(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞；その製造方法、並びにラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の、分析的な、定性的かつ定量的な決定のための方法に関する。
2018502557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞の試料中のインタクトな細胞膜を有する死細胞の数を計数するための方法であって：
−段階希釈により、１０５から１０７細胞／ｍｌの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を含有する試料を調製すること；
−試料に第一試薬チアゾールオレンジおよび第二試薬ヨウ化プロピジウムを加えて、溶液を得ること；
−溶液にアジ化ナトリウム中の蛍光微粒子の懸濁液を加えて、試験試料を得ること；
−試験試料をフローサイトフルオロメトリーによる生細胞および死細胞を含む総細胞の計数並びに死細胞だけの計数に供すること；
−間欠滅菌された試料中に存在する死細胞を計数すること、
を含む、方法。
【請求項２】
０．５ｍｌの、１０５から１０７細胞／ｍｌの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を含有する試料に、２．５マイクロリットルの第一試薬および１．５マイクロリットルの第二試薬が加えられ、溶液を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アジ化ナトリウム中の蛍光微粒子の懸濁液がポリスチレン微粒子を含み、好ましくはビーズ懸濁液が、アジ化ナトリウム０．１％溶液中の蛍光ポリスチレン微粒子の懸濁液である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１０から１００μｌ、好ましくは４０から６０μｌが含まれる、既知の量のビーズが加えられ、細胞数の決定を可能にする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インタクトな細胞壁を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を製造するための方法であって、：
−１ｘ１０６から１ｘ１０１０ＵＦＣ／ｇの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞培養物を調製すること；
−培養物を、間欠滅菌プロセスに供して、間欠滅菌されたバクテリア細胞の培養物を得ること；
−請求項１−４のいずれか一項に記載の計数方法を適用すること、
を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られる、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の培養物。
【請求項７】
ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞の試料中のインタクトな細胞膜を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌された、死んだバクテリア細胞の数を計数するためのフローサイトフルオロメトリーの使用。
【請求項８】
インタクトな細胞膜を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、死んだバクテリア細胞が、請求項１−４のいずれか一項に記載の方法により計数される、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞；その製造方法、並びにラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の、定性的かつ定量的な決定のための分析的な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間欠滅菌された胞子または細菌を製造するための技術がよく知られている。間欠滅菌は分割滅菌法であり、８０−１００℃の温度で３０分間加熱することがバッチモードで適用される。増殖型を死滅させる第一の熱処理に続いて、２４時間のインキュベーション時間が続き、胞子発芽を促進する。そのように処置された物質は、３０分間８０−１００℃の温度に戻され、胞子発芽に由来する増殖細胞を死滅させる。これらの手順は、２または３回、繰り返されるべきである。間欠滅菌は、高温に耐えられない物質、例えば胞子または乳酸菌などについて使用される。
【０００３】
間欠滅菌されたバクテリア細胞は、不活性化された複製能力および不活性化された酵素の能力を有するものである。しかしながら、間欠滅菌された細胞は、未改変の細胞構造および細胞壁を維持する。従って、間欠滅菌されたバクテリア細胞は、それらの活性の観点から、生理学的にインタクトな細胞と規定され、この理由から、それらは免疫学的に活性である。これは、間欠滅菌されたインタクトな細胞が、ＧＡＬＴに対するそれらの特定の免疫賦活性を維持することを示唆する。
【０００４】
ＧＡＬＴとしても知られている腸管関連リンパ組織は、通常、消化管レベルで存在する免疫系の部分を意味する。ＧＡＬＴは、粘膜関連リンパ組織の一例であり、第一次反応および第二次反応の両方において、病原体攻撃に対する粘膜の保護を担う。実際、胃腸系は外部環境との通信経路を代表しており、かつ主として潜在的に病原性の微生物が存在し（特に腸）、これにより、このような集団の制御を確保するための粘膜レベルで免疫系の強力な存在が必要とされている。
【０００５】
最も研究された乳酸菌株の中には間違いなく、その免疫刺激性／活性が非常に優れているため、ヒトおよび小児使用のために多くの製剤に効果的に使用されているラクトバチルス・ラムノサスＧＧ  ＡＴＣＣ  ５３１０３がある。しかしながら、これまで、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を含有する製剤は存在しなかった。これは、とりわけ、現在までバクテリア細胞の試料中に存在している間欠滅菌され、インタクトな細胞の正確な数を決定する可能性はないという事実のためである。
【０００６】
従って、迅速で、信頼性があり、かつ完全に再現可能な分析方法により、試料中に存在するインタクトかつ免疫学的に活性な細胞を有する間欠滅菌されたバクテリア細胞（未改変の細胞壁を有する細胞）の正確な数を決定できることは非常に有用である。さらに、投与を容易にし、使用される用量の再現性を確実にし、暖かな国へラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞の輸送をできる３０℃の温度でさえも貯蔵寿命を延ばし、かつ最終製品（製剤）へのバクテリア細胞の処理を容易にするために、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性な細胞の決定された数が、試験された間欠滅菌された試料中に実際に存在する数に対応することを確実にできることが重要でもあるだろう。
【０００７】
しかしながら、迅速で、正確で、信頼性があり、かつ完全に再現可能な方法で決定された細胞数を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の培養物を製造するための方法は、現在利用できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の培養物を製造するための方法が依然として必要であり；培養物は、正確で、信頼性があり、かつ完全に再現可能な細胞数を有する。さらに、未改変の細胞壁を有して、免疫系の細胞の固有の能力を維持するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のインタクトなバクテリア細胞のみを、迅速で、正確で、信頼性があり、かつ完全に再現可能な方法で計数することを可能にする分析方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されるようにラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の培養物であって；培養物は、間欠滅菌されたバクテリア細胞の、正確で、信頼性があり、かつ完全に再現可能な濃度値を有する。
【００１０】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されるように、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の製造方法であって；方法は、迅速で、正確で、信頼性があり、かつ完全に再現可能である。
【００１１】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されるように、前もって調製され、かつその後間欠滅菌に供されたラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞培養物中に存在する、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の定性的かつ定量的な決定のための分析的な方法である。
【００１２】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されるように、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞の試料中に存在する、インタクトであるが死んでいる細胞を計数するためのフローサイトフルオロメトリーの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＦＳＣ対ＳＳＣサイトグラムに関する。
【図２】図２は、ＦＬ１対ＦＬ３サイトグラムに関する。
【図３】図３は、試料のＦＳＣ対ＳＳＣサイトグラムに関する。
【図４】図４は、試料のＦＬ１対ＦＬ３サイトグラムに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書において以下に記述される。
【００１５】
本発明は、第一に、例えば１ｘ１０６から１ｘ１０１０ＵＦＣ／ｇ、好ましくは１ｘ１０７から１ｘ１０９ＵＦＣ／ｇの濃度を有する乾燥、脱水または凍結乾燥培養物などの固体形態における、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞培養物の調製を企図する。培養物は、当業者に知られた技術および装置により調製される。バクテリア細胞培養物が調製されると、これは、当業者に知られた技術に従い間欠滅菌プロセスに供され、間欠滅菌されたバクテリア細胞の培養物が得られる。
【００１６】
次に、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞を定量化するために、出願人はラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（５３１０３）について効果的に適用され、かつ細胞蛍光測定の使用に基づく、間欠滅菌されたバクテリア細胞の定性的かつ定量的な決定のための、革新的な分析的計数方法を開発した。
【００１７】
出願人は、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトなバクテリア細胞の試料にフローサイトフルオロメトリーを適用し、当該試料は、間欠滅菌についての知られた技術および装置により得られる。
【００１８】
クレームされた方法は、当業者に知られた技術および装置によるそれらの調製の際に、それらの複製能力およびそれらの酵素の能力を失活させる、当業者に知られた技術および装置で行われる間欠滅菌プロセスに供されるラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞の迅速かつ正確な計算に有用である。
【００１９】
伝統的な計数方法は、間欠滅菌された生体試料中に存在するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の死んだバクテリア細胞を定量化することができず、かつ同時に十分に確立され、かつ再現可能な生物学的活性（免疫系の刺激および／または生物活性ペプチド）を有するバクテリア細胞の試料を確実にすることができないので、当該方法は出願人により開発された。有利には、この手順は、複製できないが、細胞壁レベルで構造完全性を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞にうまく適用することができる。
【００２０】
本発明の方法は、本明細書において以下により詳細に記載される一連の段階を企図する。
【００２１】
第一に、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌され、インタクトなバクテリア細胞を計数するためのフローサイトフルオロメトリーが適用される。
【００２２】
従って、本発明の目的は、間欠滅菌された試料中のラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞およびそれらの生物学的活性の数を製造し、計数し、および決定するための細胞蛍光測定の使用である。
【００２３】
フローサイトメトリーは、細菌懸濁液中に存在する生存／死細胞を定量化するための、迅速かつ信頼性のある方法を提供する。細胞蛍光測定解析を通して、細胞壁の完全性を特異的に調べる「ＢＤＴＭ  ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ」キット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより販売される）中に含有される特定の色素の組み合わせを利用して、例えばバクテリア細胞培養物などの生体試料中で生細胞と死細胞を弁別することができる。
【００２４】
商業的に入手可能なキットは、生および死の両方の、全ての細胞を標識することができるチアゾールオレンジ（ＴＯ）などの第一染色試薬、および死細胞に特異的なヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの第二染色試薬を含有する。
【００２５】
定量的な細胞決定について、上述のキットをＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより販売される蛍光ビーズ「ＢＤＴＭ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ」の懸濁液と会合させることが重要である。ビーズ懸濁液は、アジ化ナトリウム０．１％溶液中の蛍光ポリスチレン微粒子の懸濁液である。
【００２６】
１０から１００μｌ、好ましくは４０から６０μｌが含まれる、既知の量のビーズを加えることで、収集されたデータを推定することにより、絶対的な細胞数を決定することができる。
【００２７】
インタクトな細胞質膜を有する生細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの色素に不透過性である。逆に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの色素は、損傷した細胞質膜を有する細胞に入ることができる。チアゾールオレンジ（ＴＯ）は、生および死の両方の全ての細胞に入ることができる色素である。これらの２つの染色試薬の組み合わせは、構造完全性を有する生および死の両方のバクテリア細胞を弁別するための迅速かつ信頼性のある方法を提供する。
【００２８】
試薬および試験される試料を調節するための予備工程を行う事が重要である。
【００２９】
従って、手順は以下の通りである：
全てのキット試薬をそれらの使用前に室温にする。
バクテリア細胞を含有する生体試料を室温で１−６時間、マイナス２０℃の温度で保存されていた場合は好ましくは１．５から３時間、例えば２から２．５時間、＋４℃で保存されていた場合、約６０分、例えば３０分間放置する。
ゆっくりかつ穏やかに攪拌しながら、ビーズを含有する懸濁液を置く。
【００３０】
次に、例えば１ｘ１０６から１ｘ１０１０ＵＦＣ／ｇ、好ましくは１ｘ１０７から１ｘ１０９ＵＦＣ／ｇの濃度を有する乾燥、脱水または凍結乾燥培養物などの固体形態における、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞培養物の調製およびそれに続くその間欠滅菌化が行われ、間欠滅菌されたバクテリア細胞の培養物を得られる。
【００３１】
次に、試験試料の調製が行われる。
・            液体形態の試料の場合、約１０５−１０７細胞／ｍｌの濃縮倍率が達成されるまで、０．１％滅菌ペプトン生理食塩水で１：１０の段階希釈を行う。
・            無水試料の場合、滅菌バッグ中で試料を１：１０で水を加えて元に戻し、そして、ストマッキングして調製物を均質化する。次に、液体形態の試料の場合などのその後の１：１０の希釈が行われる。
【００３２】
次に、細胞蛍光測定を使用することによる生／死細胞の量の解析が実施される。
【００３３】
死ぬ段階について、手順は以下の通りである：
・            ２分間室温で攪拌およびインキュベートしながら０．５ｍｌの適した希釈液に、２．５μｌのチアゾールオレンジＴＯおよび１．５μｌのヨウ化プロピジウムＰＩを加え；かつ
・            ビーズを含有する５０μｌの懸濁液を加えて、試料を細胞蛍光測定解析に供する。
【００３４】
次に、データの取得および解析が行われる。
【００３５】
ｘ軸が前方散乱光（ＦＳＣ）を表し、ｙ軸が側方散乱光（ＳＳＣ）を表すサイトグラムが設定され（Ｒ２、図１を参照）、解析される集団を定める。
【００３６】
使用された色素の内在化に基いて識別される細胞亜集団の適切な視覚化について、ｘ軸がＦＬ−１（ＴＯ、図２を参照）を表し、ｙ軸がＦＬ−３（ＰＩ、図２を参照）を表す、第二のサイトグラムが設定される。
【００３７】
図１は、ＦＳＣ対ＳＳＣサイトグラムに関し、一方で、図２は、ＦＬ１対ＦＬ３サイトグラムに関する。
【００３８】
次に、結果の算出および表示が行われる。
【００３９】
以下の式が使用され、試料中の死んだバクテリア細胞の数を決定する。
【数１】
2018502557.tif 000003
（＊）適用される値は、使用されているビーズの包装に報告された値であり、バッチ間で異なる；Ｄ．Ｆ．＝希釈係数
【００４０】
結果は、液体形態の試料については細胞数／ｍｌ、または無水形態の試料については細胞数／ｇとして表現される。
【００４１】
上記の式、および領域（Ｒ６）で区切られた細胞事象を使用することにより、試料中に存在する死細胞の数が得られる。
【００４２】
構造完全性を有するが死んでいる細胞は、液体形態の試料については細胞数／ｍｌ、または無水形態の試料については細胞数／ｇとして表現される。
【００４３】
実施形態は、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞の試料中のインタクトな細胞膜を有する死細胞の数を計数するための方法に関し；当該方法は、以下を含む：
−段階希釈により、１０５から１０７細胞／ｍｌの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を含有する試料を調製すること；
−試料に第一試薬チアゾールオレンジおよび第二試薬ヨウ化プロピジウムを加えて、溶液を得ること；
−溶液にアジ化ナトリウム中の蛍光微粒子の懸濁液を加えて、試験試料を得ること；
−試験試料をフローサイトフルオロメトリーによる生細胞および死細胞を含む総細胞の計数並びに死細胞だけの計数に供すること；
−間欠滅菌された試料中に存在する死細胞を計数すること。
【００４４】
好ましくは、当該方法はさらに、０．５ｍｌの、１０５から１０７細胞／ｍｌの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を含有する試料に、２．５マイクロリットルの第一試薬および１．５マイクロリットルの第二試薬が加えられ、溶液を得ることを企図する。
【００４５】
好ましくは、当該方法はさらに、アジ化ナトリウム中の蛍光微粒子の懸濁液がポリスチレン微粒子を含み、好ましくはビーズ懸濁液が、アジ化ナトリウム０．１％溶液中の蛍光ポリスチレン微粒子の懸濁液であることを企図する。
【００４６】
好ましくは、当該方法はさらに、細胞数決定を可能にするために、１０から１００μｌ、好ましくは４０から６０μｌが含まれる、既知の量のビーズを加えることを企図する。
【００４７】
別の実施形態は、インタクトな細胞壁を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞を製造するための方法に関する；方法は、以下を含む：
−１ｘ１０６から１ｘ１０１０ＵＦＣ／ｇの濃度を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞培養物を調製すること；
−培養物を、間欠滅菌プロセスに供して、間欠滅菌されたバクテリア細胞の培養物を得ること；
−上述の計数方法を適用すること。
【００４８】
別の実施形態は、上述されるバクテリア細胞を製造するための方法により得られるラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の培養物に関する。
【００４９】
別の実施形態は、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の間欠滅菌されたバクテリア細胞の試料中のインタクトな細胞膜を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、死んだバクテリア細胞の数を計数するためのフローサイトフルオロメトリーの使用に関する。
【００５０】
好ましくは、当該使用は、インタクトな細胞膜を有するラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）の、間欠滅菌され、死んだバクテリア細胞が、上述される計数方法で計数されることを企図する。
【実施例】
【００５１】
ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）のバクテリア細胞で行われた実験例が以下に示される（ｂｎ／ｇとして表現される値）：
【表１】
2018502557.tif 000004
【００５２】
図３は、試料のＦＳＣ対ＳＳＣサイトグラムに関し、一方で、図４は、試料のＦＬ１対ＦＬ３サイトグラムに関する。
【００５３】
使用されたサイトフルオロメーターおよびキットは、以下の仕様を有する。
【００５４】
４８８ｎｍのレーザー励起を備えるフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ３ＣＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  イタリア、カタログ番号３４３０２０）およびそのＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ。
ＢＤＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ  ＢＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（カタログ番号３４９４８）。
【図１】
2018502557.tif 000005
【図２】
2018502557.tif 000006
【図３】
2018502557.tif 000007
【図４】
2018502557.tif 000008
【国際調査報告】
2018502557.tif 000009
2018502557.tif 000010
2018502557.tif 000011