(57)【要約】  ヒト神経膠腫又は他のヒト腫瘍細胞に結合する、クロロトキシン若しくは関連毒素又はクロロトキシンのバリアント若しくは関連毒素を含む細胞外ドメイン、膜貫通領域、共刺激ドメイン、並びに細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ膜貫通免疫レセプター（ＣＡＲ）が記述される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原レセプターをエンコードする核酸分子であって、
前記キメラ抗原レセプターは：
クロロトキシン若しくはクロロトキシン関連毒素又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；並びに
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
を含む、
核酸分子。
【請求項２】
前記共刺激ドメインは：
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
１‐５個のアミノ酸改変を有するクロロトキシンのバリアント、を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記クロロトキシンバリアントは、１‐５個のアミノ酸改変とともに配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記キメラ抗原レセプターは、
二つの異なる共刺激ドメインであり：
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン、
を含む、
請求項２に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記キメラ抗原レセプターは、
二つの異なる共刺激ドメインであり：
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン、
を含む、
請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記キメラ抗原レセプターは：
クロロトキシン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；並びに
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
を含む、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記クロロトキシン又はそのバリアントと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記スペーサー領域は、５‐３００個のアミノ酸を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記スペーサー領域は、配列ＩＤ番号：２‐１２又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記スペーサーは、１０‐５０個のアミノ酸を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記４‐１ＢＢ共刺激ドメインは、配列ＩＤ番号：２４又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ＣＤ３ζシグナリングドメインは、配列ＩＤ番号：７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
３個から１５個のアミノ酸のリンカーが、前記共刺激ドメインと前記ＣＤ３ζシグナリングドメイン又はそれらのバリアントとの間に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
当該核酸分子は、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記キメラ抗原レセプターは、
４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、及び
配列ＩＤ番号：２‐１２のいずれか又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含むスペーサー領域、
を含む、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記１‐５個のアミノ酸改変は、１個又は２個のアミノ酸改変である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記１‐５個のアミノ酸改変は、１‐５個のアミノ酸置換である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記キメラ抗原レセプターは、
二つ又はそれ以上のクロロトキシン若しくはそのバリアント、又は二つ又はそれ以上のクロロトキシンに関連する毒素、又は少なくとも一つのクロロトキシン及び少なくとも一つのクロロトキシンに関連する毒素、
を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入されたヒトＴ細胞の集団であって、
キメラ抗原レセプターは：
クロロトキシン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；並びに
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
を含む、
ヒトＴ細胞の集団。
【請求項２３】
配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む、ヒトＴ細胞の集団。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞の集団で構成される、請求項２２に記載のヒトＴ細胞の集団。
【請求項２５】
患者の癌を処置する方法であって、
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団を投与するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２６】
前記ヒトＴ細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋メモリーＴ細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌は、神経膠芽腫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記導入されたヒトＴ細胞は、
患者からＴ細胞を採取するステップ、
セントラルメモリーＴ細胞を単離するために前記Ｔ細胞を処理するステップ、及び
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む方法によって調製される、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
配列ＩＤ番号：２６‐４０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子。
【請求項３０】
配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列に一致するポリペプチドを発現する、Ｔ細胞。
【請求項３１】
キメラ抗原レセプターをエンコードする核酸分子であって、
前記キメラ抗原レセプターは：
クロロトキシン関連毒素又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；並びに
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
を含む、
核酸分子。
【請求項３２】
前記クロロトキシン関連毒素は、配列ＩＤ番号：５７‐５９又は図２５に示されるクロロトキシン関連毒素から選択される、請求項３１に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
操作されたＴ細胞（engineered  T  cells）を使う治療を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞（Tumor-specific  T  cell）に基づく免疫療法（immunotherapy）は、抗腫瘍処置（anti-tumor  treatment）のために研究されてきた。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲｓ）は、細胞外腫瘍認識／標的化ドメイン、細胞外リンカー／スペーサー、膜貫通ドメイン、並びに細胞内Ｔ細胞活性化及び共刺激シグナリングドメインで構成される。認識／標的化ドメインの設計は、有害な標的外効果（off-target effects）を回避するために決定的に重要である。ＣＡＲ腫瘍標的化ドメインの大部分は、特定の抗原に結合する抗体の特異性を活用する、抗体配列に由来する一本鎖可変断片（single  chain  variable  fragments）（ｓｃＦｖｓ）である。ＩＬ‐１３レセプター、ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を標的とするＩＬ−１３サイトカインＣＡＲのような、通常のレセプターリガンドに由来するＣＡＲ腫瘍目標化ドメインの例も存在する。いくつかの注目に値する成功に関わらず、新規なＣＡＲ腫瘍標的化ドメインの同定及び検証は、本分野における主要な問題のままである。
【０００２】
悪性神経膠腫（ＭＧ）は、未分化星状細胞腫（ＡＡ‐ＷＨＯグレードＩＩＩ）及び神経膠芽腫（ＧＢＭ‐ＷＨＯグレードＩＶ）を含み、米国において毎年診断される約２０，０００新規症例の発生率を有する。米国脳腫瘍学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によれば、米国の２０１０年の国勢調査データに基づいて、悪性脳腫瘍を有して生活している個人の総有病者数はざっと１４０，０００人である。ＭＧはまれな疾患であるが、それは、その悪性挙動及びほぼ均一に致死的な点で高度に攻撃的且つ異質である。高グレード（高悪性度）のＭＧのための現在の標準治療法は、短期間の利益しかもたらさず、これらの脳腫瘍は事実上治癒不可能である。実際に、たとえ現代の外科的及び放射線治療技術を用いても、それは中枢神経系（ＣＮＳ）内の位置によって課された既に重度の病的状態をしばしば悪化させ、５年生存率はかなり低い。さらに、疾患が再発する患者の大多数にとって、治療の選択肢はほとんどない。したがって、特に第一線の治療法に続いて再発／進行した患者のために、より効果的な治療法に対する重要な必要性が存在する。
【０００３】
ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（Adoptive  T  cell  therapy）（ＡＣＴ）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するように操作されることができるため、ＭＧの再発率を低下させる安全且つ有効な方法を提供し得る（Cartellieriら、2010  J  Biomed  Biotechnol  2010:956304；Ahmedら、2010  Clin  Cancer  Res  16:474；Sampsonら、2014  Clin  Cancer  Res  20:972；Brownら、2013  Clin  Cancer  Res  2012  18:2199；Chowら、2013  Mol  Ther  21:629）。また、Ｔ細胞は、脳実質（brain  parenchyma）を通って移動して、浸潤性悪性細胞を標的とし、死滅させることができる（Hongら、2010  Clin  Cancer  Res  16:4892；Brownら、2007  J  Immunol  179:3332；Hongら、2010  Clin  Cancer  Res  16:4892；Yaghoubi  2009  Nat  Clin  Pract  Oncol  6:53）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】2010  J  Biomed  Biotechnol  2010:956304
【非特許文献２】2010  Clin  Cancer  Res  16:474
【非特許文献３】2014  Clin  Cancer  Res  20:972
【非特許文献４】2013  Clin  Cancer  Res  2012  18:2199
【非特許文献５】2013  Mol  Ther  21:629
【非特許文献６】2010  Clin  Cancer  Res  16:4892
【非特許文献７】2007  J  Immunol  179:3332
【非特許文献８】2010  Clin  Cancer  Res  16:4892
【非特許文献９】2009  Nat  Clin  Pract  Oncol  6:53
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ膜貫通免疫レセプター（キメラ抗原レセプター又は“ＣＡＲｓ”）が記述される。細胞外ドメインは、クロロトキシン（サソリ（Leiurus  quinquestriatus）の毒液中に見出される３６アミノ酸ペプチド毒素）、若しくは関連毒素、又はクロロトキシン若しくは関連する毒素のバリアント、並びに、任意的に、例えば、ヒトＦｃドメインの一部分を含む、スペーサー、を含む。膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナリングドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）からのシグナリングドメイン、及び一つ又はそれ以上の共刺激ドメイン（costimulatory  domain）、例えば４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、を含む。細胞外ドメインは、細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現された場合に、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性を、クロロトキシンのためのレセプターを発現しているそれらの細胞に向けさせることを可能にする。そのような細胞は、神経膠芽腫細胞を含む。細胞内領域内にＣＤ３ζと直列に、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインのような共刺激ドメインを含むことは、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受けることを可能にする。Ｔ細胞、例えば患者特異的な、自己Ｔ細胞は、本明細書において記述されるＣＡＲｓを発現するように操作されてもよく、操作された（engineered）細胞は、ＡＣＴにおいて増やされ（expanded）、使用されてもよい。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞及びガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞の両方を含む、様々なＴ細胞サブセットが使用され得る。加えて、ＣＡＲは、ＮＫ細胞のような他の免疫細胞においても発現され得る。患者が本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて処置される場合、その細胞は、自己（autologous）のＴ細胞又は同種（allogenic）のＴ細胞であってもよい。いくつかの場合において、使用される細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ４５ＲＡ−である、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含むセル集団であり、或いは、使用される細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴＣＭ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含むセル集団（すなわち、ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団）である。ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞の両方、並びに、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方を含む。そのような細胞の使用は、他の種類の患者特異的Ｔ細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期の持続性を改善することができる。
【０００６】
本明細書において記述されるものは、ＣＡＲをエンコードする（encoding）核酸分子であって：クロロトキシン（ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＫＲＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ；配列ＩＤ番号：１）、又は、システイン残基は改変されないという条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（modifications）（例えば、置換）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、を含む、核酸分子である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、クロロトキシンの代わりに、クロロトキシンに関連する毒素を含む。したがって、ＣＡＲは、ＧａＴｘ２、サソリ（Leiurus  quinquestriatus  hebraeus）からの毒素（ＶＳＣＥＤＣＰＤＨＣＳＴＱＫＡＲＡＫＣＤＮＤＫＣＶＣＥＰＩ；配列ＩＤ番号：５６）、又は、システイン残基は改変されないという条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、を含んでもよい。
【０００８】
いくつかの場合において、ＣＡＲは、一つより多くのクロロトキシン配列（例えば、連続的であるか又は１‐１０個のアミノ酸によって分離されているかのいずれかの、二つ若しくは三つ又はそれ以上の配列ＩＤ番号：１のコピー）、又は一つより多くのクロロトキシンに関連する毒素を含んでもよい。したがって、ＣＡＲは、二つ又はそれ以上のクロロトキシン配列（例えば、配列ＩＤ番号：１、続いて配列ＩＤ番号：１、続いてその分子の残り）を含んでもよく、或いは、ＣＡＲは、クロロトキシン配列に続いてクロロトキシンに関連する毒素の配列（例えば、配列ＩＤ番号：５７又は図２５に示される他の毒素）を含んでもよい。
【０００９】
ＣＡＲは、ＧａＴｘ１、サソリ（Leiurus  quinquestriatus  hebraeus）からの毒素（ＣＧＰＣＦＴＴＤＨＱＭＥＱＫＣＡＥＣＣＧＧＩＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＮＲ；配列ＩＤ番号：５７）、又は、システイン残基は改変されないという条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、を含んでもよい。
【００１０】
ＣＡＲは、ＡａＣｔｘ、サソリ（Androctonus  australis）からの毒素（ＭＣＩＰＣＦＴＴＮＰＮＭＡＡＫＣＮＡＣＣＧＳＲＲＧＳＣＲＧＰＱＣＩＣ；配列ＩＤ番号：５８）、又は、システイン残基は改変されないという条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、を含んでもよい。
【００１１】
ＣＡＲは、ＢｍＫＣＴ、サソリ（Buthus  martensii）からの毒素（ＣＧＰＣＦＴＴＤＡＮＭＡＲＫＣＲＥＣＣＧＧＩＧＫＣＦＧＰＱＣＬＣＮＲＩ；配列ＩＤ番号：５９）、又は、システイン残基は改変されないという条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：表２に示される膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、を含んでもよい。
【００１２】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、クロロトキシン配列（配列ＩＤ番号：１）が配列ＩＤ番号：５６‐５９のうちのいずれか又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントによって置き換えられている、配列ＩＤ番号：２６‐５５のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００１３】
様々な実施形態において、共刺激ドメインは：表３に示される共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される。特定の実施形態において、４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアントが存在する。いくつかの実施形態において、二つの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、並びに４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントがある。様々な実施形態において、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変は、置換である。
【００１４】
いくつかの場合において、共刺激ドメインとＣＤ３ゼータシグナリングドメインとの間及び／又は二つの共刺激ドメインの間には、１‐６個のアミノ酸の短い配列（例えば、ＧＧＧ）がある。
【００１５】
ＣＡＲの追加的な実施形態は、以下を含む：クロロトキシンレセプター（Ｃｌｔｘ‐Ｒ）のための結合特異性又は免疫原性を高める１‐５個のアミノ酸改変を有するクロロトキシンのバリアント；クロロトキシンバリアントは、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変とともに配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列を含むバリアントである；二つの異なる共刺激ドメインであり：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン；二つの異なる共刺激ドメインであり：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン；クロロトキシン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；クロロトキシン又はそのバリアントと膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、配列ＩＤ番号：２‐１２（表３）又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、スペーサー領域）；スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む；スペーサー領域は、１‐１５０個のアミノ酸を含む；スペーサーがない；４‐１ＢＢシグナリングドメインは、配列ＩＤ番号：２４のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζシグナリングドメインは、配列ＩＤ番号：２１のアミノ酸配列を含み、３個から１５個のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナリングドメイン又はそれらのバリアントとの間に位置する。二つの共刺激ドメインがある特性の実施形態において、一方は４‐１ＢＢ共刺激ドメインであり、他方は：ＣＤ２８及びＣＤ２���ｇｇから選択される共刺激ドメインである。様々な実施形態において、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変は、置換である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する；キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
また、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセット（expression  cassette）を含むベクターによって導入された（transduced）ヒトＴ細胞の集団（population）も開示され、キメラ抗原レセプターは：クロロトキシン又は１‐５個のアミノ酸改変（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、クロロトキシンに関連する毒素又は１‐５個のアミノ酸改変（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアントのいずれか；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント及び４‐１ＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントの両方；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアント、を含んでもよい。様々な実施形態において、ヒトＴ細胞の集団は、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり、或いは、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセントラルメモリーＴ細胞の組み合わせ（ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方を含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０％、８０％又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり；ＣＤ３＋細胞である細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞のうちの少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０がＣＤ８＋細胞である）。
【００１８】
また、患者の癌を処置する方法であって、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）又はセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセントラルメモリーＴ細胞の組み合わせ（すなわち、Ｔ細胞はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である）を含み、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である、自己又は同種のＴ細胞）を、投与するステップ（administering）、を含む方法も記述されている。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方を含み（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０％、８０％又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり；ＣＤ３＋細胞である細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞のうちの少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０がＣＤ８＋細胞である）、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入され、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において：癌は、神経膠芽腫（glioblastoma）であり；導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を採取するステップ（obtaining）、セントラルメモリーＴ細胞を単離するためにＴ細胞を処理するステップ、及びキメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、を含む方法によって調製された。
【００１９】
また：配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換、削除又は挿入の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；並びに、２個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子、も記述されている。
【００２０】
クロロトキシン又はそのバリアントを含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、神経膠芽腫、及びクロロトキシンのためのレセプターを発現する他の癌のような、癌の処置において有用であり得る。そのような癌は：原発性脳腫瘍及び神経膠腫（多形神経膠芽腫  ＷＨＯグレードＩＶ、未分化星状細胞腫  ＷＨＯグレードＩＩＩ、低悪性度（低グレード）星状細胞腫  ＷＨＯグレードＩＩ、毛様細胞性星状細胞腫  ＷＨＯグレードＩ、他の等級を付けられていない神経膠腫、乏突起神経膠腫、膠肉腫、神経節膠腫、髄膜腫、上衣腫）、神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫、神経芽腫、神経節腫、黒色腫（転移性）、黒色腫（原発性）、褐色細胞腫、ユーイング肉腫、原発性神経外胚葉性腫瘍、小細胞肺癌、シュワン細胞腫）、他の脳腫瘍（類表皮嚢胞（類表皮腫）、未知の病理の脳腫瘍、脳下垂体の神経膠芽腫（ｐｔ．））未知の組織期限の脳への転移腫瘍）、並びに他の癌（乳癌、乳癌転移、腎臓癌、肝臓癌肺癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌）を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかをエンコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲｓのうちの一つをエンコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球を含む。
【００２２】
本明細書に記載のＣＡＲは、クロロトキシンドメイン（すなわち、クロロトキシン又はそのバリアント）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含んでもよい。様々な異なるスペーサーが使用されてもよい。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部分、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分若しくはＣＨ３ドメイン又はそのバリアントを含む。以下の表１は、本明細書に記載のＣＡＲｓにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例
【表１】
2018531015.tif 000002
【００２３】
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全て又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインとＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリンに由来する配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸改変、例えば１、２、３、４又は５個の置換、例えば標的外結合（off-target  binding）を低減する置換、を含んでもよい。
【００２４】
“アミノ酸改変”は、タンパク質若しくはペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は削除を参照する。“アミノ酸置換”若しくは“置換”は、元の（parent）ペプチド若しくはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸の、他のアミノ酸による交換を参照する。置換は、非保存的（non-conservative）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、他の分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、或いは、保存的（conservative）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行われてもよい。そのような保存的な変化は、概して、結果として生じるタンパク質の構造及び機能のより小さな変化につながる。以下はアミノ酸の種々の分類の例である：１）無極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
【００２５】
特定の実施形態において、スペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下で更に詳細に記述されるこの番号付け体系において、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列の最初のアミノ酸が２１９であるように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。
【００２７】
特定の実施形態において、改変されたスペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ４領域に由来する：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。ここで、改変されていないスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置において上記の同定されたアミノ酸によって置換される。
【００２９】
本明細書において論じられる免疫グロブリン中のアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系（Kabatら、1991  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  第５版、米国公衆衛生局、国立保健研究機構、ベスセダ、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に従う。ＥＵインデックス若しくはKabatにおけるようなＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系は、ＥＵ抗体の番号付け（Edelmanら、1969  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  63:  78-85）を参照する。
【００３０】
様々な膜貫通ドメインが使用されてもよい。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合には、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対してカルボシキ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例
【表２】
2018531015.tif 000003
【００３１】
本明細書に記載のＣＡＲの多くは、一つ又はそれ以上の（例えば、二つの）共刺激ドメインを含む。（複数の）共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナリングドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナリングドメインと一緒に、適切な共刺激ドメインの例を含む。
表３：ＣＤ３ζドメイン及び共刺激ドメインの例
【表３】
2018531015.tif 000004
【００３２】
本明細書に記載のクロロトキシンを含むＣＡＲの中には、表４に要約されるものがあり、その中で、各ＣＡＲについてのスペーサードメイン、膜貫通ドメイン及び（複数の）共刺激ドメインが示されている。
表４：クロロトキシンを含むＣＡＲの例
【表４】
2018531015.tif 000005
＊シグナル配列を含む配列についての配列ＩＤ番号／シグナル配列を除く配列についての配列ＩＤ番号
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ‐Ｃ：ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成。（Ａ）クロロトキシン（ＣＬＴＸ）‐リダイレクト（redirected）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）カセットをエンコードするレンチウイルスコンストラクトの概要であり、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）配列の転写がＥＦ１プロモーター（ＥＦ１ｐ）によって駆動される。（Ｂ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲの図であり、細胞外３６アミノ酸クロロトキシンペプチド及びＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及び細胞内ＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞質シグナリングドメイン配列を含む。（Ｃ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲを発現するように操作された健常ドナーＴ細胞（ＨＤ１８７．２  ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ）のフローサイトメトリー分析。示されているのは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋（ＣＤ８−）Ｔ細胞サブセットの両方におけるＣＬＴＸ‐ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔ導入遺伝子の同時発現を表す、抗ＣＤ１９抗Ｆｃ及び抗ＣＤ８染色である。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の１８日後の導入された細胞（ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ）及び導入されていない細胞（モック）についての免疫反応性細胞の割合（Percentages）が示されて、ヒトＴ細胞をＣＬＴＸ−ＣＡＲ用いて形質導入する能力を実証している。
【００３４】
【図２】図２Ａ‐Ｆ：ＣＬＴＸ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、神経膠芽腫細胞株Ｕ２５１Ｔを特異的に認識する。（Ａ‐Ｆ）ＣＬＴＸは、ＧＢＭ細胞に結合し、非ＧＢＭ細胞への最小の結合を示す。示されているのは、Ａ、健常ドナー由来のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；Ｂ、ヒトＥＢＶ転換リンパ芽球細胞株、ＬＣＬ；Ｃ、大型Ｔ抗原転換ヒト胎性腎臓細胞株２９３Ｔ；Ｄ、健常ドナー由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）から分化したヒト星状細胞；及びＥ、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ２５１Ｔ、に結合する、クロロトキシン抱合（chlorotoxin-conjugated）Ｃｙ５．５（ＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５）の評価である。細胞株は、培地（未処置）中、又は１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中、３７℃で１時間にわたって培養され、次いでフローサイトメトリーによって評価された。（Ｆ）ＣＬＴＸ−ＣＡＲ  Ｔ細胞による、ＬＣＬ、２９３Ｔ又は原発性のヒト星状細胞ではなく、神経膠腫腫瘍細胞株Ｕ２５１Ｔの特異的死滅。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で７２時間にわたってＣＬＴＸ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞（ＬＣＬ、２９３Ｔ、星状細胞及びＵ２５１Ｔ）の数である。＊＊：ｐ＜０．０１；ｎｓ：非特異的であり、スチューデントのｔ検定は、図に示されるように群の間で実行された。
【００３５】
【図３】図３Ａ‐Ｂ：複数の低継代（low-passage）ヒト原発性脳腫瘍（ＰＢＴ）株へのＣＬＴＸ結合は、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立している。１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中で１時間培養され、次いでＰＥ抱合ＩＬ１３Ｒα２抗体を用いて染色された、（Ａ）４つのＩＬ１３Ｒα２‐ｌｏｗ及び（Ｂ）４つのＩＬ１３Ｒα２‐ｈｉｇｈ細胞株のフローサイトメトリー分析。
【００３６】
【図４】図４Ａ‐Ｂ：低継代ＰＢＴヒト神経膠芽腫細胞株ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞認識及び死滅は、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立している。（Ａ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、原発性ＧＢＭ株対胎性腎臓細胞株２９３Ｔのパネルの統計的に有意な死滅を示す。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたってＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞の数である。＊＊＊：ｐ＜０．００１であり、スチューデントのｔ検定は、ＰＢＴ細胞生存率と２９３Ｔ細胞との間で実行された。（Ｂ）生細胞画像化（live  cell  imaging）を用いて観察され、モック対照に比較した、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９腫瘍細胞の排除（Elimination）。エフェクター：標的比＝１：４（４，０００Ｔ細胞、１６，０００標的細胞）でモック又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養されたＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９細胞の代表的な画像であり、共培養直後（０時間）及び共培養の３日後（７２ｈ）に明視野顕微鏡によって撮影された。
【００３７】
【図５】図５Ａ‐Ｂ：ＧＢＭ細胞を用いて刺激した後のＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化（activation）。Ｔ細胞は、タンパク質輸送阻害剤（protein  transport  inhibitor）の存在下、エフェクター：標的比＝１：１（２５，０００Ｔ細胞、２５，０００標的細胞）で５時間にわたって標的細胞によって刺激された。脱顆粒を起こしているＣＡＲ‐Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して、（Ａ）ＣＤ１０７ａ免疫反応性、及び（Ｂ）細胞内染色によって決定されるサイトカイン産生によって決定された。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、２９３Ｔ細胞刺激されたＴ細胞と、ＰＢＴ刺激されたＴ細胞の各々における脱顆粒／サイトカイン分泌を比較するシダク‐ボンフェローニ補正（Sidak-Bonferroni  correction）を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）。
【００３８】
【図６】図６Ａ‐Ｃ：異なるリンカー設計を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果。（Ａ）ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）、ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）、ＣＤ８ｈ及び短いリンカー（Ｌ）を含む、リンカーが異なるＣＬＴＸ‐ＣＡＲコンストラクトの模式図（膜貫通ドメインは示されていない）。（Ｂ）異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ  ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを宿す（harboring）Ｔ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。（Ｃ）異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原攻撃（challenge）に続いて、異なるサイトカイン産生レベルを示す。異なるＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、表示されたＣＡＲ  Ｔ細胞とモックＴ細胞を比較するシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析。
【００３９】
【図７】図７Ａ‐Ｃ：異なる細胞内シグナリングドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果。（Ａ）細胞内共刺激ドメイン（ＣＤ２８及び４１ＢＢ）が異なるＣＬＴＸ‐ＣＡＲコンストラクトの模式図。（Ｂ）異なる共刺激ドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ  ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを宿すＴ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。（Ｃ）異なる共刺激ドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原攻撃に続いて、様々なレベルのサイトカインを産生する。異なるＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、表示されたＣＡＲ  Ｔ細胞とモックＴ細胞を比較するシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析。
【００４０】
【図８】図８Ａ‐Ｂ：ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、生体内で（in  vivo）、確立されたＵ２５１Ｔ  ＧＢＭ腫瘍の成長を低減する。（Ａ）ＮＳＧマウスにおけるＵ２５１Ｔ異種移植の増殖及びＴ細胞処置を示す図式。皮下に移植されたＵ２５１Ｔ細胞を有するマウス（第−１４日目から第０日目）は、ＰＢＳ（腫瘍のみ）、モックＴ細胞、又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された。（Ｂ）腫瘍進行は、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞処置によって阻害される。Ｔ細胞注入の時から２０日間（第０日目から第２０日目）にわたって、腫瘍の成長がキャリパー測定によって測定された。＊＊＊：ｐ＜０．００１、腫瘍のみ又はモック処置された群と、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞処置されたマウスにおける腫瘍体積を比較する、Ｔ細胞注入後２０日目のデータについて実行されたシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析
【００４１】
【図９】図９は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：２６）。
【００４２】
【図１０】図１０は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：２７）。
【００４３】
【図１１】図１１は、ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：２８）。
【００４４】
【図１２】図１２は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：２９）。
【００４５】
【図１３】図１３は、ＣＬＴＸ‐Ｌ‐‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３０）。
【００４６】
【図１４】図１４は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３１）。
【００４７】
【図１５】図１５は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３２）。
【００４８】
【図１６】図１６は、ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３３）。
【００４９】
【図１７】図１７は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３４）。
【００５０】
【図１８】図１８は、ＣＬＴＸ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３５）。
【００５１】
【図１９】図１９は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３６）。
【００５２】
【図２０】図２０は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ４ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３７）。
【００５３】
【図２１】図２１は、ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３８）。
【００５４】
【図２２】図２２は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：３９）。
【００５５】
【図２３】図２３は、ＣＬＴＸ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：４０）。
【００５６】
【図２４】図２４は、Ｔ２Ａ（リボソームスキップ配列）及び切断型ＣＤ１９を備えた図２１のＣＡＲを示す。切断型ＣＤ１９は、ＣＡＲと同時発現され、トランスフェクトされた細胞を同定及び定量化するための単純な方法を可能にする。
【００５７】
【図２５】図２５は、様々なクロロトキシン関連毒素及びそれらのアミノ酸配列のアライメントを示す（Dardevetら、2015  Toxins  (Basel)  7:1079）。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下に記述されるものは、クロロトキシン（ＣＬＴＸ）を含む様々なキメラ抗原レセプター（chimeric  antigen  receptors）の構造、構築及び特徴付けである。キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低限、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナリングドメインを含む組換え生体分子である。したがって、用語“抗原”は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができる任意の分子である。例えば、ＣＡＲは、細胞表面レセプターに特異的に結合するリガンドを含んでもよい。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単にそれが含む認識要素によっても呼ばれる）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜中にＣＡＲをつなぐ。細胞内シグナリングドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖からのシグナリングドメインを含み、任意的に一つ又はそれ以上の共刺激シグナリングドメインを含む。ＣＡＲｓは、ＭＨＣ拘束から独立して、抗原に結合すること及びＴ細胞活性化を導入することの両方である。したがって、ＣＡＲｓは、彼ら／彼女らのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を処置することができる“普遍的な（universal）”免疫レセプターである。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用する養子免疫療法（Adoptive  immunotherapy）は、癌の処置のための強力な治療戦略であり得る。
【００５９】
本明細書に記載のクロロトキシンを含む一つのＣＡＲは、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐Ｚｅｔａ（ゼータ）と呼ばれる。このＣＡＲは、以下を含む様々な重要な特徴を含む：クロロトキシン；ＣＨ２領域内の二つの部位においてＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）による結合を低減するような方法で変異させられた（Ｌ２３５Ｅ；  Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域；ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメイン。
【００６０】
いくつかの場合において、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲ翻訳領域（open  reading  frame）の後にＴ２Ａリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナルシグナリングテールを欠く（アミノ酸３２３で切断された）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続くベクターを使用して産生されてもよい。この配置において、ＣＤ１９ｔの同時発現は、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、それは、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、遺伝子改変細胞の正の選択（positive  selection）、並びに、養子移植に続いての生体内（in  vivo）での効率的な細胞追跡及び／又は治療用Ｔ細胞（therapeutic  T  cells）の画像化ができるようにする。ＣＤ１９ｔの同時発現は、治療用細胞を選択的に除去し、それにより自殺スイッチとして機能するための、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を使用する、導入された細胞の生体内（in  vivo）での免疫学的標的化のためのマーカーを提供する。
【００６１】
本明細書に記載のＣＡＲは、当分野において知られる任意の手段によって産生されてもよいが、好ましくは、それは組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。キメラレセプターのいくつかの領域をエンコードする核酸は、便利であるように、当分野において知られる分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって、調製され、完全なコード配列に組み立てられてもよい。結果として生じるコード領域は、好ましくは発現ベクターの中に挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を変換する（transform）ために使用される。
【００６２】
選択されていないＰＢＭＣ又は富化された（enriched）ＣＤ３  Ｔ細胞又は富化されたＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセット又はＴＣＭ又はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎは、ＣＡＲ発現のためにベクターを用いて導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、一つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫磁気的に（immunomagnetically）選択するために、例えばCliniMACS（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞について富化することによって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離されてもよい。セントラルメモリーＴ細胞について富化された細胞は、例えば、ＣＡＲ、並びに、生体内（in  vivo）検出及び潜在的な生体外（ex  vivo）選択の両方のための非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて導入された、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されてもよい。活性化／遺伝的に改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５を用いて生体外（in  vitro）で増やされ、次いで凍結保存されてもよい。
【実施例１】
【００６３】
実施例１：ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ  ＣＡＲの構築及び構造
クロロトキシンを含む有用なＣＡＲの構造、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａは、以下に記述される。コドン最適化されたＣＡＲ配列は：クロロトキシン、Ｆｃレセプター媒介認識を大幅に減少させる変異（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、共刺激ＣＤ２８細胞質シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナリングドメインを含む。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＣＤ１９ｔから、このＣＡＲ配列を分離する。このＴ２Ａ連鎖（linkage）は、
単一の転写産物からのＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの両方の同調発現（coordinate  expression）をもたらす。図１Ａは、ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔの翻訳領域の模式図である。この図において、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ  ＣＡＲ、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び切断型ＣＤ１９配列は、全て示されている。ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔカセットの発現は、ヒトＥＦ１プロモーター（ＥＦ１ｐ）によって駆動される。図１Ｂは、発現された、成熟ＣＡＲを模式的に示す。
【００６４】
ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ配列は、ヒトＧＭ‐ＣＳＦレセプターアルファリーダーペプチドクロロトキシン、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ改変ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ（ここで二重変異Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７ＱはＦｃＲ認識を妨げる）、ＣＤ２８膜貫通、ＣＤ２８細胞質シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナリングドメイン配列の融合によって生成された。この配列は、コドン最適化後に新規に（de  novo）合成された。Ｔ２Ａ配列は、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得られた。ＣＤ１９ｔ配列は、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通コンポーネントまで、リーダーペプチド配列にわたるもの（すなわち、塩基対１‐９７２）から得られた。全３つの断片、１）ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＣＤ１９ｔは、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。適切な細胞の中にトランスフェクトされると、ベクターは宿主細胞ゲノムの中に組み込まれる。ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列は、表示された様々なドメインと共に図９に表わされている。
【実施例２】
【００６５】
実施例２：ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａの発現のために使用されたｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、臨床用ベクターＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ‐Ｔ２Ａ‐ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７がシティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究所（ＴＣＴＲＬ）において導き出された、元のプラスミドである。ＣＡＲの発現に使用されたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、ＣＡＲの発現を駆動するためにヒトＥＦ１プロモーターを使用する。ベクターの５’配列及び３’配列の両方は、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから導き出されたように、ｐｖ６５３ＲＳＮから導き出された。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ‐１系統ｐＮＬ４‐３から導き出された。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は以前に記述されている。
【００６６】
ｐＨＩＶ７の構築は、以下のように実行された。簡潔に、介在ＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）とともにｇａｇ−ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（ＬＴＲｓ）から６５３ｂｐを含む、ｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた：ステップ１において、５’ＬＴＲからｒｅｖ‐応答配列（ＲＲＥ）までの配列はｐ５’ＨＩＶ−１５１を作製し、次いで５’ＬＴＲがＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変され、最初にＣＭＶエンハンサーに連結され（ligated）、次いでＳＶ４０複製開始点（origin  of  replication）連結された（ｐ５’ＨＩＶ‐２）。ステップ２において、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ−１を作製した後に、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐ削除が行われ、ＨＩＶ  Ｕ３におけるシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ‐２を形成した。ステップ３において、ｐＨＩＶ‐３を作製するために、ｐ５’ＨＩＶ‐３及びｐ３’ＨＩＶ‐２から単離された断片が結合された。ステップ４において、ｐ３’ＨＩＶ‐３を生成するために、ｐ３’ＨＩＶ‐２が余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによって更に改変され、また、ｐ３’ＨＩＶ‐４を作製するために、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片がｐ３’ＨＩＶ‐３に加えられた。ステップ５において、て、ｐＨＩＶ‐６を作製するために、ｐＨＩＶ‐３ＲＲＥはＰＣＲによりサイズを減少され、ｐＨＩＶ‐３からの５’断片（示さず）及びｐ３’ＨＩＶ‐４に連結された。ステップ６において、ｐＨＩＶ‐７を作製するために、ＨＩＶ‐１  ｐＮＬ４‐３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ‐ＢａｍＨＩ断片は、ｐＮＬ４‐３から増幅され、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置された。この元のプラスミドｐＨＩＶ７‐ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）は、４プラスミド系を使用して元のベクターをパッケージングするために使用された。
【００６７】
パッケージングシグナル、ｐｓｉ（Ψ）、は、ベクターへのウイルスゲノムの効率的なパッケージングのために要求される。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの導入効率を増強することが実証されている。
【００６８】
ヘルパー機能（ウイルスベクターの産生のために要求される）は、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させるために、３つの別個のプラスミドに分割された：１）ｐＣｇｐはウイルスベクターアセンブリのために要求されるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をエンコードする；２）ｐＣＭＶ‐Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためのウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用する、Ｒｅｖタンパク質をエンコードする；３）ｐＣＭＶ‐Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために要求される、水疱性口内炎（vesiculo-stomatitis）ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をエンコードする。
【００６９】
ｐＨＩＶ７にエンコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する、約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；全３種のヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列を含む。複数の組換え事象を要求するので、これらの領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。加えて、如何なる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製のために要求される機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を有していないであろう。
【００７０】
ＣＭＶプロモーターがＥＦ１α‐ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）によって置き換えられ、新しいプラスミドがｅｐＨＩＶ７と名付けられた。ＥＦ１ｐは、５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターが切除された後に、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを使用してｅｐＨＩＶ７に導入された。
【００７１】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染のために要求されるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。加えて、ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ゼータ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクターコンストラクトはインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含まず、そのため、標的細胞における、結果として生じ発現及び逆転写されるＤＮＡプロウイルスゲノムは、不活性なＬＴＲｓを有するであろう。この設計の結果として、一切のＨＩＶ‐１由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させると予想される。
【実施例３】
【００７２】
実施例３：患者Ｔ細胞の導入のためのベクターの産生
患者Ｔ細胞の導入のためのベクターは、以下のように調製されてもよい。各プラスミド（すなわち、１）ＣＡＲ、及び任意的に切断型ＣＤ１９のようなマーカー；２）ｐＣｇｐ；３）ｐＣＭＶ‐Ｇ；及び４）ｐＣＭＶ‐Ｒｅｖ２を発現するプラスミド）について、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種する（inoculate）ために使用される、シードバンクが生成された。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生におけるその使用に先立って、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験された。
【００７３】
簡潔に、細胞は、無菌性及びウイルス汚染が存在しないこと確認するために試験された２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から増やされる。２９３Ｔ  ＷＣＢからの２９３Ｔ細胞のバイアルが解凍される。ベクター産生及び細胞トレイン維持のために適切な数の１０層細胞ファクトリー（ＣＦｓ）を蒔くために十分な数の細胞が存在するまで、細胞は生育され及び増やされる。単一の細胞のトレインが産生のために使用されてもよい。
【００７４】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦｓまでのサブバッチで産生される。同じ週に２つのサブバッチを産生されてもよく、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週の産生につながる。一つのロットの産物を産生するために、全てのサブバッチから生成された物質は、下流の処理段階の間プールされる。２９３Ｔ細胞は、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦｓ中に蒔かれる（plated）。ファクトリーは、３７℃のインキュベーター内に置かれ、ＣＦの全層上に細胞の均一な分布を得るために水平にならされる。２日後、細胞は、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ、及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を伴う、ＣａＰＯ４法を使用して、上述の４つのレンチウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションの３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清は、回収され、精製され、濃縮される。上清がＣＦｓから除去された後に、生産最終細胞が各ＣＦから回収される。細胞は各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離により回収される。細胞は凍結培地に再懸濁され、凍結保存される。これらの細胞は、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）試験のために後に使用される。
【００７５】
ベクターを精製及び製剤化（formulate）するために、粗製上清は細胞片を除去するための膜濾過によって清澄化される。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Benzonase（登録商標））によって分解される。ウイルス上清は０．４５μｍのフィルターを使用して細胞片から清澄化される。清澄化された上清は予め秤量した容器に回収され、その中にBenzonase（登録商標）を加えられる（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間実行される。最初の接線流限外濾過（ＴＦＦ）濃度のエンドヌクレアーゼ処理された上清は、ウイルスを約２０倍濃縮しながら、粗製上清から残留低分子量成分を除去するために使用される。清澄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清は、フラックス速度（flux  rate）を最大化しながら、せん断速度を約４，０００秒−１又はそれ以下に維持するように設計された流速で、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジを通して循環させられる。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始される。ダイアフィルトレーション緩衝液としてのＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率が確立される。ウイルス上清は標的体積にされて、粗製上清の２０倍濃度を示し、ダイアフィルトレーションは１００％の透析液置換率で４回の追加交換容量にわたって続けられる。
【００７６】
ウイルス産物の更なる濃縮は、高速遠心分離技術を使用することによって達成される。レンチウイルスの各サブバッチは、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６  ｐｌｕｓ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）、６℃、１６‐２０時間で使用してペレット化される。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットは、ＰＢＳ中の４％ラクトースで５０ｍＬ体積に再構成される。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を代表する。ベクター濃縮プロセス全体は、約２００倍の体積減少をもたらす。全てのサブバッチの完了に続き、次に物質は−８０℃に置かれ、その間に各サブバッチからの試料が無菌性について試験される。サンプル無菌性の確認に続き、サブバッチを頻繁に撹拌しながら３７℃で急速に解凍される。次いで、物質はプールされ、クラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティーキャビネット内にて手動で分注される。無菌ＵＳＰクラス６、雄ネジＯリングクリオバイアル内の、１ｍＬの濃縮レンチウイルスの充填構成が使用される。
【００７７】
レンチウイルスベクター調製物の純度を確実にするために、それは、残留宿主ＤＮＡ汚染物質、並びに残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験される。他の試験の中でも、正しいベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ‐ＰＣＲによってベクター同一性が評価される。
【実施例４】
【００７８】
実施例４：ＡＣＴにおける使用に適したＴ細胞の調製
ＣＡＲを発現するためにＴＣＭが使用される場合は、適した患者の細胞は、以下のように調製されてもよい。最初に、Ｔリンパ球は、白血球フェレーシスによって患者から得られ、適切な同種又は自己のＴ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）がＣＡＲを発現するように遺伝的に変更され、次いで抗癌治療を達成するために、任意の臨床的に許容される手段によって患者に投与して戻された。
【００７９】
適切なＴＣＭは、以下のように生成されてもよい。合意された研究参加者から得られたアフェレーシス産物は、フィコール処理され（ficolled）、洗浄され、一晩インキュベートされる。次いで細胞は、ＧＭＰ等級の抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Miltenyi  Biotec）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を使用して、単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞集団を枯渇させる。枯渇に続いて、陰性画分細胞（negative  fraction  cells）は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置上でＤＲＥＧ５６‐ビオチン（ＣＯＨ臨床等級）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi  Biotec）を使用して、ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞について富化される（enriched）。
【００８０】
富化に続いて、ＴＣＭ細胞は、完全Ｘ−Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ‐２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ‐１５中に処方され、テフロン（登録商標）細胞培養バッグに移され、Ｄｙｎａｌ  Ｃｌｉｎ（商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激される。刺激後の最大５日目まで、細胞は、１．０から０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で所望のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを用いて導入される。培養は、細胞増殖のための要求に応じた完全Ｘ‐Ｖｉｖｏ１５並びにＩＬ‐２及びＩＬ‐１５サイトカインの追加を伴い（細胞密度を３×１０５と２×１０６生存細胞／ｍＬの間に保ち、サイトカイン補充は培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日）、最大で４２日間維持される。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９細胞まで増える。培養期間の終わりに、細胞は採取され、２回洗浄され、臨床等級の凍結保存培地（Cryostore  CS5,  BioLife  Solutions）中に処方される。
【００８１】
Ｔ細胞注入の日に、凍結保存及び放出された産物は、解凍され、洗浄され、再輸液のために処方される。放出された細胞産物を含む低温保存バイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清は除去され、細胞は保存料無添加の通常生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液（infusion  diluent）に再懸濁される。品質管理試験のために試料が取り出される。
【実施例５】
【００８２】
実施例５：Ｃｌｔｘ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐Ｚｅｔａの発現
図１Ｃは、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲを発現するように操作された健常ドナーＴ細胞（ＨＤ１８７．２  ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ）のフローサイトメトリー分析の結果を示す。示されているのは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋（ＣＤ８−）Ｔ細胞サブセットの両方におけるＣＬＴＸ‐ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔ導入遺伝子の同時発現を表す、抗ＣＤ１９抗Ｆｃ及び抗ＣＤ８染色である。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の１８日後の導入された細胞（ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ）及び導入されていない細胞（モック）についての免疫反応性細胞の割合が示されて、ヒトＴ細胞をＣＬＴＸ−ＣＡＲ用いて形質導入する能力を実証している。
【実施例６】
【００８３】
実施例６：クロロトキシン及びＣｌｔｘ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐ＺｅｔａＴ細胞は、神経膠腫細胞株Ｕ２５１Ｔを特異的に認識する
蛍光ラベル、Ｃｙ５．５に抱合されたクロロトキシン（ＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５）は、様々な細胞種へのクロロトキシン結合を評価するために使用された。この研究の結果は、図２Ａ‐Ｅに表されている（Ａ、健常ドナー由来のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；Ｂ、ヒトＥＢＶ転換リンパ芽球細胞株、ＬＣＬ；Ｃ、大型Ｔ抗原転換ヒト胎性腎臓細胞株２９３Ｔ；Ｄ、健常ドナー由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）から分化したヒト星状細胞；及びＥ、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ２５１Ｔ）。細胞株は、培地（未処置）中、又は１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中、３７℃で１時間にわたって培養され、次いでフローサイトメトリーによって評価された。
【００８４】
図２Ｆに示されるように、ＣＬＴＸ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、神経膠腫腫瘍細胞株Ｕ２５１Ｔを特異的に死滅させたが、ＬＣＬ、２９３Ｔ又は原発性のヒト星状細胞を死滅させなかった。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で７２時間にわたってＣＬＴＸ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞（ＬＣＬ、２９３Ｔ、星状細胞及びＵ２５１Ｔ）の数である。
【実施例７】
【００８５】
実施例７：クロロトキシンは、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立して低継代ＰＢＴ、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株に結合する
クロロトキシン結合がＩＬ１３Ｒα２発現から独立しているかどうかを調べるために、１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中で１時間培養され、次いでＰＥ抱合ＩＬ１３Ｒα２抗体を用いて染色された、ＩＬ１３Ｒα２‐ｌｏｗ細胞株及びＩＬ１３Ｒα２‐ｈｉｇｈ細胞株のフローサイトメトリー分析が実行された。図３Ａ‐Ｂに見られるように、クロロトキシンは、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立して低継代ＰＢＴ、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株に結合する。
【実施例８】
【００８６】
実施例８：ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐ＺｅｔａＴ細胞は、ＩＬ１３Ｒα２発現及びＴＣＧＡ分子サブタイプから独立して低継代ＰＢＴヒト神経膠芽腫細胞株を認識し、死滅させる
図４Ａに示されるように、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、原発性ＧＢＭ株対胎性腎臓細胞株２９３Ｔのパネルの統計的に有意な死滅を示す。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたってＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞の数である。
【００８７】
図４Ｂは、生細胞画像化を用いて観察され、モック対照に比較した、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９腫瘍細胞の排除を示す。エフェクター：標的比＝１：４（４，０００Ｔ細胞、１６，０００標的細胞）でモック又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養されたＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９細胞の代表的な画像であり、共培養直後（０時間）及び共培養の３日後（７２ｈ）に明視野顕微鏡によって撮影された、
【実施例９】
【００８８】
実施例９：ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐ＺｅｔａＴ細胞は、ＧＢＭ細胞を用いた刺激によって活性化される
（モック又はＣＬＴＸ  ＣＡＲを発現する）Ｔ細胞は、タンパク質輸送阻害剤の存在下、エフェクター：標的比＝１：１（２５，０００Ｔ細胞、２５，０００標的細胞）で５時間にわたって標的細胞によって刺激された。脱顆粒を起こしているＣＡＲ‐Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１０７ａ免疫反応性（図５Ａ）、及び細胞内染色によって決定されるサイトカイン産生（図５Ｂ）によって決定された。
【実施例１０】
【００８９】
実施例１０：異なるリンカー設計を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して有効である
図６Ａは、ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）、ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）、ＣＤ８ｈ及び短いリンカー（Ｌ）を含む、異なるスペーサー（リンカー）を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲコンストラクトの模式図である。全てが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを有する（図示されていない）。図６Ｂに示されるように、異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ  ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを宿すＴ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。図６Ｃに示されるように、異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原攻撃に続いて、異なるサイトカイン産生レベルを示す。異なるＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。
【実施例１１】
【００９０】
実施例１１：異なる細胞内シグナリングドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果
図７Ａは、異なる細胞内共刺激ドメインＣＤ２８及び４１ＢＢを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲコンストラクトの模式図である。図７Ｂに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ  ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを宿すＴ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。図７Ｃに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原攻撃に続いて、様々なレベルのサイトカインを産生する。異なるＬＴＸ‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。
【実施例１２】
【００９１】
実施例１２：ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、生体内で（in  vivo）、確立されたＵ２５１Ｔ  ＧＢＭ腫瘍の成長を低減する。
図８Ａは、ＮＳＧマウスにおけるＵ２５１Ｔ異種移植の増殖及びＴ細胞処置の研究の模式的な描写である。皮下に移植されたＵ２５１Ｔ細胞を有するマウス（第−１４日目から第０日目）は、ＰＢＳ（腫瘍のみ）、モックＴ細胞、又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された。図８Ｂ、腫瘍進行は、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞処置によって阻害される。Ｔ細胞注入の時から２０日間（第０日目から第２０日目）にわたって、腫瘍の成長がキャリパー測定によって測定された。
【実施例１３】
【００９２】
実施例１３：追加的なＣＬＴＸ  ＣＡＲ
図９‐２４は、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐Ｚｅｔａ  ＣＡＲに関して上述されたように構築及び発現されることができる様々な追加的なＣＬＴＸ‐ＣＡＲのアミノ酸配列を提示する。図８‐２４において、様々な領域（アミノ末端からカルボキシ末端までの各図の配列の下に列挙されている）は、下線部分及び非下線部分を交互にすること（alternating）によって示されている。したがって、図９において、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドは下線が引かれており、クロロトキシン配列は下線が引かれておらず、スペーサー（ＩｇＧ４（ＳｍＰ）（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ））は下線が引かれており、ＣＤ２８膜貫通配列は下線が引かれておらず、ＣＤ２８ｃｙｔｏ（ＬＬｍＧＧ）共刺激ドメインは下線が引かれており、共刺激ドメインをＣＤ３ζ配列から分離する（Ｇｌｙ）３配列は下線が引かれておらず、そしてＣＤ３ζ配列は下線が引かれている。図９‐２３において、ＣＡＲと同時発現されるＴ２Ａ及びＴ１９ｔ配列は示されていない。図２４は、Ｔ２Ａ（リボソームスキップ）及び切断型ＣＤ１９）が含まれた図２３のＣＡＲを示す。切断型ＣＤ１９は、ＣＡＲと同時発現され、トランスフェクトされた細胞を同定及び定量化するための単純な方法を可能にする。
【実施例１４】
【００９３】
実施例１４：追加的な毒素配列
図２５は、クロロトキシン及び様々なクロロトキシン関連毒素の配列アライメントを示す（Dardevetら、2015  Toxins  (Basel)  7:1079）。これらの毒素は、いくつかの場合において、本明細書に記載のＣＡＲにおけるクロロトキシンのために置換されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018531015.tif 000022
【図１７】
2018531015.tif 000023
【図１８】
2018531015.tif 000024
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018531015.tif 000033
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