(57)【要約】非ヒト動物、ならびにそれを作製および使用するための方法と組成物が提供され、該非ヒト動物はＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ３）のヒト化を含む。一部の実施形態では、該非ヒト動物が、ヒト部分および内因性部分（例えば、非ヒト部分）を含むＬａｇ３ポリペプチドを発現するように、内因性Ｌａｇ３遺伝子座位に対する遺伝子改変を有するとして記載され得る。本発明は、癌治療のために使用できる新しい治療薬および／または治療レジメンを特定し開発するための改善されたシステムを許容する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する齧歯類であって、前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドがヒト部分および内因性部分を含む、齧歯類。
【請求項２】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記内因性部分が、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの細胞内部分を含む、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項３】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記内因性部分が、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの膜貫通部分をさらに含む、請求項２に記載の齧歯類。
【請求項４】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記内因性部分が、配列番号２または配列番号４の齧歯類Ｌａｇ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の齧歯類。
【請求項５】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項６】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記ヒト部分が、配列番号６のヒトＬＡＧ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項７】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドが、内因性Ｌａｇ−３座位に配置された核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項８】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分が、内因性Ｌａｇ−３のエクソン１、５、６、７および８によりコードされる、請求項７に記載の齧歯類。
【請求項９】
前記齧歯類が、ヒト部分および内因性部分を含むヒト化ＰＤ−１ポリペプチドをさらに発現する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項１０】
前記ヒト化ＰＤ−１ポリペプチドの前記内因性部分が、内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内部分および／または膜貫通部分を含む、請求項９に記載の齧歯類。
【請求項１１】
前記ヒト化ＰＤ−１ポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を含む、請求項９または１０に記載の齧歯類。
【請求項１２】
そのゲノムが内因性部分およびヒト部分を含むヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類であって、前記内因性およびヒト部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結した、齧歯類。
【請求項１３】
前記齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターが、内因性齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターである、請求項１２に記載の齧歯類。
【請求項１４】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記内因性部分が、内因性Ｌａｇ−３のエクソン１、５、６、７および８を含む、請求項１２または１３に記載の齧歯類。
【請求項１５】
前記内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン１、５、６、７および８は、配列番号１または配列番号３の齧歯類Ｌａｇ−３  ｍＲＮＡ配列中に存在する、相当するエクソン１、５、６、７および８に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１４に記載の齧歯類。
【請求項１６】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９〜２６０をコードする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項１７】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項１８】
ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４が、配列番号５のヒトＬＡＧ−３  ｍＲＮＡ中に存在する、相当するエクソン２〜４に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１７に記載の齧歯類。
【請求項１９】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記ヒト部分が、前記齧歯類における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項１７に記載の齧歯類。
【請求項２０】
齧歯類の前記ゲノムが、内因性部分およびヒト部分を含むヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子をさらに含み、前記内因性およびヒト部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能に連結した、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項２１】
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが、内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、請求項２０に記載の齧歯類。
【請求項２２】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、４および５を含む、請求項２０または２１に記載の齧歯類。
【請求項２３】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに含む、請求項２２に記載の齧歯類。
【請求項２４】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９をコードする、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項２５】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項２６】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤＣＤ１エクソン３の全部または一部をさらに含む、請求項２５に記載の齧歯類。
【請求項２７】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、前記齧歯類における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項２８】
前記齧歯類がラットまたはマウスである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の齧歯類によって作製されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチド。
【請求項３０】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドが、配列番号８のヒト化ＬＡＧ−３ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチド。
【請求項３１】
ヒト部分および内因性部分を有するヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドをコードするヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むゲノムを有する単離された齧歯類の細胞または組織であって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結した、単離された齧歯類の細胞または組織。
【請求項３２】
ヒト部分および内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むゲノムを有する齧歯類胚性幹細胞であって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結した、齧歯類胚性幹細胞。
【請求項３３】
請求項３２に記載の胚性幹細胞から生成される齧歯類胚。
【請求項３４】
内因性Ｌａｇ−３遺伝子座からＬａｇ−３ポリペプチドを発現する齧歯類を作製する方法であって、前記Ｌａｇ−３ポリペプチドがヒト配列を含み、前記方法が、
（ａ）齧歯類胚性幹細胞の内因性Ｌａｇ−３遺伝子にゲノム断片を配置することであって、前記ゲノム断片が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む、配置することと、
（ｂ）（ａ）で生成された齧歯類胚性幹細胞を得ることと、
（ｃ）（ｂ）の前記齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作製すること、とを含む、方法。
【請求項３５】
前記ヒト配列が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヌクレオチド配列がヒトＬＡＧ−３エクソン２〜４を含む、請求項３４または３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記ヌクレオチド配列が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０をコードしている、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヌクレオチド配列が、一つ以上の選択マーカーを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヌクレオチド配列が、一つ以上の部位特異的組み換え部位を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、（ａ）の前記齧歯類胚性幹細胞の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子へゲノム断片を配置するステップをさらに含み、前記ゲノム断片は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む前記ゲノム断片が、前記ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含むゲノム断片を内因性Ｌａｇ−３遺伝子内に配置する前、または配置と同時、または配置した後に、（ａ）の前記齧歯類胚性幹細胞の前記内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子内に配置される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、第二の齧歯類と、（ｃ）の前記齧歯類を交配させることをさらに含み、前記第二の齧歯類が、ヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むゲノムを有する、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ヒト部分および内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むゲノムを有する齧歯類を作製する方法であって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結し、前記方法が、
ヒト部分および内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むように齧歯類のゲノムを改変することであって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結し、それによって前記齧歯類を作製する、改変すること、を含む、方法。
【請求項４４】
前記齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターが内因性齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒト部分がヒトＬａｇ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｌａｇ−３遺伝子が、ヒトＬＡＧ−３のエクソン２〜４を含むように改変される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｌａｇ−３遺伝子が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０をコードするよう改変される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、そのゲノムがヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むように、前記齧歯類の前記ゲノムを改変することをさらに含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ゲノムがヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１  遺伝子を含むように前記齧歯類の前記ゲノムを改変することが、そのゲノムがヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むように前記齧歯類の前記ゲノムを改変する前、同時、または後に行われる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、そのゲノムがヒト部分と内因性部分を有するＬＡＧ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含む前記齧歯類を第二の齧歯類と交配させることをさらに含み、前記第二の齧歯類が、ヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むゲノムを有する、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の方法から得られる齧歯類。
【請求項５３】
ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の抗腫瘍効果を評価する方法であって、前記方法が、
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を有するヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドをコードするヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類に前記薬剤を投与するステップであって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結した、投与するステップと、
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の１つ以上の抗腫瘍特性を決定するアッセイを行うステップ、とを含む、方法。
【請求項５４】
ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の薬物動態特性を評価する方法であって、前記方法が、
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を有するヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドをコードするヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類に前記薬剤を投与するステップであって、前記部分が齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターと動作可能に連結した、投与するステップと、
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の一つ以上の薬物動態特性を決定するアッセイを行うステップと、を含む、方法。
【請求項５５】
前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤がＬａｇ−３拮抗薬である、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、Ｌａｇ−３拮抗薬である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、抗Ｌａｇ−３抗体である、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、前記齧歯類に静脈内投与される、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、前記齧歯類に腹腔内投与される、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、前記齧歯類に皮下投与される、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターが、内因性齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターである、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
齧歯類の前記ゲノムが、内因性部分およびヒト部分を含むヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子をさらに含み、前記内因性およびヒト部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能に連結した、請求項５３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが、内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記内因性部分が、内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、４および５を含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記内因性部分が、内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９をコードする、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２を含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、ヒトＰＤＣＤ１エクソン３の全部または一部をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子の前記ヒト部分が、前記齧歯類における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項６３〜６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項５３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
そのゲノムが、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類であって、前記遺伝子が、
内因性Ｌａｇ−３エクソン１、５、６、７および８を含む内因性部分と、
ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４を含むヒト部分と、を含み、
前記内因性部分とヒト部分は、内因性齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターに動作可能に連結され、前記齧歯類は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０を含むヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する、齧歯類。
【請求項７３】
前記齧歯類により発現されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドが、配列番号８のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の齧歯類。
【請求項７４】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記ヒト部分が、前記齧歯類における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項７２または７３に記載の齧歯類。
【請求項７５】
前記齧歯類の前記ゲノムが、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子をさらに含み、前記遺伝子が、
内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、３の全部または一部、エクソン４および５を含む内因性部分と、
ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の全部または一部を含むヒト部分と、を含み、
前記内因性部分とヒト部分は、内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターに動作可能に連結され、前記齧歯類が、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を含むＰＤ−１ポリペプチドを発現する、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項７６】
前記ヒト部分が、前記齧歯類における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項７５に記載の齧歯類。
【請求項７７】
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項７８】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子のヒト部分が、前記ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのイムノグロブリン様ドメイン１および２のアミノ酸配列をコードするか、または前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分が、前記ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのイムノグロブリン様ドメイン１および２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８、５２、および７２〜７７のいずれか一項に記載の齧歯類、または請求項３４〜５１および５３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の前記ヒト部分が、ＭＨＣＩＩ結合に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするか、または前記ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの前記ヒト部分が、ＭＨＣＩＩ結合に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８、５２、および７２〜７７のいずれか一項に記載の齧歯類、ならびに請求項３４〜５１および５３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２０日出願の米国仮特許出願第６２／２５８，１８１号、および２０１６年８月３日出願の米国仮特許出願第６２／３７０，４３０号、の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
【０００２】
２０１６年１０月１８日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３４０３１＿１０２１２ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の４９ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
癌細胞は宿主免疫系を逃れる能力を有することもあり、癌は、いまだ世界の医療産業界で脅威的な課題となっている。かかる能力は、抗腫瘍免疫の阻害および／またはダウンレギュレーションの結果であると考えられていた。それでも、抗腫瘍免疫を活性化および／または促進するようにデザインされた新しい癌治療薬および治療レジメンの治療可能性を最適に決定し、癌細胞がどのように阻害信号を免疫細胞、特にＴ細胞、に提供するかという機構を決定するための有用なインビボシステムは開発されていない。このようなシステムは、インビボでの抗腫瘍環境を促進する候補薬剤の治療有効性を評価するためのアッセイ源を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、癌治療のために使用できる新しい治療薬および／または治療レジメンを特定し開発するための改善されたシステムを許容する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識を包含する。本発明は、自己免疫性（または炎症性、または感染性）疾患、障害または状態を治療するために使用できる新しい治療薬を特定し開発するための改善されたインビボシステムを許容する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識も包含する。本発明はまた、抗腫瘍免疫を促進する新しい治療薬を特定および開発するための改善されたインビボシステムを許容する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識を包含するものである。さらに、本発明は、例えば、抗腫瘍免疫を上方修正する癌治療薬を特定および開発するために使用するには、ヒト化Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（リンパ球活性化遺伝子３：Ｌａｇ−３）遺伝子を有する、および／またはそうでなければヒトまたはヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現、含有または生成する非ヒト動物が望ましいという認識も包含する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｌａｇ−３および／またはプログラム細胞死１（ＰＤ−１）を標的とすることを含む併用療法の特定および開発のための、改善されたインビボシステムを提供している。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明は操作されたＬａｇ−３遺伝子を含むゲノムを有する非ヒト動物を提供し、該操作されたＬａｇ−３遺伝子は、二つの異なる種（例えば、ヒトおよび非ヒト）からの遺伝物質を含有する。一部の実施形態では、当該操作されたＬａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのイムノグロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを１つ以上コードする遺伝物質を含む。一部の実施形態では、遺伝物質は、リガンド結合（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合）に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのＩｇ様ドメインをコードしている。ゆえに、一部の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物の操作されたＬａｇ−３遺伝子は、ヒトおよび非ヒト部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドをコードし、ここでヒトおよび非ヒト部分は互いに連結して機能的Ｌａｇ−３ポリペプチドを形成する。一部の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物の操作されたＬａｇ−３遺伝子は、ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１とＤ２）の全部または一部を含むＬａｇ−３ポリペプチドをコードする。一般的には、最初の２つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１とＤ２）は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのＮ末端の２６０アミノ酸の内に含まれている。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸残基の２１−２６０、２３−２６０、または２９−２６０の内に含まれている。または例えば図１〜２を参照のこと。
【０００６】
一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物が提供され、Ｌａｇ−３ポリペプチドはヒト部分および内因性部分を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、非ヒト動物が提供され、そのゲノムが内因性部分およびヒト部分を含むヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（または遺伝子座）を含み、内因性部分およびヒト部分は非ヒトＬａｇ−３プロモーターと動作可能に連結している。
【０００８】
一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの細胞内部分を含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの細胞内ドメインを含む。一部のある実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの膜貫通部分もさらに含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの膜貫通型ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの細胞外部分、例えば最初の２つのＩｇ様ドメインを含まないが、最後の２つのＩｇ様ドメイン（Ｄ３とＤ４）を含む、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端部分をさらに含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドのアミノ酸を含む。例えば、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドを実質的に含む。
【０００９】
一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、配列番号２または配列番号４の齧歯類Ｌａｇ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、配列番号２または配列番号４の齧歯類Ｌａｇ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列に対し、実質的に同一または同一のアミノ酸配列を持つ。
【００１０】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の内因性部分は、非ヒトＬａｇ−３のエクソン１、５、６、７および８を含む。一部の実施形態では、内因性非ヒトＬａｇ−３遺伝子のエクソン１、５、６、７および８は、配列番号１または配列番号３の齧歯類のＬａｇ−３  ｍＲＮＡ配列に存在する、相当するエクソン１、５、６、７および８に対し、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、内因性非ヒトＬａｇ−３遺伝子のエクソン１、５、６、７および８は、配列番号１または配列番号３の齧歯類のＬａｇ−３  ｍＲＮＡ配列に存在する、相当するエクソン１、５、６、７および８に対し、実質的に同一であるか、または同一である。
【００１１】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分（またはヒト配列）は、リガンド結合（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合）に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのＩｇ様ドメインを１つ以上含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１とＤ２）の全部、または一部を含む。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸残基の２１−２６０、２３−２６０、または２９−２６０の内である。一部の実施形態では、ヒト化ＬＡＧ−３ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０（または２３〜２６０または２１〜２６０）を含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分（またはヒト配列）は、配列番号６のヒトＬＡＧ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分（またはヒト配列）は、配列番号６のヒトＬＡＧ−３ポリペプチドに存在する、相当するアミノ酸配列に対し、実質的に同一または同一のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子のヒト部分（またはヒト配列）は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０（または２３−２６０または２１−２６０）をコードしている。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子のヒト部分（またはヒト配列）は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２−４（またはエクソン２、３および４）を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４は、配列番号５のヒトＬＡＧ−３ｍＲＮＡ配列に存在する、相当するエクソン２〜４に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３  遺伝子のエクソン２−４は、配列番号５のヒトＬＡＧ−３  ｍＲＮＡ配列に存在する、相当するエクソン２−４に対し実質的に同一であるか、または同一である。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子のヒト部分は、本明細書に記載される非ヒト動物における発現にコドン最適化された配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ヒト部分と内因性部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドは、本明細書に記載される内因性Ｌａｇ−３座位（または遺伝子）に位置した核酸配列によりコードされる。
【００１５】
一部の実施形態では、Ｌａｇ−３ポリペプチドの内因性部分は、内因性Ｌａｇ−３のエクソン１、５、６、７および８によりコードされる。
【００１６】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、内因性非ヒトＬａｇ−３のエクソン１、ヒトＬＡＧ−３のエクソン２−４、および非ヒトＬａｇ−３のエクソン５−８を含み、この場合において当該非ヒトおよびヒトのエクソンは、互いに、および内因性非ヒトＬａｇ−３プロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、当該ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、内因性Ｌａｇ−３座位に位置付けられている。
【００１７】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドと実質的に同一であるシグナルペプチド；ヒト部分と非ヒト部分を含む細胞外ドメインであって、当該ヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメイン（例えば、アミノ酸２６−２９０を含む配列）を含み、当該非ヒト部分は、内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの最後の２つのＩｇ様ドメインを含む；および内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞内ドメイン、を含むヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドをコードしている。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物により産生される、または発現されるＬａｇ−３ポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物により産生される、または発現されるＬａｇ−３ポリペプチドは、非ヒトシグナルペプチドの全部、または一部（例えば、キメラシグナルペプチド）とともに、非ヒト動物の細胞内で翻訳される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物により産生される、または発現されるＬａｇ−３ポリペプチドは、配列番号８のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドに存在するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物によって生成されるまたは発現されるＬａｇ−３ポリペプチドは、配列番号８のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドに存在するアミノ酸配列と実質的に同一または同一のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、単離された非ヒト細胞または組織が提供され、そのゲノムは、本明細書に記載されるＬａｇ−３遺伝子（または座位）を含む。一部の実施形態では、細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される単離された非ヒト細胞から作製される、生成される、または産生される不死化細胞が提供される。
【００２１】
一部の実施形態では、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞が提供され、そのゲノムは、本明細書に記載されるＬａｇ−３遺伝子（または座位）を含む。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、齧歯類の胚性幹細胞である。一部のある実施形態では、齧歯類の胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７ＢＬ系またはこれらの混合物からのものである。一部のある実施形態では、齧歯類の胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系およびＣ５７ＢＬ系の混合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のいずれか１つを含み、提供される。
【００２２】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作るための本明細書に記述された非ヒト胚性幹細胞の利用法が提供される。一部のある実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、本明細書に記述されたヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（または座位）を含むマウスを作るために使用される。一部のある実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はラット胚性幹細胞であり、本明細書に記述されたヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（または座位）を含むラットを作るために使用される。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト胚性幹細胞を含む、それから作られる、それから得られる、またはそれから生成される非ヒト胚が提供される。一部のある実施形態では、非ヒト胚は齧歯類胚であり、一部の実施形態ではマウス胚、一部の実施形態ではラット胎芽である。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作るための本明細書に記述された非ヒト胚の利用法を提供する。一部のある実施形態では、非ヒト胚はマウス胚であり、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（または遺伝子座）を含むマウスを作るために使用される。一部のある実施形態では、非ヒト胚はラット胚であり、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（または遺伝子座）を含むラットを作るために使用される。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される単離された非ヒト細胞もしくは組織、本明細書に記載される不死化細胞、本明細書に記載される非ヒト胚性幹細胞、本明細書に記載される非ヒト胚、または本明細書に記載される非ヒト動物を含むキットが提供される。
【００２６】
一部の実施形態では、治療または診断のための薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。
【００２７】
一部の実施形態では、疾患、障害もしくは症状の治療、予防、または改善のための薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。
【００２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターが提供される。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、本明細書に記載されるＬａｇ−３遺伝子（または座位）の全部または一部を含む。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、本明細書に記載されるＬａｇ−３遺伝子（または座位）の全部または一部を含むＤＮＡ断片を含む。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のいずれか１つを含むＬａｇ−３遺伝子（または座位）を含む。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、一つ以上の選択マーカーをさらに含む。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、１つ以上の部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔ、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。一部のある実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターは、図３に図示されている。
【００２９】
一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞、非ヒト細胞、非ヒト胚、および／または非ヒト動物を作製するための、本明細書に記載される導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、または標的化ベクターの使用が提供される。
【００３０】
一部の実施形態では、内因性Ｌａｇ−３遺伝子からＬａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製する方法が提供され、この場合において当該Ｌａｇ−３ポリペプチドは、ヒト配列を含み、当該方法は、（ａ）ゲノム断片を、非ヒト胚性幹細胞の内因性Ｌａｇ−３遺伝子に配置することであって、前記ゲノム断片は、ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む、配置すること；（ｂ）（ａ）で生成された非ヒト胚性幹細胞を取得すること；および（ｃ）（ｂ）の非ヒト胚性幹細胞を使用して非ヒト動物を作ること、とを含む。
【００３１】
内因性Ｌａｇ−３遺伝子からＬａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、当該方法は、ゲノム断片を、（ａ）の非ヒト胚性幹細胞の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子に配置するステップをさらに含み、前述のゲノム断片は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む。内因性Ｌａｇ−３遺伝子からＬａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含むゲノム断片を、内因性Ｌａｇ−３遺伝子に配置する前、または配置すると同時、または配置した後に、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含むゲノム断片が、（ａ）の非ヒト胚性幹細胞の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子に配置される。内因性Ｌａｇ−３遺伝子からＬａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、当該方法は、（ｃ）の非ヒト動物と、第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含み、前述の第二の非ヒト動物は、ヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むゲノムを有している。
【００３２】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列はヒトＬａｇ−３エクソン２〜４を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０（または２３−２６０もしくは２１−２６０）をコードしている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は一つ以上の選択マーカーを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は一つ以上の部位特異的組み換え部位を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、ヒト部分および内因性部分を持つＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むゲノムを有する非ヒト動物を作製する方法が提供され、該方法は、ヒト部分と内因性部分とを有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むように、非ヒト動物のゲノムを改変することを含み、これらの部分が非ヒトＬａｇ−３プロモーターに動作可能に連結し、それによって前述の非ヒト動物が作製される。
【００３４】
そのゲノムが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードしているＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｌａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２−４（またはエクソン２、３および４）を含むよう改変されている。そのゲノムが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードしているＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｌａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０（または２３−２６０もしくは２１−２６０）をコードするよう改変されている。
【００３５】
そのゲノムが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードしているＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、該方法は、ヒト部分と内因性部分とを含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むように、該非ヒト動物のゲノムを改変することをさらに含む。そのゲノムが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、ヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むように、前記非ヒト動物の前記ゲノムを改変することが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含むように、非ヒト動物のゲノムを改変することの前に、または同時に、または後に行われる。そのゲノムが、ヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードしているＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、該方法は、そのゲノムがヒト部分と内因性部分を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物と、第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含み、前記第二の非ヒト動物は、ヒト部分と内因性部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含むゲノムを有している。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれか１つにより取得可能な（作製される、取得される、または生成される）非ヒト動物が提供される。
【００３７】
一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の抗腫瘍効果を評価する方法が提供され、該方法は、本明細書に記述される非ヒト動物に薬剤を投与するステップ、およびヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の一つ以上の抗腫瘍特性を決定するためのアッセイを行うステップ、を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の薬物動態特性を評価する方法が提供され、該方法は、本明細書に記述される非ヒト動物に薬剤を投与するステップ、およびヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤の一つ以上の薬物動態特性を決定するためのアッセイを行うステップ、を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤はＬａｇ−３拮抗薬である。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤はＬａｇ−３作動薬である。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤は抗Ｌａｇ−３抗体である。
【００４０】
一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３を標的とする薬剤が、本明細書に記載される非ヒト動物に静脈内投与され、腹腔内投与され、または皮下投与される。
【００４１】
一部の実施形態では、そのゲノムが、内因性Ｌａｇ−３のエクソン１、５、６、７および８を含む内因性部分；およびヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２−４（またはエクソン２、３および４）を含むヒト部分、を含むＬａｇ−３遺伝子を含む、非ヒト動物が提供される。この場合において当該内因性部分およびヒト部分は、内因性の非ヒトＬａｇ−３プロモーターに動作可能に連結されており、およびこの場合において、当該非ヒト動物は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９−２６０（または２３−２６０もしくは２１−２６０）を含むＬａｇ−３ポリペプチドを発現する。
【００４２】
一部の実施形態では、非ヒト動物の腫瘍モデルが提供され、当該非ヒト動物は、本明細書に記載されるＬａｇ−３および／またはＰＤ−１のポリペプチドを発現する。
【００４３】
一部の実施形態では、非ヒト動物の腫瘍モデルが提供され、当該非ヒト動物は、本明細書に記載されるＬａｇ−３および／またはＰｄｃｄ１の遺伝子を含むゲノムを有する。
【００４４】
一部の実施形態では、非ヒト動物の腫瘍モデルが提供され、当該動物は、（ａ）そのゲノムが本明細書に記載されるＬａｇ−３および／またはＰｄｃｄ１の遺伝子を含む非ヒト動物を提供すること；および（ｂ）（ａ）の非ヒト動物に１個以上の腫瘍細胞を移植すること；それにより、前記非ヒト動物の腫瘍モデルを提供すること、により取得される。
【００４５】
一部の実施形態では、治療または診断のための薬剤の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載の非ヒト動物または細胞が提供される。
【００４６】
一部の実施形態では、疾患、障害または症状の治療、予防または改善のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞が提供される。
【００４７】
一部の実施形態では、薬品としての使用など医療で使用するための薬剤またはワクチンの製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞の利用法が提供される。
【００４８】
一部の実施形態では、疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞の利用法が提供される。
【００４９】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子に結合する抗体の製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞の使用が提供される。
【００５０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される疾患、障害、または症状は、癌または新生物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される疾患、障害、または症状は、自己免疫性（または炎症性）の疾患、障害または症状である。一部の実施形態では、本明細書に記載される疾患、障害、または症状は、感染性の疾患、障害または症状である。
【００５１】
様々な実施形態において、非ヒトＬａｇ−３プロモーターは、内因性非ヒトＬａｇ−３プロモーターであるか、またはこれを含む。
【００５２】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるＬａｇ−３遺伝子またはＰｄｃｄ１遺伝子のヒト部分（またはヒト配列もしくはヌクレオチド配列）は、本明細書に記載される非ヒト動物（または非ヒト細胞もしくは組織）における発現にコドン最適化された配列であるか、またはこれを含む。
【００５３】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物（または非ヒト細胞もしくは組織、または非ヒト胚性幹細胞、または非ヒト胚）は、ヒト化ＰＤ−１ポリペプチドをさらに発現し、当該ヒト化ＰＤ−１ポリペプチドは、ヒト部分と内因性部分を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインを実質的に含む；および特定の実施形態では、ヒト部分は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２１−１７０、２６−１６９、２７−１６９、２７−１４５、または３５−１４５を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドの内因性部分は、内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内部分および／または膜貫通部分を含む：一部の実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドの内因性部分は、内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内ドメインを含み、およびある実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドの内因性部分は、内因性ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通ドメインを実質的にさらに含む。
【００５４】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物（または非ヒト細胞もしくは組織、または非ヒト胚性幹細胞、または非ヒト胚）のゲノムは、内因性部分とヒト部分を含むＰｄｃｄ１遺伝子をさらに含み、この場合において当該内因性部分とヒト部分は、非ヒトＰｄｃｄ１プロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子の内因性部分は内因性Ｐｄｃｄ１エクソン、１、４および５を含む。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子の内因性部分は、内因性Ｐｄｃｄ１のエクソン３の全部、または一部をさらに含み、例えば、内因性ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通ドメインの一部であるアミノ酸をコードする内因性エクソン３の３’部分をさらに含む。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト部分は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５，２７〜１４５，２７〜１６９，２６〜１６９または２１〜１７０をコードする。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト部分は、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２を含む；一部のある実施形態では、例えばヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインの一部であるアミノ酸をコードするヒトエクソン３の５’末端など、ヒトＰＤＣＤ１のエクソン３の全部、または一部をさらに含む。特定の実施形態では、非ヒト動物のヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、非ヒト動物の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のエクソン１、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２、およびエクソン３の一部（例えば、細胞外ドメインの一部であるアミノ酸をコードするエクソン３の５’部分）、次いで内因性非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン３の一部（例えば、膜貫通ドメインの一部であるアミノ酸をコードするエクソン３の３’部分）とエクソン４−５を含む。
【００５５】
様々な実施形態において、非ヒトＰｄｃｄ１プロモーターは、内因性非ヒトＰｄｃｄ１プロモーターであるか、またはこれを含む。
【００５６】
様々な実施形態において、Ｌａｇ−３遺伝子のヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのイムノグロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン１（Ｄ１）および２（Ｄ２）のアミノ酸配列をコードしているか、またはＭＨＣＩＩの結合に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
【００５７】
様々な実施形態において、Ｌａｇ−３ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのイムノグロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン１（Ｄ１）および２（Ｄ２）のアミノ酸配列を含むか、またはＭＨＣＩＩの結合に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
【００５８】
様々な実施形態で、本明細書に記載の非ヒト動物は齧歯類であり、一部の実施形態ではマウスであり、一部の実施形態ではラットである。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、１２９系、ＢＡＬＢ／Ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、および混合１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系から成る群から選択され、一部のある実施形態ではＣ５７ＢＬ／６系である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意義として使用される。約／およその有無に関わらず、本明細書で使用される任意の数字は、当業者によって理解される任意の正常変動を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、例示目的のみであり限定を目的としない。
【００６１】
【図１】図１は、非ヒト（例えば、マウス）およびヒトＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）のゲノム構造の図（正確な縮尺ではない）を示す。エクソンは、各エクソンの上または下に番号を付与されている。各遺伝子に対する非翻訳領域（オープンボックス）もまた示されている。イムノグロブリン様ドメインは、正確な縮尺ではないが、帯状のボックスと、コードエクソンの上の記号の略語「Ｉｇ」により示されている。
【００６２】
【図２】図２は、ヒトＬＡＧ−３（ｈＬＡＧ３）（配列番号６）、マウスＬａｇ−３（ｍＬａｇ３）（配列番号４）、およびヒト化Ｌａｇ−３（ＨｕｍＬＡＧ３）（配列番号８）の代表的なアミノ酸配列のアライメントを示す。アスタリスクは、イムノグロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを示し、下線の文字は、挿入されたヒトＬＡＧ−３のエクソン（すなわち、エクソン２、３および４）によりコードされるアミノ酸を示す。Ｉｇ様ドメイン１（Ｄ１）と２（Ｄ２）は、配列下のフォワードスラッシュにより示される１つのアミノにより分離される。
【００６３】
【図３】図３は、非ヒトＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）のヒト化のための例示的方法の図（正確な縮尺ではない）を示す。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、それぞれ配列番号で示されている。
【００６４】
【図４】図４は、実施例１に記述されたアッセイで用いられるプローブのおよその場所を示す、マウスおよびヒトＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）遺伝子のゲノム構造の図（正確な縮尺ではない）を示す。
【００６５】
【図５】図５は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）、ホモ接合型ヒト化Ｌａｇ−３（ＨｕｍＬＡＧ−３）、ホモ接合型ヒト化ＰＤ−１（ＨｕｍＰＤ−１）、およびホモ接合型二重ヒト化Ｌａｇ−３ｘＰＤ−１（ＨｕｍＰＤ−１ｘＬＡＧ−３）のマウスに由来する活性化脾臓細胞の代表的なヒストグラムを示し、それらはヒトＬＡＧ−３、ヒトＰＤ−１、マウスＬａｇ−３、およびマウスＰＤ−１に対する抗体で染色されているか、または各アイソタイプ対照抗体で染色されている。陽性染色は、黒曲線で示されており、一方でアイソタイプ対照抗体による染色は、白い曲線で示されている。全部の染色プロファイルは、ＣＤ４＋のゲーティング内の細胞を表している。各ヒストグラムに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗体染色を用いた平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている（上行：ヒトＬＡＧ−３発現；２番目の行：マウスＬａｇ−３発現；３番目の行：ヒトＰＤ−１発現；下行：マウスＰＤ−１発現）。マウスの遺伝子型は、各列の上に示されている。ヒト化ＰＤ−１マウスに関しては、２０１５年６月１９日に出願された米国特許出願１４／７４４，５９２、および２０１５年６月１９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／０３６６４９を参照のこと。それら両方とも参照により本明細書に援用される。
【００６６】
【図６】図６は、二重ヒト化Ｌａｇ−３／ＰＤ−１マウスの様々な治療群における、３５日にわたる代表的な平均腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥＭ）を示す（対照、円：マウスもしくはヒトのＬＡＧ−３、またはマウスもしくはヒトのＰＤ−１に対し特異的ではないヒトアイソタイプ対照抗体；抗ＬＡＧ３、ダイア型：抗ヒトＬＡＧ−３抗体；抗ＰＤ１、六角形：抗ヒトＰＤ−１抗体；）矢印は抗体治療の日を示す。
【００６７】
【図７】図７は、抗ＬＡＧ３抗体単独、および抗ヒトＰＤ−１抗体と併用した場合の、確立されたＭＣ３８腫瘍に対する有効性を評価する実験における、腫瘍移植後の複数の時点での二重ヒト化Ｌａｇ−３／ＰＤ−１マウスの様々な治療群における平均腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥＭ）を示す（対照、円：マウスもしくはヒトのＬＡＧ−３、またはマウスもしくはヒトのＰＤ−１に対し特異的ではないヒトアイソタイプ対照抗体；抗ＬＡＧ３、ダイア型：抗ヒトＬＡＧ−３抗体；抗ＰＤ１、六角形：抗ヒトＰＤ−１抗体；抗ＬＡＧ３＋抗ＰＤ−１、三角形：抗ヒトＬＡＧ−３抗体と抗ヒトＰＤ−１抗体の併用）。治療日は矢印により示されている。
【００６８】
【図８−１】図８は、齧歯類（例えばラットおよびマウス）、ヒト、およびヒト化されたｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）の配列の例、ならびに非ヒトＬａｇ−３遺伝子のヒト化のための合成ＤＮＡ断片の例を示す。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧内に含まれる。アミノ酸配列に関し、膜貫通配列は、下線文字により示されている。ヒト化アミノ酸配列に関し、ヒト配列は太字で示され、括弧内に含まれている。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図８−６】同上。
【図８−７】同上。
【図８−８】同上。
【図８−９】同上。
【００６９】
【図９】図９Ａ−９Ｄは、ある例示的なヒト化Ｌａｇ−３座位におけるジャンクション配列を示す。図９Ａは、上流の挿入点をまたぐヌクレオチド配列（配列番号１２）を示しており、挿入点でヒトＬＡＧ−３ゲノム配列と連続した内因性マウス配列（下の括弧内に含まれている）を示している。図９Ｂは、自己削除型ネオマイシンカセットの５’末端をまたぐヌクレオチド配列（配列番号１３）を示しており、挿入点の下流のカセット配列（斜体のＳａｌＩ−ＸｈｏＩのコンパチブル末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）および太字のｌｏｘＰ配列とともに下の括弧内に含まれている）と連続したヒトＬＡＧ−３ゲノム配列を示す。図９Ｃは、自己削除型ネオマイシンカセットの３’末端の下流挿入点をまたぐヌクレオチド配列（配列番号１４）を示しており、マウスＬａｇ−３ゲノム配列と連続したカセット配列（太字のｌｏｘＰ部位、下線のＩ−ＣｅｕＩ認識部位、および斜体のＮｈｅＩ認識部位とともに下の括弧内に含まれている）を示す。図９Ｄは、ネオマイシンカセット（イントロン４の残り７７  ｂｐ）の欠失後、上流挿入点にわたるヌクレオチド配列（配列番号１５）は以下を含み、これは残りのカセット配列ｌｏｘＰ配列（以下の括弧内に含まれ、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩのコンパチブル末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）は斜体、ｌｏｘＰ配列は太字、Ｉ−ＣｅｕＩ認識部位は下線、およびＮｈｅＩ認識部位は斜体で示される）と並置されたマウスおよびヒトゲノム配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
［用語の定義］
本発明は本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されないが、それはこのような方法および条件は変化する場合があるからである。本発明の範囲は請求項によって定義されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、意図しないことも理解される。
【００７１】
別段の定めがない限り、本明細書に使用されるすべての用語および語句は、そうでないことが明確に示されている、または用語または語句が使用されている文脈から明らかに明白な場合を除き、その用語および語句が当技術分野で獲得された意味を含む。本明細書で説明したものと類似または同等な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験に使用できるが、特定の方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及されたすべての特許および非特許出版物は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本明細書で一つ以上の対象の値に適用される場合、「およそ」は指定された参照値と類似の値を含む。ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段定めがない限り、または文脈からそうでないことが明らかな場合（このような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）を除いて、指定された参照値のいずれかの方向に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満以内の範囲の値を含む。
【００７３】
「生物学的に活性」は、本明細書で使用される場合、生物系、インビトロまたは（例えば、生物中の）インビボで活性を持つ任意の薬剤の特徴を含む。例えば、生物内に存在する時、その生物内で生物学的効果を持つ薬剤は生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性な場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、「生物学的に活性」な部分と一般的に呼ばれる。
【００７４】
「同等」は、本明細書で使用される場合、お互いに同一ではない場合があるが、それらの間の比較を許容するのに十分類似しており、従って観察された差または類似性に基づいて合理的に結論を出すことができる、二つ以上の薬剤、実在物、状況、状態のセットなどを含む。当業者であれば、文脈内において、同等とみなされるために二つ以上のこのような薬剤、実体、状況、状況のセットなどに対して、ある所定の状況でどの程度の同一性が必要かを理解するであろう。
【００７５】
「保存的」 は、本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換を指し、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を含む側鎖Ｒ基を持つ別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。一般的に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能特性、例えば、リガンドに結合する受容体の能力などを実質的に変化させない。類似の化学特性を含む側鎖を持つアミノ酸群の例には次が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリンおよびスレオニンなどの脂肪族−ヒドロキシル側鎖、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどの塩基性側鎖、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖、ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘導などで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性がある。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスで正の値を持つ保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、ここで置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスで負でない値を持つ。
【００７６】
「対照」は、本明細書で使用される場合、結果がそれに対して比較される基準としての「対照」という当技術分野で理解される意味を含む。一般的に、対照は、このような変数についての結論を出すために、変数を分離することによって実験の完全性を増加させるために使用される。一部の実施形態では、対照は、コンパレーターを提供するために、試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。本明細書で使用される場合、「対照」は、「対照動物」を含む場合がある。「対照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。一つの実験では、「試験」（すなわち、試験されている変数）が適用される。第二の実験では、「対照」（すなわち、試験されている変数）は適用されない。一部の実施形態では、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイの、または以前に知られた量または結果）である。一部の実施形態では、対照は印刷されたかまたはそれ以外の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。対照は、陽性対照または陰性対照である場合がある。
【００７７】
「破壊」は、本明細書で使用される場合、（例えば、遺伝子または遺伝子座などの内因性相同配列での）ＤＮＡ分子での相同組み換えイベントの結果を含む。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体または遺伝子の断片（例えば、エクソン）の挿入を含む場合があり、これは内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であってもよい。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）発現および／または活性を増加する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）の配列を変える場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）を切断または断片化する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物を延長する場合があり、一部の実施形態では、破壊は融合タンパク質の組立てを達成する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響するが活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するがレベルには影響しない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。
【００７８】
「決定する」、「測定する」、「査定する」、「評価する」、「検査する」および「分析する」:という用語は本明細書において、任意の形態の測定を含むために互換的に使用され、要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。アッセイは相対的または絶対的である場合がある。「の存在をアッセイする」ことは、存在する何かの量を決定するおよび／またはそれが存在するか不在かを決定することである可能性がある。
【００７９】
「内因性遺伝子座」または「内因性遺伝子」は、本明細書において用いられる場合、本明細書に記述される改変、破壊、欠失、挿入、改変、補充、または置換の導入前に、親または基準生物において存在する遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は天然で見られる配列を持つ。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は野生型遺伝子座である。一部の実施形態では、指標生物は野生型生物である。一部の実施形態では、指標生物は遺伝子操作された生物である。一部の実施形態では、指標生物は実験室で繁殖された生物（野生型または遺伝子操作された）である。
【００８０】
「内因性プロモーター」は、本明細書で使用される場合、例えば、野生型生物で、内因性遺伝子と自然に関連するプロモーターを含む。
【００８１】
「操作された」（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）：本明細書において使用される場合、概して、ヒトの手により操作された態様を含む。例えば一部の実施形態では、自然界での順序では一緒に連結されていない２つ以上の配列がヒトの手により操作され、操作ポリヌクレオチド中で互いに直接連結された場合に、「操作された」とみなされ得る。一部の特定のかかる実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、自然界で第一のコード配列と作動的に関連しているが、第二のコード配列とは作動的に関連せずに存在し、ヒトの手により連結されて第二のコード配列と作動的に関連した制御配列を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、各々、自然界では互いに連結されていないポリペプチド要素またはドメインをコードしている第一および第二の核酸配列が、１つの操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに連結されていてもよい。同様に、一部の実施形態では、細胞または生物体が操作され、それによりその遺伝情報が改変された（例えば、従前には存在していなかった新たな遺伝物質が導入されたり、または従前には存在していた遺伝物質が変更もしくは除去された）場合に、「操作された」とみなされ得る。一般的なことであり、当技術分野の当業者に理解されているとおり、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫物も通常、実際の操作は過去の実体に対して行われていたのだとしても、「操作された」とみなされる。さらに、当技術分野の当業者により認識されているように、様々な技法が利用可能であり、それらを介して、本明細書に記載される「操作」を行うことができる。例えば、一部の実施形態では、「操作」には、分析または比較を行うようプログラムされた、または推奨された配列および／もしくは選択された配列を別手段により分析するようプログラムされた、コンピューターシステムの使用を介して（例えば核酸配列、ポリペプチド配列、細胞、組織および／または生物体の）選択または設計を行うことを含んでもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では「操作」には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成技術の使用、および／または組み換え核酸技術、例えば（例えばポリメラーゼ鎖反応などを介した）核酸増幅、ハイブリダイゼーション、突然変異誘導、形質転換、トランスフェクションなどの使用を含んでもよく、および／または様々な任意の制御交配法の使用を含んでもよい。当技術分野の当業者に認識されているように、様々な確立されているかかる技術（例えば組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法など））が当技術分野に公知であり、様々な概説および詳説の参照文献中に記載されており、それらは本明細書全体を通じ引用および／または検討されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照のこと。
【００８２】
「遺伝子」：本明細書において使用される場合、産物（例えばＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする、染色体中のＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えばエクソン配列）と非コード配列（例えばイントロン配列）の両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、１つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでもよく、および／または例えば遺伝子発現（例えば、細胞型特異的発現、誘導発現、など）の１つ以上の態様を制御することができる、もしくは影響を与えることができるイントロン配列を含んでもよい。明白性を目的として、本発明者らは以下のことを記載する。本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、概して、ポリペプチドをコードする核酸の一部を含む；当該用語は、任意で、制御配列を包含する場合があり、これは当技術分野の当業者には、文脈から明白であろう。この定義は、「遺伝子」という用語が、非タンパク質をコードする発現単位に適用されることを除外する意図はなく、本明細書に使用される当該用語は、多くの場合においてはポリペプチドをコードする核酸を含むことを明白にすることを意図している。
【００８３】
「異種」は、本明細書で使用される場合、異なる起源からの薬剤または実在物を含む。例えば、特定の細胞もしくは生物に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関連して使用される場合、該用語は、関連ポリペプチド、遺伝子または遺伝子産物が、１）ヒトの手により操作されていること、２）ヒトの手を介して細胞または生物（またはその前駆体）に導入されていること、および／または３）当該関連細胞もしくは生物（例えば関連細胞型または生物型）中に自然状態では産生されない、または存在しないこと、を明らかにする。
【００８４】
「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、その中に異種（例えば、外来性）核酸またはタンパク質が導入された細胞を含む。当業者が本開示を読めば、このような用語が特定の主題細胞を含むだけでなく、このような細胞の子孫を含むためにも使用されることを理解するであろう。特定の改変は突然変異または環境の影響のいずれかにより後続世代にも起こる場合があり、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書において用いられる場合、それらは「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であるかそれを含む。一般的に、宿主細胞は、細胞が指定される種に関わらず、異種核酸またはタンパク質の受け入れおよび／または生産に適した任意の細胞である。例示的細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプトマイセス属などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、ピヒア  メタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合を含む。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は原核であり以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は単離細胞であるかそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
【００８５】
「ヒト化」は、本明細書において使用される場合、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列）が、非ヒト動物に自然に存在する特定の遺伝子またはタンパク質の構造と実質的にまたは全く同一に対応する部分を含み、また、関連する特定の非ヒト遺伝子またはタンパク質において存在するものとは異なり、その代わりに対応するヒト遺伝子またはタンパク質において存在する同等の構造とより近接に対応する部分も含む核酸またはタンパク質を含む。一部の実施形態では、「ヒト化」遺伝子は、実質的にヒトポリペプチドのもののようなアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ヒトタンパク質またはその一部―例えば、その特性的部分）である。一例を挙げると、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、ヒト細胞外部分のもののようなアミノ酸配列および非ヒト（例えば、マウス）ポリペプチドのもののような残りの配列を持つ、細胞内部分の全部または一部を持つポリペプチドをコードする遺伝子の場合がある。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列全体を含む。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質に存在する一部分を持つ配列を含む。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質の配列全体を含み、ヒト遺伝子のホモログまたはオルソログに対応する非ヒト動物の内因性遺伝子座から発現される。
【００８６】
「同一性」は、配列の比較に関連して本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用できる当技術分野で公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書に記述された同一性は、１０．０のギャップ開始ペナルティ、０．１のギャップ延長ペナルティを用い、Ｇｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用して決定される。
【００８７】
「インビトロ」：本明細書で使用する場合、多細胞生物体内ではなく、例えば試験管または反応容器などの人工的環境、細胞培養などにおいて発生する事象を含む。
【００８８】
「インビボ」：本明細書で使用される場合、例えばヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物体内で発生する事象を含む。細胞系のシステムの文脈において、当該用語を使用して、（例えばインビトロシステムとは対照的に）、生きた細胞内で発生する事象を含む場合もある。
【００８９】
「単離された」は、本明細書において用いられる場合、（１）（天然環境および／または実験環境のいずれかで）最初に生成された時にそれが関連していた成分の少なくとも一部から分離された物質および／もしくは実体、ならびに／または（２）ヒトの手によって設計、生産、調製、および／もしくは製造された物質ならびに／または実体を含む。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連していたその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離される場合がある。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書において用いられる場合、物質は、その他の成分が実質的に含まれない場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解するように、例えば、一つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの特定のその他の成分と組み合わされた後でも、物質はまだ「単離された」または「純粋」とさえもみなされる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントはこのような担体または賦形剤を含めることなく計算される。一例を挙げると、一部の実施形態では、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、ａ）導出の起源またはソースが、自然界の天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべてと関連していない時、ｂ）それが、自然界でそれを生産する種と同じ種のその他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない時、またはｃ）自然界でそれを生産する種ではない細胞またはその他の発現系によって発現されるか、またはそうでなければそれからの成分と関連している時、「単離された」とみなされる。ゆえに、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成された、または自然界でそれを生産するものとは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。あるいはまたは追加的に、一部の実施形態では、一つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが、ａ）それが自然界で関連している、および／またはｂ）最初に生産された時にそれが関連していたその他の成分から分離されている限りは「単離された」ポリペプチドとみなされることができる。
【００９０】
「座位」：本明細書において使用される場合、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または生物ゲノムの染色体上の位置の特定の場所を含む。例えば、「Ｌａｇ−３座位」は、Ｌａｇ−３遺伝子、Ｌａｇ−３ＤＮＡ配列、Ｌａｇ−３をコードする配列、またはかかる配列が存在する位置について特定されている生物体ゲノムの染色体上のＬａｇ−３の位置の特定の場所を含み得る。「Ｌａｇ−３座位」は、限定されないが、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’のＵＴＲ、またはそれらの組み合わせなどをはじめとするＬａｇ−３遺伝子の制御要素を含有してもよい。当技術分野の当業者には、一部の実施形態において、染色体が、数百、さらには数千の遺伝子を含有し得ること、および異なる種の間で比較した場合に、類似した遺伝子座位の物理的な共局在を示し得ることが明白である。そのような遺伝子座位は、シンテニーを共有したと記載される場合がある。
【００９１】
「非ヒト動物」:本明細書で使用される場合、ヒトではない任意の脊椎生物を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、哺乳動物である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳動物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝的に改変された動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はマウス、ラット、ハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスはネズミ科のメンバーからのものである。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、齧歯類である。一部のある実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はマウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、マウスである。
【００９２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系から成る群から選択される１２９系である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照）。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ／６系との混合である。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスは、前述の１２９系の混合、または前述のＢＬ／６系の混合である。一部の実施形態では、本明細書に記述された混合の１２９系は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスはＢＡＬＢ系（例えばＢＡＬＢ／ｃ系）である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統及び前述の別系統のミックスである。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ラットである。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記述されたラット系は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから成る群から選択された二つ以上の系の混合である。
【００９４】
「核酸」は、本明細書において用いられる場合、そのもっとも広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖であるか、もしくはオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれることができる任意の化合物および／または物質を含む。一部の実施形態では、「核酸」とはオリゴヌクレオチド鎖であるか、またはホスホジエステル結合でオリゴヌクレオチド鎖組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかになるように一部の実施形態では、「核酸」は個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を含み、一部の実施形態では、「核酸」は個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を含む。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはそれを含み、一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の天然核酸残基を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の核酸類似体を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で「核酸」とは異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野では知られており、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を持つ、一つ以上の「ペプチド核酸」であるか、またはそれらを含み、それらは本発明の範囲内であるとみなされる。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、一つ以上のホスホロチオエートおよび／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は一つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、または一つ以上の天然ヌクレオシドから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、およびそれらの組み合わせ）であるか、またはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、天然核酸のものと比べて、一つ以上の改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、天然起源物からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または系での複製、および化学合成の一つ以上によって調製される。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれを超える残基の長さである。一部の実施形態では、「核酸」は一本鎖であり、一部の実施形態では、「核酸」は二重鎖である。一部の実施形態では、「核酸」はポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも一つの要素を含むヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は酵素活性を持つ。
【００９５】
「動作可能に連結した」は、本明細書において用いられる場合、記述される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を含む。コード配列に「動作可能に連結した」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合されている。「動作可能に連結した」配列には、関心の遺伝子と隣接する発現制御配列および、トランスにまたは距離を置いて作用して対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語は、本明細書において用いられる場合、それらが結合されているコード配列の発現およびプロセッシングを生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を含む。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および望ましい場合、タンパク質分泌を強化する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む一方、真核生物では、一般的に、このような制御配列はプロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【００９６】
「患者」または「対象」は、本明細書で使用される場合、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的で、それに対して提供された組成物が投与されるまたは投与される場合がある任意の生物を含む。一般的な患者には動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳類）を含む。一部の実施形態では、患者は非ヒト動物である。一部の実施形態では、患者（例えば、非ヒト動物患者）は、本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つ場合、または改変を持たない（すなわち、野生型非ヒト動物患者）場合がある。一部の実施形態では、非ヒト動物は、一つ以上の障害または状態を患っているかまたはそれらにかかりやすい。一部の実施形態では、非ヒト動物は障害または状態の一つ以上の症状を示す。一部の実施形態では、非ヒト動物は一つ以上の障害または状態と診断されている。
【００９７】
「ポリペプチド」は、本明細書に記載される場合、アミノ酸の任意の重合鎖を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、お互いに別々に自然界に存在する部分を含むアミノ酸配列を持つ（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分など、二つ以上の異なる生物からのもの）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用を通して、設計および／または生産されるという点で、遺伝子操作されたアミノ酸配列を持つ。
【００９８】
「組み換え」は、本明細書で使用される場合、組み換え手段によって設計、操作、調製、発現、生成または単離されたポリペプチド（例えば、本明細書に記述されるＬａｇ−３ポリペプチド）を指すことが意図されており、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，１９９７，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．，２００２  Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．２００２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対しトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３−５１５８を参照）または選択された配列要素の相互スプライスを伴うその他の任意の手段によって調製、発現、生成または単離されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上は自然界に存在する。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上はインシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のこのような選択配列要素は、例えば、天然または合成起源の既知の配列要素の変異誘導（例えば、インビボまたはインビトロ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、対象のソース生物（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムに見られる配列から成る。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、変異誘導（例えば、非ヒト動物での、インビトロまたはインビボ）から生じるアミノ酸配列を持ち、従って、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列から由来するが、インビボで非ヒト動物のゲノム内に自然には存在しない場合がある。
【００９９】
「置換」は、本明細書に記載される場合、それを通して（例えば、ゲノムの）宿主遺伝子座に見られる「置換された」核酸配列（例えば、遺伝子）がその遺伝子座から取り除かれ、異なる「置換」用核酸がその場所に配置されるプロセスを含む。一部の実施形態では、置換された核酸配列および置換用核酸配列は、例えば、それらがお互いに相同である、および／または対応する要素（例えば、タンパク質コード要素、調節要素など）を含むという点でお互いに同等である。一部の実施形態では、置換された核酸配列には、プロモーター、エンハンサー、スプライス供与部位、スプライスアクセプター部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうち一つ以上を含み、一部の実施形態では、置換用核酸配列には、一つ以上のコード配列を含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列は置換された核酸配列のホモログである。一部の実施形態では、置換用核酸配列は置換された配列のオルソログである。一部の実施形態では、置換用核酸配列はヒト核酸配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを含む場合を含め、置換された核酸配列は齧歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であるかまたはそれを含む。そのように配置された核酸配列は、そのように配置された配列を得るために使用されるソース核酸配列の一部である一つ以上の調節配列を含む場合がある（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’−または３’−非翻訳領域など）。例えば、様々な実施形態で、置換は、そのように配置された核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の生産を生じる異種配列を伴う内因性配列の代替であるが、内因性配列の発現の代替ではない。置換は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を持つポリペプチドをコードする核酸配列を持つ内因性ゲノム配列のものである（例えば、全てまたは一部において、内因性ゲノム配列はＬａｇ−３ポリペプチドをコードし、ＤＮＡ断片は一つ以上のヒトＬａｇ−３ポリペプチドをコードする）。様々な実施形態で、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性遺伝子またはその断片のオルソログである、またはそれと構造および／もしくは機能が実質的に類似しているかもしくは同じヒト遺伝子または断片である。
【０１００】
「参照」は、本明細書で使用される場合、対象の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値が比較される、標準または対照の剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を記述するために用いられる。一部の実施形態では、参照薬剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。一部の実施形態では、参照薬剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、随意に有形媒体で具現化された歴史的参照である。一部の実施形態では、参照は対照を指す場合がある。本明細書で使用される場合、「参照」は「参照動物」を指す場合がある。「参照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。一般的には、当業者には理解されるであろうように、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を決定または特徴付けるために利用されるものと同等の条件下で決定または特徴付けられる。
【０１０１】
「実質的に」は、本明細書で使用される場合、対象となる特徴または特性の完全またはほぼ完全な範囲または程度を示す定性的条件を含む。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象はあったとしても、完了まで進む、および／または完全な状態まで進行する、または絶対的な結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性をとらえるために使用される。また当該用語は、参照配列、分子またはドメインと比較して、配列、核酸分子もしくはタンパク質分子、またはタンパク質ドメインに言及する場合に本明細書において使用される。例えば、非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドを実質的に含むヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドに言及する場合に、「非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドを実質的に」という文言は、非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドと実質的に同一であるペプチドを含み、このペプチドは、一部の実施形態では、非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９９％、または１００％、配列が同一である；一部の実施形態では、５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が、好ましくはシグナルペプチドのＮ末端またはＣ末端のみで、例えばシグナルペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が欠失することにより、またはアミノ酸が付加することにより、非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドと異なっている。別の例として、ヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインを実質的に含むヒト化ＰＤ−１ポリペプチドに言及する場合、「ヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインを実質的に」という文言は、ヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインと実質的に同一であるポリペプチドを含み、そのポリペプチドは一部の実施形態において、ヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９９％、または１００％、配列が同一である；一部の実施形態では、５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が、好ましくはＮ末端またはＣ末端のみで、例えばＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が欠失することにより、またはアミノ酸が付加することにより、ヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインと異なっている。
【０１０２】
「実質的な相同性」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸配列間の比較を含む。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある。あるいは、相同残基は、適切に類似の構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基である場合がある。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は「疎水性」または「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を持つものとして一般的に分類される。一つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸での置換は、「相同」置換とみなされる場合がよくある。一般的なアミノ酸分類が下記に要約される。
【表１】
2018533963.tif 000002
【表２】
2018533963.tif 000003
【０１０３】
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。そのようなプログラムの例は、以下に記載されている：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ；およびＭｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を一般的に提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の残基である。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った不連続残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。
【０１０４】
「実質的な同一性」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸配列間の比較を含む。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、「実質的に同一」であると一般的にみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。そのようなプログラムの例は、以下に記載されている：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ；Ｍｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ。同一配列の特定に加え、上述のプログラムは多くの場合、同一性の程度の指標も提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。
【０１０５】
「標的化ベクター」または「標的化構築物」は、本明細書で使用される場合、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。標的化領域は、標的細胞、組織または動物の配列と同一または実質的に同一の配列を含み、相同組み換えにより、標的化構築物を、細胞、組織または動物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰおよび／またはＦｒｔ部位）を使用して狙う標的化領域も含まれる。一部の実施形態では、標的化構築物は、特に関心のある核酸配列または遺伝子、選択可能マーカー、制御およびまたは調節配列、ならびにこのような配列が関与する組み換えを支援または促進するタンパク質の外からの追加を通して媒介される組み換えを許容するその他の核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、標的化構築物は対象の遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つたんぱく質の全部または一部をコードする異種遺伝子である。一部の実施形態では、標的化構築物は対象のヒト化遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象のヒト化遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つたんぱく質の全部または一部をコードする対象のヒト化遺伝子である。一部の実施形態では、標的化構築物は対象の操作された遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の操作された遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つたんぱく質の全部または一部をコードする対象のヒト化遺伝子である。
【０１０６】
「バリアント」は、本明細書で使用される場合、参照実在物とかなりの構造的同一性を示すが、参照実在物と比べて一つ以上の化学的部分の存在が参照実在物から構造的に異なる実在物を含む。多くの実施形態では、「バリアント」は、その参照実体とは機能的にも異なる。一般的に、特定の実体が、参照実体の「バリアント」と正しくみなされるかどうかは、参照実体とのその構造同一性の程度に基づく。当業者であれば理解するように、すべての生物学的または化学的参照実体は特定の特徴的構造要素を持つ。「バリアント」は、定義によると、一つ以上のこのような特徴的構造要素を共有する別個の化学的実体である。いくつかの例を挙げると、小分子は特徴的なコア構造要素（例えば、マクロサイクルコア）および／または一つ以上の特徴的懸垂部分を持つ場合があり、従って小分子のバリアントは、コア構造要素および特徴的懸垂部分を共有するが、その他の懸垂部分および／またはコア内に存在する結合のタイプ（単に対する二重、Ｅに対するＺなど）が異なるものであり、ポリペプチドは、直線または三次元空間でお互いに対して指定された位置を持つおよび／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から成る特徴的配列要素を持つ場合があり、核酸は、直線または三次元空間でお互いに対して指定された位置を持つ複数のヌクレオチド残基から成る特徴的配列要素を持つ場合がある。例えば、「バリアントポリペプチド」は、アミノ酸配列の一つ以上の差異および／またはポリペプチド骨格に共有結合した化学的部分（例えば、炭化水素、脂質など）の一つ以上の差異の結果として、参照ポリペプチドとは異なる場合がある。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、少なくとも一つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは一つ以上の生物活性を持つ。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を共有する。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を欠く。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドと比べて一つ以上の生物活性のレベル減少を示す。多くの実施形態で、特定位置での少数の配列変更がなければ対象のポリペプチドが親のものと同一のアミノ酸配列を持つ場合、対象のポリペプチドは親または参照ポリペプチドの「バリアント」であるとみなされる。一般的に、親と比べて、バリアントの残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が置換される。一部の実施形態では、「バリアント」は親と比べて、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の置換残基を有する。しばしば、「バリアント」は、非常に少数の（例えば、５、４、３、２、または１未満）の置換された機能残基（すなわち、特定の生物活性に参加する残基）を有する。さらに、「バリアント」は一般的には５、４、３、２、または１以下の付加または欠失を持ち、親と比べて付加または欠失を持たないことがよくある。さらに、任意の付加または欠失は一般的には、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満であり、通常は約５、約４、約３、または約２残基である。一部の実施形態では、親または参照ポリペプチドは自然界に見られるものである。当業者であれば理解するように、特に対象のポリペプチドが感染因子ペプチドである時、対象の特定ポリペプチドの複数のバリアントは、通常は自然界に見られる場合がある。
【０１０７】
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それが関連している別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製および／または、真核および／または原核細胞などの宿主細胞中でそれらが連結している核酸の発現能力がある。動作可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１０８】
「野生型」は、本明細書で使用される場合、（変異体、病的、変更などと対照をなす）「正常」な状態または状況で自然界に存在する構造および／または活性を有する実体を含む当技術分野に理解されている意味を有する。当業者であれば、野生型遺伝子およびポリペプチドはしばしば複数の異なる形態（例えば、アレル）で存在することを理解するであろう。
［発明を実施するための形態］
【０１０９】
本発明は、とりわけ、癌の治療のためのＬａｇ−３調節因子（例えば、抗Ｌａｇ−３抗体）の治療有効性を決定するため、およびＴ細胞反応およびシグナル伝達のアッセイのための、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）ポリペプチドをコードするヒト化遺伝物質を持つ改善されたおよび／または遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。このような非ヒト動物は、Ｌａｇ−３調節因子の治療有効性およびそれらのＬａｇ−３阻害能力の決定の改善を提供する。ゆえに、本発明は特に、様々な癌、自己免疫性の疾患、障害または症状の治療用の抗Ｌａｇ−３治療剤の開発に有用である。特に、本発明は、非ヒト動物の細胞の表面のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの発現をもたらす非ヒト（例えばマウス）Ｌａｇ−３遺伝子のヒト化を包含する。このようなヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、抗腫瘍免疫反応を促進する抗Ｌａｇ−３治療薬の有効性を決定するための、ヒトＬａｇ−３＋細胞の供給源を提供する能力を持つ。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、非ヒト動物の細胞の表面上に発現されたヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを通したＬａｇ−３シグナル伝達の阻害を介して、免疫反応の増大を示す。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、例えばヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメインを含有する細胞外ドメインなどのヒトＬＡＧ−３ポリペプチの細胞外ドメインに相当する配列を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２９〜２６０（または２３〜２６０または２１〜２６０）に相当する配列を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、非ヒト（例えば、マウスなどの齧歯類）のＬａｇ−３ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞内尾部に相当する配列を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメインを含有する細胞外部分を含み、この場合において、そのヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの残りの部分は、非ヒト（例えばマウスなどの齧歯類）のＬａｇ−３ポリペプチドのアミノ酸から構成される。一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドのシグナルペプチドと実質的に同一であるシグナルペプチド、ヒト部分と非ヒト部分を含む細胞外ドメインであって、そのヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの最初の２つのＩｇ様ドメインを含み、その非ヒト部分は内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの最後の２つのＩｇ様ドメインを含む細胞外ドメイン、および内因性非ヒトＬａｇ−３ポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含んでいる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、非ヒト動物および異種の種（例えば、ヒト）からの遺伝物質を含有するヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含み、この場合においてそのヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４を含む。一部のある実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を��み、この場合においてそのヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４、およびイントロン４の一部（例えば、約６８ｂｐ）に相当するヒトＬＡＧ−３遺伝子の約１，７４１ｂｐを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含み、この場合においてそのヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン１、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４、および非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン５〜８を含み、この場合において、そのヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、内因性Ｌａｇ−３座位に位置しており、およびその座位で、内因性Ｌａｇ−３プロモーターに動作可能に連結されている。
【０１１０】
本発明の様々な態様が以下のセクションに詳細に記述されている。セクションの使用は本発明を限定することを意図しない。各セクションは本発明の任意の態様に適用することができる。本明細書では、特に指定のない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）
【０１１１】
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３、またはＣＤ２２３とも呼称される）は、活性化したＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、形質細胞様樹状細胞、および制御性Ｔ細胞に発現されている膜貫通型受容体である。Ｌａｇ−３は、イムノグロブリンスーパーファミリーの１種であり、ＣＤ４の構造に類似し、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４ドメインとしても知られている。図２の配列アライメント中のアスタリスクを参照のこと）。Ｌａｇ−３は、免疫反応を減弱するよう機能し、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに結合することが報告されており（Ｌａｇ−３のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインとの相互作用を介して結合すると考えられている）、Ｌａｇ−３を発現している細胞に負のシグナルを送り、抗原依存性ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の反応をダウンレギュレートする。現在のところ、ＭＨＣＩＩが、Ｌａｇ−３の唯一の公知の結合パートナーである。Ｌａｇ−３はまた、Ｔ細胞が増殖し、サイトカインを産生し、標的細胞を溶解する能力を負に制御することが報告されており、これはＴ細胞の疲弊と呼ばれている。さらにＬａｇ−３は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の機能を増強させる役割を果たすことが報告されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，２０１２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−６４）。
【０１１２】
Ｔ細胞の共刺激分子と共抑制分子（併せて、共シグナル伝達分子と名付けられている）は、Ｔ細胞の活性化、サブセット分化、エフェクター機能および生存の制御に重要な役割を果たしている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｆｌｉｅｓ，２０１３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２２７−４２）。抗原提示細胞上の同系ペプチド−ＭＨＣ複合体がＴ細胞受容体に認識された後、共シグナル伝達受容体は、免疫シナプスでＴ細胞受容体と共局在し、そこで、それらはＴＣＲシグナル伝達と相乗作用して、Ｔ細胞の活性化と機能を促進または阻害する（Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８４：４０９−２１）。基本的な免疫反応は、共刺激性シグナルと共阻害性シグナルの間のバランスにより制御されており、それらは「免疫チェックポイント」と呼称されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．、上記）。そのような「免疫チェックポイント」は、免疫システムにおいてシグナル、特にＴ細胞シグナルを上向かせる、または下向かせるよう作動する分子として記載される場合がある。Ｌａｇ−３は、末梢Ｔ細胞寛容の調節において、多くの「免疫チェックポイント」の１つとして機能する。
【０１１３】
将来のヒト患者の癌治療のための実用的な標的化療法を開発するためには、腫瘍におけるＬａｇ−３媒介機能およびＬａｇ−３経路、自動ならびに感染性免疫のより徹底的で詳細な理解が必要である。
Ｌａｇ−３配列
【０１１４】
齧歯類（例えばラットおよびマウス）、ヒト、およびヒト化されたｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）配列の例を図８に記載する。非ヒトＬａｇ−３遺伝子をヒト化するための合成ＤＮＡ断片の例もまた図８に記載する。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧内に含まれる。アミノ酸配列に関し、膜貫通配列は、下線文字により示されている。ヒト化アミノ酸配列に関し、ヒト配列は太字で示され、括弧内に含まれている。
ＤＮＡ構築物
【０１１５】
多くの場合、Ｌａｇ−３遺伝子の全部、または一部を含有するポリヌクレオチド分子はベクター、好ましくはＤＮＡベクターに挿入され、適切な宿主細胞中でそのポリヌクレオチド分子が複製される。
【０１１６】
サイズに応じて、Ｌａｇ−３遺伝子またはＬａｇ−３をコードする配列は、業者により入手可能なｃＤＮＡ源から直接クローニングされてもよく、またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能な公開配列に基づいてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されてもよい。あるいは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーが、対象遺伝子からの異種Ｌａｇ−３配列を提供してもよい（例えば、異種Ｌａｇ−３遺伝子）。ＢＡＣライブラリーは、１００〜１５０ｋｂの平均インサートサイズを含み、３００ｋｂの大きさのインサートを保有することができる（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：８７９４−７；Ｓｗｉａｔｅｋ，Ｐ．Ｊａｎｄ  Ｔ．Ｇｒｉｄｌｅｙ，１９９３，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：２０７１−８４；Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４：２１３−８、参照により本明細書に援用される）。例えばヒトおよびマウスのゲノムＢＡＣライブラリーが構築されており、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。ゲノムＢＡＣライブラリーは、異種のＬａｇ−３配列ならびに転写制御領域の源として利用することもできる。
【０１１７】
あるいは、異種Ｌａｇ−３配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転させてもよい。完全な異種遺伝子または座位をクローニングし、１個または数個のＹＡＣ内に含有させてもよい。複数のＹＡＣが使用され、重複相同性の領域を含有する場合、それらを酵母宿主株内で再結合させて、完全な座位を提示する１つの構築物を生成してもよい。哺乳類選択カセットを用いた改良によりＹＡＣのアームをさらに改変し、当技術分野に公知の方法および／または本明細書に記載される方法により、構築物を胚性幹細胞または胚に導入することを補助してもよい。
【０１１８】
非ヒト動物におけるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の構築における使用のためのｍＲＮＡおよびアミノ酸配列の例を、本明細書の例えば図８に提示する。他の異種Ｌａｇ−３配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたはその他の当技術分野に公知の配列データベースに見出すことができる。
【０１１９】
本明細書に記載されるＬａｇ−３配列を含有するＤＮＡ構築物は、一部の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物における発現のために、非ヒト制御配列（例えば齧歯類のプロモーター）に動作可能に連結された、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの細胞外部分、例えばヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０（または２３−２６０もしくは２１−２６０）をコードするヒトのＬＡＧ−３ゲノム配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬａｇ−３配列を含有するＤＮＡ構築物は、非ヒトのＬａｇ−３プロモーターに動作可能に連結されたヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０をコードするヒトＬＡＧ−３ゲノム配列と、１つ以上の非ヒトＬａｇ−３エクソン（例えば内因性Ｌａｇ−３エクソン）を含む。本明細書に記載されるＤＮＡ構築物中に含まれるヒトおよび／または非ヒトのＬａｇ−３配列は、自然界で存在する（例えばゲノム）ヒトおよび／または非ヒトのＬａｇ−３配列と同一、または実質的に同一であってもよく、人工（例えば合成）であってもよく、またはヒトの手により操作されていてもよい。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３配列は、合成起源であり、自然界に存在するヒトＬＡＧ−３遺伝子中に存在する配列を含んでもよい。例えば、ＤＮＡ構築物は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４に相当し、および例えばヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸２９−２６０などのヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの細胞外部分をコードする合成ＤＮＡを含んでもよく、それらは非ヒトＬａｇ−３制御性配列（例えばプロモーター）とコード配列（例えば１つ以上の非ヒトエクソン）に動作可能に連結されており、それによって、ヒト部分と非ヒト部分を有するＬＡＧ−３ポリペプチドが、得られたＤＮＡ構築物によりコードされる。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３配列は、異種Ｌａｇ−３遺伝子（すなわち、ヒトＬＡＧ−３遺伝子）と自然に関連している配列を含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３配列は、異種Ｌａｇ−３遺伝子（すなわち、ヒトＬＡＧ−３遺伝子）と自然に関連していない配列を含む。一部の実施形態では、Ｌａｇ−３配列は、非ヒト動物における発現に最適化された配列を含む。一部の実施形態では、非ヒトＬａｇ−３配列に動作可能に連結された異種Ｌａｇ−３配列は各々、自然界では別個のポリペプチド中に存在するＬａｇ−３ポリペプチドの一部をコードする。もし異種Ｌａｇ−３配列の発現の最適化に追加的配列が有用である場合、かかる配列を、既存の配列をプローブとして使用してクローニングしてもよい。異種Ｌａｇ−３遺伝子または異種Ｌａｇ−３コード配列の発現を最大化するために必要な追加的配列は、ゲノム配列、または所望される結果に応じて他の源から取得することができる。
【０１２０】
ＤＮＡ構築物は、当技術分野に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、大きなプラスミドの一部として調製することができる。そのような調製により、当技術分野で公知のように、効率的な方法で正しい構築物のクローニングと選択が可能となる。本明細書に記載されるヌクレオチドコード配列を１つ以上含有するＤＮＡ断片は、プラスミド上の便利な制限酵素部位の間に位置づけることができ、それによって、所望される動物への組み込みのために、残りのプラスミド配列からそれらを簡便に単離することができる。
【０１２１】
プラスミド、およびプラスミドを含有する宿主生物体の調製に使用される様々な方法が当技術分野に公知である。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現システム、ならびに一般的な組み換え法に関しては、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９。
ヒト化Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  ３を有する非ヒト動物の作製
【０１２２】
Ｌａｇ−３ポリペプチドをコードする非ヒト動物の内因性遺伝子座（例えば、Ｌａｇ−３遺伝子座）の遺伝子改変から生じる非ヒト動物の細胞表面上に、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物が提供されている。本明細書に記述された適切な例には齧歯類、特にマウスが含まれる。
【０１２３】
一部の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、異種の種（例えば、ヒト）からの遺伝物質を含み、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は異種の種由来の遺伝物質のコード化部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、細胞の細胞膜上に発現されるＬａｇ−３ポリペプチドの細胞外部分をコードする異種の種のゲノムＤＮＡを含む。該ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物、非ヒト胚、および細胞を作製するための非ヒト動物、胚、細胞および標的化構築物も提供される。
【０１２４】
一部の実施形態では、内因性Ｌａｇ−３遺伝子は削除されている。一部の実施形態では、内因性Ｌａｇ−３は変更されており、内因性Ｌａｇ−３遺伝子の一部分が異種配列（例えば、ヒトＬＡＧ−３配列の全部または一部）で置換されている。一部の実施形態では、内因性Ｌａｇ−３遺伝子のすべてまたは実質的にすべてが、異種の遺伝子（例えば、ヒトＬＡＧ−３遺伝子）で置換される。一部の実施形態では、異種Ｌａｇ−３遺伝子の一部分が、内因性Ｌａｇ−３遺伝子座で、内因性非ヒトＬａｇ−３遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、異種遺伝子はヒト遺伝子である。一部の実施形態では、改変またはヒト化は、内因性Ｌａｇ−３遺伝子の二つの複製のうちの一つに対して行われ、それによりヒト化Ｌａｇ−３遺伝子に対してヘテロ接合性の非ヒト動物を生じさせる。その他の実施形態では、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子に対してホモ接合性の非ヒト動物が提供される。
【０１２５】
様々な態様で、非ヒト動物は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子の全部または一部を内因性非ヒトＬａｇ−３遺伝子座に含む。従って、このような非ヒト動物は異種Ｌａｇ−３遺伝子を有するとして記述されることができる。内因性Ｌａｇ−３遺伝子座で置換、挿入、改変されたまたは変更されたＬａｇ−３遺伝子、またはこのような遺伝子から発現されたまたはポリペプチドは、例えば、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、サザンブロット、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、または対立遺伝子の獲得または欠失アッセイを含む、様々な方法を使用して検出できる。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子に関してヘテロ接合性である。
【０１２６】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４を含有する。
【０１２７】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、２番目、３番目、および４番目のエクソンを有するＬａｇ−３遺伝子を含み、各エクソンは、配列番号５に存在する２番目、３番目、および４番目のエクソンに対し、少なくとも５０％（例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を有する。
【０１２８】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、２番目、３番目、および４番目のエクソンを有するＬａｇ−３遺伝子を含み、各エクソンは、配列番号５に存在する２番目、３番目、および４番目のエクソンと実質的に同一であるか、または同一である配列を有する。
【０１２９】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対し、少なくとも５０％（例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む。
【０１３０】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１と実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。
【０１３１】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号１０であるか、または配列番号１０を含む。
【０１３２】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号１１であるか、または配列番号１１を含む。
【０１３３】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、非ヒトＬａｇ−３遺伝子、たとえは非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン１、５、６、７および８を含む。
【０１３４】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、１番目、５番目、６番目、７番目および８番目のエクソンを含み、各エクソンは、配列番号１または配列番号３に存在する１番目、５番目、６番目、７番目および８番目のエクソンに対し、少なくとも５０％（例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を有している。
【０１３５】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、１番目、５番目、６番目、７番目および８番目のエクソンを含み、各エクソンは、配列番号１または配列番号３に存在する１番目、５番目、６番目、７番目および８番目のエクソンと実質的に同一であるか、または同一である配列を有している。
【０１３６】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、非ヒトＬａｇ−３遺伝子、たとえは非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子の５’非翻訳領域と３’非翻訳領域を含む。
【０１３７】
様々な実施形態で、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号１または配列番号３に存在する５’非翻訳領域および３’非翻訳領域と、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）同一の配列を有する、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む。
【０１３８】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、５’非翻訳領域と３’非翻訳領域を含み、各非翻訳領域は、配列番号１または配列番号３に存在する５’非翻訳領域と３’非翻訳領域に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を有している。
【０１３９】
様々な実施形態で、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号７に存在するヌクレオチドコード化配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のヌクレオチドコード化配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を含む。
【０１４０】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号７に存在するヌクレオチドコード配列に対し、実質的に同一であるか、または同一であるヌクレオチドコード配列（例えばｃＤＮＡ配列）を含む。
【０１４１】
様々な実施形態で、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号８に存在するアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を持つＬａｇ−３ポリペプチドをコードする。
【０１４２】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子は、配列番号８に存在するアミノ酸配列に対し、実質的に同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有するＬａｇ−３ポリペプチドをコードしている。
【０１４３】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有しており、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２９−２６０に対し、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの細胞外部分（最初の２つのＩｇ様ドメインを含有する細胞外部分）に対し、実質的に同一である細胞外部分を有している。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの細胞外部分は、例えば配列番号６に記載されるヒトＬＡＧ−３ポリペプチドなどのヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ残基２１−２６０、２３−２６０または２９−２６０により表される。
【０１４５】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有し、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２９−２６０に対し、実質的に同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有し、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２３−２６０に対し、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有し、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２３−２６０に対し、実質的に同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有しており、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２１−２６０に対し、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、細胞外部分を有し、その細胞外部分は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基２１−２６０に対し、実質的に同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、例えば非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３ポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞質ドメインなどの、非ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの膜貫通部分と細胞質部分を有している。一部の実施形態では、非ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞質ドメインの配列は、図８に図示される配列である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、非ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの最後の２つのＩｇ様ドメインを含有する細胞外部分も有している。
【０１５１】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対し、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を有する。
【０１５２】
様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物により産生されるヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対し、実質的に同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
特定の多型形態、アレルバリアント（例えば、単一のアミノ酸の差）または代替的にスプライスされたイソフォームを含む、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法が提供されており、これにはこのようなポリペプチドをヒトプロモーターおよびヒト調節配列から発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法を含む。一部の実施形態では、かかるタンパク質を非ヒトプロモーターおよび非ヒト調節配列から発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供されている。一部の実施形態では、かかるタンパク質を内因性プロモーターおよび内因性調節配列から発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供されている。一部のある実施形態では、内因性プロモーターおよび内因性調節配列は、内因性齧歯類プロモーターおよび内因性齧歯類調節配列である。該方法は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの全部または一部をコードする遺伝物質を、内因性Ｌａｇ−３遺伝子に相当する非ヒト動物のゲノムの正確な位置に挿入すること、およびそれによって、全部または一部がヒトであるＬａｇ−３タンパク質を発現するヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を生成することを含む。一部の実施形態では、該方法は、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２、３および４に相当するゲノムＤＮＡを非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子に挿入すること、およびそれによって、挿入されたエクソンによりコードされるアミノ酸を含有するヒト部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドをコードするヒト化遺伝子を生成することを含む。
【０１５４】
適切な場合、ヒト（またはヒト化）Ｌａｇ−３ポリペプチドの全部または一部をコードする遺伝物質のコード領域またはポリヌクレオチド配列は、非ヒト動物の細胞からの発現のために最適化されたコドンを含むように改変される場合がある（例えば、米国特許第５，６７０，３５６号および第５，８７４，３０４号を参照）。コドン最適化配列は合成配列であり、非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一ポリペプチド（または全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する全長ポリペプチドの生物活性断片）をコードすることが好ましい。一部の実施形態では、ヒト（またはヒト化）Ｌａｇ−３ポリペプチドの全部または一部をコードする遺伝物質のコード領域は、特定の細胞タイプ（例えば、齧歯類細胞）に対してコドン使用頻度を最適化するように変更された配列を含む場合がある。例えば、非ヒト動物（例えば、齧歯類）の内因性Ｌａｇ−３遺伝子に挿入される、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２、３および４に相当するゲノムＤＮＡのコドンは、非ヒト動物の細胞での発現のために最適化される場合がある。このような配列はコドン最適化配列として記述される場合がある。
【０１５５】
ノックアウトおよびノックインを含むトランスジェニック非ヒト動物を生成する方法は、当技術分野に公知である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。例えば、トランスジェニック齧歯類の作製は、任意で、１つ以上の内因性齧歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）の遺伝座位の破壊と、その齧歯類のゲノムへの１つ以上の異種遺伝子（またはＬａｇ−３コード配列）の導入を含み、一部の実施形態では、内因性齧歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）と同じ位置である。
【０１５６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される異種（またはヒト化）Ｌａｇ−３遺伝子、または異種Ｌａｇ−３コード配列は、齧歯類のゲノムに無作為に導入される。かかる実施形態では、無作為に導入された異種（またはヒト化）Ｌａｇ−３遺伝子、または異種Ｌａｇ−３コード配列を含む、含有する、または別の手段で保有する齧歯類は、異種Ｌａｇ−３導入遺伝子または異種Ｌａｇ−３導入遺伝子構築物を有するとして特徴づけられることができる。典型的には、導入遺伝子および／または導入遺伝子構築物としては、特に、本明細書に記載される方法、または別の当技術分野に公知の方法を使用してヒトの手により非ヒト細胞（例えば齧歯類の胚性幹細胞）へと導入された核酸配列（例えば対象ポリペプチドの全部、または一部をコードしている）が挙げられる。さらに導入遺伝子は、部分的に、または完全に異種、すなわち、導入される非ヒト動物または細胞に対し、外来性であってもよい。導入遺伝子は、１つ以上の転写制御配列と、任意の他の核酸、例えばイントロンまたはプロモーターなどをさらに含んでもよく、それらは選択された核酸配列の発現に必要な場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載される異種（またはヒト化）Ｌａｇ−３遺伝子、または異種Ｌａｇ−３コード配列は、齧歯類のゲノム中の内因性Ｌａｇ−３遺伝子に導入される；一部のある実施形態では、内因性Ｌａｇ−３遺伝子座位は、１つ以上の非ヒトＬａｇ−３配列（または遺伝子断片）に動作可能に連結されたヒトＬａｇ−３配列（または遺伝子断片）を含有するよう、変更され、改変され、または操作される。
【０１５７】
様々な実施形態で、Ｌａｇ−３配列のゲノム配列は単一断片中で改変され、それにより必要な調節配列を含むことによって正常な機能が維持されるため、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の方法は、相対的に最小限の内因性タンパク質相互作用およびシグナル伝達の改変を用いることにより、非ヒト動物において自然な状態のＬａｇ−３介在性シグナル伝達を生じさせる。ゆえに、このような実施形態では、Ｌａｇ−３遺伝子改変はその他の周囲の遺伝子またはその他の内因性Ｌａｇ−３相互作用遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子など）に影響を与えない。さらに、様々な実施形態で、改変は、細胞膜上の機能的Ｌａｇ−３膜貫通ポリペプチドの組み立てに影響を与えず、結合および、改変によって影響を受けないポリペプチドの細胞質部分を通したその後のシグナル伝達を介して正常なエフェクター機能を維持する。
【０１５８】
内因性マウスＬａｇ−３遺伝子およびヒト  ＬＡＧ−３遺伝子のゲノム構造の略図（正確な縮尺ではない）が図１に提供されている。ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２、３、および４ならびにイントロン４（例えば、約６８ｂｐ）の一部分を含有するゲノム断片を使用して、内因性マウスＬａｇ−３遺伝子をヒト化するための例示的方法が図３に提供されている。図示されるように、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２、３および４ならびにイントロン４の一部分に相当する１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片が、標的化構築物によって内因性マウスＬａｇ−３遺伝子座の１，７５０ｂｐ配列の場所に挿入されている。１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片は、ヒトＤＮＡから直接クローンを作るか、またはソース配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２８６．５、配列番号９）から合成される場合がある。このゲノムＤＮＡは、リガンド結合に関与するヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸残基２９−２６０（または２３−２６０もしくは２１−２６０）を少なくともコードする遺伝子の部分を含む。
【０１５９】
内因性Ｌａｇ−３遺伝子座にヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、当技術分野で公知の任意の方法で作ることができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子とともにヒトＬＡＧ−３遺伝子の全部または一部を導入する標的化ベクターを作ることができる。図３は、ヒトＬａｇ−３遺伝子のエクソン２〜４およびイントロン４の最初の６８ｂｐに相当する１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片の挿入物を含むマウスゲノムの内因性Ｌａｇ−３座を含有する標的化ベクターを示す。図示されるように、標的化構築物は、内因性マウスＬａｇ−３遺伝子（約４６Ｋｂ）のエクソン２（すなわち、エクソン１など）の上流の配列を含む５’ホモロジーアームに続く１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片、薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列の両側に隣接するネオマイシン耐性遺伝子、約５Ｋｂ）、ならびに内因性マウスＬａｇ−３遺伝子（約５３ｂｐ）の内因性マウスエクソン５〜８の残りの配列を含む３’ホモロジーアームを含む。標的化構築物は、自動削除薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列に隣接したネオマイシン耐性遺伝子、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を含む。胚性幹細胞を電気穿孔すると、内因性野生型Ｌａｇ−３遺伝子の１，７５０ｂｐの位置に、ヒトＬＡＧ−３遺伝子の１，７４１ｂｐ（すなわち、エクソン２〜４およびイントロン４の最初の６８ｂｐ）を含む改変内因性Ｌａｇ−３遺伝子が作られ、これは標的化ベクターに含有される。ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子が作られ、１，７４１ｂｐの合成ＤＮＡ断片（すなわち、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４およびイントロン４の６８ｂｐ）によってコードされるアミノ酸を含有するヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現する細胞または非ヒト動物が結果として生じる。薬剤選択カセットは発達依存性の様式で除去される、すなわち、その生殖系細胞に上述のヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むマウスから派生した子孫は、発達中に分化細胞から選択可能マーカーを脱落させる（図３の下部を参照）。
【０１６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を有する非ヒト動物は、そのヒト化Ｌａｇ−３遺伝子に対しトランスジェニックであるとして特徴付けられ、またはトランスジェニックＬａｇ−３非ヒト動物であってもよい。そのような記載は本明細書において相互交換可能に使用され、任意の非天然非ヒト動物を指し、その非ヒト動物の細胞の１つ以上が、本明細書に記載される異種Ｌａｇ−３核酸配列および／もしくはＬａｇ−３コード配列の全部または一部を含有している。一部の実施形態では、異種Ｌａｇ−３の核酸配列および／もしくはＬａｇ−３コード配列の全部、または一部は、例えばマイクロインジェクションまたは組み換えウイルスを用いた感染などの慎重な遺伝子操作を介して、前駆細胞へ導入することにより、直接的に、または間接的に細胞内に導入される。かかる実施形態において、遺伝子操作は、伝統的な交配技術を含まず、本明細書に記載される異種Ｌａｇ−３核酸配列および／もしくはＬａｇ−３コード配列の全部または一部を含む組み換えＤＮＡ分子の導入を目的としたものである。かかる分子は、染色体内に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書において記載される場合、トランスジェニック非ヒト動物とは、本明細書に記載されるように、異種のＬａｇ−３核酸配列および／もしくはＬａｇ−３コード配列の全部または一部に対し、ヘテロ接合性またはホモ接合性である動物、ならびに／または異種Ｌａｇ−３核酸配列および／もしくはＬａｇ−３コード配列の全部または一部を１コピーまたは複数コピー有する動物を含む。
【０１６１】
トランスジェニック創始非ヒト動物は、そのゲノム中のヒト化Ｌａｇ−３遺伝子の存在に基づき特定されることができ、および／またはその非ヒト動物の組織または細胞における、挿入遺伝物質によりコードされたアミノ酸を含有するＬＡＧ−３ポリペプチドの発現に基づき特定されることができる。次いでトランスジェニック創始非ヒト動物を使用して、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を担持する追加の非ヒト動物と交配させ、それによって各々がヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を１コピー以上担持する一連の非ヒト動物を生成することができる。さらにヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を担持するトランスジェニック非ヒト動物を、所望される他の導入遺伝子（例えばヒトイムノグロブリン遺伝子）を担持する他のトランスジェニック非ヒト動物とさらに交配させてもよい。
【０１６２】
トランスジェニック非ヒト動物はまた、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子（またはヒト化Ｌａｇ−３導入遺伝子）の発現の制御または管理を可能とする選択システムを含有するよう作製されてもよい。システムの例としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６２３２−６２３６を参照のこと）および出芽酵母のＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）が挙げられる。そのような動物は、例えば１種は選択された改変（例えばヒト化Ｌａｇ−３遺伝子または導入遺伝子）を含む導入遺伝子を含有し、他方はリコンビナーゼ（例えばＣｒｅリコンビナーゼ）をコードする導入遺伝子を含有する、２種のトランスジェニック動物を交配することにより、「二重の」トランスジェニック動物を構築することにより提供され得る。
【０１６３】
本明細書に記載される非ヒト動物は、多くの場合、当該非ヒト動物の使用目的に応じて、上述のように調製され、または追加のヒト遺伝子もしくはヒト化遺伝子を含有させるための当技術分野に公知の方法を用いて作製されてもよい。かかる追加のヒト遺伝子またはヒト化遺伝子の遺伝物質は、上述の遺伝的改変を有する細胞（例えば胚性幹細胞）のゲノムのさらなる改変を介して、または所望される他の遺伝子改変系統を用いた当技術分野に公知の交配技術を介して、導入される場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＰＤ−１）、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １（ＰＤ−Ｌ１）、およびｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＣＴＬＡ−４）から選択されるヒト遺伝子またはヒト化遺伝子を１つ以上さらに含むように調製される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記述されるように、標的化ベクターを、改変された系統由来の細胞へと導入することにより調製されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化されたＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（Ｐｄｃｄ１）遺伝子をさらに含むように調製される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子と、異種（例えばヒト）由来の遺伝物質を含み、この場合においてその遺伝物質は、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＰＤ−１）、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １（ＰＤ−Ｌ１）、およびｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＣＴＬＡ−４）から選択される１つ以上の異種タンパク質の全体、または一部をコードしている。一部のある実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記述されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子、および異種の種（例えば、ヒト）由来の遺伝物質を含み、この場合において、当該遺伝物質は、異種（例えば、ヒト）ＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部をコードしている。一部のある実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、内因性部分およびヒト部分（例えば、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子の全てまたは一部のエクソン２またはエクソン３）を含むＰｄｃｄ１遺伝子をさらに含み、該ヒト部分は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインの実質的に全て（例えば、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの残基２７−１６９または２６−１６９）をコードし、内因性部分は内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内ドメインをコードし、一部の実施形態では、ヒト部分および内因性部分は、内因性Ｐｄｃｄ１プロモーターに動作可能に連結される。一部のある実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインの実質的にすべてをコードする遺伝物質（例えば、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの２７−１６９または２６−１６９残基に相当するアミノ酸をコードする遺伝物質；例えば、２０１５年６月１９日に出願され、ＷＯ２０１���１９６０５１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ１５／３６６４９の配列番号２３、および２０１５年６月１９日に出願され、ＵＳ２０１５−０３６６１７４Ａ１として公開された米国特許出願１４／７４４，５９２の配列番号２３を参照のこと。これらは参照により本明細書に援用される）を含むＰｄｃｄ１遺伝子をさらに含む。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８．２およびＮＰ＿００５００９．２、およびＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ１５１１６は、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子とヒトＰＤ−１ポリペプチドの代表的なソース配列を提供し、ここから所望されるヒト部分を取得することができる。
【０１６４】
例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む非ヒト動物は、（例えば、交雑育種または複数遺伝子標的戦略を介して）、２０１５年６月１９日に出願され、ＷＯ２０１５１９６０５１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ１５／３６６４９に記載され、および２０１５年６月１９日に出願され、ＵＳ２０１５−０３６６１７４Ａ１として公開された米国特許出願１４／７４４，５９２に記載される１つ以上の改変をさらに含んでもよい。これら出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。ある実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類を、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子（例えば、エクソン１に動作可能に連結されたヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２と、エクソン３の一部、内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１遺伝子のエクソン３、４、および５の一部）を含む齧歯類と交配させ、それによってそのヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外部分（例えばアミノ酸残基２７−１６９または２６−１６９に相当する）と、齧歯類ＰＤ−１ポリペプチドタンパク質の細胞内部分（例えば、２０１５年６月１９日に出願され、ＷＯ２０１５１９６０５１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ１５／３６６４９の配列番号５および６、ならびに／または２０１５年６月１９日に出願され、ＵＳ２０１５−０３６６１７４Ａ１として公開された米国特許出願１４／７４４，５９２の配列番号５および６を参照のこと。これらは参照により本明細書に援用される）を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードするようになる。ある実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む齧歯類を、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含む齧歯類と交配させる。そのヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする遺伝物質（例えば、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの２７−１６９または２６−１６９残基に相当するアミノ酸をコードする遺伝物質；例えば、２０１５年６月１９日に出願され、ＷＯ２０１５１９６０５１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ１５／３６６４９の配列番号２３、および／または２０１５年６月１９日に出願され、ＵＳ２０１５−０３６６１７４Ａ１として公開された米国特許出願１４／７４４，５９２の配列番号２３を参照のこと。これらは参照により本明細書に援用される）を含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、非ヒト（例えば齧歯類）のＰｄｃｄ１のエクソン１、ヒトＰＤＣＤ１のエクソン２、エクソン３（ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン３の一部と、非ヒト（例えば齧歯類）のＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン３の一部）、および非ヒト（例えば齧歯類）のＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン４〜５を含み、この場合において、一部の実施形態では、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン３の一部は、例えばＰＤ−１のｓｔａｌｋ配列のアミノ酸などのヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインの一部のアミノ酸をコードするヒトエクソン３の５’部分であり、および非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン３の一部は、非ヒトＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通ドメインの一部のアミノ酸をコードする非ヒトのエクソン３の３’部分である。特定の実施形態において、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインと実質的に同一な細胞外ドメイン、齧歯類ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通ドメインと実質的に同一な膜貫通ドメイン、および齧歯類ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内ドメインを含むヒト化ＰＤ−１ポリペプチドをコードする。
【０１６６】
マウスにおいて、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を用いる実施形態（すなわち、ヒト部分およびマウス部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドをコードするＬａｇ−３遺伝子を伴うマウス）が本明細書では広く検討されているが、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むその他の非ヒト動物も提供される。一部の実施形態では、このような非ヒト動物は、齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターに動作可能に連結したヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む。一部の実施形態では、このような非ヒト動物は、内因性Ｌａｇ−３プロモーターに動作可能に連結したヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含み、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｌａｇ−３プロモーターである。一部の実施形態では、かかる非ヒト動物は、内因性座位からヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現し、この場合において、そのヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドの少なくともアミノ酸残基２９−２６０（例えば２９−２６０、２３−２６０または２１−２６０）を含む。このような非ヒト動物には、本明細書に開示されたＬａｇ−３ポリペプチドを発現するように遺伝子改変された動物のいずれかを含み、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの哺乳類が含まれる。例えば、好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作るために他の方法が採用される。このような方法には、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を利用して好適な細胞、例えば除核卵母細胞、に遺伝子改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
【０１６７】
非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、メスウシ、齧歯類、ニワトリなどのゲノム）の改変方法には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）、またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用い、ゲノムを改変してヒト化Ｌａｇ−３および／またはヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含める方法が含まれる。
ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を有する非ヒト動物を用いる方法
【０１６８】
生物医学研究にヒト化マウスを使用することで、ヒト細胞、特にヒト免疫細胞の機能の様々な態様の理解が促進される。実際に、ヒト免疫細胞の研究に様々な免疫不全系統を使用することで、有益なインビボシステムが提供されている。しかし、それらには限界がある。例えば、これらモデルの使用によって、哺乳類の生態、特に哺乳類の免疫における明らかな違いが強調されている。標的免疫修飾の評価に免疫不全マウスを使用することは最良ではなく、そのようなマウスで観察される異常な免疫機能はしばしば、示されている表現型の理解を複雑化してしまう。これは特に、腫瘍に対する免疫反応の場合において当てはまる。近年まで、マウスにおける腫瘍に対する免疫反応（例えばＴ細胞反応）の研究は、特に、異なる源（すなわちドナー）の移植ヒト細胞が原因のＨＬＡ不適合のために、混同されていた（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（２９）：１３０２２−７）。
【０１６９】
腫瘍細胞は、Ｔ細胞の共刺激経路を変えることで、免疫認識とエフェクター反応を回避することができる。共刺激回路は、抗原刺激環境中での免疫反応の程度と期間を制御することにより、Ｔ細胞の活性化、寛容、および免疫介在性組織損傷のバランスを調節する。Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）は、Ｔ細胞活性の負の調節因子であり、メモリーＴ細胞プールのサイズを制御している（Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５４５０−５）。抗原感作されたＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＬａｇ−３の機能的役割が報告されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合後のこれらの細胞に対するＬａｇ−３のアップレギュレーションは、Ｔ細胞の増殖、活性化、および炎症促進性サイトカインの産生に負の影響をもたらす（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１２）：３２１６−２１；Ｈｕａｒｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９（３）：２１３−７；Ｍａｃｏｎ−Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｌ．ａｎｄ  Ｆ．Ｔｒｉｅｂｅｌ，２００５，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１５：１７０−８；  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｍ．Ｖ．ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｄｒａｋｅ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４４：２６９−７８）。Ｌａｇ−３阻害は、Ｔ細胞において抗腫瘍反応を増強させることが報告されている（Ｇｒｏｓｓｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：３３８３−９２）。Ｔ細胞活性化の負に調節に関与する他の阻害性受容体としては、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＰＤ−１）およびｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＣＴＬＡ−４）が挙げられる。そのリガンドであるＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  １（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１またはＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣまたはＣＤ２７３）とともに、ＰＤ−１は、環境および自己抗原に対する免疫寛容の確立および維持にとって重要なチェックポイントシグナルを伝達する（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３６：２１９−４２）。ＰＤ−１は、Ｌａｇ−３と同様に、腫瘍細胞を、宿主免疫系の免疫監視から逃れさせることによって抗腫瘍免疫を回避させる役割を果たしていることが報告されている（Ｚｏｕ，Ｃ．２００８，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４６７−７７）。
【０１７０】
本発明はとくに、癌の状況下では、これら阻害性受容体の発現は、抗原特異的Ｔ細胞機能の不全と関連しているという認識に基づいている。本発明はまた、本明細書に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子および／またはヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を使用して、免疫チェックポイントを活用したインビボシステムを作製することができるという認識に基づいている。かかる改善されたインビボシステムによって、癌患者の抗腫瘍免疫を刺激することに焦点を置いた、抗免疫チェックポイント療法および／またはその療法のレジメンの開発が可能となる。さらに、かかる改善されたインビボシステムはまた、感染性疾患および／または自己免疫性疾患においてＴ細胞活性を増強させることに焦点を置いた療法および／またはその療法のレジメンの開発をもたらすものである。
【０１７１】
本明細書に記載される非ヒト動物は、様々なアッセイに有用なヒト（またはヒト化）Ｌａｇ−３を発現する、改善されたインビボシステムおよび生体物質（例えば、細胞）の供給源を提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物を使用し、Ｌａｇ−３を標的とする、および／またはＬａｇ−３のシグナル伝達を調節する（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子などのＬａｇ−３結合パートナーとの相互作用を妨害する）療法が開発される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＬａｇ−３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用を阻害する候補治療薬（例えば、抗体）をスクリーニングおよび開発するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記述された非ヒト動物の細胞の表面上のヒト化Ｌａｇ−３の拮抗薬および／または作動薬の結合プロファイルを決定するために使用され、一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトＬａｇ−３に結合するひとつ以上の候補治療薬抗体のエピトープまたは複数のエピトープを決定するために使用される。
【０１７２】
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、抗Ｌａｇ−３抗体の薬物動態プロフィルを決定するために使用される。様々な実施形態で、本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物およびひとつ以上の対照または参照非ヒト動物がそれぞれ、ひとつ以上の候補治療抗Ｌａｇ−３抗体に様々な用量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治療薬抗体は、経口および非経口投与経路を含む、任意の望ましい投与経路で投薬される場合がある。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。非注射経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。非ヒト動物（ヒト化および対照）から血液が様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大３０日またはそれ以上の日数）で単離される。様々なアッセイは、総ＩｇＧ、抗治療抗体反応、凝集などを含むがこれらに限定されない、本明細書に記述された非ヒト動物から取得されたサンプルを使用して、投与された候補治療抗体の薬物動態プロファイルを決定するために実施される場合がある。
【０１７３】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｌａｇ−３シグナル伝達阻害または調節の治療効果および細胞変化の結果としての遺伝子発現への効果を測定するために使用される。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物またはそれらから単離された細胞は、非ヒト動物の細胞表面上のヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチド（またはＬａｇ−３ポリペプチドのヒト部分）に結合する候補治療薬に曝露され、それに続く期間の後、例えば、接着、アポトーシス、サイトカイン生産、炎症、増殖、自己免疫寛容およびウイルス感染（または反応）など、Ｌａｇ−３依存性プロセスへの効果について分析された。
【０１７４】
本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチド、従って、細胞、細胞株を発現し、細胞培養物を生成して、例えば、特に拮抗薬または作動薬がヒトＬａｇ−３配列もしくはエピトープに特異的であるかまたは、代替的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と関連するヒトＬａｇ−３配列またはエピトープに特異的である場合に、Ｌａｇ−３拮抗薬または作動薬の結合または機能をアッセイするための、結合および機能アッセイに使用するためのヒト化Ｌａｇ−３の供給源としての役割を果たすことができる。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物から単離された細胞を使用して、候補治療抗体によって結合されたＬａｇ−３エピトープを決定することができる。様々な実施形態で、本明細書に記述された非ヒト動物によって発現されたヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含む場合がある。様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドのバリアントを発現する。様々な実施形態で、バリアントは、リガンド結合と関連するアミノ酸位置の多型である。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＬａｇ−３の多型バリアントとの相互作用を通したリガンド結合の効果を決定するために使用される。
【０１７５】
本明細書に記載される非ヒト動物からの細胞は、その場限りで単離して使用するか、または多世代にわたって培養物中で維持することができる。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物からの細胞は（例えば、ウイルスの使用によって）不死化され、培養物中（例えば、連続培養物中）で無期限に維持される。
【０１７６】
様々な実施形態で、本明細書に記載される細胞および／または非ヒト動物は、抗原に対する免疫反応のＬａｇ−３媒介機能を決定するために、様々な免疫付与レジメンで使用される。一部の実施形態では、ヒト（またはヒト化）Ｌａｇ−３に結合する、またはその一つ以上の機能を阻害する候補治療薬が、本明細書に記載の非ヒト動物で特徴付けられる。適切な測定法には、様々な細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清免疫グロブリン分析（例えば、抗体価）、細胞毒性アッセイ、および免疫沈降アッセイ（例えば、リガンド・受容体相互作用の特徴付け）が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、抗原に対する免疫反応のＬａｇ−３媒介機能調節を特徴付けるために使用される。一部の実施形態では、抗原は自己免疫性の疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は炎症性疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は、癌または新生物と関連している（例えば、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ−８、ＨＴＬＶ−１、ＭＣＶなど）。一部の実施形態では、抗原は検査抗原（例えば、オボアルブミンまたはＯＶＡ）である。一部の実施形態では、抗原は、治療を必要とする一人以上のヒト患者が患っている疾患または状態と関連する標的である。
【０１７７】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＬａｇ−３を標的とする候補治療薬の薬理・毒性学的側面を検査するための自己抗体生産の力価を決定するために血清アッセイで使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物での自己抗体生産は、非ヒト動物に誘発された一つ以上の自己免疫性の疾患、障害または状態から生じる。
【０１７８】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、ある抗原に対する特異的Ｔ細胞依存性反応を含むがそれらに限定されない、免疫反応のＬａｇ−３依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するために、一つ以上の抗原を使用した曝露に使用される。
【０１７９】
様々な実施形態で、本明細書に記載される細胞および／または非ヒト動物は、ヒトＬａｇ−３シグナル伝達を調節する治療薬候補をスクリーニングおよび開発するための、（例えば、Ｔおよび／またはＢ細胞を用いる）生存および／または増殖のアッセイにおいて使用される。Ｌａｇ−３の活性化または喪失は、Ｔ細胞反応の調節に重要な役割を果たし、Ｌａｇ−３による自己免疫寛容の調節は、Ｌａｇ−３の細胞外ドメインの特異的エピトープの活性化から生じる可能性があり、従って、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞および／または本明細書に記述される非ヒト動物を使用して、候補Ｌａｇ−３調節因子（例えば、拮抗薬または作動薬）が特定、特徴付けおよび開発される可能性がある。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞および／または非ヒト動物は、Ｌａｇ−３の存在下および不在下で特定細胞（例えば、癌細胞）の増殖またはアポトーシスへの効果を決定するための生存または死亡アッセイで使用される。
【０１８０】
様々な実施形態で、本明細書に記載される細胞および／または非ヒト動物は、移植されたヒト細胞または組織に対する生理的（例えば、免疫）反応でのＬａｇ−３媒介機能を決定するための、異種（例えば、ヒト）細胞の異種移植に使用される。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ−３に結合する、またはその一つ以上の機能を阻害する候補治療薬が、本明細書に記載の非ヒト動物で特徴付けられる。適切な測定法には、様々な細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清免疫グロブリン分析（例えば、抗体価）、細胞毒性アッセイ、およびリガンド・受容体相互作用の特徴付け（免疫沈降アッセイ）が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、抗原に対する免疫反応のＬａｇ−３媒介機能調節を特徴付けるために使用される。一部の実施形態では、抗原は新生物と関連している。一部の実施形態では、抗原は自己免疫性の疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は炎症性疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は癌または新生物と関連している。一部の実施形態では、抗原は、治療を必要とする一人以上のヒト患者が患っている疾患または状態と関連する標的である。
【０１８１】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、新しいリンパ球およびその免疫機能のＬａｇ−３依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための、移植または養子移入実験で使用される。様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＴ細胞が移植されている；一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞；一部の実施形態では活性化Ｔ細胞；一部の実施形態では制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）；一部の実施形態ではメモリーＴ細胞が移植されている。
【０１８２】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞は、Ｔ細胞依存性反応および機能のＬａｇ−３依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための、Ｔ細胞アッセイで使用される。例示的Ｔ細胞アッセイには、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）制限、ウイルス抑制アッセイ、細胞毒性アッセイ、増殖アッセイおよび調節Ｔ細胞抑制アッセイが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８３】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞は、ヒトＬａｇ−３を調節する候補治療薬をスクリーニングおよび開発するために、細胞遊走アッセイで使用される。細胞遊走には、内皮を横切る細胞の移動を伴い、遊走アッセイは、白血球または腫瘍細胞による内皮との相互作用および、内皮の遊走の測定を可能にする。
【０１８４】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞は、腫瘍細胞のＬａｇ−３依存性調節、アポトーシス、および／または阻害を調節する化合物または生物薬剤となる可能性がある治療剤を決定するための、腫瘍細胞の成長（または増殖）アッセイで使用される。
【０１８５】
様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞は、Ｔ細胞から放出されるサイトカインのＬａｇ−３依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための、サイトカイン生産アッセイで使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞は、ヒト化Ｌａｇ−３と、ヒトＬＡＧ−３またはＬａｇ−３結合パートナー（例えばＭＨＣクラスＩＩ）を標的とする薬剤との相互作用から生じる細胞内サイトカイン放出の検出（および／または測定）のために使用される。
【０１８６】
様々な実施形態で、自己免疫性の疾患、障害または状態の一つ以上の機能のＬａｇ−３依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するためのインビボシステムを提供するために、自己免疫性の疾患、障害または状態が本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物に誘発される。自己免疫性の疾患、障害または症状が、本明細書に記載される１つ以上の非ヒト動物に誘導され、その後に所望される１つ以上の化合物または生物剤が投与されてもよい。
【０１８７】
本明細書に記載される非ヒト動物は、薬剤またはワクチンの分析および検査のためのインビボシステムを提供する。様々な実施形態で、候補薬剤またはワクチンが本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物に送達され、その後非ヒト動物をモニターして、薬剤またはワクチンに対する免疫反応、薬剤またはワクチンの安全性プロファイル、または疾患または状態に対する効果の一つ以上を決定する場合がある。一部の実施形態では、ワクチンは、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝炎ウイルス（例えば、ＨＣＶ）などのウイルスを標的とする。安全性プロファイルを決定するために使用される例示的方法には、毒性、最適な用量濃度、薬剤またはワクチンの有効性、および潜在的リスク因子の測定を含む。このような薬剤またはワクチンはこのような非ヒト動物で改善および／または開発される場合がある。
【０１８８】
本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトＬＡＧ−３標的化薬剤の薬物動態特性を評価するためのインビボシステムを提供する。様々な実施形態で、ヒトＬＡＧ−３標的化薬剤は、本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物に送達または投与され、その後非ヒト動物（またはそれから単離された細胞）をモニターするか、または一つ以上のアッセイを実施して、非ヒト動物に対する薬剤の効果を決定する場合がある。薬物動態特性には、動物がどのように薬剤を処理して様々な代謝物にするか（または、有毒代謝物を含む一つ以上の薬剤代謝物の有無の検出）、薬剤半減期、投与後の薬剤の循環レベル（例えば、薬剤の血清濃度）、抗薬物反応（例えば、抗薬物抗体）、薬剤の吸収および分布、投与経路、薬剤の排泄および／またはクリアランス経路を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、薬剤（例えば、ＰＤ−１調節因子）の薬物動態および薬力学特性は、本明細書に記載される非ヒト動物で、またはその使用を通してモニターされる。
【０１８９】
一部の実施形態では、アッセイを行うことには、薬剤が投与される非ヒト動物の表現型および／または遺伝子型への効果を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイを行うことには、Ｌａｇ−３調節因子（例えば、拮抗薬または作動薬）のロット間変動を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイを行うことは、本発明の非ヒト動物に投与されたＬａｇ−３標的化薬剤の効果と、参照非ヒト動物に投与されたＬａｇ−３標的化薬剤の効果の間の差異を決定することを含む。様々な実施形態で、参照非ヒト動物は、本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変（例えば、破壊、欠失またはそうでなければ非機能的Ｌａｇ−３遺伝子および／またはＰｄｃｄ１遺伝子、またはＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化を有するもの）を有していてもよく、または改変を有していなくてもよい（すなわち、野生型非ヒト動物）。
【０１９０】
ヒトＬＡＧ−３標的化薬剤の薬物動態特性を評価するために非ヒト動物で（またはそれらから単離された細胞でおよび／またはそれらを使用して）測定されうる例示的パラメーターには、凝集、オートファジー、細胞分裂、細胞死、補体媒介溶血、ＤＮＡ完全性、薬物特異抗体力価、薬剤代謝、遺伝子発現アレイ、代謝活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質生合成、タンパク質分解、タンパク質分泌、ストレス反応、標的組織薬剤濃度、標的外組織薬剤濃度、転写活性などが含まれるがこれらに限定されない。様々な実施形態で、本明細書に記載された非ヒト動物は、Ｌａｇ−３調節因子の薬学的有効量を決定するために使用される。
【０１９１】
本明細書に記載された非ヒト動物は、癌で使用する候補治療薬の開発および特徴付けのための、改善されたインビボシステムを提供する。様々な実施形態で、本明細書に記載された非ヒト動物に腫瘍が移植され、その後に、一つ以上の候補治療薬を投与する場合がある。一部の実施形態では、候補治療薬には、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体カクテルを含む場合があり、一部の実施形態では、候補治療薬は、例えば、連続的または同時に投薬される単一特異性抗体の投与などの併用療法を含む。腫瘍は、非ヒト動物内の一つ以上の場所で定着するために十分な時間を与えられる場合がある。腫瘍細胞増殖、成長、生存などは、候補治療薬の投与前と後の両方で測定される場合がある。候補治療薬の細胞毒性も、望ましい場合非ヒト動物で測定される場合がある。
【０１９２】
本明細書に記載された非ヒト動物は、ヒトに影響する疾患、障害または状態を効果的に治療するため、候補治療薬および／または治療レジメン（例えば、単剤療法、併用療法、用量範囲試験など）を評価または査定するための一つ以上の疾患モデルの開発に使用される場合がある。様々な疾患状態が本明細書に記載された非ヒト動物で確立され、その後、疾患状態での一つ以上の分子（例えば、Ｌａｇ−３標的化薬剤）の有効性を決定できるように、一つ以上の候補分子が投与される場合がある。一部の実施形態では、疾患モデルには、自己免疫性、炎症性および／または新生物の疾患、障害または状態を含む。
【０１９３】
一例を挙げると、本明細書に記載された非ヒト動物は、腫瘍または腫瘍細胞の予防および／または治療的治療のための改善された動物モデルを提供する。様々な実施形態で、本明細書に記載された非ヒト動物に一つ以上の腫瘍細胞が移植され、その後に、一つ以上の候補治療薬（例えば、抗体）を投与する場合がある。一部の実施形態では、一つ以上の候補治療薬の投与は、一つ以上の腫瘍細胞の移植および一つ以上の候補治療薬が本明細書に記載された非ヒト動物で、前記非ヒト動物の固形腫瘍の定着および／または腫瘍細胞の成長を防ぐ上での有効性について評価された後（例えば、数分または数時間後だが一般的には同じ日）に実施される。一部の実施形態では、一つ以上の候補治療薬の投与は、ひとつ以上の腫瘍細胞の移植の後（例えば、数日後）に実施され、一部のある実施形態では、一つ以上の移植された腫瘍細胞が本明細書に記載された非ヒト動物で所定サイズ（例えば、体積）に達するように十分な時間の後に実施され、一つ以上の定着腫瘍の治療での有効性について一つ以上の候補治療薬が評価される。非ヒト動物は、定着腫瘍の効果的な治療に相関する最適用量または用量範囲を決定できるように、用量によって異なる治療群に配置される場合がある。
【０１９４】
本明細書に記載される非ヒト動物は、癌における使用のためのＬａｇ−３およびＰＤ−１を標的とする薬剤を含む併用療法剤の開発および／または特性解析のためのインビボシステムを提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物は、１つ以上の腫瘍細胞を移植され、その後にヒトＬＡＧ−３およびヒトＰＤ−１を標的とする薬剤（例えば抗体）の投与が行われてもよい。一部の実施形態では、ヒトＬａｇ−３およびヒトＰＤ−１を標的とする薬剤の投与は、１つ以上の腫瘍細胞の移植の後（例えば、数分後、数時間後、または数日後）に行われ、および本明細書に記載される非ヒト動物における固形腫瘍の確立および／または腫瘍細胞の増殖の阻害における有効性に関し、前記非ヒト動物において併用療法が評価される。一部の実施形態では、ヒトＬａｇ−３およびヒトＰＤ−１を標的とする薬剤の投与は、本明細書に記載される非ヒト動物において１つ以上の移植腫瘍細胞が所定のサイズ（例えば体積）に到達するよう、充分な時間の後に行われる；および１つ以上の確立した腫瘍の治療における有効性に関し、併用療法が評価される。非ヒト動物は、定着腫瘍の効果的な治療に相関する最適治療レジメンを決定できるように、異なる治療群（単剤療法を含め）に配置される場合がある。
【０１９５】
様々な疾患状態が本明細書に記載された非ヒト動物で確立され、その後、疾患状態での一つ以上の分子（例えば、Ｌａｇ−３標的化薬剤）の有効性を決定できるように、一つ以上の候補分子が投与される場合がある。一部の実施形態では、疾患モデルには、自己免疫性、炎症性および／または新生物の疾患、障害または状態を含む。
【０１９６】
候補分子は、経口および非経口投与経路を含む任意の投与方法を使用して、非ヒト動物疾患モデルに投与することができる。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。非注射経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。併用療法を本明細書に記載される非ヒト動物で評価する時、候補分子は、同じ投与経路または異なる投与経路で投与することができる。投与レジメンを本明細書に記載される非ヒト動物で評価する時、候補分子は、一つ以上の疾患モデルが確立されている非ヒト動物で望ましい治療または予防効果を示す投与レジメンを決定するために、２か月毎、毎月、３週間毎、２週間毎、毎週、毎日、可変間隔で、および／または段階的に増大する濃度で投与される場合がある。
【０１９７】
本明細書に記載される非ヒト動物は、感染疾患で使用する候補治療薬の開発および特徴付けのための、改善されたインビボシステムを提供する。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物は、ウイルス（例えば、ＭＨＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶなど）または病原体（例えば、細菌）の注射で感染させられ、その後、一つ以上の候補治療薬を投与される場合がある。一部の実施形態では、候補治療薬には、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体カクテルを含む場合があり、一部の実施形態では、候補治療薬は、例えば、連続的または同時に投薬される単一特異性抗体の投与などの併用療法を含み、一部のある実施形態では、候補治療薬はワクチンを含む場合がある。ウイルスまたは病原体は、ウイルスまたは病原体の感染に関連する一つ以上の症状が非ヒト動物に発症するように、非ヒト動物内の一つ以上の場所または細胞に定着するのに十分な時間を与えられる場合がある。Ｔ細胞の増殖および成長は、候補治療薬の投与前と後の両方で測定される場合がある。さらに、生存、血清および／または細胞内サイトカイン分析、肝臓および／または脾臓組織病理が、ウイルスまたは病原体に感染した非ヒト動物で測定される場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ウイルス感染と関連する臓器障害の程度を決定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、特定ウイルスに感染した非ヒト動物の様々な臓器のサイトカイン発現プロファイルを決定するために使用される。
【０１９８】
本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト細胞標的化治療薬剤の有効性を評価するために用いることができる。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物にヒト細胞が移植され、ヒト細胞などを標的とする薬剤候補がこのような非ヒト動物に投与される。次に薬剤の治療有効性が、薬剤の投与後に非ヒト動物のヒト細胞をモニターすることによって決定される。非ヒト動物で試験できる薬剤には、小分子化合物、すなわち１５００ｋＤ、１２００ｋＤ、１０００ｋＤ、または８００ダルトン未満の分子量の化合物、および大分子化合物（タンパク質など、例えば抗体）の両方を含み、これらはヒト細胞を標的化する（例えば、結合するおよび／または作用する）ことによってヒト疾患および状態の治療に対して意図する治療効果を持つ。
【０１９９】
一部の実施形態では、薬剤は抗癌剤であり、ヒト細胞は癌細胞であり、これらは原発癌の細胞または原発癌から定着した細胞株の細胞でありうる。これらの実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物はヒト癌細胞を移植され、抗癌剤が非ヒト動物に投与される。薬剤の有効性は、非ヒト動物のヒト癌細胞の成長または転移が、薬剤の投与の結果として阻害されるかどうかを評価することで決定することができる。
【０２００】
特定の実施形態では、抗癌剤は抗体分子であり、これはヒト癌細胞上の抗原に結合する。特定の実施形態では、抗癌剤は、ヒト癌細胞上の抗原、およびその他のヒト細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞などのヒト免疫系の細胞（または「ヒト免疫細胞」）上の抗原に結合する二重特異性抗体である。
キット
【０２０１】
本発明はさらに、本明細書に記載される、少なくとも１つの非ヒト動物、非ヒト細胞、ＤＮＡ断片（または構築物）、および／または標的化ベクターで満たされた容器を１つ以上含むパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば調査方法）において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、（ａ）ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用に関する説明書、またはその両方、または２つ以上の実体の間の物質および／または生物製品（例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）の移送を支配する契約書、を反映している。
【０２０２】
本発明の他の特徴は、例示のために与えられ、かつその限定を意図しない例示的な実施形態の以下の記述の過程で明らかになるであろう。
【実施例】
【０２０３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し使用するかを当業者に説明するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図していない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。
実施例１  内因性Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３のヒト化
【０２０４】
本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト哺乳動物において内因性Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（Ｌａｇ−３）をヒト化する例示的方法を示す。本実施例に記述された方法は、任意のヒト配列、または所望の場合にはヒト配列（または配列断片）の組み合わせを使用して、非ヒト動物の内因性Ｌａｇ−３遺伝子をヒト化するために用いることができる。この例では、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２８６．５（配列番号９）に存在するヒトＬＡＧ３遺伝子のエクソン２、３および４を含む１，７４１ｂｐの合成ＤＮＡ断片が、マウスの内因性Ｌａｇ−３遺伝子のヒト化のために用いられる。マウス、ヒト、および例示的な本明細書で生成されたヒト化タンパク質のアライメントを図２に示す。ヒト化領域は下線が引かれている。図３は、齧歯類Ｌａｇ−３ポリペプチドのアミノ酸２１−２６０をコードする遺伝物質のヒト化のための標的化ベクターを示し、これはＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された（米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２０５】
簡潔に述べると、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンｂＭＱ−４００Ｏ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドのアミノ酸２１〜２６０をコードする、１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片を使用して、内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン２〜４（１，７５０ｂｐ）を含有する配列を欠失して、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２、３および４を挿入するように改変された。エクソン１、５、６、７および８ならびに５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有する内因性ＤＮＡは維持された。１，７４１ｂｐの合成ＤＮＡ断片（すなわち、ヒトＬＡＧ３遺伝子のエクソン２〜４に相当する）の配列解析によって、すべてのヒトＬＡＧ−３のエクソンおよびスプライシングシグナルが確認された。配列解析で、配列が参照ゲノムおよびＬＡＧ−３転写ＮＭ＿００２２８６．５に一致したことが判明した。
【０２０６】
１，７４１ｂｐ合成ＤＮＡ断片はＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）によって合成され、アンピシリン耐性プラスミドベクターにクローン化された。特有の制限酵素認識部位を用いて、リコンビナーゼ認識部位のそばに隣接した約４，９９６ｂｐ自動削除ネオマイシンカセットを結合した（ｌｏｘＰ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｐＡ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｌｏｘＰ、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）。その後の選択にはネオマイシンを用いた。標的化ベクターが直線化され、その後、マウスＢＡＣクローンｂＭＱ−４００Ｏ１７との相同組み換えが行われた。設計により、ヒトＬＡＧ−３の１，７４１ｂｐ断片と、マウス下流５０９ｂｐの間のジャンクションに、ヒトＬＡＧ−３遺伝子のイントロン４の一部が含まれた（図３）。得られた標的化ベクターは、５’から３’に向けて、ＢＡＣクローンｂＭＱ−４００Ｏ１７由来の約４６ｋｂのマウスゲノムＤＮＡを含有する５’ホモロジーアーム、１，７４１ｂｐの合成ＤＮＡ断片（ヒトＬＡＧ−３遺伝子のエクソン２〜４、およびイントロン４の一部に相当する）、ｌｏｘＰ部位に隣接した自己削除型ネオマイシンカセット、およびＢＡＣクローンｂＭＱ−４００Ｏ１７由来の約５３ｋｂのマウスゲノムＤＮＡを含有した。
【０２０７】
上述の改変ｂＭＱ−４００Ｏ１７  ＢＡＣクローンは、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔して、エクソン２からイントロン４の一部を含有するエクソン４までヒト化された（すなわち、内因性Ｌａｇ−３遺伝子の１，７５０ｂｐの欠失およびヒトＬＡＧ−３配列の１，７４１ｂｐの挿入）内因性Ｌａｇ−３遺伝子を含む改変ＥＳ細胞を作るためにしようされた。ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含む明確に標的化されたＥＳ細胞が、ヒトＬＡＧ−３配列（例えば、エクソン２〜４）の存在を検出するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記参照）によって特定され、マウスＬａｇ−３配列（例えば、エクソン２〜４および／またはエクソン１、４、５、６、７および８）の欠失および／または保持を確認した。表１は、上述の内因性Ｌａｇ−３遺伝子のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブを示す（図４）。
【０２０８】
上流の挿入点をまたぐヌクレオチド配列が下記に含まれ、挿入点でヒトＬＡＧ−３ゲノム配列と連続した内因性マウス配列（下の括弧内に含まれている）を示している：  
【化１】
2018533963.tif 000004
【０２０９】
自己削除型ネオマイシンカセットの５’末端をまたぐヌクレオチド配列が下記に含まれ、挿入点の下流のカセット配列（斜体のＳａｌＩ−ＸｈｏＩのコンパチブル末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）および太字のｌｏｘＰ配列とともに下の括弧内に含まれている）と連続したヒトＬＡＧ−３ゲノム配列を示す：
【化２】
2018533963.tif 000005
【０２１０】
自己削除型ネオマイシンカセットの３’末端の下流挿入点をまたぐヌクレオチド配列は、以下を含有した。それらは、マウスＬａｇ−３ゲノム配列と連続したカセット配列（太字のｌｏｘＰ部位、下線のＩ−ＣｅｕＩ認識部位、および斜体のＮｈｅＩ認識部位の下の括弧内に含まれている）を示している：
【化３−１】
2018533963.tif 000006
【化３−２】
2018533963.tif 000007
【０２１１】
ネオマイシンカセット（イントロン４の残り７７ｂｐ）の欠失後、上流挿入点にわたるヌクレオチド配列は以下を含み、これは残りのカセット配列ｌｏｘＰ配列（以下の括弧内に含まれ、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩのコンパチブル末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）は斜体、ｌｏｘＰ配列は太字、Ｉ−ＣｅｕＩ認識部位は下線、およびＮｈｅＩ認識部位は斜体で示される）と並置されたマウスおよびヒトゲノム配列を示す：
【化４】
2018533963.tif 000008
【０２１２】
次に陽性ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照）で雌マウスに移植し、ヒトＬＡＧ−３エクソン２〜４およびヒトＬＡＧ−３イントロン４の一部の、マウスの内因性Ｌａｇ−３遺伝子への挿入を含む一腹の子を作った。内因性Ｌａｇ−３遺伝子のエクソン２〜４（すなわち、１，７４１ｂｐの合成ＤＮＡ断片）のヒト化を持つマウスは、ヒトＬＡＧ−３遺伝子配列の存在を検出した上に記載したアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記参照）を使用した尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再び確認・特定された（図４）。仔は遺伝子型同定され、ヒト化Ｌａｇ−３遺伝子構築物に対してヘテロ接合性の動物のコホートを、特徴解析のために選択する。
【表３】
2018533963.tif 000009
実施例２  活性化Ｔ細胞上のヒト化Ｌａｇ−３の発現
【０２１３】
この例は、実施例１に従ってヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むように改変された非ヒト動物（例えば、齧歯類）が、活性化リンパ球の表面上にヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドを発現することを実証する。特に、野生型マウス、およびヒト化Ｌａｇ−３に関しホモ接合性のマウス（上述）に由来する活性化Ｔ細胞を抗Ｌａｇ−３抗体で染色し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激されたＴ細胞におけるＬＡＧ−３の発現を決定した。さらに、ヒト化Ｐｄｃｄ１（ＰＤ−１）遺伝子をさらに含有したヒト化Ｌａｇ−３マウス（二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウス）のＴ細胞に対し、ＰＤ−１とＬＡＧ−３の発現を評価した。
【０２１４】
最初に、二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウスの胚性幹細胞（ＥＳ）を、ヒト化Ｐｄｃｄ１マウスＥＳ細胞において上述（実施例１を参照のこと）のＬａｇ−３標的化ベクターを使用して作製した（ヒト化ＰＤ−１のマウスと胚性幹細胞に関しては、２０１５年６月１９日に出願され、ＵＳ２０１５−０３６６１７４Ａ１として公開された米国特許出願１４／７４４，５９２（具体的に、当該出願中の実施例１を含む）、および２０１５年６月１９日に出願され、ＷＯ２０１５１９６０５１として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１５０３６６４９を参照のこと；それら両方が、参照により本明細書に援用される）。二重ヒト化マウスＥＳ細胞は、実施例１に記載されるＬａｇ−３標的化ベクターを、ヒト部分とマウス部分を有するＰＤ−１ポリペプチドをコードしたヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含有したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの胚性幹細胞へとエレクトロポレーションすることにより生成された。そのヒト部分は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインを含有した。二重ヒト化ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照）で雌マウスに移植し、両方のヒト化遺伝子（すなわち、Ｌａｇ−３および  Ｐｄｃｄ１）を含む一腹の子を作った。マウスコロニーは、同系交配により増殖させた。
【０２１５】
簡潔に述べると、野生型マウス、実施例１で作製されたヒト化Ｌａｇ−３マウス、ヒト化ＰＤ−１マウス、および二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウス（上述）から脾臓を採取し、機械的にバラバラにさせることにより単一細胞懸濁液へと処理した。細胞は培養液（１０％  ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ）で洗浄され、１×１０６／ｍＬで再懸濁されて、２００μＬ（細胞２００，０００個）が９６ウェルプレートに蒔かれた。選択されたウェルの細胞が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（両方とも１  μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激された。メーカーの仕様書に従い、ＣＤ４およびＣＤ８を認識する抗体、ヒトＰＤ−１に対するＢＶ４２１（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１  ＴＭ）結合抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、マウスＰＤ−１に対するＢＶ４２１結合抗体（クローンＪ４３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ヒトＬＡＧ−３に対するアロフィコシアニン結合抗体（クローン３ＤＳ２２３Ｈ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、マウスＬａｇ−３に対するアロフィコシアニン結合抗体（クローンＣ９Ｂ７Ｗ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、または対応するアイソタイプ対照を用いて、ＦＡＣＳのために細胞を染色した。染色された細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーターにかけられ、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してデータが分析された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトおよびマウスＬａｇ−３の発現に対してゲート化された（ＣＤ１９−ＣＤ４＋）。代表的な結果を図５に示す。
【０２１６】
図５に示されるように、野生型マウスの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（図５、左欄）は、安定したマウスＰＤ−１（一番下の左）とマウスＬａｇ−３（上から２番目の左）の発現を示したが、ヒトＰＤ−１とヒトＬＡＧ−３の発現は完全に欠いていた。これにより、抗ヒトＰＤ−１抗体および抗ヒトＬＡＧ−３抗体は、それぞれマウスＰＤ−１タンパク質およびマウスＬａｇ−３タンパク質と交差反応しないことが示された。単一ヒト化Ｌａｇ−３マウスの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒト化Ｌａｇ−３とマウスＰＤ−１を検出可能な程度に発現していたが、マウスＬａｇ−３とヒトＰＤ−１は発現していなかった（図５、左から２番目の欄）。対応するように、単一ヒト化Ｐｄｃｄ１マウスの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒト化ＰＤ−１とマウスＬａｇ−３を発現するが、マウスＰＤ−１とヒトＬＡＧ−３は全く発現しない（図５、左から３番目の欄）。二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウスは、ヒトのＰＤ−１タンパク質とＬａｇ−３タンパク質の発現を示したが、マウスのＰＤ−１タンパク質とＬａｇ−３タンパク質の発現は示さず、マウスＰＤ−１とＬａｇ−３の全長ポリペプチドがこれらマウスで産生されていないことが確認された。
【０２１７】
まとめると、本実施例は、実施例１に記載されるヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を担持したマウスは、ヒト部分と内因性マウス部分を含むＬａｇ−３ポリペプチドを発現していることを示し、そのヒト部分は、ヒトＬＡＧ−３ポリペプチドを認識する抗体による認識を介し、検出可能に発現されている。本実施例はまた、ヒト化ＰＤ−１ポリペプチドとヒト化Ｌａｇ−３ポリペプチドの両方を発現している二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウスは、抗Ｌａｇ−３抗体および／または抗ＰＤ１抗体の有効性の検証のためのインビボシステムを提供することを示している。
実施例３  ＬＡＧ３およびＰＤ１調節因子のインビボ有効性
【０２１８】
この例は、Ｌａｇ−３およびＰＤ−１調節因子の両方（例えば、抗Ｌａｇ−３および抗ＰＤ−１抗体）をスクリーニングし、例えば、腫瘍増殖の阻害および／または腫瘍細胞の殺傷などの様々な特徴を決定するために、実施例１に従ってヒト化Ｌａｇ−３遺伝子を含むように改変された非ヒト動物（例えば、齧歯類）をインビボアッセイで使用できることを実証する。本実施例において、実施例１に記載される内因性Ｌａｇ−３遺伝子のヒト化に関しホモ接合性であり、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化に関しホモ接合性であるマウスにおいて抗Ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体がスクリーニングされ、抗Ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ１抗体を使用した単剤療法と併用療法の有効性が決定される。
【０２１９】
ＭＣ３８は、マウス腺癌細胞株であり、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統が起源である。これをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅデポジトリから取得した。ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞株を、安定的レンチウイルス形質導入により操作して膜貫通型ニワトリオボアルブミン抗原（Ｏｖａ）を発現させ、腫瘍免疫原性を増加させた。細胞株は、ヒトおよび齧歯類の病原体に関し検査し、その後にマウスに移植した。細胞を、１００μｌの無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁させ、マウス側腹に皮下移植した。
【０２２０】
簡潔に述べると、抗Ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の単独、および併用のインビボ有効性を、二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウスに移植されたＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍を使用して検証した。０日目、マウスにＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を皮下移植し、４つの処置群に無作為化した（各処置群に対し、ｎ＝７〜１２）。マウスに対照抗体（ｎ＝７、２５ｍｇ／ｋｇ）、抗Ｌａｇ−３抗体（ｎ＝１２、２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−１抗体（ｎ＝１２、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗Ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用（ｎ＝１２、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）を、３日目、７日目、１０日目、１４日目および１７日目に腹腔内注射で投与した。腫瘍体積は、実験期間中（３２日間）、週に２回、キャリパー測定によりモニタリングし、腫瘍が無い動物は、最大８０日間、腫瘍再発が無いことをモニタリングした。代表的な結果を図６に示す。
【０２２１】
図６に示されるように、抗ＰＤ−１抗体の単剤療法により腫瘍増殖が阻害され、１２匹中、２匹（１７％）で腫瘍退職があった一方、抗Ｌａｇ−３抗体の単剤療法は、この実験では有意な有効性はなかった。抗Ｌａｇ−３抗体で処置された１２匹のマウスのうち１匹で、腫瘍退縮が観察された。対照群に関しては、３２日目で腫瘍が無いマウスはいなかった。対照的に、抗Ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用療法は、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍増殖が安定的に阻害されたことが示され、１２匹中、５匹（４２％）のマウスが、実験終了時まで腫瘍がなかった（図６）。無腫瘍マウスはいずれも移植後８０日間、腫瘍再発を示さず、このことから、併用免疫療法の長期に継続する効果を示唆される。
【０２２２】
別の実験において、０日目、二重ヒト化Ｌａｇ３ｘＰＤ１マウスに、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下接種した。１０日目、平均腫瘍体積が１００ｍｍ３となったマウスを選択し、４つの処置群に無作為化した。マウスに、抗Ｌａｇ−３抗体（ｎ＝９、２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−１抗体（ｎ＝１０、１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ｌａｇ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用（Ｎ＝１１、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）、または対照抗体（ｎ＝７、２５ｍｇ／ｋｇ）を１０、１４、１７、２２日目にＩＰ注射で投与した。腫瘍体積は、腫瘍移植後２８日間モニタリングした。
【０２２３】
図７に示されるように、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍担持ヒト化マウス（腫瘍確立）を抗ｈＰＤ−１抗体と抗ｈＬＡＧ−３抗体の併用で処置したところ、腫瘍内Ｔ細胞および末梢Ｔ細胞の活性化が誘導された。抗ｈＰＤ−１抗体と抗ｈＬＡＧ−３抗体の併用は、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍増殖の安定的な阻害を示した。これらマウスにおける併用療法により、動物の生存率ならびに生存期間もまた有意に上昇した（データは示さず）。
【０２２４】
まとめると、この例は、本明細書に記載された非ヒト動物が、Ｌａｇ−３および／またはＰＤ−１を標的とする薬剤（例えば、一つ以上の抗体）のインビボでの有効性を評価するために使用でき、このような動物は抗ＰＤ−１抗体を使用した抗Ｌａｇ−３単剤療法および／または併用療法の治療ならびに予防効果を区別することにおいて有用であることを示している。さらに、本明細書に記述された非ヒト動物は、Ｌａｇ−３またはＰＤ−１を標的とする薬剤が腫瘍成長を阻害するおよび／または腫瘍細胞の殺傷を媒介する程度を評価するために使用できる。
均等
【０２２５】
本発明の少なくとも一つの実施形態のこのような記述されたいくつかの側面を持つ、様々な修正、変更、および改善を当業者であれば容易に思いつくことが当業者には理解されるはずである。このような修正、変更、および改善は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、前述の説明および図面は例示のみとしてのものであり、本発明は以下の請求項によって詳細に記述される。
【０２２６】
請求項で請求項を変更するための「第一の」、「第二の」、「第三の」などの順序の用語の使用は、それ自体は一つの請求項要素の別の要素に対する優位性、先行、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、特定の名称を持つ一つの請求項要素を（順序の用語の使用以外は）同じ名称を持つ別の要素から区別して請求項要素を区別するための標識としてのみ使用される。
【０２２７】
本明細書および請求項で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、そうでないことが明確に示されない限り、複数参照を含むと理解されるべきである。群の一つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記述は、そうではないことが示されるかまたはそうでなければ文脈から明らかでない限り、一つ、二つ以上、または群のすべての要素が、所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する場合に満足される。本発明は、群の正確に一つの要素が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、二つ以上、または群の要素全体が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別途指定されない限り、または矛盾または不一致が起こることが当業者には明らかでない限り、変形、組み合わせ、および記載された請求項の一つ以上からの一つ以上の限定、要素、句、記述用語などが、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または関連する任意のその他の請求項）に導入される並べ替えすべてを網羅することを理解すべきである。記載されたような要素が存在する場合（例えば、マーカッシュ群または類似の形式で）、要素の各サブグループも開示され、任意の要素を群から除去することができる。当然のことながら、一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などから成る、または実質的にそれらから成る。簡潔にするために、これらの実施形態はすべての場合において、多くの言葉では本明細書に特に記述されていない。これも当然のことながら、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、請求項から明示的に除外される可能性がある。
【０２２８】
当業者であれば、アッセイまたは本明細書に記述されたその他のプロセスで得られた値に起因する一般的な標準偏差または誤差を理解するであろう。本発明の背景を説明し、その実践に関して追加的詳細を提供するための本明細書の出版物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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