(57)【要約】  本発明は、ネクチン−４に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネクチン−４に対する特異性を有する抗体であって、
−ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖と、
−ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖とを有し、
−Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１が、配列番号１の３１位のアミノ酸残基から３５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２が、配列番号１の５０位のアミノ酸残基から６５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３が、配列番号１の９８位のアミノ酸残基から１０５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１が、配列番号２の２４位のアミノ酸残基から３４位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２が、配列番号２の５０位のアミノ酸残基から５６位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３が、配列番号２の８９位のアミノ酸残基から９６位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される、抗体。
【請求項２】
ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖と、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖とを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１と同一の重鎖と、配列番号２と同一の軽鎖とを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
キメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
Ｎ４１ｍａｂ抗体のＣＤＲを含むヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体をコードする、核酸分子。
【請求項７】
細胞傷害性部分にコンジュゲートされている、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；エチジウムブロミド；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルチシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリン阻害剤、例えば、メイタンシン又はその類似体若しくは誘導体；メルタシン又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグ；抗有糸分裂剤、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ若しくはＦ又はそれらの類似体若しくは誘導体；ドラスタチン１０若しくは１５又はそれらの類似体；イリノテカン又はその類似体；マイトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体若しくは誘導体；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン又はクラドリビン；アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブルモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ；プラチナ誘導体、例えば、シスプラチン又はカルボプラチン；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）又はその類似体若しくは誘導体；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）；ピロール［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリアトキシン及び関連分子、例えば、ジフテリアＡ鎖及びその活性フラグメント並びにハイブリッド分子、リシントキシン、例えば、リシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖トキシン、コレラトキシン、シガ様トキシン、例えば、ＳＬＴ  Ｉ、ＳＬＴ  ＩＩ、ＳＬＴ  ＩＩＶ、ＬＴトキシン、Ｃ３トキシン、シガトキシン、百日咳トキシン、破傷風トキシン、ボウマン・バークダイズプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルジ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカナ（Phytolacca americana）タンパク質、例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ、モモルディカ・カラチア（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン及びエノマイシントキシン；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌内毒素Ａ；ポークウィード抗ウイルスタンパク質；ジフテリントキシン；及びシュードモナス外毒素からなる群より選択される細胞傷害性部分にコンジュゲートされている、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
オーリスタチン又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされている、請求項７又は８に記載の抗体。
【請求項１０】
医薬として使用するための、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
ガンが乳ガン、卵巣ガン又は肺ガンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ガンが転移性ガンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体の少なくとも１つのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む、キメラ抗原レセプター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ネクチン−４に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ネクチン−４は、４つのメンバーを含むタンパク質のネクチンファミリーに属する表面分子である。発達及び成人期において、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞及び神経細胞では、ネクチンは、極性、増殖、分化及び遊走などの様々な生物学的過程において重要な役割を果たす細胞接着分子である。それらは、ヒトにおけるいくつかの病理学的過程に関与する。それらは、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス及び麻疹ウイルスのための主なレセプターである。ネクチン−１（ＰＶＲＬ１）又はネクチン−４（ＰＶＲＬ４）をコードする遺伝子の突然変異は、他の異常に関連する外胚葉性異形成症候群を引き起こす。ネクチン−４は、胎児発達中に発現される。成人組織では、その発現は、ファミリーの他のメンバーのものよりも限定的である。それぞれ乳ガン、卵巣ガン及び肺ガンの５０％、４９％及び８６％において（すなわち、主に予後不良の腫瘍において）、ネクチン−４は腫瘍関連抗原である。対応する正常組織では、その発現は検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン−４は、主にトリプルネガティブ及びＥＲＢＢ２＋ガン腫において発現される。これらのガンを有する患者の血清では、可溶性形態のネクチン−４の検出は、予後不良に関連する。血清ネクチン−４のレベルは転移進行中に増加し、処置後に減少する。これらの結果は、ネクチン−４が、ガンの処置のための信頼性のあるターゲットであり得ることを示唆している。したがって、先行技術には、いくつかの抗ネクチン−４抗体が記載されている。特に、エンフォルツマブベドチン（ＡＳＧ−２２ＭＥ）は、ネクチン−４をターゲティングする抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、現在、固形腫瘍を患っている患者の処置について臨床的に研究されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ネクチン−４に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明は、ネクチン−４に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。特に、本発明は、Ｎ４１ｍａｂ抗体（Ｎ４１ｍａｂ）に由来する抗体を提供する。実際、本発明者らは、Ｎ４１ｍａｂが固有の抗転移活性を有していたことを示す：Ｎ４１ｍａｂは、マトリゲル浸潤を減少させることによって、ネクチン４発現乳房腫瘍細胞の腫瘍浸潤特性を著しく減少させた。異種移植マウスモデルを使用して、本発明者らは、腫瘍細胞をマウス尾静脈に全身注射した後、１０mg/kg Ｎ４１ｍａｂでマウスを週２回処置すると、原発部位からの腫瘍拡散が著しく阻害され、さらには転移形成が遮断されることを示した。Ｎ４１ｍａｂとオーリスタチン−Ｅとのコンジュゲーション（Ｎ４１ｍａｂ−ＭＭＡＥ）は、５ng/ml（３３pM）のＩＣ５０値で、in vitroにおける乳房腫瘍細胞成長の著しい阻害を誘導した。２．５又は１０mg/kg Ｎ４１ｍａｂ−ＭＭＡＥの２回の静脈内注射で腫瘍発症時に処置したマウスは、迅速かつ持続的な腫瘍退縮を誘導した。より具体的には、本発明者らは、Ｎ４１ｍａｂが、先行技術に記載されている最新の抗ネクチン４抗体（すなわち、ＡＳＧ−２２ＭＥ）よりも効率的であることを実証する。したがって、前記抗体は、ガン患者を処置して腫瘍進行を予防及び／又は根絶するための新たな方法である。
【０００５】
本明細書で使用される「ネクチン−４」という用語は、当技術分野における一般的な意味を有し、ヒトネクチン−４、特にネイティブ配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、ヒトネクチン−４の全てのホモログ、フラグメント及び前駆体を含む。ネイティブなネクチン−４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２１７８．２を含む。
【０００６】
本明細書で使用される「抗体」又は「免疫グロブリン」は、同じ意味を有し、本発明において同等に使用されるであろう。本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体フラグメント並びに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。２種類の軽鎖（ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ））が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが存在する。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３。ＣＨと総称される）を含む。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖及び重鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ及びＣＨ）は、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤性移動、相補結合性及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対する結合性を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的な相補性による。抗体結合部位は、主に超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成される。時々、非超可変又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、抗体結合部位に関与し得るか、又はドメイン構造全体及びそれ故に結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３という３つのＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖の各Ｖ領域由来のＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体可変ドメイン中の残基は、慣例的には、Kabatらによって考案されたシステムにしたがってナンバリングされる。このシステムは、Kabat et al. This system is set forth in Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（以下、「Kabat et al.」）に記載されている。本明細書では、このナンバリングシステムが使用される。Kabat残基指定は、通常、配列番号の配列におけるアミノ酸残基の直線的なナンバリングとは直接対応しない。実際の直線的なアミノ酸配列は、フレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、基本的な可変ドメイン構造の構造要素の短縮又は要素内への挿入に対応する厳密なKabatナンバリングよりも少ない又は多いアミノ酸を含有し得る。残基の正しいKabatナンバリングは、所定の抗体について、「標準的な」Kabatナンバリング配列を有する抗体の配列において、相同性の残基のアライメントによって決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Kabatナンバリングシステムにしたがって、残基３１〜３５Ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Kabatナンバリングシステムにしたがって、残基２４〜３４Ｂ（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）に位置する。
【０００７】
本明細書で使用される「特異性」という用語は、非ネクチン−４タンパク質又は構造（例えば、ＮＫ細胞上に又は他の細胞型上に提示される他のタンパク質）との検出可能な反応性を相対的にほとんど有しない一方、ネクチン−４などの抗原上に提示されるエピトープに検出可能に結合する抗体の能力を指す。特異性は、本明細書の他の箇所に記載されているように、結合アッセイ又は競合結合アッセイによって、例えばBiacore機器を使用して相対的に決定され得る。特異性は、例えば、特異的抗原に対する結合と、無関係な分子に対する非特異的結合との親和性／アビディティの比が約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１又はそれ以上であることによって示され得る（この場合、特異的抗原は、ネクチン−４ポリペプチドである）。本明細書で使用される「親和性」という用語は、エピトープに対する抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、未結合の抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、未結合の抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄによって示される。親和定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)（これらの参考文献は、全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見られ得る。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法は、Biacore機器の使用である。
【０００８】
本発明によれば、Ｎ４１ｍａｂのＶＨ領域は、配列番号１の配列からなる。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１は、配列番号１の３１位のアミノ酸残基から３５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１の５０位のアミノ酸残基から６５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１の９８位のアミノ酸残基から１０５位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。
【０００９】
配列番号１：Ｎ４１ｍａｂのＶＨ領域ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化１】
2018531913.tif 000002
【００１０】
本発明によれば、Ｎ４１ｍａｂ抗体のＶＬ領域は、配列番号２の配列からなる。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１は、配列番号２の２４位のアミノ酸残基から３４位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２は、配列番号２の５０位のアミノ酸残基から５６位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。したがって、Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２の８９位のアミノ酸残基から９６位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される。
【００１１】
配列番号２：Ｎ４１ｍａｂ抗体のＶＬ領域ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化２】
2018531913.tif 000003
【００１２】
したがって、本発明は、Ｎ４１ｍａｂのＶＬ領域、ＶＨ領域又は１つ以上のＣＤＲの機能的変異体を含む抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体との関連で使用されるＶＬ、ＶＨ又はＣＤＲの機能的変異体は依然として、抗体が、親抗体（すなわち、Ｎ４１ｍａｂ抗体）の親和性／結合活性及び／又は特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）を保持することを可能にし、いくつかの場合では、このような本発明のモノクローナル抗体は、親Ａｂよりも高い親和性、選択性及び／又は特異性に関連し得る。このような機能的変異体は、典型的には、親Ａｂと有意な配列同一性を保持する。ＣＤＲ変異体の配列は、主に保存的置換により、親抗体配列のＣＤＲの配列と異なり得る；例えば、変異体における置換の少なくとも約３５％、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上（例えば、約６５〜９５％、例えば、約９２％、９３％又は９４％）は、保存的アミノ酸残基置換である。ＣＤＲ変異体の配列は、主に保存的置換により、親抗体配列のＣＤＲの配列と異なり得る；例えば、変異体における置換の少なくとも１０個、例えば少なくとも９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個は、保存的アミノ酸残基置換である。本発明との関連では、保存的置換は、以下のように反映されたアミノ酸分類内の置換によって定義され得る。
【００１３】
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ及びＭ
シクロアルケニル会合残基Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹ
負に荷電した残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴ
正に荷電した残基Ｈ、Ｋ及びＲ
小型残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＶ
非常に小型の残基Ａ、Ｇ及びＳ
ターン形成に関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ及びＴ
フレキシブルな残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ及びＲ
【００１４】
より保存的な置換の分類としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。疎水性／親水性及び残基の重量／サイズに関する保存もまた、Ｎ４１ｍａｂのＣＤＲと比較して、変異体ＣＤＲにおいて実質的に保持される。タンパク質への魅力的な生物学的機能の付与における疎水性アミノ酸インデックスの重要性は、当技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、そしてこれが、タンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ，抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸は、その疎水性及び荷電特性に基づいて、疎水性インデックスを割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。さらに又はあるいは、類似残基の保持は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準的な設定ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｏｐｅｎ  Ｇａｐ＝ｌｌ及びＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｇａｐ＝ｌを使用した、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ  ２．２．８）の使用によって決定した場合、類似性スコアによって測定され得る。適切な変異体は、典型的には、親ペプチドと少なくとも約７０％の同一性を示す。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。
【００１５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖を有する抗体である。
【００１６】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖を有する抗体である。
【００１７】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖と、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖とを有する抗体である。
【００１８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖を有する抗体である。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖を有する抗体である。
【００２０】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖と、ｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と、ｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）Ｎ４１ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖とを有する抗体である。
【００２１】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖を有する抗体である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。
【００２３】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖と、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖とを有する抗体である。
【００２４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号１と同一の重鎖を有する抗体である。
【００２５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号２と同一の軽鎖を有する抗体である。
【００２６】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号１と同一の重鎖と、配列番号２と同一の軽鎖とを有する抗体である。
【００２７】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、典型的にはキメラマウス／ヒト抗体である。「キメラ抗体」という用語は、非ヒト動物由来の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインとを含むモノクローナル抗体を指す。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物が使用され得る。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、Ｎ４１ｍａｂ抗体の重鎖及び軽鎖を含み得る。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｎ４１ｍａｂ抗体のＣＤＲを含むヒト化抗体である。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性のドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲを含むようにフレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されている抗体を指す。
【００２９】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖの群から選択される。本明細書で使用される「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼのパパインでＩｇＧを処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して互いに結合された抗体フラグメントを表す。「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼのペプシンでＩｇＧを処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに大きい抗体フラグメントを指す。「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合物から通常発現される共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、好ましくは遺伝子組換え技術を使用することによって、適切なコンフォメーションで保持されるＣＤＲを含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ネクチン−４に対する結合について本発明の抗体と競合する抗体を提供する。
【００３１】
所定の抗原又はエピトープに対する抗体の結合との関連で本明細書で使用される「結合」という用語は、典型的には、例えばリガンドとして可溶性形態の抗原を使用し、分析物として抗体を使用してBIAcore 3000機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合、約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下又は約１０−１１Ｍ又はさらにそれ未満のＫＤに対応する親和性による結合である。BIACORE（登録商標）(GE Healthcare, Piscaataway, NJ)は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチンに使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。典型的には、抗体は、所定の抗原と同一又は近縁ではない非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合に関するそのＫＤよりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で、所定の抗原に結合する。抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高い親和性を有する）場合、それが抗原に結合するＫＤは、典型的には、非特異的抗原に関するそのＫＤよりも少なくとも１０，０００倍低い。このような結合が、（例えば、リガンドとして可溶性形態の抗原を使用し、分析物として抗体を使用してBIAcore 3000機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して）検出可能ではないか、又はその抗体と、異なる化学構造若しくはアミノ酸配列を有する抗原若しくはエピトープとによって検出される結合よりも１００倍、５００倍、１０００倍若しくは１０００倍超低い場合、抗体は、抗原又はエピトープに本質的に結合しないと言われる。
【００３２】
さらなる抗体は、標準的なネクチン−４結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、その結合を統計的に有意に競合的に阻害する）能力に基づいて同定され得る。ネクチン−４に対する本発明の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が、ネクチン−４に対する結合についてその抗体と競合し得ることを実証する。非限定的な理論によれば、このような抗体は、それが競合する抗体と同じ又は関連する（例えば、構造的に類似の又は空間的に近接した）ネクチン−４上のエピトープに結合し得る。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に開示される抗体と同じ抗原に結合してそれと競合する抗体を提供する。本明細書で使用される場合、競合抗体が、等モル濃度の競合抗体の存在下で、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのネクチン−４結合を５０％超、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％阻害する場合、抗体は、結合について「競合する」。
【００３３】
他の実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ネクチン−４の１つ以上のエピトープに結合する。いくつかの実施態様では、本抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは、線状エピトープである。他の実施態様では、本抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは、非線状立体構造エピトープである。
【００３４】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合結合アッセイフォーマットがエピトープビニングに使用され得る。使用され得るイムノアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロットなどの技術を使用した競合アッセイシステム、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び補体固定アッセイが挙げられ得る。このようなアッセイはルーチンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。
【００３５】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の技術によって、例えば限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的又は酵素的な技術を単独で又は組み合わせて生産される。典型的には、所望の配列のアミノ酸配列を把握することにより、当業者であれば、標準的なポリペプチド生産技術によって前記抗体を容易に生産し得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは製造業者の説明書にしたがって市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, California製のもの）を使用して合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、所望の抗体を発現するであろう適切な真核生物宿主又は原核生物宿主にこのようなベクターを導入した後、ＤＮＡ発現産物として抗体を得ることができ、その後それから、周知の技術を使用してそれらを単離し得る。
【００３６】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。より具体的には、核酸分子は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。より具体的には、核酸分子は、配列番号３又は配列番号４と７０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００３７】
配列番号３重鎖：ＤＮＡ配列ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化３】
2018531913.tif 000004
【００３８】
配列番号４軽鎖：ＤＮＡ配列ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化４】
2018531913.tif 000005
【００３９】
典型的には、前記核酸は、任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターに含められ得るＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して宿主をトランスフォーメーションし、導入配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進し得るビヒクルを意味する。よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、被験体に投与されると前記抗体の発現を引き起こすか又は指令するための調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、終結因子などを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーなどが挙げられる。ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入して発現させ得る限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１βｄ２−４などが挙げられる。プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は組み込み用プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びＡＡＶベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを使用した一過性トランスフェクションによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠陥リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクション、感染又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に関する。本明細書で使用される「トランスフォーメーション」という用語は、宿主細胞が導入遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入ＤＮＡ又はＲＮＡを受容及び発現する宿主細胞は、「トランスフォーメーション」されている。
【００４１】
本発明の核酸は、適切な発現系において本発明の抗体を生産するために使用され得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運搬されて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための適切な条件下にある宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、E. coli宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されないが、原核細胞（例えば、細菌）及び真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。具体例としては、E. coli、Kluyveromyces又はSaccharomyces酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）並びに（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生された）初代又は樹立哺乳動物細胞培養物が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体を発現するリコンビナント宿主細胞を生産する方法であって、（ｉ）上記リコンビナント核酸又はベクターをin vitro又はex vivoでコンピテントな宿主細胞に導入する工程、（ｉｉ）得られたリコンビナント宿主細胞をin vitro又はex vivoで培養する工程、及び（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む方法に関する。このようなリコンビナント宿主細胞は、本発明の抗体の生産に使用され得る。
【００４２】
本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーなどによって、培養培地から適切に分離される。
【００４３】
いくつかの実施態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載されているようにＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって生産され得る。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものも適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のいずれか１つが使用され得る。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それはＩｇに属する任意の領域であり得、κクラス又はλクラスのものが使用され得る。キメラ抗体を生産するための方法は、当技術分野で周知の従来のリコンビナントＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（Morrison SL. et al. (1984)並びに特許文献米国特許第５，２０２，２３８号；及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照のこと）。
【００４４】
本発明のヒト化抗体は、以前に記載されているようにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、それらを（ｉ）ヒト抗体と同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現させることによって生産され得る。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子とが別個のベクター上に存在する種類のものであり得るか、又は両方の遺伝子が同じベクター上に存在する種類のもの（タンデム型）であり得る。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞への導入の容易性、並びに動物細胞内における抗体のＨ鎖及びＬ鎖の発現レベル間のバランスの点では、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開公報第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。従来のリコンビナントＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づいてヒト化抗体を生産するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開公報第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994))及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で公知の様々な技術を使用してヒト化され得る。このような抗体の調製のための一般的なリコンビナントＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願の欧州特許第１２５０２３号及び国際特許出願の国際公開公報第９６／０２５７６号を参照のこと）。
【００４５】
本発明のＦａｂは、ＡＭＨと特異的に反応する抗体をプロテアーゼのパパインで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核細胞発現系又は真核細胞発現系のためのベクターに挿入し、前記ベクターを原核細胞又は真核細胞に（必要に応じて）導入してＦａｂを発現させることによって生産され得る。
【００４６】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＡＭＨと特異的に反応する抗体をプロテアーゼのペプシンで処理することによって得られ得る。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して下記Ｆａｂ’を結合させることによって生産され得る。
【００４７】
本発明のＦａｂ’は、ＡＭＨと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤ジチオトレイトールで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核細胞のための発現ベクター又は真核細胞のための発現ベクターに挿入し、前記ベクターを原核細胞又は真核細胞に（必要に応じて）導入してその発現を実施することによって生産され得る。
【００４８】
本発明のｓｃＦｖは、以前に記載されているようにＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを原核細胞のための発現ベクター又は真核細胞のための発現ベクターに挿入し、次いで、前記発現ベクターを原核細胞又は真核細胞に（必要に応じて）導入してｓｃＦｖを発現させることによって生産され得る。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作製するために、ドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを三次元構造が公知のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークに移植することを伴うＣＤＲグラフティングと称される周知の技術が使用され得る（例えば、国際公開公報第９８／４５３２２号；国際公開公報第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号を参照のこと）。
【００４９】
本発明の人工抗体としては、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に改変が行なわれているものが挙げられる。典型的には、このようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行なわれる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と、抗体が由来する生殖系列配列とを比較することによって同定され得る。フレームワーク領域の配列をその生殖系列構成に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」され得る。このような「復帰突然変異」抗体もまた、本発明によって包含されることを意図する。別の種類のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内又はさらに１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより、抗体の潜在的な免疫原性を減少させることを伴う。このアプローチは「脱免疫化」とも称され、Carrらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【００５０】
本発明の抗体は、上記態様の機能的若しくは構造的な特徴の１つ以上を特徴とし得るか、又は選択された機能的及び構造的な特徴の任意の組み合わせを特徴とし得る。
【００５１】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ誘導によってガイドされるであろう。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域カッパ又はラムダのいずれかが使用され得る。所望により、本発明の抗体のクラスは、公知の方法によってスイッチングされ得る。典型的なクラススイッチング技術は、あるＩｇＧサブクラスを別のものに、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換するために使用され得る。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、アイソタイプスイッチングによって、例えば、様々な治療用途のためのＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変化され得る。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、全長抗体である。いくつかの実施態様では、全長抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施態様では、全長抗体は、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施態様では、ネクチン−４特異的ＩｇＧ４抗体は、安定化ＩｇＧ４抗体である。適切な安定化ＩｇＧ４抗体の例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域における４０９位（Kabat et al.前掲のようなＥＵインデックスで示されている）のアルギニンがリシン、トレオニン、メチオニン又はロイシン、好ましくはリシンで置換されている（国際公開公報第２００６０３３３８６号に記載されている）抗体、及び／又はヒンジ領域がＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む抗体である。他の適切な安定化ＩｇＧ４抗体は、国際公開公報第２００８１４５１４２号（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能、例えばＡＤＣＣを媒介する能力が減少又はさらに排除されるように突然変異されている非ＩｇＧ４型、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３の抗体である。このような突然変異は、例えば、Dall’Acqua WF et al., J Immunol. 177(2) : 1129-1138 (2006)及びHezareh M, J Virol. 75(24) : 12161-12168 (2001)に記載されている。
【００５２】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて又はそれに代えて、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合性及び／又は抗原依存性細胞傷害を変化させるために、Ｆｃ領域内の改変を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に改変され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が抗体に付着され得る）、又はそのグリコシル化を変化させて抗体の１つ以上の機能特性を再び変化させるように改変され得る。例えば、本発明によって提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して変化され得ることが理解されるであろう。したがって、本発明はまた、ネクチン−４に対する改善された親和性を有する本発明の抗体分子の変異体に関する。このような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、E. coliの突然変異株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及びセクシャルＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含む多くの親和性成熟プロトコールによって得られ得る。Vaughan et al.（前掲）では、これらの親和性成熟方法が検討されている。
【００５３】
いくつかの実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される（例えば、増加又は減少される）ように改変される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするように、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるように変化される。
【００５４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardらによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の突然変異の１つ以上が導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採用されたサルベージレセプター結合エピトープを含有するように、ＣＨ１又はＣＬ領域内で変化され得る。
【００５５】
いくつかの実施態様では、抗体のエフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって変化される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃレセプター又は補体のＣ１成分である。このアプローチは、Winterらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【００５６】
いくつかの実施態様では、抗体が、変化したＣ１ｑ結合及び／又は減少若しくは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００５７】
いくつかの実施態様では、それにより抗体が補体に固着する能力を変化させるために、１つ以上のアミノ酸残基が変化される。このアプローチは、Bodmerらによる国際公開公報第９４／２９３５１号にさらに記載されている。さらに別の実施態様では、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるために、及び／又はＦｃレセプターに対する抗体の親和性を増加させるために、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を改変することによって改変される。このアプローチは、Prestaによる国際公開公報第００／４２０７２号にさらに記載されている。また、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Shields, R. L. et al, 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第２０１０１０６１８０号を参照のこと）。
【００５８】
いくつかの実施態様では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、脱グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化が変化され得る。このような糖鎖の改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらし、それにより、その部位におけるグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸の置換が行われ得る。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第５，７１４，３５０号及びる米国特許第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。加えて又はあるいは、変化した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有するか若しくはフコシル残基を有しない低フコシル化若しくは非フコシル化抗体、又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証されている。このような糖鎖の改変は、例えば、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成され得る。変化したグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記載されており、本発明のリコンビナント抗体を発現させるための宿主細胞として使用して、それにより、変化したグリコシル化を有する抗体を生産し得る。例えば、Hangらによる欧州特許第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されており、このような細胞株において発現された抗体は低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠く。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が欠損した哺乳動物細胞株におけるリコンビナント発現によって生産され得る。Prestaによる国際公開公報第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結糖鎖に付着させる能力が減少した変異体ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、やはり、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化がもたらされる（Shields, R.L. et al, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umanaらによる国際公開公報第９９／５４３４２号には、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すような、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Umana et al, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180も参照のこと）。Eureka Therapeuticsはさらに、フコシル残基を欠く変化した哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を産生することができる遺伝子操作ＣＨＯ哺乳動物細胞を記載している（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。あるいは、本発明の抗体は、哺乳���物様グリコシル化パターンのために操作された酵母又は糸状菌であって、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することができる酵母又は糸状菌において生産され得る（例えば、欧州特許第１２９７１７２Ｂ１号を参照のこと）。
【００５９】
本発明によって企図される本明細書における抗体の別の改変は、ＰＥＧ化である。例えば、抗体の生物学的（例えば、血清中）半減期を増加させるために、抗体はＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はそのフラグメントは、典型的には、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに付着する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と反応される。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われ得る。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用される任意の形態のＰＥＧ、例えばモノ（ＣＩ−ＣＩＯ）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。いくつかの実施態様では、ＰＥＧ化すべき抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawaらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。
【００６０】
本発明によって企図される抗体の別の改変は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン又はそのフラグメントとをコンジュゲート又はタンパク質融合して、得られる分子の半減期を増加させることである。このようなアプローチは、例えば、Ballanceらの欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。
【００６１】
いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書における上記本発明の分子の抗体由来の第１の抗原結合部位と、少なくとも１つの第２の抗原結合部位とを含む多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部位は、例えば、ヒトエフェクター細胞上の抗原を結合させることによって、又は細胞傷害性剤若しくは第２の治療剤を結合させることによって、殺傷機構をリクルートするために使用される。本明細書で使用される「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期及び活性化期ではなく免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞としては、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞（細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む））、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞及び顆粒球、例えば好中球、好酸球及び好塩基球が挙げられる。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃレセプター（ＦｃＲ）を発現し、特定の免疫機能を遂行する。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、ＡＤＣＣ、例えばナチュラルキラー細胞を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球（マクロファージ）は、ターゲット細胞の特異的な殺傷に関与し、抗原を免疫系の他の要素に提示する。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、ターゲット抗原又はターゲット細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上における特定のＦｃＲの発現は、体液性因子、例えばサイトカインによってレギュレーションされ得る。エフェクター細胞は、ターゲット抗原を貪食し得るか、又はターゲット細胞を貪食若しくは溶解し得る。適切な細胞傷害性剤及び第２の治療剤は以下に例示されており、トキシン（例えば、放射性標識ペプチド）、化学療法剤及びプロドラッグが挙げられる。
【００６２】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部位は、ヒトＢ細胞上の抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＣＤ１３８及びＨＬＡ−ＤＲに結合する。
【００６３】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部位は、組織特異性抗原に結合し、特定の組織への二重特異性抗体の局在を促進する。
【００６４】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部位は、同じ種類の細胞、例えばネクチン−４発現細胞上に位置する抗原、典型的には、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するが、第１の抗原結合部位の結合特異性とは異なる結合特異性を有する。このような多重特異性抗体は又は二重特異性抗体は、腫瘍細胞結合の特異性を改善し得、及び／又は複数のエフェクター経路に関与し得る。例示的なＴＡＡとしては、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＲＡＧＥ（腎抗原）、ａ−フェトプロテイン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマにおけるＣＴＬ認識抗原）、ＣＴ抗原（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ５、−Ｂ６、−Ｃ２、−Ｃ３及びＤ；Ｍａｇｅ−１２；ＣＴ１０；ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、並びにＳＡＧＥ）、ムチン抗原（例えば、ＭＵＣ１、ムチン−ＣＡ１２５など）、ガングリオシド抗原、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｃ−Ｍｅｔ、Ｍａｒｔｉ、ＭｅｌａｎＡ、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＨＬＡ−Ｂ７、Ｅｐ−ＣＡＭ又はガン関連インテグリン、例えばα５β３インテグリンが挙げられる。あるいは、第２の抗原結合部位は、ネクチン−４の異なるエピトープに結合する。あるいは、第２の抗原結合部位は、血管新生因子又は他のガン関連成長因子、例えば血管内皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、アンジオゲニン又はこれらのいずれかのレセプター、特に、ガンの進行に関連するレセプターに結合し得る。
【００６５】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部位は、本発明の第２の抗体又はＡＤＣ、例えば本発明の抗体に由来する。
【００６６】
本発明の多重特異性抗体分子の例示的なフォーマットとしては、限定されないが、（ｉ）化学的なヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体（一方はネクチン−４に対する特異性を有し、他方は第２の抗原に対する特異性を有する）；（ｉｉ）２種類の抗原結合領域を含む１つの抗体；（ｉｉｉ）２種類の抗原結合領域を含む一本鎖抗体、例えば、外部ペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖ；（ｉｖ）二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（各軽鎖及び重鎖は、短いペプチド結合を介して２つの可変ドメインをタンデムに含有する）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig（商標）) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)；（ｖ）化学的に連結された二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）Ｔａｎａｄａｂ（各ターゲット抗原に対する２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物）；（ｖｉｉ）フレキシボディ（多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせ）；（ｖｉｉｉ）いわゆる「ドックアンドロック」分子（プロテインキナーゼＡ中の「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく。Ｆａｂに追加すると、異なるＦａｂフラグメントに連結された２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質を生成し得る）；（ｉｘ）いわゆるスコーピオン分子（例えば、ヒトＦａｂ−アームの両末端に融合された２つのｓｃＦｖを含む）及び（ｘ）ダイアボディが挙げられる。二重特異性抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制するための相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。このような分子は、公知の技術、例えばトリオマブ／クアドローマ(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、ノブ・イントゥー・ホール(Genentech)、CrossMAb (Roche)及び静電気マッチング(Amgen)、LUZ-Y (Genentech)、Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic (Merus)並びにDuoBody (Genmab A/S)技術などを使用して調製され得る。
【００６７】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、典型的にはDuoBody技術を使用して、コントロールされたＦａｂ−アーム交換によって得られる又は得られ得る。コントロールされたＦａｂ−アーム交換によって二重特異性抗体を生産するためのin vitro方法は、国際公開公報第２００８１１９３５３号及び国際公開公報第２０１１１３１７４６号（両方とも、Genmab A/S）に記載されている。国際公開公報第２００８１１９３５３号に記載されている１つの例示的な方法では、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーションに基づいて、２つの単一特異性抗体（両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む）間の「Ｆａｂ−アーム」又は「半分子」交換（重鎖と付着された軽鎖とのスワッピング）によって形成される。得られる生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。国際公開公報第２０１１１３１７４６号に記載されている別の例示的な方法では、第１及び第２の抗体の少なくとも１つが本発明の抗体である本発明の二重特異性抗体は、以下の工程を含む方法によって調製される：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供する工程であって、前記Ｆｃ領域が第１のＣＨ３領域を含む工程、ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供する工程であって、前記Ｆｃ領域が第２のＣＨ３領域を含み、前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強力である工程、ｃ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と共に還元条件下でインキュベーションする工程、並びにｄ）前記二重特異性抗体を取得する工程であって、第１の抗体が本発明の抗体であり、第２の抗体が異なる結合特異性を有するか、又はその逆である工程。還元条件は、例えば、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンなどから選択される還元剤を追加することによって提供され得る。工程ｄ）は、例えば、還元剤の除去によって、例えば脱塩によって、非還元性又は低還元性に回復させることをさらに含み得る。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、前記第１及び第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強力であるように、少数の非常に保存的な非対称性の突然変異のみを含む。これらの相互作用及びそれらを達成し得る方法のより詳細は、国際公開公報第２０１１１３１７４６号（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に提供されている。以下は、このような非対称突然変異の組み合わせの例示的な実施態様であり、場合により、Ｆｃ領域の一方又は両方がＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【００６８】
いくつかの実施態様では、第１のＦｃ領域は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位及び４０９位からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を有し、第２のＦｃ領域は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位及び４０９位からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を有し、第１及び第２のＦｃ領域は、同じ位置において置換されない。
【００６９】
いくつかの実施態様では、第１のＦｃ領域は、４０５位においてアミノ酸置換を有し、前記第２のＦｃ領域は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０７位及び４０９位からなる群より選択される位置において、場合により４０９位においてアミノ酸置換を有する。
【００７０】
いくつかの実施態様では、第１のＦｃ領域は、４０９位においてアミノ酸置換を有し、前記第２のＦｃ領域は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位及び４０７位からなる群より選択される位置、場合により４０５位又は３６８位においてアミノ酸置換を有する。
【００７１】
いくつかの実施態様では、第１及び第２のＦｃ領域は両方とも、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、第１のＦｃ領域は、４０５位においてＬｅｕを有し、第２のＦｃ領域は、４０９位においてＡｒｇを有する。
【００７２】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、治療部分、すなわち薬物にコンジュゲートされる。治療部分は、例えば、細胞毒、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解型ペプチド又は放射性同位体であり得る。このようなコンジュゲートは、本明細書では「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と称される。
【００７３】
いくつかの実施態様では、抗体は、細胞傷害性部分にコンジュゲートされる。細胞傷害性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；エチジウムブロミド；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルチシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリン阻害剤、例えば、メイタンシン又はその類似体若しくは誘導体；抗有糸分裂剤、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ若しくはＦ又はそれらの類似体若しくは誘導体；ドラスタチン１０若しくは１５又はそれらの類似体；イリノテカン又はその類似体；マイトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体若しくは誘導体；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン又はクラドリビン；アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブルモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ；プラチナ誘導体、例えば、シスプラチン又はカルボプラチン；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）又はその類似体若しくは誘導体；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）；ピロール［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリアトキシン及び関連分子、例えば、ジフテリアＡ鎖及びその活性フラグメント並びにハイブリッド分子、リシントキシン、例えば、リシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖トキシン、コレラトキシン、シガ様トキシン、例えば、ＳＬＴ  Ｉ、ＳＬＴ  ＩＩ、ＳＬＴ  ＩＩＶ、ＬＴトキシン、Ｃ３トキシン、シガトキシン、百日咳トキシン、破傷風トキシン、ダイズBowman-Birkプロテアーゼ阻害剤、Pseudomonas外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleutites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolacca americanaタンパク質、例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン及びエノマイシントキシン；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅＩ、Staphylococcal内毒素Ａ；pokeweed抗ウイルスタンパク質；ジフテリントキシン；及びPseudomonas外毒素からなる群より選択され得る。
【００７４】
いくつかの実施態様では、抗体は、オーリスタチン又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。オーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核及び細胞分割を妨害し（Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、抗ガン活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965）を有することが示されている。例えば、オーリスタチンＥは、パラ−アセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）及びＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。適切なオーリスタチン並びにオーリスタチン類似体、誘導体及びプロドラッグと、オーリスタチンをＡｂにコンジュゲートするための適切なリンカーとは、例えば、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号及び米国特許第６，２１４，３４５号並びに国際公開公報第０２０８８１７２号、国際公開公報第２００４０１０９５７号、国際公開公報第２００５０８１７１１号、国際公開公報第２００５０８４３９０号、国際公開公報第２００６１３２６７０号、国際公開公報第０３０２６５７７号、国際公開公報第２００７００８６０号、国際公開公報第２０７０１１９６８号及び国際公開公報第２０５０８２０２３号に記載されている。
【００７５】
いくつかの態様では、抗体は、メルタンシン（エムタンシン又はＤＭ１とも称される）又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。メルタンシンはチューブリン阻害剤であり、これは、それが、チューブリンに結合することによって微小管のアセンブリを阻害することを意味する。
【００７６】
いくつかの実施態様では、抗体は、ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。適切なＰＤＢ及びＰＤＢ誘導体、並びに関連技術は、例えば、Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010; 70(17) : 6849-6858; Antonow D. et al., Cancer J 2008; 14(3) : 154-169; Howard P.W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466及びSagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18) : 2083-2086に記載されている。
【００７７】
いくつかの実施態様では、抗体は、アントラサイクリン、メイタンシン、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、イリノテカン、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、ＰＤＢ又はそれらの任意の類似体、誘導体若しくはプロドラッグからなる群より選択される細胞傷害性部分にコンジュゲートされる。
【００７８】
いくつかの実施態様では、抗体は、アントラサイクリン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、メイタンシン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、カリチアマイシン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、デュオカルマイシン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、ドラスタチン１０又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、ドラスタチン１５又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、モノメチルオーリスタチンＥ又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、モノメチルオーリスタチンＦ又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、抗体は、イリノテカン又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされる。
【００７９】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、核酸又は核酸関連分子にコンジュゲートされる。このような一実施態様では、コンジュゲートした核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）若しくはデオキシリボヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）又は免疫刺激性核酸（例えば、免疫刺激性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、アプタマー又はリボザイムにコンジュゲートされる。
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、例えば、融合タンパク質として溶解型ペプチド、例えばＣＬＩＰ、マガイニン２、メリチン、セクロピン及びＰ１８にコンジュゲートされる。
【００８１】
いくつかの実施態様では、抗体は、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ、ＩＦＮ３、ＩＦＮｙ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム及びＴＮＦａなどにコンジュゲートされる。
【００８２】
いくつかの実施態様では、抗体は、放射性同位体又は放射性同位体含有キレートにコンジュゲートされる。例えば、抗体は、抗体と放射性同位体との錯体化を可能にするキレート剤リンカー、例えばＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ又はチウキセタンにコンジュゲートされる。さらに又はあるいは、抗体は、１つ以上の放射性標識アミノ酸又は他の放射性標識分子を含むか、又はこれらにコンジュゲートされ得る。放射性同位体の非限定的な例としては、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ及び２２７Ｔｈが挙げられる。治療目的の場合、ベータ又はアルファ粒子放射線を放出する放射性同位体、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ及び２１２Ｐｂが使用され得る。
【００８３】
分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、国際公開公報第８９／１２６２４号も参照のこと）。典型的には、核酸分子は、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基を介して、抗体のリシン又はシステインに共有結合される。人工システイン又は非天然アミノ酸の組み込みを使用したコンジュゲーション方法は、コンジュゲートの均一性を改善することが報告されている（Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutula et al. (2008)では、「THIOMAB」と称されるシステインベースの部位特異的コンジュゲーション（ＴＤＣ）が開発された。コンジュゲーションは、従来のコンジュゲーション方法と比較して改善された治療インデックスを示すと主張されている。抗体に組み込まれている非天然アミノ酸へのコンジュゲーションは、ＡＤＣについても調査されている；しかしながら、このアプローチの一般性は、未だに確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者であれば、アシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ又はＱタグ）で操作されたＦｃ含有ポリペプチド、又はポリペプチド操作によって（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸欠失、挿入、置換又は突然変異を介して）反応性にされる内因性グルタミンを想定することもできる。次いで、人工Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定かつ均一な集団を形成するために、トランスグルタミナーゼは、アミンドナー剤（例えば、反応性アミンを含むか、又はこれに付着された小分子）と共有結合的に架橋され得、アミンドナー剤は、アシルドナーグルタミン含有タグ又はアクセス可能な／露出した／反応性の内因性グルタミンによって、Ｆｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされる（国際公開公報第２０１２０５９８８２号）。
【００８４】
別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書における任意の態様又は実施態様に定義される本発明の抗体に関する。
【００８５】
本発明の抗体は、ネクチン−４を発現する細胞に関連する障害の治療又は予防において使用され得る。
【００８６】
本明細書で使用される「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクを有する患者、又は疾患に罹患したと疑われる患者、及び病気の患者、又は疾患若しくは医学的症状を患っていると診断された患者の処置を含む防護的又は予防的な処置及び治癒的又は疾患改変的な処置の両方を指し、臨床再発の抑制を含む。障害若しくは再発性障害を予防し、治癒し、その発症を遅延させ、その重症度を軽減し、若しくはその１つ以上の症候を改善するために、又はこのような処置の非存在下で予想されるよりも被験体の生存を延長させるために、処置は、医学的障害を有する被験体、又は最終的に障害を獲得し得る被験体に投与され得る。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば治療中に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含み得る。「誘導レジメン」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に、高レベルの薬物を患者に提供することである。誘導レジメンは、維持レジメン中に医師が用いるよりも多くの用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る「ローディングレジメン」を（部分的又は全体的に）用い得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中に患者を維持するために（例えば、患者を寛解状態に長期間（数カ月間又は数年間）保つために）使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、（薬物を一定間隔（例えば、毎週、毎月、毎年など）で投与する）持続的療法又は間欠療法（例えば、断続的処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定基準［例えば、疼痛、疾患徴候など］の達成時の処置）を用い得る。
【００８７】
いくつかの実施態様では、本発明は、ネクチン−４発現細胞と本発明の抗体とを接触させることによって、該細胞を殺傷するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、Ｆｃ媒介性エフェクター細胞応答、例えばＣＤＣ、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ応答を誘導することができるエフェクター細胞の存在下で、ネクチン−４発現細胞と本発明の抗体とを接触させることによって、該細胞を殺傷するための方法を提供する。この実施態様では、典型的には、抗体は全長のものであり、ＣＤＣ又はＡＤＣＣ応答をもたらすアイソタイプ、例えばＩｇＧ１アイソタイプなどのものである。いくつかの実施態様では、本発明は、ネクチン−４発現細胞と本発明のＡＤＣとを接触させることによって、該細胞を殺傷するための方法を提供する。
【００８８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ガンの処置に特に適切である。細胞１個当たりより多くの抗体が結合され得るので、ネクチン−４を過剰発現するガン細胞は、実際に本発明の抗体の良好なターゲットである。したがって、一態様では、ネクチン−４を発現する細胞を伴う障害は、ガン、すなわち腫瘍形成障害、例えばネクチン−４を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害（例えば、細胞が固形腫瘍又は血液腫瘍に由来する障害を含む）である。特に、本発明の抗体は、ネクチン−４の発現、過剰発現又は活性化に関連する過剰増殖性疾患の処置として使用され得る。特に、本発明の抗体は、乳ガン、卵巣ガン及び肺ガンの処置に特に適切である。本明細書で使用される「乳ガン」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、全ての進行段階における全ての種類の乳ガン、例えば転移性乳ガン又は乳ガン腫を含む。特に、乳ガンは、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）（これは、エストロゲン及びプロゲステロンレセプター及びヒト上皮成長因子レセプター−２（ＨＥＲ２）の陰性免疫組織化学染色によって区別され、全ての乳ガンの１５％を占める）の中から選択される。本明細書で使用される「卵巣ガン」という用語は、限定されないが、全ての進行段階における全ての種類の卵巣ガン、例えば転移性卵巣ガン又は卵巣ガン腫を含む。本明細書で使用される「肺ガン」という用語は、限定されないが、全ての進行段階における全ての種類の肺ガン、例えば肺ガン腫、転移性肺ガン、非小細胞肺ガン又は小細胞肺ガンを含む。
【００８９】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、転移性ガンの処置に特に適切である。
【００９０】
「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。本発明の抗体の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する本発明の抗体の能力などの要因にしたがって変動し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が抗体又は抗体部分の任意の毒性効果又は有害効果を上回るものである。本発明の抗体の効率的な投与量及び投与レジメンは、処置される疾患又は症状に依存し、当業者によって決定され得る。当技術分野における通常の技能を有する医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方し得る。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで、医薬組成物において用いられる本発明の抗体の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。一般に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンにしたがって治療効果をもたらすために有効な最低用量である化合物量であろう。このような有効用量は、一般に、上記要因に依存するであろう。例えば、治療用途のための治療有効量は、疾患進行を安定化する能力によって測定され得る。ガンを阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のin vitroアッセイ方法によって、腫瘍細胞成長を阻害する化合物の能力を検査することによって評価され得る。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させ得る、又は被験体における症候を別様に改善し得る。当業者であれば、被験体のサイズ、被験体の症候の重症度及び特定の組成物又は選択投与経路などの要因に基づいて、このような量を決定することができるであろう。本発明の抗体の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜１００mg/kg、例えば約０．１〜５０mg/kg、例えば約０．１〜２０mg/kg、例えば約０．１〜１０mg/kg、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、約３mg/kg、約５mg/kg又は約８mg/kgである。本発明の抗体の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２〜１００mg/kg、例えば約０．０２〜３０mg/kg、例えば約０．０５〜１０mg/kg又は０．１〜３mg/kg、例えば約０．５〜２mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下であり得、例えば、ターゲット部位の近くに投与され得る。上記処置方法及び使用における投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与され得るか、複数回分割用量が経時的に投与され得るか、又は治療状態の緊急性によって示されるように、用量は比例的に減少又は増加され得る。いくつかの実施態様では、処置の有効性は、治療中に、例えば、所定の時点でモニタリングされる。いくつかの実施態様では、有効性は、腫瘍細胞を含有するサンプルにおけるネクチン−４のレベルを測定することによって、疾患領域を可視化することによって、又は本明細書にさらに記載される他の診断方法によって、例えば、本発明の標識抗体、本発明の抗体由来のフラグメント若しくはミニ抗体を使用して１回以上のＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施することによってモニタリングされ得る。所望により、有効１日用量の医���組成物は、１日を通して適切な間隔で別個投与される２回、３回、４回、５回、６回以上のサブ用量として、場合により単位剤形で投与され得る。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、望ましくない副作用を最小化するために、長期間、例えば２４時間超にわたって緩徐な持続注入によって投与される。有効用量の本発明の抗体はまた、１週間に１回、２週間に１回又は３週間に１回の投与期間を使用して投与され得る。投与期間は、例えば、８週間、１２週間又は臨床的な進展が確立されるまで制限され得る。非限定的な例として、本発明の処置は、処置開始後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、２５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目、３３日目、３４日目、３５日目、３６日目、３７日目、３８日目、３９日目若しくは４０日目の少なくとも１つにおいて、あるいは１週目、２週目、３週目、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目、９週目、１０週目、１１週目、１２週目、１３週目、１４週目、１５週目、１６週目、１７週目、１８週目、１９週目若しくは２０週目の少なくとも１つにおいて、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、約０．１〜１００mg/kg、例えば０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００mg/kg／日の本発明の化合物の１日用量として提供され得る。
【００９１】
本発明はまた、処置すべき上記疾患又は障害に関連する少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせて本発明の抗体を使用する治療適用を提供する。このような投与は、同時、別個又は逐次であり得る。同時投与の場合、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物として又は別個の組成物として投与され得る。さらなる治療剤は、典型的には、処置すべき障害に関連する。例示的な治療剤としては、他の抗ガン抗体又はＡＤＣ、細胞傷害性剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗ガン免疫原、細胞周期コントロール／アポトーシスレギュレーション剤、ホルモンレギュレーション剤及び下記他の薬剤が挙げられる。
【００９２】
投与のために、本発明の抗体は、医薬組成物として製剤化される。本発明の抗体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって製剤化され得、それにより、治療用分子は、混合物中で薬学的に許容し得る担体と合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって耐容され得る場合、「薬学的に許容し得る担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は当業者に周知である。（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質の損失を防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。当然のことながら、医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、処置すべき症状、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。
【００９３】
典型的には、医薬組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水の追加によって注射液の再構成を可能にする乾燥（特に、凍結乾燥）組成物であり得る。
【００９４】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に使用される投与様式、関連病状あるいは所望の処置継続期間に応じて適合され得る。
【００９５】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体は、薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散され得る。
【００９６】
注射用途に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、注射容易性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００９７】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【００９８】
本発明の抗体は、中性又は塩の形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸付加塩が挙げられ、これらは、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのこのような有機酸を使用して形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は有機塩基、例えば水酸化鉄などの及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのから誘導され得る。
【００９９】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを使用することによってもたらされ得る。
【０１００】
滅菌注射溶液は、必要な場合には上記に列挙されている様々な他の成分を含む適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌ろ過することによって調製される。一般に、分散液は、基本分散媒体と、上記に列挙されている成分からの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意のさらなる所望の成分との粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１０１】
直接注射のためのより濃縮された又は高濃縮された溶液の調製も企画され、この場合、極めて急速な浸透をもたらして、高濃度の活性薬剤を小さい腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
【０１０２】
製剤化により、溶液は、投与製剤に適合した様式で、治療上有効な量で投与されるであろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記種類の注射溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどが用いられ得る。
【０１０３】
水溶液による非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合には適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、最初に十分な食塩水又はグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者には公知であろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液 １mlに溶解し、皮下注入液 １０００mlに追加するか又は提案された注入部位に注射し得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ずなされるであろう。投与責任者は、いずれの場合でも、個々の被験体にとって適切な用量を決定するであろう。
【０１０４】
本発明の抗体は、治療混合物内で、約０．０００１〜１．０mg又は約０．００１〜０．１mg又は約０．１〜１．０mg又はさらには約１０mg／用量などを含むように製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【０１０５】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固形剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞への抗体の導入について企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は当業者には公知である。
【０１０７】
ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある方法で化合物を封入し得る。細胞内ポリマーのオーバーローディングによる副作用を回避するために、（約０．１μmのサイズの）このような超微細粒子は、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリル酸ナノ粒子が、本発明における使用について企図され、このような粒子は容易に作製され得る。
【０１０８】
リポソームは、水性媒体に分散されて自発的に多重ラメラ同心状二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲の直径を有し、コアに水溶液を含有する小型単層ラメラ小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価陽イオンの存在に依存する。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。典型的には、前記キメラ抗原レセプターは、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。本発明のキメラ抗原レセプターはまた、細胞外ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインとを含む。
【０１１０】
本明細書で使用される「キメラ抗原レセプター」又は「ＣＡＲ」という用語は、当技術分野における一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナリングドメインに連結された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞特異性及び反応性を選択ターゲットに非ＭＨＣ拘束的に再指向させる能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、抗原プロセッシングとは無関係に抗原を認識する能力をＣＡＲ発現Ｔ細胞に与えて、主要な腫瘍回避機構を避ける。また、Ｔ細胞において発現される場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、本発明は、Ｎ４１ｍａｂ抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。いくつかの実施態様では、抗原結合ドメインは、リンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に位置し得る。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる群より選択される細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインとを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢは、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達して、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、本発明のキメラ抗原レセプターは、グリコシル化され得、アミド化され得、カルボキシル化され得、リン酸化され得、エステル化され得、Ｎ−アシル化され得、例えばジスルフィド架橋を介して環化され得、若しくは酸付加塩に変換され得、及び／又は場合により二量体化若しくは重合され得る。
【０１１４】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原レセプターをコードする核酸を提供する。いくつかの実施態様では、核酸は、例えば上記ベクターに組み込まれる。
【０１１５】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原レセプターをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の細胞型であり得、任意の種類の組織に由来し得、任意の発達段階のものであり得るが、宿主細胞は、例えば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＴ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えばジャーカット、ＳｕｐＴ１など又は哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、限定されないが、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液を含む多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、濃縮又は精製され得る。Ｔ細胞は任意の種類のＴ細胞であり得、限定されないが、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などを含む任意の発達段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【０１１６】
上記のように調製されたＴ細胞の集団は、公知の技術、又は本開示に基づいて当業者に明らかなその変法にしたがって、養子免疫療法のための方法及び組成物において利用され得る。例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照のこと；Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号も参照のこと。ガンの養子免疫療法は、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞が樹立腫瘍の退縮を直接的又は間接的に媒介することを目的として、該免疫細胞を腫瘍担持宿主に投与する治療アプローチを指す。リンパ球、特にＴリンパ球の輸血がこのカテゴリーに該当する。現在のところ、ほとんどの養子免疫療法は、患者自身の免疫細胞を使用した処置を対象とする自己リンパ球療法（ＡＬＴ）である。免疫細胞媒介性応答を増強するために、又は体内の特異的抗原若しくは外来物質（ガン細胞を含む）を認識するために、これらの療法は、患者自身のリンパ球を加工することを伴う。処置は、患者のリンパ球を摘出し、これらの細胞をin vitroで生物製剤及び薬物に曝露して、細胞の免疫機能を活性化することによって達成される。自己細胞が活性化されると、これらのex vivo活性化細胞を患者に再注入して、免疫系を増強してガンを処置する。いくつかの実施態様では、細胞は、最初にそれらの培地からそれらを採取し、次いで洗浄し、投与に適切な媒体及び容器系（「薬学的に許容し得る」担体）に処置有効量で細胞を濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張媒体製剤、典型的には生理食塩水、Normosol R (Abbott)又はPlasma-Lyte A (Baxter)であり得るが、５％デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液も利用され得る。ヒト血清アルブミンを注入媒体に補充し得る。組成物中の細胞の処置有効量は、所望の特異性を有するＴ細胞の相対的表現、レシピエントの年齢及び体重、ターゲット症状の重症度並びにターゲットＡｇの免疫原性に依存する。これらの細胞の量は、少なくとも約１０３個／kg、好ましくは５×１０３個／kg；及び多くとも１０７個／kg、好ましくは１０８個／kgであり得る。細胞の数は、組成物の目的の最終用途、及びそれに含まれる細胞の種類に依存するであろう。例えば、特定のＡｇに特異的な細胞が望ましい場合、集団は、７０％超、一般に８０％超、８５％及び９０〜９５％のこのような細胞を含有するであろう。本明細書で提供される用途では、細胞は一般に１リットル以下の容量であり得、５００ml以下、さらには２５０ml又は１００ml以下であり得る。臨床的に関連する数の免疫細胞が、累積的に所望の総細胞量以上の複数の注入に分けられ得る。
【０１１７】
特に、本発明の細胞は、ガンの処置に特に適切である。したがって、本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、治療有効量の本発明の細胞の集団を該被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１１８】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに例証される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ】Ｎ４１ｍａｂは、ネクチン４のＩｇＶ様ドメインを認識する  Ａ：ＥＬＩＳＡによる検出。示されているように、５ug/ml ネクチン４Ｖ−Ｆｃ又はネクチン１Ｖ−Ｆｃ（ＩｇＶドメインのみを含有する）で９６ウェルトレイを＋４℃で一晩コーティングした。Ｎ４１ｍａｂはネクチン４Ｖ−Ｆｃ（バー３）を認識するが、ネクチン１Ｖ−Ｆｃ（バー１）を認識しない。Ｂ：ＦＡＣＳによる検出。２μg/ml Ｎ４１ｍａｂ抗体を使用した、ネクチン４のＮ末端Ｆｌａｇタグ付エピトープをトランスフェクションしたＭＤＡＭＢ２３１細胞株のＦＡＣＳ分析。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Beckman-Coulter）で細胞を染色した。左：ＭＤＡＭＢ２３１細胞、右：ＭＤＡＭＢ２３１ネクチン４細胞。（−−−コントロールＩｇ）（−Ｎ４１ｍａｂ）。
【図１Ｂ】Ｎ４１ｍａｂは、ネクチン４のＩｇＶ様ドメインを認識する  Ａ：ＥＬＩＳＡによる検出。示されているように、５ug/ml ネクチン４Ｖ−Ｆｃ又はネクチン１Ｖ−Ｆｃ（ＩｇＶドメインのみを含有する）で９６ウェルトレイを＋４℃で一晩コーティングした。Ｎ４１ｍａｂはネクチン４Ｖ−Ｆｃ（バー３）を認識するが、ネクチン１Ｖ−Ｆｃ（バー１）を認識しない。Ｂ：ＦＡＣＳによる検出。２μg/ml Ｎ４１ｍａｂ抗体を使用した、ネクチン４のＮ末端Ｆｌａｇタグ付エピトープをトランスフェクションしたＭＤＡＭＢ２３１細胞株のＦＡＣＳ分析。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Beckman-Coulter）で細胞を染色した。左：ＭＤＡＭＢ２３１細胞、右：ＭＤＡＭＢ２３１ネクチン４細胞。（−−−コントロールＩｇ）（−Ｎ４１ｍａｂ）。
【図２】Ｎ４１ｍａｂは、in vitroで腫瘍細胞浸潤を遮断する  マトリゲルコーティング浸潤チャンバーを用いて、浸潤を測定した。ネクチン４の異所性発現は、細胞浸潤を著しく増加させる（バー１とバー３との比較）。浸潤アッセイ前に、１０μg/ml Ｎ４１ｍａｂでＭＤＡＭＢ２３１ネクチン４細胞を処置すると、４３％の浸潤阻害が誘導される（バー３とバー４との比較）。この結果は、３回の実験の代表である。
【図３】Ｎ４１ｍａｂは、in vivoで原発部位からの転移進行を阻害する  ルシフェラーゼ発現ＭＤＡＭＢ２３１細胞及びＭＤＡＭＢ２３１ネクチン４細胞（細胞１×１０６個）をＮＳＧマウスの皮下に異種移植した。Ｎ４１ｍａｂ（１０mg/kg）を毎週腹腔内注射した。移植後７４日目に、生物発光分析を実施した。肺は、Ｎ４１ｍａｂによる処置の存在下及び非存在下で言及された陽性器官の割合として表されている。ヒストグラムは、得られたデータをレジュームする。Ｎ４１ｍａｂによるＮＳＧマウスの処置は、肺転移を有するマウスの割合を減少させる。７１％から２５％。この結果は、２回の実験の代表である。
【図４】Ｎ４１ｍａｂは、in vivoで転移ホーミングを阻害する  ルシフェラーゼ発現ＳＵＭ１９０細胞（細胞０．５×１０６個）をＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。細胞を１０μg/ml 抗体と共にインキュベーションすることによって、及び１０mg/kg 抗体で細胞を処置することによって、ｍＡｂ処置を実施した。ＣＤ２８モノクローナル抗体をコントロールとして使用した。肺及び肝臓における３２日目の単離された器官の生物発光分析；２つの主な転移部位。この結果は、２回の実験の代表である。クロドロネートリポソーム ０．２ml（マクロファージ枯渇）で２日間前処置したＮＳＧマウスにおいて、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【図５】Ｎ４１ｍａｂ  ＥＣ５０の決定  Ａ：ＳＵＭ１９０細胞においてＦＡＣＳ分析によって、Ｎ４１ｍａｂの連続希釈物の細胞表面結合を測定した（黒色）。Ｈａ２２−２抗ネクチン４  ｍａｂ（白色）（すなわち、ＡＳＧ−２２ＭＥ）を用いて、比較を行った。Ｂ：ＥＬＩＳＡによって、リコンビナントネクチン４  ＶＣＣ−Ｆｃに対するＮ４１ｍａｂの結合を行った（黒色）。Ｈａ２２−２抗ネクチン４  ｍａｂ（白色）（すなわち、ＡＳＧ−２２ＭＥ）を用いて、比較を行った。
【図６Ａ】Ｎ４１ｍａｂのインターナリゼーション  ＭＤＡＭＢ２３１細胞において発現されたエピトープ−ＦＬＡＧタグ付ネクチン４を使用して、インターナリゼーションを行った。Ａ：ＦＡＣＳによるネクチン４の細胞表面発現。最初に、細胞をｍａｂと共に３７℃で個別に２４時間インキュベーションし、ＦＩＴＣ標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）を使用して、細胞表面発現をモニタリングした。図：太字灰色：コントロールＩｇ、点線黒色：Ｎ４２ｍａｂ、太字黒色：Ｎ４１ｍａｂ。（Ｎ４２ｍａｂは、ＩｇＶドメインに対するコントロール抗ネクチン４  ｍａｂである）  Ｂ：Ｎ４２ｍａｂ、Ｎ４１ｍａｂ及びＨａ２２−２ｍａｂによって誘導されるインターナリゼーションの割合の比較をＦＡＣＳによって行った。
【図６Ｂ】Ｎ４１ｍａｂのインターナリゼーション  ＭＤＡＭＢ２３１細胞において発現されたエピトープ−ＦＬＡＧタグ付ネクチン４を使用して、インターナリゼーションを行った。Ａ：ＦＡＣＳによるネクチン４の細胞表面発現。最初に、細胞をｍａｂと共に３７℃で個別に２４時間インキュベーションし、ＦＩＴＣ標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）を使用して、細胞表面発現をモニタリングした。図：太字灰色：コントロールＩｇ、点線黒色：Ｎ４２ｍａｂ、太字黒色：Ｎ４１ｍａｂ。（Ｎ４２ｍａｂは、ＩｇＶドメインに対するコントロール抗ネクチン４  ｍａｂである）  Ｂ：Ｎ４２ｍａｂ、Ｎ４１ｍａｂ及びＨａ２２−２ｍａｂによって誘導されるインターナリゼーションの割合の比較をＦＡＣＳによって行った。
【図７】Ｎ４１ｍａｂエピトープの特性評価  ＥＬＩＳＡによって、ｍａｂ競合アッセイを実施した。示されているように、ネクチン４ＶＣＣ−Ｆｃで９６ウェルトレイを＋４℃で一晩コーティングした。可変濃度のＮ４１ｍａｂ、Ｎ４２ｍａｂ、Ｎ４３ｍａｂ及びＨａ２２−２  ｍａｂの存在下で、ペルオキシダーゼコンジュゲートＮ４１ｍａｂの結合を測定した。Ｎ４２ｍａｂ及びＮ４３ｍａｂは、ネクチン４のＩｇＶドメインを認識する。
【図８】Ｎ４１ｍａｂ−ＭＭＡＥによるＳＵＭ１９０移植ＮＳＧマウスの処置は、持続的な腫瘍退縮期間を誘導する  Ａ：マトリゲルに包埋したＳＵＭ１９０細胞をＮＳＧマウスの両側に同所性異種移植した。この乳房腫瘍細胞株は、細胞表面において等量のＨＥＲ２及びネクチン４を発現する。３つの異なるＡＤＣを試験した：Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥ、Ｈａ２２−２−ｖｃＭＭＡＥ及びＴ−ＤＭ１。腫瘍が２００mm3（１００％）に達したら、マウスの処置を開始する。この期間では、移植後０日目及び４日目に、２用量のＡＤＣｍａｂ（２．５及び１０mg/kg）を２回静脈内投与した。３つのＡＤＣは全て活性であり、腫瘍発達を減少させた。それぞれ２．５及び１０mg/kgにおいて、Ｎ４１ｍａｂ−ＭＭＡＥは、最も長い持続的な退縮期間を誘導した。Ｂ：各処置（１０mg/kg）に応じた体重変動測定値の割合。実験中に、悪影響は認められなかった。Ｃ：初回処置後に腫瘍が２００mm3に達するまでの平均時間。
【図９】Ｎ４１ｍａｂ−ＭＭＡＥによる転移性ＮＳＧマウスの処置  ルシフェラーゼ発現ＳＵＭ１９０細胞の静脈内注射によって、転移性ＮＳＧマウスを得た。マウスは、異なる部位で転移を発症した。PhotonIMAGERを使用した発光の定量（カラム１＝コントロール；カラム２＝Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥ−１；カラム３＝Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥ−２）。総合すると、これらのデータ点は、原発性病変及び転移性病変の両方におけるＮ４ｍａｂ１−ｖｃＭＭＡＥの著しい抗腫瘍活性を示している。
【実施例】
【０１２０】
実施例１
材料及び方法
細胞株：
１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、５０ＩU/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン及び２mM グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、ヒト乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ATCC, Manassas, VA）を培養した。ＰＶＲＬ４  ｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐ３ＸＦＬＲ４．Ｃ１を細胞にトランスフェクションした［ｘ］。ＳＵＭ−１８５、ＳＵＭ−１９０及びＳＵＭ−２２５乳ガン株は、Dr S. P. Ethier (University of Michigan)よって厚意で提供されたものであった。５％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、１０μg/ml インスリン、１μg/ml ヒドロコルチゾン、５０ＩU/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン及び２mM グルタミンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中で、それらを培養した。１０％ＦＢＳ、１０μg/ml インスリン、５０ＩU/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン及び２mM グルタミンを補充したＲＰＭＩ中で、ＢＴ−４７４（ＥＲＢＢ２＋）乳ガン細胞株（ATCC）を培養した。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡ：
サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、Ｎ４１ｍａｂ抗体の特異性をコントロールし、ｍａｂ間の競合アッセイを実施した。５ug/ml ネクチン４Ｖ−Ｆｃ又はネクチン１Ｖ−Ｆｃ（ＩｇＶドメインのみを含有する）で９６ウェルトレイを＋４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳによる洗浄及び飽和の後、１％ＢＳＡ細胞を０．６２５μg/ml Ｎ４１ｍａｂと共に一晩インキュベーションした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を２５℃で２時間インキュベーションした（Pierce）。競合の場合、可変濃度の「コールド」ｍＡｂの存在下で、ペルオキシダーゼコンジュゲートＮ４１ｍａｂの結合を測定した。ペルオキシダーゼ基質 １００μlを追加し（One Step ABST, Pierce）、ＯＤを４０５nmで読み取った。
【０１２２】
フローサイトメトリー：
２μg/ml Ｎ４１ｍａｂ抗体を使用した、ネクチン４のＮ末端Ｆｌａｇタグ付エピトープをトランスフェクションしたＭＤＡＭＢ２３１細胞株のＦＡＣＳ分析。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Beckman-Coulter）で細胞を染色した。
【０１２３】
イムノブロット分析：
イムノブロット実験：細胞溶解物ＭＤＡＭＢ２３１ネクチン４細胞の分析。１００mmディッシュ中の細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５０mM Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％グリセロールを含有する氷冷溶解バッファー ７５０_lに３０分間再懸濁した。製造業者（Roche Diagnostics）によって推奨されているように、プロテアーゼ阻害剤混合物を追加した。ＳＤＳサンプルバッファー（６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７、３％ＳＤＳ、２％（v/v）２−メルカプトエタノール及び５％グリセロール）中で溶解物を加熱し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、フッ化ポリビニリデン膜（Immobilon-P, Millipore, Boston, MA）に半乾で転写し、Mini-Protean II multiscreen装置を使用して１μg/ml ＭＯＰＣ２１、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２及びＮ４１ｍａｂでプローブした。ECL (Pierce)を用いて、可視化を行った。
【０１２４】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の生産：
簡潔に言えば、精製Ｎ４１ｍａｂ及びＨａ２２−２モノクローナル抗体から、コンジュゲートを生産した。使用したリンカーは、モノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）に共有結合されたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカーボナート）である。薬物対抗体比は、それぞれ４．７３及び４．０４であった。
【０１２５】
細胞成長／生存率の測定：
ＡＤＣの効果を分析するために、製造業者（Biosource, CA, USA）によって推奨されているようにalamarBlue染色手順を使用して、細胞成長を測定した。試験には、蛍光酸化還元指標が組み込まれている。蛍光強度は、細胞代謝の減少に比例する。０日目に、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり細胞 ３０００個をＡＤＣの連続希釈物と共に３回反復でインキュベーションすることによって、実験を行った。５日目に、１／１０容量のalamarBlue溶液を３７℃で２時間インキュベーションすることによって、alamarBlueを測定し、５９５nmで読み取った（FLUOstar Optima, BMG Labtech）。
【０１２６】
浸潤アッセイ：
マトリゲル(BD BioCoat Growth Factor reduced Matrigel Invasion Chamber (Becton Dickinson, MA, USA))でコーティングした８mm孔径膜を有する２４個の細胞培養インサートを使用して、浸潤アッセイを実施した。化学誘導物質（１０％ＦＣＳ）をウェルに追加し、細胞 １０５個をＲＰＭＩ  ０．１％ＢＳＡ中のインサートにロードした。プレートを３７℃で７２時間インキュベーションした。遊走後、綿棒を用いて上部膜表面上の非遊走細胞を除去し（４回／インサート）、膜の底面に付着した遊走細胞を０．２％クリスタルバイオレットエタノール溶液（Sigma）で２０分間染色した。蒸留水 ２００mlで５回洗浄した後、倒立顕微鏡を用いて侵襲性細胞をカウントした。各測定は、２回反復で行った３回の個々の実験の平均を表す。
【０１２７】
マウス実験：
Charles River Laboratory (Margate, UK)から、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重症複合免疫不全）／ｇｃヌルマウス（ＮＳＧ）を入手した。
【０１２８】
ルシフェラーゼ発現細胞をマウスの皮下又は尾静脈又は乳房脂肪体（７週齢の雌）のいずれかに移植した。各実験で言及されているように、Ｎ４１ｍａｂ又はＡＤＣによる処置を実施した。ルシフェリン（３０mg/kg）の腹腔内注射の後、PhotonIMAGER (BiospaceLab)を使用して、生物発光分析を実施した。式Ｖ１／４＝０：５２（Ｌ×Ｗ２）を使用して、腫瘍体積を計算した。分析の終了後、マウスの剖検を行い、器官の発光を評価した。
【０１２９】
結果
結果は、図１〜９に示されている。
【０１３０】
実施例２：
材料及び方法
患者及び乳ガンサンプル。倫理声明。
遺伝子発現分析のためにＤＮＡマイクロアレイを使用して、臨床サンプルをプロファイリングした。本発明者ら独自のデータセットには、診断時において非転移性の患者に由来する処置前浸潤性ガン腫に相当する３５３症例が含まれていた。本研究は、本発明者らの施設内倫理委員会によって承認された（the Institut Paoli Calmettes (IPC) “Comite d’Orientation Strategique”承諾番号１５−００２）。各患者から、研究利用に関する書面によるインフォームドコンセントを得た。本発明者らは、ＰＶＲＬ４に相当する少なくとも１つのプローブセットを含む１７個の利用可能なデータセットを用いて本発明者らの系列をプールした。National Center for Biotechnology Information (NCBI)/Genbank GEO及びArrayExpressのデータベース並びに著者のＷｅｂサイトから、これらのセットを収集した（データは示さず）。最終的にプールしたデータセットには、ＰＶＲＬ４  ｍＲＮＡ発現を有し、臨床病理学的データが利用可能な非冗長、非転移性、非炎症性、原発性、浸潤性乳ガン ５，６７３個が含まれていた（データは示さず）。タンパク質発現のために、診断時及び全身療法前のＴＮＢＣサンプル ６１個の連続パネルの分析を、本発明者らの施設で処置した女性から得た。各患者について、研究参加に関するインフォームドコンセントを得、研究は、本発明者らの施設内倫理委員会によって承認された（データは示さず）。
【０１３１】
遺伝子発現データ分析
以前に記載されているように（２１）、Affymetrix U133 Plus 2.0ヒトマイクロアレイ(Affymetrix（登録商標）, Santa Clara, CA, USA)を使用して、本発明者ら独自の遺伝子発現データセットを作成した。ＭＩＡＭＥ準拠のデータは、ＧＥＯデータベースに保管されている（ＧＳＥ３１４４８）。NCBIプログラムBLASTN 2.2.31+を使用してその同定及び特異性を検証した異なるプローブセットを分析することによって、ＰＶＲＬ４発現を測定した（データは示さず）。データ分析は、分析前の加工が必要であった。最初に、利用可能な加工された非Affymetrixデータのための分位正規化（Agilent, SweGene, Illumina）及び生Affymetrixデータのためのノンパラメトリック分位アルゴリズムによるRobust Multichip Average（ＲＭＡ）（２２）を使用して、各データセットを別個に正規化した。Bioconductor及び関連パッケージを使用してＲで正規化を行った。第２の工程では、示されている異なる技術プラットフォームにわたってEntrezGeneIDを使用して、ハイブリダイゼーションプローブをマッピングした。複数のプローブが同じGeneIDにマッピングされる場合、本発明者らは、特定のデータセットにおいて分散が最も高いものを保持した。異なるデータセットにわたって免疫組織化学分析に関連するバイアスを回避するために、及び対応するｍＲＮＡ発現レベルの二峰性分布により、それぞれＥＳＲ１、ＰＧＲ及びＥＲＢＢ２のｍＲＮＡ発現データを使用して、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）及びＨＥＲ２の発現（陰性／陽性）を転写レベルで定義した（２３）。次いで、異なる多重遺伝子分類を各データセットに別個に適用した。ＥＳＲ１、ＰＧＲ及びＥＲＢＢ２（ＥＳＲ１＋及び／又はＰＧＲ＋及び；ＥＲＢＢ２−腫瘍の場合にはＨＲ＋；ＥＲＢＢ２＋腫瘍の場合にはＥＲＢＢ２＋及びＥＳＲ１−，ＰＧＲ−及び；ＥＲＢＢ２−腫瘍の場合にはＴＮ）のｍＲＮＡ発現レベルを使用して、並びにＰＡＭ５０分類を使用して、腫瘍の固有分子サブタイプを定義した（２４）。ＰＶＲＬ４が基礎遺伝子クラスタに存在するので、本発明者らはまた、免疫応答に関連し、ＥＲ−、ＴＮ又は基礎乳ガンにおいて検証された３つの予後遺伝子発現シグネチャー（ＧＥＳ）：「免疫応答ＧＥＳ」（２５）、「ＬＣＫ  ＧＥＳ」（２６）及び「キナーゼ免疫ＧＥＳ」（２７）を分析した。ＰＶＲＬ４  ｍＲＮＡ発現の分析前に、参照として管腔Ａ集団を使用して、各データセット内で発現データを標準化し、実験室固有の変動及び集団の不均一性によるバイアスを排除し、全てのデータセットを比較可能にする。以前に報告されているように（２８）、標準化の前後に全ての腫瘍及びＰＡＭ５０遺伝子に適用した主成分分析（ＰＣＡ）により、正規化の正確性を検証することができた。
【０１３２】
抗ネクチン−４モノクローナル抗体の生産及び選択
ネクチン−４の遠位ＩｇＶ様ドメインに対する６つの異なるモノクローナル抗体（ｍａｂ１〜ｍａｂ６）を生産及び分析した。リコンビナント可溶性キメラネクチン４Ｖ−Ｆｃタンパク質を使用して、マウスを免疫化した（６）。トランスフェクションＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用したフローサイトメトリーとＥＬＩＳＡとによって、ネクチン−４に対するハイブリドーマ由来抗体のスクリーニングを行った。
【０１３３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
凍結組織由来の５μm切片に対して、ＩＨＣを行った。切片をアセトンで１０分間固定し、１０分間風乾し、ＴＢＳＴで再水和した。０．５μg/ml ｍａｂ１／Ｎ４１ｍａｂを用いて、染色を３７℃で３時間行った。二次抗体OmnipMap抗Ms HRP (Multimer HRP, Roche)を１５分間インキュベーションした。次いで、ヘマトキシリンＩＩ及びブルーイング試薬（Roche）を用いて、対比染色を行った。陽性細胞（Ｐ）の割合に強度（Ｉ）を掛けることによって、結果をスコアリングした（Quick score）。式：ＱＳ＝Ｐ×Ｉ。最大スコアは３００である。
【０１３４】
細胞株
１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、５０ＩU/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン及び２mM グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、ヒト乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ATCC, Manassas, VA）を培養した。ＰＶＲＬ４  ｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐ３ＸＦＬＲ４．Ｃ１を細胞にトランスフェクションした（７）。ＳＵＭ１９０乳ガン株は、Dr S. P. Ethier (University of Michigan)よって厚意で提供されたものであり、５％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、１０μg/ml インスリン、１μg/ml ヒドロコルチゾン、５０ＩU/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン及び２mM グルタミンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中で培養した。
【０１３５】
ＡＤＣの生産
Concortis (San Diego, CA, USA)によって、ＡＤＣの生産を実施した。簡潔に言えば、精製ｍａｂ１／Ｎ４１ｍａｂモノクローナル抗体から、コンジュゲートを生産した。使用したリンカーは、モノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）に共有結合されたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐアミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカーボナート）である。この切断可能なリンカーは強力なバイスタンダー殺傷を誘導したので、それを選択した。薬物対抗体比は、４．７３であった。
【０１３６】
ＥＬＩＳＡ
サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、Ｎ４１ｍａｂ抗体の特異性をコントロールした。５ug/ml ネクチン４Ｖ−Ｆｃ又はネクチン１Ｖ−Ｆｃ（ＩｇＶドメインのみを含有する）で９６ウェルトレイを＋４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳによる洗浄及び飽和の後、１％ＢＳＡ細胞を０．６２５μg/ml Ｎ４１ｍａｂと共に一晩インキュベーションした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を２５℃で２時間インキュベーションした（Pierce）。ペルオキシダーゼ基質 １００μlを追加し（One Step ABST, Pierce）、ＯＤを４０５nmで読み取った。
【０１３７】
フローサイトメトリー
２□g/ml ｍａｂ１／Ｎ４１ｍａｂ抗体を使用して、ネクチン４のＮ末端Ｆｌａｇタグ付エピトープをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＦＡＣＳ分析を行った。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Beckman-Coulter）で細胞を染色した。
【０１３８】
イムノブロット分析
１００mmディッシュ中、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ネクチン−４細胞においてネクチン−４発現を分析し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５０mM Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％グリセロールを含有する氷冷溶解バッファー ７５０μlに３０分間再懸濁した。推奨されているように（Roche Diagnostics）、プロテアーゼ阻害剤混合物を追加した。ＳＤＳサンプルバッファー（６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７、３％ＳＤＳ、２％（v/v）２−メルカプトエタノール及び５％グリセロール）中で溶解物を加熱し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、フッ化ポリビニリデン膜（Immobilon-P, Millipore, Boston, MA, USA）に半乾で転写し、Mini-Protean II multiscreen装置を使用して１μg/ml ＭＯＰＣ２１、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２及びｍａｂ１／Ｎ４１ｍａｂでプローブした。ECL (Pierce)を用いて、可視化を行った。
【０１３９】
細胞成長／生存率の測定
ＡＤＣの効果を分析するために、製造業者（Biosource, CA, USA）によって推奨されているようにalamarBlue染色手順を使用して、細胞成長を測定した。試験には、蛍光酸化還元指標が組み込まれている。蛍光強度は、細胞代謝の減少に比例する。０日目に、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり細胞 ３０００個をＡＤＣの連続希釈物と共に３回反復でインキュベーションすることによって、実験を行った。５日目に、１／１０容量のalamarBlue溶液を３７℃で２時間インキュベーションすることによって、alamarBlueを測定し、５９５nmで読み取った（FLUOstar Optima, BMG Labtech）。
【０１４０】
動物モデル
実験は全て、動物管理に関するフランスのガイドラインにしたがって実施し、地方倫理委員会によって承認された（承諾番号０１１５２−０１）。Dr. C. Rivers (Margate, UK)から、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウス（ＮＳＧ）を得た。滅菌飼料及び水を不断給餌で提供する滅菌条件下でマウスを飼育し、明期１２時間及び暗期１２時間で維持した。ＳＵＭ１９０細胞を、５０％フェノールレッドフリーマトリゲル（Becton Dickinson Bioscience）に懸濁した（０．５×１０６）で乳房脂肪体に接種した。患者由来の腫瘍細胞（ＰＤＸモデル）を、５０％フェノールレッドフリーマトリゲルに懸濁した（０．２〜０．５×１０６）で乳房脂肪体に接種した。
【０１４１】
デジタルキャリパーを用いて測定し、腫瘍体積（長さ×幅２×π／６）を計算することによって、腫瘍成長をモニタリングした。各群の平均腫瘍体積が１００〜２００mm3になるように、全ての動物を処置群にランダムに割り振った。各実験で言及されているように、ＡＤＣによる処置を実施した。ルシフェラーゼ発現ＳＵＭ１９０細胞（ＰＢＳ １００μL中、細胞 ０．５×１０６個）をＮＳＧマウスの尾静脈に接種した。エンドトキシンフリールシフェリン（３０mg/kg）の追加後、PhotonIMAGER (BiospaceLab)を使用して、生物発光分析を実施した。分析の終了後、マウスの剖検を実施し、器官の発光を評価した。ＮＳＧマウスにおいて開発され、ＣＲＣＭにおいて以前に特性評価されたＰＤＸのコレクションの中から（１６）、本発明者らは、ＩＨＣ研究のために（原発性ＴＮＢＣから得られた）９つの基底様ＰＤＸモデルを選択した。各実験で言及されているように、ＡＤＣで４つのＰＤＸを処置した。
【０１４２】
統計的方法
フィッシャーの直接確率検定を使用して、腫瘍群と臨床病理学的特徴との間の相関を分析した。診断日から遠隔再発の日まで、無転移生存（ＭＦＳ）を計算した。無症候患者について診断日から最新情報の日まで、経過観察を測定した。カプラン・マイヤー法を使用して生存を計算し、ログランク検定を用いて曲線を比較した。コックス回帰分析（ワルド検定）を使用して、単変量生存分析及び多変量生存分析を行った。単変量分析で試験した変数には、診断時の患者の年齢（５０歳以下対５０歳超）、病理学的種類（管状対結節性）、病理学的腫瘍サイズ（ｐＴ：ｐＴ１対ｐＴ２〜３）、病理学的腋窩リンパ節の状態（ｐＮ：陰性対陽性）、病理学的悪性度（１〜２対３）及びＰＶＲＬ４発現（「高」対「低」）が含まれていた。単変量分析で０．０５未満のｐ値の変数を多変量分析で試験した。統計的検定は全て、５％レベルの有意性で両側であった。Ｒソフトウェア（バージョン２．３０）（バージョン２．９．１；http://www.cran.r-project.org/）の生存パッケージを使用して、統計分析を行った。本発明者らは、腫瘍マーカー予後研究（REMARK基準）に関する報告推奨に従った。データは平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として示されており、GraphPad Prismソフトウェアを使用してマンホイットニー検定によって計算した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。データは、少なくとも３回の実験の代表である。
【０１４３】
結果：
ネクチン４／ＰＶＲＬ４は、ＴＮＢＣ特異的バイオマーカーである
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ及び１００％特異的な５つの異なるＰＶＲＬ４プローブを使用してプロファイリングした一連のプールした浸潤性乳ガン ５６７３個におけるＰＶＲＬ４  ｍＲＮＡ発現を検査した（材料及び方法を参照のこと）。本発明者ら独自のサンプル系列 ３５３個の全ゲノムクラスタリングにより、ＰＶＲＬは「基礎」遺伝子クラスタ内にあったことが示された（データは示さず）。高いＰＶＲＬ４発現は、トリプルネガティブ（ＴＮ）サブタイプ及びＰＡＭ５０基礎サブタイプの両方を含む予後不良特徴に関連していた（データは示さず）。転移性再発を伴わない６１３人（平均経過観察、８３カ月間）及び転移性再発を伴う４２４人（再発までの平均時間、２４カ月間）を含む患者 １，０３７人について、無転移生存（ＭＦＳ）データが利用可能であった。５年ＭＦＳ率は、６１％であった（９５ＣＩ、０．５８〜０．６５）。全集団において、高いＰＶＲＬ４発現はより短いＭＦＳに関連していた（ｐ＝０．０１４３、ログランク検定）（データは示さず）。ＴＮサブグループにおいてのみ、高いＰＶＲＬ４発現はＭＦＳに実際に関連しており、それぞれ「ＰＶＲＬ４−高」群及び「ＰＶＲＬ４−低」群における５年ＭＦＳは４７％（９５ＣＩ、０．４０〜０．５５）対６２％（９５ＣＩ、０．５１〜０．７４）であり（ｐ＝０．０１４、ログランク検定）、（図１ｃ）、多変量分析では、ＰＶＲＬ４発現は予後影響力を保持していた（ｐ＝０．０３６、ワルド検定；ＨＲ＝１．５３［１．０２−２．３０］）（表１）。次に、本発明者らは、ＴＮＢＣ ６１個（これらのうちの１２個は、ＤＮＡマイクロアレイを使用して以前にプロファイリングされている）において、免疫組織化学によって、タンパク質レベルにおけるネクチン−４の発現を検査した。この分析に使用したモノクローナル抗体は、本発明者らのスクリーニングから選択し（次の段落を参照のこと）、ヒトネクチン−４の遠位ＩｇＶ様ドメインを認識し、他のヒトネクチン又はマウスネクチン−４と交差反応しなかった（データは示さず）。QuickScore（ＱＳ）半定量的評価に基づいて、本発明者らは、１００超のＱＳを有する「ネクチン−４−高群」と１００未満のＱＳを有する「ネクチン−４−低群」とを区別した（これらは、それぞれＴＮＢＣの６２％及び３８％に相当する）（データは示さず）。ネクチン−４発現は、原形質膜において検出された。ネクチン−４のｍＲＮＡ及びタンパク質発現は、優れた相関を示した（データは示さず；ｐ＝０．００２２）。重要なことに、正常乳腺上皮（データは示さず）及び皮膚を除く３０個の異なる成人正常組織（データは示さず）において、ネクチン−４は検出されなかった。これらの結果は、ネクチン−４が、新たな細胞表面バイオマーカー及びＴＮＢＣの潜在的なターゲットの両方であることを立証している。
【０１４４】
in vitroにおけるネクチン−４のＡＤＣベースのターゲティング
本発明者らは、ネクチン−４のＩｇＶ様遠位ドメインに対する６つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生産及び試験して、インターナリゼーションを誘導することができるｍＡｂを単離した。ＥＣ５０、最大結合能力、細胞表面インターナリゼーション及び細胞傷害性について、ｍＡｂを評価した（データは示さず）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において発現されたＦｌａｇタグ付ネクチン−４と、ＦＩＴＣ標識抗Ｆｌａｇ抗体（M2, Sigma-Aldrich）とを使用して、インターナリゼーションを試験して、残存表面ネクチン−４を定量した。ｍａｂ１は、最も効率的な抗体であった。それは、２４時間で細胞表面ネクチン−４の６０％の減少を誘導し、サポリンにコンジュゲートされたヤギ抗マウスモノクローナル抗体（mab-ZAP kit, ATS-bio）と共にインキュベーションした後に６０％の細胞成長阻害を誘導した。インターナリゼーション及び細胞傷害性は相関していた（Ｒ２＝０．９６０６）。ｍａｂ１は、in vitroにおける細胞生存及びin vivoにおける腫瘍細胞成長に影響を与えなかった（データは示さず）。次いで、切断可能なバリン−シトルリン（ｖｃ）ジペプチドリンカーを介して、ｍａｂ１をモノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートして（以下、Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥ、すなわちＡＤＣと称する）ＡＤＣを生産し、これを、選択乳ガン細胞株において特異性及び有効性についてin vitroで試験した。ネクチン−１、ネクチン−２及びネクチン−３を発現するがネクチン−４を発現しないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＡＤＣに対して非感受性であった。しかしながら、ネクチン−４の異所性発現は、ＩＣ５０＝２ng/mlで感受性を付与した（データは示さず）。内因性ネクチン−４を発現するＳＵＭ１９０細胞は、ＩＣ５０＝４ng/mlで感受性であった（データは示さず）。これらのデータにより、Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥの特異性及び有効性が示された。
【０１４５】
in vivoにおけるネクチン−４のＡＤＣベースのターゲティング
ＴＮＢＣを発症した免疫不全ＮＳＧマウスのin vivoモデル ３匹において、本発明者らのＡＤＣの活性を試験した。第１に、ＳＵＭ１９０細胞を異種移植したマウスを、Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥの２回の連続する静脈内投与で処置した（データは示さず）。これら投与は、マウスにとって毒性ではなかった（データは示さず）。Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃＭＭＡＥは、迅速（４日）かつ用量依存的な腫瘍退縮を誘導し、これは最大４０日間持続した（データは示さず）。再発後、腫瘍は依然として、少なくとも６カ月間にわたってＡＤＣに対する感受性を保持していた（データは示さず）。
【０１４６】
第２に、本発明者らは、原発性ＴＮＢＣの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を使用した。これら前臨床モデルは、乳ガンの病理学を再現する（１６）。ＰＤＸにおけるネクチン−４発現の局在性及びレベルは、ＴＮＢＣ患者において見られたものと類似していた（データは示さず）。７／９のＰＤＸでは、ネクチン−４の発現は、原形質膜において顕著に見られた（ＱＳ＞１００）。異なるＱＳを有するＴＮＢＣ  ＰＤＸマウスを、ＡＤＣの２回の連続する静脈内投与で処置した。臨床反応は、発現のレベルとほぼ相関していた：ＰＤＸ４００（ＱＳ＝３００）、ＰＤＸ３１７（ＱＳ＝１４０）、そして比較的程度は低いがＰＤＸ３４８（ＱＳ＝１００）については、迅速かつ著しい腫瘍負荷の退縮（最大３５日間）が観察されたが（データは示さず）、ＰＤＸ４３４（ＱＳ＝１０）については観察されなかった（データは示さず）。対照的に、ドセタキセルによるＰＤＸ３４８の処置（３回１０mg/kg腹腔内）は無効であった（データは示さず）。
【０１４７】
第３に、進行疾患におけるＡＤＣ処置の有効性を評価するために、本発明者らは、原発性腫瘍由来の自然発生的な転移性病変を発症しているＰＤＸ３１７及びＰＤＸ４００マウスを処置した。ＰＤＸ ２匹をＡＤＣの２回の連続する静脈内投与で処置したところ、発光分析によって３５日間にわたって観察されたように、全ての転移性病変が迅速に減少及び消失した。ＰＤＸ４００については、ＡＤＣ処置後２８日目及び４３日目に転移性再発が検出されたが、ＰＤＸ３１７については、１１２日後においても依然として観察されなかった。これらの結果により、ネクチン−４を発現する原発性ＴＮＢＣ及び転移性ＴＮＢＣの両方において、Ｎ４ｍａｂ１−ｖｃＭＭＡＥは、著しい抗腫瘍活性を有していたことが示された。
【０１４８】
参考文献：
本出願を通して、本発明が関係する技術水準が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１Ａ】
2018531913.tif 000006
【図１Ｂ】
2018531913.tif 000007
【図２】
2018531913.tif 000008
【図３】
2018531913.tif 000009
【図４】
2018531913.tif 000010
【図５】
2018531913.tif 000011
【図６Ａ】
2018531913.tif 000012
【図６Ｂ】
2018531913.tif 000013
【図７】
2018531913.tif 000014
【図８】
2018531913.tif 000015
【図９】
2018531913.tif 000016
【配列表】
2018531913000001.app
【国際調査報告】
2018531913.tif 000017
2018531913.tif 000018
2018531913.tif 000019
2018531913.tif 000020