(57)【要約】本開示は、ＣＲＩＳＰＲに使用される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態において、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡの改善された特性を提供する。ある特定の実施形態において、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｃｒＲＮＡの改善された特性を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる修飾ｃｒＲＮＡを含む、化合物。
【請求項２】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、５’−安定化である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、３’−安定化である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、チミンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、修飾核酸塩基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、中性ヌクレオシド間結合である、請求項９または１０に記載の化合物。
【請求項１２】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メトキシプロピル基を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホノ酢酸を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メチルホスホン酸を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のリン酸ジエステルヌクレオシド間結合を有する、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾結合は、互いに同じである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの５’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項９〜１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの３’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項９〜２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項９に記載の化合物。
【請求項２３】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、２’−デオキシヌクレオシドを含まない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記ｃｒＲＮＡの前記５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
前記５’末端ヌクレオシドは、非二環式２’−修飾糖部分を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記５’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
前記５’末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２９】
前記ｃｒＲＮＡの前記５’末端の前記ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｙｚＮｙｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｙは、非修飾２’−デオキシ糖部分、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分、２’−Ｆ修飾糖部分、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から独立して選択される糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択される中性ヌクレオシド間結合であり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、前記ｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項３１】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｍｓＮｘｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
Ｎｍは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｎｘは、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分及び２’−Ｆ修飾糖部分の中から選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、前記ｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ｃｒＲＮＡの前記３’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
前記ｃｒＲＮＡの前記３’末端ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｓＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ａは、ｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｚＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択されるヌクレオシド間リン酸結合または中性ヌクレオシド間結合であり、
Ａは、ｃｒＲＮＡの残りの部分であるが、
但し、前記３’末端Ｎｒが２’−Ｆ糖部分を含む場合、ｚはヌクレオシド間リン酸結合ではないものとする、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３６】
前記修飾ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
前記７つの５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
前記７つの５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、互いに同じである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記７つの５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は各々、２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｆの中から独立して選択される、請求項３６に記載の化合物。
【請求項４０】
前記７つの５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、２’−Ｏ−メチルと２’−Ｆとが交互になっている、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４２】
前記修飾ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、少なくとも４つの修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記修飾糖部分の各々は、互いに同じである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の各修飾糖部分は、ｃＥｔである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４５】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４６】
前記ｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４７】
前記ｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４８】
前記ｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項４７に記載の化合物。
【請求項４９】
前記ｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項４７に記載の化合物。
【請求項５０】
前記ｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、請求項４７に記載の化合物。
【請求項５１】
前記ｃｒＲＮＡは、２０〜２８の結合ヌクレオシドからなる、請求項４７に記載の化合物。
【請求項５２】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、１２個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項１〜５１ののいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５３】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５４】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、アルキンまたはアジドから選択される修飾を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５５】
前記化合物は、前記ｃｒＲＮＡからなる、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５６】
前記化合物は、共役基を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５７】
前記共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５８】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分の前記核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５９】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分の前記核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに１００％相補的である、請求項５８に記載の化合物。
【請求項６０】
細胞を、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項６１】
前記細胞は、Ｃａｓ９を発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞を、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の化合物、及びＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【請求項６３】
細胞を、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の化合物、及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項６４】
細胞を、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の化合物、ならびにＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項６５】
細胞を、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の化合物、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項６６】
前記ｃｒＲＮＡは、２０〜３２個のヌクレオシドからなる、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で前記細胞に取り込まれる、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
細胞を、請求項５４に記載の前記修飾ｃｒＲＮＡ、ならびにアルキン及びアジドの中から選択される修飾を含むｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項６９】
前記細胞を、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞は、Ｃａｓ９を発現する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞は、動物細胞である、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
動物に、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の修飾化合物を投与することを含む、方法。
【請求項７３】
前記投与は皮下である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与は、くも膜下腔内投与である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記動物は、Ｃａｓ９を発現する、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを投与することを含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記プラスミドは、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
標的遺伝子は、編集される、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｃｒＲＮＡは、前記標的遺伝子が編集された後に分解される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｃａｓ９は、前記ｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８４】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾されている、請求項５に記載の化合物。
【請求項８５】
１０個の５’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項３６に記載の化合物。
【請求項８６】
前記１０個の５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、互いに同じである、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
前記１０個の５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は各々、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルの中から独立して選択される、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８８】
前記１０個の５’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、２’−Ｆである、請求項８６に記載の化合物。
【請求項８９】
ｃｒＲＮＡモチーフは、表Ａに列挙されるモチーフの中から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項９０】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは、前記ｃｒＲＮＡの４つの３’末端ヌクレオシドである、請求項４２または８３〜８９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９１】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含む、請求項９０に記載の化合物。
【請求項９２】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、５つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項４２または８３〜９１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、６個の修飾ヌクレオシドを含む、請求項４２または８３〜９１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９４】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項４２または８３〜９１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９５】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、９つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項４２、８３〜８８、または９０〜９１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９６】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分は、二環式糖部分である、請求項４２または８３〜９５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９７】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の２つの３’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、請求項９６に記載の化合物。
【請求項９８】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、５つの二環式糖部分を含む、請求項９７に記載の化合物。
【請求項９９】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、６つの二環式糖部分を含む、請求項９７に記載の化合物。
【請求項１００】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、９つの二環式糖部分を含む、請求項９５に記載の化合物。
【請求項１０１】
各二環式糖部分は、ｃＥｔ及びＬＮＡの中から独立して選択される、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０２】
各二環式糖部分は、ｃＥｔである、請求項１０１に記載の化合物。
【請求項１０３】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記５’末端のヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項４２または９０〜１０２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０４】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記５’末端のヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、請求項１０３に記載の化合物。
【請求項１０５】
前記二環式糖部分は、ｃＥｔまたはＬＮＡである、請求項１０４に記載の化合物。
【請求項１０６】
二環式糖部分は、ｃＥｔである、請求項１０５に記載の化合物。
【請求項１０７】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項８３〜１０６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０８】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の前記修飾糖部分の各々は、互いに同じである、請求項９０に記載の化合物。
【請求項１０９】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項８３〜１０８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１０】
前記ｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜１０９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１１】
前記ｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜１０９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１２】
前記ｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１１１に記載の化合物。
【請求項１１３】
前記ｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜８８または９０〜１１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１４】
前記ｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１１１に記載の化合物。
【請求項１１５】
前記ｃｒＲＮＡは、２０〜２８個の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜８８または９０〜１１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１６】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、１２個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜１１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１７】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項８３〜１１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１８】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、アルキンまたはアジドから選択される修飾を含む、請求項８３〜１１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１９】
前記化合物は、ｃｒＲＮＡからなる、請求項８３〜１１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２０】
前記化合物は、共役基を含む、請求項８３〜１１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２１】
前記共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、請求項１２０に記載の化合物。
【請求項１２２】
前記共役基は、親油性である、請求項５６または１２０に記載の化合物。
【請求項１２３】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分の前記核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、請求項８３〜１２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２４】
前記ｃｒＲＮＡの前記ＤＮＡ認識部分の前記核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに１００％相同的である、請求項１２３に記載の化合物。
【請求項１２５】
細胞を、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２６】
前記細胞は、Ｃａｓ９を発現する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
細胞を、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物、及びＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【請求項１２８】
細胞を、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物、及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項１２９】
細胞を、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物、ならびにＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項１３０】
細胞を、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物、ならびにＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項１３１】
前記ｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で前記細胞に取り込まれる、請求項１２５〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記細胞は、動物細胞である、請求項１２５〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
動物に、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の修飾化合物を投与することを含む、方法。
【請求項１３４】
前記投与は、皮下投与である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記投与は、くも膜下腔内投与である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記投与は、中枢神経系に対する投与である、請求項７２または１３３に記載の方法。
【請求項１３７】
Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、請求項１３３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記動物は、Ｃａｓ９を発現する、請求項１３３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡを投与することを含む、請求項１３３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１３７または１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記プラスミドは、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１３７または１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
標的遺伝子は、編集される、請求項１３３〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ｃｒＲＮＡは、前記標的遺伝子が編集された後に分解される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記Ｃａｓ９は、前記ｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記動物は、ヒトである、請求項７１〜８２または１３２〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
細胞を、請求項１〜５９または８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることと、標的遺伝子を編集することと、前記細胞を、前記ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはＣａｓ９ヌクレアーゼの活性または発現を低下させるまたは阻害する第２の化合物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項１４７】
前記細胞は、前記標的遺伝子が編集された後に前記第２の化合物と接触させられる、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記第２の化合物は、前記ｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４６または１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ｃｒＲＮＡは、分解される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第２の化合物は、前記ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４６または１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、分解される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第２の化合物は、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡを含む、請求項１４６または１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第２の化合物は、Ｃａｓ９転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４６または１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの発現が阻害される、請求項１５２または１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記細胞は、動物細胞である、請求項１４６〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記動物は、ヒトである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾である、請求項６５または１３０に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾されている、請求項６５または１３０に記載の方法
【請求項１５９】
前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡの両方が、トランスフェクション試薬の非存在下で前記細胞に取り込まれる、請求項６５、１３０、または１５７〜１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記細胞は、動物細胞である、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記動物は、ヒトである、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
ゲノムを、請求項１〜５９または８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、ゲノム遺伝子座可視化の方法。
【請求項１６３】
オフターゲット遺伝子の編集が、２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる前記修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物の代わりに５０個超のヌクレオシドを含む非修飾ｃｒＲＮＡまたは化合物が使用された場合のオフターゲット遺伝子の編集と比べて低下する、請求項６０〜８２または１２５〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる修飾ｓｃｒＲＮＡを含む、化合物。
【請求項１６５】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、５’−安定化である、請求項１６４に記載の化合物。
【請求項１６６】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、３’−安定化である、請求項１６４または１６５に記載の化合物。
【請求項１６７】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに対する前記ｓｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、請求項１６４〜１６６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６８】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する前記ｓｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、請求項１６４〜１６７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６９】
前記ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項１６８に記載の化合物。
【請求項１７０】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、チミンである、請求項１６４〜１６９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７１】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、修飾核酸塩基である、請求項１６４〜１７０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７２】
前記修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである、請求項１７１に記載の化合物。
【請求項１７３】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１６４〜１７２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７４】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１７３に記載の化合物。
【請求項１７５】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、中性ヌクレオシド間結合である、請求項１７３または１７４に記載の化合物。
【請求項１７６】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メトキシプロピル基を含む、請求項１７５に記載の化合物。
【請求項１７７】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホノ酢酸を含む、請求項１７３〜１７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７８】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メチルホスホン酸を含む、請求項１７３〜１７７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７９】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１７３〜１７８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８０】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも２つの結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１７３〜１７９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８１】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾結合は、互いに同じである、請求項１８０に記載の化合物。
【請求項１８２】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、前記ｓｃｒＲＮＡの５’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１７３〜１８１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８３】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、前記ｓｃｒＲＮＡの３’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１７３〜１８２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８４】
前記ｓｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１７３に記載の化合物。
【請求項１８５】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、２’−デオキシヌクレオシドを含まない、請求項１６４〜１８４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８６】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項１６４〜１８５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８７】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項１８６に記載の化合物。
【請求項１８８】
前記５’末端ヌクレオシドは、非二環式２’−修飾糖部分を含む、請求項１８７に記載の化合物。
【請求項１８９】
前記５’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、請求項１８７に記載の化合物。
【請求項１９０】
前記５’末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、請求項１８７に記載の化合物。
【請求項１９１】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記５’末端の前記ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１８６〜１９０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９２】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｙｚＮｙｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｙは、非修飾２’−デオキシ糖部分、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分、２’−Ｆ修飾糖部分、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から独立して選択される糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択される中性ヌクレオシド間結合であり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、前記ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項１８６に記載の化合物。
【請求項１９３】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｍｓＮｘｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
Ｎｍは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｎｘは、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分及び２’−Ｆ修飾糖部分の中から選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、前記ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項１８６に記載の化合物。
【請求項１９４】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記３’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、請求項１８６〜１９３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９５】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記３’末端ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１９４に記載の化合物。
【請求項１９６】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｓＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ａは、前記ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、請求項１９５に記載の化合物。
【請求項１９７】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｚＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択されるヌクレオシド間リン酸結合または中性ヌクレオシド間結合であり、
Ａは、前記ｓｃｒＲＮＡの残りの部分であるが、
但し、前記３’末端Ｎｒが２’−Ｆ糖部分を含む場合、ｚはヌクレオシド間リン酸結合ではないものとする、請求項１９４に記載の化合物。
【請求項１９８】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡの前記ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、請求項１８６〜１９７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９９】
７つの３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項１９８に記載の化合物。
【請求項２００】
１０個の３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項１９８に記載の化合物。
【請求項２０１】
前記３’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、互いに同じである、請求項１９９または２００に記載の化合物。
【請求項２０２】
前記３’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は各々、２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｆの中から独立して選択される、請求項１９９または２００に記載の化合物。
【請求項２０３】
前記３’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分は、２’−Ｏ−メチルと２’−Ｆとが交互になっている、請求項２０２に記載の化合物。
【請求項２０４】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２０３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０５】
前記修飾ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、少なくとも４つの修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、請求項１６４〜２０４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０６】
前記ヌクレアーゼ認識部分の前記４つの修飾ヌクレオシドは、前記ｓｃｒＲＮＡの４つの５’末端ヌクレオシドである、請求項２０５に記載の化合物。
【請求項２０７】
前記ヌクレアーゼ認識部分の前記修飾糖部分の各々は、互いに同じである、請求項２０５または２０６に記載の化合物。
【請求項２０８】
前記ヌクレアーゼ認識部分の各修飾糖部分は、ｃＥｔまたはＬＮＡである、請求項２０７に記載の化合物。
【請求項２０９】
前記少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは各々、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含む、請求項２０５〜２０７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１０】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２０９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１１】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、５つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１２】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、６つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１３】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１４】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、９つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１６４〜２１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１５】
前記ヌクレアーゼ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分は、二環式糖部分である、請求項１６４〜２１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１６】
前記ヌクレアーゼ認識部分の２つの５’末端ヌクレオシドが二環式糖部分を含む、請求項２１５に記載の化合物。
【請求項２１７】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、５つの二環式糖部分を含む、請求項２１６に記載の化合物。
【請求項２１８】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、６つの二環式糖部分を含む、請求項２１６に記載の化合物。
【請求項２１９】
前記ヌクレアーゼ認識部分は、９つの二環式糖部分を含む、請求項２１６に記載の化合物。
【請求項２２０】
各二環式糖部分は、ｃＥｔ及びＬＮＡの中から独立して選択される、請求項２１５〜２１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２１】
各二環式糖部分は、ｃＥｔである、請求項２２０に記載の化合物。
【請求項２２２】
前記ｓｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１６３〜２２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２３】
前記ｓｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項１６３〜２２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２４】
前記ｓｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項２２３に記載の化合物。
【請求項２２５】
前記ｓｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、請求項２２３に記載の化合物。
【請求項２２６】
前記ｓｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、請求項２２３に記載の化合物。
【請求項２２７】
前記ｓｃｒＲＮＡは、２０〜２８個の結合ヌクレオシドからなる、請求項２２３に記載の化合物。
【請求項２２８】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項１６４〜２２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２９】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、請求項１６４〜２２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３０】
前記化合物は、前記ｓｃｒＲＮＡからなる、請求項１６４〜２２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３１】
前記化合物は、共役基を含む、請求項１６４〜２２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３２】
前記共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、請求項２３１に記載の化合物。
【請求項２３３】
前記共役基は、親油性基を含む、請求項２３１に記載の化合物。
【請求項２３４】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分の核酸塩基配列は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、請求項１６４〜２３３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３５】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分の前記核酸塩基配列は、ｓｃｒＲＮＡ  標的ＤＮＡに１００％相同的である、請求項２３４に記載の化合物。
【請求項２３６】
前記ｓｃｒＲＮＡは、自己相補的領域を含む、請求項１６４〜２３５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３７】
前記自己相補的領域は、前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分内にある、請求項２３６に記載の化合物。
【請求項２３８】
前記自己相補的領域は、ヘアピンを形成し得る、請求項２３６または２３７に記載の化合物。
【請求項２３９】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記自己相補的領域は、前記自己相補的領域の安定性を高める少なくとも１つの修飾を含む、請求項２３６〜２３８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４０】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記自己相補的領域は、前記自己相補的領域のハイブリダイゼーション親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、２３６〜２３９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４１】
細胞を、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項２４２】
前記細胞は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
細胞を、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物、及びヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【請求項２４４】
細胞を、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物、及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【請求項２４５】
前記ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項２４３または２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
前記ｓｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で前記細胞に取り込まれる、請求項２４１〜２４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記細胞は、動物細胞である、請求項２４１〜２４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
動物に、請求項１６３〜２４０のいずれか一項に記載の修飾化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２４９】
前記投与は、皮下投与である、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記投与は、くも膜下腔内投与である、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５１】
前記投与は、中枢神経系に対する投与である、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５２】
ヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、請求項２４８〜２５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
前記動物は、前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分によって認識されるヌクレアーゼを発現する、請求項２４８〜２５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５４】
ヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、請求項２４８〜２５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５５】
前記プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２５２または２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
前記プラスミドは、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２５２または２５４に記載の方法。
【請求項２５７】
前記ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項２５２〜２５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変される、請求項２４１〜２５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
前記ｓｃｒＲＮＡは、前記ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に分解される、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分によって認識される前記ヌクレアーゼは、前記ｓｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項２５９に記載の方法。
【請求項２６１】
前記動物は、ヒトである、請求項２４７〜２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
細胞を、請求項１６３〜２４０のいずれか一項に記載の化合物と接触させることと、ｓｃｒＲＮＡ  標的遺伝子を改変することと、前記ｓｃｒＲＮＡまたはヌクレアーゼの活性または発現を低下させるまたは阻害する第２の化合物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項２６３】
前記ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
前記細胞は、前記ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に前記第２の化合物と接触させられる、請求項２６２または２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記第２の化合物は、前記ｓｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６２〜２６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
前記ｓｃｒＲＮＡは、分解される、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
前記第２の化合物は、前記ヌクレアーゼ遺伝子を標的とするｓｃｒＲＮＡを含む、請求項２６２〜２６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６８】
前記第２の化合物は、ヌクレアーゼ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６２〜２６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
前記ヌクレアーゼの前記発現が阻害される、請求項２６７または２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
前記細胞は、動物細胞である、請求項２６２〜２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７１】
前記動物は、ヒトである、請求項２７０に記載の方法。
【請求項２７２】
ゲノムを、請求項１６３〜２４０のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、ゲノム遺伝子座可視化の方法。
【請求項２７３】
オフターゲット遺伝子の改変が、２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる前記修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物の代わりに５０個超のヌクレオシドを含む非修飾ｓｃｒＲＮＡまたは化合物が使用された場合のオフターゲット遺伝子の改変と比べて低下する、請求項２４１〜２７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７４】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む、請求項１〜５９または８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７５】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基を含む、請求項１〜５９または８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７６】
前記ｃｒＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基からなる、請求項１〜５９または８３〜１２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７７】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＵＣＵＡＣＵを含む、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７８】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＧＵＡＧＡＵを含む、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７９】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＵＣＵＡＣＵ及び配列ＧＵＡＧＡＵを含む、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８０】
前記ｓｃｒＲＮＡの前記ヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９の中から選択される配列の少なくとも１２個の核酸塩基を含む、請求項１６４〜２４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８１】
前記ＤＮＡ認識部分は、７〜９つの２’−修飾糖部分を含む、請求項１〜５９、８３〜８８、９０〜１２４、１６４〜２４０、または２７４〜２８０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８２】
前記７〜９つの２’−修飾糖部分は、２’−Ｆ修飾糖部分である、請求項２８１に記載の化合物。
【請求項２８３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分または前記ヌクレアーゼ認識部分は、５〜６つの二環式糖部分を含む、請求項２８１または２８２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８４】
前記５〜６つの二環式糖部分は、ｃＥｔである、請求項２８３に記載の化合物。
【請求項２８５】
請求項１〜５９、８３〜１２４、１６４〜２４０、または２７４〜２８５のいずれか一項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２８６】
前記投与は、硝子体内投与である、請求項７２、１３３、または２４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８７】
前記細胞は、植物細胞である、請求項６０〜７０、１２５〜１３１、１４６〜１５４、１５７〜１５９、２４１〜２４６、または２６２〜２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８８】
前記細胞は、動物細胞である、請求項６０〜７０、１２５〜１３１、１４６〜１５４、１５７〜１５９、２４１〜２４６、または２６２〜２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８９】
前記細胞は、Ｔ細胞である、６０〜７０、１２５〜１３１、１４６〜１５４、１５７〜１５９、２４１〜２４６、または２６２〜２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９０】
請求項１〜５９、８３〜１２４、１６４〜２４０、若しくは２７４〜２８４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２８５に記載の組成物を前記個体に投与すること、それによって前記個体における疾患を治療することを含む、個体における疾患を治療する方法。
【請求項２９１】
疾患の治療のための、請求項１〜５９、８３〜１２４、１６４〜２４０、若しくは２７４〜２８４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２８５に記載の組成物の使用。
【請求項２９２】
薬物の調製のための、請求項１〜５９、８３〜１２４、１６４〜２４０、または２７４〜２８４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２９３】
請求項１〜５９、８３〜１２４、１６４〜２４０、若しくは２７４〜２８４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２８５に記載の組成物を動物に投与すること、及びヒトへの移植のために前記動物から器官を採取する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、配列表とともに電子形式で出願されている。この配列表は、２０１６年６月２９日に作成された２０ＫｂのサイズのＣＯＲＥ０１３４ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという表題のファイルとして提出される。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を編集または無効化するためのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）の使用が記載されている。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｎｅｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６（２０１３）を参照されたい。
【発明の概要】
【０００３】
種々のＣＲＩＳＰＲシステムが記載されている。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１５／００６７４７、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５２：１  １７３−１（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：１−１０（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｍａｌｉ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６（２０１３）、Ｄｏｕｄｎａ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６：６２１３（２０１４）を参照されたい。また、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：１−１３（２０１５）も参照されたい。本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムでｃｒＲＮＡとして使用される修飾オリゴヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、そのような修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡと比べて改善された安定性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、５’末端及び／または３’末端が安定化される。ある特定の実施形態において、そのような安定化されたｃｒＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼによる消化に耐性である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡと比べて標的ＤＮＡに対する改善された親和性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡと比べて標的ＤＮＡに対する改善された選択性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡと比べてｔｒａｃｒＲＮＡに対する改善された親和性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡと比べて改善された細胞取り込みを有する。
【０００４】
そのようなある特定の実施形態において、修飾は、標的ＤＮＡに対する親和性を高め、標的ＤＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な親和性を保持する一方で、修飾ｃｒＲＮＡを短くすることができる。したがって、ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、非修飾ｃｒＲＮＡよりも短い。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、４０〜５０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３５〜４５結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３０〜４０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、２５〜３５結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、２０〜３０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、２５〜３５結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、２０〜３０結合ヌクレオシド長である。そのようなある特定の実施形態において、そのようなより短いｃｒＲＮＡは、改善された取り込み特性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬または電気穿孔を用いずに細胞に取り込まれる。そのようなある特定の実施形態において、細胞は動物に存在する。ある特定の実施形態において、動物はＣａｓ９を発現する。ある特定の実施形態において、動物は、Ｃａｓ９を発現させる手段を用いて予めまたは同時に処理される。そのようなある特定の実施形態において、そのような処理は、Ｃａｓ９を送達するためのベクターの投与を含む。そのようなある特定の実施形態において、そのようなベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。そのようなある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターに適合するＣａｓ９由来の黄色ブドウ球菌を発現する。
【０００５】
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲシステムでｓｃｒＲＮＡとして使用される修飾オリゴヌクレオチドも提供する。ある特定の実施形態において、そのような修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡと比べて改善された安定性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、５’末端及び／または３’末端が安定化される。ある特定の実施形態において、そのような安定化されたｓｃｒＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼによる消化に耐性である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡと比べてｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに対する改善された親和性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡと比べてｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに対する改善された選択性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡと比べてヌクレアーゼに対する改善された親和性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡと比べて改善された細胞取り込みを有する。
【０００６】
そのようなある特定の実施形態において、修飾は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに対する親和性を高め、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡ及びヌクレアーゼにハイブリダイズするのに十分な親和性を保持する一方で、修飾ｓｃｒＲＮＡを短くすることができる。したがって、ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、非修飾ｓｃｒＲＮＡよりも短い。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、４０〜５０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、３５〜４５結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、３０〜４０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、２５〜３５結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、２０〜３０結合ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、２５〜３５結合ヌクレオシド長である。そのようなある特定の実施形態において、そのようなより短いｓｃｒＲＮＡは、改善された取り込み特性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬または電気穿孔を用いずに細胞に取り込まれる。そのようなある特定の実施形態において、細胞は動物に存在する。ある特定の実施形態において、動物は、ｓｃｒＲＮＡによって認識されるヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ）を発現する。ある特定の実施形態において、動物は、ｓｃｒＲＮＡによって認識されるヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ）を発現する手段を用いて予めまたは同時に処理される。そのようなある特定の実施形態において、そのような処理は、ｓｃｒＲＮＡによって認識されるヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ）を送達するためのベクターの投与を含む。そのようなある特定の実施形態において、そのようなベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【０００７】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的遺伝子が編集された後、またはｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に阻害される。そのようなある特定の実施形態において、細胞内の修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡは、標的遺伝子またはｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が編集または改変された後に分解される。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を示すためにはｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡが必要であるため、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）は細胞内で発現され続けるが、もはや活性ではない。そのようなある特定の実施形態において、オフターゲット遺伝子の望ましくない開裂等のＣＲＩＳＰＲシステムのオフターゲット効果は、例えば、ウイルスベクターによってヌクレアーゼ活性に必要な全ての構成成分が永久的に発現され続けるＣＲＩＳＰＲシステムと比べて低い。そのようなある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡの分解は、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって促進される。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡの分解は、細胞内に存在するヌクレアーゼによって促進される。
【０００８】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細胞内のｔｒａｃｒＲＮＡの分解によって標的遺伝子が編集された後に阻害される。そのようなある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡの分解は、ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって促進される。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡの分解は、細胞内に存在するヌクレアーゼによって促進される。
【０００９】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）の発現の阻害によって標的遺伝子が編集された後またはｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に阻害される。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡによって編集または改変される。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ転写物は、ヌクレアーゼ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ転写物のハイブリダイゼーション後に分解される。
【００１０】
以下の非限定的な番号付けされた実施形態が提供される。
【００１１】
実施形態１．２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる修飾ｃｒＲＮＡを含む、化合物。
【００１２】
実施形態２．修飾ｃｒＲＮＡは、５’−安定化である、実施形態１の化合物。
【００１３】
実施形態３．修飾ｃｒＲＮＡは３’−安定化である、実施形態１または２の化合物。
【００１４】
実施形態４．修飾ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡに対するｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１〜３のいずれかの化合物。
【００１５】
実施形態５．修飾ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対するｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１〜４のいずれかの化合物。
【００１６】
実施形態６．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、チミンである、実施形態１〜５のいずれかの化合物。
【００１７】
実施形態７．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、修飾核酸塩基である、実施形態１〜５のいずれかの化合物。
【００１８】
実施形態８．修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである、実施形態７の化合物。
【００１９】
実施形態９．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態１〜８のいずれかの化合物。
【００２０】
実施形態１０．修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態９の化合物。
【００２１】
実施形態１１．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、中性ヌクレオシド間結合である、実施形態９または１０の化合物。
【００２２】
実施形態１２．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メトキシプロピル基を含む、実施形態１１の化合物。
【００２３】
実施形態１３．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホノ酢酸を含む、実施形態９〜１２のいずれかの化合物。
【００２４】
実施形態１４．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メチルホスホン酸を含む、実施形態９〜１３のいずれかの化合物。
【００２５】
実施形態１５．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態９〜１４のいずれかの化合物。
【００２６】
実施形態１６．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態９〜１５のいずれかの可能物。
【００２７】
実施形態１７．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾結合は、互いに同じである、実施形態１６の化合物。
【００２８】
実施形態１８．修飾ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの５’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態９〜１７の化合物。
【００２９】
実施形態１９．修飾ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態９〜１８の化合物。
【００３０】
実施形態２０．ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態９の化合物。
【００３１】
実施形態２１．修飾ｃｒＲＮＡは、２’−デオキシヌクレオシドを含まない、実施形態１〜２０のいずれかの化合物。
【００３２】
実施形態２２．修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態１〜２１のいずれかの化合物。
【００３３】
実施形態２３．ｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態２２の化合物。
【００３４】
実施形態２４．５’末端ヌクレオシドは、非二環式２’−修飾糖部分を含む、実施形態２３の化合物。
【００３５】
実施形態２５．５’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、実施形態２３の化合物。
【００３６】
実施形態２６．５’末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、実施形態２３の化合物。
【００３７】
実施形態２７．ｃｒＲＮＡの５’末端のヌクレオシド間は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態２２〜２６のいずれかの化合物。
【００３８】
実施形態２８．修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｙｚＮｙｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｙは、非修飾２’−デオキシ糖部分、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分、２’−Ｆ修飾糖部分、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から独立して選択される糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択される中性ヌクレオシド間結合であり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、ｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態２２の化合物。
【００３９】
実施形態２９．修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｍｓＮｘｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
Ｎｍは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｎｘは、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分及び２’−Ｆ修飾糖部分の中から選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、ｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態２２の化合物。
【００４０】
実施形態３０．ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態２２〜２９のいずれかの化合物。
【００４１】
実施形態３１．ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態３０の化合物。
【００４２】
実施形態３２．修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｓＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ａは、ｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態３１の化合物。
【００４３】
実施形態３３．修飾ｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｚＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択されるヌクレオシド間リン酸結合または中性ヌクレオシド間結合であり、
Ａは、ｃｒＲＮＡの残りの部分であるが、
但し、前記３’末端Ｎｒが２’−Ｆ糖部分を含む場合、ｚはヌクレオシド間リン酸結合ではないものとする、実施形態３０の化合物。
【００４４】
実施形態３４．修飾ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、実施形態２２〜３３のいずれかの化合物。
【００４５】
実施形態３５．７つの５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態３４の化合物。
【００４６】
実施形態３６．７つの５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、互いに同じである、実施形態３５の化合物。
【００４７】
実施形態３７．７つの５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は各々、２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｆの中から独立して選択される、実施形態３４の化合物。
【００４８】
実施形態３８．７つの５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、２’−Ｏ−メチルと２’−Ｆとが交互になっている、実施形態３７の化合物。
【００４９】
実施形態３９．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態１〜３８のいずれかの化合物。
【００５０】
実施形態４０．修飾ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、少なくとも４つの修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、実施形態１〜３９のいずれかの化合物。
【００５１】
実施形態４１．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の修飾糖部分の各々は、互いに同じである、実施形態４０の化合物。
【００５２】
実施形態４２．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の各修飾糖部分は、ｃＥｔである、実施形態４０の化合物。
【００５３】
実施形態４３．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態１〜４２のいずれかの化合物。
【００５４】
実施形態４４．ｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１〜４３のいずれかの化合物。
【００５５】
実施形態４５．ｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１〜４３のいずれかの化合物。
【００５６】
実施形態４６．ｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態４５の化合物。
【００５７】
実施形態４７．ｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態４５の化合物。
【００５８】
実施形態４８．ｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態４５の化合物。
【００５９】
実施形態４９．ｃｒＲＮＡは、２０〜２８個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態４５の化合物。
【００６０】
実施形態５０．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、１２個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１〜４９のいずれかの化合物。
【００６１】
実施形態５１．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１〜５０のいずれかの化合物。
【００６２】
実施形態５２．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、アルキンまたはアジドから選択される修飾を含む、実施形態１〜５０のいずれかの化合物。
【００６３】
実施形態５３．化合物は、ｃｒＲＮＡからなる、実施形態１〜５２のいずれかの化合物。
【００６４】
実施形態５４．化合物は、共役基を含む、実施形態１〜５２のいずれかの化合物。
【００６５】
実施形態５５．共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、実施形態５４の化合物。
【００６６】
実施形態５６．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、実施形態１〜５５のいずれかの化合物。
【００６７】
実施形態５７．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに１００％相補的である、実施形態５６の化合物。
【００６８】
実施形態５８．細胞を、実施形態１〜５７のいずれかの化合物と接触させることを含む、方法。
【００６９】
実施形態５９．細胞は、Ｃａｓ９を発現する、実施形態５８の方法。
【００７０】
実施形態６０．細胞を、実施形態１〜５７のいずれかの化合物、及びＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【００７１】
実施形態６１．細胞を、実施形態１〜５７のいずれかの化合物、及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【００７２】
実施形態６２．細胞を、実施形態１〜５７のいずれかの化合物、ならびにＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【００７３】
実施形態６３．細胞を、実施形態１〜５７のいずれかの化合物、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【００７４】
実施形態６４．ｃｒＲＮＡは、２０〜３２個のヌクレオシドからなる、実施形態５８〜６３のいずれかの方法。
【００７５】
実施形態６５．ｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で細胞に取り込まれる、実施形態５８〜６４のいずれかの方法。
【００７６】
実施形態６６．細胞を、実施形態５２の修飾ｃｒＲＮＡ、ならびにアルキン及びアジドの中から選択される修飾を含むｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【００７７】
実施形態６７．細胞を、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、実施形態６６の方法。
【００７８】
実施形態６８．細胞は、Ｃａｓ９を発現する、実施形態６６の方法。
【００７９】
実施形態６９．細胞は、動物細胞である、実施形態５８〜６８のいずれかの方法。
【００８０】
実施形態７０．動物に、実施形態１〜５７のいずれかの修飾化合物を投与することを含む、方法。
【００８１】
実施形態７１．投与は、皮下投与である、実施形態７０の方法。
【００８２】
実施形態７２．投与は、くも膜下腔内投与である、実施形態７０の方法。
【００８３】
実施形態７３．Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態７０〜７２のいずれかの方法。
【００８４】
実施形態７４．動物は、Ｃａｓ９を発現する、実施形態７０〜７２のいずれかの方法。
【００８５】
実施形態７５．Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを投与することを含む、実施形態７０〜７２のいずれかの方法。
【００８６】
実施形態７６．プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して動物内の細胞に送達される、実施形態７５の方法。
【００８７】
実施形態７７．プラスミドは、レンチウイルスを介して動物内の細胞に送達される、実施形態７５の方法。
【００８８】
実施形態７８．標的遺伝子は、編集される、実施形態７０〜７７のいずれかの方法。
【００８９】
実施形態７９．ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子が編集された後に分解される、実施形態７８の方法。
【００９０】
実施形態８０．Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態７９の方法。
【００９１】
実施形態８１．ｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾である、実施形態５の化合物。
【００９２】
実施形態８２．ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾されている、実施形態５の化合物。
【００９３】
実施形態８３．１０個の５’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態３４の化合物。
【００９４】
実施形態８４．１０個の５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、互いに同じである、実施形態８３の化合物。
【００９５】
実施形態８５．１０個の５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は各々、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルの中から独立して選択される、実施形態８３の化合物。
【００９６】
実施形態８６．１０個の５’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、２’−Ｆである、実施形態８４の化合物。
【００９７】
実施形態８７．ｃｒＲＮＡモチーフは、表Ａに列挙されるモチーフの中から選択される、実施形態４の化合物。
【００９８】
実施形態８８．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡの４つの３’末端ヌクレオシドである、実施形態４０または８１〜８７のいずれかの化合物。
【００９９】
実施形態８９．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含む、実施形態８８の化合物。
【０１００】
実施形態９０．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、５つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態４０または８１〜８９のいずれかの化合物。
【０１０１】
実施形態９１．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、６つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態４０または８１〜８９のいずれかの化合物。
【０１０２】
実施形態９２．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態４０または８１〜８９のいずれかの化合物。
【０１０３】
実施形態９３．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、９つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態４０、８１〜８６、または８８〜８９のいずれかの化合物。
【０１０４】
実施形態９４．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分は、二環式糖部分である、実施形態４０または８１〜９３のいずれかの化合物。
【０１０５】
実施形態９５．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の２つの３’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、実施形態９４の化合物。
【０１０６】
実施形態９６．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、５つの二環式糖部分を含む、実施形態９５の化合物。
【０１０７】
実施形態９７．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、６つの二環式糖部分を含む、実施形態９５の化合物。
【０１０８】
実施形態９８．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、９つの二環式糖部分を含む、実施形態９３の化合物。
【０１０９】
実施形態９９．各二環式糖部分は、ｃＥｔ及びＬＮＡの中から独立して選択される、実施形態９４〜９８のいずれかの化合物。
【０１１０】
実施形態１００．各二環式糖部分は、ｃＥｔである、実施形態９９の化合物。
【０１１１】
実施形態１０１．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の５’末端のヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態４０または８８〜１００のいずれかの化合物。
【０１１２】
実施形態１０２．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の５’末端のヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、実施形態１０１の化合物。
【０１１３】
実施形態１０３．二環式糖部分は、ｃＥｔまたはＬＮＡである、実施形態１０２の化合物。
【０１１４】
実施形態１０４．二環式糖部分は、ｃＥｔである、実施形態１０３の化合物。
【０１１５】
実施形態１０５．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態８１〜１０４のいずれかの化合物。
【０１１６】
実施形態１０６．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の修飾糖部分の各々は、互いに同じである、実施形態８８の化合物。
【０１１７】
実施形態１０７．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態８１〜１０６のいずれかの化合物。
【０１１８】
実施形態１０８．ｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜１０７のいずれかの化合物。
【０１１９】
実施形態１０９．ｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜１０７のいずれかの化合物。
【０１２０】
実施形態１１０．ｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１０９の化合物。
【０１２１】
実施形態１１１．ｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜８６または８８〜１０９のいずれかの化合物。
【０１２２】
実施形態１１２．ｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１０９の化合物。
【０１２３】
実施形態１１３．ｃｒＲＮＡは、２０〜２８個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜８６または８８〜１０９のいずれかの化合物。
【０１２４】
実施形態１１４．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、１２個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜１１３のいずれかの化合物。
【０１２５】
実施形態１１５．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態８１〜１１４のいずれかの化合物。
【０１２６】
実施形態１１６．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、アルキンまたはアジドから選択される修飾を含む、実施形態８１〜１１５のいずれかの化合物。
【０１２７】
実施形態１１７．化合物は、ｃｒＲＮＡからなる、実施形態８１〜１１６のいずれかの化合物。
【０１２８】
実施形態１１８．化合物は、共役基を含む、実施形態８１〜１１６のいずれかの化合物。
【０１２９】
実施形態１１９．共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、実施形態１１８の化合物。
【０１３０】
実施形態１２０．共役基は、親油性である、実施形態５４または１１８の化合物。
【０１３１】
実施形態１２１．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、実施形態８１〜１２０のいずれかの化合物。
【０１３２】
実施形態１２２．ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに１００％相同的である、実施形態１２１の化合物。
【０１３３】
実施形態１２３．細胞を、実施形態８１〜１２２のいずれかの化合物と接触させることを含む、方法。
【０１３４】
実施形態１２４．細胞は、Ｃａｓ９を発現する、実施形態１２３の方法。
【０１３５】
実施形態１２５．細胞を、実施形態８１〜１２２のいずれかの化合物、及びＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【０１３６】
実施形態１２６．細胞を、実施形態８１〜１２２のいずれかの化合物、及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【０１３７】
実施形態１２７．細胞を、実施形態８１〜１２２のいずれかの化合物、ならびにＣａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【０１３８】
実施形態１２８．細胞を、実施形態８１〜１２２のいずれかの化合物、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【０１３９】
実施形態１２９．ｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で細胞に取り込まれる、実施形態１２３〜１２８のいずれかの方法。
【０１４０】
実施形態１３０．細胞は、動物細胞である、実施形態１２３〜１２９のいずれかの方法。
【０１４１】
実施形態１３１．動物に、実施形態８１〜１２２のいずれかの修飾化合物を投与することを含む、方法。
【０１４２】
実施形態１３２．投与は、皮下投与である、実施形態１３１の方法。
【０１４３】
実施形態１３３．投与は、くも膜下腔内投与である、実施形態１３１の方法。
【０１４４】
実施形態１３４．投与は、中枢神経系に対する投与である、実施形態７０または１３１の方法。
【０１４５】
実施形態１３５．Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態１３１〜１３４のいずれかの方法。
【０１４６】
実施形態１３６．動物は、Ｃａｓ９を発現する、実施形態１３１〜１３４のいずれかの方法。
【０１４７】
実施形態１３７．Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド及びｔｒａｃｒＲＮＡを投与することを含む、実施形態１３１〜１３４のいずれかの方法。
【０１４８】
実施形態１３８．プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して動物内の細胞に送達される、実施形態１３５または１３７の方法。
【０１４９】
実施形態１３９．プラスミドは、レンチウイルスを介して動物内の細胞に送達される、実施形態１３５または１３７の方法。
【０１５０】
実施形態１４０．標的遺伝子は、編集される、実施形態１３１〜１３９のいずれかの方法。
【０１５１】
実施形態１４１．ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子が編集された後に分解される、実施形態１４０の方法。
【０１５２】
実施形態１４２．Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態１４１の方法。
【０１５３】
実施形態１４３．動物は、ヒトである、実施形態６９〜８０または１３０〜１４２のいずれかの方法。
【０１５４】
実施形態１４４．細胞を、実施形態１〜５７または８１〜１２２のいずれかの化合物と接触させることと、標的遺伝子を編集することと、細胞を、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはＣａｓ９ヌクレアーゼの活性または発現を低下させるまたは阻害する第２の化合物と接触させることと、を含む、方法。
【０１５５】
実施形態１４５．細胞は、標的遺伝子が編集された後に第２の化合物と接触させられる、実施形態１４４の方法。
【０１５６】
実施形態１４６．第２の化合物は、ｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１４４または１４５の方法。
【０１５７】
実施形態１４７．ｃｒＲＮＡは、分解される、実施形態１４６の方法。
【０１５８】
実施形態１４８．第２の化合物は、ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１４４または１４５の方法。
【０１５９】
実施形態１４９．ｔｒａｃｒＲＮＡは、分解される、実施形態１４８の方法。
【０１６０】
実施形態１５０．第２の化合物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡを含む、実施形態１４４または１４５の方法。
【０１６１】
実施形態１５１．第２の化合物は、Ｃａｓ９転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１４４または１４５の方法。
【０１６２】
実施形態１５２．Ｃａｓ９ヌクレアーゼの発現が阻害される、実施形態１５０または１５１の方法。
【０１６３】
実施形態１５３．細胞は、動物細胞である、実施形態１４４〜１５２のいずれかの方法。
【０１６４】
実施形態１５４．動物は、ヒトである、実施形態１５３の方法。
【０１６５】
実施形態１５５．ｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾である、実施形態６３または１２８の方法。
【０１６６】
実施形態１５６．ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾されている、実施形態６３または１２８の方法。
【０１６７】
実施形態１５７．ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が、トランスフェクション試薬の非存在下で細胞に取り込まれる、実施形態６３、１２８、または１５５〜１５６の方法。
【０１６８】
実施形態１５８．細胞は、動物細胞である、実施形態１５５〜１５７のいずれかの方法。
【０１６９】
実施形態１５９．動物は、ヒトである、実施形態１５８の方法。
【０１７０】
実施形態１６０．ゲノムを、実施形態１〜５７または８１〜１２２のいずれかの化合物と接触させることを含む、ゲノム遺伝子座可視化の方法。
【０１７１】
実施形態１６１．オフターゲット遺伝子の編集が、２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物の代わりに５０個超のヌクレオシドを含む非修飾ｃｒＲＮＡまたは化合物が使用された場合のオフターゲット遺伝子の編集と比べて低下する、実施形態５８〜８０または１２３〜１６０のいずれかの方法。
【０１７２】
実施形態１６２．２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる修飾ｓｃｒＲＮＡを含む、化合物。
【０１７３】
実施形態１６３．修飾ｓｃｒＲＮＡは、５’−安定化である、実施形態１６２の化合物。
【０１７４】
実施形態１６４．修飾ｓｃｒＲＮＡは、３’−安定化である、実施形態１６２または１６３の化合物。
【０１７５】
実施形態１６５．修飾ｓｃｒＲＮＡは、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに対するｓｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１６２〜１６４のいずれかの化合物。
【０１７６】
実施形態１６６．修飾ｓｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼに対するｓｃｒＲＮＡの親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１６１〜１６５のいずれかの化合物。
【０１７７】
実施形態１６７．ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態１６６の化合物。
【０１７８】
実施形態１６８．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、チミンである、実施形態１６１〜１６７のいずれかの化合物。
【０１７９】
実施形態１６９．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基は、修飾核酸塩基である、実施形態１６１〜１６８のいずれかの化合物。
【０１８０】
実施形態１７０．修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである、実施形態１６９の化合物。
【０１８１】
実施形態１７１．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態１６１〜１７０のいずれかの化合物。
【０１８２】
実施形態１７２．修飾ｓｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態１７１の化合物。
【０１８３】
実施形態１７３．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、中性ヌクレオシド間結合である、実施形態１７１または１７２の化合物。
【０１８４】
実施形態１７４．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メトキシプロピル基を含む、実施形態１７３の化合物。
【０１８５】
実施形態１７５．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホノ酢酸を含む、実施形態１７１〜１７４のいずれかの化合物。
【０１８６】
実施形態１７６．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、メチルホスホン酸を含む、実施形態１７１〜１７５のいずれかの化合物。
【０１８７】
実施形態１７７．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１７１〜１７６のいずれかの化合物。
【０１８８】
実施形態１７８．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも２つの結合は、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態１７１〜１７７のいずれかの化合物。
【０１８９】
実施形態１７９．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾結合は、互いに同じである、実施形態１７８の化合物。
【０１９０】
実施形態１８０．修飾ｓｃｒＲＮＡは、ｓｃｒＲＮＡの５’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態１７１〜１７９のいずれかの化合物。
【０１９１】
実施形態１８１．修飾ｓｃｒＲＮＡは、ｓｃｒＲＮＡの３’末端に２〜５つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態１７１〜１８０のいずれかの化合物。
【０１９２】
実施形態１８２．ｓｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１７１の化合物。
【０１９３】
実施形態１８３．修飾ｓｃｒＲＮＡは、２’−デオキシヌクレオシドを含まない、実施形態１６１〜１８２のいずれかの化合物。
【０１９４】
実施形態１８４．修飾ｓｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態１６１〜１８３のいずれかの化合物。
【０１９５】
実施形態１８５．ｓｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態１８４の化合物。
【０１９６】
実施形態１８６．５’末端ヌクレオシドは、非二環式２’−修飾糖部分を含む、実施形態１８５の化合物。
【０１９７】
実施形態１８７．５’末端ヌクレオシドは、二環式糖部分を含む、実施形態１８５の化合物。
【０１９８】
実施形態１８８．５’末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、実施形態１８５の化合物。
【０１９９】
実施形態１８９．ｓｃｒＲＮＡの５’末端のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１８４〜１８８のいずれかの化合物。
【０２００】
実施形態１９０．修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｙｚＮｙｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｙは、非修飾２’−デオキシ糖部分、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分、２’−Ｆ修飾糖部分、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から独立して選択される糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択される中性ヌクレオシド間結合であり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態１８４の化合物。
【０２０１】
実施形態１９１．修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−ＮｍｓＮｘｓ−Ｒ−３’を有し、
式中、
Ｎｍは、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｎｘは、非修飾２’−ヒドロキシ糖部分及び２’−Ｆ修飾糖部分の中から選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｒは、ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態１８４の化合物。
【０２０２】
実施形態１９２．ｓｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む、実施形態１８４〜１９１のいずれかの化合物。
【０２０３】
実施形態１９３．ｓｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１９２の化合物。
【０２０４】
実施形態１９４．修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｓＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ａは、ｓｃｒＲＮＡの残りの部分である、実施形態１９３の化合物。
【０２０５】
実施形態１９５．修飾ｓｃｒＲＮＡは、
式５’−Ａ−ＮｒｚＮｒ−３’を有し、
式中、
各Ｎｒは、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、
ｚは、メトキシプロピルホスホネート及びメチルホスホネートの中から選択されるヌクレオシド間リン酸結合または中性ヌクレオシド間結合であり、
Ａは、前記ｓｃｒＲＮＡの残りの部分であるが、
但し、前記３’末端Ｎｒが２’−Ｆ糖部分を含む場合、ｚはヌクレオシド間リン酸結合ではないものとする、実施形態１９２の化合物。
【０２０６】
実施形態１９６．修飾ｓｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、実施形態１８４〜１９５のいずれかの化合物。
【０２０７】
実施形態１９７．７つの３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態１９６の化合物。
【０２０８】
実施形態１９８．１０個の３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態１９６の化合物。
【０２０９】
実施形態１９９．３’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、互いに同じである、実施形態１９７または１９８の化合物。
【０２１０】
実施形態２００．３’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は各々、２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｆの中から独立して選択される、実施形態１９７または１９８の化合物。
【０２１１】
実施形態２０１．３’末端ヌクレオシドの修飾糖部分は、２’−Ｏ−メチルと２’−Ｆとが交互になっている、実施形態２００の化合物。
【０２１２】
実施形態２０２．ｓｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０１のいずれかの化合物。
【０２１３】
実施形態２０３．修飾ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、少なくとも４つの修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは各々、修飾糖部分を含む、実施形態１６１〜２０２のいずれかの化合物。
【０２１４】
実施形態２０４．ヌクレアーゼ認識部分の４つの修飾ヌクレオシドは、ｓｃｒＲＮＡの４つの５’末端ヌクレオシドである、実施形態２０３の化合物。
【０２１５】
実施形態２０５．ヌクレアーゼ認識部分の修飾糖部分の各々は、互いに同じである、実施形態２０３または２０４の化合物。
【０２１６】
実施形態２０６．ヌクレアーゼ認識部分の各修飾糖部分は、ｃＥｔまたはＬＮＡである、実施形態２０５の化合物。
【０２１７】
実施形態２０７．少なくとも４つの修飾ヌクレオシドは各々、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分である、実施形態２０３〜２０５のいずれかの化合物。
【０２１８】
実施形態２０８．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、非修飾糖部分を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０７のいずれかの化合物。
【０２１９】
実施形態２０９．ヌクレアーゼ認識部分は、５つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０８のいずれかの化合物。
【０２２０】
実施形態２１０．ヌクレアーゼ認識部分は、６つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０８のいずれかの化合物。
【０２２１】
実施形態２１１．ヌクレアーゼ認識部分は、少なくとも７つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０８のいずれかの化合物。
【０２２２】
実施形態２１２．ヌクレアーゼ認識部分は、９つの修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１６１〜２０８のいずれかの化合物。
【０２２３】
実施形態２１３．ヌクレアーゼ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分は、二環式糖部分である、実施形態１６１〜２１２のいずれかの化合物。
【０２２４】
実施形態２１４．ヌクレアーゼ認識部分の２つの５’末端ヌクレオシドが二環式糖部分を含む、実施形態２１３の化合物。
【０２２５】
実施形態２１５．ヌクレアーゼ認識部分は、５つの二環式糖部分を含む、実施形態２１４の化合物。
【０２２６】
実施形態２１６．ヌクレアーゼ認識部分は、６つの二環式糖部分を含む、実施形態２１４の化合物。
【０２２７】
実施形態２１７．ヌクレアーゼ認識部分は、９つの二環式糖部分を含む、実施形態２１４の化合物。
【０２２８】
実施形態２１８．各二環式糖部分は、ｃＥｔ及びＬＮＡの中から独立して選択される、実施形態２１３〜２１７のいずれかの化合物。
【０２２９】
実施形態２１９．各二環式糖部分は、ｃＥｔである、実施形態２１８の化合物。
【０２３０】
実施形態２２０．ｓｃｒＲＮＡは、４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１６１〜２１９のいずれかの化合物。
【０２３１】
実施形態２２１．ｓｃｒＲＮＡは、２０〜４２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１６１〜２１９のいずれかの化合物。
【０２３２】
実施形態２２２．ｓｃｒＲＮＡは、２９〜３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態２２１の化合物。
【０２３３】
実施形態２２３．ｓｃｒＲＮＡは、３２個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態２２１の化合物。
【０２３４】
実施形態２２４．ｓｃｒＲＮＡは、２９個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態２２１の化合物。
【０２３５】
実施形態２２５．ｓｃｒＲＮＡは、２０〜２８個の結合ヌクレオシドからなる、実施形態２２１の化合物。
【０２３６】
実施形態２２６．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１６１〜２２５のいずれかの化合物。
【０２３７】
実施形態２２７．ｓｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分は、１７個以下の結合ヌクレオシドからなる、実施形態１６１〜２２６のいずれかの化合物。
【０２３８】
実施形態２２８．化合物は、ｓｃｒＲＮＡからなる、実施形態１６１〜２２７のいずれかの化合物。
【０２３９】
実施形態２２９．化合物は、共役基を含む、実施形態１６１〜２２７のいずれかの化合物。
【０２４０】
実施形態２３０．共役基は、ＧａｌＮＡｃを含む、実施形態２２９の化合物。
【０２４１】
実施形態２３１．共役基は、親油性基を含む、実施形態２２９の化合物。
【０２４２】
実施形態２３２．ｓｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分の核酸塩基配列は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに少なくとも９０％相補的である、実施形態１６１〜２３１のいずれかの化合物。
【０２４３】
実施形態２３３．ｓｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分の核酸塩基配列は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡに１００％相同的である、実施形態２３２の化合物。
【０２４４】
実施形態２３４．ｓｃｒＲＮＡは、自己相補的領域を含む、実施形態１６１〜２３３のいずれかの化合物。
【０２４５】
実施形態２３５．自己相補的領域は、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分内にある、実施形態２３４の化合物。
【０２４６】
実施形態２３６．自己相補的領域は、ヘアピンを形成し得る、実施形態２３４または２３５の化合物。
【０２４７】
実施形態２３７．ｓｃｒＲＮＡの自己相補的領域は、自己相補的領域の安定性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態２３４〜２３６のいずれかの化合物。
【０２４８】
実施形態２３８．ｓｃｒＲＮＡの自己相補的領域は、自己相補的領域のハイブリダイゼーション親和性を高める少なくとも１つの修飾を含む、実施形態２３４〜２３７のいずれかの化合物。
【０２４９】
実施形態２３９．細胞を、実施形態１６１〜２３８のいずれかの化合物と接触させることを含む、方法。
【０２５０】
実施形態２４０．細胞は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態２３９の方法。
【０２５１】
実施形態２４１．細胞を、実施形態１６１〜２３８のいずれかの化合物、及びヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドと接触させることを含む、方法。
【０２５２】
実施形態２４２．細胞を、実施形態１６１〜２３８のいずれかの化合物、及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む、方法。
【０２５３】
実施形態２４３．ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態２４１または２４２の方法。
【０２５４】
実施形態２４４．ｓｃｒＲＮＡは、トランスフェクション試薬の非存在下で細胞に取り込まれる、実施形態２３９〜２４３のいずれかの方法。
【０２５５】
実施形態２４５．細胞は、動物細胞である、実施形態２３９〜２４４のいずれかの方法。
【０２５６】
実施形態２４６．動物に、実施形態１６１〜２３８のいずれかの修飾化合物を投与することを含む、方法。
【０２５７】
実施形態２４７．投与は、皮下投与である、実施形態２４６の方法。
【０２５８】
実施形態２４８．投与は、くも膜下腔内投与である、実施形態２４６の方法。
【０２５９】
実施形態２４９．投与は、中枢神経系に対する投与である、実施形態２４６の方法。
【０２６０】
実施形態２５０．ヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態２４６〜２４９のいずれかの方法。
【０２６１】
実施形態２５１．動物は、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分によって認識されるヌクレアーゼを発現する、実施形態２４６〜２４９のいずれかの方法。
【０２６２】
実施形態２５２．ヌクレアーゼ遺伝子をコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態２４６〜２４９のいずれかの方法。
【０２６３】
実施形態２５３．プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して動物内の細胞に送達される、実施形態２５０または２５２の方法。
【０２６４】
実施形態２５４．プラスミドは、レンチウイルスを介して動物内の細胞に送達される、実施形態２５０または２５２の方法。
【０２６５】
実施形態２５５．ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態２５０〜２５４のいずれかの方法。
【０２６６】
実施形態２５６．ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変される、実施形態２３９〜２５５のいずれかの方法。
【０２６７】
実施形態２５７．ｓｃｒＲＮＡは、ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に分解される、実施形態２５６の方法。
【０２６８】
実施形態２５８．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分によって認識されるヌクレアーゼは、ｓｃｒＲＮＡの非存在下でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態２５７の方法。
【０２６９】
実施形態２５９．動物は、ヒトである、実施形態２４５〜２５８のいずれかの方法。
【０２７０】
実施形態２６０．細胞を、実施形態１６１〜２３８のいずれかの化合物と接触させることと、ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子を改変することと、ｓｃｒＲＮＡまたはヌクレアーゼの活性または発現を低下させるまたは阻害する第２の化合物と接触させることと、を含む、方法。
【０２７１】
実施形態２６１．ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態２６０の方法。
【０２７２】
実施形態２６２．細胞は、ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後に第２の化合物と接触させられる、実施形態２６０または２６１の方法。
【０２７３】
実施形態２６３．第２の化合物は、ｓｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態２６０〜２６２のいずれかの方法。
【０２７４】
実施形態２６４．ｓｃｒＲＮＡは、分解される、実施形態２６３の方法。
【０２７５】
実施形態２６５．第２の化合物は、ヌクレアーゼ遺伝子を標的とするｓｃｒＲＮＡを含む、実施形態２６０〜２６２のいずれかの方法。
【０２７６】
実施形態２６６．第２の化合物は、ヌクレアーゼ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態２６０〜２６２のいずれかの方法。
【０２７７】
実施形態２６７．ヌクレアーゼの発現が阻害される、実施形態２６５または２６６の方法。
【０２７８】
実施形態２６８．細胞は、動物細胞である、実施形態２６０〜２６７のいずれかの方法。
【０２７９】
実施形態２６９．動物は、ヒトである、実施形態２６８の方法。
【０２８０】
実施形態２７０．ゲノムを、実施形態１６１〜２３８のいずれかの化合物と接触させることを含む、ゲノム遺伝子座可視化の方法。
【０２８１】
実施形態２７１．オフターゲット遺伝子の改変が、２０〜５０個の結合ヌクレオシドからなる前記修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物の代わりに５０個超のヌクレオシドを含む非修飾ｓｃｒＲＮＡまたは化合物が使用された場合のオフターゲット遺伝子の改変と比べて低下する、実施形態２３９〜２６９のいずれかの方法。
【０２８２】
実施形態２７２．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む、実施形態１〜５７または８１〜１２２のいずれかの化合物。
【０２８３】
実施形態２７３．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基を含む、実施形態１〜５７または８１〜１２２のいずれかの化合物。
【０２８４】
実施形態２７４．ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５の中から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基からなる、実施形態１〜５７または８１〜１２２のいずれかの化合物。
【０２８５】
実施形態２７５．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＵＣＵＡＣＵを含む、実施形態１６２〜２３８のいずれかの化合物。
【０２８６】
実施形態２７６．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＧＵＡＧＡＵを含む、実施形態１６２〜２３８のいずれかの化合物。
【０２８７】
実施形態２７７．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列ＵＣＵＡＣＵ及び配列ＧＵＡＧＡＵを含む、実施形態１６２〜２３８のいずれかの化合物。
【０２８８】
実施形態２７８．ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９の中から選択される配列の少なくとも１２個の核酸塩基を含む、実施形態１６２〜２３８のいずれかの化合物。
【０２８９】
実施形態２７９．ＤＮＡ認識部分は、７〜９つの２’−修飾糖部分を含む、実施形態１〜５７、８１〜８６、８８〜１２２、１６２〜２３８、または２７２〜２７８のいずれかの化合物。
【０２９０】
実施形態２８０．７〜９つの２’−修飾糖部分は、２’−Ｆ修飾糖部分である、実施形態２７９の化合物。
【０２９１】
実施形態２８１．ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分またはヌクレアーゼ認識部分は、５〜６つの二環式糖部分を含む、実施形態２７９または２８０のいずれかの化合物。
【０２９２】
実施形態２８２．５〜６つの二環式糖部分は、ｃＥｔである、実施形態２８１の化合物。
【０２９３】
実施形態２８３．実施形態１〜５７、８１〜１２２、１６２〜２３８、または２７２〜２８３のいずれかの化合物を含む、薬学的組成物。
【０２９４】
実施形態２８４．投与は、硝子体内投与である、実施形態７０、１３１、または２４６のいずれかの方法。
【０２９５】
実施形態２８５．細胞は、植物細胞である、実施形態５８〜６８、１２３〜１２９、１４４〜１５２、１５５〜１５７、２３９〜２４４、または２６０〜２６７のいずれかの方法。
【０２９６】
実施形態２８６．細胞は、動物細胞である、実施形態５８〜６８、１２３〜１２９、１４４〜１５２、１５５〜１５７、２３９〜２４４、または２６０〜２６７のいずれかの方法。
【０２９７】
実施形態２８７．細胞は、Ｔ細胞である、実施形態５８〜６８、１２３〜１２９、１４４〜１５２、１５５〜１５７、２３９〜２４４、または２６０〜２６７のいずれかの方法。
【０２９８】
実施形態２８８．実施形態１〜５７、８１〜１２２、１６２〜２３８、若しくは２７２〜２８２のいずれかの化合物、または実施形態２８３に記載の組成物を個体に投与すること、それによって個体における疾患を治療することを含む、個体における疾患を治療する方法。
【０２９９】
実施形態２８９．疾患の治療のための、実施形態１〜５７、８１〜１２２、１６２〜２３８、若しくは２７２〜２８２のいずれかの化合物、または実施形態２８３の組成物の使用。
【０３００】
実施形態２９０．薬物の調製のための、実施形態１〜５７、８１〜１２２、１６２〜２３８、または２７２〜２８２のいずれかの化合物の使用。
【０３０１】
実施形態２９１．実施形態１〜５７、８１〜１２２、１６２〜２３８、若しくは２７２〜２８２のいずれかの化合物、または実施形態２８３の組成物を動物に投与すること、及び、ヒトへの移植のために前記動物から器官を採取する方法。
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】ｈＬＤＬＲの遺伝子編集の程度を示すゲルである。
【図２】ｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を示すゲルである。
【図３】短い修飾ｃｒＲＮＡを含むｃｒＲＮＡを使用するｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を示すゲルである。
【図４ａ】図４ａ及び４ｂは、ＤＮＭＴ１遺伝子の改変部上のＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）に相補的なｓｃｒＲＮＡ標的認識部分を含む切断型ｓｃｒＲＮＡの影響を示すゲルである。図４ａ及び図４ｂは、３６個のみのヌクレオシドを含有するｓｃｒＲＮＡを含む複数の切断型ｓｃｒＲＮＡが、ＤＮＭＴ１遺伝子を改変したことを示している。
【図４ｂ】図４ａ及び４ｂは、ＤＮＭＴ１遺伝子の改変部上のＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）に相補的なｓｃｒＲＮＡ標的認識部分を含む切断型ｓｃｒＲＮＡの影響を示すゲルである。図４ａ及び図４ｂは、３６個のみのヌクレオシドを含有するｓｃｒＲＮＡを含む複数の切断型ｓｃｒＲＮＡが、ＤＮＭＴ１遺伝子を改変したことを示している。
【図５】マウスのプロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（Ｐｃｓｋ９）を編集するように設計及び合成された切断型ｔｒａｃｒＲＮＡの活性の程度を示すゲルである。
【図６】Ｐｃｓｋ９を標的とする共役または非共役修飾ｃｒＲＮＡのＤＮＡ切断活性を示すゲルである。
【図７】修飾ｃｒＲＮＡが、エクスビボで肝細胞において、ｓｇＲＮＡ陽性対照に対するのと同様の能力でＰｃｓｋ９遺伝子を破壊したことを示すゲルである。
【発明を実施するための形態】
【０３０３】
前述の一般的な説明も以下の詳細な説明もいずれも例示的かつ説明的であるにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において、単数形の使用は、別途明確に記述されない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるとき、「または（ｏｒ）」の使用は、別途記述されない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」等の用語は、別途明確に記述されない限り、１つのユニットを含む要素及び複数の成分と２つ以上のサブユニットを含む要素及び複数の成分の両方を包含する。
【０３０４】
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含むが、これらに限定されない本出願において引用されるすべての文書または文書の一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明確に組み込まれる。
【０３０５】
定義
別途示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有する。
【０３０６】
本明細書で使用されるとき、「２’−デオキシヌクレオシド」とは、天然のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られるような２’−Ｈ（Ｈ）フラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’−デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含み得るか、またはＲＮＡ核酸塩基（例えば、ウラシル）を含み得る。
【０３０７】
本明細書で使用されるとき、「２’−置換ヌクレオシド」または「２−修飾ヌクレオシド」とは、２’−置換または２’−修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用されるとき、糖部分に関連して「２’−置換」または「２−修飾」とは、ＨまたはＯＨ以外の２’−置換基を含むフラノシル糖部分を意味する。
【０３０８】
本明細書で使用されるとき、修飾オリゴヌクレオチドに関連して「３’−安定化」とは、３’末端に１つまたは複数の修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比べて、細胞または動物におけるオリゴヌクレオチドの安定性を高める１つまたは複数の修飾を３’末端に含む修飾オリゴヌクレオチドを意味する。
【０３０９】
本明細書で使用されるとき、修飾オリゴヌクレオチドに関連して「５’−安定化」とは、５’末端に１つまたは複数の修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比べて、細胞または動物におけるオリゴヌクレオチドの安定性を高める１つまたは複数の修飾を５’末端に含む修飾オリゴヌクレオチドを意味する。
【０３１０】
本明細書で使用されるとき、「二環式ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」とは、二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用されるとき、「二環式糖」または「二環式糖部分」とは、２つの環を含む修飾糖部分を意味し、第２の環は、第１の環の原子のうちの２つを接続する架橋によって形成され、それによって二環式構造を形成する。ある特定の実施形態において、二環式糖部分の第１の環は、フラノシル部分である。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、フラノシル部分を含まない。
【０３１１】
本明細書で使用されるとき、「Ｃａｓ９」とは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体中にある場合、標的ＤＮＡを認識及び／または開裂するヌクレアーゼを意味する。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌に由来する。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９は、黄色ブドウ球菌に由来する。
【０３１２】
本明細書で使用されるとき、「細胞標的部分」とは、単数または複数の特定の細胞型に結合することができる共役基または共役基の一部を意味する。
【０３１３】
本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドに関連して「相補的」とは、２つの核酸塩基配列を反対方向に整列させたときに、そのようなオリゴヌクレオチドまたはその１つ以上の領域の核酸塩基配列が、別のオリゴヌクレオチドまたは核酸またはその１つ以上の領域の核酸塩基配列にマッチすることを意味する。本明細書に記載されるような核酸塩基にマッチするかまたは相補的な核酸塩基は、別途指定されない限り、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）、ならびに５−メチルシトシン（ｍＣ）及びグアニン（Ｇ）に限定される。相補的なオリゴヌクレオチド及び／または核酸は、各ヌクレオシドに相補的な核酸塩基を有する必要はない。むしろ、いくつかのミスマッチが許容される。本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドに関連して「完全に相補的」または「１００％相補的」とは、そのようなオリゴヌクレオチドが、各ヌクレオシドにおいて別のオリゴヌクレオチドまたは核酸に相補的であることを意味する。そのような実施形態において、ミスマッチは許容されない。
【０３１４】
本明細書で使用されるとき、「共役基」とは、親化合物、例えば、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に結合する原子団を意味する。
【０３１５】
本明細書で使用されるとき、「共役リンカー」とは、共役基を親化合物、例えば、オリゴヌクレオチドに接続する原子団を意味する。
【０３１６】
本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドの文脈において「連続」とは、互いに直接隣接するヌクレオシド、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合を指す。例えば、「連続核酸塩基」とは、互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。
【０３１７】
本明細書で使用されるとき、「ｃｒＲＮＡ」とは、ＤＮＡ認識部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部を意味する。本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ認識部分」とは、ＤＮＡ標的に相補的な核酸塩基配列である。本明細書で使用されるとき、「ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合しているかまたは結合することができる核酸塩基配列である。ｃｒＲＮＡのｔｒａｃＲＮＡ認識部分は、ハイブリダイゼーションまたは共有結合的結合によりｔｒａｃｒＲＮＡに結合してもよい。
【０３１８】
本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドに関連して「完全に修飾された」とは、各糖部分が修飾された修飾オリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドに関連して「均一に修飾された」とは、各糖部分の各少なくとも１つの修飾が同じである完全に修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、均一に修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、各々、２’−ＭＯＥ修飾を有することができるが、異なる核酸塩基修飾を有し、ヌクレオシド間結合が異なり得る。
【０３１９】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子編集」とは、限定されないが、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、欠失、挿入、及び遺伝子活性化を含む、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体によって媒介される任意のプロセスを意味する。本明細書で使用されるとき、「遺伝子改変」とは、限定されないが、遺伝子ノックダウン、遺伝子破壊、欠失、挿入、及び遺伝子活性化を含む、ヌクレアーゼ／ｓｃｒＲＮＡ含有複合体によって媒介される任意のプロセスを意味する。
【０３２０】
本明細書で使用されるとき、「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、異なる分子である。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチドの部分であり、オリゴヌクレオチドは「ｓｇＲＮＡ」と称される。
【０３２１】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なオリゴヌクレオチド及び／または核酸の対形成またはアニーリングを意味する。ある特定の機構に限定されるものではないが、ハイブリダイゼーションの最も一般的な機構は、相補的な核酸塩基間のワトソン・クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン型水素結合であり得る水素結合に関与する。
【０３２２】
本明細書で使用されるとき、修飾オリゴヌクレオチドによって媒介される効果に関連して使用される場合、「高める」とは、ある特定の修飾を含有するオリゴヌクレオチドの存在下では、ある特定の修飾を含有しない対応するオリゴヌクレオチドの存在下における効果よりも、その効果が高いことを意味する。
【０３２３】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間結合」とは、オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシド間に共有結合を形成する基を意味する。本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然のヌクレオシド間リン酸結合以外の任意のヌクレオシド間結合を意味する。天然の非リン酸結合は、本明細書において修飾ヌクレオシド間結合と称される。「ホスホロチオエート結合」とは、ヌクレオシド間の結合を意味し、リン酸結合のホスホジエステル結合は、非架橋酸素原子のうちの１つを硫黄原子で置き換えることによって修飾される。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【０３２４】
本明細書で使用されるとき、「線形修飾糖」または「線形修飾糖部分」とは、非環式または非架橋修飾を含む修飾糖部分を意味する。そのような線形修飾は、二環式糖修飾とは異なる。
【０３２５】
本明細書で使用されるとき、「結合ヌクレオシド」は、連続配列として接続されたヌクレオシドである（すなわち、結合したものの間には付加的なヌクレオシドが存在しない）。結合ヌクレオシドは、ヌクレオシド間結合によって結合されてもよいか、またはされなくてもよい。
【０３２６】
本明細書で使用されるとき、「ミスマッチ」とは、第１及び第２のオリゴマー化合物を整列させたときに、第２のオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の対応する核酸塩基と対形成することができない第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基を意味する。
【０３２７】
本明細書で使用されるとき、「ＭＯＥ」とはメトキシエチルを意味する。「２’−ＭＯＥ」とは、フラノシル環の２’位にある−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を意味する。
【０３２８】
本明細書で使用されるとき、「モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドの非修飾及び／若しくは修飾糖部分、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間結合のパターンを意味する。
【０３２９】
本明細書で使用されるとき、「天然の」とは、天然に見られることを意味する。
【０３３０】
本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」とは、第２の、異なる核酸塩基と対形成することができる複素環部分を意味する。本明細書で使用されるとき、「核酸塩基配列」とは、いずれの糖修飾またはヌクレオシド間結合修飾とも関係のない連続核酸塩基の順序を意味する。本明細書で使用されるとき、「修飾核酸塩基」とは、５つの非修飾核酸塩基として本明細書において定義されるアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）以外の核酸塩基を意味する。普遍的塩基は、５つの非修飾核酸塩基のうちのいずれか１つと対形成できる核酸塩基である。
【０３３１】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基及び糖部分を含む化合物を意味する。核酸塩基及び糖部分は各々、独立して、非修飾であるかまたは修飾されている。本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオシド」とは、修飾核酸塩基及び／または修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドは、脱塩基ヌクレオシドを含む。
【０３３２】
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシド間結合を介して接続された結合ヌクレオシドの鎖を意味し、各ヌクレオシド及びヌクレオシド間結合は修飾されていてもまたは非修飾であってもよい。別途示されない限り、オリゴヌクレオチドは、８〜５０個の結合ヌクレオシドからなる。本明細書で使用されるとき、「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合が修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるとき、「非修飾オリゴヌクレオチド」とは、いずれのヌクレオシド修飾またはヌクレオシド間修飾も含まないオリゴヌクレオチドを意味する。
【０３３３】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体または希釈剤」とは、動物への投与における使用に好適な任意の物質を意味する。そのようなある特定の担体は、薬学的組成物を、対象による経口摂取のために、例えば、錠剤、丸剤、ドラジェ剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤、及びロゼンジ剤として配合することができるようにする。
【０３３４】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」とは、生理学的かつ薬学的に許容されるオリゴマー化合物等の化合物の塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ望ましくない毒性学的影響をそれに与えない塩を意味する。
【０３３５】
本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」とは、対象に投与するのに好適な物質の混合物を意味する。例えば、薬学的組成物は、ｃｒＲＮＡ化合物及び滅菌水溶液を含んでもよい。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、ある特定の細胞株における自由取り込み（ｆｒｅｅ  ｕｐｔａｋｅ）アッセイにおいて活性を示す。
【０３３６】
本明細書で使用されるとき、「リン部分」とは、リン原子を含む原子団を意味する。ある特定の実施形態において、リン部分は、モノ−、ジ−、若しくはトリ−ホスフェート、またはホスホロチオエートを含む。
【０３３７】
本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」とは、内在性酵素または他の化学物質の作用及び／または生理学的条件によって体内でまたは細胞内で活性形態に変換される不活性形態の治療物質を意味する。
【０３３８】
本明細書で使用されるとき、「ｓｃｒＲＮＡ」または「単一ｃｒＲＮＡ」とは、ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分及びヌクレアーゼ認識部分を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分またはｔｒａｃｒＲＮＡを含まないオリゴヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡは、自己相補的領域を含む。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ認識部分は、自己相補的領域と部分的または完全に重複する。本明細書で使用されるとき、「ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分」とは、ｓｃｒＲＮＡ  ＤＮＡ標的に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの一部である。本明細書で使用されるとき、「ヌクレアーゼ認識部分」とは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼではないヌクレアーゼと結合できるか、会合できるか、または結合若しくは会合に寄与することができるオリゴヌクレオチドの一部である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ認識部分は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼと結合または会合する。
【０３３９】
本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドに関連して「自己相補的」とは、少なくとも部分的にそれ自体に相補的なオリゴヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態において、自己相補的オリゴヌクレオチドは、自己相補的オリゴヌクレオチドの一部がそれ自体にハイブリダイズした場合にヘアピンを形成する。
【０３４０】
本明細書で使用されるとき、「糖部分」とは、核酸塩基を、ヌクレオシド間結合、共役基、または末端基等の別の基に結合させることができる原子団を意味する。ある特定の実施形態において、糖部分は、核酸塩基に結合してヌクレオシドを形成する。本明細書で使用されるとき、「非修飾糖部分」とは、ＲＮＡに見られるような２’−ＯＨ（Ｈ）フラノシル部分、またはＤＮＡに見られるような２’−Ｈ（Ｈ）部分を意味する。非修飾糖部分は、１’、３’、及び４’位の各々に１つの水素、３’位に酸素、そして５’位に２つの水素を有する。本明細書で使用されるとき、「修飾糖部分」または「修飾糖」とは、非修飾糖部分の少なくとも１つの水素の代わりに非水素置換基を含む糖代理物またはフラノシル部分を意味する。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は２’−置換糖部分である。そのような修飾糖部分は、二環式糖及び線形修飾糖を含む。
【０３４１】
本明細書で使用されるとき、「糖代理物」とは、核酸塩基を、ヌクレオシド間結合、共役基、または末端基等の別の基に結合させることができるフラノシル部分以外を有する修飾糖部分を意味する。糖代理物を含む修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内の１つ以上の位置に組み込むことができる。ある特定の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴマー化合物または核酸にハイブリダイズすることができる。
【０３４２】
本明細書で使用されるとき、「標的核酸」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子」、及び「核酸標的」とは、ｃｒＲＮＡが影響を与えるように設計された核酸を意味する。本明細書で使用されるとき、「ｓｃｒＲＮＡ標的核酸」、「ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡ」、「ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子」、及び「ｓｃｒＲＮＡ核酸標的」とは、ｓｃｒＲＮＡが影響を与えるように設計された核酸を意味する。「オフターゲット遺伝子」とは、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡが影響を与えるように設計されていない遺伝子である。ある特定の実施形態において、オフターゲット遺伝子の編集または改変は有害である。
【０３４３】
本明細書で使用されるとき、「末端基」とは、オリゴヌクレオチドの末端に共有結合的に結合された化学基または原子団を意味する。
【０３４４】
本明細書で使用されるとき、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」とは、Ｃａｓ９タンパク質に非共有結合的に結合することができ、かつ、ハイブリダイゼーションまたは共有結合的結合によりｃｒＲＮＡに結合することができる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部を意味する。
【０３４５】
ＣＲＩＳＰＲシステムに使用されるある特定のオリゴヌクレオチド
Ｉ．ある特定のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
ある特定の実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲに使用される修飾オリゴヌクレオチドを提供する。典型的には、ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすると同時にトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にもハイブリダイズし、次に標的ＤＮＡを開裂するｃａｓ９ヌクレアーゼをリクルートするＣＲＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を用いる。したがって、そのようなシステムにおいて、ｃｒＲＮＡは、（１）標的ＤＮＡを認識してハイブリダイゼーションすること、及び（２）ｔｒａｃｒＲＮＡを認識してハイブリダイゼーションすることの２つの機能を有する。典型的には、そのようなシステムにおいて、ｃｒＲＮＡは、それら２つの機能に対応する２つの部分であるＤＮＡ認識部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を有する。本発明は、ｃｒＲＮＡにおいて使用され得る修飾オリゴヌクレオチドを提供する。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ認識部分及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分に修飾を有してもよい。
【０３４６】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを有する細菌種の直接反復配列の一部を含む。そのようなある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、下の表から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、下の表から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、下の表から選択される配列の最初の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、下の表から選択される配列の最初の１２個の核酸塩基からなる。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分の配列は、下の表から選択される配列の最初の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の核酸塩基からなる。
【表１】
2018519811.tif 000003
【０３４７】
ある特定の場合において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、互いに結合して、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称される単一分子を形成する。ある特定の実施形態において、本発明は、ｓｇＲＮＡにおいて使用するための修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【０３４８】
ＩＩ．ある特定の単一ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｓｃｒＲＮＡ）
ある特定の代替の実施形態において、本発明は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡにハイブリダイズし、Ｃａｓ９以外のヌクレアーゼのリクルートメントに関与するｓｃｒＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲシステムにおいて使用される修飾オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはその多様体である。ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ）は、ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡを開裂する。したがって、そのようなシステムにおいて、ｓｃｒＲＮＡは、（１）ｓｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡを認識してハイブリダイゼーションすること、及び（２）ヌクレアーゼを認識してハイブリダイゼーションすることの２つの機能を有する。典型的には、そのようなシステムにおいて、ｓｃｒＲＮＡは、それら２つの機能に対応する２つの部分であるｓｃｒＲＮＡ標的認識部分及びヌクレアーゼ認識部分を有する。本発明は、ｓｃｒＲＮＡにおいて使用され得る修飾オリゴヌクレオチドを提供する。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分及び／またはヌクレアーゼ認識部分に修飾を有してもよい。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ認識部分は、ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分に対して５’である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ認識部分は、ｓｃｒＲＮＡ標的認識部分に対して３’である。
【０３４９】
ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１オルソログを有する細菌性生物からの直接反復配列の一部を含む。そのようなある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、下の表から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、下の表から選択される配列の１２個の核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分は、下の表から選択される配列の１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、下の表から選択される配列の１２個の核酸塩基からなる。ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分の配列は、下の表から選択される配列のの１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の核酸塩基からなる。ある特定の実施形態において、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分は、配列ＵＣＵＡＣＵ及びＧＵＡＧＡＵを含む。
【表２】
2018519811.tif 000004
【０３５０】
ｃｒＲＮＡとして使用されるある特定のオリゴヌクレオチド
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドからなる。本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡとしての使用に好適である。
【０３５１】
ある特定の修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の不斉中心を有し、したがって絶対立体化学の観点から、（Ｒ）若しくは（Ｓ）、糖アノマーの場合等にはα若しくはβ、またはアミノ酸の場合等には（Ｄ）若しくは（Ｌ）と定義され得るエナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性体構成を生じる。別途指定されない限り、それらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を含む全てのそのような可能な異性体が、本明細書において提供される修飾オリゴヌクレオチドに含まれる。同様に、全てのシス及びトランス異性体ならびに互変異性形態も含まれる。
【０３５２】
ある特定の実施形態において、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾糖部分、修飾核酸塩基、修飾ヌクレオシド間結合、モチーフ、及び／または長さの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０３５３】
ｓｃｒＲＮＡとして使用されるある特定のオリゴヌクレオチド
ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、修飾ｓｃｒＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドからなる。本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｃｒＲＮＡとしての使用に好適である。
【０３５４】
ある特定の修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の不斉中心を有し、したがって絶対立体化学の観点から、（Ｒ）若しくは（Ｓ）、糖アノマーの場合等にはα若しくはβ、またはアミノ酸の場合等には（Ｄ）若しくは（Ｌ）と定義され得るエナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性体構成を生じる。別途指定されない限り、それらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を含む全てのそのような可能な異性体が、本明細書において提供される修飾オリゴヌクレオチドに含まれる。同様に、全てのシス及びトランス異性体ならびに互変異性形態も含まれる。
【０３５５】
ある特定の実施形態において、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾糖部分、修飾核酸塩基、修飾ヌクレオシド間結合、モチーフ、及び／または長さの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０３５６】
修飾ｃｒＲＮＡを含むある特定の使用方法
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、インビトロ法である。ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、エクスビボ法である。ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、インビボ法である。
【０３５７】
天然及び遺伝子改変型の両方の種々のＣａｓ９多様体を、本発明の方法に使用することができる。そのようなＣａｓ９多様体は、限定されないが、遺伝子活性化等の標的核酸の開裂を必要としない用途において使用される不活性Ｃａｓ９変異体、及びＡＡＶベクター等の特定のベクターにおける発現に好適な切断型Ｃａｓ９多様体を含む。
【０３５８】
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、標的遺伝子が編集された後にＣＲＩＳＰＲシステムを阻害する（またはオフにする）ために、細胞を第２の化合物と接触させることをさらに含む。
【０３５９】
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む遺伝子編集方法は、本発明の修飾ｃｒＲＮＡの代わりに非修飾ｃｒＲＮＡを使用する遺伝子編集方法よりも少ない及び／または低い有害なオフターゲット効果をもたらす。
【０３６０】
修飾ｓｃｒＲＮＡを含むある特定の使用方法
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、インビトロ法である。ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、エクスビボ法である。ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、インビボ法である。
【０３６１】
天然及び遺伝子改変型の両方の種々のヌクレアーゼ多様体を、本発明の方法に使用することができる。そのようなヌクレアーゼ多様体は、限定されないが、遺伝子活性化等のｓｃｒＲＮＡ標的核酸の開裂を必要としない用途において使用される不活性ヌクレアーゼ変異体、及びＡＡＶベクター等の特定のベクターにおける発現に好適な切断型ヌクレアーゼ多様体を含む。
【０３６２】
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む方法は、ｓｃｒＲＮＡ標的遺伝子が改変された後にＣＲＩＳＰＲシステムを阻害する（またはオフにする）ために、細胞を第２の化合物と接触させることをさらに含む。
【０３６３】
ある特定の実施形態において、細胞を修飾ｓｃｒＲＮＡを含む化合物と接触させることを含む遺伝子編集方法は、本発明の修飾ｓｃｒＲＮＡの代わりに非修飾ｓｃｒＲＮＡを使用する遺伝子編集方法よりも少ない及び／または低い有害なオフターゲット効果をもたらす。
【０３６４】
Ａ．ある特定の修飾ヌクレオシド
本発明のある特定の化合物には、修飾ヌクレオシドが組み込まれる。別途提供されない限り、以下の修飾ヌクレオシドが、限定されることなく、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡとして使用される修飾オリゴヌクレオチドへのそのような組み込みに好適である。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分若しくは修飾核酸塩基、または修飾糖部分及び修飾核酸塩基の両方を含む。
【０３６５】
１．ある特定の糖部分
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡ等の修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含む１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含むそのような修飾オリゴヌクレオチドは、そのような糖修飾ヌクレオシドを有しないオリゴヌクレオチドと比べて、高いヌクレアーゼ安定性または標的核酸への結合親和性の増加等の望ましい特性を有し得る。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、線形修飾糖部分である。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、二環式または三環式糖部分である。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代理物である。そのような糖代理物は、置換糖部分のものに対応する１つ以上の置換を含み得る。
【０３６６】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、限定されないが２’及び／または５’位の置換基を含む１つ以上の非環式置換基を有するフラノシル環を含む線形修飾糖部分である。線形修飾糖部分に好適な２’−置換基の例は、限定されないが、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３（「ＯＭｅ」または「Ｏ−メチル」）、及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３（「ＭＯＥ」）を含む。ある特定の実施形態において、２’−置換基は、ハロ、アリール、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０置換アルコキシ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０置換アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキニル、Ｏ−アルキルエニル−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）の間から選択され、式中、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。これらの２’−置換基のある特定の実施形態は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ、チオアルキル、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルの中から独立して選択される１つ以上の置換基でさらに置換することができる。線形修飾糖部分に好適な５’−置換基の例は、限定されないが、５’−メチル（ＲまたはＳ）、５’−ビニル、及び５’−メトキシを含む。ある特定の実施形態において、線形修飾糖は、１つより多くの非架橋糖置換基、例えば、２’−Ｆ−５’−メチル糖部分を含む（さらなる２’，５’−ビス置換糖部分及びヌクレオシドについては、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号を参照）。
【０３６７】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−線形修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、及びＮ−置換アセトアミド（ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））から選択される線形２’−置換基を含む糖部分を含み、式中、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【０３６８】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−線形修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、及びＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３（「ＮＭＡ」）から選択される線形２’−置換基を含む糖部分を含む。
【０３６９】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−線形修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＨ３、及びＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択される線形２’−置換基を含む糖部分を含む。
【０３７０】
線形修飾糖部分等の修飾糖部分を含むヌクレオシドは、ヌクレオシドの糖部分上の置換（複数化）の位置（複数化）によって言及される。例えば、２’−置換または２−修飾糖部分を含むヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシドまたは２−修飾ヌクレオシドと称される。
【０３７１】
ある特定の修飾糖部分は、第２の環を形成して二環式糖部分をもたらす架橋糖置換基を含む。そのようなある特定の実施形態において、二環式糖部分は、４’及び２’フラノース環原子の間に架橋を含む。そのような４’から２’への架橋糖置換基の例は、限定されないが、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（“ＬＮＡ”）、４’−ＣＨ２−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（“ＥＮＡ”）、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（Ｓ構成において「拘束エチル」または「ｃＥｔ」と称される）、４’−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−２’、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束ＭＯＥ」または「ＭＯＥ」）及びその類似体（例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’及びその類似体（例えば、ＷＯ２００９／００６４７８を参照）、４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’及びその類似体（例えば、ＷＯ２００８／１５０７２９を参照）、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、ＵＳ２００４／０１７１５７０を参照）、４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９、７４、１１８−１３４を参照）、４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びその類似体（ＰＣＴ国際公開出願第ＷＯ２００８／１５４４０１を参照）、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、ならびに４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’を含み、式中、各Ｒ、Ｒａ、及びＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキル（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照）である。
【０３７２】
ある特定の実施形態において、そのような４’−２’架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１〜４つの結合基を独立して含み、
式中、
Ｘは、０、１、または２であり、
Ｎは、１、２、３、または４であり、
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、
各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である。
【０３７３】
さらなる二環式糖部分が当該技術分野で既知であり、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５（２２）、４４２９−４４４３、Ａｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６、７１、７７３１−７７４０、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４、４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１７、１２９、８３６２−８３７９；Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１、２、５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００１、８、１−７；Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１、３、２３９−２４３；米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、及び同第７，３９９，８４５号；ＷＯ２００４／１０６３５６、ＷＯ１９９４／１４２２６、ＷＯ２００５／０２１５７０、及びＷＯ２００７／１３４１８１；米国特許公開第２００４／０１７１５７０号、同第２００７／０２８７８３１号、及び同第２００８／００３９６１８；米国特許出願第１２／１２９，１５４号、同第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、及び同第６１／０９９，８４４；ならびにＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２が知られている。
【０３７４】
ある特定の実施形態において、二環式糖部分及びそのような二環式糖部分を組み込んだヌクレオシドはさらに、異性体構成によって定義される。例えば、ＬＮＡヌクレオシド（前述）は、α−Ｌ構成またはβ−Ｄ構成であってもよい。
【化１】
2018519811.tif 000005
α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）またはα−Ｌ−ＬＮＡ二環式ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれている（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。本明細書において、二環式ヌクレオシドの概要は、両方の異性体構成を含む。特異的な二環式ヌクレオシド（例えば、ＬＮＡまたはｃＥｔ）の位置が本明細書の例示的な実施形態において同定される場合、別途指定されない限り、それらはβ−Ｄ構成にある。
【０３７５】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、１つ以上の非架橋糖置換基及び１つ以上の架橋糖置換基（例えば、５’−置換及び４’−２’架橋糖）を含む（例えば、ＬＮＡヌクレオシドが、例えば、５’−メチルまたは５’−ビニル基でさらに置換されたＷＯ２００７／１３４１８１を参照されたく、また、例えば、米国特許第７，５４７，６８４号、同第７，７５０，１３１号、同第８，０３０，４６７号、同第８，２６８，９８０号、同第７，６６６，８５４号、及び同第８，０８８，７４６号を参照されたい）。
【０３７６】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代理物である。そのようなある特定の実施形態において、糖部分の酸素原子は、例えば、硫黄、炭素または窒素原子で置換される。そのようなある特定の実施形態において、そのような修飾糖部分はまた、前述のような架橋及び／または非架橋置換基を含む。例えば、ある特定の糖代理物は、４’−硫黄原子及び置換を２’−位（例えば、ＵＳ２００５／０１３０９２３）及び／または５’位に含む。
【０３７７】
ある特定の実施形態において、糖代理物は、５つ以外の原子を有する環を含む。例えば、ある特定の実施形態において、糖代理物は、６員テトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。そのようなテトラヒドロピランは、さらに修飾または置換されてもよい。そのような修飾テトラヒドロピランを含むヌクレオシドは、限定されないが、ヘキシトール核酸（「ＨＮＡ」）、アニトール核酸（「ＡＮＡ」）、マンニトール核酸（「ＭＮＡ」）（例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，１０，８４１−８５４を参照）、フルオロＨＮＡ：
【化２】
2018519811.tif 000006
（「Ｆ−ＨＮＡ」、例えば、米国特許第８，０８８，９０４号、同第８，４４０，８０３号、及び同第８，７９６，４３７号を参照されたく、Ｆ−ＨＮＡは、Ｆ−ＴＨＰまたは３’−フルオロテトラヒドロピランと称されてもよい）、及び式
【化３】
2018519811.tif 000007
を有するさらなる修飾ＴＨＰ化合物を含むヌクレオシドを含むが、
式中、上記修飾ＴＨＰヌクレオシドの各々について、独立して、
Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｔ３及びＴ４は各々、独立して、修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残りに結合させるヌクレオシド間結合基であるか、あるいはＴ３及びＴ４の一方は、修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残りに結合させるヌクレオシド間結合基であり、Ｔ３及びＴ４の他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合共役基または５’若しくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７は各々、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、
Ｒ１及びＲ２の各々は、水素、ハロゲン、置換若しくは非置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、及びＣＮの中から独立して選択され、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０３７８】
ある特定の実施形態において、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７が各々、Ｈである修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態において、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７のうちの少なくとも１つはＨではない。ある特定の実施形態において、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７のうちの少なくとも１つはメチルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１及びＲ２の一方がＦである修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態において、Ｒ１はＦであり、Ｒ２はＨであり、ある特定の実施形態において、Ｒ１はメトキシであり、Ｒ２はＨであり、ある特定の実施形態において、Ｒ１はメトキシエトキシであり、Ｒ２はＨである。
【０３７９】
ある特定の実施形態において、糖代理物は、５つより多くの原子及び１つより多くのヘテロ原子を有する環を備える。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシド、及びオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用が報告されている（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０、ならびに米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，０３４，５０６号を参照）。本明細書で使用されるとき、「モルホリノ」という用語は、以下の構造を有する糖代理物を意味する。
【化４】
2018519811.tif 000008
【０３８０】
ある特定の実施形態において、モルホリノは、例えば、上記のモルホリノ構造にさまざまな置換基を付加するか、または上記のモルホリノ構造のさまざまな置換基を改変することによって修飾され得る。そのような糖代理物は、本明細書において「修飾」モルホリノと称される。
【０３８１】
ある特定の実施形態において、糖代理物は、非環式部分を含む。そのような非環式糖代理物を含むヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの例は、限定されないが、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、非環式ブチル核酸（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，１１，５８５３−５８６５を参照）、ならびにＷＯ２０１１／１３３８７６に記載されるヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドを含む。
【０３８２】
修飾ヌクレオシドに使用することができる多くの他の二環式及び三環式糖ならびに糖代理物環系が、当該技術分野で既知である（例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１０，８４１−８５４を参照）。
【０３８３】
２．ある特定の修飾核酸塩基
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡ等の修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオシドと称される、核酸塩基を含まない１つ以上のヌクレオシドを含む。
【０３８４】
ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ならびにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンから選択される。ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、２−アミノプロピルアデニン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−Ｎ−メチルグアニン、６−Ｎ−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−リボシルウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、８−アザ及び他の８−置換プリン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、５−ハロウラシル、ならびに５−ハロシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−Ｎ−イソブチリルグアニン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、普遍的塩基、疎水性塩基、非特異的（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基から選択される。さらなる修飾核酸塩基は、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン、及び９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇ−クランプ）等の三環式ピリミジンを含む。修飾核酸塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアニン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンで置き換えられた塩基も含み得る。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３−２８８に開示されるもの；及びＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８，１６３−１６６  ａｎｄ  ４４２−４４３に開示されるものを含む。
【０３８５】
上で述べた修飾核酸塩基及び他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されることなく、ＵＳ２００３／０１５８４０３、ＵＳ３，６８７，８０８、４，８４５，２０５、５，１３０，３０２、５，１３４，０６６、５，１７５，２７３、５，３６７，０６６、５，４３２，２７２、５，４３４，２５７、５，４５７，１８７、５，４５９，２５５、５，４８４，９０８、５，５０２，１７７、５，５２５，７１１、５，５５２，５４０、５，５８７，４６９、５，５９４，１２１、５，５９６，０９１、５，６１４，６１７、５，６４５，９８５、５，６８１，９４１、５，７５０，６９２、５，７６３，５８８、５，８３０，６５３、及び６，００５，０９６を含む。
【０３８６】
Ｂ．ある特定の修飾ヌクレオシド間結合
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡまたは修飾ｓｃｒＲＮＡ等の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ヌクレオシド間結合を使用して一緒に結合され得る。ヌクレオシド間結合基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または不在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合は、限定されないが、ホスホジエステル結合（「Ｐ＝Ｏ」）（非修飾または天然結合とも称される）、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸、ホスホルアミデート、及びホスホロチオエート（「Ｐ＝Ｓ」）、及びホスホロジチオエート（「ＨＳ−Ｐ＝Ｓ」）を含有するホスフェートを含む。代表的な非リン含有ヌクレオシド間結合基は、限定されないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−ＳｉＨ２−Ｏ−）；及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、天然リン酸結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変更するため、典型的には増加させるために使用することができる。ある特定の実施形態において、キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ混合物として、または別個の鏡像異性体として調製され得る。代表的なキラルヌクレオシド間結合は、限定されないが、アルキルホスフェート及びホスホロチオエートを含む。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間結合の調製方法は、当業者に周知である。
【０３８７】
中性ヌクレオシド間結合は、限定されることなく、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸ｓ、ＭＭＩ（３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、アミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、メトキシプロピル、及びチオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）を含む。さらなる中性ヌクレオシド間結合は、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキシレートエステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホン酸エステル、及びアミドを含む非イオン性結合を含む（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３  ａｎｄ  ４，４０−６５を参照）。さらなる中性ヌクレオシド間結合は、混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分を含む非イオン性結合を含む。
【０３８８】
１．ある特定の修飾モチーフ
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、下の表から選択される修飾モチーフを有する。
【表３−１】
2018519811.tif 000009
【表３−２】
2018519811.tif 000010
表Ａの説明：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾ヌクレオシドを示し、「ｒ」はヌクレオシドを含有する非修飾２’−ヒドロキシ糖を示し、「ｄ」はヌクレオシドを含有する非修飾２’−デオキシ糖を示し、「ｅ」は２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｋ」ヌクレオシドを含有するｃＥｔ二環式糖を示し、「ｌ」はヌクレオシドを含有するＬＮＡ二環式糖を示す。括弧内に列挙される修飾は、任意選択的な修飾核酸塩基または任意選択的な修飾ヌクレオシド間結合である：「（Ｇ−クランプ）」は、直前の文字によって表されるヌクレオシドの一部であるＧ−クランプ修飾核酸塩基を示す。「（５−プロピン）」は、直前の文字によって表されるヌクレオシドの一部である５’−プロピニル修飾核酸塩基を示す。「（ＭＯＰ）」は、メトキシプロピル修飾ヌクレオシド間結合を示し、「（ＭＰ）」はメチルホスホン酸ヌクレオシド間結合を示し、「（ＭＭＩ）」はＭＭＩ  Ｎ−メチルヌクレオシド間結合を示す。ある特定の実施形態において、上の表中に列挙される括弧内の修飾を含むモチーフを有するｃｒＲＮＡは、示される括弧内の修飾を含む。ある特定の実施形態において、上の表中に列挙される括弧内の修飾を含むモチーフを有するｃｒＲＮＡの括弧内の修飾は、異なる修飾若しくは非修飾核酸塩基またはヌクレオシド間結合で置き換えられる。上の表中の数字の下付き文字は、同定された修飾を含む連続ヌクレオシドの数を示す。数字の下付き文字の欠如は、１つのヌクレオシドを意味する。上の表中に列挙されるモチーフは、任意のｃｒＲＮＡ核酸塩基配列及び任意のヌクレオシド間結合モチーフとともに用いられてもよい。ある特定の実施形態において、全ての核酸塩基は非修飾である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの核酸塩基は５−メチルシトシン修飾核酸塩基である。ある特定の実施形態において、ヌクレオシド間結合は全て、ホスフェート及びホスホロチオエートの中から独立して選択される。ある特定の実施形態において、１つ以上のヌクレオシド間結合は、中性ヌクレオシド間結合である。
【０３８９】
Ｃ．ある特定の共役基及び末端基
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡとして使用されるオリゴヌクレオチドは、共役基及び／または末端基をさらに含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む化合物は、共役基または末端基をさらに含む。そのようなある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の共役基に共有結合的に結合する。ある特定の実施形態において、共役基は、限定されないが、薬物動力学、薬物動態、安定性、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷、及びクリアランスを含む、結合したオリゴヌクレオチドの１つ以上の特性を改変する。ある特定の実施形態において、共役基は、結合したオリゴヌクレオチドに、新しい特性、例えば、オリゴヌクレオチドの検出を可能にするフルオロフォアまたはレポーター基を付与する。共役基及び／または末端基は、前述の修飾またはモチーフのいずれかを有するオリゴヌクレオチドに付加されてもよい。
【０３９０】
共役基は、限定されることなく、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、ビタミン部分、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フルオロフォア、及び色素を含む。ある特定の共役基が以前に記載されており、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール若しくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ヌクレオシド＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、オクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）、トコフェロール基（Ｎｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１５，４，ｅ２２０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．７２  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，１６，７３４−７４０）、またはＧａｌＮＡｃクラスター（例えば、ＷＯ２０１４／１７９６２０）である。
【０３９１】
ある特定の実施形態において、共役基は、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フィンゴリモド、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質を含む。
【０３９２】
共役基は、ｃｒＲＮＡまたはｓｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド等の親化合物に、直接または任意選択的な共役リンカーを介して結合する。ある特定の実施形態において、共役基は、オリゴヌクレオチドに直接結合する。ある特定の実施形態において、共役基は、共役リンカーを介してオリゴヌクレオチドに間接的に結合する。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、ヒドロカルビル鎖等の鎖構造、またはエチレングリコール若しくはアミノ酸単位等の反復単位のオリゴマーを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、開裂可能な部分を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、開裂可能な部分を介してオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、開裂可能な部分を含む。そのようなある特定の実施形態において、共役リンカーは、開裂可能な部分を介してオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、開裂可能な部分を含み、開裂可能な部分は、ヌクレオシド間リン酸結合等の開裂可能なヌクレオシド間結合に結合するヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、共役基は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを含み、共役基のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、親オリゴヌクレオチドに間接的に結合する。
【０３９３】
ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノから選択される１つ以上の基を含む。そのようなある特定の実施形態において、共役リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アルキル基及びアミド基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つのリン酸基を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つの中性結合基を含む。
【０３９４】
ある特定の実施形態において、前述の共役リンカーを含む共役リンカーは、例えば、本明細書において提供されるｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド及び本明細書において提供されるｓｃｒＲＮＡ  オリゴヌクレオチド等の親化合物に共役基を結合させるのに有用であることが当該技術分野で知られている、二官能性結合部分である。一般に、二官能性結合部分は、少なくとも２つの官能基を含む。官能基のうちの一方は、親化合物上のある特定の部位に結合するように選択され、他方は共役基に結合するように選択される。二官能性結合部分に使用される官能基の例は、限定されないが、求核基と反応するための求電子剤、及び求電子基と反応するための求核剤を含む。ある特定の実施形態において、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル、及びアルキニルから選択される１つ以上の基を含む。
【０３９５】
共役リンカーの例は、限定されないが、ピロリジン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、及び６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）を含む。他の共役リンカーは、限定されないが、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、または置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルを含み、好ましい置換基の非限定的なリストは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルを含む。
【０３９６】
ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、少なくとも１つの開裂可能な結合を含む原子団である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、１つ、２つ、３つ、４つ、または４つ以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、リソソーム等の細胞区画または細胞内区画内で選択的に開裂される。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、ヌクレアーゼ等の内在性酵素によって選択的に開裂される。
【０３９７】
ある特定の実施形態において、開裂可能な結合、アミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバミン酸塩、またはジスルフィドの中から選択される。ある特定の実施形態において、開裂可能な結合は、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステルである。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、ホスフェートまたはホスホジエステルを含む。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、オリゴヌクレオチドと共役リンカーまたは共役基との間のリン酸結合である。
【０３９８】
ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、ヌクレオシドである。そのようなある特定の実施形態において、非修飾または修飾ヌクレオシドは、プリン、置換プリン、ピリミジン、または置換ピリミジンから選択される任意選択的に保護された複素環塩基を含む。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン、アデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、グアニン及び２−Ｎ−イソブチリルグアニンから選択されるヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、ヌクレオシド間リン酸結合によってオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端ヌクレオシドのいずれかに結合し、ホスフェートまたはホスホロチオエート結合によって共役リンカーまたは共役基に共有結合的に結合する、２’−デオキシヌクレオシドである。そのようなある特定の実施形態において、開裂可能な部分は、２’−デオキシアデノシンである。
【０３９９】
共役基は、オリゴヌクレオチドのいずれか若しくは両方の末端及び／または任意の内部位置に結合してもよい。ある特定の実施形態において、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの２’位に結合する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方の末端に結合する共役基は、末端基である。そのようなある特定の実施形態において、共役基または末端基は、オリゴヌクレオチドの３’及び／または５’末端に結合する。そのようなある特定の実施形態において、共役基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合する。ある特定の実施形態において、共役基は、オリゴヌクレオチドの３’末端付近に結合する。ある特定の実施形態において、共役基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。ある特定の実施形態において、共役基は、オリゴヌクレオチドの５’末端付近に結合する。
【０４００】
末端基の例は、限定されないが、共役基、キャッピング基、リン酸部分、保護基、修飾または非修飾ヌクレオシド、及び独立して修飾されているかまたは非修飾の２つ以上のヌクレオシドを含む。
【０４０１】
ある特定の実施形態において、共役基は、細胞標的部分である。ある特定の実施形態において、共役基、任意選択的な共役リンカー、及び任意選択的な開裂可能な部分は、一般式
【化５】
2018519811.tif 000011
を有し、式中、ｎは１〜約３であり、ｎが１である場合ｍは０であり、ｎが２以上である場合ｍは１であり、ｊは１または０であり、ｋは１または０である。
【０４０２】
ある特定の実施形態において、ｎは１であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは１であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは１であり、ｊは１であり、ｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは２であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは２であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは２であり、ｊは１であり、ｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは３であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは３であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは３であり、ｊは１であり、ｋは１である。
【０４０３】
ある特定の実施形態において、共役基は、少なくとも１つのテザーリガンドを有する細胞標的部分を含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、分岐基に共有結合的に結合した２つのテザーリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、分岐基に共有結合的に結合した３つのテザーリガンドを含む。
【０４０４】
ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノ基から選択される１つ以上の基を含む分岐した基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基を含む。そのようなある特定の実施形態において、分岐脂肪族基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。そのようなある特定の実施形態において、分岐脂肪族基は、アルキル、アミノ、及びエーテル基から選択される基を含む。そのようなある特定の実施形態において、分岐脂肪族基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、単環式または多環式環系を含む。
【０４０５】
ある特定の実施形態において、細胞標的部分の各テザーは、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミド、ホスホジエステル、及びポリエチレングリコールから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミド、及びポリエチレングリコールから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、ホスホジエステル、エーテル、アミノ、オキソ、及びアミドから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、アミノ、オキソ、及びアミドから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、アミノ、及びオキソから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル及びオキソから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル及びホスホジエステルから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１つのリン結合基または中性結合基を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、約６〜約２０原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、約１０〜約１８原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、約１０原子長の鎖を含む。
【０４０６】
ある特定の実施形態において、細胞標的部分の各リガンドは、標的細胞上の少なくとも１つの種類の受容体に対して親和性を有する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、哺乳動物肝臓細胞の表面上の少なくとも１つの受容体に対して親和性を有する。ある特定の実施形態において、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対して親和性を有する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物である。ある特定の実施形態において、各リガンドは、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース、グルコース、グルコースアミン、及びフコースから独立して選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、３つのＧａｌＮＡｃリガンドを有する。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、２つのＧａｌＮＡｃリガンドを有する。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、１つのＧａｌＮＡｃリガンドを有する。
【０４０７】
ある特定の薬学的組成物
ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のｃｒＲＮＡを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、そのような薬学的組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、Ｃａｓ９を発現させる手段を含む。ある特定の実施形態において、そのようなＣａｓ９を発現させる手段は、プラスミドまたはウイルスベクターである。そのようなある特定の実施形態において、薬学的組成物は、好適な薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、滅菌生理食塩水溶液及び１つ以上のアンチセンス化合物を含む。ある特定の実施形態において、そのような薬学的組成物は、滅菌生理食塩水溶液及び１つ以上のアンチセンス化合物からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及び滅菌水を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つのアンチセンス化合物及び滅菌水からなる。ある特定の実施形態において、滅菌水は、医薬品グレードの水である。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及び滅菌ＰＢＳからなる。ある特定の実施形態において、滅菌ＰＢＳは、医薬品グレードのＰＢＳである。
【０４０８】
ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のｓｃｒＲＮＡを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、ヌクレアーゼを発現させる手段を含む。ある特定の実施形態において、そのようなヌクレアーゼを発現させる手段は、プラスミドまたはウイルスベクターである。そのようなある特定の実施形態において、薬学的組成物は、好適な薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、滅菌生理食塩水溶液及び１つ以上のアンチセンス化合物を含む。ある特定の実施形態において、そのような薬学的組成物は、滅菌生理食塩水溶液及び１つ以上のアンチセンス化合物からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及び滅菌水を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つのアンチセンス化合物及び滅菌水からなる。ある特定の実施形態において、滅菌水は、医薬品グレードの水である。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物及び滅菌ＰＢＳからなる。ある特定の実施形態において、滅菌ＰＢＳは、医薬品グレードのＰＢＳである。
【０４０９】
非限定的な開示及び参照による組み込み
本明細書に記載されるある特定の化合物、組成物、及び方法がある特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、以下の実施例は、本明細書に記載される化合物を例証する役目のみを果たし、それを限定するようには意図されていない。本出願に列挙される参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号等は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４１０】
本出願に添付される配列表が必要に応じて各配列を「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のいずれかと特定するが、実際には、それらの配列は、化学修飾の任意の組み合わせで修飾され得る。当業者であれば、修飾オリゴヌクレオチドを説明するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のそのような指定が、ある特定の事例において、任意であることを容易に認識する。例えば、２’−ＯＨ糖部分及びチミン塩基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの天然２’−Ｈの場合、２’−ＯＨ）または修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡの天然ウラシルの場合、チミン（メチル化ウラシル））と記載され得る。
【０４１１】
したがって、配列表中のものを含むが、これらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有する核酸を含むが、これらに限定されない天然または修飾ＲＮＡ及び／またはＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するよう意図されている。さらなる例として、かつ限定されることなく、核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するオリゴマー化合物は、修飾であろうと非修飾であろうと、そのような核酸塩基配列を有するオリゴマー化合物を包含し、それには、限定されないが、配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、及び「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」等のいくつかのＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基とを有するもの等のＲＮＡ塩基を含むそのような化合物、ならびに「ＡＴｍＣＧＡＵＣＧ」（この場合、ｍＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す）等の他の修飾塩基または天然塩基を有するオリゴマー化合物が含まれる。
【実施例】
【０４１２】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示しており、限定的ではない。さらに、ある特定の実施形態が提供される場合、本発明者らは、それらのある特定の実施形態の一般的適用を企図した。例えば、ある特定のモチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有するさらなるオリゴヌクレオチドへの合理的な支持を提供する。同様に、例えば、ある特定の高親和性修飾がある特定の位置に出現する場合、同一の位置での他の高親和性修飾は、別途示されない限り、好適であると見なされる。さらなる例として、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡのモチーフは、ｓｃｒＲＮＡにも適用され得る。具体的には、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分のモチーフが、ｃｒＲＮＡのｓｃｒＲＮＡ標的認識部分に適用されてもよい。同様に、本明細書に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分のモチーフが、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分に適用されてもよい。
【０４１３】
実施例１：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＬＤＬＲ遺伝子座に与える影響
ヒトＬＤＬＲ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ｈＬＤＬＲに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣａｓ９タンパク質及びｔｒａｃｒＲＮＡを発現するプラスミドでトランスフェクトした。代替的に、Ｃａｓ９タンパク質及び陽性対照として活性の高いｓｇＲＮＡを発現するプラスミドで、または陰性対照としてＣａｓ９（「Ｃａｓ９対照」）を含まないプラスミドで細胞をトランスフェクトした。６時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、または対照としてｃｒＲＮＡを用いずに（「陰性対照」）、下の表に記載されるｃｒＲＮＡでトランスフェクトした。２回目のトランスフェクションから４８時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、製造業者の指示に従ってＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に使用した。ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１）及び逆方向：５’−ＣＴＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２）であった。細胞開裂後、ｈＬＤＬＲの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流した（図１）。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して定量化を行い、以下の式を用いて挿入欠失の発生の割合を計算し、挿入欠失（％）＝１００×（１−（１−標的遺伝子の切断断片）０．５）、標的遺伝子の切断断片は、切断された標的遺伝子断片（複数可）の蛍光シグナルを、切断された及び無傷な標的遺伝子断片（複数可）の蛍光シグナル合計で除すことによって決定される。各修飾ｃｒＲＮＡの挿入欠失発生率を陽性対照ｓｇＲＮＡの挿入欠失発生率に対して正規化したものは、遺伝子破壊の割合と称される。下の表に示される結果は、ホスホロチオエート修飾ｃｒＲＮＡが非修飾ｃｒＲＮＡよりも活性が高かったこと、また、ホスホロチオエート及び２’−Ｏ−メチル修飾ｃｒＲＮＡは、糖修飾を含まないｃｒＲＮＡよりもさらに活性が高かったことを示している。
【表４】
2018519811.tif 000012
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４１４】
実施例２：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＶＥＧＦＡ遺伝子座に与える影響
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ｈＶＥＧＦＡに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。下の表に記載されるｃｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号３）及び逆方向：５’−ＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号４）であった。細胞開裂後、ｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流し（図２を参照）、実施例１に記載されるようにゲルを定量化した。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。結果は、多くの修飾ｃｒＲＮＡが活性であったことを示している。
【表５】
2018519811.tif 000013
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示し、「ｄ」は非修飾２’−デオキシ糖部分を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４１５】
実施例３：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＶＥＧＦＡ遺伝子座に与える影響
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ｈＶＥＧＦＡに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。下の表に記載されるｃｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトし、Ｃａｓ９／ｔｒａｃｒＲＮＡの負荷時間は２４時間とした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号３）及び逆方向：５’−ＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号４）であった。細胞開裂後、ｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流し（図３を参照）、実施例１に記載されるようにゲルを定量化した。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。結果は、多くの修飾ｃｒＲＮＡが活性または非常に活性であったことを示している。
【表６】
2018519811.tif 000014
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示し、「ｄ」は非修飾２’−デオキシ糖部分を示し、「ｅ」は２’−ＭＯＥ修飾を示し、「ｏ」はヌクレオシド間リン酸結合を示し、「ｋ」はｃＥｔ修飾を示す。下付き文字「ｍ」は、核酸塩基の５−メチル修飾を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４１６】
実施例４：修飾された短いｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＶＥＧＦＡ遺伝子座に与える影響
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ＶＥＧＦＡを標的とする、２０ヌクレオシド長未満のＤＮＡ認識部分及び／または２２ヌクレオシド長未満のｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。下の表に記載されるｃｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号３）及び逆方向：５’−ＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号４）であった。細胞開裂後、ｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流した（図３を参照）。実験を繰り返し、実施例１に記載されるように得られたゲルを定量化した。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。結果は、１２個のみのヌクレオシドｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分及び１７個のみのヌクレオシドＤＮＡ認識部分を含むｃｒＲＮＡを含む、多くの短い修飾ｃｒＲＮＡが活性であったことを示している。
【表７】
2018519811.tif 000015
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示し、「ｄ」は非修飾２’−デオキシ糖部分を示し、「ｋ」はｃＥｔ修飾を示す。下付き文字「ｍ」は、核酸塩基の５−メチル修飾を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４１７】
実施例５：ｃｒＲＮＡ修飾モチーフ
下の表に記載されるモチーフを有する修飾ｃｒＲＮＡは、任意のｃｒＲＮＡ核酸塩基配列に使用することができる。各モチーフの最初の１７〜２０個のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を表し、各モチーフの残りの１２〜２２個のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。「２９−ｍｅｒ」と表示されるモチーフは、２９個の結合ヌクレオシドを含有し、「４２−ｍｅｒ」と表示されるモチーフは、４２個の結合ヌクレオシドを含有する。下に記載されるモチーフはまた、他の長さのｃｒＲＮＡにも適用することができ、そのパターンは、オリゴヌクレオチド長に適合するように伸長または短縮される。モチーフの修飾は、上の表１〜４の下付き文字に使用される同じ単一文字の識別子を使用して記載される。数字の下付き文字は、同定された修飾を含む連続ヌクレオシドの数を示す。数字の下付き文字の欠如は、１つのヌクレオシドを意味する。さらなる略語は次の通りである：「ｌ」はＬＮＡ修飾を示し、「（ＭＯＰ）」はメトキシプロピル修飾ヌクレオシド間結合を示し、「（ＭＰ）」はメチルホスホン酸ヌクレオシド間結合を示し、「（ＭＭＩ）」はＭＭＩ  Ｎ−メチルヌクレオシド間結合を示し、「（５−プロピン）」は５−プロピン核酸塩基修飾を示し、「（Ｇ−クランプ）」はＧ−クランプ修飾核酸塩基を示す。
【表８−１】
2018519811.tif 000016
【表８−２】
2018519811.tif 000017
【０４１８】
実施例６：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＶＥＧＦＡ遺伝子座に与える影響
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ｈＶＥＧＦＡに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。下の表に記載されるｃｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号３）及び逆方向：５’−ＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号４）であった。細胞開裂後、ｈＶＥＧＦＡの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流し、実施例１に記載されるようにゲルを定量化した。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。その結果は、修飾ｃｒＲＮＡの多くが活性であり、中にはｓｇＲＮＡ陽性対照よりも活性なものもあったことを示している。
【表９】
2018519811.tif 000018
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示し、「ｄ」は非修飾２’−デオキシ糖部分を示し、「ｋ」はｃＥｔ修飾を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４１９】
実施例７：修飾ｃｒＲＮＡのオフターゲット効果
修飾ｃｒＲＮＡのオフターゲット効果を調べるために、Ｉｓｉｓ番号８０１１９３（実施例３）、８０１３８１（実施例４）、及び８３４４７２（実施例６）をヒトＭｙｃ関連因子Ｘ（ＭＡＸ）の遺伝子座の遺伝子編集に与える影響について調べた。染色体位置１４ｑ２３に、ＭＡＸ遺伝子は、Ｉｓｉｓ番号８０１１９３、８０１３８１、及び８３４４７２によって標的とされるＶＥＧＦＡ遺伝子の領域の一部または全部にマッチする２０個のヌクレオチドのうちの１８個を担持する。Ｉｓｉｓ番号８０１１９３、８０１３８１、または８３４４７２を修飾ｃｒＲＮＡとして使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ＭＡＸ遺伝子のオフターゲット部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣＧＴＣＴＧＴＴＡＧＡ−３’（配列番号１７）及び逆方向５’−ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１８）であった。細胞開裂後、ＭＡＸの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流した。実施例１に記載されるように定量化を行った。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。結果は、修飾ｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡ対照よりも低いオフターゲット効果を示したことを示している。修飾ｃｒＲＮＡのオンターゲット効果（実施例３、４、及び６を参照）を、比較のために下の３番目の列に示す。
【表１０】
2018519811.tif 000019
【０４２０】
実施例８：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がｈＴＴＲ遺伝子座に与える影響
ｈＴＴＲ遺伝子座の遺伝子編集に与える影響を調べるために、ヒトＴＴＲに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計及び合成した。下の表に記載されるｃｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ｃｒＲＮＡ標的部位を増殖するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号４１）及び逆方向：５’−ＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＧＴＡＧ−３’（配列番号４２）であった。細胞開裂後、ｈＴＴＲの遺伝子編集の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流し、実施例１に記載されるようにゲルを定量化した。修飾ｃｒＲＮＡに関する結果をｈＴＴＲを標的とする陽性対照ｓｇＲＮＡに対して正規化し、下の表に示される遺伝子破壊の割合を決定した。結果は、多くの修飾ｃｒＲＮＡが活性であり、また中にはｓｇＲＮＡ陽性対照よりもさらに活性の高いものがあったことを示している。
【表１１】
2018519811.tif 000020
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｆ」は２’−Ｆ修飾を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を示し、下線のないヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ認識部分を表す。
【０４２１】
実施例９：切断型ｓｃｒＲＮＡの遺伝子改変効果
ＤＮＭＴ１遺伝子の改変に対する効果を調べるために、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）に相補的なｓｃｒＲＮＡ標的認識部分を含む切断型ｓｃｒＲＮＡを設計及び合成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃｐｆ１をコードするプラスミド、及び下の表に列挙されるｓｃｒＲＮＡをコードする二本鎖ｇｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）でトランスフェクトした。実施例１に記載されるようにＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行い、ＤＮＭＴ１遺伝子のｓｃｒＲＮＡ部位を増幅するために使用したＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４７）及び逆方向：５’−ＣＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号）であった。細胞開裂後、ＤＮＭＴ１の遺伝子改変の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流した。結果が図４ａ及び４ｂに示される。その結果は、３６個のみのヌクレオシドを含有するｓｃｒＲＮＡを含む複数の切断型ｓｃｒＲＮＡが標的遺伝子を改変したことを示している。
【表１２】
2018519811.tif 000021
上の表中の全てのヌクレオシドは、２’−ヒドロキシ糖部分及びヌクレオシド間リン酸結合を含む非修飾リボヌクレオシドである。下線のヌクレオシドは、ｓｃｒＲＮＡの標的認識部分を表し、下線のないヌクレオシドは、ｓｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ認識部分を表す。
【０４２２】
実施例１０：切断型ｔｒａｃｒＲＮＡのＤＮＡ切断効果
マウスのプロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（Ｐｃｓｋ９）の編集に対する効果を調べるために、切断型ｔｒａｃｒＲＮＡを設計及び合成した。Ｐｃｓｋ９  ＤＮＡを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ標的部位を包含するマウスのゲノム遺伝子座の一部を、プライマー５’−ＣＴＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣ−３’（配列番号６１）及び５’−ＣＡＧＡＣＧＧＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号６２）を用いてＰＣＲにより増幅した。３０ｎＭの下の表に示す修飾ｃｒＲＮＡ（Ｉｏｎ番号９２７７２０）、及び３０ｎＭの下の表に示すｔｒａｃｒＲＮＡを用いて、インビトロ生化学アッセイにおいてＰｃｓｋ９遺伝子破壊について調べた。Ｃａｓ９による開裂後、活性の程度を分析するためにＤＮＡをゲルに流した。結果が図５に示される。その結果は、切断型ｔｒａｃｒＲＮＡがインビトロで活性を示したことを示している。
【表１３】
2018519811.tif 000022
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を表す。上の表中に示されるｔｒａｃｒＲＮＡの全てのヌクレオシドは、２’−ヒドロキシ糖部分及びヌクレオシド間リン酸結合を含む非修飾リボヌクレオシドである。
【０４２３】
実施例１１：修飾ｃｒＲＮＡの自由取り込み後の遺伝子活性化
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−５８８（２０１５）に記載されるものに類似した転写活性アッセイにおいて、修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を活性化する能力を調べた。簡潔に述べると、１つのＭＳ２アプタマー配列をｔｒａｃｒＲＮＡの５８位に挿入した。ＨＥＫ  ２９３細胞を、ＰＢＳ単独（陰性対照）で、または四量体ＶＰ１６転写活性ドメインに融合させた触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４）、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらが記載するようなＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１活性化ヘルパータンパク質、及びｔｒａｃｒＲＮＡ１．２を含有するＭＳ２アプタマーをコードするプラスミドでトランスフェクトした。下の表に列挙されるヒトＴＴＲに相補的なＤＮＡ認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを、最終濃度１ｕＭになるようにトランスフェクション試薬の非存在下でＰＢＳに加えた。ｃｒＲＮＡを含まないＰＢＳを「非ＲＮＡ」対照に加えた。４８時間後、全ＲＮＡを単離し、順方向プライマー５’−ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号６７）、逆方向プライマー５’−ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＴ−３’（配列番号６８）、及びプローブ５’−ＣＣＣＴＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＣ−３’（配列番号６９）を使用するＲＴ−ｑＰＣＲを用いて遺伝子活性化を測定した。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果をＧＡＰＤＨに対して正規化し、１．０に設定された陰性対照に対する倍数変化として下の表に表す。結果は、修飾ｃｒＲＮＡが、自由取り込みによって細胞に取り込まれ、標的遺伝子の活性化を誘導したことを示している。
【表１４】
2018519811.tif 000023
下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を表す。
【０４２４】
実施例１２：修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物を使用したＰｃｓｋ９  ＤＮＡのインビトロ消化
下の表に示される修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物は、マウスＰｃｓｋ９に相補的なＤＮＡ認識部分を含む。下の表１２に示される修飾ｃｒＲＮＡを作成し、本明細書に記載されるようにそれらのＤＮＡ切断活性及び／または遺伝子破壊活性について試験した。表１３に示される修飾ｃｒＲＮＡを合成し、インビトロでのＤＮＡ切断活性について試験した。Ｉｏｎ番号９２７７２２はＧａｌＮＡｃ共役基（「ＬＩＣＡ−１」）を含み、Ｉｏｎ番号９２７７２２の合成を以下に示す。実施例１０に記載されるようにＤＮＡ切断アッセイを行った。Ｉｏｎ番号９２７７２０または９２７７２２は、ｔｒａｃｒＲＮＡとともに使用した。ｓｇＲＮＡは、陽性対照として単独で使用した。結果が図６に示される。その結果は、共役基が結合していない修飾ｃｒＲＮＡが、インビトロでｓｇＲＮＡ陽性対照よりも強力にＰｃｓｋ９  ＤＮＡを切断したことを示している。ＧａｌＮＡｃ共役基に結合した修飾ｃｒＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ陽性対照とほぼ等しい程度までＰｃｓｋ９  ＤＮＡを切断した。
【表１５】
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【表１６】
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下付き文字：「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾を示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し、「ｏ」はヌクレオシド間リン酸結合を示し、「ｒ」は非修飾２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下線のヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ認識部分を表す。
【０４２５】
Ｉｏｎ番号９２７７２０及び９２７７２２の合成
【化６】
2018519811.tif 000026
【０４２６】
化合物３
ジクロロメタン（４０ｍＬ）中のＴＨＡ−ＧａｌＮＡｃ３  ＰＦＰエステル１（１０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１．４７ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の６−アミノ−１−ヘキサノールを滴下で加えた。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｃｏｌｕｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２２０ｇ）により精製し、ジクロロメタン中５〜２０％のＭｅＯＨで溶出して３（９．１ｇ、９４％）を得た。ＬＲ  ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ８４Ｈ１３９Ｏ３６Ｎ８［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ＝１８３７．１の計算値、実測値１８３７．９。
【０４２７】
化合物４
３（８．９６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）及びテトラゾール（０．２７３ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の０℃のＤＭＦ（２５ｍＬ）溶液に、１−メチルイミダゾール（９７μＬ、１ｍｍｏｌ）及びホスフィチル化試薬（２．３ｍＬ、７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に加温し、その温度で１２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び鹹水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。濾過後、酢酸エチル溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、最初に酢酸エチルを用いて溶出し、次いで、酢酸エチル中の５０％アセトン、その後、アセトン及びＴＨＦ中の５０％アセトンを用いて溶出し、白色の泡として４（７．５ｇ、７５％）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１４７．３２、ＬＲ  ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ９３Ｈ１５４Ｏ３７Ｎ１０Ｐ［Ｍ−Ｈ］−ｍ／ｚ＝２０３５．０の計算値、実測値２０３４．８。
【０４２８】
修飾ｃｒＲＮＡｓ、Ｉｏｎ番号９２７７２０及び９２７７２２の合成
標準的なホスホラミダイト及び固体支持体を、ヌクレオシドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣの組み込みに使用した。無水アセトニトリル中のアミダイトの０．２Ｍ溶液を合成に使用した。無水アセトニトリル中の２’−Ｏ−Ｍｅ  ＡＢｚ、Ｕ、Ｇｉｂｕ、及びＣＢｚホスホラミダイトの０．２Ｍ溶液を、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの組み込みに使用した。ＶＩＭＡＤ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）固体支持体（１００μｍｏｌ／ｇ負荷量）上でＡＫＴＡＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して修飾ｃｒＲＮＡ（６０μｍｏｌスケール）を合成し、合成のためにカラムに適切な量の固体支持体を充填した。トルエン中のジクロロ酢酸（６％）を脱トリチル化試薬として使用した。カップリングステップの間に、ＣＨ３ＣＮ中のＮ−メチルイミダゾールの存在下で４，５−ジシアノイミダゾールをアクチベーターとして使用した。アセトニトリル中５０％のピリミジン中の０．１Ｍキサンタン水素化物溶液を、接触時間３分で硫化剤として使用した。１２等量のＴＨＡ−ＧａｌＮＡｃホスホラミダイト４を３部で送達し、その後、１２分のカップリング待ち時間があった。製造業者によって供給されたプロトコルにおける他の全てのステップは、修飾しないで用いた。カップリング効率は、９７％超であった。合成終了後、トルエン中の２０％ジエチルアミンで固体支持体を４５分間処理し、ホスホロチオエート結合からシアノエチル基を除去した。次いで、含水水酸化アンモニウム（３０重量％）：エタノール（３：１）に固体支持体を懸濁し、室温で４時間撹拌させた。これに水中で１０％（Ｖ／Ｖ）のメチルアミン（４０重量％）を加え、室温で２４時間撹拌し続け、２’位のＴＢＤＭＳ基を除く全ての保護基の除去を完了した。固体支持体を濾過し、濾液が乾燥するまで濃縮させた。得られた残渣を、無水トリエチルアミントリヒドロフルオライド／トリエチルアミン／１−メチル−２−ピロリジノン溶液に再懸濁し（１．４Ｍ  ＨＦ濃度を提供するための、３ｍＬのトリエチルアミントリヒドロフルオライド、２．２５ｍＬのトリエチルアミン、及び４．５ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンの溶液９．７５）、６５℃で４時間加熱して２’位のＴＢＤＭＳ基を除去した。１．５Ｍ重炭酸アンモニウム（９．９５ｍＬ）で反応を停止し、水で希釈し、強陰イオン交換カラム上のＨＰＬＣにより精製した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝３０％含水ＣＨ３ＣＮ中の１００ｍＭ酢酸アンモニウム、Ａ中のＢ＝１．５Ｍ  ＮａＢｒ、２８カラム体積のＢの０〜６０％、流れ１４ｍＬ／分−１）。全長ｃｒＲＮＡを含有する断片を一緒にプールし、逆相カラム上のＨＰＬＣにより脱塩し、固体支持体の負荷量に基づいて１０％の単離収率でｃｒＲＮＡを得た。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＭＳＤシステムを用いたイオン対−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりオリゴヌクレオチドを特徴づけた。
【表１７】
2018519811.tif 000027
【０４２９】
実施例１３：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集がエクスビボでＰｃｓｋ９に対する与える影響
エクスビボでのＰｃｓｋ９の遺伝子編集について修飾ｃｒＲＮＡの試験を行った。Ｃａｓ９を発現するマウス由来幹細胞（Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５９，４４０−４５５（２０１４）に記載される）を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したウィリアム培地Ｅで培養した。リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、肝細胞をＩｏｎ番号９２７７２０（実施例１２を参照）及びｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ陽性対照単独でトランスフェクトした。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを使用してＰｃｓｋ９  遺伝子破壊を測定した。結果が図７に示される。その結果は、修飾ｃｒＲＮＡが、エクスビボで肝細胞においてｓｇＲＮＡ陽性対照に対するのと同様の能力でＰｃｓｋ９遺伝子を破壊したことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
2018519811.tif 000031
【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
2018519811.tif 000034
【図７】
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【国際調査報告】
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