(57)【要約】  本本発明は、蛍光分子の蛍光を増強させる基材の使用に関するものであり、上記基材は、互いが分離されている複数個の凹部を有している、固体状のポリマーのキャリアーを有し、上記の固体状のキャリアーは、少なくとも一部が金属によってコーティングされている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個または数個の蛍光分子の蛍光を増強するための、基材の使用であって、
上記基材は、互いが分離されている複数個の凹部を有している、固体状のポリマーのキャリアーを有し、
上記固体状のキャリアーは、少なくとも１つの金属によって、少なくとも部分的にコーティングされていることを特徴とする、使用。
【請求項２】
上記凹部は、互いの間の距離が０．２μｍ〜２．５μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記固体状のキャリアーの上記凹部は、長さ、および、幅を有し、
上記長さと幅との比は、２：１〜１：２であり、特に１：１であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
上記固体状のキャリアーの上記凹部は、長さ、および、幅を有し、
上記凹部の上記長さ、および、上記幅は、０．１μｍ〜２μｍであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
上記凹部は、本質的に円形であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
上記凹部の深さは、０．１μｍ〜５μｍであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記固体状のキャリアーは、順に重ねられている１つ以上の金属の層を有していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
上記固体状のキャリアー上の上記金属の層は、１０ｎｍ〜２００ｎｍの厚さである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
上記金属は、銀、金、アルミニウム、クロム、インジウム、ニッケル、パラジウム、プラチナ、亜鉛、スズ、および、これらの金属の１つ以上を含んでいる合金からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
上記合金は、銀、インジウム、および、スズを含んでいるものであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記固体状のキャリアーは、熱可塑性ポリマー、および、重縮合物からなる群から選択される少なくとも１つの材料を含むものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
上記熱可塑性ポリマーは、ポリオレフィン、ビニルポリマー、スチレンポリマー、ポリアクリレート、ポリビニルカルバゾール、ポリアセタール、および、フルオロプラスチックからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
上記重縮合物は、熱可塑性重縮合物、デュロプラスチック重縮合物、および、重付加化合物からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
上記固体状のポリマーのキャリアーの上記材料は、有機物および／または無機物である、添加剤および／または充填材を含んでおり、
上記添加剤および充填材は、好ましくは、ＴｉＯ2、ガラス、炭素、色素、脂質、および、ワックスからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
上記基材は、キャピラリーチューブの一部、マイクロタイタープレートの一部、マイクロ流体チップの一部、アッセイストリップの一部、蛍光顕微鏡のキャリアーの一部、センサーアレイの一部、または、光学検出器の一部であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
上記基材の表面にコーティングされている上記金属は、蛍光分子が直接的および／または間接的に結合するための分子を、少なくとも部分的に含んでいることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
上記蛍光分子が直接的および／または間接的に結合するための分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
１個または数個の蛍光分子の蛍光を増強するための基材であって、
上記基材は、互いが分離されている複数個の凹部を有している、固体状のポリマーのキャリアーを有し、
上記固体状のキャリアーは、少なくとも１つの金属によって、少なくとも部分的にコーティングされていることを特徴とする、基材。
【請求項１９】
上記凹部は、互いの間の距離が０．２μｍ〜２．５μｍであることを特徴とする、請求項１８に記載の基材。
【請求項２０】
上記固体状のキャリアーの上記凹部は、長さ、および、幅を有し、
上記長さと幅との比は、２：１〜１：２であり、特に１：１であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の基材。
【請求項２１】
上記固体状のキャリアーの上記凹部は、長さ、および、幅を有し、
上記凹部の上記長さ、および、上記幅は、０．１μｍ〜２μｍであることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２２】
上記凹部は、本質的に円形であることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２３】
上記凹部の深さは、０．１μｍ〜５μｍであることを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２４】
上記固体状のキャリアーは、少なくとも部分的に、順に重ねられている１つ以上の金属の層を有していることを特徴とする、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２５】
上記固体状のキャリアー上の上記金属の層は、１０ｎｍ〜２００ｎｍの厚さである、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２６】
上記金属は、銀、金、アルミニウム、クロム、インジウム、ニッケル、パラジウム、プラチナ、亜鉛、スズ、および、これらの金属の１つ以上を含んでいる合金からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２７】
上記合金は、銀、インジウム、および、スズ含んでいるものであることを特徴とする、請求項２６に記載の基材。
【請求項２８】
上記固体状のキャリアーは、熱可塑性ポリマー、および、重縮合物からなる群から選択される少なくとも１つの材料を含むものであることを特徴とする、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の基材。
【請求項２９】
上記熱可塑性ポリマーは、ポリオレフィン、ビニルポリマー、スチレンポリマー、ポリアクリレート、ポリビニルカルバゾール、ポリアセタール、および、フルオロプラスチックからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項２８に記載の基材。
【請求項３０】
上記重縮合物は、熱可塑性重縮合物、デュロプラスチック重縮合物、および、重付加化合物からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項２９に記載の基材。
【請求項３１】
上記固体状のポリマーのキャリアーの上記材料は、有機物および／または無機物である、添加剤および／または充填材を含んでおり、
上記添加剤および充填材は、好ましくは、ＴｉＯ2、ガラス、炭素、色素、脂質、および、ワックスからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の基材。
【請求項３２】
上記基材の表面にコーティングされている上記金属は、蛍光分子が直接的および／または間接的結合するための分子を、少なくとも部分的に含んでいることを特徴とする、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の基材。
【請求項３３】
上記蛍光分子が直接的および／または間接的に結合するための分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項３２に記載の基材。
【請求項３４】
請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の基材を備えていることを特徴とする、キャピラリーチューブ、チップ、好ましくはマイクロ流体チップ、キュベット、マイクロタイタープレート、蛍光顕微鏡のキャリアー、または、光学検出器。
【請求項３５】
マイクロタイタープレート、および／または、少なくとも１つのキャピラリーチューブ、および／または、少なくとも１つのチップ、および／または、少なくとも１つのキュベット、および／または、少なくとも１つのアッセイストリップを備えているセットであって、
請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の基材と、
（ｉ）蛍光分子によって標識された検体結合分子、または、（ｉｉ）酵素によって標識された検体結合分子、および、当該酵素の蛍光基質と、を備えている、セット。
【請求項３６】
請求項２５〜２７に規定されている少なくとも１つの金属を用いて、請求項１０〜２４、および、２８〜３１に規定されている固体状のキャリアーを、少なくとも部分的にコーティングする工程を有することを特徴とする、蛍光物質の蛍光を増強するための基材の製造方法。
【請求項３７】
上記少なくとも１つの金属は、スパッタリング、熱蒸着、電子ビーム物理蒸着、パルスレーザー堆積、陰極アーク蒸着、分子線エピタキシー、イオンビームサポート蒸着、および、イオンプレーティングからなる群から選択されるプロセスによって、上記固体状のキャリアーの表面上に塗布されることを特徴とする、請求項３６に記載の製造方法。
【請求項３８】
上記少なくとも部分的にコーティングされた固体状のキャリアーは、フッ素、塩素、臭素、および、ヨウ素からなる群から選択されるハロゲンの、酸および／または塩を少なくとも含んでいる水性の組成物によって処理されることを特徴とする、請求項３６または３７に記載の製造方法。
【請求項３９】
上記水性の組成物は、ＨＣｌ、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＪ、ＮａＣｌ、ＮａＦ、ＮａＢｒ、ＮａＪ、ＫＣｌ、ＫＦ、ＫＢｒ、および、ＫＪからなる群から選択される、酸および／または塩を少なくとも含んでいることを特徴とする、請求項３８に記載の製造方法。
【請求項４０】
上記固体状のキャリアーは、少なくとも１分間、好ましくは少なくとも２分間、さらに好ましくは少なくとも５分間、さらに好ましくは少なくとも１０分間、さらに好ましくは少なくとも２０分間、上記水性の組成物によって処理されることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の製造方法。
【請求項４１】
上記蛍光物質が直接的および／または間接的に結合するための分子が、少なくとも部分的に上記基材の表面をコーティングしている上記金属の上に塗布されることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４２】
上記蛍光物質が直接的および／または間接的に結合するための分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４３】
請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法により製造されることを特徴とする、蛍光物質の蛍光を増強するための基材。
【請求項４４】
以下の工程を含むことを特徴とする、サンプル中の少なくとも１つの検体を測定または定量するための方法；
ａ）任意に、上記少なくとも１つの検体を、少なくとも１つの蛍光物質を用いて、直接的または間接的に標識する工程、
ｂ）上記工程ａ）の少なくとも１つの標識された検体、または、蛍光性の検体を、請求項１９〜３４のいずれか１項に記載の基材の上に塗布する工程、
ｃ）上記基材を適切な波長の光を用いて照射することによって、上記少なくとも１つの蛍光物質を励起させる工程、および、
ｄ）上記サンプル中の少なくとも１つの検体の存在を測定するため、または、上記サンプル中の少なくとも１つの検体を定量するために、蛍光を測定する工程。
【請求項４５】
上記少なくとも１つの蛍光物質は、３６０ｎｍ〜７８０ｎｍ、好ましくは４９０ｎｍ〜６８０ｎｍに励起波長を有するものであることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記少なくとも１つの蛍光物質は、４１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは５１０ｎｍ〜７１０ｎｍに放射波長を有するものであることを特徴とする、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
上記少なくとも１つの蛍光物質は、メトキシクマリン、アミノクマリン、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、５−ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、フィコエリトリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３．５、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、および、Ｃｙ７からなる群から選択されるものであり、好ましくは、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３、フィコエリトリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ５、および、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
上記検体を少なくとも１つの蛍光物質を用いて間接的に標識する工程は、蛍光物質によって標識された検体結合分子によって行われることを特徴とする、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
上記検体結合分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ナノ構造の表面の提供と関連している。当該ナノ構造の表面は、特に、分子が当該表面に近づく際に、適切な分子の蛍光を増強することに適している。本効果は、金属増強蛍光（ＭＥＦ：metal enhanced fluorescence）、または、表面増強蛍光（ＳＥＦ：surfaces enhanced fluorescence）としても知られている。
【０００２】
ＭＥＦおよびＳＥＦは、電磁相互作用（励起）に基づくものであり、通常は、金属のナノ構造上の電子プラズマと、コヒーレント（すなわちレーザー）光との相互作用のことである。当該相互作用は、蛍光分子がそのような金属構造物の表面に近づく（例えば、結合する）際に、当該蛍光分子に由来する光の増強をもたらす。このような方法によって、表面に結合した分子は、当該分子の蛍光が増強するにつれて、より強く輝く。
【０００３】
蛍光の増強により、表面に結合した分子は、最低限の濃度において測定され得る。例えば、蛍光標識された抗体の結合は、当該抗体の結合反応（bonding kinetics）の形態にて、直接的にトレースされ得る。
【０００４】
本増強の程度（amount）は、上記金属のナノ構造物の形状、大きさ、および、距離、並びに、使用される金属の種類（例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ａｌ等）に依存する。文献において、球状（しばしばコロイドである；例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｍａｌｌ  ６（２０１０）：１０３８−４３；Ｃｏｒｒｉｇａｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  １５  （２００５）：７７７−７８４）、三角錐状またはピラミッド状（例えば、Ｐｏｍｐａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（２００６）：１２６−１３０；Ｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １５  （２００９）：２０  （２８）)、ワイヤー状、または、ロッド状の金属構造物が開示されている。当該金属構造物は、連続的ではなく、金属アイレット（metal islets）と呼ばれる形態を形成している。しかし、得られる増強因子（enhancement factors）は、著しく変化し、上記金属ナノ構造物は、大半のケース（case）では再生産できない。
【０００５】
ＵＳ  ２００５／２１４８４１には、基材についての記述がある。当該基材は、複数の凹部を有し、かつ、少なくとも一部が金属によってコーティングされている。上記基材は、様々な材料（例えば、ガラス、セラミック、または、金属）によって構成されている。ＵＳ  ２００５／２１４８４１に開示の基材の表面には、特にその凹部の内部には、リンカーが塗布されている。当該リンカーは、官能基によって、生物学的基材を固定することが可能である。当該アメリカの出願では、当該出願内に記載されている基材が、分子の蛍光の増強に適していることについて、言及されていない。
【０００６】
ＵＳ  ６，９０２，７０５には、凹部を有し得、かつ、金属（例えば、金）によってコーティングされ得る基材について開示されている。基材の表面は、生物学的な物質（例えばＤＮＡ）が当該基材の表面に結合できるように、修飾されている。上記基材上にある凹部は、シグナルを攪乱および妨害することなく、本方法によって蛍光の測定を行い得るという、メリットを有している。しかし、蛍光シグナルの増強は、これらの基材を使用しても、達成できない。
【０００７】
本発明の目的は、基材を提供することであって、当該基材は、再生可能な方法によって製造され得、当該基材は、蛍光物質が基材の近傍（例えば、１０ｎｍ以内）にまで近づくと直ぐに、蛍光物質の蛍光を増強することができる。このとき、これらの基材は、ＭＥＦ測定において、増強因子を平均以上にまでする必要がある。
【０００８】
本発明は、１個または数個の蛍光分子の蛍光を増強するための、基材および当該基材の使用方法と関連している。上記基材は、互いが分離されている複数個の凹部を有している、固体状のポリマーキャリアーを有し、上記固体状のポリマーキャリアーは少なくとも一部が金属によってコーティングされている。
【０００９】
驚くべきことに、本発明の形態を有する基材は、蛍光分子または蛍光物質の少なくとも１つが近傍にあるときに、コヒーレントライトまたはそれ以外を用いて、蛍光分子または蛍光物質の各々の蛍光収率（fluorescence yield）（蛍光収量（quantum yield））を著しく増加させることができる（金属増強蛍光：ＭＥＦ）。“蛍光収率”または“蛍光収量”は、それぞれ、放射される光子の量と、吸収される光子の量との比として理解される。
【００１０】
本発明の基材を用いたときの蛍光収率は、従来公知の基材を用いたときの収率よりも何倍も高い。なお、従来公知の基材の表面は、通常、金属アイレットの状態にある。これまで、ＭＥＦ効果は、（ｉ）堆積された金属含有コロイドの形態の金属アイレットを有する表面、または、（ｉｉ）互いが分離されており、かつ、金属によってコーティングされている、表面の（ｉ）とは異なる領域、でのみ生じ得る、と考えられてきた。それ故に、上記の蛍光収率の増加は、驚きである（Ｍａｔｖｅｅｖａ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３４  （２００４）：  ３０３−１１；  Ｇｅｄｄｅｓ  ＣＤ．、  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃ  １２  （２００２）：１２１−１２９）。連続した金属の層を有する基材、または、エレベイション（elevations）を有しない基材は、それぞれ、金属表面自体の蛍光消光効果（fluorescence quenching effect）に起因して、ＭＥＦ効果を全く示さない、または、ＭＥＦ効果をごくわずかしか示さないことが知られている（Ｐｉｎｅｄａ  Ｅ．Ｃ．、  ｅｔ  ａｌ  ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  ８３  （１９８５）：  ５３３０−５３３７；  Ｂａｒｎｅｓ  Ｗ．  Ｌ．、  Ｊ  Ｍｏｄ  Ｏｐｔ，  ４５  （１９９８）：  ６６１−６９９）。当業者（本発明の知識を持っていない人）は、エレベイションを有する固体状のキャリアー、および、金属を用いてコーティングされる凹部を有するキャリアーを選択しない。
【００１１】
本発明の基材は、蛍光物質の蛍光を増強させるために使用される。本発明の基材は、蛍光分子の増強が求められる所であればどこでも使用できる（すなわち、蛍光収率の増加）。したがって、本発明の基材は、例えば、免疫アッセイ、核酸を用いた分子診断のあらゆる形態（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、細胞に基づくバイオアッセイ（よくあるものは、ハイスループットスクリーニング）、組織学的または細胞学的な試験、マルチプレックステストシステム（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ）に使用され得、標的分子を検出するための蛍光が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、蛍光の増強は、固体状のポリマーキャリアーの表面上に配置されている金属までの距離が、０〜５０ｎｍ、好ましくは１〜５０ｎｍ、さらに好ましくは１〜４０ｎｍ、さらに好ましくは２〜４０ｎｍ、さらに好ましくは１〜３０ｎｍ、さらに好ましくは２〜３０ｎｍ、さらに好ましくは３〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１〜２０ｎｍ、さらに好ましくは２〜２０ｎｍ、さらに好ましくは３〜２０ｎｍ、さらに好ましくは５〜２０ｎｍ、さらに好ましくは５〜１５ｎｍ、のときに起こる。
【００１３】
本明細書で使用している“蛍光分子（fluorescent molecules）”は、本発明の分子として解釈でき、当該分子は、電子磁波（例えば、特定の波長の光）によって励起されることにより、自発的に光を放射する。本明細書にて“蛍光物質（Fluorophores）”は、包括的用語であり、このような分子の同義語である。本明細書にて“蛍光物質（Fluorophores）”は、蛍光または弱い蛍光の各々を発する分子、および、通常は蛍光物質として定義されていない分子、も包含する。そのような分子の例は、タンパク質および核酸であり、これらの蛍光（“内部蛍光”（intrinsic fluorescence））は、芳香族化合物（例えば、アミノ酸であるトリプトファン、または、チロシン）によって媒介される。
【００１４】
本発明の“固体状のキャリアー（solid carrier）”は、あらゆるポリマー材料から構成されていてもよく、金属によってコーティングされていてもよく、凹部が形成されていてもよい。例えば、固体状のポリマーキャリアーは、合成ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリビニル塩化物またはポリカーボネート、シクロオレフィン、ポリメチルメタクリレート、ポリラクテート、または、これらの組み合わせ）から成る物であってもよいし、を含むものであってもよい。原則として、非ポリマーキャリアー（例えば、金属、セラミック、または、ガラス）も用いられ得、これらは金属によってコーティングされ得、かつ、これらには凹部が形成され得る。
【００１５】
上記固体状のキャリアーは、熱可塑性ポリマー、および、重縮合物からなる群から選択される少なくとも１つの材料を含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、熱可塑性ポリマーは、ポリオレフィン、ビニルポリマー、スチレンポリマー、ポリアクリレート、ポリビニルカルバゾール、ポリアセタール、および、フルオロプラスチックからなる群から選択される。
【００１７】
重縮合物は、好ましくは、熱可塑性重縮合物、デュロプラスチック重縮合物、重付加化合物（polyadducts）からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、固体状のキャリアーの材料には、有機物および／または無機物である、添加剤および／または充填材が含まれている。当該添加剤および充填材は、好ましくは、ＴｉＯ2、ガラス、炭素、色素、脂質、および、ワックスからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の更なる態様は、蛍光物質の蛍光を増強するための基材の製造方法に関するものであり、当該製造方法は、本発明の固体状のキャリアーを、少なくとも１つの金属によってコーティングする工程を有している。
【００２０】
本発明の更に別の態様は、蛍光物質の蛍光を増強するための基材に関するものであり、当該基材は、本発明の製造方法によって製造され得る。
【００２１】
凹部を有している本発明の固体状のキャリアーは、原則として、各種方法を用いて生産され得る（図１５参照）。
【００２２】
（ａ）凹部を有している固体状のキャリアーは、１ステップにて生産される（例えば、射出成形（図１５（ａ）参照））。
【００２３】
（ｂ）上記凹部は、更なるステップにて、既存の固体状のキャリアー中に導入される（例えば、ホットスタンピング、電子ビームリソグラフィー、または、反応性イオンエッチングまたはレーザー切除を伴う極紫外線（ＥＵＶ：extreme ultra violet））（図１５（ｂ）参照）。
【００２４】
（ｃ）ＢＤ−５０ブルーレイディスク（ＵＶナノインプリントリソグラフィー）を製造するときのように、固体状のキャリアー上に、薄く構成され得るポリマー層が塗布され、当該固体状のキャリアー中に、凹部が導入される（図１５（ｃ）参照）。
【００２５】
これらの構造の製造に特に適しているのは、通常、ナノインプリントリソグラフィーと呼ばれる方法である（Ｃｈｏｕ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｎｏ−ｉｍｐｒｉｎｔ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂ  Ｂａｎｄ  １４、  Ｎｏ．  ６、  １９９６，  Ｓ．  ４１２９−４１３３）。ナノインプリントリソグラフィーによってナノ構造物を製造するためには、通常は、ナノ構造物インデンター（nano-structured indenter）（“マスター”（master））のみならず、通常はモノマーまたはポリマーであるポジ（positive）が求められる。上記インデンターそのものは、ナノリソグラフィーによって生産され得る。上記インデンターそのものは、別途、エッチングによっても生産され得る。ポジが、基材の上に塗布され、次いで、当該ポジが、ガラス転移温度よりも高い温度にて加熱される。すなわち、インデンターを圧縮する前に、液化される。制御可能（さらに短期間）である加熱を実現するために、レーザー、または、ＵＶライトの各々が、頻繁に使用される。加熱時のポジの粘度の故に、インデンターのギャップが、これによって完全に満たされる。冷却の後で、上記インデンターが取り出される。本発明の基材における固体状のキャリアーに相当するポジは、スパッタリングの手段を用いて、金属によってコーティングされる。
【００２６】
リソグラフィーのためのインデンターの構築は、ナノ印刷によって実現され得る。材料として、ガラス、または、光を通すプラスチック材料が用いられる。
【００２７】
特に好ましくは、射出成形によって、凹部を有する固体状のキャリアーが製造される。ここで、鋳型の挿入物は、通常、Ｎｉガルバーニ（Ni galvanics）の手段によりリソグラフィー的に製造されたＳｉウエハーから取り除かれる。
【００２８】
原則として、上記固体状キャリアーには、形状がいくつかあり（例えば、球状、または、平面状）、平面状が特に好ましい。
【００２９】
本明細書にて“凹部（recess）”は、固体状のキャリアーの表面のレベル（level）と関連しており、当該表面は、（ｉ）凹部を取り囲み、（ｉｉ）キャリアーの中へと広がり、および、（ｉｉｉ）隆起または起伏とは異なり、キャリアーの外へ広がる。本発明の凹部は、側面の壁によって範囲が定められた底を有している。したがって、その深さは、上記表面から上記凹部の底までの距離である。固体状のキャリアーの凹部は、様々な形状（例えば、球型、卵型、四辺形、長方形）であり得る。
【００３０】
本明細書にて“複数個（plurality）”の凹部とは、本発明の固体状のキャリアーが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個、さらに好ましくは少なくとも３０個、さらに好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも１００個、さらに好ましくは少なくとも１５０個、さらに好ましくは少なくとも２００個の凹部を有していることを意図している。これらの凹部は、１０００μｍ2、好ましくは５００μｍ2、さらに好ましくは２００μｍ2、さらに好ましくは１００μｍ2の固体状のキャリアーの表面上に設けられ得る。あるいは、上記凹部は、好ましくは１０００μｍ、さらに好ましくは５００μｍ、さらに好ましくは２００μｍ、さらに好ましくは１００μｍの長さの幅（across）で広がり得る。
【００３１】
本明細書にて“互いが分離されている凹部（Recesses separated from each other）”とは、上記凹部が、その側面の範囲によって互いに分離されており、かつ、互いが結合しておらず、上記固体状のキャリアーの表面でも互いが結合していないこと、を意図している。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、固体状のキャリアーの凹部は長さと幅とを有しており、その長さと幅との比は２：１〜１：２であり、特に略１：１である。
【００３３】
上記固体状のキャリアーの凹部は、原則として、あらゆる形状をしている。しかしながら、特に好ましくは、凹部の長さと幅との比は、２：１〜１：２、好ましくは１，８：１、好ましくは１，６：１、好ましくは１，５：１、好ましくは１，４：１、好ましくは１，３：１、好ましくは１，２：１、好ましくは１，１：１、好ましくは１：１，８、好ましくは１：１，６、好ましくは１：１，５、好ましくは１：１，４、好ましくは１：１，３、好ましくは１：１，２、好ましくは１：１，１、特に好ましくは１：１である。
【００３４】
本発明の更に好ましい実施形態では、上記凹部の長さと幅とは、０．１μｍ〜２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜２μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１μｍ、好ましくは０．１μｍ〜０．８μｍ、好ましくは０．２μｍ〜０．８μｍ、好ましくは０．３μｍ〜０．８μｍ、好ましくは０．１μｍ〜０．６μｍ、好ましくは０．２μｍ〜０．６μｍ、好ましくは０．３μｍ〜０．６μｍ、最も好ましくは０．２μｍ〜０．６μｍである。
【００３５】
特に好ましくは、本発明の固体状のキャリアーの凹部は、本質的に円形である。すなわち“本質的に円形（essentially round）”は、卵型および楕円形も含む。上記凹部の形状は、固体状のキャリアーの表面の上面図（top view）にて可視化される。
【００３６】
凹部の深さは、好ましくは０．１μｍ〜５μｍ、好ましくは０．１μｍ〜４μｍ、好ましくは０．１μｍ〜３μｍ、好ましくは０．１μｍ〜２μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１μｍ、好ましくは０．１μｍ〜０．９μｍ、好ましくは０．１μｍ〜０．８μｍ、好ましくは０．２μｍ〜５μｍ、好ましくは０．２μｍ〜４μｍ、好ましくは０．２μｍ〜３μｍ、好ましくは０．２μｍ〜２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１μｍ、好ましくは０．２μｍ〜０．９μｍ、好ましくは０．２μｍ〜０．８μｍ、好ましくは０．３μｍ〜５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜４μｍ、好ましくは０．３μｍ〜３μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．２μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１μｍ、好ましくは０．３μｍ〜０．９μｍ、好ましくは０．３μｍ〜０．８μｍである。凹部の深さは、固体状キャリアーの金属化された表面から凹部の底までの距離である。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態によれば、あるひとつの凹部から別の凹部までの距離（“期間”）が、０．２μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．４μｍ、より好ましくは０．４μｍ〜１．３μｍである。本発明の更に好ましい実施形態によれば、あるひとつの凹部から別の凹部までの距離は、０．２μｍ〜２μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．４μｍ、好ましくは０．２μｍ〜１．３μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．３μｍ〜１．３μｍ、好ましくは０．４μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．４μｍ〜２μｍ、好ましくは０．４μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．４μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．４μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．４μｍ〜１．４μｍ、好ましくは０．５μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．５μｍ〜２μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．４μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．３μｍ、好ましくは０．６μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．６μｍ〜２μｍ、好ましくは０．６μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．６μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．６μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．６μｍ〜１．４μｍ、好ましくは０．６μｍ〜１．３μｍ、好ましくは０．７μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．７μｍ〜２μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１．８μｍ、好ましくは０．７μｍ〜１．６μｍ、好ましくは０．７μｍ〜１．５μｍ、好ましくは０．７μｍ〜１．４μｍ、好ましくは０．７μｍ〜１．３μｍであり、最も好ましくは、０．２μｍ〜１．４μｍ、または、０．３μｍ〜１．３μｍの何れかである。凹部（“期間”）の間の距離は、上記凹部の中心から測定される。
【００３８】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、固体状のキャリアー上の金属の層は、１０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１００ｎｍの厚さを有している。
【００３９】
上記固体状のキャリアー上の特に好ましい金属の層は、１０ｎｍ〜１９０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１８０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１７０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１６０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１４０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１３０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１２０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１１０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜９０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜８０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜６０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１９０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１８０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１７０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１６０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１４０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１３０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１２０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜１１０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜９０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜８０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜６０ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜５０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１９０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１８０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１７０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１６０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１４０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１３０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１２０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１１０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜９０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜８０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜６０ｎｍ、好ましくは２０〜５０ｎｍの厚さを有している。
【００４０】
本発明では、上記固体状のポリマーキャリアーは、少なくとも１つの金属によって“少なくとも部分（at least in part）”がコーティングされている。本明細書において“少なくとも部分”とは、上記凹部が配置されている上記固体状のキャリアーの、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは１００％が、少なくとも１つの金属を用いて、当該金属によってコーティングされていることを意図している。ＭＥＦ効果は金属表面を意味するが故に、固体状のキャリアーの表面は、少なくとも凹部の領域内にて、少なくとも１つの金属によってコーティングされることが、特に好ましい。上記発明では、上記固体状のキャリアーは、いくつかの（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または、少なくとも５つ）の金属の層を有し得る。当該金属の層は、順に重ねて配置されてもよく、違う金属によって形成されていてもよい。固体状のキャリアーの上にあるいくつかの金属の層を使う利点は、キャリアーの上に直接塗布されている最初の金属の層（例えば、クロム）が、さらなる金属の層の付着を改善できることにある。
【００４１】
本明細書における用語“順に重ねられている（arranged one on top of the other）”は、金属の層が、別の金属の層の上に間接的または直接的に配置されること、を意図している。本発明では、同じ金属または異なる金属による、金属の層のマルチレイヤードシステムが形成される。
【００４２】
上記金属の層は、好ましくは連続的であって、途切れていない。しかしながら、本発明では、金属の層、または、固体状のポリマーキャリアー上の金属の層が、蛍光の増強効果が損なわれること無く、途切れ（intermittent）得ることが見出され得た。上記途切れた金属の層は、例えば、本発明の基材の表面の伝導性の測定によって、実現され得る。低い伝導性、または、導電性がないことは、各々、基材の表面上の金属の層が途切れていることを意味する。途切れた金属の層は、例えば、実質的に完全に金属によってコーティングされた基材によって製造され得る。当該金属は、好ましくは塩を含有する溶液（例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、１０ｍＭ  リン酸緩衝液）と、所定の時間（１０〜９０分間）、接触したものである。
【００４３】
本発明の上記固体状のキャリアーは、“少なくとも１つの金属によってコーティングされている（coated at least by one metal）”。好ましくは、上記金属の層は、少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つ、さらに好ましくは少なくとも５つの異なった金属を含んでいる。上記金属は、周知の方法によって、固体状のキャリアーの上に塗布され得る。このとき、好ましくは、スパッタリング（陰極スパッタリング）、熱蒸着、電子ビーム物理蒸着、パルスレーザー堆積、陰極アーク蒸着、分子線エピタキシー、イオンビームサポート蒸着、または、イオンプレーティングが使用される。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記金属は、銀、金、アルミニウム、クロム、インジウム、ニッケル、パラジウム、プラチナ、亜鉛、スズ、および、これらの金属の１つ以上を含んでいる合金からなる群から選択される。
【００４５】
本発明によると、これらの金属または合金は、各々、本発明の上記固体状のキャリアーをコーティングするために使用され得る。特に好ましくは、銀、または、銀を含む合金として、銀、または、銀を含む合金を用いて固体状のキャリアーをコーティングすれば、特に高い増強効果が得られる。特に、銀、インジウム、および、スズを含む合金が好ましい。銀を含有している合金は、好ましくは１０％超（more than）、さらに好ましくは３０％超、さらに好ましくは５０％超、さらに好ましくは７０％超、さらに好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％超の銀含有率である。
【００４６】
少なくとも１つの金属によって固体状のキャリアーをコーティングした後、または、本発明の基材、若しくは、本発明の固体状のキャリアーを用いる前の各々において、上記固体状のキャリアー、または、基材の各々は、水性の組成物によって処理される。当該水性の組成物は、少なくとも、フッ素、塩素、臭素、および、ヨウ素からなる群から選択されるハロゲンの、酸または塩を含んでいるものである。
【００４７】
基材、または、固体状のキャリアーの各々に対する前処理を介した蛍光の増強は、少なくともハロゲンの酸またはハロゲンの塩を含んでいる水溶液（例えば、バッファー）を用いることによって、さらに増強され得る。それ故に、固体状のキャリアー、または、基材の各々を、酸、または、塩を含んでいる溶液を用いて前処理することが、特に好ましい。
【００４８】
また、少なくともハロゲンの酸または塩を含んでいる水溶液（例えば、バッファー）は、測定の間も、他の溶液の代わりに使用され得る。
【００４９】
本発明によれば、ハロゲングループの全ての酸、または、これらの塩は、放射性ハロゲンと共に適しているが、しかし、実際には望まれていない。特に、フッ素、塩素、臭素、および、ヨウ素のハロゲンの酸または塩が好ましく、塩化物（chloride）（特に、金属塩化物（metal chlorides））が最も好ましい。本発明に用いられる酸、または、塩は、アルカリ金属塩、または、アルカリ土類金属塩であることが好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、または、リチウム塩であることが特に好ましい。
【００５０】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、水性の組成物は、ＨＣｌ、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＪ、ＮａＣｌ、ＮａＦ、ＮａＢｒ、ＮａＪ、ＫＣｌ、ＫＦ、ＫＢｒ、および、ＫＪからなる群から選択される、酸または塩を少なくとも含んでいる。
【００５１】
少なくともハロゲンの酸または塩を含んでいる水性の組成物は、少なくとも１つのハロゲンの酸または塩に加えて、更なる物質（例えば、別の酸、または、別の塩）を含んでいてもよい。特に好ましくは、バッファー機能を有している物質（例えば、リン酸１水素２ナトリウム（disodium hydrogen phosphate）、リン酸脱水素カリウム（potassium dehydrogenate phosphate）、炭酸塩）が使用される。
【００５２】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、上記固体状のキャリアーは、少なくとも１分間、好ましくは少なくとも２分間、さらに好ましくは少なくとも５分間、さらに好ましくは少なくとも１０分間、さらに好ましくは少なくとも２０分間、水性の組成物によって処理される。
【００５３】
本発明によれば、少なくとも１つの金属によってコーティングされたキャリアーの蛍光増強効果は、固体状のキャリアーを、少なくとも１分間、少なくともハロゲンの酸または塩を含んでいる水性の組成物を用いて、好ましくは室温（２２℃）にてインキュベートした場合に特に高くなる、ことが示された。仮に上記インキュベートを高温（例えば、３０℃〜４０℃）にて実施すると、インキュベート時間は、相応して短縮され得る（例えば、少なくとも３０秒間）。仮に上記インキュベートを低温（例えば、１０℃〜２０℃）にて実施すると、インキュベート時間は、相応して長くなり得る（例えば、少なくとも２分間）。
【００５４】
好ましい実施形態によれば、本発明の基材は、キャピラリーチューブ；マイクロタイタープレート；マイクロ流体チップ；アッセイストリップ（ラテラルフローアッセイ（lateral flow assay）のためのもの）；光学顕微鏡（特に、高い解像度の手法に用いられるものであって、例えば、ポイントスキャナー原則に沿った共焦点レーザー顕微鏡、４Ｐｉ顕微鏡、ＳＴＥＤ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡）のためのキャリアー（例えば、スライドキャリアー（slide carrier））；センサーアレイ；または；その他の光学検出器；の一部である。
【００５５】
特に好ましくは、本発明の基材のマイクロタイタープレートへの使用である。当該マイクロタイタープレートは、６個、１２個、２４個、４８個、９６個、３８４個、または、１５３６個のウェルを有することができる。マイクロタイタープレートは、様々な測定、および、アッセイに使用され、速やかにサンプルの蛍光が測定される。本発明の基材をマイクロタイタープレートのウェル内に設けることにより、サンプルの蛍光収率は、著しく増加し得る。上記基材は、様々な方法によって、ウェルの中に、導入および固定され得る。基材は、接着剤、溶接技術（例えば、レーザー溶接）、および、熱接合の手段によって、ウェル内に固定され得る。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、固体状のキャリアーは、環状オレフィンコポリマー（cycloolefine co-polymer）、または、環状オレフィンポリマー（cycloolefine polymer）を含んでいるもの、または、から成るものであって、当該固体状のキャリアーは、マイクロタイタ‐プレートの一部、または、マイクロプレートのウェルの一部である。この点において、ＣＯＰ  １０６０Ｒ  （Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）  １０６０Ｒ）に、特に適している。上記キャリアーは、その中にて、１０〜６０ｎｍ、好ましくは４０ｎｍ以下（up to）、金属（例えば、銀）によってコーティングされている。
【００５７】
蛍光物質（fluorophores）のような蛍光材料を用いた特定の測定が、キャピラリーチューブの中で行われる。それ故に、本発明の基材は、キャピラリーチューブの中に設けられることが好ましい。使用の例としては、サイトメトリー、または、フローサイトメトリーが挙げられ、蛍光の計測によって、蛍光細胞または蛍光標識された細胞の、数または種類が決定される。
【００５８】
蛍光の計測のために、マイクロ流体チップ（例えば、“ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ”への適用）内への広範な適用が行われる。当該マイクロ流体チップでは、本発明の基材は、当該チップの検出ラインに設けられ得る。
【００５９】
本発明の基材は、従来のキュベット内にも設けられ得る。それ故に、蛍光の計測において蛍光収率が著しく増加し得、その結果、サンプル中の蛍光物質が最低の量のときでさえ、計測を行うことができる。本発明では、あらゆる形状のキュベットを用い得る。
【００６０】
本発明の基材（例えば、検出ラインにおける基材）は、アッセイストリップシステム（ラテラルフローアッセイ）と共に、用いられ得る。これらは、標識された検体（例えば、蛍光標識された抗体）の蛍光を増強するために、高速試験、または、インフィールド試験（管理ポイント（point of care））のために使用され、試験の感度を向上させる。
【００６１】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、本発明の基材は、顕微鏡観察（特に蛍光顕微鏡観察）に用いられるスライドキャリアー上にも適用される。細胞構造物の標識に用いられた蛍光物質の蛍光は、選択的に増強され得る。当該方法における光学分解能は、著しく向上し得る。その結果、シグナル／ノイズの比を最適化する光の強度が、抑えられる。応用の範囲は、高分解能の手法（ポイントスキャナー原則に沿った共焦点レーザー顕微鏡、４Ｐｉ顕微鏡、ＳＴＥＤ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡）である。
【００６２】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、基材の表面をコーティングしている金属は、蛍光分子が直接的および／または間接的結合するための分子を、少なくとも部分的に含んでいる。
【００６３】
本発明の基材は、蛍光物質が基材の空間的に近く（好ましくは、２０ｎｍ以下）に位置していると、蛍光分子、または、蛍光物質の蛍光を増強させ得る。蛍光物質、または、蛍光材料の各々は、液体中にて、自由に移動し得る。このとき、これらの蛍光物質、または、蛍光材料の各々が本発明の基材に近づいたときにのみ、蛍光が増強される。蛍光物質、または、蛍光材料の各々が基材に向かって接近する確率を増加させるために、（ｉ）蛍光物質自体、または、蛍光分子自体の何れかに結合し得る分子（直接結合）、または、（ｉｉ）蛍光物質、または、蛍光分子が結合された分子（例えば、蛍光標識された抗体、間接結合）を、基材の表面（例えば、金属のコーティングの上）に、不可逆的または可逆的に結合させることが、特に有利である。そのような分子を金属構造に結合させるための方法は、十分に知られている。最もシンプルなケースにおいて、結合は、金属表面上のタンパク質の物理化学的吸着を経て実現される（イオン的、および、疎水的な相互作用を介するもの）（例えば、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎ  ９１  （２００１）：  ２３３−２４４）。金属表面の誘導体化（derivatization）に従ってタンパク質を固定する、共有結合方法も知られている（例えば、ＧＢ  Ｓｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６８  （１９９６）：  ４９０−７）。
【００６４】
直接的および／または間接的に蛍光分子または蛍光物質が結合するための分子は、それぞれ、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー（aptamers）、および、これらの組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
【００６５】
一方で、これらの分子は、蛍光物質または蛍光分子（例えば、抗体およびその断片、核酸、酵素）と直接結合することができる。一方で、これらの分子は、蛍光物質または蛍光材料の各々を備えている他の分子とも結合することができる。
【００６６】
本発明の更なる態様は、本発明の基材を備えている、キャピラリーチューブ、チップ、好ましくはマイクロ流体チップ、キュベット、マイクロタイタープレート、蛍光顕微鏡のキャリアー、または、光学検出器（optical detector field）と関連している。
【００６７】
本発明の更なる態様は、本発明の基材、酵素によって標識化され、かつ、検体に結合する分子、および、酵素の蛍光基質を有する、少なくとも１つのマイクロタイタープレート、少なくとも１つのキャピラリーチューブ、少なくとも１つのチップ（好ましくは、マイクロ流体チップ）、少なくとも１つのキュベット、および／または、少なくとも１つのアッセイストリップを備えているセットと関連している。
【００６８】
本明細書において“酵素の蛍光基質（Fluorescence substrate for an enzyme）”とは、酵素の活性中心の内部や上部に結合することができる基質であって、これによって、当該基質は、蛍光特性を得ることができる。もちろん、上記基質は、酵素と結合する前に、すでに蛍光特性を有していてもよい。
【００６９】
上述した凹部を有する固体状のキャリアーは、その後、１つまたは複数の金属（例えば、２つ、３つ、４つ、または、５つの金属）によってコーティングされる。固体状のキャリアーに金属をコーティングするための方法は、当業者にとって周知であって、好ましくは、ＰＶＤ法（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｖａｐｏｕｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（例えば、スパッタリング、および、真空蒸着）が使用される。
【００７０】
それ故に、本発明の好ましい実施形態によると、少なくとも１つの金属は、スパッタリング、熱蒸着、電子ビーム物理蒸着、パルスレーザー堆積、陰極アーク蒸着、分子線エピタキシー、イオンビームサポート蒸着、イオンプレーティング、または、従来技術の各々による他のあらゆるプロセスによって、固体状のキャリアーの表面の上に、塗布される。
【００７１】
本発明の基材の表面上に、蛍光物質または他の蛍光材料が、直接的または間接的に結合することを可能にするために、基材の表面上の金属のコーティングの少なくとも一部の上に、分子が塗布される。これによって、吸着剤、または、共有結合化学誘導体化剤（covalent chemical derivatization）を介した、蛍光物質の直接的および／または間接的な結合が可能となる。
【００７２】
本明細書において“少なくとも一部（at least in part）”とは、金属によってコーティングされた固体状のキャリアーの、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは１００％に対して、蛍光物質の直接的および／または間接的な結合のための分子が備えられていることを意図している。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態によると、蛍光物質が直接的および／または間接的に結合するための上記分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー、および、これらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、サンプル中の少なくとも１つの検体を測定または定量するための方法に関し、当該方法は、以下の工程を含む；
ａ）上記少なくとも１つの検体を、少なくとも１つの蛍光物質を用いて、直接的または間接的に標識する工程、
ｂ）上記工程ａ）の少なくとも１つの標識された検体、または、蛍光性の検体を、本発明の基材の上に塗布する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの蛍光物質を、上記基材を適切な波長の光を用いて照射することによって、上記少なくとも１つの蛍光物質を励起させる工程、および、
ｄ）上記サンプル中の少なくとも１つの検体の存在を測定するために、蛍光を測定する工程。
【００７５】
本発明の基材は、蛍光物質、および、他の蛍光分子または蛍光材料の蛍光収率を著しく上げ得、本発明の基材は、サンプルの蛍光を測定する方法に用いられ得る。そのような方法の中で本発明の基材を使用することにより、当該方法の感度を著しく上げることができ、その結果、測定される検体の量が極めて少量な場合でも測定可能であるのみならず、検体（少量の検体）の定量を、より正確に行うことができる。
【００７６】
第一の工程では、測定または定量されるサンプル内の検体が、蛍光物質または蛍光材料を使用して、直接的または間接的に標識される。検体の直接的な標識では、少なくとも１つの蛍光物質、または、少なくとも１つの蛍光材料が、測定または定量される検体の各々と、共有結合または非共有結合する（例えば、水素結合、静電結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用）。間接的な標識では、検体と結合できる蛍光標識された分子（例えば、抗体、または、その断片）が、サンプル内に導入される。当該第一のプロセスは、任意である。その理由は、既に蛍光に基づく適切な励起（fluoresce−upon appropriate excitation）を行うことが可能な、測定または定量の各々に供される検体が存在するからである。そのような検体を含むサンプルは、本発明の基材の上に直接塗布され得る、または、サンプルの処理に供され得る（本発明の方法のｂ）の工程を参照）。
【００７７】
ａ）の工程に由来する少なくとも１つの標識された検体、または、蛍光性の検体を、本本発明の基材の上に塗布した後、蛍光物質、蛍光材料または蛍光検体の各々は、蛍光の放射のための適切な波長のコヒーレントライトまたは非コヒーレントライト（例えば、レーザー、または、キセノンフラッシュライト）を用いる照射手段によって、励起される。
【００７８】
本明細書において“適切な波長のライト（Light at a suitable wavelength）”とは、本発明の方法に使用される光であって、接触を介して、物質からの蛍光の放射を誘導することに適した波長の光、である。例えば、波長４８５ｎｍの波長をもつ光は、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）の蛍光の放射を誘導することに適している。
【００７９】
光によって蛍光物質を励起するとき、これらの物質は、特定の波長の光（蛍光）を放射する。特定の波長を有して放出された当該光は、測定され、さらに、サンプル内に存在する検体を測定または定量するために用いられ得る。上記放射された光は、検出機により計測される（例えば、フォロマルチプライヤー）。上記発明では、市販のマイクロタイタープレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｆ２００ｐｒｏ、  ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦｉｌｔｅｒＭａｘ  または  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｓｅｒｉｅｓ等）、Ｆｌａｔ  Ｂｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（例えば、Ｔｅｃａｎ  ＬＳ−  Ｒｅｌｏａｄｅｄ、蛍光顕微鏡、または、その他の適当な解析システム（Ｒｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ，  Ａｂｂｏｔ  ＡｘＳＹＭ、  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｏｐｕｓ  Ｐｌｕｓ）、適当な蛍光検出器が組み込まれている場合）が用いられ得る。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの蛍光物質は、３６０〜７８０ｎｍ、好ましくは４９０〜６８０ｎｍのレンジに、放射波長を有している。
【００８１】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの蛍光物質は、４１０〜８００ｎｍ、好ましくは５１０〜７１０ｎｍのレンジに、放射波長を有している。
【００８２】
少なくとも１つの蛍光物質は、好ましくは、メトキシクマリン、アミノクマリン、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、５−ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、  フィコエリトリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３．５、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ｃｙ５．５、  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、および、Ｃｙ７からなる群から選択され、好ましくは、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３、フィコエリトリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ５、および、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０からなる群から選択される。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの蛍光物質を用いて検体を間接的にラべリングすることは、蛍光物質によって標識された検体結合分子によって行われる。
【００８４】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、検体結合分子は、抗体、抗体の断片、好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはｓｃＦｖの断片、核酸、酵素、脂質、ウイルス粒子、アプタマー、および、これらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８５】
本発明について、後述する図面および実施例を用いてさらに詳細を説明する。しかしながら、本発明は、これらに限定されない。
【００８６】
図１は、本発明の平面的な固体状のキャリアーの３次元ＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のイラストを示し、当該固体状のキャリアーは、金属によってコーティングされている（実施例１参照）。
【００８７】
図２は、蛍光物質の種類と、銀の層の厚さ（２０ｍｍのＡｇ、および、５０ｍｍのＡｇ）とに依存した、ＭＥＦ効果を示している。ＭＥＦ効果は、“相対的増加（relative increase）”にて示される。相対的増加は、６００秒間の測定期間の最後におけるシグナル（ｔ６００）の、測定開始時におけるシグナル（ｔ０）に対する比である。相対的増加が１．０の場合、シグナルの変化が無く、ＭＥＦは無い（no MEF）ことを意味している。相対的増加が大きいほど、ＭＥＦ効果が強いことを示している。蛍光物質によって変化するものの、一般的に、金属の層の厚さが増すにしたがって、ＭＥＦ効果が強くなる傾向が観察される。
【００８８】
図３は、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ  ６８０を用い、５ｎｍの厚さの銀の層を厚くしたときのＭＥＦの関係を示しでいる（実施例２参照）。層の厚さは５ｎｍから始め、ＭＥＦ効果の著しい増加を観察した。
【００８９】
図４および図５は、本発明の基材／構造物のＡＦＭ像を示し、当該基材／構造物は、異なった距離（period）の凹部を有している。
【００９０】
図６は、構造物の距離（０．８〜２．２μｍ）と、ＭＥＦ効果との関係を示している。
【００９１】
図７は、構造物の深さと、ＭＥＦとの関係を示している。
【００９２】
図８および図９は、コロイドによってコーティングされた表面と、従来技術のＭＥＦ表面（ｃｏｍｐａｎｙ  ＰＬＡＳＭＯＮＩＸ；  Ｑｕａｎｔａ−Ｗｅｌｌｓ  ２；“競合構造物”）とを比較して得られた、ＭＥＦ増強因子を示している。
【００９３】
図１０は、ナノピラー（エレベイション（elevations））、および、逆のナノピラー（凹部）における、ＭＥＦカイネティクスを示している。
【００９４】
図１１は、本発明の基材を用いて行った、抗ウサギＩｇＧ蛍光免疫アッセイを示している。
【００９５】
図１２は、金属の層によりコーティングされたキャリアーを備えている、本発明の基材を示している。固体状のキャリアーは、深さ、幅、長さを有する凹部を有している。上記凹部は、互いまでの距離（period）を所定の距離とした状態にて、固体状キャリアーの上に位置している。
【００９６】
図１３は、本発明の固体状のキャリアーの、上面図（Ａ）、および、断面図（Ｂ）である。固体状のキャリアーの凹部は、幅、長さ、および、深さによって特徴付けられ、互いまでの距離が、所定の距離である。
【００９７】
図１４は、各種バッファーを使用したときのＭＥＦ効果を示している。
【００９８】
図１５は、凹部を有する本発明の固体状のキャリアーを製造し得る、各種方法を示している。
【００９９】
〔実施例〕
〔実施例１．本発明の基材の製造〕
公知の先行技術に基づき（Ｐｏｍｐａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １  （２００６  ）：  １２６−１３０；  Ｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １５  （２００９）：  ２０  （２８）、  ＵＳ  ２００９／０２６２６４０参照）、できるだけ高く、細長い塔、またはピラーのような構造物（“ナノピラー”）の製造を試みた。構造物の高さに対する底の直径の比（“縦横比（aspect ratio）”）の高い比（１：２〜１：３）の故に、エバポレーションにおける金属の層の薄層化、および、文献のＭＥＦ効果に必要な金属アイレット構造物の製造を実現する。したがって、底の直径が異なり（２５０〜５５０ｎｍ）、かつ、高さが異なる（２５０〜８５０ｎｍ）、“ピラー”（エレベイション）を製造した。
【０１００】
上記基材の製造のために、インジェクションエンボス（injection embossing）と呼ばれる、特別な射出成形を用いた。インジェクションエンボスでは、熱可塑性プラスチックの溶解物が、僅かに開いたツール（tool）内に導入され、このとき、圧縮する工程（エンボス）が、同時に行われる。射出成形のためのナノ構造化されたインデンター（indenter）を、リソグラフィーにて製造されたシリコンマスターから、ニッケルガルバーニの手段によって取り除いた。本明細書においてシリコンマスターとは、正のラッカー（positive lacquer）によってコーティングされたシリコンウエハーを意図し、“レザーリソグラフィー”の手段によって、露光され、その後に現像されたものである。
【０１０１】
意外にも、金属によってコーティングされ、かつ、凹部を有する固体状のキャリアー（ＩＮＰｓ）のみが、著しいＭＥＦ効果を示した。一方で、エレベイションを有する固体状のキャリアーに基づく基材は、全くＭＥＦ効果を示さないか、または、極めて僅かなＭＥＦ効果しか示さなかった（参照図１０）。それ故に、ＩＮＰ構造について、さらに調査した。
【０１０２】
〔実施例２．金属の層の厚さの影響〕
直径約４５０μｍの凹部を有する固体状のキャリアーの表面上にある金属の層の厚さの影響を調査するために、様々な厚さの銀の層を、真空蒸着にて形成した。
【０１０３】
表面上への、蛍光標識された抗体の直接の吸着は、感度および増強因子に関して、異なる構造の表面同志を比較する、最も容易な方法である。ＭＥＦ効果は、以下のように示される。ＭＥＦの無い表面と比較して、抗体の結合カイネティクス（“ＭＥＦカイネティクス”）が、リアルタイムにて試験され得る。表面の近くの分子は、さらに輝く可能性があるが、しかし、離れた非結合分子は、それ以上に輝くことはない。次いで、蛍光標識された抗体を含んでいる溶液が、ナノ構造化された表面の上に滴下（drop-wise）されて配置され、適当な蛍光測定機器（Ｔｅｃａｂ２００Ｆ  ｐｒｏ）を使用して、経時的なシグナルの変化が記録された。
【０１０４】
“ＭＥＦカイネティクス”のパラメーターから離れて、増強因子を決定することは可能である。この場合、ナノ金属構造を有している表面上において、特定の濃度の蛍光標識された抗体に由来するシグナルと、ナノ金属構造を有していない表面上において、同じ抗体に由来するシグナルと、を比較する。これは、単に、効果的な占有密度（つまり、表面上の抗体の実際の量）を同じにすることを、確実にしたにすぎない。
【０１０５】
標識された２次抗体（アルカリフォスファターゼによって標識された、ロバの抗ヤギ抗体）を用いて、結合した抗体（ヤギの抗ウサギＦＩＴＣ）を検出することによって、試験された表面において抗体の占有濃度に有意差が無いことを示すことは、容易に行われ得る。
【０１０６】
製造された様々な厚さの金属の層では、０〜５０ｎｍの範囲の銀のＭＥＦ効果が、試験された蛍光分子とは無関係に、著しく増加することが示された（図２参照；相対的増加が１であることは、ＭＥＦ効果が無いことを示す）。
【０１０７】
図３は、５ｎｍという最低限の層の厚さが、ＭＥＦを得るために必要であることを示している。さらに、図３は、５ｎｍの厚さの金属層を更に厚くすると、ＭＥＦ効果が継続して増加することを示している。
【０１０８】
〔実施例３．構造物の距離の影響〕
凹部から他の凹部までの距離は、本発明の基材のＭＥＦ効果に影響を及ぼし得る。それ故に、異なる距離を有する様々な固体状のキャリアーを、例えば、銀を用いてコーティングした。
【０１０９】
【表１】
2018530754.tif 000002
【０１１０】
図４および図５は、それぞれ、０．８μｍまたは２．２μｍの距離を有する、本発明の２つの基材のＡＦＭ像を示し、銀の層の厚さは５０ｎｍである。
【０１１１】
ＭＥＦ効果の根拠を見つけるために、１〜７の全てのフィールド（fields）において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６８０（１３ｎＭ  ｉｎ  ｌ０ｍＭ  ＰＢＳ，  ｐＨ  ７．４）のＭＥＦカイネティクスを作成した（図６参照）。これに関して、距離が０．８〜１．０μｍであるときに、ＭＥＦ効果が最高値であった。１．２ｎｍの距離を起点として、ＭＥＦ効果は明らかに低下したが、しかしまだ、ＭＥＦ効果が存在した。
【０１１２】
下記の表は、フィールド１（０．８μｍ）、および、フィールド２（１．０μｍ）における、様々な蛍光標識された抗体のＭＥＦカイネティクスの測定の、相対的増加（シグナル  ｔ＝３００ｓ／シグナル  ｔ＝０ｓ）を示している。これら測定のためのＩＮＰｓ上の銀の層の厚さは、２０ｎｍであった。このとき、それぞれの蛍光物質を用いて標識されたヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４；  ｃ  ＝１３ｎＭ  にて希釈した）を使用した。
【０１１３】
【表２】
2018530754.tif 000003
【０１１４】
ＩＮＰｓ上のＭＥＦ効果は、したがって、波長レンジＥｘ／Ｅｍが４８５／５２０（ＦＩＴＣ）〜６８０／７２０（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ  ６８０）である様々な蛍光物質を用いて、明らかにした。ＩＮＰｓの使用は、特別な蛍光物質に制限されない。
【０１１５】
〔実施例４．凹部の深さのＭＥＦ効果に対する影響〕
凹部（逆にしたナノピラー；ＩＮＰｓ）の深さの影響を調べるために、異なる深さの凹部（６０ｎｍ、２４０ｎｍ、５５０ｎｍ、７５５ｎｍ、および、８７４ｎｍ）を有する固体状のキャリアーを製造し、かつ、銀（層の厚さ２０ｎｍ）を用いて真空蒸着した。
【０１１６】
蛍光標識した抗体（“ＭＥＦカイネティクス”）を用いた吸着試験によって、凹部の深さを増加させるとともに、ＭＥＦ効果が増加することが明らかになった。しかしながら、深さが６０ｎｍ未満の凹部を有する固体状のキャリアーを用いた場合、ＭＥＦ効果が決定されたが、当該ＭＥＦ効果は、他のキャリアーと比較すると明らかに低かった（図７参照）。
【０１１７】
〔実施例５．試験の比較〕
本発明の基材は、一般的に用いられている構造物と比較すると、増強されたＭＥＦ効果を示した。その根拠を見つけるために、文献（Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｔ  ｃｏｌｌｏｉｄ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ．，  Ｃ  Ｌｏｂｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｕｌ  ２００１；  １４（４）：  ２１５−２２）に開示されている方法によって、マイクロタイタープレートを銀コロイドによってコーティングした。そして、当該マイクロタイタープレートの増強因子（同様の抗体の表面濃度にて、銀コロイド無しのときの表面上のシグナルと、銀コロイド有りのときの表面上のシグナルとの比として、定義される）は、凹部（２０ｎｍ銀、０．８μｍ距離）を有する本発明の構造物と比較して、算出された。付け加えると、生産情報（ｃｏｍｐａｎｙ  ＰＬＡＳＭＯＮＩＸ；  Ｑｕａｎｔ−Ｗｅｌｌｓ  ２）によるＭＥＦに基づいた市販のマイクロタイタープレートシステムのみが、調査された。
【０１１８】
本発明の基材の増強因子を、図９に示す。本発明の増強因子は、コロイドプレート、または、ＰＬＡＳＭＯＮＩＸによるプレートよりも、１０倍高かった。明らかに低い増強因子は別として、ＰＬＡＳＭＯＸによるマイクロタイタープレートは、さらに、典型的なＭＥＦカイネティクスを示さない（図７と比較して図９を参照）。
【０１１９】
〔実施例６．抗ウサギＩｇＧ蛍光免疫アッセイ〕
本発明の基材の表面、コロイドによってコーティングされたマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の表面、および、Ｇｒｅｉｎｅｒ社による標準的なマイクロプレートを、従来技術の免疫アッセイに用いられているように、室温にて２時間、ウサギＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）を含有しているＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の溶液を用いてコーティングした。次いで、上記溶液を取り除き、０．１１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて表面を洗浄し、非特異的な結合を防ぐために、当該表面を、１時間、５％  ポリビニルピロリドン溶液と接触させた。ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した更なる洗浄工程の後、ビオチン標識された様々な濃度の抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、１時間、室温にてインキュベーションした。最後の洗浄ステップの後、最終的に、この抗ウサギＩｇＧ抗体の結合を、Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンを用いたＭＥＦカイネティクス測定の手法によって、６００秒間を超えて検出した（図１１参照）。標準的なマイクロタイタープレート上では、ＭＥＦカイネティクスが全く生じておらず、それ故に、免疫アッセイも実行できないことが明らかになった。しかしながら、コロイドにてコーティングされたマイクロタイタープレートは、わずかにＭＥＦカイネティクスを示した。一方、本発明の基材は、著しく特徴のあるＭＥＦカイネティクスを示し、したがって、本質的に急なキャリブレーションカーブ（steeper calibration curve）を有する免疫アッセイはまた、著しく高い感度を有する。
【０１２０】
この実施例に用いられた本発明の基材は、抗体にてコーティングされる前には、電気伝導率を示した。ＭＥＦカイネティクスの測定では、基材の電気伝導率は検出されなかった。これもまた、ＰＢＳバッファーとの接触による塩化銀の形成によって、引き起こされた。
【０１２１】
〔実施例７．使用されるバッファーに基づくＭＥＦ効果〕
使用されるバッファーに基づくＭＥＦ効果を調査するために、実施例３と同様に、蛍光標識された抗体（Ｃｙ５にて標識されたヤギの抗ウサギ抗体）の吸着に基づくＭＥＦカイネティクスを調べた。このとき、ＰＢＳバッファーの代わりに、純度が高いリン酸バッファー（ＰＢ；  １０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、１％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウム水溶液、および、ｄｉＨ2Ｏを使用した。上記実験は、１μｍの距離を有する基材の上にて行った（フィールド２と一致する。実施例３参照）。図１４から明らかなように、ＰＢＳからの吸着は、シグナルの増加と高い関係性があった。しかし、他の溶液からの抗体の吸着に関する著しいシグナルもまた、認められた。これは、実施例６にも記載されている、塩化銀の層が形成され得ることの結果であり得る。当該塩化銀の層は、増強効果に対して、正の影響を有している。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の平面的な固体状のキャリアーの３次元ＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のイラストを示し、当該固体状のキャリアーは、金属によってコーティングされている（実施例１参照）。
【図２】蛍光物質の種類と、銀の層の厚さ（２０ｍｍのＡｇ、および、５０ｍｍのＡｇ）とに依存した、ＭＥＦ効果を示している。
【図３】ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ  ６８０を用い、５ｎｍの厚さの銀の層を厚くしたときのＭＥＦの関係を示しでいる（実施例２参照）。
【図４】本発明の基材／構造物のＡＦＭ像を示している。
【図５】本発明の基材／構造物のＡＦＭ像を示している。
【図６】構造物の距離（０．８〜２．２μｍ）と、ＭＥＦ効果との関係を示している。
【図７】構造物の深さと、ＭＥＦとの関係を示している。
【図８】コロイドによってコーティングされた表面と、従来技術のＭＥＦ表面（ｃｏｍｐａｎｙ  ＰＬＡＳＭＯＮＩＸ；  Ｑｕａｎｔａ−Ｗｅｌｌｓ  ２；“競合構造物”）とを比較して得られた、ＭＥＦ増強因子を示している。
【図９】コロイドによってコーティングされた表面と、従来技術のＭＥＦ表面（ｃｏｍｐａｎｙ  ＰＬＡＳＭＯＮＩＸ；  Ｑｕａｎｔａ−Ｗｅｌｌｓ  ２；“競合構造物”）とを比較して得られた、ＭＥＦ増強因子を示している。
【図１０】ナノピラー（エレベイション（elevations））、および、逆のナノピラー（凹部）における、ＭＥＦカイネティクスを示している。
【図１１】本発明の基材を用いて行った、抗ウサギＩｇＧ蛍光免疫アッセイを示している。
【図１２】金属の層によりコーティングされたキャリアーを備えている、本発明の基材を示している。
【図１３】本発明の固体状のキャリアーの、上面図（Ａ）、および、断面図（Ｂ）である。
【図１４】各種バッファーを使用したときのＭＥＦ効果を示している。
【図１５】凹部を有する本発明の固体状のキャリアーを製造し得る、各種方法を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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