(57)【要約】本発明は、それによって細胞が血液脳関門の構造および機能を模倣する条件下にて流体装置内で脳内皮細胞、ならびに任意選択でアストロサイトおよびニューロンを培養することに関する。マイクロ流体装置内でこのような細胞を培養すると、単独であっても、他の細胞と組み合わせてであっても、既存のシステムよりさらに成熟および／または分化が駆動される。上記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す。マイクロ流体チップ内で細胞を培養すると、単独であっても、他の細胞と組み合わせてであっても、既存のシステムよりさらに成熟および／または分化が駆動され得る。
2018533940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備える流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記底面に細胞を播種するステップと；ｃ）脳微小血管内皮細胞の成熟を支持する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、幹細胞由来細胞、幹細胞から分化した細胞、および初代細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹細胞から分化した前記細胞が、脳微小血管内皮細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞から分化した前記細胞が、ｉＢＭＥＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｄ）前記上面に幹細胞由来細胞または幹細胞から分化した細胞を播種して播種された細胞を創製し、アストロサイトおよびニューロンの少なくとも１種の成熟を支持する条件下で前記上面に播種された細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロンが、静置培養で培養される同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アストロサイトまたはその部分が、前記膜を遊出し、前記底面上の１個または複数の脳微小血管内皮細胞に接触する条件下で培養するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記上面に播種された幹細胞から分化した細胞が、ＥＺ球、ｉＮＰＣ、またはｉＭＮＰに由来するか、またはそれらから抽出される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）の前に、前記上面または底面の少なくとも一方が、１種または複数の細胞外マトリックスタンパク質で被覆される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記上面が、ラミニンで被覆される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記底面が、コラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆され、ラミニンを欠く、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記上面上で培養された前記細胞が、周皮細胞をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｃ）の前記条件が、ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流れが、脳微小血管内皮細胞の成熟を促進する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記流れが、前記脳微小血管内皮細胞の間で細胞間タイトジャンクションの形成を促進する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞間タイトジャンクションを検出するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞間タイトジャンクションが、ＴＥＥＲ測定によって検出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｅ）パッチクランプ測定、細胞外電気生理学的測定、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングの少なくとも１つによってニューロンまたはアストロサイト活性を測定するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞間タイトジャンクションが、細胞透過性アッセイによって検出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記脳微小血管内皮細胞が、マーカーＧｌｕｔ１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｃ）の前記培養が、少なくとも４日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｃ）の前記培養が、少なくとも７日間実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記流体装置が、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、培養培地が、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記膜が、拡張性および指向性神経突起成長を促進するナノパターン化表面を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に幹細胞由来脳細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
【請求項２８】
前記脳微小血管内皮細胞が、ニューロンを含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロ流体装置が、前記膜の前記上面と流体連通した第１のマイクロ流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２のマイクロ流体チャネルを備え、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルそれぞれが、前記膜と平行である表面を含み、それぞれが側壁を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記脳微小血管内皮細胞が、管腔を形成するために前記第２のマイクロ流体チャネルの前記平行面および側壁上で成長する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記脳微小血管内皮細胞が、マーカーＧｌｕｔ１を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｅ）の前記培養が、少なくとも４日間実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ステップｅ）の前記培養が、少なくとも７日間実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロ流体装置が、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、培養培地が、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１および第２のマイクロ流体チャネルが、ポリジメチルシロキサンを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
ステップｂ）の前に、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルが、湿りを促進する処理を受ける、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
湿りを促進する前記処理が、プラズマ処理、イオン処理、気相堆積、液相堆積、吸着、吸収、または１種もしくは複数の薬剤との化学反応からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞由来脳細胞が、湿ったラミニン上に播種される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
コラーゲンとフィブロネクチンとの前記混合物が、ステップｃ）の前に乾燥される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記マイクロ流体装置が、ステップｂ）の後、かつステップｃ）の前に格納される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロ流体装置が、２５℃未満の温度で格納される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロ流体装置が、冷蔵庫内に格納される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に誘導された運動ニューロン前駆細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
【請求項４４】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ＣＮＳ障害と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記流れが、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞の分化を促進する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ニューロンに分化する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記脳微小血管内皮細胞が、ＭＣＴ８特異的甲状腺ホルモン細胞−膜輸送体欠損症と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、凍結して貯蔵され、次いでステップｃ）の前に解凍される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含む、流体装置。
【請求項５２】
前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞が、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される、請求項５１に記載の流体装置。
【請求項５３】
前記膜の前記上面と流体連通した第１のマイクロ流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２のマイクロ流体チャネルをさらに備え、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルそれぞれが、前記膜と平行である表面を含み、それぞれが側壁を含む、請求項５１に記載の流体装置。
【請求項５４】
前記脳微小血管内皮細胞が、管腔を構成するために前記第２のマイクロ流体チャネルの前記平行面および側壁上に存在する、請求項５３に記載の流体装置。
【請求項５５】
ａ）膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含み、前記マイクロ流体装置は、前記膜の前記上面と流体連通した第１の流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２の流体チャネルをさらに備える、流体装置、ｂ）前記第１および第２の流体チャネルと流体連通した流体源であって、それによって前記細胞がある流量の流体に曝露される、流体源を備えるシステム。
【請求項５６】
前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞が、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
前記マイクロ流体チップが、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備える、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５８】
流動培地と接触したニューロンのマイクロ流体培養物。
【請求項５９】
前記ニューロンが、ｉＰＳＣ由来ニューロンである、請求項５８に記載のマイクロ流体培養物。
【請求項６０】
前記ｉＰＳＣ由来ニューロンが、運動ニューロンである、請求項５９に記載のマイクロ流体培養物。
【請求項６１】
前記ニューロンが、マイクロチャネル内で、またはマイクロ流体チップの膜上で培養される、請求項５８に記載のマイクロ流体培養物。
【請求項６２】
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、請求項６１に記載のマイクロ流体培養物。
【請求項６３】
血管細胞とのニューロンのマイクロ流体共培養。
【請求項６４】
前記血管細胞が、ｉＰＳＣ由来血管細胞である、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項６５】
前記ｉＰＳＣ由来血管細胞が、脳微小血管内皮細胞である、請求項６４に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項６６】
前記ニューロンが、ｉＰＳＣ由来ニューロンである、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項６７】
前記ｉＰＳＣ由来ニューロンが、運動ニューロンである、請求項６６に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項６８】
前記ニューロンがｉＰＳＣ由来ニューロンであり、前記血管細胞がｉＰＳＣ由来血管細胞である、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項６９】
前記血管細胞が、マイクロチャネル内で、またはマイクロ流体チップの膜上で前記ニューロンと共培養される、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養。
【請求項７０】
前記マイクロ流体チップが、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備え、前記ニューロンが、前記第１の表面上で培養され、前記血管細胞が、前記第２の表面上で培養される、請求項６９に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７１】
前記ニューロンおよび血管細胞の少なくとも一部が、互いに接触している、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７２】
前記ニューロンおよび血管細胞が、流動培養培地と接触している、請求項６３に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７３】
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、請求項７２に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７４】
前記ニューロンおよび血管細胞が、同じ人の幹細胞から産生される、請求項６８に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７５】
前記ニューロンおよび血管細胞が、同じ患者の幹細胞から産生される、請求項６８に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７６】
前記患者が、ＣＮＳ障害の症状を有する、請求項７５に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７７】
前記ＣＮＳ障害が、神経変性疾患である、請求項７６に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７８】
前記神経変性疾患が、ＡＬＳである、請求項７７に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項７９】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項７７に記載のマイクロ流体共培養物。
【請求項８０】
前記ＣＮＳ障害が、アルツハイマー病である、請求項７６に記載のマイクロ流体共培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、それによって細胞が血液脳関門および／または脊髄の構造および機能を模倣する条件下にて流体装置内で内皮細胞と一緒に脳細胞、特にアストロサイトを培養することに関する。良好な生存能および機能は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、パッチクランプ、または他の試験評価基準によってであろうとそうでなくても、関門完全性および生理機能の測定を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液脳関門は、重要な臨床的に関連のあるものである。血液脳関門の機能不全が神経血管単位を変性させるためだけでなく、神経学的障害を処置するはずである薬物が、血液脳関門を透過することに失敗することが多いためでもある。疾患および医療におけるその重要性から、制御されたやり方で脳内皮微小環境の様相を再現するヒト血液脳関門の予測モデルを有することは非常に有利であるはずである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
本発明は、それによって細胞が血液脳関門（ＢＢＢ）および／または脊髄の１つまたは複数の構造的または機能的特徴（例えば、タイトジャンクション）を模倣する条件下にて（本明細書に記載の）マイクロ流体チップなどのマイクロ流体装置内で内皮細胞（好ましくは脳関連内皮細胞）、任意選択でアストロサイト、任意選択でニューロン、および任意選択で周皮細胞を培養することに関する。良好な生存能および機能は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、電気生理学的方法（例えば、パッチクランプを含む）、または他の試験評価基準によってであろうとそうでなくても、関門完全性および生理機能の測定を可能にする。実際に、マイクロ流体チップ上で成熟することを可能にされた運動ニューロンなどのニューロン細胞は、より成熟した電気生理学的特性（例えば、活動電位パターン）を示し、より進んだ、または加速された成熟を示す。よって、一実施形態では、本発明は、流動培地と接触したｉＰＳＣ由来神経前駆細胞または（代わりに）ニューロンのマイクロ流体培養物（例えば、マイクロ流体設定における、例えば、マイクロチャネルおよび／またはマイクロ流体装置などにおける培養物）を企図する。一実施形態では、ｉＰＳＣ由来神経前駆細胞または（代わりに）ニューロンは、単独で（他の細胞型を伴うことなく）培養される。一実施形態では、前記ニューロンは、ｉＰＳＣ由来ニューロンである。一実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ニューロンは、運動ニューロンである。一実施形態では、前記ニューロンは、マイクロチャネル中で、またはマイクロ流体チップの膜上で培養される。一実施形態では、前記マイクロ流体チップは、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備え、前記ニューロンは、前記第１または第２の表面上で培養される。一実施形態では、前記培養は、１０、１２、２０、２４、３０、３６日間、またはそれより多く実施される。一実施形態では、前記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す。マイクロ流体チップ内で細胞を培養すると、単独であっても、他の細胞と組み合わせてであっても、既存のシステムよりさらに成熟および／または分化が駆動される。
【０００４】
本発明がニューロンおよびＢＭＥＣのより成熟した表現型を査定する１つのタイプの試験または測定のみに限定されることは意図されていない。一実施形態では、遺伝子発現、Ｃａ２＋フラックスイメージング、免疫蛍光染色、および／または組織形態が、より成熟したニューロン、ＢＭＥＣ、および／またはアストロサイトの証拠として査定される。
【０００５】
運動ニューロンなどのニューロン（またはこれらの前駆体）が脳微小血管内皮細胞などの関連した血管細胞とマイクロ流体チップ上で共培養される（すなわち、一緒に培養される）場合、分化、成熟、および／またはコンディショニングに対するより大きい効果さえ観察される。よって一実施形態では、本発明は、ｉＰＳＣ由来神経前駆細胞または（代わりに）ニューロンの血管細胞とのマイクロ流体共培養物、例えば、ニューロンのｉＰＳＣ由来血管系（例えば、前記血管細胞はｉＰＳＣ由来血管細胞である）とのマイクロ流体共培養物を企図する。一実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来血管細胞は、脳微小血管内皮細胞である。一実施形態では、前記ニューロンは、ｉＰＳＣ由来ニューロンである。一実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ニューロンは、運動ニューロンである。一実施形態では、前記血管細胞は、マイクロチャネル中で、またはマイクロ流体チップの膜上で前記ニューロンと共培養される。一実施形態では、前記マイクロ流体チップは、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備え、前記ニューロンは前記第１の表面上で培養され、前記血管細胞は前記第２の表面上で培養される。一実施形態では、前記培養（例えば、流動条件下）は、１０、１２、２０、２４、３０、３６日間、またはそれより多く実施される。一実施形態では、前記ニューロンおよび血管細胞の少なくとも一部は、互いに接触している（直接的な物理的接触によってであっても、間接的な細胞間コミュニケーションによってであっても）。一実施形態では、前記ニューロンおよび血管細胞は、流動培養培地と接触している（例えば、細胞は、表面に接着され、培地は、制御された速度で細胞上を流れ、栄養分を運び、老廃物を除去する）。一実施形態では、前記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す。
【０００６】
マイクロ流体チップ培養により、運動ニューロン（ＭＮ）を含むｉＰＳＣ由来ニューロンの機能が増大し、加速される。ｉＢＭＥＣと共培養すると、公知の血管相互作用経路が再創製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟がさらに増大する。細胞がマイクロ流体チップ上でより完全に分化および成熟するという事実は、チップがより慣例的な培養システム（例えば、トランスウェル培養および他の静的なシステム）より良好な培養ツールであることを示し、ｉｎ  ｖｉｖｏで何が起こっているか（病態において何が起こっているかを含む）のより良好なモデルを提供する。よって、一実施形態では、本発明は、ニューロン、より具体的には、運動ニューロン、より典型的には、誘導された運動ニューロンの、脳微小血管内皮細胞、より典型的には、誘導された脳微小血管内皮細胞との共培養を含むマイクロ流体装置またはチップを企図する。一実施形態では、本発明は、マイクロ流体装置またはチップ上で共培養を行う方法であって、ニューロン、より具体的には、運動ニューロン、より典型的には、誘導された運動ニューロン、および脳微小血管内皮細胞、より典型的には、誘導された脳微小血管内皮細胞を、マイクロ流体装置またはチップ内に導入するステップと、前記細胞上に培地を流すステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、前記培養（例えば、流れ条件下で）は、１０、１２、２０、２４、３０、３６日間、またはそれより多く実施される。一実施形態では、マイクロ流体チップは、第１および第２の表面を有する多孔質膜（または他の多孔質部材）によって分離された（少なくとも部分的に）２つのマイクロチャネルを備え、運動ニューロン、より典型的には、誘導された運動ニューロンは、多孔質膜（または他の多孔質部材）の第１の側（例えば、上面）上で培養され、脳微小血管内皮細胞、より典型的には、誘導された脳微小血管内皮細胞は、多孔質膜（または他の多孔質部材）の第２の表面（例えば、底面）上で培養される。血管血流は、マイクロチャネル内で培地を流すことによって再創製することができる。
【０００７】
いずれの特定の機序にも本発明を限定するように意図していないが、ｉＰＳＣ由来脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）と接触して（直接接触していることを含む）成長したニューロン前駆細胞およびニューロンは、マイクロ流体チップ上でより完全に成熟すると考えられる。それだけに限らないが、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達、ＥＣＭ（タンパク質）キュー、物質移動（流れに起因する）、ならびに機械的な力（流体せん断を含む）を含めた、この結果に寄与する微小環境内の様々な成分が存在し得る。重要なことに、データは、分化、成熟、および／またはコンディショニングの改善を、外因性因子を加えることなく実現することができることを示す。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、電気生理学的方法およびトランスクリプトミクスによって測定した場合にニューロン生理機能を増強するためのニューロンおよび脳関連血管細胞の接触、より好ましくはマイクロ流体チップ上のｉＭＮおよびｉＢＭＥＣの直接接触を企図する。チップは、ｄｉＭＮ電気生理学的成熟を加速することが見出された。さらに、ニューロンの高度に複雑な自発的活動がチップ内で観察される。実際に、神経組織は、チップ内で、かつＢＭＥＣとの共培養においてより成熟した電気生理学的特性を有する。一部の実施形態では、より発達した電流がチップ上のニューロン内で観察される。好適な実施形態では、ｉＭＮおよびｉＢＭＥＣは、同じ人、例えば、同じ人の幹細胞から産生される。一実施形態では、ｉＭＮおよびｉＢＭＥＣは、同じ患者の株、例えば、同じ患者の幹細胞から産生される。一実施形態では、患者は、ＣＮＳ障害、より具体的には、神経変性疾患の症状を有する。一実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳである。一実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病である。一実施形態では、ＣＮＳ障害は、アルツハイマー病である。
【０００９】
関連したマーカーは、蛍光染色および免疫化学検査によって検出することができる。具体的な実施形態では、「ＢＢＢオンチップ」上の（またはそれを通じた）細胞形態および運動がリアルタイムでモニターされる。さらに、一実施形態では、「ＢＢＢオンチップ」によって提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、薬物候補を、これらが潜在的に特定の同時の条件下で、または特定の個体もしくは集団について、ＢＢＢを横断し、それに危害を加え、またはそれをあまり許容的でなくするか否かを見るために試験することを可能にすることによって、薬物開発または既存の薬剤の研究に情報を与えることができる。ＢＢＢオンチップは、動物研究の代替として潜在的に新しい処置のプレスクリーニングおよび最適化にも使用することができ、臨床研究のｉｎ  ｖｉｔｒｏ原理証明として機能を果たす。さらに、ＢＢＢオンチップモデルは、ＣＮＳ疾患進行における遺伝学の役割、環境、細胞間コミュニケーション、および関門完全性（またはその欠如）の役割を含むが、これらに限らない、疾患を研究するのに使用することができる。一実施形態では、本発明は、細胞の少なくとも１つの集団が、神経系の障害と診断された患者に由来するＢＢＢオンチップを企図する。さらに、ＢＢＢオンチップモデルは、例えば、医学的状態（例えば、遺伝子もしくは後天性疾患、症候群、または素因）の存在を判定し、あるいは潜在的処置に対する個体の応答を予測する（例えば、薬物療法の用量をその患者のその薬物療法に対する血液脳関門透過性に基づいて適応させて）ために診断的に使用することができる。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備える流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記底面に細胞を播種するステップと；ｃ）脳微小血管内皮細胞の成熟を支持する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、前記細胞は、幹細胞由来細胞、幹細胞から分化した細胞、および初代細胞からなる群から選択される。一実施形態では、幹細胞から分化した前記細胞は、脳微小血管内皮細胞である。一実施形態では、幹細胞から分化した前記細胞は、ｉＢＭＥＣである。一実施形態では、本方法は、前記上面に前記細胞を播種するステップと、アストロサイトおよびニューロンの少なくとも１種の成熟を支持する条件下で前記上面に播種された細胞を培養するステップとをさらに含む。一実施形態では、前記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す。例えば、成熟した電気生理学的特性は、生理環境下でニューロンと同様の振幅、継続時間、および周波数の負のナトリウムチャネル電流、正のカリウムチャネル電流、および／もしくは活動電位のスパイクを含み、すなわち、静置培養ニューロンと比較したとき、静置培養ニューロンは、上述の特徴の１つもしくは複数を欠く。一実施形態では、前記上面に播種された細胞の前記培養は、アストロサイトまたはその部分が、前記膜を遊出し、前記底面上の１個または複数の脳微小血管内皮細胞に接触する条件下で前記播種された細胞を培養するステップをさらに含む。一実施形態では、前記上面に播種された幹細胞から分化した前記細胞は、ＥＺ球、誘導された神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）、またはｉＭＮＰに由来するか、またはそれらから抽出される。一実施形態では、前記幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。一実施形態では、前記幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。一実施形態では、ステップｂ）の前に、前記上面または底面の少なくとも一方が１種または複数の細胞外マトリックスタンパク質で被覆される。一実施形態では、前記上面は、ラミニンで被覆される。一実施形態では、前記底面は、コラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆され、ラミニンを欠く。一実施形態では、前記上面に播種された前記細胞は、周皮細胞をさらに含む。一実施形態では、ステップｃ）の前記条件は、ある時間にわたって（例えば、４、７、１０、１２、２０、２４、３０、３６日、またはそれより多く）培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露することを含む。一実施形態では、前記流れは、前記誘導された運動ニューロン前駆（ｉＭＮＰ）細胞の分化を促進する。一実施形態では、前記流れは、前記脳微小血管内皮細胞の間で細胞間タイトジャンクションの形成を促進する。一実施形態では、本方法は、前記細胞間タイトジャンクションを検出するステップをさらに含む。一実施形態では、前記細胞間タイトジャンクションは、ＴＥＥＲ測定によって検出される。一実施形態では、本方法は、細胞内電気生理学的測定（例えば、細胞膜を横切るパッチクランプ測定）、細胞外電気生理学的測定（例えば、複数の細胞によって生成される電場電位）、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングの少なくとも１つによってニューロンまたはアストロサイト活性を測定するステップｅ）をさらに含む。一実施形態では、前記細胞間タイトジャンクションは、細胞透過性アッセイによって検出される。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、マーカーＧｌｕｔ１を発現する。一実施形態では、ステップｃ）の前記培養は、少なくとも４日間実施される。一実施形態では、ステップｃ）の前記培養は、少なくとも７日間実施される。一実施形態では、ステップｃ）の前記培養は、１０、１２、２０、２４、３０、３６日間、またはそれより多く実施される。一実施形態では、前記流体装置は、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、前記培養培地は、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る。一実施形態では、前記膜は、拡張性および指向性神経突起成長を促進するナノパターン化表面を含む。好適なナノパターンは、直線的谷およびリッジであるが、代替のもの、例えば、環状、湾曲、もしくは任意の他の所望の形状、またはこれらの組合せも企図されている。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に幹細胞由来脳細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間（例えば、４、７、１０、１２、２０、２４、３０、３６日、またはそれより多く）にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、ニューロンを含まない。一実施形態では、前記マイクロ流体装置は、前記膜の前記上面と流体連通した第１の流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２の流体チャネルを備え、前記第１および第２の流体チャネルはそれぞれ、前記膜と平行である表面を含み、それぞれは側壁を含む。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、管腔を形成するために第２の流体チャネルの平行面および側壁上で成長する。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、マーカーＧｌｕｔ１を発現する。一実施形態では、ステップｅ）の前記培養は、少なくとも４日間実施される。一実施形態では、ステップｅ）の前記培養は、少なくとも７日間実施される。一実施形態では、ステップｅ）の前記培養は、１０、１２、２０、２４、３０、３６日間、またはそれより多く実施される。一実施形態では、前記流体装置は、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、前記培養培地は、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る。一実施形態では、前記第１および第２の流体チャネルは、ポリジメチルシロキサンを含む。一実施形態では、ステップｂ）の前に、前記第１および第２のチャネルは、湿りを促進する処理を受ける。一実施形態では、湿りを促進するための前記処理は、プラズマ処理、イオン処理、気相堆積、液相堆積、吸着、吸収、または１種もしくは複数の薬剤との化学反応からなる群から選択される。一実施形態では、前記幹細胞由来脳細胞は、湿ったラミニン上に播種される。一実施形態では、コラーゲンとフィブロネクチンとの前記混合物は、ステップｃ）の前に乾燥される。一実施形態では、前記流体装置は、ステップｂ）の後、かつステップｃ）の前に格納される。一実施形態では、前記流体装置は、２５℃未満の温度で格納される。一実施形態では、前記流体装置は、冷蔵庫内に格納される。一実施形態では、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞は、凍結して貯蔵され、次いでステップｃ）の前に解凍される。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に誘導された運動ニューロン前駆細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間（例えば、４、７、１０、１２、２０、２４、３０、３６またはそれより多くの日数）にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞は、ＣＮＳ障害と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する。一実施形態では、前記流れは、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞の分化を促進する。一実施形態では、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、ＭＣＴ８特異的甲状腺ホルモン細胞−膜輸送体欠損症と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する。一実施形態では、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞は、凍結して貯蔵され、次いでステップｃ）の前に解凍される。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含む、流体装置を企図する。一実施形態では、前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞は、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される。一実施形態では、装置は、前記膜の前記上面と流体連通した第１の流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２の流体チャネルをさらに備え、前記第１および第２の流体チャネルはそれぞれ、前記膜と平行である表面を含み、それぞれが側壁を含む。一実施形態では、前記脳微小血管内皮細胞は、管腔を構成するために第２の流体チャネルの平行面および側壁上に存在する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、ａ）膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含み、前記マイクロ流体装置は、前記膜の前記上面と流体連通した第１の流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２の流体チャネルをさらに備える、流体装置、ｂ）前記第１および第２の流体チャネルと流体連通した流体源であって、それによって前記細胞がある時間（例えば、４、７、１０、１２、２０、２４、３０、３６またはそれより多くの日数）にわたってある流量の流体に曝露される、流体源を備えるシステムを企図する。一実施形態では、前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞は、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される。
【００１５】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患のヒト幹細胞ベースモデル化において使用される伝統的なｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムは、生物学的および病理学的関連性について固有の制限事項を有する。研究により、幹細胞由来神経組織は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全に成熟することができないことが明らかになった。この胎児様未成熟表現型は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成人発症病因への遺伝子寄与を研究するとき、課題を提示する。ここで本発明者らは、ｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ＭＮ）は、内因性培地コンディショニングの増強、および共培養における発生的に関連した非ニューロン細胞型の添加によってより良好に成熟することができると仮定する。これに対処するため、このような運動ニューロンがマイクロ流体装置内で成熟され、マイクロ培地体積の機能的効果が、非疾患制御およびＡＬＳ患者を起源とする人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＭＮのニューロン成熟について査定される。
【００１６】
理論に束縛されることなく、ニューロン成熟に対する非ニューロン細胞型（例えば、アストロサイトなど）の影響は、マイクロ流体装置の流体の１つまたは複数を再循環させることによって増強することができる。例えば、ニューロンコンパートメントを通じた培地の流れは、そのチャネルの出力をその入力に流体的に接続して戻し、任意選択で再循環ポンプにより流すことによって再循環させることができる。再循環の多くの方法が、例えば、出力流体がピペット操作または液体ハンドリングオペレーションまたは特殊なバルブシステムを使用して入力リザーバーに導入されて戻される個別の再循環を含めて、当技術分野で公知である。
【００１７】
一部の実施形態では、ニューロン成熟に対する非ニューロン細胞型の効果は、１種または複数の非ニューロン細胞型とともに培養することによってコンディショニングされた流体工学を伴ったマイクロ流体装置を提供することによって得ることができる。例えば、ＢＭＥＣおよび／またはアストロサイトと培養した培地を入力として使用し、またはＢＢＢチップの１つもしくは複数の入力流体と組み合わせ、混合し、かつ／もしくは交互配置することができる。コンディショニングされた流体の使用を、チップ内に非ニューロン細胞型を含めることに加えて、またはその代わりに使用することができる。
【００１８】
データ（例えば、より大きい活性を示す成熟データ（ＰＣＡ）、電気生理学データ、およびカルシウムイメージングデータ）は、ｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ＭＮ）が、内因性培地コンディショニングの増強および／または共培養における発生的に関連した、ニューロンもしくは非ニューロン細胞型の添加によって、より良好に成熟する（例えば、より成熟した状態に発達する）ことができることを示す。発生的に関連した細胞型としては、現在の標準培養法が滞っていると分かる時点で出現する脳微小血管内皮細胞およびアストロサイトがある。証拠も、アストロサイトおよびＢＭＥＣの成熟の改善を支持する。本明細書に記載した通り、アストロサイトは、プロセスから送られて内皮細胞と接触することが観察された。本明細書に記載した通り、改善された、かつ持続的関門機能は、ＢＭＥＣの成熟を示す。
【００１９】
本発明が理論によって束縛されることを意図するものではないが、マイクロ流体設定で培養される細胞が、より成熟した表現型を呈する機序に関して、それは、効果を担うチップがもたらす改善された微小環境であると考えられる。チップ微小環境の関連した要素としては（それだけに限らないが）：ａ）例えば、チップ内のより小さい体積の希釈／分布のために、同じ型の細胞間の改善された連通（一実施形態では、増強された内因性培地コンディショニングが用いられる）；ｂ）異なる細胞型間のコミュニケーション（例えば、ニューロン／アストロサイトコミュニケーション、アストロサイト／内皮細胞（ｅｎｄｏ）コミュニケーション）（一実施形態では、本発明は、共培養における発生的に関連したニューロンまたは非ニューロン細胞型を企図する）；ｃ）流動性環境に関連した大量輸送性質（例えば、流れは、オートクリンシグナル伝達、パラクリンシグナル伝達、老廃物ウォッシュアウト、栄養分の提供などに影響する）；ｄ）ＢＭＥＣの頂端側および基底側の両方へのアクセス、ならびに潜在的に、これらの２つの側の生化学的独立性／隔離；ｅ）機械的な力、この場合、特にせん断力（例えば、せん断力は、内皮細胞表現型に影響することが知られている）；ｆ）分化に関連した培地因子の補充の増強（例えば、静置培養とは対照的に、因子の濃度が培養／インキュベーションによって枯渇させられ得る場合）；ｇ）改善されたＥＣＭシグナル伝達、異なる領域内で複数のＥＣＭを被覆する能力（例えば、ニューロンコンパートメントの１つのＥＣＭおよび内皮細胞の異なるＥＣＭ）ならびにシステム内の細胞のＥＣＭおよびその組成をリモデルする能力（例えば、ＢＭＥＣは、アストロサイトに影響を与え得るＥＣＭを持っている場合がある）の両方がある。
【００２０】
理論によって束縛されることなく、チップ微小環境は、それが成熟を助ける概ね同じ理由で分化を促進すると考えられる（上記を参照）。マイクロ流体設定では、幹細胞に由来する細胞は、意図された宿命に、より完全に、より正確に、かつ／またはより速く到達すると考えられる。
【００２１】
理論によって束縛されることなく、マイクロ流体設定は、細胞の寿命の改善および／またはＢＢＢ、ニューロン、もしくは神経血管接合部の少なくとも１つの機能の維持の改善を促進すると考えられる。本発明者らは、例えば、ニューロンの生存およびこれらの発火の維持、ならびにＢＭＥＣ関門機能の維持における機能の寿命ならびに維持のこのような改善を観察する。
【００２２】
いずれの具体的な機序にも限定されるように意図していないが、データは、流れ（好ましくは連続流）条件下で（静置培養の代わりに）細胞を培養すると、経時的に、例えば、１０、１２、２０、２４、３０、および３６日、またはそれより多く測定したとき、チップ１個当たりのｉＭＮおよびＢＭＥＣの数が増加したことを示す。好適な実施形態では、ＭＮは、流れ（好ましくは連続流）条件下でｉＰＳＣ由来ＢＭＥＣとともに共培養される（例えば、膜の上面にＮＭおよび底面にＢＭＥＣ）。このような培養物は、高密度な厚い組織となり、３次元構造を示した。膜において、両細胞型が相互作用するのを観察することができた。膜の真下で、相互作用した細胞型およびｄｉＭＮがともに、大きいクラスターでボトムチャネルに浸潤するのが観察された。ＢＭＥＣは、ボトムチャネルに留まり、タイトジャンクションを形成し続けた。
【００２３】
定義
いくつかの略語を本明細書で使用する。例えば、「ＭＮ」は、運動ニューロンを指す。文字「ｉ」は、「誘導された」を示す。よって、「ｉＭＮ」は、誘導された運動ニューロン、すなわち、他の細胞、例えば、幹細胞から誘導または産生された運動ニューロンを示す。「ｄｉＭＮ」は、直接誘導された運動ニューロンを示す。「ｉＭＮＰ」は、成熟したニューロンに完全に分化してない誘導された運動ニューロン前駆細胞を示す。
【００２４】
一実施形態では、マイクロ流体装置で生成されるＢＢＢ（または単に「ＢＢＢオンチップ」）の少なくとも１種の細胞成分を生成するための出発材料は、幹細胞を含む（例えば、以下の実施例１中のプロトコールを参照）。特定の実施形態では、これらの幹細胞として、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または胚性幹細胞を挙げることができる。一実施形態では、アストロサイト、ニューロン、周皮細胞、内皮細胞、神経系列前駆細胞、または内皮系列前駆細胞へと直接再プログラムされる神経または血管系列または細胞に関連した前駆細胞（幹細胞に由来した）は、チップ上で用いられる／播種される。ＢＢＢオンチップに関与するすべての細胞型が、幹細胞から産生されなければならない訳ではないことに留意することが重要である。例えば、ＢＢＢオンチップは、初代脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）を使用することができる。健康な対象および罹病患者のヒトの皮膚または血液組織からヒトｉＰＳ細胞を再プログラムし、拡張し、かつ特徴付ける技法は、当技術分野で公知である。例えば、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１（エプスタインバー核抗原−１）エピソームプラスミドベクターシステムに基づく非統合システムを使用して、プロウイルス配列がゲノム中にランダム挿入されることの潜在的に有害な効果を回避することができる。Ｏｋｉｔａ  Ｋら、「Ａ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２０１１年５月、；８巻：４０９頁を参照。そのように産生されたｉＰＳＣ株は、正常核型とともに多能性マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）を発現することが好適である。本発明では、ｉＰＳ細胞は、ＢＢＢオンチップの成分、例えば、ＢＭＥＣ、ニューロンなどを産生させるのに使用される。多くの場合では、ｉＰＳ細胞は正常な対象由来であるが、ｉＰＳ細胞が疾患の症状を呈している患者に由来し得ることも企図されている。一実施形態では、ＢＢＢオンチップには、それだけに限らないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者由来のｉＰＳＣ由来運動ニューロンを含めた、神経系の障害と診断された患者由来のｉＰＳ細胞に由来する細胞が存在する。Ｄ．  Ｓａｒｅｅｎら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｏｃｉ  ｉｎ  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ＡＬＳ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃ９ＯＲＦ７２  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．、２０１３年１０月２３日；５巻（２０８号）：２０８ｒａ１４９頁を参照。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、チップ上で、すなわち、マイクロ流体環境下で「幹細胞由来脳細胞」を分化させることを企図する。用語「幹細胞由来脳細胞」は、一連の分化に向かう幹細胞に由来する細胞を指す。例えば、一実施形態では、誘導された運動ニューロン前駆細胞（それだけに限らないが、ｉＰＳＣ由来前脳神経前駆細胞を含む）は、人工多能性幹細胞に由来するが、これらは、完全には分化していない。一実施形態では、誘導された運動ニューロン前駆細胞は、オンチップで分化されて運動ニューロン、最終的に、成熟運動ニューロンを産生する。したがって、一実施形態では、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）マイクロ流体装置（任意選択で、膜を備え、前記膜は、上面および底面を含む）を提供するステップと；ｂ）誘導された運動ニューロン前駆細胞を（任意選択で、前記上面に、任意選択で、播種された細胞を創製するために、前記底面に脳微小血管内皮細胞）播種するステップと；ｃ）前記前駆細胞の前記少なくとも一部が運動ニューロンに分化する（かつ、好ましくは、前記運動ニューロンが本明細書に記載の試験または染色に基づいて成熟表現型を示す）ような条件下である時間（数日間〜数週間〜数カ月間）にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、本発明は（任意選択で）、ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップをさらに含む。
【００２６】
別の例として、一実施形態では、誘導された脳微小血管内皮前駆細胞は、人工多能性幹細胞に由来するが、これらは、完全には分化していない。一実施形態では、誘導された脳微小血管内皮前駆細胞は、オンチップで分化されてＢＭＥＣ、最終的に、成熟ＢＭＥＣを産生する。したがって、一実施形態では、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）マイクロ流体装置（任意選択で、膜を備え、前記膜は、上面および底面を含む）を提供するステップと；ｂ）誘導された脳微小血管内皮前駆細胞を（播種された細胞を創製するために、前記上面または前記底面に）播種するステップと；ｃ）前記前駆細胞の前記少なくとも一部が脳微小血管内皮前駆細胞に分化する（かつ、好ましくは、前記ＢＭＥＣが本明細書に記載の試験または染色に基づいて成熟表現型を示す）ような条件下である時間（数日間〜数週間〜数カ月間）にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップとを含む、方法を企図する。
【００２７】
本発明が「マイクロ流体装置」または「チップ」の特質によって限定されることは意図されていない。しかし、好適なマイクロ流体装置およびチップは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，６４７，８６１号に記載されており、これらは、マイクロチャネル中の生細胞、例えば、ある流量の培養液に曝露された、マイクロチャネル中の膜上の細胞を含むマイクロ流体「オーガンオンチップ」装置である。「オーガンオンチップ」装置内の細胞上で歪みまたは機械的な力の作動を可能にする特徴は、「ＢＢＢオンチップ」に関して任意選択であり、省略されてもよいことに留意することが重要である。流れは重要であり、静的な２Ｄ培養とは対照的である。マイクロチャネル内での流れの使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究中に細胞培養全体にわたる細胞培養培地の灌流を可能にし、したがって、よりｉｎ  ｖｉｖｏのような物理的環境を提供する。簡単に言えば、入口ポートは、細胞培養培地、血液、血液成分、またはこれらの混合物の、細胞を積んだマイクロ流体チャネルまたはチャンバー内への注入を可能にし、よって細胞に栄養分および酸素を送達する。そのとき出口ポートは、残っている液体および有害な代謝副産物を出すことを可能にする。連続流が、それが制御されたせん断力を印加することに起因して好ましいが、装置の流体経路のいずれかは、「ストップフロー」条件下で培養することもでき、この場合、流れは、静置培養が組み入れられて間欠的に連動される。
【００２８】
マイクロ流体装置は、好都合なことには、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリイミド、スチレン−エチレン−ブチレン−スチレン（ＳＥＢＳ）、ポリプロピレン、またはこれらの任意の組合せで作製される。本発明は、細胞接着、選択、または分化、または流体の湿りを促進するためにこのような物質の処理、例えば、プラズマ処理、イオン処理、気相堆積、液相堆積、吸着、吸収、または１種もしくは複数の薬剤との化学反応からなる群から選択される処理などを企図する。
【００２９】
さらに、用語「マイクロ流体の」は、本明細書では、移動中の流体が、１つまたは複数の寸法が１０ｍｍまたはそれ未満（微小規模）である１つまたは複数のチャネル内に制約され、またはそれを通じて方向を指示されるコンポーネントに関する。マイクロ流体チャネルは、１つまたは複数の方向で微小規模より大きい場合があるが、チャネルは、少なくとも１つの方向で微小規模であり得る。一部の事例では、マイクロ流体チャネルの幾何学的配置は、チャネルを通じた流体流量を制御するように構成することができる。マイクロ流体チャネルは、様々な幾何学的配置で形成して、チャネルを通じた広範囲の流量を促すことができる。しかし、本開示は、「マイクロ流体」装置に頻繁に言及するが、教示されているものの多くは、より大きい流体装置に同様または同等に当てはまることに留意することが重要である。より大きい装置は、「ＢＢＢオンチップ」が治療用途に意図されている場合、特に該当し得る。より大きい流体装置を活用し得る用途の例としては、高度に分化した細胞を産生させるための装置の使用（例えば、装置は、細胞分化および／または成熟を推進するのに使用することができ、細胞が、インプランテーション、体外装置における使用、または研究使用を含み得る下流での使用のために抽出される）、あるいはインプランテーション、または例えば、人工血液脳関門もしくは透析様技術としての体外使用のための装置の使用がある。
【００３０】
本明細書では、語句「に接続された」、「に結合された」、および「と連通した」は、機械的、電気的、磁気的、電磁的、流動的、熱的相互作用を含む２つまたはそれより多くのエンティティ間の任意の形態の相互作用を指す。例えば、一実施形態では、マイクロ流体装置内の第１および第２のチャネルは、流体リザーバーと流体連通している。２つのコンポーネントは、これらが互いに直接接触していなくても互いに結合されている場合がある。例えば、２つのコンポーネントは、中間コンポーネント（例えば、チューブまたは他の流路）によって互いに結合されている場合がある。
【００３１】
マイクロチャネルおよび／または膜の表面は、細胞の付着を支持し、組織内へのこれらの組織化を促進するために細胞接着性、選択的、または促進性分子で被覆することができる。膜が使用される場合、組織は、膜の上部面、膜の下部面、膜のいずれかの側に存在するチャネルもしくはキャビティの表面のいずれか、またはこれらの任意の組合せの上に形成することができる。一実施形態では、異なる細胞が、上部面および下部面に生存しており、それにより膜によって分離された１つまたは複数の組織間インターフェースを作っている。膜は、多孔質、柔軟、弾性、またはこれらの組合せであり得、孔は、ガスおよび／または小化学物質の交換のみを可能にするのに十分大きい、あるいは大きいタンパク質、ならびに生細胞全体および／またはこれらの部分（例えば、アストロサイトの終足）の遊走および経チャネル通過を可能にするのに十分大きい。孔のサイズ−スケールおよび製造優先事項に応じて、孔は、例えば、リソグラフィー、成形、レーザー掘削、もしくはトラックエッチングを使用して画定することができ、選択される材料（例えば、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲンゲル、ペーパー、セルロース）に固有であり得、または材料に加工することができる（例えば、オープンセルポリマーもしくはマトリックスを生成することによって）。
【００３２】
本発明が特定の「流量」または流量を生じさせる手段に限定されることは意図されていない。一実施形態では、５から２００μＬ／時間の間、より好ましくは２０〜１００μＬ／時間の間、さらにより好ましくは１０から６０μＬ／時間の間、さらにより好ましくは２０〜５０μＬ／時間の間の流量が企図されている。一実施形態では、圧力が、リザーバーに対して蓋（１１）および蓋シールを通じて印加される（図２２Ｂを参照）。例えば、１ｋＰａを印加する場合、この名目上の圧力は、一実施形態では、およそ３０〜４０μＬ／時間の流量をもたらす。０．５ｋＰａの圧力を印加する場合、この名目上の圧力は、一実施形態では、１５μＬ／時間から３０μＬ／時間の間の流量をもたらす。
【００３３】
血液脳関門を模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムの完全性および生理機能を評価する多くのやり方が存在する。最も一般的な方法のうちの２つは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）およびルシファーイエロー（ＬＹ）拒絶反応である。重要なことに、マニピュレーションは、細胞が汚染されることなく培養液中に残るために、無菌法を使用して実施されなければならない。
【００３４】
ＴＥＥＲは、膜上の１つまたは複数の細胞層を横断して電流を通過させることに対する抵抗を測定する。測定は、膜の孔サイズおよび密度によって影響され得るが、これは、細胞および／または組織の性質を確認することを目的とする。ＴＥＥＲ値は、細胞単層の完全性の良好な評価基準とみなされる。
【００３５】
ルシファーイエロー（ＬＹ）は、受動的な傍細胞拡散を通じて（細胞間の空間を通じて）のみ細胞単層を横断して進み、低透過性を有する。したがってこれは、タイトジャンクションによって細胞単層を横断して通過することを相当に妨げられる。５〜１２ｎｍ／秒以下のＬＹの透過性（Ｐａｐｐ）が、確立した単層を示すものとして報告されている。
【００３６】
表の記述
表１は、神経細胞（ＥＺ球およびｉＭＮＰ）ならびに内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）の播種について試験した様々な条件（特に表面処理および細胞播種に関連した）を示す。これらの細胞は、任意選択で、細胞の凍結在庫を起源とし得る。Ｅｂｅｒｔら、「ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅｓ：  Ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｒｏｓｅｔｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｉＰＳＣｓ」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（２０１３年）１０巻（３号）：４１７〜４２７頁；Ｌｉｐｐｍａｎｎら、「Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２年）３０巻（８号）：７８３〜７９１頁；およびＳａｒｅｅｎら、「Ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｓｕｒｖｉｖｅ，  ｍｉｇｒａｔｅ，  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ」、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１４年）５２２巻（１２号）：２７０７〜２７２８頁。ｉＢＭＥＣの最良の結果は、コラーゲンとフィブロネクチンとの混合物（４：１比）で実現された。ｉＭＮＰの最良の結果は、ラミニンで実現された。様々な表面処理および被覆材、例えば、プラズマ処理、コロナ処理、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、コラーゲン（Ｉ型およびＩＶ型を含む）、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、マトリゲル、およびこれらの混合物が当技術分野で公知である（例えば、伝統的なプレートベース組織培養またはマイクロ流体組織培養から）。ＢＢＢオンチップは、その神経成分（少なくともアストロサイトもしくは関連細胞を含む）の１種もしくは複数、内皮成分の１種もしくは複数、または両方の起源として幹細胞を使用することができる。特定の実施形態では、これらの幹細胞として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または胚性幹細胞を挙げることができる。一実施形態では、神経もしくは血管系列に関連した前駆細胞、またはアストロサイト、内皮細胞、神経系列前駆細胞、もしくは内皮系列前駆細胞に直接再プログラムされる細胞が、チップに播種するよう企図されている。細胞は、これらがＢＢＢオンチップに堆積される前にそれぞれの細胞型に分化することができ、ＢＢＢオンチップ内で分化することができ、またはＢＢＢオンチップに堆積される前に部分的に分化し、ＢＢＢオンチップ内でさらに分化することができる。ＢＢＢオンチップは、関わる細胞型のいずれの分化および／または成熟も促進することができる。これは、例えば、ＢＢＢオンチップによって生成される、もしくはその中に存在する微小環境（例えば、細胞間シグナル伝達、タンパク質被覆、流体の流れ）によって、流体培養（例えば、マイクロ流体チャネル内の流れによって促される）のために設計された分化プロトコールを使用することによって、またはこ��らの組合せによって達成することができる。表面被覆の選択は、初期の細胞付着および生存能を促進するのに重要である。さらに、表面被覆は、特異的細胞集団を選択し（例えば、幹細胞由来細胞内でありふれた混合集団を播種するとき）、かつ／または細胞に分化もしくは成熟シグナルをもたらすのに有用であり得、時に必要であり得る。表面被覆の効果または成功は、下にある基質に応じて変動し得る。それに応じて、表１に例示した結果は、ＰＤＭＳ基質に対応する。
【００３７】
表２は、マイクロ流体チップの頂端側および基底側に神経（ＥＺ球、ｉＮＰＣ、およびｉＭＮＰ）ならびに内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）を播種することについて試験した様々な条件を示す。このチップは、トップ流体チャネルおよびボトム流体チャネルを分離する多孔質膜を含んでいた（チップは、任意選択の減圧稼働チャネルを用いることなく米国特許第８，６４７，８６１号に開示の実施形態に倣ってモデル化した）。多孔質膜を含む本開示の典型的な実施形態では、任意の脳細胞（例えば、アストロサイト、ニューロン）は、前記トップ流体チャネル内に配置され、および内皮細胞（例えば、ｉＢＭＥＣ、初代ＢＭＥＣ、ＨＵＶＥＣ）は、前記ボトム流体チャネル内に配置される。しかし、他の実施形態では、内皮細胞は、トップ流体チャネル内に配置され、脳細胞は、ボトム流体チャネル内に配置される一方、さらに他の実施形態では、内皮および脳細胞の両方が、同じ流体チャネル（トップ、ボトム、または両方）内に配置される。
表３および４は、新鮮な神経細胞（ｉＭＮＰ）および新鮮な内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）の播種について試験した様々な条件を示し、特定の条件は、マイクロ流体チップ数によって関連付けられ、良好なタイトジャンクションの播種条件との相関を可能にする。チップに様々な播種密度で播種することができ、最適な密度は、細胞型、分化の段階、表面被覆、基質材料、培地組成、細胞が播種後に増殖するか否か、播種インキュベーション時間、チャネル寸法などを含む（しかしこれらに限定されない）因子によって決定される。表２に例示した装置内のＥＺ球、ｉＮＰＣ、およびｉＭＮＰを含めた神経細胞の播種密度は、例えば、１×１０３細胞／ｍＬから１×１０８細胞／ｍＬの間または１×１０４細胞／ｍＬから５×１０８細胞／ｍＬの間の範囲となり得る。表２に例示した装置内のｉＢＭＥＣを含めた内皮細胞の播種密度は、例えば、２．５×１０３細胞／ｍＬから１×１０８細胞／ｍＬの間または２×１０４細胞／ｍＬから５×１０８細胞／ｍＬの間の範囲となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、６ステップを含むマイクロ流体チップを調製し、それに播種するためのワークフローの一実施形態の概略図を示す。本実施形態は、表１および２に例示したものなどの実験に基づいてｉＢＭＥＣおよびｉＭＮＰについて明らかな異なる表面被覆の必要性／優先事項に対処する。特に、ワークフローは、一実施形態では、装置のトップ流体チャネルおよびボトム流体チャネルについて異なる表面被覆をもたらすことを目的とする。
【００３９】
【図２】図２は、マイクロ流体装置の２つの概略図を示す。マイクロ流体装置またはチップ（トップ）の一実施形態では、装置は、トップ（頂端）およびボトム（基底）チャネルを備える（２つのＸは、チャネルがプロトコールの少なくとも一部の間ブロックされることを示す）。他方の概略図（ボトム）は、マイクロ流体装置またはチップ（１６）のポートを、ピペットチップを使用して表面被覆材を担持する（例えば、溶解したタンパク質）流体を堆積し、かつ／または細胞を播種するのにどのように利用することができるかを示す。このイメージは、湿式および乾式条件で異なるＥＣＭ溶液でトップおよびボトムチャネルを被覆する、一部の実施形態における必要性に基づく典型的なチップＥＣＭ被覆プロトコールの改変を示す。開発した手順は、ボトムチャネル内に装填されるＥＣＭ１の灌流が、フレキシブルチューブをクランプし、トップチャネル内に空気を捕捉することによって膜を通じてトップチャネルに灌流することを防止した「エアダム」を伴った。第２のマイクロ流体チャネルのポートは、例えば、空気を満たし、クリップを使用して塞ぐことができる。
【００４０】
【図３】図３は、表２からのチップ１６６の顕微鏡分析を提供し、マイクロ流体装置のトップチャネル内の神経細胞（図３Ａ）およびマイクロ流体装置のボトムチャネル上のＢＭＥＣ（図３Ｂ）を示す。
【００４１】
【図４】図４は、細胞がこれらの同一性を確認するためのマーカーについて試験されたマイクロ流体チップからの３つのイメージを提供する。右上のイメージ（図４Ｂ）は、ＢＭＥＣタイトジャンクションの良好な染色を示し、チップ上のＢＢＢ形成を示す。左上で（図４Ａ）、染色は、ニューロンおよびアストロサイトを示す。図４Ｃは、イメージスライスの３Ｄ共焦点スタックの垂直２Ｄ投影であり、これは、ニューロンおよび内皮細胞の可視化を一緒に、これらがマイクロ流体装置の同じ面内になくても可能にする。
【００４２】
【図５】図５は、頂端アストロサイトの少なくとも一部（すなわち、終足）が膜を遊出し、反対側のＢＭＥＣと接触した、マイクロ流体チップからのイメージを提供する。アストロサイトと内皮細胞との間の接触またはインターフェーシングは、ｉｎ  ｖｉｖｏ血液脳関門の認識された特徴である。本発明者らの知る限りでは、このインターフェースは、血液脳関門のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて以前に決して観察されなかった。本明細書に開示の実施形態の一部において観察されたアストロサイト−内皮接触の形成の潜在性は、所望される、かつ有利なものであり、その理由は、ｉｎ  ｖｉｖｏ接触／ジャンクションが血液脳関門に特徴的なタイトバリア性に関連すると考えられるためである。
【００４３】
【図６】図６は、ｉＭＮが平坦な（パターン化されていない）表面に播種された第１のイメージ（図６Ａ）および同じ細胞がナノパターン化表面に播種された第２のイメージ（図６Ｂ）を示し、指向性の神経突起成長をもたらす。このようなナノパターニングは、ＢＢＢオンチップの膜または任意の表面に適用することができる。特定の実施形態では、ナノパターニングは、前記表面に播種されるニューロンの神経突起成長に向かわせるために膜の上面に適用される。神経突起成長に向かわせることが、一部の使用において、例えば、ニューロンもしくは血液脳関門の健康のリードアウト（例えば、神経突起成長もしくはその方向性をモニターすることによって）として、ニューロン生物学もしくは疾患（例えば、神経突起成長もしくはその方向性を妨害する状態）を研究することにおいて、または電気生理学的測定を容易にする（例えば、多電極アレイもしくはパッチクランピングを使用する）ことにおいて所望される。好適なナノパターンは、直線的谷およびリッジであるが、代替のもの、例えば、環状、湾曲、もしくは任意の他の所望の形状、またはこれらの組合せも企図されている。直線的ナノパターニングは、例えば、１０ｎｍ〜１μｍ、０．５μｍ〜１０μｍ、または５μｍ〜５０μｍの範囲の線間隔、および１０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、２００ｎｍ〜５μｍ、または２μｍ〜５０μｍの範囲の線深さを含み得る。
【００４４】
【図７】図７は、乾燥された（図７Ａ、左上）または湿ったまま（図７Ｂ、右上）のいずれかであったコラーゲンとフィブロネクチンとの４：１混合物上に播種された新鮮な（凍結されていない）ＢＭＥＣの形態、ならびに同じ新鮮な細胞がラミニン上に播種された例（図７ＣおよびＤ、矢印は、ニューロンによる細胞の汚染を示す）の顕微鏡検査を示す。
【００４５】
【図８】図８は、マイクロ流体チップ内に流れを導入するためにフレキシブルチューブによって媒介されるチップの灌流のための標準的なシリンジポンプおよびリザーバーのセットアップの一実施形態を示す概略図である。複数の流体リザーバーは、入口ポートを介して対応する複数のマイクロ流体チップと流体連通にあり、チューブは、出口ポートから来て、ある流量でチップを通じて流体を引き出すのに使用される複数のシリンジに付着している。流れの条件を作るための好都合な方法であるが、流体を駆動するための異なるポンピング手法または圧力手法を伴う他の方法も企図されている。
【００４６】
【図９】図９は、細胞が数日間（７日間）流れに曝露された（図８のシステムを使用して）マイクロ流体装置内の膜のボトム（左側）およびトップ（右側）における細胞形態を顕微鏡検査した写真を含む。図９ＡおよびＣは、ＢＭＥＣ（コラーゲン／フィブロネクチン上）およびｉＭＰ（湿ったラミニン上）が共培養されたチップ６６４の結果を示す。図９ＢおよびＤは、ｉＭＰ（ラミニン上）が単独で培養されたチップ６６３の結果を示す。
【００４７】
【図１０】図１０は、細胞が数日間流れに曝露された（図８のシステムを使用して）マイクロ流体装置内の細胞の蛍光染色の写真である。イメージは、チップ内に形成されている完全な連続したＢＭＥＣ管腔を示すボトムチャネル内のＢＭＥＣの３Ｄイメージである。
【００４８】
【図１１】図１１は、核がＤＡＰＩで染色された、神経フィラメント（緑色）に加えて神経幹細胞（赤色）の存在を示す細胞の蛍光染色の写真である。好適な実施形態では、ＢＢＢオンチップは、内皮または内皮様細胞（好ましくは脳関連内皮細胞）および任意選択でアストロサイトまたはアストロサイト様細胞を含む。しかし、一部の実施形態では、ＢＢＢオンチップは、追加の細胞型、例えば、ニューロン、周皮細胞、および様々な前駆細胞などを含有する。このような細胞は、アストロサイトまたは内皮細胞が産生される（チップ上であってもそれに先行しても）幹細胞分化プロセスの意図された、または意図されない副産物として含まれる場合があり、その理由は、幹細胞および前駆細胞は、典型的には、複数の細胞型に分化することができるためである。ニューロンの存在は、一部の実施形態では望ましく、その理由は、これらが、ＢＢＢ機能のリードアウトとして使用することができる（例えば、関門を貫通する薬剤は、測定可能なやり方でニューロンに影響し得る）ためであり、またはこれらが、他の細胞型と相互作用することができ、もしくはＢＢＢオンチップの機能を改善する局所環境の生成を助けることができるためである。同様に、周皮細胞は、一部の実施形態では望ましく、その理由は、これらが、血液脳関門の確立を助け、ＢＢＢ健康を評価するために潜在的にモニターすることができることが当技術分野で考えられているためである。ニューロンまたは内皮系列前駆細胞は、一部の実施形態では望ましく、その理由は、これらが、細胞集団に活気を与え、ＢＢＢ健康を評価するために潜在的にモニターすることができるためである。したがって、一部の実施形態では、ニューロン、周皮細胞、ニューロン系列前駆細胞、内皮系列前駆細胞、またはこれらの組合せもしくはこれらの前駆細胞を、ＢＢＢオンチップに堆積させることができる。他の実施形態では、分化プロセスは、これらの細胞型の１種または複数を産生させるために用いられる（チップ上であってもそれに先行しても）。
【００４９】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＢＢＢオンチップで実施した機能的測定に関するグラフを示す。図１２Ａは、流れ、静的、および対照条件下でのマイクロ流体チップ上の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定からの結果／リードアウトを示す。明らかに、流れは、最適な結果のために重要である。図１２Ｂは、トランスウェルに対するＴＥＥＲ測定を示す。ＴＥＥＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの典型的な評価基準であり、モデルおよび実験的なリードアウト（例えば、ＢＢＢモデルを実験条件に付した後）の両方を評価するのに使用される。本発明の一部の態様は、１つまたは複数のＢＢＢオンチップのＴＥＥＲの測定を含む。これは、例えば、導入された薬剤を伴う実験のリードアウト、特異的細胞または細胞型（例えば、患者特異的、疾患集団、または疾患もしくは状態をシミュレートするために処置された）を伴う実験のリードアウト、などとしてＢＢＢオンチップの開発、成熟、または品質を評価するのに行うことができる。ＴＥＥＲ測定に適した電極をマイクロ流体装置にどのように一体化するかは当技術分野で公知である。Ｄｏｕｖｉｌｌｅら、「Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ−Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｔｏ  Ｍｅａｓｕｒｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｒｏｓｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ」、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２０１０年３月１５日；８２巻（６号）：２５０５〜２５１１頁。
【００５０】
【図１３】図１３ＡおよびＢは、ＴＥＥＲ測定が、一実施形態においてどのように行われたかを示す。図１３Ａは、チップ上の電極がどのように、チップに嵌合するピペットチップとともに接続されたかを示す拡大された概略図であり；図１３Ｂは、上皮電圧抵抗計の右に接続された同じチップを示す。
【００５１】
【図１４】図１４Ａは、別のラウンドのプロトタイプＴＥＥＲチップに対する経過観察実験であり、それは、チップ上の流れの存在下で増大し、その後チップをＴＮＦａ、炎症促進性サイトカインに曝露して関門機能が弱まったｉＢＭＥＣ関門機能を示した。より高いＴＥＥＲ値は一般に、よりタイトな関門を示し、それは、血液脳関門にとって典型的には望ましい。図１４Ｂも、ＴＮＦアルファ曝露を伴うが、リードアウトは、デキストラン−ＦＩＴＣによって測定した場合の膜透過性である。
【００５２】
【図１５】図１５は、フルオレセインナトリウムの傍細胞透過性結果（およびその構造）を示す。本発明の一部の態様は、様々な追加の薬剤（例えば、薬物、化学物質、ホルモン、血液成分、バイオマーカー）の透過性を確認することを含む。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門の１種または複数の薬剤への透過性の定性的または定量的推定を可能にすることができる。さらに、本発明の一部の態様によれば、１種の薬剤の透過性が、第２の薬剤、処理、または実験条件に応えて測定される（例えば、別の薬物療法の血液脳関門透過性に対する薬物療法の効果を測定して）。
【００５３】
【図１６】図１６Ａは、血液脳関門を横断してヒト血液を走らせている間のユーザーインターフェースおよび条件を示す。図１６Ｂは、血液脳関門（ＢＢＢ）、ＢＭＥＣの層を使用して本明細書に記載のマイクロ流体装置内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで作られた関門を横断するヒト血液からの溶質の輸送を測定するための設備セットアップを示す。実証されるように、一部の実施形態は、装置内の１つまたは複数の流体チャネルを通して任意選択で灌流された血液または血液成分を含む。血液または血液成分は、例えば、生化学的キューを提供することによってＢＢＢオンチップ機能を改善することができるので、血液または血液成分の使用が望まれ、または反対に、例えば、血液は、調査下にあり得る有害物を含有し得るのでＢＢＢオンチップに害を与える。一部の態様では、透過性アッセイは、潜在的によりｉｎ  ｖｉｖｏ様の結果をもたらすために血液または血液成分を含む。他の態様では、個体特異的血液または血液成分が、個別化されたＢＢＢ関連評価基準を潜在的にもたらすために使用される。これは、例えば、血液または成分由来の１種または複数の薬剤または成分の透過性の測定、装置に含まれる血液または別の液体に添加され得る１種または複数の薬剤の透過性に対する血液または成分の効果、ＢＢＢオンチップまたはそのコンポーネントのいずれかの健康に対する血液または成分の効果（陽性であっても陰性であっても）などを含み得る。これは、例えば、血液または血液成分が担持する疾患、バイオマーカー、または感染エージェントを同定するための診断上の使用を含み得る。
【００５４】
【図１７ＡＢ】図１７は、グラフにした結果とともに（図１７Ｂ）、図１６に示したセットアップを使用した質量分析による甲状腺ホルモン輸送の測定（図１７Ａ）を示す。患者血液を、マイクロ流体チップを通してＢＭＥＣ下でチャネル内に流した後、血液から神経コンパートメント内への、すなわち、ＢＭＥＣ関門を通した化合物の輸送を測定することが可能であった。この場合、実験は、非罹病個体を起源とするｉＰＳ由来細胞を含むＢＢＢオンチップの対照セット、およびアラン・ハーンドン・ダドリー症候群（ＡＨＤＳ）と診断された患者を起源とするｉＰＳ由来細胞を含む第２のセットのＢＢＢオンチップを含んでいた。図１７Ａ中の質量分析データは、ＭＣＴ８輸送体欠陥をオーガン−チップで再現することができることを確認するための初期の実験である
【図１７Ｃ】図１７は、グラフにした結果とともに（図１７Ｂ）、図１６に示したセットアップを使用した質量分析による甲状腺ホルモン輸送の測定（図１７Ａ）を示す。患者血液を、マイクロ流体チップを通してＢＭＥＣ下でチャネル内に流した後、血液から神経コンパートメント内への、すなわち、ＢＭＥＣ関門を通した化合物の輸送を測定することが可能であった。この場合、実験は、非罹病個体を起源とするｉＰＳ由来細胞を含むＢＢＢオンチップの対照セット、およびアラン・ハーンドン・ダドリー症候群（ＡＨＤＳ）と診断された患者を起源とするｉＰＳ由来細胞を含む第２のセットのＢＢＢオンチップを含んでいた。図１７Ａ中の質量分析データは、ＭＣＴ８輸送体欠陥をオーガン−チップで再現することができることを確認するための初期の実験である
【００５５】
【図１８】図１８は、マイクロ流体装置（「ＢＢＢオンチップ」）内でニューロンからバッチクランプによって収集した電気生理学的記録を示す。矢印（図１８Ａ）は、シグナル活動電位を示す。電流記録（図１８Ｂ、右）は、負のナトリウムチャネル電流（Ｎａ＋）および正のカリウムチャネル（Ｋ＋）を示す。オンチップでのこれらの測定は、例えば、ニューロン成熟の目安をもたらすのに、またはニューロン健康のリードアウトとして使用することができる。ひいては、ニューロンの成熟または健康を、ＢＢＢオンチップ品質の指標として（例えば、実験を開始する前）、あるいは例えば、薬剤がＢＢＢを横断した、病状が現れた、ＢＢＢが改変され、もしくは損なわれた、または反対に、ＢＢＢもしくは神経の機能もしくは健康が改善されたことを示す実験のエンドポイントとして使用することができる。パッチクランピングは、例えば、エラストマーＢＢＢオンチップ装置の柔らかいボディを通じてパッチクランプ電極を挿入することを含めて、様々な方法によってＢＢＢオンチップ上で実施することができる。パッチクランピングと同様に、他の電気生理学的リードアウトも、例えば、装置中に１つまたは複数の電極を含めることによって得ることができる。特に、多電極アレイ（ＭＥＡ）を、装置内の流体チャネルまたはキャビティ中にそれまたは同様のものを有する実施形態の膜上に一体化することができる。電気生理学的測定（パッチクランピング、ＭＥＡ）は、励起可能であると当技術分野で示されたアストロサイトにも適用することができる。
【００５６】
【図１９】図１９は、神経チャネルにおけるカルシウム流出イメージングの結果を示す。写真（図１９Ａ、左上）は、このようなイメージの動画からの単一蛍光像である。着色された円は、３つのグラフにおけるタイムトレースに対応する位置を示す。トレース（図１９ＢおよびＣ）は、リアルタイムでマイクロ流体チップ内のニューロン機能を観察することが可能であることを示す。電位依存性カルシウムチャネルの強力なブロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）を添加すると、この活性が取り除かれる（図１９Ｄ、右下）。カルシウムイメージングまたは電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングは、電気生理学的リードアウトと同様の利点をもたらすが、電極が必要でないという利点ももたらす。したがって、本発明の一部の態様は、カルシウムまたは電圧感受性色素またはタンパク質の存在下でのイメージングによってＢＢＢオンチップを測定して、ニューロンまたはアストロサイト励起の電位記録および任意選択のマニピュレーションを可能にする方法を含む。これらの測定は、例えば、ニューロン成熟の目安をもたらすのに、またはニューロン健康のリードアウトとして使用することができる。ひいては、ニューロンの成熟または健康を、ＢＢＢオンチップ品質の指標として（例えば、実験を開始する前）、あるいは例えば、薬剤がＢＢＢを横断した、病状が現れた、ＢＢＢが改変され、もしくは損なわれた、または反対に、ＢＢＢもしくは神経の機能もしくは健康が改善されたことを示す実験のエンドポイントとして使用することができる。
【００５７】
【図２０】図２０は、神経前駆細胞から神経細胞を産生させるためのプロトコール、およびその産生を確認する染色結果の両方を示す。このような技法は、ｉＰＳＣから直接多分化能神経幹細胞および運動ニューロン前駆体を作製することを可能にし、多くの神経細胞型（ニューロン、アストロサイトなど）への分化を可能にする。
【００５８】
【図２１】図２１は、７つの異なるチップ、すなわち、ＭＣＴ８細胞株または患者由来の細胞が存在するチップ（２２８５〜２２８８）と比較した正常細胞が存在するチップ（２２８０、２２８９、および２２８４）のトップチャネル内の補正されたＴ３濃度を示す。
【００５９】
【図２２】図２２Ａは、それぞれが入口および出口ポート（２）を有する２つのマイクロチャネル（１）、ならびに（任意選択の）減圧ポートを備えるマイクロ流体装置またはチップ（１６）の一実施形態を示す概略図である。図２２Ｂは、チップ（１６）が担体（１７）中に挿入された、リザーバーの上に透明（または半透明）カバー（１１）を特徴として備える灌流ディスポーザブルまたは「ポッド（ｐｏｄ）」（１０）の一実施形態の上側の概略図である。チップに細胞を播種し、次いで灌流ディスポーザブルまたはポッド内に挿入するための担体中に置くことができ、その後、リザーバー中の培養培地がマイクロチャネル中に流れ、細胞（例えば、ＢＭＥＣおよびＭＮの両方）を灌流する。
【００６０】
【図２３】図２３は、例示的なマイクロ流体装置または「オーガンオンチップ」（１６）装置の概略図を示す。アセンブルされた装置が、上面（２１）を示して図２３Ａに概略的に示されている。図２３Ｂは、平行配置でチャネル（９８）を有するボトムピース（９７）および複数のポート（２）を有するトップピース（９９）を、トップ（９９）とボトム（９７）ピースとの間に膜（１０１）を含む組織間インターフェースシミュレーション領域とともに示す図２３Ａの装置の分解図を示し、この領域で（一実施形態では）細胞挙動ならびに／またはガス、化学物質、分子、微粒子、および細胞の通過がモニターされる。一実施形態では、入口流体ポートと出口流体ポートとは、第１の中央マイクロチャネルと連通しており、その結果、流体は、第２の中央マイクロチャネルとは独立に第１の中央マイクロチャネルを介して入口流体ポートから出口流体ポートに動的に進むことができる。入口と出口流体ポートとの間を通過する流体は、中央マイクロチャネル間で分配され得ることも企図されている。いずれかの実施形態では、第１の中央マイクロチャネルを通過する流量などの流体の流れの特性は、第２の中央マイクロチャネルを通じた流体の流れの特性とは独立に制御可能であり、逆の場合も同様である。
【００６１】
【図２４】図２４は、マイクロ流体装置またはチップ内で培養されたニューロンからの電気生理学的データのプリントアウトであり、チップ内での高度に複雑な自発的活動を示す。
【００６２】
【図２５】図２５は、マイクロ流体装置またはチップ内で単独で培養された（図２５Ａ、上のパネル）およびＢＭＥＣとともに共培養された（図２５Ｂ、ボトムパネル）ニューロンからの電気生理学的データのプリントアウトであり、神経組織がチップ内で、かつＢＭＥＣとの共培養においてより成熟した電気生理学的特性を有することを示す。
【００６３】
【図２６】図２６は、マイクロ流体装置またはチップ内で単独で培養された（図２６Ａ、トップパネル）およびＢＭＥＣとともに共培養された（図２６Ｂ、ボトムパネル）ニューロンからの電気生理学的データのプリントアウトであり、神経組織がＢＭＥＣとともに共培養中であるときチップ内でより成熟した電気生理学的特性を有することを示す。
【００６４】
【図２７】図２７は、ＢＭＥＣとともに共培養された（図２７Ｄ、ボトムパネル）、単独で培養された（図２７Ｃ、ボトムパネルから上の最初のパネル）、（９６ウェル）静置培養で内皮細胞馴化培地またはＥＣＣＭで培養された（図２７Ｂ、ボトムパネルから上の２番目のパネル）ニューロン（ＭＮ）を、コンディショニングされていない培地（９６ウェル）静的対照（図２７Ａ、トップパネル）とともに比較した神経カルシウム測定リードアウトを提供する。各ニューロンの活性は、同時に追跡および分析される（カルシウム流入は、チップ内にてライブで観察することができるニューロン活性の間接的な評価基準である）。結果は、共培養により、ｄｉＭＮ神経カルシウムの一過性の活性が増大する、すなわち、ＭＮがｉＢＭＥＣと接触すると過渡周波数の有意な増大が観察されることを示す。
【００６５】
【図２８】図２８は、ＢＭＥＣとともに共培養された（右端）、単独で培養された（左の次のバー）、静置培養で内皮細胞馴化培地またはＥＣＣＭで培養された（左の次のバー）ニューロン（ＭＮ）を、コンディショニングされていない培地静的対照（左端）とともに比較した神経カルシウム測定（細胞１個当たりの平均周波数事象）の棒グラフである。結果は、共培養により、ｄｉＭＮ神経カルシウムの一過性の活性が増大する、すなわち、ＭＮがｉＢＭＥＣと接触すると過渡周波数の有意な増大が観察されることを示す。
【００６６】
【図２９】図２９は、マイクロ流体チップ内でのｉＭＮのトランスクリプトミクス研究の結果を示す。ニューロンは、チップ上で単独で培養されたものであり（図２９Ａ、トップボックス）、またはＢＭＥＣとの共培養にあったものであり（図２９Ｂ、ボトムボックス）、これを９６ウェル静置培養と比較した。ＭＮをＦＡＣＳで選別し、ＲＮＡをシーケンシングした（すなわち、遺伝子発現を検出した）。ＦＡＣＳ選別ＭＮ由来のＲＮＡ−Ｓｅｑは、神経発達遺伝子経路（ＰＣ１）がチップ内で上方調節されることを示す。血管相互作用遺伝子（ＰＣ３）は、ｉＢＭＥＣとの共培養で再創製される。さらに、チップ誘導遺伝子（ＰＣ２）、すなわち、チップ上で単に培養されることから細胞内で誘導された遺伝子活性が存在する。
【００６７】
【図３０】図３０は、図３４が調製された詳細な結果を示し、様々な神経発達遺伝子（ＰＣ１）、チップ誘導遺伝子（ＰＣ２）、および血管相互作用遺伝子（ＰＣ３）の名称を示す。図３０の右の色付きバーは、５条件のそれぞれ（列）における各遺伝子の発現（行）を表す。列の順序は、ＭＮのみ、ＢＭＥＣ／ＭＮ、９６ウェル対照、９６ウェルＥＣＣＭ、ＭＮ前駆細胞である。赤色＝高い、および青色＝低い。これらの血管遺伝子経路は、いずれの他の培養系においても誘導されることが示されておらず、成熟および活性の観察される増大を誘導している場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞が血液脳関門および／または脊髄の１つまたは複数の構造的または機能的特徴（例えば、タイトジャンクション）を模倣する条件下にて流体装置内で内皮細胞（好ましくは脳関連内皮細胞）、および任意選択でアストロサイト、任意選択でニューロン、および任意選択で周皮細胞を培養することに関する。本明細書に記載の流れを伴ったマイクロ流体チップなどのマイクロ流体装置内でこれらの細胞を培養すると、単独であっても、他の細胞と組み合わせてであっても、既存のシステムよりさらに成熟および／または分化が推進される。例えば、ニューロンの成熟した電気生理学的特性は、生理環境下でニューロンと同様の振幅、継続時間、および周波数の負のナトリウムチャネル電流、正のカリウムチャネル電流、および／もしくは活動電位のスパイクを含み、または静置培養ニューロンと比較したとき、静置培養ニューロンは、上述の特徴の１つもしくは複数を欠く。証拠も、アストロサイトおよびＢＭＥＣの成熟の改善を支持する。本明細書に記載した通り、アストロサイトは、プロセスから送られて内皮細胞と接触することが観察された。本明細書に記載した通り、改善された、かつ持続的関門機能は、ＢＭＥＣの成熟を示す。良好な生存能および機能は、ＴＥＥＲ、透過性アッセイ、パッチクランプ（もしくは他の電気生理学的方法）、カルシウムもしくは電圧イメージング、または他の試験評価基準によってであろうとそうでなくても、関門完全性および生理機能の測定を可能にする。本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ「ＢＢＢオンチップ」の観察される特性としては、（１）内皮細胞間のタイトジャンクション（これは、物質に対する選択的透過性を作る）；（２）内皮細胞がアストロサイトと接触することにより例示される任意選択の細胞間コミュニケーション（例えば、これらの細胞を分離する膜の部分的遊出による終足接触）；（３）任意選択の長い神経突起、（４）細胞分化およびタイトジャンクション形成に影響を与える任意選択の流体の流れ；および（５）ＢＢＢ成分の成熟度および完全性を表す高い電気抵抗がある。神経突起に関して、一実施形態では、本発明は、長い直接的な（例えば、相対的に直線的な経路に沿った）神経突起成長を促進するナノパターン化表面上での播種を企図する。好適なナノパターンは、直線的谷およびリッジであるが、代替のもの、例えば、環状、湾曲、もしくは任意の他の所望の形状、またはこれらの組合せも企図されている。内皮細胞に関して、一実施形態では、本発明は、チップ上に管腔（例えば、フローチャネルを少なくともその長さの一部にわたって完全に裏打ちする）を形成するＢＭＥＣを企図する。他の利点（例えば、内皮層安定性）の中でも、これは、血液または血液成分とともに装置を使用することを潜在的に可能にする。選択的透過性に関して、本発明は、一実施形態では、ＢＭＥＣの下のチャネル内に物質を、少なくとも１種の物質がＢＭＥＣ関門を通過し（例えば、膜のボトム側のＢＭＥＣ細胞）、かつ膜の上のチャネル内に入るように導入すること、および前記少なくとも１種の物質を検出すること（例えば、抗体、質量スペクトルなどを用いて）を企図する。
【００６９】
ヒト血液脳関門のモデルについて強い必要性が存在するが、他の生物体（動物に限定されない）の血液脳関門のモデルを開発することも望ましい。特に目的とするものは、例えば、マウス、ラット、イヌ、およびサルのモデルであり、その理由は、これらが典型的には薬物開発において使用されるためである。したがって、ＢＢＢオンチップは、ヒト由来細胞だけでなく、他の生物体由来の細胞も利用することができる。さらに、使用されるすべての細胞型が同じ種を起源とすることが好ましいが（例えば、細胞間コミュニケーションが有効であることを保証するために）、種をミックスすることも時に望ましい場合がある（例えば、所望の細胞型が乏しく、または技術的課題を有する場合）。
【００７０】
好適な実施形態の記述
一実施形態では、本発明は、細胞の少なくとも１つの集団が、神経系の障害と診断された患者に由来するＢＢＢオンチップを企図する。本発明が特定のＣＮＳ障害に限定されることは意図されていないが、一実施形態では、障害は、ＡＬＳである。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳および脊髄内の運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる重度の神経変性状態である。一実施形態では、本発明は、ＡＬＳを有する患者から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成し、これらをマイクロ流体装置に播種するための運動ニューロン前駆細胞に分化させることを企図する。現在、ＡＬＳの有効な処置は存在しない。一実施形態では、本発明は、後続の臨床治験における成功を予測するために薬物を試験するためのモデル系としてＢＢＢオンチップを企図する。
【００７１】
別の実施形態では、ＣＮＳ障害は、パーキンソン病（ＰＤ）である。ＰＤは、ドーパミンニューロンの喪失によって主に特徴付けられる神経変性障害であるが、これは、多くの他の病理学的変化にも至る。
【００７２】
さらに別の実施形態では、ＣＮＳ障害は、アルツハイマー病である。アルツハイマー病は、記憶、思考、および挙動の問題を引き起こすタイプの認知症である。症状は通常、徐々に発症し、経時的に悪化し、日々のタスクを邪魔するほどの重症となる。
【００７３】
ｉＰＳＣ技術を、病態における患者特異的表現型を模倣するマイクロ流体チップと一緒に使用することができることが企図されている。例えば、別の実施形態では、ＭＣＴ８特異的甲状腺ホルモン細胞−膜輸送体欠損症と診断された患者に由来する細胞を、「ＢＢＢオンチップ」の細胞成分の少なくとも１つとしてマイクロ流体装置において使用することが企図されている。この疾患は、重度認知障害、小児低血圧、筋肉量減少および全身性筋力低下、進行性痙性四肢麻痺、関節性拘縮、ならびに特徴的な発作もしくは運動誘発性ジスキネジア（ｐａｒｏｘｙｓｍｓ  ｏｒ  ｋｉｎｅｓｉｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａｓ）を伴ったジストニア運動および／またはアテトーゼ運動によって特徴付けられる。発作は、症例の約２５％で起こる。患者は、高血清３，３’，５−トリヨードチロニン（Ｔ３）濃度および低血清３，３’，５’−トリヨードチロニン（逆Ｔ３またはｒＴ３）濃度を含む病理特徴的甲状腺試験結果を呈する。血清テトラヨードチロニン（チロキシンまたはＴ４）濃度は、低減されることが多いが、低正常範囲内であり得；血清ＴＳＨ濃度は、正常であるか、またはわずかに上昇している。ＳＬＣ１６Ａ２（ＭＣＴ８としても公知）は、突然変異がこの障害を引き起こすことが知られている唯一の遺伝子である。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
細胞を培養されたｉＰＳＣから直接、または前分化細胞の凍結ロットから調製する。細胞を、解凍し（または新鮮に解離させ）、８〜９日目（ＢＭＥＣ分化の場合において）に、かつ神経分化の様々なポイントでチップに播種する。
【表Ａ】
2018533940.tif 000003
【００７５】
ＭＮの場合では、例えば、細胞を、新たに分化した培養物から、または解凍したバイアルから直接、分化の１２日目に播種する。ｉＰＳＣ由来前脳神経前駆細胞培養物（ダビングされたＥＺ）を、解離させて、または３次元で付着および拡張させた神経球としてチップ内に培養した（図３頂端を参照）。運動ニューロンの産生のためのプロトコールで使用される様々な因子（上記チャートおよびタブを参照）を提供する（出発材料としてｉＰＳＣを使用する）。
【００７６】
（実施例２）
本実施例では、運動ニューロンの産生のための別のプロトコールを出発材料としてｉＰＳＣを使用して提供する：
【表Ｂ】
2018533940.tif 000004
【００７７】
運動ニューロンの産生のためのプロトコールで使用される様々な因子（上記チャートおよびタブを参照）を提供する（出発材料としてｉＰＳＣを使用する）。
【００７８】
（実施例３）
本実施例は、異なる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で処置した表面上に細胞の凍結在庫からの神経（ＥＺ球およびｉＭＮＰ）ならびに内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）を播種するために試験される様々な条件を探索する。ｉＢＭＥＣの最良の結果は、５×１０６細胞／ｍｌの播種濃度を使用してコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物（４：１の比）で実現された（表１）。これらの結果を考慮して、播種をマイクロ流体装置、すなわち、チップで試みた。表２は、細胞の凍結在庫を使用してマイクロ流体チップの頂端側および基底側に神経（ＥＺ球、ｉＮＰＣ、およびｉＭＮＰ）ならびに内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）を播種するために試験した様々な条件を示す。
【００７９】
様々なプロトコールを探索したが、マイクロ流体チップを調製し、それに播種するための一実施形態は６ステップを含む。図１は、ワークフローを示す。最初に、チップ（またはその領域）を、湿りまたはタンパク質接着を促進するために処理した（例えば、プラズマ処理によって）。次いで１つまたは複数のチャネルを塞ぐ（図２の上の概略図を参照。ここで「Ｘ」は、チャネルがトップおよびボトムチャネルを有するマイクロ流体装置またはチップ内でブロックされていることを示す）。図２（下の概略図）は、マイクロ流体装置のポートを、ピペットチップを使用して流体（例えば、ＥＣＭを含む）または細胞を導入するのに、どのように利用することができるかを示す。このプロトコールを使用して、ボトムチャネルのためのＥＣＭ混合物を最初に導入し、過剰物を除去し、残りを乾燥させる。その後（ステップ３）、トップチャネルのためのＥＣＭを導入する。ＢＭＥＣをボトムチャネルに播種することができる。トップチャネルを洗浄することができる。最後に、神経細胞を導入およびインキュベートして、付着させることができる。培養物を、ＢＭＥＣをチップ上に播種した同日または翌日のいずれかに、上述したＢＭＥＣの播種の後にチップ内に播種した。チップを、１４日間培養し、固定し、該当するマーカーについて染色した。共焦点イメージングは、ｚスタックでの遊出を示す。
【００８０】
図３は、表２からのチップ１６６の顕微鏡分析を提供し、マイクロ流体装置のトップチャネル内の神経細胞（左）およびマイクロ流体装置のボトムチャネル上のＢＭＥＣ（右）を示す。神経細胞およびＢＭＥＣが付着した。
【００８１】
次いで付着した細胞を、マーカーについて試験してこれらの同一性を確認した。図４は、イメージスライスの３Ｄ共焦点スタックの垂直２Ｄ投影であり、これは、ニューロンおよび内皮細胞の可視化を一緒に、これらがマイクロ流体装置の同じ面内になくても可能にする。ＢＭＥＣは、Ｇｌｕｔ１マーカーを示し、一方ニューロンは、ＮＦＨについて陽性である。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。
【００８２】
図５は、頂端アストロサイトの少なくとも一部（すなわち、終足）が膜を遊出し、反対側のＢＭＥＣと接触した、マイクロ流体チップからのイメージを提供する。アストロサイトは、赤色染色されたＢＭＥＣに対して白色で示されている。
【００８３】
（実施例４）
本発明は、一実施形態では、細胞を播種するためにナノパターン化表面を利用することを企図する。図６は、ｉＭＮＰが平坦な（パターン化されていない）表面に播種された第１のイメージ（トップ）および同じ細胞がナノパターン化表面に播種された第２のイメージ（ボトム）を示す。明らかに、ナノパターン化表面は、指向性の神経突起成長（例えば、ラインパターンで）をもたらす。
【００８４】
（実施例５）
細胞の凍結在庫を使用することができるが（特に神経細胞について）、新鮮な細胞が播種に使用されるとき最良の結果を得ることができる（特にＢＭＥＣについて）ことが見出された。図７は、乾燥された（図７Ａ、左上）または湿ったままであった（図７Ｂ、右上）のいずれかのコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物上に播種した新鮮な（凍結されていない）ＢＭＥＣ、および同じ新鮮な細胞をラミニン上に播種した一例（図７ＣおよびＤ）の形態の顕微鏡検査を示す。興味深いことに、ラミニンを使用したとき、ＢＭＥＣはニューロンを含まなかった（ニューロンによる細胞の汚染を示す図７Ｄ中の矢印を参照）。
【００８５】
表３および４は、新鮮な神経細胞（ｉＭＮＰ）および新鮮な内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）の播種について試験した様々な条件を示し、特定の条件は、マイクロ流体チップ数によって関連付けられ、良好なタイトジャンクションの播種条件との相関を可能にする。マイクロ流体チップ５７４についての染色結果（図示せず）（条件について表３を参照）は、細胞がＢＭＥＣタイトジャンクションのマーカーであるＧｌｕｔ１（赤色染色）に陽性であることを示した（核もＤＡＰＩから青色に染色された）。チップ５７４の播種条件は、良好なタイトジャンクションをもたらした。マイクロ流体チップ６６５についての染色結果（図示せず）（条件について表３を参照）は、細胞がＧｌｕｔ１に陽性であることを示した。よってチップ６６５の播種条件も、良好なタイトジャンクションをもたらした。マイクロ流体チップ６６７についての染色結果（図示せず）（条件について表３を参照）は、細胞がＧｌｕｔ１に陽性であることを示した。よってチップ６６７の播種条件は、良好なタイトジャンクションをもたらした。マイクロ流体チップ６９３についての染色結果（条件について表３を参照）は、細胞がＧｌｕｔ１に陽性であることを示した。よってチップ６９３の播種条件は、良好なタイトジャンクションをもたらした。
【００８６】
マイクロ流体チップ７３３についての染色結果（図示せず）（条件について表４を参照）は、細胞がＧｌｕｔ１に陽性であることを示した。結果（図示せず）は、ラミニン単独で被覆すると（播種の前）、ＢＭＥＣタイトジャンクション形成不良がもたらされることも明らかになった。
【００８７】
（実施例６）
慣例的な静置培養と異なり、本発明は、細胞が、栄養分を提供し、かつ老廃物を除去する一定流量の培地に曝露されるマイクロ流体装置を企図する。図８は、マイクロ流体チップ内に流れを導入するためのシステムの一実施形態を示す写真である。複数の流体リザーバーは、入口ポートを介して対応する複数のマイクロ流体チップと流体連通にあり、チューブは、出口ポートから来て、ある流量でチップを通じて流体を引き出すのに使用される複数のシリンジに付着している。図９は、細胞が数日間流れに曝露された（図８のシステムを使用して）マイクロ流体装置内の膜のボトム（左側）およびトップ（右側）における細胞形態を顕微鏡検査した写真を含む。図１０は、細胞が数日間流れに曝露された（図８のシステムを使用して）マイクロ流体装置内の細胞の蛍光染色を示す。イメージは、チップ内に形成されている完全な連続したＢＭＥＣ管腔を示すボトムチャネル内のＢＭＥＣの３Ｄイメージである。図１１は、核がＤＡＰＩで染色された、神経突起（緑色）に加えて神経幹細胞（赤色）の存在を示す細胞の蛍光染色の写真である。
【００８８】
（実施例７）
ＢＢオンチップでの良好な細胞生存能および機能は、ＴＥＥＲ、パッチクランプ、または他の試験評価基準によってであろうとそうでなくても、関門完全性および生理機能の測定を可能にする。
【００８９】
ＴＥＥＲ：図１２Ａは、流れ、静的、および対照条件下でのマイクロ流体チップ上の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定からの結果／リードアウトを示す。細胞は、各チャネル上に組み込まれた金電極を備える高いチャネルＰＤＭＳチップに蒔いた（図１３Ａを参照）。ＢＭＥＣを播種した後、経内皮電気抵抗を、電極をＥＶＯＭ２電圧抵抗計に接続することによって測定した（図１３Ｂを参照）。図１２Ａは、ＢＢＢオンチップ内の流れの有益な効果、すなわち、流れに応答したより高いＴＥＥＲを示す予備データを表示する。特に、およそ４０時間の時点で、流れの下でＢＢＢオンチップについて観察されたＴＥＥＲ値は、静的条件下での同様のチップより有意に高く、すなわち、ｉＰＳ脳微小血管内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）は、静置培養で維持されたチップと比較して、プロトタイプＴＥＥＲチップ上にて流れ条件下でよりタイトな細胞間ジャンクションまたは関門機能を形成した。「損傷した」チップは、プロトタイプであるＴＥＥＲチップに起因する失敗であった。図１２Ｂは、細胞がトランスウェル内で培養されたＴＥＥＲ結果を示す。
【００９０】
図１４Ａは、別のラウンドのプロトタイプＴＥＥＲチップに対する経過観察実験であり、それは、チップ上の流れの存在下で増大し、その後チップをＴＮＦａ、炎症促進性サイトカインに曝露して関門機能が弱まったｉＢＭＥＣ関門機能を示した。より高いＴＥＥＲ値は一般に、よりタイトな関門を示し、それは、血液脳関門にとって典型的には望ましい。
【００９１】
パッチクランプ：図１８は、マイクロ流体装置（「ＢＢＢオンチップ」）内でニューロンからバッチクランプによって収集した電気生理学的記録を示す。オンチップでのこれらの測定を使用してニューロン成熟の目安をもたらすことができ、すなわち、ニューロン細胞の成熟をより正確に記述する。パッチクランプ記録を助けるための堅いＰＥＴ膜を伴った、特別に設計した「開放可能な」チップ（この場合、チップを部分的にディスアセンブルして半多孔質膜上の細胞を直接露出することができる）内で細胞を上述した通り培養した。ＰＤＭＳを試みたが失敗に終わった。ＰＥＴ膜チップを、チップ内の６および２４日におけるエンドポイントで開放した。チップ内に播種した個々のニューロンにガラスマイクロピペットで直接アクセスし、細胞電気生理学的特性を、電気容量、膜静止電圧、自発的活動、および誘導された活性を含めて記録した。図１８は、チップ上で培養されたニューロンからの誘導された活動電位の全細胞パッチ記録である。矢印（図１８Ａ）は、シグナル活動電位を示す。電流記録（図１８Ｂ、右）は、負のナトリウムチャネル電流（Ｎａ＋）および正のカリウムチャネル（Ｋ＋）が正常なニューロン機能のために必要であり、ニューロンが成熟するにつれてより顕著になることを示す。
【００９２】
カルシウムフラックス：図１９は、神経チャネル内のカルシウムフラックスイメージングの結果を示す。蛍光カルシウム流入活性化色素（Ｆｌｕｏ−４）を使用して、チップ内に播種されたニューロンを、高分解能高フレームレートカメラを使用してイメージングした。最大で数百のニューロンの蛍光強度変化を、平均ピクセル強度を経時的に記録することによって同時に分析した（ｄＦ／Ｆ）。これらの値を時間に対してプロットした。これらの値を、自発的神経活動およびニューラルネットワーク形成を相関させる波形性質について分析する。これは、マルチステップビデオ処理後およびシグナル分析（オープンソースＭＡＴＬＡＢソフトウェアパッケージから実行することができるビデオ圧縮、シグナルクリーンアップ、自動またはマニュアルＲＯＩ検出などを含む）によって達成される。写真（図１９Ａ、左上）は、このようなイメージの動画からの単一蛍光像である。着色された円は、３つのグラフにおけるタイムトレースに対応する位置を示す。トレースは、リアルタイムでマイクロ流体チップ内のニューロン機能を観察することが可能であることを示す。この場合、Ｃａ２＋フラックスをチップ上で測定してニューロン活性の直接的リードアウトを得ることができることが示される。電位依存性カルシウムチャネルの強力なブロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）を添加すると、この活性が取り除かれる（図１９Ｄ、右下）。このタイプの実験は、ニューロン活動が薬理学的刺激によってモジュレートされるとき、重要となる。
【００９３】
ＩＣＣオーバーレイデータ：細胞を染色した後撮影したイメージを重ねることによって、特異的細胞同定を元の活性トレースと組み合わせてチップ内の個々の細胞型の特異的活性を判定することができる。オーバーレイデータ（図示せず）は、運動ニューロンがチップ内で実際により活性であることを示す。これは、細胞型特異的レポーター株を用いて達成することもできる。
【００９４】
（実施例８）
脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血液と中枢神経系（ＣＮＳ）との間に動的インターフェースを形成する血液脳関門（ＢＢＢ）を構成する。この高度に特殊なインターフェースは、化学物質、毒素、および薬物を含む流体および溶質の傍細胞拡散が脳に入るのを制限する。本実施例では、フルオレセインナトリウムが、マイクロ流体装置に播種されたＢＭＥＣの傍細胞透過性アッセイで使用される。
【００９５】
蛍光プローブ（例えば、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ）にコンジュゲートしたアルブミンまたはデキストランが、漏出の変化、よって関門機能をモニターするのに頻繁に使用される。この場合、デキストラン−ＦＩＴＣ、４ＫＤａの緑色蛍光分子、またはナトリウムフルオレセイン（０．３ＫＤａ分子）が、ボトム（「血液側」）チャネルに添加される。傍細胞透過性を、トップ（「脳側」）チャネル上の蛍光性分子の透過性を測定することによって算出した。低透過性が適切な関門機能の目安である。図１４Ｂは、ＴＮＦ−アルファ曝露を伴うが、リードアウトは、デキストラン−ＦＩＴＣによって測定された膜透過性である。図１４Ｂにより、ＴＮＦａ曝露が、デキストラン−ＦＩＴＣ、蛍光標識低分子による半多孔質膜を通じた透過性の増大によって関門機能およびＴＥＥＲの低下をもたらすことが確認される。
【００９６】
図１５は、傍細胞透過性アッセイからのフルオレセインナトリウムの結果（またはその構造）を示す。チップに健康対照（ＣＴＲ）またはＭＣＴ８欠損患者から採取したｉＰＳＣ由来ＢＭＥＣを播種し、傍細胞透過性を、上述したナトリウムフルオレセイントレーサーの血液から脳への透過性をモニターすることによって判定した。流れは、明らかに重要である。
【００９７】
本実験では、使用した薬剤は、フルオレセインであった。本発明の一部の態様では、同様の試験を行って様々な追加の薬剤（例えば、薬物、化学物質、ホルモン、血液成分、バイオマーカー）の透過性を確認することが企図されている。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ血液脳関門の１種または複数の薬剤への透過性の定性的または定量的推定を可能にすることができる。さらに、本発明の一部の態様によれば、１種の薬剤の透過性が、第２の薬剤、処理、または実験条件に応えて測定される（例えば、別の薬物療法の血液脳関門透過性に対する薬物療法の効果を測定して）。本発明者らは透過性に言及しているが、本発明者らは、薬剤を関門の片側から他方の側に送るための（方向にかかわらず）能動輸送、ポンピング、または任意の他の手段を除外することを意味してないことに留意することが重要である。関門を通じた薬剤の侵入は、例えば、質量分析、抗体ベース法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ビーズベースアッセイ）、または光学的方法（例えば、蛍光シグネチャー、ラマン分光法、吸光度）を使用して測定することができる。
【００９８】
（実施例９）
一部の実施形態は、装置内の１つまたは複数の流体チャネルを通して任意選択で灌流された血液または血液成分を含む。血液または血液成分は、例えば、生化学的キューを提供することによってＢＢＢオンチップ機能を改善することができるので、血液または血液成分の使用が望まれ、または反対に、例えば、血液は、調査下にあり得る有害物を含有し得るのでＢＢＢオンチップに害を与える。一部の態様では、透過性アッセイは、潜在的によりｉｎ  ｖｉｖｏ様の結果をもたらすために血液または血液成分を含む。他の態様では、個体特異的血液または血液成分が、個別化されたＢＢＢ関連評価基準を潜在的にもたらすために使用される。これは、例えば、血液または成分由来の１種または複数の薬剤または成分の透過性の測定、装置に含まれる血液または別の液体に添加され得る１種または複数の薬剤の透過性に対する血液または成分の効果、ＢＢＢオンチップまたはそのコンポーネントのいずれかの健康に対する血液または成分の効果（陽性であっても陰性であっても）などを含み得る。これは、例えば、血液または血液成分が担持する疾患、バイオマーカー、または感染エージェントを同定するための診断上の使用を含み得る。
【００９９】
本実施例では、ＢＭＥＣを横断するホルモン輸送を、質量分析によって健康および罹病組織において「ＢＢＢオンチップ」で測定した。甲状腺ホルモンは、ボトムチャネルに添加し、トップチャネルで測定した。甲状腺ホルモン（Ｔ３およびＴ４）を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して検出した。
【０１００】
ＭＣＴ８バックグラウンドからのＢＭＥＣを使用した。図１６Ａは、血液脳関門を横断してヒト血液を走らせている間のユーザーインターフェースおよび条件を示す。図１６Ｂは、血液脳関門、ＢＭＥＣの層を使用して本明細書に記載のマイクロ流体装置内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで作られる関門を横断するヒト血液からの溶質の輸送を測定するためのセットアップを示す。図１６Ｂは、ヒト血液がどのように高いチップのボトムチャネル内に灌流されたかを示す。本実験では、甲状腺ホルモンを上述したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。このセットアップは、ＢＢＢを横断するタンパク質の濾過を試験するのにも使用されることになる。
【０１０１】
図１７は、グラフにした結果とともに（図１７Ｂ）、図１６Ｂに示したセットアップを使用した質量分析による甲状腺ホルモン輸送の測定（図１７Ａ）を示す。患者血液を、マイクロ流体チップを通してＢＭＥＣ下でチャネル内に流した後、血液から神経コンパートメント内への、すなわち、ＢＭＥＣ関門を通した化合物の輸送を測定することが可能であった。この場合、実験は、非罹病個体を起源とするｉＰＳ由来細胞を含むＢＢＢオンチップの対照セット、およびアラン・ハーンドン・ダドリー症候群（ＡＨＤＳ）と診断された患者を起源とするｉＰＳ由来細胞を含む第２のセットのＢＢＢオンチップを含んでいた。簡単に言えば、ｉＢＭＥＣを、ＭＣＴ８甲状腺ホルモン輸送体内に不活化遺伝子突然変異を有する患者から生成した。この突然変異は、患者においてＢＢＢを横断するＴ３／Ｔ４輸送の欠陥および神経発達の欠陥に至る。図１７Ａ中の質量分析データは、ＭＣＴ８輸送体欠陥をオーガン−チップで再現することができることを確認するための初期の実験である。
【０１０２】
（実施例１０）
本実施例では、疾患モデルをさらに評価した。試料は、Ｔ３の各試料１００μｌを採取し、それをＴ４の等価な試料と混合することによって調製した。これを、各試料について、かつまた較正曲線について行った。タンパク質および塩を溶液から沈殿させ；試料を乾燥させ、同じ体積中に再懸濁させた。較正曲線により、Ｔ３およびＴ４の両方の濃度（ｍＭでの）の算出が可能になった。
【０１０３】
Ｔ３／Ｔ４実験について、以下の４条件をマイクロ流体チップで試験した：
１．ボトムチャネル内で通常培地中１ｎＭ  Ｔ３およびトップチャネル上でＴ３を含まない培地。両側は、３０μｌ／時間の流量で流れていた。
２．ボトムチャネル内で通常培地中１００ｎＭ  Ｔ３およびＴ４、ならびにトップチャネル上でＴ３を含まない培地。やはり、両側は、３０μｌ／時間の流量で流れていた。
３．９０μｌ／時間でのボトムチャネル上のヒト血漿、および１時間静的に保ったトップチャネル上のＴ３を含まない培地。
４．９０μｌ／時間でのボトムチャネル上のヒト血漿、および１時間静的に保ったトップチャネル上のＴ３を含まない培地。
【０１０４】
各実験について、デキストラン−ＦＩＴＣをボトムチャネル中に使用して傍細胞拡散を補正した。
【０１０５】
上述した４条件から、１００ｎＭのみが検出を有意に上回り、これらは、図２１に示した通り、よく働いた。チップ２２８０、２２８９、および２２８４には、単一対照株由来の細胞が存在する。チップ２２８５および２２８６には、同質遺伝子的突然変異ＭＣＴ８株が存在する。チップ２２８７および２２８８には、突然変異ＭＣＴ８患者由来の細胞が存在する。図２１は、各チップのトップチャネル内の補正されたＴ３濃度を示す棒グラフである。明らかに、正常ＭＣＴ８株と比較して突然変異ＭＣＴ８株においてＴ３輸送の低減が存在し、血液脳関門を使用する疾患モデル化、オーガンオンチップ装置の一態様を実証している。
【０１０６】
（実施例１１）
一実施形態では、本発明は、電気生理学的方法およびトランスクリプトミクスによって測定した場合にニューロン生理機能を増強するためのマイクロ流体チップ上のニューロンと脳関連欠陥細胞との接触、より好ましくはｉＭＮとｉＢＭＥＣとの直接接触を企図する。チップは、ｄｉＭＮ電気生理学的成熟を加速することが見出された。
【０１０７】
本実験では、チップ内に播種したｄｉＭＮを播種後１２日後に記録した。図２４は、チップ内で確立されているニューラルネットワークを示すニューロン活性の高度に複雑で反復性のバーストを示す誘発されていない自発的に活動性のニューロンの全細胞パッチクランプ記録を提供する。
【０１０８】
チップ内で６日目にニューロン中に電流を注入することによって発火するように誘導されたとき、より分解された活動電位が伝統的な培養（図２５Ａ）と比較して観察される（図２５Ｂ）。
【０１０９】
チップ（ＭＮ／ＢＭＥＣ）内でＢＭＥＣと共培養されるニューロンは、ニューロンが活動電位を発火するように誘導された際に記録される電流トレースによって表されるように、チップ（ＭＮのみ）上で単独で培養されたＭＮ（図２６Ａ）より顕著な電流（図２６Ｂ）を示す。これらの観察される電気生理学的特性は、ニューロンがこの時点でより成熟していることを示すとして当技術分野で十分に確立されている。
【０１１０】
（実施例１２）
対照研究では、カルシウム流入生細胞イメージングを、チップ（ＭＮチップ）内で、およびＢＭＥＣとの共培養において（ＭＮ／ＢＭＥＣ）培養されたｄｉＭＮに対して実施した。ニューロンカルシウム流入を、以前に記載した通り記録し、時間に対してプロットした（図２７、右パネル）。カルシウム流入事象またはピークは、神経活動に対応し、自動化されたソフトウェアおよび盲検化されたヒト技術者の両方によってカウントした。各事象に時間を記した値を割り当て、時間に対して各追跡されたニューロンについて表した。
【０１１１】
図２８は、チップ上の記録されるニューロンの周波数が伝統的な９６ウェル培養対照（ＣＴＲＬ９６）と比較して両チップ条件において有意に増大することを示す棒グラフである。この増大は、ＢＭＥＣでプレコンディショニングされた培地で処理された９６ウェル培養（ＥＣＣＭ９６）において観察されず、ニューロンの流出する能力の増大がもっぱらチップ内で実現されることを示した。この効果は、共培養においてチップにＢＭＥＣを添加するとさらに増大した。周波数の増大は、ＭＮが成熟する際にｉｎ  ｖｉｖｏで起こることが公知であり、ニューロンがチップ内でより速く成熟することを示す。
【０１１２】
（実施例１３）
本実験では、ｄｉＭＮに核タグ付きＧＦＰレポーター導入遺伝子を安定にトランスフェクトし、トップチャネル上に播種した。ＮＯＮ−ＧＦＰ  ＢＭＥＣをボトムチャネル中に播種した。チップをこの構成または非ＢＭＥＣ対照（チップ上にｄｉＭＮのみおよび標準９６ウェルプレート内にｄｉＭＮの両方）において成熟させた。細胞をチップ上で６日後にＦＡＣＳ選別してＮＯＮ−ＧＦＰ  ＢＭＥＣからｄｉＭＮ培養物を精製した。これらの精製細胞をすべての条件においてｍＲＮＡシーケンシングし、客観的主成分分析（ＰＣＡ）をすべての試料に対して行った。第１の主成分は、発現された異なる遺伝子によって条件を分離した。ＰＣ１は、前駆細胞プールからすべての培養物を分離し（黒色）、ＰＣ２遺伝子は、チップ内のｄｉＭＮから９６ウェル培養物を分離し、ＰＣ３は、ＢＭＥＣとの共培養においてもっぱら発現された遺伝子を分離した（図２９）。
【０１１３】
各ＰＣからの上位２００の高度に発現された遺伝子および下位１００の低発現された遺伝子を、客観的遺伝子オントロジープラットフォームＤＡＶＩＤに登録した。得られた経路は、チップ特異的ＰＣ２遺伝子セット内に増大した神経分化を含んでいた（図３０、中央のリスト）。血管相互作用遺伝子経路は、共培養チップにおいて見出され、血管系とニューロンとの間の公知のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子経路がチップ装置内で再現されたことを示した。図３０の右の色付きバーは、５条件のそれぞれ（列）における各遺伝子の発現（行）を表す。列の順序は、ＭＮのみ、ＢＭＥＣ／ＭＮ、９６ウェル対照、９６ウェルＥＣＣＭ、ＭＮ前駆細胞である。赤色＝高い、および青色＝低い。これらの血管遺伝子経路は、いずれの他の培養系においても誘導されることが示されておらず、成熟および活性の観察される増大を誘導している場合がある。
【表１】
2018533940.tif 000005
【表２】
2018533940.tif 000006
【表３】
2018533940.tif 000007
【表４】
2018533940.tif 000008
【図１】
2018533940.tif 000009
【図２】
2018533940.tif 000010
【図３Ａ】
2018533940.tif 000011
【図３Ｂ】
2018533940.tif 000012
【図４】
2018533940.tif 000013
【図５】
2018533940.tif 000014
【図６Ａ】
2018533940.tif 000015
【図６Ｂ】
2018533940.tif 000016
【図７】
2018533940.tif 000017
【図８】
2018533940.tif 000018
【図９】
2018533940.tif 000019
【図１０】
2018533940.tif 000020
【図１１】
2018533940.tif 000021
【図１２】
2018533940.tif 000022
【図１３Ａ】
2018533940.tif 000023
【図１３Ｂ】
2018533940.tif 000024
【図１４】
2018533940.tif 000025
【図１５】
2018533940.tif 000026
【図１６】
2018533940.tif 000027
【図１７Ａ】
2018533940.tif 000028
【図１７Ｂ】
2018533940.tif 000029
【図１７Ｃ】
2018533940.tif 000030
【図１８Ａ】
2018533940.tif 000031
【図１８Ｂ】
2018533940.tif 000032
【図１９】
2018533940.tif 000033
【図２０】
2018533940.tif 000034
【図２１】
2018533940.tif 000035
【図２２Ａ】
2018533940.tif 000036
【図２２Ｂ】
2018533940.tif 000037
【図２３Ａ】
2018533940.tif 000038
【図２３Ｂ】
2018533940.tif 000039
【図２４】
2018533940.tif 000040
【図２５】
2018533940.tif 000041
【図２６】
2018533940.tif 000042
【図２７】
2018533940.tif 000043
【図２８】
2018533940.tif 000044
【図２９】
2018533940.tif 000045
【図３０】
2018533940.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月26日(2018.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備える流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）播種された内皮細胞を創製するように前記底面に内皮細胞を播種するステップと；ｃ）前記上面にニューロンを播種して、播種されたニュ−ロンを創製するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された内皮細胞および前記播種されたニュ−ロンを曝露するステップと
を含み、
前記ニューロンが、前記流れへの曝露の後、静置培養で培養される同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、
方法。
【請求項２】
前記内皮細胞が、幹細胞由来細胞、幹細胞から分化した細胞、および初代細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｅ）アストロサイトを播種して播種されたアストロサイト細胞を創製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アストロサイトまたはその部分が、前記膜を遊出し、前記底面上の１個または複数の脳微小血管内皮細胞に接触する条件下で前記アストロサイトを培養するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ニューロンが、ＥＺ球、ｉＮＰＣ、またはｉＭＮＰに由来するか、またはそれらから抽出される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に誘導された運動ニューロン前駆細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
【請求項７】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ＣＮＳ障害と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記流れが、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞の分化を促進する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ニューロンに分化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記脳微小血管内皮細胞が、ＭＣＴ８特異的甲状腺ホルモン細胞−膜輸送体欠損症と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、凍結して貯蔵され、次いでステップｃ）の前に解凍される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
流動培地と接触したニューロンのマイクロ流体培養物であって、前記ニューロンは、マイクロチャネル内で、またはマイクロ流体チップの膜上で培養されており、前記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、マイクロ流体培養物。
【請求項１５】
血管細胞とのニューロンのマイクロ流体共培養物であって、前記ニューロンおよび血管細胞は、流動培養培地と接触しており、前記ニューロンは、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、流体共培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
表２は、マイクロ流体チップの頂端側および基底側に神経（ＥＺ球、ｉＮＰＣ、およびｉＭＮＰ）ならびに内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）を播種することについて試験した様々な条件を示す。このチップは、トップ流体チャネルおよびボトム流体チャネルを分離する多孔質膜を含んでいた（チップは、任意選択の減圧稼働チャネルを用いることなく米国特許第８，６４７，８６１号に開示の実施形態に倣ってモデル化した）。多孔質膜を含む本開示の典型的な実施形態では、任意の脳細胞（例えば、アストロサイト、ニューロン）は、前記トップ流体チャネル内に配置され、および内皮細胞（例えば、ｉＢＭＥＣ、初代ＢＭＥＣ、ＨＵＶＥＣ）は、前記ボトム流体チャネル内に配置される。しかし、他の実施形態では、内皮細胞は、トップ流体チャネル内に配置され、脳細胞は、ボトム流体チャネル内に配置される一方、さらに他の実施形態では、内皮および脳細胞の両方が、同じ流体チャネル（トップ、ボトム、または両方）内に配置される。
表３および４は、新鮮な神経細胞（ｉＭＮＰ）および新鮮な内皮細胞（ｉＢＭＥＣ）の播種について試験した様々な条件を示し、特定の条件は、マイクロ流体チップ数によって関連付けられ、良好なタイトジャンクションの播種条件との相関を可能にする。チップに様々な播種密度で播種することができ、最適な密度は、細胞型、分化の段階、表面被覆、基質材料、培地組成、細胞が播種後に増殖するか否か、播種インキュベーション時間、チャネル寸法などを含む（しかしこれらに限定されない）因子によって決定される。表２に例示した装置内のＥＺ球、ｉＮＰＣ、およびｉＭＮＰを含めた神経細胞の播種密度は、例えば、１×１０３細胞／ｍＬから１×１０８細胞／ｍＬの間または１×１０４細胞／ｍＬから５×１０８細胞／ｍＬの間の範囲となり得る。表２に例示した装置内のｉＢＭＥＣを含めた内皮細胞の播種密度は、例えば、２．５×１０３細胞／ｍＬから１×１０８細胞／ｍＬの間または２×１０４細胞／ｍＬから５×１０８細胞／ｍＬの間の範囲となり得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備える流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記底面に細胞を播種するステップと；ｃ）脳微小血管内皮細胞の成熟を支持する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
（項目２）
前記細胞が、幹細胞由来細胞、幹細胞から分化した細胞、および初代細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
幹細胞から分化した前記細胞が、脳微小血管内皮細胞である、項目２に記載の方法。
（項目４）
幹細胞から分化した前記細胞が、ｉＢＭＥＣである、項目２に記載の方法。
（項目５）
ｄ）前記上面に幹細胞由来細胞または幹細胞から分化した細胞を播種して播種された細胞を創製し、アストロサイトおよびニューロンの少なくとも１種の成熟を支持する条件下で前記上面に播種された細胞を培養するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ニューロンが、静置培養で培養される同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、項目５に記載の方法。
（項目７）
アストロサイトまたはその部分が、前記膜を遊出し、前記底面上の１個または複数の脳微小血管内皮細胞に接触する条件下で培養するステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記上面に播種された幹細胞から分化した細胞が、ＥＺ球、ｉＮＰＣ、またはｉＭＮＰに由来するか、またはそれらから抽出される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、項目５に記載の方法。
（項目１１）
ステップｂ）の前に、前記上面または底面の少なくとも一方が、１種または複数の細胞外マトリックスタンパク質で被覆される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記上面が、ラミニンで被覆される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記底面が、コラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆され、ラミニンを欠く、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記上面上で培養された前記細胞が、周皮細胞をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１５）
ステップｃ）の前記条件が、ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記流れが、脳微小血管内皮細胞の成熟を促進する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記流れが、前記脳微小血管内皮細胞の間で細胞間タイトジャンクションの形成を促進する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞間タイトジャンクションを検出するステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞間タイトジャンクションが、ＴＥＥＲ測定によって検出される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ｅ）パッチクランプ測定、細胞外電気生理学的測定、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングの少なくとも１つによってニューロンまたはアストロサイト活性を測定するステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞間タイトジャンクションが、細胞透過性アッセイによって検出される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記脳微小血管内皮細胞が、マーカーＧｌｕｔ１を発現する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
ステップｃ）の前記培養が、少なくとも４日間実施される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
ステップｃ）の前記培養が、少なくとも７日間実施される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記流体装置が、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、培養培地が、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記膜が、拡張性および指向性神経突起成長を促進するナノパターン化表面を含む、項目５に記載の方法。
（項目２７）
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に幹細胞由来脳細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
（項目２８）
前記脳微小血管内皮細胞が、ニューロンを含まない、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記マイクロ流体装置が、前記膜の前記上面と流体連通した第１のマイクロ流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２のマイクロ流体チャネルを備え、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルそれぞれが、前記膜と平行である表面を含み、それぞれが側壁を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記脳微小血管内皮細胞が、管腔を形成するために前記第２のマイクロ流体チャネルの前記平行面および側壁上で成長する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記脳微小血管内皮細胞が、マーカーＧｌｕｔ１を発現する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
ステップｅ）の前記培養が、少なくとも４日間実施される、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
ステップｅ）の前記培養が、少なくとも７日間実施される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記マイクロ流体装置が、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートをさらに備え、培養培地が、前記入口ポートに入り、前記出口ポートを出る、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記第１および第２のマイクロ流体チャネルが、ポリジメチルシロキサンを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
ステップｂ）の前に、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルが、湿りを促進する処理を受ける、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
湿りを促進する前記処理が、プラズマ処理、イオン処理、気相堆積、液相堆積、吸着、吸収、または１種もしくは複数の薬剤との化学反応からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記幹細胞由来脳細胞が、湿ったラミニン上に播種される、項目２７に記載の方法。
（項目３９）
コラーゲンとフィブロネクチンとの前記混合物が、ステップｃ）の前に乾燥される、項目２７に記載の方法。
（項目４０）
前記マイクロ流体装置が、ステップｂ）の後、かつステップｃ）の前に格納される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記マイクロ流体装置が、２５℃未満の温度で格納される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記マイクロ流体装置が、冷蔵庫内に格納される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
細胞を培養する方法であって、ａ）膜を備えるマイクロ流体装置を提供するステップであって、前記膜は、上面および底面を含むステップと；ｂ）前記膜の前記上面をラミニンで、前記底面をコラーゲンとフィブロネクチンとの混合物で被覆するステップであって、前記混合物は、ラミニンを含まないステップと；ｃ）播種された細胞を創製するために、前記上面に誘導された運動ニューロン前駆細胞、前記底面に脳微小血管内皮細胞を播種するステップと；ｄ）ある時間にわたって培養培地の流れに前記播種された細胞を曝露するステップと；ｅ）前記底面上の前記脳微小血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成する条件下で前記播種された細胞を培養するステップとを含む、方法。
（項目４４）
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ＣＮＳ障害と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記流れが、前記誘導された運動ニューロン前駆細胞の分化を促進する、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、ニューロンに分化する、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記脳微小血管内皮細胞が、ＭＣＴ８特異的甲状腺ホルモン細胞−膜輸送体欠損症と診断された患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記誘導された運動ニューロン前駆細胞が、凍結して貯蔵され、次いでステップｃ）の前に解凍される、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含む、流体装置。
（項目５２）
前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞が、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される、項目５１に記載の流体装置。
（項目５３）
前記膜の前記上面と流体連通した第１のマイクロ流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２のマイクロ流体チャネルをさらに備え、前記第１および第２のマイクロ流体チャネルそれぞれが、前記膜と平行である表面を含み、それぞれが側壁を含む、項目５１に記載の流体装置。
（項目５４）
前記脳微小血管内皮細胞が、管腔を構成するために前記第２のマイクロ流体チャネルの前記平行面および側壁上に存在する、項目５３に記載の流体装置。
（項目５５）
ａ）膜を備える流体装置であって、前記膜は、上面および底面を含み、前記上面は、少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞を含み、前記底面は、脳微小血管内皮細胞を含み、前記マイクロ流体装置は、前記膜の前記上面と流体連通した第１の流体チャネルおよび前記膜の前記底面と流体連通した第２の流体チャネルをさらに備える、流体装置、ｂ）前記第１および第２の流体チャネルと流体連通した流体源であって、それによって前記細胞がある流量の流体に曝露される、流体源を備えるシステム。
（項目５６）
前記少なくとも１種の幹細胞由来脳細胞が、誘導された運動ニューロン前駆細胞、ＥＺ球由来細胞、およびｉＮＰＣからなる群から選択される、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記マイクロ流体チップが、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備える、項目５５に記載のシステム。
（項目５８）
流動培地と接触したニューロンのマイクロ流体培養物。
（項目５９）
前記ニューロンが、ｉＰＳＣ由来ニューロンである、項目５８に記載のマイクロ流体培養物。
（項目６０）
前記ｉＰＳＣ由来ニューロンが、運動ニューロンである、項目５９に記載のマイクロ流体培養物。
（項目６１）
前記ニューロンが、マイクロチャネル内で、またはマイクロ流体チップの膜上で培養される、項目５８に記載のマイクロ流体培養物。
（項目６２）
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、項目６１に記載のマイクロ流体培養物。
（項目６３）
血管細胞とのニューロンのマイクロ流体共培養。
（項目６４）
前記血管細胞が、ｉＰＳＣ由来血管細胞である、項目６３に記載のマイクロ流体共培養。
（項目６５）
前記ｉＰＳＣ由来血管細胞が、脳微小血管内皮細胞である、項目６４に記載のマイクロ流体共培養。
（項目６６）
前記ニューロンが、ｉＰＳＣ由来ニューロンである、項目６３に記載のマイクロ流体共培養。
（項目６７）
前記ｉＰＳＣ由来ニューロンが、運動ニューロンである、項目６６に記載のマイクロ流体共培養。
（項目６８）
前記ニューロンがｉＰＳＣ由来ニューロンであり、前記血管細胞がｉＰＳＣ由来血管細胞である、項目６３に記載のマイクロ流体共培養。
（項目６９）
前記血管細胞が、マイクロチャネル内で、またはマイクロ流体チップの膜上で前記ニューロンと共培養される、項目６３に記載のマイクロ流体共培養。
（項目７０）
前記マイクロ流体チップが、第１および第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを備え、前記ニューロンが、前記第１の表面上で培養され、前記血管細胞が、前記第２の表面上で培養される、項目６９に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７１）
前記ニューロンおよび血管細胞の少なくとも一部が、互いに接触している、項目６３に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７２）
前記ニューロンおよび血管細胞が、流動培養培地と接触している、項目６３に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７３）
前記ニューロンが、静置培養で培養された同じニューロンと比較してより成熟した電気生理学的特性を示す、項目７２に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７４）
前記ニューロンおよび血管細胞が、同じ人の幹細胞から産生される、項目６８に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７５）
前記ニューロンおよび血管細胞が、同じ患者の幹細胞から産生される、項目６８に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７６）
前記患者が、ＣＮＳ障害の症状を有する、項目７５に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７７）
前記ＣＮＳ障害が、神経変性疾患である、項目７６に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７８）
前記神経変性疾患が、ＡＬＳである、項目７７に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目７９）
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、項目７７に記載のマイクロ流体共培養物。
（項目８０）
前記ＣＮＳ障害が、アルツハイマー病である、項目７６に記載のマイクロ流体共培養物。
【国際調査報告】
2018533940.tif 000047
2018533940.tif 000048