(57)【要約】  埋め込まれた血管系を含む又は含まない、ネフロンなどの、3D印刷管状構築物並びに管状組織構築物を印刷する方法を記載する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状組織構築物を印刷する方法であって、
1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンを形成するステップであって、各犠牲フィラメントが変色性インク及び複数の所定の種類の生細胞を含み、各所定の種類の生細胞が犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積されている、ステップ、
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、
変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、各異なる所定の種類の生細胞の少なくとも一部が、変色性インクの除去の後に異なる所定の位置に残存し、それにより、管状組織構築物を形成する、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
管状組織構築物が、ネフロン又はネフロンの尿細管部である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
基板が潅流可能なチップである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
管状組織構築物を1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配が、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
複数の所定の種類の生細胞が、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞及び有窓性糸球体内皮細胞の少なくとも2つを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、管の相互貫入網状構造を形成させるステップ、及び
第2の変色性インクを除去し、それにより管状組織構築物における管の相互貫入網状構造を形成するステップ
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
生上皮又は内皮細胞の懸濁液を1つ以上の管に注入するステップをさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
管の相互貫入網状構造が、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップが、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に起こり、それにより、1つ以上の機能性通路パターンが形成され、同時に細胞外マトリックス組成物に埋め込まれる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップが、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積後に起こり、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップの後に1つ以上の機能性通路パターンがそれにより形成され、埋め込まれる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
変色性インクを除去することが、1つ以上の犠牲フィラメントを冷却することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
1つ以上の犠牲フィラメントのそれぞれが、基板上又は基板内に堆積する前に単一プリントヘッドを介して押し出される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
1つ以上の犠牲フィラメントのそれぞれが、複数のプリントヘッドを介して押し出される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
管状組織構築物が、ネフロン、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパである、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
それぞれが複数の生細胞を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンを形成するステップであって、それぞれの組織パターンが1つ以上の所定の細胞型を含む、ステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
それぞれが1つ以上の細胞外マトリックス成分を含む1つ以上の追加のフィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、パターン化された化学的に不均質のマトリックスを形成するステップをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
1つ以上の追加の堆積されたフィラメントが、細胞が負荷されたものであり、それぞれが1つ以上の種類の生細胞を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
管状組織構築物を印刷する方法であって、
1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンを形成するステップであって、各犠牲フィラメントが、変色性インク及び複数の所定の種類の結合ドメインを含み、各所定の種類の結合ドメインが、犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積され、所定の種類の標的細胞に結合することができる、ステップ、
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、
変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、異なる所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部が、変色性インクの除去の後に異なる所定の位置に残存する、ステップ、及び
少なくとも1つの所定の種類の標的細胞を含む懸濁液を機能性通路に注入するステップであって、標的細胞が、対応する所定の種類の結合ドメインに結合し、それにより、管状組織構築物を形成する、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項２０】
基板が潅流可能なチップである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
管状組織構築物を1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露する、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配が、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
懸濁液が複数の所定の種類の標的細胞を含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
管状組織構築物が、ネフロン又はネフロンの尿細管部である、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
所定の種類の標的細胞が、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、エリスロポエチンを発現する間質線維芽細胞、又は集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、及び他の内皮系列細胞から成る群から選択される、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
標的細胞に対する結合ドメインが、抗体、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び細菌から成る群から選択される、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
機能性通路パターンを取り囲む細胞外マトリックスが、1つ以上の犠牲フィラメントにより堆積された結合ドメインを捕捉するための所定のカップリング部分を含む、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
カップリング部分が、結合ドメインに対して化学的に反応性であり、それにより、変色性インクの除去の前、除去中又は除去の後に接触により結合ドメインを局所的に捕捉する、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
カップリング部分が、天然細胞外マトリックス結合ドメイン、抗体、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び細菌を含む、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、管の相互貫入網状構造を形成するステップ、及び
第2の変色性インクを除去し、それにより、管状組織構築物中の管の相互貫入網状構造を形成するステップ
をさらに含む、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
生上皮又は内皮細胞の懸濁液を1つ以上の管に注入するステップをさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
管の相互貫入網状構造が、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを含む、請求項３０又は３１記載の方法。
【請求項３３】
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップが、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に起こり、それにより、1つ以上の機能性通路パターンが形成され、同時に細胞外マトリックス組成物に埋め込まれる、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップが、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積後に起こり、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップの後に1つ以上の機能性通路パターンがそれにより形成され、埋め込まれる、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
変色性インクを除去することが、1つ以上の犠牲フィラメントを冷却することを含む、請求項１９〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
1つ以上の犠牲フィラメントのそれぞれが、基板上又は基板内に堆積する前に単一プリントヘッドを介して押し出される、請求項１９〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
1つ以上の犠牲フィラメントのそれぞれが、基板上又は基板内に堆積する前に複数のプリントヘッドを介して押し出される、請求項１９〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
管状組織構築物が、ネフロン、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパである、請求項１９〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
それぞれが複数の生細胞を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンを形成するステップであって、それぞれの組織パターンが1つ以上の所定の細胞型を含む、ステップをさらに含む、請求項１９〜３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路であって、パターン化細胞層が1つ以上の種類の生細胞を含み、各種類の生細胞が機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている、機能性通路、及び
1つ以上の機能性通路を少なくとも部分的に取り囲んでいる細胞外マトリックス組成物
を含む、印刷管状組織構築物。
【請求項４１】
パターン化細胞層が、少なくとも2つの所定の種類の複数の生細胞を含み、細胞外マトリックス組成物が、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる、請求項４０記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４２】
細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造をさらに含む、請求項４０又は４１記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４３】
細胞外マトリックス組成物中の通路又は上皮通路の網状構造をさらに含む、請求項４０〜４２のいずれか１項記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４４】
管状組織構築物がネフロンである、請求項４０〜４３のいずれか１項記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４５】
パターン化細胞層が、それぞれがネフロンの異なる所定の位置に沿って分布している腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞又は有窓性糸球体内皮細胞を含む、請求項４０〜４４のいずれか１項記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４６】
管状組織構築物が、ネフロン、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパである、請求項４０記載の印刷管状組織構築物。
【請求項４７】
機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路であって、パターン化細胞層が1つ以上の種類の生細胞を含み、各種類の生細胞が機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている、機能性通路、
血管通路の網状構造、及び
1つ以上の機能性通路及び血管通路の網状構造を少なくとも部分的に取り囲んでいる細胞外マトリックス組成物
を含む、埋め込まれた血管系を含む印刷管状組織構築物。
【請求項４８】
パターン化細胞層が、少なくとも2つの所定の種類の複数の生細胞を含み、細胞外マトリックス組成物が、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる、請求項４７記載の埋め込まれた血管系を含む印刷管状組織構築物。
【請求項４９】
管状組織構築物が、ネフロン又はネフロンの尿細管部である、請求項４７又は４８記載の埋め込まれた血管系を含む印刷管状組織構築物。
【請求項５０】
パターン化細胞層が、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞及び有窓性糸球体内皮細胞の少なくとも2つを含む、請求項４７〜４９のいずれか１項記載の埋め込まれた血管系を含む印刷管状組織構築物。
【請求項５１】
管状組織構築物が、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパである、請求項４７記載の埋め込まれた血管系を含む印刷管状組織構築物。
【請求項５２】
ネフロンを印刷する方法であって、
1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップであって、各犠牲フィラメントが、犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2のインク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3のインク製剤を含み、
第1の変色性インク製剤が変色性インク及び腎近位尿細管細胞を含み、
第2の変色性インク製剤が変色性インク及びヘンレ係蹄細胞を含み、
第3の変色性インク製剤が変色性インク及び腎遠位尿細管細胞を含む、ステップ、
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、
変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、第1のインクの除去の後に腎近位尿細管細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存し、第2のインクの除去の後にヘンレ係蹄細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存し、第3のインクの除去の後に腎遠位尿細管細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存し、それにより、ネフロンを形成する、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項５３】
基板が潅流可能なチップである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ネフロンを1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露する、請求項５２又は５３記載の方法。
【請求項５５】
1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配が、ネフロンの発生、分化及び/又は機能をさらに導く、請求項５２〜５４のいずれか１項記載の方法。
【請求項５６】
単一プリントヘッドを介して1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する、請求項５２〜５５のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップが、
ノズル出口に流体連通した少なくとも第1のインク供給通路、第2のインク供給通路及び第3のインク供給通路を含むノズル本体を提供するステップ、
第2のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第2の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第1のインク製剤を第1のインク供給通路中に流れさせ、それにより、第1の所定の長さにわたって第1のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出すステップ、
第2のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第1のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、
第1のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第2のインク製剤を第2のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第2の所定の長さにわたって第2のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出すステップ、及び
第3のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第2のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、
第1のインク製剤及び第2のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第2の供給通路中に流れることを妨げながら第3のインク製剤を第3のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第3の所定の長さにわたって第3のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出し、それにより、フィラメントの異なる所定の長さにわたって複数の細胞型を含む1つ以上の連続した犠牲フィラメントを3D印刷するステップ
を含む、請求項５２〜５６のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
複数のプリントヘッドを介して1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路であって、パターン化細胞層が、
1つ以上の機能性通路の第1の所定の長さにわたる腎近位尿細管細胞、
1つ以上の機能性通路の第2の所定の長さにわたるヘンレ係蹄細胞、及び
1つ以上の機能性通路の第3の所定の長さにわたる腎遠位尿細管細胞
を含む、機能性通路、並びに
1つ以上の機能性通路を少なくとも部分的に取り囲む細胞外マトリックス組成物
を含む3D印刷ネフロン。
【請求項６０】
1つ以上の組織パターンをさらに含み、各組織パターンが1つ以上の所定の細胞型の複数の生細胞を含み、細胞外マトリックス組成物が、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる、請求項５９記載の3D印刷ネフロン。
【請求項６１】
細胞外マトリックス組成物中の管の相互貫入網状構造をさらに含む、請求項５９又は６０記載の3D印刷ネフロン。
【請求項６２】
管の相互貫入網状構造が機能性通路と相互貫入する血管パターンを含む、請求項６１記載の3D印刷ネフロン。
【請求項６３】
ネフロンを印刷する方法であって、
1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップであって、各犠牲フィラメントが、犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2のインク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3のインク製剤を含み、
第1の変色性インク製剤が変色性インク及び腎近位尿細管細胞を標的にする第1の所定の種類の結合ドメインを含み、
第2の変色性インク製剤が変色性インク及びヘンレ係蹄細胞を標的にする第2の所定の種類の結合ドメインを含み、
第3の変色性インク製剤が変色性インク及び腎遠位尿細管細胞を標的にする第3の所定の種類の結合ドメインを含む、ステップ、
機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲む、ステップ、
変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、第1の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存し、第2の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存し、第3の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存している、ステップ、
腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞の少なくとも1つを含む懸濁液を機能性通路内に注入するステップであって、細胞がそれらの対応する所定の結合ドメインに結合し、それにより、ネフロンを形成する、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項６４】
基板が潅流可能なチップである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ネフロンを1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露する、請求項６３又は６４記載の方法。
【請求項６６】
1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配が、ネフロンの発生、分化及び/又は機能をさらに導く、請求項６３〜６５のいずれか１項記載の方法。
【請求項６７】
懸濁液が、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞を含む、請求項６２〜６６のいずれか１項記載の方法。
【請求項６８】
結合ドメインが、抗体、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び細菌から成る群から選択される、請求項６２〜６７のいずれか１項記載の方法。
【請求項６９】
それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、血管パターンを形成するステップ、及び
第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作り、それにより、管状組織構築物中の血管網を形成するステップ
をさらに含む、請求項６２〜６８のいずれか１項記載の方法。
【請求項７０】
生上皮細胞の懸濁液を1つ以上の血管通路に注入するステップをさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
単一プリントヘッドを介して1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する、請求項６２〜７０のいずれか１項記載の方法。
【請求項７２】
複数のプリントヘッドを介して1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する、請求項６２〜７０のいずれか１項記載の方法。
【請求項７３】
管状組織構築物を印刷する方法であって、
それぞれが複数の所定の種類の生細胞を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンを形成するステップであって、それぞれの組織パターンが少なくとも2つの所定の細胞型を含み、それぞれの所定の種類の生細胞が細胞負荷フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積されている、ステップ、
それぞれが変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンと相互貫入する機能性通路パターンを形成するステップ、
1つ以上の組織パターン及び機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、
変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の機能性通路を作り、それにより、組織構築物中の相互貫入通路網状構造を形成するステップ
を含む、前記方法。
【請求項７４】
基板が潅流可能なチップである、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
管状組織構築物を1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露する、請求項７３又は７４記載の方法。
【請求項７６】
1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配が、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く、請求項７３〜７５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
1つ以上の細胞負荷フィラメントのそれぞれが、細胞外マトリックス材料をさらに含む、請求項７３〜７６のいずれか１項記載の方法。
【請求項７８】
細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸、プロテオグリカン及び/又はそれらの組合せの1つ以上を含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
1つ以上の細胞負荷フィラメントの少なくとも1つが、薬物、小分子、毒素、タンパク質及びホルモンから成る群から選択される1種以上の機能性化学物質をさらに含む、請求項７３〜７８のいずれか１項記載の方法。
【請求項８０】
それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、管の相互貫入網状構造を形成するステップ、及び
第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の通路を作り、それにより、管状組織構築物中における管の網状構造を形成するステップ
をさらに含む、請求項７３〜７９のいずれか１項記載の方法。
【請求項８１】
生上皮又は内皮細胞の懸濁液を1つ以上の管に注入するステップをさらに含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
第1及び第2の変色性インクを除去することが、1つ以上の犠牲フィラメントを冷却することを含む、請求項７３〜８１のいずれか１項記載の方法。
【請求項８３】
管状組織構築物が、ネフロン又はネフロンの尿細管部である、請求項７３〜８２のいずれか１項記載の方法。
【請求項８４】
複数の所定の種類の生細胞が、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞又は有窓性糸球体内皮細胞を含む、請求項７３〜８３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８５】
管状組織構築物が、ネフロン、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパである、請求項７３記載の方法。
【請求項８６】
犠牲フィラメントのそれぞれが、細胞外マトリックス材料をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項８７】
細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、増殖因子及び/又はそれらの組合せの1つ以上を含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
犠牲フィラメントのそれぞれが、細胞外マトリックス材料をさらに含む、請求項１９〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項８９】
細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、増殖因子及び/又はそれらの組合せの1つ以上を含む、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
連続した犠牲フィラメントが、細胞外マトリックス材料をさらに含む、請求項４５〜５８のいずれか１項記載の方法。
【請求項９１】
細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、増殖因子及び/又はそれらの組合せの1つ以上を含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
連続した犠牲フィラメントが、細胞外マトリックス材料をさらに含む、請求項６３〜７２のいずれか１項記載の方法。
【請求項９３】
細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、増殖因子及び/又はそれらの組合せの1つ以上を含む、請求項９３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許文書は、参照により本明細書に組み込まれる、2015年5月5日に出願した米国仮特許出願第62/157,286号の合衆国法典第35巻第119条(e)による出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
本明細書で引用するすべての特許、特許出願及び刊行物並びに他の参考文献は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物のそれらの全体としての開示は、本明細書で説明し、請求する発明の発明日に当業者に公知の最先端技術をより十分に説明するために参照により本出願に組み込まれる。
【０００３】
連邦政府の助成による研究又は開発
本発明は、米国科学財団EAGERにより授与された契約第CMMI-1548261号の下で政府の支援により行われた。
【０００４】
本開示は、一般的に組織工学に関し、より詳細には、埋め込まれた血管系及び/又は尿細管を含む管状組織構築物を製作することに関する。
【背景技術】
【０００５】
3次元(3D)血管新生組織を要求に応じて作る能力は、組織工学、薬物スクリーニング、毒性学、3D組織培養及び臓器修復における科学的及び技術的進歩を可能にし得る。天然組織、究極的に、臓器、いくつかの重要な構成要素、すなわち細胞、細胞外マトリックス(ECM)、上皮及び血管系を模倣する組織工学により作製される3D組織構築物を生産するには複雑な配置にアセンブルすることが必要な場合がある。これらの構成要素のそれぞれは、極めて重要な役割を果たしており、細胞は、すべての生体系の基本単位であり、ECMは、構造の支えとなり、上皮は、間質機能単位を与え、血管網は、効率的な栄養素及び老廃物の輸送、温度調節、因子の送達並びに長距離シグナル伝達経路をもたらす。各細胞の数百マイクロメートル以内の潅流可能な血管系がなければ、3次元組織は、壊死領域を急速に発生し得る。組織構築物に血管網を埋め込むことができなかったため、数十年にわたり3D組織工学の進歩が妨げられていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
管状組織構築物を生産する必要性は、埋め込まれた血管系及び埋め込まれた上皮組織の両方に当てはまる。本発明者らの方法は、それらの長さに沿って複数の種類の細胞を含む、ネフロンなどの体内の上皮網にまで広範囲に及ぶ。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態は、管状組織構築物を印刷する方法に関する。方法は、1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンを形成させることを含む。各犠牲フィラメントは、変色性インク(fugitive ink)及び複数の所定の種類の生細胞を含むものであり、それぞれの所定の種類の生細胞は、犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積される。方法はまた、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、及び変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップを含む。それぞれの異なる所定の種類の生細胞の少なくとも一部は、変色性インクの除去の後に異なる所定の位置に残存し、それにより、管状組織構築物を形成する。基板は、潅流可能なチップであり得る。管状構築物は、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露される可能性があり、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。管状組織構築物は、ネフロン又はネフロンの尿細管部であってもよく、複数の所定の種類の生細胞は、ネフロン又はネフロンの尿細管部に存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系を含み得る。或いは、管状組織構築物は、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、気道上皮、精巣上体、尿道、肝胆管、膵管又はリンパであってもよい。方法は、それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、管の相互貫入網状構造(interpenetrating network)を形成させるステップ、及び第2の変色性インクを除去して、管状組織構築物における管の相互貫入網状構造を作るステップをさらに含み得る。管の相互貫入網状構造は、血管通路(vascular chnnel)を形成し得る。
【０００８】
特定のさらなる実施形態は、管状組織構築物を印刷する他の方法に関する。方法は、1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンを形成するステップを含む。各犠牲フィラメントは、変色性インク及び複数の所定の種類の結合ドメインを含むものであり、それぞれの所定の種類の結合ドメインは、犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積され、所定の種類の標的細胞に結合することができる。方法はまた、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、及び変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップを含む。異なる所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部は、変色性インクの除去の後に異なる所定の位置に残存する。方法はまた、少なくとも1つの所定の種類の標的細胞を含む懸濁液を機能性通路に注入するステップであって、標的細胞は、対応する所定の種類の結合ドメインに結合し、それにより、管状組織構築物を形成する、ステップを含む。特定の実施形態では、懸濁液は、多数の所定の種類の標的細胞を含む。標的細胞に対する結合ドメインは、タンパク質、例えば、抗体、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、細菌又はそれらの組合せであり得る。基板は、潅流可能なチップであり得る。管状構築物は、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露される可能性があり、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。管状組織構築物は、ネフロンであってもよく、少なくとも1つの所定の種類の生細胞は、ネフロンに存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系からなる群から選択される。特定の実施形態では、管状組織構築物は、他の管状臓器、例えば、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、気道上皮、精巣上体、尿道、肝胆管、膵管又はリンパであってもよい。機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップが、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に起こり、それにより、1つ以上の機能性通路パターンを形成し、同時に細胞外マトリックス組成物に埋め込むことができる。方法は、それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを形成するステップ、及び第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作るステップであって、それにより、管状組織構築物中の相互貫入血管網を形成する、ステップをさらに含み得る。方法は、生上皮細胞の懸濁液を1つ以上の血管通路に注入するステップをさらに含み得る。
【０００９】
さらなる実施形態は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路を含む印刷管状組織構築物であって、パターン化細胞層は、1つ以上の種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞は、機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置され、細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の機能性通路を少なくとも部分的に取り囲んでいる、印刷管状組織構築物に関する。パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の種類の複数の生細胞を含み得る。パターン化細胞層は、ネフロンに存在し、それぞれがネフロンの異なる所定の位置に沿って分布している腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系を含み得る。管状組織構築物は、ネフロンであってもよい。代替実施形態では、管状組織構築物は、他の管状臓器、例えば、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、気道上皮、精巣上体、尿道、肝胆管、膵管又はリンパであってもよい。細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。印刷管状組織構築物は、細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造をさらに含み得る。或いは、印刷管状組織構築物は、細胞外マトリックス組成物中の通路又は上皮通路の網状構造をさらに含み得る。
【００１０】
特定のさらなる実施形態は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路を含む埋め込まれた血管系を有する印刷管状組織構築物に関し、パターン化細胞層は、1つ以上の種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞は、機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている。埋め込まれた血管系を有する印刷管状組織構築物は、1つ以上の機能性通路を相互導通させる血管通路の網状構造並びに1つ以上の機能性通路及び血管通路の網状構造を少なくとも部分的に取り囲む細胞外マトリックス組成物も含む。パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の細胞型の複数の生細胞を含んでいてもよく、細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。印刷管状組織構築物は、ネフロンであってもよく、パターン化細胞層は、ネフロンに存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系の少なくとも2つを含む。特定の代替実施形態では、埋め込まれた血管系を有する印刷管状組織構築物は、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパであってもよい。
【００１１】
他の実施形態は、ネフロンを印刷する方法に関し、方法は、1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップを含む。各犠牲フィラメントは、犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2の変色性インク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3の変色性インク製剤を含み、第1の変色性インク製剤は、変色性インク及び腎近位尿細管細胞を含み、第2の変色性インク製剤は、変色性インク及びヘンレ係蹄細胞を含み、第3の変色性インク製剤は、変色性インク及び腎遠位尿細管細胞を含む。方法はまた、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、及び変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、第1のインクの除去の後に腎近位尿細管細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存し、第2のインクの除去の後にヘンレ係蹄細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存し、第3のインクの除去の後に腎遠位尿細管細胞の少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存し、それにより、ネフロンを形成する、ステップを含む。基板は、潅流可能なチップであり得る。ネフロンは、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露される可能性があり、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、ネフロンの発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。基板上及び/又は基板内に1つ以上の連続した犠牲フィラメントを堆積させて、機能性通路を形成する堆積させて、機能性通路を形成するは、単一のプリントヘッドを介してであってよい。1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップは、ノズル出口に流体連通した少なくとも第1のインク供給通路、第2のインク供給通路及び第3のインク供給通路を含むノズル本体を提供するステップ、並びに第2のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第2の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第1のインク製剤を第1のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第1の所定の長さにわたって第1のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出すステップを含む。方法はまた、第2のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第1のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、第1のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第2のインク製剤を第2のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第2の所定の長さにわたって第2のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出すステップを含む。方法はさらに、第3のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第2のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、第1のインク製剤及び第2のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第2の供給通路中に流れることを妨げながら第3のインク製剤を第3のインク供給通路中に流れさ���、それにより、その第3の所定の長さにわたって第3のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出し、それにより、フィラメントの異なる所定の長さにわたって多数の細胞型を含む1つ以上の連続した犠牲フィラメントを3D印刷するステップを含む。
【００１２】
さらなる実施形態は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路であって、パターン化細胞層は、1つ以上の機能性通路の第1の所定の長さにわたる腎近位尿細管細胞、1つ以上の機能性通路の第2の所定の長さにわたるヘンレ係蹄細胞、及び1つ以上の機能性通路の第3の所定の長さにわたる腎遠位尿細管細胞を含む、機能性通路、並びに1つ以上の機能性通路を少なくとも部分的に取り囲む細胞外マトリックス組成物を含む、3D印刷ネフロンに関する。3D印刷ネフロンは、機能性通路の異なる長さに沿ってネフロンに存在する集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系をさらに含み得る。3D印刷ネフロンは、1つ以上の組織パターンをさらに含み、各組織パターンは1つ以上の所定の細胞型の複数の生細胞を含み、細胞外マトリックス組成物は1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。3D印刷ネフロンは、細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造をさらに含み得る。
【００１３】
また他の実施形態は、ネフロンを印刷する方法に関し、方法は、1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成するステップであって、各犠牲フィラメントが犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2の変色性インク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3の変色性インク製剤を含み、第1の変色性インク製剤が変色性インク及び腎近位尿細管細胞を標的にする第1の所定の種類の結合ドメインを含み、第2の変色性インク製剤が変色性インク及びヘンレ係蹄細胞を標的にする第2の所定の種類の結合ドメインを含み、第3の変色性インク製剤が変色性インク及び腎遠位尿細管細胞を標的にする第3の所定の種類の結合ドメインを含む、ステップ、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作るステップであって、第1の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存し、第2の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存し、第3の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部がインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存し、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞の少なくとも1つを含む懸濁液を機能性通路内に注入し、細胞がそれらの対応する所定の結合ドメインに結合し、それにより、ネフロンを形成する、ステップを含む。懸濁液は、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞を含み得る。結合ドメインは、ペプチド、タンパク質、例えば、抗体、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基、細菌又はそれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、パターン化犠牲フィラメントを取り囲む細胞外マトリックスは、犠牲フィラメントの結合ドメインを捕捉するための所定のカップリング部分を含む。カップリング部分は、結合ドメインに対して化学的に反応性であり、それにより、犠牲フィラメントの排出の前、排出中又は排出の後に接触により前記結合ドメインを局所的に捕捉する。カップリング部分は、天然細胞外マトリックス結合ドメイン、抗体、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び細菌を含む。方法は、それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを形成するステップ、及び第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作り、それにより、管状組織構築物中の相互貫入血管網を形成するステップ並びに生上皮細胞の懸濁液を1つ以上の血管通路に注入するステップをさらに含み得る。ネフロンは、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露される可能性があり、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、ネフロンの発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。
【００１４】
また他の実施形態は、管状組織構築物を印刷する方法に関し、方法は、それぞれが複数の所定の種類の生細胞を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンを形成するステップであって、それぞれの組織パターンが少なくとも2つの所定の細胞型を含む、ステップを含み、それぞれの所定の種類の生細胞は、細胞負荷フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積されている。方法はまた、それぞれが変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンと相互貫入する機能性通路パターンを形成するステップ、1つ以上の組織パターン及び機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲むステップ、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の機能性通路を作り、それにより、組織構築物中の相互貫入通路網状構造を形成するステップを含む。基板は、潅流可能なチップであり得る。管状構築物は、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露される可能性があり、1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。1つ以上の細胞負荷フィラメントは、細胞外マトリックス材料、例えば、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAM)、ポリエチレングリコール(PEG)、ゼラチンメタクリレート(GeIMA)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)、絹、ヒアルロン酸、増殖因子、プロテオグリカン様ヘパリン硫酸若しくはその他及び/又はそれらの組合せを含み得る。本方法において、1つ以上の細胞負荷フィラメントの少なくとも1つは、薬物、小分子、毒素、タンパク質及びホルモンからなる群から選択される1種以上の機能性化学物質をさらに含み得る。管状組織構築物は、ネフロンであってもよく、前記所定の種類の生細胞は、ネフロンに存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系を含む。或いは、管状組織構築物は、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパであってもよい。方法は、それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを形成するステップ、及び第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作り、それにより、管状組織構築物における相互貫入血管網を形成するステップをさらに含み得る。方法は、生上皮細胞の懸濁液を1つ以上の血管通路に注入するステップをさらに含み得る。
【００１５】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報の写しは、請求及び必要料金の支払いにより当局により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ：血管系、細胞外マトリックス及び細胞を組み合わせて印刷することができるバイオプリンティングの概念の説明図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ：3次元に正確に配置された血管系及び多数の細胞型を含む3D印刷異種組織構築物の概略図を示す。
【図２Ａ】2つの組織パターン及び相互貫入血管網を含む2D組織構築物を示す断面概略図である。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ｂ：組織パターン及び相互貫入血管網を含む3D組織構築物の例を示す図である。図２Ｃ：2つの組織パターン及び相互貫入血管網を含む3D組織構築物の例を示す図である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂ：2つの組織パターン及び相互貫入血管網を含む3D組織構築物の例を示す図である。
【図４】各z軸が独立に制御される、専用3Dプリンター上に取り付けられた4つのプリントヘッド(ノズル)を示す図である。
【図５】図５Ａ：4つのプリントヘッド(ノズル)を示す図である。図５Ｂ：複雑なインクパターンが4つのノズルから連続的に堆積されて多様な組成を有する4層微細構造を形成する4層微細構造を示す図である。図５Ｃ：堆積工程の各層の連続製作画像を示し、各差し込み図は、各層の幾何構造を示す図である。
【図６】図６Ａ：Pluronic F127のゾル-ゲル転移の概略図を示す。図６Ｂ：40重量%Pluronic F127インクのせん断係数(G'及びG'')における温度依存性を示す図である。図６Ｃ：GelMAの特徴を示すヘリックス-コイル転移の概略図を示す。図６Ｄ：GelMAのせん断係数の温度依存性を示す図である。図６Ｅ：細胞を負荷したGelMAを示す図である。図６Ｆ：10T1/2線維芽細胞を負荷したGelMAのせん断係数を温度の関数として示す図である。
【図７】図７Ａ及び７Ｂ：直径が115μm〜500μmの範囲にある、GelMA中に形成されたID通路を示す図である。図７Ｃ：視覚化のための水溶性蛍光染料により潅流した通路を示す図である。図７Ｄ〜７Ｅ：単一30μmガラス毛細管を用いて印刷した曲線フィラメントによる2D階層的分岐網状構造を示す図である。図７Ｆ：視覚化のための赤色蛍光染料により潅流した構造を示す図である。図７Ｇ〜７Ｉ：変色性インクの排出後に潅流することができる3D血管パターンを作るために犠牲フィラメントから印刷した高度に周期的な3D格子を示す図である。図７Ｊ：HUVEC懸濁液により潅流した2D血管網内の代表的マイクロ通路の光学画像を示す図である。図７Ｋ：マイクロ流路壁の内側を覆う生HUVEC細胞を含む図7Jに示すマイクロ流路の共焦点画像を示す図である。
【図８】図８Ａ：犠牲フィラメントを堆積させ、変色性インクを除去することにより作られた様々な通路径の代表的断面を示す図である。図８Ｂ：Pluronic F127を含む様々な印刷犠牲フィラメントの膨潤比(Dfinal/Dinitial)を示すプロットである。各データポイントは、一定の速度、圧力及びノズル高(z軸)でそれぞれ堆積させた、6つの試料の平均値である。直径は、トップダウン光学顕微鏡法により印刷後及び排出後に再び直接測定する。
【図９】図９Ａ〜９Ｂ：内皮化血管通路は、示したように、フィブリンゲル中で作ることができる。図９Ｃ及び９Ｄ：製作済みの分岐血管網における動物血液浸潤の前後の写真を示す。
【図１０】図１０Ａ：4つの別個のインクにより印刷されている最終3D印刷異種組織構築物構造の平面図を示す。図１０Ｂ：図１０Ａに示す組織構築物を作るために用いた複合ツールパスの等角図を示し、緑色フィラメントは、GFP HNDF負荷GelMAを含み、青色フィラメントは、10T1/2線維芽細胞負荷GelMAを含み、赤色フィラメントは、RFP HUVECを用いて内皮化することができるプルロニックインクを含む。灰色の網掛け領域は、3D印刷構築物を封入する純GelMAマトリックスに対応する。図１０Ｃ：印刷直後の図１０Ａの構造の緑色蛍光通路でオーバーレイした明視野顕微鏡像である。図１０Ｄ：印刷された構造のスパニング及び面外特性(out-of-plane nature)を示す写真である。図１０Ｅ：変色性インクの排出工程の実証を示す図である。図１０Ｆ：図１０Ａの構造の3つの蛍光通路:10T1/2線維芽細胞(青)、HNDF(緑)、HUVEC(赤)の複合画像を示す。図１０Ｇ：非印刷対照と比較した印刷10T1/2線維芽細胞の細胞生存率アッセイ結果を示す図である。
【図１１】図１１Ａ：変色性インクを含む複数細胞負荷フィラメント及び犠牲フィラメントを含む3層構造の概略図を示す。図１１Ｂ：内皮化の前の排出微細構造の写真を示す。図１１Ｃ：2日間の培養後のGFP HNDF(緑)及びRFP HUVEC(赤)の落射蛍光画像を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃ：フィブリン-ゼラチンを含むGF負荷細胞外マトリックス材料の直接印刷による増殖因子(GF)勾配の形成を示す概略図を示す。図１２Ｄ：1通路のみにおける蛍光標識BSAによる平行血管通路の潅流用の例示的型を示す図である。図１２Ｅ及び１２Ｆ：24時間で図１２Ｄの2つの通路の間に生じたほぼ直線的勾配を示す図である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄ：フィブリン-ゼラチン相互貫入ポリマー網状構造の合成を示す図である。最初に、ゲル前駆体をトランスグルタミナーゼ(TG)と一緒に混合する。次いで、トロンビン酵素によりフィブリノーゲンを重合することによって、フィブリン網状構造が形成される。第2の相がフィブリンゲルの周りに形成され、2つの相がTGにより徐々に共に架橋する。図１３Ｅ〜１３Ｆ：フィブリン-ゼラチンマトリックス材料の機械的特性を示す図である。図１３Ｇ〜１３Ｊ：それぞれ線維芽細胞(結合組織)、平滑筋細胞、内皮細胞及び腎近位尿細管(上皮)細胞に対するフィブリン-ゼラチンマトリックスの接着性の多様性を示す図である。
【図１４】フィブリン-ゼラチン相互貫入ポリマー網状構造の光学的特性に対するTGインキュベーション時間の影響を示す図である。透明度は、ローダミンタグ付きフィブリノーゲン及び共焦点顕微鏡を用いて視覚化される、フィブリンゲルの最終細孔構造によって決定される。
【図１５Ａ】組織構築物の受動的揺動潅流用の例示的型を示す図である。
【図１５Ｂ−Ｇ】図１５Ｂ〜１５Ｄ：組織構築物の受動的揺動潅流用の例示的型を示す図である。図１５Ｅ〜１５Ｇ：組織構築物の能動的ポンプベースの潅流用の例示的型を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ：変色性インクから形成された犠牲フィラメント内の内皮細胞の堆積、細胞外マトリックス組成物による犠牲フィラメントの封入、及び通路壁の内側を覆う内皮細胞を含む通路を形成するための変色性インクの排出を模式的に示す図である。図１６Ｄ：HUVECの分散体を含む印刷された変色性インク(Pluronic F127)を示す図である。図１６Ｅ：図１６Ｅは、注型及び液化後の変色性インクを示す図である。図１６Ｆ：図１６Ｆは、HUVECの1日のインキュベーションの後の血管網を示す図である。図１６Ｇ：図１６Ｇは、24時間の能動潅流後の血管網を示す図である。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａ：組織構築物(具体的には、この例では、上皮組織構築物)における機能性通路網状構造を形成するための細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路の作製を示す図である。ステップは、機能性通路パターンを形成するための変色性インク(細胞負荷変色性インクであり得る)を含む1つ以上の犠牲フィラメントの堆積、細胞外マトリックス組成物による通路パターンの少なくとも部分的な封入、機能性通路を形成するための変色性インクの除去、及び上皮細胞により機能性通路の内側を覆うための任意選択の播種アプローチを含む。図１７Ｂ：通路の内側が上皮細胞により覆われている、細胞外マトリックス組成物中の2つの機能性通路を示す図である。
【図１７Ｃ−Ｆ】図１７Ｃ：通路の内側が上皮細胞により覆われている、細胞外マトリックス組成物中の2つの機能性通路を示す図である。図１７Ｄ〜１７Ｆ：PTECによる内面被覆の通路の様々な共焦点顕微鏡画像及びNa/K  ATPaseを含む様々な細胞特異的タンパク質が発現している、免疫蛍光画像を示す図である。
【図１７Ｇ−Ｉ】上皮細胞を有する腎近位尿細管(黒で囲んだ)を示す図である(図１７Ｇ)。近位尿細管を作製するための屈曲路の印刷を図１７Ｈに示し、核(青)及びATPase(緑)について染色されることが示されている一般的な上皮形成尿細管の拡大図を図１７Ｉに示す。
【図１７Ｊ−Ｘ】図１７Ｊ〜Ｎ：2D皿上のいくつかの機能特性(AQP1(１７Ｊ)、ATPase(１７Ｋ)、ドーム形成(１７Ｌ)、繊毛(１７Ｍ)、ZO-1(１７Ｎ))について免疫蛍光を用いて染色した近位尿細管上皮細胞(PTEC)及び培養におけるドームの存在を示す図である。図１７Ｏ〜Ｔ：2D皿上のいくつかの機能特性(AQP1(１７Ｏ)、ATPase(１７Ｐ)、ドーム形成(１７Ｒ)、繊毛(１７Ｓ)、ZO-1(１７Ｔ))について免疫蛍光を用いて染色した潅流済み尿細管構築物を示す図である。特性は、潅流済み尿細管構築物に保持又は増強されていた。図１７Ｕ〜Ｘ：構築物における細胞の融合性を強調した尿細管、一次繊毛及び刷子縁の形成のSEM及びTEM像を示す図である。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ：播種後3日目におけるHUVEC(赤)及びHNDF(緑)の最初は均一な分布を強調している図である。図１８Ｄ〜１８Ｅは、8日後の同じ通路を示し、その時点に通路が異なる外側間質(HNDF)層及び融合性内皮(HUVEC)層を含む。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｆ：変色性インクを細胞負荷マトリックス上に直接印刷し、より多くの細胞負荷マトリックスで封入し、変色性インクを排出して、血管通路を形成し、血管通路にHUVECを播種した後、内皮細胞が融合層を形成し、時間とともに毛細血管に集合することを示す図である。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃ：2つの細胞型(ゼラチン-フィブリン細胞外マトリックス材料内に分散したHNDF及びHUVEC)を含む印刷細胞負荷フィラメントにおける自発新生血管系形成を示す共焦点顕微鏡画像である図である。
【図２１】図２１Ａ：埋込み印刷法を示す概略図を示す。図２１Ｂ：埋込み印刷に適する半相互貫入ポリマー網状構造(IPN)(例えば、PAA-GelMA)を含む細胞外マトリックス組成物の概略図を示す。図２１Ｃ：埋込み印刷により構築することができる任意3D形状を有する複合異種構造を示す図である。図２１Ｄ：埋込み印刷に適するインク及びマトリックスのレオロジーの代表的なレオロジー的測定を示す図である。図２１Ｅ：埋込み印刷により形成された血管網を含む血管立方体の写真である。図２１Ｆ：半IPN細胞外マトリックス組成物内の印刷細胞負荷フィラメントを示す図である。
【図２２】半IPN細胞外マトリックス組成物の透明度が置換の程度(DS)によって調節することができることを示す図である。
【図２３Ａ−Ｅ】図２３Ａ：ネフロンの説明図である。図２３Ｂ〜Ｅ：ネフロンに存在する細胞の種類を示すネフロンの断面図を示す写真である。
【図２３Ｆ】埋込みネフロン印刷(ポリジメチルシロキサン(PDMS)中蛍光染料を含むプロニック)の写真である。
【図２４】図２４Ａ〜Ｃ：印刷されたインク及びマトリックス内のフィブリン構造の画像を示す図である。図２４Ｄ：トロンビンを加える前のTGプレインキュベーション時間を示す写真を示す。これらのゲルに用いたTG濃度は、0.2重量%である。スケールバー=50μm。
【図２５】図２５Ａ：より低いプラトーせん断弾性係数を示す細胞生存率に対するゼラチン処理の結果を示すグラフを示す。図２５Ｂ：より低いせん断応力を示す細胞生存率に対するゼラチン処理の結果を示すグラフを示す。図２５Ｃ及び２５Ｄ：印刷された細胞負荷フィラメントが、ゼラチンを70℃(図２５Ｃ)で可溶化した場合に95℃(図２５Ｄ)で可溶化したゼラチンによって得られたものと比較してさほど均一でないことを示す写真を示し、スケールバー=250μmである。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｓ：シリコーンインターフェースチップの構築及びチップ上の厚い血管新生組織の潅流の概略の説明を示す図である。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｆ：3D血管新生組織の製作を示す図である。図２７Ａ：組織製造工程の概略の説明を示す図である。図２７Ｂ：2Dのマトリックスの上で増殖するHUVECの写真を示す図である。図２７Ｃ：3Dのマトリックスの内部で増殖するHNDFの写真を示す図であり、スケールバー=50μmである。図２７Ｄ：2Dのマトリックスの上で増殖するhMSCの写真を示す図である。図２７Ｅ及び２７Ｆ：印刷したとき(図２７Ｅ)並びにアクチン(緑)及び核(青)を染色した場合の3D印刷フィラメントにおける3日後(図２７Ｆ)の95℃処理ゼラチンを用いて調製した印刷hMSC負荷インクの画像を示す図である。図２７Ｇ：ゼラチン処理温度がプラトー係数及び印刷後の細胞生存率に影響を及ぼすことを示す図である。温度が高いほど、係数が低く、印刷後のHNDFの生存率が高い。図２７Ｈ：チップ上に印刷された相互貫入犠牲(赤)及び細胞インク(緑)の写真であり、スケールバー=2mmである。図２７Ｉ：犠牲及び細胞インクのトップダウン明視野像を示す図であり、スケールバー=50μmである。図２７Ｊ：潅流チャンバー内に収容された完成構築物の写真を示す。図２７Ｋ及び２７Ｌ：潅流チャンバー内に収容された完成構築物の対応する断面を示す図であり、スケールバー=5mmである。
【図２８】図２８Ａ：ゼラチン-フィブリンの3段階ゲル化を示す概略図を示す。図２８Ｂ：フィブリンの高密度の線維状網状構造がトロビンの添加後に形成されることを示すゼラチン-フィブリンIPN内のローダミン標識フィブリノーゲンの蛍光画像を示す図であり、スケールバー=50μmである。図２８Ｃ：37℃において、フィブリノーゲンが添加後にゼラチンの溶液粘度を増加させるが、室温における得られたゲルのせん断プラトー係数をわずかに変化させるにすぎないことを示すグラフを示す。図２８Ｄ：ゼラチン-フィブリンインクの粘弾性挙動が数桁の大きさのせん断弾性係数によって強調されることを示すグラフを示す。室温(22℃)及びそれ未満では、印刷可能ゼラチン-フィブリンインクの係数は、IE4〜IE5 Paである。温度を30℃超に上昇させた場合、溶液は、細胞分散及び注型にレオロジー的に適しており、ゼロに近いせん断弾性係数を有する粘性状態にある。図２８Ｅ及び２８Ｆ：フィブリン-ゼラチンの動的せん断弾性係数がトロンビンの添加後の時間とともに急速に増加し(フィブリン網状構造の形成を示す)、一方、プラトー弾性係数がフィブリン-ゼラチン複合体内のフィブリン含量の増加とともに増加し(図２８Ｅ)、IPNのフィブリン相が、得られるゲルにより大きい剛性を付与する(図２８Ｆ)ことを示すグラフを示す。
【図２９】図２９Ａ：様々なマトリックス製剤上の接着挙動及び相対細胞拡散を示す表を示す。図２９Ｂ：ゲル上の低、中及び高レベルの細胞拡散の例を示すRFP-HUVECの蛍光顕微鏡写真を示す。フィブリノーゲンは、pH7でゲル化して不透明なフィブリンゲルを生成し、pH7.5で透明又は「澄明」なフィブリンゲルを生成する。pHは、1M NaOHを用いて調整し、スケールバー=50μmである。
【図３０】図３０Ａ：単一のHUVEC被覆血管通路を支持する線維芽細胞負荷マトリックス及び潅流チップ内に収容されたものを示す概略図である。図３０Ｂ及び３０Ｃ：42日後の血管網の共焦点顕微鏡像を示す図であり、CD-31(赤)、vWF(青)及びVE-カドヘリン(マゼンタ)であり、スケールバー=100μmである。図３０Ｄ：トップダウン(左)及び45日における(右)断面共焦点顕微鏡により示されたHUVEC被覆(赤)血管網を支持するHNDF負荷(緑)マトリックスの長期潅流を示す図であり、スケールバー=100μmである。図３０Ｅ：FITC-デキストランの拡散透過率の低下によって実証された、通路の内膜により付与されたバリア特性の定量化を示す棒グラフを示す。図３０Ｆ：血管系からの距離の関数として蛍光強度により示された3Dマトリックス内のGFP-HNDFの分布を示す。
【図３１】図３１Ａ：HUVECの内層を有する及び有さない通路を介して潅流したFITC標識デキストラン(70kDa)の画像を示す図である。蛍光シグナルを30分まで5分ごとに記録して、ゲル内への拡散の程度を測定した。図３１Ｂ：細胞内層を有する場合と有さない場合の計算拡散透過率の棒グラフを示す。図３１Ｃ：時間の経過に伴う蛍光シグナルの遅い広がりを実証する細胞内層によるFITC-デキストラン蛍光シグネチャーを示す図であり、スケールバー=500μmである。
【図３２】血管新生組織内の線維芽細胞の増殖を示す図である。GFP発現線維芽細胞負荷ゼラチン-フィブリンヒドロゲルをRFP発現HUVECで被覆されている4つの印刷通路を介して潅流する。GFPレベルにより測定される、細胞密度は、通路に最も近い位置で最大であり、通路から遠い中心部で低下しており、スケールバー=500μmである。
【図３３】図３３Ａ：専用潅流チップ内の印刷異種組織の形状を示す概略図を示し、分岐状血管構造が格子構造内に印刷されているhMSC中に広がっており、HNDFが注型されて、間質腔を満たしている。図３３Ｂ：専用潅流チップ内の及び側面からの専用潅流チップから除去された印刷組織の写真を示す。図３３Ｃ：能動潅流及びin situ分化の30日後の1cm厚の血管新生造骨組織構築物の断面を通しての共焦点顕微鏡像を示す図であり、スケールバー=1.5mmである。図３３Ｄ：図３３Ｃに示す赤色線の内側の厚い組織試料にわたるオステオカルシン強度を示す図である。図３３Ｅ：hMSC内に局在のオステオカルシン(紫)を示す高分解能画像を示す図であり、それらは、30日後に対称性骨芽細胞様の形態をとると思われ、スケールバー=100μmである。図３３Ｆ〜３３Ｇ：hMSCの近くに局在すると思われる、コラーゲンI(黄)について染色した厚い組織構築物の画像を示す図であり、スケールバー=200μmである。図３３Ｈ：CaP沈着を染色するために用いたアリザリンレッドの画像を示し、時間の経過に伴う組織成熟及び分化を示す、アルカリホスファターゼを染色するためにファストブルーを用いる図であり、スケールバー=200μmである。
【図３４】図３４Ａ：種々の培地条件の存在下でポリスチレンウエル中で培養したhMSC’sの画像を示す図である。14日目に、細胞をファストブルー及びアリザリンレッドで染色して、それぞれ骨細胞及び沈着鉱物を視覚化し、スケールバー=2mmである。図３４Ｂ：各ウエル内の9つの異なる位置における500nmでの平均吸光度を示すグラフを示す。500nm吸光度は、ウエル中のアリザリンレッドの量の尺度である。基礎培地=Rooster培地、増殖培地=Rooster培地+GTX培地ブースター。骨補足剤=10mMベータ-グリセロホスフェート及び50μg mL-1のL-アスコルビン酸。BMP-2濃度=100ng mL-1。
【図３５】図３５Ａ：in situで造骨系(osteogenic lineage)に分化した厚い血管新生組織の成熟の画像を示す図である。成熟を視覚化するために厚い血管新生組織を様々な時点に解析する。コラーゲンI(ピンク)の沈着は、無細胞足場に存在せず、その代わり組織中の細胞により分泌され、3日後にhMSC及びHNDFの近くの領域に非常にわずかなコラーゲンが存在するが、30日目までに、印刷hMSCがフィラメント及び血管通路の周りの円周の両方においてかなりのコラーゲンを産生した。スケールバー=100μmである。図３５Ｂ：in situで造骨系に分化した厚い血管新生組織の成熟の画像を示す図である。血管網を介する造骨カクテルの送達は、最初にhMSCの造骨系関与を、次いで30日にわたる鉱物の沈着をもたらした。これは、ファストブルーにより観察できるアルカリホスファターゼ発現の出現及びその後のCaP鉱物化によって明らかである。スケールバー=100μmである。
【図３６】図３６Ａ：近位曲尿細管を強調するネフロンの概略図を示す図である。図３６Ｂ及び３６Ｃ：変色性インクを最初にゼラチン-フィブリノーゲン細胞外マトリックスECM上に印刷する(i)、さらなるECMを印刷物の周りに注型する(ii)、変色性インクを排出して、開いた尿細管を作る(iii)及びPTEC細胞を尿細管内に播種し、長時間にわたり潅流する(iv)、3D屈曲性潅流可能近位尿細管の製作における各種ステップの概略図を示す図である。図３６Ｄ：共焦点顕微鏡法により取得した印刷近位曲尿細管の3Dレンダリングを示す図である。図３６Ｅ：白い長方形によって表した図３６Ｄにおける領域のより高い倍率の像を示す図であり、スケールバー=200μmである。図３６Ｆ：上皮内層によって周囲を囲まれた開いた内腔が3Dで作られ、チップ上で一方向に潅流されている、製作工程の結果を示す図解を示す。
【図３７】PTEC細胞で内側が覆われ、線維芽細胞負荷細胞外マトリックスに埋め込まれている3D近位尿細管(線維芽細胞が周囲ECM中で増殖している状況において、融合性上皮に成長した3D  PTの位相差画像)を示す図である。
【図３８】独立に対応することができる潅流可能な管の3つの層で構築されたPTモデルを示す図である。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｋ：3D近位尿細管の成熟過程を示す図である。図３９Ａ：成熟(十分に融合性)尿細管の写真である。図３９Ｂ：0日目におけるPTEC負荷を示す図であり、スケールバー=500μmである。図３９Ｃ：図３９ＢのPTEC負荷のより高倍率の写真を示す図であり、スケールバー=300μmである。図３９Ｄ：非接着細胞が洗い流された後の1日目におけるPTECの尿細管への接着を示す図であり、スケールバー=200μmである。図３９Ｅ：2日目におけるPTECの尿細管中への増殖の低倍率の写真を示す図であり、スケールバー=500μmである。図３９Ｆ：細胞がコロニー又はクラスターから増殖している4日目における画像であり、スケールバー=100μmである。図３９Ｇ：細胞がほぼ融合性である4日目における画像であり、スケールバー=100μmである。図３９Ｈ：38日目における成熟尿細管の画像を示す図であり、スケールバー=500μmである。図３９Ｉ：図３９Ｈに示した38日目における融合性尿細管のより高倍率の写真を示す図であり、スケールバー=100μmである。図３９Ｊ：その屈曲した構造のため、それ自体の350μm以内に接近する、尿細管の画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図３９Ｋ：PTモデルの構築及び成熟の時系列を示す図である。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｄ：シクロスポリンA誘導性細胞毒性の明視野画像を示す図である。図４０Ｅ〜４０Ｈ：シクロスポリンA誘導性細胞毒性の3Dレンダリングを示す図である。図４０Ｉ〜４０Ｌ：様々な濃度のシクロスポリンAを24時間投与した、印刷され、潅流されたPTの高倍率画像を示す図であり、アクチン(緑)及び核(青)が染色されており、それぞれスケールバー=200μm(a〜h)及びスケールバー=20μm(i〜l)である。図４０Ｍ：シクロスポリンAの投与後に行った拡散透過率の測定を示すグラフを示し、*p<0.003、**p<0.02である。図４０Ｎ：シクロスポリンAの投与後に2D対照(裸皿上)について測定した細胞生存率を示すグラフを示す(示したすべての集団は、p<0.005で統計的に有意に異なっている)。
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄ：様々な時点:t=0分(４１Ａ)、t=45分(４１Ｂ)並びにt=0分(４１Ｃ)及び5分(４１Ｄ)(裸3D PT(PTECを有さない)からなる対照試料について)に取得した蛍光画像を示す。ここで、FITC標識デキストランは、融合PTECで覆われた3D PTを通してのFITC標識デキストラン(70kDa)溶液による潅流の後に周囲ECM中にはるかにより速く拡散する。スケールバー=200μm。図４１Ｅ：近位尿細管上皮を有する及び有さない3D PT通路の測定拡散透過率を示す棒グラフを示す。
【図４２】図４２Ａ：互いに隣接した6つのPT(すなわち、多重3D近位尿細管)のSEM画像を示す図であり、スケールバー=500μmである。図４２Ｂ：背景に示されているより大きい3D PTの内側を撮影した高倍率画像を示す図であり、スケールバー=50μmである。
【図４３】図４３Ａ：ECMの成分並びに各種刺激の関数としてのそれらのゲル化及び架橋の概略図を示す。図４３Ｂ：腎上皮機能、輸送、エンドサイトーシス、ホルモン応答、損傷応答及び3種の細胞株(初代腎PTEC、PTEC-TERTI及びA498がん腎細胞株)の細胞分化に関連する33の選択される遺伝子の相対的mRNAレベルを示す図である。PTEC-TERTI細胞は、初代PTECと転写的に同様であり、A498腎がん表皮細胞株と異なる。
【図４４】図４４Ａ〜４４Ｃ：3D近位尿細管潅流液分析後のIL-6(図４４Ａ)、IL-8(図４４Ｂ)及びMCP-1(図４４Ｃ)の相対濃度の棒グラフを示す。
【図４５】図４５Ａ：6週目に撮影した成熟3D PT構築物の位相差画像を示す図であり、スケールバー=500μmである。図４５Ｂ：6週目に撮影した3D PT構築物の位相差画像を示す図であり、スケールバー=250μmである。図４５Ｃ：5週目における尿細管内のPTECのTEM像を示す図であり、スケールバー=5μmである。図４５Ｄ：潅流を用いずにECMで被覆された2D皿上で増殖させたPTECのTEM像を示す図であり、スケールバー=5μmである。図４５Ｅ：許可により転載した(Mescher, A. in Junqueira's BasicHistology: Text and Atlas, Edn. 1385 (McGraw-Hill Education, 2013)、PTECが緊密に充填し、頂端側における高密度の刷子縁、密着結合及び堅固な基底膜を示す、天然組織において認められる円柱上皮の概略図を示す。図４５Ｆ：3D PT構築物(3DP)並びに3つの2D対照(2DP=潅流を用いた2DにおけるECM上のPTEC、2D=潅流を用いない2DにおけるECM上のPTEC、Dish=潅流しなかった裸の組織培養皿)のTEM像から測定したPTEC細胞高さを示す図であり、*p<0.001、**p<0.02である。図４５Ｇ：3D PT内のPTECの融合層を示す低(スケールバー=50μm)及びより高(スケールバー=20μm)倍率のSEM画像を示す図であり、白矢印は、細胞当たり1つの密度の一次繊毛の存在を強調する。図４５Ｈ：一次繊毛(赤)を強調する頂端側を示す部分的尿細管の3Dレンダリングを示す図であり、スケールバー=20μmである。図４５Ｉ：緑色のNa/K  ATPaseの存在を強調するPTの画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図４５Ｊ：黄色のAQPIの存在を強調する3D PTの画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図４５Ｋ：赤色のアクチンを強調し、黄色のAQPIを示す図２５Ｊにおける画像の高倍率写真を示す図であり、スケールバー=20μmである。
【図４６】図４６Ａ：6週目におけるPTECの頂端側の刷子縁のTEM像を示す図であり、スケールバー=1μmである。図４６Ｂ：人工細胞外マトリックス(ECM)、細胞により分泌された基底膜タンパク質(BM)、基底外側嵌合(BI)及び白矢印により印を付けた膜における円形陥入の存在を強調した6週目におけるPTECの基底側のTEM像を示す図であり、スケールバー=1μmである。図４６Ｃ：細胞が分泌した基底膜タンパク質、すなわち、ラミニン(赤の主要タンパク質)及びコラーゲンIV(緑)を示す6週目におけるPTECを示す図であり、スケールバー=10μmである。図４６Ｄ：バイオプリントされた尿細管におけるPTEC間の密着結合(白矢印)を示す図であり、スケールバー=500nmである。図４６Ｅ：PTにおける染色された細胞結合タンパク質Kカドヘリン(マゼンタ)を示す図であり、スケールバー=10μmである。図４６Ｆ及び４６Ｇ：3D PT構築物(3DP)並びに3つの2D対照(2DP=潅流を用いた2DにおけるECM上のPTEC、2D=潅流を用いない2DにおけるECM上のPTEC、Dish=潅流しなかった裸の組織培養皿)のTEM像から定量した微小繊毛長(４６Ｆ)及び微小繊毛密度(４６Ｇ)を示す図であり、p<0.001である。
【図４７】図４７Ａ：Na+/K+ ATPaseの基底外側発現が明らかであり、2つの一次繊毛が頂端側に可視である、Na+/K+ ATPase(緑)及びアセチル化チューブリン(赤)について染色されたPTECの3D再構成を示す図であり、スケールバー=10μmである。図４７Ｂ：一次繊毛のTEM像を示す図であり、スケールバー=1μmである。
【図４８】図４８Ａ：裸(青)及びECM被覆(緑)プラスチック皿上の2D対照を含む並びに65日間潅流した3D PT(マゼンタ)における、いくつかの条件下でFITC標識ヒト血清アルブミンを2時間与えたPTECの蛍光強度を比較したフローサイトメトリーデータを示すグラフである。図４８Ｂ：図４８Ａに示したものと同じPTEC試料についてメガリンの蛍光強度を比較したフローサイトメトリーデータのグラフを示す。図４８Ｃ：FITC標識アルブミン(赤)について染色された3D PT構築物の蛍光画像を示す図であり、スケールバー=20μmである。図４８Ｄ：FITC標識メガリン(青)について染色された3D PT構築物の蛍光画像を示す図であり、スケールバー=20μmである。図４８Ｅ：FITC標識アルブミン及びFITC標識メガリン(青)について染色された3D PT構築物の蛍光画像を示す図であり、スケールバー=20μmである。
【図４９】図４９Ａ：4週目における健常近位尿細管の明視野画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図４９Ｂ：シクロスポリンA曝露の24時間後の尿細管の明視野画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図４９Ｃ：全細胞の<5%が死滅していることを示すシクロスポリンA曝露後24時間における尿細管の生(緑)及び死(赤)染色を示す画像を示す図であり、スケールバー=100μmである。図４９Ｄ：アクチン(緑)及び核(青)が染色されている、10μMシクロスポリンAを投与した後に認められた損傷を示す高倍率画像を示す図であり、スケールバー=20μmである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
相互貫入血管系を含む印刷組織構築物及びそのような組織構築物を印刷する方法を本明細書で述べる。図1Aにバイオプリンティングの概念の説明図を示す。該印刷法は、3D組織培養及び薬物スクリーンから臓器移植に及ぶ用途のための所定の位置に細胞、血管系、上皮通路及び細胞外マトリックスを含む異種2D及び3D組織構築物の製作を可能にし得る。
【００１８】
少なくとも2種類の生細胞を含み、各種類の生細胞が管状組織構築物の異なる所定の位置に沿って配置されているネフロンなどの印刷管状組織構築物及びそのような管状組織構築物を3D印刷する方法も述べる。図23A〜Fにその長さに沿って様々な種類の細胞を有するネフロンの図解(A〜E)及び埋込みネフロン印刷(F)の図解を示す。構築物は、例えば、薬物毒性学、全臓器印刷、臓器補完及び/又は透析置換/補足に用いることができる。
【００１９】
図1B及び図2A〜2Cに3次元に正確に配置された血管系及び多数の細胞型を含む例示的印刷組織構築物を示す概略図を示す。図2A又は2Cについて述べると、例示的な印刷組織構築物100は、第1の組織パターン115a及び第2の組織パターン115bを含み、第1及び第2の組織パターン115a、115bのそれぞれは、1つ以上の所定の細胞型の複数の生細胞を含む。例えば、第1の組織パターン115aは、細胞型A及びBを含み、第2の組織パターン115bは、細胞型Cを含み得る。生細胞を含み、所定の細胞型を有する1つ以上の細胞負荷フィラメント105の配置は、各組織パターン115a、115bを定義し得る。この例において、第1の組織パターン115aを定義する細胞負荷フィラメント105は、細胞型A及び細胞Bを含み、第2の組織パターン115bを定義する細胞負荷フィラメントは、細胞型Cを含む。血管通路の網状構造135は、組織パターン115a、115bと相互貫入している。細胞外マトリックス組成物130は、1つ以上の組織パターン115a、115b及び血管通路の網状構造135を少なくとも部分的に取り囲んでいる。
【００２０】
印刷組織構築物における他のパターン又は網状構造と「相互貫入する」パターン又は網状構造は、他のパターン又は網状構造の1つ以上のフィラメント、通路又は一部と積み重なり、部分的若しくは完全に上に重なり、部分的若しくは完全に下に重なり、取り囲み、中に埋め込まれ、且つ/又は織り合わされている1つ以上のフィラメント、通路又は一部を含むと理解することができる。「基板上に堆積された」フィラメントは、基板上に直接的に、基板内に直接的に、又は基板上に以前に堆積若しくは形成された他のフィラメント、通路若しくは一部に直接的に堆積されることを理解することができる。
【００２１】
次に図2Bについて述べると、埋込み血管系を含む組織構築物は、1つ以上の細胞負荷フィラメント105を堆積させることによって印刷することができ、各細胞負荷フィラメント105は、1つ以上の組織パターン115(この例では1つの組織パターン)を形成するために基板110上に、複数の生細胞を含む。組織パターン115は、1つ以上の所定の細胞型の細胞を含む。それぞれが変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメント120も、基板110上に堆積させて、1つ以上の組織パターン115と相互貫入する血管パターン125を形成する。1つ以上の組織パターン115及び血管パターン125は、細胞外マトリックス組成物130によって部分的又は完全に取り囲まれている。次に変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物130中の血管通路の網状構造135を作る。このようにして、相互貫入血管網が組織構築物100中に形成される。
【００２２】
組織構築物は、n種までの所定の細胞型を含み得る。例えば、nは、1≦n≦300、2≦n≦200又は2≦n≦100を満たし得る。より一般的には、nは、50以下、30以下又は20以下である。例えば、2種以上、4種以上、8種以上、16種以上又は20種以上の所定の細胞型が組織構築物中に存在し得る。さらに、潅流、マトリックスキュー(matrix cues)又は潅流増殖因子、小分子若しくは他の作用物質により誘導されたときに20種以上の細胞型に変化し得る、あらゆる起源の、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞などの、1種の細胞型を印刷することができる。
【００２３】
図2A〜2Cの例により示されているように、各組織パターンは、1つ以上の細胞負荷フィラメントの2又は3次元配置を含み又はそれにより定義され、各組織パターン(及びしたがって、細胞負荷フィラメントの各配置)は、所定の細胞型の異なるサブセットを含み得る。例えば、5種の所定の細胞型(例えば、細胞型A、B、C、D及びE)並びに3種の組織パターン(例えば、組織パターン1、2及び3)を含む組織構築物において、1つ以上の細胞負荷フィラメントの第1の配置により定義される、組織パターン1は、細胞型Aを含み得る。1つ以上の細胞負荷フィラメントの第2の配置により定義される、組織パターン2は、細胞型B及びCを含み得る。1つ以上の細胞負荷フィラメントの第3の配置により定義される、組織パターン3は、細胞型A及びEを含み得る。
【００２４】
生細胞に加えて、1つ以上の細胞負荷フィラメントは、細胞外マトリックス材料と呼ぶことができる合成又は天然由来の生体適合性物質を含み得る。1つ以上の細胞負荷フィラメントのそれぞれは、下で述べるような1つ以上の機能性化学物質(例えば、薬物、毒素、タンパク質及び/又はホルモン)も又は代わるべきものとして含み得る。各組織パターンは、いくつかの実施形態においてその間の接触の領域で少なくとも部分的に融合していてもよい、細胞負荷フィラメント(複数可)の1つの層又は多数の層を含み得る。例えば、1つ以上の細胞負荷フィラメントから形成された隣接する層は、フィラメントの組成及び堆積(又は堆積後)条件によって部分的又は完全に融合し得る。
【００２５】
組織構築物における細胞負荷フィラメントの配置は、連続又は不連続であり得る。連続的配置においては、例示的な組織パターンの(及び1種以上の所定の細胞型を含む)細胞負荷フィラメントは、組織構築物における単一の相互貫入組織網状構造を形成し得る。例えば、所定の細胞型(複数可)の生細胞を含む単一の細胞負荷フィラメントは、単層又は多層に堆積させて、連続的配置を形成することができる。或いは、所定の細胞型(複数可)の生細胞を含む複数の細胞負荷フィラメントは、単層又は多層に堆積させて、連続的配置を形成することができ、細胞負荷フィラメントのそれぞれは、同じ所定の細胞型(複数可)を含む他の細胞負荷フィラメントと物理的に接触しており、おそらく部分的に融合している。
【００２６】
1種以上の所定の細胞型を含む細胞負荷フィラメントの不連続的配置においては、所定の細胞型(複数可)の単一の相互貫入組織網状構造は、組織構築物内に形成されない。その代わり、所定の細胞型(複数可)を含む細胞負荷フィラメントは、組織構築物全体にわたって均一又は不均一に分散され得る。その結果、所定の細胞型(複数可)に対応する細胞も組織構築物全体にわたって均一又は不均一に(例えば、凝集塊で)分散され得る。この実施形態では、所定の組織パターン及び細胞型(複数可)の細胞負荷フィラメントのすべてが同じ細胞型(複数可)の細胞を含む他の細胞負荷フィラメントと物理的に接触している可能性があるか又はいずれもその可能性がない。
【００２７】
1つ以上の細胞負荷フィラメントのそれぞれは、少なくとも1つの生細胞を含み、多数の生細胞を含み得る。例えば、細胞負荷フィラメントのそれぞれは、少なくとも約100細胞/ml、少なくとも約1000細胞/ml、少なくとも約104細胞/ml、少なくとも約105細胞/ml、少なくとも約106細胞/ml、少なくとも約107細胞/ml又は少なくとも約108細胞/mlの細胞濃度を有し得る。一般的に、細胞濃度は、約109細胞/mlより高くない、又は約108細胞/mlより高くない。これと一致して、組織構築物の1つ以上の組織パターンは、少なくとも約100細胞/ml、少なくとも約1000細胞/ml、少なくとも約104細胞/ml、少なくとも約105細胞/ml、少なくとも約106細胞/ml、少なくとも約107細胞/ml又は少なくとも約108細胞/mlの細胞濃度を有し得る。一般的に、組織パターンにおける細胞濃度は、約109細胞/mlより高くない、又は約108細胞/mlより高くない。
【００２８】
細胞濃度は、細胞負荷フィラメントのそれぞれの全体にわたって実質的に均一(例えば、±10%以内、±5%以内又は±1%以内)であり、且つ細胞濃度は、組織パターンのそれぞれの全体にわたっても実質的に均一であり得る。或いは、約10細胞/クラスターから約1000細胞/クラスターまでの、又は約10細胞/クラスターから約100細胞/クラスターまでの範囲のサイズであり得る細胞の凝集体若しくはクラスターを含む細胞負荷フィラメントを堆積させることが可能である。そのようなクラスターは、細胞負荷フィラメント内に均一に又は不均一に(且つしたがって1つ以上の組織パターン全体にわたって均一に又は不均一に)分散させることができる。全体的にみて、細胞濃度は、組織構築物全体にわたって実質的に均一であり得る、或いは細胞濃度は、1つ以上の組織パターンの位置と形態によって、且つ/又は1つ以上の組織パターン内の細胞分布によって定義することができる組織構築物内の所定の不均一性を含み得る。
【００２９】
1つ以上の組織パターンと相互貫入している血管網は、血管通路の2又は3次元の相互貫入配置である。血管網は、複数の分岐血管通路への親血管通路からの1つ以上の分岐(例えば、分岐、三分岐等)を含み得る。血管網は、より大きい径の血管がより小さい径の血管に分岐する、階層的分岐構造を有し得る。血管通路の一部又はすべては、湾曲した経路をたどり、したがって、曲線であるとみなされ得る。血管網における血管通路のすべてが同じ径を有し得る。或いは血管通路の少なくとも1つ、一部又はすべてが異なる径を有し得る。場合によっては、血管通路の1つ以上がその長さに沿って不均一な径を有し得る。
【００３０】
組織構築物の細胞が、血管通路の相互貫入網状構造に生き残るのに十分に近接していることが有益である。組織及び臓器様構造を作製する以前の試みに関連する1つの主要な問題は、接近可能な潅流可能血管系が存在しない領域において壊死領域が発生し得ることである。本製作物において、各細胞負荷フィラメント及びひいては各細胞は、血管網に近い位置又は血管網が形成され得る位置に配置することができる。例えば、各組織パターンを形成する1つ以上の細胞負荷フィラメントの少なくとも一部、及びひいては生細胞の一部又はすべては、血管通路から約1mm以下、約500μm以下、約300μm以下、約200μm以下、約100μm以下、約50μm以下、及び/又は約10μm以下離れていてもよい。1つ以上の細胞負荷フィラメント及びひいては生細胞の少なくとも一部は、血管通路と直接接触するように堆積させることができる。血管網の一部、例えば、最小毛細血管は、犠牲フィラメントの堆積及び変色性インクの除去の後に血管新生及び/又は細管形成によって形成され得ることが想定される。例えば、内皮細胞を含む細胞負荷フィラメントは、細管形成及び/又は血管新生を促進して新たな毛細血管を発生させるために変色性網状構造に隣接して堆積させることができる。
【００３１】
細胞負荷(及び他の)フィラメントの堆積のための下記の印刷法は、高い位置精度を可能にするので、組織構築物内の生細胞及び/又は細胞外マトリックス材料の配置を±200μm以内、±100μm以内、±50μm以内、±10μm以内又は±1μm以内に制御することができる。
【００３２】
上述のように、2種以上の細胞型の細胞を含む細胞負荷フィラメントを堆積させることによって異なる型の細胞を互いに近接して配置することができる。相互貫入血管系に加えて、特定の種類の細胞を他のものと近接して配置することができるように1つ以上の組織パターンを1つ以上の他の組織パターンと相互貫入させることができることも予期される。例えば、第1の種類の細胞(例えば、上皮又は内皮細胞)を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントを、第2の種類の細胞(例えば、平滑筋細胞)を含む1つ以上の細胞負荷フィラメントと積み重ね、部分的若しくは完全に上に重ね、部分的若しくは完全に下に重ね、取り囲み、中に埋め込み、且つ/又は織り合わすことができる。いくつかの実施形態では、組織パターンのすべてが少なくとも1つの他の組織パターンと相互貫入し得るものであり、組織パターンのすべてが他の組織パターンのすべてと相互貫入し得ることも予期される。
【００３３】
細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の組織パターンを部分的又は完全に取り囲み得るものであり、完全に取り囲まれている組織パターンは、露出細胞負荷フィラメントを含まない。細胞外マトリックス組成物は、血管通路の網状構造も部分的又は完全に取り囲み得るものであり、完全に取り囲まれている血管網は、露出血管通路を含まない。例えば、血管通路の網状構造は、細胞外マトリックス組成物によって完全に取り囲まれていることがあり得るが、組織パターンは、細胞外マトリックス組成物によって部分的にのみ取り囲まれている(例えば、隣接している)ことがあり得る。そのような例では、細胞負荷フィラメントは、血管パターンが封入された後に堆積させることができる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス組成物は、細胞外マトリックス組成物と共に堆積させることができる、下文で述べるような、さらなる生細胞及び/又は1つ以上の機能性化学物質を含み得る。そのような細胞外マトリックス組成物は、細胞負荷マトリックスと呼ぶことができる。下文で述べるように、細胞外マトリックス組成物は、当業者に公知の他の方法により印刷、注型又は形成することができる。
【００３４】
組織構築物は、所望の2D又は3D形状を有し得る。例えば、組織構築物は、細胞負荷フィラメントの単相又は多層及び相互貫入血管網から構築された平面形状を有し得る。そのような構造は、所望の高さ(「厚さ」)を有し得る。一般的に、組織構築物は、約100cm以下、約10cm以下、約1cm以下、約1mm以下、約500μm以下、約100μm以下、一般的に少なくとも約10μm、少なくとも約100μm、少なくとも約200μm又は少なくとも約1mmの高さを有し、用途は、組織培養及び薬物スクリーニングから皮膚構築物及び角膜置換に及ぶ。特定の代替実施形態では、組織構築物は、少なくとも1cmの厚さを有し得る、好ましくは、1cmの厚さを超え得る。組織構築物に関する「厚い」という用語は、1mmより厚いことを意味する。
【００３５】
或いは、血管網が埋め込まれている組織構築物は、任意又は用途依存性3Dサイズ及び形状を有し得る。組織構築物は、中実構造、多孔質構造及び/又は中空構造(例えば、管状若しくは非管状)を有していてもよく、特定の臓器の形態及び機能を模倣するように製作することができる。例えば、組織構築物は、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、膀胱、膣、尿道、気管、食道、皮膚又は他の身体器官のサイズ及び形状を有し得る。3Dサイズ及び形状は、下文で述べるように、場合によっては、型により決定され得る。
【００３６】
一般的に、相互貫入血管パターンを有する細胞負荷フィラメントの3次元配置において、犠牲フィラメントは、細胞負荷フィラメントの一部分の下にある又は上にある部分を有し得るものであり、犠牲及び細胞負荷フィラメントは、鉛直方向(重力によって定められる)に垂直なXY平面に限定され得る又は限定され得ない。犠牲フィラメントは、細胞負荷フィラメントの一部又はすべてと物理的に接触していてもよく、いくつかの実施形態では、フィラメントは、接触部分において部分的又は完全に融合していてもよい。犠牲及び細胞負荷フィラメントの両方は、接触点の間に支持されずに伸びるスパニング部分(spanning portions)を含み得る。
【００３７】
図2A〜2Cに血管パターン125又は血管通路の網状構造135により相互貫入された1つ以上の組織パターン115をそれぞれ含む例示的な組織構築物100を示す。図2Aにおいて、2つの細胞負荷フィラメント105をそれぞれ含む2つの組織パターン115a、115bを基板110上に単層で堆積させる。血管パターン125の犠牲フィラメント120は、細胞負荷フィラメント105と隣接し、且つ/又は物理的に接触しており、各犠牲フィラメント120は、変色性インクを含んでいる。細胞外マトリックス組成物130による封入後に、変色性インクを除去して、血管通路の網状構造135を形成することができる。
【００３８】
図2Bに相互貫入血管パターン125の犠牲フィラメント120と交互に配置されている細胞負荷フィラメント105の3D格子構造115を含む組織構築物100の概略図を示す。犠牲フィラメント120を構成する変色性インクを最終的に除去して、図2Bに視覚化することもできる、血管通路の網状構造135を作る。
【００３９】
図2Cの組織構築物100は、血管通路の網状構造135により(又は変色性インクがまだ除去されなかった場合には犠牲フィラメント120を含む血管パターン125により)相互貫入された曲線細胞負荷フィラメント105によりそれぞれ定義される2つの組織パターン115a、115bを含む。血管網135は、様々な長さ及び直径の曲線通路を含む階層的分岐構造を有する。固体基板110は、組織構築物100の下部に示されているが、この図及び他の例示する図において、下部の固体基板110は、存在しないことがあり得る。
【００４０】
図3Aに血管パターン125の犠牲フィラメント120との半織構造における細胞負荷フィラメント105を含む2つの例示的な組織パターン115a、115bの上面図を示す。図3Bに細胞外マトリックス組成物130により取り囲まれた多層の同じ組織パターン115a、115b及び血管パターン125(又は変色性インクがまだ除去されなかった場合には血管通路の網状構造135)を示す。
【００４１】
組織構築物における生細胞及び所定の細胞型は、生殖細胞、体細胞及び幹細胞を含む、哺乳類の身体を構成する細胞から選択される哺乳類細胞型を含み得る。細胞の型によって、哺乳類の身体を構成する細胞は、非常に早期の胚における3つの主要な生殖細胞層である内胚葉、外胚葉又は中胚葉の1つに由来し得る。「生殖細胞」という用語は、配偶子(卵及び精子)を生じる細胞の系列を意味する。「体細胞」という用語は、多細胞生物の身体を形成する生体細胞、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞又は未分化幹細胞以外の細胞を意味する。例えば、哺乳動物において、体細胞は、すべての内部器官、皮膚、骨、血液及び結合組織を構成している。したがって、細胞は、器官、皮膚、骨、血液及び結合組織(すなわち、間質細胞)を含む、哺乳類細胞から単離された体細胞を含み得る。体細胞の例としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、腱細胞、マスト細胞、遊走細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症細胞、内皮細胞、筋細胞(心、骨格及び平滑筋細胞)、脂肪細胞(すなわち、脂肪細胞(lipocyte)又は脂肪細胞(fat cell))、柔組織細胞(ニューロン及び巨細胞、ネフロン細胞(すなわち、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞及び有窓糸球体内皮細胞(すなわち、有足細胞))、肝細胞、膵細胞、肺実質細胞)並びに非柔組織細胞(類洞肝内皮細胞、クッパー細胞及び肝星細胞)などがある。「幹細胞」という用語は、無期限に分裂し、特殊化した細胞を含む、哺乳類の身体の実質的にすべての細胞を生じさせる能力を有する細胞を意味する。幹細胞は、さらなる特殊化を受けたときに、機能性又は体細胞を生じさせることができる多能性前駆細胞になる、多能性細胞を含む。幹及び前駆細胞の例としては、赤血球、白血球及び血小板を生じさせる骨髄に由来する造血幹細胞(成体幹細胞、すなわち、血球芽細胞)、間質細胞、脂肪細胞及び各種の骨細胞を生じさせる骨髄由来の間葉系幹細胞(成体幹細胞)、様々な種類の皮膚細胞を生じさせる上皮幹細胞(前駆細胞)、神経及び巨細胞を生じさせる神経幹細胞及び神経前駆細胞、並びに分化筋組織に寄与する筋衛星細胞(前駆細胞)などがある。
【００４２】
いくつかの実施形態では、組織構築物の開発に用いる患者特異的な所定の細胞型を得るための出発物質として人工多能性幹細胞(iPSC)を用いることができる。iPSCは、成体細胞から直接作製することができ、無限に自己再生し、無制限の発生能を有する一種の多能性幹細胞である。例えば、iPSCは、ネフロンに存在する患者固有の腎臓前駆又は個別の細胞系(例えば、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞及び有窓糸球体内皮細胞(すなわち、有足細胞))を得るために用いることができる。
【００４３】
組織構築物は、増殖因子、増殖阻害剤、サイトカイン、ステロイド及び/又はモルフォゲンを含むが、これらに限定されない、薬物、毒素、タンパク質及び/又はホルモンから選択される1種以上の機能性化学物質も含み得る。いくつかの細胞特異的な例としては、VEGF、EGF、TGF-ベータを含むが、これらに限定されない、骨形成タンパク質、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子などがある。1種以上の機能性化学物質は、細胞負荷フィラメント(複数可)及び/又は犠牲フィラメントにより堆積させることができ、周囲の細胞外マトリックス組成物中に拡散し得る。
【００４４】
そのようなアプローチは、細胞外マトリックス組成物内のキューの勾配を発生させるために用いることができる。細胞は、細胞の移動、増殖及び分化を誘導し得る発生、創傷治癒及び炎症反応時に固定及び拡散性化学的キューの勾配に反応する。キューの勾配を導入する1つの方法は、濃度勾配を発生させるための細胞外マトリックス組成物による封入により外に拡散し得る、図12A〜12Cに示すように、目的のキューを前負荷した細胞負荷フィラメントを直接印刷することである。そのような勾配は、トランスグルタミナーゼの作用により足場に固定しても又は固定しなくてもよい。或いは、固定された長期の勾配を発生させるために、変色性インクを除去することによって形成された通路を用いて、周囲の細胞外マトリックス組成物中に拡散し得る因子を導入することができる。例えば、一対の平行通路を作製し、蛍光BSAを1つの通路のみを通して流すことによる蛍光標識BSAの直線勾配の形成を図12D〜12Fに示す。24時間目に、ほぼ直線的勾配が2つの通路の間に見られる(図12E〜12F)。
【００４５】
細胞負荷フィラメントの細胞外マトリックス材料並びに組織及び血管パターンを少なくとも部分的に取り囲む細胞外マトリックス組成物は、合成又は天然由来生体適合性材料を含み得る。細胞外マトリックス材料及び細胞外マトリックス組成物は、同じ又は異なる生体適合性材料を含み得る。細胞負荷フィラメント及び、いくつかの実施形態において、細胞外マトリックス組成物は、下文で述べるように、マイクロノズルを介する押出しを必要とする3D印刷法で堆積させることができるため、細胞外マトリックス材料及び細胞外マトリックス組成物の1つ又は両方が(1)ずり減粘挙動を示すこと、(2)規定の降伏応力τyを示すこと、並びに/又は(3)せん断弾性係数G'及びせん断粘性係数G''を有し、室温でG'>G''であることが有益であり得る。
【００４６】
一例において、細胞外マトリックス材料及び/又は細胞外マトリックス組成物は、ゲルを含み得る。バイオプリンティング用途に理想的なインクは、せん断弾性係数の初期の増加によって確認することができる、低粘度溶液から固体様ゲルへの急速な転移を示し得る。急速で、制御可能なゲル化は、緩徐なゲル化過程に特有な膨潤及び解離を最小限にする又は未然に防止することによって印刷された構造の忠実度を増大させる可能性がある。「ゲル」という用語は、粘性又は剛性をもたらすためのゲル化剤を含み得る半固体物質を意味する。ゲルは、増粘剤、架橋剤又は重合剤などのゲル化剤の使用により形成することができ、架橋構造又は非架橋構造を含み得る。ゲルは、疎水性又は親水性であり得る。適切なゲルのいくつかの例は、ヒドロゲル、熱可逆性ゲル、光感受性ゲル、pH感受性ゲル、ペプチドゲル又は細胞型特異性ゲルを含む。ゲルのさらなる例は、シリカゲル、シリコーンゲル、アロエベラゲル、アガロースゲル、ナフィオン、ポリウレタン、エラストマー(熱可塑性、鉱油熱可塑性等)、イオン交換ビーズ、オルガノゲル、キセロゲル及び親水コロイドを含む。ヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロネート、フィブリン、アルギネート、アガロース、キトサン、ゼラチン、マトリゲル、グリコサミノグリカン及びそれらの組合せに由来するものを含む。一例において、ゲルは、光重合性メタクリレート(MA)基で修飾されている変性コラーゲンである、ゼラチンメタクリレート(GelMA)を含み得る。適切なヒドロゲルは、合成ポリマーを含み得る。特定の代替実施形態では、ヒドロゲルは、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリエチレンオキシド及びそのコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン並びにそれらの組合せに由来するものを含み得る。細胞外マトリックス材料及び/又は細胞外マトリックス組成物は、コラーゲン(例えば、I、III及びIV)、フィブリン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ゼラチン(例えば、低及び高ブルームゼラチン及び/又は温度処理)、ラミニン、ヒアルロネート(例えば、ヒアルロン酸)、エラスチン及び/又はプロテオグリカンを含む、1つ以上の細胞外マトリックス成分などの、天然由来の生体適合性材料を含み得る。細胞外マトリックス材料及び/又は細胞外マトリックス組成物用の他の適切な生体適合性材料は、セルロース、マトリゲル、アクリレート、アクリルアミド、乳酸-グリコール酸コポリマー、エポキシド、アルデヒド、尿素、アルコール、ポリエステル、絹、カルボポール、タンパク質、グリコササミノグリカン、炭水化物、鉱物、塩、粘土、ヒドロキシアパタイト及び/リン酸カルシウムを含み得る。さらなる例は、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAM)、ポリエチレングリコール(PEG)、ゼラチンメタクリレート(GelMA)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)の変形形態及び/又は組合せを含み得る。上に示した材料の組合せも細胞外マトリックス材料及び/又は細胞外マトリックス組成物として使用されることが予期される。
【００４７】
好ましい実施形態では、細胞外マトリックス材料及び/又は細胞外マトリックス組成物は、ゼラチン及びフィブリンを含み得る。ゼラチン及びフィブリンは、天然細胞外マトリックス(ECM)を模倣する相互貫入ポリマー網状構造を形成する可能性があり、細胞付着性、バイオプリンティング、透明性及び生体適合性について最適化することができる。フィブリン-ゼラチン相互貫入ポリマー網状構造は、図13A〜13Dに示すように、フィブリノーゲン及びゼラチンの溶液を遅効性Ca2+依存性酵素である、トランスグルタミナーゼ(TG)と混合して、後にウシトロンビンと混合してフィブリンゲル骨格を形成することができるゲル前駆溶液を調製することによって作製することができる。フィブリンは、ウシトロンビン及び塩化カルシウムにより活性化された濃縮フィブリノーゲン溶液から調製することができる。フィブリンは、印刷構造の迅速で、制御可能なゲル化を可能にする迅速凝固相である。有利なことに、フィブリン及びゼラチンは、強い界面を形成すると同時に、可動表面鎖の絡み合いにより結合させることができる。この性質の一体型ゲル(monolithic gels)の生成は、トランスグルタミナーゼ(TG)の遅い架橋速度論により、可能である。トロンビンは、フィブリンゲルの形成を迅速に誘導するが、IPNに存在するゼラチンは、既に注型された層上に犠牲インク印刷し、最終的に液体ゼラチン-フィブリンにより封入することを可能にする。2つの相は、結合し、一体型ゲルを生成する。下文における実施例においてさらに検討する、この材料系は、ゲル化速度論、界面接着、機械的特性、光学的特性及び細胞-材料相互作用を改良するために容易に調整することができる。
【００４８】
上述のように、変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、1つ以上の組織パターンと相互貫入する血管パターンを形成することができる。血管パターンは、1つ以上の犠牲フィラメントの2又は3次元相互貫入配置又は網状構造を含む。細胞外マトリックスによる部分的又は完全な封入の後の変色性インクの除去により、組織構築物中の血管通路の潅流可能な網状構造が作られる。細胞負荷フィラメントと同様に、犠牲フィラメントは、マイクロノズルを介する押出しを必要とする3D印刷法で堆積させることができるため、変色性インクが(1)ずり減粘挙動を示すこと、(2)規定の降伏応力τyを示すこと、並びに/又は(3)せん断弾性係数G'及びせん断粘性係数G''を有し、室温でG'>G''であることが有益であり得る。
【００４９】
堆積用の基板は、一般的に、ガラス又は他のセラミック、シリコーン、PDMS、アクリル、ポリウレタン、ポリスチレン又は他のポリマーなどの材料を含む。いくつかの実施形態では、基板は、生組織若しくは脱水組織、又は上述の細胞外マトリックス組成物のうちの1つを含み得る。基板は、印刷の前に清浄にし、表面処理することができる。例えば、ガラス基板は、細胞負荷フィラメントのガラス基板への結合を促進するためにシラン処理を受けることができる。いくつかの実施形態では、例えば、参照により組み込まれる、W. Wuら、Adv. Mater. 23 (2011)H178-H183に記載されているように、基板は、固相材料でなくて、代わりに液又はゲル相であってもよく、注意深く制御されたレオロジー特性を有し得ることが想定される。Wuらの製作物において、変色性インクが合成ヒドロゲル中に印刷されて、網状構造を形成した。しかし、これらの合成材料は、細胞の付着及び増殖を持続させず、それらの使用を非生物学的用途に限定するものである。本開示においては、印刷のための適切なレオロジーを維持すると同時に細胞付着、移動、増殖及び組織特異的機能を促進する細胞外マトリックス組成物を述べる。図21Aに概略的に示すように、細胞負荷及び犠牲フィラメントを印刷中に細胞外マトリックス組成物中に埋め込み、それにより、細胞外マトリックス組成物による組織及び血管パターンの少なくとも部分的な取り囲みが細胞負荷及び犠牲フィラメントのそれぞれの堆積中に起こる。これは、例えば、図21Cに示すように、印刷中に支持材料を必要とし得る任意に複雑な3D構造を含む。上述のように、組織及び血管パターンの形成及び埋込みが同時に起こる場合、その上及び/内に堆積が起こる基板は、細胞外マトリックス組成物を保持する容器又は細胞外マトリックス組成物自体であるとみなすことができる。
【００５０】
細胞外マトリックス組成物を形成するために、ミクロゲル(例えば、ポリアクリル酸(PAA)ミクロゲル)をレオロジー改質剤として用い、ゼラチンメタクリレートなどの、先に述べた、1つ以上の細胞外マトリックス材料と混合することができる。図21Bに概略的に示すように、半相互貫入ポリマー網状構造(半IPN)が形成され得る。ミクロゲルは、化学的に架橋した3次元ポリマー網状構造からなるコロイドゲル粒子を含むと理解され得る。ミクロゲルは、殻のみを有し、芯を有さない立体的に安定化したコロイドとして作用し得る。それらは、組成が異なり得るものであり、PAA、ポリスチレン、PEG及び/又は他の生体材料を含み得る。天然細胞外マトリックス材料又は生体材料を理想的なレオロジーを付与するためにミクロゲルの形態に変換することができると予期される。適切な生体材料の例は、ヒアルロン、コラーゲン、アルギネート、フィブリン、アルブミン、フィブロネクチン、エラスチン又はマトリゲルを含む。或いは、PEG、アクリレート、ウレタン又はシリコーンなどの合成材料を同様な方法で改質することができる。
【００５１】
埋込み印刷に適切であるインク及びマトリックスのレオロジーの代表的なレオロジー的測定を図21Dに示す。一例において、高分子量(>1.25MDa)PAAミクロゲルをレオロジー改質剤として用い、ゼラチン-メタクリレート(GelMa)と混合して、前述のように内皮化することができる、複合3D血管網の作製を支持する細胞外マトリックス組成物を作製する。細胞外マトリックス組成物の透明度は、図22に示すように、置換の程度及びメッシュサイズを変化させることによって変化させることができる。図21Eに3D血管網の埋込み印刷に対する制御を示す血管立方体を示し、図21FにPAA-GelMA細胞外マトリックス組成物内の印刷細胞負荷フィラメントを示す。
【００５２】
方法は、細胞外マトリックス組成物によって組織及び血管パターンを取り囲む又は封入する前に、1つ以上の構造フィラメントを基板上及び/又は基板内に層ごとに所定のパターンで堆積させて、型を形成することをさらに含み得る。構造フィラメントは、上述の例示的な細胞外マトリックス組成物又は細胞外マトリックス材料から選択される1つ以上の構造材料を含み得る。型は、封入中に細胞外マトリックス組成物を保持し得るものであり、組織構築物の一部として残ってもよく、又は処理後に除去することもできる。構造フィラメントは、基板上及び/又は基板内の組織構築物並びにXY平面外の組織構築物の3次元形状のすべて又は少なくとも一部の外周を定義し得る。
【００５３】
型は、組織構築物の形状を定義することに加えて、他の機能も有し得る。例えば、型は、印刷組織構築物中の通路の潅流のための界面としての役割を果たし得る。図15A〜15D及び15E〜15Gに印刷型又は界面構造の例示的な設計を示す。図15A〜15Dに示す例示的な型は、受動的揺動潅流用に設計されている。界面構造とも呼ぶことができる、型は、PDMSを含み得る型の底部とガラスを含み得る上にあるカバーとの間に組織構築物を固定化することによって揺動中に血管新生組織を所定の位置に保持することができる。潅流は、短期間(すなわち、14日)であってもよい。特定の実施形態では、血管新生組織をチップ上で長期間(>3ヵ月)潅流することができる。
【００５４】
特定の実施形態では、実施例の項に述べるように、管状組織構築物は、型上、例えば、動脈及び静脈循環のための潅流可能なチップ上の血管新生マトリックス中に印刷し、且つ/又は埋め込むことができる。専用の潅流チップを製造するために、シリコーンインクを注射器に充填し、遠心力を作用させて、気泡を除去し、先細りノズル(例えば、410μm)を介して堆積させ、直接インクライティングを用いて印刷することができる(図26A〜B参照)。専用MATLABソフトウエアを用いてガスケット設計を作製することができ、構造を例えば、50mm×75mmガラススライド上に印刷することができる。印刷後、チップをオーブン中で80℃で1時間以上硬化させ、室温で保存する。
【００５５】
特定のさらなる実施形態では、潅流可能なチップ上への管状組織構築物の印刷により、管状組織構築物を1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配に曝露することが可能になる。1種以上の生物学的作用物質、生物学的作用物質勾配、圧力及び/又は酸素圧勾配は、管状組織構築物の発生、分化及び/又は機能をさらに導く可能性がある。
【００５６】
図15E〜15Gの型の設計は、組織構築物の能動的ポンプベースの潅流を可能にし、組織構築物の血管通路と流体連通した(例えば、と連続した)流路を含む。流路としての役割を果たす通路は、型自体に部分的又は完全に埋め込むことができ、中空ピン(例えば、金属ピン)を用いて、図15F〜15Gに示すように血管通路と連結することができる。図15Eに示す例示的型は、組織構築物を製作する場合に、型の内部に延在する中空ピンを含む、流路を含む複数の控壁を有する壁を有する。組織構築物の血管通路は、流路に接続されたチューブから血管通路に流れを導入することを可能にするための中空ピンの開口部と連続していてもよく、流体は、血管通路から1つ以上の他の開口部を介して除去することができる。
【００５７】
一例において、型は、粘弾性、非毒性、生体適合性であり、可逆性プレスフィットシールを形成することができることが公知である構造材料である、シリコーンで形成することができる。構造材料を3D印刷して、1つ以上のシリコーン、エポキシ、アクリル酸のエステル、又は上文で示した1つの細胞外マトリックス組成物を含む1つ以上の未硬化構造フィラメントを形成することができる。印刷が完了した後、構造フィラメントを適切な時間(例えば、約1時間以上)硬化させることができ(例えば、加熱又は光重合することにより)、その後、型は、所望の材料特性を示し得る。
【００５８】
組織及び血管パターンの封入は、液化マトリックス前駆体を型に注型し、マトリックス前駆体をゲル化して、細胞外マトリックス組成物を形成することを含み得る。マトリックスの注型は、約25℃〜40℃で行うことができる。例えば、ゼラチンメタクリレート又はGelMAは、37℃の温度で注型することができる。注型の後、マトリックス前駆体を冷却して(例えば、GelMAの場合には約15℃に又はGelbrinの場合には約4℃に)、剛性物理ゲルを形成することができる。或いは、封入は、上文で示したように、埋込み又は全方向3D印刷法における組織及び血管パターンの堆積中に起こり得る。細胞外マトリックス組成物は、細胞負荷及び犠牲フィラメントと同様な、フィラメント堆積により堆積させることができることも予期される。例えば、下文で述べるように、細胞外マトリックス組成物を含む1つ以上のECMフィラメントをノズルから押出して、基板上及び/又は基板内に層ごとに堆積させて、所望の3D形状を構築することができる。そのような場合、細胞外マトリックス組成物を含む型を用いることは、必要でない可能性がある。
【００５９】
細胞外マトリックス組成物は、永続的に化学架橋構造を形成するための変色性インクの除去の前又は後に硬化させることができる。細胞外マトリックス組成物によって、硬化には加熱、UV照射又は化学添加物(例えば、酵素硬化)を必要とし得る。
【００６０】
基板上及び/又は基板内に堆積されたフィラメント-1つ以上の組織パターンを定義する細胞負荷フィラメント、相互貫入血管パターン若しくは機能性通路パターンを定義する1つ以上の犠牲フィラメント、型を定義し得る1つ以上の構造フィラメント及び/又は細胞外マトリックス組成物を生じさせ得る1つ以上のECMフィラメント-のいずれか又はすべては、基板上及び/又は基板内に堆積される前にノズルから押出すことができる。続く押出し工程の考察において、犠牲フィラメント、細胞負荷フィラメント、構造フィラメント及び/又はECMフィラメントは、加工ステップがフィラメント組成物のいずれか又はすべてに適用可能であるので、「フィラメント」と総称することができる。
【００６１】
図4にフィラメントを押出し、それらを基板上及び/又は基板内に堆積するために用いることができる例示的なノズル又はプリントヘッドを示す。示したノズルは、4つの独立したz軸を備えた大型ビルドプラットフォーム(750mm×650mm)を含む特注の3Dプリンターの部品である。図5A〜5Cに4つのノズルのそれぞれからの異なる組成のフィラメントの連続堆積による4層多材料構築物の3D印刷の実物説明を示す。図5Cの差し込み図に3D構造の反復単位を各層について示す。
【００６２】
図4及び5Aの例示的なプリンターに4つのノズルが存在するが、3D印刷により組織構築物を形成するために用いられるノズルの数は、より低い又はより高い場合がある。一般的に、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、最大N個のノズルをフィラメントを押出すために用いることができ、ここで1≦N≦1024であり、より一般的にはNは、512以下であり、Nは、256以下であり、Nは、128以下であり、又はNは、64以下である。フィラメントは、直列堆積法で連続的に又は並列堆積法で同時にN個のノズルから押出すことができ、各ノズルは、異なる前駆体インク(例えば、1つ以上の所定の細胞型を含む細胞負荷インク、変色性インク、構造インク又はECMインク)を含み得る)。堆積が並列及び直列堆積ステップの両方を含み得ることも予期される。連続又は直列印刷を促進するために、図4に示すように、ノズルをz方向に独立に制御することができる。
【００６３】
各ノズルは、サイズが約1μm〜約1mm、より一般的には約50μm〜約500μmの内径を有し得る。ノズルのサイズは、所望のフィラメント径に応じて選択することができる。注入圧力及びノズルの並進速度によって、堆積フィラメントは、約1μm〜約10mm、より一般的には約100μm(0.1mm)〜約1mmの範囲の直径を有し得る。ノズルに供給されるインクは、Luer-Lok(商標)又は他のコネクターにより印刷用ノズルに個別に接続することができる独立した注射筒に収容することができる。それぞれのフィラメントの押出しは、約1psi〜約200psi、約10psi〜約80psi又は約20psi〜約60psiの印加圧力下で行われ得る。押出し中の圧力は、一定であってもよく、又は変化してもよい。交番圧力源を用いることにより、100psi若しくは200psiより高い且つ/又は1psiより低い圧力を印刷中にかけることができる。可変圧力により、フィラメントの長さに沿って変化する直径を有するフィラメントを得ることができる。そのようなアプローチは、例えば、様々な長さ及び直径の犠牲フィラメントから形成される、図2C及び図7E〜7Fに示す分岐状の階層的血管網を形成するために用いることができる。押出しは、周囲温度又は室内温度条件(例えば、約18℃〜約25℃)で行うことができる。
【００６４】
各フィラメントの押出し及び堆積中、ノズルを所定の経路(例えば、(x1, y1, z1)から(x2, y2, z2)へ)に沿って±100μm以内、±50μm以内、±10μm以内又は±1μm以内の位置精度で移動させることができる。したがって、フィラメントは、±200μm以内、±100μm以内、±50μm以内、±10μm以内又は±1μm以内の位置精度で堆積させることができる。約3m/秒(例えば、約1cm/秒〜約3m/秒)と高い、より一般的には約1mm/秒〜約500mm/秒、約1mm/秒〜約100mm/秒又は約1mm/秒〜約10mm/秒の範囲の速度でノズルを移動させ、フィラメントを堆積させることができる。
【００６５】
ノズルの所定の経路は、プリンターのビルドプラットフォームのサイズによって決定される少なくとも約2400cm2、少なくとも約2700cm2、最大約1m2のXY境界面積を有し得る。例えば、ビルドプラットフォームは、約60cm〜約100cmの長さ及び約40cm〜約100cmの幅を有し得る。各プリントヘッドは、z方向に約10cm〜約50cm又は約10cm〜約30cmの距離移動させることができる。
【００６６】
堆積フィラメントは、適切な組成及びレオロジー特性を有する前駆体インク(例えば、1つ以上の所定の細胞型を含む細胞負荷インク、変色性インク、構造インク又はECMインク)から形成される。前駆体インクは、粘弾性で、非線形せん断依存性を有する粘度を有する。前駆体インクの粘度は、約0.001Pa-秒〜約10,000Pa-秒の範囲にある。前駆体インクは、レオロジー特性を制御する助けとするために粘稠化剤を任意選択で含み得る。各細胞負荷インク、並びに任意選択で、変色性インク及び/又はECMインクは、液体若しくはゲルであり得る担体中の1種以上の所定の細胞型の1つ以上の細胞を含み得る。担体は、上述の細胞外マトリックス材料に加えて、上述の1つ以上の機能性化学物質を含み得る。担体は、また若しくは代わりになるべきものして、細胞の増殖を持続させるように意図されている細胞培養培地を含み得る。一例において、ヒドロゲルと混合された生細胞を含む細胞負荷インクを形成するために、所定の量のヒドロゲル前駆体粉末を細胞培養培地と混合して、適切な組成の溶液を調製する。次いで目的の細胞を所望の細胞濃度(例えば、細胞負荷フィラメントについて上述した細胞濃度のいずれか)で溶液中に分散させ、十分に混合する。例示的な細胞負荷GelMAインク、細胞負荷ゼラチン-フィブリンインク、Pluronic F127変色性インク及びPDMS構造インクを調製するステップは、以下の実施例で述べる。
【００６７】
組織及び血管パターンの封入の後、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造を形成することができる。変色性インクは、生体適合性材料を含み得るものであり、室温での堆積中の細胞負荷調合物及び細胞外マトリックス組成物との生体適合性を得るために設計することができる。適切な変色性インクは、例えば、Pluronic F127、Pluronic F123、アガロース、糖、ワックス及び脂肪油(例えば、Criscoなどの動物脂肪由来の油)を含み得る。ヒドロゲルを細胞外マトリックス組成物(及び/又は細胞外マトリックス材料)に用い、Pluronic F127のようなヒドロゲルを変色性インクとして用いる場合、印刷後の変色性インクの歪みを避けるために変色性インク及びマトリックスヒドロゲルが同様な含水率(例えば、±30%以内)を有することが有利であり得る。変色性インク及び細胞外マトリックス組成物はまた、下文でさらに述べるように、相補的熱転移を有するように選択することができる。
【００６８】
Pluronic F127は、製作工程を完了するために必要な短期間にわたり複数の細胞型に対して生物学的に不活性であるFDA承認済みの材料である。該材料は、PEO-PPO-PEO配置で配列した疎水性ポリプロピレンオキシド(PPO)セグメント及び2つの親水性ポリエチレンオキシド(PEO)セグメントを含む。Pluronic F127は、臨界ミセル濃度(CMC;約21重量%)及びゲル化温度以上で熱的に可逆性ゲル化を受ける。ゲル化温度は、PEO-PPO-PEO濃度が増加するとき約10℃〜4℃低下する。これらの臨界パラメーターの両方を超えるとき、親水性PEOセグメントは、水により十分に溶媒和されるコロナに自己集合するが、疎水性PPOセグメントは、ミセルコア内で強固に会合するので、ミセルが形成する。しかし、ゲル化温度以下では、個々のPEO-PPO-PEO種が水に可溶性になって、その濃度がCMCを超える系についてはゲル-液体転移を生じるように、疎水性PPO単位が水和される。したがって、該材料は、ゲル化点以下に冷却することにより液化する。
【００６９】
パターン化細胞及び周囲細胞外マトリックス組成物は、犠牲フィラメントの堆積又は変色性インクの除去中に損傷されないことが重要であり、したがって、過酷な溶媒及び/又は高温を除去工程中に用いないことが好ましい。変色性インク及び細胞外マトリックス組成物/材料の適切な選択により、組織構築物の損傷を伴わずに変色性インクを除去することができる。例えば、変色性インクが上述のようにゲル-液体転移を受ける場合、封入後の血管パターンの冷却は、変色性インクの除去に有効であり得る。Pluronic F127を除去するために、血管パターンは、濃度によって、約1℃以下の温度に冷却することができる。変色性インクを除去用の適切な水溶液に溶解することができることも予期される。変色性インクが液化又は溶解したならば、血管パターンの露出端に真空をかけて、インクを抽出することができる。
【００７０】
有利には、組織構築物は、止血機能を促進し、様々な組織に固有の血管の適所を確立する助けとなると同時に、流体の拡散のバリアとなる血管通路の内面を覆う内皮細胞の付着及び増殖を維持するように設計することができる。内皮化を促進するために、いくつかの実施形態では、変色性インクを含む犠牲フィラメント(複数可)は、複数の内皮細胞又は他の生細胞をさらに含んでいてもよい。図16A〜16Cに示すように、細胞は、犠牲フィラメントにより堆積させることができ、変色性インクの除去後に血管通路に残存し得る。通路の直接細胞膜形成は、細胞が変色性インクの液化後に通路壁に吸着する場合に達成することができる。このアプローチにより、流動抵抗の増大のため直接注入を用いて入れることが困難であり得る高度に蛇行した網状構造又は小通路に生細胞を組み込むことが可能になる。内皮細胞及びPluronic F127を含む変色性インクの排出によって形成された通路を含む例示的な印刷組織構築物を図16D〜16Gに示し、実施例でさらに述べる。他の例において、上皮細胞を変色性インクに入れて供給し、哺乳類の腺、腎臓又は肝臓に存在する管状上皮組織を作製することができる。
【００７１】
変色性インクと共に内皮及び/又は他の生細胞を堆積させることに加えて、又はそれに代わるものとして、変色性インクの除去後の血管通路に生細胞(例えば、内皮細胞)の懸濁液を注入することによって内皮化を達成することができる。これらのアプローチの1つ又は両方を用いて、1つ以上の血管通路の壁の内面を覆う最大100%の融合性を有する内皮層を形成することができ、ここで100%の融合性は、壁が内皮細胞によって完全に覆われることを意味する。血管通路が実際の血管として機能し得るように、血管通路の網状構造に形成された各内皮層は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は100%の融合性を有し得る。下文の実施例で述べるように、代表的な階層的分岐網状構造へのヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)懸濁液の注射とそれに続く緩やかな揺り動かしに成功を収めることができることが示された(図7J参照)。48時間後に、代表的な分岐微小通路内の共焦点撮像と組み合わせた生/死染色により判定したとき、これらの細胞は、95%を超える生存率を保持し、ほぼ融合層に集合していた。
【００７２】
多数の種類の細胞を血管通路に注入することができる。in vivoでは、毛細血管より大きい直径を有するすべての血管は、外側線維組織層、平滑筋層及び内皮細胞の内層を含む。線維芽細胞などの、1つ以上の他の種類の細胞を変色性インクの除去後に内皮細胞と共に注入することができる。下文の実施例で述べるように、血管通路に、それぞれ天然血管の解剖学を模倣して、間質及び内皮層に自己集合し得る2つの細胞型である、線維芽細胞及びHUVECを共播種することができる。
【００７３】
同じ又は異なる変色性インクを犠牲フィラメントとして堆積させて、上述のように除去して、組織構築物内の血管通路に加えて又は代わりに通路、管及び/又はコンパートメントを形成することができることも予期される。言い換えれば、1つ以上の追加の犠牲フィラメントを堆積させて、血管パターンに加えて又は代わりに、基板上及び/又は基板内に機能性通路パターンを形成することができる。これを図17Aに概略的に示す。
【００７４】
各追加の犠牲フィラメントは、血管パターンを定義するために用いた変色性インク(血管パターンが存在する場合)と同じ又は異なる、第2の変色性インクを含み得る。堆積後、血管パターンに関して上述したように、機能性通路は、細胞外マトリックス組成物(例えば、図17AのステップIIIに示すヒドロゲル溶液)により少なくとも部分的に取り囲むことができる。1つ以上の機能性通路パターンが同時に形成され、細胞外マトリックス組成物に埋め込まれるように、細胞外マトリックス組成物による機能性通路パターンの少なくとも部分的な取り囲みは、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に起こり得ることも予期される。機能性通路パターンの形成及び埋込みが同時に起こる場合、その上及び/内に堆積が起こる基板は、細胞外マトリックス組成物を保持する容器又は細胞外マトリックス組成物自体であるとみなすことができる。図17AのステップVに示すように、また血管通路に関して上述したように、次に第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中に1つ以上の機能性通路を作ることができる。したがって、図17A(中央)及び17Bに示すように、機能性通路網状構造を、この例では上皮組織構築物である、組織構築物中に形成させることができる。1つ以上の種類の生細胞(例えば、上皮細胞)を追加の犠牲フィラメントにより堆積させることができ、生細胞の少なくとも一部は、第2の変色性インクの除去の後に1つ以上の機能性通路に残存し得る。また若しくはそれに代わるべきものとして、図17AのステップVIに示すように、第2の変色性インクを除去した後に、生細胞(例えば、上皮細胞)の懸濁液を機能性通路に注入することができる。
【００７５】
機能性通路は、管状組織又は組織成分を定義し得る。3D印刷及び上皮形成により形成させることができる管状構造の例は、(腎臓の)ネフロン、(腎臓の)ネフロンの尿細管部分、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパを含むが、これらに限定されない。そのような印刷上皮組織構築物は、その上の上皮層を含む1つ以上の機能性通路を含み得るものであり、細胞外マトリックス組成物は、図17A(中央)及び17Bに示すように、1つ以上の機能性通路を少なくとも部分的に取り囲み得る。間質層も上皮層上に存在し得る。印刷上皮組織構築物は、上述のように、細胞外マトリックス組成物中の、それぞれが1種以上の所定の細胞型の複数の生細胞を含む、1つ以上の組織パターンをさらに含み得る。生細胞及び1種以上の所定の細胞型は、上皮細胞及び/又は上述の他の細胞型を含み得る。印刷上皮組織構築物は、上文でも述べたように、細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造をさらに含み得る。
【００７６】
例えば、リンパ系の脈管(通路)の網状構造は、変色性インクを含む犠牲フィラメントを用いて作ることができる。他の例において、任意の所望の形状のコンパートメントは、犠牲フィラメントの所定の配置を堆積させることによって組織構築物内に埋め込むことができる。そのような埋込みコンパートメントは、細胞の挙動、分化、機能、移動及び/又は増殖を導くためのいくつかの実施形態において犠牲フィラメントにより堆積させることができる増殖因子、追加の細胞及び/又は補足的足場物質を含めるために用いることができる。
【００７７】
後に上皮細胞を播種する(上皮形成)機能性通路を含む印刷上皮組織構築物を図17A〜17Fに示す。図17A〜17Bについて述べると、印刷組織構築物は、ネフロンの一部である、近位屈曲尿細管である。それは、単純又は屈曲形状で印刷し、図17C〜17Fに示すように、成長し、機能性通路の周囲を取り囲む、上皮細胞を播種することができる。用いた細胞は、ヒト腎近位尿細管細胞(PTEC)である。しかし、このアプローチは、多くの種類の上皮組織に適用することができる。例えば、in vitroモデルは、組織固有の疾患及び毒性試験のために製作することができる。この種の機能性ヒト組織模倣体は、大きな臓器の成長のための構成要素として又は高処理薬物毒性及びスクリーニングに用いることができる。
【００７８】
少なくとも2種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞が管状組織構築物の異なる所定の位置に沿って配置されている、下記のネフロンなどの、印刷管状組織構築物及び管状組織構築物を3D印刷する方法を述べる。
【００７９】
腎臓は、外部領域(皮質)及び内部領域(髄質)の2つの領域からなっている。皮質及び髄質は、ネフロン(腎臓の機能単位である)、血管、リンパ管及び神経から構成されている。各腎臓は、単一細胞層からなる中空管である、約120万のネフロンを含む。図23Aに示すように、各ネフロンは、腎小体、近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位端及び集合管系からなっている。
【００８０】
尿の形成における最初のステップは、糸球体毛細血管(すなわち、糸球体)を通しての血漿の限外濾過から始まる。糸球体は、輸入細動脈により供給され、輸出細動脈により排出される毛細血管の網状構造からなっている。毛細血管は、ボウマン嚢の内葉を形成する、足細胞と呼ばれる、上皮細胞により覆われている。内葉細胞は、血管極においてボウマン嚢の壁側層を形成するように反映されている。内葉と壁側層の間の間隙は、糸球体の尿管極において近位尿細管の内腔になる、ボウマン腔と呼ばれる。糸球体毛細血管の内皮細胞は、足細胞により囲まれている、基底膜により覆われている。
【００８１】
近位尿細管は、最初にいくつかのコイルを形成し、髄質に向かって下降するわずかな部分がそれに続く。次のセグメントは、近位尿細管の直線部分、細い下行脚、細い上行脚(長いヘンレ係蹄を有するネフロンにおいてのみ)及び太い上行脚からなるヘンレ係蹄(図には「中間尿細管」と記す)である。集合管系の前の最後のセグメントは、遠位尿細管である。
【００８２】
各ネフロンセグメントは、特定の輸送機能を果たすのに特異的に適する細胞からなっている(図23B〜E)。近位尿細管は、近位尿細管にのみ存在する、著しく増幅した頂端膜(細胞の尿管側、刷子縁と呼ばれる)を有する。基底外側膜(細胞の血液側)は、高度に陥入している。これらの陥入は、多くのミトコンドリアを含む。対照的に、ヘンレ係蹄の細い下行脚及び細い上行脚は、発達不良な頂端及び基底外側表面及び少数のミトコンドリアを有する。太い上行脚及び遠位尿細管の細胞は、多くのミトコンドリア及び基底外側膜の高度の陥入を有する。集合管は、主細胞及び介在細胞という2種類の細胞からなっている。主細胞は、中等度に陥入した基底外側膜を有し、少数のミトコンドリアを含む。介在細胞は、高密度のミトコンドリアを有する。ネフロンの最終セグメントである内部髄質集合管は、内部髄質集合管細胞からなっている。
【００８３】
特定の実施形態において、ネフロンと類似し、機能する印刷管状構築物を述べる。印刷管状構築物は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む1つ以上の機能性通路であって、パターン化細胞層が1つ以上の種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞が機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている、機能性通路を含む。パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の種類の複数の生細胞(例えば、直上で述べたように)、或いは、少なくとも3つの所定の種類の複数の生細胞、或いは、少なくとも4つ以上の所定の種類の複数の生細胞を含み得る。特定の代替実施形態では、パターン化細胞層は、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び/又は腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、並びに有窓性糸球体内皮細胞(すなわち、足細胞)、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞を含み、それぞれが構築物の異なる所定の位置に分布し、それによりネフロンを形成し得る。特定の他の実施形態では、患者固有のiPSCを用いて、組織構築物の開発用の患者固有の所定の細胞型を得ることができる。例えば、患者固有のiPSCを用いて、ネフロンに存在する腎臓前駆若しくは個別細胞系(例えば、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び/又は腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、並びに有窓性糸球体内皮細胞(すなわち、足細胞))を得ることができる。iPSC由来の細胞系は、患者固有の管状組織構築物を印刷するための所定の種類の細胞として用いることができる。
【００８４】
図23Fに埋込みネフロン印刷(PDMSにおける蛍光染料を含むプルロニック)の写真を示す。
【００８５】
具体的には、特定の代替実施形態では、印刷管状組織構築物は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む機能性通路であって、パターン化細胞層が1つ以上の種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞が機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている、機能性通路を含む。印刷管状組織構築物は、機能性通路を少なくとも部分的に取り囲んでいる細胞外マトリックス組成物も含む。パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の種類(上述のような)の複数の生細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。細胞外マトリックス組成物は、コラーゲン(例えば、I、III及びIV)、フィブリン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ゼラチン(例えば、低及び高ブルームゼラチン及び/又は温度処理)、ラミニン、ヒアルロネート(例えば、ヒアルロン酸)、エラスチン及び/又はプロテオグリカンを含む、1つ以上の細胞外マトリックス成分などの、天然由来の生体適合性材料を含み得る。細胞外マトリックス組成物用の他の適切な生体適合性材料は、セルロース、マトリゲル、アクリレート、アクリルアミド、乳酸-グリコール酸コポリマー、エポキシド、アルデヒド、尿素、アルコール、ポリエステル、絹、カルボポール、タンパク質、グリコサミノグリカン、炭水化物、鉱物、塩、粘土、ヒドロキシアパタイト及び/リン酸カルシウムを含み得る。さらなる例は、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAM)、ポリエチレングリコール(PEG)、ゼラチンメタクリレート(GelMA)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)の変形形態及び/又は組合せを含み得る。特定の実施形態では、印刷管状組織構築物は、細胞外マトリックス組成物中の血管通路の網状構造も含み得る。特定の代替実施形態では、機能性通路は、生理機能の改善又は疾患状態モデリングをもたらし得る、免疫細胞、線維芽細胞、幹細胞、iPSCなども含み得る。
【００８６】
埋込み血管系を含む印刷管状組織構築物は、機能性通路の長さに沿ってその上にパターン化細胞層を含む機能性通路を含み得る。パターン化細胞層は、1つ以上の種類の生細胞を含み、それぞれの種類の生細胞は、機能性通路の異なる所定の位置に沿って配置されている。特定の実施形態では、パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の細胞型の複数の生細胞を含む。細胞外マトリックス組成物は、組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。特定の実施形態では、パターン化細胞層は、少なくとも2つの所定の細胞型の複数の生細胞を含み、細胞外マトリックス組成物は、1つ以上の組織パターンを少なくとも部分的に取り囲んでいる。印刷管状組織構築物は、機能性通路と相互貫入する血管通路の網状構造も含み、細胞外マトリックス組成物は、機能性通路及び血管通路の網状構造を少なくとも部分的に取り囲んでいる。細胞外マトリックス組成物は、コラーゲン(例えば、I、III及びIV)、フィブリン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ゼラチン(例えば、低及び高ブルームゼラチン及び/又は温度処理)、ラミニン、ヒアルロネート(例えば、ヒアルロン酸)、エラスチン及び/又はプロテオグリカンを含む、1つ以上の細胞外マトリックス成分などの、天然由来の生体適合性材料を含み得る。細胞外マトリックス組成物用の他の適切な生体適合性材料は、セルロース、マトリゲル、アクリレート、アクリルアミド、乳酸-グリコール酸コポリマー、エポキシド、アルデヒド、尿素、アルコール、ポリエステル、絹、カルボポール、タンパク質、グリコサミノグリカン、炭水化物、鉱物、塩、粘土、ヒドロキシアパタイト及び/リン酸カルシウムの変形形態及び/又は組合せを含み得る。さらなる例は、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAM)、ポリエチレングリコール(PEG)、ゼラチンメタクリレート(GelMA)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)の変形形態及び/又は組合せを含み得る。特定の実施形態では、管状組織構築物は、ネフロンであり、パターン化細胞層は、ネフロンに存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系、又はそれらの組合せから選択される少なくとも2つの細胞型を含む。特定の代替実施形態では、埋込み血管系を含む印刷管状組織構築物は、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパであり得る。特定の実施形態では、機能性通路は、生理機能の改善又は疾患状態モデリングをもたらし得る、免疫細胞、線維芽細胞、幹細胞、iPSC(患者固有のiPSCを含む)なども含み得る。
【００８７】
異なるアプローチを用いて、管状組織構築物の長さに沿って複数の種類の複数の細胞を含む、ネフロンなどの管状組織構築物を作製することができる。この点について、単一の管の長さに沿って機能し得る細胞型を分布させる(pattern)ための3D印刷方法を述べる。
【００８８】
第1のアプローチは、変色性インクにより複数の細胞型を直接堆積させることにより管状組織構築物を印刷することに関する。具体的には、管状組織構築物を印刷する方法は、犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させることを含み、各犠牲フィラメントは、変色性インク及び複数の所定の種類の生細胞を含んでいる。各所定の種類の生細胞を犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積させる。次に、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲む。次に、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の機能性通路を作り、各異なる所定の種類の生細胞の少なくとも一部が、変色性インクの除去後に異なる所定の位置に残存し、それにより、管状組織構築物を形成することができる。さらなるステップは、それぞれが第2の変色性インクを含む1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させるステップ、及び第2の変色性インクを除去し、それにより、管状組織構築物中の管の相互貫入網状構造を形成するステップを含み得る。生上皮又は内皮細胞の懸濁液を1つ以上の管に注入することができる。特定の実施形態では、管の相互貫入網状構造は、機能性通路パターンと相互貫入している血管通路パターンを含む。「相互貫入」という用語は、本発明との関係においては、通路パターンが互いに流体接触していても又はしていなくてもよいことを意味する。例えば、機能性通路パターンは、血管パターンと近接しているが、互いに流体接触しない(すなわち、独立に制御可能な(addressable)相互貫入網状構造)ものであり得る。特定の実施形態では、細胞外マトリックス組成物による機能性通路パターンの取り囲みは、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に起こり、それにより、機能性通路パターンが細胞外マトリックス組成物中で同時に形成され、埋め込まれ得る。前述のように、変色性インクは、犠牲フィラメントを冷却することによって除去することができる。さらに、方法の任意選択ステップとして、それぞれが複数の生細胞を含む、細胞負荷フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、それぞれが所定の細胞型を含む、組織パターンを形成することができる。
【００８９】
特定の実施形態では、犠牲フィラメントは、基板上及び/又は基板内に堆積させる前に単一プリントヘッドを介して押し出すことができる。単一プリントヘッドを用いて犠牲フィラメントを押し出す方法は、その全体として本明細書に組み込まれる、2015年3月13日に出願された「複数の材料の3D印刷のためのプリントヘッド及び方法」と題する米国仮特許出願第62/133,039号にすでに記載された。或いは、犠牲フィラメントは、複数のプリントヘッドを介して押し出されてもよい。複数のプリントヘッドを用いて犠牲フィラメントを押し出す方法は、その全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0314954号にすでに記載された。
【００９０】
具体的には、ネフロンを印刷するために、連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する。各犠牲フィラメントは、犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2の変色性インク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3の変色性インク製剤を含む。追加の変色性インク製剤も用いることができる。第1の変色性インク製剤は、変色性インク及び第1の種類の細胞、例えば、腎近位尿細管細胞を含み、第2の変色性インク製剤は、変色性インク及び第2の種類の細胞、例えば、ヘンレ係蹄細胞を含み、第3の変色性インク製剤は、変色性インク及び第3の種類の細胞、例えば、遠位尿細管を含む等である。さらなる変色性インク製剤は、ネフロンに存在する集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、腎微小血管細胞、腎前駆細胞、多能性幹細胞若しくは複能性幹細胞、他の内皮系列細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系を含み得る。次に、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に取り囲む。次いで変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の機能性通路を作り、腎近位尿細管細胞の少なくとも一部が、第1のインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存し、ヘンレ係蹄細胞の少なくとも一部が、第2のインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存し、遠位尿細管の少なくとも一部が、第3のインクの除去の後に1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存し、それにより、ネフロンを形成する。特定の実施形態では、連続犠牲フィラメントは、単一プリントヘッドを介して基板上及び/又は基板内に堆積させる。
【００９１】
犠牲フィラメントの長さに沿って複数の種類の複数の細胞を含む犠牲フィラメントを単一プリントヘッドを介して堆積させるために、ノズル出口と流体連通した複数のインク供給通路(例えば、第1のインク供給通路、第2のインク供給通路、第3のインク供給通路等)を含むノズル本体を用いる。第2のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第2の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第1のインク製剤を第1のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第1の所定の長さにわたって第1のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出す。第1のインク製剤を含む十分な第1の長さの連続した犠牲フィラメントが堆積されたならば、第2のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第1のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、第1のインク製剤及び第3のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第3の供給通路中に流れることを妨げながら第2のインク製剤を第2のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第2の所定の長さにわたって第2のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出す。第2のインク製剤を含む十分な第2の長さの連続した犠牲フィラメントが堆積されたならば、第3のインク供給通路に注入パルスを印加しながら第2のインク供給通路に中止パルスを印加するステップ、それにより、第1のインク製剤及び第2のインク製剤がそれぞれ第1の供給通路及び第2の供給通路中に流れることを妨げながら第3のインク製剤を第3のインク供給通路中に流れさせ、それにより、その第3の所定の長さにわたって第3のインク製剤を含む連続した犠牲フィラメントをノズル出口を介して押し出し、それにより、フィラメントの異なる所定の長さにわたって複数の細胞型を含む連続した犠牲フィラメントを3D印刷する代替実施形態では、連続した犠牲フィラメントは、複数のプリントヘッドを介して基板上及び/又は基板内に堆積させることができる。複数のプリントヘッドを用いて組織構築物を印刷する方法は、その全体として組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0314954号にすでに記載された。
【００９２】
複数の種類の複数の細胞をそれらの長さに沿って含む、ネフロンなどの管状組織構築物を作製するための第2のアプローチは、管状組織構築物に堆積させるべき様々な標的細胞に対する特異的「結合ドメイン」又は「リガンド」を直接堆積させることを含む。管状組織構築物における配置のための特定の細胞を標的にするために用いることができる様々な種類の結合ドメイン又はリガンドが存在する。結合ドメイン又はリガンドの例は、ペプチド、タンパク質、例えば、抗体、小ペプチド、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び/又は細菌を含む。
【００９３】
本発明との関係においては、結合ドメインは、分子又は構造が、所定の種類の標的細胞により発現又は結合されたタンパク質上の部位、特定の原子又は分子(すなわち、「受容体」)と結合することを可能にする物理化学的特徴又は特性を有する分子又は構造の一部である。受容体は、化学基、分子、細菌又はウイルスなどの、特定の結合ドメイン又はリガンドに対する親和性を有する所定の種類の細胞の表面上又は内部の化学基又は分子(タンパク質としての)である。受容体は、そのリガンドに高い親和性で特異的に結合する。
【００９４】
すべてのタンパク質が他の分子に結合する。リガンドに結合する又はそれと相互作用するタンパク質の能力は、それらの間の弱い非共有結合の形成に依存する。この過程は、各タンパク質のアミノ酸配列及びそれらの側鎖(又はR基)が互いに相互作用する方法に依拠している。異なる側鎖は、異なる結合を形成することができる。このため、タンパク質相互作用は、非常に特異的であり得る。したがって、タンパク質は、所定の種類の標的細胞により発現された又はそれと結合したタンパク質(「受容体」)上の部位にタンパク質間相互作用又は結合により結合する結合ドメイン又はリガンドとして堆積させることができる。結合ドメインとして堆積させることができるタンパク質の一例は、抗体を含む。
【００９５】
抗体は、「抗原」と呼ばれる、他のタンパク質(細胞内及び細胞外タンパク質)を認識し、それに結合する「Y」字形のタンパク質である。抗原は、本発明との関係においては、所定の種類の標的細胞により発現された又はそれと結合した分化分子である。抗体は、抗原に対する顕著な特異性を示す。標的細胞に結合させるために用いることができる抗体系は、標的細胞上に存在する抗原と直接結合する抗体を含む。異なる種類の細胞は、それらの表面上の異なる組合せの抗原及び/又は分化分子を発現し、抗体により標的にされ得る、異なる細胞内及び分泌可能タンパク質を産生する。具体的には、抗体の「Y」の各先端は、これらの2つの構造が正確に結合することを可能にする、分化分子上の1つの特定のエピトープに対して特異的である(鍵に同様に)パラトープを含む。この結合機構を用いて、抗体は、標的細胞を識別又は固定化することができる。細胞に直接結合する抗体は、様々な抗体供給業者から直接購入することができる。
【００９６】
異なる種類の細胞により発現された受容体は、DNA又はRNAに結合し、相互作用することもできる。したがって、特定の実施形態では、DNA及び/又はRNAは、結合ドメインとして機能することができる。らせんDNAの主鎖は、糖-リン酸-糖結合で構成されており、ジエステル基におけるリン酸は、負電荷を有する。特定の配列における塩基対A-T及びG-Cは、主溝における相互作用表面をもたらし、小溝においてはさほど一般的でない。N及びO原子は、水素結合により互いに対する塩基対合に関与しているが、他の基NH及びO基は、タンパク質におけるアミノ酸の側鎖に対して原子表面をもたらす。タンパク質は、特定の塩基若しくは荷電リン酸又は両方に結合することができる、荷電アミノ酸を有する。しかし、主鎖におけるリン酸基への結合は、配列特異的ではなく、相互作用性電荷によるものである。したがって、特定の実施形態では、DNAを所定の種類の細胞に対する結合ドメインとして堆積させることができる。特定の代替実施形態では、RNAを所定の種類の細胞に対する結合ドメインとして堆積させることができる。
【００９７】
結合ドメインは、医薬品又はウイルス若しくは微生物の外側の部分などの、小分子でもあり得る。
【００９８】
結合ドメインは、化学官能基も含み得る。
【００９９】
特定の実施形態では、所定の種類の細胞若しくは全細胞により発現された又はそれと結合した特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド(DNA及びRNA)又はペプチド分子である、アプタマーを所定の種類の細胞に対する結合ドメインとして用いることができる。アプタマーは、通常、大規模なランダム配列プールからそれらを選択することによって作られる。アプタマーは、それらの様々な標的に対して頑健な結合親和性(それらがそれらの特異的標的を高精度で識別することを意味する、すなわち、それらがそれらの標的を決定したならば、強い結合でそれに結合する)を示す。アプタマーペプチドの一例は、本発明との関係において、所定の種類の細胞により発現される又はそれと結合する、特異的標的タンパク質/受容体に対して高親和性結合表面をもたらすペプチドループを示すように
改変された小さく、高度に安定なタンパク質であるアフィマー(affimers)を含む。
【０１００】
ナノ粒子も所定の種類の細胞に対する結合ドメインとして用いることができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、細胞結合を可能にする結合ドメインとして作用し得る、コーティングを含むことができ、且つ/又は生体分子(モノクローナル抗体、アプタマー、ストレプトアビジン若しくはペプチドなど)に結合させることができる。複数の標的基を有する、多価ナノ粒子は、より強い固定をもたらし得る、クラスター受容体であり得る。したがって、特定の実施形態では、リガンド(ナノ粒子の外側を覆う又は結合させた)を含む細胞標的ナノ粒子を所定の種類の細胞に対する結合ドメインとして用いることができる。これらのリガンドは、細胞の表面上に見いだされる、相補的分子又は受容体を認識し、結合することができるという点で特殊である。
【０１０１】
特定のさらなる実施形態では、パターン化犠牲フィラメントを取り囲む細胞外マトリックスは、犠牲フィラメントの結合ドメインを捕捉するための所定のカップリング部分を含み得る。カップリング部分は、結合ドメインに対して化学的に反応性であり、それにより、犠牲フィラメントの排出の前、排出中又は排出の後に接触により前記結合ドメインを局所的に捕捉する。カップリング部分は、天然細胞外マトリックス結合ドメイン、抗体、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基及び細菌を含む。
【０１０２】
前述のように、ネフロンなどの管状組織構築物を作製するための第2のアプローチは、それぞれが変色性インク及び複数の所定の種類の結合ドメインを含む、1つ以上の犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンを形成するステップを含む。様々な種類の結合ドメインを上文で詳細に述べた。所定の種類の結合ドメインのそれぞれは、犠牲フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積されており、所定の種類の標的細胞に結合することができる。機能性通路パターンは、細胞外マトリックス組成物によって取り囲む(部分的又は完全に)ことができる(上文で詳細に述べたように)。特定の実施形態では、1つ以上の犠牲フィラメントの堆積中に機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって取り囲むことができ、それにより、1つ以上の機能性通路パターンが形成され、同時に細胞外マトリックス組成物中に埋め込まれる。細胞外マトリックス組成物が配置されたならば、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の1つ以上の機能性通路を作ることができる。異なる所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部が変色性インクの除去の後に異なる所定の位置に残存することが重要である。次に、少なくとも1つの所定の種類の標的細胞を含む懸濁液を機能性通路に注入することができる。標的細胞は、対応する所定の種類の結合ドメインに結合し、それにより、ネフロンなどの、管状組織構築物を形成する。特定の実施形態では、懸濁液は、複数(3種以上)の所定の種類の標的細胞を含み得る。細胞は、印刷される管状臓器又は管状臓器の一部に通常存在する個別の細胞系及び/又はiPSC由来の細胞であり得る。上文で詳細に述べたように、標的細胞に対する結合ドメインは、タンパク質、例えば、抗体、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、細菌若しくは他の適切な結合ドメイン、又はそれらの組合せであり得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを作製するために、それぞれが第2の変色性インクを含む犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させることができる。次に、第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作り、それにより、ネフロンなどの、管状組織構築物における相互貫入血管網を形成することができる。生上皮細胞の懸濁液を血管通路に注入することができる。細胞外マトリックス組成物による機能性通路パターンの少なくとも部分的な取り囲みが犠牲フィラメントの堆積中に起こる、特定の実施形態では、それにより機能性通路パターンを形成し、同時に細胞外マトリックス組成物に埋め込むことができる。特定の実施形態では、それぞれが複数の生細胞を含む細胞負荷フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、それぞれが1つ以上の所定の細胞型を含む、組織パターンを形成することもできる。
【０１０４】
結合ドメインを利用するアプローチを用いてネフロンを印刷するために、各犠牲フィラメントが犠牲フィラメントの第1の長さにわたる第1の変色性インク製剤、犠牲フィラメントの第2の長さにわたる第2の変色性インク製剤及び犠牲フィラメントの第3の長さにわたる第3変色性インク製剤を含む、1つ以上の連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路を形成する。第1の変色性インク製剤は、例えば、変色性インク及び第1の種類の細胞、例えば、腎近位尿細管細胞を標的にする第1の所定の種類の結合ドメインを含む。第2の変色性インク製剤は、例えば、変色性インク及び第2の種類の細胞、例えば、ヘンレ係蹄細胞を標的にする第2の所定の種類の結合ドメインを含む。第3の変色性インク製剤は、例えば、変色性インク及び第3の種類の細胞、例えば、腎遠位尿細管細胞を標的にする第3の所定の種類の結合ドメインを含む。次に、機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的に(又は完全に)取り囲む。次いで変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中に機能性通路を作る。インクの除去後に第1の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第1の長さに沿って残存する。インクの除去後に第2の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第2の長さにおいて残存する。インクの除去後に第3の所定の種類の結合ドメインの少なくとも一部が1つ以上の機能性通路の第3の長さにおいて残存する。次に、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞、集合管、有窓糸球体内皮細胞などの、少なくとも1つの種類の所定の細胞を含む懸濁液を機能性通路に注入し、細胞がそれらの対応する所定のドメインに結合し、それによりネフロンを形成する。特定の実施形態では、懸濁液は、所定の種類の細胞の一部又はすべてを含む。結合ドメインは、ペプチド、タンパク質、例えば、抗体、DNA、RNA、アプタマー、ナノ粒子、小分子、化学官能基、細菌若しくは他の適切な結合ドメイン、又はそれらの組合せであり得る。
【０１０５】
また、第2の変色性インクを含む犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを形成することができる。次いで、第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を作り、それにより、管状組織構築物における相互貫入血管網を形成することができる。生上皮細胞の懸濁液を血管通路に注入することができる。単一のプリントヘッド又は複数のプリントヘッドを用いて、連続した犠牲フィラメントを基板上及び/又は内に堆積させることができる。
【０１０６】
管状組織構築物を印刷する他のアプローチにおいて、それぞれが複数の所定の種類の生細胞を含む細胞負荷フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、組織パターンを形成することができる。組織パターンのそれぞれが少なくとも2つの所定の細胞型を含み、各所定の種類の生細胞が細胞負荷フィラメントの長さに沿った異なる所定の位置に堆積されている。所定の細胞型は、腎臓細胞(例えば、腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞及び腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸球体内皮細胞)及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは患者固有の細胞系を含む、本明細書で述べたあらゆる細胞であり得る。変色性インクを含む犠牲フィラメントも基板上及び/又は基板内に堆積させて、組織パターンと相互貫入する機能性通路パターンを形成することができる。次に、組織パターン及び機能性通路パターンを細胞外マトリックス組成物によって少なくとも部分的又は完全に取り囲むことができ、変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の機能性通路を作り、それにより、組織構築物における相互貫入通路網を形成することができる。特定の実施形態では、細胞負荷フィラメントは、細胞外マトリックス材料も含み得る。細胞外マトリックス材料は、ゼラチン、フィブリン、ゼラチンメタクリレート、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブリノーゲン、マトリゲル、ラミニン、カルボポール、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ゼラチンメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、絹、ヒアルロン酸及び/又はそれらの組合せを含み得る。細胞負荷フィラメントは、薬物、小分子、毒素、タンパク質及びホルモンからなる群から選択される機能性化学物質も含み得る。特定の実施形態では、第2の変色性インクを含む犠牲フィラメントを基板上及び/又は基板内に堆積させて、機能性通路パターンと相互貫入する血管パターンを形成することができ、第2の変色性インクを除去して、細胞外マトリックス組成物中の血管通路を形成し、それにより、管状組織構築物における相互貫入血管網を形成することができる。生上皮細胞の懸濁液を血管通路に注入することができる。組織構築物は、ネフロンであってもよく、複数の所定の種類の生細胞は、ネフロンに存在する腎近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、有窓性糸とｋぅ球体内皮細胞、iPSC及び/又はiPSC由来の患者固有の腎臓前駆若しくは個別細胞系を含み得る。特定の実施形態では、管状組織構築物は、腸、乳管、汗腺、結腸、食道、胃、耳管、気道上皮、精巣上体、精細管、尿道、肝胆管、膵管、総胆管、脳脊髄脳室及び水管、耳下腺、口腔粘膜、卵管、輸精管又はリンパであってもよい。
【０１０７】
さらなる実施形態は、リンパ管及び神経を完全にして(3D印刷により)、ネフロンなどの、3D印刷管状構造の生理機能を改善することを予期する。
【０１０８】
図17G〜Iに示すように、近位尿細管を用いて上皮形成する能力が実証される(図17G、黒で丸を付けた)。近位尿細管を作製するための屈曲した経路の印刷を下に示し(図17H、左下)、一般的な上皮形成尿細管の拡大図を核(青)及びATPase(緑)について染色して示す(図17I)。
【０１０９】
図17J〜Nに2D皿上のいくつかの機能特性(AQP1、ATPase、繊毛、ZO-1)及び培養におけるドームの存在について免疫蛍光を用いて染色した近位尿細管上皮細胞(PTEC)を示す。
【０１１０】
図17O〜Tに2D皿上のいくつかの機能特性(AQP1、ATPase、繊毛、ZO-1)について免疫蛍光を用いて染色した潅流尿細管構築物を示す。特性は、潅流尿細管構築物において保持又は増強されていた。
【０１１１】
図17U〜Xに構築物における細胞の融合性を強調した尿細管、一次繊毛及び刷子縁の形成のSEM及びTEM像を示す。
【実施例】
【０１１２】
[実施例1]
変色性インク
図6Aについて述べると、印加せん断応力が降伏応力(τy)を超える場合に(例えば、印刷中に)強いずり減粘応答、並びに印加せん断応力がτyを下回る場合に(例えば、印刷後に)せん断粘性係数(G'')を超えるプラトーせん断弾性係数(G')を示す、高度に濃縮された(40重量%)Pluronic F127Aを例示システム用の変色性インクとして選択する。変色性インクの弾性は、図6Bに示すように22℃で約2×104 Paであることが見い出される。CMT(約4℃)未満では、インクが液化し、その弾性が数桁低下し、それにより組織構築物からのその除去が容易になる。
【０１１３】
上述のように、変色性インクから形成される犠牲フィラメントは、1つ以上の追加の細胞、増殖因子、薬物等を含み得る。例えば、内皮、上皮及び/又は他の細胞を変色性インク内に分散させ、犠牲フィラメントにより堆積させることができる。変色性インクを除去して、血管(又は他の)通路を形成する場合、細胞は、残存し、通路の壁の内面を覆う。
【０１１４】
このアプローチを高度に濃縮された細胞負荷変色性(プルロニック)インク(1×107細胞/ml)を用いて実証する。変色性インクを堆積させ、細胞外マトリックス組成物によって封入する。血管通路を形成するための変色性インクの除去の後に、図16A〜16Cに図式的に、図16D〜16Gに実験的に示すように、内皮細胞は、通路の壁に付着したままとなる。図16Gに24時間にわたって潅流された、このアプローチを用いて作製された単純通路を示す。内皮細胞は、通路の内面を覆っていると思われ、従来の播種アプローチを用いて作製されたものと定性的に類似しているように見える。この手法は、とりわけ、細胞が詰まり、流れを妨げて、不均一な播種につながる可能性がある高度に分岐した血管網の場合の既存の血管経路への内皮細胞の播種の代替法となる。
【０１１５】
細胞外マトリックス組成物及び材料
上述のように、天然ECMを模倣し、組織構築物の細胞外マトリックス組成物及び/又は材料に用いることができるゼラチン及びフィブリンに基づく相互貫入ポリマー網状構造が開発された。
【０１１６】
図13A〜13Dにゼラチン-フィブリン相互貫入ポリマー網状構造又はゼラチン-フィブリンマトリックスの製作を示す。第1に、ゲル前駆体を最初に混合する。トロンビン酵素によるフィブリノーゲンの重合により、フィブリンゲル又は網状構造が形成される。この相は、せん断弾性係数の増加によって示される、初期の機械的強度及び剛性をもたらす。第2の相(ゼラチン)がフィブリンゲルの周囲に形成され、2つの相がトランスグルタミナーゼ(TG)により徐々に一緒に架橋される。図13E及び13Fにゼラチン-フィブリン相互貫入ポリマー網状構造のせん断係数対時間(G'及びG'')並びに応力-歪み曲線を示す。
【０１１７】
TGは、多種多様な生物学的機能を有する天然酵素タンパク質架橋剤であり、例えば、in vivoでの創傷治癒時に上方制御され得る。TGインキュベーション時間を変化させることにより、フィブリンゲルの光学的特性(例えば、透明度)を調整することができる。透明度は、ローダミンタグ付きフィブリノーゲン及び共焦点顕微鏡法により視覚化されるフィブリンゲルの最終細孔構造によって決定づけられる。TG及びゼラチンが天然フィブリンの重合を妨害するかどうかを究明することも興味深い。共焦点顕微鏡像により、図14に示すように、フィブリンの線維性が保存され、インキュベーション時間などの種々の処理条件を変化させることによって精密に調整することができることが明らかになる。フィブリン-TGインキュベーション時間が長いほど、線維網の密度が高くなり、結果として、光学的透明度が高くなる。
【０１１８】
製作の検討のほかに、細胞材料相互作用は、材料の選択に際して重要な役割を果たすものである。ゼラチン-フィブリンマトリックスは、線維芽細胞(結合組織)、平滑筋細胞、内皮細胞及び腎近位尿細管細胞(上皮)を含む多種の細胞型と適合性があることが示された。ゼラチン-フィブリンマトリックスの接着力は、様々な基板上の細胞の投影面積を比較することによって定量化した。ゼラチン-フィブリンマトリックスは、天然フィブリン、組織培養ポリスチレン(TCPS)及びゼラチンメタクリレート(GelMa)を含む他のすべての材料より優れていた。図13G〜13Iに例示的なゼラチン-フィブリンマトリックス表面上の血管を作製するのに必須の様々な細胞-線維芽細胞、内皮細胞及び平滑筋細胞を示す。接着力の多様性を強調するために、図13Jに示すように、組織特異的上皮細胞を表面上に増殖させた。
【０１１９】
第2の例において、生体適合性であり、容易に加工され、安価である、ゼラチンメタクリレート(GelMA)を細胞負荷製剤用の細胞外マトリックス材料として、且つ封入ステップ用の細胞外マトリックス組成物として使用するために選択する。GelMAは、マトリックスが印刷後にUV光により共有結合により架橋されることを可能にする、光重合性メタクリレート(MA)により修飾されている変性コラーゲンである。物理的ゲル化は、図6Cに示すように、コラーゲンと構造類似性を有する分子内三重らせんの集合により生じる。濃度、メタクリル化の程度及び温度を変化させることにより、水性GelMA系のせん断降伏応力及び弾性係数を系統的に調節することができる。
【０１２０】
細胞外マトリックス組成物は、15重量% GelMAを細胞培養培地に溶解することによって製造する。約25℃以上では、組成物は、10-1Pa未満のG'値を有する低粘性流体である。25℃未満に冷却することにより、組成物は、ゲル化を受け、透明な粘弾性細胞外マトリックス材料となる。細胞外マトリックス組成物の弾性は、温度の低下とともに増加し、それぞれ印刷及び変色性インクの除去の一般的な条件に対応する、22℃及び2℃で約103Pa及び2×104PaのG'値が観測される。
【０１２１】
同じ水性GelMA組成物は、印刷のための生細胞を含む細胞負荷インクを調製するために用いる。以前の試験により、細胞がインテグリン結合モチーフ及びマトリックス金属プロテイナーゼ感受性基の存在によりGelMAを介して接着し、リモデリングし、移動することが示された。15重量% GelMAインクへの中等度の濃度、例えば、2×106細胞/mLの10T1/2線維芽細胞の混入(図6E及び6F)により、ゲル化が起こる温度又は目的の温度範囲、例えば、2℃〜40℃にわたる組成物の弾性が有意に変化しない。したがって、純粋及び細胞負荷GelMAインクは、同様な方法で、印刷し、必要に応じてさらに処理することができる。
【０１２２】
変色性Pluronic F127、純GelMA及び細胞負荷GelMAインクについて認められた熱的に可逆性のゲル化の差異により、3つの異なる加工ウインドウが生じる。約4℃〜25℃では、各インクは、剛性であり、固体様応答を示し、G'>G''である。T≧25℃では、変色性Pluronic F127変色性インクは、剛性であり、固体様(G'>G'')であるが、純及び細胞負荷GelMAインクは、容易に流れる液体である。約4℃未満では、Pluronic F127変色性インクは、容易に流れる液体であるが、純及び細胞負荷GelMAインクは、剛性であり、固体様(G'>G'')である。
【０１２３】
血管パターンの印刷
Pluronic F127-GelMA系について上述した相補的な熱的挙動を利用して、複数の犠牲フィラメントを含む代表的な血管パターンを印刷し、次いでこれを無細胞性細胞外マトリックス組成物(純GelMA)に封入する。図7A〜7Kに各血管網設計の概略図及び対応する光学像により1D、2D及び3D血管網の形成並びに通路の内皮化を示す。変色性インクを除去した後、各血管網を視覚化の助けとするために蛍光赤色染料で潅流する(図7C、7F及び7I)。各組織構築物内で、犠牲フィラメントの直径は、印刷圧力、速度及び/又はノズル高を変更することによって所望の通りに変化させることができる。例えば、45μmから500μmに漸増する直径を有する1D微小通路アレイは、各印刷通路(feature)の間で印刷圧力及びノズル高を段階的に単に増加させることにより単一30μmノズルを用いて印刷する(図7A〜7B)。
【０１２４】
GelMAマトリックスを光重合した後、印刷構築物を4℃未満に冷却することによって変色性インクを除去して、開放1D微小通路を得る。図8Aに示す、これらの1D通路の代表的な断面画像から、それらの最終直径が約100μm〜約1mmの範囲にあることがわかる。GelMAインクが変色性インクよりも高い含水率を有するため、印刷血管通路は、水が周囲マトリックスから変色性インク(プロニックF127)中に拡散するので膨潤する可能性がある。実際、直径は、ほぼ2倍であり、この材料系については初期の微小通路直径と無関係である膨潤比を有する(図8B)。
【０１２５】
2D血管網設計は、生体系に見いだされる階層的な分岐モチーフを模倣しており、大きな通路が分岐して、代謝費を最小限にすると同時に効率的な血流、栄養素の輸送及び老廃物の除去を最大限にするより小さな通路を形成する。これらの2D階層的血管網は、30マイクロメートルの単一ノズルを用いて印刷する(例えば、図7E及び7F)。印刷された最大通路(直径が650μm)は、潅流用の単一の入口及び出口を備えているが、最小通路(直径が45μm)は、隣接する管路の間の特性拡散距離を減少させる。最後に、図7G、7H及び7Iに示し、均一な微小通路の3D周期的アレイを含む、3D微小血管網を印刷する。埋め込まれた微小通路が3つの次元すべてに相互貫入しているため、変色性インクは、周囲のGelMAマトリックスから急速にしかも高い忠実度で除去することができる。
【０１２６】
血管通路の播種
多種類の流体を埋め込み血管網に流して、それらの潅流可能な性質を実証することができる。例えば、2D階層的分岐網状構造にヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)懸濁液を注射した後、緩やかに揺り動かす。しに成功を収めることができることが示された(図7J参照)。48時間後に、代表的な分岐微小通路内の共焦点撮像と組み合わせた生/死染色により判定したとき、細胞が95%を超える生存率を保持し、ほぼ融合層に集合していることが見いだされる。
【０１２７】
血管通路にHUVECに加えて線維芽細胞又は平滑筋細胞などの複数の細胞型を播種することができる。ここで、線維芽細胞をHUVECと共播種する。潅流培養の約1週間後に、均一に共播種された内皮細胞及び線維芽細胞が外側被覆間質(ヒト皮膚線維芽細胞;HNDF)及び融合性内側内皮(HUVEC)の2つの異なる層に自己集合することが見いだされる。図18A〜18Cは、播種後3日目におけるHUVEC(赤)及びHNDF(緑)の最初は均一な分布であることを強調している。図18D〜18Eに通路が異なる外側間質(HNDF)層及び融合性内皮(HUVEC)層を含んでいる、8日後の同じ通路を示す。融合性内皮は、細胞が融合性網状構造を形成するときに発現する内皮特異的結合タンパク質(マゼンタで示す)である、血管内皮カドヘリン(VE-Cad)について染色する免疫組織化学を用いて視覚化する。
【０１２８】
製作された通路壁に沿った内皮細胞の付着及び増殖をさらに促進するために、図9A〜9Dに示すように、HUVEC懸濁液を導入する前にフィブロネクチン溶液を管路を通して潅流することによって壁の内側を覆うことができる。また、動物血液を2D血管網の入口に直接注入した場合、それが網状構造全体を通って出口まで急速に流れる。これらの最初の実物説明は、ほぼ任意設計の潅流可能な血管系を創製する可能性を示すものである。
【０１２９】
1つ以上の細胞型を含む細胞負荷フィラメントの印刷
単一インクフィラメント内の2つ以上の細胞型の送達を可能にする細胞共培養インクの印刷を実証する。図20A〜20Cにおいて明らかなように、この例では、ゼラチン-フィブリンマトリックス材料中HNDF及びHUVECの分散体を含む細胞負荷インクが、印刷フィラメントにおける自発的新生血管系の形成をもたらすことが観察される。これは、HUVECの単一培養に基づく印刷フィラメントにおいては認められない。このアプローチは、組織特異的細胞型(例えば、肝細胞、膵島、足細胞、ニューロン等)又は幹細胞(例えば、iPSC、MSCs等)を含む1つ以上の細胞型を含む細胞負荷フィラメントを用いて、所望の不均質性を達成すること、且つ機能を増強することもできることを示唆するものである。
【０１３０】
細胞負荷マトリックス上への変色性インクの印刷
先の例と同様に、HNDF及びHUVECを細胞外マトリックス組成物(具体的には、ゼラチン-フィブリンマトリックス材料)内に分散させて、細胞負荷マトリックスを形成する。変色性インクを細胞負荷マトリックス上に直接印刷し、次いでゼラチン-フィブリンマトリックス材料により封入する。変色性インクを排出して、血管通路を形成し、血管通路にHUVECを播種する。時間の経過につれて、HUVECが印刷細胞負荷フィラメント内の毛細管構造中に集合する。図19A〜19Dに内皮細胞が血管通路に付着した状態になり、融合層を形成することを示し、図19E〜19Fに本方法が細胞リモデリング及びより高レベルの生物学的過程をもたらすことを示す融合性血管からの小毛細血管の血管新生発芽の証拠を示す。
【０１３１】
2つの効果がこの観察された挙動に寄与すると仮定される。第1に、線維芽細胞は、しばしば血管新生過程をもたらす、線維芽細胞増殖因子(FGF)のような特定の化学的きっかけを介するin vitroでの血管新生促進支持細胞であることが多数回示された。さらに、マトリックス内の増殖性細胞の密集集団は、拡散のみによっては満たされる可能性がない広範囲の代謝上の要求を有する。数100マイクロメートルの血管内にない細胞は、酸素ストレス状態になり、最終的に壊死することは、広く受け入れられている。in vivoで、壊死を防ぐための無細胞性構造内への宿主血管系の動員が観察された。
【０１３２】
相互貫入血管系を含む組織構築物の印刷
血管、複数の種類の細胞及び細胞外マトリックス組成物を十分に備えた組織構築物の製作を実証するために、様々な設計の3D不均質性構造を印刷する。
【０１３３】
第1の構造は、平面の内外に印刷された半織構造からなっている(図10A〜10G)。この4層組織構築物は、それぞれが異なる細胞型及び変色性インクを含む犠牲フィラメントから形成される血管パターンを含む2つの組織パターンを含む。組織構築物は、PDMS、変色性Pluronic F127及び2種の細胞負荷GelMAインクの4種のインクを印刷し、続いて純GelMAインクを37℃で堆積させて、印刷構造を完全に封入し、最後にGelMAマトリックスを架橋させるために光重合にかけることによって層ごとの構築順序で製造する。この3D構造は、印刷能力を実証するために着想され、製作されたものであり、4層印刷構築物全体を通しての共焦点撮像も容易にする。
【０１３４】
先に示したように、PDMSインクは、各組織構築物を取り囲み、封入ステップに用いる純GelMAインクの型としての役割を果たす高縦横比境界線の形で最初に印刷する。変色性インク及び緑色蛍光タンパク質発現ヒト新生児皮膚線維芽細胞(HNDF)又は樹立マウス線維芽細胞株である非蛍光10T1/2sを含む両細胞負荷GelMAインクを所定の連続工程において200μmノズルを介して2×106細胞/mLの濃度で共印刷する。図10Cに印刷直後の3D構造の画像を示す。印刷細胞通路を容易に視覚化できるように、緑色蛍光通路のみを明視野像上にオーバーレイする。製作の後、変色性インクを液化し、3D構築物から除去する。排出処置は、空の注射器の先端を微小通路の入口及び出口に入れ、適度の真空下で全血管網を吸引により排出することを含む。除去工程は、迅速であり、高忠実度の相互貫入血管系が得られ、次いでこれを上述のように内皮化する。
【０１３５】
組織構築物の特徴付け
顕微鏡法を用いて、独立に染色されている3種の細胞型(緑色GFP HNDF, 青色10T1/2及び赤色HUVEC)の位置を特定する。この人工組織構築物の半織性が図10B〜10Dに示す概略図及び画像に明確に見える。共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、この3D組織構築物を十分にインタロゲイトし、各細胞の正確な位置を決定することが可能である。2日間の培養の後のXY、XZ及びYZにおける3D印刷構造の共焦点顕微鏡像を図10Gに示す。このアプローチの多用途性を実証するために、他の3D組織構築物も設計し、印刷した。細胞負荷フィラメントが高密度で、相互貫入性であるため、共焦点像を得ることは困難であるが、GelMA中の緑色蛍光タンパク質発現HNDF及び3D血管網の内面を覆う赤色HUVECの両方が見える。
【０１３６】
細胞生存率の検討
最終ステップとして、1週間にわたる印刷10T1/2線維芽細胞の生存率を検討した。0日目に、細胞生存率は、61%であったが、7日後に82%に増加した。対照(0日目に78%)と比較して低い初期生存率が存在するが、印刷細胞は、増殖し、時間の経過につれて広がり、1週間後に培養中の同様なレベルの生存率に至った。初期の生存率の低下は、印刷工程中に細胞が経験したせん断又は伸長応力により生じた可能性がある。印加圧力、ノズル径、細胞の種類及び環境条件が印刷後の細胞生存率に影響を及ぼす可能性がある。他の重要なパラメーターは、所望の人工組織構築物を印刷するために必要な総構築時間である。細胞負荷インクを劣化する前にインク貯槽に保存することができる最長時間が存在し得る。しかし、高処理多材料印刷用の以前に報告された多ノズルプリントヘッドの実装(J. A. Lewisら、「Multinozzle Deposition System for Direct Write Applications」、国際特許公開番号PCT/US2012/044794、2012年6月29日出願、参照により組み込まれる)により、単一ノズル印刷と比較して特性構築時間が2桁短縮し得る。例えば、一般的なヒト成人の肝臓と同等な1000cm3の容積を有する人工組織構築物を印刷するには一般的な印刷速度で単一200μmノズルを用いて約72時間必要である得る。しかし、64多ノズルアレイの実装により、各構築時間が約1時間に短縮し得る。
【０１３７】
[実施例2]
厚い生組織の3Dバイオプリンティング
厚い生組織の製作に重要なことは、多材料3Dバイオプリンティング用の生物学的、犠牲及びエラストマーインクの設計である。
【０１３８】
方法
溶液の調製
人工組織構築物を作製する前にマトリックス及びインク前駆体溶液を調製した。15重量/容積%ゼラチン溶液(A型、ブタ皮膚からの300ブルーム(bloom)、Sigma)は、DPBS(カルシウム及びマグネシウム不含有の1Xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水)を70℃(特記しない限り)に加温し、次いで激しく撹拌しながらゼラチン粉末を溶液に加えることにより調製した。70℃(特記しない限り)で12時間撹拌することによりゼラチンを完全に溶解し、次いで1M NaOHを用いてpHを7.5に調整した。温ゼラチン溶液を濾過滅菌し、後(<3ヵ月)の使用のために分割して4℃で保存した。
【０１３９】
フィブリノーゲン溶液(50mg mL-1)は、凍結乾燥ウシ血漿タンパク質(Millipore)をカルシウム及びマグネシウム不含有の滅菌DPBSに37℃で溶解することにより調製した。溶液を乱すことなく37℃に45分間保持して、完全に溶解した。
【０１４０】
トランスグルタミナーゼ(TG)溶液(60mg mL-1)は、凍結乾燥粉末(Moo Glue)をカルシウム及びマグネシウム不含有のDPBSに溶解し、20秒間緩やか混合することにより調製した。次いで溶液を37℃で20分間放置し、使用前に濾過滅菌した。
【０１４１】
250mM CaCl2保存溶液は、CaCl2粉末をカルシウム及びマグネシウム不含有のDPBS(Corning)に溶解することにより調製した。
【０１４２】
トロンビンの保存溶液を調製するために、凍結乾燥トロンビン(Sigma Aldrich)を滅菌DPBSを用いて500UmL-1に再構成し、分割して-20℃で保存した。トロンビン分割試料を使用直前に解凍した。
【０１４３】
マトリックス製剤:
ゼラチン-フィブリンIPNsを調製するために、フィブリノーゲン、ゼラチン、カルシウム及びTGを37℃で様々な濃度で一緒に混合した。一般的な最終濃度は、10mg mL-1フィブリノーゲン、7.5重量%ゼラチン、2.5mM CaCl2及び0.2重量%TGであった。大規模組織(図33)を印刷するために、印刷フィラメントへの拡散及び希釈を補償するために1重量%TGを用いた。トロンビンと混合する前にこれらの組成物を放置する時間がマトリックスの光学的透明度を決定づけるものであった(図24A〜24D)。この待機ステップは、「TGプレインキュベーション時間」と呼び、一般的に15〜20分であった。TGプレインキュベーション時間の後、溶液をトロンビンと500:1の比で速やかに混合し、1UmL-1の最終濃度が得られた。混合した後、フィブリノーゲンのフィブリンゲルへの不可逆的な酵素により促進される重合が急速に起こるので、マトリックスを30秒以内に注型した。
【０１４４】
インク製剤:
厚い血管新生組織の3Dバイオプリンティングのためのいくつかのインクを調製した。
【０１４５】
専用の潅流チップを作製するために用いる、第1のインクは、混合機(速度2000、AE-310、Thinky Corp、Japan)を用いて均質にした10:1基剤対触媒(重量)を含む2部シリコーンエラストマー(SE 1700、DOW Chemical)からなっていた。シリコーンインクは、触媒と混合してから2時間以内に印刷した。
【０１４６】
血管系を印刷するために用いる変色性インクであった、第2のインクは、脱イオン限外濾過(DIUF)水中38重量%Pluronic F127(Sigma)及び100UmL-1トロンビンからなっていた。このインクを調製するために、40%保存Pluronic F127を粉末が完全に溶解するまでThinky混合機を用いて均質化し、その後4℃で保存した。使用する前に、2000UmL-1トロンビン溶液を1:200の比で変色性(プルロニック)インクに加え、Thinky混合機を用いて均質化した。次いで、このインクを注射器(EFD Inc.、East Providence、RI)に4℃で充填し、遠心力を作用させて、気泡を除去した。印刷する前に、このインクを室温にした。
【０１４７】
細胞負荷印刷可能インクである、第3のインクは、特に明記しない限り、7.5重量/容積%ゼラチン及び10mg ml-1フィブリノーゲンからなっていた。特に、インクの剛性は、ゼラチン処理温度(70℃〜95℃)を変化させることにより調整した(図25A〜25I)。このインクは、IPNマトリックスと同様に調製したが、TG又はトロンビンは、この製剤に用いなかった。
【０１４８】
印刷されたインクの架橋は、注型の後の周囲マトリックスからのトロンビン及びTGの拡散により達成された。細胞をインク中に均一に分散させるために、フィブリノーゲン-ゼラチン混合物を37℃で液体状態に維持し、次いで、2×106細胞mL-1より高い濃度を有する細胞懸濁液を緩やかなピペッティングにより混合した。インクを十分に混合した後、インクを4℃に15分間保持して、ゼラチン相の熱的ゲル化を促進した。次に、インクを冷蔵庫から取り出し、室温で少なくとも15分間平衡化し、3Dバイオプリンターに装填し、直ちに最長2時間使用した。
【０１４９】
フィブリノーゲン-発蛍光団コンジュゲーション
印刷フィラメント及び注型マトリックス中のフィブリン網状構造を視覚化するために、フィブリノーゲンを2つの発蛍光団にコンジュゲートした。具体的には、1gのウシフィブリノーゲンを100mlの50mMホウ酸緩衝液pH 8.5(Thermo Scientific)に溶解して、10mg ml-1溶液を調製した。この溶液に、フルオレセイン又はローダミンとコンジュゲートしたN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を10:1染料:フィブリノーゲンのモル比で加えた。室温で2時間の反応の後、浴中PBSを1日2回交換した、PBSに対する2L浴中10kDa MWCO透析チューブを用いた3日間にわたる透析により、標識フィブリノーゲンを非コンジュゲート染料から分離した。透析が完了した後、蛍光コンジュゲートフィブリノーゲンを-80°Cで凍結し、凍結乾燥し、使用前に-20℃で保存した。
【０１５０】
レオロジー的特徴付け:
インクのレオロジーは、直径40mm、2°円錐及び平板形状を有する応力制御レオメーター(DHR-3、TA Instruments、New Castle、DE)を用いて測定する。せん断貯蔵(G')及び損失(G'')係数は、1Hzの振動数及び0.01の振動歪み(γ)で測定する。温度掃引は、ペルチエプレートプレートを用いて-5℃〜40℃の範囲にわたって実施した。試料は、試料全体の温度勾配を最小限にするために試験前に5分間、後のそれぞれの温度で1分間平衡化した。時間掃引は、特に明期しない限り、37℃又は22℃に保持した温度制御ペルチエプレート上に予混合溶液を速やかにのせることにより実施した。溶液が注型後に急速にゲル化するため、混合中の気泡の発生を最小限にすることが重要であった。
【０１５１】
細胞培養及び維持管理:
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)(Rooster Bio)をブースター培地(Booster Media)(Rooster Bio)中で培養し、2継代を超えて用いなかった。
【０１５２】
緑色蛍光タンパク質発現ヒト新生児皮膚線維芽細胞(GFP-HNDF、Angio-Proteomie)を、高グルコース及びピルビン酸ナトリウムを含み、10%ウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products)を添加したダルベッコ修正イーグル培地(Dulbelco's modified Eagle medium)(DMEM)(GlutaMAX(商標)、Gibco)中で培養した。
【０１５３】
初代赤色蛍光タンパク質発現ヒト臍静脈内皮細胞(RFP-HUVEC)(AngioProteomie)をEGM-2培地(完全EGM(商標)-2 BulletKitTM、Lonza)中で培養した。
【０１５４】
すべての細胞培養を各供給業者の取扱説明書に従って継代した。GFP-HNDF及びRFP HUVECは、それぞれ15及び9継代を超えて用いなかった。
【０１５５】
3D潅流チップの製作
すべての血管新生組織は、ビルド容積725mm×650mm×125mmを有する3軸運動制御ガントリ上に取付けた4つの独立に制御可能なプリントヘッドを装着した特注設計の多材料3Dバイオプリンター(AGB 10000、Aerotech Inc.、Pittsburgh、PA USA)で作製した。各インクは、様々なサイズ(すなわち、直径100μm〜410μm)のノズルをルアロック(EFD Inc.、East Providence、RI、USA)を介して取付けた別個の注射筒の内部に収容した。インクは、1mm s-1〜5cm s-1の印刷速度に対応する10〜140psiの範囲の空気圧を印加することによって各堆積ノズルを介して押し出した(800Ultra dispensing system、EFD Inc.、East Providence、RI、USA)。印刷の前に、直角に取付けた光学顕微鏡(LS-7600 series、Keyence、Japan)を用いて4つのプリントヘッドの相対X-Yオフセットを決定した。
【０１５６】
専用の潅流チップを製造するために、シリコーンインクを10ml注射器に充填し、遠心力を作用させて、気泡を除去し、先細り410μmノズルを介して堆積させた。専用MATLABソフトウエアを用いてガスケット設計を作製し、構造を50mm×75mmガラススライド上に印刷した。印刷後、チップをオーブン中で80℃で1時間以上硬化させ、室温で保存した。
【０１５７】
厚い血管新生組織を作製するために、複数のインクを専用の潅流チップ内に連続的に共印刷した。基層を形成するために、0.1重量%のTGを含むゼラチン-フィブリンマトリックスの薄膜を潅流チップの底部上に注型し、乾燥した。次に、変色性Pluronic F127及び細胞負荷インクを表面上に印刷した。変色性(Pluronic F127)及び細胞負荷インクは、それぞれ直線状及び先細り型ノズルを用いて印刷した。印刷後、ステンレス金属管を潅流チップのガイド通路を通して送り込み、押し込んで、入口及び出口に配置した変色性インクからなる印刷された垂直の柱状体と物理的に接触させた(図26A〜26S)。封入の前に、TGを溶融37℃ゼラチン-フィブリンマトリックス溶液に加え、所望のマトリックスの透明度に応じて2〜20分間プレインキュベートした(図24D)。細胞負荷マトリックスを形成するために、溶融37℃ゼラチン-フィブリンマトリックスを最初にHNDF-GFP細胞と混合し、次いでトロンビンと混合した。次に、このマトリックスを直ちに潅流チップ内に注型して、印刷組織を完全に封入した。この場合、このマトリックスは、トロンビン活性により急速なゲル化を受けた。次いで組織を37℃で1時間保存して、フィブリンの重合を終結させ、TGに網状構造を架橋させた。次いで構造全体を4℃に冷却して、印刷変色性インクを液化し、次いでこれを冷細胞培地を用いてデバイスを通して洗い流し、印刷組織内に埋め込まれた所望の血管網としての役割を果たし、細胞負荷マトリックスを取り囲む開いた管路を残す。
【０１５８】
3D潅流チップを機械加工済みステンレススチール製の底の上にのせ、厚いアクリル製の蓋を上にのせた。蓋及び底を4本のネジにより一緒に固定して、シリコーン3D印刷ガスケットの上部の周りのシールを形成した。次に、滅菌済み2栓蠕動チューブ(PharMed BPT)に培地を満たし、培地貯槽としての役割を果たした、10ml注射器(EFD Nordson)に取付けた無菌フィルターの出口に接続した。蠕動チューブを各潅流チップの入口に接続する前に、37℃、5% CO2のインキュベーター中で6時間以上平衡化した培地を培地貯槽に加え、すべての空気が置換されるまで、重力により、フィルター及び蠕動チューブに流した。潅流回路を完成させるために、シリコーンチューブを潅流チップの出口と培地貯槽の上部の入口の間に接続した。ホースピンチオフクランプを潅流チップの入口及び出口に付けて、内皮を損傷させたり又は血管系に気泡を導入したりすることがあり得る、蠕動ポンプから外れた場合の制御不能な流れが起こることを防いだ。培地貯槽は、インキュベーター環境を貯槽と接続する無菌フィルターにより常時大気圧と平衡させた。
【０１５９】
血管網の内皮化
チップ出口から蠕動チューブを除去して、50〜500μLのHUVEC懸濁液(1×107細胞mL-1)をピペットにより注入して、血管網を満たした。次いで、シリコーンチューブをチップ出口に戻し、出口及び入口ピンチクランプの両方をシールした。潅流チップを37℃でインキュベートして、無流動条件下で通路への細胞の接着を促進した。30分後に、チップを180°反転させて、通路の他の側への細胞の接着を促進し、通路における細胞の円周播種を達成した。最後に、能動的潅流を開始する前に細胞を37℃で5時間から一夜までの間にさらにインキュベートした。
【０１６０】
能動的潅流:
内皮細胞の播種の後、蠕動チューブを24チャンネル蠕動ポンプ(Ismatec)に取付け、その後、入口及び出口ホースのクランプを外して、潅流の準備をした。次いで、蠕動ポンプを所望の潅流速度で始動させた。単一血管通路については、潅流速度を13μL/分に設定したが、厚く、大規模な組織については、27μL/分に設定した。
【０１６１】
細胞生存率アッセイ:
細胞生存率は、各条件について2×106細胞mL-1でインクを印刷することによって印刷後に測定した。印刷細胞の生存率については、印刷フィラメントをガラス基板上に堆積させ、共焦点顕微鏡法による撮像(n=3固有の試料、撮像n=10回)の前に、カルセイン-AM(「生」、1μL mL-1、Invitrogen)及びエチジウムホモダイマー(「死」、4μL mL-1、Invitrogen)を用いて染色した。ImageJソフトウエアにおける3Dオブジェクツカウンタープラグイン(3D objects counter plugin)を用いて生及び死細胞数を得た。各試料について結果を平均し、標準偏差を算定した。
【０１６２】
撮像及び解析:
組織の印刷及び集合の顕微鏡写真及びビデオをDSLRカメラ(Canon EOS、5D Mark II、Canon Inc.、USA)を用いて収集した。蛍光染料を用いて、Pluronic F127(赤、Risk Reactor)及びゼラチン-フィブリンインク(フルオレセイン、Sigma Aldrich)の視覚化を改善した。Keyence Zoom(VHX-2000、Keyence、Japan)、倒立蛍光(Axiovert 40 CFL、Zeiss)及び正立共焦点顕微鏡(LSM710、Zeiss)を含む様々な顕微鏡を用いて、印刷組織構造を視覚化した。ImageJを用いて、蛍光チャンネルを組み合わせることによって複合顕微鏡像を得た。共焦点スタックの3Dレンダリング及び視覚化は、Imaris 7.6.4、Bitplane Scientific Software及びImageJソフトウエアを用いて行った。細胞の計数は、Imarisにおける半自動ネイティブアルゴリズム並びにImageJ計数及び追跡アルゴリズムを用いて行った。
【０１６３】
免疫染色:
免疫染色及び共焦点顕微鏡法を用いて、3D視覚化組織を評価した。印刷組織を最初に潅流によりリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で数分間洗浄した。次に、10%緩衝ホルマリンを3D組織を通して10〜15分間潅流した。組織を潅流チップから除去し、10%緩衝ホルマリンに浸した。ホルマリンによる固定時間は、組織構築物の厚さによって異なっており、1cmの厚さの組織については約2時間の固定が必要であった。次いで3D組織をPBSで数時間洗浄し、PBS中1重量%のウシ血清アルブミン(BSA)を用いて一夜ブロックした。目的の細胞タンパク質又はバイオマーカーに対する一次抗体を0.5重量% BSA及び0.125重量% TritonXの溶液中で下の表1に示す希釈度で構築物と共に2日間インキュベートした。
【０１６４】
【表１】
2018521710.tif 000003
【０１６５】
非結合一次抗体の除去は、PBS又はPBS中0.5重量% BSA及び0.125重量% TritonXの溶液に対する1日間の洗浄ステップを用いて達成された。二次抗体をPBS中0.5重量% BSA及び0.125重量% TritonXの溶液中で上の表1に示す希釈度で構築物と共に1日間インキュベートした。試料をNucBlue又はActinGreenで2時間対比染色し、撮像の前にPBSで1日間洗浄した。共焦点顕微鏡観察は、405、488、514、561及び633nmの波長のスペクトルレーザーを用いた10X〜40Xの範囲の水浸対物レンズ付き正立Zeiss LSM 710を用いて実施した。zスタックの画像再構成は、最大ピクセル強度設定でz投影機能を用いてImageJで実施した。3次元画像再構成は、Imarisソフトウエアを用いて実施した。
【０１６６】
hMSC染色
ファストブルー(Sigma Aldrich)及びアリザリンレッド(SigmaFast、Sigma Aldrich)を用いて、AP活性及びカルシウム沈着を視覚化した。ファストブルーの1つの錠剤を10mLのDI水に溶解した。この溶液を暗所に保存し、2時間以内に用いた。細胞を上述のようにカルシウム及びマグネシウム不含有のDPBS中0.05% Tween 20を用いて洗浄した。次いで、試料をファストブルー溶液で覆い、暗所で5〜10分間インキュベートし、PBS-Tween緩衝液を用いて洗浄した。鉱物化を評価するために、2%アリザリンレッド溶液をDI水に溶解し、激しく混合し、濾過し、24時間以内に用いた。試料をDI水中で平衡化し、アリザリンレッド溶液と共に2〜5分間インキュベートし、次いで染色溶液を除去し、試料をDI水で3回又はバックグラウンド染料が観察できなくなるまで洗浄した。
【０１６７】
FITC-デキストラン透過性試験:
印刷血管系のバリア機能を評価するために、血管通路に、生存中に、25μg/mLのFITCコンジュゲート70kDaデキストラン(FITC-Dex、Sigma product 46945)を含む培養培地を3分間にわたり20μL/分、その後の約33分間にわたり1μL/分の速度で潅流した。広視野蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を用いてFITC-Dexの拡散パターンを検出した。蛍光画像は、潅流の前及び後に3〜5分ごとに33分間にわたり取得した。FITC-Dexの拡散透過率は、以下の式を用いて時間の経過に伴う蛍光強度の変化を定量化することによって計算した。
【０１６８】
【数１】
2018521710.tif 000004
式中、Pdは、拡散透過係数であり、I1は、初期の時点における平均強度であり、I2は、ある時間後(t、約30分)の平均強度であり、Ibは、バックグラウンド強度(FITC-Dexの潅流前に撮影された画像)であり、dは、通路の直径である(Price G, Tien J (2011) Methods in Molecular Biology ed khademhosseini A (Humana Press))。
【０１６９】
透過率の測定は、1)細胞内層を有する潅流通路、2)細胞内層を有さない潅流通路(空の通路)の2種類の通路について実施した。各種類について、3つの独立した試料(n=3)の測定から拡散透過率を計算した。
【０１７０】
考察
加工性、異種集積化、生体適合性及び長期安定性の付随要件を満たすために、本発明者らは、最初に新たな印刷可能な細胞負荷インク並びにゼラチン及びフィブリノーゲンの混合物を含む注型可能な細胞外マトリックス(ECM)を開発した(Lee KY, Mooney DJ (2001) Hydrogels for Tissue Engineering. Chem Rev 101(7):1869-1880)。
【０１７１】
具体的には、これらの材料は、トロンビン及びトランスグルタミナーゼの二重酵素戦略により架橋させたゼラチン-フィブリンからなる強靭な相互貫入ポリマー網状構造を形成する(図26及び27A〜27L)。細胞負荷インクは、周囲条件下での自立性フィラメント構造の印刷並びにパターン化細胞負荷及び変色性(血管系)インクを溶解又は歪ませることなく、注型による印刷組織構造のその後の充填を同時に促進しなければならない(図27A)。ゼラチン-フィブリノーゲンの網状構造が熱的に可逆的なゲル化を起こすことから、それぞれゲル及び流体の状態が要求される、印刷及び注型の両方にそれを使用することが可能となる(図28A〜28F)。トロンビンは、フィブリノーゲンを速やかに重合させるために用いられる(Mosesson MW (1998), Semin Thromb Hemost 24(2):169-174)が、TGは、培養におけるゲルに機械的及び熱的安定性を付与する徐効性Ca2+依存性酵素架橋剤であり(Chen R-N, Ho H-O, Sheu M-T (2005) Characterization of collagen matrices crosslinked using microbial transglutaminase.Biomaterials 26(20):4229-4235)、これにより長期の潅流を可能にする。特に、印刷された細胞負荷インクは、印刷中の重合を妨げるいずれの酵素も含まない。注型可能な(マトリックス)インクは、トロンビン及びTGの両方を含むが、これらは、隣接する印刷フィラメント中に拡散して、フィブリンの天然線維状構造が保存されている(図24)、連続的な相互貫入ポリマー網状構造(IPN)を形成する。重要なことに、これらのインクが硬化するために、散乱性組織内の低い浸透深さを有する(Jayakumar MKG, Idris NM, Zhang Y (2012) Remote activation of biomolecules in deep tissues using near-infrared-to-UV upconversion nanotransducers. Proceedings of the National Academy of Sciences 109(22):8483-8488)、UV照射を必要としないので、本発明者らのアプローチは、任意に厚い組織を製作することが可能なものである。
【０１７２】
ゼラチン-フィブリンマトリックスは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト新生児皮膚線維芽細胞(HNDF)及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を含む、目的の複数の細胞型の2D及び3D培養条件を支持する(図27B〜D及び図29A〜B)。
【０１７３】
本発明者らは、内皮細胞が、このマトリックス表面上及びバルク中で増殖し、広がる血管内皮カドヘリン(VE-Cad)(図27B)並びにHNDF(図27C)及びhMSC(図27D)を発現することを見いだした。
【０１７４】
さらに、印刷細胞の生存率は、ゼラチンがどのように前処理されたかによって、95%程度と高いことがあり得る。より高温では、ゼラチンの平均分子量が低くなり(70℃処理での69kDaから95℃処理での32kDaに)、容易に印刷することができる、より低い粘度、せん断降伏応力及びせん断弾性係数を有するより軟性のゲルが得られる(図27E及び図25)。印刷後に、この軟性ゼラチン-フィブリノーゲン内のhMSCは、広がり、増殖し続け、細胞コンファインメント(confinement)(Klumpers DD, Zhao X, Mooney DJ, Smit TH (2013) Cell mediated contraction in 3D cell-matrix constructs leads to spatially regulated osteogenic differentiation. Integr Biol 5(9):1174-1183)及びポアソン効果による収縮(Oster GF, Murray JD, Harris AK (1983) Mechanical aspects of mesenchymal morphogenesis. J Embryol Exp Morphol:83-125)に起因して生じる可能性がある、印刷方向に沿って整列する高密度の細胞構造に収縮する。
【０１７５】
厚い生体組織を潅流チップ内に構築するために、本発明者らは、細胞負荷、変色性及びシリコーンインクを共印刷した(図27H〜27I)。
【０１７６】
最初に、図26A〜26Sに示すように、シリコーンインクをガラス基板上に印刷し、硬化させて、専用の潅流チップを作製する。次に、細胞負荷及び変色性インクをチップ上に印刷し、次いで注型可能なECMマトリックスに封入する(図27J〜27L)。血管網を定義する、変色性インクは、トリブロックコポリマー(すなわち、ポリエチレンオキシド(PEO)-ポリプロピレンオキシド(PPO)-PEO)からなる。このインクは、以前に示したように、ゲル-液転移を受ける、ほぼ4℃に冷却することにより作製した組織から除去することができる。この工程により、次にHUVECより内面が被覆される、開放通路の広がる網状構造が生じる。次いで血管系を、広範囲の流量にわたって滑らかな流れを発生する外部ポンプ(示さず)を用いて長時間にわたり潅流する(Giulitti Sら(2013) Optimal periodic perfusion strategy for robust long-term microfluidic cell culture. Lab on a Chip 13(22):4430)。
【０１７７】
安定な血管系の形成を実証するために、本発明者らは、線維芽細胞負荷マトリックス内に埋め込まれた2つの並行通路からなる単純組織構築物を印刷した(FIGs. 30A-30F)。通路の内面をHUVECで覆い、その後、内皮増殖培地により潅流して、各血管の内面を覆う融合性単層を形成する(図30A)。
【０１７８】
重要なことに、能動的潅流の6週間後に、これらの内皮細胞は、内皮細胞表現型を維持し、融合性のままであり、CD31、フォンヴィビレブランド因子(vWF)及び血管内皮カドヘリン(VECad)の発現(図30B-30C)によって特徴付けられる。代表的な血管の断面は、内腔の形成を示している(図30D)。内皮のバリア機能の確認で、本発明者らは、非被覆(裸)通路と比較して拡散透過率の5倍の低下を測定した(図30E及び図31A〜31C)。周囲マトリックス内にある間質HNDFは、血管系の約1mm以内の領域に局在の細胞拡散及び増殖性表現型を示し(図30F及び図32)、これらの領域からさらに離れた細胞は、おそらく不十分な栄養の供給のため静止状態になる。潅流可能な血管系は、長期間にわたる1mmより厚い生組織を維持するために極めて重要である。
【０１７９】
複雑な微小環境における創発現象を探究するために、本発明者らは、hMSCインクを3D格子状に印刷することによる異種組織構造(厚さ>1cm及び容積10cm3)並びにHUVECにより内面が覆われ、間質腔内に均一に分布したHNDF負荷細胞外マトリックスによって埋められた相互貫入分岐血管網を作製した(図33A)。線維芽細胞負荷マトリックスは、印刷幹細胞負荷組織及び血管網を支持し、且つ結合する結合組織を形成する。埋め込まれた血管網は、印刷組織と潅流チップとの間の境界となる単一の入口及び出口を有するように設計されている。この網状構造は、組織の中心部内の深部を含む、組織全体にわたる均一な潅流を保証するために対称的に分岐している。栄養素、酸素及び老廃物の輸送を可能にすることに加えて、潅流血管系は、組織の中心部の細胞に因子が欠乏するバルク送達法よりも均一に特定の分化因子を組織に送達するために用いられる(Griffith LG and Swartz MA (2006) Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol 7(3):211-224)。この汎用プラットフォーム(図33A)は、印刷hMSCの増殖及び分化を正確に制御するために用いる。さらに、印刷細胞構造及び埋込み血管網の両方がこの厚い組織で肉眼的に見える(図33B)。
【０１８０】
高密度の骨形成組織を開発するために、本発明者らは、初期増殖期(6日)中に組織に増殖培地を、その後、数週間潅流する骨形成分化カクテルを経血管的に送達した。本発明者らの最適化カクテルは、鉱物沈着及びアルカリホスファターゼ(AP)発現を促進するための、BMP-2、アスコルビン酸及びグリセロホスフェートからなっている。
【０１８１】
組織の成熟を評価するために、細胞機能及びマトリックス組成の変化を経時的に観察する。以前の試験(Klumpers DDら(2013) Cell mediated contraction in 3D cell-matrix constructs leads to spatially regulated osteogenic differentiation. Integr Biol 5(9):1174-1183)と良く一致して、本発明者らは、hMSCにおけるAP発現が3日以内に起こるが、hMSCによる可視コラーゲン-1沈着と一致する、鉱物沈着は、14まで注目に値するものにならない(図35A〜35B)。分化hMSCの表現型は、印刷構造にわたって異なっており、フィラメントコア内の細胞は、最密充填で、圧密状態であり、高い鉱物化を伴っているが、辺縁部にあるものは、より伸長しており、印刷フィラメントを封入した状態であり、より低い鉱物化を示している。本発明者らは、HNDF及びhMSCの両方の亜集団がそれらの最初のパターン化形状から血管網に向かって移動し、通路の周囲を取り囲んでいることを観察する(図33C)。30日後に、印刷hMSCは、組織内にオステオカルシンを発現しており、オステオカルシン発現は、最も近い血管からの距離に比例している(図3d)。さらに、本発明者らは、コラーゲンの沈着が印刷フィラメント内及び血管系の周囲に局在していることを見いだす。
【０１８２】
要約すると、チップ上で長期(>30日)の潅流が可能であるプログラム可能な細胞不均質性を有する厚い血管化ヒト組織が多材料バイオプリンティングにより作製された。生理的に適切な3D組織微小環境を反復する能力は、広範囲の潅流可能な内皮化血管網を含む組織内のhMSCのin situでの発達の本発明者らの観察により示される創発性の生物学的現象の探究を可能にする。本発明者らの3D組織製造プラットフォームは、ex vivo及びin vivoでの応用のためのヒト組織を作製し、研究するための新たな道を切り開くものである。
【０１８３】
[実施例3]
潅流可能なチップ上の曲3D腎近位尿細管のバイオプリンティング
細胞外マトリックスの調製及びレオロジー
ECMは、ゼラチン及びフィブリンの網状構造からなるものであり、上文の実施例2で述べたように調製した。
【０１８４】
直径40mm、2°円錐及びプレートの形状を有する応力制御レオメーター(DHR-3、TA Instruments、New Castle、DE)をインクのレオロジー測定に用いた。せん断貯蔵(G')及び損失(G'')係数を1Hzの振動数及び0.01の振動歪み(γ)で測定した。時間掃引は、37℃に保持したペルチエプレート上にトロンビンを含む予混合ECM溶液を速やかにのせることにより実施した。
【０１８５】
インク製剤
潅流可能PTモデルの3Dバイオプリンティングには2種のインクが必要である。2種のインクを上文の実施例2で述べたように調製した。
【０１８６】
3D潅流可能近位尿細管構築物のバイオプリンティング
3D PT構築物は、725mm×650mm×125mmのビルド容積を有する3軸運動制御ガントリ上に取付けた4つの独立に制御可能なプリントヘッドを装着した特注設計の多材料3Dバイオプリンター(AGB 10000、Aerotech Inc.、Pittsburgh、PA USA)を用いて作製した。インクは、様々なサイズ(すなわち、直径50μm〜410μm)のノズルをルアロック(EFD Inc.、East Providence、RI、USA)を介して取付けた別個の注射筒に収容した。インクは、1mm/s〜5cm/sの印刷速度に対応する10〜90psiの範囲の空気圧を印加することによって堆積ノズルを介して押し出した(800 Ultra dispensing system、EFD Inc.、East Providence、RI、USA)。
【０１８７】
専用の潅流チップガスケットを作製するために、シリコーンインクを先細り型410μmノズルを介して50mm×75mmガラススライド上に堆積させた。ガスケット設計は、最終ガスケット構造用のGコードを発生した専用のMATLABスクリプトを用いて作製した。印刷後、潅流チップガスケットをオーブン中で80℃で1時間以上硬化させ、使用前に室温で保存した。
【０１８８】
潅流チップ内に3D PTを形成するには、ECMを注型すること及び変色性インクを印刷することの組合せを必要とする。最初に、実施例2で上述したように、ECMの光学的透明度を改善するために10mg/mLフィブリノーゲン、7.5重量%ゼラチン、2.5mM CaCl2及び0.2重量% TGからなるECM溶液を使用前に37℃で15〜20分間平衡化した。次に、溶液をトロンビンと500:1の比率で速やかに混合して、1U/mLの最終トロンビン濃度を得た。急速混合の直後に、ECM溶液を潅流チップの底部上に注型した。37℃で2分以内に、フィブリノーゲンのフィブリンゲルへの重合が起こった。次いで、底部のECM層を、平坦な表面を形成するように、窒素中でわずかに乾燥した。変色性Pluronic F127インク(100U/mLトロンビンを含む)を先細り200μmノズルを用いて屈曲フィラメント(尿細管)の形態で底部ECM層上に印刷した。専用のPythonスクリプト(MeCode)を用いて、Gコードにおけるツールパスを指定した。変色性インクの印刷の直後に、シリコーンガスケットを介して連結した金属製の中空潅流ピンを印刷インクと接触させた。上述のように、印刷尿細管の上にECM溶液を注型することによってECMの上層を形成させた。HNDFのような細胞をECMに混入した場合(図37)、トロンビン混合及びその後の注型の前に、それらを平衡期間の後に直接混合した。ECM上層を注型した後、構築物を37℃に1時間保持して、フィブリンの重合を終結させ、TGに網状構造を架橋させた。次いで、構築物を4℃に15〜20分間冷却して、印刷変色性インクを液化し、これを冷細胞培地を用いてデバイスから洗い流して、尿細管外ECM腔に細胞を含む又は含まないECM内に埋め込まれた所望の尿細管網状構造としての役割を果たす開放管路を残した。
【０１８９】
さらに、これらの管状構造は、層ごとにアセンブルして、3D構造を作製することができる。例えば、図38に示す3層構造は、次の層の変色性インクを印刷し、さらなるECMを注型する前に各層に20分のみを与えて37℃でゲル化したことを除いて、すべて同じ方法を用いて構築した。図38の差し込み図に蛍光染料で潅流した3つの別個の管に接続された3つのピンを示す。この多層モデルは、3Dにおける血管層及び近位尿細管を調和させるためにバイオプリンティングをマイクロ流体工学とどのようにして組み合わせることができるかを示す実物説明である。さらに、構築後にすべての層を排出した。水性リスクリアクター(risk reactor)染料を通路に潅流し、視覚化のためにUVにより励起した。
【０１９０】
各3D PT構築物を機械加工済みステンレススチール製の底の上にのせ、厚いアクリル製の蓋を上にのせた。蓋及び底を4本のネジにより一緒に固定して、印刷シリコーンガスケットの周りのシールを形成した。次に、滅菌済み2栓蠕動チューブ(PharMed BPT、内径0.25mm)に培地を満たし、培地貯槽としての役割を果たした、10ml注射筒(EFD Nordson)に取付けた無菌フィルターの出口に接続した。37℃、5% CO2のインキュベーター中で3時間以上平衡化したPTEC培地(増殖用に設計された、ATCC製剤+1% FBS、1%アプロチニン及び1%抗生物質-抗真菌薬)を培地貯槽に加え、貯槽からのチューブをチップの出口(金属中空潅流ピン)に接続した。潅流回路を完成させるために、貯槽からのシリコーンチューブをチップ上の入口潅流ピンの入口に接続した。ホースピンチオフクランプを潅流チップの入口及び出口に付けて、内皮を損傷させたり又は血管系に気泡を導入したりすることがあり得る、蠕動ポンプから外れた場合の制御不能な流れが起こることを防いだ。培地貯槽は、培地貯槽の上部の無菌フィルターによりインキュベーター内の大気圧条件と常時平衡させた。
【０１９１】
細胞培養
ヒト不死化PTEC(RPTEC/TERT1、ATCC CRL-4031)をATCCの指示に従って培養し、すべてのPTモデル試験に20継代まで用いた。遺伝子発現解析のために、ヒト初代RPTEC(Cell Science)、不死化PTEC(RPTEC-TERT1、Evercyte)及びA498(ATCC HTB-44)腎臓がん細胞を用い、供給業者の指示に従って培養した。GFPを発現する、ヒト新生児皮膚線維芽細胞(HNDF)(Angio-Proteomie)を供給業者の指示に従って培養し、15継代まで用いた。
【０１９２】
遺伝子発現解析
ヒト初代RPTEC(Cell Science)、不死化RPTEC-TERT1(Evercyte)及びA498(ATCC HTB-44)腎臓がん細胞を供給業者の指示に従って96ウエルにおいて増殖させ、融合後3日目に培養培地を100μl/ウエルの1×RNA溶解混合物(QuantiGene(登録商標)試料処理キット、QS0101)と交換することにより収集した。次いで40μlの溶解物をmRNA捕捉磁気ビーズセット(Panomics QuantiGene(登録商標) Plex Set 12631、カタログ番号312631)と混合し、一夜インキュベートし、分岐DNA増幅のために処理し、製造業者の指示(Panomics QuantiGene(登録商標) Plexアッセイキット、QP1015)に従って解析した。PPIBプローブを標準化のためのハウスキーピング遺伝子として用いた。蛍光強度(FI)データは、3回の生物学的反復実験の平均値及び標準偏差として示した。
【０１９３】
培地潅流液のサイトカイン分析
培地潅流液を細胞播種後25日間の期間にわたって尿細管から採取し、分析の前に-80℃で保存した。サイトカインのプロファイリングのために、上清を氷上で解凍し、試料希釈緩衝液(BioRadカタログ番号M60-009RDPD)で2倍に希釈し、製造業者の指示に従って、Bio-Plex Pro(商標)Human Chemokine IL-6(Set #171BK29MR2)、IL-8(Set #171-BK31MR2)及びMCP-1(Set #171-BK36MR2)並びにBio-Plex(登録商標)200システム(BioRad)を用いてLuminex技術ベースのELISAにより分析した。データは、技術的3反復実験の平均サイトカイン濃度及び標準偏差として報告した。
【０１９４】
上皮形成及び縦方向培養(longitudinal culture)
各印刷3D PT構築物を、細胞負荷/播種の前にインキュベーター中でPTEC培地により数時間潅流した。TECs(PTEC/TERT1、ATCC)をそれらの培養皿からトリプシン処理し、培地中で約2×107細胞/mLに濃縮した。次いで細胞懸濁液を出口を介して潅流チップ中に負荷した(図39B及び39C)。負荷済み構築物をインキュベーター中に横方向に数時間配置し、次いで180°反転し、無流動で尿細管中で一夜インキュベートした。翌日、重力による流動下で非接着細胞を尿細管から洗い流した。次いで新鮮な培地の潅流を開始したところ、残存細胞が密集し、次いでそれらが播種後約3週目に融合性の状態に達するまで(図39K)それらのコロニーから増殖した(図39F)。増殖期中に、PTECにATCCガイドラインに従って調製したPTEC培地と、さらに1%アプロチニン(EMD Millipore、ECMの分解を遅くするために用いた)、1%ウシ胎児血清(FBS)及び1%抗生物質-抗真菌薬(Gibco)を供給した。成熟後、FBSを除去し、PTECは、緊密な上皮単層に詰まった(示さず)。播種後1日目に、PTECを、尿細管断面よって0.1〜0.5ダイン/cm2に変化するせん断応力と同等と見なされる、1μl/分の連続した一方向流に曝露した。培地は、閉ループ回路で蠕動ポンプにより供給し、2日ごとに交換した。
【０１９５】
アルブミン取込み試験
アルブミン取込みは、印刷3D PTモデル並びに2D対照について評価した。第1の対照は、組織培養プラスチック上で増殖したPTECからなっているが、第2の対照は、本発明者らのECM上で増殖したPTECからなっている。各場合に、PTECを融合性を示すまで増殖させ、血清不含有培地中で成熟させた。FITCとコンジュゲートしたヒト血清アルブミン(HSA-FITC、Abcam ab8030)をPTEC培地に50μg/mLで懸濁する。すべての試料をそれらの培地中でHSA-FITCと共に2時間インキュベートする(潅流の場合、それを開放内腔を通して潅流する)。曝露後、すべての試料を3倍量で洗浄し、次いで10×トリプシンを用いてトリプシン処理して、個々の細胞を収集する。細胞を固定し、メガリンについて一次及び二次抗体を用いて対比染色する。表2に用いた特異抗体を示す。
【０１９６】
【表２】
2018521710.tif 000005
【０１９７】
それらの試料からの細胞及び裸細胞をフローサイトメトリー(BD LSR Fortessa)により解析し、データを試料当たりn=10,000細胞から収集した。PTECにおけるHSA-FITC及びメガリンの画像を得るために、洗浄ステップの後にトリプシン処理する代わりに所定の位置でホルマリンで固定する。それらの試料をメガリンについて対比染色し、共焦点顕微鏡法(Zeiss LSM710)を用いて撮像する。
【０１９８】
シクロスポリンA試験
2D対照及び印刷3D PTの両方におけるCysAの毒性作用を探究した。2Dにおいて、細胞を組織培養プラスチック上の96ウエルフォーマットに播種し、融合性を示すまで増殖させた。それらにATCCのガイドラインに従って培地を供給した。CysA(Sigma-Aldrich、SML1018)をそれらの培地に様々な濃度で懸濁し、細胞と共に24時間インキュベートした。フェナジンメトスルフェート(MTS)の存在下における(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)を用いた生存率アッセイを曝露後24時間目に行った。このアッセイは、細胞が融合性に達した当日に細胞にCysAを投与することにより、初期融合性時に、並びに細胞が融合性に達した数日後にCysAを投与することにより、後期融合性時にPTECにおいて完了した。特に、毒性結果は、各場合について同様であった(図40N)。3D PTについて、CysAは、血清を最低限10日間培地に含めなかった、融合性に達した後に(約3週目に)成熟尿細管の開放内腔を通して様々な濃度で供給した。CysA曝露後24時間目に、FITC-デキストラン漏出試験(以下で述べる)を実施して、PTECのバリア機能に対する擾乱を評価し、定量化した。直後に、PTを10%緩衝ホルマリンを用いて1時間固定し、上の表2に示すようにアクチン及びDAPIについて対比染色した(特殊染色)。
【０１９９】
拡散透過率の測定
3Dの上皮のバリア機能を評価するために、25μg/mLのFITCコンジュゲート70kDaデキストラン(FITC-Dex、Sigma product 46945)を含むPTEC培地を3分間にわたり15μL/分、その後約30〜45分間にわたり1μL/分の速度で開放内腔に潅流することによって、拡散透過率を定量化した。全試験は、視野内の尿細管及び周囲ECMの両方についてライブセルイメージングのもとで実施した(図41A〜41E)。FITC-Dexの拡散パターンは、広視野蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を用いて検出した。蛍光像は、潅流の前及び30〜45分間にわたり3〜5分ごとに取り込んだ。FITC-Dexの拡散透過率は、以下の式を用いて蛍光強度の経時的変化を定量化することによって計算した(Price, G. & Tien, J. in Biological Microarrays, Vol. 671. (eds. A. Khademhosseini, K.-Y. Suh & M. Zourob) 281-293 (Humana Press, 2011))。
【０２００】
【数２】
2018521710.tif 000006
【０２０１】
Pdは、拡散透過係数であり、I1は、初期の時点における平均強度であり、I2は、t〜30〜45分における平均強度であり、Ibは、バックグラウンド強度(FITC-Dexの潅流の前に撮影した画像)であり、dは、通路の直径である。
【０２０２】
電子顕微鏡観察
透過型電子顕微鏡観察(TEM)のために、2D又は3D構造のPTECを0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)中2.5%グルタルアルデヒド、1.25%パラホルムアルデヒド及び0.03%ピクリン酸を用いて固定した。小試料(1mm×1mm)を除去し、0.1Mカコジル酸緩衝液で洗浄し、1%四酸化オスミウム(OsO4)(EMS)及び1.5%フェロシアン化カリウム(KFeCN6)(Sigma)中に1時間浸し、水で3回洗浄し、その後、様々な度数のアルコール(それぞれ10分;50%、70%、90%、2×10分100%)で脱水した。次いで試料をプロピレンオキシド(EMS)中に1時間入れ、プロピレンオキシド及びTAAB Epon(Marivac Canada Inc.、St. Laurent、Canada)の1:1混合物中で一夜インキュベートした。翌日、試料をTAAB Eponに包埋し、60℃で48時間重合させた。超薄切片(約60nm)をReichert Ultracut-Sミクロトームで切り出し、銅グリッド上にのせ、クエン酸鉛で染色し、JEOL 1200EX透過型電子顕微鏡で観察し、像をAMT 2k CCDカメラで記録した。画像解析は、ImageJソフトウエアを用いて実施した。
【０２０３】
走査型電子顕微鏡観察(SEM)のために、3Dの潅流済みPTECを10%緩衝ホルマリンを用いて1時間固定した。試料を薄切して(約1mm厚)、開いた内腔の周囲を取り囲む細胞を露出させた。固定剤をPBSx2を用いて洗い流し、その後、様々な度数のアルコール(それぞれ20分;30%、50%、70%、90%、3×20分100%)で脱水した。次いで試料を50%エタノール及び50%ヘキサメチルジシラザン(HMDS)中に30分間、その後100%HMDS中に3×30分間入れた。すべてのステップを閉鎖密封ガラス容器中で実施した。HMDSによる最終洗浄の後、試料を除去し、フュームフード内のN2中開放容器に入れて、乾燥した。乾燥試料を導電性カーボンテープを用いてアルミニウムピンマウントに取り付け、Tescan Vega SEMにより撮像した。
【０２０４】
免疫染色
免疫染色の後に共焦点顕微鏡法を用いて、2D及び3D PTECモデルにおけるタンパク質の細胞局在性を評価した。免疫染色の前に、各構築物をPBSで洗浄し、次いで10%緩衝ホルマリンを用いて20分間から1時間固定した。固定剤を数時間にわたるPBSによる数回の洗浄を用いて除去し、次いでPBS中1重量%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて一夜ブロックした。目的の細胞タンパク質又はバイオマーカーに対する一次抗体を0.5重量% BSA及び0.125重量% Triton X-100の溶液中で上の表2に示した希釈度で構築物と共に1日間インキュベートした。非結合抗体の除去は、PBS又はPBS中0.5重量% BSA及び0.125重量% Triton X-100の溶液に対する1日間の洗浄ステップを用いて達成された。二次抗体は、PBS中0.5重量% BSA及び0.125重量% Triton X-100の溶液中で上の表に示した希釈度で構築物と共に1日間インキュベートした。試料をNucBlue又はActinGreenで2時間対比染色し、次いで撮像の前にPBSで1日間洗浄した。
【０２０５】
画像レンダリング及び解析
位相差顕微鏡法は、1.25X〜40Xの範囲の対物レンズ付きの倒立Leica DM IL鏡を用いて実施した。共焦点顕微鏡法は、405、488、514、561及び633nmの波長のスペクトルレーザーを用いた5X〜40Xの範囲の水浸対物レンズ付きの正立Zeiss LSM 710を用いて実施した。zスタックの画像再構成は、最大ピクセル強度設定のz投影機能を用いてImageJで実施した。輝度の増加は、全z投影画像にわたって均一に行った。3D画像の再構成は、Imarisソフトウエアを用いて実施した。インキュベーターシステムにおける新たなCytoSMART(Lonza)を用いて、微速度撮影画像を取り込んだ。拡散透過性の定量化のための画像解析は、以前に報告された方法を用いたカスタムMATLABスクリプトを用いて実施した(Price, G. & Tien, J. in Biological Microarrays, Vol. 671. (eds. A. Khademhosseini, K.-Y. Suh & M. Zourob) 281-293 (Humana Press, 2011))。TEM像解析は、各条件の少なくとも3つの独立した試料における細胞高さ(n≧50)、微絨毛密度(n≧25)及び微絨毛長(n≧200)を測定するためにImageJソフトウエアを用いて実施した。
【０２０６】
統計解析
データは、平均値±標準偏差として表した。統計解析は、MATLABを用いて行い、統計的有意性は、チューキーの多重対比較検定を用いてANOVAにより判定されるp<0.05の値で判定した。異なる有意水準(p値)をアステリスクにより示し、個別のp値を各図の説明文に示す。
【０２０７】
結果
3D近位尿細管の印刷、播種及び縦方向培養
述べたバイオプリンティング法を用いて、図36Aに示すような、ネフロンの3D近位曲尿細管セグメントを構築した。最初に、図36B及び36Cに示すように、3D組織チップの外縁の境界を定めるシリコーンガスケットをガラススライド上に印刷した。ゼラチン-フィブリンヒドロゲル(Kolesky, D.B.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2016))からなる人工細胞外マトリックス(ECM)の層をガスケット内に均一に堆積させた。次に、ピンク色で示した、変色性インクをECM層上に印刷した。「変色性インク」という用語は、最終的に液化し、最終3D PT構築物から除去される印刷材料を意味する。印刷後、変色性インクを、ガスケット壁を介して連結した中空金属ピンに接続し、追加のECMを印刷構造上に注型した。次いで、3D組織モデルを潅流可能なチップ内に収容し、それを4℃に冷却して、液化し、その後、変色性インクを除去して、ECM内に埋め込まれた開放屈曲管状通路を得た。最後に、細胞培地を外部蠕動ポンプによりチップ上の3D屈曲管状構造を通して潅流した。特に、述べた方法は、正確に制御されたサイズ、曲率及び位置を有する多種多様な立体配置の3D近位尿細管モデルを作製することができる。例えば、アッセイの統計的妥当性を増大させるために又は基底側アクセス通路を備えるために複数の尿細管が必要である場合、それらは、互いに並行して印刷することができ(図42A及び42B参照)、独立に又は単一の入口を介して潅流することができる。図42A及び42Bに示すように、複数のPTを並行して印刷し、融合性の状態まで増殖するPTEC細胞により内面を覆うことができる。
【０２０８】
ECM及び変色性インクの組成及びレオロジー特性は、述べたバイオファブリケーション法向けに特別に調整した。実施例2で述べたように、ECMは、フィブリノーゲン、ゼラチン並びに2種の酵素(トロンビン及びトランスグルタミナーゼ)からなっていた。二重酵素スキームは、フィブリンを生成するフィブリノーゲンに対する作用により、印刷構造の周囲のECMの急速な固化を可能にするものであった。第2の酵素であるトランスグルタミナーゼは、アセンブリー時のECMの上及び下層の途切れのない集積を可能にする、フィブリンによるゼラチンのより緩徐な架橋をもたらした(図43A参照)。さらに、ECMの弾性係数(〜3.5kPa)は、健常腎臓の皮質の弾性係数(〜4kPa)に類似しており(Bensamoun, S.F., Robert, L., Leclerc, G.E., Debernard, L. & Charleux, F. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clin. Imaging 35, 284-287 (2011))、マトリックスの剛性及び組成の両方が組織固有の細胞の機能の保持のために重要であった(Jansen, J.ら Biotechnological challenges of bioartificial kidney engineering. Biotechnol Adv 32, 1317-1327 (2014);及びFurness, P.N. Extracellular matrix and the kidney. J. Clin. Pathol. 49, 355-359 (1996))。変色性インクは、室温で水中臨界ミセル濃度以上で粘弾性ゲルを形成する、ポリエチレン-ポリプロピレン-ポリエチレンのトリブロックコポリマー(Pluronic(登録商標) F127)からなっていた。このインクは、潅流可能組織チップを4℃に冷却したとき、それらの条件下でECMからのその除去を可能にする、ゲル-液体転移を示した(Kolesky, D.B.ら、Adv. Mater. 26, 3124-3130 (2014);及びWu, W.ら、Adv Mater 23, H178-183 (2011))。変色性インクは、高濃度のトロンビン(100U/mL)も含んでいた。このインクが注型工程中にECMにより取り囲まれた場合、可溶性フィブリノーゲンは、不溶性フィブリンに速やかに変換され、内腔の周囲のフィブリンの鋳型となり、細胞培地の所望の長期潅流を促進する。
【０２０９】
細胞を導入する前に、3D組織チップを細胞培地により37℃で一夜潅流して、残留変色性インク又は酵素を除去し、インキュベーター中で37℃及び5% CO2でマトリックスと平衡させた。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)の触媒サブユニットの安定発現により不死化したヒト腎近位尿細管細胞からなっていたPTEC-TERT1細胞を導入した(Wieser, M.ら、American journal of physiology. Renal physiology 295, F1365-1375 (2008))。PTEC-TERT1は、テロメア短縮に起因してin vitroで有限の寿命を有する初代細胞に対するさらなる複製上の優位性を有する初代PTEC細胞の形態及び機能特性を維持している細胞モデルとして開発された。90集団倍加までのPTEC-TERT1のゲノム安定性が実証された(Wieser, M.ら (2008))。33の鍵PTEC遺伝子について遺伝子発現解析を行い、それらを初代PTEC及び腎臓がん細胞株A498と比較することによって、PTEC-TERT1をプロファイルした(図43B)。mRNAレベルは、PTEC-TERT1細胞が初代腎PTEC細胞と転写段階で近いことを示すものであった。薬物発見及び安全性プラットフォームにおける拡張可能で、安定な細胞系の必要性を考慮して、本発明者らは、述べた3D PTモデルをPTEC-TERT1を用いて最適化した(これによりPTECと呼ぶ)。
【０２１０】
曲尿細管を融合性PTEC単層により取り囲むために、組織培養プラスチック皿からの細胞を最初にトリプシン処理し、濃縮し、印刷構造の開放内腔中に潅流した。細胞を尿細管中で無流動のもとで一夜インキュベートして、ECMへの接着を促進し、次いで1日目に軽く洗い流して、非接着細胞を除去した。尿細管におけるそれらの成熟過程の時系列を図39A〜39Kに示す。特に、PTECは、尿細管内で融合性の状態に達するまで増殖し、約3週間の期間にわたり3Dの解放内腔を取り囲む(図39K)。さらに、PTECが炎症誘発性サイトカインのin vivo及びin vitroでの産生に能動的に関与するので、本発明者らは、尿細管潅流液中のIL6、IL-8及びMCP1の蓄積を経時的に測定した。サイトカインプロファイルは、増殖及び成熟期において異なる濃縮を示し、尿細管が融合性の状態の後に安定したことが示唆される(図44A〜44C)。図44A〜44Cにおける薄灰色のバーは、尿細管の増殖期を表す。12日目に、尿細管は、ほぼ融合性であり、FBSが培地から除去されたが、融合性尿細管のプロファイルを濃灰色バーで示す。融合性の状態に達し、FBSが除去されたならば、サイトカインレベルが安定化することに注意すること。さらに、血清の除去の後のIL-6の濃度の低下は、初代ヒトPTECにおけるIL-6の産生に対するアルブミンの以前に報告された誘導効果と一致していた(Pearson, A.L., Colville-Nash, P., Kwan, J.T. & Dockrell, M.E. Albumin induces interleukin-6 release from primary human proximal tubule epithelial cells. JN journal of nephrology 21, 887 (2008))。
【０２１１】
複雑さのレベルを増加させるために、線維芽細胞又は免疫細胞などの、支持細胞を印刷尿細管を取り囲んでいるECM中に懸濁することができる。図37に示すように、線維芽細胞は、ECMの尿細管外腔において尿細管に隣接して生存することができる。150μm〜700mの範囲の尿細管径が印刷された。ここに示したアッセイ及び定量的測定は、約1μL/分の流量のもとに400μm〜550μmの範囲の直径を有するPTにおいて行われた。低(図36D)及び高倍率(図36E及び36F)の成熟PTの画像から、PTECが内腔を取り囲み、それらのin vivoでの表現型について予測されたように、立方体状の形態をとることが明らかにされる。
【０２１２】
具体的には、図36Dに共焦点顕微鏡法により取得された印刷近位曲尿細管の3Dレンダリング(アクチンが赤で、核が青で染色されている)を示し、白色の点線は、PTEC細胞が3Dの開放内腔を取り囲んでいる下に示すスケールバー=500μmの断面図の位置を表す。図36Eは、白色の矩形によって表した(d)における領域のスケールバー=200μmの高倍率像である。図36Fは、上皮内層により取り囲まれた開放内腔を3Dで作製し、チップ上で一方向に潅流するという作製法の結果を示す概念図である。
【０２１３】
これらの人工3D屈曲PTは、閉鎖ループ系で培地を供給することによって縦方向に維持されていた。培地は、2日ごとに交換し、尿細管は、長期間生存しており、試験した最長期間は、2ヵ月を超えている(65日)。
【０２１４】
3D近位尿細管は組織様極性上皮を形成する
PTECを尿細管に播種し、成熟するまで増殖させた後、光学顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法(SEM)及び透過型電子顕微鏡法(TEM)の組合せを用いて、印刷され、潅流された3D PTの特徴付けを行った(図45A〜46K及び46A〜46G)。
【０２１５】
図45A〜45Kに近位尿細管の形態及び分子マーカーを以下のように示す:(A)6週目に撮影した成熟3D PT構築物の位相差画像、スケールバー=500μm、(B)6週目における3D PT構築物の位相差画像、スケールバー=250μm、(C)5週目における尿細管内のPTECのTEM像、スケールバー=5μm、(D)潅流を用いずにECMで被覆された2D皿上で増殖させたPTECのTEM像、スケールバー=5μm、(E)許可により転載した(Mescher, A. in Junqueira's BasicHistology: Text and Atlas, Edn. 1385 (McGraw-Hill Education, 2013)、PTECが緊密に充填し、頂端側における高密度の刷子縁、密着結合及び堅固な基底膜を示す、天然組織において認められる円柱上皮の概略図、(F)3D PT構築物(3DP)並びに3つの2D対照(2DP=潅流を用いた2DにおけるECM上のPTEC、2D=潅流を用いない2DにおけるECM上のPTEC、Dish=潅流しなかった裸の組織培養皿)のTEM像から測定したPTEC細胞高さ、*p<0.001,**p<0.02、(G)3D PT内のPTECの融合層を示す低(スケールバー=50μm)及び高(スケールバー=20μm)倍率のSEM像、白矢印は、細胞当たり1つの密度の一次繊毛の存在を強調する、(H)一次繊毛(赤)を強調する、頂端側を示す部分的尿細管の3Dレンダリング、スケールバー=20μm、(I)緑色のNa/K  ATPaseの存在を強調するPTの画像、スケールバー=100μm、(J)黄色のAQP1の存在を強調する3D PTの画像、スケールバー=100μm、(K)赤色のアクチンを強調し、黄色のAQP1を示す(j)における画像の高倍率像、スケールバー=20μm。
【０２１６】
具体的には、位相差顕微鏡法における低(図45A)及び高(図45B)倍率像から、PTECが尿細管全体にわたって増殖し、円柱状に充填することが明らかされている。尿細管断面のTEM像は、PTECが緊密に充填された円柱状の腎尿細管上皮に集合することをさらに示している(図45C及び45D)。図45Eに概略的に示すように、上皮は、基底側に形成された基底膜及び円柱状の形態の細胞を有する開放内腔に面する頂端側の微小繊毛の刷子縁を有するはずである。TEM像から、潅流を用いずにECM上に2Dで同じ期間中に増殖させた同じ細胞(図45D)と比較して3D近位尿細管内の円柱状の細胞形態(図45C)による、細胞高の増加を定量化した。重要なことに、印刷され、潅流された3D PT構築物におけるPTECは、潅流を用いない平面対照と比べて細胞高の2倍の増加及び本発明者らのECM上の潅流された2D対照と比べて40%の増加を示した。
【０２１７】
3D PTの頂端側のSEM像(図45G)から、融合層の形成及び一次繊毛の存在(細胞当たり1つ、in vivoで観察されたものと類似)が明らかにされている。一次繊毛は、開放内腔内に延在する感覚小器官であり、せん断応力に反応する。それは、上皮細胞の表現型の維持のために重要であり、細胞が単離され、せん断応力の非存在下で2Dで培養されるならば、しばばしば失われる(Jang, K.J.らHuman kidney proximal tubule-on-a-chip for drug transport and nephrotoxicity assessment. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro 5, 1119-1129 (2013))。一次繊毛は、アセチル化チューブリンについて染色することによって、免疫蛍光を用いて、述べたPTにおいても観察された(図45Hにおける3Dレンダリング並びに図47A及びBにおいて赤色で示された)。さらに、本発明者らは、上皮マーカーNa+/K+ ATPaseの発現(図45H及び45I)並びに再びin vivoでのPTEC表現型と類似している、側底細胞膜へのその適切な細胞レベル下局在(図47A)を確認した。近位尿細管固有(遠位尿細管と対比)の水通路アクアポリン1(AQP1)も尿細管を通して優勢であり(図45J)、より高い倍率のAQP1染色は、膜表面上の斑点パターンを有する(図45K)。
【０２１８】
細胞の極性は、上皮細胞の基本的な特徴であり、PTECによるベクトル輸送(vectorial transport)に極めて重要である。したがって、本発明者らは、TEMを用いて本発明者らの3D PTの頂端側を最初に特徴付けることによってPTECの極性を探究した(図46A)。頂端表面においては、微小繊毛が存在し、2Dにおけるよりも顕著である刷子縁を形成した(図46A及び図45Cを図45Dと比較)。基底(図46B)表面では、基底外側嵌合(BI)が顕著である。これらのBIは、in vivoでの外側及び基底縁の表面積を拡張し、2Dの細胞(図45D)は、主として平坦であり、BIを欠いていた。白矢印により印を付けた、側膜における円形陥入の存在は、能動輸送の機構が外側表面に存在することを示唆するものである。さらに、ECM及びPTECにより堆積された基底膜(BM)タンパク質の形態の間に明確な差異がある。BMタンパク質組成のさらなる探究により、成熟3D PT構築物において、PTECがラミニン及びコラーゲンIVを堆積したことが明らかになった(図46C)。観察された他の重要な特性は、TEMにおける隣接細胞間の密着結合の存在(図46D)及び特有の敷石パターンで細胞を連結する、図46EにおけるKカドヘリンなどの、細胞結合タンパク質の存在である。最後に、刷子縁の特性をTEM画像解析により定量化した。3D印刷し、潅流したPTにおける平均微小繊毛長は、2D非潅流対照より約200%長く、2D潅流対照より約40%高いことが見い出された(図46F)。同時に、微小繊毛密度も、すべての2D対照状態(すべての2D対照は統計的に同様であった)と比較して印刷し、潅流した3D PT構築物において有意に高かった(図46G)。
【０２１９】
PTECは、健常で、融合性である場合、高分子量デキストランのような特定のタンパク質の透過に対するほぼ漏れのないバリアを形成する。バリア機能は、伝統的な方法により評価した(Price, G. & Tien, J. in Biological Microarrays, Vol. 671. (eds. A. Khademhosseini, K.-Y. Suh & M. Zourob) 281-293 (Humana Press, 2011))。具体的には、FITC標識デキストラン(70kDa)を成熟PTの開放内腔を通して潅流し、広視野蛍光顕微鏡を用いて蛍光の強度を経時的に取り込んだ。FITC強度値から、拡散透過率を計算し、上皮内層を有さない3D尿細管と比較した(図41A〜41E)。拡散透過係数の劇的な低下(1桁以上)は、印刷し、潅流した3D PT構築物における上皮バリアがほぼ漏れがなく、機能し得ることを示すものであった。
【０２２０】
アルブミン取込み
PTEC細胞による受容体媒介エンドサイトーシスは、体液恒常性のために必須である。糸球体濾液からの血漿タンパク質の再吸収は、刷子縁にあるメガリン-キュビリン複合体に部分的に依拠しており(Cui, S.ら Megalin/gp330 mediates uptake of albumin in renal proximal tubule. American Journal of Physiology-Renal Physiology 271, F900-F907 (1996); Gekle, M. Renal proximal tubular albumin reabsorption: daily prevention of albuminuria. Physiology 13, 5-11 (1998);及び Norden, A.G.ら Urinary megalin deficiency implicates abnormal tubular endocytic function in Fanconi syndrome. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 125-133 (2002))、PTECによるアルブミンの取込みをモニターすることによりin vitroでモデル化することができる。FITC標識ヒト血清アルブミン(HSA)を取り込む、潅流3D PT構築物又は2D対照において増殖した、PTECの能力を試験した。FITC-HASへの2時間の曝露後に、PTECを採取し、メガリン発現について染色し、フローサイトメトリーにより解析した。アルブミンの取込みに関する結果を図48Aに示す。2D対照における大集団は、非蛍光対照と同様の蛍光強度を示しているのに対して、3D PT構築物の内面を覆う細胞は、FITC-HSA強度の有意な増加を示している。アルブミンの輸送体の1つである、メガリンに関する結果は、その発現も3D PTにおいて最高であったことを示すものである(図48B)。フローサイトメトリーにより解析した集団の蛍光強度の平均値を表3に示す。
【０２２１】
【表３】
2018521710.tif 000007
【０２２２】
2D対照に反して、メガリン発現の増大は、潅流3D PTにおける優れたアルブミン機能性取込みと強く相関しており、3D構造及び潅流の両方が、細胞極性及び刷子縁の増大におそらく起因して上皮機能を改善することが示唆される(図46A〜46G)。最後に、FITC-HSA(図48C)、メガリン(図48D)及びそれらの組合せ(図48E)の画像から、3D PTの内面を覆うPTECにおけるアルブミン及びメガリンの重複する分布が明らかにされている。したがって、述べた、人工3D PT構築物は、いずれの2D対照と比べても優れたアルブミン取込み機能を示す。
【０２２３】
薬物毒性試験
シクロスポリンAは、拒絶反応を予防するために移植手術の後に一般的に投与される薬物であり、腎近位尿細管細胞に損傷を与える公知の腎臓毒素であwpる。潅流3D PTに対するその作用を試験するために、3D PTを様々な濃度のシクロスポリンA(CysA)に曝露し、アクチンフィラメントの免疫染色により、細胞形態及び細胞骨格形成の変化をモニターした。尿細管の明視野像(図40A〜40D)及びアクチン染色の対応する3Dレンダリング(図40E〜40H及び図40I〜40L)から、CysA誘発性損傷の用量依存的徴候が明らかである。細胞間結合の軽微な切断(図49A〜D)及びアクチンの再構成(図40J)が10μM CysAで認められたのに対して、細胞を欠いている離散部位が50μM CysAで容易に明らかであり(図40G及び40K)、100μM CysAで悪化した(図40D、40H及び40L)。本発明者らは、50及び100μM CysAで細胞層が締まり、曲がったことも確認している(図40G、40K及び39)。最後に、処理した尿細管におけるFITC-デキストラン(70kDa)の拡散透過率を定量化することによって上皮バリア機能のCysA誘発性破綻を評価した。図40Mに示すように、50及び100μM CysAへの曝露により、上皮バリアの透過率がそれぞれほぼ4倍及び6倍増加した。2D培養プラスチック皿上で増殖したPTECのそれぞれの細胞生存率が50及び100μM CysAによる処理後に40%及び60%低下したことが見い出された(図40N)。全体的にみて、これらの結果から、3D PT構築物を用いて、腎臓毒性を定性的に(免疫染色)且つ定量的に(拡散透過率測定)評価することができることがわかる。
【０２２４】
考察
バイオプリンティングの最近の進歩により、人工細胞外マトリックス内の広範囲に広がり、相互に連結した通路の作製が可能となった(Kolesky, D.B.ら、Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2016); Kolesky, D.B.ら 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26, 3124-3130 (2014);及びMiller, J.S.ら Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature materials 11, 768-774 (2012))。これらの通路の内面を内皮細胞により被覆し、潅流して、埋め込まれた血管系を有する組織を作製することができることが先に示された(Kolesky, D.B.ら(2016)及びKolesky, D.B.ら(2014))。in vitroでの上皮化により潅流可能で、屈曲した3D近位尿細管を製作するための経路が現在開発されている。重要なことに、本発明者らの3D PTモデルにおいて生理的に適切なせん断応力で縦断的研究を可能とするための制御された一方向流が組み込まれた。3D細胞培養、チップ上組織及びバイオプリンティング法を同時に取り入れることによって、チップ上の3D組織及び臓器モデルを製造するための容易で、カスタマイズ可能なプラットフォームが創製された。尿細管のサイズ及び屈曲を含む形状をプログラム可能に規定する能力は、ゲル中ピン引抜き生成直尿細管に依拠している既存の3D PTモデルにまさっている。さらに、述べた人工の3DバイオプリンティングされたPTは、解析のための莫大な数の細胞、例えば、フローサイトメトリーによる正確なサンプリングに必要な10,000個の細胞をはるかに超える細胞の収集を可能にする。それに反して、高細胞集団の定量的な研究は、平面的なマイクロ流体力学ベースのデバイスにおいて達成することが以前には困難であった(Adler, M.らA quantitative approach to screen for kidney toxic compounds in vitro. J. Am. Soc. Nephrol. (2015);及びAdler, M.ら A quantitative approach to screen for kidney toxic compounds in vitro. J. Am. Soc. Nephrol. (2015))。
【０２２５】
本研究に基づいて、基底側アクセス、血管新生又は隣接通路におけるPTEC間のクロストーク(crosstalk)の研究を促進するために複数の尿細管が互いに一緒にパターン化されている、より複雑な構築物を作製することができる(図42A〜B及び38)。例えば、3D PT並びに埋め込まれる血管系と組み込まれる足細胞及びメサンギウム細胞を共印刷することができる。iPSC由来の腎前駆細胞も3D潅流条件下で成熟のために播種することが可能である。述べた、汎用性のバイオプリンティング法は、尿細管外腔に複数の細胞型を組み込み(図37)、それにより、細胞間相互作用を研究するために必要な所定のレベルの複雑さをプログラムすることも可能にするものでもある。
【０２２６】
フィブリノーゲン及びゼラチンの酵素的架橋に基づく、人工ECMは、管状印刷構造の形成及び好ましいPTECマトリックス相互作用を可能にする。PTECは、60日間以上維持することができ、多くの重要な形態学的特徴及び機能性マーカーを含む、in vivoでの機能性細胞の特質を示す融合層を形成する。興味深いことに、3D印刷及び潅流構築物は、2D潅流対照と比較して微小繊毛長、密度及び細胞高の増大を示す。3D事例におけるこれらの増強の原因を十分に解釈するためにより広範囲の研究が必要であるが、頂端収縮、細胞間シグナル伝達及びせん断応力プロファイルなどのいくつかの因子を検討することが可能である。
【０２２７】
述べた3D PT構築物は、細胞間結合の弱化などの、細胞死の前の薬物誘発性尿細管損傷の機構を解釈し、実時間創傷治癒をモニタリングし、腎バリアを介する薬物輸送の細胞及び分子的側面を研究するために用いることができる。その外径及び曲率がin vivo PTをより厳密に模倣している印刷3D尿細管内に播種されたPTECの形態及び機能は、上皮の構造及び機能のさらなる改善が可能であるかを探査するために検討することができる(〜60μmの直径が生理的である)。より小さい直径を有する3D尿細管は、観察される刷子縁をさらに増強し得ると考えられる。現在のところ、微小繊毛は、本発明者らの3D PTで1.3±0.3μmであり、これは、平面対照より有意に高く、ラット腎臓に見い出された微小繊毛長が2.73±0.13μmであることに近い。
【０２２８】
要約すると、述べた方法は、3D細胞培養、チップ上組織及びバイオプリンティング法を組み合わせて、専用の潅流チップ上の細胞外マトリックス内に埋め込まれた3D腎近位曲尿細管を作製する。これらの3D PTモデルは、2D対照において増殖した同じ細胞と比べてin vivoでの表現型及び機能特性を有する組織様上皮の形成を促進する。述べたバイオプリンティング法は、薬物スクリーニング、機構的薬物研究、疾患モデル、及び最終的には、再生医療の進歩を可能にし得る、in vivo微小環境をより十分に反復するチップ上3D組織を作製するための新たな道を開くものである。
【０２２９】
3Dバイオプリンティングにより要求に応じて上皮を有する血管新生異種組織構築物を作製するための新たなアプローチを開発し、本開示において述べた。この高度に拡張可能なプラットフォームは、血管系、上皮、複数の細胞型並びに任意選択で、薬物、毒素、タンパク質及び/又はホルモンなどの他の機能性化学物質が細胞外マトリックス内の所望の位置にプログラム可能に配置されている人工組織構築物の製作を可能にする。この技術は、移植に必要な機能性3D組織及び臓器の速やかな製造につながる可能性がある。
【０２３０】
以下の特許及び特許出願公開は、それらの全体が参照により組み込まれる。2014年11月4日に出願された「埋め込まれた血管系を含む組織構築物を印刷する方法」と題する、国際公開第PCT/US2014/063810号、2012年6月29日に出願された「直接書き込みアプリケーション用の多ノズル堆積システム」と題する、国際公開第PCT/US2012/044794号、2011年3月22日にPCT/US2011/29429として出願された「ヒドロゲル構造の直接書き込み用の粘弾性インク」と題する、米国特許出願公開第2013/0,084,449号、及び2008年6月5日に出願された「微小毛細血管網」と題する、米国特許第8,101,139号。
【０２３１】
本発明をその特定の実施形態に関してかなり詳細に述べたが、本発明から逸脱することがない他の実施形態が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲は、本明細書に含まれている好ましい実施形態の記述に限定されるべきではない。文字通り又は等価によって、特許請求の範囲の意味の範囲内にあるすべての実施形態は、それに含まれるものとする。
【０２３２】
さらに、上述の優位性は、必ずしも本発明の唯一の優位性ではなく、また、述べた優位性のすべてが本発明のすべての実施形態によって達成されることは、必ずしも予測されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｇ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ−Ｆ】
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【図１７Ｇ−Ｉ】
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【図１７Ｊ−Ｘ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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