められた間隔および／またはより長い特定の期間を必要とする。一実施形態では、特定の体積は１μＬと１５００μＬとの間であり、決められた間隔は４時間または８時間ごとに１回である。別の実施形態では、決められた期間は２４時間、４８時間、７２時間、または１２０時間である。決められた間隔または特定の期間の任意の範囲を使用することができる。
【０１５１】
さらに、適用ステップ５００、６００は、手動または自動で行うことができ、自動化は、ロボット液体ハンドリング装置、流体装置と入れ子式に係合するピストンアセンブリ、ウィックと組み合わせたカバートレイ、または本明細書に記載の他の実施形態を使用して行われる。さらに、流体が繰り返し添加されるとき、ウェルの間の流出またはオーバーフローを防止するために余分な流体を除去する必要があり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、流体を適用するステップが繰り返される場合に、投与ウェルから最も遠い下流のウェルから流体を吸い上げる追加のステップを含むことができる。流体を吸い上げる追加のステップは、手動または自動で行うことができ、自動化は、ロボット液体ハンドリング装置、流体装置と入れ子式に係合するピストンアセンブリ、ウィックと組み合わせたリザーバトレイ、または本明細書に記載の他の実施形態を使用して行われる。適用ステップ５００、６００が実行されているいくつかの実施形態では、吸い上げステップは必要ではなく、代わりに、収集ウェル、オーバーフロー構造、または追加の流体装置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法の性能に影響を与えることなく、過剰またはオーバーフローが適切に蓄積することを可能にする。
【０１５２】
ステップ５１０（または、ステップ６１０）では、複数のウェルのうちの少なくとも１つの細胞培養物への影響（または、細胞傷害性）として流体ＥＣ５０が決定される。続いて、ステップ５２０（または、ステップ６２０）において、少なくとも１つの流体ＥＣ５０を、静的系において試験化合物に対して決定された細胞培養物への影響（または細胞培養物の細胞傷害性）としての静的ＥＣ５０と比較する。ステップ５２２（または６２２）において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０のより低い値が判定され、影響（または細胞傷害性）を増強する試験化合物への細胞培養物の応答を予測する。ステップ５２４（または６２４）において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０のより高い値が判定され、影響（または細胞傷害性）を減少させる試験化合物への細胞培養物の応答を予測する。ステップ５２６（または６２６）において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０の略同様の値が判定され、影響（または細胞傷害性）にほぼ影響しない試験化合物への細胞培養物の応答を予測するか、または影響（または細胞傷害性）の予測をしない可能性がある。細胞培養物の応答は、薬物動態学的応答、薬力学的応答、試験化合物の代謝、流体成分の代謝、細胞傷害性、細胞受容体応答、細胞フィードバックシグナル、細胞増殖、細胞分化、または細胞再生の１つ以上を備えることができる。
【０１５３】
用量応答曲線（または濃度応答曲線）は、多くの種類の実験の結果をプロットするために使用することができ、ここで、用量応答曲線のＸ軸は、物質（例えば、試験化合物）の濃度をプロットし、Ｙ軸は、特定の環境（例えば、影響、細胞傷害性）による物質への応答をプロットする。一般に、ＥＣ５０は、単純に、底部のベースラインと上端の最大応答との間の応答の中間（例えば、影響、細胞傷害性）を引き起こす物質（例えば、試験化合物）の濃度として定義することができる。換言すれば、ＥＣ５０は、物質の効力（有効性）の尺度と考えてもよい。ＩＵＰＡＣは、定義された条件の下で所定の集団において試験生物の５０％に一定の影響を生じると予想される環境培地中の物質の統計的に導出されたメジアン濃度としてＥＣ５０を定義する。ＥＣ５０判定の一般的なガイドラインは、Ｐｈａｒｍ  Ｓｔａｔ．の２０１１  Ｍａｒ−Ａｐｒ；  １０（２）：１２８−３４に掲載されたＪ．Ｌ．Ｓｅｂａｕｇｈによる“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ＥＣ５０／ＩＣ５０  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ”という刊行物で見ることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
本発明の実施形態では、複数のウェルのうちの少なくとも１つの細胞培養物についての影響（または、細胞傷害性）として流体ＥＣ５０が決定される。さらに、いくつかの実施形態では、静的系における試験化合物の細胞培養物に対する影響（または細胞培養物の細胞傷害性）としての静的ＥＣ５０が決定される。言い換えると、流体ＥＣ５０は、流体連通するか、または少なくとも１つの流体流チャネルによって接続される、複数のウェルを含む流体装置の流体系の１つ以上の個々のウェルについて決定してもよい。対照的に、静的系の１つ以上の個々のウェルについて静的ＥＣ５０を決定することができ、静的系は、１つ以上の個々のウェルが流体接続状態にない限り、流体装置に含まれても含まれなくてもよく、ウェルの間の少なくとも１つの流体流チャネルが存在する場合、少なくとも１つの流体流チャネルは、１つ以上の個々のウェルの間の流体流を許容しない。
【０１５５】
１つ以上の実施形態において、静的ＥＣ５０は、流体交換のない静的系の少なくとも１つの個々のウェルまたは個々のウェルの平均において試験化合物の複数の濃度を試験することによって決定することができる。一実施形態において、静的ＥＣ５０は、細胞が暴露される時間の量を掛けた少なくとも５つの薬物濃度の影響（例えば、細胞傷害性）の大きさから生成されたシグモイドＥｍａｘ薬力学モデルを用いて決定することができる。生成されたモデルはシグモイド曲線を含むことができるが、いくつかの実施形態では線形モデルも使用することができる。同様に、少なくとも１つの流体ＥＣ５０を決定することができる。さらなるＥＣ５０決定方法は、以下に概説する実施例で見ることができる。
【０１５６】
ステップ５１０（またはステップ６１０）および／またはステップ５２０（またはステップ６２０）でＥＣ５０を決定する場合には、当技術分野で周知であったり、本願で開示のいくつかの新規な様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、既知の濃度の検出可能な追跡化合物を有する追跡流体を別個の行の流体装置の第２の投与ウェルに適用し、それにより、既知の濃度の追跡化合物を標準曲線として使用して、複数のウェルのそれぞれにおける試験化合物の濃度を計算するステップをさらに含む。一実施形態において、追跡化合物は、放射線、光学的、蛍光、ルミネセンス、組織化学、免疫組織化学、または光吸収のうちの１つ以上によって検出可能とすることができる。別の実施形態において、追跡化合物は、細胞培養培地に溶解された０．５ｕＭ〜５ｕＭの濃度のフルオレセイン塩とすることができ、フルオレセイン塩は、プレート蛍光読取機器において、５１５〜５３５ｎｍ間の発光波長、４７０〜４９０ｎｍ間の波長の蛍光励起によって検出可能である。
【０１５７】
さらに別の実施形態において、追跡化合物は、基質、代謝産物などの流れを検出するのに使用するために、任意の投与ウェル１１０に適用することができる。追跡化合物は、流動中に細胞によって活性化することができ、質量分析代用物として使用することができる。活性化により蛍光を生じることがある。
【０１５８】
他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、細胞培養物を内部に有する複数のウェルに存在する細胞傷害性検出試薬をさらに含み、これらの実施形態では、流体ＥＣ５０を決定するステップは、細胞傷害性検出試薬の検出を含むことができる。一実施形態では、細胞傷害性検出試薬は蛍光によって検出可能とすることができる。別の実施形態において、細胞傷害性検出試薬は、二本鎖ＤＮＡに結合した場合に蛍光を発する試薬を含むことができ、蛍光プレート読取機器において５１５〜５３５ｎｍ間の発光波長、４７０〜４９０ｎｍ間の波長の蛍光励起によって検出可能である。代替実施形態では、細胞傷害性検出試薬は、プレートイメージング装置内の個々の細胞を画像化することによって検出される。
【０１５９】
代替実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、細胞培養物を内部に有する複数のウェルに存在する影響検出試薬をさらに含み、これらの実施形態では、流体ＥＣ５０を決定するステップは、影響検出試薬の検出を含むことができる。一実施形態では、影響検出試薬は蛍光によって検出可能とすることができる。別の実施形態において、影響検出試薬は、放射線、光学的、蛍光、ルミネセンス、組織化学、免疫組織化学、または光吸収のうちの１つ以上によって検出可能とすることができる。代替実施形態では、影響検出試薬は、プレートイメージング装置内の個々の細胞を画像化することによって検出される。
【０１６０】
ステップ５２０（または、ステップ６２０）において、少なくとも１つの流体ＥＣ５０を、静的系において試験化合物に対して決定された細胞培養物への影響（または、ステップ６２０の場合、細胞培養物の細胞傷害性）としての静的ＥＣ５０と比較する。流体学的に接続された複数のウェル中の調整勾配を用いて少なくとも１つの流体ＥＣ５０が決定される場合、試験化合物の「測定された影響」が生物学的活性により増強されるか、または減少されるかを予測するために、静的ＥＣ５０と比較することができ、換言すれば、試験化合物への細胞培養物の応答が、増強または減少する影響（または、細胞傷害性）を生じるかどうかを予測することができる。一実施形態において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０のより低い値を判定することができ（５２２、６２２）、影響（または細胞傷害性）を増強する、試験化合物への細胞培養物の応答を予測する。別の実施形態において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０のより高い値を判定することができ（５２４、６２４）、影響（または細胞傷害性）を減少する、試験化合物への細胞培養物の応答を予測する。別の実施形態において、静的ＥＣ５０に対して少なくとも１つの流体ＥＣ５０の略同様の値を判定することができ（５２６、６２６）、影響（または細胞傷害性）にほぼ影響しない、試験化合物への細胞培養物の応答を予測するか、または影響（または細胞傷害性）の予測をしない可能性がある。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、静的ＥＣ５０と比較して投与ウェルの下流の複数のウェルの流体ＥＣ５０の傾向を調べることにより、試験化合物と、細胞培養物と同様のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞との相互作用が、特定の影響（例えば、細胞傷害性）を減少させるか、または増強するかどうかを予測することができる。例えば、静的ＥＣ５０に対して複数のウェルのうちの少なくとも１つからの流体ＥＣ５０のより低い値は、細胞活性が試験化合物の影響（例えば、細胞傷害性）を増強することを予測することができる一方で、より高い値は細胞活性が試験化合物の影響（例えば、細胞傷害性）を減少させることを予測することができる。さらに、いくつかの実施形態では、これらの予測は、流体内で起こる細胞活動の先験的知識なしで、または最低限の知識で行うことができる。
【０１６２】
本明細書に記載の様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、実際の代謝副生成物および連続ウェル内で生じる処理の知識を必要とせずに、試験化合物が細胞培養物によって代謝されることから生じる影響を判定するのに有用であり得る。いくつかの実験では、試験化合物が流体装置の連続ウェルを通過する場合、細胞によって生成される代謝産物に対する試験化合物の割合が変化することが示されている。代謝産物は、試験化合物に向けられた細胞における化学反応から生成され、したがって試験化合物の濃度を低下させ、試験化合物の代謝産物の濃度を増加させる。したがって、いくつかの実施形態では、プレートの各連続ウェルにおける細胞傷害性に対する流体ＥＣ５０は、代謝生成物に対する特定の割合の試験の影響を任意の時点で反映することができる。
【０１６３】
本明細書に記載のシステムおよび方法に加えて、本発明は、流体装置１００のウェル１２０の間の流体流を制御するための特徴および／または方法ステップも含むことができる。特に、流体は、気体、液体、またはその両方を指すことができる。バイオアッセイは、流体装置１００内の液体流体、流体装置１００内の気体流体、またはその両方で実行することができる。ウェル１２０および／または投与ウェル１１０は、チャネルカバー２３０、投与ウェルチャネルカバー１６０、カバートレイ２６０、または流体装置１００の他の任意の部分もしくは構成要素（部品）を使用することによって、空気／流体界面でセグメント化する（分ける）ことができる。
【０１６４】
隣接するウェル１２０の間の流体流を制御することによって、本明細書に開示された実施形態は、ウェル１２０の間の確立された勾配を乱すことなく、上流ウェルの生物学的応答に対する下流ウェルの暴露および非暴露をさらに制御する。流体流が十分に減衰または停止された場合、本発明は、利用者が、履歴プレートリーダ（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒｓ）、イメージャ（ｉｍａｇｅｒｓ）、および現在利用可能な固定容積生化学アッセイを用いて、分析評価をサンプリングし、行いおよび／または薬物の特定の細胞株との静的相互作用を比較評価することを可能にする。流体流の中断（休止）は、変化しない環境において従来のアッセイを完了させることを可能にする。例えば、化学的、毒性、または細胞代謝の勾配を維持しながら、時間分解された流体の流れを一時的に遮断することが有利であるため、流れの永続的な停止は望ましくない。測定が行われると、遮断部を取り除くことによって、同じチャネル内で流体流を再開することができる。遮断部は、流れを止める液体および／または物理的プラグ７００、８００であってもよく、液体および／または物理的プラグ７００、８００は、ウェル１２０内でバイオアッセイの生成物を効果的に分離し、後のウェルへの流体培地の漏れを防止するか、少なくとも大幅に減少させる。流れを停止および再開する場合、バイオアッセイの化学および／または培地とは干渉が最小であるか、または全く干渉しないことが望ましい。物理的プラグ７００または液体プラグ８００を提供および／または使用する１つの目的は、バイオアッセイまたは分析を実行するためにウェル１２０の間の流体流を停止させるか、または少なくとも著しく減衰させ、次いで、実験を継続するために流れを再開し、後の時点が、ウェルが互いと再び流体的に係合した場合に評価されることを可能にすることができる。
【０１６５】
本発明の少なくとも１つの実施形態では、流体装置１００のウェル１２０、チャネル１３０、および／またはマイクロチャネル２００の間の流れを機械的に制御するために物理的プラグ７００が設けられる。物理的プラグ７００は、任意の数の非透過性材料から構成することができる。例えば、物理的プラグ７００は、ポリマー、合成ポリマー、生分解性ポリマー、プラスチック、生分解性プラスチック、熱可塑性物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ガラス、ＰＹＲＥＸ（登録商標）、もしくはホウケイ酸塩、またはそれらの組み合わせの１つから成ることができる。さらに、物理的プラグ７００は、物理的プラグ７００の形状を、プラグ７００に係合する流体装置１００の形状に適合させるための変形可能部分７１０を画定するために、これらの材料のいずれかでコーティングすることができ、またはこれらの材料のいずれかの追加の外部層を備えることができる。物理的プラグ７００および／または変形可能部分７１０は、流体装置１００の形状に適合するのに十分に可鍛性（柔軟）とすることができ、いくつかの実施形態では、より密接に形状に適合するように圧縮可能であり得るが、損傷を受けずに複数の係合および係合解除に耐えるのに十分強くすることができる。様々な厚さ、硬度、および化学組成のゴムコーティングを、所望の形状および用途に従って使用することができる。
【０１６６】
上述したように、流体装置１００は、流体フローチャネル１３０および／またはマイクロチャネル２００によって相互接続された多数のウェル１２０を含むことができる。さらに、流体装置１００は、多数の行を含むことができる（例えば、図４２参照）。図４１および図４２に示すように、チャネル１３０の形状は、流体装置１００の各行内に配置されたインサート（挿入体）１５５によって画定することができる。チャネル１３０は、インサート１５５または流体装置１００と係合するチャネルカバー２３０によってさらに画定することができる（例えば、図４１参照）。チャネルカバー２３０は、その中にマイクロチャネル２００を画定することができ、または単にチャネル１３０を覆うことができる。チャネルカバー２３０は、そこを通る流体流を受容するために、隣接するウェル１２０と流体的に係合するマイクロチャネル開口部２０５を画定することができる。さらに、チャネルカバー２３０は、各ウェル１２０の上部１２５に係合するためのウェル係合部分２３５を画定することができる。
【０１６７】
１つのウェル１２０から下流の隣接するウェル１２０への流体流を減衰または停止させるために、物理的プラグ７００またはその変形可能部分７１０は、インサート１５５もしくは流体装置１００のウェル１２０の上部１２５、チャネルカバー１６０のウェル係合部分２３５、インサート１５５もしくは流体装置１００のチャネル１３０、および／またはチャネルカバー２３０のマイクロチャネル開口部２０５と封止的に係合するよう整形（形状化）することができる。例えば、本発明の一実施形態は、ウェル１２０と封止的に係合するよう整形されたウェル係合部分２３５を含む、図４５に示される物理的プラグ７００を含むことができ、それにより、流体チャネル１３０、マイクロチャネル２００、またはマイクロチャネル開口部２０５との流体係合を防止することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、物理的プラグ７００は、少なくとも１つのウェル１２０、ウェル１２０の少なくとも１つの行、ウェル１２０の少なくとも１つの列、様々なウェル１２０、または流体装置１００の各ウェル１２０の流体流を封止的に係合する、および／または防止することができる。流体流の封止係合および／または防止は、物理的プラグ７００の変形可能部分７１０によって部分的または全体的に提供することができる。いくつかの実施形態では、変形可能部分７１０は、一体構造であってもよく、物理プラグ７００の表面に適用されるスプレー式塗布の形態であってもよい。他の実施形態では、変形可能部分７１０は、複数の別個の部分から構成することができる。
【０１６９】
流体装置１００の使用方法は、物理的プラグ７００の流体装置１００との係合および／または係合解除を含むことができる。例えば、物理的プラグ７００は、少なくとも１つのウェル１２０と係合するための少なくとも１つのインサート係合態様７２０を画定することができる。インサート係合態様７２０の対応するウェル１２０への係合は、物理的プラグ７００に加えられた圧力を用いて行ってもよい。ウェル１２０およびインサート係合態様７２０は、有利には、必要とされる力は最小限であるにもかかわらずウェル１２０およびインサート係合態様７２０の２つが流体流を制御するために効果的に係合されるよう、ウェル１２０およびインサート係合態様７２０の２つの選択的係合を可能にするように整形することができる。一実施形態では、物理的プラグ７００は、最も下流のウェル１２０に最初に係合し、次いで、それに続く各上流ウェル１２０に係合することができ、一方、別の実施形態では、物理的なプラグは、投与ウェル１１０に最初に係合し、次いで、それに続く各下流ウェル１２０に係合することができる。物理的プラグ７００のいくつかの実施形態は、プラグ７００を流体装置１００から容易に取り外すために、一方または両方の端部にタブ７３０を含むかまたは画定することができる。係合と同様に、プラグ７００の係合解除は、行に沿っていずれかの方向に連続して実行してもよく、またはレバレッジ（てこ）動作を使用してほぼ同時に実行してもよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、流体装置１００を使用する方法は、物理的プラグ７００を適用する前に１つ以上のウェル１２０から液体を除去するステップをさらに含むことができ、および／または流体装置１００から物理的プラグ７００を取り外した後に１つ以上のウェル１２０に液体を追加するステップを含むことができる。さらに、流体装置１００に係合する前に、物理的プラグ７００の滅菌が必要とされてもよい。いくつかの実施形態の物理的プラグ７００の流体装置１００への適用は、流体の変位をもたらす可能性があるので、流体の除去は、流体の化学的性質または細胞を変える圧力の増加を防止するため、または流体のオーバーフローを防止するために、望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、内部の流体の変位を可能にする形状を画定する物理的プラグ７００を使用することによって流体を除去する追加のステップなしに、流体の変位を安全に行うことができる。例えば、物理的プラグ７００がウェル係合態様７２０を含む実施形態では、ウェル係合態様７２０の最底部側は、その内部の流体の変位を可能にするように凹形とすることができる。
【０１７１】
少なくとも１つの実施形態では、物理的プラグ７００は、スイッチ、レバー、または物理的プラグ７００に圧力を加えるための他の動作可能（使用可能）な部品の使用によって、流体装置１００と強制的に係合するか、強制的に流体装置１００との係合を増加させることができる。物理的プラグ７００に少なくとも流体装置１００の方向に圧力を加えることにより、プラグ７００の変形可能部分７２０が、流体装置とよりぴったりと係合することができ、および／または流体の流れを制御するためにより強力な封止を形成することができる。一実施形態では、物理的プラグ７００は、マイクロチャネル２００を形成するチャネルカバーの部分に圧力を加え、それにより、動作可能な部品が移動または回転した場合に、マイクロチャネル２００内の流体流を閉じ込めるために、チャネルカバー２３０内で具現化されるか、チャネルカバー２３０に係合可能にすることができる。例えば、楔形状の物理的プラグ７００は、楔の頂部（先端）がチャネルカバー２３０内の少なくとも１つのマイクロチャネル２００のすぐ上の位置に強制的に配置されるよう回転され、これにより、チャネルカバー２３０に、マイクロチャネル２００を崩壊および閉鎖させ、そこを通る流体流を阻止することができる。
【０１７２】
本発明の少なくとも別の実施形態では、ウェル１２０、チャネル１３０、および／またはマイクロチャネル２００の間の液体の流れを制御するために、液体プラグ８００を設けることができる。液体プラグは、流体装置１００の培地よりも高い粘度を有する液体であってもよく、または、適切な刺激でより粘度の高い状態に変化することが可能な液体（例えば、温度の低下を受けている寒天）であってもよい。流体装置１００を使用する方法は、液体の流れを制御するために液体プラグ８００を使用するための追加のステップをさらに含むことができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、流体装置１００を使用する方法は、１つ以上のウェル１２０から液体を除去するステップをさらに含むことができる。その後、液体プラグ８００を１つ以上のウェル１２０に追加することができる。本方法の一実施形態では、全てのウェル１２０からの液体を除去し、液体プラグ８００で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ある行の他の全てのウェル１２０の液体を液体プラグ８００で置き換えて、ウェル１２０、チャネル１３０、および／またはマイクロチャネル２００の間の液体の流れを制御することができる。液体プラグ８００がウェル１２０の培地を置換するウェル１２０では、ウェル１２０の細胞培養物が犠牲になる可能性がある。液体培地を置換するために液体プラグ８００を使用するインターウェル方法（図４４参照）は、液体プラグ８００が流体装置１００の隣接する行に使用されるウェル１２０を交互にすることを含むこともできる。このようにして、同じ列のウェル１２０の細胞培養物のみを犠牲にするのではなく、代替の細胞培養物を犠牲にすることができ、その結果、データが行全体にわたって複製（再現）され、犠牲ウェル１２０に補間され得る。
【０１７４】
他の実施形態では、流体装置１００を使用する方法は、１つ以上のウェル１２０から液体の一部のみを除去するステップを含むことができる。ウェル１２０内に残っている液体がチャネル１３０またはマイクロチャネル２００のレベルより下になるよう、十分な液体を除去することができ、それによって、液体を１つのウェル１２０から隣接する下流ウェル１２０に吸い上げる毛細管および表面エネルギー力を弱める。毛細管および表面エネルギー力は、液体培地が回収（除去）される場合に弱まるが、流体流を提供する程度には依然として存在し得る。液体の流れをさらに制御するために、液体プラグ８００を液体が引き出された各ウェル１２０に追加することができる。いくつかの実施形態では、液体プラグ８００は、毛細管作用によってチャネル１３０および／またはマイクロチャネル２００を通って流れ、それによって、ウェル１２０の間の液体培地の流れを制御することができる。他の実施形態では、液体プラグ８００は、液体が引き出されたウェル１２０と係合する１つ以上のチャネル１３０またはマイクロチャネル２００に追加することもできる。液体が取り出されたウェル１２０を「キャップオフ（蓋をする；ｃａｐ  ｏｆｆ）」するために、液体プラグ８００を使用するこのイントラウェル法（図４３参照）は、流体装置のウェル１２０を底部から読み取る場合に、液体培地と液体プラグ８００との間の異なる難溶性指標を利用者が利用することを可能にする。例えば、蛍光を検出する場合、蛍光の検出は、液体プラグ８００と液体培地との界面／境界における難溶性指標の変化の鏡のような効果（鏡面的な効果；ｍｉｒｒｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔ）によって向上させることができる。いくつかの実施形態では、液体プラグ８００は、光学的に透明であってもよく、またはわずかに不透明であってもよい。
【０１７５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、液体プラグ８００は、例えば、オリーブ油、ベビーオイル、鉱油、キャノーラ油、グリセリン、グリセロール、ゼラチン、寒天、またはそれらの組み合わせとすることができる。異なる粘度、密度、表面張力、および凝集力の液体プラグ８００を使用することができる。最大の有効性を達成するために、液体プラグ８００は、重力駆動流体力および毛細管駆動流体力の両方を克服することができ、液体プラグ８００が、一旦定置された後（一旦安定した後）、ウェル１２０の液体培地上に堆積されたままとなり、ウェル１２０、チャネル１３０、およびマイクロチャネル２００の間の、好ましくは不活性の点まで、流れに抵抗することを確実にすることができる。物理的プラグ７００と比較して、液体プラグ８００は、一般に、ウェル内の培養物および培地の汚染の危険性が低く、プレートリーダ分析により大きな柔軟性を可能にするという利点を有する。しかし、物理的プラグ７００と同様に、利用者は、液体培地を汚染することを回避し、および／または細胞培養物の長期生存性を損なうことなく、液体プラグ８００が無菌であり、生体適合性であることを保証することができる。
【０１７６】
液体培地および／または液体プラグ８００は、本明細書で説明するステップを実行するために、任意の数の方法で追加することができる。例えば、ピペットを使用して、液体培地または液体プラグ８００を少なくとも１つのウェル１２０、チャネル１３０、またはマイクロチャネル２００に追加することができる。処理されるべき容積のピペットの制御は、手動で、デジタル的に、または機械的に制御することができる。いくつかの実施形態では、液体培地または液体プラグ８００を流体装置１００に追加するために、本明細書に記載のアセンブリ３００と同様または同一のピストンアセンブリ３００を提供することができる。
【０１７７】
液体培地および／または液体プラグ８００は、本明細書で説明するステップを実行するために、任意の数の方法で除去することができる。液体培地を除去する場合、ウェル１２０の細胞培養物およびウェルの間の勾配を邪魔しないように注意する。液体プラグ８００を除去する際には、細胞培養物および勾配だけでなく、それらが存在する液体培地を除去しないまたは邪魔しないように注意する。少なくとも１つの実施形態では、ピペットを使用して、少なくとも１つのチャネル１３０および／またはマイクロチャネル２００から液体プラグ８００を取り除き、少なくとも１つのウェル１２０の液体培地の上に存在する液体プラグ８００の層を除去し、および／またはウェル１２０内から液体プラグ８００を除去することができる。より高い粘度の液体プラグ８００を効果的に取り扱うために、ピペットはラージボア（大口径）ピペットまたはポジティブディスプレイスメントピペット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｉｐｅｔｔｅ）とすることができる。他の実施形態では、ウィックを使用して液体培地または液体プラグ８００を各ウェルから個々に抜き取ることができる。代替的に、液体プラグ８００を除去する場合、十分な量の液体プラグ８００を除去するよう、ウィックまたは真空を最下流のウェルまたはリザーバに配置して、チャネル１３０および／またはマイクロチャネル２００を通って液体プラグ８００を抜き取ることができる。そのような実施形態では、十分な量の液体プラグ８００が除去されると、液体培地を少なくとも１つのウェル１２０に加えることができる。液体培地および液体プラグ８００が一旦定置すると、流体装置に追加される場合はいつでも必要に応じて、追加の液体培地が、まだ残っている液体プラグ８００の層を効果的に持ち上げて、液体プラグ８００の残りの層を吸い上げるか、または真空にすることができるように維持される。さらに別の実施形態では、液体プラグ８００は、液体プラグ８００を溶解するためおよび／または流体装置１００内に保持されたプラグ８００の粘度を低下させるためのプラグ化学物質の使用によって除去することができる。
【０１７８】
実施形態を様々な図面の様々な実施形態に関連して説明してきたが、逸脱することなく他の同様の実施形態を使用することができ、または同じ機能を実行するために説明した実施形態に修正もしくは追加を行うことができることを理解されたい。したがって、開示された実施形態は、いずれかの単一の実施形態に限定されるべきではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に従って幅広く解釈されるべきである。
【０１７９】
実施例１
【０１８０】
タイトル：いくつかの実験的アプローチの間の細胞傷害性を比較する、ＨｅｐＧ２細胞に対するタモキシフェンの影響を調べる。
【０１８１】
導入
【０１８２】
予測毒性学の新しいパラダイムには、毒性物質または薬物暴露による早期開始の細胞事象の評価が含まれる。このパラダイムの大きな課題の１つは、そのような開始事象が適応性があるか、毒性につながるかどうかを判断することである。ｍＲＮＡレベルの変化などの細胞事象と細胞傷害のアウトカム（結果）とを関連付ける細胞培養モデルが、有害反応と適応応答とを区別するためにしばしば使用される。次いで、各応答を生成するために必要な暴露レベルは、用量応答曲線を介して可能性の高いｉｎ  ｖｉｖｏ曝露シナリオに推定（外挿）される。
【０１８３】
流体装置は、細胞ベースアッセイへの流体運動および勾配毒性曝露の適用を可能にする汎用システムである。流体装置によってもたらされる時間分解動的曝露シナリオは、よりｉｎ  ｖｉｖｏライクであり（よりｉｎ  ｖｉｖｏに近く）、適応性対毒性のメカニズムのより正確な評価を可能にすることができる。さらに、動的曝露シナリオでは、エンドポイントの用量応答曲線から外挿する代わりに、実際の閾値を確認することを可能にする。
【０１８４】
流体装置の使用および勾配曝露の細胞傷害性への影響を実証するために、いくつかの実験的アプローチの間の細胞傷害性を比較する、ＨｅｐＧ２細胞に対するタモキシフェンの影響を調べる一連の実験を行った。
【０１８５】
使用される材料および器具は：ＨｅｐＧ２細胞；少なくとも１つの流体装置；１０％ＦＢＳ、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、１ＸＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭを含む培養培地；ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎ；ＤＭＳＯに溶解したタモキシフェン；フルオレセイン塩；Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏマルチモードプレートリーダ、を含む。
【０１８６】
方法
【０１８７】
Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰｒｏのＺ高さ焦点の最適化。流体装置は、プレートリーダ、イメージャ、および自動液体処理に適合するよう設計されたＳＢＳフォーマットのマイクロタイタープレートである。流体装置を横切る流体の重力引っ張りを可能にするために、プレートの一端でウェル高さを高くして設計し、その後、各ウェルを０．５ｍｍ低くした。したがって、流体装置の第２列のウェルの底部の間の距離は、第１１列のウェルの底部よりも６ｍｍ高い。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏは、実験的に各測定の最適な高さを判定する機能を備えているため、ウェルの高さが測定に及ぼす影響が無効になる。
【０１８８】
ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎの測定に最適な高さを判定するために、ＨｅｐＧ２細胞を流体装置のウェルにプレーティングし、ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎの存在下で界面活性剤で溶解した。各ウェルで、これは、ｚ高さを最適化するための焦点として働く最大のＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎ蛍光を生じた。流体装置について決定されたｚ高さを図３２に示す。分析の速度を向上させるために、以降の実験では、読み取りごとに最適化するのではなく、このセット高さパラメータを使用した。
【０１８９】
フルオレセイン標準曲線の作成
【０１９０】
流体装置は、重力、表面張力、および拡散の組合せが毒性物質を下流ウェルに流す供給源となる特定のソースウェル内に毒性物質を適用することを可能にするよう設計されている。濃度が各ウェルで時間とともに変化しているので、データ分析のための任意の所定の時間における毒性物質または薬物の濃度を判定するためには、標準の同時適用が必要である。フルオレセイン塩は、原形質膜（細胞膜）に浸透しない比較的毒性のない色素であり、医療および環境トレーサ色素（基準）として一般に使用されている。フルオレセインをトレーサ色素として利用するために、既知のフルオレセイン濃度の標準曲線を作成する。この標準曲線は、フルオレセインの絶対濃度を計算するために実験的蛍光測定値が使用される一次方程式を作成する。次いで、この実験濃度に実験基質の開始濃度を掛けて、実験の任意の所定の時間における各濃度を得る。
【０１９１】
フルオレセイン標準曲線を作成するために、流体装置の各行を、完全培地に溶解した０．００１ｕＭ〜１ｕＭのフルオレセインの単一濃度で満たした。次いで、図３２のｚ高さを使用してＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏを使用してｅｘ４８５／ｅｍ５２５でプレートを読み取った。１ｕＭ希釈の最適な利得設定値（ｇａｉｎ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ）を決定するために装置を設定した。各行からの値を平均し、濃度に対してプロットし、線形標準曲線を得た（図３３参照）。この曲線の方程式は、線形回帰分析を用いて決定された。後の実験で使用するために利得設定値を記録した。
【０１９２】
流体装置を使用した曝露の利用者定義ダイナミクス。流体は平衡状態に向かって移動しているので、システム内の流体流を維持するために一定間隔でソースウェルに補充することが重要である。補充の間隔（リズム、周期；ｃａｄｅｎｃｅ）は、毒性物質がどれくらい早くシステムを通過するかを判定する。勾配形成に対する補充間隔の影響を実証するために、流体装置のウェルをウェル２〜１１中の１００ｕＬの完全培地で満たした。４００ｕＬの培地をソースウェルに加え、続いて２００ｕＬの１ｕＭフルオレセインを加えた。フルオレセイン濃度は、ｅｘ／ｅｍ  ４８５ｎｍ／５２５ｎｍに設定されたＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  １０００プレートリーダを使用して経時的に監視した。システムを補充するために、１００ｕＬの培地をウェル１１から除去し、１００ｕＬの１ｕＭフルオレセインをソースウェルに追加した。これを１日２回または３回繰り返した。図３９は、７２時間にわたる補充間隔による代表的なウェル４および８におけるフルオレセイン濃度曲線を示す。１日３回補充すると、１日２回に比べてより顕著な濃度上昇を生じた。
【０１９３】
ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎを用いたタモキシフェンに対するＨｅｐＧ２細胞の応答に対する流速の影響。ＨｅｐＧ２細胞の応答に対する流れのタモキシフェンへの影響を比較するために、薬物が、２つの異なる速度（２Ｘ（２回）および３Ｘ（３回））で供給ソースウェルに適用されるか、または流れがない場合（静的）に個々のウェルに直接適用される、流体装置のウェルで細胞を処理した。各条件について、ＨｅｐＧ２細胞を流体装置の個々のウェルに５０ｕＬの培地中に１ウェルあたり３０，０００細胞の密度で播種した。この密度は、約６０％コンフルエント（細胞が非常に接近し密集した状態）に相当した。図４０は、タモキシフェンの細胞傷害性の時間影響を掛けた濃度を含む、タモキシフェンに対するＨｅｐＧ２応答に対する流れの影響を示す。流体装置中のＨｅｐＧ２細胞を、経時的に濃度が増加するタモキシフェンで処理した。１５０ｕＭのタモキシフェンを１日２回（２Ｘ）または１日３回（３Ｘ）のいずれかで、流体装置のソースウェルに注入した。任意の所定時間での絶対濃度の計算を可能にするために、２つの無細胞系の行に１ｕＭフルオレセインを注入した。試薬ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎを用いて、細胞毒性を監視した。各時点の間の曲線値の下の面積を得て、（処理／コントロール）の最大％として表される影響に対してプロットした。単一のプロットを得るためにデータを一緒にプールした。ＥＣ５０値は、ＰＫＳｏｌｖｅｒのＳｉｇｍｏｉｄ  ＥＭａｘモデルによって計算した。
【０１９４】
フローベース処理。２Ｘおよび３Ｘ実験では、フルオレセインを濃度の基準として利用するために、Ａ行およびＢ行は無細胞のままであった。１日順化させた後、培地を、１ウェル当たり１００ｕＬの容量を用いてＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎの１：２０００希釈物を含有する培地に交換した。４００ｕＬのＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎ含有培地もまた、ソースウェルに添加した。流体接続を、加湿インキュベーター内で３７℃で３０分間形成および安定化させた。各行の流体接続が確認されたら、０．１％ＤＭＳＯ中の１５０ｕＭタモキシフェンまたは０．１％ＤＭＳＯ単体のいずれかを含むＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎを含む培地２００ｕＬをソースウェルに添加した。行ＡおよびＢに、０．１％ＤＭＳＯ中の１ｕＭフルオレセイン２００ｕＬをソースウェルに添加した。全ての条件について、Ｚ高さ焦点面に最適化されたＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  Ｍ１０００マルチモードプレートリーダを用いて蛍光を監視した。２Ｘおよび３Ｘプレートでは、ウェル１１から１００ｕＬを吸い取り、１日２回（２Ｘ）または１日３回（３Ｘ）に相当する間隔で１００ｕＬの新鮮な投与溶液をソースウェルに適用することにより、培地の流れを維持した。
【０１９５】
静的処理。静的な流体条件では、播種後、細胞を１日間順化させ、次いで培地を、０．１％ＤＭＳＯまたは０．１％ＤＭＳＯ単独中の上記濃度のタモキシフェンを含む培地５０ｕＬに変更した。蛍光の分析が各ウェルの細胞死の程度を判定するインキュベーションを２４時間続けた。各濃度の９つの複製物を平均した。
【０１９６】
データ分析。２Ｘおよび３Ｘフロープレート中の任意の所定の時間における濃度を決定するために、α−細胞性フルオレセインのコントロール行から得られたＲＦＵ値を各列について平均し、フルオレセイン標準曲線を用いて実際のフルオレセイン濃度を決定した（図３３参照）。フルオレセインの開始濃度は１ｕＭであり、タモキシフェンの開始濃度は１５０ｕＭであったので、各ウェルのフルオレセインの量に１５０を掛けて、対応するタモキシフェン濃度を得た。各時点の曲線下面積（ＡＵＣ）は、濃度値に、ＰＫＳｏｌｖｅｒのＡＵＣｔ関数を用いた最後の時点からの時間（ｈｏｕｒｓ）における時間を掛けて得た。静的条件の場合、濃度は処理時間全体にわたって一定であり、したがってＡＵＣを得るために濃度に２４時間を掛けた。影響レベルは、処理された値をコントロール値で除し、１００％最大応答に正規化することによって得られる。ＰＫＳｏｌｖｅｒの「Ｓｉｇｍｏｉｄ  Ｅｍａｘ」薬力学モデルを使用して、ＥＣ５０値および線形フィット（ラインフィット；ｌｉｎｅ−ｆｉｔｓ）を生成した（図３５から図３７参照）。さらなる詳細については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇらによる、“Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”，９９（２０１０）３０６−３１４を参照されたい。
【０１９７】
結論。フロー条件下での流体装置における処理と静的培養物との間の曲線の差は、細胞傷害性に関与する分子メカニズムを判定する手段を提供する。
【０１９８】
実施例２
【０１９９】
タイトル。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ静的曝露と比較して、時間分解非線形毒性曝露を用いた予測ＥＣ５０の相違
【０２００】
概要。標準的な２次元静的細胞培養系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性評価のための限られたツールである。単層で増殖した細胞は、適切な細胞−細胞接触を形成せず、静的培養ウェル内で増殖した細胞は、加えられた毒性物質に関係しない潜在的ストレス応答および毒性を引き起こす廃棄物の量の増加および溶存酸素の量の減少を受ける。これらの制限を克服するために、研究者は、細胞が導入される環境の生理学的関連性を改善するために、３Ｄスキャフォールド（三次元足場材）、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）、ヒドロゲル、および流体システムに注目している。ここでは、９６ウェルプレートの各行の１０ウェルをマイクロ流体チャネルと接続するように設計された流体システムの評価を示す。このシステムは、ウェルを連続的に連結して、薬剤または毒性物質を適用することができる細胞チャンバのカスケードを形成する。毒性物質は、時間分解形で親代謝産物の勾配を形成する下流のウェルで混合され、相互作用する代謝産物を生成する上流のコンパートメント（区画）内で細胞と相互作用する。そのようなシステムは、より生活に似た環境での毒性測定の時間動力学による濃度を可能にする。このシステムの価値を実証するために、試薬ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎを用いた静的条件と比較した、ＨｅｐＧ２細胞に対するタモキシフェンの影響を評価した。フルオレセイントレーサ分子を用いることで、流体系における曝露が、非線形で、ｉｎ  ｖｉｖｏで予測される血漿曲線に類似した形状であることを示すことができた。静的系と流動系との間のＡＵＣの比較は、静的系の細胞よりもタモキシフェンに対して約４倍感受性が低い、流動系におけるＨｅｐＧ２細胞を有する劇的に異なる用量応答曲線形状およびＥＣ−５０を明らかにした。
【０２０１】
背景
【０２０２】
予測毒性学の新しいパラダイムには、毒性物質または薬物暴露による早期開始の細胞事象の評価が含まれる。このパラダイムの大きな課題の１つは、そのような開始事象が適応性があるか、毒性につながるかどうかを判断することである。ｍＲＮＡレベルの変化などの細胞事象と細胞傷害アウトカムとを関連付ける細胞培養モデルが、有害反応と適応応答とを区別するためにしばしば使用される。次いで、各応答（反応）を生成するために必要な暴露レベルは、用量応答曲線を介して可能性の高いｉｎ  ｖｉｖｏ曝露シナリオに推定される。
【０２０３】
流体装置は、細胞ベースアッセイへの流体運動および勾配毒性曝露の適用を可能にする汎用システムである。流体装置によってもたらされる時間分解動的曝露シナリオは、よりｉｎ  ｖｉｖｏライクであり、適応性対毒性のメカニズムのより正確な評価を可能にすることができる。さらに、動的曝露シナリオでは、エンドポイントの用量応答曲線から外挿する代わりに、実際の閾値を確認することを可能にする。
【０２０４】
流体装置の使用および勾配曝露の細胞傷害性への影響を実証するために、いくつかの実験的アプローチの間の細胞傷害性を比較する、ＨｅｐＧ２細胞に対するタモキシフェンおよびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の影響を調べる一連の実験を行った。
【０２０５】
目標。流体装置の流体培養物と標準静的流体培養物とを使用して、タモキシフェンまたはアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）処理ＨｅｐＧ２細胞についての全時間分解暴露細胞死ＥＣ５０を評価する。
【０２０６】
流体装置の設計の概要。図２９から図３１を参照のこと。図２９は、実施例２で使用される流体装置の設計特徴を示す。流体装置は、最大６００ｕＬの培地を保持できる超大規模ソースウェルを特徴とするよう設計されている。各行の各後続ウェルは、プレートの上面を横切って延びるマイクロチャネルによって共に接続される。行カバーは、システム内の培地とセルとの両方に完全にアクセスできるように、オープンウェルを伴う閉鎖チャネルシステムを作製するのに役立つ。ウェル１２の多孔質ウィックは、余分な流体のシンク（流し）として機能する。図３０は、実施例２で使用される流体装置の使用概要を示す。流体装置は、細胞および組織を播種し、流れを開始し、長期培養のためにリニューアル（刷新）および補充するために使用される。図３１は、実施例２で使用される流体装置の例示的なウェルとの流体工学混合を示す。流体ベクトルの線は、個々のウェル全体を移動する流体の方向を示す。画像は、ＢＭＧ  Ｌａｂ  ＴｅｃｈのＣｌａｒｉｏｓｔａｒ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ＲｅａｄｅｒのＷｅｌｌｓｃａｎ機能を使用して取得した。指示された時間で３０Ｘ３０  ２Ｄグリッドを蛍光強度のために測定し、混合動態を測定した。６０分で、グリッドの％ＣＶは、ほぼ完全な混合を示す２％未満であった。
【０２０７】
方法。流体装置の行に沿って蛍光を測定するためのＺ高さ焦点を最適化する。リアルタイム濃度勾配を外挿するフルオレセイン標準曲線を作成する。ＨｅｐＧ２細胞およびＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎ（細胞傷害性試薬）を使用して、タモキシフェンおよびＡＰＡＰ誘導細胞死のＥＣ５０を決定する。
【０２０８】
結果
【０２０９】
図３２から図３７を参照のこと。図３２は、決定された最適なＺ高さ焦点を示す表である。ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎの存在下で流体装置のウェルにＨｅｐＧ２細胞をプレーティングすることにより、最適なＺ高さを決定した。次いで、細胞を溶解して最大シグナルを生成させた。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏのｚスキャン設定を使用して、最適な焦点高さを特定した。
【０２１０】
図３３は、決定したフルオレセイン標準曲線を描いたグラフである。フルオレセイン標準曲線を作成するために、流体装置の各行を、完全培地に溶解した０．００１ｕＭ〜１ｕＭのフルオレセインの単一濃度で満たした。次いで、表のｚ高さを使用してＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏを使用してｅｘ４８５／ｅｍ５２５でプレートを読み取った。１ｕＭ希釈の最適利得設定値を決定するために装置を設定した。各行からの値を平均し、濃度に対してプロットし、線形標準曲線を得た。この曲線の方程式は、線形回帰分析を用いて決定した。後の実験で使用するために利得設定値を記録した。
【０２１１】
図３４は、実験的プレート構成を示す。無細胞ウェルは、３００００のＨｅｐＧ２細胞を播種した細胞と全く同じように処理した。播種および付着後、培地をＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎの１：２０００希釈物を含む培地に交換した。毒性物質、溶媒（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、または１ｕＭ蛍光トレーサを、記載のようにソースウェルに適用した。
【０２１２】
ＡＵＣ曝露に基づいてＥＣ５０を得るためのデータ分析手順の概要を示す。行ＡおよびＢのＲＦＵ値は、標準曲線を使用して［ｕＭ］フルオレセインに変換される。計算されたｕＭフルオレセイン（ＸＦＬ）は、次の式で「予期」毒性濃度（ＸＥ）に変換される：ＸＥ＝ＸＦＬ＊Ｘｉ：ここで、Ｘｉは流体装置のソースウェルに適用される初期毒性濃度である。曲線下面積（ＡＵＣ）濃度は、各時点で線形台形法を用いて計算される。さらなる詳細については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＫＳｏｌｖｅｒ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９９、Ｉｓｓｕｅ  ３、２０１０年９月、３０６〜３１４頁を参照されたい。
【０２１３】
図３５から図３７は、細胞傷害性のＥＣ５０に対する時間曝露を掛けた濃度の影響を示す。図３５は、経時的なタモキシフェンＡＵＣの影響を示す。流体装置中のＨｅｐＧ２細胞を、経時的に濃度が増加するタモキシフェンで処理した。図３６は、タモキシフェン濃度に時間ＥＣ５０を掛けたものを示す。タモキシフェンの反復注入後の各ウェルのＥＣ５０を計算した。１５０ｕＭのタモキシフェンを１日３回、流体装置のソースウェルに注入した。２つの無細胞系の行に１ｕＭフルオレセインを注入して、任意の時点における絶対濃度の計算を可能にした。試薬ＣｅｌｌＴｏｘＴＭＧｒｅｅｎを用いて、細胞毒性を監視した。各時点の間の曲線値の下の面積を得て、（処理／コントロール）の最大％として表される影響に対してプロットした。ＥＣ５０値は、ＰＫＳｏｌｖｅｒのＳｉｇｍｏｉｄ  ＥＭａｘモデルによって計算した。図３７は、ＡＰＡ濃度に時間ＥＣ５０を掛けたものを示す。計算は、５０ｍＭのＡＰＡＰを使用したことを除いて、図３６の計算と同じであった。
【０２１４】
結論
【０２１５】
流体装置は、強い（ｒｏｂｕｓｔ）時間分解毒性勾配の生成を可能にする。下流のウェルにおけるタモキシフェンおよびＡＰＡＰの観察されたＥＣ−５０は、標準的な静的培養法を使用した場合に予想されたものとは異なっていた。タモキシフェンの観察されたＥＣ５０は失活を示唆したが、ＡＰＡＰの観測されたＥＣ５０は、ＨｅｐＧ２細胞におけるこれらの毒性物質の挙動について知られているものと一致する毒性中間体の生物活性化を示唆する。
【０２１６】
流体装置の各ウェルにおける逐次代謝を通した代謝産物対親の比が増加するにつれて、各ウェルにおける全親＋代謝産物濃度のＥＣ５０の性質は、システムに導入される代謝産物が毒性であるかどうかを示す。代謝の増加（例えば、代謝産物対親の比の増加）に伴うＥＣ５０の減少は、産生される代謝産物が親よりも毒性が低いことを示す。逆に、代謝の増加に伴うＥＣ５０の減少は、産生される代謝産物が親よりも毒性が高いことを示す。代謝が結果に影響を及ぼさなかった場合の予期されるＥＣ５０の線を描くことによって、これらの代謝産物の構造の事前知識なしに、代謝産物の毒性の真／偽（すなわち、ブール型）の判断材料を提供可能であることを示す。そのようなアプローチは、任意の代謝産物を同定し、単離し、精製し、試験するための広範な作業の前に代謝が重要な生物活性を有するかどうかによって化学物質を分類する方法としてヒット・トゥー・リードおよびリード最適化の努力に使用することができる（図３８参照）。図３８は、少なくとも１つの流体ＥＣ５０が静的ＥＣ５０と比較される実施形態を示す。
【０２１７】
実施例３
【０２１８】
図４６を参照すると、７日および９日間にわたるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）で処理した静的プレートおよび流体装置１００の培養された細胞の比較が示される。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて生存細胞を測定した。データは、溶媒（ＤＭＳＯ）コントロールに対して正規化される。７日目：静止プレート（黒色）におけるＡＰＡＰの毒性は、最も高い濃度でのみわずかに検出可能である。流体装置１００（灰色）は、上流細胞において産生され、下流に流れる毒性／反応性代謝物の特徴である下流細胞死効果を示す。９日目：最も高いＡＰＡＰ濃度（５ｍＭ）での静的プレートにおける明らかな細胞死および２．５ｍＭでの限界効果。流体装置１００におけるより顕著な下流代謝産物効果は、毒性薬物応答のメカニズムについての洞察を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【国際調査報告】
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