(57)【要約】  本開示は、タンパク質を生成するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質（例えば、薬物代謝酵素及び輸送体ベシクル）の生成における、エレクトロポレーションを介した遺伝子送達に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合タンパク質を発現する膜ベシクルを生成する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞を、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＧ２、及びそれらの相同体からなる群より選択される膜結合タンパク質をコードする核酸と接触させるステップ；
ｂ）前記核酸が前記哺乳動物細胞内に入るように、前記哺乳動物細胞をエレクトロポレーションするステップ；及び
ｃ）目的の前記膜結合タンパク質を発現する膜ベシクルを単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記エレクトロポレーションするステップの後に、前記細胞を培養するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養するステップが、酪酸ナトリウムの添加を含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離するステップが、前記細胞の均質化を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記膜結合タンパク質が、前記膜結合タンパク質を天然形態で生じる翻訳後修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、Ｓ２、ＭＤＣＫ−Ｉ、ＭＤＣＫ−ＩＩ、ＬＬＣ−ＰＫ１、Ｃａｃｏ−２、Ｈｕｈ７、又はＶ７９細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記膜ベシクルを試験化合物と接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物が薬物であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）哺乳動物細胞を、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＧ２、及びそれらの相同体からなる群より選択される輸送体タンパク質をコードする核酸と接触させるステップ；
ｂ）前記核酸が前記哺乳動物細胞内に入るように、前記哺乳動物細胞をエレクトロポレーションするステップ；
ｃ）前記輸送体タンパク質を発現する細胞膜ベシクルを単離するステップ；及び
ｄ）前記細胞膜ベシクルを前記試験化合物と接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
前記輸送体タンパク質による前記試験化合物の輸送を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定するステップが、輸送の動態を測定するステップを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞膜を前記薬物輸送体の阻害剤と接触させて、前記阻害剤による前記薬物輸送体の活性又は輸送の阻害を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって生成された、単離された膜ベシクル。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１５年１１月２５日出願の米国仮特許出願第６２／２５９，７８８号の米国法典第３５編特許法１１９条に基づく優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、タンパク質を生成するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質（例えば、薬物代謝酵素及び薬物輸送体ベシクル、ミクロソーム、又は細胞画分）の生成におけるエレクトロポレーションを介した遺伝子送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
組み換えタンパク質の発現は、研究、工業、及び製薬バイオ産業の多くの態様において重要である。例えば、薬物代謝酵素及び輸送体タンパク質の発現は、しばしば、創薬及び医薬品開発において重要である。これらのタンパク質の多くでは、哺乳動物細胞における発現は、正しい翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はシリル化）の必要性の理由から、原核細胞における発現よりも好ましい。
【０００４】
組み換えタンパク質を発現する宿主細胞を生成するための幾つかの方法が知られている。最も基本的な方法では、異種タンパク質をコードする遺伝子及び適切な制御領域を含む核酸構築物が宿主細胞内に導入され、一体化される。導入の方法には、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、及びリポフェクションが含まれる。他の方法では、導入された核酸構築物を増幅するために、選択スキームが用いられる。これらの方法では、細胞は、増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子と異種タンパク質をコードする遺伝子とを同時トランスフェクトされる（例えば、非特許文献１参照）。最初の形質転換体の選択後、トランスフェクトされた遺伝子は、培地中の選択的薬剤（例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ）の段階的増加によって増幅される。幾つかの事例では、外来遺伝子が、これらの手順によって数百倍に増幅されうる。哺乳動物細胞において組み換えタンパク質を発現させる他の方法は、エピソームベクター（例えば、プラスミド）を用いたトランスフェクションを利用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Schroder and Friedl, Biotech. Bioeng. 53(6):547-59(1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
組み換えタンパク質の発現のための哺乳動物細胞株を作出する現行の方法には、幾つかの欠点がある。このような問題には、細胞毒性、より大きい遺伝子又は遺伝子構築物の送達不能性、発現レベルにおける顕著なバッチ間の非一貫性、不安定な発現、及び、発現されたタンパク質の不適切な局在性、翻訳後修飾、及び／又は折り畳みが含まれる。したがって、組み換えタンパク質を発現する宿主細胞を作出するための改善された方法が本技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、タンパク質を生成するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質（例えば、薬物代謝酵素及び薬物輸送体ベシクル、ミクロソーム又は細胞画分）の生成におけるエレクトロポレーションを介した遺伝子送達に関する。
【０００８】
例えば、幾つかの実施形態では、本開示は、ベシクル又はミクロソームのものを含む、膜結合タンパク質を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態では、本方法は、ａ）哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、Ｓ２、ＭＤＣＫ−Ｉ、ＭＤＣＫ−ＩＩ、ＬＬＣ−ＰＫ１、Ｃａｃｏ−２、Ｈｕｈ７、及びＶ７９細胞）を、膜結合タンパク質（例えば、輸送体タンパク質（例えば、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＧ２、又はそれらの相同体）をコードする核酸と接触させるステップ；ｂ）哺乳動物細胞を、核酸が該哺乳動物細胞内に入るようにエレクトロポレーションするステップ；及び、ｃ）目的の膜結合タンパク質を含む細胞膜を単離するステップを含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、イヌ細胞、又はブタ細胞である。幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマである。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本方法は、エレクトロポレーションステップ後に細胞を培養するステップをさらに含む（例えば、酪酸ナトリウムの存在下）。幾つかの実施形態では、単離するステップは均質化を含む。幾つかの実施形態では、目的の膜結合タンパク質は、天然の膜結合タンパク質に似た翻訳後修飾を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本方法は、膜結合タンパク質を試験化合物（例えば、薬物）と接触させるステップをさらに含む。
【００１２】
さらなる実施形態は、前述の方法のいずれかによって生成された、単離されたベシクル又はミクロソームを提供する。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本開示は、目的のタンパク質を含む細胞画分（例えば、膜又はサイトゾル画分）を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態では、目的のタンパク質は、薬物代謝酵素（ＤＭＥ）である。幾つかの実施形態では、ＤＭＥは、シトクロムＰ４５０（例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４Ｆ２、又はＣＹＰ２Ｊ２）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、フラビンモノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）、モノアミンオキシダーゼＡ及びＢ（ＭＡＯ  Ａ及びＢ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ１及びＮＡＴ２）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ１Ａ、ＳＵＬＴ１Ｂ、ＳＵＬＴ１Ｃ、ＳＵＬＴ１Ｅ、ＳＵＬＴ２Ａ、ＳＵＬＴ２Ｂ、ＳＵＬＴ４Ａ）、エステラーゼ（例えば、カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）、カルボキシルエステラーゼ２（ＣＥＳ２）、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、カルボキシメチレンブテノリダーゼ（ＣＭＢＬ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アリールアセトアミドデアセチラーゼ（ＡＡＤＡＣ）、又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ））、若しくはウリジン５′−ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）（例えば、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ２Ａ１、ＵＧＴ２Ａ２、ＵＧＴ２Ａ３、ＵＧＴ２Ｂ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１０、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＵＧＴ２Ｂ１７、又はＵＧＴ２Ｂ２８）である。
【００１４】
さらなる実施形態は、ａ）上述した又は本明細書に記載のタンパク質を得るステップ；及び、ｂ）該タンパク質を試験化合物と接触させるステップを含む、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。幾つかの実施形態では、本方法は、輸送体タンパク質による試験化合物の輸送を測定するステップをさらに含む。幾つかの実施形態では、測定するステップは、輸送の動態を測定するステップを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、タンパク質（例えば、ＤＭＥ）による試験化合物の修飾を評価するステップをさらに含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、本方法は、タンパク質を阻害剤と接触させ、阻害剤による基質の活性、輸送、又は修飾の阻害を測定するステップをさらに含む。
【００１６】
さらなる実施形態が、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】さまざまな量のヒトＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐＤＮＡを使用する、付着したＨＥＫ２９３細胞のエレクトロポレーション後の生存細胞のパーセンテージを示すグラフ
【図１Ｂ】エレクトロポレーション及び回収後に得られた生存細胞の総量を示すグラフ
【図２Ａ】ＥＰ後、Ｔ＝０、２４時間、及び４８時間における総生存細胞数を示すグラフ
【図２Ｂ】生存細胞のパーセンテージを示すグラフ
【図３Ａ】Ｔ＝２４時間及びＴ＝４８時間における、ＤＮＡの量を増加させてトランスフェクトさせた細胞の単層の顕微鏡写真
【図３Ｂ】生存細胞のパーセンテージを記録したグラフ
【図４】さまざまな量のＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍｌのＭＤＲ１）をトランスフェクトされ、エレクトロポレーション後に懸濁液又は付着フォーマットのいずれかで培養されたＨＥＫ２９３細胞から調製されたＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルとともに５分間インキュベーションした後のＮ−メチルキニジン（ＮＭＱ）取り込み活性を示すグラフ
【図５】ｈＢＣＲＰベシクルにおけるエストロン−３−硫酸（Ｅ３Ｓ）取り込み活性を示すグラフ
【図６】ｈＭＲＰ２ベシクルにおけるＣＤＣＦ取り込み活性を示すグラフ
【図７】小規模ＥＰデバイス（ＯＣ−４００）又は大規模ＥＰデバイス（ＣＬ−２バッグ）を使用して３００μｇ／ｍＬのＭＤＲ１  ｃＤＮＡをトランスフェクトされ、エレクトロポレーション後に懸濁液フォーマット中で培養されたＨＥＫ２９３細胞から調製されたＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルとともに５分間インキュベーションした後のＮＭＱ取り込み活性を示すグラフ
【図８Ａ】濃度に対するＡＯ活性を示すグラフ。プローブ基板フタラジンを使用した場合に標準的なミカエリス・メンテン動態曲線を示した、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて調製された組み換え第Ｉ相薬物代謝酵素アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）を示している。
【図８Ｂ】市販の系に対するＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＯについてのＶｍａｘの比較を示すグラフ。プローブ基板フタラジンを使用した場合に標準的なミカエリス・メンテン動態曲線を示した、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて調製された組み換え第Ｉ相薬物代謝酵素アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）を示している。
【図９Ａ】エレクトロポレーションによってＨＥＫ２９３細胞内へと送達され、その後、採取前に懸濁液中で２４〜７２時間培養した第ＩＩ相薬物代謝酵素ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）ｃＤＮＡのミクロソーム活性を示すグラフ
【図９Ｂ】エレクトロポレーションによってＨＥＫ２９３細胞内へと送達され、その後、採取前に懸濁液中で２４〜７２時間培養した第ＩＩ相薬物代謝酵素ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）ｃＤＮＡのミクロソーム収量を示すグラフ
【図１０】ＨＥＫ２９３ミクロソームにおけるＵＧＴ１Ａ１の活性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本開示の理解を容易にするため、多くの用語が以下に定義される。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、用語「宿主細胞」とは、インビトロに位置するかインビボに位置するかにかかわらず、任意の真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び昆虫細胞）を指す。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、培養された細胞、初代細胞培養胞、及び不死化細胞培養胞を含む、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、用語「細胞培養」とは、細胞の任意のインビトロ培養を指す。この用語には、継代細胞株（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、及び、卵母細胞及び胚を含む、インビトロで維持される他の細胞集団が含まれる。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」とは、適切な制御要素と関連している場合に複製可能であり、かつ、細胞間で遺伝子配列を移動することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等といった任意の遺伝要素を指す。よって、該用語には、クローニング及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターが含まれる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、用語「ゲノム」とは、生物の遺伝物質（例えば染色体）を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、用語「目的のタンパク質」又は「目的の膜結合タンパク質」とは、目的の核酸によってコードされたタンパク質のことを指す。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、用語「目的の膜結合タンパク質」とは、その天然又は非天然状態において、細胞膜に及ぶ、結合する、若しくは関連している、タンパク質を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、用語「外来遺伝子」とは、宿主生物又は細胞には自然には存在しない、あるいは、宿主生物又は細胞内に人工的に導入される、遺伝子のことを指す。
【００２６】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド又は前駆体（例えば、プロインスリン）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長又はフラグメントの所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持されている限り、完全長コード配列又は該コード配列のいずれかの部分にコードされうる。該用語はまた、構造遺伝子のコード領域も包含し、かつ、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端に、約１ｋｂ以上の距離で、５’及び３’末端の両方のコード領域に隣接して配置された配列を含む。コード領域の５’に位置し、かつ、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。３’又はコード領域の下流に位置し、かつ、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡ及び遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される、遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーなどの制御要素を含みうる。イントロンは、核又は一次転写産物から除去又は「スプライシング」される；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列又は順序を指定するように機能する。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子発現」とは、遺伝子の「転写」を通じて（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）、遺伝子にコードされた遺伝情報をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）へと、及び、タンパク質をコードする遺伝子については、ｍＲＮＡの「翻訳」を通じてタンパク質へと、変換するプロセスのことを指す。遺伝子発現は、プロセスの多くの段階で制御することができる。「アップレギュレーション」又は「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）の産生を増加させる制御のことを指すのに対し、「ダウンレギュレーション」又は「抑制」とは、産生を低下させる制御のことを指す。アップレギュレーション又はダウンレギュレーションに関与する分子（例えば、転写因子）はしばしば、それぞれ「活性化因子」及び「抑制因子」と呼ばれる。
【００２８】
天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列について言及するために「アミノ酸配列」が列挙される場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」など、「アミノ酸配列」及び同様の用語は、そのアミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子に関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、用語「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、「〜をコードするＤＮＡ」、「〜をコードするＲＮＡ配列」、及び「〜をコードするＲＮＡ」とは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸のストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの順序又は配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。よって、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列Ａは、アミノ酸配列をコードする。
【００３０】
用語「動作可能な組合せで」、「動作可能な順序で」、及び「動作可能に結合された」とは、本明細書で用いられる場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を導くことができる核酸分子が産生されるような方法における、核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような方法における、アミノ酸配列の連結のことも指す。
【００３１】
本明細書においてその用語が用いられる場合、用語「インビトロ」とは、人工環境、及び人工環境内で生じるプロセス又は反応のことを指す。インビトロの環境は、試験管及び細胞培養で構成されうるが、これらに限定されない。用語「インビボ」とは、自然環境（例えば、動物又は細胞）、及び、自然環境内で生じるプロセス又は反応のことを指す。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語「精製された」とは、それらの自然環境から取り出された、単離された、又は分離された、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかである、分子を指す。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、天然に関連している他の成分を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、含まない。
【００３３】
用語「試験化合物」とは、研究、診断、又は治療用途に有用であると考えられている、任意の化学物質、医薬品、薬物などを指す。試験化合物は、既知の特性及び活性と未知の特性及び活性の両方を伴う化合物を含む。組み換えタンパク質（例えば、輸送体タンパク質又は薬物代謝酵素）と相互作用する試験化合物は、本開示のスクリーニング方法を使用してスクリーニングすることによって、多くの特性について評価されうる。
【００３４】
本開示の詳細な説明
本開示は、タンパク質を生成するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質（例えば、薬物代謝酵素及び輸送体）の生成におけるエレクトロポレーションを介した遺伝子送達に関する。
【００３５】
薬物のＡＤＭＥ研究のための組み換えタンパク質又は細胞の使用に関連するいくつかのモデルが使用される。例えば、Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）薬物代謝酵素、ＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）輸送体ベシクル、及びＴｒａｎｓｐｏｒｔｏＣｅｌｌｓ（商標）ＳＬＣ輸送体細胞（コーニング社、米国ニューヨーク州コーニング所在）は、インビトロアッセイのための過剰発現させた組み換え薬物代謝酵素を含む、昆虫の細胞膜又はサイトゾル画分である。ＡＢＣ輸送体ベシクルは、裏返しにされた膜ベシクルである（例えば、もともとは細胞の内側に面していた官能基が、薬物にアクセス可能になるように外側にひっくり返されている）。ＡＢＣベシクルは、薬物の体内動態におけるＡＢＣ輸送体の関与を研究するための「ゴールドスタンダード」とみなされる。現在、ほとんどのベシクルは、ウイルス送達方法とともに昆虫細胞／バキュロウイルス（ＢＥＶ）発現系を使用して作られる。ＢＥＶ発現系の性質に起因して、産生物は、低い活性及び一貫性のないバッチ間性能に悩まされうる。
【００３６】
したがって、本開示の実施形態は、エレクトロポレーションを介して哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）において組み換えタンパク質（例えば、薬物代謝酵素の膜／サイトゾル画分及びＡＢＣ輸送体ベシクル）を生成するための改善されたシステム及び方法を提供する。エレクトロポレーションされた後、細胞は培養される（例えば、２〜３日間）。目的のタンパク質が発現されると、該発現されたタンパク質は、正しい翻訳後修飾を得て、細胞又は細胞膜における正しい位置に向けられる。培養後、細胞は採取されて、細胞画分（例えば、膜画分、サイトゾル画分）が調製される。
【００３７】
幾つかの実施形態では、酪酸ナトリウムがエレクトロポレーション後の培地に補充されて、活性をより高めるためにタンパク質発現を促進する。幾つかの実施形態では、酪酸ナトリウムは使用されない。
【００３８】
本明細書に記載されるシステム及び方法は、さまざまな薬物代謝酵素（ＤＭＥ）、及び薬物輸送体ベシクル、ミクロソーム又は細胞画分の発現における用途を見出す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、他の発現系（例えば、大腸菌又は昆虫細胞）では低い活性を生じる、「発現困難」な複雑な膜タンパク質の発現における用途を見出す。本明細書に記載される方法によって作出されるベシクル又は膜画分は、既存のベシクル生成物の欠点：低い活性、低い「ヒト類似性（human-like）」、及び大きいバッチ間変動に直接対処した。
【００３９】
本開示は、本明細書に記載されるシステム及び方法を使用した発現のための特定のタンパク質に限定されない。例としては、ＤＭＥ（例えば、サイトゾル又は膜細胞画分における）及び輸送体タンパク質（例えば、ベシクルにおける）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ＤＭＥの例としては、多くの種から誘導されるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）（例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４Ｆ２、又はＣＹＰ２Ｊ２）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、フラビンモノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）、モノアミンオキシダーゼＡ及びＢ（ＭＡＯ  Ａ及びＢ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ１及びＮＡＴ２）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ１Ａ、ＳＵＬＴ１Ｂ、ＳＵＬＴ１Ｃ、ＳＵＬＴ１Ｅ、ＳＵＬＴ２Ａ、ＳＵＬＴ２Ｂ、ＳＵＬＴ４Ａ）、エステラーゼ（例えば、カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）、カルボキシルエステラーゼ２（ＣＥＳ２）、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、カルボキシメチレンブテノリダーゼ（ＣＭＢＬ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アリールアセトアミドデアセチラーゼ（ＡＡＤＡＣ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））、並びに、表１に示されるウリジン５′−ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）などが挙げられるがこれらに限られない。例示的なＵＧＴ相同体（例えば、ラット、マウス、イヌ、及びサル）が示されている。ヒト遺伝子名が最初に列挙されている。野生型の遺伝子及びタンパク質についての核酸及びペプチド配列、並びに共通の対立遺伝子変異体へのリンクを提供する、遺伝子のＯＭＩＭ受託番号が提供されている。
【００４１】
【表１】
2018534941.tif 000003
【００４２】
薬物輸送体の例としては、下記表２に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。ヒト遺伝子名が最初に列挙されている。例示的な相同体（例えば、ラット、マウス、イヌ、及びサル）は、最初の文字を大文字で、小文字として示されている。野生型の遺伝子及びタンパク質についての核酸及びペプチド配列、並びに共通の対立遺伝子変異体へのリンクを提供する、遺伝子のＯＭＩＭ受託番号が提供される。
【００４３】
【表２】
2018534941.tif 000004
【００４４】
エレクトロポレーションを使用することにより、遺伝子送達方法は、はるかによく制御され（ＢＥＶ系とともに用いられるウイルス送達方法に対して）、より高いバッチ間の一貫性をもたらす。加えて、哺乳動物細胞を使用することで、組み換えタンパク質は、より「ヒト類似性」となり、タンパク質１ｍｇあたり、より大きい活性を有することが予定されている（例えば、発現されたタンパク質の大部分が、不適切な翻訳後修飾に起因して非機能的となる、ＢＥＶ又は大腸菌を介した発現に対して）。例えば、本開示の開発中に行われた実験は、本明細書に記載されるエレクトロポレーション方法を使用して発現されたＵＧＴ１Ａ１が、ＢＥＶ系で発現されたＵＧＴ１Ａ１よりも５倍超活性であることを示した。加えて、既存のＢＥＶ方法を使用すると、新しいベシクル又は新しいＤＭＥミクロソーム／サイトゾル画分の発達には６〜８ヶ月かかる；本明細書に記載されるエレクトロポレーション方法を使用することにより、発達時間は２〜３ヶ月へと大幅に短縮されうる。
【００４５】
本開示の宿主細胞培養物は、培養される特定の細胞に適した培地中で調製される。ハムＦ１０（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）などの市販の培地は、例示的な栄養溶液である。適切な培地は、それらの開示がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第５，１２２，４６９号；同第４，５６０，６５５号の各明細書；並びに、国際公開第９０／０３４３０号、及び同第８７／００１９５号にも記載されている。これらの培地に、必要に応じて、血清、ホルモン、及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（gentamycin／gentamicin）など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、脂質（リノール酸又は他の脂肪酸など）、及びそれらの適切な担体、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充してもよい。他の必要な補充物質もまた、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めてもよい。哺乳動物細胞培養については、培地の浸透圧は、概して、約２９０〜３３０ｍＯｓｍである。
【００４６】
本開示はまた、トランスフェクトされた宿主細胞のためのさまざまな培養システム（例えば、ペトリ皿、Ｔ型培養瓶、マルチフラスコ、マルチウェルプレート、ローラーボトル、及びバイオリアクタ）の使用も予定されている。例えば、トランスフェクトされた宿主細胞を、灌流システム内で培養することができる。灌流培養とは、高い細胞密度で維持される培養を通じて、培地の連続的な流れを提供することを指す。細胞は懸濁され、増殖のための固体担体を必要としない。該して、新鮮な栄養素は、有毒な代謝産物の付随的な除去、及び、理想的には、死細胞の選択除去を伴って、連続的に供給される。濾過、捕捉、及びマイクロカプセル化方法はすべて、培養環境を十分な速度でリフレッシュするのに適している。
【００４７】
別の例として、幾つかの実施形態では、流加培養法を用いることができる。好ましい流加培養では、哺乳動物宿主、細胞、及び培地が最初に培養容器に供給され、追加の培養栄養素が、培養終了前に定期的な細胞及び／又は産生物の採取を伴って又は伴わずに、培養の間に培養物に、連続的に又は個別の増分で供給される。流加培養には、例えば、定期的に全培養物（細胞及び培地を含む）が取り出され、新鮮な培地に交換される、半連続流加培養が含まれうる。流加培養は、培養プロセスの開始時に細胞培養のすべての成分（細胞及びすべての培養栄養素を含む）が培養容器に供給される、単純なバッチ培養とは区別される。流加培養は、さらに、処理中に培養容器から上清が取り出されない限り、灌流培養とも区別することができる（灌流培養では、細胞は、例えば、ろ過、カプセル化、マイクロキャリアへの固定等により、培養物中に拘束され、培地は、連続的に又は断続的に、培養容器に導入され、培養容器から取り出される）。
【００４８】
さらには、培養細胞は、特定の宿主細胞及び予定される特定の生産計画に適しうる任意のスキーム又はルーチンに従って増殖させることができる。したがって、本開示は、単一ステップ又は複数ステップの培養手順を予定している。単一ステップの培養では、宿主細胞は、培養環境内に接種され、本開示のプロセスは、細胞培養の単一の生産段階の間に用いられる。あるいは、多段階培養が想定されている。多段階培養では、細胞は、複数のステップ又は段階で培養することができる。例えば、細胞は、第１のステップ又は増殖段階の培養で増殖させることができ、ここで、細胞は、場合によっては保管場所から取り出されて、増殖及び高生存性を促進するのに適した培地に接種される。宿主細胞培養物に新鮮な培地を添加することにより、細胞は、適切な期間、増殖段階において維持されうる。
【００４９】
流加培養又は連続細胞培養条件は、細胞培養の増殖段階における哺乳動物細胞の増殖を促進するように考案される。増殖段階では、細胞は、増殖のために最大化された条件下及び期間で増殖される。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などの培養条件は、特定の宿主とともに用いられるものであり、当業者には明白であろう。概して、ｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）又は塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５〜７．５のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養にとって適切な温度範囲は、約３０℃〜３８℃であり、適切なｄＯ２は、５〜９０％の空気飽和である。
【００５０】
ポリペプチドの生産段階の後、目的のタンパク質を含むポリペプチド又は膜（例えば、ベシクル又はミクロソーム）は、当技術分野で十分に確立されている技術を使用して、培地から回収される。
【００５１】
本開示は、脂質ベシクルを単離する特定の方法に限られない。例示的な方法は、例えば、その各々の全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、米国特許第８，７４７，８６９号；米国特許出願公開第２０１２／００９３８８５号、同第２０１５／０１４１６３４号、及び同第２０１４／００８０１３１号の各明細書に記載されている。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して発現されたタンパク質及び該タンパク質を含む膜ベシクルは、薬物及び薬物候補の薬物スクリーニング用途（例えば、毒性、活性、細胞内への輸送、動態アッセイ、阻害剤アッセイ、又は代謝産物の同定のためのスクリーニングなど）における用途を見出す。
【実施例】
【００５３】
次の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を例証する役割を果たし、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５４】
実施例１
細胞培養−エレクトロポレーションのための細胞調製
簡潔に言えば、１日目に、４ｍＭのＬ−グルタミン（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．社からＧｉｂｃｏカタログ番号２５０３０−０８１で市販される）を補充した、補充ＣＤ２９３培地（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．社から、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１９１３−０１９で市販される）を使用して、２９３−Ｆ細胞を、０．７〜１．０×１０６細胞／ｍｌの密度で、適切なサイズの振とうフラスコに継代した。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（米国マサチューセッツ州ローレンス所在のＮｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から市販される）を使用して、細胞生存率及び細胞数を決定した。
【００５５】
エレクトロポレーション（ＥＰ）
２日目に、細胞をＥＰに供した。手短に言えば、細胞生存率及び細胞密度の決定後、１００ｇで１０分間、スピンさせることによって細胞をペレット化して沈降させ（pelleted down）、その後、培地を吸引し、細胞を、ＥＰバッファ（米国メリーランド州ゲイザースバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．社からカタログ番号Ｂ２０１で市販される、ＭａｘＣｙｔｅ）中に再懸濁した。１００ｇで１０分間、スピンさせることによって、細胞懸濁液を再びペレット化して沈降させ、次に、１００×１０６細胞／ｍｌに達するように、適量のＥＰバッファ中に再懸濁し、これを細胞ストックとして使用した。ＥＰに用いられるｃＤＮＡを、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、滅菌水中で調製した。ＯＣ−４００処理アセンブリに用いられる各試料について、０．４ｍｌの細胞ストック及びＤＮＡを、表に示されるように１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、又は４００μｇ／ｍｌの最終濃度のＤＮＡ及び試料あたり４０×１０６細胞の細胞密度を結果的に生じるように、滅菌した１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。ＣＬ−２処理アセンブリに用いられる各試料については、４０ｍｌの細胞ストック及びＤＮＡを、３００μｇ／ｍｌの最終濃度のＤＮＡを結果的に生じるように、５０ｍｌの滅菌したコニカルチューブに入れた。
【００５６】
すべての試料を、ＨＥＫ細胞のＥＰのための製造指示書に従って、ＯＣ−４００処理アセンブリ又はＣＬ−２処理アセンブリ（米国メリーランド州ゲイザースバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．社から市販される）に移した。ＥＰの後、細胞を慎重にピペットで取り出し、適当な大きさの振とうフラスコの底に移し、８％のＣＯ２で、３７℃で２０分間、インキュベートし、その後、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に達するように、適量の温められた培養培地を振とうフラスコに加えた。細胞を、８％のＣＯ２で、３７℃で０．５〜１時間、インキュベートした。インキュベーション後に、細胞生存率及び細胞密度を決定した。
【００５７】
細胞回収
小規模実験については、細胞の一部（例えば、５×１０６細胞）を培養から取り出し、１００ｇで１０分間、スピンダウンし、播種培地（ＤＭＥＭ、米国バージニア州マナサス所在のＭｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．社から市販される、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸及び１０％ウシ胎児血清を補充した高グルコース）のＣｏｒｎｉｎｇ社のＢｉｏｃｏａｔ（商標）ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたＴ型培養瓶又はＴＣ処理されたＴ型培養瓶（米国ニューヨーク州コーニング所在のコーニング社から市販される）上に播種し、８％のＣＯ２で、３７℃で培養した；残りの細胞を、１００ｇで１０分間、スピンダウンし、次に、２５ｍＬの温められた補充ＣＤ２９３培地中に再懸濁し、８％のＣＯ２で、３７℃で培養した。２４時間ごとに、細胞を培養した懸濁液について、細胞生存率及び密度を決定した。４８時間又は適当なインキュベーション期間の後、懸濁液中で培養された細胞を、１００ｇで１０分間、スピンダウンした；付着フォーマット中で培養された細胞を、ＰＢＳ（ＴＣ処理されたＴ型培養瓶）によって、又は、ＥＤＴＡを伴う２ｍｌの０．２５％トリプシンとともに２〜３分間、インキュベートし、次に、播種培地（ＰＤＬで処理したＴ型培養瓶）で中和することによって、採取した。細胞懸濁液を１００ｇで１０分間、スピンダウンした。大規模実験については、ＥＰ及び回収後、細胞を２Ｌの振とうフラスコ内で培養した。２４時間後、２ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した又は補充していない１００ｍＬの新鮮なＣＤ２９３培地を各フラスコに加えた。細胞を、１００ｇで１０分間、スピンダウンすることによって、４８時間の時点で採取した。
【００５８】
ベシクルの調製
粗形質膜ベシクルを次のように調製した。簡潔に言えば、細胞回収ステップから得られた細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。結果的に得られたペレットを、１：５００希釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社から、カタログ番号Ｐ８３４０で市販される）を補充した適量（４×ペレット重量）のＴＭＥＰバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、５０ｍＭのマンニトール、２ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）で希釈し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザに移し、１０ストロークで、手動で均質化した。細胞溶解物を４℃で１０分間、２６００ｒｐｍで遠心分離した。上清を新しい遠心管セットに移し、４℃で１５分間、３７，０００ｒｐｍでスピンした。結果的に得られたペレットを適量のＴＭＥＰバッファ中に再懸濁し、１０ストロークのＤｏｕｎｃｅＢホモジナイザで均質化した。膜ベシクルを等分し、使用まで−８０℃で保管した。
【００５９】
ヒト組み換えＡＯ及びＵＧＴ１Ａ１酵素の調製
組み換えＡＯ及びＵＧＴ１Ａ１酵素を次のように調製した。簡潔に言えば、細胞回収ステップから得られた細胞ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。結果的に得られたペレットを、適量の０．１Ｍリン酸カリウムバッファで希釈して、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザ内に移し、次に、１０ストロークで均質化した。細胞溶解物を４℃で１０分間、２６００ｒｐｍで遠心分離した。上清を新しい遠心管セットに移し、４℃で１５分間、３７，０００ｒｐｍでスピンした。組み換えＡＯについては、上清（水溶性画分）を等分し、使用まで−８０℃で保管した。ＵＧＴ１Ａ１ミクロソームについては、ペレットを適量の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファ中に再懸濁し、１０ストロークのＤｏｕｎｃｅホモジナイザで均質化した。ＵＧＴ１Ａ１ミクロソームを等分し、使用まで−８０℃で保管した。
【００６０】
輸送体取り込みアッセイ
Ｎ−メチル−キニジン（ＮＭＱ）（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社から市販される）を、５μΜの最終濃度で、ＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクル取り込みアッセイのためのプローブ基板として使用した；エストロン−３−硫酸（Ｅ３Ｓ）を、１％の［３Ｈ］エストロン−３−硫酸（米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から市販される）及び９９％の冷エストロン−３−硫酸（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社から市販される）からなる１μΜの最終濃度で、ＢＣＲＰベシクル取り込みアッセイのためのプローブ基板として使用した；５（６）−カルボキシ−２，’７’−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＣＦ）（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．社から市販される）を、５μΜの最終濃度で、ＭＲＰ２ベシクルのためのプローブ基板として使用した。取り込みバッファ（４７ｍＭのＭＯＰｓ、６５ｍＭのＫＣｌ及び７ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中、５０μｇのベシクル及び最終濃度の１．２５倍のプローブ基板と２．５ｍＭのＧＳＨ（ＭＲＰ２についてのみ）とを含む６０μｌの反応混合物を３７℃で５分間、プレインキュベートした。５ｍＭのＡＴＰ又はＡＭＰの添加によって取り込みを開始し、その後、３７℃において、ＭＤＲ１ベシクルでは５分間、ＢＣＲＰベシクルでは３分間、及びＭＲＰ２ベシクルでは１５分間、インキュベートした。吸引マニホルド（米国マサチューセッツ州ビレリカ所在のＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販される）を通じてガラス繊維（Ｇ／Ｆ）フィルタプレート（米国マサチューセッツ州ビレリカ所在のＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社からカタログ番号ＭＳＦＢＮ６Ｂ１０で市販される）上に反応溶液を移すことによってアッセイを終了させ、次に、フィルタプレートを洗浄用の冷バッファ（４０ｍＭのＭＯＰｓ及び７０ｍＭのＫＣ１、ｐＨ７．４）で５回洗浄した。フィルタプレートを暗所で、室温で１〜２時間乾燥後、ＢＣＲＰベシクルでは、５０μＬのシンチレーション液（米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から市販される、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）を試料ウェルに加えた。プレートを、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から市販される）上で直接読み取った。ＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルについては、１００μＬの１０％ＳＤＳを試料ウェルに加えた；ＭＲＰ２ベシクルについては、１００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨを試料ウェルに加えた。室温で１０分間のインキュベーション後、フィルタプレートを９６ウェルプレート（米国マサチューセッツ州テュークスベリー所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される）上に置き、２０００ｒｐｍで５分間、スピンさせて、放出された化合物を９６ウェルレシーバプレートへと溶出させた。ＭＲＰ２ベシクルにおけるＣＤＣＦの取り込みについては、Ｅｘ４８５ｎｍ、Ｅｍ５３８ｎｍで、蛍光リーダーＳａｆｉｒｅ２（Ｔｅｃａｎ社から市販される）で直接蛍光を測定した。ＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルにおけるＮＭＱの取り込みについ��は、１００μｌの０．１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに加え、次に、Ｅｘ３５５ｎｍ、Ｅｍ４４８ｎｍにおいて、蛍光プレートリーダーＳａｆｉｒｅ２を使用して、蛍光を測定した。
【００６１】
ＡＯアッセイ
ＡＯアッセイは、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．４）中、３７℃で行われる。１７０μＬのアッセイバッファを２０μＬの１ｍＭフタラジンと混合し、ヒートブロック内で３７℃に予熱した。反応を５ｍｇ／ｍＬのＡＯ試料１０μＬで開始する。キャップは、酸素循環のために開けておく必要がある。インキュベーション後、１００μｌの９４％アセトニトリル／６％氷酢酸を加えることによって反応を停止させた。反応混合物を３分間、遠心分離し（１０，０００×ｇ）、上清をＨＰＬＣで分析した。
【００６２】
ＵＧＴ１Ａ１アッセイ
５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、２ｍＭのウリジンジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０２５ｍｇ／ｍｌのアラメチシン、及び１５０μＭのベータ−エストラジオールを含む０．２ｍｌの反応混合物を、３７℃で３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの９４％アセトニトリル／６％氷酢酸を加えることによって反応を停止させた。反応混合物を３分間、遠心分離し（１０，０００×ｇ）、上清をＨＰＬＣで分析した。
【００６３】
結果
結果を図１〜１０に示す。
【００６４】
図１〜３は、細胞が、エレクトロポレーションの後に生存能及び増殖を示すことを示している。図１Ａは、さまざまな量のヒトＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐＤＮＡを使用した、付着したＨＥＫ２９３細胞のエレクトロポレーション後の生存細胞のパーセンテージを示している。図１Ｂは、エレクトロポレーション及び回収後に得られた生存細胞の総量を示している。生存率及び回収は、試験した全ての濃度にわたって高かった。図２は、エレクトロポレーション後Ｔ＝０、２４時間、及び４８時間における総生存細胞数（Ａ）、及び生存細胞のパーセンテージ（Ｂ）を示している。細胞カウント数は、４つの投与量すべてについて、エレクトロポレーション後に経時的に増加した。生存細胞のパーセントは、経時とともに高く維持された。図３は、Ｔ＝２４時間及びＴ＝４８時間における、ＤＮＡ量を増加させてトランスフェクトされた細胞の単層を示している（図３Ａ）。生存細胞のパーセンテージをグラフに記録した（図３Ｂ）。生存細胞は、試験試料のすべてについて、経時とともに増加した。
【００６５】
図４及び７は、上述のように調製されたベシクルによるＮ−メチルキニジン（ＮＭＱ）の取り込みを示している。図４は、さまざまな量のＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍｌのＭＤＲ１）をトランスフェクトされ、エレクトロポレーション後に懸濁液又は付着フォーマットのいずれかで培養されたＨＥＫ２９３細胞から調製されたＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルとともに５分間インキュベーションした後のＮＭＱの取り込み活性を示している。定量的結果を下記表３に示す。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
図７は、小規模ＥＰデバイス（ＯＣ−４００）又は大規模ＥＰデバイス（ＣＬ−２バッグ）を使用して、３００μｇ／ｍＬのＭＤＲ１  ｃＤＮＡをトランスフェクトされ、エレクトロポレーション後に懸濁液フォーマット中で培養されたＨＥＫ２９３細胞から調製されたＭＤＲ１／Ｐ−ｇｐベシクルとともに５分間インキュベーションした後のＮＭＱの取り込み活性を示している。
【００６８】
図５は、上述のように調製されたベシクルによるエストロン−３−硫酸（Ｅ３Ｓ）の取り込みを示している。供給業者の試料に見られるように、取り込み活性は、コレステロール（Ｃ）で処理された後にのみ観察された（「Ｃ前」の試料を「Ｃ後」の試料と比較）。対照的に、本明細書に記載される方法を使用するエレクトロポレーションされたＨＥＫ細胞では、コレステロールは必要とされなかった。
【００６９】
図６は、ｈＭＲＰ２ベシクルにおけるＣＤＣＦの取り込みを示している。定量的データを下記表４に示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
図８は、上述のように調製された細胞画分／サイトゾルにおけるＡＯの活性を示している。図８Ａは、濃度に対するＡＯ活性を示すグラフであり、図８Ｂは、市販の系に対するＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＯについてのＶｍａｘの比較を示すグラフである。図８Ａ及びＢは、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて調製された組み換え第Ｉ相薬物代謝酵素アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）が、プローブ基板フタラジンを使用した場合に、標準的なミカエリス・メンテン動態曲線を示したことを示している。
【００７２】
図９及び１０は、上述のように調製された細胞画分／膜画分（ミクロソーム）におけるＵＧＴ１Ａ１活性を示している。図９Ａ及びＢは、エレクトロポレーションでＨＥＫ２９３細胞に送達され、その後、採取前に懸濁液中で２４〜７２時間培養された、第ＩＩ相薬物代謝酵素ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）ｃＤＮＡのミクロソーム活性（９Ａ）及びミクロソーム収量（９Ｂ）を示している。図１０は、以前のゴールドスタンダード方法（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標））と比較して、驚くべき活性を示す、ＨＥＫ２９３ミクロソームにおけるＵＧＴ１Ａ１の活性を示している。
【００７３】
上記明細書で言及されたすべての刊行物及び特許は、ここに参照することによって本明細書に取り込まれる。本開示の記載される方法及びシステムのさまざまな修正及び変形は、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本開示は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本開示は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、関連分野の当業者にとって自明である本開示を実施するために、記載されるモードをさまざまに修正することは、以下の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
【００７４】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００７５】
実施形態１
膜結合タンパク質を発現するベシクルを生成する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞を、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＧ２、及びそれらの相同体からなる群より選択される膜結合タンパク質をコードする核酸と接触させるステップ；
ｂ）前記核酸が前記哺乳動物細胞内に入るように、前記哺乳動物細胞をエレクトロポレーションするステップ；及び
ｃ）目的の前記膜結合タンパク質を発現するベシクルを単離するステップ
を含む、方法。
【００７６】
実施形態２
前記エレクトロポレーションするステップの後に、前記細胞を培養するステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００７７】
実施形態３
前記培養するステップが、酪酸ナトリウムの添加を含むことを特徴とする、実施形態２に記載の方法。
【００７８】
実施形態４
前記単離するステップが、前記細胞の均質化を含むことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００７９】
実施形態５
前記膜結合タンパク質が、天然形態の前記膜結合タンパク質に似た翻訳後修飾を含むことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【００８０】
実施形態６
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、Ｓ２、ＭＤＣＫ−Ｉ、ＭＤＣＫ−ＩＩ、ＬＬＣ−ＰＫ１、Ｃａｃｏ−２、Ｈｕｈ７、又はＶ７９細胞であることを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【００８１】
実施形態７
前記ベシクルを試験化合物と接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００８２】
実施形態８
前記試験化合物が薬物であることを特徴とする、実施形態７に記載の方法。
【００８３】
実施形態９
試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）哺乳動物細胞を、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＧ２、及びそれらの相同体からなる群より選択される輸送体タンパク質をコードする核酸と接触させるステップ；
ｂ）前記核酸が前記哺乳動物細胞内に入るように、前記哺乳動物細胞をエレクトロポレーションするステップ；
ｃ）前記輸送体タンパク質を発現する細胞膜を単離するステップ；及び
ｄ）前記細胞膜を前記試験化合物と接触させるステップ
を含む、方法。
【００８４】
実施形態１０
前記輸送体タンパク質による前記試験化合物の輸送を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態９に記載の方法。
【００８５】
実施形態１１
前記測定するステップが、輸送の動態を測定するステップを含むことを特徴とする、実施形態１０に記載の方法。
【００８６】
実施形態１２
前記細胞膜を前記薬物輸送体の阻害剤と接触させて、前記阻害剤による前記薬物輸送体の活性又は輸送の阻害を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
【００８７】
実施形態１３
実施形態１〜６のいずれかに記載の方法によって生成された、単離されたベシクル。
【００８８】
実施形態１４
目的のタンパク質を含む細胞画分を生成する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞を、シトクロムＰ４５０、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、フラビンモノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）、モノアミンオキシダーゼＡ及びＢ（ＭＡＯ  Ａ及びＢ）、エステラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、ウリジン５′−ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、及びそれらの相同体からなる群より選択される薬物代謝酵素をコードする核酸と接触させるステップ；
ｂ）前記核酸が前記哺乳動物細胞内に入るように、前記哺乳動物細胞をエレクトロポレーションするステップ；及び
ｃ）前記薬物代謝酵素を含む細胞画分を単離するステップ
を含む、方法。
【００８９】
実施形態１５
前記シトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４Ｆ２、及びＣＹＰ２Ｊ２からなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１４に記載の方法。
【００９０】
実施形態１６
前記エステラーゼが、カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）、カルボキシルエステラーゼ２（ＣＥＳ２）、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、カルボキシメチレンブテノリダーゼ（ＣＭＢＬ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アリールアセトアミドデアセチラーゼ（ＡＡＤＡＣ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）からなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１４に記載の方法。
【００９１】
実施形態１７
前記ＵＧＴが、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ２Ａ１、ＵＧＴ２Ａ２、ＵＧＴ２Ａ３、ＵＧＴ２Ｂ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１０、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＵＧＴ２Ｂ１７、及びＵＧＴ２Ｂ２８からなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１４に記載の方法。
【００９２】
実施形態１８
前記エレクトロポレーションするステップの後に、前記細胞を培養するステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【００９３】
実施形態１９
前記培養するステップが、酪酸ナトリウムの添加を含むことを特徴とする、実施形態１８に記載の方法。
【００９４】
実施形態２０
前記単離するステップが、前記細胞の均質化を含むことを特徴とする、実施形態１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【００９５】
実施形態２１
前記薬物代謝酵素が、天然形態の該薬物代謝酵素に似た翻訳後修飾を含むことを特徴とする、実施形態１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【００９６】
実施形態２２
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、Ｓ２、ＭＤＣＫ−Ｉ、ＭＤＣＫ−ＩＩ、ＬＬＣ−ＰＫ１、Ｃａｃｏ−２、Ｈｕｈ７、又はＶ７９細胞であることを特徴とする、実施形態１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【００９７】
実施形態２３
前記細胞画分がサイトゾル画分であることを特徴とする、実施形態１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【００９８】
実施形態２４
前記細胞画分が膜画分であることを特徴とする、実施形態１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【００９９】
実施形態２５
前記細胞画分を試験化合物と接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態１４〜２４のいずれかに記載の方法。
【０１００】
実施形態２６
前記試験化合物が薬物であることを特徴とする、実施形態２５に記載の方法。
【０１０１】
実施形態２７
前記薬物の修飾を評価するステップをさらに含むことを特徴とする、実施形態２６に記載の方法。
【０１０２】
実施形態２８
実施形態１４〜２４のいずれかに記載の方法によって生成された細胞画分。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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