(57)【要約】本発明は、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来脊髄運動ニューロンとヒト筋芽細胞由来骨格筋細胞との共培養から調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト神経筋接合部モデルに関する。本発明は、候補化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト神経筋接合部モデルの活性を増加させるかまたは低下させるかを決定することによって、神経筋接合部活性をモジュレートする化合物の能力について該化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明は、例えば、ヒト運動ニューロンとヒト骨格筋の共培養物とを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部を含む組成物であって、該運動ニューロンはヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来脊髄運動ニューロンを含み、該骨格筋はヒト筋芽細胞由来骨格筋またはＰＳＣ由来筋肉を含む組成物を提供する。
2018531012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト運動ニューロンとヒト骨格筋の共培養物とを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部を含む組成物であって、該運動ニューロンはヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来脊髄運動ニューロンを含み、該骨格筋はヒト筋芽細胞由来骨格筋またはＰＳＣ由来筋肉を含む組成物。
【請求項２】
前記神経筋接合部がＰＳＣ由来筋肉細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記運動ニューロンが、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子９（ＨＢ９）、神経フィラメントマーカーＳＭＩ３２、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ホメオボックス転写因子ＮＫＸ６．１、オリゴデンドロサイト転写因子２（ＯＬＩＧ２）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）、およびアグリン（ＡＧ）の１種または複数を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒトＰＳＣ由来脊髄運動ニューロンを、ヒトＰＳＣを有効量の少なくとも１つのＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）阻害剤、少なくとも１つの腹側化因子、および少なくとも１つの尾方化因子と接触させることによって分化させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤が、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項５に記載に記載の組成物。
【請求項７】
ＢＭＰシグナル伝達の前記阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項５に記載に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの腹側化因子が、ヘッジホッグ経路の活性化剤を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記ヘッジホッグ経路の前記活性化剤が、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、パーモルファミン、およびその組合せからなる群から選択される、請求項８に記載に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの尾方化因子が、レチノイン酸（ＲＡ）、ウィングレス（Ｗｎｔ）活性化因子、およびその組合せからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記運動ニューロンが光感受性タンパク質を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記光感受性タンパク質は光ゲートイオンチャネルを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記光ゲートイオンチャネルが、ロドプシン、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、アーキロドプシン、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記チャネルロドプシンはチャネルロドプシン−２である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、ＡＬＳ、重症筋無力症、または悪液質と診断されたか、またはＡＬＳ、重症筋無力症、または悪液質を有するリスクのある被験体から単離された細胞に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、重症筋無力症患者由来の免疫グロブリンの存在下で共培養され、該免疫グロブリンは該患者の前記神経筋接合部のタンパク質に対する自己抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、悪液質と診断されたか、または悪液質を有するリスクのある被験体由来の血液、血清、および／または血漿の存在下で共培養される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、タンパク質分解因子および／または炎症性サイトカインの存在下で共培養される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマおよびインターロイキン６からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップと、該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップとを含み、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を増加させる候補化合物が該アゴニストとして選択される方法。
【請求項２１】
神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下で、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、
（ｂ）該候補化合物の非存在下で、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の活性を比較するステップと、
（ｄ）（ａ）の活性のレベルが（ｂ）の活性のレベルより高い場合に、該候補化合物を該アゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップと、該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップとを含み、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を低下させる候補化合物が該アンタゴニストとして選択される方法。
【請求項２３】
神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下で、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、
（ｂ）該候補化合物の非存在下で、請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の活性を比較するステップと、
（ｄ）（ａ）の活性のレベルが（ｂ）の活性のレベルより低い場合に、該候補化合物をアンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性が、前記運動ニューロンおよび／または筋肉において検出可能な活動電位の振幅、該運動ニューロンおよび／または筋肉において検出可能な活動電位の周波数、該運動ニューロンおよび／または筋肉において検出可能な活動電位の期間、該運動ニューロンによって放出される神経伝達物質のレベル、該運動ニューロンと該筋肉との間のシナプスの神経伝達物質のレベル、カルシウム電流の振幅、カルシウム電流の周波数、カルシウム電流の期間、筋肉運動、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記運動ニューロンが光ゲートイオンチャネルを発現し、該運動ニューロンが、該運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに十分な光の波長に該運動ニューロンを曝露することによって刺激される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記運動ニューロンが、該運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに有効な量で、電流を該運動ニューロンに注入すること、および／または該運動ニューロンの膜電位を脱分極させることによって刺激される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部を含むキット。
【請求項２８】
ＰＳＣ由来運動ニューロンと骨格筋、またはそれらの共培養物を含むキット。
【請求項２９】
神経筋接合部活性をモジュレートする遺伝子を同定する方法であって、神経筋接合部の運動ニューロンおよび／または筋肉の遺伝子の発現レベルを上昇させるまたは低下させるステップと、該神経筋接合部の活性を決定するステップとを含み、遺伝子の発現レベルの上昇または低下と相関する神経筋接合部活性の増加または低下が、該遺伝子が神経筋接合部活性のモジュレーターであることを示す方法。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部を調製する方法であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を脊髄運動ニューロンに分化させるステップと、該ＰＳＣ由来脊髄運動ニューロンを骨格筋と共培養するステップとを含む方法。
【請求項３１】
前記ＰＳＣを、該ＰＳＣを有効量の少なくとも１つのＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）阻害剤、少なくとも１つの腹側化因子、および少なくとも１つの尾方化因子と接触させることによって脊髄運動ニューロンへと分化させ、該分化した脊髄運動ニューロンが、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子９（ＨＢ９）、神経フィラメントマーカーＳＭＩ３２、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ホメオボックス転写因子ＮＫＸ６．１、オリゴデンドロサイト転写因子２（ＯＬＩＧ２）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）、およびアグリン（ＡＧ）の１種または複数を発現する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月７日に出願された米国仮出願第６２／２３８，５３１号の優先権を主張し、その内容全体が組み込まれる。
【０００２】
補助金情報
本発明は、米国国立衛生研究所および米国国立神経疾患・卒中研究所によって授与された補助金番号ＮＳ０５２６７１のもとの政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
１．緒言
本発明は、ヒト神経筋接合部のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用する、神経筋活性および／または筋活性のモジュレーターを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
神経筋疾患は、運動ニューロンもしくは筋肉細胞の損失、運動ニューロンもしくは筋肉細胞の機能の低減、または中枢神経系（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系（ＰＮＳ）の運動経路における変性変化に起因する運動ニューロンおよび／または筋の機能の障害をもたらす疾患である。このような疾患は、運動ニューロン以外のニューロンの破壊によって引き起こされるアルツハイマー病などの他の神経変性疾患とは異なる。典型的には、神経筋疾患は、発生における、または進行性の変性障害である。症状として、嚥下困難、四肢の脱力、不明瞭発語、歩行障害、顔面脱力および筋痙攣が挙げられうる。呼吸は、死に至ることの多いこれらの疾患の後期に影響を受ける場合がある。ほとんどの神経筋疾患の原因は知られていないが、環境的、毒性、ウイルス性または遺伝性要因のすべてが疑わしい。
【０００５】
脊髄運動ニューロンと骨格筋との間の接続は、随意運動を制御するヒト錐体路運動系の重要な最終経路である（Barkerら、１９８５年）。脊髄運動ニューロンと骨格筋との間の接続は、多くの外傷性変性疾患および炎症性疾患による著しい影響を受け、これらの疾患は、古典的には、主に、神経筋接合部のニューロン側（KuwabaraおよびYuki、２０１３年；Sendtner、２０１４年；Silvaら、２０１４年；Titulaerら、２０１１年）、または筋肉側（MercuriおよびMuntoni、２０１３年；Plompら、２０１５年）のいずれかに影響を及ぼすと考えられる。筋肉の除神経および再神経支配は、筋肉の生理機能を劇的に変化させることが明らかである（Cisternaら、２０１４年；DaubeおよびRubin、２００９年）。反対に、筋肉に依存する栄養シグナル、細胞接着シグナル、および軸索ガイダンスシグナルが神経筋接合部の形成および維持において本質的な役割を果たすことについての証拠が増加している。身体運動などの生理学的活動または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および他の神経筋疾患などの病態は、神経筋接合部の強度および機能に大いに影響を及ぼす（Moloneyら、２０１４年）。動物モデルと同様に、神経筋の発達および疾患を研究するためのヒト系は、脊髄運動ニューロンと骨格筋を含む神経筋接合部の主要構成成分を含み、機能的試験および操作を受けることができるはずである。
【０００６】
再生医療および疾患モデリングにおいて多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来ニューロンを適用することにより、理想的には、複雑なヒトの機能的ネットワークまたは組織にそれらのニューロンを統合することが必要となる。いくつかのＣＮＳ細胞型では、ヒト器官の小型三次元モデルバージョンを作製するために多能性細胞が使用される、より統合的な組織工学手法の開発によってこの必要性に対処してきた（LancasterおよびKnoblich、２０１４年）。その上、ニューロンの最も重要な特性の１つ、すなわち、機能的シナプスを形成し、適当な下流標的に情報を伝達するそれらの能力は、大部分、未だにヒトオルガノイドおよび他のＰＳＣベースのモデル系において調べられていない。
【０００７】
ヒトＰＳＣからの脊髄運動ニューロンの作製は進歩してきたが（Amorosoら、２０１３年；Calderら、２０１５年；Chanら、２００７年；Davis-Dusenberyら、２０１４年；Mauryら、２０１５年；Pataniら、２０１１年）、ヒト骨格筋に機能的に接続し、ヒト骨格筋機能を制御するそれらの能力は評価されていない。したがって、ニューロンの接続性、およびこのような接続性に関して化合物をモジュレートする効果を評価するために使用することができる多能性幹細胞から調製された神経筋接合部のｉｎ  ｖｉｔｒｏヒトモデルに対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、ヒト運動ニューロンおよびヒト筋肉細胞（例えば、前記運動ニューロンおよび任意選択で前記筋肉細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の産物である）を培養することによって調製された培養ヒト神経筋接合部（ＮＭＪ）に関する。
【０００９】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、ヒト運動ニューロンをヒト筋肉細胞（例えば、ミオサイト）または筋肉組織と共培養することによって調製されるヒト神経筋接合部（ＮＭＪ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに関する。
【００１０】
ある特定の非限定的実施形態では、ヒト運動ニューロンはヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来ニューロンである。ある特定の非限定的実施形態では、ヒト筋肉細胞は、ヒト筋芽細胞由来骨格筋細胞である。ある特定の非限定的実施形態では、ヒト筋肉細胞は、ＰＳＣ由来筋肉細胞である。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ヒトＰＳＣ由来脊髄運動ニューロンは、ヒトＰＳＣを有効量の少なくとも１つのＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）阻害剤、少なくとも１つの腹側化因子（ventralizing factor）、および少なくとも１つの尾方化因子（caudalizingfactor）を接触させることによって分化させる。
【００１２】
ある特定の非限定的実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤、またはそれらの組合せである。
【００１３】
ある特定の非限定的実施形態では、少なくとも１つの腹側化因子は、ヘッジホッグ経路、例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）の活性化剤、パルモルファミン、またはそれらの組合せを含む。
【００１４】
ある特定の非限定的実施形態では、少なくとも１つの尾方化因子は、レチノイン酸（ＲＡ）、ウィングレス（Ｗｎｔ）活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１５】
ある特定の非限定的実施形態では、ヒト筋肉細胞は、被験体から得られる。ある特定の非限定的実施形態では、筋肉細胞は、筋肉細胞前駆体、例えば、筋芽細胞に脱分化させ、ＰＳＣ由来運動ニューロンと共に培養される。
【００１６】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪモデルは、ヒト運動ニューロンを被験体から得られたヒト筋肉組織と共培養することによって調製される。
【００１７】
非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの運動ニューロンは、光遺伝学的（optogenetic）制御下にあり、運動ニューロンと筋肉細胞または組織との共培養は、筋肉運動を誘導する光刺激で活性化されうる。
【００１８】
ある特定の非限定的実施形態では、ＰＳＣ由来運動ニューロンおよび／または筋肉細胞もしくは組織は、神経筋疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症および／または悪液質を有する被験体から得られたＰＳＣから調製される。
【００１９】
本発明は、ヒトＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用を介してＮＭＪ活性をモジュレートする化合物を同定するための方法にも関する。ある特定の非限定的実施形態では、候補化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの使用を介するＮＭＪアゴニストとして同定することができ、有効量の候補化合物へのＮＭＪの曝露はＮＭＪ活性を増加させる。
【００２０】
ある特定の非限定的実施形態では、候補化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの使用を介するＮＭＪアンタゴニストとして同定することができ、有効濃度の候補化合物へのＮＭＪの曝露はＮＭＪ活性を低下させる。
【００２１】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイによって、ＮＭＪ活性化の尺度（measurement）として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでの筋肉収縮の振幅および／または周波数および／または期間が測定され、筋肉収縮の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、筋肉収縮の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００２２】
ある特定の非限定的実施形態では、アッセイによって、ＮＭＪの活動電位が測定される。ある特定の実施形態では、活動電位は、運動ニューロンにおいて測定される。ある特定の実施形態では、活動電位は、筋肉において測定される。非限定的な一実施形態では、活動電位の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、活動電位の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００２３】
ある特定の非限定的実施形態では、アッセイによって、ＮＭＪの運動ニューロンによって放出されたか、または運動ニューロンと筋肉組織との間のシナプスに存在する神経伝達物質の濃度またはレベルが測定され、神経伝達物質の濃度またはレベルの上昇はＮＭＪ活性の増加を示し、神経伝達物質の濃度またはレベルの低下はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００２４】
ある特定の非限定的実施形態では、アッセイによって、ＮＭＪモデルにおける筋肉および／または運動ニューロンのカルシウム電流が測定され、カルシウム電流の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、カルシウム電流の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００２５】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、（ａ）候補化合物の存在下で、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、（ｂ）候補化合物の非存在下で、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の活性を比較するステップと、（ｄ）（ａ）の活性レベルが（ｂ）の活性レベルより高い場合にアゴニストとして候補化合物を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００２６】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、（ａ）候補化合物の存在下で、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、（ｂ）候補化合物の非存在下で、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部の活性を決定するステップと、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の活性を比較するステップと、（ｄ）（ａ）の活性レベルが（ｂ）の活性レベルより低い場合にアンタゴニストとして候補化合物を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、ヒトＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用を介して、ＮＭＪ活性をモジュレートする遺伝子を同定するための方法にも関する。ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下した場合にアッセイすることができる。ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが上昇した場合にアッセイすることができる。ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で通常発現しない１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが運動ニューロンまたは筋肉で発現された場合にアッセイすることができる。遺伝子の発現レベルの上昇または低下がＮＭＪ活性をモジュレートする場合、このような遺伝子はＮＭＪをモジュレートする遺伝子として選択されうる。
【００２８】
本発明は、ＰＳＣもしくはＰＳＣ由来運動ニューロンおよび骨格筋、またはそれらの共培養物を含むキットも提供する。ある特定の実施形態では、ＰＳＣまたはＰＳＣ由来ニューロンはヒトのものである。ある特定の実施形態では、骨格筋はヒト筋芽細胞由来骨格筋である。ある特定の実施形態では、骨格筋はＰＳＣ由来筋肉である。ある特定の実施形態では、骨格筋は被験体から得られる。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】図１Ａ〜Ｒは、ｈＰＳＣ由来脊髄運動ニューロン（ＭＮ）の光遺伝学的制御を示す。（Ａ）ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ導入遺伝子を保有するクローンｈＥＳＣ株のＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＤＡＰＩ染色を示す。（Ｂ）２０日目（Ｄ２０）に、明視野（ＢＦ）下で調査した場合に、ＭＮクラスターがＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現することを示す。（Ｃ）沈降によるニューロンクラスターの精製後に、ＭＮクラスターが富化されることを示す。（Ｄ）精製後に、ＱＲＴ−ＰＣＲで測定すると、脊髄運動ニューロン（ｓＭＮ）マーカーが上方調節されていることを示す。（Ｅ）精製後に、ＱＲＴ−ＰＣＲで測定すると、非ニューロンマーカーが下方調節されていることを示す。（Ｆ）培養３０日目に、脊髄ＭＮがＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現すること、ならびにＨＢ９およびＩＳＬ１染色を示す。（Ｇ）培養３０日目に、脊髄ＭＮのＣｈＡＴおよびＳＭＩ３２の共染色を示す。（Ｈ）代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によるＭＮの分化によってＣｈＲ２−ＥＹＦＰ＋ＭＮを発現するＭＮが産生されたことを示す。（Ｉ）培養３０日目に、脊髄ＭＮ（代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によって分化した）がＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ＨＢ９およびＩＳＬ１を発現することを示す。（Ｊ）培養６０日目に、脊髄ＭＮ（代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によって分化した）がＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ＣｈＡＴおよびＳＭＩ３２を発現することを示す。（Ｋ）電気生理学のために選択された明視野およびＥＹＦＰチャネルにおけるニューロンを示す。（Ｌ）培養６０日以降（Ｄ６０＋）に、脱分極電流注入に応じて、ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を発火させることを示す。（Ｍ、Ｎ）光遺伝学的刺激に応じて、成熟ＣｈＲ２＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を正確に発火させることを示す。（Ｏ）ｈＳｙｎ−ＥＹＦＰ導入遺伝子を保有するクローンｈＥＳＣ株のＯＣＴ４およびＤＡＰＩ染色を示す。（Ｐ）培養３０日目に、精製したｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮがＥＹＦＰ、ＨＢ９およびＩＳＬ１を発現することを示す。（Ｑ）電流注入に応じて、成熟ＥＹＦＰ＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を発火させることを示す。（Ｒ）成熟ＥＹＦＰ＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが光刺激に応答しないことを示す。スケールバーは１００μＭである。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１−２】図１Ａ〜Ｒは、ｈＰＳＣ由来脊髄運動ニューロン（ＭＮ）の光遺伝学的制御を示す。（Ａ）ｈＳｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ導入遺伝子を保有するクローンｈＥＳＣ株のＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＤＡＰＩ染色を示す。（Ｂ）２０日目（Ｄ２０）に、明視野（ＢＦ）下で調査した場合に、ＭＮクラスターがＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現することを示す。（Ｃ）沈降によるニューロンクラスターの精製後に、ＭＮクラスターが富化されることを示す。（Ｄ）精製後に、ＱＲＴ−ＰＣＲで測定すると、脊髄運動ニューロン（ｓＭＮ）マーカーが上方調節されていることを示す。（Ｅ）精製後に、ＱＲＴ−ＰＣＲで測定すると、非ニューロンマーカーが下方調節されていることを示す。（Ｆ）培養３０日目に、脊髄ＭＮがＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現すること、ならびにＨＢ９およびＩＳＬ１染色を示す。（Ｇ）培養３０日目に、脊髄ＭＮのＣｈＡＴおよびＳＭＩ３２の共染色を示す。（Ｈ）代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によるＭＮの分化によってＣｈＲ２−ＥＹＦＰ＋ＭＮを発現するＭＮが産生されたことを示す。（Ｉ）培養３０日目に、脊髄ＭＮ（代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によって分化した）がＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ＨＢ９およびＩＳＬ１を発現することを示す。（Ｊ）培養６０日目に、脊髄ＭＮ（代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）によって分化した）がＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ＣｈＡＴおよびＳＭＩ３２を発現することを示す。（Ｋ）電気生理学のために選択された明視野およびＥＹＦＰチャネルにおけるニューロンを示す。（Ｌ）培養６０日以降（Ｄ６０＋）に、脱分極電流注入に応じて、ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を発火させることを示す。（Ｍ、Ｎ）光遺伝学的刺激に応じて、成熟ＣｈＲ２＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を正確に発火させることを示す。（Ｏ）ｈＳｙｎ−ＥＹＦＰ導入遺伝子を保有するクローンｈＥＳＣ株のＯＣＴ４およびＤＡＰＩ染色を示す。（Ｐ）培養３０日目に、精製したｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮがＥＹＦＰ、ＨＢ９およびＩＳＬ１を発現することを示す。（Ｑ）電流注入に応じて、成熟ＥＹＦＰ＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが活動電位を発火させることを示す。（Ｒ）成熟ＥＹＦＰ＋ｈＥＳＣ由来ＭＮが光刺激に応答しないことを示す。スケールバーは１００μＭである。エラーバーはＳＥＭを表す。
【００３０】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、機能的ヒト筋線維の作製を示す。（Ａ）成人ドナー（ｈＭＡ、上のパネル）と胎児ドナー（ｈＭＦ、下のパネル）に由来するヒト筋芽細胞。（Ｂ）分化１７日目のヒト筋線維。（Ｃ）３５日目のヒト筋線維のカルシウムイメージング。アセチルコリン（ＡＣｈ）はロバストなカルシウムトランジェントを誘導する。各トレースは別個の線維を近似する。スケールバーは１００μＭである。
【００３１】
【図３−１】図３Ａ〜Ｒは、神経筋共培養物の特徴付けを示す。（Ａ、Ｅ）開始の１週間（１Ｗ）後の、ＥＹＦＰおよび明視野チャネルでの、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｂ、Ｆ）開始の６〜８週間後の、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｃ、Ｇ）５０秒間（上のパネル）および５００秒間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた共培養物の筋攣縮の定量。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｄ、Ｈ）ベクロニウム（２μＭ）は、成人筋線維（Ｄ）および胎児筋線維（Ｈ）の光に惹起される収縮性を遮断する。（Ｉ）（Ｊ）に示されるカルシウムイメージング実験のＥＹＦＰおよび明視野の写真。（Ｊ）２分間（上のパネル）および４０分間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた筋線維のカルシウムトランジェントのレシオメトリック分析。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｋ）単一の筋線維からの鋭い電極記録。０．２および２Ｈｚでの光遺伝学的刺激に応じたベクロニウム感受性の活動電位の発生。（Ｌ）神経筋接続性の長期安定性。個々の領域の運動を５、１５および２５日目に定量し、０日目の運動に対して正規化した。（Ｍ）共培養物は、ビメンチン＋およびＧＦＡＰ＋間質の緻密層を含有する。（Ｎ）共培養物はＥＹＦＰ＋軸索およびデスミン＋筋線維の緻密ネットワークを示す。（Ｏ）収縮領域におけるＥＹＦＰ＋ニューロン突起と密接に接触する多核横紋筋線維。（Ｐ）ＥＹＦＰ＋ニューロン突起およびシナプトフィジン標識と密接に関連するクラスター化アセチルコリン受容体（ＢＴＸ）の高出力共焦点イメージング。（Ｑ、Ｒ）収縮領域（左）と非収縮領域（右）はＡＣｈＲクラスタリングについて比較した。ＢＴＸ＋ドットの定量によって収縮領域／神経支配領域における有意な増加が明らかになった。＊ｐ＜０．０５。Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨにおいて、１ピクセルは０．５μｍに対応する。スケールバーは、Ｉ、Ｋの５０μｍ、およびＰ、Ｑの２５μｍを除いて、１００μｍである。
【図３−２】図３Ａ〜Ｒは、神経筋共培養物の特徴付けを示す。（Ａ、Ｅ）開始の１週間（１Ｗ）後の、ＥＹＦＰおよび明視野チャネルでの、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｂ、Ｆ）開始の６〜８週間後の、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｃ、Ｇ）５０秒間（上のパネル）および５００秒間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた共培養物の筋攣縮の定量。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｄ、Ｈ）ベクロニウム（２μＭ）は、成人筋線維（Ｄ）および胎児筋線維（Ｈ）の光に惹起される収縮性を遮断する。（Ｉ）（Ｊ）に示されるカルシウムイメージング実験のＥＹＦＰおよび明視野の写真。（Ｊ）２分間（上のパネル）および４０分間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた筋線維のカルシウムトランジェントのレシオメトリック分析。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｋ）単一の筋線維からの鋭い電極記録。０．２および２Ｈｚでの光遺伝学的刺激に応じたベクロニウム感受性の活動電位の発生。（Ｌ）神経筋接続性の長期安定性。個々の領域の運動を５、１５および２５日目に定量し、０日目の運動に対して正規化した。（Ｍ）共培養物は、ビメンチン＋およびＧＦＡＰ＋間質の緻密層を含有する。（Ｎ）共培養物はＥＹＦＰ＋軸索およびデスミン＋筋線維の緻密ネットワークを示す。（Ｏ）収縮領域におけるＥＹＦＰ＋ニューロン突起と密接に接触する多核横紋筋線維。（Ｐ）ＥＹＦＰ＋ニューロン突起およびシナプトフィジン標識と密接に関連するクラスター化アセチルコリン受容体（ＢＴＸ）の高出力共焦点イメージング。（Ｑ、Ｒ）収縮領域（左）と非収縮領域（右）はＡＣｈＲクラスタリングについて比較した。ＢＴＸ＋ドットの定量によって収縮領域／神経支配領域における有意な増加が明らかになった。＊ｐ＜０．０５。Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨにおいて、１ピクセルは０．５μｍに対応する。スケールバーは、Ｉ、Ｋの５０μｍ、およびＰ、Ｑの２５μｍを除いて、１００μｍである。
【図３−３】図３Ａ〜Ｒは、神経筋共培養物の特徴付けを示す。（Ａ、Ｅ）開始の１週間（１Ｗ）後の、ＥＹＦＰおよび明視野チャネルでの、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｂ、Ｆ）開始の６〜８週間後の、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮと成人由来筋線維（ｈＭＡ）および胎児由来筋線維（ｈＭＦ）との共培養物。（Ｃ、Ｇ）５０秒間（上のパネル）および５００秒間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた共培養物の筋攣縮の定量。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｄ、Ｈ）ベクロニウム（２μＭ）は、成人筋線維（Ｄ）および胎児筋線維（Ｈ）の光に惹起される収縮性を遮断する。（Ｉ）（Ｊ）に示されるカルシウムイメージング実験のＥＹＦＰおよび明視野の写真。（Ｊ）２分間（上のパネル）および４０分間（下のパネル）の光遺伝学的刺激に応じた筋線維のカルシウムトランジェントのレシオメトリック分析。各トレースは別個の線維を近似する。（Ｋ）単一の筋線維からの鋭い電極記録。０．２および２Ｈｚでの光遺伝学的刺激に応じたベクロニウム感受性の活動電位の発生。（Ｌ）神経筋接続性の長期安定性。個々の領域の運動を５、１５および２５日目に定量し、０日目の運動に対して正規化した。（Ｍ）共培養物は、ビメンチン＋およびＧＦＡＰ＋間質の緻密層を含有する。（Ｎ）共培養物はＥＹＦＰ＋軸索およびデスミン＋筋線維の緻密ネットワークを示す。（Ｏ）収縮領域におけるＥＹＦＰ＋ニューロン突起と密接に接触する多核横紋筋線維。（Ｐ）ＥＹＦＰ＋ニューロン突起およびシナプトフィジン標識と密接に関連するクラスター化アセチルコリン受容体（ＢＴＸ）の高出力共焦点イメージング。（Ｑ、Ｒ）収縮領域（左）と非収縮領域（右）はＡＣｈＲクラスタリングについて比較した。ＢＴＸ＋ドットの定量によって収縮領域／神経支配領域における有意な増加が明らかになった。＊ｐ＜０．０５。Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨにおいて、１ピクセルは０．５μｍに対応する。スケールバーは、Ｉ、Ｋの５０μｍ、およびＰ、Ｑの２５μｍを除いて、１００μｍである。
【００３２】
【図４−１】図４Ａ〜Ｑは、重症筋無力症の疾患モデリングを示す。（Ａ、Ｄ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧ（患者Ｈ）と補体（Ａ）または対照のＩｇＧと補体（Ｄ）の添加前の脊髄ＭＮと成人筋線維（ｈＭＡ）との成熟した、収縮性の共培養物のＫｉｎｅｔｏｇｒａｍ。（Ｂ、Ｅ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧと補体（Ｂ）または対照のＩｇＧと補体（Ｅ）の添加後の３日目におけるＡおよびＤと同じ共培養物。（Ｃ、Ｆ）３日目のピリドスチグミン（ＰＹＲ、１０μＭ）添加後のＢおよびＥと同じ共培養物。（Ｇ）０日目の％としての、３日目にＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２）と補体または対照のＩｇＧと補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｈ）３日目のピリドスチグミン添加の前および後のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｉ）３日目のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体のウォッシュアウト後の４日目および６日目の運動の回復。（Ｊ）すべて補体なしで、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）、対照のＩｇＧで処理した培養物および未処理培養物の運動の定量。（Ｋ、Ｌ）カルシウムイメージングのために選択された領域における、４８時間での、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）および補体または対照のＩｇＧおよび補体で処理した成人の筋肉（ｈＭＡ）との機能的ＭＮの共培養物の明視野およびＥＹＦＰの画像。（Ｍ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じたカルシウム増加の定量。（Ｎ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じた反応性線維のパーセンテージ。（Ｏ、Ｐ、Ｑ）ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）または対照のＩｇＧと補体の添加２４時間後の、ＥＹＦＰとＢＴＸを共標識した神経筋接合部へのヒト補体Ｃ３ｃの沈着に対する免疫細胞化学（Ｏ、Ｐ）および定量（Ｑ）。点線の小さいボックス内の領域は、実線のボックスで拡大されている。スケールバーは、Ｋ、Ｌでは１００μｍ、Ｏ、Ｐでは１０μｍを示す。Ａ〜Ｆでは、１ピクセルは０．５μｍに対応する。ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべてのエラーバーはＳＥＭを表す。
【図４−２】図４Ａ〜Ｑは、重症筋無力症の疾患モデリングを示す。（Ａ、Ｄ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧ（患者Ｈ）と補体（Ａ）または対照のＩｇＧと補体（Ｄ）の添加前の脊髄ＭＮと成人筋線維（ｈＭＡ）との成熟した、収縮性の共培養物のＫｉｎｅｔｏｇｒａｍ。（Ｂ、Ｅ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧと補体（Ｂ）または対照のＩｇＧと補体（Ｅ）の添加後の３日目におけるＡおよびＤと同じ共培養物。（Ｃ、Ｆ）３日目のピリドスチグミン（ＰＹＲ、１０μＭ）添加後のＢおよびＥと同じ共培養物。（Ｇ）０日目の％としての、３日目にＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２）と補体または対照のＩｇＧと補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｈ）３日目のピリドスチグミン添加の前および後のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｉ）３日目のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体のウォッシュアウト後の４日目および６日目の運動の回復。（Ｊ）すべて補体なしで、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）、対照のＩｇＧで処理した培養物および未処理培養物の運動の定量。（Ｋ、Ｌ）カルシウムイメージングのために選択された領域における、４８時間での、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）および補体または対照のＩｇＧおよび補体で処理した成人の筋肉（ｈＭＡ）との機能的ＭＮの共培養物の明視野およびＥＹＦＰの画像。（Ｍ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じたカルシウム増加の定量。（Ｎ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じた反応性線維のパーセンテージ。（Ｏ、Ｐ、Ｑ）ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）または対照のＩｇＧと補体の添加２４時間後の、ＥＹＦＰとＢＴＸを共標識した神経筋接合部へのヒト補体Ｃ３ｃの沈着に対する免疫細胞化学（Ｏ、Ｐ）および定量（Ｑ）。点線の小さいボックス内の領域は、実線のボックスで拡大されている。スケールバーは、Ｋ、Ｌでは１００μｍ、Ｏ、Ｐでは１０μｍを示す。Ａ〜Ｆでは、１ピクセルは０．５μｍに対応する。ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべてのエラーバーはＳＥＭを表す。
【図４−３】図４Ａ〜Ｑは、重症筋無力症の疾患モデリングを示す。（Ａ、Ｄ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧ（患者Ｈ）と補体（Ａ）または対照のＩｇＧと補体（Ｄ）の添加前の脊髄ＭＮと成人筋線維（ｈＭＡ）との成熟した、収縮性の共培養物のＫｉｎｅｔｏｇｒａｍ。（Ｂ、Ｅ）重症筋無力症（ＭＧ）のＩｇＧと補体（Ｂ）または対照のＩｇＧと補体（Ｅ）の添加後の３日目におけるＡおよびＤと同じ共培養物。（Ｃ、Ｆ）３日目のピリドスチグミン（ＰＹＲ、１０μＭ）添加後のＢおよびＥと同じ共培養物。（Ｇ）０日目の％としての、３日目にＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２）と補体または対照のＩｇＧと補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｈ）３日目のピリドスチグミン添加の前および後のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体とで処理した培養物の運動の定量。（Ｉ）３日目のＭＧのＩｇＧ（患者番号１および２の組合せ）と補体のウォッシュアウト後の４日目および６日目の運動の回復。（Ｊ）すべて補体なしで、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）、対照のＩｇＧで処理した培養物および未処理培養物の運動の定量。（Ｋ、Ｌ）カルシウムイメージングのために選択された領域における、４８時間での、ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）および補体または対照のＩｇＧおよび補体で処理した成人の筋肉（ｈＭＡ）との機能的ＭＮの共培養物の明視野およびＥＹＦＰの画像。（Ｍ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じたカルシウム増加の定量。（Ｎ）ＭＧおよび対照培養物ならびにＰＹＲ添加後の光遺伝学的刺激に応じた反応性線維のパーセンテージ。（Ｏ、Ｐ、Ｑ）ＭＧのＩｇＧ（患者番号１）または対照のＩｇＧと補体の添加２４時間後の、ＥＹＦＰとＢＴＸを共標識した神経筋接合部へのヒト補体Ｃ３ｃの沈着に対する免疫細胞化学（Ｏ、Ｐ）および定量（Ｑ）。点線の小さいボックス内の領域は、実線のボックスで拡大されている。スケールバーは、Ｋ、Ｌでは１００μｍ、Ｏ、Ｐでは１０μｍを示す。Ａ〜Ｆでは、１ピクセルは０．５μｍに対応する。ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべてのエラーバーはＳＥＭを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ヒト神経筋接合部（ＮＭＪ）が、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来脊髄運動ニューロンをヒト筋芽細胞由来骨格筋、またはＰＳＣ由来筋肉細胞と共培養することによって調製される、ＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの作製に関する。ある特定の実施形態では、ニューロンは、光遺伝学的制御下にあり、ニューロンの活性化は、光を用いる刺激によって達成されうる。本明細書に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ＮＭＪ活性のモジュレーター、およびそれによって運動ニューロンおよび／または筋活性をモジュレートする化合物を同定するために使用されうる。ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、神経筋疾患を有する被験体由来のＰＳＣから調製され、その結果、疾患状態のＮＭＪの活性をモジュレートすることができる化合物を同定することができ、同定された化合物は、神経筋疾患を処置する際に治療的に有効でありうる。
【００３４】
限定としてではなく、開示の明確性を目的として、本発明の詳細な記載は以下の小項目に分割される：
（ｉ）培養した神経筋接合部（ＮＭＪ）、および
（ｉｉ）ＮＭＪモジュレーターを同定する方法。
【００３５】
この明細書において使用される用語は、一般に、この発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈で、当技術分野における通常の意味を有する。ある特定の用語については、本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の作製方法および使用方法を説明する際に、専門家にさらなるガイダンスを与えるために、以下で、または本明細書の他の場所で論じられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、特許請求の範囲および／または明細書の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用する場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、および「１つまたは１つより多い（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも一致する。またさらに、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は互換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドの用語であることを認識している。
【００３７】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、部分的に特定の値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に応じて、当業者によって決定されるその値に対する許容される誤差範囲内を意味する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当技術分野の慣行によって、３または３超の標準偏差内を意味する場合がある。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスについて、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味しうる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「モジュレートする」または「改変する」は、運動ニューロンがシナプスを形成する際の運動ニューロンおよび／または筋肉の特定の活性の量、質または効果の増加または低下を意味する。「モジュレーター」は、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して同定される任意の阻害性または活性化化合物、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターおよびそれらのホモログ（断片、変異体および模倣体を含む）を指す。
【００３９】
「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、本明細書で使用される場合、運動ニューロンがシナプスを形成する際に、運動ニューロンおよび／または筋肉の生体活性を低減する、低下させる、遮断する、妨げる、活性化を遅延させる、不活性化する、感度を低下させるまたは下方調節する、モジュレートする化合物を指す。用語「アンタゴニスト」は、完全な、部分的、およびニュートラルなアンタゴニストならびにインバースアゴニストを含む。
【００４０】
「誘導剤」、「活性化剤」または「アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、運動ニューロンがシナプスを形成する際に、運動ニューロンおよび／または筋肉の生体活性を増加させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、活性化を増強する、感度を上げるまたは上方調節する、モジュレートする化合物を指す。用語「アゴニスト」は、完全および部分的アゴニストを含む。
【００４１】
本明細書における「個体」または「被験体」は、脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定例として、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。
【００４２】
物質の「有効量」は、その用語が本明細書で使用される場合、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、例えば、「有効量」は、物質が適用される文脈に応じて変わる。ＮＭＪの活性をモジュレートするための組成物を投与する文脈では、組成物の有効量は、ＮＭＪの活性を増加させるか低下させるのに十分な量である。例えば、増加または低下は、ＮＭＪ活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の増加または低下でありうる。有効量は、１回または複数回の投与で投与されうる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、かつ当技術分野において十分に理解されるように、「筋肉」または「筋組織」は筋細胞を含む組織であり、筋細胞は筋フィラメントタンパク質を含む筋細胞線維（すなわち、筋線維）として組織化され、筋組織を形成する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織、または器官の通常の機能に損傷を与えるかまたはそれらを妨げる任意の状態または障害を指す。
【００４５】
５．１  培養神経筋接合部（ＮＭＪ）
本発明は、ヒト運動ニューロンおよびヒト筋肉細胞（例えば、前記運動ニューロンおよび任意選択で前記筋肉細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の産物である）を培養することによって調製された培養ヒト神経筋接合部（ＮＭＪ）に関する。
【００４６】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、ＮＭＪの活性をモジュレートする能力についての推定化合物を評価するために使用されてもよいヒト神経筋接合部（ＮＭＪ）系のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを提供する。前記モデル系を使用して、筋活性、例えば、収縮性に関して本発明の化合物の効果（複数可）を試験してもよい。
【００４７】
ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来脊髄運動ニューロンをヒト筋肉細胞（例えば、筋細胞）もしくはＰＳＣ由来筋肉細胞、または筋肉組織、例えば、ヒト筋芽細胞由来骨格筋またはＰＳＣ由来骨格筋と共培養することによって調製される。ある特定の実施形態では、細胞は、非ヒト細胞、例えば、非ヒト哺乳動物由来のＰＳＣおよび筋肉細胞である。
【００４８】
非限定的な一実施形態では、ＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。ある特定の非限定的実施形態では、ＰＳＣは人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）である。ＰＳＣの脊髄運動ニューロンへの分化は、ＰＳＣを少なくとも１種のＳＭＡＤ阻害剤、ある特定の非限定的実施形態では、少なくとも２種のＳＭＡＤ阻害剤（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるChambersら、２００９年に記載されている）、少なくとも１種の腹側化因子、例えば、ヘッジホッグ経路（ＨＨ）の活性化剤（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはパルモルファミンを投与することによる）、ならびに少なくとも１種の尾方側因子、例えば、レチノイン酸（ＲＡ）および／またはウィングレス（Ｗｎｔ）活性化因子（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるCalderら、J Neurosci.２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に記載されている）と接触させることによって達成されうる。
【００４９】
ある特定の非限定的実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤は、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｎｏｄａｌ、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、またはそれらのシグナル経路を受容体および下流のエフェクターを遮断することによって遮断する。ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、番号がＣＡＳ３０１８３６−４１−９、分子式がＣ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、名称が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである分子を指す。例えば、以下の構造を参照のこと：
【化１】
2018531012.tif 000003
【００５０】
ある特定の非限定的実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤はＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含む。ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁に開示されている。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、小分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン、を指し、化学式Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６を有し、以下の式を有する。
【化２】
2018531012.tif 000004
【００５１】
ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９は、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤でもあり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナル、ならびにそれに続くＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を含む複数の生物シグナルの伝達の阻害をもたらす（参照により本明細書に組み込まれるＹｕら、（２００８年）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４巻：１３６３〜１３６９頁；Ｃｕｎｙら（２００８年）Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １８巻：４３８８〜４３９２頁）。
【００５２】
本開示の分化方法は、ヒト幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させることをさらに含む。本明細書で使用される場合、リガンドに関する用語「ＷＮＴ」または「ウィングレス」はＷＮＴ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーにおける受容体など、ＷＮＴ受容体と相互作用することができる分泌タンパク質（すなわち、ヒトにおけるＩｎｔｌ（インテグレーション１））の群を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関する用語「ＷＮＴ」または「ウィングレス」は、β−カテニンで媒介されるかまたはβ−カテニンを有さないＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体など、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体から構成されるシグナル経路を指す。本明細書に記載されている目的として、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニン、例えばＷＮＴ／−カテニンによる媒介を含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に対するＧＳＫ３βを低下させる。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤であってよい。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣａｄｉｇａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００６年；１１９巻：３９５〜４０２頁；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  ２００７年；１９巻：６５９〜６７１頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｂｌｅら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００３年；１１６巻：１１７５〜１１８６頁を参照されたい。
【００５４】
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１１／１４９７６２、ＷＯ１３／０６７３６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣａｌｄｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知）は、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指し、以下の式を有する。
【化３】
2018531012.tif 000005
【００５５】
ＣＨＩＲ９９０２１は、選択性が高く、関連するおよび関連しないキナーゼのパネルに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭおよびげっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。
【００５６】
本開示の分化方法は、ヒト幹細胞をヘッジホッグ経路（ＨＨ）の１つまたは複数の活性化剤と接触させること（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を投与することによって）をさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「ソニックヘッジホッグ」、「ＳＨＨ」、または「Ｓｈｈ」は、ヘッジホッグと称され、別のものはデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）であり、一方、３つ目はインディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）である、哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリーにおける少なくとも３つのタンパク質のうちの１つであるタンパク質を指す。Ｓｈｈは、膜貫通分子であるＰａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣ）およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）と相互作用することによって少なくとも２種の膜貫通タンパク質と相互作用する。Ｓｈｈは、典型的には、ＰＴＣに結合し、次いで、シグナルトランスデューサーとしてＳＭＯの活性化を可能にする。ＳＨＨの非存在下では、ＰＴＣは典型的にはＳＭＯを阻害し、順次、ある特定の遺伝子の転写が起こらないように転写抑制因子を活性化する。Ｓｈｈが存在し、ＰＴＣに結合する場合、ＰＴＣは、ＳＭＯの機能を妨げることはできない。ＳＭＯが阻害されないと、ある特定のタンパク質が核に侵入し、ある特定の遺伝子の活性化を可能にする転写因子として作用することができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２０００年  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化剤は、ＰＴＣまたはＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストなどに結合する分子または化合物を含む、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化する任意の分子または化合物を指す。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定例は、ＷＯ１０／０９６４９６、ＷＯ１３／０６７３６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、およびＫｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に開示されている。このような化合物の例は、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、タンパク質ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ（すなわち、ＳＨＨを活性化するためにＳＨＨ受容体に結合することができる全長マウスソニックヘッジホッグタンパク質の組換えＮ−Ｔ末端断片、例えばＲ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのカタログ番号：４６４−５Ｈ−０２５／ＣＦ）および小分子Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト、例えばパルモルファミンなどである。
【００５７】
ある特定の実施形態では、細胞を少なくとも１種のＳＭＡＤ阻害剤と接触させた１〜１５日後から、腹側化因子および尾方化因子を有効量で細胞と接触させる。非限定的な一実施形態では、細胞を少なくとも１種のＳＭＡＤ阻害剤と接触させた後の１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、または１〜１０日目、およびその間の日数から、腹側化因子および尾方化因子を細胞と接触させる。ある特定の非限定的実施形態では、細胞を少なくとも１種のＳＭＡＤ阻害剤と接触させた後の少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日目に開始して、腹側化因子および尾方化因子を細胞と接触させ、細胞が回収され、精製されるまで細胞と共に培養される。非限定的な一実施形態では、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くの日数の間、腹側化因子および尾方化因子を細胞と接触させる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMauryら、Nat Biotechnol.２０１５年１月；３３巻（１号）：８９〜９６頁（電子出版２０１４年１１月１０日）に記載されている、当技術分野で公知の他の運動ニューロンの分化方法を使用することもできる。
【００５８】
ある特定の非限定的実施形態では、ＰＳＣは、そのそれぞれの内容が参照により全体が組み込まれる米国特許第８，６４２，３３４号；国際公開第ＷＯ／２０１１／１４９７６２号、同第ＷＯ／２０１３／０６７３６２号、同第ＷＯ／２０１４／１７６６０６号、および同第ＷＯ／２０１５／０７７６４８号；ならびに２０１６年６月１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／０３５３１２号に記載されている方法に従って分化させうる。
【００５９】
ある特定の非限定的実施形態では、運動ニューロンは、例えば、そのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBoydenら、２００５年；Zhangら、２０１１年；Brysonら、２０１４年；Cunninghamら、２０１４年；Steinbeckら、２０１５年に記載されているように、運動ニューロンの光遺伝学的制御を可能にする１種または複数のタンパク質を発現する組換え細胞である。例えば、ＮＭＪにおいて、このようなタンパク質の１種または複数を発現する運動ニューロンを光で刺激することによって、運動ニューロンが活性化され（例えば、細胞を脱分極させることによって）、その結果、細胞は筋肉組織を活性化し得、細胞はＮＭＪ上にシナプスを形成する。ある特定の非限定的実施形態では、１種または複数のタンパク質は、光感受性タンパク質、その誘導体、およびその組合せ、例えば、レチニリデンタンパク質（例えば、ロドプシン）、例えばチャネルロドプシン−１またはチャネルロドプシン−２などのチャネルロドプシンなどの光ゲートイオンチャネルを含みうる。光感受性タンパク質の他の例として、これらに限定されないが、ハロロドプシン、アーキロドプシン、バクテリオロドプシン、およびプロテオロドプシンが挙げられる。
【００６０】
ある特定の非限定的実施形態では、光感受性タンパク質は、ニューロン特異的プロモーター、例えば、シナプシンプロモーターに作動可能に連結される。
【００６１】
ある特定の非限定的実施形態では、組換え運動ニューロンは、検出可能マーカー、例えば、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ）などの蛍光タンパク質；β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）；オキシダーゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素；ならびに／または抗原分子をさらに発現しうる。ある特定の実施形態では、検出可能マーカーは、光感受性タンパク質と共に融合タンパク質、例えば、チャネルロドプシン−２−ＥＹＦＰとして発現されうる。
【００６２】
非限定的な一実施形態では、ＰＳＣ由来運動ニューロンは、約１０から１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多くの日数の間、その間の日数、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多くの日数の培養で分化させた後に精製される。ある特定の実施形態では、細胞は、培養物を解離させ（例えば、２０日目に）、ニューロンクラスターを沈降させることによって精製し、一方、上清は非ニューロン細胞を含有する。
【００６３】
ある特定の非限定的実施形態では、ＰＳＣ由来運動ニューロンは、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子９（ＨＢ９）、神経フィラメントマーカーＳＭＩ３２、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ホメオボックス転写因子ＮＫＸ６．１、オリゴデンドロサイト転写因子２（ＯＬＩＧ２）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）および／またはアグリン（ＡＧ）の１種または複数を発現する。
【００６４】
非限定的な一実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＣおよび／または筋芽細胞は、神経筋疾患を有さない被験体に由来する。ある特定の非限定的実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＣおよび／または筋芽細胞は、神経筋疾患、例えば、ＡＬＳ、重症筋無力症、または悪液質を有するか、または神経筋疾患を有するリスクがある被験体から得られる。ある特定の非限定的実施形態では、神経筋疾患は、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症、進行性球麻痺、偽性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、または当技術分野で公知の任意の他の運動ニューロン疾患である。
【００６５】
ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪを使用して重症筋無力症をモデル化する。非限定的な一実施形態では、ＮＭＪの運動ニューロンと筋肉構成成分は、重症筋無力症患者由来の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の存在下で共培養され、ここで、該免疫グロブリンは患者の神経筋接合部のタンパク質（例えば、アセチルコリン受容体、ＡＣｈＲ）に対する自己抗体を含む。ある特定の実施形態では、運動ニューロンと筋肉は、活性補体系構成成分とさらに共培養される。ある特定の非限定的実施形態では、病原抗体のＡＣｈＲへの結合により補体カスケードが活性化され、ＮＭＪの破壊が生じる。ある特定の実施形態では、運動ニューロンと筋肉は、重症筋無力症と診断されたか、または重症筋無力症を有するリスクのある被験体由来の血液、血清、および／または血漿の存在下で共培養される。ある特定の非限定的実施形態では、重症筋無力症のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルを、例えば、ＮＭＪの活性を増加させる化合物を同定するために、本明細書に記載されているように、ＮＭＪ活性をモジュレートする化合物についてスクリーニング方法で使用する。
【００６６】
ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪを使用して悪液質をモデル化する。非限定的な一実施形態では、ＮＭＪの運動ニューロンおよび筋肉構成成分を、がん細胞培養物からの馴化培地（condition medium）の存在下で共培養する。非限定的な一実施形態では、ＮＭＪの運動ニューロンおよび筋肉構成成分を、悪液質であると診断されたか、または悪液質を有するリスクのある被験体由来の血液、血清、および／または血漿の存在下で共培養する。非限定的な一実施形態では、ＮＭＪの運動ニューロンおよび筋肉構成成分を、タンパク質分解因子、および／または炎症性サイトカイン、例えば、これらに限定されないが、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマおよびインターロイキン６の存在下で共培養する。ある特定の非限定的実施形態では、悪液質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルを、例えば、ＮＭＪの活性を増加させる化合物を同定するために、本明細書に記載されているように、ＮＭＪ活性をモジュレートする化合物についてスクリーニング方法で使用する。
【００６７】
ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの筋肉構成成分は、ヒト初代筋芽細胞から調製されるか、またはＰＳＣに由来する。ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの筋肉構成成分は、筋肉細胞前駆体、例えば、筋芽細胞に脱分化させたヒト筋肉細胞から調製され、ＰＳＣ由来運動ニューロンと共に培養される。ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの筋肉構成成分は、ヒト被験体から得られたヒト筋肉組織から調製される。任意の前述の細胞または組織は、例えば、成人（ｈＭＡ）および／または胎児（ｈＭＦ）ドナー被験体由来でありうる。
【００６８】
ある特定の非限定的実施形態では、分化前に、筋肉細胞前駆体に脱分化させるヒト初代筋芽細胞、ＰＳＣ、および／またはヒト筋肉細胞を、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれより高いコンフルエントレベルが達成されるまで培養することができる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、筋肉細胞前駆体に脱分化させるヒト初代筋芽細胞、ＰＳＣ、および／またはヒト筋肉細胞を、約４から５、６、７、８、９、１０、１５、１７、２０、２５、３０、３５もしくは４０日の間、およびその間の値の日数、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれよりも多くの日数の間、多核筋管へ、次いで、筋線維に分化するように誘導する。ある特定の非限定的実施形態では、分化後、筋肉組織は、アセチルコリン（ＡＣｈ）による刺激に対して応答（すなわち、収縮）する。ある特定の実施形態では、分化筋肉組織は、検出可能レベルのＡＣｈ受容体（ＡＣｈＲ）サブユニット、例えば、ＣＨＲＮＧ遺伝子によってコードされた胎児ガンマサブユニットなどを発現する。ある特定の実施形態では、分化筋肉組織は、検出可能レベルの筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、デスミンおよび／またはミオシンを発現する。
【００７０】
非限定的な一実施形態では、筋肉細胞前駆体に脱分化させるヒト初代筋芽細胞、ＰＳＣ、および／またはヒト筋肉細胞を、それらが７０％コンフルエンスに達したら分化するように誘導し、ここで、該細胞は、分化開始後約４から７日以内に多核筋管に分化し、約１０から１７日目までに筋線維を形成し、アセチルコリン（ＡＣｈ、例えば、５０μＭ）による刺激によって筋線維の収縮を起こすことができる。
【００７１】
ある特定の非限定的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルは、ＰＳＣ由来筋肉細胞から調製される。
【００７２】
ある特定の非限定的実施形態では、ＰＳＣ由来運動ニューロンは、例えば、当技術分野で公知の方法を使用して筋肉細胞または組織上で運動ニューロンを培養することによって、本明細書に記載されている筋肉細胞または組織と共培養される。
【００７３】
ある特定の実施形態では、共培養で使用される運動ニューロンを、約１０から３０日の間、約１０から２５日の間、約１５から２０日の間、もしくは約２０から２５日の間、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０，４５、５０もしくはそれよりも多くの日数の間、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多くの日数までの間分化させている。
【００７４】
ある特定の実施形態では、共培養で使用される筋肉細胞を、約４から２５日の間、約５から２０日の間、約５から１５日の間、約５から１０日の間、約１０から１７日の間、もしくは約４から７日の間、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれよりも多くの日数の間、または４、５、６、７、８、９、１０、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれよりも多くの日数までの間分化させている。
【００７５】
非限定的な一実施形態では、共培養で使用される運動ニューロンを、約２０から２５日の間分化させ、共培養で使用される筋肉細胞は、約５から１０日の間分化させている。
【００７６】
神経筋共培養を確立するために、ＰＳＣ由来運動ニューロンを筋肉細胞または組織、例えば、筋芽細胞由来筋肉組織またはＰＳＣ由来筋肉組織上に置き、次いで、運動ニューロンおよび筋肉組織が機能的神経筋接合部を形成するのに十分な条件下で培養することができる。ある特定の非限定的実施形態では、運動ニューロンおよび筋肉細胞または組織は、非ニューロン細胞、例えば、原位置で収縮する筋肉を保つ非ニューロン細胞の層の成長に十分な時間共培養される。非限定的な一実施形態では、非ニューロン細胞は、結合組織、例えば、ビメンチンおよび／またはＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）を発現する間質細胞を形成する。
【００７７】
例えば、運動ニューロンおよび筋肉組織は、機能的神経筋接合部を確立するために、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０週またはそれよりも多くの間共培養されうる。例えば、このような共培養後、筋肉組織は、ＡＣｈによる刺激に対する収縮性応答を示す。運動ニューロンが光感受性タンパク質を発現する（すなわち、光遺伝学的制御にさらされる）実施形態では、前記筋肉組織は、運動ニューロンが光（例えば、運動ニューロンによって発現される光感受性タンパク質の活性化に特異的な光の波長、例えば、チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）の励起のための４７０ｎｍ）によって刺激されると収縮性応答を示す。
【００７８】
５．２  ＮＭＪモジュレーターを同定する方法
本発明は、運動ニューロンがシナプス接続を形成する際に運動ニューロンおよび／または筋肉の活性をモジュレートする（すなわち、ＮＭＪ活性のモジュレーション）化合物を同定する方法を提供する。神経筋接合部の活性をモジュレートする候補化合物のキャパシティーは、本明細書に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの活性をモジュレートする候補化合物の能力をアッセイすることによって決定することができる。したがって、本明細書に記載されている方法は、候補化合物が、当技術分野で公知の任意のＮＭＪ活性指数、例えば、神経伝達物質の放出もしくは安定性の増加もしくは低下、例えば、カルシウム、ナトリウムもしくはカリウムなどのイオンの透過性、および／または運動ニューロンと筋肉との間の接続性をモジュレートするかどうかを決定するための方法を提供する。非限定的な一実施形態では、候補化合物は、運動ニューロンと筋肉との間の神経の接続性を増加または低下させることによってＮＭＪ活性をモジュレートすることができる。
【００７９】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの運動ニューロンおよび／または筋肉の活性を増加させることによってＮＭＪの活性をモジュレートする候補化合物を同定する方法であって、候補化合物が、前記活性を、候補化合物が存在しない場合の運動ニューロンおよび／または筋肉の活性と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれよりも大きく増加させる方法を提供する。ＮＭＪ活性を増加させることによってＮＭＪの活性をモジュレートする候補化合物は、ＮＭＪアゴニストとして選択されうる。
【００８０】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの運動ニューロンおよび／または筋肉の活性を低減させることによってＮＭＪの活性を低減させる候補化合物を同定する方法であって、候補化合物が、前記活性を、候補化合物が存在しない場合の運動ニューロンおよび／または筋肉の活性と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれよりも大きく低減させる方法を提供する。ＮＭＪ活性を低減させることによってＮＭＪの活性をモジュレートする候補化合物は、ＮＭＪアンタゴニストとして選択されうる。
【００８１】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪ活性を低減させることによってＮＭＪの活性をモジュレートする化合物を、例えば、処置の治療方法の一部として、麻酔剤および／または筋弛緩剤として使用することができる。
【００８２】
特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、光遺伝学的技術を使用して決定することができる。例えば、ＮＭＪの運動ニューロンは、光によって刺激された場合に運動ニューロンを脱分極させ、その結果活動電位が開始する、レチニリデンタンパク質（例えば、ロドプシン）、例えば、チャネルロドプシンなどの光ゲートイオンチャネルを発現しうる。ある特定の実施形態では、運動ニューロンはチャネルロドプシン−２を発現する。一実施形態では、チャネルロドプシン−２は、シナプシンプロモーターに作動可能に連結する。ある特定の非限定的実施形態では、光ゲートイオンチャネルを発現する運動ニューロンは、光ゲートイオンチャネルを活性化する波長で運動ニューロンに集光された光で刺激することができ、ＮＭＪにおいて運動ニューロンがシナプスを形成する際の運動ニューロンおよび／または筋肉の活性は、候補化合物の存在下で決定することができる。
【００８３】
ある特定の非限定的実施形態では、運動ニューロンは、当技術分野で公知の技術を使用して、細胞に、電流（例えば、分極電流）を注入することによって刺激することができる。ある特定の非限定的実施形態では、運動ニューロンは、当技術分野で公知の技術を使用して、細胞の膜電位を脱分極させることによって刺激することができる。ある特定の非限定的実施形態では、筋肉は、例えば、筋肉を神経伝達物質と接触させることによって刺激することができる。運動ニューロンおよび／または筋肉を刺激する際に、ＮＭＪの活性は、候補化合物の存在下および非存在下で決定することができる。
【００８４】
非限定的な一実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪの活動電位の振幅および／または周波数および／または期間を測定することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、活動電位は運動ニューロンにおいて測定される。ある特定の実施形態では、活動電位は筋肉において測定される。活動電位の振幅および／または周波数および／または期間は、例えば、特定波長の光を用いる運動ニューロンの刺激後（例えば、光遺伝学的制御下の場合）、または運動ニューロンへの電流（例えば、分極電流）の注入によって刺激された場合、または例えば、筋肉を神経伝達物質と接触させることによる筋肉の直接刺激の際に測定することができる。非限定的な一実施形態では、活動電位の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、活動電位の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００８５】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、神経伝達物質、例えば、刺激の際にＮＭＪ運動ニューロンによって放出されるＡＣｈのレベルまたは濃度を測定することによって決定することができ、運動ニューロンによって放出されたか、またはＮＭＪにおける筋肉とシナプスに存在する神経伝達物質の濃度またはレベルの上昇はＮＭＪ活性の増加を示し、運動ニューロンによって放出されたか、またはＮＭＪにおける筋肉とシナプスに存在する神経伝達物質の濃度またはレベルの低下はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００８６】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、例えば、筋肉に接してシナプスを形成する運動ニューロンの刺激の際、または例えば、筋肉を神経伝達物質と接触させることによる筋肉の直接刺激の際に、ＮＭＪの筋肉および／または運動ニューロンにおけるカルシウム電流の振幅および／または周波数および／または期間を測定することによって決定することができる。一実施形態では、筋肉および／または運動ニューロンにおけるカルシウム電流の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、筋肉および／または運動ニューロンにおけるカルシウム電流の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００８７】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、筋肉に接してシナプスを形成する運動ニューロンの刺激の際、または例えば、筋肉を神経伝達物質と接触させることによる筋肉の直接刺激の際に、ＮＭＪの筋肉の運動を測定することによって決定することができる。一実施形態では、筋肉運動の振幅および／または周波数および／または期間の増加はＮＭＪ活性の増加を示し、筋肉運動の振幅および／または周波数および／または期間の減少はＮＭＪ活性の低下を示す。
【００８８】
ある特定の実施形態では、候補化合物は、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの使用を介してＮＭＪアゴニストとして同定することができ、ＮＭＪを有効量の候補化合物に曝露することによって、例えば、候補化合物と接触させていないＮＭＪと比較して、ＮＭＪ活性が増加する。
【００８９】
ある特定の実施形態では、候補化合物は、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＪモデルの使用を介してＮＭＪアンタゴニストとして同定することができ、ＮＭＪを有効量の候補化合物に曝露することによって、例えば、候補化合物と接触させていないＮＭＪと比較して、ＮＭＪ活性が低下する。
【００９０】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪは、光ゲートイオンチャネル、例えば、チャネルロドプシン−２を発現する運動ニューロンを含み、光誘導筋肉収縮は、ＡＣｈＲ抗体力価の上昇した重症筋無力症患者からのＩｇＧ画分（例えば、２００ｎＭの総ＩｇＧ）とともにインキュベーションする前および後の、運動ニューロンと成人由来（または胎児由来）筋芽細胞との機能的共培養物において測定することができる。活性補体は、ＩｇＧと一緒に添加することができる（例えば、血清の形態で添加することができる）。ＮＭＪ培養物の領域を、培養物をＩｇＧおよび補体と接触させる前に、およびＩｇＧと補体に曝露した後（例えば、ＩｇＧと補体に曝露した少なくとも３日後）に再度、ＮＭＪ活性について試験することができる。
【００９１】
ある特定の非限定的実施形態では、本発明は、ヒトＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用を介してＮＭＪ活性をモジュレートする遺伝子を同定する方法も提供する。ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下した場合にアッセイすることができる。１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、運動ニューロンおよび／または筋肉を、例えば、１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡに対して標的化されたアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子；１つまたは複数の遺伝子によって発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体、またはその活性断片と接触させることによって、遺伝子由来の機能的タンパク質の発現を低下させる１つまたは複数の遺伝子に変異を導入することによって、または遺伝子発現を低下させるために当技術分野で公知の任意の他の方法によって低下させることができる。
【００９２】
ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが上昇する場合にアッセイすることができる。ある特定の非限定的実施形態では、ＮＭＪの活性は、ＮＭＪ、例えば、健康な野生型ＮＭＪの運動ニューロンおよび／または筋肉で通常発現しない１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが運動ニューロンおよび／または筋肉で発現される場合にアッセイすることができる。ある特定の非限定的実施形態では、遺伝子の発現レベルは、その遺伝子を含む発現ベクターを運動ニューロンおよび／または筋肉に組換えにより導入することによって上昇させることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子によって発現されたタンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され、次いで、運動ニューロンおよび／または筋肉に直接接触させることができる。
【００９３】
遺伝子の発現レベルの上昇または低下がＮＭＪ活性をモジュレートする場合、このような遺伝子は、ＮＭＪをモジュレートする遺伝子として選択されうる。
【実施例】
【００９４】
６．実施例
本開示の主題は、限定としてではなく、本発明の例として提供される以下の実施例を参照して、よりよく理解される。
【００９５】
６．１
（実施例１）
光遺伝学的制御下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部を使用するヒト神経筋疾患のモデリング
【００９６】
概要
疾患モデリングおよび再生医療におけるヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来ニューロンの潜在能力を十分に把握するには、複雑な機能的系でのそれらの照合が必要である。ここで、本発明者らは、ヒトＰＳＣ由来脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的制御の確立を示す。これらの運動ニューロンをヒト筋芽細胞由来骨格筋と共培養することが、光刺激の際に攣縮を誘発しうる。生理学的アプローチおよびイメージングアプローチを使用して、新たに確立した、すべてのヒト神経筋接合部を特徴付けた。神経筋疾患をモデル化するために、本発明者らは、これらの共培養物を重症筋無力症患者からのＩｇＧと、および活性補体とインキュベートした。重症筋無力症は、神経筋接合部を選択的に標的とする自己免疫障害である。本発明者らは、筋肉強度の特徴的損失のサロゲートマーカーに該当する、筋肉収縮の振幅における可逆的低減を観察した。疾患の重要な態様とその対症療法を再現することができることにより、本発明者らの新規な神経筋接合部アッセイが、神経筋疾患および再生のモデリングに広く密接な関係を有することが示される。
【００９７】
結果
ヒト脊髄ＭＮ集団において光遺伝学的制御を確立するために、本発明者らは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下で、チャネルロドプシン−２−ＥＹＦＰまたはＥＹＦＰ単独の発現のために、レンチウイルスベクターで未分化Ｈ９ｈＥＳＣを形質導入した。シナプシンプロモーターは、ヒトＰＳＣ由来ニューロンにおける正確かつロバストな発現のために選択した。クローンｈＥＳＣ株を増殖させ、導入遺伝子のゲノム統合（データは示さず）および多能性マーカー発現の維持（図１Ａ、Ｏ）に関してＰＣＲで検証した。種々のニューロン分化パラダイム（Steinbeckら、２０１５年）を通じてロバストな導入遺伝子発現を有するＥＳＣクローンのみを、さらなる実験のために選択した。脊髄運動ニューロンへの分化は、ＳＭＡＤによる二重阻害（Chambersら、２００９年）と、腹側化のためのヘッジホッグ経路の活性化および尾方化のためのレチノイン酸への曝露（Calderら、２０１５年）とを組み合わせることによって達成した。分化２０日目までに、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ導入遺伝子は、これらの培養条件下で出現するニューロンクラスターにおいて強く発現した（図１Ｂ）。本発明者らは、２０日目に培養物を解離させ、非ニューロン細胞を含有する上清を廃棄する一方でニューロンクラスターを沈降させることを含む簡便な精製手順を開発した。このストラテジーにより、ｈＥＳＣ由来ＭＮの有意な精製が可能となった（図１Ｃ）。５回の連続したＭＮ分化のＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、精製ＭＮクラスター中の真の脊髄運動ニューロン（ｓＭＮ）マーカーＩＳＬ１、ＮＫＸ６．１およびＯＬＩＧ２の３倍富化が確認され（図１Ｄ）、一方、非ニューロン夾雑物についてのマーカー（ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１）は精製ＭＮ培養物中でおよそ１０倍枯渇した（図１Ｅ）。４０日目の精製ＭＮに関するさらなるＱＲＴ−ＰＣＲ実験において、本発明者らは、生理学的に関連するＭＮマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）およびアグリン（ＡＧ）が発現されることを見出した（ＣＨＡＴ  ６０．３±２９．６％  ＨＰＲＴ、ＡＣＨＥ  ＨＰＲＴの２７３．６±５９．３％、ＡＧ  ＨＰＲＴの７９．３±３２．１％）。免疫細胞化学によって、本発明者らは、精製ＭＮが、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（図１Ｆ）ならびにＣｈＡＴおよび成熟神経フィラメントマーカーＳＭＩ３２（図１Ｇ）と組み合わせて、ＨＢ９およびＩＳＬ１を発現したことを確認した。ＭＮ誘導（Mauryら、２０１５年）についての代替プロトコルにより、同等の結果が得られた（図１Ｈ〜Ｊ）。光遺伝学的制御を電気生理学実験で検証した。明視野および緑色蛍光光学下で同定した成熟した脊髄運動ニューロンでは（６０日目を超える）（図１Ｋ）、強い活動電位（ＡＰ）の発火が、脱分極電流の注入ステップによって、−７０±２ｍＶに保った膜電位から惹起された（図１Ｌ）。膜の静止電位は、−６２．４±４．８ｍＶであった。さらに、４つのＣｈＲ２発現ニューロンのうちの４つが、０．２〜１０Ｈｚの広範な周波数範囲で、光誘導ＡＰを発火した（図１Ｍ、Ｎ）。スパイクフィデリティは、０．２から２Ｈｚで１００％、５Ｈｚで９３．３±５．７％および１０Ｈｚで６５．５±２３．３％であった。ＥＹＦ���  ｈＥＳＣ株由来の精製ニューロンは、ＨＢ９およびＩＳＬ１も発現し（図１Ｏ、Ｐ）、電流注入によってＡＰの発火を誘導することができた（図１Ｑ）。膜の静止電位は、−５８．４±２．６ｍＶであった。期待されたように、２つの試験したＥＹＦＰ＋ニューロンのうち２つは、いかなる光刺激にも応答しなかった（図１Ｒ）。
【００９８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的骨格筋を得るために、本発明者らは、成人（ｈＭＡ）および胎児（ｈＭＦ）ドナー由来のヒト初代筋芽細胞を使用した。両方のタイプの筋芽細胞を（図２Ａ）、それらが７０％コンフルエンスに達したら分化するように誘導した。両方の筋芽細胞培養物を融合して、分化開始後の４から７日以内に多核筋管を形成させた。アセチルコリン（ＡＣｈ、５０μＭ）による刺激は、成人および胎児の筋線維を収縮させ、信頼度は１０日目から１７日目へと高まった（図２Ｂ）。筋肉の機能性を、カルシウムイメージング実験においてさらに評価した。カバーガラス上に置いた筋肉培養物を、分化３５日目に、カルシウム色素Ｆｕｒａ２とともにインキュベートした。ＡＣｈによる刺激後、線維は異なるカルシウムトランジェントを生じた（図２Ｃ）。ＱＲＴ−ＰＣＲによるＡＣｈＲサブユニットの定量により、３０日目の筋肉培養物が胎児のガンマサブユニットを発現するのに対し（ＣＨＲＮＧ、ｈＭＡ培養物におけるＨＰＲＴの３２．２±８．６％およびｈＭＦ培養物におけるＨＰＲＴの９７．１±３３．４％）、成人イプシロンサブユニットはほとんど検出不能である（ＣＨＲＮＥ  ｈＭＡおよびｈＭＦ培養物におけるＨＰＲＴ発現の＜０．２％、ＣＨＲＮＧ：ＣＨＲＮＥ比  両方の筋肉のタイプに対して＞１００）ことが明らかになった。ヒト筋培養物も筋肉特異的キナーゼを発現した（ＭｕＳＫ、ｈＭＡ培養物におけるＨＰＲＴの４４．８±１８．５％およびｈＭＦ培養物におけるＨＰＲＴの７３．８±１５．８％）。免疫細胞化学分析により、多核筋管がミオシンを発現し、一方、間葉系間質が中間体フィラメントであるビメンチンを発現したことが確認された。構造的にインタクトな筋管は、少なくとも９０日目まで培養物中で維持することができるが、これらの条件下では、典型的な骨格筋の横紋は発達しなかった。
【００９９】
神経筋共培養を確立するために、本発明者らは、精製したＣｈＲ２発現脊髄運動ニューロン（２０〜２５日目）を使用し、それらを分化前の骨格筋線維（５〜１０日目）上に置いた。プレーティング後、ｈＥＳＣ由来脊髄ＭＮ細胞体は、ニューロンクラスター内でほとんどそのままであったが、成人および胎児の筋肉を横切って軸索を延長させた（最初の週のうちに最大２ｍｍ、図３Ａ、Ｅ）。共培養物を、毎週間隔で、神経筋の接続性の確立について試験した。この目的のために、培養物を、明視野照明下で観察し、間欠的にブルーライトパルスで刺激した。共培養開始の６から８週間後、伸長した円柱状の線維芽細胞由来筋肉線維は形態上インタクトなままであり、光遺伝学的刺激に応じて収縮を開始した（４７０ｎｍ、０．２Ｈｚ、３００ミリ秒のパルス幅）。図３Ｂ、Ｆは、両方の筋肉のタイプを有する成熟した共培養物を示す。図３Ｃ、Ｇは、このような培養物由来の個々の線維の筋攣縮の定量を示す。下のパネルは、８．５分にわたる長期間の実験を示す（図３Ｃは０．２Ｈｚ、図３Ｇは０．１Ｈｚ）。６３０ｎｍの光はいかなる筋肉の収縮を引き起こさず、筋攣縮がＣｈＲ２活性化の結果であることを示した。ベクロニウム（２μＭ）、すなわちニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）のアンタゴニストの添加は、すべての試験培養物において、光誘導筋攣縮を完全に遮断した（図３Ｄ、Ｈ）。これらのデータは、接続性が、機能的神経筋コリン作動性シナプスを介して実際に確立され、細胞融合の結果ではなかったことを示す（すなわち、直接的に筋肉の活性化を引き起こす筋肉膜へのＣｈＲ２の移動）。同様の結果が、代替プロトコル（Mauryら、２０１５年）を介して生じたＣｈＲ２＋ＭＮをｈＭＡまたはｈＭＦ由来の筋肉上に置いた場合に達成された（データは示さず）。ほとんどのＭＮのみの培養物は、いかなる光誘導攣縮も示さなかった。しかしながら、長期間のＭＮのみの分化のおよそ２０％が、光誘導されるベクロニウム感受性攣縮を示すことがある、非神経の過成長を生じた。これらのデータは、精製が最適ではないＭＮ培養物がＰＳＣ由来の筋原細胞を含有する場合があることを示唆する。脊髄運動ニューロンと骨格筋を含む沿軸中胚葉構造の両方を生じることができる前駆体の誘導が最近報告された（Goutiら、２０１４年）。しかしながら、このようなＰＳＣ由来筋肉様細胞は、初代筋芽細胞由来線維に典型的な孤立した伸長形態を示さなかった。
【０１００】
次に、本発明者らは、機能的神経筋培養物における重要な生理学的パラメーターを特徴付けた。成熟した共培養物をカルシウム色素Ｆｕｒａ２と共にインキュベートし、連続的な灌流のためのイメージングチャンバーにマウントした。光刺激に応じて筋肉収縮を示すことが以前に同定された領域（図３Ｉ）では、４７０ｎｍの光遺伝学的刺激が筋線維においてカルシウムスパイクを生じ、これは、ベクロニウムによって遮断されうる（６／６培養物、図３Ｊ）。図３Ｊの下のパネルにより、４５分にわたるカルシウムイメージング実験において神経筋興奮性の長期安定性が確認される。別の研究では、位相差顕微鏡法下での円柱状かつ横紋状の外観によって、かつ光誘導攣縮を受ける能力によって同定した骨格筋管（ｎ＝５）を、細胞内記録のために選択した（図３Ｋ）。光応答性の筋管を鋭い電極で突き刺し、筋肉のＡＰを０．２から２Ｈｚの周波数で４４７ｎｍの光遺伝学的刺激の間、記録した。スパイクフィデリティは、０．２Ｈｚで１００％、０．５Ｈｚで９３．３±６．７％、１Ｈｚで７５±１５．０％および２Ｈｚで８０±１０．０％であった。ベクロニウム（２μＭ）は、可逆的方式で、筋線維中の光誘導ＡＰを完全に遮断した。数日および数週間の経過にわたって、神経筋接続性の安定性に対処するために、収縮性領域（ｎ＝７）を５日毎に評価した。定量的分析により、７つすべての領域が光遺伝学的刺激に対して応答性のままであり、収縮は、０日目と比較して、２５日目まで、１３７．３±５０．７％まで増加したことが明らかになった（図３Ｌ）。
【０１０１】
共培養物の形態学的特徴付けにより、原位置で収縮する筋肉を保つために必要であると思われる非ニューロン細胞の層の存在が明らかになった。これらの間質細胞の大多数はビメンチンを、少数はＧＦＡＰを発現した（図１Ｍ）。ほとんどの収縮性領域では、ニューロン突起の緻密なネットワークが、デスミン（図３Ｎ）またはミオシン（データは示さず）染色した筋管と密接に接触していることが見出された。ニューロンのＥＹＦＰ＋ボタン（bouton）が、横紋状の多核化筋肉線維と密接に接触していることが見出された（図３Ｏ）。筋線維上のアセチルコリン受容体をブンガロトキシン（ＢＴＸ）で標識した。高出力共焦点イメージング（図３Ｐ）により、ＭＮシナプス終末に近接して配置される筋膜上のアセチルコリン受容体のプラーク様クラスター形成（Marquesら、２０００年）が明らかになった。筋線維上のＢＴＸ＋ドットの定量により、非収縮領域と比較して、収縮領域および強力な神経支配領域における有意な増加が明らかになった（図３Ｑ、Ｒ；対応のない両側ｔ検定、ｐ＝０．０１６、ｔ＝２．６０）。ＱＲＴ−ＰＣＲによるＡＣｈＲサブユニットの定量により、６週間成熟した共培養物が胎児ガンマサブユニットを発現し（ＣＨＲＮＧ、ｈＭＡ共培養物におけるＨＰＲＴの１７．３±７．５％およびｈＭＦ共培養物におけるＨＰＲＴの２７．４±９．０％）、一方、成人イプシロンサブユニットはほとんど検出不能であった（ＣＨＲＮＥ  ｈＭＡおよびｈＭＦ共培養物におけるＨＰＲＴ発現の＜０．１％、ＣＨＲＮＧ：ＣＨＲＮＥ比  両方の筋肉のタイプについて＞１００）ことが明らかになった。したがって、ヒト脊髄運動ニューロンとの共培養は、この時点まで、成人イプシロンサブユニットの発現を誘導しなかった。神経筋共培養物は、筋肉特異的キナーゼも発現した（ＭｕＳＫ、ｈＭＡ共培養物におけるＨＰＲＴの７．９±１．９％およびｈＭＦ共培養物におけるＨＰＲＴの２７．７±１０．３％）。
【０１０２】
次に、本発明者らは、機能的神経筋共培養物が、古典的なヒト神経筋疾患をモデル化するのに適するかに取り組むようにした。重症筋無力症（ＭＧ）（Toykaら、１９７７年；Verschuurenら、２０１３年）は、神経筋接合部のタンパク質（例えば、アセチルコリン受容体、ＡＣｈＲ）に対する自己抗体の出現によって引き起こされる。病原抗体のＡＣｈＲへの結合により補体カスケードを活性化し、神経筋エンドプレートの破壊をもたらし（Sahashiら、１９８０年）、これは、最終的に、患者の進行性筋力低下を引き起こす。したがって、本発明者らは、ＡＣｈＲ抗体力価の明らかに上昇した２名のＭＧ患者（番号１および番号２）からのＩｇＧ画分（２００ｎＭの総ＩｇＧ）とともにインキュベーションする前（図４Ａ、Ｄ）および後に、ＭＮと成人由来筋芽細胞（ｈＭＡ）との機能的共培養物における光誘導筋収縮を定量した。サンドグロブリン（ＳＧ）多価ＩｇＧは対照としての役割を果たした。活性補体を含有する２％の新鮮ヒト血清をすべてのＩｇＧと一緒に添加した。正に同じ培養領域を、ＩｇＧと補体に曝露した３日後に再び試験した場合、本発明者らは、光刺激に応じた筋攣縮が、ＭＧのＩｇＧと補体と共にインキュベートした培養物では低減した（図４Ｂ）が、対照のＩｇＧと補体と共にインキュベートした対照培養物では低減しなかった（図４Ｅ）ことを見出した。収縮性培養物における筋肉攣縮の注意深い定量により、ＩｇＧおよび補体の添加前の初期の運動（０日目、１００％）と比較して、対照培養物（ｎ＝１４）は、３日目で１２５％まで筋肉収縮の増加を示すことが明らかになった。対照的に、ＭＧ患者のいずれかからのＩｇＧと共にインキュベートした培養物は、収縮性において有意な低下（番号１、ｎ＝１４、６８％および番号２、ｎ＝１１、６０％）を示した（図４Ｇ、一元ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００４６、Ｆ（２，３６）＝６．２５）。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験によって、対照群とＭＧ群のいずれかとの間の有意な差が明らかになり（ＣＴＲＬ対番号１、ｐ＜０．０５、ｑ＝２．９３およびＣＴＲＬ対番号２、ｐ＜０．０１、ｑ＝３．１３）、筋無力症の表現型が導入されたことが示唆された。処置応答がモデル化されうるかを試験するために、本発明者らは、ＭＧ培養物（図４Ｃ、Ｆ、ｎ＝８）および対照（図４Ｆ、ｎ＝４）をＡＣｈエステラーゼ阻害剤であるピリドスチグミン（ＰＹＲ、１０μＭ）とともにインキュベートした。本発明者らは、ＭＧ培養物におけるＰＹＲの適用が有意な治療効果を誘導することを見出した（図４Ｃおよび４Ｈ、＋２２％、対応のある両側ｔ検定、ｐ＝０．００２、ｔ＝４．６９）。次に、本発明者らは、血漿交換療法治療（Goldら、２００８年）を模倣して、筋無力症の表現型が、ＭＧのＩｇＧと補体のウォッシュアウト後に可逆的かどうかを評価した。ＭＧのＩｇＧと補体を０日目に培地に添加し、同一の培養領域（ｎ＝４）を３日目のウォッシュアウトの１および３日後（それぞれ、４日目および６日目）に再び試験した。定量分析により、４つの培養物のうちの４つにおいて、ＭＧのＩｇＧと補体のウォッシュアウトにより、筋無力症の表現型の逆転が生じることが明らかになった（図４Ｉ、Ｄ３対Ｄ６、対応のある両側ｔ検定、ｐ＝０．００９８���ｔ＝１０．０９）。本発明者らは、７日の時間経過にわたって、補体を添加しない対照とＭＧの番号１のＩｇＧの効果も試験した。未処理の培養物（ｎ＝５）とＣＴＲＬ  ＩｇＧで処理した培養物（ｎ＝６）は、経時的に収縮性が増加し、一方、ＭＧの番号１のＩｇＧで処理した培養物（ｎ＝７）は、５日目と７日目におよそ７０％までの、遅延したが有意な収縮性の低下を示した（７日目の、ＣＴＲＬ対ＭＧ、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０５、ｑ＝３．１０）。
【０１０３】
筋無力症の表現型をさらに特徴付けるために、本発明者らは、カルシウムイメージング実験を実施した。ＭＧの番号１のＩｇＧの短期間の適用により、筋線維から記録した光誘導カルシウムシグナルは低減されなかった（０．２から５μＭ、６０分まで、データは示さず）。したがって、培養物を、対照およびＭＧの番号１のＩｇＧおよびヒト補体で２日間前処理した。カルシウムイメージングを、同様の量の筋肉線維および緻密な神経支配を有する領域で実施した（図４Ｋ、Ｌ）。光誘導カルシウムピークは、視野において同定可能な全ての線維において定量した場合、対照（ｎ＝６、図４Ｍ、ＣＴＲＬ対ＭＧ、対応のない両側ｔ検定、ｐ＝０．０１２、ｔ＝２．８３）と比較してＭＧ番号１のＩｇＧおよび補体（ｎ＝１１）で処理した培養物において有意に弱かった。ＰＹＲの適用後に、本発明者らは、光誘導カルシウムスパイクの少量であるが有意な増加を検出した（ｎ＝８、図４Ｍ、ＭＧ対ＭＧ＋ＰＹＲ、対応のある両側ｔ検定、ｐ＝０．０４６、ｔ＝２．４２）。さらに、反応性線維のパーセンテージは、対照と比較して、ＭＧの番号１のＩｇＧと補体とで処理した培養物において低減した（図４Ｎ、ＣＴＲＬ７８％対ＭＧ３２％、対応のない両側ｔ検定、ｐ＜０．００１、ｔ＝４．７９）。ＰＹＲの適用後、本発明者らは、有意には届かないが、より高いパーセンテージの反応性線維への傾向を見出した（図４Ｎ、ＭＧ対ＭＧ＋ＰＹＲ、対応のある両側ｔ検定、ｐ＝０．０６５、ｔ＝２．１９）。最後に、本発明者らは、神経筋接合部への補体攻撃を確認するようにした。この目的のために、２４時間、ＭＧの番号１のＩｇＧとヒト補体とで処理した培養物およびＣＴＲＬのＩｇＧとヒト補体で処理した培養物を、ヒト補体断片Ｃ３ｃを認識する抗体で染色した。ＢＴＸとＥＹＦＰとによる共標識によって、特に、ＭＧの神経筋接合部における筋膜上への標的化補体の沈着が明らかになったが、ＣＴＲＬ培養物においては明らかではなかった（図４Ｏ、Ｐ）。定量によって、対照と比較して、ＭＧ培養物の神経筋接合部における補体の有意な沈着が明らかになった（図４Ｑ、対応のない両側ｔ検定、ｐ＝０．００８、ｔ＝３．８９）。ＭＮのみの培養物は、増量するＭＧおよび対照のＩｇＧおよび補体とともにインキュベートした場合に毒性の徴候を示さなかった。
【０１０４】
考察
再生医療において最も期待されるヒト脊髄運動ニューロンの適用（Davis-Dusenberyら、２０１４年；SteinbeckおよびStuder、２０１５年）は、神経筋接合部を介して骨格筋に機能的に接続するそれらの能力に依存する。しかしながら、ニューロンの移植片対宿主接続性の非常に一般的な展望は、技術的制限と適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの欠如によって十分に検証されないままである。光遺伝学を使用して、本発明者らは、多大な治療的潜在性を有するヒトＰＳＣ由来ニューロン集団が、その真正のヒト標的組織に機能的に接続することをはじめて実証する。一研究では、成体マウスの坐骨神経の部分的に除神経した枝に移植した、光遺伝学的制御下の、マウス胚性幹細胞由来運動ニューロンが、後肢の下部筋肉を再神経支配した（Brysonら、２０１４年）。しかしながら、本研究は、ＰＳＣ由来運動ニューロンと筋芽細胞由来筋肉とから調製した完全ヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経筋接合部について記載し、ここで、運動ニューロンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋肉に対する機能的シナプス形成することができる。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチによって、機能的実験において、神経筋接続性の詳細な機能的特徴付けおよび細胞融合の明確な排除が可能となる。いかなる特定の理論にも拘泥されることなく、本発明者らの系では、神経筋のシナプス形成は、おそらく、ＭｕＳＫとラプシンを介してシグナル伝達して神経筋接続部のアセンブリーを誘導するＭＮ終末によるアルギンの分泌に関する（SanesおよびLichtman、２００１年；Wuら、２０１０年）。プラーク様ＡＣｈＲクラスタリング（Marquesら、２０００年）は、刺激により誘導した収縮性の強化と共に（図４Ｊ）、完全に機能的であるが未だ未成熟の神経筋シナプスの形成を示唆する。
【０１０５】
ヒト再生医療の意義を超えて、本発明者らの新規培養系は、すべてのヒト系における神経筋疾患のモデリングを可能とする。本発明者らは、古典的な神経筋疾患である重症筋無力症の特定の機能的かつ構造上の表現型およびその処置（Goldら、２００８年；Verschuurenら、２０１３年）が、筋無力症患者のＩｇＧと補体とを簡単に添加することによって、神経筋共培養物において再現されうることを示す。本発明者らの発見により、神経筋疾患の変性および再生の態様の両方をこのヒト機能的神経筋共培養物中で研究することができることが示される。したがって、本発明者らは、新規系により、患者に特異的なｉＰＳＣ由来ニューロン（Kiskinisら、２０１４年）または筋肉（Darabiら、２０１２年；Skoglundら、２０１４年）を使用して神経筋接合部いずれかの側から生じる疾患プロセスの解明が可能となり得ることを提案する。
【０１０６】
方法
シナプシン−ｈＣｈＲ２−ＥＹＦＰのｈＥＳＣ株
Ｈ９ヒトＥＳ細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し（ｐＬｅｎｔｉ−Ｓｙｎ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥ）、クローン密度でプレーティングした。出現するコロニーを導入遺伝子統合に関して、ＰＣＲによってスクリーニングし、分化させて、すべてのニューロン後代において安定な長期発現を確実にした。
【０１０７】
脊髄運動ニューロンの作製
ＥＳ細胞をコンフルエント単層にプレート培養し、ＳＭＡＤによる二重阻害によって神経誘導を開始した。腹側化および尾方化のために、パルモルファミンとレチノイン酸を１日目〜１５日目に添加した（Calderら、２０１５年）。２０日目までに出現するＭＮクラスターを沈降によって精製した。
【０１０８】
ヒト初代筋芽細胞培養
ヒト初代筋芽細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（成人ドナー）およびＬｏｎｚａ（胎児ドナー）から購入した。両方の筋芽細胞集団は骨格筋成長培地（ＳｋＧＭ−２、Ｌｏｎｚａ）で成長させた。筋芽細胞が、２％のウマ血清を含有する培地に曝露することによって、７０％コンフルエンスに達したら、分化を誘導した。
【０１０９】
神経筋共培養の開始
筋芽細胞分化の開始の５から１０日後、精製したＭＮクラスターをマトリゲルに再懸濁させ、筋培養物の上部の中心にプレーティングした。培養物を、２％のウマ血清を添加してＭＮ分化培地中に保った。
【０１１０】
共培養試験
成熟した共培養物を、間欠的に蛍光光に対してシャッターを開きながら、１０×の明視野照明下で観察した（４７０ｎｍ、２ｍＷ／ｍｍ２、およそ３００ミリ秒のパルス）。安定な収縮領域を、標準のＴｙｒｏｄｅ溶液中、室温で、一定の明視野照明下で画像化した（４０ミリ秒の曝露時間、５００ミリ秒毎、１００フレーム）。光遺伝学的刺激（４７０または６３０ｎｍ、２ｍＷ／ｍｍ２、およそ３００ミリ秒のパルス）を指定の周波数で適用した。運動の定量のために、複数の代表的な高コントラスト領域を自動でトレースした（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【０１１１】
カルシウムイメージング
カバーガラス上の筋管または共培養物をレシオメトリックカルシウム色素Ｆｕｒａ２とともにインキュベートし、標準のＴｙｒｏｄｅ溶液中連続灌流下で画像化した。筋管はアセチルコリンで刺激した。共培養物には、５秒毎に４７０ｎｍ（４ｍＷ／ｍｍ２）で１０ミリ秒間の光遺伝学的刺激のために照明を当てた。
【０１１２】
電気生理学
成熟したＥＹＦＰ＋  ＭＮの全細胞に関して、電流固定記録を室温で実施した。光惹起ＡＰを、４４７ｎｍのダイオードレーザー（ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ）を使用して、およそ１ｍＷ／ｍｍ２の５ミリ秒の光パルスで誘発した。光刺激に応じて収縮する筋管を、細胞内記録のために鋭い電極で突き刺した。
【０１１３】
ヒト血清とニコチン性アセチルコリン受容体に対する抗体を含有する重症筋無力症のＩｇＧとを用いる処理
５名の健康なドナー由来の血清（補体を含有する）をプールし、示された培地に添加した（２％ｖ／ｖ）。ＩｇＧ画分を２名の重度に罹患したＭＧ患者から得て、サンドグロブリン多価ＩｇＧは対照としての役割を果たした（すべて２００ｎＭの総ＩｇＧ、患者番号１  ＡＣｈＲ抗体力価５７６ｎｍｏｌ／ｌ、番号２  ＡＣｈＲ抗体力価１７ｎｍｏｌ／ｌ）。患者は、調査に対してこれらの材料を使用するための同意書を与え、これは、Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１１４】
免疫細胞化学およびイメージング
細胞または培養物はＰＦＡ中に固定し、５％ＦＢＳ／０．３％Ｔｒｉｔｏｎでブロッキングした。一次抗体を製造業者の推奨に従ってインキュベートし、続いて、適当なＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒコンジュゲート二次抗体をインキュベートした。染色したものを倒立蛍光顕微鏡で画像化するか、または共焦点イメージングを４０／６３×の油浸対物レンズを使用する白色レーザー技術を備える倒立Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８顕微鏡で実施し、続いて、示された場合には、次にデータデコンボリューションを実施した。
【０１１５】
７．引用文献
1.  Amoroso, M.W., Croft,G.F., Williams, D.J., O'Keeffe, S., Carrasco, M.A., Davis, A.R., Roybon, L.,Oakley, D.H., Maniatis, T., Henderson, C.E., et al. (2013). Acceleratedhigh-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.The Journal of neuroscience 33, 574-586.
2.  Barker, A.T., Jalinous, R., and Freeston, I.L. (1985). Non-invasivemagnetic stimulation of human motor cortex. Lancet 1, 1106-1107.
3.  Boyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K.(2005). Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuralactivity. Nature neuroscience 8, 1263-1268.
4.  Bryson, J.B., Machado, C.B., Crossley, M., Stevenson, D., Bros-Facer, V.,Burrone, J., Greensmith, L., and Lieberam, I. (2014). Optical control of musclefunction by transplantation of stem cell-derived motor neurons in mice. Science344, 94-97.
5.  Calder, E.L., Tchieu, J., Steinbeck, J.A., Tu, E., Keros, S., Ying, S.W.,Jaiswal, M.K., Cornacchia, D., Goldstein, P.A., Tabar, V., et al. (2015).Retinoic Acid-Mediated Regulation of GLI3 Enables Efficient MotoneuronDerivation from Human ESCs in the Absence of Extrinsic SHH Activation.DOI:10.1523/JNEUROSCI.3046-14.2015
6.  Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain,M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES andiPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27,275-280.
7.  Chan, A., Lee, D.H., Linker, R., Mohr, A., Toyka, K.V., and Gold, R.(2007). Rescue therapy with anti-CD20 treatment in neuroimmunologicbreakthrough disease. Journal of neurology 254, 1604-1606.
8.  Cisterna, B.A., Cardozo, C., and Saez, J.C. (2014). Neuronal involvementin muscular atrophy. Frontiers in cellular neuroscience 8, 405.
9.  Cunningham, M., Cho, J.H., Leung, A., Savvidis, G., Ahn, S., Moon, M.,Lee, P.K., Han, J.J., Azimi, N., Kim, K.S., et al. (2014). hPSC-derivedmaturing GABAergic interneurons ameliorate seizures and abnormal behavior inepileptic mice. Cell stem cell 15, 559-573.
10.  Darabi, R., Arpke, R.W., Irion, S., Dimos, J.T., Grskovic, M., Kyba, M.,and Perlingeiro, R.C. (2012). Human ES- and iPS-derived myogenic progenitorsrestore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophicmice. Cell stem cell 10, 610-619.
11.  Daube, J.R., and Rubin, D.I. (2009). Needle electromyography. Muscle& nerve 39, 244-270.
12.  Davis-Dusenbery, B.N., Williams, L.A., Klim, J.R., and Eggan, K. (2014).How to make spinal motor neurons. Development 141, 491-501.
13.  Espuny-Camacho, I., Michelsen, K.A., Gall, D., Linaro, D., Hasche, A.,Bonnefont, J., Bali, C., Orduz, D., Bilheu, A., Herpoel, A., et al. (2013).Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrateefficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron 77, 440-456.
14.  Gold, R., Hohlfeld, R., and Toyka, K.V. (2008). Progress in the treatmentof myasthenia gravis. Therapeutic advances in neurological disorders 1, 36-51.
15.  Gouti, M., Tsakiridis, A., Wymeersch, F.J., Huang, Y., Kleinjung, J.,Wilson, V., and Briscoe, J. (2014). In vitro generation of neuromesodermalprogenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification ofspinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology 12, e1001937.
16.  Kiskinis, E., Sandoe, J., Williams, L.A., Boulting, G.L., Moccia, R.,Wainger, B.J., Han, S., Peng, T., Thams, S., Mikkilineni, S., et al. (2014).Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through geneticcorrection of mutant SOD1. Cell stem cell 14, 781-795.
17.  Kuwabara, S., and Yuki, N. (2013). Axonal Guillain-Barre syndrome: conceptsand controversies. The Lancet Neurology 12, 1180-1188.
18.  Lancaster, M.A., and Knoblich, J.A. (2014). Organogenesis in a dish:modeling development and disease using organoid technologies. Science 345,1247125.
19.  Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2010).Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Natureprotocols 5, 688-701.
20.  Marques, M.J., Conchello, J.A., and Lichtman, J.W. (2000). From plaque topretzel: fold formation and acetylcholine receptor loss at the developingneuromuscular junction. The Journal of neuroscience 20, 3663-3675.
21.  Maury, Y., Come, J., Piskorowski, R.A., Salah-Mohellibi, N., Chevaleyre,V., Peschanski, M., Martinat, C., and Nedelec, S. (2015). Combinatorialanalysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stemcells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology 33, 89-96.
22.  Mercuri, E., and Muntoni, F. (2013). Muscular dystrophies. Lancet 381,845-860.
23.  Moloney, E.B., de Winter, F., and Verhaagen, J. (2014). ALS as a distalaxonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability inthe presymptomatic stages of the disease. Frontiers in neuroscience 8, 252.
24.  Patani, R., Hollins, A.J., Wishart, T.M., Puddifoot, C.A., Alvarez, S.,de Lera, A.R., Wyllie, D.J., Compston, D.A., Pedersen, R.A., Gillingwater,T.H., et al. (2011). Retinoid-independent motor neurogenesis from humanembryonic stem cells reveals a medial columnar ground state. Naturecommunications 2, 214.
25.  Philippidou, P., and Dasen, J.S. (2013). Hox genes: choreographers inneural development, architects of circuit organization. Neuron 80, 12-34.
26.  Plomp, J.J., Morsch, M., Phillips, W.D., and Verschuuren, J.J. (2015). Electrophysiological analysisof neuromuscular synaptic function in myasthenia gravis patients and animalmodels. Experimental neurology DOI 10.1016/j.expneurol.2015.01.007
27.  Sahashi, K., Engel, A.G., Lambert, E.H., and Howard, F.M., Jr. (1980).Ultrastructural localization of the terminal and lytic ninth complementcomponent (C9) at the motor end-plate in myasthenia gravis. Journal ofneuropathology and experimental neurology 39, 160-172.
28.  Sanes, J.R., and Lichtman, J.W. (2001). Induction, assembly, maturationand maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature reviews Neuroscience 2,791-805.
29.  Sendtner, M. (2014). Motoneuron disease. Handbook of experimentalpharmacology 220, 411-441.
30.  Silva, N.A., Sousa, N., Reis, R.L., and Salgado, A.J. (2014). From basicsto clinical: a comprehensive review on spinal cord injury. Progress inneurobiology 114, 25-57.
31.  Skoglund, G., Laine, J., Darabi, R., Fournier, E., Perlingeiro, R., andTabti, N. (2014). Physiological and ultrastructural features of human inducedpluripotent and embryonic stem cell-derived skeletal myocytes in vitro.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America111, 8275-8280.
32.  Steinbeck, J.A., Choi, S.J., Mrejeru, A., Ganat, Y., Deisseroth, K.,Sulzer, D., Mosharov, E.V., and Studer, L. (2015). Optogenetics enablesfunctional analysis of human embryonic stem cell-derived grafts in aParkinson's disease model. Nature biotechnology 33, 204-209.
33.  Steinbeck, J.A., and Studer, L. (2015). Moving Stem Cells to the Clinic:Potential and Limitations for Brain Repair. Neuron 86, 187-206.
34.  Titulaer, M.J., Lang, B., and Verschuuren, J.J. (2011). Lambert-Eaton myasthenicsyndrome: from clinical characteristics to therapeutic strategies. The LancetNeurology 10, 1098-1107.
35.  Toyka, K.V., Drachman, D.B., Griffin, D.E., Pestronk, A., Winkelstein,J.A., Fishbeck, K.H., and Kao, I. (1977). Myasthenia gravis. Study of humoralimmune mechanisms by passive transfer to mice. The New England Journal ofMedicine 296, 125-131.
36.  Verschuuren, J.J., Huijbers, M.G., Plomp, J.J., Niks, E.H., Molenaar,P.C., Martinez-Martinez, P., Gomez, A.M., De Baets, M.H., and Losen, M. (2013).Pathophysiology of myasthenia gravis with antibodies to the acetylcholinereceptor, muscle-specific kinase and low-density lipoprotein receptor-relatedprotein 4. Autoimmunity reviews 12, 918-923.
37.  Wu, H., Xiong, W.C., and Mei, L. (2010). To build a synapse: signalingpathways in neuromuscular junction assembly. Development 137, 1017-1033.
38.  Zhang, F., Vierock, J., Yizhar, O., Fenno, L.E., Tsunoda, S.,Kianianmomeni, A., Prigge, M., Berndt, A., Cushman, J., Polle, J., et al.(2011). The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell 147, 1446-1457.
【０１１６】
本開示の主題およびその利点について詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲によって定義された発明の精神および範囲を逸脱せずに、種々の変化、置換および変更を本明細書において行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されている過程、機械、製造物、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者が本開示の主題の開示から容易に理解するように、本明細書に記載されている対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施し、または実質的に同じ結果を達成する既存のまたは後に開発される過程、機械、製造物、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用できる。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような過程、機械、製造物、組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことを意図する。
【０１１７】
その開示が、参照によりすべての目的のために全体として本明細書に組み込まれる特許、特許出願、刊行物、製品の記載およびプロトコルがこの出願を通して引用されている。
【図１−１】
2018531012.tif 000006
【図１−２】
2018531012.tif 000007
【図２】
2018531012.tif 000008
【図３−１】
2018531012.tif 000009
【図３−２】
2018531012.tif 000010
【図３−３】
2018531012.tif 000011
【図４−１】
2018531012.tif 000012
【図４−２】
2018531012.tif 000013
【図４−３】
2018531012.tif 000014
【国際調査報告】
2018531012.tif 000015
2018531012.tif 000016