(57)【要約】本発明は、ブルトン型チロシンキナーゼの阻害剤として有用であり、それに関する所望の特徴を示す化合物及びその組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物１及びアジピン酸：
【化１】
2018521029.tif 000041
を含む、固体の化合物２。
【請求項２】
前記固体が、化合物１及びアジピン酸の共結晶である結晶性固体である、請求項１に記載の固体。
【請求項３】
前記結晶性固体が非晶質化合物２を実質的に含まない、請求項２に記載の固体。
【請求項４】
前記固体が不純物を実質的に含まない、請求項１に記載の固体。
【請求項５】
前記固体がＩ型である、請求項２に記載の固体。
【請求項６】
約６．３４度、約９．２４度及び約２７．３７度２θから選択される、そのＸＲＰＤの１つ以上のピークを有する、請求項５に記載の固体。
【請求項７】
約６．３４度、約９．２４度及び約２７．３７度２θから選択される、そのＸＲＰＤの少なくとも２つのピークを有する、請求項６に記載の固体。
【請求項８】
図５に示されるものと実質的に類似しているＸＲＰＤを有する、請求項５に記載の固体。
【請求項９】
前記化合物がＩＩ型である、請求項２に記載の固体。
【請求項１０】
約７．０４度、約２０．０８度及び約２５．１４度２θから選択される、そのＸＲＰＤの１つ以上のピークを有する、請求項９に記載の固体。
【請求項１１】
約７．０４度、約２０．０８度及び約２５．１４度２θから選択される、そのＸＲＰＤの少なくとも２つのピークを有する、請求項１０に記載の固体。
【請求項１２】
図１０に示されるものと実質的に類似しているＸＲＰＤを有する、請求項９に記載の固体。
【請求項１３】
前記固体が非晶質固体である、請求項１に記載の固体。
【請求項１４】
前記固体が結晶性の化合物２を実質的に含まない、請求項１３に記載の固体。
【請求項１５】
前記固体が不純物を実質的に含まない、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の固体、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の固体またはその組成物の有効量をブルトン型チロシンキナーゼに接触させることを含む、ブルトン型チロシンキナーゼの酵素活性を減少させる方法。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の固体またはその組成物の有効量を対象に投与することを含む、ブルトン型チロシンキナーゼの阻害に反応する疾患を治療する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の固体またはその組成物の有効量を対象に投与することを含む、自己免疫不全、炎症性疾患及び癌からなる群から選択される疾患を治療する方法。
【請求項２０】
前記疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、白血病及びリンパ腫から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
プロテインキナーゼは、腫瘍学、神経学及び免疫学の多くのヒト疾患の発生及び治療で重要な役割を果たす、５００以上のタンパク質からなる大きな多重遺伝子族である。Ｔｅｃキナーゼは、５つの要素（Ｔｅｃ（肝細胞癌内で発現するチロシンキナーゼ）、Ｂｔｋ（ブルトン型チロシンキナーゼ）、Ｉｔｋ（インターロイキン−２（ＩＬ−２）誘発性Ｔ細胞キナーゼ、ＥｍｔまたはＴｓｋとしても知られる）、Ｒｌｋ（静止期リンパ球キナーゼ、Ｔｘｋとしても知られる）、及びＢｍｘ（染色体Ｘ上の骨髄チロシンキナーゼ遺伝子、Ｅｔｋとしても知られる））からなる、非受容体型チロシンキナーゼであり、ならびにそれは主として造血細胞中で発現するが、Ｂｍｘ及びＴｅｃの発現は、内皮細胞及び肝細胞において検出されている。Ｔｅｃキナーゼ（Ｉｔｋ、Ｒｌｋ及びＴｅｃ）はＴ細胞内で発現し、すべてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流で活性化される。Ｂｔｋは、Ｂ細胞活性化、増殖、及び分化の調節に関与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の下流メディエーターである。更に具体的にはＢｔｋは、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート（ＰＩＰ３）に結合するＰＨドメインを含む。ＰＩＰ３結合は、Ｂｔｋを誘導してホスホリパーゼＣ（ＰＬＣγ）をリン酸化し、それによりＰＩＰ２を加水分解して２つの二次メッセンジャー、イノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成して、プロテインキナーゼＰＫＣを活性化し、その後、追加的なＢ細胞シグナル伝達を誘導する。Ｂｔｋ酵素活性を不能にする突然変異により、原発性免疫不全であるＸＬＡ症候群（Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症）を生じる。ＴｅｃキナーゼがＢ細胞及びＴ細胞シグナル伝達の両方において果たす重大な役割を考慮すれば、Ｔｅｃキナーゼは、自己免疫不全の目的とする対象になっている。
【０００２】
したがって、Ｂｔｋに効果的な阻害剤は当該技術分野において特に必要である。本発明はこれらの及び他の必要性も満足させるものである。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の新規な形態及びその組成物は、１つ以上のプロテインキナーゼの阻害剤として有用であり、それに関して望ましい特徴を示すことが、今では判明している。一般的に酸付加形態または遊離塩形態及びその薬学的に許容される組成物は、本明細書で詳述するとおり、様々な疾患もしくは障害の重篤度を治療するまたは軽減することにとって有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】アジピン酸及び化合物１Ａ型と共に、化合物２Ｉ型及び化合物２ＩＩ型のＸＲＰＤパターンを示す。
【図２】化合物２Ｉ型のＤＳＣ／ＴＧＡデータを示す。
【図３】化合物２ＩＩ型のＤＳＣ／ＴＧＡデータを示す。
【図４】化合物２ＩＩ型のＴＧＡ／ＤＳＣデータを示す。
【図５】実施例４の手順により得られた化合物２Ｉ型のスケールアップ試料のＸＲＰＤパターンを提供する。
【図６】実施例４の手順により得られた化合物２Ｉ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを提供する。
【図７】化合物２Ｉ型がやや吸湿性であることを示す、２５℃／相対湿度８０％にて０．３％の水分取り込みを示すＤＶＳ結果を提供する。
【図８】実施例５の手順を使用して調製した化合物２Ｉ型のＸＲＰＤパターンを示す。
【図９】実施例５の手順を使用して調製した化合物２Ｉ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを示す。
【図１０】実施例６の手順により得られた化合物２ＩＩ型のＸＲＰＤパターンを提供する。
【図１１】実施例６の手順により得られた化合物２ＩＩ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを提供する。
【図１２】化合物２ＩＩ型がやや吸湿性であることを示す、２５℃／相対湿度８０％にて０．３％の水分取り込みを示すＤＶＳ結果を提供する。
【図１３】化合物２ＩＩ型及び化合物２Ｉ型の溶解度データを示す。
【図１４】化合物２Ｉ型単結晶の３次元構造を示す。
【図１５】化合物２Ｉ型単結晶の単位格子を示す。
【図１６】化合物２ＩＩ型単結晶の３次元構造を示す。
【図１７】化合物２ＩＩ型単結晶の単位格子を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明の特定の態様の概説：
ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０８９３３７号（２０１４年１２月１１日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／６９８５３号（「出願８５３」））は特定のＢｔｋ阻害剤化合物を記載し、そのすべてを本明細書に参照により組み込む。このような化合物は、３−イソプロポキシ−Ｎ−（２−メチル−４−（２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジル）アゼチジン−１−カルボキサミド、化合物１を含む。
【０００６】
【化１】
2018521029.tif 000002
【０００７】
化合物１は遊離塩基であり、出願８５３では化合物番号Ｉ−２１として示す。化合物１の合成は出願８５３の実施例２１で詳述されており、参照を容易にするために本明細書に再掲する。
【０００８】
化合物１は、ＢＴＫ阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでＢＴＫに対して効力を示した（例えば、出願８５３の表１及び表２を参照）。例えば、化合物１がｉｎ  ｖｉｔｒｏ Ｂｔｋキナーゼアッセイで測定したＩＣ５０＜１０ｎＭ、及びｐＢＴＫアッセイで測定したＩＣ５０＜５００ｎＭを有することを、出願８５３は報告する。したがって、化合物１は、ＢＴＫの活性と関連した１つ以上の疾患を治療するために有用である。
【０００９】
改善された水溶解度、安定性、吸収性、生物学的利用能及び製剤の容易さなどの特性を付与する、化合物１の酸付加生成物または固体を提供することは、望ましい。したがって本発明は、化合物１の遊離塩基形態及び酸付加形態を提供する。
【００１０】
１．化合物２（アジピン酸×化合物１）
一実施形態によれば、本発明は、化合物１及びアジピン酸を含む化学種化合物２を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、化合物２は
【００１２】
【化２】
2018521029.tif 000003
【００１３】
として示される。
化合物２は種々の形態で存在することができると、企図されている。化合物２が固体のとき、前記化合物は、非晶質、結晶性またはこれらの混合物であり得る。代表的な固体を、下で更に詳細に記載する。
【００１４】
いくつかの実施形態で、本発明は、不純物を実質的に含まない化合物２を提供する。本明細書で使用する場合「不純物を実質的に含まない」という用語は、化合物が有意な量の異物を含まないことを意味する。このような異物は、過剰なアジピン酸、過剰な化合物１、残留溶媒、または化合物２の調製及び／またはその単離から生じ得る他の任意の不純物を含むことができる。いくつかの実施形態で、化合物２の少なくとも約９５重量％が存在する。本発明の更に他の実施形態では、化合物２の少なくとも約９９重量％が存在する。
【００１５】
一実施形態によれば、化合物２は、少なくとも約９７、９７．５、９８．０、９８．５、９９、９９．５、９９．８重量％の量で存在し、パーセンテージは組成物の総重量を基準とする。別の実施形態によれば、化合物２は、ＨＰＬＣクロマトグラムの総面積に対して、有機不純物全体の約３．０ＨＰＬＣ面積％以下を含み、特定の実施形態で約１．５ＨＰＬＣ面積％の有機不純物を含む。他の実施態様において、化合物２は、ＨＰＬＣクロマトグラムの総面積に対して、任意の単一不純物の約１．０ＨＰＬＣ面積％以下、任意の単一不純物の約０．６ＨＰＬＣ面積％以下、及び特定の実施形態で任意の単一不純物の約０．５ＨＰＬＣ面積％以下を含む。
【００１６】
化合物２で示す構造は、化合物２のすべての互変異性形態を含有することも意味する。そのうえ、本明細書に示された構造は、１つ以上の同位体標識原子の存在下でのみ異なる化合物を含有することも意味する。例えば重水素もしくは三重水素による水素の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ標識炭素による炭素の置換を除いて、本発明の構造を有する化合物は本発明の範囲内である。
【００１７】
化合物２は種々の形態で存在することができるということが見いだされた。代表的なそのような形態は、本明細書に記載のような多形体を含む。
いくつかの実施形態では、化合物２は非晶質である。いくつかの実施形態において、化合物２は非晶質であり、結晶性化合物２を実質的に含まない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、化合物２は結晶性の固体である。他の実施形態において、化合物２は、非晶質化合物２を実質的に含まない結晶性の固体である。本明細書で使用する場合「非晶質化合物２を実質的に含まない」という用語は、化合物が有意な量の非晶質化合物２を含まないことを意味する。特定の実施形態で、少なくとも約９５重量％の結晶性化合物２が存在する。本発明の更に他の実施形態において、少なくとも約９９重量％の結晶性化合物２が存在する。
【００１９】
一実施形態において、化合物２は、約１：１である（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論を有する。「モノアジペート」という用語は、このような化学量論を有する化合物を指す。
【００２０】
別の実施形態で、化合物２は、約２：１である（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論を有する。「ヘミアジペート」という用語は、このような化学量論を有する化合物を指す。
【００２１】
【化３】
2018521029.tif 000004
【００２２】
化合物２は少なくとも２つの異なる固体で存在できるということが、見いだされた。
いくつかの実施形態では、約１：１の（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論である。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書でＩ型（すなわち、「モノアジペート」）と称される化合物２の固体を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、約２：１の（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論である。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書でＩＩ型（すなわち、「ヘミアジペート」）と称される化合物２の固体を提供する。
【００２４】
固体の調製のための塩基及び酸化合物の組み合わせにおいて、ΔｐＫａ（ｐＫａ（塩基）−ｐＫａ（酸））≧１は、一般的に２つの化合物がイオン化される塩化合物の形成を可能にする。この閾値が満たさない場合、非イオン性相互作用（例えば、水素結合）は依然として、中性酸と塩基化合物の間に発生して、例えば共結晶を形成することができる。化合物１（塩基）のｐＫａは、電位差滴定を介して３．３１（±０．０６）であると決定し、一方アジピン酸は、約４．４のｐＫａ１及び約５．４のｐＫａ２を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、化合物２（例えば化合物２Ｉ型または化合物２ＩＩ型）は、共結晶である。本明細書で使用する場合「共結晶」は、同じ結晶格子の２つ以上（例えば２）の分子からなる結晶性材料である固体である。共結晶において、水素結合、または他の非共有結合性もしくは非イオン性分子相互作用（例えば、ファンデルワールス力またはπ−π相互作用）は、結晶格子中に存在する化合物の間に存在できる。
【００２６】
化合物２Ｉ型
いくつかの実施形態では、化合物２Ｉ型は、下記の表１に記載されているピークから選択される少なくとも１、２、３、４または５スペクトルピーク（複数可）を有する。
【００２７】
【表１】
2018521029.tif 000005
【００２８】
いくつかの実施形態では、化合物２Ｉ型は、約６．３４、９．２４、２７．３７から選択されるＸ線粉末回折パターンの１つ以上のピークを有するという点を特徴とする。いくつかの実施形態では、化合物２Ｉ型は、約６．３４、９．２４、２７．３７から選択されるＸ線粉末回折パターンの２つ以上のピークを有するという点を特徴とする。いくつかの実施形態では、化合物２Ｉ型は、約６．３４、９．２４、２７．３７から選択されるＸ線粉末回折パターンの３つすべてのピークを有するという点を特徴とする。本明細書で使用する場合「約」という用語は、２θ度値に関して使われるとき、表示値±０．２度２−θ値を指す。
【００２９】
特定の実施形態で、Ｘ線粉末回折パターンは、図５に示されるＸＲＰＤと実質的に類似している。
化合物２Ｉ型を調製する方法は以下に記載されている。
【００３０】
いくつかの実施形態では、約１：１である化合物２Ｉ型の（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論である。
化合物２ＩＩ型
いくつかの実施形態では、化合物２ＩＩ型は、下記の表２に記載されているピークから選択される少なくとも１、２、３、４または５スペクトルピーク（複数可）を有する。
【００３１】
【表２】
2018521029.tif 000006
【００３２】
いくつかの実施形態では、化合物２ＩＩ型は、約７．０４、２０．０８、２５．１４から選択されるＸ線粉末回折パターンの１つ以上のピークを有するという点を特徴とする。いくつかの実施形態では、化合物２ＩＩ型は、約７．０４、２０．０８、２５．１４から選択されるＸ線粉末回折パターンの２つ以上のピークを有するという点を特徴とする。いくつかの実施形態では、化合物２ＩＩ型は、約７．０４、２０．０８、２５．１４から選択されるＸ線粉末回折パターンの３つすべてのピークを有するという点を特徴とする。
【００３３】
特定の実施形態で、Ｘ線粉末回折パターンは、図１０に示されるＸＲＰＤと実質的に類似している。
化合物２ＩＩ型を調製する方法は以下に記載されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、約２：１である化合物２ＩＩ型の（化合物１）：（アジピン酸）の化学量論である。
化合物を提供する一般的方法
化合物１は、出願８５３に詳細が記載された方法に従って調製されて、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本明細書に記載されるように、化合物２及びその形態は、化合物１をアジピン酸と結合させて化合物１から調製して、生成物、化合物２を形成する。化合物１及びアジピン酸の化学量論は変化できる。したがって本発明の別の態様は、化合物２及びその形態を調製する方法を提供する。
【００３６】
一般的に上述したように、いくつかの実施形態において、本発明は、化合物２
【００３７】
【化４】
2018521029.tif 000007
【００３８】
を調製する方法であって、化合物１
【００３９】
【化５】
2018521029.tif 000008
【００４０】
を、化合物２を形成するのに好適な条件下でアジピン酸と、所望により好適な溶媒と結合する工程を含む、前記方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、化合物１とアジピン酸を含む固体（すなわち化合物２Ｉ型）を作成する方法を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、化合物１とアジピン酸を含む固体（すなわち化合物２ＩＩ型）を作成する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、化合物１とアジピン酸を含む固体（すなわち非晶質）を作成する方法を提供する。
【００４２】
好適な溶媒は、化合物１及び／またはアジピン酸が可溶性である、または少なくとも部分的に可溶性である、任意の溶媒系（例えば、１つの溶媒または溶媒混合物）であり得る。
【００４３】
本発明に有用な好適な溶媒の例は、プロトン性溶媒、非プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態で、好適な溶媒は、エーテル、エステル、アルコール、ケトンまたはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、溶媒は１つ以上の有機アルコールである。いくつかの実施形態において、溶媒は塩素化されている。いくつかの実施形態で、溶媒は芳香族溶媒である。
【００４４】
特定の実施形態で、好適な溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはアセトンであり、前記溶媒は無水、または水もしくはヘプタンと結合している。いくつかの実施形態で、好適な溶媒は、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリム、ジグリム、メチルｔ−ブチルエーテル、ｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール及びアセトニトリルを含む。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はエタノールである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は無水エタノールである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はＭＴＢＥである。
【００４５】
いくつかの実施形態において、好適な溶媒は酢酸エチルである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は、メタノール及び塩化メチレンの混合物である。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は、アセトニトリル及び水の混合物である。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、アセトンまたはテトラヒドロフランである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はジエチルエーテルである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は水である。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はメチルエチルケトンである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はトルエンである。いくつかの実施形態において、好適な溶媒はテトラヒドロフランである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、溶媒を除去する工程及び／または溶媒を添加する工程を含む、化合物２を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、添加した溶媒は、除去した溶媒と同じである。いくつかの実施形態では、添加した溶媒は、除去した溶媒と異なる。溶媒除去の方法は合成及び化学技術において周知であり、本明細書に記載のもの及び裏付けとなる実施例のもののうちのいずれかを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
いくつかの実施形態では、化合物２を調製する方法は、調製物を加熱する工程及び／またはそれを冷却する工程を含む。
いくつかの実施形態では、化合物２を調製する方法は、調製物をかき混ぜる工程及び／または撹拌する工程を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、化合物２を調製するする方法は、好適な酸を化合物１の溶液または懸濁液に加える工程を含む。
いくつかの実施形態では、化合物２を調製する方法は、加熱する工程を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、化合物２は混合物から沈殿させる。いくつかの実施形態において、化合物２は混合物から結晶化させる。いくつかの実施形態では、化合物２は、溶液へ種晶を入れた（すなわち、化合物２の結晶を溶液に加える）後、溶液から結晶化される。
【００５０】
化合物２は、反応混合物から沈殿できる、または蒸発、蒸留、濾過（例えばナノ濾過、限外濾過）、逆浸透、吸収、及びヘプタンなどの逆溶媒を加えることによる、冷却による、もしくはこれらの方法の異なる組み合わせによる反応などの方法によって溶媒の一部もしくは全部の除去によって生成できる。
【００５１】
一般的に上述されているように、化合物２は所望により単離される。化合物２が当業者に周知の任意の好適な物理的手段によって単離され得ることは、理解されるであろう。特定の実施形態で、沈殿した固体である化合物２は、濾過によって上清から分離される。他の実施態様において、沈殿した化合物２は、上清をデカントすることによって上清から分離される。
【００５２】
特定の実施形態で、化合物２は、濾過によって上清みから分離される。
特定の実施形態で、単離された化合物２は空気乾燥される。他の実施形態において、単離した化合物２は、減圧下で、所望により高温で乾燥する。
【００５３】
本明細書に記載されるように、化合物２は非晶質固体であり得る。非結晶固体は当業者に周知であり、種々の方法（例えば凍結乾燥、融解、沈殿（例えば超臨界流体から）、機械的処理（例えば製粉）、クエンチ冷却、脱溶媒和、回転蒸発、沈殿及び噴霧乾燥）により調製することができる。
【００５４】
使用方法
特定の実施形態で、本発明の化合物（例えば化合物２）は医薬品用である。いくつかの実施形態で、本発明の化合物は、キナーゼ阻害剤として有用である。特定の実施形態で、本発明の化合物はＢｔｋの選択的阻害剤である。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｔｋ酵素活性を低減させる方法を提供する。このような方法は、提供される化合物の有効量をＢｔｋに接触させることを含む。したがって本発明は、Ｂｔｋを本発明の化合物と接触させることによりＢｔｋ酵素活性を阻害する方法を更に提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｔｋ酵素活性を低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、Ｂｔｋを有効量の提供される化合物と接触させることを含む。したがって本発明は、Ｂｔｋを本発明の化合物と接触させることによりＢｔｋ酵素活性を阻害する方法を更に提供する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、Ｂｔｋ酵素活性は、Ｂｔｋキナーゼ酵素活性を指す。例えばＢｔｋ酵素活性が低下すると、ＰＬＣγのＰＩＰ３結合及び／またはリン酸化が減少する。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、１μＭ未満である。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、５００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、１００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、０．１ｎＭ〜１０μＭである。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、０．１ｎＭ〜１μＭである。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、０．１ｎＭ〜１００ｎＭである。いくつかの実施形態において、提供される化合物のＢｔｋに対するＩＣ５０は、０．１ｎＭ〜１０ｎＭである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、提供される化合物は、Ｂｔｋ酵素活性を阻害すること（すなわち低下させること）によって緩和され得る疾患及び障害の治療に有用である。「疾患」とは、疾患または疾患の症状を指す。したがって本発明は、それを必要とする対象の自己免疫疾患、炎症性疾患及び癌を治療する方法を提供する。そのような方法は、治療に有効な量の提供される化合物を対象に投与することを含む。
【００５８】
「自己免疫不全」という用語天然型は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、円形脱毛症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、セリアック病、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、及びウェゲナー肉芽腫症などの、天然抗原に対する不適切な免疫反応を含む、疾患または障害を含む。「炎症性疾患」という用語は、アレルギー、喘息、前立腺炎、糸球体腎炎、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）、再灌流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶及び血管炎などの急性または慢性炎症を含む疾患または障害を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、関節リウマチまたはループスを治療する方法を提供する。
【００５９】
「癌」という用語は、異常細胞増殖及び／または増殖を含む、疾患または障害を意味する。いくつかの実施形態において、このような「癌」は、グリオーマ、甲状腺癌、乳癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、胃癌、消化管間葉性腫瘍、膵臓癌、胆管癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、腎細胞癌、リンパ腫（例えば、未分化大細胞型リンパ腫）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、慢性リンパ性白血病）、多発性骨髄腫、悪性中皮腫、悪性黒色腫及び結腸癌（例えば、マイクロサテライト高不安定性大腸癌）を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、白血病またはリンパ腫を治療する方法を提供する。
【００６０】
本明細書で使用する場合「対象」という用語は、医薬組成物が投与される哺乳動物を指す。代表的な対象としては、ヒトに加え、獣医学的動物及び実験動物、例えばウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス及び水生哺乳動物が挙げられる。
【００６１】
アッセイ
有用なＴｅｃキナーゼ（例えばＢＴＫ）ファミリー阻害剤を開発するために、Ｔｅｃキナーゼファミリーの酵素活性を低下させることが可能な候補阻害剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定してもよい。当該技術分野において周知の方法及び／または本明細書で提示されたそれらの方法を利用して、阻害剤化合物の活性をアッセイすることができる。
【００６２】
Ｔｅｃキナーゼファミリーメンバーの酵素活性を低下させる化合物を、組換えまたは天然型のいずれかの生物活性のあるＴｅｃキナーゼファミリーメンバーを使用して、同定及び試験してもよい。Ｔｅｃキナーゼは、天然細胞で見いだされ得る、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離され得る、または細胞内で同時発現もしくは発現され得る。阻害剤の非存在下でのＴｅｃキナーゼファミリーメンバー（例えばＢＴＫ）の酵素活性に対する、阻害剤の存在下でのその活性の低下を測定することは、実施例で以下に記載されたＰＯＬＹＧＡＴ−ＬＳアッセイなどの当該技術分野で周知の様々な方法を利用して実施されてもよい。Ｂｔｋ及び他のＴｅｃキナーゼの活性をアッセイする他の方法は、当該技術分野で周知である。好適なアッセイ法の選択は、当業者の能力内で十分に行われる。
【００６３】
Ｔｅｃキナーゼファミリーメンバーの酵素活性を低下させることが可能な化合物が同定されたら、この化合物は、Ｔｅｃキナーゼファミリーメンバーを他の酵素に対して選択的に阻害する能力について試験され得る。本発明の化合物による阻害は、当該技術分野において周知のもしくは本明細書に記載の別のものなどの標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定される。
【００６４】
Ｔｅｃキナーゼファミリーメンバー（例えばＢＴＫ）の活性に関連する表現型で検出可能な変化を誘発する能力について、化合物を細胞モデルまたは動物モデルで更に試験してもよい。細胞培養に加えて、動物モデルを用いて、動物モデルの自己免疫不全、炎症性疾患または癌を治療する能力について、Ｔｅｃキナーゼファミリーメンバー阻害剤を試験してもよい。
【００６５】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、化合物２を含む、または薬学的に許容される賦形剤（例えば、担体）と組み合わせた化合物２を含む、医薬組成物を提供する。
【００６６】
この医薬組成物は、本明細書に開示された阻害剤の光学異性体、ジアステレオマー、または薬学的に許容される塩を含む。医薬組成物中に含まれる化合物２は、上述した担体部分に共有結合されてもよい。あるいは、医薬組成物中に含まれる化合物２は、担体部分に共有結合されていない。
【００６７】
本明細書で使用する場合「薬学的に許容される担体」有害には、医薬賦形剤、例えば活性剤と有害に反応しない腸内または非経口投与に好適な医学的、生理学的に許容できる有機または無機担体物質を指す。好適な薬学に許容される担体としては、水、塩類溶液（リンガー液など）、アルコール、油、ゼラチン、及び炭水化物（例えばラクトース、アミロースまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ならびにポリビニルピロリジンが挙げられる。そのような調製物は、滅菌されて、所望する場合、本発明の化合物と有害に反応しない補助剤（例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤及び／または芳香剤など）と混合させることができる。
【００６８】
本発明の化合物は、対象に単独で投与することができる、または同時投与することができる。同時投与は、この化合物の個別でもしくは組み合わせ（２つ以上の化合物）での、同時または連続の投与を包含することを意味する。調製物は、所望する場合、他の活性物質（例えば、代謝分解を低下させるもの）と併用することもできる
製剤
本発明の化合物は、多種多様な経口、非経口及び局所投与剤形で調製ならびに投与することができる。したがって本発明の化合物は、注射により（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内または腹腔内に）投与することができる。更に本明細書に記載の化合物は、吸入により、例えば鼻孔内に投与することができる。そのうえ本発明の化合物は、経皮的に投与することができる。複数の投与経路（例えば、筋肉内、経口、経皮）を使用して、本発明の化合物を投与し得ることも想定される。したがって本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤、及び１つ以上の本発明の化合物を含有する、医薬組成物も提供する。
【００６９】
本発明の化合物から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固体の調製物としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐剤、及び分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても機能し得る、１つ以上の物質であり得る。
【００７０】
粉末で、担体は、微粉化された活性成分との混合物中の微粉化固体である。錠剤で、活性成分は、必要な結合特性を有する担体と適切な割合で混合されて、所望の形状及びサイズに圧縮される。
【００７１】
粉末及び錠剤は、好ましくは活性化合物を５％〜７０％含有する。好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂などである。「調製物」という用語は、他の担体を含むまたは含まない活性化合物が担体によって取り囲まれ、つまり担体と会合されたカプセルを提供する、活性化合物と担体としての封入材料との配合物を包含することを意図する。同様に、カシェ剤及びトローチ剤が含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸剤、カシェ剤及びトローチ剤を、経口投与に好適な固体剤型として用いることができる。
【００７２】
坐剤を調製するために、低融点ワックス（例えば脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物）が最初に融解され、活性成分は撹拌などによりその中に均一に分散される。融解された均一混合物は、それから簡便なサイズの型中に注がれて、放置して冷却され、それにより固化される。
【００７３】
液体形態の調製物としては、溶液、懸濁液及びエマルション、例えば水または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口注入の場合、液体調製物は、ポリエチレングリコール水溶液の液剤に製剤化することができる。
【００７４】
非経口投与が必要または所望である場合、本発明の化合物に特に好適な混合物は、注射用滅菌溶液、好ましくは油性または水性溶液、及び懸濁液、エマルション、または坐剤を含む挿入物である。特に非経口投与用の担体としては、デキストロースの水溶液、生理食塩水、純水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ピーナッツオイル、ゴマ油、ポリオキシエチレンブロックポリマーなどが挙げられる。アンプルは、簡便な単位用量である。本発明の化合物は、リポソーム中に組み込ませること、または経皮ポンプもしくはパッチを介して投与することもできる。本発明で使用するための好適な医薬混合物は、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）及び国際特許第ＷＯ９６／０５３０９号に記載されるものを含み、その両方の教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
経口使用に好適な水溶液は、活性成分を水に溶解させ、所望の場合、好適な着色剤、香味料、安定剤及び増粘剤を添加することにより調製することができる。経口使用に適した水性懸濁液は、水中の微粉化活性成分を粘性材料（例えば天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び他の周知の懸濁化剤）に分散することにより作製することができる。
【００７６】
使用の少し前に経口投与用の液体調製物に変化される固体調製物も、含まれる。そのような液体形態としては、溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香味料、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【００７７】
医薬調製物は、好ましくは単位投与形態である。そのような形態において、調製物は、活性成分を適切な量で含有する単位用量に細分される。単位投与形態は、個別の量の調製物を含む包装された調製物（例えば包装された錠剤、カプセル及びバイアルまたはアンプル）中の粉末であり得る。単位投与形態は、カプセル、錠剤、カシェ剤もしくはトローチ剤そのものであってもよく、またはこれらのいずれかの適切な数が包装された形態でもよい。
【００７８】
単位用量調製物中の活性成分の量は、活性成分の特定の用途及び効力に応じて０．１ｍｇ〜１００００ｍｇ、より一般的には１．０ｍｇ〜１０００ｍｇ、最も一般的には１０ｍｇ〜５００ｍｇで変えられ得る、または調整され得る。組成物は、所望する場合、他の適合性のある治療剤も含有し得る。
【００７９】
いくつかの化合物は制限された水への溶解度を有することができ、したがって組成物中に界面活性剤または他の適切な共溶媒を必要とする場合がある。そのような共溶媒としては、ポリソルベート２０、６０及び８０、プルロニックＦ−６８、Ｆ８４及びＰ−１０３、シクロデキストリン、ならびにポリオキシル３５ヒマシ油が挙げられる。そのような共溶媒は通常、約０．０１重量％〜約２重量％の間のレベルで用いられる。
【００８０】
製剤を分散させる際の変動性を低下させるため、製剤の懸濁液もしくはエマルションの成分の物理的分離を減少させるため、及び／または別の方法で製剤を改善するために、単純な水溶液よりも大きな粘度が望ましい場合がある。そのような粘度上昇剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。そのような薬剤は通常、約０．０１重量％〜約２重量％の間のレベルで用いられる。
【００８１】
本発明の組成物は、徐放性及び／または快適性を与える成分を追加として含んでいてもよい。そのような成分としては、高分子量のアニオン性粘液模倣ポリマー、ゲル化多糖類、及び微粉化薬物担体基質が挙げられる。これらの成分は、米国特許第４，９１１，９２０号、同第５，４０３，８４１号、同第５，２１２，１６２号、及び同第４，８６１，７６０号により詳細に議論されている。これらの特許の全内容は、参照によりですべての目的でその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
有効な投与量
本発明により提供される医薬組成物は、有効成分が治療に有効な量、すなわち意図する目的を実現するのに効果的な量で含有される組成物を包含する。特定用途に効果的な実際の量は、とりわけ治療される状態に依存する。例えば癌を治療する方法で投与される場合、そのような組成物は、所望の結果を実現する（例えば、対象の癌細胞数を減少させる）のに効果的な有効成分の量を含有する。
【００８３】
投与される化合物の投与量及び頻度（単回または反復投与）は、投与経路；レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康状態、体重、ボディマス指数及び食事；治療される疾患（例えば、Ｂｔｋ阻害に応答する疾患）の症状の性質及び程度；他の疾患または他の健康関連問題の存在；併用治療の種類；ならびに任意の疾患または治療レジメンによる合併症を含む、様々な要因に応じて変動することができる。他の治療レジメンまたは薬剤を、本発明の方法及び化合物と共に使用することができる。
【００８４】
本明細書に記載の任意の化合物について、治療に有効な量は、最初に細胞培養アッセイから決定され得る。標的濃度は、例えば記載した方法を利用して、測定されたキナーゼ酵素活性を低下せることが可能な活性化合物（複数可）の濃度である。
【００８５】
ヒトに使用される治療に有効な量は、動物モデルから決定されてもよい。例えばヒト用の投与量を、動物に効果的であることがわかった濃度を得るために配合することができる。ヒトの投与量は、上述のように、キナーゼ阻害をモニタリングして、投与量を上方または下方に調整することにより、調整することができる。
【００８６】
投用量は、患者の要件及び用いられる化合物に応じて変化し得る。本発明に関連して、患者に投与される投与量は、だんだんと患者の有益な治療反応を得るのに十分でなければならない。投与量のサイズも、任意の有害な副作用の存在、性質及び程度により決定される。一般的に治療は、化合物の最適投与量よりも少ない、少なめの投与量で開始される。その後、投与量は、環境下で最適な効果に到達するまで、少しの増分で増加される。いくつかの実施形態において、用量範囲は０．００１〜１０ｗ／ｖ％である。いくつかの実施形態において、用量範囲は０．１〜５ｗ／ｖ％である。投与量及び間隔は、治療される特定の臨床的適応に効果的な投与された化合物のレベルを提供するように、個別に調整することができる。これは、個々の疾患状態の重篤度に相応する治療レジメンを提供する。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を説明することを意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
一般実験
略語
ＭｅＯＨ                メタノール
ＤＭＳＯ                ジメチルスルホキシド
ＮＭＰ                  １−メチル−２−ピロリドン
ＤＭＡｃ                Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＥｔＯＨ                エタノール
ＩＰＡ                  イソプロピルアルコール
ＡＣＮ                  アクリロニトリル
ＤＣＭ                  ジクロロメタン
ＴＨＦ                  テトラヒドロフラン
２−ＭｅＴＨＦ          ２−メチルテトラヒドロフラン
ＣＨＣｌ３              トリクロロメタン
ＭＩＢＫ                メチルイソブチルケトン
ＥｔＯＡｃ              酢酸エチル
ＩＰＡｃ                酢酸イソプロピル
ＭＴＢＥ                メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＤＳＣ                  示差走査熱量測定
ＩＣ                    イオンクロマトグラフィー
ＮＭＲ                  核磁気共鳴
ＴＧＡ                  熱重量分析
ＸＲＰＤ                Ｘ線粉末回折
計器及び方法
Ａ．Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）
ＸＲＰＤ解析のために、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｍｐｙｒｅａｎ  Ｘ線粉末回折計を使用した。使用するパラメーターを表３に示す。
【００８８】
【表３】
2018521029.tif 000009
【００８９】
Ｂ．熱重量（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＴＧＡデータは、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製ＴＡ  Ｑ５００／Ｑ５０００  ＴＧＡを使用して収集した。ＤＳＣは、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製ＴＡ  Ｑ２００／Ｑ２０００ＤＳＣを使用して実施した。詳細なパラメーターを表４に示す。
【００９０】
【表４】
2018521029.tif 000010
【００９１】
Ｃ．ＨＰＬＣ
ＤＡＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００を使用し、詳細なクロマトグラフィー条件を表５に示す。
【００９２】
【表５】
2018521029.tif 000011
【００９３】
Ｄ．ＤＶＳ
ＤＶＳは、ＳＭＳ（表面計測システム）ＤＶＳ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃを介して測定した。２５℃の相対湿度は、ＬｉＣｌ、Ｍｇ（ＮＯ３）２及びＫＣｌの潮解点に対して較正した。ＤＶＳ試験の実際のパラメーターを表６に示す。
【００９４】
【表６】
2018521029.tif 000012
【００９５】
Ｅ．溶液ＮＭＲ
溶液ＮＭＲは、ＤＭＳＯ−ｄ６を使用したＢｒｕｋｅｒ４００Ｍ  ＮＭＲ分光計で収集した。
【００９６】
実施例１：３−イソプロポキシ−Ｎ−（２−メチル−４−（２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジル）アゼチジン−１−カルボキサミド（化合物１）
化合物１の合成は、出願８５３の実施例２１に詳述されており、参照を容易にするために本明細書に再掲する。
スキーム１
【００９７】
【化６】
2018521029.tif 000013
【００９８】
（４−ブロモ−２−メチルフェニル）メタンアミンの調製
【００９９】
【化７】
2018521029.tif 000014
【０１００】
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の４−ブロモ−２−メチルベンゾニトリル（３ｇ、１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＨ３ＴＨＦ（４５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃にて１時間撹拌し、１６時間８０℃に加熱した。次に混合物を、ＭｅＯＨでクエンチした。濃縮後、残留物を飽和ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ溶液と共に撹拌し、濾過した。瀘塊をエーテル（２０ｍＬ×３）ですすぎ、真空下で乾燥して、（４−ブロモ−２−メチルフェニル）メタンアミン（３．２ｇ、収率：９０％）を白色固体として得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：２００．１。
【０１０１】
ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモ−２−メチルベンジルカルバメートの調製。
【０１０２】
【化８】
2018521029.tif 000015
【０１０３】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の（４−ブロモ−２−メチルフェニル）メタンアミン（１．２ｇ、６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（１．８２ｇ、１８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（１．４３ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にて１時間撹拌した。水（５０ｍＬ）で希釈した後、混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出した。混合有機物を、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して、濾過し、濃縮して、粗標題生成物（１．７ｇ、収率９５％）を白色固体として得て、それは更に精製することなく、次工程にて直接使用した。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：３００．１。
【０１０４】
ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルカルバメートの調製
【０１０５】
【化９】
2018521029.tif 000016
【０１０６】
１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモ−２−メチルベンジルカルバメート（１．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で４，４，４’，４’，５，５，５’，５’−オクタメチル−２，２’−ビ（１，３，２−ジオキサボロラン）（１．５２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（１．７５ｇ、１８ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２ＤＣＭ（４０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１００℃にて２時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出した。混合有機層を食塩水で洗浄し、乾燥して、濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（４，４，５，５−タートメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルカルバメート（１．２ｇ、収率６９％）を白色固体として得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：３４８．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．６１−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｂｒ，１Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，１２Ｈ）。
【０１０７】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）−２−メチルベンジルカルバメートの調製。
【０１０８】
【化１０】
2018521029.tif 000017
【０１０９】
１，４−ジオキサン（２８ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジルカルバメート（３．４７ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び２，４−ジクロロピリミジン（１．７９ｇ、１２ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２ＤＣＭ（８１５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（２．７６ｇ、２０ｍｍｏｌ）をＮ２下にて加えた。混合物を９０℃で２時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物をＨ２Ｏ（８０ｍＬ）で希釈し、ＥＡ（８０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を乾燥して、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝５：１〜２：１）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）−２−メチルベンジルカルバメート（２．６７ｇ、収率８０％）を白色固体として得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：３３４．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．１２（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｂｒ，１Ｈ），４．３８（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０１１０】
ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジルカルバメートの調製
【０１１１】
【化１１】
2018521029.tif 000018
【０１１２】
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）−２−メチルベンジルカルバメート（３３３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及び１−メチル−ピラゾール−４−アミン（１２６ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ２（ＤＢＡ）３（９２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、Ｓ−Ｐｈｏｓ（８２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（６５０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＮ２下にて添加した。混合物を１２０℃で２時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物をＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ＥＡ（６０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を乾燥して、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝３：１〜１：１）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジルカルバメート（２４８ｍｇ、収率６３％）を白色固体として得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：３９５．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：８．３８（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９７−７．９３（ｍ，３Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。
【０１１３】
４−（４−（アミノメチル）−３−メチルフェニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−アミンの調製
【０１１４】
【化１２】
2018521029.tif 000019
【０１１５】
メタノール中のＨＣｌ溶液（３０ｍＬ、ガスＨＣｌから調製）中のｔｅｒｔ−ブチル２−メチル−４−（２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジルカルバメート（３．９４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の混合物を、６時間、室温して撹拌した。溶媒を除去して、固体を冷ジエチルエーテル（１００ｍＬ）ですすいだ。固体を真空下で乾燥して、４−（４−（アミノメチル）−３−メチルフェニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−アミン（２．９７ｇ、収率９０％）を黄色固体として得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋：２９５．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：７．９８−７．９６（ｍ，１Ｈ），７．６６−７．２２（ｍ，６Ｈ），４．１０（ｓ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ）。
【０１１６】
【化１３】
2018521029.tif 000020
【０１１７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５８ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）中の４−（４−（アミノメチル）−３−メチルフェニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−アミン塩酸塩（実施例１で調製）（２００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、３−イソプロポキシアゼチジン（１１３ｍｇ、０．７４７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール（０．１１０ｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４７３ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）にゆっくり加えて、一晩室温にて撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、ＤＭＦで洗浄して、分取ＨＰＬＣで精製し、生成物を固体（８２ｍｇ、収率：３０％）として得た。ＬＣＭＳ：保持時間＝１．０５分、ｍ／ｚ４３６．３。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．４８（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝５．０２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｓ，３Ｈ），７．５５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝５．２７Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），４．１５−４．４８（ｍ，３Ｈ），３．９０−４．１３（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．４６−３．６９（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．０８（ｄ，Ｊ＝６．２７Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１１８】
実施例２：最初の添加剤スクリーニング
化合物１を、新しい固体を調製するための添加剤スクリーニングの出発材料として使用した。化合物１及び共結晶形成剤の混合物を、混合後の観察に応じて異なる温度で撹拌した（表７）。
１．可能性がある反応を示す明らかな変色のある懸濁液を、室温にて撹拌した。
２．透明溶液を４℃にて撹拌し、沈殿を生じさせた。
３．未溶解固体があって明らかな変色がない懸濁液を、５０℃にて撹拌し、反応の速度を上げた。
４．撹拌後に得られた透明溶液を、できるだけ多くの結晶を確認する可能性を最大にするため、室温にてゆっくり蒸発させた。
【０１１９】
【表７】
2018521029.tif 000021
【０１２０】
表７に示すように、２つの固体、化合物２Ｉ型及び化合物２ＩＩ型を、スクリーニングから得た。これらの実験から得た固体は、ＴＧＡ及びＤＳＣによって特性決定した。
図１は、アジピン酸及び化合物１Ａ型と共に、化合物２Ｉ型及び化合物２ＩＩ型のＸＲＰＤパターンを示す。
【０１２１】
図２は、化合物２Ｉ型のＤＳＣ／ＴＧＡデータを示す。８１．６℃での吸熱、続いて１５４．４℃（開始温度）での融解／分解と明らかに関連する吸熱、その直後に３番目の吸熱が見えたことを、図は示す。１５０℃までに２．２％の重量喪失が観察された。
【０１２２】
図３は、化合物２ＩＩ型のＤＳＣ／ＴＧＡデータを示す。１６６．１℃（開始温度）での融解／分解と明らかに関連する吸熱を、図は示す。１５０℃までに１．２％の重量喪失が観察された。
【０１２３】
実施例３：化合物２ＩＩ型のスケールアップ調製
化合物２ＩＩ型の調製は、以下の手順に従ってスケールアップした。
１．４３ｍＬのＴＨＦ及び１．０ｇの化合物１を、１００ｍＬの容器に加えた。
２．懸濁液を、撹拌（５００ｒｐｍ）しながら４５℃まで加熱した。
３．アジピン酸０．３５ｇを容器に加えた。
４．透明溶液が得られるまで、反応物を４５℃で撹拌した。
５．４２ｍＬのｎ−ヘプタン（逆溶媒）を加えて、沈殿を生じさせた。
６．懸濁液を、ゆっくりと１時間以内で室温まで冷却した。
７．ｎ−ヘプタン４３．４ｍＬを５時間以内で徐々に加えて、混合物を１２時間の室温にて撹拌した。
８．混合物を真空濾過し、湿塊を５０℃にて真空下で乾燥した。
９．固体を収集した（１．３ｇ得て、収率約９６．３％）。
【０１２４】
図４は、化合物２ＩＩ型のＴＧＡ／ＤＳＣデータを示す。１５０℃までに１．２％の重量喪失、及び１６６．１℃（開始温度）での明らかな融解／分解吸熱を、データは示した。
【０１２５】
実施例４：化合物２Ｉ型のスケールアップ調製（手順１）
化合物２Ｉ型の調製は、以下の手順を使用してスケールアップした。
１．８０ｍｇの化合物１及び８０ｍｇのアジピン酸（荷電モル比１：３、化合物１／酸）を、２０ｍＬのガラスバイアル内に量り入れた。
２．５ｍＬのＴＨＦをバイアルに加えて、混合物を５０℃で撹拌し、透明溶液を得た。
３．溶液を８ｍＬのｎ−ヘプタン内に完全に注いで、沈殿を生じさせた。混合物を室温にて１時間撹拌し、ゲルを最初に観察した。
４．約５分間の撹拌後、黄色固体が発生して、更に２時間撹拌した。
５．混合物を真空濾過し、濾塊を移して、２時間５０℃にて乾燥した。特性決定のために固形物を収集する。
【０１２６】
図５は、以前に調製した化合物２Ｉ型と一致する、スケールアップ試料のＸＲＰＤパターンを提供する。
図６は、スケールアップ手順により得られた化合物２Ｉ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを提供する。０．６％の重量喪失がＴＧＡで１２０℃までに観察されて、ＤＳＣ結果は１５５．４℃（開始温度）での急な融解吸熱を示し、化合物２Ｉ型が無水物であることを示唆する。
【０１２７】
図７は、化合物２Ｉ型がやや吸湿性であることを示す、２５℃／相対湿度８０％にて０．３％の水分取り込みを示すＤＶＳ結果を提供する。
更にＸＲＰＤデータは、形態変化がＤＶＳ試験後に観察されないことを示した。
【０１２８】
実施例５：化合物２Ｉ型のスケールアップ調製（手順２）
３ｇ規模の化合物２Ｉ型の調製は、下記の手順に従った。
１．２．４ｇの化合物１及び３．１ｇのアジピン酸（荷電モル比１：４、遊離塩基／酸）を５００ｍＬの晶析装置内に量り入れた。
２．１１６ｍＬのＴＨＦを加えて、混合物を５０℃で撹拌し、透明溶液を得た。
３．５８ｍＬのｎ−ヘプタンを溶液内に充填して、続いて１２０ｍｇの化合物２Ｉ型の種を添加した。混濁材料が直ちに発生した。
４．１１６ｍＬのｎ−ヘプタンと続けて充填して、油状系を生じさせた。
５．反応物を室温まで冷却し、１８時間撹拌した。反応物をサンプリングして、ＸＲＰＤ及びＤＳＣで解析して、過剰な酸が発生したことを示した。
６．２０ｍＬのＴＨＦを晶析装置に加えて、２時間撹拌した。反応物をサンプリングして、ＸＲＰＤ及びＤＳＣで解析して、純粋な化合物２Ｉ型を得たことを示した。
７．反応物を濾過し、それから室温にて１時間、真空乾燥した。
８．固体３．２ｇを収集した（収率約９９％）。
【０１２９】
図８は、本方法を使用して調製した化合物２Ｉ型のＸＲＰＤパターンを示し、所望の生成物がうまく調製されたことを示す。
図９は、本方法を使用して調製した化合物２Ｉ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを示す。この図において、１２０℃までに０．５％の重量喪失がＴＧＡで観察されて、ＤＳＣ結果は１５５．２℃（開始温度）での急な融解吸熱を示した。
【０１３０】
実施例６：化合物２ＩＩ型の調製
化合物２ＩＩ型を、以下の手順に従って調製した。
１．１５０ｍＬのＴＨＦ及び３．５ｇの化合物１を、４５℃にて５００ｍＬの晶析装置内に加えて、透明溶液を得て、続いて１．２４ｇのアジピン酸を添加した。
２．１００ｍＬのｎ−ヘプタン及び０．８８ｇの種化合物を、晶析装置に加えて、５時間かけて２００ｍＬのｎ−ヘプタンを添加した。
３．バッチを５℃に冷却し、１．５時間５℃に維持した。
４．バッチを濾過し、それから室温にて２時間、真空乾燥した。
５．固体３．７ｇを収集した（収率約９２％）。
【０１３１】
図１０は、スケールアップ調製により得られた化合物２ＩＩ型のＸＲＰＤパターンを提供する。
図１１は、化合物２ＩＩ型のＴＧＡ及びＤＳＣデータを提供する。０．４％の重量喪失がＴＧＡで１２０℃までに観察されて、ＤＳＣ結果は１６４．７℃（開始温度）での急な融解吸熱を示し、化合物２ＩＩ型が無水物であることを示唆する。
【０１３２】
図１２は、化合物２ＩＩ型がやや吸湿性であることを示す、２５℃／相対湿度８０％にて０．３％の水分取り込みを示すＤＶＳ結果を提供する。
更にＸＲＰＤデータは、形態変化がＤＶＳ試験後に観察されないことを示した。
【０１３３】
実施例７：化合物２ＩＩ型の調製（手順２）
化合物２ＩＩ型を、以下の手順に従って調製した。
４−（４−（アミノメチル）−３−メチルフェニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−アミンの調製
【０１３４】
【化１４】
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【０１３５】
１．５．０ｋｇの１−メチル−ピラゾール−４−アミン塩酸塩及び９．２ｋｇの水を、フラスコ（「フラスコ１」）に加えた。
２．フラスコ１の内容物を、溶解するまで１５〜２５℃で撹拌した。
３．９．６ｋｇのｔｅｒｔ−ブチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）−２−メチルベンジルカルバメート、１５．６ｋｇの２−ブタノール及び１４．６ｋｇの水を、別のフラスコ（「フラスコ２」）に加えた。
４．フラスコ２の内容物を、透明溶液が観察されるまで５５〜６５℃で撹拌した。
５．フラスコ１の内容物をフラスコ２に加えて、フラスコ１を５ｋｇの水ですすぎ、すすぎ液をフラスコ２へ移した。
６．フラスコ２の内容物を８０〜９０℃まで加熱して、少なくとも１６時間の８０〜９０℃で撹拌した。
７．フラスコ２の内容物を３０〜４０℃まで冷却した。
８．温度を３０〜４０℃に維持しつつ、水４６．１ｇをフラスコ２に加えた。
９．水酸化アンモニウム（２８〜３０％）２４．２ｋｇを、２５．７ｋｇの水で希釈し、少なくとも１時間かけてフラスコ２に加えた。
１０．５ｋｇの水をフラスコ２に加えた。
１１．フラスコ２の内容物を少なくとも１時間かけて１０〜２０℃まで冷却した。
１２．フラスコ２の内容物を、少なくとも１時間１０〜２０℃で撹拌した。
１３．フラスコ２の内容物を真空濾過し、固体生成物を単離した。
１４．生成物を７５℃以下にて真空下で乾燥した。
１５．生成物７．６５ｋｇが得られ（収率９０．０％）、ＮＭＲは事前の割当と一致した。
化合物Ｉの調製
【０１３６】
【化１５】
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【０１３７】
１．２２．０ｋｇジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び６．６ｋｇの４−（４−（アミノメチル）−３−メチルフェニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−アミンをフラスコ（「フラスコ３」）に加えた。
２．フラスコ３の内容物を、固形物が溶解するまで２８〜３２℃で撹拌した。
３．２２．０ｋｇのＤＭＳＯを、別のフラスコ（「フラスコ４」）に加えた。
４．４．４ｋｇの１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）をフラスコ４に加えた。
５．フラスコ４の内容物を、固形物が溶解するまで２８〜３２℃で撹拌した。
６．フラスコ３の内容物を、２８〜３２℃にて少なくとも１時間かけてフラスコ４内に加えて、フラスコ３を２．１ｋｇのＤＭＳＯですすぎ、すすぎ液をフラスコ４へ移した。
７．フラスコ４の内容物を、少なくとも３０分間２８〜３２℃で撹拌した。
８．３．４ｋｇの３−イソプロポキシアゼチジンをフラスコ４に加え、移動容器及びラインを１ｋｇのＤＭＳＯですすぎ、すすぎ液をフラスコ４に加えた。
９．フラスコ４の内容物を、少なくとも４時間２８〜３２℃で撹拌した。
１０．フラスコ４の内容物を２０℃以下に冷却した。
１１．２３．２ｋｇの水を、フラスコ４の内容物の温度を３０℃以下に維持する速度で、フラスコ４に０〜５℃の間の温度で加えた。
１２．フラスコ４の内容物を１８〜２０℃まで冷却した。
１３．０．１３２ｋｇの化合物１の種結晶を、フラスコ４に充填した。
１４．フラスコ４の内容物を、少なくとも１時間撹拌して、生成物を沈殿させた。
１５．２３．１ｋｇの水を、温度を３０℃以下に制限する速度で、フラスコ４に充填した。
１６．フラスコ４の内容物を、少なくとも３０分間１５〜２５℃で撹拌した。
１７．フラスコ４の内容物を真空濾過し、固体生成物を単離した。
１８．生成物を、１９．８ｋｇの水で３回洗浄した。
１９．生成物をトレイに移し、６０℃以下にて水≦２％まで真空下で乾燥した。
２０．９．７ｋｇの化合物１が得られ（収率９９．０％）、ＮＭＲは事前の割当と一致した。
化合物２ＩＩ型の調製
【０１３８】
【化１６】
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【０１３９】
１．エタノール１８．４Ｌ及び４．６ｋｇの化合物１を、２つのフラスコ（「フラスコ５」及び「フラスコ６」）にそれぞれ加えた。
２．フラスコ５及びフラスコ６の内容物を７０〜７５℃に加熱した。
３．エタノール１３．８Ｌ及びアジピン酸１．４ｋｇを、２つのフラスコ（「フラスコ７」及び「フラスコ８」）にそれぞれ加えた。
４．フラスコ７及びフラスコ８の内容物を７０〜７５℃に加熱した。
５．フラスコ７の内容物をフラスコ５内に加えて、フラスコ７を２．３Ｌのエタノールですすぎ、すすぎ液をフラスコ５へ加えた。
６．フラスコ８の内容物をフラスコ６内に加えて、フラスコ８を２．３Ｌのエタノールですすぎ、すすぎ液をフラスコ６へ加えた。
７．フラスコ５及びフラスコ６の内容物を、少なくとも３０分間７０〜７５℃で撹拌した。
８．フラスコ５及びフラスコ６の内容物を、０．４５μｍの研磨濾過フィルターに通して濾過して別のフラスコ（「フラスコ９」）に入れて、フラスコ５及びフラスコ６をそれぞれ２．３Ｌのエタノールですすぎ、すすぎ液をフラスコ９に加えた。
９．フラスコ９の内容物を、少なくとも３０分間７０〜７５℃で撹拌した。
１０．フラスコ９の内容物を６０〜６４℃まで冷却した。
１１．１２０ｇの化合物２ＩＩ型及び５Ｌのエタノールを、フラスコ（「フラスコ１０」）に加えた。
１２．フラスコ１０の内容物を、少なくとも２時間１５〜２５℃で撹拌した。
１３．フラスコ１０の内容物を濾過して、固形物を除去し、濾液を得た（「フラスコ１０濾液」）。
１４．１８４ｇの化合物２ＩＩ型の種を、フラスコ（「フラスコ１１」）に加えた。
１５．２Ｌのフラスコ１０濾液を、フラスコ１１に加えた。
１６．フラスコ１１の内容物をフラスコ９に加えて、フラスコ１１を２Ｌのフラスコ１０濾液ですすぎ、すすぎ液をフラスコ９へ移した。
１７．フラスコ９の内容物を、少なくとも１時間５５〜６５℃で撹拌した。
１８．フラスコ９の得られた懸濁液を少なくとも３時間かけて０〜１０℃まで冷却した。
１９．フラスコ９の懸濁液を、少なくとも３０分間０〜１０℃で撹拌した。
２０．フラスコ９の懸濁液の吸引物を濾過して、固体生成物を収集した。
２１．生成物塊を、２５ｋｇの研磨濾過した酢酸エチルで３回洗浄した。塊を少なくとも１５分間すすぎ溶媒に浸漬して、その後各すすぎ液を吸引した。
２２．生成物をトレイに移し、５０℃以下にて一定重量まで真空下で乾燥した。
２３．生成物９．６５ｋｇが得られ（収率９０．０％）、ＨＰＬＣは純度９９．５％を示した。
【０１４０】
実施例８：溶解度測定を介した熱力学的関係試験
リード処理溶媒系は、ＥｔＯＨ、またはＥｔＯＨ及び水の共溶媒である。種々の温度（１０℃及び５０℃）、酸と化合物１の荷電モル比（１、２、３及び４）及びＥｔＯＨと水の溶媒比（ｖ／ｖ＝１／０、７／３及び１／１）を試験した。７０〜１００ｍｇの化合物２Ｉ型またはＩＩ型を計量して、１．５ｍＬのガラスバイアルに計算量の酸と、併せてバイアルへ０．５ｍＬの対応する溶媒も加えた。混合物を、４日間、所望の条件下で磁気的に撹拌した。残留する固体をＸＲＰＤ解析のために単離し、濾過した母液の濃度をＨＰＬＣを介して測定した。溶解度データを表８に示し、図１３に示す。高温、酸と遊離塩基の低荷電比及び減少した含水量が化合物２ＩＩ型を安定させるのに好ましいことを、結果は示した。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
実施例９：化合物２ＩＩ型の多形体スクリーニング
化合物２ＩＩ型の溶解度を、室温（２０±３℃）で２０つの溶媒で試験した。約２ｍｇの固体を、３ｍＬのガラスバイアルに加えた。それから表９の溶媒を、固体が溶解するまたは総体積２ｍＬになるまで、段階的（１回当たり１００μＬ）にバイアルに加えた。結果を表９にまとめ、多形体スクリーニングの溶媒選択を導くために使用する。
【０１４３】
化合物２ＩＩ型の多形体スクリーニングは、異なる溶液結晶化または固体転移法を使用して実施した。スクリーニングで利用した方法及び同定した結晶形状を、表１０にまとめた。表が示すように、化合物２ＩＩ型の新規な結晶形状はスクリーニングで発見されなかった。
【０１４４】
【表９】
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【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
１．逆溶媒の添加
合計２１つの逆溶媒添加実験を実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、０．１〜２．４ｍＬの溶媒中に溶解させて、透明溶液を得た。溶液を磁気的に撹拌し、それから沈殿物が現れるまたは逆溶媒の合計量が１５．０ｍＬになるまで、１回当たり０．１ｍＬの逆溶媒を添加した。沈殿物をＸＲＰＤ解析のために単離した。透明溶液を移して、１日間５℃にて撹拌し、それから固体をＸＲＰＤによって試験した。最終の透明溶液を移して、室温にて蒸発させた。結果を表１１にまとめる。
【０１４７】
【表１１】
2018521029.tif 000028
【０１４８】
２．固体蒸気拡散
固体蒸気拡散実験を、異なる１３種類の溶媒を使用して実施した。約１０ｍｇの化合物２ＩＩ型を３ｍＬバイアルに量り入れ、それを２ｍＬの前記溶媒入りの２０ｍＬバイアルに入れた。２０ｍＬバイアルはキャップで封止して、室温に維持して、溶媒蒸気を７日間試料と相互作用させた。固体はＸＲＰＤで試験し、結果は、化合物２ＩＩ型だけが観察されることを示す表１２にまとめた。
【０１４９】
【表１２】
2018521029.tif 000029
【０１５０】
３．溶液蒸気拡散
１２つの溶液蒸気拡散実験を実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、０．６〜２．４ｍＬの適切な溶媒中に溶解させて、３ｍＬバイアルに透明溶液を得た。この溶液を３ｍＬの前記溶媒入りの２０ｍＬバイアル内に入れた。２０ｍＬバイアルはキャップで封止して、室温に維持して、有機蒸気を試料と十分な時間、相互作用させた。沈殿物をＸＲＰＤ解析のために単離した。結果は表１３にまとめ、それは化合物１Ａ型ならびに化合物２Ｉ型及びＩＩ型が観察されたことを示した。
【０１５１】
【表１３】
2018521029.tif 000030
【０１５２】
４．ポリマー誘導結晶化
ポリマー誘導結晶化実験は、５つの異なる溶媒の２セットのポリマー混合物で実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型試料を、０．８〜２．０ｍＬの適切な溶媒中に溶解させて、３ｍＬバイアルに透明溶液を得た。約２ｍｇのポリマー混合物を、３ｍＬのガラスバイアルに加えた。すべての試料はパラフィルムを使用して封止されて、それから移されて、室温で蒸発させ、沈殿を誘発した。固形物をＸＲＰＤ解析のために単離した。結果は表１４にまとめ、それは化合物１Ａ型ならびに化合物２Ｉ型及びＩＩ型が生成されたことを示した。
【０１５３】
【表１４】
2018521029.tif 000031
【０１５４】
５．緩徐な蒸発
蒸発実験は１０つの条件下で実施した。簡潔には約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、３ｍＬガラスバイアルの０．７〜２．５ｍＬの対応する溶媒中に溶解させた。視覚的な透明溶液を室温にて蒸発させ、沈殿を生じさせた。固形物をＸＲＰＤ解析のために単離し、結果は表１５にまとめ、それは化合物１Ａ型ならびに化合物２Ｉ型及びＩＩ型が生成されたことを示した。
【０１５５】
【表１５】
2018521029.tif 000032
【０１５６】
６．室温での懸濁液
懸濁液転換実験は、異なる１２つの溶媒系で室温にて実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、１．５ｍＬガラスバイアルの０．５ｍＬの溶媒に懸濁させた。懸濁液を約４日間の室温にて撹拌した後、残留する固形物をＸＲＰＤ解析のために単離した。結果は表１６にまとめ、それは化合物１Ｂ型及び化合物２ＩＩ型が生成されたことを示した。
【０１５７】
【表１６】
2018521029.tif 000033
【０１５８】
７．５０℃での懸濁液
懸濁液転換実験を、異なる１２つの溶媒系で５０℃でも実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、１．５ｍＬガラスバイアルの０．５ｍＬの溶媒に懸濁させた。懸濁液を約４日間の５０℃にて撹拌した後、残留する固形物をＸＲＰＤ解析のために単離した。結果は表１７にまとめ、それは化合物１Ａ型及びＢ型ならびに化合物２ＩＩ型が生成されたことを示した。
【０１５９】
【表１７】
2018521029.tif 000034
【０１６０】
８．緩徐な冷却
徐冷実験を８つの溶媒系で実施した。約２０ｍｇの化合物２ＩＩ型を、室温にて３ｍＬガラスバイアルの１．０ｍＬの溶媒に懸濁させた。それから懸濁液を５０℃まで加熱し、２時間平衡させて、ナイロン膜（孔径０．４５μｍ）を使用して新しいバイアルに濾過した。濾液を０．１℃／分の速度でゆっくりと５℃に冷却した。得られた固体を５℃の等温で維持し、ＸＲＰＤ解析のために単離した。透明溶液を蒸発させて、５℃で乾燥し、それから固形物をＸＲＰＤで試験した。結果は表１８にまとめ、それは化合物１Ａ型及び化合物２ＩＩ型が得られたことを示した。
【０１６１】
【表１８】
2018521029.tif 000035
【０１６２】
９．粉砕
粉砕誘導相移行実験を、添加物有り／無しの２つの条件で実施した。約１５ｍｇの化合物２ＩＩ型を、乳鉢に量り入れ、それから５分間、乳棒を使用して手動で粉砕した。固形物をＸＲＰＤで解析し、新規な結晶形態は発生していなかった（表１９）。
【０１６３】
【表１９】
2018521029.tif 000036
【０１６４】
実施例１０：ヒトＢ細胞刺激のためのプロトコル。
ヒトＢ細胞は、１５０ｍｌの血液から精製される。簡潔には、血液はＰＢＳで１／２に希釈され、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配で遠心されることができる。Ｂ細胞は、Ｍｉｌｅｎｙｉ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）製Ｂ細胞分離キットＩＩを使用した負の選択によって、単核球細胞から分離することができる。それからウェル当たり５０，０００Ｂ細胞を、９６ウェルプレートのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１０ｕｇ／ｍｌによって刺激できる。化合物はＤＭＳＯで希釈して、細胞に加えることができる。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％である。増殖は、３日後にＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して測定することができる。
【０１６５】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏＢｔｋキナーゼアッセイＢＴＫ−ｐｏｌｙＧＡＴ−ＬＳアッセイ。
ＢＴＫｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでの目的は、ＩＣ５０の測定を通してＢＴＫに対する化合物の能力を決定することである。化合物の阻害は、活性ＢＴＫ酵素（Ｕｐｓｔａｔｅ１４−５５２）、ＡＴＰ及び阻害剤の存在下で、フルオレセイン標識ｐｏｌｙＧＡＴペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＶ３６１１）のリン酸化量をモニタリングした後に測定できる。ＢＴＫキナーゼ反応は、黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３６９４）で実施できる。典型的なアッセイでは、キナーゼ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのＮａ３ＰＯ４、５ｍＭのＤＴＴ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び０．２ｍｇ／ｍｌカゼイン）中のＡＴＰ／ペプチドマスター混合物（最終濃度：ＡＴＰ１０μＭ、ｐｏｌｙＧＡＴ１００ｎＭ）のアリコット２４μＬを、各ウェルに添加できる。次に１００％ＤＭＳＯ溶媒中の４倍の４０×化合物滴定液１μＬを添加し、続いて１×キナーゼ緩衝液中のＢＴＫ酵素混合物１５μＬ（最終濃度０．２５ｎＭ）を添加できる。このアッセイを３０分間インキュベートし、その後５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液２８μＬで停止させた。キナーゼ反応物のアリコット（５μＬ）を低容量の白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６７４）に移して、２×検出緩衝液（４ｎＭのＴｂ−ＰＹ２０抗体を含むＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＰＶ３５７４：ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＰＶ３５５２）５μＬを添加できる。プレートを覆って、室温で４５分間インキュベートできる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５（３３２ｎｍ励起、４８８ｎｍ発光、５１８ｎｍフルオレセイン発光）での時間分解蛍光（ＴＲＦ）を測定できる。ＩＣ５０値を、ＤＭＳＯ対照から決定された１００％酵素活性と、ＥＤＴＡ対照からの０％活性との４パラメーターフィッティングを利用して計算できる。
【０１６６】
実施例１２：マウス全血のＢＴＫ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
抗ウサギＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、ＰＢＳで１：５０に希釈したウサギ抗ＢＴＫ  Ｃ８２Ｂ８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）の３５μＬ／ウェルでコーティングした。プレートを、２時間±１時間、室温にて振り混ぜながら（設定３〜５）、または一晩４℃にて、インキュベートすることができる。プレートを、ＴＢＳＴ中の３％ＭＳＤブロッカーＡを使用して、ＭＳＤブロッカーＡ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で遮断できる。コーティングしたプレートを最初に２５０μＬ／ウェルＴＢＳＴで３回洗浄して、続いて２００μＬ／ウェル３％ブロッカーＡ／ＴＢＳＴを添加できる。プレートを、室温にて２時間より長く振り混ぜながら、または一晩４℃にて遮断することができる。
【０１６７】
全血を、１６×１００のナトリウムヘパリン管のＤＢＡ／１マウスから採取することができる（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３６７８７４）。複数のＤＢＡ／１マウスからの血液をプールすることができる。ウェル当たりの９６μＬの全血を、毎回先端を変えて９６丸底プレートへ分取することができる。４μＬの希釈試験化合物を、各試料に加えて、混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることができる。
【０１６８】
試験化合物の連続希釈において、１０００×プレートは、１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物の連続希釈によって生成することができる。１０つの希釈（１０ｍＭで開始して１：３で終了）を、ウェルＡ１に１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭで１５μＬ試験化合物を添加する；ウェルＡ２〜Ａ１２に１０μＬの１００％ＤＭＳＯを添加する；ウェルＡ１〜ウェルＡ２の５μＬを希釈して混合することによって作成し、１：３の連続希釈を続け、ウェルＡ１０への移動の間に先端を変える。ウェルズＡ１１及びＡ１２は、試験化合物を含有しない１００％ＤＭＳＯを含むことができる。
【０１６９】
希釈１において、１：４０のプレートを作製できる。１２ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、各試験化合物またはＤＭＳＯ濃度を、１０００×原液プレートの各ウェルから２μＬを７８μＬの水に加えて混合することによって、１：４０に希釈することができる。
【０１７０】
希釈２において、試験化合物またはＤＭＳＯを、１：２５に希釈することによって全血に添加することができる。１２ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、１：４０プレート（Ｂ）からの４μＬを、９６μＬの全血に加えて混合することができる。
【０１７１】
全血を溶解させるために使用する溶解緩衝液は、以下のとおり調製することができる。１０×溶解緩衝液は、１５００ｍＭのＮａＣｌ；２００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのＥＧＴＡ及び１０％のトリトン−Ｘ−１００を使用して調製することができる。１０×溶解緩衝液はｄＨ２Ｏ中１倍に希釈でき、完全溶解緩衝液（＋／−ホスファターゼ阻害剤）は以下のとおり調製することができる。
【０１７２】
【表２０】
2018521029.tif 000037
【０１７３】
１００ｕＬの完全溶解緩衝液（＋／−ホスファターゼ阻害剤）を各ウェルに加えて、数回上下に分注することによってよく混合することができる。ウェル１〜１０及び１２はホスファターゼ阻害剤を含有する（＋ＰＰｉ）１×溶解緩衝液を受け、ウェル１１はホスファターゼ阻害剤を含有しない（−ＰＰｉ）１×溶解緩衝液を受けることができる。試料を１時間、氷上でまたは４℃でインキュベートすることができる。試料を、完全溶解の半分の時点で再び混合することができる。
【０１７４】
ブロッキング緩衝液を、各ウェル当たり２５０μＬのＴＢＳＴで３回、ブロックしたＭＳＤプレートを洗浄することができる。１００〜１５０μＬの全血溶解物をコーティング及びブロックしたＭＳＤプレートの各ウェルに加えて、続いて振り混ぜながら低温室で一晩インキュベートすることができる。
【０１７５】
それからプレートを、各ウェル当たり２５０μＬのＴＢＳＴで４回洗浄できる。ビオチン化ホスホチロシンマウスｍＡｂ（ｐＹ１００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を、１％のブロッカーＡに１：１２５に希釈できる。マウス抗ＢＴＫｍＡｂ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を、１％のブロッカーＡに１：９００に希釈できる。３５μＬの希釈ｐＹ１００または希釈抗ＢＴＫ  ｍＡｂを各ウェルに加えて、２時間、室温にて振り混ぜながらインキュベートすることができる。
【０１７６】
それからプレートを２５０μＬのＴＢＳＴ／ウェルで３回洗浄することができる。３％のブロッカーＡ中の３５μＬの１：５００のストレプトアビジン−スルホ−タグ標識抗体を、各ウェルに加えることができる。抗ＢＴＫにおいて、３％のブロッカーＡ中の１：５００の抗マウス−タグ標識抗体の３５μＬを、各ウェルに加えることできる。プレートを、１時間、室温にて振り混ぜながらインキュベートすることができる。
【０１７７】
プレートを発現させて読み取るために、ｄＨ２Ｏ中の１×読み取り緩衝剤を、４×原液から調製することができる。プレートを２５０μＬのＴＢＳＴ／ウェルで３回、洗浄することができる。１５０μＬの１×ＭＳＤ読み取り緩衝剤を、各ウェルに加える。プレートは、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で読み取ることができる。
材料
【０１７８】
【表２１】
2018521029.tif 000038
【０１７９】
実施例１３：ＤＢＡ１マウスのＰＫ／ＰＤ相関
マウスはＣＭＣ−Ｔｗｅｅｎ中の試験化合物を経口投与（ＰＯ）されることができて（ＰＯ）、投与後に種々の時間で、ＣＯ２窒息によって屠殺することができる。ヘパリン加全血を心穿刺によって直ちに採取して、２つの試料に分割することができる。１つの試料は存在する試験化合物の量を定量化するために使用することができ、残りは、ホスファターゼ阻害剤の存在下で、ＭＳＤ溶解緩衝液中に溶解させる。溶媒（ＣＭＣ−Ｔｗｅｅｎ）を投与されたマウスの心穿刺からのヘパリン加全血は、ホスファターゼ阻害剤の存在（高制御）下または不存在（低制御）下で溶解させることができる。溶解全血試料は、上述のとおりホスホＢＴＫについて解析されることができる。投与されたマウスからの各血液試料のホスホＢＴＫの阻害％は、以下のとおり計算することができる。（１−（（ｐＢＴＫ（ｘＰＰｉ）−ｐＢＴＫ（溶媒−ＰＰｉ））／ｐＢＴＫ（溶媒＋ＰＰｉ）））＊１００、式中、ｐＢＴＫ（ｘ＋ＰＰｉ）は、各試料化合物処理済みマウスからの全血のＥＣＬシグナルであり、ｐＢＴＫ（溶媒−ＰＰｉ）は、ホスファターゼ阻害剤の不存在（低制御）下での溶媒処理済みマウスの溶解した全血の平均的ＥＣＬシグナルであり、及びｐＢＴＫ（溶媒＋ＰＰｉ）は、ホスファターゼ阻害剤の存在（高制御）下での溶媒処理済みマウスの溶解した全血の平均的ＥＣＬシグナルであり得る。
【０１８０】
実施例１４：ヒト全血のｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＤアッセイ
ヒトヘパリン加静脈血は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．またはＳｅｒｅＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入して、一晩輸送されることができる。全血は９６ウェルプレートに分取されて、ＤＭＳＯ中の試験化合物の連続希釈によって、または薬物のないＤＭＳＯを「添加する」ことができる。すべてのウェルのＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であり得る。プレートを３７℃で３０分間インキュベートできる。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液を、薬物含有試料及びＤＭＳＯのみの試料（＋ＰＰｉ、高制御）の１つに加えることができ、その一方で、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液を、他のＤＭＳＯのみの試料（−ＰＰｉ、低制御）に加えることができる。すべての溶解全血試料は、総ＢＴＫ捕捉及び実施例１２に記載されたホスホチロシン検出方法に供与され得る。ＥＣＬ値は、＋ＰＰｉ高制御及び−ＰＰｉ低制御によって定義される最大及び最低の制限を有する、柱状ならびに最適な曲線でグラフで示されることができ、補間法によってＥＣＬシグナルの５０％阻害になる試験化合物濃度を推定するために用いることができる。
【０１８１】
実施例１５：化合物２Ｉ型の単結晶の調製
１０．２ｍｇの化合物２ＩＩ型及び３．６ｍｇのアジピン酸を、０．６ｍＬのジクロロメタン／アセトニトリル（１／５、ｖ／ｖ）混合溶媒を添加した３ｍＬバイアルに量り入れた。溶液をボルテックスして、３分間超音波処理した。バイアルを５０℃のオーブンに保存して０．５時間加熱し、それから溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過して、５０℃で予熱した別の２つの３ｍＬバイアルに入れた。化合物２Ｉ型の種を濾液入りのバイアルに入れた。それからバイアルを５０℃のバイオ化学インキュベーターに置いて、０．０１℃／分の速度で５０℃から５℃まで冷却した。５日後に、棒状結晶が得られた。化合物２Ｉ型の単結晶の３次元構造体及び化合物２Ｉ型単結晶の単位格子を、それぞれ図１４及び図１５に示す。結晶データ及び構造精密化の詳細を表２０に示す。
【０１８２】
【表２２】
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【０１８３】
実施例１６：化合物２ＩＩ型の単結晶の調製
５．０ｍｇの化合物２ＩＩ型を、０．８ｍＬのメチルイソブチルケトンを添加した３ｍＬバイアルに量り入れた。溶液をボルテックスして、３分間超音波処理した。それからバイアルを５０℃のオーブンに保存して０．５時間加熱し、次に溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過して、５０℃で予熱した別の３ｍＬバイアルに入れて、化合物２ＩＩ型の種を濾液入りのバイアルに入れて、結晶成長を生じさせた。それからバイアルを５０℃のバイオ化学インキュベーター内に移動して、０．０１℃／分の速度で５０℃から５℃まで冷却した。３日後に、棒状結晶が得られた。化合物２ＩＩ型の単結晶の３次元構造体及び化合物２ＩＩ型単結晶の単位格子を、それぞれ図１６及び図１７に示す。結晶データ及び構造精密化の詳細を表２１に示す。
【０１８４】
【表２３】
2018521029.tif 000040
【０１８５】
本開示がこの詳細な説明と関連して記載されると共に、前述の説明は本発明の範囲を例示したものであって、発明の範囲を限定することを意図したものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されることを理解すべきである。他の態様、利点及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月9日(2018.2.9)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月１０日出願の米国仮特許出願第６２／１７３，８９６号の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に組み込む。
発明の背景
プロテインキナーゼは、腫瘍学、神経学及び免疫学の多くのヒト疾患の発生及び治療で重要な役割を果たす、５００以上のタンパク質からなる大きな多重遺伝子族である。Ｔｅｃキナーゼは、５つの要素（Ｔｅｃ（肝細胞癌内で発現するチロシンキナーゼ）、Ｂｔｋ（ブルトン型チロシンキナーゼ）、Ｉｔｋ（インターロイキン−２（ＩＬ−２）誘発性Ｔ細胞キナーゼ、ＥｍｔまたはＴｓｋとしても知られる）、Ｒｌｋ（静止期リンパ球キナーゼ、Ｔｘｋとしても知られる）、及びＢｍｘ（染色体Ｘ上の骨髄チロシンキナーゼ遺伝子、Ｅｔｋとしても知られる））からなる、非受容体型チロシンキナーゼであり、ならびにそれは主として造血細胞中で発現するが、Ｂｍｘ及びＴｅｃの発現は、内皮細胞及び肝細胞において検出されている。Ｔｅｃキナーゼ（Ｉｔｋ、Ｒｌｋ及びＴｅｃ）はＴ細胞内で発現し、すべてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流で活性化される。Ｂｔｋは、Ｂ細胞活性化、増殖、及び分化の調節に関与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の下流メディエーターである。更に具体的にはＢｔｋは、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート（ＰＩＰ３）に結合するＰＨドメインを含む。ＰＩＰ３結合は、Ｂｔｋを誘導してホスホリパーゼＣ（ＰＬＣγ）をリン酸化し、それによりＰＩＰ２を加水分解して２つの二次メッセンジャー、イノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成して、プロテインキナーゼＰＫＣを活性化し、その後、追加的なＢ細胞シグナル伝達を誘導する。Ｂｔｋ酵素活性を不能にする突然変異により、原発性免疫不全であるＸＬＡ症候群（Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症）を生じる。ＴｅｃキナーゼがＢ細胞及びＴ細胞シグナル伝達の両方において果たす重大な役割を考慮すれば、Ｔｅｃキナーゼは、自己免疫不全の目的とする対象になっている。
【国際調査報告】
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