(57)【要約】試料中の１または複数の分析物を検出するための、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）活性試薬および方法が、本明細書で提供される。前記ＳＥＲＳ活性試薬は、患者における感染性疾患の診断、または生物学的試料中の毒素、細菌、ウイルス、病原体、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体もしくは違法薬物の検出において、適応可能であり、高感度であり、使用が容易である。かかる方法は、警察、兵士または医療従事者によって野外で取り扱われ得、専門の訓練を必要としない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するための表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）活性試薬であって、  （ａ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；
（ｂ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および
（ｃ）１または複数のラマン活性マーカーを含む、試薬。
【請求項２】
前記ＳＥＲＳ活性表面が、金属（銀、金、Ｃｕ、ある特定の他の遷移金属および窒化チタンを含むがこれらに限定されない）、半導体基材（酸化チタン、酸化亜鉛、セレン化亜鉛を含むがこれらに限定されない）または半金属（グラフェンおよび二硫化モリブデンを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記アプタマーが官能化されている、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
前記アプタマーが、前記ＳＥＲＳ活性表面に共有結合により、または非共有結合により付加されている、請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
前記アプタマーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５および６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項６】
前記ラマン活性マーカーが、色素、蛍光マーカー、カーボンナノチューブ、フラーレン、アルケン、アルキンまたはアジドを含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項７】
前記ラマン活性マーカーが、蛍光または非蛍光ラマン高感度マーカーであり、前記マーカーが、アジド、アルキン、フルオレセイン（ＦＡＭ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ３．５、ローダミン６Ｇ、Ｃｙ５、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジンおよび量子ドットからなる群から選択される、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記アプタマーが、前記分析物の結合の際にコンフォメーション変化を起こす、請求項１に記載の試薬。
【請求項９】
前記コンフォメーション変化が、前記ラマン活性マーカーを、前記ＳＥＲＳ活性表面の表面に近接近させ、ラマンシグナルにおける増強をもたらす、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記ラマン活性マーカーが、前記アプタマーに共有結合により付加されている、請求項１に記載の試薬。
【請求項１１】
前記分析物が、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害剤、薬物、医薬品、栄養素、プリオン、毒素、毒物、爆薬、農薬、化学兵器剤、バイオハザード剤、放射性同位体、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、麻薬、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物および夾雑物からなる群から選択される、請求項１に記載の試薬。
【請求項１２】
ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；
（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および
（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカー
を含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬；
ｂ）少なくとも１つのラマン高感度マーカー対照；
ｃ）少なくとも１つの陽性生物学的流体または組織対照；ならびに
ｄ）少なくとも１つの陰性生物学的流体または組織対照
を含む診断キット。
【請求項１３】
ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；
（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および
（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカー
を含む１または複数のＳＥＲＳ活性試薬；ならびに
ｂ）ラマン検出器
を含む検出システム。
【請求項１４】
前記ラマン検出器が、携帯型であるか、または携帯型でない、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
試料収集装置をさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
生物学的試料中の１または複数の分析物の存在を決定するための方法であって、
ａ）生物学的試料を受け取るステップ；
ｂ）前記生物学的試料を、
（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；
（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および
（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカー
を含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；
ｃ）前記分析物を前記アプタマーと接触させるステップ；
ｄ）前記分析物を前記アプタマーを結合させるステップであって、前記結合が、前記アプタマーにコンフォメーション変化を起こさせる、ステップ；
ｅ）前記１または複数の分析物に結合した前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；
ｆ）ラマンシグナルを検出して、ラマンスペクトル（単数または複数）を生成するステップ；ならびに
ｇ）（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルを、対照の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが、前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される、ステップ、
を含む方法。
【請求項１７】
対照と比較した、（ｆ）における前記ラマンスペクトル中の前記ラマンシグナルにおける増加が、前記１または複数の分析物の量と相関し得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析物の結合の際の前記アプタマーにおける前記コンフォメーション変化が、前記ラマン活性マーカーを、前記ＳＥＲＳ活性表面に近接近させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象における疾患または障害を診断するための方法であって、
ａ）対象から生物学的試料を受け取るステップ；
ｂ）前記生物学的試料を、
（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；
（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および
（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカー
を含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；
ｃ）前記少なくとも１つのＳＥＲＳ試薬の、前記生物学的試料中の１または複数の分析物への結合を可能にするステップであって、前記結合が、前記ＳＥＲＳ試薬の前記１または複数のアプタマーにおいてコンフォメーション変化を引き起こす、ステップ；
ｄ）前記１または複数の分析物に結合した前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；
ｅ）前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを検出するステップ；ならびに
ｆ）（ｅ）において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の前記ラマンシグナルを、実験室で得られた陰性対照試料、対照対象（健康な対象）から受け取った生物学的試料、または多数の対照対象（健康な対象）からのプールされた生物学的試料において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｅ）において検出された前記ラマンシグナルが、位置および／または強度において前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記疾患が診断される、ステップ
を含む方法。
【請求項２０】
前記疾患または障害が、感染性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患、がん、心理的疾患、代謝疾患、自己免疫疾患、性行為感染症、胃腸疾患、肺疾患、心血管疾患、ストレス関連障害および疲労関連障害、真菌性疾患、病原体疾患ならびに肥満関連障害からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年２月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／１１８，４５３号、２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願番号第６２／２６３，９９５号および２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願番号第６２／２６４，０８８号に基づく優先権を主張しており、それらの各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本発明は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用して、官能化されたアプタマーが結合した分析物を検出するための製品および方法を対象とする。このシステムは、３つの基本的な部分：ＳＥＲＳ活性表面、アプタマー、およびアプタマーに付加されたラマン活性マーカーから構成される。官能化されたアプタマーは、ＳＥＲＳ活性表面に共有結合により、または非共有結合により付加される。この複合体が、アプタマー結合標的（即ち、分析物）を含む試料と接触される場合、アプタマー上のラマン活性マーカーは、ＳＥＲＳ活性基材に接近し、ラマン活性マーカーのシグネチャースペクトル特徴を有する強いラマンシグナルを生じる。各アプタマー（または特異的標的のためのアプタマーセット）のための異なるラマン活性マーカーの使用により、このアッセイは、多重化のために容易に適応され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の一実施形態は、試料中の標的分子を検出する方法であって、前記試料を、ＳＥＲＳ活性表面に共有結合により、または非共有結合により付加された１または複数の標的特異的アプタマーと接触させるステップを含む方法を対象とし、前記１または複数のアプタマーは（各々）、前記１または複数のアプタマーへの前記標的の結合の際に、前記ラマン活性マーカーが、ラマン活性表面に十分に接近して、検出可能なラマンシグナルを生成するように、それに共有付加されたラマン活性マーカーを有する。したがって、複合体形成の際に標的特異的シグナルが、ラマン活性マーカーがＳＥＲＳ活性基材に接近したため検出される。この検出スキームは、当該分野で公知の検出スキームを超える多くの利点を有する。例えば、この検出スキームは、ＥＬＩＳＡフォーマットで使用されるものなどのサンドイッチアッセイの複雑さを回避し、他のタイプのアッセイにおいてしばしば使用されるシグナル減少ではなく、シグナルにおける増加を模索する。
【０００４】
本発明は、分析物の結合が、コンフォメーション変化を起こすようにアプタマーを誘導し、それによって、ラマン活性マーカーをＳＥＲＳ活性表面と近接近させる限り、アプタマーの５’末端もしくは３’末端において、または代替的にアプタマーの末端から１〜１０塩基以内で、または代替的にアプタマー骨格に沿った任意の場所に共有結合したラマン活性マーカーを有する標的特異的アプタマーもまた提供する。アプタマーは、チオール連結を介して、または他の好都合な部分によって付加され得、マーカーは、修飾されたオリゴヌクレオチドまたは他の共有結合もしくは非共有結合連結を介して組み入れることができる。他の実施形態では、１または複数のオリゴヌクレオチドが、アプタマーにハイブリダイズされ得るＳＥＲＳ活性表面に付加され得る。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、末端チオール修飾を伴って、標的特異的である。一部の実施形態では、ラマン活性マーカーは、アプタマー骨格に沿った所定の位置でアプタマーに共有結合によりコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マーカーは、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ３．５、ローダミン６Ｇ、Ｃｙ５など、またはそれらの組合せである。
【０００５】
本発明の別の態様は、その長さに沿って所定の位置でＤＮＡ骨格中に組み込まれたラマン活性マーカーを有する標的特異的ＤＮＡアプタマーと共有結合または配位共有結合したＳＥＲＳ活性表面を含む問題の組成物を提供し、その標的への前記アプタマーの結合の際に、前記マーカーは、励起の際に前記マーカーについてのラマンシグネチャースペクトルを生じさせるのに十分に、前記ＳＥＲＳ活性表面に接近する。
【０００６】
本発明の別の態様は、（ａ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｂ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および（ｃ）１または複数のラマン活性マーカーを含む、分析物を検出するための表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）活性試薬に関する。一部の実施形態では、試薬は、（ｃ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性表面は、金属（銀、金、Ｃｕ、ある特定の他の遷移金属および窒化チタンを含むがこれらに限定されない）、半導体基材（酸化チタン、酸化亜鉛、セレン化亜鉛を含むがこれらに限定されない）または半金属（グラフェンおよび二硫化モリブデンを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性表面は、生物学的試料中に導入されるナノ粒子（ＮＰ）であり得、またはＳＥＲＳ活性材料は、ＮＰ（ＳＥＲＳ活性または不活性）が包埋されたか、もしくは包埋されていない固体支持体であり得る。支持体材料は、紙；セルロース；ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むプラスチックを含むがこれらに限定されない材料から構成され得る。一部の実施形態では、これらの支持体材料は、１またはいくつかのＳＥＲＳ活性材料でコーティングされる。別の実施形態は、１またはいくつかのＳＥＲＳ活性材料でコーティングされたこれらの支持体材料のうちの１またはいくつかから構成された、パターン形成された表面であり得る。ある特定の実施形態では、アプタマーは、官能化されている。
【０００８】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、１）ＳＥＲＳ活性表面に結合するようにチオールで、および２）検出を増強するためにラマン活性マーカーで官能化されている。
【０００９】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、ＳＥＲＳ活性表面に共有結合または非共有結合によって付加されている。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性表面は、１または複数のアプタマーで修飾されていない。
【００１１】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、および６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、色素または蛍光マーカーを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、蛍光マーカーであり、前記蛍光マーカーは、フルオレセイン（ＦＡＭ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ３．５、ローダミン６Ｇ、Ｃｙ５、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット（cresyl  fast  violet）、クレシルブルーバイオレット（cresyl  blue  violet）、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、カーボンナノチューブおよびフラーレンからなる群から選択される。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、分析物の結合の際にコンフォメーション変化を起こす。
【００１５】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、分析物の結合の際にコンフォメーション変化を起こす。
【００１６】
ある特定の実施形態では、分析物の結合の際のアプタマーのコンフォメーション変化は、ラマン活性マーカーを、ＳＥＲＳ活性表面の表面に近接近させ、ラマンシグナルにおける増強をもたらす。
【００１７】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、アプタマーに共有結合によって付加される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害剤、薬物、医薬品、栄養素、プリオン、毒素、毒物、爆薬、農薬、化学兵器剤、バイオハザード剤、放射性同位体、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、麻薬、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物、依存性薬物、夾雑物および発射残渣からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬；ｂ）ラマンベースの検出システムが動作していることを示すためのラマン活性マーカー対照；ｃ）少なくとも１つの血液、血清、他の流体もしくは組織試料、または実験室で調製された陽性対照；ならびにｄ）少なくとも１つの血液、血清、他の流体もしくは組織試料、または実験室で調製された陰性対照を含む診断キットに関する。一部の実施形態では、試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、キットは、試料採取カートリッジをさらに含み得る。
【００２１】
本発明の別の態様は、ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｉｉ）１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む１または複数のＳＥＲＳ活性試薬で修飾されていないか、または修飾されている；ならびにｂ）ラマン検出器またはラマン機器を含む検出システムに関する。一部の実施形態では、上記試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ラマン検出器は、携帯型である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、システムは、試料収集装置をさらに含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在を決定するための方法であって、ａ）生物学的試料を受け取るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）分析物をアプタマーと接触させるステップ；ｄ）アプタマーによる分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、アプタマーにコンフォメーション変化を起こさせる、ステップ；ｅ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｆ）ラマンシグナルを検出して、ラマンスペクトルを生成するステップ；ならびにｇ）（ｆ）において検出されたラマンシグナルを、対照の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが、前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される、ステップを含む方法に関する。ステップ（ｅ）のある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性表面は、分析物を認識するアプタマーに結合させる。ステップ（ｇ）のある特定の実施形態では、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが、標的分析物の非存在下でのラマンシグナルとは異なる場合に、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される。一部の実施形態では、試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００２５】
類似して、本発明は、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在を決定するための方法であって、ａ）生物学的試料を得るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面で修飾されていないか、または修飾されている；（ｉｉ）１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）分析物をアプタマーと接触させるステップ；ｄ）アプタマーによる分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、アプタマーにコンフォメーション変化を起こす、ステップ；ｅ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｆ）ラマンシグナルを検出して、ラマンスペクトルを生成するステップ；ならびにｇ）（ｆ）において検出されたラマンシグナルを、対照の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが、前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される、ステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、対照と比較した、（ｆ）におけるラマンスペクトル中のラマンシグナルにおける増加は、１または複数の分析物の量と相関する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、分析物の結合の際のアプタマーのコンフォメーション変化は、ラマン活性マーカーを、ＳＥＲＳ活性材料の表面に近接近させる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本方法は、生物学的試料中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の分析物を検出するために使用され得る。
【００２９】
本発明の別の態様は、対象における疾患または障害を診断するための方法であって、ａ）対象から生物学的試料を受け取るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないまたは修飾されている；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）少なくとも１つのＳＥＲＳ試薬による、生物学的試料中の分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、ＳＥＲＳ試薬の１または複数のアプタマーにおいてコンフォメーション変化を引き起こす、ステップ；ｄ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｅ）少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを検出するステップ；ならびにｆ）（ｅ）において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを、対照対象（健康な対象）から受け取った生物学的試料において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｅ）において検出された前記ラマンシグナルが、ラマン高感度マーカーピークの位置および／または強度において前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記疾患が診断される、ステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００３０】
類似して、本発明は、対象における疾患または障害を診断するための方法であって、ａ）対象から生物学的試料を得るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面であって；（ｉｉ）１または複数のアプタマーで修飾されていないか、または修飾されている；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）少なくとも１つのＳＥＲＳ試薬による、生物学的試料中の１または複数の分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、ＳＥＲＳ試薬の１または複数のアプタマーにおいてコンフォメーション変化を引き起こす、ステップ；ｄ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｅ）少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを検出するステップ；ならびにｆ）（ｅ）において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを、対照対象（健康な対象）から受け取った生物学的試料において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｅ）において検出された前記ラマンシグナルが、ラマン高感度マーカーピークの位置および／または強度において前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記疾患が診断される、ステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、試薬は、（ｉｉｉ）において、１または複数のラマン活性マーカーで修飾されていないか、または修飾されていることを含む。
【００３１】
代替的に、本発明は、対象における疾患または障害を診断するための方法であって、ａ）対象の生物学的試料において測定されたラマンシグナルを受け取るステップ；ｂ）対照対象の生物学的試料において測定された参照ラマンシグナルを受け取るステップ；およびｃ）（ａ）のラマンシグナルを（ｂ）の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ａ）における前記ラマンシグナルが、位置および／または強度において（ｂ）における前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記疾患が診断される、ステップを含む方法に関する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、感染性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患、がん、心理的疾患、代謝疾患、自己免疫疾患、性行為感染症、胃腸疾患、肺疾患、心血管疾患、ストレス関連障害および疲労関連障害、真菌性疾患、病原体疾患ならびに肥満関連障害からなる群から選択される。
【００３３】
本発明は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用して、官能化されたアプタマーが結合した分析物を検出するための試薬および方法を対象とする。このシステムは、３つの部分：ＳＥＲＳ活性表面またはナノ粒子（これ以降、ＳＥＲＳ活性表面と呼ぶ）、アプタマー、およびアプタマーに付加されたラマン活性マーカーから構成される。官能化されたアプタマーは、ＳＥＲＳ活性表面に共有結合または非共有結合によって付加される。この複合体が、アプタマー結合標的（即ち、分析物）を含む試料と接触される場合、アプタマー上のラマン活性マーカーは、ＳＥＲＳ活性基材に接近し、ラマン活性マーカーのシグネチャー特徴（単数または複数）を有する強いラマンシグナルの観察を生じさせる。各アプタマー（または特異的標的のためのアプタマーセット）のための異なるラマン活性マーカーの使用により、このアッセイは、多重化のために容易に適応され得る。
【００３４】
本発明の別の態様は、（ａ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｂ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｃ）１または複数のラマン活性マーカーを含む、Ｂｏｒｒｅｌｉａの種における１または複数の分析物を検出するための表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）活性試薬に関する。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性表面は、金属（銀、金、Ｃｕ、ある特定の他の遷移金属および窒化チタンを含むがこれらに限定されない）、半導体基材（酸化チタン、酸化亜鉛、セレン化亜鉛を含むがこれらに限定されない）または半金属（グラフェンおよび二硫化モリブデンを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される。
【００３６】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、官能化されている。
【００３７】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、１）ＳＥＲＳ活性表面にアプタマーを結合させるために、および２）検出を増強するためにラマン活性マーカーで、官能化されている。
【００３８】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、ＳＥＲＳ活性表面に共有結合または非共有結合によって付加されている。
【００３９】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号６７〜８４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、色素、アジド、アルキン、量子ドット、カーボンナノチューブまたは蛍光マーカーを含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、蛍光マーカーであり、前記蛍光マーカーは、アジド、アルキン、フルオレセイン（ＦＡＭ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ３．５、ローダミン６Ｇ、Ｃｙ５、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、カーボンナノチューブおよびフラーレンからなる群から選択される。
【００４２】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーにコンジュゲートされたアプタマーは、分析物の結合の際に再組織化を受ける。
【００４３】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーにコンジュゲートされたアプタマーは、分析物の結合の際にコンフォメーション変化を起こす。
【００４４】
ある特定の実施形態では、分析物の結合の際のアプタマーのコンフォメーション変化は、ラマン活性マーカーを、ＳＥＲＳ活性表面の表面に近接近させ、ラマンシグナルにおける増強を引き起こす。
【００４５】
ある特定の実施形態では、ラマン活性マーカーは、アプタマーに共有結合により付加されている。
【００４６】
ある特定の実施形態では、分析物は、表面タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害剤、薬物、医薬品、栄養素、プリオン、毒素、毒物、爆薬、農薬、化学兵器剤、バイオハザード剤、放射性同位体、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、麻薬、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物、依存性薬物、夾雑物および発射残渣からなる群から選択される。
【００４７】
ある特定の実施形態では、Ｂｏｒｒｅｌｉａの種は、Borrelia  afzelii、Borrelia  americana、Borrelia  andersonii、Borrelia  anserina、Borrelia  baltazardii、Borrelia  bavariensis、Borrelia  bissettii、Borrelia  brasiliensis、Borrelia  burgdorferi、Borrelia  californiensis、Borrelia  carolinensis、Borrelia  caucasica、Borrelia  coriaceae、Borrelia  crocidurae、Borrelia  dugesii、Borrelia  duttonii、Borrelia  garinii、Borrelia  graingeri、Borrelia  harveyi、Borrelia  hermsii、Borrelia  hispanica、Borrelia  japonica、Borrelia  kurtenbachii、Borrelia  latyschewii、Borrelia  lonestari、Borrelia  lusitaniae、Borrelia  mazzottii、Borrelia  merionesi、Borrelia  microti、Borrelia  miyamotoi、Borrelia  parkeri、Borrelia  persica、Borrelia  recurrentis、Borrelia  sinica、Borrelia  spielmanii、Borrelia  tanukii、Borrelia  texasensis、Borrelia  theileri、Borrelia  tillae、Borrelia  turcica、Borrelia  turdi、Borrelia  turicatae、Borrelia  valaisiana、Borrelia  venezuelensis、Borrelia  vincentii、Borrelia  burgdorferi  B31、Borrelia  burgdorferi  N40、Borrelia  burgdorferi  JD1、またはBorrelia  burgdorferi  297から選択される。
【００４８】
本発明の別の態様は、ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬；ｂ）少なくとも１つの陽性対照；ならびにｃ）少なくとも１つの陰性対照を含む診断キットに関する。
【００４９】
本発明の別の態様は、ａ）（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む１または複数のＳＥＲＳ活性試薬；ならびにｂ）ラマン検出器を含む検出システムに関する。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ラマン検出器は、携帯型であるか、または携帯型でない。
【００５１】
ある特定の実施形態では、システムは、試料収集装置をさらに含む。
本発明の別の態様は、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在を決定するための方法であって、ａ）生物学的試料を受け取るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）分析物をアプタマーと接触させるステップ；ｄ）アプタマーによる分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、１または複数のアプタマーにコンフォメーション変化を起こす、ステップ；ｅ）１または複数のアプタマーに結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｆ）ラマンシグナルを検出して、ラマンスペクトルを生成するステップ；ならびにｇ）（ｆ）において検出されたラマンシグナルを、対照の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが、ラマン高感度マーカーと関連するピークの位置および／または強度において前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される、ステップを含む方法に関する。本発明の方法は、Ｂｏｒｒｅｌｉａの直接検出および／または抗Ｂｏｒｒｅｌｉａ抗体の検出を可能にする。
【００５２】
類似して、本発明は、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在を決定するための方法であって、ａ）生物学的試料を得るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）分析物をアプタマーと接触させるステップ；ｄ）アプタマーによる分析物の結合を可能にするステップであって、前記結合が、１または複数のアプタマーにコンフォメーション変化を起こす、ステップ；ｅ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｆ）ラマンシグナルを検出して、ラマンスペクトルを生成するステップ；ならびにｇ）（ｆ）において検出されたラマンシグナルを、対照の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｆ）において検出された前記ラマンシグナルが前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、生物学的試料中の１または複数の分析物の存在が決定される、ステップを含む方法に関する。本発明の方法は、抗Ｂｏｒｒｅｌｉａ抗体の検出とは対照的に、Ｂｏｒｒｅｌｉａの直接検出を可能にする。
【００５３】
ある特定の実施形態では、対照と比較した、（ｆ）におけるラマンスペクトル中のラマンシグナルにおける増加は、１または複数の分析物の量と相関する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、分析物の結合の際のアプタマーのコンフォメーション変化は、ラマン活性マーカーを、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の表面に近接近させる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本方法は、生物学的試料中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の分析物を検出するために使用され得る。
【００５６】
本発明の別の態様は、対象におけるライム病を診断するための方法であって、ａ）対象から生物学的試料を受け取るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）生物学的試料中の１または複数の分析物による、少なくとも１つのＳＥＲＳ試薬の結合を可能にするステップであって、前記結合が、ＳＥＲＳ試薬の１または複数のアプタマーにおいてコンフォメーション変化を引き起こす、ステップ；ｄ）１または複数の分析物に結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｅ）少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを検出するステップ；ならびにｆ）（ｅ）において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを、対照対象（健康な対象）から受け取った生物学的試料において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｅ）において検出された前記ラマンシグナルが前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記ライム病が診断される、ステップを含む方法に関する。ステップ（ｄ）のある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性試薬は、分析物を認識するアプタマーに結合させる。ステップ（ｆ）のある特定の実施形態では、（ｅ）において検出されたラマンシグナルは、標的分析物の非存在下でのラマンシグナルとは異なる。
【００５７】
類似して、本発明は、対象におけるライム病を診断するための方法であって、ａ）対象から生物学的試料を得るステップ；ｂ）生物学的試料を、（ｉ）１または複数のＳＥＲＳ活性表面；（ｉｉ）Ｂｏｒｒｅｌｉａの種において見出される１または複数の分析物に対する１または複数のアプタマー；および（ｉｉｉ）１または複数のラマン活性マーカーを含む少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬と接触させるステップ；ｃ）生物学的試料中の１または複数の分析物による、少なくとも１つのＳＥＲＳ試薬の結合を可能にするステップであって、前記結合が、ＳＥＲＳ試薬の１または複数のアプタマーにおいてコンフォメーション変化を引き起こす、ステップ；ｄ）１または複数のアプタマーに結合した少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬を照射するステップ；ｅ）少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを検出するステップ；ならびにｆ）（ｅ）において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬のラマンシグナルを、陰性対照対象（健康な対象）から受け取った生物学的試料、多数の陰性対照対象からのプールされた試料、または実験室で調製された陰性対照試料において検出された前記少なくとも１つのＳＥＲＳ活性試薬の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ｅ）において検出された前記ラマンシグナルが前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、ライム病が診断される、ステップを含む方法に関する。
【００５８】
代替的に、本発明は、対象におけるライム病を診断するための方法であって、ａ）対象の生物学的試料において測定されたラマンシグナルを受け取るステップ；ｂ）対照対象の生物学的試料において測定された参照ラマンシグナルを受け取るステップ；およびｃ）（ａ）のラマンシグナルを（ｂ）の参照ラマンシグナルと比較するステップであって、（ａ）における前記ラマンシグナルが、位置および／または強度において（ｂ）における前記参照ラマンシグナルとは異なる場合に、前記ライム病が診断される、ステップを含む方法に関する。
【００５９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしこの詳細な説明から、本発明の精神および範囲の内の種々の変更および修正が当業者に明らかになるので、この詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるものの、例示のみとして与えられていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ＳＥＬＥＸを使用したアプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化を示す模式図を示す。典型的には、８〜１２ラウンドの選択が、密に結合する高特異性アプタマーを生成するために使用される（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｔｅｍａｋｅｒ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｎｔｒ／ａｐｔａｍｅｒｓからの図）。
【図２Ａ−Ｂ】図２は、６つのパネルを含む。パネルＡは、マイクロ波ベースの合成方法を使用して産生された銀ＮＰの吸収スペクトルの比較を示す。４０１ｎｍにおけるプラズモン吸収最大および６０ｎｍのＦＷＨＭが、３週間の期間にわたってＡｇ  ＮＰによって維持される。それらを合成した当日のＮＰの吸収スペクトル（青色）、および合成の３週間後の同じＮＰの吸収スペクトル（赤色）、および合成の３週間後に遠心分離した反応混合物中で貯蔵したＮＰの吸収スペクトル（緑色）が示され、観察されたスペクトル特性を維持するＮＰの能力が精製の方法に依存しなかったことを実証している。パネルＢは、Ａｇ  ＮＰの存在下（青色）および非存在下（赤色）でのメルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ溶液のラマンスペクトルの比較を示す。アスタリスクは、その上で試料を乾燥させたケイ素基材のスペクトル寄与を示す。パネルＣは、ＮａＣｌの添加の際のジチオール末端ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰの吸収スペクトルを示す。２５ｍＭのＮａＣｌの添加は、１５分後に、定常の吸収に達した吸収強度における減少を生じた。ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭまで増加させることは、プラズモン吸収の強度におけるさらなる減少を生じた。第３のアリコートの添加は、アリコートの添加直後にプラズモン吸収のほぼ完全な喪失を生じた。パネルＤおよびＥは、ジチオール修飾ＤＮＡによるＡｇ  ＮＰの表面修飾のスペクトル照合を示す。パネルＤは、還元剤の非存在下での、ＤＮＡで修飾されたＮＰのＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰプラズモン吸収の代表的スペクトル分析を示す。スペクトルは、２５ｍＭ増分での０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムの添加の、プラズモン吸収に対する影響に従うことが記録された。パネルＥは、プラズモン吸収強度における減少の、ジチオール末端ＤＮＡで修飾されたＡｇ  ＮＰへの塩化ナトリウムの添加との比較を示す。４０３ｎｍにおけるプラズモンの吸収における変化は、初期プラズモン吸収強度の割合として示される。スペクトルは、プラズモン吸収強度が初期強度の５０％を下回って低下するまで収集した。パネルＦは、ＤＴＴ処理後の５’−ＦＡＭ、３’−ジチオール修飾ＤＮＡの発光スペクトルを示す。ＴＣＥＰ還元の存在下でＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（赤色、下）および還元剤の非存在下でジスルフィドＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（青色、上）のＤＴＴ処理から生じるＦＡＭ発光スペクトル。
【図２Ｃ−Ｅ】図２は、６つのパネルを含む。パネルＡは、マイクロ波ベースの合成方法を使用して産生された銀ＮＰの吸収スペクトルの比較を示す。４０１ｎｍにおけるプラズモン吸収最大および６０ｎｍのＦＷＨＭが、３週間の期間にわたってＡｇ  ＮＰによって維持される。それらを合成した当日のＮＰの吸収スペクトル（青色）、および合成の３週間後の同じＮＰの吸収スペクトル（赤色）、および合成の３週間後に遠心分離した反応混合物中で貯蔵したＮＰの吸収スペクトル（緑色）が示され、観察されたスペクトル特性を維持するＮＰの能力が精製の方法に依存しなかったことを実証している。パネルＢは、Ａｇ  ＮＰの存在下（青色）および非存在下（赤色）でのメルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ溶液のラマンスペクトルの比較を示す。アスタリスクは、その上で試料を乾燥させたケイ素基材のスペクトル寄与を示す。パネルＣは、ＮａＣｌの添加の際のジチオール末端ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰの吸収スペクトルを示す。２５ｍＭのＮａＣｌの添加は、１５分後に、定常の吸収に達した吸収強度における減少を生じた。ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭまで増加させることは、プラズモン吸収の強度におけるさらなる減少を生じた。第３のアリコートの添加は、アリコートの添加直後にプラズモン吸収のほぼ完全な喪失を生じた。パネルＤおよびＥは、ジチオール修飾ＤＮＡによるＡｇ  ＮＰの表面修飾のスペクトル照合を示す。パネルＤは、還元剤の非存在下での、ＤＮＡで修飾されたＮＰのＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰプラズモン吸収の代表的スペクトル分析を示す。スペクトルは、２５ｍＭ増分での０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムの添加の、プラズモン吸収に対する影響に従うことが記録された。パネルＥは、プラズモン吸収強度における減少の、ジチオール末端ＤＮＡで修飾されたＡｇ  ＮＰへの塩化ナトリウムの添加との比較を示す。４０３ｎｍにおけるプラズモンの吸収における変化は、初期プラズモン吸収強度の割合として示される。スペクトルは、プラズモン吸収強度が初期強度の５０％を下回って低下するまで収集した。パネルＦは、ＤＴＴ処理後の５’−ＦＡＭ、３’−ジチオール修飾ＤＮＡの発光スペクトルを示す。ＴＣＥＰ還元の存在下でＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（赤色、下）および還元剤の非存在下でジスルフィドＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（青色、上）のＤＴＴ処理から生じるＦＡＭ発光スペクトル。
【図２Ｆ】図２は、６つのパネルを含む。パネルＡは、マイクロ波ベースの合成方法を使用して産生された銀ＮＰの吸収スペクトルの比較を示す。４０１ｎｍにおけるプラズモン吸収最大および６０ｎｍのＦＷＨＭが、３週間の期間にわたってＡｇ  ＮＰによって維持される。それらを合成した当日のＮＰの吸収スペクトル（青色）、および合成の３週間後の同じＮＰの吸収スペクトル（赤色）、および合成の３週間後に遠心分離した反応混合物中で貯蔵したＮＰの吸収スペクトル（緑色）が示され、観察されたスペクトル特性を維持するＮＰの能力が精製の方法に依存しなかったことを実証している。パネルＢは、Ａｇ  ＮＰの存在下（青色）および非存在下（赤色）でのメルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ溶液のラマンスペクトルの比較を示す。アスタリスクは、その上で試料を乾燥させたケイ素基材のスペクトル寄与を示す。パネルＣは、ＮａＣｌの添加の際のジチオール末端ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰの吸収スペクトルを示す。２５ｍＭのＮａＣｌの添加は、１５分後に、定常の吸収に達した吸収強度における減少を生じた。ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭまで増加させることは、プラズモン吸収の強度におけるさらなる減少を生じた。第３のアリコートの添加は、アリコートの添加直後にプラズモン吸収のほぼ完全な喪失を生じた。パネルＤおよびＥは、ジチオール修飾ＤＮＡによるＡｇ  ＮＰの表面修飾のスペクトル照合を示す。パネルＤは、還元剤の非存在下での、ＤＮＡで修飾されたＮＰのＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰプラズモン吸収の代表的スペクトル分析を示す。スペクトルは、２５ｍＭ増分での０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムの添加の、プラズモン吸収に対する影響に従うことが記録された。パネルＥは、プラズモン吸収強度における減少の、ジチオール末端ＤＮＡで修飾されたＡｇ  ＮＰへの塩化ナトリウムの添加との比較を示す。４０３ｎｍにおけるプラズモンの吸収における変化は、初期プラズモン吸収強度の割合として示される。スペクトルは、プラズモン吸収強度が初期強度の５０％を下回って低下するまで収集した。パネルＦは、ＤＴＴ処理後の５’−ＦＡＭ、３’−ジチオール修飾ＤＮＡの発光スペクトルを示す。ＴＣＥＰ還元の存在下でＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（赤色、下）および還元剤の非存在下でジスルフィドＤＮＡで処理されたＡｇ  ＮＰ（青色、上）のＤＴＴ処理から生じるＦＡＭ発光スペクトル。
【図３Ａ−Ｂ】図３は、６つのパネルを含む。パネルＡは、１００μＭ溶液の硝酸カリウム（赤色、上）または塩化ナトリウム（緑色）の存在下、および塩の非存在下（青色、下）での、メルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ水溶液のラマンスペクトルの比較を示す。パネルＢは、漸増するラマンシグナル強度に対する塩添加剤の効力の比較を示す。５’−ＦＡＭジチオール化ＤＮＡで修飾されたＡｇＮＰ表面のラマンスペクトルは、ＫＮＯ３の添加（緑色）が、ＮａＣｌの存在下（赤色）または添加された塩の非存在下（青色）よりも、最も強いスペクトル特徴を生じさせることにおいて、より強いスペクトル特徴を生じることを明らかにしている。ＤＮＡ修飾は、５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で実施した。パネルＣは、メルカプトフェノールおよびＦＡＭ末端ＤＮＡから構成された混合型単層で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。下から上へと示されるスペクトルは、４μＭメルカプトフェノールの単層、および各スペクトルにおける大きさの順に減少する４ｍＭから４μＭまでの範囲の濃度のＭＣＰを伴うＦＡＭ修飾ＤＮＡの混合型単層を有するＡｇ  ＮＰのものである。パネルＤは、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。明瞭さのために全てのスペクトルをオフセットした；６３２．８ｎｍの入射光で収集したデータ。矢印の色は、スペクトル特徴の供給源と一致する；赤色矢印は、ＭＣＰからの寄与を示し、黒色矢印は、ＦＡＭ末端ＤＮＡからの寄与を示す。パネルＥは、７８５ｎｍの入射光で収集した、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。矢印は、混合型単層の成分に由来するスペクトル特徴を示す。３０５ｃｍ−１、７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における特徴は、ジチオール修飾ＤＮＡの５’末端において見出されるＦＡＭ色素に由来するが、３９３ｃｍ−１、６３６ｃｍ−１、１０１０ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１および１１７５ｃｍ−１における特徴は、ＭＣＰ単層からの寄与である。パネルＦは、混合型単層Ａｇ  ＮＰ上のＭＣＰおよびＦＡＭのスペクトル強度に対する、ＭＣＰおよびＭＣＨの濃度の影響の比較を示す。２つの濃度のＭＣＰにおけるＦＡＭ由来の特徴（１０５０ｃｍ−１；青色および緑色）およびＭＣＰ由来の特徴（１０７６ｃｍ−１；赤色および紫色）の観察されたスペクトル強度が示される。４０μＭのＭＣＰ（青色および赤色）および４μＭのＭＣＰ（緑色および紫色）で収集した混合型単層の２つの成分のスペクトル強度。
【図３Ｃ−Ｅ】図３は、６つのパネルを含む。パネルＡは、１００μＭ溶液の硝酸カリウム（赤色、上）または塩化ナトリウム（緑色）の存在下、および塩の非存在下（青色、下）での、メルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ水溶液のラマンスペクトルの比較を示す。パネルＢは、漸増するラマンシグナル強度に対する塩添加剤の効力の比較を示す。５’−ＦＡＭジチオール化ＤＮＡで修飾されたＡｇＮＰ表面のラマンスペクトルは、ＫＮＯ３の添加（緑色）が、ＮａＣｌの存在下（赤色）または添加された塩の非存在下（青色）よりも、最も強いスペクトル特徴を生じさせることにおいて、より強いスペクトル特徴を生じることを明らかにしている。ＤＮＡ修飾は、５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で実施した。パネルＣは、メルカプトフェノールおよびＦＡＭ末端ＤＮＡから構成された混合型単層で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。下から上へと示されるスペクトルは、４μＭメルカプトフェノールの単層、および各スペクトルにおける大きさの順に減少する４ｍＭから４μＭまでの範囲の濃度のＭＣＰを伴うＦＡＭ修飾ＤＮＡの混合型単層を有するＡｇ  ＮＰのものである。パネルＤは、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。明瞭さのために全てのスペクトルをオフセットした；６３２．８ｎｍの入射光で収集したデータ。矢印の色は、スペクトル特徴の供給源と一致する；赤色矢印は、ＭＣＰからの寄与を示し、黒色矢印は、ＦＡＭ末端ＤＮＡからの寄与を示す。パネルＥは、７８５ｎｍの入射光で収集した、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。矢印は、混合型単層の成分に由来するスペクトル特徴を示す。３０５ｃｍ−１、７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における特徴は、ジチオール修飾ＤＮＡの５’末端において見出されるＦＡＭ色素に由来するが、３９３ｃｍ−１、６３６ｃｍ−１、１０１０ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１および１１７５ｃｍ−１における特徴は、ＭＣＰ単層からの寄与である。パネルＦは、混合型単層Ａｇ  ＮＰ上のＭＣＰおよびＦＡＭのスペクトル強度に対する、ＭＣＰおよびＭＣＨの濃度の影響の比較を示す。２つの濃度のＭＣＰにおけるＦＡＭ由来の特徴（１０５０ｃｍ−１；青色および緑色）およびＭＣＰ由来の特徴（１０７６ｃｍ−１；赤色および紫色）の観察されたスペクトル強度が示される。４０μＭのＭＣＰ（青色および赤色）および４μＭのＭＣＰ（緑色および紫色）で収集した混合型単層の２つの成分のスペクトル強度。
【図３Ｆ】図３は、６つのパネルを含む。パネルＡは、１００μＭ溶液の硝酸カリウム（赤色、上）または塩化ナトリウム（緑色）の存在下、および塩の非存在下（青色、下）での、メルカプトフェノール（ＭＣＰ）の２００μＭ水溶液のラマンスペクトルの比較を示す。パネルＢは、漸増するラマンシグナル強度に対する塩添加剤の効力の比較を示す。５’−ＦＡＭジチオール化ＤＮＡで修飾されたＡｇＮＰ表面のラマンスペクトルは、ＫＮＯ３の添加（緑色）が、ＮａＣｌの存在下（赤色）または添加された塩の非存在下（青色）よりも、最も強いスペクトル特徴を生じさせることにおいて、より強いスペクトル特徴を生じることを明らかにしている。ＤＮＡ修飾は、５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で実施した。パネルＣは、メルカプトフェノールおよびＦＡＭ末端ＤＮＡから構成された混合型単層で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。下から上へと示されるスペクトルは、４μＭメルカプトフェノールの単層、および各スペクトルにおける大きさの順に減少する４ｍＭから４μＭまでの範囲の濃度のＭＣＰを伴うＦＡＭ修飾ＤＮＡの混合型単層を有するＡｇ  ＮＰのものである。パネルＤは、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。明瞭さのために全てのスペクトルをオフセットした；６３２．８ｎｍの入射光で収集したデータ。矢印の色は、スペクトル特徴の供給源と一致する；赤色矢印は、ＭＣＰからの寄与を示し、黒色矢印は、ＦＡＭ末端ＤＮＡからの寄与を示す。パネルＥは、７８５ｎｍの入射光で収集した、メルカプトフェノール（ＭＣＰ；下）、ＦＡＭ末端ＤＮＡ（中）、および４ｍＭのＭＣＰを伴うＦＡＭ末端ＤＮＡの混合型単層（上）で修飾されたＡｇ  ＮＰのラマンスペクトルの比較を示す。矢印は、混合型単層の成分に由来するスペクトル特徴を示す。３０５ｃｍ−１、７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における特徴は、ジチオール修飾ＤＮＡの５’末端において見出されるＦＡＭ色素に由来するが、３９３ｃｍ−１、６３６ｃｍ−１、１０１０ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１および１１７５ｃｍ−１における特徴は、ＭＣＰ単層からの寄与である。パネルＦは、混合型単層Ａｇ  ＮＰ上のＭＣＰおよびＦＡＭのスペクトル強度に対する、ＭＣＰおよびＭＣＨの濃度の影響の比較を示す。２つの濃度のＭＣＰにおけるＦＡＭ由来の特徴（１０５０ｃｍ−１；青色および緑色）およびＭＣＰ由来の特徴（１０７６ｃｍ−１；赤色および紫色）の観察されたスペクトル強度が示される。４０μＭのＭＣＰ（青色および赤色）および４μＭのＭＣＰ（緑色および紫色）で収集した混合型単層の２つの成分のスペクトル強度。
【図４】図４は、２つのパネルを含む。パネルＡは、ＴＡＭＲＡ含有バソプレシン標的化アプタマーで修飾されたＡｇ  ＮＰが、構造的に関連するタンパク質：オキシトシンおよびサブスタンスＰと比較した、バソプレシンに対する選択性を実証していることを示す。線形相関がバソプレシン（Ｒ２：０．９９）で観察されたが、サブスタンスＰ（Ｒ２：０．６３）とオキシトシン（Ｒ２：０．１９）との間の相互作用は、濃度とスペクトル強度との間の線形相関を生じさせなかった。パネルＢは、ＴＡＭＲＡ含有バソプレシン標的化アプタマーで修飾されたＡｇ  ＮＰの単層組成物の比較を示す。バソプレシン標的化アプタマー単独、または４０μＭのＭＣＰとタンデムのバソプレシン標的化アプタマーのいずれかによるＡｇ  ＮＰ表面の修飾（それぞれ、Ｒ２：０．９９および０．９６）は、バソプレシン濃度とスペクトル特徴強度との間の線形相関を生じさせた。対照的に、バソプレシン標的化アプタマーおよび４ＭのＭＣＨで修飾されたＮＰは、線形相関を生じさせなかった（Ｒ２：０．０３）。
【図５】図５は、２つのパネルを含む。パネルＡは、溶液を３０秒間にわたって１２０℃に加熱し、この温度で３０、６０および９０秒間維持したマイクロ波ベースの合成方法を使用して産生された銀ＮＰの吸収スペクトルを示す。産生されたＮＰは、参考文献からのスペクトルと遜色がないスペクトル特性（４０１ｎｍ；ＦＷＨＭ＝６０ｎｍ）を示す。パネルＢは、Leona、M.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ２００９年、１０６巻、１４７５７頁からのマイクロ波合成されたＡｇ  ＮＰの例示的な吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、２つのパネルを含む。パネルＡは、ヒト血液からのＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＳＥＲＳベースの検出の模式図を示す。血液、血清または血漿の液滴が、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ特異的タンパク質の検出のために直接使用される。血液、血清または血漿は、アプタマーコーティングされたＳＥＲＳ活性表面に曝露され、濾過され、ラマン分光法によって照合される。スペクトルは、小さい機器で分析され、結果は、３０分未満で入手可能である。パネルＢは、Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ若虫中のＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの提案されたＳＥＲＳベースの検出の模式図を示す。クロアシダニ若虫が収集され溶解される。ホモジネートは、アプタマーコーティングされたナノ粒子と混合され、ラマン分光法によって照合される。スペクトルは、携帯型機器で分析され、結果は、２０分未満で入手可能である。
【図７】図７は、マイクロカラムの使用による、複数の標的に対するアプタマー選択ワークフローを示す２つのパネルを含む。パネルＡは、１０μＬのＧＦＰ固定化樹脂を満たしたマイクロカラムを示す。パネルＢは、ＲＮＡアプタマーの多重化選択を示す。破線の矢印で示されるステップは、任意選択であり、各ラウンドにおいて必ずしも実施されるわけではない（Szeto,  K.ら  PLoS  ONE  ２０１３年、８巻、ｅ８２６６７）。
【図８】図８は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡタンパク質へのＯｓｐＡアプタマー（配列番号４）の高親和性結合を示す。結合についてのＫｄは、蛍光異方性によって決定される場合、およそ２．２ｎＭである。
【図９】図９は、生物学的標的の検出のためのラマン活性マーカー修飾アプタマーの原理の模式図（パネルＡ）および実証（パネルＢ）を示す２つのパネルを含む。パネルＡは、ラマン活性色素（青色丸によって示される）が、標的分析物（赤色丸によって示される）への曝露の際に、ラマン基材表面（黄色ブロックによって示される）に近接近することを示す。色素とＳＥＲＳ基材とが近接近すると、４つの標的分析物の検出を促進する高い強度のＳＥＲＳシグナルが生じる（Baker,  B.  R.ら  J.  Am.  Chem.  Soc.  ２００６年、１２８巻、３１３８頁に由来する図）。パネルＢは、原理を実証するスペクトルを示す−本発明者らは、ラマン活性色素ＴＡＭＲＡを用いて、バソプレシン標的化アプタマーを修飾した。ＴＡＭＲＡラマンシグナルの強度は、標的分子バソプレシンの濃度と共に増加することが観察された。これは、生物学的標的の検出におけるラマン活性色素修飾アプタマーの効力を実証している。
【図１０】図１０は、多重検出において用いられるラマン活性色素のラマンスペクトルを示す。各色素は、４つの標的分析物の各々の代用品（ｐｒｏｘｙ）として機能し、他の色素を含有する試料のスペクトル中でのそれらの識別を可能にするスペクトル特徴を有し、唾液または他の生物学的マトリックスにおける分析物検出を促進する（Cao,  Y.  C.ら  Science  ２００２年、２９７巻、１５３６頁）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（詳細な説明）
Ａ．定義
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられるある特定の用語をここにまとめる。他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６２】
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、この冠詞の文法的客体のうちの１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために、本明細書で使用される。例として、「１つの（an）要素」とは、１つの要素または１つよりも多くの要素を意味する。
【００６３】
Ｂ．ナノ粒子および他のＳＥＲＳ活性基材材料
ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、本発明のラマン活性表面を提供するために使用され、当該分野で公知である。他のＳＥＲＳ活性材料コーティング表面、金属コーティング表面、またはＳＥＲＳ活性ナノ粒子が包埋された表面が、本発明によって企図される。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子には、米国特許出願公開第２００４／０１３４９９７号に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。例えば、銀（Ａｇ）ナノ粒子は、ＡｇＮＯ３のマイクロ波ベースの還元を使用して、または当業者に公知のいくつもの他の方法によって、調製され得る。銀および金のナノ粒子もまた公知であり、使用され、商業的にまたは合成によって得ることができ、本発明の方法における使用のために適応され得る。ナノ粒子に加えて、以下を含むがこれらに限定されない他のＳＥＲＳ活性基材が使用され得る：ラマン活性のために金属でコーティングしたコアシェル、中空もしくはＳｉビーズ、または適切な支持体上の金属、半導体もしくは半金属から構成される他のＳＥＲＳ活性基材、またはＳＥＲＳ活性材料でコーティングしたポリマー性表面；これらの材料には、ＮＰが包埋されていてもいなくてもよい。Wang,  W.ら、Appl.  Phys.  Lett.  １０６巻、２０１５年、２１１６０４頁。
【００６４】
ある特定の実施形態では、ＳＥＲＳ活性ＮＰは、遊離であり得、生物学的試料中に導入され得るか、またはＳＥＲＳ活性材料は、ＮＰ（ＳＥＲＳ活性または不活性）が包埋された固体支持体であり得る。支持体材料は、紙；セルロース；ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリジメチルシロキサン（polydimenthyl  siloxane）（ＰＤＭＳ）を含むプラスチック、または他のポリマー性材料を含むがこれらに限定されない材料から構成され得る。一部の実施形態では、これらの支持体材料は、１またはいくつかのＳＥＲＳ活性材料でコーティングされる。別の実施形態は、１またはいくつかのＳＥＲＳ活性材料でコーティングされた支持体材料のうちの１またはいくつかから構成された、パターン形成された表面であり得る（Wang,  W.ら、Appl.  Phys.  Lett.  １０６巻、２０１５年、２１１６０４頁）。
【００６５】
アプタマーがＳＥＲＳ活性基材に付加される場合、アプタマーは、共有結合または非共有結合いずれかによって、ＳＥＲＳ活性表面に結合させ得る。ＤＮＡアプタマーは、チオールで修飾し得る。共有結合、供与（dative）結合または配位（coordinate）共有結合による付加のために、表面またはＳＥＲＳ活性基材は、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーまたはオリゴヌクレオチドを付加するために適切な種々の反応性基、典型的にはチオールを含有するように修飾され得るが、当該分野で公知の任意の基が使用され得る。例えば、キャッピング試薬、例えば、ジヒドロリポ酸を、ラマン活性表面に共有結合的に付加することができ、アミン末端ＤＮＡアプタマーを、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いた、標準的なアミンのカルボン酸へのコンジュゲーションを使用して、ナノ粒子に共有結合的に連結することができる。非共有結合によるアプタマー付加のために、バーコードＤＮＡ、ユニバーサルプライマー、またはＤＮＡ（またはＲＮＡ）の他の結合特異的配列、即ち、捕捉オリゴを、ナノ粒子またはＳＥＲＳ活性表面に付加することができる。かかる捕捉オリゴは、捕捉オリゴの相補的配列を有する標的特異的アプタマーとハイブリダイズする（典型的には、ラマン活性マーカーから顕著な距離で、またはラマン活性マーカーとは反対の末端の近傍において）。
【００６６】
Ｃ．アプタマー
アプタマーは、常にではないが典型的には１００塩基長を下回る、高い親和性および特異性で他の分子に結合する能力を有する、一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子である。アプタマーは、例えば、試験管内進化法（Systematic  Evolution  of  Ligands  by  EXponential  enrichment）（ＳＥＬＥＸ；図１）と呼ばれるプロセスによる、ランダムオリゴヌクレオチドプールを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化プロセスを使用して生成され得る。ＳＥＬＥＸプロセスは、これらの小さいオリゴヌクレオチドが、高い特異性および親和性で特異的標的と相互作用し得る独自の３次元構造へと折り畳まる能力によって制御される。アプタマーは、金属イオン１、小分子、例えば、有機色素２およびアミノ酸３、医学的に関連する分子、例えば、抗生物質４およびペプチド５、ならびに生物学的に適切な分子、例えば、タンパク質６、７、細胞全体、ウイルスおよびウイルス感染細胞８、および細菌９、１０を含む広範な種々の標的に対して生成されたものであり得る。特定のアプタマーまたはアプタマーセットについての配列が公知になると、これらのアプタマーは、オリゴヌクレオチド（oligonucelotide）については当該分野で公知の標準的な技術を使用して、または合成もしくは組換えＤＮＡ技術を介して、容易に合成され得る。オキシトシン、バソプレシン、他のホルモン、感染性疾患因子および疾患マーカータンパク質を結合するアプタマーが、特に目的とされる。
【００６７】
さらに、アプタマーは、カンナビノイド／カンナビス／マリファナ（Δ９−テトラヒドロカンナビノール、ＴＨＣ）、合成カンナビノイド、カリソプロドール（およびメプロバメート）、コカイン（メチルベンゾイルエクゴニン）、デキストロメトルファン、ジフェンヒドラミン、ガンマ−ヒドロキシブチレート（ＧＨＢ、ＧＢＬおよび１，４−ＢＤ）、ケタミン、リゼルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、ブプレノルフィン（サブテックス（subutex））、メサドン、メタンフェタミン、アンフェタミン、メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ、エクスタシー）、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、オピエート（オキシコドン、プロポキシフェン、モルヒネおよびヘロイン）またはフェンシクリジン（ＰＣＰ）を含むがこれらに限定されない違法薬物を結合し得る。
【００６８】
本発明のアプタマーは、持続性感染性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患、がん、心理的疾患、代謝疾患、自己免疫疾患、性行為感染症、胃腸疾患、肺疾患、心血管疾患、ストレス関連障害および疲労関連障害、真菌性疾患、病原体疾患、肥満関連障害、またはこれらに関するバイオマーカーを検出するなどの、診断適用および予後適用に有用である。ウイルス性感染性疾患には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、インフルエンザウイルス、Ａ型およびＢ型肝炎、ＦＩＶ、レンチウイルス、ペスチウイルス、ウエストナイルウイルス、麻疹、天然痘、牛痘、エボラ、コロナウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ジャガイモＳウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれる。本発明のアプタマーは、病原体、例えば、マラリアなどの種々の寄生生物と関連する抗原、抗体または他の分析物を検出し得る。さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｎｇｕｅ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊媒介生物中のＰ．ｖｉｖａｘ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａおよびＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅなどの、細菌、真菌および他の病原体疾患が含まれる。例示的な種には、Neisseria  gonorrhea、Mycobacterium  tuberculosis、Candida  albicans、Candida  tropicalis、Trichomonas  vaginalis、Haemophilus  vaginalis、Group  B  Streptococcus  sp.、Microplasma  hominis、Hemophilus  ducreyi、Granuloma  inguinale、Lymphopathia  venereum、Treponema  pallidum、Brucella  abortus、Brucella  melitensis、Brucella  suis、Brucella  canis、Campylobacter  fetus、Campylobacter  fetus  intestinalis、Leptospira  pomona、Listeria  monocytogenes、Brucella  ovis、Chlamydia  psittaci、Trichomonas  foetus、Toxoplasma  gondii、Escherichia  coli、Actinobacillus  equuli、Salmonella  abortus  ovis、Salmonella  abortus  equi、Pseudomonas  aeruginosa、Corynebacterium  equi、Corynebacterium  pyogenes、Actinobaccilus  seminis、Mycoplasma  bovigenitalium、Aspergillus  fumigatus、Absidia  ramosa、Trypanosoma  equiperdum、Clostridium  tetani、Clostridium  botulinum；または真菌、例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど；または他の病原体、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが含まれる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）の重点病原体もまた含まれる。これらには、カテゴリーＡ因子、例えば、大痘瘡（天然痘）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（ラッサ（ラッサ熱）、フニン（アルゼンチン出血熱）および関連ウイルス）；カテゴリーＢ因子、例えば、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部および西部ウマ脳脊髄炎）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のヒマ毒毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素；ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ；カテゴリーＣ因子、例えば、ニパウイルス、ハンタウイルス、Ａｅｄｅｓ蚊中の黄熱、および多剤耐性結核；蠕虫、例えば、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＴａｅｎｉａ；ならびに原生生物、例えば、スナバエ中のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ（例えば、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、サシガメ中のシャーガス病が含まれる。
【００６９】
細菌病原体には、肺炎球菌；ブドウ球菌；および連鎖球菌を含むがこれらに限定されない、細菌病原性グラム陽性球菌などが含まれるがこれらに限定されない。病原性グラム陰性球菌には、髄膜炎菌および淋菌が含まれる。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａおよびｅｉｋｅｎｅｌｌａ；類鼻疽；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；細菌性赤痢；ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ；軟性下疳；ブルセラ症；野兎病；ｙｅｒｓｉｎｉａ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）；ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓおよびｓｐｉｒｉｌｕｍ；ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；ジフテリア；コレラ；炭疽；ならびに鼠径リンパ肉芽腫症（donovanosis）（鼠径肉芽腫）が含まれる。病原性嫌気性細菌には、破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム；結核；ハンセン病および他のマイコバクテリアが含まれる。病原性スピロヘータ疾患には、梅毒；トレポネーマ症：イチゴ腫、ピンタおよび地方病性梅毒；ならびにレプトスピラ症が含まれる。高等な病原体細菌および病原性真菌によって引き起こされる他の感染には、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症（paracoccidiodomycosis）、ペトリエリジオーシス（petriellidiosis）、トルロプシス症、菌腫および黒色真菌症；ならびに皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染には、リケッチア性（rickettsial）およびリケッチア症が含まれる。マイコプラズマおよびクラミジア感染の例には、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；鼠径リンパ肉芽腫症（lymphogranuloma  venereum）；オウム病；および出生時クラミジア感染が含まれる。病原性原生生物および蠕虫ならびにそれらによる真核生物の感染には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（trematode）または吸虫（fluke）；および条虫（サナダムシ）感染が含まれる。
【００７０】
本発明のアプタマーは、持続性感染性疾患を検出するなどの、診断適用および予後適用に有用である。ある特定の実施形態では、アプタマーは、指腹採血または標準的な採血から採取されたヒト血液、血清または血漿を使用して、ヒトにおける、Ｂｏｒｒｅｌｉａ科中の種によって引き起こされる感染、例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染を検出し得る。さらに、アプタマーは、ライムおよび他のマダニ媒介性病原体、例えば、Ｂａｂｅｓｉａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ａｎａｐｌａｓｍａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、ならびに他の新興マダニ媒介性病原体、例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍｉｙａｍｏｔｏｉ、紅斑熱およびポワッサンウイルスを検出し得る。アプタマーは、Borrelia  afzelii、Borrelia  americana、Borrelia  andersonii、Borrelia  anserina、Borrelia  baltazardii、Borrelia  bavariensis、Borrelia  bissettii、Borrelia  brasiliensis、Borrelia  burgdorferi、Borrelia  californiensis、Borrelia  carolinensis、Borrelia  caucasica、Borrelia  coriaceae、Borrelia  crocidurae、Borrelia  dugesii、Borrelia  duttonii、Borrelia  garinii、Borrelia  graingeri、Borrelia  harveyi、Borrelia  hermsii、Borrelia  hispanica、Borrelia  japonica、Borrelia  kurtenbachii、Borrelia  latyschewii、Borrelia  lonestari、Borrelia  lusitaniae、Borrelia  mazzottii、Borrelia  merionesi、Borrelia  microti、Borrelia  miyamotoi、Borrelia  parkeri、Borrelia  persica、Borrelia  recurrentis、Borrelia  sinica、Borrelia  spielmanii、Borrelia  tanukii、Borrelia  texasensis、Borrelia  theileri、Borrelia  tillae、Borrelia  turcica、Borrelia  turdi、Borrelia  turicatae、Borrelia  valaisiana、Borrelia  venezuelensis、Borrelia  vincentii、Borrelia  burgdorferi  B31、Borrelia  burgdorferi  N40、Borrelia  burgdorferi  JD1、またはBorrelia  burgdorferi  297を検出するために使用され得る。Ｂｏｒｒｅｌｉａ種は、Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓマダニにおいて見出され得る。
【００７１】
「Ｂａｂｅｓｉａ」とは、Babesia  bigemina、Babesia  bovis、Babesia  canis、Babesia  cati、Babesia  divergens、Babesia  duncani、Babesia  felis、Babesia  gibsoni、Babesia  herpailuri、Babesia  jakimovi、Babesia  major、Babesia  microti、Babesia  ovate、またはBabesia  pantheraeを含むがこれらに限定されないＢａｂｅｓｉａ科の感染性原生生物種を指す。「Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ」とは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｍｕｒｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓを含むがこれらに限定されないＥｈｒｌｉｃｈｉａ科の感染性病原性種を指す。「Ａｎａｐｌａｓｍａ」とは、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｃｅｎｔｒａｌｅ、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍｅｓａｅｔｅｒｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｏｖｉｓまたはＡｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓを含むがこれらに限定されないＡｎａｐｌａｓｍａ科の感染性病原性種を指す。「Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ」とは、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅまたはＢａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅを含むがこれらに限定されないＢａｒｔｏｎｅｌｌａ科の感染性病原性種を指す。
【００７２】
それらの標的認識能、選択性および高親和性結合に基づいて、アプタマーは、抗体になぞらえられる。しかし、アプタマーは、それらの独自の特徴により、それらの開発および適用の範囲において、より多くの柔軟性を有する。具体的には、ＳＥＬＥＸプロセスによるアプタマーの生成に必要な時間は、比較的短い。さらに、種々の官能基および特定の部分、例えば、ビオチン、カルボキシル、アミノおよびチオール基を組み入れるために必要とされる生化学的操作を許容するアプタマーが化学合成され得、これらの基および部分のほとんどは、アプタマーによる標的の認識に影響を与えない。アプタマーは、増加した圧力が選択プロセスの間に適用され得、それらの標的に対するアプタマーの親和性または選択性を潜在的に増加させる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に従順である。
【００７３】
例えば、アプタマーは、１０１４〜１０１５のランダムＤＮＡまたはＲＮＡ配列アプタマーのプール（合成オリゴヌクレオチドを産生する市販の供給源由来のプールとして購入される）から選択され、配列特異的アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを使用して富化される。ＳＥＬＥＸは、典型的には固体支持体上の標的への、ならびに、そのプールが「陰性」標的について富化されていないことを確実にするための「陰性」標的（即ち、プロセスの他の部分、例えば、標的の非存在下の、プロセスにおいて使用されるプラスチック、または固体支持体）への、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマープールの曝露を伴う。アプタマーは、標的と相互作用し、標的に結合し、非結合アプタマーは洗浄して除去される。結合したアプタマーは、溶出され、隣接不変領域を増幅プライマー部位として使用するＰＣＲによってコピーされる。このプロセスは、数個のアプタマーがプールの大部分になるまで、富化されたアプタマープールを用いて反復される。ゲルシフトアッセイ、蛍光異方性実験または他の結合実験が、所与の標的に対するアプタマーの親和性を決定するために使用され得る。
【００７４】
用語「％相同性」は、本明細書で、本明細書の用語「％同一性」と相互交換可能に使用され、通常は、配列アライメントプログラムを使用してアラインした場合の、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーの核酸配列間での核酸同一性のレベルを指す。
【００７５】
例えば、本明細書で使用する場合、８０％相同性とは、規定されたアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、その所与の配列の長さにわたって８０％よりも高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルには、本明細書に記載される所与の配列に対する８０、８５、９０、９５、９８％またはそれ超の配列同一性が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
２つの配列間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータープログラムには、ＢＬＡＳＴプログラムのパッケージソフト、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおいて公にアクセス可能な、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ、ならびに他の次世代ＤＮＡ配列決定分析プログラムが含まれるがこれらに限定されない。他のプログラムには、Ｇａｌａｘｙ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、ＤＮＡＮｅｘｕｓ、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、Ｓｏｆｔｇｅｎｅ  ＮｅｘｔＧＥＮｅが含まれる。
【００７７】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５および６６、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５および６６、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
ライム検出のための例示的なアプタマー配列は、表１に提供される。
【表１】
2018512598.tif 000002
【００７９】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号６７〜８４、もしくはそれらの任意のホモログ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号６７〜８４、もしくはそれらの任意のホモログ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
参考文献
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(2)    Ellington,  A.  D.  et  al.  Nature  1990,  346,  818。
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(10)    Kim,  Y.  S.  et  al.  Anal.  Biochem.  2013,  436,  22。
【００８１】
Ｄ．ラマン活性マーカー分子
ラマン活性マーカーは、１または複数のアプタマーに共有結合により付加されている化学的部分である。マーカーは、典型的には、合成オリゴヌクレオチド中への取込みのために設計されたホスホルアミダイト（固体支持体上でＤＮＡ配列を構築するために使用されるモノマー）中に組み入れた蛍光マーカーである。例えば、合成オリゴ分子中にそれらもまた組み入れることができるアルキン、アジドなど、ホスホルアミダイほどには大きくない（したがって、アプタマーと標的との相互作用に影響を与える可能性はそれほど高くない）第２のクラスのラマン活性マーカーもまた存在する（Yamakoshi（２０１２年）J  Am  Chem  Soc  １３４巻：２０６８１〜９頁）。有用なラマン活性マーカーには、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ３．５、ローダミン６Ｇ、Ｃｙ５が含まれるがこれらに限定されない。蛍光色素よりもはるかに多くのラマン活性マーカーが利用可能であるので、ラマンマーカー分子の軽微な化学的修飾は、２つの分子が事実上識別不能な蛍光スペクトルを示す場合であっても、異なるラマンスペクトルを有する新たなラマン活性マーカーをもたらし得る。Kneippら  Chem.  Rev.  ９９巻、２９５７頁（１９９９年）；Grahamら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ３９巻、１０６１頁（２０００年）。これは、所与の標的に対する各アプタマーまたはアプタマーのセットの独自のスペクトルシグネチャーを有するラマン活性マーカーを使用することによる多重化を可能にする。
【００８２】
ラマン分光法に使用され得るラマン活性マーカーの非限定的な例には、アルキン、アジド、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＴＲ）色素、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、カーボンナノチューブおよびフラーレンが含まれる。これらおよび他のラマン標識は、商業的供給源（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から得ることができるか、そして／または当該分野で公知の方法によって合成され得る。
【００８３】
多環式芳香族化合物は、当該分野で公知のように、ラマン活性マーカーとして機能し得る。当業者は、使用されるラマン標識が、識別可能なラマンスペクトルを生成するはずであり、異なる型のアプタマーに特異的に結合し得るか、またはかかるアプタマーと特異的に会合し得ることを認識する。
【００８４】
標識またはラマン活性マーカーは、アプタマーに直接付加され得、または固相ＤＮＡ合成の間に種々のリンカー化合物を介して付加され得る。開示された方法において使用される架橋試薬およびリンカー化合物は、当該分野で公知である。アプタマーなどの他の分子と共有結合によって反応するように設計された反応性基を含有するラマン標識は、市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。標識された分析物を調製するための方法は、公知である（例えば、米国特許第４，９６２，０３７号；米国特許第５，４０５，７４７号；米国特許第６，１３６，５４３号；米国特許第６，２１０，８９６号）。
【００８５】
Ｅ．標的の定義
本明細書で使用する場合、用語「標的」または「分析物」は、相互交換可能に使用され、検出および／または識別のための目的の任意の原子、化学物質、分子、化合物、組成物または凝集物を意味する。分析物の非限定的な例には、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害剤、薬物、医薬品、栄養素、プリオン、毒素、毒物、爆薬、農薬、化学兵器剤、バイオハザード剤、放射性同位体、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、麻薬、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、依存性薬物、廃棄物、発射残渣および／または夾雑物が含まれる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、分析物または標的は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ科の種中に存在する。ある特定の実施形態では、分析物は、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＢｍｐＡ、またはそれらの組合せから選択されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ表面タンパク質である。ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣおよびＢｍｐＡは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ上で見出される外側表面タンパク質であり；これらは、ヒトにおいて、またはマダニの解剖学的形態内で、差次的に発現される。ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢは、マダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの生存に必須のようであり、ＯｓｐＣは、感染マダニによる哺乳動物宿主の感染に必須である。
【００８７】
Ｆ．生物学的試料
本明細書で使用する場合、用語「生物学的試料」には、血液、血液製剤、血清、血漿、他の血液画分、組織、組織抽出物、尿、脳脊髄液、唾液、糞便、皮膚、毛、頬組織、臓器組織、息、胸水、汗または痰が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「試料収集装置」または「試料収集デバイス」には、スワブまたは他のマトリックス（濾紙、綿、パッドまたは発泡体）、ディップスティック、試験ストリップ、カップ、カートリッジ、キャピラリーまたはチューブが含まれ得るがこれらに限定されない。その中に収集されたまたは含有される生物学的試料は、例えば、水または適切な緩衝液中で復元され得る。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、復元を必要としない。試料収集デバイスは、そのデバイスが陽性対照であるか陰性対照であるかを示すために、例えば、色素、検出可能なタグまたはバーコードを使用して、カラーコード化され得る。ある特定の実施形態では、マトリックスまたは収集デバイスは、結合型ポリオレフィン線維（bonded  polyolefin  fiber）、例えば、結合型ポリオレフィン線維（Bonded  Polyolefin  Fibre）、グラスファイバー、セルロース、綿、ポリエチレン、ナイロン、天然高分子、ポリビニルスルホン、シリカ、グラスファイバー、バインダーを含むグラスファイバー、酢酸セルロースまたはニトロセルロース（ＮＣ）から作製され得る。「試料収集装置」または「試料収集デバイス」は、ハウジングを含み得、前記ハウジングは、試料収集に適切に適応された材料、例えばプラスチックなどを含み得る。
【００８９】
試料収集デバイスは、酵素もしくはプロテアーゼ、タンパク質、生物学的試料を処理し有効期間を増加させるための化合物もしくは防腐剤、化学物質安定剤、希釈剤、緩衝液、添加剤、界面活性剤、脂質、糖、炭水化物、またはそれらの任意の組合せをさらに含み得る。例えば、酵素またはプロテアーゼは、生物学的試料または試験試料を可溶化し得る。例えば、酵素は、ムチンであり得るがこれに限定されない。タンパク質は、ウシ血清アルブミンであり得るがこれに限定されない。防腐剤は、アジ化ナトリウムであり得るがこれに限定されない。他の添加剤および安定剤には、オルトリン酸水素二ナトリウム無水物、オルトリン酸二水素カリウム、ｄ−マンニトール、またはそれらの任意の組合せが含まれ得るがこれらに限定されない。
【００９０】
Ｇ．ラマン検出器または機器
分析物は、ＳＥＲＳラマン分光法または他の適切なラマン分光技術の公知の方法、例えば、チップ増強ラマン散乱（ＴＥＲＳ）および単一分子ラマン散乱（ＳＭＥＲＳ）によって検出および／または識別され得る。表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、ハイパーラマン分光法およびコヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）についてのバリエーションは、開示されている。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳでは、ラマン検出の感度は、粗面化金属表面またはナノ粒子、例えば、銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面上に吸着された分子について、１０６またはそれ超倍、増強される。本発明に従ってラマン活性マーカーをアプタマーに付加することによって、さらなるより強いシグナル増強が生じ；さらに、マーカーの付加は、それを取り囲むマトリックス、または未修飾のアプタマーと比較した場合に独自であると予測されるマーカーの公知かつ別個のスペクトル特性を介した標的の識別を可能にする。ＳＥＲＳ検出の１つの有用な方法は、米国特許出願公開第２０１３／０１０７２５４号に記載されている。
【００９１】
ラマン検出ユニットの非限定的な例は、米国特許第６，００２，４７１号に開示されている。励起ビームは、５３２ｎｍ波長の周波数倍化Ｎｄ：ＹＡＧレーザーまたは３６５ｎｍ波長の周波数倍化Ｔｉ：サファイアレーザーのいずれかによって生成される。パルスレーザービームまたは連続レーザービームが使用され得る。励起ビームは、共焦点オプティクスおよび顕微鏡対物レンズを通過し、１または複数の分析物を含有するラマン活性複合体に集中される。ラマン発光シグナルは、顕微鏡対物レンズおよび共焦点オプティクスによって収集され、スペクトル解離のために単色光分光器にカップリングされる。共焦点オプティクスは、背景シグナルを低減させるために、ダイクロイックフィルター、バリアフィルター、共焦点ピンホール、レンズおよびミラーの組合せを含む。標準的なフルフィールドオプティクスも、共焦点オプティクスと同様に使用され得る。ラマン発光シグナルは、シグナルの計数およびデジタル化のためのコンピューターとインターフェース接続されたアバランシェフォトダイオードを含むラマン検出器によって検出される。
【００９２】
単一光子計数モードで操作されるガリウム−ヒ化物光電子増倍管（ＲＣＡ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃ３１０３４またはＢｕｒｌｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃ３１０３４０２）と共にＳｐｅｘ  Ｍｏｄｅｌ  １４０３二重格子分光光度計（double-grating  spectrophotometer）を含むラマン検出ユニットの別の例は、米国特許第５，３０６，４０３号に開示されている。励起供給源は、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ、Ｍｏｄｅｌ  １６６の５１４．５ｎｍラインのアルゴンイオンレーザー、および６４７．１ｎｍラインのクリプトンイオンレーザー（Ｉｎｎｏｖａ  ７０、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を含む。
【００９３】
ある特定の実施形態では、典型的な入射波長は、約４８８、約５１４．５、約５３２ｎｍ、約６３２．８、約７８５ｎｍおよび約１０６４ｎｍである。
【００９４】
代替的な励起供給源には、３３７ｎｍの窒素レーザー（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）および３２５ｎｍのヘリウム−カドミウムレーザー（Ｌｉｃｏｎｏｘ）（米国特許第６，１７４，６７７号）、発光ダイオード、Ｎｄ：ＹＬＦレーザー、ならびに／または種々のイオンレーザーおよび／もしくは色素レーザーが含まれる。励起ビームは、バンドパスフィルター（Ｃｏｒｉｏｎ）を用いてスペクトル的に精製され得、６×対物レンズ（Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｍｏｄｅｌ  Ｌ６Ｘ）を使用してラマン活性複合体に集中され得る。対物レンズは、励起ビームおよび発光されたラマンシグナルのための直角の幾何学を生じさせるためにホログラフィックビームスプリッター（Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｄｅｌ  ＨＢ  ６４７−２６Ｎ１８）を使用することによって、分析物の励起およびラマンシグナルの収集両方のために使用され得る。ホログラフィックノッチフィルター（Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）が、レイリー散乱された放射を低減させるために使用され得る。代替的なラマン検出器には、赤色増強増感型電荷結合素子（red-enhanced  intensified  charge-coupled  device）（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＩＳＡ  ＨＲ−３２０スペクトログラフが含まれる。他のタイプの検出器、例えば、フーリエ変換スペクトログラフ（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ干渉計に基づく）、荷電注入デバイス、フォトダイオードアレイ、ＩｎＧａＡｓ検出器、電子倍増ＣＣＤ、増感型ＣＣＤおよび／またはフォトトランジスタアレイも使用され得る。
【００９５】
通常のラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導ラマン利得分光法（stimulated  gain  Raman  spectroscopy）、ハイパーラマン散乱、分子光学レーザー試験器（molecular  optical  laser  examiner）（ＭＯＬＥ）もしくはラマンマイクロプローブもしくはラマン顕微鏡法もしくは共焦点ラマンマイクロ分光法（confocal  Raman  microspectrometry）、３次元もしくは走査型ラマン、飽和ラマン分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマン脱共役分光法（Raman  decoupling  spectroscopy）またはＵＶ−ラマン顕微鏡法が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知のラマン分光法または関連技術の任意の適切な形態または構成が、本発明の複合体の検出のために使用され得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ポイントオブケア試験装置、例えば携帯型ラマン検出器が適切に機能しているかどうかを試験するための方法を開示する。本方法は、（ａ）試料収集デバイスを水、緩衝化溶液または生物学的試料と接触させるステップ；（ｂ）試料収集デバイスをポイントオブケア試験装置中に挿入するステップ；および（ｃ）陽性対照または陰性対照の存在を検出するステップであって、陽性対照または陰性対照の存在が、ポイントオブケア試験装置が適切に機能していることを示す、ステップを含む。ある特定の実施形態では、較正のための標準的な試験カートリッジが、ポイントオブケア試験装置が適切に機能しているかどうかを試験するために使用され得る。
【００９７】
Ｈ．他のテクノロジー
マダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの存在を検出するための現在の方法は、マダニホモジネート中に存在する細菌性タンパク質を検出するための免疫学的方法を使用する。典型的には、これらの試験は、時間がかかり、実施のための著しい技術的熟練および訓練を必要とする。しばしば、マダニは、試験実験室に送られ、結果が返ってくるまで数週間かかり得；多くの個体は、マダニ試験の結果を受け取る前に、ライム病の症状を既に示し得る。
【００９８】
ヒトにおけるライム病を検出するための現在の受容された方法は、ヒト抗Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗体の検出のための標的として全細胞ホモジネートを使用する、ＣＤＣ承認された２段階の血清学的プロトコールに基づく。第１段階の試験は、典型的には、抗ライムＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出するためにＥＬＩＳＡまたは関連のアッセイを使用し、陽性または多義的な結果は、第２の試験、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対して特異的と判断されるバンドを検出するためにＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抽出物を使用するＩｇＭまたはＩｇＧイムノブロットの使用を促す。いくつかの問題が、これらの血清学的アッセイについて存在する：１）劣った感度；２）感染の最初の４〜６週間における非常に低いレベルの抗Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗体；３）一部の個体における劣った抗Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ応答；４）イムノブロットの主観的解釈；および５）抗体処置したまたは再感染した個体においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染を診断できないこと。この試験は、抗体産生を検出するものであり、病原体を直接検出するわけではないので、この試験は、感染の３週間以内に感染を検出することができない。さらに、この試験は、特異性＞８０％を有するが、５０〜６０％の感度しか有さない。米国における現在の概算は、およそ３００，０００のヒトライム病試験がオーダーされているが、多くの臨床医は、低い感度に起因してこの試験をオーダーしていないことを示唆している。ライム病報告の低い比率は、一部、臨床医にとって現在利用可能な診断ツールの劣った品質に起因している。
【００９９】
血清学ベースのアッセイに加えて、いくつかの他の新たなアッセイが、文献中および市場に出現し始めている。ライム診断学のためのメタボロミクスアプローチが、最近記載された（Mollins,  C.R.ら  Clin  Infect  Dis.  ２０１５年３月１１日）。この方法は、開発の初期段階にあり、機器集約的な技術的に進歩したＧＣ−ＭＳ分析を必要とし、ポイントオブケア（ＰＯＣ）検出の可能性を下げる。Ｃｅｒｅｓ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、尿からライム抗原を濃縮し、標準的なイムノアッセイテクノロジーを使用してそれらの存在を検出する、ナノ粒子ベースのアッセイを開発している（Douglas,  T.A.ら  Biomaterials.  ２０１１年２月；３２巻（４号）：１１５７〜６６頁；ｗｗｗ．ｃｅｒｅｓｎａｎｏ．ｃｏｍ）。このアッセイは、抗Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗体の代わりにライム抗原を直接検出するが、このアッセイは、ライム抗原を検出するために、実施に４時間超が必要であり、ＰＯＣ検出を困難にもする、イムノアッセイテクノロジーを使用する。
【０１００】
種々の他のライム病診断アッセイが、文献中に記載されている。一部には、直接的ＤＮＡ増幅ベースのアッセイ、培養ベースのアッセイおよび他の直接的ライム抗原検出方法、例えば、抗体修飾カーボンナノチューブへのライム抗原結合を測定するトランジスタベースのアッセイ（Lerner,  M.B.ら  Biosens  Bioelectron.  ２０１３年７月１５日；４５巻：１６３〜７頁）が含まれる。これらのアッセイの多くは、開発の初期段階にあり、または現在のＣＤＣ承認された２段階のイムノアッセイよりも劣った結果を生じている。
【０１０１】
本発明は、以下を含む、上記方法のいくつかの利点を有する：１）ＤＮＡアプタマーは、他の検出システムにおいて使用される抗ライム抗原抗体に代わる、高親和性で柔軟性があり、容易に生成および修飾される代替品を提供する；２）ナノ粒子ベースの抗原結合は、バルク血液、血清または血漿由来の抗原の容易かつ迅速な結合および分離を可能にする；３）ＳＥＲＳの１０６〜１０１４倍のシグナル増幅は、超高感度のライム抗原検出を可能にする；４）ＤＮＡアプタマーに沿ったラマン標識の独自配置は、ＳＥＲＳベースの検出の特異性および感度を劇的に改善する；ならびに５）抗原結合からＳＥＲＳ検出までの検出方法全体にかかるのは３０分未満であり、これにより、この検出方法は、ＰＯＣ診断適用のために高度に適切なものになっている。
【０１０２】
上記開示から理解できるように、本発明は、広範な種々の適用を有する。本発明は、例示に過ぎず、本発明の定義および範囲を限定することを決して意図しない、以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０１０３】
（例示）
Ｉ．感染性疾患を検出するための試薬および方法（実施例１〜４）
【０１０４】
（実施例１）
（オキシトシン（ＯＴ）およびオキシトシン−ｇｌｙ−ｌｙｓ−ａｒｇ（ＯＴ−ＧＫＲ）に対するアプタマー選択）
ＯＴおよびＯＴ−ＧＫＲのためのアプタマーを、Ｈｏｏｎら１に記載される選択プロセスを適応させることによって選択した。この方法では、ビオチン−ＯＴおよびビオチン−ＯＴ−ＧＫＲを、磁性ビオチン化ミクロスフェアに結合させ、これらのミクロスフェアを、ペプチドホルモンに結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを未結合のオリゴから分離するための、容易に収集される基材として作用する。アプタマー選択ライブラリーとして使用されるオリゴヌクレオチドプールは、アプタマー選択後のアプタマーライブラリーのＰＣＲ増幅のために必要なプライマー部位として作用し得る不変のＤＮＡ配列の短いストレッチが隣接する４０のランダムヌクレオチドからなった。アプタマーライブラリーの配列は、以下であった：
5’−ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT−[N]40−AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC−3’(配列番号1)
【０１０５】
このオリゴについての隣接領域を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォームでのＤＮＡの次世代配列決定（ＮＧＳ）のためのアダプター配列に対して相補的であるように選択した。
【０１０６】
簡潔に述べると、アプタマー選択プロセスは以下の通りである：
・０．１ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ｍ２７０を、標的に対する選択の各ラウンドのために使用し、０．１ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓを、各陰性選択のために使用する。
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳで３回洗浄する。
・陽性選択のためのＤｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌのビオチン−ＯＴまたはビオチン−ＯＴ−ＧＫＲと共に、室温で３０分間（一定の回転で）インキュベートする。
・ペプチド結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳで３回洗浄する。
・全てのＤｙｎａｂｅａｄｓ試料（ＯＴ、ＯＴ−ＯＫＲ、および陰性対照のための２試料）を、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで２回洗浄する。
・アプタマー選択ライブラリーＤＮＡ（選択の第１のラウンドでは、１５ｎｍｏｌのＤＮＡを各選択のために使用する；引き続く選択ラウンドでは、以前のラウンドから収集されたアプタマーライブラリーの９０％を使用する）を、９５℃で５分間、０℃で５分間および室温で５分間インキュベートする。
・ＤＮＡを、陰性対照Ｄｙｎａｂｅａｄｓに添加し、室温で３０分間、一定の回転でインキュベートする。
・陰性選択Ｄｙｎａｂｅａｄｓ由来の上清を、ＯＴ結合ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＴ−ＧＫＲ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓのいずれかに移す  −  試料を、室温で３０分間、一定の回転でインキュベートする。
・上清をＤｙｎａｂｅａｄｓから除去し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回およびＰＢＳで１回洗浄する。
・アプタマーライブラリーＤＮＡが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＣＲ増幅および分析の準備ができるまで、−２０℃で貯蔵する。
・ＰＣＲ分析後、各試料のおよそ２０％を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器でのＮＧＳ  ＤＮＡ配列決定に送り、残りの画分を、次のラウンドのアプタマー選択に使用される一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成するために使用した。
・ｓｓＤＮＡを、非対称ＰＣＲと、その後のＤＮＡの逆相補鎖のラムダエキソヌクレアーゼ消化とを使用して生成する。
【０１０７】
ハイスループットＤＮＡ配列決定
アプタマー選択後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合したオリゴヌクレオチドを、オリゴの５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｄａｐｔｅｒ配列を付加するプライマー、およびオリゴの３’末端に対する６塩基バーコードを含有するＴｒｕＳｅｑ  Ｉｎｄｅｘｅｄプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅する。表１．３は、ＮＧＳ分析のために生成される４つの試料を示す。下線付きの配列は、プールされた試料をＤＮＡ配列決定手順で識別するために必要とされる６塩基バーコードを示す。
【０１０８】
【表１．３】
2018512598.tif 000003
【０１０９】
ＰＣＲ増幅後、試料を配列決定する。およそ等モル量の４つの試料をプールし、一晩の分析で２０，０００，０００のＤＮＡ鎖を配列決定することが可能なＭｉＳｅｑシーケンサーの単一のレーンで実行する。機器を、最大５０ｂｐ長の配列を読み取るように設定して、全ての配列決定反応においてランダム配列がその全体で決定されるようにする。各試料と関連する配列を、配列決定反応の前にＰＣＲによってアプタマーに付加された６塩基バーコードによって識別する。
バイオインフォマティクス
【０１１０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑハイスループットＤＮＡシーケンサーによって生成された配列データを分析するために、アプタマー分析のための分析ツールを、Ｌａｔｕｌｉｐｐｅら４に記載される方法を適応させることによって開発した。
【０１１１】
最初に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＤＮＡシーケンサーからのデータを、ＤＮＡバーコードによって選別し、ホモポリマーの長いストレッチを含む配列などのアーチファクト配列を除去するために数学的にフィルタリングする。次いで、単一の試料由来の全ての配列を比較し、試料内の全ての正確な一致を計数し、配列が存在する回数によって選別する。各試料由来の最も一般的な５０００の配列を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ中にエクスポートする。特異的配列の存在の数を、各試料について、各試料（即ち、ＯＴ、ＯＴ−ＧＫＲまたは陰性対照）について生成される配列の総数に対して標準化する。ＯＴ選択由来の最も共通して存在する試料を、ＯＴ−ＧＫＲ選択および陰性対照選択由来の配列と比較し、ＯＴ選択に独自の配列を強調する。これらの配列を、潜在的ＯＴアプタマーとして標識する。同じ分析を使用してＯＴ−ＧＫＲ選択を分析して、潜在的ＯＴ−ＧＫＲアプタマーであるアプタマーを生成する。
【０１１２】
表１．４は、これらの分析からの結果を示す。上位３０の配列のうち、１つのオキシトシンアプタマー配列だけが、ＯＴライブラリーに独自であり、かつ上位５０００の陰性対照配列には存在しない（Ｒが後ろにあるオリゴ番号）。２つのさらなる配列が、ＯＴに独自であり、陰性対照配列において稀にのみ見出された（約５×１０６配列のうち５回よりも少ない）（Ｙが後ろにあるオリゴ番号）。上位３０のＯＴ−ＧＫＲ配列について、２つの独自の配列が見出され、ＯＴに独自であり陰性対照配列において稀にのみ見出された１つの配列が見出された。
【０１１３】
表１．４に示される結合に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドを合成し、ＯＴおよびＯＴ−ＧＫＲ結合について試験した：
オキシトシン
5’-ATGCAAATTAGCATAAGCAGCTTGCAGACCCATAATGTC-3’  (配列番号6)
5’-ATAGTGTTATTAATATCAAGTTGGGGGAGCACATTGTAG-3’  (配列番号7)
5’-CTTGTTTACGAATTAAATCGAAGTGGACTGCTGGCGGAA-3’  (配列番号8)
オキシトシン−ＧＫＲ
5’-TAAACGTGACGATGAGGGACATAAAAAGTAAAAATGTCT-3’  (配列番号9)
5’-ATGCAAATTAGCATAAGCAGCTTGCAGACCCATAATGTC-3’  (配列番号6)
5’-AGTTGCCATACAAAACAGGGTCGCCAGCAATATCGGTAT-3’  (配列番号11)
【０１１４】
【表１．４−１】
2018512598.tif 000004
【表１．４−２】
2018512598.tif 000005
【０１１５】
（実施例２）
（アプタマー修飾銀ナノ粒子（Ａｇ−ＮＰ）の合成およびそれを用いたオキシトシン検出）
Ａｇ  ＮＰの合成を、ＮＰを、グルコースおよびクエン酸塩の存在下での硫酸銀の還元を介して合成された、Ｌｅｏｎａ５によって記載される文献手順を使用して実施した。簡潔に述べると、合成方法は、硫酸の添加を介した硝酸銀の水溶液からの硫酸銀の沈殿を伴った。新たに沈殿した硫酸銀塩の５×１０−４Ｍ水溶液を調製し、１２．５ｍＬのこの溶液を、クエン酸塩の１％溶液（１ｍＬ）およびグルコースの１％溶液（５００μＬ）と混合した。溶液を、溶液の温度を１２０℃まで３０秒間かけて上昇させ、この温度で３０、６０または９０秒間維持した３つの加熱プログラムを使用して、マイクロ波消化システム（Ａｎｔｏｎ  Ｐａｒｒ  Ｍｕｌｔｉｗａｖｅ  ３０００）を使用して加熱した。次いで、ＮＰを、１５分間の遠心分離によって精製し、その後、上清を除去し、蒸留脱イオン水と交換してクエン酸塩濃度を低減させた。
【０１１６】
温度プログラムの各々が、文献５、６中で報告されたものと遜色がない分光学的特性を実証したＡｇ  ＮＰを生じた（図５、パネルＡおよびパネルＢ）。吸収最大は、文献５からの５６ｎｍ値と遜色がない６０ｎｍの値を有する半値全幅を伴って、４０１ｎｍにおいて見出された。プラズモン共鳴は、粒子サイズと密接に関連するので、ＮＰは、文献７との比較により、これらのデータに基づいて、２０〜２５ｎｍであると決定される。
【０１１７】
ＮＰの吸収スペクトルを、合成を最初に実施した３週間後に収集して、ＮＰの安定性を実証した。遠心分離前の高いクエン酸塩およびグルコース濃度を有する反応混合物中で貯蔵したＮＰの吸収スペクトル、ならびにＮＰを合成した当日にクエン酸塩濃度を低下させるために遠心分離したＮＰの吸収スペクトルを比較した（図５、パネルＡ）。互いとの、および合成の当日に収集したスペクトルとの吸収スペクトルの類似性は、マイクロ波ベースの合成方法が、オキシトシン検出のための強い方法の基礎として機能することが可能な安定なＡｇ  ＮＰを産生することを示している。
【０１１８】
次いで、これらのＡｇ  ＮＰがラマン増強を生じさせる能力を、モデルＳＥＲＳ活性化合物メルカプトフェノール（ＭＣＰ）を使用して実証した。以下の２つの重要な理由のために、ＭＣＰをこれらの研究において使用した：ＭＣＰは、ＳＥＲＳ基材としてのＮＰの有効性が決定されるのを可能にするシグネチャーラマンスペクトルを生じる、およびＭＣＰは、チオール化アプタマーによってＡｇ  ＮＰの表面を修飾するために使用されるものと類似したチオール連結を介してＡｇ  ＮＰと相互作用する。Ａｇ  ＮＰの存在下、および硝酸カリウムの１００μＭ溶液で収集したＭＣＰの２００μＭ溶液のスペクトルを、ＮＰの非存在下での同じ溶液のスペクトルと比較したところ、ＮＰの存在によって提供された５オーダーの大きさの増強が実証された（図２、パネルＢ）。
【０１１９】
Ａｇ  ＮＰの合成が、Ｌｅｏｎａ５によって記載される文献手順を使用して実施され成功を収めたたこと、および合成されたＡｇ  ＮＰがスペクトル強度において５オーダーの大きさの増加を生じさせる能力の実証は、研究のこの相を、チオール化ＤＮＡによるＡｇ  ＮＰおよびＡｕ  ＮＰの修飾に焦点を当てることにした。チオール化ＤＮＡを、典型的には、オリゴヌクレオチドでＮＰ表面を修飾することを見越したチオールまたはジチオール部分へのジスルフィド（disufide）の還元を必要とするジスルフィド部分を使用して合成する。還元を実施するために、３つの方法を適用した：第１は、塩基性条件下でのジチオスレイトール（ＤＴＴ）によるジスルフィドの還元８、酸性条件下でのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるジスルフィドの還元９、またはジスルフィド末端ＤＮＡをＮＰに単に曝露させてジスルフィドの還元を促進すること１０を含んだ。
【０１２０】
表面修飾の効力の調査を、モノチオール部分またはジチオール部分のいずれかが末端にあるオリゴヌクレオチドで修飾されたＤＮＡを使用して実施した。このアプローチの効力を、吸収分光法を使用してモニタリングした。ＮＰの表面修飾は一般に、チオール修飾ＤＮＡの存在下での１６〜２４時間にわたるＮＰのインキュベーションと、その後のＮＰ表面におけるＤＮＡ濃度の増加を促進するための塩のゆっくりとした添加とを伴う。２〜５日間のスパンにわたる、典型的には５０ｍＭ増分での、３００ｍＭの最終濃度までの塩のゆっくりとした添加は、ＤＮＡ骨格中のリン酸部分の電荷と拮抗して反発を低減させることによって、ＮＰ表面におけるＤＮＡの濃度を増加させることを意図している。塩条件は、ＤＮＡ修飾ＮＰ  ＳＥＲＳ基材を産生するために調整され得る。
【０１２１】
モノチオール末端オリゴヌクレオチドとジチオール末端オリゴヌクレオチドとの比較は、ジチオール末端オリゴヌクレオチドによる表面修飾における以下の２つのパラメーターの調査を伴った：ジスルフィド修飾剤を活性化するために使用される還元剤、ならびにＮＰ表面におけるＤＮＡの濃度を増加させるための塩の比率および濃度。表面修飾の効力を、表面プラズモン吸収の保持を測定することによってモニタリングした。Ａｇ  ＮＰ表面をライゲーションすることが可能なジチオール末端を産生するためにジスルフィド修飾ＤＮＡを還元する初期ステップを、ジチオスレイトール（dithiothretol）（ＤＴＴ）の存在下９、（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）の存在下８、およびＮＰ懸濁物へのジスルフィドの直接的曝露によって還元剤の非存在下１０で、実施した。
【０１２２】
図２、パネルＣに示すように、プラズモンは、ジチオール末端ＤＮＡ、および２５ｍＭのＮａＣｌの添加の両方への曝露後に安定である。濃度を５０ｍＭの塩まで増加させることで、より低いエネルギーへのプラズモン吸収の最初のシフトが生じる。塩濃度を合計で１００ｍＭにする塩のさらなる添加は、ＮＰ凝集を示す、プラズモンの迅速な喪失を生じる。
【０１２３】
これらのアプローチの各々を、並行して実施し、吸収分光法を使用してモニタリングした（図２、パネルＤ）。表面プラズモンの強度は、還元方法の各々により、ジチオール修飾ＤＮＡの付加が成功したことを示したが、ＮＰ表面におけるＤＮＡの濃度を増加させるために塩化ナトリウムを添加した場合には、有意差が認められた。還元剤の非存在下またはＴＣＥＰの存在下で修飾したＡｇ  ＮＰへの、２５ｍＭアリコートでの塩化ナトリウムの添加は、プラズモン吸収の強度を有意に減少させなかったが、ＤＴＴで還元したジチオール修飾ＤＮＡに曝露させたＮＰは、プラズモン吸収における有意な減少を生じた。種々のジスルフィド還元性条件の存在下で修飾したＮＰへの塩化ナトリウムの添加の際のプラズモン吸収強度における変化の比較（図２、パネルＥ）により、ＴＣＥＰを用いてまたは還元剤の非存在下で調製したＮＰが、Ａｇ  ＮＰプラズモンの最良の保持を生じることが確認される。
【０１２４】
ＮＰの表面修飾を、２つの方法で確認した：第１は、ジチオール末端ＤＮＡに曝露させていないＮＰを、ＤＮＡ修飾ＮＰと同じ塩化ナトリウム添加条件に曝露させた対照実験である。これは、２５ｍＭの塩化ナトリウムの添加の際に、プラズモン強度の有意な喪失を生じた（図２、パネルＥ）。表面修飾の第２の実証は、５’末端に存在する蛍光ＦＡＭマーカーの存在を利用した。Ｍｉｒｋｉｎおよび共同研究者らによって確立されたプロトコールに従って、ＤＮＡ修飾ＮＰをＤＴＴの０．１Ｍ溶液に曝露させることによって、ＦＡＭ修飾ＤＮＡをＡｇ  ＮＰの表面から除去した１１。上清からＡｇを分離するための試料の遠心分離後に、溶液の蛍光を、４８８ｎｍの光による照射の際に測定した（図２、パネルＦ）。得られた発光スペクトルは、ジチオール修飾ＤＮＡによるＮＰ表面の修飾の成功を実証している。発光スペクトルの相対強度は、表面修飾が還元剤の非存在下で最も有効であることを示唆しており、吸収研究において観察されたものを確認した。
【０１２５】
本明細書で開発した方法は、モノチオールまたはジチオール末端アプタマーオリゴヌクレオチドによるラマン活性Ａｇ  ＮＰの信頼性のある修飾を促進する。ジチオール末端オリゴは、モノチオール末端オリゴよりも安定なＮＰを産生し、表面修飾手順の全ての引き続く最適化において用いられ得る。ジチオール修飾ＤＮＡアプタマー代用品もまた、５’末端において蛍光マーカーＦＡＭで修飾した。ジスルフィド修飾剤は、ＮＰ表面においてＤＮＡをアンカリングするにあたりより有効であることが示されており１０、ＦＡＭ末端ＤＮＡは、蛍光実験を介してＮＰ表面におけるＤＮＡの存在を実証するために使用されている１１。これらの結果に基づき、還元剤の非存在下で、ＮＰ表面におけるＤＮＡの濃度を増加させるために５０ｍＭのＮａＣｌを添加して調製したＡｇ  ＮＰを、全ての引き続くラマン研究において使用した。
【０１２６】
（実施例３）
（使用者の使いやすさおよび増加した感度のための試料調製）
一般的な無機塩の添加を介して、「ホットスポット」を形成するようにＮＰを近接近させることは、この適用に十分に適している。塩の添加は、溶液中のＮＰの凝集を生じることが示唆されており、それにより生じたＮＰの接近は、ＮＰプラズモンの「共有」を生じ、個々のＳＥＲＳ活性ＮＰの存在下で観察されたものを超えて振動性スペクトルの増強を増加させる。
【０１２７】
ラマン散乱増強を生じさせるＮＰの効力に対する塩の影響を例示するために、２つの一般的な塩である硝酸カリウムおよび塩化ナトリウムの１００μＭ溶液を添加することの影響を調査した。図３、パネルＡに示すように、両方の塩の添加は、スペクトル強度の１オーダーの大きさの増加を生じ、硝酸カリウムは、塩化ナトリウムの導入の際に生じたものよりも６０％高いスペクトル強度を生じた。これらの結果は、この試みで確立された方法の基礎を形成した。
【０１２８】
ＤＮＡ修飾方法の開発の成功に基づいて、得られた材料のラマン照合を、６３２．８ｎｍおよび７８５ｎｍの入射波長を使用して照合したところ、５’末端において本発明者らの配列中に組み入れた蛍光ＦＡＭなどの別々の分子を示唆する別個の再現性のあるスペクトル特徴の存在が明らかになった。オリゴヌクレオチドの存在下で色素マーカーを示す特徴を観察する能力は、複数の色素について、Ｍｉｒｋｉｎおよび共同研究者らによって実証されており、これらの色素と関連する強い独特の特徴に基づく多重化のためにこれを使用している１２。
【０１２９】
第１の研究を実施して、スペクトル分析の直前に導入されたどの塩添加剤が最も大きいスペクトル特徴を提供するかを決定した。図３、パネルＢに示すように、ＫＮＯ３の添加は、おそらくは、スペクトル強度における相乗的増加をもたらす「ホットスポット」形成に起因して、より高い強度のラマン特徴を生じる。この観察と一致して、５’−ＦＡＭ末端ＤＮＡで修飾したＡｇ  ＮＰで観察されたスペクトル特徴は、ＫＮＯ３の存在下で最も強力であった。
【０１３０】
ＦＡＭによって実証された強いスペクトル特徴は、オキシトシン検出のための方法の開発のための機会を提供する。５’−ＦＡＭの鋭い強いスペクトル特徴は、メルカプトフェノール（ＭＣＰ）の強度と匹敵し、分析標的の代用品として使用され得るスペクトル特徴を提供する。ＦＡＭ修飾アプタマーとアプタマー標的との相互作用は、ＦＡＭ由来のスペクトル特徴の強度における変化を誘導する。
【０１３１】
ＦＡＭ由来のスペクトル特徴およびＭＣＰ由来のスペクトル特徴の両方が観察されるＡｇ  ＮＰ表面単層を産生するために、ＦＡＭ  ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰを、変動する濃度のＭＣＰに曝露させた。ＦＡＭ修飾および４ｍＭから４μＭの範囲のＭＣＰ濃度から構成されるＡｇ  ＮＰ表面における混合型単層を調査したところ、ＭＣＰスペクトル特徴およびＦＡＭスペクトル特徴の両方の存在が、４μＭの濃度のＭＣＰで最も効率的に観察された（図３、パネルＣ）。ＮＰ表面における混合型ＭＣＰ／ＦＡＭ  ＤＮＡ単層について、ＭＣＰおよびＦＡＭからの、実証された別個の容易に区別可能なスペクトル特徴が明らかになった（図３、パネルＤ）。７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における特徴は、ジチオール修飾ＤＮＡの５’末端において見出されるＦＡＭ色素に由来するが、６１３ｃｍ−１、１０１０ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１および１１７５ｃｍ−１における特徴は、ＭＣＰ単層からの寄与である。これら２つの別個の群の特徴の存在は、これらがレシオメトリックな定量化に使用され得ることを示しており、この定量化では、ＦＡＭ修飾ＤＮＡ由来の特徴が分析物の導入の際に変化するが、ＭＣＰ特徴は一定のままである。
【０１３２】
７８５ｎｍの入射光を使用したシステムのさらなる調査により、類似のセットのスペクトル特徴が明らかになった。この入射波長を使用する計測手段は、市販されており、比較的安価であり、分光法の訓練をほとんどしていない者による使用のために容易にアクセス可能であるので、これらの分光学的特徴をより低いエネルギーの入射光へと変換する能力は重要である。４ｍＭのＭＣＰおよびＦＡＭ修飾ＤＮＡから構成された表面単層を有するＡｇ  ＮＰの収集されたスペクトルは再び、混合型単層の２つの成分に容易に割り当てられ得るスペクトル特徴を実証した。ＦＡＭ修飾ＤＮＡは、３０５ｃｍ−１、７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における特徴に寄与したが、ＭＣＰは、３９３ｃｍ−１、６３６ｃｍ−１、１０１０ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１および１１７５ｃｍ−１における特徴に寄与した。これらのスペクトルは、６３３ｎｍでの照射下で観察された特徴と類似の特徴、ならびに７８５ｎｍスペクトルに特異的なさらなる特徴を明らかにしている（図３、パネルＥ）。
【０１３３】
スペクトル最適化プロセスの第２の態様として、ＭＣＨまたはＭＣＰのいずれかとカップリングされたラマン標識ＤＮＡから構成された混合型単層の影響、単層のシグナル強度、ならびに表面単層のさらなる修飾の影響を調査した。メルカプトヘキサノールの添加が、ラマン分光法を使用する色素修飾バソプレシン（vasopresin）のラマン強度を改善することが実証された、Ｌｉｎおよび共同研究者らの研究１３は、この適用のための分光学的方法におけるさらなる改善を明らかにする、種々の表面修飾および新たな基材の調査のための基礎として機能した。
【０１３４】
ラマンシグナル強度を増加させるための方法として調査した第１のアプローチは、１−メルカプトヘキサン−６−オール（ＭＣＨ）をＦＡＭ−ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰに添加することを伴った。この分子の表面単層への添加は、標的認識のためにアプタマーに依存する以前のラマンベースの検出スキーム１３において、増加したシグナル強度を生じさせた。
【０１３５】
３つの濃度のＭＣＨ：４００μＭ、４０μＭおよび４μＭをＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰに添加したところ、３つ全ての濃度において、７１４ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における２つのＦＡＭ由来のスペクトル特徴の強度における有意な増加が明らかになった。最も大きい増加は、最も低い濃度で観察され（図３、パネルＦ）、ＮＰ表面においてＤＮＡを置き換えるチオール化分子の以前の観察と一致している。この現象を利用して、Ａｇ  ＮＰ表面からＦＡＭ修飾ＤＮＡを置き換えて、ＮＰの表面修飾の成功を実証した（図２、パネルＦ）。
【０１３６】
色素修飾アプタマーの代用物であるＦＡＭ−ＤＮＡから構成された混合型表面単層を有するＡｇ  ＮＰのラマン強度に対するＭＣＨの影響を研究する一つの研究と並行した調査を、ＭＣＰを使用して実施し、オキシトシンがそれに対して定量化され得る内部標準を実行した。最適な表面層組成を識別するために、ＭＣＰおよびＦＡＭと関連する２つの最も大きいスペクトル特徴、それぞれ１０５０ｃｍ−１および１０８０ｃｍ−１の、ベースライン補正した強度を、ＦＡＭ−ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰに添加するＭＣＨおよびＭＣＰの濃度を変動させて比較した。
【０１３７】
４μＭから４００μＭまでの範囲の３つの濃度のＭＣＰ、および２つの濃度のＭＣＨ、４μＭおよび４０μＭを試験した。この比較により、ＭＣＰおよびＦＡＭ  ＤＮＡスペクトル特徴の両方の最も大きい増強が、中間の濃度のＭＣＰ、４０μＭの添加で観察されたことが明らかになった（図３、パネルＦ）。表面修飾のために利用可能なＭＣＰが少ないので、最も低い濃度のＭＣＰ（４μＭ）の添加があまり強くない１０８０ｃｍ−１特徴を生じることは直観で理解できるが、ＭＣＰの濃度における４００μＭまでの増加に伴う、スペクトル強度における減少もまた存在し、これは、ＮＰ表面におけるチオール化分子間の競合を示唆している。競合の影響は、ＦＡＭ由来のラマン強度においても反映される：４００μＭのＭＣＰの添加は、より低い強度を生じるが、４μＭのＭＣＰの添加は、１０５０ｃｍ−１特徴の強度における最小の変化を生じる。
【０１３８】
まとめると、これらの調査は、アプタマー修飾Ａｇ  ＮＰが行われて、オキシトシンレベルのＳＥＲＳベースの定量的決定を最適化するために必要なパラメーターの理解を提供する。第１は、ＦＡＭ−ＤＮＡ修飾Ａｇ  ＮＰの表面にチオール化分子を付加することの影響を調査することを含んだ。以下の２つの分子成分を試験した：内部標準分子であるＭＣＰ、およびＮＰ表面上の占有されていない空間を満たし、表面における分子の組織化を促進することが可能な分子であるＭＣＨ。この研究により、ＦＡＭ特徴およびＭＣＰ特徴のために最適なシグナル強度を提供するための、２つの分子成分の濃度間のバランスの必要性が明らかになった。
【０１３９】
（実施例４）
（アプタマー修飾ＮＰベースのオキシトシン検出の効力）
実施例３で確立した条件を使用して、標的およびウシ血清アルブミンを含有する緩衝溶液からの識別および定量のためのプロセスを調査する。オキシトシンの代用品としてのバソプレシンの濃度を、ｎＭからμＭにわたる濃度範囲の溶液にわたって調査して、検量線の作成、および提案されたアプローチの検出限界の決定の両方を行う。この方法を、９アミノ酸のオキシトシンペプチドを使用して開発し、１２アミノ酸のプロ−オキシトシンとの使用のために拡張させる。
【０１４０】
オキシトシン標的化アプタマーを試験するための調製において、ラマンベースのホルモン検出の初期調査を、Heら（Analytica  Chimica  Acta  ７５９巻（２０１３年）７４〜８０頁）で報告されたバソプレシン標的化アプタマーを使用して実施する。バソプレシンは、オキシトシンと同様９アミノ酸のホルモンであり、２アミノ酸がオキシトシンと異なるので、これはオキシトシンの優れた代用品である。バソプレシンアプタマーを、ＴＡＭＲＡ修飾ウラシルホスホルアミダイ（phorphoramidite）で修飾して、標的ホルモンへの曝露の際にアプタマーの構造における変化の識別を可能にした：ＴＡＭＲＡは、ＦＡＭのラマンスペクトル特徴と遜色がない強いラマンスペクトル特徴を有することが公知であり、バソプレシンに対する類似のラマンベースの検出方法において使用されている。ＴＡＭＲＡ修飾塩基を、バソプレシンへのアプタマー修飾ＮＰの曝露の際にＴＡＭＲＡシグナル強度における最も大きい差異を生じさせると仮説が立てられた、ＮＰ表面から最も遠い位置であるアプタマー上の２２位に挿入した。
【０１４１】
バソプレシンアプタマー修飾ＮＰの応答を、２つの方法で調査した。第１は、バソプレシンへのシステムの曝露の際に観察される変化の、オキシトシン、ならびに長さ、サイズおよび質量がバソプレシンと類似しているが配列は類似していないニューロペプチドであるサブスタンスＰにシステムを曝露させた場合に観察される変化との比較により、標的分子間を区別するアプタマーベースのアッセイの能力を確立した。第２の研究は、色素修飾アプタマー単独から、およびＭＣＰまたはＭＣＨを有するアプタマーから構成される単層を有するＮＰを使用して観察される応答の比較により表面修飾の影響を確立した。
【０１４２】
３つのタンパク質に対する応答の比較により、標的分子に対するバソプレシン−アプタマーベースのＳＥＲＳアッセイの選択性が明らかになる（図４、パネルＡ）。１ｎＭ〜１０μＭの範囲にわたるバソプレシン濃度へのアプタマー修飾ＮＰの曝露により、ラマンスペクトルにおける１３５５ｃｍ−１特徴の強度における線形の増加が明らかになった。これは、類似の濃度範囲のオキシトシンへの曝露に応答した応答が測定される場合には当てはまらず、選択された特徴の強度と分析物の濃度との間の相関はほとんど存在しなかった。サブスタンスＰへのシステムの曝露により、濃度と特徴強度との間のいくらかの相関が明らかになったが、この相関は、バソプレシンで観察されたものほど良好ではなかった。驚くべきことに、ラマンシグナルの強度がそれに対して定量され得る内部標準として意図されるＭＣＰの存在は、スペクトル特徴の強度を有意に増加させる（図４、パネルＢ）。この効果、つまり第２の化合物の単層への添加の際の増強は、ＭＣＨの添加の際に観察された。しかし、この設定におけるＭＣＨの添加は、スペクトル特徴の強度を増加させず、応答特性を弱め、ＶＰ濃度と特徴強度との間の相関は存在しなかった。
【０１４３】
アプタマー修飾ＮＰを使用した、構造的に類似のホルモン分子、例えば、オキシトシンとバソプレシンとの区別を超えて、本発明者らの試みは、ラマンベースの分析適用に共通する問題であるスペクトル特徴強度の再現性を改善することに焦点を当てた。特に、乾燥試料を用いた場合の再現性の問題は、それに対するアプタマーが開発された標的における異常に大きいシグナル増強を生じる「ホットスポット」、または２つのラマン活性ＮＰの接合部に分析物が存在する領域の存在と関連する場合が多い。
【０１４４】
実施例１〜４についての参考文献
(1)  Hoon,  S.  et  al.  BioTechniques  2011,  51,  413.
(2)  Stoltenburg,  R.  et  al.  J  Anal  Methods  Chem  2012,  2012,  14.
(3)  Schuetze,  T.  et  al.  PLoS  ONE  2011,  6,  e29604.
(4)  Latulippe,  D.  R.  et  al.  Anal.  Chem.  2013,  85,  3417.
(5)  Leona,  M.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2009,  106,  14757.
(6)  O’Donnell,  D.  et  al.  Submitt.  Publ.  2013.
(7)  Navarro,  J.  R.  G.  et  al.  Analyst  2013,  138,  583.
(8)  Liu,  J.  et  al.  Nat.  Protoc.  2006,  1,  246.
(9)  Thompson,  D.  G.  et  al.  Anal.  Chem.  2008,  80,  272805.
(10)  Dougan,  J.  A.  et  al.  Nucleic  Acids  Res.  2007,  35,  3668.
(11)  Hurst,  S.  J.  et  al.  Anal.  Chem.  2006,  78,  8313.
(12)  Cao,  Y.  C.  et  al.  Science  2002,  297,  1536.
(13)  Yang,  J.  et  al.  ACS  Nano  2013,  7,  5350.
【０１４５】
ＩＩ．ライム病を検出するための試薬および方法（実施例５〜８）
ライム病は、グラム陰性スピロヘータＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉなどの種々のマダニ媒介性病原体によって引き起こされ、Ｉｘｏｄｉｄマダニ種によって伝染される。これは、米国における主要な媒介生物媒介性の感染性疾患であり、毎年報告される症例の数において着実な上昇がある（ＣＤＣ  −  Ｃａｓｅｓ  ｂｙ  Ｓｔａｔｅ−Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｌｙｍｅ／ｓｔａｔｓ／ｃｈａｒｔｓｔａｂｌｅｓ／ｒｅｐｏｒｔｅｄｃａｓｅｓ＿ｓｔａｔｅｌｏｃａｌｉｔｙ．ｈｔｍｌ（２０１３年１１月１８日にアクセスした））。流行地における古典的なブルズアイ（bull's-eye）発疹（遊走性紅斑またはＥＭ発疹）のライム病の症状の提示は、診断試験なしで即時に処置されることを示すが、２０％もの多くのライム病の症例は、ＥＭ発疹の提示も認識もなしにあまり十分に診断されない二次的症状に進行する（Biesiada,  G.ら  Arch  Med  Sci  ２０１２年、８巻、９７８頁）。
【０１４６】
現在のＣＤＣ承認された診断試験は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とその後のイムノブロット（ＩＢ）分析とからなる、２段階のシステムである（Ellis,  D.  I.ら  Analyst  ２０１３年、１３８巻、３８７１頁；Wu,  X.ら  Analyst  ２０１３年、１３８巻、３００５頁）。試験の第２段階であるＩＢ分析は、費用と時間がかかり、技術的に困難である。２段階の血清学的ライム試験レジームにおける固有の欠点には、結果を解釈することの複雑さ、および感染後のタイミングへの抗体産生の依存が含まれる（DeBiasi,  R.  L.ら  Current  Infectious  Disease  Reports  ２０１４年、１６巻、４５０頁）。試験があまりに早く（感染の６〜８週間後）またはあまりに遅く（感染の４〜６ヶ月後）のいずれかに行われる場合、抗ライム抗体は、検出可能なレベルでは存在しない可能性がある。これは特に、発熱、関節痛および「脳の霧（brain  fog）」などの症状が非特異的であり、診断が困難であるライム病ついて問題である。臨床コミュニティは、プライマリケアの医師がそれを処方するのに気が進まないほどにこの試験が信頼性がないと感じており、多くは、疾患についての彼らの経験および患者との相互作用の方がより信頼性のある診断アプローチであると感じている。これは、顕著な臨床的欠点である：ライム病の正確な診断は、短い過程の単純な抗生物質によるその処置を可能にし、費用および未処置の症例と関連する苦しみを防止する。多数の血清学的ライム病試験が最近開発されており、米国において使用されているが、新たな試験は、不十分な抗原提示に起因して、類似のレベルの偽陽性および／またはさらなる偽陰性を示す（Wu,  X.ら  Analyst  ２０１３年、１３８巻、３００５頁）；確立されたＣＤＣ承認された２段階の試験フォーマットにとって代わるものは存在しない。
【０１４７】
低い感度が、ＣＤＣ承認された試験の問題となっており、試験において扱われてこなかったこの欠点が、現在のプロトコールを超える改善を促進した。アッセイシステムの低い感度が、マダニ媒介生物によって分泌される因子であるＢｏｒｒｅｌｉａスピロヘータまたは他の未知の因子の免疫抑制的性質に起因するかどうかにかかわらず、ヒトの血液または血清中のライム病原体Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよび他のマダニ媒介性病原体を検出するための高度に高感度のアッセイが、現在利用可能ではないが大いに必要とされるツールである、この疾患と闘うことにおける貴重なツールを、第一線の臨床医に提供することが明らかである。
【０１４８】
（実施例５）
（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ表面タンパク質ＯｓｐＡに対するアプタマー選択）
新規高親和性ライム特異的アプタマーを、特別に設計し製造したマイクロカラムを用いることによって生成した（図７、パネルＡ）。これらのカラムに、標的コンジュゲート化アガロースビーズ、またはブランクのアガロースビーズ（陰性選択のため）を充填した。カラムは、連続してまたは並行して実行され得、複数の標的に対するアプタマーの効率的な選択を同時に可能にする。図７、パネルＢに示す模式図は、ＲＮＡアプタマーの選択を例示するが、このシステムは、逆転写ステップおよび転写ステップを単に除去することによって、一本鎖ＤＮＡアプタマーの生成に容易に適応可能である。
【０１４９】
アプタマー開発プロセスは、不必要なＤＮＡの増幅ステップおよび精製ステップを排除する、二重サイクルＳＥＬＥＸを介したＲＮＡアプタマー単離（RNA  Aptamer  Isolation  via  Dual-cycles-SELEX）（ＲＡＰＩＤ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる簡素化されたアプタマー選択プロセスを利用した（Szeto,  K.ら、PLoS  ONE  ２０１３年、８巻、ｅ８２６６７）。ＲＡＰＩＤ−ＳＥＬＥＸは、１つのセットのカラムから溶出されたアプタマープールが、選択ラウンド間にＤＮＡ増幅を伴わずに第２のセットのカラムに添加されるのを可能にし、全ての奇数ラウンド後のＰＣＲ増幅を排除する（Szeto,  K.ら  PLoS  ONE  ２０１３年、８巻、ｅ８２６６７）。全ての他の増幅および精製ステップの排除は、アプタマー選択の各ラウンドの平均時間をおよそ５０％低減させ、選択プロセス全体に必要な時間を６７％〜７５％低減させる。
【０１５０】
ハイスループットの次世代ＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）を使用して、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙと協力して、マイクロカラムＳＥＬＥＸの各ラウンドから選択されたアプタマー配列を決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳ機器は、２×１０７〜２×１０８のＤＮＡ配列／実行を生成し、ＳＥＬＥＸプロセスによるＤＮＡ配列の富化の高度に正確な統計分析を促進することが可能であった。
【０１５１】
上記方法を使用して、ＯｓｐＡを結合し検出するＤＮＡアプタマーを選択した：配列番号６７〜７２。
【０１５２】
【表２】
2018512598.tif 000006
【０１５３】
蛍光異方性を使用して、ＯｓｐＡに対して生成されたアプタマーの感度を決定した。図８は、ＯｓｐＡタンパク質へのＯｓｐＡアプタマーの結合を実証する蛍光異方性実験の結果を示す。標的タンパク質濃度の増加に伴う異方性における顕著な増加により、このＯｓｐＡ  ＤＮＡアプタマーが、ＯｓｐＡタンパク質についてＫｄ＝２．２ｎＭを有することが明らかになった。
【０１５４】
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＯｓｐＣおよびＢｍｐＡに特異的なアプタマーを、同じ方法を使用して、生成し、配列決定し、特徴付ける。
【０１５５】
【表３】
2018512598.tif 000007
【０１５６】
蛍光異方性は、それらの標的に対するＤＮＡアプタマーの結合親和性を可能にするために、ＥＭＳＡおよびマイクロプレート捕捉アッセイで補完され得る。
【０１５７】
（実施例６）
（標的タンパク質へのＯｓｐＡ、ＯｓｐＣおよびＢｍｐＡアプタマー結合の特徴付け）
特異的Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質への個々のアプタマーの結合親和性を検出および定量するために必要な方法が開発される。種々の方法が、潜在的ＤＮＡアプタマーオリゴヌクレオチドへの標的結合を実証するために使用され得る。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）；蛍光異方性測定；ＤＮＡプルダウンアッセイ；マイクロプレート捕捉アッセイが、その標的に対するアプタマーの親和性を決定するために使用され得るが、本発明者らは、ＯｓｐＡに対して生成されたアプタマーの感度を決定するために、蛍光異方性を効率的に用いた（図８）。簡潔に述べると、蛍光標識された標的タンパク質、この場合には、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＣのいずれかを、漸増濃度の標的特異的アプタマーに対してアッセイした。アプタマー結合の際の蛍光タンパク質の回転速度における変化を、色素発光の分極率における変化を介して検出し、その標的に対するアプタマーの親和性を決定するための迅速かつ信頼性のある試験を提供した。標的タンパク質濃度の増加に伴う異方性における顕著な増加により、このＯｓｐＡアプタマーが、およそ２．２ｎＭのＫｄで結合することが明らかになった。
【０１５８】
蛍光標識タンパク質の異方性測定は、溶液中でのアプタマーの回転の速度における顕著な減少を生じる、アプタマー結合が複合体のサイズを顕著に増加させる場合に最も効率的である。蛍光異方性は、その標的に対するＯｓｐＡアプタマーのＫｄを決定するために効率的に用いられるが、これは、全てのアプタマー−標的相互作用について当てはまるわけではない。蛍光異方性が効率的と証明されない場合、それらの標的に対するＤＮＡアプタマーの結合親和性を可能にするためのＥＭＳＡおよびマイクロプレート捕捉アッセイが利用され得る。
【０１５９】
３つの標的タンパク質に対して最も高い親和性を有するアプタマーを識別するために、各Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質について最も一般的なアプタマー配列のうち最大で６つを、合成およびスクリーニングする。０．１ｎＭから１００ｎＭまでの範囲の濃度のライム特異的アプタマーをこれらの実験に使用する；１ｎＭ未満〜５ｎＭの結合親和性が、使用に適切であるとみなされる。それらの特異的標的に対して最も高い親和性を有する１または２つのアプタマーを、実施例７および８において使用する。
【０１６０】
（実施例７）
（ＳＥＲＳによるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の検出）
ナノ粒子を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ特異的ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣおよびＢｍｐＡタンパク質の捕捉および検出のために、実施例５で最適化したチオール化アプタマーで修飾した（ＡｐＮＰ）。Ａｇナノ粒子を、マイクロ波照射下でのクエン酸ナトリウムによる硝酸銀溶液の還元を伴う単純な確立された文献手順を使用して合成する（Leona,  M.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ２００９年、１０６巻、１４７５７頁）、またはＡｇナノ粒子は、商業的供給源（例えば、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ；Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ；またはＮａｎｏｐａｒｔｚ；Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ）から購入されるＡｕ  ＮＰである。
【０１６１】
アプタマーによる表面修飾は、標準的なチオール−金属相互作用を介して実施され、標的ＮＰサイズに適切なアプタマーの濃度を、等式１を使用して計算する（Taton,  T.  A.、Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry；John  Wiley  &  Sons  Inc.：New  York、２００２年）。
アプタマーの量＝Ａｎ×Ｃｎ×Ｄｏ×Ｖ      （１）
Ａｎ＝ＮＰ表面積（ｃｍ−２）；Ｃｎ＝粒子濃度（粒子Ｌ−１）；Ｄｏ＝アプタマー密度（ｍｏｌ  ｃｍ−２）；Ｖ＝反応容積（Ｌ）
【０１６２】
表面修飾の効率を決定するために、フルオロフォア修飾ライム特異的アプタマーを、Ｍｉｒｋｉｎおよび共同研究者らによって開発された蛍光定量的定量技術において用いる（Demers,  L.  M.ら  Anal  Chem  ２０００年、７２巻、５５３５頁）。
【０１６３】
実施例５で開発したアプタマーを、標的分子の代用品として機能したラマン活性色素で修飾する。これは、図９、パネルＡに模式的に示される（Baker,  B.  R.ら  J.  Am.  Chem.  Soc.  ２００６年、１２８巻、３１３８頁に由来する図）。この原理を実証するために、バソプレシンを標的にするために開発されたアプタマーを、強いラマンシグナルを有することが公知の分子であるＴＡＭＲＡで修飾した（図１０）（Cao,  Y.C.ら  Science  ２００２年、２９７巻、１５３６頁）。ラマンシグナルの強度は、バソプレシンの濃度に呼応して増加し、標的分子の代用品として使用されるラマン活性色素の原理を実証した。このＴＡＭＲＡ修飾アプタマーの、類似のポリペプチド（即ち、サブスタンスＰおよびオキシトシン；データ示さず）への曝露は、ラマンシグナル強度における有意な増加を生じず、アプタマーベースのＳＥＲＳ検出アプローチが、その標的を検出することおよび顕著な構造的類似性を有する分子からその標的を区別することの両方が可能であることを実証している。
【０１６４】
図９、パネルＢは、認識要素としての色素修飾アプタマーの原理を実証するが、配列における色素の配置、および色素の実体は、ライム病関連タンパク質に対する最適な感度を提供し得る。実施例５において開発した各アプタマーを、末端位置において、および複数の内部位置において、ラマン活性マーカーで修飾する。これらの色素を、高いシグナル強度（例えば、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５およびＴＡＭＲＡ）、およびそれらの容易な識別を可能にした別個のスペクトル特徴について選択する（図１０）（Cao,  Y.  C.ら  J.  Am.  Chem.  Soc.  ２００２年、１２５巻、１４６７６頁）。ラマン活性色素を、市販の試薬を使用して、オリゴヌクレオチド合成の間にアプタマーＤＮＡ配列中に組み入れる。
【０１６５】
ラマン調査を、研究グレードの計測手段を使用して開始して、分光学的方法を最適化する。次いで、これらの方法を、携帯型の市販のベンチトップまたはハンドヘルドのラマン分光計において頻繁に使用される波長である７８５ｎｍの入射光を使用する携帯型の市販の分光計を使用して再試験する。
【０１６６】
アプタマー修飾ＮＰの各々を、それに対するアプタマー修飾ＮＰが設計されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ特異的タンパク質のうちの１つを含有する溶液に曝露させて、アプタマーに標的を捕捉させる。このプロセスを、それに対するアプタマーが開発されていないＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の存在下で各々のＡｐＮＰを用いて反復して、それらの標的分子に対するＡｐＮＰの特異性を実証する。標的捕捉のためのインキュベーション条件を最適化するために、以下の３つの変数を調査する：ＮＰ表面におけるアプタマー濃度、ラマンスペクトル特徴を安定化および最適化するために意図される添加剤の濃度および組成、ならびにＡｐＮＰと標的代謝物とのインキュベーション時間。ＮＰ表面におけるアプタマー濃度とインキュベーション時間との最適な組合せを調査して、分析物の各々についての検出限界を決定する。これらの調査において確立された検出限界を、確立された標準的な生物学的アッセイ、例えば、市販のライムイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）の感度と比較して、引き続く調査がそれに対して比較され得る値を提供する。
【０１６７】
他の表面修飾が実施され得る。例えば、表面修飾は、アプタマーによってカバーされないナノ粒子表面の一部をコーティングするためにＰＥＧを含み得る。代替的に、表面修飾は、アルキルチオールを含み得る。
【０１６８】
（実施例８）
（ヒトライム病血清パネルにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の迅速な検出）
ヒトライム病血清パネルにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の迅速な検出を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＣｅｎｔｅｒおよびＷｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅのＪｏｉｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｏｆｆｉｃｅと協力して実施する。ヒト血清パネルを、以下の２つの別々の供給源から得る：種々の感染性疾患状態および他の疾患状態についてのヒト血清パネルを提供する会社であるＳｅｒａＣａｒｅからの市販のライム病血清パネル（ｗｗｗ．ｓｅｒａｃａｒｅ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｐａｎｅｌｓ）；およびＵＳ  ＣＤＣから入手可能なライム病血清パネル（Ｍｏｌｉｎｓ、２０１４  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０１４０９−１４）。これらのパネルは、未感染の個体由来の血清および疾患の種々の段階にあるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染した個体由来の血清を含む。これらのパネルは、前臨床試験に理想的である。
【０１６９】
これらの研究のために、陰性対照またはライム陽性試料のいずれかである５〜１０μＬのヒト血清を、緩衝液中に希釈し、実施例６に記載したようにＡｐＮＰと混合する。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ標的タンパク質へのＡｐＮＰの結合後、試料を半分に分ける；１つのアリコートを、ベンチトップラマン分光計においてＳＥＲＳのために分析し、第２のアリコートを、市販のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉイムノアッセイを使用した分析のためにとっておく。上で参照したパネルは、未感染個体由来の血清を含み、陰性対照として使用される。これらの研究では、以下を含むいくつかの変数を直接研究する：最適な結合に必要な時間；最適なシグナルに必要なＡｐＮＰの濃度；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の検出に必要なヒト血清の最小量；ならびにＯｓｐＡ、ＯｓｐＣおよびＢｍｐＡアッセイの相対感度。ＳＥＲＳベースのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉアッセイの感度および特異性を決定する。種々の統計分析を使用して、ヒトにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ検出を最適化するために必要な最良の診断モデルおよびカットオフを決定する。
【０１７０】
（感染Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓマダニからのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉタンパク質の迅速な検出）
実施例５、６および７において開発したアッセイを使用して、感染Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓマダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの検出を実証する。２つの別々の供給源から得たマダニを使用する。対照の非感染Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓマダニ若虫を、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｉｃｋ  Ｒｅａｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入する。Ｔｉｃｋ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｆａｃｉｌｉｔｙは、研究適用のために種々の生活環段階にある未感染の実験室生まれのマダニを提供する、個別支払いの施設である。
【０１７１】
野生のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染マダニを、Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓと協力して収集する。それらの生息地におけるＩ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓの生存に対する環境条件の影響を研究する。マダニを以下のように収集する：Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ若虫を、それらの季節的な活動のピークの間の５月と７月との間に、フィールドから収集する（Falco,  R.  C.ら  Am.  J.  Epidemiol.  １９９９年、１４９巻、７７１頁）。十分に確立された引き摺り試料採取（drag  sampling）法を使用してそれらを収集する：１平方メートルの面積を有する白い布を、植林領域中の植生および落葉落枝の上を引き摺る（Schulze,  T.  L.ら  J.  Med.  Entomol.  １９９７年、３４巻、６１５頁）。この布は、Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓが付着する動物の毛の線維を模倣する。若虫を、さらなる分析に使用できるようになるまで、Ｃａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて−８０℃で貯蔵する。Ｃａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究は、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＨｕｄｓｏｎ  Ｒｉｖｅｒ  Ｖａｌｌｅｙにおいて収集されたＩ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ若虫の５５％もが、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染していることを示している（Aliota,  M.  T.ら  Vector  Borne  Zoonotic  Dis.  Larchmt.  N  ２０１４年、１４巻、２４５頁）。
【０１７２】
実験室育ちかまたは収集されたかのいずれかの、５匹と１０匹との間のマダニ若虫を、それらを微量遠心管中に配置することによって溶解させ、緩衝化溶解溶液中で使い捨てのホモジナイザーを用いてホモジナイズする。マダニが破壊されたところで、ホモジネートのアリコートを短時間遠心分離してデブリを除去し、抽出物を、実施例７に記載したようにＡｐＮＰと混合する。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ標的タンパク質へのＡｐＮＰの結合後、試料を半分に分ける；１つのアリコートを、ベンチトップラマン分光計においてＳＥＲＳのために分析し、第２のアリコートを、市販のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉイムノアッセイを使用した分析のためにとっておく。Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｉｃｋ  Ｒｅａｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た実験室生まれのマダニ若虫は、陰性対照として機能する。
【０１７３】
以下を含むいくつかの変数を直接研究する：最適な結合に必要な時間；最適なシグナルに必要なＡｐＮＰの濃度；Ｏｓｐタンパク質の検出に必要な感染若虫の最小数；ならびにＯｓｐＡ、ＯｓｐＢおよびＯｓｐＣアッセイの相対感度。ＳＥＲＳベースのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉアッセイの感度および特異性を決定する。
【０１７４】
（参照による組み込み）
本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許出願、特許および刊行された特許出願、ならびに図面および配列表の内容は、各個々の刊行物または特許が具体的かつ個々に参照によって組み込まれたかのように、本明細書でそれらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が支配し得る。
【０１７５】
（均等物）
形態および細部における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲から逸脱することなしにそれらにおいてなされ得ることが、当業者に理解される。当業者は、本明細書に記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識し、または慣用的に過ぎない実験を使用してかかる均等物を確認することができる。本発明の具体的実施形態が議論されてきたが、上記明細書は、例示的であって限定的ではない。本発明の多くのバリエーションは、本明細書を検討すれば、当業者に明らかとなり得る。本発明の全範囲は、それらの全範囲の均等物と共に特許請求の範囲を参照して、およびかかるバリエーションと共に明細書を参照して、決定されるべきである。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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