(57)【要約】  本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４機能に拮抗する抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を処置する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号２２）（式中、Ｘ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＮまたはＳである）のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、ＶＧＬＭＧＰＦＸＩ（配列番号２３）（式中、ＸはＤまたはＮである）のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＲＡＳＱＳＶＸ１Ｘ２ＹＬＸ３（配列番号２４）（式中、Ｘ１はＳまたはＧであり；Ｘ２はＲ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ３はＧまたはＡである）のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＴ（配列番号２５）（式中、Ｘ１はＧまたはＡであり；Ｘ２はＡまたはＴであり；Ｘ３はＴ、Ｓ、Ｒ、またはＮである）のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＱＱＹＧＸ１ＳＰＸ２Ｔ（配列番号２６）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＷまたはＦである）のアミノ酸配列を含む、
前記抗体。
【請求項２】
ＣＤＲＨ１は、配列番号１および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＣＤＲＨ３は、配列番号３および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＣＤＲＬ１は、配列番号４、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＣＤＲＬ２は、配列番号５、および配列番号３１〜３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
ＣＤＲＬ３は、配列番号６、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３；配列番号２７、配列番号２および配列番号３；または配列番号２７、配列番号２および配列番号２８に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６；配列番号２９、配列番号３２および配列番号３６；配列番号２９、配列番号３３および配列番号３７；配列番号３０、配列番号３１および配列番号６；配列番号２９、配列番号３４および配列番号６；または配列番号２９、配列番号３５および配列番号３７に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項９】
相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、前記抗体。
【請求項１０】
配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
ヒトＩＧＫＶ３−２０生殖系列配列またはヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号７および配列番号８；配列番号７および配列番号４４；配列番号７および配列番号４５；配列番号３８および配列番号８；配列番号３８および配列番号４５；配列番号３９および配列番号４３；配列番号３９および配列番号４５；配列番号３９および配列番号４６；配列番号３９および配列番号４７；配列番号４０および配列番号４３；配列番号４０および配列番号８；配列番号４０および配列番号４４；配列番号４０および配列番号４５；配列番号４１および配列番号８；配列番号４１および配列番号４４；配列番号４１および配列番号４５；配列番号４１および配列番号４７；配列番号４２および配列番号４３；または配列番号４２および配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む前記抗体。
【請求項２８】
配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２９】
配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３０】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む前記抗体。
【請求項３１】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む前記抗体。
【請求項３２】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む前記抗体。
【請求項３３】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む前記抗体。
【請求項３４】
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＩＧＫＶ３−２０生殖系列配列またはヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と
を含む前記抗体。
【請求項３５】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む、請求項１〜１３、１８〜２９、または３４のいずれか
１項に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
重鎖定常領域はＩｇＧ１である、請求項３５に記載の単離された抗体。
【請求項３７】
重鎖定常領域はＩｇＧ２である、請求項３５に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
ヒトＩｇＧκおよびＩｇＧλからなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１〜２２、２５〜２９、または３４〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、該バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡからなる群から選択されるヒトＦｃガンマ受容体に、該野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも高い親和性で結合する、請求項１〜１３、１８〜２９、または３４〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４０】
抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、該バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＦｃγＲＩＩＢに、該野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い親和性で結合する、請求項１〜１３、１８〜２９、または３４〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４１】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＧ１、バリアントヒトＩｇＧ２、またはバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域である、請求項３９または４０に記載の単離された抗体。
【請求項４２】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、１またはそれ以上の下記アミノ酸突然変異：Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、およびＬ３２８Ｅを含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４３】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、Ｓ２６７ＥとＬ３２８Ｆ；Ｐ２３８ＤとＬ３２８Ｅ；Ｐ２３８Ｄからなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットと、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ；Ｐ２３８Ｄ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ；Ｇ２３６ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｓ２３９ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｖ２６２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆ；ならびにＶ２６４Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆからなる群から選択される１またはそれ以上の置換とを含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、またはヒトＦｃγＲＩに対するＩｇＧの親和性を低下させる１またはそれ以上のアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項４０に記載の単離された抗体。
【請求項４５】
ＦｃγＲＩＩＢは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞、および活性化Ｔ細胞からなる群から選択される細胞上に発現される、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４６】
抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、該バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＦｃガンマ受容体に、該野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が該ヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも高い親和性で結合する、請求項１〜１３、１８〜２９、または３４〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４７】
ヒトＦｃガンマ受容体は免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項４６に記載の単離された抗体。
【請求項４８】
ヒトＦｃガンマ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩからなる群から選択される、請求項４６または４７に記載の単離された抗体。
【請求項４９】
ヒトＦｃガンマ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項４８に記載の単離された抗体。
【請求項５０】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、１またはそれ以上の下記アミノ酸突然変異：Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、およびＰ３９６Ｌを含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５１】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、Ｓ２３９Ｄ；Ｔ２５６Ａ；Ｋ２９０Ａ；Ｓ２９８Ａ；Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３３４Ａ；Ａ３３９Ｔ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；ならびにＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌからなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５２】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、下記アミノ酸突然変異：Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含む、請求項５１に記載の単離された抗体。
【請求項５３】
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、下記アミノ酸突然変異：Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含むバリアントヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である、請求項５１に記載の単離された抗体。
【請求項５４】
ヒトＦｃガンマ受容体は、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群から選択される細胞上に発現される、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５５】
非フコシル化Ｆｃ領域を含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の抗体と、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合について交差競合する単離された抗体。
【請求項５７】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の抗体と同じヒトＣＴＬＡ−４タンパク質のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項５８】
配列番号７７の残基１４０〜１４１からなるエピトープに結合する、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５９】
配列番号７７の残基１４０および１４１からなる群から選択される少なくとも１個の残基に結合する、請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６０】
配列番号７７の残基１４０〜１４３からなるエピトープに結合する、請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６１】
配列番号７７の残基１３５〜１４３からなるエピトープに結合する、請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６２】
配列番号７７の残基１４０〜１４９からなるエピトープに結合する、請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６３】
配列番号７７の残基１３５〜１４９からなるエピトープに結合する、請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６４】
配列番号７７の残基８０〜８２からなるエピトープに結合する、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６５】
ヒト抗体である、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６６】
ＣＴＬＡ−４に拮抗する、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６７】
ヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６へのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質の結合を阻害する、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６８】
細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、または検出可能な標識にコンジュゲートされた、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６９】
請求項１〜６８のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項７０】
請求項１〜６８のいずれか１項に記載の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項７０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７２】
請求項７０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７１に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項７３】
ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、請求項７２に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体を産生する方法。
【請求項７４】
有効量の請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる方法。
【請求項７５】
有効量の請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
【請求項７６】
抗体または医薬組成物は皮下または静脈内投与される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
抗体または医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で静脈内投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
抗体または医薬組成物は皮下投与され、該抗体は、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の抗体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
抗体または医薬組成物は腫瘍内投与される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８０】
抗体または医薬組成物は０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で腫瘍内投与される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
さらなる治療剤を対象に投与することをさらに含み、場合により、該さらなる治療剤は全身投与される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
対象は固形腫瘍を有し、さらなる治療剤は抗ＰＤ−１抗体であり、場合により、該抗ＰＤ−１抗体はペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
対象は頭頸部扁平上皮癌を有し、さらなる治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体であり、場合により、該抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブであり、
場合により、方法は該対象に化学療法剤を投与することをさらに含み、場合により、該化学療法剤は全身投与され、場合により、該化学療法剤はゲムシタビンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
対象はＨＥＲ２＋乳がんを有し、さらなる治療剤は抗ＨＥＲ２抗体であり、場合により、該抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブであり、
場合により、方法は該対象に化学療法剤を投与することをさらに含み、場合により、該化学療法剤は全身投与され、場合により、該化学療法剤はゲムシタビンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
抗体は請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の抗体である、請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
抗体または医薬組成物は腫瘍流入領域リンパ節に送達される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８７】
抗体は請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の抗体である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
さらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む、請求項７４〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
さらなる治療剤は化学療法剤またはチェックポイント標的剤である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニストＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、およびアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
さらなる治療剤はインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
阻害剤は、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモッド、およびＮＬＧ９１９からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
阻害剤はエパカドスタットである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
阻害剤はＦ００１２８７である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
阻害剤はインドキシモッドである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
阻害剤はＮＬＧ９１９である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
さらなる治療剤はワクチンである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
ワクチンは、抗原性ペプチドと複合体化した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
熱ショックタンパク質はｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化しており、ＨＳＰＰＣは対象から得られた腫瘍に由来する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
免疫療法のための医薬組成物または医薬を調製するための、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１０１】
免疫療法のための医薬を調製するための細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、または検出可能標識にコンジュゲートされた請求項１〜６７のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１０２】
免疫療法のための医薬を調製するための、請求項６９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０３】
免疫療法は対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるためのものである、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０４】
免疫療法はがんを処置するためのものである、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０５】
免疫療法は感染症を処置または防止するためのものである、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年５月２９日に米国仮特許出願第６２／１６８，３９１号；２０１５年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／１８２，３６３号；２０１５年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１９０，６５３号；２０１５年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，２０２号；２０１６年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２８０，２６３号；２０１６年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２９２，５００号；２０１６年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，５５８号；２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，２２６号の利益を主張し、それぞれ、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
１．分野
本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
Ｔリンパ球は、抗原に対する適応免疫応答の中心となる。ナイーブなＴ細胞の完全な活性化には少なくとも２つのシグナルが必要である（非特許文献１）。第１に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用によって、抗原特異的シグナルが提供される。第２に、Ｔ細胞上の受容体と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のそのリガンドとの相互作用によって、共刺激シグナルが提供される。ＴＣＲ／ＭＨＣと共刺激相互作用の両方の会合は、カルシウム−カルシニューリンおよびＲＡＳマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼを含むいくつかの細胞内経路によるＴ細胞活性化、次いで、ＩＬ−２のようなサイトカインを含むいくつかのエフェクター化合物の転写因子の活性化をもたらす。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）プールの生成、および活性化ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の増殖をもたらす。完全なＴ細胞活性化にとって共刺激は重要であるだけでなく、ＴＣＲ／ＭＨＣ会合中に共刺激がないとアネルギーおよび／またはアポトーシスをもたらす。
【０００４】
複数の正および負の共刺激経路がＴ細胞調節に関与するが、最も重要なものはＴ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）との間のものである。ＣＤ２８は、ＴＨ１表現型細胞へのＴ細胞分化を促進し、Ｂ細胞による抗体産生およびＴ細胞の活性化を増強する。樹状細胞（ＤＣ）およびＢ細胞のようなＡＰＣ上に発現されるＢ７−１およびＢ７−２は、重複しているが、異なる機能を有する。Ｂ７−２は構成的に発現され、ＴＣＲ／ＭＨＣ会合と同時にＡＰＣ上で迅速に上方調節される（シグナル１）。Ｂ７−１発現は休止細胞上では非常に低いが、典型的には、長いＴ細胞刺激後に誘導される。これらの差異は、Ｂ７−２はＴ細胞活性化の初期化において重要であるが、Ｂ７−１は免疫応答を永続させるのに大きな役割を果たすことを示唆している。
【０００５】
Ｔ細胞活性化の後、負調節性受容体細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｔ細胞上で上方調節される（非特許文献２）。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８と構造的に相同であるが、Ｂ７−１リガンドとＢ７−２リガンドの両方により堅く結合する。ＣＴＬＡ−４は、いくつかの方法で免疫応答を阻害する：それはＢ７リガンドについてＣＤ２８と競合し、かくして、共刺激を遮断する；それはＴ細胞活性化を阻害するように負にシグナルを発する；ならびにそれはトランスエンドサイトーシスによって反対の細胞に由来するＣＤ８０およびＣＤ８６を捕捉して、ＣＤ２８による共刺激を妨げることができる（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ  １９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１８５〜９０頁
【非特許文献２】Ａｌｅｇｒｅら、２００１、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：２２０〜８頁
【非特許文献３】ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、１９９５、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：４５９〜４６５頁
【非特許文献４】Ｗａｌｕｎａｓら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４０５〜４１３頁
【非特許文献５】Ｑｕｒｅｓｈｉら、２０１１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２：６００〜６０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫応答を促進し、維持するＢ７共刺激経路の重要な役割を考慮すれば、この経路に拮抗するように設計された治療剤は、自己免疫疾患および障害の処置にとって有望である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３．概要
本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４機能、例えば、ＣＴＬＡ−４媒介性免疫抑制に拮抗する抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を処置する方法も提供される。本明細書に開示される抗体は、抗原（例えば、腫瘍抗原）に応答したＴ細胞活性化を増加させる、および／またはＴｒｅｇ媒介性免疫抑制を減少させ、したがって、対象におけるがんを処置するのに特に有用である。
【０００９】
したがって、一態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む単離された抗体であって、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号２２）（式中、Ｘ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＮまたはＳである）のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、ＶＧＬＭＧＰＦＸＩ（配列番号２３）（式中、ＸはＤまたはＮである）のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＲＡＳＱＳＶＸ１Ｘ２ＹＬＸ３（配列番号２４）（式中、Ｘ１はＳまたはＧであり；Ｘ２はＲ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ３はＧまたはＡである）のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＴ（配列番号２５）（式中、Ｘ１はＧまたはＡであり；Ｘ２はＡまたはＴであり；Ｘ３はＴ、Ｓ、Ｒ、またはＮである）のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＱＱＹＧＸ１ＳＰＸ２Ｔ（配列番号２６）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＷまたはＦである）のアミノ酸配列を含む、
前記抗体を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号１および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号３および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号４、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号５および配列番号３１〜３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３；配列番号２７、配列番号２および配列番号３；または配列番号２７、配列番号２および配列番号２８に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６；配列番号２９、配列番号３２および配列番号３６；配列番号２９、配列番号３３および配列番号３７；配列番号３０、配列番号３１および配列番号６；配列番号２９、配列番号３４および配列番号６；または配列番号２９、配列番号３５、および配列番号３７に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号２２）（式中、Ｘ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＮまたはＳである）のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、ＶＧＬＭＧＰＦＸＩ（配列番号２３）（式中、ＸはＤまたはＮである）のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＲＡＳＱＳＶＸ１Ｘ２ＹＬＸ３（配列番号２４）（式中、Ｘ１はＳまたはＧであり；Ｘ２はＲ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ３はＧまたはＡである）のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＴ（配列番号２５）（式中、Ｘ１はＧまたはＡであり；Ｘ２はＡまたはＴであり；Ｘ３はＴ、Ｓ、Ｒ、またはＮである）のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＱＱＹＧＸ１ＳＰＸ２Ｔ（配列番号２６）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＷまたはＦである）のアミノ酸配列を含む、
前記抗体を提供する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号１および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号３および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号４、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号５および配列番号３１〜３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３；配列番号２７、配列番号２および配列番号３；または配列番号２７、配列番号２および配列番号２８に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６；配列番号２９、配列番号３２および配列番号３６；配列番号２９、配列番号３３および配列番号３７；配列番号３０、配列番号３１および配列番号６；配列番号２９、配列番号３４および配列番号６；または配列番号２９、配列番号３５、および配列番号３７に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列（例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＨＶ３−２１＊０１）に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩＧＫＶ３−２０生殖系列配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１）またはヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列（例えば、配列番号１１のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＨＶ３−１１＊０１）に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００１７】
別の態様では、本開示は、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号７と配列番号８；配列番号７と配列番号４４；配列番号７と配列番号４５；配列番号３８と配列番号８；配列番号３８と配列番号４５；配列番号３９と配列番号４３；配列番号３９と配列番号４５；配列番号３９と配列番号４６；配列番号３９と配列番号４７；配列番号４０と配列番号４３；配列番号４０と配列番号８；配列番号４０と配列番号４４；配列番号４０と配列番号４５；配列番号４１と配列番号８；配列番号４１と配列番号４４；配列番号４１と配列番号４５；配列番号４１と配列番号４７；配列番号４２と配列番号４３；または配列番号４２と配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００１９】
別の態様では、本開示は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ヒトＩＧＫＶ３−２０生殖系列配列またはヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２０】
別の態様では、本開示は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合について交差競合する単離された抗体を提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と同じヒトＣＴＬＡ−４タンパク質上のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。
【００２２】
別の態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４１を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４１からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０および１４１からなる群から選択されるヒトＣＴＬＡ−４の少なくとも１個の残基に結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４３を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４３からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１３５〜１４３を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１３５〜１４３からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４９を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１４０〜１４９からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１３５〜１４９を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基１３５〜１４９からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基８０〜８２を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７７の残基８０〜８２からなるヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、抗体のヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合、次いで、重水素の添加の際に、配列番号７７の残基１４０〜１４１を含む領域中でのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質中の水素と、重水素との交換が、水素／重水素交換により決定された場合、抗体の非存在下での同じ領域中でのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質中の水素と、重水素との交換と比較して実質的に減少する抗体を提供する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４の領域は、配列番号７７の残基１４０〜１４３を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４の領域は、配列番号７７の残基１３５〜１４３を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４の領域は、配列番号７７の残基１４０〜１４９を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４の領域は、配列番号７７の残基１３５〜１４９を含む。ある特定の実施形態では、抗体のヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合、次いで、重水素の添加の際に、配列番号７７の残基８０〜８２を含む領域中でのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質中の水素と、重水素との交換は、水素／重水素交換により決定された場合、抗体の非存在下での同じ領域中でのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質中の水素と、重水素との交換と比較して実質的に減少する。
【００２４】
ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１である。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧκおよびＩｇＧλからなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡからなる群から選択されるヒトＦｃガンマ受容体に、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも高い親和性で結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＦｃγＲＩＩＢに、野生型ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い親和性で結合する。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＧ１、バリアントヒトＩｇＧ２、またはバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、１またはそれ以上の下記アミノ酸突然変異：Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、およびＬ３２８Ｅを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、Ｓ２６７ＥとＬ３２８Ｆ；Ｐ２３８ＤとＬ３２８Ｅ；Ｐ２３８Ｄからなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットと、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ；Ｐ２３８Ｄ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ；Ｇ２３６ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｓ２３９ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｖ２６２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆ；ならびにＶ２６４Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆからなる群から選択される１またはそれ以上の置換とを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、またはヒトＦｃγＲＩに対するＩｇＧの親和性を低下させる１またはそれ以上のアミノ酸突然変異をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞、および活性化Ｔ細胞からなる群から選択される細胞上で発現される。
【００２６】
ある特定の実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも高い親和性で結合する。ある特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体は、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩＡである。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、１またはそれ以上の下記アミノ酸突然変異：Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、およびＰ３９６Ｌを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、Ｓ２３９Ｄ；Ｔ２５６Ａ；Ｋ２９０Ａ；Ｓ２９８Ａ；Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３３４Ａ；Ａ３３９Ｔ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；ならびにＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌからなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、下記アミノ酸突然変異：Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、下記アミノ酸突然変異：Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含む。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵナンバリングシステムによる、下記アミノ酸突然変異：Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含むバリアントヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、非フコシル化Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、腫瘍内送達のために製剤化される。ある特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、抗体は、腫瘍流入領域リンパ節への送達のために製剤化される。ある特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は、腫瘍流入領域リンパ節に送達される。ある特定の実施形態では、抗体は、皮下送達のために製剤化される。ある特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は、皮下的に送達される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体は、ＦｃγＲＩＩｃである。ある特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体は、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群から選択される細胞上で発現される。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体はＣＴＬＡ−４と拮抗する。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６へのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質の結合を阻害する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、抗体は、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、または検出可能な標識にコンジュゲートされる。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の抗体に関する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、免疫療法のための医薬組成物または医薬を調製するための、本発明の抗体の使用に関する。好ましくは、免疫療法は、対象において抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるため、場合により、がんを処置するため、または感染症を処置もしくは防止するためのものである。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、診断剤としての使用のための本発明の抗体に関する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、生物試料中のヒトＣＴＬＡ−４のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のための本発明の抗体の使用に関する。
【００３３】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様では、本開示は、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体を産生させる方法であって、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、対象において抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、皮下または静脈内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で静脈内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、または２００倍低い用量で腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で１０倍低い用量で腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で１００倍低い用量で腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与され、方法はさらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態においては、さらなる治療剤は、全身投与される。ある特定の実施形態では、対象は固形腫瘍を有し、さらなる治療剤は抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブまたはニボルマブである。ある特定の実施形態では、対象は頭頸部扁平上皮癌を有し、さらなる治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。ある特定の実施形態では、対象はＨＥＲ２＋乳がんであり、さらなる治療剤は抗ＨＥＲ２抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。ある特定の実施形態では、これらの方法は、化学療法剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、全身投与される。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、ゲムシタビンである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与され、対象は進行性または転移性固形腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与され、対象は頭頸部がん（例えば、再発性／不応性頭頸部扁平上皮癌）を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍内投与され、対象は、乳がん（例えば、再発性／不応性ＨＥＲ２＋乳がん）を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍流入領域リンパ節に送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、または２００倍低い用量で局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で１０倍低い用量で局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身投与により与えられる用量よりも最大で１００倍低い用量で局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、局部投与（例えば、皮下投与）により送達され、方法はさらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、ワクチンである。ある特定の実施形態では、ワクチンは、抗原性ペプチドと複合体化した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。一実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化しており、ＨＳＰＰＣは対象から得られた腫瘍に由来する。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレチクリン、その突然変異体、およびその２つ以上の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｈｓｃ７０である。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｈｓｐ７０である。ある特定の実施形態では、抗原性ペプチドは合成のものである。ある特定の実施形態では、対象はがんを有する。ある特定の実施形態では、対象は感染症を有する。ある特定の実施形態では、これらの方法は、さらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤である。ある特定の実施形態では、チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、およびアゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＤＲ３抗体、アゴニスト抗ＴＮＦＳＦ１５抗体、およびアゴニスト抗ＣＤ２７抗体からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、放射線療法である。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。好適なＩＤＯ阻害剤としては、限定されるものではないが、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモッド、およびＮＬＧ９１９が挙げられる。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、ワクチンである。ある特定の実施形態では、ワクチンは、抗原性ペプチドと複合体化した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。一実施形態では、熱ショックタンパク質はｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化しており、ＨＳＰＰＣは対象から得られた腫瘍に由来する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、および／または本発明の組換え宿主細胞に関する。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、診断剤としての使用のための、本発明の抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、および／または本発明の組換え宿主細胞に関する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、生物試料中のヒトＣＴＬＡ−４のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のための、本発明の抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、および／または本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
【００３９】
一態様では、医薬としての使用のための、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００４０】
一態様では、診断剤としての使用のための、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００４１】
一態様では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、および／または本発明の組換え宿主細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。一態様では、医薬組成物は、医薬および／または診断剤としての使用のためのものである。
【００４２】
一態様では、本発明は、抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４３】
一態様では、本発明は、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４４】
一態様では、本発明は、対象に、有効量の本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物を投与することを含む、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４５】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４６】
一態様では、本発明は、対象におけるがんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４７】
一態様では、本発明は、対象に、有効量の本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物を投与することを含む、対象におけるがんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００４８】
一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤、好ましくは、抗ＰＤ−１抗体に関する。
【００４９】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤、好ましくは、抗ＰＤ−１抗体に関する。好ましい実施形態では、がんは、固形腫瘍である。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物は、対象に腫瘍内投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で対象に腫瘍内投与される。
【００５０】
一態様では、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤、好ましくは、抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物、キットまたはキットの部品に関する。
【００５１】
一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤に関する。
【００５２】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤に関する。好ましい実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物は、対象に腫瘍内投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で対象に腫瘍内投与される。
【００５３】
一態様では、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤を含む医薬組成物、キットまたはキットの部品に関する。
【００５４】
一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤に関する。
【００５５】
一態様では、本発明は、ＨＥＲ２＋乳がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤に関する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物は、対象に腫瘍内投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で対象に腫瘍内投与される。
【００５６】
一態様では、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体、ならびに場合により、（ｃ）化学療法剤を含む医薬組成物、キットまたはキットの部品に関する。
【００５７】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物であって、対象に腫瘍内投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で対象に腫瘍内投与される前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００５８】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物であって、対象に皮下または静脈内投与され、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで、場合により、３週毎に１回の間隔で対象に静脈内投与される前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００５９】
一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤に関する。好ましい実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤またはインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤またはワクチンである。
【００６０】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤に関する。好ましい実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤またはインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤またはワクチンである。
【００６１】
一態様では、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤を含む医薬組成物、キットまたはキットの部品に関する。好ましい実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤またはインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤またはワクチンである。
【００６２】
一態様では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のため、および／または抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるための方法における使用のための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物であって、腫瘍流入領域リンパ節に送達される前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物に関する。
【００６３】
一態様では、本発明は、対象におけるがんの処置のための方法における、および／または抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させるための方法における、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物の使用であって、前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物が腫瘍流入領域リンパ節に送達される、使用に関する。
【００６４】
一態様では、本発明は、例えば、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる、がんを処置する、または感染症を処置する、もしくは防止するための免疫療法のための医薬を調製するための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物の使用に関する。
【００６５】
一態様では、本発明は、例えば、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる、がんを処置する、または感染症を処置する、もしくは防止するための免疫療法のための医薬を調製するための、本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物の使用であって、前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物が腫瘍流入領域リンパ節に送達される、使用に関する。
【００６６】
一態様では、本発明は、例えば、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる、がんを処置する、または感染症を処置する、もしくは防止するための免疫療法のための医薬を調製するための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体、ならびに場合により（ｃ）化学療法剤の使用に関する。
【００６７】
一態様では、本発明は、例えば、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる、がんを処置する、または感染症を処置する、もしくは防止するための免疫療法のための医薬を調製するための、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物ならびに（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体、ならびに場合により（ｃ）化学療法剤の使用であって、前記本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物が腫瘍流入領域リンパ節に送達される、使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１−１】図１Ａは、表面プラズモン共鳴によって測定した、二量体および単量体の組換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＣＴＬＡ−４についての抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の結合親和性（ＫＤ）を示す表である。図１Ｂは、フローサイトメトリーで測定した、ＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照のＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を算出し、抗体濃度の範囲に対してプロットした。図１Ｃおよび１Ｄは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体と比較して示した、関連するファミリーメンバー（組換えヒトＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、および組換えカニクイザルＰＤ−１）と比較した、組換えヒト（ｒｈ）およびカニクイザル（ｒｃ）ＣＴＬＡ−４に結合するＡＧＥＮ１８８４および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の選択性を示す図である。結合をサスペンションアレイ技術（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって測定し、３つの異なる抗体濃度（１０、１００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）での平均蛍光強度（ＭＦＩ）を図１Ｃに示す。図１Ｄは、図１Ｃに示されるデータに基づいた相対結合親和性の要約表である。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】図２Ａは、活性化初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞に対するＡＧＥＮ１８８４ｗ、抗ＣＴＬＡ−４参照抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。簡潔に述べると、フローサイトメトリーによる抗体結合分析の５日前について、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して、新しく単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激した。抗体濃度の範囲にわたって平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。図２Ｂは、活性化（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を組換えＩＬ−２で３日間）初代カニクイザルＣＤ８＋  Ｔ細胞を使用した濃度滴定にわたってＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した、ＡＧＥＮ１８８４および抗ＣＴＬＡ−４参照抗体の細胞内結合を示す図である。データはフローサイトメトリーによって生成され、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の割合としてＣＴＬＡ−４＋  Ｔ細胞のパーセント率として示されている。図２Ｃは、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激ＣＤ４＋ヒト、カニクイザル、ラット、またはマウスＴ細胞へのＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の結合を試験するフローサイトメトリー分析からの結果を示す図である。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】図３Ａは、サスペンションアレイ技術を使用したリガンドブロッキングアッセイの模式図を示す図である。図３Ｂおよび３Ｃは、ＡＧＥＮ１８８４、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ１）抗体の用量滴定の非存在下（１００％）または存在下における、ＣＴＬＡ−４コンジュゲートビーズへ結合した組換えＣＤ８０−Ｆｃ（図３Ｂ）およびＣＤ８６−Ｆｃタンパク質（図３Ｃ）のパーセント率を示す図である。図３Ｄは、漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ１）抗体の存在下で、ＣＴＬＡ−４発現Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）に結合する組換えＣＤ８０−ＦｃおよびＣＤ８６−Ｆｃのパーセント率を示す図である。図３Ｅは、固定濃度の直接蛍光色素コンジュゲートＡＧＥＮ１８８４ｗまたは参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体を添加する前に、ＣＴＬＡ−４発現Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）をＣＤ８０−ＦｃまたはＣＤ８６−Ｆｃの滴定用量と共にインキュベートしたアッセイの結果を示す図である。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＣＤ８０−ＦｃまたはＣＤ８６−Ｆｃ濃度の範囲に対してプロットした。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】図４Ａは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ；ＳＥＡ）刺激に対する初代ヒトＰＢＭＣの培養物についての抗ＣＴＬＡ−４抗体の機能的活性を示す図である。具体的には、図４Ａは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ＡＧＥＮ１８８４ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の用量反応に応答するＩＬ−２産生における変化倍数を示す図である。エラーバーは、３つに重複させたウェルからの標準偏差を表す。図４Ｂおよび４Ｃは、ＣＴＬＡ−４の遮断がＴ細胞活性化をもたらすことを示すＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。ＩＬ−２プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子に加えて細胞表面ＣＴＬＡ−４を恒常的に発現するように遺伝子操作された、ヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を共発現するＣＤ３およびＣＤ２８を、ＣＤ８０とＣＤ８６を発現する抗原提示細胞株（Ｒａｊｉ）と共培養した。図４Ｂは、フローサイトメトリーにより測定したＲａｊｉ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を示す一対のヒストグラムを示す図である。ＴＣＲシグナル伝達は、漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下で抗ＣＤ３抗体を使用して誘発された。図４Ｃは、アイソタイプ対照抗体と比較して漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗに応答して、ＩＬ−２遺伝子活性化の代替マーカーであるルシフェラーゼ発現の増加倍数を示す図である。図４Ｄおよび４Ｅは、高濃度の抗ＣＤ３抗体の存在下で、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗが初代ＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生を減少させる能力を試験するアッセイの結果を示す図である。漸増濃度の可溶性（図４Ｄ）またはプレート結合（図４Ｅ）ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体のいずれかの存在下で、初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。試験した抗体濃度に対してＣＤ８＋  ＩＦＮγ＋  Ｔ細胞の百分率をプロットする。点線は、抗ＣＤ３抗体刺激の非存在下での、ＣＤ８＋  ＩＦＮγ＋  Ｔ細胞の頻度を示す。図４Ｆは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激に対する初代ヒトＰＢＭＣの培養物上で、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗの機能的活性を、単独で、または抗ＬＡＧ−３抗体ＡＧＥＮ１７４６、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）と組み合わせて示すグラフである。ＩＬ−２濃度の平均および標準偏差が示される。ＩＣはアイソタイプ対照の略である。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図５−１】図５Ａは、表面プラズモン共鳴により測定した、二量体および単量体組換えヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４に対するＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体の結合親和性（ＫＤ）を示す図である。図５Ｂは、フローサイトメトリー分析で測定した、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体、およびＩｇＧ２アイソタイプ対照のＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、試験した異なる抗体濃度に対してプロットした。図５Ｃは、サスペンションアレイ技術により測定した、漸増濃度のＡＧＥＮ２０４１ｗまたは参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体（ビーズを添加する前において１２、３７、１１１、３３３、１０００、３０００および９０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での、ＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０およびＣＤ８６結合の百分率を示すグラフである。図５Ｄおよび５Ｅは、それぞれ図１Ｃおよび１Ｄに示されるものと同様の表を示す図であり、関連するファミリーメンバー（組換えヒトＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、およびＰＤ−１；ならびに組換えカニクイザルＰＤ−１）と比較した、組換えヒト（ｒｈ）およびカニクイザル（ｒｃ）ＣＴＬＡ−４に結合するＡＧＥＮ２０４１ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体の選択性を、アイソタイプ対照ＩｇＧ２抗体に対して試験した。図５Ｄは、サスペンションアレイ技術によって測定されたＭＦＩ値を示す図であり、図５Ｅは、図５Ｄに示されるデータに基づく要約表である。
【図５−２】図１−１の続き。
【図６】図６Ａは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激に対する初代ヒトＰＢＭＣの培養物における抗ＣＴＬＡ−４抗体の機能的活性を示す図である。図６Ａは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体と比較した、ＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＡＧＥＮ２０４１ｗの用量応答に応答するＩＬ−２産生における変化倍数を示す図である。エラーバーは、３つに重複させたウェルからの標準偏差を表す。図６Ｂは、ＡＧＥＮ２０４１ｗおよびＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体を試験するＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターアッセイからの結果を示すグラフである。漸増用量のＡＧＥＮ２０４１ｗおよびアイソタイプ対照抗体について、ＩＬ−２遺伝子活性化の代替マーカーであるルシフェラーゼ発現の増加倍数が示されている。
【図７】図７Ａは、フローサイトメトリー分析で測定した、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５（安定クローン１０５によって産生されたＡＧＥＮ１８８４ｗ）、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照の、ＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、抗体滴定に対してプロットした。図７Ｂは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後のＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照によって増強されたＩＬ−２産生を調べるアッセイの結果を示す図である。図７Ｂにおいては、６つの生物学的複製物およびＩＬ−２の変化倍数の平均値（バー）が示されている。
【図８−１】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図８Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（図８Ｂ）およびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８（図８Ｃ）を発現するＣＨＯ細胞に対する抗体の用量滴定の結合曲線を示す図である。二次検出抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットしている。エラーバーは、３つの重複物からの標準偏差を表す。試験した抗体は、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体であった。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、表面プラズモン共鳴によって決定された、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（図９Ａ）またはヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（図９Ｂ）に結合した、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の抗体濃度の範囲における３つの重複サンプルの平均応答（応答単位、ＲＵ）を示すグラフである。
【図１０−１】図１０Ａは、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）遺伝子レポーターアッセイの模式図を示す図である。図１０Ｂ〜１０Ｇは、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５またはＡＧＥＮ１８８４ｗ（図１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆおよび１０ＧにおけるＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５；図１０Ｄおよび１０ＥにおけるＡＧＥＮ１８８４ｗ）の、ＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｖ１５８変異体またはＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｆ１５８変異体のいずれかを発現するレポーター細胞株を活性化する能力を、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体（図１０Ｂおよび１０Ｃ）、ＡＧＥＮ２０４１ｗ（図１０Ｄおよび１０Ｅ）およびＡＧＥＮ１８８４ｗ  Ｎ２９７Ａ変異体（図１０Ｆおよび１０Ｇ）のものと比較した、レポーターアッセイの結果を示す図である。相対光単位（ＲＬＵ）は、抗体濃度の範囲に対して、プロットされている。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１０−３】図１０−２の続き。
【図１１】ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体を、ＣＴＬＡ−４を発現する標的細胞に抗体が結合した場合の、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１変異体を発現するレポーター細胞株を活性化する能力について試験した、レポーターアッセイの結果を示す図である。相対光単位（ＲＬＵ）は、抗体濃度の範囲に対して、プロットされている。
【図１２】図１２Ａは、フローサイトメトリー分析で測定した、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ変異体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照のＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、試験した異なる抗体濃度に対してプロットした。図１２Ｂは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後のＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照によって誘導されたＩＬ−２産生を調べるアッセイの結果を示す図である。図１２Ｂにおいては、６つの生物学的複製物およびＩＬ−２の変化倍数の平均値（バー）が示されている。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、抗ＣＴＬＡ−４抗体のアンタゴニスト活性に対するＦｃＲ会合の遮断の影響を調べる、アッセイの結果を示す図である。図１３Ａにおいては、７つの生物学的複製物およびＩＬ−２の変化倍数の平均値（バー）が示されている。図１３Ｂにおいては、ＩＬ−２産生（ｐｇ／ｍｌ）の７つの生物学的複製物が示されている。
【図１４】１０μｇ／ｍｌのＡＧＥＮ１８８４ｗ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、またはＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体に応答するブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激に対するヒトＰＢＭＣのＩＬ−２産生を示すグラフである。ＩＬ−２産生の平均値（バー）を、試験した各々の抗体について示す。
【図１５】ＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、またはアイソタイプ対照抗体の用量滴定と共に、エフェクター細胞の存在下での標的細胞溶解のパーセント率を示すグラフである。細胞表面にＣＴＬＡ−４を恒常的に発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を標的細胞として使用し、ＮＫ９２−ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞をエフェクター細胞として使用した。
【図１６】ＣＤ８０−Ｆｃ−Ｈｉｓ、ＣＤ８６−Ｆｃ−Ｈｉｓ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＡＧＥＮ１８８４の、ＣＴＬＡ−４についての結合親和性（ＫＤ）を比較する図である。ＷａｌｋｅｒおよびＳａｎｓｏｍ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１１年は、ＷａｌｋｅｒおよびＳａｎｓｏｍ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１年）１１（１２）巻：８５２〜６３頁のことを指す。Ｘｕら、ＪＩ  ２０１２年は、Ｘｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２年）１８９（９）巻：４４７０〜７頁のことを指す。
【図１７−１】図１７Ａは、ヒトＣＴＬＡ−４（配列番号７７）、カニクイザルＣＴＬＡ−４（配列番号８４）、マウスＣＴＬＡ−４（配列番号８５）およびラットＣＴＬＡ−４（配列番号８６）についての配列アラインメントを示す図である。ドットは、対応するヒト残基と同一の残基を表す。＊（アスタリスク）は、単一の、完全に保存された残基を持つ位置を示す。：（コロン）は、強く類似した特性のグループ間の保存を示す。．（ピリオド）は、弱く類似した特性のグループ間の保存を示す。図１７Ｂおよび１７Ｃは、ヒトＣＴＬＡ−４（配列番号７７）、カニクイザルＣＴＬＡ−４（配列番号８４）、ヒトＣＤ２８（配列番号８７）、ヒトＩＣＯＳ（配列番号８８）、ヒトＢＴＬＡ（配列番号８９）およびヒトＰＤ−１（配列番号９０）についての配列アラインメントを示す図である。図１７Ａ〜Ｃにおいて、ヒトＣＴＬＡ−４がＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｆａｂに結合したときの重水素取り込みの強力な減少を示す２つの領域を下線で示した：Ｑ８０ＶＴ８２およびＹ１３５ＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩ１４９。図１７Ｄは、タンパク質データバンクファイル３ｏｓｋおよび１ｉ８ｌにおけるＸ線座標の複合アセンブリである。この複合構造解析は、ＣＴＬＡ−４およびＢ７−１クラスターのデイジーチェーンクラスタリングを示している。これは、シグナル伝達コンピテント免疫複合体の最も単純なオリゴマー形態であると考えられるヒトＣＴＬＡ−４二量体を共にしたヒトＢ７−１二量体のモデルを提供する。ＣＴＬＡ−４とＢ７−１との間の接触部位には、Ｍ１３４ＹＰＰＰＹＹ１４０領域が含まれるが、この特定のモチーフに限定されない。図１７Ｅは、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦａｂのヒトＣＴＬＡ−４への結合のモデルを示す図である。図１７Ａ〜１７Ｅの先述の説明に示されたＣＴＬＡ−４のすべての残基は、配列番号７７に従って番号付けされている。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１７−３】図１７−２の続き。
【図１７−４】図１７−３の続き。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、カニクイザルにおけるＴ細胞依存性抗原応答（ＴＤＡＲ）調査の結果を示す図である。ＡＧＥＮ１８８４ｗ（１０ｍｇ／ｋｇ）、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）（図１８Ａ）、ＡＧＥＮ２０４１ｗ（１０ｍｇ／ｋｇ）（図１８Ｂ）、または対照物（図１８Ａおよび１８Ｂ）を、１日目および２９日目にＨＢｓＡｇワクチン（後肢において３０μｇ）と共に静脈内投与（ゆっくりとしたボーラス）により投与した。ＥＬＩＳＡを使用し、抗ＨＢｓＡｇ（ＩｇＧ）血清力価について２つの重複サンプルを分析した。データポイントは、各々の処置群における平均±ＳＥＭを表す。
【図１９−１】図１９Ａおよび１９Ｂは、それぞれ、可変重鎖ＢＡＤＤ４１１−２３５４（配列番号７）、ＢＡＤＤ４１２−２３５６（配列番号３８）、ＢＡＤＤ４１２−２３５７（配列番号３９）、ＢＡＤＤ４１２−２３５８（配列番号４０）ＢＡＤＤ４１２−２３５９（配列番号４１）、およびＢＡＤＤ４１２−２３６０（配列番号４２）、ならびに可変軽鎖ＢＡＤＤ４１２−２３６７（配列番号４３）、ＢＡＤＤ４１２−２３７６（配列番号８）、ＢＡＤＤ４１２−２３８２（配列番号４４）、ＢＡＤＤ４１２−２３８４（配列番号４５）、ＢＡＤＤ４１２−２３９０（配列番号４６）およびＢＡＤＤ４１２−２３９３（配列番号４７）の配列アラインメントを示す図である。示された重鎖および軽鎖のＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｅは、サスペンションアレイ技術によって測定した、１９の抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＡＧＥＮ１８８４−ＡＧＥＮ１９０２）の用量滴定の存在下での、ＣＴＬＡ−４をカップリングさせたビーズへの組換えＣＤ８０−ＰＥまたはＣＤ８６−ＰＥ結合の百分率を示すグラフである。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−２の続き。
【図２０−４】図２０−３の続き。
【図２０−５】図２０−４の続き。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
５．詳細な説明
本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４機能、例えば、ＣＴＬＡ−４媒介性免疫抑制に拮抗する抗体を提供する。また、これらの抗体、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞を含む医薬組成物、ならびにこれらの抗体を使用して対象を処置する方法も提供される。本明細書に開示される抗体は、抗原（例えば、腫瘍抗原）に応答したＴ細胞活性化を増加させる、したがって、対象におけるがんを処置する、または感染症を防止する、もしくは処置するのに特に有用である。本明細書に開示される抗体は、がんを処置するため、または感染症を防止する、もしくは処置するための医薬組成物における使用にとって、またはそのための医薬の製造においても有用である。
【００７０】
５．１  定義
本明細書で使用される用語「約」および「およそ」は、数値または数値範囲を修飾するために使用される場合、その値または範囲の５％〜１０％上および５％〜１０％下の偏差が、記載される値または範囲の意図される意味の範囲内に依然としてあることを示す。
【００７１】
本明細書で使用される用語「ＣＴＬＡ−４」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４を指す。ＣＴＬＡ−４ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当業界で周知である。例示的なヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ預託ＧＩ：１５７７８５８５に記載され、例示的なマウスＣＴＬＡ−４アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ預託ＧＩ：１５７７８５８６に記載されている。
【００７２】
本明細書で使用される用語「抗体」および「複数の抗体」は、完全長抗体、抗体の抗原結合断片、および抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域またはＶＬ領域を含む分子を含む。抗体の例としては、モノクローナル抗体、組換え産生された抗体、一特異的抗体、多特異的抗体（二特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２個の重鎖分子と２個の軽鎖分子とを含むテトラマー抗体、および抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー、抗体軽鎖−抗体重鎖対、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、上記のいずれかの抗原結合断片が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）のものであってよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＩｇＧ抗体、またはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４）またはサブクラスである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。
【００７３】
本明細書で使用される用語「ＶＨ領域」および「ＶＬ領域」は、それぞれ、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３および４ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２および３を含む、単一抗体重鎖および軽鎖可変領域を指す（Ｋａｂａｔら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）を参照されたい）。
【００７４】
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖と軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に認められる非連続的抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２、６６０９〜６６１６頁（１９７７）およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、ならびにＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁（１９９６）により記載されており、その定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。上記の引用文献のそれぞれによって定義されたＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較のために記載される。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は、配列比較に基づいて、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲである。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを示す。
【００７５】
本明細書で使用される用語「ＥＵナンバリングシステム」とは、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、６３、７８〜８５頁（１９６９）およびＫａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、第５版、１９９１に記載された、抗体の定常領域のＥＵナンバリング慣例を指す。
【００７６】
本明細書で使用される用語「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」とは、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸を指す。本明細書で使用される用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」は、可変領域の部分であるが、ＣＤＲの部分ではない（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を使用する）アミノ酸残基を含む。
【００７７】
Ｆｃの文脈において本明細書で使用される用語「非フコシル化」または「非フコシル化された」とは、ＥＵ指数（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））に従って番号付けられた、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の残基２９７、または非ＩｇＧ１もしくは非ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン中の対応する残基に直接または間接に共有結合したフコースの実質的な欠如を指す。かくして、複数の非フコシル化抗体を含む組成物中では、抗体の少なくとも７０％が、抗体のＦｃ領域の残基２９７において直接または間接に（例えば、介在する糖により）フコシル化されておらず、一部の実施形態では、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、Ｆｃ領域の残基２９７において直接または間接にフコシル化されていない。
【００７８】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」とは、少なくとも約１ｘ１０−６Ｍ、１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍ、もしくはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合する抗体の能力を指す。
【００７９】
本明細書で使用される「エピトープ」は、当業界における用語であり、抗体が特異的に結合することができる、抗原の局部領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続的アミノ酸であってよく（線状もしくは連続エピトープ）、またはエピトープは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２つ以上の非連続領域と一緒になってもよい（立体的、非線状、不連続、もしくは非連続エピトープ）。ある特定の実施形態では、抗体が結合するエピトープを、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶試験、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析（例えば、液体クロマトグラフィー、電子スプレー質量分析）と組み合わせた水素／重水素交換、アレイに基づくオリゴペプチド走査アッセイ、および／または突然変異誘発マッピング（例えば、部位特異的突然変異誘発マッピング）によって決定することができる。Ｘ線結晶学については、結晶化を、当業界で公知の方法のいずれかを使用して達成することができる（例えば、Ｇｉｅｇｅ  Ｒら（１９９４）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５０（Ｐｔ  ４）：３３９〜３５０頁；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９９０）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８９：１〜２３頁；Ｃｈａｙｅｎ  ＮＥ（１９９７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１２６９〜１２７４頁；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９７６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５１：６３００〜６３０３頁）。抗体：抗原結晶を、周知のＸ線回折技術を使用して試験し、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （１９８５）  ｖｏｌｕｍｅｓ  １１４  ＆  １１５、Ｗｙｃｋｏｆｆ  ＨＷら（編）；Ｕ．Ｓ．２００４／００１４１９４を参照されたい）、およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９３）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４９（Ｐｔ  １）：３７〜６０頁；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９７）  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２７６Ａ：３６１〜４２３頁、Ｃａｒｔｅｒ  ＣＷ（編）；Ｒｏｖｅｒｓｉ  Ｐら（２０００）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５６（Ｐｔ１０）：１３１６〜１３２３頁）などのコンピュータソフトウェアを使用して精緻化することができる。突然変異誘発マッピング試験を、当業者には公知の任意の方法を使用して達成することができる。アラニン走査突然変異誘発技術などの突然変異誘発技術の説明については、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  Ｍら（１９９５）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１３８８〜１３９４頁およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＢＣ  ＆  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１〜１０８５頁を参照されたい。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片のエピトープは、アラニン走査突然変異誘発試験を使用して決定される。
【００８０】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、本明細書に記載される治療または防止手段を指す。「処置」の方法は、疾患もしくは障害の１もしくはそれ以上または再発疾患もしくは障害の１もしくはそれ以上の症状を防止する、治癒させる、遅延させる、その重症度を低下させる、もしくはそれを改善するため、またはそのような処置の非存在下で予想されるものを超えて対象の生存を延長させるために、疾患もしくは障害を有する、またはそのような疾患もしくは障害を有する素因がある対象への抗体の投与を用いる。
【００８１】
対象への療法の投与の文脈において本明細書で使用される用語「有効量」とは、所望の予防または治療効果を達成する療法の量を指す。
【００８２】
本明細書で使用される用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００８３】
水素−重水素交換は、以下のステップ：（ａ）水性バッファー中のＣＴＬＡ−４のみ、または抗体と組み合わせたＣＴＬＡ−４の溶液を取得し、この溶液を約９０％体積／体積過剰の重水標識バッファー中で、例えば、０、６０、３００、１８００、および７２００秒間希釈するステップ；（ｂ）ｐＨを低下させることにより水素と重水素との交換をクエンチするステップ；（ｃ）試料をプロテアーゼ消化および質量分析にかけるステップ；ならびに（ｄ）ＣＴＬＡ−４タンパク質分解ペプチド中への重水素取込みを算出し、抗体の存在下または非存在下での重水素取込みを比較するステップを含むアッセイを使用して評価される。抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下での水素／重水素交換が、前記アッセイによってアセスメントされた場合、抗体の非存在下での水素／重水素交換と比較して少なくとも１０％減少する場合、ＣＴＬＡ−４タンパク質分解ペプチド中での水素と重水素との交換は「減少する」。
【００８４】
５．２  抗ＣＴＬＡ−４抗体
一態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４機能に拮抗する抗体を提供する。例示的抗体のアミノ酸配列を、本明細書の表１〜６に記載する。
【００８５】
【表１】
2018521638.tif 000002
【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
【表４】
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【００８９】
【表５】
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【００９０】
【表６】
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【００９１】
【表７】
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【００９２】
【表８】
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【００９３】
【表９】
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【００９４】
【表１０】
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【００９５】
【表１１】
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【００９６】
【表１２】
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【００９７】
【表１３】
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【００９８】
【表１４】
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【００９９】
【表１５】
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【０１００】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号２２）（式中、Ｘ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＮまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；および／または
（ｂ）ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；および／または
（ｃ）ＶＧＬＭＧＰＦＸＩ（配列番号２３）（式中、ＸはＤまたはＮである）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；および／または
（ｄ）ＲＡＳＱＳＶＸ１Ｘ２ＹＬＸ３（配列番号２４）（式中、Ｘ１はＳまたはＧであり；Ｘ２はＲ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ３はＧまたはＡである）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；および／または
（ｅ）Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＴ（配列番号２５）（式中、Ｘ１はＧまたはＡであり；Ｘ２はＡまたはＴであり；Ｘ３はＴ、Ｓ、Ｒ、またはＮである）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および／または
（ｆ）ＱＱＹＧＸ１ＳＰＸ２Ｔ（配列番号２６）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＷまたはＦである）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含む前記抗体を提供する。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、抗体は、上記のＶＨ  ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つ全部を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表２中の抗体の１つのＣＤＲＨ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表２中の抗体の１つのＣＤＲＨ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表２中の抗体の１つのＣＤＲＨ３を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表２中の抗体の１つの１つ、２つ、または３つ全部のＶＨ  ＣＤＲを含む（例えば、表２の１行中のＶＨ  ＣＤＲ、例えば、ＶＨ  ＣＤＲの全部が抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗに由来する）。ある特定の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＶＨフレームワークを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載の抗体のＶＨフレームワーク領域（例えば、表４の１行中のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つ）を含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、抗体は、上記のＶＬ  ＣＤＲの１つ、２つ、または３つ全部を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３中の抗体の１つのＣＤＲＬ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３中の抗体の１つのＣＤＲＬ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３中の抗体の１つのＣＤＲＬ３を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３中の抗体の１つの１つ、２つ、または３つ全部のＶＬ  ＣＤＲを含む（例えば、表３中の１行中のＶＬ  ＣＤＲ、例えば、ＶＬ  ＣＤＲの全部が抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗに由来する）。ある特定の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＶＬフレームワーク領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表５に記載の抗体のＶＬフレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、表５の１行中のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つ）を含む。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＳＹＸ１ＭＸ２（配列番号２２）（式中、Ｘ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＮまたはＳである）のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、ＶＧＬＭＧＰＦＸＩ（配列番号２３）（式中、ＸはＤまたはＮである）のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＲＡＳＱＳＶＸ１Ｘ２ＹＬＸ３（配列番号２４）（式中、Ｘ１はＳまたはＧであり；Ｘ２はＲ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ３はＧまたはＡである）のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＴ（配列番号２５）（式中、Ｘ１はＧまたはＡであり；Ｘ２はＡまたはＴであり；Ｘ３はＴ、Ｓ、Ｒ、またはＮである）のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＱＱＹＧＸ１ＳＰＸ２Ｔ（配列番号２６）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＷまたはＦである）のアミノ酸配列を含む、
前記抗体を提供する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号１〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号３および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号４、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号５および配列番号３１〜３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、表２中の抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、表３中の抗体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；配列番号２７、配列番号２、および配列番号３；または配列番号２７、配列番号２、および配列番号２８に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号２９、配列番号３２、および配列番号３６；配列番号２９、配列番号３３、および配列番号３７；配列番号３０、配列番号３１、および配列番号６；配列番号２９、配列番号３４、および配列番号６；または配列番号２９、配列番号３５、および配列番号３７に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号３２、および配列番号３６；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号３３、および配列番号３７；配列番号２７、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号２７、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号３３、および配列番号３７；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号６；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号３４、および配列番号６；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号３５、および配列番号３７；配列番号２７、配列番号２、配列番号２８、配列番号４、配列番号５、および配列番号６；配列番号２７、配列番号２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、および配列番号３６；配列番号２７、配列番号２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、および配列番号３７；または配列番号２７、配列番号２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３５、および配列番号３７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲを、免疫グロブリン構造ループの位置を指す、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームに従って決定することができる（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ＆  Ｌｅｓｋ  ＡＭ（１９８７）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１〜９１７頁；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  Ｂら（１９９７）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７〜９４８頁；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃら（１９９２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：７９９〜８１７頁；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａら（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（１）：１７５〜８２頁；および米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）。典型的には、Ｋａｂａｔのナンバリング慣例を使用する場合、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ１ループは、重鎖アミノ酸２６〜３２、３３、または３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ２ループは、重鎖アミノ酸５２〜５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ３ループは、重鎖アミノ酸９５〜１０２に存在するが、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ１ループは、軽鎖アミノ酸２４〜３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ２ループは、軽鎖アミノ酸５０〜５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ３ループは、軽鎖アミノ酸８９〜９７に存在する。Ｋａｂａｔのナンバリング慣例を使用してナンバリングされた場合、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４との間で変化する（これは、ＫａｂａｔのナンバリングスキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を置くためである；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わる；３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わる；３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＶＬのＣｈｏｔｈｉａのＶＬ  ＣＤＲを含む前記抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＣｈｏｔｈｉａのＶＨ  ＣＤＲを含む前記抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＣｈｏｔｈｉａのＶＨ  ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａのＶＬ  ＣＤＲを含む前記抗体を提供する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する抗体は、ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲが同じアミノ酸配列を有する、１またはそれ以上のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合し、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲとの組合せを含む、単離された抗体を提供する。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲを、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ（１９９９）  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ７：１３２〜１３６頁およびＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐら（１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：２０９〜２１２頁に記載のＩＭＧＴナンバリングシステムに従って決定することができる。ＩＭＧＴナンバリングスキームによれば、ＣＤＨＲ１は２６〜３５位にあり、ＣＤＲＨ２は５１〜５７位にあり、ＣＤＲＨ３は９３〜１０２位にあり、ＣＤＲＬ１は２７〜３２位にあり、ＣＤＲＬ２は５０〜５２位にあり、ＣＤＲＬ３は８９〜９７位にある。特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ（１９９９）上掲およびＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐら（１９９９）上掲に記載のようなＩＭＧＴナンバリングシステムにより決定される、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合し、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲを、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭら（１９９６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２：７３２〜７４５頁に従って決定することができる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１、４２２〜４３９頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）も参照されたい。特定の実施形態では、本開示は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭらの方法により決定される、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合し、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲを、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの妥協であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）により使用される、ＡｂＭ超可変領域を指す、ＡｂＭナンバリングスキームに従って決定することができる。特定の実施形態では、本開示は、ＡｂＭナンバリングスキームにより決定される、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合し、本明細書の表６に開示された抗体（例えば、ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＡＧＥＮ２０４１ｗ）のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０１１４】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列とを含み、それぞれのＣＤＲが、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との組合せ、ＩＭＧＴナンバリングシステム、ＡｂＭの定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義される、前記抗体を提供する。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域が、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む、前記抗体を提供する。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２から選択される１またはそれ以上の領域（例えば、これらの領域の２、３、４または５つ）は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来してもよい。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２は、全てヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来する。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２から選択される１またはそれ以上の領域（例えば、これらの領域の２、３、４または５つ）は、ヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来してもよい。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２は全てヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来する。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２から選択される１またはそれ以上の領域（例えば、これらの領域の２、３、４または５つ）は、ヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来してもよい。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２は全てヒトＩＧＨＶ３−２１生殖系列配列に由来する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２から選択される１またはそれ以上の領域（例えば、これらの領域の２、３、４または５つ）は、ヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来してもよい。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２は全てヒトＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ３−１１生殖系列配列に由来する。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７および配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８および配列番号４３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号７および配列番号８；配列番号７および配列番号４４；配列番号７および配列番号４５；配列番号３８および配列番号８；配列番号３８および配列番号４５；配列番号３９および配列番号４３；配列番号３９および配列番号４５；配列番号３９および配列番号４６；配列番号３９および配列番号４７；配列番号４０および配列番号４３；配列番号４０および配列番号８；配列番号４０および配列番号４４；配列番号４０および配列番号４５；配列番号４１および配列番号８；配列番号４１および配列番号４４；配列番号４１および配列番号４５；配列番号４１および配列番号４７；配列番号４２および配列番号４３；または配列番号４２および配列番号４５に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合について、それぞれ、配列番号７および配列番号８に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と交差競合する単離された抗体を提供する。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本開示は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と同じヒトＣＴＬＡ−４タンパク質上のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。
【０１２６】
任意のＩｇ定常領域を、本明細書に開示される抗体において使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｉｇ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２重鎖定常領域である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＩｇＧ領域は、例えば、野生型Ｆｃ領域を有する抗体、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢまたはＦＣＧＲ２Ｂとしても知られる）に対する増大した親和性を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）とＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の両方よりもＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）に対する選択的に増大した親和性を有する。ＣＤ３２Ｂに対する親和性の増大をもたらす配列変化は、当業界で公知であり、例えば、Ｍｉｍｏｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １０：５８９〜５９８頁（２０１３）、Ｃｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４５：３９２６〜３９３３頁（２００８）、およびＳｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：６８５〜６９１頁（２００９）（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＥＵ指数（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１））に従ってナンバリングされた、Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、およびＬ３２８Ｅからなる群から選択される突然変異、ならびにその組合せを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆ置換を含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＰ２３８ＤおよびＬ３２８Ｆ置換を含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＰ２３８Ｄ置換ならびにＥ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、およびその組合せからなる群から選択される置換を含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＰ２３８Ｄ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ置換を含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＧ２３６ＤおよびＳ２６７Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２３９ＤおよびＳ２６７Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＶ２６２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＶ２６４Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆを含むその断片を含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＩｇＧ領域は、例えば、野生型Ｆｃ領域を有する抗体、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増大した親和性を有する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性の増大をもたらす配列変化は、当業界で公知であり、例えば、Ｋｅｌｌｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１０５〜１１３頁（２０１４）、Ｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０３：４００５〜４０１０頁（２００６）、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１〜６６０４頁（２００１）（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＥＵ指数（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１））に従ってナンバリングされた、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、およびＰ３９６Ｌ、ならびにその組合せからなる群から選択される突然変異を含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２３９Ｄを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＴ２５６Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＫ２９０Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２９８Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＩ３３２Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＥ３３３Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＫ３３４Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＡ３３９Ｔを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＧ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを含むその断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、またはＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌを含むその断片を含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗体依存的細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ナチュラルキラー細胞媒介性細胞枯渇を開始させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ナチュラルキラー細胞が浸潤した腫瘍を処置するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗体依存的細胞性貪食（ＡＤＣＰ）活性を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マクロファージ媒介性細胞枯渇を開始させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マクロファージが浸潤した腫瘍を処置するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、腫瘍内調節性Ｔ細胞を選択的に枯渇させる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、活性化状態で、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に結合する活性化可能抗体である。ある特定の実施形態では、活性化可能抗体は、非切断状態の抗体の、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質への結合を阻害するマスキング部分と、抗体にカップリングした少なくとも１つの切断性部分とを含み、例えば、切断性部分は腫瘍微小環境中で富化されるプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。例示的な活性化可能抗体は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，５１３，３９０号および第８，５１８，４０４号、ならびに米国特許出願第２０１４／０２５５３１３号、第２０１４／００１０８１０号、第２０１４／００２３６６４号に記載されている。ある特定の実施形態では、活性化可能抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに結合する野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域よりも高い親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。
【０１３１】
５．３  医薬組成物
生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）中に所望の純度を有する本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む組成物が本明細書に提供される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントにとって非毒性的であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成性対抗イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、場合により、１またはそれ以上のさらなる予防剤または治療剤とを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に、有効量の本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片と、場合により、１またはそれ以上のさらなる予防剤または治療剤とを含む。一部の実施形態では、抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。本明細書に記載の医薬組成物は、ＣＴＬＡ−４活性を阻害し、がんまたは感染症のような状態を処置するのに有用であってよい。
【０１３３】
一態様では、医薬としての使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【０１３４】
一態様では、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【０１３５】
非経口調製物において使用される薬学的に許容される担体としては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、バッファー、酸化防止剤、局所麻酔剤、懸濁剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤ならびに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸化リンゲル注射液が挙げられる。非水性非経口ビヒクルとしては、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナッツ油が挙げられる。静菌性または静真菌性濃縮液中の抗微生物剤を、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む、複数用量容器中に包装された非経口調製物に添加することができる。等張剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。バッファーとしては、リン酸バッファーおよびクエン酸バッファーが挙げられる。酸化防止剤としては、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤および分散剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。薬学的担体としては、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；およびｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も挙げられる。
【０１３６】
医薬組成物を、対象への任意の投与経路のために製剤化することができる。投与経路の特定例としては、鼻内、経口、肺、経皮、皮内、および非経口が挙げられる。皮下、筋肉内または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も、本明細書で企図される。注射液を、液体溶液もしくは懸濁液としての従来の形態、注射前の液体中の溶液もしくは懸濁液にとって好適な固体形態で、またはエマルジョンとして調製することができる。また、注射液、溶液およびエマルジョンは、１またはそれ以上の賦形剤を含有する。好適な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。さらに、必要に応じて、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度増強剤、ならびに例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンのような他のそのような薬剤のような少量の非毒性補助物質も含有してもよい。
【０１３７】
抗体の非経口投与のための調製物は、即時注射可能な滅菌溶液、皮下注射錠剤を含む、使用直前に溶媒とすぐに混合される、凍結乾燥粉末のような滅菌乾燥可溶性生成物、注射可能な滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルとすぐに混合される滅菌乾燥不溶性生成物ならびに滅菌エマルジョンが挙げられる。溶液は、水性または非水性であってもよい。
【０１３８】
静脈内投与される場合、好適な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールおよびその混合物のような、増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０１３９】
抗体を含む局所混合物は、局部および全身投与について記載されるように調製される。得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであってよく、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、気泡、エアロゾル、潅注、スプレー、坐剤、包帯、皮膚パッチまたは局部投与にとって好適な任意の他の製剤として製剤化することができる。
【０１４０】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を、吸入などによる、局所適用のためにエアロゾルとして製剤化することができる（例えば、炎症疾患、特に、喘息の処置にとって有用なステロイドの送達のためのエアロゾルを記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号および第４，３６４，９２３号を参照されたい）。気道への投与のためのこれらの製剤は、単独で、またはラクトースのような不活性担体と共に、ネブライザのためのエアロゾルもしくは溶液の形態で、または送気のための超微粒粉末として存在してもよい。そのような事例では、製剤の粒子は、一実施形態では、５０μｍ未満、一実施形態では、１０μｍ未満の直径を有する。
【０１４１】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を、眼中、ゲル、クリーム、およびローションの形態などでの、皮膚および粘膜への局所適用のため、ならびに眼への適用のため、または嚢内もしくは髄腔内適用のためのような、局部または局所適用のために製剤化することができる。局所投与は、経皮送達のため、また、眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入療法のために企図される。抗体の鼻溶液を、単独で、または他の薬学的に許容される賦形剤と共に投与することもできる。
【０１４２】
イオントフォレーゼおよび電気泳動デバイスを含む、経皮パッチは、当業者には周知であり、抗体を投与するために使用することができる。例えば、そのようなパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、第６，２６１，５９５号、第６，２５６，５３３号、第６，１６７，３０１号、第６，０２４，９７５号、第６，０１０，７１５号、第５，９８５，３１７号、第５，９８３，１３４号、第５，９４８，４３３号、および第５，８６０，９５７号に開示されている。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよび他の混合物としての投与のために復元することができる凍結乾燥粉末である。それはまた、固体またはゲルとして復元および製剤化することもできる。凍結乾燥粉末は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的に許容されるその誘導体を、好適な溶媒中に溶解することによって調製される。一部の実施形態では、凍結乾燥粉末は、滅菌される。溶媒は、安定性を改善する賦形剤または粉末もしくは粉末から調製された、復元された溶液の他の薬学的成分を含有してもよい。使用することができる賦形剤としては、限定されるものではないが、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の好適な薬剤が挙げられる。溶媒はまた、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムのようなバッファー、または一実施形態では、ほぼ中性のｐＨの当業者には公知の他のそのようなバッファーを含有してもよい。その後の溶液の滅菌濾過、次いで、当業者には公知の標準的な条件下での凍結乾燥により、所望の製剤が得られる。一実施形態では、得られる溶液を、凍結乾燥のためのバイアルに分配する。それぞれのバイアルは、単一用量またはそれ以上用量の化合物を含有する。凍結乾燥粉末を、約４℃から室温までのような、適切な条件下で保存することができる。この凍結乾燥粉末の、注射用水による復元により、非経口投与における使用のための製剤が得られる。復元のために、凍結乾燥粉末を、滅菌水または他の好適な担体に添加する。正確な量は、選択される化合物に依存する。そのような量を、経験的に決定することができる。
【０１４４】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体および本明細書に提供される他の組成物を、処置される対象の特定の組織、受容体、または身体の他の領域に標的化されるように製剤化することもできる。多くのそのような標的化方法が当業者には周知である。そのような標的化方法は全て、本発明の組成物中での使用について本明細書で企図される。標的化方法の非限定例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号、および第５，７０９，８７４号を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍に標的化される。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために使用される組成物は、滅菌されていてもよい。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１４６】
５．４  使用方法
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用して対象を処置する方法を提供する。ＣＴＬＡ−４機能の阻害から利益を得る対象における任意の疾患または障害を、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用して処置することができる。本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、腫瘍に対する免疫系の寛容性を阻害するのに特に有用であり、したがって、がんを有する対象のための免疫療法として使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象は、免疫療法を以前に受けたことがある。ある特定の実施形態では、対象は、いかなる免疫療法も以前に受けたことがない。ある特定の実施形態では、がんは進行性または転移性のがんである。本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物を用いて処置することができるがんとしては、限定されるものではないが、固形がん（例えば、再発性または不応性固形がん、および進行性または転移性固形がん）、癌腫、肉腫、メラノーマ（例えば、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのメラノーマ）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、尿路上皮がん、卵巣がん、前立腺がん（例えば、転移性ホルモン不応性前立腺がんおよび進行性転移性前立腺がん）、膵臓がん、乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がん（例えば、再発性／不応性ＨＥＲ２＋乳がん））、頭頸部がん（例えば、再発性／不応性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、グリオーマ、悪性グリオーマ、多形成グリア芽細胞腫、脳転移、メルケルがん、胃がん、胃食道がん、腎細胞癌、ブドウ膜メラノーマ、結腸がん、子宮頸がん、リンパ腫（例えば、再発性または不応性リンパ腫）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、および多発性骨髄腫が挙げられる。ある特定の実施形態では、がんは、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物の腫瘍内投与を用いて処置される。本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物の腫瘍内投与を用いて処置することができるがんとしては、限定されるものではないが、固形腫瘍（例えば、進行性または転移性固形腫瘍）、頭頸部がん（例えば、再発性／不応性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、および乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がん（例えば、再発性／不応性ＨＥＲ２＋乳がん））が挙げられる。
【０１４７】
本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物を用いて処置することができるさらなるがんとしては、限定されるものではないが、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、基底細胞癌、膀胱がん、芽腫、脳転移、乳がん、バーキットリンパ腫、癌腫（例えば、腺癌（例えば、胃食道接合部の））、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん（結腸がんおよび直腸がん）、子宮内膜癌、食道がん、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃がん、胃食道接合部癌、胃腸がん、グリア芽細胞腫（例えば、新しく診断された、または再発した、例えば、多形成グリア芽細胞腫）、グリオーマ、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、肝転移、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、腎臓がん（例えば、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍）、喉頭がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病）、肝臓がん（例えば、肝癌およびヘパトーマ）、肺がん（例えば、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）、リンパ芽球性リンパ腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性脳腫瘍、転移性がん、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、神経芽腫、眼メラノーマ、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん（例えば、膵管腺癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性）、転移性、転移性ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性、アンドロゲン非依存性））、腎細胞癌（例えば、転移性）、唾液腺癌、肉腫（例えば、横紋筋肉腫）、皮膚がん（例えば、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ））、軟組織肉腫、固形腫瘍、扁平上皮癌、滑膜肉腫、精巣がん、甲状腺がん、移行上皮がん（尿路上皮細胞がん）、ブドウ膜メラノーマ（例えば、転移性）、いぼ状癌、外陰部がん、ならびにヴァルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、ヒト肉腫または癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌（例えば、転移性）、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、または網膜芽腫である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、急性リンパ球性白血病もしくは急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病もしくは慢性リンパ球性白血病）；ホジキン病；非ホジキン病；急性骨髄性白血病；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；未分化大細胞リンパ腫；眼内リンパ腫；濾胞性リンパ腫；小腸リンパ腫；または脾性辺縁帯リンパ腫である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、消化管間質腫瘍、頭部および／もしくは頸部がん（例えば、下咽頭扁平上皮癌、喉頭扁平上皮癌、中咽頭扁平上皮癌、もしくは喉頭いぼ状癌）、子宮内膜間質肉腫、マスト細胞肉腫、成人軟部肉腫、子宮肉腫、メルケル細胞癌、尿路上皮癌、脳転移を伴うメラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、肝臓転移を伴うブドウ膜メラノーマ、非小細胞肺がん、直腸がん、または骨髄異形成症候群である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、転移性である。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんとして、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、メラノーマ、気管支がん、膀胱がん、脳もしくは中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、子宮もしくは子宮内膜がん、口腔もしくは咽頭のがん、非ホジキンリンパ腫、甲状腺がん、腎臓がん、胆道がん、小腸もしくは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、扁平上皮がん、中皮腫、骨癌、胸腺腫（ｔｈｙｏｍａ）／胸腺癌、グリア芽細胞腫、骨髄異形成症候群、軟部組織肉腫、ＤＩＰＧ、腺癌、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、または膵臓がんが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんとして、癌腫（例えば、腺癌）、リンパ腫、芽腫、メラノーマ、肉腫、または白血病が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんとして、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、グリア芽細胞腫、グリオーマ、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝癌およびヘパトーマ）、膀胱がん、乳がん、炎症性乳がん、メルケル細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、膀胱がん、子宮内膜癌、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、唾液腺癌、腎臓がん（例えば、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍）、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、精巣がん、食道がん、漿液性腺癌または様々な型の頭頸部がんが挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんとして、線維形成性メラノーマ、炎症性乳がん、胸腺腫、直腸がん、肛門がん、または外科的に処置可能な、もしくは外科的に処置不可能な脳幹グリオーマが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。別の特定の実施形態では、がんは、多形成グリア芽細胞腫である。一部の実施形態では、多形成グリア芽細胞腫は再発性である。一部の実施形態では、多形成グリア芽細胞腫は、新しく診断されたものである。一部の実施形態では、多形成グリア芽細胞腫は、非メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する対象におけるものである。一部の実施形態では、多形成グリア芽細胞腫は、ベバシズマブ療法に対して不応性である。一部の実施形態では、多形成グリア芽細胞腫は、ベバシズマブ療法を受けたことがない対象におけるものである。
【０１５０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、転移性メラノーマ（例えば、抵抗性転移性メラノーマ）、転移性卵巣がん、または転移性腎細胞癌である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、イピリムマブに対して耐性であるメラノーマである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、ニボルマブまたはペンブロリズマブに対して耐性であるメラノーマである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、イピリムマブおよびニボルマブまたはペンブロリズマブに対して耐性であるメラノーマである。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における感染症を防止または処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。一実施形態では、感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、原生動物感染、または寄生虫感染）を防止および／または処置するための方法が本明細書で提供される。前記方法に従って防止および／または処置される感染は、本明細書で同定される感染性因子により引き起こされる。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその組成物は、対象に投与される唯一の活性薬剤である。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその組成物は、感染症の処置のために抗感染介入（例えば、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、または抗蠕虫剤）と共に使用される。
【０１５２】
本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物によって処置および／または防止することができる感染症は、限定されるものではないが、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、およびウイルスなどの感染性因子によって引き起こされる。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物によって処置および／または防止される感染症は、ウイルスによって引き起こされる。本明細書に記載の方法に従って防止および／または処置することができるウイルス疾患またはウイルス感染としては、限定されるものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ（例えば、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢ）、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス（ｈｕｎｔａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘のようなウイルス疾患の因子によって引き起こされるものが挙げられる。
【０１５３】
防止および／または処置することができる細菌感染としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・ビリダンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により引き起こされる感染が挙げられる。本明細書に記載の方法に従って防止および／または処置することができる細菌（例えば、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、黄色ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェカリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・ビリダンス、およびシュードモナス・エルギノーサ）により引き起こされる細菌疾患としては、限定されるものではないが、マイコバクテリア・リケッチア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、Ｓ．ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）（炭疽病）、破傷風、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム、百日咳（ｐｅｒｔｉｓｓｕｓ）、コレラ、伝染病、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌、およびレジオネラが挙げられる。
【０１５４】
本明細書に記載の方法に従って防止および／または処置することができる原生動物によって引き起こされる原生動物疾患または原生動物感染としては、限定されるものではないが、リーシュマニア症、コクシジウム症、トリパノソーマ住血吸虫またはマラリアが挙げられる。本明細書に記載の方法に従って防止および／または処置することができる寄生虫によって引き起こされる寄生虫疾患または寄生虫感染としては、限定されるものではないが、クラミジアおよびリケッチアが挙げられる。
【０１５５】
本明細書に記載の方法に従って防止および／または処置することができる真菌疾患または真菌感染としては、限定されるものではないが、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染、接合菌症、カンジダ乳腺炎、潜在性トリコスポロン血症を伴う進行性播種性トリコスポロン症、播種性カンジダ症、肺パラコクシジオイデス症、肺アスペルギルス症、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）肺炎、クリプトコックス髄膜炎、コクシジオイデス性髄膜脳炎および脳脊髄血管炎、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）感染、フサリウム・ケラティティス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、副鼻腔真菌症、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）心内膜炎、脛骨軟骨発育不全症、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）膣炎、口腔咽頭カンジダ症、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症、足白癬、皮膚カンジダ症、真菌性胎盤炎、播種性トリコスポロン症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、真菌性角膜炎、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）感染、真菌性腹膜炎、クルブラリア・ゲニクラタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）感染、ブドウ球菌性眼内炎、スポロトリクム症、および皮膚糸状菌症によって引き起こされるものが挙げられる。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、感染症は急性である。ある特定の実施形態では、感染症は慢性である。ある特定の実施形態では、感染症は、フラビウイルス、例えば、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ポーワッサンウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、黄熱病ウイルス、およびチクングンヤ熱ウイルスによって引き起こされる。ある特定の実施形態では、感染症は、エボラウイルスによって引き起こされる。ある特定の実施形態では、感染症は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる。ある特定の実施形態では、感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその医薬組成物は、ウイルス制御を促進する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその医薬組成物は、ウイルス保有を除去する。
【０１５７】
本発明は、一態様では、医薬としての使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物に関する。
【０１５８】
本発明は、一態様では、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体、および／または免疫療法（例えば、対象における抗原に応答したＴ細胞活性化を増加させる、がんを処置する、または感染症を処置もしくは防止するための免疫療法）のための医薬組成物または医薬を調製するための、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組み合わせたその使用に関する。
【０１５９】
本発明は、一態様では、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物に関する。
【０１６０】
本発明は、一態様では、腫瘍に対する免疫系の寛容性を阻害するため、および／またはがんを有する対象のための免疫療法のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物に関する。
【０１６１】
本発明は、一態様では、感染症の処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物に関する。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、これらの方法は、さらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤である。ある特定の実施形態では、チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＤＲ３抗体、アゴニスト抗ＴＮＦＳＦ１４抗体、およびアゴニスト抗ＣＤ２７抗体からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、チェックポイント標的剤は、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体である。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに対するアゴニストまたは腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーである。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤に関する。好ましい実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤またはチェックポイント標的剤である。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤に関する。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本発明は、感染症の処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）さらなる治療剤に関する。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＩＤＯ（インドールアミン−（２，３）−ジオキシゲナーゼ）および／またはＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）のような免疫調節酵素を標的とする化合物と共に対象に投与される。ある特定の実施形態では、そのような化合物は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐ；例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１０／００５９５８を参照されたい）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、インドキシモッド（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、およびＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からなる群から選択される。一実施形態では、化合物は、エパカドスタットである。別の実施形態では、化合物は、Ｆ００１２８７である。別の実施形態では、化合物は、インドキシモッドである。別の実施形態では、化合物は、ＮＬＧ９１９である。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）免疫調節酵素を標的とする化合物に関する。好ましい実施形態では、化合物は、ＩＤＯおよび／またはＴＤＯを標的とする。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）免疫調節酵素を標的とする化合物に関する。好ましい実施形態では、化合物は、ＩＤＯおよび／またはＴＤＯを標的とする。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ワクチンと共に対象に投与される。ある特定の実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンまたは熱ショックタンパク質に基づく病原体ワクチンである。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンと共に対象に投与される。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、全ての種にわたって遍在的に認められる高度に保存されたタンパク質のファミリーである。熱ショックまたは、毒素への曝露、酸化ストレスもしくはグルコース除去などの他の形態のストレスの結果として、それらの発現をはるかにより高いレベルまで強力に誘導することができる。分子量に従って５つのファミリーが分類されている：ＨＳＰ−１１０、−９０、−７０、−６０および−２８。ＨＳＰは、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）中で交差提示経路により免疫原性ペプチドを送達し、Ｔ細胞活性化をもたらす。ＨＳＰは、腫瘍特異的免疫を誘導することができる腫瘍関連抗原性ペプチド形成複合体のシャペロン担体として機能する。死滅しつつある腫瘍細胞からの放出の際に、ＨＳＰ−抗原複合体は抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれ、そこで、抗原はＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合するペプチドにプロセシングされ、抗腫瘍ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をもたらす。腫瘍調製物に由来するＨＳＰ複合体によって惹起される免疫は、それぞれの対象のがんによって発現されるユニークな抗原性ペプチドレパートリーを特異的に指向する。
【０１７０】
熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は、抗原性ペプチドと非共有的に複合体化された熱ショックタンパク質からなるタンパク質ペプチド複合体である。ＨＳＰＰＣは、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を惹起する。特定の実施形態では、抗原性ペプチドは、処置されるがんに対する抗原性を示す。ＨＳＰＰＣは、膜受容体（主にＣＤ９１）を介してＡＰＣによって、またはＴｏｌｌ様受容体への結合によって効率的に捕捉される。ＨＳＰＰＣの内在化は、ケモカインおよびサイトカイン産生と共にＡＰＣの機能的成熟をもたらし、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球ならびにＴｈ１およびＴｈ２媒介性免疫応答の活性化をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法において使用されるＨＳＰＰＣは、抗原性ペプチドと複合体化したストレスタンパク質のｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、またはｈｓｐ９０ファミリーに由来する１またはそれ以上の熱ショックタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣは、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレチクリン、またはその２つ以上の組合せを含む。
【０１７１】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、がんを処置するために、熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）、例えば、熱ショックタンパク質ペプチド複合体−９６（ＨＳＰＰＣ−９６）と共に対象に投与される。ＨＳＰＰＣ−９６は、抗原性ペプチドと複合体化した、９６ｋＤａの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、ｇｐ９６を含む。ＨＳＰＰＣ−９６は、対象の腫瘍から製造されたがん免疫療法であり、がんの抗原性「フィンガープリント」を含有する。ある特定の実施形態では、このフィンガープリントは、その特定の対象の特定のがん細胞にのみ存在するユニークな抗原を含有し、ワクチンの注射は、特定のがんフィンガープリントを有する細胞を認識および攻撃するように対象の免疫系を刺激することを意図する。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ−９６は、対象の腫瘍組織から産生される。特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ（例えば、ＨＳＰＰＣ−９６）は、処置されるがんまたはその転移の型の腫瘍から産生される。別の特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ（例えば、ＨＳＰＰＣ−９６）は、処置される対象にとって自己由来のものである。ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、非壊死性腫瘍組織である。ある特定の実施形態では、ワクチンレジメンを産生するために、少なくとも１グラム（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０グラム）の非壊死性腫瘍組織が使用される。ある特定の実施形態では、外科的切除後、非壊死性腫瘍組織は、ワクチン調製における使用の前に凍結される。一部の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ−９６は、精製技術によって腫瘍組織から単離され、濾過され、注射可能なワクチンのために調製される。ある特定の実施形態では、対象は、６〜１２用量のＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ−９６を投与される。そのような実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ−９６の用量を、最初の４用量については毎週、次いで、２〜８のさらなる用量については２週毎に投与することができる。
【０１７３】
本明細書に記載の方法に従って使用することができるＨＳＰＰＣのさらなる例は、以下の特許および特許出願：米国特許第６，３９１，３０６号、第６，３８３，４９２号、第６，４０３，０９５号、第６，４１０，０２６号、第６，４３６，４０４号、第６，４４７，７８０号、第６，４４７，７８１号、第６，６１０，６５９号に開示され、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本発明は、医薬としての使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）ワクチンに関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンまたは熱ショックタンパク質に基づく病原体ワクチンである。好ましい実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質に基づくウイルスワクチンである。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法における使用のための、（ａ）本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む本発明の医薬組成物ならびに（ｂ）ワクチンに関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンである。
【０１７６】
抗ＣＴＬＡ−４抗体およびさらなる治療剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント標的剤、ＩＤＯ阻害剤、および／またはワクチン）を、別の剤形として別々に、連続的に、または同時に投与することができる。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は非経口的に投与され、ＩＤＯ阻害剤は経口的に投与される。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、対象に腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、さらなる治療剤と共に対象に腫瘍内投与される。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、全身投与される。ある特定の実施形態では、対象は固形腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、対象は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有する。ある特定の実施形態では、対象はＨＥＲ２＋乳がんを有する。ある特定の実施形態では、全身投与されるさらなる治療剤は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）である。ある特定の実施形態では、全身投与されるさらなる治療剤は、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ）である。ある特定の実施形態では、全身投与されるさらなる治療剤は、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）である。ある特定の実施形態では、全身投与されるさらなる治療剤は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）である。ある特定の実施形態では、対象は固形腫瘍を有し、全身投与されるさらなる治療剤は抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）である。ある特定の実施形態では、対象は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有し、全身投与されるさらなる治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ）である。ある特定の実施形態では、対象はＨＥＲ２＋乳がんを有し、全身投与されるさらなる治療剤は抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）である。ある特定の実施形態では、対象は化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）をさらに受けていた。一態様では、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物が対象に腫瘍内投与される、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物と、場合により、さらなる治療剤とに関する。１つの好ましい実施形態では、さらなる治療剤は、対象に投与され、より好ましくは、さらなる治療剤は対象に全身投与される。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に開示される方法において使用される。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発された、ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６としても知られる、ニボルマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．により開発された、ラムブロリズマブまたはＭＫ−３４７５としても知られる、ペンブロリズマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＣｕｒｅＴｅｃｈにより開発された、ＣＴ−０１１としても知られる、ピジリズマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された、ＡＭＰ−５１４としても知られる、ＭＥＤＩ０６８０である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された、ＰＤＲ００１である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された、ＲＥＧＮ２８１０である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｐｆｉｚｅｒにより開発されたＰＦ−０６８０１５９１である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢｅｉＧｅｎｅにより開発されたＢＧＢ−Ａ３１７である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏおよびＴｅｓａｒｏにより開発されたＴＳＲ−０４２である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｈｅｎｇｒｕｉにより開発されたＳＨＲ−１２１０である。
【０１７９】
本明細書に開示される処置方法において使用することができる抗ＰＤ−１抗体のさらなる非限定例は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる以下の特許および特許出願に開示されている：米国特許第６，８０８，７１０号；米国特許第７，３３２，５８２号；米国特許第７，４８８，８０２号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，１１４，８４５号；米国特許第８，１６８，７５７号；米国特許第８，３５４，５０９号；米国特許第８，６８６，１１９号；米国特許第８，７３５，５５３号；米国特許第８，７４７，８４７号；米国特許第８，７７９，１０５号；米国特許第８，９２７，６９７号；米国特許第８，９９３，７３１号；米国特許第９，１０２，７２７号；米国特許第９，２０５，１４８号；米国特許出願公開第２０１３／０２０２６２３  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１３／０２９１１３６  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／０３５６３６３  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１６／００７５７８３  Ａ１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３３０９１  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０３６３９４  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６６４  Ａ２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０９８０４  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０６１０７  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０５８５７３  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０８５８４７  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／２００１１９  Ａ１号；ＰＣＴ公開第２０１６／０１５６８５  Ａ１号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２０８５６  Ａ１号。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が本明細書に開示される方法において使用される。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたアテゾリズマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＣｅｌｇｅｎｅおよびＭｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発されたデュルバルマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｍｅｒｃｋ  ＳｅｒｏｎｏおよびＰｆｉｚｅｒにより開発された、ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても知られるアベルマブである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発されたＭＤＸ−１１０５である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅおよびＧＳＫにより開発されたＡＭＰ−２２４である。
【０１８１】
本明細書に開示される処置方法において使用することができる抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定例は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる以下の特許および特許出願に開示されている：米国特許第７，９４３，７４３号；米国特許第８，１６８，１７９号；米国特許第８，２１７，１４９号；米国特許第８，５５２，１５４号；米国特許第８，７７９，１０８号；米国特許第８，９８１，０６３号；米国特許第９，１７５，０８２号；米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６  Ａ１号；米国特許出願公開第２００３／０２３２３２３  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２４９  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／０２２５４８３  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／０３４６２０８  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／０３５５１８４  Ａ１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１０００７９  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０２２７５８  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０５５８９７  Ａ２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０６１６６８  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１０９１２４  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１９５１６３  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０００６１９  Ａ１号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０３０３５０  Ａ１号。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体が、本明細書に開示される方法において使用される。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発されたＢＭＳ−９８６０１６である。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより開発されたＬＡＧ５２５である。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＧＳＫにより開発されたＧＳＫ２８３１７８１である。
【０１８３】
本明細書に開示される処置方法において使用することができる抗ＬＡＧ−３抗体の非限定例は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる以下の特許および特許出願に開示されている：米国特許第９，２４４，０５９号；米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／００９３５１１  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／０２８６９３５  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０  Ａ１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０４２２４６  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１１６５３９  Ａ１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／２００１１９  Ａ１号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２８６７２  Ａ１号。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体が本明細書に開示される方法において使用される。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂおよびＩｍＣｌｏｎｅにより開発されたセツキシマブ、ＡｂｇｅｎｉｘおよびＡｍｇｅｎにより開発されたパニツムマブ、ＣＭＩ  ＣｕｂａおよびＹＭ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたニモツズマブ、ＩｍＣｌｏｎｅにより開発されたネシツムマブ、Ｇｅｎｍａｂにより開発されたザルツムマブ、Ｔａｋｅｄａにより開発されたマツズマブ、Ｍｅｒｃｋ  ＳｅｒｏｎｏおよびＳｙｍｐｈｏｇｅｎにより開発されたＳｙｍ００４、ＧｌｙｃａｒｔおよびＲｏｃｈｅにより開発されたイムガツズマブ、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＲｏｃｈｅにより開発されたデュリゴツマブ、Ａｂｂｏｔｔにより開発されたデパツキシズマブ、Ａｂｂｖｉｅにより開発されたデパツキシズマブマホドチン、ＡｄｉｍａｂおよびＭｅｒｒｉｍａｃｋにより開発されたＭＭ−１５１、Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓにより開発されたＧＣ１１１８、ＡｍｇｅｎおよびＩｍｍｕｎｏＧｅｎにより開発されたＡＭＧ５９５、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅにより開発されたＣｅｔｕＧＥＸ、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎにより開発されたラプリツキシマブ、ＧｅｎｍａｂおよびＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより開発されたＪＮＪ−６１１８６３７２、Ｓｉｎｏｃｅｌｌｔｅｃｈにより開発されたＳＣＴ２００、Ｌｉｌｌｙにより開発されたＬＹ３１６４５３０、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｅｎｌｉｕｓにより開発されたＨＬＸ０７、またはＳｙｎｅｒｍｏｒｅにより開発されたＳＹＮ００４である。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体が本明細書に開示される方法において使用される。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＲｏｃｈｅにより開発されたトラスツズマブ、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＲｏｃｈｅにより開発されたトラスツズマブエムタンシン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたペルツズマブ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓにより開発されたエルツマキソマブ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓにより開発されたマルゲツキシマブ、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋにより開発されたＭＭ−１１１、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎにより開発されたＣＴ−Ｐ０６、Ｐｆｉｚｅｒにより開発されたＰＦ−０５２８００１４、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋにより開発されたＭＭ−３０２、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．により開発されたＳＢ３、Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＣＰ  Ｇｕｏｊｉａｎにより開発されたＣＭＡＢ３０２、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅにより開発されたＴｒａｓＧＥＸ、ＡｍｂｒｘおよびＺｈｅｊｉａｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより開発されたＡＲＸ７８８、Ｓｙｎｔｈｏｎにより開発されたＳＹＤ９８５、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂおよびｆ−ｓｔａｒにより開発されたＦＳ１０２、Ｂｉｏｃａｄにより開発されたＢＣＤ−０２２、Ａｍｇｅｎにより開発されたＡＢＰ９８０、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏにより開発されたＤＳ−８２０１ａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｅｎｌｉｕｓにより開発されたＨＬＸ０２、またはＢｉｏｃｏｎおよびＭｙｌａｎにより開発されたＣＡＮＭＡｂである。
【０１８６】
本明細書に記載の抗体または医薬組成物を、様々な経路によって対象に送達することができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、非経口、鼻内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、腫瘍内、結膜および皮下経路が挙げられる。また、例えば、吸入器またはネブライザ、およびスプレーとしての使用のためのエアロゾル化剤を含む製剤の使用による、肺投与を用いることもできる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または医薬組成物は、皮下的または静脈内的に送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または医薬組成物は、腫瘍内的に送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、腫瘍流入領域リンパ節に送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または医薬組成物は、局部投与（例えば、皮下投与）により送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、全身的に送達される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、局部的に送達される。
【０１８７】
一態様では、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物が腫瘍内的に対象に送達される、対象の腫瘍流入領域リンパ節に送達される、または局部投与（例えば、皮下投与）により対象に投与される、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物と、場合により、さらなる治療剤とに関する。
【０１８８】
状態の処置および／または防止において有効である抗体または組成物の量は、疾患の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。
【０１８９】
組成物中で用いられる正確な用量はまた、投与経路、およびそれにより引き起こされる感染または疾患の重症度に依存し、医師の判断およびそれぞれの対象の環境に従って決定するべきである。例えば、有効用量もまた、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態（年齢、体重および健康を含む）、患者がヒトであるか、もしくは動物であるかどうか、投与される他の医薬、または処置が予防的であるか、もしくは治療的であるかどうかに応じて変化してもよい。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。安全性および効能を最適化するために、処置用量は最適に滴定される。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇで対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、上記の用量で、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。
【０１９１】
一態様では、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物が、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇで、より好ましくは、３週毎に、対象に投与される、がんの処置のための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物と、場合により、さらなる治療剤とに関する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．３ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、１ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、３ｍｇ／ｋｇまたは約３ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、６ｍｇ／ｋｇまたは約６ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、１０ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇで、３週毎に対象に（例えば、静脈内注射により）投与される。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇで腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、上記の用量で３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０３ｍｇ／ｋｇまたは約０．０３ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．３ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、１ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、３ｍｇ／ｋｇまたは約３ｍｇ／ｋｇで３週毎に腫瘍内注射により対象に投与される。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または医薬組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇで局部投与（例えば、皮下投与）により対象に投与される。
【０１９６】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、またはウェスタンブロッティングのようなイムノアッセイを含む当業者には公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質レベルをアッセイすることもできる。好適な抗体アッセイ標識は、当業界で公知であり、グルコースオキシダーゼのような酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）のような放射性同位体；ルミノールのような発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。そのような標識を使用して、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を標識することがで
きる。あるいは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を認識する第２抗体を標識し、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片と共に使用して、ＣＴＬＡ−４タンパク質レベルを検出することができる。一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質レベルをアッセイおよび／または検出するための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用に関する。
【０１９７】
ＣＴＬＡ−４タンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、第１の生物試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質のレベルを、直接的に（例えば、絶対タンパク質レベルを決定するか、もしくは見積もることにより）または相対的に（例えば、第２の生物試料中の疾患関連タンパク質レベルと比較することにより）、定性的または定量的に測定するか、または見積もることを含むことが意図される。第１の生物試料中のＣＴＬＡ−４ポリペプチド発現レベルを、測定するか、または見積もり、標準が、障害を有さない個体から得られる第２の生物試料から取られるか、または障害を有さない個体の集団に由来するレベルを平均化することによって決定される、標準的なＣＴＬＡ−４タンパク質レベルと比較することができる。当業界で理解されるように、一度、「標準」ＣＴＬＡ−４ポリペプチドレベルが既知となれば、それを比較のための標準として繰り返し使用することができる。
【０１９８】
本明細書で使用される用語「生物試料」とは、ＣＴＬＡ−４を発現する可能性がある対象、細胞株、組織、または他の細胞源から得られる任意の生物試料を指す。動物（例えば、ヒト）から組織生検および体液を取得するための方法は、当業界で周知である。生物試料は、末梢単核血液細胞を含む。
【０１９９】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を、当業者には周知であり、標準的であり、本明細書に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの適用を含む、予後診断、診断、モニタリングおよびスクリーニング適用のために使用することができる。免疫系の状態および／または免疫応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアセスメントおよび評価のための予後診断、診断、モニタリングおよびスクリーニングアッセイおよびキットを使用して、免疫系の機能障害を有する、もしくは有すると疑われることが既知のものを含む患者の試料を評価するため、または予測される、もしくは所望の免疫系応答、抗原応答もしくはワクチン応答に関して評価するために予測、診断およびモニタリングすることができる。免疫系の状態および／または免疫応答のアセスメントおよび評価はまた、異なる薬剤または抗体もしくはその抗原結合断片に対する、薬物の臨床試験について、あるいは特定の化学療法剤または抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、その組合せの投与についての患者の好適性を決定するのにも有用である。この型の予後診断的および診断的モニタリングおよびアセスメントは、乳がんにおけるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）、Ｄａｋｏ）を使用して既に実用化されており、このアッセイはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を使用する抗体療法について患者を評価するためにも使用されている。ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用は、指向性細胞療法および免疫系の調節および免疫応答の放射イメージングを含む。
【０２００】
一態様では、本発明は、診断剤としての使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物に関する。
【０２０１】
一態様では、本発明は、免疫系の機能障害および／またはがんの予測、診断および／またはモニタリングのための方法における使用のための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または医薬組成物に関する。
【０２０２】
一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの対象の生物試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質レベルをアッセイおよび／または検出することにより、対象における免疫系の機能障害および／またはがんを予測、診断および／またはモニタリングするための、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用に関する。
【０２０３】
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を、生検試料の免疫組織化学分析において使用することができる。別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を使用して、ＣＴＬＡ−４のレベル、または膜表面上にＣＴＬＡ−４を含有する細胞のレベルを検出した後、そのレベルをある特定の疾患症状に関連付けることができる。本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、検出可能なレベルまたは機能的レベルを担持してもよい。蛍光標識を使用する場合、当業界で公知の現在利用可能な顕微鏡および蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ）または両方法手順の組合せを使用して、特異的結合メンバーを同定し、定量することができる。本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、蛍光標識を担持してもよい。例示的な蛍光標識としては、例えば、反応性およびコンジュゲート化プローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセインおよびテキサスレッド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ色素およびＤｙＬｉｇｈｔ色素が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび１８６Ｒｅのような放射性標識を担持してもよい。放射性標識を使用する場合、当業界で公知の現在利用可能な計測手順を使用して、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）への抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片の特異的結合を同定および定量することができる。標識が酵素である例では、当業界で公知の現在利用されている比色分析、分光測光、蛍光分光測光、電流測定または気体定量技術のいずれかによって、検出を達成することができる。試料または対照試料と、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片とを、抗体またはその抗原結合断片と、ＣＴＬＡ−４との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、これを達成することができる。抗体またはその抗原結合断片と、ＣＴＬＡ−４との間で形成される任意の複合体を、試料および対照中で検出および比較する。ＣＴＬＡ−４への本明細書に記載の抗体の特異的結合を考慮して、抗体またはその抗原結合断片を使用して、細胞表面上でのＣＴＬＡ−４発現を特異的に検出することができる。本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を使用して、免疫親和性精製によりＣＴＬＡ−４を精製することもできる。また、例えば、ＣＴＬＡ−４またはＣＴＬＡ−４／ＣＴＬＡ−４リガンド複合体の存在の程度の定量的分析のための試験キットの形態で調製することができるアッセイシステムも本明細書に含まれる。システムまたは試験キットは、標識された成分、例えば、標識された抗体と、１またはそれ以上のさらなる免疫化学試薬とを含んでもよい。
【０２０４】
一実施形態では、本発明は、（１）試料および場合により、対照試料と、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片とを、抗体またはその抗原結合断片とＣＴＬＡ−４との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、ならびに（２）試料および場合により、対照中で形成された複合体を検出および比較することを含む、生物試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質レベルをアッセイおよび／または検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関する。
【０２０５】
５．５  抗ＣＴＬＡ−４抗体を産生するポリヌクレオチド、ベクターおよび方法
別の態様では、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）抗原に特異的に結合する本明細書に記載の抗体またはその断片（例えば、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、大腸菌および哺乳動物細胞）中での組換え発現のためのそのようなポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。本明細書で提供される抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞中でのその効率的な発現のための発現ベクターが本明細書で提供される。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然の供給源（例えば、マウスまたはヒト）中に存在する他の核酸分子から分離されたものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような、「単離された」核酸分子は、組換え技術により産生される場合、他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まなくてもよい、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。例えば、「実質的に含まない」の用語は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）の他の材料、例えば、細胞材料、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆体および／または他の化学物質を有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子は単離または精製される。
【０２０７】
特定の態様では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合し、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびにＣＴＬＡ−４ポリペプチドへの結合についてそのような抗体と競合する（例えば、用量依存的様式で）か、もしくはそのような抗体のエピトープと同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供される。
【０２０８】
ある特定の態様では、本明細書に記載の抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の抗体のＶＬ  ＦＲおよびＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい（例えば、表１を参照されたい）。
【０２０９】
また、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種シグナル配列との置き換え、およびｍＲＮＡ不安定エレメントの除去により最適化される抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードするポリヌクレオチドも本明細書で提供される。ｍＲＮＡ中にコドン変化を導入すること、および／または阻害領域を除去することにより組換え発現のための抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメイン、もしくはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法を、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号；第６，１７４，６６６号；第６，２９１，６６４号；第６，４１４，１３２号；および第６，７９４，４９８号に記載の最適化方法を適応することによって実行することができる。例えば、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位および不安定エレメント（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチエレメント）を、組換え発現のためにＲＮＡの安定性を増加させるための核酸配列によりコードされるアミノ酸を変化させることなく突然変異させることができる。変化は、例えば、同一のアミノ酸のための代替的なコドンを使用して、遺伝子コードの縮重性を使用する。一部の実施形態では、保存的突然変異、例えば、元のアミノ酸と類似する化学構造および特性および／または機能を有する類似アミノ酸をコードする１またはそれ以上のコドンを変化させることが望ましい。そのような方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによりコードされる抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍またはそれ以上、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片の発現を増加させることができる。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片（例えば、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片（例えば、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、相補性）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片をコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２００５／００４８５４９号（例えば、段落７２〜７３）を参照されたい。
【０２１１】
当業界で公知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを取得し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載の抗体、例えば、表１に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列、および改変型のこれらの抗体を、当業界で周知の方法を使用して決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られるヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生成するような方法でアセンブリする。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  Ｇら（１９９４）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２〜６頁に記載）からアセンブリすることができ、簡潔に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いで、ＰＣＲによるライゲートしたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０２１２】
あるいは、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを、当業界で周知の方法（例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング法）を使用して、好適な供給源（例えば、ハイブリドーマ）に由来する核酸から生成することができる。例えば、既知の配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅を、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られるゲノムＤＮＡを使用して実施することができる。そのようなＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする配列を含む核酸を取得することができる。そのようなＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を取得することができる。増幅された核酸を、宿主細胞中での発現のため、およびさらなるクローニングのためにベクター中にクローニングして、例えば、キメラおよびヒト化抗体を生成することができる。
【０２１３】
特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能でないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成するか、または配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、もしくは例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングすることにより、もしくは好適な供給源（例えば、本明細書に記載の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞のような、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成された抗体ｃＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から取得することができる。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅された核酸を、当業界で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０２１４】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として役立ち得る。一度単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター中に入れた後、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞）、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中での抗ＣＴＬＡ−４抗体の合成を得ることができる。
【０２１５】
全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローン中でＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者には公知のクローニング技術を使用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインを、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクター中にクローニングし、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインを、軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。ある特定の実施形態では、ＶＨまたはＶＬドメインを発現させるためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変領域、定常ドメインのためのクローニング部位、およびネオマイシンのような選択マーカーを含む。ＶＨおよびＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１つのベクター中にクローニングすることもできる。次いで、当業者には公知の技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株中に同時トランスフェクトして、完全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定な、または一過的な細胞株を生成する。
【０２１６】
また、例えば、マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有的に連結することにより、ＤＮＡを改変することもできる。
【０２１７】
また、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする。
【０２１８】
ハイブリダイゼーション条件は、当業界で記載されており、当業者には公知である。例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、約４５℃、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、次いで、約５０〜６５℃での０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄を含んでもよい；高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、約４５℃、６ｘＳＳＣ中でのフィルターに結合した核酸へのハイブリダイゼーション、次いで、約６８℃、０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄を含んでもよい。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者には公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（編）（１９８９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ６．３．１〜６．３．６頁および２．１０．３頁に記載されており、参照されたい。
【０２１９】
ある特定の態様では、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する本明細書に記載の抗体（またはその抗原結合断片）ならびに関連するポリヌクレオチドおよび発現ベクターを発現する（例えば、組換え的に）細胞（例えば、宿主細胞）が本明細書で提供される。宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞中での組換え発現のための抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が本明細書で提供される。また、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒトまたはヒト化抗体）を組換え的に発現させるためのそのようなベクターを含む宿主細胞も本明細書で提供される。特定の態様では、宿主細胞からそのような抗体を発現させることを含む、本明細書に記載の抗体を産生させるための方法が本明細書で提供される。
【０２２０】
ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する本明細書に記載の抗体（例えば、完全長抗体、抗体の重鎖および／もしくは軽鎖、または本明細書に記載の単鎖抗体）の組換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含む。一度、本明細書に記載の抗体分子、抗体の重鎖および／もしくは軽鎖、またはその断片（例えば、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子の産生のためのベクターを、当業界で周知の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により産生させることができる。かくして、ヌクレオチド配列をコードする抗体または抗体断片（例えば、軽鎖もしくは重鎖）を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者には周知である方法を使用して、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖もしくは重鎖）をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子組換えが挙げられる。また、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体もしくはその断片の重鎖もしくは軽鎖可変領域、または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターも提供される。そのようなベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号および第ＷＯ８９／０１０３６号；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変領域を、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖と全軽鎖の両方の発現のためにそのようなベクター中にクローニングすることができる。
【０２２１】
従来の技術によって発現ベクターを細胞（例えば、宿主細胞）に導入した後、得られる細胞を従来の技術によって培養して、本明細書に記載の抗体またはその断片を産生させることができる。かくして、宿主細胞中での本明細書に記載の抗体もしくはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその断片、または本明細書に記載の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドであって、そのような配列の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、二重鎖抗体の発現のために、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、個別に、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞中で同時発現させることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体、またはその断片の重鎖と軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体、またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載の抗体、またはその断片の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターの２つの異なるベクターを含有する。他の実施形態では、第１の宿主細胞は、本明細書に記載の抗体、またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に記載の抗体の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。特定の実施形態では、第１の細胞により発現される重鎖／重鎖可変領域は、第２の細胞の軽鎖／軽鎖可変領域と結合して、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を形成した。ある特定の実施形態では、そのような第１の宿主細胞と、そのような第２の宿主細胞とを含む宿主細胞の集団が本明細書で提供される。
【０２２２】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖／軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むベクターの集団が本明細書で提供される。
【０２２３】
様々な宿主発現ベクター系を使用して、本明細書に記載の抗体分子を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を産生した後、精製することができるビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコード配列を形質転換またはトランスフェクトした場合、ｉｎ  ｓｉｔｕで本明細書に記載の抗体分子を発現することができる細胞でもある。これらのものとしては、限定されるものではないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターを形質転換した細菌（例えば、大腸菌およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））のような微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス・ピチア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を形質転換した植物細胞系（例えば、クラミドモナス・レインハルドティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のような緑藻類）；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を担持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１もしくはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０およびＢＭＴ１０細胞）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させるための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体を発現させるための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に、全組換え抗体分子の発現のための大腸菌などの細菌細胞、または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）を、組換え抗体分子の発現のために使用する。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと共に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ＭＫ  ＆  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ  （１９８６）  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１〜５頁；およびＣｏｃｋｅｔｔ  ＭＩら（１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（７）：６６２〜７頁）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞によって産生される。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導的プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。
【０２２４】
細菌系では、発現される抗体分子のために意図される使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のそのような抗体を産生させようとする場合、抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、抗体コード配列をｌａｃＺコード領域と読み枠を合わせたベクター中に個別にライゲートして、融合タンパク質を産生させることができる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ  Ｕ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ  （１９８３）  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２：１７９１〜１７９４頁）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  Ｓ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ  Ｍ  （１９８５）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：３１０１〜３１０９頁；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  Ｇ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＳＭ  （１９８９）  Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４：５５０３〜５５０９頁）などが挙げられる。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、次いで、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされる標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２２５】
昆虫系では、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用することができる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）中に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０２２６】
哺乳動物宿主細胞中で、いくつかのウイルスに基づく発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列にライゲートすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えにより、アデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）中への挿入は、感染した宿主中で生存でき、抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  Ｊ  ＆  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ  （１９８４）  ＰＮＡＳ  ８１（１２）：３６５５〜９頁を参照されたい）。また、挿入される抗体コード配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シグナルも必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確保するために所望のコード配列の読み枠と同調しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものであってもよい。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの含有により、発現の効率を増強することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇら（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４頁を参照されたい）。
【０２２７】
さらに、挿入される配列の発現を調節するか、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴および特異的機構を有する。発現される外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確保するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウスミエローマ細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞中で産生させる。
【０２２８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、フコース含量が減少しているか、またはフコース含量がない。そのような抗体を、当業者には公知の技術を使用して産生させることができる。例えば、抗体を、フコシレートの能力が欠損した、またはそれを欠く細胞中で発現させることができる。特定の例では、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの両対立遺伝子のノックアウトを有する細胞株を使用して、フコース含量が減少した抗体またはその抗原結合断片を産生することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、フコース含量が減少した抗体またはその抗原結合断片を産生するために使用することができるそのようなシステムの例である。
【０２２９】
組換えタンパク質の長期的、高収率の産生のために、安定な発現細胞を生成することができる。例えば、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を安定に発現する細胞株を遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供される細胞は、軽鎖／軽鎖可変領域と、重鎖／重鎖可変領域とを安定に発現し、これらは結合して本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を形成する。
【０２３０】
ある特定の態様では、ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、遺伝子操作された細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞に、その染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖させてフォーカスを形成させ、次いで、細胞株中でクローニングおよび増殖させることができる。この方法を有利に使用して、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片を発現する細胞株を遺伝子操作することができる。そのような遺伝子操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０２３１】
限定されるものではないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍら（１９７７）  Ｃｅｌｌ  １１（１）：２２３〜３２頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＥＨ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ（１９６２）  ＰＮＡＳ  ４８（１２）：２０２６〜２０３４頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  Ｉら（１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２２（３）：８１７〜２３頁）遺伝子などの、いくつかの選択系を使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子のための選択の基礎として使用することもできる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍら（１９８０）  ＰＮＡＳ  ７７（６）：３５６７〜７０頁；Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋら（１９８１）  ＰＮＡＳ  ７８：１５２７〜３１頁）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ  ＆  Ｂｅｒｇ  Ｐ  （１９８１）  ＰＮＡＳ  ７８（４）：２０７２〜６頁）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ  ＧＹ  ＆  Ｗｕ  ＣＨ（１９９１）  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７〜９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ｐ  （１９９３）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３２：５７３〜５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６〜９３２頁；およびＭｏｒｇａｎ  ＲＡ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ  （１９９３）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：１９１〜２１７頁；Ｎａｂｅｌ  ＧＪ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ（１９９３）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１（５）：２１１〜５頁）；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ＲＦら（１９８４）  Ｇｅｎｅ  ３０（１−３）：１４７〜５６頁）。組換えＤＮＡ技術の当業界で一般に公知の方法を日常的に適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ＮＣら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）、１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  Ｆら（１９８１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１〜１４頁に記載されている。
【０２３２】
抗体分子の発現レベルを、ベクター増幅によって増加させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ＣＲ  ＆  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ  ＣＣＧ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅される領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ＧＦら（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７〜６６頁）。
【０２３３】
宿主細胞に、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターとの、本明細書に記載の２つ以上の発現ベクターを同時トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。宿主細胞に、異なる量の２つ以上の発現ベクターを同時トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞に、以下の比のいずれか１つ：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０の第１の発現ベクターと第２の発現ベクターをトランスフェクトすることができる。
【０２３４】
あるいは、重鎖と軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、それを発現することができる単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、軽鎖を、重鎖の前に置いて、過剰の毒性遊離重鎖を回避するべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ＮＪ（１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５６２〜５６５頁；およびＫｏｈｌｅｒ  Ｇ（１９８０）  ＰＮＡＳ  ７７：２１９７〜２１９９頁）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。発現ベクターは、単シストロン性または多シストロン性であってもよい。多シストロン性核酸構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、または２〜５、５〜１０もしくは１０〜２０個の範囲の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードしてもよい。例えば、二シストロン性核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第１の遺伝子（例えば、本明細書に記載の抗体の重鎖）、および第２の遺伝子（例えば、本明細書に記載の抗体の軽鎖）を含んでもよい。そのような発現ベクター中、両遺伝子の転写をプロモーターにより誘導することができるが、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存的走査機構によるものであってよく、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ非依存的機構、例えば、ＩＲＥＳによるものであってもよい。
【０２３５】
一度、本明細書に記載の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、それを、免疫グロブリン分子の精製のための当業界で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、プロテインＡ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー後の特異的抗原に対するアフィニティによる）、遠心分離、分別溶解（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準的な技術により精製することができる。さらに、本明細書に記載の抗体を、本明細書に記載の、またはそうでなければ当業界で公知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を容易にすることができる。
【０２３６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、単離または精製される。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体の調製は、細胞材料および／または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、抗体が、それが単離または組換え産生される細胞の細胞成分から分離された抗体の調製物を含む。かくして、細胞材料を実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）および／または抗体のバリアント、例えば、異なる翻訳後改変型の抗体もしくは他の異なるバージョンの抗体（例えば、抗体断片）を有する抗体の調製物を含む。抗体が組換え産生される場合、それはまた、一般的には培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％未満である。抗体が化学合成により産生される場合、それは一般的には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それはタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、抗体のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の、目的の抗体以外の化学的前駆体または化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単離または精製される。
【０２３７】
ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する抗体またはその断片を、抗体の合成のための当業界で公知の任意の方法により、例えば、化学合成または組換え発現技術により産生させることができる。本明細書に記載の方法は、別途指摘しない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および改変、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当業界の技術の範囲内にある関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載されており、文献中で完全に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔら（１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７および年次更新）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７および年次更新）  Ｇａｉｔ（編）（１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）（１９９１）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂら（編）（１９９９）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０２３８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、例えば、ＤＮＡ配列の合成、遺伝子操作による作出を含む任意の手段によって調製、発現、作出または単離された抗体（例えば、組換え抗体）である。ある特定の実施形態では、そのような抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物または哺乳動物（例えば、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列）を含む。
【０２３９】
一態様では、本明細書に記載の細胞または宿主細胞を培養することを含む、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を作製する方法が本明細書で提供される。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞または宿主細胞（例えば、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を使用して、抗体またはその抗原結合断片を発現させること（例えば、組換え的に発現させること）を含む、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を作製する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、細胞は、単離された細胞である。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞中に導入されている。特定の実施形態では、方法は、細胞または宿主細胞から単離された抗体またはその抗原結合断片を精製するステップをさらに含む。好ましくは、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０２４０】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当業界で公知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）の第１１章、第５版、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０２４１】
ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはその組合せの使用を含む、当業界で公知の様々な技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当業界で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ  ＆  Ｌａｎｅ  Ｄ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ＧＪら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３  ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）に教示されたものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を産生させることができる。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体を、本明細書に記載の抗体またはその断片、例えば、そのような抗体の軽鎖および／または重鎖を外因的に発現する宿主細胞から組換え的に産生させることができる。
【０２４２】
特定の実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一の細胞（例えば、組換え抗体を産生するハイブリドーマまたは宿主細胞）によって産生される抗体であって、例えば、ＥＬＩＳＡまたは当業界で公知の、もしくは本明細書に提供される実施例に記載の他の抗原結合アッセイもしくは競合結合アッセイにより決定された場合、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する前記抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一特異的または多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）である。本明細書に記載のモノクローナル抗体を、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁に記載のハイブリドーマ法によって作製することができる、または例えば、本明細書に記載の技術を使用してファージライブラリーから、例えば、単離することができる。クローン細胞株およびそれにより発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当業界で周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）、第５版、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、上掲の第１１章を参照されたい）。
【０２４３】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生させ、スクリーニングするための方法は、当業界で日常的であり、周知である。例えば、ハイブリドーマ法では、マウス、またはヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターもしくはマカクザルのような他の適切な宿主動物を免疫して、免疫化のために使用されるタンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４））に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫することができる。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（編）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。さらに、ＲＩＭＭＳ（反復免疫多部位）技術を使用して、動物を免疫することができる（その全体が参照により組み入れられるＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥら（１９９７）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１〜９頁）。
【０２４４】
一部の実施形態では、マウス（またはラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、もしくはイヌのような他の動物）を、抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４））で免疫し、一度、免疫応答が検出されたら、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されたら、マウス脾臓を取り出し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を、任意の好適なミエローマ細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０に由来する細胞に、周知の技術によって融合させて、ハイブリドーマを形成させる。ハイブリドーマを、限界希釈によって選択およびクローニングする。ある特定の実施形態では、免疫したマウスのリンパ節を取り出し、ＮＳ０ミエローマ細胞と融合させる。
【０２４５】
かくして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する好適な培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０２４６】
特定の実施形態は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるミエローマ細胞を用いる。これらのミエローマ細胞株は、ＮＳ０細胞株またはＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞のようなマウスミエローマ株である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ（１９８４）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１〜５頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７））。
【０２４７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、当業界で公知の方法、例えば、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定する。
【０２４８】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（編）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、上掲）。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。
【０２４９】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から好適に分離する。
【０２５０】
本明細書に記載の抗体は、特異的なＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）を認識する抗体断片を含み、当業者には公知の任意の技術によって生成することができる。例えば、本明細書に記載のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）のような酵素を使用する、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができる。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２つの同一のアームの一方に対応し、重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインと対形成した完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域中のジスルフィド結合によって連結された抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。
【０２５１】
さらに、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を、当業界で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に展示させる。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、罹患した組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅させる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーと一緒に組み換え、ファージミドベクター中にクローニングする。ベクターを大腸菌中にエレクトロポレーションし、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む線維性ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインを、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え的に融合させる。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、抗原を用いて選択または同定することができる。本明細書に記載の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕら（１９９５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１〜５０頁；Ａｍｅｓ  ＲＳら（１９９５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡら（１９９４）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃ  Ｌら（１９９７）  Ｇｅｎｅ  １８７：９〜１８頁；Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ  ＆  Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ（１９９４）  Ａｄｖａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５７：１９１〜２８０頁；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４号；国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号、第ＷＯ９５／２０４０１号、および第ＷＯ９７／１３８４４号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示されたものが挙げられる。
【０２５２】
上記参考文献に記載されたように、ファージ選択後、ファージ由来抗体コード領域を単離し、これを使用して、ヒト抗体、または他の任意の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成し、例えば、以下に記載のような、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主中で発現させることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片のような抗体断片を組換え産生するための技術を、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ＲＬら（１９９２）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４〜９頁；Ｓａｗａｉ  Ｈら（１９９５）  ＡＭ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：２６〜３４頁；およびＢｅｔｔｅｒ  Ｍら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３頁に開示されたもののような当業界で公知の方法を使用して用いることもできる。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、鋳型、例えば、ｓｃＦｖクローンからＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者には公知のクローニング技術を使用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインを、ＶＨ定常領域を発現するベクター中にクローニングし、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインを、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬドメインを、必須の定常領域を発現する１つのベクター中にクローニングすることもできる。次いで、当業者には公知の技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株中に同時トランスフェクトして、完全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定な、または一過的な細胞株を生成する。
【０２５４】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分枝に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合したマウスまたはラットモノクローナル抗体の可変領域を含有してもよい。キメラ抗体を産生するための方法は、当業界で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜７頁；Ｏｉ  ＶＴ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４〜２２１頁；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤら（１９８９）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２頁；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、および第６，３３１，４１５号を参照されたい。
【０２５５】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体はまた、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含んでもよい。ヒト化抗体を、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体を、限定されるものではないが、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許第ＥＰ５９２１０６号および第ＥＰ５１９５９６号；Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１）  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８（４／５）：４８９〜４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭら（１９９４）  Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４頁；およびＲｏｇｕｓｋａ  ＭＡら（１９９４）  ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３頁）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３／１７１０５号；Ｔａｎ  Ｐら（２００２）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１１１９〜２５頁；Ｃａｌｄａｓ  Ｃら（２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３５３〜６０頁；Ｍｏｒｅａ  Ｖら（２０００）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０（３）：２６７〜７９頁；Ｂａｃａ  Ｍら（１９９７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（１６）：１０６７８〜８４頁；Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡら（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９（１０）：８９５〜９０４頁；Ｃｏｕｔｏ  ＪＲら（１９９５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ〜５９７７ｓ頁；Ｃｏｕｔｏ  ＪＲら（１９９５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（８）：１７１７〜２２頁；Ｓａｎｄｈｕ  ＪＳ（１９９４）  Ｇｅｎｅ  １５０（２）：４０９〜１０頁およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴら（１９９４）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３５（３）：９５９〜７３頁に開示された技術を含む、当業界で公知の様々な技術を使用して産生することができる。また、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４  Ａ１号（２００５年２月２４日）も参照されたい。
【０２５６】
多特異的（例えば、二特異的）抗体を作製するための方法は記載されており、例えば、米国特許第７，９５１，９１７号；第７，１８３，０７６号；第８，２２７，５７７号；第５，８３７，２４２号；第５，９８９，８３０号；第５，８６９，６２０号；第６，１３２，９９２号および第８，５８６，７１３号を参照されたい。
【０２５７】
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体を、当業界で周知の方法によって産生することができる。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ  ＆  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ（１９９９）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３１：２５〜３８頁；Ｎｕｔｔａｌｌ  ＳＤら（２０００）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １（３）：２５３〜２６３頁；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ（２００１）  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４（４）：２７７〜３０２頁；米国特許第６，００５，０７９号；ならびに国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号、第ＷＯ９４／２５５９１号および第ＷＯ０１／４４３０１号を参照されたい。
【０２５８】
さらに、ＣＴＬＡ−４抗原に特異的に結合する抗体を、順に使用して、当業者には周知の技術を使用して抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＮＳ  ＆  Ｂｏｎａ  ＣＡ（１９８９）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７〜４４４頁；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ  Ａ  （１９９１）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７（８）：２４２９〜２４３８頁を参照されたい）。
【０２５９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体と同じＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）のエピトープに結合する本明細書に記載の抗体は、ヒト抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）への結合から、本明細書に記載の抗体のいずれか１つを競合的に遮断する（例えば、用量依存的様式で）本明細書に記載の抗体は、ヒト抗体またはその抗原結合断片である。ヒト抗体を、当業界で公知の任意の方法を使用して産生することができる。例えば、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚性幹細胞中に無作為に、または相同組換えにより導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および送達領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞中に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えにより、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々に、または同時に非機能的にすることができる。特に、ＪＨ領域の同型欠失は、内因性抗体産生を防止する。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現する同型子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４）の全部または一部で正常な様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫されたトランスジェニックマウスから取得することができる。トランスジェニックマウスにより担持されるヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の間に再配列し、続いて、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ  Ｄ（１９９５）  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５〜９３頁を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９６／３４０９６号および第ＷＯ９６／３３７３５号；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照されたい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍ；米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（商��）（Ｋｉｒｉｎ）およびＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。
【０２６０】
ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に特異的に結合するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法を含む当業界で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、および第５，８８５，７９３号；ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５、および第ＷＯ９１／１０７４１号も参照されたい。
【０２６１】
一部の実施形態では、ヒト抗体を、マウス−ヒトハイブリドーマを使用して産生することができる。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を形質転換したヒト末梢血リンパ球を、マウスミエローマ細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス−ヒトハイブリドーマを産生し、これらのマウス−ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４））に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定することができる。そのような方法は、当業界で公知であり、例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ  Ｈら（２００４）  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４６：１９〜２３頁；Ｎａｇａｎａｗａ  Ｙら（２００５）  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １４：２７〜３１頁に記載されており、参照されたい。
【０２６２】
５．６  キット
また、本明細書に記載の１もしくはそれ以上の抗体、またはその医薬組成物もしくはコンジュゲートを含むキットも提供される。特定の実施形態では、本明細書で提供される１もしくはそれ以上の抗体またはその抗原結合断片のような、本明細書に記載の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬包装物またはキットが本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物と、本明細書に記載のもののような、任意の予防剤または治療剤とを含有する。ある特定の実施形態では、キットは、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）および／もしくはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）のようなＴ細胞分裂促進因子、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のようなＴＣＲ複合体刺激抗体を含有してもよい。場合により、そのような容器と共に、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局により処方された形態の通知書であって、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による認可を反映する前記通知書があってもよい。
【０２６３】
また、上記方法において使用することができるキットも提供される。一実施形態では、キットは、１またはそれ以上の容器中の、本明細書に記載の抗体、好ましくは、精製された抗体を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のキットは、対照として実質的に単離されたＣＴＬＡ−４抗原（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）を含有する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ＣＴＬＡ−４抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のキットは、抗体のＣＴＬＡ−４抗原への結合を検出するための１またはそれ以上のエレメントを含有する（例えば、抗体を、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物のような検出可能な基質にコンジュゲートするか、または第１抗体を認識する第２抗体を検出可能な基質にコンジュゲートすることができる）。特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、組換え産生された、または化学合成されたＣＴＬＡ−４抗原を含んでもよい。キット中に提供されるＣＴＬＡ−４抗原を、固相支持体に結合させることもできる。さらに特定の実施形態では、上記のキットの検出手段は、ＣＴＬＡ−４抗原が結合する固相支持体を含む。また、そのようなキットは、結合しないレポーター標識された抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体を含んでもよい。この実施形態では、抗体のＣＴＬＡ−４抗原への結合を、前記レポーター標識された抗体の結合によって検出することができる。
【０２６４】
一実施形態では、本発明は、生物試料中のヒトＣＴＬＡ−４のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイおよび／または検出のための本発明のキットの使用に関する。
【実施例】
【０２６５】
６．実施例
このセクション（すなわちセクション６）の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためではない。
【実施例１】
【０２６６】
６．１  実施例１：抗ＣＴＬＡ−４抗体の特徴付け
この実施例は、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体の特徴付けを記載する。特に、ＡＧＥＮ１８８４と命名された抗体は、以下に記載される多くのアッセイにおいて特徴付けられた。抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。抗体ＡＧＥＮ１８８４は、定常領域についてインフレームで可変領域をクローニングすることを容易にする、軽鎖定常ドメインにおける、Ｋａｂａｔによる番号付けでの、Ｔ１０９Ｓ置換（すなわち、野生型Ｆｃ配列に対して１０９位におけるスレオニンのセリンでの置換）を含むヒトＩｇＧ１抗体である。この突然変異は、抗体結合または機能に影響を及ぼさない保存的改変である。Ｋａｂａｔによる番号付けでの、１０９位におけるスレオニンを含む、ＡＧＥＮ１８８４ｗと命名された野生型対応物もまた生成された。抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、配列番号９３の重鎖および配列番号１３の軽鎖を含むヒトＩｇＧ１抗体である。
【０２６７】
６．１．１  表面プラズモン共鳴による動態解析
表面プラズモン共鳴を使用して、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００／Ｔ２００感度増強システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＦａｂ捕捉アッセイ）の親和性を決定した。ランニングバッファーとして１×ＤＰＢＳ（ＰＡＡ、Ｈ１５−００２）プラスＰ２０（０．０５％、Ｐｉｅｒｃｅ、２８３２０）を使用して、２５℃ですべての相互作用を分析した。固定化された抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆａｂ捕捉キット、２８９５８３２５）を介して、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シリーズＳ  ＣＭ５、ＢＲ−１００５−３０）のチップ表面に抗ＣＴＬＡ−４抗体（ランニングバッファー中で８μｇ／ｍｌ）を捕捉した。ＣＴＬＡ−４抗原の非特異的相互作用を検出するために、抗体捕捉はフローセル２においてのみ実行され、フローセル１においては捕捉抗体のみが固定化された。抗ＣＴＬＡ−４抗体の捕捉後、ＣＴＬＡ−４抗原を両方のフローセルに別々の量で流した。具体的には、組換えヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７２６８−ＣＴ）、組換えヒトＣＴＬＡ−４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、組換えカニクイザルＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０２１３−Ｃ０２Ｈ）、および組換えカニクイザルＣＴＬＡ−４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０２１３−Ｃ０８Ｈ）を１００ｎＭ、２５ｎＭおよび６．２５ｎＭで流した；ならびに、組換えマウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、＃４３４−ＣＴ）、組換えラットＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃８１０６９−Ｒ０２Ｈ）および組換えラットＣＴＬＡ−４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃８１０６９−Ｒ０８Ｈ）を４００ｎＭ、１００ｎＭおよび２５ｎＭで流した。ブランク曲線（ランニングバッファーのみ）もまた、各々の実行に含めた。流速１０μｌ／分で、会合を９０秒間行い、解離を６００秒間行った。各々の実験の後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００３−５５）で６０秒間３０μｌ／分で再生工程を実行した。結合曲線は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０．１を使用して、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルをＲｍａｘのグローバルフィットで適用して評価した。これらの値から、様々な抗原についてのＡＧＥＮ１８８４および参照抗ＣＴＬＡ−４抗体の親和性（ＫＤ）を算出し、図１Ａに示した。この調査において使用した組換え単量体カニクイザルＣＴＬＡ−４、マウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、および単量体ラットＣＴＬＡ−４は、品質管理アセスメントに失敗した。組換えマウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃタンパク質への抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合は、５０％の凝集を示したが、それはおそらく非特異的相互作用によるものであった。表面プラズモン共鳴分析を、後に、ＡＧＥＮ１８８４ｗについて３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭおよび１３．３ｎＭでの品質管理アセスメントを通過した組換えマウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃８１０６９−Ｒ０２Ｈ）を使用して２回繰り返した。ＡＧＥＮ１８８４ｗは、マウスＣＴＬＡ−４への検出可能な結合を示さなかった。
【０２６８】
６．１．２  ＣＴＬＡ−４を過剰発現する細胞への抗体結合
１０％  ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）（Ｇｉｂｃｏ）および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を維持した。抗体で染色する前に、細胞をＦＡＣＳバッファー（２％  ＦＢＳを含むＰＢＳ）で１回洗浄した。ＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照の連続希釈液を、１０μｇ／ｍｌで開始し、９６ウェル丸底プレート上の、２つに重複させたウェルに１００μｌの容量で加え、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、０．２５μｌのＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１００μｌのＦＡＣＳバッファーを用い、４℃で３０分間染色した。その後、細胞を２回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。サンプルをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で取得した。
ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析し、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してプロットした。図１Ｂに示すように、抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上に発現するヒトＣＴＬＡ−４に結合した。
【０２６９】
６．１．３  ＣＴＬＡ−４抗体選択性アッセイ
ＣＴＬＡ−４についてのＡＧＥＮ１８８４の選択性を、サスペンションアレイ技術をマルチプレックスアッセイとして使用して、他のメンバーの免疫グロブリンスーパーファミリーに対してアセスメントした。いくつかの免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを、標準ＮＨＳ−エステル化学反応を使用してＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）マイクロスフェアに化学的にカップリングさせた。ＡＧＥＮ１８８４の精製物質、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照をアッセイバッファー（Ｒｏｃｈｅ  １１１１２５８９００１）中に１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌまで希釈した。簡潔に述べると、各々の希釈液２５μｌを、９６ハーフウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＶＮ１２５０）中で１時間、５μｌのアッセイバッファー中の１５００  Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）マイクロスフェアと共に、暗所（２０℃、６５０ｒｐｍ）でインキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）マイクロスフェアを、組換えヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７２６８−ＣＴ）、組換えカニクイザルＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０２１３−Ｃ０２Ｈ）、ｒｈＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、＃３４２−ＣＤ−２００）、ｒｈＩＣＯＳ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、＃１６９−ＣＳ−０５０）、ｒｈＢＴＬＡ−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１１８９６−Ｈ０２Ｈ）、ｒｈＰＤ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１０８６−ＰＤ）、または組換えカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃ（社内で生産されたもの）と、ＣＯＯＨビーズ表面とのアミンカップリングを介してカップリングさせた。１：３希釈系列（０．０８〜５４０ｎｇ／ｍｌ）で、２つに重複させた２５μｌのヒトＩｇＧ１標準（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５１５４）を使用して標準曲線を作成した。Ｒ−ＰＥ（２．５μｇ／ｍｌ；ＪＩＲ  １０９−１１６−０９８、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ  Ｒａｐｉｄ  ＲＰＥ抗体コンジュゲーションキット、ＬＮＫ０２２ＲＰＥ）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２６０μｌおよびもう１時間のインキュベーション時間（２０℃、６５０ｒｐｍ）を使用して、検出を行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、プレートを分析した。４８μｌのサンプル容量で１ウェル当たり合計１００個のビーズを計数した。ＰＥ  ＭＦＩ値を使用して、上記の組換えタンパク質への特異的または非特異的結合を決定した。
【０２７０】
図１Ｃおよび１Ｄに示されるように、抗体ＡＧＥＮ１８８４は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４への特異的結合を実証した。試験した濃度では、他の列挙された免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーへの有意な結合は観察されなかった。
【０２７１】
６．１．４  活性化Ｔ細胞によって発現されるＣＴＬＡ−４に結合する抗体
次に、活性化ヒトＴ細胞の表面上に発現したＣＴＬＡ−４へのＡＧＥＮ１８８４ｗの結合を調べた。健康なドナーバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、ＬＬＣ）からのフィコール勾配密度分離を介して単離したヒトＰＢＭＣを、磁性ビーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、手付かずのＣＤ４＋  Ｔ細胞について濃縮した。その後、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の濃縮した集団を、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に、１×１０６個／ｍｌで再懸濁した。１００μｌ中に１×１０５個の細胞を、抗ＣＤ３抗体（３μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で予めコートした平底９６ウェルプレートの各々のウェルに播種し、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。５日目に、細胞をプールし、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して計数した。５００００個の細胞を、１０μｇ／ｍｌでの開始の連続希釈した、１００μｌのＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照を用いて、９６ウェル丸底プレート上に４℃で３０分間染色した。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、０．２５μｌのＰＥ標識マウス抗ヒトカッパ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡＰＣ−ＣＤ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１μｌを含む１００μｌのＦＡＣＳバッファーを用い、４℃で、３０分間染色した。その後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁した。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で取得した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＰＥの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ；ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析した。図２Ａに示すように、ＡＧＥＮ１８８４ｗは、活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の表面上に発現したＣＴＬＡ−４に結合した。
【０２７２】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＴＬＡ−４への抗体ＡＧＥＮ１８８４の結合特性を、フローサイトメトリー分析によって分析した。フィコール勾配を介して単離されたカニクイザルＰＢＭＣ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、オランダ）を、プレート結合８μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＢＤ、５５７０５２）および０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．１６−０２８９−８５）を使用して、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５８９１０６）存在下で３日間、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃および５％  ＣＯ２で活性化した。活性化後、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中に１：１００に希釈した抗ＣＤ８ａ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、９０４３−００８７−１２０）と共に３０分間、４℃で細胞をインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、製造業者のプロトコールに従って、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅキット（５１−２０９０ＫＺ）のＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ手順に適用した。９から０．０３７μｇ／ｍｌのＡＧＥＮ１８８４、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照の１：３の連続希釈液を、細胞に加えた。サンプルをＦＡＣＳバッファー２００μｌ中に懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。細胞内染色のために使用する場合には、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４は、活性化されたカニクイザルＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合を示した（図２Ｂ）。
【０２７３】
さらに、ヒト、カニクイザル（Ｉｎｄｏｃｈｉｎｅｓｅ）、ラット、またはマウスからの末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を、９６ウェル丸底組織培養プレート（１×１０５細胞／ウェル）のウェルの中に分注し、１０％ウシ胎仔血清、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で４日間、３７℃、５％ＣＯ２で刺激した。刺激後、細胞を洗浄し、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してＦｃ受容体を遮断し、抗体の非特異的結合を防止した。細胞を再び洗浄し、希釈したＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４抗体（クローンＯＫＴ４、ＧＫ１５、またはＷ３／２５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１００μｌに再懸濁した。暗所で４５分間、インキュベートした後、細胞を３回洗浄し、ＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセット（ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の取扱説明書に従って使用して、透過処理した。透過処理後、０．００００３μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまでの範囲での連続希釈の蛍光標識した（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標））ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはアイソタイプ対照抗体と共に、細胞を暗所で４５分間、４℃でインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）を使用したフローサイトメトリー分析の前に、細胞を２回洗浄した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０）を使用してデータを分析した。図２Ｃに示すように、抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、ＰＨＡ刺激ＣＤ４＋ヒトおよびカニクイザルＴ細胞に結合したが、ラットまたはマウスＴ細胞には結合しなかった。
【０２７４】
６．１．５  リガンド遮断活性
抗ＣＴＬＡ−４抗体がリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６の結合を遮断するか否かを決定するために、ランキングアッセイの設定を、サスペンションアレイ技術（図３Ａに模式図を示す）を使用して行った。５μｌのアッセイバッファー中の１２００Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、＃１４  ＬＣ１００１４−０１）を９６ウェル半領域プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．、３８８４）の各々のウェルに添加した。ビーズを、ＣＯＯＨビーズ表面とのアミンカップリングを介してＣＴＬＡ−４抗原（ｒｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ、＃７２６８−ＣＴ）とカップリングさせた。カップリング反応は、ＣＴＬＡ−４抗原５０μｇ／ｍｌおよび１ｍｌ当たり１×１０７個のＬｕｍｉｎｅｘビーズを使用して行った。標準的なＮＨＳエステル化学反応を使用し、抗原の第一級アミン基とビーズ表面上のカルボキシル基との間にカルボジイミド結合を形成させた（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｘｍａｐ  ｃｏｏｋｂｏｏｋ、第３章）。
【０２７５】
タンパク質の抗原カップリングは、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）の存在下でマイクロスフェアカルボキシル基をまずＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）試薬で活性化して、スルホ−ＮＨＳエステル中間体を形成する、単純な２段階カルボジイミド法である。その後、反応中間体を、標的分子（抗体、タンパク質またはペプチド）の第一級アミンとの反応によって置き換えて、アミド共有結合を形成させる。カップリングさせたビーズを、様々な濃度の抗ＣＴＬＡ−４抗体（ビーズを添加する前、１ウェル当たり２５μｌアッセイバッファー中に９０００ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌの濃度）と共に、２０℃および６５０ｒｐｍで１時間、インキュベートした。試験した抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＡＧＥＮ１８８４、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体であった。その後、１ｎＭの濃度での３０μｌのＲ−ＰＥ標識ＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１４０−Ｂ１）またはＣＤ８６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１４１−Ｂ２）を各々のウェルに添加して、６０μｌの全ウェル容量（１ウェル当たり１２００個のビーズおよび最終濃度０．５ｎＭの標識ＣＤ８０またはＣＤ８６）とした。リガンドの標識は、製造業者のプロトコールに従って、Ｒ−ＰＥ標識キット（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ、ＬＹＮＸ  Ｒａｐｉｄ  ＲＰＥ抗体コンジュゲーションキット、ＬＮＫ０２３ＲＰＥ）を使用して、社内で行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、プレートを分析した。１００個のビーズを、５０μｌのサンプル容量中、１ウェルごとに計数した。リガンドのみの対照の非競合シグナル（１００％結合）のＭＦＩ値を使用して、リガンドブロッキング能を算出した。ＰＥ検出可能なシグナルは、抗原に結合するリガンドを示した。ＡＧＥＮ１８８４は、５６ｎｇ／ｍｌの推定ＩＣ５０でＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０（図３Ｂ）およびＣＤ８６（図３Ｃ）の結合を阻害した。
【０２７６】
次に、組換えＣＤ８０−ＦｃおよびＣＤ８６−Ｆｃの、細胞表面に発現したＣＴＬＡ−４への結合を遮断する抗ＣＴＬＡ−４抗体の能力を調べた。簡潔に述べると、ＣＴＬＡ−４発現Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（０、０．００１、０．００４、０．０１２、０．０３７、０．１１、０．３３、０．９９、２．９６μｇ／ｍｌ）、続いて、固定濃度（０．６２５μｇ／ｍｌ）の蛍光標識ＣＤ８０−ＦｃまたはＣＤ８６−Ｆｃと共に、インキュベートした。ＣＤ８０−ＦｃまたはＣＤ８６−Ｆｃの結合を受けた細胞のパーセント率を、フローサイトメトリーによって決定した。図３Ｄに示すように、ＡＧＥＮ１８８４ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体は、ＣＴＬＡ−４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞へのＣＤ８０−ＦｃおよびＣＤ８６−Ｆｃの結合を阻害した。
【０２７７】
さらに、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗを、細胞表面に発現したＣＴＬＡ−４および組換えＣＤ８０またはＣＤ８６の事前形成した複合体を破壊するその能力について調べた。簡潔に述べると、細胞表面上にＣＴＬＡ−４を恒常的に発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を、連続希釈したＣＤ８０−ＦｃまたはＣＤ８６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０〜０．０００２μｇ／ｍｌ）と共に、９６ウェル丸底プレート内において、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、固定濃度（６７ｎＭ）の蛍光標識（ＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５）ＡＧＥＮ１８８４ｗまたは参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体を添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、細胞をＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ  Ａｅａｒ）１００μｌに再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーターを使用して、サンプルを分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０）を使用して、データを分析した。抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０またはＣＤ８６の事前形成された複合体を用量依存的に破壊した（図３Ｅ）。
【０２７８】
６．１．６  ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後のヒトＴ細胞における抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
初代ヒトＴ細胞における抗ＣＴＬＡ−４抗体の機能的活性を、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後にアセスメントした。ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中に凍結保存したＰＢＭＣ（１０５細胞／ウェル）を９６ウェルＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））に添加した。細胞を、３．２、１６、８０、４００、２０００、１００００、および５００００ｎｇ／ｍｌの漸増抗体濃度ならびに１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２および９７％湿度で、５日間培養した。試験した抗体は、ＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。清澄した上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−２の力価は、電気化学発光（ＭＳＤ）によって生成された。
【０２７９】
図４Ａに示されるように、ＡＧＥＮ１８８４ｗは、ＳＥＡ刺激の存在下で、Ｔ細胞のＩＬ−２産生を増加した。
【０２８０】
６．１．７  ＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーター細胞株における抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗの機能的活性を、ＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、さらに分析した。簡潔に述べると、ＣＤ２８を内因的に発現するヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を、ＩＬ−２プロモーターによって駆動され、細胞表面ＣＴＬＡ−４およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子操作した。遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株を、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する抗原提示細胞株（Ｒａｊｉ）と共に共培養した。マウス抗ヒトＣＤ３抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）誘発（シグナル１）を達成した；ならびに共刺激シグナル伝達（シグナル２）は、Ｒａｊｉ細胞上で発現されるＣＤ８０およびＣＤ８６によってトランスで提供された。Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、フローサイトメトリーによって確認した（図４Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株へのＴＣＲのクロスリンクはＩＬ−２発現を誘発し、Ｔ細胞活性化の代替マーカーであるルシフェラーゼ産生をもたらした。これらの２つの細胞株の共培養は、阻害性共受容体ＣＴＬＡ−４（Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現される）が、その天然リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６（Ｒａｊｉ細胞上で発現される）と会合し、Ｔ細胞活性化を阻害する結果となることが、ルシフェラーゼ発現の欠如によって実証された。この阻害は、漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗ（０〜３００μｇ／ｍｌ）を、添加することにより軽減されたが、それは、ＡＧＥＮ１８８４ｗがＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を遮断し、これらのリガンドと共刺激Ｔ細胞共受容体ＣＤ２８との相互作用をシフトさせることによる。ルシフェラーゼ発現をＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を使用して定量し、得られたデータを使用して、最大応答倍数値（ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較したＡＧＥＮ１８８４ｗでの増加倍数）を決定するために使用した。
【０２８１】
図４Ｃに示されるように、このＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、Ｔ細胞のＣＴＬＡ−４媒介阻害を用量依存的に解放した。
【０２８２】
６．１．８  抗ＣＴＬＡ−４抗体のアゴニスト活性の欠損
ＡＧＥＮ１８８４ｗがＣＴＬＡ−４フォワードシグナル伝達を媒介する可能性を評価した。初代ＣＤ３発現ヒトＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｎ  Ｔ細胞マイクロビーズキットを使用して末梢血単核細胞から単離し、ＴＣＲシグナル伝達を活性化するためにプレート結合抗ＣＤ３抗体（クローンＳＰ３４、１０μｇ／ｍｌ）と共に培養した。ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、可溶性またはプレート結合型（０．００３〜５０μｇ／ｍｌ）のいずれかにおけるＴＣＲ活性化に関連させて含めた。培養４日後およびＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標））との最後の６時間のインキュベーション後、抗ＣＤ３抗体（ＡＰＣ  Ｃｙ７、クローンＳＰ３４）、抗ＣＤ８抗体（ＰＥ  Ｃｙ７、クローンＳＫ１）、および抗ＣＤ４抗体（ＰｅｒｃＰ  Ｃｙ５．５、クローンＬ２００）を含む表面系統マーカーに対する蛍光色素コンジュゲート抗体で細胞を染色し、続いて、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で透過処理した。細胞内サイトカイン産生の評価のために、抗ＩＦＮγ抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７、クローンＢ２７）および抗ＴＮＦα抗体（ＰＥ、クローンＭａｂ１１）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを使用したフローサイトメトリー分析のために細胞を取得し、Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０でデータ解析を行った。
【０２８３】
漸増濃度の可溶性（図４Ｄ）またはプレート結合（図４Ｅ）ＡＧＥＮ１８８４ｗは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して、ＣＤ８＋  ＩＦＮγ＋  Ｔ細胞の百分率に影響を与えなかった。５０μｇ／ｍｌの高濃度では、ＡＧＥＮ１８８４ｗはＣＴＬＡ−４アゴニスト抗体として作用しなかった。
【０２８４】
６．１．９  抗ＬＡＧ−３抗体または抗ＰＤ−１抗体との組合せ
次に、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗを、抗ＬＡＧ−３アンタゴニスト抗体または抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体との相乗作用について、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で最適以下に刺激したＰＢＭＣを使用して調べた。簡潔に述べると、凍結保存されたヒトＰＢＭＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を、ノルモシン（商標）（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＃ａｎｔ−ｎｒ）および１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中に、１０５細胞／ウェルで、９６ウェルＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））内にプレーティングした。１０μｇ／ｍｌの可溶性ＡＧＥＮ１８８４ｗまたはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下、５μｇ／ｍｌの抗ＬＡＧ−３  ＩｇＧ１抗体ＡＧＥＮ１７４６、ニボルマブ（ロットＡＡＢ５７１９、Ｍｙｏｄｅｒｍ）、ペムブロリズマブ（ロット７００２６８８３００、Ｍｙｏｄｅｒｍ）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、またはＩｇＧ４アイソタイプ対照と共に、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、および９７％湿度で、５日間培養した。試験した抗体およびそれぞれのそれらの濃度を、図４Ｆに示す。このアッセイにおいて使用される抗ＬＡＧ−３抗体ＡＧＥＮ１７４６は、米国出願公開第２０１１／０１５０８９２号（参照によって本明細書に組み入れる）に提供される抗体２５Ｆ７の可変領域に基づいて生成された。ＡＧＥＮ１７４６は、配列番号９１のアミノ酸配列の重鎖および配列番号９２のアミノ酸配列の軽鎖を含む（表８）。清澄した上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＩＬ−２サイトカインを検出した。ＩＬ−２濃度の平均および標準偏差を算出した。
【０２８５】
【表１６】
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【０２８６】
図４Ｆに示されるように、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗと抗ＬＡＧ−３抗体ＡＧＥＮ１７４６、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの組合せは、単剤処理を超えて最適以下にＳＥＡスーパー抗原で刺激されたＰＢＭＣから、ＩＬ−２産生を増強した。
【実施例２】
【０２８７】
６．２  実施例２：抗ＣＴＬＡ−４抗体とＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域との比較
この実施例においては、ヒトＩｇＧ１抗体であるＡＧＥＮ１８８４ｗを、ヒトＩｇＧ２抗体、ＡＧＥＮ２０４１ｗに変換した。抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗは、ＡＧＥＮ１８８４ｗと同じ重鎖可変領域および同じ軽鎖を共有するが、ヒトＩｇＧ２定常領域を含む。抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗは、配列番号９４の重鎖配列および配列番号１３の軽鎖配列を含む。
【０２８８】
さらに、突然変異したＦｃ領域を有する多くのＡＧＥＮ１８８４ｗもまた、試験して、抗ＣＴＬＡ−４抗体のアンタゴニスト活性におけるＦｃγＲ相互作用の影響を調べた。ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａは、配列番号９５の重鎖配列および配列番号１３の軽鎖配列を含む。ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、配列番号９６の重鎖配列および配列番号１３の軽鎖配列を含む。ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、配列番号９７の重鎖配列および配列番号１３の軽鎖配列を含む。すべての残基は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【０２８９】
６．２．１  ＩｇＧ２定常領域を用いた抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合、リガンドブロッキングおよび選択性分析
抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体の親和性を、セクション６．１．１に記載したように表面プラズモン共鳴によって分析した。試験したＣＴＬＡ−４抗原は、組換えヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７２６８−ＣＴ）、組換えヒトＣＴＬＡ−４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、組換えカニクイザルＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０２１３−Ｃ０２Ｈ）、および組換えカニクイザルＣＴＬＡ−４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０２１３−Ｃ０８Ｈ）であった。親和性値を図５Ａに列挙した。
【０２９０】
次に、ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞へのＡＧＥＮ２０４１ｗの結合を、セクション６．１．２に記載のアッセイと同様のフローサイトメトリーアッセイで分析した。簡潔に述べると、ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、最初にＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体、またはＩｇＧ２アイソタイプ対照の連続希釈液で染色し、その後、ＡＰＣコンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で取得し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析した。ＡＧＥＮ２０４１ｗは、ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合した（図５Ｂ）。
【０２９１】
ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ２アイソタイプ対照のリガンドブロッキング活性を、セクション６．１．５に記載されるようにサスペンションアレイ技術を使用して調べた。図５Ｃに示すように、ＡＧＥＮ２０４１ｗは、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＴＬＡ−４への結合を阻害した。
【０２９２】
ＡＧＥＮ２０４１ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体の選択性を、セクション６．１．３に記載されるようなサスペンションアレイ技術を使用し、ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体と比較した。図５Ｄおよび５Ｅに示すように、ＡＧＥＮ２０４１ｗは、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４に特異的に結合する。関連するファミリーメンバー（組換えヒトＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、およびＰＤ−１；ならびに組換えカニクイザルＰＤ−１）に対する有意な結合は観察されなかった。
【０２９３】
６．２．２  ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後の、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を用いた抗ＣＴＬＡ−４抗体の、ヒトＴ細胞に対する効果
抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＡＧＥＮ２０４１ｗの機能的活性を、ＩＬ−２の誘導についての初代ヒトＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。このアッセイは、セクション６．１．６に記載されるように行った。簡潔に述べると、ヒトＰＢＭＣを、０．０１６、０．０８、０．４、２．０、１０、５０および２５０μｇ／ｍｌならびに１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の漸増抗体濃度の存在下で、５日間培養した。試験した抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＡＧＥＮ２０４１ｗ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、およびＩｇＧ２アイソタイプ対照であった。ＩＬ−２の力価は、電気化学発光（ＭＳＤ）によって決定した。
【０２９４】
図６Ａに示すように、ＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＡＧＥＮ２０４１ｗの両方は、ＳＥＡ刺激後にＩＬ−２産生を刺激した。
【０２９５】
６．２．３  ＩｇＧ２定常領域を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体のＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーター細胞株に対する効果
次に、抗ＣＴＬＡ−４抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗの機能的活性を、上に記載のものと同様のＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して評価した。簡単に説明すると、表面ＣＴＬＡ−４およびＩＬ−２プロモーターの下流にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、漸増濃度のＡＧＥＮ２０４１ｗまたはＩｇＧ２アイソタイプ対照を含むウェルに添加した。続いて、ＣＤ８０およびＣＤ８６を内因的に発現し、「Ｔ細胞活性化因子」を発現するように遺伝子操作されたＲａｊｉ細胞を、細胞培養液に添加した。「Ｔ細胞活性化因子」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を抗原非依存的に結合し、Ｔ細胞活性化をもたらす専有の細胞表面受容体である。遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株上でのＴＣＲの刺激は、ルシフェラーゼ産生をもたらすＩＬ−２発現を誘発する。このアッセイにＡＧＥＮ２０４１ｗを添加すると、（Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現された）ＣＴＬＡ−４の、（Ｒａｊｉ細胞上で発現された）天然リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との会合が遮断され、ルシフェラーゼ産生が増大する。ルシフェラーゼ濃度をＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）を使用して定量し、得られたデータを使用して、最大応答倍数値（抗体無しの基本ルシフェラーゼ活性と比較したＡＧＥＮ２０４１ｗでの増加倍数）を決定した。
【０２９６】
図６Ｂに示されるように、漸増濃度のＡＧＥＮ２０４１ｗにより、用量依存的にＴ細胞活性化が増強する結果となった。その一方、ＩｇＧ２アイソタイプ対照は、試験した最高濃度でさえもルシフェラーゼ発現を増強しなかった。
【０２９７】
６．２．４  安定クローンによって産生されたＡＧＥＮ１８８４ｗの特徴付け
この実施例においては、細胞表面に発現したＣＴＬＡ−４への結合について、および初代ヒトＰＢＭＣアッセイにおける機能的活性について、安定クローン１０５によって産生されたＡＧＥＮ１８８４ｗ（ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５）を調べた。
【０２９８】
ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞へのＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５の結合を、セクション６．１．２に記載のアッセイと同様のフローサイトメトリーアッセイにおいて分析した。簡潔に述べると、最初に、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｐｒｏｍｅｇａ）を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の連続希釈液で染色し、その後、ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で取得し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析した。ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５は、ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合した（図７Ａ）。
【０２９９】
ＩＬ−２産生を誘導するＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５の能力を、セクション６．１．６に記載のアッセイと同様のアッセイで調べた。簡潔に述べると、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２０μｇ／ｍｌのＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、ヒトＰＢＭＣを５日間、培養した。ＩＬ−２の力価は、電気化学発光（ＭＳＤ）によって決定した。図７Ｂに示されるように、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５は、ＳＥＡ刺激後のＩＬ−２産生を誘導した。
【０３００】
６．２．５  表面発現Ｆｃガンマ受容体に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合
ＣＨＯ細胞の表面上で発現するヒトのＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡへの抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合を、フローサイトメトリーによって測定した。簡潔に述べると、ヒトＦｃγＲＩＩＡＨ１３１、ＦｃγＲＩＩＢ、またはＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８をコードするｃＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、下記のＣＨＯ細胞株を生成した：ｒＣＨＯ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ＋、ｒＣＨＯ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ＋、およびｒＣＨＯ−ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ＋。０．００５６〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の抗体の用量滴定の結合を行い、フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）二次抗体により、一次抗体が検出された。フローサイトメトリーにより、サンプルを試験し、ＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を解析し、結合曲線を生成するために使用した。試験した抗体は、ＡＧＥＮ１８８４ｗ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体であった。この調査では２つの異なる増殖培地で生産されたＡＧＥＮ１８８４ｗを使用した：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．からの増殖培地ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）／Ｔｈｅｒｍｏ（ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ）およびＬｏｎｚａからの増殖培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２（ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ）。参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体は、ＡＧＥＮ１８８４ｗにおけるものとは異なるＩｇＧ１アロタイプを含む。ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、１０００μｇ／ｍｌでのみ試験した。
【０３０１】
図８Ａに示されるように、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯおよびＡＧＥＮ２０４１ｗは、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体が示すよりも、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１発現細胞への結合の増強を示した。同様に、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯおよびＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯのＦｃγＲＩＩＢ発現細胞への結合は、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体のものよりも強かった（図８Ｂ）。すべてのＩｇＧ１抗体、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ、および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体は、細胞表面上に発現したＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８と同様に結合した（図８Ｃ）。ＡＧＥＮ２０４１ｗは、ＩｇＧ１抗体が示すよりも、ＦｃγＲＩＩＢ（図８Ｂ）およびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８（図８Ｃ）へのより弱い結合を示した。
【０３０２】
６．２．６  組換えＦｃガンマ受容体への抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡへの抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ、ＡＧＥＮ２０４１ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の結合を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）を使用して測定した。
【０３０３】
ＦｃγＲＩＩＡへの結合のために、ＣＭ５チップに対する直接固定化法を、標準的なアミン化学反応を使用して適用した。組換えヒトＦｃγＲＩＩＡ−Ｈｉｓタンパク質を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）中で希釈して１０μｇ／ｍｌの濃度とし、５μｌ／分の流速での８分間の注入を使用して、フローセル２および４に固定化した。参照フローセルとして使用されたフローセル１および３は、偽カップリングした。すなわち、フローセル２および４のようにアミンカップリング試薬をフローセル上にＦｃγＲＩＩＡ無しで流した。ＨＢＳ−ＥＰ  Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファー中のトラスツズマブ１ｍｇ／ｍｌを各々のフローセル上に１００μｌ／分の流速で０．５分間注入するように使用して、固定化したＦｃγＲＩＩＡ表面の性能を試験した。
【０３０４】
ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合について、捕捉方法は、ＣＭ５チップに対し、固定化した抗テトラＨｉｓ抗体を介して行った。マウス抗Ｈｉｓ抗体を、酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）中で希釈して１０μｇ／ｍｌの濃度とし、１０μｌ／分の流速で５分間の注入を使用して、標準的なアミン化学反応によって、４つのフローセルすべてに固定化した。５μｌ／分の流速で２分間、１μｇ／ｍｌの濃度でＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｈｉｓの溶液を注入することによって、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｈｉｓタンパク質をチップ表面に捕捉した。
【０３０５】
分析前に、すべての試験抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファーにバッファー交換した。バッファー交換したサンプルおよび中間ストック溶液のタンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００分光光度計を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。
【０３０６】
各々のサンプルを、１０００μｇ／ｍｌで開始する２倍希釈についての８点濃度系列で分析した。Ｂｉａｃｏｒｅ制御ソフトウェアバージョン４．１およびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１を使用して、データを収集および処理した。用量応答曲線は、５つのパラメータロジスティック（５ＰＬ）モデルにフィッティングさせた。使用されたデフォルトの曲線加重係数は、以下の通りであった。
分散＝０．０２×応答（ＲＵ）１．８
【０３０７】
結合データもまた、ＳｔａｔＬＩＡバージョン３．２を使用して分析した。平行性は、ＳｔａｔＬＩＡのカイ２乗検定（Ｐ＜０．０１）を用いてアセスメントした。
【０３０８】
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡについてのＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−ＰｏｗｅｒＣＨＯ、ＡＧＥＮ２０４１ｗおよび参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体の平均応答（共鳴単位）を、それぞれ、図９Ａおよび９Ｂに示した。
【０３０９】
６．２．７  Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩＡレポーター細胞株に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
ＡＧＥＮ１８８４ｗが活性化Ｆｃガンマ受容体を介してＣＴＬＡ−４とシグナルを共役させる能力を、標的細胞と共にＦｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現するレポーター細胞株を使用して評価した（アッセイ模式図を図１０Ａに示す）。このアッセイにおいては、ヒトＣＴＬＡ−４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を標的細胞として使用した。Ｖ１５８変異体（高親和性）またはＦ１５８変異体（低親和性）のいずれかのＦｃγＲＩＩＩＡを安定に発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞、およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントをエフェクター細胞として使用した。アッセイは、製造業者の取扱説明書に従って行った。簡潔に述べると、ＣＴＬＡ−４を発現する標的細胞２５μｌ（２５，０００細胞）を、９６ウェル白色平底プレート中で４μｇ／ｍｌで開始する２５μｌの連続希釈抗体と混合した。その後、２５μｌ中に１５００００個のエフェクター細胞をウェルに添加し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。抗原が標的細胞の表面上に位置する、抗体／抗原複合体のＦｃγＲＩＩＩＡへの結合は、エフェクター細胞のプロモーター／レポーター構築物へシグナル伝達し、ルシフェラーゼ遺伝子転写をもたらす。次の日、プレートをインキュベーターから取り出し、３０分間、冷却した。７５μｌの室温Ｂｉｏ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各々のウェルに添加し、ルミネセンスをＥｎＶｉｓｏｎマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、相対光単位（ＲＬＵ）を記録した。試験した抗体は、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５またはＡＧＥＮ１８８４ｗ（図１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆおよび１０ＧについてはＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、ならびに図１０Ｄおよび１０ＥについてはＡＧＥＮ１８８４ｗ）；ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ（図１０Ｆおよび１０Ｇ）；ＡＧＥＮ２０４１ｗ（図１０Ｄおよび１０Ｅ）；参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体（図１０Ｂおよび１０Ｃ）；ならびにＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（図１０Ｂ〜１０Ｇ）であった。
【０３１０】
ＣＴＬＡ−４を発現する細胞に結合すると、ＩｇＧ１抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５は、ＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｖ１５８変異体（図１０Ｂ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｆ１５８変異体（図１０Ｃ）の両方を活性化した。予想した通りに、ＩｇＧ２抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗはＦｃγＲＩＩＩＡを介してシグナル伝達しなかった（図１０Ｄおよび１０Ｅ）。このレポーターアッセイの特異性を確認するために、ＡＧＥＮ１８８４ｗ（ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ）のＦｃ受容体（ＦｃＲ）−サイレント変異体を同じアッセイで試験したが、この突然変異体もまたＦｃγＲＩＩＩＡを介してシグナル伝達しなかった（図１０Ｆおよび１０Ｇ）。
【０３１１】
６．２．８  Ｆｃガンマ受容体ＩＩＡレポーター細胞株に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
次に、標的細胞（ヒトＣＴＬＡ−４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞）と共にＦｃγＲＩＩＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現するレポーター細胞株を使用して、ＡＧＥＮ２０４１ｗがＦｃγＲＩＩＡを介してＣＴＬＡ−４とシグナルを共役させる能力を評価した。高親和性１３１  Ｈ／Ｈ多型を有するＦｃγＲＩＩＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを、エフェクター細胞として使用した。簡潔に述べると、標的細胞（６×１０６細胞／ｍｌ）２５μｌを、９６ウェル白色アッセイプレートの、２つに重複させたウェルに、０．１μｇ／ｍｌで開始する連続希釈抗体２５μｌと混合した。試験した抗体は、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２抗体、およびＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体であった。その後、エフェクター細胞（６×１０６細胞／ｍｌ）２５μｌを各々のウェルに添加し、エフェクター対標的の比が１：１となるようにした。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２で２０時間、インキュベートした。このインキュベーションの後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を室温で解凍し、各々のウェルに７５μｌを添加した。５〜１０分以内に、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用しルミネセンスを測定した。バックグラウンドのルミネセンスを各々のサンプルの読み取り値から差し引き、補正した相対光単位（ＲＬＵ）を記録した。
【０３１２】
図１１に示されるように、ＣＴＬＡ−４を発現する細胞に結合すると、ＩｇＧ２抗体ＡＧＥＮ２０４１ｗはＦｃγＲＩＩＡＨ１３１を活性化した。
【０３１３】
６．２．９  抗ＣＴＬＡ−４抗体のアンタゴニスト活性に対するＦｃガンマ受容体結合の効果
この実施例では、抗ＣＴＬＡ−４抗体のアンタゴニスト活性に対するＦｃγＲ結合の効果を調べた。
【０３１４】
最初に、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５およびＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａの、細胞表面に発現したＣＴＬＡ−４への結合を、セクション６．１．２に記載のアッセイと同様のフローサイトメトリーアッセイにおいて比較した。簡潔に述べると、まず、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｐｒｏｍｅｇａ）を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の連続希釈液で染色し、その後、ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。サンプルをＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において取得し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析した。ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５およびＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａは、ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞に対する同様の結合を示した（図１２Ａ）。
【０３１５】
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能的活性に対するＦｃ受容体（ＦｃＲ）会合の依存性を、セクション６．１．６に記載のアッセイと同様のアッセイにおいてアセスメントした。簡潔に述べると、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２０μｇ／ｍｌのＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、ヒトＰＢＭＣを５日間、培養した。ＩＬ−２の力価は、電気化学発光（ＭＳＤ）によって決定した。
【０３１６】
ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａは、細胞表面に発現したＣＴＬＡ−４に対する同様の結合にもかかわらず（図１２Ａ）、初代ヒトＰＢＭＣアッセイにおけるＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５のものと比較して、ＩＬ−２分泌の増強の低下を示した（図１２Ｂ）。
【０３１７】
機能的活性のためのＦｃＲ会合の必要性のさらなる証拠として、ＦｃＲブロッカーの存在下または非存在下における、ＩＬ−２分泌を誘導する能力について、抗ＣＴＬＡ−４抗体を試験した。
【０３１８】
ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中の凍結保存したＰＢＭＣ（１０５細胞／ウェル）を、９６ウェルＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））に添加した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０μｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と共に、ＦｃＲブロッカーの存在下または非存在下において、３７℃、５％  ＣＯ２、および湿度９７％で、５日間、培養した。試験した抗ＣＴＬＡ−４抗体は、参照ＩｇＧ１抗体（図１３Ａ）およびＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５（図１３Ｂ）であった。ＦｃＲブロッカーは、抗ＣＤ１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３０２０１３）、抗ＣＤ３２（Ｒ＆Ｄ  ＃ＡＦ１３３０）および抗ＣＤ６４（Ｒ＆Ｄ  ＃ＡＦ１２５７）抗体（各々１０μｇ／ｍｌ）（図１３Ａ）または抗ＣＤ３２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃１６−０３２９−８１）のみ（図１３Ｂ）であった。図１３Ｂの対照群においては、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−１０５およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照もまた、図に示されるようにマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４００１２４）と共にインキュベートした。清澄した上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−２の力価は、電気化学発光（ＭＳＤ）によって生成された。
【０３１９】
ＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４に対する抗体（図１３Ａ）を使用した、またはＣＤ３２に対する抗体（図１３Ｂ）を使用した、ＦｃＲ遮断は、この初代ヒトＰＢＭＣアッセイにおいて抗ＣＴＬＡ−４抗体がＩＬ−２分泌を誘導する能力を減少させた。
【０３２０】
次に、突然変異したＦｃ領域を有するいくつかの抗ＣＴＬＡ−４抗体の機能的活性を、ＰＢＭＣを使用して試験した。簡潔に述べると、９６ウェルＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））内に、ノルモシン（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中に１０５細胞／ウェルで、凍結保存されたヒトＰＢＭＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）をプレーティングした。細胞を、１４２ｎｇ／ｍｌのＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０μｇ／ｍｌのＡＧＥＮ１８８４ｗ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｎ２９７Ａ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、またはＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体の存在下、３７℃、５％  ＣＯ２および９７％湿度で５日間、培養した。清澄した上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０３２１】
ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強する、Ｆｃ領域の３重突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを有するＡＧＥＮ１８８４ｗは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有するＡＧ
ＥＮ１８８４ｗよりも、多くのＩＬ−２分泌を刺激した（図１４）。
【０３２２】
６．２．１０  Ｆｃ媒介エフェクター細胞ポテンシャル
この例においては、ＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する能力について、抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗを分析した。簡単に説明すると、細胞表面上のＣＴＬＡ−４を恒常的に発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞（標的細胞）を、９６ウェル丸底プレート中に１×１０４細胞／ウェルで、培養した。漸増濃度のＡＧＥＮ１８８４ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体またはアイソタイプ対照抗体（すべて０〜１０μｇ／ｍｌで）および５×１０４個のＮＫ９２−ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞（エフェクター細胞）を標的細胞に添加した。３７℃および５％  ＣＯ２で６時間、インキュベートした後、細胞傷害性検出キット（ＬＤＨ）（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット；Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の取扱説明書に従って使用して、上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の測光定量により、標的細胞の溶解をアセスメントした。ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  マイクロプレートデータ取得および解析ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データを取得した。すべての抗体濃度を３つに重複させて試験した。
【０３２３】
図１５に示されるように、抗体ＡＧＥＮ１８８４ｗは、エフェクター細胞の存在下で、ＣＴＬＡ−４発現標的細胞の溶解を効果的に媒介した。
【０３２４】
６．２．１１  抗ＣＴＬＡ−４抗体のエピトープマッピング
ＡＧＥＮ１８８４ｗ（ＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｆａｂ）のＦａｂ断片とヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとの相互作用を、水素−重水素交換（ＨＤＸ）質量分析によって調査した。ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン単独またはＡＧＥＮ１８８４ｗ−Ｆａｂとの組合せで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水中で、１０倍量の酸化ジュウテリウム標識バッファーで希釈し、室温で様々な時間（０、６０、３００、１８００、および７２００秒）、インキュベートした。１容量の４Ｍグアニジン塩酸塩、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）バッファーを添加することによって、重水素の水素との交換をクエンチし、最終ｐＨは２．５であった。その後、サンプルをオンカラムでペプシン／プロテアーゼタイプＸＩＩ消化に供し、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。ＭＳ単独のモードで質量スペクトルを記録した。重水素取り込みの算出のために、与えられたペプチドについての質量スペクトルを、抽出されたイオンクロマトグラムピークにわたって組み合わせ、加重平均ｍ／ｚを算出した。天然ペプチドの質量（０分）から加重平均質量までの質量増加は、重水素取り込みのレベルに対応する。すべてのペプチドの交換時間にわたる重水素ビルドアップ曲線を、さらなる分析のためにプロットし、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェアを用いて比較した。
【０３２５】
大部分のＣＴＬＡ−４ペプチドは、抗ヒトＣＴＬＡ−４  Ｆａｂの存在下および非存在下で、同一または類似の重水素レベルを示した。しかしながら、いくつかのペプチドセグメントにおいては、Ｆａｂ結合に際して重水素取り込みが有意に減少することが見出された。本段落のすべての残基は、配列番号７７に従って番号付けされている。ヒトＣＴＬＡ−４をＦａｂに結合させた場合、Ｑ８０ＶＴ８２（配列番号７８）およびＹ１３５ＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩ１４９（配列番号７９）の２つの領域が、強い重水素保護となった。重水素の取り込みの最も強い減少がＹ１４０Ｌ１４１で観察されたが、それ故にこれはＣＴＬＡ−４上のＡＧＥＮ１８８４ｗのエピトープの主要な特徴であるように思われた。ＡＧＥＮ１８８４ｗが強く結合するヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４の配列の検査により、上に記載の２つの領域において、１４１位のロイシンのメチオニン置換を除いて、ほぼ完全な配列同一性が明らかになった（図１７Ａ）。その一方で、ＡＧＥＮ１８８４ｗは、Ｙ１４０ＬＧＩ１４３（配列番号８０）の４つの位置のうちの３つでヒトＣＴＬＡ−４と異なるマウスまたはラットのいずれかのＣＴＬＡ−４（図１７Ａ）に有意な程度で
結合しなかった（データは示さず）。さらなる選択性データは、ＡＧＥＮ１８８４ｗが、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４に対して高い特異性で結合するが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１を含む他の関連ＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないことを示した（データは示さず）。これらの関連タンパク質間の配列比較により、非ＣＴＬＡ−４タンパク質のすべてが、Ｙ１４０ＬＧＩ１４３（配列番号８０）配列（図１７Ｂ）において異なることが示され、ＡＧＥＮ１８８４ｗの結合に対するこのエピトープの重要性がさらに支持された。
【０３２６】
６．２．１２  カニクイザルにおけるＴ依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）調査
カニクイザルにおける８週間のＴＤＡＲ調査を行って、ＡＧＥＮ１８８４ｗおよびＡＧＥＮ２０４１ｗが、Ｂ型肝炎ワクチン（ＥＮＥＲＩＸ−Ｇ（登録商標））（ＨＢｓＡｇ）に対するＴ細胞依存性抗体応答を増強する能力を調べた。１日目（予備（ｐｒｉｍｅ））および２９日目（追加（ｂｏｏｓｔ））の後肢に、注入当たり１０μｇ（合計３０μｇ）で３回の皮下注射で、ＨＢｓＡｇワクチンを投与した。１日目および２９日目に、ワクチン抗原と共に、静脈内ボーラス注射（１０ｍｇ／ｋｇ）によりＡＧＥＮ１８８４ｗ（Ｎ＝６）またはＡＧＥＮ２０４１ｗ（Ｎ＝６）を２回投与した。同じ投与スケジュールを使用して、１つの動物対照群（Ｎ＝３）には、３ｍｇ／ｋｇの参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体と組み合わせてＨＢｓＡｇワクチンを与え、他の動物対照群（Ｎ＝６）には、対照物：２０ｍＭトリス塩酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％マンニトール、０．１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０と共にＨＢｓＡｇを与えたが、抗ＣＴＬＡ−４抗体は投与しなかった。８週間の調査の間、調査期間中の選択した時点（−２０日目、−７日目、＋１５日目、＋２９日目、＋４３日目、＋５９日目、および＋６９日目）で採取した血清サンプルについて、抗ＨＢｓＡｇ（ＩｇＧ）解析を行った。比色ＥＬＩＳＡアッセイによって、血清力価を測定した。
【０３２７】
ＡＧＥＮ１８８４ｗ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体、または対照物を与えられた動物は、第２のワクチン用量後、ピークとなって減退する、測定可能な抗体力価で正常な既往応答を示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。しかしながら、ＡＧＥＮ１８８４ｗ、ＡＧＥＮ２０４１ｗ、および参照抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の非存在下で与えられた対照物を超えて抗ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ応答を増強することが示された。
【実施例３】
【０３２８】
６．３  実施例３：抗ＣＴＬＡ−４抗体の特徴付け
この実施例においては、以下の１９種の抗ＣＴＬＡ−４抗体を結合およびリガンドブロッキングについて特徴付けた：ＡＧＥＮ１８８４、ＡＧＥＮ１８８５、ＡＧＥＮ１８８６、ＡＧＥＮ１８８７、ＡＧＥＮ１８８８、ＡＧＥＮ１８８９、ＡＧＥＮ１８９０、ＡＧＥＮ１８９１、ＡＧＥＮ１８９２、ＡＧＥＮ１８９３、ＡＧＥＮ１８９４、ＡＧＥＮ１８９５、ＡＧＥＮ１８９６、ＡＧＥＮ１８９７、ＡＧＥＮ１８９８、ＡＧＥＮ１８９９、ＡＧＥＮ１９００、ＡＧＥＮ１９０１、およびＡＧＥＮ１９０２。これらの抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を表６において開示した。図１９Ａおよび１９Ｂは、それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖の配列アラインメントを示す。
【０３２９】
６．３．１  抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合およびリガンドブロッキング分析
上に記載の１９種の抗ＣＴＬＡ−４抗体の親和性を、セクション６．１．１に記載したものと同様のアッセイで、表面プラズモン共鳴によって分析した。試験したＣＴＬＡ−４抗原は、組換えヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７２６８−ＣＴ）であった。抗ＣＴＬＡ−４抗体（ランニングバッファー中に６μｇ／ｍｌ）をＣＭ５センサーチップのチップ表面に捕捉した。１９種の抗体は、ｎＭの親和性で組換えヒトＣＴＬＡ−４に結合した（データは示さず）。
【０３３０】
１９種の抗ＣＴＬＡ−４抗体のリガンドブロッキング活性を、セクション６．１．５に記載したものと同様のアッセイで、サスペンションアレイ技術を使用して調べた。様々な濃度の抗ＣＴＬＡ−４抗体（ビーズを添加する前に３，０００ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、リガンドブロッキングを試験した。図２０Ａ〜２０Ｅに示されるように、１９種の抗ＣＴＬＡ−４抗体のすべてが、ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０およびＣＤ８６への結合を遮断した。
【０３３１】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および付属の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３３２】
本明細書中に引用されるすべての参考文献（例えば、刊行物または特許もしくは特許出願）は、各々の個別の参考文献（例えば、刊行物または特許もしくは特許出願）が具体的かつ個別に参照によってその全体がすべての目的のために本明細書に組み入れると示されているのと同じ程度に、参照によってその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内である。
【図１−１】
2018521638.tif 000018
【図１−２】
2018521638.tif 000019
【図２−１】
2018521638.tif 000020
【図２−２】
2018521638.tif 000021
【図３−１】
2018521638.tif 000022
【図３−２】
2018521638.tif 000023
【図４−１】
2018521638.tif 000024
【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
2018521638.tif 000032
【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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