(57)【要約】  ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、および線維症のバイオマーカーならびにＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および／または線維症の診断（または診断支援）を行う方法が本明細書に記載されている。そのほかに、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨとを識別する方法、線維症の病期を分類する方法、肝疾患の重症度を決定する方法、肝疾患または線維症の重症度を決定する方法、ならびにＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、および／または線維症の進行／退縮をモニターする方法が本明細書に記載されている。
2018502286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、
前記被験体が肝疾患を有するかを診断するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、被験体が肝疾患を有するかの診断または診断支援を行う方法。
【請求項２】
前記肝疾患がＮＡＦＬＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝疾患がＮＡＦＬＤであり、かつ前記１種以上のバイオマーカーが５−メチルチオアデノシン（５−ＭＴＡ）、グリシン、セリン、ロイシン、４−メチル−２−オキソペンタノエート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、２−ヒドロキシブチレート、プロリルプロリン、ラノステロール、タウロ−β−ムリコレート、およびデオキシコレートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肝疾患がＮＡＳＨであり、かつ前記１種以上のバイオマーカーが表７、８、１０、および／または１１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記肝疾患が線維症であり、かつ前記１種以上のバイオマーカーが表１２、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記診断がＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別する工程を含む、請求項１に記載の方法
【請求項７】
前記サンプルが、質量分析、ＥＬＩＳＡ、および抗体結合からなる群から選択される１つ以上の技術を用いて分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される１種以上のバイオマーカーまたは測定を含む数学モデルを用いて前記被験体および前記被験体の生物学的サンプルを分析する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、
肝線維症の病期を決定するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの高ステージ肝線維症および／または低ステージ肝線維症の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝線維症を有する被験体の線維症の病期を決定する方法。
【請求項１０】
肝線維症を有する被験体の肝線維症の病期を決定するために数学モデルが使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体の第１の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択され、かつ前記第１のサンプルが第１の時間点で前記被験体から取得される、工程と、
前記被験体の第２の生物学的サンプルを分析して前記１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記第２のサンプルが第２の時間点で前記被験体から取得される、工程と、
前記被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために前記第１のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記第２のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較する工程と、
を含む、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、前記第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、ならびに／または前記第１および第２のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルの比較の結果と、前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルと、を比較する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される１種以上のバイオマーカーまたは測定を含む数学モデルを用いて前記被験体および前記被験体の生物学的サンプルを分析する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、
前記被験体の肝疾患の重症度を決定するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーのそれほど重篤でない肝疾患および／またはより重篤な肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別する方法。
【請求項１５】
肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別するために数学モデルが使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表２、３、４、５、７、８、１０、および／または１１から選択される、工程と、
前記被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとの識別を支援する方法。
【請求項１７】
肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとの識別を支援するために数学モデルが使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
肝疾患スコアの決定が前記方法を支援する、請求項１、９、１１、１４、および１６に記載の方法。
【請求項１９】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１９および２０から選択される、工程と、
前記被験体が肝疾患を有するかを診断するために前記サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、被験体が肝疾患を有するかの診断または診断支援を行う方法。
【請求項２０】
前記肝疾患がＮＡＳＨであり、かつ前記１種以上のバイオマーカーが表１９から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝疾患が線維症であり、かつ前記１種以上のバイオマーカーが表２０から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記診断がＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記診断がＮＡＳＨと線維症とを識別する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが、分質量分析、ＥＬＩＳＡ、および抗体結合からなる群から選択される１つ以上の技術を用いて分析される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、表１９および／または２０から選択される１種以上のバイオマーカーまたは測定を含む数学モデルを用いて前記被験体および前記被験体の生物学的サンプルを分析する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表２０から選択される、工程と、
肝線維症の病期を決定するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの高ステージ肝線維症および／または低ステージ肝線維症の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝線維症を有する被験体の線維症の病期を決定する方法。
【請求項２７】
肝線維症を有する被験体の肝線維症の病期を決定するために数学モデルが使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体の第１の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択され、かつ前記第１のサンプルが第１の時間点で前記被験体から取得される、工程と、
前記被験体の第２の生物学的サンプルを分析して前記１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記第２のサンプルが第２の時間点で前記被験体から取得される、工程と、
前記被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために前記第１のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記第２のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較する工程と、
を含む、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法。
【請求項２９】
前記方法が、前記第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、前記第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、ならびに／または前記第１および第２のサンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルの比較の結果と、前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルと、を比較する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、表１９および／または２０から選択される１種以上のバイオマーカーまたは測定を含む数学モデルを用いて前記被験体および前記被験体の生物学的サンプルを分析する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択される、工程と、
前記被験体の肝疾患の重症度を決定するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーのそれほど重篤でない肝疾患および／またはより重篤な肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別する方法。
【請求項３２】
肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別するために数学モデルが使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１９から選択される、工程と、
前記被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとの識別を支援する方法。
【請求項３４】
肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとの識別を支援するために数学モデルが使用される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
被験体の生物学的サンプルを分析して前記サンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、前記１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択される、工程と、
前記被験体においてＮＡＳＨと線維症とを識別するために前記サンプル中の前記１種以上のバイオマーカーのレベルと前記１種以上のバイオマーカーの肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、
を含む、肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨと線維症との識別を支援する方法。
【請求項３６】
肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨと線維症との識別を支援するために数学モデルが使用される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
肝疾患スコアの決定が前記方法を支援する、請求項１９、２６、２８、３１、３３、および３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０８１，９０３号および２０１５年４月１日出願の米国仮特許出願第６２／１４１，４９４号（それらの全内容は本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、脂肪肝疾患のバイオマーカーおよび前記バイオマーカーに基づく方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂質蓄積、炎症、肝細胞バルーニング、およびさまざまな度合いの線維症を特徴とする、単純良性脂肪症から非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）までの範囲にわたる全組織学的スペクトルを包含する非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の有病率は、肥満の蔓延に呼応して増加し続けている。肥満関連肝疾患への認識が高まっているにもかかわらず、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの病理発生についてよく理解されておらず、ＮＡＳＨを適応症とするＦＤＡ認可療法は存在しない。ＮＡＳＨの診断は、依然として複雑であり侵襲性肝生検が必要であるためかなりのリスクを伴う。したがって、予後予測の目的で肝疾患を有するかまたはその疑いがある（すなわち、より進行した肝疾患病期への進行のリスクがある）患者においてＮＡＦＬＤの診断または病期判定が可能な血液ベースの代謝物バイオマーカーのプロファイルの同定は、大きな医療上の必要性が満たされていない。
【０００４】
肝臓の脂肪変化は、肝細胞内への脂質の過剰蓄積から生じる。脂肪肝は、肝細胞中へのトリグリセリドおよび他の脂肪の蓄積である。脂肪肝疾患は、脂肪肝単独（単純脂肪肝、脂肪症）から肝炎症（脂肪肝炎）を伴う脂肪肝までの範囲にわたりうる。肝臓に脂肪があることは正常ではないが、それ自体はおそらく害や永久的損傷をほとんど引き起こさないであろう。脂肪症は、慢性肝疾患に進行することは稀な良性病態であると一般に考えられている。これとは対照的に、脂肪肝炎は、肝線維症および肝硬変に進行するおそれがあり、肝細胞癌を伴う可能性があり、しかも肝関連の罹患および死亡をもたらすおそれがある。
【０００５】
脂肪症は、アルコールの使用（アルコール関連脂肪肝）によりまたはアルコールの不在下（非アルコール性脂肪肝疾患ＮＡＦＬＤ）で起こりうる。脂肪肝炎は、アルコール誘発肝損傷に関連しうるかまたはアルコールに関連しないこともありうる。脂肪肝炎が存在するがアルコール使用歴がない場合、その病態は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と称される。
【０００６】
アルコールの不在下では、単純脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）およびＮＡＳＨの主なリスク因子は、肥満、糖尿病、および高トリグリセリドレベルである。ＮＡＳＨでは、脂肪は肝臓に蓄積し、最終的には瘢痕組織を引き起こす。このタイプの肝炎は、糖尿病、タンパク質栄養失調症、肥満、冠動脈疾患、およびコルチコステロイド投薬治療に関連しているように思われる。肝線維症または肝硬変は、ＮＡＳＨの患者の１５〜５０％に存在する。線維症の患者の約３０％は、１０年後に硬変を発症する。
【０００７】
脂肪肝疾患は、現在、米国では肝機能検査値の上昇の最も一般的な原因である。それは、現在おそらく、穏やかなトランスアミナーゼ上昇の最大の理由である。脂肪症は、一般集団の約２５〜３５％が罹患している。ＮＡＦＬＤは、肥満患者の８０％超に見いだされる。ＮＡＳＨは、米国人の２〜５パーセントが罹患しており、ルーチン肝生検を受けている患者の１．２〜９％で検出されている。肥満手術を受けている患者の５０％超はＮＡＳＨを有する。この疾患は男性および女性を襲い、初期の研究では症例の＞７０％が女性であったと報告されているが、最近の研究では患者の５０％が女性であると報告されている。脂肪肝はすべての年齢層で起こる。米国では、ＮＡＳＨは、青年の間で最も一般的な肝疾患であり、成人の慢性肝疾患の３番目に多い原因である（Ｃ型肝炎およびアルコールに次いで）。
【０００８】
ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤは両方とも、より一般的になってきている。それはおそらく、肥満の米国人の数が増えていることが理由である。過去１０年間で肥満の割合は成人で２倍、子供で３倍になった。肥満はまた、ＮＡＳＨの人の健康をさらに悪化させる可能性のある糖尿病および高血中コレステロールの一因となる。糖尿病および高血中コレステロールもまた、米国人の間でより一般的になってきている。
【０００９】
ＮＡＳＨは、通常、症状がほとんどまたはまったくないサイレント疾患である。患者は、一般に、初期には体調が良く、疾患がより進行するとまたは硬変が発症すると疲労、体重減少、脱力感などの症状を持ち始めるにすぎない。ＮＡＳＨの進行は、何年もさらには何十年もかかることがある。プロセスは、特異療法を施さないでも停止したりいくつかの場合にはそのまま回復したりすることもある。そのほかに、ＮＡＳＨは、徐々に悪化して肝臓で瘢痕化または「線維症」の発生および蓄積を引き起こすこともある。線維症が悪化するにつれて硬変を発症する。肝臓は、かなり瘢痕化して硬化し正常に機能できない状態となる。ＮＡＳＨを有する者がすべて硬変を発症するとは限らないが、重篤な瘢痕化または硬変が存在すると進行を停止できる治療はほとんどない。硬変を有する者は、体液貯留、筋消耗、腸出血、および肝不全を経験する。肝移植は、肝不全を伴う進行した硬変に対する唯一の治療法であり、移植は、ＮＡＳＨを有する人々の間でますます実施されようになっている。ＮＡＳＨは、米国ではＣ型肝炎およびアルコール性肝疾患に次いで硬変の主な原因の１つに位置付けられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などのルーチン血液検査パネルに含まれる肝検査値の上昇を有することが見いだされる者は、通常、ＮＡＳＨが最初に疑われる。さらなる評価で肝疾患の明確な理由（たとえば、投薬、ウイルス性肝炎、またはアルコール過剰使用）が示されない場合かつ肝臓のＸ線検査またはイメージング検査で脂肪が見られる場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの診断を証明しそれを単純脂肪肝と区別する唯一の手段は肝生検である。肝生検では、皮膚を介して針を挿入し肝臓の小片を取り出す必要がある。炎症および損傷を伴うことなく組織に脂肪が見られる場合、単純脂肪肝またはＮＡＦＬＤと診断される。組織の顕微鏡検査で肝細胞の炎症および損傷を伴って脂肪が見いだされる場合、ＮＡＳＨと診断される。生検では、肝臓に瘢痕組織が発生したかを決定する必要がある。現在、血液検査や血液スキャンでは信頼性をもってこの情報を提供することができない。したがって、より低侵襲性の診断方法（すなわち、生検を必要としない方法）の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、被験体が肝疾患を有するかを診断するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体において肝疾患の診断または診断支援を行う方法を提供する。
【００１２】
他の態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のＮＡＳＨバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表７、８、１０、および／または１１から選択される、工程と、被験体がＮＡＳＨを有するかを診断するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＮＡＳＨ陽性および／またはＮＡＳＨ陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体においてＮＡＳＨの診断または診断支援を行う方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のＮＡＦＬＤバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表２、３、４、５、７、８、１０、および／または１１から選択される、工程と、被験体がＮＡＦＬＤを有するかを診断するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＮＡＦＬＤ陽性および／またはＮＡＦＬＤ陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体においてＮＡＦＬＤの診断または診断支援を行う方法を提供する。この態様の特徴として、１種以上のバイオマーカーは、５−メチルチオアデノシン（５−ＭＴＡ）、グリシン、セリン、ロイシン、４−メチル−２−オキソペンタノエート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、２−ヒドロキシブチレート、プロリルプロリン、ラノステロール、タウロ−β−ムリコレート、およびデオキシコレートからなる群から選択しうる。
【００１４】
他の態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のＮＡＳＨおよび／またはＮＡＦＬＤバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表２、３、４、５、７、８、１０、および／または１１から選択される、工程と、ＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別する方法を提供する。
【００１５】
他の態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の線維症バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１２、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、被験体が線維症を有するかを診断するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの線維症陽性および／または線維症陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体において肝線維症の診断または診断支援を行う方法を提供する。
【００１６】
他の態様では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１２、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、肝線維症の病期を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝線維症病期の参照レベルとを比較する工程と、を含む、肝線維症を有する被験体の線維症の病期を決定する方法を提供する。
【００１７】
他の実施形態では、本開示は、被験体の第１の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択され、かつ第１のサンプルが第１の時間点で被験体から取得される、工程と、被験体の第２の生物学的サンプルを分析して１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時間点で被験体から取得される、工程と、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較する工程と、を含む、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態では、本開示は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１２、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１４、１６、および／または１８から選択される、工程と、被験体の肝疾患の重症度を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのそれほど重篤でないおよび／またはより重篤な参照レベルとを比較する工程と、を含む、被験体においてそれほど重篤でないものとより重篤なものとを識別する方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の態様では、被験体が肝疾患を有するかの診断または診断支援を行う方法は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１９および２０から選択される、工程と、被験体が肝疾患を有するかを診断するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む。
【００２０】
この態様の特徴として、肝疾患はＮＡＳＨでありうるとともに、１種以上のバイオマーカーは表１９から選択しうる。この態様の他の特徴として、肝疾患は線維症でありうるとともに、１種以上のバイオマーカーは表２０から選択しうる。さらなる特徴として、診断は、ＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別する工程またはＮＡＳＨと線維症とを識別する工程を含みうる。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、肝線維症を有する被験体の線維症の病期を決定する方法は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表２０から選択される、工程と、肝線維症の病期を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの高ステージ肝線維症および／または低ステージ肝線維症の参照レベルとを比較する工程と、を含む。
【００２２】
本発明の他の態様では、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法は、被験体の第１の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択され、かつ第１のサンプルが第１の時間点で被験体から取得される、工程と、被験体の第２の生物学的サンプルを分析して１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時間点で被験体から取得される、工程と、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較する工程と、を含む。
【００２３】
本発明の他の態様では、肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別する方法は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択される、工程と、被験体の肝疾患の重症度を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのそれほど重篤でない肝疾患および／またはより重篤な肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、を含む。
【００２４】
さらに他の態様では、肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとの識別を支援する方法は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１９から選択される、工程と、被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、を含む。
【００２５】
さらなる態様では、肝疾患と診断された被験体においてＮＡＳＨと線維症との識別を支援する方法は、被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが表１９および／または２０から選択される、工程と、被験体においてＮＡＳＨと線維症とを識別するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、を含む。
【００２６】
さらに他の実施形態では、本開示は、肝疾患スコアを決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、代謝物の数（Ｘ軸）の関数としてＭＲＩ  ＰＤＦＦ相関の平均Ｒ２値（Ｙ軸）を示すグラフ図である。
【図２】図２は、線維症のステージ０〜１と線維症のステージ２〜４とを分離するためにＡＵＣ＞０．６６６３の８種の代謝物のすべての可能なモデルの組合せを当てはめることにより計算された曲線下面積（ＡＵＣ）の範囲を示すグラフ図である。
【図３】図３は、線維症のステージ０〜１と線維症のステージ３〜４とを分離するためにＡＵＣ＞０．７２１７の７種の代謝物のすべての可能なモデルの組合せを当てはめることにより計算された曲線下面積（ＡＵＣ）の範囲を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、および線維症のバイオマーカー、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および／または線維症の診断（または診断支援）を行う方法、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨとを識別する方法、線維症の病期を分類する方法、肝疾患の重症度を決定する方法、肝疾患または線維症の重症度を決定する方法、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、および／または線維症の進行／退縮をモニターする方法、さらには肝疾患のバイオマーカーに基づく他の方法が本明細書に記載されている。
【００２９】
しかしながら、本発明をさらに詳細に説明する前に最初に以下の用語を定義する。
【００３０】
定義：
「バイオマーカー」とは、第２の表現型を有する（たとえば、疾患を有してない）被験体または被験体群の生物学的サンプルと比較して、第１の表現型を有する（たとえば、疾患を有する）被験体または被験体群の生物学的サンプル中に示差的に存在する（すなわち、増加または減少する）化合物、好ましくは代謝物を意味する。バイオマーカーは、任意のレベルで示差的に存在しうるが、一般に、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも６５％少なくとも６０％少なくとも５５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも１３０％、少なくとも１２０％、少なくとも１１０％、少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも１５０％、少なくとも１４０％、もしくはそれ以上増加したレベルで存在するか、または一般に、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％（すなわち、不在）減少したレベルで存在する。バイオマーカーは、好ましくは、統計的に有意なレベルで示差的に存在する（すなわち、ウェルチのＴ検定またはウィルコクソンの順位和検定のいずれかを用いて決定したとき、０．０５未満のｐ値および／または０．１０未満のｑ値）。
【００３１】
１種以上のバイオマーカーの「レベル」とは、サンプル中のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度を意味する。
【００３２】
「サンプル」または「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された生物学的物質を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに好適な任意の生物学的物質を含有しうるとともに、被験体の細胞物質および／または非細胞物質を含みうる。サンプルは、任意の好適な生物学的流体、たとえば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）などから単離可能である。
【００３３】
「被験体」とは、任意の動物を意味するが、好ましくは、哺乳動物、たとえば、ヒト、サル、非ヒト霊長動物、マウス、ウサギなどである。
【００３４】
バイオマーカーの「参照レベル」とは、特定の疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、あるいはそれらの欠如、さらには疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、あるいはそれらの欠如の組合せの指標となるバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」参照レベルとは、特定の疾患状態または表現型の指標となるレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」参照レベルとは、特定の疾患状態または表現型の欠如の指標となるレベルを意味する。たとえば、バイオマーカーの「ＮＡＳＨ陽性参照レベル」とは、被験体においてＮＡＳＨの陽性診断の指標となるバイオマーカーのレベルを意味し、バイオマーカーの「ＮＡＳＨ陰性参照レベル」とは、被験体においてＮＡＳＨの陰性診断の指標となるバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「参照レベル」は、バイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度、バイオマーカーの存在または不在、バイオマーカーの量または濃度の範囲、バイオマーカーの最小および／または最大の量または濃度、バイオマーカーの平均の量または濃度、ならびに／あるいはバイオマーカーのメジアンの量または濃度でありうるとともに、それに加えて、バイオマーカーの組合せの「参照レベル」はまた、２種以上のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度の互いの比でありうる。特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に対するバイオマーカーの適切な陽性および陰性の参照レベルは、１つ以上の適切な被験体で所望のバイオマーカーのレベルを測定することにより決定しうるとともに、かかる参照レベルは、特定の被験体集団に合わせて調整しうる（たとえば、ある特定の年齢または性別の被験体のサンプル中のバイオマーカーレベルと、ある特定の年齢群または性別群の特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に対する参照レベルと、の間で比較が行えるように、参照レベルは年齢を一致させうるかまたは性別を一致させうる）。かかる参照レベルはまた、バイオマーカーのレベルが使用される特定の技術によって異なりうる場合、生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定するために使用される特定の技術（たとえば、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳなど）に合わせて調整しうる。
【００３５】
「非バイオマーカー化合物」とは、第２の表現型を有する（たとえば、第１の疾患を有していない）被験体または被験体群の生物学的サンプルと比較して、第１の表現型を有する（たとえば、第１の疾患を有する）被験体または被験体群の生物学的サンプル中に示差的に存在しない化合物を意味する。しかしながら、そのような非バイオマーカー化合物は、第１の表現型（たとえば、第１の疾患を有する）または第２の表現型（たとえば、第１の疾患を有していない）と比較して、第３の表現型を有する（たとえば、第２の疾患を有する）被験体または被験体群の生物学的サンプル中のバイオマーカーでありうる。
【００３６】
「代謝物」または「低分子」とは、細胞中に存在する有機および無機の分子を意味する。この用語は、大きなタンパク質（たとえば、２，０００，３，０００、４，０００，５，０００、６，０００，７，０００、８，０００，９，０００、または１０，０００を超える分子量を有するタンパク質）、大きな核酸（たとえば、２，０００、３，０００，４，０００、５，０００，６，０００、７，０００，８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する核酸）、大きな多糖（たとえば、２，０００、３，０００，４，０００、５，０００，６，０００、７，０００，８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する多糖）などの大きな高分子を含まない。細胞の低分子は、一般に、細胞質または他のオルガネラたとえばミトコンドリアの溶液中に遊離状態で見いだされ、そこでは、さらに代謝可能なまたは高分子と呼ばれる大きな分子の生成に使用可能な中間体のプールを形成する。「低分子」という用語は、シグナリング分子および食料に由来するエネルギーを使用可能な形態に変換する化学反応の中間体を含む。低分子の例としては、糖、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、細胞プロセス時に形成される中間体、および細胞内に見いだされる他の低分子が挙げられる。
【００３７】
「代謝プロファイル」または「低分子プロファイル」とは、標的の細胞、組織、器官、生物、またはそれらの一部（たとえば、細胞区画）内の低分子の完全または部分インベントリーを意味する。インベントリーは、存在する低分子の量および／またはタイプを含みうる。「低分子プロファイル」は、単一の技術または複数の異なる技術を用いて決定しうる。
【００３８】
「メタボローム」とは、所与の生物に存在する低分子のすべてを意味する。
【００３９】
「脂肪症」とは、炎症が存在しない脂肪肝疾患を意味する。この病態は、アルコールの使用によりまたはアルコールの使用によらずに起こりうる。
【００４０】
「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）とは、肝臓に有害と考えられる量のアルコールを摂取しない被験体でも起こる脂肪肝疾患（脂肪症）を意味する。
【００４１】
「脂肪肝炎」とは、炎症を伴う脂肪肝疾患を意味する。脂肪肝炎は、硬変に進行しうるとともに肝細胞癌を伴いうる。この病態は、アルコールの使用によりまたはアルコールの使用によらずに起こりうる。
【００４２】
「非アルコール性脂肪肝炎」（ＮＡＳＨ）とは、肝臓に有害と考えられる量のアルコールを摂取しない被験体でも起こる脂肪肝炎を意味する。ＮＡＳＨは、硬変に進行しうるとともに肝細胞癌を伴いうる。
【００４３】
「線維症」とは、炎症の進行の結果としての肝臓への細胞外マトリックスタンパク質の蓄積を意味する。線維症は、肝生検サンプルで組織学的に５つのステージ０〜４に分類される。ステージ０は線維症でないことを意味し、ステージ１は軽度の線維症を意味し、ステージ２は中度の線維症を意味し、ステージ３は重度の線維症を意味し、そしてステージ４は硬変を意味する。
【００４４】
「肝疾患」とは、本明細書で用いられる場合、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、線維症、および硬変を意味する。
【００４５】
「ＮＡＦＬＤ活性スコア」または「ＮＡＳ」とは、ＮＡＦＬＤに対する組織学的スコア付けシステムを意味する。スコアは、脂肪症、小葉炎症、脂肪肉芽腫の不在、肝細胞バルーニングなどの組織学的特徴の変化の評価を含む。線維症は、ＮＡＳに依存せずに評価される。
【００４６】
肝疾患の「重症度」とは、肝臓への脂肪蓄積を伴う低重症度の疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪蓄積に加えて低レベルの炎症および／または線維症を伴って重症度が増加したもの（すなわち、ボーダーラインＮＡＳＨ）、より高レベルの炎症および線維症を伴って重症度がさらに増加したもの（すなわち、ＮＡＳＨ）にわたる非アルコール性肝疾患活性のスペクトルに基づく肝疾患の程度を意味する。重症度は、線維症の病期に基づきうるかまたはＮＡＳを用いて評価しうる。
【００４７】
本明細書で用いられる選択された脂肪酸脂質代謝物の命名に関して、接頭辞「ＣＥ」、「ＤＡＧ」、「ＦＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＬＰＣ」、「ＬＰＥ」、「Ｏ−ＰＣ」、「Ｐ−ＰＥ」、「ＰＩ」、「ＳＭ」、「ＴＡＧ」、「ＣＥＲ」、「ＤＣＥＲ」、「ＬＣＥＲ」、または「ＴＬ」が付いた脂肪酸は、それぞれ、サンプル中のコレステリルエステル、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）、遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、１−エーテル結合ホスファチジルコリン、１−ビニルエーテル結合ホスファチジルエタノールアミン（プラスマロゲン）、ホスホイノシトール、スフィンゴミエリン、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）、セラミド、ジヒドロセラミド、ラクトセラミド、および全脂質内に存在する指定の脂肪酸を意味する。「ＴＬ」とは、サンプル中の全脂質内に存在する指定の脂肪酸を意味する。いくつかの実施形態では、指定の脂肪酸成分は、接頭辞により示唆される脂質クラス内の全脂肪酸の割合として定量される。たとえば、略号「ＴＬ１６：０」は、パルミチン酸（１６：０）が含まれるサンプル中の全脂質のパーセントを示唆する。「ＴＬＴＬ」または「全脂質合計」という用語は、サンプル中に存在する全脂質の絶対量（たとえば、ｎモル／グラム単位）を示唆する。いくつかの実施形態では、指定の脂肪酸成分は、接頭辞により示唆される脂質クラス内の全脂肪酸の割合として定量される。特定の脂質クラスの接頭辞または他の指標が付いていない脂肪酸への参照は、一般に、サンプル中の全脂質内に存在する脂肪酸を示唆する。接頭辞「ＣＥ」、「ＤＡＧ」、「ＦＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＬＰＣ」、「ＬＰＥ」、「Ｏ−ＰＣ」「Ｐ−ＰＥ」「ＰＩ」、「ＳＭ」、「ＴＡＧ」、「ＣＥＲ」、「ＤＣＥＲ」、または「ＬＣＥＲ」に続く「ＬＣ」という用語は、サンプル中の接頭辞により示唆される全脂質クラスの量を意味する（たとえば、血清または血漿１グラム当たりｎモルとして表されるそのクラスの脂質の濃度）。たとえば、血漿または血清から得られる測定値に関して、略号「ＰＣ１８：２ｎ６」は、リノール酸（１８：２ｎ６）が含まれる血漿中または血清中のホスファチジルコリンのパーセントを示唆し、「ＴＧＬＣ」という用語は、血漿中または血清中に存在するトリグリセリドの絶対量（たとえば、ｎモル／グラム単位）を示唆する。トリアシルグリセロールに関して、代謝物名は、その化合物の親物質を表す（たとえば、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：２は、５３個の全炭素および６個の全二重結合を有する脂肪酸が結合されたトリアシルグリセロールが代謝物であることを示唆する。−ＦＡ１８：２は、質量分析計で同定された断片を意味する（すなわち、この実施例ではＴＡＧの３つの脂肪酸の１つは１８：２である））。「ＭＵＦＡ」、「ＰＵＦＡ」、および「ＳＦＡ」は、それぞれ、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸を意味する。
【００４８】
Ｉ．バイオマーカー
本明細書に記載のＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および線維症のバイオマーカーは、メタボロミックプロファイリング技術を用いて発見された。かかるメタボロミックプロファイリング技術は、以下に示される実施例、さらには米国特許第７，００５，２５５号明細書、同第７，３２９，４８９号明細書、同第７，５５０，２５８号明細書、同第７，５５０，２６０号明細書、同第７，５５３，６１６号明細書、同第７，６３５，５５６号明細書、同第７，６８２，７８３号明細書、同第７，６８２，７８４号明細書、同第７，９１０，３０１号明細書、および同第７，９４７，４５３号明細書（それらの全内容は本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる）に、より詳細に記載されている。
【００４９】
一般に、代謝プロファイルは、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症と診断されたヒト被験体さらには１つ以上の他の群のヒト被験体（たとえば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症と診断されなかった対照被験体）の生物学的サンプルで決定された。ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症を有する被験体の生物学的サンプルの代謝プロファイルは、１つ以上の他の群の被験体の生物学的サンプルの代謝プロファイルと比較された。他の群（たとえば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症と診断されなかった対照被験体）と比較して、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症を有する被験体のサンプルの代謝プロファイルで統計的に有意なレベルで示差的に存在する分子を含めて、そうした示差的に存在する分子は、それらの群を識別するバイオマーカーとして同定された。そのほかに、他の群と比較して、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、または線維症を有する被験体のサンプルの代謝プロファイルで統計的に有意なレベルで示差的に存在する分子を含めて、そうした示差的に存在する分子はまた、それらの群を識別するバイオマーカーとして同定された。
【００５０】
バイオマーカーは本明細書でより詳細に考察される。発見されたバイオマーカーは以下の群に対応する。
【００５１】
ＮＡＦＬＤを有する被験体とＮＡＦＬＤと診断されなかった被験体とを識別するバイオマーカー（表２、３、４、５を参照されたい）。
【００５２】
ＮＡＳＨを有する被験体とＮＡＦＬＤを有する被験体とを識別するバイオマーカー（表７、８を参照されたい）。
【００５３】
線維症を有する被験体と線維症を有していない対照被験体とを識別するバイオマーカー（表１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０を参照されたい）。
【００５４】
線維症の病期を識別するバイオマーカー（表１０、１１、１２、１４、１６、１８を参照されたい）。
【００５５】
ＮＡＳＨを有する被験体とＮＡＳＨを有していない対照被験体とを識別するバイオマーカー（表２０を参照されたい）。
【００５６】
ＩＩ．方法
Ａ．肝疾患の診断
ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および線維症のバイオマーカーの同定は、肝疾患の存在に合致する１つ以上の症状を呈する被験体における肝疾患の診断（または診断支援）を可能にし、以前に肝疾患を有すると同定されなかった被験体における肝疾患の初期診断および以前に肝疾患の治療を受けた被験体における肝疾患の再発の診断を含む。被験体が肝疾患を有するかの診断（または診断支援）を行う方法は、（１）被験体の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）被験体が肝疾患を有するかの診断（または診断支援）を行うためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較する工程と、を含む。使用される１種以上のバイオマーカーは、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０ならびにそれらの組合せから選択される。かかる方法が肝疾患の診断支援に使用される場合、この方法の結果は、被験体が肝疾患を有するかの臨床判断に有用な他の方法（またはその結果）と共に使用しうる。
【００５７】
サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するために任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを分析しうる。好適な方法としては、クロマトグラフィー（たとえば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）、質量分析（たとえば、ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、他の免疫化学的技術、およびそれらの組合せが挙げられる。さらに、たとえば、測定が望まれるバイオマーカーのレベルと相関する化合物（または複数の化合物）のレベルを測定するアッセイを用いて、１種以上のバイオマーカーのレベルを間接的に測定しうる。
【００５８】
表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０ならびにそれらの組合せまたはそれらの任意の一部分のバイオマーカーのすべての組合せを含めて、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０のバイオマーカーの１つ以上のレベルは、被験体が肝疾患を有するかの診断支援を行う方法で決定および使用しうる。バイオマーカーの組合せのレベルを決定することにより、肝疾患の診断および肝疾患の診断支援でより高い感度および特異度を可能にしうる。たとえば、生物学的サンプル中のある特定のバイオマーカー（および非バイオマーカー化合物）のレベルの比により、肝疾患の診断および肝疾患の診断支援でより高い感度および特異度を可能にしうる。
【００５９】
一例として、バイオマーカーのすべての組合せを含めて、表２、３、４、５、７、８、１０、および／または１１ならびにそれらの任意の組合せの１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体がＮＡＦＬＤを有するかの診断または診断支援を行う方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、３−ヒドロキシイソブチレート、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、２−アミノアジペート、４−メチル−２−オキソペンタノエート、２−ヒドロキシブチレート、プロリルプロリン、およびタウロ−β−ムリコレートのうちの１つ以上は、ＮＡＦＬＤの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。他の例として、１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、イソロイシン、グルタメート、α−ケトグルタレート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレイン酸）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グリシン、セリン、ロイシン、デオキシコレート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、およびラノステロールからなる群から選択しうるとともに、１種以上のバイオマーカーと組み合わせて使用しうる。
【００６０】
他の例として、バイオマーカーの組合せのすべてを含めて、表７、８、１０、１１、および／または２０ならびにそれらの任意の組合せの１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体がＮＡＳＨを有するかの診断または診断支援を行う方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、バリルグリシン、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、フコース、タウリン、γ−グルタミルヒスチジン、３−ヒドロキシイソブチレート、ＣＥ（２４：１）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１４：１）、ＬＰＣ（１４：０）、ＳＭ（１８：１）、ＰＥ（１５：０／２２：４）、ＦＦＡ（２０：０）、ＬＰＣ（１２：０）、ＬＣＥＲ（２６：０）、ＬＰＥ（１４：１）、ＰＩ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（２０：４）、ＤＣＥＲ（２０：０）、ＬＣＥＲ（１４：０）、ＰＥ（１５：０／１８：４）、ＰＩ（１８：０／１６：１）、ＰＥ（１６：０／２２：２）、ＰＥ（Ｐ−１４：１／１８：１）、ＰＣ（１６：０／１４：１）、ＰＥ（１８：０／１７：０）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１８：０）、ＰＥ（Ｐ−１８：０／１６：１）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／１８：０）、ＣＥＲ（２６：０）、ＰＥ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（１８：４）、およびＰＥ（Ｏ−１８：０／１４：１）のうちの１つ以上は、ＮＡＳＨの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレイン酸）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＬＰＥ（１８：２）、ＬＰＥ（２０：３）、ＰＥ（１４：０／１４：１）、ＰＣ（１４：０／２２：４）、ＰＣ（１５：０／１６：１）、ＰＣ（２０：０／１４：１）、ＰＣ（１７：０／２２：６）、ＰＥ（１５：０／１８：３）、ＰＥ（１７：０／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：３）、ＰＣ（１８：１／２２：６）、ＰＣ（１８：１／２２：５）、ＰＣ（１４：０／１８：４）、ＳＭ（１６：０）、ＣＥ（２４：０）、ＰＣ（１４：０／２０：２）、ＰＣ（１４：０／２０：３）、ＰＣ（１８：１／１８：４）、ＳＭ（１８：０）、ＰＣ（１４：０／１８：２）、およびＰＣ（１４：０／１６：１）からなる群から選択しうる。
【００６１】
他の例として、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、および／または２０の１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体においてＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別する方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、３−ヒドロキシイソブチレート、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、２−アミノアジペート、４−メチル−２−オキソペンタノエート、２−ヒドロキシブチレート、プロリルプロリン、タウロ−β−ムリコレート、ＣＥ（２４：１）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１４：１）、ＬＰＣ（１４：０）、ＳＭ（１８：１）、ＰＥ（１５：０／２２：４）、ＦＦＡ（２０：０）、ＬＰＣ（１２：０）、ＬＣＥＲ（２６：０）、ＬＰＥ（１４：１）、ＰＩ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（２０：４）、ＤＣＥＲ（２０：０）、ＬＣＥＲ（１４：０）、ＰＥ（１５：０／１８：４）、ＰＩ（１８：０／１６：１）、ＰＥ（１６：０／２２：２）、ＰＥ（Ｐ−１４：１／１８：１）、ＰＣ（１６：０／１４：１）、ＰＥ（１８：０／１７：０）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１８：０）、ＰＥ（Ｐ−１８：０／１６：１）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／１８：０）、ＣＥＲ（２６：０）、ＰＥ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（１８：４）、およびＰＥ（Ｏ−１８：０／１４：１）のうちの１つ以上は、ＮＡＳＨとＮＡＦＬＤとを識別するために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、イソロイシン、グルタメート、α−ケトグルタレート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレイン酸）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グリシン、セリン、ロイシン、デオキシコレート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、ラノステロール、ＬＰＥ（１８：２）、ＬＰＥ（２０：３）、ＰＥ（１４：０／１４：１）、ＰＣ（１４：０／２２：４）、ＰＣ（１５：０／１６：１）、ＰＣ（２０：０／１４：１）、ＰＣ（１７：０／２２：６）、ＰＥ（１５：０／１８：３）、ＰＥ（１７：０／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：３）、ＰＣ（１８：１／２２：６）、ＰＣ（１８：１／２２：５）、ＰＣ（１４：０／１８：４）、ＳＭ（１６：０）、ＣＥ（２４：０）、ＰＣ（１４：０／２０：２）、ＰＣ（１４：０／２０：３）、ＰＣ（１８：１／１８：４）、ＳＭ（１８：０）、ＰＣ（１４：０／１８：２）、およびＰＣ（１４：０／１６：１）からなる群から選択しうる。
【００６２】
他の例として、表１０、１１、１２、１４、１６、１８、および／または２０の１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体が線維症を有するかの診断または診断支援を行う方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、グルタレート（ペンタンジオエート）、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、２−アミノヘプタノエート、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、ＣＥＲ（１４：０）、ＤＣＥＲ（１４：０）、ＬＰＥ（１２：０）、ＤＣＥＲ（１８：０）、ＰＥ（１８：０／２２：２）、ＰＥ（Ｐ−１８：０／１８：３）、ＬＰＣ（１７：０）、ＬＰＣ（２２：０）、ＣＥＲ（１８：１）、ＬＣＥＲ（２２：０）、ＰＥ（１６：０／２０：１）、ＣＥ（１５：０）、ＰＥ（１６：０／２２：４）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／２０：２）、ＬＰＣ（２０：０）、ＬＰＥ（２４：０）、ＰＣ（１２：０／１４：１）、ＰＥ（１７：０／２２：２）、ＳＭ（１８：１）、ＣＥＲ（１６：０）、ＬＣＥＲ（２４：０）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／２０：３）、ＣＥ（１７：０）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１８：３）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１６：１）、ＬＰＥ（１４：１）、ＦＦＡ（２４：０）、ＰＥ（Ｏ−１６：０／１８：４）、ＦＦＡ（１５：０）、ＳＭ（１４：０）、ＬＰＣ（２０：２）、ＰＥ（Ｐ−１４：１／１８：１）、ＳＭ（２４：１）、ＰＩ（１８：０／２０：２）、ＬＰＣ（１５：０）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／１８：１）、ＰＩ（１８：１／２０：３）、ＰＥ（１６：０／１６：１）、ＤＡＧ（１８：１／２０：３）Ｘ−１９５６１、Ｘ−１８８８９、Ｘ−２１４７１、Ｘ−１１８７１、およびＸ−１２８５０のうちの１つ以上は、被験体が線維症を有するかの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレエート）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、イソロイシン、α−ケトグルタレート、ＰＥ（１８：２／２０：２）、ＰＥ（１４：０／１６：１）、ＰＥ（１４：０／１４：１）、ＰＥ（１６：０／１８：１）、ＰＥ（１８：１／１８：１）、ＰＥ（１７：０／２０：４）、ＰＥ（１４：０／２０：５）、ＰＥ（１６：０／２２：５）、ＰＥ（１８：２／２０：３）、ＰＥ（１６：０／２０：４）、ＰＥ（１４：０／１８：２）、ＰＥ（１８：１／１８：４）、ＰＥ（１５：０／２２：６）、ＰＥ（１６：０／１４：０）、ＬＰＣ（１８：３）、ＴＡＧ５５：７−ＦＡ２０：３、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：２、ＴＡＧ５５：７−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５３：５−ＦＡ１８：２、ＴＡＧ５３：７−ＦＡ１８：３、ＴＡＧ５５：８−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５３：５−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５��：６−ＦＡ２０：３、ＴＡＧ５７：９−ＦＡ２２：６、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：３、ＴＡＧ５５：６−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：４−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：４−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５１：４−ＦＡ１６：０、ＴＡＧ５３：３−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５１：３−ＦＡ１６：０、ＴＡＧ５１：４−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５６：５−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５６：５−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５６：４−ＦＡ２０：４、ＰＥ（１４：０／１８：１）、ＰＣ（１４：０／１８：４）、ＰＣ（１８：２／２２：５）、ＰＣ（２０：０／２２：５）、ＳＭ（１８：０）、ＣＥ（１８：０）、ＰＣ（１８：２／１８：４）、およびＰＣ（１４：０／２０：２）からなる群から選択しうる。
【００６３】
他の例として、表１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８の１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体において線維症の病期を決定する方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、グルタレート（ペンタンジオエート）、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、２−アミノヘプタノエート、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、およびシクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）のうちの１つ以上は、被験体が線維症を有するかの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレエート）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、イソロイシン、およびα−ケトグルタレートからなる群から選択しうる。
【００６４】
サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定した後、このレベルと肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較して、被験体が肝疾患を有するかの診断または診断支援を行う。肝疾患陽性参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、被験体において肝疾患の診断の指標となる。肝疾患陰性参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、被験体において肝疾患でない診断の指標となる。それに加えて、肝疾患陰性参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体において肝疾患の診断の指標となる。肝疾患陽性参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体において肝疾患でない診断の指標となる。
【００６５】
生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとの単純比較（たとえば、マニュアル比較）を含めて、種々の技術を用いて、１種以上のバイオマーカーのレベルと肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較しうる。また、１つ以上の統計解析（たとえば、ｔ検定、ウェルチのＴ検定、ウィルコクソンの順位和検定、ランダムフォレスト、Ｔスコア、Ｚスコア）を用いてまたは数学モデル（たとえば、アルゴリズム、統計モデル、混合効果モデル）を用いて、生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと肝疾患陽性および／または肝疾患陰性の参照レベルとを比較しうる。
【００６６】
たとえば、単一のアルゴリズムまたは複数のアルゴリズムを含む数学モデルを用いて、被験体が肝疾患を有するかを決定しうる。また、数学モデルを用いて、肝疾患のタイプ（たとえば、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤ）または線維症の病期も識別しうる。例示的な数学モデルでは、測定されたバイオマーカーのレベル間の数学的関係に基づくアルゴリズムまたは一連のアルゴリズムを用いて、被験体が肝疾患を有するか、肝疾患が被験体において進行または退縮しているか、被験体がより進行したまたはそれほど進行していない肝疾患を有するかなどを決定するために、被験体の任意の数（たとえば、２、３、５、７、９など）のバイオマーカーの測定レベルを使用しうる。一例として、数学モデルはロジスティック回帰モデリングである。他の例として、数学モデルは多重ロジスティック回帰モデリングである。
【００６７】
この方法の結果は、被験体において肝疾患の診断に有用な他の方法（またはその結果）と共に使用しうる。たとえば、この方法の結果は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、線維症、または硬変の診断を確認するための侵襲性追跡検査（たとえば肝生検）の根拠となる患者の指標を提供しうる。
【００６８】
一態様では、本明細書に提供されるバイオマーカーは、被験体において肝疾患の存在および／または重症度を示唆する肝疾患スコア（たとえば、ＮＡＳＨスコア、ＮＡＦＬＤスコア、線維症スコア）を医師に提供するために使用可能である。スコアは、バイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組合せの参照レベルが臨床的に有意に変化することに基づく。参照レベルはアルゴリズムから導出可能である。スコアは、正常（すなわち肝疾患でない）から重篤に至るまでの肝疾患の重症度範囲に被験体を配置するように使用可能である。スコアは複数の方法で使用可能であり、たとえば、疾患の進行、退縮、または寛解は、スコアの定期的な決定およびモニタリングによりモニター可能であり、治療的介入に対する反応は、スコアのモニタリングにより決定可能であり、また、薬剤有効性は、スコアを用いて評価可能である。
【００６９】
被験体の肝疾患スコアを決定する方法は、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０で同定される肝疾患バイオマーカーの１つ以上を用いて生物学的サンプルで実施しうる。この方法は、被験体の肝疾患スコアを決定するためにサンプル中の１つ以上の肝疾患バイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの肝疾患参照レベルとを比較する工程を含みうる。この方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のマーカーを含めて、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０に列挙されたものから選択される任意の数のマーカーを利用しうる。回帰分析などの統計的方法を含めて任意の方法により、複数のバイオマーカーと肝疾患とを相関付けうる。
【００７０】
１種以上のバイオマーカーのレベルを決定した後、このレベルと肝疾患の参照レベルまたは１種以上のバイオマーカーの参照曲線とを比較してサンプル中の１種以上のバイオマーカーのそれぞれの評点を決定しうる。任意のアルゴリズムを用いて評点を統合し、被験体のスコアたとえば肝疾患スコアを生成しうる。アルゴリズムは、バイオマーカーの数、バイオマーカーと肝疾患との相関などを含む肝疾患に関連する任意の因子を考慮しうる。
【００７１】
実施形態では、１種以上のバイオマーカーを変数として含む数学モデルまたは式は、回帰分析たとえば線形重回帰を用いて確立される。限定されるものではないが、例として、確立される式は、以下のものを含みうる。
【００７２】
Ａ＋Ｂ（バイオマーカー１）＋Ｃ（バイオマーカー２）＋Ｄ（バイオマーカー３）＋Ｅ（バイオマーカー４）＝Ｒスコア
【００７３】
Ａ＋Ｂ＊ｌｎ（バイオマーカー１）＋Ｃ＊ｌｎ（バイオマーカー２）＋Ｄ＊ｌｎ（バイオマーカー３）＋Ｅ＊ｌｎ（バイオマーカー４）＝ｌｎＲスコア
【００７４】
式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、定数であり、バイオマーカー１、バイオマーカー２、バイオマーカー３、バイオマーカー４は、アナライト（バイオマーカー）の測定値であり、かつＲスコアは、肝疾患の存在または不在または重症度の尺度である。
【００７５】
式は、１種以上のバイオマーカー、たとえば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０種、またはそれ以上のバイオマーカーを変数として含みうる。
【００７６】
Ｂ．肝疾患の進行／退縮をモニターする方法
肝疾患のバイオマーカーを同定することにより、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターすることも可能である。被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法は、（１）被験体の第１の生物学的サンプルを分析して、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０から選択される１種以上の肝疾患バイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第１のサンプルが第１の時間点で被験体から取得される、工程と、（２）被験体の第２の生物学的サンプルを分析して１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時間点で被験体から取得される、工程と、（３）被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較する工程と、を含む。この方法の結果は、被験体において肝疾患の経過（すなわち、なんらかの変化がある場合、進行または退縮）の指標となる。
【００７７】
表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０ならびにそれらの組合せまたはそれらの任意の一部分のバイオマーカーのすべての組合せを含めて、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０のバイオマーカーの１つ以上のレベルは、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法で決定および使用しうる。たとえば、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０あるいはそれらの任意の一部分のバイオマーカーのすべての組合せを含めて、１種のバイオマーカー、２種以上のバイオマーカー、３種以上のバイオマーカー、４種以上のバイオマーカー、５種以上のバイオマーカー、６種以上のバイオマーカー、７種以上のバイオマーカー、８種以上のバイオマーカー、９種以上のバイオマーカー、１０種以上のバイオマーカーなどのレベルは、被験体の肝疾患の進行／退縮をモニターする方法で決定および使用しうる。
【００７８】
一例として、表２、３、４、５、７、８、１０、および／または１１の１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体においてＮＡＦＬＤの進行／退縮をモニターする方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、３−ヒドロキシイソブチレート、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、２−アミノアジペート、４−メチル−２−オキソペンタノエート、２−ヒドロキシブチレート、プロリルプロリン、およびタウロ−β−ムリコレートのうちの１つ以上は、ＮＡＦＬＤの進行／退縮をモニターするために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、イソロイシン、グルタメート、α−ケトグルタレート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレイン酸）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グリシン、セリン、ロイシン、デオキシコレート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、およびラノステロールからなる群から選択しうる。
【００７９】
他の例として、バイオマーカーのすべての組合せを含めて、表７、８、１０、１１、および／または２０ならびにそれらの任意の組合せの１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体においてＮＡＳＨの進行／退縮をモニターする方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、バリルグリシン、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、フコース、タウリン、γ−グルタミルヒスチジン、３−ヒドロキシイソブチレート、ＣＥ（２４：１）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１４：１）、ＬＰＣ（１４：０）、ＳＭ（１８：１）、ＰＥ（１５：０／２２：４）、ＦＦＡ（２０：０）、ＬＰＣ（１２：０）、ＬＣＥＲ（２６：０）、ＬＰＥ（１４：１）、ＰＩ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（２０：４）、ＤＣＥＲ（２０：０）、ＬＣＥＲ（１４：０）、ＰＥ（１５：０／１８：４）、ＰＩ（１８：０／１６：１）、ＰＥ（１６：０／２２：２）、ＰＥ（Ｐ−１４：１／１８：１）、ＰＣ（１６：０／１４：１）、ＰＥ（１８：０／１７：０）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１８：０）、ＰＥ（Ｐ−１８：０／１６：１）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／１８：０）、ＣＥＲ（２６：０）、ＰＥ（１６：０／１６：０）、ＬＰＥ（１８：４）、およびＰＥ（Ｏ−１８：０／１４：１）のうちの１つ以上は、ＮＡＳＨの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレイン酸）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＬＰＥ（１８：２）、ＬＰＥ（２０：３）、ＰＥ（１４：０／１４：１）、ＰＣ（１４：０／２２：４）、ＰＣ（１５：０／１６：１）、ＰＣ（２０：０／１４：１）、ＰＣ（１７：０／２２：６）、ＰＥ（１５：０／１８：３）、ＰＥ（１７：０／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：２）、ＰＥ（１８：２／２０：３）、ＰＣ（１８：１／２２：６）、ＰＣ（１８：１／２２：５）、ＰＣ（１４：０／１８：４）、ＳＭ（１６：０）、ＣＥ（２４：０）、ＰＣ（１４：０／２０：２）、ＰＣ（１４：０／２０：３）、ＰＣ（１８：１／１８：４）、ＳＭ（１８：０）、ＰＣ（１４：０／１８：２）、およびＰＣ（１４：０／１６：１）からなる群から選択しうる。
【００８０】
他の例として、表１０、１１、１２、１４、１６、１８、および／または２０の１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体において線維症の進行／退縮をモニターする方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、グルタレート（ペンタンジオエート）、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、２−アミノヘプタノエート、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、シクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）、ＣＥＲ（１４：０）、ＤＣＥＲ（１４：０）、ＬＰＥ（１２：０）、ＤＣＥＲ（１８：０）、ＰＥ（１８：０／２２：２）、ＰＥ（Ｐ−１８：０／１８：３）、ＬＰＣ（１７：０）、ＬＰＣ（２２：０）、ＣＥＲ（１８：１）、ＬＣＥＲ（２２：０）、ＰＥ（１６：０／２０：１）、ＣＥ（１５：０）、ＰＥ（１６：０／２２：４）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／２０：２）、ＬＰＣ（２０：０）、ＬＰＥ（２４：０）、ＰＣ（１２：０／１４：１）、ＰＥ（１７：０／２２：２）、ＳＭ（１８：１）、ＣＥＲ（１６：０）、ＬＣＥＲ（２４：０）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／２０：３）、ＣＥ（１７：０）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１８：３）、ＰＥ（Ｐ−１６：０／１６：１）、ＬＰＥ（１４：１）、ＦＦＡ（２４：０）、ＰＥ（Ｏ−１６：０／１８：４）、ＦＦＡ（１５：０）、ＳＭ（１４：０）、ＬＰＣ（２０：２）、ＰＥ（Ｐ−１４：１／１８：１）、ＳＭ（２４：１）、ＰＩ（１８：０／２０：２）、ＬＰＣ（１５：０）、ＰＥ（Ｏ−１８：０／１８：１）、ＰＩ（１８：１／２０：３）、ＰＥ（１６：０／１６：１）、ＤＡＧ（１８：１／２０：３）Ｘ−１９５６１、Ｘ−１８８８９、Ｘ−２１４７１、Ｘ−１１８７１、およびＸ−１２８５０のうちの１つ以上は、被験体における線維症の進行／退縮をモニターするために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレエート）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、イソロイシン、α−ケトグルタレート、ＰＥ（１８：２／２０：２）、ＰＥ（１４：０／１６：１）、ＰＥ（１４：０／１４：１）、ＰＥ（１６：０／１８：１）、ＰＥ（１８：１／１８：１）、ＰＥ（１７：０／２０：４）、ＰＥ（１４：０／２０：５）、ＰＥ（１６：０／２２：５）、ＰＥ（１８：２／２０：３）、ＰＥ（１６：０／２０：４）、ＰＥ（１４：０／１８：２）、ＰＥ（１８：１／１８：４）、ＰＥ（１５：０／２２：６）、ＰＥ（１６：０／１４：０）、ＬＰＣ（１８：３）、ＴＡＧ５５：７−ＦＡ２０：３、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：２、ＴＡＧ５５：７−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５３：５−ＦＡ１８：２、ＴＡＧ５３：７−ＦＡ１８：３、ＴＡＧ５５：８−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５３：５−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５５：６−��Ａ２０：３、ＴＡＧ５７：９−ＦＡ２２：６、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：３、ＴＡＧ５５：６−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：６−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：４−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５３：４−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５１：４−ＦＡ１６：０、ＴＡＧ５３：３−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５１：３−ＦＡ１６：０、ＴＡＧ５１：４−ＦＡ１８：１、ＴＡＧ５６：５−ＦＡ２０：４、ＴＡＧ５６：５−ＦＡ１８：０、ＴＡＧ５６：４−ＦＡ２０：４、ＰＥ（１４：０／１８：１）、ＰＣ（１４：０／１８：４）、ＰＣ（１８：２／２２：５）、ＰＣ（２０：０／２２：５）、ＳＭ（１８：０）、ＣＥ（１８：０）、ＰＣ（１８：２／１８：４）、およびＰＣ（１４：０／２０：２）からなる群から選択しうる。
【００８１】
１種以上のバイオマーカーのレベルの経時変化（もしあれば）は、被験体において肝疾患の進行または退縮の指標となりうる。被験体において肝疾患の経過を特徴付けるために、第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、ならびに／または第１および第２のサンプル中のバイオマーカーのレベルの比較の結果と、肝疾患陽性および肝疾患陰性の参照レベルと、を比較しうる。１種以上のバイオマーカーのレベルが経時的に増加または減少して（たとえば、第１のサンプルと第２のサンプルとを比較して）肝疾患陽性参照レベルに類似してくる（または肝疾患陰性参照レベルに類似しなくなる）ことが比較から示唆されるのであれば、その結果は肝疾患の進行の指標となる。１種以上のバイオマーカーのレベルが経時的に増加または減少して肝疾患陰性参照レベルに類似してくる（または肝疾患陽性参照レベルに類似しなくなる）ことが比較から示唆されるのであれば、その結果は肝疾患の退縮の指標となる。
【００８２】
一実施形態では、評価は、被験体において肝疾患の指標となりかつ経時的にモニター可能である肝疾患スコア（たとえば、ＮＡＳＨスコア、ＮＡＦＬＤスコア、線維症スコア）に基づきうる。第１の時間点のサンプルの肝疾患スコアと少なくとも第２の時間点のサンプルの肝疾患スコアとを比較することにより、肝疾患の進行または退縮を決定することが可能である。被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするかかる方法は、（１）被験体の第１の生物学的サンプルを分析して第１の時間点で被験体から取得した第１のサンプルの肝疾患スコアを決定する工程と、（２）被験体の第２の生物学的サンプルを分析して第２の肝疾患スコアを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時間点で被験体から取得される、工程と、（３）被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターするために第１のサンプルの肝疾患スコアと第２のサンプルの肝疾患スコアとを比較する工程と、を含む。
【００８３】
本明細書に記載のバイオマーカーおよびアルゴリズムは、治療経路を決定する際、たとえば、外科手順（たとえば、腎全摘出または腎部分摘出）などの手順を実行するか、薬剤療法で治療するか、または経過観察法を利用するかを決定する際、医師に指針を与えたりまたは医師を支援したりしうる。
【００８４】
本明細書に記載の他の方法と同様に、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法で行われる比較は、単純比較、１つ以上の統計解析、数学モデル（アルゴリズム）、およびそれらの組合せを含めて種々の技術を用いて行いうる。
【００８５】
この方法の結果は、被験体において肝疾患の進行／退縮の臨床モニタリングを行うのに有用な他の方法（またはその結果）と共に使用しうる。
【００８６】
肝疾患の診断（または診断支援）を行う方法との関連で以上に記載したように、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するために任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを解析しうる。そのほかに、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０あるいはそれらの任意の一部分のバイオマーカーのすべての組合せを含めて、１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体において肝疾患の進行／退縮をモニターする方法で決定および使用しうる。
【００８７】
かかる方法は、肝疾患を有する被験体において肝疾患の経過をモニターするために実施しうるか、または肝疾患を有していない被験体（たとえば、肝疾患を発症する素因を有することが疑われる被験体）において肝疾患の素因のレベルをモニターするために使用しうる。
【００８８】
Ｃ．肝線維症の病期判定方法
肝疾患のバイオマーカーを同定することにより、被験体の肝線維症の病期を決定することが可能である。線維症の病期を決定する方法は、（１）被験体の生物学的サンプルを分析して、表１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８に列挙された１種以上のバイオマーカーのレベルをサンプルで決定する工程と、（２）被験体の肝線維症の病期を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの高ステージ線維症および／または低ステージ線維症の参照レベルとを比較する工程と、を含む。この方法の結果は、被験体の肝疾患の病期の臨床判断に有用な他の方法（またはその結果）と共に使用しうる。たとえば、この方法の結果は、肝線維症の病期に基づいてＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨが疑われると診断された場合、侵襲性追跡検査（たとえば肝生検）の根拠となる患者の指標を提供しうる。
【００８９】
肝疾患の診断（または診断支援）を行う方法との関連で以上に記載したように、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するために任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを解析しうる。
【００９０】
表１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８ならびにそれらの組合せに列挙された１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体の肝線維症の病期を決定する方法で決定しうる。たとえば、表１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８あるいはそれらの任意の一部分のバイオマーカーのすべての組合せを含めて、１種のバイオマーカー、２種以上のバイオマーカー、３種以上のバイオマーカー、４種以上のバイオマーカー、５種以上のバイオマーカー、６種以上のバイオマーカー、７種以上のバイオマーカー、８種以上のバイオマーカー、９種以上のバイオマーカー、１０種以上のバイオマーカーなどのレベルは、被験体の肝疾患の病期を決定する方法で決定しうる。たとえば、次のバイオマーカー、すなわち、グルタレート（ペンタンジオエート）、エピアンドロステロンスルフェート、アンドロステロンスルフェート、Ｉ−ウロビリノーゲン、１６−ヒドロキシパルミテート、フコース、タウリン、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、１６ａ−ヒドロキシＤＨＥＡ３−スルフェート、デヒドロイソアンドロステロンスルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、２−アミノヘプタノエート、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、γ−グルタミルヒスチジン、バリルグリシン、およびシクロ（Ｌ−ｐｈｅ−Ｌ−ｐｒｏ）のうちの１つ以上は、被験体が線維症を有するかの診断または診断支援を行うために単独または組合せで使用しうる。１種以上の追加のバイオマーカーは、任意選択的に、タウロコレート、グリココレート、タウロケノデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グルタメート、ＴＬ１６：１ｎ７（１６：１ｎ７、パルミトレエート）、ＴＬ１６：０（１６：０、パルミチン酸）、イソロイシン、およびα−ケトグルタレートからなる群から選択しうる。
【００９１】
サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定した後、被験体の肝線維症の病期を予測するためにこのレベルと低ステージ肝線維症および／または高ステージ肝線維症の参照レベルとを比較する。高ステージ肝線維症参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、高ステージ肝線維症を有する被験体の指標となる。低ステージ肝線維症参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、低ステージ肝線維症を有する被験体の診断の指標となる。そのほかに、低ステージ肝線維症参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、低ステージ肝線維症を有していない被験体の指標となる。高ステージ肝線維症参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、高ステージ肝線維症を有していない被験体の指標となる。
【００９２】
被験体の肝線維症の病期の決定に使用可能なバイオマーカーセットを同定するために研究を行った。他の実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカーは、被験体において肝線維症の病期を示唆する線維症スコアを医師に提供するために使用可能である。スコアは、バイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組合せの参照レベルが臨床的に有意に変化することに基づく。参照レベルはアルゴリズムから導出可能である。線維症スコアは、正常（すなわち、肝線維症でないステージ０）から高ステージ肝線維症（すなわち、ステージ３〜４）に至るまでの肝線維症の病期を被験体において決定するために使用が可能である。
【００９３】
以上に記載の方法と同様に、１種以上のバイオマーカーのレベルは、単純比較、１つ以上の統計解析、およびそれらの組合せを含めて種々の技術を用いて高ステージ肝線維症および／または低ステージ肝線維症の参照レベルと比較しうる。
【００９４】
Ｄ．  それほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別する方法
肝疾患のバイオマーカーを同定することにより、それほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別するバイオマーカーを同定することも可能である。肝疾患を有する被験体においてそれほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患とを識別する方法は、（１）被験体の生物学的サンプルを分析して、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０に列挙された１種以上のバイオマーカーのレベルをサンプルで決定する工程と、（２）被験体の肝疾患の重症度を決定するためにサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのそれほど重篤でない肝疾患および／またはより重篤な肝疾患の参照レベルとを比較する工程と、を含む。この方法の結果は、被験体の肝疾患の重症度の臨床判断に有用な他の方法（またはその結果）と共に使用しうる。
【００９５】
肝疾患の診断（または診断支援）を行う方法との関連で以上に記載したように、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するために任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを分析しうる。
【００９６】
一例として、バイオマーカーのすべての組合せを含めて、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、および／または２０ならびにそれらの任意の組合せに列挙された１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験体の肝疾患の重症度を決定する方法で決定しうる。一例として、ＮＡＦＬＤは低重症度の肝疾患であり、ボーダーラインＮＡＳＨは中重症度の肝疾患であり、かつＮＡＳＨは高重症度の肝疾患である。他の例として、ステージ０の肝線維症は低重症度の肝疾患であり、ステージ１〜２の肝線維症は中重症度の肝疾患であり、かつステージ３〜４の線維症は高重症度の肝疾患である。他の例として、ＮＡＳＨは高重症度の肝疾患であり、かつ非ＮＡＳＨは低重症度の肝疾患である。他の例として、線維症は高重症度の肝疾患であり、かつ非線維症は低重症度の肝疾患である。他の例として、ＮＡＦＬＤは非ＮＡＦＬＤよりも高重症度の肝疾患である。
【００９７】
サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定した後、被験体の肝疾患の侵攻性を決定するためにこのレベルとそれほど重篤でない肝疾患および／またはより重篤な肝疾患の参照レベルとを比較する。より重篤な肝疾患参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、より重篤な肝疾患を有する被験体の診断の指標となる。それほど重篤でない肝疾患参照レベルに一致するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、それほど重篤でない肝疾患を有する被験体の指標となる。そのほかに、それほど重篤でない肝疾患参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、それほど重篤でない肝疾患を有していない被験体の指標となる。より重篤な肝疾患参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（とくに統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、より重篤な肝疾患を有していない被験体の指標となる。
【００９８】
それほど重篤でない肝疾患とより重篤な肝疾患との識別に使用可能なバイオマーカーセットを同定するために研究を行った。他の実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカーは、被験体において肝疾患の重症度を示唆する肝疾患スコアを医師に提供するために使用可能である。スコアは、バイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組合せの参照レベルが臨床的に有意に変化することに基づく。参照レベルはアルゴリズムから導出可能である。肝疾患スコアは、正常（すなわち肝疾患でない）からより重篤な肝疾患に至るまでの肝疾患の重症度を被験体において決定するために使用可能である。
【００９９】
以上に記載の方法と同様に、１種以上のバイオマーカーのレベルは、単純比較、１つ以上の統計解析、およびそれらの組合せを含む種々の技術を用いて、より重篤な肝疾患および／またはそれほど重篤でない肝疾患の参照レベルと比較しうる。
【０１００】
被験体が肝疾患を有するかの診断（または診断支援）を行う方法と同様に、被験体の肝疾患の重症度を決定する方法は、生物学的サンプルを分析して１種以上の非バイオマーカー化合物のレベルを決定する工程をさらに含みうる。
【０１０１】
ＩＩＩ．他の方法
本明細書で考察されたバイオマーカーの他の使用方法もまた企図される。たとえば、米国特許第７，００５，２５５号明細書、米国特許第７，３２９，４８９号明細書、米国特許第７，５５３，６１６号明細書、米国特許第７，５５０，２６０号明細書、米国特許第７，５５０，２５８号明細書、米国特許第７，６３５，５５６号明細書、米国特許出願公開第１１／７２８，８２６号明細書、米国特許出願公開第１２／４６３，６９０号明細書、および米国特許出願公開第１２／１８２，８２８号明細書に記載の方法は、本明細書に開示されたバイオマーカーの１つ以上を含む低分子プロファイルを用いて実施しうる。
【０１０２】
本明細書に列挙された方法のいずれでも、使用されるバイオマーカーは、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８の０．０５未満のｐ値を有するバイオマーカーから選択しうる。本明細書に記載方法のいずれで使用されるバイオマーカーも、肝疾患で減少するか（対照と比較して）、または高ステージ線維症で減少するか（対照または低ステージ線維症と比較して）、またはより重篤な状態で少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％（すなわち不在）減少する（対照もしくはそれほど重篤でない状態と比較して）、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８のバイオマーカー、ならびに／あるいは肝疾患で増加するか（対照と比較して）、高ステージ線維症で増加するか（対照または低ステージ線維症と比較して）、またはより重篤な状態で少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、もしくはそれ以上増加する（対照もしくはそれほど重篤でない状態と比較して）、表２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、および／または１８のバイオマーカーから選択しうる。
【実施例】
【０１０３】
限定することを意図したものではないが以下の例示的な実施例により本発明をさらに説明する。
【０１０４】
Ｉ．一般的方法
Ａ．サンプル調製
サンプルは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製の自動ＭｉｃｒｏＬａｂ  ＳＴＡＲ（登録商標）システムを用いて調製した。ＱＣ目的で抽出プロセス時の第１の工程前に回収標準を添加した。低分子の最大回収を可能にしつつタンパク質画分を除去するために、メタノール抽出を用いてサンプル調製を行った。得られた抽出物は５つの部分に分けた。すなわち、１つは正イオンモードエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つは負イオンモードエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つはＬＣ極性プラットフォーム用、１つはＧＣ−ＭＳによる分析用であり、１つのサンプルは予備として保存した。有機溶媒を除去するためにサンプルを窒素下でＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）上にしばらく配置した。ＬＣ用としてサンプルを窒素下で一晩貯蔵した。ＧＣ用としてサンプルを真空下で一晩乾燥させた。次いで、ＬＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＭＳのいずれかの適切な装置に合わせてサンプルを調製した。
【０１０５】
Ｂ．超高性能液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
ＬＣ／ＭＳ解析では、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ−ＩＩ）源および３５，０００の質量分解能で操作されるＯｒｂｉｔｒａｐ質量アナライザーと連動させてＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分析計を使用した。サンプル抽出物を乾燥させ、次いで、注入およびクロマトグラフィー一貫性を保証するために一定濃度で８種以上の注入標準をそれぞれ含有した酸性または塩基性のＬＣ適合性溶媒で再構成した。個別の専用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８−２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を用いて２つの独立した注入を行って、一方のアリコートは酸性正イオン最適化条件を用いて分析し、他方のアリコートは塩基性負イオン最適化条件を用いて分析した。酸性条件で再構成された抽出物は、０．１％ギ酸を含有する水およびメタノールを用いてＣ１８カラムからグラジエント溶出させた。塩基性抽出物は、６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有するメタノールおよび水を用いてＣ１８から同様に溶出させた。第３のアリコートは、１０ｍＭギ酸アンモニウムを有する水およびアセトニトリルからなるグラジエントを用いてＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨアミド２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）から溶出させた後、負イオン化により分析した。ＭＳ分析では、動的排除を用いてＭＳスキャンとデータ依存性ＭＳ２スキャンとを交互に行い、スキャン範囲は８０〜１０００ｍ／ｚであった。
【０１０６】
Ｃ．ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）
ＧＣ／ＭＳ解析では、少なくとも２４時間にわたり真空乾燥下でサンプルを再乾燥させた後、ビストリメチル−シリル−トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）を用いて乾燥窒素下で誘導体化した。ＧＣカラムは、２０ｍ×０．１８ｍｍＩＤであり、５％フェニル、９５％ジメチルシリコーン相を用いた。温度ランプは、１８分間で６０℃から３４０℃までであった。サンプルは、単位質量分解能で電子衝撃イオン化を用いてＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ高速スキャン単一四重極質量分析計により分析した。装置は、質量分解能および質量確度に関して毎日調整および校正を行った。
【０１０７】
Ｄ．脂質分析
ＧＣ−ＦＩＤ
いくつかの実施例では、クロロホルム：メタノール（２：１ｖ／ｖ）を用いてＦｏｌｃｈらの方法（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２２６：４９７−５０９）により基準内部標準の存在下で脂質を抽出した。１００℃、窒素雰囲気下、密閉バイアル内、メタノール中１％硫酸で脂質を４５分間エステル交換した。得られた脂肪酸メチルエステルを０．０５％ブチル化ヒドロキシトルエン含有ヘキサンとの混合物から抽出し、ヘキサン抽出物を窒素下で密閉することによりＧＣに備えた。３０ｍ  ＤＢ８８キャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびフレームイオン化検出器を備えたキャピラリーＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣ）により、脂肪酸メチルエステルを分離および定量した。ピーク面積を内部標準のものと比較することにより、それぞれの脂質の絶対濃度を決定する。
【０１０８】
ＴＲＵＥＭＡＳＳ複合脂質パネル
いくつかの実施例では、内部標準の存在下でメタノール：ジクロロメタンによりサンプルから脂質を抽出した。窒素下で抽出物を濃縮し、０．２５ｍＬの１０ＭＭ酢酸アンモニウム入りジクロロメタン：メタノール（５０：５０）で再構成した。ナノＰＥＥｋチューブおよびＳｃｉｅｘ  ＳｅｌｅｘＩｏｎ−５５００ＱＴＲＡＰを備えたＳｈｉｍａｚｄｕ  ＬＣでインフュージョンＭＳ分析を行うために、抽出物をインサートに移してバイアル内に配置した。ポジティブモードおよびネガティブモードの両方のエレクトロスプレーによりサンプルを分析した。５５００ＱＴＲＡＰスキャンは、合計１，１００ＭＲＭ超のＭＲＭモードで行う。標的化合物とその割当て内部標準とのピーク面積比を求め、次いで、サンプルに添加された内部標準の濃度を乗算することにより、個別の脂質種を定量した。クラス内のすべての分子種の合計から脂質クラス濃度を計算し、個別の脂肪酸が各クラスに占める割合を計算することにより脂肪酸組成を決定した。
【０１０９】
Ｅ．データ処理および解析
各装置（ＧＣ−ＦＩＤを除く）上の各生物学的マトリックスデータセットに対して、各内部標準でピーク面積の相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算し、抽出効率、装置性能、カラム健全性、クロマトグラフィー、および質量校正を確認した。これらの内部標準のいくつかは、保持指数（ＲＩ）マーカーとして機能し、保持時間およびアライメントに関してチェックした。ＵＰＬＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳシステムに付随するソフトウェアの修正版は、ピーク検出および積分に使用した。この処理の出力は、ｍ／ｚ比、保持時間、および曲線下面積値のリストを生成した。ソフトウェアは、シグナル対ノイズ比、高さ、および幅の閾値を含むピーク検出の基準を特定した。
【０１１０】
ＱＣサンプルを含む生物学的データセットは、固定ＲＩ値が割り当てられた内部標準を利用する保持指数に基づいて、クロマトグラフィーによりアライメントさせた。実験ピークのＲＩは、値が変化しないフランキングＲＩマーカー間の線形当てはめを仮定することにより決定される。ＲＩに基づく利益は、サンプルｐＨやカラム製造後年数などの系統誤差により引き起こされる保持時間ドリフトを補正することである。各化合物のＲＩは、その２つの外側保持マーカーとの溶出関係に基づいて指定される。インハウスソフトウェアパッケージを用いて、基準標準およびルーチン検出未知化合物のインハウスライブラリー（化学ライブラリー）に対して積分アライメントピークをマッチングさせた。このライブラリーは、ポジティブ、ネガティブ、またはＧＣ−ＭＳデータ収集法に特有なものである。マッチングは、ＬＴＱおよびＤＳＱデータについて０．４ｍ／ｚ以内のライブラリー基準標準に対するプロスペクティブ同定および実験的プレカーサー質量マッチングで１５０ＲＩ単位以内の保持指数値に基づくものであった。実験的ＭＳ／ＭＳは、基準標準のライブラリースペクトルと比較してフォワードスコアおよびリバーススコアを割り当てた。完全フォワードスコアは、実験スペクトル中のすべてのイオンが適正比で基準標準のライブラリーに見いだされることを示唆し、完全リバーススコアは、すべての基準標準ライブラリーイオンが適正比で実験スペクトル中に存在することを示唆しよう。フォワードスコアおよびリバーススコアを比較して、提案されたマッチングにＭＳ／ＭＳフラグメント化スペクトルスコアを与えた。次いで、すべてのマッチングを分析者が手作業で精査して、以上の基準に基づいて各コールの合格または不合格を決定した。しかしながら、分析者による手作業の精査は必要とされない。いくつかの実施形態では、マッチングプロセスは完全自動化される。
【０１１１】
化学ライブラリー、指定化合物およびルーチン検出未知化合物を同定するための積分アライメントピークのマッチング方法、ならびにサンプル中の低分子を同定するためのコンピューター可読コードに関するさらなる詳細は、米国特許第７，５６１，９７５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。
【０１１２】
Ｆ．品質管理
生物学的サンプルから個別のサンプルのそれぞれのアリコートを組み合わせて技術的レプリケートを作製し、以上に記載したように抽出した。このプールサンプルの抽出物を各装置の各データセットに対して６回注入し、プロセス変動を評価した。追加の品質管理として、５つの水アリコートも各装置のサンプルセットの一部として抽出し、アーチファクト同定のプロセスブランクとして利用した。ＱＣサンプルはすべて、抽出効率および装置性能を評価するためにならびにイオン同定のための保持指数マーカーとして利用するために、装置内部標準を含んでいた。標準は、同位体標識されたものであるか、さもなければ内因性イオンの検出を妨害しないように選択された外因性分子であった。
【０１１３】
Ｇ．統計解析
欠測値は、もしあれば、その特定化合物で観測された最小値であるとした。ＮＡＦＬＤ群と非ＮＡＦＬＤ群との間の差を解析するために混合効果モデルを使用し、代謝物と臨床パラメーターとの間の相関も混合効果モデルで評価した。統計解析は自然対数変換データで行った。ＮＡＦＬＤ群と非ＮＡＦＬＤ群との分離および線維症の病期に基づく群の分離を行うグローバル生化学的プロファイルの能力を決定するために、ランダムフォレスト（ＲＦ）解析を行った。ＮＡＦＬＤと非ＮＡＦＬＤとの識別および線維症の病期の識別を行う個別の代謝物バイオマーカーおよびいくつかの臨床パラメーターの性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。線維症と非線維症との識別およびＮＡＳＨと非ＮＡＳＨとの識別を行う個別の代謝物バイオマーカーの性能を評価するために、χ２分析を含むロジスティック回帰およびＡＵＣを使用した。複数のバイオマーカーの組合せ（バイオマーカーパネル）の性能を分析するために、多重ロジスティック回帰モデリングを行った。
【０１１４】
実施例１．ヒト血清中のＮＡＦＬＤの代謝物バイオマーカー
脂肪酸、コレステロール代謝脂質、およびビタミンＥに対して４つのグローバル代謝プロファイリング質量分析プラットフォームさらにはＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて、ＮＡＦＬＤ（ＭＲＩイメージングで＞５％の脂肪症により定義される）の３６名の被験体およびＮＡＦＬＤでない１１８名の被験体の血清サンプルを分析した。合計７７０種の指定代謝物が患者サンプルで検出された。年齢、性別、人種、民族、身長／体重／体重指数（ＢＭＩ）、喫煙歴、糖尿病歴、グルコース、アルブミン、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ、総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、トリグリセリド、フェリチン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、ＨＢＡ１ｃ、白血球（ＷＢＣ）数、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、血小板数、プロトロンビン時間、国際標準比（ＩＮＲ）、インスリン、および肝臓イメージングパラメーター、たとえば、ＭＲＩプロトン密度脂肪分率（ＭＲＩ  ＰＤＦＦ）およびＭＲＥ（エラストグラフィー）を含む臨床パラメーターが、被験体に対して提供された。ＮＡＦＬＤまたは非ＮＡＦＬＤの臨床判断にＭＲＩ  ＰＤＦＦのデータを使用した。
【０１１５】
ＮＡＦＬＤ群と非ＮＡＦＬＤ群とを分離するグローバル生化学的プロファイルの能力を決定するために、ランダムフォレスト（ＲＦ）解析を行った。ＲＦは、多数の決定木に基づく不偏かつ教師付き分類技術である。ＮＡＦＬＤ群と非ＮＡＦＬＤ群とを用いて全研究コホート（ｎ＝１５４）の血清代謝プロファイルに基づくＲＦ分類分析を行ったところ、８３．１％の確度で２つの群に分かれた。すべての指定代謝物を用いて、８３．９％（１１８名中９９名）の非ＮＡＦＬＤおよび８０．６％（３６名中２９名）のＮＡＦＬＤの被験体は適正に分類され、全体で８３．１％の予測確度であった。
【０１１６】
ＮＡＦＬＤと非ＮＡＦＬＤとを識別するいくつかの臨床パラメーターの性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。結果は表１に示される。この患者コホートではＭＲＩ  ＰＤＦＦを用いてＮＡＦＬＤを診断したので、そのパラメーターのＡＵＣは１．０００である。
【０１１７】
【表１】
2018502286.tif 000003
【０１１８】
個別の代謝物がＮＡＦＬＤ群と非ＮＡＦＬＤ群とをどの程度良好に識別したかを評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。サンプル中に検出された７７０種すべての指定代謝物で取得した測定値を用いて、ロジスティック回帰分析を行った。ＮＡＦＬＤ患者サンプルと非ＮＡＦＬＤ患者サンプルとを識別する＞０．７００のＡＵＣを有する代謝物は表２に示されている。
【０１１９】
【表２】
2018502286.tif 000004
【０１２０】
【表３】
2018502286.tif 000005
【０１２１】
バイオマーカーの種々の組合せ（「バイオマーカーパネル」）の性能を分析するために、多重ロジスティック回帰モデリングを行った。モデルに含める変数（たとえば、代謝物バイオマーカー）の数を決定するために、リーブワンアウト交差検証法を使用した。この方法では、データセットから１つのサンプルを除去して残りのデータにモデルを当てはめ、次いで、当てはめたモデルを用いて残されたサンプルを予測する。この方法は、将来的性能の推定を提供する。ここで、より多くの変数をモデルに加えたときの相関の変化を評価するために、臨床パラメーターＭＲＩプロトン密度脂肪分率（ＭＲＩ  ＰＤＦＦ）を使用した。化合物の数が増加するにつれて、最適数に達するまで相関の平均Ｒ２値は増加することから、変数の選択は多かれ少なかれ安定であることが示唆される。この分析モデルでは、少なくとも２変数を用いたモデルで相関が増加し、５変数で相関がピークとなる。図１は、相関分析の結果のグラフを示している。マーカーの数はＸ軸上にプロットされ、ＭＲＩ  ＰＤＦＦを用いた平均相関はｙ軸上にプロットされる。この分析に基づいて、４変数および５変数のモデルの性能を評価した。４変数および５変数を用いたモデルは以下に例証される。５個を超える変数をモデルに含めうることは、図１に例示された結果から明らかである。
【０１２２】
一例として、ＮＡＦＬＤの患者とＮＡＦＬＤでない個体とを識別する１３種の代謝物バイオマーカーで得られた測定値を用いて、４変数および５変数のモデルによる多重ロジスティック回帰モデリングを行った。これらのバイオマーカーは、グリシン、セリン、ロイシン、４−メチル−２−オキソペンタノエート、３−メチル−２−オキソバレレート、バリン、３−メチル−２−オキソブチレート、２−ヒドロキシブチレート、５−メチルチオアデノシン、プロリルプロリン、ラノステロール、タウロ−β−ムリコレート、およびデオキシコレートを含んでいた。列挙された１３種の代謝物を用いて生成された４変数モデルは７１５個存在した。これらのモデルのうち２０４個は、ＡＵＣが＞０．８００であった。１３種の列挙された代謝物を用いて生成された５変数モデルは１２８７個存在した。これらのモデルのうち４９３個は、ＡＵＣが＞０．８００であった。表３は、最高水準のＡＵＣを有する３０個の４変数モデルを示している。表４は、上位３０個まで５変数モデルを示している。表５は、４変数および５変数のモデルで使用した１３種の代謝物およびＡＵＣ＞０．８００を有するモデルでの所与の代謝物の存在率（パーセント単位）を示している。たとえば、５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）は、ＡＵＣ＞０．８００を有する２０４個すべての４変数モデルの９２．２％で同定され、かつＡＵＣ＞０．８００を有する４９３個すべての５変数モデルの９３．５％で同定された。
【０１２３】
【表４】
2018502286.tif 000006
【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
【表８】
2018502286.tif 000010
【０１２８】
実施例２．ヒト血清中のＮＡＳＨの代謝物バイオマーカー
脂肪酸、コレステロール代謝脂質、およびビタミンＥに対して４つのグローバル代謝プロファイリング質量分析プラットフォームさらにはＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて、ＮＡＦＬＤの１８名の被験体およびボーダーラインＮＡＳＨの１８名の被験体の血清サンプルを分析した。患者の生検サンプルの組織学的分析を用いて、すべての診断を熟練病理学者により決定した。合計７２１種の指定代謝物がこのコホートのサンプルで検出された。年齢、性別、身長／体重／体重指数（ＢＭＩ）、糖尿病歴、グルコース、インスリン、ＨＢＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、トリグリセリド、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、脂肪症、小葉炎症、門脈炎症、バルーニング、およびＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）を含む臨床パラメーターが、被験体に対して提供された。
【０１２９】
ＮＡＳＨとボーダーラインＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤとを識別するいくつかの臨床パラメーターの性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。結果は表６に示される。
【０１３０】
【表９】
2018502286.tif 000011
【０１３１】
混合効果モデルを用いて７２１種すべての指定代謝物を分析した。ＮＡＳＨサンプルとＮＡＦＬＤサンプルとの比較で有意に変化した（ｐ＜０．０５、ｑ＜０．１）代謝物は表７に示される。表７に示される他の比較は、ベースライン（ＢＬ）ＮＡＳＨ対ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ対ＢＬ  ＮＡＳＨである。表７は、各代謝物に対して、代謝物の生化学名、基準標準のインハウス化学ライブラリー中のバイオマーカー化合物の内部識別子（ＣｏｍｐＩＤ）、各比較でのバイオマーカーの変化倍率（ＦＣ）、異なるサンプルタイプ中の平均レベルと対比される１つのサンプルタイプ中のバイオマーカーの平均レベルの比（たとえば、ＮＡＳＨ対ＮＡＦＬＤ）、およびバイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値を含む。
【０１３２】
【表１０】
2018502286.tif 000012
【０１３３】
【表１１】
2018502286.tif 000013
【０１３４】
【表１２】
2018502286.tif 000014
【０１３５】
個別の代謝物がＮＡＳＨ群とボーダーラインＮＡＳＨ群およびＮＡＦＬＤ群とをどの程度良好に識別するかを評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。７２１種すべての指定代謝物でロジスティック回帰分析を行った。ＮＡＳＨ患者サンプルとボーダーラインＮＡＳＨ患者サンプルおよびＮＡＦＬＤ患者サンプルとを識別する＞０．６２０のＡＵＣを有する代謝物は表８に示されている。ボールド体の代謝物は、ＮＡＳＨ患者サンプルとＮＡＦＬＤ患者サンプルとを比較してｐ＜０．０５、ｑ＜０．１で有意である。
【０１３６】
【表１３】
2018502286.tif 000015
【０１３７】
【表１４】
2018502286.tif 000016
【０１３８】
実施例３．ヒト血清中の線維症の代謝物バイオマーカー
肝生検診断されたＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤの１５２名の被験体の血清サンプルを分析に使用した。患者の生検サンプルの組織学的分析を用いて、すべての診断を熟練病理学者により決定した。線維症の病期（ステージ０、最小重症度、ステージ１〜２、中重症度、ステージ３〜４、高重症度）に基づく疾患重症度に従って、患者サンプルを３群に分けた。脂肪酸、コレステロール代謝脂質、およびビタミンＥに対して４つのグローバル代謝プロファイリング質量分析プラットフォームさらにはＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて、すべてのサンプルを分析した。合計７２１種の指定代謝物がサンプルコホートで検出された。年齢、性別、身長／体重／体重指数（ＢＭＩ）、糖尿病歴、グルコース、インスリン、ＨＢＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、トリグリセリド、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、脂肪症、小葉炎症、門脈炎症、バルーニング、およびＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）を含む臨床パラメーターが、被験体に対して提供された。
【０１３９】
線維症のステージ３〜４（高重症度）とステージ１〜２（中重症度）およびステージ０（低重症度）とを識別する臨床パラメーターの性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。結果は表９に示される。
【０１４０】
【表１５】
2018502286.tif 000017
【０１４１】
混合効果モデルを用いて、サンプルで検出された７２１種の指定代謝物の測定レベルを分析した。ステージ３＋４（高重症度）線維症サンプルとステージ０（低重症度）線維症サンプルとの比較で有意に変化した（ｐ＜０．０５、ｑ＜０．１）代謝物は表１０に示されている。表１０に示される他の比較は、ステージ３＋４（高重症度）対ステージ１＋２（中重症度）およびステージ１＋２対ステージ０である。表１０は、各代謝物に対して、代謝物の生化学名、基準標準のインハウス化学ライブラリー中のバイオマーカー化合物の内部識別子（ＣｏｍｐＩＤ）、異なるサンプルタイプ中の平均レベルと対比される１つのサンプルタイプ中のバイオマーカーの平均レベルの比である各比較でのバイオマーカーの変化倍率（ＦＣ）、およびバイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値を含む。
【０１４２】
【表１６】
2018502286.tif 000018
【０１４３】
【表１７】
2018502286.tif 000019
【０１４４】
【表１８】
2018502286.tif 000020
【０１４５】
【表１９】
2018502286.tif 000021
【０１４６】
【表２０】
2018502286.tif 000022
【０１４７】
【表２１】
2018502286.tif 000023
【０１４８】
個別の代謝物がステージ３〜４線維症群とステージ１〜２線維症群およびステージ０線維症群とをどの程度良好に識別するかを評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。サンプル中に検出された７２１種すべての指定代謝物で取得した測定値を用いて、ロジスティック回帰分析を行った。ステージ３〜４線維症患者サンプルとステージ１〜２線維症患者サンプルおよびステージ０線維症患者サンプルとを識別する＞０．６２０のＡＵＣを有する代謝物は表１１に示されている。
【０１４９】
【表２２】
2018502286.tif 000024
【０１５０】
【表２３】
2018502286.tif 000025
【０１５１】
【表２４】
2018502286.tif 000026
【０１５２】
【表２５】
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【０１５３】
実施例４．ヒト血清中の線維症の代謝物バイオマーカー
他の例として、非アルコール性脂肪肝疾患のスペクトルにわたる２００名の被験体の血清サンプルを分析した。線維症の病期（ステージ０、線維症でない（Ｎ＝１２）、ステージ１、低重症度（Ｎ＝３８）、ステージ２、中重症度（Ｎ＝１００）、ステージ３、高重症度（Ｎ＝４２）、ステージ４、硬変（Ｎ＝８））に基づく疾患重症度に従って、患者サンプルを５群に分けた。脂肪酸、コレステロール代謝脂質、およびビタミンＥに対して４つのグローバル代謝プロファイリング質量分析プラットフォームさらにはＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて、すべてのサンプルを分析した。合計７９０種の指定代謝物および３６１種の非指定代謝物がサンプルコホートで検出された。年齢、性別、人種、民族、身長／体重／体重指数（ＢＭＩ）、喫煙歴、糖尿病歴、脂肪症、線維症、小葉炎症、門脈炎症、肝細胞性バルーニング、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）、空腹時グルコース、空腹時インスリン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ、総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、トリグリセリド、ＨＢＡ１ｃ、およびヘモグロビン（ＨＧＢ）を含む臨床パラメーターが、被験体に対して提供された。
【０１５４】
これらの被験体で線維症の病期判定を行うために単独または組合せで使用した、サンプル中に検出された代謝物の統計的有意性および予測性能は、ｔ検定、ＡＵＣ計算、ロジスティック回帰、およびランダムフォレスト解析を用いて評価した。比較のために、通常測定される臨床パラメーターである年齢、２型糖尿病、ＢＭＩ、ＨＤＬコレステロール、性別、フルクトース、およびアルコール使用歴の性能もまた、単独または組合せで評価した。これらの解析の結果はこの実施例に提供される。これらの結果から、多くの代謝物は単独で、臨床パラメーターを単独で用いて得られるよりも高いＡＵＣを有し、いくつかの場合には、臨床パラメーターの組合せよりも性能が優れていることが示される。さらに、我々の解析では、臨床パラメーターの組合せのいずれよりも良好な予測性能を有する代謝物の組合せが同定された。
【０１５５】
サンプル中に検出された１１５１種の代謝物の測定レベルは、より重篤な線維症の被験体から採取されたサンプルで測定されたレベルと、それほど重篤でない線維症の被験体または線維症でない被験体から採取されたサンプルで測定されたレベルと、を比較するために、ウェルチの２サンプルｔ検定を用いて解析した。研究で検出された代謝物は表１２に示されている。表１２に示される比較は、ステージ２〜４対ステージ０〜１、ステージ３〜４対ステージ１〜２、ステージ３〜４対ステージ０〜１、ステージ４対ステージ０、ステージ３〜４対ステージ０、そしてステージ１〜２対ステージ０、ステージ３〜４対ステージ１〜２、ステージ３〜４対ステージ２、およびステージ２対ステージ０〜１である。表１２は、各代謝物に対して、代謝物の生化学名、基準標準のインハウス化学ライブラリー中のバイオマーカー化合物の内部識別子（ＣｏｍｐＩＤ）、異なるサンプルタイプ中の平均レベルと対比される１つのサンプルタイプ中のバイオマーカーの平均レベルの比である各比較でのバイオマーカーの変化倍率（ＦＣ）、およびバイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値を含む。ボールド体のフォントの変化倍率値は、所与の比較でｐ値が０．０５未満であったことを示唆する。
【０１５６】
【表２６】
2018502286.tif 000028
【０１５７】
【表２７】
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【０１５８】
【表２８】
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【０１５９】
【表２９】
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【０１６０】
【表３０】
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【０１６１】
【表３１】
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【０１６２】
【表３２】
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【０１６３】
【表３３】
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【０１６４】
【表３４】
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【０１６５】
【表３５】
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【０１６６】
【表３６】
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【０１６７】
【表３７】
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【０１６８】
【表３８】
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【０１６９】
【表３９】
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【０１７０】
【表４０】
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【０１７１】
【表４１】
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【０１７２】
【表４２】
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【０１７３】
【表４３】
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【０１７４】
【表４４】
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【０１７５】
【表４５】
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【０１７６】
線維症ステージ０〜１と線維症ステージ２〜４との識別
線維症のステージ０〜１サンプルとステージ２〜４サンプルとを識別するいくつかの通常測定される臨床パラメーター（年齢、２型糖尿病、ＢＭＩ、ＨＤＬコレステロール、性別、フルクトース、およびアルコール使用歴）の性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）の解析を行った。個別の臨床パラメーターで計算したＡＵＣは、ＢＭＩでの０．５０７９から２型糖尿病での０．６０９６までの範囲内であった。データは表１３に示されている。これらの７つの臨床パラメーターでは合計で１２７通りの組合せが可能であり、これらの臨床パラメーターを用いて１２７通りのすべての可能な組合せモデルを評価した。得られた最も高いＡＵＣは０．６６６３であり、それは７つの臨床パラメーターをすべて当てはめたモデルから導出された。
【０１７７】
【表４６】
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【０１７８】
また、線維症ステージ０〜１サンプルと線維症ステージ２〜４サンプルとを識別する個別の代謝物の性能を評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。サンプル中に検出された１１５１種すべての代謝物で得られた測定値で、ロジスティック回帰分析を行った。線維症ステージ０〜１患者サンプルと線維症ステージ２〜４患者サンプルとを識別する＞０．６００のＡＵＣを有する代謝物を同定した。これらは表１４に示されている。これらのうち、１１４種の代謝物は、最良臨床パラメーターの２型糖尿病で得られた０．６０９６のＡＵＣよりも大きい個別のＡＵＣを有する。さらに、８種の代謝物、すなわち、Ｘ−１４６６２、リボース、Ｉ−ウロビリノーゲン、Ｘ−１２８５０、マレート、グルタレート（ペンタンジオエート）、２−アミノヘプタノエート、およびＸ−１５４９７は、年齢、２型糖尿病、ＢＭＩ、ＨＤＬコレステロール、性別、フルクトース、およびアルコール使用歴の７つすべての臨床パラメーターを使用する最良モデルから計算されたＡＵＣである０．６６６３よりも大きいＡＵＣを有する。代謝物およびデータは表１４に列挙されている。
【０１７９】
Ｘ−１４６６２、リボース、Ｉ−ウロビリノーゲン、Ｘ−１２８５０、マレート、グルタレート（ペンタンジオエート）、２−アミノヘプタノエート、およびＸ−１５４９７（ＡＵＣ＞０．６６６３を有する８種の代謝物）を用いて合計で２５５通りの組合せが可能であり、線維症ステージ０〜１と線維症ステージ２〜４とを分けるために２５５通りのすべての可能な組合せモデルを評価した。８種の代謝物のすべての可能なモデルの組合せを当てはめて得られる各モデルで計算されたＡＵＣは、０．６５２３〜０．７７７４の範囲内であり、データは図２に示されている。すべての可能なモデルの組合せの平均ＡＵＣは０．７５であり、臨床パラメーターのみからなる任意のモデルを用いて得られる最も高いＡＵＣよりも高い。
【０１８０】
【表４７】
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【０１８１】
【表４８】
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【０１８２】
【表４９】
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【０１８３】
また、ランダムフォレスト解析を用いて線維症ステージ０〜１または線維症ステージ２〜４に基づいて被験体を分類するのに有用な統計モデルを誘導するために、代謝物バイオマーカーを使用した。ランダムフォレストの結果から、サンプルは７４％の確度で分類されたことが示される。陽性に分類されたすべての被験体に占める真陽性の被験体（すなわち、線維症ステージ２〜４の被験体）の割合である陽性的中率は、８４％であった。このランダムフォレストからランダムフォレストモデルを用いて新しい観測をどれくらい正確に予測できるか（たとえば、サンプルがステージ０〜１線維症またはステージ２〜４線維症の被験体のものであるか）の推定を与える「アウトオブバッグ」（ＯＯＢ）エラー率は、２６％であった。このモデルでは、新しい被験体セットで使用した場合、線維症ステージ０〜１の被験体のアイデンティティーは５４％の確率で適正に予測可能であり、線維症ステージ２〜４の被験体のアイデンティティーは８１％の確率で予測可能であると推定された。
【０１８４】
ランダムフォレスト変数選択手順に基づいて、線維症のステージ０〜１またはステージ２〜４を予測するモデルまたはアルゴリズムの構築に確実に有意であると考えられる代謝物を同定し、重要度によりランク付けした。この解析に従って群を識別するうえで最重要の代謝物は、リボース、Ｘ−１４６６２、イソロイシン、Ｉ−ウロビリノーゲン、グルタレート（ペンタンジオエート）、Ｘ−１２２６３、Ｘ−１９５６１、２−アミノヘプタノエート、Ｘ−１８９２２、γ−グルタミルイソロイシン、Ｘ−１２８５０、１−アラキドニルグリセロール、Ｘ−１７１４５、マレエート（ｃｉｓ−ブテンジオエート）、マレート、Ｘ−２１８９２、Ｎ−メチルプロリン、Ｘ−１２７３９、Ｘ−２１４７４、トレオネート、Ｘ−１１８７１、グルタメート、Ｘ−１５４９７、１−ステアロイルグリセロホスホイノシトール、Ｘ−２１６５９、３−ヒドロキシオクタノエート、３−メチルグルタコネート、Ｘ−１４３０２、Ｘ−１２８１２およびフマレートである。ランダムフォレスト解析により同定された代謝物は、４種（Ｘ−２１６５９、Ｘ−２１４７４、３−メチルグルタコネートおよびＸ−１２８１２）を除いてすべて、臨床パラメーターの２型糖尿病のＡＵＣである０．６０９６よりも大きい個別のＡＵＣを有していた。
【０１８５】
線維症ステージ０〜２と線維症ステージ３〜４との識別
曲線下面積（ＡＵＣ）の決定およびロジスティック回帰より、線維症のステージ０〜２とステージ３〜４とを識別する臨床パラメーターの性能を評価した。個別の臨床パラメーターのＡＵＣは、０．５０５６（性別）から０．６１８３（２型糖尿病）までの範囲内であり、データは表１５に示されている。７つの臨床パラメーターでは合計で１２７通りの組合せが可能であり、これらの臨床パラメーターを用いて１２７通りのすべての可能な組合せモデルを誘導した。７つの臨床パラメーターをすべて当てはめたモデルから最も高いＡＵＣが得られ、そのＡＵＣは０．６６８６であった。
【０１８６】
【表５０】
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【０１８７】
また、個別の代謝物が線維症ステージ０〜２のサンプルと線維症ステージ３〜４のサンプルとをどの程度良好に識別したかを評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。サンプル中に検出された１１５１種すべての代謝物で得られた測定値で、ロジスティック回帰分析を行った。６１種の代謝物は、最良臨床パラメーターの２型糖尿病で得られた０．６１８３のＡＵＣよりも大きい個別のＡＵＣを有する。３種の代謝物（γ−トコフェロール、タウロコレート、およびキシリトール）は、評価した臨床パラメーターの７つすべてを用いて得られたモデルから計算された最も高いＡＵＣである０．６６８６よりも大きい個別のＡＵＣを有する。データは表１６に示されている。これらの３種の代謝物（γ−トコフェロール、タウロコレート、およびキシリトール）を用いて線維症ステージ０〜２と線維症ステージ３〜４とを分けるすべての可能な組合せモデルを生成した。３種の代謝物をすべて含有するモデルを用いて計算された最も高いＡＵＣは０．７１３１であった。これは臨床パラメーターのみを用いた０．６１８３のＡＵＣよりも改善されている。
【０１８８】
【表５１】
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【０１８９】
また、ランダムフォレスト解析を用いて線維症ステージ０〜２または線維症ステージ３〜４に基づいて被験体を分類するのに有用な統計モデルを誘導するために、代謝物バイオマーカーを使用した。ランダムフォレストの結果から、サンプルは７０％の確度で分類されたことが示される。陰性に分類されたすべての被験体に占める真陰性の被験体（すなわち、線維症ステージ０〜２の被験体）の割合である陰性的中率は、７９％であった。ランダムフォレストモデルを用いて新しい観測をどれくらい正確に予測できるか（たとえば、サンプルがステージ０〜２線維症またはステージ３〜４線維症の被験体のものであるか）の推定を与える「アウトオブバッグ」（ＯＯＢ）エラー率は、３０％であった。このモデルでは、新しい被験体セットで使用した場合、線維症ステージ０〜２の被験体のアイデンティティーは８１％の確率で適正に予測可能であり、線維症ステージ３〜４の被験体のアイデンティティーは３６％の確率で予測可能であると推定された。
【０１９０】
ランダムフォレスト変数選択手順に基づいて、線維症のステージ０〜２またはステージ３〜４を予測するモデルまたはアルゴリズムの構築に確実に有意であると考えられるバイオマーカー化合物を同定し、重要度によりランク付けした。この解析に従って群を識別するうえで最重要のバイオマーカーは、１，５−アンヒドログルシトール（１，５−ＡＧ）、グリココレート、Ｉ−ウロビリノーゲン、ｃｙｓ−ｇｌｙ（酸化）、タウロケノデオキシコレート、タウロコレート、１６−ヒドロキシパルミテート、キシリトール、Ｘ−１２８１２、γ−トコフェロール、Ｘ−１２８５０、フルクトース、Ｘ−１４６６２、グルコース、Ｘ−１７４５３、フコース、マンノース、グリコケノデオキシコレート、Ｘ−１１８７１、パルミトイルパルミトイルグリセロホスホコリン、Ｘ−１４６５８、イミダゾールプロピオネート、Ｘ−１２０９３、Ｘ−１４３０２、２−ヒドロキシグルタレート、Ｘ−１２２６３、システイン−グルタチオン−ジスルフィド、タルトロネート（ヒドロキシマロネート）、アスパルチルロイシン、およびグルタレート（ペンタンジオエート）である。ランダムフォレスト解析により同定された代謝物は、４種（フルクトース、Ｘ−１２０９３、２−ヒドロキシグルタレート、Ｘ−１２２６３）を除いてすべて、臨床パラメーターの２型糖尿病のＡＵＣである０．６１８３よりも大きい個別のＡＵＣを有していた。
【０１９１】
線維症ステージ０〜１と線維症ステージ３〜４との識別
線維症のステージ０〜１とステージ３〜４とを識別する臨床パラメーター（年齢、２型糖尿病、ＢＭＩ、ＨＤＬコレステロール、性別、フルクトース、およびアルコール使用歴）の性能を評価するために、ロジスティック回帰および曲線下面積（ＡＵＣ）を実施した。個別の臨床パラメーターのＡＵＣは、０．４９３９（ＢＭＩ）から０．６６９８（２型糖尿病）までの範囲内であり、データは表１７に示されている。これらの７つの臨床パラメーターでは合計で１２７通りの組合せが可能であり、これらの臨床パラメーターを用いて１２７通りのすべての可能な組合せモデルを評価した。最も高いＡＵＣは０．７２１７であり、それは７つの臨床パラメーターをすべて当てはめたモデルから導出された。
【０１９２】
【表５２】
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【０１９３】
また、線維症ステージ０〜１サンプルと線維症ステージ３〜４サンプルとを識別する個別の代謝物の性能を評価するために、ロジスティック回帰モデルおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用した。サンプル中に検出された１１５１種すべての代謝物で得られた測定値で、ロジスティック回帰分析を行った。この解析では、最良臨床パラメーターである２型糖尿病のＡＵＣの０．６６８９よりも大きい個別のＡＵＣを有する５３種の代謝物が同定された。７種の代謝物（Ｘ−１４６６２、Ｉ−ウロビリノーゲン、Ｘ−１２８５０、グルタレート（ペンタンジオエート）、キシリトール、Ｘ−１１８７１、Ｘ−１１５３７）は、年齢、２型糖尿病、ＢＭＩ、ＨＤＬコレステロール、性別、フルクトース、およびアルコール使用歴の７つの臨床パラメーターをすべて使用するモデルから計算されたＡＵＣである０．７２１７よりも大きいＡＵＣを有していた。データは表１８に示されている。Ｘ−１４６６２、Ｉ−ウロビリノーゲン、Ｘ−１２８５０、グルタレート（ペンタンジオエート）、キシリトール、Ｘ−１１８７１、Ｘ−１１５３７（ＡＵＣ＞０．７２１７を有する７種の代謝物）を用いて、線維症ステージ０〜１と線維症ステージ３〜４とを分ける１２７通りの可能な組合せのモデルをすべて生成した。各モデルでＡＵＣを計算し、７種の代謝物のすべての可能なモデルの組合せを当てはめて得られたＡＵＣは、０．７２９６〜０．８７８８の範囲内であり、モデルのうち８９個は、０．８よりも大きいＡＵＣを有する。データは図３に示されている。
【０１９４】
【表５３】
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【０１９５】
実施例５．ヒト血清中のＮＡＳＨの脂質代謝物バイオマーカー
他の例として、ＮＡＳＨを有すると分類された１８１名の被験体およびＮＡＳＨを有していないと分類された１９名の被験体（すなわち、非ＮＡＳＨ被験体はＮＡＦＬＤまたはボーダーラインＮＡＳＨとして分類された）を含めて、ＮＡＦＬＤからＮＡＳＨに至るまでの非アルコール性脂肪肝疾患のスペクトルにわたる２００名の被験体の血清サンプルを分析した。μＭ単位で測定される代謝物のレベルは、ＴＲＵＥＭＡＳＳ複合脂質パネル分析を用いてサンプルで決定した。
【０１９６】
これらの被験体でＮＡＳＨの存在または不在を決定するサンプル中に検出された個別の代謝物の統計的有意性および予測性能は、χ２分析を含むロジスティック回帰およびＡＵＣの計算を用いて評価した。ＮＡＳＨでない被験体から採取したサンプルで測定されたレベルと対比してＮＡＳＨを有する被験体から採取したサンプル中の代謝物レベルを比較するために、ウェルチの２サンプルｔ検定を使用した。ロジスティック回帰モデルおよびＡＵＣにより、個別の代謝物がＮＡＳＨ群と非ＮＡＳＨ群とをどの程度良好に識別するかを評価した。サンプル中に検出されたすべての脂質代謝物で得られた測定値を用いて、統計解析を行った。ＮＡＳＨ患者サンプルと非ＮＡＳＨ患者サンプルとの識別に有用な代謝物は表１９に示されている。χ２ｐ値は＜０．１であり、かつＡＵＣはすべての代謝物で＞０．５である。表１９は、各代謝物に対して、代謝物の脂質クラス、代謝物名、非ＮＡＳＨサンプルと対比したＮＡＳＨサンプルのロジスティック回帰およびχ２分析で決定されたｐ値、ＡＵＣ、および非ＮＡＳＨサンプルと対比したＮＡＳＨサンプルの代謝物レベルの変化の方向（ＤＯＣ）を含む。
【０１９７】
【表５４】
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【０１９８】
【表５５】
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【０１９９】
実施例６．ヒト血清中の線維症の脂質代謝物バイオマーカー
他の例として、線維症を有すると分類された１５０名の被験体および線維症を有していないと分類された５０名の被験体（すなわち、非線維症被験体はＮＡＦＬＤ、ボーダーラインＮＡＳＨ、またはＮＡＳＨとして分類された）を含めて、ＮＡＦＬＤから線維症に至るまでの非アルコール性脂肪肝疾患のスペクトルにわたる２００名の被験体の血清サンプルを分析した。μＭ単位で測定される代謝物のレベルは、ＴＲＵＥＭＡＳＳ複合脂質パネル分析を用いてサンプルで決定した。
【０２００】
これらの被験体で線維症の存在または不在を決定するサンプル中に検出された個別の代謝物の統計的有意性および予測性能は、χ２分析を含むロジスティック回帰およびＡＵＣの計算を用いて評価した。線維症でない被験体から採取したサンプルで測定されたレベルと対比して線維症を有する被験体から採取したサンプル中の代謝物レベルを比較するために、ウェルチの２サンプルｔ検定を使用した。ロジスティック回帰モデルおよびＡＵＣにより、個別の代謝物が線維症群と非線維症群とをどの程度良好に識別するかを評価した。サンプル中に検出されたすべての脂質代謝物で得られた測定値を用いて、ロジスティック回帰およびχ２分析を行った。線維症患者サンプルと非線維症患者サンプルとの識別に有用な代謝物は表１９に示されている。χ２ｐ値は＜０．１であり、かつＡＵＣはすべての代謝物で＞０．５である。表２０は、各代謝物に対して、代謝物の脂質クラス、代謝物名、非線維症サンプルと対比した線維症サンプルのロジスティック回帰およびχ２分析で決定されたｐ値、ＡＵＣ、および非線維症サンプルと対比した線維症サンプルの代謝物レベルの変化の方向（ＤＯＣ）を含む。
【０２０１】
【表５６】
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【０２０２】
【表５７】
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【０２０３】
【表５８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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