(57)【要約】免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）関連疾患の予防または処置に使用するワクチンであって、薬学的に許容される担体に結合するペプチドを含み、前記ペプチドが、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１３；ｐ９３３８）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１４；ｐ９０４１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１５；ｐ９０４２）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１６；ｐ９０４３）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１８；ｐ８５９６）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１９；ｐ８５９７）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１２０；ｐ８５９８）、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）からなる群から選択される、ワクチンを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）関連疾患の予防または処置に使用するワクチンであって、薬学的に許容される担体に結合する少なくとも１つのペプチドを含み、前記ペプチドが、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１３；ｐ９３３８）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１４；ｐ９０４１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１５；ｐ９０４２）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１６；ｐ９０４３）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１８；ｐ８５９６）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１９；ｐ８５９７）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１２０；ｐ８５９８）、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）からなる群から選択される、ワクチン。
【請求項２】
ＩｇＥ関連疾患が、（好ましくは、季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫毒、サソリ毒、クモ毒、ラテックスまたはイエダニアレルギーなどの）アレルギー性疾患、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻ポリポーシス、木村病、（接着剤、抗菌薬、芳香剤、毛髪染料、金属、ゴム成分、局所用薬物、ロジン、ワックス、研磨剤、セメントおよび革への）接触皮膚炎、慢性副鼻腔炎、アトピー性湿疹、（好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性じんましんなどの）ＩｇＥ関連自己免疫疾患、コリン性じんましん、マスト細胞症（特に皮膚マスト細胞症）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管性浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー（特に特発性および運動誘発性アナフィラキシー）、免疫療法、好酸球関連疾患（好ましくは、好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎）；リンパ腫、抗酸化処置の感作の副作用、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流、から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
少なくとも１つのシステイン残基が、リンカーとして、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
少なくとも１つのシステイン残基が、リンカーとして、ペプチドのＮ末端に結合する、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
担体がタンパク質担体である、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
タンパク質担体が、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、Ｃｒｍ−１９７、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）からなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ワクチンがアジュバントと共に処方され、好ましくは、担体に結合するペプチドがＡｌｕｍに吸着している、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与で処方される、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ペプチドが、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量で、ワクチンに含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ペプチドが、担体と、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、特に２〜５アミノ酸残基を有するペプチドリンカーによって結合する、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−ＧｌｙおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙからなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
少なくとも２つのペプチドを含み、ワクチンが、（ａ）１以上のＩｇＥペプチドと組み合わされた、請求項１記載の１以上のペプチドまたは、（ｂ）請求項１記載の２以上のペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）およびＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）からなる群から選択されるペプチドならびに、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）からなる群から選択されるペプチドを含み、特に、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）およびＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）を含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
場合により薬学的に許容される担体と結合し、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１３；ｐ９３３８）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１４；ｐ９０４１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１５；ｐ９０４２）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１６；ｐ９０４３）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１８；ｐ８５９６）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１９；ｐ８５９７）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１２０；ｐ８５９８）、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）からなる群から選択される、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物の特許としての、ＩｇＥ介在疾患の処置および予防のための能動ワクチン接種に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＥは、感作個体における微量のアレルゲンに対する即時型過敏性反応を仲介する。アレルギー反応の有効性は、ＩｇＥの局所的な存在、粘膜におけるマスト細胞上の親和性の高いＩｇＥ受容体の上方制御、およびＩｇＥの、その受容体からの例外的に遅い解離に基づく。しかしながら、この非常に珍しい免疫グロブリンのアイソタイプは、「アレルゲン受容体」を構成するだけでなく、寄生虫感染症、腫瘍免疫および自己免疫疾患において、役割を果たす。多様なアレルギー疾患および併存疾患における臨床的な抗ＩｇＥ治験の出現と共に、あらゆる種類のＩｇＥ依存性疾患およびＩｇＥ関連疾患が同定されている（Holgate 2014）。産業化社会において、アレルギーの有病率は現在、１０〜３０％に達する。結果として、ＩｇＥ経路および特にＩｇＥ分子自体を標的とする新規な薬剤の開発に、多大な努力が注がれている。近年、ＩｇＥが、炎症関連疾患およびアレルギー関連疾患（慢性じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患および様々な（自己）免疫介在性疾患を含む）の拡大された領域においても、役割を果たし得る根拠が見つかった（Holgate 2014）。したがって、治療上および予防上のＩｇＥターゲティングは、より多くの疾患における大きな課題として認識されている。結果として、安価で広範囲に適用できる抗ＩｇＥ治療の需要が増加している。
【０００３】
ＩｇＥは、主に、可溶性血漿タンパク質または、（例えば、マスト細胞または好塩基球上の）親和性の高いＩｇＥ受容体、もしくは親和性の低い受容体によって捕捉された、受容体に結合したタンパク質として存在する。あるいは、この分子は、珍しい、ＩｇＥがスイッチした細胞（抗原またはアレルゲン刺激によって、ＩｇＥ産生血漿細胞に最終的に分化する、膜ＩｇＥ陽性Ｂ細胞など）上の、Ｂ細胞受容体（すなわち、ＩｇＥ−ＢＣＲ）として見出される。対応して、受容体に結合したＩｇＥは、エフェクター細胞（例えば、マスト細胞など）上のアレルギー応答を仲介し、一方、ＩｇＥ−ＢＣＲは、共刺激シグナルの存在または非存在にそれぞれ依存して、Ｂ細胞刺激または抑制のいずれかにおいて必要とされる、膜に組み込まれた受容体である。
【０００４】
アレルギーにおいて、可溶性血漿ＩｇＥは、その可変領域を介して、多価アレルゲンを認識し、その定常鎖を介して、ＩｇＥ受容体と結合する。結果として、ＩｇＥ受容体のシグナル伝達は、ＩｇＥ受容体を保有する細胞を介する臓器特異的反応および全身性アレルギー反応を仲介する。したがって、原型の抗ＩｇＥ抗体オマリズマブ（登録商標）による、ＩｇＥ／ＩｇＥ受容体相互作用のブロッキングは、血漿のＩｇＥレベルを効率的に減少させ、それによってアレルギー患者の臨床症状を軽減する（Milgrom 1999）。ＩｇＥ／ＩｇＥ受容体競合を標的とする場合、非常に高い親和性が必要とされる。一方、可溶性型とのＩｇＥ結合を制限し、例えば、望ましくない過敏性のトリガーとなり得る好塩基球およびマスト細胞上に存在する、受容体結合型のＩｇＥとの結合を制限しないように、高い特異性が必要とされる。オマリズマブ（登録商標）の出現と共に、このターゲティングの原理は、重症の、治療抵抗性の喘息の処置における、よく実証された、治療上および商業上成功した治療法となっている。同時に、ＩｇＥターゲティングの分野は、オマリズマブ（登録商標）を用いた、より多くの保険適応外の探索的試験と共に拡大している（Incorvaia 2014）。効力の改善を特徴とし、医薬品の特徴を有する、第二世代の治療用抗ＩｇＥ抗体が、新規なＩｇＥに関連する臨床症状に向けて、急速に進歩することが想定される。
【０００５】
その成功にもかかわらず、オマリズマブ（登録商標）をより広範囲のＩｇＥに関連する症状に適用することを妨げる、いくつかの制限がある。これは、小児科の疾患、食物アレルギー、アレルギー性鼻結膜炎などのより軽度なアレルギーの症状および軽症型アレルギー性喘息における適用、または非常な高ＩｇＥ疾患における他の過剰な適用を含む。治療用抗体の商品の費用は、一般的に高く、例えば、オマリズマブ（登録商標）では、４００〜５００ＩＵ／ｍｌのＩｇＥ血漿レベルを有する７０〜８０ｋｇの患者において、隔週に３７５ｍｇの皮下注射を必要とする。このような投与量のため、この薬剤は、ＩｇＥが非常に高い患者または体重が重く、肥満の患者には承認されず、アレルギー性鼻結膜炎などの広範な疾患において手頃な値段ではない。使用が制限される他の理由は、食物アレルギーなどの特定の疾患における、利点に対する好ましくないリスクの割合、効力もしくは患者のコンプライアンスの欠如、または単純な、喘息患者のサブグループにおける効力の欠如を含む。定義によって、オマリズマブ（登録商標）などの抗可溶性ＩｇＥ抗体の受動的投与は、薬力学的な要求を満たすために、本質的に高い投与量を必要とする。
【０００６】
オマリズマブ（登録商標）の投与計画の改変によって、現在の抗ＩｇＥ治療における投与の制限が著しく緩和し、経済的負担が低下することは想定されない（Lowe et al 2015）。これらの制限のため、受容体／リガンド相互作用ではなく、ＩｇＥの供給に対処する、代替のＩｇＥターゲティング機構が開発され、検証されてきた：
【０００７】
可溶性ＩｇＥとは対照的に、膜型ＩｇＥは、ＩｇＥ−ＢＣＲを示す。この型は、分化した、ＩｇＥがスイッチした細胞において発現する、ＩｇＥ重鎖転写物の３’末端の選択的にスプライシングされた伸長部によって、生成する（Achatz 2008に概説）。選択的なスプライシングは、受容体分子のいわゆる細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）およびそれに続く、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを包含する、４番目の免疫グロブリンドメインのＣ末端に位置する３つのさらなるドメインを含むタンパク質の、伸長したバリアントをコードする。ＩｇＥ−ＥＭＰＤは、ＩｇＥ−ＢＣＲに特有であり、したがってＩｇＥがスイッチしたＢ細胞上にのみ存在する。ＩｇＥ−ＢＣＲを介するシグナル伝達は最終的に、Ｂ細胞のＩｇＥ産生血漿細胞への分化を導き、この細胞は、正のフィードバックループにおけるＩｇＥを介するアレルギー反応を次々に刺激する。
【０００８】
ＢＣＲの架橋がアポトーシスを誘導すること（Benhamou 1990）、およびＩｇＥ産生を抑制するためにＩｇＥ−ＢＣＲを架橋した抗体を適用する場合、類似の概念が、（例えばアレルギーにおける）治療目的に活用され得ること（Chang 1990; Haba 1990）が、従前示されている。この提案に基づいて、可溶性ＩｇＥまたは、（例えばマスト細胞放出反応およびアナフィラキシーのリスクを与える、マスト細胞または好塩基球上に）固定化したＩｇＥと反応しない、膜ＩｇＥの構成要素に対する受動免疫または能動免疫によって、抗体を標的とすることが実行可能なはずである。この概念（Infuhr et al. 2005）のインビトロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)の証明が、様々なモデルにおけるＩｇＥ−ＢＣＲのＥＭＰＤ領域に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、従前与えられた（WO 1998/053843 A1; Chen 2002; Feichtner 2008; Brightbill 2010）。あるいは、膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤに対して免疫化した、マウス由来の免疫血清が、膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤを発現する細胞において、インビトロのアポトーシスおよびＡＤＣＣを促進できることが示され、これによって、この手法を、受動免疫化の代わりに能動免疫化によっても達成し得ることが示唆された（Lin et al. 2012；WO 2004/000217 A2; EP 1 972 640 A1; US 2014/0220042 A1などによって従前提案された）。
【０００９】
ＩｇＥ ＥＭＰＤ領域に対する能動的なワクチン接種によって、ＩｇＥ−ＢＣＲに対処するという概念は、当初においてさらに提案されていた（例えば、US 5,274,075 A, WO 1996/012740 A1およびWO 1998/053843 A1）。初期の考えは、共刺激シグナルの非存在下において、ＩｇＥ−ＢＣＲの架橋が、様々な細胞性機構によってＩｇＥ産生の阻害を最終的に導くということであった（Wu 2014）。さらなる細胞性機構が、ＩｇＥ−ＢＣＲターゲティング戦略の作用におけるインビボでの機序に貢献し得る。これらの機構は、アネルジー（Batista 1996）、アポトーシス（Poggianella 2006）、補体依存性細胞溶解（Chen 2002）または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）（Chen 2010）を含む。結論として、ＩｇＥ ＥＭＰＤターゲティングは、アレルギー疾患において示されるような血漿ＩｇＥを効率的に減少させる（Gauvreau 2014）。可溶性ＩｇＥターゲティング（例えば、オマリズマブ（登録商標）を用いる）とは対照的に、膜ＩｇＥターゲティングは、その受容体を介するエフェクター機能または遊離の血漿ＩｇＥの排除ではなく、ＩｇＥ供給に対処する。
【００１０】
WO 2010/097012 A1は、βリンパ球上のヒトｍ／ｇＥに結合する抗ＣεｍＸ抗体を開示する。WO 2008/116149 A2は、アポトーシス性の抗ＩｇＥ抗体に言及する。WO 69/12740 A1は、アレルギーの処置における、合成されたＩｇＥ膜アンカーペプチドの免役原を開示する。
【００１１】
抗体治療の成功にもかかわらず、受動免疫化の一般的な関心には、抗体または関連する足場などの組換え巨大治療分子を用いた場合の、抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の誘導が残存する。定義によって、抗ＩｇＥ治療は、反復投与を伴う長期の処置を必要とする。同時に、ＡＤＡ誘導のリスクは、大量の組換えタンパク質をより長い処置期間にわたって反復投与しなければならない場合に、特に関連性がある。現在、巨大タンパク質治療に対するＡＤＡ誘導のリスクは、組換えバイオ医薬品が、ヒト血漿と混合すると凝集する傾向がある場合には特に、確実には予測できない。結果として、大規模な臨床治験を必要とし、同時に、抗薬剤抗体（ＡＤＡ）によって生じる問題および現代の生物製剤の免疫原性の原因と結果に対するオープンな議論が、産業からの商業的および戦略的関心によって制限される（Deehan 2015）。一方、Ｔ細胞免疫原性は、厳密な前臨床評価を必要とする（Jawa 2013）。さらに、巨大な生物製剤の商品の費用は、特に、例えばモノクローナル抗体などのバイオ医薬品を、ＩｇＥ経路が発病に貢献する役割を果たす、「軽度の」症状（アレルギー性鼻炎および結膜炎など）または非アレルギー性疾患（例えば、慢性じんましんなど）に適用すべきである場合、公的な医療制度において、課題をもたらし続けている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、全ての種類のＩｇＥ介在性疾患、特に、コストの理由、患者のコンプライアンスまたは組換えバイオ医薬品（ヒト化モノクローナル抗体など）の注入による有害作用のために、受動免疫化で現在処置されない、それらの疾患における、効率的で、費用対効果の高い、安全で長続きする予防または処置計画を提供することである。一方、能動免疫化をこのような計画として選択すると、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の、標的自体に対する反応を、自己免疫様有害作用のリスクを排除するために、回避することが望まれる。この計画は、その疾患に特異的でなければならず、患者の免疫系の正常な免疫学的能力は、薬剤の投与によって妨害されるべきではない。
【００１３】
したがって、本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）関連疾患の予防または処置に使用するワクチンを提供し、このワクチンは、薬学的に許容される担体に結合した、少なくとも１つのペプチドを含み、前記ペプチドは、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１３；ｐ９３３８）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧ（配列番号１１４；ｐ９０４１）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１５；ｐ９０４２）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥ（配列番号１１６；ｐ９０４３）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１８；ｐ８５９６）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１９；ｐ８５９７）、ＨＳＧＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１２０；ｐ８５９８）、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）、およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）（以下、「本発明のペプチド」または「本ペプチド」と呼ぶ）からなる群から選択される。
【００１４】
本発明におけるペプチドを、ＩｇＥ関連疾患の処置および予防において、能動的な抗ＥＭＰＤワクチン接種に用いる。ＩｇＥ関連疾患は、（季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫毒、サソリ毒、クモ毒、ラテックスまたはダストアレルギーなどの）アレルギー性疾患、ペットアレルギー、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリポーシス、木村病、（接着剤、抗菌薬、芳香剤、毛髪染料、金属、ゴム成分、局所用薬物、ロジン、ワックス、研磨剤、セメントおよび革への）接触皮膚炎、慢性副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥが役割を果たす自己免疫疾患（「自己アレルギー」）、慢性（特発性）および自己免疫性じんましん、コリン性じんましん、マスト細胞症（特に皮膚マスト細胞症）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管性浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー（特に特発性および運動誘発性アナフィラキシー）、免疫療法、好酸球関連疾患（好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎など）を含む（例えば、Holgate 2014, US 8,741,294 B2, Usatine 2010参照）。さらに、本発明におけるペプチドを、リンパ腫の処置または、抗酸化処置の感作の副作用、特に胃または十二指腸の潰瘍または逆流の予防に用いる。本発明において、用語「ＩｇＥ関連疾患」は、用語「ＩｇＥ依存性疾患」または「ＩｇＥ介在性疾患」を含み、または同意語として使用する。
【００１５】
したがって、受動的に投与する生物製剤の制限に対して、本発明は、安全な、能動ワクチン接種の手法を提供する。本発明において、抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤ応答を、患者に誘導し、長続きするＩｇＥ抑制を提供する。綿密な(close-meshed)受動免疫化プロトコルとは対照的に、能動免疫化は、より低いコストでのより少ない注入を必要とする。「治療」または「予防」の能動ワクチン接種の手法の利点は、それらの分子サイズおよび抗原性によって、望ましくない抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を誘導し得る、大量の「外来性」組換えタンパク質またはバイオ医薬品の投与を避けるために、身体の自身の液性免疫応答を活用することである。さらに、安全性の前提条件として、抗ＩｇＥ ＥＭＰＤ免疫を液性系に厳密に制限する（すなわち、ワクチンが誘導する抗体）が、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の、ＩｇＥ ＥＭＰＤに対する反応を回避する、ワクチン製剤を必要とする。これに関連して、Ｂ型肝炎コア抗原結合型ペプチドワクチンを、抗膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤが標的とする免疫応答を能動的に誘導するのに使用することが、以前に提案された（Lin 2012）。この能動的な抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤワクチンの提案は、ＩｇＥ−ＥＭＰＤを、ＩｇＥ関連疾患における治療様式としての能動ワクチン接種によって対処する場合に、自己反応性Ｔ細胞における安全性の懸念を考慮しなかった。自己反応性Ｔ細胞の誘導は、例えば、多発性硬化症において、ＥＡＥ動物モデルに実験的な脳炎を意図的に誘導するためにペプチドワクチン接種を用いた場合に、観察できる（Petermann 2011）。ワクチンペプチドによって誘導される、望ましくないＴ細胞反応における別の例は、例えば、アミロイドβ(Abeta)ペプチドを含むＴ細胞エピトープを用いた、中断された臨床ワクチン治験であった（Pride 2008）。現在、（自己抗原としての）ＩｇＥ ＥＭＰＤに対する、可能性のある自己反応性Ｔ細胞応答の高いリスクは、排除できない。したがって、本発明におけるワクチンのような、任意の種類のヘルパーＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、または阻害性Ｔ細胞応答を回避するワクチンは、先行技術の提案と比較して、明らかに有益である：治療用ペプチドワクチンの考えは、望ましくない自己免疫様疾患を生じ得る、制御できない、自己反応性Ｔ細胞を避けるために、任意の「天然の」、「自己」Ｔ細胞エピトープを完全に回避することである。代わりに、所望の標的（ＩｇＥ ＥＭＰＤなど）と効率的に交差反応する抗体を産生する液性免疫応答を効率的に誘導すべきである。
【００１６】
従前提案された抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤ能動ワクチンペプチドおよびタンパク質とは対照的に、本発明のワクチンは、任意の望ましくないＴ細胞エピトープを持たない、より短いペプチドを含む。特に、担体（ＫＬＨまたはＣＲＭなど）またはビロソームと組み合わせて、Ｂ細胞エピトープを高密度で露出する、ＶＬＰまたはポリマーに基づく担体を、Ｔ細胞刺激のために明確なＴ細胞エピトープと組み合わせる。あるいは、リポソーム、ミセル、またはポリマーナノ粒子（特許WO 2007127221に提案されているものなど）を含む、担体部分を含む粒子を用いてもよい。本質的に、それらは、抗原ペプチドの高密度な露出によって、抗ＥＭＰＤ特異的Ｂ細胞応答を誘導できるが、Ｔ細胞のヘルプは、ワクチン製剤（すなわち、本発明のペプチド自体）のＢ細胞エピトープではなく、担体上または担体内に存在するＴ細胞エピトープによってのみ、寄与される。このような好ましい実施態様において（Lin 2012によって提案される、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）とは対照的に）、ペプチドを、組換えＶＬＰタンパク質の一部に組み込む代わりに、不活性なリンカーを介して担体の表面と連結する場合、ＩｇＥに対する、非特異的で、意図しないＴ細胞応答は生じない。さらに、その短いサイズに基づいて、本発明のワクチンペプチドを、本明細書の実施例または膜ＩｇＥ ＥＭＰＤの種々のエピトープを標的とする先行技術の抗体（Chowdhury 2012）において観察されるような、望ましくないオフターゲットの応答を誘導しないように開発した。
【００１７】
結論として、本発明は、抗体を介するエフェクター機能（ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋、ＡＤＣＣおよびＩｇＥ−ＢＣＲを保有する標的細胞におけるアポトーシスなど）を特異的に誘導する、特異的な抗ＩｇＥ ＥＭＰＤワクチンペプチドを提案する。従前提案されたワクチンとは対照的に、本発明は、（１）Ｔ細胞エピトープを持たず、（２）同等の生物活性／細胞活性を維持するが、オフターゲット抗体を誘導するリスクが増加しない、ワクチンペプチドを提供する。
【００１８】
したがって（後述の実施例の項において、広範に示すように）、本発明におけるペプチドは、先行技術において従前提案されたような担体タンパク質を組み込む、または結合する、ペプチドまたは他のＥＭＰＤ由来のタンパク質またはペプチド配列よりも、能動的なＢ細胞ワクチンとして優れている。これらの優れた性質は、実施例の項から明白であり、本発明におけるペプチドの優位性を、先行技術のワクチン候補と比較する（例えば、Lin et al. 2012; WO 2004/000217 A2; EP 1 972 640 A1; US 2014/0220042 A1）。これらの結果は、先行技術の提案が、本発明のペプチドよりも、能動的なＢ細胞ワクチン接種に適合していないことを示す。
【００１９】
例えば、本発明のペプチドは、ＨＬＡクラスＩに結合せず、したがって、ＨＬＡクラスＩに制限された細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導できない。
【００２０】
特に、本発明における１１および１２アミノ酸長のペプチドは（定義によって）、短すぎるため、ＨＬＡクラスＩＩと効率的に結合せず、したがってＨＬＡクラスＩＩに制限されたＴヘルパー応答を通常誘導しない。
【００２１】
本発明のペプチドは免疫原性であり、誘導される抗体は、他のペプチドよりも、膜ＩｇＥ−ＢＣＲ膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤによく結合する。本ペプチドは、従前提案されたペプチド（Lobert, 2013; McIntush, 2013; Ahmed, 2015）とは対照的に、オフターゲット効果および未知の細胞表面タンパク質（例えば、ＰＢＭＣ由来）に非特異的に結合する抗体の誘導に関して、安全である。本発明のペプチドは、細胞のアポトーシスを駆動するために、ＢＣＲを介してシグナル伝達を誘導する、機能的な膜ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋に介在する抗体応答を誘導できる。ＩｇＥ ＥＭＰＤ領域由来の他の短ペプチドと比較して、本ペプチドは、膜ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋において、より効率的であり、かつ先行技術由来の長いペプチドに対して、少なくとも同程度に効率的である。それらの架橋の有効性は、２以上の短ペプチドの組合せによって、増強し得る。
【００２２】
本発明のペプチドは、それらの機能的活性に共に寄与する、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを誘導する可能性がある（他の抗ＥＭＰＤ抗体において以前に示されているように）。
【００２３】
本発明のペプチドは、ＥＭＰＤペプチドに対する親和性を示す抗体を誘導できる。これは、長いペプチドによって生成する抗体よりも、類似の範囲における、膜ＩｇＥ架橋／シグナル誘導に相関する。
【００２４】
本発明のペプチドは、ヒトＥＭＰＤによる内在性ＥＭＰＤ配列の置換を有するトランスジェニックマウス由来のマウス脾細胞からのＩｇＥの分泌を阻害できる。
さらに、本ペプチドは、ヒトＰＢＭＣからのＩｇＥ分泌を阻害できる。
【００２５】
本ペプチドはまた、天然配列と比較して類似または改善した、免疫原性、安全性、特異性、機能的活性を与える、特定のアミノ酸置換を含む、天然配列のペプチドバリアント（「ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（登録商標）」）を含む。例えば、特に、ｐ９３４７（配列番号１０９）などに代表されるような二重アミノ酸置換は、天然配列と比較して、著しく改善した性質を示す。
【００２６】
本発明のペプチド（およびＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（登録商標））によって誘発される抗体は、ヒトＩｇＥ−ＥＭＰＤに対して特異的に作られる。モノクローナル抗体での受動ワクチン接種に対する、能動免疫化の主要な利点は、個人および／または医療制度におけるより低いコスト、レジメン完了後の免疫応答の推定上のより長い持続、および応答のポリクローナルな性質による、抗薬剤抗体の誘発のより低い可能性である。
【００２７】
本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体に結合した膜ＩｇＥ特異的ペプチドから構成される。この担体を、本発明のペプチドに直接連結してもよい。また、ペプチドと担体との間に、特定のリンカー分子を与えることもできる。そのようなリンカーの提供は、ワクチンに有益な性質をもたらし得る（例えば、免疫原性の改善、特異性の改善、または取り扱いの改善（例えば、溶解性または製剤能力の改善による））。好ましい実施態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にリンカーとして結合する、少なくとも１つのシステイン残基を含む。ペプチドの両方の配向（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端に連結したバリアント）が本発明の実施において許容されるが、これらのバリアントの１つが、他のバリアントと比較して有利な効果（例えば、ＨＬＡ結合の性質に関して）を与え得るため、いくつかのペプチドでは、Ｎ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチドのいずれかを用いることが好ましい場合がある。好ましい具体例は、配列番号１〜１４および１７におけるペプチドである。次いで、このシステイン残基を用いて、ペプチドを担体と共有結合（「連結」）させてもよい。
【００２８】
したがって、本発明の好ましいワクチンにおいて、ペプチドをリンカーによって、担体に結合する。リンカーは、薬学的に適し、許容される、任意の共有結合または非共有結合で化学的に連結した部分であり得る。好ましい実施態様において、リンカーは、ペプチドリンカー、特に１〜５アミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。好ましいペプチドリンカーは、ワクチン技術において、適用および／または承認されたリンカーであり；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−ＧｌｙおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどの、システイン残基を含む、またはからなるペプチドリンカーが特に好ましい。あるいは、これらのペプチドリンカーのアミノ酸を、可溶性または担体からのペプチドエピトープの物理的な間隔を保証するために、荷電アミノ酸と置換または組み合わせてもよい。
【００２９】
好ましい他のリンカー部分は、医薬品に既に用いられている（そして、安全であることが公知である）、化学共役分子であり、本発明のペプチドと薬学的に許容される担体との間の有効な連結を保護する。そのようなリンカーはまた、２つの化学的部分の間（本明細書においては、ペプチドと担体との間）に空間的な距離を与える「スペーサー」として、医薬品において、提案され、または使用されるコンジュゲートについて、想定されてきた。例えば、２つの異なる化学的な反応基（担体に特異的な第一の反応基；ペプチドに特異的な第二の反応基）を有する、二重特異性の低分子量（例えば、ＭＷ５００Ｄａ以下、好ましくは３００Ｄａ以下、特に１００Ｄａ以下）分子を、リンカーとして用いてもよい。疎水性相互作用または例えばビオチン／（ストレプト）アビジン系による、ペプチドと担体との結合も可能である。
【００３０】
本発明はまた、（ａ）先行技術における１以上のペプチド候補（例えば、ＩｇＥ関連疾患の予防または処置について、先行技術で提案されたＩｇＥペプチド（またはｍＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチド））と組み合わせた、本発明の１以上のペプチドを含み、または、（ｂ）本発明における２以上のペプチドを含む、ペプチドの組合せを含む。好ましくは、ペプチドの組合せは、ＩｇＥの異なる領域由来の２つのペプチド（例えば、８−１２および／または２２−３２の天然アミノ酸残基、特に、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１０９；ｐ９３４７）、ＱＱＬＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１０；ｐ８５９９）、ＱＱＱＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１１；ｐ８６００）およびＱＱＬＧＬＰＲＡＡＥＧ（配列番号１１２；ｐ８６０１）からなる群から選択されるペプチド、ならびにＩｇＥ分子の別の領域由来のペプチド、特に、ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ（配列番号１２１；ｐ７５８０）、ＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬ（配列番号１２２；ｐ７５７７）、ＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧ（配列番号１１７；ｐ７５７５）およびＷＰＧＰＰＥＬＤＶ（配列番号１２５；ｐ７５８５）からなる群から選択されるペプチド）を含む。したがって、配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または１１６の少なくとも１つ、および配列番号１１７、１２１、１２２または１２５（または、配列番号１１７、１２１、１２２または１２５の１３、１２、１１、１０、９、８、７または６アミノ酸長のフラグメント）を含む組合せ、特に配列番号１０９および１２１を含む組合せ、が特に好ましい。本発明はまた、配列番号１２１の１３、１２、１１、１０、９、８、７または６アミノ酸長を有する、ｐ７５８０（ＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧ；配列番号１２１）のフラグメント単独または、特に本明細書で開示される製剤における、適切なリンカーアミノ酸またはリンカーペプチドおよび担体を有する、本発明の他のペプチドとの組合せを指す。
【００３１】
したがって、本ペプチドは、ＩｇＥワクチンにおける先行技術の提案と比較して、著しく区別される特徴を有し、これによって、本ペプチドは、ワクチン製剤において、担体を取り込み、または担体と結合する、従前提案されたペプチドまたは他のＥＭＰＤ由来のタンパク質もしくはペプチド配列よりも、能動的なＢ細胞ワクチンとして優れている。
【００３２】
本ワクチンは、本発明のペプチドを含み、このペプチドは、薬学的に許容される担体と結合している。本発明において、本発明のペプチドを輸送する任意の適切な担体分子を、この担体が薬学的に許容される限り（すなわち、そのような担体を、そのようなワクチンのヒトレシピエントに投与する医薬品に提供できる限り）、本発明のワクチンに用いてもよい。本発明における好ましい担体は、タンパク質担体、特にキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（プロテインＤ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）である。好ましい担体はまた、非毒性ジフテリア毒素変異体、特にＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７であり（例えば、Uchida, 1973参照）、ＣＲＭ１９７が特に好ましい。
【００３３】
連結したペプチドは、厳密にＢ細胞応答を誘導するが、Ｔ細胞応答は担体タンパク質のみが寄与するため、担体タンパク質は、ＶＬＰ担体などの他の担体と比較して、明確な利点を有する。さらに、ペプチドに結合する担体の密度は、Ｂ細胞の活性化および分化における、効果的なＢＣＲの活性化を与える。これは、ペプチドエピトープを組換えタンパク質に組み込み、Ｂ細胞応答のみを誘導するように必ずしも設計されない、Lin et alによって提案されるＶＬＰに基づくワクチンとは対照的である。ペプチドエピトープの、組換えタンパク質構造への組み込みは、ペプチドを構造的に拘束し、その抗原の性質およびエピトープの露出を変化させ得ることを意味する。したがって、本発明のペプチドを、ワクチンペプチドの構造的柔軟性を保証するために、一方の末端のみにおいて結合することが好ましい。
【００３４】
ＫＬＨまたはＣＲＭなどの従来の担体タンパク質に加えて、２以上の標的（例えば細胞またはこれらの細胞上の受容体；抗原提示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞など）と結合することを介して作用する、現代の足場または細胞ターゲティングの実体も使用できる。薬学的に活性な担体のように、このような実体は、例えば抗原プロセシング、抗原プロセシング、Ｂ細胞またはＴ細胞刺激に関与する、受容体および／または細胞を標的とし、かつ／または刺激することができる。このような（複数の）機能性担体を、免疫学的イベントをトリガーするために、種々のターゲティング部分（例えば、ＡＢ、ｓｃＦｖ、代替の足場（抗体（Weidle 2014）または天然もしくは代替の足場（Weidle 2013）に基づく、二重および多特異性タンパク質または融合タンパク質など）または血液型抗原、糖、ウイルスおよびその部分または受容体リガンド（特徴的な官能基（２以上の種々の型のドメイン、リガンドまたは受容体など）と結合できる、ＣＤ４０Ｌなど））を介する、ＤＣターゲティングを用いる、融合タンパク質または多特異性(poly-specific)実体（Kreutz, 2013などに例示される）として提供できる。例えば、Liu et al, 2014は、リンパ節ターゲティングの目的において、親油性アルブミン結合実体を用いている。あるいは、Silva et al. 2013は、ＤＣの対処におけるナノ粒子の使用を示した。
【００３５】
本発明におけるワクチンは、ヒト個体に適用するのに適切なワクチン製剤またはワクチン組成物である（この点において、用語「ワクチン」、「ワクチン組成物」および「ワクチン製剤」は、本明細書において互換的に用いられ、これらは、アジュバントと組み合わせた、薬学的に許容される担体に結合する、本発明のペプチドを含む医薬品を特定する）。
【００３６】
好ましい実施態様において、本発明のワクチンは、アジュバントと共に処方され、好ましくは、キャリアに結合するペプチドはＡｌｕｍに吸着している。
【００３７】
本発明のワクチンは、好ましくは、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与、特に皮下または皮内投与で、処方される。
【００３８】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、本発明のペプチドを、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量で、含む。本発明のワクチンを、任意の適切な適用方法（例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口的、皮下、経皮的、皮内など）で、任意の適切な送達デバイスで、投与してもよい(O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735)。したがって、本発明のワクチンは、好ましくは、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与において処方される（例えば、"Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004参照）。
【００３９】
本発明のワクチンは、医薬組成物において、本発明のペプチドを、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量、あるいは、例えば１００ｆｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、好ましくは１０ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ、特に１００ｐｍｏｌ〜１００ｎｍｏｌの量で、含む。典型的に、ワクチンはまた、緩衝液、安定剤などの、補助物質を含み得る。
【００４０】
典型的に、本発明のワクチン組成物はまた、例えば緩衝液、安定剤などの、補助物質を含み得る。好ましくは、そのような補助物質（例えば、水、緩衝液および／または安定剤などの、薬学的に許容された賦形剤）を、０．１〜９９％（重量）、より好ましくは５〜８０％（重量）、特に１０〜７０％（重量）で含む。考え得る投与レジメンは、約１〜１２月間の、毎週、隔週、４週毎（毎月）または隔月の処置を含む；しかしながら、他のワクチンにおいて既に示唆されている他の方法に加えて、２〜５回、特に３〜４回の、初期の（１月または２月以内の）ワクチン投与後、６〜１２月または何年か後の追加のワクチン接種が好ましい。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチンにおけるペプチドを、免疫化毎に０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．５〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇの量で、個体に投与する。好ましい実施態様において、これらの量は、本発明のワクチン組成物中に存在する全てのペプチドの量を指す。別の好ましい実施態様において、これらの量は、組成物中に存在する単一のペプチド毎の量を指す。言うまでもなく、様々な異なるペプチドが異なる量または等量で存在する、ワクチンを提供できる。しかしながら、本発明のペプチドを、代替の方法として、体重１ｋｇ当たり０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜３００μｇの量（１回の投与量）で、個体に投与してもよい。
【００４２】
担体物質と組み合わせ、１つの剤形を生成し得るペプチドの量は、処置されるホストおよび投与の特定の方法に依存して、様々である。組成物の投与量は、個体の病態、年齢、性別および体重などの要素、ならびに個体に所望の応答を誘発させる抗体の能力に従って、様々であり得る。投与計画を調整し、最適な治療応答を提供できる。例えば、分割量を、毎日数回投与してもよく、または投与量を、治療状態の緊急性に応じて減少させてもよい。ワクチンの投与量はまた、状況に依存して、最適な予防投与の応答を与えるように、様々であってよい。例えば、本発明のワクチンを、本発明の組成物の投与によって誘導される抗体のレベルに常に依存して、数日間、１もしくは２週間、または数月もしくは数年の間隔で、個体に投与してもよい。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチン組成物を、２ないし１０回、好ましくは２ないし７回、さらにより好ましくは５回以下、最も好ましくは４回以下で、適用する。この免疫化の回数は、基本免疫化(basic immunization)をもたらし得る。特に好ましい実施態様において、次のワクチン接種との間の時間間隔を、２週間〜５年、好ましくは１月〜３年以内、より好ましくは２月〜１．５年の間で選択する。代表的なワクチン接種の計画は、６〜８週間に渡り、かつ６月以内の３〜４回の初期のワクチン接種を含んでもよい。その後、ワクチン接種を２〜１０年毎に繰り返してもよい。本発明のワクチンの反復投与は、治療用ワクチンの最終的な効果を最大化し得る。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチンは少なくとも１つのアジュバントと共に処方される。
「アジュバント」は、抗原の免疫応答を増強する化合物または混合物である（すなわち、本発明におけるＡＦＦＩＴＯＰＥ（登録商標））。アジュバントは、主に送達システム、もしくは主に免疫調節剤として働き、またはその両方の強力な特徴を有する。適切なアジュバントは、ヒトを含む哺乳類における使用に適したアジュバントを含む。
【００４５】
本発明の特に好ましい実施態様において、本明細書で定義されるワクチン組成物に使用する少なくとも１つのアジュバントは、自然免疫系を刺激できる。
【００４６】
自然免疫応答は、細胞表面のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および細胞内のＮｏｄ−ＬＲＲタンパク質（ＮＬＲ）を介し、それぞれＤ１領域およびＤ０領域を介する。自然免疫応答は、ＴＬＲ活性化に対するサイトカイン産生ならびに特定のＮＬＲ（Ｉｐａｆを含む）に対するカスパーゼ１の活性化およびＩＬ−１βの分泌を含む。この応答は、特定の抗原に依存しないが、抗原特異的な適応免疫応答のためのアジュバントとして働き得る。
【００４７】
多数の異なるＴＬＲが特徴付けられてきた。これらのＴＬＲは、異なるリガンドに結合し、活性型となり、これらは同様に、異なる生物または構造体に位置している。特定のＴＬＲにおいて応答を誘発できる、免疫賦活化合物の開発が、当分野で興味の対象となっている。例えば、US 4,666,886は、ＴＬＲ２アゴニストである、特定のリポペプチド分子を記述する。WO 2009/118296、WO 2008/005555、WO 2009/111337およびWO 2009/067081はそれぞれ、ＴＬＲ７の小分子アゴニストの種類を記述する。WO 2007/040840およびWO 2010/014913は、疾患の処置のためのＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストを記述する。これらの様々な化合物は、小分子免疫賦活化合物（ＳＭＩＰ）を含む。
【００４８】
自然免疫系を刺激できる少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、好ましくは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９アゴニスト、特に好ましくはＴＬＲ４アゴニストを含み、または、からなる。
【００４９】
Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストは、当分野でよく知られている。例えば、ＴＬＲ２アゴニストは、Ｐａｍ３ＣｙｓＳｅｒＬｙｓ４、ペプチドグリカン（Ｐｐｇ）、ＰａｍＣｙｓであり、ＴＬＲ３アゴニストはＩＰＨ ３１ＸＸであり、ＴＬＲ４アゴニストは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、Ｅ６０２０、ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−６０１、ＣＲＸ−６７５、５Ｄ２４．Ｄ４、ＲＣ−５２７であり、ＴＬＲ７アゴニストは、イミキモド、３Ｍ−００３、アルダラ、８５２Ａ、Ｒ８５０、Ｒ８４８、ＣＬ０９７であり、ＴＬＲ８アゴニストは３Ｍ−００２であり、ＴＬＲ９アゴニストは、フラジェリン、Vaxlmmune、ＣｐＧ ＯＤＮ（ＡＶＥ０６７５、ＨＹＢ２０９３）、ＣＹＴ００５−１５ ＡｌｌＱｂＧ１０、ｄＳＬＩＭである。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様において、ＴＬＲアゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、ポリＩ：Ｃ、ＧＬＡ、フラジェリン、Ｒ８４８、イミキモド、およびＣｐＧからなる群から選択される。
【００５１】
本発明の組成物はＭＰＬを含んでもよい。ＭＰＬは、合成的に生成するＭＰＬまたは天然資源から得られるＭＰＬであってよい。言うまでもなく、本発明の組成物に、化学的に修飾したＭＰＬを添加することもできる。そのようなＭＰＬの例は、当分野で公知である。
【００５２】
本発明のさらに好ましい実施態様において、少なくとも１つのアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１、油中水エマルジョンおよびリポソームを含む、または、からなる。
【００５３】
少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、ＭＦ５９、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群から選択される。
【００５４】
ヒトに使用できる公知の適切な送達システム型アジュバントの例は、限定されないが、Ａｌｕｍ（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタナイド(Montanide)などの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子またはナノ粒子、を含む。
【００５５】
ヒトに使用できる公知の適切な免疫調節型アジュバントの例は、限定されないが、アクイラの樹木(Aquilla tree)の樹皮由来のサポニン抽出物（ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ）、ＴＬＲ４アゴニスト（ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ−ＡＱなど）、ＬＴ／ＣＴ変異体、およびサイトカイン（種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）またはＧＭ−ＣＳＦなど）など、を含む。
【００５６】
ヒトに使用できる、送達の特徴および免疫調節の特徴の両方を有する、公知の適切な免疫調節型アジュバントの例は、限定されないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Sjoelander et al.(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO06/134423およびWO07/026,190参照）または、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲ４アゴニストなど）と水中油エマルジョンの組合せである、ＧＬＡ−ＥＭを含む。
【００５７】
本発明のワクチン組成物の有効性を増強するさらなる代表的なアジュバントは、限定されないが：（１）水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁の構成要素などの、他の特異的な免疫刺激剤を含む、または含まない）、例えば（ａ）ＳＡＦ（１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック(pluronic-blocked)ポリマーＬ１２１、およびサブミクロンのエマルジョンにマイクロ流動化(microfluidize)したｔｈｒ−ＭＤＰまたはボルテックスし、より大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるｔｈｒ−ＭＤＰのいずれか、を含む）、および（ｂ）ＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ribi Immunochem、Hamilton、Mont.）（２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１以上の細菌細胞壁の構成要素（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））など）を含む）など；（２）サポニンアジュバント（ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）(Cambridge Bioscience、Worcester、Mass.)、Abisco（登録商標）(Isconova、Sweden)、またはIscomatrix（登録商標）(Commonwealth Serum Laboratories、Australia)など）、これらを用いてもよく、またはＩＳＣＯＭ（免役刺激複合体）などから生成した粒子でもよく、ここでＩＳＣＯＭＳはさらなる界面活性剤を含まなくてもよい（例えばWO00/07621）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（WO99/44636）など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの、サイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、GB-2220221、EP-A-0689454参照）、ここで肺炎球菌サッカライドと共に用いる際は、場合により、実質的にＡｌｕｍを含まず（例えばWO00/56358参照）；（６）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231参照）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えばWO99/52549参照）；（８）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノールとの組合せ(WO01/21207)、またはポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤と、オクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤との組合せ(WO01/21152)；（９）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）(WO00/62800)；（１０）免疫賦活剤および金属塩の粒子（例えばWO00/23105参照）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えばWO99/11241）；
（１２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えばWO98/57659）；（１３）これらの組成物の効果を増強する免疫賦活剤として作用する他の物質、を含む。ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５ アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン(N-25 acetyl-normnuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine)（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）など、を含む。
【００５８】
本発明の特に好ましい組成物は、アジュバントとして、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、水中油エマルジョン、ならびにＴｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、リポソームおよび／またはサポニン含有アジュバントを含む。本発明の組成物はまた、アジュバントとして、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、水酸化アルミニウムを含んでもよい。
本発明を、以下の実施例および図によってさらに説明するが、本発明がそれらによって限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】ヒトＩｇＥ−ＢＣＲ ＥＭＰＤ領域の２２番目から始まる、１２アミノ酸以下の長さを有する、ワクチンペプチドは、例えば、従前提案された、能動的抗膜ＩｇＥ ＥＭＰＤワクチンからの隣接するＥＭＰＤ由来のペプチドよりも、低いＨＬＡクラスＩ結合の予測のスコアを示す。
【００６０】
【図１Ｂ】図１Ａの予測における候補ペプチドを集め、ＲＥＶＥＡＬ（登録商標） ＨＬＡクラスＩ−ペプチド結合アッセイを用いて分析し、それらのＨＬＡ分子内への取り込みレベルを決定した。
【００６１】
【図２Ａ】注入した全てのペプチドは免疫原性である。
【図２Ｂ】それらの免疫原性とは対照的に、全ての免疫血清が、ＨＥＫ細胞上に発現した膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤを認識したわけではない。
【図２Ｃ】ワクチンで誘導した抗体による、細胞表面上の膜ＩｇＥ−ＢＣＲ認識は、少数のペプチドワクチンに限られる。
【００６２】
【図３】本発明のペプチドは、ＩｇＥ ＥＭＰＤ特異的抗体を誘導し、これは、従前提案された能動ワクチンとは対照的に、ヒトＰＢＭＣとの非特異的なオフターゲット結合を示さない。
【００６３】
【図４Ａ】ＥＭＰＤとの特異的な結合によって、ＩｇＥ−ＢＣＲと架橋できる抗体を誘導する、短い免疫化ペプチドの同定。
【００６４】
【図４Ｂ】ヒトＥＭＰＤの中型および大型のフラグメントを含む、先行技術の免役原と、類似のＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性を有する、抗ＥＭＰＤ抗体を誘導するワクチンペプチドの同定。
【００６５】
【図５】ワクチンで誘導された抗体のオフレート(off-rate)は、ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性と相関する。本発明の短ペプチド（ｐ９３４７、ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１、ｐ９０４１、ｐ９０４２、ｐ９０４３など）は、長い、および中程度のサイズの先行技術由来のペプチド（ｐ８４９２、ｐ８４９４およびｐ８４９５）と類似した、結合の性質を達成する。
【００６６】
【図６】免疫原性が、または機能的に等価である、ｐ９３４７のバリアントペプチド。
【００６７】
【図７Ａ】本発明の短ペプチドでのトランスジェニックマウスの免疫化は、インビボでの全ＩｇＥレベルを減少させる。
【図７Ｂ】本発明の短ペプチドでのトランスジェニックマウスの免疫化は、インビボでのオボアルブミン特異的なＩｇＥレベルを減少させる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６８】
実施例１：ヒトＩｇＥ ＥＭＰＤ領域由来のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの同定。
ヒト膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤ由来のいくつかのペプチドは、独立したＨＬＡ結合アルゴリズムによって予測されるように、一般的な共通のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に、潜在的に結合し得る（図１Ａ）。これはまた、能動的な抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤワクチン接種における、以前に公開されたペプチド（例えば、Lin et al. 2012およびUS 2014/0220042 A1からのｐＰＡ−９において以前に公開された、配列の１つ、およびEP 1 972 640 A1からのペプチドtopEMPD-2）を含む。これらの特定のペプチドが、膜ＩｇＥを発現する細胞によってどの程度生成し、次いで細胞表面上のＨＬＡクラスＩ分子によってどの程度提示されるかということは、正確に予測できないため、これらのペプチドは、上述のような望ましくないＴ細胞応答の誘導のリスクを提起し得る。したがって、ＨＬＡクラスＩと結合することが予測された（図１Ａ）、以前に公開された１３種のペプチドのうち、６種のペプチドを、図１Ｂにおいて示されるように、インビトロでのＨＬＡ分子との結合について、確認した。対照的に、本発明の、新規に設計された数種のペプチド（ｐ９３４７−２からｐ９３４７−４、ｐ８５９９−２からｐ８５９９−４、ｐ８６００−１およびｐ８６００−２を含む）は、図１Ｂに記載されるように、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と結合せず、したがって、これらの対立遺伝子において、膜ＩｇＥ−ＥＭＰＤを発現するＢ細胞に対する、望ましくないＴ細胞応答を誘導しない。
【００６９】
１１アミノ酸長および１２アミノ酸長が、ＨＬＡクラスＩＩに結合する通常の物質の下限であるため、本発明の短ペプチドによるＨＬＡクラスＩＩ結合の可能性は低い（Hemmer et al 2000）。
【００７０】
図１Ａは、予測の感度および特異度の改善を得るために、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Rammensee et al 1999）、ｎｅｔＭＨＣ（Lundegaard et al 2008）、ＰＲＥＤＥＰ（Schueler-Furman et al. 2000）について、それぞれＳ、ＮおよびＰの文字で示される、多様な結合予測アルゴリズムで分析した、７種の関連するＨＬＡクラスＩ対立遺伝子における予測スコアを示す。
【００７１】
この組合せの評価は、（群１）ＥＭＰＤ領域全体由来の、最良のＨＬＡ結合候補（トップＥＭＰＤペプチド）、（群２）Lin et al 2012およびUS 2014/0220042 A1による、ｐＰＡ−９由来のフラグメント、ｐＰＡ−９配列を含むヒトＥＭＰＤ由来のＶＬＰワクチン（先行技術Ｉペプチド）、ならびに（群３）Lin et al 2012による、ＶＬＰワクチンに使用する、ｐ８４９５配列由来のフラグメント、およびWO 1996/012740 A1のｐＰＡ−１（先行技術ＩＩペプチド）、本発明のワクチンペプチドと比較する場合に、（群４）本発明の請求項のペプチド（ｐ９３４７、ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１、ｐ９３３８、ｐ９０４１およびｐ９０４２を含む）由来のフラグメント、の明白な区別を可能にする。（示された予測方法における）各カラムの上位２つに位置する、ＨＬＡクラスＩ結合スコアを灰色で強調し、長いペプチドを有する以前に提案された能動ワクチン（群（１）〜（３）参照）と、短ペプチドを有する本発明のペプチド（群（４）参照）との間の差異を指摘し、本発明のペプチドは有意に低いリスクを示す。ペプチドｔｏｐＥＭＰＤ−２は、特許EP 1 972 640 A1の請求項の配列（ペプチドｐＰＡ−１３）の一部である。
【００７２】
ＨＬＡクラスＩ分子との結合を、公知のＴ細胞エピトープ／正の基準のペプチド（１００％として定義）と比較した。テストした対立遺伝子を各列に記載し、各行のテストしたペプチドを図のようにグループ化した。さらに、ｐ７５７７、ｐ７５８０およびｐ７５７５配列に由来する３種のペプチド（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって、最も高いスコアが予測された）それぞれを、上述のいくつかのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子における、インビトロのプールとして、テストした。ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の公知のＴ細胞エピトープ（Lauer 2004）において観察された値（６７．５％）以上の値を「結合ペプチド」と考え、強調した。いくつかの組合せでは、決定されず、「ｎ．ｄ．」と表示した。
結果として、本発明の請求項のワクチンペプチドは、図１Ｂに示されるように、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合しない。
【表１−１】
2018522885.tif 000002
【表１−２】
2018522885.tif 000003
【表１−３】
2018522885.tif 000004
【００７３】
表１：示されるように、本特許出願のペプチド、配列および使用／目的の起源を示す、組み込まれたペプチドおよび配列の表。配列前の「Ｃ−」または配列後の「−Ｃ」は、ペプチドが担体に結合するのに必要なシステインが、元のタンパク質配列の一部ではないことを示し、配列前後の「Ｃ」は、天然に存在するシステインを示す（グリシン−グリシン−システインリンカー（「−ｇｇＣ」、「Ｃｇｇ−」）または他のリンカーにおいて、同様に適用する）；Ｃ結合ペプチドと追加のＣを含まないペプチドにおけるペプチド名（「ｐＸＸＸＸ」）は、コア配列が同一であるため、同一である。
【００７４】
実施例２：ペプチドワクチンが誘導した免疫血清の免疫原性および標的接触性
ペプチドｐ７５７７、ｐ７５８０およびｐ７５７５は、ラモス(Ramos)細胞上で、最も高いＭＦＩ比を与えるが、それらの力価は、図２Ａで示される他のペプチドの１つと同程度（またはそれ未満）である。したがって、意外にも、ペプチドｐ７５７７、ｐ７５８０およびｐ７５７５ならびにその後の誘導体（ｐ９３４７、ｐ８５９９、ｐ８６００およびｐ８６０１）は、担体タンパク質に基づくペプチドワクチンにおける最も適した候補である。
【００７５】
抗ヒトＥＭＰＤペプチドワクチン（アジュバントとしてＡｌｕｍを混合した、ＫＬＭまたはＣＲＭを含む、ペプチド−担体コンジュゲートから構成される）の隔週での４回の注入後に取り出した、マウス血漿を、ＢＳＡと結合した、注入したペプチドに対する力価を決定するため、標準的なＥＬＩＳＡ法でテストした。力価を、４つのパラメータでのカーブフィッティングを用いて、それらの希釈物のＥＣ５０によって計算し、力価は主に、１０＾４〜１０＾５（ｙ軸上の灰色の区間）の値を示す。各点は、一匹の動物での力価を示し、横線は、ｘ軸に示されるペプチドで免疫化した各動物群の幾何平均を示す。まとめると、全ヒトＥＭＰＤ配列ならびに１個および２個のアミノ酸交換（ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１）を包含する、テストした全てのペプチドは、マウスにおいて免疫原性であり、したがって、能動的な抗ＥＭＰＤワクチン接種における免疫原の可能性があるとみなされる。図２Ａに示されるように、注入した全てのペプチドは免疫原性である。
【００７６】
図２Ａと同様の免疫血清を、免疫化に用いたペプチド（図２Ａに示されるペプチド）と同様のペプチドを用いる、ポリクローナル抗体の親和性精製に用い、ＨＥＫ ｗｔ（バックグラウンドの信号）またはＨＥＫ−Ｃ２Ｃ４（特異的な信号）を発現する細胞における力価依存的な染色を可能とした。これらの集団の染色強度（ＭＦＩ）から、特異度の指標（ＳＩ）を、材料と方法において後述される式に従って計算し、ｙ軸上にプロットした。より高いＳＩは、標的結合のより高い特異度を反映し（右側の、陽性対照であるｍＡＢ抗ＩｇＥ Ｌｅ２７およびＢＳＷ１７など）、１付近のＳＩは、ＨＥＫ−ｗｔ細胞およびＨＥＫ−Ｃ２Ｃ４細胞が、特異的な標的相互作用（ｙ軸の「特異度の閾値」として表される）の非存在を、同等によく示すと認識されることを示す（例えば、マウスＩｇＧ対照、右から３、４および５番目の試料など）。強いバックグラウンドの信号を示す、ＨＥＫ ｗｔ細胞に、０．２のＳＩ値を与えた。各点は、一匹の動物から親和性精製した抗体または対照ＡＢを示し、横線は、ｘ軸上に示されるペプチドで免疫化した各群の平均を示す。注目すべきことに、全ての注入したペプチドは類似の免疫原性である（図２Ａ）が、細胞状況におけるＥＭＰＤの種々の区間の接触可能性は、わずかな領域（例えば、ｐ７５８０およびｐ７５７５またはｐ７５７２、ｐ７５９３およびｐ７５８５など）に制限される（図２Ｂ）。この予想外の特徴を、「天然」型のＩｇＥ ＥＭＰＤの代替(surrogate)を発現する細胞モデル、すなわち、図２Ｃで示されるような、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β存在下において、さらに確認した。
【００７７】
図２Ｂと同様の試料を、力価非依存的な、所定の親和性精製した抗体濃度（２５μｇ／ｍｌ）を用いる、ＥＭＰＤにおける膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４−陰性または膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４−陽性ラモス細胞の染色に用いた。ｙ軸における染色強度の比を、膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４発現細胞における染色強度（ＭＦＩ）を、誘導していない細胞由来の、膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４陰性のバックグラウンドの信号で割ることによって、計算する。１付近または１未満のＭＦＩ比（「特異度の閾値」として標識される、ｙ軸上の点線）は、標的の非特異的な染色を反映する。負の対照（「非一次抗体」から始まる、右の試料ブロック）および陽性対照（「抗ＩｇＥ（Ｌｅ２７）」から始まる、右の試料ブロック）はそれぞれ、約１または約５のＭＦＩ比を示す。１より高いＭＦＩ比は、特異的な細胞表面の信号を示す（例えば、陽性対照ｍＡＢ 抗ＩｇＥ Ｌｅ２７およびＢＳＷ１７など；パネルの右側）。
【００７８】
ＨＥＫ細胞とは異なり、ラモス細胞は、Ｉｇ αおよびＩｇ βに結合する内在性ＢＣＲを発現するため、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βなしの場合よりも、より天然な構造的状況における、特定のＥＭＰＤエピトープの接触可能性を反映する。ペプチドｐ７５７２、ｐ７５９３およびｐ７５８５によって包含される領域は、Ｉｇ αおよびＩｇ βの発現によって遮蔽または負の影響を受けることが、Chen et al, 2010によって、従前記述されており、したがって、これらのアクセサリータンパク質を発現しないＨＥＫ細胞における信号とは対照的に、ラモス細胞では認識されない。各点は一匹の動物を示し、線はｘ軸上に示されるペプチドで免疫化した各群の平均を示す（対照ＡＢでは、各記号は、独立した生物学的反復を示す。）。
【００７９】
実施例３：本発明の請求項のペプチドは、ヒトＰＢＭＣとオフターゲット結合する免疫血清を誘導しない。
広く発現するタンパク質（ＡＲＡＰ３、ｐＰＡ−３）とのオフターゲット結合を、ｐ７５７０（図２）またはｐＰＡ−４（Chowdhuy et al, 2012）の領域における、ヒトＥＭＰＤの領域を標的とするｍＡＢによって、観察してきた。したがって、本ワクチンペプチドを、これらのｍＡＢと類似するオフターゲットな免疫応答を誘導するリスクについて、評価する必要がある。
【００８０】
ＫＬＨ／ペプチドワクチンで免疫化したマウスの、同様の免疫血清および抗体生成は、図２Ｂおよび図２Ｃと同様である。これらを、細胞表面抗原との、望ましくないオフターゲット結合について、テストした。容易に接触可能な、血漿に露出したヒト細胞の代替として、２体の健常なドナー由来のＰＢＭＣを、フローサイトメトリーの染色に用いた（ｙ軸上に示すＰＢＭＣ結合（ＭＦＩ））。ＩｇＥ−ＢＣＲ陽性のＢ細胞は、末梢血において辛うじて検出できるため、このような分析における通常のＦＡＣＳの検出限界を下回る（Davies et al 2013）。試料の中央の３つの群に示されるように（ｘ軸上に示される、利用可能な免疫血清）、テストしたｐ７５７５由来の全ての免疫血清からのＰＢＭＣ結合の信号は、バックグラウンドのレベルのままであったが、大きなペプチド由来の免疫血清（左のブロック「ｐ８４９２、ｐ８４９４、ｐ８４９５」参照）は、不明確な細胞表面の抗原との非特異的なオフターゲット結合を反映する、明確な正の信号を生じた。４本のバーの各群は、パネル内の種々の網掛けのバーによって示されるように、それぞれ、３体の健常なドナーのＰＢＭＣ由来のＢ細胞および非Ｂ細胞に対する、ある血漿試料でのオフターゲット測定を表す。明るい灰色のバーは、Ｂ２２０陽性Ｂ細胞との非特異的な結合を反映し、暗い灰色のバーは、Ｂ２２０陰性細胞とのオフターゲット結合を反映する（すなわち、ＰＢＭＣ中の非Ｂ細胞）。染色の陽性対照に用いた、アイソタイプ対照および抗ヒトＨＬＡ−ＤＲを、右に示す。
【００８１】
図３に示すように、本発明のペプチドは、以前に提案された能動ワクチン（Lin et al 2012またはUS 2014/0220042 A1によって提案された能動ワクチンなど）とは対照的に、ヒトＰＢＭＣとの非特異的なオフターゲット結合を示さない、ＩｇＥ ＥＭＰＤ特異的な抗体を誘導する。
【００８２】
実施例４：請求項のワクチンペプチドのＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性
図２Ｂおよび図２Ｃと同様の抗体、免疫血清および親和性精製物を、それらのＩｇＥ ＥＭＰＤ特異度およびＩｇＥ−ＢＣＲに架橋する能力において、事前に選択した。抗体による機能的なＩｇＥ−ＢＣＲ架橋の代替として、（実施例２Ｃのような）膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４発現ラモス細胞を、テスト抗体または対照抗体と共にインキュベートし、対照ＩｇＧ（１００％に設定）に対する相対的なＥｄＵ取り込み（ｙ軸上にプロット）によって測定されるように、機能的な増殖阻害について測定した。パネルの右側に示されるように、ラモス細胞において内因的に発現するＢＣＲとの抗ＩｇＭ結合を、ＢＣＲ架橋による増殖阻害の陽性対照として用いた。各点は、一匹の動物由来の、親和性精製した抗ＥＭＰＤまたは対照抗体の相対的な増殖阻害活性を（％において）示す（抗ＩｇＭの場合、各記号は独立した生物学的反復を示す）。横線は、ｘ軸の各ペプチド名によって示される、ワクチン接種した各動物群からの平均架橋活性を表す。結果として、ペプチドｐ７５７５が、他のＥＭＰＤワクチンペプチドと比較して、最も高い架橋活性を有することがわかった。
【００８３】
任意のＴ細胞エピトープを持たないワクチンペプチドを提供するため、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを含み得る、長いペプチド（例えば、＞２０ＡＡ）の代わりに、短いペプチド（例えば、＜１２〜１５ＡＡの範囲）を使用する必要がある。しかしながら同時に、免疫化ペプチドの短縮化が、効率的なＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性を維持する抗体応答を生じるか否かは明らかでない。図４Ｂにおけるこの目的のため、図２Ｂ、図２Ｃおよび図３Ｂにおける、短ペプチドで誘導された免疫血清を、それらがＩｇＥ−ＢＣＲと架橋する能力について（ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４を発現するラモス細胞において示されるように）、スクリーニングした。機能性の読み出しにおける代替として、相対的な増殖阻害活性を、図４Ａに示されるように表し、ｙ軸上にプロットした。ヒトＥＭＰＤを認識し、架橋するヒト化ｍＡＢである、キリズマブ（Quilizumab）を、さらなる陽性対照として用いた。意外にも、本発明由来の短い１１アミノ酸長（ｐ９３３８、ｐ９０４１、ｐ９０４２、ｐ９０４３）および１２アミノ酸長（ｐ９３４７、ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１）のペプチドは、そのＴ細胞エピトープのために、ワクチン接種に適さない、以前に公開された大きなペプチド（先行技術由来のペプチドｐ８４９２、ｐ８４９４およびｐ８４９５に例示される）と、同等の架橋活性を生じる免疫血清を誘導する。したがって、本発明の短ペプチドは、それらのサイズの減少にも関わらず、ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋抗体の誘導を可能にするのに十分なエピトープ情報を含む。図４Ａと同様に、記号、ペプチドおよび対照をｘ軸上に示す。
【００８４】
図４Ｃにおいて、複数のＥＭＰＤペプチドでのワクチン接種における相乗効果をテストするため、ウサギの一方の側腹部にｐ９３４７、および他方の側腹部にｐ７５８０を、同時に注入した。抗体を、図４Ａおよび図４Ｂのように、精製し、架橋活性についてテストした。誘導された抗体による、機能的なＩｇＥ ＢＣＲ架橋における代替として、（実施例４Ａおよび４Ｂのように）膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４発現ラモス細胞を、テスト抗体または対照抗体と共にインキュベートし、対照血清ＩｇＧ（１００％に設定）に対する相対的なＥｄＵ取り込み（ｙ軸上にプロット）によって測定されるように、機能的な増殖阻害について測定した。単一のエピトープに対して作られた、想定される抗体は、中間の架橋活性を示したが、それらの組合せは、（単一のエピトープと等量の全濃度で）予想外の相乗効果をもたらす。抗ＩｇＭ抗体（ラモス細胞における内因的に発現したＢＣＲに結合）および抗ＦＬＡＧ抗体（誘導されたＩｇＥ Ｃ２Ｃ４タンパク質上のＦＬＡＧタグと結合）を、陽性対照として用いた。図４Ａと同様に、記号、ペプチドおよび対照をｘ軸上に示す。
【００８５】
結果として、ＥＭＰＤの２つの異なる領域に対して免疫化することによって、一匹の動物において誘導された抗体を組み合わせることで、得られた架橋効果は、単一のエピトープのみの場合よりも、強い増殖阻害の相乗作用を与える。
【００８６】
図４Ａは、ＥＭＰＤに特異的に結合することによってＩｇＥ−ＢＣＲと架橋できる、抗体を誘導する、短い免疫化ペプチドの同定を要約する。図４Ｂは、ヒトＥＭＰＤの中程度および大きなサイズのフラグメントを含む、先行技術の免役原と、類似のＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性を有する抗ＥＭＰＤ抗体を誘導するワクチンペプチドの同定を示す。図４Ｃは、ワクチン接種における異なるエピトープの組合せでの、相乗効果を示す。
【００８７】
実施例５：架橋活性とヒトＥＭＰＤに対する親和性との間の相関
（図２、図４Ａおよび図４Ｂのように）ＫＬＨペプチドワクチンで誘導した免疫血清を、５ Ｃ末端アミノ酸以外のヒトＥＭＰＤの領域全体を包含するペプチド（ｐ９２６７）に対するそれらのオフレートについて、表面プラズモン共鳴によって分析した。計算されたオフレート（１／ｓにおける；ｘ軸上に示す）は、親和性の１つのパラメータを規定する。ラモス細胞における機能的なＩｇＥ−ＢＣＲ架橋（図４における増殖阻害活性で反映されるような）をｙ軸上にプロットする。結果として、短いワクチンペプチド（最も好ましくは、本発明におけるｐ９３４７（＊）、ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１、ｐ９３３８（＊）、ｐ９０４１、ｐ９０４２、ｐ９０４３、およびｐ７５７５、ｐ８５９６、ｐ８５９７など）は、オフレートと機能的なＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性の良い相関（ピアソンｒ＝−０．４７２５；ｐ値（両側）＜０．０００１；Ｒ２＝０．２２３２）を示す抗体を誘導する。
【００８８】
図５は、ワクチンで誘導した抗体のオフレートが、ＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性と相関することを示す。本発明の短ペプチド（ｐ９３４７、ｐ８５９９、ｐ８６００、ｐ８６０１、ｐ９３３８、ｐ９０４１、ｐ９０４２、ｐ９０４３など）は、長いサイズおよび中程度のサイズの先行技術由来のペプチド（ｐ８４９２、ｐ８４９４およびｐ８４９５）と、類似した結合の性質を達成する。
【００８９】
実施例６：請求項のペプチドの改変
実施例６において、マウスを、ペプチドｐ８５９９および、規定した同一の位置（四角で囲まれた、元々「Ｑ」の位置）において単一のアミノ酸交換を含む、類似したペプチドで免疫化した。交換を、アミノ酸の物理化学的性質に基づいて行った。個々のバリアントの免疫原性を比較するため、免疫血清を、注入したペプチド（灰色の点）に対する力価（ＥＣ５０）について、ＥＬＩＳＡで分析し、ｙ軸上にプロットした。誘導した免疫血清の、元のペプチドとの交差反応性（ＥＣ５０）を、黒の三角形でプロットする。各記号は、一匹の動物由来の、ｐ９３４７の元の配列または注入したペプチドに対する力価を表し、横線は、ｘ軸上に示す各交換を有するペプチドで免疫化した各動物群からの幾何平均を示す。
【００９０】
意外にも、ｘ軸上（＊）に示されるアミノ酸置換は、物理化学または他の任意のパラメータで予測できない様式で、元の配列（ｐ９３４７）で達成できる免疫応答を維持またはさらに改善した。同様に、ペプチドｐ８６００およびｐ８６０１（実施例２、４、５および６）での結合および架橋のデータは、ｐ９３４７の最後から２番目の位置を、ＧからＥにさらに置換でき、それによって、ｐ８６０１に示されるように、二重置換においても、完全な機能性を維持することを示す。
【００９１】
実施例７：動物モデルにおける、インビボでのＩｇＥ抑制の証明
（図２のように）ｐ９３４７ワクチンで免疫化したマウスから得た、親和性精製した抗血清の受動的な投与は、図８Ａおよび図８Ｂにそれぞれ示すように、全ＩｇＥおよびオボアルブミン（Ｏｖａ）特異的なＩｇＥを抑制する。ＩｇＥを誘導するため、マウスをＯｖａ(Sigma)で３回処理（ワクチン接種プロトコルの２、１５および２３日目）した。血漿を２７日目に取り出し、全マウスＩｇＥおよびＯｖａ特異的マウスＩｇＥを、ｙ軸上に示すように、ＥＬＩＳＡ(Biolegend and Cayman Chemical, respectively)で定量化した。抗体のインビボでの機能的活性を、内在性マウスＩｇＥ−ＥＭＰＤをコードするエクソンを、Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドにおけるＺｎｆ戦略を用いて、ヒト相同配列（長いバリアント；配列番号１２６に帰属：ＧＬＡＧＧＳＡＱＳＱＲＡＰＤＲＶＬＣＨＳＧＱＱＱＧＬＰＲＡＡＧＧＳＶＰＨＰＲＣＨＣＧＡＧＲＡＤＷＰＧＰＰＥＬＤＶＣＶＥＥＡＥＧＥＡ）に置換した、新たに作製したホモ接合ＩｇＥ−ｈｕＥＭＰＤノックインマウスモデルに、毎週、受動的に導入することによって、テストした。スクランブルした対照ペプチド（「スクランブルした」と呼ぶ；ｐ９５５３：ＣＬＡＧＱＧＲＱＰＱＧＡ；配列番号１２７に帰属）およびモノクローナル対照抗体ｍＡＢ ＩｇＧ２ａ（アイソタイプ対照；Biolegend）ならびに正の基準としてのｍＡＢ ４７Ｈ４（ＥＰ２１３２２３０Ｂ１、ＵＳ８６３２７７５Ｂ２およびＵＳ２００９００１０９２４；キリズマブ（登録商標）のマウス原型）を、対照の目的で用いた。各点は、一匹の動物由来のＩｇＥレベルを示す。横線は、ｘ軸上の各ペプチド名（またはｍＡＢ）で示される、ワクチン接種した各動物群からの平均ＩｇＥレベルを示す。結果として、ｐ９３４７特異的抗血清の受動的な導入は、全ＩｇＥ（図８Ａ）およびＯｖａ特異的ＩｇＥ（図８Ｂ）を減少させる。これらのデータは、本発明におけるペプチドｐ９３４７に基づくワクチンで誘導される、抗体が、どのように、アレルゲン特異的なＩｇＥの代替としての、インビボでの全ＩｇＥを阻害でき、Ｏｖａに誘導されたＩｇＥを抑制できるかについての、例を与える。
【００９２】
材料と方法
実施例１−材料と方法：
図１Ａ：合理的なＨＬＡ結合予測の感度を得るため、２つまたは３つの、最も明確なＭＨＣ結合予測の方法を、３つのオンライン予測プログラム（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）；ｎｅｔＭＨＣ（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetMHC/）；ＰＲＥＤＥＰ（http://margalit.huji.ac.il/Teppred/ mhc-bind/index.html））を用いて適用し、これらはそれぞれ、モチーフマトリックス、ＡＮＮ回帰およびスレッディング(threading)を含む、異なるアルゴリズムに基づく。これは、図１Ａに示されるワクチンペプチド由来の、潜在的に共通のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに結合する、９アミノ酸長のペプチドの同定を可能にした。感度の戦略を与えるため、ＨＬＡに結合するペプチドの同定について、任意のプログラムにおける最も高い予測を有するペプチドを、さらに残りのプログラムで分析した。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ予測は、０（結合なし）〜３６（最大の結合）の範囲のスコアとして与えられる。ｎｅｔＭＨＣは親和性を（ｎＭにおいて）評価し、０〜５０ｎＭは強い結合物質と考えられ、弱い結合物質の閾値のスコアは５００ｎＭである。ＰＲＥＤＥＰは、「エネルギースコア」（最低値＝最大の結合）を計算する。テストしたいくつかの対立遺伝子に置いて、ＰＲＥＤＥＰは、所定のペプチド長における結合を予測できず、したがって、次のより短いペプチド長において用いた。
【００９３】
図１Ｂ：ＨＬＡ結合の生化学的な確認のため、インビトロ結合アッセイを適用した。高スループットなＰｒｏＩｍｍｕｎｅ ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）結合アッセイは、各候補ペプチドが１以上のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＨＬＡ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する（Schwabe et al 2008）。テストペプチドの結合と、高親和性の基準Ｔ細胞エピトープの結合を比較することによって、タンパク質配列における、最も可能性の高い免疫原性ペプチドを同定できる。検出は、天然の立体構造のＭＨＣ−ペプチド複合体の存在または非存在に基づく。計画の明細書に従って、図１Ａからの候補ペプチドを、図１Ａに示される対立遺伝子と共に集め、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣペプチド結合アッセイを用いて分析し、ＭＨＣ分子への取り込みのレベルを決定した。ＭＨＣ分子との結合を、非常に強い結合の性質を有する、公知のＴ細胞エピトープ（陽性対照ペプチド）と比較した。各ＭＨＣ−ペプチド複合体における、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）結合スコアを、関連する陽性対照の結合との比較によって、計算した。公知のＴ細胞エピトープ（ＨＣＶ Ｅ１ ２０７−２１４を用いた（Lauer 2004））のスコアと同等以上のスコアを有するペプチドを、免疫学的に重要で、または良い結合物質としてさらなる調査が必要であり得る、ペプチドとみなす。実験の標準誤差を、３回の陽性対照での結合実験によって得た。この対照における標準誤差を、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣペプチド結合アッセイにおいて得ることができる、誤差の程度の例示として、以下に報告する。
【００９４】
２組目の実験において、所定の３種のペプチドの等モル混合物のプールを、示されている、図１からの特定の対立遺伝子および、さらにＡ＊０１：０１、Ａ＊２４：０２、Ａ＊２９：０２、Ｂ＊０８：０１、Ｂ＊１４：０１、Ｂ＊４０：０１における結合について、テストした。
【００９５】
実施例２−材料と方法：
ＥＬＩＳＡプロトコルを、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートで行い、これを、１０ｍＭの適切なペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（ＧＭＢＳ（Applichem）を含む、ウシＢＳＡ（Sigma））で被覆し、ＰＢＳで希釈し、次いで、ＰＢＳ中において１％ＢＳＡで１時間、室温でブロックし、４℃で一晩振盪した。血漿希釈物を、ウェルに添加し、１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で段階希釈し、ＲＴで１時間振盪しながらインキュベートし、次いで、１ｘＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。検出のために、ビオチン化した抗マウスＩｇＧ１（Ｈ＋Ｌ）（Southern Biotech、１：２０００希釈）を、ＲＴで１時間、振盪しながら添加し、１ｘＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。その後、ストレプトアビジンと結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Roche、０．１Ｕ／ｍｌ）を、３７℃で３０分間添加した。可視化のために、１ｘＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、基質ＡＢＴＳ（BioChemica, AppliChem）を添加した。振盪しながらＲＴで３０分間インキュベートした後、反応を１％ＳＤＳで止めた。４０５ｎｍでの吸光度を、マイクロウェルプレートリーダー(Sunrise, Tecan, Switzerland)で測定した。グラフパッド（プリズム）を用いて、４つのパラメータでのカーブフィッティングを用いる非線形回帰分析によって、ペプチド力価と呼ばれる、ＥＣ５０を計算した。
【００９６】
ワクチン接種プロトコル：ペプチドを、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成法（EMC microcollections GmbH、＞９５％の純度）で、合成し、いくつかはＮ末端またはＣ末端に、結合のためのシステインを（必要な場合に）有する。ペプチドを、Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ、Applichem）を用いて、担体タンパク質キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Biosyn GmbHまたはSigma Aldrich）またはＣ反応性組換えＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異タンパク質（前臨床用ＣＲＭ、PFEnex, San Diego）と結合した。ペプチド−担体コンジュゲートを、アジュバントとしての水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ、Brenntag）に吸着させた。ワクチンの投与は、３０μｇのペプチドプラス０．１％Ａｌｕｍを含んでいた。８〜１２週齢の野生型のメスＢａｌｂ／ｃ(Janvier, St. Berthevin)に、側腹部の皮下（ｓ．ｃ．）において、隔週の間隔で４回注入した。血漿を、最後の注入の２週間後に取り出した。
【００９７】
膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４ヒトＥＭＰＤ細胞モデル：ヒトバーキットリンパ腫由来のラモス細胞（Ｒａｍｏｓ−ＥＲＨＢ、ＥＣＡＣＣ番号８５０３０８０４）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＣＳ、抗生物質中で、５％ＣＯ２／３７℃で培養した。Ｎ末端ＦＬＡＧタグ、次いでＩｇＥ重定常鎖(heavy constant chain)（２〜４ドメイン）、次いでヒトＩｇＥ−ＢＣＲのヒトＥＭＰＤ、ＴＭおよびＩＣ領域を含む、膜ＩｇＥ−Ｃ２Ｃ４のＴＥＴ誘導性発現を、遺伝子合成によって構築し、ＴＥＴ誘導性発現ベクター中にクローン化し、適切なレギュレーターコンストラクトと共に、ラモス細胞中に安定に導入した。得られた細胞系は、誘導性ＩｇＥ−ＢＣＲモデルを発現し、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βの存在下において、細胞表面上の天然ヒトＥＭＰＤの露出におけるモデルを提供し、膜ＩｇＥ架橋および細胞内シグナル伝達の評価を可能にする。膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４発現を、５００μｇ／ｍｌドキシサイクリン(Clontech)の一晩の添加によって誘導し、これは本文のあらゆる箇所で「Ｃ２Ｃ４」と呼ばれる。対照的に、誘導しない細胞（「ｗｔ」と呼ばれる）は、膜ＩｇＥ Ｃ２Ｃ４を発現しない。さらに、ＨＥＫ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞、Invitrogen）を、振盪Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地(Gibro)において、３７℃で培養した。安定なＨＥＫ−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ膜ＩｇＥ−Ｃ２Ｃ４発現細胞のクローンを、誘導性ラモス細胞における同一のコンストラクトを駆動する、ＣＭＶ駆動型哺乳類発現ベクターを用いて、作製した。
【００９８】
血漿由来のポリクローナルＡＢの親和性精製：染色および架橋実験において、ペプチドワクチンで誘導した抗体を、注入したペプチドと磁性ビーズとのシステインを介する結合によって（１ ｍのヨードアセチル活性化ＢｃＭａｇ、Bioclone）、製造者の指針に従って、マウス／ウサギ血漿から親和性精製し、次いで、５０μｌマウス血漿を、ＲＴで２時間、一定の撹拌下でインキュベートした。結合後、ビーズを８回洗浄し、次いで、ｐＨ１．９の０．２Ｍグリシン、０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９で中和した。最後に、溶出した抗体を、Ｓｐｉｎ−Ｘｒ ＵＦ５００(Millipore)カラムを用いて、濃縮し、ＰＢＳ中に再バッファーリングし、４℃で保存した。タンパク質含量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００(Thermo Scientific)で定量化した。
【００９９】
フローサイトメトリーにおける細胞染色ならびに「特異度の指標」およびＭＦＩ比の決定：ＨＥＫ−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ｗｔおよびＨＥＫ−膜ＩｇＥ−Ｃ２Ｃ４細胞を、２５μｇ／ｍｌの親和性精製した抗体で染色し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ヤギ−ａ−マウスＩｇＧ−ビオチン（１：５００、Southern Biotech）およびＳｔｒｅｐ−ＰＥ（１：４０、RDSystems）でインキュベートした。Ｃ２Ｃ４細胞を、ウサギ ａ−ＦＬＡＧ（Sigma ９μｇ／ｍｌ）およびＰｅｒＣＰヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）２（２．５μｇ／ｍｌ、Jackson Immuno Research）で、同時に染色した。
【０１００】
特異度の指標（ＳＩ）の決定：（１）結合しない対照試料を除く、全ての試料を、平均のＰｅｒＣＰ信号（すなわち、膜ＩｇＥコンストラクトの発現）で正規化した。（２）両方のサブ集団のＰＥ値を、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照のＰＥ強度で正規化した。（３）ｗｔ細胞が２以上の値（ｗｔ細胞との強い結合）を有する場合、ＳＩ値を０．２に設定した。（４）全ての他の試料において、ＳＩを、Ｃ２Ｃ４陽性細胞における正規化したＰＥ値を、ｗｔ細胞から得られるバックグラウンド値で割ることによって得る。
【０１０１】
ラモス（−ｗｔおよび−Ｃ２Ｃ４発現）細胞を、２５μｇ／ｍｌの、ワクチンで誘導した、親和性精製した抗体または対照ＡＢで染色し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ １％ＦＣＳ）で洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（３μｇ／ｍｌ、Jackson Immuno Research）と共にインキュベートした。Ｃ２Ｃ４細胞を、ウサギａ−ＦＬＡＧ（Sigma ９μｇ／ｍｌ）およびＰｅｒＣＰヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）２（２．５μｇ／ｍｌ、Jackson Immuno Research）で、同時に染色した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD)上で得、ＦｌｏｗＪｏ(Treestar)で評価し、ｗｔ、ＦＬＡＧ陰性生細胞および生きたＣ２Ｃ４、ＦＬＡＧ陽性集団を得、ＭＦＩ比（ＭＦＩ（膜ＩｇＥ−Ｃ２Ｃ４陽性細胞）／ＭＦＩ（Ｃ２Ｃ４陰性細胞））の決定を可能とした。
【０１０２】
実施例３−材料と方法：
ワクチン接種したマウス由来の血漿を、実施例２で記述されるように、ポリクローナル抗体の親和精製に用いた。
ＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析：健常なドナーのバフィーコート由来のＰＢＭＣを精製（フィコール比重(Ficoll gradient)）し、液体窒素で凍結した。細胞を、１０％ＦＣＳ(Gibco)および抗生物質を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地(Gibco)で一晩培養し、２５μｇ／ｍｌの、マウス由来の、ワクチンで誘導した、親和性精製した抗体または対照ＡＢ（BiolegendおよびBiogenesからのマウスＩｇＧ１、共にBiolegendからの、技術的対照としての、０．０４μｇ／ｍｌにおける、ＩｇＧ２ａおよび抗ＨＬＡ−ＤＲ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ １％ＦＣＳ）で洗浄し、ＰＥロバａ−マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（２．５μｇ／ｍｌ、Jackson Immuno Research）と共にインキュベートした。Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ ａ−マウス／ヒトＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（１０μｇ／ｍｌ、Biolegend）またはアイソタイプ対照で、さらに染色した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD)上で得、生きたリンパ球のサブ集団（Ｂ細胞：ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０陽性、非Ｂ細胞：ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０陰性）のＭＦＩを評価することによって、ＦｌｏｗＪｏ(Treestar)で調べた。
【０１０３】
実施例４−材料と方法：
膜ＩｇＥ架橋アッセイ：ラモス細胞（ｗｔおよびＣ２Ｃ４；実施例２参照）を、試料毎に５０万個播種し、実施例２のように、１０μｇ／ｍｌの、ワクチンで誘導した、親和性精製した抗体または対照抗体と共に、完全培地で１時間インキュベートした。細胞を回転させ、親和性精製した抗体由来の、二次の架橋剤ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント(Jackson Immuno Research)と共に、等濃度で、完全培地（Ｃ２Ｃ４細胞では、ドキシサイクリンを含む）に再懸濁し、一晩インキュベートし、ＢＣＲ架橋を誘導した。マウス／ヒトキメラ抗体を、マウスＩｇＧ２ａ重定常鎖で再設計し、プロテインＡで精製し、１μｇ／ｍｌで陽性阻害対照として用いるという実験的な目的で、キリズマブ（原型のヒト化モノクローナルＡＢ結合ヒトＥＭＰＤ）(Brightbill et al, 2010)を、ＣＨＯ細胞に発現させた。ヤギ抗ＩｇＭ(Southern Biotech)およびウサギ抗ＦＬＡＧ(Sigma)を、陽性対照として、それぞれ３および１０μｇ／ｍｌで用いた。
【０１０４】
２匹のニュージーランドホワイトウサギを、一方の側腹部にＣＲＭ−ｐ９３４７（３０μｇ）、および他方の側腹部にＫＬＨ−ｐ７５８０（１００μｇ）で、実施例２のマウスにおいて記述されるように、免疫化した。
増殖を、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標） ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８フローサイトメトリーアッセイキット(Invitrogen)によって、製造者の説明書に従って、定量化した。簡潔に述べると、１０μＭ ＥｄＵを、固定化および展開の１時間前に添加した。試料を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD)上で得、％ＥｄＵ陽性細胞を評価することによって、ＦｌｏｗＪｏ(Treestar)で調べた。架橋活性の代替としての増殖阻害を、血漿からのＩｇＧ由来のＥｄＵ陽性細胞の比率（通常約４０％）を１００％と設定することによって、計算した。
【０１０５】
実施例５−材料と方法：
ＢｉａＣｏｒｅによる親和性決定：ワクチンで誘導した抗体のオフレートを、ＢｉａＣｏｒｅ２０００装置(GE Healthcare)を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標））で分析した。ビオチンタグを付けた抗原ｐ９２６７(EMC, Tubingen, Germany)を、ＨＥＰＥＳでバッファーリングした生理食塩水、ｐＨ７．４（ＨＢＳ）をランニングバッファーとして用いて、ストレプトアビジンで被覆したＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）センサーチップの表面上に固定化した。最低限の５０反応単位（ＲＵ）のペプチドを、チップ上にロードし、フローセル１を空のままにし、基準（バックグラウンド信号）として用いた。次いで、フリーのストレプトアビジン結合部位を、フリーのビオチン(Sigma-Aldrich)および未処置の血漿（１：１００）でブロックした。１００μｌの未精製の各血漿試料（ＨＢＳで１：１００希釈）を、３０μｌ／分の流速で注入し、チップ表面を、各血漿注入後、１５μｌの１０ｍＭグリシン、ｐＨ＜＝２．２で再生した。各実行後、第一のフローセルのバックグラウンド信号を、続くリガンド結合フローセルで得られた信号から引いた。チップ表面の安定性を、対照抗体の繰り返しの注入で制御した。評価において、血漿注入終了時のＲＵ値を、結合した抗体の全量の指標として用いた。オフレート値（１／ｓ）を、ＢＩＡ評価ソフトウェア（解離における、１：１のラングミュア相互作用モデル）を用いて計算した。オフレートは、抗体のリガンドからの解離速度を記述し、個々の血漿試料由来の親和性決定における（オンレート以外の）重要なパラメータを構成し、したがって反映する。一貫して、ヒトＥＭＰＤペプチドに対する、より低い抗体のオフレートは、細胞の読み出しシステムにおける、相対的により強いＩｇＥ−ＢＣＲ架橋活性と相関する。
膜ＩｇＥ架橋活性：実施例４と同様。
【０１０６】
実施例６−材料と方法：
元のＥＭＰＤ配列から始まる、単一アミノ酸交換を、類似または異なる物理化学的性質に基づいて、選択した。マウスを、実施例２に記述するように、ワクチン接種した。免疫血清を、図２Ａのように、注入したペプチドおよび元のペプチドにおいて、分析した。
【０１０７】
実施例７−材料と方法：
ヒトＩｇＥ−ＥＭＰＤにおけるホモ接合マウスを、１週間間隔で注入したペプチドまたはモノクローナル抗体（４７Ｈ４またはアイソタイプ対照）について、親和性で精製した担体タンパク質上の指定のペプチドを注入したマウス由来の血清の投与によって、受動的に免疫化した。
【０１０８】
さらに、群に、オボアルブミン(Sigma)を、２、１５および２３日目に注入した。血漿を、２７日目に取り出し、全ＩｇＥ含量およびｏｖａ特異的ＩｇＥ含量について、ＥＬＩＳＡで分析した（それぞれ、BiolegendおよびCayman Chemical）。
【０１０９】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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