(57)【要約】  好中球増加を介する大腸癌又は膵癌の治療に使用するための活性成分としてのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を提供する。このコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）から成る群から選択される。これら２つの組換えタンパク質は、最も高頻度の形態の癌のうちの２つに対する新しい治療選択肢になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、好中球増加を介する大腸癌又は膵癌の治療に使用するための活性成分としてのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）。
【請求項２】
前記ＣＳＦは単一の活性成分として投与される、請求項１に記載の使用のためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）。
【請求項３】
前記コロニー刺激因子は可溶性コロニー刺激因子タンパク質である、請求項１〜２のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）。
【請求項４】
前記ＣＳＦの投与は注射によるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）。
【請求項５】
好中球増加を誘発するのに使用される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための可溶性コロニー刺激因子（ＣＳＦ）タンパク質。
【請求項６】
前記大腸癌は大腸の腺癌である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項７】
前記膵癌は膵外分泌癌である。請求項１〜６のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項８】
前記コロニー刺激因子は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項９】
前記ＧＭ−ＣＳＦはサルグラモスチム又はモルグラモスチムである、請求項８に記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１０】
前記コロニー刺激因子は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１１】
前記Ｇ−ＣＳＦはフィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、又はリペグフィルグラスチムである、請求項１０に記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１２】
前記ＣＳＦの投与は１００〜１０００μｇ／日の用量である、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１３】
前記投与される用量は４〜１６週間の期間にわたって適用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１４】
前記投与は皮下に、経口的に、筋肉内に、又は静脈内に行われる、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１５】
前記投与は、Ｇ−ＣＳＦについては１００〜６００μｇ／日の用量であり、及びＧＭ−ＣＳＦについては２００〜８００μｇ／日の用量で、４〜１６週の期間にわたって行われる、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１６】
前記誘発された好中球増加は、１５，０００〜４５，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１７】
前記Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは併用化学抗悪性腫瘍療法として投与される、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１８】
Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭＣＳＦは、膵癌の治療のために、ゲムシタビン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、エルロチニブ、エベロリムス、マイトマイシンＣ、スニチニブ、又はそれらのいずれかの組合せからなる群から選択された化合物と別々に、同時に、又は逐次的に投与され、且つ前記化合物の投与は任意選択的に放射線治療と併用される、請求項１７に記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【請求項１９】
Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは、大腸癌の治療のために、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ジブ−アフリベルセプト、レゴラフェニブ、ラムシルマブ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される化合物と別々に、同時に、又は逐次的に投与され、且つ前記化合物の投与は任意選択的に放射線治療と併合される、請求項１７に記載の使用のためのコロニー刺激因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最も広く蔓延している形態の悪性腫瘍の２つ、即ち膵癌及び大腸癌の治療用の顆粒球コロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を提供する。これらの２つの組換えタンパク質の使用は、これら２つの疾患を診療所で治療するための新たな治療選択肢になる。
【背景技術】
【０００２】
癌は第一世界の主要な死因の１つである。過去の認識とは対照的に、癌は現在、中でも遺伝、感染症、及び生活習慣に関連する要因が突出している無数の変数によって引き起こされる、非常に多様な状態を包含する包括的な用語とみなされている。悪性腫瘍の発生につながり得る多数且つ多様な病理過程が存在するため、各々の種類の癌は特定の治療法には有利に反応するが、他の治療法にはそうではないことが、今では広く認識されている。驚くべきことに、同じ種類の癌であっても異なる患者では、注目される癌誘発突然変異の詳細なパターンに応じて、治療応答が異なり得る。更に驚くべきことに、同じ患者に由来する同じ腫瘍からの細胞もまた、それらのクローン起源に応じて、疾患修飾治療に対し異なる応答を示し得る。
【０００３】
あらゆる生物医学的進歩、並びに社会、公共機関、製薬業界及びバイオテクノロジー業界がこの疾病に取り組むために払ってきた努力にもかかわらず、多くの悪性腫瘍は依然として高い死亡率を有する。癌との闘いは勝利には程遠い。この疾病の不均質性は汎用治療法の開発を阻害するので、異なる形態のための特定の治療法を考案し、開発しなければならない。現在、新しい癌の生物学的治療法の開発に伴う総コストは、およそ１２億ドルであると推定される（非特許文献１）。しかし、過去数十年間に達成された大きな進歩にもかかわらず、ほとんどの場合、治療分子は癌性細胞に対し選択的ではなく、常に様々な毒性副作用が起きるので、使用されている治療法の大部分は重い負担を抱えている。
【０００４】
好中球数が異常に低下する好中球減少症は、化学療法に関連する最も重大且つ頻発する副作用の１つである。ほとんどの癌治療は細胞傷害性であり、一連の分子機構による癌性細胞分裂を阻害する。これにより癌細胞は迅速に分裂できなくなり、それは治療効果に戻る。しかし、体内で高い頻度で分裂する多くの正常な細胞株（上皮細胞又は白血球等）の分裂速度もまた非選択的治療によって損なわれ、それは重大な副作用につながる。好中球は通常、循環する白血球の中で最も大きい割合を占め、血液中に発見された細菌を破壊することによって、感染に対する一次防御として働く。従って、化学療法に関連する好中球減少症を有する癌患者は細菌により感染し易く、即座に治療を受けなければ、これらの状態は生命を脅かし命取りになるおそれがある。
【０００５】
細胞傷害性化学療法による好中球の欠乏を補うために、化学療法レジメンを受ける癌患者は同時に、一連の好中球増強治療を処置される。化学療法によって生じた好中球減少症の現在の標準治療は、２つの組換えタンパク質、即ち顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の使用に基づく。それらはどちらも好中球前駆体及び成熟好中球の生存、増殖、分化、及び機能を刺激し、こうして抗腫瘍療法の好中球欠乏特性を補償し、望ましくない感染を回避する。フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、サルグラモスチム、及びモルグラモスチム等、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの様々な類似体が、化学療法に関連する好中球減少症の治療のために承認されている。
【０００６】
上述した高額の開発コストに照らして、製薬業界は、摩耗による資源の全体的な無駄を削減する革新的な処方を模索している。これに関して、コストを抑制した新しい治療法を見出すための現在の傾向の１つは、薬剤再利用又はリプロファイリングと呼ばれてきたものである。この戦略は、既に開発された薬剤の新たな効能を見出すことに基づく。承認済みの薬剤は前臨床及び臨床段階で服用されてきたので、それらのＡＤＭＥ特性、バイオアベイラビリティ、及び毒性は許容できることが知られており、従って、これらの障害物に関連する障壁の大部分は原則的に問題ではない。従って、公知の安全な薬剤に、開発された目的の効能とは異なる第２の効能が見出された場合、当然、その開発は、実験的なインビボ又はヒトの試験が利用できない新たに発見された分子の場合よりずっと容易になるはずである、ということになる。
【０００７】
リプロファイリング戦略は、有機小分子であるかそれとも組換えタンパク質であるかに関わらず、任意の薬剤に使用することができる。癌の分野で再利用のために試験されているタンパク質の中で、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦは特に注目するに値する。それらは様々な癌の化学療法として試験され、様々な程度の成功を収めてきた。ＧＭ−ＣＳＦは、外科的切除術後にメラノーマ患者の長期療法として皮下投与された場合、治療効果を有することが証明された（非特許文献２）。また、前立腺癌の患者に治療効果があることが証明された（非特許文献３）。しかし、他の種類の悪性腫瘍では結果は期待外れであった。例えば、肉腫の治療における単剤療法としてのＧＭ−ＣＳＦの使用は、治療効果を示さなかった（非特許文献４）。
【０００８】
大腸癌の場合、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの役割は先行技術の多数の文献に見られる通り、有害であるように思われる。従って、ＧＭ−ＣＳＦはヒト大腸癌の疾患進行に関連付けられてきた（非特許文献５及び６）。同様に、Ｇ−ＣＳＦは大腸癌の侵襲性及び悪性度にも関連付けられてきた（非特許文献７〜９）。膵癌に関し、診療所におけるＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの潜在的役割はまだ決定されていない（非特許文献１０及び１１）。
【０００９】
大腸癌及び膵癌は発生率に関して上位１０位以内にあり、２０１２年の総死亡数はそれぞれ６９４，０００人及び３３０，０００人にのぼったため、且つ依然としてかなりのパーセンテージ又は症例数に予後不良を伴っているため、それらと戦うための新規の治療が非常に求められている。現在の薬局方の中でこれら２つの病気に対する新しい治療を見出すことが極めて望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７，ｖｏｌ．２５，ｐｐ．２０９−２１６
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１６１４−１６２１
【非特許文献３】Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００６，ｖｏｌ．１７５，ｐｐ．２０８７−２０９１
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，ｖｏｌ  １８，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２２１９
【非特許文献５】Ａｓｉａｎ  Ｐａｃ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．２００９，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１０２１−１０２４
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２００７，ｖｏｌ．３８０，ｐｐ．２０８−１２
【非特許文献７】Ｏｓａｋａ  Ｃｉｔｙ  Ｍｅｄ．Ｊ．２０１１，ｖｏｌ．５７，ｐｐ．７９−８４
【非特許文献８】Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１５ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１４７−５４
【非特許文献９】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２０１４，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１２１１−２０
【非特許文献１０】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２００７，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３０−４
【非特許文献１１】Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２００９，ｖｏｌ．４８，ｐｐ．６８７−９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明者らは驚いたことに、可溶性活性医薬成分として注射によって投与された外因性Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦが、大腸癌及び膵癌に強い化学療法効果を有すること、即ち、これら２つの承認済み組換えタンパク質薬剤が大腸癌及び膵癌における癌性細胞の進行を遅らせることができることを発見した。注目すべきは、効能がゲムシタビンのような現在使用されている化学療法による治療に匹敵することである。
【００１２】
好中球数の増加によってもたらされる大腸癌及び膵癌に対するＧ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの顕著な抗腫瘍活性は、（現在好中球減少症の治療に使用されている）これら２つの組換え薬剤を、これら２つの形態の癌に対する２つの新しい抗悪性腫瘍治療の選択肢として再利用するための道を開く。
【００１３】
患者における好中球増加を誘発するためのＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦいずれかの投与は、本書で請求する２種類の癌に対し顕著な治療効果を有することが認められる。特筆すべきは、この治療効果が、被検体が薬理学的に誘発された好中球減少症を有するか否かに関係しないことである。本発明は、いずれかの他の薬剤による患者の疾病の治療によって生じた好中球減少症であるか否かに関わらず、癌患者における好中球増加を誘発することに基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明の第１態様は、好中球数の増加を通して大腸癌又は膵癌を治療するための活性成分としてのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）であり、コロニー刺激因子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。
【００１５】
特筆すべきこととして、発明者らは、これら２つの悪性腫瘍の治療薬としてのそれらの多用途性を明確に示す本明細書に掲げる実験データにより、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦが種々の大腸癌及び膵癌のインビボモデルに有効であることを証明した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｐａｎｃ−１モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果。ヒト膵臓ＳＣ腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果が示されている。Ｐａｎｃ−１ＳＣ腫瘍を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスを１０μｇ／Ｋｇの用量でＧ−ＣＳＦの皮下注射により毎日処置する一方、全実験期間中、８０ｍｇ／Ｋｇの用量でＧＥを週２回腹腔内注射した。４８日間の処置に対する生理食塩水群（実線）、Ｇ−ＣＳＦ１０μｇ／Ｋｇ群（破線）、及びＧＥ８０ｍｇ／ｋｇ群（点線）の総腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥ）を示す。
【図２】ＭｉａＰａｃａモデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果。ヒト膵臓ＳＣ腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果を示す。ＭｉａＰａｃａ  ＳＣ腫瘍を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスを１０μｇ／ｋｇの用量でＧ−ＣＳＦの皮下注射により毎日処置する一方、全実験期間中、８０ｍｇ／Ｋｇの用量でＧＥを週２回腹腔内注射した。３７日間の処置に対する生理食塩水群（実線）、Ｇ−ＣＳＦ１０μｇ／ｋｇ群（破線）、及びＧＥ８０ｍｇ／ｋｇ群（点線）の総腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥ）を示す。
【図３】Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果。マウス膵臓ＳＣ腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果を示す。Ｐａｎｃ０２  ＳＣ腫瘍を担持するＣ５７ＢＪＬ６マウスを１００μｇ／ｋｇの用量でＧ−ＣＳＦの皮下注射により毎日処置した。２２日間の処置に対する生理食塩水群（実線）、Ｇ−ＣＳＦ１００μｇ／ｋｇ群（破線）の総腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥ）を示す。
【図４】Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果。マウス結腸直腸ＳＣ腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果を示す。結腸直腸ＳＣ腫瘍を担持するＢａｌｂＣマウスを１０μｇ／ｋｇの用量でＧ−ＣＳＦの皮下注射により毎日処置した。１８日間の処置に対する生理食塩水群（実線）及びＧ−ＣＳＦ１０μｇ／ｋｇ群（破線）の総腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥ）を示す。
【図５】Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおける腫瘍の顆粒球。５日間１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦにより処置されたＣｏｌｏｎ−２６腫瘍からフローサイトメトリにより分析した、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋トリプル陽性集団と定義される腫瘍の顆粒球レベルを示す。腫瘍由来の顆粒球細胞を陽性細胞の百分率±ＳＥとして示す。
【図６】Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果に対するセファデックスの影響。結腸直腸ＳＣ腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍効果を示す。セファデックス丘疹の有無に関わらず、Ｃｏｌｏｎ−２６ＳＣ腫瘍を担持するＢａｌｂＣマウスを、５０μｇ／ｋｇの用量でＧ−ＣＳＦの皮下注射により毎日処置した。１９日間の処置に対する生理食塩水群（丸印）、Ｇ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇ群（四角、ＩＴ５０と略記する）、セファデックス−生理食塩水群（三角形）、及びセファデックス＋Ｇ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇ群（×印、ＩＴ−セファデックスと略記する）の総腫瘍体積（ｍｍ３±ＳＥ）を示す。
【図７】健康な免疫適格マウス及び免疫不全マウスにおける末梢血顆粒球レベルに対するＧ−ＣＳＦの効果。Ｃ５７ＢＪＬ６におけるＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）、並びに胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスにおける１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの単回投与の皮下注射後の、健康なＣ５７ＢＪＬ６マウス及び胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスにおける末梢血顆粒球レベルを示す。様々な時点に血液試料を採取し、末梢血顆粒球レベルを顆粒球の総数（ＧＲＡ×１０∧９／Ｌ）として示す。
【図８】ＭｉａＰａｃａモデルにおける末梢血顆粒球レベルに対するＧ−ＣＳＦの効果。１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの皮下注射後のＭｉａＰａｃａ  ＳＣ腫瘍を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスにおける末梢血顆粒球レベルを示す。１．５時間に血液試料を採取し、末梢血顆粒球レベルを顆粒球の総数（ＧＲＡ×１０∧９／Ｌ）として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
理解を助けるために、以下の定義を含めておく。これらは明細書、請求の範囲、及び図面の全体に適用される。
【００１８】
本書で使用する用語「抗悪性腫瘍療法」とは、抗腫瘍活性医薬成分（ＡＰＩ）の投与に基づく治療、即ち、制御されない細胞増殖及び癌細胞の分裂を直接又は間接的に抑止、遅延、又は減速させる目的でＡＰＩが投与される治療のことである。
【００１９】
大腸癌又は膵癌の治療での使用に関連して言及する用語「好中球増加」とは、基本的に好中球の量を増加させることによって引き起こされる抗悪性腫瘍療法のことである。
【００２０】
本書で使用する用語「好中球」とは、哺乳動物において最も豊富な（最高７５％まで）タイプの白血球である好中性顆粒球のことであり、自然免疫系における中心的な部分である。それらは骨髄の幹細胞に由来する。好塩基球及び好酸球と共に、それらは多形核細胞ファミリー（ＰＭＮ）の一部を形成する。
【００２１】
本書で使用する用語「コロニー刺激因子」（ＣＳＦ）とは、造血細胞のタンパク質受容体に結合し、種々の細胞内信号伝達事象を誘発し、最終的に様々な造血細胞系統の増殖及び分化を導く一連の糖タンパク質のことである。ファミリーはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦから構成される。本発明でＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦのいずれかである）が使用される場合、野生型の哺乳動物糖タンパク質、特にヒト糖タンパク質のいずれか、及びこれらのタンパク質に由来し且つアミノ酸修飾を含むいずれかの活性医薬成分に関連する。これらのアミノ酸修飾は、組換え技術に基づくタンパク質の生成プロセス、ペグ化、及びグリコシル化によるアミノ酸付加を含む。
【００２２】
本書で使用する用語「可溶性コロニー刺激因子（ＣＳＦ）タンパク質」とは、単離された可溶性タンパク質の形で非経口的に投与されるＣＳＦのことである。このタンパク質は、患者に直接投与される場合、抗体のようないずれかの他の巨大分子又はいずれかの他の治療用タンパク質と共有結合されず、また可溶性ＣＳＦタンパク質をコードする核酸、ベクター、又はその他の形態で投与されるものでもない。
【００２３】
コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）又はＣ１７ｏｒｆ３３としても知られるタンパク質顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、骨髄による顆粒球の生成を刺激する四重らせん束構造の糖タンパク質である。それは、内皮細胞及びマクロファージによって生成され、２つの関連白血球集団、即ち顆粒球及び単球マクロファージの生成、分化、及び機能を制御する、サイトカインファミリーの一員である。ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質はＵｎｉｐｒｏｔデータベースにエントリＰ０９９１９により見出すことができる（バージョン１６９、最後の更新は２０１５年４月２９）。現在、ヒトＧ−ＣＳＦに非常によく似た幾つかの活性医薬成分、即ちフィルグラスチム、レノグラスチム、リペグフィルグラスチム、及びペグフィルグラスチムが存在する。フィルグラスチムは、大腸菌で産生される（且つ従って真核生物細胞によって発現される場合のようにグリコシル化しない）ので、細菌中での発現を可能にするためにＮ−末端メチオニン残基が付加されているという点で、天然タンパク質とは異なる。ペグフィルグラスチムは、低いクリアランスのため半減期が増大するフィルグラスチムのペグ化バージョンである。どちらのＡＰＩも現在、化学療法を受けている癌患者の化学療法関連好中球減少症の治療のために診療所で標準使用されている。
【００２４】
コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても知られるタンパク質顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、骨髄による顆粒球及びマクロファージの生成を刺激する四重らせん束構造の糖タンパク質である。それはサイトカインファミリーの一員であり、２つの関連白血球集団、即ち顆粒球及び単球マクロファージの生成、分化、及び機能を制御する。ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにエントリＰ０４１４１により見出すことができる（バージョン１６０、最後の更新は２０１５年５月２７日）。現在、ヒトＧＭ−ＣＳＦに基づく２つの活性医薬成分、即ちサルグラモスチム及びモルグラモスチムが存在する。それらは両方とも、化学療法を受けている癌患者の化学療法関連好中球減少症の治療に処方される。
【００２５】
本書で使用する用語「膵癌」は、外分泌腫瘍及び内分泌腫瘍の両方を指す。
【００２６】
本書で使用する用語「大腸癌」は、大腸又は直腸を起源とするいずれかの癌、特に腺癌だけでなく、大腸の消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、扁平上皮癌、神経内分泌癌、及び肉腫をも指す。
【００２７】
本書で使用する用語「好中球増加抗悪性腫瘍療法」は、基本的に好中球の数を増加させることによって効果がもたらされる抗悪性腫瘍療法を指す。
【００２８】
本書で使用する用語「好中球増加の誘発」は、いずれかの以前の治療又は同時治療によって誘発された好中球減少症があるか否かに関わらず、好中球数を標準レベル超に増大させ、やがてそれを持続させることを目標として、被検体又は患者に施される治療を指す。ヒト被検体における治療は、好中球数の６００％〜１０００％の増加を導くであろう。ヒト成人における好中球数は、約２，０００ｕ／マイクロリットル〜７，５００ｕ／マイクロリットルの間であるときに正常であるとみなされることを指摘しておきたい。「好中球増加の誘発」は、結果的に２０，０００ｕ／マイクロリットル〜４５，０００ｕ／マイクロリットルの間の好中球数をもたらすことができ、従って、それらの標準値と比較したときにその数は明らかに増加している。
【００２９】
本書で使用する用語「治療有効量」は、投与した場合に治療効果をもたらすのに充分であるＣＳＦの量を指す。本発明に従って投与される特定の用量は、言うまでもなく、投与されるＣＳＦ、投与の正確な経路、治療される特定の癌、レシピエント被検体、及び同様の考慮事項を含め、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。
【００３０】
上述の通り、本発明の第１態様は、好中球増加を介して大腸癌又は膵癌を治療するための活性成分としてのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）であり、コロニー刺激因子は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。
【００３１】
大腸癌又は膵癌の治療において好中球増加抗悪性腫瘍療法として使用するためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）であって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択されるコロニー刺激因子もまた本発明の一部とみなされる。
【００３２】
本発明は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の用途として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択されたコロニー刺激因子を、好中球増加を介して大腸癌又は膵癌を治療するための活性成分として含む薬剤の製造において再処方することができる。
【００３３】
本発明はまた、ヒトを含めそれを必要とする被検体に治療有効量のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を活性成分として投与するステップを含む、好中球増加を介して大腸癌又は膵癌を治療する方法として再処方することもでき、コロニー刺激因子は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は単一の活性成分として投与される。
【００３５】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は可溶性コロニー刺激因子タンパク質である。
【００３６】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の投与は注射による。
【００３７】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、コロニー刺激因子の使用は好中球増加を誘発するためである。
【００３８】
大腸癌又は膵癌の治療において抗悪性腫瘍療法として使用するためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）もまた、本発明の一部を形成する。
【００３９】
更に、大腸癌又は膵癌の治療において好中球増加抗悪性腫瘍療法として使用するためのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）もまた、本発明の一部を形成する。
【００４０】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、好中球増加は４〜２０週間持続する。
【００４１】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、好中球増加は８〜１６週間持続する。
【００４２】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、可溶性コロニー刺激因子（ＣＳＦ）タンパク質は好中球増加の誘発に使用される。
【００４３】
本発明の第１態様の特定の実施形態では、大腸癌は大腸の腺癌である。
【００４４】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、膵癌は膵外分泌癌である。
【００４５】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【００４６】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）はサルグラモスチム又はモルグラモスチムである。
【００４７】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦは哺乳動物及び特にヒトの組換えＧＭ−ＣＳＦである。
【００４８】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
【００４９】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）はフィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、及びリペグフィルグラスチムである。
【００５０】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは哺乳動物及び特にヒトの組換えＧ−ＣＳＦである。
【００５１】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は１００〜１０００μｇ／日の用量で投与される。
【００５２】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦについては１００〜５００μｇ／日の用量で投与される。且つＧＭ−ＣＳＦについては２００〜８００μｇ／日の用量で投与される。
【００５３】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は２９０〜３１０μｇ／日の用量で投与される。
【００５４】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は３００μｇ／日の用量で投与される。
【００５５】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、ＣＳＦは１〜５０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。
【００５６】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、ＣＳＦは５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、１５μｇ／ｋｇ／日、２０μｇ／ｋｇ／日、２５μｇ／ｋｇ／日、３０μｇ／ｋｇ／日、３５μｇ／ｋｇ／日、４０μｇ／ｋｇ／日、４５μｇ／ｋｇ／日、又は５０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。
【００５７】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は６〜１６週の期間にわたって投与される。
【００５８】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は一連のサイクルで断続的に投与され、サイクルは１〜５とすることができ、各投与サイクルには休止期間が組み入れられ、各休止期間は１〜１２週間であり、各投与サイクルは４〜１６週間である。
【００５９】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は２．５か月及び３．５か月の期間にわたって投与される。
【００６０】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は３か月の期間にわたって投与される。
【００６１】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は皮下に、経口的に、筋肉内に、又は静脈内に投与される。これは、投与経路が皮下投与、経口投与、筋肉内投与、及び静脈内投与から選択されることを意味する。
【００６２】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦについては１００〜５００μｇ／日の用量で、且つＧＭ−ＣＳＦについては２００〜８００μｇ／日の用量で、４〜１６週間にわたって皮下投与される。
【００６３】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は、１〜５０μｇ／ｋｇ／日の用量で４〜１６週間の期間にわたって皮下投与される。
【００６４】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は３００μｇ／日の用量で３か月の期間にわたって皮下投与される。
【００６５】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、誘発された好中球増加は１５，０００〜６０，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する。
【００６６】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、誘発された好中球増加は１５，０００〜５０，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する。
【００６７】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、誘発された好中球増加は１５，０００〜４５，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する。
【００６８】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、誘発された好中球増加は２０，０００〜４０，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する。
【００６９】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、誘発された好中球増加は２５，０００〜３５，０００ユニット／マイクロリットルの好中球数を有する。
【００７０】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は、単一の化学抗悪性腫瘍療法として、任意選択的に放射線治療と組み合わせて、投与される。
【００７１】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は併用化学抗悪性腫瘍療法として投与される。
【００７２】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、コロニー刺激因子は放射線治療と同時に、又は逐次的に投与される。
【００７３】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは、膵癌の治療のために、ゲムシタビン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、エルロチニブ、エベロリムス、マイトマイシンＣ、スニチニブ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択された化合物と別々に、同時に、又は逐次的に投与される。
【００７４】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは、膵癌の治療のために、ゲムシタビン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、エルロチニブ、エベロリムス、マイトマイシンＣ、スニチニブ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択された化合物と別々に、同時に、又は逐次的に投与され、前記化合物の投与は任意選択的に放射線治療と併用される。
【００７５】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは、大腸癌の治療のために、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ジブ−アフリベルセプト、レゴラフェニブ、ラムシルマブ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択された化合物と別々に、同時に、又は逐次的に、投与される。
【００７６】
本発明の第１態様の別の特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦは、大腸癌の治療のために、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ジブ−アフリベルセプト、レゴラフェニブ、ラムシルマブ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択された化合物と別々に、同時に、又は逐次的に投与され、前記化合物の投与は任意選択的に放射線治療と併用される。
【００７７】
本明細書及び請求の範囲全体を通して、語「〜を含む」及びこの語の変形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素、又はステップを排除することを意図するものではない。更に、語「〜を含む」及びその変形は用語「〜からなる」を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、明細書を検討することにより当業者には明瞭になり、あるいは本発明の実施によって学習することができる。以下の実施例は例証として提供するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。更に、本発明は、本明細書に記載する特定の好適な実施形態の全ての可能な組合せを網羅する。
【実施例】
【００７８】
Ａ）材料及び方法
細胞株
ヒト膵臓腺癌細胞株、Ｐａｎｃ−１及びＭｉａＰａｃａ細胞、並びにマウス膵臓腺癌細胞Ｐａｎｃ０２を膵癌有効性研究に使用した。マウス結腸直腸癌細胞株、Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を大腸癌有効性研究に使用した。全ての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位のペニシリン／ｍＬ、１００ｇのストレプトマイシン／ｍＬ、及び追加の２ｍＭグルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ベルギー国ベルビエ、Ｌｏｎｚａ）で規定通りに培養し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内に維持し、３〜４日毎に継体培養した。
【００７９】
マウスモデル及び腫瘍成長の研究
動物の処置は欧州共同体指令８６／６０９／ＥＥＣの指針に適合し、現地倫理委員会によって承認された。雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（６週齢、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ）を用いて、Ｐａｎｃ−１及びＭｉａＰａｃａ細胞株から皮下（ＳＣ）膵臓腫瘍を発生させた。免疫適格性モデル、Ｃ５７ＢＪＬ６雌マウス（６週齢、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ）及びＢａｌｂ／Ｃ（６週齢、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ）を用いて、それぞれＰａｎｃ０１及びＣｏｌｏｎ−２６細胞株からＳＣ腫瘍を発生させた。全ての細胞株をマウスの右側腹部に６×１０６／細胞／マウスの割合で注入した。全ての動物の体重を計測し、手動キャリパを用いて週３回腫瘍を測定した。Ａｔｔｉａ及びＷｅｉｓｓによって記載された方程式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．４×（大径×小径２）に従ってＳＣ腫瘍体積を算出した（Ａｔｔｉａ  ＭＡ，ｅｔ．ａｌ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９６６，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１７８７−１８００）。
【００８０】
膵癌モデルにおける抗腫瘍効果の研究
免疫不全マウス及び免疫適格マウスの様々な膵癌モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍能力を評価するために、ＳＣ腫瘍が９０〜１１０ｍｍ３の範囲の腫瘍体積に達したときに、処置を開始した。Ｇ−ＣＳＦ療法について、Ｐａｎｃ−１（図１）及びＭｉａＰａｃａ（図２）を有する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス並びにＰａｎｃ０２を有するＣ５７ＢＪＬ６マウス（図３）を無作為に生理食塩水群、Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム−アムジェン）群、及びゲムシタビン（ＧＥ）群に分割した。Ｇ−ＣＳＦ処置は全試験期間中毎日皮下に適用する一方、ＧＥ処置は全試験期間中週２回腹腔内に適用した。各処置に関する詳細をこの表に記載する。
【００８１】
【表１】
2018522030.tif 000002
【００８２】
大腸癌モデルにおける抗腫瘍効果の研究
マウス結腸直腸癌におけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍能力を評価するために、ＳＣ腫瘍が９０〜１１０ｍｍ３の範囲の腫瘍体積に達したときに、Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍を担持する免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃマウスを処置した。Ｇ−ＣＳＦ療法について、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを無作為に生理食塩水群及びＧ−ＣＳＦ群に分割した。Ｇ−ＣＳＦ処置（フィルグラスチム−アムジェン）は全実験期間中毎日皮下に適用した（図４）。実験５日目に、各処置の動物４匹を屠殺し、腫瘍を集めた。ＦＡＣＳによって顆粒球（ＧＲＡ）細胞を検出し、これらの細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇのマーカを分析した（図５）。各処置の詳細をこの表に記載する。
【００８３】
【表２】
2018522030.tif 000003
【００８４】
上述の通り、抗腫瘍の研究を実施し、腫瘍学的実験研究のための現地倫理指針によって指示された動物福祉の徴候及び症状に従って動物を屠殺した。
【００８５】
Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおけるセファデックスの影響
セファデックスを処置した免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃ腫瘍担持マウスで抗腫瘍実験を実施した。ＳＣ  Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍が９０〜１１０ｍｍ３の範囲の腫瘍体積に達したときに、セファデックス処置を開始し、１６％のセファデックス（セファデックスＧ−１５０、スェーデン国Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を０．５ｍＬマウスの左側腹部に皮下注射した。含まれる対照動物は生理食塩水群及びセファデックス群であった。この実験では、Ｇ−ＣＳＦ群に５０μｇ／ｋｇの用量を処置した（フィルグラスチム−アムジェン）。各群に４匹の動物が存在し、それらの生存を毎日監視した（図６）。このモデルでは、セファデックスは機能的顆粒球を血液からセファデックス丘疹内に分散させ、こうしてＧ−ＣＳＦの抗腫瘍活性を無効にした。
【００８６】
末梢血液像の評価
末梢血はマウスから日常的に入手可能な唯一の組織であり、様々な用量のＧ−ＣＳＦ（フィルグラスチム−アムジェン）を皮下注射した後の血球集団の挙動に関する情報を提供するために、末梢血液像についても評価した。ＥＤＴＡ入りバキュテイナ採血管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＣＢ３００）にヘパリン処置したシリンジにより右大腿動脈から採取した末梢血は即座に、血球分画自動分析器（ＡＢＡＣＵＳ  ＪＵＮＩＯＲ  ＶＥＴ）による分画血球計数（赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板（ＰＬＴ））及び血中ヘモグロビン濃度の測定を受けた。３〜５匹のマウスから各実験群のデータを得た。発明者らは特に、Ｇ−ＣＳＦの初回の皮下投与から１．５又は２、６、１０、及び２４時間後に決定された末梢血における顆粒球の分布に注目した。末梢血顆粒球レベルを健康なマウス（図７）及び腫瘍担持マウス（図８）で分析した。健康なＣ５７ＢＪＬ６マウスにＧ−ＣＳＦを１０μｇ／ｋｇ注射し、健康な胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに異なる用量、即ち０、１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを注射した（図７）。皮下ＭｉａＰａｃａ腫瘍を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを注射し、１．５時間後に血液を抽出した（図８）。
【００８７】
Ｂ）結果
ヒトの大腸癌及び膵癌に対するコロニー刺激因子の抗腫瘍効果を一連のインビボ試験により実験的に検証した（Ｇ−ＣＳＦ）。
【００８８】
Ｇ−ＣＳＦの抗腫瘍効果を評価する前に、発明者らは、健康な免疫適格マウス及び免疫不全マウスにおける末梢血顆粒球レベルに対するＧ−ＣＳＦの効果を分析した。健康な動物における様々な用量のＧ−ＣＳＦ（１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇ）の単回注射後に、発明者らは、両方の動物モデルにおける末梢血顆粒球が顕著に増加し、Ｇ−ＣＳＦ注射の６時間後に最大レベルに達することを観察した。Ｃ５７ＢＪＬ６マウスにおける用量が１０μｇ／ｋｇのときの顆粒球レベルの増加は、非処置動物と比較して２．５倍であった。他方、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスにおける顆粒球レベルの増加はＣ５７ＢＪＬ６マウスの場合と同様であった。Ｇ−ＣＳＦの用量が１０μｇ／ｋｇのとき、顆粒球レベルの増加は、非処置動物と比較して２．５倍であった一方、用量が２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇの場合の増加は、それぞれ３．５倍、３．７倍、及び３．５倍であり（図７）、２５μｇ／ｋｇより高い用量で生物学的飽和レベルに達したことが確認された。
【００８９】
Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム−アムジェン）の抗腫瘍活性を評価するために、発明者らは３つの膵腫瘍モデル、即ちＰａｎｃ−１、ＭｉａＰａｃａ、及びＰａｎｃ０２細胞からの異種移植の研究を利用し、それらについて腫瘍体積を測定することによって腫瘍の増殖を分析した。Ｐａｎｃ−１モデルの動物に、用量１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを毎日皮下注射し、且つゴールド標準治療として、４８日間の治療期間中、８０ｍｇ／Ｋｇのゲムシタビン（ＧＥ）を週２回皮下注射した。Ｇ−ＣＳＦの治療は腫瘍成長の強力な抑止を生じ、生理食塩水と比較して最高９０％までの腫瘍抑止に達し、ゲムシタビンにより同様の結果が得られた（図１）。更に、Ｐａｎｃ−１モデルと同一条件下で処置されたＭｉａＰａｃａ腫瘍は、治療から３７日後に腫瘍成長の顕著な抑止を示した（図２）。このモデルでは、腫瘍抑止能力は生理食塩水と比較して最高５５％に達した。このモデルでは、発明者らは、１０、２５、５０、及び１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの初回の皮下注射後に末梢血顆粒球レベルを分析したときに、用量応答的な増加を観察した（図８）。
【００９０】
Ｐａｎｃ０２モデルの動物に用量１００μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを、２０日の処置期間中、毎日皮下注射した。Ｇ−ＣＳＦによる処置は、このマウス腫瘍モデルのアグレッシブなプロファイル特性のため、他のヒト膵腫瘍モデル（Ｐａｎｃ−１及びＭｉａＰａｃａ等）と比較して低い抗腫瘍活性を生じた。処置の抑止能力は、生理食塩水と比較して約５０％の腫瘍抑止に達した（図３）。
【００９１】
大腸癌におけるＧ−ＣＳＦの治療上の可能性を決定するために、発明者らはマウス大腸癌モデルにおける抗腫瘍活性をも評価した。Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍を担持する免疫適格動物に、１８日の処置期間中、用量１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを毎日皮下注射した。Ｇ−ＣＳＦによる処置は、Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍を担持する免疫適格動物に、１９日の期間中、用量５０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを毎日皮下注射したときに、最高で６０％の腫瘍抑止（図４）及び最高で７０％の腫瘍抑止を達成した（図６）。Ｇ−ＣＳＦ後のＣｏｌｏｎ−２６腫瘍内への免疫細胞、主に好中球の浸潤を研究するために、発明者らはフローサイトメトリ研究を実施し、３つの抗原ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｇ、及びＣＤ１１ｂの発現を分析した。Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍で観察された抗腫瘍効果と一致して、１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの皮下注射は、このモデルで、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋トリプル陽性集団として定義される腫瘍湿潤顆粒球のかなりの増加を示した（図５）。Ｇ−ＣＳＦを長期間毎日使用することに関係する、研究対象の全ての腫瘍モデルにおける体重損失として表される、何らかの毒性の証拠が観察された。
【００９２】
Ｇ−ＣＳＦの効果は、好中球によって誘発される炎症促進反応に関係することを実証するために、発明者らは、セファデックスの１５％溶液を同時に注射することによる、Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおけるＧ−ＣＳＦの抗腫瘍能力に取り組んだ。セファデックスモデルは、主に好中球を刺激する治療反応における免疫系の意義を検証するための技術として、文献に幅広く記載されてきた（Ｊａｇａｎｊａｃ  Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．“Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｌｋｅｒ  ２５６  ｃａｒｃｉｎｏｍａ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００８，ｖｏｌ．２６０，ｐｐ．１８０−１８６）。この研究の目的は、Ｇ−ＣＳＦの抗腫瘍効果が主として免疫系の刺激によって支配されることを、間接的に実証することであった。事実、発明者らは高用量のセファデックスの単回皮下投与し、常に炎症の病巣を引き起こした（それによって、毎日のＧ−ＣＳＦの注射後に刺激されるものを含めて、免疫細胞を引き付ける、）。理論的に、腫瘍の成長に対するＧ−ＣＳＦの治療効果が部分的に免疫細胞の刺激によるものであった場合、結果的に、セファデックスの存在下ではＧ−ＣＳＦ処置動物の抗腫瘍効果が損なわれることになる。得られた結果は、この理論と一致し、癌治療でＧ−ＣＳＦが投与される場合に、免疫系の刺激が重要な役割を果たすことが実証された（図６）。Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍を担持する免疫適格動物に、１９日の期間中、用量５０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを毎日処置し、腫瘍抑止は７０％に達した一方で、Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍及びセファデックスを担持する免疫適格動物に、１９日の期間中、用量５０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを毎日処置し、腫瘍抑止は５０％に達した。さらに、セファデックスの皮下注射は末梢血の好中球レベルの低下を誘発したが、それはＧ−ＣＳＦの注射後に円滑に回復する。
【００９３】
要するに、これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦの毎日の皮下送達が、これらのモデルにおける腫瘍に顆粒球を特異的に動員することによって仲介される強力な抗腫瘍効果を膵臓及び大腸の腫瘍に誘発することを示している。
【００９４】
本願で引用した参考文献：
Ａｔｔｉａ  ＭＡ，Ｗｅｉｓｓ  ＤＷ．“Ｉｍｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９６６，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１７８７−１８００．
ＤｉＭａｓｉ  ＪＡ，Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ  ＨＧ．“Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７，ｖｏｌ．２５，ｐｐ．２０９−２１６
Ｓｐｉｔｌｅｒ  ＬＥ．，ｅｔ．ａｌ．“Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒａｎｙｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１６１４−１６２１
Ｒｉｎｉ  Ｂｌ，ｅｔ．ａｌ．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ”Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００６，ｖｏｌ．１７５，ｐｐ．２０８７−２０９１
Ｃａｒｓｏｎ  ＥＪ．，ｅｔ．ａｌ．“Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ（ｙｅａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＧＭ−ＣＳＦ）ａｓ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓａｒｃｏｍａｓ”Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，ｖｏｌ  １８，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２２１９
Ｄｅｍｉｒｃｉ，Ｕ．，ｅｔ．ａｌ．“Ｓｅｒｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ａ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ？，Ａｓｉａｎ  Ｐａｃ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．２００９，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１０２１−１０２４
Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．“Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｃａｓｅ．”Ｏｓａｋａ  Ｃｉｔｙ  Ｍｅｄ．Ｊ．２０１１，  ｖｏｌ．５７，ｐｐ．７９−８４
Ｊａｇａｎｊａｃ  Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．“Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｌｋｅｒ  ２５６  ｃａｒｃｉｎｏｍａ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００８，ｖｏｌ．２６０，ｐｐ．１８０−１８６
Ｍｒｏｃｚｋｏ  Ｂ．ｅｔ．ａｌ．“Ｓｅｒｕｍ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ”Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．２００７，ｖｏｌ．３８０，ｐｐ．２０８−１２．
Ｋｉｍ  ＪＳ．  ｅｔ．ａｌ．“Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−  ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ”Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１５，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１４７−５４
Ｍｏｒｒｉｓ  ＫＴ．ｅｔ．ａｌ．“Ｇ−ＣＳＦ  ａｎｄ  Ｇ−ＣＳＦＲ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１２１１−２０
Ｇｒｏｂｌｅｗｓｋａ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．“Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ）ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  （Ｍ−ＣＳＦ）ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２００７，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３０−４．
Ｊｏｓｈｉｔａ  Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．“Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｈｏｗｉｎｇ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｕｒｓｅ”Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２００９，ｖｏｌ．４８，ｐｐ．６８７−９１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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