(57)【要約】本出願は、絹フィブロイン系材料、その製造方法及び使用方法に関する。提供される材料は、天然又は合成材料のいずれかに由来する現在の記憶ポリマーと比較して、同等な又はより良好な体積膨潤、生体適合性及び／又は劣化分解性を示すと同時に形状記憶特性を示す。本開示の実施形態は、生体材料、生体医学器具、バイオセンシング、制御された放出用途、ドラッグデリバリー、エレクトロニクス、劣化分解が調整可能な材料、光学、フォトニクス、補綴、再生医療、ロボット工学、組織工学用途、組織再生、組織骨格（スキャフォールディング）及び／又は創傷凝固を含む広範囲の用途に有用であるが、これらに限定されるものではない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹材料であって、相互連結し、均一な間隔をおいて配置された、丸い形態を有する細孔と、氷結晶が実質的に存在しないことと、実質的に均一な細孔形状と、又はそれらの組み合わせと、を特徴とする構造を有し、前記絹材料は、ａ）圧縮前の前記材料の初期体積に対して減少した体積の圧縮状態に圧縮されやすい、ｂ）環境トリガーに応答して、前記圧縮状態から、前記初期体積に匹敵する膨張体積を有する膨張状態に膨張する能力を特徴とする、絹材料。
【請求項２】
絹材料であって、トリガーを受けた場合、少なくとも２倍の体積膨張、及び／又は約４００％の質量増加を達成し、相互連結し、均一な間隔をおいて配置された、丸い形態を有する細孔と、氷結晶が実質的に存在しないことと、実質的に均一な細孔形状と、又は  それらの組み合わせと、を特徴とする構造を有するスポンジを形成することを特徴とする構造を有する、絹材料。
【請求項３】
前記材料は、圧縮後にトリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、体積膨張することを特徴とする、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項４】
膨潤は、少なくとも２倍、及び／又は約４００％である、請求項３に記載の絹材料。
【請求項５】
前記トリガーは、水性媒体、熱、電場又は磁場、ｐＨ、光、圧力、イオン、酵素、及び糖からなる群から選択される１つ又は複数の要素を含む、請求項３に記載の絹材料。
【請求項６】
前記トリガーは、水、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、ダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）、体液、又はそれらの組み合わせであり、前記材料は、乾燥した場合に圧縮されたままであり、前記水性媒体中への浸漬後にのみ膨張する、請求項５に記載の絹材料。
【請求項７】
前記絹材料は、約５００Ｄａ〜約３０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する絹フィブロインを含む、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項８】
前記絹材料は、約０．１％〜約５０％の範囲内の濃度の絹フィブロインを含む、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項９】
可塑剤を含む、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項１０】
前記可塑剤は、グリセロール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、１，４ブタンジオール、１，２，４ブタントリオール、スレイトール、エリスリトール、１，２ペンタンジオール、１，５ペンタンジオール、アドニトール、１，２，６ヘキサントリオール、及び糖、からなる群から選択される１つ又は複数の要素を含む、請求項９に記載の絹材料。
【請求項１１】
前記可塑剤は非毒性である、請求項９に記載の絹材料。
【請求項１２】
前記可塑剤はグルコース、ソルビトール、又はマンニトールである、請求項１０に記載の絹材料。
【請求項１３】
可塑剤：絹の重量比が、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、若しくは７５％、及び／又は約０．０５〜約０．８である、請求項９に記載の絹材料。
【請求項１４】
前記絹フィブロインは、チロシン残基の約５％〜約７５％が共有結合的に修飾されている修飾された絹フィブロインである、請求項８に記載の絹材料。
【請求項１５】
前記材料は、発泡体、ファイバー、メッシュ、フィルム、ハイドロゲル、又はそれらの組み合わせである、請求項８に記載の絹材料。
【請求項１６】
前記材料は、約５μｍ〜約５００μｍの範囲内の平均細孔径を有する、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項１７】
前記材料は、体積全体にわたって均一である細孔を特徴とする、請求項１又は２に記載の絹材料。
【請求項１８】
前記材料は、約５ｋＰａ〜約２５００ｋＰａの範囲内の弾性率値を特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の絹材料。
【請求項１９】
前記材料は、約５００Ｐａ〜約１５００ｋＰａの範囲内の弾性率値を特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の絹材料。
【請求項２０】
前記材料は、約５００Ｐａ〜約１５００ｋＰａの範囲内の貯蔵弾性率値を特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の絹材料。
【請求項２１】
前記材料は、最大９０％の圧縮歪みを受けた場合、前記材料は、前記トリガーを受けた場合、塑性変形の兆候を示さずに復元することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の絹材料。
【請求項２２】
前記材料は、前記トリガーを受けた場合、塑性変形の兆候を示さずに最大１００ｋＰａの圧縮応力から復元する、請求項２１に記載の絹材料。
【請求項２３】
前記材料は、溶媒に曝された場合、復元する、請求項２１に記載の絹材料。
【請求項２４】
前記材料は、溶媒に曝された場合、出発質量から最大約９００％膨潤することを特徴とする、請求項９に記載の絹材料。
【請求項２５】
前記材料は、溶媒に曝された場合、出発体積から最大約５０倍体積膨潤することを特徴とする、請求項９に記載の絹材料。
【請求項２６】
前記材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の絹材料。
【請求項２７】
前記添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分は、治療剤、細胞、有機体、抗体、核酸、増殖因子、ホルモン、ポリペプチド、及び／又は光学的若しくは電気的活性作用物質からなる群から選択される１つ又は複数の要素を含む、請求項２６に記載の絹材料。
【請求項２８】
前記作用物質及び／又は添加剤は、抗生物質、小分子、酵素、酵素阻害剤、抗炎症剤及び／又は薬剤を含む、請求項２７に記載の絹材料。
【請求項２９】
前記膨潤した材料は前記作用物質を取り込む、請求項２６に記載の絹材料。
【請求項３０】
前記材料は、材料作製中に前記作用物質が予め添加されている、請求項２６に記載の絹材料。
【請求項３１】
前記材料は、生体内に存在する場合、細胞によって浸潤されることを特徴とする、請求項２６に記載の絹材料。
【請求項３２】
前記材料は、生体内に存在する場合、著しい免疫反応なしに、分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解することを特徴とする、請求項２６に記載の絹材料。
【請求項３３】
前記膨潤は、少なくとも６倍である、請求項９に記載の材料。
【請求項３４】
前記膨潤は、最大約５０倍である、請求項９に記載の材料。
【請求項３５】
前記膨潤は、最大約９００％である、請求項９に記載の材料。
【請求項３６】
方法であって、絹フィブロイン溶液を、絹のガラス転移温度より低い凍結温度に冷却する工程を含み、前記冷却する工程は、前記絹溶液が、相互連結し、均一な間隔をおいて配置された、丸い形態を有する細孔と、氷結晶が実質的に存在しないことと、実質的に均一な細孔形状と、又はそれらの組み合わせと、を特徴とする絹材料を形成するのに十分に遅いと判断された速度で実施される、方法。
【請求項３７】
前記絹材料は、約５００Ｄａ〜約３０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する絹フィブロインを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記絹フィブロイン溶液は、約０．１％〜５０％の絹を含有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記絹フィブロイン溶液は、可塑剤を含有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記可塑剤は、グリセロール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、１，４ブタンジオール、１，２，４ブタントリオール、スレイトール、エリスリトール、１，２ペンタンジオール、１，５ペンタンジオール、アドニトール、１，２，６ヘキサントリオール、及び糖、からなる群から選択される１つ又は複数の要素を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記可塑剤は非毒性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記可塑剤はグルコース、ソルビトール、又はマンニトールである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
可塑剤：絹の重量比が、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、若しくは７５％、及び／又は約０．０５〜約０．８である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記絹フィブロインは、チロシン残基の約５％〜約７５％が共有結合的に修飾されている修飾された絹フィブロインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記絹フィブロイン上のチロシン残基をスルホン酸で修飾する工程、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記修飾する工程は、ジアゾニウムカップリング反応により反応させ、スルホン酸修飾チロシン残基を形成する工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記材料を不溶性にするために前記材料を処理する工程を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記処理する工程は前記材料をメタノールへ曝す工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記材料は２０％を超える可塑剤を有する場合、前記材料は不溶性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記速度は、固定速度である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記凍結温度は、約−２０℃未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記凍結温度は、約−２０℃〜約−５０℃の範囲内である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
前記凍結温度は、約−５０℃未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記冷却速度は、約−１．０℃／分未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
前記冷却速度は、約−１０℃／分〜約−０．００５℃／分の範囲内である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５６】
前記冷却速度は、約−０．０１℃／分〜約−０．１℃／分の範囲内である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５７】
前記冷却速度は、約−０．１℃／分未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５８】
前記冷却速度は、約−０．０５℃／分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５９】
前記冷却する工程は、絹フィブロイン溶液を容器内に維持する工程を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６０】
前記容器はアルミニウムである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記容器は熱伝導性である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記熱伝導性は、約１６７Ｗ／ｍ−Ｋ（メートル法）又は１１６０ＢＴＵ−ｉｎ／ｈｒ−ｆｔ２−°Ｆ（英語）と同等以上である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記容器の熱伝導率及び形状は、前記材料を均一に凍結させる形状である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記材料の貯蔵弾性率値を約５ｋＰａ〜約２０００ｋＰａの範囲内に調整することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６５】
前記材料の貯蔵弾性率値を約５ｋＰａ〜約１５００ｋＰａの範囲内に調整することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６６】
前記材料の貯蔵弾性率値を約５００Ｐａ〜約１５００ｋＰａの範囲内に調整することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６７】
前記調整する工程は、前記絹フィブロイン水溶液中の前記絹フィブロインの平均分子量を約１０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの範囲内で変化させる工程を含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法
【請求項６８】
前記調整する工程は、前記絹フィブロイン水溶液の濃度を約０．１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％の範囲内で変化させる工程を含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記調整する工程は、可塑剤含量を約４０％（ｗ／ｗ）まで変化させる工程を含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記調整する工程は、スルホン酸修飾チロシン残基を約５％〜約７５％の間で変化させる工程を含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
方法であって、絹記憶発泡体材料に圧縮力を印加して圧縮する工程と、圧縮された材料が環境トリガーを受けて、膨張して絹スポンジを形成する工程と、を含み、前記絹スポンジは、圧縮前の前記絹記憶発泡体の体積に匹敵する体積、及び  相互連結し、均一な間隔をおいて配置された、丸い形態を有する細孔と、氷結晶が実質的に存在しないことと、実質的に均一な細孔形状と、又は  それらの組み合わせと、を特徴とする構造を有する、方法。
【請求項７２】
前記絹記憶発泡体材料は、絹フィブロイン、及び可塑剤を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記絹スポンジは、約５００Ｄａ〜約３０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する絹フィブロインを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記絹スポンジは、約０．１％〜約５０％の範囲内の濃度の絹フィブロインを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記可塑剤は、グリセロール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、１，４ブタンジオール、１，２，４ブタントリオール、スレイトール、エリスリトール、１，２ペンタンジオール、１，５ペンタンジオール、アドニトール、１，２，６ヘキサントリオール、及び糖、からなる群から選択される１つ又は複数の要素を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
可塑剤：絹の重量比が、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、若しくは７５％、及び／又は約０．０５〜約０．８である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記絹フィブロインは、チロシン残基の約５％〜７５％が共有結合的に修飾されている修飾された絹フィブロインである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記絹スポンジは、約５μｍ〜約５００μｍの範囲内の平均細孔径を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記絹スポンジは、体積全体にわたって均一である細孔を特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記絹スポンジは、約５ｋＰａ〜約２５００ｋＰａの範囲内の弾性率値を特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
前記絹スポンジは、約５００Ｐａ〜約１５００ｋＰａの範囲内の圧縮弾性率値を特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８２】
前記絹スポンジは、約５００Ｐａ〜約１５００ｋＰａの範囲内の貯蔵弾性率値を特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記絹スポンジは、最大９０％の圧縮歪みを受けた場合、前記材料は、前記トリガーを受けた場合、塑性変形の徴候を示さずに復元することを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８４】
前記絹スポンジは、前記トリガーを受けた場合、塑性変形の兆候を示さずに最大１００ｋＰａの圧縮応力から復元する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記絹スポンジは、溶媒に曝された場合、復元する、請求項７０に記載の方法。
【請求項８６】
前記絹スポンジは、溶媒に曝された場合、出発質量から最大約９００％膨潤することを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８７】
前記絹スポンジは、前記溶媒に曝された場合、出発体積から最大約５０倍体積膨潤することを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８８】
前記膨潤は、少なくとも６倍である、請求項７０に記載の方法。
【請求項８９】
前記膨潤は、最大約５０倍である、請求項７０に記載の方法。
【請求項９０】
前記膨潤は、最大約９００％である、請求項７０に記載の方法。
【請求項９１】
前記受ける工程は、水性媒体中でインキュベーションを行う工程を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項９２】
前記媒体は、水、ＰＢＳ、細胞培地である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記インキュベーションを行う工程は、約１時間未満行われる、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記インキュベーションを行う工程は、少なくとも１２〜２４時間行われる、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、「形状記憶絹材料」と題する２０１５年３月１２日に出願された米国仮出願第６２／１３２，４２９号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金ＥＢ００２５２０及び米国陸軍から授与された助成金Ｗ８１ＸＷＨ−１４−２−０００４の下での政府の支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
刺激応答性ポリマーは、変形された形状から、外的刺激の存在下で元の予め定義された形状に復元することができる「スマートな」材料のサブクラスである。この挙動を示す材料は、形状記憶ポリマー（ＳＭＰ）としてよく知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
とりわけ、本開示は、形状記憶特性を有する絹フィブロイン系材料を提供する。本開示はまた、このような絹フィブロイン系材料を製造する、及び使用する方法を提供する。
【０００５】
本開示の実施形態は、生体材料、生体医学器具、バイオセンシング、制御された放出用途、ドラッグデリバリー、エレクトロニクス、劣化分解が調整可能な材料、光学、フォトニクス、補綴、再生医療、ロボット工学、組織工学用途、組織再生、組織骨格（スキャフォールディング）及び／又は創傷凝固を含む広範囲の用途に有用であるが、これらに限定されるものではない。
【０００６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料には、特に、充填剤、パッキング材料、センサとして多数の独特の用途に、及び様々な器具に可能性を与える。提供される絹フィブロイン系材料は、例えば、埋め込み型生体医学器具として有用である。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は圧縮可能であり、それらの生体内移植のための挿入器具に導入されてもよい。  移植されると、このような材料は、例えばトリガー及び／又は外部刺激によって膨張し得る。いくつかの実施形態では、このような材料は、膨張時に、実質的に元の形状に復元する。したがって、このような材料からなる生体医学器具を、例えば、低侵襲技術により移植することができる。このような低侵襲移植技術は、しばしば、複雑で侵襲性の高い外科手術及び／又は医療処置よりも望ましい。
【０００７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、圧縮されやすい（例えば、材料は、少なくとも２つの異なる状態、即ち圧縮前の状態と圧縮状態をとることができる、並びにいくつかの実施形態では、少なくとも３つの異なる状態、即ち圧縮前の状態、圧縮状態、及びいくつかの実施形態では実質的に圧縮前の状態と同一でありうる膨張状態をとることができる、という特徴がある）。いくつかの実施形態では、圧縮は、材料の体積を、圧縮前の初期の体積に対して減少させる。代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、圧縮により形状変形を生じる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の圧縮された絹フィブロイン系材料は、圧縮されていない他の同一の材料と比べて、より小さな体積及び／又は変形した形状を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の絹フィブロイン系材料は、それらが圧縮状態にある場合、トリガー及び／又は外部刺激を受けるまで、その減少した体積及び／又は変形した形状を保持することを特徴とする。
【０００９】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、圧縮された絹フィブロイン系材料はより大きな体積に、いくつかの実施形態では、それらの圧縮前の体積と実質的に同一の体積まで、復元する。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた後、圧縮された絹フィブロイン系材料は、変形していない形状に復元し、いくつかの実施形態では、圧縮前の形状と実質的に同一形状に復元する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、圧縮された絹フィブロイン系材料は、その圧縮状態からの体積膨張を特徴とする。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、圧縮された絹フィブロイン系材料は膨潤する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激は、例えば、熱、電場又は磁場、ｐＨ、光、圧力、水、イオン、酵素又は糖、及びそれらの組み合わせを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激は、例えば水性媒体、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）等、又は細胞培養培地、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）、ウシ胎児血清、体液、又はそれらの組み合わせへの絹フィブロイン系材料の曝露を含む、又はそれらからなる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、蚕を含む様々な昆虫の絹から産生される絹フィブロインである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料が、特定の分子量範囲内の絹フィブロインを含むことを特徴とするならば、本明細書に記載のように、材料は１つ又は複数の望ましい特性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の絹フィブロイン系材料を選択、設計及び／又は製造する技術が、特定の分子量範囲内でこのような絹フィブロインを選択、設計及び／又は製造を含むならば、１つ又は複数の望ましい（例えば、所定の所望の）特性を有する材料が提供される。
【００１４】
例えば、いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片である、又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、様々な分子量の絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片を使用することができる。いくつかの実施形態では、様々な分子量の絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片は、絹フィブロインポリペプチドである、又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロインポリペプチドの平均分子量は、例えば、約３ｋＤａ〜約４００ｋＤａである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、特定の分子量範囲内の絹フィブロインポリペプチドの調製を、熱処理（例えば、煮沸）により調製することができる。いくつかの実施形態では、このような熱処理は、特定の期間、例えば約５分〜約１２０分又はそれ以上の範囲内で適用される。絹フィブロインの水溶液については、煮沸時間と絹フィブロイン分子量の関係が確立されている。したがって、当業者であれば、本明細書に記載の絹フィブロイン系材料を調製するために、目的の分子量範囲内で絹フィブロインポリペプチドを適切に調製することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、絹フィブロインは、絹水溶液から調製される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、絹水溶液から調製された絹フィブロイン系材料は、例えば、望ましい機械的、電気的及び光学的特性、環境安定性、生体適合性、並びに調整可能な劣化分解を含む好ましい特性を示した。
【００１８】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、約１％絹〜約５０％絹の間の絹溶液濃度を有する絹溶液（例えば、水溶液）から調製される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、絹溶液（例えば、水溶液）から調製され、様々な材料フォーマット、例えば、繊維、発泡体、粒子、フィルム及び／又はヒドロゲル等を形成する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、修飾された絹からなる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、修飾された絹は、（例えば、アミノ酸のＲ基への）１つ又は複数のペンダント部分の付加、１つ又は複数の非天然アミノ酸の包含、１つ又は複数の成分、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子、金属等、との会合（例えば、との共有結合）により、非修飾絹とは異なる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹フィブロイン系材料の製造中に、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹溶液中の絹と反応するため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹フィブロイン系材料の製造中に、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹溶液と混合されるため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹フィブロイン系材料と混合され、添加され、適用されるため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、添加剤、作用物質及び／又は、機能的部分が絹フィブロイン系材料中の絹と反応するため、非修飾絹とは異なる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、このような修飾された絹からなる絹フィブロイン系材料は、例えば、本明細書に記載のようないくつかの絹フィブロイン系材料の特有の膨潤特性を特徴とする。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、非修飾絹に比べて改善された親水性を示す。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、非修飾絹に比べて水を吸収する能力が向上している。
【００２４】
いくつかの特定の実施形態では、例えば、修飾された絹は、４−スルホン酸による修飾により天然の絹とは異なる。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は、（例えば、ポリリジン部分及び絹フィブロイン部分を含む融合ペプチドである）ポリリジンで修飾される。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹はペグ化される。他の例示的な可塑剤は、本出願全体に渡って記載されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、修飾された絹は、非修飾絹に比べて改善された疎水性を示す。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹材料中の非極性流体（例えば、油又は脂肪）の吸収を増加させることができる。
【００２６】
いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は４−（ヘプチルオキシ）アニリンで修飾される。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は４’−アミノアセトフェノンで修飾される。他の例示的な可塑剤は、本出願全体に渡って記載されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、修飾された絹フィブロイン系は、１つ又は複数の修飾アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸残基は修飾チロシン残基である。いくつかの実施形態では、修飾チロシン残基は（例えば、１つ又は複数のペンダント基の付加により）共有結合的に修飾される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の絹フィブロイン系材料中の約５％〜約７５％の絹フィブロインは、修飾された絹である、又はこれを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は可塑剤を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、可塑剤を含まない他の同一の材料と比べて、このような材料のいくつかの特性を高める。いくつかの実施形態では、可塑剤は、絹フィブロイン系材料の結晶化度を高める。
【００３１】
いくつかの実施形態では、可塑剤は、例えば、グリセロール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、１，４ブタンジオール、１，２，４ブタントリオール、スレイトール、エリスリトール、１，２ペンタンジオール、１，５ペンタンジオール、アドニトール、１，２，６ヘキサントリオール、糖、例えばグルコース、ソルビトール、若しくはマンニトール等、又はそれらの組み合わせである、又はそれらを含むことができる。他の例示的な可塑剤は、本出願にわたって記載されている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、可塑剤は非毒性である。いくつかの実施形態では、非毒性可塑剤は、絹フィブロイン系材料の生体適合性を維持する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、可塑剤の絹に対する比は、可塑剤重量の絹重量に対して約１％〜約７５％の間である。いくつかの実施形態では、可塑剤の絹に対する重量比は、約０．０５〜約０．８である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は水に不溶性である。いくつかの実施形態では、少なくとも２０％の可塑剤を有する絹フィブロイン系材料は水に不溶性である。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は不溶性であるように処理される。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料はメタノール中に浸漬される。いくつかの実施形態では、このようなメタノール処理された絹フィブロイン系材料は水に不溶性である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料に組み込まれる場合、異なる分子組成の可塑剤は、様々な細孔特性及び／又は様々な特性を有する絹フィブロイン系材料を産生する。いくつかの実施形態では、特性は、例えば、機械的、光学的、及び／又は電気的特性を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、既存の形状記憶ポリマーを超える利点を提供する特有の特性を特徴とする。いくつかの実施形態では、可塑剤と修飾された絹である絹、又は修飾された絹である絹又は修飾された絹を含む絹、両方を含む絹フィブロイン系材料は、本明細書に記載の特有の膨潤特性を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、圧縮された絹フィブロイン系材料は、その材料の圧縮状態の体積から少なくとも２倍の体積膨潤を示す。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、圧縮された可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、その材料の圧縮状態の体積から最大約５０倍の体積膨潤を示す。
【００３８】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激（例えば水性媒体）を受けた場合、圧縮された絹フィブロイン系材料は、その材料の圧縮状態から少なくとも約４００質量％の膨潤を示す。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激（例えば水性媒体）を受けた場合、圧縮された可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、その材料の圧縮状態から最大約９００質量％の膨潤を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、細孔である、又は細孔として記載される連続気泡を含む構造を有する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、氷結晶が実質的にないことを特徴とする。
【００４１】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料中の細孔が、実質的に均一な丸い形状であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料中の細孔は、体積全体にわたって均一に間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料中の細孔は、バルク材料を横切る相互連結した細孔であり、いくつかの実施形態では、このような相互連結した細孔はバルク材料全体を横切る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料中の細孔は、約５μｍ〜約５００μｍの平均直径を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように、絹フィブロイン系材料は、圧縮後に実質的に復元することを特徴とする。いくつかの実施形態では、平均細孔径が、その圧縮前の状態の細孔径と比べて圧縮及び／又は膨張からの復元後に実質的に同一であるので、提供される絹フィブロイン系材料中の平均細孔径は、圧縮又は膨張によって損なわれない。いくつかの実施形態では、材料の細孔形態を特徴付ける１つ又は複数の特徴は、圧縮及び／又は膨張から復元した後の材料の細孔形態が、その圧縮前の状態と比べて実質的に同一であるという点で、提供される絹フィブロイン系材料中の材料の細孔形態は、圧縮によっても膨張によっても損なわれない。
【００４４】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約１ｋＰａ〜約２５００ｋＰａの範囲の弾性率値を特徴とする。
【００４５】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約５００Ｐａ〜約３０００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率値を特徴とする。
【００４６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約１ｋＰａ〜約３０００ｋＰａの範囲の貯蔵弾性率値を特徴とする。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように、提供される絹フィブロイン系材料は、圧縮歪みを受けると、それらの体積及び／又は形状を実質的に復元することを特徴とする。
【００４８】
いくつかの実施形態では、最大９０％の圧縮歪みを受けると、絹フィブロイン系材料は、元の体積の約１０％以下に圧縮される。いくつかのこのような実施形態では、提供される圧縮された絹フィブロイン系材料は、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、それらの体積及び／又は形状を実質的に復元することを更に特徴とする。いくつかの実施形態では、復元した材料は、実質的に塑性変形の兆候が全くない。
【００４９】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は最大約１００ｋＰａの圧縮応力を受けると、このような材料は、トリガー及び／又は外部刺激を受け、それらの体積及び／又は形状を実質的に復元することを更に特徴とする。いくつかの実施形態では、復元した材料は、実質的に塑性変形の兆候が全くない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は生体適合性である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分としては、例えば、治療剤、細胞、有機体、抗体、核酸、増殖因子、ホルモン、ポリペプチド、及び／又は光学的に若しくは電気的活性作用物質が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分としては、例えば、抗生物質、小分子、酵素、酵素阻害剤、抗炎症剤及び／又は薬剤が挙げられる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、材料作製中に添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分が予め添加されている。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、材料が圧縮前の状態にある場合、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を取り込む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、材料が膨張状態にある場合、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を取り込む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、材料を圧縮及び／又は膨張から復元させる場合、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を取り込む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は生分解性である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、このような材料は分解し（decompose）、劣化分解し（degrade）、剥離し、又は溶解することを特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、このような材料が分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解して、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を放出することを特徴とする。
【００５５】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は生体内に導入される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、圧縮状態で、本明細書に記載の絹フィブロイン系材料を生体内に移植する。  いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、このような材料が圧縮状態にあるときに、移植器具（例えば、針又はカニューレ）に導入される。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、移植された絹フィブロイン系材料は、体内の空間を満たすように膨潤するという点を更に特徴とする。いくつかの実施形態では、形状記憶特性を有する絹フィブロイン系材料は、それらを圧縮して挿入器具に適合させることを可能にし、その後、組織の再生要件を維持しながら、生理学的トリガー等のトリガーによって元の形状に膨張させることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は細胞浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、生体内に存在する場合にそれらが浸潤することを特徴とする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、生体内に存在する場合、分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解する。  いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、生体内に存在する場合、著しい免疫反応なしに、分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解する。  いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、予測可能な劣化分解速度を示す。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、生体内に再吸収され、天然の組織と置き換えられる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書において提供される絹フィブロイン系材料を作製する方法を提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹溶液を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、約５分〜約９０分間、Ｎａ２ＣＯ３中で絹を煮沸することを含む。いくつかの実施形態では、絹繊維を臭化リチウム（ＬｉＢｒ）中で可溶化し、次いで水に対して透析して約３．５ｋＤａ〜約４００ｋＤａのポリマー分子量を得た。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、約０．１％〜５０％の絹濃度を有する絹溶液を提供することを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、修飾された絹からなる絹フィブロイン溶液を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を修飾すること、又は絹フィブロイン系材料を修飾することを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液を修飾する方法又は絹フィブロイン系材料を修飾する方法は、絹溶液又は絹フィブロイン系材料に添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を添加、混合、及び／又は塗布することを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液を修飾する方法又は絹フィブロイン系材料を修飾する方法は、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を絹溶液又は絹フィブロイン系材料と反応させることを含む。
【００６４】
いくつかの特定の実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液（例えば、絹フィブロイン水溶液）又は絹フィブロイン系材料を提供すること、及びスルホン酸修飾によりアミノ酸残基を修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液又は絹フィブロイン系材料を提供すること、及びポリリジン修飾によって修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液又は絹フィブロイン系材料を提供すること、及びジアゾニウムカップリング反応によりチロシン残基を修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液又は絹フィブロイン系材料を提供すること、及び４−（ヘプチルオキシ）アニリンで修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液又は絹フィブロイン系材料を提供すること、及び４’−アミノアセトフェノンで修飾することを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、約１％〜約７５％の修飾された絹（例えば、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のペンダント基の付加により共有結合的に修飾されたチロシン残基）を含む絹フィブロイン溶液を調製すること、及び／又は提供することを含む。いくつかの実施形態では、このような溶液を調製すること、及び／又は提供することは、修飾された絹からなる絹溶液を非修飾の絹溶液と混合することを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹溶液を可塑剤と混合することを含む。いくつかの実施形態では、絹溶液と可塑剤を混合すると、絹に対する可塑剤の重量比が約５％〜約８０％の絹溶液が得られる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、本明細書に記載のような絹フィブロイン溶液を凍結乾燥することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、凍結乾燥中に絹フィブロイン溶液を維持するための容器を提供することを含む。いくつかの実施形態では、このような容器は、凍結乾燥中に絹溶液の体積が均一に凍結するように最適化された形状を有する。いくつかの実施形態では、このような容器は熱伝導性であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、熱伝導性容器は、１６７Ｗ／ｍ−Ｋ（メートル法）又は１１６０ＢＴＵ−ｉｎ／ｈｒ−ｆｔ２−°Ｆ（英語）以上の熱伝導率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、例えば、容器は、アルミナ、アルミニウム、ベリリア、真鍮、銅、金、鉄、銀、タングステン、及び／又は亜鉛で作られる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹水溶液を目標温度で凍結させること又は凍結乾燥することを含む。いくつかの実施形態では、目標温度は少なくとも絹のガラス転移温度より低い。いくつかの実施形態では、目標温度は約−２０℃〜約−５０℃である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、絹水溶液を凍結させること又は凍結乾燥することは、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと及び／又はゆっくりと凍結させることを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、絹溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥をすること及び／又はゆっくりと凍結させることは、絹フィブロイン溶液を一定速度（℃／分）で冷却することを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥をすること、及び／又はゆっくりと凍結させることは、試料容器を既に目標温度にある冷凍庫に直接置くこととして定義される迅速凍結に比べて、より遅い冷却速度で生じる。いくつかの実施形態では、提供される方法は、絹溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと、及び／又は約５時間〜約２５時間の間で温度に到達するような速度でゆっくりと凍結させることを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥をすること、及び／又は約−１０℃／分〜約−０．００１℃／分の速度でゆっくりと凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥をすること、及び／又は約−０．１℃／分〜約−０．０１℃／分の速度でゆっくりと凍結させることを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、各々の異なる速度により、細孔径、細孔形状、タンパク質二次構造及び／又はそれらの組み合わせに関して僅かに異なる構造を有する絹フィブロイン系材料が産生される。特定の理論に束縛されるものではないが、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと及び／又はゆっくりと凍結させることは、絹フィブロイン系材料の細孔率及び膨潤速度に影響する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥をすること、及び／又は固定速度、可変速度若しくはそれらの組み合わせを含む温度プロファイルでゆっくりと凍結させることを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、メタノールで絹フィブロイン系材料を処理することを含む。いくつかの実施形態では、処理工程は、提供される絹フィブロイン系材料をメタノールに浸漬することを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料をメタノールで処理すると、水不溶性絹フィブロイン系材料が得られる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、提供される絹フィブロイン系材料を圧縮状態及び／又は変形形状へ圧縮することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、提供される絹フィブロイン系材料を膨張状態へ膨潤させることを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、絹フィブロイン系材料が実質的に元の形状に戻るように、絹フィブロイン系材料の圧縮状態からの復元を誘発することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、材料が実質的に元の体積に戻るように、復元を誘発することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、材料が実質的に元の体積に戻るように、復元を誘発することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、絹フィブロイン系材料が圧縮された体積の約２倍〜約５０倍の間で急速に膨潤及び膨張するように、圧縮された絹フィブロイン系材料の復元を誘発することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、圧縮状態の質量から少なくとも約４００％まで急速に膨潤及び膨張するように、圧縮された絹フィブロイン系材料の復元を誘発することを含む。いくつかの実施形態では、水性媒体へ曝すことを含むトリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、絹フィブロイン系材料は、圧縮状態から約９００％までの膨潤を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
本開示の前述及び他の目的、態様、特徴、及び利点は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することにより、より明らかになるであろう。
【００８０】
【図１】熱誘導変形を受ける感熱性形状記憶ポリマー（ＳＭＰ）発泡体を示す。その熱転移温度（Ｔｔｒ）を超えて加熱し、圧縮応力を加えることによって材料の永続的な形状を変形させることができる。熱転移温度以下に冷却すると、材料は一時的な形状に固定されることができる。熱転移温度以上に再度加熱することにより、材料を元の形状に復元させることができる。材料は、特定のトリガー条件下で（例えば、転移温度で、又は転移温度を超えて、溶媒の存在下で）、外力により変形され得る初期設定形状（永続的な形状）を有する。変形後、材料は一時的な形状で存在する。この例では、材料は圧縮されている。初期刺激（温度、溶媒）が再現されると、誘発された復元が開始される。この刺激後に、材料は元の形状又は体積を復元し、その結果、復元した形状になる。
【図２】１０分間対２０分間煮沸した絹から得られた発泡体の貯蔵弾性率を示す。繭の煮沸時間は、精製フィブロインの分子量に影響する。煮沸時間が短いほど分子量が高くなる。グリセロールを１０％（ｗ／ｗ）以下含有する発泡体では、より高分子量のフィブロインは、より低分子量のフィブロインと比較して著しく大きな貯蔵弾性率をもたらす。これは、様々な組織再生又は治療用途に合わせた特定の機械的特性を有する発泡体を作製するために使用され得る。
【図３−１】絹発泡体中の可塑剤として作用し、形状記憶及びエラストマー特性を付与する異なるポリオール添加剤を示す。図３のパネル（Ａ）は、絹発泡体の分子当たりの炭素数で分けられたポリオール添加物の簡略リストを示す。図３のパネル（Ｂ）は、各ポリオールの添加が、凍結乾燥プロセス後の細孔形状の結果に影響を及ぼすことを示す。これは、これらのポリオールの吸湿性及び凍結中の水分子を封鎖する能力により、より大きな氷結晶、そしてその結果大きな細孔が得られ得る。図３のパネル（Ｃ）は、このようなポリオール添加剤の添加を示す。この添加は、平均細孔径を変化させる効果を示す。図３のパネル（Ｄ）は、このようなポリオール添加剤の添加を示し、各ポリオールは発泡体の全体の剛性に影響を与え、絹単独のコントロールより柔らかい泡を生成する。
【図３−２】同上。
【図４】貯蔵弾性率を示す。図４のパネル（Ａ）は、２０ＭＢの絹で作られた低速凍結発泡体の貯蔵弾性率を示す。低速凍結発泡体を、温度が−５０℃に達するまで−０．０５℃の速度で凍結させた。図４のパネル（Ｂ）は、２０ＭＢの絹で作られた急速凍結発泡体の貯蔵弾性率を示す。急速凍結発泡体を−５０℃に予め設定した棚に置いた。急速冷凍発泡体は、低速凍結発泡体よりも著しく硬く、異なる量のグリセロールを含有する発泡体の貯蔵弾性率の間に有意な相違はなかった。
【図５】特注のアルミニウム金型を示す。いくつかの実施形態では、例えば窪みは１２ｍｍ（直径）×２０ｍｍ（深さ）であり、約２ｍＬの溶液を保持する。アルミニウムの高い熱伝導率は、凍結中の溶液の温度を精密に制御することを可能にし、最終的に水の結晶化に影響を与え、従って、発泡体内の細孔率及び細孔の形状に影響を及ぼす。
【図６】材料のＳＥＭ画像を示す。図６のパネル（Ａ）は、ポリスチレン金型内の凍結発泡体から生じる典型的な二重層を示す。この二重層の結果、２つの領域が得られる。上部には丸みを帯びた均一な細孔があり、底部にはランダムで脆い細孔があり、それは切断されて廃棄されなければならない。図６のパネル（Ｂ）は、アルミニウム金型に入れた二重層を産生しない発泡体を示しているが、代わりに発泡体全体にわたって一貫した丸みのある細孔形態を示す。発泡体の底面が画像の底に向くように、画像を位置合わせした。二重層の存在は、発泡体の最上層に予測できない細孔形態を生じ、不均一な機械的特性及び細孔形態を引き起こす。
【図７】広範囲の圧縮後に元の形状を保持する形状記憶絹発泡体を示す。ここでは、長さ約３ｃｍ×幅約１ｃｍの複雑な形状の発泡体を巻いて乾燥させ、１／２インチの六角ナットの内径に挿入する。ＰＢＳに浸漬するとすぐに、発泡体は元の形状とサイズに復元する
【図８】形状記憶絹発泡体の膨潤及び弾性率データを示す。図８のパネル（Ａ）は、絹／グリセロール発泡体の体積膨潤データを示す。体積膨張は、９０％圧縮時の発泡体の体積をＰＢＳ中において復元した後の体積と比較することによって測定された。絹単独（０％グリセロール）は、圧縮直後に体積が２倍増加したが、３０％グリセロール発泡体は体積が約６倍増加した。図８のパネル（Ｂ）は、絹発泡体の圧縮弾性率を示す。絹／グリセロール発泡体は、発泡体中のグリセロール含有量に応じて３５〜８１０ｋＰａの範囲の様々な機械的係数を示すが、メタノール処理をしない他の絹／グリセロール配合物は７．５ｋＰａという低い弾性率を有する発泡体を産生した。
【図９】マウスで、皮下移植８週間後に回収された発泡体の組織を示す。図９のパネル（Ａ）は、絹単独の発泡体を示す。図９のパネル（Ｂ）は、絹−グリセロール発泡体を示す。絹単独の発泡体と絹−グリセロール発泡体の両方が、最小の炎症反応を示す。しかしながら、細胞浸潤は、絹単独と比較して、グリセロール発泡体においてはるかに大きい。これにより、絹−グリセロール発泡体の劣化分解が速くなった。
【図１０】８０％歪みに対する圧縮後の復元率を示す。グリセロールを含む又は含まない絹発泡体は、メタノールで処理されたか、未処理のまま（高グリセロール含有発泡体の場合のみ）かのいずれかであり、強い圧縮後に元のサイズに復元する能力をＤＭＡにより測定した。グリセロール含有量が増加するにつれて、発泡体はより高い復元率を示す。メタノール処理をしない４０％ｗ／ｗグリセロールを含有する発泡体の場合、圧縮後の復元率はほぼ１００％である。
【図１１】高圧縮状態からの発泡体の体積膨張を示す。グリセロールの添加又は低スルホン酸修飾は、絹単独のコントロールと比較して膨潤の軽度の改善をもたらす。しかし、高スルホン酸修飾は膨潤を２０〜２５倍まで増加させる。グリセロールによるスルホン酸の高修飾は、圧縮後に非常に高い膨潤を生じるが、材料は、もはや硬質の連続気泡多孔質材料を維持しない半ゲル状態に変化する。ＳＡＡ＝スルホン酸アゾシルク修飾
【図１２】絹単独、絹−グリセロール及び絹−スルホン酸修飾発泡体の二次構造のＦＴＩＲ分析を示す。スルホン酸修飾が増加するにつれて、グリセロール含有量が高くなることによる結晶化が減少し、結果としてβシート構造が低下する。ＳＡＡ＝スルホン酸アゾシルク修飾
【図１３】修飾された絹発泡体の８０％歪みにおける圧縮弾性率及び圧縮応力を示す。修飾された絹発泡体は、絹単独のコントロールと比較して、匹敵する機械的剛性を示す。８０％の圧縮応力は、針を通して注入する間に発泡体を加圧するのに必要な応力に相当することを意味する。絹−グリセロール発泡体は、高圧縮時に著しく増加した圧縮応力を示すが、スルホン酸アゾシルク修飾発泡体は、高変形時に圧縮応力を低下させる。絹−グリセロール／スルホン酸修飾発泡体は、コントロールと比較して高い圧縮に必要な力が少なくてよく、注入可能な用途にはより少ない力しか必要としないことを示している。ＳＡＡ＝スルホン酸アゾシルク修飾
【図１４】ｐＨ７の水中の、絹単独及びジアゾニウム修飾絹（カルボニルピークに対して正規化）の分光光度分析を示す。ジアゾニウム修飾チロシン残基のモル当量を、３２５ｎｍでのアゾベンゼン吸光度に基づいて計算した
【図１５】絹−グリセロールスポンジの機械的圧縮分析を示す。図１５のパネル（Ａ）は、メタノール洗浄後処理を行った絹単独、後処理を行わない４０％ｗ／ｗグリセロールを含む絹、及びメタノール洗浄後処理を行った４０％ｗ／ｗグリセロールを含む絹、の１０ｍＥの絹スポンジの応力−歪み曲線を示す。図１５のパネル（Ｂ）は、負荷サイクル対無負荷サイクルの曲線下の面積の比を計算することにより、ヒステリシスの評価を示す。値が小さいほど、圧縮サイクル中のヒステリシスが小さいことを示す。図１５のパネル（Ｃ）は、抽出時間及びグリセロール濃度を変化させた絹スポンジの圧縮弾性率を示す。左パネルのスポンジはメタノール洗浄で後処理し、右パネルのスポンジは後処理しなかった。図１５のパネル（Ｄ）は、８０％圧縮歪み後のスポンジの復元率を示す。左パネルのスポンジはメタノール洗浄で後処理し、右パネルのスポンジは後処理しなかった。
【図１６】絹単独及び絹−４０％ｗ／ｗグリセロールスポンジの１０００サイクルの疲労試験を示す。周波数は０．５Ｈｚで一定に保たれ、振幅は歪みを１〜１０％変化させた。すべてのスポンジは、１０００サイクルにわたって疲労が低く、動的弾性率の変化が最小であることを示した。
【図１７】ジアゾニウム修飾絹スポンジの機械的圧縮分析を示す。図１７のパネル（Ａ）は、修飾チロシン残基及びグリセロール濃度の濃度を変化させた１０ｍＥの絹スポンジの圧縮弾性率を示す。図１７のパネル（Ｂ）は、８０％の軸方向歪みにおけるピーク圧縮応力を示す。
【図１８】９０％軸方向圧縮後の１×ＰＢＳにおける絹スポンジの体積膨張を示す。スルファニル酸（％ＳＡＡ）とグリセロール添加物とのチロシン修飾の組み合わせは、絹単独のコントロールと比較して圧縮された材料の体積膨潤を改善する。高いジアゾニウム修飾では、膨潤したスポンジは、非晶質形状及びゲル状の粘稠性を仮定すると、その剛性を失った。
【図１９】圧縮された絹スポンジの水和及び復元を示す。非修飾のスポンジは、一般的に、機械圧縮による塑性変形を示す。更に、水和は非修飾のスポンジでは遅く、迅速な体積復元をもたらさない。あるいは、グリセロール修飾スポンジは、水性媒体の迅速な吸収及び体積膨張、並びに元の形状へのほぼ完全な復元を示す。
【図２０−１】ＦＴ−ＩＲ分析による絹−グリセロールスポンジの二次構造を示す。図２０のパネル（Ａ）は、メタノール処理前（ＭｅＯＨ洗浄前）の二次構造要素について分析された絹−グリセロールスポンジを示す。図２０のパネル（Ｂ）は、メタノール処理後（ＭｅＯＨ洗浄後）の二次構造要素について分析された絹−グリセロールスポンジを示す。図２０のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、様々な量のグリセロールを含有するスポンジを示す。図２０のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、ブレンド比：（ａ）絹単独、（ｂ）１ｗ／ｗ％グリセロール、（ｃ）５ｗ／ｗ％グリセロール、（ｄ）１０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｅ）１５ｗ／ｗ％グリセロール、（ｆ）２０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｇ）３０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｈ）４０ｗ／ｗ％グリセロール、を含む。図２０のパネル（Ｃ）は、メタノール処理前（ＭｅＯＨ洗浄前）の相対濃度に関して二次構造要素について分析された絹−グリセロールスポンジを示す。図２０のパネル（Ｄ）は、メタノール処理後（ＭｅＯＨ洗浄後）の相対濃度に関して二次構造要素について分析された絹−グリセロールスポンジを示す。図２０のパネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、様々な量のグリセロールを含有するスポンジを示す。図２０のパネル（Ｃ）及びパネル（Ｄ）は、様々な抽出時間（１０ｍＥ、３０ｍＥ及び６０ｍＥ）で処理された絹を含有する絹−グリセロールスポンジを更に示す。図２０のパネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、（ｉ）βシート、（ｉｉ）αらせん、（ｉｉｉ）ランダムコイル、及び（ｉｖ）βターンの相対濃度を示す。
【図２０−２】同上。
【図２１】ＦＴ−ＩＲ分析によるジアゾニウム修飾絹スポンジの二次構造を示す。親水性化学物質によるチロシン残基の修飾は、βシート構造の有意な減少をもたらした。図２１のパネル（Ａ）は、二次構造要素について分析されたジアゾニウム修飾絹スポンジを示す。図２１のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、様々な量のグリセロール及びスルホン酸アゾシルクを含有するスポンジを示す。図２１のパネル（Ａ）は、ブレンド比：（ａ）絹単独、（ｂ）３０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｃ）１０％ＳＡＡ、（ｄ）１０％ＳＡＡ、３０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｅ）３０％ＳＡＡ、（ｆ）３０％ＳＡＡ、３０ｗ／ｗ％グリセロール、（ｇ）６０％ＳＡＡ、（ｈ）６０％ＳＡＡ、３０ｗ／ｗ％グリセロール、を含む。図２１のパネル（Ｂ）は、様々な量のグリセロールを含有するスポンジを示す。図２１のパネル（Ｂ）は、様々な量のグリセロール（０％グリセロール及び３０％グリセロール）を含有する絹−グリセロールスポンジを更に示す。図２１のパネル（Ｂ）は、（ｉ）βシート、（ｉｉ）αらせん、（ｉｉｉ）ランダムコイル、及び（ｉｖ）βターンの相対濃度を示す。
【図２２−１】修飾された絹スポンジの細孔形態を示す。図２２のパネル（Ａ）は、非修飾絹単独のスポンジ（左）及びジアゾニウム修飾スポンジ（右）の巨視的説明を示す。図２２のパネル（Ｂ）は、グリセロール及び修飾チロシンを含有するスポンジの内部材料の形態を示す走査電子顕微鏡検査を示す。グリセロールは、絹の材料に丸みを帯びた細孔形状を付与し、ジアゾニウム修飾の増加は、フィブリル構造の形成を誘発する。（スケールバーは主画像で１００μｍ、差込画像で２００μｍ）    図２２のパネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、水銀圧入ポロシメトリーによる細孔径分布を示す。３０％ｗ／ｗグリセロールの添加は、より長い抽出時間に由来して、スポンジのサイズ分布を狭くし、減少させる。図２２のパネル（Ｅ及びＦ）は、ジアゾニウム修飾スポンジの細孔径分布を示す。チロシン修飾に起因する膨潤は、より大きな細孔直径方向へのシフトを生じさせる。
【図２２−２】同上。
【図２３】マウスモデルにおける絹−グリセロールスポンジの生体内皮下移植を示す。図２３のパネル（Ａ）は、細胞浸潤が材料の周囲に限定されている絹単独のコントロールと比較して、細胞浸潤がグリセロール含有スポンジで増強されていることを示す組織学的検査を示す。スポンジ体積の巨視的評価により、絹スポンジへのグリセロールの添加が生体内劣化分解速度を増加させることが明らかになった。図２３のパネル（Ｂ）は、点線の円が、絹単独（白）対３０％（ｗ／ｗ）グリセロール（赤）群を２週間及び１２週間の時点で視覚的に比較できことを示す。図２３のパネル（Ｃ）は、２、４、８及び１２週の時点での絹単独対３０％ｗ／ｗグリセロールのスポンジ直径群の比較を示す。
【図２４】０〜１０％ｗ／ｗの様々な量のグリセロールを含有する絹溶液の示差走査熱量測定を示す。溶液のガラス転移温度（垂直ハッシュマークで示される）は、絹ブレンド中のグリセロール濃度の増加とともに減少した。このことは、凍結乾燥中のスポンジの安定性に影響を与え、乾燥中の構造の崩壊及び緻密化を可能にし得る。ブレンド率は次のとおりである：ａ）絹単独、ｂ）２％ｗ／ｗグリセロール、ｃ）４％ｗ／ｗグリセロール、ｄ）６％ｗ／ｗグリセロール、ｅ）８％ｗ／ｗグリセロール、ｆ）１０％ｗ／ｗグリセロール。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
定義
本開示が、より容易に理解されるように、最初にいくつかの用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して述べられている。
【００８２】
本出願では、文脈から特に明白でない限り、用語「ａ（１つの）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る。本出願で使用される場合、用語「又は」は、「及び／又は」を意味すると理解され得る。本出願では、「備えている」及び「含んでいる」という用語は、単独で、又は１つ又は複数の追加の構成要素又は工程と共に、それらによって提示されるかにかかわらず、項目化された構成要素又は工程を含むと理解され得る。特に明記しない限り、「約」及び「およそ」という用語は、当業者により理解されるであろうような、標準的な変動を許容できると理解され得る。本明細書において範囲が与えられる場合、終点が含まれる。本出願で使用される場合、用語「含む（comprise）」並びにその用語の変形「含んでいる（comprising）」及び「含む（comprises）」等は、他の添加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図しない。
【００８３】
本出願で使用されているように、用語「約」及び「およそ」は同等物として使用される。本出願では、約／およその有無にかかわらず使用される任意の数字は、当業者によって認識される任意の通常の変動を網羅することを意味する。ある実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、別段の記載がない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された基準の（より大きい、より小さい）の何れかの方向において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれよりも小さい値に含まれる、範囲の値を指す（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００８４】
「投与」：本明細書で、「投与」という用語は、被験体への組成物の投与を指す。投与は、任意の適切な経路により行われ得る。例えば、いくつかの実施形態では、投与は気管支（気管支点滴を含む）、口腔内、腸内、皮内（interdermal）、動脈内、皮膚内（intradermal）、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、心室内、粘膜、鼻、口、直腸、皮下、舌下、局所、気管内（気管内点滴を含む）、経皮、膣及び硝子体で行われる。
【００８５】
「親和性」：当技術分野で公知のように、「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーに結合する際の堅さの尺度である。親和性は、様々な方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、定量アッセイによって測定される。いくつかのこのような実施形態では、結合パートナーの濃度は、生理学的条件を模倣するために、リガンド濃度を超えて固定されてもよい。代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、結合パートナーの濃度及び／又はリガンド濃度を変化させ得る。いくつかのこのような実施形態において、親和性は、比較可能な条件（例えば、濃度）下での参照物質と比較され得る。
【００８６】
「作用物質」：本明細書で、「作用物質」という用語は、例えば、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、低分子、金属、又はそれらの組み合わせを含む任意の化学的薬品クラスの化合物又は実体を指す。文脈から明らかなように、いくつかの実施形態では、作用物質は、細胞若しくは有機体、又はそれらの画分、抽出物、若しくは成分であることができる、又は含み得る。いくつかの実施形態では、作用物質は、天然に存在するか、及び／又は自然から得られるという点で天然物質である、又は天然物質を含む作用物質である。いくつかの実施形態では、作用物質は、ヒトの手の操作によって設計され、操作され、及び／若しくは産生され、並びに／又は天然には見出されない人工的な１つ又は複数の実体である、又はこれらを含む。いくつかの実施形態では、作用物質は、単離又は純粋な形態で利用され得る。いくつかの実施形態では、作用物質を加工していない形態で利用することができる。いくつかの実施形態では、潜在的な作用物質は、例えば、それらの中の活性作用物質を同定又は特徴付けるためにスクリーニングされ得るコレクション又はライブラリーとして提供される。本開示に従って利用され得る作用物質のいくつかの特定の実施形態は、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子等を含む。いくつかの実施形態では、作用物質はポリマーである、又はポリマーを含む。いくつかの実施形態では、作用物質はポリマーではなく、及び／又はポリマーを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、作用物質は、少なくとも１つのポリマー部分を含む。いくつかの実施形態では、作用物質は、ポリマー部分を欠いているか、又は実質的に含まない。
【００８７】
「類似体」：本明細書で、「類似体」という用語は、１つ又は複数の特定の構造的特徴、要素、成分、又は部分を参照物質と共有する物質を指す。典型的には、「類似体」は、例えばコア構造又は共通構造を共有するような参照物質との著しい構造類似性を示すが、いくつかの点で異なってもいる。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質の化学的操作によって参照物質から生成され得る物質である。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質を生成するものと実質的に同様の（例えば、複数の工程を共有する）合成プロセスの実行によって生成され得る物質である。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質を生成するために使用される合成プロセスとは異なる合成プロセスの実行によって生成される、又は生成され得る。
【００８８】
「アミノ酸」：本明細書で、「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で、例えば１つ又は複数のペプチド結合の形成によってポリペプチド鎖に取り込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに共通して見出される２０の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成により調製されるか、天然源から得られるかに係わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ末端及び／又はアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、本明細書の一般構造と比較して構造上の修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、及び／又は置換によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、例えば、他の点では同一の非修飾アミノ酸を含むポリペプチドと比較して、修飾アミノ酸を含むポリペプチドの循環半減期を変えることができる。いくつかの実施形態では、このような修飾は、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連する活性を、そうでなければ同一の非修飾アミノ酸を含むものと比較して有意に変化させない。文脈から明らかなように、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離アミノ酸を指すのに使用され、いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸残基を指すために使用される。
【００８９】
「抗体」：本明細書で、「抗体」という用語は、特定の標的抗原に特異的な結合を付与するのに十分な標準免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で公知であるように、自然界で産生される完全な抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）と、２つの同一の軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）とからなり、互いに会合して一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれる約１５０ｋＤ四量体作用物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長）、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙのステムの基部に位置する）からなる。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を連結する。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りの部分に連結する。このヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体中で互いに連結する。各軽鎖は、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、続いて別の「スイッチ」によって互いに分離されたカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインの２つのドメインからなる。完全な抗体四量体は、重鎖及び軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結されている２つの重鎖−軽鎖二量体からなり、２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに連結して、二量体が互いに連結され、四量体が形成される。自然発生的に産生された抗体もグリコシル化され、典型的にはＣＨ２ドメイン上にグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中にお互いに詰め込まれた２つのβシート（例えば、３本鎖、４本鎖又は５本鎖のシート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として公知の３つの超可変ループ、及び４つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。天然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域はドメインの構造的フレームワークを提供するβシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域は３次元空間に集められ、それらはＹ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生成する。抗体ポリペプチド鎖間のアミノ酸配列比較は、２つの軽鎖（κ及びλ）クラス、いくつかの重鎖（例えば、μ、γ、α、ε、δ）クラス及びある種の重鎖サブクラス（α１、α２、γ１、γ２、γ３、γ４）を規定する。抗体クラス（［ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む］ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、［ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む］ＩｇＧ、ＩｇＭ）は、利用される重鎖配列のクラスに基づいて規定される。本開示の目的のために、ある実施形態では、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体は、このようなポリペプチドが天然に産生されているか（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）、又は、組換え工学、化学合成、若しくは他の人工的システム若しくは方法によって産出されるかどうかにかかわらず、「抗体」と呼ばれることができ、及び／又は「抗体」と���て使用されることができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルであり、いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類又はヒト抗体の特徴である定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知のように、ヒト化、霊長類化、キメラ化等である。更に、本明細書で、「抗体」という用語は、（別段の記載がないか、又は文脈から明らかでない限り）適切な実施形態では、代替の提示において抗体の構造的及び機能的特徴を捕捉するための当技術分野で公知若しくは開発された構成物又は構成のいずれかを指すことができると理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、この用語は、二重特異性抗体又は他のマルチ特異性抗体（例えば、ｚｙｂｏｄｉｅｓ等）、小型モジュール免疫薬（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖抗体、カメロイド抗体、及び／又は抗体断片を指すことができる。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、抗体は共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分等］、又は他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコール等］）を含み得る。
【００９０】
「会合している」又は「と会合している」：本明細書で、「会合している」又は「と会合している」という用語は、典型的には、（例えば、連結作用物質として働く１つ又は複数の以上の追加の実体を介して）直接的に又は間接的に、互いに物理的に近接している２つ以上の実体を指し、関連する条件、例えば生理学的条件下で実体が物理的に近接したままであるように十分に安定した構造を形成する。いくつかの実施形態では、会合している実体は互いに共有結合している。いくつかの実施形態では、会合している実体は非共有結合している。いくつかの実施形態では、会合している実体は、特定の非共有相互作用によって（即ち、相互作用パートナーと使用の状況で存在する他の実体とを区別する相互作用リガンド間の相互作用、例えば、ストレプトアビジン／アビジン相互作用、抗体／抗原相互作用等、によって）互いに連結されている。代替的又は追加的に、十分な数のより弱い非共有結合相互作用が、部分が会合したままであるのに十分な安定性を提供することができる。例示的な非共有相互作用としては、親和性相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、パイスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
「結合」：本明細書で、「結合」という用語は、典型的には、２つ以上の実体の間の非共有結合を指すことが理解されるであろう。「直接」結合は、実体間又は部分間の物理的接触を含む。間接結合は、１つ又は複数の中間体との物理的接触を介した物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、典型的には、（例えば、キャリア実体と、及び／又は生物系又は細胞中で共有結合的に、又はそうでなければ会合している間）相互作用する実体又は部分が単独で又はより複雑なシステムの状況で研究される場所を含む、様々な状況のいずれかにおいて評価されることができる。
【００９２】
「結合剤」    一般に、「結合剤」という用語は、本明細書に記載の目的の標的に結合する任意の実体を指すために本明細書中で使用される。多くの実施形態では、目的の結合剤は、特定の相互作用接触において、他の潜在的な結合している相手と標的とを区別する点で、その対象物と特異的に結合するものである。一般に、結合剤は、任意の化学薬品クラスの実体（例えば、ポリマー、非ポリマー、小分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸等）であることができる、又は含み得る。いくつかの実施形態では、結合剤は単一の化学成分である。いくつかの実施形態では、結合剤は、非共有的相互作用によって関連条件下で互いに会合する２つ以上の別個の化学成分の複合体である。例えば、当業者は、いくつかの実施形態では、結合剤が「一般的な」結合部分（例えば、ビオチン／アビジン／ストレプトアビジン及び／又はクラス特異抗体の１つ）を含み得ること、及び一般的な結合部分のパートナーに連結された「特異的」結合部分（例えば、抗体又は特定の分子標的を有するアプタマー）を含み得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、このようなアプローチは、異なる特異的結合部分を同じ一般的結合部分のパートナーと連結させることにより、複数の結合剤のモジュールアセンブリを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、結合剤は、（例えば、抗体又は抗体断片を含む）ポリペプチドである、又はポリペプチドを含む。  いくつかの実施形態では、結合剤は小分子である、又は小分子を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は核酸である、又は核酸を含む。いくつかの実施形態では、結合剤はアプタマーである、又はアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、結合剤はポリマーであり、いくつかの実施形態では、結合剤はポリマーではない。いくつかの実施形態では、結合剤はポリマー部分を欠いている点で非ポリマーである。いくつかの実施形態では、結合剤は炭水化物である、又は炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、結合剤はレクチンである、又はレクチンを含む。いくつかの実施形態では、結合剤はペプチド模倣物である、又はペプチド模倣物を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は骨格タンパク質である、又は骨格タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、ミモトープである、又はミモトープを含む。いくつかの実施形態では、結合剤はステープルペプチドである、又はステープルペプチドを含む。ある実施形態では、結合剤は核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである、又は核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【００９３】
「生体適合性」：本明細書で、「生体適合性」という用語は、生体組織と接触して、例えば生体内に置かれた場合、生体組織に重大な害を及ぼさない材料を指す。  ある実施形態では、材料が細胞に対して毒性でない場合、材料は「生体適合性」である。ある実施形態では、生体内で細胞への添加が２０％以下の細胞死をもたらす場合、及び／又は生体内へのその投与が重大な炎症又は他のそのような有害な効果を誘導しない場合、材料は「生体適合性」である。
【００９４】
「生分解性」：本明細書で、「生分解性」という用語は、材料が細胞に導入された場合に、（例えば、酵素分解、加水分解、及び／又はそれらの組み合わせによる細胞機構によって）、細胞が細胞に対して重大な毒性作用を伴わずに再使用又は処理することができる成分に劣化分解される材料を指す。ある実施形態では、生分解性材料の分解によって生成される成分は、生体適合性であり、従って、生体内で重大な炎症及び／又は他の有害作用をもたらさない。  いくつかの実施形態では、生分解性ポリマー材料は、それらの成分モノマーに分解する。いくつかの実施形態では、（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）生分解性材料の分解は、エステル結合の加水分解を含む。代替的に、又は追加的に、いくつかの実施形態では、（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）生分解性材料の分解は、ウレタン結合の切断を伴う。例示的な生分解性ポリマーとしては、例えば、乳酸及びグリコール酸等のヒドロキシ酸のポリマーを含み、例えば、ポリ（ヒドロキシル酸）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、及びＰＥＧとのコポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、それらのブレンド及びコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。多くの天然に存在するポリマーも生分解性であり、例えば、タンパク質、例えばアルブミン、コラーゲン、ゼラチン及びプロラミン等、例えば、ゼイン、及び多糖類、例えばアルギン酸塩、セルロース誘導体及びポリヒドロキシアルカノエート等、例えば、ポリヒドロキシブチラートブレンド、及びそれらのコポリマー、が挙げられる。当業者は、このようなポリマーが、（例えば、当技術分野で公知の特定の化学基の置換又は付加のみが異なる実質的に同一の構造による親ポリマーに関連する）それらの生体適合性及び／又は生分解性誘導体に、いつなるかを理解する、又は決定することができるであろう。
【００９５】
「生物学的活性」：本明細書で、「生物学的活性」という語句は、（例えば、（例えば、単離された、培養された、組織中の、生体内の）細胞内の、細胞培養中の、組織内の、生物体内等の）生物学系において活性を有する物質を指す。例えば、生物に投与されたときに、その生物に生物学的作用を及ぼす物質は、生物学的に活性であると考えられる。しばしば生物活性物質の一部又は断片のみが、活性が存在するために必要とされる（例えば、必要かつ十分である）ことは、そのような状況では、その部分又は断片は、「生物学的に活性な」部分又は断片であると考えられることが、当業者には理解されるであろう。
【００９６】
「特徴的部分」：本明細書で、「特徴的な部分」という用語は、最も広い意味において、その存在（又は不在）が、特定の特徴、属性又はその物質の活性の存在（又は不在）と相関する物質の部分を指す。いくつかの実施形態では、物質の特徴的な部分は、特定の形体、属性、又は活動を共有する物質及び関連する物質に見られるが、特定の形体、属性、又は活動を共有していない物質及び関連する物質に見られない部分である。ある実施形態では、特徴的な部分は、少なくとも１つの機能的特徴を完全な物質と共有する。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質又はポリペプチドの「特徴的部分」は、共にタンパク質又はポリペプチドの特徴である、アミノ酸の連続したストレッチ、又はアミノ酸の連続したストレッチのコレクションを含むものである。いくつかの実施形態では、各々のこのような連続したストレッチは、一般的に、少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０以上のアミノ酸を含む。一般に、（例えば、タンパク質、抗体等の）物質の特徴的な部分は、上記で特定された配列及び／又は構造的同一性に加えて、関連する完全な物質と少なくとも１つの機能的特徴を共有するものである。いくつかの実施形態では、特徴的部分は生物学的に活性であり得る。
【００９７】
「同等の」：本明細書で、「同等の」という用語は、相互に同一ではないが、それらの間の比較を可能にするのに十分類似している２つ以上の作用物質、実体、状態、条件セット等を指し、観察された差異又は類似性に基づいて結論を合理的に引き出し得る。当業者であれば、２つ以上のこのような作用物質、実体、状態、条件セット等が同等とみなされるためには、任意の与えられた状況においてどのような程度の同一性が必要であるかを、状況で理解するであろう。
【００９８】
「共役」：本明細書で使用され、用語「共役」、「連結」、「付着」及び「会合」が２つ以上の部分に関して使用される場合は、部分が直接的に又は連結剤として働く１つ又は複数の付加的な部分を介して物理的に互いに会合又は結合して、構造が使用される条件下、例えば生理学的条件下で部分が物理的に会合したままであるように十分に安定な構造を形成することを、意味する。典型的には、該部分は、１つ又は複数の共有結合により、又は特異的結合を含む機構により付着される。あるいは、十分な数のより弱い相互作用が、部分が物理的に会合したままであるのに十分な安定性を提供することができる。
【００９９】
「に対応する」：本明細書で、「に対応する」という用語は、ポリマー中の残基、例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基又は核酸中のヌクレオチド残基等、の位置／同一性を示すためにしばしば使用される。当業者は、平易化のために、このようなポリマー中の残基は、しばしば、参照関連ポリマーに基づくカノニカルナンバリングシステムを用いて示され、そのため、例えば、参照ポリマー中の１９０番目の位置の残基「に対応する」第１のポリマー中の残基は、例えば実際には第１のポリマー中の１９０番目の残基である必要はなく、むしろ参照ポリマー中の１９０番目の位置に見出される残基に相当すること、当業者は、ポリマーの配列を比較するために特別に設計された１つ又は複数の市販のアルゴリズムを使用することによる方法を含む「対応する」アミノ酸を同定する方法を容易に理解すること、を理解するであろう。
【０１００】
「検出実体」：本明細書で、「検出実体」という用語は、検出可能な任意の要素、分子、機能的部分、化合物、断片又は部分を指す。いくつかの実施形態では、検出実体が単独で提供又は利用される。いくつかの実施形態では、検出実体が、別の作用物質に会合して（例えば、結合されて）提供され、及び／又は利用される。検出実体の例としては、様々なリガンド、放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒ等）、蛍光色素（特定の例示的な蛍光色素については、下記参照）、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタン等）、生物発光剤、スペクトル分解可能無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金等）ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体例については以下を参照）、比色標識（例えば、色素、コロイド金等）、ビオチン、ジオキシゲニン、ハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
「測定する」：本明細書に記載された多くの方法は、「測定する」工程を含む。当業者は、本明細書を読むと、このような「測定」が、例えば、本明細書で明示的に参照される特定の技術を含む、当業者に利用可能な任意の様々な技術を使用することにより利用され得るか、又は達成され得る、ことが理解できるであろう。いくつかの実施形態では、測定することは、物理的試料の操作を含む。いくつかの実施形態では、測定することは、例えばコンピュータ又は関連分析を実行するように適合された他の処理ユニットを利用する、データ又は情報の検討及び／又は操作を含む。いくつかの実施形態では、測定することは、情報源から関連情報及び／又は材料を受け取ることを含む。いくつかの実施形態では、測定することは、試料又は実体の１つ又は複数の特徴を比較可能な基準と比較することを含む。
【０１０２】
「剤形」：本明細書で、「剤形」という用語は、被験体へ投与する治療剤の物理的に別個の単位を指す。各単位は所定量の活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、このような量は、関連する集合に投与された場合（すなわち、治療用投薬レジメンを用いて）、所望の又は有益な結果と相関すると決定された投与レジメンに従った投与に適切である単位投与量（又はその全画分）である。
【０１０３】
「カプセル化された」：「カプセル化された」という用語は、本明細書では、別の材料によって完全に囲まれている物質を指すのに使用される。
【０１０４】
「機能的」：本明細書で、「機能的」生物学的分子は、それが特徴付けられる特性及び／又は活性を示す形態の生物学的分子である。生物学的分子は、２つの機能（即ち、２機能性）又は多くの機能（即ち、多機能性）を有し得る。
【０１０５】
「移植片拒絶」：本明細書で、「移植片拒絶」という用語は、ドナー個体からレシピエント個体へ移植された組織の拒絶を指す。いくつかの実施形態では、移植片拒絶は、ドナー個体とレシピエント個体が同じ種である同種移植片拒絶を指す。典型的には、同種移植片拒絶は、ドナー組織が、レシピエント免疫系が拒絶反応を呈する同種抗原を有する場合に起こる。
【０１０６】
「高分子量ポリマー」：本明細書で、「高分子量ポリマー」という用語は、少なくとも約２００ｋＤａの分子量を有するポリマー（例えば、絹等のタンパク質ポリマー）からなるポリマー及び／又はポリマー溶液を指し、３０％以下の絹フィブロインは、１００ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、高分子量ポリマー及び／又はポリマー溶液は、少なくとも約１００ｋＤａ以上の平均分子量を有し、例えば、少なくとも約１５０ｋＤａ、少なくとも約２００ｋＤａ、少なくとも約２５０ｋＤａ、少なくとも約３００ｋＤａ、少なくとも約３５０ｋＤａ、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、５０％以下、例えば４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下の絹フィブロインを有する高分子量ポリマーは、１５０ｋＤａ未満、又は１２５ｋＤａ未満、又は１００ｋＤａ未満の分子量分布を有し得る。
【０１０７】
「加水分解性」：本明細書で、「加水分解性」という用語は、加水分解的切断によって劣化分解する材料を指すために使用される。いくつかの実施形態では、加水分解性材料は水中で劣化分解する。いくつかの実施形態では、加水分解性材料は、他の任意の作用物質又は材料の不在下で水中で劣化分解する。いくつかの実施形態では、加水分解性材料は、加水分解によって、例えば水中で完全に劣化分解する。対照的に、用語「非加水分解性」は、典型的には、加水分解により、及び／又は水の存在下で（例えば、水のみの存在下で）完全には劣化分解しない材料を指す。
【０１０８】
「親水性」：本明細書で、「親水性」及び／又は「極性」という用語は、水と混合するか、又は水に容易に溶解する傾向を指す。
【０１０９】
「疎水性」：本明細書で、「疎水性」及び／又は「非極性」という用語は、水に反発する、水と結合しない、又は水に容易に溶解できない傾向を意味する。
【０１１０】
「同一性」    本明細書で、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間等の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であると考えられる    例えば、２つの核酸又はポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実行され得る（例えば、最適な整列のためにギャップを第１及び第２の配列の一方又は両方に導入することができ、非同一配列は、比較目的のために無視されることができる）。ある実施形態では、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は実質的に１００％の長さである。次に、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）によって占有される場合、その時分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されることができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているMeyersとMiller（CABIOS、1989,4:11-17）のアルゴリズムを用いて測定されることができる。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで作製された核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて測定され得る。
【０１１１】
「低分子量ポリマー」：本明細書で、「低分子量ポリマー」という用語は、約２０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの範囲内の分子量を有するポリマー（例えば、タンパク質ポリマー）からなるポリマー及び／又はポリマー溶液、例えば絹を指す。いくつかの実施形態では、低分子量ポリマー（例えば、タンパク質ポリマー）は、下限値（例えば、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、又はそれよりも上）と、上限値（例えば、約４００ｋＤａ、約３７５ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約３２５ｋＤａ、約３００ｋＤａ、又はそれよりも下）との間の範囲内の分子量を有す。いくつかの実施形態では、低分子量ポリマー（例えば、絹等のタンパク質ポリマー）には、約４００ｋＤを超える分子量を有するポリマーが実質的にない。いくつかの実施形態では、提供される材料中の最高分子量ポリマーは、約３００〜約４００ｋＤ未満（例えば、約４００ｋＤ未満、約３７５ｋＤ未満、約３５０ｋＤ未満、約３２５ｋＤ未満、約３００ｋＤ、等）である。いくつかの実施形態では、低分子量ポリマー及び／又はポリマー溶液は、集合中のポリマー断片の総モル数の１５％以下が２００ｋＤａを超える分子量を有し、集合中の絹フィブロイン断片の総モル数の少なくとも５０％は特定の範囲内の分子量を有し、特定の範囲は約３．５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ又は約５ｋＤａ〜約１２５ｋＤａであることを特徴とする分子量範囲を有するポリマー断片の集合を含み得る。
【０１１２】
「マーカー」：本明細書で、マーカーは、その存在又はレベルが特定の状態又は事象の特徴である実体又は部分を指す。いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在又はレベルは、疾患、障害又は状態の存在又は段階の特徴であり得る。ほんの一例を挙げると、いくつかの実施形態では、この用語は、特定の腫瘍、腫瘍サブクラス、腫瘍のステージ等に特有である遺伝子発現産物を指す。代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在又はレベルは、例えば特定のクラスの腫瘍に特有である特定のシグナル伝達経路の活性（又は活性レベル）と相関する。マーカーの存在又は非存在の統計的有意性は、個々のマーカーに応じて異なり得る。いくつかの実施形態では、マーカーの検出は、腫瘍が特定のサブクラスであるという高い確率を反映する点で非常に特異である。そのような特異性は、感度を犠牲にして生じ得る（即ち、腫瘍がマーカーを発現すると予想される腫瘍であっても、陰性の結果が生じる可能性がある）。逆に、高感度のマーカーは、低感度のマーカーより特異性が低い可能性がある。本開示によれば、有用なマーカーは、腫瘍の特定のサブクラスを１００％の精度で区別する必要はない。
【０１１３】
「モジュレーター」：「モジュレーター」という用語は、目的の活性が観察される系における実体の存在又はレベルが、モジュレーターが存在しない場合に他の類似の条件下で観察された変化と比較して、その活性のレベル及び／又は性質の変化と相関する実体を指すのに使用される。いくつかの実施形態では、モジュレーターが存在しない場合に、他の点で類似の条件下で観察されたものと比較して、その存在下でその活性が増加するという点で、モジュレーターはアクチベーターである。いくつかの実施形態では、モジュレーターが存在しない場合に、他の点で類似の条件下で比較して、その存在下でその活性が低下するという点で、モジュレーターは拮抗薬又は阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、標的実体の活性が目的の活性である標的実体と直接相互作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、標的実体の活性が目的の活性である標的実体と間接的に（即ち、標的実体と相互作用する中間体と直接的に）相互作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、目的の標的実体のレベルに影響を及ぼし、代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、モジュレーターは、標的実体のレベルに影響を与えることなく、目的の標的実体の活性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、目的の標的実体のレベル及び活性の両方に影響を与えるが、観察された活性の差異は、観察されたレベルの差異によって完全に説明されるわけではない、かつ観察されたレベルの差異に相応しているわけではない。
【０１１４】
「ナノ粒子」：本明細書で、「ナノ粒子」という用語は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する粒子を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、National  Science  Foundationによって定義されるように、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、National  Institutes  of  Healthによって定義されるように、１００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ミセル膜によってバルク溶液から分離された閉鎖区画を含み、典型的には、（例えば、内腔を画定するために）空間又は区画を取り囲んで包囲する両親媒性実体からなる点でミセルである。いくつかの実施形態では、ミセル膜は、少なくとも１つのポリマー、例えば生体適合性及び／又は生分解性ポリマー等からなる。
【０１１５】
「ナノ粒子組成物」：本明細書で、用語「ナノ粒子組成物」は、少なくとも１つのナノ粒子及び少なくとも１つの追加の作用物質又は成分を含有する組成物を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、本明細書に記載の実質的に均一なナノ粒子の集合体を含む。
【０１１６】
「核酸」：本明細書で、「核酸」という用語は、最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれている、又は組み込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれている、又は組み込まれ得る化合物及び／又は物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語はほとんど同じ意味で使用され得る。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ並びに単鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡを包含する。更に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」及び／又は類似の用語は、核酸類似体、即ちホスホジエステル骨格以外の類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格中のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本開示の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列」という用語は、互いに縮重したバージョンである、及び／又は同じアミノ酸配列をコード化するすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び／又はＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。核酸は、天然源から精製され、組換発現系を用いて産生され、必要に応じて精製され、化学的に合成等をされることができる。場合により、例えば化学的に合成された分子の場合、核酸はヌクレオシド類似体、例えば化学的修飾塩基又は糖を有する類似体、骨格修飾体等を含み得る。他に示されない限り、核酸配列は５’から３’方向に提供される。用語「核酸セグメント」は、本明細書では、より長い核酸配列の一部である核酸配列を指すのに使用される。多くの実施形態では、核酸セグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレート塩基、修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）、及び／又は修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）である、又はこれらを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、具体的には、送達を促進又は達成するために化学修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシドを含むポリヌクレオチド及び残基）を意味する「非修飾核酸」に関する。
【０１１７】
「医薬組成物」：本明細書で、「医薬組成物」という用語は、１つ又は複数の薬理学的に許容される担体と共に製剤化される活性剤を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連する集合に投与された場合、所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンにおいて投与に適切な単位投与量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、下記の適合する形態を含む固体又は液体形態で投与のために特別に製剤化され、適合するものとしては、経口投与、例えばドレンチ（水性若しくは非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、頬の内側、舌下、及び全身性吸収、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内若しくは硬膜外注射による、例えば無菌溶液若しくは懸濁液、又は徐放性製剤；局所適用、例えば、皮膚、肺、又は口腔に適用されるクリーム、軟膏、又は制御放出のパッチ若しくはスプレー；膣内若しくは直腸内へ、例えば、ペッサリー、クリーム若しくは泡；舌下で；眼に；経皮的に；又は経鼻的に；肺に、及び他の粘膜表面に、が挙げられる。
【０１１８】
「生理学的条件」：本明細書で、「生理学的条件」という語句は、組織の細胞内及び細胞外の流体において遭遇する可能性がある化学的（例えば、ｐＨ、イオン強度）及び生化学的（例えば、酵素濃度）条件の範囲に関する。ほとんどの組織では、生理学的ｐＨは約６．８〜約８．０の範囲であり、温度範囲は約２０〜４０℃、約２５〜４０℃、約３０〜４０℃、約３５〜４０℃、約３７℃であり、大気圧は約１である。いくつかの実施形態では、生理学的条件は、水性環境（例えば、水、生理食塩水、リンガー溶液、若しくは他の緩衝溶液）を利用する、又は含む。いくつかのこのような実施形態では、水性環境は、リン酸緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）である、又はこれを含む。
【０１１９】
「ポリペプチド」：本明細書で、「ポリペプチド」という用語は、一般的に、ペプチド結合によって互いに連結された、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーの当該技術分野で認識されている意味を有する。いくつかの実施形態では、この用語は、ポリペプチドの特定の機能的なクラスを指すために使用される。このような各クラスについて、本明細書は、クラス内の公知の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列のいくつかの例を提供する。いくつかの実施形態では、このような公知のポリペプチドは、そのクラスのための参照ポリペプチドである。このような実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、関連する参照ポリペプチドとの著しい配列相同性又は同一性を示すクラスの任意のメンバーを指す。多くの実施形態において、このようなメンバーはまた、参照ポリペプチドと有意な活性を共有する。代替的に又は追加的に、多くの実施形態では、このようなメンバーはまた、参照ポリペプチドと（及び／又はクラス内の他のポリペプチド、いくつかの実施形態ではクラス内のすべてのポリペプチドと）特定の特有の配列要素を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０〜４０％であり、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより高い参照ポリペプチドとの全体的な配列相同性又は同一性を示し、及び／又は、非常に高い配列同一性、しばしば９０％、又は更に９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％より高い少なくとも１つの領域（即ち、いくつかの実施形態では、特有の配列要素であることができる、又はそれを含み得る保存領域）を含む。このような保存された領域は、通常、少なくとも３〜４個、しばしば最大２０個以上のアミノ酸を包含する。いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれより大きい連続アミノ酸の少なくとも１つのストレッチを包含する。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含む、又はそれからなることができる。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含む又はそれらからなることができる。それらの各々は、目的のポリペプチドに見出されるより、互いに対して異なる空間配置で同じ親ポリペプチドに見出される（例えば、親に直接連結された断片は目的のポリペプチドにおいて空間的に分離されていてもよく、又はその逆であっても良く、及び／又は、断片は親のものとは異なる目的のポリペプチドに異なる順序で存在していても良い）目的のポリペプチドはその親ポリペプチドの誘導体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、又はその両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみ又は非天然アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、又はその両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＤ−アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＬ−アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、１つ又は複数のアミノ酸側鎖を修飾する、並びに／又は、１つ又は複数のアミノ酸側鎖に結合した、及び／若しくはポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、若しくはその両方に結合した１つ又は複数のペンダント基を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状であることができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状ではない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは線状である。
【０１２０】
「多糖類」：「多糖類」という用語は、糖のポリマーを指す。典型的には、多糖類は、少なくとも３つの糖を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然糖（例えば、ぶどう糖、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース及びキシロース）、代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、及びヘキソースのような修飾された糖）を含む。
【０１２１】
「細孔率」：本明細書で、「細孔率」という用語は、材料中の空隙の尺度を指し、０〜１００％の百分率での、総体積にわたる空隙の体積の割合である。細孔率の測定は、標準化された技術、例えば水銀ポロシメトリー及び気体吸着（例えば、窒素吸着）を用いており、当業者に公知である。
【０１２２】
「タンパク質」：本明細書で、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（即ち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸のストリング）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）を含み得る、及び／又は他の方法で処理又は修飾され得る。当業者は、「タンパク質」が、（シグナル配列を有する又は有さない）細胞によって産生された完全ポリペプチド鎖であることができる、又はその特徴的部分であることができると理解するであろう。当業者は、タンパク質が、時には、例えば１つ又は複数のジスルフィド結合によって連結されているか、又は他の手段によって会合されている２つ以上のポリペプチド鎖を含み得ることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はその両方を含むことができ、そして当技術分野で公知の任意の様々なアミノ酸修飾又は類似体を含み得る。有用な修飾としては、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は、一般的に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、又は１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すのに使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／又はその特徴的な部分である。
【０１２３】
「参照」：「参照」という用語は、本明細書では、目的の作用物質、個体、集合、試料、配列若しくは値を比較する、標準の若しくはコントロールの作用物質、個体、集合、試料、配列又は値を記載するためにしばしば使用される。いくつかの実施形態では、参照の作用物質、個体、集合、試料、配列又は値は、目的の作用物質、個体、集合、試料、配列又は値の試験又は測定と実質的に同時に試験及び／又は測定される。いくつかの実施形態では、参照の作用物質、個体、集合、試料、配列又は値は、選択的に有形の媒体で具体化される組織学的参照である。典型的には、当業者に理解されるように、参照の作用物質、個体、集合、試料、配列又は値は、目的の作用物質、個体、集合、試料、配列若しくは値を測定する又は特徴付けるために利用される標準と同等な条件下で測定される又は特徴付けられる。
【０１２４】
「小分子」：本明細書で、「小分子」という用語は、天然の又は人工的に生成されたか（例えば、化学合成を介して）に関係なく、比較的低分子量を有し、かつ有機及び／又は無機化合物である分子を指すのに使用される。典型的には、「小分子」は単量体であり、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。一般に、「小分子」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、又は約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、又は約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、又は約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、小分子はポリマーではない。いくつかの実施形態では、小分子はポリマー部分を含まない。いくつかの実施形態では、小分子はタンパク質でも、ポリペプチドでもない（例えば、オリゴペプチドでもペプチドでもない）。いくつかの実施形態では、小分子はポリヌクレオチドではない（例えば、オリゴヌクレオチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は多糖類ではない。いくつかの実施形態では、小分子は多糖類を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等ではない）。いくつかの実施形態では、小分子は脂質ではない。いくつかの実施形態では、小分子は調節剤である。いくつかの実施形態では、小分子は生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、小分子は検出可能である（例えば、少なくとも１つの検出可能な部分を含む）。いくつかの実施形態では、小分子は治療剤である。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて、局所的又は全身的効果を生じるという点で生物学的に活性である。特定の好ましい実施形態では、小分子は薬剤である。好ましくは、必ずしもそうではないが、薬剤は、適切な政府機関又は機関による使用のために安全かつ効果的であると既にみなされている。例えば、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．に基づいてＦＤＡによって列挙されたヒト用医薬品であり、§§３３０．５，３３１から３６１、及び４４０から４６０は、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．に基づきＦＤＡによってリストされた獣医学用医薬品であり、§§５００から５８９は、参照により本明細書に組み込まれ、全て本出願に従って使用するのが許容可能であると考えられる。
【０１２５】
「溶液」：本明細書で、「溶液」という用語は、広義には、１つの相からなる均質な混合物を指す。典型的には、溶液は、１つ又は複数の溶媒に溶解された１つ又は複数の溶質を含む。混合物の特性（例えば、濃度、温度、及び密度等）は体積中に均一に分布し得るという点で、特徴付けられる。したがって、本出願の文脈において、「絹フィブロイン溶液」は、水等の溶媒に溶解された可溶性形態の絹フィブロインタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液は、絹フィルム及び他の骨格等の固体状態絹フィブロイン材料（即ち、絹マトリックス）から調製され得る。典型的には、固体状態の絹フィブロイン材料は、水及び緩衝液等の水溶液を用いて絹フィブロイン溶液中に再構成される。均質ではない液体混合物、例えばコロイド、懸濁液、乳濁液は溶液とはみなされないことに注意されたい。
【０１２６】
「安定な」：本明細書の組成物に適用される場合、「安定な」という用語は、組成物が指定された条件下で一定の期間にわたって、その物理的構造及び／又は活性の１つ又は複数の態様を維持することを意味する。いくつかの実施形態では、期間は少なくとも約１時間であり、いくつかの実施形態では、期間は約５時間、約１０時間、約１日、約１週間、約２週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約８ヶ月、約１０ヶ月、約１２ヶ月、約２４ヶ月間、約３６ヶ月間、又はそれより長い。いくつかの実施形態では、期間は、約１日〜約２４ヶ月間、約２週間〜約１２ヶ月間、約２ヶ月間〜約５ヶ月間等である。いくつかの実施形態では、指定された条件は、周囲条件（例えば、室温及び周囲圧力）である。いくつかの実施形態では、指定された条件は、生理学的条件（例えば、生体内、又は約３７℃の血清若しくはリン酸緩衝生理食塩水中）である。いくつかの実施形態では、指定された条件は、冷蔵下（例えば、約４℃、−２０℃又は−７０℃以下）である。いくつかの実施形態では、指定された条件は暗中である。
【０１２７】
「実質的に」：本明細書で使用される「実質的に」という用語及び文法上の等価物は、目的の特徴又は特性の全体又はほぼ全体の範囲又は程度を示す定性的条件を指す。当業者は、生物学的及び化学的現象があっても、完了すること、及び／若しくは完全に達成すること、又は絶対的結果を達成若しくは回避することはほとんどないことを理解するであろう。
【０１２８】
「徐放」：「徐放」という用語は、本明細書では、長期間にわたって生じる当該技術分野で理解されている放出の意味に従って使用される。長期間は、少なくとも約３日、約５日、約７日、約１０日、約１５日、約３０日、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約６ヶ月、又は更には約１年であることができる。いくつかの実施形態では、徐放は実質的に非即放性である。いくつかの実施形態では、徐放は、長期間にわたって放出速度が約５％を超えて、約１０％を超えて、約１５％を超えて、約２０％を超えて、約３０％を超えて、約４０％を超えて、又は約５０％を超えて変化しないように、長期間にわたる安定放出を含む。いくつかの実施形態では、徐放は一次速度論による放出を含む。いくつかの実施形態では、徐放は初期の即放出を含み、続いて安定放出の期間が続く。いくつかの実施形態では、徐放は初期の即放出を含まない。いくつかの実施形態では、徐放は実質的に非即放性放出である。
【０１２９】
「治療薬」：本明細書で、「治療剤」という語句は、生物に投与された場合に所望の薬理学的効果を誘発する任意の作用物質を指す。いくつかの実施形態では、作用物質は、適切な集合の全体に統計的に有意な効果を示す場合、治療剤であると考えられる。いくつかの実施形態では、適切な集合は、モデル生物の集合であってもよい。いくつかの実施形態では、適切な集合は、様々な基準、例えば、特定の年齢層、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態等によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害及び／又は状態の１つ又は複数の症状や特徴を、緩和する、改善する、やわらげる、抑制する、予防する、発症を遅延させる、重症度を軽減する、及び／又は発生を減らすのに使用され得る任意の物質である。
【０１３０】
「治療有効量」：本明細書で、「治療有効量」という用語は、治療用投薬レジメンに従って、疾患、障害及び／又は状態に罹患しているか、又は感染しやすい集合に投与される場合に、疾患、障害、及び／又は状態を治療するのに十分な量を意味する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患、障害及び／又は状態の１つ又は複数の症状の発生率及び／又は重症度を低下させる量、及び／又は発症を遅延させる量である。当業者は、「治療有効量」という用語は、実際には、治療が特定の個体において成功することを必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、そのような治療を必要とする患者に投与された場合、多数の被験体において特定の所望の薬理学的反応を示す量であることができる。具体的には、特定の被験体は、実際には、「治療有効量」に対して「不応性」である場合があることが理解される。ほんの一例を挙げると、難治性被験体は、臨床効果を得ることができないような生物学的利用能が低い可能性がある。いくつかの実施形態では、治療有効量の言及は、１つ又は複数の特定の組織（例えば、疾患、障害又は状態の影響を受けた組織）又は体液（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿等）において測定される量への言及を指し得る。当業者は、いくつかの実施形態では、治療上有効な量を処方し、及び／又は１回で投与できることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療有効量は、例えば投薬レジメンの一部として、複数回の服用で、処方及び／又は投与され得る。
【０１３１】
「治療する」：本明細書中で、用語「治療する」という用語は、部分的又は完全に、特定の疾患、障害及び／又は状態の１つ又は複数の症状又は特徴を緩和すること、改善すること、やわらげること、抑制すること、（少なくとも一定期間）予防すること、発症の遅延すること、重症度を軽減すること、頻度を減少させること及び／又は発生率を低下させること、を指す。いくつかの実施形態では、疾患に関連する病理を発症する危険性を減少させる目的で、疾患の症状、徴候、若しくは特徴を示さない、並びに／又は疾患の初期症状、徴候、及び／若しくは特徴のみを示す被験体に治療を施してもよい。いくつかの実施形態では、疾患の１つ又は複数の症状、徴候、及び／又は特徴の発現後に治療を施し得る。
【０１３２】
「変異体」：本明細書で、「変異体」という用語は、参照実体との有意な構造的同一性を示すが、参照実体と比較して１つ又は複数の化学的部分の存在又はレベルにおいて参照実体と構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態では、変異体も、その参照実体と機能的に異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異体」であると適切にみなされるか否かは、その参照実体との構造の同一性の程度に基づいている。当業者が理解するように、任意の生物学的又は化学的参照実体は、特定の特徴的な構造要素を有する。定義による変異体は、１つ又は複数のこのような特徴的な構造要素を共有する別個の化学物質である。ほんの数例を挙げると、小分子は、特有のコア構造要素（例えば、マクロサイクルコア）及び／又は１つ又は複数の特有のペンダント部分を有し得る。その結果、小分子の変異体は、コア構造要素及び特有のペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分及び／又はコア内に存在する結合の種類（単一対２重、Ｅ対Ｚ等）が異なるものであり、ポリペプチドは、線状又は三次元空間において互いに対して指定された位置を有する及び／又は特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸からなる特有の配列要素を有すことができ、核酸は、線状又は三次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基からなる特有の配列要素を有し得る。例えば、変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列の１つ又は複数の相違、及び／又はポリペプチド骨格に共有結合している化学的部分（例えば、炭水化物、脂質等）の１つ又は複数の相違の結果として、参照ポリペプチドと異なり得る。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％である参照ポリペプチドとの全体的な配列同一性を示す。代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１つの特有の配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドは、１つ又は複数の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を共有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を欠いている。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較してレベルが低下した１つ又は複数の生物活性を示す。多くの実施形態では、目的のポリペプチドが親ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するが、特定の位置において少数の配列改変のアミノ酸配列を有する場合には、目的のポリペプチドは親又は参照ポリペプチドの「変異体」であると考えられる。典型的には、変異体中の残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が親と比較して置換される。いくつかの実施形態では、変異体は、親と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１の置換残基を有する。しばしば、変異体は、非常に少数（例えば、５、４、３、２又は１未満）の置換官能性残基（即ち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。更に、変異体は、典型的には、５、４、３、２又は１以下の付加又は欠失を有し、多くの場合、親と比較して付加も欠失もない。更に、任意の付加又は欠失は、典型的には、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６残基未満であり、一般に約５、約４、約３、又は約２残基未満である。いくつかの実施形態では、親ポリペプチド又は参照ポリペプチドは、自然界で見出されるものである。当業者が理解するように、目的の特定のポリペプチドの複数の変異体は、特に、目的のポリペプチドが感染病原体ポリペプチドである場合、一般に自然界で見出され得る。
［発明を実施するための形態］
【０１３３】
特に、本開示は、絹フィブロイン系材料並びにこのような絹フィブロイン系材料を製造及び使用する方法を提供する。本開示による様々な実施形態を本明細書で詳細に説明する。特に、本開示は、絹フィブロイン系材料及び種々の用途におけるそれらの使用方法を記載しており、用途としては、例えば、生体材料、生体医学器具、バイオセンシング、制御された放出用途、ドラッグデリバリー、エレクトロニクス、劣化分解が調整可能な材料、光学、フォトニクス、再生医療、センサ、組織工学用途、組織再生、組織骨格、及び／又は創傷凝固等が挙げられる。
【０１３４】
提供される絹フィブロイン系材料は、既存の形状記憶材料を超える利点を提供する優れた特有の特性を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料は、圧縮され易いため、このような材料は、圧縮前の状態と圧縮された状態との少なくとも２つの異なる状態をとり得ることを特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料は、膨潤し易いため、このような材料は、更に膨張した状態をとり得ることを特徴とする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、圧縮歪みは、絹フィブロイン系材料の体積を、圧縮前の状態の体積に対して減少させる。いくつかの実施形態では、圧縮歪みは、絹フィブロイン系材料の形状を、圧縮前の状態の形状と比べて変形させる。代替的に又は追加的に、いくつかの実施形態では、膨潤は、絹フィブロイン系材料の体積をその圧縮前の状態の体積に対して比べて増加させ、その結果、その体積がその圧縮前の状態の体積よりも実質的に同等又はより大きい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、圧縮状態にある場合、トリガー及び／又は外部刺激を受けるまで、その減少した体積及び／又は変形した形状を保持することを特徴とする。いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、このような絹フィブロイン系材料はより大きな体積に復元する。いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、それらの圧縮前の体積に実質的に復元する。いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、それらの圧縮前の形状に実質的に復元する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、提供される絹フィブロイン系材料は体積膨張することを特徴とする。いくつかの実施形態では、少なくとも約９０％の圧縮歪みによって圧縮された場合、元の体積の約１０％以下に圧縮され、このような材料は、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、それらの体積及び／又はそれらの形状を実質的に復元することを特徴とする。いくつかの実施形態では、このように復元した材料は、実質的に塑性変形の兆候がない。いくつかの実施形態では、最大１００ｋＰａの圧縮応力によって圧縮される場合、このような材料は、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、それらは、それらの体積及び／又はそれらの形状を復元することを特徴とする。いくつかの実施形態では、このように復元した材料は、実質的に塑性変形の兆候がない。
【０１３８】
形状記憶ポリマーは、一般的に、変形された形状から、刺激の存在下で元の予め定義された形状に復元し得る材料の種類を記載する。いくつかの合成形状記憶ポリマー、例えば、ポリウレタン、シリコーン、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）、及びポリ（グリコリド）等が存在する。例えば、Wong  Y、Kong  J、Widjaja  LK、Venkatraman  SS  Biomedical  applications  of  shape-memory  polymers:  how  practically  useful  are  they?  Sci  China  Chem  2014;  57(4):476-89を参照されたい。Safranski  DL,  Smith  KE,  Gall  K.  Mechanical  requirements  of  shape-memory  polymers  in  biomedical  devices,  Polym  Rev  2013;53(1):76-91も参照されたい。生体医学器具の場合、移植可能な形状記憶材料は、荷重支持の用途のために十分に丈夫で耐疲労性であり、閉鎖空間内で膨張するのに十分に強い復元力を示し、制御された分解性及び再吸収性を有し、及び周囲の組織と生体適合性でなければならない。例えば、Hager,  M.  D.,  Bode,  S.,  Weber,  C.及びSchubert,  U.  S.,  Shape  memory  polymers:    Past,  present  and  future  developments,    49-50  Progress  in  Polymer  Science,    3-33  (2015)を参照されたい。
【０１３９】
合成材料は、一般的に、乾燥すると十分な剛性及び靭性を有するが、長期間濡れたり、生物学的環境に曝された場合に機械的完全性が失われることが多い。それらはまた、水溶性リンカーの添加によって劣化分解するようにプログラムされる必要があり、生体適合性は、多くの要因、例えば、分解生成物、移植の位置、疲労レベル及び体内での持続時間等に応じている。これらの材料は、必ずしも生物学的免疫反応を引き起こすとは限らないが、組織とうまく一体化しないこともある。
【０１４０】
あるいは、特定の生物学的に誘導された材料を処理してＳＭＰのように挙動させることができる。天然素材は、体内の化学的及び酵素作用による生体適合性及び分解性の利点をしばしば享受する。Correia及びManoは、水の存在下で膨張する形状記憶ゲニピン架橋キトサン骨格を作製した。Correia  CO、Mano  JF  Chitosan  scaffolds  with  a  shape  memory  effect  induced  by  hydration.  J  Mater  Chem  B  2014;  2  (21):3315-23.を参照されたい。ゲニピンと架橋することにより、非架橋キトサンと比較して、キトサンネットワークが水中でより大きく膨潤することができる（最高４００重量％）。更に、架橋キトサンは、６０％歪み変形後に９８％の復元を示したが、復元は遅く１５分を要した。Bencherif他は、形状記憶ゲルを生成するクリオゲル化プロセスによりメタクリレート化されたアルギン酸骨格を作製した。Bencherif  SA,  Sands  RW,  Bhatta  D,  Arany  P,  Verbeke  CS,  Edwards  DA他,    Injectable  preformed  scaffolds  with  shape-memory  properties,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  2012,  109  (48):19590-5を参照されたい。アルギン酸塩ゲルは、９０％の変形後に元の体積の９２％を復元することができ、低侵襲移植のために針を通して注入することができた。更に、ゲルに細胞を含浸させ、治療用途のための細胞送達デバイスとして使用することができる。ゲルを生体内に移植し、２日後に回収した。このゲルはマウスにおいて生体適合性を示し、最小限の劣化分解だけが報告された。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、既存の合成又は天然形状記憶ポリマーとは対照的に、可塑剤を含有する絹フィブロイン系材料は、急速な復元を示す。いくつかの実施形態では、急速な復元は数秒以内に起こる。いくつかの実施形態では、急速な復元は、塑性変形の証拠を示さずに、最大５０倍の体積膨張及び最大９００％の質量膨張を示す。
【０１４２】
本開示より前は、凍結乾燥法は、恒温環境（例えば、実験室のフリーザー又はチェストフリーザー）内で溶液を急速に凍結させることに重点を置き、そして試料を数日間その一定温度で放置した。迅速凍結又は急速凍結は、棚温度を目標温度に設定することによって達成され、その結果溶液は１時間未満で設定温度まで凍結させる。
【０１４３】
急速凍結プロセスは、氷結晶をランダムな形状及びサイズで溶液中に成長させ、異なる細孔形状の予測不可能な配列を生成させる。
【０１４４】
対照的に、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、一定期間にわたって制御された凍結乾燥及び／又はゆっくりした凍結を利用する。いくつかの実施形態では、例えば、試料は、目標温度に到達するのに５時間、１０時間、又は２０時間を要する。いくつかの実施形態では、提供される方法は、一定期間にわたり制御された凍結乾燥及び／又はゆっくりした凍結を含み、絹フィブロイン系材料を産生して細孔を含む構造を形成する。いくつかの実施形態では、このような細孔は、バルク材料全体に相互連結され、実質的に均一な間隔を有し、実質的に丸い形態を有し、実質的に均一な細孔形状を有し、及び／又は本明細書に記載のような氷結晶が実質的に存在しないことを特徴とする。
【０１４５】
従来の方法は、迅速凍結にプラスチックの窪みを利用する。プラスチックは熱を伝導せず、使用時に棚の設定点よりも温かい絹の溶液が得られる。所望の温度よりも高い温度に保持された試料は、溶液の凍結に不一致を生じさせる。例えば、プラスチック金型は、典型的には、発泡体の半分が丸い細孔を有し、半分が細孔径及び幾何学形状の不均質な分布を含む二重層を形成させる。
【０１４６】
更に、いくつかの実施形態では、形状記憶ポリマーを成形するためにポリスチレン窪みプレートを利用した従来の凍結乾燥法とは異なり、提供される方法は、アルミニウムのような高い熱伝導性の材料を利用し、提供される絹フィブロイン系材料を形成する。いくつかの実施形態では、提供される方法は、円形の細孔、間隔が均一な細孔分布、間隔が均一な細孔径分布、及び体積全体にわたる均質な細孔形態を有することを特徴とする、絹フィブロイン系材料の形成を含む。
【０１４７】
可塑剤分子及び制御された凍結乾燥プロセスを使用しなければ、従来の発泡体は圧縮された場合に塑性変形する。一般に、塑性変形は好ましくない品質と考えられる。塑性変形した材料は、元の形状とは異なる機械的特性を示す。このように塑性変形した材料は、例えば、体内の空隙を充填することができない、細胞浸潤が可能にならない、及び／又は生体内での劣化分解速度を予測できない。
【０１４８】
対照的に、いくつかの実施形態では、本方法及びそれから形成された絹フィブロイン系材料は、圧縮後の塑性変形の証拠を示さない。
【０１４９】
更に、従来の形状記憶ポリマーとは異なり、いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料は、生体内に移植され、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、膨張して体内の空隙を充填する。
【０１５０】
更に、本発明の方法及びそれで形成された絹フィブロイン系材料は、いくつかの実施形態では、細胞浸潤を可能にし、予測可能な劣化分解速度を有する。これらは従来の形状記憶ポリマーには明らかに存在しない特性である。
絹フィブロイン系材料
【０１５１】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片である、又はそれらを含む。
絹
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ポリマーは絹である。絹は、特定の生物の特殊な腺で産生される天然タンパク質繊維である。生物における絹産生は、特にハチ類（ミツバチ、スズメバチ、及びアリ）で一般的であり、時には巣の構築に使用される。他の種類の節足動物、例えばクモ（例えば、クモの糸）等の最も著しく様々なクモ形類動物もまた糸を産生する。昆虫やクモが生成する絹繊維は、公知の最も強い天然繊維であり、合成高性能繊維にも匹敵する。
【０１５３】
絹は、古代中国で初めて登場して以来、非常に望まれて広く使われている織物材料である。（Elisseeff,  “The  Silk  Roads:  Highways  of  Culture  and  Commerce,”  Berghahn  Books/UNESCO,  New  York  (2000)を参照されたい。Vainker,  “Chinese  Silk:  A  Cultural  History,”  Rutgers  University  Press,  Piscataway,  New  Jersey  (2004))も参照されたい。光沢があり滑らかな絹は、ファッションデザイナーに好まれているだけではなく、機械的に頑丈であり、体内で無害に劣化分解するので、新たな機会を提供する非常に強固で生体適合性のある材料基材として、繊維技術者にも好まれている（Altman他,  Biomaterials,  24:  401  (2003)を参照されたい。Sashina他,  Russ.  J.  Appl.  Chem.,  79:  869  (2006)も参照されたい）。
【０１５４】
絹は、下記の様々な種により、自然の力で産生される。様々な種としては、Antheraea  mylitta、Antheraea  pernyi、Antheraea  yamamai、Galleria  mellonella、Bombyx  mori、Bombyx  mandarina、Galleria  mellonella、Nephila  clavipes、Nephila  senegalensis、Gasteracantha  mammosa、Argiope  aurantia、Araneus  diadematus、Latrodectus  geometricus、Araneus  bicentenarius、Tetragnatha  versicolor、Araneus  ventricosus、Dolomedes  tenebrosus、Euagrus  chisoseus、Plectreurys  tristis、Argiope  trifasciata、及びNephila  madagascariensisが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
一般に、本発明に従って使用する絹は、任意のこのような生物によって組換え供給源から産生され得る、又は、例えば、絹タンパク質を産生するための細胞又は生物の遺伝子操作及び／又は化学合成を含む人工的プロセスによって調製され得る。本開示のいくつかの実施形態では、絹は、カイコ、Bombyx  moriによって産生される。
【０１５６】
当該技術分野で公知のように、絹は、より短い（約１００アミノ酸）末端ドメイン（Ｎ末端及びＣ末端）に隣接した巨大な内部反復を有するモジュラー設計である。天然の絹は高分子量（２００〜３５０ｋＤａ以上）であり、転写物は１０，０００塩基対以上であり、アミノ酸は３０００超である（Omenetto及びKaplan(2010)Science  329:528-531に概説されている）。カイコ絹の場合、より大きなモジュラードメインに、疎水性電荷基を有する比較的短いスペーサーが介在している。Ｎ末端及びＣ末端は、絹のアセンブリ及びアセンブリのｐＨ調節を含むプロセシングに関与する。Ｎ末端及びＣ末端は、内部モジュールと比較してそのサイズが比較的小さいにもかかわらず、高度に保存されている。以下の表１は、絹産生種及び絹タンパク質の例示的なリストを提供する。
【表１−１】
2018511677.tif 000002
【表１−２】
2018511677.tif 000003
絹フィブロイン
【０１５７】
フィブロインは、絹を産生する特定のクモ及び昆虫種によって産生される構造タンパク質の一形態である。カイコBombyx  moriが産生する繭絹は、安価で大量生産され、織物等の多数の商業的応用に適切であるので、特に興味深い。
【０１５８】
カイコ繭絹は、２つの構造タンパク質、フィブロイン重鎖（約３５０ｋＤａ）及びフィブロイン軽鎖（約２５ｋＤａ）、を含み、これらはセリシンと呼ばれる非構造タンパク質ファミリーと会合しており、セリシンがフィブロインと接着して繭を形成している。フィブロインの重鎖及び軽鎖は、２つのサブユニットのＣ末端でジスルフィド結合によって連結されている。（Takei,  F.,  Kikuchi,  Y.,  Kikuchi,  A.,  Mizuno,  S.  and  Shimura,  K.  (1987)  105  J.  Cell  Biol.,  175-180を参照されたい。Tanaka,  K.,  Mori,  K.及びMizuno,  S.  114  J.  Biochem.  (Tokyo),  1-4  (1993);  Tanaka,  K.,  Kajiyama,  N.,  Ishikura,  K.,  Waga,  S.,  Kikuchi,  A.,  Ohtomo,  K.,  Takagi,  T.  及び  Mizuno,  S.,  1432  Biochim.  Biophys.  Acta.,  92-103  (1999)も参照されたい。Y  Kikuchi,  K  Mori,  S  Suzuki,  K  Yamaguchi  及び  S  Mizuno,  “Structure  of  the  Bombyx  mori  fibroin  light-chain-encoding  gene:  upstream  sequence  elements  common  to  the  light  and  heavy  chain,  ”  110  Gene,  151-158  (1992))も参照されたい）。セリシンは、材料に粘着性を与える絹の高分子量の可溶性糖タンパク質成分である。これらの糖タンパク質は親水性であり、水中で煮沸することによって繭から容易に除去することができる。
【０１５９】
本明細書中で、「絹フィブロイン」という用語は、カイコ、クモ、若しくは他の昆虫によって産生されるか、又は他の方法で生成されるかどうかに関わらず、絹フィブロインタンパク質を指す（Lucas他,  13  Adv.  Protein  Chem.,  107-242  (1958)）。いくつかの実施形態では、絹フィブロインを、溶解したカイコ絹又はクモの糸を含有する溶液から得る。例えば、いくつかの実施形態では、カイコ絹フィブロインをBombyx  moriの繭から得る。いくつかの実施形態では、クモ絹フィブロインを例えばNephila  clavipesから得る。別のいくつかの実施形態では、本発明での使用に適切な絹フィブロインを、細菌、酵母、哺乳動物の細胞、トランスジェニック動物、又はトランスジェニック植物から採取した遺伝子操作した絹を含有する溶液から得る。例えば、国際特許公開第９７／０８３１５号及び米国特許第５，２４５，０１２号を参照されたい。これらの各々は全体が参照され本明細書に組み込まれる
【０１６０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物を構築するために使用する絹溶液は、フィブロインタンパク質を含み、本質的にセリシンを含まない。いくつかの実施形態では、種々の本発明の組成物を構築するために使用する絹溶液は、フィブロインの重鎖を含むが、本質的に他のタンパク質を含まない。他の実施形態では、種々の本発明の組成物を構築するために使用する絹溶液は、フィブロインの重鎖及び軽鎖の両方を含むが、本質的に他のタンパク質を含まない。特定の実施形態では、種々の本発明の組成物を構築するために使用する絹溶液は、絹フィブロインの重鎖及び軽鎖の両方を含み、いくつかのかかる実施形態では、絹フィブロインの重鎖及び軽鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して連結している。フィブロインの重鎖及び軽鎖が存在するいくつかの実施形態では、これらは１つ、２つ、３つ、又はそれを超えるジスルフィド結合を介して連結している。異なる種の絹産生生物及び異なる絹型が、異なるアミノ酸組成を有するにもかかわらず、種々のフィブロインタンパク質は特定の構造的特徴を共有する。絹フィブロイン構造の一般的な傾向は、通常はグリシンとアラニンが交互に、又はアラニンのみが並ぶことにより特徴づけられるアミノ酸配列である。このような構造により、フィブロイン分子がβシート高次構造に自己組織化される。これらの「アラニンリッチ」疎水性ブロックは、典型的には、嵩高い側鎖基を有するアミノ酸のセグメント（例えば、親水性スペーサー）によって隔てられている。
【０１６１】
本明細書中で明確に例示した特定の絹材料を、典型的には、カイコBombyx  moriによって紡ぎ出された材料から調製した。典型的には、繭を０．０２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液中で煮沸し、次に、水で完全にすすぎ落として糊のようなセリシンタンパク質を抽出する。次に、抽出された絹を、溶媒中に、例えば、ＬｉＢｒ（例えば、９．３Ｍ等）溶液中に室温で溶解した。そして、得られた絹フィブロイン溶液を、本明細書中のいずれかの場所に記載の種々の用途のために更に処理することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、絹フィブロインタンパク質又はその変異体に由来する断片に対応するアミノ酸配列を有するペプチド鎖又はポリペプチドを指す。本開示の絹フィブロイン系材料との関係において、絹フィブロイン断片は、１つ又は複数の集合又は組成物内の絹フィブロイン断片のように天然に存在する絹フィブロイン相対物の全長よりもより短い絹フィブロインペプチド鎖又はポリペプチドを、一般的に指す。いくつかの実施形態では、例えば、絹フィブロイン系材料は、約３．５ｋＤａ〜約４００ｋＤａの平均分子量を有する絹フィブロインポリペプチドからなる。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片の適切な範囲は、平均分子量約３．５ｋＤａ〜約２００ｋＤａの絹フィブロインポリペプチド、平均分子量約３．５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの絹フィブロインポリペプチド、平均分子量約３．５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａの絹フィブロインポリペプチド、を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、絹フィブロインポリペプチドは、約３．５ｋＤａ、約４ｋＤａ、約４．５ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約９５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１０５ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１１５ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１２５ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、又は約４００ｋＤａの平均分子量を有す。いくつかの好ましい実施形態では、絹フィブロインポリペプチドは、約１００ｋＤａの平均分子量を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片である、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、様々な分子量の絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片を使用することができる。いくつかの実施形態では、様々な分子量の絹フィブロイン及び／又は絹フィブロイン断片は、絹フィブロインポリペプチドである。いくつかの実施形態では、絹フィブロインポリペプチドは、サイズが「縮小」されており、例えば、元の又は野生型の相対物よりも小さく、「低分子量絹フィブロイン」と呼ばれ得る。低分子量絹フィブロインに関する更なる詳細については、本明細書と同時に提出された表題「LOW  MOLECULAR  WEIGHT  SILK  FIBROIN  AND  USES  THEREOF」と題する米国仮出願を参照されたい。その全内容は参照され本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、絹フィブロインポリペプチドは、３５０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、２５０ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１７５ｋＤａ未満、１５０ｋＤａ未満、１２０ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、９０ｋＤａ未満、８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、１５ｋＤａ未満、１２ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、９ｋＤａ未満、８ｋＤａ未満、７ｋＤａ未満、６ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、４ｋＤａ未満、３．５ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、２．５ｋＤａ未満、２ｋＤａ未満、１．５ｋＤａ未満、又は約１．０ｋＤａ未満等以下の平均分子量を有す。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片のポリマーは、大気沸騰温度又はその近く（例えば、約５％以内）で、少なくとも１分間の煮沸、少なくとも２分間の煮沸、少なくとも３分間の煮沸、少なくとも４分間の煮沸、少なくとも５分間の煮沸、少なくとも６分間の煮沸、少なくとも７分間の煮沸、少なくとも８分間の煮沸、少なくとも９分間の煮沸、少なくとも１０分間の煮沸、少なくとも１１分間の煮沸、少なくとも１２分間の煮沸、少なくとも１３分間の煮沸、少なくとも１４分間の煮沸、少なくとも１５分間の煮沸、少なくとも１６分間の煮沸、少なくとも１７分間の煮沸、少なくとも１８分間の煮沸、少なくとも１９分間の煮沸、少なくとも２０分間の煮沸、少なくとも２５分間の煮沸、少なくとも３０分間の煮沸、少なくとも３５分間の煮沸、少なくとも４０分間の煮沸、少なくとも４５分間の煮沸、少なくとも５０分間の煮沸、少なくとも５５分間の煮沸、少なくとも６０分間以上、例えば、少なくとも７０分間以上、少なくとも８０分間以上、少なくとも９０分間以上、少なくとも１００分間以上、少なくとも１１０分間以上、少なくとも１２０分間以上の煮沸で、絹の繭を脱ガムすることにより、得ることができる。本明細書で、「大気沸騰温度」という用語は、大気圧下で液体が沸騰する温度を指す。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片から製造される本開示の絹フィブロイン系材料は、絹の繭を水溶液中で、少なくとも約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約４５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃、少なくとも約１２０℃の温度で脱ガムすることにより形成され得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、そのような上昇した温度は、加圧下で加熱プロセスの少なくとも一部（例えば、煮沸プロセス）を実施することによって達成され得る。例えば、本明細書に記載の絹フィブロイン断片が産生され得る好適な圧力は、典型的には約１０〜４０ｐｓｉであり、例えば約１１ｐｓｉ、約１２ｐｓｉ、約１３ｐｓｉ、約１４ｐｓｉ、約１５ｐｓｉ、約１６ｐｓｉ、約１７ｐｓｉ、約１８ｐｓｉ、約１９ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ、約２１ｐｓｉ、約２２ｐｓｉ、約２３ｐｓｉ、約２４ｐｓｉ、約２５ｐｓｉ、約２６ｐｓｉ、約２７ｐｓｉ、約２８ｐｓｉ、約２９ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ、約３１ｐｓｉ、約３２ｐｓｉ、約３３ｐｓｉ、約３４ｐｓｉ、約３５ｐｓｉ、約３６ｐｓｉ、約３７ｐｓｉ、約３８ｐｓｉ、約３９ｐｓｉ、又は約４０ｐｓｉである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は絹の濃度を制御することによって調節される。いくつかの実施形態では、重量百分率の絹フィブロインが、必要に応じた任意の濃度で溶液中に存在し得る。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度の絹フィブロインを有し得る。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液は、約１ｍｇ／ｍＬ未満、約１．５ｍｇ／ｍＬ未満、約２ｍｇ／ｍＬ未満、約２．５ｍｇ／ｍＬ未満、約３ｍｇ／ｍＬ未満、約３．５ｍｇ／ｍＬ未満、約４ｍｇ／ｍＬ未満、約４．５ｍｇ／ｍＬ未満、約５ｍｇ／ｍＬ未満、約５．５ｍｇ／ｍＬ未満、約６ｍｇ／ｍＬ未満、約６．５ｍｇ／ｍＬ未満、約７ｍｇ／ｍＬ未満、約７．５ｍｇ／ｍＬ未満、約８ｍｇ／ｍＬ未満、約８．５ｍｇ／ｍＬ未満、約９ｍｇ／ｍＬ未満、約９．５ｍｇ／ｍＬ未満、約１０ｍｇ／ｍＬ未満、約１１ｍｇ／ｍＬ未満、約１２ｍｇ／ｍＬ未満、約１３ｍｇ／ｍＬ未満、約１４ｍｇ／ｍＬ未満、約１５ｍｇ／ｍＬ未満、約１６ｍｇ／ｍＬ未満、約１７ｍｇ／ｍＬ未満、約１８ｍｇ／ｍＬ未満、約１９ｍｇ／ｍＬ未満、約２０ｍｇ／ｍＬ未満、約２５ｍｇ／ｍＬ未満、約３０ｍｇ／ｍＬ未満、約３５ｍｇ／ｍＬ未満、約４０ｍｇ／ｍＬ未満、約４５ｍｇ／ｍＬ未満、又は約５０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度の絹フィブロインからなることができる。
絹系材料の劣化分解特性
【０１６８】
更に、当業者が認識するように、研究者が絹の劣化分解プロセスを制御することができる多くの研究が確立されている。本開示による、このような制御は、特に電子部品自体が生体適合材料である、及び／又は電子部品が生体適合材料と適合する電子部品の作製において特に価値がある。組織工学及び組織移植に使用される生体材料には、分解性（例えば、生物分解性）がしばしば不可欠である。本開示は、このような分解性が絹電子部品の作製にも関連し有用であるという認識を包含する。
【０１６９】
本開示によれば、絹系材料の１つの特に望ましい特徴は、それらがプログラム可能に分解可能であるという事実である。即ち、当該技術分野で公知のように、特定の絹系材料がどのように調製されるかに応じて、特定の速度で劣化分解するように制御することができる。劣化分解性及び絹系材料からの物質の制御された放出が公表されている（例えば、国際特許公開第２００４／０８０３４６号、国際特許公開第２００５／０１２６０６号、国際特許公開第２００５／１２３１１４号、国際特許公開第２００７／０１６５２４号、国際特許公開第２００８／１５０８６１号、国際特許公開第２００８／１１８１３３号を参照されたい。これらの各々は参照され本明細書に組み込まれる）。
【０１７０】
絹材料生成の制御方法及び絹系材料の様々な形態により、既知の劣化分解特性を有する絹組成物を生成し得る。例えば、様々な絹フィブロイン系材料を使用して、治療薬等の封入された作用物質を活性形態で挿入することができ、その後、制御された方法で、例えば数分、数時間、数日、数週間から数ヶ月にわたって放出し得る。層状絹フィブロインコーティングを使用して任意の材料、形状及びサイズの基材を被覆することができ、その後制御された放出のために、例えば２〜９０日間分子を閉じ込めるために使用され得ることが示されている。
結晶質絹材料
【０１７１】
当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているように、絹タンパク質は結晶配列で互いに積み重なり得る。このような配列の様々な特性は、例えば、材料中のβシート構造の程度、このようなβシート間の架橋度、特定のドーパント又は他の材料の存在（又は不在）によって決定される。いくつかの実施形態では、絹マトリックスの特定の特性を達成するために、これらの特徴の１つ又は複数が意図的に制御され、又は操作される。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、例えばβシート構造及び／又は水素結合を含む結晶構造を特徴とする。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約０％〜約４５％の範囲内のβシート構造の百分率であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、例えば約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１％、約１％、約１％、約１％、約１％、約１％、約１％、約１％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、又は約４５％の、βシート構造を備える結晶構造を特徴とする。
絹フィブロイン系材料
【０１７２】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、圧縮されやすい。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料を、圧縮前の体積に対して、最大元の約３０％、元の約４０％、元の約５０％、元の約６０％、元の約７０％、元の約８０％、又は元の約９０％圧縮することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、圧縮は、針を通して注入する間に発泡体を圧縮するのに必要な応力に相当することを意味する。約８０％の圧縮応力は、注入用の針の中への挿入に相当することを意味する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は注入可能である。いくつかの実施形態では、注入用組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用することによって修飾される。いくつかの実施形態では、増粘剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー、又はそれらの組み合わせである。増粘剤の好ましい濃度は、選択された作用物質及び注入粘度に応じている。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、提供される絹フィブロイン系材料は体積膨張することを特徴とする。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、提供される絹フィブロイン系材料は迅速膨潤を示す。いくつかの実施形態では、迅速再膨潤は数秒又は数十秒のオーダーである。いくつかの実施形態では、迅速膨潤は、約２分、約３分、約４分、約５分、又は約１０分等のオーダーである。いくつかの実施形態では、膨潤はより長い時間を必要とし得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、提供される絹フィブロイン系材料は体積膨潤を示す。いくつかの実施形態では、そのような絹フィブロイン系材料は、圧縮状態の体積に対して体積で約２倍（「２×」）、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、又はそれを超えて膨潤する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、例えば水性媒体へ曝すこと等、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、提供される絹フィブロイン系材料は、圧縮状態の質量に対して質量で少なくても約４００％、約４５０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、若しくは約１０００％、又はそれを超えて膨潤する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、圧縮された場合、絹フィブロイン系材料は、その圧縮前状態の形状と比較して変形し得る。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、トリガー及び／又は外部刺激を受けた場合、変形からそれらの圧縮前状態の形状に実質的に復元し得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、修飾された絹からなる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹フィブロイン系材料の製造中に、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹溶液中の絹と反応するため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹フィブロイン系材料の製造中に、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹溶液と混合されるため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分が絹フィブロイン系材料と混合され、添加され、適用されるため、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、添加剤、作用物質及び／又は、機能的部分が絹フィブロイン系材料中の絹と反応するため、非修飾絹とは異なる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、修飾された絹は、（例えば、アミノ酸のＲ基への）１つ又は複数のペンダント部分の付加、１つ又は複数の非天然アミノ酸の包含、１つ又は複数の成分、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子、金属等、との関連（例えば、との共有結合）により、非修飾絹とは異なる。いくつかの実施形態では、修飾された絹フィブロイン系は、１つ又は複数の修飾アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸残基は修飾チロシン残基である。いくつかの実施形態では、修飾チロシン残基は（例えば、１つ又は複数のペンダント基の付加により）共有結合的に改質される。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、このような修飾された絹からなる絹フィブロイン系材料は、例えば、本明細書に記載のようないくつかの絹フィブロイン系材料の特有の膨潤特性を特徴とする。いくつかの実施形態では、修飾された絹を含む絹フィブロイン系材料は、親水性を高めているため、修飾された絹フィブロイン系材料は非修飾の絹材料と比較してその親水性が改善されている。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は吸水能力が向上しているため、修飾された絹フィブロイン系材料は、非修飾の絹材料と比較して吸水能力が改善されている。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、非修飾絹に比べて改善された疎水性を示す。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、絹材料中の非極性流体（例えば、油又は脂肪）の吸収を向上することができる。
【０１８４】
いくつかの特定の実施形態では、例えば、修飾された絹は、修飾４−スルホン酸のため天然絹とは異なる。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は、（例えば、ポリリジン部分及び絹フィブロイン部分を含む融合ペプチドである）ポリリジンで改質される。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹はペグ化される。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は４−（ヘプチルオキシ）アニリンで修飾される。いくつかの特定の実施形態では、修飾された絹は４’−アミノアセトフェノンで修飾される。他の例示的な可塑剤は、本出願全体に渡って記載されている。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、修飾された絹を含む絹フィブロイン系材料は、約５％〜約７５％の修飾絹濃度を特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、少なくとも約５％の修飾、少なくとも約１０％の修飾、少なくとも約１５％の修飾、少なくとも約２０％の修飾、少なくとも約２５％の修飾、少なくとも約３０％の修飾、少なくとも約３５％の修飾、少なくとも約４０％の修飾、少なくとも約４５％の修飾、少なくとも約５０％の修飾、少なくとも約５５％の修飾、少なくとも約６０％の修飾、少なくとも約６５％の修飾、少なくとも約７０％の修飾、少なくとも約７５％の修飾、又はより多い修飾を特徴とする。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は可塑剤を含む。いくつかの実施形態では、可塑剤を含むこのような絹フィブロイン系材料は、可塑剤材料を含まない絹フィブロイン系材料と比較して、向上した特性を示す。いくつかの実施形態では、可塑剤を含むこのような絹フィブロイン系材料は、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料と比べて高い結晶化度を示す。いくつかの実施形態では、可塑剤を含む提供される絹フィブロイン系材料は、可塑剤濃度が高くなると復元特性が改善する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、少なくとも１％の可塑剤、少なくとも２％の可塑剤、少なくとも３％の可塑剤、少なくとも４％の可塑剤、少なくとも５％の可塑剤、少なくとも６％の可塑剤、少なくとも７％の可塑剤、少なくとも８％の可塑剤、少なくとも９％の可塑剤、少なくとも１０％の可塑剤、少なくとも１５％の可塑剤、少なくとも２０％の可塑剤、少なくとも２５％の可塑剤、少なくとも３０％の可塑剤、少なくとも３５％の可塑剤、少なくとも４０％の可塑剤、少なくとも４５％の可塑剤、少なくとも５０％の可塑剤、少なくとも５５％の可塑剤、少なくとも６０％の可塑剤、少なくとも６５％の可塑剤、少なくとも７０％の可塑剤、又はそれを超える可塑剤を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、本明細書に記載のように圧縮から復元する。いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約２５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約３０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約３５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約４０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約４５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約５０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約５５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約６０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約６５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約７０％、又は圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約７５％に復元する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、本明細書に記載のように圧縮から復元する。いくつかの実施形態では、可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約２５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約３０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約３５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約４０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約４５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約５０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約５５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約６０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約６５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約７０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約７５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約８０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約８５％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約９０％、圧縮された後にそれらの元の体積の少なくとも約９５％、又は圧縮された後にそれらの元の体積の約１００％に復元する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２０％ｗ／ｗのグリセロールを含む提供される絹フィブロイン系材料は、圧縮後に元の体積の９０〜９５％に復元する。メタノール処理なしでは、本明細書で提供されるグリセロール含有絹フィブロイン材料は、過酷な圧縮（約８０％）後に元の体積のほぼ１００％に復元することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、それらの出発質量の約４００％膨潤した。いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、それらの元の体積に対して不完全な復元を示した。いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、復元後に塑性変形を示した。いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、圧縮状態から元の体積の約２倍までの体積膨張を示した。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含む提供される絹フィブロイン系材料は、それらの出発質量の約９００％まで膨潤した。いくつかの実施形態では、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料は、それらの元の体積に対して完全な復元を示した。いくつかの実施形態では、可塑剤を含むこのような絹フィブロイン系材料は、復元後に塑性変形の形跡を示さなかった。いくつかの実施形態では、可塑剤を含む絹フィブロイン系材料は、圧縮状態から元の体積の約６０倍までの体積膨張を示した。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、材料が、少なくとも約２０％の可塑剤、少なくとも約２５％の可塑剤、少なくとも３０％の可塑剤、少なくとも３５％の可塑剤、少なくとも４０％の可塑剤、少なくとも４５％の可塑剤、少なくとも５０％の可塑剤、少なくとも５５％の可塑剤、少なくとも６０％の可塑剤、少なくとも６５％の可塑剤、少なくとも７０％の可塑剤、からなる場合、水に不溶性であることを特徴とする。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、連続気泡、細孔を含む構造を特徴とする。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、実質的に丸みを帯びていることを特徴とする細孔を含む。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は細孔を含み、このような材料は、このような細孔がそのバルク全体に均一に分布していることを特徴とする。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は細孔を含み、このような材料は、このような細孔がそのバルク全体で相互連結していることを特徴とする。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、提供される方法で形成される細孔は、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、約１００μｍ、約１２５μｍ、約１５０μｍ、約１７５μｍ、約２００μｍ、約２２５μｍ、約２５０μｍ、約２７５μｍ、約３００μｍ、約３２５μｍ、約３５０μｍ、約３７５μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約４７５μｍ、若しくはは約５００μｍ、又はそれを超える平均細孔径を有す。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料中の平均細孔径は、圧縮又は膨張によって損なわれない、即ち、圧縮前状態の平均細孔径は、復元後のその平均細孔径と比べて実質的に同一である。いくつかの実施形態では、材料の細孔形態を特徴付ける１つ又は複数の特徴は、圧縮及び/又は膨張から復元した後の材料の細孔形態が、その圧縮前の状態と比べて実質的に同一であるという点で、提供される絹フィブロイン系材料中の材料の細孔形態は、圧縮によっても膨張によっても損なわれない。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約1kPa〜約2500kPaの範囲の弾性率値を特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、約１ｋＰａ未満、約２ｋＰａ未満、約３ｋＰａ未満、約４ｋＰａ未満、約５ｋＰａ未満、約６ｋＰａ未満、約７ｋＰａ未満、約８ｋＰａ未満、約９ｋＰａ未満、約１０ｋＰａ未満、約１５ｋＰａ未満、約２０ｋＰａ未満、約２５ｋＰａ未満、約３０ｋＰａ未満、約３５ｋＰａ未満、約４０ｋＰａ未満、約４５ｋＰａ未満、約５０ｋＰａ未満、約５５ｋＰａ未満、約６０ｋＰａ未満、約６５ｋＰａ未満、約７０ｋＰａ未満、約７５ｋＰａ未満、約８０ｋＰａ未満、約８５ｋＰａ未満、約９０ｋＰａ未満、約９５ｋＰａ未満、約１００ｋＰａ未満、約１２５ｋＰａ未満、約１５０ｋＰａ未満、約１７５ｋＰａ未満、約２００ｋＰａ未満、約２２５ｋＰａ未満、約２５０ｋＰａ未満、約２７５ｋＰａ未満、約３００ｋＰａ未満、約３２５ｋＰａ未満、約３５０ｋＰａ未満、約３７５ｋＰａ未満、約４００ｋＰａ未満、約４２５ｋＰａ未満、約４５０ｋＰａ未満、約４７５ｋＰａ未満、約５００ｋＰａ未満、約６００ｋＰａ未満、約７００ｋＰａ未満、約８００ｋＰａ未満、約９００ｋＰａ未満、約１０００ｋＰａ未満、約１１００ｋＰａ未満、約１２００ｋＰａ未満、約１３００ｋＰａ未満、約１４００ｋＰａ未満、約１５００ｋＰａ未満、約１６００ｋＰａ未満、約１７００ｋＰａ未満、約１８００ｋＰａ未満、約１９００ｋＰａ未満、約２０００ｋＰａ未満、約２１００ｋＰａ未満、約２２００ｋＰａ未満、約２３００ｋＰａ未満、約２４００ｋＰａ、又は約２５００ｋＰａ未満、の弾性率を特徴とする。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約５００Ｐａ〜約３０００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率値を特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、圧縮弾性率が、約５００Ｐａ未満、約６００Ｐａ未満、約７００Ｐａ未満、約８００Ｐａ未満、約９００Ｐａ未満、約１ｋＰａ未満、約２ｋＰａ未満、約３ｋＰａ未満、約４ｋＰａ未満、約５ｋＰａ未満、約６ｋＰａ未満、約７ｋＰａ未満、約８ｋＰａ未満、約９ｋＰａ未満、約１０ｋＰａ未満、約１５ｋＰａ未満、約２０ｋＰａ未満、約２５ｋＰａ未満、約３０ｋＰａ未満、約３５ｋＰａ未満、約４０ｋＰａ未満、約４５ｋＰａ未満、約５０ｋＰａ未満、約５５ｋＰａ未満、約６０ｋＰａ未満、約６５ｋＰａ未満、約７０ｋＰａ未満、約７５ｋＰａ未満、約８０ｋＰａ未満、約８５ｋＰａ未満、約９０ｋＰａ未満、約９５ｋＰａ未満、約１００ｋＰａ未満、約１２５ｋＰａ未満、約１５０ｋＰａ未満、約１７５ｋＰａ未満、約２００ｋＰａ未満、約２２５ｋＰａ未満、約２５０ｋＰａ未満、約２７５ｋＰａ未満、約３００ｋＰａ未満、約３２５ｋＰａ未満、約３５０ｋＰａ未満、約３７５ｋＰａ未満、約４００ｋＰａ未満、約４２５ｋＰａ未満、約４５０ｋＰａ未満、約４７５ｋＰａ未満、約５００ｋＰａ未満、約６００ｋＰａ未満、約７００ｋＰａ未満、約８００ｋＰａ未満、約９００ｋＰａ未満、約１０００ｋＰａ未満、約１１００ｋＰａ未満、約１２００ｋＰａ未満、約１３００ｋＰａ未満、約１４００ｋＰａ未満、約１５００ｋＰａ未満、約１６００ｋＰａ未満、約１７００ｋＰａ未満、約１８００ｋＰａ未満、約１９００ｋＰａ未満、約２０００ｋＰａ未満、約２１００ｋＰａ未満、約２２００ｋＰａ未満、約２３００ｋＰａ未満、約２４００ｋＰａ未満、約２５００ｋＰａ未満、約２６００ｋＰａ未満、約２７００ｋＰａ未満、約２８００ｋＰａ未満、約２９００ｋＰａ未満、又は３０００ｋＰａ未満であることを特徴とする。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約１ｋＰａ〜約３０００ｋＰａの範囲の貯蔵弾性率値を特徴とする。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、圧縮弾性率が、  約１ｋＰａ未満、約２ｋＰａ未満、約３ｋＰａ未満、約４ｋＰａ未満、約５ｋＰａ未満、約６ｋＰａ未満、約７ｋＰａ未満、約８ｋＰａ未満、約９ｋＰａ未満、約１０ｋＰａ未満、約１５ｋＰａ未満、約２０ｋＰａ未満、約２５ｋＰａ未満、約３０ｋＰａ未満、約３５ｋＰａ未満、約４０ｋＰａ未満、約４５ｋＰａ未満、約５０ｋＰａ未満、約５５ｋＰａ未満、約６０ｋＰａ未満、約６５ｋＰａ未満、約７０ｋＰａ未満、約７５ｋＰａ未満、約８０ｋＰａ未満、約８５ｋＰａ未満、約９０ｋＰａ未満、約９５ｋＰａ未満、約１００ｋＰａ未満、約１２５ｋＰａ未満、約１５０ｋＰａ未満、約１７５ｋＰａ未満、約２００ｋＰａ未満、約２２５ｋＰａ未満、約２５０ｋＰａ未満、約２７５ｋＰａ未満、約３００ｋＰａ未満、約３２５ｋＰａ未満、約３５０ｋＰａ未満、約３７５ｋＰａ未満、約４００ｋＰａ未満、約４２５ｋＰａ未満、約４５０ｋＰａ未満、約４７５ｋＰａ未満、約５００ｋＰａ未満、約６００ｋＰａ未満、約７００ｋＰａ未満、約８００ｋＰａ未満、約９００ｋＰａ未満、約１０００ｋＰａ未満、約１１００ｋＰａ未満、約１２００ｋＰａ未満、約１３００ｋＰａ未満、約１４００ｋＰａ未満、約１５００ｋＰａ未満、約１６００ｋＰａ未満、約１７００ｋＰａ未満、約１８００ｋＰａ未満、約１９００ｋＰａ未満、約２０００ｋＰａ未満、約２１００ｋＰａ未満、約２２００ｋＰａ未満、約２３００ｋＰａ未満、約２４００ｋＰａ未満、約２５００ｋＰａ未満、約２６００ｋＰａ未満、約２７００ｋＰａ未満、約２８００ｋＰａ未満、約２９００ｋＰａ未満、又は約３０００ｋＰａ未満であることを特徴とする。
【０２００】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は生体適合性である。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、材料作製中に添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分が予め添加されている。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、膨張状態にあるとき、添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を取り込む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は生分解性である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、このような材料は分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解することを特徴とする。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、このような材料が分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解して、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を放出することを特徴とする。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は生体内に導入される。  いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、生体内に存在する場合、分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解する。いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、生体内に存在する場合、著しい免疫反応なしに、分解し、劣化分解し、剥離し、又は溶解する。いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、予測可能な劣化分解速度を示す。いくつかの実施形態では、このような絹フィブロイン系材料は、生体内に再吸収され、天然の組織と置き換えられる。
添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分
【０２０５】
本発明に包含される実施形態のいずれにおいても、絹フィブロイン系材料は、特定の用途に応じて、１つ又は複数の添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、並びに他の活性剤若しくは不活性剤を更に含み得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上）の添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み得る。理論に拘束されることを望むものではないが、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分は、１つ又は複数の望ましい特性、例えば、強度、柔軟性、処理及び取り扱いの容易さ、生体適合性、生体吸収性、表面形態、組成物中に存在する１つ又は複数の活性作用物質等放出速度及び／又は反応速度等を提供又は高めることができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のこのような添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分は、絹フィブロイン系材料と（例えば、その材料を構成する絹フィブロイン等のポリマーと）共有結合又は非共有結合することができ、絹組成物中に均質に又は不均質に組み込まれ得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分は、（例えば、化学修飾又は遺伝子操作により）ポリマーと共有結合された部分であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、添加剤は、絹フィブロイン系材料又は絹フィブロイン系材料成分と非共有結合している。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を、総絹組成物の約０．０１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％〜約７０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約６０ｗｔ％、約１０ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、約１５ｗｔ％〜約４５ｗｔ％、又は約２０ｗｔ％〜約４０ｗｔ％の合計量で含む。いくつかの実施形態では、組成物中の絹フィブロイン対添加剤の比は、約１０００：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０００（ｗ／ｗ）、約５００：１（ｗ／ｗ）〜約１：５００（ｗ／ｗ）、約２５０：１（ｗ／ｗ）〜約１：２５０（ｗ／ｗ）、約２００：１（ｗ／ｗ）〜約１：２００（ｗ／ｗ）、約２５：１（ｗ／ｗ）〜約１：２５（ｗ／ｗ）、約２０：１（ｗ／ｗ）〜約１：２０（ｗ／ｗ）、約１０：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）、又は約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、１つ又は複数の添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を、ポリマーに対するモル比、例えば、少なくとも１０００：１、少なくとも９００：１、少なくとも８００：１、少なくとも７００：１、少なくとも６００：１、少なくとも５００：１、少なくとも４００：１、少なくとも３００：１、少なくとも２００：１、少なくとも１００：１、少なくとも９０：１、少なくとも８０：１、少なくとも７０：１、少なくとも６０：１、少なくとも５０：１、少なくとも４０：１、少なくとも３０：１、少なくとも２０：１、少なくとも１０：１、少なくとも７：１、少なくとも５：１、少なくとも３：１、少なくとも１：１、少なくとも１：３、少なくとも１：５、少なくとも１：７、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：３０、少なくとも１：４０、少なくとも１：５０、少なくとも１：６０、少なくとも１：７０、少なくとも１：８０、少なくとも１：９０、少なくとも１：１００、少なくとも１：２００、少なくとも１：３００、少なくとも１：４００、少なくとも１：５００、少なくとも６００、少なくとも１：７００、少なくとも１：８００、少なくとも１：９００、又は少なくとも１：１００で含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、絹部分：添加剤比は、例えば、最大で１０００：１、最大で９００：１、最大で８００：１、最大で７００：１、最大で６００：１、最大で５００：１、最大で４００：１、最大で３００：１、最大で２００：１、最大で１００：１、最大で９０：１、最大で８０：１、最大で７０：１、最大で６０：１、最大で５０：１、最大で４０：１、最大で３０：１、最大で２０：１、最大で１０：１、最大で７：１、最大で５：１、最大で３：１、最大で１：１、最大で１：３、最大で１：５、最大で１：７、最大で１：１０、最大で１：２０、最大で１：３０、最大で１：４０、最大で１：５０、最大で１：６０、最大で１：７０、最大で１：８０、最大で１：９０、最大で１：１００、最大で１：２００、最大で１：３００、最大で１：４００、最大で１：５００、最大で１：６００、最大で１：７００、最大で１：８００、最大で１：９００、又は最大で１：１０００である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、絹部分：添加剤比は、例えば、約１０００：１〜約１：１０００、約９００：１〜１：９００、約８００：１〜１：８００、約７００：１〜１：７００、約６００：１〜１：６００、約５００：１〜１：５００、約４００：１〜１：４００、約３００：１〜１：３００、約２００：１〜１：２００、約１００：１〜１：１００、約９０：１〜１：９０、約８０：１〜１：８０、約７０：１〜１：７０、約６０：１〜１：６０、約５０：１〜１：５０、約４０：１〜１：４０、約３０：１〜１：３０、約２０：１〜１：２０、約１０：１〜１：１０、約７：１〜１：７、約５：１〜１：５、約３：１〜１：３、又は約１：１である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば、治療剤、予防剤及び／又は診断剤を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分は、１つ又は複数の治療剤である、又はこれらを含む。一般に、治療剤は、医薬活性（例えば、１つ又は複数の関連する前臨床モデル又は臨床設定において統計的有意性が示されている活性）を有する小分子及び／又は有機化合物である、又はこれらを含む。いくつかの実施形態では、治療剤は臨床的に使用される薬剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ペプチド核酸、アプタマー、抗体若しくはそのフラグメント若しくはその部分、麻酔剤、抗凝血剤、抗がん剤、酵素阻害剤、ステロイド剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤、抗原、ワクチン、抗体、鬱血除去剤、高血圧治療剤、鎮静剤、避妊剤、プロゲステロン作用剤、抗コリン作用剤、鎮痛剤、抗うつ剤、抗精神病剤、β−アドレナリン遮断剤、利尿剤、心血管治療剤、血管作用剤、抗緑内障剤、神経保護剤、血管形成抑制剤、ホルモン剤、ホルモン拮抗薬、増殖因子又は組換え増殖因子及びそのフラグメント及びバリアント、サイトカイン、酵素、抗生物質又は抗菌性合成物、抗真菌剤、抗ウイルス剤、毒素、プロドラッグ、化学療法剤、小分子、薬（例えば、薬、染料、アミノ酸、ビタミン、酸化防止剤）、薬剤、並びにそれらの組合せであるか、又はこれらを含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば細胞を含む。  本明細書において使用に適した細胞は、前駆細胞又は幹細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、胆管細胞、膵島細胞、甲状腺、副甲状腺、副腎、視床下部、下垂体、卵巣、睾丸、唾液腺細胞、脂肪細胞、及び前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／若しくは機能的部分、例えば細菌、真菌、植物若しくは動物、又はウイルス等の生物を含む。いくつかの実施形態では、活性剤は、神経伝達物質、ホルモン、細胞内シグナル伝達物質、薬学的に活性な薬剤、毒性薬剤、農薬、化学毒、生物毒、微生物、並びに動物細胞、例えば、ニューロン、肝臓細胞、及び免疫系細胞等、を含み得る、又はこれらから選択され得る。活性剤はまた、治療用化合物、例えば、薬理学的材料、ビタミン、鎮静剤、催眠剤、プロスタグランジン及び放射性医薬品等を含み得る。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば抗生物質を含む。絹フィブロイン系材料に組み込むのに適した抗生物質は、アミノグリコシド（例えば、ネオマイシン）、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン（例えば、セファゾリン、セファクロール、セフジトレン、セフジトレン、セフトビプロール）、グリコペプチド（例えば、バンコマイシン）、マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン）、モノバクタム、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン）、ポリペプチド（例えば、バシトラシン、ポリミキシンＢ）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、オフロキサシン等）、スルホンアミド（例えば、スルファサラジン、トリメトプリム、トリメトプリムスルファメトキサゾール（コトリモキザゾール））、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン等）、クロラムフェニコール、リンコマイシン、クリンダマイシン、エタンブトール、ムピロシン、メトロニダゾール、ピラジンアミド、チアンフェニコール、リファンビシン、チアンフェニコール、ダプソン、クロファジミン、キヌプリスチン、メトロニダゾール、リネゾリド、イソニアジド、ホスホマイシン、フシジン酸、β−ラクタム抗生物質、リファマイシン、ノボビオシン、フシジン酸ナトリウム、カプレオマイシン、コリスチメタート、グラミシジン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ナリジクス酸、及びバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。例えば、β−ラクタム系抗生物質は、アジオシリン、アズトレオナム、カルベニシリン、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セファロリジン、セファロチン、モキサラクタム、ピペラシリン、チカルシリン及びそれらの組み合わせであることができる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば抗炎症剤を含む。抗炎症剤は、副腎皮質ステロイド（例えば、グルココルチコイド）、毛様麻痺薬、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、免疫選択的な抗炎症薬派生物（ＩｍＳＡＩＤｓ）、及びそれらの任意の組合せを含む。例示のＮＳＡＩＤとしては、セレコキシブ（Celebrex（登録商標））；ロフェコキシブ（Vioxx（登録商標））、エトリコキシブ（Arcoxia（登録商標））、メロキシカム（Mobic（登録商標））、バルデコキシブ、ジクロフェナク（Voltaren（登録商標）、Cataflam（登録商標））、エトドラク（Lodine（登録商標））、スリンダク（Clinori（登録商標））、アスピリン、アルクロフェナック、フェンクロフェナク、ジフルニサル（Dolobid（登録商標））、ベノリレート、ホスホサール、アセチルサルチル酸を含むサリチル酸、アセチルサルチル酸ナトリウム、アセチルサルチル酸カルシウム、及びサリチル酸ナトリウム；イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、ケトプロフェン、カルプロフェン、フェンブフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、スプロフェン、トリアプロフェニック酸（triaprofenic  acid）、フェノプロフェン、インドプロフェン、ピロプロフェン、フルフェナム酸、メフェナム酸、メクロフェナム酸、ニフルミン酸、サルサレート、ロルメリン（rolmerin）、フェンチアザク、チロミソール、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、アパゾーン（apazone）、フェプラゾーン（feprazone）、スドキシカム、イソキシカム、テノキシカム、ピロキシカム（Feldene（登録商標））、インドメタシン（Indocin（登録商標））、ナブメトン（Relafen（登録商標））、ナプロキセン（Naprosyn（登録商標））、トルメチン、ルミラコキシブ、パレコキシブ、リコフェロン（ＭＬ３０００）、及び、薬理学的に許容できる塩、異性体、鏡像異性体、派生物、プロドラッグ、結晶多形体、非晶質の修飾体、共結晶とその組合せを挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば、抗体を含む。絹フィブロイン系材料に組み込む適切な抗体は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アルツモマブペンテテート（altumomab  pentetate）、アルシツモマブ、アトリズマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、デノスマブ、エドレコロマブ、エフングマブ（efungumab）、エルツマキソマブ（ertumaxomab）、エタラシズマブ、ファノレソマブ（fanolesomab）、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イゴボマブ（igovomab）、イミシロマブ（imciromab）、ラベツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン（nofetumomab  merpentan）、オレゴボマブ、ペムツモマブ（pemtumomab）、ペルツズマブ、ロベリズマブ（rovelizumab）、ルプリズマブ（ruplizumab）、スレソマブ（sulesomab）、タカツズマブテトラキセタン、テフィバズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、ボツムマブ（votumumab）、ザルツムマブ、及びザノリムマブを含むが、これらに限定されない。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば、ポリペプチド（例えば、タンパク質）を含む。ポリペプチドは、１つ又は複数の抗原、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、酵素、及びそれらの任意の組合せを、作用物質及び／又は官能基として含むがこれらに限定されない。本明細書において使用に適した例示的な酵素としては、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミロース、有機リン酸デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラッカーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み、例えば、創傷治癒に特に有用である。いくつかの実施形態では、創傷治癒に有用な薬剤は、創傷治癒カスケードの刺激因子、エンハンサー又はポジティブメディエーターを含み、それらは１）自然創傷治癒過程を促進又は早める、又は、２）不適切若しくは遅延した創傷治癒に関連する影響を減少させ、影響としては例えば、有害な炎症、上皮形成、血管新生及びマトリックス沈着、並びに瘢痕及び線維症が挙げられる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば、光学的に又は電気的に活性な作用物質を含む。光学的に又は電気的に活性な作用物質としては、発色団：発光性有機化合物、例えばルシフェリン、カロテン等；発光性無機化合物、例えば化学染料等；集光性化合物、例えばクロロフィル、バクテリオロドプシン、プロトロドプシン、及びポルフィリン等；光捕獲複合体、例えば、フィコビリタンパク質等；及び、関連する電子活性化合物：並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み、例えば、絹フィブロイン系材料の化学修飾に特に有用である。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み、例えば、特に親水性、水の吸収性、形状保持性又は疎水性を改善する。それらとしては、４−スルファニル酸、ポリリシン、４−（ヘプチルオキシ）アニリン、４’−アミノアセトフェノン、超吸収性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。超吸収性ポリマーの例としては、ポリアクリル酸ナトリウム、架橋ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアクリル酸、吸湿性材料、（例えば、修飾又は非修飾の）セルロース及びデンプン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、そられに限定されない。
可塑剤
【０２２３】
いくつかの実施形態では、任意であるが、適切な添加剤の例としては、１つ又は複数の可塑剤を含み得るが、限定するものではない。本開示の文脈において使用される場合、用語「可塑剤」及び「可塑化作用物質」はほとんど同じ意味で使用される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、可塑剤を含む提供される絹フィブロイン系材料は、可塑剤濃度の増加と共に改善された復元特性を示す。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料調製物は、可塑性及び柔軟性を促進し、並びに脆性を減少させるための可塑剤を含む。いくつかの実施形態では、可塑剤を含むこのような絹フィブロイン系材料は、可塑剤を含まない絹フィブロイン系材料と比べて高い結晶化度を示す。いくつかの実施形態では、可塑剤を含む提供される絹フィブロイン系材料は、可塑剤濃度の増加と共に改善された復元特性を示す。典型的には、いくつかの実施形態では、可塑剤は、生体高分子と水素結合又は静電結合を形成し、生体高分子材料中に保持された遊離結合水及び凍結結合水の量を増加する吸湿性物質である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、可塑剤は、グリセロール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、１，４ブタンジオール、１，２，４ブタントリオール、スレイトール、エリスリトール、１，２ペンタンジオール、１，５ペンタンジオール、アドニトール、１，２，６ヘキサントリオール、グリセリン；オレイン酸グリセリル；オレイルアルコール；ＰＥＧ−４；ＰＥＧ−６；ＰＥＧ−８；ＰＥＧ−１２；ＰＥＧ−１６；ＰＥＧ−２０；ＰＥＧ−３２；ＰＥＧ−７５（参考文献、Handbook  of  Green  Chemistry,  Part  IV  Functional/Application,  pp.  2759）、ステアリン酸、オレイン酸、乳酸ナトリウム、Emerest（登録商標）2618；Emerest（登録商標）2619；Hydrobrite（登録商標）200PO；Hydrobrite（登録商標）380PO；Hydrobrite（登録商標）550PO  PEG-20ステアリン酸塩；ラウリン酸プロピレングリコール；Semtol（登録商標）40；Semtol（登録商標）70；Semtol（登録商標）85；Semtol（登録商標）100；Semtol（登録商標）350（参考文献、Handbook  of  Green  Chemistry,  Part  IV  Functional/Application,  pp.  2755）、ポリアクリル酸ナトリウム、架橋ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアクリル酸、吸湿性材料、（例えば、修飾又は非修飾の）セルロース及びデンプン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、メタノール、エタノール、プロパノール異性体：１−プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノール異性体：ｎ−ブタノール；ｓｅｃ−ブタノール；イソブタノール；ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール異性体（アミルアルコール）：ｎ−ペンタノール；イソブチルカルビノール；活性アミルアルコール；第三ブチルカルビノール；３−ペンタノール；メチル（ｎ）プロピルカルビノール；メチルイソプロピルカルビノール；ジメチルエチルカルビノール、ヘキサノール：ｎ−ヘキサノール及び関連異性体、ヘプタノール及び関連異性体、オクタノール及び関連異性体、ノナノール及び関連異性体、デカノール及び関連異性体、ジオール、ビシナルジオール（隣接する原子に結合したヒドロキシル基）；限定されないが例えば：プロパン−１，２−ジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ジオール；限定されないが例えば：プロパン−１，３−ジオール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４ジオール；限定されないが例えば：１，４−ブタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，５ジオール及びより長いジオール；トリオール；限定されないが例えば：グリセロール、ベンゼントリオール、ピロガロール、１，２，６ヘキサントリオール、１，３，５−ペンタントリオール、フェノール；限定されないが例えば：ヒドロキノン、レゾルシノール、メタクレゾール、オイゲノール、チモール、ピロガロール、シュガーアルコール又は多価アルコール、アラビトール、エリスリトール、フシトール、ガラクチトール、グリセロール、イジトール、イノシトール、イソマルト、ラクチトール、マルティトール、マルトテトライトール（Maltotetraitol）、マルトトリイトール、マンニトール、リビトール（アドニトール）、ソルビトール、スレイトール、ボレミトール、キシリトール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、水素化された澱粉加水分解物；ポリグリシトール（食品産業で使用される糖アルコールの混合物）、プロピレングリコール（Ｅ１５２０）、ヘキシレングリコール、及びブチレングリコール；グリセリルトリアセテート（Ｅ１５１８）；ビニルアルコール；ネオアガロビース；糖アルコール／糖ポリオール：グリセロール／グリセリン、ソルビトール（Ｅ４２０）、キシリトール、マルチトール（Ｅ９６５）；ポリマーポリオール（例えば、ポリデキストロース（Ｅ１２００））；キリヤ（Ｅ９９９）；尿素；アロエベラゲル；ＭＰジオール；アルファヒドロキシ酸（例えば、乳酸）；蜂蜜、糖類及び単糖類（例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類）；限定されないが例えば：スクロース、グルコース、フルクトース、リボース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、トレハロース、又はこれらの組み合わせ、であるか、又は含むが、これらに限定されない。
「核酸」
【０２２６】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び/又は機能的部分、例えば核酸剤を含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、核酸剤を放出し得る。いくつかの実施形態では、核酸剤は、治療剤である、又は治療剤を含む。いくつかの実施形態では、核酸剤は、診断剤である、又は診断剤を含む。いくつかの実施形態では、核酸剤は、予防剤である、又は予防剤を含む。
【０２２７】
当業者は、核酸剤が広い範囲内の長さを有し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、核酸剤は、少なくとも約４０、例えば少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、又は少なくとも約３０００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸剤は、約６〜約４０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、核酸剤は、長さが約１２〜約３５ヌクレオチド、長さが約１２〜約２０ヌクレオチド、又は長さが約１８〜約３２ヌクレオチドであることができる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、ロック核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、及び／又はこれらの組み合わせであることができる、又はそれらを含み得る。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つのタンパク質コード要素である又はそれを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、タンパク質コード配列の相補体である少なくとも１つの要素である又はそれを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は複数の遺伝子発現調節要素（例えば、プロモーター要素、エンハンサー要素、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、転写終結配列、翻訳開始配列、翻訳終結配列等）を含むヌクレオチド配列を有する）。いくつかの実施形態では、核酸は、複製起点を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は複数の組込み配列を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、分子内又は分子間組換えに関与する１つ又は複数の要素（例えば、相同組換え）を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞、組織、又は生物内の標的とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞内の標的に作用する（例えば、結合する、切断する等）。いくつかの実施形態では、核酸は、提供された組成物からの放出後に細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、核酸は、提供された組成物からの放出後に細胞内のゲノムに組み込まれる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、一本鎖ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸剤は、より高次の構造（例えば、二本鎖及び／又は三本鎖構造）に折り畳まれるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸剤は、オリゴヌクレオチドである、又はオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。核酸剤は、個々のヌクレオチドレベル又はオリゴヌクレオチド骨格レベルでの化学修飾を含むことができ、又は修飾を有していなくてもよい。
【０２３１】
本開示のいくつかの実施形態では、核酸剤はｓｉＲＮＡ剤である。短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、およそ１９塩基対の長さであり、場合により更に１つ又は２つの一本鎖オーバーハングを含む二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成されてもよく、あるいは、自己ハイブリダイズ部分を含む単一のＲＮＡ分子から生成されてもよい。ｓｉＲＮＡ分子の遊離５’末端がリン酸基を有し、遊離３’末端がヒドロキシル基を有することが一般に好ましい。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分は、１つ又は複数の不対ヌクレオチドからなる１つ又は複数のバルジを含むことができるが、通常はそうではない。ｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的転写物とハイブリダイズする部分を含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、標的転写物の領域と正確に相補的であり、ｓｉＲＮＡが１つのミスマッチもなしに標的転写物にハイブリダイズすることを意味する。本発明の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡと標的転写物の標的部分との間の１つ又は複数のミスマッチが存在し得る。完全な相補性が達成されない本発明のほとんどの実施形態では、任意のミスマッチがｓｉＲＮＡ末端に又はその近くに位置することが一般に好ましい。
【０２３２】
ショートヘアピン型ＲＮＡ  は、ＲＮＡｉを仲介するのに十分長い（典型的には少なくとも１９塩基対の長さ）二本鎖（デュプレックス）構造を形成するようにハイブリダイズする、又はハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補的部分を含むＲＮＡ分子と、典型的にはループを形成する長さ約１〜１０ヌクレオチドの間の少なくとも１つの一本鎖部分を含むＲＮＡ分子とを指す。二本鎖部分は、１つ又は複数の不対ヌクレオチドからなる１つ又は複数のバルジを含むことができるが、通常はそうではない。後述するように、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡにプロセシングされると考えられている。したがって、ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡの前駆体であり、一般に標的転写物の発現を同様に阻害することができる。
【０２３３】
ｓｉＲＮＡの記載において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を参照することがしばしば便利であろう。一般的に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の二重鎖部分の配列は標的転写物の標的部分と実質的に同一であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、以下で更に議論するように、この領域における標的転写物に対して実質的に相補的である。ｓｈＲＮＡは、自己ハイブリダイズする単一のＲＮＡ分子を含むが、得られる二本鎖構造は、センス及びアンチセンス鎖又は部分を含むと考えられ得ると理解されるであろう。したがって、本明細書では、ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖、又はセンス及びアンチセンス部分を指すことが便宜的であろう。ここで、アンチセンス鎖又は部分は、二本鎖を形成する又は形成することができ、標的転写物の標的部分に実質的に相補的である分子のそのセグメントであり、センス鎖又は部分は、二本鎖を形成する又は形成することができ、標的転写物の標的部分と配列が実質的に同一である分子のセグメントである。
【０２３４】
説明の目的のために、以下の議論は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではなくｓｉＲＮＡを指すことができる。しかし、当業者に明らかなように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖に関連する教示は、一般に、対応するｓｈＲＮＡのステム部分のセンス及びアンチセンス部分に適用可能である。したがって、一般的に以下の考察はｓｈＲＮＡにも適用される。
【０２３５】
ｓｉＲＮＡ剤は、１）標的転写物の安定性が、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの存在下でその非存在と比較して低下している場合、及び／又は、２）ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、少なくとも約１５以上の、より好ましくは少なくとも約１７、更により好ましくは少なくとも約１８又は１９から約２１〜２３ヌクレオチドのストレッチのための標的転写物との、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の正確な配列相補性を示す場合、及び／又は、３）ｓｉＲＮＡの１つの鎖又はｓｈＲＮＡの自己相補的部分の１つは、生体外での小さな（＜５０ヌクレオチド）ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションでの厳重な条件下で、及び／又は、典型的に哺乳動物細胞の細胞質又は核内で見られる条件下で、標的転写物にハイブリダイズする場合、本明細書に記載される目的ために標的転写物に標的化されると考えられる。  転写物を標的とする効果は、転写物の合成を指示する遺伝子の発現を低減又は阻害することであるので、転写物を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもまた、遺伝子自体（すなわち、ゲノムＤＮＡ）がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は細胞サイレンシング機構の成分と相互作用するとは考えられないとしても、転写物の合成を指示する遺伝子を標的とすると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、転写物を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、転写物の合成のための鋳型を提供する遺伝子を標的とすると理解される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ剤は、ポリペプチド（例えば、タンパク質）の発現を阻害することができる。例示的なポリペプチドとしては、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）及びタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
増殖因子
【０２３７】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、増殖因子を放出し得る。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン系材料は、複数の増殖因子を放出し得る。いくつかの実施形態では、当該分野で公知の増殖因子としては、例えば、アドレノメデュリン、アンギオポイエチン、オートクリン運動性因子、好塩基球、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質、コロニー刺激因子、結合組織増殖因子、内皮細胞、表皮増殖因子、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞、グリア細胞系由来神経栄養因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、増殖分化因子９、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターロイキン、ケラチノサイト増殖因子、ケラチン生成細胞、リンパ球、マクロファージ、肥満細胞、筋スタチン、神経増殖因子、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、骨芽細胞、血小板、炎症誘発性、間質細胞、Ｔリンパ球、トロンボポエチン、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子α、血管内皮増殖因子、及びこれらの組合せが挙げられる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み、例えば、創傷治癒に特に有用である。欠損修復及び／又は治癒のための増殖因子として有用な例示的な作用物質は、限定されるものではないが、当技術分野で公知の、又はいずれ開発される欠損治療方法のための増殖因子を含み得る。欠損治療方法のための増殖因子として、例示的な因子、作用物質又は方法は、骨及び／又は組織欠損の治癒を促進するための、天然若しくは合成増殖因子、サイトカイン、又はそれらのモジュレーターを含む。適切な例としては、１）外用薬又は包帯剤及び関連する治療剤及び創傷清拭剤（例えば、Santyl（登録商標）コラーゲン分解酵素等）及びIodosorb（登録商標）（カデキソマーヨウ素）；２）全身又は局所用のクリーム又はゲルを含む抗菌剤、例えば、ＳＡＧ（銀抗菌ゲル）、（CollaGUARD（商標）、Innocoll、Inc）（精製Ｉ型コラーゲンタンパク質ベースの包帯）、ＣｏｌｌａＧＵＡＲＤ  Ａｇ（感染した創傷や感染の危険にさらされた創傷用の銀を染み込ませたコラーゲンベースの生物活性包帯）、DermaSIL（登録商標）（深くて激しく滲出する創傷用のコラーゲン合成発泡複合材料包帯）等の銀含有薬剤；３）細胞療法又は生物工学処理された皮膚、皮膚代用物、及び皮膚同等物、例えば、Ｄｅｒｍｏｇｒａｆｔ（サイトカイン及び増殖因子を分泌するヒト線維芽細胞の３次元マトリックス培養）、Apligraf（登録商標）（ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞）、Graftskin（登録商標）（表皮細胞と線維芽細胞との二重層であり、正常な皮膚と組織学的に類似し、及び正常な皮膚により産生されるものと類似した増殖因子を産生する）、ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（ヒト線維芽細胞由来一時的皮膚代替物）、及びOasis（登録商標）（活性な生体材料であり、増殖因子と、コラーゲン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンのような細胞外マトリックス成分との両方を含む）；４）創傷治癒を促進するために創傷に導入されるサイトカイン、増殖因子、又はホルモン（天然及び合成の両方）、例えば、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＢＤＧＦ、インテグリン、プラスミン、セマフォーリング、血液由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、組織増殖因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ（ＡＡ、ＡＢ、及びＢの３つのサブタイプの１つ又は複数が使用され得る）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦβ３とＴＧＦβ１とＴＧＦβ２（例えば、マンノース−６−リン酸）の相対レベルを調節する因子、性ステロイド、例えば、エストロゲン、エストラジオール、又はエチニルエストラジオール、ジエネストロール、メストラノール、エストラジオール、エストリオール、抱合型エストロゲン、硫酸ピペラジンエストロン、スチルベストロール、ホスフェステロール四ナトリウム、リン酸ポリエストラジオール、チボロン、植物エストロゲン、１７−β−エストラジオールからなる群から選択されるエストロゲン受容体作動物質；チモシン−β−４等の胸腺ホルモン類、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７）、ケラチノサイト増殖因子、ＴＮＦ、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＩＬ−１０並びにそれらのモジュレーター等の炎症応答���ジュレーターのインターロイキンファミリー；ＩＮＦ（ＩＮＦ−α、−β、及び−δ）；アクチビン又はインヒビンの刺激剤、及びインターフェロンγプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の阻害剤及びアデノシン３’，５’−環状モノホスフェート（ｃＡＭＰ）経路のメディエーターの阻害剤；アデノシンＡ１アゴニスト、アデノシンＡ２アゴニスト、又は、５）創傷治癒に有用な他の作用物質、例えば、天然又は合成同族体の両方のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＩＧＦのアゴニスト及びアンタゴニスト；ＩＧＦ−１、炎症誘発性サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、及びレプチン；並びに、６）ＩＧＦ−１及びＫＧＦ  ｃＤＮＡ、自家組織の血小板ジェル、次亜塩素酸（Ｓｔｅｒｉｌｏｘ（登録商標）リポ酸、一酸化窒素シンターゼ３、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、ＣＣＴ−ＥＴＡ、αｖβ６インテグリン、増殖因子プライミング線維芽細胞及びデコリン、銀含有創傷包帯、Ｘｅｎａｄｅｒｍ（登録商標）、パパイン創傷清拭剤、ラクトフェリン、サブスタンスＰ、コラーゲン、及びシルバーＯＲＣ、胎盤アルカリホスファターゼ又は胎盤成長因子、ヘッジホッグシグナリングのモジュレーター、コレステロール合成経路のモジュレーター、及びＡＰＣ（活性化プロテインＣ）、ケラチノサイト増殖因子、ＴＮＦ、トロンボキサンＡ２、ＮＧＦ、ＢＭＰ骨形成タンパク質、ＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）、創傷治癒ケモカイン、デコリン、乳酸誘発血管新生のモジュレーター、タラ肝油、胎盤アルカリホスファターゼ又は胎盤成長因子、チモシンβ４、を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、創傷治癒に有用な１、２、３、４、５又は６種類の薬剤を組み合わせて使用することができる。より詳細は、米国特許第８，２４７，３８４号に見出すことができ、その内容は、参照され本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
治癒のための増殖因子に有用な（例えば、増殖因子及びサイトカインを含む）作用物質は、すべての自然に生じる多形体（例えば、増殖因子又はサイトカインの多形体）を包含することが理解されるべきである。また、機能的断片、創傷治癒に又はその機能的断片の有用な前記作用物質の１つを含むキメラタンパク質、創傷治癒剤の１つ又は複数のアミノ酸の類似の置換によって得られる同族体、及び種同族体が包含される    創傷治癒に有用な１つ又は複数の作用物質は、組換えＤＮＡ技術の産物であり、創傷治癒に有用な１つ又は複数の作用物質は、トランスジェニックテクノロジーの産物であり得ることが意図される。例えば、血小板由来増殖因子は、ＰＤＧＦのコード配列を含む組換えＰＤＧＦ又は遺伝子治療ベクターの形態で提供され得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を含み、例えば、診断薬として特に有用である。いくつかの実施形態では、診断薬は、ガスと、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ支援断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影、Ｘ線、蛍光透視法、及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で使用される市販のイメージング剤と、造影剤とを含む。ＭＲＩの造影剤として使用するのに適した材料の例としては、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、及びクロム等と同様にガドリニウムキレートが挙げられる。ＣＡＴ及びＸ線撮像に有用な材料の例としては、ヨウ素系材料が挙げられる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分、例えば、治療剤及び／又は診断剤として特に有用な放射性核種を含む。使用される放射性核種の中では、γ放射体、陽電子放射体、及びＸ線放射体が診断及び／又は治療に適しているが、β放射体及びα放射体も治療に使用され得る。本発明による熱応答性コンジュゲートを形成するのに適した放射性核種は、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、及び１８Ｆを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、診断剤は、蛍光性、発光性又は磁性部分であることができる。
【０２４２】
蛍光部分及び発光部分は、「色素」、「標識」又は「指示薬」と一般に呼ばれる様々な異なる有機又は無機の小分子を含む。例えば、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン染料、アレクサ染料、シアニン染料等が挙げられる。蛍光部分及び発光部分は、種々の天然のタンパク質及びその誘導体、例えば遺伝子操作された変異体を含み得る。例えば、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化されたＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン、及びサファイア蛍光タンパク質、サンゴ蛍光タンパク質等が挙げられる。発光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリン及びその誘導体が挙げられる。多数の蛍光性及び発光性色素及びタンパク質が当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号、Valeur,  B.,  “Molecular  Fluorescence:  Principles  and  Applications,”  John  Wiley  and  Sons,  2002、Handbook  of  Fluorescent  Probes  and  Research  Products,  Molecular  Probes,  9th  edition,  2002、及びThe  Handbook  -  A  Guide  to  Fluorescent  Probes  and  Labeling  Technologies,  Invitrogen,  10th  editionを参照されたい。これらはInvitrogenのＷｅｂサイトで入手できる。これらの両方は参照され本明細書に組み込まれる）。
絹フィブロイン系材料を製造する方法
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、本明細書に記載のような絹溶液を提供することを含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、本明細書に記載の修飾された絹を含む絹フィブロイン溶液を調製すること及び／又は提供することを含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、修飾された絹を含む絹フィブロイン溶液を提供することを含む。いくつかの実施形態では、修飾された絹は、修飾アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾チロシン残基は、（例えば、１つ又は複数のペンダント基の付加による）共有結合的に修飾チロシン残基である、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、約１％〜約９０％の間のこのような修飾された絹の濃度を含む。いくつかの実施形態では、共有結合的に修飾されたチロシン残基。いくつかの実施形態では、提供される絹フィブロイン系材料は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又はそれより高い、濃度の修飾された絹を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を修飾すること、又は絹フィブロイン系材料を修飾することを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液を修飾する方法又は絹フィブロイン系材料を修飾する方法は、絹溶液又は絹フィブロイン系材料に添加剤、作用物質及び／又は機能的部分を添加、混合、及び／又は塗布することを含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン溶液を修飾する方法又は絹フィブロイン系材料を修飾する方法は、添加剤、作用物質、及び／又は機能的部分を絹溶液又は絹フィブロイン系材料と反応させることを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、修飾された絹を含む絹フィブロイン溶液を調整することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液（例えば、絹フィブロイン水溶液）を提供し、及び溶液を修飾することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン系材料を提供し、及び材料を修飾することを含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン水溶液を提供すること、及び／又は絹フィブロイン系材料を提供することを含む。いくつかの特定の実施形態では、このような方法は、４−スルホン酸で修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、このような方法は、ジアゾニウムカップリング反応による修飾を含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、ポリリジンで修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、このような方法は、４−（ヘプチルオキシ）アニリンで修飾することを含む。いくつかの特定の実施形態では、このような方法は、４’−アミノアセトフェノンで修飾することを含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、約１％〜約７５％の修飾された絹（例えば、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のペンダント基の付加により共有結合的に修飾されたチロシン残基）を含む絹フィブロイン溶液を調製すること、及び／又は提供することを含む。いくつかの実施形態では、このような溶液を調製すること、及び／又は提供することは、修飾された絹からなる絹溶液を非修飾の絹溶液と混合することを含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、本明細書に記載の絹溶液を可塑剤と混合することを含む。いくつかの実施形態では、絹溶液と可塑剤を混合することにより、絹に対する可塑剤の重量比が約５％〜約８０％の絹溶液を得る。いくつかの実施形態では、絹溶液と可塑剤とを混合することにより、絹に対する可塑剤の重量比が約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又はこれより高い絹溶液を得る。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を凍結乾燥することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと及び／又はゆっくりと凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、一定期間にわたる制御された凍結乾燥及び／又はゆっくりとした凍結は、絹フィブロインマトリックス内に多孔質構造を生成するために使用される。特定の理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態では、速度は、氷結晶がどのように形成するのかを決定し、それが提供される絹フィブロイン系材料の形態及び機械的特性に最終的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、一定期間にわたって制御された凍結乾燥及び／又はゆっくりとした凍結が、間隔が均一で相互連結した丸い細孔形態を有する絹フィブロイン系材料を形成する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと、及び／又は目標温度までゆっくりと凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、目標温度は約−２０℃〜約−５０℃である。いくつかの実施形態では、目標温度は、絹のガラス転移温度より少なくとも低温である。いくつかの実施形態では、目標温度は、少なくとも約−２０℃、少なくとも約−２５℃、少なくとも約−３０℃、少なくとも約−３５℃、少なくとも約−４０℃、少なくとも約−４５０℃、又は少なくとも約−５０℃である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと、及び／又は固定又は可変速度でゆっくりと凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、棚温度は固定又は可変速度に従って冷却される。いくつかの実施形態では、このような速度での冷却は、目標温度に達するまで行われる。いくつかの実施形態では、目標温度に到達する時間は、例えば、約１０〜約２０時間の間である。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、絹フィブロイン溶液を一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと及び／又は約−１．０℃／分〜約０．００１℃／分の速度でゆっくりと凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、一定期間にわたって制御された凍結乾燥を行うこと及び／又は、約−１．０℃／分未満、約−０．０９℃／分未満、約−０．０８℃／分未満、約−０．０７℃／分未満、約−０．０６℃／分未満、約−０．０５℃／分未満、約−０．０４℃／分未満、約−０．０３℃／分未満、約−０．０２℃／分未満、約−０．０１℃／分未満、約−０．００９℃／分未満、約−０．００８℃／分未満、約−０．００７℃／分未満、約−０．００６℃／分未満、約−０．００５℃／分未満、約−０．００４℃／分未満、約−０．００３℃／分未満、約−０．００２℃／分未満、又は約−０．００１℃／分未満の速度でゆっくりと凍結させることを含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、提供された絹溶液の体積が凍結乾燥中に均一に凍結するように最適化された形状を有する容器を提供することを含む。いくつかの実施形態では、容器は熱伝導性である。いくつかの実施形態では、容器は、１６７Ｗ／ｍ−Ｋ（メートル法）又は１１６０ＢＴＵ−ｉｎ／ｈｒ−ｆｔ２−°Ｆ（英語）以上の熱伝導率を有する。いくつかの実施形態では、例えば、容器は、アルミナ、アルミニウム、ベリリア、真鍮、銅、金、鉄、銀、タングステン、及び／又は亜鉛で作られる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロイン系材料を提供し、調製し、及び／又は製造する方法は、提供される絹フィブロイン系材料を凍結乾燥後にメタノール中に浸漬して、実質的に水に不溶性の絹フィブロイン系材料を形成することを含む。いくつかの実施形態では、０〜１５％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含有する絹フィブロイン系材料を９０％（ｖ／ｖ）メタノールに１時間浸漬し、ドラフトチャンバー中で１２時間乾燥させた。いくつかの実施形態では、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含有する材料はメタノール処理なしで水に不溶性であった。
【実施例】
【０２５７】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態及び態様を説明する。当業者には、本発明の趣旨又は範囲を変更することなく、様々な修正、追加、置換等を行うことができ、そのような修正及び変形は、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内に包含されることは明らかであろう。以下の実施例は決して本発明を限定するものではない。
実施例１
【０２５８】
本実施例は、本開示のいくつかの実施形態による、水又はＰＢＳのような水性媒体の存在によって誘発される変形の後の急速な再膨潤を示す絹材料を記載する。
方法：
【０２５９】
Bombyx  moriの繭を０．０２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液中で１０分又は２０分間煮沸した後、純水ですすいだ。抽出した絹フィブロインを化学フード内で１２時間乾燥した後、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液に６０℃で４時間溶解し、２０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。この溶液をPierce  Slide-a-Lyzer  cassettes、MWCO3500Da(Rockford,IL)を用いて３日間蒸留水に対して透析してＬｉＢｒを除去した。溶液を遠心分離して、精製中に形成された凝集物を除去した。絹フィブロイン水溶液の最終濃度は６〜８％（ｗ／ｖ）であった。この濃度をすべての実験で３％（ｗ／ｖ）まで純水で希釈した。
【０２６０】
煮沸時間は、絹フィブロインの分子量に影響を及ぼし、分子量は、得られた発泡体の貯蔵弾性率に影響を及ぼすことが示された（図２）。これまでのところ、１０及び２０分の煮沸絹しか試験をしていないが、（５分の煮沸による）より大きい分子量の絹又は（３０分又は６０分の煮沸による）より小さい分子量の絹は、それぞれがより硬い又は軟らかい発泡体を産生することが予想される。分子量が膨潤及び変形復元にどのように影響するかは不明である。
可塑剤／絹フィブロインブレンドの調製
【０２６１】
いくつかのポリオール可塑剤は、特有の物理的特性を有する絹の記憶発泡体を作製するために添加剤、作用物質及び／又は機能的部分として使用されている。各ポリオールは分子組成がわずかに異なり、その結果、様々な細孔形態及び貯蔵弾性率を有する絹発泡体が作製される（図３）。現在の研究は主としてグリセロールに重点を置いているが、スレイトール、１，５ペンタンジオール、１，３プロパンジオール及び１，２，６ヘキサントリオールのような他のポリオールを用いていくつかの予備的データを収集している。今後の研究は、これらの発泡体の生体適合性を保つために毒性がないと考えられるこれらのポリオールのみを選択することに焦点を当てるであろう。
【０２６２】
絹／グリセロール発泡体を作製するために、水性グリセロール溶液を精製絹フィブロイン溶液と０、１、５、１０、１５、２０、３０及び４０％の重量比で混合した（ｗグリセロール／ｗ絹）。
凍結乾燥処理
【０２６３】
制御された凍結乾燥法を使用して、絹フィブロインマトリックス内に多孔質構造を生成した。恒温環境（実験室の冷凍庫又はチェストフリーザ）で絹の溶液を急速に凍結させることに重点を置き、試料を数日間その温度で放置する他の凍結乾燥法とは異なり、この新しいプロセスは、発泡体の多孔度、細孔の形態、膨潤速度及び機械的強度に影響を与える、高度に制御された低速凍結プロセスを利用する。
【０２６４】
絹／グリセロール溶液を、凍結乾燥装置内で、−２０℃又は−５０℃で凍結させた。絹溶液は、この範囲内のいずれの温度においても凍結され、形状記憶発泡体を作製することができる。凍結温度の唯一の制限は、絹水溶液のガラス転移温度（は適切な凝固するためにこの温度より低くなければならない）及び冷凍庫の能力（実験室の凍結乾燥装置は、−５０℃よりも低い温度を連続して維持することができない）である。したがって、これらの２つの温度は極端な温度として選択された。
【０２６５】
棚温度を−０．０５℃／分の一定速度で冷却し、目標温度に達するまで、−２０℃及び−５０℃にそれぞれ１０時間又は２０時間かかった。凍結速度は、氷結晶がどのように形成されるかを決定するので非常に重要であり、発泡体の形態及び機械的特性に最終的に影響を及ぼす（図４）。制御されたゆっくりとした凍結は、発泡体中に均一に間隔を置いて相互連結した丸い細孔形態を生じさせる。急速冷凍は、棚温度を目標温度に設定することによって達成され、その結果、溶液は１時間未満で凍結する。急速凍結は、氷結晶がランダムな形状及びサイズで成長し、異なる細孔形状の予測不能な配列を生成する。（ｃｒｅａｔ：生成する）    今後の研究は、異なる固定凍結速度（例えば、−０．０１℃又は−０．１℃）が形状記憶絹発泡体の機械的及び形態の特徴にどのように影響するかを測定することに重点を置くであろう。
カスタム金型設計
【０２６６】
絹／グリセロールブレンドをカスタム設計されたアルミニウム金型中で凍結した（図５）。プレートは、発泡体の大きなバッチを作製するための３８０個の窪みがあり、各窪みは直径１２ｍｍ及び深さ２０ｍｍである。
【０２６７】
発泡体を成形するためにポリスチレン製の窪みプレートを使用していた従来の凍結乾燥法とは異なり、アルミニウムの高い熱伝導率により、絹溶液の温度をよりよく制御することができる。熱を伝導しないプラスチックは、絹の溶液が棚の設定点よりも温かくなる。これは、溶液が凍結のむらの原因となる。例えば、プラスチック金型は、典型的には、発泡体の半分が丸い細孔を有し、半分が細孔径及び幾何学形状の不均質な分布を含む二重層を形成させる。アルミニウムは二重層を生成しないで、代わりに発泡体全体に丸い細孔を産生する（図６）。
後処理
【０２６８】
凍結乾燥後、０〜１５％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含有する全ての発泡体を直ちに９０％（ｖ／ｖ）メタノール中に１時間浸漬し、ドラフトチャンバー中で１２時間乾燥させた。２０％（ｗ／ｗ）以上のグリセロールを含有する発泡体を、１）１時間のメタノール処理及び１２時間の乾燥、と、２）後処理なし、の２つの群に分けた。発泡体を水に不溶性にするためにメタノール処理を行うが、２０％（ｗ／ｗ）以上のグリセロールを含有する発泡体はメタノール処理なしで水に不溶性であることが観察された。
結果：膨潤、力学、及び細孔の形態
【０２６９】
圧縮前後の発泡体の質量及び体積の両方を測定することにより、膨潤を定量化した。注入をシミュレートするために、スポンジを９０％歪みまで（又はそれらの元の高さの１０％まで）圧縮し、ＰＢＳ中に沈めた。ＰＢＳ中に浸漬する前後の試料の質量及び寸法の両方を測定することにより膨潤を計算し、それによりＰＢＳの吸収を測定した。圧縮後、絹単独（コントロール）のスポンジは、それらの出発質量の約４００％膨潤したが、塑性変形を示し、元の体積への復元は不完全であった。グリセロールを含む絹スポンジは、それらの出発質量の８００％以上膨潤し、それらの初期体積へほぼ完全に復元した（図７）。絹単独のスポンジの場合、圧縮状態からの体積膨張はおよそ２倍であったが、グリセロールを含むスポンジでは約６倍であった    （図８左）。
【０２７０】
可塑剤を含む絹スポンジの剛性は、ＰＢＳ中での膨潤後、約７．５ｋＰａ〜８１０ｋＰａの範囲であり、それは様々な軟部組織の再構築に適している範囲である。機械的剛性は、絹の分子量、グリセロール含有量及びメタノール処理時間（処理なし対１時間メタノール処理）を変えることによって調整され得る。図８右において、グリセロール含有量のみを調整することにより、弾性率は、約３５ｋＰａ〜８１０ｋＰａの範囲のオーダーの範囲に及び得る。
【０２７１】
スポンジは１００〜２００μｍの細孔径を有し、それはバルク材料への細胞の浸潤に対応するのに十分な大きさである。更に、細孔径及び形状は、いくつかの種の絹／グリセロール発泡体配合物の圧縮によって損なわれなかった。凍結速度を変えることにより、制御された凍結乾燥プロセスによって、細孔径及び形状を調節し得る。
結果：生体内劣化分解
【０２７２】
マウスへ、絹単独の（コントロール）及び絹−グリセロール発泡体の皮下移植を行い、材料又は処理方法の結果として起こり得るいかなる炎症反応も観察した。発泡体をエチレンオキシドガスで滅菌し、完全に水和させた後に移植した。２、４、８及び１２週間後に回収された材料の組織学的解析は、両方の群において最小限の免疫反応があるが、絹−グリセロール発泡体においてのみ広範囲の細胞浸潤及び材料劣化分解があることを示す（図９）。材料の再吸収及び天然組織による置換に劣化分解及び細胞浸潤が必要であるため、これらは理想的な性質である。今後の研究では、グリセロールの濃度、発泡体密度、又はフィブロインの分子量を変えることによって、劣化分解を制御及び調整する方法を見出すであろう。
結論
【０２７３】
ここで論じるアプローチは、水やＰＢＳのような水性媒体の存在によって誘発される変形の後に迅速な再膨潤することができる材料を提供することにより、現在の絹発泡体技術を改善する（材料は乾燥したときに圧縮され、媒体中に浸漬した後にのみ膨張する。可塑剤分子及び制御された凍結乾燥プロセスを使用しなければ、絹発泡体は一般に圧縮されると塑性変形する。これは、圧縮された材料が元の形状とは異なる機械的特性を示し、本体の空隙を埋めることができず、細胞浸潤及び予測可能な劣化分解速度を妨げるので、好ましくない品質である。これらの形状記憶絹発泡体はまた、天然材料由来の現在の記憶ポリマーと比較して、同等又はより良好な体積膨潤、生体適合性及び分解性を示し、弾性率の範囲を満たすように容易に調整され得る。このため、絹の記憶発泡体は、皮膚の欠陥、審美的な機能強化（胸部、大腿部、臀部等）のための軟部組織フィラーとして、又は顔面の変形のための再吸収可能な移植片として使用され得る。更に、絹の記憶発泡体は、そのエラストマー特性により、ドラッグデリバリー、組織再生又は創傷凝固のための最小侵襲性移植器具用として、実現可能な材料となる。
実施例２
【０２７４】
本実施例は、本開示のいくつかの実施形態によるスルホン酸修飾を伴う形状記憶絹材料を記載する。
方法：
【０２７５】
Bombyx  moriの繭を０．０２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液中で１０分又は２０分間煮沸した後、純水ですすいだ。抽出した絹フィブロインを化学フード内で１２時間乾燥した後、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液に６０℃で４時間溶解し、２０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。この溶液をPierce  Slide-a-Lyzer  cassettes、MWCO3500Da(Rockford,IL)を用いて３日間蒸留水に対して透析してＬｉＢｒを除去した。溶液を遠心分離して、精製中に形成された凝集物を除去した。絹フィブロイン水溶液の最終濃度は６〜８％（ｗ／ｖ）であった。この濃度をすべての実験で３％（ｗ／ｖ）まで純水で希釈した。
修飾された絹発泡体の調製
【０２７６】
絹／グリセロール発泡体を作製するために、水性グリセロール溶液を精製絹フィブロイン溶液と０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７５％の重量比で混合した（グリセロール重量／絹重量）。
【０２７７】
Ｍｕｒｐｈｙらのに見られるように、絹フィブロインタンパク質内のチロシン残基のスルホン酸修飾をジアゾニウムカップリング反応により行った。（Murphy,  Amanda  R.;  St.  John,  Peter;  Kaplan,  David  L.  Modification  of  silk  fibroin  using  diazonium  coupling  chemistry  and  the  effects  on  hMSC  proliferation  and  differentiation.  Biomaterials  2008;29:2829-2838を参照されたい）。この反応により、約６０％のチロシン残基がスルホン酸で修飾された絹溶液が得られた。この溶液を非修飾の絹溶液と混合して、より少ない修飾（例えば、１０％及び３０％修飾チロシン）を有する溶液を調製した。
【０２７８】
凍結乾燥後、発泡体を、１）１時間のメタノール処理、２）処理なし、の２つの群に分けた。
機械的試験
【０２７９】
体積膨潤：湿った発泡体シリンダー（直径４．５ｍｍ）を一方向に最大高さの１０％まで圧縮した。発泡体の体積を圧縮状態で測定し、次いで水中に１５秒間沈めた。得られた発泡体体積を再測定し、膨潤体積と圧縮された体積との比を計算した。
【０２８０】
圧縮弾性率及び復元率：発泡体を動的機械分析（ＤＭＡ）機械に装填し、注入中に受ける圧縮をシミュレートするために８０％歪みまで圧縮した。１〜２％歪みの応力−歪み曲線の傾きから圧縮弾性率を計算した。８０％歪みにおける応力を測定することによってピーク圧縮応力を計算した。ランプ速度は１ｍｍ／分であった。
結果：膨潤、復元、力学
【０２８１】
凍結乾燥した絹発泡体へのグリセロールの添加は圧縮後の弾性及び復元を増加させることが観察されている。更に、高濃度（＞２０％ｗ／ｗ）のグリセロールは、絹材料を結晶化させ、材料を水に不溶性にする。これと比較して、絹単独の発泡体は、水に不溶性であるために後処理（例えば、メタノール、オートクレーブ、水アニーリング）を必要とする。
【０２８２】
図１０において、絹発泡体は、グリセロールの濃度が増加するにつれて復元率を改善することが示されている。正確な比較を行うために、０％（コントロール）〜４０％ｗ／ｗのグリセロールを含有する発泡体をメタノール処理した。絹単独のコントロール発泡体は、圧縮後元の体積の約７５〜８０％に復元したのに対して、２０％ｗ／ｗを超えるグリセロールを含有する発泡体は９０〜９５％に復元する。メタノール処理を行わない場合、グリセロール含有発泡体は、過酷な圧縮後に元の体積のほぼ１００％復元し得る。
【０２８３】
体積膨潤に関しては、絹単独のコントロールは、圧縮された体積から２〜３倍に膨張するが、グリセロールを３０％ｗ／ｗ添加することにより、圧縮された体積の最大６〜７倍までの膨潤を改善することができた。絹発泡体の膨潤ポテンシャルを更に改善するために、ジアゾニウムカップリング反応を用いて絹チロシン残基をスルホン酸で修飾した。凍結乾燥した絹骨格の親水性を高めるために、スルホン酸修飾を選択した。グリセロールとの組み合わせにおいて、これらの修飾は、絹単独のコントロールと比較して、多量の水を吸収し、高体積膨潤することが可能な親水性発泡体をもたらすと考えられていた。
【０２８４】
図１１では、１０％スルホン酸で修飾した絹骨格は、グリセロール−絹発泡体よりも改善を示さなかったが、より高い修飾は、膨潤が圧縮された体積の２０倍を超える改善を示した。グリセロールの添加により、３０％のスルホン酸修飾絹は、ある程度の構造を維持しながら、圧縮された体積の４０倍を超えて膨潤することができる。膨潤後、グリセロール／３０％スルホン酸修飾された絹骨格は、ポリマーネットワーク内にいくつかの識別可能な固体粒子を有する非晶質形状のセミゲルに変化した。
【０２８５】
グリセロールを含まない未処理のジアゾニウム結合絹発泡体は水に溶解した。予想されるように、グリセロールの添加は、スルホン酸修飾があまり高くない限り、溶解を妨げた。例えば、グリセロールを含有する３０％スルホン酸修飾骨格は溶解しなかったが、グリセロールを含有する６０％スルホン酸修飾骨格は、水に速やかに溶解した。親水性化学物質によるチロシン残基の修飾は、グリセロール又はメタノール処理を用いた発泡体におけるβシート形成を妨げるであろうと予測された。これを確認するために、種々の濃度のスルホン酸を有する発泡体の二次構造をグリセロール存在下と非存在下とで比較した（図１２）。
【０２８６】
予想通り、コントロール発泡体は主として非晶質構造を示し、絹−グリセロール発泡体は強いβシートピークを有している。スルホン酸修飾発泡体では、修飾及び一定のグリセロール濃度が増加すると、βシートピークが消失する。このことは、水を吸収しながら発泡体が膨張する能力を適切に説明している。結晶性が低下することにより、発泡体が結合させるのに十分な架橋を持たない点まで、より大きく膨張することができるであろう。
【０２８７】
最後に、図１３は、修飾された発泡体対絹単独のコントロールの機械的特性を強調する。絹単独、絹−グリセロール、及び絹−スルホン酸修飾発泡体はすべて同様の機械的剛性を有する。完全に膨潤したときに軟質ゲルに変化する絹−グリセロール／スルホン酸修飾発泡体は、高い保水性にもかかわらず、絹単独の発泡体とほぼ同様に軟らかい。注目すべきは、８０％歪みでのピーク圧縮応力は、発泡体を元のサイズの２０％に圧縮するのに必要な力に相当することを意味し、従って注入の効果をシミュレートする。絹−グリセロール発泡体は、高い圧縮に対してより大きな力を必要とするように見えるが、絹−スルホン酸修飾発泡体は、圧縮に匹敵する力を必要とする。更に、絹−グリセロール／スルホン酸修飾発泡体は、おそらく材料の非晶質形状に起因して、圧縮には非常に少ない力を必要とする。このことは、修飾された絹発泡体が注入の間、より容易に圧縮し得ることを示している。
結論
【０２８８】
スルホン酸を添加することにより、これらの凍結乾燥絹−グリセロール発泡体の形状記憶及び超吸収性を更に変化させた。グリセロール含有量及びスルホン酸修飾の両方を調整することにより、結晶化度を制御することができ、したがって膨潤を制御できる。高い膨潤性と構造的完全性とのバランスを取らなければならない。理想的には、これらの発泡体は高度に多孔質の固体であるが、高吸収性のヒドロゲルにも使用できる。
【０２８９】
得られた発泡体は、絹単独のコントロールよりも良好な復元、より大きな膨潤のオーダー、及び高歪みでの同等又はより低い圧縮強度、を達成することができ、復元能力が高い形状記憶特性を依然として維持しながら、注入のために必要な力をより少なくすることができることを示している。
実施例３
【０２９０】
本実施例は、本開示のいくつかの実施形態による、水又はＰＢＳのような水性媒体の存在によって誘発される変形の後の急速な再膨潤を示す絹材料を記載する。
材料及び方法
絹溶液の調製
【０２９１】
絹フィブロイン溶液を以前の報告のように調製した。例えば、Rockwood,  D.  N.,  Preda,  R.  C.,  Yucel,  T.,  Wang,  X.,  Lovett,  M.  L.及び  Kaplan,  D.  L.,  Materials  fabrication  from  Bombyx  mori  silk  fibroin,  6  Nature  Protocols  10,  1612-31  (2011)を参照されたい。簡潔に述べると、Bombyx  mori繭から絹フィブロインタンパク質を、０．０２Ｍ炭酸ナトリウム溶液中で１０、３０又は６０分間煮沸することにより（以下、それぞれ１０ｍＥ（「分抽出」）、３０ｍＥ、及び６０ｍＥと呼ぶ）抽出して、セリシンを除去した。抽出した絹フィブロインを洗浄し、化学フード内で１２時間乾燥した後、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液中に６０℃で４時間溶解し、２０％ｗ／ｖ溶液を得た。この溶液をPierce  Slide-a-Lyzercassettes,  MWCO3500Da(Rockford,  IL)を用いて３日間蒸留水に対して透析してＬｉＢｒを除去した。溶液を遠心分離して、精製中に形成された凝集物を除去した。絹フィブロイン水溶液（以後、絹と呼ぶ）の最終濃度は約６〜８％ｗ／ｖであった。すべての実験のためにこの濃度を脱イオン水で３％ｗ／ｖに希釈し、使用するまで２〜５℃で保存した。ジアゾニウムカップリング修飾のみについて、ホウ酸塩緩衝液（１００ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９）（Buph  borate緩衝液パック、Pierce,Woburn  MA）に対して、絹溶液を更に２４時間透析した。
修飾された絹ブレンドの調製
【０２９２】
強化された親水性及び形状記憶特性を有する絹スポンジを作製するために２つの方法を用いた。全ての配合物について概要を述べる。最初に、絹フィブロイン水溶液を特定のポリオール添加剤、例えば、グリセロール（Sigma-Aldrich,  St.  Louis,MO）等と以前記載したように混合した。例えば、Lu,  S.,  Wang,  X.,  Lu,  Q.,  Zhang,  X.,  Kluge,  J.,  Uppal,  N.,  Kaplan,  D.  L.,  Insoluble  and  flexible  silk  films  containing  glycerol,  11  Biomacromolecules  1,  143-50  (2010)を参照されたい。簡潔に述べると、７００ｍｇ／ｍＬのグリセロール溶液を、種々の重量：重量（ｗ／ｗ）比：１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、３０：７０及び４０：６０グリセロール重量：絹重量、で絹溶液に添加した。相分離がもはや見えなくなるまで、穏やかに反転させることにより溶液を均質化した。
【０２９３】
絹修飾の第２の方法はスルファニル酸でチロシン残基を修飾するジアゾニウムカップリング反応によるものであった。例えば、Murphy,  A.  R.,  St  John,  P.,及び  Kaplan,  D.  L.,  Modification  of  silk  fibroin  using  diazonium  coupling  chemistry  and  the  effects  on  hMSC  proliferation  and  differentiation,  29  Biomaterials  19,  2829-38  (2008)を参照されたい。簡潔に述べると、スルファニル酸（水溶液３０ｍＬ、０．０６５Ｍ）とｐ−トルエンスルホン酸（７．５ｍＬ、１．７６Ｍ）の冷却溶液を撹拌し、氷浴中で１０分間保持した。次に、亜硝酸ナトリウム（７．５ｍＬ、０．Ｍ）をその溶液に添加し、短時間撹拌し、氷中で更に３０分間保持した。次いで、ジアゾニウム塩溶液をホウ酸塩緩衝液中の１０ｍＥの絹溶液に添加して、理論収率の約６０％のチロシン修飾を達成した。絹タンパク質の修飾を確認し、分光光度分析により定量した。修飾されたチロシン残基の相対濃度を計算するために、３２５ｎｍにおける修飾された絹溶液の吸光度値を使用した。ジアゾニウム修飾絹溶液を非修飾１０ｍＥ絹溶液で希釈して、１０％及び３０％収率の修飾チロシン残基を有するブレンドを得た。溶液を３％ｗ／ｖの絹タンパク質濃度に希釈し、使用前の２４時間以内の間、２〜５℃で保存した。図中、ジアゾニウム修飾スポンジは、「スルホン酸アゾシルク」についてはＳＡＡと略記される。
凍結乾燥処理及び後処理
【０２９４】
制御された凍結乾燥法を用いて、絹マトリックス内に均質に分布した多孔質構造を生成した。修飾された絹ブレンドをカスタム設計されたアルミニウム金型（図５）内で凍結した。アルミニウム型は、スポンジの大きなバッチを作るために３８０個の窪み（１２ｍｍφ、深さ２０ｍｍ）を含んでいた。絹溶液の１．５ｍＬ分取を各窪みに加えた後、VirTis  Genesis  25L  Super  XL凍結乾燥機（SP  Scientific,Stone  Ridge,NY）に移した。以前に公表された実施要綱の改訂版を用いて試料を凍結した。例えば、Guziewicz,  N.,  Best,  A.,  Perez-Ramirez,  B.,及び  Kaplan,  D.  L.,  Lyophilized  silk  fibroin  hydrogels  for  the  sustained  local  delivery  of  therapeutic  monoclonal  antibodies,  32  Biomaterials  10,  2642-2650  (2011)を参照されたい。簡潔に述べると、試料を周囲温度から冷却し、５℃で１時間保持し、次いで−４５℃で凍結させ（ランプ速度：−０．０５℃／分）、１２時間保持した。一次乾燥は、ピラニーゲージ圧力が静電容量マノメータ圧力より低くなるまで、−２０℃で、５０ｍＴの真空下で実施した。Patel,  S.  M.,  Doen,  T.,及び  Pikal,  M.  J.,  Determination  of  End  Point  of  Primary  Drying  in  Freeze-Drying  Process  Control,  11  AAPS  PharmSciTech,  1,  73-84  (2010)。２次乾燥工程を４℃で１０時間行った。
後処理
【０２９５】
凍結乾燥の完了時に、０〜１５％（ｗ／ｗ）グリセロールを含有するスポンジを直ちに９０％（ｖ／ｖ）メタノール中に１２時間浸漬した後、洗浄し、試験まで脱イオン水中に保存した。２０％（ｗ／ｗ）以上のグリセロールを含有するスポンジを２つの方法のいずれか、１）１２時間のメタノール処理及び脱イオン水中での保存、又は２）後処理のメタノール処理なしで脱イオン水中に直接保存、で後処理した。各群について、試料のサブセットを脱イオン水から取り出し、２回凍結乾燥して材料を乾燥させた。これらのサンプルは、画像解析及び細孔率の特性評価のために、室温で乾燥剤パケットを入れた密閉チューブ内に保存した。
分析技術
圧縮弾性率、復元率、膨潤、及び疲労
【０２９６】
TA  Instruments  RSA3  Dynamic  Mechanical  Analyzer  (TA  Instruments,  New  Castle,  DE)での一軸圧縮試験により、絹スポンジの機械的特性を評価した。試験の前に、スポンジを均一な円筒サイズ（８ｍｍφ、高さ５ｍｍ）に切断し、真空下（約６０ｋＰａ真空）で１×  ＰＢＳ中で３０分間再水和させ、材料全体に適切な水和を確保した。次に、試料をＰＢＳ中で室温及び室圧下で１２時間保持した。再水和後、スポンジ試料を、１×  ＰＢＳが入っている浸漬浴内のステンレス鋼平行プレートの間に入れた。上部プレートと試料との間の適切な接触を確実にするために、すべての試料を０．５グラムの初期予圧で分析した。各スポンジは、注入のような厳しい物理的応力をシミュレートするために、軸方向の８０％歪み（初期高さの２０％）の適用の前後で、弾性率、ヒステリシス及び形状復元率を順番に測定するカスタムマクロにかけられた。各試験前に、１ｍｍ／分のランプ速度で４０％軸方向歪みまで４サイクル予備調整し、ＰＢＳ中で３０分間回復させてから、一次試験を開始した。前調製後、０．５グラムの予荷重を印加して試料の初期高さを記録した。
【０２９７】
スポンジ試料は、以下の一連の試験を受けた。１）２０％歪みまで負荷／除負荷する（予備圧縮剛性のために、「プレ」と呼ばれる）；２）８０％の軸方向歪まで負荷／除負荷する（高圧縮サイクル）；３）２０％の軸方向歪み（圧縮後の剛性のために、「ポスト」と呼ばれる）まで負荷／除負荷する。ランプ速度はすべての試験で１ｍｍ／分で一定に保った。１〜５％の軸方向歪みの範囲内において各応力−歪み曲線の線形弾性領域の傾きによって、圧縮弾性率を計算した。復元率は、（０．５グラムの予備負荷を印加した）前の、対、８０％の軸方向歪み後のスポンジの高さを比較することによって計算した。各歪みの負荷領域と除負荷領域との曲線下に広がる面積の比としてヒステリシスを測定した。疲労の測定のために、１、５又は１０％の軸方向歪みのいずれかで０．５Ｈｚの周波数、サイクル荷重下で１０００サイクルの試料の貯蔵弾性率をモニターした。膨張率は、選択された最大圧縮（初期高さ５％、軸方向歪み９５％）時、並びに残留水を吸い上げることによる脱水後のスポンジの軸方向及び径方向寸法を測定することによって計算した。試料を１×ＰＢＳ中で３０秒間再水和させた。試料体積を再測定し、圧縮された体積と比較した。
水銀圧入ポロシメトリー
【０２９８】
水和後及びその後の凍結乾燥の後に、水和した形状を保ちながら材料を乾燥させた修飾された絹スポンジの細孔率及び細孔径分布を評価するために水銀圧入式ポロシメトリー測定を行った。円柱状スポンジ試料（膨潤度に基づいて寸法は可変）を、Quantachrome  PoreMaster水銀圧入ポロシメータ（Quantachrome  Instruments,  Boynton  Beach,  FL）により分析した。各配合物について、５つの試料を集め、０．５ｃｃのステム体積を有するガラス試料セル中に入れた。マイクロメーター範囲内の細孔径を評価するために、低圧サイクル（最高圧力：５０ｐｓｉ又は３４４ｋＰａ）を実施した。結果は、細孔径（μｍで）対細孔径分布関数ＦＶのヒストグラムとして報告され、ここで、ＦＶ＝−［ｄＶ／ｄｌｏｇ（Ｄ）］、Ｖは累積細孔容積、Ｄは細孔直径である。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）
【０２９９】
ＦＴ−ＩＲ及びフーリエ自己デコンボリューション（ＦＳＤ）を使用して、絹スポンジのタンパク質二次構造要素を分析及び定量した。ＭＩＲａｃｌｅ（登録商標）減衰全反射（ＡＴＲ）ゲルマニウム結晶と組み合わせたJASCO  FTIR  6200分光計（JASCO、東京、日本）を用いてスポンジを測定した。 バックグラウンドスキャンとスペクトルスキャンは、１試料あたり３２スキャンで２ｃｍ−１の分解能で４０００〜６００ｃｍ−１で測定した。スポンジ試料は、処理された後（凍結乾燥サイクルの直後）又は水和後のいずれかで測定された。水和した場合、吸水による干渉を低減するために、スポンジを空気を流したフード内で１２時間乾燥させ、分析まで乾燥剤下で保管された。二次構造は、Opus  5.0ソフトウェア（Bruker,  Billerica,  MA）を用いてＦＳＤ及びピークフィッティングによりアミドＩ領域（１５９０〜１７１０ｃｍ−１）内で定量した。各生ＩＲスペクトルを、２５〜２６ｃｍ−１の半値幅及び０．３のノイズ低減係数を有するローレンツ（Lorentzian）線形状を用いて、ベースライニング、９点スムージング（Savitzky-Golay法）及びデコンボリューション処理した。アポダイゼーションはブラックマンハリス関数により行った。デコンボリューションされたアミドＩ領域は、先に説明したように１１ガウスライン形状プロファイルでカーブフィットした。例えば、Hu,  X.,  Kaplan,  D.及び  Cebe,  P.,  Determining  beta-sheet  crystallinity  in  fibrous  proteins  by  thermal  analysis  and  infrared  spectroscopy,  39  Macromolecules  18,  6161-6170  (2006)を参照されたい。ピークは以前の研究に基づいて特定の二次構造要素に割り当てられた。例えば、Lawrence,  B.  D.,  Omenetto,  F.,  Chui,  K.及び  Kaplan,  D.  L.,  Processing  methods  to  control  silk  fibroin  film  biomaterial  features,  43  J.  Materials  Science  21,  6967-6985  (2008)を参照されたい。各構造の相対的な寄与は、全てのフィッティングしたピーク面積合計に対するピーク下の面積の比から計算された。
示差走査熱量測定
【０３００】
様々な濃度のグリセロール（０〜１０％ｗ／ｗ）を含有する絹溶液を４％ｗ／ｖの絹タンパク質に希釈し、TA  Instruments  G100示差走査熱量計（New  Castle,  DE）で分析した。１０μＬの試料を蓋付きのアルミニウム密閉パンに入れ、加熱中の蒸発を低減するために試料をプレスして密封した。温度変調測定は、６０秒の変調時間及び１±０．３１８℃の温度変調振幅で、試料を−４５℃に冷却し、２．０℃／分の速度で２０℃に加熱して行った。溶液のガラス転移温度は、サブサーマルステップ変化時の変曲点として測定した。
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
【０３０１】
修飾された絹スポンジの細孔の形態を評価するためにＳＥＭを使用した。絹タンパク質スポンジは、Zeiss  EVO  MA10電子顕微鏡（Carl  Zeiss  AG,  Germany）を用いて画像化された。水和及びその後の再凍結乾燥の後に、円筒形試料を分析した。試料を水平軸に沿って切断し、銅テープ上にマウントし、画像化する前に金でスパッタリングした。
生体内皮下移植
【０３０２】
すべての動物試験は、タフツ大学動物管理機関及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）及び国立衛生研究所の実験動物衛生研究所（ＯＬＡＷ）によって規定された規則に従って承認された議定書にしたがって行われた。６−８週齢のＢａｌｂ−Ｃ雌マウスをCharles  River  Labs(Wilmington,  MA)から購入し、移植研究の前に１週間順応させた。誘導のために３％のイソフルランの吸入により動物を麻酔し、外科手術中に２％を維持した。麻酔の間中、全ての動物を加熱パッド上に置いた。絹スポンジを湿式オートクレーブサイクルで２５分間滅菌し、滅菌１×  ＰＢＳ中で手術前に２４時間平衡化させた。マウスには、４つの時点（２、４、８及び１２週）に、無作為に１つの時点につき２匹の動物を割り当てた。各マウスは、２種類の絹スポンジ試料（５ｍｍφ、高さ３ｍｍ）を有した。３％ｗ／ｖ絹単独、及び３０％ｗ／ｗグリセロールを含有する３％ｗ／ｖ絹（Ｎ＝４／群／時点）。スポンジを肩甲骨及び背部の鼠径部に皮下移植した。各時点で、動物を安楽死させ、組織学的検査のために周囲の組織と一緒に絹のスポンジを摘出した。キャリパーを用いて各試料のスポンジ直径を測定し、その後試料を固定してホルマリン中に保存した。
組織化学
【０３０３】
切除した組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、キシレン及び勾配エタノール浴で脱水した後、パラフィンワックスに包埋した。試料を切片にし、ガラススライド上に載せ、細胞浸潤を視覚化するためにヘマトキシリン及びエオシン（H&E;  Sigma-Aldrich,  St.  Louis,  MO）で染色した。Zeiss  Axiovert  40  CFL光学顕微鏡及び１０倍対物レンズ（Carl  Zeiss,  Germany）を用いて試料を画像化した。
統計
【０３０４】
データは平均±標準偏差として表される。機械的データ（Ｎ＝３／群）及び２次構造分析（Ｎ＝３／群）について、ｐ＜０．０５の一元配置分散分析及びチューキーポストホック分析を用いて、絹単独のコントロールと比較して実験群の有意性を決定した。「プレ」と「ポスト」との圧縮スポンジ（群につきＮ＝３、依存サンプリング）の機械的特性間の有意性は、ｐ＜０．０５で認められる統計的有意性を有する対ｔ検定によって決定した。生体内劣化分解の有意性は、ｐ＜０．０５の各時点で、絹単独のコントロールと絹−グリセロール試料との間の独立ｔ検定（Ｎ＝４／群／時点）により決定された。
結果：
ジアゾニウム修飾絹スポンジ
【０３０５】
ジアゾニウムカップリングによる修飾は、分光光度分析によって確認された（図１４）。例えば、Murphy,  A.  R.,  St  John,  P.及び  Kaplan,  D.  L.,  Modification  of  silk  fibroin  using  diazonium  coupling  chemistry  and  the  effects  on  hMSC  proliferation  and  differentiation,  29  Biomaterials  19,  2829-38  (2008）を参照されたい。修飾は、絹単独のコントロールと比較して２８０ｎｍでのチロシン吸収ピークの減少、及び修飾された絹における３２５及び３９０ｎｍのピークを有するアゾベンゼンによる吸収の増加を観察することによって検出された。修飾されたチロシン残基の理論収率は、絹タンパク質あたりの利用可能なチロシン残基及び添加されたジアゾニウム塩濃度に基づいて５８．６％と計算された。絹タンパク１分子当たりの実際のチロシン修飾は、ベールの法則を用いて推定された。例えば、Murphy,  A.  R.,  St  John,  P.及び  Kaplan,  D.  L.,  Modification  of  silk  fibroin  using  diazonium  coupling  chemistry  and  the  effects  on  hMSC  proliferation  and  differentiation,  29  Biomaterials  19,  2829-38  (2008)を参照されたい。Pielak,  G.  J.,  Urdea,  M.  S.,  Igi,  K.及び  Legg,  J.  I.,  Azo  protein  analogues:  synthesis  and  characterization  of  arsanilazo  and  sulfanilazo  derivatives  of  tyrosine  and  histidine,  23  Biochemistry,  589-596  (1984)も参照されたい。    修飾されたチロシン濃度は、２２，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて３２５ｎｍでの吸光度から計算した。この百(100)分率は、この値を絹タンパク質のモル濃度と比較することによって推定された。アゾ修飾チロシンの推定収率は５７％であった。簡潔にするために、これらのスポンジの名称は６０％に丸めた。修飾されたジアゾニウム−絹ストックを天然の絹溶液で希釈され、より低い比率の修飾されたチロシンを有する溶液を得た。
圧縮力学と修飾された絹スポンジの復元
グリセロールのみで修飾されたスポンジ
【０３０６】
グリセロール（４０質量％）、メタノールの後処理又は両方のいずれかで修飾された１０分間の抽出絹スポンジの代表的な応力−歪みプロファイルを図１５に示す。一般に、高グリセロール含有量（２０％ｗ／ｗ以上）とメタノール後処理の組み合わせは、（メタノール処理された）絹単独又は（メタノール処理なしの）未処理絹−グリセロールと比較して絹スポンジの剛性を増加させた。同様に、メタノール処理した絹単独のスポンジでは、（負荷対無負荷サイクルの曲線下の面積の比として報告される）ヒステリシスの変化が観察され、未処理の及びメタノール処理された絹−グリセロールスポンジの両方に比べて、圧縮中に大きなヒステリシスを示した（図１５Ｂ）。
【０３０７】
スポンジの圧縮弾性率は、ＰＢＳ中での水和後約７．５ｋＰａ〜４５．９ｋＰａの範囲であり（図１５Ｃ）、様々な軟部組織の再構築に適した範囲であった。例えば、Discher,  D.  E.,  Mooney,  D.  J.及び  Zandstra,  P.  W.,  Growth  factors,  matrices,  and  forces  combine  and  control  stem  cells,  324  Science  5935,  1673-1677  (2010)を参照されたい。メタノールで後処理したスポンジでは、グリセロール含有量を増加させると圧縮弾性率が増加する。グリセロール含有量が低いと、材料に架橋及び不溶性を引き起こすのに十分ではないので、メタノール洗浄がない場合、試験には高グリセロール含有量（３０％ｗ／ｗ以上）を含有する絹スポンジのみが考慮された。メタノール後処理をしていない絹−グリセロールスポンジは、メタノール処理した相対物よりも非常に軟らかかった。
【０３０８】
絹抽出時間のみでは、スポンジの剛性に影響を与えなかった。低グリセロール含有量（０及び１０％ｗ／ｗ）では、スポンジ圧縮弾性率に有意差はなかった。一般に、グリセロール含有量の変化は、１０分及び３０分の抽出絹スポンジに最も大きな影響を与えた。１０ｍＥの絹スポンジは、グリセロール含有量が増加するにつれて弾性率が増加し、コントロールスポンジと比較して３０及び４０％ｗ／ｗで有意な変化を示した。３０ｍＥのスポンジは、グリセロール含有量が２０％ｗ／ｗでピーク圧縮弾性率を有する二相性反応を有していた。３０％ｗ／ｗ未満グリセロールの絹単独のコントロールと比較して６０ｍＥスポンジの剛性に有意差はなかった。メタノール処理なしでは、１０ｍＥ及び６０ｍＥのスポンジは、絹単独のコントロールよりも著しく硬くはなかった。
【０３０９】
８０％歪み後の高さの変化を測定するだけでなく、高圧縮前（「プレ」）及び後（「ポスト」）の圧縮弾性率を比較することによって観察される形状適合度は、タンパク質の分子量及びグリセロール含有量の両方によって影響を受けた（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。メタノール後処理試料では、１０分の抽出絹は高圧縮後の弾性率の最大差を示したが、６０ｍＥスポンジの弾性率には有意差はなかった（表４）。メタノール後処理なしの絹−グリセロールスポンジ（３０％及び４０％ｗ／ｗ）は、抽出時間に関係なく、８０％軸方向歪み前後の弾性率で測定した。形状復元は一般的にグリセロール濃度の増加と共に改善された。グリセロールを４０％ｗ／ｗ含み、メタノール処理をしていない１０ｍＥのスポンジは、最も高い復元率（初期高さの９８．３％、対１０ｍＥのコントロールスポンジで７８．６％復元率）を示した。１０ｍＥのスポンジでは、コントロールスポンジ及び４０％ｗ／ｗグリセロールを含有するスポンジの両方が、１０００サイクルにわたって圧縮係数の増加が最小となり、同様の耐疲労性を示した（図１６）。
【表２】
2018511677.tif 000004
【０３１０】
メタノール後処理による１０％ジアゾニウム修飾絹スポンジ（１０分間の抽出）は、非修飾の絹単独のスポンジと比較してより強かった（１２．９±０．７ｋＰａ対６．７±０．６ｋＰａ、図１７）。計算されたジアゾニウム修飾チロシン残基の含有量が３０％及び６０％に増加するにつれて、圧縮弾性率はそれぞれ１１．０±０．８及び５．８±０．１ｋＰａに低下した。１０％及び３０％ジアゾニウム修飾スポンジ（メタノール後処理なし）に３０％ｗ／ｗグリセロールを添加すると、圧縮弾性率はそれぞれ９．０±１．７及び９．２±０．０２ｋＰａに低下した。６０％ジアゾニウム修飾グリセロールスポンジは、それらの形状を維持することができず、ゲル様の粘稠性が生じた。圧縮弾性率は測定できなかった。
【０３１１】
大きな軸方向歪み（最大高さ８０％）は、グリセロールを含まない６０％ＳＡＡ修飾スポンジを除いて、グリセロールの有無に係わらずすべてのジアゾニウム修飾スポンジの圧縮後の材料の圧縮弾性率を顕著に低下させた。グリセロールを含む１０％及び３０％ジアゾニウム修飾スポンジは、高圧縮前後で圧縮弾性率が最大に変化し、塑性変形に対する低い抵抗性を示した。８０％軸方向歪みにおけるピーク圧縮応力も記録した。この値は注入する力の予測因子として用いられた。８０％圧縮時のピーク応力が大きければ、注入する力が高くなる可能性が高い。一般に、３０％ｗ／ｗグリセロールの添加は、０％グリセロール相対物と比較して、すべてのスポンジの平均圧縮応力を増加させる。ジアゾニウム修飾含有量が増加するにつれて、圧縮弾性率で観察される傾向に従って、ピーク応力が減少する。
膨潤率
【０３１２】
膨潤を、高い軸方向圧縮前後のスポンジの体積を測定することによって定量した。１０ｍＥの絹フィブロインに由来するスポンジは、非常に高い圧縮（９５％の軸方向歪み、又はそれらの元の高さの５％）に供され、残留及び非結合水を吸い取ることによって乾燥された。膨潤は、１×  ＰＢＳ中への浸漬前後の試料の軸方向及び半径方向の寸法を測定することによって計算し、これにより培地の吸収を測定した（図１８、１９）。この試験は、注入可能性の重要なパラメータである総体積を考慮しているため、（試料の高さのみに焦点を当てている）復元試験を補完する。圧縮後、絹単独（コントロール）のスポンジは圧縮体積の２．９倍に膨潤し、高い塑性変形及び元の体積への不完全な復元を示した。３０％ｗ／ｗグリセロールを含む未処理の絹スポンジは、圧縮体積の５．９倍に膨潤した。一般に、ジアゾニウム修飾は、圧縮後の絹スポンジの体積膨張を増加させた。１０％、３０％及び６０％のチロシン修飾を有するジアゾニウムスポンジは、それぞれ圧縮状態から７．７倍、９．５倍、１６．９倍の体積膨張を示した。３０％ｗ／ｗグリセロールを添加することにより、これらのジアゾニウム修飾スポンジの体積膨張は、それぞれ５．４倍、１４．２倍及び７１．４倍に変化した。グリセロールを添加する場合と添加しない場合の１０％及び３０％ジアゾニウム修飾スポンジの体積膨張に有意差はなかった。
二次構造解析
グリセロールのみで修飾されたスポンジ
【０３１３】
二次構造を測定して、タンパク質構造の変化をバルクスポンジの機械的特性の差で相関させた（図２０、表５）。各修飾剤の結果としての結晶化度の差を検出するために、メタノール後処理の前後に、グリセロールを含む材料及び含まない材料について、ＦＴ−ＩＲスペクトルを記録した。抽出時間は、タンパク質二次構造において重要な役割を果たさなかった。メタノール処理前の絹−グリセロールスポンジでは、１５％ｗ／ｗグリセロール以上でβシート構造の増加が始まる。２０％（ｗ／ｗ）グリセロール以下では、スポンジが水性媒体中に部分的又は完全に可溶性であることが観察されたので、メタノール後処理工程なしでは機械的分析には使用しなかった。高いグリセロール濃度を有する絹材料のβシート構造の増加は、他のいくつかの研究で報告されている。例えば、Jose,  R.  R.,  Brown,  J.  E.,  Polido,  K.  E.,  Omenetto,  F.  G.及びKaplan,  D.  L.,  Polyol-Silk  Bioink  Formulations  as  Two-Part  Room-Temperature  Curable  Materials  for  3D  Printing,  1  ACS  Biomaterials  Science  &  Engineering  9,  780-788  (2015)を参照されたい。Lu,  Q.,  Hu,  X.,  Wang,  X.,  Kluge,  J.,  Lu,  S.,  Cebe,  P.及びKaplan,  D.  L.,  Water-insoluble  silk  films  with  silk  I  structure,  6  Acta  Biomaterialia  4,  1380-7  (2010)、Pei,  Y.,  Liu,  X.,  Liu,  S.,  Lu,  Q.,  Liu,  J.,  Kaplan,  D.  L.及びZhu,  H.,  Mild  process  to  design  silk  scaffolds  with  reduced  β-sheet  structure  and  various  topographies  at  nanometer  scale,  13  Acta  Biomaterialia,  168-176  (2015)も参照されたい。    あるいは、メタノール前処理スポンジで２０％ｗ／ｗ以上にグリセロール濃度を増加させると、βターン、ランダムコイル及びα−ヘリックス構造の減少を誘発した。メタノール処理後、１５％ｗ／ｗ以下のグリセロールを含有するすべてのスポンジはβシート構造の有意な増加を示し、ランダムコイル及びα−ヘリックス構造の有意な減少を示した。２０％ｗ／ｗグリセロールを含有するスポンジは、メタノール処理後にβシート構造がわずかに減少し、他の３つの構造要素がわずかに増加する傾向にあった。更に、８００〜１１５０ｃｍ−１のピークは、以前はグリセロールからの吸収バンドと関連していた。例えば、Ramos,  O.  L.,  Reinas,  I.,  Silva,  S.  I.,  Fernandes,  J.  C.,  Cerqueira,  M.  a.,  Pereira,  R.  N.,  Malcata,  F.  X.,  Effect  of  whey  protein  purity  and  glycerol  content  upon  physical  properties  of  edible  films  manufactured  therefrom,  30  Food  Hydrocolloids  1,  110-122  (2013)を参照されたい。この領域におけるピーク強度の低下は、メタノール洗浄後にグリセロールが材料から除去されたことを示唆している。
【表３】
2018511677.tif 000005
【０３１４】
ジアゾニウム修飾絹スポンジの二次構造要素を、１０ｍＥ３０％ｗ／ｗグリセロールスポンジと、１０ｍＥ未処理０％ｗ／ｗグリセロールスポンジ群との間で比較した（図２１）。以前に見られたように、３０％ｗ／ｗグリセロールを非修飾絹スポンジに添加すると、コントロール絹単独のスポンジと比較してβシート含有量が非常に増加する（５０．５％±０．３％対３５．６±１．０％）。しかし、チロシン残基にジアゾニウム修飾を加えると、試験された修飾チロシン濃度の範囲内でβシート構造の大きな減少が観察された。一般的に、絹−グリセロールスポンジ中のβシート含有量は、ジアゾニウム含有量が増加するにつれて減少した。更に、αヘリカル及びランダムコイル構造は非常に増加し、ジアゾニウム修飾絹−グリセロールスポンジ中のβターン構造は、絹単独のスポンジ中に対して非常に減少した。
細孔形態及び細孔率
【０３１５】
適切な組織の統合を容易にするために、多孔質材料は、細胞の浸潤に適応するのに十分に大きい相互連結した連続気泡構造を含まなければならない。水和状態の細孔形態を捕捉するために、ＳＥＭ分析の前にスポンジを脱イオン水で膨潤させ、再び凍結乾燥させた。図２２Ａは、非修飾絹スポンジ対ジアゾニウム修飾絹スポンジの巨視的外観を示し、図２２Ｂは、異なる濃度のジアゾニウム修飾を有する断面スポンジ（グリセロール有り及び無しの１０ｍＥの絹）の顕微鏡細孔形態を示す。本発明者らは、グリセロールの存在にかかわらず、チロシン修飾の濃度が増加すると、直径が拡大した細孔を産生することを認めた。更に、グリセロールの添加は、より丸みを帯びた形態を有する細孔を生じさせたが、グリセロールを含まない絹スポンジは、典型的にはギザギザ又は層状の細孔を示した。
【０３１６】
水銀圧入式ポロシメトリーをも用いて、修飾された絹スポンジの細孔容積及びサイズ分布を特徴付けた（表６）。抽出時間は細孔径分布及び形態に影響を及ぼし、より長い抽出時間はより大きな多分散性を生じさせた（図２２Ｃ）。平均細孔径は１１．３μｍ、１３．１μｍ及び１４．２μｍであり、ピーク極大値は、１０ｍＥ、３０ｍＥ及び６０ｍＥに対して、それぞれ１１．６μｍ、２９．２μｍ及び３４．５μｍに位置していた    ３０％ｗ／ｗのグリセロールを添加すると、全ての抽出時間において細孔径分布関数が狭くなり、細孔直径は主に５〜５０μｍの間であった（図２２Ｄ）。平均細孔径は１３．５μｍ、１５．５μｍ、２０．８μｍであり、ピーク極大値は、１０ｍＥ、３０ｍＥ及び６０ｍＥに対して、それぞれ３３．２及び１１．０μｍ（２つのピーク）、１６．７μｍ、並びに１９．３μｍに位置していた。本発明者らは、親水性スルファニル酸基で絹を修飾することにより、細孔直径の大きな増加を認めた（図２２Ｅ）。１０％、３０％及び６０％のジアゾニウム修飾の場合、平均細孔直径はそれぞれ５１．９μｍ、５５．３μｍ及び７６．８μｍであり、３０％ｗ／ｗグリセロールの添加により平均直径はそれぞれ６４．１μｍ、５４．１μｍ、及び９１．２μｍであった。全ての試料は、非常に多孔性であり、３０ｍＥ、３０％ｗ／ｗグリセロール試料は最も低い細孔率、８８．５％の空隙（総材料体積のうちの空隙体積）を有していた。
【表４】
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生体内劣化分解
【０３１７】
絹単独（コントロール）及び絹−グリセロールスポンジをマウスに皮下移植し、炎症反応及びバルクスポンジ構造内への細胞浸潤をモニターした。スポンジを湿式オートクレーブサイクルで滅菌し、１×  ＰＢＳで完全に水和させた後に移植した。２、４、８及び１２週間後に回収された物質の組織学的解析は、両方の群において最小限の免疫反応しか示さなかったが、コントロール群と比較して、絹−グリセロールスポンジでは広範な細胞浸潤及び材料劣化分解が見られた（図２３）。１２週間までに、Ｈ＆Ｅ染色は、細胞が絹単独のコントロールスポンジの周囲にほとんど追いやられたことを示した。対照的に、細胞は、絹−グリセロールスポンジの中心内に深く浸潤することができた。本発明者らは、摘出されたスポンジの直径を測定することによって、絹単独のコントロールでは初期の膨潤が８週間にわたって継続し、一方、絹−グリセロールスポンジではすでに２週間以内に劣化分解し始めたことを認めた。この実験の終わりまでに、絹単独のコントロールでは初期体積の９３．１％が残っていたのに対して、絹−グリセロールスポンジでは、初期体積の６９．９％しか残っていなかった。
考察
【０３１８】
この研究の目的は、圧縮後に高い膨潤及び形状復元を示す生分解性スポンジを、注入可能な器具を用いて軟部組織フィラー用途に使用するために、開発することであった。以前の研究で示されているように、多孔性の絹の骨格は、機械的に堅牢で、調整可能であり、長期間生体内において体積を保持することができる。例えば、Bellas,  E.,  Lo,  T.  J.,  Fournier,  E.  P.,  Brown,  J.  E.,  Abbott,  R.  D.,  Gil,  E.  S.,  Kaplan,  D.  L.,  Injectable  Silk  Foams  for  Soft  Tissue  Regeneration,  4  Advanced  Healthcare  Materials  3,  452-459  (2015)を参照されたい。Bellas,  E.,  Panilaitis,  B.  J.  B.,  Glettig,  D.  L.,  Kirker-Head,  C.  A,  Yoo,  J.  J.,  Marra,  K.  G.,  Kaplan,  D.  L.,  Sustained  volume  retention  in  vivo  with  adipocyte  and  lipoaspirate  seeded  silk  scaffolds,  34  Biomaterials  12,  2960-  8  (2013),  Wang,  Y.,  Rudym,  D.  D.,  Walsh,  A.,  Abrahamsen,  L.,  Kim,  H.  J.,  Kim,  H.  S.,  Kaplan,  D.  L.,  In  vivo  degradation  of  three-dimensional  silk  fibroin  scaffolds,  29  Biomaterials,  3415-3428  (2008)も参照されたい。  残念なことに、これらの絹骨格も比較的脆く、高い応力下で塑性変形する傾向がある。大規模な欠損及び軟部組織の再建には浸潤外科技術を必要とするのが理想的であるが、これらの３次元絹骨格は、低侵襲の配置方法及び小体積の欠損修復に必要とされる機械的弾性を達成するために実質的な再改質が必要である。形状記憶特性を有する多孔質絹材料を設計するこれまでのアプローチは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）による化学修飾に焦点を当ててきた。例えば、Gil,  E.  S.及びHudson,  S.  M.,  Effect  of  Silk  Fibroin  Interpenetrating  Networks  on  Swelling  /  Deswelling  Kinetics  and  Rheological  Properties  of  Poly(N-isopropylacrylamide)  Hydrogels,  8  Biomacromolecules,  258-264  (2007)を参照されたい。Gil,  E.  S.,  Park,  S.-H.,  Tien,  L.  W.,  Trimmer,  B.,  Hudson,  S.  M.及びKaplan,  D.  L.,  Mechanically  robust,  rapidly  actuating,  and  biologically  functionalized  macroporous  poly(N-isopropylacrylamide)/silk  hybrid  hydrogels,  26  Langmuir  19,  15614-24  (2010)も参照されたい。これらの材料は、温度の変化に応答して膨潤及び縮むことができる。注入可能な用途では、誘発可能な材料は、注入の間の圧縮及び移植後の拡張が望まれることが理想的であるが、合成物質及びＰＮＩＰＡＡｍのような潜在的に有毒な添加物の生体系における安全性及び生分解性の欠如に関する懸念がある。現在の研究では、無毒で生物学的に安全な添加物と化学修飾を用いて、水和反応に応答して誘発された膨張を示し、経年しても完全な分解性を保持する材料を設計しようとした。これらの材料は、理論上は、圧縮され、不飽和状態で注入され、そして、水和した培地中で元の体積及び連続気泡構造に膨張して、組織の膨化、周囲の細胞外マトリックスの細胞浸潤及びリモデリングに対応するであろう。
【０３１９】
これらの新しいスポンジ設計は、主に２つの別々の方法、即ち、吸湿性ポリオール添加剤（例えば、グリセロール等）と絹タンパク質とのブレンドと、親水性化学物質（例えば、４−スルファニル酸又はポリ−リジン等）による絹の化学修飾と、を融合させることに重点を置く。いくつかのポリオール可塑剤は、弾性特性を有する絹材料を作製するための添加剤として最近の研究で報告されている。例えば、Jose,  R.  R.,  Brown,  J.  E.,  Polido,  K.  E.,  Omenetto,  F.  G.及びKaplan,  D.  L.,  Polyol-Silk  Bioink  Formulations  as  Two-Part  Room-Temperature  Curable  Materials  for  3D  Printing,  1  ACS  Biomaterials  Science  &  Engineering  9,  780-788  (2015)を参照されたい。Lu,  Q.,  Hu,  X.,  Wang,  X.,  Kluge,  J.,  Lu,  S.,  Cebe,  P.及びKaplan,  D.  L.,  Water-insoluble  silk  films  with  silk  I  structure,  6  Acta  Biomaterialia  4,  1380-7  (2010),  Pei,  Y.,  Liu,  X.,  Liu,  S.,  Lu,  Q.,  Liu,  J.,  Kaplan,  D.  L.及びZhu,  H.,  Mild  process  to  design  silk  scaffolds  with  reduced  β-sheet  structure  and  various  topographies  at  nanometer  scale,  13  Acta  Biomaterialia,  168-176  (2015)も参照されたい。    予備研究では、いくつかのポリオール、特にグリセロールは、絹の物理的架橋を誘発する固有の能力を有し、したがって高い結晶性及び不溶性を有するブレンドされた絹材料を製造することが示されている。現在の研究は主としてグリセロールに焦点を当てているが、高い柔軟性及び形状記憶特性を有する材料をもたらす絹−グリセロール相互作用に関してはほとんど理解されていない。絹−グリセロールスポンジでは、２つの主な傾向、圧縮後復元の増加、及びグリセロール濃度の増加に相関するスポンジの圧縮弾性率の増加、が観察される。図１５では、特に短い抽出時間で得られるスポンジの圧縮復元率は、メタノール後処理スポンジ中のグリセロール含有量と共に着実に増加する。メタノールの後処理なしの高グリセロール含有（４０％ｗ／ｗ）スポンジでは、復元率は、６０ｍＥスポンジでは低下し、３０ｍＥスポンジでは変化せず、更に１０ｍＥスポンジでは改善することを示した。抽出時間は、未処理の絹−グリセロールスポンジの復元において役割を果たすことは明らかである。ＦＴＩＲによる二次構造は、機械的堅牢性及び形状復元に寄与する可能性のある高グリセロール含有スポンジの結晶化度（βシート含有量）の増加を示す。しかし、抽出時間全体での二次構造の相違は、各グループ内で最小限である。以前の報告はまた、低分子量絹由来の絹スポンジが物理的負荷の下で崩壊しやすいこと、分子絡み合いが不十分であることに起因する事象を記載している。例えば、Rnjak-Kovacina,  J.,  Wray,  L.  S.,  Burke,  K.  A,  Torregrosa,  T.,  Golinski,  J.  M.,  Huang,  W.及びKaplan,  D.  L.,  Lyophilized  silk  sponges:  a  versatile  biomaterial  platform  for  soft  tissue  engineering,  1  ACS  Biomaterials  Science  &  Engineering  4,  260-270  (2015)を参照されたい。鎖の絡み合いの弱さは、抽出時間のより長い絹スポンジでは圧縮後の復元が減少する理由となり得る。
【０３２０】
絹−グリセロールスポンジの増加した圧縮弾性率は、示差走査熱量測定（図２４）で観察される溶液ガラス転移温度（溶液Ｔｇｓ）によって説明され得る。グリセロールは凍結防止剤として作用し、絹−グリセロール溶液のＴｇを低下させる。本発明者らの凍結乾燥手順では、絹−グリセロール（１０％ｗ／ｗ）溶液のガラス転移温度よりも温かい−２０℃で主に乾燥する。これはタンパク質ケーキの崩壊をもたらし、潜在的に緻密化を引き起こす結果となり得る。メタノール後処理されていない絹−グリセロールスポンジは水中で膨潤しやすく、構造的な崩壊は無関係であった。しかしながら、メタノールで処理されたスポンジは、この緻密化状態で更に架橋し、その結果、絹単独のコントロールスポンジよりも密度の高い構造に固定する。絹−グリセロール材料は絹単独のコントロールと比較してより低い弾性率を有することが期待された。例えば、Lu,  Q.,  Hu,  X.,  Wang,  X.,  Kluge,  J.,  Lu,  S.,  Cebe,  P.及びKaplan,  D.  L.,  Water-insoluble  silk  films  with  silk  I  structure,  6  Acta  Biomaterialia  4,  1380-7  (2010)を参照されたい。Pei,  Y.,  Liu,  X.,  Liu,  S.,  Lu,  Q.,  Liu,  J.,  Kaplan,  D.  L.及びZhu,  H.,  Mild  process  to  design  silk  scaffolds  with  reduced  β-sheet  structure  and  various  topographies  at  nanometer  scale,  13  Acta  Biomaterialia,  168-176  (2015)も参照されたい。しかし、メタノールで処理したスポンジの緻密化は、増加した剛性を説明することができる。  将来の研究では、溶液Ｔｇ以下の温度で形成されたスポンジの力学を研究する必要があり、これは他の研究で観察された傾向を総括し得る。
【０３２１】
親水基を有する絹タンパク質の化学修飾は以前に報告されている。例えば、Murphy,  A.  R.,  St  John,  P.及びKaplan,  D.  L.,  Modification  of  silk  fibroin  using  diazonium  coupling  chemistry  and  the  effects  on  hMSC  proliferation  and  differentiation,  29  Biomaterials  19,  2829-38  (2008)を参照されたい。これらの研究は、生体適合性、ドラッグデリバリー及びタンパク質構造についての絹材料のジアゾニウム修飾を評価している。本明細書に示された研究は、ジアゾニウム修飾絹タンパク質形式の未だ研究されていない材料特性に焦点を当てている。予測されるように、親水性化学物質を添加することにより、水性媒体の絹骨格内への取り込みが改善し、βシート結晶の形成を抑制することにより、内部マトリックスの応力緩和が改善し、特定の配合物においてその圧縮状態の８０倍までの体積膨潤が可能になる。驚くべきことに、βシート含有量の著しい減少にもかかわらず、（メタノール及びグリセロールの両方で処理した）すべてのジアゾニウムスポンジはほとんど不溶性であった。スポンジが部分的に可溶性であるかどうか、及び物理的な架橋がまだ起こっているかどうかを決定するためには、材料のより厳密な特徴付けが必要である。更に、現在の研究における全ての復元／膨張試験は、制限のない状態で行われた。将来の分析では、移植を模倣した制限された状態でスポンジの復元を試験する必要がある。６０％ＳＡＡ／３０％ｗ／ｗグリセロール絹スポンジは、制限された条件下で膨張する機械的堅牢性を有するとは考えにくい。しかし、より低い修飾を有するスポンジは、膨張力を発揮するのに十分な構造を保持し得る。
【０３２２】
細孔形態、相互連結性及び総体積は、本発明者らのスポンジの開発において重要な特徴であった。一般に、小さな細孔（＜１００μｍの直径）を有するマトリックスは、細孔があまりにも制限されるため、細胞の浸潤に適応し得ないが、一方、大きな直径の細孔は適切な細胞付着を妨げる可能性がある。例えば、Lutolf,  M.  P.及びHubbell,  J.  A.  Synthetic  biomaterials  as  instructive  extracellular  microenvironments  for  morphogenesis  in  tissue  engineering,  23  Nature  Biotechnology  1,  47-55  (2005)を参照されたい。Rnjak-Kovacina,  J.,  Wray,  L.  S.,  Burke,  K.  a,  Torregrosa,  T.,  Golinski,  J.  M.,  Huang,  W.及びKaplan,  D.  L.,  Lyophilized  silk  sponges:  a  versatile  biomaterial  platform  for  soft  tissue  engineering,  1  ACS  Biomaterials  Science  &  Engineering  4,  260-270  (2015)も参照されたい。更に、全細孔率及び細孔相互連結性は、両方とも、体積膨潤、材料劣化分解及び細胞性リモデリング速度に影響を与える可能性のある培地及び細胞浸潤の取り込みにおいて重要な役割を果たす。従って、本発明者らは、高い細孔率及び相互連結性を有する骨格を生成することが知られている制御された凍結乾燥プロセスを使用することを選択した。冷却中に凍結温度及びランプ速度を制御することにより、凍結乾燥中に細孔の形状を変えることができる。例えば、O’Brien,  F.  J.,  Harley,  B.  A.,  Yannas,  I.  V.及びGibson,  L.,  Influence  of  freezing  rate  on  pore  structure  in  freeze-dried  collagen-GAG  scaffolds,  25  Biomaterials  6,  1077-1086  (2004)を参照されたい。目標は機械的に等方性の材料を創造することであったので、熱伝導性成形材料中でゆっくりとした凍結速度を使用して熱伝達を改善し、他の研究で見られるような一方向氷結晶形成及び細長い細孔を制限することを選択した。例えば、Mandal,  B.  B.,  Gil,  E.  S.,  Panilaitis,  B.及びKaplan,  D.  L.,  Laminar  Silk  Scaffolds  for  Aligned  Tissue  Fabrication,  13  Macromolecular  Bioscience  1,  48-58  (2013)を参照されたい。この方法は、図２２に示されるように、高度に丸みを帯びた形態の細孔を産生した。
【０３２３】
水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）により、細孔特性を測定した。これまでの多くの研究は、ポリマースポンジの細孔構造を分析するために走査電子顕微鏡又は組織化学染色に依存してきたが、これらの方法は、材料の断面切り出しが微細構造に損傷を与える可能性があり、よって明確な境界を有する細孔が得られないため、主観的である可能性がある。ＭＩＰは、全体積に渡って無傷の材料の細孔率を代替的に測定する。残念なことに、これらの技術のいくつかの主な制限は、材料を乾燥して測定しなければならず、一方、移植された材料は通常完全に水和されていることである。乾燥させたスポンジは、その水和状態と比較して、より小さい細孔直径を有することが予測される。多孔性骨格形態を分析する将来の研究には、高分解能で水和骨格を測定することができる分析技術、例えば、マイクロコンピュータ断層撮影法又は環境ＳＥＭ等を含む必要がある。
【０３２４】
それにもかかわらず、本発明者らは、タンパク質の抽出時間が細孔径の不均一性に影響を与え、より長い抽出時間が細孔形状のより大きな多分散性をもたらすことを認めた。この結果は、抽出時間が短いほど粘性の高い絹溶液が産生され、高い粘度は氷結晶の形成及び広がりを制限するため、溶液の粘度と関係がある。３０％ｗ／ｗグリセロールの添加は、５〜５５μｍの間で直径を狭め、材料の細孔分布を変化させる。グリセロールの添加は、高抽出絹溶液中での氷結晶の成長を制限し得る絹溶液粘度を増加させることを示した。例えば、Jose,  R.  R.,  Brown,  J.  E.,  Polido,  K.  E.,  Omenetto,  F.  G.及びKaplan,  D.  L.,  Polyol-Silk  Bioink  Formulations  as  Two-Part  Room-Temperature  Curable  Materials  for  3D  Printing,  1  ACS  Biomaterials  Science  &  Engineering  9,  780-788  (2015)を参照されたい。しかしながら、グリセロールが水を隔離し、タンパク質−水の分離を促進し、凍結乾燥の間に高密度及び低密度のタンパク質領域を生じさせるという別の説明があり得る。  最後に、チロシン修飾された絹の添加により、絹骨格の細孔径が大きく増加した。予想されたように、親水性の化学的性質及び減少したβシート含有量は、媒体の取り込みを高め、高膨潤に対応するためにタンパク質マトリックスの応力緩和を可能にした。図２２に示されるように、走査電子顕微鏡観察は、チロシン修飾された絹スポンジの内部形態が、グリセロールの添加により、より繊維性になることを明らかにしている。増加した表面積は、６０％ＳＡＡ／３０％ｗ／ｗグリセロールスポンジの流体取り込み能力に寄与する可能性が高い。しかしながら、材料は完全に剛性を欠き、膨化剤としても組織充填剤としても不適当である。
【０３２５】
すべての場合において、以前に機械的圧縮を受けていない材料の細孔形態を測定した。将来の研究では、多孔質材料の内部構造に対する高圧縮の影響を調査する必要がある。本研究では、体積の復元が初期マトリックス形状の保存を暗示していると仮定したが、これは真実とは限らない。高い圧縮は、細胞壁を崩壊させ、亀裂を生じさせ、又は不可逆的に変形させ得る。スポンジの機械的特性は、大部分が細胞壁の完全性に関連するため、８０％歪み前後の機械的圧縮を比較することによって評価される形状適合度は、細孔の損傷を推定するのに有用な基準である。メタノール後処理なしのグリセロール含有スポンジは、抽出時間に依存しない圧縮前及び圧縮後の圧縮弾性率の間に有意差を示さなかった。このことは、グリセロールが壁の柔軟性を改善し、機械的完全性を保持し、永久変形又は破壊を防止し得ることを示す。しかし、おそらくナノスケールでの細孔壁表面のより詳細な調査は、疲労に対する真の抵抗を決定するための将来の研究において評価されるであろう。
【０３２６】
生体内評価は、皮下に移植した場合、絹単独のコントロールと比較して、絹−グリセロールスポンジは劣化分解速度が著しく増加したことを明らかにした（図２３）。これは、絹単独のコントロールと比較して、プロテアーゼ溶液中の絹−グリセロールスポンジの劣化分解速度の増加を示す、最近公開された生体内分解試験と一致する。例えば、Pei,  Y.,  Liu,  X.,  Liu,  S.,  Lu,  Q.,  Liu,  J.,  Kaplan,  D.  L.及びZhu,  H.,  Mild  process  to  design  silk  scaffolds  with  reduced  β-sheet  structure  and  various  topographies  at  nanometer  scale,  13  Acta  Biomaterialia,  168-176  (2015)を参照されたい。明らかにするために、浸潤されていない空間の面積を測定することによるのではなく、キャリパーを使用して試料の直径を測定することにより、スポンジの劣化分解を定量化した。繊維組織浸潤の間に残存する絹がしばしば観察されたので、スポンジの直径と細胞浸潤の深さは、２つの別個の属性であった。しかし、絹材料の分解が主に細胞媒介であるので、絹−グリセロールスポンジ内への細胞浸潤の増加が、急速な劣化分解を説明する可能性が高い。更に、スポンジの直径は、物理的圧縮の結果として減少したようには見えなかった。組織学的検査により、細孔容積は全時点でほぼ同等であるように見える。もしスポンジが生体内で圧縮されていれば、本発明者らはバルク材料の緻密化を観察するであろう。更に、本発明者らは全時点で最小の組織炎症を示す多核巨大細胞が存在しないことに留意した。例えば、Meinel,  L.,  Hofmann,  S.,  Karageorgiou,  V.,  Kirker-Head,  C.,  McCool,  J.,  Gronowicz,  G.,  Kaplan,  D.  L.,  The  inflammatory  responses  to  silk  films  in  vitro  and  in  vivo,  26  Biomaterials  2,  147-155  (2005)を参照されたい。Thurber,  A.  E.,  Omenetto,  F.  G.及びKaplan,  D.  L.,  In  vivo  bioresponses  to  silk  proteins,  71  Biomaterials,  145-157  (2015)も参照されたい。
【０３２７】
なぜ細胞が絹−グリセロールスポンジにうまく浸透できるのかは不明である。１つの説明は、絹−グリセロールスポンジが水性媒体中で膨潤能力を高め、細孔直径を増大させ、それにより周囲の細胞へのより良いアクセスを可能にする、というものである。あるいは、グリセロールは、身体固有の脂肪及び油の誘導体である。絹スポンジ内に存在する残留グリセロールは、細胞によって認識され、そうでなければ異物である物の中への移動を促進し得る。本研究では３０％ｗ／ｗグリセロール比しか観察されなかったので、将来の生体内試験では、劣化分解速度及び細胞浸潤がグリセロール含有量によってどのように影響されるかを調べなければならない。
【０３２８】
最後に、材料力学、細孔形態及び生体内劣化分解速度をすべて、絹タンパク質（３％ｗ／ｖ）の単一濃度で調べた。より高いタンパク質濃度は、すべてのスポンジの弾性率を増加させる可能性が高く、材料をより広い範囲の軟部組織の修復に適切なものにすると共に、生体内での体積保持を延長する。しかし、復元及び形状記憶特性が現在のスポンジとどのように比較されるかは不明である。多くの組織膨化処置は、適切な組織再生を支援するために、現在の絹−グリセロールスポンジが可能であるよりも長い体積保持を必要とするが、３％  ｗ／ｖタンパク質濃度は、最初は脂肪組織の弾性率を模倣するように選択された。短期（３〜６ヶ月）の膨化を必要とする用途では、３０％ｗ／ｗグリセロールを含む３％ｗ／ｖの絹スポンジが、迅速な組織の統合及び天然の軟部組織機構の再現のために理想的な候補である。
結論
【０３２９】
本明細書で論じるアプローチは、水やＰＢＳのような水性媒体の存在によって誘発される急速な圧縮復元に耐えることができる材料を提供することにより、現在の絹スポンジ技術を改善する。ジアゾニウム化学修飾物及びグリセロール添加物を使用することにより、絹タンパク質スポンジに膨潤する能力を与え、材料を、体内の空隙又は創傷の充填する、及び組織リモデリングのための細胞浸潤を増強するのに有益なものとする。これらの修飾絹スポンジは、皮膚の欠損、審美的な機能強化（胸部、大腿部、臀部等）のための軟部組織充填剤として、又は顔面変形のための再吸収可能な移植片として使用され得る。更に、これらの絹スポンジのエラストマー特性により、これらの材料は、ドラッグデリバリー、組織再生又は創傷凝固における低侵襲性の移植方法のための実行可能な候補となるであろう。今後の研究では、グリセロールの濃度、親水性、絹分子の架橋密度、及びタンパク質の濃度を変えることにより、機構及び劣化分解を更に調整する方法を決定するであろう。
他の実施形態及び等価物
【０３３０】
本開示は、いくつかの特定の実施形態及び本開示の実施例を明示的に論じてきたが、当業者は、本発明はこのような実施形態又は実施例に限定されるものではないことを理解するであろう。逆に、本開示は、当業者には理解されるように、このような特定の実施形態並びに／又は実施例の様々な代替、変更、及び均等物を包含する。
【０３３１】
したがって、明示的に述べられていないか、又は文脈から明らかに必要とされない限り（例えば、そうでなければ実施不可能）、例えば、方法及び図は、工程又は構成要素の特定の記載された順序又は配置に限定されるものとして読まれるべきではない。更に、いくつかの実施形態では、さまざまな実施形態で例示され得る特定の要素の様々な特徴を互いに組み合わせることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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