(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の研究及び臨床診断の双方において、標的抗体の検出の安定性、感度、及び選択性が高いカルジオリピン及び他のリン脂質の新しい合成類似体を提供すること。【解決手段】自己抗体、特にリン脂質に対する自己抗体の識別に有用なリン脂質−ペプチド又はリン脂質−タンパク質共役体が提供される。更に、リン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体の中間体、及びそれらの調製方法、及び合成方法が提供される。【選択図】図１
2018502818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）のリン脂質タンパク質共役体であって、
【化１】
2018502818.tif 000028
Ｌが、１，２，３−トリアゾール、一般式ＲＣ（Ｏ）ＮＨＲ’のアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせ等のリンカーであり、Ｒはリン脂質であり、Ｒ’はタンパク質／ペプチドであり、前記リン脂質及びタンパク質又はペプチドが生物学的に相補的である、リン脂質タンパク質共役体。
【請求項２】
前記タンパク質又はペプチドが、β２−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、及び少なくとも１０であり最大で１００までのアミノ酸残基を有する合成ペプチドから選択される、請求項１に記載のリン脂質−ペプチド又はリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項３】
前記リン脂質が、カルジオリピン、１，２−ジステアロイル−ホスホエタノールアミン等のホスホエタノールアミンの脂肪酸誘導体から選択される、請求項１又は２に記載のリン脂質−ペプチド又はリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項４】
前記リンカーが、アミドによって共役された１，２，３−トリアゾールである、請求項１から３のいずれか１項に記載のリン脂質−ペプチド又はリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項５】
前記共役体が式ＢＣ−１及びＢＣ−２の化合物から選択され、
【化２】
2018502818.tif 000029
ｂ２ＧＰＩがβ２−糖タンパク質Ｉを表し、ＰＴがプロトロンビンを表す、請求項１から４のいずれか１項に記載のリン脂質−ペプチド又はリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項６】
以下の式を有する、請求項１に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【化３】
2018502818.tif 000030
【請求項７】
以下の式を有する、請求項１に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【化４】
2018502818.tif 000031
【請求項８】
以下の式を有する、請求項１に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【化５】
2018502818.tif 000032
【請求項９】
以下の式を有する、請求項１に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【化６】
2018502818.tif 000033
【請求項１０】
以下の式（ＢＣ−７）及び（ＢＣ−８）を有する化合物から成る群から選択され、
【化７】
2018502818.tif 000034
【化８】
2018502818.tif 000035
ｎが１〜２０の範囲内の整数であり、Ｙ+が任意の適切なカチオンである、請求項１に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項１１】
Ｙ+がＮａ+、Ｋ+、又は１／２Ｃａ2+である、請求項１０に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項１２】
前記タンパク質／ペプチドが、β２−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、及び少なくとも１０であり最大で１００までのアミノ酸基を有する合成ペプチドから成る群から選択される、請求項１０から１１のいずれか１項に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項１３】
前記タンパク質／ペプチドが、β２−糖タンパク質Ｉ、プロトンビンから成る群から選択される、請求項１０から１１のいずれか１項に記載のリン脂質−タンパク質共役体。
【請求項１４】
以下の式（ＣＬ−１）から（ＣＬ−６）の１つから選択され、
【化９】
2018502818.tif 000036
【化１０】
2018502818.tif 000037
【化１１】
2018502818.tif 000038
【化１２】
2018502818.tif 000039
【化１３】
2018502818.tif 000040
【化１４】
2018502818.tif 000041
Ｙ+が任意の適切なカチオンであり得る、タンパク質又はペプチドと共役するための、カルジオリピン類似体。
【請求項１５】
Ｙ+がＮａ+、Ｋ+、又は１／２Ｃａ2+である、請求項１４に記載のカルジオリピン類似体。
【請求項１６】
以下の式の化合物から成る群から選択されるタンパク質又はペプチド誘導体：
【化１５】
2018502818.tif 000042
【請求項１７】
前記タンパク質が、β２−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、及び少なくとも１０であり最大で１００までのアミノ酸残基を有する合成ペプチドから成る群から選択される、請求項１６に記載のタンパク質又はペプチド誘導体。
【請求項１８】
前記タンパク質が、β２−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビンから成る群から選択される、請求項１６に記載のタンパク質又はペプチド誘導体。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の前記共役体に対する自己免疫抗体を検出するための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体、特にカルジオリピン等のリン脂質及びカルジオリピン−ｂ２−糖タンパク質Ｉ（アポリポタンパク質Ｈ）等のリン脂質−タンパク質複合体に対する自己抗体を識別するのに有用なリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。本発明は更に、リン脂質類似体と、そのような類似体並びにリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体を調製するための方法と、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の合成類似体は、人の疾患の研究及び臨床診断における分子認識のための極めて重要で多様なツールを含んでいる。近年、ナノバイオテクノロジー及び生体分子認識のための合成プローブに関して、人工的な核酸及びタンパク質の生物共役体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の調製では著しい進展があった。更に、新しい銅触媒を用いるアジド−アルキン環化付加及び歪みで促進される銅フリーのアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ及びＳＰＡＡＣ）クリックケミストリー反応は、生物共役に有効であり、優れた収率で安定した生成物が得られることが証明された。しかしながら、ＣｕＡＡＣ／ＳＰＡＡＣクリックケミストリーは、脂質の生物共役の分野では詳細な調査が行われていない。
【０００３】
脂質は、生物における最も重要なプロセスに関与する生体分子であり、従って、人の疾患の分子診断及び研究には極めて重要である。脂質は、他の生体分子よりも水媒体の溶解度が低く、酸化に対する感受性が高いので、生物共役には非常に困難な物体である。
【０００４】
ＣｕＡＡＣ及びＳＰＡＡＣクリックケミストリー反応によって典型的に示される近年の生物共役戦略の進展（非特許文献１参照）は、人工的な脂質生物共役体の調製を更に推進するための基礎となる可能性がある。
【０００５】
自己免疫疾患の診断は過去５０年間にわたって行われてきたが、今なお対処すべき疑問及び問題は多い。例えば、自己のリン脂質に対する抗体は、人の抗リン脂質症候群（ＡＰＳ：Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の最大の謎の１つである。ＡＰＳは、血栓症及び反復性（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）妊娠損失を含む多くの発現及び重大な損害を患者に引き起こす自己免疫疾患である。かつて、ＡＰＳの診断には、哺乳動物のミトコンドリア内膜の重要成分のリン脂質であるカルジオリピンに対する抗体の検出が必要であった。
【０００６】
しかしながら、いくつかのウィルス及び細菌感染を有する患者で抗体が生成されることがわかった。更に、近年、カルジオリピンに対する一部の抗体はカルジオリピンそのものではなく、カルジオリピンに結合する血漿タンパクのβ２−ＧＰＩに対するものであることが実証された。このため、ＡＰＳの最新の診断では、抗カルジオリピン抗体、抗β２−ＧＰＩ抗体、他のリン脂質（ホスファチジルセリンを含む）に対する抗体、及びループスアンチコアグラントと呼ばれる混合リン脂質の抗体について、別個の試験が必要である。
そのような診断手法は時間がかかり、費用も高い。更に、抗カルジオリピン抗体についての現在の試験は天然源から得られた不均質なリン脂質分子を使用しているので、化学安定性が低く、選択性が低く、異なる作業グループ間で結果に著しい不一致が生じる。
【０００７】
特許文献１は、クリック反応基、リンカー、及び求核基を含む担体分子を有する化合物について記載している。反応基は、標準的なＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＥ）エステル及びペルフルオロフェノール（ＰＦＰ：ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃ）エステルよりも加水分解安定性が高く、介在リンカーを介してクリック反応基に付着されるとクリック標識試薬を形成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１３４９２５Ａ１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｇ．Ｐａｕｌｉｃｋ、Ａ．Ｒ．Ｗｉｓｅ、Ｍ．Ｂ．Ｆｏｒｓｔｎｅｒ、Ｊ．Ｔ．Ｇｒｏｖｅｓ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７年、１２９、１１５４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
自己免疫疾患の研究及び臨床診断の双方において、標的抗体の検出の安定性、感度、及び選択性が高いカルジオリピン及び他のリン脂質の新しい合成類似体が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標的抗体の検出の安定性、感度、及び選択性が向上した新規のリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体を提供する。これらの新規のリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体は、人の自己免疫疾患の研究及び診断、特にカルジオリピン等のヒトリン脂質に対する自己抗体の識別に有用である。
【００１２】
本発明の第１の態様において、以下の式のリン脂質タンパク質共役体が提供される。
【化１】
2018502818.tif 000003
Ｌは、１，２，３−トリアゾール、アミド、又はそれらの組み合わせ等のリンカーであり、リン脂質及びタンパク質は生物学的に相補的である、すなわちインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で相互作用する。
【００１３】
本発明の代替的な実施形態において、以下の式（Ｉ）のリン脂質タンパク質共役体が提供される。
【化２】
2018502818.tif 000004
Ｌは、１，２，３−トリアゾール、一般式ＲＣ（Ｏ）ＮＨＲ’のアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせ等のリンカーであり、Ｒはリン脂質でＲ’はタンパク質／ペプチドであり、リン脂質及びタンパク質又はペプチドは生物学的に相補的である。
【００１４】
本発明の好適な実施形態において、リン脂質−ペプチド共役体及びリン脂質−タンパク質共役体のタンパク質又はもっと短いペプチド部分、例えば１０から１００のアミノ酸は、β２−ＧＰＩ及びプロトロンビンから選択される。特に好適な実施形態において、本発明者は、１，２，３−トリアゾールリンカーを介して、生物学的に相補的な分子、すなわち、ホスホエタノールアミンとヒトβ２−糖タンパク質Ｉ及びプロトロンビン、並びにカルジオリピンと一連の免疫原性ペプチド及びタンパク質（ヒトβ２−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、及びそれらのフラグメント）を共有結合した。好ましくは、リン脂質は、カルジオリピン、１，２−ジステアロイル−ホスホエタノールアミン等のホスホエタノールアミンの脂肪酸誘導体から選択される。タンパク質及びペプチドは、末端アミノ末端、又はリシン等のアミノ酸を含有するアミンを介して、リンカーに結合することができる。
【００１５】
得られたリン脂質−ペプチド共役体及びリン脂質−タンパク質共役体は、自己免疫複合体に対する自己免疫抗体について驚くほど高い結合親和性及び特異性を示す。従って、これらの共役体は、抗リン脂質症候群や全身性エリテマトーデス等、上記のリン脂質及びタンパク質に対する自己抗体の生成を伴う自己免疫疾患の診断及び治療において極めて有用である。また、これら新規の共役体では驚くべきことに保存時の安定性が向上した。
【００１６】
本発明の好適な生物共役体
本発明の好適な生物共役体は、以下の式（ＢＣ−１）及び（ＢＣ−２）から成る群から選択することができる。
【化３】
2018502818.tif 000005
式中、ｂ２ＧＰＩはβ２−糖タンパク質Ｉを表し、ＰＴはプロトロンビンを表す。
【００１７】
本発明に従った更に別の有用な共役体は、以下から成る群から選択された化合物である。
【化４】
2018502818.tif 000006
【化５】
2018502818.tif 000007
【化６】
2018502818.tif 000008
【化７】
2018502818.tif 000009
【００１８】
重要な点として、ＢＣ−１からＢＣ−６では、Ｎａ+を、Ｋ+又はＣａ2+等の他の任意の適切なカチオンで置き換えることができる。「タンパク質」部分は、β２−ＧＰＩ及びプロトロンビンを含む本発明のタンパク質及びペプチドのいずれかとすればよい。
【００１９】
好適な実施形態において、本発明の共役体は、式（ＢＣ−７）の共役体である。
【化８】
2018502818.tif 000010
ｎは整数であり、１〜２０の範囲内とすることができ、例えば５〜１５であり、好ましくは１０〜１３である。タンパク質／ペプチド部分は、β２−糖タンパク質Ｉ及び／又はプロトロンビンを含む本発明のタンパク質及びペプチドのいずれかとすればよい。タンパク質／ペプチドがプロトロンビンである場合、ｎは好ましくは１２〜１３である。タンパク質部分がβ２糖タンパク質Ｉである場合、ｎは好ましくは１０〜１１である。Ｙ+は任意の適切なカチオンとすればよい。好ましくは、Ｙ+はＮａ+、Ｋ+、又は１／２Ｃａ2+とすることができる。
【００２０】
生物共役体（ＢＣ−７）は、カルジオリピン類似体（ＣＬ−５）及びタンパク質中間体（ｉｎｔ−３）の「クリック」結合によって得られることに留意すべきである。これは、以下のスキームＩＩの反応と類似のものである。
【００２１】
式ＢＣ−７の化合物は、従来技術の既知の共役体に比べ、自己免疫抗体の検出において驚くほど特異的であり、本明細書に記載する研究において安定的であることが示されている。理論に束縛されるものではないが、細長いリンカー及びリン脂質の酸化状態が検出の向上の原因であり得ると考えられる。
【００２２】
更に別の好適な実施形態において、本発明の共役体は、式（ＢＣ−８）の共役体である。
【化９】
2018502818.tif 000011
ｎは整数であり、１〜２０の範囲内とすることができ、例えば５〜１５であり、好ましくは１０〜１３である。タンパク質／ペプチド部分は、β２−糖タンパク質Ｉ及び／又はプロトロンビンを含む本発明のタンパク質及びペプチドのいずれかとすればよい。タンパク質／ペプチドがプロトロンビンである場合、ｎは好ましくは１２〜１３である。タンパク質部分がβ２糖タンパク質Ｉである場合、ｎは好ましくは１０〜１１である。Ｙ+は任意の適切なカチオンとすればよい。好ましくは、Ｙ+はＮａ+、Ｋ+、又は１／２Ｃａ2+とすることができる。
【００２３】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）及び／又は式（ＢＣ−１）から（ＢＣ−８）の共役体を用いて自己免疫抗体を検出するための方法である。別の態様は、式（Ｉ）及び／又は式（ＢＣ−１）から（ＢＣ−８）の共役体に対する自己免疫抗体を検出するための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）である。好適な共役体は、（ＢＣ−７）及び（ＢＣ−８）であり、特に（ＢＣ−８）である。
【００２４】
本発明の好適なリン脂質中間体
本発明は更に、以下から成る群から選択されたペプチド又はタンパク質との共役のためのカルジオリピン類似体（ＣＬ−１）〜（ＣＬ−４）を提供する。
【化１０】
2018502818.tif 000012
【化１１】
2018502818.tif 000013
【化１２】
2018502818.tif 000014
【化１３】
2018502818.tif 000015
【００２５】
重要な点として、ＣＬ−１からＣＬ−４では、Ｎａ+を、Ｋ+又はＣａ2+等の他の任意の適切なカチオンで置き換えることができる。
【００２６】
本発明の好適な実施形態では、ペプチド又はタンパク質との共役のためのカルジオリピン類似体は、式（ＣＬ−５）及び式（ＣＬ−６）から成る群から選択された化合物である。
【化１４】
2018502818.tif 000016
Ｙ+は任意の適切なカチオンとすればよい。好ましくは、Ｙ+は、Ｎａ+、Ｋ+、又は１／２Ｃａ2+とすることができる。
【化１５】
2018502818.tif 000017
ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを表す。（ＣＬ−６）では、Ｎａ+を、Ｋ+又は１／２Ｃａ2+等の他の任意の適切なカチオンで置き換えることができる。
【００２７】
上述の試薬は、本発明に従って適用可能である広範囲にわたる同様の化合物からのいくつかの例である。
【００２８】
本発明の好適なタンパク質及びペプチド中間体
本発明は更に、本発明の共役体の調製に有用な、以下の一般式（ｉｎｔ−１）〜（ｉｎｔ−３）から選択されるペプチド及びタンパク質誘導体を提供する。
【化１６】
2018502818.tif 000018
【００２９】
本発明の更に別の態様では、本発明のリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体を調製するための方法が提供される。この方法は、以下のスキームＩ、スキームＩＩ、又はスキームＩＩＩに従って、本発明のタンパク質誘導体をカルジオリピンリン脂質と反応させることを含む。
【化１７】
2018502818.tif 000019
【化１８】
2018502818.tif 000020
【化１９】
2018502818.tif 000021
【００３０】
「タンパク質」部分は、β２−ＧＰＩ及びプロトロンビンを含む本発明のタンパク質及びペプチドのいずれかとすればよい。
【００３１】
本発明の更に別の態様では、抗リポイド抗体に対する抗原の抗原性及び特異性を維持しながら、カルジオリピン類似体（又は本明細書に記載するように修飾されたカルジオリピンを含むリポイド抗原）をペプチド／タンパク質（又は固体支持体）に付着させるための手法が提供される。本明細書に記載する方法を用いて、カルジオリピン−付着分子複合体を生成することができる。このように免疫原性カルジオリピン複合体を付着させる能力によって、ＥＬＩＳＡ及び免疫学的検定デバイス等の非溶液ベースの免疫学的検定における使用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＳＰＡＡＣクリックケミストリーによって新規の生物共役体を調製するための合成戦略を示す。図１ｂは、均質フォーマット及び２Ｄアレイフォーマットにおける新規のリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質生物共役体による特異抗体の検出を示す。
【図２】化学安定性が向上した新規のカルジオリピン類似体を合成するための一般的な戦略を示す。
【図３】本発明の抗原に対する自己免疫抗体を検出するための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）のスキームを示す。
【図４】自己免疫抗体のＥＬＩＳＡ検出における本発明のリン脂質抗原の性能比較を示す。
【図５】カルジオリピン−β２ＧＰＩ及びカルジオリピン−ＰＴ複合体、特に化合物７及び８の合成戦略を示す。試薬及び条件：（ｉ）０．１Ｍの重炭酸塩緩衝剤−ＤＭＳＯ  ９：１、４℃、１２時間。（ｉｉ）対応するアジド、ＣｕＳＯ4：ＴＢＴＡ  １：１．１、アスコルビン酸、１ｘＰＢＳ−ＤＭＳＯ−ｔＢｕＯＨ  ３：２：０．１、ｖ／ｖ／ｖ、（ｉｉｉ）ＫＭｎＯ4、ＮａＩＯ4、ｔ−ＢｕＯＨ−Ｈ２Ｏ  ９：１、ｖ／ｖ、室温、１２時間。（ｉｖ）スクシンイミドエステル、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＭＳＯ、室温、１２時間。（ｖ）タンパク質２、３、８、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝剤−ＤＭＳＯ  ９：１、ｖ／ｖ、室温、１２時間。（ｖｉ）ＫＭｎＯ４、ＮａＩＯ4、ｔ−ＢｕＯＨ−Ｈ2Ｏ  ９：１、ｖ／ｖ、４５℃、１時間、マイクロ波反応器。（ｖｉｉ）スクシンイミドエステル、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＭＳＯ、室温、５時間。３−アジドプロパン−１−アミン、室温、１２時間。
【図６】図５の化合物７〜８及び対照を用いて得られたＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す〔抗原間でグループ化した患者（６Ｂ）及び健康な対照（６Ａ）の吸収度〕。陰性及び陽性の対照（ＨＮＰ及びＨＣＬ、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ）を、それぞれ「ｘ」及び星印で示す。図６Ａの共役体５及び６は、それぞれ本明細書のスキームＶＩの化合物６及び７に対応する。
【図７】病気の状態の患者（ＳＵＨコホート）について、ａＰＬＰと臨床パラメータとの間で観察された相関のデータプロットを示す。スチューデントｔ検定は、排他的に図５の抗原８を用いてスミス正値性（Ｓｍｉｔｈ  ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）と上昇ａＰＬＰタイターとの間の相関を示した。
【図８】病気の状態の患者（ＳＵＨコホート）について、ａＰＬＰと臨床パラメータとの間で観察された相関の線形回帰プロットを示す。Ｓｔａｔａを用いて最小二乗回帰（ＯＬＳ）解析を行った。図５の抗原８について、スミス陰性（Ｓｍｉｔｈ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）群及びスミス陽性（Ｓｍｉｔｈ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）群のａＰＬＰタイターの差は、０．００２のｐ値で統計的に有意であることがわかった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書において、焦点となる生物共役体は、β２−糖タンパク質Ｉ（β２−ＧＰＩ）、プロトロンビン、及びそれらの短い免疫原性フラグメント（一般配列Ａｎを有するペプチドであり、ここでＡはアミノ酸、ｎは１０から５０である）に付着したカルジオリピン及びホスファチジルセリンである。図２に従って、化学安定性を高めた合成カルジオリピン類似体を調製し、次いでβ２−糖タンパク質Ｉ又はその短いフラグメントとの生物共役に適用する。
【００３４】
次に、ＣｕＡＡＣ及びＳＰＡＡＣ反応条件下で（図１ａ）、カルジオリピン及びホスファチジルセリンの新規のアジド誘導体の化学修飾を、対応するタンパク質の末端アルキン又はジフルオロシクロオクチン（ｄｉｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）部分にリンクさせる。
【００３５】
自己免疫疾患の診断及び研究のためのリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体の調製において、便利な生物共役戦略を求める要望は大きい。今日まで利用可能な方法の中で、アジド−アルキン環化付加の２つの変形、すなわち銅触媒を用いるクリック反応及び歪みで促進されるクリック反応（それぞれＣｕＡＡＣ及びＳＰＡＡＣ）は、近年、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボの双方で安定した１，２，３−トリアゾール生成物が得られる有望な合成手法であることが実証された（Ｈ．Ｃ．Ｈａｎｇ、Ｊ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ．Ｃｈａｒｒｏｎ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１１年、４４、６９９、及びＪ．Ａ．Ｐｒｅｃｈｅｒ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｙ、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１、１３）。例えば、アジド及びアルキン官能化脂肪酸及び脂質レポーターは、ＣｕＡＡＣ反応によって細胞への付着が成功し、脂質輸送及び代謝のための強力なツールを与えた（Ｈ．Ｃ．Ｈａｎｇ、Ｊ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ．Ｃｈａｒｒｏｎ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１１年、４４、６９９）。更に、ＣｕＡＡＣプロトコルを用いて、いくつかの脂質レポーターによるビオチンの生物共役が高い収率で達成された（Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｃｈｅｒ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｙ、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１、１３）。ＣｕＡＡＣ反応の欠点は、反応のために必要な銅の毒性が高いことである。このため、ＣｕＡＡ生物共役戦略はインビトロ条件のみに制限される。一方、ＳＰＡＡＣ手法はインビボの生物共役に広く利用されて、生物全体の細胞プロセス及び代謝経路を監視する機会を与えたが、主な焦点はタンパク質及びグリカンである（Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｃｈｅｒ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｙ、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１、１３）。
【００３６】
ＳＰＡＡＣ手法によって生物共役を実行するため、生体分子にアジド及びシクロオクチン官能基を付着させる必要がある（図１ａ）。これは、市販の試薬を用い、文献に記載されたプロトコルに従って実行可能である（Ｍ．Ｇ．Ｐａｕｌｉｃｋ、Ａ．Ｒ．Ｗｉｓｅ、Ｍ．Ｂ．Ｆｏｒｓｔｎｅｒ、Ｊ．Ｔ．Ｇｒｏｖｅｓ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７年、１２９、１１５４３(非特許文献１)）。穏和な無毒条件下で高収率の所望の生物共役体を提供するので、ＳＰＡＡＣクリックケミストリーは、インビトロ及びインビボの双方で生物分析に適用できる新規のリン脂質−タンパク質共役体の調製において理想的な最適の方法であるように見える。
【００３７】
現在の生物分析は、様々な試薬の調製を必要とし、厳密にこの方法のために適合された条件の適用も必要とするいくつかのフォーマットで実行することができる。特定の抗体を検出するための１つの有望な方法は、単純かつ迅速な技法である均質性（「オールインソリューション（ａｌｌ−ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」）分析である（Ｍ．Ｃｈａｓｓｉｇｎｏｌ、Ｙ．Ａｕｂｅｒｔ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｕ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ．Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  ２００７年、２６、１６６９）。均質性分析は、例えば標的生体分子の蛍光標識及び蛍光信号を監視することによるそれらの相互作用の追跡を用いて実行することができる。もう１つの有望な生物分析方法は２Ｄアレイ上の固定化であり、この方法は感度が高く、標的の抗体タイプ検証の可能性があるので、人の疾患の血清診断には特に強力である。前述の方法に従って、タンパク質、ペプチド、及びＤＮＡを２Ｄアレイ上で固定化することができる（Ａ．Ｍ．Ｒｏｕｑｕｅｔｔｅ、Ｃ．Ｄｅｓｇｒｕｅｌｌｅｓ、Ｌｕｐｕｓ２００６年、１５、４０３、及びこの中で言及された参考文献、及びＡ．Ｃａｓｔｒｏ、Ｈ．Ｗａｎｇ、ＷＯ２００７／０６１７９３Ａ２号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４５７２号）。しかしながら、比較的小さい脂質分子の場合、アレイに付着させるために、脂質を表面との相互作用から保護し、従って免疫原性活性の低下を防ぐタンパク質積み荷（ｃａｒｇｏ）が必要である。かつては、ＢＳＡ及びＫＬＨタンパク質に付着させた天然カルジオリピンを含有するニトロセルロースストリップを調製し、更に血清診断研究に適用した（Ａ．Ｃａｓｔｒｏ、Ｈ．Ｗａｎｇ、ＷＯ２００７／０６１７９３Ａ２号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４５７２号）。得られた共役体は、調製後に高い免疫原性活性を与えて、未知の機構によってアレイ保存された状態で急速に劣化した（ｄｅｇｒａｄｅ）（この観察は最近、中央疫学研究機構（ロシア国モスクワ）で行われたが、反復合成手順はＷＯ２００７／０６１７９３Ａ２号に記載されている）。従って、この分野における全体的な方向性は、天然プロトタイプに比べて化学安定性を高めた合成カルジオリピン類似体を調製し、その後でタンパク質／ペプチドへの付着及び固定化を行うというものである（Ｊ．Ｓ．Ｙａｄａｖ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６年、３７、６６０３、及びＫ．Ｋａｓｉｒｅｄｄｙ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５年、３３、３４５）。
【００３８】
実施例
実施例１  図２の式１０〜１１のタンパク質リン脂質共役体の合成手法
図２に従った合成のための試薬及び条件は以下の通りである。
ａ）９−デセン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ、０℃。ｂ）ＮａＨ、１０−ブロモ−１−デセン、ＤＭＦ、０℃から室温。ｃ）ＤＤＱ、ＤＣＭ、Ｈ2Ｏ、０℃。ｄ）ＭｅＯＰＣｌ2、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ、−７８℃。ＨＯＣＨ2ＣＨ（ＯＭＰＭ）ＣＨ2ＯＨ、−７８℃から室温。３０％水溶液Ｈ２Ｏ２、ＤＣＭ、室温。ｅ）ＤＤＱ、ＤＣＭ、Ｈ２Ｏ、０℃。ｆ）ＮａＩ、２−ブタノン、８０℃。ｇ）ＮａＩＯ4、ＫＭｎＯ4、ｔＢｕＯＨ、Ｈ2Ｏ、室温。ｈ）ＤＩＣ、ＮＨＳ、室温。ｉ）タンパク質、緩衝剤１２ｔ、室温。
【００３９】
図２の類似体（８〜９）のタンパク質又はペプチドに対するアンカリングは、ＮａＩＯ４−ＫＭｎＯ４で酸化させた末端二重結合による脂肪酸残基の付着を行い、その後タンパク質とのＮＨＳ支援の結合によって達成することができる。あるいは、リン脂質８〜９のアジド誘導体及びアルキン標識タンパク質を用いたＣｕＡＡＣ及びＳＰＡＡＣ手法を実行することができる。これらの共役について、上記のステップｈ）は以下の通りである。
【００４０】
ＳＰＡＣＣ共役
ｈ）ＤＩＣ、ＮＨＳ、１２ｔ、室温。ｉ）３−アジドプロパン−１−アミン、ｔＢｕＯＨ、Ｅｔ3Ｎ、３ｔ、室温。ｊ）タンパク質／ペプチドシクロオクチン誘導体、３〜２４ｔ、室温。
【００４１】
ＣｕＡＡＣ共役
ｈ）ＤＩＣ、ＮＨＳ、１２ｔ、室温。ｉ）３−アジドプロパン−１−アミン、ｔＢｕＯＨ、Ｅｔ3Ｎ、３ｔ、室温。ｊ）タンパク質／ペプチドアルキン誘導体、Ｃｕ−ＴＢＴＡ、アスコルビン酸、３〜２４ｔ、室温。
【００４２】
実施例２  蛍光標識及びＥＬＩＳＡアッセイ
リン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質共役体の確認された化学構造及び純度に伴う合成脂質の実証された免疫原性によって、リン脂質−抗体結合プロセスに関する化学的及び臨床的に重要な新規の情報が与えられている。
【００４３】
これらの主な研究は２つの試験で実行することができる。第１に、蛍光標識を用いた均質性アッセイにおいて本発明のリン脂質−ペプチド及びリン脂質−タンパク質構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）の試験を行う。また、調製した生物共役体によって特定の自己抗体を標的とするための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）も用いる。本明細書では、ＡＰＳ及び他の自己免疫疾患と診断された患者の血清サンプルにおいて、二次ＨＰＲ標識抗体が、合成リン脂質−ペプチド抗原及びリン脂質−タンパク質抗原と抗体との間の相互作用の信号となる（例えば図１ｂ及び図３を参照のこと）。
【００４４】
実施例３  タンパク質−カルジオリピン生物共役体の合成及び安定性の研究
試薬及び溶剤    ウシ心臓からのカルジオリピンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、合成カルジオリピン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、卵からのホスファチジルコリン（ＰＣ  Ｌ−α異性体、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、合成ホスファチジルコリン（１８：１  Δ９−シス異性体、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＫＭｎＯ4、ＮａＩＯ4、Ｎａ2ＳＯ3、ウシ血清からのアルブミン（ＢＳＡ）、リソジム（ｌｙｓｏｚｉｍｅ）、ミオグロビン、スカシガイからのヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、β２−糖タンパク質Ｉヒト、非組み換え型（Ｄｉａｒｅｃｔ抗原）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、Ｆｌｕｋａ）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｔ−ブタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００４５】
方法    １．５ｍＬプラスチック製エッペンドルフ型チューブで反応を行った。エッペンドロフ型サーモミキサ５４３６シェーカを用いて混合を行い、回転遠心分離機（ＨＥＴＯＶＡＣ  ＶＲ−１）を用いて蒸発を行った。
【００４６】
分析    ＭＡＬＤＩ  ＨＲＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ）を用いて脂質分子を分析した。ＬＣ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いてタンパク質−脂質共役体を分析した。
【化２０】
2018502818.tif 000022
スキームＩＶ  カルジオリピン−タンパク質共役体の代表的な合成。試薬及び条件：（ｉ）ＫＭｎＯ4−ＮａＩＯ4／ｔ−ＢｕＯＨ−水  １：１（ｖ／ｖ）、２ｔ。（ｉｉ）ＮＨＳ／ＤＩＣ／ＤＭＳＯ、１２ｔ。（ｉｉｉ）対応するタンパク質（ＢＳＡ、ＫＬＨ、β２−ＧＰＩ、リゾチーム又はミオグロビン）／ＤＭＳＯ−炭酸塩緩衝剤（ｐＨ８．５）９：１（ｖ／ｖ）、１２ｔ
【００４７】
酸化カルジオリピンＣｌｏｘ（２）の合成    ステップｉ
２ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ中のカルジオリピン１（２０ｍｇ、天然（ｎ）又は合成（ｓ））溶液に、１００ｍｋｌのＭＱ水中の２０ｍｇのＮａＨＣＯ3を加え、５分間混合した。その後、１２０ｍｋｌの水中の１２ｍｇのＮａＩＯ4、４００ｍｋｌの水中の１５ｍｇのＫＭｎＯ4、及び５００ｍｋｌのｔ−ＢｕＯＨを続けて加えた。この混合物を２時間室温に維持し、次いで１５０ｍｇのＮａ2ＳＯ3を加え、更に１０分間混合した。得られた混合物を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上の相をピペットで取った。ｔ−ＢｕＯＨ相を、飽和ＮａＣｌ水溶液中の５％ＨＣｌ水溶液で洗い、ｓｐｅｅｄｖａｃで蒸発乾固させ、ＤＭＳＯに再び溶かした。
【００４８】
並行して、空気に触れるとカルジオリピンの酸化を防ぐことが知られているホスファチジルコリン１６ｍｇの存在下で、上述のようにカルジオリピンの酸化を行った（スキームＶ、ＰＣ天然（ｎ）又はＰＣ合成（ｓ））。従ってこの酸化実験により、タンパク質積み荷に付着させるための４つの脂質試薬が得られた。すなわち、ＣＬｏｘ（ｎ）、ＣＬｏｘ（ｓ）、ＣＬｏｘ（ｎ）−ＰＣｏｘ（ｎ）、及びＣＬｏｘ（ｓ）−ＰＣｏｘ（ｓ）である。ＨＲＭＳ  ＭＡＬＤＩスペクトルによって酸化を確認した。
【化２１】
2018502818.tif 000023
スキームＶ  ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び酸化ホスファチジルコリン（ＰＣｏｘ）の化学構造。双方ともナトリウム塩。
【００４９】
カルジオリピンＣＬ−ＮＨＳ（３）の活性化エステルの合成  ステップｉｉ
１ｍＬのＤＭＳＯ中の酸化脂質試薬２（１０ｍｇのカルジオリピン）の溶液に、５ｍｇのＮＨＳ及び１０ｍｋｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを加えた。脂質が完全に溶けるまで（約２時間）反応混合物を撹拌した。反応を室温で一晩そのまま放置した。得られた溶液を精製せずに次のステップで用いた。ＣＬ−ＮＨＳの保存：−７０℃。
【００５０】
タンパク質−カルジオリピン共役体の合成（ＣＬ−タンパク質）
０．２Ｍの炭酸塩緩衝剤（ｐＨ８．５）１００ｍｋｌ中の１ｍｇのタンパク質の溶液に、８７５ｍｋｌのＤＭＳＯ及び１５ｍｋｌのＣＬ−ＮＨＳ３の溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。反応を２０分間混合し、次いで一晩そのまま放置した。得られた試薬は、精製なしで、文献に従った診断に有用である。我々は、＋４℃で４か月間保存した後、及び−２０℃で１年間保存した後に、ＬＣ−ＭＳによって、以下に記載する混合物内の共役の安定性を評価した（表１）。天然脂質成分は他の群によって以前に適用した。見てわかるように、これらの試薬は保存中に急速に劣化するが、合成脂質及び開発した保存条件（特に３及び４）を用いると、共役体は脱気の必要なく−２０℃で１年間まで安定していた。保存時の劣化に対する安定性の最良の結果は、本明細書で調製した新規の共役体８、１０、１６、及び１８によって示された。下の表１に安定性を示す。
【表１】
2018502818.tif 000024
【００５１】
カルジオリピン−タンパク質共役体の保存及び分析
以下の共役混合物を＋４℃及び−２０℃で保存した。
１．ＤＭＳＯ−０．２Ｍ炭酸塩緩衝剤の共役体１〜１８の溶液（濃度−１０ｍｇ／ｍＬ）。
２．ＤＭＳＯ−０．２Ｍ炭酸塩緩衝剤の共役体１〜１８の溶液（濃度−１０ｍｇ／ｍＬ）に、１−チオグリセリンを加える（最終濃度−１ｍＭ）。
３．ＤＭＳＯ−０．２Ｍ炭酸塩緩衝剤の１〜１８の溶液（濃度−１０ｍｇ／ｍＬ）に、１−チオグリセリンを加える（最終濃度−５ｍＭ）。
４．ＤＭＳＯ−０．２Ｍ炭酸塩緩衝剤の１〜１８の溶液（濃度−１０ｍｇ／ｍＬ）に、１−チオグリセリン（最終濃度−５ｍＭ）及びＳＤＳ（最終濃度−０．０１％）を加える。
【００５２】
結果を上の表１に示す。
【００５３】
実施例４  トリアゾール−アミドリンカーを用いたタンパク質リン脂質共役体の合成手法
この例では、臨床的に関連したβ２ＧＰＩ及びＰＴに対して合成ＰＥ（ホスホエタノールアミン）抗原を付着させるための新しいＣｕＡＡＣクリック手法を実証する。構造上の差があるにもかかわらず、ＣＬ及びＰＥは双方とも免疫源性であり、抗リン脂質（ａＰＬ）の診断に有用であることが証明されている。クリック手順は、酸化リン脂質に比べて化学安定性が向上した生成物の収率及び純度が高いという利点を有する。更に、この新しい手順は、同様の量の様々なリン脂質及びタンパク質に対して直接使用することができる。以前に報告された類似体と比較するため、ＰＥ−ＢＳＡ共役体も調製した（下記のスキームＶＩ）。
【００５４】
スキームＶＩ    アミドカップリング及びクリックケミストリーによる新しいリン脂質−タンパク質共役体の合成。試薬及び条件：（ｉ）０．１Ｍの重炭酸塩緩衝剤−ＤＭＳＯ  ９：１、＋４℃、１２時間。（ｉｉ）ＰＥアジド、ＣｕＳＯ4：ＴＢＴＡ  １：１．１、アスコルビン酸、１ｘＰＢＳ−ＤＭＳＯ−ｔＢｕＯＨ  ３：２：０．１、ｖ／ｖ／ｖ、（ｉｉｉ）ＫＭｎＯ4、ＮａＩＯ4、ｔ−ＢｕＯＨ−Ｈ2Ｏ  ９：１、ｖ／ｖ、室温、１２時間。（ｉｖ）スクシンイミドエステル、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＭＳＯ、室温、１２時間。（ｖ）タンパク質２，３，８、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝剤−ＤＭＳＯ  ９：１、ｖ／ｖ、室温、１２時間。
【化２２】
2018502818.tif 000025
【００５５】
まず、我々は、各タンパク質を水溶性アルキン活性化エステルのアルキン基で官能化し、次いでこれにモル比１：２５で市販のＰＥアジドによるＣｕＡＡＣクリック反応を行った。簡単な沈殿の後、良好な収率及び純度で所望の共役５〜７を得た（スキーム１、収率≧８０％、ゲル電気泳動によって決定されるような完全な変換）。本発明者は、ＣｕＡＡＣケミストリーが、自己免疫疾患診断の高い可能性を有する新規のリン脂質−タンパク質共役体を調製するための改良された方法であることを実証した。得られたリン脂質−タンパク質共役体は、自己免疫抗体に対して高い結合親和性及び特異性を示す。
【００５６】
図３は、本発明の抗原、すなわちリン脂質、タンパク質、及びリン脂質−タンパク質共役体に対する自己免疫抗体を検出するための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）の代表的なスキームを示す。Ｐ＝タンパク質、Ｌ＝リンカー、Ｒ−リン脂質残基である。ＴＭＢ＝３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＨＰＲ＝西洋わさびペルオキシダーゼである。
【００５７】
一連の疾患関連の血漿又は人の正常な血漿（ＨＮＰ、ｎ＝１０、図３、表２）を適用して、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）において共役体及び対照抗原を用いた。疾患関連のサンプルは、リン脂質、β２ＰＰＩに対する高レベルの抗体（ａＰＬ）を含んだ。交差反応を評価するための対照サンプルは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡに対する自己抗体を含んだ。
【表２】
2018502818.tif 000026
【００５８】
ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡのような他の抗原とのａＰＬの高い交差反応性は、自己免疫疾患の研究及び診断における有用性を妨げるものである。ＰＥとＰＴ及びＰＥとβ２−ＧＰＩのような、生物学的に相補的な分子の共有結合架橋によって、ａＰＬの特異性の向上を達成した。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ実験により、これがＰＥ−β２−ＧＰＩ共役体で達成されたことが示される（ＡＰＬ、ａ−ｓｓＤＮＡ、及びａ−ｄｓＤＮＡで培養した場合、吸収度は１．０２対０．４７〜０．５４）（表２）。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ試験の再現性及び−２０℃で溶液中に保存した時の抗原の安定性を試験した（図４）。後者はＴＬＣ及びゲル電気泳動によって行った。図４から明らかであるように、共役体５〜７は、個々のリン脂質及び酸化カルジオリピン共役体よりも優れた再現性を示した（それぞれ９７〜９８％対８３〜８９％）。溶液中に保存した時の安定性は、酸化ＣＬ類似体の１．５〜２か月に対し、−２０℃で６か月まで延長した。これにより、新規の分子の高い純度及び免疫原性がそれらの診断性能に良い影響を与え、様々な自己免疫症状の研究での適用が可能となることが示される。
【００６０】
実施例５  カルジオリピンアジド試薬の調製及びタンパク質に対する「クリック」共役のための新しい戦略
新しい合成の背後にある（ｂｅｙｏｎｄ）基本原理は、純粋かつ充分に特徴付けられた合成脂質を使用すること、及びタンパク質に対する生物共役の際に生じる立体障害を低減することであった。後者は、カルジオリピン及びアジド部分の間の拡張リンカーを用いて行った（図５を参照のこと）。
【００６１】
５．１  図５のカルジオリピン−アジド１０の合成
１．５ｍＬのｔＢｕＯＨ１００μＬ中のカルジオリピン（ＣＬ）１（１０ｍｇ、６．６６μｍｏｌ）の溶液を、ＮａＨＣＯ3（１００μＬ中１０ｍｇ）、ＮａＩＯ4（２００μＬ水中３０ｍｇ）、及びＫＭｎＯ4（２００μＬ水中１０ｍｇ）と混合した。反応に３分間アルゴンを流し、その後４５℃で１時間マイクロ波反応器（１５Ｖ）内に保持した。出発物質がＴＬＣによって検出不可能となった後、１５０ｍｇのＮａ2ＳＯ3を加えることで反応を急冷した。その後、混合物を５％ＨＣｌでｐＨ３．０に酸性化し、ｔ−ＢｕＯＨで２度洗った。ｔ−ＢｕＯＨ部分をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、真空で蒸発させた。収率８６％、Ｒf０．３７（クロロホルム：メタノール：水  ３：１．５：０．２、ｖ／ｖ／ｖ）、ＨＲＭＳ−ＥＳＩ  ｍ／ｚ、１４０６．８４７７２（〔Ｍ＋Ｎａ］＋、Ｃ72Ｈ130Ｎａ2Ｏ19Ｐ2計算値１４０６．８４７６６）。１ｍＬのＤＭＳＯ中の酸化カルジオリピン（５ｍｇ）の溶液に、２０μＬのＤＭＳＯ中の４ｍｇのスクシンイミドエステル及び８μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを加えた。反応を５時間室温に維持した後、ＴＬＣは出発物質の完全な変換を示した。中間体ＮＨＳ−カルジオリピンを更に室温で暗所において１２時間、３−アジドプロパン−１−アミン（１．１ｅｑ、０．３５ｍｇ）と反応させた。生成物を精製せずに更に別のステップで使用した。Ｒf０．５５（クロロホルム：メタノール：水  ３：０．５：０．２、ｖ／ｖ／ｖ）、ＨＲＭＳ−ＥＳＩ  ｍ／ｚ、１４８８．９１２０９（〔Ｍ＋Ｎａ］＋、Ｃ75Ｈ136Ｎ4Ｎａ2Ｏ18Ｐ2計算値１４８８．９１２０３）。
【００６２】
５．２  クリック反応
本明細書で前述したようにクリック反応を行った。生成物を、まずＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲルろ過によって精製し、その後、冷アセトン（−２０℃）から沈殿させた。得られた共役体を冷アセトンで２度洗浄し、真空で乾燥させ、質量分析及びゲル電気泳動で分析した。２８０ｎｍの吸収度に基づく生成物の最終収率は、８８％（６、スキームＶＩ）、９２％（７、スキームＶＩ）、８９％（７、図５）、８４％（８、図５）であった。
【００６３】
生成物抗原７〜８（図５）の化学組成をゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルによって検証した。ＭＳデータによると、カルジオリピン残基はβ２ＧＰＩ及びＰＴにそれぞれ付着した。これは、タンパク質（１〜２残基）に対するＮＨＳ−カルジオリピン誘導体の直接結合を用いた以前の手法に比べて顕著であり、カルジオリピン試薬の立体障害が低減した結果であり得る。
【００６４】
実施例６  対照と比較される新しい分子の優れた特異性及び安定性
上述のように、現在適用されているリン脂質抗原の大きな問題は、低い安定性と高い交差反応性である。この結果、検出される抗体は自己免疫疾患に対して特異的でなく、試験は診断のための価値が低いか又はゼロである。我々は、生物学的に関連した自己免疫抗原を模倣する共有結合リン脂質及びタンパク質を含有する新しい抗原を調製した。対照と比較した安定性及び特異性を確認するため、我々は、ＨＩＶ−１抗原及び健康な対照に対する充分に特徴付けられたヒト単クローン抗体によるＥＬＩＳＡアッセイを実行した。
【００６５】
６．１  ＥＬＩＳＡアッセイ、再現性分析、及び抗原安定性の試験を前述のように行った（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５、２０、１０２５３〜１０２６３）。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイは２つの培養ステップ及びその後の酵素促進信号発生を含む。最初の培養は、マイクロプレートの表面上で固定化した抗原にサンプル内の標的抗体を結合させることを含む。第２のステップでは、結合した抗体が、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で共有結合標識された二次抗抗体（例えば抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭ）と相互作用する。Ｈ2Ｏ2の存在下で、ＨＲＰは、無色の有機基質ＴＭＢの酸化ＴＭＢ（ｏｘ）への変換に触媒作用を及ぼす。これは４５０ｎｍで特有の吸収度信号を有する（Ａ450）。従って、Ａ450を測定することにより、固定化した抗原に対する特定の抗体のタイターを定量化することができる。
【００６６】
まず、最初の実験と同じ条件でブロッキング時にコーティングしていないマイクロプレートを用いて、各サンプルのバックグラウンド信号がＡ450０．０６未満であることを試験した。ａＰＬＰ−抗原結合の平衡時間を決定するため、予めコーティングしたマイクロプレートに１：２００の希釈の血漿サンプルによる培養を４０分から３時間にわたって行った。二次培養は常に、１：３５．０００希釈の対応するＨＲＰ共役体を用いて室温で１時間行った。このアッセイの結果は支援情報（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に提出されている。
【００６７】
一連の対照希釈の試験を行うことで（ＨＮＰ、ＨＣＬ、１：５０から１：２０００の希釈）、各抗原の線形範囲を決定した。結果によると、血漿の希釈１：１００〜１：７５０が各抗原のアッセイの線形範囲内であった（Ｒ2＞０．９７）。対照及び患者サンプルでは、弱い正（＋／−）及び正（＋）の信号は、それぞれ健康な対照コホート（ｎ＝１６）の平均値の２倍及び３倍の信号と判定された。
【００６８】
６．２  特異性の評価（化合物の番号は上記のスキームＶＩ又は図５で各化合物について注記したものと同様）
表１に、ＨＩＶ−１抗原及び健康な血清サンプルに対する単クローン抗体を用いて得られた新規の抗原及び対照についてのＩｇＧクラスＥＬＩＳＡの結果を示す。我々は、ＰＬ及びタンパク質１＋８及び１＋３の非共有結合複合体の最高レベルの非特異的結合を観察した（スキームＶＩ、混合抗原対照）。これに対して、架橋共役（６〜７、スキームＶＩ）及び（７〜８、図５）では、１＋８及び１＋３、スキームＶＩに比べ、同様の実験（例えば表３、（８、図５）のデータにおいて、非特異的結合は低度からゼロである。共役６〜７（スキームＶＩ）は、抗ｇｐ４１に対する弱い結合を示したのに対し、ＰＬ−タンパク質共役において抗ｐ２４及びＢ１２抗体に対する結合は完全に消えた。ＨＩＶ−１特異的単クローン抗体及び混合ＰＬＰ対照で観察された健康な対照血清における高い反応性は、ポリクローナル抗体との非特異的相互作用を生じる非共有結合構造の高い不均質性の結果である可能性がある。また、抗原６〜７（スキームＶＩ）を含むホスホエタノールアミンの交差反応性は、ＰＥＧリンカーの存在によって生じ得る。タンパク質に対するホスホエタノールアミン付着のための代替的なリンカー設計は、我々の進行中の研究の目的であり、近い将来に発表されるはずである。最後に、図５の最も特異的な抗原７〜８を以下で述べる人のサンプルの研究に更に適用した。
【表３】
2018502818.tif 000027
【００６９】
６．３  多様な保存条件下での図５の抗原７〜８の再現性及び化学安定性
本明細書に記載したように実験を行い、これにより、図５の７〜８を用いたＥＬＩＳＡアッセイが高い再現性を有し、吸収度値の変動は独立した各分析について０．５〜０．８の平均タイター範囲内であることが示された。また、抗原７〜８及びカルジオリピンを、−２０℃及び＋４℃で暗い色のガラス瓶に保存し、＋４℃でマイクロタイタープレート上に固定化した後、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、及びＭＡＬＤＩ  ＭＳによって分析した。抗原７〜８は、ガラス瓶内及びマイクロタイタープレート表面上で＋４℃で３か月まで安定し、ガラス瓶内で−２０℃で１年まで安定していた。注目すべきことに、現在のキットで用いられるカルジオリピンは、ガラス瓶内又はマイクロタイタープレート上で＋４℃で約３週間保存した後、及びガラス瓶内で−２０℃で３か月保存した後に劣化した。
【００７０】
実施例７  新しい抗原を用いた患者サンプルにおける自己抗体検出
スキームＶＩの抗原６〜７及び図５の７〜８又は対照抗原でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、最初のＥＬＩＳＡアッセイを手作業で行った。まず、市販の多クローン対照（人の正常な血漿ＨＮＰ及びカルジオリピンに対する抗体を含有する人の血漿ＨＣＬ（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ））を用いて、予めコーティングしたマイクロプレートを分析した。血漿滴下実験により、希釈に対するＩｇＭ抗原の低い応答性が示される一方、ＩｇＧ抗原は高度の線形性で希釈に対して信号の低減を示した（Ｒ２＞０．９５、支援情報）。従って、この研究で我々はＩｇＧアッセイに焦点を当てた。更に、アッセイの再現性及びＰＬＰ安定性を前述のように調査したところ、我々の以前のデータと一致して、対照と比べて優れたレベルが示された。
【００７１】
次に、抗原７及び８（図５）を適用した場合、開発したＥＬＩＳＡ条件下でのＳＵＨコホート（小児ＳＬＥと診断された２７人の患者）の調査により、５人及び７人のａＰＬＰ陽性の患者を識別した（１９％及び２６％）。これは、β２ＧＰＩ及び混合抗原カルジオリピン＋β２ＧＰＩを用いてそれぞれ検出した９人及び３人の陽性患者（３３％及び１１％）と対照的である。新しい抗原のロバスト性及び臨床関連性について、オーデンセ大学病院（ＯＵＨ、デンマーク国）から得られた成人患者の血液サンプルの分析によって更に評価した。このアッセイは、ＳＵＨコホートと同様のプレートコーティング、培養条件、対照、及びカットオフ値を用いて実行したが、完全自動化レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）で行った。その結果を、同様の条件下でＯＵＨ患者について実行された抗カルジオリピン試験及び抗β２ＧＰＩ試験（Ｅｕｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）と比較した。
【００７２】
図６に、多クローン対照抗原、健康な対照血清、及び２人の患者コホートについてのＥＬＩＳＡ結果の要約を示す（「５」及び「６」はそれぞれスキームＶＩの化合物６及び７に対応する）。陰性及び陽性の対照（ＨＮＰ及びＨＣＬ、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ）を、それぞれ「ｘ」及び星印で示す。見てわかるように、健康な対照のバックグラウンド信号は、カルジオリピン１、ＰＴ、及びホスホエタノールアミンとＰＴの混合物で、最も高かった。ＳＵＨサンプルは、特に図５の抗原８、及び混合抗原カルジオリピン＋β２ＧＰＩを適用した場合、ＯＵＨコホートよりも高いａＰＬＰタイターを示した。留意すべきことは、図５の化合物７〜８で示されるａＰＬＰ陽性サンプルが、分離した抗原で示されるものとは劇的に異なったことである。ＡＮＯＶＡを用いた群分析により、０．０１のｐ値で、ＳＵＨコホート及びＯＵＨコホート内の群間で統計的に有意な差を確認した。
【００７３】
最後に我々は、投薬使用に関して患者の医療記録を分析した。データを、１つ以上の投薬を含む群に分割し、Ｓｔａｔａで統計的な分析を行った。２つの独立した試験を用いて（スチューデントｔ検定及びフィッシャー検定）、特定の投薬又は投薬群と上昇ａＰＬＰタイターとの間に相関がないことを確認した。
【００７４】
実施例８  図５の抗原８の疾患活動性とａＰＬＰタイターとの間の相関
統計分析のため、各患者の以下の臨床パラメータについて検討する。すなわち、年齢（開始時及びサンプル日時）、性別、民族、人種、診断、疾患活動性（開始時及びサンプル日時）、臨床症状、患者の訴え、及び治療履歴である。Ｓｔａｔａでスチューデントｔ検定及び最小二乗回帰（ＯＬＳ：ｏｒｄｉｎａｒｙ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ）分析を用いて、表１に報告した抗原及び対照について差を分析した。ＡＮＯＶＡを用いて抗原タイター平均の差について群間で比較を行った。各相関について、０．０５未満のｐ値を有意と見なした。
【００７５】
スチューデントｔ検定は、排他的に抗原８を用いてスミス正値性と上昇ａＰＬＰとの間の相関を示した（図７）。
【００７６】
観察された臨床パラメータとａＰＬＰタイターとの間の統計的な差を更に評価するため、Ｓｔａｔａを用いて最小二乗回帰（ＯＬＳ）分析を行った。スミス陰性群及びスミス陽性群のａＰＬＰタイターの差は、０．００２のｐ値で統計的に有意であることがわかった（図８）。
【００７７】
留意すべきこととして、抗原７又は他の抗原及び対照では、臨床パラメータとの相関は観察されなかった（ｐ＞０．０９）。これによって、抗原８による特性の一意性、及びスミス正値性が示す高活性自己免疫状態の予測における可能性が示唆される。
【００７８】
結論
この研究において我々は、新規の合成リン脂質−タンパク質抗原、すなわちカルジオリピン−β２ＧＰＩ及びカルジオリピン−ＰＴを紹介し、自己抗体の診断法におけるそれらの有用性を証明する。本明細書に報告する新規の抗原は、従来のＣｕＡＡＣクリックケミストリー手法によって、高い収率及び純度で調製される（実施例５）。ヒト単クローン抗体に対する特異性の試験により、位置選択的に生物学的に相補的な分子を共役させる結果として、特異性向上の仮説が証明される（実施例６）。次に我々は、患者サンプル及び健康な対照を用いた酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）で、調製したＰＬＰの有用性を示す（実施例７）。最後に我々は、観察したａＰＬＰと多数の臨床パラメータとの相関を証明し、上昇ａＰＬＰタイターに対する高い疾患活動性の因果効果を検証する（実施例８）。
【００７９】
我々の所見によって、架橋ＰＬＰの予測可能性が、市場で現在入手できるその成分の単純な混合物、又はそれぞれに対する別個の試験よりも大きいことが示される〔３７〕。更に、（図５の）調製された抗体７〜８は、現在入手できるＰＬ抗原よりも高い再現性及び安定性を示し、直接的な合成ルート、高い化学的均質性、及び非特異ヒト抗体に対する交差反応性の低減という利点を有する（表３）。
【００８０】
参考文献
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・ＷＯ２０１２／１３４９２５Ａ１号
・Ｈ．Ｃ．Ｈａｎｇ、Ｊ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ．Ｃｈａｒｒｏｎ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１１年、４４、６９９
・Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｃｈｅｒ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｙ、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１、１３
・Ｍ．Ｃｈａｓｓｉｇｎｏｌ、Ｙ．Ａｕｂｅｒｔ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｕ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ．Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ２００７年、２６、１６６９
・Ａ．Ｍ．Ｒｏｕｑｕｅｔｔｅ、Ｃ．Ｄｅｓｇｒｕｅｌｌｅｓ、Ｌｕｐｕｓ２００６年、１５、４０３、及びこの中で言及された参考文献
・Ａ．Ｃａｓｔｒｏ、Ｈ．Ｗａｎｇ、ＷＯ２００７／０６１７９３Ａ２号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４５７２号
・Ｊ．Ｓ．Ｙａｄａｖ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６年、３７、６６０３
・Ｋ．Ｋａｓｉｒｅｄｄｙ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５年、３３、３４５
・Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５、２０、１０２５３〜１０２６３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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