(57)【要約】本発明は、概して、稀な細胞および無細胞分子に対する質量タグ分析に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのポアを有する本質的に非吸収性の膜、その本質的に非吸収性の膜と作動可能に会合したマイクロウェルおよび電場発生器を備える装置を提供する。この装置は、電場発生器によって発生される電場が、マイクロウェル内のサンプルと作動可能に相互作用し、本質的に非吸収性の膜における少なくとも１つのポアを通ってサンプルの液滴を排出するように構成され得る。ある特定の実施形態において、本発明の装置は、異成分で構成されたサンプル由来の標的分析物、例えば、生物学的サンプル由来の稀な標的分析物（例えば、稀な細胞）の検出および必要に応じてその定量のために使用される。
2018533746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポアを含む本質的に非吸収性の膜；
該本質的に非吸収性の膜と作動可能に会合するマイクロウェル；および
電場発生器
を備える装置であって、ここで、該装置は、該電場発生器によって発生される電場が、該マイクロウェル内のサンプルと作動可能に相互作用し、該本質的に非吸収性の膜における該少なくとも１つのポアを通って該サンプルの液滴を排出するように構成されている、装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポアが、近位開口部、遠位開口部および壁を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つのポアの前記壁が、前記近位開口部および前記遠位開口部に対して９０度であるように配向されている、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つのポアの前記壁が、前記近位開口部から前記遠位開口部に向かって次第に細くなっている、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポアの前記壁が、前記遠位開口部から前記近位開口部に向かって次第に細くなっている、請求項２に記載の装置。
【請求項６】
前記本質的に非吸収性の膜が、複数のポアを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記複数のポアが、同じ寸法を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記複数のポアが、異なる寸法を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
前記装置が、質量分析計をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記装置が、前記電場発生器が前記マイクロウェル内の前記サンプルに電場を誘導的に与えるように構成されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
異成分で構成されたサンプルから標的分析物を検出するための方法であって、該方法は、
少なくとも１つのポアを含む本質的に非吸収性の膜、該膜と作動可能に会合するマイクロウェル、および該膜と作動可能に会合する電場発生器を備える装置を提供する工程、
異成分で構成されたサンプルを少なくとも該膜に導入する工程；
該サンプルに、各々が第１の分子を含む複数の親和性剤を導入する工程であって、ここで、該複数の親和性剤は、該サンプル中の該標的分析物に特異的に結合する、工程；
結合していない親和性剤を除去する工程；
１つまたはそれを超えるさらなる分子を該サンプルに導入する工程であって、ここで、該１つまたはそれを超えるさらなる分子は、該第１の分子と相互作用して、質量分析標識を形成する、工程；
該電場発生器を介して該サンプルに電圧を提供して、該少なくとも１つのポアを通って液滴を放出させる工程であって、ここで、該液滴は、該サンプルの一部および該質量分析標識を含む、工程；および
該液滴を該質量分析標識の存在について分析する工程であって、ここで、該質量分析標識の存在は、該サンプル中の該標的分析物の存在を示す、工程
を含む、方法。
【請求項１２】
前記第１の分子が、質量分析標識前駆体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、前記質量分析標識前駆体と相互作用して前記質量分析標識を形成する変化剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の分子が、変化剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、前記変化剤と相互作用して前記質量分析標識を形成する質量分析前駆体標識である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の分子が、質量分析標識前駆体であり、前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、該質量分析標識前駆体と相互作用して前記質量分析標識を形成する第１および第２の変化剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記親和性剤が、粒子状である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記親和性剤が、非粒子状である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分析物が、稀な細胞であり、前記異成分で構成されたサンプルが、異成分で構成された生物学的サンプルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
分析される質量分析標識の量を定量することによって、前記サンプル中の前記標的分析物を定量する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル分析方法であって、該方法は、
標的分析物を含むと疑われるサンプルを、ポアを含む膜に導入する工程；
１つまたはそれを超える試薬を該膜上の該サンプルに導入して、該標的分析物が該サンプル中に存在する場合、該標的分析物と会合した質量分析標識を生成する工程、
該膜に電場を印加することにより、該膜の該ポアから排出されて質量分析計に導入される該サンプルの１つまたはそれを超える液滴を発生させる工程；
該質量分析計を介して、該質量分析標識の存在を検出することによって該標的分析物の存在を検出する工程；
該検出する工程の結果に基づいて、該標的分析物が存在する場合、該膜の該ポアと会合した該サンプルの一部を該膜から抽出する工程；および
抽出された該サンプルの一部を分析する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
前記膜上の前記サンプルに１つまたはそれを超える試薬を導入する工程が、
各々が第１の分子を含む複数の親和性剤を該サンプルに導入する工程であって、ここで、該複数の親和性剤は、該サンプル中の該標的分析物に特異的に結合する、工程；
結合していない親和性剤を除去する工程；および
１つまたはそれを超えるさらなる分子を該サンプルに導入する工程であって、ここで、該１つまたはそれを超えるさらなる分子は、該第１の分子と相互作用して質量分析標識を形成する、工程
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の分子が、質量分析標識前駆体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、前記質量分析標識前駆体と相互作用して前記質量分析標識を形成する変化剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の分子が、変化剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、前記変化剤と相互作用して前記質量分析標識を形成する質量分析前駆体標識である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の分子が、質量分析標識前駆体であり、前記１つまたはそれを超えるさらなる分子が、該質量分析標識前駆体と相互作用して前記質量分析標識を形成する第１および第２の変化剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記親和性剤が、粒子状である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記親和性剤が、非粒子状である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的分析物が、稀な細胞であり、前記サンプルが、異成分で構成された生物学的サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
分析される質量分析標識の量を定量することによって、前記サンプル中の前記標的分析物を定量する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第62/222,940号に対する利益および優先権を主張し、この内容は全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、稀な細胞および無細胞分子の質量タグ分析に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞分析は、例えば、多くの疾患の診断などの医学的応用において重要である。細胞に結合しているまたは細胞に含まれている稀な分子の検出も、望ましい。細胞分析の医学的応用には、目的のある特定の細胞の単離が必要であり、それらの細胞は、通常、分析中のサンプルのほんの一部分でしかない。例えば、循環腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、転移性がんの診断において特に興味深い。従来の方法では、ＣＴＣは、まず赤血球（ＲＢＣ）を溶解によって除去することによって、全血から単離される。１０ｍＬの血液サンプル中、約８００，０００，０００個の白血球（「ＷＢＣ」）から数百個のＣＴＣが単離される。ゆえに、分離効率および細胞回収率が高い方法が必要である。
【０００４】
しかしながら、既存の技術は、サンプルから稀な分子を検出するには効果がない。例えば、稀な分子が見つけ出される数をはるかに上回る数分子コピーを必要とする従来の親和性アッセイでは、稀な分子を検出できない。従来の核酸アッセイであれば、稀な分子を検出できる。しかしながら、分析時間として数日間かかり得る１つまたはそれを超える非常に長い精製工程および増幅に標的核酸を供しなければならない。
【０００５】
多孔性マトリックスを用いて稀な細胞を分離するための細胞濾過は、細胞をサイズによって選別するために用いられる有用な方法であり、ほとんどの場合、そのような濾過方法は、分離後の細胞の抽出を可能にする。しかしながら、既存の濾過方法は、ある特定の因子（例えば、インビトロの細胞が単一の直径ではなく直径の範囲を有していることが挙げられる）によって制限される。そのうえ、細胞濾過の手法では、ほんの数個の稀な細胞しか回収できない。稀な分子のコピー数は、タンパク質の場合、細胞１つあたりわずか数万コピー、または遺伝子変異の場合、細胞１つあたり数コピーで有意であり得る。
【０００６】
稀な細胞は、従来の走査顕微鏡法によって単一細胞レベルにまで下げて分析することができる。しかしながら、顕微鏡法は、その走査および分析が自動化されたとしても、走査される各サンプルに対して２４時間またはそれを超える時間を要し得る。そのうえ、測定されたタンパク質量の有意性を判定するために、複数の像を有する稀な細胞のすべてを、病理学者が視覚的に調べなければならない。
【０００７】
質量分析（ＭＳ）は、ＭＳを日常的な親和性の反応系と競合しないようにするいくつかの課題を有する。顕著な問題は、サンプル干渉（マトリックス重複ピーク）により目的のマーカーを分離できないこと、臨床サンプル中のバックグラウンドに起因して感度が低下すること（ピコモル濃度（ｐＭ）がナノモル濃度（ｎＭ）に低下すること）、１マイクロリットル（μｌ）未満のサンプルが、イオン化に向けて非効率的にしか捕捉されず、かつ血液などの複雑なサンプルにおける干渉ピークから非効率的にしか単離されないために、低ｎＬサンプル体積を扱うことができないことである。さらに、ＭＳは、イオン化された同じ質量の他の分子との競合に起因して、ある特定の質量を検出できないことが多い。これらの課題は、通常、問題を引き起こし、間違った結果をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
稀な標的の検出を行う際に質量スペクトル分析を用いるとき、希釈によって検出感度がかなり低下するので、検出液体の希釈を回避することが重要であることを本発明は認識している。検出液体中の細胞または捕捉粒子は、各々がユニークな性質を有するので、個々に検出されるべきである。したがって、本発明は、正確な少量の検出液体を膜から放出させること、および検出液体の希釈を回避しつつ、液体の液滴を質量分析計に送達することを提供する方法および装置を提供する。
【０００９】
本発明の態様は、少なくとも１つのポアを含む本質的に非吸収性の（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）膜（非吸収性の（ｎｏｎ−ｂｉｂｕｌｏｕｓ）膜）、その膜と作動可能に会合するマイクロウェル、およびその膜と作動可能に会合する電場発生器を備える装置を用いて達成される。異成分で構成されたサンプル（例えば、血液サンプル）が、少なくともそのマイクロウェル、膜、またはその装置の両方に導入される。そのサンプルに、複数の親和性剤が導入される。その複数の親和性剤の各々は、第１の分子を含む。その複数の親和性剤は、サンプル中の標的分析物に特異的に結合する。結合していない親和性剤が、除去される（例えば、洗浄によって）。１つまたはそれを超えるさらなる分子が、そのサンプルに導入される。その１つまたはそれを超えるさらなる分子は、第１の分子と相互作用して、質量分析標識を形成する。少なくとも１つのポアを通って液滴を放出させるために、電場発生器を介して電圧がサンプルに提供される。その液滴は、サンプルの一部および質量分析標識を含む。その液滴は、例えば、イオン化された質量分析標識の質量分析によって、質量分析標識の存在について分析される。その質量分析標識の存在は、サンプル中に標的分析物が存在することを示唆する。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、分析される質量分析標識の量を定量することによって、サンプル中の標的分析物を定量する工程をさらに含み得る。
【００１０】
通常、少なくとも１つのポアは、近位開口部、遠位開口部および壁を備える。多くの異なる配向のポアが、本発明の範囲内である。例えば、少なくとも１つのポアの壁は、近位開口部および遠位開口部に対して９０度であるように配向されていることがある。別の実施形態では、少なくとも１つのポアの壁は、近位開口部から遠位開口部に向かって次第に細くなっている。別の実施形態では、少なくとも１つのポアの壁は、遠位開口部から近位開口部に向かって次第に細くなっている。
【００１１】
ある特定の実施形態において、本質的に非吸収性の膜は、複数のポアを含む。その複数のポアは、同じ寸法を有し得る。あるいは、その複数のポアは、異なる寸法を有し得る。そのような実施形態において、上記装置は、電場発生器から電場を発生することにより、複数のポアのうちのただ１つから液滴が生成されるように構成されている。
【００１２】
上記装置は、質量分析計をさらに備え得る。質量分析計は、例えば、Ｇａｏら（Ｚ．Ａｎａｌ．１５  Ｃｈｅｍ．２００６，７８，５９９４−６００２）、Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８０：７１９８−７２０５，２００８）、Ｈｏｕら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８３：１８５７−１８６１，２０１１）、Ｓｏｋｏｌら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１１，３０６，１８７−１９５）、Ｘｕら（ＪＡＬＡ，２０１０，１５，４３３−４３９）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，２４２１−２４２５）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２，１８７−２５  ２１４）；Ｓａｎｄｅｒｓら（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００９，１６，１１−２０）；Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１７），５９９４−６００２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ．，２００６，１７０９−１７１１）；およびＦｉｃｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，７９，８０７６−８０８２）．）、（これらの各内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるような卓上用の質量分析計または小型の質量分析計であり得る。
【００１３】
ある特定の実施形態において、上記装置は、例えば、米国特許第９，１８４，０３６号（この内容の全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されているように、電場発生器がマイクロウェル内のサンプルに電場を誘導的に与えるように構成されている。
【００１４】
ある特定の実施形態において、第１の分子は、質量分析標識前駆体である。そのような実施形態において、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、質量分析標識前駆体と相互作用して質量分析標識を形成する変化剤（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）である。
【００１５】
他の実施形態において、第１の分子は、変化剤である。そのような実施形態において、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、変化剤と相互作用して質量分析標識を形成する質量分析前駆体標識である。
【００１６】
ある特定の実施形態において、第１の分子は、質量分析標識前駆体であり、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、質量分析標識前駆体と相互作用して質量分析標識を形成する第１および第２の変化剤である。
【００１７】
親和性剤は、粒子状または非粒子状であり得る。標的分析物は、稀な細胞であり得、異成分で構成されたサンプルは、異成分で構成された生物学的サンプルであり得る。
【００１８】
本発明のいくつかの例示的な方法は、少なくとも１つのポアを含む本質的に非吸収性の膜から液体を放出する方法に関する。その本質的に非吸収性の膜は、液体を保持できるマイクロウェルと会合し得る。少なくとも１つのポアと本質的に非吸収性の膜の少なくとも１つの表面との交差度は、約３０°〜約１５０°の角度である。その方法は、本質的に非吸収性の膜上の液体を電場に曝露して、その本質的に非吸収性の膜の少なくとも１つのポアを通ってその液体の１つまたはそれを超える液滴を放出させる工程を含み得る。
【００１９】
他の例示的な方法は、稀な分子および稀でない分子の１つまたはそれを超える異なる集団を含むと疑われるサンプル中の稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出する工程を含む。サンプル（通常、液体の形態）は、マイクロウェル、および少なくとも１つのポアを有する本質的に非吸収性の膜を備える装置に接触され得る。少なくとも１つのポアと本質的に非吸収性の膜の少なくとも１つの表面との交差は、約３０°〜約１５０°の角度である。そのサンプルは、稀な標的分子の異なる各集団に対して、稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に特異的であってそれに結合する結合パートナーを含む親和性剤とともにインキュベートされ得る。その親和性剤は、質量分析標識前駆体または第１の変化剤を含む。その親和性剤は、非粒子状または粒子状であり得る。第１の変化剤は、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進するか、または質量分析標識前駆体を含む実体を親和性剤から放出させる。第１の変化剤が、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進しない場合、そのサンプルは、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進する第２の変化剤に供される。その質量分析標識は、稀な標的分子の集団のうちの１つに対応する。本質的に非吸収性の膜上のサンプルは、電場に曝露されて、本質的に非吸収性の膜の少なくとも１つのポアを通ってサンプルの１つまたはそれを超える液滴を放出する。それらの液滴は、質量分析に供されることにより、異なる各質量分析標識の存在および／または量が明らかにされる。異なる各質量分析標識の存在および／または量は、各マイクロウェルに対するサンプル中の稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量と相関し得る。
【００２０】
他の態様において、本発明は、標的分析物を含むと疑われるサンプルを、ポアを含む膜（例えば、本質的に非吸収性の膜であるが、必要に応じて、吸収性の膜）に導入する工程を含む、サンプル分析方法を提供する。その膜上のサンプルに、１つまたはそれを超える試薬が導入されて、標的分析物がサンプル中に存在する場合、標的分析物と会合した質量分析標識が生成される。電場がその膜に印加され、それにより、膜のポアから排出されたサンプルの１つまたはそれを超える液滴が生成され、質量分析計に導入される。標的分析物の存在は、質量分析計を介して質量分析標識の存在を検出することによって検出される。次いで、検出工程の結果に基づくと標的分析物が存在する場合、膜のポアと会合しているサンプルの一部がその膜から抽出され、その抽出されたサンプルの一部が分析される。本発明の方法は、分析される質量分析標識の量を定量することによって、サンプル中の標的分析物を定量する工程をさらに含み得る。
【００２１】
膜上のサンプルに１つまたはそれを超える試薬を導入することは、各々が第１の分子を含む複数の親和性剤をそのサンプルに導入する工程（ここで、その複数の親和性剤は、サンプル中の標的分析物に特異的に結合する）、結合していない親和性剤を除去する工程、および１つまたはそれを超えるさらなる分子をそのサンプルに導入する工程（ここで、その１つまたはそれを超えるさらなる分子は、第１の分子と相互作用して、質量分析標識を形成する）を含み得る。
【００２２】
ある特定の実施形態において、第１の分子は、質量分析標識前駆体である。そのような実施形態において、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、質量分析標識前駆体と相互作用して質量分析標識を形成する変化剤である。
【００２３】
他の実施形態において、第１の分子は、変化剤である。そのような実施形態において、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、変化剤と相互作用して質量分析標識を形成する質量分析前駆体標識である。
【００２４】
他の実施形態において、第１の分子は、質量分析標識前駆体であり、１つまたはそれを超えるさらなる分子は、質量分析標識前駆体と相互作用して質量分析標識を形成する第１および第２の変化剤である。
【００２５】
これらの実施形態のすべてにおいて、親和性剤は、粒子状または非粒子状であり得る。例示的な実施形態において、標的分析物は、稀な細胞であり、サンプルは、異成分で構成された生物学的サンプルである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、異なるポアの配向を有する本発明の装置の例を描写している概略図である。
【００２７】
【図２】図２は、本発明に係る装置の別の例を描写している概略図である。
【００２８】
【図３】図３は、図１に示された装置から液体液滴を放出させるための本発明の装置および方法の一例を描写している概略図であり、その液滴は、質量分析計の取り入れ口に入る。
【００２９】
【図４】図４は、１つより多いポアを有する本発明の装置および方法の一例を描写している概略図である。ポアの１つから放出された液滴が、質量分析計の取り入れ口に入る。
【００３０】
【図５】図５は、図４の装置の本質的に非吸収性の膜を描写しており、ここで、その本質的に非吸収性の膜上のある領域が、さらなる分析のために特定される。
【００３１】
【図６】図６は、マイクロウェルアレイの一例を描写している概略図である。
【００３２】
【図７】図７は、アレイおよび電場発生器を備える装置の一例を描写している概略図である。
【００３３】
【図８−１】図８Ａ〜Ｃは、本発明の装置から直接スプレーされたＦＣ−２ペプチドを示している質量スペクトルのセットである。この質量スペクトルのセットは、様々な濃度のペプチドＦＣ−２から生成されたｍ／ｚ４１２に対するＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図８−２】図８Ａ〜Ｃは、本発明の装置から直接スプレーされたＦＣ−２ペプチドを示している質量スペクトルのセットである。この質量スペクトルのセットは、様々な濃度のペプチドＦＣ−２から生成されたｍ／ｚ４１２に対するＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【００３４】
【図９−１】図９Ａ〜Ｃは、本発明の装置から直接スプレーされたＦＣ−２ペプチドを示している質量スペクトルのセットである。この質量スペクトルのセットは、様々な濃度のペプチドＦＣ−２から生成されたｍ／ｚ４１２に対するＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図９−２】図９Ａ〜Ｃは、本発明の装置から直接スプレーされたＦＣ−２ペプチドを示している質量スペクトルのセットである。この質量スペクトルのセットは、様々な濃度のペプチドＦＣ−２から生成されたｍ／ｚ４１２に対するＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【００３５】
【図１０】図１０は、ＭＳの入口に向けられた本発明の装置からのスプレープルームの写真である。
【００３６】
【図１１】図１１は、ＤＥＳＩに有効なスプレーを生成するためおよび方向付けるためのスプレーデバイスを示している概略図を示している。
【００３７】
【図１２】図１２は、低温プラズマ（ＬＴＰ）プローブの１つの実施形態を示している概略図を示している。
【００３８】
【図１３】図１３は、イオンビームを生成するために紙片に供給されるイオンを生成するための液体の概略図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明は、概して、膜から、特に、ほんのわずかな分子（フェムトモル濃度（ｆＭ）スケールまたはそれより小さい）しか含まない少量（マイクロリットル（μＬ）スケールまたはそれより小さい）の液体の分析の領域における膜から液体を放出させるための方法および装置に関する。いくつかの態様において、本発明は、稀な分子および稀でない分子の１つまたはそれを超える異なる集団を含むと疑われる生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）中の稀な分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出するための方法、装置およびキットに関する。いくつかの態様において、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血液）中で自由に循環している稀な分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出するための方法およびキットに関する。他の態様において、本発明は、稀な細胞および稀でない細胞の１つまたはそれを超える異なる集団を含むと疑われる生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）中の稀な細胞と会合した稀な分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出するための方法およびキットに関する。
【００４０】
サンプル中の稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出するための本発明の方法は、稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団の濃度を稀でない分子の濃度を超えて高める工程を含み得る。濃縮されたサンプルが、形成され、稀な標的分子の異なる各集団に対して、その稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に特異的であってそれに結合する結合パートナーを含む親和性剤とともにインキュベートされる。その親和性剤は、非粒子状または粒子状であり得る。その親和性剤は、ＭＳ標識前駆体からの質量分析（ＭＳ）標識の形成を促進するかまたはＭＳ標識前駆体を含む実体を親和性剤から放出する、ＭＳ標識前駆体または第１の変化剤を含む。そのＭＳ標識は、稀な標的分子の集団のうちの１つに対応する。インキュベートされたサンプルを多孔性マトリックスと接触させることによって、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）および濾液が形成される。第１の変化剤が、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進しない場合、その保持液および濾液の一方または両方が、親和性剤からのＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進する第２の変化剤に供される。その保持液および濾液の一方または両方が、ＭＳ分析に供されることにより、異なる各ＭＳ標識の存在および／または量が明らかにされる。異なる各ＭＳ標識の存在および／または量は、サンプル中の稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量に関係する。
【００４１】
別の例では、稀な細胞および稀でない細胞を含むと疑われる血液サンプル中の稀でない細胞に対する稀な細胞の比が高められる。その血液サンプル、血小板不活化剤、フィブリン形成停止剤およびフィブリンを、所定のレベルの稀な細胞の凝集を引き起こすのに十分な量で合わせることによって、処理された血液サンプルが調製される。次いで、その処理された血液サンプルは、凝集した稀な細胞が多孔性マトリックス上に優先的に保持されるように多孔性マトリックスと接触される。
【００４２】
別の例では、インタクトな核酸を有する稀な細胞を、稀な細胞および稀でない細胞を含むサンプル中の稀でない細胞から分離する方法が用いられる。そのサンプルは、水性媒質と合わせられ、その合わせたものは、稀でない細胞から核酸を選択的に放出させるが稀な細胞からは放出させないために、ある時間にわたってある温度で保持される。そのサンプルは、稀でない細胞から稀な細胞を分離するために濾過に供される。
全体的な解説
【００４３】
本明細書中に記載される装置は、本質的に非吸収性の膜上に保持された少量の液体から、イオン化された液滴を形成することを可能にし、さらに、その後、その本質的に非吸収性の膜から本質的に非吸収性の膜（非吸収性の膜）の少なくとも１つのポアを通って液滴を放出させることを可能にする。
本発明の装置の一例が、図１に描写されている。装置１０は、マイクロウェル１４、および少なくとも１つのポア１８を有する本質的に非吸収性の膜１６を有する環状の壁１２を備える。ポア１８と本質的に非吸収性の膜１６とは、点２０において９０°の角度で交差している。そのポアは、装置１０からの液滴（例えば、液体液滴）が生成および放出されるのを促進するように作用する。
【００４４】
本発明の装置の別の例が、図２に描写されている。装置３０は、マイクロウェル３４、および少なくとも１つのポア３８を有する本質的に非吸収性の膜３６を有する環状の壁３２を備える。膜３６の上面３６ａとポア３８の内面３８ａとは、点４０において９０°の角度で交差し、膜３６の下面３６ｂとポア３８の内面３８ａとは、点４２において９０°の角度で交差している。そのポアは、装置３０から液滴（例えば、液体液滴）が生成および放出されるのを促進するように作用する。
【００４５】
図３は、図１に記載されているような装置からの液滴（例えば、液体液滴）の放出の一例を描写している。液体２４が、マイクロウェル１４に含まれているが、本質的に非吸収性の膜１６のポア１８を通過するのに十分な体積を有していない。ポア１８を通って本質的に非吸収性の膜１６から液滴２４ａを放出させるのに十分な強度を有する電場を発生するように、電場発生器２０がワイヤー２０ａによって活性化される。液滴２４ａは、質量分析計２８の入口２６に収集される。
【００４６】
質量分析計２８は、卓上用の質量分析計または小型の質量分析計などの当該分野で公知の任意のタイプの質量分析計であり得る。例示的な小型の質量分析計は、例えば、Ｇａｏら（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，５９９４−６００２）（この内容の全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されている。数千ワットの電力でラボスケールの機器に使用されるポンプシステムと比較して、小型の質量分析計は、一般に、より小さなポンプシステム（例えば、Ｇａｏらに記載されているシステムの場合、わずか５Ｌ／分（０．３ｍ３／時）の隔膜ポンプおよび１１Ｌ／ｓのターボポンプを備える１８Ｗのポンプシステム）を有する。他の例示的な小型の質量分析計は、例えば、Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８０：７１９８−７２０５，２００８）、Ｈｏｕら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８３：１８５７−１８６１，２０１１）およびＳｏｋｏｌら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１１，３０６，１８７−１９５）、（これらの各内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。小型の質量分析計は、例えば、Ｘｕら（ＪＡＬＡ，２０１０，１５，４３３−４３９）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，２４２１−２４２５）；Ｏｕｙａｎｇら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２，１８７−２１４）；Ｓａｎｄｅｒｓら（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００９，１６，１１−２０）；Ｇａｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１７），５９９４−６００２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ．，２００６，１７０９−１７１１）；およびＦｉｃｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，７９，８０７６−８０８２）。）、（これらの各内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）にも記載されている。
【００４７】
図４は、ポアのアレイを含む本発明の装置の別の例を描写している。液体６４は、装置５０のマイクロウェル５４に含まれており、本質的に非吸収性の膜５６のポア５８ａ〜５８ｄを通過するのに十分な体積を有しない。マイクロウェル５４は、環状の壁５６を有する。本質的に非吸収性の膜５６から個別のポア５８ｂだけを通って液滴６４ａを放出させるのに十分な強度を有する電場を発生するように、電場発生器６０が活性化される。液滴６４ａは、質量分析計６８の入口６６に収集される。この例では、電場発生器の寸法は、単一のポアまたはポアのサブセットに正確に電場が印加されるように選択される。したがって、その電場発生器は、その電場発生器が、そのような印加を可能にする少なくとも一部（例えば、先端、ワイヤー、針、錐、長方形または球形）を備えるようにしかるべくデザインされている。この例では、電場の印加点における電場発生器の寸法は、ほぼ、電場の選択的な印加が望まれるポアまたはポアのサブセットのサイズであるべきである。したがって、電場の印加点における電場発生器の寸法は、ポアまたはポアのサブセットのサイズの約２００％以下かつ約５０％以上、または約１５０％以下かつ約２５％以上、または約１００％以下かつ約５０％以上、または約５０％以下かつ約２５％以上であるべきである。さらに、質量分析計の入口は、電場発生器と整列しているべきである。いくつかの例では、質量分析計の入口は、電場の印加点における電場発生器の寸法に合う寸法を有する。
【００４８】
図４および５を参照すると、液滴６４ａの中のＭＳ標識が、ＭＳ分析の結果として特定され、本質的に非吸収性の膜５６上の対応する領域５９が、さらなる分析のために選択される。領域５９から、例えば、吸引、打ち出し、切開もしくは抽出または上記の２つもしくはそれを超えるものの組み合わせによって、液体または粒子（細胞を含む）が取り出される。
【００４９】
上に記載された装置では、本質的に非吸収性の膜は、本質的にまたは完全に液体を透過させない平らな表面であり得る。その本質的に非吸収性の膜は、少なくとも１つのポア、およびある特定の実施形態では、１つより多いポア（例えば、ポアのアレイ）を含む。その少なくとも１つのポアは、本質的に非吸収性の膜内で、定まった配向を有する。その定まった配向は、ポアの壁が本質的に非吸収性の膜の表面とどのように交差しているかに関して説明され得る。例えば、ポアは、ポアの壁が、本質的に非吸収性の膜の表面（マイクロウェルに面している上面（近位面）および質量分析計に面している底面（遠位面））と９０度で交差するような垂直壁を有し得る。そのようなポアの配向は、図１Ａに示されている。
【００５０】
他の配向も可能であり、当業者は、本発明が、特定のポアの配向に限定されないことを認識するだろう。例えば、ポアの壁は、２つの表面の交差において約３０°〜約１５０°の角度で本質的に非吸収性の膜の表面と交差し得る。それは、図１Ｂに示されているように、ポアが近位面から遠位面に向かって次第に細くなるようにさせる（すなわち、ポアは、より狭くなるような大きさである）。あるいは、ポアは、図１Ｃに示されているように、遠位面から近位面に向かって次第に細くなり得る（すなわち、ポアは、より広くなるような大きさである）。本質的に非吸収性の膜が１つより多いポアを含むいくつかの例では、交差の角度は、ポアごとに高い精度（１変動率未満）を有し、すなわち、それらのポアはすべて、同じ寸法を有する。したがって、この例では、ポアと本質的に非吸収性の膜の表面との角度は、１°を超えて別のポアの角度と異ならない。他の実施形態では、ポアの一部または全部が、互いに異なる寸法を有する。
【００５１】
用語「交差」は、２つの表面が互いに接触している点または点の連続を意味する。本質的に非吸収性の膜が１つより多いポアを含むいくつかの例では、ポアの１つと本質的に非吸収性の膜の表面との角度が、別のポアの角度と、例えば、１°を超えて、または０．５°を超えて、または０．２°だけ、または０．１°を超えて、または０．０５°を超えて、または０．０１°を超えて、または０．００５°を超えて、または超えて、または０．００１°を超えて、異ならない。
【００５２】
いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜上の液体は、本質的に非吸収性の膜から１つまたはそれを超える液体液滴の放出を引き起こす電場に曝露される。その電場は、液滴内の分子のイオン化も引き起こし得る。本質的に非吸収性の膜は、電場発生器とも会合する。電場発生器が活性化されると、電場が発生し、それによって、液体がより多くポアを通過し、膜から少なくとも１つのポアを通って、例えば、質量分析計の入口に、放出される液体液滴を形成する。
【００５３】
上で述べたように、本質的に非吸収性の膜は、液体を保持することができるマイクロウェルと会合する。句「〜と会合する」は、本質的に非吸収性の膜とマイクロウェルとが、本質的に非吸収性の膜がマイクロウェルの底面またはマイクロウェルの上面に存在し得る単一ユニットを形成し得ることを意味する。
【００５４】
液体は、ＭＳ標識を含むサンプルまたは液体であり得る。液体は、サンプルに導入されるＭＳ標識でもあり得る。いくつかの例において、液体は、溶媒、例えば、エレクトロスプレー質量分析において使用されるスプレー溶媒を含む。いくつかの例において、エレクトロスプレーイオン化のための溶媒としては、極性有機化合物、例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノールおよびプロパノール）、アセトニトリル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびニトロメタン；非極性有機化合物、例えば、ヘキサン、トルエン、シクロヘキサン；および例えば、水、またはそれらの２つもしくはそれを超える組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、溶媒は、改質剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）として、１つまたはそれを超える酸または塩基、例えば、揮発性の塩および緩衝液、例えば、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）、揮発性の酸、例えば、ギ酸、酢酸またはトリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ドデシル硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、および非揮発性の塩または緩衝液、例えば、ナトリウムおよびカリウムの塩化物およびリン酸塩を含み得る。
【００５５】
膜は、本質的に非吸収性であり、これは、その膜が本質的に液体を吸収できないこと（非吸収性）を意味する。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜によって吸収される液体の量は、約２（容量）％未満または約１％未満または約０．５％未満または約０．１％未満または約０．０１％未満または０％である。本質的に非吸収性の膜は、非繊維状であり得、これは、その膜が、繊維を少なくとも９５％含まないか、または繊維を少なくとも９９％含まないか、または繊維を少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％含まないか、または繊維を１００％含まないことを意味する。
【００５６】
本質的に非吸収性の膜は、固形の非可撓性の材料であり得、液体を透過させない（その膜１つまたはそれを超えるポアを除いて）。本質的に非吸収性の膜は、有機材料もしくは無機材料または水不溶性材料を含み得る。本質的に非吸収性の膜の形状は、例えば、本質的に非吸収性の膜のためのホルダーまたは保持物の性質、ポアの性質および形状、ポアと本質的に非吸収性の膜との角度、マイクロウェルの性質、電荷発生の性質、ならびに質量標識の性質のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜の形状は、例えば、円形、卵形、長方形、正方形、六角形、平面または平らな表面（例えば、ストリップ、ディスク、フィルム、膜およびプレート）である。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜は、堅いかまたは非可撓性であり、これは、本質的に非吸収性の膜が、本質的に非吸収性の膜の面から約１°を超えてまたは約０．５°を超えてまたは約０．１°を超えて曲げられない場合があることを意味する。
【００５７】
本質的に非吸収性の膜は、多種多様の材料から製作され得、その材料は、天然に存在するものであってもよいし、合成のもの、重合体または非重合体であってもよい。本質的に非吸収性の膜を製作するためのそのような材料の例としては、例えば、プラスチック、例えば、ポリカーボネート、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ−（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリイミド、ポリウレタンおよびパリレン（ｐａｒａｙｌｅｎｅ）；シラン；ケイ素；窒化ケイ素；グラファイト；セラミック材料（例えば、アルミナ、ジルコニア、ＰＺＴ、炭化ケイ素、窒化アルミニウム）；金属材料（例えば、金、タンタル、タングステン、白金およびアルミニウム）；ガラス（例えば、ホウケイ酸塩、ソーダ石灰ガラスおよびＰＹＲＥＸ（登録商標）（低熱膨張ホウケイ酸ガラス，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））；および生体吸収性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトンおよびポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｉｃ  ａｃｉｄ））が実例として挙げられるがこれらに限定されず、これらは、例えば、それらだけでまたは互いにおよび／もしくは他の材料とともに使用される。本質的に非吸収性の膜を製作するための材料は、吸収性および／または透過性であるがゆえに本明細書中に記載される原理と一致しない、繊維状の材料（例えば、セルロース（紙を含む）、ニトロセルロース、酢酸セルロース、レーヨン、ジアセテート、リグニン、鉱物繊維、繊維状タンパク質、コラーゲン、合成繊維（例えば、ナイロン、ダクロン、オレフィン、アクリル、ポリエステル繊維）または他の繊維状の材料（ガラス繊維、金属繊維）を含まない。
【００５８】
各マイクロウェルについて本質的に非吸収性の膜は、少なくとも１つのポアを含む。本質的に非吸収性の膜は、１つより多いポア、例えば、１平方センチメートル（ｃｍ２）あたり約２，０００，０００のポアを含み得る。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜のｃｍ２あたりのポアの数は、例えば、１〜約２，０００，０００、または１〜約１，０００，０００、または１〜約５００，０００、または１〜約２００，０００、または１〜約１００，０００、または１〜約５０，０００、または１〜約２５，０００、または１〜約１０，０００、または１〜約５，０００、または１〜約１，０００、または１〜約５００、または１〜約２００、または１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約２０、または１〜約１０、または２〜約５００，０００、または２〜約２００，０００、または２〜約１００，０００、または２〜約５０，０００、または２〜約２５，０００、または２〜約１０，０００、または２〜約５，０００、または２〜約１，０００、または２〜約５００、または２〜約２００、または２〜約１００、または２〜約５０、または２〜約２０、または２〜約１０、または５〜約２００，０００、または５〜約１００，０００、または５〜約５０，０００、または５〜約２５，０００、または５〜約１０，０００、または５〜約５，０００、または５〜約１，０００、または５〜約５００、または５〜約２００、または５〜約１００、または５〜約５０、または５〜約２０、または５〜約１０である。本質的に非吸収性の膜のポアの密度は、例えば、本質的に非吸収性の膜の表面積の約１％〜約２０％、または約１％〜約１０％、または約１％〜約５％、または約５％〜約２０％、または約５％〜約１０％である。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜のポアのサイズは、本明細書中に記載されるように形成される液体液滴の通過を可能にしつつ、液体を優先的に保持するのに十分なサイズである。本質的に非吸収性の膜のポアのサイズは、例えば、液体の性質、細胞のサイズ、捕捉粒子のサイズ、質量標識のサイズ、分析物のサイズ、標識粒子のサイズ、稀でない分子のサイズ、および稀でない細胞のサイズに依存する。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜のポアの平均サイズは、例えば、約０．１〜約２０ミクロン、または約０．１〜約５ミクロン、または約０．１〜約１ミクロン、または約１〜約２０ミクロン、または約１〜約５ミクロン、または約１〜約２ミクロン、または約５〜約２０ミクロン、または約５〜約１０ミクロンである。
【００５９】
上記のとおり、本質的に非吸収性の膜の上部表面および／または底部表面と、ポアの内壁との交差は、例えば、約３０°〜約１５０°、または約３０°〜約１２５°、または約３０°〜約１１０°、または約３０°〜約１００°、または約３０°〜約９５°、または約３０°〜約９０°、または約４５°〜約１５０°、または約６０°〜約１５０°、または約７５°〜約１５０°、または約８０°〜約１５０°、または約８５°〜約１５０°、または約９０°〜約１５０°、または約４５°〜約１２５°、または約６０°〜約１１０°、または約７０°〜約１００°、または約８０°〜約１００°、または約８５°〜約９５°、または約９０°の角度を有する。表面の交差は、各表面の形状、例えば、ポアの形状に依存し、例えば、線状、円形、卵形、六角形、正方形もしくは長方形またはそれらの組み合わせであり得る。
【００６０】
膜の上記の特徴は、膜から液滴として放出される液体の量の高レベルの正確さを可能にする。液滴中の液体の量の変動（ＣＶ）は、例えば、約１％（容量／容量）を超えないか、または約０．５％を超えないか、または約０．１％を超えない場合がある。さらに、溶媒からの質量脱着（ｍａｓｓ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が生じる時間（脱着時間）も、変動が小さく、すなわち、約５００ミリ秒（ｍｓｅｃ）を超えて、または約４００ｍｓｅｃを超えて、または約３００ｍｓｅｃを超えて、または約２００ｍｓｅｃを超えて、または約１００ｍｓｅｃを超えて、または約５０ｍｓｅｃを超えて、または約１０ｍｓｅｃを超えて変動せず、それにより、短時間でのイオンの捕捉がより容易になり、ゆえに、公知の方法と比べてより小さなスプレー体積が可能になる。脱着時間は、本質的に非吸収性の堅い膜の場合、さらに短くなる。さらに、本質的に非吸収性の膜が、１つより多いポアを含み、本質的に非吸収性の膜の表面における１つのポアに対する角度が、別のポアに対する角度と０．５°を超えて異ならない場合、およそ５０ｍｓｅｃというより短い脱着時間が達成され得る。本明細書中に記載される装置を用いて得られる精度は、高度に定量的な結果を可能にさせる。句「質量脱着」とは、溶媒分子からの質量標識イオンの分離のことを指す。
【００６１】
マイクロウェル、およびポアを有する膜は、例えば、微小電気機械（ＭＥＭＳ）技術、金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）技術、マイクロシーブを作製するためのマイクロ製造プロセス、レーザー技術、照射、成形およびマイクロマシニング、またはそれらの組み合わせによって製作され得る。
【００６２】
上で述べたように、本質的に非吸収性の膜（非吸収性の膜）のポアからの、帯電した液滴および分析物イオンを含む分析物（または質量タグ）の排出は、その膜付近での電場の発生によって達成される。その電場は、約１キロボルト（ｋＶ）〜約１０キロボルト（ｋＶ）、または約１ｋＶ〜約５ｋＶまたは約２ｋＶ〜約１０ｋＶまたは約５ｋＶ〜約１０ｋＶまたは約６．０〜６．５ｋＶの電位を、本質的に非吸収性の膜から０．０５ｍｍ〜最大２０ｍｍ離れて位置する導体素子（本明細書中以後、電場発生器と称される）に提供することによって確立される。その装置は、典型的には、質量分析計の入口のキャピラリーから０．０１ｍｍ〜５ｍｍの距離に配置され、それは、−３００Ｖから最大＋３００Ｖまでの電位で保持され得る。
【００６３】
電場の性質および強度は、以下のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する：液体の性質、ポアサイズ、スプレー液体の量、膜と電場発生器との間の距離、膜と質量分析計の入口との間の距離、ならびに電場発生器および質量分析計の入口に印加される電位。いくつかの場合、膜から持続的なスプレーを発生させるために、電位は、高電源を介して持続的に供給される。他の場合、電位は、電場発生器に接続された圧電デバイス（例えば、帯電防止銃）を加圧または減圧することによって供給される。さらに、膜からの帯電した液滴および分析物の不連続な排出は、１ｋＶ〜約１５ｋＶの範囲の１つの電気パルスまたはひと続きの電気パルスを、電場発生器に個々のパルス１つあたり０．５ｍｓもの短い持続時間から、個々のパルス１つあたり２分もの長い持続時間にわたって提供することによって達成され得る。
【００６４】
ポアまたはポアのサブセットを通って排出される液体の体積は、例えば、サンプルの体積、ポアのサイズ、分析の性質、ウェルのサイズ、１つのウェルにおけるポアの数、発生された電場（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｉｌｅｄ）におけるウェルの数、発生された電場におけるポアの数、ポアサイズ、ポア角度、および膜の剛性に依存する。いくつかの例では、排出される液体の体積は、例えば、約１ｆＬ〜約１μＬまたは約１ｎＬ〜約１μＬである。
【００６５】
いくつかの例では、電場発生器は、本質的に非吸収性の膜と会合しており、活性化されると電場を発生する。いくつかの例では、電場発生器は、本質的に非吸収性の膜に対する支持体と一体になった電気グリッド線である。いくつかの例では、電場発生器は、本質的に非吸収性の膜とは分離した電気グリッドであり、本質的に非吸収性の膜へのおよび本質的に非吸収性の膜からの動きに対して配置されている。いくつかの例では、電場発生器および本質的に非吸収性の膜の一方または両方が、本質的に非吸収性の膜の領域または特定の本質的に非吸収性の膜もしくは本質的に非吸収性の膜の群において液滴の形成を選択的に誘導するために電場発生器の活性化を可能にするように電場発生器を本質的に非吸収性の膜に対して配置させるように動かすことができるロボットアームに取り付けられており、ここで、その本質的に非吸収性の膜は、下記で論じられるような本質的に非吸収性の膜のアレイの一部であり得る。
【００６６】
いくつかの例では、電場発生器は、線、プレート、イオン流またはそれらの組み合わせである。電場発生器への例えば電位の印加によって、電場発生器が活性化される。イオン流は、種々の手段によって発生され得、それらの手段としては、誘電体バリア放電によるプラズマの発生、好適な導体素子への交流電位の印加、好適な導体素子への静電位の印加、または好適な導体素子に接続された圧電材料の圧縮が挙げられるがこれらに限定されない。いずれの場合でも、好適な導体素子は、電場の強度（電位の印加における）が、周囲の媒体の電気的破壊を引き起こすのに十分な大きさであるように、好適な幾何学の電気伝導性材料から構成される。いくつかの場合、この好適な導体素子は、ワイヤー、突起もしくはひと続きの突起、プレート、グリッドもしくはメッシュ、とがった棒、または粗面であり得る。イオン流は、好適な液体をエレクトロスプレーすることによっても発生され得る。発生されたイオン流は、非吸収性の膜の片側に向けられ、その膜の反対側は、先に記載されたような質量分析計の入口付近に位置している。そのイオン流は、以下に限定されないが、イオン流が非吸収性の膜に向かって移動し、非吸収性の膜に衝突するような適切な様式でイオン流発生器を置くことによって、イオンをその膜に静電気的に向かわせるように好適な電位をひと続きの伝導性電極に提供することによって、または空気の力（例えば、流動気体）を使用してイオン流を膜に向かって運ぶことによって、方向づけられ得る。サンプルの誘導帯電および誘導イオン化も使用され得、それらは、下記でさらに説明され、また、例えば米国特許第９，１８４，０３６号（この内容の全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されている。
【００６７】
本質的に非吸収性の膜は、マイクロウェルであり得るハウジングと会合し得、本質的に非吸収性の膜は、そのハウジングの中に、例えば、ハウジングの上部または底面に、位置し得る。ハウジングは、本質的に非吸収性の膜の材料と適合性である任意の好適な材料から構築され得る。そのような材料の例としては、本質的に非吸収性の膜に対して上に列挙された材料のいずれかが一例として挙げられるが、それらに限定されない。ハウジングおよび本質的に非吸収性の膜のための材料は、同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜は、マイクロウェルの一部である。
【００６８】
上で述べたように、いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜は、マイクロウェルまたはマイクロウェルのアレイの一部である。それらのマイクロウェルのうちの少なくとも２つの本質的に非吸収性の膜は、同じであり得るかまたは異なり得る液体サンプルを含み得、その少なくとも２つのマイクロウェルの本質的に非吸収性の膜の各々から液滴を選択的に放出させるために、電場が活性化され得る。マイクロウェルの上部または底部が、本質的に非吸収性の膜を備え得る。マイクロウェルの容積は、例えば、液体サンプルの性質、ポアの性質、本質的に非吸収性の膜の性質およびサイズ、スプレー溶媒、捕捉粒子または細胞、分析物の濃度、質量標識の濃度に依存する。いくつかの例では、マイクロウェルの体積は、約１フェムトリットル（ｆＬ）〜約１００マイクロリットル（μＬ）、または約１μＬ〜約１００ナノリットル（ｎＬ）、または約１μＬ〜約５０ｎＬ、または約１μＬ〜約１０ｎＬ、または約１μＬ〜約５ｎＬ、または約１μＬ〜約１ｎＬ、または約１ｎＬ〜約２ｎＬである。マイクロウェルが円形であるいくつかの例では、マイクロウェルの寸法は、約５マイクロメートル（μｍ）〜約４０ミリメートル（ｍｍ）、または約５μｍ〜約５００μｍ、または約５００μｍ〜約２ｍｍ、または約２ｍｍ〜約４０ｍｍである。単一のポアを囲むマイクロウェルは、定義された体積の液体を保持し得、それにより、定義されたスプレー液体体積が可能になり、ゆえに、固定された高濃度の分析物およびポア内の液体の短い脱着時間が可能になる。
【００６９】
アレイは、例えば、２〜約１００，０００マイクロウェル、または２〜約５０，０００マイクロウェル、または２〜約１０，０００マイクロウェル、または２〜約５，０００マイクロウェル、または２〜約２，５００マイクロウェル、または２〜約１，０００マイクロウェル、または２〜約５００マイクロウェル、または２〜約１００マイクロウェル、または２〜約５０マイクロウェル、または約１０〜約１００，０００マイクロウェル、または約１０〜約５０，０００マイクロウェル、または約１０〜約１０，０００マイクロウェル、または約１０〜約５，０００マイクロウェル、または約１０〜約２，５００マイクロウェル、または約１０〜約１，０００マイクロウェル、または約１００〜約１０，０００マイクロウェル、または約１００〜約５，０００マイクロウェル、または約１００〜約２，５００マイクロウェル、または約５，０００〜約１０，０００マイクロウェル、または約２，５００〜約７，５００マイクロウェルを含み得る。
【００７０】
本明細書中に記載される原理に従った一例における装置１０のアレイが、図５に描写されている。装置１０（各々がマイクロウェル１４を含む）の２４×３２グリッド（７６８）を含むアレイ７０が示されている。
【００７１】
上で述べたように、マイクロウェルのアレイおよび電場発生器は、その一方または両方が、１つまたはそれを超えるマイクロウェルに対して電場を選択的に活性化するような様式で動かされ得るように互いに配置され得る。例証としてであって限定ではない例が、図６〜７に示されている。装置８０は、アレイ７０および電場発生器７４を備える。ロボットアーム７２は、アレイ７０の動きを制御し、必要に応じて、ロボットアーム７６は、電場発生器７４の動きを制御する。装置８０は、ロボットアーム７２および７６の一方または両方に対する支持を提供するハウジングも備える（図示せず）。ロボットアーム７２およびロボットアーム７６の各々は、アレイ７０および電場発生器７４の一方または両方が互いに対して動かされ得るように、好適な電子機器およびコントローラ（図示せず）を用いて別々に制御可能である。質量分析計の入口は、電場発生器の動きとそろえられる。このようにして、アレイ７０を備える１つまたはそれを超える装置８０に電場が選択的に印加されることにより、アレイ７０のマイクロウェルの本質的に非吸収性の膜の特定領域の取り調べが可能になり得る。液滴のイオン化は、本質的に非吸収性の膜の異なる領域のみへの電位の印加によって、またはナノ構造を含む外部構造を使用して、選択された領域からのイオン化を促進することによって、その領域から達成され得る。さらに、アレイ７０は、膜から選択的に放出された液体の液滴が質量スペクトル分析に供され得るように、質量分析計の取り入れ口に対して配置され得る（図４を参照のこと）。
【００７２】
図６〜７に示されている例では、電場発生器７４を制御しているロボットアームが、アレイ７０の上に示されていることに注意するべきである。これは、単なる例証であり；いくつかの例では、ロボットアーム７６は、例えば、アレイ７０の下に存在し得るか、またはアレイ７０の近く（アレイ７０の側に）存在し得る。
【００７３】
本発明の装置は、膜上の正確な小さい体積の液体の放出が望まれる任意の状況における用途を有する。そのような用途の例としては、例えば、稀な標的分子、稀でない分子、稀でない細胞および稀な細胞の検出が例証として挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜は、１つより多いポアを含み、個別のポアまたはポアのサブセットから液滴を選択的に放出させるために、電場が活性化される。放出された液滴は、質量分析に供されて、特定のＭＳ標識が位置する個別のポアまたはポアのサブセットの近くの領域が決定される。その領域に対応する膜上の液体は、下記でさらに十分に論じられる方法による分析のために取り出される。その個別のポアの近くの液体は、例えば、吸引、その膜の領域の打ち出し、持ち上げ、切開もしくは抽出、またはそれらの２つもしくはそれを超える組み合わせによって取り出され得る。
【００７４】
誘導荷電
例えば、米国特許第９，１８４，０３６号（この内容の全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されているような誘導エレクトロスプレーイオン化では、サンプルを含む本質的に非吸収性の膜の近くに置かれた１つまたはそれを超える電極（例えば、電場発生器）に電位が印加され得る。それは、１０〜２０００Ｈｚの範囲の周波数において、ポジティブモードまたはネガティブモードで繰り返しパルスする。強い動的な電磁場が、本質的に非吸収性の膜において発生され、その電磁場は、本質的に非吸収性の膜の具体的に標的化されたポアの中にその電磁場の焦点を与えて、そのポアから、帯電した液滴のバーストがもたらされる。
【００７５】
誘導荷電では、高電源（例えば、電場発生器）は、サンプル、またはサンプルを含む本質的に非吸収性の膜と接触しない。このようにして、イオンが誘導荷電によって生成される。すなわち、誘導性の方法を用いることにより、主要な微小滴が荷電される。これは、制御された集中的な液滴の生成を可能にする。生成された液滴は、質量分析計に向けられる。
【００７６】
電極（例えば、電場発生器）を本質的に非吸収性の膜の所望のポアの近くに（通常、２〜５ｍｍ離して）置き、それを高い陽電位まで繰り返しパルスすることによって（５〜７ｋＶ、５０〜３，０００Ｈｚ、約０．２〜２ｍｓのパルス幅）、本質的に非吸収性の膜上の特定の位置から帯電した液滴を生成できる。電磁的誘導は、本質的に非吸収性の膜の特定のポアだけから帯電した液滴のバーストをもたらす、本質的に非吸収性の膜のその特定のポアのすぐ近くに高電場を生成する。
【００７７】
いくつかの例では、質量タグ放出剤を適用した後に、質量タグ化された稀な細胞または粒子を有する本質的に非吸収性の膜から、本明細書中で論じられるようなＭＳ標識を含む液体が直接発射され得る。したがって、質量分析計への入口などのより小さな領域に、放出された帯電した微小滴／溶媒和イオンのアンビエント静電集束が達成される。いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜の表面の近くに高電場を提供するための本質的に非吸収性の膜の上または下の点のアレイによって提供されるナノ特徴を用いて、電場によって補助される、帯電した液滴の排出が達成される。
【００７８】
いくつかの例では、本質的に非吸収性の膜の固有のナノ特徴を用いることにより、帯電した液滴の電界放出によって、湿った本質的に非吸収性の膜から、分析物を有するイオンのスプレーが生成され得る。空気の力と静電力との組み合わせを用いて、その後の質量分析計による分析のためのイオンが収集され得る。これには、質量分析計の入口からの吸引によって（例えば、真空によって）または質量分析計と無関係な提供される気体流による空気の力が提供される場合が含まれる。
【００７９】
脱着エレクトロスプレーイオン化
本質的に非吸収性の膜上のサンプルに向けられるイオンビームを生成するための１つの実施形態は、例えば、Ｔａｋａｔｓら（米国特許第７，３３５，８９７号）（この内容の全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されている脱着エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）を用いる。ＤＥＳＩは、周囲条件下の大気圧または減圧において材料（分析物）のイオン化および脱着を可能にする。ＤＥＳＩシステムは、通常、ネブライジングガス中に液体の液滴を送達することによってＤＥＳＩ活性スプレー（ＤＥＳＩ−ａｃｔｉｖｅ  ｓｐｒａｙ）を生成するためのデバイスを備える。そのシステムは、ＤＥＳＩ活性スプレーをある表面上に向けるための手段も備える。そのＤＥＳＩ活性スプレーは、表面との接触点において、帯電した液体液滴および無電荷の液体液滴の両方またはいずれか、気体イオン、ネブライジングガスの分子ならびに付近の大気の分子を含み得ることが理解される。空気圧によって補助されるスプレーは、サンプルを保持している本質的に非吸収性の膜上に向けられ、そこで、そのスプレーは、１つまたはそれを超える分析物がサンプル中に存在する場合、それらの分析物と相互作用し、本質的に非吸収性の膜のポアを通って排出される分析物の脱着したイオンを生成する。脱着したイオンは、質量分析の場合は質量分析器に、サイズによる分離および生じる電圧変動の計測の場合はＩＭＳデバイスに、分光分析の場合は炎光分光計などに向けられ得る。
【００８０】
図１１は、ＤＥＳＩシステム１００の１つの実施形態を模式的に図示している。このシステムでは、スプレー１１０は、従来のエレクトロスプレーデバイス１２０によって生成されている。デバイス１２０は、スプレーキャピラリー１３０を備えており、このスプレーキャピラリーを通って、液体溶媒１４０が供給される。取り囲んでいるネブライザーキャピラリー１５０は、輪状の空間を形成しており、そこを通って、窒素（Ｎ２）などのネブライジングガスが高速で供給される。１つの例において、液体は、水／メタノール混合物であり、ガスは、窒素であった。高電圧が、電源１７０によって金属接続素子を介して液体溶媒に印加される。高速で流れるネブライジングガスがキャピラリー１３０を出る液体と相互作用した結果が、液体液滴を含むＤＥＳＩ活性スプレー１１０の形成である。ＤＥＳＩ活性スプレー１１０は、中性の大気分子、ネブライジングガスおよび気体イオンも含み得る。エレクトロスプレーデバイス１２０が記載されているが、ネブライジングガスの噴射によって運ばれる液体液滴流を生成することができる任意のデバイスを、ＤＥＳＩ活性スプレー１１を形成するために使用してよい。
【００８１】
スプレー１１０は、サンプルを保持している本質的に非吸収性の膜上に向けられる。本質的に非吸収性の膜のポアを通ってサンプルから離れる脱着したイオンが、分析用の質量分析計の大気入口または境界面に、収集および導入される。本質的に非吸収性の膜は、可動のプラットフォームであり得るか、または異なる領域においてサンプルを脱着およびイオン化するための周知の駆動手段によってｘ、ｙまたはｚ方向に動かされ得る可動のプラットフォーム上に乗せられ得る。プラットフォームの電位および温度も、公知の手段によって制御され得る。質量分析計に通常見られる任意の大気境界面が、本発明において使用するのに適しているだろう。加熱された代表的なキャピラリー大気境界面を用いて、良好な結果が得られた。金属または絶縁体で作られている、長い可撓性のイオン移動ラインを介してサンプリングする大気境界面を用いても、良好な結果が得られた。
【００８２】
低温プラズマ
本質的に非吸収性の膜上のサンプルに向けられるイオンビームを生成するための１つの実施形態は、Ｏｕｙａｎｇら（米国特許第８，５１９，３５４号）（この各内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている低温プラズマ（ＬＴＰ）プローブを使用する。エレクトロスプレーまたはレーザーに基づくアンビエントイオン源とは異なり、プラズマ源は、エレクトロスプレー溶媒、補助ガスおよびレーザーを必要としない。ＬＴＰは、比較的低い運動エネルギーであるが反応性イオンおよび中性イオンとともに高エネルギー電子を有する非平衡のプラズマとして特徴づけられ得る；その結果は、表面から分析物を脱着およびイオン化するためならびに分析物の分子イオンまたはフラグメントイオンを生成するために使用され得る、低温周囲プラズマである。高温（平衡）プラズマと比べたときのＬＴＰの際立った特徴は、ＬＴＰが、分子を原子または小さい分子フラグメントに破壊しないがゆえに、生成されたイオンに分子の情報が保持されていることである。ＬＴＰのイオン源は、サイズが小さい可能性、低電力および少量のガスを消費する（または周囲空気だけを使用する）可能性を有し、これらの利点は、運転経費を減少させ得る。費用節約に加えて、ＬＴＰベースのイオン化法は、現場でのリアルタイムの解析的分析のために移動式の質量分析計を用いて利用される可能性を有する。（Ｇａｏ，Ｌ．；Ｓｏｎｇ，Ｑ．；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｄ．Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，５９９４−６００２；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｃ．Ｃ．；Ｔａｌａｔｙ，Ｎ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００６，１７０９−１７１１；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｃ．Ｃ．；Ｊｕｓｔｅｓ，Ｄ．Ｒ．；Ｎｏｌｌ，Ｒ．Ｊ．；Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｎ．Ｌ．；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｂ．Ｃ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ  ２００６，１３１，５５６−５６７）。
【００８３】
例示的なＬＴＰプローブを図１２に示す。そのようなプローブは、放電ガスの入口ポートを有するハウジング、プローブの先端、２つの電極、および誘電体バリアを備え得、ここで、その２つの電極は、その誘電体バリアによって分断されており、電源からの電圧の印加によって、電場および低温プラズマが発生し、電場もしくは気体流またはその両方が、低温プラズマをプローブの先端の外に噴射する。本明細書中に記載されるプローブのイオン源は、誘電体バリア放電（ＤＢＤ；Ｋｏｇｅｌｓｃｈａｔｚ，Ｕ．，Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ２００３，２３，１−４６）に基づく。誘電体バリア放電は、高電圧信号、例えば、交流を、誘電体バリアによって分断された２つの電極間に印加することによって達成される。その２つの電極間に、非熱的低電力プラズマが生成され、その誘電体が、変位電流を制限する。このプラズマは、固体サンプル表面ならびにイオン化液体および気体から分子を脱着／イオン化するために使用され得るサンプルの周囲環境中の反応性イオン、電子、ラジカル、励起中性種および準安定種を含む。そのプラズマは、放電領域から引き出され得、電場による力または電場と気体流とが組み合わさった力によって、サンプル表面に向かい得る。
【００８４】
ある特定の実施形態において、上記プローブは、電源をさらに備える。その電源は、直流または交流を提供し得る。ある特定の実施形態において、その電源は、交流を提供する。ある特定の実施形態において、放電ガスが、放電ガス入口ポートを通ってプローブに供給され、電場および／または放電ガスが、低温プラズマをプローブの先端の外に噴射する。放電ガスは、任意のガスであり得る。例示的な放電ガスとしては、ヘリウム、圧縮空気または周囲空気、窒素およびアルゴンが挙げられる。ある特定の実施形態において、誘電体バリアは、電気絶縁材料から構成される。例示的な電気絶縁材料としては、ガラス、石英、セラミックスおよびポリマーが挙げられる。他の実施形態において、誘電体バリアは、各端が開いているガラス管である。他の実施形態において、電場を変動させることにより、サンプル中の分析物から生成されるイオンのエネルギーおよび断片化の程度が調整される。
【００８５】
低温プラズマプローブからのプラズマ放電は、サンプルを保持している本質的に非吸収性の膜上に向いている。そのプラズマは、サンプルと相互作用し、サンプルの液体液滴を、本質的に非吸収性の膜のポアを通って排出させ、分析用の質量分析計の大気の入口または境界面に導入させる。
【００８６】
湿った多孔性材料を用いたイオン化
本質的に非吸収性の膜上のサンプルに向かうイオンビームを生成するための１つの実施形態は、Ｏｕｙａｎｇら（米国特許第８，８５９，９５６号）（この各内容の全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている、イオンを生成するために湿らされた多孔性材料を含むプローブを使用する。例示的なプローブを図１３に示す。多孔性材料（例えば、紙（例えば、濾紙またはクロマトグラフィー紙）または他の類似の材料）を使用することにより、液体が保持され、また、高電圧がその材料に印加されたとき、その液体は、その材料の縁から直接発生されるイオンビームに変化される。その多孔性材料は、連続溶媒流などの溶媒流から離れたまま維持される（すなわち、分離するかまたは切り離される）。その代わりに、液体が、多孔性材料上に点在される。次いで、点在された液体は、高電圧源に接続されて、サンプルを保持している本質的に非吸収性の膜上に向けられたその液体のイオンビームを生成する。本質的に非吸収性の膜のポアを通ってサンプルから出てきた脱着したイオンは、収集されて、分析用の質量分析計の大気の入口または境界面に導入される。その液体は、別個の溶媒流の必要なしに、多孔性材料を通って輸送される。空気の補助も必要ない；むしろ、単に電圧が多孔性材料に印加される。
【００８７】
ある特定の実施形態において、上記多孔性材料は、任意のセルロース系材料である。他の実施形態において、上記多孔性材料は、非金属性の多孔性材料（例えば、コットン、リネンウール、合成繊維または植物の組織）である。なおも他の実施形態において、上記多孔性材料は、紙である。紙の利点としては、費用（紙は安価である）；完全に商品化されていて、その物理的および化学的特性を調節することができること；粒状物（細胞およびちり）を液体サンプルから濾過できること；容易に成形されること（例えば、切りやすい、裂きやすい、または折り畳みやすい）；毛管現象によってその中を液体が流れること（例えば、外からのポンピングおよび／または電源なしに）；および使い捨てであることが挙げられる。
【００８８】
ある特定の実施形態において、上記多孔性材料は、スプレーのために最適化された巨視的角度を有する固体の先端と一体化されている。
【００８９】
特定の実施形態において、上記多孔性材料は、濾紙である。例示的な濾紙としては、セルロース濾紙、無灰濾紙、ニトロセルロース紙、ガラスマイクロファイバー濾紙およびポリエチレン紙が挙げられる。任意のポアサイズを有する濾紙を使用してよい。例示的なポアサイズとしては、Ｇｒａｄｅ  １（１１μｍ）、Ｇｒａｄｅ  ２（８μｍ）、Ｇｒａｄｅ  ５９５（４〜７μｍ）およびＧｒａｄｅ  ６（３μｍ）が挙げられる。ポアサイズは、スプレー材料の内側への液体の輸送に影響するだけでなく、先端におけるテイラーコーンの形成にも影響し得る。最適なポアサイズは、安定したテイラーコーンを生成し、液体の蒸発を減少させる。濾紙のポアサイズも、濾過における重要なパラメータであり、すなわち、その濾紙は、オンライン前処理デバイスとして作用する。低ｎｍの範囲のポアサイズを有する、再生セルロースの商業的に入手可能な限外濾過膜が、１０００Ｄａもの小ささの粒子を保持するためにデザインされている。１０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量カットオフを有する限外濾過膜が、商業的に入手できる。
【００９０】
本発明のプローブは、単純に、多孔性材料の縁で発生される高電場の使用に基づいて、ミクロンスケールの液滴を生成するためにうまく働く。特定の実施形態において、多孔性材料は、イオン発生のために、巨視的に鋭い先（例えば、三角形の先）を有するように成形される。本発明のプローブは、種々の先端幅を有し得る。ある特定の実施形態において、プローブの先端幅は、少なくとも約５μｍまたはそれより広い、少なくとも約１０μｍまたはそれより広い、少なくとも約５０μｍまたはそれより広い、少なくとも約１５０μｍまたはそれより広い、少なくとも約２５０μｍまたはそれより広い、少なくとも約３５０μｍまたはそれより広い、少なくとも約４００μまたはそれより広い、少なくとも約４５０μｍまたはそれより広いなどである。特定の実施形態において、その先端幅は、少なくとも３５０μｍまたはそれより広い。他の実施形態において、プローブの先端幅は、約４００μｍである。他の実施形態において、本発明のプローブは、３次元の形状、例えば、円錐形の形状を有する。
【００９１】
稀な標的分子の検出
いくつかの例では、本発明の装置は、親和性剤およびＭＳ法を用いて検出可能な異なる標識を使用して稀な標的分子の異なる集団を検出する際に使用される。いくつかの例では、稀な標的分子の異なる集団の間で区別するために選択されたＭＳ標識を生成するために、１つまたはそれを超える変化剤が使用される。それらの方法は、分離方法も使用し、その方法では、液体液滴が生成され、異なる各ＭＳ標識の存在および量の一方または両方についてＭＳ法によって調べられる。ＭＳ標識の区別によって、稀な標的分子の異なる各集団の存在および量の一方または両方に関する情報が得られる。ＭＳ標識の数は、稀な標的分子１つあたり１０６個またはそれを超えるほど多い場合もあるし、稀な標的分子１つあたり１０個という少なさである場合もある。稀な標的分子１つあたりのＭＳ標識の数は、例えば、約１０〜約１０１２個、または約１０〜約１０１０個、または約１０〜約１０８個、または約１０〜約１０６個、または約１０〜約１０４個、または約１０〜約１００個、または約１００〜約１０１０個、または約１００〜約１０８個、または約１００〜約１０６個、または約１００〜約１０４個であり得る。
【００９２】
いくつかの例では、上記方法は、稀な分子および稀でない分子の１つまたはそれを超える異なる集団を含むと疑われるサンプル中の稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団を検出するための方法である。液体の形態のサンプルは、本質的に非吸収性の膜を構成しているマイクロウェルに接触される。必要に応じて、好適な手法、例えば、濾過を用いることによって、稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団の濃度が、稀でない分子の濃度を超えて高められることにより、濃縮されたサンプルが形成される。そのサンプルは、稀な標的分子の異なる各集団に対して、稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に特異的であってそれに結合する特異的結合パートナーを含む親和性剤とともにインキュベートされる。その親和性剤は、質量分析標識前駆体または第１の変化剤を含む。その親和性剤は、非粒子状または粒子状であり得る。第１の変化剤は、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進するか、または親和性剤から質量分析標識前駆体を含む実体を放出させる。第１の変化剤が、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進しない場合、サンプルは、質量分析標識前駆体からの質量分析標識の形成を促進する第２の変化剤に供される。その質量分析標識は、稀な標的分子の集団のうちの１つに対応するか、またはその１つを構成する。本質的に非吸収性の膜上のサンプルは、電場に曝露されて、本質的に非吸収性の膜の少なくとも１つのポアを通ってサンプルの液滴を放出する。それらの液滴は、質量分析に供されることにより、異なる各質量分析標識の存在および／または量が明らかにされる。各マイクロウェルに対するサンプル中の稀な標的分子の異なる各集団の存在（ｐｒｅｓｅｎｔ）および／または量に対する異なる各質量分析標識の存在および／または量。
【００９３】
１つのアプローチにおいて、粒子の拡大が用いられ、それにより、粒子の凝集またはクラスター化がもたらされて、粒子凝集物が形成される。１つの例において、より大きな粒子（キャリア粒子）が、多くのより小さな粒子（標識粒子）によってコーティングされ得る。拡大をさらに達成するために、そのキャリア粒子は、１つまたはそれを超える連結基を用いて他のキャリア粒子と繋がれ得る。質量標識のサイズは、比較的小さいので、標識粒子は、表面上におよそ１０５個であり得るＭＳ標識を含む。このアプローチでは、非常に低いバックグラウンドレベルが達成される。キャリア粒子および標識粒子は、本質的に非吸収性の膜におけるポアより小さい直径を有するべきである。
【００９４】
下記で論じられる１つまたはそれを超える特定手法が、本明細書中に記載される原理に従ってサンプルを本質的に非吸収性の膜と接触させた後でサンプルに適用され得ることに注意するべきである。したがって、１つまたはそれを超える稀な標的分子を特定するためにサンプルを分析するためのアプローチは、まず、どのマイクロウェルが、目的の稀な標的分子を有しているかを特定することを含む。したがって、その後の分析のために稀な標的分子を含むサンプルを有するマイクロウェルを特定する手法が、スクリーニング法として用いられ得る。
【００９５】
分析されるべきサンプルは、稀な標的分子、稀でない細胞および稀な細胞を含むと疑われるサンプルである。それらのサンプルは、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプルであり得る。生物学的サンプルは、哺乳動物の被験体または非哺乳動物の被験体由来であり得る。哺乳動物の被験体は、例えば、ヒトまたは他の動物種であり得る。生物学的サンプルとしては、例えば、生体液（例えば、全血、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、便、尿、髄液、唾液、糞便、脳脊髄液、涙液および粘液）が挙げられる。生物学的組織としては、例えば、例証として、毛、皮膚、器官または他の身体部分由来の切片または切除組織が挙げられる。多くの場合、サンプルは、全血、血漿または血清である。稀な細胞は、例えば、肺がん、気管支がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、肝臓がん、胆管がん、膀胱がん、卵巣がん、脳のがん、中枢神経のがん、腎臓がん、骨盤がん、子宮体がん、口腔がんまたは咽頭がんまたはメラノーマがん由来であり得る。稀な細胞は、例えば、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌および原虫）；悪性細胞（例えば、悪性新生物またはがん細胞）；循環内皮細胞；循環腫瘍細胞；循環がん幹細胞；循環がん間葉細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｓｏｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）；循環上皮細胞；胎児細胞；免疫細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、単球）；および幹細胞であり得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、試験されるべきサンプルは、ヒト被験体であるがこれに限定されない哺乳動物由来の血液サンプルである。その血液サンプルは、細胞、例えば、稀でない細胞および稀な細胞を含む血液サンプルである。いくつかの例では、血液サンプルは、全血または血漿である。
【００９６】
句「稀な標的分子」とは、サンプル中で検出され得るバイオマーカーを含む分子のことを指し、ここで、その分子またはバイオマーカーは、特定の細胞集団を示すものである。稀な標的分子としては、抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ビタミン、アレルゲン、自己免疫性抗原、炭水化物、脂質、糖タンパク質、コファクター、抗体および酵素）および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
句「稀な標的分子の集団」とは、その分子群に特異的な共通の抗原または核酸を共有する分子群のことを指す。句「〜に特異的」は、その共通の抗原または核酸が、その分子群を他の分子と区別することを意味する。
【００９８】
稀でない分子は、サンプル中の稀な分子の量と比べたとき、比較的多い量で存在する。
【００９９】
句「細胞集団」とは、その表面上またはその細胞内に抗原または核酸を有する細胞群のことを指し、ここで、その抗原は、その群のすべての細胞に共通であり、その抗原は、その細胞群に特異的である。
【０１００】
稀な細胞は、サンプル中の稀でない細胞の量と比べたとき、比較的少ない量でサンプル中に存在する細胞である。いくつかの例では、稀な細胞は、稀な細胞を含むと疑われるサンプル中の全細胞集団の約１０−８重量％〜約１０−２重量％の量で存在する。稀な細胞は、悪性細胞（例えば、悪性新生物またはがん細胞）；循環内皮細胞；循環上皮細胞；間葉系（ｍｅｓｏｃｈｙｍａｌ）細胞；胎児細胞；免疫細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、単球）；幹細胞；有核赤血球（正赤芽球または赤芽球）；および未熟な顆粒球であり得るが、これらに限定されない。
【０１０１】
稀でない細胞は、サンプル中の稀な細胞の量と比べたとき、比較的多い量で存在する細胞である。いくつかの例では、稀でない細胞は、稀でない細胞および稀な細胞を含むと疑われるサンプル中の全細胞集団中の稀な細胞の量よりも少なくとも約１０倍または少なくとも約１０２倍または少なくとも約１０３倍または少なくとも約１０４倍または少なくとも約１０５倍または少なくとも約１０６倍または少なくとも約１０７倍または少なくとも約１０８倍多い。稀でない細胞は、例えば、白血球、血小板および赤血球であり得るが、これらに限定されない。
【０１０２】
稀な細胞の稀な標的分子としては、例えば、がん細胞タイプバイオマーカー、がんタンパク質およびがん遺伝子、化学療法剤抵抗性バイオマーカー、転移潜在性バイオマーカー、ならびに細胞分類マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。がん細胞タイプバイオマーカーとしては、例えば、サイトケラチン（ＣＫ）（ＣＫ１、ＣＫ２、ＣＫ３、ＣＫ４、ＣＫＳ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８およびＣＫ９、ＣＫ１０、ＣＫ１２、ＣＫ１３、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ１８、ＣＫ１９およびＣＫ２）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンが例証として挙げられるが、これらに限定されない。変異が原因で治療に関連する可能性の高いがんタンパク質およびがん遺伝子として、例えば、ＷＡＦ、ＢＡＸ−１、ＰＤＧＦ、ＪＡＧＧＥＤ１、ＮＯＴＣＨ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＨＲ、ＣＡｌＸ、ＭＩＢ１、ＭＤＭ、ＰＲ、ＥＲ、ＳＥＬＳ、ＳＥＭ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＥＭＬ−４、ＤＲＡＦＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＡＢＬ１、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＭＥＫ１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＡＴＭ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＧＮＡ１１、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＤＤＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１、ＮＲＡＳ、ＦＧＦＲ１およびＲＯＳ１が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
内皮細胞分類マーカーとしては、例えば、ＣＤ１３６、ＣＤ１０５／エンドグリン、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４５、ＣＤ３４、Ｃｄ４１  ＣＤ１３６、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、ＥＳＡＭ、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｉｋ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ２０２ｂ／ＴＥＫ、ＣＤ５６／ＮＣＡＭ、ＣＤ７３／ＶＡＰ−２、クローディン５、Ｚ０−１およびビメンチンが例証として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
転移潜在性バイオマーカーとしては、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−１）、ＣＤ９５、セリンプロテアーゼ（例えば、プラスミンおよびＡＤＡＭ）；セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ビクニン）；マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ９）；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＴＩＭＰ−１）が挙げられるがこれらに限定されない。化学療法剤抵抗性バイオマーカーとしては、ＰＬ２Ｌ  ｐｉｗｉ様、５Ｔ４、ＡＤＬＨ、β−インテグリン、α６インテグリン、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｍｅｔ、ＬＩＦ−Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＥＳＡ、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＫＳ、ＴＲＡＦ２およびＡＢＣトランスポーター、ＣＤ４５またはＣＤ３１を欠くががん幹細胞を示唆するＣＤ３４を含むがん細胞；ならびにＣＤ２４を欠くがＣＤ４４を含むがん細胞が例証として挙げられるが、これらに限定されない（ｂｕｔ  ａｒｅ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）。
【０１０５】
本明細書中の方法では、白血球は、稀でない細胞として除外され得る。例えば、ある細胞が目的の稀な細胞ではないことを示すために、マーカー（例えば、白血球上に存在する、ＣＤ４５、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４、ＣＤ６ＳおよびＣＤＳであるがこれらに限定されない）を用いることができる。特定の非限定的な例では、ＣＤ４５抗原（タンパク質チロシンホスファターゼレセプタータイプＣまたはＰＴＰＲＣとしても知られ、当初は白血球共通抗原と呼ばれていた）が、すべての白血球を検出する際に有用である。
【０１０６】
さらに、ＣＤ４５は、稀な細胞であると考えられ得る種々のタイプの白血球を区別するために使用することができる。例えば、顆粒球は、ＣＤ４５＋、ＣＤ１５＋によって示され；単球は、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋によって示され；Ｔリンパ球は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋によって示され；Ｔヘルパー細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋によって示され；細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤＳ＋によって示され；β−リンパ球は、ＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋またはＣＤ４５＋、ＣＤ２０＋によって示され；血小板は、ＣＤ４５＋、ＣＤ６１＋によって示され；ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋およびＣＤ３−によって示される。さらに、通常使用される２つのＣＤ分子、すなわち、ＣＤ４およびＣＤ８が、一般に、それぞれヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞に対するマーカーとして使用される。他の一部の白血球が、これらのＣＤ分子も発現するので（一部のマクロファージは、低レベルのＣＤ４を発現し；樹状細胞は、高レベルのＣＤＳを発現する）、これらの分子は、ＣＤ３＋と組み合わせて定義される。
【０１０７】
他の場合、稀な細胞は、病原体であり、それらとしては、グラム陽性菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｂ群連鎖球菌、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．緑色連鎖球菌、黄色ブドウ球菌およびｓａｐｒｏｐｈｙｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびそれらの耐性菌）；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含むがこれに限定されない）；グラム陰性菌（例えば、大腸菌、肺炎桿菌、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、緑膿菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、霊菌およびＤｉｐｈｔｈｅｒｏｉｄｓ（ｇｎｂ）ならびにそれらの耐性菌であるがこれらに限定されない）；ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＦｌｕおよびＭＥＲＳＡであるがこれらに限定されない）；および性感染症が挙げられるが、これらに限定されない。稀な細胞病原体を検出する場合、その稀な細胞病原体集団に結合する結合パートナーを含む粒子試薬が加えられる。さらに、病原体上の細胞性の稀な標的分子の各集団に対して、その集団中の細胞性の稀な標的分子に結合する、細胞性の稀な標的分子に対する結合パートナーを含む試薬が加えられる。
【０１０８】
句「非細胞性の稀な標的分子」とは、細胞に結合されていないかつ／またはサンプル中で自由に循環している、稀な標的分子のことを指す。そのような非細胞性の稀な標的分子としては、疾患の医学的診断において有用な生体分子が挙げられ、その有用な生体分子としては、例えば、がん、心臓の損傷、循環器疾患、神経疾患、鬱血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ／ｈｅｍａｓｔａｓｉｓ）、胎児の母体内評価（ｆｅｔａｌ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、受胎能、骨の状態、ホルモンレベル、ビタミン、アレルギー、自己免疫疾患、高血圧症、腎疾患、糖尿病、肝疾患、感染症を検出するためのバイオマーカー、および疾患の医学的診断において有用な他の生体分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
上で述べたように、いくつかの場合、稀な標的分子の１つまたはそれを超える集団は、非細胞性の稀な標的分子の集団であり得る。そのような場合、非細胞性の稀な標的分子の１つまたは異なる集団の濃度を稀でない分子の濃度を超えて上昇させることにより、濃縮されたサンプルを形成する目的で、非細胞性の稀な標的分子の各集団に対して、非細胞性の稀な標的分子に対する結合パートナーを含む捕捉粒子実体が加えられ、その結合パートナーは、その集団中の非細胞性の稀な標的分子に結合して、粒子に結合した非細胞性の稀な標的分子を形成することによって、非細胞性の稀な標的分子が粒子状の形態になる。
【０１１０】
粒子の組成は、有機または無機、磁性または非磁性であり得る。有機ポリマーとしては、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）、ポリ（スチレン／アクリレート）、ポリ（エチレンテレフタレート）、メラミン樹脂、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）が例証として挙げられるが、これらに限定されず、これらは、それらだけでまたは他の材料とともに使用され、それらのラテックス、微小粒子およびナノ粒子の形態を含む。それらの粒子は、例えば、炭素（例えば、カーボンナノチューブ）、金属（例えば、金、銀および鉄であり、それらの金属酸化物も含む）、コロイド、デンドリマー、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）、核酸、分枝鎖ＤＮＡおよびリポソームも含み得る。
【０１１１】
粒子実体の粒子の直径は、例えば、稀な標的分子の性質、サンプルの性質、本質的に非吸収性の膜の性質およびポアサイズ、膜への粒子の接着、粒子の表面、本質的に非吸収性の膜の表面、液体のイオン強度、液体の表面張力および液体中の構成要素、ならびに付着される親和性剤およびＭＳ標識前駆体の数、サイズ、形状および分子構造のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。粒子の直径は、バックグラウンドの寄与を許容され得るレベルにまで減少させるのに十分大きくなくてはならないが、稀でない分子からの粒子の分離が非効率的になってしまうほど大きくあってはならない。いくつかの例では、本明細書中に記載される原理に従って、粒子の平均直径は、少なくとも約０．０２ミクロン（２０ｎｍ）かつ約２００ミクロン以下または約１２０ミクロン以下であるべきである。いくつかの例では、粒子は、例えば、約０．１ミクロン〜約２０ミクロン、または約０．１ミクロン〜約１５ミクロン、または約０．１ミクロン〜約１０ミクロン、または約０．０２ミクロン〜約０．２ミクロン、または約０．２ミクロン〜約１ミクロン、または約１ミクロン〜約５ミクロン、または約１ミクロン〜約２０ミクロン、または約１ミクロン〜約１５ミクロン、または約１ミクロン〜約１０ミクロン、または約５ミクロン〜約２０ミクロン、または約５〜約１５ミクロン、または約５〜約１０ミクロン、または約６〜約１５ミクロン、または約６〜約１０ミクロンの平均直径を有する。いくつかの例では、表面への粒子の接着は、粒子直径が、本質的に非吸収性の膜のポアサイズより小さい直径であり得るほど強い。他の例では、物理的に、粒子が本質的に非吸収性の膜のポアを通って落ちることができないように、粒子は、本質的に非吸収性の膜のポアサイズよりも十分に大きい。
【０１１２】
捕捉粒子実体も、非細胞性の稀な標的分子に特異的な結合パートナーを含む。句「結合パートナー」とは、特異的結合対のメンバーである分子のことを指す。ある特異的結合対のメンバーは、ある領域を表面上または空隙内に有する２つの異なる分子のうちの一方であり、その領域は、他方の分子に特異的に結合し、それにより、他方の分子の特定の空間的構成および極性構成と相補的であると定義される。特異的結合対のメンバーは、免疫学的対（例えば、抗原−抗体またはハプテン−抗体）、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、酵素−基質、核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡおよびポリヌクレオチド対（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ）のメンバーであり得る。結合パートナーは、粒子試薬の粒子に、共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。「非共有結合的に」は、結合パートナーが、水素結合、ファンデルワールス力、静電力、疎水性作用、粒子内への物理的捕捉および荷電相互作用のうちの１つまたはそれを超えるものの結果として粒子に結合されることを意味する。「共有結合的に」は、結合パートナーが、結合または連結基によって粒子に結合されることを意味し、その連結基は、脂肪族または芳香族であり得、炭素、酸素、硫黄、窒素およびリンを含む２〜約６０個またはそれを超える原子の鎖を含み得る。
【０１１３】
いくつかの例では、サンプルは、被験体の身体から好適な容器（例えば、カップ、バッグ、ボトル、キャピラリーまたは針であるがこれらに限定されない）に収集される。血液サンプルは、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（採血チューブであって、ＢＤから商業的に入手可能）に収集され得る。その容器は、サンプルが送達される収集媒質を含み得る。その収集媒質は、通常、乾燥した媒質であり、血液サンプルと混合されたとき、血液サンプル中の血小板の不活化を達成するのに有効な量の血小板不活化剤を含み得る。
【０１１４】
血小板不活化剤としては、キレート剤（例えば、三酢酸部分もしくはその塩、四酢酸部分もしくはその塩、五酢酸部分もしくはその塩、または六酢酸部分もしくはその塩を含む作用物質）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその塩またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびその塩である。血小板不活化剤の有効量は、例えば、血小板不活化剤の性質、血液サンプルの性質、血小板活性化のレベルおよびイオン強度のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。いくつかの例では、抗血小板薬としてのＥＤＴＡの場合、容器内の乾燥ＥＤＴＡの量は、約１．０〜約２．０ｍｇ／ｍＬ血液、または約１．５ｍｇ／ｍＬ血液の濃度をもたらし得る量である。血小板不活化剤の量は、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の血小板不活化を達成するのに十分な量である。
【０１１５】
上で述べたように、必要に応じて、稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団の濃度が、稀でない分子の濃度を超えて高められることにより、濃縮されたサンプルが形成される。いくつかの例では、サンプルを本質的に非吸収性の膜と接触させる前に、そのサンプルを、稀でない分子は多孔性マトリックスを通過させつつ、稀な標的分子は保持される多孔性マトリックスを用いる濾過手順に供することによって、稀な標的分子の濃度が高められる。１つまたはそれを超える稀な標的分子が、非細胞性である場合、すなわち、細胞または他の生物学的粒子と会合していない場合、そのサンプルは、１つまたはそれを超える捕捉粒子実体と合わせられ、ここで、各捕捉粒子実体は、その非細胞性の稀な標的分子の各集団の非細胞性の稀な標的分子に対する結合パートナーを含むことにより、非細胞性の稀な標的分子が粒子状の形態になる、すなわち、粒子に結合した非細胞性の稀な標的分子を形成する。サンプルと捕捉粒子実体とを合わせたものは、非細胞性の稀な標的分子と、捕捉粒子実体の対応する結合パートナーとの結合を可能にする時間にわたって、それを可能にする温度において、保持される。中程度の温度が、通常使用され、それは、約５℃〜約７０℃または約１５℃〜約７０℃または約２０℃〜約４５℃の範囲であり得る。インキュベーション期間のための時間は、例えば、約０．２秒〜約６時間または約２秒〜約１時間または約１〜約５分間である。
【０１１６】
サンプルと本質的に非吸収性の膜とを接触させるための時間は、例えば、稀な標的細胞および／または粒子に結合した稀な標的分子の異なる集団の性質およびサイズ、本質的に非吸収性の膜の性質、本質的に非吸収性の膜のポアのサイズ、本質的に非吸収性の膜上のサンプルに適用される真空のレベル、濾過される体積、および本質的に非吸収性の膜の表面積のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、接触の時間は、約１分間〜約１時間、約５分間〜約１時間、または約５分間〜約４５分間、または約５分間〜約３０分間、または約５分間〜約２０分間、または約５分間〜約１０分間、または約１０分間〜約１時間、または約１０分間〜約４５分間、または約１０分間〜約３０分間、または約１０分間〜約２０分間である。
【０１１７】
本明細書中の方法において、濃縮されていないかまたは濃縮されたサンプルは、稀な標的分子の異なる各集団に対して、稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に特異的であってそれに結合する結合パートナーを含む親和性剤とともにインキュベートされ得る。その親和性剤は、ＭＳ標識前駆体、または異なる各ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進するかもしくはＭＳ標識前駆体を含む実体を親和性剤から放出させる第１の変化剤も含む。多くの例において、上記の組み合わせは、水性媒質中に提供され、その水性媒質は、もっぱら水であり得るか、または有機溶媒、例えば、極性非プロトン性溶媒、極性プロトン性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、有機酸またはアルコール、および水と混和性の非極性溶媒、例えば、ジオキセンも、約０．１容量％〜約５０容量％または約１容量％〜約５０容量％または約５容量％〜約５０容量％または約１容量％〜約４０容量％または約１容量％〜約３０容量％または約１容量％〜約２０容量％または約１容量％〜約１０容量％または約５容量％〜約４０容量％または約５容量％〜約３０容量％または約５容量％〜約２０容量％または約５容量％〜約１０容量％の量で含み得る。いくつかの例では、水性媒質に対するｐＨは、通常、中程度のｐＨである。いくつかの例では、水性媒質のｐＨは、約５〜約８または約６〜約８または約７〜約８または約５〜約７または約６〜約７または生理学的ｐＨである。様々な緩衝液が、所望のｐＨを達成するためおよび任意のインキュベーション期間中にｐＨを維持するために使用され得る。例証的な緩衝液としては、ホウ酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝食塩水）、炭酸塩、ＴＲＩＳ、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳおよびＢＩＣＩＮＥが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
使用される水性媒質の量は、いくつかの因子（例えば、サンプルの性質および量、試薬の性質および量、稀な標的細胞の安定性、ならびに稀な標的分子の安定性であるがこれらに限定されない）に依存する。いくつかの例では、１０ｍＬのサンプルあたりの水性媒質の量は、約５ｍＬ〜約１００ｍＬ、または約５ｍＬ〜約８０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約６０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約２０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約１００ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約８０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約６０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約２０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約１００ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約８０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約６０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約３０ｍＬである。
【０１１９】
１つまたはそれを超える稀な標的分子が、細胞の一部である場合、水性媒質は、細胞を溶解するための溶解剤も含み得る。溶解剤は、細胞の膜の完全性を破壊することによってその細胞の細胞内の内容物を放出させる化合物または化合物の混合物である。溶解剤の例としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、低イオン強度水溶液（低張性溶液）、細菌剤（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、脂肪族アルデヒド、および補体依存性溶解を引き起こす抗体が挙げられるが、これらに限定されない。様々な補助的な材料が、希釈媒質中に存在し得る。水性媒質中のすべての材料が、所望の効果または機能を達成するのに十分な濃度または量で存在する。
【０１２０】
いくつかの例では、１つまたはそれを超える稀な標的分子が、細胞の一部である場合、サンプルの細胞を固定することが望ましい場合がある。細胞の固定は、細胞を固定化し、細胞の構造を保存し、それらの細胞によく似た条件における細胞をインビボ様の条件および目的の抗原が特異的な親和性剤によって認識されることができる条件で維持する。使用される固定液の量は、細胞を保存するが、その後のアッセイにおいて誤った結果をもたらさない量である。固定液の量は、例えば、固定液の性質および細胞の性質のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、固定液の量は、約０．０５重量％〜約０．１５重量％または約０．０５重量％〜約０．１０重量％または約０．１０重量％〜約０．１５重量％である。細胞の固定を行うための作用物質としては、例えば、架橋剤、例えば、アルデヒド試薬（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド）；アルコール（例えば、Ｃ１−Ｃ５アルコール、例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロパノール）；ケトン（例えば、Ｃ３−Ｃ５ケトン、例えば、アセトン）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ１−Ｃ５またはＣ３−Ｃ５という呼称は、アルコールまたはケトンにおける炭素原子の数のことを指す。１つまたはそれを超える洗浄工程が、緩衝水性媒質を用いて、固定された細胞に対して行われる。
【０１２１】
必要であれば、固定の後、その細胞調製物は、透過処理にも供され得る。いくつかの場合、固定剤（例えば、アルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）またはケトン（例えば、アセトン））が、透過処理ももたらし、さらなる透過処理工程は必要ない。透過処理は、細胞膜を通過した目的の標的分子への接近を提供する。使用される透過処理剤の量は、細胞膜を破壊して、標的分子への接近を可能にする量である。透過処理剤の量は、透過処理剤の性質ならびに細胞の性質および量のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。いくつかの例では、透過処理剤の量は、約０．０１％〜約１０％または約０．１％〜約１０％である。細胞の透過処理を行うための作用物質としては、アルコール（例えば、Ｃ１−Ｃ５アルコール、例えば、メタノールおよびエタノール）；ケトン（例えば、Ｃ３−Ｃ５ケトン、例えば、アセトン）；界面活性剤（例えば、サポニン、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル緩衝液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）およびＴＷＥＥＮ−２０（ポリソルベート２０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能））が挙げられるが、これらに限定されない。１つまたはそれを超える洗浄工程が、緩衝水性媒質を用いて、透過処理された細胞に対して行われる。
【０１２２】
上で述べたように、本明細書中の方法において使用される親和性剤は、稀な標的分子に特異的な親和性剤である。親和性剤は、特異的結合対のメンバーであり、そのメンバーは、ある領域を表面上または空隙内に有する２つの異なる分子のうちの一方であり、その領域は、他方の分子に特異的に結合し、それにより、他方の分子の特定の空間的構成および極性構成と相補的であると定義される。特異的結合対のメンバーは、免疫学的対（例えば、抗原−抗体およびハプテン−抗体）のメンバーであり得るが、他の特異的結合対としては、例えば、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、酵素−基質、アプタマー、核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡおよび核酸対（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ）が挙げられる。細胞の場合、親和性剤は、細胞に会合した標的分子抗原を特異的に認識するかまたはそれに結合する作用物質である。
【０１２３】
特異的結合は、他の分子の実質的に低い認識と比べて、２つの異なる分子のうちの一方の、他方に対する特異的認識を含む。他方で、非特異的結合は、特異的な表面構造と比較的無関係な分子間の非共有結合性の結合を含む。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用をはじめとしたいくつかの因子に起因し得る。
【０１２４】
細胞を特定するイムノアッセイにおいて使用するための標的分子に特異的な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。そのような抗体は、当該分野で周知の手法（例えば、宿主の免疫化および血清の収集）によって調製され得るか（ポリクローナル）、または持続的なハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質を収集することによって調製され得るか（モノクローナル）、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列もしくはその変異誘発されたバージョンをクローニングして発現させることによって調製され得る。
【０１２５】
抗体には、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントが含まれ得、その免疫グロブリンには、様々なクラスおよびアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなど）が含まれる。そのフラグメントには、例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’が含まれ得る。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持されている限り、必要に応じて、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの凝集物、ポリマーおよび結合体を使用することができる。
【０１２６】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当該分野で周知の手法によって調製され得る。例えば、１つのアプローチにおいて、モノクローナル抗体は、体細胞ハイブリダイゼーション法によって得られる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２６５：４９５−４９７，１９７５の標準的な手法に従って作製され得る。モノクローナル抗体の手法の総説は、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｅｄ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７８）、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：４９５（１９７７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８：６９２（１９８０）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３（Ｐａｒｔ  Ｂ）：３−４６（１９８１）に見られる。一般に、モノクローナル抗体は、公知の手法（例えば、クロマトグラフィ、例えば、ＤＥＡＥ  クロマトグラフィ、ＡＢｘクロマトグラフィおよびＨＰＬＣクロマトグラフィ；および濾過であるがこれらに限定されない）によって精製され得る。
【０１２７】
親和性剤は、標的核酸に相補的な核酸（例えば、ポリヌクレオチド）であり得る。ポリヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログである任意の長さのヌクレオチドの重合体の形態のことを指す。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドの構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識する構成要素との結合体化などによって、さらに修飾され得る。
【０１２８】
親和性剤は、ＭＳ標識前駆体、またはＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進する変化剤を含み、ここで、そのＭＳ標識は、稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に対応する。ＭＳ標識は、稀な標的分子の集団のうちの１つと、稀な分子の他の集団との区別を可能にする。さらに、ＭＳ標識の選択は、ＭＳによる分析において質量が重複することを回避するため、ＭＳ分析におけるバックグラウンド干渉を回避するため、および多重化を可能にするために行われ得る。
【０１２９】
句「質量分析標識」または「ＭＳ標識」とは、各ユニークな質量が、稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量に対応し、かつ各ユニークな質量が、稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量を明らかにするために使用されるように、ユニークな質量、好ましくは３ｋＤＡ未満を有する１つの分子または分子群のことを指す。ＭＳ標識は、定義された質量の分子であり、それらのＭＳ標識としては、例えば、その質量が、例えば置換および鎖のサイズによって変動され得る、ポリペプチド、ポリマー、脂肪酸、炭水化物、有機アミン、核酸および有機アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。重合体材料の場合、反復単位の数は、質量が、サンプルからのバックグラウンド質量と重複しない領域内であるように調整される。句「ＭＳ標識」は、親和性粒子によって捕捉される分析物、誘導体化された分析物（ここで、その誘導体化は分析物をイオン性にする）、およびイオンの形態の誘導体化されていない分析物も含む。ＭＳ標識は、イオン化の際の構造および断片化に起因して、ユニークな質量パターンを生成する。
【０１３０】
用語「分析物」とは、検出されるべき分子のことを指す。例示的な分析物としては、薬物、代謝産物、農薬および汚染物質が例証として挙げられるが、これらに限定されない。代表的な分析物としては、アルカロイド、ステロイド、ラクタム、アミノアルキルベンゼン、ベンゾヘテロ環式化合物（ｂｅｎｚｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）、プリン、マリファナに由来する薬物、ホルモン、ポリペプチド（タンパク質を含む）、免疫抑制剤、ビタミン、プロスタグランジン、三環系抗うつ薬、抗腫瘍薬、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（ポリヌクレオシドおよびポリヌクレオチドを含む）、種々の個々の薬物（メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、クロラムフェニコール、抗コリン薬を含む）ならびに上記のすべての代謝産物および誘導体も例証として挙げられるが、これらに限定されない。疾患状態に関係する代謝産物、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、カナマイシン（ｋａｎａｍｉｃｉｎ）、トブラマイシンおよびアミカシン）および農薬（例えば、ポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフェート、カルバメートおよびポリハロゲン化スルフェンアミド）ならびにそれらの代謝産物および誘導体も含まれる。用語「分析物」には、ポリペプチドおよびタンパク質、多糖および核酸のうちの２つまたはそれを超えるものの組み合わせも含まれる。そのような組み合わせとしては、例えば、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核および細胞膜の構成要素が挙げられる。タンパク質分析物としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、がん抗原、栄養マーカーおよび組織特異的抗原が挙げられる。そのようなタンパク質としては、プロタミン、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、Ｔ細胞レセプター、プロテオグリカン、ＨＬＡ、未分類のタンパク質、例えば、ソマトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン、ヒト血漿中に見られるタンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ルテオトロピン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、組織ホルモン、サイトカイン、がん抗原、例えば、ＰＳＡ、ＣＥＡ、α−フェトプロテイン、酸性ホスファターゼ、ＣＡ１９．９、ＣＡ１５．３およびＣＡ１２５、組織特異的抗原、例えば、アルカリホスファターゼ、ミオグロビン、ＣＰＫ−ＭＢおよびカルシトニン、ならびにペプチドホルモンが例証として挙げられるが、これらに限定されない。他の目的の重合体材料は、ムコ多糖および多糖である。上で示されたように、分析物という用語には、さらに、例えば、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド分析物（例えば、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖）が含まれる。
【０１３１】
「ＭＳ標識前駆体」は、変化剤の作用によってＭＳ標識をもたらす任意の分子である。ＭＳ標識前駆体は、それ自体が変化剤の作用を通じて、例えば、切断、ある部分との反応、誘導体化、または分子、電荷もしくは原子の付加もしくは除去、または上記の２つもしくはそれを超えるものの組み合わせによって、別のＭＳ標識に変換されるＭＳ標識であり得る。
【０１３２】
用語「変化剤」とは、ＭＳ標識前駆体を変化させる能力を有する物質のことを指す。ある特定の実施形態において、変化剤は、ＭＳ標識前駆体と相互作用して、約１Ｄａ〜約３ｋＤａの範囲内または約１Ｄａ〜約５０Ｄａの範囲内または約５０Ｄａ〜約１５０Ｄａの範囲内または約１５０Ｄａ〜約７００Ｄａの範囲内または約７００Ｄａ〜約３ｋＤａの範囲内のユニークな質量を有するＭＳ標識をもたらすことができる。いくつかの例では、ＭＳ標識のユニークな質量は、約３ｋＤａ未満である。ＭＳ標識前駆体は、結合の切断によって変更されて、中性イオン、陰イオンもしくは陽イオンまたはラジカルを形成し得る。変化剤によるＭＳ標識前駆体の変化は、ＭＳ標識前駆体への原子、電荷もしくは電子の付加、またはＭＳ標識前駆体からの原子、電荷もしくは電子の除去、またはＭＳ標識前駆体における結合の切断、またはＭＳ標識前駆体における結合の形成によるものであり得る。変化剤としては、化学剤（例えば、触媒（例えば、酵素（偽酵素（ｐｓｅｕｄｏｅｎｚｙｍｅｓ）を含む）および金属）、酸化剤、還元剤、酸、塩基、置換反応（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）または置換反応（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を促進する作用物質；およびイオン化剤であるがこれらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、変化剤は、ＭＳ標識前駆体と、例えば、ＭＳ標識を形成する部分との反応を促進することによって、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進する。いくつかの例では、変化剤は、例えば、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の放出を促進することによって、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進する。
【０１３３】
ＭＳ標識前駆体の性質は、例えば、ＭＳ標識の性質、使用されるＭＳ法の性質、使用されるＭＳ検出器の性質、稀な標的分子の性質、親和性剤の性質、使用される任意のイムノアッセイの性質、サンプルの性質、使用される任意の緩衝液の性質、分離の性質のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、ＭＳ標識前駆体は、質量が置換および／または鎖のサイズによって変動し得る分子である。ＭＳ標識前駆体から生成されるＭＳ標識は、定義された質量の分子であり、それは、分析されるサンプル中に存在するべきでない。さらに、それらのＭＳ標識は、ＭＳ検出器によって検出される範囲内に存在するべきであり、重複する質量を有するべきでなく、一次質量によって検出可能であるべきである。本発明の方法において使用するためのＭＳ標識前駆体の例としては、例証としてであって限定でなく、ポリペプチド、有機ポリマーおよび無機ポリマー、脂肪酸、炭水化物、環状炭化水素、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、有機カルボン酸、有機アミン、核酸、有機アルコール（例えば、アルキルアルコール、アシルアルコール、フェノール、ポリオール（例えば、グリコール）、チオール、エポキシド、第一級、第二級および第三級アミン、インドール、第三級および第四級アンモニウム化合物、アミノアルコール、アミノチオール、フェノールアミン、インドールカルボン酸、フェノール酸、ビニル酸（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ  ａｃｉｄ）、カルボン酸エステル、リン酸エステル、カルボン酸アミド、ポリアミドおよびポリエステル由来のカルボン酸、ヒドラゾン、オキシム、トリメチルシリルエノールエーテル、アセタール、ケタール、カルバメート、尿素、グアニジン、イソシアネート、スルホン酸、スルホンアミド、スルホニル尿素、硫酸エステル、モノグリセリド、グリセロールエーテル、スフィンゴシン塩基、セラミン（ｃｅｒａｍｉｎｅｓ）、セレブロシド、ステロイド、プロスタグランジン、炭水化物、ヌクレオシドおよび治療薬が例証として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
ＭＳ標識前駆体は、１〜約１００，０００のＭＳ標識、または約１０〜約１００，０００のＭＳ標識、または約１００〜約１００，０００のＭＳ標識、または約１，０００〜約１００，０００のＭＳ標識、または約１０，０００〜約１００，０００のＭＳ標識を含み得る。ＭＳ標識前駆体は、タンパク質、ポリペプチド、ポリマー、粒子、炭水化物、核酸、脂質、または付着によってＭＳ標識の複数の反復単位を含むことができる他の高分子を含み得る。すべてのＭＳ標識前駆体が、多くのＭＳ標識を生成し得るので、複数のＭＳ標識は増幅可能である。
【０１３５】
例えば、ポリペプチドＭＳ標識前駆体の場合、そのポリペプチドの鎖長は、バックグラウンドピークのない質量領域内のＭＳ標識をもたらすように調整され得る。さらに、ＭＳ標識は、試験されているサンプル中に存在しないユニークな質量を有するＭＳ標識前駆体から生成され得る。ポリペプチドＭＳ標識前駆体は、さらなるアミノ酸または誘導体化アミノ酸を含み得、それにより、方法を多重化して、一度に１つより多い結果を得ることが可能になる。ポリペプチドＭＳ標識前駆体の例としては、例えば、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリセリン、ポリトレオニン、ポリシステイン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリメチオニン、ポリプロリン、ポリフェニルアラニン、ポリチロシン、ポリトリプトファン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン、ポリグルタミン、ポリヒスチジン、ポリリジンおよびポリアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸または誘導体化アミノ酸の混合物によって区別されるポリペプチドＭＳ標識前駆体は、ラジカルありまたはなしで偶数または奇数電子イオン（ｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｏｎ）を有する質量を生成する。いくつかの例では、ポリペプチドは、触媒によって修飾されることができる。例えば、例証としてであって限定でなく、触媒としてペルオキシダーゼ酵素を用いて、フェノールおよび芳香族アミンがポリトレオニンに付加され得る。別の例では、例証としてであって限定でなく、触媒としてペルオキシダーゼ酵素を用いて、芳香族アミンに電子が伝達され得る。別の例では、例証としてであって限定でなく、触媒としてホスファターゼを用いて、有機ホスフェートからホスフェートが除去され得る。
【０１３６】
別の例では、例証としてであって限定でなく、ＭＳ標識前駆体からＭＳ標識を生成する部分として、誘導体化剤が使用される。例えば、ジニトロフェニルおよび他のニトロフェニル誘導体が、ＭＳ標識前駆体から形成され得る。他の例としては、エステル化、アシル化、シリル化、保護的なアルキル化、ケトン−塩基縮合（例えば、シッフ塩基）、環化、蛍光性誘導体の形成および無機アニオンによる誘導体化が例証として挙げられるが、これらに限定されない。誘導体化反応は、ＭＳ分析前であるが親和性反応の後に微量反応において生じ得るか、または親和性試薬に結合体化されたＭＳ標識前駆体を生成するために用いられ得る。
【０１３７】
いくつかの例では、ＭＳ標識前駆体は、ＭＳ標識前駆体から得られるＭＳ標識の中に残る同位体（例えば、２Ｈ、１３Ｃおよび１８Ｏであるがこれらに限定されない）を含み得る。そのＭＳ標識は、イオン化の後の一次質量または二次質量によって検出され得る。いくつかの例では、ＭＳ標識前駆体は、結合の切断を引き起こす比較的高い電位を有するものであり、例えば、アルキル化アミン、アセタール、第１級アミンおよびアミドであるがこれらに限定されず、ここで、そのＭＳ標識は、ラジカルありまたはなしで偶数または奇数電子イオンを有する質量を生成し得る。ポリペプチドの選択によって、ユニークなＭＳスペクトルシグネチャが生成され得る。
【０１３８】
上で述べたように、変化剤は、酵素（偽酵素を含む）であり得る。いくつかの例では、触媒は、例えば、シリカゲル、木炭、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（架橋デキストランゲル、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）、クエン酸セルロース、カオリナイト、リン酸セルロース、酸性粘土、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＸＥ−９７（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓが製造しているカルボン酸陽イオン交換樹脂）、カルボキシメチルセルロース、ガラス、石英、ｄｏｗｅｘ−５０、デンプンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリアミノ酸またはアミノベンジルセルロースと固定化された水不溶性酵素誘導体によって生じ得る。架橋剤を用いることにより、その酵素を固定化することができる。そのような架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、アジプイミド酸ジメチル、カルボジイミド、無水マレイン酸、ＭＤＡメチレンジアニリン、ヒドラジドおよびアシルアジドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
いくつかの例では、本明細書中に記載される原理に一致するための酵素は、酵素基質（例えば、ＭＳ標識前駆体）として、未変換の基質の存在下において質量分析計の質量検出器によって検出されるＭＳ標識に変換し得る、高い代謝回転速度を有する任意の酵素である。その酵素は、試験されているサンプル中に存在するべきでないか、または、サンプル中に存在する場合、試験前にサンプルから除去されなければならない。この目的に適した酵素の例としては、例えば、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ、脂質ホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、セリンホスファターゼ、トレオニンホスファターゼおよびヒスチジンホスファターゼ）；オキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、銅アミンオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、血漿アミンオキシダーゼ、トリプトファンペルオキシダーゼ、ウリカーゼオキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）；β−ガラクトシダーゼ；トランスフェラーゼ（例えば、Ｄ−アラニントランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、アリールトランスフェラーゼ、単一炭素トランスフェラーゼ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃａｒｂｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ケトントランスフェラーゼ、アルデヒドトランスフェラーゼ、窒素含有基転移酵素、リン含有基転移酵素、硫黄含有基転移酵素およびペントシルトランスフェラーゼ）；ペプチダーゼ（例えば、ペプシン、パパイン、レンニン（キモシン）、レニン、トロンビン、トリプシン、マトリックスメタロペプチダーゼ、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）、システインプロテアーゼおよびカルボキシペプチダーゼ）；アルドラーゼ（例えば、カルボキシルアルドラーゼ、アルデヒドアルドラーゼ、オキソ酸、トリプトファナーゼ）；脂肪酸酵素（例えば、脂肪酸アミン加水分解酵素、脂肪酸シンターゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ）、および上記の２つまたはそれを超えるものの組み合わせ（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アシラーゼ、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、ホスホグルコムターゼ、リボヌクレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クエン酸シンテターゼ、ウレアーゼ、アミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびズブチロペプチダーゼのうちの２つまたはそれを超えるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
酵素に対する基質は、その基質に対するその酵素の作用によって放出されるＭＳ標識を含むＭＳ標識前駆体である。酵素基質の一部であり得るそのようなＭＳ標識としては、例えば、フェノール（基質、例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、アミノ酸、ペプチド、炭水化物（６−ホスホ−Ｄ−グルコネート）、脂肪酸（アセチル−ＣｏＡ）、アルキルアミン、グリセロールに由来する）；およびナフトール（基質、例えば、ｐ−ニトロナフチルホスフェート、ｐ−ニトロ−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシドに由来する）が例証として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
親和性剤に付着された部分からＭＳ標識を放出させるために使用され得る金属としては、例えば、遷移金属（例えば、パラジウム、白金、金、ルテニウム、ロジウムまたはイリジウム）、キレートされた金属（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）またはｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）によって錯体化された、例えば、鉄、銅、コバルト、マグネシウム）、金属酸化体（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、酸化銀、クロム酸、過マンガン酸カリウムおよび過ホウ酸ナトリウム）および金属還元体（例えば、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、亜リン酸塩およびナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
ＭＳ標識は、直接検出され得るか、または放出されたＭＳ標識が、別の化合物とさらに反応して、ＭＳ法によって検出される誘導体ＭＳ標識を形成し得る。誘導体ＭＳ標識は、ＭＳ標識前駆体から得られるＭＳ標識から形成される化合物であり、ここで、その化合物も、ＭＳ法によって検出可能である。誘導体ＭＳ標識を形成するこのアプローチは、本明細書中に記載される原理に一致する方法の多重化能力をさらに高める。例えば、放出されたフェノールまたはナフトールは、ペルオキシダーゼの存在下において芳香族アミンに結合し得る（例えば、米国特許第５，１８２，２１３号（この関連する開示は、参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。１つの例において、放出されたナフトールは、アルカリ性の媒質中の過酸化的に活性な物質の存在下において、フェニレンジアミン、例えば、α−フェニレンジアミン二塩酸塩と結合して、誘導体ＭＳ標識を生成する。異なるナフトールおよび／または異なるフェニレンジアミンを用いて多重化が達成され得る。
【０１４３】
内部標準は、質量スペクトル分析の重要な面である。いくつかの例では、稀な標的分子の検出のために使用されるＭＳ標識に加えて、（内部標準として）計測され得る第２の質量標識が、加えられ得る。その内部標準は、ＭＳ標識と同様の構造を有するが、質量にわずかなずれがある。さらなるアミノ酸または誘導体化アミノ酸を含む内部標準が調製され得る。あるいは、同位体標識（例えば、２Ｈ（Ｄ）、１３Ｃおよび１８Ｏであるがこれらに限定されない）を組み込むことによって、内部標準が調製され得る。そのＭＳ同位体標識は、天然に存在する物質より大きな質量を有する。例えば、同位体標識されたＭＳ標識、例えば、グリセロール−Ｃ−ｄ７、酢酸ナトリウム−Ｃ−ｄ７、ピルビン酸ナトリウム−Ｃ−ｄ７、Ｄ−グルコース−Ｃ−ｄ７、重水素化グルコースおよびデキストロース−Ｃ−ｄ７が、それぞれグリセロール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、グルコースおよびデキストロースに対する内部標準として働き得る。
【０１４４】
ＭＳ標識前駆体または変化剤は、結合によって直接または連結基の仲介を介して共有結合的に親和性剤に付着され得る（それにより、修飾された親和性剤が得られる）。いくつかの実施形態において、修飾された親和性剤の調製は、直接的な結合による親和性剤へのＭＳ標識前駆体または変化剤の付着に適した官能基を使用することによって行われ得る。使用される官能基の性質は、例えば、ＭＳ標識前駆体の性質、変化剤の性質および親和性剤の性質（１つまたはそれを超える異なる粒子、例えば、親和性剤の一部であり得るキャリア粒子および標識粒子の性質を含む）のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。多数の好適な官能基が、アミノ基およびアルコールに付着するために利用可能であり；そのような官能基としては、例えば、活性化エステル（例えば、カルボン酸エステル、イミド酸エステル、スルホン酸エステルおよびリン酸エステルを含む）；活性化された亜硝酸エステル（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎｉｔｒｉｔｅｓ）；アルデヒド；ケトン；およびアルキル化剤が挙げられる。
【０１４５】
連結基は、１〜約６０個またはそれを超える原子、または１〜約５０個の原子、または１〜約４０個の原子、または１〜３０個の原子、または約１〜約２０個の原子、または約１〜約１０個の原子の鎖であり得、その原子の各々は独立して、一般に、炭素、酸素、硫黄、窒素およびリン、通常は、炭素および酸素からなる群より選択される。連結基におけるヘテロ原子の数は、約０〜約８、約１〜約６または約２〜約４の範囲であり得る。連結基の原子は、水素以外の原子、例えば、アルキル、アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシまたはアラルコキシ基の形態の、例えば、炭素、酸素および窒素のうちの１つまたはそれを超える原子で置換され得る。通則として、特定の連結基の長さは、合成の都合に備えるために任意に選択できるが、ただし、連結された分子が本明細書中に開示される方法に関係する機能を発揮する能力を有する状態で、連結基によって引き起こされる干渉は最小である。
【０１４６】
連結基は、脂肪族であってもよいし、芳香族であってもよい。ヘテロ原子が存在するとき、酸素は、一般に、炭素、硫黄、窒素またはリンに結合したオキシまたはオキソとして存在し；硫黄は、一般に、チオエーテルまたはチオノとして存在し；窒素は、一般に、炭素、酸素、硫黄またはリンに結合した、ニトロ、ニトロソまたはアミノとして一般に存在し；リンは、一般には通常、ホスホン酸モノエステルまたはホスホン酸ジエステルおよびリン酸モノエステルまたはリン酸ジエステルとして、炭素、硫黄、酸素または窒素に結合している。連結基に存在する官能基としては、エステル、チオエステル、アミド、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ基、チオエーテル、カルボキシレートなどが挙げられ得る。連結基は、高分子（例えば、多糖、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチドおよびデンドリマー）でもあり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ＭＳ標識前駆体または場合によっては変化剤と、親和性剤とが、共に非共有結合的に連結され得る。結合対、通常、特異的結合対のメンバーが、使用され、ここで、一方のメンバーが、親和性剤に連結されており、他方のメンバーが、ＭＳ標識前駆体または変化剤に連結されている。結合対のメンバーが結合すると、親和性剤とＭＳ標識前駆体または変化剤との非共有結合性の連結がもたらされる。それらの結合対のメンバーは、ＭＳ標識前駆体もしくは変化剤および親和性剤の一方もしくは両方に直接連結され得るか、または連結基（その性質は上で論じられた）の仲介を介して間接的に連結され得る。いくつかの例では、特異的結合対のメンバーは、比較的高い結合定数を有し、例えば、例証として、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン結合、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）およびＦＩＴＣに対する抗体、ローダミン（テキサスレッド）およびローダミンに対する抗体、ジギトニン（ＤＩＧ）およびＤＩＧに対する抗体、非ヒト種抗体（例えば、ヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリ、ヒツジ）および抗種抗体であるがこれらに限定されない。
【０１４８】
別個の個々の反応物中の異なる各親和性剤をＭＳ標識前駆体または変化剤に連結し、次いで、修飾された親和性剤を混合して、修飾された親和性剤を含む混合物を形成することによって、修飾された親和性剤は調製され得る。あるいは、異なる親和性剤が混合され得、その混合物に対して、親和性剤をＭＳ標識前駆体または変化剤に連結する反応が、行われ得る。これにより、一度に１つより多い結果を得るために方法が多重化されることが可能になる。
【０１４９】
本発明の方法において使用されるそれぞれの異なる修飾された親和性剤の量は、例えば、稀な標的分子のそれぞれの異なる集団の性質および潜在的な量、ＭＳ標識の性質、親和性剤の性質、存在する場合には細胞の性質、使用される場合には粒子の性質、ならびに使用される場合にはブロッキング剤の量および性質のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。いくつかの例では、使用される異なる修飾された各親和性剤の量は、約０．００１μｇ／μＬ〜約１００μｇ／μＬ、または約０．００１μｇ／μＬ〜約８０μｇ／μＬ、または約０．００１μｇ／μＬ〜約６０μｇ／μＬ、または約０．００１μｇ／μＬ〜約４０μｇ／μＬ、または約０．００１μｇ／μＬ〜約２０μｇ／μＬ、または約０．００１μｇ／μＬ〜約１０μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約１００μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約８０μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約６０μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約４０μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約２０μｇ／μＬ、または約０．５μｇ／μＬ〜約１０μｇ／μＬである。
【０１５０】
使用される変化剤の数は、ＭＳ標識前駆体の性質、変化剤の性質、変化剤が媒質中で遊離しているのかまたは修飾された親和性剤の一部であるのか、ならびに使用される異なる親和性試薬の性質および数のうちの１つまたはそれを超えるものに応じて、ＭＳ標識前駆体１つにつき１、またはＭＳ標識前駆体２つにつき１、またはＭＳ標識前駆体３つにつき１から、使用されるＭＳ標識前駆体すべてにつき１までであり得る。例えば、ＭＳ標識前駆体の各々が、親和性剤に対する異なるＭＳ標識の不安定なエステルまたは不安定なアミド結合を含む場合、ジスルフィド結合、エステル結合またはアミド結合の加水分解を引き起こして、異なるＭＳ標識をもたらす単一の変化剤が使用され得る。１つの変化剤、またはＭＳ標識前駆体の数より少ない変化剤を使用する他の例では、使用され得る。別の例では、異なる変化剤を使用することにより、使用される異なる各タイプの親和性剤に対してＭＳ標識が生成され得る。
【０１５１】
修飾された親和性剤を細胞上または粒子試薬上の稀な標的分子に結合させるために、水性媒質中にサンプル（必要に応じて濃縮されたもの）と修飾された親和性剤とを含む組み合わせが、ある温度においてある時間にわたって保持されることによって、処理される。変化剤を含む修飾された各親和性剤に対して、変化剤が作用するＭＳ標識前駆体が、その組み合わせに含められ、ここで、そのＭＳ標識前駆体は、ＭＳ標識に変換される。いくつかの例では、さらなる部分が加えられ、ここで、変化剤が、その部分とＭＳ標識前駆体との反応を促進して、ＭＳ標識をもたらす。いくつかの例では、修飾された親和性剤は、ＭＳ標識前駆体を含み、変化剤は、媒質中の結合していない物質としてその組み合わせに含められる。この例では、変化剤は、親和性剤のＭＳ標識前駆体に対して作用して、ＭＳ標識を生成する。いくつかの例では、ＭＳ標識前駆体を含む実体を親和性剤から放出させる第１の変化剤が使用され、その後、第２の変化剤が使用されて、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成が促進される。
【０１５２】
この処理の温度および持続時間は、例えば、サンプルの性質、稀な標的分子の性質、稀でない分子の性質、修飾された親和性剤の性質、ＭＳ標識前駆体の性質および変化剤の性質に依存する。いくつかの例では、中程度の温度が一般に使用され、通常、一定温度、好ましくは、室温である。保持期間中の温度は、一般に、例えば、約５℃〜約９９℃または約１５℃〜約７０℃または約２０℃〜約４５℃の範囲である。保持期間は、例えば、約０．２秒〜約２４時間または約１秒〜約６時間または約２秒〜約１時間または約１〜約１５分である。この期間は、例えば、媒質の温度および様々な試薬の結合の速度に依存する。
【０１５３】
修飾された親和性剤、すなわち、変化剤によって作用され、稀な標的分子に結合されるようになった親和性剤は、必要に応じて、標的分子に結合されなかった修飾された親和性剤から分離される。いくつかの例では、この分離は、サンプル中の稀でない分子の数を減少させることを含む。
【０１５４】
処理されたサンプルと、本質的に非吸収性の膜との接触は、稀な標的細胞、または粒子に結合した稀な標的分子を、本質的に非吸収性の膜の表面上に保持して、上で論じられたような稀な標的細胞、または粒子に結合した稀な標的分子の異なる集団を有する本質的に非吸収性の膜の表面を得るのに十分な時間にわたって続けられる。その期間は、例えば、稀な標的細胞、または粒子に結合した稀な標的分子の異なる集団の性質およびサイズ、多孔性マトリックスの性質、多孔性マトリックスのポアのサイズ、多孔性マトリックス上の血液サンプルに適用される真空のレベル、濾過されるべき体積、ならびに多孔性マトリックスの表面積のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、接触の時間は、例えば、約１分間〜約１時間、約５分間〜約１時間、または約５分間〜約４５分間、または約５分間〜約３０分間、または約５分間〜約２０分間、または約５分間〜約１０分間、または約１０分間〜約１時間、または約１０分間〜約４５分間、または約１０分間〜約３０分間、または約１０分間〜約２０分間である。
【０１５５】
第１の変化剤が、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進しない場合、保持液は、親和性剤からのＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進する第２の変化剤に供される。
【０１５６】
保持液は、ＭＳ分析に供されて、異なる各ＭＳ標識の存在および／または量が明らかにされる。異なる各ＭＳ標識の存在および／または量は、稀な標的細胞および／または粒子に結合した稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量に関係する。
【０１５７】
ＭＳ分析は、正確な同定および測定のために、分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を決定する。ＭＳ法は、いくつかの手法によって分子を、粒子としての集団にイオン化し得、それらの手法としては、例えば、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）エレクトロスプレーイオン化法（ｉＥＳＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）および電子イオン化法（ＥＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、電場脱着／電界イオン化法（ＦＣ／ＦＩ）、サーモスプレーイオン化法（ＴＳＰ）、ナノスプレーイオン化法が挙げられ得るが、これらに限定されない。それらの集団が、いくつかの手法によって、質量検出器においてフィルタリングおよび分離が行われ、それらの手法としては、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオントラップ、四重極マスフィルター、セクター質量分析（ｓｅｃｔｏｒ  ｍａｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）が例証として挙げられるが、これらに限定されない。ＭＳ法は、例えば、マイクロチャネルプレート、電子増倍管またはファラデーカップを用いて、分子を検出する。ＭＳ法は、第１のＭＳからの帯電した質量粒子が第２のＭＳに分離される、タンデム型ＭＳ／ＭＳ法として繰り返され得る。
【０１５８】
質量分析器としては、例えば、四重極型、飛行時間型（ＴＯＦ）分析器、磁場型、フーリエ変換イオントラップおよび四重極イオントラップが挙げられるが、これらに限定されない。タンデム型（ＭＳ−ＭＳ）質量分析計は、１つより多い分析器を有する機器である。タンデム型質量分析計としては、例えば、四重極−四重極、磁場型−四重極、四重極−飛行時間型が挙げられるが、これらに限定されない。質量分析計の検出器は、例証としてであって限定でなく、例えば、光電子増倍管、電子増倍管またはマイクロチャネルプレートであり得る。
【０１５９】
質量分析による分析の後、異なる各質量分析標識の存在および／または量が、稀な標的細胞および／または粒子に結合した稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量と関係づけられる。ＭＳ標識と標的分子との関係は、その標的分子に特異的な、使用される修飾された親和性剤によって確立される。キャリブレータを使用して、ＭＳ標識からのシグナルの量と、サンプル中の稀な標的分子の量との関係が確立される。サンプルは、さらなる分析に供され得る。
【０１６０】
上で述べたように、本質的に非吸収性の膜は、１つより多いポアを含み得、電場は、個別のポアから液滴を選択的に放出するように活性化され得る。放出された液滴は、質量分析に供されて、特定のＭＳ標識が位置する個別のポアに隣接する領域が決定される。その領域に対応する膜上の液体が、分析のために取り出される。その個別のポアに隣接する液体は、上で述べた方法のいずれかによって取り出され得る。分析のための方法としては、例えば、イムノアッセイ、酵素増幅、細胞濾過、核酸配列決定、質量分析、化学分析、核酸増幅、核酸発現、細胞成長および細胞応答アッセイ、またはそれらの２つもしくはそれを超えるものの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
１つの例において、サンプルは、好適な細胞緩衝液を含む容器内に収集される。収集されたサンプルは、濾過に供されて、細胞に結合した稀な標的分子の数が、サンプル中の他の分子（例えば、稀でない細胞）の数を超えて濃縮される。細胞に結合した稀な標的分子に特異的な抗体に連結された変化剤を含む親和性剤が、濾過デバイスの本質的に非吸収性の膜上に保持された濃縮されたサンプルと合わせられる。好適なインキュベーション期間の後、その膜は、緩衝液で洗浄される。ＭＳ標識前駆体が、その膜上のサンプルに加えられる。親和性剤の変化剤は、親和性剤と、細胞に結合した標的分子とを含む免疫複合体の一部である。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、その変化剤は、ＭＳ標識前駆体に対して作用することにより、その稀な標的分子に対応するＭＳ標識を生成する。本質的に非吸収性の膜は、電場に供され、ＭＳ標識が収集される。いくつかの実施形態において、スプレー液体またはスプレー溶媒が、本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜は、電場および必要に応じて真空に曝露されて、その多孔性の膜から液体の液滴を放出する。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、そのＭＳ標識は、稀な標的分子に対応する特有のスペクトルを与える。このスペクトルは、その膜上の稀な細胞の濃度および位置と相関し得る。その膜上の稀な細胞の位置は、さらなる分析のために、どこから稀な細胞を取り出すかを特定することができる。上記の例では、ただ１つの稀な標的分子の検出が描写されている；しかしながら、任意の数の稀な標的分子が、上で論じられたような上で論じられたような様々なＭＳ標識前駆体を用いることにより、単一のサンプルに対する単一の方法で測定され得ることが認識されるべきである。
【０１６２】
別の例では、サンプルは、好適な細胞緩衝液を含む容器内に収集される。収集されたサンプルは、濾過に供されて、細胞に結合した稀な標的分子の数が、サンプル中の他の分子（例えば、稀でない細胞）の数を超えて濃縮される。細胞に結合した稀な標的分子に特異的な抗体に連結されたＭＳ標識前駆体を含む親和性剤が、濾過デバイスの本質的に非吸収性の膜上に保持された濃縮されたサンプルと合わせられる。好適なインキュベーション期間の後、その膜は、緩衝液で洗浄される。変化剤が、その膜上のサンプルに加えられる。親和性剤のＭＳ標識前駆体は、親和性剤と、細胞に結合した標的分子とを含む免疫複合体の一部である。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、その変化剤は、ＭＳ標識前駆体に対して作用することにより、その稀な標的分子に対応するＭＳ標識を生成する。本質的に非吸収性の膜は、電場に供され、ＭＳ標識が収集される。いくつかの実施形態において、スプレー液体またはスプレー溶媒が、本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜は、電場および必要に応じて真空に曝露されて、その多孔性の膜から液体の液滴を放出する。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、そのＭＳ標識は、稀な標的分子に対応する特有のスペクトルを与える。このスペクトルは、その膜上の稀な細胞の濃度および位置と相関し得る。上記の例では、ただ１つの稀な標的分子の検出が描写されている；しかしながら、任意の数の稀な標的分子が、上で論じられたような上で論じられたような様々なＭＳ標識前駆体を用いることにより、単一のサンプルに対する単一の方法で測定され得ることが認識されるべきである。
【０１６３】
別の例では、サンプルは、容器内に収集され、希釈された形態または未希釈の形態で、本質的に非吸収性の膜に加えられる。この例では、稀な標的分子は、非粒子状であり、すなわち、稀な標的分子は、細胞または他の粒子に結合されていない。収集されたサンプルは、稀な標的分子に対する抗体に付着した粒子を含む粒子試薬と合わせられる。細胞に結合していない稀な標的分子が、粒子上の抗体に結合するのを可能にすることにより、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子をもたらすインキュベーション期間の後、そのサンプルは、濾過に供されて、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子の数が、サンプル中の他の分子（例えば、稀でない細胞）の数を超えて濃縮される。濾過デバイスの表面上に保持されたサンプルは、好適な緩衝液で洗浄される。粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子に特異的な抗体に連結された変化剤を含む親和性剤が、濾過デバイスの膜上に保持された濃縮されたサンプルと合わせられる。好適なインキュベーション期間の後、その膜は、緩衝液で洗浄される。ＭＳ標識前駆体が、その膜上のサンプルに加えられる。親和性剤の変化剤は、親和性剤と、粒子に結合していて細胞に結合していない標的分子とを含む免疫複合体の一部である。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、その変化剤は、ＭＳ標識前駆体に対して作用することにより、その稀な標的分子に対応するＭＳ標識を生成する。本質的に非吸収性の膜は、電場に供され、ＭＳ標識が収集される。いくつかの実施形態において、スプレー液体またはスプレー溶媒が、本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜は、電場および必要に応じて真空に曝露されて、その多孔性の膜から液体の液滴を放出する。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、そのＭＳ標識は、稀な標的分子に対応する特有のスペクトルを与える。このスペクトルは、その膜上の稀な細胞の濃度および位置と相関し得る。上記の例では、ただ１つの、細胞に結合していない稀な標的分子の検出が描写されている；しかしながら、任意の数の稀な標的分子（細胞に結合したものと細胞に結合していないものの両方）が、上で論じられたような様々なＭＳ標識前駆体を用いることにより、単一のサンプルに対する単一の方法で測定され得ることが認識されるべきである。
【０１６４】
別の例では、液体サンプルは、容器内に収集され、希釈された形態または未希釈の形態で、本質的に非吸収性の膜に加えられる。この例では、稀な標的分子は、非粒子状であり、すなわち、稀な標的分子は、細胞または他の粒子に結合されていない。収集されたサンプルは、稀な標的分子に対する抗体に付着した粒子を含む粒子試薬と合わせられる。細胞に結合していない稀な標的分子が、粒子上の抗体に結合するのを可能にすることにより、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子をもたらすインキュベーション期間の後、そのサンプルは、濾過に供されて、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子の数が、サンプル中の他の分子（例えば、稀でない細胞）の数を超えて濃縮される。濾過デバイスの表面上に保持されたサンプルは、好適な緩衝液で洗浄される。粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子に特異的な抗体に連結されたＭＳ標識前駆体を含む親和性剤が、濾過デバイスの膜上に保持された濃縮されたサンプルと合わせられる。好適なインキュベーション期間の後、その膜は、緩衝液で洗浄される。変化剤が、その膜上のサンプルに加えられる。親和性剤のＭＳ標識前駆体は、親和性剤と、粒子に結合していて細胞に結合していない標的分子とを含む免疫複合体の一部である。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、その変化剤は、ＭＳ標識前駆体に対して作用することにより、その稀な標的分子に対応するＭＳ標識を生成する。本質的に非吸収性の膜は、電場に供され、ＭＳ標識が収集される。いくつかの実施形態において、スプレー液体またはスプレー溶媒が、本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜は、電場および必要に応じて真空に曝露されて、その多孔性の膜から液体の液滴を放出する。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、そのＭＳ標識は、稀な標的分子に対応する特有のスペクトルを与える。このスペクトルは、その膜上の稀な細胞の濃度および位置と相関し得る。上記の例では、ただ１つの、細胞に結合していない稀な標的分子の検出が描写されている；しかしながら、任意の数の稀な標的分子（細胞に結合したものと細胞に結合していないものの両方）が、上で論じられたような様々なＭＳ標識前駆体を用いることにより、単一のサンプルに対する単一の方法で測定され得ることが認識されるべきである。
【０１６５】
別の例では、サンプルは、容器内に収集され、希釈された（ｄｉｌｕｔｅ）形態または未希釈の形態で、本質的に非吸収性の多孔性の膜に加えられる。この例では、稀な標的分子は、非粒子状であり、すなわち、稀な標的分子は、細胞または他の粒子に結合されていない。収集されたサンプルは、稀な標的分子に対する抗体に付着した粒子を含む粒子試薬と合わせられる。細胞に結合していない稀な標的分子が、粒子上の抗体に結合するのを可能にすることにより、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子をもたらすインキュベーション期間の後、そのサンプルは、濾過に供されて、粒子に結合していて細胞に結合していない稀な標的分子の数が、サンプル中の他の分子（例えば、稀でない細胞）の数を超えて濃縮される。濾過デバイスの表面上に保持されたサンプルは、好適な緩衝液で洗浄される。細胞に結合していない稀な標的分子をＭＳ標識に変換する変化剤が、膜上のサンプルに加えられる。好適なインキュベーション期間の後、その膜は、緩衝液で洗浄される。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、その変化剤は、稀な標的分子に対して作用することにより、その稀な標的分子に対応するＭＳ標識を生成する。本質的に非吸収性の膜は、電荷電場に供され、ＭＳ標識が収集される。いくつかの実施形態において、スプレー液体またはスプレー溶媒が、本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜は、電場および必要に応じて真空に曝露されて、その多孔性の膜から液体の液滴を放出する。稀な標的分子が、サンプル中に存在する場合、そのＭＳ標識は、稀な標的分子に対応する特有のスペクトルを与える。このスペクトルは、その膜上の稀な細胞の濃度および位置と相関し得る。上記の例では、ただ１つの、細胞に結合していない稀な標的分子の検出が描写されている；しかしながら、任意の数の稀な標的分子（細胞に結合したものと細胞に結合していないものの両方）が、上で論じられたような様々なＭＳ標識前駆体を用いることにより、単一のサンプルに対する単一の方法で測定され得ることが認識されるべきである。
【０１６６】
粒子の拡大を使用する方法の例
上で述べたように、１つのアプローチでは、粒子の拡大が用いられ、それにより、粒子の凝集またはクラスター化がもたらされて、ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体を含む粒子凝集物が形成される。
【０１６７】
句「粒子の拡大」とは、単一の稀な標的分子を示す標識粒子の数が向上する、粒子の凝集物またはクラスターの形成のことを指す。いくつかの例では、稀な標的分子を示す粒子の凝集物における標識分子の数は、１０１０〜１個、または１０９〜１個、または１０８〜１個、または１０７〜１個、または１０６〜１個、または１０５〜１個、または１０４〜１個、または１０３〜１個、または１０２〜１個、または１０〜１個、または１０１０〜１０２個、または１０１０〜１０３個、または１０１０〜１０４個、または１０１０〜１０５個である。粒子の拡大は、多くのＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体が会合した多くの小さな標識粒子と会合した、より大きな粒子（キャリア粒子）を使用することによって達成される。
【０１６８】
用語「〜と会合される」とは、２つの部分が互いに結合される様を指す。会合は、上で定義されたような共有結合または非共有結合を介したものであり得る。付着は、２つの部分の間の直接的な結合によって達成されてもよいし、または連結基が、２つの部分の間において使用されてもよい。連結基は、例えば、上に記載されたとおりであり得る。
【０１６９】
キャリア粒子の組成は、例えば、捕捉粒子実体について上に記載されたとおりであり得る。キャリア粒子のサイズは、１つまたはそれを超える標識粒子を収容するのに十分に大きい。標識粒子と単一のキャリア粒子との比は、例えば、１０６対１または１０５対１または１０４対１または１０３対１または１０２対１または１０対１であり得る。キャリア粒子の直径も、例えば、稀な標的分子の性質、サンプルの性質、本質的に非吸収性の膜の性質およびポアサイズ、膜への粒子の接着、粒子の表面、膜の表面、液体のイオン強度、液体の表面張力および液体中の構成要素、ならびに会合される標識粒子の数、サイズ、形状および分子構造のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。多孔性マトリックスが、濾過分離工程において使用されるとき、キャリア粒子の直径は、粒子の拡大の利点を達成するためにいくつかの標識粒子を保持するのに十分に大きいが、濾過デバイスの本質的に非吸収性の膜のポアを通過するのに十分に小さくあるべきである。いくつかの例では、キャリア粒子の平均直径は、少なくとも約０．１ミクロンかつ約１ミクロン以下または約５ミクロン以下であるべきである。いくつかの例では、キャリア粒子は、約０．１ミクロン〜約５ミクロン、または約１ミクロン〜約３ミクロン、または約４ミクロン〜約５ミクロン、約０．２ミクロン〜約０．５ミクロン、または約１ミクロン〜約３ミクロン、または約４ミクロン〜約５ミクロンの平均直径を有する。
【０１７０】
標識粒子の組成は、例えば、捕捉粒子実体について上に記載されたとおりであり得る。標識粒子のサイズは、例えば、キャリア粒子の性質およびサイズ、ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体、変化剤の性質およびサイズ、稀な標的分子の性質、サンプルの性質、本質的に非吸収性の膜の性質およびポアサイズ、粒子の表面、膜の表面、液体のイオン強度、および液体の表面張力、および液体中の構成要素のうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、標識粒子の平均直径は、少なくとも約０．０１ミクロンかつ約０．１ミクロン以下または約１ミクロン以下であるべきである。いくつかの例では、標識粒子は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．５ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．４ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．３ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．２ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．１ミクロン、または約０．０１ミクロン〜約０．０５ミクロン、または約０．１ミクロン〜約０．５ミクロン、または約０．０５ミクロン〜約０．１ミクロンの平均直径を有する。いくつかの例では、標識粒子は、イオン会合によって、遊離カルボン酸基を有する磁性キャリア粒子に連結され得る、シリカナノ粒子であり得る。
【０１７１】
標識粒子と会合されるＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体の数は、例えば、ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体の性質およびサイズ、標識粒子の性質およびサイズ、リンカーアームの性質、標識粒子上の官能基の数およびタイプ、ならびにＭＳ標識前駆体上の官能基の数およびタイプのうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、単一の標識粒子と会合されるＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体の数は、約１０７〜１個、または約１０６〜１個、または約１０５〜１個、または約１０４〜１個、または約１０３〜１個、または約１０２〜１個、または約１０〜１個である。
【０１７２】
上で述べたように、いくつかの例が、稀な分子および稀でない分子の１つまたはそれを超える異なる集団を含むと疑われるサンプル中の稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団の方法に関する。稀でない分子の濃度を超えて高められた濃度の稀な標的分子の１つまたはそれを超える異なる集団を有するサンプル（ここで、その稀な標的分子は、粒子状の形態である）は、稀な標的分子の異なる各集団に対して、稀な標的分子の集団のうちの１つの稀な標的分子に特異的でありそれに結合する結合パートナーを含む親和性剤とともにインキュベートされる。その親和性剤は、ＭＳ標識前駆体または第１の変化剤を含む。稀な標的分子の異なる各集団に対して、親和性剤は、粒子試薬を含む。第１の変化剤は、ＭＳ標識前駆体からのＭＳ標識の形成を促進するか、または親和性剤からＭＳ標識前駆体を含む実体を放出させる。インキュベート中に、稀な標的分子の異なる各集団に対して、親和性剤の粒子試薬から粒子凝集物が形成される。インキュベートされたサンプルを本質的に非吸収性の膜と接触させることによって、保持液および濾液が形成される。その保持液は、本質的に非吸収性の膜上に配置されるようになる。スプレー液体またはスプレー溶媒が、その本質的に非吸収性の膜を構成しているウェルに加えられ、その膜が、電場および必要に応じて真空に曝露されることにより、液体の液滴がその多孔性の膜から放出される。
【０１７３】
いくつかの例では、液体液滴が本質的に非吸収性の膜のポアを通過するのを促進するために、本質的に非吸収性の膜上のサンプルに、真空が適用される。適用される真空のレベルは、例えば、稀な細胞および／または粒子試薬の異なる集団の性質およびサイズ、本質的に非吸収性の膜の性質、ならびに本質的に非吸収性の膜のポアのサイズのうちの１つまたはそれを超えるものに依存し得る。いくつかの例では、適用される真空のレベルは、約１ミリバール〜約１００ミリバール、または約１ミリバール〜約８０ミリバール、または約１ミリバール〜約５０ミリバール、または約１ミリバール〜約４０ミリバール、または約１ミリバール〜約３０ミリバール、または約１ミリバール〜約２５ミリバール、または約１ミリバール〜約２０ミリバール、または約１ミリバール〜約１５ミリバール、または約１ミリバール〜約１０ミリバール、または約５ミリバール〜約１００ミリバール、または約５ミリバール〜約８０ミリバール、または約５ミリバール〜約５０ミリバール、または約５ミリバール〜約３０ミリバール、または約５ミリバール〜約２５ミリバール、または約５ミリバール〜約２０ミリバール、または約５ミリバール〜約１５ミリバール、または約５ミリバール〜約１０ミリバールである。真空の適用は、電場の印加と連係して行われるので、本明細書中に記載される原理にって本質的に非吸収性の膜を構成する個々のマイクロウェルから液体液滴を選択的に放出することができる。
【０１７４】
液滴は、異なる各ＭＳ標識の存在および／または量を明らかにするためにＭＳ分析に供される。異なる各ＭＳ標識の存在および／または量は、サンプル中の非細胞性の稀な標的分子の異なる各集団の存在および／または量に関係する。このようにして、さらなる分析のためのサンプルが特定され得る。１つのアプローチでは、目的の材料を含む本質的に非吸収性の膜が、任意の好都合な方法によって取り出され得る。そのような方法の例としては、例えば、目的の本質的に非吸収性の膜の一部の打ち出しまたは濾過が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
粒子凝集物のサイズは、例えば、捕捉粒子の性質およびサイズ、キャリア粒子の性質およびサイズ、標識粒子の性質およびサイズ、連結基の性質およびサイズ、ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体の性質およびサイズ、変化剤の性質、稀な標的分子の性質、サンプルの性質、濾過マトリックスの性質およびポアサイズ、粒子の表面、マトリックスの表面、液体のイオン強度、ならびに液体の表面張力、ならびに液体中の構成要素のうちの１つまたはそれを超えるものに依存する。本明細書に記載の粒子にしたがういくつかの例では、粒子凝集物の平均直径は、少なくとも約０．１ミクロンかつ約５００ミクロン以下または約１，０００ミクロン以下である。いくつかの例では、粒子凝集物は、例えば、約０．１ミクロン〜約１，０００ミクロン、または約０．１ミクロン〜約５００ミクロン、または約０．１ミクロン〜約１００ミクロン、または約０．１ミクロン〜約１０ミクロン、または約０．１ミクロン〜約５ミクロン、または約０．１ミクロン〜約１ミクロン、または約１ミクロン〜約１０ミクロン、または約１０ミクロン〜約５００ミクロン、または約１０ミクロン〜約１００ミクロンの平均直径を有する。
【０１７６】
１つの例において、稀な標的分子は、およそ約１０ミクロン（μｍ）の細胞の表面に付着される。この例では約１μｍという平均直径を有するキャリア粒子が、第１の連結基を用いて特異的結合パートナー、例えば、稀な標的分子に対する抗体に連結される。第２の連結基が、さらなるキャリア粒子を互いに線状の様式で連結する。この例では、細胞１つあたりのキャリア粒子の数は、約１，０００である。さらに、各キャリア粒子１つあたりおよそ１００個の標識粒子（直径約２００ｎｍ）が、第３の連結基を用いて連結される。各標識粒子に対して、約１０５個のＭＳ標識（質量標識）が、第４の連結基を用いてそれに連結される。この例では、ＭＳ標識は、約１ｎｍというサイズを有する。それらの連結基は、上に記載されたような任意の連結基から選択され得、それらの２つまたはそれを超えるものは、同じであってもよいし、それらの連結基の各々は、互いに異なっていてもよい。いくつかの例では、例えば、キャリア粒子が、互いからもしくは細胞から切断され得る、かつ／または標識粒子が、キャリア粒子から切断され得る、かつ／またはＭＳ標識もしくはＭＳ標識前駆体が、標識粒子から切断され得るように、１つまたはそれを超える連結基が、切断可能な部分を有する。連結基の切断可能な部分が互いに異なる場合、様々な連結基の切断は、連続的に行われ得る。
【０１７７】
上で述べたように、１つまたはそれを超える連結基は、切断剤によって切断可能である、切断可能な部分を含み得る。その切断剤の性質は、切断可能な部分の性質に依存する。切断可能な部分の切断は、例えば、酸化、還元、加溶媒分解、例えば、加水分解、光分解、熱分解、電気分解、超音波処理および化学的置換のうちの１つまたはそれを超えるものを含む、化学的な方法または物理的な方法によって達成され得る。切断可能な部分および対応する切断剤の例としては、還元剤、例えば、チオールを用いて切断され得るジスルフィド；酸化剤、例えば、過ヨウ素酸塩を用いて切断され得るジオール；過マンガン酸塩または四酸化オスミウムによって切断され得るジケトン；ハイドロサルファイトを用いて切断され得るジアゾ結合またはオキシム結合；塩基性条件下において切断され得るβ−スルホン；α−炭素が、例えば、カルボニルまたはニトロによって活性化される場合に、塩基を用いて切断され得る、テトラアルキルアンモニウム（ｔｅｔｒａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、トリアルキルスルホニウム、テトラアルキルホスホニウム（ｔｅｔｒａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）；アルカリ性条件下において加水分解剤、例えば、ヒドロキシルアミン、アンモニアまたはトリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミンまたはトリエチルアミン）を用いて切断され得るエステル結合およびチオエステル結合；還元によって脱離が生じるキノン；光分解的に切断され得る置換ベンジルエーテル；熱的に切断され得るカーボネート；配位子が、より高い親和性配位子で置換され得る、金属キレート；一重項酸素を用いて切断され得るチオエーテル；酸性条件下において切断可能であるヒドラゾン結合；第四アンモニウム塩（例えば、水酸化ナトリウム水溶液によって切断可能）；トリフルオロ酢酸によって切断可能な部分、例えば、ベンジルアルコール誘導体、テイコプラニンアグリコン、アセタールおよびチオアセタール；例えば、ＨＦまたはクレゾールを用いて切断され得る、チオエーテル；スルホニル（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸またはチオアニソールによって切断可能）；求核剤によって切断可能な部位、例えば、フタルアミド（例えば、置換ヒドラジンを用いて切断可能）；切断が、媒質のイオン強度を変更すること、破壊的なイオン性の物質を加えること、ｐＨを低下もしくは上昇させること、界面活性物質を加えること、超音波処理すること、および帯電した化学物質を加えることによって達成され得る、イオン会合（逆に帯電した部分の誘引）；および適切な波長を有する光、例えば、３００ｎｍまたはそれを超えるＵＶ光を用いて切断可能である、光切断可能な結合が例証として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
１つの例において、切断可能な結合は、ジスルフィド結合を含むＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）（ＳＰＤＰ）との結合体化を用いて形成され得る。例えば、アミン官能基を含む標識粒子が、ＳＰＤＰに結合体化され、次いで、得られ得る結合体が、チオール官能基を含むＭＳ標識と反応され得、それにより、そのＭＳ標識部分とその結合体との結合がもたらされる。ジスルフィド還元剤（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））が、変化剤として使用されることにより、ＭＳ標識として、チオール化されたペプチドが放出され得る。
【０１７９】
濾過デバイスの膜上での粒子凝集物（粒子クラスター）の形成の、例証としてであって限定ではない例が、次に論じられる。細胞、またはサンプル中の非粒子状の稀な標的分子を捕捉した捕捉粒子を、濾過スライドの膜と接触させ、ここで、その膜のポアのサイズは、細胞、または粒子に結合した稀な標的分子を保持することについて上に記載されたとおりである。上で論じられたように、非粒子状の材料を除去するためならびに稀でない分子および稀でない細胞の数を減少させるための好適な洗浄の後、上に記載されたようなキャリア粒子のセットが、稀な標的分子の異なる各集団に対して加えられ、ここで、それらのキャリア粒子の各セットは、測定される異なる稀な標的分子に特異的な特異的結合パートナーを含む。その特異的結合パートナーは、第１の連結基を用いてキャリア粒子に連結される。キャリア粒子は、第２の連結基を用いて互いに連結される。もう１回の洗浄工程の後、標識粒子を加え、ここで、標識粒子の各セットは、測定される異なる稀な標的分子に対するＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体を含む。標識粒子は、キャリア粒子上の官能基と反応性である官能基を含む。それらの官能基の反応は、第３の連結基を形成させる。ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体は、第４の連結基を用いて標識粒子に結合される。結果として、稀な標的分子、キャリア粒子、標識粒子およびＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体を含む粒子クラスターが形成される。
【０１８０】
いくつかの例では、上で論じられたような官能基の対応する適切な官能性を用いて、１つまたはそれを超える連結基が、上に記載されたように共有結合的に形成される。いくつかの例では、１つまたはそれを超える（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）連結基が、上で論じられたように、非共有結合的に形成される。結合対、通常、特異的結合対のメンバーが使用され、ここで、一方のメンバーが、１つの連結基部分に連結されており、他方のメンバーが、第２の連結基部分に連結されている。結合対のメンバーが結合すると、それらの結合対メンバーおよび２つの連結基部分を含む連結基が形成される。結合対メンバーの結合は、最終的に連結基を形成する２つの連結基部分の非共有結合性の連結をもたらす。それらの連結基部分は、上で論じられたように、結合または連結基であり得る。上で述べたように、結合対のメンバーは、比較的高い結合定数を有し、そのメンバーは、例えば、例証として、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン結合、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）およびＦＩＴＣに対する抗体、ローダミン（テキサスレッド）およびローダミンに対する抗体、ジギトニン（ＤＩＧ）およびＤＩＧに対する抗体、非ヒト種抗体（例えば、ヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリ、ヒツジ）および抗種抗体であるが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの例では、例証としてであって限定でなく、第１の連結基は、ビオチンに連結された二次抗体を使用している切断不可能な結合を含み得、ここで、その二次抗体は、稀な標的分子に対する抗体に結合し、ビオチンは、キャリア粒子の表面上のストレプトアビジン分子に結合する。あるいは、抗体は、一般に公知である生物結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）法を用いて、粒子上のカルボン酸および抗体上のアミンへのアミド結合（ａｍｉｄｅ  ｂｏｕｎｄｓ）を介してキャリア粒子に直接結合体化され得る。別の例では、第１の連結基は、ビオチンに連結されており、かつ例えばＳＰＤＰとの反応によって形成されるジスルフィドリンカーによって抗体に付着されている、小分子ペプチドを使用している切断可能な結合を含み得る。いくつかの例では、第２の連結基は、キャリア粒子が、その表面上にストレプトアビジン分子を有する切断不可能な結合を含み得、ビオチンと小分子との結合体、例えば、ビオチン−ＦＩＴＣが、連結基を形成するために使用される。切断可能な結合が、第２の連結基にとって望ましいとき、ビオチン−ＦＩＴＣ剤が、切断可能な部分、例えば、ジスルフィド結合を含む。第２の連結基の小分子部分、例えば、ＦＩＴＣ部分は、キャリア粒子の表面上の小分子に対する結合パートナー（例えば、ＦＩＴＣに対する抗体）に結合する。第３の連結基は、連結部分が、アミド結合によってＦＩＴＣまたはビオチンに付着されたペプチドを有する、切断不可能な結合を含み得るか、または第３の連結基は、連結部分が、ジスルフィド結合によってＦＩＴＣまたはビオチンに付着されたペプチドを有する、切断可能な結合を含み得る。第３の連結基は、標識粒子上のイオン化されたアミンまたは他の基が、標識粒子上のイオン化されたカルボン酸または他の基に引きつけられるイオン結合を含み得る。上で説明したように、ＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体は、切断可能な結合（例えば、ジスルフィド結合によって付着されたペプチドまたは他のＭＳ標識であるがこれらに限定されない）によって、標識粒子に付着される。
【０１８２】
句「小分子」は、例えば、約１００〜約２，０００、または約２００〜約２，０００、または約３００〜約２，０００、または約５００〜約２，０００、または約１，０００〜約２，０００、または約５００〜約１，５００、または約１，０００〜約１，５００、または約１，０００〜約１，２００の範囲の分子量を有する分子を指す。小分子の例としては、例えば、ビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニル、フルオレセイン、ローダミン、低分子ペプチド（上述の分子量の限界を満たすもの）、ビタミンＢ１２およびホレートが例証として挙げられるが、これらに限定されない。小分子対に対する小分子結合パートナーの例としては、例えば、ビオチンに対するビオチン結合パートナー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンに対する抗体）、ジゴキシンに対するジゴキシン結合パートナー（例えば、ジゴキシンに対する抗体）、ジゴキシゲニンに対するジゴキシゲニン結合パートナー（例えば、ジゴキシゲニンに対する抗体）、２，４−ジニトロフェニルに対する２，４−ジニトロフェニル結合パートナー（例えば、２，４−ジニトロフェニルに対する抗体）、フルオレセインに対するフルオレセイン結合パートナー（例えば、フルオレセインに対する抗体）、ローダミンに対するローダミン結合パートナー（例えば、ローダミンに対する抗体）、ペプチドに対するペプチド結合パートナー（例えば、ペプチドに対する抗体）、分析物特異的結合パートナー（例えば、Ｂ１２に対する内因子、ホレートに対するホレート結合因子）が例証として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
ＭＳ標識としても機能し得る小分子ペプチドの例としては、ヒスチジン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、プロリン、バリン、チロシン、グリシン、トレオニン、セリン、アルギニン、システインおよびイソロイシンならびにそれらの誘導体のうちの２つまたはそれを超えるものを含むペプチドが例証として挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、それらのペプチドは、約１００〜約３，０００質量単位の分子量を有し、３〜３０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの例では、それらのペプチドは、チロシン、グリシン、メチオニン、トレオニン、セリン、アルギニン、フェニルアラニン、システインおよびイソロイシンからなる群より選択される９個のアミノ酸を含み、１，０２１．２；１，０３１．２；１，０３３．２；１，０７７．３；１，０８７．３；１，１２７．３；１，１３７質量単位の質量を有するか；または上記群からの３個のアミノ酸を有し、３３５．４、４３３．３、３９０．５、４２６．５および４０５．５質量単位の質量を有する。ペプチドにおけるアミノ酸の数は、例えば、使用されるＭＳ法の性質によって決定される。例えば、検出のためにＭＡＬＤＩを使用するとき、ペプチドは、約６００〜約３，０００の範囲内の質量を有し得、約６〜約３０個のアミノ酸から構築される。あるいは、検出のためにＥＩＳを使用するとき、ペプチドは、約１００〜約１，０００の範囲内の質量を有し得、例えば、１〜９個のアミノ酸または誘導体から構築される。いくつかの例では、ペプチド標識におけるアミノ酸の数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり得る。
【０１８４】
ＭＳ標識としてペプチドを使用することには、いくつかの利点があり、それらの利点としては、以下：１）タンパク質、抗体、粒子および他の生化学的実体に結合体化することが比較的容易であること；２）多くの異なる質量を可能にするために質量を変更することが比較的容易であるがゆえに、多重化されたアッセイ形式および標準物質が提供されること；および３）使用される質量分析計に対して質量を調整できることが挙げられるが、これらに限定されない。結合体化のために、ペプチドは、結合体化において使用される末端システインを有し得る。イオン化のために、ペプチドは、帯電したアミン基を有し得る。いくつかの例では、アミノ酸ペプチドは、Ｎ末端に遊離アミンおよびＣ末端に遊離酸を有する。いくつかの例では、アミノ酸ペプチドは、同位体標識されているか、または同位体で誘導体化されている。ペプチドは、小分子（例えば、ビオチンまたはフルオレセイン）に対する対応する結合パートナー（この例ではストレプトアビジンまたはフルオレセインに対する抗体である）に結合するために、その小分子に結合体化され得る。ビオチンまたはフルオレセインは、Ｎ末端において結合体化され得、Ｃ末端は遊離酸であり得る。
【０１８５】
本明細書中に記載される方法は、微量分析、すなわち、およそ１〜約１００，０００コピーの稀な細胞または稀な標的分子のわずかな量の材料を含む。このプロセスは、質量分析計の検出限界での微量分析を含むので、これらのわずかな量の材料は、濃度が検出範囲内になるように検出体積が極めて小さい、例えば、１０−１５リットルであるときだけ、検出され得る。本明細書中に記載される原理に一致する方法および装置の例は、蒸発を減少させるかまたは回避する。
【０１８６】
稀な細胞または稀な標的分子に対して放出されるＭＳ標識またはＭＳ標識前駆体の量の再現性を得ることは、その形成を測定すること、ならびにキャリア粒子および標識粒子の本質的に完全な回収を必要とする。ゆえに、１つのアプローチでは、キャリア粒子、標識粒子、連結基および／またはＭＳ標識もしくはＭＳ標識前駆体は、蛍光分子（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、蛍光性希土類キレート、アミノ−クマリン、ウンベリフェロン、オキサジン、テキサスレッド、アクリドン、ペリレン、インダセン（ｉｎｄａｃｉｎｅｓ）、例えば、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンおよびそのバリアント、９，１０−ビス−フェニルエチニルアントラセン、スクアライン色素ならびにフルオレサミンであるがこれらに限定されない）の存在によって蛍光にされ得る。次いで、処理の前および後に、蛍光顕微鏡を用いることにより、キャリア粒子、標識粒子、連結基および／またはＭＳ標識もしくはＭＳ標識前駆体の位置を明らかにすることができる。これは、システムの機能の確認方法として役立ち、稀な細胞または稀な標的分子の細胞構造上もしくは捕捉粒子上の位置に関するさらなる情報について評価される。
【０１８７】
方法を行うためのキット
本発明の装置および試薬は、本発明の方法を都合よく行うために有用なキットとして存在し得る。１つの実施形態において、キットは、本質的に非吸収性の膜と修飾された親和性剤（異なる稀な各標的分子に対して１つ）との包装された組み合わせを含む。そのキットは、稀でない細胞を分析から除外できるように、稀でない細胞に向けられた１つまたはそれを超える未標識の抗体または核酸プローブも含み得る。修飾された親和性剤が、ＭＳ標識前駆体または変化剤を含むか否かに応じて、そのキットは、修飾された親和性剤の一部ではないＭＳ標識前駆体または変化剤の他方も含み得る。そのキットは、ＭＳ標識前駆体と反応してＭＳ標識を生成する部分に対する基質も含み得る。さらに、そのキットは、例えば、固定剤、透過処理剤、および細胞への非特異的結合を防止するブロッキング剤のうちの１つまたはそれを超えるものも含み得る。本方法を行うための他の試薬もまた、キットに含められ得、そのような試薬の性質は、使用される特定の形式に依存する。それらの試薬は、各々が別個の容器の中に存在してもよいし、様々な試薬が、それらの試薬の交差反応性および安定性に応じて、１つまたはそれを超える容器の中で合わせられていてもよい。キットは、本方法を行うための他の別々に包装された試薬（例えば、分析を行うための、補助的な試薬、結合剤、サンプル収集用の容器および細胞用の支持体、例えば、顕微鏡用スライド）をさらに含み得る。
【０１８８】
キット内の様々な試薬の相対量は、本方法の間に生じる必要のある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するため、およびさらには本方法の感度を実質的に最適化するために、大きく変動し得る。適切な状況下において、キット内の１つまたはそれを超える試薬は、賦形剤を含む乾燥粉末として、通常、凍結乾燥された粉末として、提供され得、その粉末は、溶解されると、本明細書中に記載される原理に一致する方法を行うために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。そのキットは、本明細書中に記載される原理に一致する試薬を使用する方法の書面による説明をさらに含み得る。
【０１８９】
句「少なくとも」は、本明細書中で使用されるとき、指定の物品の数が、列挙されている数と等しいかまたはそれより大きい場合があることを意味する。句「約」は、本明細書中で使用されるとき、列挙されている数字が、プラスまたはマイナス１０％異なり得ることを意味し；例えば、「約５」は、４．５〜５．５の範囲を意味する。
【０１９０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を、例証としてであって限定でなくさらに説明し、本発明の範囲を説明することを意図しているのであって、限定することを意図していない。本明細書中に開示される部およびパーセンテージは、別段示されない限り、容積基準である。
【０１９１】
参照による援用
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）に対する参照および引用が、本開示全体にわたって行われている。そのような文書のすべてが、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１９２】
等価物
本明細書中に示されているおよび記載されているものに加えて、本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な改変が、本明細書に引用された科学文献および特許文献の参照を含む、この文書の全内容から当業者にとって明らかになるだろう。本明細書中の主題は、様々な実施形態およびその等価物における本発明の実施に適合され得る重要な情報、例証およびガイダンスを含む。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：膜からの液体液滴の放出
合計３つの本質的に非吸収性の膜を、試験のために使用した。第１の膜は、直径およそ７０μｍおよび高さ３６０μｍの６４００個のマイクロウェルからなる８×８ｍｍ２のケイ素領域を含む本質的に非吸収性の膜であった。各ウェルの底面は、ウェルの開口部内のほぼ中心に位置する５μｍの孔を有する、１μｍの厚さの窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）の堅い膜によって覆われていた。その膜の表面と孔との交差において形成される角度は、９０°であった。第２の膜は、直径５μｍの約１０８，０００個のポアを含む領域を有する単一のマイクロウェルからなる本質的に非吸収性の１μｍの厚さの窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）の８×８ｍｍ２の堅い膜であり、第２の膜は、そのマイクロウェルの開口部内のほぼ中心に位置した。その膜の表面とすべてのポア孔との交差において形成される角度は、９０°であり、１°を超えて変動しなかった。第３の膜は、可撓性のポリカーボネートの本質的に非吸収性の膜であった。第３の膜は、３．７ｃｍ２であり、単一のマイクロウェルの底面に位置した。第３の膜は、約１００，０００個の直径８μｍのポアを有した。その膜の表面とポア孔との交差において形成される角度は、個別のポアの間で、３０〜１５０°で変動した。
【０１９４】
溶媒と大気との界面における電場の強度が、液体の表面張力に起因する力に打ち勝つほど十分な大きさになったとき、ＥＳＩが生じる。この時点において、液体は引き出されて錐体になり、そこから帯電した液滴が排出された。これらの液滴は、蒸発と分裂のサイクルを経て、最終的に、分析用の質量分析計の真空システム内に吸い込まれる気相イオンを生成した。この例において膜表面から直接エレクトロスプレーを生成する際、スプレーされる溶液は、マイクロウェルを含むチップ（エッチングされたシリコンウエハハウジング）の上面を十分に湿らせなければならない。表面に対して理想的な湿潤性を示す溶媒は、溶媒が加えられると、本質的にウェルを満たすので、スプレー事象の間、連続的な溶媒送達のためのキャピラリーフローを提供し得る。Ｓｉ３Ｎ４膜の裏面は、理想的には、スプレー溶媒と非湿潤性の相互作用を有するべきである。このタイプの相互作用は、その液体を、各５μｍポア上で単一の液滴に切り離す。個々の液滴の存在は、ある電位の印加においてより高い電場強度をもたらす高い湾曲度をもたらすので（平らな湿った表面と比べて）、エレクトロスプレーの形成に役立つ。さらに、質量分析計のキャピラリー入口を膜の底面の近くに配置することによって、電場強度がさらに高まり、その膜の選択された領域からエレクトロスプレーを生成することが可能になるので、空間的情報が収集される。スプレー溶媒は、十分に極性であるべきであり、大気の電気的破壊をもたらす電場強度より低い電場強度のエレクトロスプレーを可能にするのに十分低い表面張力を有するべきである。
【０１９５】
直接的な膜スプレーの最初の試験のためのスプレー溶媒として、アセトニトリルおよびメタノールを選択した。ＴＨＥＲＭＯ  ＬＴＱ（リニアイオントラップ）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ＬＬＣ製）の大気圧イオン化（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｌｅｔ）（ＡＰＩ）用の標準的な真っ直ぐなキャピラリーを、開口部が上を向くように９０°の角度で曲げた長いキャピラリーで置き換えて、実験を行った。すべての実験において、底面が地面と平行になり、曲がったキャピラリーの入口からおよそ１ｍｍ離れるように、膜を位置させた。膜の底面および曲がったキャピラリーを、ダイオードレーザーを用いて照らし、ＣＭＯＳカメラで映像を記録した。
【０１９６】
実験の第１のセットでは、５０μＬのメタノール（またはアセトニトリル）を膜の上面上に直接ピペットで移し、プラズマを静電気防止銃から溶媒に向けることによって、電位を印加した。このようにして電位が印加されたとき、別個のスプレー事象が可視化され、記録された質量スペクトルは、同じ溶液を、ナノＥＳＩを介してスプレーしたものに特有であるピークを示した。溶媒が枯渇すると、スペクトルは大幅に異なり、ＭＳ入口において遮られていない静電気防止銃を発射したときに見られるものに特徴的なものになった。
【０１９７】
さらなる実験は、多孔性の膜はスプレーするが、スプレーされる材料の量が変わりやすいこと（２０％ｃｖ）、ならびに分析物イオン、および分析物を含む帯電した液滴の排出が起きる時点も同様に１００ｍｓｅｃを超えて変わりやすく、これが短時間のスケールかつ少量のスプレー体積で生じるので、イオンの捕捉が難しくなることを示した；したがって、定量的でない方法がもたらされた。コントロールとして、固定された配向のポアを有する可撓性の（１度を超える角度を引き起こす）不透過性層を試験した。この層を用いたときの結果は、スプレーされた材料が２０％ＣＶを超えて変動するというものであった。本明細書中に記載される原理に一致する特徴を有する使用された膜は、１％ＣＶ未満のスプレー量をもたらした。
【０１９８】
四次のペプチド（ＦＣ−２）を含む溶液を可撓性の膜と非可撓性の膜の両方からスプレーすることによって、可撓性の膜と非可撓性の膜の性能の比較を行った。この比較は、血液を濾過するために以前使用されていた膜を用いて行った。可撓性の膜の場合、その膜を、曲がったＭＳ入口のおよそ０．５ｍｍ上に配置し、その膜のおよそ５ｍｍ上に配置されたワイヤー（電場発生器）に６．５ｋＶの電位を印加した。次いで、イオンｍ／ｚ４１２のＭＳ／ＭＳスペクトルを記録しながら、ＦＣ−２ペプチドを含む溶液（２５μＬの、０．１％ギ酸を含む４：１メタノール：水）をその膜の上部に適用した。ＦＣ−２ペプチドは、ポジティブモードでエレクトロスプレーされたとき、ｍ／ｚ４１２の分子イオンを生成し、それは、ＣＩＤフラグメントに供されたとき、主にｍ／ｚ３５３となる。非可撓性の膜の場合、その手順は、以下の変更と同一であった：電場発生器の電圧を６．０ｋＶに設定し、適用される液体の量を５μＬとした。いずれの場合でも、ＦＣ−２ペプチドの濃度を１、１０および１００ｎＭに調整した。可撓性および非可撓性の膜に対するｍ／ｚ４１２のＣＩＤスペクトルが、それぞれ図８Ａ〜Ｃおよび図９Ａ〜Ｃに示されている。可撓性の膜からのスプレーの形成は、液体を膜に適用した後、１〜３秒という時間にわたって生じ、生じたスプレーの写真を図１０に示す。非可撓性の膜の場合、匹敵するスプレープルームは、観察されなかったことから、スプレーの形成は個々のウェルから生じていることが示唆される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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