(57)【要約】  本発明は、キメラ又はヒト化抗CD303抗体、これらの抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸、発現ベクター、前記抗体を発現する宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物、加えて、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)、並びに形質細胞様樹状細胞が関与する炎症性疾患、詳細には自己免疫疾患の処置又は予防におけるそれらの使用に関する。
2018511328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCD303抗原の細胞外ドメイン(配列番号130)に対するモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)ヒトCD303抗原への結合に関して、
i)重鎖可変領域が配列番号43を含み、軽鎖可変領域が配列番号48を含む抗体、
ii)重鎖可変領域が配列番号44を含み、軽鎖可変領域が配列番号49を含む抗体、
iii)重鎖可変領域が配列番号45を含み、軽鎖可変領域が配列番号50を含む抗体、
iv)重鎖可変領域が配列番号46を含み、軽鎖可変領域が配列番号51を含む抗体、
v)重鎖可変領域が配列番号47を含み、軽鎖可変領域が配列番号52を含む抗体
から選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、
b)軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体。
【請求項２】
ヒトCD303抗原の細胞外ドメイン(配列番号130)に対するモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)CHO細胞で産生されたヒトCD303抗原の細胞外ドメインに対する抗体と比較して、Fcγ受容体IIIa(FcγRIIIa、CD16a)への改善された親和性を有すること、及び
b)軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体。
【請求項３】
その重鎖が、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-H(IMGT命名法による重鎖CDR)を含むこと、及びその軽鎖が、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-L(IMGT命名法による軽鎖CDR)を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体:
i)CDR1-H-ファミリー1:配列番号1、CDR2-H-ファミリー1:配列番号2、CDR3-H-ファミリー1:配列番号3、CDR1-L-ファミリー1:配列番号4、CDR2-L-ファミリー1:配列番号5、CDR3-L-ファミリー1:配列番号6、又は
ii)CDR1-H-ファミリー2:配列番号7、CDR2-H-ファミリー2:配列番号8、CDR3-H-ファミリー2:配列番号9、CDR1-L-ファミリー2:配列番号10、CDR2-L-ファミリー2:配列番号11、CDR3-L-ファミリー2:配列番号12。
【請求項４】
その重鎖が、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-H(IMGT命名法による重鎖CDR)を含むこと、及びその軽鎖が、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-L(IMGT命名法による軽鎖CDR)を含むことを特徴とする、請求項3に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体:
i)CDR1-H-122A2:配列番号13、CDR2-H-122A2:配列番号14、CDR3-H-122A2:配列番号15、CDR1-L-122A2:配列番号16、CDR2-L-122A2:配列番号17、CDR3-L-122A2:配列番号18、
ii)CDR1-H-102E9:配列番号19、CDR2-H-102E9:配列番号20、CDR3-H-102E9:配列番号21、CDR1-L-102E9:配列番号22、CDR2-L-102E9:配列番号23、CDR3-L-102E9:配列番号24、
iii)CDR1-H-104C12:配列番号25、CDR2-H-104C12:配列番号26、CDR3-H-104C12:配列番号27、CDR1-L-104C12:配列番号28、CDR2-L-104C12:配列番号29、CDR3-L-104C12:配列番号30、
iv)CDR1-H-114D11:配列番号31、CDR2-H-114D11:配列番号32、CDR3-H-114D11:配列番号33、CDR1-L-114D11:配列番号34、CDR2-L-114D11:配列番号35、CDR3-L-114D11:配列番号36、又は
v)CDR1-H-104E10:配列番号37、CDR2-H-104E10:配列番号38、CDR3-H-104E10:配列番号39、CDR1-L-104E10:配列番号40、CDR2-L-104E10:配列番号41、CDR3-L-104E10:配列番号42。
【請求項５】
その重鎖が、配列番号43から47、131から133、及び138から140から選択される配列、又は配列番号43から47、131から133、及び138から140の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項６】
その軽鎖が、配列番号48から52、134から137、及び141から143から選択される配列、又は配列番号48から52、134から137、及び141から143の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項７】
キメラ抗体、有利には重鎖及び軽鎖定常領域がヒト起源であるキメラ抗体に関連することを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含む重鎖及び軽鎖を有することを特徴とする、請求項7に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体:
i)抗体122A2:重鎖:配列番号55、軽鎖:配列番号60、
ii)抗体102E9:重鎖:配列番号56、軽鎖:配列番号61、
iii)抗体104C12:重鎖:配列番号57、軽鎖:配列番号62、
iv)抗体114D11:重鎖:配列番号58、軽鎖:配列番号63、又は
v)抗体104E10:重鎖:配列番号59、軽鎖:配列番号64。
【請求項９】
ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１０】
その重鎖が、配列番号131から133及び138から140から選択される配列又は配列番号131から133の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むこと、有利には、その重鎖が配列番号131、配列番号132及び配列番号139から選択される配列、又は配列番号131、配列番号132及び配列番号139の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むことを特徴とする、請求項9に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１１】
その軽鎖が、配列番号134から137及び141から143から選択される配列、又は配列番号134から137及び141から143の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むこと、有利にはその軽鎖が、配列番号134、配列番号135、及び配列番号142から選択される配列、又は配列番号134、配列番号135、及び配列番号142の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含むことを特徴とする、請求項9又は10に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１２】
可変領域が以下のアミノ酸配列又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する重鎖及び軽鎖を有することを特徴とする、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体:
i)抗体122A2H5:重鎖:配列番号131、軽鎖:配列番号134、
ii)抗体122A2H6:重鎖:配列番号132、軽鎖:配列番号134、
iii)抗体122A2H7:重鎖:配列番号133、軽鎖:配列番号134、
iv)抗体122A2H9:重鎖:配列番号131、軽鎖:配列番号135、
v)抗体122A2H10:重鎖:配列番号132、軽鎖:配列番号135、
vi)抗体122A2H14:重鎖:配列番号132、軽鎖:配列番号136、
vii)抗体102E9H6:重鎖:配列番号139、軽鎖:配列番号141、
viii)抗体102E9H7:重鎖:配列番号140、軽鎖:配列番号141、
ix)抗体102E9H9:重鎖:配列番号138、軽鎖:配列番号142、
x)抗体102E9H10:重鎖:配列番号139、軽鎖:配列番号142。
【請求項１３】
以下のアミノ酸配列又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含む重鎖及び軽鎖を有することを特徴とする、請求項12に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体:
i)抗体122A2H5:重鎖:配列番号150、軽鎖:配列番号153、
ii)抗体122A2H6:重鎖:配列番号151、軽鎖:配列番号153、
iii)抗体122A2H7:重鎖:配列番号152、軽鎖:配列番号153、
iv)抗体122A2H9:重鎖:配列番号150、軽鎖:配列番号154、
v)抗体122A2H10:重鎖:配列番号151、軽鎖:配列番号154、
vi)抗体122A2H14:重鎖:配列番号151、軽鎖:配列番号155、
vii)抗体102E9H6:重鎖:配列番号158、軽鎖:配列番号160、
viii)抗体102E9H7:重鎖:配列番号159、軽鎖:配列番号160、
ix)抗体102E9H9:重鎖:配列番号157、軽鎖:配列番号161、
x)抗体102E9H10:重鎖:配列番号158、軽鎖:配列番号161。
【請求項１４】
アイソタイプIgG、詳細にはIgG1であることを特徴とする、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１５】
その重鎖及び/又はその軽鎖が、配列番号65の異種シグナルペプチドを更に含むことを特徴とする、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１６】
SP2/0;YB2/0;IR983F;ヒト骨髄腫Namalwa;PERC6;CHO細胞株、とりわけCHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-、又はFUT8遺伝子及び/又はGMD遺伝子をコードする両方の対立遺伝子が欠失したCHO細胞株;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt-4;COS-7;293-HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0-Ag14、P3X63Ag8.653、アヒル胚細胞株EB66(登録商標)(Valneva社);ラット肝癌細胞株H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)、NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)から選択される細胞株中で産生されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１７】
65%以下のフコース含量を有することを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１８】
30%以上のオリゴマンノース型N-グリカン含量を有することを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項１９】
50%以上のガラクトース含量を有することを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項２０】
Fcフラグメントが、以下:
・N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y、
・P230S/N315D/M428L/N434Y、
・E294del/T307P/N434Y、
・T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y、
・V259I/N315D/N434Y、又は
・T256N/A378V/S383N/N434Y
の変異又は変異の組合せをそれらのFcフラグメント中に有することを特徴とし、Fcフラグメントにおけるアミノ酸の番号付けが、KabatのEUインデックスの番号付けである、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
Fcフラグメントの293位(Del293)又は294位(Del294)にアミノ酸の欠失を有することを特徴とし、Fcフラグメント中のアミノ酸の番号付けが、KabatのEUインデックスの番号付けである、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
フラグメントFv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc又はダイアボディから選択されることを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の機能的な抗体フラグメント。
【請求項２３】
請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸。
【請求項２４】
配列番号86から95、及び181から193の少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項23に記載の核酸。
【請求項２５】
請求項23又は請求項24に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６】
請求項23若しくは請求項24に記載の少なくとも1つの核酸又は請求項25に記載のベクターを含む、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物。
【請求項２７】
以下の細胞株:SP2/0;YB2/0;IR983F;ヒト骨髄腫Namalwa;PERC6;CHO細胞株、とりわけCHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-、又はFUT8遺伝子及び/又はGMD遺伝子をコードする両方の対立遺伝子が欠失したCHO細胞株;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt-4;COS-7;293-HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0-Ag14、P3X63Ag8.653、アヒル胚細胞株EB66(登録商標)(Valneva社);ラット肝癌細胞株H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)、NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)から選択される、請求項26に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
医薬品として使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項２９】
CD303抗原を発現する造血器腫瘍、とりわけ芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍の処置又は予防で使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【請求項３０】
炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患の処置又は予防で使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質細胞様樹状細胞(pDC)が関与する、CD4+CD56+表現型の造血器腫瘍、又は炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患を処置又は予防するための治療抗体の分野に存する。本発明は、CD303抗原に対して作製された5つのモノクローナル抗体、並びにそれらの機能的なフラグメント及び誘導体、前記抗体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸、発現ベクター、前記抗体を発現する宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物、並びに前記抗体の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞(本明細書を通して「DC」と称される)は、免疫系の抗原提示細胞(APC)である。特定の条件下で、DCは、ニューロンの樹状突起に類似した細胞質の突起を有する。
【０００３】
樹状細胞は、2つの主要な機能:
・樹状細胞は、「非自己」(外来の)抗原をTリンパ球に提示することによって、これらの外来抗原に対して作製された適応免疫応答を誘発する機能、及び
・樹状細胞は、いわゆる「負の選択」プロセスにより胸腺中のT細胞を教育することによって、「自己」に対する中枢性寛容を維持する機能
を有する。
【０００４】
DCは、それらが受ける刺激に従って様々な部分集団に分化することが可能である。DCには、3つの主要なタイプ:従来型DC、形質細胞様DC(「pDC」と称される)及び炎症性DCがある。
【０００５】
従来型DCは、リンパ系器官又は末梢中で自己又は非自己抗原を提示する。炎症性DCは、血中単球に由来する可能性があり、炎症又は感染後の刺激の場合にのみ出現する。
【０００６】
形質細胞様DC(pDC)は、循環しており、丸く、基底状態では樹状突起を有さないが、活性化の後、一般的にウイルス抗原によって樹状突起を獲得する。刺激後、それらは大量のI型インターフェロン(IFN)を産生し、主として抗ウイルス応答又は自己免疫疾患に関与する。表現型では、それらは、とりわけ以下のマーカー:CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+を特徴とする。
【０００７】
pDCは、それが追加のマーカー(CD56)を獲得する造血器腫瘍の原因であり得る。これは、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)と称される。これらの腫瘍はまた、CD4+CD56+造血器腫瘍とも称される。これらの造血器腫瘍はまれであり(急性白血病の1%)、リンパ節症又は脾臓の腫脹及び頻発する血球減少症に関連する皮膚結節として出現する。皮膚の症状発現は非常に迅速であり、それに続いて骨髄の浸潤が起こる。これらの腫瘍の起源における造血細胞はpDCであることが現在認められている。
【０００８】
これらの芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍のための現行の処置は、化学療法に基づく。この処置は、最初は比較的有効であるが、頻発な早期の再発(約9ヶ月)を特徴とし、全生存期間の中央値は、わずか約13ヶ月である。別の処置は、造血細胞の同種移植に基づくが、これも長期の生存を可能にしない。
【０００９】
WO2012/080642において、抗BDCA-2(すなわち、抗CD303)抗体を使用して、腫瘍細胞の枯渇によってこれらの新生物を処置することが提唱されている。
【００１０】
pDCはまた、詳細にはそれらのI型IFN分泌を介して、特定の炎症性疾患、とりわけ特定の自己免疫疾患にも関与する。
【００１１】
処置の1つは、抗IFNα抗体の使用に基づく。しかしながら、この処置は全身性のIFNα中和を引き起こすことから、日和見感染のリスクを増加させる可能性がある。したがって、局所炎症に関与するpDCを除去することによって自己免疫疾患処置するために、抗BDCA-2(抗CD303)抗体(詳細には抗体AC144)を使用することも、WO01/365487及びWO2012/080642で提唱されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO01/365487
【特許文献２】WO2012/080642
【特許文献３】WO2014/09339
【特許文献４】WO00/42072
【特許文献５】WO2004/029207
【特許文献６】WO2004/063351
【特許文献７】WO2004/074455
【特許文献８】WO02/060919
【特許文献９】WO2010/045193
【特許文献１０】WO2010/106180
【特許文献１１】WO99/51642
【特許文献１２】WO2012/175751
【特許文献１３】WO2011/114063
【特許文献１４】WO2007/048077
【特許文献１５】EP1176195A1
【特許文献１６】WO01/77181
【特許文献１７】WO2012/041768
【特許文献１８】WO2008/028686
【特許文献１９】WO2013/061010
【特許文献２０】WO2013/117871
【特許文献２１】WO00/26357
【特許文献２２】WO90/04036
【特許文献２３】WO95/17085
【特許文献２４】WO01/26455
【特許文献２５】WO2004/050847
【特許文献２６】WO2005/033281
【特許文献２７】WO2007/106078
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/
【非特許文献２】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)
【非特許文献３】Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)
【非特許文献４】Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)
【非特許文献５】http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi
【非特許文献６】Int J Hematol.2005年2月;81(2):148〜54
【非特許文献７】IMGT.org
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、これらの処置を有効にするために、ヒトにおいて、最も効率的なできる限りのpDC除去を可能にする好適なモノクローナル抗体を有することが必要である。この目的を達成するために、CD303抗原に対する高親和性及びエフェクター性能(ADCC、CDC、貪食、Fc受容体、詳細にはFcγ受容体III(FcγRIII、CD16とも称される)によるCD303の交差を介したシグナル伝達、及び/又はアポトーシス)を有し、生理学的条件においてpDCを除去することを可能にする、キメラ又はヒト化抗体が必要である。これまでに利用可能な抗CD303抗体が不十分であることから、所望の特性を有する新しい抗CD303抗体への必要性がある。
【００１５】
WO2014/09339は、重鎖及び軽鎖の配列によって定義されるヒト化抗CD303抗体、とりわけCD303抗原に最良の親和性を有する抗体である抗体BIIB059を記載している。抗体BIIB059は、CHO細胞で産生され、特定の特性に関して特徴付けられた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の状況において、本発明者らは、このような特性を有する5つのキメラモノクローナル抗体を生成した。これらのキメラ抗体の少なくとも2つ(122A2及び102E9)が、WO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)の能力より大きいヒトCD303抗原の細胞外ドメインに結合する能力を有する(詳細には122A2)。更に、これらの2つのキメラ抗体に由来するヒト化抗体を生成し、特徴付けた。これらのヒト化抗体は、元のキメラ抗体より高い生産性で産生することができ、更に、キメラ抗体122A2に由来するもののなかでも、特定のものが、元のキメラ抗体の能力より更に高い、したがってWO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)の能力より高いヒトCD303抗原の細胞外ドメインに結合する能力を有する。またYB2/0細胞で産生されたキメラ及びヒト化抗体もFcγRIIIa(CD16a)に対する高親和性を有し、低い抗原密度でも強いADCC応答を誘導することが可能である。また上記抗体はCDC活性も有し、IFN-α及びTNF-αの分泌を阻害することが可能である。
【００１７】
第1の態様において、本発明は、したがって、ヒトCD303抗原(配列番号130)の細胞外ドメインに対して作製されたモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)ヒトCD303抗原への結合に関して、
i)重鎖可変領域が配列番号43を含み、軽鎖可変領域が配列番号48を含む抗体、
ii)重鎖可変領域が配列番号44を含み、軽鎖可変領域が配列番号49を含む抗体、
iii)重鎖可変領域が配列番号45を含み、軽鎖可変領域が配列番号50を含む抗体、
iv)重鎖可変領域が配列番号46を含み、軽鎖可変領域が配列番号51を含む抗体、
v)重鎖可変領域が配列番号47を含み、軽鎖可変領域が配列番号52を含む抗体
から選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、
軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体に関する。
【００１８】
また本発明は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の細胞外ドメインに対して作製されたモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)CHO細胞で産生されたヒトCD303抗原の細胞外ドメインに対して作製された抗体と比較して、FcγRIIIa(CD16a)への改善された親和性を有すること、及び
b)軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体にも関する。
【００１９】
また本発明は、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸にも関する。
【００２０】
また本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターにも関する。
【００２１】
また本発明は、本発明に係る少なくとも1つの核酸又は本発明に係るベクターを含む、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物にも関する。
【００２２】
また本発明は、医薬品として使用するための、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体にも関する。
【００２３】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、CD303抗原を発現する造血器腫瘍の処置若しくは予防、又は炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患の処置若しくは予防で使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】キメラ抗体122A2のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１Ｂ】キメラ抗体102E9のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１Ｃ】キメラ抗体104C12のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１Ｄ】キメラ抗体114D11のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１Ｅ】キメラ抗体104E10のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１Ｆ】抗体BIIB059発現ベクターのマップを示す図である。
【図２Ａ】本発明に係る抗体の抗原結合を示す図である。異なる抗体濃度(対数単位で提示される)で本発明に係る抗体により標識されたFcγ鎖-CD303 Jurkat細胞(CD303分子約25,000〜35,000個/細胞を発現する)の平均蛍光強度(MFI)。
【図２Ｂ】本発明に係る抗体の抗原結合を示す図である。異なる抗体濃度(対数単位で提示される)で本発明に係るキメラ抗体により標識されたCAL-1細胞(BPDCN患者から確立された細胞株)の平均蛍光強度(MFI)。
【図２Ｃ】本発明に係る抗体の抗原結合を示す図である。ヒト化抗体BIIB059を含むか又は関連のない抗体を含む、キメラ抗体122A2及び102E9の1つで標識されたCAL-1細胞(BPDCN患者から確立された細胞株、CD303分子約3,000〜6,000個/細胞を発現する)の平均蛍光強度(MFI)。
【図２Ｄ】本発明に係る抗体の抗原結合を示す図である。CD303発現ベクターでトランスフェクトされ、CD303分子約40,000〜50,000個/細胞のそれらのCD303の高度な発現に関して選択された、ヒト化抗体BIIB059を含むか又は関連のない抗体を含む、キメラ抗体122A2及び102E9の1つで標識されたCAL-1細胞の平均蛍光強度(MFI)。
【図３】FcγRIIIa(CD16a)結合を示す図である。(A)本発明に係る抗体のCD16結合を、フィコエリトリンをカップリングしたマウス抗CD16抗体、3G8を使用した競合実験で研究した。抗CD16である3G8のCD16への結合(平均蛍光強度値)は、添加された増加する濃度の本発明に係る抗体(μg/mL)の関数として測定される。(B)本発明に係るキメラ抗体ch.122A2及びch.102E9、キメラ抗体リツキサン、並びに出願WO2014/09339に記載されるヒト化抗体(BIIB059)のCD16結合を、フィコエリトリンをカップリングしたマウス抗CD16抗体、3G8を使用した競合実験で研究した。抗CD16である3G8のCD16への結合(平均蛍光強度値)は、添加された増加する濃度の本発明に係る抗体(μg/mL)の関数として測定される。
【図４】Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞(A)又はCAL-1細胞(B)に関する本発明のキメラ抗体及びヒト化抗体BIIB059により誘導されたADCC活性を示す図である。(A)本発明に係るキメラ抗体により誘導されたFcγ鎖-CD303 Jurkat標的細胞のADCCによる溶解のパーセンテージ(%溶解、実施例2で定義された通り)は、抗体濃度(ng/mL、対数目盛)の関数として表される。(B)本発明に係るキメラ抗体、122A2及び102E9により誘導された、並びにヒト化抗体BIIB059によりにより誘導されたCAL-1標的細胞のADCCによる溶解のパーセンテージ(%溶解、実施例2で定義された通り)は、抗体濃度(ng/mL、対数目盛)の関数として表される。
【図５】pDCによるIFN-α分泌の本発明の抗体により誘導された阻害を示す図である。10及び0.1μg/mLの本発明のキメラ抗体、並びに関連のない対照キメラ抗体の存在下における、CpGで活性化された精製されたpDCによって分泌されたIFN-αの量(pg/mLで)。
【図６】本発明のキメラ抗体(10μg/mL)及び関連のない対照キメラ抗体の存在下における、CpGで活性化された精製されたpDCによるTNF-α分泌の本発明の抗体により誘導された阻害を示す図である。
【図７】Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞に関する本発明の抗体により誘導されたCDC活性を示す図である。本発明に係るキメラ抗体により誘導されたFcγ鎖-CD303 Jurkat標的細胞のCDCによる溶解のパーセンテージ(%溶解、実施例2で定義された通り)は、抗体濃度(ng/mL、対数目盛)の関数として表される。
【図８Ａ】空のベクターpCEP4のマップを示す図である。
【図８Ｂ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｃ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｄ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｅ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｆ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｇ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｈ】ヒト化抗体122A2の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｉ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｊ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｋ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｌ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｍ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図８Ｎ】ヒト化抗体102E9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図９Ａ】抗体102E9に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。抗体102E9に由来するヒト化抗体の濃度の関数としての450nmにおけるODを、1.25、2.5、5、10及び20ng/mLで、対照:上清単独(mock)及びキメラ抗体102E9と共に試験した。ヒト化抗体102E9H5、102E9H6、102E9H7、102E9H9、102E9H10及び102E9H11。
【図９Ｂ】抗体102E9に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。抗体102E9に由来するヒト化抗体の濃度の関数としての450nmにおけるODを、1.25、2.5、5、10及び20ng/mLで、対照:上清単独(mock)及びキメラ抗体102E9と共に試験した。ヒト化抗体102E9H13、102E9H14、及び102E9H15。
【図１０】5ng/mLの抗体における抗体102E9に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。CD303細胞外ドメインに対する102E9に由来するヒト化抗体の相対的な親和性の比較であり、ここでキメラ抗体の結合を100%とする。キメラ抗体の結合に類似した結合を表す抗体(相対的な親和性の少なくとも70%)は、*で表示される。
【図１１Ａ】抗体122A2に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。抗体122A2に由来するヒト化抗体の濃度の関数としての450nmにおけるODを、1.75、2.5、5、及び10ng/mLで、対照:上清単独(mock)及びキメラ抗体102E9と共に試験した。ヒト化抗体122A2H5、122A2H6、122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、122A2H17、122A2H15、並びにハイブリッド抗体122A2H3及び122A2H8。
【図１１Ｂ】抗体122A2に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。抗体122A2に由来するヒト化抗体の濃度の関数としての450nmにおけるODを、1.75、2.5、5、及び10ng/mLで、対照:上清単独(mock)及びキメラ抗体102E9と共に試験した。ヒト化抗体122A2H5、122A2H6、122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、122A2H17、122A2H13、122A2H18、及び122A2H11。
【図１１Ｃ】抗体122A2に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。抗体122A2に由来するヒト化抗体の濃度の関数としての450nmにおけるODを、1.75、2.5、5、及び10ng/mLで、対照:上清単独(mock)及びキメラ抗体102E9と共に試験した。ヒト化ハイブリッド抗体122A2H15及び122A2H19、並びに抗体122A2H4、122A2H8、122A2H12、122A2H16、122A2H1、122A2H2及び122A2H3。
【図１２】5ng/mLの抗体における抗体102E9に由来するヒト化抗体の抗原結合を示す図である。CD303細胞外ドメインに対する102E9に由来するヒト化抗体の相対的な親和性の比較であり、ここでキメラ抗体の結合を100%とする。キメラ抗体の結合より優れた結合を表す抗体(相対的な親和性>100%)は、*で表示される。
【図１３】0.1μg/mL(上清中)の濃度における選択された122A2に由来する様々な抗体のCAL-1細胞へのCD303結合:フローサイトメトリーによる平均蛍光強度(MFI)の観察。関連のないmAb-上清:上清で希釈した関連のないmAb。hum:ヒト化抗体。hyb:ハイブリッド抗体。
【図１４】キメラ抗体122A2及び122A2に由来するヒト化抗体によるIFN-α分泌の阻害を示す図である。
【図１５Ａ】YB2/0細胞における産生に関する、ヒト化抗体122A2H5の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１５Ｂ】YB2/0細胞における産生に関する、ヒト化抗体122A2H7の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１５Ｃ】YB2/0細胞における産生に関する、ヒト化抗体122A2H9の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１５Ｄ】YB2/0細胞における産生に関する、ヒト化抗体122A2H10の重鎖又は軽鎖のための発現ベクターのマップを示す図である。
【図１６】キメラ抗体122A2、ヒト化抗体122A2H9、又は関連のない抗体によって活性化されたCD16 Jurkat細胞によるIL-2の放出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
抗体、機能的なフラグメント又は誘導体
本発明は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の細胞外ドメインに対して作製されたモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)ヒトCD303抗原への結合に関して、
i)重鎖可変領域が配列番号43を含み、軽鎖可変領域が配列番号48を含む抗体、
ii)重鎖可変領域が配列番号44を含み、軽鎖可変領域が配列番号49を含む抗体、
iii)重鎖可変領域が配列番号45を含み、軽鎖可変領域が配列番号50を含む抗体、
iv)重鎖可変領域が配列番号46を含み、軽鎖可変領域が配列番号51を含む抗体、
v)重鎖可変領域が配列番号47を含み、軽鎖可変領域が配列番号52を含む抗体
から選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、
b)軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体に関する。
【００２６】
有利には、重鎖は、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-H(IMGT命名法による重鎖CDR)を含み、軽鎖は、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-L(IMGT命名法による軽鎖CDR)を含む:
i)CDR1-H-ファミリー1:配列番号1、CDR2-H-ファミリー1:配列番号2、CDR3-H-ファミリー1:配列番号3、CDR1-L-ファミリー1:配列番号4、CDR2-L-ファミリー1:配列番号5、CDR3-L-ファミリー1:配列番号6、又は
ii)CDR1-H-ファミリー2:配列番号7、CDR2-H-ファミリー2:配列番号8、CDR3-H-ファミリー2:配列番号9、CDR1-L-ファミリー2:配列番号10、CDR2-L-ファミリー2:配列番号11、CDR3-L-ファミリー2:配列番号12。
【００２７】
以下のTable 1(表1)は、本発明に係る抗体の2つのファミリーのCDR-IMGTのアミノ酸配列を要約する。
【００２８】
【表１】
2018511328.tif 000003
【００２９】
有利には、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖は、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-H(IMGT命名法による重鎖CDR)を含み、軽鎖は、以下のアミノ酸配列、又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する3つのCDR-L(IMGT命名法による軽鎖CDR)を含む:
i)CDR1-H-122A2:配列番号13、CDR2-H-122A2:配列番号14、CDR3-H-122A2:配列番号15、CDR1-L-122A2:配列番号16、CDR2-L-122A2:配列番号17、CDR3-L-122A2:配列番号18、
ii)CDR1-H-102E9:配列番号19、CDR2-H-102E9:配列番号20、CDR3-H-102E9:配列番号21、CDR1-L-102E9:配列番号22、CDR2-L-102E9:配列番号23、CDR3-L-102E9:配列番号24、
iii)CDR1-H-104C12:配列番号25、CDR2-H-104C12:配列番号26、CDR3-H-104C12:配列番号27、CDR1-L-104C12:配列番号28、CDR2-L-104C12:配列番号29、CDR3-L-104C12:配列番号30、
iv)CDR1-H-114D11:配列番号31、CDR2-H-114D11:配列番号32、CDR3-H-114D11:配列番号33、CDR1-L-114D11:配列番号34、CDR2-L-114D11:配列番号35、CDR3-L-114D11:配列番号36、又は
v)CDR1-H-104E10:配列番号37、CDR2-H-104E10:配列番号38、CDR3-H-104E10:配列番号39、CDR1-L-104E10:配列番号40、CDR2-L-104E10:配列番号41、CDR3-L-104E10:配列番号42。
【００３０】
有利には、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖は、配列番号43から47から選択される配列又は配列番号43から47の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含む。
【００３１】
加えて、又は代替として、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の軽鎖は、配列番号48から52から選択される配列又は配列番号48から52の1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を有する可変領域を含む。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、可変領域が以下のアミノ酸配列又は以下の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を有する重鎖及び軽鎖を有する:
i)抗体122A2:重鎖:配列番号43、軽鎖:配列番号48、
ii)抗体102E9:重鎖:配列番号44、軽鎖:配列番号49、
iii)抗体104C12:重鎖:配列番号45、軽鎖:配列番号50、
iv)抗体114D11:重鎖:配列番号46、軽鎖:配列番号51、又は
v)抗体104E10:重鎖:配列番号47、軽鎖:配列番号52。
【００３３】
以下のTable 2(表2)は、本発明に係る様々な抗体によって使用されるマウスVH、JH及びVL並びにJL遺伝子セグメント並びにパーセント同一性を要約する。
【００３４】
【表２】
2018511328.tif 000004
【００３５】
以下のTable 3(表3)は、本発明者らによって生成された抗CD303抗体の重鎖及び軽鎖のCDR及び可変領域のアミノ酸配列を要約する。
【００３６】
【表３Ａ】
2018511328.tif 000005
【００３７】
【表３Ｂ】
2018511328.tif 000006
【００３８】
【表３Ｃ】
2018511328.tif 000007
【００３９】
【表３Ｄ】
2018511328.tif 000008
【００４０】
ヒトCD303抗原は、C型レクチンドメインファミリー4、メンバーC(CLEC4)であり、DLEC、HECL、BDCA2、CLECSF7、CLECSF11、又はPRO34150とも称される(CLEC4遺伝子に関するEntrez Geneウェブサイトを参照)。これは、明確なシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質内ドメイン(アミノ酸1〜21)、膜貫通領域(アミノ酸22〜41)、ネックドメイン(アミノ酸42〜82)、及び炭水化物認識ドメイン(CRD、アミノ酸83〜213)を含む213アミノ酸のIII型膜貫通糖タンパク質である(Dzionekら、2001)。このタンパク質をコードするmRNA配列は、GenBankデータベースの2002年2月14日のバージョンにおいて受託番号AF293615.1(配列番号129)で見出すことができ、一方でアミノ酸配列は、GenBankデータベースの2002年2月14日のバージョンにおいて受託番号AAL37036.1(配列番号130)で入手可能である。
【００４１】
「抗体」又は「免疫グロブリン」は、所与の抗原のための少なくとも1つの結合ドメイン及びFc受容体(FcR)に結合することが可能なFcフラグメントを含む定常ドメインを含む分子を意味する。ヒト及びマウスのようなほとんどの哺乳動物において、抗体は、4つのポリペプチド鎖、すなわち分子にフレキシビリティーを付与する様々な数のジスルフィド架橋によって一緒に結合した2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる。各軽鎖は、定常ドメイン(CL)及び可変ドメイン(VL)からなり、重鎖は、抗体のアイソタイプに従って、可変ドメイン(VH)及び3つ又は4つの定常ドメイン(CH1からCH3又はCH1からCH4)からなる。ラクダ及びラマ等の少数のまれな哺乳動物において、抗体は、2つの重鎖のみからなり、各重鎖は可変ドメイン(VH)及び定常領域を含む。
【００４２】
可変ドメインは、抗原認識に関与し、一方で定常ドメインは、抗体の生物学的、薬物動態学的及びエフェクター特性に関与する。
【００４３】
可変領域は、それぞれの抗体ごとに異なる。実際に、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子はそれぞれ、重鎖の場合はVH、DH及びJH-CH並びに軽鎖の場合はVL及びJL-CLと称される3つ及び2つの別個の遺伝子セグメントの組換えによって生成される。CH及びCLセグメントは組換えに参加せず、それぞれ重鎖及び軽鎖の定常領域を形成する。VH-DH-JH及びVL-JLセグメントの組換えは、それぞれ重鎖及び軽鎖の可変領域を形成する。VH及びVL領域はそれぞれ、3つの高度可変ゾーン、又はCDR1、CDR2及びCDR3と称される相補性決定領域(CDR)を有し、CDR3は、組換えゾーン中に配置されているため最も可変である。これらの3つのCDR、特にCDR3は、抗原と接触すると予想される抗体の部分に見出され、したがって抗原認識にとって非常に重要である。したがって、3つのCDR並びに抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれを保持する抗体はほとんど、元の抗体の抗原特異性を保持する。一定数のケースにおいて、CDRの1つのみ、とりわけCDR3のみを保持する抗体も元の抗体の特異性を保持する。CDR1、CDR2及びCDR3はそれぞれ、少なくともそれぞれのVH又はVLセグメントごとに異なるフレームワーク領域(FR)にそれぞれ対応するFR1、FR2及びFR3を前に有する。またCDR3の後に、フレームワーク領域、FR4があってもよい。
【００４４】
抗体のCDRは、当業者公知の基準と比較したその重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列によって定義される。CDRを決定するための様々な方法が提唱されており、CDRと定義された抗体の重鎖又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列の一部は、選択される方法に従って変化する。第1の決定方法は、Kabatら(1991)によって提唱されているものである。この方法において、CDRは、抗体-抗原結合に関与するアミノ酸を探すことによって定義される。第2の方法は、高度可変領域を決定することに基づくIMGTによって提唱された。この方法において、固有の番号付けは、抗原の受容体、鎖のタイプ又は種に関係なく可変領域を比較するために定義されている(Lefrancら、2003)。この番号付けは、フレームワーク領域((FR1-IMGT:1位から26位、FR2-IMGT:39位から55位、FR3-IMGT:66位から104位及びFR4-IMGT:118位から128位)及び相補性決定領域(CDR1-IMGT:27位から38位、CDR2-IMGT:56位から65位及びCDR3-IMGT:105位から117位)の標準化した定義を提供する。最後に、「共通」と称される番号付けもあり、これは、特定のCDRの配列が、Kabatの番号付けとIMGTの番号付けとの間の共通配列に対応するものである。本明細書を通して、CDR配列は、IMGTの番号付けによって示される。詳細には、CDRは、http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/で利用可能な、及びBrochetら-2008に記載されているIMGT/V-QUESTプログラムを使用することによって決定された。
【００４５】
配列が抗体ごとに強く変化する可変ドメインとは異なり、定常ドメインは、種及びアイソタイプに典型的な抗体間で非常に類似したアミノ酸配列を特徴とし、任意選択で少数の体細胞変異を有することもある。Fcフラグメントは天然に、CH1ドメインを除いた重鎖定常領域からなり、すなわち、下部のヒンジ領域並びに定常ドメインCH2及びCH3又はCH2からCH4(アイソタイプに応じて)からなる。ヒトIgG1において、完全なFcフラグメントは、226位のシステイン残基(C226)から始まる重鎖のC末端部分からなり、Fcフラグメントにおけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書を通して、Edelmanら-1969及びKabatら-1991に記載されるEUインデックスの番号付けである。対応する他のタイプの免疫グロブリンのFcフラグメントは、当業者によって配列アライメントから容易に同定することができる。
【００４６】
Fcフラグメントは、CH2ドメインでグリコシル化され、2つの重鎖のそれぞれに297位のアスパラギン残基(Asn297)に結合したN-グリカンの存在を伴う。
【００４７】
以下の結合ドメインは、Fcに配置されており、抗体の生物学的特性にとって重要である:
-  抗体の薬物動態学的特性(インビボにおける半減期)に関与する、新生児型Fc受容体(FcRn)結合ドメイン:
様々なデータから、CH2及びCH3ドメインの境界に配置された特定の残基がFcRn結合に関与することが示唆されている、
-  補体依存性細胞傷害(CDC)応答に関与する、補体C1qタンパク質結合ドメイン:CH2ドメインに配置されている、
-  貪食又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)タイプの応答に関与する、Fc受容体(FcR)結合ドメイン:CH2ドメインに配置されている。
【００４８】
本発明の状況において、抗体のFcフラグメントは、上記で定義されたように天然であってもよいし、そうでなければ、機能的なFcR(IgGの場合はFcγR)結合ドメイン、好ましくは機能的なFcRn結合ドメインを含むという条件で、様々な方法で改変されていてもよい。改変としては、Fcフラグメントの特定の部分の欠失を挙げることができ、ただしFcフラグメントが機能的なFcR(IgGの場合はFcγR)結合ドメイン、好ましくは機能的なFcRn結合ドメインを含有することを条件とする。改変としては更に、抗体の生物学的特性に影響を与えることができる様々なアミノ酸置換を挙げることができ、ただしFcフラグメントが機能的なFcR結合ドメイン、好ましくは機能的なFcRn結合ドメインを含有することを条件とする。詳細には、抗体がIgGである場合、抗体は、WO00/42072、Shieldsら-2001、Lazarら-2006、WO2004/029207、WO2004/063351、WO2004/074455に記載されるような、FcγRIIIa(CD16a)結合を増加させることを意図した変異を含んでいてもよい。例えばShieldsら-2001、Dall'Acquaら-2002、Hintonら-2004、Dall'Acquaら-2006(a)、WO00/42072、WO02/060919、WO2010/045193、又はWO2010/106180で記載されるように、FcRn結合、したがってインビボにおける半減期を増加させるための変異も存在していてもよい。他の変異、例えば相補タンパク質への結合、したがってCDC応答を減少又は増加させるための変異が、任意選択で存在していてもよい(WO99/51642、WO2004/074455、Idusogieら-2001、Dall'Acquaら-2006(b)、及びMooreら-2010を参照)。
【００４９】
本発明の状況において、FcRn結合、したがってインビボにおける半減期を増加させるための変異を含む好ましい変異体は、WO2010/106180に記載されるそれらのFcフラグメントに以下:
・N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y、
・P230S/N315D/M428L/N434Y、
・E294del/T307P/N434Y、
・T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y、
・V259I/N315D/N434Y、又は
・T256N/A378V/S383N/N434Y
の変異の組合せを含む変異体であり、ここでFcフラグメントにおけるアミノ酸の番号付けは、参照により本明細書に組み入れられるKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)に記載されるEUインデックスの番号付けである。「EUインデックス」又は「KabatのEUインデックス」は、ヒトIgG1抗体のアミノ酸の番号付けを指す。
【００５０】
代替として、とりわけpDCが関与する、炎症性、とりわけ自己免疫疾患の処置に関する本発明の状況において、抗体のFcフラグメントを含まないフラグメント又は誘導体が有用な場合もあることから、本発明に係る抗体は、エフェクター機能がない変異したFcフラグメントを有していてもよい。エフェクター機能がない変異したFcフラグメントを生じる変異の例は、Fcフラグメントの293位(Del293)又は294(Del294)における単一のアミノ酸欠失であり、この場合、Fcフラグメントにおけるアミノ酸の番号付けは、KabatのEUインデックスの番号付けである(WO2012/175751)。
【００５１】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、同一で固有な抗原特異性を有する抗体分子を含む組成物を意味する。組成物中に存在する抗体分子は、それらの翻訳後修飾に関して、とりわけそれらの糖付加構造又はそれらの等電点に関して異なっている可能性があるが、全て同じ重鎖及び軽鎖配列によってコードされており、したがっていずれの翻訳後修飾の前では同じタンパク質配列を有する。それでも、翻訳後修飾に関するタンパク質配列における特定の差(例えば、重鎖C末端リシンの切断、アスパラギン残基の脱アミド及び/又はアスパラギン酸残基の異性化等)が、組成物中に存在する様々な抗体分子間に存在する場合がある。
【００５２】
本発明の開示の文脈で言及されるパーセント同一性は、Needleman及びWunschのアルゴリズム(1970)等の当業者周知のあらゆるアルゴリズムを使用して、比較しようとする配列のグローバルアライメント、すなわち、それらの全体が全長にわたり採用される配列のアライメントに基づき決定される。この配列比較は、当業者周知のあらゆるソフトウェアを使用して実行してもよく、例えば、ニードル(Needle)ソフトウェアを使用して、10.0に等しい「ギャップオープン」パラメーター、0.5に等しい「ギャップ伸長」パラメーター、及び「Blosum 62」マトリックスを使用することによって実行してもよい。ニードルソフトウェアは、例えばウェブサイトebi.ac.ukにおいて名称「Align」で利用可能である。
【００５３】
本発明に係る抗体のCDR又は可変領域が、上述したもの及び配列リスト(参照配列)に記載のものの1つに対して100%同一ではないが、1つのこのような参照配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する場合、それは、参照配列に比べて挿入、欠失又は置換を有する可能性がある。それが置換に起因する場合、置換は、好ましくは、「等価な」アミノ酸、すなわち構造が元のアミノ酸の構造に類似しているため、抗体の生物活性を変化させる可能性が低いあらゆるアミノ酸でなされる。以下のTable 4(表4)に、このような置換の例を提示する。
【００５４】
【表４】
2018511328.tif 000009
【００５５】
抗体は、それらの定常領域の性質に従って数々のアイソタイプを有する場合があり、γ、α、μ、ε及びδ定常領域は、それぞれ免疫グロブリンIgG、IgA、IgM、IgE及びIgDに対応する。有利には、本発明の状況において医薬品として使用される組成物中に存在するモノクローナル抗体は、アイソタイプIgGを有する。実際に、このアイソタイプは、最大数の個体(ヒト)において抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を生成する能力を示す。γ定常領域は、数々のサブタイプ:γ1、γ2、γ3を含み、これら3つのタイプの定常領域は、ヒト相補体、及びγ4と結合する特徴を有することから、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を作り出す。有利には、本発明の状況において医薬品として使用される組成物中に存在するモノクローナル抗体は、アイソタイプIgG1又はIgG3、好ましくはIgG1を有する。
【００５６】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利にはキメラ又はヒト化抗体であり、詳細にはその重鎖及び軽鎖定常領域がヒト起源であるキメラ抗体である。
【００５７】
「キメラ」抗体は、所与の種の抗体に由来する天然の可変領域(軽鎖及び重鎖)を、前記所与の種にとって異種の種の抗体の軽鎖及び重鎖定常領域と組み合わせて含有する抗体を意味する。有利には、本発明に従って医薬品として使用するためのモノクローナル抗体組成物がキメラモノクローナル抗体を含む場合、そのモノクローナル抗体は、ヒト定常領域を含む。キメラ抗体は、非ヒト抗体から、当業者周知の遺伝子組換え技術を使用することによって調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーター及び非ヒト抗体の可変領域をコードする配列、並びにヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えDNAの重鎖及び軽鎖をクローニングすることによって調製することができる。キメラ抗体を調製するための方法について、例えば、Verhoeyenら-1988による文書を参照し得る。
【００５８】
「ヒト化」抗体は、非ヒト起源の抗体に由来するCDRを含有する抗体であって、抗体分子の他の部分が1種(又は数種)のヒト抗体に由来するものを意味する。更に、フレームワーク領域(FR)の特定の残基は、結合親和性を保持するように改変されていてもよい(Jonesら-1986;Verhoeyenら、1988;Riechmannら-1988)。本発明に係るヒト化抗体は、当業者公知の技術、例えば、Almagroら-2008による総論で要約されているような、CDRグラフティング、リサーフェイシング、超ヒト化(superhumanization)、ヒト鎖の含量、FRライブラリー、誘導選択(guided selection)、FRシャッフリング及びヒト化工学(humaneering)技術によって調製し得る。
【００５９】
上述したCDR又は可変領域配列を含む5つのキメラ抗体に加えて、本発明者らは、最初に得られた5つの抗CD303抗体のうち2つに由来するヒト化抗体も生成した。この目的を達成するために、2つの抗体のそれぞれについて、数々の変異した重鎖可変領域配列(ヒト配列により類似した配列の作製を目的とした変異)及び数々の変異した軽鎖可変領域配列を生成し、互いに対で組み合わせて、ヒトCD303抗原(配列番号130)に結合する可能な限り最も強い(有利にはマウス又はキメラ抗体の結合能力の少なくとも70%の、より有利にはマウス又はキメラ抗体の結合能力に類似した、より一層有利にはマウス又はキメラ抗体の結合能力より高い)能力を有するヒト化抗体を得ることを試みた。
【００６０】
抗体122A2に関して、試験された重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列(ヒト化された、すなわち変異した)を、以下のTable 5(表5)に提示する。
【００６１】
【表５Ａ】
2018511328.tif 000010
【００６２】
【表５Ｂ】
2018511328.tif 000011
【００６３】
ヒト化抗体122A2はしたがって、有利には、その重鎖が配列番号131から133から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むもの、有利には、その重鎖が配列番号131及び132から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むものから選択される。
【００６４】
ヒト化抗体122A2はまた、有利には、その軽鎖が配列番号134から137から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むもの、有利には、その軽鎖が配列番号134及び135から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むものからも選択される。
【００６５】
本発明者らによって生成された様々なヒト化抗体122A2は、以下のTable 6(表6)に記載されるアミノ酸配列を有する可変領域を含む重鎖及び軽鎖を有する。好ましいヒト化抗体122A2は(なぜならこれらは、元のキメラ抗体の抗原結合に等しいか又はそれより高い抗原結合を表すため)、その重鎖及び軽鎖が、以下のTable 6(表6)において抗体122A2H5、122A2H9、122A2H6、122A2H10、122A2H14、122A2H7、122A2H11及び122A2H15に関して記載される配列(以下のTable 6(表6)において太字で示される)を含むアミノ酸配列を有する可変領域を含むものである。最も好ましいヒト化抗体122A2は、元のキメラ抗体の抗原結合より高い抗原結合を表すもの:122A2H5、122A2H9、122A2H6、122A2H10、122A2H14、122A2H7、詳細には122A2H5、122A2H9、122A2H7、及び122A2H10である。
【００６６】
【表６】
2018511328.tif 000012
【００６７】
抗体102E9に関して、試験された重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列(ヒト化された、すなわち、変異した)を、以下のTable 7(表7)に提示する。
【００６８】
【表７】
2018511328.tif 000013
【００６９】
ヒト化抗体102E9はしたがって、有利には、その重鎖が配列番号138から140から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むもの、有利には、その重鎖が配列番号139のアミノ酸配列を有する可変領域を含むものから選択される。
【００７０】
ヒト化抗体102E9はまた、有利には、その軽鎖が配列番号141から143から選択されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むもの、有利には、その軽鎖が配列番号142のアミノ酸配列を有する可変領域を含むものからも選択される。
【００７１】
本発明者らによって生成された様々なヒト化抗体102E9は、以下のTable 8(表8)に記載されるアミノ酸配列を有する可変領域を含む重鎖及び軽鎖を有する。好ましいヒト化抗体102E9は(なぜならこれらは、元のキメラ抗体の結合に類似したキメラ抗体のレベルでの結合、ELISAにおいてキメラ抗体の結合の少なくとも70%の結合を表すため)、その重鎖及び軽鎖が、以下のTable 8(表8)において抗体102E9H6、102E9H7、102E9H9、及び102E9H10に関して記載される配列(以下のTable 8(表8)において太字で示される)を含むアミノ酸配列を有する可変領域を含むものであり、より有利には、その重鎖及び軽鎖が、以下のTable 8(表8)において抗体102E9H10に関して記載される配列を含むアミノ酸配列を有する可変領域を含むものである。
【００７２】
【表８】
2018511328.tif 000014
【００７３】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、ヒト定常領域とのキメラであるか、又はそうでなければヒト化されており、有利には、配列番号53又は配列番号144のアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常領域(これは、追加のC末端リシン残基を有する配列番号53のヒト重鎖定常領域配列に対応する)を含むと予想される。加えて、又は代替として、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、ヒトとのキメラであるか、又はそうでなければヒト化されており、定常領域は、有利には配列番号54のアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常領域を含むと予想される。アイソタイプ  IgG1の好ましいヒト重鎖(配列番号53又は配列番号144)又は軽鎖(配列番号54)定常領域配列は、以下のTable 9(表9)に提示される。
【００７４】
【表９】
2018511328.tif 000015
【００７５】
したがって、本発明に係るキメラ又はヒト化抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び軽鎖は、有利には以下のTable 10(表10)に記載される配列を含む(又はこのような配列から本質的になるか若しくはからなる)。
【００７６】
【表１０Ａ】
2018511328.tif 000016
【００７７】
【表１０Ｂ】
2018511328.tif 000017
【００７８】
【表１０Ｃ】
2018511328.tif 000018
【００７９】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖は、有利には、配列番号65の配列の少なくとも1つの異種シグナルペプチド(MRWSWIFLLLLSITSANA、シグナルペプチドMB7)を更に含む。実際に、このペプチドは、より高次の真核細胞株において組換えタンパク質の発現及び分泌を改善することが示されてきた(WO2011/114063を参照)。したがって、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖は、有利には、本発明に係る抗体のVH領域のアミノ酸配列の1つ(配列番号43から47)へのシグナルペプチドMB7のアミノ酸配列(配列番号65)のN末端からC末端の融合体からなる配列番号66から70から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこのような配列から本質的になるか若しくはからなる。加えて、又は代替として、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の軽鎖は、有利には、本発明に係る抗体のVL領域のアミノ酸配列の1つ(配列番号48から52)へのシグナルペプチドMB7のアミノ酸配列(配列番号65)のN末端からC末端の融合体からなる配列番号71から75から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこのような配列から本質的になるか若しくはからなる。
【００８０】
好ましい重鎖及び軽鎖定常領域を付加することによって、以下のTable 11(表11)に記載されるように、本発明に係る抗体の好ましい完全アミノ酸配列が得られる。重鎖について、定常領域は更に、追加のC末端リシン残基を含有していてもよい。したがって、本発明に係るキメラ又はヒト化抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び軽鎖は、有利には以下のTable 11(表11)に記載される配列を含む(又はこのような配列から本質的になるか若しくはからなる)。
【００８１】
【表１１Ａ】
2018511328.tif 000019
【００８２】
【表１１Ｂ】
2018511328.tif 000020
【００８３】
【表１１Ｃ】
2018511328.tif 000021
【００８４】
【表１１Ｄ】
2018511328.tif 000022
【００８５】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、本発明の説明に記載される、とりわけ以下の本発明に係る核酸、ベクター、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック植物に関するセクションに記載される、あらゆる宿主細胞、あらゆるトランスジェニック非ヒト動物又はあらゆるトランスジェニック植物から生産され得る。
【００８６】
「機能的なフラグメント」は、抗原結合ドメインを保持する、したがって元の抗体と同じ抗原特異性を有する抗体フラグメントを意味し、例えばフラグメントFv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc又はダイアボディである。本発明に係る機能的な抗体フラグメントはしたがって、有利には、フラグメントFv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc又はダイアボディから選択される。
【００８７】
抗体の「誘導体」は、担体ペプチドと、CD303を認識するその能力を保持することを可能にする元の抗体の少なくとも1つのCDRとからなる融合タンパク質を意味する。
【００８８】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、65%未満か又はそれに等しい低いフコース含量を有する。
【００８９】
「フコース含量」は、各抗体の各重鎖のFcフラグメントのAsn297残基に付着したN-グリカン内のフコシル化形態のパーセンテージを意味する。「低いフコース含量」は、65%未満か又はそれに等しいフコース含量を意味する。実際に、抗体組成物のフコース含量が、FcγRIIIを介して強いADCC応答を誘導する前記組成物の能力において重要な役割を果たすことが目下公知である。有利には、フコース含量は、65%未満か又はそれに等しい、好ましくは60%、55%又は50%未満か又はそれに等しい、更に45%、40%、35%、30%、25%又は20%未満か又はそれに等しい。しかしながら、フコース含量がゼロであることが必ずしも必要ではなく、例えば5%、10%、15%又は20%より大きいか又はそれに等しくてもよい。フコース含量は、例えば5%から65%の間、5%から60%の間、5%から55%の間、5%から50%の間、5%から45%の間、5%から40%の間、5%から35%の間、5%から30%の間、5%から25%の間、5%から20%の間、10%から65%の間、10%から60%の間、10%から55%の間、10%から50%の間、10%から45%の間、10%から40%の間、10%から35%の間、10%から30%の間、10%から25%の間、10%から20%の間、15%から65%の間、15%から60%の間、15%から55%の間、15%から50%の間、15%から45%の間、15%から40%の間、15%から35%の間、15%から30%の間、15%から25%の間、15%から20%の間、20%から65%の間、20%から60%の間、20%から55%の間、20%から50%の間、20%から45%の間、20%から40%の間、20%から35%の間、20%から30%の間、20%から25%の間であり得る。
【００９０】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は更に、異なるタイプの糖付加(オリゴマンノースのN-グリカン又は2分岐のコンプレックス型であり、バイセクティングN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基、又は2分岐のコンプレックス型のN-グリカンのケースではガラクトース残基の比率は様々である)を有していてもよく、ただしそれらは低いフコース含量を有する。したがって、オリゴマンノース型N-グリカンは、様々な糖付加阻害剤、例えばα1,2-マンノシダーゼI阻害剤(例えばデオキシマンノジリマイシン(DMM))又はα-グルコシダーゼ阻害剤(例えばカスタノスペルミン(Cs))の存在下で培養すること;又はCHO細胞株Lec1で抗体を産生することによって得ることもできる。トランスジェニックヤギの乳汁における産生もまた、大部分のN-グリカンがオリゴマンノース型であり、少数が、1又は2つのガラクトースを有し、バイセクティングGlcNAcを有さず、シアル化されていないフコシル化した2分岐のコンプレックス型の形態(G1F又はG2F)を形成する抗体を生じる(WO2007/048077を参照)。2分岐のコンプレックス型のN-グリカンは、ほとんどの哺乳類細胞で得ることができるが、糖付加の特徴が改変された細菌、酵母又は植物でも得ることができる。フコース含量を限定するために、Fcフラグメントに結合したGlcNAcへのフコースの付加に関与する低い活性の酵素1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)を天然に有する細胞株;例えばYB2/0細胞株、アヒル胚細胞株EB66(登録商標)、ラット肝癌細胞株H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)又は細胞株NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC2856)が使用され得る。他の遺伝子のためのものであって、その発現又は過剰発現により低いフコース含量が生じる変異細胞株、例えばGDP-フコース合成が減少したCHO細胞株の変異体であるCHO細胞株Lec13も使用が可能である。また、目的の細胞株を選択して、N-グリカンのフコシル化経路に関与するタンパク質(とりわけFUT8であり、Yamane-Ohnukiら-2004を参照されたい。更にGMD、GDP-フコース輸送に関与する遺伝子もあり、Kandaら-2007を参照されたい)の発現を減少させたり又は無効にしたりすること(とりわけ干渉RNAを使用することによって、又は目的のタンパク質を発現する遺伝子の変異若しくは欠失によって)も可能である。別の代替法は、目的の細胞株を選択して、GnTIII(β(1,4)-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII)タンパク質等のN-グリカンのフコシル化に干渉するタンパク質を何らかの方法で過剰発現することで構成される。詳細には、低いフコシル化N-グリカンを有する抗体はとりわけ、以下により得られた:
・YB2/0(EP1176195A1、WO01/77181、Shinkawaら-2003を参照)、CHO Lec13(Shieldsら-2002を参照)、EB66(登録商標)(Olivierら-2010)、ラット肝癌細胞株H4-II-E(DSM ACC3129)、H4-II-Es(DSM ACC3130)(WO2012/041768を参照)並びにヒト細胞株NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC2856)(WO2008/028686を参照)における産生。
・FUT8(Moriら-2004、Suzukiら-2007、Cardarelliら-2009、Cardarelliら-2010、Herbstら-2010)又はGMD(ゴルジ装置におけるGDP-フコース輸送体をコードする遺伝子、Imai-Nishiyaら-2007を参照)に対して作製された短鎖干渉RNAの存在下における野生型CHO細胞株における産生。
・1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子の両方の対立遺伝子が欠失した(Yamane-Ohnukiら-2004)、又はゴルジ装置におけるGDP-フコース輸送体をコードするGMD遺伝子の両方の対立遺伝子が欠失した(Kandaら-2007)CHO細胞株における産生。
・GnTIII(β(1,4)-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII)酵素をコードする遺伝子を遺伝子導入により過剰発現させたCHO細胞株における産生(Umanaら-1999)。得られたN-グリカンは、低いフコシル化に加えて、高いバイセクティングGlcNAc含量を特徴とする。
・短鎖干渉RNAの使用によってβ1,2-キシロース及びα1,3-フコース残基の含量を強く低減させたトランスジェニック植物(ベンサミアナタバコ(N.benthamiana))における産生(Forthalら-2010)。
【００９１】
オリゴマンノース型N-グリカンは、2分岐のコンプレックス型のN-グリカンと比較して低下したインビボにおける半減期を有する。その結果として、有利には、本発明に係る抗体は、それらのFc-フラグメントのN-糖付加部位に、上記で定義されたような低いフコース含量を有する2分岐のコンプレックス型のグリカン構造を有する。
【００９２】
詳細には、本発明に係るモノクローナル抗体は、60%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量及び上記で定義されたような低いフコース含量を有していてもよい。上記モノクローナル抗体はまた、65%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量及び上記で定義されたような低いフコース含量を有していてもよい。上記モノクローナル抗体はまた、70%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量及び上記で定義されたような低いフコース含量を有していてもよい。上記モノクローナル抗体はまた、75%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量及び上記で定義されたような低いフコース含量を有していてもよい。上記モノクローナル抗体はまた、80%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量及び上記で定義されたような低いフコース含量を有していてもよい。上記モノクローナル抗体はまた、60%、65%、70%、75%又は80%より大きいG0+G1+G0F+G1Fの形態の含量、及び50%未満のG0F+G1Fの形態の含量を有していてもよい。G0、G1、G0F及びG1Fの形態は、以下で定義される通りである:
【００９３】
【化１】
2018511328.tif 000023
【００９４】
このような抗体組成物は、とりわけ、YB2/0細胞、CHO Lec13細胞、FUT8若しくはGMDに対して作製された短鎖干渉RNAの存在下で培養された野生型CHO細胞株、又は1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子の両方の対立遺伝子若しくはゴルジ装置におけるGDP-フコース輸送体をコードするGMD遺伝子の両方の対立遺伝子が欠失したCHO細胞株における産生によって得てもよい。
【００９５】
しかしながら、別の実施形態において、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、高いオリゴマンノース型N-グリカンの含量を有する。
【００９６】
「オリゴマンノース型N-グリカン」は、N-グリカンの五糖コアが、2つのN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基(それらの1つは、抗体のFcフラグメントのAsn297残基に結合している)及び3つのマンノース残基からなり、五糖コアの末端マンノース残基に結合した1つから6つの追加のマンノースによって補充されているN-グリカンを意味する。オリゴマンノース型N-グリカンは、フコシル化されていない。
【００９７】
「オリゴマンノース型N-グリカンの含量」は、各抗体の各重鎖のFcフラグメントのAsn297残基に付着したN-グリカン中におけるオリゴマンノース型のパーセンテージを意味する。「高いオリゴマンノース型N-グリカンの含量」は、30%より大きいか又はそれに等しい、有利には35%より大きいか又はそれに等しい、40%より大きいか又はそれに等しい、45%より大きいか又はそれに等しい、50%より大きいか又はそれに等しい、55%より大きいか又はそれに等しい、60%より大きいか又はそれに等しい、65%より大きいか又はそれに等しい、70%より大きいか又はそれに等しい、75%より大きいか又はそれに等しい、80%より大きいか又はそれに等しい、85%より大きいか又はそれに等しい、90%より大きいか又はそれに等しいオリゴマンノース型N-グリカンの含量を意味し、又は95%より大きいか又はそれに等しいオリゴマンノース型N-グリカンの含量も意味する。
【００９８】
低いフコース含量に加えて、又はその代替として、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、高いガラクトース含量を有する。
【００９９】
抗体の「ガラクトース含量」又は「ガラクトシル化レベル」は、以下の式:
【０１００】
【数１】
2018511328.tif 000024
【０１０１】
に従って抗体から放出されたN-グリカンの分析的クロマトグラムから計算されたパーセンテージを意味し、式中:
-  「n」は、クロマトグラム、例えば順相高速液体クロマトグラフィー(NP-HPLC)スペクトルで分析されたN-グリカンのピークの数であり、
-  「Galの数」は、ピークに対応するグリカンのアンテナ上のガラクトースの数であり、
-  「Aの数」は、ピークに対応するグリカン型のN-アセチル-グルコサミンのアンテナの数であり、
-  「%相対面積」は、対応するピーク下面積のパーセンテージである。
【０１０２】
「高いガラクトース含量」は、30%より大きいか又はそれに等しい、有利には50%より大きいか又はそれに等しい、有利には55%より大きいか又はそれに等しい、60%より大きいか又はそれに等しい、65%より大きいか又はそれに等しい、70%より大きいか又はそれに等しい、75%より大きいか又はそれに等しい、80%より大きいか又はそれに等しい、85%より大きいか又はそれに等しい、90%より大きいか又はそれに等しい、95%より大きいか又はそれに等しいガラクトース含量を意味し、又は100%に等しいガラクトース含量も意味する。
【０１０３】
また本発明は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の細胞外ドメインに対して作製されたモノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体であって、
a)CHO細胞で産生されたヒトCD303抗原の細胞外ドメインに対して作製された抗体と比較して、FcγRIIIa(CD16a)への改善された親和性を有すること、及び
b)軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域であること
を特徴とする、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的なフラグメント若しくは誘導体にも関する。
【０１０４】
FcγRIIIa(CD16a)に関する抗体のFcフラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR、とりわけBIAcore 2000デバイス-Pharmacia Biosensor、Upsala、Swedenを使用したもの)及びスキャッチャード分析等の数々の方法によって測定することができる。FcγRをコードする8つの遺伝子がヒトで同定されているが、5つのみが、発現された受容体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)をコードする。全ては、免疫細胞の活性化を阻害する受容体であるFcγRIIbを除いて、エフェクター細胞を活性化する受容体である。FcγRIaは、免疫グロブリンに対する高親和性を特徴とし(5×10-7から10-10MのKd)、一方でFcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIbは、低い親和性の受容体に特徴的である(10-7M未満のKd)。本発明に係る抗体は、CHO細胞で生産されたヒトCD303抗原の細胞外ドメインに対して作製された抗体と比較して、FcγRIIIa(CD16a)への改善された親和性を有する。この比較に関して、好ましくは、標準的な状態で、Fcフラグメントが高度にフコシル化されている(Fcフラグメントに付着したオリゴ糖の少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%がフコシル化されている)抗体を生産する野生型CHO細胞株、例えば以下の細胞株:CHO-K-1(ATCC(登録商標)CCL-61(商標))、CHO Pro-5(ATCC(登録商標)CRL-1781(商標))、CHO dhfr-(ATCC(登録商標)CRL-9096(商標))、CHO-DP12(ATCC(登録商標)CRL-12444(商標)又はATCC(登録商標)CRL-12445(商標))、CHO DUKX-B11(ATCC CRL-9010)、及びCHO DG-44(Urlaubら、Cell 33[2]、405-412、1983)の1つを挙げることができる。CHO細胞で生産されたヒトCD303抗原の細胞外ドメインに対して作製された抗体と比較してFcγRIIIa(CD16a)への改善された親和性を有する本発明に係る抗体(上記で定義され通り)は、この改善された親和性により、FcγRIIIa(CD16a)から、ポリクローナルIgG抗体、とりわけ血清中に存在するIgGに置き換わらない、又はあまり置き換わらないようにすることができるという利点を有する。このような抗体は、有利には、FcγRIIIa(CD16a)に対して高親和性、すなわち、スキャッチャード分析又はBIAcore(標識非含有の表面プラズモン共鳴ベースの)技術によって決定した場合、少なくとも2×106M-1に等しい、少なくとも2×107M-1、2×108M-1又は2×109M-1に等しい親和性を有する。
【０１０５】
CHO細胞で生産された抗体と比較して有意に改善されたFcγRIIIa(CD16a)への高親和性は、CD303細胞外ドメインへの結合に関して本発明者らにより開発された特異的な抗体と競合するその能力、及びその軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種由来の定常領域であるという事実によって定義された、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体に関して上述した様々な方法で得ることができる。詳細には、CHO細胞で生産された抗体と比較して有意に改善されたFcγRIIIa(CD16a)への高親和性は、
・上述したようにFcγRIIIa(CD16a)結合を増加させるFcフラグメントにおける変異の存在(詳細には、WO00/42072、Shieldsら-2001、Lazarら-2006、WO2004/029207、WO2004/063351、WO2004/074455に記載される、FcγRIIIa(CD16a)結合を増加させる変異)、及び/又は
・抗体の糖付加を制御すること、とりわけ:
○上述したように、2分岐のコンプレックス型の形態内で、及び/又は高いオリゴマンノース型N-グリカンの含量を介して、低いフコース含量を制御すること、及び/又は
○上述したような高いガラクトース含量を制御すること
により得てもよい。
【０１０６】
このような本発明に係る抗体は、加えて、CD303細胞外ドメインへの結合に関して本発明者らにより開発された特異的な抗体と競合するその能力、及びその軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種由来の定常領域であるという事実によって定義された本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体に関して上述したあらゆる特徴又は特徴の組合せを有し得る。
【０１０７】
核酸、ベクター、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック植物
また本発明は、上述したような本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸(核酸又はヌクレオチド配列とも称される)にも関する。
【０１０８】
特定のアミノ酸配列をコードするが遺伝子コードの縮重のために異なる核酸配列は全て、本発明の範囲内である。
【０１０９】
詳細には、本発明に係る核酸の配列は、目的の宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物においてそれらの発現が促進されるように最適化されてもよい。実際のところ、一般的には、同じアミノ酸(メチオニン及びトリプトファンを除く)をコードする3つのヌクレオチドの組合せは多数あり、これらは同義コドンと称される。しかしながら、一般的に、これらの組合せの一部が、細胞又は所与の生物によって優先的に使用される(これは、遺伝子コード使用のバイアスと称される)。この選好は、とりわけ細胞が由来する産生生物に依存する。その結果として、1つ又は複数の生物に由来するタンパク質が異種生物又はこのような異種生物の細胞で産生される場合、タンパク質をコードする核酸配列を主として異種生物の好ましいコドンを使用するように改変することが有用であり得る。異なる種が優先的に選ぶコドンの使用に関する文献においてデータを入手でき、当業者であれば、どのように異種生物又は異種生物の細胞において所与のタンパク質の発現を最適化するかを理解している。
【０１１０】
本発明に係る核酸は、有利には、本発明に係る抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列をコードしており、ドブネズミ(Rattus norvegicus)細胞での発現に最適化されている、以下のTable 12(表12)に記載される配列番号86から95(キメラ抗体)の少なくとも1つを含む。
【０１１１】
【表１２Ａ】
2018511328.tif 000025
【０１１２】
【表１２Ｂ】
2018511328.tif 000026
【０１１３】
【表１２Ｃ】
2018511328.tif 000027
【０１１４】
本発明に係る核酸はまた、有利には、本発明に係るヒト化抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列をコードしており、ドブネズミ細胞での発現に最適化されている、以下のTable 13(表13)に記載される配列番号181から187(抗体122A2に由来するヒト化抗体)の少なくとも1つを含んでいてもよい。
【０１１５】
【表１３Ａ】
2018511328.tif 000028
【０１１６】
【表１３Ｂ】
2018511328.tif 000029
【０１１７】
本発明に係る核酸はまた、有利には、本発明に係るヒト化抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列をコードしており、ドブネズミ細胞での発現に最適化されている、以下のTable 14(表14)に記載される、配列番号188から193(抗体102E9に由来するヒト化抗体)の少なくとも1つを含んでいてもよい。
【０１１８】
【表１４Ａ】
2018511328.tif 000030
【０１１９】
【表１４Ｂ】
2018511328.tif 000031
【０１２０】
好ましい重鎖又は軽鎖定常領域をコードする核酸配列はまた、ドブネズミ細胞での発現に最適化されており、好ましくは以下のTable 15(表15)に記載されるものである。
【０１２１】
【表１５】
2018511328.tif 000032
【０１２２】
したがって、本発明に係る抗体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸は、好ましくは、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体のVH領域をコードする配列番号86から90の1つ及び好ましいヒト重鎖定常領域をコードする配列番号96(配列番号98から102を参照)、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体のVL領域をコードする配列番号91から95の1つ及び好ましいヒト軽鎖定常領域をコードする配列番号97(配列番号103から107を参照)、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体のVH領域をコードする配列番号181から183の1つ及び好ましいヒト重鎖定常領域をコードする配列番号96(配列番号194から196を参照)、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体のVL領域をコードする配列番号184から187の1つ及び好ましいヒト軽鎖定常領域をコードする配列番号97(配列番号197から200を参照)、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体のVH領域をコードする配列番号188から190の1つ及び好ましいヒト重鎖定常領域をコードする配列番号96(配列番号201から203を参照)、
・本発明に係る好ましいキメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体のVL領域をコードする配列番号191から193の1つ及び好ましいヒト軽鎖定常領域をコードする配列番号97(配列番号204から206を参照)
の5'から3'への融合体からなる、以下のTable 16(表16)に記載される少なくとも1つの核酸配列を含む(又はから本質的になる、又はからなる)。
【０１２３】
【表１６Ａ】
2018511328.tif 000033
【０１２４】
【表１６Ｂ】
2018511328.tif 000034
【０１２５】
本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸は、有利には、異種シグナルペプチドMB7をコードする核酸配列(MRWSWIFLLLLSITSANA、配列番号65)、とりわけ配列番号108の核酸配列(ATGAGGTGGTCCTGGATCTTCCTGCTGCTGCTGAGCATCACCAGCGCCAACGCC)を含む。実際に、このペプチドは、より高次の真核細胞株において組換えタンパク質の発現及び分泌を改善することが示されてきた(WO2011/114063を参照)。
【０１２６】
したがって、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖をコードする核酸は、有利には、シグナルペプチドMB7(配列番号108)をコードする核酸配列から、本発明に係る抗体のVH領域をコードする核酸配列(キメラ抗体については配列番号86から90、キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体については配列番号181から183、及びキメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体については配列番号188から190)の1つの5'から3'への融合体からなる、配列番号109から113(キメラ抗体)、配列番号207から209(キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体)及び配列番号214から216(キメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体)から選択される核酸配列を含む(又はから本質的になる、又はからなる)。
【０１２７】
加えて、又は代替として、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の軽鎖をコードする核酸は、有利には、シグナルペプチドMB7(配列番号108)をコードする核酸配列から、本発明に係る抗体のVL領域のアミノ酸配列(キメラ抗体については配列番号91から95、キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体については配列番号184から187、及びキメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体については配列番号191から193)の1つの5'から3'への融合体からなる、配列番号114から118、(キメラ抗体)、配列番号210から213(キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体)及び配列番号217から219(キメラ抗体102E9に由来するヒト化抗体)から選択される核酸配列を含む(又はから本質的になる、又はからなる)。
【０１２８】
好ましい重鎖及び軽鎖定常領域を付加することによって、以下のTable 17(表17)に記載されるように、本発明に係る抗体の好ましい完全アミノ酸配列が得られる。
【０１２９】
したがって、本発明に係るキメラ又はヒト化抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸は、有利には、以下のTable 17(表17)に記載される少なくとも1つの配列を含む(又はこのような配列から本質的になる、又はからなる)。
【０１３０】
【表１７Ａ】
2018511328.tif 000035
【０１３１】
【表１７Ｂ】
2018511328.tif 000036
【０１３２】
【表１７Ｃ】
2018511328.tif 000037
【０１３３】
また本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターにも関する。このようなベクターは、前記核酸配列の発現に必要なエレメント、とりわけプロモーター、転写開始コドン、終結配列、及び好適な転写調節配列を含む。これらのエレメントは、発現に使用される宿主に従って様々であり、それらの一般知識に基づき当業者によって容易に選択される。詳細には、真核細胞での発現のために設計されたベクターの場合、ベクターは、有利には、コザックコンセンサス配列、すなわち、AUG開始コドン周辺の真核性のメッセンジャーRNAの翻訳開始部位で見出される保存された配列(一般的にGCCGCC(A/G)CCATGG、翻訳開始コドンは下線で示す)を含む。ベクターは、とりわけプラスミド又はウイルスベクターであり得る。これは、本発明に係る核酸をクローニング又は発現するのに使用される。
【０１３４】
本発明の状況において使用することができる好ましいベクターの例としては、以下が挙げられる。
・WO2013/061010に記載されているようなベクター(特に好ましい)であって、以下の調節エレメント:hCMVieウイルスエンハンサーであって、配列番号220のヌクレオチド配列、又は配列番号220と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有し、本質的に転写活性化特性を有する、前記エンハンサー、及びサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)プロモーター領域であって、配列番号221のヌクレオチド配列、又は配列番号221と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有し、本質的にプロモーター活性を有する、前記プロモーター領域を含む少なくとも1つの転写単位を含む、ベクター。
有利には、ベクター中に含まれる転写単位は、以下の2つの追加の成分の少なくとも1つを更に含む:
○詳細には、以下からなる群:
・配列番号222のヌクレオチド配列、又は配列番号222と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、HTLV-1ウイルスのロングターミナルリピート(LTR)調節(R)領域、
・配列番号223のヌクレオチド配列、又は配列番号223と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、NF-κΒ抑制因子(NRF)遺伝子の5'UTR、
・配列番号224のヌクレオチド配列、又は配列番号224と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、真核開始因子4GI(eIF4GI)遺伝子の5'UTR
より選択される、プロモーター領域の下流に位置する5'非翻訳領域(5'UTR)であって、前記核酸は、前記配列番号222、223、224と少なくとも70%の配列同一性を有し、本質的にmRNA安定化及び翻訳促進特性を有する、5'UTR。
○詳細には、以下からなる群:
・配列番号225のヌクレオチド配列、又は配列番号225と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、延長因子1α(EF1α)遺伝子のイントロン、
・配列番号226のヌクレオチド配列、又は配列番号226と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、マウスROSAのイントロン、
・配列番号227のヌクレオチド配列、又は配列番号227と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、HTLV-1ウイルスの5'LTRのイントロン、
・配列番号228のヌクレオチド配列、又は配列番号228と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、pCI-neoのイントロン、
・配列番号229のヌクレオチド配列、又は配列番号229と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、ユビキチン遺伝子のイントロン、
・配列番号230のヌクレオチド配列、又は配列番号230と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、ヒトROSAのイントロン
より選択される、プロモーター領域の下流及び翻訳開始部位の上流に位置するイントロン。
有利には、ベクター中に含まれる転写単位は、hCMVieウイルスエンハンサー、CDK9のプロモーター領域、eIF4GI遺伝子の5'UTR及びEF1α遺伝子のイントロンを含み、配列番号231のヌクレオチド配列を有する(「HKgenEFss」ベクター)。
・WO2013/117871に記載されているようなベクターであって、以下の調節エレメント:
○hCMVieウイルスエンハンサーであって、配列番号232のヌクレオチド配列、又は配列番号232と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有し、本質的に転写活性化特性を有する、前記エンハンサー、
○β-アクチンプロモーター領域であって、配列番号233のヌクレオチド配列、又は配列番号233と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有し、本質的にプロモーター活性を有する、前記プロモーター領域、及び
○前記プロモーター領域の下流及び翻訳開始部位の上流に位置する核酸であって、以下:
・配列番号234のヌクレオチド配列、又は配列番号234と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、HTLV-1ウイルスの5'ロングターミナルリピート(LTR)の調節(R)領域、
・配列番号235のヌクレオチド配列、又は配列番号235と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、NF-κΒ抑制因子(NRF)遺伝子の5'UTR、
・配列番号236のヌクレオチド配列、又は配列番号236と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、真核開始因子4GI(eIF4GI)遺伝子の5'UTR
から選択される少なくとも1つの5'非翻訳領域(5'UTR)を含み、前記核酸は、配列番号234、配列番号235又は配列番号236によって表される配列の1つと少なくとも70%の配列同一性を有し、本質的にmRNA安定化及び翻訳促進特性を有する、前記核酸
を含む少なくとも1つの転写単位を含む、ベクター。
ベクター中に含まれる転写単位は、詳細には、以下:
○配列番号237のヌクレオチド配列、又は配列番号237と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、延長因子1α(EF1α)遺伝子のイントロン、
○配列番号238のヌクレオチド配列、又は配列番号238と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、マウスROSAのイントロン、
○配列番号239のヌクレオチド配列、又は配列番号239と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を有する、ヒトROSAのイントロン
からなる群より選択されるイントロンであって、
(i)5'UTRの下流及び翻訳開始部位の上流、又は
(ii)プロモーターの下流及び5'UTRの上流、又は
(iii)翻訳開始部位の後及びコード配列内、又は
(iv)コード配列の終止コドンからポリアデニル化シグナルの間
に配置される、前記イントロンを更に含んでいてもよい。
有利には、ベクター中に含まれる転写単位は、hCMVieウイルスエンハンサー、β-アクチンプロモーター領域、HTLV-1ウイルスの5'UTR(U1)及びeIF4GI遺伝子の5'UTR(U3)を含み、配列番号240のヌクレオチド配列を有する。
【０１３５】
また本発明は、本発明に係る少なくとも1つの核酸又は本発明に係るベクターを含む、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物にも関する。
【０１３６】
宿主細胞は、原核又は真核生物の起源由来であってもよく、詳細には細菌、昆虫、植物、酵母又は哺乳類細胞から選択されてもよい。次いで、宿主細胞を好適な条件下で培養することによって、本発明に係る抗体、機能的なフラグメント又は誘導体を産生してもよい。本発明に係る宿主細胞は、とりわけ、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の重鎖及び軽鎖のための発現ベクターによって細胞株を形質転換すること、及び得られた様々な細胞クローンを分離することにより得ることができる。形質転換細胞株は、好ましくは真核生物の起源由来であってもよく、詳細には昆虫、植物、酵母又は哺乳類細胞から選択されてもよい。抗体産生に好適な細胞株としては、とりわけ、SP2/0;YB2/0;IR983F;ヒト骨髄腫Namalwa;PERC6;CHO細胞株、とりわけCHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-、CHO-DP12、CHO DUKX-B11、CHO DG-44、又はFUT8遺伝子及び/又はGMD遺伝子をコードする両方の対立遺伝子が欠失したCHO細胞株;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt-4;COS-7;293-HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0-Ag14、P3X63Ag8.653、アヒル胚細胞株EB66(登録商標)(Valneva社);ラット肝癌細胞株H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)(WO2012/041768を参照)、NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)(WO2008/028686を参照)から選択される細胞株が挙げられる。
【０１３７】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、目的の遺伝子(ここでは再アレンジメントされた抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子)を受精卵に直接注入することにより得てもよい(Gordonら-1980)。トランスジェニック非ヒト動物はまた、目的の遺伝子(ここでは抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再アレンジメントされた遺伝子)を胚幹細胞に導入して、キメラ凝集方法又はキメラ注射方法によって動物を調製することにより得てもよい(Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)を参照)。トランスジェニック非ヒト動物はまた、目的の遺伝子(ここでは抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再アレンジメントされた遺伝子)が導入された核を除核した卵に移植するクローニング技術により得てもよい(Ryanら-1997;Cibelliら-1998、WO00/26357)。目的の抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物は、上記の方法によって調製することができる。次いでトランスジェニック動物に抗体が累積されて、とりわけ動物の乳汁又は卵から回収することができる。トランスジェニック非ヒト動物の乳汁で抗体の産生に関して、調製方法は、WO90/04036、WO95/17085、WO01/26455、WO2004/050847、WO2005/033281、WO2007/048077にとりわけ記載されている。乳汁から目的のタンパク質を精製するための方法も公知である(WO01/26455、WO2007/106078を参照)。目的のトランスジェニック非ヒト動物としては、とりわけ、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ウシ(とりわけ雌ウシ)、及び家禽(とりわけニワトリ)が挙げられる。
【０１３８】
本発明に係るトランスジェニック植物は、抗体産生を可能にするあらゆる植物から選択され得る。トランスジェニック植物で多数の抗体がすでに生産されており、目的の抗体を発現するトランスジェニック植物を得て、抗体を回収するのに必要な技術は、当業者周知である(Stogerら-2002、Fisherら-2003、Myら-2003、Schillbergら-2005を参照)。例えば短鎖干渉RNAにより、天然ヒト抗体(キシロース非含有)の糖付加に類似しているが追加でわずかなフコシル化を有する糖付加を得るために、植物で得られた糖付加に影響を与えることも可能である(Forthalら-2010)。
【０１３９】
抗体の治療用途
また本発明は、医薬品として使用するための、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体にも関する。
【０１４０】
第1の実施形態において、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、CD303抗原を発現する造血器腫瘍の処置又は予防で使用される。これは、とりわけ表現型CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、CD56+の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)のケースである。
【０１４１】
第2の実施形態において、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患の処置又は予防で使用される。本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、pDCが関与する疾患、より詳細にはpDCによるIFN-α分泌が関与する疾患の処置又は予防で使用される。詳細には、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体は、有利には、pDCの役割が確立されている以下の疾患:アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、1b型糖尿病、自己免疫性血小板減少症(又は血小板減少症)(とりわけ特発性血小板減少性紫斑病、又はITP)、全身性強皮症(進行性全身性強皮症又は全身性硬化症とも称される)、リウマチ様関節炎の処置又は予防で使用される(Wollenbergら-2002及びCao-2014を参照)。
【０１４２】
本発明はまた、以下にも関する:
・CD303抗原を発現する造血器腫瘍、とりわけ表現型CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、CD56+の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)を処置又は予防するための医薬品を調製するための、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の使用。
・炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患、詳細には上述の疾患を処置又は予防するための医薬品を調製するための、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の使用。
【０１４３】
本発明はまた、以下にも関する:
・CD303抗原を発現する造血器腫瘍、とりわけ表現型CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、CD56+の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)の処置又は予防における、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の使用。
・炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患、詳細には上述の疾患の処置又は予防における、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の使用。
【０１４４】
本発明はまた、以下にも関する:
・患者におけるCD303抗原を発現する造血器腫瘍、とりわけ表現型CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、CD56+の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)を処置又は予防するための方法であって、前記患者に、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の有効量を投与することを含む、方法。
・患者における炎症性疾患、とりわけ自己免疫疾患、詳細には上述の疾患の1つを処置又は予防するための方法であって、前記患者に、本発明に係る抗体、それらの機能的なフラグメント又は誘導体の有効量を投与することを含む、方法。
【０１４５】
「処置」は、臨床的又は生化学的なレベルで観察された患者の疾患の改善を意味する。
【０１４６】
「予防」は、疾患の発病を予防するか若しくは遅延させること、又は疾患に関連する臨床的又は生化学的な症状発現の強度を低減させることを意味する。
【０１４７】
当業者は、それらの一般知識に基づき、どの臨床的又は生化学的な症状発現が所与の疾患に関連があるか、及びどれが、改善される(処置)又は予防される、遅延される、又は強度が低減される(予防)可能性が高いかを、どのように決定するかを認識している。CD303抗原を発現する造血器腫瘍、とりわけ芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)に関して、目的の生物学的なパラメーターは、芽球の数であり得る。炎症性疾患に関して、目的の生物学的なパラメーターは、pDCの数、又は炎症に寄与する分子(炎症性サイトカイン、とりわけINFα)の局所又は全身における数であり得る。
【０１４８】
以下の実施例は、本発明を例示することを目的とする。
【実施例】
【０１４９】
(実施例1)
5つのキメラ抗体及び従来技術のヒト化抗体の調製及び構造
IgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有する5つのキメラモノクローナル抗体を生成し、それらの構造を特徴付けた。加えて、その配列が出願WO2014/09339に記載されているヒト化抗体BIIB059を、本発明に係るキメラ抗体と比較するために複製した。
【０１５０】
材料及び方法
マウスハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖のシーケンシング
Macherey-Nagel社からのNucleoSpin RNA IIキット(カラム精製)を使用して各ハイブリドーマからの全RNAを抽出した。
【０１５１】
mRNAをcDNAに変換し、GeneRacerキット(Invitrogen社)を使用して抗体の重鎖及び軽鎖を増幅し、M13ベクターにクローニングした。次いで細菌をM13ベクターで形質転換し、M13配列陽性のクローンを配列決定した。
【０１５２】
重鎖のVH、DH、JHセグメント、並びに軽鎖のVL及びJLセグメントの決定
重鎖及び軽鎖並びに重鎖及び軽鎖CDRの配列によって使用される可変部分、V及びJセグメントを、以下のアドレス:http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgiで入手可能なIMGTのドメインギャップアラインツール(Ehrenmannら-2010及びEhrenmannら-2011を参照)を使用することによって決定した。
【０１５３】
キメラ抗体のための発現ベクターの構築
5つのマウス抗体の可変領域、VH及びVLの配列を、ドブネズミからのコドンの優先的な使用のために最適化した。異種シグナルペプチドMB7をコードする配列を、各抗体の可変領域、VH又はVLをコードする配列の5'末端に追加で導入した。
【０１５４】
ヒト定常部分の配列を、H鎖の場合はApaI/AscI消化(IgG1m1.17)及びカッパ鎖の場合はDraIII/XbaIによって、ヒト抗アカゲザルD抗体(T125)のための発現ベクターCHK622-21から抽出した。
【０１５５】
最後に、同じ鎖の可変及び定常部分を一般的なHKgenEFssベクターにKAPA T4リガーゼを用いたライゲーションによって同時に導入し、ベクターHKBDCA-2-122A2、HKBDCA-2-102E9、HKBDCA-2-104C12、HKBDCA-2-114D11、及びHKBDCA-2-104E10を生成した(図1A〜図1Eを参照)。
【０１５６】
キメラ抗体の産生
ベクターHKBDCA-2-122A2、HKBDCA-2-102E9、HKBDCA-2-104C12、HKBDCA-2-114D11、及びHKBDCA-2-104E10(図1A〜図1Eを参照)をYB2/0細胞にトランスフェクトし、各抗体を産生するクローンを選択して、キメラ抗体を産生した。
【０１５７】
WO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)に対応する抗体の産生
前記特許出願に記載される配列に基づき、重(H)鎖及び軽(K)鎖の配列を、2つのH及びK配列のそれぞれの側にコザック配列及び制限部位を付加することによって合成し、消化/ライゲーションによってそのままクローニングした。
【０１５８】
ヒト化抗体BIIB059を産生するのに使用した発現ベクターは、CHO細胞で抗体を最適に産生することを可能にする、バイシストロン性のベクターである10,835bpのHKgenEFssである(図1F)。重鎖及び軽鎖のクローニングは、2つの逐次工程で行われる。第1の工程は、H鎖を消化/ライゲーションによってNheI/AscIクローニング部位間に挿入して、この鎖のみを含有する中間ベクターを産生することからなる。第2の工程の間、同じ技術によってK鎖をSpeI/XbaIクローニング部位間に挿入する。ライゲーション酵素は、KAPA T4 DNAリガーゼ(Kapa Biosystems社)である。しかしながら、SpeI/XbaI制限部位によって生成された平滑末端によって線形化したプラスミドが環化しないようにするのに、K鎖挿入前の脱リン酸化工程が必要である。
【０１５９】
ヒト化抗体BIIB059は、出願WO2014/09339の条件を満たすためにCHO細胞株からの一過性トランスフェクションによって生産される。この細胞株は、4mMグルタミンが補充されたProCHO4培地で培養される。実験室で、2日ごとに1mL当たり細胞2×105個から3×105個で細胞株を維持する。トランスフェクションに使用された溶液は、緩衝液(OptiPRO)及びトランスフェクション試薬(Freestyle Max試薬)である。
【０１６０】
産生されたら、抗体BIIB059を、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１６１】
結果
上記のTable 2(表2)に、5つの抗体の重鎖VH、DH、JHセグメント、並びに軽鎖VL及びJLセグメントに関するデータを提示する。以下のことが特筆される:
・以下のTable 18(表18)で例示されるように、ファミリー1の2つの抗体(122A2及び104C12)の共通点は、同じVHセグメント(IGHV1S137*01)の使用に加えて、同じファミリーのVL(IGKV10-96*01/IGKV10-96*02)及びJL(IGKJ1*01/IGKJ1*02)セグメントの使用である。したがってこれらの2つの抗体は、類似の構造を有する。
・ファミリー2の3つの抗体(102E9、114D11及び104E10)の共通点は、以下のTable 18(表18)で例示されるように、同じVH、JH、VL及びJLセグメントの使用である。したがってこれらの3つの抗体は、類似の構造を有する。
【０１６２】
【表１８】
2018511328.tif 000038
【０１６３】
更に、上記のTable 3(表3)に、5つの抗体のCDR及び可変領域のアミノ酸配列に関するデータを提示する。以下のことが特筆される:
・ファミリー1の2つの抗体(122A2及び104C12)は、同じCDR1-H及びCDR2-L配列を有し、加えて高度に類似したCDR2-H、CDR1-L及びCDR3-L配列(1又は2アミノ酸のみの差)を有する。以下のTable 19(表19)で例示されるように、CDR3-H配列でさえも高い相同性を有する(11アミノ酸のうち5つが共通)。これは、これらの2つの抗体が極めて類似した構造を有することを立証する。
・ファミリー2の3つの抗体(102E9、114D11及び104E10)は、同じCDR2-L配列を有し、加えて高度に類似したCDR1-H、CDR2-H、CDR1-L及びCDR3-L配列(1つのアミノ酸のみの差)を有する。以下のTable 19(表19)で例示されるように、CDR3-H配列でさえも、高い相同性を有する(14アミノ酸のうち12個が共通)。これは、これらの3つの抗体が実に高度に類似した構造を有することを立証する。
【０１６４】
【表１９】
2018511328.tif 000039
【０１６５】
上記のTable 9(表9)に、5つの抗体の定常領域のアミノ酸配列に関するデータを提示する。
【０１６６】
更に、各抗体の可変領域(VH及びVL)及び定常領域の核酸配列を上記のTable 12(表12)及びTable 15(表15)に提示する。
【０１６７】
最後に、5つの抗体のための発現ベクターのマップを図1A〜図1Eに提示する。
【０１６８】
結論
IgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有し、CD303抗原に対して作製された5つのキメラモノクローナル抗体を生成し、それらの構造を特徴付けた。2つの抗体(122A2及び104C12)は類似の構造を有し、抗体サブファミリー(ファミリー1)を形成すること、及び他の3つの抗体(102E9、114D11及び104E10)も構造的に極めて類似しており、別の抗体サブファミリー(ファミリー2)を形成することがわかる。
【０１６９】
出願WO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)の配列を有するヒト化抗体もCHO細胞中で産生した(出願WO2014/09339に記載の通りに)。
【０１７０】
次いでこれらの抗体をそれらの生物学的特性に関して特徴付けた(実施例2を参照)。
【０１７１】
(実施例2)
5つのキメラ抗体及び出願WO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)に対応する抗体の生物学的特性
実施例1で生成されたIgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有し、CD303抗原に対して作製された5つのキメラモノクローナル抗体を、様々な生物学的特性に関して試験した。特定のケースにおいて、これらの特性を、出願WO2014/09339に記載される抗体(BIIB059)に対応する抗体(同じ配列及び同じ産生株)の特性と比較した。
【０１７２】
材料及び方法
試験された抗体
試験された抗体は、実施例1に記載した通りに調製されたものである。
【０１７３】
抗原結合
CD303+細胞(CD303を過剰発現する、Fcγ鎖-CD303 Jurkat、CAL-1、及びCAL-1)への結合
様々な抗原密度でCD303を発現する様々な型の細胞を使用した:
1.CD303分子約25,000〜35,000個/細胞を発現する、Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞、
2.細胞1個当たり約3,000〜6,000個のCD303分子を発現する、Maeda Tら(Int J Hematol.2005年2月;81(2):148〜54)に記載されるようなCAL-1細胞、
3.高いCD303発現、細胞1個当たり約40,000〜50,000個のCD303分子のために選択された、CD303発現ベクターでトランスフェクトされたCAL-1細胞。
【０１７４】
CD303を発現する細胞及び抗体は、希釈剤(PBS+1%FCS)中で調製される。
【０１７５】
1×105個の細胞を、100μLの抗体(抗CD303又は陰性対照)と共に、様々な濃度(0〜40μg/mL、最終濃度)で4℃で30分インキュベートする。
【０１７６】
希釈剤で洗浄した後、4℃で45分、フィコエリトリン(PE)をカップリングしたヤギ抗マウスIgG F(ab')2フラグメント(希釈剤で1:100に希釈した100μL)を添加することによって、抗体を可視化する。次いで細胞を洗浄して、フローサイトメトリー(FC500、Beckman Coulter)によって分析する。
【０１７７】
FcγRIIIa(CD16a)結合
NK細胞を、末梢血単核細胞(PBMC)から単離し、次いで、10μL/試験で、様々な濃度の試験された抗体(0から100μg/mL)と共にインキュベートし、同時にフィコエリトリンをカップリングしたマウス抗体(3G8-PE、Beckman Coulter社)と共にインキュベートした。
【０１７８】
洗浄後、3G8-PEのNK細胞によって発現されたCD16への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。平均蛍光強度(MFI)値はパーセンテージとして表され、100%は、3G8-PE抗体単独を用いて得られた値であり、0%は、3G8-PEの非存在下で得られた値である。
【０１７９】
IC50値(3G8結合の50%阻害を誘導するのに必要な抗CD303抗体の濃度)は、PRISMソフトウェアを使用して計算される。
【０１８０】
ADCC
Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞(細胞35,000個/ウェル)を、96ウェルの平底プレート中、NK細胞及び増加する濃度の抗CD303抗体と共に37℃で4時間インキュベートする。インキュベーション後、上清を収集する。抗CD303抗体により誘導された標的細胞の溶解を、溶解した標的細胞により上清に放出された細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)酵素を定量することによって、発色により測定する(細胞傷害検出キット(LDH)、Roche Diagnostics社)。
【０１８１】
溶解のパーセンテージは、以下の式:
%溶解=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]
に従って計算され、式中、ER及びSRは、それぞれLDHの実験上の放出(ER)及び自発的な放出(SR)を表し、NCは、NK細胞の天然の細胞傷害を表す。
【０１８２】
結果(%溶解)は、抗体の希釈係数の関数として表される。各抗体につき、「50%活性」値は、この抗体で得られたプラトー値の50%を誘導するのに必要な抗体の希釈係数に対応する。この値は、PRISMソフトウェアを用いて計算された。
【０１８３】
IFN-α分泌の阻害
細胞の調製
末梢血単核細胞(PBMC)を、健康なドナーの末梢血からフィコール密度勾配によって単離する。pDCを、陰性枯渇(Miltenyi Biotec社-形質細胞様樹状細胞単離キット、ヒト)によって精製する。細胞を計数し、希釈剤(RPMI1640+10%ウシ胎児血清(FCS))中に細胞2×105個/mLで再懸濁する。
【０１８４】
精製されたpDCによるIFN-α分泌
次いでこの懸濁液(205μL/ウェル)を24ウェルの平底培養プレートに移す。
【０１８５】
CpG ODN(10μM、50μL)、IL-3(100ng/mL、50μL)、抗体(100μg/mL、50μL)及び希釈剤(100μL)を添加する。次いでプレートを37℃、7%CO2で一晩インキュベートする。
【０１８６】
IFN-αアッセイ
各ウェルの培養上清を収集し、FlowCytomix Human IFN-αキット(Bender MedSystems BMS216FF+ベーシックキットBMS8420FF)を使用することによるフローサイトメトリーによってアッセイする。
【０１８７】
各サンプルの阻害のパーセンテージを、陰性対照(CPGによって活性化されたpDC、抗CD303モノクローナル抗体非含有)に関して評価する。
【０１８８】
20%未満の阻害を生じるサンプルを非阻害剤とみなし、20%から75%の間の阻害を生じるものを弱い阻害剤とみなし、75%より大きい阻害を生じるものを強い阻害剤とみなす。
【０１８９】
TNF-α分泌の阻害
細胞の調製
末梢血単核細胞(PBMC)を、健康なドナーの末梢血からフィコール密度勾配によって単離する。pDCを、陰性枯渇(Miltenyi Biotec社-形質細胞様樹状細胞単離キット、ヒト)によって精製する。細胞を計数し、希釈剤(RPMI1640+10%ウシ胎児血清(FCS))中に細胞2×105個/mLで再懸濁する。
【０１９０】
精製されたpDCによるTNF-α分泌
次いでこの懸濁液(205μL/ウェル)を24ウェルの平底培養プレートに移す。
【０１９１】
CpG ODN(10μM、50μL)、IL-3(100ng/mL、50μL)、抗体(100μg/mL、50μL)及び希釈剤(100μL)を添加する。次いでプレートを37℃、7%CO2で一晩インキュベートする。
【０１９２】
TNF-αアッセイ
各ウェルの培養上清を収集し、FlowCytomix Human IFN-αキット(Bender MedSystems BMS216FF+ベーシックキットBMS8420FF)を使用することによるフローサイトメトリーによってアッセイする。
【０１９３】
各サンプルの阻害のパーセンテージを、陰性対照(CPGによって活性化されたpDC、抗CD303モノクローナル抗体非含有)に関して評価する。
【０１９４】
20%未満の阻害を生じるサンプルを非阻害剤とみなし、20%から75%の間の阻害を生じるものを弱い阻害剤とみなし、75%より大きい阻害を生じるものを強い阻害剤とみなす。
【０１９５】
補体依存性細胞傷害(CDC)活性の測定
Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞を、増加する濃度の抗CD303抗体(0から5,000ng/mL)と共に、源として乳児ウサギ血清(1:10希釈)の存在下でインキュベートする。
【０１９６】
37℃で2時間インキュベートした後、溶解した標的細胞により上清に放出された細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)酵素の量を、細胞傷害検出キット(LDH)(Roche Diagnostics社、製品番号11644793001)で測定する。
【０１９７】
結果
抗原結合
Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞への結合
図2A及び以下のTable 20(表20)に、本発明に係る抗体の、Fcγ鎖-CD303 Jurkat細胞上におけるCD303抗原への結合に関する試験の結果を提示する。
【０１９８】
【表２０】
2018511328.tif 000040
【０１９９】
用量-応答モデリングの後に計算されたこれらの相対的なKdの結果及びBmax値は、抗体を、以下の2つのグループに分類することを可能にする:第1のグループは、抗体104C12(Bmax:MFI=27.7、Kd=0.17μg/mL)及び122A2(Bmax:MFI=26.2、Kd=0.13μg/mL)を含有し、これは、第2のグループの抗体:114D11(Bmax:MFI=24.7、Kd=3.9μg/mL)、104E10(Bmax:MFI=23.7、Kd=6μg/mL)及び102E9(Bmax:MFI=24.9、Kd=3.8μg/mL)に匹敵し、それより高い相対的な親和性を表す。
【０２００】
これらの結果から、生成された全てのキメラ抗体は、それらにとって特異的なJurkat細胞の表面上で発現されたCD303抗原と効率的に結合することが示される。
【０２０１】
CAL-1細胞への結合
図2B及び以下のTable 21(表21)に、本発明に係るキメラ抗体の、CAL-1細胞上のCD303抗原への結合に関する試験の結果を提示する。
【０２０２】
【表２１】
2018511328.tif 000041
【０２０３】
用量-応答モデリングの後に計算されたこれらの相対的なKdの結果及びBmax値は、抗体を、以下の2つのグループに分類することを可能にする:第1のグループは、抗体104C12(Bmax:MFI=29.02、Kd=0.34μg/mL)及び122A2(Bmax:MFI=25.2、Kd=0.20μg/mL)を含有し、これは、第2のグループの抗体:114D11(Bmax:MFI=30.1、Kd=1.7μg/mL)、104E10(Bmax:MFI=29.2、Kd=1.93μg/mL)及び102E9(Bmax:MFI=30.47、Kd=1.81μg/mL)に匹敵し、それより高い相対的な親和性を表す。
【０２０４】
これらの結果はとりわけ、Jurkat-CD303細胞への結合に関する結果と相関する。
【０２０５】
別の実験で、キメラ抗体122A2及び102E9並びにヒト化抗体BIIB059のCAL-1細胞結合を試験した。図2C及び以下のTable 22(表22)に、結果を提示する。
【０２０６】
【表２２】
2018511328.tif 000042
【０２０７】
これらのデータから、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9(詳細にはキメラ抗体122A2)は、ヒト化抗体BIIB059より強くCAL-1細胞の表面上のCD303抗原に結合することが示される。
【０２０８】
CD303抗原を過剰発現するCAL-1細胞への結合
図2D及び以下のTable 23(表23)に、本発明に係るキメラ抗体122A2及び102E9並びにヒト化抗体BIIB059の、CD303発現ベクターでトランスフェクトされCD303分子約40,000〜50,000個/細胞(又は野生型CAL-1細胞より約10倍多く)を発現するCAL-1細胞上におけるCD303抗原への結合に関する試験の結果を提示する。
【０２０９】
【表２３】
2018511328.tif 000043
【０２１０】
これらのデータからも、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9(詳細にはキメラ抗体122A2)は、ヒト化抗体BIIB059より強く、CD303発現ベクターでトランスフェクトされCD303分子約40,000〜50,000個/細胞を発現するCAL-1細胞の表面上のCD303抗原に結合することが示される。
【０２１１】
FcγRIIIa(CD16a)結合
図3Aに、本発明に係る5つのキメラ抗体のFcγRIIIa(CD16a)への結合に関する試験の結果を提示する。それによれば、本発明に係るキメラ抗体は全て、最適化された結合親和性でCD16aと効率的に結合することが可能であることが示される。これらは、以下のTable 24(表24)で例示されるように、18.08から45.02μg/mLの範囲の、更には18μg/mL未満もの、CHO細胞で産生された抗体(リツキサン)のIC50値より低いIC50値を有する。
【０２１２】
【表２４】
2018511328.tif 000044
【０２１３】
図3B及び以下のTable 25(表25)に、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9、並びにヒト化抗体BIIB059のFcγRIIIa(CD16a)結合に関する試験の結果を提示する。それによれば、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9は、抗体リツキサン及びBIIB059よりかなり強くFcγRIIIa(CD16a)に結合することが示される。
【０２１４】
【表２５】
2018511328.tif 000045
【０２１５】
ADCC
図4A及び以下のTable 26(表26)に、Fcγ鎖-CD303 Jurkat標的細胞における本発明に係る5つのキメラ抗体のADCCに関する試験の結果を提示する。
【０２１６】
【表２６】
2018511328.tif 000046
【０２１７】
これらの結果から、5つの抗CD303キメラ抗体は、Jurkat-CD303細胞の溶解を誘導する(Emax約40%)ことが示される。104C12(EC50:0.21ng/mL)、122A2(EC50:0.16ng/mL)、114D11(EC50:3.6ng/mL)、102E9(EC50:3.4ng/mL)及び104E10(EC50:8.3ng/mL)に関するEC50値は、高親和性を有する抗体は、ADCCに関して、より低い親和性を有する抗体より有効であることを示唆する。
【０２１８】
図4B及び以下のTable 27(表27)に、CAL-1標的細胞上における関連のない抗体(抗第VIII因子阻害剤抗体、抗Id FVIII)、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9、並びにヒト化抗体BIIB059のADCCに関する試験の結果を提示する。
【０２１９】
【表２７】
2018511328.tif 000047
【０２２０】
これらの結果から、ヒト化抗体BIIB059とは異なり、本発明に係る2つのキメラ抗体、122A2及び102E9は、CD303抗原を非常に弱く発現するCAL-1細胞の溶解を誘導することが可能なことが示される。更に、本発明に係るキメラ抗体122A2のADCC応答が本発明に係るキメラ抗体102E9と比較してより強いことも、高親和性を有する抗体は、ADCCに関して、より低い親和性を有する抗体より有効であることを示唆する。
【０２２１】
IFN-α分泌の阻害
図5に、活性化されたpDCによるIFN-α分泌の阻害に関する試験の結果を提示する。
【０２２２】
これらの結果から、5つの抗CD303キメラ抗体は、CpGによって活性化されたpDCによって分泌されたIFN-αの阻害及び試験された両方の濃度(10及び0.1μg/mL)での上記阻害を誘導することが示される。0.1μg/mLの濃度において、IFN-αアッセイは、他の3つの抗体(114D11、102E9、104E10)と比較した抗体104C12及び122A2の利点を示す。
【０２２３】
TNF-α分泌の阻害
図6に、活性化されたpDCによるTNF-α分泌の阻害に関する試験の結果を提示する。
【０２２４】
これらの結果から、10μg/mLにおける5つの抗CD303キメラ抗体は、CpGによって活性化されたpDCによって分泌されたTNF-αの阻害を誘導することが示される。
【０２２５】
補体依存性細胞傷害(CDC)活性
図7に、CDC試験の結果を提示する。それによれば、5つのキメラ抗体は実際にCDC活性を有することが示される。
【０２２６】
(実施例3)
キメラ抗体122A2及び102E9に由来するヒト化抗体の調製及び特徴付け
材料及び方法
ヒト化配列の定義
IMGT.orgのデータベース及びモデリングを利用したインシリコにおけるヒト化の作業に取り組み、マウス相同体の代わりに「ヒトアミノ酸」を含有する重鎖及び軽鎖の可変部分の様々な配列を定義した。
【０２２７】
各VH又はVLドメインにつき、元のキメラ抗体のマウス配列に最も近いアミノ酸配列を有するVH又はVLドメインをコードするヒト遺伝子を決定した。以下のTable 28(表28)に、キメラ抗体122A2及び102E9に関して決定された最も近いヒトVH及びVL遺伝子を示す。
【０２２８】
【表２８】
2018511328.tif 000048
【０２２９】
各VH及びVLドメインにつき、元のキメラ抗体のマウスアミノ酸配列と最も近いヒト遺伝子のアミノ酸配列とのアライメントに基づいて、2つのアミノ酸配列(マウス/ヒト)間の異なる変異位置を決定し、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸で置き換えた様々な数の変異を取り込んだ数々のマウス配列を生成した。
【０２３０】
したがって、抗体122A2及び102E9のそれぞれにつき、3つのバージョンの各重鎖可変部分(Hha、Hhb及びHhc)及び軽鎖可変部分(Kha、Khb及びKhc)を決定した。抗体122A2に関して、軽鎖可変部分(Khd)の第4のバージョンが追加される。これらの様々な配列は、以下のTable 29(表29)に記載されるように、元のキメラ抗体のVH及びVL領域と比べて様々な数の変異を含む:
【０２３１】
【表２９】
2018511328.tif 000049
【０２３２】
発現ベクターの調製
様々な配列を、「ストリング」と称されるドブネズミにコドン最適化された直鎖状の二本鎖DNAとして合成した。
【０２３３】
ヒト化抗CD303抗体をコードする発現ベクターの構築は、In-Fusion(登録商標)HDクローニングキット(Clontech(登録商標)Laboratories)による相同組換えによって行われる。各Ig重鎖及び軽鎖につき選択された発現ベクターは、市販のベクターpCEP4(Invitrogen社)である。これは、特定の試験を行うために十分な量の抗体を迅速に産生するのに使用される細胞株であるヒト細胞株FreeStyle HEK-293と組み合わせて使用される場合、生産性が高いという利点を有する。pCEP4は、モノシストロニックであり、10,186bpのサイズを有し、目的の遺伝子を発現するのに必要な全てのエレメント、すなわち、アンピシリン耐性遺伝子、複製起点(pUC起点)、CMVプロモーター及びSV40ポリAを有する(図8Aを参照)。目的の配列は、NheI制限部位とXhoI制限部位との間、プロモーターの下流にクローニングされる(図8B〜図8Nを参照)。まず、必要な場合、ベクターを開くためにこれらの酵素による消化が行われる。次いで線形化したベクターを精製するのにNucleoSpinプラスミドキット(Macherey-Nagel社)を使用した精製が必要であり、10,163bpに低減させる。
【０２３４】
可変部分の合成と平行して、マトリックスとして、ドブネズミに最適化されたH及びK鎖の定常部分を含有するベクターCHK622-21を使用したPCR増幅により、重鎖及び軽鎖の定常部分を調製した。このPCRは、高忠実度のDNAポリメラーゼであるHerculase II Fusion(Agilent Technologies社)と、組換えクローニングを可能にするためにそれらの3'末端におけるクローニングのための制限部位、加えてベクターに相補的な15bpが定常部分に付加されるように定義されたプライマーとを使用して行われた。PCRが行われたら、目的のフラグメントが実際に増幅されたことを確認するために、更に前記フラグメントを回収する手段として、精製ゲル(1.25%低アガロース)を泳動する。低電圧下で精製ゲルを通過するサンプルの移動が起こり、DNAフラグメントの優れた分離がもたらされる。
【０２３５】
全ての遺伝子エレメントが調製されたら、これらは、In-Fusion(登録商標)キットにより組み立てることができる。したがって、混合物、すなわち線形化したベクター(0.5μL)、50ng/μLの初期濃度の「ストリング」(1μL)、及び重鎖又は軽鎖の定常部分(1μL)を滅菌水で10μLにして、とりわけ高忠実度のPCR酵素CloneAmp(商標)HiFiからなる凍結乾燥した製品を含有するキットのチューブに添加する。次いで混合物を、37℃で15分、次いで50℃で15分インキュベートする。平行して、可変及び定常部分を含まない線形化したベクターのみでのライゲーションを行い、実験のための陰性対照として使用されると予想される。
【０２３６】
次いでベクターを高度にコンピテントな大腸菌(E. coli)NEB5-アルファ細菌にクローニングし、各ベクターの様々なクローンの配列をシーケンシングによって確認した。クローンが配列中で一致することが宣言されたら、選択されたクローンの細菌培養物(300mL)を、それに含有される目的のベクターを精製するために、NucleoBond Xtra EFキット(Macherey-Nagel社)を使用して調製する。得られたプラスミドは、滅菌され、産生株で同時トランスフェクションを行うのに十分な量である。
【０２３７】
FreeStyle HEK-293細胞における抗体の産生
抗体を、FreeStyleヒト胎児腎臓(HEK)-293細胞株からの一過性の同時トランスフェクションによって産生する。この最終産物は、懸濁液中及び血清の非存在下で増殖する能力を有する不死化細胞株である。このHEK株は、8mMグルタミンが補充されたFreestyle F17発現培地(Life Technologies社)中で培養され、組換えタンパク質のより大量でより速い生産性も可能にする。
【０２３８】
同時トランスフェクションの間、実験を検証するのに使用される対照は、トランスフェクションを受けていないHEK細胞の培養物、及びトランスフェクション率を決定するために24時間後に使用されるベクター、蛍光タンパク質GFPをコードするpMAXでトランスフェクトされた細胞株に相当する増殖対照である。DNA、トランスフェクション試薬及び細胞を希釈するのに使用される緩衝液は、OptiMEM(登録商標)(Life Technologies社)である。ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞にベクターを導入することを可能にすると予想されるトランスフェクション試薬(TA)である。1:2の比率のDNAとTA、及び1:3の比率のH鎖を含むベクターとK鎖を含むベクターが観察される。DNA/TA複合体を細胞と接触させた後、37℃で8%CO2と共に振盪することにより後者を培養する。
【０２３９】
同時トランスフェクション後7日間の産生の最後に、細胞培養物を3,000gで15分遠心分離する。産生された抗体を含有する透明化した上清を収集し、その後のCD303タンパク質に関するヒト化抗体の親和性研究を行うための各上清の抗体の量を正確に推測するために、市販のキット、FastELISA(RD-Biotech社)を使用してアッセイする。
【０２４０】
発現ベクターで安定してトランスフェクトされたYB2/0クローンによるキメラ抗体122A2の特定のヒト化誘導体の産生
YB2/0クローンを、キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体122A2H5、122A2H7、122A2H9及び122A2H10をコードする核酸配列を含む発現ベクターで安定してトランスフェクトした。次いで抗体を産生し、上清中のそれらの量をアッセイした。
【０２４１】
HEK株における一過性トランスフェクションに使用されるモノシストロニックなベクターから、軽鎖(122A2H5:pCEP4_Kha_122A2;122A2H9:pCEP4_Khb_122A2;122A2H10:pCEP4_Khb_122A2;122A2H7:pCEP4_Kha_122A2)を、SpeI-XbaI消化によってHKgenEFssベクターに導入して、中間ベクターを得た。次いで、これらの中間ベクターにNheI-AscI消化を行い、重鎖(122A2H5:pCEP4_Hha_122A2;122A2H9:pCEP4_Hha_122A2;122A2H10:pCEP4_Hhb_122A2;122A2H7:pCEP4_Hhc_122A2)を導入した。
【０２４２】
ELISAによる産生された抗体の抗原結合の特徴付け
FreeStyle HEK-293細胞で産生された様々な抗体の結合能力の研究は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって行われる。
【０２４３】
この比色アプローチを使用する技術は、抗原-抗体相互作用を検出して可視化することを可能にする。ELISAの原理は、第1に、MaxiSorpプレートの各ウェルを、10ngの抗原で、このケースではCD303細胞外ドメインでコーティングすることである。後者を供給元であるMybiosourceから購入した。第2に、上清に含有される産生された様々な抗体を全て同じ濃度に希釈し、抗原と接触させて、それらを結合させる。第3の工程は、抗CD303抗体の抗原結合の増幅検出に必要な二次抗体であるHRPコンジュゲート抗ヒト抗体を添加することからなる。最後に、酵素のための基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、又はTMB)を含有する溶液を使用して検出を行う。基質の色の出現は、抗原-抗体複合体の形成を示す。この色の強度は、存在する酵素の量、したがって抗原に結合した試験された抗体の量に比例する。H2SO4(酸)を添加することによって反応を止める。これらの色は、分光光度計を使用して450nmの波長で読み取られる。
【０２４４】
フローサイトメトリーによる産生された抗体の抗原結合の特徴付け
ELISAにより得られた結果を確認する目的で、FreeStyle HEK-293細胞で産生された様々な抗体をフローサイトメトリーにより評価する。フローサイトメトリーは、細胞の環境において、組換え抗体はその抗原に結合することが可能であることを確認すること、したがってELISAにより得られた結果を確認することを可能にする。
【０２４５】
この技術を行うのに使用される細胞株であるCAL-1は、BPDCN患者から得られた形質細胞様樹状細胞の白血病細胞株である。産生された抗体を、上清中でだけでなく、プロテインA-セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー(本明細書では詳述しない)によって精製された形態でも試験した。
【０２４６】
細胞染色のために、細胞及び抗体をPBS/1%FCSで希釈する。100μLの反応物体積で、1×105細胞を、4℃で30分、試験しようとする抗CD303抗体と共に、2つの濃度:0.1μg/mL又は1μg/mLでインキュベートする。このインキュベーションに続いて、数回の洗浄が行われる。次いでこのようにして形成された細胞/抗体複合体を、1:50に希釈した二次抗体、蛍光色素であるフィコエリトリンにカップリングされた抗ヒトIgG Fc F(ab')2と4℃で30分接触させる。細胞を最後に洗浄し、フローサイトメトリー(FC500、Beckman Coulter社)によって、とりわけ平均蛍光強度(MFI)を測定することによって研究する。起こり得る非特異的な結合、例えば、二次抗体と単独で若しくは直接的に接触する細胞、又は試験された抗体を関連のないキメラ抗体(第VIII因子抗イディオタイプ)と置き換える細胞等を消去するために、様々な陰性対照が使用される。最後に、例えば上清(mock)の使用等の他の対照により、後者が膜抗原への抗体の親和性に影響を与えないことを示すことができる。
【０２４７】
IFN-α分泌の阻害
細胞の調製
末梢血単核細胞(PBMC)を、健康なドナーの末梢血からフィコール密度勾配によって単離する。細胞107個/ウェル(200μL)を、1μMのCpG ODN 2216-1(Invivogen社)及び10ng/mLのIL-3(製品番号:130-093-909、Miltenyi Biotec社)の存在下で24ウェルの平底培養プレートに移す。抗CD303又は関連のない抗体を、RPMI10%FCS培地中の様々な濃度(0から1μg/mL)で添加した。次いでプレートを、37℃、7%CO2で一晩インキュベートした。
【０２４８】
IFN-αアッセイ
各ウェルの培養上清を収集し、ヒトIFN-αモジュールセットキット(製品番号:BMS216MST、eBioscience)を使用することによるELISAによってアッセイする。
【０２４９】
Jurkat-CD16細胞によるIL-2分泌の誘導
この試験は、CD16 Jurkat細胞上で発現されたCD16(Fcγ受容体III)に結合し、IL-2分泌を誘導する抗CD303抗体の能力を評価する。
【０２５０】
この試験は、96ウェルプレート中で、抗CD303抗体、CD303を発現する標的細胞、CD16 Jurkat細胞及びホルボールミリステートアセテート(PMA)を接触させることを本質とする。
【０２５１】
37℃で一晩インキュベートした後、プレートを遠心分離し、上清中の分泌されたIL-2の量をアッセイする。
【０２５２】
結果
HEK-293F細胞で産生されたベクターの同時トランスフェクション
2つの候補抗体の様々な代表的なバージョンを産生させるために、ヒト化重鎖及び軽鎖配列を発現するベクターから、様々な重(H)鎖/軽(L又はK)鎖の組合せをHEK-293F細胞中での一過性の同時トランスフェクションによって産生させた。この方式で、以下のものを産生させた(以下のTable 30(表30)を参照):
1.ハイブリッド抗体(2つのIg鎖の1つはヒト化され、他方はキメラである)、及び
2.ヒト化抗体。
【０２５３】
【表３０】
2018511328.tif 000050
【０２５４】
36個の分子のセットを産生するために様々な一過性の同時トランスフェクションを行う間、1日目にベクターpMAXを使用してトランスフェクション効率を決定した。
【０２５５】
7日目における産生の最後に、産生されたタンパク質を含有する上清を収集し、遠心分離し、ろ過して、最終的に産生されたIgGにおけるタイターを測定するためにアッセイする(以下のTable 31(表31)及びTable 32(表32)を参照)。このようにして得られた濃度は、H鎖及びK鎖のタイプ、すなわち、産生された抗体の様々なバージョンが有するキメラ又はヒト化されたH鎖及びK鎖のタイプに応じて様々である。
【０２５６】
【表３１】
2018511328.tif 000051
【０２５７】
【表３２】
2018511328.tif 000052
【０２５８】
抗体濃度は、産生された組合せに加えて、H及び/又はK鎖(ヒト化又はキメラ)のタイプにも依存することを特筆することができる。この状況において、キメラ抗体122A2及び102E9の生産性、加えてハイブリッドのほとんど(上記で示されたような、キメラH又はK鎖及びヒト化H又はK鎖の組合せ)の生産性は、残りの分子よりかなり低い。この観察は、十分な細胞発現には不向きなキメラH及びK鎖の発現に関する。
【０２５９】
キメラ抗体をヒト化抗体から区別するものは、変異したアミノ酸であり、生産性における変動は、固有に数個のアミノ酸に依存する。
【０２６０】
したがって、102E9に由来する抗体に関して、キメラ重鎖又は軽鎖を有するハイブリッド抗体及びHhc重鎖を有するヒト化抗体(102E9H7、102E9H11及び102E9H15)は全て、より低い生産性を有する。
【０２６１】
122A2に由来する抗体のケースにおいて、これは、より低い生産性を生じるキメラK及びヒト化H Hha鎖である。キメラ抗体122A2は、そのハイブリッド及びヒト化誘導体のうち所定のものと比較して最も低い生産性を有することが見出されている。偶然にも、ヒト化は、122A2H10(Hhb、Khb)のケースにおいて体積当たりのタイターを100倍にも増加させることを可能にした。
【０２６２】
最後に、ヒト化抗体122A2は、全体的にヒト化抗体102E9より優れて産生されることが特筆される。これは、同じアイソタイプの抗体の発現が、それらの一次配列、主としてそれらの可変部分に高度に依存していることを立証する。
【０２６３】
ELISAによる産生された抗体の抗原結合の特徴付け
産生後に収集された培養上清でELISAを行った。まず、全てのサンプルが同じ条件下になるように、これらを全て同じ濃度に希釈する。更に、最初の希釈は、トランスフェクションの間増殖対照として使用される細胞培養物から遠心分離されろ過された上清を使用してなされる。これらの培養物は抗体を発現せず、したがって「mock」培養物と称される。次いでサンプルを、MaxiSorp 96ウェルプレートで、PBS、4%BSA及び0.05%トウィーンを含有する緩衝液を使用して半分に希釈する。
【０２６４】
産生された全ての抗体は、122A2又は102E9に由来するかどうかにかかわらず、分光光度法によって読み取った場合にその強度が定量可能な色のシグナルを生じた。これは、CD303細胞外ドメインに特異的に結合する様々な抗体の能力であると解釈することができる。しかしながら、抗原ごとに親和性の差があり、これはOD450の差として表される。
【０２６５】
したがって、産生された各抗体につき、抗体濃度の関数としてOD450をグラフ表示することが可能となった。結果は、プラトーに至る対数期を有する二相曲線である。このグラフ表示は、試験された抗体及びそれから誘導されたキメラ抗体を、CD303抗原へのそれらの親和性の関数として分類することを可能にした。
【０２６６】
102E9に由来する抗体のケースにおいて、抗体を、各ウェル中に1.25ng/mLから20ng/mLの範囲で堆積させた。OD450シグナルの飽和は、約10ng/mLの抗体濃度として表される。図9は、様々なヒト化抗体で得られた結果を示す。5ng/mLの濃度を使用して、ヒト化抗体を分類する(図10)。
【０２６７】
CD303抗原に加えてキメラ抗体に結合するヒト化抗体はない。それにもかかわらず、全てのヒト化抗体が、CD303抗原に結合する適度な能力を保存する。ヒト化抗体102E9H10は、全てのヒト化抗体のなかで最良のCD303抗原結合能力を有する。元のキメラ抗体、102E9と比較して、約20%しか結合の損失がないことが表される(図10)。3つの他のヒト化抗体、102E9H6、102E9H7及び102E9H9もまた、参照キメラ抗体に類似した結合能力を有する。これらは、それぞれ73%(102E9H6)、76%(102E9H7)及び71%(102E9H9)のCD303細胞外ドメイン結合能力を有する。
【０２６８】
122A2に由来する抗体のケースにおいて、試験された抗体濃度は、1.75から10ng/mLの範囲である。使用された対照は、以前と同じもの:上清単独(mock)及びキメラ抗体であり、ここでは122A2である。図11は、様々なヒト化抗体で得られた結果を示す。5ng/mLの濃度を使用して、ヒト化抗体を分類する(図12)。
【０２６９】
試験された全ての抗体は、CD303細胞外ドメインへの結合が可能である。「上清」陰性対照サンプルは、ゼロに近いOD450を有する。したがって上清に起因する非特異的な結合はない。更に、試験された全てのサンプルで用量応答作用も観察される。様々なヒト化抗体を表す曲線のほとんどが、キメラ抗体122A2の曲線と外観の点で類似している。
【０２７０】
最後に、122A2の数々のヒト化抗体(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10、122A2H11、122A2H14及び122A2H15)は、少なくともキメラ抗体のCD303細胞外ドメイン結合能力に等しく(122A2H11及び122A2H15)、時にはそれより有意に高い(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10、及び122A2H14)CD303細胞外ドメイン結合能力を有すると考えられる。
【０２７１】
産生された抗体の抗原結合のフローサイトメトリーによる特徴付け
更に抗体結合をフローサイトメトリーによっても研究し、ELISAにより得られた結果を確認した。
【０２７２】
抗体102E9に関して、ヒト化抗体102E9H10、102E9H6、102E9H7、102E9H9及びキメラ抗体102E9を選択して、この技術によって特徴付けた。
【０２７３】
抗体122A2に関して、上清中のヒト化抗体122A2H5、122A2H6、122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、122A2H17、122A2H15、ハイブリッド抗体122A2H8、122A2H3及びキメラ抗体122A2を特徴付けのために選択した。122A2H8は、キメラ抗体の親和性より高い親和性を有する最良のハイブリッド抗体を表し、一方で122A2H3は、親抗体の親和性よりかなり低い親和性を有する。選択されたヒト化抗体は、元のキメラ抗体と比較して標的タンパク質により優れた親和性を有するものに属するとみなされる。
【０２７４】
抗体102E9のケースにおいて、ヒト化抗体とキメラ抗体との間にほとんど差はない(ここで例示せず)。
【０２７５】
抗体122A2のケースにおいて、図13に結果を提示する(これは、0.1μg/mLの濃度における試験された各抗体の平均蛍光を表す)。それによれば、特定のヒト化抗体(上清中で試験された)はキメラ抗体122A2と比較してより優れた親和性を示すことが示される。これは、とりわけヒト化抗体122A2H5、122A2H9、102E9H7、及び122A2H10のケースである。これまでにELISAによって少なくともキメラ抗体のキメラ抗体に等しい結合能力を有すると同定され、フローサイトメトリーによって試験された他のヒト化抗体(122A2H14及び122A2H15)は、サイトメトリー試験において、キメラ抗体の結合よりわずかに低いが、キメラ抗体の結合への類似性を保った結合(MFI)を有する。その結果として、フローサイトメトリーにより得られた結果は、これまでにELISAにより得られた結果を裏付ける。
【０２７６】
同じ抗体を精製された形態で評価したところ、これらは同じ結果を示す。
【０２７７】
IFN-α分泌の阻害
CpGモチーフは、PBMCに含有されるpDCからIFN-α分泌を誘導する。この実験において(図14)、様々な抗CD303抗体(キメラ122A2及び4つのヒト化抗体122A2)が媒介するIFN-α分泌の阻害を比較した。
【０２７８】
IC50値(以下のTable 33(表33))は、以下の通りであった:
・キメラ抗体ch.122A2について、0.95ng/mL、
・ヒト化抗体h122A2H5について、0.81ng/mL、
・ヒト化抗体h122A2H7について、0.86ng/mL、
・ヒト化抗体h122A2H9について、0.91ng/mL、及び
・ヒト化抗体h122A2H10について、0.94ng/mL。
【０２７９】
【表３３】
2018511328.tif 000053
【０２８０】
これらの結果から、試験された4つのヒト化モノクローナル抗体122A2は、キメラ抗体のIC50より低いか又はそれに等しいIC50でIFN-α分泌を阻害することが可能であることが示される。
【０２８１】
キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体のための発現ベクターで安定してトランスフェクトされたYB2/0クローンによる産生
キメラ抗体122A2に由来するヒト化抗体122A2H5、122A2H7、122A2H9及び122A2H10は、生産性及び抗原結合に関して特に有利なようであった。したがってこれらを選択して、これらの抗体のための発現ベクターで安定してトランスフェクトされたYB2/0クローンを産生させた。
【０２８２】
図15A〜図15Dに、ヒト化抗体122A2H5、122A2H7、122A2H9及び122A2H10を発現するHKgenEFssベクターのマップを提示する。
【０２８３】
以下のTable 34(表34)に、このようにして得られた4つのクローンに関する上清アッセイデータを提示する。それによれば、これらの4つのヒト化抗体は十分な生産性で産生することができ、抗体122A2H9が最良の生産性を有することが示される。
【０２８４】
【表３４】
2018511328.tif 000054
【０２８５】
Jurkat-CD16細胞によるIL-2分泌の誘導
キメラ抗体122A2に由来し、安定なYB2/0クローンによって産生されたヒト化抗体122A2H9の、CD16と結合して、Jurkat-CD16細胞によるIL-2分泌を誘導する能力を試験し、キメラ抗体122A2の能力と比較した。
【０２８６】
図16に、得られた例示的な結果を提示する。加えて、以下のTable 35(表35)でng/mL(50%)で表される数々の実験の結果を提示し、Table 1(表1)において、この値は、キメラ抗体のプラトーの50%に到達するのに必要な抗体の量を表す。値が低いほど、より優れた活性を示す。
【０２８７】
【表３５】
2018511328.tif 000055
【０２８８】
これらの結果から、Fcフラグメント配列がキメラ抗体のそれと同一であるにもかかわらず、ヒト化抗体122A2H9は、キメラ抗体の分泌より、よりわずかに高いJurkat-CD16細胞によるIL-2分泌を誘導することが示される。
【０２８９】
結論
抗体の免疫原性の寛容を最適化するために、本発明者らによって生成された5つのキメラ抗体の2つに、CD303抗原への類似の又は有意に異ならない親和性を保存する目的でヒト化を行った。この目的を達成するために、数々のヒト化重鎖及び軽鎖を、元の抗体のそれぞれで組み合わせて試験し、HEK-293F細胞にトランスフェクトした。
【０２９０】
サンプルのアッセイ後、抗体濃度は、産生された組合せで、元のアミノ酸配列に依存し(122A2に由来するヒト化抗体は、102E9に由来するヒト化抗体より優れて産生される)、更にはH及び/又はK鎖のタイプ(ヒト化又はキメラ)にも依存することが特筆された。これらのデータから、全体的に、同じアイソタイプの抗体の発現は、それらの一次配列、主としてそれらの可変部分に高度に依存することが確認される。更に、元の2つのキメラ抗体の一方又は他方に由来する多数のヒト化抗体が、元のキメラ抗体より優れて産生される。
【０２９１】
このようにして産生された抗体をELISAによって特徴付けた。試験された抗体が互いに類似する限りにおいて、元のキメラ抗体と同じ抗原結合特徴を有するヒト化抗体を同定することは難しかった。数々の濃度で抗体を試験する場合、様々な抗体間のOD450における実際の差が観察される濃度に分析の焦点を当てた。したがって、5ng/mLの濃度が、102E9、102E9H10からの最良のヒト化抗体が、キメラ抗体の結合能力の80%であるCD303細胞外ドメイン結合能力を有することを示すことができる。この方式で、4つのヒト化抗体(102E9H10、102E9H6、102E9H7及び102E9H9)が同定され選択され、フローサイトメトリーにより目的のヒト化抗体であることが確認された。
【０２９２】
122A2に由来するヒト化抗体のケースにおいて、数々の抗体が、第1のELISAにより、少なくともキメラ抗体のCD303細胞外ドメイン結合能力に等しく(122A2H11及び122A2H15)、実際にはそれより高い(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10、及び122A2H14)CD303細胞外ドメイン結合能力を有することが明確に同定された。これらの上清から得られた結果は、フローサイトメトリーを使用した直交方法によって補足された。
【０２９３】
全体として、上記に示した結果は、各キメラ抗体122A2及び102E9につき、元のキメラ抗体より優れた生産性で産生することができ、以下のCD303抗原結合能力を有するヒト化抗体(したがってヒトにおいて免疫原性が低下した)を生成することができることを示す:
・少なくともキメラ抗体102E9の誘導体に関してキメラ抗体のそれに近い(抗体102E9H10の場合少なくとも80%、抗体102E9H6、102E9H7及び102E9H9の場合少なくとも70%の)CD303抗原結合能力。
・少なくともキメラ抗体122A2の誘導体に関して、キメラ抗体のそれに等しい(122A2H11及び122A2H15)、実際にはそれより高い(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10、及び122A2H14)CD303抗原結合能力。
【０２９４】
更に、122A2に由来するヒト化抗体は、IFN-α分泌、加えてキメラ抗体122A2を阻害することが可能である。
【０２９５】
特定の122A2に由来するヒト化抗体の場合、十分な生産性で抗体を産生する安定してトランスフェクトされたYB2/0クローンを得ることができた。これらの抗体は、CD16に結合して、Jurkat-CD16細胞によるIL-2分泌を誘導する強い能力を有する。
【０２９６】
(参考文献)
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【図１Ａｅｔ１Ｂ】
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【図１Ｃｅｔ１Ｄ】
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【図１Ｅｅｔ１Ｆ】
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【図２Ａｅｔ２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａｅｔ３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａｅｔ８Ｂ】
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【図８Ｃｅｔ８Ｄ】
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【図８Ｅｅｔ８Ｆ】
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【図８Ｇｅｔ８Ｈ】
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【図８Ｉｅｔ８Ｊ】
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【図８Ｋｅｔ８Ｌ】
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【図８Ｍｅｔ８Ｎ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａｅｔ１５Ｂ】
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【図１５Ｃｅｔ１５Ｄ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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