(57)【要約】  本開示は、細胞においてタンパク質を発現させるために有用なキメラ転写後調節要素（ＰＲＥ）およびベクターに関する。ＰＲＥは、複数の異なる天然型ＰＲＥ配列から選択された、アルファ、ベータ、および、任意でガンマサブエレメントを含み、それらの天然型の対応物より強力であることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと
を備えるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１フラグメントは、前記第２フラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていない、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ｃ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のガンマサブエレメントから成る第３フラグメントを更に含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１２、１６もしくは２０の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１２、１６もしくは２０と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１フラグメントは、前記第３フラグメントと前記第２フラグメントとの間にある、請求項３から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第３フラグメントは、前記第１フラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていない、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１４および３を連続的に備える、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の核酸配列を備える、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の核酸配列を備える、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のアルファサブエレメントから成る第２フラグメントと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第３フラグメントと
を備えるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記アルファサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、９、１４もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、９、１４もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アルファサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記第２フラグメントは、前記第１フラグメントと前記第３フラグメントとの間にあり、各フラグメントは、隣接するフラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていない、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと
を備えるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
（ｃ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のガンマサブエレメントから成る第３フラグメントを更に含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項のポリヌクレオチド、および、タンパク質コード配列を備えるポリヌクレオチド構築物。
【請求項１９】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと、
（ｃ）タンパク質コード配列と
を備えるポリヌクレオチド構築物。
【請求項２０】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のアルファサブエレメントから成る第２フラグメントと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第３フラグメントと、
（ｄ）タンパク質コード配列と
を備えるポリヌクレオチド構築物。
【請求項２１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと、
（ｃ）タンパク質コード配列と
を備えるポリヌクレオチド構築物。
【請求項２２】
前記タンパク質コード配列は、前記第１フラグメントと前記第２フラグメントとの間に位置する、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項２３】
３'‐ＵＴＲを更に備える、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項２４】
前記３'‐ＵＴＲは、前記第１フラグメントと前記第２フラグメントとの間に位置する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項２５】
ポリ（Ａ）配列を更に備える、請求項１８から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項２６】
請求項１８から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、参照によって内容が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／２４６，８４１号の利益を主張するものである。
【０００２】
遺伝子配列の転写（すなわち、ｍＲＮＡの生成）は、多くの異なるレベルで制御される。転写開始部位またはプロモーターは、複数の異なる強度を有し、所与の遺伝子の転写の開始の頻度は、エンハンサー配列によって増加させることもできる。転写中の一時停止は、転写の速度、ひいては、所与の期間内に生産される転写産物の量に影響を及ぼし得る。また、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング、ポリアデニル化および切断の速度は、転写単位によって生産されるｍＲＮＡの量に影響を及ぼし得る。更に、ｍＲＮＡ分子内の配列は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、および、ｍＲＮＡのターンオーバーの速度（すなわち、細胞質内安定性）を調節し得る。
【０００３】
細胞質内蓄積およびｍＲＮＡの安定性を調節する、ｍＲＮＡ分子内の特定の配列が同定され、転写後調節（ＰＲＥ）要素と称される。ＰＲＥ配列は、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）のゲノム、および、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）のゲノムの中において同定された。例えば、Ｄｏｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５０８５−５０９２を参照されたい。
【０００４】
インビトロにおけるポリペプチド（例えば、治療用抗体、成長因子）の発現は、医薬品業界にとって重要であり、タンパク質発現を最大化する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、安定性および発現効率が改善された発現構築物を生成するのに有用なキメラＰＲＥ配列を提供する。一実施形態において、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントとを備えるポリヌクレオチドが提供される。
【０００６】
いくつかの態様において、第１フラグメントは、第２フラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていない。いくつかの態様において、第１フラグメントは、第２フラグメントから１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチドより遠く離れていない。
【０００７】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、転写後調節要素（ＰＲＥ）のガンマサブエレメントから成る第３フラグメントを更に含む。いくつかの態様において、ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１２、１６もしくは２０の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１２、１６もしくは２０と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、ガンマサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、第１フラグメントは、第３フラグメントと第２フラグメントとの間にある。いくつかの態様において、第３フラグメントは、第１フラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていないか、または、代替的に、第１フラグメントから１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１ヌクレオチドより遠く離れていない。
【０００９】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１４および３を連続的に含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の核酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の核酸配列を含む。
【００１０】
また、一実施形態において、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のアルファサブエレメントから成る第２フラグメントと、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第３フラグメントとを備えるポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
いくつかの態様において、アルファサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、９、１４もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、９、１４もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、アルファサブエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、第２フラグメントは、第１フラグメントと第３フラグメントとの間にあり、各フラグメントは、隣接するフラグメントから２０ヌクレオチドより遠く離れていないか、または、代替的に、隣接するフラグメントから１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１ヌクレオチドより遠く離れていない。
【００１２】
更に別の実施形態において、本開示は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントとを備えるポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、（ｃ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のガンマサブエレメントから成る第３フラグメントを更に含む。
【００１３】
また、一実施形態において、本開示のポリヌクレオチドおよびタンパク質コード配列を備えるポリヌクレオチド構築物が提供される。
【００１４】
また、一実施形態において、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと、（ｃ）タンパク質コード配列とを備えるポリヌクレオチド構築物が提供される。
【００１５】
更に、一実施形態において、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）転写後調節要素（ＰＲＥ）のアルファサブエレメントから成る第２フラグメントと、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第３フラグメントと、（ｄ）タンパク質コード配列とを備えるポリヌクレオチド構築物が更に提供される。
【００１６】
更に、一実施形態において、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、９もしくは１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第１フラグメントと、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列から成る第２フラグメントと、（ｃ）タンパク質コード配列とを備えるポリヌクレオチド構築物が更に提供される。
【００１７】
これらの実施形態のいずれかの一態様において、タンパク質コード配列は、第１フラグメントと第２フラグメントとの間に位置する。一態様において、構築物は、３'‐ＵＴＲを更に含む。一態様において、３'‐ＵＴＲは第１フラグメントと第２フラグメントとの間に位置する。一態様において、構築物は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。
【００１８】
また、一実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物を含む細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】様々なαサブエレメントの多重整列を示す。
【００２０】
【図２】様々なβサブエレメントの多重整列を示す。
【００２１】
【図３】様々なγサブエレメントの多重整列を示す。
【００２２】
【図４】ＰＲＥ要素の試験に使用されるプラスミド（ｐＣＴ２．１）の概略図を示す。異なる複数のＰＲＥをリツキシマブ軽鎖コード配列とＢＧＨポリアデニル化シグナルとの間のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
【００２３】
【図５】いくつかのＰＲＥ構築物の２つのアッセイ（２日目および４日目）における力価（μｇ／ｍＬ）を示す。
【００２４】
【図６】多くのＰＲＥ構築物の発現量の相対的な倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示す（棒線：試験１、試験２、平均）。
【００２５】
【図７Ａ】示された多くのＰＲＥ構築物の発現量の相対的な倍率変化を示す。
【図７Ｂ】示された多くのＰＲＥ構築物の発現量の相対的な倍率変化を示す。
【００２６】
【図８Ａ】２日目における構築物ｐＣＴ２．５２の強度をＷＰＲＥ（ｐＣＴ２．０）および対照であるｐＣＴ２．１と比較している。
【図８Ｂ】４日目における構築物ｐＣＴ２．５２の強度をＷＰＲＥ（ｐＣＴ２．０）および対照であるｐＣＴ２．１と比較している。
【００２７】
【図９Ａ】示されている構築物の各々についての一過性発現量の相対的な倍率変化を示す。
【図９Ｂ】示されている構築物の各々についての一過性発現量の相対的な倍率変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［１．定義］
すべての数字の表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量（範囲を含む）は、０．１の変化量で＋または−に変動する近似値である。常に明示的に記述されるわけではないが、すべての数字の表示には、「約」という用語が先行することを理解されたい。常に明示的に記述されるわけではないが、本明細書に記載される試薬は例に過ぎず、そのような試薬の同等物は当技術分野において周知であることも理解されたい。
【００２９】
文脈上の別段の明確な記載がある場合を除き、明細書および請求項において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、複数のものに対する言及を含む。例えば、「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のポリヌクレオチド（それらの混合物を含む）を含む。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかである、任意の長さの高分子形のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造への修飾は、もしある場合、ポリヌクレオチドの構築の前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは重合後、標識部分への連結などにより、更に修飾され得る。また、この用語は、二本鎖および一本鎖の分子両方を指す。別段の記載がある場合、または、必要である場合を除き、本開示の任意の実施形態のポリヌクレオチドは、二本鎖形と、二本鎖形を形成することが知られている、または、予想される、２つの相補的な一本鎖形の各々とを含む。
【００３１】
［２．キメラ転写後調節要素（ＰＲＥ）］
ＤＮＡウイルスである、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などのヘパドナウイルス科は、イントロンを含まないヘパドナウイルスゲノム由来の表面抗原転写産物の細胞質内蓄積を促す、転写後調節要素（ＰＲＥ）と名付けられたＲＮＡ核外輸送要素を含む。同様の、より強力な三成分ＰＲＥがウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に存在し、ＷＨＶ  ＰＲＥまたはＷＰＲＥとして知られている。同様に、ヒトＢ型肝炎ウイルスＰＲＥは、ＨＰＲＥと呼ばれている。ＷＰＲＥは、多種多様なウイルスベクターからの導入遺伝子発現を増加させる。一般的に、ＰＲＥ配列は、一過性遺伝子発現を増進するのに有用である。
【００３２】
一部のＰＲＥ配列（例えばＨＰＲＥ）は、２つの個別かつ連結されたサブエレメントである、αサブエレメント（ＰＲＥα）およびβサブエレメント（ＰＲＥβ）を含み（従って二成分）、一方、他の配列（例えばＷＰＲＥ）は、追加のサブエレメントであるγサブエレメント（ＰＲＥγ）を含む（従って「三成分」）。これらのサブエレメントの各々は、複数の種に跨って非常に良く保存されている。図１〜３における、整列された複数の配列を参照されたい。
【００３３】
ＰＲＥ配列がどのように遺伝子発現に影響を及ぼすかについての機構は、完全に分かっているわけではない。Ｄｏｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．は、「ＨＰＲＥαおよびＨＰＲＥβの順序を切り替えられることは、サブエレメントがモジュールであること、ひいては、サブエレメントが細胞ＲＮＡ結合タンパク質の別個の結合部位を表している可能性がもっとも高いことを示唆している」と説明している（Ｄｏｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  Ｊｕｎ；  ７２（６）：  ５０８５‐５０９２  ａｔ  ５０８５）。Ｄｏｎｅｌｌｏは更に、「三成分ＷＰＲＥが二成分ＨＢＶＰＲＥより著しく強い活性を示すことは、転写後調節効果（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）の強度は、ＲＮＡにおけるサブエレメントの数によって決定されることを実証している」（同出典）ことを発見した。従って、この研究は、任意の個別のサブエレメントの有効性ではなく、むしろ、サブエレメントの数が、ＰＲＥ配列の強度を決定するための主な因子であることを示唆している。
【００３４】
しかしながら、驚くべきことに、および、意外なことに、本開示の実験は、個別のサブエレメントの各々の強度が、ＰＲＥ配列の全体的な強度を決定する上で重要な役割を果たすことを示している。更に、サブエレメントのある特定の組み合わせは、他のものより効果的であり得る。従って、複数の異なるＰＲＥ配列に由来するサブエレメントの特定の組み合わせを有するキメラＰＲＥが提供され、これらの組み合わせを含む構築物の安定性および／または発現量を増加させる上で驚くほど高い活性を有する。
【００３５】
ＷＰＲＥおよびＨＰＲＥに加えて、他のＰＲＥ配列が、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）およびウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）から発見されている。ＰＲＥ配列は、典型的には、高度に保存されている（表１を参照されたい）。
［表１：ＷＰＲＥとの配列同一性］
【表１】
2018534946.tif 000002
【００３６】
下の表２は、天然型ＰＲＥ配列およびキメラＰＲＥ配列を含む、複数の異なるＰＲＥ配列の相対的な活性をまとめている。
［表２：ＰＲＥ配列の相対的な活性］
【表２】
2018534946.tif 000003
【００３７】
表２から分かるように、ＧＳＰＲＥ由来のαサブエレメント、ＨＰＲＥ由来のβサブエレメント、および、ＷＰＲＥ由来のγサブエレメントは、それらの種類の中で、より活性が高いサブエレメントである。更に、以下の組み合わせは優れた活性を示す。
（１）ＧＳＰＲＥのαサブエレメント、ＨＰＲＥのβサブエレメント、任意でＨＰＲＥのγサブエレメント、（２）ＷＰＲＥのγサブエレメント、ＨＰＲＥのβサブエレメント、（３）ＷＰＲＥ、ＢＰＲＥまたはＡＳＰＲＥのαサブエレメント、ＨＰＲＥのβサブエレメント、任意でγサブエレメント。
【００３８】
従って、本開示の一実施形態によれば、ＧＳＰＲＥのαサブエレメント（ＧＳＰＲＥα）およびＨＰＲＥのβサブエレメント（ＨＰＲＥβ）、任意でγサブエレメントを含むキメラＰＲＥが提供され、それらの各々は、生物学的同等物で置き換えることができる。
【００３９】
本明細書において使用される、基準ポリヌクレオチドの「生物学的同等物」とは、基準ポリヌクレオチドに対して特定の配列同一性を有する、または、限定的なヌクレオチドの追加、削除および／または置換によって基準ポリヌクレオチドから修飾された、核酸配列を指す。一実施形態において、特定の配列同一性は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、代替的に、９９％である。一実施形態において、生物学的同等物は、１、２、３、４、または、代替的に５つより多くないヌクレオチドの追加、削除、置換、または、それらの組み合わせによって基準ポリヌクレオチドから修飾されたものである。
【００４０】
この組み合わせの任意のγサブエレメントは、いずれかのＰＲＥに由来する任意のγサブエレメント、または、その生物学的同等物であり得る。一態様において、γサブエレメントは、ＷＰＲＥ、ＧＳＰＲＥ、ＢＰＲＥまたはＡＳＰＲＥに由来する。一態様において、γサブエレメントは、ＷＰＲＥまたはＧＳＰＲＥに由来する。一態様において、γサブエレメントはＷＰＲＥγである。
【００４１】
別の実施形態において、キメラＰＲＥは、ＷＰＲＥに由来するγサブエレメント（ＷＰＲＥγ）、任意のＰＲＥに由来するαサブエレメント、ＨＰＲＥに由来するβサブエレメント（ＨＰＲＥβ）を含み、それらの各々は、生物学的同等物と置き換えることができる。いくつかの態様において、αサブエレメントは、ＧＳＰＲＥ、ＨＰＲＥ、ＷＰＲＥ、ＢＰＲＥもしくはＡＳＰＲＥに由来するか、または、そのようなαサブエレメントの生物学的同等物である。
【００４２】
別の実施形態において、キメラＰＲＥは、ＷＰＲＥ、ＢＰＲＥまたはＡＳＰＲＥのαサブエレメント、および、ＨＰＲＥのβサブエレメント（ＨＰＲＥβ）、任意で、γサブエレメントを含む。一態様において、αサブエレメントはＷＰＲＥに由来する。一態様において、αサブエレメントはＢＰＲＥに由来する。一態様において、αサブエレメントはＡＳＰＲＥに由来する。一態様において、γサブエレメントはＷＰＲＥに由来する。一態様において、γサブエレメントはＧＳＰＲＥに由来する。
【００４３】
キメラＰＲＥがαサブエレメントおよびβサブエレメントのみを有するとき、いくつかの態様において、αサブエレメントは、βサブエレメントと同一の方向であり、その下流にある。いくつかの態様において、αサブエレメントは、βサブエレメントと同一の方向であり、その上流にある。いくつかの態様において、αサブエレメントは、βサブエレメントと比べて反対の方向であり、その上流にある。いくつかの態様において、αサブエレメントは、βサブエレメントと比べて反対の方向であり、その下流にある。
【００４４】
キメラＰＲＥが３つのサブエレメントを全部有するとき、いくつかの態様において、３つのサブエレメントは全部、同一の方向である。一態様において、サブエレメントの順序は、上流から下流の順に、γ‐α‐β、γ‐β‐α、α‐β‐γ、β‐α‐γ、α‐γ‐βまたは、β‐γ‐αである。一態様において、上記の順序のいずれかにおいて、αサブエレメントのみが逆方向である。一態様において、上記の順序のいずれかにおいて、βサブエレメントのみが逆方向である。一態様において、上記の順序のいずれかにおいて、γサブエレメントのみが逆方向である。
【００４５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、任意で、追加的なαサブエレメント、βサブエレメント、および／または、γサブエレメントが任意で存在し得て、これらは、自身の種類のサブエレメントに隣接して配置されてよく、または、異なる種類のサブエレメントによって隔てられてもよい。
【００４６】
いくつかの態様において、２つの隣接するサブエレメントの間に異なる転写調節要素が挿入され得る。例えば、５'‐ＵＴＲもしくは３'‐ＵＴＲが、αサブエレメントとβサブエレメントとの間に、または、γ‐サブエレメントとαサブエレメントとの間に挿入され得る。
【００４７】
上の構成の各々において、各サブエレメントの間、または、サブエレメントと隣接ＵＴＲとの間の距離は調整できる。一態様において、任意の隣接するサブエレメントの間の距離は、５０ヌクレオチドより大きくない。一態様において、任意の隣接するサブエレメントの間の距離は、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチドより大きくない。一態様において、任意の隣接するサブエレメントの間の距離は、少なくとも１、２、３、４、５または１０ヌクレオチドである。
【００４８】
更に、本開示のキメラＰＲＥのサブエレメントの各々は、互いに隣接している必要はなく、発現構築物の他の要素の隣に配置され得ることが想定される。例えば、αサブエレメントおよびβサブエレメントは、目的遺伝子または３'‐ＵＴＲに隣接し得る。一態様において、αサブエレメントは、プロモーターと目的遺伝子との間にあり、βサブエレメントは、目的遺伝子と３'‐ＵＴＲとの間、または、３'‐ＵＴＲの後にある。別の態様において、βサブエレメントは、プロモーターと目的遺伝子との間にあり、αサブエレメントは、目的遺伝子と３'‐ＵＴＲとの間、または、３'‐ＵＴＲの後にある。一態様において、αサブエレメントおよびβサブエレメントの両方は、プロモーターと目的遺伝子との間、または、目的遺伝子と３'‐ＵＴＲとの間にある。γサブエレメントが使用されるとき、上記の位置のいずれかに配置され得て、プロモーターの前、プロモーターと目的遺伝子との間、目的遺伝子と３'‐ＵＴＲとの間、または、３'‐ＵＴＲの後であり得る。
【００４９】
ＨＰＲＥ、ＷＰＲＥ、ＧＳＰＲＥ、ＢＰＲＥおよびＡＳＰＲＥの配列、ならびに、修飾されたバージョンを有するそれらの個別のサブエレメントが、下の表３に示されている。一般的に、αサブエレメントのヌクレオチドは下線付きであり、βサブエレメントのヌクレオチドは太線であり、γサブエレメントのヌクレオチドはイタリックである。
［表３：天然型のＨＰＲＥ、ＷＰＲＥ、ＧＳＰＲＥ、ＢＰＲＥおよびＡＳＰＲＥ、ならびに、天然型または修飾された個別のサブエレメントの配列］
【表３】
2018534946.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００５０】
上の表における配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：が下の表４にまとめられている。
［表４：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：のまとめ］
【表８】
2018534946.tif 000009
【００５１】
試験された一部のキメラＰＲＥ配列の配列が下の表５に示されている。
［表５：キメラＰＲＥの配列］
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【００５２】
下の表６は、一部の追加のＰＲＥ配列およびそれらのサブエレメントの配列を示す。これらは、本開示のキメラＰＲＥを生成するために使用され得る。
［表６：追加の天然型ＰＲＥの配列］
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００５３】
［３．ポリヌクレオチド構築物／ベクター］
本開示の任意のキメラＰＲＥを含むポリヌクレオチド構築物（またはベクター）も提供される。ベクターは、真核細胞（例えば哺乳類細胞）において組み換えポリペプチドを発現するのに有用である。ベクターは、１または複数の目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする配列を含み得る。本開示の目的のために、目的遺伝子は、導入遺伝子とも呼ばれる。
【００５４】
転写および転写後調節配列、 ならびに、任意で翻訳調節配列は、ベクターにおいて目的遺伝子と関連付けられ得る（すなわち、作動可能に連結される）。転写調節配列は、例えば、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む。転写後調節配列は、例えば、イントロンおよびＰＲＥを含む。翻訳調節配列は、例えば、リボソーム結合部位（例えば、コザック配列）を含む。
【００５５】
特定の実施形態において、異種配列の挿入を促進するために、「ポリリンカー」としても知られているマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）がベクター内に存在する。例えば、ＭＣＳは、導入遺伝子配列の挿入を促すために、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に配置され得る。導入遺伝子配列を含むベクターにおいて、プロモーター、導入遺伝子配列およびポリアデニル化シグナルを含むベクターの部分は、「発現カセット」と称される。
【００５６】
真核細胞において活性のあるプロモーターは、当技術分野において周知である。例示的な真核生物プロモーターは、例えば、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス主要最初期（ＭＩＥ）プロモーター、ＥＦ１‐アルファ（翻訳伸長因子‐１αサブユニット）プロモーター、Ｕｂｃ（ユビキチンＣ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、アクチンプロモーターなどを含む。また、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０３１０４、Ｕｅｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：５７９１−５７９８、Ｓｃｈｏｒｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：１７８７−１７８８、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：１０７７８−１０７８４；  Ｄｒｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１（Ｄ１）：Ｄ１５７−Ｄ１６４、および、２０１４年７月１６日にアクセスされた、真核生物プロモーターのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ）も参照されたい。
【００５７】
また、エンハンサーがベクター上に含まれ得る。非限定的な例には、ＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡ配列の中のものが含まれる。過去に、５個の胚性幹細胞（ＥＳＣ）転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｅｓｒｒｂ）がスーパーエンハンサーを占有することが示され、ＥＳＣの制御に貢献する多くの追加の転写因子がある。６個の追加の転写因子（Ｎｒ５ａ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ３、Ｔｃｆ３）は、典型的なエンハンサーおよびスーパーエンハンサーの両方を占有し、これらはすべて、スーパーエンハンサーにおいて多く存在する。これらのいずれか、または、更に当技術分野において周知のものが本明細書において使用され得る。
【００５８】
真核細胞において活性のあるポリアデニル化シグナルが当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、および、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３'末端切断、切断部位におけるｍＲＮＡ前駆体のポリアデニル化、および、ポリアデニル化シグナルの下流における転写の終了を指令する。一般的に、ポリアデニル化シグナルにはコア配列ＡＡＵＡＡＡが存在する。また、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：２１０４−２１１３を参照されたい。
【００５９】
本明細書において開示されるベクターにおいて使用され得る例示的なイントロンには、βグロブリンイントロン、および、「イントロンＡ」としても知られている、ヒト／マウス／ラット／他の種のサイトメガロウイルス主要最初期（ＭＩＥ）遺伝子の第１イントロンが含まれる。
【００６０】
本開示のベクターに含まれ得る更なる転写後調節要素には、これらに限定されないが、ＣＭＶ  ＭＩＥの５'‐未翻訳領域、ヒトＨｓｐ７０遺伝子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子のＳＰ１６３配列、および、アデノウイルス後期ｍＲＮＡに関連付けられた三成分リーダー配列が含まれる。例えば、Ｍａｒｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６９：９−１５を参照されたい。
【００６１】
更なる実施形態において、本明細書において開示されるベクターは、足場付着領域（ＳＡＲ）としても知られているマトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含む。ＭＡＲ（クロマチンを開く）およびＳＡＲ配列は、特に、隣接配列のクロマチン構造（インスレーター）を隔離するように働く。従って、異種配列がしばしば染色体上に組み込まれる安定形質転換細胞において、ＭＡＲまたはＳＡＲ配列は、抑制クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）を有する細胞ゲノムの領域に組み込まれた導入遺伝子の転写の抑制を防止し得る。従って、１または複数のＭＡＲまたはＳＡＲ配列をベクター内に含めることによって、安定形質転換細胞において、ベクターからの導入遺伝子の発現が促され得る。
【００６２】
例示的なＭＡＲおよびＳＡＲ要素は、インターフェロンベータ遺伝子、ニワトリリゾチーム遺伝子、インターフェロンアルファ‐２遺伝子、Ｘ２９遺伝子ＭＡＲおよびＳ４  ＭＡＲに由来するものを含む。ＭＡＲまたはＳＡＲ配列は、ベクター内の任意の位置に配置され得る。特定の実施形態において、ＭＡＲおよび／またはＳＡＲ要素は、目的遺伝子の（転写的な意味で）上流にある発現カセット内に配置され得る。
【００６３】
特定の実施形態において、本明細書において開示されているベクターは、真核細胞において機能する選択マーカー（すなわち、真核選択マーカー）をコードするヌクレオチド配列を含むので、適切な選択が適用されたとき、選択マーカーを含まない細胞は、死ぬか、または、選択マーカーを含む細胞より明らかにゆっくりと増殖する。真核細胞において機能する例示的な選択マーカーは、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子であり、選択は、グルタミンを含まない培地において細胞を培養することによって適用されるか、または、Ｌ‐メチオニンスルホキシイミンを用いて選択されるか、または、その両方である。真核細胞において機能する別の例示的な選択マーカーは、ネオマイシン（ｎｅｏ）に対する抵抗性をコードする遺伝子であり、選択は、ネオマイシン、ゲンタマイシンまたはＧ４１８を含む培地において細胞を培養することによって適用される。追加の選択マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲとも称され、メトトレキサートに対する抵抗性を付与する）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシンに対する抵抗性を提供する）、および、ハイグロマイシンキナーゼ（ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を提供する）が含まれる。真核細胞において機能する更なる追加の選択マーカーが当技術分野において周知である。
【００６４】
上記の１または複数の選択マーカーをコードする配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている。上記のように、真核細胞において機能するプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、当技術分野において周知である。
【００６５】
特定の実施形態において、本明細書において開示されるベクターは、２またはより多くの発現カセットを含み得る。例えば、一方が抗体重鎖をコードし、他方が抗体軽鎖をコードする２つの発現カセットを含むベクターが、機能的な抗体分子の生成のために使用され得る。
【００６６】
また、本明細書において開示されるベクターは、原核細胞において機能する複製起点（すなわち、原核複製起点）を含む。原核細胞において機能する複製起点が当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、大腸菌のｏｒｉＣ起点と、例えばｐＳＣ１０１起点、ｐＢＲ３２２起点（ｒｅｐ）およびｐＵＣ起点などのプラスミド起点と、ウイルス（すなわちバクテリオファージ）複製起点とを含む。原核複製起点を同定するための方法が、例えば、Ｓｅｒｎｏｖａ  ＆  Ｇｅｌｆａｎｄ  （２００８）  Ｂｒｉｅｆ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９（５）：３７６−３９１において提供されている。
【００６７】
また、本明細書において開示されるベクターは、原核細胞において機能する選択マーカー（すなわち原核選択マーカー）を含む。原核細胞において機能する選択マーカーが当技術分野において周知であり、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンのいずれか１つに対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードする配列を含む。アンピシリン（および他のベータラクタム系抗生物質）に対する抵抗性を付与するポリペプチドの例は、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）酵素である。カナマイシン抵抗性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の活性によってもたらされ得て、クロラムフェニコール抵抗性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによってもたらされ得る。
【００６８】
例示的な導入遺伝子には、任意の組み換えタンパク質、または、例えば、ホルモン（例えば成長ホルモンなど）エリスロポエチン、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）、抗体複合体、融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ‐融合タンパク質）、インターロイキン、ＣＤタンパク質、ＭＨＣタンパク質、酵素および凝固因子が含まれる。抗体重鎖および抗体軽鎖は、別個のベクターから、または、２つの発現カセットを含む同一のベクターから発現され得る。
【００６９】
一実施形態において、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターは、本開示のＰＲＥ配列に加えて、以下の要素のうちの１または複数、または、全部を含む。（ａ）下流ＵＴＲの逆相補鎖（ＲＣ−ｄＵＴＲ）下流配列（例えばウイルス配列由来）、（ｂ）プロモーター（例えばウイルスのプロモーター）、（ｃ）未翻訳領域（ＵＴＲ）上流配列（例えばウイルス配列由来）、（ｄ）イントロンＡ（例えばＥＦＩアルファイントロン、または、ウイルス配列由来）、（ｅ）ＵＴＲ下流配列（例えば、ウイルスの３'‐ＵＴＲ）。
【００７０】
一実施形態において、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターは、本開示のＰＲＥ配列に加えて、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｅ）、（ａ）および（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）、（ｃ）および（ｅ）、または、（ｄ）および（ｅ）など、そのような要素のうちの少なくとも２つを含む。
【００７１】
一実施形態において、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターは、本開示のＰＲＥ配列に加えて、（ｂ）および（ｃ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）および（ｅ）、（ｂ）および（ｄ）および（ｅ）、（ａ）および（ｂ）および（ｃ）、（ａ）および（ｂ）および（ｄ）、（ａ）および（ｂ）および（ｅ）、（ａ）および（ｃ）および（ｅ）、（ａ）および（ｃ）および（ｄ）、（ａ）および（ｄ）および（ｅ）など、そのような要素のうちの少なくとも３つを含む。
【００７２】
一実施形態において、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターは、本開示のＰＲＥ配列に加えて、（ａ）および（ｂ）および（ｃ）および（ｄ）、（ａ）および（ｂ）および（ｃ）および（ｅ）、（ａ）および（ｂ）および（ｄ）および（ｅ）、（ａ）および（ｃ）および（ｄ）および（ｅ）、（ｂ）および（ｃ）および（ｄ）および（ｅ）など、そのような要素のうちの少なくとも４つを含む。
【００７３】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ポリアデニル化シグナルが任意で含まれ得る。
【００７４】
ＰＲＥ配列は、ベクターにおける任意の位置に配置され得るが、目的遺伝子と同一の方向であることが好ましい。一態様において、ＰＲＥ配列は、目的遺伝子の上流にある。別の態様において、ＰＲＥ配列は、目的遺伝子の下流にある。一態様において、ＰＲＥ配列は、目的遺伝子とポリアデニル化シグナルとの間に位置する。別の態様において、ＰＲＥ配列は、ポリアデニル化シグナルの下流にある。一態様において、ＰＲＥ配列は、目的遺伝子と３'‐ＵＴＲとの間に位置する。別の態様において、ＰＲＥ配列は３'‐ＵＴＲの下流にある。
【００７５】
［４．細胞および細胞培養］
本開示は、細胞において組み換えポリペプチドを発現するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載されているようなベクターを細胞内に導入する段階と、ベクターが一過的にまたは安定的に細胞内に維持される条件下で細胞を培養する段階とを備える。細胞は、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９を用いた特異的挿入によって生成された安定的な細胞株などの、原核性または真核性の細胞であり得る。組み換えポリペプチドの発現に使用できる培養真核細胞は、当技術分野において周知である。そのような細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞が含まれる。従って、本開示は、本明細書に記載されているようなベクターを含む細胞を提供する。
【００７６】
例示的な酵母細胞には、これらに限定されないが、トリコデルマ・エスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂａｅ）、および、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。例示的な昆虫細胞株には、これらに限定されないが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、および、ドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）細胞が含まれる。例示的な植物細胞には、これらに限定されないが、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞およびタバコＢＹ２細胞が含まれる。
【００７７】
組み換えポリペプチドの発現に有用な培養哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ウイルス性形質転換ＨＥＫ細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２０細胞、ＣＶ‐１細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、３Ｔ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、ＣＡＰ‐Ｔ（登録商標）細胞（後者の２つの細胞株は、ドイツ、ケルンのＣｅｖｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって市販されている）が含まれる。また、ＣＨＯ細胞の多くの派生物、例えば、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＧ−４４、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓなど、または、ＣＨＯ−Ｍ、ＣＫ１  ＳＶ  ＣＨＯ、ＣＨＯＺＮなどの操作されたＣＨＯ細胞が利用可能である。また、哺乳類初代細胞を使用できる。
【００７８】
特定の実施形態において、細胞は無血清培地において培養される。例えば、患者に投与するための治療用タンパク質を製造するために、無血清培地において発現細胞を増殖させる必要がある。更なる実施形態において、細胞は、ポリペプチド発現に使用される前に、無血清培地における増殖のために事前に適応された。
【００７９】
本明細書に記載されているようなベクターは、当技術分野において周知である方法を使用して、上記の細胞のいずれかに導入することができる。そのような方法には、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介法、電気穿孔、バイオリスティックデリバリ（すなわち、微粒子射出）、プロトプラスト融合、ＤＥＡＥデキストラン媒介法、リン酸カルシウム共沈が含まれる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７、および、定期的最新情報を参照されたい。
【００８０】
細胞培養のための標準的方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙの「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００５を参照されたい。
【００８１】
［例］
本開示は、以下の例を参照することによって更に理解されるが、これらの例は本発明の単なる例示に過ぎないものとする。本発明の範囲は、例示されている実施形態によって限定されない。これらの実施形態は、発明の一態様の説明に過ぎないものとする。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な修正形態が、上記の説明および付属図面から、当業者にとって明らかとなるであろう。そのような修正形態は、添付の特許請求の範囲に属する。
【００８２】
［例１：ＰＲＥ配列を試験するためのベクター］
この例において、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの軽鎖をコードする配列を含むベクター（ｐＣＴ２．１）を使用して、トランスフェクションされた細胞におけるｍＲＮＡ量に対する複数の異なるＰＲＥ配列の影響を試験した。
【００８３】
ｐＣＴ２．１ベクターの概略図を図４に示す。軽鎖遺伝子の上流において、ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期（ＭＩＥ）プロモーター、５'未翻訳領域およびイントロンＡを含む。軽鎖遺伝子の下流において、ベクターは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含む。また、ベクターは、原核生物の複製起点（ｏｒｉ）、および、原核細胞における選択のためのマーカー（ｂｌａ）、ならびに、真核生物の選択カセットを含む。真核生物の選択カセットは、ＳＶ４０早期プロモーターおよびＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルの転写制御下にある選択可能マーカー（ＧＳ／ｐｕｒｏ／ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ）を含む。
【００８４】
［例２：ＰＲＥ機能を試験するためのアッセイシステム］
軽鎖発現量に対する、複数の異なるＰＲＥ、修飾されたＰＲＥ、および、ハイブリッドＰＲＥの影響は、軽鎖濃度の測定前に電気穿孔によって、リツキシマブ軽鎖を発現する、ＰＲＥを含むプラスミドをＣＨＯ細胞の中に導入することによって試験された。試験された各ＰＲＥについて、ＰＲＥの配列が化学的に合成され、次に、軽鎖配列とＢＧＨポリアデニル化シグナルとの間に位置するｐＣＴ２．１ベクターにおけるＢａｍＨＩ部位に挿入された（図４を参照されたい）。
【００８５】
これらの実験のために、ＣＨＯＫ１細胞が無血清培地に適応され、電気穿孔を使用してトランスフェクションされた。各トランスフェクションについて、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用し、製造元によって推奨される条件を使用して、ｐＭａｘ  ＧＦＰプラスミドをＰＲＥ試験ベクターと共に（各プラスミドの比率は１：１０）トランスフェクションさせた。
【００８６】
電気穿孔の後、細胞をＴ２５フラスコまたは６ウェルプレート無血清培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）へ移した。３７℃で２４時間培養後、ＶｉＣｅｌｌカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、インディアナ州インディアナポリス）を使用して生細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率を決定した。２４時間後、ＡｃｃｕｒｉＣ６  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用してＧＦＰ発現を測定し、リツキシマブ軽鎖の濃度を決定するためにサンプルを保存した。
【００８７】
リツキシマブ軽鎖の濃度は、トランスフェクションの２４時間後および４８時間後にサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定された。ＥＬＩＳＡのために、プレートをヤギ・ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ）でコーティングした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ・モノクローナル抗ヒトカッパ軽鎖Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰ５０２Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を検出抗体として使用した。ペルオキシダーゼ活性を測定するために、ｏ‐フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が基質として使用され、ＢＭＧ  ＰＯＬＡＲＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＭＴＸ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、バージニア州ヴィーナ）を用いて４８０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【００８８】
［例３：ＰＲＥ配列の比較］
表３に示されている多くの異なるＰＲＥ配列を試験するために、例２に記載のアッセイシステムを使用した。試験ＰＲＥ配列は、リツキシマブ軽鎖配列とＢＧＨポリアデニル化部位との間に位置するＢａｍＨＩ部位で、ｐＣＴ２．１ベクター（上の例１）内に挿入された。
【００８９】
プラスミドの各々は、例２に記載されているように、電気穿孔によって、浮遊培養された無血清培地適応ＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクションされ、トランスフェクションの２４時間後および４８時間後の両方に、リツキシマブ軽鎖の濃度が測定された。ＥＬＩＳＡアッセイから得られた抗体濃度をＧＦＰの平均蛍光強度で割ることによって、異なるサンプル間で軽鎖発現を標準化され、標準化された軽鎖発現量が測定された。
【００９０】
表７は、例において試験されたＰＲＥのサブエレメント構造を示す。
［表７：例において試験されたＰＲＥ（「‐」は、サブエレメントが無いことを示す）］
【表１５】
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＊変異サブエレメント
【００９１】
図５は、トランスフェクションの２日後および４日後に、多くのＰＲＥ構築物を比較した結果を示す。構築物２．０（ＷＰＲＥ）および２．８（ＧＳＰＲＥ）は、同様の効力を有する。しかしながら、ＧＳＰＲＥにおけるγサブエレメントがＷＰＲＥのγサブエレメントと置き換えられたとき、融合構築物（２．４）は、ＷＰＲＥまたはＧＳＰＲＥのいずれかより３３％強力であった。このことは、ＷＰＲＥのγサブエレメントがＧＳＰＲＥより強く、一方、ＧＳＰＲＥの他のサブエレメント（例えば、αサブエレメント）がＷＰＲＥより強い可能性があることを実証している。
【００９２】
ＢＰＲＥ（２．９）は、３つの要素を全部含んでいるが、それでもＢＰＲＥはＷＰＲＥより遥かに弱い。このことは、三成分である（すなわち、３つのサブエレメントを全部含む）からといってＰＲＥ要素が強力になるわけではないことを示唆している。むしろ、その強度の大部分は、各個別のサブエレメントの強度に依存する。同様に、二成分構築物２．５は、三成分構築物２．８、２．９および２．１０より強い。
【００９３】
上記の発見に基づき、この例では、構築物２．２１（ＢＰＲＥのγサブエレメントを削除し、そのβサブエレメントをＨＰＲＥのものと置き換えた）、２．２２（αサブエレメントに点変異を導入した）、２．２３（ＧＳＰＲＥのβサブエレメントをＨＰＲＥのものと置き換えた）、および、２．２４（２．２３のγおよびαサブエレメントの各々に点変異がある）を更に設計した。
【００９４】
比較を図６に示す。構築物２．２１、２．５、２．６および２．７は、任意のγサブエレメントが欠如したＰＲＥであるが、それでもすべて、γサブエレメントを含むＷＰＲＥと同じくらい良いか、または、より優れている。従って、この実験から、ＰＲＥ要素の強度がサブエレメントの数より、各サブエレメントの強度に依存することが更に確認された。
【００９５】
これらのＰＲＥ構築物は再度、８回繰り返して試験された。その結果は、図７Ａおよび図７Ｂに示されている。ＢＰＲＥαおよびＨＰＲＥβ（２．２１）の組み合わせは、発現量がもっとも高いものの１つであり、発現量が７２％増加した。しかしながら、α（２．２２）における点変異は、発現量を１９％だけ増加させる構築物をもたらす。更に、２．２１のαサブエレメントをノックアウトすると、構築物の有効性が２６％になる。このことは、ＢＰＲＥαサブエレメントの重要性を示唆している。
【００９６】
ＧＳＰＲＥのβサブエレメントをＨＰＲＥのβサブエレメントで置き換えたもの（２．２３）は、発現量が４６．６％増加し、一方、ＷＰＲＥガンマ置換（２．４）では、発現量が３３％増加した。従って、ＨＰＲＥのβサブエレメントは、ＷＰＲＥのγサブエレメントより強力である。
【００９７】
従来は、「転写後調節効果の強度は、ＲＮＡにおけるサブエレメントの数によって決定される」（Ｄｏｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  Ｊｕｎ；  ７２（６）：  ５０８５‐５０９２  ａｔ  ５０８５）と考えられていた。しかしながら、本実験はここで、ＢＰＲＥのアルファ、ＨＰＲＥのベータ、および、ＷＰＲＥのガンマ要素の各々を、それぞれの分子の機能におけるもっとも重要な部分として示している（２．２１および２．２２、２．２３および２．８、２．４および２．８）。従って、従来の理解とは対照的に、本研究は、ＰＲＥの強度はサブエレメントの数に依存せず、各サブエレメントの強度に依存することを示している。
【００９８】
図８Ａおよび図８Ｂは、構築物２．５２を２．０および２．１と比較する、２つの実験の集計データを示している。４日目において、ｐＣＴ２．５２（ＷＰＲＥガンマ＋ＧＳＰＲＥアルファ＋ＨＰＲＥベータ）は、２．０（ＷＰＲＥ）より２倍強い。また、ｐＣＴ２．０（ＷＰＲＥ）は、発現量が最高に到達した後に発現量が一定に留まるので、対照に対する優位性を次第に失うが（図８Ｂにおける４日目を図８Ａにおける２日目と比較）、一方、新しく設計されたキメラｐＣＴ２．５２ＰＲＥは、対照と併せて発現量が増加し続けたことに留意することも興味深い。
【００９９】
ＰＲＥ構築物は全部、８回反復して再度試験され、最終データは、上の表２に示されている。
【０１００】
［例４：天然型ＰＲＥと他の調節要素との間の相互作用］
この実験では、ＰＲＥと他の調節要素との間の関係を試験した。下の表８に列挙された構築物は、示されているプロモーターまたは他の調節要素を含んでいる。更に、構築物２．５２、２．５３および２．５４は、２．５２について表２に示されているようなＰＲＥサブエレメントを含む。これらには、ＷＰＲＥのγサブエレメント、ＧＳＰＲＥのαサブエレメント、ＨＰＲＥのβサブエレメントが含まれる。構築物２．０、２．３６、２．３９および２．５０は、天然型ＷＰＲＥ（すなわち、全部ＷＰＲＥに由来するγ、α、βサブエレメント）を含み、構築物２．１、２．３２、２．３７および２．５１は、任意のＰＲＥ要素を含まない。
［表８：例において試験された構築物（「‐」は、要素が欠如していることを示す）］
【表１６】
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【０１０１】
図９Ａは、ＲＣ−ｄＵＴＲ、Ｕ−ＵＴＲ、イントロンＡおよび／またはｄ−ＵＴＲが構築物から除去されたとき、構築物２．５２（すなわち、ＷＰＲＥのγサブエレメント、ＧＳＰＲＥのαサブエレメント、ＨＰＲＥのβサブエレメント）のキメラＰＲＥの有効性が減少したことを示す。驚くべきことに、そのような除去は、ＷＰＲＥについて顕著な負の影響を示さなかった（図９Ｂにおける構築物２．０、２．３２、２．３７、２．５０を比較）。対照として、ＰＲＥ要素が使用されなかったとき、これらの更なる調節要素の除去は、負の影響を与えた（図９Ｂの左半分を参照）。
【０１０２】
従って、この実験は、天然型ＷＰＲＥ要素が、更なる調節要素、ＲＣ−ｄＵＴＲ、Ｕ−ＵＴＲ、イントロンＡまたはｄ−ＵＴＲのうちの１または複数の存在による恩恵を受けなかったことを示唆する。天然型ＷＰＲＥ、および、これらの調節要素のうちの１または複数は、冗長な機能を有し得ると考えられる。また、これらの調節要素のうちの１または複数と天然型ＷＰＲＥ要素との間の他の種類の相互作用もあり得る。そのような非生産的相互作用が、試験されたキメラＰＲＥ要素では観察されなかったことも、そのようなキメラＰＲＥ要素の予想外の利点を更に強調する。
【０１０３】
本発明は、上記の実施形態と併せて説明されたが、上記の説明は例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではなく説明することを意図していることを理解されたい。本発明の範囲における、他の態様、利点および修正形態は、本発明に関連する当業者にとって明らかであろう。
【０１０４】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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