(57)【要約】本発明は、改善された糖尿病治療のための、アルファ細胞集団からベータ細胞集団を生成する方法であって、前記アルファ細胞集団を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、モノクローナルグルカゴン中和抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせで接触させることによる、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ細胞集団を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物と組み合わせて接触させる工程を含む、
膵臓ベータ細胞集団を製造するための方法。
【請求項２】
グルカゴン中和モノクローナル抗体が、グルカゴンに結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記グルカゴン中和モノクローナル抗体が、ＧＬＵ００１である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
グルカゴン中和モノクローナル抗体が、グルカゴンに対する結合について、ＧＬＵ００１と競合する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
グルカゴン中和モノクローナル抗体が、ＧＬＵ００１と同じエピトープに結合する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アルファ細胞集団レギュレーション化合物が、分泌因子、例えば、肝臓由来の因子である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記アルファ細胞集団レギュレーション化合物が、グルカゴンレセプターアンタゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストを、モノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物と組み合わせて含む、
医薬調製物（組み合わせもしくは医薬組成物、又はキット）。
【請求項９】
糖尿病の処置に使用するための、請求項８記載の医薬調製物。
【請求項１０】
膵臓ベータ細胞集団を製造するための、グルカゴン中和モノクローナル抗体との組み合わせにおける、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの使用。
【請求項１１】
中和モノクローナル抗体が、Ｇｌｕ００１である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ベータ細胞集団の増加を必要とする患者において、ベータ細胞集団を増加させるための方法であって、前記患者に、有効量のＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストとモノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物と組み合わせて投与する工程を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ細胞集団からベータ細胞集団を生成する方法であって、前記アルファ細胞集団を、ＧＡＢＡ又は任意のＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴンシグナル伝達を除去することによりアルファ細胞集団をレギュレーションする化合物、例えば、グルカゴン中和モノクローナル抗体、又は、例えば、グルカゴンレセプターアンタゴニストと接触させることによる、方法に関する。
【０００２】
［背景］
糖尿病は、高血糖及び膵臓におけるインスリン生成ベータ細胞の機能不全又は損失により特徴付けられる。したがって、糖尿病を治癒する方法は、機能的なβ細胞集団を再生させ、及び／又は、アルファ細胞からのグルカゴン分泌を阻害することである。一般的には、操作されたマウスモデルを使用して、アルファ細胞を機能的なβ細胞に再プログラムすることができることが証明されている。さらに、この戦略では、マウスは、ベータ細胞集団のほぼ完全な除去から複数回回復することができることが示されている。この再プログラミングは、２つの転写因子であるＡｒｘ及びＰａｘ４間の相互作用により決まる。開発中に、これらは、これら２つの遺伝子の転写状態を制御する阻害性交叉レギュラトリー回路を介した、内分泌サブタイプ運命の仕様の基礎をなすプロセスにおいて、アンタゴニスト活性を表わすことが示された（Al-Hasani et al., 2013）。
【０００３】
加えて、複数の研究から、ＧＡＢＡが、ベータ細胞増殖を誘引し、ベータ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアポトーシスから保護することにより、ベータ細胞集団を維持するのに関与していることが証明されている。ＧＡＢＡが、血中グルコースレベルを低下させ、マウスのストレプトゾトシン誘引性糖尿病において、ベータ細胞集団における保護的及び再分化的効果を発揮することができたことが示された。示唆された説明は、また、ＧＡＢＡには、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を反転させ（Soltani et al., 2011）、ヒト膵島における増殖を誘引する（Purwana et al., 2014）ことも見出された。２０１３年９月１６日付けの特許出願（国際公開公報第２０１４０４８７８８号）（P. Collombat）に記載されたように、ＧＡＢＡを投与されたマウスは、ベータ細胞集団を、アルファ細胞の新生及びアルファ細胞のベータ細胞への変換により、補充することができる。
【０００４】
グルカゴンシグナル伝達が存在しないと、アルファ細胞集団の増加がもたらされるであろう。この自己再生プロセスは、複数のトランスジェニックマウスモデル：１）プログルカゴンをグルカゴンに処理することができないプロホルモンコンベルターゼ−２ノックアウト（ＰＣ２−ＫＯ）（Furuta et al., 1997）及び２）（グルカゴンを感知できない）グルカゴンレセプターＫＯにおいて示されている。両方とも、重大なアルファ細胞過形成をもたらす（Gelling et al., 2003）。同様に、プログルカゴン−ＫＯマウスは、Ａｒｘを発現するランゲルハンス膵島において、グルカゴン陰性アルファ細胞の広いアップレギュレーションを有する（Hayashi et al., 2009）。さらに、グルカゴンレセプターの肝臓特異的ＫＯは、全体的なグルカゴンレセプターＫＯと比較して、同様のアルファ細胞過形成を有することが示されている。このことは、アルファ細胞過形成を媒介する肝臓由来因子の存在を示唆している。アルファ細胞過形成が野生型動物中において誘引することができることも示されている。９ヶ月にわたってグルカゴンで免疫化されたウサギにおいて、アルファ細胞集団の劇的な増殖が認められている。
【０００５】
したがって、糖尿病患者における最適な治療効果のための、ベータ細胞へのその後の変換及び高グルカゴン血症の低下を伴う、アルファ細胞の誘引性再分化の促進的なメカニズムについての必要性が存在する。
【０００６】
［概要］
本発明は、アルファ細胞集団において、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物と組み合わせて接触させることを含む、ベータ細胞集団を製造するための方法を提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、本発明の方法により得ることができる膵臓ベータ細胞に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、ベータ細胞集団を製造するための、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおける、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの使用に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、特に、グルコール不耐性及び／又は糖尿病の処置における、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおける、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの使用に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、アルファ細胞を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおいて接触させることを含む、医薬調製物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、糖尿病を予防し、又は、治療するための方法において使用するために、アルファ細胞を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおいて接触させることを含む、医薬調製物に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、ベータ細胞集団の増加を必要とする患者において、ベータ細胞集団を増加させるための方法であって、前記患者に、有効量のＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストとモノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせとの組み合わせを投与する工程を含む、方法に関する。
【００１３】
本発明は、糖尿病のための新規な治療としての、アルファ細胞の再分化及びその後のベータ細胞変換を改善する。
【００１４】
本発明は、ＧＡＢＡにより、グルカゴンに対する中和抗体とＧＡＢＡとを組み合わせることにより媒介されるベータ様細胞新生を改善するのに役立つ。同新生により、アルファ細胞集団が増加し、ベータ細胞に変換することができる細胞が増加する。
【００１５】
一実施態様において、本発明は、グルカゴン中和抗体及びＧＡＢＡによるアルファ細胞集団の増加による、誘引されたアルファ細胞過形成をベータ細胞過形成に変換することによる、促進的なベータ細胞新生を提供する。
【００１６】
また、本発明は、例示的な実施態様の開示から明らかであろう、更なる課題を解決することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＧＬＵ００１（４μg/g bw）の毎日注入により、マウスにおいて有意に血中グルコースが低下することを示す。日量４μg/g bw Ｇｌｕ００１又は（アイソタイプ対照としての）ａＴＮＰにより、グルカゴンシグナル伝達が損なわれたマウスにおいて、血中グルコースの有意な減少が観察された。９匹のマウスに、時間＝０及び１週間の間に２４時間毎に、ａＴＮＰ（対照）を投与し、１２匹のマウスに、ＧＬＵ００１（抗ｇｃｇ）を注入した。
【図２】図２は、Ｎｋｘ６．１、ＢｒｄＵ、及びＧｃｇについての三重免疫染色からの定量データを示す。ＢｒｄＵ陽性細胞を、計測された細胞総数の関数としてプロットする。各記号は、１匹のマウスからの計測を表わす。ＧＬＵ００１処置マウスは、ａＴＮＰ処置マウスと比較して、ＢｒｄＵを有するアルファ細胞の顕著に大きな割合を有した。ＧＬＵ００１又はａＴＮＰ処置マウスのＢｒｄＵ包含に関して、β細胞の変化は観察されなかった。
【図３】図３は、生理食塩水（Ａ）、ＧＡＢＡ（Ｂ）、Ｇｌｕ００１（Ｃ〜Ｄ）、又はＧＡＢＡとＧｌｕ００１との両方（Ｅ〜Ｆ）により、１ヶ月間処置された３ヶ月齢のＷＴ動物を示す。得られた膵臓の免疫組織化学特徴決定から、ＧＡＢＡ処置に基づくインスリン＋細胞数の増加が示される（Ａと比較したＢ）。この増加は、Ｇｌｕ００１処置マウス（Ｃ）には見られない。Ｇｌｕ００１処置マウス（Ｃ）では、グルカゴン＋細胞の過形成のみが検出された（Ｄ）。重要なことに、組み合わせ処置に基づいて、このグルカゴン＋細胞の過形成が見られない（Ｆ）。一方、インスリン＋細胞数の大規模な増加が認められる（Ｅ）。このインスリン＋細胞の過形成は、「ＧＡＢＡのみ」で処置されたマウスにおいてより広範囲にわたる。このことは、Ｇｌｕ００１は、インスリン＋細胞の過形成を更に増大させる。
【図４】図４は、生理食塩水、ＧＡＢＡ，又はＧＡＢＡとＧｌｕ００１との両方で１ヶ月間処置された、３ヶ月齢のＷＴ動物のＯＧＴＴ（経口ブドウ糖負荷試験）を示す。ＧＡＢＡにより、グルコースボーラスに対する応答が改善されることが認められる。このことは、ベータ細胞集団の増加を示唆している。重要なことに、この応答は、Ｇｌｕ００１とＧＡＢＡとの両方の存在下において更に改善され、ベータ様細胞含量の増加が認められる線が得られる。
【図５】図５は、媒体、ａＧＣＧＲ、及びＧＬＵ００１による１週間の処置後に測定された、循環性グルカゴンの血漿レベルを示す。ａＧＣＧＲ及びＧＬＵ００１処置マウスは、媒体処置マウスと比較して、循環性グルカゴンレベルを有意に向上させた。データは、平均±ＳＥＭである。
【図６】図６は、膵臓におけるインスリン及びグルカゴンについての免疫組織化学染色を示す。ソフトウェアプログラムVISを、アルファ細胞及びベータ細胞の面積を定量するのに使用した。Ｇｌｕ００１及びａＧＣＧｒ処置の両方により、アルファ細胞過形成が生じ、媒体処置対照と比較して、アルファ細胞集団が、３．８倍（Ｇｌｕ−００１）及び１１．６倍（ａＧＣＧｒ）増加した。ベータ細胞集団は、両方の処置により影響を受けなかった。
【００１８】
［説明］
本発明は、アルファ細胞集団において、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせで接触させることを含む、膵臓ベータ細胞集団を製造するための方法を提供する。
【００１９】
一実施態様において、本発明のアルファ細胞集団レギュレーション化合物は、肝臓由来因子である。
【００２０】
一実施態様において、本発明のアルファ細胞集団レギュレーション化合物は、グルカゴンレセプターアンタゴニストである。
【００２１】
一実施態様において、本発明のアルファ細胞集団レギュレーション化合物は、グルカゴンレセプターシグナル伝達阻害剤である。
【００２２】
一実施態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる膵臓ベータ細胞に関する。
【００２３】
一実施態様において、本発明は、特に、糖尿病の予防又は治療における、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせでの、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの医療的使用に関する。
【００２４】
一実施態様において、本発明は、ベータ細胞集団を製造するための、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおける、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの使用に関する。
【００２５】
一実施態様において、本発明は、アルファ細胞を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせにおいて接触させることを含む、医薬調製物に関する。
【００２６】
一実施態様において、本発明は、更に、ベータ細胞集団の増加を必要とする患者において、ベータ細胞集団を増加させるための方法であって、前記患者に、有効量のＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストとモノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせを投与する工程を含む、方法に関する。
【００２７】
一実施態様において、本発明は、糖尿病のための新規な治療として、アルファ細胞の再分化及びその後のベータ細胞変換を改善する。
【００２８】
一実施態様において、本発明は、ＧＡＢＡにより、グルカゴン中和抗体とＧＡＢＡとを組み合わせることにより媒介されるベータ様細胞新生を改善するのに役立つ。同新生により、アルファ細胞集団が増加し、ベータ細胞に変換することができる細胞が増加する。
【００２９】
一実施態様において、本発明は、グルカゴン中和抗体及びＧＡＢＡによりアルファ細胞集団を増加させ、誘引されたアルファ細胞過形成を新たなベータ細胞に変換することにより、促進的なベータ細胞新生を提供する。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、グルカゴンシグナル伝達を減少させることにより、血中グルコースを改善するのに役立つ。
【００３１】
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」又は「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｉｔｕｓ）」という用語は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病（妊娠中）、及び、高血糖を生じさせる他の状態を含む。この用語は、膵臓が十分な量のインスリンを生成できないか、又は、身体細胞がインスリンに適切に応答できないため、細胞がグルコースを吸収するのが妨げられる代謝性障害に使用される。結果として、グルコースが血中に蓄積される。
【００３２】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病及び若年発症型糖尿病は、ベータ細胞破壊により引き起こされ、通常、絶対的なインスリン依存性をもたらす。
【００３３】
インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）及び成人発症型糖尿病としても公知の２型糖尿病は、著しいインスリン抵抗性、及びこのため、相対的なインスリン依存性に関連し、及び／又は、主に、インスリン抵抗性を伴うインスリン分泌不全に関連する。
【００３４】
「処置」という用語は、言及された疾患、障害、又は状態の予防及び最小化の両方（すなわち、処置）を含むことを意味し、文脈により明確に反対に示されない限り、ＧＡＢＡ及びＧｌｕ００１又はＧＡＢＡ及びＧｌｕ００１を含む組成物の予防的及び治療的投与の両方を含む。
【００３５】
投与経路は、本発明の化合物を身体中の所望又は適切な箇所に、例えば、非経口的に、例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内で効果的に輸送する、任意の経路であることができる。あるいは、本発明の化合物は、経口、肺、直腸、経皮、口腔、舌下、又は経鼻で投与することができる。
【００３６】
投与される本発明の化合物量、本発明の化合物をどのような頻度で投与するかの決定、及び、場合により、別の抗糖尿病化合物と組み合わせて投与する本発明の１つ以上の化合物の選択は、糖尿病の処置に精通している実務家との協議において決定される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「膵臓ベータ細胞」、「ベータ細胞」、又は「インスリン分泌性ベータ細胞」という用語は、互換的に使用され、グルコースによる刺激に基づいて、インスリンを産生することができる細胞を意味する。より好ましくは、特異的な表面抗原の発現は、細胞が膵臓ベータ細胞であるかどうかを判定するのに使用される。例えば、膵臓ベータ細胞は、グルコース輸送体であるＧｌｕｔ２を発現している。あるいは、特異的転写因子の発現は、細胞が膵臓ベータ細胞であるかどうかを判定するのに使用される。例えば、膵臓ベータ細胞は、転写因子であるＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、ＭａｆＡ、及びＰａｘ４を高度に発現している。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「膵臓アルファ細胞」、「アルファ細胞」、又は「グルカゴン発現細胞」という用語は、互換的に使用され、グルカゴンを発現することができ、この結果として、血糖レベルを低下させることができる細胞を意味する。より好ましくは、特異的転写因子の発現は、細胞が膵臓アルファ細胞であるかどうかを判定するのに使用される。例えば、膵臓アルファ細胞は、転写因子であるＡｒｘ、Ｂｒｎ−４、及びＭａｆＢを発現している。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「レセプターアゴニスト」という用語は、そのレセプター（例えば、ＧＡＢＡレセプター）のネイティブなリガンド、レセプターを同様に「活性化する」その類似物もしくは他のリガンド、及び／又は、レセプターの陽性アロステリックモデュレータを意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡ」という用語は、式（１）：
【化１】
2018502084.tif 000002
で表示されるガンマ−アミノ酪酸又はその薬学的に許容し得る塩、その溶媒和物又はプロドラッグ、及びそれらの混合物を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡＡレセプター特異的アゴニスト」という用語は、ＧＡＢＡＡレセプターにアゴニスト活性を有し、ＧＡＢＡＢにアゴニスト活性を実質的に有さない作用剤を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡＡレセプター優先アゴニスト」は、ＧＡＢＡＢにより、ＧＡＢＡＡレセプターに大きいアゴニスト活性を有する作用剤を意味する。典型的には、ＧＡＢＡＡレセプター優先アゴニストは、ＧＡＢＡレセプターにおけるアゴニスト活性についての従来のアッセイ法を使用して決定された場合、ＧＡＢＡＢにより、ＧＡＢＡＡレセプターに、少なくとも１．２倍、より好ましくは、少なくとも１．５倍、更により好ましくは、少なくとも２倍、及び最も好ましくは、少なくとも３倍、少なくとも５培、又は少なくとも１０倍大きい活性を有する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡＢレセプター特異的アゴニスト」という用語は、ＧＡＢＡＢレセプターにアゴニスト活性を有し、ＧＡＢＡＡにアゴニスト活性を実質的に有さない作用剤を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡＢレセプター優先アゴニスト」は、ＧＡＢＡＡにより、ＧＡＢＡＢレセプターに大きいアゴニスト活性を有する作用剤を意味する。特定の実施態様では、ＧＡＢＡＢレセプター優先アゴニストは、ＧＡＢＡレセプターにおけるアゴニスト活性についての従来のアッセイ法を使用して決定された場合、ＧＡＢＡＡにより、ＧＡＢＡＢレセプターに、少なくとも１．２倍、より好ましくは、少なくとも１．５倍、更により好ましくは、少なくとも２倍、及び最も好ましくは、少なくとも３倍、少なくとも５培、又は少なくとも１０倍大きい活性を有する。
【００４５】
特定の一実施態様では、ＧＡＢＡレセプターアゴニストは、ＧＡＢＡ−Ａ及びＧＡＢＡ−Ｂレセプターの両方に作用する。特定の一実施態様では、ＧＡＢＡレセプターアゴニストは、ＧＡＢＡＡ又はＧＡＢＡＢレセプターに、優先的に又は排他的に作用する。
【００４６】
ＧＡＢＡレセプターアゴニストは、当業者に周知である。
【００４７】
ＧＡＢＡレセプターアゴニストの非限定的な例は、特定のバルビツラート（例えば、チオペンタール、チアミラール、ペントバルビタール、セコバルビタール、ヘキソバルビタール、ブトバルビタール、アモバルビタール、バルビタール、メホバルビタール、フェノバルビタール、プリミドン等）、特定のベンゾジアゼピン（例えば、ミダゾラム、トリアゾラム、ロメタゼパム、フルタゾラム、ニトラゼパム、フルリトラゼパム、ニメタゼパム、ジアゼパム、メダゼパム、オキサゾラム、プラゼアム、トフィソパム、リルマザホノエ、ロラゼパム、テマゼパム、オキサゼパム、フルイダゼパム、クロルジアゼポキシド、クロキサゾラム、フルトプラゼパム、アルプラゾラム、エスタゾラム、ブロマゼパム、フルラゼパム、クロラゼパートカリウム、ハロキザゾラム、エチルロフラゼパート、クアゼパム、クロナゼパム、メキサゾラム等）、特定のチエノジアゼピン（例えば、エチゾラム、ブロチゾラム、クロチザエパム等）、特定のジアルキルフェノール（例えば、プロポホール、ホスプロポホール等）、特定の非ベンゾジアゼピン（例えば、ゾルピデム、ゾピクロン、エキソゾピクロン等）等を含む。
【００４８】
別の実施態様では、ＧＡＢＡレセプターアゴニストは、ムスシモール、ＴＨＩＰ／ガボキサドール、イソグバシン、コウジ酸アミン、ホモタウリン、ホモハイポタウリン、trans−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸、trans−アミノ−４−クロトン酸、ｐ−グアニジノプロピオン酸、ホモ−Ｐ−プロリン、イソニペコチン酸、３−（（アミノイミノメチル）チオ）−２−プロペン酸（ＺＡＰＡ）、イミダゾール酢酸、及びピペリジン−４−スルホン酸（Ｐ４Ｓ）からなる群より選択される。あるいは、グルタマートのＧＡＢＡ及びＣＯ２への脱カルボキシル化を触媒する酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を使用することができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「アルファ細胞集団レギュレーション化合物」という用語は、マウス及びヒトにおいて、アルファ細胞集団を広くアップレギュレーションすることが公知の、機能的なグルカゴンレセプター（ＧｌｕＲ）のシグナル伝達の中和を模倣する化合物を意味する。アルファ細胞集団レギュレーション化合物の列記は、１）グルカゴンがそのレセプターに結合し、同レセプターを活性化するのを妨害し、２）グルカゴンの生成又は処理を妨害し、３）グルカゴンレセプターからの下流のシグナル伝達の生成を妨害し、４）グルカゴンシグナル伝達が存在しないことに対する応答において生成される肝臓由来因子を分泌するであろう、全ての分子及び生物製剤を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「グルカゴン」という用語は、マウスとヒトとの間で１００％保存されている、プログルカゴンから得られるペプチド配列を意味する。グルカゴンは、肝臓におけるグルカゴンレセプター（ＧｌｕＲ）の活性化により、血中グルコースを増加させることが周知である。ＧｌｕＲシグナル伝達の不存在により、血中グルコース及びアルファ細胞過形成の減少がもたらされる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「グルカゴン中和モノクローナル抗体」という用語は、グルカゴンがグルカゴンレセプター（ＧｌｕＲ）に結合し、同レセプターを活性化させるのを妨害するであろう抗体を意味する。一実施態様において、「グルカゴン中和モノクローナル抗体」は、グルカゴンに対して強力な結合親和性を有することにより、グルカゴンがグルカゴンレセプター（ＧｌｕＲ）に結合し、同レセプターを活性化させるのを妨害する抗体を意味する。
【００５２】
別の実施態様では、「グルカゴン中和モノクローナル抗体」は、グルカゴンレセプターに結合することにより、グルカゴンがグルカゴンレセプター（ＧｌｕＲ）に結合し、同レセプターを活性化させるのを妨害するであろう抗体を意味する。
【００５３】
「グルカゴン中和」抗体の非限定的な例は、モノクローナル抗グルカゴン抗体を含むが、これらに限定されない。例えば、同モノクローナル抗グルカゴン抗体は、Ｇｌｕ−ｍＡｂ（NovoClone GLU-001, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)もしくはａＧＣＧＲ（米国特許出願公開公報第２０１１／０２２３１６０号に開示されたAmgen A-3を有するＶＨ及びＶＬドメインを共有する抗体）、又は類似物（「ＧＬＵ００１」のヒト化版を含むが、これに限定されない）を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、「ＧＬＵ００１、Ｇｌｕ００１、ＧＬＵ−００１、又はＧｌｕ−００１」は、哺乳類のグルカゴン（マウスとヒトのグルカゴンは同一である）に結合する、マウスモノクローナル抗体を意味する。Ｇｌｕ００１は、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞とＸ６３−ＡＧ８−６．５，３骨髄細胞との融合物から選択されるハイブリドーマにより生成されるクラスＩｇＧ１抗体である。競合的放射線免疫アッセイ法により、会合定数（Ｋａ）は、０．６．１０１〜１/molに決定された。スキャッチャード分析から算出されるＧｌｕ−００１の総結合能は、４０nmol/mlであった。合成のグルカゴンフラグメントによる結合試験により、抗体結合エピトープは、グルカゴンのアミノ酸配列のセグメント５〜１５に位置したことが示された。グリセンチン（プログルカゴンのグルカゴン含有フラグメント）に対する交叉反応性は、１００％であると決定された。グルカゴン様ペプチド１、腸阻害性ポリペプチド、グリセンチン関連膵臓ペプチド、血管作動性腸ポリペプチド、又は膵臓ポリペプチドに対して結合しなかった。Ｇｌｕ００１が、細胞培養において生成され、プロテインＡセファロースカラムにおいて精製され、濃縮された（Brand et al., 1994）。
【００５４】
グルカゴンがグルカゴンレセプターに結合するのを妨害するアンタゴニスト抗体用のスクリーニングアプローチは、以下に記載された２種類のアッセイ法を含む。２つのアッセイ法について、ＧＬＵ００１又はａＧＣＧＲと同様の特性を有する抗体がグルカゴン誘引性シグナル伝達及び結合を妨害することができることが共通している。
【００５５】
アッセイ法Ａ：置換アッセイ法：フローサイトメトリー
アッセイ原理
グルカゴンのそのレセプターへの結合と拮抗する試験抗体の能力を決定するために、フローサイトメトリーを使用する置換アッセイ法が適用される。選択されたグルカゴン又はグルカゴンレセプター特異的抗体が、レセプタートランスフェクション細胞に結合するＦＬＡＧ又はビオチン化タグ付きグルカゴンをブロックする能力について試験される。対照として、非トランスフェクション細胞及び無関係の抗体が使用される。
【００５６】
アッセイ法プロトコール
アッセイ法を、レセプター陽性細胞（５００００個／ウェル）に対する用量設定（５ug/ml、２．５ug/ml、１．２５ug/ml、０．６３ug/ml、０．３１ug/ml、０．１６ug/ml、０．０８、及び０ug/mlをダプリケートで試験）で、５０μl/ウェル 希釈モノクローナル抗体を加えることにより行い、９６ウェルプレート（Greiner, cat no. 65021）中において、固定濃度でのＦＬＡＧ又はビオチン化タグ付きグルカゴンの存在下で（一系列において２０ng/ml、及び、一系列において２ng/ml）、４℃において１時間インキュベーションする。インキュベーション及び洗浄（５％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含み、２００ｇで５分間遠心分離されたＰＢＳバッファー）後、５０μl/ウェル 二次抗体（ＡＰＣ  抗ＦＬＡＧタグａｂ、Perkin Elmer、終濃度５μg/ml）又はストレプトアビジンＡＰＣ（ＰＢＳバッファー中で１：４００希釈）を加え、４℃において、更に１時間インキュベーションする。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒド（体積当たりに１重量％（w/v） パラホルムアルデヒド）により固定する。サンプルを、例えば、BD FACS Cantoフローサイトメーターを使用して分析する。シグナルを、ＡＰＣチャネルにおいて収集した。結果の分析を、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン５）を使用して行った。
【００５７】
アッセイ法Ｂ：レポーター遺伝子アッセイ法
アッセイ原理
そのレセプターの活性化についてグルカゴンと拮抗する試験抗体の能力を決定するために、フローサイトメトリーを使用するレポーター遺伝子アッセイ法が適用される。選択されたグルカゴン又はグルカゴンレセプター特異的抗体を、グルカゴンレセプターの活性化を妨害する能力について試験する。対照として、非トランスフェクション細胞及び無関係な抗体を使用する。使用される細胞株は、ｃＡＭＰ誘引性プロモーター（ＣＲＥ）の制御下において、グルカゴンレセプター及びルシフェラーゼを過剰発現するＢＨＫである。細胞を、９６ウェルプレートにおいて、一晩培養し、その後、抗体の存在下又は非存在下において、グルカゴンにより３時間刺激する。機能的なグルカゴンレセプターを発現している細胞をグルカゴンで刺激した場合、細胞内ｃＡＭＰの増加が生じる。これにより、細胞は、ルシフェラーゼを生成する。ルシフェラーゼ活性を、溶解させた細胞中において、ルシフェリン（Steady Glo）を加えることにより測定する。ルシフェリンは、以下に示された等式により、オキシルシフェリンに変換される。ルミネッセンスを、例えば、Envision（Perkin Elmer）により測定する。
【００５８】
アッセイ法プロトコール
ＢＨＫ  ｈ−グルカゴンＲ＋ｌｕｃ  ｐＬｊ６−４−２５の細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ １００μl中において、７５，０００個／ウェルで含む９６ウェルプレートで、３７℃及び５％ ＣＯ２において一晩増殖させる。培地を、グルカゴン（一系列において２０ng/ml、及び、一系列において２ng/ml）を含有する１００μl/ウェル アッセイ培地（１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）で置き換え、用量設定レベルの関連する抗体（５ug/ml、２．５ug/ml、１．２５ug/ml、０．６３ug/ml、０．３１ug/ml、０．１６ug/ml、０．０８、及び０ug/mlをダプリケートで試験）を加える。プレートを、インキュベーター中において、３時間インキュベーションする。プレートを、室温で１５分間インキュベーションする。５０μl/ウェル Steady Glo（Promega）を加える。２０〜３０分後、プレートを、例えば、Envision読取機により読み取る。
【００５９】
同じ抗原に結合する抗体を、それらの共通する抗原に同時に結合するそれらの能力に関して特徴決定することができ、「競合結合／ビニング」に供することができる。本文脈において、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体を分類する方法を意味する。抗体の「ビニング」は、標準的な技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリーに基づくアッセイ法において、それらの共通する抗原に対する２つの抗体の競合結合に基づくことができる。
【００６０】
抗体の「ビン」は、参照抗体を使用して定義される。第２の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができない場合、第２の抗体は、参照抗体と「同じビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体及び第２の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合し、「競合抗体」を構成する。第２の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができる場合、第２の抗体は、別々の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体及び第２の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」を構成する。
【００６１】
「グルカゴンレセプターをターゲットとするｓｉＲＮＡ」の非限定的な例は、グルカゴンレセプターｍＲＮＡの除去又は分解を促進するであろう、短干渉オリゴヌクレオチド配列を含む。このような分子は、２型糖尿病の処置について記載されている。
【００６２】
本明細書において、「リガンド」という用語は、生物学的目的を果たすために、生体分子に結合することができ、生体分子と複合体を形成することができる、任意の物質を意味する。この用語のある意味において、リガンドは、分子間力、例えば、イオン結合、水素結合、及びファンデルワールスにより、ターゲットタンパク質上の部位に結合するシグナルトリガー分子である。リガンドの前記生体分子との会合は、通常、可逆的である。天然のリガンドのその対応物であるレセプターへの結合は、レセプタータンパク質のコンホーメーションを変化させてもよいし、又は、変化させなくてもよい。
【００６３】
本発明のタンパク質のリガンドコンポーネントは、抗体又はそのフラグメントであることができる。
【００６４】
本明細書において、「抗体」という用語は、生殖系免疫グロブリン配列から得られるタンパク質を意味する。同タンパク質は、抗原又はその一部に特異的に結合することができる。抗体という用語は、任意のクラス（又はアイソタイプ）の全長抗体を含む。同クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＹである。抗原又はその一部に特異的に結合する抗体は、その抗原又はその一部に排他的に結合してもよいし、又は、限定された数の対応抗原又はそれらの一部に結合してもよい。
【００６５】
天然の全長抗体は、通常、少なくとも４つのペプチド鎖：ジスルフィド結合により連結されている２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。一部の場合には、天然の抗体は、ラクダ科において見出された重鎖のみの抗体（ＶＨＨフラグメント）及び軟骨魚類において見出されたＩｇＮＡＲの場合におけるように、４つ未満の鎖を含む。特定の薬学的関心の免疫グロブリンの１つのクラスは、ＩｇＧである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、その重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に細分することができる。軽鎖は、その配列組成の差に基づいて、２種類の鎖、カッパー及びラムダ鎖に分けることができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合により相互に連結された２つの重鎖と、２つの軽鎖（それぞれジスルフィド結合により重鎖に付着）とから構成される。ＩｇＧ重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、最大３つの重鎖定常（ＣＨ）領域：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３とを含むことができる。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含むことができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変性領域に更に分割することができる。超可変性領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨｖＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域により分断されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、典型的には、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、下記順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で配列される。重鎖及び軽鎖の超可変領域を有する可変ドメインは、抗原と相互作用することができる結合ドメインを形成する。一方、抗体の定常領域は、ホスト組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。同ホスト組織又は因子は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃレセプター、及び、古典的な補体系のＣ１複合体の第１補体（Ｃ１ｑ）を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であることができる。その意味において、モノクローナル抗体は、１つのＢ細胞から発現され、又は、Ｂ細胞のクローン集団により発現された、固有の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列のセットを表わす。本発明の抗体は、当業者に公知の種々の方法を使用して生成し、精製することができる。例えば、抗体は、ハイブリドーマ細胞から生成することができる。抗体は、Ｂ細胞増殖により生成することができる。抗体又はそのフラグメントは、哺乳類若しくは微生物発現系において、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によりリコンビナントに発現させることができる。また、抗体又はそのフラグメントは、細胞表面結合分子として、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、又はリボソームもしくはｍＲＮＡディスプレイによっても、リコンビナントに発現させることができる。生成後に、抗体は、グルカゴンに対する結合性について、スクリーニングされてもよい。
【００６７】
本発明の抗体は、単離されていてもよい。「単離された抗体」という用語は、環境中の他の成分から分離され、及び／又は、回収されている抗体を意味する。同環境中において、同抗体が生成され、及び／又は、それが生成された環境中に存在する成分の混合物から精製される。
【００６８】
抗体の特定の抗原結合フラグメントは、抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントにより行うことができる場合、本発明の文脈に適切であることができる。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原、例えば、グルカゴン又は本明細書で記載された別のターゲット分子に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）Ｓ、Ｆｖ（典型的には、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Bird et al., Science 1988; 242:42S-426；及びHuston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883を参照のこと）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的には、ＶＨ及びＣＨＩドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）フラグメント；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；１つのＶＨ及び１つのＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパーボディ（例えば、Ill et al.. Protein Eng 1997;10:949-57を参照のこと）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的なパラトープを含む。この場合、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基もしくはポリペプチドは、機能的な抗体フラグメントを形成するために、互いに会合し、又は、連結していることができる。種々の種類の抗体フラグメントが、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136；国際公開公報第２００５０４０２１９号ならびに米国特許出願公開公報第２００５０２３８６４６号及び同第２００２０１６１２０１号に記載され、又は、レビューされている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができる。フラグメントは、インタクトな抗体と同じ方法において、有用性についてスクリーニングすることができる。
【００６９】
「Ｆａｂ」及び「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含めた抗体の「Ｆａｂフラグメント」は、前記抗体から、抗体の重鎖を連結させるヒンジシステイン残基のＮ末端又はＣ末端側のヒンジ領域における重鎖の開裂により得られる。「Ｆａｂ」フラグメントは、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインと、重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、そのヒンジシステインにより全体的に共有結合している、一対の「Ｆａｂ」フラグメントを含む。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントから、Ｆ（ａｂ’）２中の重鎖を連結しているヒンジジスルフィド結合の開裂により、形式的に得られる。抗体フラグメントのジスルフィド結合以外の化学カップリングも、当技術分野において公知である。Ｆａｂフラグメントは、潜在的により低い親和性で、その抗原に結合する親抗体の能力を保持している。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、二価結合することができ、一方、Ｆａｂ及びＦａｂ’フラグメントは、一価で結合することができる。一般的には、Ｆａｂフラグメントは、定常ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、すなわち、Ｆｃレセプターとの相互作用が生じるであろうＦｃ部を欠いている。このため、Ｆａｂフラグメントは、一般的には、エフェクター機能を欠いている。Ｆａｂフラグメントは、当技術分野において公知の方法により、例えば、パパインを使用してＦａｂを得る抗体の酵素開裂、又は、ペプシンを使用してＦ（ａｂ’）２を得る抗体の酵素開裂のいずれかにより生成することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２を含めたＦａｂフラグメントは、当業者に周知の技術を使用してリコンビナントに生成することができる。
【００７０】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体フラグメントであり、一般的には、天然に共有結合することができる会合、例えば、一本鎖可変ドメインフラグメント（ｓｃＦｖ）において、１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインの二量体を含む。この構成では、Ｆｖフラグメントは、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を画定するものである。まとめると、６つの超可変領域又はそれらの部分集合は、抗体に抗原結合特異性を付与する。ただし、抗原に特異的な３つの超過片領域のみを含む１つの可変ドメインであっても、抗原を認識し、抗原に結合する能力を保持することができるが、通常、結合部位全体より親和性が低い（Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996）。例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）のみを有する天然のラクダ科抗体は、抗原に結合することができる（Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002；Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655）。
【００７１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、１つのポリペプチド鎖に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することができるポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖのレビューについては、Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照のこと。
【００７２】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを意味する。同フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬ）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つの可変ドメイン間を対合するには短過ぎるリンカーを使用することにより、可変ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合され、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開公報第９３／１１１６１号；及びHollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448に、より完全に記載されている。
【００７３】
「直線抗体」という表現は、Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062に記載された抗体を意味する。簡潔に、これらの抗体は、互いに相補的な軽鎖ポリペプチドを有し、一対の抗原結合領域を形成している、一対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含有する。直線抗体は、二重特異性又は単特異性であることができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「モノボディ」という用語は、重鎖可変ドメインを有し、軽鎖可変ドメインを有さない抗原結合分子を意味する。モノボディは、軽鎖の非存在下において、抗原に結合することができ、典型的には、３つの超可変領域、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と指定されるＣＤＲを有する。重鎖ＩｇＧモノボディは、ジスルフィド結合により連結している、２つの重鎖抗原結合分子を有する。重鎖可変ドメインは、１つ以上の超可変領域、好ましくは、ＣＤＲＨ３又はＨＶＬ−Ｈ３領域を含む。
【００７５】
抗体フラグメントは、従来のリコンビナント又はたんぱく質操作技術を使用して得ることができる。このフラグメントは、グルカゴンに対する結合性について、又は、別の機能について、インタクトな抗体と同じ方法においてスクリーニングすることができる。
【００７６】
本発明の抗体フラグメントは、トランケーションにより、例えば、ポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去により調製することができる。また、フラグメントは、１つ以上の内部欠失によっても生成することができる。
【００７７】
本発明の抗体は、Ｇｌｕ００１抗体のフラグメント、Ｇｌｕ００１抗体、もしくは各種これらの抗体のいずれか１つでもよく、又は、これらを含んでもよい。本発明の抗体は、これらの抗体もしくはその変異体の内の１つの抗原結合部でもよく、又は、これらを含んでもよい。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体もしくはその変異体の内の１つのＦａｂフラグメントでもよく、又は、これらの抗体もしくはその変異体の内の１つから得られた一本鎖抗体でもよい。
【００７８】
本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることができる。本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部及び／又はＣＤＲ領域の少なくとも一部がヒト生殖系免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する抗体を含むことを意図している（例えば、ヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有することができる）。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も、ヒト生殖系免疫グロブリン配列から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、又は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異により導入される変異）を含むことができる。
【００７９】
このようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であることができる。このようなヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られ、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有し、不死化細胞に融合されているＢ細胞を含むハイブリドーマにより生成することができる。
【００８０】
ヒト抗体は、ヒト生殖系配列の選択に基づく配列ライブラリから単離することができ、天然及び合成の配列多様性により更に多様化することができる。
【００８１】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化、続けて、リンパ球のエプスタインバーウイルスによるトランスフォーメーションにより調製することができる。
【００８２】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変型、例えば、抗体と別の作用剤又は抗体とのコンジュゲートを意味する。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンから得られた配列（ＣＤＲ領域又はその一部）を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を意味する。このため、ヒト化抗体は、少なくともレシピエントの超可変領域からの残基が非ヒト種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類からの抗体（ドナー抗体）の超可変領域からの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。同ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、配列組成、及び機能性を有する。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。このような改変の例は、１つ以上のいわゆる逆突然変異の導入である。同逆突然変異は、典型的には、ドナー抗体から得られたアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に公知のリコンビナント技術を使用して行うことができる（例えば、Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. C. Loを参照のこと）。軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインに適したヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列又は構造の相同性により特定することができる。あるいは、固定されたレシピエントフレームワークを、例えば、構造の知識、生理学的及び生化学的特性に基づいて使用することができる。レシピエントフレームワークは、成熟抗体配列から得られた生殖系であることができる。ドナー抗体からのＣＤＲ領域は、ＣＤＲグラフト化により移すことができる。ＣＤＲグラフト化されたヒト化抗体は、例えば、親和性、機能性、及び生理学的特性について、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入（逆突然変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を有する、重要なフレームワーク位置の特定により、更に最適化することができる。ドナー抗体由来の逆突然変異に加えて、ヒト化抗体は、ＣＤＲ又はフレームワーク領域への生殖系残基の導入、免疫原性エピトープの削除、部位特異的突然変異誘発、親和性成熟等により操作することができる。
【００８４】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能を更に精緻にさせる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインを含むであろう。同可変ドメインにおいて、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、同可変ドメインにおいて、全て又は実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。また、ヒト化抗体は、場合により、少なくとも、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を含むことができる。
【００８５】
「ヒト化抗体誘導体」という用語は、ヒト化抗体の任意の改変型、例えば、抗体と別の作用剤又は抗体とのコンジュゲートを意味する。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が、典型的には、異なる種に由来する免疫グロブリン可変領域及び定常領域の遺伝子から遺伝子操作により構築されている抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントが、ヒト定常領域に連結していることができる。
【００８７】
「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生成するために、免疫コンピテントな脊椎動物の免疫化に使用される分子実体を意味する。本明細書において、Ａｇは、より広く名づけられ、一般的には、Ａｂにより特異的に認識されるターゲット分子を含むことを意図している。このため、抗原は、免疫化プロセス又はＡｂを生成するのに使用される他のプロセス、例えば、ファージディスプレイに使用される分子のフラグメント又は模倣物を含む。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、「抗原結合ポリペプチド」、例えば、抗体（Ａｂ）とその対応する抗原（Ａｇ）との間での分子相互作用に関して定義される。一般的には、「エピトープ」は、Ａｂが特異的に結合するＡｇの区域又は領域、すなわち、Ａｂと物理的に接触する区域又は領域を意味する。物理的な接触は、Ａｂ及びＡｇ分子中の原子についての種々の評価基準（例えば、距離カットオフ２〜６Å、例えば、３Å、例えば、４Å、例えば、５Å、又は、溶媒アクセシビリティ）を使用して定義することができる。タンパク質エピトープは、Ａｂへの結合に直接関与するＡｇにおけるアミノ酸残基（エピトープの免疫ドミナントコンポーネントとも呼ばれる）、及び、Ａｂにより効果的にブロックされるＡｇのアミノ酸残基等の結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、すなわち、Ａｂの「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内のアミノ酸残基を含むことができる。
【００８９】
本明細書において、エピトープという用語は、特に断りない限り、本発明に基づく抗グルカゴン抗体又は別のグルカゴン特異的作用剤に特異的に結合するグルカゴンの任意の特定の領域における結合領域の両方の種類を含む。グルカゴンは、数多くの種類のエピトープを含むことができる。同エピトープは、（１）直線ペプチドエピトープ、（２）成熟グルカゴンのコンホーメーション中で互いに近くに位置する１つ以上の非連続アミノ酸からなるコンホーメーショナルエピトープ、及び（３）グルカゴンに共有結合する分子構造、例えば、炭水化物基の全体又は一部のいずれかからなる翻訳後エピトープを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
所定の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）対についてのエピトープを、種々のレベルの詳しさで、各種の実験的及びコンピュータ上のエピトープマッピング法を使用して説明することができ、特徴付けることができる。実験的方法は、突然変異誘発、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素重水素交換質量分光法（ＨＸ−ＭＳ）、及び種々の競合結合法；当技術分野において公知の方法を含む。各方法は固有の原理によるため、エピトープの説明は、決定される方法に密接に関連付けられる。このため、利用されるエピトープマッピング法に応じて、所定のＡｂ／Ａｇ対についてのエピトープは、異なって説明される場合がある。その最も詳細なレベルにおいて、ＡｇとＡｂとの間の相互作用についてのエピトープは、Ａｇ−Ａｂ相互作用に存在する原子接触を画定する空間配位、及び、結合熱力学に対するその相対的な寄与についての情報により説明することができる。より低いレベルの詳しさにおいて、エピトープは、ＡｇとＡｂとの間の原子接触を画定する空間配位により特徴付けることができる。更により低いレベルの詳しさにおいて、エピトープは、具体的な評価基準、例えば、Ａｂ：Ａｇ複合体中の原子間距離又は同原子の溶媒アクセシビリティにより定義されるように含むアミノ酸残基により特徴付けることができる。更により低いレベルの詳しさにおいて、エピトープは、例えば、他のＡｂとの競合結合による機能により特徴付けることができる。また、エピトープは、別のアミノ酸による置換がＡｂとＡｇとの間の相互作用の特徴を変化させるであろうアミノ酸残基を含むように、より全体的に定義することができる。
【００９１】
使用されるエピトープマッピング法に応じて、エピトープの説明及び定義が異なるレベルの詳しさで得られるという事実から、同じＡｇ上の異なるＡｂについてのエピトープ比較は、異なるレベルの詳しさで同様に行うことができる。
【００９２】
一実施態様において、ＧＬＵ００１は、機能的なベータ細胞集第の最大再分化を得るために、ＧＡＢＡと共配合される。
【００９３】
更なる実施態様では、アルファ細胞集団増加を刺激するＧｌｕＲシグナル伝達を妨害する他の化合物（例えば、グルカゴンレセプターアンタゴニスト、グルカゴンレセプターをターゲットにする阻害性ｓｉＲＮＡ）が、ＧＡＢＡレセプターアゴニストと共配合されるであろう。
【００９４】
一実施態様において、本発明は、アルファ細胞の再分化及びその後のベータ細胞変換について当技術分野において公知の方法と比較して、機能的なベータ細胞集団の促進的な回復法を提供する。
【００９５】
一実施態様において、本発明は、グルカゴンレベルの所望の低下を提供する。
【００９６】
一実施態様において、本発明は、真正の膵臓ベータ細胞による十分な内因性インスリン生成を提供する。
【００９７】
一実施態様において、本発明は、より速いアルファ細胞再分化を提供する。より速いアルファ細胞再分化、及びこれにより、より速いベータ様細胞のベータ細胞への新生の可能性は、正常な血糖に戻すのを速め、これにより、副作用及び合併症を減少させるのに望ましい。また、より速いアルファ細胞再分化は、糖尿病の強力な治癒にも関連する。
【００９８】
グルカゴンシグナル伝達の除去は、新たなアルファ細胞の生成を向上させる。ＧＡＢＡレセプターアゴニスト媒介性のアルファからベータ細胞への変換を低下したグルカゴンシグナル伝達と組み合わせた場合、ベータ細胞再分化はかなり増加される。アルファからベータ細胞への変換（ＧＡＢＡレセプターアゴニスト）とより効率的なアルファ細胞補充（グルカゴンシグナル伝達の除去による）との組み合わせられた原理により、強力で、より効率的な糖尿病治療が提供される。
【００９９】
驚くべきことに、ＧＡＢＡとＧＬＵ００１との組み合わせにより、ベータ様細胞新生の顕著な改善及びグルカゴンレベルの非常に望ましい低下が可能となる。実際に、ＧＬＵ００１は、効率的なグルカゴン枯渇及び増加したアルファ細胞集団を促進する。このような過形成のアルファ細胞は、ＧＡＢＡの投与に基づいてベータ様細胞に変換される。このため、ベータ様細胞新生は、ＧＡＢＡのみの投与と比較して、この組み合わせを使用して劇的に速められるため、糖尿病治療に関して、大きな関心の対象である。
【０１００】
実施態様
１．  アルファ細胞集団を、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストと、グルカゴン中和モノクローナル抗体又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせで接触させる工程を含む、
膵臓ベータ細胞集団を製造するための方法。
【０１０１】
２．  グルカゴン中和モノクローナル抗体が、グルカゴンに結合する、実施態様１記載の方法。
【０１０２】
３．  前記グルカゴン中和モノクローナル抗体が、ＧＬＵ００１である、実施態様１記載の方法。
【０１０３】
４．  グルカゴン中和モノクローナル抗体が、グルカゴンに対する結合について、ＧＬＵ００１と競合する、実施態様１記載の方法。
【０１０４】
５．  グルカゴン中和モノクローナル抗体が、ＧＬＵ００１と同じエピトープに結合する、実施態様１記載の方法。
【０１０５】
６．  前記アルファ細胞集団レギュレーション化合物が、分泌因子、例えば、肝臓由来の因子である、実施態様１記載の方法。
【０１０６】
７．  前記アルファ細胞集団レギュレーション化合物が、グルカゴンレセプターアンタゴニストである、実施態様１記載の方法。
【０１０７】
８．  ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストを、モノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせで含む、
医薬調製物（組み合わせもしくは医薬組成物、又はキット）。
【０１０８】
９．  糖尿病の処置に使用するための、実施態様８記載の医薬調製物。
【０１０９】
１０．  膵臓ベータ細胞集団を製造するための、グルカゴン中和モノクローナル抗体との組み合わせにおける、ＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストの使用。
【０１１０】
１１．  中和モノクローナル抗体が、Ｇｌｕ００１である、実施態様１０記載の使用。
【０１１１】
１２．  ベータ細胞集団の増加を必要とする患者において、ベータ細胞集団を増加させるための方法であって、前記患者に、有効量のＧＡＢＡ又はＧＡＢＡレセプターアゴニストとモノクローナル抗体ＧＬＵ００１又は他のアルファ細胞集団レギュレーション化合物との組み合わせとの組み合わせを投与する工程を含む、
方法。
【実施例】
【０１１２】
略称の列記
ＡｒＸ：ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ関連ホメオボックス遺伝子
ＢｒｄＵ：ブロモデオキシウリジン
ＧＡＢＡ：ガンマ−アミノ酪酸
ＧｌｕＲ：グルカゴンレセプター
Ｐａｘ４：ペアードボックス遺伝子４
ｓｉＲＮＡ：短干渉ＲＮＡ
Ｐｄｘ１：膵臓及び十二指腸ホメオボックス１
ＭａｆＡ：転写因子ＭａｆＡ
Ｎｋｘ６：ＮＫ６ホメオボックス１
ＰＣ２：プロプロテインコンベルターゼ２
【０１１３】
全体的な方法
全てのマウスを飼育し、Taconics（Ry, Denmark）から輸送した。マウスを、実験の間、Animal Unit（Novo Nordisk, Malov, Denmark）又はValrose facility（Nice-FR）のいずれかにおいて維持した。動物を維持し、実験を、デンマークの法律及びNovo Nordisk A/Sの拘束基準に従って、又はフランスの倫理条例に従って行った。
【０１１４】
マウス系統
ＮＭＲＩ、Ｃ５７Ｂｌ６、及び１２９ＳＶマウスは、Naval Medical Research Institute（NMRI）及びJackson Laboratoryから得た。実験に使用されるマウスは、１〜４８週齢とした。
【０１１５】
血中グルコース測定
全ての実験において、マウスを、自由に飼育した。血液を、マウスの尾の先端から、１０μlガラス管内に収集し、グルコース／ラクタート系溶液（EKF-diagnostic, 0201-0002-024）に移し、BIOSEN S_line（EKF-diagnostic）で分析した。BIOSEN S_line装置は、酵素電流測定分析により、グルコース濃度を測定する。
【０１１６】
グルカゴン投与
GlucaGen（登録商標） HypoKit（Novo Nordisk）からのグルカゴンを、滅菌Ｈ２Ｏに溶解させ、無菌の０．９％ 生理食塩水（DAK）中で希釈した。グルカゴン溶液を、マウスの尾静脈に注入した。濃度２．８６pmol/g bwを使用した。
【０１１７】
グルカゴン測定
全ての実験において、マウスを、自由に飼育した。血液を、舌下静脈から収集し、遠心分離して、血漿を得た。グルカゴンレベルを、Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay（LOCI）を使用して測定した。
【０１１８】
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）による分裂細胞のラベリング
ＢｒｄＵは、チミジンの合成ヌクレオシド類似物である。ＢｒｄＵは、細胞がＤＮＡを合成する際に取り込まれる。その後、ＢｒｄＵは、抗体により検出することができる。ＢｒｄＵ（MP Biomedicals, #100171）を、飲料水（０．９mg/ml）により、マウスに投与した。ＢｒｄＵを光から保護するために、ボトルを、アルミニウムホイルにより覆った。この水を、１週間に２回交換した。
【０１１９】
増殖のための組織の処理（ＩＨＣ）
マウスを、頚椎脱臼により殺処分した。膵臓を、素早く取り出し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、４％ ＰＦＡ中において、４℃で８時間固定した。その後、膵臓を、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の３０％ スクロースにおいて一晩インキュベーションし、Tissue-Tek O.C.T Compound（Sakura Finetek）中に包埋し、クリオスタットにおいて、１０μm 切片にカットした。抗原賦活化を、ＫＩ−６７（クエン酸バッファー  ｐＨ＝６．０、マイクロ波）及びＢｒｄＵ（クエン酸バッファー  ｐＨ＝６．０、マイクロ波及び２M ＨＣｌ、３０分間）の検出に使用した。切片を、０．５％ ＴＮＢブロッキングバッファー（PerkinElmer #NEL704A001KT）中において、少なくとも１時間ブロッキングした。この後、（０．５％ ＴＮＢブロッキングバッファー中で希釈された）抗体を加えた。切片を、一次抗体と共に十分にインキュベーションし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、二次抗体と共に、３０分〜１時間インキュベーションした。最後に、切片を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、グリセロール系封入剤（KPL #71-00-16）に載せた。
【０１２０】
増殖に使用された抗体
免疫組織化学は、生体組織中の抗原に特異的に結合する抗体の原理を利用している。蛍光体に連結させた二次抗体を使用することにより、抗原は、組織中に位置させることができる。抗体によるマルチラベリング実験には、種々のホストから得られた一次抗体と、このホストからの免疫グロブリンに特異的に反応する二次抗体との利用可能性が必要である。一次抗体には、マウス抗Ｎｋｘ６．１（１：２５０、Abcore #F55A10）、ヒツジ抗ＢｒｄＵ（１：５００、Abcam #ab1893-125）、モルモット抗グルカゴン（１：２０００、Millipore #4031-01F）、ヤギ抗Ｐｄｘ１（１：１５０００、Abcore #2027）、マウス抗ＫＩ−６７（１：５００、Pharmingen #36521A）、マウス抗ソマトスタチン（１：１００、BioLabs #SOM-018）、ウサギ抗ｈ−ソマトスタチン（１：１０００  Dako #A566）、ウサギ抗膵臓ポリペプチド（１：１００  DAKO #A619）、モルモット抗インスリン（１：５００  Abcam #ab7842）、マウス抗インスリン（１：１００  Biolaps #HUI-18）を使用した。二次抗体には、Ｃｙ２−ロバ抗マウス（#715-225-150）、Ｃｙ３−ロバ抗ヒツジ（#713-165-147）、Ｃｙ５−ロバ抗モルモット（#706-175-148）、Ｃｙ３−ロバ抗ヤギ（#705-165-147）、Ｃｙ２−ロバ抗モルモット（#706-225-148）、Ｃｙ５−ロバ抗マウス（#715-175-151）、Ｃｙ２−ロバ抗ウサギ（#711-225-152）、Ｃｙ３−ロバ抗ウサギ（#711-166-152）を使用した。核を、ＤＡＰＩにより可視化した。ＤＡＰＩは、ＤＮＡに結合する蛍光染色である（３５８nmでの励起及び４６１nmでの蛍光）である。ＤＡＰＩ（０．５％ ＴＮＢブロッキングバッファー中に１：１０００希釈されたストック）を、二次抗体と共に加えた。管を、Dolichos Biflorusアグルチニン（ＤＢＡ）により特定した。
【０１２１】
共焦点レーザー走査顕微観察（ＣＬＳＭ）
スライドを、LSM 510 META Axio Imager（Zeiss）においてスキャンした。蛍光体励起を、アルゴンレーザー（４８８nm、レーザー出力５０％）、ヘリウム／ネオンレーザー（５４３nm）、及びヘリウム／ネオンレーザー（６３３nm）を取り付けたLSM510レーザーモジュールにより行った。Plan-Neofluar１０×／０．３、２５／４０×／１．３、又は６３×／１．４対物レンズを使用した。発せられた蛍光を、ＢＰ５０５〜５３０nm（Ｃｙ２）、ＬＰ４２０nm（ＤＡＰＩ）、及びＬＰ５６０nmフィルタ（Ｃｙ３）を使用して検出した。Ｃｙ５を、６３６〜７５４nmに設定されたLSM510 METAモジュールにより記録した。蛍光を、正方形の８ビット画像（１０２４×１０２４ピクセル）として記録した。ピクセル時間３．２０μsを使用した。
【０１２２】
アルファ／ベータ細胞集団算出のための組織の処理（ＩＨＣ）
マウスを、頸椎脱臼により殺処分した。消化管領域を、素早く取り出し、１０％ 中性緩衝ホルマリン中において、室温で２４時間固定した。その後、膵臓を取り出し、メッシュバッグ中にソーセージを押し進め、パラフィンに加工した。最後に、膵臓を、４つのスラブに切断し、その後、これらのスラブを、パラフィンブロック内に包埋した。ブロックを、ミクロトームで３μm 切片にカットした。
【０１２３】
免疫組織化学染色
切片を、水に対してキシレン及びエタノールを浸透させて脱脂した。抗原を、マイクロ波加熱により、ＴＥＧバッファー（AMPQ17020, Ampliqon）中において、２０分間賦活化させた。その後、スライドを、水で洗浄した。偽陽性染色シグナルを回避するために、複数のブロッキング工程を適用した。内因性過酸化水素を、切片と１％ 過酸化水素とを１５分間インキュベーションし、続けて、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄することによりブロッキングした。内因性ビオチンを、切片とアビジン（X0590, DAKO）とを１０分間インキュベーションし、続けて、ＴＢＳＴと洗浄することによりブロッキングした。内因性アビジンを、切片とビオチン（X0590, DAKO）とを１０分間インキュベーションし、続けて、ＴＢＳＴで洗浄することによりブロッキングした。最後に、切片を、０．０５％ ＴＮＢバッファー（Perkin Elmer）により６０分間ブロッキングした。同バッファーは、抗体カクテルに使用されるバッファーである。ついで、モルモット抗インスリン（１：７５、A0564, DAKO）、ウサギ抗Ｎｋｘ６．１（１：２０００、PA5-23070, Thermo Scientific）、及びマウス抗グルカゴン（１：７８００、Ｇｌｕ−００１、Novo Nordisk A/S）を、０．０５％ ＴＮＢバッファー中で希釈し、切片に６０分間加えた。その後、切片を、ＴＢＳＴ中で洗浄し、二次抗体：ロバ抗モルモット−Ｃｙ２（１：１００、706-225-148, Jackson ImmunoResearch）、ロバ抗マウス−Ｃｙ５（１：１００、715-175-151, Jackson ImmunoResearch）、及びロバ抗ウサギ−ビオチン（１：２００、711-065152, Jackson ImmunoResearch）を、ＤＡＰＩ核対比染色（１：１０００、H3569, Invitrogen）と共に混合し、３０分間アプライした。再度、切片を、ＴＢＳＴ中で洗浄した。０．０５％ ＴＮＢバッファー（１：５００、NFL701A001KT, Perkin Elmer）中に希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰを、１５分間アプライした。その後、切片を、ＴＢＳＴ中で洗浄し、ＴＳＡ−Ｃｙ３（１：１００、NFL701A001KT, Perkin Elmer）を、１５分間アプライした。最後に、切片を、ＴＢＳＴで洗浄し、蛍光媒体（S3023, DAKO）中に載せ、カバーガラスを乗せた。
【０１２４】
画像分析
染色された膵臓切片を、VS120 Olympusスライドスキャナにおいて画像化した。画像を、閾値系アルゴリズムによるVIS（visioPharm）において分析した。シグナル強度が１０００以上に達した場合、ＤＡＰＩは、陽性であると考えられた。Ｃｙ２シグナル強度が１５００以上に達した場合、インスリン染色は、陽性であると考えられた。Ｃｙ３シグナル強度が１０００以上に達した場合、Ｎｋｘ６．１染色は、陽性であると考えられた。Ｃｙ５シグナル強度が７００以上に達した場合、グルカゴン染色は、陽性であると考えられた。ベータ細胞を、核Ｎｋｘ６．１発現及び細胞質インスリン発現を有する細胞として定義した。アルファ細胞を、ベータ細胞の近くで、細胞質グルカゴン発現を有する細胞として定義した。アルファ及びベータ細胞の面積を、手作業で決定された閾値及び定義に基づいて、ソフトウェアにより算出した。切片組織における総組織面積を、陽性のＤＡＰＩ核の面積に基づいて算出した。アルファ細胞集団を、アルファ細胞面積／総組織面積として算出した。ベータ細胞面積を、ベータ細胞面積／総組織面積として算出した。最後に、データを、媒体対照群に対して正規化した。
【０１２５】
定量分析
全ての統計学的分析を、Prismにおいて、スチューデントｔ検定及びＡＮＯＶＡを使用して行った。
【０１２６】
実施例１：ＧＡＢＡによるアルファ細胞のベータ細胞への変換
ＧＡＢＡ投与
ＧＡＢＡ（Sigma）を、新鮮に調製された（マウス体重４０ｇ当たりに）５０〜５００μM 溶液の腹腔内注入により、１週間に１回投与した。
【０１２７】
結果
国際公開公報第１４０４８７８８号において言及されたように、ベータ様細胞数の進行的な増加が、ＧＡＢＡ投与に基づいて認められる。系統トレースから、このような過形成細胞は、一旦発現されたグルカゴンを有する細胞から得られることが示される。重要なことに、このような新たに形成されたベータ様細胞は機能的であり、ベータ細胞の化学的切除後に、膵島を再配置させることができる。ついで、当該動物は、正常な平均寿命を表わす。
【０１２８】
実施例２：グルカゴンシグナル伝達の薬理学的阻害
注入用抗体
クラスＩｇＧ１に属する２つのマウスモノクローナル抗体を、注入用に使用した。グルカゴンの中和用に、抗グルカゴン抗体を使用した（ＧＬＵ−００１、Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark）。抗２，４，６−トリニトロフェニル抗体（ａＴＮＰ、Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark）を、対照として使用した。この抗体は、（Brand et al., 1994）に記載されている。ＧＬＵ−００１（ＰＢＳ中の５．０mg/ml、０．０５％ アジ化物）は、０．４６EU/mgを含有した。ａＴＮＰ（ＰＢＳ中の１．４mg/ml、０．０５％ アジ化物）は、エンドトキシン精製後に、３．９EU/mgを含有した。抗体を、０．９％ 無菌生理食塩水（DAK）中で希釈し、マウスの尾静脈に注入した（４μg/g bw）。
【０１２９】
定量分析
全ての統計学的分析を、Excel（Microsoft）において行った。２つの群間の血中グルコースを比較するために、分散の差について試験するために、Ｆ検定を使用した。平均を比較するための独立したデータについて、スチューデントｔ検定を使用した。Ｐ値＜０．０５は、有意であると考えられた。１週間、対照抗体（ａＴＮＰ）を受けさせた４匹（メス３匹及びオス１匹）のマウスと、ＧＬＵ−００１を受けさせた４匹のマウス（メス３匹及びオス１匹）における増殖を分析した。Ｐｄｘ１．Ｎｋｘ６．１、又はグルカゴン陽性細胞の数を計測し、ＢｒｄＵ／ＫＩ−６７の存在又は不存在に従って分類した。各マウスから、２８０個超のα細胞及び９００個超のβ細胞を、ＢｒｄＵ取込みについて試験した。同様に、各マウスから、１４０個超のα細胞及び５００個超のβ細胞を、ＫＩ−６７発現について試験した。細胞を、離れた切片（１００μm超）から計測した。ＢｒｄＵ又はＫＩ−６７について陽性の細胞割合を算出した。分散の差について試験するために、Ｆ検定を使用し、平均を比較するための独立したデータについてスチューデントｔ検定を使用した。分散が等しいという帰無仮説をＦ検定が否定した場合、不等分散ｔ検定（ウェルチ検定）を、平均を比較するために使用した。Ｐ値＜０．０５は、有意であると考えられた。
【０１３０】
結果
ラットにおける以前の実験は、１時間にわたって膵臓から放出された１４倍超の量のグルカゴンに対応する外因性グルカゴン負荷を中和するために、抗ｇｃｇ抗体ＧＬＵ−００１をアプライしている。ＧＬＵ−００１の中和効果がマウスにおいて同様であったかどうかを試験するために、１２匹のマウスに、ＧＬＵ００１又はａＴＮＰのいずれかを注入し、その後に、外因性グルカゴンを投与した。対照抗体（ａＴＮＰ）で予め処置されたマウスの血中グルコースは、外因性グルカゴンに応答して、著しく増加した。初期値６．８±０．２mMと比較して、最大７．４±０．１mMが、注入後１５分で見出された。
【０１３１】
グルカゴンの作用は、ＧＬＵ−００１による事前処置により完全に除去された。ＧＬＵ−００１で予め処置されたマウスは、グルカゴン投与後の１５分での６．４±０．２mMと比較して、６．７±０．３mMの初期血中グルコース値を有した。
【０１３２】
ＧＬＵ−００１がＮＭＲＩマウス中における血中グルコースレベルを低下させることができる期間を決定するために、これらのマウスに、ＧＬＵ−００１又はａＴＮＰを注入した。血中グルコースを、２４時間毎に測定した。ＧＬＵ−００１投与により、自由に飼育されたマウスにおける血中グルコースは、注入後２４時間で有意（Ｐ＜０．００１）低下した。血中グルコースは、対照における６．９±０．１mMと比較して、ＧＬＵ−００１処置マウスにおいて、６．１±０．２mMであった。差異は、注入後４８時間では検出されなかった。
【０１３３】
ＧＬＵ−００１が注入後２４時間でも活性であったかどうかを試験するために、外因性グルカゴンを注入した。予想通り、血中グルコースは、外因性グルカゴンの注入前の対照と比較して、ＧＬＵ−００１処置マウスにおいて顕著に低下した。しかしながら、グルカゴン負荷に応答した差異は、４８時間後に観察されなかった。
【０１３４】
１週間でのグルカゴンシグナル伝達の免疫中和
２１匹のマウスに、ＧＬＵ−００１又はａＴＮＰ（対照）を、１週間注入した。血液サンプルを、抗体投与直前に採取した。血中グルコースレベルは一貫して、６日の間、ＧＬＵ−００１処置マウスについて、対照と比較して、有意に低下したことが見出された。マウスに、実験全体を通して飲料水中のＢｒｄＵを投与し、タモキシフェンを、１日目、３日目、及び５日目に経口投与した。マウス系統：Ｎｇｎ３ＣｒｅＥＲＴＭ；Ｒｏｓａ２６Ｒマウス（６ヶ月齢）。値は、平均±ＳＥとする。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照群（スチューデントｔ検定）。
【０１３５】
α細胞及びβ細胞中へのＢｒｄＵの取込み
誘引されたグルカゴンの損なわれたグルカゴンシグナル伝達によりアルファ細胞の再分化が誘引されたかどうかを決定するために、ＢｒｄＵ取込みを試験した。ＢｒｄＵは、新たに合成されたＤＮＡに取り込まれる、チミジンの合成ヌクレオシド類似体である。ＢｒｄＵを、マウスに、実験全体を通して飲料水により投与した。新たに複製された細胞を、抗ＢｒｄＵ抗体により検出した。アルファ細胞及びベータ細胞それぞれの有糸分裂指数を決定するために、ＢｒｄＵ染色を、抗ｇｃｇ及び抗Ｎｋｘ６．１との組み合わせにおいて行った。まとめると、１週間での内因性グルカゴンの中和により、α細胞におけるＢｒｄＵの取込みの顕著な増加が生じた。一方、ベータ細胞には影響しなかった。
【０１３６】
実施例２ａ：グルカゴン阻害に対する応答におけるグルカゴンレベルの向上及びアルファ細胞集団の増加
注入用抗体
クラスＩｇＧ１に属する１つのマウスモノクローナル抗体を、注入用に使用した。グルカゴンシグナル伝達の中和用に、抗グルカゴンレセプター抗体を使用した（Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark）。媒体であるＤＰＢＳ  ｐＨ７．４を、対照として使用した。ａＧＣＧＲ（ＤＰＢＳ  ｐＨ７．４中の６．６７mg/ml）は、エンドトキシン精製後に、０．１EU/mg未満を含有した。抗体を、ＤＰＢＳ  ｐＨ７．４中で希釈し、マウスの腹腔内に注入した（４mg/kg 体重）。
【０１３７】
結果
抗グルカゴンレセプター抗体（ａＧＣＧＲ）を使用するグルカゴンシグナル伝達の阻害が媒体処置マウスと比較してアルファ細胞増殖の増大をもたらすであろうかどうかを試験するために、１０匹のマウスに、媒体又はａＧＣＧＲのいずれかを、１〜８週間投与した。血漿中のグルカゴンの循環レベルの向上は、増大したアルファ細胞増殖のインジケータとして機能することができた。したがって、１週間の処置後、血漿を単離し、グルカゴンの循環レベルを定量した。これにより、ａＧＣＧＲ処置マウスが媒体処置マウスより顕著に高い血漿グルカゴンレベルを示すことが証明された。
【０１３８】
アルファ細胞集団
膵臓アルファ細胞集団を、免疫組織化学により評価した。膵臓を収集し、固定し、パラフィンに加工した。膵臓の４つの切片を、抗インスリン、抗Ｎｋｘ６．１、及び抗グルカゴンにより染色した。切片画像を、ソフトウェアVISにおいて分析した。ベータ細胞を、Ｎｋｘ６．１陽性核及びインスリン陽性細胞質を有する細胞として定義した。アルファ細胞を、ベータ細胞近くにおけるグルカゴン陽性細胞質を有する細胞として定義した。細胞集団を、アルファ細胞面積／総組織面積として算出した。結果から、１ヶ月のａＧＣＧＲ処置により、アルファ細胞過形成が誘引され、媒体対照と比較して、アルファ細胞集団の１１．６倍の増加が示された。ベータ細胞集団は、ａＧＣＧＲ処置により影響を受けなかった。
【０１３９】
実施例３：ＧＡＢＡとＧｌｕ００１とを組み合わせで処置されたマウスにおける、ベータ細胞集団の促進的な再分化
ＧＡＢＡとＧｌｕ００１との組み合わせがベータ細胞集団を増加させることができたかどうかを決定するために、野生型マウスに、１）生理食塩水、２）ＧＡＢＡ（５０μM/４０ｇ  マウスを毎日ＩＰ注入）、３）Ｇｌｕ００１（４mg/kgの毎日ＩＰ注入）、及び４）ＧＡＢＡ＋Ｇｌｕ００１を処置した。生理食塩水で処置されたマウスにおいて、ベータ細胞集団は正常であった。一方、ＧＡＢＡ処置により、アルファ細胞の犠牲において、ベータ細胞集団の予想された増加が誘引された。Ｇｌｕ００１で処置されたマウスにおいて、ベータ細胞集団は、生理食塩水で処置された動物のベータ細胞集団と同等であった。一方、アルファ細胞集団は、顕著に増加したようであった。一方、ＧＡＢＡとＧｌｕ００１との組み合わせで処置されたマウスは、全ての他の群と比較して、非常に大きな膵島を表わした。このことから、組み合わせ投与の相乗効果が示唆される。このことは、Ｇｌｕ００１により誘引されたアルファ細胞増殖の増大、その後の、ベータ細胞集団増加への移行を示している。
【０１４０】
増加したベータ細胞集団も耐糖性の作用を有したかどうかを試験するために、マウスを、ＯＧＴＴに供した。この実験において、ＧＡＢＡ処置マウスは、未処置マウスと比較して、改善されたグルコースクリアランスを表わした。一方、ＧＡＢＡ  Ｇｌｕ００１処置マウスは、グルコースクリアランスの更なる改善を示した。このことは、増加したベータ細胞集団が改善された機能をももたらすことを示唆している。
【０１４１】
本発明の特定の特徴が、本明細書において例示され、記載されているが、多くの改変、置換、変更、及び均等物が、当業者に現在明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲内にあるこのような全ての改変及び変更に及ぶことを意図していることを理解されたい。
【０１４２】
参考文献
【表１】
2018502084.tif 000003
【図１】
2018502084.tif 000004
【図２】
2018502084.tif 000005
【図３】
2018502084.tif 000006
【図４】
2018502084.tif 000007
【図５】
2018502084.tif 000008
【図６】
2018502084.tif 000009
【国際調査報告】
2018502084.tif 000010
2018502084.tif 000011
2018502084.tif 000012