(57)【要約】  本発明は、試料を封入するためのマイクロ流体デバイスのサイズ決定方法に関する。封入すべき試料は、分散媒液中に浮遊した状態の細胞（生体試料）又は微粒子を含むことができる。本発明は、細胞培養液に含まれる外植片を封入するためのマイクロ流体デバイスのサイズ決定方法にも関する。【選択図】図１
2018533946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散媒液中に浮遊した状態の細胞又は微粒子の少なくとも１つの集団を含む初期試料を封入するように意図されたマイクロ流体デバイス（１０）のサイズ決定方法であって、前記マイクロ流体デバイス（１０）は、
・  前記試料を含む前記分散媒液を受け取るように適合された、直径Ｄinの円筒形入力タンクに対応する入力ゾーン（１）と、
・  面積Ｓch及び長さＬchの基部（５１）と、高さＨchの側壁（５２）とを有し、前記試料の少なくとも一部を内部に封入し、長さＬin、高さＨin及び幅Ｗinの第１のチャネル（２）を通じて前記入力ゾーン（１）と連通する封入ゾーン（５）と、
・  前記試料を含む前記分散媒液を放出するように適合され、直径Ｄoutの円筒形出力タンクに対応し、長さＬout、高さＨout及び幅Ｗoutの第２のチャネル（３）を通じて前記封入ゾーン（５）と連通する出力ゾーン（４）と、
を備え、
前記方法は、封入すべき細胞又は微粒子の数の関数として前記デバイス（１０）のサイズを決定することから成り、
Ａ．前記封入ゾーン（５）を特徴付ける前記表面Ｄchと前記高さＨchとを定めるように、封入すべき細胞又は微粒子の好ましい量と、前記封入ゾーン（５）の前記基部（５）の前記細胞又は微粒子による好ましいカバー率φとの関数として前記封入ゾーン（５）のサイズを決定するステップと、
Ｂ．前記第１のチャネル（２）及び前記第２のチャネル（３）のサイズを決定するステップと、
を含み、前記ステップＢは、
・ｂ１）粒子又は細胞の沈降速度ｖsediを計算するステップと、
・ｂ２）前記封入ゾーン（５）における前記分散媒液の速度ｖchを前記粒子又は細胞の沈降速度ｖsediの関数として以下の式（１）に従って決定するステップと、
【数１】
2018533946.tif 000019
・ｂ３）前記入力ゾーン（１）と前記出力ゾーン（４）との間に注入される、前記封入ゾーン（５）における適切な流れを構築するために必要な媒液の体積ΔＺの関数として、前記デバイスにおける充填損失を決定するステップと、
・ｂ４）前記分散媒液のΔＺ及び前記速度ｖchから、前記マイクロ流体デバイス（１０）の幾何学的パラメータを決定するステップと、
を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記封入ゾーン（５）の前記サイズを決定するステップＡは、
Ａ１）前記封入ゾーン（５）の前記基部の前記表面Ｓchを以下のストークス式（５）に従って決定するステップを含み、
【数２】
2018533946.tif 000020
式中、
−  φは、前記基部（５１）のカバー率であり、
−  ｒは、粒子又は細胞の半径であり、
−  Ｎは、以下の式（６）によって定義される、封入すべき神経細胞又は細胞の数であり、
【数３】
2018533946.tif 000021
式中、
−  φは、前記試料中の細胞又は神経細胞の濃度であり、
−  Ｖは、以下の式（７）によって定義される、瞬間ｔにおいて前記マイクロ流体デバイス（１０）に流入する前記試料の体積であり、
【数４】
2018533946.tif 000022
式中、
−  Ｑは、前記マイクロ流体デバイス（１０）における前記試料の流量であり、
前記ステップＡは、
Ａ２）前記マイクロ流体デバイス（１０）のユーザが、前記高さＨchの壁部の前記高さＨchを前記封入ゾーン（５）における好ましい体積の量と関連する製造制約との関数として固定するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記封入ゾーン（５）は、Ｌch＝Ｄchであるような直径Ｄchの円形の基部（５１）を含む円筒形状を有する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子又は細胞の沈降速度ｖsediは、下位ステップｂ１）において以下のストークス式（８）に従って計算され、
【数５】
2018533946.tif 000023
式中、
−  ｒは、粒子又は細胞の半径であり、
−  ηは、前記分散媒液の動的粘度であり、
−  Δρは、前記封入すべき粒子又は細胞の密度と前記分散媒液の密度との間の密度差である、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロ流体デバイス（１０）の前記幾何学的パラメータを決定する前記ステップｂ４）は、
・ｂ４１）前記マイクロ流体デバイス（１０）の７つの幾何学的パラメータを８つの幾何学的パラメータＤin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout、Ｌout及びＷoutの中から選択する下位ステップと、
・ｂ４２）残りの未知の幾何学的パラメータを前記分散媒液のΔＺ及び前記速度ｖchの関数として計算する下位ステップと、
を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記未知のパラメータは、前記下位ステップｂ４２）において、前記マイクロ流体デバイス（１０）における前記分散媒液の通常の充填損失及び層流のための以下の式（２’）から計算され、
【数６】
2018533946.tif 000024
式中、
−  Ｑは、以下の式（９）によって定義される、前記デバイス（１０）における一定の流体流量であり、
【数７】
2018533946.tif 000025
−  ｇは、重力加速度を示し、
−  ηは、前記分散媒液の動的粘度を示し、
−  ρは、前記分散媒液の密度を示し、
−  Ｌchは、前記封入ゾーン（５）の幅を示し、
−  λは、以下の式（３）に従って低レイノルズ数について計算された摩擦係数を示す、
【数８】
2018533946.tif 000026
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記未知のパラメータは、以下の式（４）に従って計算されるＬoutである、
【数９】
2018533946.tif 000027
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料は、細胞培養液中に浮遊した状態の、或いは塩水又は真水に関わらず水、溶媒、ヒドロゲル又は有機骨格、或いはポリマー中に浮遊した状態の神経細胞及び真核細胞から選択された細胞の集団から成る生体試料である、
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料は、金属微粒子から選択された、或いは半導体材料又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で形成された、塩水又は真水に関わらず水、溶媒、ヒドロゲル又は有機骨格、或いはポリマー中に浮遊した状態の微粒子の集団から成る非生体試料である、
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記封入ゾーン（５）は、少なくとも１つの単離チャンバ（７）内の前記試料を通過させて戻さない液圧抵抗を有する少なくとも１つのさらなるチャネル（６）を通じて前記単離チャンバ（７）に接続される、
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離チャンバ（７）は、さらなるマイクロ流体デバイスの封入ゾーンである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離チャンバは、さらなる試料を含む、
請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記封入ゾーン（５）内の前記初期試料と前記単離チャンバ（６）内の前記さらなる試料との間の相互作用を研究するための、請求項１２に従ってサイズ決めされたようなマイクロ流体デバイス（１０）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を封入するためのマイクロ流体デバイスのサイズ決定方法に関する。
【０００２】
本発明では、２種類の試料について検討する。この方法では、封入すべき試料が、
−  分散媒液中に浮遊した状態の細胞集団（例えば、細胞培養液中に浮遊した状態の神経細胞及び真核細胞におけるもの、この試料は生体試料である）又は微粒子集団のいずれか、
−  或いは細胞培養液に含まれる少なくとも１つの外植片から成る生体試料、
から成ることができる。
【０００３】
本発明における生体試料とは、遺伝情報を含んで自力での生殖が可能な、又は生体系内での生殖が可能な試料を意味する。
【背景技術】
【０００４】
神経工学における大きな難題の１つは、集団（ｎ＞１００細胞／ｍｌ）内の神経細胞の細胞体（ソーマ）の、各ソーマの濃度、空間的位置決め及び位置決めの均一性に関する位置決めの制御である。この難題は、神経回路網のインビトロ研究を、より一般的には脳のラポール構造／機能の研究を著しく制限するものである。
【０００５】
当業者であれば、細胞培養のためのソーマの位置決め技術を複数知っている。とりわけ、最も広く使用されている技術は、特にマイクロ流体チップを用いて神経細胞の位置決めとその後の培養とを行うことから成るが、細胞の位置決め及び密度を正確に制御できず、従って当業者の関心が限られている（文献［１］〜［３］）。
【０００６】
また、当業者であれば、マイクロ流体チップのタイプによっては、２つの神経細胞集団を接続する（文献［４］、［５］）ものもあれば、神経細胞集団を共に接続せずに細胞体と軸索とを分離する（文献［１］〜［３］）ものもあることも知っている。
【０００７】
第２の神経細胞培養技術は、マイクロピラーを実装したマイクロ流体チップを用いて神経細胞を界面で分離する（文献［６］）。マイクロピラーの位置決めによって細胞の位置決めも可能になるものの、神経細胞は個々に位置決めされ、従って集団全体を平均密度又は高密度で培養することが妨げられ、この技術についての関心も限られている。
【０００８】
第３の神経細胞培養技術は、神経細胞が沈着したシリコンビーズを利用する。これらのボールを組み合わせることによって神経回路網が構築される。しかしながら、このような技術では神経細胞の数及び密度が制限され、神経回路網の構造が制御されず、細胞体が軸索によって分離されない（文献［６］、［８］）。
【０００９】
第４の技術は、マイクロ流体構成内で分離できる適合した骨格内でこれらの骨格の層流を通じて神経細胞の培養を行った後に冷凍することから成る（文献［９］）。しかしながら、これらの技術は、培養物中の流体の均質性に起因して細胞共培養を行うのが困難であり、最終的な神経回路網のアクセス可能なサイズが限られるという理由で限界がある。
【００１０】
最後に、第５の技術は、マイクロチャンバ内で神経細胞の培養を行って神経スフェロイドを形成し、これらの神経スフェロイドを組織ブロックに組み合わせて培養物を作り直した後に、この培養物を他のブロックに組み合わせることから成る。しかしながら、この技術には、時間が掛かるとともに複数の培養レベルが必要であるという不利点がある。また、この技術では、神経細胞の密度の制御及び軸索の細胞体の分離もできない（文献［１０］）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、神経細胞が初代細胞であるか、それとも細胞株であるかに関わらず、その細胞体の集団全体の規模での、マイクロ流体チャンバ内での、制御された表面密度又は体積密度での制御された位置決めを可能にすることによって上記の不利点を排除することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的のために、本出願人は、分散媒液中に浮遊した状態の神経細胞などの細胞の流れを最適化するためのマイクロ流体デバイス（又はマイクロ流体チップ）のサイズ決定方法を開発した。
【００１３】
封入すべき試料が、分散媒液中に浮遊した状態の細胞又は微粒子の集団から成る場合には、
・  試料を含む分散媒液を受け取るように適合された、直径Ｄinの円筒形入力タンクに対応する入力ゾーンと、
・  面積Ｓch及び長さＬchの基部と、高さＨchの側壁とを有し、試料の少なくとも一部を内部に封入し、長さＬin、高さＨin及び幅Ｗinの第１のチャネルを通じて入力ゾーンと連通する封入ゾーン（又は沈着チャンバ）と、
・  試料を含む分散媒液を放出するように適合され、直径Ｄoutの円筒形出力タンクに対応し、長さＬout、高さＨout及び幅Ｗoutの第２のチャネルを通じて封入ゾーンと連通する出力ゾーンと、
を含むマイクロ流体デバイス（又はマイクロ流体チップ）を使用する。
【００１４】
利点として、封入ゾーンは、Ｌch＝Ｄchであるような直径Ｄchの円形基部を含む円筒形状を有することができる。しかしながら、他の幾何学的形状も可能である。
【００１５】
従って、この場合、本発明の目的は、このようなマイクロ流体デバイスのサイズ決定方法であって、
Ａ．封入ゾーンを特徴付ける表面Ｄchと高さＨchとを定めるように、封入すべき細胞又は微粒子の好ましい量と、封入ゾーンの基部の細胞又は微粒子による好ましいカバー率φとの関数として封入ゾーンのサイズを決定するステップと、
Ｂ．第１のチャネル及び第２のチャネルのサイズを決定するステップと、
を含み、このステップＢが、
・ｂ１）粒子又は細胞の沈降速度ｖsediを計算するステップと、
・ｂ２）封入ゾーンにおける分散媒液の速度ｖchを粒子又は細胞の沈降速度ｖsediの関数として以下の式（１）に従って決定するステップと、
【数１】
2018533946.tif 000003
・ｂ３）入力ゾーンと出力ゾーンとの間に注入される、封入ゾーンにおける適切な流れを構築するために必要な媒液の体積ΔＺの関数として、デバイスにおける充填損失を決定するステップと、
・ｂ４）分散媒液のΔＺ及び速度ｖchから、マイクロ流体デバイスの幾何学的パラメータを決定するステップと、
を含む、方法である。
【００１６】
本発明において、マイクロ流体デバイスの幾何学的パラメータとは、上述したマイクロ流体デバイスの形態及び寸法を特徴付けるパラメータであるＤin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout、Ｌout及びＷoutを意味する。
【００１７】
本発明において、十分な流れとは、細胞又は粒子を前記出力ゾーンに引き寄せることなく、又はこの時点で出力ゾーンに出て行く細胞の損失を最小化することなく、封入ゾーン内における細胞又は粒子の沈着を可能にする流れを意味する。ここでは、十分な流れが入力タンクと出力タンクとの間の体積差によって引き起こされる。流れを可能にするために、外部ポンプシステムを使用することもできる。
【００１８】
本発明による方法の最初のステップは、封入ゾーンを特徴付ける面積Ｄchと高さＨchとを定めるように、封入すべき細胞又は微粒子の好ましい数と、封入ゾーンの基部の細胞又は微粒子による好ましいカバー率φとの関数として封入ゾーン（又は沈着チャンバ）のサイズを決定するステップである。
【００１９】
本発明において、封入ゾーンの基部のカバー率φとは、封入ゾーンの基部の全表面に対する、基部に沈着した粒子によって覆われた表面の比率φを意味する。
【００２０】
その他の点では、封入ゾーンのサイズが、選択された用途の関数として決定される。このサイズは、半径及び高さが数十マイクロメートルから数ミリメートルまで様々とすることができる。
【００２１】
利点として、このサイズ決定ステップＡは、
Ａ１）封入ゾーンの基部の表面Ｓchを以下のストークス式（５）に従って決定するステップを含み、
【数２】
2018533946.tif 000004
式中、
−  φは、基部のカバー率φであり、
−  ｒは、粒子又は細胞の半径であり、
−  Ｎは、以下の式によって定義される、封入すべき神経細胞又は細胞の数であり、
【数３】
2018533946.tif 000005
式中、
−  φは、前記試料中の細胞又は神経細胞の（実験の開始時に測定された）濃度であり、
−  Ｖは、以下の式によって定義される、瞬間ｔにおいて前記マイクロ流体デバイスに流入する試料の体積であり、
【数４】
2018533946.tif 000006
式中、
−  Ｑは、前記マイクロ流体デバイスにおける試料の流量であり、
このステップＡは、
Ａ２）マイクロ流体デバイスのユーザが、高さＨchの壁部の高さＨchを封入ゾーンにおける好ましい体積の量と関連する製造制約との関数として固定するステップをさらに含むことができる。
【００２２】
本発明による方法の第２のステップｂ２）は、第１及び第２のチャネルのサイズを決定するステップである。このステップＢは、いくつかの下位ステップを含む。
【００２３】
最初の下位ステップは、粒子又は細胞の沈降速度ｖsediを計算するステップｂ１）である。
【００２４】
利点として、粒子又は細胞の沈降速度ｖsediは、以下のストークス式（８）に従って計算することができ、
【数５】
2018533946.tif 000007
式中、
−  ｒは、粒子又は細胞の半径であり、
−  ηは、前記分散媒液の動的粘度であり、
−  Δρは、封入すべき粒子又は細胞の密度と分散媒液の密度との間の密度差である。
【００２５】
第２の下位ステップは、前記封入ゾーンにおける分散媒液の速度Ｖchを計算するステップｂ２）である。この決定は、下位ステップｂ１）において計算された沈降速度ｖsediから、以下の式（１）に従って行われる。
【数６】
2018533946.tif 000008
【００２６】
実際には、試料全体を封入ゾーンに封入するには、式１に従って、封入ゾーンにおける分散媒液の流速Ｖchが、沈降速度ｖsediに封入ゾーン（又はチャンバ）の高さＨchと長さＤchとの比率を乗じたもの以下でなければならないことが分かっている。
【００２７】
式（１）は、本発明によるマイクロ流体デバイスの３つの動作形態を決定する。本発明によるマイクロ流体デバイスの（後述するような）充填損失を決定するための幾何学的特性と動作条件（試料の入力体積及び細胞又は微粒子の濃度）とを考慮すると、デバイスは、生体試料の一部のみをチャンバ５に封入するよう、
【数７】
2018533946.tif 000009
或いは本発明の目的のように生体試料全体を封入ゾーンに均一に封入するよう、
【数８】
2018533946.tif 000010
又は不均一に封入するよう、
【数９】
2018533946.tif 000011
に設計することもできる。
【００２８】
第３の下位ステップは、入力ゾーンと出力ゾーンとの間に注入される、封入ゾーンにおける適切な流れを構築するために必要な媒液の体積ΔＺの関数として、本発明によるマイクロ流体デバイスにおける充填損失を決定するステップｂ３）である。この充填損失は、本発明によるマイクロ流体デバイスの使用中に注入される分散媒液の量によって設定される。
【００２９】
第４の下位ステップは、分散媒液のΔＺ及び速度ｖchから、前記マイクロ流体デバイスの幾何学的パラメータであるＤin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout、Ｌout及びＷoutを決定するステップｂ４）である。
【００３０】
この決定のために考慮される充填損失は、通常の充填損失である。本発明において、特異な充填損失は無視される。
【００３１】
通常の充填損失は、第１及び第２のチャネルの壁部に対する液体の摩擦と密接に関連する。マイクロ流体デバイス全体を通じて液体流が層状である低レイノルズ数（Ｒｅ＜＜１）を有する形態では、これらの形態の通常の充填損失が、以下の一般式（２）によって大まかに推定され、
【数１０】
2018533946.tif 000012
式中のＷ、Ｈ及びＬは、チャネルの幅、高さ及び長さを表し、Ｑは、分散媒液の体積流量を示し、ｇは重力加速度を示し、η及びρは、液体の動的粘度及び密度をそれぞれ示し、最後にλは、以下の式に従って低レイノルズ数を概算する摩擦係数を示し、
【数１１】
2018533946.tif 000013
この摩擦係数λは、本発明によるマイクロ流体デバイスのチャネル毎に計算される。
【００３２】
また、特異な充填損失は基本的に配管事故に起因し、マイクロ流体デバイスの異なる要素間の形状の変化に関連する。通常、これらの充填損失は以下の式によって推定される。
【数１２】
2018533946.tif 000014
【００３３】
この式では、ｖが、関連する区分内の液体の速度を表し、ｇが、重力加速度を示し、Ｋが、特異な充填損失のタイプに依存するパラメータである。なお、パラメータＫは、配管事故のタイプ（突然の収縮、突然の拡張、突然の屈曲、湾曲など）の関数として推定され、このパラメータＫの推定は、配管事故のタイプの関数とは異なる、当業者に周知の公式によって行われる。
【００３４】
上述した式（２）及び（２の２）から明らかなように、充填損失は、マイクロ流体デバイスのチャネルの寸法のみならず、体積流量、動的粘度及び通常の充填損失の液体密度、並びに特異な充填損失及びこれらの特異な充填損失のタイプに関連する区分内の液体の速度にも依存する。
【００３５】
下位ステップｂ４）の、本発明によるマイクロ流体デバイスの幾何学的パラメータを決定するステップは、
・Ｂ４１）マイクロ流体デバイスの７つの幾何学的パラメータを８つの幾何学的パラメータＤin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout、Ｌout及びＷoutの中から（封入ゾーンの幾何学的形状の関数として）選択するステップと、
・Ｂ４２）残りの未知の幾何学的パラメータを分散媒液のΔＺ及び速度ｖchの関数として計算する下位ステップと、
によって有利に行うことができる。
【００３６】
本発明の範囲内では、特異な充填損失が無視され、マイクロ流体デバイス内の分散媒液の流れが層状であるという仮定が出発点である。
【００３７】
このように、この点（分散媒液の通常の充填損失ΔＺ及び層流）については、下位ステップｂ４２）において、一般式（２）から導出された以下の式（２’）から未知のパラメータを計算することができ、
【数１３】
2018533946.tif 000015
式中、
−  Ｑは、以下の式（９）によって定義される、デバイスにおける一定の流体流量であり、
【数１４】
2018533946.tif 000016
−  ｇは、重力加速度を示し、
−  ηは、分散媒液の動的粘度を示し、
−  ρは、分散媒液の密度を示し、
−  Ｌchは、封入ゾーンの幅を示し（封入ゾーンが円形形状である場合には、Ｌch＝Ｗch＝Ｄchである）、
−  λは、以下の式（３）に従って低レイノルズ数について計算された摩擦係数を示す。
【数１５】
2018533946.tif 000017
【００３８】
未知のパラメータをＬoutとする選択が行われた（他のパラメータであるＤin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout及びＷoutは確定している）場合には、以下の式（４）に従ってＬoutを計算することができる。
【数１６】
2018533946.tif 000018
【００３９】
上述したように、封入すべき試料は、分散媒質中に浮遊した状態の細胞又は微粒子の集団から成る。この試料は、非生体試料とすることも、又は生体試料とすることもできる。
【００４０】
この本発明による方法の実施形態の第１の変形形態によれば、試料は、細胞培養液中に浮遊した状態の、或いは塩水又は真水に関わらず水、溶媒、ヒドロゲル又は有機骨格、或いはポリマー中に浮遊した状態の神経細胞及び真核細胞から選択された細胞の集団から成る生体試料とすることができる。利点として、生体試料は、ミリリットル当たり１００細胞〜ミリリットル当たり１０10細胞に及ぶ細胞の集団を含むことができる。生体試料内の細胞のタイプに関わらず、細胞の沈降速度は、ブラウン運動によって誘発される速度よりも速くなければならない。
【００４１】
この本発明による方法の実施形態の第２の変形形態によれば、試料は、金属微粒子から選択された、或いは半導体材料又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で形成された、塩水又は真水に関わらず水、溶媒、ヒドロゲル又は（例えば、コラーゲンタイプの）有機骨格、或いはポリマー中に浮遊した状態の微粒子の集団から成る非生体試料とすることができる。
【００４２】
利点として、封入ゾーンは、単離チャンバ内の試料を通過させて戻さない液圧抵抗を有する少なくとも１つのさらなるチャネルを通じて少なくとも１つの単離チャンバに接続することができる。
【００４３】
利点として、この単離チャンバは、さらなるマイクロ流体デバイスの封入ゾーンとすることができる。
【００４４】
利点として、この単離チャンバは、さらなる試料を含むことができる。この場合、このようにしてサイズ決めされたマイクロ流体デバイスを、封入ゾーン内に配置された初期試料と単離チャンバ内のさらなる試料との間の相互作用の研究に使用することができる。
【００４５】
本発明によるサイズ決定法は、様々な分野で使用することができる。例えば、試料が生体試料である場合、本発明による方法は、生体試料が神経細胞集団を含む場合には神経科学の分野において、或いは生体試料が癌細胞集団を含む場合には癌腫学の分野において使用することができる。試料が非生体試料である場合、本発明による方法は、例えば非生体試料が金属粒子集団を含む場合には光通信学の分野において使用することができる。
【００４６】
試料が、細胞培養液中に含まれる少なくとも１つの外植片から成る生体試料である場合には、第１の実施形態において使用されるものとは異なる、試料の性質に合わせて特に適合されたマイクロ流体デバイス（又はマイクロ流体チップ）が使用される。このようなデバイスは、
・  試料を含む細胞培養液を受け取るように適合された、直径Ｄinの円筒形入力タンクに対応する入力ゾーンと、
・  内部に封入ゾーンが配置され、一方で前記入力ゾーンと連通し、他方で以下の第２のチャネルと連通する、長さＬin、高さＨin及び幅Ｗinの第１のチャネルと、
・  一方で前記第１のチャネルと連通し、他方で前記試料を含む液体を放出するように適合された出力ゾーンであって、直径Ｄoutの円筒形出力タンクに対応する出力ゾーンと連通する、長さＬout、高さＨout及び幅Ｗoutの第２のチャネルと、
を含む。
【００４７】
この場合、本発明の目的は、このようなマイクロ流体デバイスのサイズ決定方法であって、
Ａ．前記マイクロ流体デバイスに封入すべき外植片を選択するステップと、
Ｂ．前記外植片を生存のために必要な量の分散媒液と共に導入できるように前記入力ゾーンのサイズを決定するステップと、
Ｃ．試料の少なくとも一部が第１のチャネルの前記封入ゾーンに封入され、入力ゾーンに導入された細胞培養液が第１のチャネル、封入ゾーン、第２のチャネルを通じて出力ゾーンに向かって流れることができるように、第２のチャネルの幅Ｗout及び／又は高さＨoutが第１のチャネルの幅Ｗin及び／又は高さＨinよりもそれぞれ小さくなるように前記第１及び第２のチャネルのサイズを決定するステップと、
を含む方法である。
【００４８】
利点として、第２のチャネルの幅Ｗout及び／又は高さＨoutは、外植片の寸法よりも小さくすることができる。
【００４９】
利点として、第１のチャネルの幅Ｗin及び／又は高さＨinは、外植片の寸法よりも少なくとも１％だけ大きくすることができる。
【００５０】
利点として、マイクロ流体デバイスの出力ゾーンは、計画する用途にとって培養液の流れが十分になるように、前記細胞培養液の吸引を可能にするように適合することができる。
【００５１】
本発明のこの実施形態において、十分な流れとは、出力吸引による流れを意味する。流れを容易にするために、外部ポンプシステムを利用することもできる。
【００５２】
この本発明による第２のサイズ決定法において生体試料として使用できる外植片の特定の例は、組織、網膜、神経節又は海馬である。
【００５３】
添付図及び対応する実施例を参照しながら非限定的な例として示す以下の説明から、本発明のその他の利点及び特定の特徴が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の方法の第１の実施形態に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイスの一例の概略断面図、及びこの同じデバイスの平面図である。
【図２】図１に示すマイクロ流体デバイスの封入ゾーン（又は沈着チャンバ）の写真である。
【図３】本発明の方法の第２の実施形態に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイスの一例の概略断面図及び概略平面図である。
【図４】外植片が神経節である場合の図３のマイクロ流体デバイスの封入ゾーンの写真である。
【図５】外植片が海馬である場合の図３のマイクロ流体デバイスの封入ゾーンの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１〜図８に示す同一の要素は、同一の参照番号によって識別する。実施例１では、図１及び図２についてさらに詳細に解説し、実施例２では、図３〜図５についてさらに詳細に解説する。
【実施例１】
【００５６】
第１の実施形態：神経細胞の沈着に使用することを考慮した（図１及び図２に示す）マイクロ流体チップのサイズ決定。
【００５７】
デバイス
本発明による方法（第１の実施形態）に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイス１０を神経細胞の沈着に使用する。
【００５８】
図１には、とりわけ本発明の方法の第１の実施形態に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイス１０の例を（断面図及び平面図で）示す。図２は、神経細胞の沈着の場合に使用する沈着チャンバ５の写真である。
【００５９】
このマイクロ流体デバイス１０は、生体試料を含む液体を受け取るように適合された入力ゾーン１と、この液体を放出するように適合された出力ゾーン４とを含む。入力ゾーン１及び出力ゾーン４は、同じ直径と異なる高さ（入力ゾーン１の高さの方が出力ゾーン４の高さよりも低い）とを有する円筒形タンクに対応する。具体的に言えば、入力ゾーン１に対応するタンクの直径Ｄinは、出力ゾーン４に対応するタンクの直径Ｄoutと同じである。しかしながら、入力ゾーン１及び出力ゾーン４は、異なる直径を有することもできる。また、入力ゾーン１及び／又は出力ゾーン４は、円筒形以外の形態（例えば、正方形）を有することもできる。
【００６０】
なお、入力ゾーン１の寸法（高さ及び断面）は、入力ゾーン１内に導入される生体試料に関連して選択され、入力ゾーン１の寸法は神経細胞のインビトロ研究を行うためにこれらの神経細胞が封入ゾーン（又は沈着チャンバ）において１２時間〜４８時間に及ぶ期間（ただしこれらの期間に限定されるわけではない）にわたって生き残るために必要な、細胞培養液に含まれる全ての栄養素を蓄積できるようなものであることが好ましい。
【００６１】
図１のマイクロ流体デバイス１０は、生体試料を封入する封入ゾーン（又は沈着チャンバ）５をさらに含む。具体的に言えば、図１の例では、チャンバ５が、長さＤchと高さＨchとを有する円筒形を有する。なお、図１の例では、（円筒形チャンバの直径に対応する）長さＤchが、入力ゾーン１の直径Ｄin及び出力ゾーン４の直径Ｄoutよりも小さい。しかしながら、長さＤchは、入力ゾーン１の直径Ｄin及び出力ゾーン４の直径Ｄout以上とすることもできる。また、チャンバ５は、例えば細長い形、三角形、正方形又は五角形などの他の形態を有することもできる。
【００６２】
また、チャンバ５の寸法（高さ及び長さ）は、入力ゾーン１によって受け取られてこのチャンバ５に封入すべき液体の体積の関数として決定され、数マイクロメートルから数センチメートルまで様々とすることができる。
【００６３】
また、図１には、チャンバ５が第１のチャネル２と第２のチャネル３との間に配置され、第１のチャネル２が入力ゾーン１とチャンバ５とを接続し、第２のチャネル３がチャンバ５と出力ゾーン４とを接続していることも示す。第１のチャネル２は、高さＨin、長さＬin及び幅Ｗinを有し、第２のチャネル３は、高さＨout、長さＬout及び幅Ｗoutを有する。第１及び第２のチャネルは、入力ゾーン１及び出力ゾーン４の高さよりも低い高さを有し、入力ゾーン１によって受け取られた液体が第１のチャネル２、チャンバ５、第２のチャネル３を通じて出力ゾーン４に向かって流れるように互いに相対的に配置される。
【００６４】
なお、図１のマイクロ流体デバイス内の液体の流れは、入力ゾーン１の残りの量の液体を除去するか、或いは出力ゾーン４に同等の量の液体を追加するかによっていつでも停止することができる。
【００６５】
また、図１の例では、第１のチャネル２の高さＨin及び幅Ｗinが、第２のチャネル３のそれぞれの高さＨout及び幅Ｗoutよりも大きく、第１のチャネル２の長さＬinが、第２のチャネル３の長さＬoutと同じである。なお、別の例では、第１のチャネル２の高さＨin及び幅Ｗinを、第２のチャネル３のそれぞれ高さＨout及び幅Ｗout以下にし、第１のチャネル２の長さＬinを、第２のチャネル３の長さＬoutよりも長く又は短くすることもできる。
【００６６】
図１のマイクロ流体デバイス１０の封入ゾーン（チャンバ５）の上流に第１のチャネル２が存在して下流に第２のチャネル３が存在することにより（「上流」及び「下流」という用語は、入力ゾーン１によって受け取られた液体の上述した流れの方向に関連して決定される）、具体的にはこれらの２つのチャネルの寸法（すなわち、高さ、長さ及び幅）を十分に適合させることにより、封入ゾーンに封入される生体試料の空間分布を制御することによってこの封入ゾーンに生体試料の少なくとも一部が封入されることが分かっている。とりわけ、第１のチャネル２及び第２のチャネル３のそれぞれの寸法をマイクロ流体デバイス１０内の充填損失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ）の関数として適合させることで、チャンバ５内の液体流の速度を制御できるとともに、この速度の制御により、このチャンバ５内の生体試料の空間分布を液体流の最中に制御できるようなマイクロ流体デバイス１０が得られることが分かっている。なお、チャンバ５内の液体流の速度は、マイクロ流体デバイス１０の入力ゾーン１内の液体の体積と出力ゾーン４内の液体の体積との差分に依存する。このように、チャンバ５内の液体流の速度の制御は、この入力ゾーン１における液体の体積と出力ゾーン４における液体の体積との差分によって行うことができる。この液体の体積差の制御は、入力ゾーン１又は出力ゾーン４から一定量の液体を除去するか、或いはこれらのゾーンに一定量の液体を追加するかによって行うことができる。
【００６７】
試料
この例において実装した試料は、
−  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ｂ２７、Ｌ−システイン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む細胞培養液
−  の中に浮遊した状態の５．１０7神経細胞／ｍＬ、
を含む神経細胞の培地である。
【００６８】
図１及び図２のマイクロ流体チップの試料の関数としてのサイズ決定
図１のマイクロ流体デバイス１０の沈着チャンバ５に神経細胞集団を封入した例を図２の写真によって示しており、このチップ１０では、入力ゾーン１の直径と出力ゾーン４の直径とが同じではない。
【００６９】
具体的に言えば、図２の写真は、２００μｍの長さのスケールバー１１と、チャンバ５（封入ゾーン）に封入された細胞とを示すものである。これらの細胞は、約１０μｍの寸法及び９５％の表面密度の神経細胞である。
【００７０】
図２のように、封入ゾーンは４つのゾーン（図２のゾーン（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）を参照）に分離される。
【００７１】
図２に示すように、神経細胞は、封入ゾーンの表面を均一に覆う。なお、この封入ゾーンにおける均一な封入を得るために、第１のチャネル及び第２のチャネルの寸法は、チャンバ５内の液体の流速ｖchを制御できるマイクロ流体デバイス１０を提供するように適合されている。とりわけ、図２の例の均一な封入の場合には、チャンバ５内の液体の流速ｖchが、生体試料の沈降速度ｖsediにチャンバ５の高さＨchと長さＤchとの割合を乗じたもの以下になるように（式１に従って）制御される。
【００７２】
なお、第１のチャネル及び第２のチャネルの寸法の適合は、上述した式（２’）及び（４）の充填損失と、神経細胞の濃度及び寸法と、入力ゾーン１、出力ゾーン４及びチャンバ５の寸法とを考慮して行ったものである。
【００７３】
具体的に言えば、図１に示すマイクロ流体チップ１０は、
−  流入チャネル２が、１００μｍの高さＨinと、１２０μｍの幅Ｗinと、１５００μｍの長さＬinとを有し、
−  流出チャネル３が、２０μｍの高さＨoutと、１２０μｍの幅Ｗoutとを有し、
−  沈着チャンバ５も円筒形であって、１００μｍの高さと、５００μｍの直径とを有し、
−  入力ゾーン１も円筒形であって、５ｍｍの高さＤinと、４ｍｍの直径とを有し、出力ゾーン４も円筒形であって、４ｍｍの高さと、４．５ｍｍの直径Ｄoutとを有する、
という特徴を有する。
【００７４】
Ｌoutは、式（２’）から開始する本発明によるサイズ決定法に従って計算される。
【００７５】
この例では、最初に確定したパラメータが、Ｄin、Ｈin、Ｗin、Ｌin、Ｄout、Ｈout及びＷoutであった。
【００７６】
しかしながら、Ｌoutとは異なる別の未知のパラメータを計算して他の７つの残りのパラメータを確定することもできる。
【００７７】
沈着チャンバ５内の細胞培養液の流速は４１・１０-5ｍ／ｓであり、この速度は、入力ゾーン１に２０μＬの体積の液体を導入することによって得られたものである。
【００７８】
なお、Ｔａｙｌｏｒ他による公表文献［１］のマイクロ流体デバイスには、本発明に従ってサイズ決定されるマイクロ流体デバイス１０に存在するような、Ｔａｙｌｏｒ封入ゾーン（培養チャンバ）に接続された第１のチャネル及び第２のチャネル等が存在しない。Ｔａｙｌｏｒのデバイスでは、封入ゾーンにおける試料の空間分布を制御することによってこの封入ゾーン内に試料を封入することができない。
【００７９】
チャンバ５における液体流の速度を制御すると、このチャンバ５における生体試料の空間分布を液体流の最中に制御できるようになる。
【００８０】
実験プロトコル
細胞の成長には、あらゆる形の汚染を避けるために無菌培地が必要である。マイクロ流体チップは、組み立てると無菌ではなくなり、従って使用前に滅菌する必要がある。
【００８１】
このため、この神経細胞の沈着例において使用するマイクロ流体チップ１０（図２に示すのはその沈着チャンバ５である）を（無菌層流を含むフードなどの）無菌環境に導入し、チャネル２、３及び沈着チャンバ５内の水に取って代わるように充填ゾーンにエタノールを導入する。次に、エタノールを無菌水で３回すすいだ後に、チップ１０を３０分にわたってＵＶに曝す。
【００８２】
次に、細胞の培養を促すために沈着チャンバの表面を官能化することができる。
【００８３】
チップ１０の準備が整うと、予め定めた体積の試料（０．５ｍＬ〜１０ｍＬ）を充填ゾーン（入力ゾーン１）内に堆積させ、流れを生じさせて細胞の沈着を開始する。
【００８４】
この流れは、入力ゾーン１に残っている量の液体を除去するか、或いは出力ゾーンに同等の量を追加するか（入力と出力との間で静水圧を均等化すること）によっていつでも停止することができる。
【実施例２】
【００８５】
第２の実施形態：外植片の沈着に使用することを考慮した（図３〜図５に示す）マイクロ流体チップのサイズ決定。
【００８６】
デバイス
本発明による方法（第２の実施形態）に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイス１０を外植片の沈着に使用する。
【００８７】
図３には、とりわけ本発明の方法の第２の実施形態に従ってサイズ決めされたマイクロ流体デバイス１０の例を（断面図及び平面図で）示す。
【００８８】
図３に示すように、マイクロ流体デバイス１０は、生体試料を含む液体を受け取るように適合された入力ゾーン１と、この液体を放出するように適合された出力ゾーン４とを含む。入力ゾーン１及び出力ゾーン４は、同じ直径と同じ高さとを有する円筒形タンクに対応する。具体的に言えば、入力ゾーン１に対応するタンクの直径Ｄinは、出力ゾーン４に対応するタンクの直径Ｄoutと同じである。
【００８９】
しかしながら、入力ゾーン１及び出力ゾーン４は、異なる直径及び／又は高さを有することもできる。また、入力ゾーン１及び／又は出力ゾーン４は、円筒形以外の形態（例えば、正方形）を有することもできる。
【００９０】
なお、入力ゾーン１の寸法（高さ及び直径）は、図１のマイクロ流体デバイス１０の入力ゾーン１の場合と同様に、生体試料がこの入力ゾーン１を通じて図３のマイクロ流体デバイス１０に流入できるように、この入力ゾーン１によって受け取られる外植片（特に、神経節又は海馬）の寸法に関連して選択される。
【００９１】
また、図１のマイクロ流体デバイス１０の入力ゾーン１の場合と同様に、図３のマイクロ流体デバイス１０の入力ゾーン１の寸法は、細胞のインビトロ研究を行うために外植片が封入ゾーンにおいて１２時間〜４８時間とすることができる期間（ただしこれらの期間に限定されるわけではない）にわたって生き残るために必要な、液体に含まれる多くの栄養素を蓄積できるように十分なものであることが好ましい。
【００９２】
図３のマイクロ流体デバイス１０は、外植片を封入する封入ゾーン５をさらに含む。この封入ゾーンは、第１のチャネル２の空間に対応し（例えば、以下の図４及び図５の例における第１のチャネル２の下流の空間を参照）、この封入ゾーン５の寸法は、数マイクロメートルから数センチメートルまで様々とすることができる。
【００９３】
また、マイクロ流体デバイス１０は、入力ゾーン１及び出力ゾーン４の高さよりもそれぞれ低い高さを有する第１のチャネル２及び第２のチャネル３も含む。また、図３に示すように、第１のチャネル２は、高さＨin、長さＬin及び幅Ｗinを有し、第２のチャネル３は、高さＨout、長さＬout及び幅Ｗoutを有する。
【００９４】
また、図３のマイクロ流体デバイス１０の第１のチャネル２及び第２のチャネル３は、入力ゾーン１を通じて導入された外植片を含む細胞培養液が第１のチャネル２、封入ゾーン、第２のチャネル３を通じて出力ゾーン４に向かって流れるように互いに相対的に配置される。
【００９５】
なお、図３のマイクロ流体デバイス内の液体の流れは、入力ゾーン１に残っている量の液体を除去するか、或いは出力ゾーン４に同等の量の液体を追加するかによっていつでも停止することができる。
【００９６】
また、出力ゾーン４は、マイクロ流体デバイス１０内の液体の速度を高めるため、液体を吸引することができるように適合させることもできる。とりわけ、この液体の吸引は、ピペット、ノズル又は吸引毛管を用いて行うことができ、出力ゾーン４の寸法は、ピペット、ノズル又は吸引毛管の寸法に対応するように適合される。
【００９７】
なお、図１のマイクロ流体デバイス１０の場合と同様に、図３のマイクロ流体デバイス１０の第１のチャネル２及び第２のチャネル３のそれぞれの寸法は、液体流の最中に生体試料の少なくとも一部が封入ゾーン５に封入され、この封入ゾーン５内の生体試料の空間分布が制御されるように適合される。具体的に言えば、第２のチャネル３の幅Ｗout及び／又は高さＨoutは、第２のチャネル３が生体試料のための物理的障壁として機能し、従って、上述したように第１のチャネル２の空間内で生体試料の封入が行われるように、第１のチャネル２のそれぞれの幅Ｗin及び／又は高さＨinよりも小さい。１つの例によれば、第２のチャネル３の幅Ｗout及び／又は高さＨoutは、第１のチャネル２のそれぞれの幅Ｗin及び／又は高さＨinよりも小さい以外に、第２のチャネル３が生体試料の特定の寸法に適合する改善された物理的障壁を提供して第２のチャネル３における生体試料の通過をより効果的に阻止するように、生体試料の寸法よりも小さい。
【００９８】
また、第１のチャネル２の幅及び／又は高さの適合は、外植片の寸法に依存するとともに、生体試料が損傷を伴わずに第１のチャネル２を通過できるように、あらゆる場合において浮遊状態の生体試料の寸法よりも少なくとも１％大きいことが好ましい。
【００９９】
また、第１のチャネル２の長さについては、外植片を第１のチャネル２に導入して経路上のアクシデント（封入ゾーンに到達する前の第１のチャネル２の壁部への望ましくない外植片の付着）を防ぐようにできるだけ短いことが好ましい。
【０１００】
図３の例では、封入ゾーンにおける空間分布を制御することによって生体試料の少なくとも一部を封入ゾーン５に封入する決定的な要素が、上述したマイクロ流体デバイス１０の特定の構造であり、図１の例のような充填損失ではない。このように、図３のマイクロ流体デバイス１０内に第１のチャネル２及び第２のチャネル３が存在することにより、具体的にはこれらの２つのチャネル２、３のそれぞれの寸法を上述したように十分に適合させることにより、封入ゾーンにおける生体試料の空間分布を制御することによって、封入ゾーン内の液体流の速度を制御して生体試料の少なくとも一部をこの封入ゾーンに封入できるようなマイクロ流体デバイス１０が得られることが分かっている。なお、この図３の例では、上述した液体吸引によって封入ゾーン内の液体流の速度を制御することもできる。
【０１０１】
試料
この例において実装した試料の一方（図４の場合）は、
−  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ｂ２７、Ｌ−システイン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する細胞培養液
−  の中に浮遊した状態の神経節、
を含む生体試料である。
【０１０２】
この例において実装した他方の試料（図５の場合）も生体試料であるが、この試料は、
−  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ｂ２７、Ｌ−システイン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する細胞培養液
−  の中に浮遊した状態の海馬、
を含む生体試料である。
【０１０３】
図４及び図５のマイクロ流体チップの外植片のサイズの関数としてのサイズ決定
図４及び図５には、図３に概略的に示すマイクロ流体デバイス１０の封入ゾーンの平面図に相当する写真をそれぞれ示しており、
−  図４では、封入された外植片１２が２５０μｍの直径の神経節であり、
−  図５では、封入された外植片１３が３ｍｍの長さ及び２００μｍの幅の海馬である。
【０１０４】
図４及び図５で明らかなように、封入ゾーン５は第１のチャネル２の下流の空間に対応し、第２のチャネル３の高さは、第２のチャネル３における外植片の通過が妨げられるようなものである。なお、図４及び図５の例では、入力チャネル２が、１．２ｍｍの高さ、２．３ｍｍの幅及び３ｍｍの長さを有し、チャネル出力３が、１００μｍの高さ、１００μｍの幅及び４ｍｍの長さを有する。また、図４及び図５の例では、（図４及び図５には示していない）入力ゾーンが円筒形であって５ｍｍの高さと４ｍｍの直径とを有し、（図４及び図５には示していない）出力ゾーンも円筒形であって５ｍｍの高さと２ｍｍの直径とを有する。
【０１０５】
図４及び図５の例では、入力ゾーン１を通じて導入される液体の体積が４０μＬであり、封入ゾーン内の液体の流速が吸引によって引き起こされる。
【０１０６】
参考文献一覧
［１］Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｍ．他著「ＣＮＳ軸索の損傷、再生及び輸送のためのマイクロ流体培養プラットフォーム（Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＣＮＳ  ａｘｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ，  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２巻、第８号、２００５年８月、５９９〜６０５ページ
［２］Ｐａｒｋ，Ｊ．、Ｋｏｉｔｏ，Ｈ．、Ｊ．、及びＨａｎ，Ａ．著「ＣＮＳ軸索髄鞘形成の研究のためのマイクロ流体区分化共培養プラットフォーム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＣＮＳ  ａｘｏｎ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  １１、１１４５〜１１５３ページ（２００９年）
［３］Ｓｈｉ，Ｐ．、Ｎｅｄｅｌｅｃ，Ｓ．、Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．及びＫａｍ，Ｌ．Ｃ．著「軸索誘導の薬理学的検査のためのマイクロ流体工学／蛋白質パターン化の組み合わせプラットフォーム（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｘｏｎ  ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ）」、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １０、１００５〜１０ページ（２０１０年）
［４］Ｐｅｙｒｉｎ，Ｊ．Ｍ．他著「マイクロ流体チャンバにおける有向神経回路網の復元のための軸索ダイオード（Ａｘｏｎ  ｄｉｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｍｂｅｒｓ）」、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １２、３６６３ページ（２０１１年）
［５］Ｂａｒｂａｔｉ，Ａ．Ｃ．、Ｆａｎｇ，Ｃ．、Ｂａｎｋｅｒ，Ｇ．、及びＫｉｒｂｙ，Ｂ．Ｊ．著「ラット海馬初代神経細胞の培養：細胞播種、コヒーレント成長及び溶質送達のためのマイクロ流体デバイスの設計、分析及び最適化（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ：  ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｅｅｄｉｎｇ，  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ，  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  １５、９７〜１０８ページ（２０１３年）
［６］Ｄｉｎｈ，Ｎ．Ｄ．他著「最小主義的神経細胞共培養のマイクロ流体構成（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ）」、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３、１４０２〜１２ページ（２０１３年）
［７］Ｐａｕｔｏｔ，Ｓ．、Ｗｙａｒｔ，Ｃ．、及びＩｓａｃｏｆｆ，Ｅ．Ｙ．著「有向３Ｄ神経回路網のコロイド誘導組み立て（Ｃｏｌｌｏｉｄ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ３Ｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ５、７３５〜７４０ページ（２００８年）
［８］Ｈｕａｎｇ，Ｚ．他著「マイクロチップ上における機能的３次元神経回路網の組み立て（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）」、Ｓｍａｌｌ（２０１４年）、ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１４００５１３
［９］Ｂａｎｇ，Ｓ．、Ｎａ，Ｓ．、Ｊａｎｇ，Ｊ．Ｍ．、Ｋｉｍ，Ｊ．、及びＪｅｏｎ，Ｎ．Ｌ．「マイクロ流体デバイスにおける工学的に整列した神経回路（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａｌｉｇｎｅｄ  ３Ｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ）」、Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．５、１５９〜１６６ページ（２０１６年）
［１０］Ｋａｔｏ−Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｍ．、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｏｎｏｅ，Ｈ．、及びＴａｋｅｕｓｈｉ，Ｓ．著「３Ｄ異種神経回路網組み立てのためのミリメートルサイズ神経構築ブロック（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ−ｓｉｚｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ３Ｄ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」、Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．２、１５６４〜７０ページ（２０１３年）
【図１】
2018533946.tif 000028
【図２】
2018533946.tif 000029
【図３】
2018533946.tif 000030
【図４】
2018533946.tif 000031
【図５】
2018533946.tif 000032
【国際調査報告】
2018533946.tif 000033
2018533946.tif 000034
2018533946.tif 000035
2018533946.tif 000036
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2018533946.tif 000038