(57)【要約】  本明細書は、腫瘍性製剤（neoplastic formulations）を含む種々の組成物、およびそれらの使用方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
即時使用可能なビンクリスチン組成物であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相、
前記第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、および、
前記リポソーム相内にてカーゴとして被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）安定化水溶液、
を含み、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
即時使用可能なビンクリスチン組成物。
【請求項２】
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記リポソーム相がスフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記連続した水相のｐＨが、約５〜約８．８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが加水分解抵抗性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
薬剤が、前記連続した水相中よりも前記安定化水溶液中においてより安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
哺乳類においてがんを治療する方法であって、請求項１に記載の組成物の治療量を、それを必要とする前記哺乳類へ投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記がんが、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ビンクリスチンが、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類におけるがんの再発を治療する方法であって、前記哺乳類へ請求項１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記がんの再発が、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類が、以前に少なくとも１回の多剤併用レジメン（multi-agent combination regime）を受けたことがある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
リポソームで被包された前記ビンクリスチンが、少なくとも１つのさらなる化学療法薬と同時投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
リポソーム中においてビンクリスチンを安定化する方法であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相内にてリポソーム相を分散することを含み、
前記リポソーム相は、前記リポソーム相内にて被包された安定化水溶液を含有し、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
方法。
【請求項２７】
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記リポソーム相が、スフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記連続した水相のｐＨが、約５〜約８．８である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記リポソームが加水分解抵抗性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
薬剤が、前記連続した水相中においてよりも前記安定化水溶液中においてより安定である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ビンクリスチンのような化学療法薬のリポソーム製剤は、それらの非カプセル化形態よりも有意な抗がん臨床的有用性を提供し得る。製剤ナノ粒子処方は、インビボにおける薬物滞留性の延長、より長い薬物動態学的な半減期、および腫瘍部位における蓄積量の増加を可能にすることができる。これは、臨床成績の改善とも言い換えることができる。これらの特性はビンクリスチンのような細胞周期特異的薬剤に対して特に誘因性であり得、細胞有糸分裂の間にチューブリン結合を破壊する。劇的なリポソーム由来の優位性は、用量キャップによらずに硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（ＶＳＬＩ）を強力に投与する能力において強調され、薬剤投与量の増加を可能にさえすることができる。一方で、重大な用量を制限するニューロパソジカルな（neuropathogical）毒性を避けるため、非カプセル化ビンクリスチンを用量キャップにより処方してもよい。
【０００２】
リポソーム製剤の有効性は、治療薬を保持するリポソームの能力、および活性薬剤の化学安定性を維持するリポソームの能力にあるように思われる。例えばＶＳＬＩなどにおいて、スフィンゴミエリンコレステロールで構成されるリポソームが使用される場合、これらの加水分解抵抗性リポソームは治療上有意義な薬剤保持時間を可能にすると考えられている。しかしながら、ビンクリスチンの化学不安定性はＶＳＬＩの有効時間安定性を制限し得る。Marqibo（登録商標）に対する安定性研究は、室温における構成の２４時間以内に起こったＶＳＬＩ分解を示しているように思われる。現在の認可ＦＤＡ表示は、構成後２４時間以内の投与を要求している。ＶＳＬＩに見られる長期間安定性の限界の結果として、これは投与の直前に薬局で調製される。
【０００３】
名目上は安定性である即時使用可能な製剤形態を達成することができないため、硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（０．１６ｍｇ／ｍＬ）（ＶＳＬＩ）は、Marqibo（登録商標）キットの一部として供給される３つの製剤成分から薬局にて構成される。３つの製剤成分とは、硫酸ビンクリスチン注射（ＶＳＩ、米国薬局方）、スフィンゴミエリンコレステロールリポソーム注射（ＳＣＬＩ）、およびリン酸ナトリウム注射（ＳＰＩ）である。３つの構成成分キットは、少なくとも２４ヶ月間の有効期間安定性を有する組成を提供する手段として選択した。キットの安定性は、２〜８℃にて最短有効期限を有する、例えば硫酸ビンクリスチン注射などのキット成分によって管理されてもよい。
【０００４】
したがって、薬局にて多段階の配合を行うのを避けるため、即時使用可能な製剤形態を開発することが望ましくあり得る；これは、Marqibo投与の容易性を強化し、付属機器、例えば結晶水浴（constitution water bath）を入手する必要をなくし、そして薬物調剤ミスの可能性を最小限に抑えるであろう。生成物の安定性は、ビンクリスチン、主にＮ−デスホルミルビンクリスチン（ＮＦＶ、N-desformylvincristine）の組成物の分解によって制限されている。これはＶＳＬＩおよびさらにＶＳＩの、最大の単一分解物（Marqiboキットの構成成分）であると思われる。経時的なこの不純物の増加により、２４ヶ月の使用期限を有するMarqiboキットおよびＶＳＩの両方が導かれる。
【０００５】
ビンクリスチンとは、ツルニチニチソウ（Vinca rosea）という植物の葉から単離された二量体のインドールジヒドロインドール（indoledihydroindol）化合物である。アルカロイドはベルバナミン（velbanamine）種に架橋したＮ−デスメチル−Ｎ−ホルミル−ビンドリン部分で構成される。これはその塩形態において最も安定すると思われる。塩は理論量の酸をアルカロイド遊離塩基の溶液へ加えることによって容易に調製されるが、しかしながら上述の通り、ビンクリスチン塩でさえも安定性に限度がある（４℃で２４ヶ月）。硫酸ビンクリスチンのＮ−脱ホルミル化（N-deformylation）は、ビンクリスチンの顕著な分解経路である。Ｎ−ホルムアミドは緊張したビンドリンヘテロ環のＮ１窒素に位置し、同様にアミドのカルボニル機能を求核攻撃または加水分解のいずれかに対して脆弱である位置まで膨張させる。その他の少数の分解経路としては、ビンクリスチンの加水分解変換（４−脱アセチル化、または脱炭酸反応後の１８’におけるメチルエステルの減少など）が挙げられる。
【０００６】
ビンクリスチンのこの不安定性は、ＶＳＩの米国薬局方導入者であるEli Lillyまで遡り、安定した非カプセル化ビンクリスチン製剤の開発を妨害し続けている。Lillyは硫酸ビンクリスチン注射の凍結乾燥（freeze dried）または冷凍乾燥（lyophilized）製剤の開発を求めていた。ビンクリスチン分解は、硫酸ビンクリスチンを含有する即時使用可能な溶液に有利なこれらの組成の放棄をもたらすと考えられる。ビンクリスチンは、温度、酸、および光ストレスに感受性がある。これらはその他の関連する不純物と同様に、Ｎ−デスホルミルビンクリスチン種に対して分解をもたらす。空気酸化は寄与体であり得、組成物が不純物を分解するため、乾熱滅菌がＶＳＬＩまたはＶＳＩと両立することはできないことが示されてきた。
【０００７】
ビンクリスチンの構造の複雑性、および二量体のしばしば予測不可能な化学物質感受性はこれまで、製剤処方のための一般的な種類の賦形剤の使用についての悩みの種であった。Eli Lillyの科学者は、塩化物イオンの存在が「腫瘍退縮性のビンカ二量体に対する有害作用」を有し得るため最小化されるべきであることをＶＳＩの処方開発において述べた。薬剤処方における塩化物イオンの有害な労力（Deleterious efforts）はまれである。塩化ナトリウムは所望の等張性の特性を提供するため製剤処方において広く使用されている。ドキソルビシンおよびビンクリスチンはどちらも０．４５％の含水塩化ナトリウムとリンゲル液との混合物中において２５℃〜３７℃で急速に分解することが、あるレポートによって主張されている。塩化物イオンはまた、等張剤として塩化ナトリウムを含有する眼科製剤中のチメロサール（抗真菌薬）の不安定性とも結びつけられる。これらの知見は独特かつ極端なビンクリスチンの化学物質感受性を強調している。
【０００８】
貯蔵期間が延長可能なMarqibo（登録商標）のための即時使用可能な製剤形態を開発できないことによってＶＳＬＩを投与する代替法の研究がなされ、３バイアルキットの開発が導かれた。Marqibo（登録商標）の投与（薬局での構成を伴う）のための３バイアル構造プロセスは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１２年８月に販売が承認された。
【０００９】
即時使用可能な組成の開発は、Marqibo（登録商標）投与にとって有意な改善となるであろう。Inex（Marqibo導入者）によって、冷凍乾燥、イオン透過孔装填、および／またはマンガンもしくは硫酸マグネシウムリポソーム（magnesium sulfate liposome）装填台を用いたＶＳＬＩ製剤の安定性を改善するための研究が提唱された。これらの提案は、リポソームがｐＨ勾配法と比べてより穏やかであるかまたは電気的中性となることが主張された、第２世代のカプセル封入法の使用に基づいた。しかしながら、安定性の即時使用可能な製剤形態がMarqiboの開発期間中に達成されることは一切なかった。ＶＳＬＩの即時使用可能な製剤形態は依然として必要とされ続けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの実施形態として、以下を含む即時使用可能なビンクリスチン組成物が挙げられる：第１水性緩衝液を含む連続した水相、第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、およびリポソーム相内にてカーゴとして被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）安定化水溶液（安定化水溶液は、第２水性緩衝液、および第２水性緩衝液内にて分散した安定化したビンクリスチンを含む；第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができ、安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンはビンクリスチンを安定化する；ならびに、連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する）。
【００１１】
いくつかの実施形態として、以下を含むリポソーム中においてビンクリスチンを安定化する方法が挙げられる：第１水性緩衝液を含む連続した水相内にてリポソーム相を分散すること（リポソーム相は、リポソーム相内にて被包された安定化水溶液を含有する；安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化ビンクリスチンを含む；第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができ、安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンはビンクリスチンを安定化する；ならびに、連続した水相および安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する）。
【００１２】
いくつかの実施形態として、以下を含む組成物の治療量を投与することを含む、哺乳類においてがんを治療する方法が挙げられる：第１水性緩衝液を含む連続した水相、第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、およびリポソーム相内にてカーゴとして被包された安定化水溶液（安定化水溶液は、第２水性緩衝液、および第２水性緩衝液内にて分散した安定化したビンクリスチンを含む；第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができ、安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンはビンクリスチンを安定化する；ならびに、連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、硫酸ビンクリスチンリポソーム製剤のための被包化メカニズムの再現である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書は、安定性を強化した硫酸ビンクリスチンリポソーム注射のための即時使用可能な製剤に関する組成物および方法について開示する。いくつかの実施形態は、現在のＶＳＬＩ製剤にて使用されるクエン酸緩衝液を硫酸アンモニウム緩衝液（ＡＳ）と置き換えること、および安定した硫酸ビンクリスチン種の濃度を増加させる多重のリポソーム膜ｐＨ平衡を作成することによって、達成された（図１を参照されたい）。相補的な外部ｐＨ緩衝液と組み合わさった硫酸アンモニウムはＮ−デスホルミルビンクリスチンに対するビンクリスチンの分解を緩和し得る一方で、スフィンゴミエリンコレステロールリポソームの構造的および力学的な統合性を維持することができる。これにより、膜貫通式の方法によってビンクリスチンを効率的に装填および保持することが可能となり得る。いくつかの実施形態は、様々な種類のリンパ腫を治療する方法（非ホジキンリンパ腫の再発形態を治療する方法など）に関する。典型的に、本開示に基づく薬剤を安定化するための即時使用可能な組成物は、連続した水相、連続した水相中にて分散したリポソーム相、およびリポソーム相内にてカーゴとして被包された安定化水溶液を含み得る。
【００１５】
連続した水相は第１水性緩衝液を含み得る。第１緩衝液はビンクリスチンを安定化することができ、ビンクリスチンの被包促進に役立てることができる。例えば、中性または高いｐＨ値である連続した水相（図１に図示される外部リン酸緩衝液など）は、ビンクリスチンがリポソーム膜を主に遊離塩基形態で通過することを可能にすることができる。対照的に、リポソーム中に被包された安定化水溶液は、リポソーム内の中性ビンクリスチンの量が無視できる程度であるように、ビンクリスチンの酸塩基平衡を操作する（ｄｒｉｖｅ）ため充分に低いｐＨ値を有する。例えばこれは、図１の内部リポソーム溶液に図示される、ビンクリスチン遊離塩基、硫酸ビンクリスチン、アンモニア、および硫酸アンモニウムの間の平衡によって表される。これは、より高いビンクリスチン遊離塩基濃度を有し得る連続した水相間のビンクリスチン遊離塩基の濃度勾配、および無視できる程度のビンクリスチン遊離塩基濃度を有し得るリポソーム内にて被包された安定化水溶液を提供することができる。この濃度勾配は高濃度のビンクリスチン遊離塩基を有する連続した水相からリポソーム内の安定化水溶液への遊離ビンクリスチンの遊走を操作することができ、無視できる濃度の中性ビンクリスチンを有する。ビンクリスチンの塩形態は典型的にリポソーム障壁から連続した水相へと通過しないが、中性のビンクリスチンはリポソーム障壁からリポソーム内の安定化水溶液へと通過することができるために、ビンクリスチン装填もまた操作することができると考えられている。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第１水性緩衝液には主に中性ビンクリスチンを提供するｐＨ値まで連続した水相を緩衝することができるあらゆる緩衝液、例えば、酸または塩基の抱合体（一価陰イオンの共役塩基、二価陰イオンの共役塩基、三価陰イオンの共役塩基、共役塩基、共役酸、またはこれらのあらゆる混合物もしくは組合せなど）と組合せられた塩、酸、または塩基などが含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの実施形態において、あらゆる上述の組合せが用量設定された混合物中に存在し得る。いくつかの実施形態において、緩衝液とは硫酸塩緩衝液である。いくつかの実施形態において、緩衝液とは、リン酸塩緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液）、重炭酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液などである。いくつかの実施形態において、第１水性緩衝液は主に担体溶媒であり得るか、またはリポソーム相の液体担体であり得る。
【００１７】
第１水性緩衝液は、あらゆる好適な濃度で存在し得る。例えば第１水性緩衝液は、ほぼ等張性（約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭまたは約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度など）で緩衝液を作る濃度で存在し得る。
【００１８】
リポソームは当業者によって理解される少なくとも広範な意味を包含し、またラメラ相二重層（脂質二重層など）を含む小胞またはナノ粒子も包含する。いくつかの実施形態において、リポソームまたはリポソームの層は、リポソームナノ粒子を形成するとして当業者に周知である、あらゆる物質を含む第１水性緩衝液中において実質的に不溶性である、あらゆる物質によって形成される。いくつかの実施形態において、リポソームはラメラ相脂質二重層を含む小胞を形成し得るあらゆる物質を含む。リポソームは、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン）、糖脂質、ホスホグリセリド、ポリエチレングリコール、コレステロールなどといった、脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、リポソームは、ペグ化および／または非ペグ化されたホスファチジルコリン脂質および／またはリン脂質を含む。いくつかの実施形態において、いくつかのリポソームからなる脂質成分は、リポソームの脂質二重層に対する有用な特性（例えば、弾性改善、薬剤装填改善など）をもたらし得るあらゆる脂肪酸尾部を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子またはリポソームは溶媒障壁を作成するために使用されるか、または化学勾配もしくは浸透勾配を作成するために使用される。リポソームまたはナノ粒子は、実質的に異なるｐＨ値である２つの水溶液を分離するために使用することができる。ナノ粒子はまた、実質的に同じｐＨ値である２つの水溶液を分離するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は実質的に異なる緩衝液を含む２つの溶液を分離するために使用することができる。リポソームまたはナノ粒子はまた、実質的に同様の緩衝液を含む２つの溶液を分離するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、リポソームは、どちらも実質的に異なるｐＨ値であり、実質的に異なる緩衝液を含む２つの水溶液を分離するために使用される。いくつかの実施形態において、２つの水溶液の分離によって形成された勾配は、リポソームまたはナノ粒子の装填効率を増加させることができる。いくつかの実施形態において、リポソームによって形成された層は、リポソーム相（liposome phase）、リポソームの相（liposomal phase）、または内部ナノ粒子相と記載する。
【００２０】
被包されたカーゴは、当業者によって理解される少なくとも広範な意味を包含し、リポソームの脂質二重層による周囲の水相から分離される水相を包含するべきである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、リポソームは、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化ビンクリスチンを含み得る安定化水溶液を被包する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第２水性緩衝液は、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム緩衝液、クエン酸アンモニウム緩衝液、リン酸アンモニウム緩衝液、炭酸水素アンモニウム塩緩衝液、炭酸アンモニウム緩衝液、ホウ酸アンモニウム緩衝液など）を含む安定化水溶液のｐＨを緩衝することができる、あらゆる緩衝液を含む。アンモニウム緩衝液は、最初は同様のｐＨ値を提供するその他の緩衝液と比較して低いｐＨ値にて経時的に安定化水溶液を維持することによって、ビンクリスチンを安定化するのに役立ち得ると考えられている。非アンモニウム緩衝液は経時的にそれらの緩衝能力を失い得ると考えられている。一度薬剤がリポソーム中に被包されると、リポソーム中で錯イオン遊走平衡を作り出す高濃度となり得、これは平衡していない場合ビンクリスチンの分解に寄与し得る。意外にもアンモニウム緩衝液は、最初は同様のｐＨ値であったその他の緩衝液よりもさらに安定したｐＨを維持することができる。これは、図１に図示したようなシステムのため、遊離アンモニアはリポソーム障壁を通じて逃げプロトンが残されることができ、それによって内部のリポソームｐＨ値が安定化されるという理由であり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、安定化した、治療効果のある薬剤とは安定化水溶液中にて安定化させることのできるあらゆる薬物である。いくつかの実施形態において、安定化した、治療効果のある薬剤とはビンクリスチンなどの抗がん剤であるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
ビンクリスチンは、次の化学構造式によって表すことができる。
【化１】
2018521080.tif 000002
【００２５】
ビンクリスチンはまた、次の化学名によって表すこともできる：（３ａＲ，３ａ１Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，５ａＲ，１０ｂＲ）−メチル−４−アセトキシ−３ａ−エチル−９−（（５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）−５−エチル−５−ヒドロキシ−９−（メトキシカルボニル）−２，４，５，６，７，８，９，１０−オクタヒドロ−１Ｈ−３，７−メタノ［１］アザシクロウンデシノ［５，４−ｂ］インドール−９−イル）−６−ホルミル−５−ヒドロキシ−８−メトキシ−３ａ，３ａ１，４，５，５ａ，６，１１，１２−オクタヒドロ−１Ｈ−インドリジノ［８，１−ｃｄ］カルバゾール−５−カルボキシレート。
【００２６】
いくつかの実施形態において、第２水性緩衝液は安定化水溶液内にて溶解したビンクリスチンを安定化させるために役立つ。いくつかの実施形態において、治療効果のある薬剤は、第１水性緩衝液中におけるよりも安定化水溶液おける方が実質的により安定性である。いくつかの実施形態において、ビンクリスチンは第１水性緩衝液におけるよりも安定化水溶液における方が実質的により安定性である。
【００２７】
安定化水溶液は第２水性緩衝液を含む。第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができる少なくとも１の溶質を有する塩を含むべきである。溶質がリポソーム相の外に輸送する場合、安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す。したがって、正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンはビンクリスチンを安定化することができる。リポソーム相の外に輸送することができ、正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す多くの塩が存在する。例えば、電荷的中性塩基はリポソーム相の外へ輸送することができる。したがって、中性塩基の塩（アンモニア、アミン、アミノ酸、ホスフィンなど）について、中性塩基（例えば、アンモニアまたはアミン）はリポソーム相の外に輸送することができ、塩由来のカチオンまたはヒドロニウムイオンは安定化水溶液中に残存することができる。好適な安定化塩の例としては、これらに限定されないが、アンモニアの塩、またはアミンの塩（メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、など）を挙げることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、治療効果のある薬剤は、アンモニウム塩によって第２水性緩衝液中にて実質的に安定化される。いくつかの実施形態において、硫酸アンモニウム緩衝液はデスホルミルビンクリスチンに対するビンクリスチンの分解率を実質的に減少させる。いくつかの実施形態において、硫酸アンモニウムは脱ホルミル化に対してビンクリスチンを実質的に保護する。いくつかの実施形態において、アンモニウムイオンの存在は脱ホルミル化に対してビンクリスチンを実質的に保護することができる。いくつかの実施形態において、アンモニウムイオンの溶液への主な寄与体は硫酸アンモニウムである。いくつかの実施形態において、あらゆるアンモニウム塩緩衝液は脱ホルミル化に対してビンクリスチンの保護に寄与してもよい。
【００２９】
第２水性緩衝液は、安定化水溶液中にビンクリスチンの安定化に役立ち得るｐＨ値で存在してもよい。いくつかの実施形態において、第２水性緩衝液（例えば、硫酸アンモニウムといったアンモニウム塩など）が存在していてもよい。請求項１に記載の組成物は、アンモニウム塩が第２水性緩衝液中に、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、連続した水相または第１水性緩衝液は、約ｐＨ５〜約ｐＨ８．８、または約ｐＨ９、約ｐＨ５〜約ｐＨ６、約ｐＨ６〜約ｐＨ７、約ｐＨ７〜約ｐＨ８、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．８、または約ｐＨ９、約ｐＨ７．２〜約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．４〜約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．８〜約ｐＨ８、約ｐＨ８〜約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．２〜約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．４〜約ｐＨ８．８、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．４、約ｐＨ８であるか、またはこれらの値によって境界づけられたあらゆるｐＨ値、もしくはこれらの値のいずれかの間のあらゆるｐＨ値である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、安定化水溶液または第２水性緩衝液は、約ｐＨ３〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ３〜約ｐＨ４、約ｐＨ３．５〜約ｐＨ４．５、約ｐＨ４〜約ｐＨ５、約ｐＨ４であるか、またはこれらの値によって境界づけられたあらゆるｐＨ値、もしくはこれらの値のいずれかの間のあらゆるｐＨ値である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、連続した水相と安定化水溶液との間、または第１水性緩衝液と第２水性緩衝液との間のｐＨ値の差異またはΔｐΗは、１ｐＨ単位〜約４ｐＨ単位、約２ｐＨ単位〜約３ｐＨ単位、約１．５ｐＨ単位〜約２．５ｐＨ単位、約２．５〜約３．５ｐＨ単位、約３ｐＨ単位〜約４ｐＨ単位、約３．８ｐＨ単位であるか、またはこれらの値によって境界づけられたあらゆる差異、もしくはこれらの値のいずれかの間のあらゆる差異である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ΔｐΗはリポソーム被包効率を高めるために役立ち得る。いくつかの実施形態において、有用なリポソーム装填を達成するために役立つΔｐΗは、約１ｐＨ単位〜約４ｐＨ単位、約２ｐＨ単位〜約３ｐＨ単位、約１．５ｐＨ単位〜約２．５ｐＨ単位、約２．５ｐＨ単位〜約３．５ｐＨ単位、約３ｐＨ単位〜約４ｐＨ単位、約３．８ｐＨ単位であるか、またはこれらの値によって境界づけられたあらゆる差異、もしくはこれらの値のいずれかの間のあらゆる差異である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、リポソームの活性成分の装填は、膜貫通電位差装填と記述することができる。いくつかの実施形態において、電位は上述のプロトン勾配によって作成され、これによりリポソーム内の治療薬の蓄積がもたらされる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ΔｐΗ、使用する緩衝液、およびリポソームの組合せにより、治療効果のある薬剤の良好な装填のために必要とされる特性、および治療効果のある薬剤の分解を最小化する特性の両方の均衡が得られる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、開示した組成物は硫酸アンモニウム緩衝液を包含し、これは安定した硫酸ビンクリスチン種の濃度増加をもたらす多重リポソーム膜ｐＨ平衡を作り出すことができる（図１を参照されたい）。相補的な外部ｐＨ緩衝液によって調節されるイオン移動と組合せられた硫酸アンモニウム平衡の開示したリポソーム製剤の使用は、驚くべきことにＮ−デスホルミルビンクリスチン（ＮＦＶ）に対するビンクリスチンの分解を緩和するが、リポソームの構造的及び動的完全性を維持して、膜貫通式の方法によるビンクリスチンの効率的な装填および保持を可能とする。
【００３７】
Ｎ−デスホルミルビンクリスチンは次の構造式によって表すことができる。
【化２】
2018521080.tif 000003
【００３８】
Ｎ−デスホルミルビンクリスチンはまた、次の化学名によって表すこともできる：（３ａＲ，３ａ１Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，５ａＲ，１０ｂＳ）−メチル４−アセトキシ−３ａ−エチル−９−（（５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）−５−エチル−５−ヒドロキシ−９−（メトキシカルボニル）−２，４，５，６，７，８，９，１０−オクタヒドロ−１Ｈ−３，７−メタノ［１］アザシクロウンデシノ［５，４−ｂ］インドール−９−イル）−５−ヒドロキシ−８−メトキシ−３ａ，３ａ１，４、５、５ａ、６、１１，１２−オクタヒドロ−１Ｈ−インドリジノ［８、１−ｃｄ］カルバゾール−５−カルボキシレート。
【００３９】
ＮＦＶは、勾配が存在する場合（すなわち、内部のｐＨ４および外部のｐＨ７．５）、または外部および内部ｐＨが同一である場合（すなわち、ｐＨ４）でさえ、しばしば形成され得る。これは、ビンクリスチン種（不可逆的な脱ホルミル化反応に感受性であり得る）がリポソーム内部で形成され得るということを示し得る。ひとつの可能性のある種は中性ビンクリスチンであり、ビンクリスチン分解経路に対して感受性があり得る。現在開示されている組成物のひとつの優位性は、リポソーム内にて分解に感受性のあるビンクリスチン種の形成を最小化するそれらの能力である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書にて開示した組成物を、がん治療のためまたは再発したがんの治療のために哺乳類へ投与することができる。いくつかの実施形態において、がんはリンパ腫または白血病を含む。いくつかの実施形態において、哺乳類は以前にがん治療の経験があってもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書にて開示した組成物は哺乳類において新生物を治療するための方法に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示した組成物は、哺乳類において新生物の再発形態を治療するための方法に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示された組成物は、様々な種類のリンパ腫を治療するための方法に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示された組成物は、非ホジキンリンパ腫を治療するために投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示された組成物は、非ホジキンリンパ腫の再発の治療のために投与することができる。
【００４２】
新生物という用語は、本明細書にて使用される場合、当業者によって理解される少なくとも広範な意味を包含し、細胞、腫瘍、悪性滲出液、嚢胞などのあらゆる異常増殖もまた包含する。新生物の例としては、種々の細胞型、これらに限定されないが、新生細胞、内皮細胞、または免役学的な細胞（白血球細胞、骨髄細胞、リンパ細胞など）を挙げることができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、治療される新生物はがんである。
【００４４】
組成物が硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（ＶＬＳＩ）であるいくつかの実施形態において、組成物を、がんまたは再発したがんを治療するため哺乳類へ投与することができる。組成物は、約１ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２、約２ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２、約２ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２、約２ｍｇ／ｍ２、約１．５ｍｇ／ｍ２、約２．２５ｍｇ／ｍ２、約２．５ｍｇ／ｍ２、約３ｍｇ／ｍ２、約２．０ｍｇ／ｍ２、約２．１ｍｇ／ｍ２、約２．２ｍｇ／ｍ２、約２．３ｍｇ／ｍ２、約２．４ｍｇ／ｍ２、または約１．９ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、ＶＬＳＩは他の治療用化合物と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ＶＬＳＩは他の抗悪性腫瘍薬と組み合わせて投与される。
【００４５】
実施例１：低遊離薬剤含量、透析Marqibo製剤
硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（ＶＳＬＩ）の安定性はＮ−デスホルミルビンクリスチン（ＮＦＶ）に対するその分解に反映される。ＶＳＬＩは、３バイアルキット製剤からなる場合、ビンクリスチンの電位分解のため２４時間以内に投与することが必要とされ得る。ＶＳＬＩの調製はまた、５％以下の遊離ビンクリスチンを常に達成する。遊離ビンクリスチンは外部ｐＨ７．４の緩衝環境（buffer environment）中に存在するであろう。しかしながら、ビンクリスチンはその塩形態（ｐＫａ５．０および７．４）において最も安定し、ｐＨ７．４では平衡がｐＨ４．０のリポソーム内部と比較して塩形態に対してあまり好ましくないと考えられている。これは、遊離ビンクリスチンがＮＦＶの形成、およびそのＶＳＬＩの総合安定性に対する影響にどの程度寄与したかを試験するために有用であり得る。
【００４６】
ＶＳＬＩは、Marqiboキットと等価の成分、すなわち、ＶＳＩ、ＳＰＩ、およびＳＣＬＩから調製した。遊離（非被包）ビンクリスチンは、異なるｐＨ条件下において種々の緩衝液を用いて透析することによって除去した。変異体を最高で１２週間安定させ、判断基準を示す主要なＶＳＬＩ安定性について評価した。変動により以下の外部緩衝液を用いて透析を試験した。
（ａ）リン酸緩衝スクロース液、ｐＨ７．４
（ｂ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４
（ｃ）リン酸緩衝スクロース液、ｐＨ４．０
（ｄ）リン酸緩衝スクロース液、ｐＨ５．０
【００４７】
ｐＨ４．０〜７．４の外部緩衝液を用いる外部ビンクリスチン遊離ＶＳＬＩの調製
キット成分由来の３つの別々のＶＳＬＩ被包を行い（各３１ｍＬ）、プールした。装填後の試料を分析のために除去し、残存する試料の量を４つに分けた（各およそ２１．７５ｍＬ）。これらの試料を、Spectrapor No.1（幅４０ｍｍ、６〜８ｋＤａ  ＭＷＣＯ）の透析膜バッグに設置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸緩衝スクロース液（ｐＨ７．４）のいずれかを用いて、光から保護しながら室温で２４時間にわたり４体積交換することで、２０体積超過に対して透析した。調製したＰＢＳは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウムを含有し、ｐＨは７．４であった。リン酸緩衝スクロースは、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有し、ｐＨは７．４であった。透析後、同一の緩衝液由来の試料を一緒にプールし、無菌状態下において使い捨て注射器フィルター（Pall Acrodiscs、孔径０．２μｍ、Supor膜）を用いて滅菌ろ過し、そして個別の滅菌した管（４．２ｍＬ）に安定性研究の各時点（２〜８℃で、０、２、４、８、１２週間；室温で２、４、８、１２週間、および４０℃で２週間）で分注した。
【００４８】
ｐＨ４およびｐＨ５の外部緩衝液による外部のビンクリスチンを含有しないＶＳＬＩの調製
予備小規模評価
初期検査研究を実施して、低ｐＨ条件下におけるMarqiboの透析が実際に発生したかどうかを確認した。計８ｍＬのＶＳＬＩ生成物を上述のMarqiboキットバイアルから調製し、装填後の物質を、Spectrapor No.1（幅２０ｍｍ、６〜８ｋＤａ  ＭＷＣＯ）透析膜バッグ中にて２０体積超過に対して透析するため、ｐＨ４、５、または６のいずれかであるＳＰＩ溶液を用いて光から保護しながら２〜８℃で２４時間にわたり４体積交換することで、２ｍＬの分注量に分けた。透析後の試料を遊離ビンクリスチン含量（表１）について分析した。これにより、低ｐＨの外部緩衝液による透析が可能であることを示す。
【表１】
2018521080.tif 000004
【００４９】
透析変異体のスケールアップ
ＶＳＬＩ生成物の５０ｍＬ溶液を上述のMarqiboキットバイアルから調製した。装填後の生成物量を２つに分け、その各々半分をSpectrapor No.1（幅４０ｍｍ、６〜８ｋＤａ  ＭＷＣＯ）透析膜バッグ中へ設置し、２０体積超過に対してｐＨ４または５のいずれかであるリン酸緩衝スクロース液を用いて、光から保護しながら２〜８℃で７２時間にわたり４体積交換することで透析した。透析後の試料を収集し、滅菌ろ過し、個別の滅菌した管（３．５ｍＬ）に安定性研究の各時点（２〜８℃で、０、２、４、８、１２週間、および室温で２、４週間）で分注した。
【００５０】
安定性分析プロトコル
各安定性時点にて、試料を以下について分析した：ｐＨ（Beckman Phi 360 pH meter）、重量モル浸透圧濃度（Wescor Inc., Vapro 5520 vapor pressure osmometer）、粒径、総量および遊離ビンクリスチン、ならびに薬剤関連不純物。
【００５１】
結果
３バイアル製剤から調製されたＶＳＬＩの外部緩衝液から遊離ビンクリスチンの除去をもたらす安定性が、表２に示される。遊離ビンクリスチンの除去はＶＳＬＩ安定性を改善するようには考えられなかった。４週間以内に、ＮＦＶの量が４℃で倍加し、８週間までには全ての緩衝液およびｐＨ変異体に対する分解率が１．３％ＮＦＶ／月超となった。ビンクリスチン総量はＮＦＶ形成と同時に減少した。遊離外部ビンクリスチンを伴わないＶＳＬＩもまた、薬剤が室温でより急速に分解される周知のビンクリスチン化学分解特性に従って、２週間以内にＮＦＶ比率を倍加した。これらの分解率は、ＮＦＶに対するビンクリスチン分解のため２４時間の構成の内にＶＳＬＩを投与する必要をもたらした、３バイアルMarqiboキット安定性に対して４℃で観測された１．６％ＮＦＶ／月と同様である。
【００５２】
これらの透析研究による結果は、ＶＳＬＩの安定性操作はＮ−デスホルミルビンクリスチン（ＮＦＶ）の形成が担うことを確証させた。ＶＳＬＩの有効期限は、どの程度急速にＮＦＶが３．０の規格限界を超えるレベルまで増加するかによって決定される。ビンクリスチン総量の減少は、観測されたＮＦＶの増殖と相関する。不純物の総量はＮＦＶの増殖とは不釣合いに増加しなかった。これは総不純物割当（total impurity assignment）に含まれている。新規の不純物は観測されなかった。全ての変異体は、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、および粒径に対する許容ＶＳＬＩ判断基準以内のままであり、規格を超える傾向はこれらの判断基準に対して一切観測されなかった。そのうえ、マンニトール（３バイアル製剤に存在する）に対する等張剤としてのスクロースの置換は、ビンクリスチンの分解率に何ら効果を有しなかった。
【００５３】
さらに、表２に示される結果は、ｐＨ４およびｐＨ５の緩衝液を用いた透析による遊離ビンクリスチンの除去はリポソーム膜の完全性を変化させなかったことを実証した。ΔｐΗ勾配の規模の変更はリポソーム含量の漏洩を引き起こさなかった（予想していた通りに、ｐＨ装填勾配が損なわれていた場合）。遊離ビンクリスチンは、長期間に渡り全ての変異体において絶えず低いままであった。
【表２】
2018521080.tif 000005
これらの透析研究の結果は、遊離外部ビンクリスチン分解が、観測されたＶＳＬＩの安定性の決定において重要な役割を担っていないことを実証しており、またこれは、ＶＳＬＩの安定性全体に対するマイナーな方法におそらく寄与する傾向がある。これらの結果は、ビンクリスチンの分解が３バイアルキットから調製したＶＳＬＩの構成後にリポソーム内部で発生していることを示している。リポソームの内部と外部との間のΔｐΗ勾配の維持、またはＶＳＬＩのΔｐΗの除去（もしくは最小化）は、３バイアル製剤に対するリポソーム内部のビンクリスチンの安定性を改善しない。
【００５４】
実施例２：硫酸アンモニウムＶＣＲリポソーム変異体
Marqiboは、Marqibo Kit構成成分（ＶＳＩ、ＳＣＬＩ、およびＳＰＩ）を薬局で一緒にインキュベートすることにより構成される。硫酸ビンクリスチン（弱塩基）は、内部ＳＣＬＩのｐＨ値４．０と得られるリポソーム外部ＳＰＩ緩衝液のｐＨ値７．４とのｐＨの差異によって、作成される膜貫通型勾配の反応によりリポソーム内へ装填される。装填プロセスの間、ビンクリスチンの中性型だけがリポソーム膜を通過し、クエン酸塩としてＳＣＬＩ内部に補足される。クエン酸緩衝液によるこの装填は９５％超のビンクリスチン装填を提供する。しかしながら、一度構成されると、リポソーム内部ｐＨが４．０（塩種としてビンクリスチンを維持するべきである）であっても２４時間以内にＮＦＶの増殖が発生するように、内部クエン酸ビンクリスチンは中程度に不安定である。上述の初期遊離薬剤透析実験から、ビンクリスチンの分解は、外部ビンクリスチン（ｐＨ７．４）環境またはリポソームからのビンクリスチン漏出いずれからでもなく、リポソーム内部に発生するものと考えられる。内部リポソームにおけるクエン酸緩衝液能力は非効率的であり、プロトンおよび溶質イオンがリポソームの内部ｐＨ４．０緩衝液を不安定化する程に膜を通過して移動することを可能にし得るということが考えられる。この可能性を試験するため、リポソーム内部のクエン酸ナトリウム緩衝液を代替の「装填電池」と置換した。一連の実験は、内部リポソーム緩衝液が硫酸アンモニウム溶液（ＡＳ）である条件で行った。２５０ｍＭの硫酸アンモニウムのｐＨは約５．５である：しかしながら、リポソーム内部では、アンモニアとアンモニウム塩との間の解離平衡によって、中性のアンモニア分子がリポソーム膜を通過することが可能となり、後に残された水素イオンの結果として内部ｐＨを効果的に低下させる。得られる内部ｐＨは約４である。この平衡状態は、Marqiboのリポソーム環境内部におけるクエン酸ナトリウム−クエン酸平衡状態よりも良好な塩形態として硫酸ビンクリスチンを維持することができる。これらの実験において、外部ｐＨは５．５〜８の間で変化し、約４．０の内部ｐＨを維持した（上述のアンモニア／アンモニウム平衡状態の結果として）。モル濃度または緩衝容量は２５０〜３５０ｍＭのＡＳの間で変化し、重量モル浸透圧濃度全体に寄与する等張性の構成成分はポリオールおよびイオン性塩を用いて変化した。全ての実験において、リポソームはＳＣＬＩと本質的に同一の組成におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールから構成された。変化はクエン酸緩衝液の硫酸アンモニウム緩衝液との置換だけであった。
【００５５】
リポソーム調製単位プロセス
本実施例は、スフィンゴミエリンコレステロールリポソーム生成に使用される一般的な方法を説明する。
【００５６】
標的リポソーム成分調製計算
Marqiboリポソーム膜はスフィンゴミエリン（ＳＭ）およびコレステロール（ＣＨ）を重量配分比２．５：１で含有し、ここでは最終生成物ＶＳＬＩが２．３７ｍｇ／ｍＬのＳＭを含有する。
【００５７】
これらの実験において、プロセスを容易にするため、および薬剤装填ステップのため充分に濃縮させるため、非薬剤装填リポソーム変異体に対する標的濃度は４３ｍｇ／ｍＬのＳＭで選択した。
【００５８】
リポソーム調製単位プロセスは次のとおりである：７０ｍＬの最終生成物の標的に対する。
【００５９】
１．水和反応（リポソームの形成）
脂質の溶解。ＳＭおよびＣＨ脂質原材料を、エタノール中にて溶解する。充分なエタノールを使用して、１５．７％（ｖ／ｖ）の水和相における最終濃度を得る。上記の実施例において、３ｇのＳＭおよび１．２ｇのＣＨを秤量し、一緒に混合し、１３ｍＬで２００プルーフのエタノール中にて溶解する。溶解は、エタノール脂質混合物を密封した容器中において７５℃で透明なエタノール溶液が得られるまで温めることによって達成する。
【００６０】
水性水和反応。上で調製した脂質溶液は、事前に水浴中で６５℃に平行化されているエタノール脂質溶液を水相へ急激に注ぐことによって「水和されている」。本実施例では、リポソーム製剤によって被包される対象の溶質を含有する、７０ｍＬの水相を使用した。例えば、３５０ｍＭの硫酸アンモニウムまたは関連する塩である。得られる混合物を撹拌しながら０．５〜１時間インキュベートして、脂質を完全に水和させる。脂質のエタノール溶液が水相と混合される場合、エタノール溶媒は急激に希釈されることで脂質が水へと曝され、これによって不均質な大きさの分布でリポソーム小胞を同時に形成する脂質がもたらされる。水和反応は、水分子が分子の親水部分と完全に会合することを確実にする。
【００６１】
２．小型化
リポソームの形成に続き、小胞は均一かつ好ましい粒子直径（この場合、約１００ｎｍ）を有するリポソームの集合を作成するような大きさに作成される。これは、上述のステップ１にて作成したリポソーム懸濁液を圧力下にて所定の孔径の膜を通じて押出することによって、達成される。押出は６５℃で行われ、膜の孔を通じたリポソームの通過は水和反応から残存するエタノールによって促進される。この処理を行うことによって、リポソームは使用した膜の孔の直径にほぼ一致する。これらの研究では、総容積１００ｍＬを有することのできるLipex押出器（Northern Lipids）を使用し、リポソーム懸濁液は、窒素ガスを用いて１００〜４００ｐｓｉの圧力で、孔径０．２μｍ（流路３ヶ所）および０．０８μｍ（流路５ヶ所）の２５ｍｍ直径ポリカーボネート膜を通過した（Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes）。リポソーム粒径は、動的光散乱法（Brookhaven Instruments Corporation）を使用するZetaPALS分粒器によって測定する。
【００６２】
３．外部緩衝液交換
この段階では、外部水相（例えば、３５０ｍＭの硫酸アンモニウム溶液）を、透析またはダイアフィルトレーションによって１０％のスクロース液、またはＳＰＩといったその他所望の緩衝液と交換し、同時にエタノールを除去する。このプロセスはリポソーム勾配（すなわち、リポソームン内部の硫酸アンモニウム緩衝液およびリポソーム外部の１０％のスクロース緩衝液）を確立する。硫酸アンモニウムはアンモニウムと硫酸イオンとに水性媒体中で高度に解離される。荷電イオンであるためこれらはリポソーム膜を通過することができないが、しかしながらアンモニウムイオンはまた水とアンモニアとの平衡状態にもあり、アンモニアは中性ガスとしてリポソーム膜を通過することができる。アンモニア分子がリポソーム内部を離れる時、プロトンが後に残される（リポソーム膜内部のｐＨを約４まで低下させる）。これは、リポソーム内部が約ｐＨ４．０であり、外部が交換緩衝液（例えば、７．４）のｐＨであるΔｐΗ勾配を確立する。この勾配を使用してビンクリスチンをリポソーム中へ装填する。ダイアフィルトレーションプロトコル（生成物量５０ｍＬ超に対する）は、QuixStandダイアフィルトレーションシステム（GE Healthcare Life Sciences）に接続された、MidGeeカートリッジ（モデルＵＦＰ−３００−Ｅ−３ＭＡ、３００，０００ＭＷＣＯ）を用いて、緩衝液の１５体積を交換した。透析（生成物量５０ｍＬ未満に対する）は、リポソーム懸濁液を６〜８０００のＭＷＣＯであるSpectrum Spectrapore分子多孔質膜中へ設置すること、およびそれを２０体積超過緩衝液中にて室温で懸濁させることからなり、外部緩衝液は１日の間に４回交換する（一晩に渡る１回の交換を含む）。次の外部緩衝液交換は、各ダイアフィルトレーション後調製のＳＭ含量はStewartリン脂質コリンアッセイを用いて測定した。
【００６３】
４．薬剤装填
薬剤装填を、ＶＳＬＩ処方薬対脂質比を用いて実施して、所望の総容積を達成する。ＶＳＬＩ装填混合物は０．１６ｍｇ／ｍＬのビンクリスチン、２．３７ｍｇ／ｍＬのＳＭ（リポソーム調製など）のための標的であり、所望の実験変異体に使用される外部リポソーム緩衝液によって所望の総容積まで調節される。装填は、外部緩衝液、薬剤、およびリポソーム溶液（室温まで予備平衡化した）を混合し、混合物を１０分間６５℃で水浴中にて穏やかに混合しながらインキュベートすることによって実施する。その後、混合物を水浴から除去して室温まで冷却し、２〜８℃で保管する。
【００６４】
５．滅菌ろ過およびバイアル充填
薬剤装填バルクリポソーム懸濁液は、従来法のリポソーム滅菌技術（保存に好適なバイアル中へのろ過など）によって滅菌することができる。無菌／滅菌技術は全体を通して使用され、操作はNunair Class IIのＡ型／Ｂ３型Biological Safety Cabinet中で実施される。室温でのバルク生成物は、滅菌した２５ｍｍ直径の０．２μｍ孔径Acrodisc（登録商標）シリンジフィルター、ルアーフィッティングを有する滅菌した１０ｍＬシリンジを用いるSupor（登録商標）膜（Pall Corp.）を通じてろ過する。バルクは１０ｍＬの定量で滅菌した受け取り容器へとろ過する。
【００６５】
リポソーム変異体調製は、種々のモル濃度のＡＳを内部リポソーム緩衝液として補足することによって作成した。リポソームは上述のプロセスを用いて調製した。リポソームは、４３ｍｇ／ｍＬのＳＭにおける７０ｍＬの最終水和容量およびＳＭ／ＣＨの重量配分比２．５：１となるように二通りに秤量された、スフィンゴミエリン（ＳＭ）およびコレステロール（ＣＨ）によって調製した。脂質混合物を９．５ｍＬのエタノール中にて７５℃で溶解し、エタノール脂質溶液を７０ｍＬの余熱したＡＳ溶液（６５℃）へ注ぐことによって水和し、３０分間混合して、１２％ｖ／ｖの最終エタノール濃度を作成した。このように形成したリポソームは、孔径０．２μｍのポリカーボネート膜（３ヶ所の流路）および０．０８μｍ（５ヶ所の流路）を通じてLipex押出器（Northern Lipids）中に連続的に押出することにより、サイズ分けした。続く押出では、各調製物は、ＭｉｄＧｅｅカートリッジ（モデルＵＦＰ−３００−Ｅ−３ＭＡ、３００，０００ＭＷＣＯ）およびQuixStandホルダー（GE Healthcare Life Sciences）において１５体積交換を用いて１０％のスクロース液（同時にあらゆるエタノールを除去する）中へダイアフィルトレーションした。各ダイアフィルトレーション後の調製物のＳＭ含量はStewartリン脂質コリンアッセイを用いて測定した。
【００６６】
上で調製したリポソームを用いる小規模試験薬装填は、ｐＨ５．５、６．５、もしくは７．５へ調節したＳＰＩ緩衝液、またはｐＨ５．５、６．５、もしくは７．５へ調節したリン酸緩衝スクロースのいずれかを用いて実施した。５％未満の遊離ビンクリスチンを装填する変異体をスケールアップに選択した（ｐＨ６．５、７．５のＳＰＩ緩衝液、およびｐＨ６．５のリン酸緩衝スクロースであった）。大規模装填は、以前に記載した構成手順に従って各ＡＳ変異体および緩衝液に対し実施した。得られる薬剤被包リポソーム混合物を滅菌ろ過し、安定性について、２〜８℃で、０、２、４、８、１２週間、および室温で２、４週間監視した。
【００６７】
上の実施例の項で記載した小規模硫酸アンモニウム予備実験は、ＡＳ変異体のカプセル化効率を試験した。これらの結果は、硫酸アンモニウム内部緩衝液（平衡条件下においておよそ４．０の内部リポソームｐＨ値を導く）は、外部緩衝液ｐＨが６．５以上であってポリオールを使用していなかった場合に最適なビンクリスチン装填が可能であるということを示唆している。ｐＨ５．５の外部緩衝液を用いる全ての変異体は９０％未満で装填した（明白に不十分な膜貫通型ΔｐＨ勾配を提供する）。ＰＢＳ緩衝液変異体は全て薬剤の少なくとも９５％装填した一方で、スクロースを使用した変異体は様々な結果を示した（より広範である８９〜９５％被包を示す）。２５０ｍＭおよび３５０ｍＭの緩衝能変異体はどちらも、ｐＨおよびポリオール変動で同様の被包傾向を示した。９５％以上の装填を示した全ての変異体はスケールアップし、安定性について評価した。
【００６８】
硫酸アンモニウムリポソームのスケールアップの２４週安定性結果を表３に概説する。全ての変異体は所望のＶＳＬＩ粒径および重量モル浸透圧濃度判断基準を維持した。遊離ビンクリスチンのｐＨおよび割合もまた、安定性モニタリング期間中一定のままであった。硫酸アンモニウム緩衝液はスフィンゴミエリンコレステロールリポソームの透過特性を変化させなかった。３バイアルMarqibo製剤における改善した安定性を、ｐＨ７．５の外部ＰＢＳ緩衝液を有する２５０ｍＭおよび３５０ｍＭの硫酸アンモニウムの製剤で観測した。これらの変異体について、分解率は冷蔵温度にて月毎に０．２％のＮＦＶを観測した。この割合によって製剤の有効期限を約１年間として計画することができた。さらに、不純物総量はＮＦＶ％のあらゆる増加と比例して増加したのみであった。不純物総量の全体は６％未満のＶＳＬＩ判断基準をはるかに下回るレベルを維持した。
【００６９】
ｐＨ６．５の外部緩衝液を伴う硫酸アンモニウムリポソーム、または緩衝液がポリオール等張剤（例えば、スクロース）を含有する場合は、ｐＨ７．５の変異体と比較して劣る安定率がもたらされた。これらの変異体に対する分解率は冷蔵温度で１．５〜１．８ＮＦＶ％／月の範囲にわたった（表３）；割合は現在の３バイアルクエン酸ベースキット製剤のＶＳＩ成分（表２）と同様であった。２５０ｍＭおよび３５０ｍＭの変異体はどちらも、ｐＨおよび浸透物質変化に同じ傾向を示した。そのうえ、安定性が室温で監視された全ての場合において、急速なビンクリスチン分解が見られた。冷蔵した試料だけが硫酸アンモニウム製剤で好適な安定性特性を提供した。
【００７０】
２５０ｍＭおよび３５０ｍＭの硫酸アンモニウムビンクリスチンリポソームＳＰＩ（ｐＨ７．４）製剤は、市販の即時使用可能な製剤に好適な予備的な有効期限の必要性を示す。これらはさらなる評価に対して選択した。
【表３】
2018521080.tif 000006
【００７１】
実施例３：硫酸アンモニウムＶＣＲリポソーム被包ならびに
二価イオンおよびポリオールによる安定性
一連の実験は、ＶＳＬＩ含有二価イオンまたはポリオールが被包ビンクリスチンを増強するかどうかを試験するために行われた。
【００７２】
Marqibo生成物として同一の脂質組成物を有し、２００ｍＭの硫酸マグネシウムまたは２００ｍＭの硫酸マンガンのいずれかで２００ｍＭの硫酸アンモニウムを被包する、リポソーム変異体調製物を作成した（２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、および２００ｍＭの硫酸マグネシウムまたは２００ｍＭの硫酸マンガンのいずれか）。これらの調製物の各々を１０％のスクロース中にダイアフィルトレーションし、脂質濃度を上述の通りに分析した。くわえて、リポソーム中において、ｐＨ７．４である５％のマンニトール−２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４であるＳＰＩ、およびｐＨ７．０であるＳＰＩで２５０ｍＭの硫酸アンモニウム被包するリポソームを調製した。薬剤装填は、各変異体が１０分間（標準条件）または１０分間に対して６５℃で３０分間のいずれかでインキュベートするよう試みた。
【００７３】
小規模予備実験の結果を表６に示す。Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋がリポソームの内部緩衝液中に含まれた場合、および６５℃で１０分間（標準条件）または３０分間のいずれかでインキュベートした場合の薬剤装填結果は、標準３バイアルキット構成と比較して効率的でない装填を示した。最良装填比率である６〜８％の遊離薬剤が１０分間のインキュベーションで観測されたが、クエン酸−Ｍｇ変異体は例外であり、２１％の遊離薬剤を示した。二価金属イオンの存在が、ｐＨ勾配平衡の破壊または膜透過性の崩壊のいずれかをもたらすと考えられる。
【表４】
2018521080.tif 000007
【００７４】
ＭｇＳＯ４変異体を伴う硫酸アンモニウム（装填後に６％の遊離薬剤を示した）をスケールアップし、安定性について監視した。スケールアップにおいて、この製剤変異体は、以前に観測された二価イオンの存在下における乏しいリポソーム装填効率を再確認した；３８％の遊離薬剤が構成後に観測された（表７）。この混合勾配変異体をさらに再透析によって処理して、外部遊離ビンクリスチンを除去した。続いて、再透析後の変異体を安定性について監視した。５週間の監視の間、遊離薬剤レベルはさらなる薬剤の漏洩がリポソームより発生しないことを示す定常性を保った。しかしながら、ＮＦＶに対する急速分解およびＶＣＲの減少が観測された（５週間で１２．２％のＮＦＶをもたらす）。これは２５０ｍＭのＡＳ  ＳＰＩ（ｐＨ７．４）リポソーム製剤よりも６２倍急速であった（図７）。これらの結果は、二価の硫酸塩を含有するＶＳＬＩは被包ビンクリスチンの改善した安定性を提供しないことを実証した。
【００７５】
マンニトールを有するＡＳ製剤は、０．１４％ＮＦＶ／月である非ポリオール含有製剤と比較して０．１７％ＮＦＶ／月の分解率を示した（表７）。しかしながら、９３．４％のビンクリスチンのみのその被包はポリオールを有しない製剤のそれより効率的ではなかった。
【表５】
2018521080.tif 000008
【００７６】
実施形態
実施形態１．組成物であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相、
該第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、および、
該リポソーム相内にてカーゴとして被包された安定化水溶液、
を含み、
該安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
該第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができ、該安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、該正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは該ビンクリスチンを安定化し、且つ、
該連続した水相および該安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
組成物。
【００７７】
実施形態２．リポソーム中においてビンクリスチンを安定化する方法であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相内にてリポソーム相を分散することを含み、
該リポソーム相は、リポソーム相内にてカーゴとして被包された安定化水溶液を含有し、
該安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化ビンクリスチンを含み、
該第２水性緩衝液は、リポソーム相の外に輸送することができ、安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、該正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは該ビンクリスチンを安定化し、且つ、
該連続した水相および該安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
方法。
【００７８】
実施形態３．該第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、実施形態１または２に記載の組成物または方法。
【００７９】
実施形態４．該第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、実施形態１、２、または３に記載の組成物または方法。
【００８０】
実施形態５．該リポソーム相がスフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、実施形態１、２、３、または４に記載の組成物または方法。
【００８１】
実施形態６．該第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、実施形態１、２、３、４、または５に記載の組成物または方法。
【００８２】
実施形態７．該ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、実施形態１、２、３、４、５、または６に記載の組成物または方法。
【００８３】
実施形態８．該安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、実施形態１、２、３、４、５、６、または７に記載の組成物または方法。
【００８４】
実施形態９．該連続した水相のｐＨが、約５〜約８である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、または８に記載の組成物または方法。
【００８５】
実施形態１０．該連続した水相のｐＨが、約７〜８．８である、実施形態９に記載の組成物。
【００８６】
実施形態１１．該連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、実施形態１０に記載の組成物。
【００８７】
実施形態１２．該リポソームが加水分解抵抗性である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に記載の組成物または方法。
【００８８】
実施形態１３．ビンクリスチンが、該連続した水相中においてよりも該安定化水溶液中においてより安定である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２に記載の組成物または方法。
【００８９】
実施形態１４．該連続した水相と該安定化水溶液との割合が、該２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３に記載の組成物または方法。
【００９０】
実施形態１５．該アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で該第２水性緩衝液中に存在する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に記載の組成物または方法。
【００９１】
実施形態１６．該アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の組成物または方法。
【００９２】
実施形態１７．治療量の実施形態１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に記載の組成物を、それを必要とする哺乳類へ投与することを含む、哺乳類においてがんを治療する方法。
【００９３】
実施形態１８．該がんが、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、実施形態１７に記載の方法。
【００９４】
実施形態１９．該哺乳類へ実施形態１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に記載の組成物を投与することを含む、哺乳類におけるがんの再発を治療する方法。
【００９５】
実施形態２０．該がんの再発が、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、実施形態１９に記載の方法。
【００９６】
実施形態２１．該哺乳類が、以前に少なくとも１回の多剤併用レジメンを受けたことがある、実施形態１７、１８、１９、または２０に記載の方法。
【００９７】
実施形態２２．少なくとも１つの他の化学療法薬と同時投与される、実施形態１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【００９８】
実施形態２３．該哺乳類がヒトである、実施形態１７、１８、１９、２０、２１、または２２に記載の方法。
【００９９】
実施形態２４．ビンクリスチンを脱ホルミル化から保護する方法であって、ビンクリスチンをアンモニウム塩緩衝液と混合することを含む、方法。
【０１００】
実施形態２５．該ビンクリスチンが、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の容量で投与される、実施形態２３に記載の方法。
【０１０１】
別段示されない限り、成分の定量、分子量などの特性、反応条件、および本明細書において使用される数字などを表す全ての数字、ならびに請求項は、全ての例において用語「約」によって修正されるものであると理解されたい。したがって、反対の指示が無い限り、数値パラメーターは本明細書の範囲内で説明され、そして付属する請求項は、本開示の実施形態によって得られるように求められた所望の特性に応じて変動し得る近似である。少なくとも、そして等価物の学説の適用が特許請求の範囲を制限することは意図せず、各数値パラメーターは少なくとも報告された有効桁の数を考慮して、そして一般的な端数処理技術を適用することによって解釈されるべきである。本開示の広範にわたる範囲を説明する数値の範囲およびパラメーターが近似であるものの、特定の実施例において説明される数値は可能な限り正確に報告されている。あらゆる数値は、しかしながら、それら各々の試験測定にて見出される標準偏差が必然的にもたらすいくらかの誤差を、本質的に含有する。一実施形態において、用語「約」および「およそ」とは、示された範囲の１０％以内の数値パラメーターを指す。
【０１０２】
本開示の実施形態を記述する文脈において（特に、以下の請求項の文脈において）使用される、用語「ひとつの（a）」、「ひとつの（an）」、「該（the）」、および同様の指示対象は、本明細書において別段に示されない限り、または文脈と明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含するものとして解釈されたい。本明細書における値の範囲の詳説は単に、範囲に収まる各別個の値を個々に参照するための簡潔な表現方法として機能するものである。本明細書において別段に示されない限り、個々の値は、それが本明細書において個別に参照されたかのように、本明細書に組み込まれるものである。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書にて別段に示されない限り、または文脈と明確に矛盾しない限り、あらゆる好適な順番で実施することができる。本明細書にて提供される、あらゆる例、および全ての例、または例示的な用語（例えば、「など（such as）」）の使用は、本開示の実施形態をより明らかにすることを意図するものであり、本開示の範囲を制限するものではない。本明細書における用語は、本開示の実施形態の実行に必須であるあらゆる非請求要素を示すものとして解釈するべきではない。
【０１０３】
本明細書にて開示される代替的な要素または実施形態の分類は、制限であるとして解釈されないものである。各群の構成要素は、個別に言及および主張され得るか、またはその他の群の構成要素もしくは本明細書にて見られるその他の要素とのあらゆる組合せで言及および主張され得る。群の１つ以上の構成要素が、利便性および／または特許性の理由から、群に含まれてもよく、または群から削除されてもよいということは予測されよう。あらゆるその様な包含または削除が発生する場合、本明細書は、付属の請求項にて使用される全てのMarkush群の書面による明細をそのように満たすように修正された群を含有するものと見なされる。
【０１０４】
本開示の実施形態を実行するため発明者に周知である最良の方法が含まれる、ある特定の実施形態が本明細書にて説明される。当然、これらの実施形態に対する変形は、前述の描写を読む際に、当業者には明らかであろう。発明者は、その様な変形を適切に使用する熟練の当業者を期待しており、そして発明者は本開示の実施形態が本明細書にて特に記載された方法とは別の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、本明細書に付属の請求項に記載される主題の全ての修正および等価物を、準拠法によって許可されるように含む。さらに、全ての可能性があるその変形における上述の要素のあらゆる組合せが、本明細書において別段に示されない限り、または文脈と明確に矛盾しない限り、本開示によって包含される。
【０１０５】
本明細書にて開示される特定の実施形態は、「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consisting essentially）」という用語を用いる請求項によってさらに限定されてもよい。請求項で使用された場合、申請されたか、または補正を追加されたかに関わらず、移行用語（transition term）「からなる（consisting of）」は、請求項に明記されない、あらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。移行用語「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特定の物質またはステップ、ならびに基本的特性および新規特性には実質的に影響しない特定の物質またはステップに対して、請求項の範囲を限定する。その様に主張される本開示の実施形態は、本質的にまたは明白に、本明細書にて記述され、使用可能である。
【０１０６】
なおその上に、あらゆる参照が本開示を通じて特許および刊行物に対してなされている場合、これらの参照および刊行物の各々は、それらの全体が本明細書へ個別に組み込まれる。
【０１０７】
最後に、本明細書にて開示される実施形態は本開示の原理の解説であるということを理解されたい。使用することができるその他の修正は、本開示の範囲内である。したがって、例として、しかし限定するものではないが、本開示の実施形態の代替構造が本明細書に記載の教示にしたがって利用されてもよい。したがって、本開示は、示した通り、および解説した通りに厳密に制限されるものではない。
【０１０８】
（付記）
（付記１）
即時使用可能なビンクリスチン組成物であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相、
前記第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、および、
前記リポソーム相内にてカーゴとして被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）安定化水溶液、
を含み、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
即時使用可能なビンクリスチン組成物。
【０１０９】
（付記２）
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、付記１に記載の組成物。
【０１１０】
（付記３）
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、付記１に記載の組成物。
【０１１１】
（付記４）
前記リポソーム相がスフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、付記１に記載の組成物。
【０１１２】
（付記５）
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、付記２に記載の組成物。
【０１１３】
（付記６）
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、付記１に記載の組成物。
【０１１４】
（付記７）
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、付記１に記載の組成物。
【０１１５】
（付記８）
前記連続した水相のｐＨが、約５〜約８．８である、付記１に記載の組成物。
【０１１６】
（付記９）
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、付記１に記載の組成物。
【０１１７】
（付記１０）
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、付記１に記載の組成物。
【０１１８】
（付記１１）
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、付記１０に記載の組成物。
【０１１９】
（付記１２）
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、付記１に記載の組成物。
【０１２０】
（付記１３）
前記リポソームが加水分解抵抗性である、付記１に記載の組成物。
【０１２１】
（付記１４）
薬剤が、前記連続した水相中よりも前記安定化水溶液中においてより安定である、付記１に記載の組成物。
【０１２２】
（付記１５）
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、付記１に記載の組成物。
【０１２３】
（付記１６）
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、付記１に記載の組成物。
【０１２４】
（付記１７）
前記アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、付記１６に記載の組成物。
【０１２５】
（付記１８）
哺乳類においてがんを治療する方法であって、付記１に記載の組成物の治療量を、それを必要とする前記哺乳類へ投与することを含む、方法。
【０１２６】
（付記１９）
前記がんが、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、付記１８に記載の方法。
【０１２７】
（付記２０）
前記ビンクリスチンが、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、付記１８に記載の方法。
【０１２８】
（付記２１）
哺乳類におけるがんの再発を治療する方法であって、前記哺乳類へ付記１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【０１２９】
（付記２２）
前記がんの再発が、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、付記２１に記載の方法。
【０１３０】
（付記２３）
前記哺乳類が、以前に少なくとも１回の多剤併用レジメン（multi-agent combination regime）を受けたことがある、付記２１に記載の方法。
【０１３１】
（付記２４）
リポソームで被包された前記ビンクリスチンが、少なくとも１つのさらなる化学療法薬と同時投与される、付記２１に記載の方法。
【０１３２】
（付記２５）
前記哺乳類がヒトである、付記２１に記載の方法。
【０１３３】
（付記２６）
リポソーム中においてビンクリスチンを安定化する方法であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相内にてリポソーム相を分散することを含み、
前記リポソーム相は、前記リポソーム相内にて被包された安定化水溶液を含有し、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有する、
方法。
【０１３４】
（付記２７）
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、付記２６に記載の方法。
【０１３５】
（付記２８）
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、付記２７に記載の方法。
【０１３６】
（付記２９）
前記リポソーム相が、スフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、付記２７に記載の方法。
【０１３７】
（付記３０）
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、付記２７に記載の方法。
【０１３８】
（付記３１）
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、付記２７に記載の方法。
【０１３９】
（付記３２）
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、付記２７に記載の方法。
【０１４０】
（付記３３）
前記連続した水相のｐＨが、約５〜約８．８である、付記２７に記載の方法。
【０１４１】
（付記３４）
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、付記２７に記載の方法。
【０１４２】
（付記３５）
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、付記２７に記載の方法。
【０１４３】
（付記３６）
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、付記３４に記載の方法。
【０１４４】
（付記３７）
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、付記２７に記載の方法。
【０１４５】
（付記３８）
前記リポソームが加水分解抵抗性である、付記２７に記載の方法。
【０１４６】
（付記３９）
薬剤が、前記連続した水相中においてよりも前記安定化水溶液中においてより安定である、付記２７に記載の方法。
【０１４７】
（付記４０）
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、付記２７に記載の方法。
【０１４８】
（付記４１）
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、付記２７に記載の方法。
【図１】
2018521080.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月3日(2018.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
即時使用可能なビンクリスチン組成物であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相、
前記第１水性緩衝液内にて分散したリポソーム相、および、
前記リポソーム相内にてカーゴとして被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）安定化水溶液、
を含み、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有し、
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約９である、
即時使用可能なビンクリスチン組成物。
【請求項２】
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リポソーム相がスフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが加水分解抵抗性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ビンクリスチンが、前記連続した水相中よりも前記安定化水溶液中においてより安定である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
リポソーム中においてビンクリスチンを安定化する方法であって、
第１水性緩衝液を含む連続した水相内にてリポソーム相を分散することを含み、
前記リポソーム相は、前記リポソーム相内にて被包された安定化水溶液を含有し、
前記安定化水溶液は、第２水性緩衝液、およびそこに溶解した安定化したビンクリスチンを含み、
前記第２水性緩衝液は、前記リポソーム相の外に輸送することができ、前記安定化水溶液中に正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンを残す、少なくとも１つの溶質を有する塩を含み、前記正電荷を持つ溶質またはヒドロニウムイオンは前記ビンクリスチンを安定化し、且つ、
前記連続した水相および前記安定化水溶液は、少なくとも２ｐＨ単位のｐＨ差を有し、
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約９である、
方法。
【請求項１７】
前記第２水性緩衝液がアンモニウム塩を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１水性緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リポソーム相が、スフィンゴミエリンコレステロールリポソームを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２水性緩衝液が硫酸アンモニウムを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ビンクリスチンが硫酸ビンクリスチンを含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記連続した水相のｐＨが、約７〜約８．８である、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記連続した水相のｐＨが、約７．５〜約８．８である、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記安定化水溶液のｐＨが、約３〜約５である、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ビンクリスチンが硫酸塩形態にある、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記リポソームが加水分解抵抗性である、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ビンクリスチンが、前記連続した水相中においてよりも前記安定化水溶液中においてより安定である、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記連続した水相と前記安定化水溶液との割合が、前記２つの相の混合がｐＨ約６〜約８．８の結合水相を結果として生じるような割合である、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンモニウム塩が、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で前記第２水性緩衝液中に存在する、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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