(57)【要約】  本発明は抗体による線維症および／または線維性疾患の治療に関する。とりわけ、本発明は、これだけに限定されるものではないが全身性硬化症（ＳＳｃ）を含めた、線維症および／または線維性疾患に罹患している患者への抗α−ｖインテグリン（受容体）抗体の投与に関する。より具体的には、本発明は、前記抗体による皮膚、肺、心臓、肝臓および／または腎臓の線維症の治療に関する。より一層具体的には、本発明は、これだけに限定されるものではないが皮膚、肺、心臓および／または腎臓の全身性硬化症を含めた、全身性硬化症に罹患している患者への、抗α−ｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、その構造変異体または改変体による、αｖ−インテグリンを標的とする遺伝子組み換え型脱免疫化モノクローナル抗体の投与に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症および／または線維性障害に罹患している患者の治療における使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項２】
前記線維症および／または線維性障害によって侵されている臓器が、肺、肝臓、腎臓、心臓系または皮膚から成る群から選択される、請求項１に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項３】
前記線維性障害が、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す、請求項１または２に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項４】
前記線維性障害が全身性硬化症（ＳＳｃ）であるかまたはそれを含む、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項５】
全身性硬化症（ＳＳｃ）に罹患している患者の治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項６】
前記全身性硬化症が、肺、肝臓、腎臓、心臓系または皮膚の全身性硬化症を含む、請求項４または５に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項７】
前記全身性硬化症が、肺、肝臓、腎臓、心臓および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す、請求項４、５、または６のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項８】
前記全身性硬化症が、心臓系、血管および／または血液を侵す、請求項４に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項９】
前記線維性障害および／または全身性硬化症が、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症を含む、請求項の１〜８のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１０】
前記線維性障害および／または全身性硬化症が、肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１１】
前記治療すべき疾患が、肺および／または皮膚の全身性硬化症である、請求項１に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１２】
前記皮膚の全身性硬化症が、びまん皮膚硬化型全身性硬化症（ｄｃＳＳｃ）または限局皮膚硬化型全身性硬化症（ＩｃＳＳｃ）である、請求項１１に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１３】
肺線維症、肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）、および／または強皮症関連間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）の治療における使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１４】
前記治療が、月毎に５００ｍｇ〜３０００ｍｇの量の、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量の投与を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１５】
前記治療が、月毎に１０００ｍｇ〜２０００ｍｇの量の、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量の投与を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１６】
前記用量、好ましくは有効量が単回投与で投与される、請求項１４または１５に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１７】
前記治療が、月毎に約５００ｍｇ、月毎に約１０００ｍｇ、月毎に約１５００ｍｇ、月毎に約２０００ｍｇまたは月毎に約２５００ｍｇの量の前記抗体、生物学的に活性なその変異体または改変体の投与を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１８】
前記量を単回投与で投与する、請求項１７に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項１９】
前記抗体、あるいは前記生物学的に活性なその変異体または改変体が単独療法として投与される、請求項の１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項２０】
前記生物学的に活性なその変異体または改変体が、ＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較して、アミノ酸配列が少なくとも８０％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも９８％同一であるまたは少なくとも９９％同一であるＤＩ１７Ｅ６のＣＤＲ領域ならびに重鎖および軽鎖の可変領域を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項２１】
以下の重鎖フレームワーク領域：
【化１】
2018534340.tif 000064
｛配列中、太字および下線を引いた位置の１もしくは複数は変異しており、本来のそれぞれの配列と比較して異なる｝の中に１もしくは複数の改変を含む、請求項２０に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項２２】
前記生物学的に活性なその変異体または改変体が、ＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が、少なくとも８０％同一であり、少なくとも９０％同一であり、少なくとも９５％同一であり、少なくとも９９％同一であり、少なくとも９９．５％同一でありまたは少なくとも９９．９％同一である定常領域を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項２３】
ヒトＩｇＧ２の代わりにヒトＩｇＧ１定常領域を含むか、またはヒトＩｇＧ１ヒンジの代わりにヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を含む、請求項２２に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項２４】
前記抗体がＭＭＦ（ミコフェノレート）と組み合わせて併用療法設定で投与される、請求項の１〜２３のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項２５】
前記疾患が全身性硬化症（ＳＳｃ）または強皮症−ＩＬＤ（ＳＳｃ−ＩＬＤ）である、請求項２４に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項２６】
ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上の遺伝子を含む線維症遺伝子シグネチャー。
【請求項２７】
遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）を含む線維症遺伝子シグネチャー。
【請求項２８】
抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を投与することによって対象の線維症および／または線維性障害を治療する方法であって、ここで、前記対象が請求項２６または２７に記載の遺伝子シグネチャーにより特徴付けられる、方法。
【請求項２９】
抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を投与することによって対象の線維症および／または線維性障害を治療する方法であって、ここで、前記対象が、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上、好ましくは５以上、より好ましくは９以上、より一層好ましくは１５以上、そして特に１６、１７、１８または１９種類の遺伝子を含む多遺伝子シグネチャーから計算した閾値より高いスコアにより特徴付けられ、特に、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）に基づく９種類の遺伝子シグネチャーが、以降ＴＵＡＤシグネチャーとも呼ばれる方法。
【請求項３０】
遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上、好ましくは５以上、より好ましくは９以上、より一層好ましくは１５以上、そして特に１６、１７、１８または１９種類の遺伝子を含む多遺伝子シグネチャーから計算した閾値より高いスコアの変化を追跡することによって、対象の線維性疾患における線維症の重症度、および／または線維症を発症する可能性がある疾患における線維症の出現を観察する方法であって、特に、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）に基づく９種類の遺伝子シグネチャーが、以降ＴＵＡＤシグネチャーとも呼ばれる方法。
【請求項３１】
請求項２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記線維症および／または線維性障害が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のとおりである方法。
【請求項３２】
前記患者にミコフェノラートも与える、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６がアビツズマブである、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者にミコフェノラートも与える、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項３５】
前記障害がＳＳｃ−ＩＬＤであり、かつ、前記患者にミコフェノラートも与える、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項３６】
前記抗体がアビツズマブである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体。
【請求項３７】
線維症および／または線維性障害の予防および／または治療のための薬物の製造のための、ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の生物学的に活性なその変異体または改変体の使用。
【請求項３８】
前記薬物が、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の線維症および／または線維性障害の治療のためのものである、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記ＤＩ１７Ｅ６抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体がアビツズマブである、請求項３６、３７、または３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記ＤＩ１７Ｅ６抗体がアビツズマブであり、かつ、前記線維性障害および／または全身性硬化症が、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症を含む、請求項３６、３７、３８、または３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記ＤＩ１７Ｅ６抗体がアビツズマブであり、かつ、前記線維性障害および／または全身性硬化症が、肺線維症、肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）、および／または強皮症関連間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）を含む、請求項３６、３７、３８、３９、または４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記ＤＩ１７Ｅ６抗体がアビツズマブであり、かつ、前記線維性障害および／または全身性硬化症が、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を含む、請求項３６、３７、３８、３９、４０、または４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
前記治療が、ミコフェノール酸、ミコフェノラート、ミコフェノラートモフェチル、ミコフェノラートナトリウム、メトトレキサート、アメソプテリン、およびプレドニゾンから成る群から選択される１若しくは複数の有効成分の投与をさらに含む、請求項３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
前記抗体が、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体。
【請求項４６】
前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体による線維症および／または線維性疾患の治療に関する。さらに、本発明は抗体による線維症および／または線維性疾患の予防に関する。とりわけ、本発明は、これだけに限定されるものではないが全身性硬化症（ＳＳｃ）を含めた、線維症および／または線維性疾患に罹患している患者への抗α−ｖインテグリン（受容体）抗体の投与に関する。より具体的には、本発明は、前記抗体による皮膚、肺、心臓、肝臓および／または腎臓の線維症の治療、および／またはその予防に関する。より一層具体的には、本発明は、これだけに限定されるものではないが皮膚、肺、心臓および／または腎臓の全身性硬化症を含めた、全身性硬化症に罹患している患者への、αｖ−インテグリンを標的とする遺伝子組み換え型脱免疫化モノクローナル抗体の投与に関する。特に、本発明は、抗α−ｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６（アビツズマブ）、その構造変異体または改変体による前記患者の治療法に関する。前記治療法の重要な目的の一つは、患者の前記線維症および／または線維性疾患を遅らせる、止める、および／または逆戻りさせ、その結果、好ましくは、線維症および／または線維性疾患に罹患している患者の状態を広く改善することである。前記治療法のさらなる重要な目的の一つは、患者の全身性硬化症を遅らせ、止め、および／または逆戻りさせ、その結果、好ましくは、前記全身性硬化症に罹患している患者の状態とクオリティオブライフを広く改善することである。本発明の別の好ましい態様は、抗α−ｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６（アビツズマブ）、および／またはその構造変異体または改変体を投与することによって、線維症および／または線維性疾患を発症しそうな対象、好ましくはヒト対象の線維症および／または線維性疾患に対する予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、臓器または組織における、好ましくは修復もしくは反応プロセスでの、過剰な線維組織、好ましくは線維性結合組織の形成と規定されることが好ましい。これは、好ましくは反応状態、良性状態、または病理状態と見なすことができる。傷害に対する反応において、これは、好ましくは瘢痕化と呼ばれ、線維症が単独の細胞株から生じる場合には、好ましくは線維腫と呼ばれる。生理学的には、線維症は結合組織を沈着させるように典型的には作用し、そしてそれが、下にある臓器または組織の構造および機能を破壊する可能性がある。線維症は、好ましくは、線維組織の過剰な沈着、ならびに治癒における結合組織沈着プロセスの病理学的状態を説明するのに使用され得る。本発明の状況において、線維症という用語は、好ましくは、線維組織の過剰沈着の病理学的状態を説明するのに使用され得る。両方ともコラーゲンやグリコサミノグリカンを含めた結合組織を敷く刺激細胞が関与する点において、病理学的な意味での線維症は瘢痕化プロセスと類似している。マクロファージと呼ばれる免疫細胞、ならびに間質と呼ばれる表層間のいずれかの損傷組織は典型的にはＴＧＦ−βを放出する。これに関しては、近い組織の炎症、または増強された循環メディエーターを伴った全身性炎症性状態を含めた、多くの理由が存在する。ＴＧＦ−βは線維芽細胞の増殖および活性化を刺激し、次に、それが通常、結合組織の堆積を引き起こす。
【０００３】
線維症は、典型的に炎症または損傷の結果として、体内の多くの臓器の多くの組織で起こる可能性があり、そして、例としては：
肺の線維症、例えば、肺線維症、嚢胞性線維症および／または特発性肺線維症；肝臓の線維症、例えば、肝硬変；
心臓の線維症、例えば、心房線維症、心内膜線維症および／または過去の心筋梗塞の結果として生じる損傷としてのもの、
が挙げられる。
【０００４】
そのうえ、線維症、および特に病的な線維症は、関節線維症（主に膝と肩、しかし、他のさまざまな関節でも起こる）、クローン病（腸）、デュピュイトラン拘縮（主に手および／または指におけるもの）、ケロイド（主に、皮膚を侵す）、縦隔線維症（主に、縦隔の軟組織に関連する）、骨髄線維症（主に、骨髄を侵す）、ペーロニ病（陰茎）、腎性全身性線維症（主に、皮膚を侵す）、進行性塊状線維症（例えば、肺のもの、多くの場合、炭坑夫塵肺症の結果として生じる合併症）、後腹膜線維症（主に、後腹膜腔の軟組織を侵す）、および／または強皮症もしくは全身性硬化症（主に皮膚および／または肺を侵す）を含むことが好ましい。
【０００５】
線維症、病的な線維症および線維性疾患または線維性障害といった用語は、当該技術分野で知られ、そして、理解されている。好ましくは、線維症のすべての病理学的形態、すなわち、急性損傷および／または正常な創傷治癒に直接関連しない形態もまた、本発明の状況において線維性障害と呼ばれる。よって、線維性障害とは、好ましくは、所望の、正しい創傷治癒プロセスで通常見られる線維化のレベルを超えている線維化の状態である。
【０００６】
全身性硬化症（ＳＳｃ、ＩＣＤ−１０分類法Ｍ３４）は、本発明に従って治療されるべき特に好ましい線維性障害である。また、全身性硬化症は、全身性強皮症と呼ばれることも多く、時には進行性全身性硬化症とも呼ばれる。全身性硬化症は、例えば肺、心臓、または腎臓などの重要臓器の疼痛、障害、進行性機能障害、および最終的に不全症に至る、自己免疫、血管障害、および進行性線維症を特徴とする、臨床および実験室所見の特徴的な、しかし、可変のスペクトルを有する臨床的に不均一な多臓器結合組織疾患である。好ましくは、ＳＳｃは限局性強皮症と呼ばれる疾患群と区別されることができ、そして、限局性強皮症は、好ましくは、例えばモルフェア、線状強皮症および剣創状強皮症、さらに、好ましくは、強皮症の１若しくは複数の兆候に類似した他の疾患などの健常状態も含まれる。
【０００７】
ＳＳｃの病原は現在知られていない。しかしながら、臨床所見のスペクトルは、血管異常、免疫仲介性損傷、およびほとんどどの臓器にも潜在的可能性がある線維症の様々な程度の因果関係である。ＳＳｃの臓器病変は、例えば肺、肝臓、腎臓および心臓などの重要臓器が侵されたとき、その機能の低下と早期死亡につながる。皮膚はほとんど常に関係する。皮膚病変のパターンに基づいて、ＳＳｃは、びまん性皮膚硬化型（ｄｃ）ＳＳｃと限局性皮膚硬化型（Ｉｃ）ＳＳｃとに分類される。ＩｃＳＳｃでは、皮膚病変は典型的に、四肢遠位部から膝および肘へと広がり；ｄｃＳＳｃでは、皮膚病変は典型的に、体幹、上腕および／または大腿部を含む近位に広がる。好ましいサブセットおよび疾患分類法に関するさらなる詳細は、「分類法」および「診断と症状」の項で見ることができる。ＳＳｃは、例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、関節リウマチまたはシェーグレン症候群などの他の結合組織疾患（ＣＴＤ）と重複する特徴を有する。
【０００８】
ＳＳｃは典型的に、以下の組織病理学的特徴および病態生理学的特徴のうちの１もしくは複数を伴う：
ｉ）血管異常：
ＳＳｃ血管異常の特徴的な病理学的所見は、複数の血管床の小動脈および細動脈にかかわる非炎症性の増殖性／閉塞性血管障害である。長年のＳＳｃにおいて、これらの病巣は炎症がないときに一般的に起こるが、初期疾患では、炎症細胞の潤滑が多くの臓器で目立つ。血管損傷に関する組織病理学的証拠は、線維症が病変部および非病変部の皮膚で検出され得る前に存在し、全身性のプロセスを示す。一般的に、例えばレイノー現象などの発現は他の疾患発現に先行する。ＳＳｃ血管障害のさらなる臨床兆候としては、皮膚の血管拡張、爪郭の毛細血管の変化、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、デジタルピット形成、胃腔血管拡張、および強皮症腎クリーゼが挙げられる。
【０００９】
確立したＳＳｃに罹患している患者では、最も特徴的な血管知見は、小および中サイズの動脈の無菌性内膜増殖である。疾患の後期ステージでは、大量の線維素沈着および血管周囲の線維症が進行性の管腔閉塞の原因となり、そして、損傷性組織の微小血管が著しく少ない。血管の供給の損失は慢性的な組織低酸素につながる。
【００１０】
初期の血管損傷は、外見上、内皮細胞傷害である。二次的に、血小板が活性化されるようになり、そして、血管収縮、線維芽細胞活性化、および筋線維芽細胞分化転換に寄与し得るメディエーターを放出し得る。内皮の機能不全は、低下した血流反応および血管障害を増幅する酸化ストレスを伴う虚血再潅流の発現をもたらす異常な血管拡張／収縮につながる可能性がある。知られている中で最も強力な血管収縮剤であるエンドセリン−１は、ＩｃＳＳｃよりｄｃＳＳｃにおいてより高いレベルで、ＳＳｃに罹患している患者で高められることが報告されている。微小血管の閉塞性の血管障害は、組織低酸素および記載した組織再構成につながる。血管形成は、ＳＳｃにおいて損なわれるので、進行性の血管損失に寄与し得る。
【００１１】
ｉｉ）組織線維症：
線維症は、過剰量のＩ型コラーゲンおよび他の線維状コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内の他の結合組織分子の蓄積を特徴とする。そのプロセスは、組織構造の破損を引き起こす。ＳＳｃでは、皮膚および内臓の組織間腔および血管の線維症が、それらの進行性機能障害および最終的な不全症に直接寄与する。肺、胃腸管、心臓、腱鞘、および筋束周辺部組織周囲の骨格筋が、最も顕著に影響を受ける。
【００１２】
皮膚の線維症（ＳＳｃの顕著な特徴）は真皮の著明な膨張を引き起こす。そのプロセスは毛嚢、汗腺、および他の皮膚付属器を破壊する。コラーゲン線維蓄積は、真皮深部で最も顕著であり、脂肪細胞の取り込みにより徐々に隣接した脂肪層に浸潤する。線維芽細胞と収縮性平滑筋細胞との間の媒介物であり、かつ、線維形成で大きな役割を果たすα−平滑筋アクチン陽性筋線維芽細胞の割合は、病変皮膚において増大する。
【００１３】
初期の肺損傷では、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、および好酸球を有する肺胞壁のまばらな浸潤が見られる。進行により、間質性肺線維症と血管損傷が顕著であり、同じ病巣内に共存することも多い。肺動脈の内膜肥厚には、ＰＡＨが潜在し、そして、剖検にて、複数の肺塞栓および心筋線維症を伴うことが多い。肺生検試料に見られる典型的な病理組織パターンは、非特異性間質性肺炎、軽度〜中程度の組織間腔炎症を特徴とする間質性肺疾患の形態、ＩＩ型肺胞細胞過形成、および線維症の一様な分布である。一般的ではないが、ＳＳｃは通常型間質性肺炎パターンに関連し、そしてそれは、点在している線維芽細胞巣と線維症のまばらな分布を特徴とする。肺胞中隔の進行性の肥厚は、最終的に空隙および蜂巣肺の閉塞と、結果として生じる肺血管の損失につながる。このプロセスは、ガス交換を損ない、肺の動脈内血圧を増大するのに寄与する。ｄｃＳＳｃに罹患している患者の間質性肺疾患の有病率は約５３％であると報告されており、そして、ＩｃＳＳｃに罹患している患者では約３５％である。
【００１４】
胃腸管内では、病理変化は口から直腸までのどのレベルでも起こり得る。食道は、粘膜固有層、粘膜下組織、および筋肉層の線維症、ならびに特徴的な血管障害によって事実上常に影響を受ける。
【００１５】
正常な腸構造の置き換えは、不規則な蠕動運動、胃食道逆流および小腸運動障害、偽性閉塞、ならびに細菌異常増殖をもたらす。慢性胃食道逆流は、食道の炎症、潰瘍形成、および狭窄形成によって複雑化される。
【００１６】
腎臓では、血管障害が顕著であり、糸球体腎炎は稀である。慢性腎虚血は、萎縮した糸球体および他の虚血性変化を伴う。急性強皮症腎クリーゼに罹患している患者は、悪性高血圧の他の形態から区別できない劇的な組織変化を示す。ＳＳｃの腎臓における血管の変化は、小葉間動脈および弓状動脈で最も顕著であり、そしてそれは、弾性板の重複、著しい血管内膜増殖、および基質の蓄積を示す。また、これらの変化は腎発症がないＳＳｃ患者でも見られる可能性がある。細動脈壁の類線維素壊死が見られることもある。血管内膜肥厚は、管腔の重度の狭窄および完全な閉塞につながり、微小血管症性溶血反応を伴うことが多い。
【００１７】
剖検では、心臓病変の兆候が、ＳＳｃに罹患している患者の７０％で見られる。軽度な心嚢水腫が一般的である；時々、収縮性心膜炎を伴った線維症が起こることがある。特徴的な病理学的所見は心筋の収縮性帯壊死であり、そしてそれは、虚血再灌流障害を反映すると思われる。顕著な組織間腔および血管周囲の線維症は、臨床的に明らかな心合併がないときに起こり得る。
【００１８】
線維性変化を有する他の臓器としては、甲状腺、勃起機能不全に関連する陰茎の血管、唾液腺および涙腺が挙げられる。滑膜の生検試料は、小規模な細動脈における線維症および特徴的な血管変化を示す。
【００１９】
過度のコラーゲン沈着および他のＥＣＭ要素の細胞起源は、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞である。結合組織に通常存在している線維芽細胞、または血管周囲に存在している周皮細胞が、ＴＧＦ−βなどの成長因子によって活性化されるようになり、増殖およびコラーゲン合成の増加をもたらし得る。組織傷害、機械的な張力、およびＴＧＦ−βは、線維芽細胞様細胞の活性化と表現型変化を誘発し、線維芽細胞−筋線維芽細胞形質転換（ＦＭＴ）と表されるプロセスである、これらの細胞の筋線維芽細胞への形質転換をもたらす。筋線維芽細胞は、増強された運動性、平滑筋アクチンの発現、コラーゲン合成の増加、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤、および他のＥＣＭ成分を特徴とする。筋線維芽細胞は、線維性応答中のＴＧＦ−β活性化の主な起源であり、初期肉芽組織の関与する収縮に関して反応性である。病理的線維形成では、筋線維芽細胞は存続し、慢性瘢痕の過度に収縮したＥＣＭ特徴をもたらす。
【００２０】
免疫機能不全：
免疫系の先天性および順応性の能力は、初期ＳＳｃで活性化され、そして、自己免疫が主体であると思われる；しかしながら、発症機序における細胞性および液性自己免疫エフェクター経路の役割は不明確である。
【００２１】
病気の初期段階では、活性化されたＣＤ４およびＣＤ８リンパ球、単球、マクロファージ、そして、それほど多くないがＢ細胞、好酸球、マスト細胞、およびナチュラルキラー細胞が、病変皮膚、肺、および他の患部器官の血管周囲領域で観察される。皮膚の単核球浸潤は、主にＣＤ３ＣＤ４陽性Ｔ細胞であり、活性化マーカーを発現する。
複数の抗原特異性を有する循環自己抗体は、ＳＳｃに罹患しているほとんどすべての患者で検出できる。
【００２２】
ＳＳｃ関連自家抗体は、診断マーカーとして臨床的有用性が実証されているが、疾患発現に対するそれらの寄与は不明確なので、これらの自家抗体が、血管障害、組織損傷、および／または線維症に先行するかまたは因果関係があるかわかっていない。標的特異性および臨床的関連性を表１にまとめる。
【００２３】
表１．自家抗体の頻度とそれらの主な臨床的関連性
【００２４】
【表１】
2018534340.tif 000002
【００２５】
略語：ＰＢＣ、原発性胆汁性肝硬変；ＰＭ／ＤＭ、多発性筋炎／皮膚筋炎；ＳＤＶ、重度のデジタル血管障害；ＳＲＣ、強皮症腎クリーゼ。
【００２６】
ＳＳｃは典型的に、以下の臨床的特徴のうちの１もしくは複数を伴う：
ＳＳｃの臨床兆候は多様であり、複雑な基本病理を反映している。様々な臨床所見の頻度は、疾患のステージおよびサブセットによって異なる。臓器病変の経過および重症度は個々の患者で予測できない。加えて、それぞれの合併症の重症度および活性は、治療法の決定をおこなう際に考慮される必要がある。疲労感および倦怠感は、その初期相で通常さらに目立つが、病気の期間を通じて共通である。反応性鬱病は、多くの場合、過酷で、かつ、外見を損なうこの疾患によくある付随物である。
【００２７】
教科書で報告された主要臓器兆候の有病率を表２に示す。高い頻度は、様々な関連臓器系の臨床的特徴に関して全員が１９８０ＡＣＲ基準を満たす７，６５５人の患者の特徴に基づくEuropean Scleroderma Trials and Research（ＥＵＳＴＡＲ）コホートから最近公表され、そして、表にした総説（表２および３）に示されている。典型的には、報告されている３〜５：１の優位性で、女性は男性より影響を受ける。
【００２８】
表２．ＳＳｃの臨床的特徴
【表２】
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【００２９】
表３．ＳＳｃ対照の臨床的特徴
【００３０】
【表３】
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【００３１】
分類法：
ＳＳｃの顕著な特徴は、皮膚の硬化および肥厚であるが（「強皮症」）、多くの内臓もたＳＳｃに関与し得る。２つの主要な臨床サブセットが、皮膚病変と追加の関連臨床的および実験的特徴のパターンによって差別化される（表４）。ＣＲＥＳＴ症候群（皮膚石灰症、レイノー現象、食道運動障害、足指硬化症、血管拡張に由来する頭字語）は、臨床所見の組み合わせに基づいて個別化されたが、ＩｃＳＳＣとして分類されてもよい。ＳＳｃは、他の結合組織疾患の特徴を有するか、またはそれらの基準を満たす。皮膚病変を伴わないＳＳｃ（「強皮症のない強皮症」）は稀であり、皮膚標徴の欠如により経過において晩発であると通常診断された。幼児期および青年期のＳＳｃは非常に稀である。さらなる分類法は「診断と症状」と題した項で見ることができる。
【００３２】
表４．ＳＳｃサブセットの主要な臨床所見
【表４】
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【００３３】
診断と症状：
ＳＳｃの診断は、通常、臨床兆候、特に皮膚病変のパターンに基づいておこなわれる。米国リウマチ学会（ＡＣＲ）は、患者を分類するために診断基準を提案した。いずれか一方の大基準（すなわち、近位強皮症）または２以上の小基準（すなわち、［１］足指硬化症、［２］指先のデジタル陥凹性瘢痕または遠位指腹の実体損失、［３］両側性基底肺線維症）が、ＳＳｃとして患者を分類するのに必要である。
【００３４】
症例および疾患比較コホートに適用されたとき、基準は、明確なＳＳｃに関して９７％の感度および９８％の特異性を有した。これらの基準は、ＳＳｃに罹患しているすべての患者を含むわけではないように見える。ＥＵＳＴＡＲ（ＥＵＬＡＲ強皮症試験および調査グループ）コホートでは、患者の８３．５％だけが１９８０ＡＣＲ基準を満たし、初期疾患および重複症候群に罹患している患者が除外群の最も大きい割合を構成する。
【００３５】
この問題を克服するために、ＡＣＲおよび欧州リウマチ学会（ＥＵＩＡＲ）は、２０１３の間に発行されるはずのＳＳｃの改訂基準で一致した。改訂基準を図１に示す。
【００３６】
ＳＳｃの診断には、組織生検を必要としないことが好ましい。
【００３７】
表５：全身性硬化症の分類のためのＡＣＲ−ＥＵＬＡＲ基準
１．これらの基準は、ＳＳｃ研究に組み入れる対象となったすべての患者に適用可能である。
２．これらの基準は、例えば：腎性硬化性線維症、糖尿病性浮腫性硬化、硬化性粘液水腫、エリスロ筋肉痛、ポルフィリア、硬化性苔癬、移植片対宿主病、および糖尿病性手関節症などのそれらの兆候がより明らかな全身性硬化症様疾患を患っている患者には適用不可である。「指を割く皮膚肥厚」に罹患している患者もＳＳｃを患っているに分類されない。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
ＳＳｃの典型的な症状を、表の形態で以下に示す（表６）。
表６．ＳＳｃの症状（臨床兆候および他の臨床所見、表２および３を参照）
【００４０】
【表６】
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【００４１】
すべてのＳＳｃ患者の診断からの平均生存期間は約１３年であると報告されており、その一方で、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の５年生存率は４０〜６０％であると報告されており、ＳＳｃ全体と比較して、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者のより高い死亡率を示している。
【００４２】
ＳＳｃにおける死亡は、典型的にＳＳｃ臓器病変（〜５３％）、癌（〜１５％）またはアテローム性動脈硬化症のためである。ＳＳｃ臓器病変による死亡は、びまん性皮膚病変に罹患しており、より高い発症年齢、かつ、男性の患者においてより一般的である。
【００４３】
最近、ＳＳｃにおける死亡の原因およびリスク因子が、欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）強皮症試験および調査（ＥＵＳＴＡＲ）データベースによって報告された。そのデータベースは、ＡＣＲ１９８０分類基準を満たす５，８６０人のＳＳｃ患者を含んでいた。死因および併発症データは、２８４人の死亡者のうちの２３４人から入手可能であった。彼らは、５５％の死亡がＳＳｃに直接関連し、そして、４％の分類不可能と思われる原因と共に、４１％が非ＳＳｃ原因に関連していたと報告した。２８４人の死亡患者のうち、５４．６％が、びまん皮膚硬化型疾患（ｄｃＳＳｃ）を患っており、そして、４０．５％が限局皮膚硬化型疾患（ＩｃＳＳｃ）を患っていた。疾患持続期間の中央値は、ｄｃＳＳｃでは７．１年、そして、ＩｃＳＳｃでは１５年であった。１９％が肺線維症で死亡し、そして、１４％が肺動脈高血圧症で死亡した。ＳＳｃ関連心筋疾患の死亡は１４％であり、ほとんどの原因が不整脈に関連する。腎の死因は４％しか占めておらず、そのすべてが強皮症腎クリーゼに関連した。患者の３パーセントは胃腸関連の原因で死亡した。非ＳＳｃ関連の死亡に関して、原因は以下のとおりであった：感染症（すべての死亡のうちの１３％）、新生物（１３％）、および心血管疾患（１２％）。次に、非ＳＳｃ関連死亡の患者を、ＳＳｃ関連の併発症について分析した。肺炎で死亡した多くの患者もまた、記録された吸引の有無にかかわらず胃食道逆流症を患っていた。肺癌で死亡した１４人の患者のうち、９人は肺線維症を併発していた。この試験では、生存率の低下の独立予測因子としては、タンパク尿の存在、肺動脈高血圧症、８０％未満の強制肺活量が予測される肺制限、ニューヨーク心臓協会クラスＩＩより重い呼吸困難、レイノー現象の高い発症年齢、一酸化炭素の低い拡散容量、ならびに１０未満の変法ロッドマン皮膚スコアが挙げられた。すべてのＳＳｃ関連死亡のうちの３５％がＩＬＤに、そして、２６％がＰＡＨに直接起因しているので、この報告は、ＩＬＤおよびＰＡＨがＳＳｃ関連死亡の主な原因であり、かつ、非ＳＳｃ関連死亡にも寄与しているようであるという以前の知見を補強した。１２，８２９人の患者を含む１８の試験に関する最近の系統的レビューおよび展望解析では、心臓病患者、ＩＬＤ、肺高血圧症および腎兆候の死亡リスクが高められた。
【００４４】
ＩＬＤの存在は、ＳＳｃにおける死亡率と顕著に関連している。低いＦＶＣは死亡率に関連している（VIRGINIA D. STEEN and THOMAS A. MEDSGER, JR., ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 43, No. 11 , November 2000, pp 2437-2444, Assassi et al., Arthritis Rheum: 2009 October 15; 61(10): 1403-1411）。＜７０％のＥＶＣでは、ＳＳｃ−ＩＬＤにおいて＞７０％より高い死亡率を予測した（Goh et al., ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 56, No. 6, June 2007, pp 2005-2012）。１２、１８、および２４カ月前のＦＶＣの減少は、死亡率を予測すると考えられる。
【００４５】
ＳＳｃに罹患している９５３人の患者に関する遡及的研究では、重度のＩＬＤに罹患している患者は約３０％の９年生存率を有したが、その一方で、臓器系の重度病変を有しなかったＳＳｃに罹患している患者は７２％の９年生存率を有した。
【００４６】
障害は、線維症、そして特に、ＳＳｃに関して同じく脅迫的な問題である。例えば、呼吸困難は、ＳＳｃにおいて一般的である（最大５０％）。主要な寄与因子としてはＩＬＤとＰＡＨが挙げられるにもかかわらず、気管支拡張症、肺胞出血、食道運動障害に起因する吸引を伴った胃食道逆流、関節炎、肥満、貧血、および運動不足による体調不良もまた寄与する可能性がある。
【００４７】
呼吸困難は、機能および健常関連のクオリティオブライフ（ＨＲＱｏＬ）について非常に重要かつ独立した予測因子である。ＦＶＣおよび肺動脈収縮期圧は、呼吸困難の有意な独立予測因子であった。
【００４８】
改訂健常状態質問票（ＨＡＱ）の障害指数（ＤＩ）は、強皮症心臓、腎臓病、腱摩擦音、手の拘縮、および近位筋強度と相関する。増強されたＨＡＱ−ＤＩは、死亡率の予測に役立ち、そして、低減された拳の閉鎖、低減された手の広がり、および関節圧痛の有無に相関する。ＳＳｃにおける障害は、障害の最も強力な予測因子である呼吸困難および疾病の種類によって時間と共に悪化する。デジタル潰瘍に罹患している患者は、著しく高度に広範囲の障害、手の障害、および不安症を患う。ＳＳｃに罹患しているほとんどの患者が、日常の活動に制限があり、自宅にて多くの介助を必要とする。改訂Ｒｏｄｎａｎ皮膚スコア（ｍＲＳＳ）によって評価された皮膚病変は、障害および疼痛と強く関連している。ＳＳｃに罹患している患者と比較して、乾癬性関節炎および関節リウマチ関節病変は、乾癬性関節炎に比べてＳＳｃでより能力を奪い、そして、ＳＳｃ患者は、関節リウマチに罹患している患者に比べてより疼痛を経験した。ＳＳｃは、鬱病および不安症の高頻度出現を伴う。鬱病はＩＬＤを伴う。健常に関連するクオリティオブライフは、ＳＳｃ患者で低減され、そして、関節リウマチ患者に類似している。レイノー現象は、障害（全体、握力、飲食、身支度）、疼痛、および気分に影響する。疼痛および欝症状は、身体機能および社会的適合の顕著な決定因子である。
【００４９】
運動障害および生産性の損失は、労働状況の最近の展望研究において結論づけられるように、ＳＳｃに罹患している患者に重要である。報告された標準化した雇用率は、０．７０〜０．７７であり、そして、雇用されている患者の割合は１１．３％〜８２％に及んだ。フルタイムおよびパートタイム病欠率もまた高まり、ならびに支払われた労働の生産性を損なわせたと見積もられる。ＳＳｃの作業障害は、関節リウマチにおけるものより大きく報告される。
【００５０】
したがって、線維症、線維症性疾患の分野における治療オプションに関して、非常に高度でまだ対処されていない医療上の必要性が存在し、そして、特にＳＳｃおよび関連適応症においてはそうである。
【００５１】
さらに、対象、好ましくはそれを発症しそうなヒトの対象の線維症、線維症性疾患を予防するための予防オプションに関して、非常に高度でまだ対処されていない医療上の必要性が存在し、そして、特にＳＳｃおよび関連適応症においてはそうである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５２】
既知のモノクローナル抗α ｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６（ＤＩ−１７Ｅ、ＤＩ１７Ｅ６、アビツズマブ（Abituzumab、abituzumab）、ＥＭＲ６２２４２またはＥＭＤ５２５７９７とも呼ばれる）が、線維症、そして特に線維性障害の発症、出現、および／または兆候に関連する細胞シグナル伝達プロセスを妨げる際に非常に効果的であることが発明者らによって見出された。そのうえ、前記抗α ｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６が、全身性硬化症の発症、出現、および／または兆候に関連する細胞シグナル伝達プロセスを妨げる際に非常に効果的であることが発明者らによって見出された。その結果、兆候は、本明細書中に示される、ならびに前述および後述するように実施例の項に示されている。よって、本発明の対象は、線維症および／または線維性障害の治療における使用のためのモノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体である。本発明の好ましい対象は、全身性硬化症の治療における使用のためのモノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体である。したがって、本発明のさらなる対象は、線維症および／または線維性障害の治療薬の製造のため、そして特に全身性硬化症の治療のためのモノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体の使用、ならびに／あるいは、モノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体を患者に投与することを含む、線維症および／または線維性障害の治療のため、そして特に全身性硬化症の治療のための方法である。その好ましい安全性プロフィールに起因して、モノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体は、前記疾患の予防にも好適であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】アビツズマブは、Ｈ３５８線維芽細胞とＣａｌｕ３線維芽細胞の共培養物において高αＳＭＡ発現を妨げる。
【図２】アビツズマブは、Ｈ３５８線維芽細胞共培養において高ＦＭＴ関連遺伝子発現を妨げる。
【図３】ＴＧＦ−βは、ヒト肺線維芽細胞においてインテグリン発現を増強する。
【図４】ＴＧＦ−βは、肺線維芽細胞においてαＳＭＡ、ＩＬ−６、および他の筋線維芽細胞マーカー遺伝子発現を増強する。
【図５】線維芽細胞培養物のアビツズマブ処理は、αＳＭＡおよびＩＬ−６のＴＧＦ−β誘発性の増加を低減する。
【図６】アビツズマブ処理は、ＴＧＦｂ誘発性コラーゲンゲル収縮を低減する。
【図７】抗ＨＥＬ−ＡＢ ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１および１０Ｄ５それぞれとの比較において、アビツズマブによるＬＡＰへのαｖβ６の結合の阻害。
【図８】線維症／ＳＳｃシグネチャーを見つけるためのストラテジーチャート。
【図９】ＳＳｃと正常皮膚におけるＲＧＳ５発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ４５４８５のＳＳｃおよび正常皮膚によるＲＧＳ５発現。
【図１０】それぞれ、初期ＩＰＦと健常な肺、および進行ＩＰＦと健常な肺におけるＣＯＬ１５Ａ１の発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ２４２０６の初期ＩＰＦ、進行ＩＰＦ、および正常肺によるＣＯＬ１５Ａ１発現。
【図１１】それぞれ、初期ＩＰＦと健常な肺、および進行ＩＰＦと健常な肺におけるＣＯＬ１Ａ１の発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ２４２０６の初期ＩＰＦ、進行ＩＰＦ、および正常肺によるＣＯＬ１Ａ１発現。
【図１２】それぞれ、初期ＩＰＦと正常肺、およびＳＳｃ−ＰＦと正常肺におけるＣＯＭＰの発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ４８１４９のＩＰＡＨ（ＰＰＨ）、ＩＰＦ、ＳＳｃ−ＰＡＨ、ＳＳｃ−ＰＦ、および正常肺（ＮＬ）によるＣＯＭＰ発現。
【図１３】それぞれ、初期ＩＰＦと正常肺およびＳＳｃ−ＰＦと正常肺におけるＩＧＦＢＰ２の発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ４８１４９のＩＰＡＨ（ＰＰＨ）、ＩＰＦ、ＳＳｃ−ＰＡＨ、ＳＳｃ−ＰＦ、および正常肺（ＮＬ）によるＩＧＦＢＰ２発現。
【図１４ａ】それぞれ、初期ＩＰＦと正常肺、およびＳＳｃ−ＰＦと正常肺におけるＳＳＰ１の発現を比較する調整ｔ−検定のそれぞれの結果を用いたＧＳＥ４８１４９のＩＰＡＨ（ＰＰＨ）、ＩＰＦ、ＳＳｃ−ＰＡＨ、ＳＳｃ−ＰＦ、および正常肺（ＮＬ）によるＳＳＰ１発現。
【図１４ｂ】ＳＳｃおよび正常皮膚における１９種類の遺伝子のシグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４５４８５のＳＳｃおよび正常皮膚による１９種類の遺伝子の線維症／ＳＳｃシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１５ａ】ＳＳｃおよび正常皮膚における１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ３２４１３のＳＳｃおよび正常皮膚による１９種類の遺伝子の線維症／ＳＳｃシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１５ｂ】ＳＳｃおよび正常皮膚における９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ３２４１３のＳＳｃおよび正常皮膚による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１６ａ】ＳＳｃおよび正常皮膚で１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ９２８５のＳＳｃおよび正常皮膚による１９種類の遺伝子の線維症／ＳＳｃシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１６ｂ】ＳＳｃおよび正常皮膚における９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ９２８５のＳＳｃおよび正常皮膚による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１７ａ】それぞれ、初期ＩＰＦと正常肺、および進行ＩＰＦと正常肺における１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ２４２０６の初期ＩＰＦ、進行ＩＰＦ、および健常な肺による１９種類の遺伝子の線維症／ＳＳｃシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１７ｂ】それぞれ、初期ＩＰＦと健常な肺、および進行ＩＰＦと健常な肺における９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ２４２０６の初期ＩＰＦ、進行ＩＰＦ、および健常な肺による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１８ａ】それぞれ、ＩＰＦと正常肺、およびＳＳｃ−ＰＦと正常肺における１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４８１４９のＩＰＡＨ（ＰＰＨ）、ＩＰＦ、ＳＳｃ−ＰＡＨ、ＳＳｃ−ＰＦ、および正常肺（ＮＬ）による１９種類の遺伝子の線維症／ＳＳｃシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１８ｂ】それぞれ、ＩＰＦと正常肺、およびＳＳｃ−ＰＦと正常肺における９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４８１４９のＩＰＡＨ（ＰＰＨ）、ＩＰＦ、ＳＳｃ−ＰＡＨ、ＳＳｃ−ＰＦ、および正常肺による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図１９ａ】対照肝臓組織に対して、それぞれＮａｓｈ、脂肪症、および健常な肥満における１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４８４５２のＮａｓｈ、脂肪症、健常な肥満および正常な肝臓による１９種類の遺伝子のＳＳｃ／線維症シグネチャーのシグネチャースコア。
【図１９ｂ】対照肝臓組織に対して、それぞれＮａｓｈ、脂肪症、および健常な肥満における９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４８４５２のＮａｓｈ、脂肪症、健常な肥満および正常な肝臓による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図２０ａ】片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４９５４１の軽度および進行ステージの肝線維形成の１９種類の遺伝子のＳＳｃ／線維症のシグネチャーのシグネチャースコア。
【図２０ｂ】片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４９５４１の軽度および進行ステージの肝線維形成の９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図２１ａ】対照肝臓組織に対して、それぞれＮａｓｈ、ＰＳＣ、ＰＢＣ、およびＮＡＦＬＤにおける１９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ６１２６０のＮａｓｈ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、ＰＢＣ（胆管の原発性胆管炎）、ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、健常な肥満、および正常な肝臓による１９種類の遺伝子のＳＳｃ／線維症シグネチャーのシグネチャースコア。
【図２１ｂ】対照肝臓組織に対して、それぞれＮａｓｈ、ＰＳＣ、ＰＢＣ、およびＮＡＦＬＤにおける９種類の遺伝子シグネチャースコアを比較する片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ６１２６０のＮａｓｈ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、ＰＳＣ（原発性硬化性胆管炎）、ＰＢＣ（胆管の原発性胆管炎）、ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、健常な肥満、および正常な肝臓による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【図２２ａ】片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４４４２６の原発性骨髄線維症および正常骨髄による１９種類の遺伝子のＳＳｃ／線維症シグネチャーのシグネチャースコア。
【図２２ｂ】片側ｔ−検定の結果を用いたＧＳＥ４４４２６の原発性骨髄線維症および正常骨髄による９種類の遺伝子のＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコア。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の詳細な説明
既知のモノクローナル抗αｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６（本明細書中でアビツズマブ、アビツズマブ、ＥＭＲ６２２４２またはＥＭＤ５２５７９７とも呼ばれる）が、線維症、そして特に線維性障害の発症、出現、および／または兆候に関連する細胞シグナル伝達プロセスを妨げるのに非常に効果的であることがわかった。
【００５５】
先におよび／または以下で詳細に考察された、特に以下で考察される機構に縛られることなく、本明細書中に記載の抗体ＤＩ１７Ｅ６、そして好ましくは生物学的に活性なその変異体または改変体の標的化部位、結合親和力／結合特性、および選択性プロファイルの独特な組み合わせにより、シグナル伝達経路と、本明細書中に記載の抗体ＤＩ１７Ｅ６、そして好ましくはまた、生物学的に活性なその変異体または改変体との相互作用が、線維症の発症、そして特に線維症および／または線維性障害、特に本明細書中に記載の線維性障害、の処置のために重要な経路であることは、強く信じられ、かつ、本明細書中に含まれる実施例およびデータで十分証明される。本発明の基礎となる結果およびデータに関する我々の理解の観点から、関連経路は以下でさらに詳細に考察される。
【００５６】
一般に、線維症は、細胞外マトリックスの産生、堆積、および収縮による過度の瘢痕化を特徴とし、そしてそれは、筋線維芽細胞の増殖および活性化によって駆動されると考えられている。線維症は、今日まで効果的な治療法が存在していない疾患の最大のグループの１つである。線維形成過程は、前線維形成メディエーターおよび抗線維形成メディエーターのネットワーク内の複雑な相互作用セットによって調整される。ＴＧＦ−β（すなわち、形質転換成長因子β、またＴＧＦｂ、ＴＧＦ ｂ、ＴＧＦＢ、ＴＧＦ Ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ＴＧＦ−Ｂ、ＴＧＦβ、ＴＧＦ βまたはＴＧＦ−βとも呼ばれる）シグナル伝達は、線維芽細胞から（増強された細胞外マトリックス堆積に寄与する）筋線維芽細胞への転換（ＦＭＴ）に重要な役割を果たすと考えられており、そのため、疾患の主なドライバーであると考えられる。
【００５７】
ＴＧＦ−βアイソフォームは、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質と複合体を形成する潜在型前駆体として合成され、そしてそれは、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）領域を含む。これらのプロセス中のαｖインテグリンとＴＧＦ−βの間のクロストークに関して実質的な証拠が存在する。ＴＧＦ−β１のＬＡＰは、ＴＧＦ−β１の活性化をもたらすインテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８と相互作用するＲＧＤモチーフを含む。アビツズマブは、リガンド結合αｖサブユニットにアロステリックに阻害し、その結果、リガンドがすべてのαｖβヘテロ二量体に結合することを妨げるので、それによって、潜在型ＴＧＦ−βのαｖインテグリン依存性活性化を阻害し、その結果、線維芽細胞および他の前駆体による筋線維芽細胞表現型の獲得を妨げる、汎αｖインテグリン抗体である。
【００５８】
得られたデータは、モノクローナル抗アルファαｖ抗体ＤＩ１７Ｅ６、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体が、例えばビトロネクチン、フィブロネクチンおよびＴＧＦ−β１（ＬΑΡ−β１）の潜在型関連タンパク質などのαｖインテグリンリガンド内のＲＧＤ含有配列に結合することを含めた、αｖインテグリンの複数の機能を妨げることができることを実証する。
【００５９】
よって、αｖインテグリンの顕著な機能の１つが、ＴＧＦ−βの活性化の制御であることがわかる。そのため、本明細書中で考察されたデータに基づいて、サイトカインＴＧＦ−βが、本明細書中に記載したＳＳｃを含めた、生理学的な線維形成および病理学的な線維症の主な調節物質であり、さらに、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が、線維症、線維症および／または全身性硬化症の治療に有利であると思われる様式でＴＧＦ−βの活性化を制御できる、と考えられる。
【００６０】
この役割は別として、ＴＧＦ−βには、組織修復、血管新生、免疫調節、細胞増殖、および分化における他の多くの機能がある。ＴＧＦ−βは、血小板、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、および線維芽細胞によって分泌され得る。そのシグナル伝達および細胞調節は非常に複雑である。
【００６１】
ほとんどのＴＧＦ−β産生細胞が、ＥＣＭリザーバ中に潜在型複合体として存在し、受容体と相互作用することができない生物学的に不活性な前駆体分子としてそれを産生する。結合可能な活性形態への、その潜在型ＴＧＦ−βの転換は、その細胞表面受容体が、トロンボスポンジン−１、特定のαｖβｘインテグリンヘテロ二量体（図１）、および様々なプロテアーゼなどの分子によって媒介され、そして、厳密に調整される。活性化ＴＧＦ−βは、II型ＴＧＦ−β受容体に結合し、標的遺伝子の誘導につながる細胞内情報伝達カスケードを始動する。今までのところ、αｖβ３、αｖβ３、αｖβ６およびαｖβ８がＴＧＦ−βの活性化を制御し得る証拠が存在する。これは、先におよび／または以下でさらに詳細に記載および考察される。
【００６２】
サイトカインＴＧＦ−βは、ＳＳｃ（「組織病理学および病態生理学的特徴」に関係する項もまた参照）を含めた、生理学的な線維形成および病理的な線維症の主な調節物質であると見なされる。ＴＧＦ−βの多数の細胞効果が本明細書中に記載され、そして、インテグリンとの接続および／またはインテグリンを伴うことを含めて、ＴＧＦ−βの最も適切な役割のいくつかを表７（以下）に示す。
【００６３】
表７．ＴＧＦ−βの線維形成活性
【表７】
2018534340.tif 000008
【００６４】
よって、本発明の好ましい対象は、線維症、特に全身性硬化症（ＳＳｃ）に罹患している患者の治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体に関する。好ましくは、「線維症」および／または「全身性硬化症」という用語は、当該技術分野で知られている意味および特徴を有する。より好ましくは、「線維症」および／または「全身性硬化症」という用語は、先におよび／または以下に記載した意味および特徴を有する。
【００６５】
よって、本発明の好ましい対象は、全身性硬化症における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体に関し、ここで、全身性硬化症は、肺、肝臓、腎臓、心臓系、および／または皮膚の全身性硬化症を含む。より好ましくは、本発明に従って治療されるべき疾患は、肺、肝臓、および腎臓の全身性硬化症から選択される。特に好ましくは、本発明に従って治療されるべき疾患は、肺の全身性硬化症であるか、または肺の全身性硬化症を含む。
【００６６】
全身性硬化症における使用のための、好ましくは先におよび／または以下でさらに詳細に記載の全身性硬化症で使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が同様に好まれ、好ましくは、ここで、全身性硬化症が、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚、より好ましくは肺、肝臓、腎臓、および／または心臓、そして、特に肺または心臓、から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
【００６７】
全身性硬化症の治療における使用、好ましくは先におよび／または以下でさらに詳細に記載する全身性硬化症の治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体もまた、同様に好まれ、ここで、全身性硬化症は、心臓系、血管および／または血液を侵す。よって、本発明に従って治療されるべき疾患は、拡張機能障害および骨髄線維症から選択されることが好ましい。
【００６８】
よって、使用のための、好ましくは先におよび／または以下で詳細に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体がより一層好まれ、ここで、全身性硬化症は、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症を含む。
【００６９】
よって、使用のための、好ましくは先におよび／または以下で詳細に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体がより一層好まれ、ここで、全身性硬化症は適応症または疾患を含み、ここで、巣状糸球体硬化症、または原発性巣状糸球体硬化症、および分節性糸球体硬化症、または原発性巣状糸球体硬化症の両方の臨床所見または兆候の１もしくは複数が存在する。したがって、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の治療における、使用のための、好ましくは先におよび／または以下で詳細に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体がより一層好まれる。
【００７０】
よって、使用のための、好ましくは先におよび／または以下でより詳細に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が特に好まれ、ここで、前記治療は、肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）に罹患している患者を含む。
【００７１】
あるいは、請求項１に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が好まれ、ここで、治療されるべき疾患は皮膚の全身性硬化症である。
【００７２】
好ましくは、皮膚の全身性硬化症は、びまん皮膚硬化型全身性硬化症（ｄｃＳＳｃ）と限局皮膚硬化型全身性硬化症（ＩｃＳＳｃ）から成る群から選択される。
【００７３】
本発明の特に好ましい対象としては、以下のものが挙げられる：
肺線維症、肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）、および／または強皮症関連間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）の治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性な変異体その改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６。
【００７４】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記治療は、１週または２週間あたり１０ｍｇ〜１０００ｍｇの量で、前記抗体、または生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量を投与することを含む。
【００７５】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記治療は、４週間以内または１カ月以内に約５００ｍｇ、約１０００ｍｇまたは約１５００ｍｇの量で、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量を投与することを含む。好ましくは、前記用量の投与は、４週間毎または毎月、何度か反復される。
【００７６】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記治療は、４週間毎に約５００ｍｇの量で、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量を投与することを含む。
【００７７】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記治療は、４週間毎に１０００ｍｇの量で、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量を投与することを含む。
【００７８】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記治療は、４週間毎に１５００ｍｇの量で、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体の用量、好ましくは有効量を投与することを含む。
【００７９】
好ましくは、それぞれ、４週間毎または毎月の前記用量の前記投与は、少なくとも４回、より好ましくは少なくとも８回、より一層好ましくは少なくとも１６回、および特に少なくとも２４回反復される。
【００８０】
典型的には、４週間毎または毎月の前記用量の前記投与は、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５または約３年間反復される。
【００８１】
よって、それぞれ、４週間毎または毎月の前記用量の前記投与は、好ましくは約３６回以下、より好ましくは約２８回以下、より一層好ましくは約２４回以下、そして、特に約１６回以下または約１２回反復される。
【００８２】
したがって、前記反復投与の好ましい持続期間の範囲は、４〜３６カ月、８〜３６カ月、１２〜３６カ月、８〜２８カ月、１２〜２８カ月、または１６〜２８カ月である。
【００８３】
しかしながら、原則として、前記反復投与の上限はない。しかしながら、患者の状態がどう進展したかを見て、そして、新しい反復投与が開始されるべきかまたはそうでないか決めるために、少なくとも一時的に、約０．５年後に、約１年後、約１．５年後に、約２年後に、または約２．５年後に、前記反復投与を止めることが妥当であり得る。先に記載の反復投与は、アビツズマブに関して特に好まれる。
【００８４】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、好ましくは直前の段落に記載の使用のための抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、用量、好ましくは有効量が単回投与で投与される。
【００８５】
先におよび／または以下で記載する治療における使用のための、好ましくは直前の２つの段落のうちの少なくとも一方に記載の使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記抗体、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体は、単独療法として投与される。
【００８６】
先におよび／または以下で記載する使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、前記生物学的に活性な変異体または改変体は、ＤＩ１７Ｅ６のＣＤＲ領域、ならびに重鎖および軽鎖可変領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも８０％同一、好ましくはＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９０％同一、より好ましくはＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９５％同一、そして、より一層好ましくはＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９８％同一、そして、特にＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９９％同一である。
【００８７】
先におよび／または以下で記載する使用のための、特に直前の段落に記載の使用のための、重鎖フレームワーク領域：
【化１】
2018534340.tif 000009
【００８８】
｛式中、太字および下線を引いた位置のうちの１若しくは複数が、変異していて、本来のそれぞれの配列と比較して異なっている｝の中に１若しくは複数の修飾を含むＤＩ１７Ｅ６抗体。
【００８９】
先におよび／または以下で記載する使用のための、ＤＩ１７Ｅ６抗体、および／または生物学的に活性なその変異体または改変体、ここで、生物学的に活性なその変異体または改変体が定常領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも８０％同一であり、好ましくはＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、そしてより好ましくは、ＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９５％同一であり、より一層好ましくはＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９８％同一であり、そして、特に、ＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較してアミノ酸配列が少なくとも９９％同一である。
【００９０】
先におよび／または以下で記載する使用のための、ヒトＩｇＧ２の代わりにヒトＩｇＧ１定常領域を含むか、またはヒトＩｇＧ１ヒンジの代わりにヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を含む、ＤＩ１７Ｅ６抗体、および／または、生物学的に活性なその変異体または改変体。
【００９１】
本発明のより特に好ましい対象としては、以下のものが挙げられる：
ＤＩ１７Ｅ６抗体、および／あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を患者に投与することを含む、線維症、好ましくは全身性硬化症、特に先におよび／または以下で記載する全身性硬化症を治療する方法、ここで、生物学的に活性な変異体または改変体は、ＣＤＲ領域、ならびに重鎖および軽鎖可変領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較して、アミノ酸配列が８０％〜９５％同一である。
【００９２】
ＤＩ１７Ｅ６抗体、および／あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を患者に投与することを含む、線維症、好ましくは全身性硬化症、特に先におよび／または以下で記載する全身性硬化症を治療する方法、ここで、生物学的に活性な変異体または改変体は定常領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の定常領域と比較して、アミノ酸配列が少なくとも８０％〜９８％同一である。
【００９３】
重鎖フレームワーク領域：
【化２】
2018534340.tif 000010
【００９４】
｛式中、太字および下線を引いた位置のうちの１若しくは複数が、変異していて、本来のそれぞれの配列と比較して異なっている｝の中に１若しくは複数の改変体を含む、ＤＩ１７Ｅ６抗体、および／あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を患者に投与することを含む、線維症、好ましくは全身性硬化症、特に先におよび／または以下で記載する全身性硬化症を治療する方法。
【００９５】
ヒトＩｇＧ２の代わりにヒトＩｇＧ１定常領域を含むか、またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の代わりにヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を含む修飾ＤＩ１７Ｅ６抗体の投与を含む、先におよび／または以下で記載する、好ましくは直前に記載したそれぞれの方法。
【００９６】
第１相の非盲検試験による安全性の結果から、４つの用量レベルのそれぞれにおける単剤ＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）の反復点滴は、概ね十分な耐容性を示し、患者において安全であるように見える。用量制限毒性（ＤＬＴ）および点滴反応はない。用量に関して、ＴＥＡＥ、ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ（第３．０版）グレード、または薬物関連の分布状態に何ら傾向は観察されない。さらに、個々のコホート内でいかなる特定事象も蓄積した証拠はない。１１名の患者が、薬物関連と考えられるＴＥＡＥを経験した。この点に関して、合計４名の患者で報告された掻痒、紅斑、および発疹などの皮膚症状は、インテグリンが上皮表現型の維持に関与していることを考慮すると、ＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）に関連した予測可能な有害事象である。粘膜炎および舌腫脹の症状もまた、ＥＭＤ ５２５７９７の作用機序に特有なものである場合があるが、疲労と共に基礎疾患の徴候である場合もある。８名の患者に観察された血液学的および生化学的毒性の変化もまた、基礎疾患および併用薬によって説明することができる。
【００９７】
試験薬の単回投与および複数回投与の後のＰＫ評価により、ＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）は、膜結合受容体を標的とする他の抗体について記載されているように、受容体を媒介としたクリアランスモデルに従う挙動をしたことが示唆される。健常ボランティアにおける以前の試験結果と一致して、ｍＣＲＰＣ患者におけるＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）のＰＫは用量依存的であり、結合していない受容体のアベイラビリティによって主に決定されるクリアランスを示す。本試験で使用される用量では、１０００ｍｇ以上の用量で、ほぼすべての受容体が飽和し、薬物クリアランスに対して僅かな寄与しかしていないと仮定することができる。免疫学的に誘発された、ＤＩ１７Ｅ６に対する抗体を、一部の患者（１６％）に検出することができる；しかしながら、ＰＫまたは安全性への影響は見出すことができなかった。
【００９８】
よって、本発明の好ましい対象は、以下のとおりである：
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記抗体の用量、好ましくは有効量は、２週間あたり５００ｍｇ〜１５００ｍｇまたは１カ月あたり１０００〜３０００ｍｇ、好ましくは２週間あたり５００〜１０００ｍｇまたは１カ月あたり１０００〜２０００ｍｇである。
【００９９】
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記抗体の用量、好ましくは有効量は、１カ月あたり約５００ｍｇ、１カ月あたり約１０００ｍｇ、１カ月あたり約１５００ｍｇまたは１カ月あたり約２０００ｍｇである。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、５００〜１０００ｍｇの用量、好ましくは有効量が単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１０００〜２０００ｍｇの用量、好ましくは有効量が単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、５００〜１０００ｍｇの用量、好ましくは有効量が１カ月に一度の単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１０００〜２０００ｍｇの用量、好ましくは有効量が１カ月に一度の単回注入によって投与される）。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、約５００ｍｇの用量、好ましくは有効量が単回注入によって投与される。
【０１００】
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１０００ｍｇの用量、好ましくは有効量が単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１５００ｍｇの用量、好ましくは有効量が単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１５００ｍｇの用量、好ましくは有効量が１カ月に一度の単回注入によって投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、１５００ｍｇの用量、好ましくは有効量が４週間に一度の単回注入によって投与される。
【０１０１】
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、
ここで、抗体は、追加の同時療法剤を伴わない単独療法設定で投与される。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、追加の同時療法剤と組み合わせて併用療法設定で投与される。
【０１０２】
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、ＭＭＦ（ミコフェノレート（Mycophenolat）またはミコフェノラート（Mycophenolate））と組み合わせて併用療法設定で投与される。
【０１０３】
・先におよび／または以下で記載するＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、ＭＭＦ（ミコフェノレートまたはミコフェノラート）と組み合わせて併用療法設定で投与される。
・先におよび／または以下で記載するＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、ＭＭＦ（ミコフェノレートまたはミコフェノラート）と組み合わせて併用療法設定で１カ月あたり約５００ｍｇの量で、好ましくは１カ月に一度の単独投与として約５００ｍｇの量が投与される。
・先におよび／または以下で記載するＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、ＭＭＦ（ミコフェノレートまたはミコフェノラート）と組み合わせて併用療法設定で１カ月あたり約１，０００ｍｇの量で、好ましくは１カ月に一度の単独投与として約１，０００ｍｇの量で投与される。
【０１０４】
・先におよび／または以下で記載するＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のためのＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、抗体は、ＭＭＦ（ミコフェノレートまたはミコフェノラート）と組み合わせて併用療法設定で１カ月あたり約１，５００ｍｇの量で、好ましくは１カ月に一度の単独投与として約１，５００ｍｇの量で投与される。
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、線維症、好ましくは過度の、および／または病的な線維症の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
【０１０５】
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、線維性障害、好ましくは先におよび／または以下で記載するような線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・先におよび／または以下で記載する疾患の治療における使用のための、先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記疾患で侵される臓器は、肺、肝臓、腎臓、心臓系または皮膚から成る群から選択される。
【０１０６】
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、線維症、好ましくは過度の、および／または病的な線維症の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、線維症、過度の線維症および／または病的な線維症は、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、線維性障害、好ましくは先におよび／または以下で記載する線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記線維性障害は、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
【０１０７】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、全身性硬化症は、肺、肝臓、腎臓、心臓系、および／または皮膚の全身性硬化症を含む。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、全身性硬化症は、心臓系、血管、および／または血液を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は、肺および／または皮膚を侵す。
【０１０８】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は肺を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は皮膚を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は肝臓を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は腎臓を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は心臓を侵す。
【０１０９】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、全身性硬化症は、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症を含む。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体、ここで、前記全身性硬化症は、肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）を含む。
【０１１０】
・肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・ＳＳｃ−ＩＬＤまたは強皮症−ＩＬＤの治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・強皮症−ＩＬＤに罹患している患者の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
【０１１１】
・皮膚の全身性硬化症（ｄｃＳＳｃ）または限局皮膚硬化型全身性硬化症（ＩｃＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・全身性硬化症に関連する間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）に罹患している対象、好ましくはヒト対象の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・全身性硬化症に関連する間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）に罹患している対象、好ましくはヒト対象の治療における使用のためのアビツズマブ。
【０１１２】
・既にミコフェノラートを与えた、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している対象、好ましくはヒト対象の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・既にミコフェノラート、好ましくは一定容量のミコフェノラートを与えた、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している対象、好ましくはヒト対象の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するＤＩ１７Ｅ６抗体。
・既にミコフェノラートを与えた、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している対象、好ましくはヒト対象の治療における使用のためのアビツズマブ。
【０１１３】
・線維症および／または線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、生物学的に活性な変異体または改変体は、ＤＩ１７Ｅ６のＣＤＲ領域、ならびに重鎖および軽鎖可変領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の可変領域と比較して、アミノ酸配列が少なくとも８０％、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０１１４】
・線維症および／または線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、生物学的に活性な変異体または改変体は、ＤＩ１７Ｅ６の重鎖および／または軽鎖可変領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の重鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、アミノ酸配列が少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または少なくとも９９．５％同一である。
【０１１５】
・線維症および／または線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、ここで、生物学的に活性な変異体または改変体は、ＤＩ１７Ｅ６の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域を含み、そしてそれは、ＤＩ１７Ｅ６の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域のそれぞれと比較して、アミノ酸配列が少なくとも９０％、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。
【０１１６】
・先におよび／または以下で記載する線維症および／または線維性障害の治療における使用のための、重鎖フレームワーク領域：
【化３】
2018534340.tif 000011
｛式中、太字および下線を引いた位置のうちの１もしくは複数が、変異していて、ＤＩ１７Ｅ６の本来のそれぞれの配列と比較して異なっている｝の中に１若しくは複数の改変体を含む、先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体。
【０１１７】
・好ましくは先におよび／または以下で記載する様式での、線維性障害、好ましくは先におよび／または以下で記載する線維性障害の治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、前記線維性障害は、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
【０１１８】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、全身性硬化症は、肺、肝臓、腎臓、心臓系、および／または皮膚の全身性硬化症を含む。
【０１１９】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、前記全身性硬化症は、肺、肝臓、腎臓、心臓、および皮膚から成る群から選択される１若しくは複数の臓器を侵す。
【０１２０】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、全身性硬化症は、心臓系、血管、および／または血液を侵す。
【０１２１】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、前記全身性硬化症は、肺、および／または皮膚を侵す。
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、全身性硬化症は、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨまたはＮａｓｈ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症を含む。
【０１２２】
・全身性硬化症（ＳＳｃ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載するような前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体、ここで、前記全身性硬化症は、肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）を含む。
【０１２３】
・肺線維症および／または肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）の治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体。
【０１２４】
・ＳＳｃ−ＩＬＤまたは強皮症−ＩＬＤの治療における使用のための先におよび／または以下で記載する前記抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６の生物学的に活性な変異体または改変体。
【０１２５】
・抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を投与することによって対象の線維症および／または線維性障害を治療する方法、ここで、前記対象は、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上、好ましくは５以上、より好ましくは９以上、より一層好ましくは１５以上、そして特に１６、１７、１８または１９種類の遺伝子を含む多遺伝子シグネチャーから計算した閾値より高いスコアを特徴とし、特に、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）に基づく９種類の遺伝子シグネチャーは、以降ＴＵＡＤシグネチャーとも呼ばれた。
【０１２６】
・遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上、好ましくは５以上、より好ましくは９以上、より一層好ましくは１５以上、そして特に１６、１７、１８または１９種類の遺伝子を含む多遺伝子シグネチャーから計算した閾値より高いスコアの変化を追跡することによって、対象の線維性疾患における線維症の重症度、および／または線維症を発症する可能性がある疾患における線維症の出現を観察する方法であって、特に、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）に基づく９種類の遺伝子シグネチャーは、以降ＴＵＡＤシグネチャーとも呼ばれた。
【０１２７】
・抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体を投与することによって対象の線維症および／または線維性障害を治療する方法、ここで、前記対象は、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＲＧＳ５（ＮＭ＿００３６１７）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＩＧＦＢＰ２（ＮＭ＿０００５９７）、ＮＭ＿００５５７６、ＭＯＸＤ１（ＮＭ＿０１５５２９）、ＡＤＲＡ２Ａ（ＮＭ＿０００６８１）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＭＭＰ１０（ＮＭ＿００２４２５）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＮＭ＿０１４４５２）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＴＧＦ−β３（ＮＭ＿００３２３９）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、ＳＰＰ１（ＮＭ＿０００５８２）、ＣＣＬ２（ＮＭ＿００２９８２）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）から成る群から選択される２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、より一層好ましくは１５以上、そして特に１６、１７、１８または１９種類の遺伝子を含む遺伝子シグネチャーを特徴とし、特に、遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１（ＮＭ＿００１８５５）、ＣＯＬ１Ａ１（ＮＭ＿００００８８）、ＣＯＭＰ（ＮＭ＿００００９５）、ＣＯＬ１０Ａ１（ＮＭ＿０００４９３）、ＣＯＬ５Ａ１（ＮＭ＿００００９３）、ＣＯＬ５Ａ２（ＮＭ＿０００３９３）、ＩＴＧＡ７（ＮＭ＿００２２０６）、ＭＭＰ１１（ＮＭ＿００５９４０）、およびＴＮＣ（ＮＭ＿００２１６０）に基づく９種類の遺伝子シグネチャーは、以降ＴＵＡＤシグネチャーとも呼ばれた。
【０１２８】
・線維症および／または線維性障害の予防および／または治療のための薬物の製造のための、ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは本明細書中の記載に準じた生物学的に活性なその変異体または改変体そして、特にアビツズマブの使用。
・線維症および／または線維性障害の予防および／または治療、そして特に、特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症の予防および／または治療のための薬物の製造のための、ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは本明細書中に記載した内容に準じた生物学的に活性なその変異体または改変体、そして特にアビツズマブの使用。
【０１２９】
・本明細書中に記載した線維症および／または線維性障害の予防および／または治療、そして特に特発性肺線維症、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性巣状糸球体硬化症、原発性分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、拡張機能障害、および骨髄線維症から成る群から選択される１若しくは複数の適応症の予防および／または治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用。
・好ましくは肺線維症、肺胞隔炎（間質性肺疾患、ＩＬＤ）、および／または強皮症関連間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）を含めた全身性硬化症の予防および／または治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用。
【０１３０】
・巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の予防および／または治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用。
・本明細書中に記載の線維症および／または線維性障害の予防および／または治療のための薬物の製造のためのＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは本明細書中に記載した内容に準じた生物学的に活性なその変異体または改変体、そして特にアビツズマブの使用、ここで、治療は、ミコフェノール酸、ミコフェノラート、ミコフェノラートモフェチル、ミコフェノラートナトリウム、メトトレキサート、アメソプテリン、およびプレドニゾンから成る群から選択される１若しくは複数の有効成分の投与をさらに含む。
【０１３１】
・本明細書中に記載した線維症および／または線維性障害の治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用、ここで、治療は、ミコフェノール酸、ミコフェノラート、ミコフェノラートモフェチル、および／またはミコフェノラートナトリウムの投与をさらに含む。
・本明細書中に記載した線維症および／または線維性障害の予防および／または治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用、ここで、治療は、メトトレキサート、および／またはアメソプテリンの投与をさらに含む。
・本明細書中に記載した線維症および／または線維性障害の予防および／または治療のための薬物の製造のためのアビツズマブの使用、ここで、治療はプレドニゾンの投与をさらに含む。
【０１３２】
その独自の様々な作用様式のため、ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは本明細書中に記載した内容に準じた生物学的に活性なその変異体または改変体、そして特にアビツズマブは、基本的に、線維症、線維性障害、特に本明細書中に記載の線維症および／または線維性障害の予防および／または治療で適用されるすべての治療オプションと組み合わせて適用可能であると考えられる。
【０１３３】
よって、これだけに限定されるものではないが、ミコフェノール酸、ミコフェノラート、ミコフェノラートモフェチル、ミコフェノラートナトリウム、メトトレキサート、アメソプテリン、およびプレドニゾンから成る群から選択される１若しくは複数の有効成分を含めた、線維症および／または線維性障害の治療における典型的な標準薬物の投与を含めた治療計画への、ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体、好ましくは、本明細書中に記載した内容に準じた生物学的に活性なその変異体または改変体、そして特にアビツズマブの追加。
【０１３４】
よって、先におよび／または以下で記載する、好ましくは先に記載した使用のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体は特に好まれ、ここで、前記抗体、または前記その改変体は、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である。同様に、先におよび／または以下で記載する、好ましくは先に記載した方法は特に好まれ、ここで、前記抗体または前記その改変体は、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である。同様に、線維症および／または線維性障害、先におよび／または以下で記載する、そして特に好ましくは先に記載したもの予防および／または治療のための薬物の製造のための、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体は特に好まれ、ここで、前記抗体または前記その改変体は、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である。
【０１３５】
本発明によると、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６（好ましくは、本明細書中でアビツズマブまたはアビツズマブとも呼ばれる）は、αｖインテグリン（受容体）に対して遺伝子操作された特異的にオーダーメイドされたＩｇＧ２ハイブリッドモノクローナル抗体である。この抗体は、ＷＯ２００９／０１０２９０に詳細に記載されており、そしてその開示は、その全体が本明細書中に援用される。
【０１３６】
その超可変領域（ＣＤＲ）は、マウスｍＡｂ １７Ｅ６（ＥＭＤ ７３０３４）に由来する。このマウスＩｇＧ１親抗体は、例えば、Mitjansら（1995;J.Cell Sci.108,2825）ならびに米国特許第５，９８５，２７８号明細書および欧州特許第７１９８５９号明細書に記載されている。マウスｍＡｂ １７Ｅ６は、ハイブリドーマ細胞株２７２−１７Ｅ６により産生され、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０で寄託されている。
その軽鎖ドメインは、ヒト化モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体４２５（マツズマブ）に由来する。この抗体は、例えば欧州特許第０５３１４７２Ｂ１号明細書に詳細に記載されており、そのマウス対応物４２５（マウスＭＡｂ ４２５、ＡＴＣＣ ＨＢ９６２９）に由来する。この抗体は、ヒトＡ４３１癌細胞株に対して産生されたものであり、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の外部ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが見出された。マツズマブは臨床試験で高い効力を示した。
【０１３７】
概して、本発明に従って使用される抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６は、以下のものを含む：
（ｉ）マウスモノクローナル抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６に由来するＣＤＲ軽鎖および重鎖領域、
（ｉｉ）ヒト化モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体４２５から得られる軽鎖フレームワーク領域、
（ｉｉｉ）マウスモノクローナル抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６に由来する重鎖フレームワーク領域（任意選択で、特定位置のアミノ酸の１つまたは複数の変異を含む）、および（ｉｖ）ヒトＩｇＧ２に由来する重鎖定常領域およびヒト定常κ軽鎖領域、ここで、前記ＩｇＧ２ドメインでは、ＩｇＧ２ヒンジ領域がヒトＩｇＧ１ヒンジドメインで置換されており、任意選択で、ＩｇＧ２内で１つまたは複数の変異がなされている。
【０１３８】
具体的には、特許請求の範囲にある治療ならびに上記および下記に記載の臨床試験における治療のために使用されるＤＩ１７Ｅ６（「ＤＩ１７Ｅ６γ２ｈ（Ｎ２９７Ｑ）」または「ＥＭＤ ５２５７９７」と命名される）は、以下のアミノ酸配列を有する：
（ｉ）可変および定常軽鎖配列（配列番号１）：
【０１３９】
【化４】
2018534340.tif 000012
および
（ｉｉ）可変および定常重鎖配列（配列番号２）：
【化５】
2018534340.tif 000013
【０１４０】
配列中、下線付き配列は、ＣＤＲ（太字、マウス親抗体と同一）を含有する可変領域を示す。改変ＩｇＧ１ヒンジ領域は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３）で示され、ＡＱはＩｇＧ２ドメイン内の置換である。
【０１４１】
しかしながら、国際公開第２００９／０１０２９０号パンフレットで示されるように、ＤＩ１７Ｅ６の変異体もまた、本発明の教示に従って使用することができる。したがって、下記の重鎖フレームワーク領域内の１つまたは複数の改変を含むＤＩ１７Ｅ６変異体は、記載されるように、前立腺癌患者の治療に使用することができる：
【０１４２】
【化６】
2018534340.tif 000014
【０１４３】
配列中、太字および下線付き位置の１つまたは複数は変異している。より詳細には、重鎖フレームワーク領域の下記変異位置では、１つ、複数、またはすべての下記位置を変異させることができる：Ａ９、Ｅ１３、Ｍ２０、Ｋ３８、Ｒ４０、Ａ７２、Ｓ７６、Ｑ８２、Ｇ８５、Ｔ８７、Ｓ９１、およびＳ１１３。これらの変異体は、上記配列で定義されるＤＩ１７Ｅ６と比較して、同じかまたは極めて類似した生物活性および効力を示す。
【０１４４】
一般に、記載の本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６と機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつＣＤＲ領域ならびに重鎖および軽鎖可変領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの可変領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。加えて、本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６と機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ定常領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの定常領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。この抗体のＩｇＧ鎖の定常領域を変化させると、免疫原性、ＡＤＣＣ等の特定の性質を改善することができる。
【０１４５】
好ましくは、記載の本発明はまた、（未改変）ＤＩ１７Ｅ６またはアビツズマブと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ重鎖および軽鎖可変領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの重鎖および軽鎖可変領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。加えて、本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６、好ましくはこの段落の直前に記載したものと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ定常領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの定常領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％もしくは少なくとも９９．９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。この抗体のＩｇＧ鎖の定常領域を変化させると、免疫原性、ＡＤＣＣ等の特定の性質を改善することができる。
【０１４６】
より一層好ましくは、記載の本発明はまた、（未改変）ＤＩ１７Ｅ６またはアビツズマブと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ可変重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの可変重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。加えて、本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６、好ましくはこの段落の直前に記載したものと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ定常領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの定常領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％もしくは少なくとも９９．９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。
【０１４７】
特に好ましくは、記載の本発明はまた、（未改変）ＤＩ１７Ｅ６またはアビツズマブと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域が、（未改変）ＤＩ１７Ｅ６またはアビツズマブと１００％同一であるが、しかし、前記ＣＤＲ領域以外の重鎖および軽鎖可変領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの重鎖および軽鎖可変領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。加えて、好ましくは、本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６、好ましくはこの段落の直前に記載したものと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ定常領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの定常領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％もしくは少なくとも９９．９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。
【０１４８】
特に好ましくは、記載の本発明はまた、（未改変）ＤＩ１７Ｅ６またはアビツズマブと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、可変重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの可変重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。かつ、前記ＣＤＲ領域以外の重鎖および軽鎖可変領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの重鎖および軽鎖可変領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。加えて、好ましくは、本発明はまた、未改変ＤＩ１７Ｅ６、好ましくはこの段落の直前に記載したものと機能的および／または薬学的に同一または同様であり、かつ定常領域が、ＤＩ１７Ｅ６のそれぞれの定常領域と比較して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％もしくは少なくとも９９．９％同一である、ＤＩ１７Ｅ６抗体の改変体および変異体を含む。
【０１４９】
特に好ましくは、ＤＩ１７Ｅ６抗体またはアビツズマブは、ヒトαｖインテグリンリガンドに結合するリガンドを標的化および阻害する先におよび以下に記載するＩｇＧ２サブクラスの遺伝子組み換え、脱免疫化モノクローナル抗体である。特に好ましくは、前記ＤＩ１７Ｅ６抗体またはアビツズマブのＦｃ領域に通常存在する糖鎖構造が、分子を非グリコシル化する接続点として通常役立つアミノ酸残基を遺伝的に変更することによって取り除かれた。抗体は、特に好ましくは、４本のポリペプチド鎖である、それぞれ４４７個のアミノ酸から成る２本の同一の重鎖およびそれぞれ２１４個のアミノ酸から成る２本の同一の軽鎖から構成される。典型的には、４本の鎖が共有結合（ジスルフィド）および非共有結合の組み合わせによって保持される。分子の大体の分子量は１４５ｋＤａである。
【０１５０】
より具体的には、本明細書中に記載したＤＩ１７Ｅ６抗体、そして特にアビツズマブまたはＥＭＤ５２５７９７は、高親和性汎αｖインテグリン阻害剤として特徴づけられ、そしてそれは、インビトロにおいて、潜在型ＴＧＦ−βのインテグリン依存性活性化を阻害すること、ＦＭＴを阻害すること、筋線維芽細胞に対してインテグリンの上方制御を妨げること、および筋線維芽細胞の収縮を妨げることが示された。よって、それは、ヒトαｖインテグリン鎖に特異的である独特のエピトープに特異的に結合する。さらに、それは、例えばα４β１や血小板フィブリノーゲン受容体αＩＩｂβ３などの他のインテグリンと交差反応しないので、好ましくはＡＤＣＣおよびＣＤＣを引き起こさない。
【０１５１】
本発明によると、ＤＩ１７Ｅ６は、線維症、より好ましくは全身性硬化症に罹患している患者において、そして特に、本明細書中に記載の全身性硬化症の適応症の１もしくは複数において、非常に効果的であると考えられる。より具体的には、アビツズマブは、線維症、より好ましくは全身性硬化症に罹患している患者において、そして特に、本明細書中に記載した全身性硬化症の適応症の１もしくは複数において非常に効果的であると考えられた。
【０１５２】
さらに、本明細書中に記載のＤＩ１７Ｅ６、そして特に、アビツズマブは、本明細書中に記載の線維症のより効果的な、および／またはより安全な治療を提供するのに好適であり、うまく許容され、および以前に知られている治療法で見られるより良好な免疫応答を引き起こし得る、と考えられる。好ましくは、アビツズマブを用いた治療は、より効果的、より安全であり、より良好に許容されて、そして、ＳＳｃ−ＩＬＤに罹患している患者、好ましくはまたミコフェノラートの一定用量を既に受けている患者の治療におけるより良好な免疫応答を引き起こし得る、と考えられる。
【０１５３】
本発明に記載のとおり、ＴＧＦ−βは、組織線維症の主メディエーターであることが示されている。ＳＳｃに罹患している患者では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路が活性化され、および一部のαｖβｘインテグリンヘテロ二量体がＴＧＦ−βの活性化を制御するという知見と共に、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体が、周知のＴＧＦ−β活性化との干渉により、そしてさらに、線維症にかかわることがわかっているαｖインテグリンに対するＴＧＦ非依存性機能により、ＳＳｃにおいて有益な効果を有すると考えられる。そのため、ＥＭＤ５２５７９７は、患者で多重様式の作用によってＳＳｃにおいて有益であり得る。このことは、先におよび／または以下で詳細に記載される。しかしながら、交差反応性の欠如のため（段落Ａ３．１．３ 作用の様式を参照）、線維症の齧歯動物モデルにおいてＤＩ１７Ｅ６は直接試験されることができない。ＳＳｃまたはＳＳｃ−ＩＬＤのヒト以外の霊長類の線維症の前臨床モデルは、実行不可能と言わないまでの、困難だと思われる。ＤＩ１７Ｅ６以外の妨害αｖ抗体を用いた前臨床実験がヒト細胞で行われたが、インビボ実験の矛盾する結果はそれらの関連性を制限する。よって、とりわけ、齧歯動物における前臨床線維症モデルにおける遺伝的または代用抗体媒介性αｖインテグリン妨害の効果、さらに、αｖインテグリン妨害に関して、他の臓器におけるＳＳｃ兆候に比べてＳＳｃ−ＩＬＤ疾患適応症（急性肺傷害応答、異常な上皮創傷閉鎖応答、ＥＭＴ）を援助するより多くの証拠の存在を、我々は本明細書中に記載する。
【０１５４】
インビトロにおけるαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの抗体媒介性妨害は、ＳＳｃまたは特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者のいずれかの組織サンプルから得られたヒト線維芽細胞においてＴＧＦ−β依存性応答を阻害することが示され（Asano et al., American Journal of Pathology, Vol. 168, No. 2, February 2006, The Journal of Immunology, 2005, 175: 7708-7718, ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 52, No. 9, September 2005, pp 2897-2905, Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 1761-1769, Scotton et al., J. Clin. Invest.  119:2550-2563 (2009)）、今までのところ、インビボにおいてこれらのインテグリンがＴＧＦ−βを活性化することの説得力のある証拠がない。例えば、αｖβ３およびαｖβ５の遺伝子欠失は、ブレオマイシン誘発性肺線維症において効果がない（Atabai et al., J. Clin. Invest. 119:3713-3722 (2009)）。しかしながら、β８インテグリン（Ｉｔｇｂ８）の遺伝子除去と、αｖβ６の抗体阻害との組み合わせは、Ｔｇｆｂ１ヌルマウスに見られるのと同様の表現型を除いて、Ｉｔｇｂ８−／−動物に比べて、より重度の表現型をもたらすことが示され（Aluwihare et al., Journal of Cell Science 122, 2009, 227- 232）、いずれかまたは両方のインテグリンが、インビボにおいて胎児から成体マウスへの分化の様々な状況で、マウスでの、生物学的発生中のＴＧＦ−βの活性化に役割を果たし得ると考察された。
【０１５５】
Takahashiら（Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 24, pp. 264-271, 2001）は、マウスのブレオマイシン誘発性肺線維症の発症機序におけるオステオポンチンの役割を調査した。オステオポンチン（ＯＰＮ）は、活性化マクロファージによって産生され、およびαｖインテグリンと相互作用することによって、細胞の接着性および遊走を含めた様々な機能を媒介するサイトカインの１つであることが報告されている。線維芽細胞に対するＯＰＮのこれらの効果は、このモデルにおいて、抗マウスαｖインテグリンモノクローナル抗体（ＲＭＶ−７）の添加によって著しく抑えられた。
【０１５６】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）は肺線維症の重要なドライバーであるので、その作用を阻害する治療戦略が求められる。しかしながら、ＴＧＦ−βには、治療学的な阻害の解決を難しくする他の恒常的役割がある。よって、Horanら（Am J Respir Crit Care Med Vol 177. pp 56-65, 2008）は、マウスブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおいて、αｖｂ６媒介性ＴＧＦ−β活性化を妨げるモノクローナルｐＳｍａｄ２／３一次抗体を使用して、肺におけるＴＧＦ−βの主要な活性化因子であるインテグリンαｖｂ６の阻害を調査した。前記αｖｂ６インテグリン抗体を使用したＴＧＦ−βの部分的阻害は、前記マウスモデルにおいて炎症を悪化させずにマウス肺線維症を妨害するのに有効であると記載された。
【０１５７】
ＲＧＤ配列配列を含む合成ペプチドは、様々な細胞系でインテグリン関連機能を阻害できると記載した。Moonら（Respiratory Research 2009, 10:18）は、気管内（ｉ．ｔ．）のリポ多糖（ＬＰＳ）処置に対する主要な炎症反応に対する、およびマウスにおける急性肺傷害の発症中のインテグリンシグナル伝達マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路に対する、合成Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）ペプチドの効果を調査した。ＲＧＤＳを用いた前処置は、ＬＰＳ治療後４または２４時間における、好中球およびマクロファージ数、総タンパク質量レベル、ならびにＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２レベル、そして、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中のマトリックスメタロプロテアーゼー９活性、のＬＰＳ誘発性増加を阻害した。重要なことには、炎症反応およびキナーゼ経路の阻害は、このペプチドがＬＰＳ治療の２時間後に投与された際にさらに明白であった。同様に、αｖインテグリンに対する妨害抗体は、ＬＰＳの４または２４時間後の、肺内へのＬＰＳ誘発性炎症細胞の遊走、タンパク質の蓄積、およびＢＡＬ中の炎症誘発性メディエーター産生を著しく阻害した。これらの結果は、αｖインテグリンに高特異性を有するＲＧＤＳが、このマウスモデルにおける急性肺傷害のＬＰＳ誘発性発症中の炎症カスケードを減弱することを示唆する。
【０１５８】
αｖβ６インテグリンによる潜在型ＴＧＦ−βの活性化は、急性肺傷害の発症における重要な１ステップであることが報告された。Jenkinsら（J. Clin. Invest. 116:1606- 1614 (2006)）は、トロンビン、およびプロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲＩ）の他の作動薬がαｖβ６インテグリン特異的様式でＴＧＦ−βを活性化することを示す。この効果は、ＰＡＲＩ特異的であり、かつ、ＲｈｏＡおよびＲｈｏキナーゼによって媒介されると考えられる。ＰＡＲ１特異的ペプチドＴＦＩＩＲＮの気道内注入は、高い一回換気量の換気中の肺浮腫を増強し、そしてこの効果がαｖβ６インテグリンに対する妨害抗体によって完全に阻害されることが記載されている。しかしながら、我々がＬＡＰに結合するが、ＴＧＦ−βを活性化しない細胞質変異体を同定したので、αｖβ６によるＴＧＦ−βの活性化はおそらく、ＬＡＰへの単純に結合することを上回る必要がある。さらに、
ともにＬＡＰに結合することができるが、αｖβ１およびα８β１インテグリンは共にＴＧＦ−βを活性化しない。αｖβ６依存性ＴＧＦ−β活性化のＰＡＲＩ媒介性促進は、それによって急性肺傷害の発症に寄与する凝固カスケードが活性化する１つの機構として解釈されるだろうことが、これらのインビトロ実験で確認した。
【０１５９】
形質転換成長因子（ＴＧＦ）ファミリーメンバーは、細胞増殖、マトリクス産生、および組織の炎症に対する効果によって創傷修復に関する複数の態様を調整するが、創縫合自体に対するＴＧＦ−βの効果は論議を呼んでいる。Neuohrら（Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. Vol. 35, pp 252-259, 2006）は、使用したＴＧＦ−βに対する妨害抗体が、この気道上皮細胞培養モデルにおける初代気道上皮細胞単層のひっかき傷の閉鎖度合いを高めた一方で、外因性ＴＧＦ−１βの添加は閉鎖の度合いを阻害した報告しており、ＴＧＦ−βの内因性活性化が創縫合の度合いに対するブレーキとして役立つであろうことを示唆している。ＴＧＦ−β１の妨害は創縫合の度合いを高めたが、一方で、ＴＧＦ−β２の妨害はこの細胞培養モデルでは効果がなかった。ここで、ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β２でない）は、共に前記気道上皮細胞で発現されることがわかったインテグリンファミリーの２つのメンバー、αｖβ６およびαｖβ８によって活性化され得る。記載したモデルにおいて、細胞層の創傷は両インテグリンの効果によってＴＧＦ−βの活性化を誘発したが、ヒトαｖβ８に対して選ばれたマウスモノクローナル抗体（３７Ｅ１）は創縫合の度合いを高めたが、その一方で、ヒトαｖβ６（抗ＨＥＬ−ＡＢ ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１、１０Ｄ５）に対する選ばれたマウスモノクローナル抗体は高めなかった。
【０１６０】
形質転換成長因子−ｂ１（ＴＧＦ−β１）は、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化の強力なメディエーターであり、そしてそれは、細胞骨格タンパク質、α平滑筋アクチンの容貌を特徴とする。Lygoeら（Wound Rep. Reg. 2004;12:461-470）は、選択されたモノクローナルマウス抗ヒト抗体（αｖβ３に対してＬＭ６０９、β１に対してＰ４Ｃ１０、αｖβ５対してＰ１Ｆ６、β１に対してＡ１１Ｂ２、αｖに対してＬ２３０）を用いたαｖおよび／またはβ１インテグリンの妨害は、ＴＧＦ−β１−誘発性筋線維芽細胞分化を妨げ、α平滑筋アクチンの発現増加によって見られ、そして、３種類のヒト線維芽細胞細胞株（口、皮膚、および腎臓由来）でコラーゲンゲル収縮を高めた、と記載している。さらに、αｖ特異的インテグリンαｖβ５およびαｖβ３の妨害は、口および皮膚由来の線維芽細胞の潜在筋線維芽細胞分化を抑制した；しかしながら、腎臓細胞では、分化の妨害はαｖβ３ではなく、αｖβ５インテグリンの妨害で見られただけであった。これらのデータは、口、皮膚、および腎臓由来のヒト線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化におけるαｖインテグリンの役割を示し、そして、一般的な分化経路であろうことを示唆する。
【０１６１】
αｖインテグリンはまた、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＨ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）因子などの様々な成長因子との相互作用による血管新生の最適な機能に関与するであろう。ＢＩＢＦ−１１２０のように、Boehringer Ingelheim製の新規化学物質（ＮＣＥ）は、これらの受容体のチロシンキナーゼを標的として、そして、ＳＳｃ−ＩＬＤと共通する特徴を有する肺線維症の別の形態である特発性肺線維症（ＩＰＦ）におけるＰｏＣトライアルにおいて暫定的な効能を示し、ＤＩ１７Ｅ６がこれらの受容体の阻害によって潜在的な薬効を有すると予想される。このことは、ヒト細胞を用いて観察されたＤＩ１７Ｅ６によるＶＥＧＦ誘発性ＥＲＫリン酸化の阻害と一致している。
【０１６２】
以下に考察した機構に縛られることなく、本発明の基礎となる結果に基づいて、我々は、上皮系から間葉系への転換（ＥＭＴ）は、線維症、線維性障害、および／または線維化性肺障害に寄与すると考える。ＴＧＦ−βおよびαｖβｘインテグリンは、この分化転換プロセスに関与すると考えられ、抗αｖインテグリン抗体ＤＩ１７Ｅ６、あるいは生物学的に活性なその変異体または改変体によるこれらのインテグリンの機能の阻害は、ＥＭＴを下方制御し、その結果、線維症、線維性障害、および／または線維化性肺障害において有益になる。
【０１６３】
酸化ストレスは、線維症における役割を果たすと考えられる。αｖβｘインテグリンを発現する細胞は、酸化ストレス誘発性アポトーシスから保護されると考えられる。そのため、これらのインテグリンの機能を妨げる作用物質が、線維芽細胞および筋線維芽細胞のアポトーシスを増強するのを可能にすると思われる。
【０１６４】
一部のαｖβｘインテグリンが、ＳＳｃ−ＩＬＤおよび肺線維症の他の形態において過剰発現されることがわかっているので、ＳＳｃ−ＩＬＤおよびＩＰＦに罹患している患者からの肺生検中の呼吸器上皮は、免疫組織化学によって高レベルのαｖβ６を発現する。αｖβ３、αｖβ５およびαｖβ６発現Ｔ細胞数の増加は、正常対照に比べて、ＳＳｃに罹患している患者からの気管支肺胞洗浄液中で見られる（Luzina et al., Am J Respir Crit Care Med Vol 177. pp 56-65, 2008）。しかしながら、β６インテグリンノックアウトマウスが肺炎症を発症するが、ブレオマイシン曝露後に肺線維症の発症まで進行しないことが示された（Luzina et al., ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 48, No. 8, August 2003, pp 2262-2274）。
【０１６５】
ＳＳｃに罹患している患者由来の皮膚線維芽細胞は、αｖβ３およびαｖβ５の促進された発現、ならびに高いＴＧＦ−β活性化を示し、そしてそれは、αｖβ５に対する妨害抗体Ｐ１Ｆ６によって阻害される（Asano et al., ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 52, No. 9, September 2005, pp 2897-2905; Journal of Immunology, 2005, 175: 7708-7718; American Journal of Pathology, Vol. 168, No. 2, February 2006; Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 1761-1769）。抗αｖβ５抗体を用いた増強された免疫染色は、ＩＰＦに罹患している患者の肺の線維芽細胞巣で見られる。（Scotton et al., J. Clin. Invest. 119:2550-2563 (2009)）。
【０１６６】
軟骨オリゴマータンパク質（ＣＯＭＰ）は、軟骨、腱、および他の結合組織に存在する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。ＣＯＭＰは、ＳＳｃに罹患している患者からの皮膚生検において過剰発現されている。ＳＳｃでは、血清ＣＯＭＰレベルは高く、死亡率を予測し、改訂Ｒｏｄｎａｎ皮膚スコア（ｍＲＳＳ）を用いて計測される肺機能衰弱および皮膚線維症と相関する。ＣＯＭＰはまた、皮膚病変の重症度を予測するＳＳｃ皮膚の４つのシグネチャーＲＮＡのうちの１つでもある。
【０１６７】
Yangらは、ペリオスチンが強皮症のマウスモデルにおけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ依存性機構を介した皮膚硬化症を容易にする、と記載している（Yang L, Serada S, Fujimoto M, Terao M, Kotobuki Y, et al. (2012) PLoS ONE 7(7): e41994 doi:10.1371/journal. pone. 0041994）。患者と健常ドナー由来の皮膚を使用することで、同様に、ペリオスチンの発現が、免疫組織化学および免疫ブロッティング分析によって評価された。さらに、組み換えマウスペリオスチンが、インビトロにおけるにＣｏｌ１ａ１発現を直接誘発し、この効果は、抗αｖ機能的妨害抗体またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２のいずれかを用いたαｖインテグリン媒介性ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の妨害によって阻害されたことがわかった。その結果、ペリオスチンがマウスにおけるブレオマイシン誘発性強皮症の発症機序に本質的な役割を担っていること、およびペリオスチンがヒト強皮症の潜在的治療標的を提示する可能性があることが結論づけられる。
【０１６８】
Wuら（Journal of Investigative Dermatology (2012) 132, 1605-1614）は、ブレオマイシン誘発性線維症モデルのマウスにおいて、炎症誘発特性および線維化促進特性を有するマトリックス細胞タンパク質、オステオポンチン（ＯＰＮ）の全身性硬化症および皮膚線維症における役割を調査した。それによると、ＯＰＮ欠損マウスは、前記線維症モデルにおいて、野生型（ＷＴ）マウスと比べてわずかしか皮膚線維症を発症しなかった。最終的に、彼らは、ＯＰＮ欠損マクロファージによるＴＧＦ−β産生がＷＴと比べて低減されていることを見出した。結論として、ＯＰＮレベルは、ＳＳｃ患者において増強されると報告されて、得られたデータは、ＯＰＮがマウスにおける皮膚線維症の発症で重要な役割を果たし、よって、ＯＰＮがＳＳｃの治療標的であろうことを示唆すると考えられる。
【０１６９】
ＳＳｃに罹患している合計７０人の患者の血漿が、対照としての２０人の年齢適合健常ボランティアおよび５９人の特発性肺高血圧症に罹患している患者と共に、Lorenzenらによって分析された（Rheumatology 2010;49:1989-1991 doi:10. 1093/rheumatology/keq223 Advance Access publication 20 July 2010）。結果は、モノクローナルＯＰＮ抗体がコラーゲン誘発性関節炎モデルで使用されたので、Ｔ細胞走化性の新規治療標的としてＯＰＮ阻害剤を使用する可能性を示し得る。結論として、ＯＰＮレベルは、ＳＳｃの肺線維症の発症に沿うように記載して、その結果、この合併症の魅力的なバイオマーカーであるであろう。
【０１７０】
概要では、本発明の基礎となる結果およびデータに基づいて、我々は、ＤＩ１７Ｅ６、および好ましくは同様に本明細書中に記載した生物学的に活性なその変異体および改変体の、αｖβｘインテグリンとの特異的相互作用が、線維症、ＳＳｃを含めた線維性障害の発症機序に対処する特に有利な様式で、ＴＧＦ−βおよび複数の付加機構の活性化を制御すると強く考えている。そのため、線維症、線維性障害、好ましくはＳＳｃ、そして特にＳＳｃ−ＩＬＤのシグナル伝達との前記相互作用の有利に有益な効果が予想される。
【０１７１】
様々な癌の適応症におけるＥＭＤ５２５７９７の素晴らしい安全性および耐容性が、ＳＳｃを含めた、特にＳＳｃ−ＩＬＤを含めた線維症においても同様であると予想される。ＥＭＤ５２５７９の期待される利益と共に、ＳＳｃ−ＩＬＤにおけるＥＭＤ５２５７９７の利益／リスク比は、ＳＳｃ−ＩＬＤにおいてプラスであって、かつ、ＣＹＣに関するより大きくなければならない。よって、ＥＭＤ５２５７９７は、ＳＳｃの他の兆候に対しても同様に有益であると考えられる。
【０１７２】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用する、ある細胞集団から放出されるタンパク質に対する総称である。このようなサイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンがある。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦβなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦαおよびＴＧＦβなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；ＩＦＮα、ＩＦＮβ、およびＩＦＮγなどのインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン；およびＴＮＦαまたはＴＮＦβが含まれる。本発明による好ましいサイトカインは、インターフェロンおよびＴＮＦａである。
【０１７３】
「抗血管新生剤」は、血管の新生を阻止またはある程度妨害する天然または合成の化合物を指す。抗血管新生分子は、例えば、血管新生の増殖因子または増殖因子受容体に結合し、それを妨害する生体分子であってもよい。本明細書の好ましい抗血管新生分子は、受容体、好ましくはインテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に結合する。この用語には、本発明に従って、インテグリン（受容体）阻害剤も含まれる。
用語「インテグリン阻害剤」または「インテグリン受容体阻害剤」は、インテグリン受容体を妨害および阻害する天然または合成の分子を指す。ある場合には、この用語には、前記インテグリン受容体のリガンド（例えば、αvβ3については：ビトロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ｖｏｎ ＷｉＩＩｅｂｒａｎｄ因子、トロンボスポンジン、ラミニン；αvβ5については：ビトロネクチン；αvβ1については：フィブロネクチンおよびビトロネクチン；αvβ6については：フィブロネクチン）に対するアンタゴニストが含まれる。インテグリン受容体に対するアンタゴニストは、本発明によれば好ましい。インテグリン（受容体）アンタゴニストは、天然または合成のペプチド、非ペプチド、ペプチドミメティカ、免疫グロブリン、例えば抗体もしくはその機能性断片、または免疫コンジュゲート（融合タンパク質）であってもよい。本発明の好ましいインテグリン阻害剤は、αvインテグリン（例えば、αvβ3、αvβ5、αvβ6、およびサブクラス）の受容体に対するものである。好ましいインテグリン阻害剤は、αvアンタゴニストであり、具体的には、αvβ3アンタゴニストである。本発明の好ましいαvアンタゴニストは、ＲＧＤペプチド、ペプチドミメティック（非ペプチド）アンタゴニスト、およびαv受容体を妨害する抗体などの抗インテグリン受容体抗体である。代表的な非免疫学的αvβ3アンタゴニストは、米国特許第５，７５３，２３０号明細書および米国特許第５，７６６，５９１号明細書の教示に記載されている。好ましいアンタゴニストは、直鎖状および環状のＲＧＤ含有ペプチドである。環状ペプチドは、通常、安定性が高く、血清半減期の延長を引き出す。しかしながら、本発明の最も好ましいインテグリンアンタゴニストは、インテグリン受容体であるαvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αＩＩｂβ3の妨害に効果的なシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（ＥＭＤ １２１９７４、Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ（登録商標）、Merck KGaA, Germany）；欧州特許第０７７０６２２号明細書）である。線維性障害の患者へのＤＩ１７Ｅ６とＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅとの併用療法は、本発明に従って効果的である。
【０１７４】
ＤＩ１７Ｅ６は、静脈内注射により通常投与されるが、抗体／タンパク薬にとって当技術分野で好都合な他の投与形態が適用可能である。国際公開第２００５／０７７４１４号パンフレットまたは国際公開第２００３／０５３４６５号パンフレットに記載のものなど、リポソーム製剤を含むすべての標準輸液および製剤が適用可能である。加えて、ＤＩ１７Ｅ６および任意選択で（細胞傷害性を高めるために）化学療法薬（Biomaterials 2010, 8, 2388-98; Wagner et al.）を負荷されたヒト血清アルブミンナノ粒子を準備することが好ましい。
【０１７５】
抗αｖインテグリン抗体として特に好まれるＤＩ１７Ｅ６、または本発明によるＤＩ１７Ｅ６は、登録国際一般名称（ＩＮＮ）アビツズマブを有する抗体である。
【０１７６】
本発明に関して、アビツズマブは、ヒトαｖインテグリンに結合するリガンドを標的とし、妨害するＩｇＧ２サブクラスの遺伝子組み換え、脱免疫化モノクローナル抗体である。加えて、Ｆｃ領域に通常存在する炭水化物構造は、分子を非グリコシル化する取付点として通常役立つアミノ酸残基を遺伝的に変更することによって取り除いた。したがって、抗体アビツズマブは、それぞれ４４７個のアミノ酸から成る好ましくは同一の２本の重鎖、およびそれぞれ２１４個のアミノ酸から成る好ましくは同一の２本の軽鎖の４本のポリペプチド鎖で好ましくは構成される。４本の鎖が共有結合（ジスルフィド）および非共有結合の組み合わせによって一つに保持される。分子の大体の分子量は１４５ｋＤａである。
【０１７７】
抗体アビツズマブは、無血清成長培地での哺乳動物細胞培養によって製造され得る。抗体は、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。そのプロセスはまた、特定のウイルス不活性化および除去ステップを含んでもよい。抗体アビツズマブは、次に、製剤バッファー中に移され、そして、所望の濃度にされ得る。
【０１７８】
好ましい医薬品の記載と組成物：
例えば、２５０ｍｇ／１０ｍＬの濃度においてアビツズマブは、静脈（ｉ．ｖ．）投与を意図した無菌液として最終製剤として使用され得る。
アビツズマブ製剤は、
例えば、灰色のブチルゴム栓で封をされた、および、例えば、アルミニウム／赤色ポリプロピレンフリップオフシールで密封された、３０ＲＩ型ガラスバイアルで供給され得る。斯かるバイアルは、例えば、安定剤としてポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）を含んだ、使用された、例えば、２５ｍｇ／ｍＬの保存料無添加のクエン酸塩緩衝生理食塩溶液として２５０ｍｇのアビツズマブを含む使い捨てのバイアルとして使用され得る。斯かるバイアルは、１０ｍＬの容量のアビツズマブ最終製剤を取り出すのに十分な過多量を含んでもよい。一般的に、かかるアビツズマブの最終製剤に関して、安全、かつ、現在の欧州薬局方（ＥＰ）または米国薬局方（ＵＳＰ）またはその両方に準拠すると見なされた賦形剤のみが使用される。
【０１７９】
特に好ましくは、アビツズマブは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を引き起こさないように遺伝子を組み換えられたヒト化ＩｇＧ２抗体である。前記アビツズマブ抗体は高い特異性でヒトαｖインテグリン受容体サブユニットに結合し、その結果、αｖヘテロ二量体（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８）に結合するリガンドを阻害する。それは、αｖインテグリンを特異的に阻害し、αｖインテグリン媒介性細胞接着および遊走を妨害する。それは、血小板フィブリノーゲン受容体αＩＩｂβ３を含めた他のインテグリンと交差反応せず、ヒトおよびサルαｖインテグリンのみを認識する。アビツズマブは、リガンドポケットに位置しないかまたはそれに接近するαｖインテグリン受容体サブユニット上のエピトープを認識する。そのため、その作用機序は、例えば環状ＲＧＤペプチドなどの純粋なリガンド競合拮抗薬について記載したものと異なっている。インテグリンαｖβ３およびαｖβ５は、活性化内皮細胞（ＥＣ）、休止血小板、平滑筋細胞、甲状腺、一部の腎臓内皮および上皮、卵管内皮、および破骨細胞において選択的に発現される。さらに、αｖインテグリンは、例えば結腸直腸癌や前立腺癌由来のものを含めた様々な腫瘍実体からの悪性細胞において不特定の程度まで発現される。したがって、標的へのアビツズマブの結合は、好ましくはインテグリン受容体を機能的に妨害し、その結果、対応する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンド（すなわち、ビトロネクチン）にそれが結合するのを阻害する。
【０１８０】
ヒトおよび様々な動物種における免疫組織化学的（ＩＨＣ）検査は、アビツズマブが高度に種特異的であること：アビツズマブはヒトおよびカニクイザルαｖインテグリンだけに、ヒト組織とサル組織との間に匹敵する交差性で結合することを示した。アビツズマブは、例えばＥＣＭへのＥＣ接着、焦点接着の不安定化、ＥＣ遊走、血管新生成長因子シグナル伝達（ＶＥＧＦ誘発性ＥＲＫリン酸化）の伝達およびＥＣ生存率などの腫瘍血管新生にかかわるいくつかの態様を妨げることがインビトロにおいて示された。アビツズマブはまた、腫瘍細胞に直接影響する。インビトロ実験は、アビツズマブがαｖインテグリンのリガンドへの細胞接着および腫瘍細胞の増殖に影響し得ることを明らかにした。
【０１８１】
インビボにおいて、アビツズマブの抗腫瘍効果は、腫瘍異種移植モデル（例えば、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、前立腺癌）のための様々なαｖインテグリン発現性腫瘍細胞株を使用することで評価された。アビツズマブはヒトおよびサルαｖインテグリンに特異的であるので、その抗血管形成活性は、従来の齧歯動物の異種移植腫瘍モデルでは試験できない。そのため、マウスにおける異種移植腫瘍実験は、アビツズマブの潜在的抗腫瘍活性を単に実証した。アビツズマブは、癌細胞株または様々な適応症（例えば、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、前立腺癌、およびＣＲＣ）の初代外植片を使用したインビボ腫瘍実験において成長を阻害できる。
【０１８２】
アビツズマブの抗血管形成作用機序は、悪性細胞の標的αｖインテグリンが存在しない際にヒト皮膚異種移植片／腫瘍細胞株実験において評価された。アビツズマブは、ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト皮膚に注入されたヒトαｖインテグリン欠損黒色腫細胞の成長を阻害した。腫瘍細胞自体における標的の不存在のため、アビツズマブはヒト内皮細胞だけを標的とする可能性があり、そして、腫瘍成長減退はおそらく腫瘍血管新生の阻害によって引き起こされる。カニクイザルにおけるアビツズマブの全身投与は、血管新生を刺激するための、血管由来成長因子を含むＭａｔｒｉｇｅｌプラグを皮下移植した際の血管新生の誘発を妨害した。
【０１８３】
本明細書中に記載した対象が本発明により特に好ましく、ここで、２以上の好ましい、より好ましい、および／または特に好ましい実施形態、態様、および／または対象の特徴は１つの実施形態、態様、および／または対象に組み合わせられる。好ましくは、本願発明によると、好ましい対象または実施形態は、他の好ましい対象または実施形態と組み合わせられ得る；より好ましい対象または実施形態は、他のそれほど好ましくないまたはより一層好ましい対象または実施形態と組み合わせられ得る；特に好ましい対象または実施形態は、他のまさに好ましいまたはまさにより好ましい対象または実施形態と組み合わせられ得る、などである。
【０１８４】
「約（about）」という用語は、数、図面、範囲、および／または量に関して本明細書中で使用される場合、「およそ（circa）」および／または「だいたい（approximately）」といった意味を指すことが好ましい。それらの用語の意味は、当該技術分野で周知であり、それぞれの数、図面、範囲、および／または量についてプラス／マイナス１５％、そして特にプラス／マイナス１０％の変動、偏差、および／または可変性を含むことが好ましい。
【０１８５】
「約（about）」という用語は、数、図面、範囲、および／または量に関して本明細書中で使用される場合、「およそ（circa）」および／または「だいたい（approximately）」といった意味を指すことが好ましい。それらの用語の意味は、当該技術分野で周知であり、それぞれの数、図面、範囲、および／または量について少なくともプラス／マイナス５％の変動、偏差、および／または可変性を含むことが好ましい。
【０１８６】
「（単数若しくは複数の）障害」および「（単数若しくは複数の）疾患」という用語は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野で周知であり、そして、理解される。本発明の状況において、それらは、同義語として使用されるのが好ましく、よって、互換可能であることが好ましく、本明細書中でそれらが使用される場合、別の状況であっても大きな影響がない。したがって、「（単数若しくは複数の）線維性障害」および「（単数若しくは複数の）線維症」という用語は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野で周知であり、そして、理解される。本発明の状況において、それらは、同義語として使用されるのが好ましく、よって、互換可能であることが好ましく、本明細書中でそれらが使用される場合、別の状況であっても大きな影響がない。
【０１８７】
これだけに限定されるものではないが、治療計画、服薬スケジュールや臨床試験のデザインを含めた医療状況において、患者、医療スタッフおよび／または医師の便宜および／または使いやすさのため、ならびに結果の信頼性および／または再現性、などのために、「週」／「１週間」、「月」／「1カ月」および／または「年」／「１年間」という用語は、グレゴリオ暦の定義から少し逸脱して使用されることもある。例えば、前記医療状況において、１カ月は２８日間と見なされることが多く、そして、１年は４８週間と見なされることが多い。
【０１８８】
よって、本発明の状況において、「週」または「１週間」という用語は、好ましくは約５日間、約６日間または約７日間の期間を指し、そして、より好ましくは約７日間の期間を指す。
医療状況において、「月」または「１カ月」という用語は、好ましくは約２８日間、約２９日間、約３０日間または約３１日間の期間を指し、そして、より好ましくは約２８日間、約３０日間または約３１日間の期間を指す。
医療状況において、「年」または「１年」という用語は、好ましくは約１２カ月の期間、または約４８週間、約５０週間、もしくは約５２週間の期間を指し、そして、より好ましくは１２カ月の期間、または約４８週間もしくは約５２週間の期間を指す。
本発明は、実施例によって以下でさらに詳細に説明される。本発明は、特許請求の範囲に記載した範囲の全体にわたって実施され得ることが好ましく、ここに示した実施例に制限されない。
【０１８９】
そのうえ、以下の実施例は、当業者が例示を通して本発明をより理解するのを補助するために与えられる。実施例は、特許請求の範囲によって与えられた保護範囲を制限することを意図しない。実施例で規定されたプロセス、化合物、組成物、および／または用途に関して例示された特徴、特性、および利点は、実施例で具体的に記載および／または規定されていない他のプロセス、化合物、組成物、および／または用途に割り当てられてもよいが、特許請求の範囲で規定されたものの範囲内に入る。
【０１９０】
以下の実施例は、より詳細に本発明を説明するが、本発明および特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１９１】
実施例１
筋線維芽細胞の分化は、上皮線維芽細胞の共培養において誘発され、そして、アビツズマブによって阻害される
略語表
αＳＭＡ：α平滑筋アクチン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｃｙ５：シアニン５
ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
ＦＧＭ：線維芽細胞増殖培地
ＦＭＴ：線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換
ＦＩＴＣ：蛍光イソチオシアネート
ＩＸＭ：Ｉｍａｇｅ Ｘｐｒｅｓｓマイクロスクリーニングシステム
μｇ：マイクログラム
ｍｇ：ミリグラム
ｍＬ：ミリリットル
ｎｇ：ナノグラム
ＮＨＤＦ：正常ヒト皮膚線維芽細胞
ＮＨＬＦ：正常ヒト肺線維芽細胞
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＧＦ−β１：形質転換成長因子β
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＩＬ：インターロイキン
【０１９２】
概要
ＴＧＦ−β１は、増強された細胞外マトリックス堆積に寄与する線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換（ＦＭＴ）の強力なメディエーターであり、そして、線維症の主なドライバーである。αｖインテグリンとＴＧＦ−βとの間のクロストークに関する実質証拠がこれらのプロセス中に存在する。ＴＧＦ−βは、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）領域を含む潜伏型で分泌される。ＴＧＦ−β１のＬＡＰは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８と相互作用して、ＴＧＦ−β１の活性化をもたらすＲＧＤモチーフを含む。アビツズマブは、αｖに特異的なヒト抗体なので、そのため、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８を阻害する。
【０１９３】
ＦＭＴを妨害するアビツズマブの能力を、線維形成を経た組織における上皮細胞と線維芽細胞の潜在的相互作用を模倣した、上皮細胞／線維芽細胞共培養を使用することで調べた。線維芽細胞とＮＣＩ−Ｈ３５８細胞またはＣａｌｕ３細胞の共培養は、ＦＭＴのマーカーであるαＳＭＡおよび複数のｍＲＮＡ転写物の誘発をもたらし、またＩＬ−６産生も増加した。この系では、これらのマーカーはアビツズマブ処理で低減され、そのαｖインテグリンがＦＭＴにおいて役割を担っていることを実証した。
【０１９４】
序論
線維症は、細胞外マトリックスの産生、堆積、および収縮による過度の瘢痕化を特徴とし、そして、筋線維芽細胞の増殖および活性化によって駆動されると考えられる。線維症は、それに対して効果的な治療法がない疾患の最大のグループの１つである。線維形成過程は、線維化促進および抗線維形成メディエーターのネットワーク内の複雑な相互作用セットによって調整される。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、増強された細胞外マトリックス堆積に寄与し、そして、疾患の主なドライバーである筋線維芽細胞転換（ＦＭＴ）に対して線維芽細胞において重要な役割を果たすと考えられる。
【０１９５】
ＴＧＦ−βアイソフォームは、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質と複合体を形成する潜在型前駆体として合成され、そしてそれは、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）領域を含む。これらのプロセス中のαｖインテグリンとＴＧＦ−βの間のクロストークに関する実質証拠が存在する。ＴＧＦ−β１のＬＡＰは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８と相互作用して、ＴＧＦ−β１の活性化をもたらすＲＧＤモチーフを含む。アビツズマブは、リガンド結合性αｖサブユニットにアロステリックに結合し、それにより、リガンドがすべてのαｖβヘテロ二量体に結合することを妨害し、そのため、潜在型ＴＧＦ−βのαｖインテグリン依存性活性化を阻害し、よって、線維芽細胞および他の前駆体による筋線維芽細胞表現型の獲得を妨害する汎αｖインテグリン抗体である。
【０１９６】
研究の性質と目的
本研究の目的は、インビトロにおけるＴＧＦ−β活性化およびＦＭＴを妨害するアビツズマブの能力を測定し、それによって、線維症のための治療薬としてのその可能性を示すことであった。
【０１９７】
材料と方法
試験系
試験系は、線維症を経た組織における上皮細胞と線維芽細胞の潜在的相互作用を模倣した上皮細胞／線維芽細胞共培養である。健常ドナー由来の正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）または正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、ＮＣＩ−Ｈ３５８またはＣａｌｕ３細胞株と共に共培養した。
【０１９８】
【表８】
2018534340.tif 000015
【０１９９】
試験物質と刺激
【表９】
2018534340.tif 000016
【０２００】
備品と器具
【表１０−１】
2018534340.tif 000017
【表１０−２】
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【０２０１】
【表１１】
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【０２０２】
実験計画
研究設計の概略
線維芽細胞培養培地（２％ＦＢＳを含むＦＧＭ）：ＦＧＭ(商標)−２ブレットキット(商標)（ＣＣ−３１３２）は、以下の成長サプリメント：０．５ｍｌのｈＦＧＦ−Ｂ（ＣＣ４０６５Ｊ）；０．５ｍｌのインスリン（ＣＣ−４０２１Ｊ）；１０ｍｌのＦＢＳ（ＣＣ−４１０１Ｊ）；０．５ｍｌのＧＡ−１０００（ＣＣ４０８１Ｊ）を含有する、線維芽細胞の細胞基礎培地（ＣＣ−３１３１）および線維芽細胞ブレットキット（ＣＣ−４１２６）の５００ｍｌボトル１本を含む。
【０２０３】
ＦＭＴアッセイのための線維芽細胞培地（０．１％ＦＢＳを含むＦＧＭ）：ＦＧＭ(商標)−２ブレットキット(商標)（ＣＣ−３１３２）は、以下の成長サプリメント：０．５ｍｌのｈＦＧＦ−Ｂ（ＣＣ−４０６５Ｊ）；０．５ｍｌのインスリン（ＣＣ−４０２１Ｊ）；０．５ｍｌのＦＢＳ（ＣＣ−４１０１Ｊ）；０．５ｍｌのＧＡ−１０００（ＣＣ４０８１Ｊ）を含有する、線維芽細胞の細胞基礎培地（ＣＣ−３１３１）および線維芽細胞ブレットキット（ＣＣ−４１２６）の５００ｍｌボトル１本を含む。
【０２０４】
ＮＣＩ−Ｈ３５８培地：５５ｍｌの熱不活性化ＦＢＳ＋５ｍｌのピルビン酸ナトリウムを含有する５００ｍｌのＲＰＭＩ。
Ｃａｌｕ−３培地：５５ｍｌの熱不活性化ＦＢＳを含有する５００ｍｌのＤＭＥＭ。
【０２０５】
ＮＨＬＦおよびＮＨＤＦを、Ｔ１５０組織培養フラスコ内、２％のＦＢＳを含むＦＧＭ中で、それらがアッセイ日に７０〜８０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を、６ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５０２２）ですすぎ、６ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５０１２）で室温にて５分間トリプシン処理した。トリプシンを、６ｍｌのトリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５００２）で不活性化し、４００ｇにて４分間スピンダウンし、そして、２％のＦＢＳを含むＦＧＭで１回洗浄した。
【０２０６】
画像研究のために、線維芽細胞（ＮＨＬＦまたはＮＨＤＦ）を、コラーゲン１細胞用器具９６ウェル黒色／透明プレートに１０，０００細胞／ウェルにて播種した。細胞を、２％のＦＢＳ含有ＦＧＭ中で８時間培養した。培地を吸引し、そして、細胞を、０．１％のＦＢＳ含有ＦＧＭ中で一晩飢餓状態にした。培地を吸引し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度にてアビツズマブまたは抗ＨＥＬ ＩｇＧを含む、０．１％ＦＢＳ含有１００μｌのＦＧＭを加え、そして、３０分間インキュベートした。共培養について：ＮＣＩ−Ｈ３５８またはＣａｌｕ−３を、１００μｌのＮＣＩ−Ｈ３５８またはＣａｌｕ−３培地中、２，０００細胞の密度にて線維芽細胞を含むウェル内で平板培養した。５日後に、培地を回収し、ＩＬ−６検出のために−８０℃にて保存した。細胞を固定し、そして、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）染色手順に従って染色した。
【０２０７】
遺伝子発現研究のために、線維芽細胞（ＮＨＬＦまたはＮＨＤＦ）を、２４ウェル培養プレート内に２００，０００細胞／ウェルにて播種した。細胞を、２％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中、８時間培養した。培地を吸引し、そして、細胞を、０．１％のＦＢＳ含有ＦＧＭ中で一晩飢餓状態にした。培地を吸引し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度にてアビツズマブまたは抗ＨＥＬ ＩｇＧを含む、０．１％ＦＢＳ含有３００μｌのＦＧＭを加え、そして、３０分間インキュベートした。共培養について：ＮＣＩ−Ｈ３５８またはＣａｌｕ−３を、３００μｌのＮＣＩ−Ｈ３５８またはＣａｌｕ−３培地中、４０，０００細胞の密度にて線維芽細胞を含むウェル内で平板培養した。７日後に、培地を回収し、ＩＬ−６検出のために−８０℃にて保存した。細胞を、ＲＮＡ分離やＲＴ−ＰＣＲの準備のために−８０℃にて保存した。
【０２０８】
αＳＭＡ蛍光抗体法：細胞を、ＰＢＳ（９６ウェルプレートに２００μｌ）で２回洗浄し、次に、固定／透過処理溶液で室温にて４５分間固定した（９６ウェルプレートに５０μＬ）。次に、細胞を、５分間のインキュベーションを用いて、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（１：１０希釈にて蒸留水で希釈）を使用して３回洗浄した。細胞を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（９６ウェルプレートに５０μｌ）で室温にて６０分間妨害した。
プレートを、各洗浄の間の５分間のインキュベーションを用いて、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（９６ウェルプレートに２００μｌ）を使用して２回洗浄した。抗ＳＭＡ抗体を、洗浄バッファー中に１：１００希釈にて加え、そして、室温にて３時間インキュベートした。次に、プレートを、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（９６ウェルプレートに２００μｌ）で２回洗浄した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８と結合した二次Ａｂヤギ抗マウスＩｇＧを、１００μｌの終量においてＰｅｒｍ洗浄バッファー中に１：２００希釈にて使用し、そして、室温にて１時間インキュベートした。細胞を、各洗浄間の５分間のインキュベーションを伴って、２００μｌの１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファーを使用して２回洗浄した。ＤＡＰＩを１：１０００希釈にて洗浄バッファーに加え、そして、２００μｌをプレートに加え、室温にて５分間インキュベートし、溶液を吸引し、そして、２００μｌの１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファーで置換した。
【０２０９】
遺伝子発現解析のために、ＲＮｅａｓｙ９６キット（Qiagen）に入っている「RNeasy 96 Protocol for Isolation of Cytoplasmic RNA from Animal Cells-using Vaccum Technology」にしたがってＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成を、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Qiagen）に記載の手順にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍサイクラーのサイクル条件を用いて、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄキットおよびＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイのＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲを使用しておこなった。
【０２１０】
出力
画像化のためのプレート出力手順
Ｉｍａｇｅ Ｘｐｒｅｓｓマイクロスクリーニングシステム（ＩＸＭ）機器およびＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを、画像収集および解析のために使用した。二色染色：ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣ染色のために、プレート収集画像化プロトコール：「２０１４−ＹＷ−ＳＭＡ４８８−ＤＡＰＩ−１０ｘ」を使用した。データ解析のために、多重波長細胞スコア化解析パラメータプロトコール「２０１４−５−７−ＹＷ−ＳＭＡ４８８−ＤＡＰＩ−４ｘ−２ｐａｒａ ａ」を使用して、ＦＭＴによるＳＭＡ線維誘発の量を定量化した。個々のウェルの画像を、ＢＭＰファイルとしてダウンロードした。
【０２１１】
ＩＬ−６のＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ‐６のレベルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、市販のＩＬ−６ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｄｕｏｓｅｔ ＩＬ−６、R & D Systems）を使用して測定した。４５０ｎｍにおける光学濃度測定値（ＯＤ）を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅリーダー（Molecular Devices）および内部ＩＬ−６標準からＯＤ測定値を使用して計算した４−パラメーターロジスティック曲線の当てはめから推定した各サンプルのＩＬ−６濃度を使用しておこなう。
【０２１２】
遺伝子発現解析
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ｆｌｅｘ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍサイクラーによるＲＴ−ＰＣＲの実施が完了した後、すべてのウェルのＣＴ値を、相対発現の計算のためにＥｘｃｅｌのスプレッドシートにダウンロードした。
【０２１３】
使用したコンピュータプログラム
【表１２】
2018534340.tif 000020
【０２１４】
相対遺伝子発現（基礎レベル）および倍率変化の計算
ＣT閾値サイクル。ＣTは、反応中に作り出される蛍光が閾値線と交差するサイクル数である。ＣT値は対数的であり、定量分析法に直接使用される。
【０２１５】
相対遺伝子発現（基礎レベル）について：
ΔＣT値を計算する。ΔＣT＝ＣT標的−ＣT参照文献(GAPDH)
基礎レベルでの相対遺伝子発現としてでの２-ΔCTを計算する。
【０２１６】
相対遺伝子発現（治療後の倍率変化）について：
ΔＣT値を計算する。ΔＣT＝ＣT標的−ＣT参照文献(GAPDH)
ΔΔＣT値を計算する。ΔΔＣT＝ＡＣT試験サンプル（治療）−ＡＣTキャリブレーターサンプル（治療なし）
内因性標準（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対する正規化およびキャリブレーター（治療前または対照）に関連する、標的の量は：２-ΔΔCTによって示される。
【０２１７】
結果
アビツズマブは、Ｈ３５８線維芽細胞とＣａｌｕ３線維芽細胞との共培養において高められたαＳＭＡ発現を妨害する（図１も参照）
試験は、線維形成過程中のαｖインテグリンとＴＧＦ−βとの間の仮定されたクロストークに関する実質証拠を示した。腫瘍上皮細胞／線維芽細胞共培養系を、線維症をへた組織の上皮細胞と線維芽細胞との潜在的相互作用を模倣するために使用した。共培養の７日後に、αＳＭＡの基礎レベルは、肺線維芽細胞または皮膚線維芽細胞の単独培養において低くなった。ＮＣＩ−Ｈ３５８およびＣａｌｕ−３は、線維芽細胞層におけるαＳＭＡ発現を誘発した（図１）。ＮＨＬＦ＋ＮＣＩ−Ｈ３５８；ＮＨＬＦ＋Ｃａｌｕ−３；ＮＨＤＦ＋ＮＣＩ−Ｈ３５８；ＮＨＤＦ＋Ｃａｌｕ３共培養へのアビツズマブの添加は、線維芽細胞におけるαＳＭＡ発現の誘発を阻害した。
【０２１８】
アビツズマブは、Ｈ３５８線維芽細胞共培養物におけるＦＭＴ関連遺伝子の高められた発現を妨害する（図２も参照）
ＮＨＬＦ＋ＮＣＩ−Ｈ３５８；ＮＨＤＦ＋ＮＣＩ−Ｈ３５８の共培養は、ＦＭＴのマーカーである複数のｍＲＮＡ転写物を誘発し、そしてまたＩＬ−６産生も増強した。この系において、これらのマーカーはアビツズマブ処理によって低減され、αｖインテグリンがＦＭＴにおいて実質的な役割を担っていることを実証した。
【０２１９】
参考文献一覧
【化７】
2018534340.tif 000021
【０２２０】
実施例２
ヒト肺線維芽細胞表におけるＴＧＦ−β誘発性ＦＭＴに対するアビツズマブの効果
図面の一覧
図３：ＴＧＦ−βは、ヒト肺線維芽細胞においてインテグリン発現を増強する。
図４：ＴＧＦ−βは、肺線維芽細胞においてαＳＭＡ、ＩＬ−６、および他の筋線維芽細胞マーカー遺伝子の発現を増強する。
図５：線維芽細胞培養物のアビツズマブ処理は、ＴＧＦ−β誘発性のαＳＭＡおよびＩＬ−６の増強を低減する。
図６：アビツズマブ処理は、ＴＧＦ−β誘発性コラーゲンゲル収縮を低減する。
【０２２１】
略語表
αＳＭＡ：α平滑筋アクチン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｃｙ５：シアニン５
ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
ＦＧＭ：線維芽細胞増殖培地
ＦＭＴ：線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換
ＦＩＴＣ：蛍光イソチオシアネート
ＩＸＭ：Ｉｍａｇｅ Ｘｐｒｅｓｓマイクロスクリーニングシステム
μｇ：マイクログラム
ｍｇ：ミリグラム
ｍＬ：ミリリットル
ｎｇ：ナノグラム
ＮＨＤＦ：正常ヒト皮膚線維芽細胞
ＮＨＬＦ：正常ヒト肺線維芽細胞
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＧＦ−β１：形質転換成長因子β
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ｈ：ヒト
ＩＬ：インターロイキン
【０２２２】
概要
ＴＧＦ−β１は、増強された細胞外マトリックス堆積に寄与する線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換（ＦＭＴ）の強力なメディエーターであり、そして、線維症の主なドライバーであることをここに示す。さらに、αｖインテグリンとＴＧＦ−βとの間のクロストークに関して示される実質証拠がこれらのプロセス中に存在する。ＴＧＦ−βは、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）領域を含む潜伏型で分泌される。ＴＧＦ−β１のＬＡＰは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８と相互作用して、ＴＧＦ−β１の活性化をもたらすＲＧＤモチーフを含む。アビツズマブは、αｖに特異的なヒト抗体なので、そのため、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８を阻害する。
【０２２３】
インテグリンの発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した、そして、ヒト肺線維芽細胞がＩＴＧＢ１＞ＩＴＧＢ５＞ＩＴＧＢ８＞ＩＴＧＢ３を発現することがわかった。ＴＧＦ−β誘発性ＦＭＴは、ＩＴＧＢ５の発現増強、そして、ある程度のＩＴＧＢ１、およびＩＴＧＢ３の発現増強を引き起こした。ＴＧＦの−β処理は、肺線維芽細胞において筋線維芽細胞マーカー遺伝子を増強し、そして、蛍光抗体法は、αｖβ５発現の増強を明らかにした。アビツズマブ処理は、αＳＭＡの発現増加、ＩＬ−６の産生およびコラーゲンゲル収縮を低減し、それによって、ＴＧＦ−β誘発性ＦＭＴを妨害する能力を実証した。
【０２２４】
序論
線維症は、細胞外マトリックスの産生、堆積、および収縮による過度の瘢痕化を特徴とし、そして、筋線維芽細胞の増殖および活性化によって駆動されると考えられる。線維症は、それに対して効果的な治療法がない疾患の最大のグループの１つである。線維形成過程は、線維化促進および抗線維形成メディエーターのネットワーク内の複雑な相互作用セットによって調整される。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、増強された細胞外マトリックス堆積に寄与し、そして、疾患の主なドライバーである筋線維芽細胞転換（ＦＭＴ）に対して線維芽細胞において重要な役割を果たすと考えられる。
【０２２５】
ＴＧＦ−βアイソフォームは、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質と複合体を形成する潜在型前駆体として合成され、そしてそれは、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）領域を含む。これらのプロセス中のαｖインテグリンとＴＧＦ−βの間のクロストークに関する実質証拠が存在する。ＴＧＦ−β１のＬＡＰは、インテグリンαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８と相互作用して、ＴＧＦ−β１の活性化をもたらすＲＧＤモチーフを含む。アビツズマブは、リガンド結合性αｖサブユニットにアロステリックに結合し、それにより、リガンドがすべてのαｖβヘテロ二量体に結合することを妨害し、そのため、潜在型ＴＧＦ−βのαｖインテグリン依存性活性化を阻害し、よって、線維芽細胞および他の前駆体による筋線維芽細胞表現型の獲得を妨害する汎αｖインテグリン抗体である。本研究は、αｖインテグリンおよび線維性遺伝子発現に対するＴＧＦ−βの効果、しかも、アビツズマブが正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）におけるＴＧＦ−β誘発性遺伝子発現を妨害する強力な証拠を提供した。
【０２２６】
材料と方法
試験系
試験系は、潜在型ＴＧＦ−βを伴ったまたはそれなしのＴＧＦ−β１で刺激した健常ドナー由来のＮＨＬＦである。初代ＮＨＬＦは、ＴＧＦ−β刺激後にα平滑筋アクチン（最初の出力）を上方制御する。
【０２２７】
【表１３】
2018534340.tif 000022
【０２２８】
試験物質と刺激
【表１４】
2018534340.tif 000023
【０２２９】
【表１５】
2018534340.tif 000024
【０２３０】
【表１６】
2018534340.tif 000025
【０２３１】
備品と器具
【表１７−１】
2018534340.tif 000026
【表１７−２】
2018534340.tif 000027
【０２３２】
【表１８】
2018534340.tif 000028
【０２３３】
計画
研究設計の概略
ＮＨＬＦ培養培地（２％ＦＢＳを含むＦＧＭ）：ＦＧＭ(商標)−２ブレットキット(商標)（ＣＣ−３１３２）は、以下の成長サプリメント：０．５ｍｌのｈＦＧＦ−Ｂ（ＣＣ４０６５Ｊ）；０．５ｍｌのインスリン（ＣＣ−４０２１Ｊ）；１０ｍｌのＦＢＳ（ＣＣ−４１０１Ｊ）；０．５ｍｌのＧＡ−１０００（ＣＣ４０８１Ｊ）を含有する、線維芽細胞の細胞基礎培地（ＣＣ−３１３１）および線維芽細胞ブレットキット（ＣＣ−４１２６）の５００ｍｌボトル１本を含む。
【０２３４】
ＦＭＴアッセイのためのＮＨＬＦ培地（０．１％ＦＢＳを含むＦＧＭ）：ＦＧＭ(商標)−２ブレットキット(商標)（ＣＣ−３１３２）は、以下の成長サプリメント：０．５ｍｌのｈＦＧＦ−Ｂ（ＣＣ−４０６５Ｊ）；０．５ｍｌのインスリン（ＣＣ−４０２１Ｊ）；０．５ｍｌのＦＢＳ（ＣＣ−４１０１Ｊ）；０．５ｍｌのＧＡ−１０００（ＣＣ４０８１Ｊ）を含有する、線維芽細胞の細胞基礎培地（ＣＣ−３１３１）および線維芽細胞ブレットキット（ＣＣ−４１２６）の５００ｍｌボトル１本を含む。
【０２３５】
ＮＨＬＦを、Ｔ１５０組織培養フラスコ内、２％のＦＢＳを含むＦＧＭ中で、それらがアッセイ日に７０〜８０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を、６ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５０２２）ですすぎ、６ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５０１２）で室温にて５分間トリプシン処理した。トリプシンを、６ｍｌのトリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＣＣ−５００２）で不活性化し、４００ｇにて４分間スピンダウンし、そして、２％のＦＢＳを含むＦＧＭで１回洗浄した。画像研究のために、細胞を、コラーゲン１細胞用器具９６ウェル黒色／透明プレートに７５００細胞／ウェルにて播種した。遺伝子発現研究のために、細胞を、２４ウェル培養プレート内に５０，０００細胞／ウェルにて播種した。細胞を、２％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中、８時間培養した。培地を吸引し、そして、細胞を、０．１％のＦＢＳ含有ＦＧＭ中で一晩飢餓状態にした。
【０２３６】
αｖインテグリン、αＳＭＡ、および遺伝子発現に対するＴＧＦ−βの効果を調査するために：培地を吸引し、そして１００μｌの、０．１％ＦＢＳ含有ＦＧＭを加え、ＴＧＦ−βを、１００μｌの、０．１％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中に所望の濃度の２Ｘ（２０ｎｇ／ｍｌ）で加えた。７２時間後に、培地を回収し、ＩＬ−６検出のために−８０℃にて保存した。
【０２３７】
ＴＧＦ−β誘発性の線維芽細胞−筋線維芽細胞転換（ＦＭＴ）に対するアビツズマブの効果を調査するために、ＮＨＬＦをコラーゲン１細胞用器具９６ウェル黒色／透明プレートに７５００細胞／ウェルにて播種し、２％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中で８時間培養した。培地を吸引し、そして、細胞を０．１％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中で一晩飢餓状態にした。培地を吸引し、２５ｎｇ／ｍｌの濃度にてアビツズマブまたは抗ＨＥＬ ＩｇＧを含む１００μｌの、０．１％ＦＢＳ含有ＦＧＭを加え、３０分間インキュベートした。ＴＧＦ−βを、１００μｌの、０．１％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中に所望の濃度の２Ｘ（潜在型ＴＧＦ−β１＝４０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−β＝０．３１２ｎｇ／ｍｌ）にて加えた。７２時間後に、培地を回収し、ＩＬ−６検出のために−８０℃にて保存した。
【０２３８】
免疫蛍光法を使用したαｖインテグリン、αＳＭＡ発現研究のために、細胞を固定し、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）およびαｖインテグリン染色手順にしたがって染色した。ＦＭＴ関連遺伝子発現解析のために、ＲＮＡ分離およびＲＴ−ＰＣＲの準備ができるまで、細胞を−８０℃にて保存した。
【０２３９】
α平滑筋アクチンおよびαｖインテグリン蛍光抗体法：細胞を、ＰＢＳ（９６ウェルプレートに２００μｌ）で２回洗浄し、次に、固定／透過処理溶液で室温にて４５分間固定した（９６ウェルプレートに５０μＬ）。次に、細胞を、５分間のインキュベーションを用いて、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（１：１０希釈にて蒸留水で希釈）を使用して３回洗浄した。細胞を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（９６ウェルプレートに５０μｌ）で室温にて６０分間妨害した。プレートを、各洗浄の間の５分間のインキュベーションを用いて、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（９６ウェルプレートに２００μｌ）を使用して２回洗浄した。抗ＳＭＡ抗体を、洗浄バッファー中に１：１００希釈にて加えた。抗インテグリンＡｂを、終濃度としてＰｅｒｍバッファー中に１μｇ／ｍｌにて使用し、そして、室温にて３時間インキュベートした。次に、プレートを、１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファー（９６ウェルプレートに２００μｌ）で２回洗浄した。１００μｌの終量において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８と結合した二次Ａｂヤギ抗マウスＩｇＧを、Ｐｅｒｍ洗浄バッファー中に１：２００希釈にて使用し、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７に結合した二次Ａｂヤギ抗ウサギＩｇＧを、Ｐｅｒｍ洗浄バッファー中に１：１００の希釈にて使用し、そして、室温にて１時間インキュベートした。細胞を、各洗浄間の５分間のインキュベーションを伴って、２００μｌの１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファーを使用して２回洗浄した。ＤＡＰＩを１：１０００希釈にて洗浄バッファーに加え、そして、２００μｌをプレートに加え、室温にて５分間インキュベートし、溶液を吸引し、そして、２００μｌの１Ｘ ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄バッファーで置換した。
【０２４０】
遺伝子発現解析のために、ＲＮｅａｓｙ９６キット（Qiagen）に入っている「RNeasy 96 Protocol for Isolation of Cytoplasmic RNA from Animal Cells-using Vaccum Technology」にしたがってＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成を、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Qiagen）に記載の手順にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍサイクラーのサイクル条件を用いて、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄキットおよびＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイのＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲを使用しておこなった。
【０２４１】
ゲル収縮アッセイについて：Ｔ１５０内で培養したヒト線維芽細胞をＨＥＰＥＳで１回すすぎ、上清を取り除き、そして、６ｍｌのトリプシンを各フラスコに室温にて５分間かけて加え、６ｍｌのトリプシン中和溶液を加え、そして、４００ｇの遠心分離によって細胞を回収した。細胞を２％ＦＢＳ含有ＦＧＭ中に２×１０６細胞／ｍｌにて再懸濁した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのアビツズマブまたは抗ＨＥＬ ＩｇＧで１５分間処理した。コラーゲン格子を、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）含有または不含で、２倍量（１２０μｌ）の「処理」細胞懸濁液と８倍量（４８０μｌ）の冷コラーゲンゲル溶液とを混合することによって形成した。５００μｌの細胞−コラーゲン混合物を２４ウェルプレートの各ウェルに移し、３７℃にて１時間培養した。コラーゲン重合後に、１ｍｌの培地を、それぞれのコラーゲンゲル格子上に加えた。コラーゲンゲルを無菌のへらを使用してそっと持ち上げ、ゲルを培地上に浮かせた。コラーゲンゲルサイズを、５日間観察し、そして写真を５日目に撮影した。
【０２４２】
出力
画像化のためのプレート出力手順
Ｉｍａｇｅ Ｘｐｒｅｓｓマイクロスクリーニングシステム（ＩＸＭ）機器およびＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを、画像収集および解析のために使用した。三色染色について：ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびＣｙ５のために、プレート収集画像化プロトコール：「２０１４−ＹＷ−ＳＭＡ−ｌｎｔ−ＤＡＰＩ−６４７−１０ｘ」を使用した。二色染色について：ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣ染色のために、プレート収集画像化プロトコール：「２０１４−ＹＷ−ＳＭＡ４８８−ＤＡＰＩ−１０ｘ」を使用した。データ解析のために、多重波長細胞スコア化解析パラメータプロトコール「２０１４−５−７−ＹＷ−ＳＭＡ４８８−ＤＡＰＩ−４ｘ−２ｐａｒａ ａ」を使用して、ＦＭＴによるＳＭＡ線維誘発の量を定量化した。個々のウェルの画像を、ＢＭＰファイルとしてダウンロードした。
【０２４３】
ＩＬ−６のＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ‐６のレベルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、市販のＩＬ−６ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｄｕｏｓｅｔ ＩＬ−６、R & D Systems）を使用して測定した。４５０ｎｍにおける光学濃度測定値（ＯＤ）を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅリーダー（Molecular Devices）および内部ＩＬ−６標準からＯＤ測定値を使用して計算した４−パラメーターロジスティック曲線の当てはめから推定した各サンプルのＩＬ−６濃度を使用しておこなう。
【０２４４】
遺伝子発現解析
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ｆｌｅｘ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍサイクラーによるＲＴ−ＰＣＲの実施が完了した後、すべてのウェルのＣＴ値を、相対発現の計算のためにＥｘｃｅｌのスプレッドシートにダウンロードした。
【０２４５】
使用したコンピュータプログラム
【表１９】
2018534340.tif 000029
【０２４６】
相対遺伝子発現（基礎レベル）および倍率変化の計算
ＣT閾値サイクル。ＣTは、反応中に作り出される蛍光が閾値線と交差するサイクル数である。ＣT値は対数的であり、定量分析法に直接使用される。
【０２４７】
相対遺伝子発現（基礎レベル）について：
ΔＣT値を計算する。ΔＣT＝ＣT標的−ＣT参照文献(GAPDH)
基礎レベルでの相対遺伝子発現としてでの２-ΔCTを計算する。
【０２４８】
相対遺伝子発現（治療後の倍率変化）について：
ΔＣT値を計算する。ΔＣT＝ＣT標的−ＣT参照文献(GAPDH)
ΔΔＣT値を計算する。ΔΔＣT＝ＡＣT試験サンプル（治療）−ＡＣTキャリブレーターサンプル（治療なし）
内因性標準（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対する正規化およびキャリブレーター（治療前または対照）に関連する、標的の量は：２-ΔΔCTによって示される。
【０２４９】
結果
ＴＧＦ−βは、ヒト肺線維芽細胞におけるインテグリン発現を増強する（図３も参照）
ＮＨＬＦにおけるインテグリンの発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析し、ＮＨＬＦが、定常状態で、かつ、ＩＴＧＢ１＞ＩＴＧＢ５＞ＩＴＧＡＶ＞ＩＴＧＢ８＞ＩＴＧＢ３の順の発現レベルでインテグリンを発現することがわかった。αｖインテグリンとＴＧＦ−βとの間にクロストークがあることが仮定され、そのため、我々はＦＭＴアッセイによりインテグリン発現におけるＴＧＦ−βの効果を調べた。我々は、ＴＧＦ−β誘発性ＦＭＴがＩＴＧＢ５の発現増強、ならびにＩＴＧＢ１およびＩＴＧＢ３のある程度の発現増強を引き起こすことがわかり；蛍光抗体染色は、αｖβ５発現の増強を明らかにした（図３：ＴＧＦ−βはヒト肺線維芽細胞においてインテグリン発現を増強する、を参照）。
ＴＧＦ−βは、肺線維芽細胞においてαＳＭＡ、ＩＬ−６、および他の筋線維芽細胞マーカー遺伝子発現を増強する（図４も参照）
ＴＧＦ−β処理は、免疫蛍光法およびＲＴ−ＰＣＲによって検出されたとおり、ＩＬ６産生およびα平滑筋発現を増強した。ＴＧＦ−β処理は、例えばα平滑筋、コラーゲン、フィブロネクチン、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ１、ペリオスチン、肺線維芽細胞におけるＮ−カドヘリン発現などの筋線維芽細胞マーカー遺伝子を増強した（図４：ＴＧＦ−βは、肺線維芽細胞におけるαＳＭＡ、ＩＬ−６、および他の筋線維芽細胞マーカー遺伝子の発現を増強する、を参照）。
【０２５０】
線維芽細胞培養物のアビツズマブ処理は、αＳＭＡおよびＩＬ−６におけるＴＧＦ−β誘発性増強を低減する（図５も参照）
図１に示したとおり、ＴＧＦ−βはインテグリンの発現を増強し、この実験では、我々は、高用量の潜在型ＴＧＦ−βと一緒に、インテグリンの発現を増強するのに準最適用量の活性ＴＧＦ−βを用いてＮＨＬＦを処理した。潜在型ＴＧＦ−β１と活性ＴＧＦ−β１の組み合わせは、潜在型または活性型単独と比較して、αＳＭＡを発現する細胞をより多く誘発した。アビツズマブ処理は、αＳＭＡの発現、ＩＬ−６の産生、およびＴＧＦ−β活性化によって引き起こされるＦＭＴ遺伝子発現を低減した（図５：線維芽細胞培養物アビツズマブ処理は、αＳＭＡおよびＩＬ−６におけるＴＧＦ−β誘発性増強を低減する、を参照）。
【０２５１】
アビツズマブ処理は、ＴＧＦ−β誘発性コラーゲンゲル収縮を低減する（図６も参照）
三次元コラーゲンゲル試験を、線維芽細胞収縮研究に使用した。ＴＧＦ−β１によるαＳＭＡタンパク質の変化、ならびにアビツズマブ以外のαｖインテグリンの妨害が、機能的結果につながったかどうか決定するために、コラーゲンゲル収縮アッセイをおこなった。アビツズマブを細胞に添加したとき、それはＴＧＦ−βの添加によって引き起こされる収縮の程度を低減した（図６：アビツズマブ処理は、ＴＧＦ−β誘発性コラーゲンゲル収縮を低減する、参照）。
【０２５２】
考察
この報告では、我々は、ヒト肺線維芽細胞において、ＴＧＦ−βが、αｖインテグリン、αＳＭＡ、ならびに他のＦＭＴの遺伝子、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ１、ペリオスチン、Ｎ−カドヘリンなどの発現を増強することを示した。線維芽細胞培養物のアビツズマブ処理は、αＳＭＡ、ＩＬ６、ＣＴＧＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ、ＰＬＯＤにおけるＴＧＦ−β誘発性増加を低減する。
【０２５３】
アビツズマブは、そうである。細胞外マトリックス産生過剰部位における潜在型ＴＧＦ−βのαｖインテグリン依存性活性化を妨害することが示されている。ここで、我々は、アビツズマブが線維芽細胞−筋線維芽細胞転換を妨害することをインビトロ培養系を使用して示した。ＴＧＦ−βは、αｖインテグリンを上方制御し、潜在型ＴＧＦ−βのαｖインテグリン依存性活性化を妨害し、筋線維芽細胞細胞膜上におけるインテグリンの局所的上方制御を妨害し、その結果、ＴＧＦ−β活性化の悪循環および筋線維芽細胞の蓄積を断ち切ることができる。
【０２５４】
参考文献
【化８】
2018534340.tif 000030
【０２５５】
付録
ＲＴ−ＰＣＲのための遺伝子リスト
【表２０−１】
2018534340.tif 000031
【表２０−２】
2018534340.tif 000032
【表２０−３】
2018534340.tif 000033
【０２５６】
【表２１】
2018534340.tif 000034
【０２５７】
実施例３：
潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合に対するアビツズマブの効果
略語表
αＳＭＡ：α平滑筋アクチン
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
μｇ：マイクログラム
ｍｇ：ミリグラム
ｍＬ：ミリリットル
ＬＡＰ：潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）
ＬＴＢＰ：潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質
ｎｇ：ナノグラム
ＴＧＦ−β１：形質転換成長因子−β１
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ｈ：ヒト
ＩＬ：インターロイキン
【０２５８】
概要
αｖβ３、αｖβ３、αｖβ６、およびαｖβ８はＴＧＦ−βの活性化を制御し得る。
ＴＧＦ−β１は、様々な臓器における組織線維症発症において重要な役割を果たす主要な線維形成促進サイトカインである。ＴＧＦ−β１は、組織線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を促進することによって線維症に寄与する。筋線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を産生し、そして、線維症中のＥＣＭの伸縮のための主要なドライバーである。ＴＧＦ−β１は潜在型複合体の状態で分泌され、ＴＧＦ−β１に加えて、それはまた、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）および潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）も含む。複合体は、ＬＴＢＰがＥＣＭに固定され、かつ、ＬＡＰが、αｖサブユニット上のαｖインテグリン、すなわち、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８のうちの１つを結合するとき、活性ＴＧＦ−β１を放出するように解放構造を採用し得る。
【０２５９】
アビツズマブは、αｖインテグリンのリガンド結合性αｖサブユニットに特異的なヒト抗体である。αｖサブユニットに結合すると、アビツズマブは、αｖインテグリンがＬＡＰなどのリガンドに結合することを妨害する。この試験の目標は、アビツズマブがαｖβ６へのＬＡＰの結合を妨げる能力を評価することであった。
【０２６０】
抗βαｖ６ベースのＥＬＩＳＡアッセイ使用して、我々は、アビツズマブが、用量依存的にＥＬＩＳＡプレートにあらかじめコートされたＬＡＰへのαｖβ６の結合を妨害できることを実証した。その知見は、アビツズマブが、ＴＧＦ−βの活性化における重要なステップである、ＬＡＰへのαｖインテグリンの結合を妨げる能力を明確に実証する。これは、線維症を治療するためのアビツズマブを開発するための科学的基礎の一部を形成する。
【０２６１】
序論
ＴＧＦ−β１（主要な線維形成促進サイトカイン）は、様々な臓器における組織線維症の発症で重要な役割を果たす。ＴＧＦ−β１は、組織線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を促進することによって線維症に寄与する。筋線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を産生し、そして、収縮させる。それらは、線維症中のＥＣＭの伸縮のための主要なドライバーである。ＴＧＦ−β１は潜在型複合体の状態で分泌され、ＴＧＦ−β１に加えて、それはまた、潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）および潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）も含む。複合体は、ＬＴＢＰがＥＣＭに固定され、かつ、ＬＡＰが、αｖサブユニット上のαｖインテグリン、すなわち、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６およびαｖβ８のうちの１つを結合するとき、活性ＴＧＦ−β１を放出するように解放構造を採用し得る。本研究の目的は、αｖβ６へのＬＡＰの結合をアビツズマブが妨げる能力を評価することであった。
【０２６２】
材料と方法
材料
試験系
試験系は、プレートを組み換えヒトＬＡＰでコートし、次に、アビツズマブ（別名ＤＩ１７Ｅ６）の存在または不存在下で、組み換えヒトαｖβ６と共にインキュベートする、競合結合アッセイである。ＬＡＰに結合したαｖβ６の量を、ウサギ抗αｖβ６抗体（捕獲抗体）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（検出抗体）を使用したＥＬＩＳＡによって検出する。
【０２６３】
材料と器具
主要な材料
【表２２】
2018534340.tif 000035
【０２６４】
主要な装置
【表２３】
2018534340.tif 000036
その他の材料と装置に関しては、リポートＳＷＥ００１７４を参照。
【０２６５】
コーティングバッファー（再蒸留水中）：
２００ｍＭのＴｒｉｓ
１５０ｍＭのＮａＣｌ
ＨＣｌで７．４にｐＨに調整
＋１ｍＭのＣａＣｌ２；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０１ｍＭのＭｎＣｌ２
ブロッキングバッファー（再蒸留水中）：
５０ｍＭのＴｒｉｓ
１００ｍＭのＮａＣｌ
ＨＣｌで７．４にｐＨを調整
＋５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
洗浄および希釈バッファー（再蒸留水中）：
２００ｍＭのＴｒｉｓ
１５０ｍＭのＮａＣｌ
ＨＣｌで７．４にｐＨを調整
＋１ｍＭのＣａＣｌ２；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０１ｍＭのＭｎＣｌ２
＋０．１ｍｇ／ｋｇのＢＳＡ
実験計画
研究設計の概要
ＬＡＰを用いたプレートのコーティング。
組み換えヒトＬＡＰを、０．１μｇ／ｍｌの終濃度でプレートに加え、そして、ＬＡＰでプレートをコートするために４℃にて一晩インキュベートした。次に、プレートを空にし、そして、１００μｌのブロッキングバッファーと共に３７℃にて２時間インキュベートして、プレートへのαｖβ６の非特異的結合を妨害した。
【０２６６】
ＬＡＰコートプレートへのαｖβ６、アビツズマブまたは対照抗体の添加。５０μｌのあらかじめ希釈したアビツズマブまたは対照抗体を、段階希釈の高濃度から低濃度までを各ウェルに加えた。次に、５０μｌのαｖβ６溶液を各ウェルに加えた。抗体の終濃度は、２．５μｇ／ｍｌ〜０．１６ｎｇ／ｍｌ、そしてαｖβ６に関しては０．２５μｇ／ｍｌであった。
【０２６７】
アビツズマブの効果を、他の２種類の抗αｖβ６抗体：ＭＳＢ００１１５２１Ｈ−１および１０Ｄ５、と比較した。ＩｇＧ２ａをアビツズマブのアイソタイプ対照ＩｇＧとして使用した。抗ＨＥＬ（ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）由来の非哺乳動物タンパク質、ヘベイン様プレプロタンパク質に特異的な抗体であり、ＭＳＢ００１１５２１Ｈ−１の陰性対照抗体として使用した。１７Ｅ６は、アビツズマブまたはＤＩ１７Ｅ６が誘導された元の非脱免疫化マウス汎抗αｖ抗体である。これらの抗体をアビツズマブまたはＤＩ１７Ｅ６と同じ濃度で加えた。
プレートをαｖβ６、およびアビツズマブまたはその対照抗体と共に３７℃にて６０分間インキュベートした。次に、プレートを、二次抗体の添加のために洗浄した。
【０２６８】
プレートにＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧの添加、発色現像、および読み取り。プレートに、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを加え、そして、３７℃にて９０分間インキュベートした。次に、プレートにＲ＆Ｄ基質試薬（Ｐａｃｋ ＤＹ９９９）を添加し、２０分間インキュベートして発色現像し、その後、その反応をＲ＆Ｄ停止溶液ＤＹ９９４の添加によって停止させた。次に、Ｔｅｃａｎ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒ ｌｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００により４５０ｎｍにてプレートを読み取った。
【０２６９】
出力
ＬＡＰへのαｖβ６の結合を、ＥＬＩＳＡを使用することによって計測した。ＬＡＰに結合したαｖβ６の量を、研究設計において先に記載した手順を用いることによって測定した。
【０２７０】
結果
アビツズマブは、ＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害する（図７も参照）
あらかじめコートしたＬＡＰへのαｖβ６の結合を、特異的な抗αｖβ６抗体ベースのＥＬＩＳＡによって検出した。それをＬＡＰであらかじめコートしたプレート内でαｖβ６と同時にインキュベートしたとき、結合は濃度依存的にＤＩ１７Ｅ６によって妨害された。抗αｖβ６抗体ＭＳＢ００１１５２１Ｈ−１および１０Ｄ５もまた、結合を阻害した。対照的に、アイソタイプ対照ＩｇＧ２も陰性対照抗体（抗ＨＥＬ、ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１）も阻害作用を示さない。また、αｖβ３のインテグリン特異的阻害抗体ＬＭ６０９もＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害しなかった。その知見は、ＤＩ１７Ｅ６がＬＡＰへのαｖβ６の結合を特異的に阻害することを示す。
【０２７１】
ＬＡＰへのαｖβ６の結合を、ＥＬＩＳＡを使用することによって計測した。ＬＡＰに結合したαｖβ６の量を、研究計画で先に記載した手順を用いることによって測定した。
【０２７２】
結果
アビツズマブは、ＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害する。
あらかじめコートしたＬＡＰへのαｖβ６の結合を、特異的な抗αｖβ６抗体ベースのＥＬＩＳＡによって検出した。それをＬＡＰであらかじめコートしたプレート内でαｖβ６と同時にインキュベートしたとき、結合は濃度依存的にＤＩ１７Ｅ６によって妨害された。抗αｖβ６抗体ＭＳＢ００１１５２１Ｈ−１および１０Ｄ５もまた、結合を阻害した。対照的に、アイソタイプ対照ＩｇＧ２も陰性対照抗体（抗ＨＥＬ、ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１）も阻害作用を示さない。また、αｖβ３のインテグリン特異的阻害抗体ＬＭ６０９もＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害しなかった。その知見は、ＤＩ１７Ｅ６がＬＡＰへのαｖβ６の結合を特異的に阻害することを示す。
【０２７３】
表形式の研究レポート
【表２４】
2018534340.tif 000037
【０２７４】
考察
この試験において、我々は、アビツズマブ（ＤＩ１７Ｅ６）が特異的に、かつ、濃度依存的にＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害することを示した。その知見は、アビツズマブが、
ＴＧＦ−βの活性化における重要なステップである、ＬＡＰへのαｖインテグリンの結合を妨げる能力を明確に実証する。この兆候は、線維症および／または線維性障害を治療するためのアビツズマブを使用するための科学的基礎の重要な部分を形成する（図７：図７は、アビツズマブによるＬＡＰへのαｖβ６の結合の阻害を示す、も参照）。コートしたＬＡＰへのαｖβ６の結合を、ブランク（αｖβ６不含なしでバッファー）を上回るαｖβ６含有ウェル（無処置）における吸光度の増大として検出した。値を、１００％として前者および０％として後者を用いて正規化した。ＤＩ１７Ｅ６の両バッチ（バッチ番号４０３５０および１３２４５）とも、抗αｖβ６抗体ＭＳＢ００１１５２１Ｈ−１と同様に、しかし、抗αｖβ６抗体０Ｄ５より良好に、濃度依存的にＬＡＰへのαｖβ６の結合を低減した。対照的に、アイソタイプ対照ＩｇＧ（ＩｇＧ２）も陰性対照抗体（抗ＨＥＬ、ＭＳＢ００１１５２３Ｈ−１、データ未掲載）も、同じ濃度範囲で結合に影響した。また、αｖβ３特異的阻害抗体ＬＭ６０９は、ＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害しなかった。
【０２７５】
実施例４：
線維症／全身性硬化症の遺伝子シグネチャー
概要
・この試験の目標は、全身性硬化症（ＳＳｃ）に罹患している患者の線維症の状況を診断および観察するためのロバスト遺伝子シグネチャーを見つけることであった。
・シグネチャーのための遺伝子を二元的なストラテジーを使用して同定した：
ｏ文献ベースの遺伝子リストを事前に定義し、そして、確立されたマイクロアレイベースの遺伝子発現データにおいてＳＳｃ皮膚での上方制御について試験した。
ｏ全遺伝子の客観的な分析では、３種類の公共ＳＳｃデータセットを使用して、ＳＳｃ皮膚で上方制御される候補遺伝子を見つける。
【０２７６】
・さらに、最終前の候補遺伝子リストを、肺線維症とそれらの関係について２つの公共ゲノムスケール遺伝子発現データによって選別した。
・最終的に、候補遺伝子のリストを、固体組織と比較して、免疫関連組織における上方制御に関して選別した。
・概要では、我々は、５つの適当なデータセットを分析することによって、ＳＳｃおよび肺線維性組織において上方制御される１９種類の非免疫関連遺伝子のロバストシグネチャーを見つけることができる。
【０２７７】
・ＴＧＦ−βを補充したか、またはヒト上皮Ｈ３５８肺細胞株からの細胞と共培養したかのいずれかのヒト線維芽細胞を用いた実験において、ＴＧＦ−βの上方シグネチャー／アビツズマブの下方シグネチャー（以降、ＴＵＡＤシグネチャーと呼ばれる）に含まれるべき遺伝子は、ＴＧＦ−β投与後の上方制御を示す（３つの反復実験にわたる倍率変化の中央値）。
【０２７８】
・さらに、９つの遺伝子の最終的なＴＵＡＤシグネチャーを、ヒトＨ３５８細胞を用いた共培養し、そして、２種類の用量にて抗ＨＥＬ（ニワトリ卵リゾチーム）またはアビツズマブのいずれかで処理した正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＦＬ）を用いた実験に供した。ＴＵＡＤは、ａ）アビツズマブ処理後の９種類の遺伝子シグネチャーの全遺伝子の下方調節のために、およびｂ）正味のＴＵＡＤの９種類の遺伝子シグネチャースコアの下方調節のために、アビツズマブによって下方調節され得るＴＧＦ−β連鎖線維症シグネチャーとして受け入れられるべきであった。
【０２７９】
序論
この試験は、二重プロセスを使用した全身性硬化症（ＳＳｃ）に罹患している患者の線維症のモニタリングのためのロバスト遺伝子シグネチャーを見つけることを目指す。ＳＳｃおよびＴＧＦ誘導（simulated）線維芽細胞において上方制御されると報告された文献ベースの遺伝子、ならびに公共データセットにおいてＳＳｃ／線維症に罹患している患者における上方制御の有力な証拠を有する遺伝子は、最終的にＳＳｃおよびＩＰＦにおける線維症に関するロバスト遺伝子シグネチャーを得るために、さらなる分析に供されるべきであった。
【０２８０】
加えて、我々は、ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ発現プロファイリング実験を実施して、ＴＧＦ−βによって上方制御される遺伝子の、ＴＵＡＤシグネチャーと呼ばれる別のシグネチャーを同定し、それによって、１９種類の遺伝子シグネチャーのＴＧＦ−β依存性遺伝子サブグループを示す。最終的に、我々は、アビツズマブがＴＵＡＤシグネチャーを下方調節し得るかどうか試験するために、このＴＵＡＤシグネチャーを別の実験に供する。
【０２８１】
材料
ＳＳｃ／線維症において上方制御される遺伝子の評価のために、我々は以下のデータセットを使用する。データセットは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベースで入手可能である。遺伝子発現は、遺伝子ごとのプローブセット強度を平均化することによって得られる。
【０２８２】
全身性硬化症データセット
ＧＳＥ９２８５（Milano et al., 2008）は合計で７５個のサンプルを含む。皮膚生検を、びまん性ＳＳｃ（ｄＳＳｃ）に罹患しているの１７人の患者、限局性ＳＳｃ（ＩＳＳｃ）に罹患している７人の患者、限局性強皮症に罹患している３人の患者、および６人の健常対照の前腕および背部から採取した。
【０２８３】
データセットＧＳＥ３２４１３（Pendergrass et al., 2012）は合計で８９個の皮膚生検サンプルから成る。遺伝子発現を、ＳＳｃに罹患している２２人の患者および９人の健常対照を計測した。１３人のＳＳｃ患者をリツキシマブで処置し、９人は未処理である。我々は、ＳＳｃ皮膚と正常皮膚との間の示差的発現の評価のためにベースライン／処理前サンプルを使用し、そして、処置の６および３６カ月後に採取した生検検体を除く。
【０２８４】
ＧＳＥ４５４８５（Hincliff et al., 2013）は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）で処置した１２人のＳＳｃ患者および１０人の健常対照からの合計で８３人の皮膚生検を含む。ＳＳｃ患者由来のベースライン（前処置）サンプルのみが分析に含まれ、ＭＭＦ処置の６および１２カ月後に採取されたサンプルを除外した。
【０２８５】
肺線維症データセット
ＧＳＥ２４２０６（Meltzer et al., 201）は、初期／進行性特発性肺線維症（ＩＰＦ）に罹患している１１人の患者由来の１７個の肺サンプル。６人の患者が、上葉および下葉からの１組のサンプルを提供し、５人の患者が単独サンプルに寄与した。６個の対照標本を、肺移植時点における所定の肺容量減少の健常ドナーから得た。
【０２８６】
データセットＧＳＥ４８１４９（未発表）は、合計で５３個の肺サンプルを含む。特発性肺動脈高血圧（ＩＰＡＨ）に罹患している８人の患者、ＩＰＦに罹患している１３人の患者、ＳＳｃに起因する肺動脈高血圧に罹患している１０人の患者（ＳＳｃ−ＰＡＨ）、およびＳＳｃに起因する肺線維症に罹患している１３人の患者（ＳＳｃ−ＰＦ）、ならびに９人の健常対照が含まれる。ＧＳＥ２１３６９は、２３人の対象の２９個の肺組織サンプルを含む。通常型間質性肺炎／特発性肺線維症（ＵＩＰ／ＩＰＦ）と診断された１１人の患者、および６人の対照のデータは使用し、非特異性間質性肺炎に罹患している患者のサンプルを除外した。
【０２８７】
免疫関連のデータセット
データセットＧＳＥ１１３３（Su et al., 2004）に含まれた２８個の免疫関連組織および１１８個の非免疫／非癌組織の遺伝子発現をこの試験で使用した。
【０２８８】
バリデーションデータセット
データセットＧＳＥ２２４５９（Park et al., 2010）は、１年プロトコール生検検体において線維症および炎症の兆候を有する６５人の腎移植受容者を含む。
データセットＧＳＥ６１２６０（Hovarth et al., 2014）は、１３４個のＮａｓｈ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、ＰＳＣ（原発性硬化性胆管炎）、ＰＢＣ（胆管の原発性胆管炎）、ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）、健常な肥満、および正常肝サンプルを含む。
データセットＧＳＥ４８４５２（Ahrens et al., 2013）は、Ｎａｓｈ（非アルコール性の脂肪肝疾患）、脂肪症、健常な肥満、および正常肝からの７３個のサンプルを含む。
【０２８９】
データセットＧＳＥ４９５４１（Moylan et al., 2014）は、ＮＡＦＬＤに罹患している７２人（軽いＮＡＦＬＤ、線維症ステージ０〜１に罹患している４０人、および進行性ＮＡＦＬＤ、線維症ステージ３〜４に罹患している３２人）の患者を含む。
データセットＧＳＥ３９４９１（Hyland et al., 2014）は、４３人のＢＥ患者の食道扁平上皮（ＮＥ）および胃噴門（ＮＣ）からのバレット化生および適合正常粘膜の１２０個のサンプルを含む。
【０２９０】
データセットＧＳＥ２６８８６（Wang et al., 2013）は、バレット食道患者の２０個の標本、腺癌患者の２１個の標本および正常食道扁平上皮を有する患者からの１９個の生検検体、扁平上皮癌の９個の標本を含む。
データセットＧＳＥ３７２００（Silvers et al., 2010）は、３１このバレット食道サンプルおよび１５個の腺癌サンプルを含む。
データセットＧＳＥ４７４６０（未発表）は合計で５８２人の対象を含み、２５４人は間質性肺疾患に罹患しており、２２０人はＣＯＰＤに罹患しており、そして１０８人は対照である。
【０２９１】
データセットＧＳＥ２４９８８（Mura et al. 2012）は、肺移植を受けたＰＦ患者の受容者臓器からの１１６個のサンプルを含む。
データセットＧＳＥ１７９７８（Emblom-Callahan et al., 2010）は、末期特発性肺線維症の患者の１２個の肺および正常肺（対照）の６人のドナーからの５８個のサンプルを含む。
データセットＧＳＥ５３８４５（DePianto et al., 2015）は、４０人のＩＰＦ患者および８人の健常対照からのサンプルを含む。
データセットＧＳＥ４４４２６（Desterke et al., 2015）は、原発性骨髄線維症からの６個の骨髄サンプルおよび６つの対照サンプルを含む。
【０２９２】
ＴＧＦ−βまたはアビツズマブで処理した正常ヒト線維芽細胞に関する２つのデータセット
データセットは、１９種類の線維症シグネチャー遺伝子のうち１７個に関する発現データを含む。１７種類の遺伝子のうちの３個の発現は、定量化の下限（ＩＩＯＱ）の下にあった。その結果、第一のデータセット（ＡＢ００１）は、９個のサンプルで計測された１４種類の遺伝子の発現レベルを含んだ。９個のサンプルを３つのサンプル群：ＮＨＬＦ単独、ＮＨＬＦ＋ＴＧＦ−β、ＮＨＬＦ＋Ｈ３５８に分類し得る。第二のデータセット（ＡＢ００２）は、１１個のサンプル：４０ｎｇ／ｍｌ抗ＨＥＬ（３回の反復）で処理したＮＨＬＦ、４０ｎｇ／ｍｌのアビツズマブ（２回の反復）で処理したＮＨＬＦ、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＬ（３回の反復）で処理したＮＨＬＦ、１０μｇ／ｍｌのアビツズマブ（３回の反復）で処理したＮＨＬＦ、を含む。
【０２９３】
シグネチャーのスコア化
我々は、我々の１９種類の遺伝子および９種類の遺伝子シグネチャーを、我々の特許請求の範囲を支持する結果をもたらすいくつかの方法でスコア化し得ることがわかった。
発現の未加工の強度は、ログ−形質転換または形質転換であり得る。
Ｚ正規化：複数の試料（＞＝９）を有するデータセットでは、発現Ｚスコアを得るために、それぞれの遺伝子発現ベクターは、平均または中央値に中心を置き、そして、正規化し得る。
基準として処理前強度を使用した正規化：：比は、処理前および処理後の発現強度から計算できる。これらの比は、任意選択でログスケール化され得る。
サンプルごとのシグネチャーの概要スコアは、遺伝子を越えた合計、平均、または加重平均として計算される。
【０２９４】
文献ベースの遺伝子リスト
ＳＳｃおよびＴＧＦ刺激性線維芽細胞における上方制御に関係する１４３個の遺伝子が、
びまん性ＳＳｃに罹患している患者の皮膚病を予測する「Ｌａｆｙａｔｉｓシグネチャー」から４種類の遺伝子を含むＤａｉｇｅｎ Ｘｕ（TIP Immunology）によって提案された（Farina et al., 2010）。１３５個が、３つのＳＳｃデータセットのうちの少なくとも１つで計測される。１３５個の遺伝子のリストは表９で見ることができる。
【０２９５】
使用したコンピュータプログラム
【表２５】
2018534340.tif 000038
【０２９６】
所望の線維症／ＳＳｃシグネチャーの同定のためのストラテジー
図面では、所望の線維症／ＳＳｃシグネチャーの同定のためのストラテジーを概説する。我々は、文献由来遺伝子と非文献由来遺伝子とで異なる。両方の遺伝子セットを、３つのＳＳｃデータセットに対して試験し、肺線維症データセットにより選別し、そして、最終的に、もうひとつの肺線維症データセットにより正当性を確認した。そのシングルステップを、次節において詳細に記載する。
【０２９７】
ステップ１：最終前の遺伝子リストを得る
線維症／ＳＳｃ関連遺伝子の候補リストを得るために、我々は、それぞれのＳＳｃデータセットの遺伝子ごとにＲバイオコンダクターパッケージｌｉｍｍａ（Smyth, 2004）で実施される示差的発現分析の調整ｔ−検定を実施した。線形モデルを、「ＳＳｃ−正常」サンプルの対比を用いてあらゆる遺１伝子に当てはめた。線形モデルの当てはめを前提として、共通の値に向けた標準誤差の実証的なベイズ適正化によって、調整ｔ統計値を計算した。誤同定率（ＦＤＲ）を制御するベンジャミン・ホッホバーグ手順（Benjamini and Hochberg, 1995）によって、ｐ値を複数の試験について調整した。
【０２９８】
文献ベースの遺伝子の解析
全遺伝子を、先に記載したように、３つのＳＳｃデータセットにより、ＳＳｃと正常皮膚との間の示差的発現について試験した。以下の基準を満たした場合に、文献からの事前定義遺伝子を線維症遺伝子の最終前リストに組み込んだ：
・遺伝子が、３つの公共ＳＳｃデータセットのうちの少なくとも１つで有意に上方制御される（調整ｐ値＜０．０５）、および
・遺伝子が、３つのデータセットのすべてで有意に下方制御されてはならない。
データセットを通じて、同時の有意な上方および下方制御による遺伝子の除外はなかった。文献からの１３５個の事前定義遺伝子のうち４０個がこれらの基準を満たした。
【０２９９】
公用データマイニングに基づく追加の線維症／ＳＳｃ遺伝子
文献から事前定義されていない他のすべての遺伝子に関して、基準を厳しくした。以下の基準を満たした場合に、遺伝子を、上方制御される線維症／ＳＳｃ遺伝子の最終前リストに組み込んだ：
・遺伝子が、３つの公共ＳＳｃデータセットのうちの（少なくとも）２つで有意に上方制御される（調整ｐ値＜０．０５）、および
・遺伝子が、３つのデータセットのすべてで有意に下方制御されてはならない。
文献由来ではない６２個の遺伝子が、健常な皮膚と比較して、ＳＳｃにおいて上方制御されることがわかった。１つのＳＳｃデータセットにおける有意な下方調整のため、６２個の遺伝子のうち２個を除外したが、さらなる分析の対象となった６０個の遺伝子をもたらした。
合計で、１００個の遺伝子が、上方制御される線維症／ＳＳｃ遺伝子の最終前リストに含まれた。
【０３００】
ステップ２：肺線維症における示差発現に関する最終前遺伝子リストの選別
ＳＳｃで上方制御されることがわかった遺伝子が肺線維症（ＰＦ）でも上方制御されるかどうか評価するために、２つのデータセット、ＧＳＥ２４２０６およびＧＳＥ４８１４９を使用した。１００個の遺伝子のうち９６個が、２つのＰＦデータセットのうちの少なくとも１つで存在した。我々は、調整ｔ試験を用いた線維性肺組織における上方制御について４つの比較で９６個の遺伝子を試験した：
１．ＧＳＥ２４２０６：正常対初期ＩＰＦ
２．ＧＳＥ２４２０６：正常対進行性ＩＰＦ
３．ＧＳＥ４８１４９：正常対ＩＰＦ
４．ＧＳＥ４８１４９：正常対ＳＳｃ−ＰＦ
【０３０１】
この選別ステップを通過させるために、遺伝子は、少なくとも２つの比較において有意に上方制御され（ベンジャミン・ホッホバーグ調整ｐ値＜０．０５）、そして、すべての比較において有意な下方制御がない必要がある。２０個の候補遺伝子がステップ２後に残った。
【０３０２】
ステップ３：免疫関連組織における上方調整に関する前最終遺伝子リストの選別
線維症／ＳＳｃ関連遺伝子の候補リストからの遺伝子を残すために、我々は、正常組織データセットＧＳＥ１１３３の遺伝子ごとにＲバイオコンダクターパッケージｌｉｍｍａで実施される示差的発現分析の調整ｔ−検定を実施した。線形モデルを、「免疫−その他」サンプルの対比を用いてあらゆる遺１伝子に当てはめた。線形モデルの当てはめを前提として、共通の値に向けた標準誤差の実証的なベイズ適正化によって、調整ｔ統計値を計算した。誤同定率（ＦＤＲ）を制御するベンジャミン・ホッホバーグ手順（Benjamini and Hochberg, 1995）によって、ｐ値を複数の試験について調整した。１つの遺伝子（ＢＩＲＣ３）を、免疫関連対他の正常（非癌）組織サンプルにおける上方制御のため除外した。
【０３０３】
線維症／ＳＳｃ１９遺伝子シグネチャー
文献からの予備的知識および公的に入手可能なデータセットの遺伝子発現情報からの予備的知識によって、我々は、ＳＳｃおよび肺線維症において上方制御される１９個の非免疫関連遺伝子から成る本当に見込みのある線維症／ＳＳｃシグネチャーを構成した。遺伝子の完全なリストを表９に示す。
１９個の遺伝子の発現データを（データセット単位で）正規化、すなわち平均中心化し、およびサンプルを通して正規化する。１９個の遺伝子を通じた平均が、サンプルごとのシグネチャースコアとして使用する。
【０３０４】
線維症／ＳＳｃ ＴＧＦ−β上方／アビツズマブ下方（ＴＵＡＤ）９遺伝子シグネチャー
我々は、１９遺伝子シグネチャーの遺伝子のサブセットとしてＴＧＦ−β上方／アビツズマブ下方シグネチャーのための遺伝子を選択することを目指した。そのため、我々は以下の実験を行った。正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）にＴＧＦ−βを補い、そして、ヒト上皮Ｈ３５８肺細胞株由来の細胞と共培養した。線維症シグネチャーの１９個の遺伝子のうちの１４個この遺伝子に関して、我々は、発現シグナルを得ることができた。ＴＧＦ−β上方／アビツズマブ下方シグネチャー（以降、ＴＵＡＤシグネチャーと呼ばれる）に含まれるべき遺伝子に関して、それは、ＴＧＦ−βの投与後に上方制御を示さなければならなかった（３つの反復実験を通じて倍率変化の中央値）。この基準を使用して、我々は９個の遺伝子を選択した。これらの９個の遺伝子が、我々の９遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーを構成する（★によって示した表９を参照）。
【０３０５】
さらに、９個の遺伝子から成る最終的なＴＵＡＤシグネチャーを、ヒトＨ３５８細胞と共培養し、そして、４０ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌにて抗ＨＥＬ（ニワトリ卵リゾチーム）またはアビツズマブで処理する正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＦＬ）を用いた実験に供した（上記データセットの説明を参照）。
【０３０６】
我々は、（以前にＴＧＦ−βによって上方制御されることがわかった）それぞれ９個の遺伝子が、抗ＨＥＬ対照と比較したときに、アビツズマブによって下方制御され得ることを見出した。よって、ＴＵＡＤ９種類の遺伝子シグネチャーは、ａ）抗ＨＥＬと比較して、アビツズマブ処理後の９種類の遺伝子シグネチャーの全遺伝子の下方調節、およびｂ）抗ＨＥＬと比較して、アビツズマブ処理後の正味ＴＵＡＤ９種類の遺伝子シグネチャースコアの下方調節のため、によって実証された、アビツズマブによって下方調節され得るＴＧＦ−β誘発性線維症シグネチャーを表す。
【０３０７】
線維症／ＳＳｃシグネチャーに含まれる１９種類の遺伝子の示差的発現分析の結果を、ＳＳｃ対正常皮膚の比較について表１０、表１１および表１２に、ＳＳｃ−ＰＦ対正常肺の比較について表１３に、ＵＩＰ／ＩＰＦ対正常肺の比較について表１４に、初期ＩＰＦ対正常肺の比較について表１５に、ならびに進行性ＩＰＦ対正常肺の比較について表１６に示す。
１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子のいずれも免疫関連組織対非免疫関連組織において上方制御されない（表１７）。
【０３０８】
１９種類の遺伝子線維症／ＳＳｃシグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーの性能
別個のデータセットにおいて、１つの遺伝子は、正常皮膚と比較して、ＳＳｃにおいてのＲＧＳ５（図９）、ならびに正常肺と比較して、例えば、ＩＰＦおよびＳＳｃ−ＰＦにおけるＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＭＰ、ＩＧＦＢＰ２ａおよびＳＳＰ１（図１０〜図１４ａ）のように上方制御された発現を示すが、１９種類の遺伝子線維症／ＳＳｃシグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーに由来するシグネチャースコアは皮膚（図１４ｂ、図１５ａ、図１５ｂ、図１６ａ、および図１６ｂ）、肺（図１７ａ、図１７ｂ、図１８ａ、および図１８ｂ）、肝臓（図１９ａ、図１９ｂ、図２０ａ、図２０ｂ、図２１ａ、および図２１ｂ）、および骨髄（図２２ａおよび図２２ｂ）における線維症のモニタリングに関してよりロバストなシグナルを提供する。
【０３０９】
対照臓器発現データが入手不可能である食道および腎臓の線維症に関して、１９種類の遺伝子線維症／ＳＳｃシグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーに含まれた遺伝子は協調的に発現され、１０００反復によって得られるより高い無作為に予想されるコヒーレンススコア（Staub, 2012）によって規定される（表１８）。
【０３１０】
肝臓サンプル（ＧＳＥ６１２６０）では、１９種類の遺伝子線維症／ＳＳｃシグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコアは、それぞれ０．５０５および０．５２３のスピアマン相関係数を有する（Hovarth et al., 2014に記載の）線維症スコアと良好に相関する（表１９）。
【０３１１】
結論
我々のＴＵＡＤ多重遺伝子発現シグネチャーは、アビツズマブでの処理によって下方調節され得るので、さらに、（前段落で言及したように）様々な線維症において、それが疾患の重症度および／または線維症の程度に連結するので、ＴＵＡＤシグネチャーが、線維症において臨床的に特別なニーズのある指標と見なすことができる。ＴＵＡＤシグネチャーは、アビツズマブ処置のための患者選択に使用できる：ＴＵＡＤシグネチャーに関する高ベースライン／処理前レベルは、アビツズマブが療法の成功を達成する最高の可能性を有している患者を選択するのに使用できる。なぜなら、我々は、高いＴＵＡＤシグネチャー状況が線維性疾病の状態に連結することを実証するだけではなく、アビツズマブがＴＵＡＤシグネチャーを効果的に下方制御できることも実証したからである。加えて、我々が疾病の重症度との繋がりを実証したので−ＴＵＡＤシグネチャーは線維症を観察するのに使用でき、および−ＴＵＡＤシグネチャーを下方制御する実証済みのアビツズマブの能力により−そのため、それはまたアビツズマブの有効性を観察するのにも使用できる。療法応答を予測するマーカーとして役立つ言及したＴＵＡＤシグネチャー能力により、およびいくつかの線維症における疾病の重症度または線維症の存在との繋がりにより、我々は、アビツズマブが一般のすべての線維症に対して使用できる薬剤であると考える。
【０３１２】
表
表８．３つのＳＳｃデータセットのうちの少なくとも１つに存在するＳＳｃおよびＴＧＦ刺激性線維芽細胞において上方制御される遺伝子の文献ベースのリスト
【表２６−１】
2018534340.tif 000039
【表２６−２】
2018534340.tif 000040
【表２６−３】
2018534340.tif 000041
【表２６−４】
2018534340.tif 000042
【表２６−５】
2018534340.tif 000043
【表２６−６】
2018534340.tif 000044
【０３１３】
表９．１９種類の遺伝子ＳＳｃ／線維症シグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャー（★によって印をつけた遺伝子）
【表２７】
2018534340.tif 000045
【０３１４】
表１０．ＧＳＥ４５４８５においてＳＳｃと正常皮膚サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表２８】
2018534340.tif 000046
【０３１５】
表１１．ＧＳＥ３２４１３においてＳＳｃと正常皮膚サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表２９】
2018534340.tif 000047
【０３１６】
表１２．ＧＳＥ９２８５においてＳＳｃと正常皮膚サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３０】
2018534340.tif 000048
【０３１７】
表１３．ＧＳＥ４８１４９においてＳＳｃ−ＰＦと正常肺サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３１】
2018534340.tif 000049
【０３１８】
表１４．ＧＳＥ４８１４９においてＵＩＰ／ＩＰＦと正常肺サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３２】
2018534340.tif 000050
【０３１９】
表１５．ＧＳＥ２４２０６において初期ＩＰＦと正常肺サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３３】
2018534340.tif 000051
【０３２０】
表１６．ＧＳＥ２４２０６において進行性ＩＰＦと正常肺サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３４】
2018534340.tif 000052
【０３２１】
表１７．ＧＳＥ１１３３において免疫関連サンプルと非免疫／非癌サンプルとを比較する１９種類の線維症／ＳＳｃシグネチャー遺伝子に関する調整ｔ検定の結果
【表３５】
2018534340.tif 000053
【０３２２】
表１８．それぞれのデータセットにおいて、それぞれ、無作為に選定した９個および１９個の遺伝子から算出した最小および最大コヒーレンススコアを伴った、異なる適応症における１９種類の遺伝子ＳＳｃ／線維症シグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーのコヒーレンススコア
【表３６】
2018534340.tif 000054
【０３２３】
表１９．ＧＳＥ６１２６０における、１９種類の遺伝子ＳＳｃ／線維症シグネチャーおよび９種類の遺伝子ＴＵＡＤシグネチャーのシグネチャースコアと、炎症、ＮＡＳ（ＮＡＤＬＦ活性スコア）および線維症スコアとのスピアマン相関
【表３７】
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【０３２４】
参考文献一覧
【化９】
2018534340.tif 000056
【０３２５】
実施例５：
第１相 臨床研究の試験
第１相試験は、ＤＩ１７Ｅ６で治療されたＣＲＰＣ患者について、前立腺特異抗原、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、ならびに軟組織転移および骨転移に対する効果を含む、安全性、薬物動態、および抗腫瘍活性を決定するために開始された。患者はすべて、化学療法後に進行性疾患に罹患していた。患者は、１時間にわたる、２５０、５００、１０００、または１５００ｍｇのＤＩ１７Ｅ６による静脈内点滴で治療された。
適格患者は、１８歳以上で、前化学療法後に骨転移の証拠がある、組織学的または細胞学的に確認された前立腺癌に罹患していた。患者は、両側性睾丸摘出を受けたか、またはゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストもしくはアンタゴニストによる持続的アンドロゲン枯渇療法を受けているかのいずれかであり、登録前の少なくとも４週間、抗アンドロゲン療法を中止していた。患者は、持続して（すなわち、少なくとも３か月）ビスホスホネート療法を受け続けているか、または全血清テストステロンレベルが５０ｎｇ／ｄＬ未満の状態でビスホスホネート療法を受けないでいるかのいずれかである必要があった。すべての患者について、少なくとも２回の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）値が、スクリーニングの少なくとも２週間前に測定された個人の最下点レベルから最低１０％増加しているとして定義される進行性疾患の証拠があった；結節性または内臓に関連する進行は、ＰＳＡとは別個に包含するのに十分であった。さらに、患者は、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）スコアが０〜２、平均余命が少なくとも３か月、および十分な血液、腎臓、および肝臓機能があることが必要であった。各試験センターの治験審査委員会が、試験プロトコールを承認し、すべての患者が書面によるインフォームドコンセントを提出した。
【０３２６】
この第１相の複数機関、非盲検、段階的用量増加試験では、ｍＣＲＰＣ患者に、２５０、５００、１０００、または１５００ｍｇの用量でＥＭＤ ５２５７９７を、隔週１時間にわたり、３回静脈内点滴投与した後、６週目の終わりに応答評価した。進行性疾患の証拠がない患者には、疾患進行または容認できない毒性が現れるまで、さらに隔週投与を行うのが適正であった。用量制限毒性（ＤＬＴ）を最初の６週間で評価し、ＥＭＤ ５２５７９７の最終投与の４週間後まで、安全性のために患者を経過観察した。患者を４系列の用量コホートで募集した；用量コホート内の６名の患者の最後の患者が６週目の終わりに達した後に、安全性モニタリング委員会（Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が次の段階的用量増加を決定した。
４３〜８０歳の間（年齢の中央値、６６歳）の２６名の男性患者を登録し、少なくとも１回のＥＭＤ ５２５７９７静脈内点滴を行った。これらの患者は安全性集団を構成した。患者はすべて、白色人種であった。全体的に、人口統計的特性は、４つの用量コホートにわたって同等であり（表１ａ）、最初の診断からの期間の中央値は、５．２年（２〜１８年の範囲）であり、診断から最初の転移性疾患までの期間の中央値は、０．１年（０〜１６年の範囲）であった。ＤＬＴ期間の終了前に、２名の患者が取り消され、その後、後を継いで２４名の患者が６週間の治療を通して、ＥＭＤ ５２５７９７を３回投与された。
【０３２７】
表１ａ．患者のベースライン人口統計(安全性集団)
【表３８】
2018534340.tif 000057
【０３２８】
要約 (表１ｂ):
【表３９】
2018534340.tif 000058
【０３２９】
この第Ｉ相試験から得られる臨床結果はドイツの３施設およびベルギーの１施設で実施された。
【０３３０】
治療期間
２４名の患者（４３〜８０歳）について、３回（１、３、および５週目）投与後、６週目の終わりに応答評価した。用量制限毒性（ＤＬＴ）を最初の６週間にわたり評価し、ＤＩ１７Ｅ６の最終投与の４週間後まで安全性のために患者を経過観察した。
表２ａに、各コホートにおける患者ごとの薬物曝露を要約する。患者の平均ＥＭＤ ５２５７９７曝露期間は、１１７．５日であった（中央値７４．５日；範囲１４〜５３４日）。２４名の患者のうちの１３名は、曝露期間が期待より長期（８４日超）であり、５００ｍｇコホートの２名の患者は、２９７および５３４日間の治療継続中であり、１０００ｍｇコホートの１名の患者は、３１０日間治療を受けている。６週間のＤＬＴ期間内にＤＬＴは報告されなかった。すべての患者が少なくとも１つのＴＥＡＥを経験したが、ＴＥＡＥにおいて用量依存的な関係は観察されなかった。
【０３３１】
表２ａ:各用量コホートにおける患者ごとのＤＩ１７Ｅ６曝露期間
【表４０】
2018534340.tif 000059
【０３３２】
試験プロトコールでは、被験対象はＤＩ１７Ｅ６の少なくとも３用量（２５０、５００、１０００ｍｇ／隔週）を隔週で投与されることになることが明示された。
【表４１−１】
2018534340.tif 000060
【表４１−２】
2018534340.tif 000061
【０３３３】
表２ｂ：治療期間の値を示す（２０１０年８月の状況）。用量レベル１：２５０ｍｇのＤＩ１７Ｅ６、用量レベル２：５００ｍｇのＤＩ１７Ｅ６、用量レベル３：１０００ｍｇのＤＩ１７Ｅ６、および用量レベル４：１５００ｍｇのＤＩ１７Ｅ６。
【０３３４】
安全性／副作用
表３に薬物関連ＴＥＡＥを要約する。１１名の患者（４２．３％）が薬物関連ＴＥＡＥを経験し、それらは、器官別大分類の「皮膚および皮下組織障害」（合計４名の患者；全身性掻痒、紅斑、発疹）、「全身障害および投与局所様態」（合計３名の患者；疲労、粘膜炎、末梢性浮腫）、「胃腸障害」（合計２名の患者；口腔乾燥、舌腫脹、上部消化管出血）、および「感染症および寄生虫症」（合計２名の患者；鼻炎、敗血症）で、最も頻繁に報告があった。２名の患者（７．７％）のみが、薬物関連のグレード３または４のＴＥＡＥであった：５００ｍｇコホートの１名の患者が、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）のグレード３の増加を経験し、１０００ｍｇコホートの１名の患者がグレード３の敗血症を経験した。
【０３３５】
２名の患者が、治療に関連すると考えられる重篤なＴＥＡＥを経験した。それらは、２５０ｍｇコホートの患者におけるグレード１の上部消化管出血、および１０００ｍｇコホートの１名の患者におけるグレード３の敗血症であった。スクリーニングでは、この後者の患者は、尿路感染症および最後の事象がＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）に関連すると考えられる敗血症の再発事象が進行中との診断を受けた。４名の患者が死亡し、研究者は、死亡はすべて、ＥＭＤ ５２５７９７に合理的に関連づけられるものではないと評価した。
【０３３６】
６名の患者（２３．１％）が、ＴＥＡＥにより治療を永続的に中止したが、これらには、２５０ｍｇコホートの４名の患者（１２日目に上部消化管出血、５３日目に筋無力症、４６日目に対麻痺、および３０日目に尿管閉塞）、ならびに５００ｍｇ（５３４日目にグレード３のＧＧＴ増加）および１５００ｍｇ（８５日目に中枢神経系転移）コホートのそれぞれ１名の患者が含まれる。投与部位の皮膚反応は報告されなかった。ポストベースラインの血液学および生化学毒性のグレード３または４への移行が、８名の患者で起こった。しかしながら、検査所見、生命徴候、またはＥＣＧ記録には明白な傾向はなかった。全体として、患者の６５．４％は、ベースラインと比較して、治療において同じ最悪のＥＣＯＧパフォーマンスステータスを示した。
【０３３７】
表３．薬物に関連した、治療中に発生した有害事象★(TEAE)
【表４２】
2018534340.tif 000062
【０３３８】
観察された副作用の例：
（ｉ）６２歳男性が、ＤＩ１７Ｅ６（２５０ｍｇ）の最初の点滴でかつそれのみを受けて１３日後にグレード１の上部消化管出血を経験した。この被験対象は非重篤な吐血をして入院した。胃鏡検査により、食道下部に病変が示された。活発な出血を遮断し、被験対象をオメプラゾールで処置して、この事象は解決した。
（ｉｉ）７９歳の患者が、ＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）（１０００ｍｇ）の最後の点滴の１日後で最初の点滴の９週間後に、フェカリス菌（e.faecalis）による敗血症（グレード２）を発症した。この患者は入院し、回復して退院した。１か月後、この患者は、最後の点滴の４日後で最初の点滴の２．５か月後に、フェカリス菌により、再び２回目の敗血症エピソード（グレード３）を発症した。この患者は入院し、回復して退院した。さらに１か月後、この患者は、最後の点滴の４日後で最初の点滴の３．５か月後に、ＥＭＤ ５２５７９７に起因する、３回目の敗血症エピソード（グレード３）を発症した。
【０３３９】
要約：
・蓄積した安全性データを４つのＳＭＣすべてで精査した。
・全体として、ＤＬＴは観察されなかった：ＤＬＴは、アレルギー性／過敏性反応および７日以内に可逆的で臨床相関のない任意の範囲外臨床検査値を除いて、研究者および／または治験依頼者により治験薬に関連すると合理的に疑われる、６週目の終わりまでに発生するグレード３または４の任意の血液毒性または非血液毒性として定義される。
・現在までＭＴＤに達してない
・全体として、２つのＳＡＥのみが、試験薬に関連するものとして観察された。
薬物動態および薬力学
単回投与および複数回投与の後、ＥＭＤ ５２５７９７は用量依存的で非線形のＰＫプロフィールを示した。最初の１時間静脈内点滴の後、投与開始後の１〜２時間以内に、ＤＩ１７Ｅ６（ＥＭＤ ５２５７９７）はＣmaxに概ね到達した。排出半減期は、用量と共に増加するＥＭＤ ５２５７９７クリアランスの結果として、用量と共に増加したが、平均分布容積は、用量範囲全体にわたり一定のままであった（表４）。
以下の表４に示されるように、コホート２のＣＲＰＣ患者への５００ｍｇ／隔週の投与では、ＩＣ９５の血清レベルに到達したが、２５０ｍｇ／隔週のコホート１の患者では、到達しなかった。５００ｍｇ／隔週のコホート２におけるＥＭＤ ５２５７９７の血清トラフ濃度は、ＩＣ95を上回り、非線形ＣＬ経路のＩＣ99に到達する（２５０ｍｇ／隔週は到達しなかった）。
【０３４０】
表４：
【表４３】
2018534340.tif 000063
ＡＵＣT’：１つの完全な投与間隔内の濃度時間曲線下面積；Ｃmax’：最大血清濃度、Ｃmin’：血清トラフ濃度；比＿ＡＵＣ：相対的な曲線下面積［ＡＵＣT（投与期間３）／ＡＵＣT（投与期間１）］；比＿Ｃmax’：相対的な最大血清濃度［Ｃmax（投与期間３）／Ｃmax（投与期間１）］；ｔmax’：Ｃmax’に到達する時間；Ｖss’：定常状態の見かけの分布容積。
【０３４１】
複数回投与の後、最大血清濃度および曝露は、１５００ｍｇでそれぞれ１．３３および１．７０の最大値（投与期間３／投与期間１）まで濃度依存的に累積した。
ほとんどの患者では、ＣＴＣ濃度はベースライン値周辺で安定なままであった（データを示さず）。２名の患者では、ＣＴＣ濃度の相当な減少が、治療の開始後それぞれ１４日目および４２日目ごろに観察された。
抗ＥＭＤ ５２５７９７抗体が、２５名（１６．０％）の評価可能患者のうちの４名に検出された。４名の患者すべてが２５０ｍｇコホートであった；２名の患者は２週間後に血清反応陰性の状態に戻り、１名の患者は経過観察を受けず、１名の患者は試験期間全体を通して血清反応陽性のままであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
2018534340.tif 000082
【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
2018534340.tif 000084
【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
2018534340.tif 000086
【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
2018534340.tif 000090
【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【国際調査報告】
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