(57)【要約】  本発明は、一般的に、水生種被験体において免疫応答を誘発する方法に関する。特に、免疫応答を誘導し、病原体を撃滅する被験体の能力を高めるための免疫調節薬組成物を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエント水生種被験体において免疫応答を誘発する方法であって、
ａ．有効量の免疫調節薬組成物を水生種被験体に投与すること（ここで、前記免疫調節薬組成物は、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフ、少なくとも１つの非免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む）
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記リポソームの送達媒体が、多重層ベシクル脂質および押出し処理された脂質からなる群より選択される脂質を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポソームの送達媒体が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロールからなる群より選択される脂質のペアを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節薬組成物がさらに生物学的薬剤を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与が感染性因子に対する曝露の前である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記投与が感染性因子に対する曝露の後である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫調節薬組成物が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的薬剤が、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌薬およびそれらいずれかの組合せからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記水生種被験体が魚である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記魚がサケである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記魚がナマズである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記魚がコイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記魚がマスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記魚がブリである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記魚がバスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が養殖で育てる魚である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
さらに薬学的に許容され得る担体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
養殖で育てる魚の生産の改善方法であって、前記魚に免疫調節薬組成物を投与すること（ここで、前記免疫調節薬組成物は、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列とカチオン性リポソームとを含む）を含む、前記方法。
【請求項１９】
養殖で育てる魚の生存性の改善方法であって、前記魚に免疫調節薬組成物を投与すること（ここで、前記免疫調節薬組成物は、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列とカチオン性リポソームとを含む）を含む、前記方法。
【請求項２０】
ワクチン抗原に対する免疫応答の改善方法であって、水生種のレシピエント被験体に免疫調節薬組成物を投与すること（ここで、前記免疫調節薬組成物は、少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列とカチオン性リポソームとを含む）を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、自然免疫を賦活することにより被験体において免疫応答を誘発する方法に関する。特に、水生種の構成員の自然免疫を賦活するために免疫調節薬組成物を使用する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、水生種被験体の自然免疫を調節するために免疫賦活性プラスミドを使用する方法に関する。免疫賦活性プラスミドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４またはその組合せの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：１の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：４の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：２の配列を含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：３の配列を含むものであり得る。
【０００３】
他の態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４またはその組合せの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、配列番号：４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：１の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：４の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：２の配列からなるものであり得る。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは配列番号：３の配列からなるものであり得る。
【０００４】
いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含んでいないものである。他の態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子でない選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含むものである。
【０００５】
また、本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列と薬学的に許容され得る担体を含む医薬用製剤に関する。
【０００６】
さらに、本発明は、カチオン性リポソーム送達媒体と本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を含む免疫調節薬組成物に関する。
【０００７】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を使用する方法に関する。好適な使用方法としては、水生種の被験体への治療的投与が挙げられる。かかる治療的投与には、被験体（１例または複数例）の予防的処置、発症予防処置および感染後処置が包含される。
【０００８】
本発明は、被験体において免疫応答を賦活または誘発する方法に関する。いくつかの態様では、該方法は、被験体に本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することにより被験体において免疫応答を賦活することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、被験体に本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を投与することにより被験体において免疫応答を賦活することを含むものである。
【０００９】
他の目的および特色は一部において自明であり、一部において本明細書に以下に示している。
【００１０】
以下の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の特定の態様のさらなる実例を示すために含めている。本発明は、この図面うちの１つ以上を、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細説明と合わせて参照することにより、よりよく理解され得よう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｐＭＢ７５．６プラスミド（配列番号：２）のマップを示す。
【図２】図２は、ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド（配列番号：１）のマップを示す。
【図３】図３は、ｐＬａｃＺ７５．６プラスミド（配列番号：４）のマップを示す。
【図４】図４は、魚用水槽Ｍ５の抗原刺激後の毎日の死亡率のパーセンテージをグラフで示したものである。
【図５】図５は、魚用水槽Ｍ６の抗原刺激後の毎日の死亡率のパーセンテージをグラフで示したものである。
【図６】図６は、ワクチン試験の各群の合算死亡率のカプランマイヤー生存曲線を示す。縦軸は特定の時点ＤＰＣ（横軸）における生存確率である。曲線の末端の十字形は打ち切りデータを表す（魚は２７ＤＰＣを超えて生存）。ＤＰＣ：抗原刺激後の日数。
【図７】図７は、ワクチン試験の１２の魚群間のペアワイズ比較を示し、連関している群（緑色の丸で表示したノードとして表す）は群間で有意差を示さない（α＝０．０５）。
【図８】図８は、デキストロース５％処置対照群と比較した場合のワクチン試験群の生存率の相対的パーセンテージをグラフで示したものである。比較は、実験終了時（ＲＰＳｅｎｄ）の累積死亡率間で行った。デキストロース５％群とその他の処置間の有意な累積死亡率の差（α＝０．０５）には＊を表示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に従い、レシピエント被験体において免疫応答を誘発し得る組成物ならびに使用方法が見出された。特に、本発明は、核酸組成物または免疫調節薬組成物およびその使用に関する。かかる免疫調節薬組成物は、水生種の構成員の免疫機構を調節するために使用され得ることが見出された。本発明は、微生物、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、カビ、真菌、酵母、寄生虫および当該技術分野で知られた他の微生物によって引き起こされる感染性疾患の処置および予防に特に有用である。該組成物および該免疫調節薬組成物の使用方法を以下により詳細に論考する。
【００１３】
Ｉ．組成物
本発明において有用な組成物、例えば本明細書に記載のものは、一般的に、感染性疾患の予防的治療薬、発症予防的治療薬または処置治療薬として使用され得るものである。かかる組成物を本明細書において免疫調節薬組成物と称する。免疫調節薬組成物は、少なくとも、レシピエント被験体において免疫応答を誘導し得る免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫応答は自然免疫応答である。いくつかの態様では、免疫応答は自然免疫応答と獲得免疫応答の組合せである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はリポソーム送達媒体もまた含むものであり得る。
【００１４】
Ａ．核酸
いくつかの態様では、本発明は、感染性疾患原因因子の処置または予防に有用な核酸分子に関する。本明細書に記載の核酸分子は免疫賦活性プラスミド内に、線状の二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、アミノ酸配列、リボ核酸（ＲＮＡ）またはその組合せとして含められ得る。いくつかの態様では、本発明は、免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列を含む核酸分子、ベクターおよび宿主細胞（インビトロ、インビボまたはエキソビボ）に関する。
【００１５】
本明細書に記載の核酸分子はＣｐＧモチーフの含有量が高い。かかるＣｐＧモチーフにより、免疫監視機構受容体、例えば特定のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ９およびＴＬＲ２１など）によって免疫賦活が誘導され得る。また、本明細書に記載の核酸分子は非免疫賦活性ＣｐＧモチーフも含んでいる。いくつかの態様では、該核酸分子は、ランダム核酸配列において予測されるＣｐＧモチーフの頻度と比べて約２〜２０％増のＣｐＧモチーフを含むものである。いくつかの態様では、該核酸分子は、ランダム核酸配列において予測されるＣｐＧモチーフの頻度と比べて約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２５、３０、３５、４０％またはそれ以上増のＣｐＧモチーフを含むものである。いくつかの態様では、該核酸分子は、ランダム核酸配列において予測されるＣｐＧモチーフの頻度と比べて約１０％増のＣｐＧモチーフを含むものである。いくつかの態様では、脊椎動物のＤＮＡと比べて１０倍を超える高含有量のＣｐＧモチーフが観察される。いくつかの態様では、該核酸分子は、脊椎動物のＤＮＡと比べて約２〜５０倍またはそれ以上のＣｐＧモチーフを含むものである。いくつかの態様では、該核酸分子は、脊椎動物のＤＮＡと比べて約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５倍またはそれ以上のＣｐＧモチーフを含むものである。
【００１６】
いくつかの態様では、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含んでいない免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列に関する。該プラスミドは、選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く欠いているものであり得る。例えば、本明細書に記載のｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く含んでいないものである。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列を配列番号：１に示す。
【００１７】
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長または機能性の選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードしている核酸配列を含んでいないものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含んでいないものである。例えば、該プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含んでいないものである。いくつかの態様では、本明細書に記載のプラスミドは好ましくは、免疫原をコードしていないものである。
【００１８】
いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子でない選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を含むものであり得る。例えば、本明細書に記載のｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドは、スクリーニング可能マーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を含むものである。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のマップを図３に示し、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列を配列番号：４として示す。図３に示すように、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６はｐＧＣＭＢ７５．６と類似しているが、ＬａｃＺスクリーニング可能マーカーを含んでいる。
【００１９】
ｐＭＢ７５．６（配列番号：２もしくは配列番号：３（ｐ  ＭＢ７５．６，ＡｓｃＩ制限部位を有する））、ｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号：１）またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号：４）プラスミドのヌクレオチド配列は、その免疫賦活特性に有意に有害に影響を及ぼさない一定の程度までは異なっていてもよいことは認識されよう。いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）を含むものである。
【００２０】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）を含むものである。
【００２１】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：２の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：２の配列を含むものである。
【００２２】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：３の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：３の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：３の配列を含むものである。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号：１）からなるものである。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくはｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号：４）からなるものである。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：２の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：２の配列からなるものである。
【００２６】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号：３の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである免疫賦活性プラスミドに関する。免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号：３の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなるものである。いくつかの態様では、免疫賦活性プラスミドは、より好ましくは配列番号：３の配列からなるものである。
【００２７】
本発明の別の重要な態様により、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４とハイブリダイズする核酸配列を含む、免疫応答を賦活し得る免疫賦活性ＤＮＡ配列または免疫賦活性プラスミドを提供する。好適な核酸配列としては、本発明の核酸と相同的である、実質的に類似している、または同一であるものが挙げられる。いくつかの態様では、相同核酸配列は、配列番号：１と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：４と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：２と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号：３と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％  ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列類似性を有するもの、またはそのそれぞれの相補配列である。配列類似性は、当該技術分野で知られたいくつかのアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載のＢＬＡＳＴを用いて計算され得る。該核酸は、遺伝コードの縮重のため上記の核酸と配列が異なる場合があり得る。一般に、参照配列は１８個のヌクレオチド、さらに通常は３０個以上のヌクレオチドであり、比較の目的のために該組成物の全核酸配列を含むものであってもよい。
【００２８】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が本明細書において想定される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションなどの条件が挙げられる。別の例は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性させ、断片化処理したサケ精子ＤＮＡの溶液中での一晩のインキュベーション後、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃での洗浄である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、上記の具体的な条件の少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％程度にストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件は当該技術分野で知られており、また、本発明の核酸のホモログを同定するためにも使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６，ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。
【００２９】
本明細書に記載のＤＮＡ分子の変異型ヌクレオチドもまた、該変異型が、本明細書に記載の自然免疫応答賦活能を維持している核酸配列を含むものである限り、使用され得る。かかる変異体のＤＮＡ配列は、通常、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっている。配列変更は置換、挿入、欠失またはその組合せであり得る。クローン化遺伝子の変異誘発のための手法は当該技術分野で知られている。部位特異的変異誘発のための方法は、Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２，１９９３；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３，１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９，１９８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８において知得され得、すべて、引用により本明細書に組み込まれる。要約すると、本発明は、被験体の自然免疫応答を賦活し得る核酸配列およびそのバリアントまたは変異型に関する。また、本発明は、本記載の核酸配列にコードされた中間ＲＮＡ、ならびにそれにコードされた任意の結果物のアミノ酸配列も包含している。
【００３０】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が配列番号１、２、３および４に示す配列と異なっている場合、該プラスミド内のＣｐＧジヌクレオチドは好ましくはインタクトなままである。あるいはまた、該プラスミドのヌクレオチド配列が、ＣｐＧジヌクレオチドが除去されているように改変される場合、該プラスミドの配列は、別の位置が、該プラスミド内のＣｐＧジヌクレオチドの総数が同じままであるように改変され得る。また、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列に既に存在しているものに加えてさらなるＣｐＧジヌクレオチドを該プラスミドに導入してもよい。したがって、例えば、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドは好ましくは、少なくとも約２００個、少なくとも約２２０個、少なくとも約２４０個、少なくとも約２６０個、少なくとも約２７０個、少なくとも約２７５個、少なくとも約２８０個、少なくとも約２８３個、少なくとも約２８５個、または少なくとも約２８８個のＣｐＧジヌクレオチドを含むものである。例えば、免疫賦活性プラスミドは２８３個のＣｐＧジヌクレオチドを含むものであり得る。
【００３１】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が本明細書に示した配列から変更する場合、該プラスミド内のＣｐＧモチーフの型は、結果的にもたらされるサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化が調節されるように変更される。例えば、特定の閾値の免疫賦活性プラスミド／ＤＮＡに応答性の特定のサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化を増大させるために免疫賦活性ＣｐＧモチーフの数を増加させてもよい。さらなる一例として、特定のサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子の活性化を低減させるため、および／または他のＤＮＡ監視機構分子の活性化を増大させるために非免疫賦活性ＣｐＧモチーフの数を増加させてもよい。
【００３２】
特に、本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列と薬学的に許容され得る担体を含む医薬用製剤に関する。
【００３３】
Ｂ．免疫調節薬
本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドとの使用のための好適な免疫調節薬組成物は、米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１Ａ１号および同第２０１３／０２９５１６７Ａ１号に記載されており、どちらの内容も引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
免疫調節薬組成物は、リポソーム送達媒体および本明細書に記載の少なくとも１種類の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を含むものである。
【００３５】
好適なリポソーム送達媒体の一例は、処置対象の被験体の組織に核酸分子を送達し得る脂質組成物を含むものである。リポソーム送達媒体は好ましくは、核酸分子および／または生物学的薬剤が送達されるのに充分な量の時間、被験体内で安定なままでいることができるものである。例えば、リポソーム送達媒体は、レシピエント被験体内で少なくとも約５分間、少なくとも約１時間または少なくとも約２４時間安定なものである。
【００３６】
本発明のリポソーム送達媒体の一例は、細胞内に核酸分子を送達するために細胞の原形質膜と融合し得る脂質組成物を含むものである。核酸分子が１種類以上のタンパク質をコードしているものである場合、該核酸：リポソーム複合体は、好ましくは少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）のタンパク質発現／ミリグラム（ｍｇ）全組織タンパク質／マイクログラム（μｇ）送達核酸のトランスフェクション効率を有するものである。例えば、核酸：リポソーム複合体のトランスフェクション効率は、少なくとも約１０ｐｇのタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸；または少なくとも約５０ｐｇのタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸であり得る。該複合体のトランスフェクション効率は１フェムトグラム（ｆｇ）のタンパク質発現／ｍｇ全組織タンパク質／μｇ送達核酸という低値であってもよいが、上記の量がより好ましい。
【００３７】
本発明の好ましいリポソーム送達媒体の一例は、直径が約１００〜５００ナノメートル（ｎｍ）のものである。例えば、リポソーム送達媒体は、直径が約１５０〜４５０ｎｍまたは約２００〜４００ｎｍのものであり得る。
【００３８】
好適なリポソームとしては、任意のリポソーム、例えば、当業者に知られた遺伝子送達方法に一般的に使用されているものなどが挙げられる。好ましいリポソーム送達媒体は多重層ベシクル（ＭＬＶ）脂質および押出し処理された脂質を含むものである。ＭＬＶの調製方法は当該技術分野でよく知られている。より好ましいリポソーム送達媒体は、ポリカチオン性脂質組成物（すなわち、カチオン性リポソーム）を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールとコンジュゲートさせたコレステロール骨格を有するリポソームを含むものである。例示的なカチオン性リポソーム組成物としては、限定されないが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とコレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）とコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）とコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とコレステロール、およびその組合せが挙げられる。送達媒体としての使用に最も好ましいリポソーム組成物の一例は、ＤＯＴＩＭとコレステロールを含むものである。
【００３９】
好適な核酸分子としては、本明細書に記載の任意の免疫賦活性プラスミドが挙げられる。コード核酸配列は、タンパク質またはペプチドの少なくとも一部分をコードしているものであるが、非コード配列は、タンパク質またはペプチドのいずれの部分もコードしていないものである。本発明によれば、「非コード」核酸は、転写単位の調節領域、例えばプロモーター領域を含んでいてもよい。用語「空ベクター」は、用語「非コード」と互換的に使用される場合があり得、特に、タンパク質コード部分がない核酸配列、例えば、遺伝子挿入配列を有しないプラスミドベクターをいう。本明細書に記載のプラスミドにコードされたタンパク質の発現は免疫応答の誘導に必要とされない；したがって、該プラスミドに、転写制御配列に作動可能に連結されたなんらのコード配列を含める必要はない。しかしながら、該組成物に、免疫原および／またはサイトカインをコードしている核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含めることにより、さらなる利点が得られる場合があり得る（すなわち、抗原特異的な増強された免疫）。免疫原および／またはサイトカインをコードしているかかる核酸配列は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドに含めてもよく、該組成物中の別個の核酸（例えば、別個のプラスミド）に含めてもよい。
【００４０】
リポソームと本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたは免疫賦活性ＤＮＡ配列との複合体化は、当該技術分野で標準的な方法を用いて、または米国特許第６，６９３，０８６号（その内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行われ得る。リポソームに添加するプラスミドの好適な濃度としては、全身性免疫応答が誘発されるような充分な量のプラスミドが被験体に送達されるために有効な濃度が挙げられる。例えば、約０．１μｇ〜約１０μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得るか、約０．５μｇ〜約５μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得るか、または約１．０μｇのプラスミドが約８ｎｍｏｌのリポソームと合わされ得る。組成物中の脂質に対するプラスミドの比（プラスミド（μｇ）：脂質（ｎｍｏｌ））は重量基準でプラスミド：脂質が少なくとも約１：１（例えば、プラスミド１μｇ：脂質１ｎｍｏｌ）であり得る。例えば、脂質に対するプラスミドの比は少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０または少なくとも約１：２０であり得る。本明細書において示す比は、組成物中のカチオン性脂質の量に対するものであり、組成物中の脂質の総量に対するものではない。本発明の組成物中の脂質に対するプラスミドの比は、好適には約１：１〜約１：８０のプラスミド：脂質（重量基準）；約１：２〜約１：４０のプラスミド：脂質（重量基準）；約１：３〜約１：３０のプラスミド：脂質（重量基準）；または約１：６〜約１：１５のプラスミド：脂質（重量基準）である。
【００４１】
Ｃ．生物学的薬剤
本明細書に記載の任意の免疫調節薬組成物は、リポソーム送達媒体および少なくとも１種類の本明細書に記載のプラスミドに加えて、さらに少なくとも１種類の生物学的薬剤を含むものであってもよい。
【００４２】
好適な生物学的薬剤は、疾患の予防または処置に有効な薬剤である。かかる生物学的薬剤としては、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌薬または任意のその組合せが挙げられる。好適な免疫増強タンパク質は、免疫を増強することが知られているタンパク質である。非限定的な一例として、サイトカイン（これは、１つのファミリーのタンパク質群を包含している）は既知の免疫増強タンパク質ファミリーである。好適な免疫原は、免疫原を被験体に投与すると、該被験体の組織内にみられるものと同じまたは類似のタンパク質に対して免疫原特異的免疫応答を起こすように体液性および／または細胞性免疫応答を誘発するタンパク質である。免疫原としては、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌によって発現される病原性の抗原が挙げられ得る。好ましい抗原としては、被験体において感染性疾患を引き起こす生物体に由来する抗原が挙げられる。本発明によれば、免疫原は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘発するタンパク質（天然に存在するか、または合成により誘導されたもの）のいずれかの部分であってもよい。そのため、抗原または免疫原のサイズは、約５〜１２個のアミノ酸という小さいものであってもよく、完全長のタンパク質という大きいものであってもよく、その間の任意のサイズが包含され得る。抗原は、多量体タンパク質または融合タンパク質であってもよい。抗原は、精製された抗原であってもよい。あるいはまた、該免疫増強タンパク質または免疫原は、該免疫賦活性プラスミドにコードさせてもよく、該免疫調節薬組成物中に含めた別の核酸にコードさせてもよい。該免疫増強タンパク質または免疫原を免疫調節薬組成物中の核酸分子にコードさせる場合、該免疫原が被験体の組織内で発現され、それにより、該被験体において非特異的免疫応答に加えて免疫原特異的免疫応答が誘発されるように、該免疫増強タンパク質または免疫原をコードしている核酸配列を転写制御配列に作動可能に連結させる。免疫原性、例えば、病原体抗原の免疫原性またはサイトカイン活性についてスクリーニングするための手法は当業者に知られており、さまざまなインビトロアッセイおよびインビボアッセイが挙げられる。
【００４３】
生物学的薬剤がワクチンである場合、ワクチンとしては、ウイルス、細菌もしくは寄生虫の感染性の生ワクチンまたはウイルス、細菌もしくは寄生虫の死菌／不活化ワクチン、またはサブユニットワクチン、または当該技術分野で知られた任意のワクチンが挙げられ得る。１種類以上のワクチンが本発明の免疫調節薬組成物と併用して使用され得る。好適なワクチンとしては、当該技術分野で知られた水生種に対するものが挙げられる。
【００４４】
生物学的薬剤は抗菌薬であってもよい。好適な抗菌薬としては：キノロン系、好ましくはフルオロキノロン系、β−ラクタム、およびマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミン（ＭＬＳ）系抗生物質が挙げられる。
【００４５】
好適なキノロン系としては、ベノフロキサシン、ビンフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、ジェミフロキサシン、イバフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、プラドフロキサシン、パーフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシンおよびトスフロキサシンが挙げられる。好ましいフルオロキノロン系としては、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシンおよびプラドフロキサシンが挙げられる。好適なナフチリドンとしてはナリジクス酸が挙げられる。
【００４６】
好適なβ−ラクタム系としては、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖ［すなわち、アモキシシリン／クラブラン酸］、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェノキシメチルペニシリン、ピペラシリン、プロカインペニシリン、テモシリンおよびチカルシリン）；セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファロニウム、セファマンドール、セファプリリン、セファゾリン、セフェピム、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフキノム、セフタジジム、セフチオフル、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファロチンおよびデフォテタン）；カルバペネムならびにペネム（例えば、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネムおよびメロペネム）；モノバクタム（例えば、アズトレオナム、ノカルジシンＡ、タブトキシニン−β−ラクタムおよびチゲモナム）；ならびにβ−ラクタマーゼ阻害薬（例えば、クラブラン酸、スルバクタムおよびタゾバクタム）が挙げられる。好ましいβ−ラクタム系としてはセファロスポリン、特に、セファゾリンが挙げられる。
【００４７】
好適なＭＬＳ系抗生物質としては、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシンおよび任意のマクロライド系抗生物質が挙げられる。好ましいリンコサミド系抗生物質はピルリマイシンである。
【００４８】
他の抗菌薬としては、アミノグリコシド、クロピドール、ジメトリダゾール、エリスロマイシン、フラミセチン、フラゾリドン、ハロフジノン、２−ピリドン、ロベニジン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、種々のプレウロムチリン（例えば、チアムリンおよびバルネムリン）、ならびに種々のストレプトマイシン（例えば、モネンシン、ナラシンおよびサリノマイシン）が挙げられる。
【００４９】
ＩＩ．方法
本発明の目的は、免疫調節薬組成物、免疫賦活性プラスミド（またはＤＮＡ配列）、および免疫を賦活して未感染被験体に対して防御免疫、感染被験体に対して防御免疫、未感染被験体に対して免疫の増強、感染被験体に対して免疫の増強、感染被験体に対して治療的免疫またはその組合せをもたらす方法を提供することである。そのため、本発明の組成物は、被験体を予防的に免疫処置するために使用され得るか、または被験体を処置するために使用され得る。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドまたはＤＮＡ配列を被験体に投与し、該被験体において免疫機構を賦活することを含むものである。
【００５０】
Ａ．被験体の免疫機構の不活方法
本発明は、レシピエント被験体において免疫機構を賦活または増強する方法に関する。該方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はレシピエント被験体における免疫応答を賦活するものであり、該免疫応答により感染の撃滅が補助される。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物はサイトゾル内ＤＮＡ監視機構分子を活性化させるものである。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、少なくとも１種類の生物学的薬剤、例えばワクチンの前に投与した場合、ワクチンと共投与した場合、ワクチン接種後に投与した場合またはワクチンと混合した場合、かかるワクチンの作用を増強するものである。いくつかの態様では、該方法は、レシピエント被験体を感染性疾患から防御するため、および感染性疾患を有する集団を処置するための新たな処置ストラテジーをもたらすものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬をワクチンと併用して使用した場合、免疫調節薬組成物なしでのワクチンの使用と比べて、疾患に対してより速やかでより長期間でより良好な防御をもたらすものである。
【００５１】
免疫応答はレシピエント被験体において、有効量の免疫調節薬組成物を投与することにより活性化され得、該組成物は、本明細書に記載の任意のリポソーム送達媒体、本明細書に記載の任意の免疫賦活性プラスミド（またはＤＮＡ配列）を含むものであり、本明細書に記載の任意の生物学的薬剤が含まれていてもよい。生物学的薬剤は免疫調節薬と混合もしくは共投与され得るか、または独立していることが想定される。独立投与は、免疫調節薬の投与の前であっても後であってもよい。また、１回より多くの免疫調節薬または生物学的薬剤の投与が使用され得ることも想定される。さらに、１種類より多くの生物学的薬剤が免疫調節薬と共投与される、免疫調節薬の前に投与される、免疫調節薬の投与の後に投与される、または免疫調節薬と並行して投与される場合もあり得る。
【００５２】
Ｂ．被験体の生存性の改善方法
本発明は、水生種の構成員の生存性の改善方法に関する。該生存性の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の生存性の改善をもたらすものである。
【００５３】
Ｃ．生産の改善方法
本発明は、養殖で育てる水生種の構成員の生産の改善方法に関する。該生産の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の生産の改善をもたらすものである。生産の改善の評価方法は当該技術分野で知られている。当業者には、生産の改善は、免疫調節薬組成物を受けた被験体と免疫調節薬組成物を受けていない被験体間で、健康状態、体重、サイズ、肉質および他のパラメータを比較して測定され得ることが認識されよう。
【００５４】
Ｄ．飼料の利用率の改善方法
本発明は、養殖で育てる水生種の構成員の飼料の利用率の改善方法に関する。該飼料の利用率の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の飼料の利用率の改善をもたらすものである。飼料の利用率の評価方法は当該技術分野で知られている。当業者には、飼料の利用率の改善は、免疫調節薬組成物を受けた被験体と免疫調節薬組成物を受けていない被験体間で、健康状態、体重、サイズ、肉質および他のパラメータを比較して測定され得ることが認識されよう。
【００５５】
Ｅ．生存率の改善方法
本発明は、養殖で育てる水生種の構成員の生存率の改善方法に関する。該生存率の改善方法は、被験体に有効量の本明細書に記載の免疫調節薬組成物を投与することを含むものである。いくつかの態様では、該方法は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べてレシピエント被験体の生存率の改善をもたらすものである。生存率の改善の評価方法は当該技術分野で知られている。当業者には、生存率の改善は、免疫調節薬組成物を受けた被験体と免疫調節薬組成物を受けていない被験体間で、健康状態、体重、サイズ、肉質および他のパラメータを比較して測定され得ることが認識されよう。
【００５６】
有効量の本明細書に記載の任意の免疫調節薬組成物が被験体に投与され得る。有効量は、レシピエント被験体において免疫応答を活性化させるに充分なものである。かかる活性化の測定方法は当該技術分野で知られている。また、当業者には、有効量は、年齢、体重、被験体の種および感染段階ならびに当該技術分野で知られた他の要素に依存することが認識されよう。好適な有効量は約０．１μｇ〜１，０００μｇ／被験体の範囲であり得る。いくつかの態様では、有効量は約０．１μｇ〜約１０μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約０．５μｇ〜約５μｇ、約０．２５μｇ〜約５μｇ、約０．０５μｇ〜約１０μｇ、約５μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約２０μｇ、約２０μｇ〜約３０μｇ、約３０μｇ〜約４０μｇ、約４０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約７０μｇ、約７０μｇ〜約９０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約１５０μｇ、約１５０μｇ〜約２００μｇ、約２００μｇ〜約２５０μｇ、約２５０μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約３５０μｇ、約３５０μｇ〜約４００μｇ、約４００μｇ〜約４５０μｇ、約４５０μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約５５０μｇ、約５５０μｇ〜約６００μｇ、約６００μｇ〜約６５０μｇ、約６５０μｇ〜約７００μｇ、約７００μｇ〜約７５０μｇ、約７５０μｇ〜約８００μｇ、約８００μｇ〜約８５０μｇ、約８５０μｇ〜約９００μｇ、約９００μｇ〜約９５０μｇ、約９５０μｇ〜約１０００μｇの範囲であり得る。好ましくはいくつかの態様では、有効量は約０．５μｇ〜約１０μｇの範囲である。
【００５７】
Ｆ．使用のための条件
本発明の方法は、被験体が、免疫応答が誘発され易い疾患から防御されるように該被験体における免疫応答を活性化させるものである。本明細書で用いる場合、語句「疾患から防御される」とは、疾患の症状の低減；疾患の発生の低減；疾患の臨床的もしくは病理学的重症度の低減；または疾患を引き起こす病原体の排出の低減をいう。被験体の防御は、本発明の治療用組成物が被験体に投与されたとき、疾患の発生を予防する、治癒する、および／または疾患症状、臨床徴候、病態もしくは原因を緩和もしくは低減させる該組成物の能力を示す場合もあり得る。そのため、疾患からの被験体の防御は、疾患発生の予防（予防的処置）と疾患を有する被験体の処置（治療的処置）の両方を包含している。用語「疾患」は、被験体の正常な健康状態からの任意の逸脱をいい、疾患症状が存在している状態、ならびに逸脱（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝的欠陥など）が発生しているが症状はまだ現れていない病状を包含している。
【００５８】
本発明の方法は、疾患の予防、疾患に対するエフェクター細胞免疫の賦活、疾患の解消、疾患の緩和および原発性疾患の発生に起因する続発性疾患の予防のために使用され得る。
【００５９】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、ワクチンと共投与した場合、ワクチン単独の投与と比べて被験体の自然免疫応答を改善するために使用され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、ワクチンと共投与した場合、ワクチン単独の投与と比べて被験体の獲得免疫応答を改善するために使用され得る。一般的に、ワクチン１回の投与では、獲得免疫を賦活するために時間を要するため、被験体が即座に防御されることはない。用語「改善する」は、本発明では、ワクチンが被験体を防御し始めるまで、および／または防御期間を延長し始めるまでの、ワクチンによって付与された獲得免疫による被験体における自然免疫応答の誘発をいう。
【００６０】
いくつかの態様では、本発明の方法は、多種多様な病原体の感染に対して防御するために該組成物を投与することを含むものである。投与する組成物に、特異的応答を誘発させるための特異的抗原を含めてもよく、含めなくてもよい。本発明の方法は、レシピエント被験体を感染性の微生物因子、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫に起因する疾患から防御するものであることが想定される。当業者には、本明細書に記載の免疫調節薬組成物は、数多くの感染性因子（これは、列挙するには数が多過ぎる）に対して有効であることが認識され、理解されよう。本明細書に示した感染性因子は例示の目的で示したものであり、使用範囲の限定のために示したものではない。
【００６１】
Ｇ．投与
さまざまな投与経路が利用可能である。選択される具体的な様式はもちろん、選択される具体的な生物学的薬剤、被験体の年齢および一般健康状態、処置対象の具体的な病状ならびに治療有効性に必要とされる投薬量に依存する。本発明の方法は、臨床的に許容され得ない有害効果を引き起こすことなく有効な活性化レベルの免疫応答がもたらされる任意の投与様式を用いて実施され得る。該組成物は、簡便には単位投薬形態で提示され得、当該技術分野でよく知られた任意の方法によって調製され得る。
【００６２】
免疫調節薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧、卵内、経口、眼内、気管内、鼻腔内、浸漬、泳いでいる間に皮膚もしくは鰓からの取込み、または当該技術分野で知られた他の方法によって投与され得る。一態様では、該免疫調節薬は皮下投与される。別の態様では、該免疫調節薬は筋肉内投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は噴霧薬として投与される。別の態様では、該免疫調節薬は経口投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は皮下投与され得る。
【００６３】
一観点において、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）の前に単独で投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）後に単独で投与され得る。別の態様では、該免疫調節薬は被験体に、抗原刺激（または感染）と同時に単独で投与され得る。
【００６４】
いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、抗原刺激の前にワクチン接種と同時に共投与され得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、抗原刺激（または感染）と同時にワクチン接種と同時に共投与され得る。いくつかの態様では、共投与は、ワクチンと免疫調節薬を、被験体の概ね同じ位置の異なる２つの部位に互いに隣同士に投与すること（すなわち、被験体の首に互いに隣同士に注射）、被験体の概ね同じ位置の反対側に投与すること（すなわち、首の片側に一方）、または同じ被験体の異なる位置に投与することを含むものであり得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、ワクチン接種および抗原刺激の前に投与され得る。いくつかの態様では、免疫調節薬組成物は、ワクチン接種後だが抗原刺激の前に投与され得る。免疫調節薬組成物を、抗原刺激（または感染）前にワクチン接種を受けた被験体に、抗原刺激後に投与してもよい。
【００６５】
当業者には、投与経路は、被験体および被験体の健康または状態に応じて異なり得ることが認識されよう。示した投与経路は例示の目的のためのものであり、限定のために示したものではない。
【００６６】
ワクチン接種は、どの年齢で行ってもよい。ワクチンは、皮下、噴霧、経口、眼内、気管内、鼻腔内、卵内、浸漬または当該技術分野で知られた他の方法によって投与され得る。経口ワクチンは、飼料または水中に含めて投与され得る。さらに、本発明の方法は、ルーチンワクチン接種スケジュールに基づいて使用され得ることが想定される。
【００６７】
また、免疫調節薬組成物は、皮下、眼内、気管内、鼻腔内、卵内、または当該技術分野で知られた他の方法によっても投与され得る。例えば、免疫調節薬組成物は卵内投与され得る。あるいはまた、免疫調節薬組成物は噴霧薬として投与され得る。
【００６８】
卵に対する投与は抗原刺激（または感染）の前であっても抗原刺激の後であってもよい。
【００６９】
該免疫調節薬は、被験体に抗原刺激の約１〜約１４日前にまたは抗原刺激の約１〜約１４日後に投与され得る。例えば、該免疫調節薬は、抗原刺激の前に約１〜約７日間または抗原刺激後に約１〜約７日間投与され得る。該免疫調節薬は好適には、抗原刺激の前に１、２、３、４、５、６、７日間または抗原刺激後に１、２、３、４、５、６、７日間投与される。
【００７０】
他の送達系としては、時限的、遅延放出または徐放送達系が挙げられ得る。かかる系により該組成物の反復投与を回避することができ、したがって簡便性が高まり得る。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。このようなものとしては、ポリマーベースの系、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物が挙げられる。薬物を含有している前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。
【００７１】
また、送達系としては、脂質、例えば、ステロール（コレステロール、コレステロールエステルなど）、ならびに脂肪酸または中性脂肪（モノ−、ジ−、およびトリ−グリセリドなど）；ハイドロゲル放出系；シリコン系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；慣用的な結合剤と賦形剤が使用された圧縮錠；部分溶融埋入物；などである非ポリマー系も挙げられる。具体例としては、限定されないが、本発明の薬剤が、ある形態でマトリックス内に含有された崩壊系（米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号および同第５，７３６，１５２号に記載のものなど）、ならびに活性成分がポリマーから制御された速度で透過する拡散系（例えば、米国特許第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載）が挙げられる。また、ポンプベースハードウェア送達系も使用され得、その一部のものは埋込み用に適合されたものである。
【００７２】
上記の組成物、生成物および方法において、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得るが、上記の説明および以下に示す実施例に含まれた事柄はすべて、実例であると解釈すべきであり、限定的な意味で解釈すべきでないことを意図する。
【００７３】
定義
用語「有効量」は、所望の生物学的効果が実現されるのに必要または充分な量をいう。例えば、感染性疾患を処置または予防するための免疫調節薬の有効量は、微生物に曝露されると免疫応答の発現を引き起こし、したがって、被験体内の微生物量の低減、好ましくは微生物の根絶を引き起こすのに必要な量である。任意の具体的な適用での有効量は、処置対象の疾患もしくは病状、被験体の体格または疾患もしくは病状の重症度などの要素に応じて異なり得る。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、経験的に免疫調節薬の有効量を決定することができよう。
【００７４】
用語「サイトカイン」は、免疫増強タンパク質ファミリーをいう。サイトカインファミリーには、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子ならびにケモカイン（すなわち、細胞、特に食細胞の遊走および活性化を調節するタンパク質）が含まれる。例示的なサイトカインとしては、限定されないが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が挙げられる。
【００７５】
用語「誘発する」は、活性化させる、賦活する、生じさせる、または上方調節するという用語と互換的に使用され得る。
【００７６】
被験体において「免疫応答を誘発する」という用語は、具体的には、免疫応答の活性をコントロールすること、または影響を及ぼすことをいい、免疫応答を賦活すること、免疫応答を上方調節すること、免疫応答を増強させること、および／または免疫応答を改変すること（例えば、被験体における優勢な型の免疫応答を有害または無効なものから有益または防御的なものにさらに変化させる型の免疫応答を誘発することによって）が包含され得る。
【００７７】
用語「作動可能に連結された」とは、核酸分子が転写制御配列に、該分子が宿主細胞内にトランスフェクト（すなわち、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）されると発現可能な様式で連結されていることをいう。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。さまざまなかかる転写制御配列が当業者に知られている。好ましい転写制御配列としては、トリ、魚類、哺乳動物、細菌、ウイルス、植物および昆虫の細胞内で機能するものが挙げられる。任意の転写制御配列が本発明で使用され得るが、該配列としては、免疫原または免疫賦活性タンパク質をコードしている配列と天然状態で会合している天然に存在している転写制御配列が挙げられ得る。
【００７８】
用語「核酸分子」および「核酸配列」は互換的に使用され得、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体が包含され得る。この用語はまた、オリゴヌクレオチドおよびより大きな配列、例えばプラスミド、例えば本明細書に記載の免疫賦活性プラスミドも包含しており、タンパク質またはその断片をコードしている核酸分子および調節領域、イントロンまたは他の非コードＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸分子の両方を包含している。典型的には、オリゴヌクレオチドは約１〜約５００個のヌクレオチドの核酸配列を有するものであり、より典型的には少なくとも約５ヌクレオチド長である。核酸分子は、任意の供給源、例えば、哺乳動物、魚類、細菌、昆虫、ウイルス、植物、合成供給源またはその組合せに由来するものであり得る。核酸分子は、一般的に当該技術分野で知られた方法、例えば、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）または化学合成によって作製されたものであってもよい。核酸分子には、天然核酸分子およびそのホモログ、例えば限定されないが、天然の対立遺伝子バリアントおよび修飾核酸分子（かかる修飾が本発明の方法に有用な免疫応答を誘発する該核酸分子の能力に実質的に支障を来さないような様式でヌクレオチドが、挿入、欠失、置換または逆転しているもの）が包含される。核酸ホモログは、当業者に知られたいくつかの方法を用いて作製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」は、該遺伝子が発現された生物体を、通常であれば該生物体を死滅させるか、もしくはその増殖を抑止し得る選択的薬剤（例えば、抗生物質）または条件から保護する産物をコードしている遺伝子をいう。選択可能マーカー遺伝子は、最も一般的には抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）である。したがって、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、カナマイシン耐性遺伝子をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供し、次いで、カナマイシン含有培地上または該培地中で培養した場合、該プラスミドが成功裡に取り込まれ、カナマイシン耐性遺伝子が発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のみが生き残る。用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」はまた、生物体の増殖に必須の化合物の合成に関与している酵素をコードしている遺伝子も包含している。必須化合物を合成することができない栄養要求性生物体に導入した場合、かかる遺伝子により、該生物体が、該必須化合物を補給した培地中で増殖することが可能になる。例えば、リシンの生合成に関与している酵素における変異のため、または該酵素がないため、アミノ酸リシンに対して栄養要求性の細菌細胞は、通常、リシンが補給されていない培地上で増殖することができない。かかる細菌を、リシンの生合成に関与している酵素をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供した場合、該プラスミドが成功裡に取り込まれ、該酵素が発現された細菌が、リシンが補給されていない培地上で培養した場合に生き残る。用語「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」はさらに、毒／解毒剤選択を可能にする遺伝子も包含している。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、細胞分裂に必須の酵素であるＤＮＡジャイレースに結合するタンパク質をコードしている。ＤＮＡジャイレースに結合すると、ｃｃｄＢ遺伝子産物は遺伝子の複製を障害し、細胞死を誘導する。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子産物を発現している細菌は生き残ることができない。ｃｃｄＡ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子産物の天然の阻害薬として作用するタンパク質（「解毒剤」）をコードしている。したがって、自身の細菌ゲノム内にｃｃｄＢ遺伝子を有する細菌を、ｃｃｄＡ遺伝子産物をコードしているプラスミドを導入するための形質転換手順に供した場合、該プラスミドを成功裡に取り込み、ｃｃｄＡ遺伝子を発現する細胞のみが生き残る。
【００８０】
用語「スクリーニング可能マーカー」および「スクリーニング可能マーカー遺伝子」は、スクリーニング可能マーカー遺伝子を発現している細胞とスクリーニング可能マーカー遺伝子を発現していない細胞を観測者が識別することを可能にする産物をコードしている遺伝子をいう。スクリーニング可能マーカー遺伝子系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ｌａｃＺ遺伝子および蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青蛍光タンパク質（ＢＦＰ）またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をコードしている遺伝子が挙げられる。
【００８１】
本明細書で用いる場合、用語「生産の改善」は、免疫調節薬組成物を受けた被験体と免疫調節薬組成物を受けていない被験体間での健康状態、体重、サイズ、肉質などの測定値または他のパラメータにおける改善をいう。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「生存性の改善」は、免疫調節薬組成物を受けていない被験体と比べたレシピエント被験体の生存率の改善をいう。
【００８３】
本明細書で用いる場合、用語「被験体」は、相当な数の任意の変種の水生種を含む水生種の構成員をいう。被験体は、飼育用であれ野生であれ、水生種の任意の構成員であり得、繁殖、食肉または産卵のために商業的に育てられるものであってもよい。例示的な水生種としては、限定されないが、淡水または海水中に生息する任意の種の魚、甲殻類、軟体動物が挙げられる。代表的な種としては、限定されないが、脊索動物門、脊索動物亜門および魚上綱の任意の構成員などの魚が挙げられる。さらなる一例として、限定されないが、かかる魚としては、ナマズ、ブチナマズ、ブラックブルヘッド、イエローブルヘッド、ブラウンブルヘッド、コイ、フナ、マス、ニジマス、ブラウントラウト、カワマス（ｓｐｅｃｋｌｅｄ  ｂｒｏｏｋ  ｔｒｏｕｔ）、サケ、大西洋サケ、ギンザケ、マスノスケあるいはキングサーモン、テンチ、ローチ、パイク、パイクパーチ、ドーバーソール、ターボット、ブリ（ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ）、バス、コクチバス、オオクチバス、シマスズキ、ストライパー、サバヒー、テラピア、グレーマレット、ウナギ、タラが挙げられ、本発明の実施対象となり得る任意の他の変種または水生種は当業者に自明であろう。いくつかの態様では、被験体は感染性疾患を有すると診断されたものであり得るか、感染性疾患のリスクがあるものであり得るか、または感染性疾患が起こっているものであり得る。被験体は任意の年齢、例えば、卵内、新生、幼若、成体、中年齢または高年齢のものであり得る。
【表１】
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2018521108.tif 000004
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【００８４】
［実施例］
本発明のさらなる実例を示すために以下の非限定的な例を示す。
【００８５】
［実施例１］ＩＰＮＶとの共存による抗原刺激を用いて不活化ＩＰＮＶ抗原とともに製剤化した場合のＤＮＡ免疫調節薬を投与された大西洋サケの評価。
【００８６】
この試験の目的は、ＩＰＮＶとの共存の前にサケに投与したＤＮＡ免疫調節薬の有効性を調べることであった。
【００８７】
免疫調節薬
この試験で使用したＤＮＡ免疫調節薬は、ＣｐＧジヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡリポソーム複合体であった。プラスミドＤＮＡは配列番号：２に示すｐＭＢ７５．６プラスミドである。プラスミドＤＮＡリポソーム複合体は５％デキストロース溶液で製剤化した。
【００８８】
この試験で使用したＭｏｎｔａｎｉｄｅ油（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７６３  Ａ）は、強力で長期の免疫応答をもたらすＩ型アジュバントである代謝可能な油である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７６３  Ａ  ＶＧ（供給元はＳｅｐｐｉｃ）は、注射可能で代謝可能な油（鉱油は含有していない）および極精製乳化剤（マンニトールと精製オレイン酸（植物起源）から得られる）を含有している。
【００８９】
ＩＰＮＶ抗原
ＩＰＮＶ（伝染性膵臓壊死症ウイルス）をＣＨＳＥ−２１４細胞株で、１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまで増殖させた。抗原をホルマリンで不活化させ、次いで、上記の免疫調節薬のいずれか１種類（種々の処置において一定濃度）と合わせて製剤化した。
【００９０】
Ａｌｐｈａ  Ｊｅｃｔ（登録商標）２−２
この市販のワクチンを対照として使用した。このワクチンは、フルンクロース（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｅ）およびＩＰＮＶ感染による魚の死亡を抑制するために使用される油乳剤である。
【００９１】
ＩＰＮＶ抗原ワクチン製剤
ＩＰＮＶ抗原を、３つの異なる濃度／比率のＤＮＡ免疫調節薬またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ油のいずれかと合わせた１価ワクチンとして製剤化した。処置組成物のまとめを表２に示す。
【表２】
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【００９２】
試験動物
大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）をワクチン接種していない状態で入手し、免疫状態は供給元で記録されていた。性成熟した、損傷した、または奇形の魚は試験から除外した。魚を１２の処置群（処置群Ａ〜Ｌ）に分け、３０匹ずつの魚を３つの水槽に入れ、合計３６０匹の処置魚／水槽にした。７２匹の魚からなる別の群を、３つの水槽の各々において攻撃体すなわちＩＰＮＶを能動的に排出する魚として使用した。ワクチンの投与前、処置日の２週間前に供試魚に麻酔し、ＰＩＴタグの埋込みによって標識した。
【００９３】
試験計画
魚は、ワクチンの投与前に最低４８時間絶食させた。処置群には、表２の上記のいろいろな用量のワクチンまたは対照物質を処置日に投与した。ワクチンまたは対照物質は、表２に従って腹腔内投与した。試験は３つの水槽で実施した。各水槽は、１２の実験群の３０ずつの魚を有するものにした。２つの水槽は二連の抗原刺激実験として使用した（水槽１および２，表３）。３つ目の水槽は、免疫調節試験中のサンプリングのために使用した（水槽３，表３）。
【表３】
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【００９４】
抗原刺激実験は、最低６００度日後、ワクチン接種のおよそ６週間後に海水に移すこと、および光周期の操作と一緒に実施した。魚は、抗原刺激の前に最低２５時間絶食させた。抗原刺激はすべての水槽で同時に実施した。攻撃体には培養ウイルスを腹腔内注射し、抗原刺激時に脂ビレを切除することによって標識した。注射および標識後、攻撃体を導入した。初めは水槽１および２の魚を水槽Ｍ５およびＭ６に割り当て、初めは水槽３の魚を水槽Ｍ２に移した。
【００９５】
サンプリング
各時間点で、魚を致死させ、組織、例えば頭腎、肝臓および脾臓の試料を免疫プロファイリングのために採取した。また、血清学的検査および／またはトランスクリプトーム分析のために血液も収集した。各時間点で、５匹の魚／処置を致死させ、試料を採取した。ワクチン接種前に、一般母集団からの１０匹の魚をサンプリングした。ワクチン接種後、水槽３からのサンプルをワクチン接種後２４時間目と４８時間目に収集した。抗原刺激後、水槽１および２からのサンプルを、標準的な確認用の致死（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ  ｌｏｓｓ）のために採取した（死亡率１０％）。水槽３からのサンプルは、抗原刺激後３日目と７日目に収集した。抗原刺激期間の終了時、生き残っていた魚を致死させ、試料を採取した。
【００９６】
ＩＰＮＶ抗原刺激水槽（水槽１および２）から代表選択した死んだ魚の腎臓を試料採取し、ＩＰＮＶ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡにおいて試験した。選択は、魚（３０匹／水槽）の合計１０％までの死亡率の最初、真ん中および最後で行った。
【００９７】
抗原刺激中に代表選択した死んだ魚（供試に含めた魚の総数の約１０％）は、細菌検査により検査した。
【００９８】
結果
攻撃体の導入後、抗原刺激試験を、陰性対照群において死亡率が横ばい状態になるか、または１００％に達するまで進行させた。死亡率は、水槽１および２において感染後、２２日目から２８日目の間に平坦域に達した（図４および図５）。
【００９９】
死亡した魚は、ＩＰＮＶ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡおよび細菌検査分析を用いてサンプリングした。ＩＰＮＶ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡ試験により、水槽Ｍ６の魚の７５．５％、水槽Ｍ５の魚の６２．５％および水槽Ｍ２の魚ではたった３５．２％がＩＰＮＶについて陽性であること示された（表４）。死亡率１０％の分からのサンプルを細菌検査分析に供した。種々の水槽の魚から採取した試料のうち細菌増殖がないもののパーセンテージは、水槽Ｍ５、Ｍ６およびＭ２で、それぞれ７７．５％、６４．９％および９８．１％であった（表５）。その後、死亡が記録されたものの大多数は細菌増殖について陰性であった。
【表４】
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【表５】
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【０１００】
各処置群（群Ａ〜Ｌ）の生存期間を理解し、比較するために、合算データのカプランマイヤー生存曲線を調べた。図６において観察されるように、生存確率は、２つの相違する集団において離れていた。生存確率が低い方の集団は、デキストロース（Ａ）または抗原なしで３つの異なる用量のＤＮＡ免疫調節薬（Ｂ、ＣおよびＤ）で処置された魚で構成されたものであり、一方、高い方の生存確率を示す集団は、ＩＰＮＶ抗原のみ（Ｅ）、ＤＮＡ免疫調節薬と製剤化されたＩＰＮＶ抗原（Ｆ、ＧおよびＨ）またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ油と製剤化されたＩＰＮＶ抗原（Ｉ、ＪおよびＫ）、ならびに市販のワクチン（Ｌ）で処置された群で構成されたものであった。全体として比較した場合、１２種類の異なる処置間で生存曲線において統計学的有意差がみられた（カイ２乗＝１１０．６  ｄｆ＝１１；ｐ値（＜０．０００１）＝２．２×１０−１６）。
【０１０１】
処置群を２つの相違するクラスター間に分けた（図７）。一方のクラスターには、デキストロース処置（Ａ）ならびに抗原なしのすべてのＤＮＡ免疫調節薬処置（Ｂ、Ｃ、Ｄ）を含めた。他方のクラスターは、ＩＰＮＶ抗原のみ（Ｅ）、ＤＮＡ免疫調節薬製剤化ワクチン（Ｆ、Ｇ、Ｈ）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤化抗原（Ｉ、Ｊ、Ｋ）および市販のワクチン（Ｌ）で処置された魚で構成した。
【０１０２】
２つのクラスター間の有意差は明白であり、したがって、ワクチン接種により魚の生存率が陰性対照群と比べて有意に改善されるが、異なるワクチン製剤間には差異はみられないことが確認された。
【０１０３】
相対的生存割合を、実験終了時（ＲＰＳｅｎｄ）にすべての処置群において計算した（図８）。５％デキストロース陰性対照群とすべての製剤化ワクチン群間で有意差が測定された。
【０１０４】
Ｓｐｅｉｌｂｅｒｇ評価尺度を使用し、ワクチンを製剤化するために使用したアジュバントの起こり得るマイナスの効果を評価した。副次的効果は特に観察されなかった。組織病変はほぼ存在せず、わずかに偶発的に市販の製剤品において癒着および色素沈着に関するレベル２（低い）スコアならびにＤＮＡ免疫調節薬でレベル１のスコアリングがみられた（表６）。サンプリングしたいずれの魚においても残存ワクチンは検出され得なかった。
【表６】
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【０１０５】
結論
この試験では、ワクチンとして不活性なＩＰＮＶと製剤化したＤＮＡ免疫調節薬の有効性を大西洋サケにおいて評価した。ＤＮＡ免疫調節薬を単独で投与した場合（処置Ｂ、ＣおよびＤ）、最小限の防御がもたらされ、死亡率は９３．３〜１００％の範囲であり、生存確率はデキストロースのみの対照群と有意に異ならなかった。これは、ＤＮＡ免疫調節薬によって誘発される自然免疫応答が抗原刺激時点（ワクチン接種後５８８度日またはおよそ７週間目）までにおそらく消えてしまっているであろうことから予測されたが、これは本試験では評価しなかった。
【０１０６】
図８に示されるように、不活化ＩＰＮＶ抗原単独の存在は、ワクチン接種した魚の生存確率を有意に高めるのに充分であり、５％デキストロース群と比べてＲＰＳｅｎｄで２１．４％であった。この防御は、ＤＮＡ免疫調節薬（Ｆ＝２８．７％，Ｇ＝４２．９％，Ｈ＝４１．１％）およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｉ＝４２．９％，Ｊ＝３９．３％，Ｋ＝２３．２％）のアジュバント添加製剤によりさらに高まった。安全面に関して、問題点は記録されず、本ＤＮＡ免疫調節薬は魚における使用に安全であると判断された。
【０１０７】
この試験では、本ＤＮＡ免疫調節薬の水産用ワクチンのアジュバントとしての使用の可能性、大西洋サケにおける免疫応答の誘導を補助するその能力ならびに１０ｕｇ以下で投与した場合のその安全性プロフィールが示された。
【０１０８】
本発明の要素またはその好ましい実施形態（１つもしくは複数）を紹介している場合、冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つ以上の該要素が存在していることを意味していることを意図している。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包含的であり、記載の要素以外のさらなる要素が存在していてもよいことを意味していることを意図している。
【０１０９】
上記のことに鑑みると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の好都合な結果が得られることがわかるであろう。
【０１１０】
上記の生成物、組成物および方法において、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得るため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示された事柄はすべて、実例であると解釈すべきであり、限定的な意味で解釈すべきでないことを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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