(57)【要約】  本発明は、水処理システムの特定の部分に存在する特定の微生物を識別するための方法及び組成物に関する。本方法は、プロセスからサンプルを得ることと、問題のある生物が許容可能な閾値を超えているかどうかを決定することとを含む。そうであれば、望ましくない任意の欠陥または問題が発生するずっと前に是正した生物防除手順を適用することができる。
2018512163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水処理システムにおいて微生物によって引き起こされる問題に前もって対処する方法であって、
前記システムの少なくとも一部における全微生物集団を測定することと、
前記全微生物集団に関連する微生物集団の少なくとも１つのサブグループの量を測定することと、
前記微生物の少なくとも１つのサブグループの量が閾値を超えているかどうかを決定することであって、前記閾値は、前記微生物のサブグループの所定の絶対量、前記微生物のサブグループの所定の相対量、及びそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つである、決定することと、
任意に、前記微生物の少なくとも１つのサブグループの存在を是正するための生物防除手順を策定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記微生物のサブグループが、糸状性細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物のサブグループは、スピロジラ、クラドフォラ、ピトフォラ、Ｏ．シフォノクラデス・ピトフォラ・ピトフォラ、ウルビバクター・リトラリス（Ｕｌｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ヴェテリバクター・ウラジオストケンシス、ウィークセラ・ヴィロサ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ）、フコバクター、ゲリバクター、オルニトバクテリウム・リノトラチェーレ（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、リエメレラ・コハムビナ（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ｃｏｈａｍｂｉｎａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム、ヘルペトシフォン（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）、ハリスコノバクター、スファエロチラス、サイトファガ・サクシカン、ウラジバクター、プフェイフェレラ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒｅｌｌａ）、バチルス・アクアティリス、フレキシバクター・マリナス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）、フラボバクテリウム・オドラタム、ミクロスシーラ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ）、フレキシトリックス（Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ）、カプノサイトファガ、タキソバクター、スポロキトファガ、サプロスピラ、クリソバクテリウム、ヒメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記閾値は、前記全微生物集団の少なくとも５〜９０％の量の微生物のサブグループである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの測定値が、連鎖停止配列決定、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡに基づく分析、イオントレント半導体配列決定、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、質量分析、ＰＣＲ分析、パイロシーケンシング、ｑＰＣＲ分析、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出による配列決定、合成による配列決定、１つ以上の微生物に関連する抗体の測定、１つ以上の微生物に関連するホルモンの測定、１つ以上の微生物に関連する分泌物の測定、１つ以上の微生物に関連するタンパク質の測定、１つ以上の微生物に関連する有機分子の測定、１つ以上の微生物に関連する分子の測定、蛍光ファージ、細胞選別機、ならびにそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される１つのプロセスによって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記処理は、前記微生物集団の少なくとも１つのサブグループの原因である入力源を識別することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記水処理システムは、市水、水道水、池の水、海水、湖水、ろ過された水、脱塩水、再循環水、排水、蒸留水、凝縮ボイラー水、冷却水、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つの供給源からの供給水を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物のサブグループが由来する水源を識別することと、前記微生物のサブグループが由来する水源からの水の導入後１週間以内までに、前記微生物の少なくとも１つのサブグループの存在を是正するための生物防除手順を策定することと、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水処理システムは、製紙、冷却水、ボイラー水、食品製造、飲料製造、鉱石処理、アルミナ処理、バイオディーゼル製造、蒸留、石油化学精製、石油化学合成、ポリマー合成、プラスチック製造、排水処理、ランドリー、ウエアウォッシング、水処理、固液分離、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つの項目の１つ以上の段階である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
識別された生物を保存及び／または送信することができるフォーマットに記録することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記識別された生物を是正することに関連する殺生物プログラムを実施することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの測定値が、前記処理システムのサンプル製品から取られる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、非常に乾燥しているため、その上には生存生物がほとんどまたは全くない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物のサブグループが、バイオフィルム形成体を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物のサブグループが由来する原材料、製品中間体、または前記システムに加えられる処理添加剤を識別することと、前記微生物のサブグループのこの供給源の導入後１週間以内までに、前記微生物の少なくとも１つのサブグループの存在を是正するための生物防除手順を策定することと、をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年４月１５日に出願された米国特許出願第１４／６８７，０１７号の利益を主張する、２０１６年４月１４に出願されたＰＣＴ国際出願であり、その開示の全体が組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発に関する声明
非適用。
【０００３】
本発明は、概して、多様度及び生存度の閾値を決定するのに有用な物質の組成物、装置及び方法に関する。閾値は、微生物がプロセス効率問題または製品品質問題の起因となっているかどうかを決定するために使用され得る。閾値はまた、特定の微生物がプロセス流に入った場所及び／または増殖した場所を特定するのにも有用である。
【背景技術】
【０００４】
工業プロセス流中の望ましくない微生物の存在は、装置表面への付着、機械性能の低下、生産効率の低下、及び仕様外の最終製品などの多くの問題を引き起こす可能性がある。どの生物が増殖しているか及びどのように増殖しているかを正確に特定することができれば、これらの問題に対処する上で大いに役立つ。
【０００５】
例えば、製紙システムでは、微生物の増殖は非常に有害でコストがかかる場合がある。装置表面上の微生物の増殖は、それが取れてシート欠陥及び穴の一因となる堆積物の形成につながる可能性がある。汚染されたシャワー水処理物または処理水は、フェルト上に細菌の増殖をもたらし、これは一般的にフェルト上にプラグ（plug）を形成する結果となる。これらのプラグは、多くの問題、特にペーパーウェブからの水分除去の障害を次々と引き起こす。結果として、微生物の増殖は、過剰かつ高価な、フェルトまたは他の製紙装置の複数のボイルアウト及び洗浄の必要性をもたらすことがある。これらの問題は、どの微生物が発生したかの決定が正しくない場合に悪化し得る。なぜなら、これは、フェルトの耐用年数の短縮をもたらし、紙の品質をさらに低下させ、処理装置にさらに影響を及ぼす腐食性化学処理の必要性をもたらす可能性があり、及び／または潜在する微生物寄生を防除さえしないかもしれない可能性があるからである。さらに、生物学的に引き起こされた問題と機械的または化学的に引き起こされた問題とを間違って区別することは、不十分で、無駄で、非生産的な努力をさらに招く可能性がある。
【０００６】
どの微生物が製紙システムに存在するかを識別するための多くの従来技術の方法が知られている。しかし、これらの方法は、紙シートまたはフェルトに適用されたときに特に不十分である。米国特許第８，０１２，７５８号、同第７，９８１，６７９号及び同第７，９４９，４３２号のような従来技術の方法のいくつかは、生存している微生物によって生じた製紙システムの流体中の様々な影響を検出する。ＵＳ５，２８１，５３７のような他の方法は、生存微生物汚染物質のサンプルを得て、それをより多く増殖させて様々な分析を行うことに依存する。しかし、紙シート及びフェルトの場合では、これらの方法は、フェルトまたは紙のサンプルが採取されるまでに、培養するための十分な（または任意の）生きた生物、またはそれらが生成するいずれの化学生成物ももはや含まないため、特に不十分である。また、加熱または乾燥セクションの下流にある製紙システムの項目（紙シート及びフェルトなど）も、既に欠陥を引き起こした後に微生物を死滅させるというすべての欠陥を有するであろう。生存生物の存在に依存しない代替の方法は、しばしば偽陽性を生じるので、不十分である傾向がある。例えば、ニンヒドリン（第一級または第二級アミンを検出するために使用される）及びＩＲ分光法は、非生物的起源物（化学的添加物または汚染物質など）を有する可能性のある物質を検出するため、しばしば偽陽性または偽陰性を生じる。
【０００７】
したがって、工業プロセス流及び装置上に存在する微生物の適切な識別のための新規な方法及び組成物には明確な有用性があることは明らかである。この欄に記載された技術は、特に指定されない限り、本明細書で言及されたいかなる特許、刊行物または他の情報も、本発明に関する「先行技術」であるという承認を構成することを意図するものではない。さらに、この欄は、検索が行われたこと、または３７  ＣＦＲ§１．５６（ａ）で規定されている他の関連情報が存在しないことを意味すると解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記で認識された長く存在しているが解決されていない必要性を満たすために、本発明の少なくとも１つの実施形態は、水処理システムにおける微生物に起因した問題を前もって対処する方法を対象とする。方法は、システムの少なくとも一部における全微生物集団を測定するステップと、全微生物集団に関連する微生物集団の少なくとも１つのサブグループの量を測定するステップと、微生物の少なくとも１つのサブグループの量が閾値を超えているかどうかを決定するステップであって、前記閾値は、前記微生物のサブグループの所定の絶対量、前記微生物のサブグループの所定の相対量、及びそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つである、ステップと、微生物の少なくとも１つのサブグループの存在を是正するための生物防除手順を任意に策定するステップと、を含む。
【０００９】
微生物のサブグループは、糸状性細菌を含み得る。微生物のサブグループは、スピロジラ、クラドフォラ、ピトフォラ、Ｏ．シフォノクラデス・ピトフォラ・ピトフォラ、ウルビバクター・リトラリス（Ｕｌｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ヴェテリバクター・ウラジオストケンシス、ウィークセラ・ヴィロサ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ）、フコバクター、ゲリバクター、オルニトバクテリウム・リノトラチェーレ（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、リエメレラ・コハムビナ（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ｃｏｈａｍｂｉｎａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム、サイトファガ・サクシカン、ウラジバクター、プフェイフェレラ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒｅｌｌａ）、バチルス・アクアティリス、フレキシバクター・マリナス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）、フラボバクテリウム・オドラタム、ミクロスシーラ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ）、フレキシトリックス（Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ）、カプノサイトファガ、タキソバクター、スポロキトファガ、サプロスピラ、クリソバクテリウム、ヒメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。閾値は、微生物のサブグループが、全微生物集団の少なくとも５〜９０％の量であると測定される。
【００１０】
少なくとも１つの測定値は、以下からなるリストから選択された１つのプロセスによって取得されてもよい：連鎖停止配列決定、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡに基づく分析、イオントレント半導体配列決定、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、質量分析、ＰＣＲ分析、パイロシーケンシング、ｑＰＣＲ分析、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出による配列決定、合成による配列決定、１つ以上の微生物に関連する抗体の測定、１つ以上の微生物に関連するホルモンの測定、１つ以上の微生物に関連する分泌物の測定、１つ以上の微生物に関連するタンパク質の測定、１つ以上の微生物に関連する有機分子の測定、１つ以上の微生物に関連する分子の測定、蛍光ファージ、細胞選別機、ならびにそれらの任意の組み合わせ。
【００１１】
方法は、微生物集団の少なくとも１つのサブグループの原因である入力源を識別することをさらに含み得る。入力源は、市水、水道水、池の水、海水、湖水、ろ過された水、脱塩水、再循環水、排水、蒸留水、凝縮ボイラー水、冷却水、二酸化チタン、粘土、プロセス添加剤、ポリマー、染料、蛍光増白剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つの供給源からの給水、原材料、繊維、または染料であり得る。方法は、微生物のサブグループが由来する水源を識別するステップと、微生物のサブグループが由来する水源からの水の導入後１週間以内までに、微生物の少なくとも１つのサブグループの存在を是正するための生物防除手順を策定するステップと、をさらに含むことができる。
【００１２】
水処理システムは、製紙、冷却水、ボイラー水、食品製造、飲料製造、鉱石処理、アルミナ処理、バイオディーゼル製造、蒸留、石油化学精製、石油化学合成、ポリマー合成、プラスチック製造、排水処理、ランドリー、ウエアウォッシング、水処理、固液分離、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つの項目の１つ以上の段階であり得る。方法は、識別された生物を保存及び／または送信することができるフォーマットに記録するステップをさらに含み得る。
【００１３】
方法は、識別された生物を是正することに関連する殺生物プログラムを実施するステップをさらに含み得る。方法は、プロセスシステムのサンプル製品からの少なくとも１つの測定値を取るステップをさらに含み得る。サンプルは、非常に乾燥しているため、その上には生存生物がほとんどまたは全くなくてもよい。
【００１４】
追加の特徴及び利点は、本明細書に記載されており、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
【００１５】
以下、発明を実施するための形態を、以下の図面を具体的に参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】フェルト透過性問題（ＰＭ２ピックアップフェルト）がない製紙機械からのフェルト及びフェルト透過性の問題（ＰＭ１ピックアップフェルト）を有する機械からのフェルトサンプルのｑＰＣＲ分析の円グラフを示す。
【図２】ｑＰＣＲによって決定される、時間に対するフェルト織物中の細菌の相対的存在量の円グラフを示す。円グラフ上の数字は、サンプルの全細菌負荷を表す。
【図３】プログラム最適化前（１ヶ月前）及びプログラム最適化中（２〜７ヶ月）の機械の生地の寿命（日数）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示の目的のために、図面中の同様の参照番号は、他に示されない限り、同様の特徴を指すものとする。図面は、本発明の原理の単なる例示であり、本発明を図示の特定の実施形態に限定することを意図したものではない。
【００１８】
定義
以下の定義は、本願でどのように用語が使用されているか、特にどのように請求項が解釈されるかを決定するために提供される。定義の構成は便宜上のものであり、定義のいずれかを特定のカテゴリーに限定することを意図しない。
【００１９】
「連鎖停止配列決定」とは、一本鎖ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、正常デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡ鎖伸長を終結する修飾ヌクレオチド（ジデオキシＮＴＰ）を必要とする方法を意味する。これらの鎖終結ヌクレオチドは、２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成に必要な３’−ＯＨ基を欠き、ｄｄＮＴＰが組み込まれたときにＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡの伸長を停止させる。ｄｄＮＴＰは、自動配列決定装置での検出のために、放射能標識または蛍光標識されてもよい。場合によっては、鎖終結配列決定は、一本鎖鋳型に相補的なＤＮＡの新しい鎖の合成を伴い得る（ステップＩ）。鋳型ＤＮＡには、４つすべてのデオキシヌクレオチド、それぞれ異なる色の蛍光タグで標識された４つのジデオキシヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼの混合物が供給される（ステップＩＩ）。すべての４つのデオキシヌクレオチドが存在するので、鎖伸長は、偶然に、ＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドを挿入するまで進行する。その結果は、すべて異なる長さのＤＮＡ鎖の新しい組である（ステップＩＩＩ）。次いで、断片を、ゲル電気泳動を用いてサイズ分けする（ステップＩＶ）。各標識ＤＮＡ断片がゲルの底で検出器を通過すると、色が記録される。次いで、各ヌクレオチド配列を表す色のパターンからＤＮＡ配列を再構成する（ステップＶ）。
【００２０】
「欠陥」とは、工業プロセスまたはプロセス流に関連した項目の望ましくない属性を意味し、製紙プロセスの文脈では、それは、フェルト上の１つ以上のプラグ、ならびに穴、変色、すじ、斑点、半透明点、及びそれらの任意の組み合わせなどの紙シートの属性を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
「変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）」は、アクリルアミドゲルを横切って移動する際にサンプルを変性させる化学勾配を用いる電気泳動の一形態を意味する。ＤＧＧＥは、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸に適用することができ、したがって、ユーザーは、サンプル中に存在する異なるＤＮＡ／ＲＮＡ配列の数を評価することができる。代表的な例は、以下の科学論文に見出され得る：Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ，ｂｙ  Ｇ．Ｍｕｙｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．３，ｐｐ．６９５−７００，Ｍａｒｃｈ（１９９３）。
【００２２】
「ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応」または（デジタル（ｄｉｇｉｔａｌ）ＰＣＲ、デジタル（Ｄｉｇｉｔａｌ）ＰＣＲ、ｄＰＣＲ、またはｄｅＰＣＲ）とは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸を直接定量及びクローン的に増幅するために使用され得る従来のポリメラーゼ連鎖反応法の改良を意味する。ｄＰＣＲと従来のＰＣＲとの主な違いは、核酸量の測定方法であり、前者はＰＣＲより正確な方法である。ＰＣＲは単一のサンプルにつき１つの反応を行う。ｄＰＣＲも、サンプル中で単一の反応を行うが、サンプルは多数の区画に分離され、反応は各区画内で個別に行われる。この分離により、核酸量のより信頼性の高い収集及びより高感度な測定が可能になる。代表的な例は、米国特許６，１４３，４９６号及びＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．９２３６−９２４１，Ａｕｇｕｓｔ（１９９９）による科学論文Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲに記載される。
【００２３】
「ＤＮＡに基づく分析」とは、ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、イオン半導体配列決定、パイロシーケンシング、合成による配列決定、訴訟による配列決定、連鎖停止配列決定、及び任意のそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＤＮＡ分析の方法を意味する。
【００２４】
「フェルト」とは、材料のコンベヤーとして機能する製紙プロセスで使用される混紡ウールまたは他の任意の繊維でできたベルトを意味し、この混紡繊維は水または他の流体が通過し得る複数の内腔を画定する。フェルトはまた、プレスロール間のクッション性を提供することもでき、製紙材料から水を除去するために使用される媒体であってもよい。フェルトには、ボトムフェルト、ボトムボードフェルト、シリンダーティッシュウェットフェルト、ドライヤーフェルト、エンドレスフェルト、ピックアップフェルト、サクションピックアップフェルト、ハーパートップフェルト、及びトップフェルトを含むがこれらに限定されない。
【００２５】
「イオントレント半導体配列決定」とは、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡ配列決定の方法を意味する。これは、鋳型鎖の配列に基づいて相補鎖を構築する間の「合成による配列決定」の方法であり、その代表的な例はウェブサイトに記載されている：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｉｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔ−ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ（２０１３年１２月２３日にアクセスされた）。
【００２６】
「ＭＡＬＤＩ」とは、生体分子（ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖などの生体高分子）及び大きな有機分子（ポリマー、デンドリマー、及び他の巨大分子など）を同定するために使用される質量分析計の一形態であるマトリックス支援レーザー脱離／イオン化を意味し、典型的には、それに対してレーザーをパルスしてサンプルをガス状イオン状態にアブレーションさせた後、質量分析法でサンプルを分析する。生物を識別するためのＭＡＬＤＩの代表的な例は、以下の科学論文に記載されている：
Ｐｈｙｌｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｂｙ  Ｇ．Ｃ．Ｃｏｎｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１０３−１１２，（２００１）、
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｒｏｔｈｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｂｙ  Ａ．Ｆｅｒｒｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８（５），１５４２−１５４８，（２０１０  Ｍａｙ）、及び
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂｏｒｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｙ  Ｍ．Ｐａｖｌｏｖｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｊ．；７：１３５−１４１（２０１３）。
【００２７】
「質量分析」または（ＭＳ）は、質量電荷比と気相イオンの存在量を測定することにより、サンプル中に存在する化学物質の量と種類を特定するために使用される分析化学技術を意味し、テキストブックにより詳しく記述されている：Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−Ａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｒｓｅ，ｂｙ  Ｋ．Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ：Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）。
【００２８】
「微生物」とは、限定されない製紙プロセスのような工業プロセスまたは流れにおいて使用される装置内に、その装置に隣接して、その装置の上で、またはその装置に付随してそれ自体を取り込むのに十分に小さい任意の生物を意味し、それは、限定されないが、裸眼で見ることができる１つ以上の生物と同様に、顕微鏡の助け無しには見ることができないほど小さなそれらの生物、裸眼で見ることができないほど小さい多くの個々の生物を除く裸眼で見ることができるほど小さな生物の集団またはコロニーを含み、それは、限定されないが、何らかの形で水処理システムを損なう生物が含まれ、それは、限定されないが、以下のテキストブックに記載されているように識別された微生物も含む：Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（１４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，（２０１４）ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：Ｖｏｌ  ７：Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｄｅｌｔａ  ａｎｄ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｄｅｅｐｌｙ  Ｒｏｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｙ  Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｍ．，Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，（２００６）。
【００２９】
「紙製品または紙シート」は、必ずしもそうではないがセルロース繊維を含む、従来の製紙プロセスで形成された繊維構造体最終製品を意味する。このような最終製品の例は、ティッシュペーパー、トイレットペーパー、テーブルナプキン、コピー用紙、プリンタ用紙、筆記用紙、ノート紙、新聞紙、板紙、ポスター紙、ボンド紙、段ボールなどを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
「製紙プロセス」は、水性セルロース製紙用完成紙料を形成し、完成紙料を排出してシートを形成し、シートを乾燥させることを含む、パルプから紙製品を製造する方法の任意の部分を意味する。製紙完成紙料を形成、排水及び乾燥するステップは、当業者に一般的に知られている任意の従来の方法で行うことができる。製紙プロセスはまた、パルプ化段階、すなわち、リグノセルロース系原料からパルプを製造する段階及び漂白段階、すなわち、明るさ向上のためのパルプの化学的処理を含むことができ、それはまた、限定されないが、パルプ化、消化、精練、乾燥、カレンダリング、プレス、クレープ加工、脱水、及び漂白のような１つ以上のステップを含み得、製紙は、参考文献Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｇａｒｙ  Ａ．Ｓｍｏｏｋ，Ａｎｇｕｓ  Ｗｉｌｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（２００２）ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｎａｌｃｏ  Ｗａｔｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｂｙ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｆｌｙｎｎ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ（２００９）ｉｎ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｐｐ．３２．１−３２．４４にさらに記載される。
【００３１】
「ＰＣＲ分析」は、ポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。
【００３２】
「プラグ」は、フェルトの管腔内に配置された材料の固体、半固体、粘土及び／または他の堆積物を意味する。プラグは、内腔を通る材料の流れを抑制し、及び／またはフェルトの他の機能性を損なう可能性がある。
【００３３】
「プライマー」は、ＤＮＡの特定の部分に相補的であることが知られており、ＤＮＡの特異的部分に隣接するＤＮＡに相補的なヌクレオチド鎖の合成の出発点として役立つ物質の組成物、典型的には短い鎖のヌクレオチドを意味する。
【００３４】
「プローブ」は、ＤＮＡの標的部分に結合するように構築及び配置された物質の組成物を意味し、そのように結合されたときに容易に検出され、それによってＤＮＡの標的部分の存在または非存在を示すために用いられ得る。
【００３５】
「パイロシーケンシング」とは、「合成による配列決定」の原理に基づくＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ中のヌクレオチドの順序を決定する）方法を意味する。これは、ジデオキシヌクレオチドによる連鎖停止ではなく、ヌクレオチドの取り込みに対するピロホスフェート放出の検出に依存する点で、サンガー配列決定とは異なる。可能なＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇヌクレオチドの４つのうちの１つだけが添加され、一度に利用可能であるという事実によって、次の相補的ヌクレオチドの取り込み時に放出される光によって、所望のＤＮＡ配列を決定することができ、その結果、一本鎖鋳型（決定すべき配列である）上にただ１つの文字だけを組み込むことができる。代表的な例は、文献Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｈｅｄｓ  Ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｂｙ  Ｍｏｓｔａｆａ  Ｒｏｎａｇｈｉ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：３−１１（２００１）に見出され、それは、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１１／１／３．ｆｕｌｌ．ｈｔｍｌ＃ｒｅｆ−ｌｉｓｔ−１において見出される（２０１３年１２月２３日にアクセスされた）。
【００３６】
「ｑＰＣＲ分析」は、定量的及び／または定性的なポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。
【００３７】
「オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出による配列決定」とは、数億から数千億の小さな配列読み取りを一度に生成する方法を意味する。これは、未知の配列の小さな断片を磁気ビーズに付着させ、次いで浸漬ＰＣＲを行うことによって達成される。代表的な例は、以下のウェブサイトで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｇｔｃ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｏｌｉｄ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｏｖｅｒｖｉｅｗ（２０１３年１２月２３日にアクセスされた）。さらに営業用パンフレット：ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２０１０）参照。
【００３８】
「合成による配列決定」とは、ＤＮＡ配列決定としても知られている一連のＤＮＡ塩基対を決定するために用いられる手法を意味する。この配列決定法は、ＤＮＡ鎖に導入される際の単一塩基の識別を可能にする可逆的な色素ターミネーターに基づく。代表的な例は、以下のウェブサイトで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｎｘｓｅｑ．ｂｉｔｅｓｉｚｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ−ｔｈｅ−ｉｌｌｕｍｉｎａ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｌｍｎ（２０１３年１２月２３日にアクセスされた）。
【００３９】
上記定義または本出願の他の箇所に記載されている説明が、辞書に一般的に用いられている、または本願に参照により組み込まれるソースに述べられている意味（明示的または黙示的）と矛盾する場合、本願及び請求項の項目は特に、一般的な定義、辞書の定義、または参照により組み込まれている定義ではなく、本願の定義または説明に従って解釈されるべきと理解される。上記に照らして、用語が辞書によって解釈される場合にのみ用語が理解できる場合、その用語が、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって定義されている場合、この定義は、請求項の用語がどのように定義されるかを制御する。示されたすべての化学構造はまた、すべての可能な立体異性体の代替物も含む。
【００４０】
本発明の少なくとも１つの実施形態は、多様度指数の変化が水処理システムの生物制御における変化を保証する閾値を決定する方法を対象とする。例えば、米国特許出願第１３／３７４，９４９号、同第１３／５５０，７４８号、及び同第１４／１３８，５２６号に記載されているように、多様度指数は、微生物によって引き起こされる欠陥または問題の可能性を決定するのに有用なツールである。さらに、特定の微生物感染を特定することは、どんな種類の欠陥または問題が生じ得るかを示すのに役立ち得る。多様度指標は、そのような欠陥または問題のプリカーソルである指数の変化の閾値を特定することに依存する。したがって、微生物が問題の主原因であると考えられる閾値を決定する方法には大きな有用性と価値がある。
【００４１】
少なくとも１つの実施形態では、多様度指数の変化が潜在的な将来または現在する問題または欠陥を示すかどうかを決定する方法は、水処理システムに存在する微生物多様度を決定すること、全集団に対する１つ／いくつか／各検出された微生物の存在量を決定すること、全集団の存在量が、微生物が欠陥または問題を引き起こす可能性があることを示すかどうかを決定すること、任意の１つまたはいくつかの微生物の相対的または絶対的存在量が所定の閾値を超えるかどうかを決定すること、ならびに任意に、微生物（複数可）を排除／対処するための生物防除プロトコールまたは手順を策定することを含む。
【００４２】
少なくとも１つの実施形態では、閾値は、分析におけるばらつきだけでなく生産上の問題に関連する存在量のレベルを相関させる、歴史的な微生物及びプロセス効率及び品質データを用いて識別される。この値は、微生物が効率または製品品質に悪影響を及ぼす前により高いレベルの微生物汚染を許容し得るシステムもあるため、プロセスの用途ごとに異なる場合があり得る。少なくとも１つの実施形態では、その後の分析は、処理が、集団を、生産及び品質問題が微生物の増殖が止まることに関連するという保証を提供する所定の閾値未満に減少させたことを確認するために使用される。
【００４３】
上記プロセスの１つ以上のステップを達成するための少なくとも１つの実施形態では、以下の文献のいずれか１つ、いくつかまたはすべてからの１つ以上の方法、組成物、及び装置が用いられる：米国特許出願：第１３／２８９，５４７号、第１３／３７４，９４９号、第１３／５５０，７４８号、第１４／１３８，５２６号、米国特許：第８，６１３，８３７号、第７，０１８，７９３号、第６，８４９，３９５号、第６，０５４，２６７号、米国特許出願公開：第２００２／００３１７７１号、第２０１３／０１８６５８２号、及び国際特許出願：第ＷＯ２００８／０６１１９３  Ａ２号、第ＷＯ２００７／０２４２９５  Ａ２号、第ＷＯ２００４／０４６３７５  Ａ２号、及び第ＷＯ２００４／０４２０８２  Ａ１号。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態では、方法は、全微生物集団に対する糸状性細菌／微生物の量の最大５％から最大９０％以上の上昇を測定するステップを含む。少なくとも１つの実施形態において、方法は、全微生物集団に対する少なくとも１つの生物の量の以下からなるリストから選択される５〜９０％の上昇を測定するステップを含む。スピロジラ、クラドフォラ、ピトフォラ、Ｏ．シフォノクラデス・ピトフォラ・ピトフォラ、ウルビバクター・リトラリス（Ｕｌｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ヴェテリバクター・ウラジオストケンシス、ウィークセラ・ヴィロサ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ）、フコバクター、ゲリバクター、オルニトバクテリウム・リノトラチェーレ（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、リエメレラ・コハムビナ（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ｃｏｈａｍｂｉｎａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム、サイトファガ・サクシカン、ウラジバクター、プフェイフェレラ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒｅｌｌａ）、バチルス・アクアティリス、フレキシバクター・マリナス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）、フラボバクテリウム・オドラタム、ミクロスシーラ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ）、フレキシトリックス（Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ）、カプノサイトファガ、タキソバクター、スポロキトファガ、サプロスピラ、クリソバクテリウム、ヒメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、及びそれらの任意の組み合わせ。少なくとも１つの実施形態において、方法は、全微生物集団に対する少なくとも１つの生物の量の５〜９０％の上昇を測定するステップを含み、該生物は、テキストブックＴｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：Ｖｏｌ  ７：Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｄｅｌｔａ  ａｎｄ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｄｅｅｐｌｙ  Ｒｏｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｙ  Ｄｗｏｒｋｉｎ，  Ｍ．，Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，（２００６）に記載されるまたは言及されるものの１つである。
【００４５】
少なくとも１つの実施形態では、多様度指数の変化は、どのプロセス入力が問題または欠陥の潜在的または実際の原因であるかを識別するために使用される。そのようなプロセス入力には、水源、材料源、及び設備の特定部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、処理水システムは、池の水、海水、湖水、ろ過水、脱塩水、再循環水、廃水、蒸留水、凝縮水、凝縮ボイラー水、冷却水、及びそれらの任意の組み合わせの１つ以上の種類を含むが、これらに限定されない多数の新規及び／または再循環水源を含む。さらに、処理システムは、１つ以上の原材料または部分的に処理された材料をそれに導入することができる。また時々、装置またはパイプ／フローラインの１つ以上の部分は、所与の操作において使用されているもしくは使用されておらず、またはその特定の表面は処理対象と接触しているもしくは接触していないことがある。特定の問題が、生物がこれらのプロセス入力のうちの１つまたはいくつかのみから生じた結果である場合、それらのプロセス入力が使用されているとき、または処理を標的とする及び／もしくは汚染された入力に追加の処理を加えるときには、生物防除処理のみを使用することが効率的である。さらに、問題生物の多くが実際に欠陥または問題を引き起こすように蓄積／繁殖するまで待機するのではなく、閾値を超えた場合に生物防除を実施する方がより効率的である。
【００４６】
少なくとも１つの実施形態では、データを使用した多様度指数の一部または全部を測定する方法は、以下の１つ以上を使用する。連鎖停止配列決定、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡに基づく分析、イオントレント半導体配列決定、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、質量分析、ＰＣＲ分析、パイロシーケンシング、ｑＰＣＲ分析、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出による配列決定、合成による配列決定、１つ以上の微生物に関連する抗体の測定、１つ以上の微生物に関連するホルモンの測定、１つ以上の微生物に関連する分泌物の測定、１つ以上の微生物に関連するタンパク質の測定、１つ以上の微生物に関連する有機分子の測定、１つ以上の微生物に関連する分子の測定、蛍光ファージ、細胞選別機、ならびにそれらの任意の組み合わせ。
【００４７】
少なくとも１つの実施形態では、処理水システムは、限定されないが、製紙、冷却水、ボイラー水、食品製造、飲料製造、鉱石処理、アルミナ処理、バイオディーゼル製造、蒸留、石油化学精製、石油化学合成、ポリマー合成、プラスチック製造、排水処理、ランドリー、ウエアウォッシング、水処理、固液分離、及びそれらの任意の組み合わせの１つ以上の処理段階であり得る。
【００４８】
少なくとも１つの実施形態では、方法は、製造システムから採取された様々なサンプル中の微生物の検出に適用することができる。これらのサンプルには、装置の表面、水または液体サンプル、及び／またはプロセスの中間製品または最終段階製品の全部または部分断片上の堆積物が含まれる。それは、製品サンプルまたは製品サンプル全体の欠陥を分析することができる。
【００４９】
少なくとも１つの実施形態では、製造プロセスの中間製品または最終製品に位置する微生物に対して高感度かつ迅速な検出方法が提供される。方法は、サンプル抽出物中に存在する物質の分析を含む。これらのサンプルは、高度に乾燥されていてもよく、汚染微生物の生きたサンプルをほとんどまたは全く含まなくてもよい。ＤＮＡ分析を利用するいくつかの従来技術の方法には、微生物の存在または非存在を決定するためのプローブを利用したｉｎ  ｓｉｔｕ方法を記載したＷＯ２００５／０４２０８２が含まれる。しかしながら、ｉｎ  ｓｉｔｕ法は、サンプル採取時に乾燥するので、紙シートまたはフェルトには適用できない。ｉｎ  ｓｉｔｕ法はまた、微生物の細胞分裂の間にプローブを適用することを含み、これは紙シートまたはフェルト上ではほとんどまたはもはや生きていない生物を有する紙シートまたはフェルト上では不可能である。少なくとも１つの実施形態において、ＤＮＡに基づく分析は、プローブの使用を含む。
【００５０】
少なくとも１つの実施形態において、ＤＮＡに基づく分析は、微生物の存在または非存在を検出するためのＰＣＲプライマーの使用を含む。米国特許第５，９２８，８７５号は、胞子形成細菌の存在または非存在を検出するためのＰＣＲプライマーの使用を記載している。少なくとも１つの実施形態では、プライマーは、生物の群の中で高度に保存されているＤＮＡ鎖の一部に向けられている。結果として、ＤＮＡのその特定の部分の存在を検出することは、特定の生物の存在の決定的証拠である。ＰＣＲ分析は、その汚染微生物を正確に識別することが困難であるため、サンプルを分析するのに特に有用である。なぜなら、それらが伝統的なメッキ法またはＡＴＰ測定においては実行可能な生物を欠くからである。
【００５１】
少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、ｔｈｅ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｂｙ  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３９，ｐｐ．４８７−４９１（１９８８）に記載の１つ以上の方法を利用することを含む。少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、ｔｈｅ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｖｉａ  ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  ｂｙ  Ｋａｒｙ  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５５，ｐｐ．３３５−３５０（１９８７）に記載の１つ以上の方法を利用することを含む。
【００５２】
少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、Ｔｒａｄｅ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ  ｑＰＣＲ  ｇｕｉｄｅ，ｐｒｅｆａｃｅｄ  ｂｙ  Ｊｏ  Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ、（以下のウェブサイトからダウンロードされるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅ−ｂｒｏｗｓｅｒ．ｈｔｍｌ  ｏｎ  Ｊａｎｕａｒｙ  １９，２０１２）に記載のｑＰＣＲ分析である。少なくとも１つの実施形態では、この方法は定量的ｑＰＣＲ分析である。少なくとも１つの実施形態では、この方法は定性的ｑＰＣＲ分析である。
【００５３】
少なくとも１つの実施形態に示されるように、ＤＮＡが、市販されているＤＮＡ抽出キットのいずれかを用いてサンプルから一度抽出されると、定量的ＰＣＲアプローチのようなＰＣＲアプローチを用いてリアルタイムで分析することができる。定量的ＰＣＲは、ＰＣＲと同じ方法論を利用するが、リアルタイム定量的成分を含む。この技術では、特定の遺伝子の生物または機能の同一性に基づいて目的のＤＮＡ配列を標的化するためにプライマーが使用される。得られたＤＮＡまたは「ＤＮＡアンプリコン」を検出するために、蛍光のような検出のいくつかの形態を使用することができる。蛍光の変化は、標的ＤＮＡの量の変化に正比例する。所定の蛍光閾値に達するのに必要なサイクル数を、特定のＤＮＡ標的に対応する標準と比較する。標準は、典型的には、いくつかのログにまたがる濃度で純粋で既知の量の標的遺伝子である。サンプル中に存在する標的ＤＮＡのコピー数は、標準曲線を用いて計算される。次いで、サンプル当たりのコピー数を使用して、サンプルあたりの細胞数を決定する。
【００５４】
少なくとも１つの実施形態では、全細菌を定量するための保存的アプローチを用いて細菌からのＤＮＡ配列を標的とするプライマーセットが使用される。少なくとも１つの実施形態では、メイオテルマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、シュードキサントモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、及びデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む一次バイオフィルム形成細菌を標的とするプライマーセットが使用される。少なくとも１つの実施形態では、細菌のスフィンゴモナス科に属する適応性バイオフィルム形成体を標的化するためにプライマーセットが使用される。少なくとも１つの実施形態では、適応性バイオフィルム形成体は、他のバイオフィルム及びプランクトン性微生物と比較して、酸化剤系生物防除プログラムに対してより高い耐性を示した。少なくとも１つの実施形態において、プライマーは、真菌及び細菌の感染を区別するために使用される。
【００５５】
少なくとも１つの実施形態では、処理システムは、シャワー流に出入りする材料と、生きたサンプルを容易に得ることができる様々な微生物を含有する液溜めとを含む。しかしながら、プロセスシステムは時々、限定されないが、湿潤状態と乾燥状態との間の移行のような変化を含む動的環境であり、空気と液体の迅速な通過を含み、ｐＨ温度、塩分、光、レオロジー、粘度、疎水性、ハイドロ・フェリシティ、及び形状／配向（例えば、曲げ、屈曲、圧延など）、ならびにそれらの任意の組み合わせにおける急激な変化を含む。結果として、プロセス流の所定の点でサンプルに生息する生物の集団は、水源またはシャワー流及び液状流域などの適用装置内に存在する集団とは異なる場合がある。その結果、シャワー流及び液溜めの典型的な分析は、サンプル中にどの微生物が存在するのかを正確には特定しない。しかし、これらの環境に生息することができることが知られている生物の種類を考慮したサンプルの分析は、サンプルの汚染を本当に正確に分析することを可能にする。
【００５６】
少なくとも１つの実施形態では、この方法は、ドメインレベルなどのカテゴリーレベルで微生物を区別することを含む。生物的生命は、３つのドメイン、古細菌、バクテリア、及び真核生物のうちの１つによって分類され得る。同様に、方法は、生物界のレベルのカテゴリーで微生物を区別することを含む。生物的生命は、５つの界によって分類され得る：モネラ、プロテスタント、植物、動物、及び真菌。これらの異なるカテゴリーの生物は非常に異なるＤＮＡを有し、これらの区別の１つで生物のＤＮＡを特定することに焦点を当てたプロトコールは、より具体的な決定よりもはるかに単純である。サンプルでは、カテゴリーからの生物はしばしば異なって最もよく扱われるため、そのような単純な形式の識別を使用して、特定の汚染物質に最も適した特定のレジメンを正確に特定することができる。
【００５７】
少なくとも１つの実施形態では、２つ以上の一意的に認識可能なヌクレオチド配列を有する生物を同定するために２つ以上のプライマーが使用される。少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析を用いて、特定の生物に特有のまたはほぼ特有の酵素に関連するゲノム配列を検出する。
【００５８】
少なくとも１つの実施形態では、方法は、欠陥を検出し、次いで、欠陥の原因を適切に関連付けるためにＰＣＲ分析を利用することを含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は、欠陥が完全に生物学的に基づく、完全に非生物化学的に基づく、または非生物化学的、機械的及び生物学的に基づく供給源の組み合わせから生じたものであるかどうかを決定する。
【００５９】
少なくとも１つの実施形態では、サンプル中の欠陥は、穴、穴の少なくとも一部の周囲に変色したハローを有する穴、変色の筋、点、半透明の点、及びそれらの任意の組み合わせの１つ以上である。
【００６０】
少なくとも１つの実施形態では、閾値レベルは、偽陽性を考慮しないために使用される方法論である。時には、ＰＣＲ分析は存在するが特定の欠陥の原因ではない微量の微生物を検出する。少なくとも１つの実施形態では、方法は、１つ以上の特定の生物について知られている所定のレベルよりも低い濃度で検出された任意の生物の存在を考慮しないことを含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は、（欠陥の）グラム当たり１０４細胞未満のレベルで検出された任意の生物の存在を考慮しないことを含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は、ｍｌ当たり１０４細胞未満のレベルで検出された任意の生物の存在を考慮しないことを含む。
【００６１】
少なくとも１つの実施形態では、分析の結果は、１つ以上の殺生物性組成物が水処理システム中の１つ以上の場所にどのくらい、どのような種類で、どのくらいの頻度で添加されるかを決定することによって、生物防除プログラムを補強するために使用される。
【００６２】
少なくとも１つの実施形態では、方法は、従来技術の方法によって検出されないであろう微生物を検出することができる。例えば、汚染物質が嫌気性または硫酸塩還元生物の蔓延によって引き起こされる場合、ＯＲＰ検出などの方法は、汚染源を生物的なものとして正確に識別しないので、抗菌的アプローチではなく化学物質の適用を間違って示唆する。しかし、ＤＮＡアプローチを利用すると、すべての生命にＤＮＡが含まれているため、常に生物的蔓延を正確に示す。
【００６３】
少なくとも１つの実施形態では、微生物多様度を評価するための方法が使用される。方法は、サンプル抽出物中の核酸の分析に基づき得る。より具体的には、それは、限定されないが、細菌；スフィンゴモナス種；エリスロバクター種；シュードモナス種；バークホルデリア種；ハリスコノバクター種；サプロスピラ種；シュヘンデレラ種；レプトストリックス種；スファエロチラス・ナタンス；バチルス種；アノキシバチラス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）種；シトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）−フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）−バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）門のメンバー；ヘルペトシフォン（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）を含む緑色の非硫黄細菌、メイオテルマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）種を含むデイノコッカス・サーマス門のメンバー；カタラーゼ産生細菌、アミラーゼ生産菌、ウレアーゼ生産菌、真菌などのような全生物の検出のためのｑＰＣＲのようなＰＣＲを利用する。これらの技術は、保存された配列に基づいて標的生物の検出及び定量を可能にするプライマー及び標準物質のペアを利用する。プライマーは、進化によって高度に保存されている微生物ゲノム中の領域を標的とする一方、特定の門または属用のプライマーは、ゲノムのより多くの可変領域を標的とする。
【００６４】
サンプル中に存在する目的の生物を正確に定量することができることにより、その生物をサンプル中の全細菌負荷のパーセンテージとして表現することが可能になる。多数の生物を検出することができれば、サンプル中の微生物集団の多様度のスナップショットを決定することができる。このスナップショットは多様度指数と呼ばれる。多様度指数は、いくつかの標的生物の相対存在量として定量的に表すこともできる。プロセスの任意の部分の多様度指数は、機械やプロセスが正常に稼働しているときに測定でき、そしてベースラインを作成する。機械またはプロセスの性能が悪いときに測定された多様度指数は、微生物集団の変動を探し、どの細菌群がプロセスの問題の原因であるかを決定するために、ベースラインと比較することができる。多様度指数は、サンプル位置間またはベースラインに対するモニタリングデータを比較するために、シャノン多様度指数計算を用いて比較を容易にするために定量化することもできる。治療戦略と供給ポイントは、問題に対処するためにそれに応じて変更することができる。
【００６５】
ＤＮＡの定量化に基づく多様度指数は、生存能力とは無関係に、プロセス中の生物の存在及び多様度を測定する。リボ核酸（ＲＮＡ）、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、生存生物によってのみ産生される分子であり、標的に依存して、特定の門または細菌の属に特有の特性を有する。上記の生物に特有のｍＲＮＡ配列を増幅することにより、どの細菌がそれらの生存可能な形態で存在するかを決定することが可能になる。生存生物の正確な検出は、処理水の処理戦略の有効性を評価するためのツールとして使用できる。これは、多様度指数と生存率指数との比較によって達成することができる。
【００６６】
この方法は、プロセスサンプル中に存在する生存細菌の量及びタイプを定量化する。定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応法は、メッセンジャーリボソーム核酸（ｍＲＮＡ）を検出するために適用することができる。ｍＲＮＡは、リボソームに送られて、翻訳として知られるプロセスでタンパク質合成の青写真となる翻訳されたＤＮＡである。ｍＲＮＡは、生存細胞によってのみ産生される。市販のキットを使用して、生存細胞からのＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの検出には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応における余分なステップが必要である。ｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写するために、逆転写酵素を反応カクテルに添加する。この実験には２組のプライマーが必要である。第１のものは特異的ｍＲＮＡを標的とし、第２のものは逆転写酵素反応によって産生されて得られたｃＤＮＡを増幅するために使用される。
【実施例】
【００６７】
上記は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、例示のために提示されており、本発明の範囲を限定するものではない特に、実施例は、本発明に先立つ原理の代表例を示し、これらの原理は、これらの実施例に列挙された特定の条件に厳密に限定されない。結果として、本発明は本明細書に記載された実施例への様々な変更及び改変を含み、そのような変更及び改変は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくかつその意図する利点を消失することなくなされ得ることを理解すべきである。したがって、そのような変更及び修正は添付の特許請求の範囲によってカバーされることが意図される。
【００６８】
閾値決定の例
コーティングされていないフリーシート工場は、その製紙機の１つでフェルト透過性の問題を抱えていた。この工場における機械のうちの１つに対するフェルト織物の浸透度は、他の２つの機械よりも著しく大きな割合で減少した。この問題を解決するためのすべての化学的手段が使い尽くされ、工場は可能性のある問題として微生物汚染に目を向け始めた。しかし、工場の生物防除プログラムは、細菌数が少なく、ＡＴＰ測定値が低く、機械表面に粘液付着がないためうまく機能していると認識されていた。
【００６９】
この問題を解決するために、ｑＰＣＲを用いて影響を受けていない機械からのフェルトサンプルを、問題を抱えている機械からのものと比較した（図１）。両方のフェルトに同じ量の全細菌（約１０７細胞／ｇ）が含まれていたが、問題のあるフェルトには単一の生物群、すなわち適応性バイオフィルム形成体が優勢である細菌集団が存在していたことが即座に明らかとなった。これらの細菌は、他のフェルトに少量存在していた。
【００７０】
フェルトで繁殖している優勢な細菌集団が発見された後、フェルト洗浄薬品が変更された。織物はその後の停止期間中に再分析された。適応性バイオフィルム形成菌集団は、全集団の２５％に減少し、全体の細菌負荷は変化しないことが観察された（図２）。
【００７１】
これらのデータに基づいて、適応性バイオフィルム形成体に対して良好な有効性を有することが示されている第２の化学物質を、フェルト洗浄プロトコールに加えた。この第２の化学物質調整の後、フェルトは停止期間中に再分析された。ＤＮＡの結果から、全細菌負荷は変化しないままであり、適応性バイオフィルム形成体は全集団の約１０％に減少したことが示された（図２）。新しい化学物質の組み合わせは、今後４ヶ月間装置上で実施することができた。この数ヶ月の間に、適応性バイオフィルム形成集団は、この機械上のフェルト織物から除去された。この群の細菌を排除することにより、フェルトの脱水効率が向上し、生地の寿命が４日間延長された（図３）。
【００７２】
本発明は多くの異なる形態で実施することができるが、ここでは本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に記載する。本開示は、本発明の原理の単なる例示であり、本発明を図示の特定の実施形態に限定することを意図したものではない。本明細書で言及したすべての特許、特許出願、科学論文、及び他の参照された材料は、その全体が参考として援用される。さらに、本発明は、本明細書に記載され、及び／または本明細書に組み込まれた、本明細書に記載の様々な実施形態のいくつかまたはすべての可能な組み合わせを包含する。さらに、本発明は、本明細書に記載され、及び／または本明細書に組み込まれる、本明細書に記載された様々な実施形態のいずれか１つまたはいくつかを特に排除する任意の可能な組み合わせを包含する。
【００７３】
上記の開示は、例示的なものであり、包括的ではないものとする。この説明は、当業者に多くの変形物及び代替物を示唆するであろう。これらの代替物及び変形物はすべて、請求項の範囲内に含まれることが意図されており、用語「含む」は、「含むが、これに限定されない」を意味する。当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態と同等の他の均等物を認識することができ、その均等物も請求項に包含されることを意図する。
【００７４】
本明細書に開示されるすべての範囲及びパラメーターは、その中に包含される任意の及びすべての部分範囲、ならびに終点間のすべての数を包含するものと理解される。例えば、「１〜１０」の記載された範囲は、最小値１と最大値１０との間の（及びそれらを含む）すべての部分範囲を含むと考えられるべきである。すなわち、最小値１以上（例えば、１〜６．１）で始まり、最大値１０以下（例えば、２．３〜９．４、３〜８、４〜７）で終わり、ならびに最終的にその範囲内に含まれる各１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０のそれぞれの数までであるすべての部分範囲である。特に明記しない限り、本明細書のパーセンテージ、比及び割合はすべて重量基準である。
【００７５】
これにより、本発明の好ましい実施形態及び代替実施形態の説明が完了する。当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態と同等の他の均等物を認識することができ、その均等物は添付の請求項に包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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