(57)【要約】【課題】本発明は、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の転換活性が高められた、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体及びこれを用いたタガトースの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項２】
前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはトリプトファン（Ｗ）で置換され、
前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、
前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）またはアルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、
前記２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはバリン（Ｖ）で置換され、
前記３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換され、
前記３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されたことを特徴とする、請求項１に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項３】
前記Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、９７番スレオニン（Ｔ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、３３７番リシン（Ｋ）、３６６番アラニン（Ａ）、４０２番セリン（Ｓ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）、および４４０番チロシン（Ｙ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項１に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項４】
前記９７番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換され、
前記１２６番バリン（Ｖ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）で置換されて、
前記１４５番トリプトファン（Ｗ）は、アラニン（Ａ）で置換され、
前記１６３番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン（Ｑ）で置換され、
前記１６４番リシン（Ｋ）は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記１６６番プロリン（Ｐ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２４１番バリン（Ｖ）は、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）またはシステイン（Ｓ）で置換され、
前記２７６番スレオニン（Ｔ）は、グルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）で置換され、
前記３３７番リシン（Ｋ）は、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）で置換されて、
前記３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記４０２番セリン（Ｓ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記４２９番アスパラギン酸（Ｄ）は、プロリン（Ｐ）で置換され、
前記４４０番チロシン（Ｙ）は、アラニン（Ａ）で置換されたことを特徴とする、請求項３に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項５】
前記９７番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基がさらに変異されたＣ４−エピメラーゼ変異体は、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番アスパラギン酸（Ｄ）、および２３１番アスパラギン酸（Ｄ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項３に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項６】
前記１６４番リシン（Ｋ）は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記１６６番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されたことを特徴とする、請求項５に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項７】
前記１６３番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異されたＣ４−エピメラーゼ変異体は、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項３に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項８】
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されたことを特徴とする、請求項７に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項９】
前記３３７番リシン（Ｋ）のアミノ酸残基がさらに変異されたＣ４−エピメラーゼ変異体は、
１５７番グリシン（Ｇ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）および４４１番グリシン（Ｇ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項３に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項１０】
前記１５７番グリシン（Ｇ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記１６０番アラニン（Ａ）は、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記１６７番グルタミン酸（Ｅ）は、アラニン（Ａ）、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）で置換され、
前記１７７番フェニルアラニン（Ｆ）は、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｌ）で置換され、
前記２１８番グリシン（Ｇ）は、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記２９５番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記３０２番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）で置換され、
前記３６１番フェニルアラニン（Ｆ）は、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）で置換され、
前記４４１番グリシン（Ｇ）は、グルタミン酸（Ｅ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたことを特徴とする、請求項９に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を暗号化する核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含む、タガトース生産用の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、請求項１２に記載の形質転換体、または請求項１３に記載のＤ−タガトース生産用の組成物とＤ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を反応させて前記Ｄ−フルクトースをエピマー化（ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）する工程を備える、Ｄ−タガトースの製造方法。
【請求項１５】
前記エピマー化する工程は、金属塩が存在する条件で行われることを特徴とする、請求項１４に記載のＤ−タガトースの製造方法。
【請求項１６】
前記エピマー化する工程の前に、砂糖を酵素で加水分解してＤ−フルクトースを得る工程またはブドウ糖を酵素で異性化する工程をさらに備えることを特徴とする、請求項１４に記載のＤ−タガトースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転換活性が高められたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、及びこれを用いたＤ−タガトースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タガトースは、牛乳、チーズ、カカオなどの食品、リンゴやミカンなどの甘味の天然果実に少量だけ存在する天然甘味料であり、カロリーは砂糖の１／３程度の１．５ｋｃａｌ／ｇであり、ＧＩ（Ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｉｎｄｅｘ、血糖指数）は３であって砂糖の５％水準であるにもかかわらず、砂糖と同様の甘さを有し、様々な健康機能性がある。そのため、様々な製品に活用した場合、健康と味を同時に満足させる代替甘味料として利用できる。
【０００３】
従来知られているタガトースの生産方法は、ガラクトースを主原料とする化学的方法（触媒反応）と生物学的方法（異性化酵素反応）がある（韓国公開特許第２００９−００８２７７４号を参照）。しかし、ガラクトースの基礎原料となる乳糖は、国際市場での原乳と乳糖の生産量、需要と供給量などによって価格が不安定であり、タガトース生産における原料の安定的な需給には限界がある。したがって、通常の一般的な糖（砂糖、ブドウ糖、果糖など）を原料としてタガトースが製造できる新たな方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、転換活性が高められたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。具体的な様態として、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）と３８６番アルギニン（Ｒ）が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することができる。
【０００５】
本発明の他の目的は、前記ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を暗号化する核酸、前記核酸を含む形質転換体、または本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトース生産用の組成物を提供することである。
【０００６】
本発明のさらに他の目的は、前記ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、本発明の形質転換体、または本発明のタガトース生産用の組成物と、Ｄ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を反応させてエピマー化することを含む、Ｄ−タガトースの製造方法を提供することである。
【０００７】
以下、本発明に関してより詳細に説明する。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野または類似分野における熟練者なら十分に認識と類推できるため、その説明を省略する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的を達成するために、本発明の一様態では、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から９番ヒスチジン（Ｈ）、２１番チロシン（Ｙ）、６０番グルタミン酸（Ｅ）、６２番バリン（Ｖ）、６８番グルタミン酸（Ｅ）、７７番ロイシン（Ｌ）、９１番ロイシン（Ｌ）、９７番スレオニン（Ｔ）、１２５番セリン（Ｓ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４０番ロイシン（Ｌ）、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１４９番グルタミン（Ｑ）、１５７番グリシン（Ｇ）、１５８番アラニン（Ａ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、１７５番グルタミン酸（Ｅ）、１７６番グリシン（Ｇ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、１８５番セリン（Ｓ）、２０２番メチオニン（Ｍ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２２１番チロシン（Ｙ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２４２番チロシン（Ｙ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、２８４番バリン（Ｖ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、２９７番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）、３１６番ロイシン（Ｌ）、３３７番リシン（Ｋ）、３５１番プロリン（Ｐ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）、３８６番アルギニン（Ｒ）、３８８番イソロイシン（Ｉ）、４０２番セリン（Ｓ）、４０３番チロシン（Ｙ）、４１５番バリン（Ｖ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）、４４０番チロシン（Ｙ）と４４１番グリシン（Ｇ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する［下記の表２〜５参照］。
【０００９】
本発明の一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体である。
【００１０】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはトリプトファン（Ｗ）で置換できる。
【００１１】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は４０３番に位置の他に、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００１２】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、またはチロシン（Ｙ）で置換されることができる。
【００１３】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）、および３８６番アルギニン（Ｒ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００１４】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１８５番セリン（Ｓ）は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換されることができ；２６７番バリン（Ｖ）は、メチオニン（Ｍ）で置換されることができ；２６８番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換されることができ；２７２番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができ；３０６番トリプトファン（Ｗ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができ；３８６番アルギニン（Ｒ）は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができる。
【００１５】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、この時、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体はさらに１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、１７５番グルタミン酸（Ｅ）、２９７番アスパラギン（Ｎ）、および３８８番イソロイシン（Ｉ）がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で、１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で、２９７番アスパラギン（Ｎ）はリシン（Ｋ）で、３８８番イソロイシン（Ｉ）はバリン（Ｖ）で置換されることができる。
【００１６】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、２６７番バリン（Ｖ）と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのＣ４−エピメラーゼ変異体は、３５１番プロリン（Ｐ）がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換されることができる。
【００１７】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）及び３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、この時、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は６８番グルタミン酸（Ｅ）がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の６８番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で置換されることができる。
【００１８】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、および３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、６０番グルタミン酸（Ｅ）、２０２番メチオニン（Ｍ）、２２１番チロシン（Ｙ）および２４２番チロシン（Ｙ）アミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の６０番グルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で、２０２番メチオニン（Ｍ）はスレオニン（Ｔ）で、２２１番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で、２４２番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることができる。
【００１９】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）及び２７２番スレオニン（Ｔ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、９１番のロイシン（Ｌ）、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）及び１７６番グリシン（Ｇ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の９１番ロイシン（Ｌ）は、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）またはアスパラギン（Ｎ）で、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）はフェニルアラニン（Ｆ）で、１７６番グリシン（Ｇ）はヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）で置換されることができる。
【００２０】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）及び３０６番トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は２８４番バリン（Ｖ）及び４１５番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の２８４番バリン（Ｖ）はアラニン（Ａ）で、４１５番バリン（Ｖ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換されることができる。
【００２１】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸の他に、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）の２７２番スレオニン（Ｔ）及び３０６番トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１６６番プロリン（Ｐ）または２３１番アスパラギン酸（Ｄ）がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができる。
【００２２】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）及び３８６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は１２６番バリン（Ｖ）がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１２６番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｒ）またはスレオニン（Ｔ）で置換されることができる。
【００２３】
本発明の一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列で構成されるヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であることができる。
【００２４】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）と３８６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、９７番スレオニン（Ｔ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、３３７番リシン（Ｋ）、３６６番アラニン（Ａ）、４０２番セリン（Ｓ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）または４４０番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体はそれぞれ独立して、９７番スレオニン（Ｔ）はアラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換されることができ；１２６番バリン（Ｖ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）で置換されることができ；１４５番トリプトファン（Ｗ）は、アラニン（Ａ）で置換されることができ；１６３番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン（Ｑ）で置換されることができ；１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換されることができ；１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ；２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ；２４１番バリン（Ｖ）は、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）またはシステイン（Ｓ）で置換されることができ；２７６番スレオニン（Ｔ）は、グルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）で置換されることができ；３３７番リシン（Ｋ）は、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）で置換されることができ；３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、またはシステイン（Ｃ）で置換されることができ；４０２番セリン（Ｓ）はフェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）またはチロシン（Ｙ）で置換されることができ；４２９番アスパラギン酸（Ｄ）はプロリン（Ｐ）で置換されることができ；４４０番チロシン（Ｙ）はアラニン（Ａ）で置換されることができる。
【００２５】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３８６番トリプトファン（Ｗ）と９７番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基の他に１６４番リシン（Ｋ）、１６６番アスパラギン酸（Ｄ）または２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換されることができ；１６６番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ；２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができる。
【００２６】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３８６番トリプトファン（Ｗ）及び１６３番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基の他に、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができる。
【００２７】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３８６番トリプトファン（Ｗ）及び３３７番リシン（Ｋ）のアミノ酸残基の他に、１５７番グリシン（Ｇ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）または４４１番グリシン（Ｇ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１５７番グリシン（Ｇ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されることができ；１６０番アラニン（Ａ）は、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換されることができ；１６７番グルタミン酸（Ｅ）は、アラニン（Ａ）、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）で置換されることができ；１７７番フェニルアラニン（Ｆ）は、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｌ）で置換されることができ；２１８番グリシン（Ｇ）は、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはシステイン（Ｃ）で置換されることができ；２９５番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換されることができ；３０２番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）で置換されることができ；３６１番フェニルアラニン（Ｆ）は、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）で置換されることができ；３６６番アラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）で置換されることができ；４４１番グリシン（Ｇ）は、グルタミン酸（Ｅ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることができる。
【００２８】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、７７番ロイシン（Ｌ）、１５８番アラニン（Ａ）、またはこれらの組合せのアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の７７番ロイシン（Ｌ）は、プロリン（Ｐ）またはアルギニン（Ｒ）で、１５８番アラニン（Ａ）はスレオニン（Ｔ）で置換されることができる。４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、７７番ロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基と１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基が変異された 本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の３８６番アルギニン（Ｒ）は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができる。
【００２９】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１８５番目の他に、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００３０】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１８５番セリン（Ｓ）および１２５番セリン（Ｓ）の他に、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）又はこれらの組合せのアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２６７番バリン（Ｖ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）、またはこれらの組合せのアミノ酸残基がさらに変異されることができる。一実施例において、１８５番セリン（Ｓ）、１２５番セリン（Ｓ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、２６７番バリン（Ｖ）及び３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、３８６番アルギニン（Ｒ）がさらに変異されることができる。
【００３１】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体である。
【００３２】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基の他に、１２５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）及び２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）または３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ、３８６番アルギニン（Ｒ）は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができる。
【００３３】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２７２番スレオニン（Ｔ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）及び３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基の他に、９７番スレオニン（Ｔ）、１４９番グルタミン（Ｑ）、１６６番プロリン（Ｐ）または３５１番プロリン（Ｐ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の９７番スレオニン（Ｔ）はアラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換されることができ、１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ、１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ、３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換されることができる。
【００３４】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２７２番スレオニン（Ｔ）、１２５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）及び２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）および１７５番グルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換されることができ、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換されることができ、１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で置換されることができる。
【００３５】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から７７番ロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。
【００３６】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、７７番のロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基の他に、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００３７】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、ロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基の他に、１５８番アラニン（Ａ）または３５１番プロリン（Ｐ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１５８番アラニン（Ａ）は、スレオニン（Ｔ）で置換されることができ、３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、７７番のロイシン（Ｌ）、１２５番セリン（Ｓ）、および１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基の他に９番ヒスチジン（Ｈ）、６０番グルタミン酸（Ｅ）および４１５番バリン（Ｖ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の９番ヒスチジン（Ｈ）はチロシン（Ｙ）で置換されることができ、６０番グルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されることができ、４１５番バリン（Ｖ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換されることができる。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。
【００３９】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基の他に、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００４０】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１５８番アラニン（Ａ）と１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、１４９番グルタミン（Ｑ）、２６７番バリン（Ｖ）および３５１番プロリン（Ｐ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ、２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換されることができ、３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換されることができる。
【００４１】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から３５１番プロリン（Ｐ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。
【００４２】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、３５１番プロリン（Ｐ）のアミノ酸残基の他に１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。
【００４３】
一実施例における本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、３５１番プロリン（Ｐ）、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、これらのヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２１番チロシン（Ｙ）、６２番バリン（Ｖ）、１４９番グルタミン（Ｑ）及び３１６番ロイシン（Ｌ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の２１番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることができ、６２番バリン（Ｖ）はイソロイシン（Ｉ）で置換されることができ、１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換されることができ、３１６番ロイシン（Ｌ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることができる。
【００４４】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、および１７５番グルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。
【００４５】
一実施例において、本発明の１２５番セリン（Ｓ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、および１７５番グルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、１４０番ロイシン（Ｌ）、３８６番アルギニン（Ｒ）、２６８番セリン（Ｓ）、および２９７番アスパラギン（Ｎ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができる。本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体の１４０番ロイシン（Ｌ）はプロリン（Ｐ）で、３８６番アルギニン（Ｒ）はプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されることができ、２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で、２９７番アスパラギン（Ｎ）はリシン（Ｋ）で置換されることができる。
【００４６】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１４９番グルタミン（Ｑ）および２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基が変異されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体であり得る。
【００４７】
本発明の一実施例によれば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は野生型ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）から表２〜５に開示された変異アミノ酸残基位置及び置換されたアミノ酸残基から導出できるアミノ酸配列（例えば、配列番号３、表３のＭ１２５変異体）で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、またはこれらのアミノ酸配列を有する変異体と比較して５０％以上の遺伝的相同性を有し、一実施例では６０％、７０％、７５％、８０％の遺伝的相同性を有し、他の実施例では８５％、９０％、９５％の相同性を有し、さらに他の実施例では９７％または９９％の相同性を有するポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。
【００４８】
本発明における「相同性」という用語は、二つのポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）間の同一性の百分率を意味する。一方の部分から他方の部分までの配列間に相応性は周知の当該技術によって決定できる。例えば、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列して、相同性を決定することができる。また、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件でポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解し、分解された断片の長さを測定することで相同性を決定することができる。
【００４９】
本発明における「相同」という用語は、すべての文法的形態やスペリング変異形態は（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｌｌｉｎｇ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）、スーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）と他種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含み、「共通進化起源」を有するタンパク質との間の関係を意味する。これらのタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、高レベルの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。しかし、一般の使用と本発明における「相同」は「非常に高い」などの形容詞によって修飾される場合、配列の類似性を意味し、共通進化起源を意味することではない。
【００５０】
本発明における「配列類似性」という用語は、共通進化起源の共有には関係がなく、タンパク質の塩基配列やアミノ酸配列の間の同一性や相応性の程度を意味する。一実施例では、二つのアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さにおいて、ポリペプチドのマッチが少なくとも２１％（一実施例において少なくとも約５０％、他の実施例において約７５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％）であった場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同の配列は、データバンクで使用される標準ソフトウェアを使用して、例えば、特定システムのために定義された厳格な条件下で用いた混成化実験によって配列を比較することで確認することができる。定義された適切な混成化条件は、当該技術の範囲内に属する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、ｉｎｆｒａを参照）。
【００５１】
本発明に記述されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、Ｄ−フルクトースの４番炭素の位置をエピマー化してＤ−タガトースに転換してＣ４−エピマー化の活性単位が高められ、Ｄ−フルクトースからＤ−タガトースを生産することができる。
【００５２】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、高温性ロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、またはディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）属に属する高温性微生物のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したものであり得る。具体的にテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属微生物のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したもの、より具体的にテルモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはテルモトガマリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したものであり得る。
【００５３】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼは中温性の微生物（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）が生産する酵素と同一の機能を有しながら、極限反応（高温など）条件で安定した反応ができ、中温性の微生物による汚染防止、気質の溶解度が低い物質の溶解度の増加、反応速度の増加などの多くの利点があるため、中温性酵素を利用した産業的な欠点を克服することができる長所がある。
【００５４】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を発現するＤＮＡ（例えば、配列番号４）でＥ．ｃｏｌｉなどの菌株に形質転換させ、これを培養して培養物を得て前記培養物を破砕し、カラムなどを介して精製したものであり得る。前記形質転換用菌株として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などがある。
【００５５】
本発明の他の実施例によれば、本発明は本明細書に記載されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を暗号化する核酸、前記核酸を含む形質転換体、または本明細書に記載されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトース生産用の組成物が提供される。
【００５６】
他の実施例は、本明細書に記載されたＣ４−エピメラーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本発明における「ベクター」の用語は、有機体、例えば宿主細胞に塩基のクローニングおよび／または転移するため任意の媒体をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片を複製できる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得る。ここで、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち、自己制御によって複製が可能である任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。「ベクター」という用語は、試験管内、生体外または生体内で有機体、例えば、宿主細胞に塩基を導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒介物を含む。「ベクター」の用語にはミニサークルＤＮＡが含まれ得る。
【００５７】
本発明における「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包括的に含む意味であり、核酸の基本的な構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部分が変形された類似体も含まれる（参照文献：Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；  ＵｈｌｍａｎとＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０））。
【００５８】
本発明における「形質転換」という用語は、核酸断片が宿主生物のゲノムの中に移動して安定的に遺伝されることを言い、「形質転換体」は核酸がこのゲノムの中に移動して安定的に遺伝される有機体を言う。形質転換体は、例えば、原核細胞または真核細胞であり、具体的には、エンテロバクテリア科の微生物またはコリネ型微生物など、より具体的に、エスケリキア属の微生物、セラチア属の微生物などを挙げることができ、最も具体的には大腸菌である。
【００５９】
有機体内に形質転換する方法は、前記核酸を有機体に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野で公知された適切な標準技術を適切に選択して行うことができる。一例として、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、カルシウムホスフェート共沈殿（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法などがあるが、これらに限定されない。
【００６０】
ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトース生産用の組成物は、Ｄ−タガトース生産用の組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができる。これらの賦形剤として、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などがあるが、これらに限定されない。前記組成物内のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、組成物の固形重量を基準に０．１重量％〜７０重量％の範囲で含まれることができる。
【００６１】
本発明のさらに他の実施例は、本発明は本明細書に記載されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、本明細書に記載された形質転換体、または本明細書に記載されたタガトース生産用の組成物と、Ｄ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を反応させて前記Ｄ−フルクトースをエピマー化する工程を備えたＤ−タガトースの製造方法を提供する。
【００６２】
以下、本発明の様態によるＤ−タガトースの製造方法について説明する。
【００６３】
本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、これを暗号化する核酸を含む形質転換体、またはこれを含むＤ−タガトース生産用の組成物は、Ｄ−フルクトースと反応してＤ−フルクトースの４番目の炭素をエピマー化することができる。
【００６４】
単糖類は、一般的にアルドヘキソース（ａｌｄｏｈｅｘｏｓｅ）とケトヘキソース（ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅ）に大別される。本発明の原料であるＤ−フルクトースはケトヘキソースの一つであり、これを使用してＤ−タガトースを製造することができる。
【００６５】
前記Ｄ−フルクトースは、砂糖の加水分解により製造することと、ブドウ糖を異性化して製造することができる。これにより、フルクトース、砂糖とブドウ糖などの普遍化されて安価な原料を使用して高収率でタガトースを製造することができるため、タガトースの大量生産が可能になる。
【００６６】
本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程はｐＨ５〜８、他の実施例においてｐＨ６〜８で実施することができる。本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程は６０〜８５℃、他の実施例によると８０〜８５℃の範囲で実施することができる。前記ｐＨまたは温度条件で本発明の変異体酵素を処理した場合、比較的に高温で反応を進めることができるため、製造工程中の微生物汚染を最小限に抑えることを基質として使用される果糖の溶解度が増加することができ、酵素の反応速度及び転換率を極大化することができる。
【００６７】
また、本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程は、１０〜５０％（ｗ／ｖ）Ｄ−フルクトース濃度で実施することができる。一実施例によれば、前記Ｄ−フルクトース濃度は２０〜５０％（ｗ／ｖ）、他の実施例によると２０〜４０％（ｗ／ｖ）で実施することができる。本発明の変異体酵素は高濃度のＤ−フルクトースからＤ−タガトースを生産することができ、経済的かつ効率的にＤ−タガトースが生産できる利点がある。
【００６８】
前記本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程は、金属塩が存在する条件で実施することができる。一実施例における本発明の金属塩は、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４からなる群より選択される一つ以上であり、他の実施例ではＺｎＳＯ４を使用することができる。本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程が金属塩の存在条件で行われることで、転換活性が高まる効果を得ることができる。
【００６９】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程の前に砂糖を加水分解してＤ−フルクトースを得る工程をさらに備えることができる。前記加水分解に使用される酵素は、β−フルクトフラノシダーゼ、インベルターゼ、サッカラーゼなどを含むβ−Ｄ−フルクトシダーゼ；スクラーゼ、α−グルコシダーゼとα−Ｄ−グルコヒドロラーゼからなる群より選択された一つ以上であるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程の前に、ブドウ糖を異性化してＤ−フルクトースを得る工程をさらに備えることができる。前記異性化酵素は、グルコースイソメラーゼまたはホスホグルコイソメラーゼであるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程の後に、エピマー化反応物を得る工程をさらに備えることができる。
【００７２】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明のエピマー化反応物を得る工程の後に、得られたエピマー化反応物を精製する工程をさらに備えることができる。
【００７３】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明のエピマー化反応物を精製する工程の後に、前記精製されたエピマー化反応物を結晶化する工程をさらに備えることができる。
【００７４】
前記エピマー化反応物を精製する方法は、特に制限されず、本発明の技術分野における通常の方法を使用することができる。非限定的な例として、クロマトグラフィー、分別結晶およびイオン精製などを挙げることができる。前記精製方法は１つだけ実施することと、二つ以上の方法を並行こともできる。例えば、クロマトグラフィーを介してエピマー化反応物を精製することができ、前記クロマトグラフィーによる糖の分離は分離しようとする糖とイオン樹脂に付着した金属イオンとの間の弱い結合力の差を利用して行うことができる。
【００７５】
また、本発明は、本発明の精製工程の前または後に脱色、脱塩、またはその両方を実施することをさらに備えることができる。前記脱色および／または脱塩を行うことにより、不純物のないより精製されたエピマー化反応物を得ることができる。
【００７６】
前記精製されたエピマー化反応物は、濃縮後にＳＭＢクロマトグラフィー工程を介して純粋なタガトース液を得た後に結晶化する工程を行うことができる。
【００７７】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明の結晶化する工程の前に前記分離収得したタガトース液を濃縮する工程をさらに備えることができる。前記濃縮は、精製されたタガトース反応物の濃度を約２．５〜３倍に濃縮したものであり、前記の濃縮する工程を介してより効率的に結晶化することができる。
【００７８】
結晶化する方法は、特に限定されず、通常使用される結晶化方法を使用することができる。例えば、冷却結晶化方法を用いた結晶化方法を使用することができる。前記結晶化工程を介して最終的に精製されたＤ−タガトースを高収率で得ることができる。
【００７９】
本発明の一実施例によれば、本発明の製造方法は、本発明の精製工程の後に未反応のＤ−フルクトースをエピマー化する工程に再利用したり、本発明の結晶化工程後に結晶が分離された母液を前記精製工程に再利用したり、またはこれらの両方を実施する工程をさらに備えることができる。前記工程によってＤ−タガトースをさらに高収率で得ることと廃棄されるＤ−フルクトースの量を低減することができるため、経済的に利点がある。
【００８０】
本明細書で前記用語「ｎ番目の炭素」とは、ＩＵＰＡＣで規定による炭素番号をつける規則に基づいて決定された炭素を意味し、これはＣｎで表現することができる。このとき、ｎは１以上の整数をいう。例えば、「４番目炭素でエピマー化」されることを「Ｃ４−エピマー化」で表すことができる。
【００８１】
本明細書で配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端からｎ番目のアミノ酸残基（Ｘ）は、ｎＸで簡単に表すことができる。
【００８２】
また、本発明で変異されるアミノ酸残基で置換されるアミノ酸に関する言及がない場合は、本明細書の他の部分で言及された該当位置のアミノ酸残基における置換可能なアミノ酸を考慮することができる。
【００８３】
本明細書におけるアミノ酸は以下の略語で表記することができる。
【００８４】
【表１】
2018521653.tif 000002
【発明の効果】
【００８５】
本発明は、Ｄ−フルクトースの４番目炭素をエピマー化してＤ−タガトースへの転換活性が高められたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）変異体を製造して利用することで、普遍化した原料あるＤ−フルクトースを使用してＤ−タガトースを効率的に大量生産することができる。また、製造費用が低減されて経済的かつ高収率でＤ−タガトースを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明の例示であり、本発明の内容をこれらによって限定解釈してはいけない。
【００８７】
実施例
【００８８】
実施例１．改良ターゲット部位の設計と解析
【００８９】
テルモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（以下、野生型という）のアミノ酸と相同性を有する相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ、他の微生物種で同一機能を有すると予測される相同遺伝子）の活性部位の３次構造モデル分析に基づいて、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を１次選定し、これらのアラニンスキャニング突然変異（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）分析後、再設計された（ｒｅｆｉｎｉｎｇ）活性部位の構造とＤ−フルクトースの間のドッキングモデル分析の結果に基づいて、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために改良ターゲット部位を設計した。以下、これを詳細に説明する。
【００９０】
１−１．相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）分析
【００９１】
野生型のアミノ酸配列（配列番号１）と相同性を有する相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースを利用して選別し［配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）８０％と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）５０％以上の相同遺伝子を約６０本］、選別した相同遺伝子のアミノ酸配列間の多重配列アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析により、野生型のアミノ酸配列において機能的に重要であると予測されるアミノ酸残基を同定した。
【００９２】
１−２．酵素３次構造モデルの分析
【００９３】
タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）のデータベース内に、野生型および相同遺伝子と３０％以上のアミノ酸配列の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示すタンパク質の構造がなく、ホモロジーモデリング方法による野生型の３次構造モデル予測の精度が低いと予想されるため、様々なモデリングサーバー（ＲａｐｔｏｒＸ、Ｒｏｂｅｔｔａ、ＭｏｄＷｅｂ、Ｍ４Ｔ、ＨＨｐｒｅｄ、ＰＨＹＲＥ２、ＩＴＡＳＳＥＲとＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）を介して得られた３次構造モデルの間の活性部位を比較・分析し、同一であると予測される構造部位に関する情報を得た。
【００９４】
１−３．アラニンスキャニング変異とドッキング分析
【００９５】
上述した相同遺伝子間のアミノ酸配列の分析と活性部位の３次構造モデルの分析に基づいて選定されたアミノ酸をアラニンに置換変異して、これらの組換え変異酵素を大腸菌で生産した後、各変異部位の特性を分析した。前記アラニンスキャニング突然変異分析の後、再設計された活性部位の構造とＤ−フルクトース間のドッキングシミュレーションを介して、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を選別してＤ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために、改良ターゲット部位を設計した。アラニンスキャン変異を介して活性が完全に消失するアミノ酸部位［触媒金属イオン結合残基と脱プロトン化／プロトン化（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）に関与する触媒残基であると推定］は、活性を改良するためのターゲット部位から排除した。
【００９６】
実施例２．変異酵素の生産と活性が改良された変異酵素の選別
【００９７】
実施例１で設計したターゲット部位（野生型ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から９、２１、６０、６２、６８、７７、９１、９７、１２５、１２６、１４０、１４１、１４５、１４９、１５７、１５８、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１６８、１７５、１７６、１７７、１８５、２０２、２１８、２２１、２３１、２４１、２４２、２６７、２６８、２７２、２７６、２８４、２９５、２９７、３０２、３０６、３１６、３３７、３５１、３６１、３６６、３８６、３８８、４０２、４０３、４１５、４２９、４４０、および４４１番のアミノ酸残基）の５４カ所の一部位飽和突然変異ライブラリー（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｔｅ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙ）を作製し、活性単位が改良される変異部位とアミノ酸をスクリーニング選別した。選抜された改良部位の情報を統合して複数の変異酵素を作製した後、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位が高められた変異酵素を開発した。
【００９８】
２−１．飽和突然変異（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
【００９９】
野生型酵素遺伝子の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現のために製作された組換えベクター（ｐＥＴ２１ａのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位に野生型を導入し、野生型のＣ−末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇが結合した組換え酵素を発現）を変異株ライブラリー作製用の飽和突然変異誘発法のテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いた。変異分布の多様性および変異体の収率などを考慮して、逆（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）ＰＣＲベースの飽和突然変異誘発法を使用し（２０１４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４９：９０−９８）、製作された変異株ライブラリーのスクリーニング規模を最小限に抑えるため（飽和突然変異時に導入されるコドンの数を最小限に抑えること）、終止コドンを排除し、大腸菌のレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎｓ）が最小化されたＮＤＴ、ＶＭＡ、ＡＴＧとＴＧＧの混合プライマーを（２０１２  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５２：１４９−１５８）を設計して使用した。詳細には、各々の変異部位の上流塩基１５ｂｐと変異部位を置換する塩基３ｂｐ（各々ＮＤＴ、ＶＭＡ、ＡＴＧとＴＧＧ）、下流塩基１５ｂｐで全長は３３ｂｐにして、混合プライマーを製作して使用した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１０分間の伸長を３０回繰り返した後、７２℃で６０分間伸長反応を行った。変異部位別の飽和突然変異ライブラリーを作製した後、ライブラリー別の変異株をランダム選抜＜変異１１個＞して塩基配列を分析して、アミノ酸変異の分布を評価した。この分析結果に基づいて、ライブラリー別配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）９０％以上のスクリーニング規模を設定した（２００３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５；３１：ｅ３０）。
【０１００】
２−２．活性改良変異酵素のスクリーニングと、複数の変異酵素の製作
【０１０１】
製作された飽和突然変異ライブラリーから活性改良の変異酵素を大量で高速スクリーニングするために、Ｄ−フルクトースを特異的に定量化できる発色測定法を用いた。詳細には、７０％のフォリン−チオカルトー溶液（ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ  ｒｅａｇｅｎｔ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）と基質反応完了液を１５：１の割合で混合した後、８０℃で５分間反応し９００ｎｍで測定してＯＤ値で比較分析した。
【０１０２】
野生型酵素（配列番号１）と相対活性を比較して活性（Ｄ−フルクトース転換・Ｄ−タガトース生成）が増加した変異部位５４か所の変異体を１次選抜し、該当遺伝子は塩基配列分析してアミノ酸変異情報を分析した（表２〜表５）。
【０１０３】
前記１次選抜された変異酵素は、精製（Ｈｉｓ−ｔａｇ親和クロマトグラフィ）酵素液を用いてフルクトースと反応させた後、反応産物をＨＰＬＣ分析法（カラムＳｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＰ−Ｇ、カラム分析温度８０℃、移動相Ｈ２Ｏ、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ検出器）を用いて、野生型酵素に比べＤ−フルクトース転換・Ｄ−タガトース生成活性が増加した変異株２２２種を最終選抜した。
【０１０４】
実施例３．活性改良の変異酵素に対する特性の比較と評価
【０１０５】
単位活性が改良された単一部位の変異酵素と、これらを組み合わせた多重部位の変異酵素に対して、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化の相対活性を評価するために、各酵素を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて精製し（Ｈｉｓ−ｔａｇ親和クロマトグラフィー）、各酵素を１０ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で３０％（ｗ／ｖ）のＤ−フルクトース基質に添加した後、ｐＨ７．０［５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液］と６０℃で２時間反応させテルモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来の野生型組換え酵素（野生型、配列番号１）と比較して、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化の相対活性を測定した。
【０１０６】
【表２】
2018521653.tif 000003
【０１０７】
【表３】
2018521653.tif 000004
【０１０８】
【表４】
2018521653.tif 000005
【０１０９】
【表５】
2018521653.tif 000006
【０１１０】
前記の結果から、本発明のＣ４−エピメラーゼ変異体がＤ−フルクトースＣ４−エピマー化活性が野生型酵素より増加したことを確認することができ、特にＭ１８４の酵素変異体は活性単位が約２０倍増加したことと分析され、野生型酵素に比べてタガトースの製造活性が著しく増加することを確認できる。
【０１１１】
2018521653.tif 000007
【配列表】
2018521653000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月30日(2018.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項２】
前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはトリプトファン（Ｗ）で置換され、
前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、
前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）またはアルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、
前記２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはバリン（Ｖ）で置換され、
前記３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換され、
前記３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されたことを特徴とする、請求項１に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、９７番スレオニン（Ｔ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、３３７番リシン（Ｋ）、３６６番アラニン（Ａ）、４０２番セリン（Ｓ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）、および４４０番チロシン（Ｙ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項４】
前記９７番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換され、
前記１２６番バリン（Ｖ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）で置換されて、
前記１４５番トリプトファン（Ｗ）は、アラニン（Ａ）で置換され、
前記１６３番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン（Ｑ）で置換され、
前記１６４番リシン（Ｋ）は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記１６６番プロリン（Ｐ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２４１番バリン（Ｖ）は、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）またはシステイン（Ｓ）で置換され、
前記２７６番スレオニン（Ｔ）は、グルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）で置換され、
前記３３７番リシン（Ｋ）は、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）で置換されて、
前記３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記４０２番セリン（Ｓ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記４２９番アスパラギン酸（Ｄ）は、プロリン（Ｐ）で置換され、
前記４４０番チロシン（Ｙ）は、アラニン（Ａ）で置換されたことを特徴とする、請求項３に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、９７番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、および２３１番アスパラギン酸（Ｄ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項６】
前記１６４番リシン（Ｋ）は、メチオニン（Ｍ）で置換され、
前記１６６番プロリン（Ｐ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されたことを特徴とする、請求項５に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、１６３番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項８】
前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されたことを特徴とする、請求項７に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基と３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、３３７番リシン（Ｋ）のアミノ酸残基が変異され、さらに、１５７番グリシン（Ｇ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）および４４１番グリシン（Ｇ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項１０】
前記１５７番グリシン（Ｇ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、
前記１６０番アラニン（Ａ）は、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記１６７番グルタミン酸（Ｅ）は、アラニン（Ａ）、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）で置換され、
前記１７７番フェニルアラニン（Ｆ）は、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｌ）で置換され、
前記２１８番グリシン（Ｇ）は、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記２９５番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、
前記３０２番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）で置換され、
前記３６１番フェニルアラニン（Ｆ）は、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）で置換され、
前記３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）で置換され、
前記４４１番グリシン（Ｇ）は、グルタミン酸（Ｅ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたことを特徴とする、請求項９に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を暗号化する核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含む、タガトース生産用の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、請求項１２に記載の形質転換体、または請求項１３に記載のＤ−タガトース生産用の組成物とＤ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を反応させて前記Ｄ−フルクトースをエピマー化（ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）する工程を備える、Ｄ−タガトースの製造方法。
【請求項１５】
前記エピマー化する工程は、金属塩が存在する条件で行われることを特徴とする、請求項１４に記載のＤ−タガトースの製造方法。
【請求項１６】
前記エピマー化する工程の前に、砂糖を酵素で加水分解してＤ−フルクトースを得る工程またはブドウ糖を酵素で異性化する工程をさらに備えることを特徴とする、請求項１４に記載のＤ−タガトースの製造方法。
【国際調査報告】
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