(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、化学的に制御されたＤＮＡの切り出しおよび反転操作を用いてＤＮＡ配列の状態をコードすることにより、in vitroおよびin vivoでステートマシンを構築するための、リコンビナーゼベースのフレームワークである。特に本開示は、システムであって、（ａ）ｎ個のセリンリコンビナーゼ（ｎは２より大）；および（ｂ）ｎ個のセリンリコンビナーゼの各々についてｎ−１対の同族の組換え認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、を含み、ここで、（ｂ）のｎ（ｎ−１）対のＲＲＳは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳがｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成に配置され、およびここで、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、前記システムを提供する。
2018534921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システムであって、
（ａ）ｎ個のセリンリコンビナーゼ（ｎは２より大）；および
（ｂ）ｎ個のセリンリコンビナーゼの各々についてｎ−１対の同族の組換え認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、
を含み、ここで、（ｂ）のｎ（ｎ−１）対のＲＲＳは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳがｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成に配置され、およびここで、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、
前記システム。
【請求項２】
ｎが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
ｎ個のセリンリコンビナーゼが、Ｂｘｂ１、Ｔｐ９０１、Ａ１１８、ＰｈｌＦおよびＡｒａＣから選択される、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
ＲＲＳが、attB部位、attP部位、ＣＡジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＣＡジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＧＴジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＧＴジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＡＧジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＡＧジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＴＣジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＴＣジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＡＡジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＡＡジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＧＧジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、およびＧＧジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
システムがさらに、ｎ個のセリンリコンビナーゼの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
少なくとも１つのプロモーターが誘導性である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
少なくとも１つのプロモーターが、ＰＰｈ１Ｆ、ＰＢＡＤおよびＰＬｔｅｔＯから選択される、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
（ｂ）の操作された核酸がさらに、検出可能な分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
検出可能な分子が蛍光分子である、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
システムであって、
（ａ）３個のセリンリコンビナーゼ；および
（ｂ）３個のセリンリコンビナーゼの各々について２対の同族のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、
を含み、ここで、（ｂ）の６対のＲＲＳは、６対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳが６対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成で配置され、およびここで、６対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、６対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、
前記システム。
【請求項１１】
システムであって、
（ａ）４個のセリンリコンビナーゼ；および
（ｂ）４個のセリンリコンビナーゼの各々について３対の同族のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、
を含み、ここで、（ｂ）の１２対のＲＲＳは、１２対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳが１２対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成で配置され、およびここで、１２対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、１２対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、
前記システム。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムを含む、細胞。
【請求項１３】
細胞が、細菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が幹細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムまたは請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の細胞を、治療用デバイスまたは診断用デバイスとして使用する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムを使用して、細胞の分化を制御する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムを使用して、細胞内の化学シグナルを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、２０１６年６月１０日に出願された米国仮出願第62/348,601号、２０１５年１１月１８日に出願された米国仮出願第62/256,829号、および２０１５年１０月１日に出願された米国仮出願第62/235,776号の利益を主張する；これら仮出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ステートマシンとは、いくつかの状態のいずれかで存在し、状態間の遷移が入力によって制御されるところのシステムである（１）。ステートマシンの次の状態は、特定の入力だけでなく、その現在状態によっても決定される。この状態依存の論理は、入力の順序に依存した出力を生成するために使用することができ、出力が現在の入力の組合せにのみ依存する組合せ論理回路とは異なっている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
ステートマシンは、順序に依存した情報処理を行う人工および自然のコンピューティングシステムの背後にある、精巧な機能の基礎である。リコンビナーゼを用いて、遺伝子調節事象の識別性および順序を記録し、かつ精巧な入出力機能を実行するステートマシンを、生細胞内に実装することができる。図１は、２つの入力「Ａ」および「Ｂ」の各「配列文字列」について異なる状態に入るステートマシンを示し、これによって我々は、これらの２つの入力のそれぞれ異なる組み合わせおよび順序付けを参照する：｛入力なし、Ａのみ、Ｂのみ、Ａに続いてＢ（Ａ→Ｂ）、Ｂに続いてＡ（Ｂ→Ａ）｝。
【０００４】
本明細書で提供されるのは、化学的に制御されたＤＮＡの切り出しおよび反転操作を用いてＤＮＡ配列中の状態をコードすることにより、ステートマシンを生細胞内に構築するための、リコンビナーゼベースのフレームワークである。この戦略は、配列決定および／またはＰＣＲによる状態の便利な読み取り、ならびに遺伝子発現の複雑な調節を可能にする。このフレームワークは、３つの化学的入力を用いて１６のＤＮＡ状態を制御する、大腸菌におけるステートマシンの操作によって検証された。これらのステートマシンは、すべての入力の時間的順序を記録して、遺伝子発現の多入力多出力制御を行うことが可能であった。さらに本明細書において提供されるのは、リコンビナーゼベースのステートマシンを用いた、遺伝子調節プログラムの自動化設計のための計算ツールである。本開示の拡張性あるフレームワークは、組み合わせ的かつ時間的事象が複雑な細胞機能をどのように調節するかを記録および研究するため、および精巧な細胞挙動をプログラミングするための、新しい戦略を可能にするであろう。
【０００５】
いくつかの態様は、システムであって、（ａ）ｎ個のセリンリコンビナーゼ（ｎは２より大）；および（ｂ）ｎ個のセリンリコンビナーゼの各々についてｎ−１対の同族組換え認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、を含み、ここで、（ｂ）のｎ（ｎ−１）対のＲＲＳは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳがｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成に配置され、およびここで、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、ｎ（ｎ−１）対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、前記システムを提供する。
【０００６】
いくつかの態様において、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上である。
いくつかの態様において、ｎ個のセリンリコンビナーゼは、Ｂｘｂ１、Ｔｐ９０１、Ａ１１８、ＰｈｌＦおよびＡｒａＣから選択される。
いくつかの態様において、ＲＲＳは、attB部位、attP部位、ＣＡジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＣＡジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＧＴジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＧＴジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＡＧジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＡＧジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＴＣジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＴＣジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＡＡジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、ＡＡジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位、ＧＧジヌクレオチドを含むように改変されたattB部位、およびＧＧジヌクレオチドを含むように改変されたattP部位から選択される。
【０００７】
いくつかの態様において、システムはさらに、ｎ個のセリンリコンビナーゼの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのプロモーターは誘導性である。
いくつかの態様において、少なくとも１つのプロモーターは、ＰＰｈ１Ｆ、ＰＢＡＤおよびＰＬｔｅｔＯから選択される。
いくつかの態様において、（ｂ）の操作された核酸はさらに、検出可能な分子をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、検出可能な分子は蛍光分子である（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰなど）。
【０００８】
いくつかの態様において、システムであって、（ａ）３個のセリンリコンビナーゼ；および（ｂ）３個のセリンリコンビナーゼの各々について２対の同族リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、を含み、ここで、（ｂ）の６対のＲＲＳは、６対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳが６対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成で配置され、およびここで、６対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、６対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、前記システムが提供される。
【０００９】
いくつかの態様において、システムであって、（ａ）４個のセリンリコンビナーゼ；および（ｂ）４個のセリンリコンビナーゼの各々について３対の同族リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む、操作された核酸、を含み、ここで、（ｂ）の１２対のＲＲＳは、１２対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳが１２対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳによって互いに分離されるように、重なり合う構成で配置され、およびここで、１２対のＲＲＳの各対の２つのＲＲＳ間の組換えは、１２対のＲＲＳの別の対の少なくとも１つのＲＲＳを反転させるか、または切り出す、前記システムが提供される。
【００１０】
本明細書でさらに提供されるのは、本開示のシステムを含む、細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、細菌細胞または哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。
本明細書でさらに提供されるのは、本開示のシステムまたは本開示の細胞を、治療用デバイスまたは診断用デバイスとして使用する方法である。
いくつかの態様は、本開示のシステムを使用して、細胞の分化を制御する方法を提供する。
いくつかの態様は、本開示のシステムを使用して、細胞内の化学シグナルを検出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ステートマシンの例を示す図である。ノードは状態を表し、矢印は、入力が介在する状態間の遷移を表す。２つの入力「Ａ」および「Ｂ」の可能な配列文字列のそれぞれは、一意的な状態を生成する。
【００１２】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、レジスタ上の組換えの規則を示す図である。レジスタは、下線を引いたアルファベット記号（任意のＤＮＡ）と形状記号（認識部位）のアレイとして描かれている。（Ａ）attB-attP対の部位が整列していない場合、それらの間のＤＮＡは組換え中に反転される。（Ｂ）attB-attP対の部位が整列している場合、それらの間のＤＮＡは組換え中に切り出される。（Ｃ）複数の入力は、自身のattB-attP対上で動作する異なるリコンビナーゼを駆動することができる。この例では、入力「Ａ」はオレンジのリコンビナーゼを駆動し、入力「Ｂ」は青のリコンビナーゼを駆動する。（Ｄ）所与のリコンビナーゼに対する複数の直交attB-attP対を、レジスタ上に置くことができる。ここで、異なる形状は、attB-attPの２つの対を示す。リコンビナーゼごとに、最大６つの直交性および指向性のattB-attP対を作製することができる（３１）。図９Ａ〜図９Ｃは、ここに示した組換え反応のさらなる詳細を示す。
【００１３】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、２入力５状態ＲＳＭの設計と検証を示す図である。（Ａ）ＲＳＭを実装するために使用する２つのプラスミド（上）および、２つの入力（ａＴｃとＡｒａ；下）の配列文字列それぞれについて得られたレジスタを示す詳細な状態図が、示されている。（Ｂ）大腸菌におけるＲＳＭの性能。ノードは、入力のＡＴｃ（オレンジの矢印）とＡｒａ（青の矢印）の配列文字列で誘導された細胞の集団を表す。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃまたは１％ｗ／ｖのＡｒａ）で３０℃で１８時間、３つの生物学的反復物において処理した。ノードのラベルは、予想される状態（図１２に対応）、および、その状態にある細胞のパーセントであって、各集団の個々の細胞（３つの生物学的反復物のすべてにわたって合計された少なくとも１７細胞）からのコロニーのサンガー配列決定によって決定された前記パーセントを示す。
【００１４】
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、３入力１６状態ＲＳＭへの拡張を示す図である。（Ａ）ＲＳＭを実装するために使用する２つのプラスミド。ａＴｃ、ＡｒａおよびＤＡＰＧはそれぞれ、ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１およびＡ１１８リコンビナーゼの発現を誘導する。出力プラスミド上のレジスタの詳細な状態図を図１２に示す。（Ｂ）大腸菌におけるＲＳＭの性能。ノードは、入力のＡＴｃ（オレンジ色の矢印）、Ａｒａ（青色の矢印）、およびＤＡＰＧ（紫色の矢印）のすべての配列文字列で誘導された細胞の集団を表す。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃ、１％ｗ／ｖのＡｒａ、または２５μＭのＤＡＰＧ）で３０℃で２４時間、３つの生物学的反復物において処理した。ノードのラベルは、予想される状態（図１２に対応）、および、その状態にある細胞のパーセントであって、各集団の個々の細胞（３つの生物学的反復物のすべてにわたって合計された少なくとも１７細胞）からのコロニーのサンガー配列決定によって決定された前記パーセントを示す。
【００１５】
【図５】図５は、ＧＲＳＭデータベースを示す図である。流れ図は、データベースが如何にして作成されたかを示す（上部）。データベースには、異なる遺伝子調節プログラム用のＧＲＳＭレジスタのリストが予めコンパイルされている（中部）。状態図は遺伝子調節プログラムを表し、各ノードは、その状態でどの遺伝子が発現されるかに対応する異なる色のストライプを含む（ストライプなしは、いかなる遺伝子の発現もないことを表す）。検索機能は、ユーザー指定の遺伝子調節プログラムを受け入れて、データベースからそれを実装できるレジスタを返す（下部）。
【００１６】
【図６】図６Ａ〜図６Ｅは、２入力５状態ＧＲＳＭの実装を示す図である。大腸菌にＧＲＳＭを構築し（各パネルＡ〜Ｅについて１つずつ）、左に示した遺伝子調節プログラムを実装し、ここで各ノードは、その状態でどの遺伝子産物（緑色＝ＧＦＰ、赤色＝ＲＦＰ、青色＝ＢＦＰ）が発現されるかに対応する、異なる色のストライプを含有する（ストライプなしは、いかなる遺伝子の発現もないことを表す）。対応するＧＲＳＭ状態図は中間の列に描かれており、発現（ＯＮ）蛍光レポーターは影付けされた遺伝子によって表され、非発現（ＯＦＦ）蛍光レポーターは輪郭を示した遺伝子によって表される。右の列において、ノードは、入力のＡＴｃ（オレンジ色の矢印）とＡｒａ（青色の矢印）のすべての配列文字列で誘導された細胞の集団を表す。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃまたは１％ｗ／ｖのＡｒａ）で３０℃で２４時間、３つの生物学的反復物において処理した。ノードは、フローサイトメトリーによって測定された異なる遺伝子発現プロファイル（蛍光レポーターのＯＮ／ＯＦＦ組み合わせ）を有する細胞のパーセントに応じて、影付けされる。ノードのラベルは、予想される遺伝子発現プロファイルを有する細胞のパーセントを示す（３つの生物学的反復物のすべてにわたって平均）。
【００１７】
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、３入力１６状態ＧＲＳＭの実装を示す図である。大腸菌にＧＲＳＭを構築して、パネルＡおよびパネルＢの左下に示された遺伝子調節プログラムを実装し、ここで各ノードは、その状態でどの遺伝子産物（青色＝ＢＦＰ、緑色＝ＧＦＰ）が発現されるかに対応する、異なる色のストライプを含有する（ストライプなしは、いかなる遺伝子の発現もないことを表す）。対応するＧＲＳＭ状態図は各パネルの上部に描かれており、発現（ＯＮ）蛍光レポーターは影付けされた遺伝子によって表され、非発現（ＯＦＦ）蛍光レポーターは輪郭を示した遺伝子によって表される。各パネルの右下において、ノードは、入力のＡＴｃ（オレンジ色の矢印）、Ａｒａ（青色の矢印）、およびＤＡＰＧ（紫色の矢印）のすべての配列文字列で誘導された細胞の集団を表す。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃ、１％ｗ／ｖのＡｒａ、または２５μＭのＤＡＰＧ）で３０℃で２４時間、３つの生物学的反復物において処理した。ノードは、フローサイトメトリーによって測定された遺伝子発現ありまたはなしの細胞のパーセントに応じて、影付けされる。ノードのラベルは、予想される遺伝子発現プロファイルを有する細胞のパーセントを示す（３つの生物学的反復物のすべてにわたって平均）。
【００１８】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８の順方向および逆方向組換え活性を示す図である。（Ａ）大腸菌における実験設定。誘導性リコンビナーゼシステムを入力プラスミド上に含む細胞を、この研究で用いた３つのリコンビナーゼ（ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８）のそれぞれについて、attB-attP（ＧＦＰ発現なし）またはattL-attR（ＧＦＰ発現あり）を含むプラスミドで形質転換した。（Ｂ）リコンビナーゼ誘導ありまたはなしで、３０℃で１６時間インキュベートした後の細胞の蛍光分布。誘導された培養物を、飽和量の誘導物質（ＢｘｂＩについては２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃ、ＴＰ９０１については１％ｗ／ｖのＡｒａ、またはＡ１１８については２５μＭのＤＡＰＧ）で処理した。３つの生物学的反復物が示されている。分布は、双指数スケールで示す。それぞれの誘導されたおよび誘導されなかった反復物は、ＧＦＰを有さない対照集団によって設定される閾値（点線の垂直線）から決定される、ＧＦＰを発現する細胞のパーセントでラベルされる。
【００１９】
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、詳細な組換えメカニズムを示す図である。（Ａ）attB-attP対の部位が整列していない場合、それらの間のＤＮＡは組換え中に反転される。（Ｂ）attB-attP対の部位が整列している場合、それらの間のＤＮＡは組換え中に切り出される。切り出された断片は環状になり、失われたと推定される。（Ｃ）リコンビナーゼは、複数のattB-attP対を標的とすることができる。それらの対がミスマッチの中心ジヌクレオチドを有する場合、それらは自身の中でのみ組み換えられる。ここでは、２つの直交反転動作が示されている。
【００２０】
【図１０】図１０は、ＰＣＲに基づく状態質問ツール（ＰＳＩＴ）を示す。フローチャートは、ＰＳＩＴアルゴリズムおよびユーザーインタフェースの概要を示す。ＰＳＩＴは、ＤＮＡレジスタ設計を入力として受け入れ、ｑＰＣＲによる状態質問のために使用できるすべての可能なプライマー対集合のリストを出力する。プライマーは、それらが結合するＤＮＡ領域および方向によって特定される。
【００２１】
【図１１】図１１は、図３Ａの２入力５状態ＲＳＭの、定量的ＰＣＲに基づく質問を示す図である。ユークリッド距離は、類似性の計量として測定される。ＲＳＭを含有する異なる実験的大腸菌集団のｑＰＣＲ測定値（我々のＰＳＩＴプログラムで設計された３つのプライマー対を用いた）を、すべての細胞が５つの可能な状態（Ｓ１〜Ｓ５）の１つを採用する場合の予想結果と比較した。各実験集団は、ヒートマップの垂直軸に沿って示された入力に曝露された。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃまたは１％ｗ／ｖのＡｒａ）で３０℃で１８時間処理した。データは、３つの生物学的反復物について示される。すべての実験集団は、その予想される状態に最もよく一致した（右の予想状態図による）。
【００２２】
【図１２】図１２は、図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭにおけるレジスタの、詳細な状態図を示す図である。ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８をそれぞれ活性化する入力ＡＴｃ（オレンジ）、Ａｒａ（青色）、およびＤＡＰＧ（紫色）の異なる配列文字列に応答した、レジスタの異なる組換え状態を示す。
【００２３】
【図１３】図１３は、図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭの、定量的ＰＣＲに基づく質問を示す図である。類似性の計量としてのユークリッド距離。ＲＳＭを含有する異なる実験的大腸菌集団のｑＰＣＲ測定値（我々のＰＳＩＴプログラムにより設計された６つのプライマー対を用いた）を、すべての細胞が１６の可能な状態（Ｓ１〜Ｓ１６）の１つを採用する場合の予想結果と比較した。各集団は、ヒートマップの垂直軸に沿って示された入力に曝露された。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃ、１％ｗ／ｖのＡｒａ、または２５μＭのＤＡＰＧ）で３０℃で２４時間、３つの生物学的反復物において処理した。すべての実験集団は、その予想される状態に最もよく一致した（右の予想状態図による）。
【００２４】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＧＲＳＭデータベースの適用範囲を示す図である。（Ａ）データベース内に表された遺伝子調節プログラムの、それらが調節する遺伝子数の関数としての、数。（Ｂ）データベース内に表現されている可能性のある遺伝子調節プログラムの、それらが調節する遺伝子数の関数としての割合。この割合を計算するために、遺伝子調節プログラムの総数を調節する遺伝子数の関数として、例１２で導出された式を使用した。
【００２５】
【図１５】図１５は、ＧＲＳＭデータベースからのレジスタの遺伝子をいかにして置き換えて、他の遺伝子調節プログラムを実装するレジスタを得ることができるかの例を示す図である。左側では、１つの遺伝子が双方向性ターミネーターに置き換えられている。真中では、両方の異なる遺伝子が同じ遺伝子のコピーで置き換えられている。右側では、１つの遺伝子が２つの異なる遺伝子からなるバイシストロン性オペロンに置き換えられている（この場合、バイシストロンの最初の遺伝子は、３’末端に暗黙のターミネーターを持たない）。各遺伝子調節プログラムの状態図上のストライプは、どの遺伝子がどの状態で発現されるべきかを示し、異なる色のストライプは異なる遺伝子を表す。
【００２６】
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｅは、異なる入力時間での２入力５状態ＲＳＭの試験を示す図である。（Ａ）大腸菌に実装したＧＲＳＭ（図６Ｅから）。ＧＲＳＭにおけるＦＰ遺伝子（緑色＝ＧＦＰ、赤色＝ＲＦＰ、青色＝ＢＦＰ）は、それぞれが各状態で発現されるか否かに応じて、陰付けするかまたは輪郭を描く。（Ｂ）８つの可能なＦＰ発現プロファイルが存在する。ＧＲＳＭの各状態は、一意的ＦＰ発現プロファイルを採用する。図６Ｅからのデータがこれを確認する。（Ｃ〜Ｅ）増加する時間（１時間のステップで）の入力で処理した細胞のＦＰ発現プロファイル分布。３つの生物学的反復物のデータが示されている。すべての入力曝露は、３０℃で飽和濃度の入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃまたは１％ｗ／ｖのＡｒａ）で行った。カラムの陰付けは、フローサイトメトリーで測定された、異なるＦＰ発現プロファイル（パネルＢに対応）を有する細胞のパーセントに従って行う。逐次誘導については、最初の入力曝露期間の後に、第２の入力を２つの異なる戦略を用いて適用した：第２の入力を培養物に直接加え（パネルＤ）、培養物を、第２の入力を含有する新しい培地に１：２５希釈する（パネルＥ）。注目すべきは、前者の戦略では、第１入力は第２入力暴露期間の前に希釈されていなかったことである。
【００２７】
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃは、同じ遺伝子調節プログラムについての異なるＧＲＳＭの実装を示す図である。ＧＲＳＭを大腸菌に構築し（各パネルＡ〜Ｃについて１つずつ）、左側に示す遺伝子調節プログラムを実装し、ここで各ノードは、ＧＦＰ発現を示す緑色のストライプまたはＧＦＰ発現なしを示すストライプなしを含む。対応するＧＲＳＭ状態図は中間の列に示され、発現（ＯＮ）ＧＦＰは、陰付けされたｇｆｐ遺伝子によって表され、非発現（ＯＦＦ）ＧＦＰは、輪郭を描かれたｇｆｐ遺伝子によって表される。右の列では、ノードは、入力ＡＴｃ（オレンジ色の矢印）とＡｒａ（青色の矢印）のすべての配列文字列で誘導された細胞の集団を表す。培養物を、飽和濃度の各入力（２５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃまたは１％ｗ／ｖのＡｒａ）で３０℃で２４時間、３つの生物学的反復物において処理した。ノードは、フローサイトメトリーで測定した、ＧＦＰ ＯＮ対ＧＦＰ ＯＦＦの細胞のパーセント（全３つの生物学的反復物にわたって平均）に従って、陰付けする。ノードのラベルは、予想される遺伝子発現プロファイルを有する細胞のパーセントを示す。
【００２８】
【図１８】図１８は、ＧＲＳＭデータベースにおける遺伝子調節プログラムの設計スペースが、非常に退化していることを示す。プロットは、ＧＲＳＭデータベース中の遺伝子調節プログラム当たりのレジスタの中央値を、それらが調節する遺伝子の数の関数として示す。
【００２９】
【図１９】図１９は、図３Ａの２入力５状態ＲＳＭの質問に使用される、定量的ＰＣＲプライマー対を示す図である。各プライマーは、示されたレジスタ領域に示された方向で結合する。実際のプライマー配列を表６に示す。マップは、どのプライマー対がどの状態で増幅すべきかを示し、ここで状態は、状態図に示されるように互いに関連する。
【００３０】
【図２０】図２０は、図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭの質問に使用される、定量的ＰＣＲプライマー対を示す図である。各プライマーは、示されたレジスタ領域に示された方向で結合する。実際のプライマー配列を表７に示す。マップは、どのプライマー対がどの状態で増幅すべきかを示し、ここで状態は、状態図に示されるように互いに関連する。
【００３１】
【図２１】図２１は、本明細書で使用するすべてのプラスミドおよびそれらの関連パーツを示す図である。ｐＮＲ６４およびｐＮＲ２２０は、kanRおよびＣｏｌＥ１を有するベクター骨格上に構築された入力プラスミドである。他のすべてのプラスミドは、camRを有するＢＡＣベクター上に構築される。プロモーターは薄緑色であり、遺伝子は暗緑色であり、ターミネーターは赤色であり、attB部位は青色であり、attP部位は灰色であり、attL部位は黒色であり、attR部位はマゼンタである。すべてのリコンビナーゼ認識部位のラベルに続く２つの文字は、ジヌクレオチド配列である。入力プラスミド（ｐＮＲ６４およびｐＮＲ２２０）およびリコンビナーゼ反応試験プラスミド（ｐＮＲ２３０、ｐＮＲ２３９、ｐＮＲ２７６、ｐＮＲ２７９、ｐＮＲ２８０およびｐＮＲ２８７）については、遺伝子およびプロモーターのみを示し、出力プラスミド（ｐＮＲ１６０、ｐＮＲ１８８、ｐＮＲ１６３、ｐＮＲ１６４、ｐＮＲ１６５、ｐＮＲ１６６、ｐＮＲ１８６、ｐＮＲ１８７、ｐＮＲ２９１、ｐＮＲ２９２、およびｐＮＲ２８４）については、レジスタ上のパーツのみを示す。すべての出力プラスミドは、レジスタ領域に隣接する同一の３つのターミネーターを有することに留意されたい。これらのターミネーターは、レジスタを十分に絶縁状態に保つために構成されており、実際にはいかなるレジスタ設計のパーツでもない。プラスミド画像は、市販のソフトウェアGeneious R8を用いて作成した。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
細胞内でのシグナル伝達および遺伝子調節事象のシーケンスを記録し応答する合成ステートマシンは、複雑な生物系の研究および工学における、変形力のある（transformative）ツールとなり得る。例えばヒトの発達において、前駆細胞は、転写因子（ＴＦ）活性化のタイミングおよび順序によって決定される、異なる機能を有する特定の細胞型に分化する（２、３）。この情報は、研究者がヒト幹細胞を分化細胞にプログラムすること（４、５）、逆に、外因性の連続したＴＦ活性化を用いて分化細胞を幹細胞に再プログラムする（６、７）ことを可能にする。しかし、異なる細胞系統を駆動するＴＦカスケードの経時的な組織化については、未だにほとんど知られていない。個々の細胞におけるＴＦ活性化の順序に応答して、遺伝子発現を記録し作動させるステートマシンは、これらの分化プロセスを理解し調節するのに有用である。
【００３３】
かかるステートマシンはまた、細胞外および細胞内因子の出現および順序にも依存し得る、疾患の進行についての我々の理解を改善することができる。例えば、癌において、腫瘍における遺伝子変異の時間的順序は、その表現型を決定し得る（８）。同様に、体細胞性疾患および病原体感染の両方において、異なる環境条件に対する疾患細胞の事前適応は、細胞が薬物処置に応答して行動する方法に影響を及ぼし得る（９〜１２）。ステートマシンを疾患モデルに組込み、続いて処置に耐えられる細胞の履歴を分析することは、疾患の進行がどのように治療応答に影響するかを理解するのに有用である。
【００３４】
生物システムの理解と操作を変える可能性があるにもかかわらず、複雑で機能的なステートマシンは、拡張性かつ汎用性のあるフレームワークが欠如しているために、生細胞にはまだ実装されていない（１３）。本明細書では、状態がＤＮＡ配列でコードされている生細胞にステートマシンを実装するための、拡張性のあるリコンビナーゼベースの戦略が提供される。状態の情報をＤＮＡ配列中に直接記憶することは、それが細胞に最小限の負担で安定して維持されることを保証する。リコンビナーゼは、スイッチ（１５〜１９）、化学パルスカウンタ（２０）、メモリと一体化されたブール論理ゲート（２１、２２）、および時間論理（２３）を実装するために使用されてきた。リコンビナーゼを本明細書で提供されるように使用して、入力と一意的な遺伝子発現出力の集合のすべての可能な配列文字列を区別できるような、拡張性のあるステートマシンを実装する。本開示のステートマシンの実装を、「リコンビナーゼベースのステートマシン」（ＲＳＭ）と呼ぶ。
【００３５】
リコンビナーゼおよび組換え認識配列
本明細書で使用する場合、「リコンビナーゼ」とは部位特異的酵素であって、典型的には約３０塩基対（ｂｐ）〜４０ｂｐの短いＤＮＡ配列（単数または複数）を認識し、これらのリコンビナーゼ認識配列の間での組換えを媒介し、それによってリコンビナーゼ認識配列間のＤＮＡ断片の切り出し、組込み、反転、または交換をもたらす、前記部位特異的酵素である。本明細書で使用する場合、「遺伝要素」とは、遺伝子発現において役割を果たすＤＮＡの配列を指す。例えば、プロモーター、転写ターミネーター、および産物（例えば、タンパク質産物）をコードする核酸は、それぞれ遺伝要素であると考えられる。
【００３６】
リコンビナーゼは、明確な生化学的特性に基づき、２つの異なるファミリー：セリンリコンビナーゼ（例えば、リゾルベースおよびインベルターゼ）とチロシンリコンビナーゼ（例えば、インテグラーゼ）に分類することができる。セリンリコンビナーゼおよびチロシンリコンビナーゼはさらに、双方向性リコンビナーゼおよび一方向性リコンビナーゼに分けられる。双方向性セリンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、β−６、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡおよびγδが挙げられ；一方向性セリンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、Ｂｘｂ１、φＣ３１、ＴＰ９０１、ＴＧ１、φＢＴ１、Ｒ４、φＲＶ１、φＦＣ１、ＭＲ１１、Ａ１１８、Ｕ１５３およびｇｐ２９が挙げられる。双方向性チロシンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、およびＲが挙げられる。一方向性チロシンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、ラムダ、ＨＫ１０１、ＨＫ０２２およびｐＳＡＭ２が挙げられる。セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名称は、リコンビナーゼがＤＮＡを攻撃するために使用して鎖交換中にＤＮＡに共有結合する、保存された求核性アミノ酸残基に由来する。リコンビナーゼは、遺伝子ノックアウトの生成および選別問題の解決を含む、多くの標準的な生物学的用途に使用されている。いくつかの態様において、セリンリコンビナーゼのみが使用される。
【００３７】
組換えの結果は、典型的には３０ｂｐ未満の長さの、組み換えされる２つの短い反復ＤＮＡ配列の位置および配向に部分的に依存する。リコンビナーゼは、各リコンビナーゼに特異的なこれらの反復配列に結合し、これは本明細書では「リコンビナーゼ認識配列」または「リコンビナーゼ認識部位」と呼ばれる。したがって本明細書で使用する場合、リコンビナーゼは、リコンビナーゼが反復ＤＮＡ配列間の反転または切り出しを媒介できる場合に、リコンビナーゼ認識部位に「特異的」である。本明細書で使用する場合、リコンビナーゼはまた、介在する遺伝要素（例えば、プロモーター、ターミネーター、または出力核酸配列）に隣接するその「同族リコンビナーゼ認識部位」を認識する、とも言える。遺伝要素は、その要素が２つの反復ＤＮＡ配列の間に位置して直接隣接する場合に、リコンビナーゼ認識部位に「隣接する」と言う。いくつかの態様において、リコンビナーゼ認識部位は互いに重なり合わない。しかしながら他の態様において、リコンビナーゼ認識部位は、以下に記載されるように互いに重なり合うこともあり、これにより組み合わせの複雑性が大幅に増加される。
【００３８】
反転組換えは、２つの短い反転された反復ＤＮＡ配列間で起こる。ＤＮＡを折り曲げるタンパク質によってアシストされるＤＮＡループ形成は、２つの反復配列を一緒にし、この点においてＤＮＡの切断およびライゲーションが起こる。この反応はＡＴＰ非依存性であり、スーパーコイルＤＮＡを必要とする。かかる反転組換え事象の最終結果は、反復部位間のＤＮＡの伸長が反転して（すなわち、ＤＮＡの伸長が配向を逆転させて）、コードされた鎖が今や非コード鎖となり、逆もまた同様である。かかる反応においては、ＤＮＡは保存されて、ＤＮＡの正味の増加も損失もない。
逆に、組込み（切り出し）組換えは、同じ方向に配向された２つの短い反復ＤＮＡ配列間で起こる。この場合、介在するＤＮＡは切り出し／除去される。
【００３９】
リコンビナーゼはまた、非可逆的または可逆的で分類することもできる。本明細書で使用する場合、「非可逆的リコンビナーゼ」とは、２つの相補的組換え部位の間の組換えを触媒することができるが、追加の因子の補助なしでこの組換えにより形成されるハイブリッド部位間の組換えを触媒することができない、リコンビナーゼを指す。したがって、「非可逆的認識部位」とは、非可逆的リコンビナーゼの２つのＤＮＡ認識配列のうちの最初のものとして機能し、その部位での組換え後にハイブリッド認識部位に改変される、リコンビナーゼ認識部位をいう。「相補的非可逆的認識部位」とは、非可逆的リコンビナーゼの２つのＤＮＡ認識配列のうちの第２のものとして機能し、その部位での相同組換え後にハイブリッド組換え部位に改変されるリコンビナーゼ認識部位をいう。例えば、attBとattPは、Ｂｘｂ１とｐｈｉＣ３１リコンビナーゼの非可逆的組換え部位であり、attBはattPの相補的非可逆的組換え部位であり、逆もまた同様である。最近、attB／attP部位を突然変異させて、相互にのみ相互作用するが、他の突然変異体とは相互作用しない直交Ｂ／Ｐ対を作製できることが示された。これにより、１つのリコンビナーゼが、複数の直交Ｂ／Ｐ対の切り出しまたは組込みまたは反転を制御することが可能となる。
【００４０】
ｐｈｉＣ３１（φＣ３１）インテグラーゼは、例えば、真核細胞には見られない追加因子が不在の場合、attB×attP反応のみを触媒する。リコンビナーゼは、attBとattPの間の組換えの際に形成される、attLとattRハイブリッド組換え部位の間の組換えを媒介することができない。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼなどのリコンビナーゼは、単独では逆反応を触媒することができないので、ｐｈｉＣ３１のattB×attP組換えは安定である。
非可逆的リコンビナーゼおよび非可逆的リコンビナーゼをコードする核酸は、当技術分野で記載されており、常套の方法を用いて得ることができる。非可逆的リコンビナーゼの例としては、限定はされないが、ｐｈｉＣ３１（φＣ３１）リコンビナーゼ、コリファージＰ４リコンビナーゼ、コリファージラムダインテグラーゼ、リステリアＡ１１８ファージリコンビナーゼ、およびアクチノファージＲ４ Ｓｒｅリコンビナーゼ、ＨＫ１０１、ＨＫ０２２、ｐＳＡＭ２、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０１、ＴＧ１、φＢＴ１、φＲＶ１、φＦＣ１、ＭＲ１１、Ｕ１５３およびｇｐ２９が挙げられる。
【００４１】
逆に、「可逆的リコンビナーゼ」とは、２つの相補的リコンビナーゼ認識部位間の組換えを触媒することができ、また追加因子の助けなしに、初期組換え事象によって形成された部位間の組換えを触媒し、それによりこれを逆転させることができる、リコンビナーゼを指す。組換えによって生成された生成物部位は、それ自体、その後の組換えのための基質である。可逆的リコンビナーゼシステムの例としては、限定はされないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘおよびＦｌｐ−ｆｒｔ系、Ｒ、β−６、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡおよびγδが挙げられる。
【００４２】
本明細書で提供されるリコンビナーゼは、本開示の態様において使用され得るリコンビナーゼの排他的な例であることを意味しない。本開示の論理およびメモリシステムの複雑性は、新しい直交リコンビナーゼのためのデータベースを採掘するか、または規定されたＤＮＡ特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって、拡大することができる。有用なリコンビナーゼの他の例は当業者に知られており、発見または生成される任意の新しいリコンビナーゼは、本開示の異なる態様において使用可能であることが期待される。
いくつかの態様において、リコンビナーゼはセリンリコンビナーゼである。したがっていくつかの態様において、リコンビナーゼは非可逆的であると考えられる。いくつかの態様において、リコンビナーゼはチロシンリコンビナーゼである。したがっていくつかの態様において、リコンビナーゼは可逆的であると考えられる。
【００４３】
プロモーター
本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、残りの核酸配列の転写の開始および速度が制御されるところの、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る小領域も含み得る。プロモーターは、構成的、誘導的、活性化可能、抑制可能、組織特異的またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００４４】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動するか、または転写を駆動する。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」および「制御下にある」とは、プロモーターが、それが調節して配列の転写開始および／または発現を制御するところの核酸配列に関して、正確な機能的位置および／または配向にあることを示す。「逆方向プロモーター」は、上記のように、核酸配列が逆の配向にあるプロモーターであり、その結果、コード鎖は今や非コード鎖であり、逆もまた同様である。逆方向プロモーター配列は、本開示の様々な態様において、特定の状態を調節するために使用され得る。したがって、いくつかの態様において、プロモーターは、相補的リコンビナーゼ認識部位に隣接する逆方向プロモーターであり、部位の組換えの際に正しい向きに反転する（例えば、そして作動可能に連結された核酸配列の発現を駆動する）。本開示のいくつかの態様において、プロモーターは、プロモーターの下流にある核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を意味する「エンハンサー」と共に使用しても、使用しなくてもよい。エンハンサーは、プロモーターおよび／またはコードされた核酸の前または後の任意の機能的な位置に配置され得る。
【００４５】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ（および／またはシグマ因子）に対するその親和性に応じて、強または弱に分類される；これは、プロモーター配列がポリメラーゼの理想的コンセンサス配列にどれだけ密接に類似しているかに関連する。プロモーターの強度は、転写の開始がそのプロモーターにおいて高頻度または低頻度で起こるかどうかに依存し得る。異なる強度を有する異なるプロモーターを使用して、遺伝子出力発現の異なるデジタル設定可能レベル（例えば、弱プロモーターから開始される遺伝子発現のレベルは、強プロモーターから開始される遺伝子発現のレベルよりも低い）を有する論理ゲートを、構築することができる。例えば、図２６Ａ〜図２６Ｃに示すデータは、入力誘導物質の様々なデジタル組み合わせが、使用されるプロモーターの変動する強さおよびそれらのそれぞれの出力の合計に基づいて、複数レベルのアナログ遺伝子発現出力をもたらすことを実証する。
【００４６】
プロモーターは、遺伝子または配列に天然に関連するもの、例えば所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られるものあってよい。かかるプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様にエンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列と天然に関連するものであってよい。
【００４７】
いくつかの態様において、コード核酸セグメントは、天然環境においてコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す組換えまたは異種プロモーターの制御下に、位置し得る。組換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において核酸配列と通常は関連しないエンハンサーをいう。かかるプロモーターまたはエンハンサーは、以下を含み得る：他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー；任意の他の原核細胞、ウイルス細胞または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー；および、「天然に存在しない」合成プロモーターまたはエンハンサー、例えば、当技術分野で知られている遺伝子工学の方法によって発現を変化させる異なる転写調節領域および／または突然変異の異なる要素を含むものなど。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、本開示に関連して、ＰＣＲを含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて、生産され得る（米国特許第4,683,202号および第5,928,906号）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞器官内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列を、本開示に従って使用することができる。
【００４８】
誘導性プロモーター
本明細書で使用する場合、「誘導性プロモーター」とは、誘導物質または誘導剤の存在下で、これに影響されて、またはこれに接触されて、転写活性を開始または増強することを特徴とするものである。「誘導物質」または「誘導剤」は、内因性もしくは通常は外因性の化合物またはタンパク質であって、これは投与されると、誘導性プロモーターからの転写活性を誘導するように活性化する。
【００４９】
本開示に従って使用するための誘導性プロモーターは、原核および真核宿主生物の両方において機能し得る。いくつかの態様において、哺乳動物誘導性プロモーターが使用される。本明細書で使用するための哺乳動物誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、プロモーター型ＰＡｃｔ：ＰＡＩＲ、ＰＡＲＴ、ＰＢＩＴ、ＰＣＲ５、ＰＣＴＡ、ＰＥＴＲ、ＰＮＩＣ、ＰＰＩＰ、ＰＲＯＰ、ＰＳＰＡ／ＰＳＣＡ、ＰＴＥＴ、ＰＴｔｇＲ、プロモーター型ＰＲｅｐ：ＰＣｕＯ、ＰＥＴＲ ＯＮ８、ＰＮＩＣ、ＰＰＩＲ ＯＮ、ＰＳＣＡ ＯＮ８、ＰＴｅｔＯ、ＰＵＲＥＸ８、プロモーター型ＰＨｙｂ：ｔｅｔＯ７−ＥＴＲ８−ＰｈＣＭＶｍｉｎ、ｔｅｔＯ７−ＰＩＲ３−ＥＴＲ８−ＰｈＣＭＶｍｉｎ、およびｓｃｂＲ８−ＰＩＲ３−ＰｈＣＭＶｍｉｎが挙げられる。いくつかの態様において、他の生物由来の誘導性プロモーター、ならびに原核生物（例えば、ＰＰｈ１Ｆ、ＰＢＡＤおよびＰＬｔｅｔＯ）または真核生物宿主で機能するように設計された合成プロモーターを使用することができる。本明細書で使用するための非哺乳動物誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、レンチウイルスプロモーター（例えば、ＥＦα、ＣＭＶ、ヒトシナプシンＩ（ｈＳｙｎＩ）、ＣａＭＫＩＩα、ｈＧＦＡＰおよびＴＰＨ−２）およびアデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＫＩＩα（ＡＡＶ５）、ｈＳｙｎＩ（ＡＡＶ２）、ｈＴｈｙ１（ＡＡＶ５）、ｆＳＳＴ（ＡＡＶ１）、ｈＧＦＡＰ（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８）、ＭＢＰ（ＡＡＶ８）、ＳＳＴ（ＡＡＶ２））が挙げられる。本開示の誘導性プロモーターの１つの重要な機能的特徴は、外部から適用された誘導物質への曝露によるその誘導性である。
【００５０】
誘導物質の投与または除去は、作動可能に連結された核酸配列（例えば、リコンビナーゼをコードする核酸）の転写の「オン」状態または「オフ」状態の間の切り替えをもたらす。したがって、本明細書で使用する場合、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターの「オン」状態は、プロモーターが核酸配列の転写を活発に駆動している状態（すなわち、連結された核酸配列が発現される状態）を指す。逆に、酸配列に作動可能に連結された、または条件的に作動可能に連結されたプロモーターの「オフ」状態は、プロモーターが核酸配列の転写を活発に駆動していない状態（すなわち、連結された核酸配列が発現されない状態）を指す。
【００５１】
本開示に従って使用するための誘導性プロモーターは、１つ以上の生理学的条件、例えばｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水勾配、細胞表面結合、および1つ以上の外因性または内在性誘導剤の濃度、などの変化によって誘導され得る（または抑制され得る）。外因性の誘導物質または誘導剤は、限定することなく、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖類および多糖類、核酸、タンパク質転写アクチベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質類似体、ホルモンまたはそれらの組み合わせを含み得る。誘導性プロモーターを誘導または抑制する条件（複数可）および／または薬剤（複数可）は、本明細書に記載の論理ゲートの入力（複数可）とすることができる。
【００５２】
本開示に従って使用するための誘導性プロモーターには、本明細書に記載されるかまたは当業者に知られている任意の誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが以下を含む：化学的／生化学的に調節される、および物理的に調節されるプロモーター、例えばアルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系、これには、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質（ｔＴＡ））、ステロイド調節性プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、モスエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーター）、金属調節性プロモーター（例えば、酵母、マウスおよびヒトからのメタロチオネイン（金属イオンと結合またはこれを封鎖するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーター）、病原調節性プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）により誘導）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節性プロモーター（例えば、植物細胞からの光応答性プロモーター）。
【００５３】
いくつかの態様において、本開示に従って使用される誘導物質はＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）であり、これは、細菌クオラムセンシングに関与するシグナル伝達分子のクラスである。クオラムセンシングは、集団密度に基づく群ベースの挙動の調整を可能にする、細菌間の通信方法である。ＡＨＬは細胞膜を横切って拡散することができ、ｐＨ値のある範囲にわたり増殖培地中で安定である。ＡＨＬは、ＬｕｘＲなどの転写活性化因子に結合し、同族プロモーターからの転写を刺激することができる。
【００５４】
いくつかの態様において、本開示に従って使用される誘導物質はアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）であり、これは、抗生物質活性を示さないテトラサイクリンの誘導体であり、テトラサイクリン制御の遺伝子発現系、例えば細菌中で、使用するように設計されている。
他の誘導性プロモーター系を、本開示に従って使用してもよい。
【００５５】
ターミネーター
本明細書において提供されるのは、本開示のいくつかの態様において使用するためのターミネーター配列である。本明細書で使用する「ターミネーター」または「ターミネーター配列」は、転写を停止させる核酸配列である。ターミネーターは、一方向性または双方向性であってよい。これは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。ターミネーター配列は、上流のプロモーターによる下流の核酸配列の転写活性化を妨ぐ。したがって、ある態様においては、ＲＮＡ転写物の産生を終了させるターミネーターが企図される。ターミネーターは、望ましい出力発現レベル（例えば、低い出力レベル）を達成するために、in vivoで必要となり得る。
【００５６】
最も一般的に使用される種類のターミネーターは、順方向ターミネーターである。通常転写される核酸配列の下流に配置される場合、順方向転写ターミネーターは、転写を中止させる。いくつかの態様においては双方向性転写ターミネーターが提供され、これは通常、順方向鎖および逆方向鎖の両方で転写を終結させる。いくつかの態様において、逆方向転写ターミネーターが提供され、これは通常、逆方向鎖のみで転写を終結させる。
【００５７】
原核生物系において、ターミネーターは通常、２つのカテゴリー：（１）ｒｈｏ非依存性ターミネーターおよび（２）ｒｈｏ依存性ターミネーターに分類される。Ｒｈｏ非依存性ターミネーターは、一般に、Ｇ−Ｃ塩基対と続くいくつかのＴ塩基に富むステムループを形成する、パリンドローム配列から構成される。理論に束縛されることを望むものではないが、従来の転写終結モデルは、ステムループがＲＮＡポリメラーゼを停止させ、ポリＡテールの転写がＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を巻き戻して、これをＲＮＡポリメラーゼから解離させるというものである。
【００５８】
真核生物系において、ターミネーター領域は、新しい転写物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列を含むことができ、こうしてポリアデニル化部位を露出させる。これは、特殊な内因性ポリメラーゼにシグナル伝達して、約２００Ａ残基（ポリＡ）のストレッチを、転写物の３’末端に付加する。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定して見え、より効率的に翻訳される。したがって真核生物を含むいくつかの態様において、ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含み得る。いくつかの態様において、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進する。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位要素は、出力核酸レベルを増強し、および／または核酸間のリードスルーを最小限にするように機能することができる。
【００５９】
本開示に従って使用するためのターミネーターには、本明細書に記載されるかまたは当業者に知られている任意の転写ターミネーターが含まれる。ターミネーターの例としては、限定はされないが、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、ならびに例えばＳＶ４０ターミネーター、ｓｐｙ、ｙｅｊＭ、ｓｅｃＧ−ｌｅｕＵ、ｔｈｒＬＡＢＣ、ｒｒｎＢ Ｔ１、ｈｉｓＬＧＤＣＢＨＡＦＩ、ｍｅｔＺＷＶ、ｒｒｎＣ、ｘａｐＲ、ａｓｐＡおよびａｒｃＡターミネーターなどのウイルス終結配列が挙げられる。いくつかの態様において、終結シグナルは、転写または翻訳され得ない配列、例えば、配列切断（truncation）に起因するものであり得る。
他の誘導性プロモーター系を、本開示に従って使用してもよい。
【００６０】
細胞
本明細書で提供される使用のために操作される細胞は、任意の細胞または宿主細胞であってよい。本明細書で定義するように、「細胞」または「細胞系」は、すべての既知の独立した生体の、基本的な構造および機能単位である。これは、生物として分類される生命の最小単位である。ほとんどの細菌などのいくつかの生物は、単細胞である（１つの細胞からなる）。ヒトなどの他の生物は、多細胞である。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明に従って使用する細胞は原核細胞であり、これは、細胞エンベロープならびに、細胞ゲノム（ＤＮＡ）およびリボソームおよび様々な種類の封入体を含む細胞質領域を、含むことができる。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞である。本明細書で使用する場合、用語「細菌」は、細菌のすべてのバリアント、例えば、原核生物およびシアノバクテリアを包含する。細菌は、小さく（典型的な線形寸法は、約１ミクロン）、コンパートメント化されておらず、７０Ｓの環状ＤＮＡおよびリボソームを有する。細菌という用語はまた、真正細菌および古細菌の細菌細分も含む。真正細菌はさらに、グラム陽性およびグラム陰性の真正細菌に細分することができ、これは細胞壁構造の差異に依存する。また、本明細書には、全体の形態のみに基づいて分類されたもの（例えば、球菌、桿菌）も含まれる。いくつかの態様において、細菌細胞はグラム陰性細胞であり、いくつかの態様において、細菌細胞はグラム陽性細胞である。本発明に従って使用され得る細菌細胞の例としては、限定はされないが、以下の種からの細胞が含まれ得る：Yersinia種、Escherichia種、Klebsiella種、Bordetella種、Neisseria種、Aeromonas種、Franciesella種、Corynebacterium種、Citrobacter種、Chlamydia種、Hemophilus種、Brucella種、Mycobacterium種、Legionella種、Rhodococcus種、Pseudomonas種、Helicobacter種、Salmonella種、Vibrio種、Bacillus種、Erysipelothrix種、Salmonella種、Stremtomyces種。いくつかの態様において、細菌細胞は、以下からのものである：Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、Clostridium butyricum、Brevibacterium lactofermentum、Streptococcus agalactiae、Lactococcus lactis、Leuconostoc lactis、Streptomyces、Actinobacillus actinobycetemcomitans、Bacteroides、cyanobacteria、Escherichia coli、Helobacter pylori、Selnomonas ruminatium、Shigella sonnei、Zymomonas mobilis、Mycoplasma mycoides、Treponema denticola、Bacillus thuringiensis、Staphlococcus lugdunensis、Leuconostoc oenos、Corynebacterium xerosis、Lactobacillus planta rum、Streptococcus faecalis、Bacillus coagulans、Bacillus ceretus、Bacillus popillae、Synechocystis PCC6803株、Bacillus liquefaciens、Pyrococcus abyssi、Selenomonas nominantium、Lactobacillus hilgardii、Streptococcus ferus、Lactobacillus pentosus、Bacteroides fragilis、Staphylococcus epidermidis、、Zymomonas mobilis、Streptomyces phaechromogenes、Streptomyces ghanaenis、Halobacterium GRB株、またはHalobaferax種Aa2.2株。
【００６２】
いくつかの態様において、本開示による使用のための細胞は真核細胞であり、これは、核などの特定の代謝活性が生じる膜結合区画を含む。本発明による使用のための真核細胞の例としては、限定はされないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae）および植物細胞が挙げられる。いくつかの態様において、真核細胞は、脊椎動物由来である。本発明による使用のための脊椎動物細胞の例としては、限定はされないが、精子、卵子および胚細胞を含む生殖細胞、ならびに腎臓、肺、脾臓、リンパ系、心臓、胃、腸、膵臓、筋肉、骨、神経、脳および上皮細胞を含む非生殖細胞が挙げられる。胚性幹細胞を含む幹細胞もまた、使用することができる。
【００６３】
以下の実施例で詳述するように、リコンビナーゼを用いて重複および直交リコンビナーゼ認識部位から組み立てられたＤＮＡレジスタを操作することにより、ステートマシンを作製した。数学的フレームワークを使用して、ステートマシンの情報容量と拡張性を分析し、その限界を理解した。固定数の入力に対して、ＲＳＭによって可能な情報容量は、従来の組合せ回路よりもはるかに大きい。さらに、科学コミュニティにアクセス可能な豊富なデータベース（例１４および例１５）を作製し、２入力５状態遺伝子調節プログラムを実装したＧＲＳＭレジスタの自動設計を可能にした。
【００６４】
ＲＳＭフレームワークの検証は、２入力５状態および３入力１６状態のＲＳＭを構築し、これらをサンガー配列決定およびｑＰＣＲで試験し、それらを適用して状態依存性の遺伝子調節プログラムを構築することにより、行った。本開示のステートマシンは、遺伝子プログラミングの他の戦略、例えば状態なしの組合せブール論理ゲート（３３〜４４）、複数の入力を組み込まないセルカウンタ（２０）、すべての可能な入力の識別性および順列を１つの回路に報告できない時間論理回路（２３）、および重複するリコンビナーゼ認識部位を使用せず、したがって順序依存性の入力処理を行うことができないその他の多入力リコンビナーゼベースの回路（２１，２２）などとは異なっている。
【００６５】
ＲＳＭを細菌に実装したが、本明細書で提供されるフレームワークは、リコンビナーゼが機能的である他の生物にも拡張可能である。例えば、本明細書で使用される大セリンリコンビナーゼ（ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８）、ならびに哺乳動物細胞における組換えを触媒するφＣ３１、φＦＣ１、φＲＶ１、Ｕ１５３、およびＲ４（４５〜４８）を、用いることができる。
異なる生物で機能する追加のリコンビナーゼの同定は、我々のフレームワークの適用性を拡大するであろう。組換え指向性因子などのタンパク質を介した可逆的組換え事象の取り込みはまた、遺伝子調節状態間の可逆的移行を可能にするであろう（１５）。所望の用途に応じて、ここでＲＳＭを駆動するために使用される原型の誘導性プロモーターは、記録される所望のシグナルに対応するセンサーで置き換えることができる。かかるセンサーは、それらがリコンビナーゼ活性を制御できる限り、必ずしも転写調節に基づく必要はない。
【００６６】
ＲＳＭを複雑なシステムに組み込むことにより、継続的なモニタリングおよび／またはサンプリングを必要とすることなく、時間的に分散した事象を研究者らが調査することが可能となる。例えば、ＲＳＭを腫瘍モデルに組み込むことによって、科学者は、癌遺伝子活性化および腫瘍抑制因子失活事象の識別および順序を個々の癌細胞で記録し、さらにこの情報をトランスクリプトーム解析または薬物アッセイからの表現型データと相関させることができる。ＴＥＴ２（腫瘍抑制因子）およびＪＡＫ２（癌原遺伝子）の両方に突然変異を含む骨髄増殖性新生物の最近の研究において、突然変異の発生順序が、治療に対する感受性を含む疾患表現型の決定に役割を果たすことが発見された（８）。この研究は、他の悪性腫瘍における順序依存性の潜在的影響とそれらを研究することの重要性を強調する。ＧＲＳＭからのレポーター遺伝子発現に基づく細胞選別を用いて、遺伝子調節摂動の異なる識別性および順序に曝された細胞を分離することができ、これはその後、細胞の機能的相違を決定するためにさらに研究することができる。
【００６７】
自然発生する信号を記録して応答することとは別に、ＲＳＭは、それらを制御する信号がユーザーによって適用される場合に、適用を有する。例えば、ＲＳＭは、入力の同時組合せに基づかず、しかし入力の順序によって、遺伝子発現を生成することができる。したがってＲＳＭは、バイオエンジニアにとって、制御信号の数が限られている細胞株における複数の機能をプログラムするために、有用であり得る。例えばＲＳＭは、少数の入力の順序および識別性に基づいて、多くの異なる細胞運命経路の下で細胞分化をプログラムするために、使用され得る。
【００６８】
生物学的な研究および工学への応用を超えて、本明細書に記載の仕事はまた、リコンビナーゼシステムに対する興味深い数学的構造も明らかにした。一見すると、リコンビナーゼ操作の非交換的（non-commutative）挙動は、ＲＳＭにおける可能な状態の数とそれが組み込むリコンビナーゼの数との間に、超指数関数的関係が存在する可能性があることを示唆する。しかし我々の結果は、状態の数が指数関数的に束縛されることを示している（ボックス１、例７および例８）。
【実施例】
【００６９】
例１．リコンビナーゼベースのステートマシンのパーツおよび操作
ＲＳＭにおいて、化学シグナルは入力として機能し、状態は「レジスタ」と呼ばれるＤＮＡの所定の領域内のＤＮＡ配列によって定義される。レジスタ上の組換え事象を触媒して状態を変化させる大セリンリコンビナーゼの発現を誘導することによって、化学シグナルは、状態の遷移を媒介する。具体的には、各リコンビナーゼは、レジスタ上の同族の一対のＤＮＡ認識部位、attP（ファージ由来）およびattB（そのバクテリア宿主由来）を認識し、それらの間の組換え反応を行い、attLおよびattR部位（attBとattPの結合した半分から構成される）を生じさせる（２４、２５）。余分な補因子が存在しない場合、この反応は非可逆的である（例６および図８Ａ〜８Ｂ）（２６〜２８）。同族attB-attP（attPを有するattB）対における各部位は、その極性を決定する適合する中心ジヌクレオチドを有する（２９、３０）。２つの部位がレジスタ上で整列していない（逆の極性に向いている）場合、それらの組換えの結果は、それらの間でのＤＮＡの反転である（図２Ａ；図Ｓ２Ａ）。代替的に、２つの部位がレジスタ上で整列している（同じ極性に向いている）場合、それらの組換えの結果は、それらの間のＤＮＡの切り出しである（図２Ａ；図Ｓ２Ｂ）。レジスタから切り出されたＤＮＡセグメントは、複製起点の欠如のために失われるとする。
【００７０】
ＲＳＭに複数の入力がある場合、それらは、独自のattB-attP対でのみ動作する別個のリコンビナーゼをそれぞれ駆動することができる。文献では、少なくとも２５個（推定直交性）の大セリンリコンビナーゼが記載され試験されており（１８、２５）、バイオインフォマティクスマイニングを用いてより多くの発見が可能である（１８）。複数のリコンビナーゼのための認識部位は、レジスタ上にいくつかの異なる方法で配置され得る。異なるリコンビナーゼからのattB-attP対が入れ子になるかまたは重なり合う場合、１つのリコンビナーゼの操作は、――それらのattBおよびattP部位の相対的配向を再配列するか、対における片方または両方の部位をレジスタから切り出して、これらの部位における任意の種類の下流動作を排除することによって――その後のリコンビナーゼの操作に影響し得る。例えば、図２Ｃの初期のレジスタ設計を考慮すると、入力「Ｂ→Ａ」を適用することによって一意的なＤＮＡ配列が得られるが、「Ａ→Ｂ」を適用することは、「Ａ」のみを適用した場合に予想されるのと同じＤＮＡ配列をもたらし、なぜならば、「Ａ」駆動性リコンビナーゼが、「Ｂ」駆動性リコンビナーゼの部位を切り出すからである。
【００７１】
我々はＲＳＭの「情報容量」を、それがアクセス可能な異なる状態の数、したがってそれが区別できる入力の配列文字列の数によって測定する。レジスタ上のリコンビナーゼ操作の非交換的性質を考えると、ＲＳＭの情報容量は、Ｎ個の入力に対してＮ！のように挙動すると、単純に考えるかも知れない。しかし、ＲＳＭを、各入力駆動リコンビナーゼがレジスタ上に１つのattB-attP対のみを有するように設計する場合、ＲＳＭの情報容量は決して２Ｎ――リコンビナーゼ操作が交換的である場合に予想される結果――を超えることはない（ボックス１、例７）。この情報のボトルネックを回避するためには、リコンビナーゼ当たり複数の直交attB-attP対を用いて、レジスタを設計しなければならない。リコンビナーゼの直交attB-attP対は、天然attB-attP対の各部位の中心ジヌクレオチドを変異させることによって、操作することができる（２９〜３１）。同じ中心ジヌクレオチド配列を有する部位の対は組換えすべきであるが、中心ジヌクレオチド配列が一致しない場合には、組換えすべきではない（図２Ｄ、図Ｓ２Ｃ）。
【００７２】
例２．２入力５状態のリコンビナーゼベースステートマシンの構築
２つの入力のすべての配列文字列に対して異なる状態（合計５つ）に入るＲＳＭを実装するためには、１つのリコンビナーゼに対して２つの直交attB-attP対を使用し、他のリコンビナーゼに対して１つのattB-attP対を使用すれば十分であった。ＲＳＭの設計およびその状態図の詳細な表現を、図３Ａに示す。このＲＳＭは、２つのプラスミド：入力プラスミドと出力プラスミドからなる。高いコピー数での入力プラスミドは、２つの大セリンリコンビナーゼＢｘｂＩおよびＴＰ９０１を、それぞれアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）誘導性ＰＬｔｅｔＯプロモーターおよびアラビノース（Ａｒａ）誘導性ＰＢＡＤプロモーターから発現する。出力プラスミドは単一コピー数において、入力プラスミドから発現されたリコンビナーゼにより改変されるレジスタを含む。
【００７３】
このレジスタはもともと、整列したＢｘｂＩ attB-attP対および２つの整列していない直交ＴＰ９０１ attB-attP対からなる。ＡＴｃが最初にシステムに導入されると、ＢｘｂＩが発現され、ＴＰ９０１の認識部位を含むその同族認識部位対の内部のＤＮＡが切り出される。続いてＡｒａのシステムへの導入はＴＰ９０１の発現を誘導し、ＴＰ９０１はレジスタ外縁のその同族認識部位を再組換えし、その間のすべてを反転させる。逆に、Ａｒａが最初にシステムに導入されると、外側のＴＰ９０１部位は、レジスタの縁部の間のすべてを反転させ、内側のＴＰ９０１部位は、レジスタの内側部分を反転させ、したがって、ＢｘｂＩ認識部位を非整列の構成に設定する。続くＡＴｃのシステムへの適用は、ＢｘｂＩ部位の間のＤＮＡ配列を反転させる。その結果、入力の各配列文字列は、レジスタ上に別個のＤＮＡ配列を生じさせる。
【００７４】
大腸菌（E. coli）におけるＲＳＭの性能を評価するために、入力のＡＴｃおよびＡｒａの５つの配列文字列（入力なし、ＡＴｃのみ、Ａｒａのみ、ＡＴｃ→Ａｒａ、およびＡｒａ→ＡＴｃ）で処理された５つの細胞集団を増殖させた。３つの生物学的反復物それぞれにおける各集団からの少なくとも２２個の細胞のコロニーにおいて、レジスタをサンガー配列決定し、予想されるＤＮＡ配列を有する細胞のパーセントを決定した（図３Ｂ）（３２）。入力の各配列文字列で処理された全細胞の少なくとも９７％が、予想された状態を採用し、したがってＲＳＭの適合度を確認した。表１は、予想された状態にない、配列決定されたレジスタの情報を示す。
【００７５】
状態のサンガー配列決定読み取りのスループットが低いため、我々はまた、状態について全集団レベルで便利に質問する、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に基づく方法を開発した。レジスタにおけるＤＮＡセグメントの切り出しおよび反転は、いくつかの状態においては増幅するが他では増幅しないプライマー対の設計を可能にする。我々は、所与のレジスタの各状態を一意的に同定するプライマー対のすべての可能な集合を同定するために、ＰＣＲに基づく状態質問ツール（ＰＳＩＴ）のコンピュータプログラムを作成した（図１０、例１６）。２入力５状態ＲＳＭについて、３つのプライマー対の集合を選択し、ＡＴｃおよびＡｒａ入力のすべての可能な配列文字列で処理された細胞の各集団から単離されたＤＮＡ上で、ｑＰＣＲを行った。増幅されたレジスタＤＮＡの分画量を集合内の各プライマー対について計算し、各集団のすべての細胞が５つの可能な状態のうちの１つを採用した場合に予想されるものと比較した（３２）。配列決定結果と一致して、すべての実験集団のｑＰＣＲ測定値は、各集団のすべての細胞が予想された状態を採用した場合に予想されるものと、最も類似していた（図１１）。
【００７６】
例３．リコンビナーゼベースのステートマシンの拡張
我々は、入力のすべての各配列文字列に対して異なる状態に入るＲＳＭを構築するための、モジュラーレジスタ設計戦略を開発した（Ｎ個の入力について約ｅＮ！個の状態；例９、例１０、表２を参照）。Ｎ個の入力に対し、この設計戦略はリコンビナーゼあたりＮ−１個の認識部位を使用するために、最大７個の入力（１３７００個の状態）のレジスタ設計に制限されるが、なぜならば、大セリンリコンビナーゼあたり６つの直交性および方向性のattB-attP対しか作製することができないからである（３１）。
【００７７】
図３Ａに示す２入力５状態のＲＳＭは、組合せ計算によって達成可能な２入力４状態システムに対して情報容量のわずかな改善しか示さないため、我々のＲＳＭフレームワークによって可能となる情報容量を、３入力１６状態のＲＳＭに拡張することでさらに実証しようと試みた（図４Ａおよび図１２）。このステートマシン用の入力プラスミドは、２，４−ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）誘導性ＰＰｈｌＦプロモーター系の下で追加のリコンビナーゼＡ１１８を発現し、そのレジスタは、３つのリコンビナーゼのそれぞれに対して２つの直交attB-attP対を使用する（例１０の設計戦略に従う）。
【００７８】
大腸菌におけるこのＲＳＭの性能を評価するために、ＡＴｃ、ＡｒａおよびＤＡＰＧの入力の全１６個の配列文字列で処理された１６の細胞集団を増殖させた。予想されるＤＮＡ配列を有する細胞のパーセントを決定するために、３つの生物学的反復物それぞれにおける各集団からの５〜６個の細胞のコロニーにおいて、レジスタを配列決定した（図４Ｂ）（３２）。ほとんどの集団で、１００％の細胞が予想された状態を採用し、性能が最低の集団（ＡＴｃ→Ａｒａ→ＤＡＰＧ）においても、８８％の細胞がそれらの予想された状態を採用した。表１は、予想された状態にない、配列決定されたレジスタの情報を示す。我々はまた、各集団の優勢な状態を、ｑＰＣＲにより、ＰＳＩＴ（３２）によって解明された６つのプライマー対の集合を用いて測定した。配列決定の結果と一致して、すべての実験集団のｑＰＣＲ測定値は、各集団のすべての細胞がそれらの予想された状態を採用した場合に予想されるものと、最も類似していた（図１３）。
【００７９】
例４．遺伝子調節リコンビナーゼベースのステートマシン
我々のステートマシンのフレームワークは、どの遺伝子が各状態において発現されるべきか、または発現されるべきではないかを特定する、状態依存性の遺伝子調節プログラムの作成を可能にする。これは、広範な生物学的用途、例えば合成分化カスケードのプログラミング、生物学的事象の識別性および順序を選択可能または分類可能なレポーターにコードすること、または、特定順序の生物学的事象を経験する細胞への遺伝子摂動の標的化などに、有用であり得る。遺伝子調節プログラムは、プロモーター、ターミネーター、および遺伝子などの遺伝子調節要素をＲＳＭのレジスタに組み込むことにより、実装することができる。各状態におけるこれらの要素の再配置は次に、遺伝子発現を予測可能な様式で変えるべきである。かかるＲＳＭは、各状態が一連の出力に関連するオートマトン理論からの、Mooreマシンの生物学的実現である（１）。ここではそれらを、遺伝子調節リコンビナーゼベースのステートマシン（ＧＲＳＭ）と呼ぶ。
【００８０】
研究者が所望の遺伝子調節プログラムのための回路を設計するのを助けるために、２入力５状態ＧＲＳＭレジスタの検索可能なデータベースを作成した。この「ＧＲＳＭデータベース」（図５）をコンパイルするために、機能的に異なるパーツ（ターミネーター、構成的プロモーター、および遺伝子から作製される；詳細については例１１を参照）を図３Ａの検証された５状態レジスタの各リコンビナーゼ認識部位の前後に挟み込むことによって得られる、すべての可能なレジスタを最初に列挙した。各レジスタの各状態を遺伝子転写について評価し、同じ遺伝子調節プログラムを実装するレジスタを集めた。この評価ステップの間、すべての遺伝子がその３’末端に双方向性ターミネーターを有しており、したがってＲＮＡポリメラーゼが（いずれかの方向に）遺伝子を横切って別の遺伝子を転写する可能性を許容しない、と仮定した。我々はまた、レジスタ内の各遺伝子が異なっていると仮定した。これらの仮定は、レジスタ設計を簡素化し、データベースを管理しやすいサイズに保ち、高速な計算検索を可能にするために行った。
【００８１】
データベースの冗長性を避けるために、余分なパーツ（ターミネーター、プロモーター、またはいかなる状態でも遺伝子調節に影響を与えない遺伝子、を含有するパーツ）を有するレジスタは、その「親」レジスタ［余分なパーツ（単数または複数）を除いて同じレジスタ］もデータベースに表示されている場合には、データベースから除去した。さらに、各状態で遺伝子を全く転写しなかったか、または同じ遺伝子を転写したすべてのレジスタも、データベースから除去したが、これは、この遺伝子調節が実装に重要ではないからである。
【００８２】
得られたデータベース（例１４）は、１７４，２６４個の遺伝子調節プログラムを実装する合計５，１９２，８１９個のＧＲＳＭレジスタを含む。各レジスタは、どの２つのレジスタも、すべての同じ位置においてすべての同じパーツを有しないという意味で、異なっている。データベースのレジスタは、１〜１４個の遺伝子のいずれかの転写を調節する（図１４Ａ）。３つまでの遺伝子を調節する任意の所望のプログラムのためのレジスタが、データベースに存在する可能性が高い――これは、可能な１遺伝子調節プログラムの１００％、可能な２遺伝子調節プログラムの９５％、および可能な３遺伝子の６１％を含む（図１４Ｂ）。さらに、可能な４遺伝子調節プログラムの２７％がデータベースに示されているが、その割合は、可能な遺伝子調節プログラムの数が各追加の遺伝子と共に指数関数的に増加するにつれて、急激に低下する（例１２）。簡単な遺伝子置換原則を適用して、データベースに表された調節プログラムの範囲を超えることができ、これは例えば、レジスタ上の複数の異なる遺伝子を同じ遺伝子のコピーに置き換えること、または遺伝子を複数シストロン性オペロンで置き換えることによる（図１５）。ＧＲＳＭデータベースを設計または探索に便利に利用するために、ユーザーが指定した遺伝子調節プログラムを受け入れて、これを実装するために使用できるデータベースからのすべてのレジスタを返す、検索機能を作製した（図５、例１５）。
【００８３】
大腸菌における機能的ＧＲＳＭを作製するために、レジスタにおいて出力プラスミドを我々のデータベースから置き換えた以外は、我々の２入力５状態ＲＳＭ（図３Ａ）と同じ入出力プラスミドスキームを実施した。蛍光タンパク質（ＦＰ）遺伝子をレジスタ上に構築して、遺伝子調節性能を評価した。入力のＡＴｃおよびＡｒａの５つの配列文字列すべてで処理された細胞集団を増殖させ、次いで各集団についてフローサイトメトリーを使用して、別個のＦＰ発現プロファイルを有する細胞のパーセントを測定した（３２）。４つの単一遺伝子調節プログラム（図６Ａ〜Ｄ）および１つの多遺伝子調節プログラム（各状態において３つの異なるＦＰの一意的な部分集合が発現された、図６Ｅ）を、予想されるＦＰ発現プロファイルを採用する各実験集団からの少なくとも９４％の細胞を有して、首尾よく実装した。これらのＧＲＳＭは、細胞事象の識別性および順序に関する便利な蛍光ベースの報告を可能にする。例えば、図６ＥのＧＲＳＭは、フローサイトメトリー（図１６Ａ〜図１６Ｅ）を使用して、増加する入力時間（１時間のステップで）を有する基礎となるＲＳＭの性能を評価することを可能にした。我々の発見は、２時間の入力持続時間が、大部分の細胞がその期待された状態をとるためには十分であることを実証した。
【００８４】
遺伝子調節パーツが特定の配置に組み立てられた場合に、予測できない振る舞いが生じることがあるため、一部のＧＲＳＭは予想通りの遺伝子調節プログラムを実装できない可能性がある。実際にこれは、我々が初期に試験したＧＲＳＭ、すなわち入力としてＡｒａのみまたはＡＴｃ→Ａｒａへの曝露の後に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現すると予想されたＧＲＳＭの場合であった（図１７Ａ）（３２）。デバッグするよりも、我々は、初期のＧＲＳＭよりも優れた性能を有するデータベース（図１７Ｂ〜Ｃ）からの異なるレジスタを使用して、２つの代替的ＧＲＳＭを構築した；そのうちの１つは、少なくとも９５％の細胞が、各実験集団について予想される遺伝子発現プロファイルを有していた（図１７Ｃ）。一般に、我々のデータベースに表された多くの遺伝子調節プログラムは、それらを実装することができる複数の可能なレジスタを有する（図１８）。例えば、ほとんどの１遺伝子調節プログラムは、少なくとも３７３の可能なレジスタを有し、ほとんどの２遺伝子調節プログラムは、少なくとも５５の可能なレジスタを有し、ほとんどの３遺伝子調節プログラムは、少なくとも１４の可能なレジスタを有する。最大１４までの遺伝子を調節する、データベース内のプログラムであっても、そのほとんどは、それらを実装することができる少なくとも４つの可能なレジスタを有する。この高度に退化した（degenerate）設計スペースは、特定のレジスタが特定の規格に準拠しない場合に、互いの代替として機能することができる一連のＧＲＳＭレジスタを提供する。計算的および実験的に導出されたさらなる規則は、成功した遺伝子調節機能の可能性についての候補レジスタのランク付けを、可能にし得る。
【００８５】
ＧＲＳＭの拡張性を実証するために、遺伝的パーツを図４Ａのレジスタに挟み込むことにより、２つの３入力６状態ＧＲＳＭを構築した。１つのＧＲＳＭは、入力Ａｒａ→ＤＡＰＧ→ＡＴｃ（図７Ａ）を受け取った場合に、遺伝子（青色蛍光タンパク質）の発現をオンにするだけの、３入力パスコードスイッチとして機能する。他のＧＲＳＭは、デフォルトで遺伝子（ＧＦＰ）を発現し、Ａｒａ→ＤＡＰＧ→ＡＴｃ軌道に沿わない任意の入力を受け取った場合に、これをオフにする（図７Ｂ）。両方のＧＲＳＭは大腸菌に実装され、入力のＡＴｃ、ＡｒａおよびＤＡＰＧの１６の配列文字列すべてで試験された（３２）。フローサイトメトリーにより、各実験集団からの細胞の少なくとも９３％が、予想される遺伝子発現プロファイルを採用したことが明らかになった。このように、効率的に機能する拡張性あるＧＲＳＭを、我々の設計フレームワークを使用して実装することができる。
【００８６】
材料および方法（例１〜４について）
株、培地、抗生物質、および誘導物質
すべてのプラスミドは、大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯ（F- 80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-, PN25/tetR, Placiq/lacI, Spr）に実装して試験した。すべての実験は、０．４％グリセロールを添加したAzure Hi-Def培地（Teknova, Hollister, USA）で行った。クローニングのために、大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯまたはＥＰＩ３００（F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA dhfr）を、「プラスミドの構築およびクローニング」の節に示されているようにして用いた。すべてのクローニングは、Luria-Bertani（ＬＢ）−Miller培地（BD Difco）またはAzure Hi-Def培地中で、「プラスミドの構築およびクローニング」の節に示されているようにして行った。ＬＢプレートは、ＬＢを１．５％ｗ／ｖ寒天（Apex）と混合することによって作製した。クローニングおよび実験の両方について、抗生物質を以下の濃度で使用した：クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）。実験のために、誘導物質を以下の濃度で使用した：ＡＴｃ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｒａ（１％ｗ／ｖ）およびＤＡＰＧ（２５μＭ）。
【００８７】
プラスミドの構築およびクローニング
すべてのプラスミドは、基本的な分子クローニング技術およびギブソンアセンブリを用いて構築した（４９、５０）。表３と表４に、関連するパーツ、それらの配列、およびそれらが由来するソースのリストを示す。
すべての入力プラスミド（ｐＮＲ６４およびｐＮＲ２２０）は、カナマイシン耐性カセット（ｋａｎＲ）およびＣｏｌＥ１（高コピー）複製起点を有する。入力プラスミドｐＮＲ６４は、Bonnet et al. (2013)のDual Recombinase Controller（Addgene #44456）から適合させた。このDual Recombinase Controllerのクロラムフェニコール耐性カセットをｋａｎＲに置き換えて、ｐＮＲ６４を作製した。ｐＮＲ２２０を作製するために、Nielsen, et al.（３６）からのＰｈｌＦプロモーター系をｐＮＲ６４上に挿入して、Dr. James Thomson（USDA-ARS WRRC, Albany, CA）から授与されたＡ１１８リコンビナーゼの発現を駆動した。いかなる入力もない状態でＡ１１８をしっかり制御するために、強力な構成的ｐｒｏＤプロモーターからｐｈｌＦ遺伝子（ＰＰｈ１Ｆからの転写を抑制することに関与する）を発現させた（５１）。すべての入力プラスミドを、化学的コンピテント大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯに形質転換し、続いてQIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて単離し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）で検証した。
【００８８】
すべての出力プラスミド（ｐＮＲ１６０、ｐＮＲ１６３、ｐＮＲ１６４、ｐＮＲ１６５、ｐＮＲ１６６、ｐＮＲ１８６、ｐＮＲ１８７、ｐＮＲ１８８、ｐＮＲ２９１、ｐＮＲ２９２、およびｐＮＲ２８４）は、クロラムフェニコール耐性カセット（ＣＡＭＲ）を有しており、少ないコピー数を保証するために細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター骨格の上に構築されたが、これは理想的には、１細胞あたり約１個のレジスタが望ましいからである。使用したＢＡＣはWild et al.（５２）由来であり、ＥＰＩ３００細胞においてCopy Control（Epicenter）を用いてより高いコピー数に誘導することができる。ｐＮＲ１６０およびｐＮＲ１８８に対するattBおよびattP認識部位の文字列は、Integrated DNA Technologiesから合成され、それぞれの骨格にクローニングされた。すべてのＧＲＳＭ出力プラスミド（ｐＮＲ１６３、ｐＮＲ１６４、ｐＮＲ１６５、ｐＮＲ１６６、ｐＮＲ１８６、ｐＮＲ１８７、ｐＮＲ２９１、ｐＮＲ２９２、およびｐＮＲ２８４）の構築のために、ｐＮＲ１６０（２入力５状態用）とｐＮＲ１８８（３入力１６状態用）上の認識部位のアレイを、ギブソンアセンブリを使用してプロモーター、ターミネーター、および遺伝子で挟み込んだ。プラスミド上での望ましくない組換えを防ぐために、同じプラスミド上で同一パーツ配列の再使用は避けた。プロモーターについては、ｐｒｏＤ、ＢＢａ＿Ｒ００５１、およびＢＢａ＿Ｊ５４２００を使用したが、これらはすべて以前に、強い発現を有することを特徴としていた（５３）。ｐｒｏＤプロモーターは、様々な状況にわたって一貫した性能で役立つ、絶縁プロモーターである（５１）。我々は、Hsu et al.により特徴付けられた、２０ｎｔの初期転写配列（それぞれＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＡＡ（配列番号１）およびＡＴＡＧＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＴ（配列番号２））の上流に、２つのプロモーター、ＢＢａ＿Ｒ００５１およびＢＢａ＿Ｊ５４２００を融合し（５４）、それぞれ連結パーツｐｒｏＮＲ３およびｐｒｏＮＲ４と命名した。Chen et al.により特徴付けられた一連の検証済みの強力な配列多様的ターミネーターの中から、我々のＧＲＳＭのターミネーターを選択した（５５）。多くの場合にターミネーターを直列に構築して、終端効率を高めた。最後に、蛍光レポーター遺伝子gfpmut3b（５６）、mrfp（５７）、およびmtagbfp（５８）を用いて、出力を生成した。各遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、Salis Lab ＲＢＳ計算機を用いて最適化した（５９）。各ＲＢＳの上流で自己切断ハンマーヘッドリボザイムを融合して、上流の５’非翻訳転写領域が下流遺伝子の翻訳を妨害するのを防いだ（６０）。すべての出力プラスミドを化学的コンピテント大腸菌株ＥＰＩ３００またはＤＨ５αＰＲＯに形質転換し、続いてQIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて単離し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）で検証した。
【００８９】
出力プラスミドと同様に、本研究で使用した各リコンビナーゼの順方向（attB-attP→attL-attR）および逆方向（attL-attR→attB-attP）組換え効率を試験するためのすべてのプラスミド（図８Ａ〜８Ｂ参照）は、クロラムフェニコール耐性カセット（camR）を有し、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上に構築される。順方向反応試験プラスミド（ＢｘｂＩについてはｐＮＲ２３０、Ａ１１８についてはｐＮＲ２３９、ＴＰ９０１についてはｐＮＲ２７６）は、順方向に配向したｐｒｏＤプロモーターの下流の逆方向に配向したgfpmut3b（上記の出力プラスミドと同じＲＢＳおよびリボザイムに結合）、およびその遺伝子に隣接する同族リコンビナーゼのための整列していないattBおよびattP部位を用いて、それぞれ構築された。各順方向反応試験プラスミドを、化学的コンピテント大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯに形質転換し、続いてQIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて単離し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）で検証した。逆方向反応試験プラスミド（ＢｘｂＩについてはｐＮＲ２７９、Ａ１１８についてはｐＮＲ２８０、ＴＰ９０１についてはｐＮＲ２８７）を生成するために、各順方向反応試験プラスミドを、ｐＮＲ２２０入力プラスミドを含む化学的コンピテント大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯに形質転換し、各試験プラスミドについて同族リコンビナーゼを誘導し、組換えプラスミドを細胞から、QIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて単離した。次いで、各逆方向反応試験プラスミドを、化学的コンピテントな大腸菌株ＤＨ５αＰＲＯに形質転換し、次いでQIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて再び単離し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）で検証した。これらの試験プラスミドの第２の形質転換および単離ステップは、それらを、第１の単離ステップ後の精製ＤＮＡ溶液中に必然的に存在するｐＮＲ２２０プラスミドから分離するために行われた。
【００９０】
ＲＳＭの実装
すべてのＲＳＭは、２プラスミドシステム（１入力プラスミドおよび１出力プラスミド）で実装した。表５は、各ＲＳＭおよびそれらを実装するために使用した入力および出力プラスミドの名称を示す。すべての２入力ＲＳＭは、ｐＮＲ６４入力プラスミドと所望の遺伝子調節プログラムに応じた様々な出力プラスミドを使用した。すべての３入力ＲＳＭは、ｐＮＲ２２０入力プラスミドと所望の遺伝子調節プログラムに応じた様々な出力プラスミドを使用した。
２入力５状態ＲＳＭについては、入力プラスミド（ｐＮＲ６４）と出力プラスミドを同時に、化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５αＰＲＯ細胞に形質転換した。形質転換後、細胞をクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレーティングした。これらのプレートからのコロニーを用いて、ＲＳＭ試験実験を開始した（下の「試験」の節を参照）。
【００９１】
３入力１６状態ＲＳＭについては、最初に入力プラスミド（ｐＮＲ２２０）を化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５αＰＲＯ細胞に形質転換し、形質転換体をカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレーティングした。続いてコロニーを、Azure Hi-Def培地（カナマイシン含有）に接種し、３７℃で一晩増殖させた後、新鮮培地（一晩と同じ培地）に１：２０００に希釈し、３７℃でＯＤ６００が０．２〜０．５となるまで再増殖させた。次いで、この培養物からの細胞を化学的コンピテントにし、出力プラスミドで形質転換した。この場合の逐次的形質転換の目的は、phlF遺伝子（入力プラスミド上）が、（これも入力プラスミド上の）ＰＰｈｌＦプロモーターからのＡ１１８リコンビナーゼの発現を抑制するのに十分高いレベルで発現されるための時間を許容することであった。これは、出力プラスミドがシステムに導入された場合に、最小のリコンビナーゼレベルを保証するためであった；さもなければ、出力プラスミド上のレジスタは、化学誘導事象をその実際の発生前に誤って記録した可能性がある。出力プラスミドの形質転換後、細胞をクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレーティングした。これらのプレートからのコロニーを用いて、ＲＳＭ試験実験を開始した（以下の「試験」の節を参照）。
【００９２】
図３Ａの２入力５状態ＲＳＭを試験するための実験
１つの生物学的反復物について２入力５状態ＲＳＭを試験するために、入力プラスミドｐＮＲ６４および出力プラスミドｐＮＲ１６０を含む大腸菌細胞のコロニーを、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む培地に接種し、３７℃で一晩（約１８時間）増殖させ、２ラウンドの誘導に続いて１ラウンドの増殖（outgrowth）を行った。第１ラウンドの誘導のために、一晩培養物を、誘導物質なしの各培地、ＡＴｃを含む培地、およびＡｒａを含む培地に１：２５０希釈し、３０℃で１８時間増殖させた。第２ラウンドの誘導のために、これらの３つの培養物を再び新鮮培地に１：２５０希釈した：誘導なしの培養物を、誘導物質なしの培地に再度希釈し、ＡＴｃ誘導培養物を誘導物質なしの各培地およびＡｒａを含む培地に希釈し、Ａｒａ誘導培養物を誘導物質なしの各培地およびＡＴｃを含む培地に希釈した。これらの培養物を再び、３０℃で１８時間増殖させた。得られた培養物は、入力ＡＴｃおよびＡｒａの５つの配列文字列すべてで処理された細胞の５つの集団を表した。最後に、増殖のために、これらの培養物を誘導物質なしの培地に１：２５０希釈し、３７℃で約１８時間増殖させた。この最終増殖の目的は、集団間で検出された差異が、それらの現在の環境ではなく入力の履歴に起因し得るように、すべての細胞集団を誘導物質なしの状態に正規化することであった。この実験は、各生物学的反復物について異なる出発コロニーを用いて繰り返した。すべての培養物を、２５０μＬ培地（９６ウェルプレート中）中、９００ｒｐｍで振とうして増殖させた。すべての培地はクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含んでいた。実験からの最終集団を、配列決定アッセイおよびｑＰＣＲアッセイで分析した（下記参照）。
【００９３】
図３Ａの２入力５状態ＲＳＭを試験するための配列決定アッセイ
配列決定アッセイのために、前節の５つの実験集団の各々（３つの生物学的反復物の各々から）を１：１０６に希釈し、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし（１００μｌ）、３７℃で一晩、得られた各コロニーが、各実験集団からの単細胞のクローン集団を表すように、増殖させた。各プレート（実験集団）からの約２４（少なくとも２２）のコロニーに対する出力プラスミド上のレジスタ領域を、コロニーＰＣＲで増幅し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）に送った。配列決定反応からのクロマトグラムを、予想されるレジスタ配列と整列させて、それらが一致するか否かを決定した。３つすべての反復物からの結果が合計され、予想される配列と一致する細胞のパーセントを図３Ｂに示す。
【００９４】
図３Ａの２入力５状態ＲＳＭを試験するための定量的ＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲアッセイのために、前節の５つの実験集団の各々から（３つの生物学的反復物の各々から）のプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kitで単離し、ｑＰＣＲ反応における鋳型として使用した。すべてのｑＰＣＲ反応は、Roche LightCycler 96 Real-Time System上でKAPA SYBR（登録商標）FAST Master Mixを使用し、Kapa Biosystems推奨プロトコル（２００ｎＭの各プライマー、１０μｌの２ｘマスターミックス、および２０μｌの反応物中２０ｎｇ以下の鋳型）に従って実施した。各鋳型は、ＰＳＩＴによって解明された３つのプライマー対（「ｐｐ１」、「ｐｐ２」、および「ｐｐ３」）のそれぞれ（説明については「ＰＣＲに基づく状態質問ツール」の節を、プログラムについては例１６を参照）、および出力プラスミドの骨格を増幅する正規化プライマー対（「ｐｐＮ」）を用いて、ｑＰＣＲ増幅した。図１９は、３つのＰＳＩＴプライマー対が結合するレジスタ上の領域および、それらが増幅すると考えられるレジスタ状態を示す。表６にプライマー配列を示す。各プライマー対のｑＰＣＲ反応を、実験鋳型とともに、各プライマー対によって増幅されるレジスタ状態「Ｓ３」（図１９参照）を含む出力プラスミドから完全に構成された対照鋳型を用いて行った。この出力プラスミドをＡｒａ処理した大腸菌集団から単離し、配列を確認して、レジスタ状態がＳ３と一致することを確実にした。各実験鋳型（「ｔ１」、「ｔ２」、「ｔ３」、「ｔ４」または「ｔ５」）について、各プライマー対（ｐｐ１、ｐｐ２またはｐｐ３）によって増幅された出力プラスミドの「分画量」を以下により算出した：
【数１】
2018534921.tif 000003
式中、txは目的の実験鋳型（ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４またはｔ５）、ppyは目的のプライマー対（ｐｐ１、ｐｐ２またはｐｐ３）、tcは対照鋳型（Ｓ３における出力プラスミド）、ppnは正規化プライマー対（ｐｐＮ）であり、Cqはその下付き文字で示される鋳型とプライマー対のｑＰＣＲ反応からのＣｑ値である。
【００９５】
これらのftx,ppy値から、各実験鋳型のｑＰＣＲ結果ベクトルftxを作成した：
【数２】
2018534921.tif 000004
この結果ベクトルを、鋳型がＲＳＭのある特定状態からのレジスタで完全に構成された場合に得られる理論的結果ベクトル、ftsと比較した：
【数３】
2018534921.tif 000005
式中、tsは、１つの状態（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、またはＳ５）からのレジスタで完全に構成された鋳型である。ftx,ppy値は、特定のプライマー対ppyがその状態を増幅するか否かによって、０または１である（図１９）。ftxのftsに対する類似性を、ユークリッド距離、Dtx,tsで定量化した：
【数４】
2018534921.tif 000006
【００９６】
各実験的に誘導された鋳型のｑＰＣＲ結果ベクトルと各状態の理論的ｑＰＣＲ結果ベクトルとの間のユークリッド距離は、図１１のヒートマップに、３つの生物学的反復物のそれぞれについて表示される。
【００９７】
図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭを試験するための実験
３入力１６状態ＲＳＭを１つの生物学的反復物について試験するために、入力プラスミドｐＮＲ２２０および出力プラスミドｐＮＲ１８８を含有する大腸菌細胞のコロニーを、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む培地に接種し、３７℃で一晩（約１８時間）増殖させ、３ラウンドの誘導に続いて１ラウンドの増殖を行った。第１ラウンドの誘導のために、一晩培養物を、誘導物質なしの各培地、ＡＴｃ含有培地、Ａｒａ含有培地、およびＤＡＰＧ含有培地に１：２５０希釈し、３０℃で２４時間増殖させた。第２ラウンドの誘導のために、これらの４つの培養物を、次に再び新鮮培地に１：２５０希釈した；非誘導培養物を、誘導物質なしの培地に希釈した；ＡＴｃ誘導培養物を、誘導物質なしの各培地、Ａｒａ含有培地、およびＤＡＰＧ含有培地に希釈した；Ａｒａ誘導培養物を、誘導物質なしの各培地、ＡＴｃ含有培地、およびＤＡＰＧ含有培地に希釈した；ならびに、ＤＡＰＧ誘導培養物を、誘導物質なしの各培地、ＡＴｃ含有培地、およびＡｒａ含有培地に希釈した。これらの培養物を再び、３０℃で２４時間増殖させた。第３ラウンドの誘導のために、これらの１０の培養物の各々を、再び新鮮培地に１：２５０希釈した：非誘導→非誘導培養物を、誘導物質なしの培地に希釈した；ＡＴｃ→非誘導培養物を、誘導物質なしの培地に希釈した；ＡＴｃ→Ａｒａ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＤＡＰＧ含有培地に希釈した；ＡＴｃ→ＤＡＰＧ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＡｒａ含有培地に希釈した；Ａｒａ→非誘導培養物を、誘導物質なしの培地に希釈した；Ａｒａ→ＡＴｃ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＤＡＰＧ含有培地に希釈した；Ａｒａ→ＤＡＰＧ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＡＴｃ含有培地に希釈した；ＤＡＰＧ→非誘導培養物を、誘導物質なしの培地に希釈した；ＤＡＰＧ→ＡＴｃ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＡｒａ含有培地に希釈した；ＤＡＰＧ→Ａｒａ培養物を、誘導物質なしの各培地およびＡＴｃ含有培地に希釈した。これらの培養物を再び、３０℃で２４時間増殖させた。得られた培養物は、入力ＡＴｃ、ＡｒａおよびＤＡＰＧの１６個のすべての配列文字列で処理された１６の細胞集団を表した。最後に、増殖のために、これらの培養物を誘導物質なしの培地に１：２５０希釈し、３７℃で１８時間増殖させた。この実験は、各生物学的反復物について異なる出発コロニーを用いて繰り返した。すべての培養物を、９００ｒｐｍで振とうした２５０μＬ培地（９６ウェルプレート中）で増殖させた。すべての培地は、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含んでいた。実験からの最終集団を、配列決定アッセイおよびｑＰＣＲアッセイで分析した（下記参照）。
【００９８】
図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭを試験するための配列決定アッセイ
配列決定アッセイのために、前節から（３つの生物学的反復物の各々から）の１６の実験集団の各々を１：１０６希釈し、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレーティングし（１００μｌ）、３７℃で一晩、得られたコロニーが各実験集団から単細胞のクローン集団を表すように、増殖させた。各プレート（実験集団）からの５〜６コロニーの出力プラスミド上のレジスタ領域をコロニーＰＣＲで増幅し、サンガー配列決定（Quintara Biosciences）に送った。配列決定反応からのクロマトグラムを、予想されるレジスタ配列と整列させて、それらが一致するか否かを決定した。３つすべての生物学的反復物からの結果を合計し、予想される配列と一致する細胞のパーセントを図４Ｂに示す。
【００９９】
図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭを試験するための定量的ＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲアッセイのために、前節から（３つの生物学的反復物の各々から）の１６の実験集団の各々からのプラスミドを、QIAGEN（登録商標）QIAprep Spin Miniprep Kitで単離し、ｑＰＣＲ反応における鋳型として用いた。２入力５状態ＲＳＭ試験と同様に、すべてのｑＰＣＲ反応は、Roche LightCycler 96 Real-Time System上でKapa SYBR（登録商標）FAST Master Mixを使用し、Kapa Biosystems推奨プロトコル（２００ｎＭの各プライマー、１０μｌの２ｘマスターミックス、および２０μｌの反応物中２０ｎｇ以下の鋳型）に従って実施した。各鋳型は、ＰＳＩＴによって解明された６つのプライマー対（「ｐｐ１」、「ｐｐ２」、「ｐｐ３」、「ｐｐ４」、「ｐｐ５」および「ｐｐ６」）および出力プラスミドの骨格を増幅した正規化プライマー対（「ｐｐＮ」）で増幅した。図２０は、６つのＰＳＩＴプライマー対が結合するレジスタ上の領域および、それらが増幅すると考えられるレジスタ状態を示す。表７は、実際のプライマー配列を示す。２入力５状態システムと同様に、各プライマー対のｑＰＣＲ反応も、各プライマー対によって増幅されるレジスタを含む出力プラスミドから完全に構成された対照鋳型を用いて行った。しかし、２入力５状態ＲＳＭとは異なり、各プライマー対によって増幅される単一レジスタ状態は存在しなかった。そこで、状態「Ｓ２」の出力プラスミドをｐｐ１、ｐｐ４、ｐｐ５の対照鋳型として、および状態「Ｓ８」の出力プラスミドをｐｐ２、ｐｐ３、ｐｐ６の対照鋳型として使用した（図２０）。レジスタ状態Ｓ２を有するプラスミドを、ＡＴｃ処理大腸菌集団から単離し（および配列を確認し）、レジスタ状態Ｓ８のプラスミドを、Ａｒａ→ＤＡＰＧ処理大腸菌集団から単離した（および配列を確認した）。各実験鋳型について各プライマー対によって増幅されたプラスミドの分画量を計算し、次いで各鋳型のデータを、２入力５状態ＲＳＭの場合と同じ方法で（ただし６つのプライマー対および１６の状態に一般化したことを除く）、各理論状態と（ユークリッド距離により）比較した。すなわち：
【数５】
2018534921.tif 000007
【０１００】
各実験的に誘導された鋳型のｑＰＣＲ結果ベクトルと各状態の理論的ｑＰＣＲ結果ベクトルとの間のユークリッド距離を、図１３のヒートマップに、３つの生物学的反復物のそれぞれについて表示する。
【０１０１】
図６および図１７Ａ〜図１７ＣのＧＲＳＭレジスタを設計する
所望の遺伝子調節プログラムを、データベース検索機能［MATLAB R2013b（Mathworks, Natick, USA）でコード化：例１５］に入力し、レジスタの出力リストを受け取り、そこから実装のための候補を選択した。表８は、所望の遺伝子調節プログラムを特定するために使用したMATLAB検索機能入力マトリックス、および遺伝子調節プログラムを実装するために我々が選んだ検索機能出力ベクトルを、検索機能の使用説明書に従って示す（例１５）。
【０１０２】
図６および図１７Ａ〜図１７ＣのＧＲＳＭを試験するための実験
２入力５状態ＧＲＳＭを試験する実験は、図３Ａの２入力５状態ＲＳＭを試験するための実験と同じフォーマットに従ったが、ただし、誘導ラウンドについて１８時間の誘導の代わりに２４時間の誘導を使用し、実験集団を配列決定およびｑＰＣＲアッセイで分析する代わりに、蛍光アッセイを使用した（「蛍光アッセイ」の節を参照）。
【０１０３】
図７のＧＲＳＭを試験するための実験
３入力１６状態ＧＲＳＭを試験する実験は、図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭを試験するための実験と同じフォーマットに従ったが、ただし、実験的集団を配列決定およびｑＰＣＲアッセイで分析する代わりに、蛍光アッセイを使用した（「蛍光アッセイ」の節を参照）。
【０１０４】
図８Ａ〜８ＢのＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８の可逆性の試験
我々の研究における各リコンビナーゼ（ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８）について、互いの組換え版である２つのプラスミドを単離した：１つは、attB-attPを有しＧＦＰ発現なしのもの（ＢｘｂＩについてはｐＮＲ２３０、Ａ１１８についてはｐＮＲ２３９、およびＴＰ９０１についてはｐＮＲ２７６）、他方は、attL-attRおよびＧＦＰ発現を有するもの（ＢｘｂＩについてはｐＮＲ２７９、Ａ１１８についてはｐＮＲ２８０、およびＴＰ９０１についてはｐＮＲ２８７）である。これらのプラスミド各々を、入力プラスミドｐＮＲ２２０（「ＲＳＭの実装」の節に記載の通りに調製した）を含む化学的コンピテントな大腸菌ＤＨ５αＰＲＯに形質転換した。各形質転換体の組換えを測定するために、コロニーをカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む培地に接種し、３７℃で一晩（約１８時間）増殖させ、１ラウンドの誘導およびそれに続く増殖に供した。誘導のために、一晩培養物を、誘導物質なしの培地および誘導物質含有培地（ＢｘｂＩについてはＡＴｃ、ＴＰ９０１についてはＡｒａ、またはＡ１１８についてはＤＡＰＧ）に１：２５０希釈して入れ、３０℃で１６時間増殖させた。増殖のために、これらの培養物を、誘導物質なしの培地に１：２５０希釈して入れ、３７℃で１８時間増殖させた。この実験を、３つの生物学的反復物の各々について異なる開始コロニーを用いて繰り返した。すべての培養物を、９００ｒｐｍで振とうした２５０μＬ培地（９６ウェルプレート中）で増殖させた。ＧＦＰを発現する各集団からの細胞のパーセンテージを、「蛍光アッセイ」の節に記載されているように測定した。
【０１０５】
図１６Ａ〜１６ＥのＲＳＭ経時実験
１つの生物学的反復物について、入力プラスミドｐＮＲ６４および出力プラスミドｐＮＲ２９１を含有する大腸菌ＤＨ５αＰＲＯ細胞のコロニーを、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む培地に接種し、３７℃で一晩（約１８時間）培養し、新鮮培地に１：１７０に再希釈し、１１個の培養物に分け、３０℃で増殖させた。細胞が０．１のＯＤ６００に達したら、１つの培養物からの細胞を新鮮培地に１：１２５に再希釈し、３７℃で増殖させた。この（誘導されない）集団は、図１６Ｃ〜Ｅの０時間の時点となる。他のすべての培養物は、増殖の前に誘導された。Ａｒａを５つの培養物に直接添加し、ＡＴｃを別の５つに直接添加し、これらを３０℃で増殖を継続させた。各入力についての５つの培養物のそれぞれは、（各入力について）１時間ステップで分離された誘導時点となる；それらを入力種培養物と呼ぶ。１時間後、１つのＡＴｃ種培養物からの細胞を新鮮培地に１：１２５希釈し、これを３７℃で増殖させた。これは、図１６ＣにおいてＡＴｃの１時間時点となる。同じ種培養物から、細胞をＡｒａを含む培地に１：２５希釈し、入力暴露時間（１時間）の等価量で３０℃で増殖させた後、新鮮培地に１：１２５希釈し、３７℃で増殖させた。これは、図１６ＥにおいてＡＴｃ→Ａｒａの１時間時点になる。次に、同じ種培養物について、Ａｒａを直接加え、入力暴露時間（１時間）の等価量で３０℃で細胞を増殖させた後、新鮮培地に１：１２５希釈して３７℃で増殖させた。これは、図１６ＤにおいてＡＴｃ→Ａｒａの１時間時点となる。Ａｒａ種培養について１時間後に同じ手順を行ったが、ただし、逐次的に添加された入力として、ＡＴｃを用いた。続いてこのプロセスを、異なるＡＴｃおよびＡｒａ種培養物で２時間、および３、４および５時間繰り返した。最終細胞を増殖のために希釈した後（初期誘導開始後１０時間）、すべての細胞集団の増殖を１６時間続けた。この実験を３つの生物学的反復物について繰り返した。すべての培養物を、９００ｒｐｍで振とうした２５０μＬ培地（９６ウェルプレート中）で増殖させた。すべての培地はクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含んでいた。実験の最終集団を、フローサイトメトリーで分析した（「蛍光アッセイ」の節参照）。
【０１０６】
蛍光アッセイ
蛍光アッセイを用いたすべての実験において、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Research Products International）に１：１２５希釈し、BD-FACS LSRFortessa-HTS細胞分析器（BD Biosciences, CA）に供した。各試料について３０，０００個の細胞を測定し、実験中の全細胞について前方散乱および側方散乱により一貫してゲート制御した。ＧＦＰ（gfpmut3bの産物）強度をＦＩＴＣチャンネル（４８８ｎｍ励起レーザー、５３０／３０検出フィルター）で、ＲＦＰ（mrfpの産物）強度をPE-Texas Redチャンネル（５６１ｎｍ励起レーザー、６１０／２０検出フィルター）で、およびＢＦＰ（mtagbfpの産物）強度をPacBlueチャネル（４０５ｎｍ励起レーザー、４５０／５０検出フィルター）で測定した。蛍光閾値を各チャネルに適用して、発現した（ＯＮ）細胞の、発現していない（ＯＦＦ）蛍光タンパク質に対するパーセンテージを決定した。閾値は、陰性対照（ｐＮＲ６４および蛍光レポーター遺伝子なしのＢＡＣを含む、大腸菌ＤＨ５αＰＲＯ）集団に基づいて、これらの陰性対照細胞の０．１％が、各チャネルにおいてＯＮ蛍光タンパク質発現を有すると考えられるようにした（０．１％の偽陽性率に対応）。
【０１０７】
すべての蛍光に基づく実験は、３つの生物学的反復物を有した。リコンビナーゼ可逆性実験（図Ｓ１）およびＲＳＭ経時実験（図１６Ａ〜１６Ｅ）については、３つすべての反復物のデータが示されている。ＧＲＳＭ実験（図６、図７および図１７Ａ〜１７Ｃ）については、３つすべての反復物のデータが平均化される。これらの実験では、任意の蛍光部分集団のパーセントに対する最大の標準誤差は、１．２２％であった。
【０１０８】
ＧＲＳＭデータベースおよび検索機能
ＧＲＳＭデータベースは、MATLAB R2013b（Mathworks, Natick, USA）を使用して構築され、一部はハーバード大学のFAS Division of Science、Research Computing Groupの支援を受けたOdysseyクラスター上で動作する。
データベースは３つのアレイを含む：registerArray――ＧＲＳＭレジスタのアレイ、grpArray――遺伝子調節プログラムのアレイ、およびregister2grp――registerArrayの各レジスタをgrpArrayの対応する遺伝子調節プログラムにマップするアレイ（インデックスにより）。
【０１０９】
grpArrayの各遺伝子調節プログラムは、「０」と「１」の７０要素ベクトルで表される。１４要素の各連続ストレッチは、状態Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５にそれぞれ属し、これらは図３Ａの状態に対応する。各状態内で、各要素（１〜１４）は遺伝子（それぞれ「Ｇ１」〜「Ｇ１４」）を表す。例えば、grpArrayのベクトルが与えられると、要素１はＳ１のＧ１を表し、要素１５はＳ２のＧ１を表し、要素２９はＳ３のＧ１を表し、要素４３はＳ４のＧ１を表し、要素５７はＳ５のＧ１を表し、要素２はＳ１のＧ２を表し、要素１６はＳ２のＧ２を表す、等々である。各要素のバイナリ値は、その特定状態のその遺伝子がＯＦＦ（「０」）であるか、またはＯＮ（「１」）であるかを示す。遺伝子調節プログラムにおける各状態の任意の与えられた遺伝子の値が０の場合、その遺伝子は、調節プログラムに存在しない。
【０１１０】
registerArrayの各レジスタは、数字「１」〜「２５」の７要素ベクトルで表される。ベクトルの各要素は、図３Ａに示すレジスタの認識部位を挟み込むＤＮＡ領域（「ａ」〜「ｇ」）に対応する。各要素の値（１〜２５）は、表９に定義されるパーツを表す。各パーツは、各パーツが機能的に異なるように配置された、遺伝子、ターミネーター、および構成的プロモーターから構成される（例１１参照）。非パリンドロームパーツ（表９に示す）は、レジスタ上で反転したように見えることがあり、その場合、それらは負の値をとる。例えば、パーツ「１」は遺伝子であり、これは非パリンドロームパーツである。レジスタベクトルの要素に「１」と表示されている場合は、これは左から右（５’から３’）を向いており、レジスタベクトルの要素に「−１」と表示されている場合は、右から左（５’から３’）を向いている。
【０１１１】
パーツのすべての明示的に示されたターミネータ（表９）は一方向性であり、したがって、転写はそれらを逆方向に通過できることに注意することが重要である。しかし、パーツ「３」の一方向性ターミネーターは、パーツの機能を変更することなく、双方向性ターミネーターに置き換えることができる。これは、パーツ「３」のプロモーターの上流に付加的なターミネーターを配置すると、転写のみが終了され、その後に同じ方向に再開されるからである。また、パーツ「７」の一方向性は、下位のレジスタの遺伝子調節プログラムに必ずしも必要ではない。すなわち、下位のレジスタにより実装される遺伝子調節に影響を及ぼすことなく、パーツ「７」（それ自体は一方向性ターミネーター）は、パーツ「４」（それ自体は双方向性ターミネーター）に置き換えることができる。この区別をデータベースユーザーに明確にするために、registerArrayのパーツ「７」のすべての出現を解析し、その一方向性が下位のレジスタの遺伝子調節プログラムにとって重要でない場合には、それを特別な識別子であるパーツ「１５」に置き換えた。したがって、registerArrayのパーツ「７」のすべての出現は、下位のレジスタの遺伝子調節プログラムのための「ターミネーターリードスルー」（一方向性ターミネーターによる逆方向への転写）を必要とするパーツを表す。同様に、収束（対面）プロモーターは互いに破壊的に干渉し得るので（６１）、「プロモーターリードスルー」を必要とするプロモーターを有するパーツについては、特別な区別がなされた（プロモーターを介した逆方向への転写、表９）。パーツ「１０」（それ自体はプロモーター）は、レジスタの内容によってはリードスルーが必要な場合があり、時にはそうでない場合があるため、registerArrayのパーツ「１０」のすべての出現を解析し、下位のレジスタの遺伝子調節プログラムのためにリードスルーを必要としない場合は、それを特別な識別子であるパーツ「１４」に置き換えた。したがって、registerArrayのパーツ「１０」のすべての出現は現在、下位のレジスタの適切な遺伝子調節プログラムのためのプロモーターリードスルーを必要とするパーツを表す。
【０１１２】
registerArrayにおいて遺伝子を有するすべてのパーツはまた、これらの遺伝子の３’末端に双方向性ターミネーターを有する。これらのターミネーターは、表９に明示的に示されていない。データベースはそれ以外では余分なターミネーター、プロモーターおよび遺伝子を避けるために減少されたが、遺伝子の３’末端の暗黙のターミネーターは、時には余分なものになることがある。すなわちこれらは、下位のレジスタの適切な遺伝子調節プログラムのために必要でない可能性がある。
最後に、アレイregister2grpは、registerArrayと同じ数の要素を有する。これは、registerArrayの各レジスタを、grpArrayの対応する遺伝子調節プログラムのインデックスの値にマップする。
我々はデータベースを、MATLAB MATファイル（Additional Database S1）として提示する；ここで、各アレイはMATLAB変数に格納されている。このMATファイルデータベースの検索機能も、MATLAB R2013bで作成され、実行にはMATLABソフトウェアが必要である。MATLAB検索関数のコードおよびその動作についてのさらなる情報は、例１５に含まれている。
【０１１３】
ＰＣＲに基づく状態質問ツール（ＰＳＩＴ）
ＰＳＩＴアルゴリズムは、抽象データ型（クラスDNARegister）を使用してレジスタを表す。入力されたDNARegisterとそのすべての組換え状態を一意的に検出するために用いられるプライマー対の集合を決定するために、アルゴリズムは、（１）入力レジスタを「再組換え」して、入力の任意の配列文字列から生じるすべての状態のDNARegisterのインスタンスを生成し、（２）認識部位と認識部位アレイの末端部との間の各領域に結合するすべての可能なプライマーからなるプライマー対のリストを生成し、（３）それらが隣接領域にある場合、任意の所与の状態においてのみ増幅するプライマー対に、リストを絞り込み、および、（４）ＤＮＡレジスタの各可能な状態を一意的に識別するために使用できるプライマー対のこの最終リストの、すべての部分集合を決定する。プライマー対部分集合のこの最終的なリストは、次に、どのプライマー対がどの状態で増幅するかに関する詳細と共に、出力として戻される。ｑＰＣＲとの互換性のために、ステップ３は、すべてのアンプリコンが短く、すべてのプライマー対は、増幅した場合に常に同じアンプリコンを産生することを保証する（状態にかかわらず）。ＰＳＩＴプログラムは、Python 2.7で実装された。ＰＳＩＴプログラムのコードおよび、それがどのように機能するかについての詳細は、例１６に含まれている。
【０１１４】
例５．ＲＳＭの数学的考察
ＲＳＭを、各入力駆動リコンビナーゼがレジスタ上に１つのattB-attP対のみを有するように設計する場合、状態の数は２Ｎを超えることができない。これを証明するために、まず「縮小不能性（irreducibility）」という概念を導入する。リコンビナーゼの縮小不能な文字列とは、リコンビナーゼが所定の順序でレジスタに適用された場合に、各リコンビナーゼがレジスタ上で操作（切り出しまたは反転）を行うものである。縮小不能な配列について、次の２つのステートメントを作成可能である：
【０１１５】
ステートメント１：レジスタのすべての可能な状態は、リコンビナーゼのいくつかの縮小不能な文字列の適用によってアクセス可能でなければならない。これは、（１）各状態が、組換え操作の文字列の結果であること、および（２）組換え操作の文字列に対応するリコンビナーゼの文字列が、定義により縮小不能であること、を考慮することによる。
ステートメント２：リコンビナーゼあたり１対のattB-attPを有するレジスタを仮定すると、リコンビナーゼの同じ部分集合からのすべての縮小不能な文字列は、レジスタ上で同じ状態を生成する。これは、以下を考慮することによる：（１）レジスタ上のすべての「再編成可能な（rearrangeable）」ＤＮＡセグメントには、適用されるリコンビナーゼの部分集合に属するattBおよび／またはattP部位が両側に隣接している、（２）縮小不能性の定義により、縮小不能な文字列の各リコンビナーゼは、そのattB-attP対の間の組換えを触媒するであろう、および、（３）attBとattP部位との間の組換えが起こると、それらは常に同じ接合部を形成する――attBの後端はattPの前端に結合し、attBの前端はattPの後端に結合する。したがって、すべての「再編成可能な」ＤＮＡセグメントは、これらのリコンビナーゼが適用される順序にかかわらず、リコンビナーゼの縮小不能な文字列が適用された後に、同じ接合部を形成するであろう。
【０１１６】
Ｎ個の入力駆動リコンビナーゼと、レジスタのリコンビナーゼ当たり１対のattB-attPとを仮定すると、すべての状態は、リコンビナーゼのいくつかの縮小不能な文字列によってアクセス可能でなければならず（ステートメント１）、Ｎ個のリコンビナーゼの同じ部分集合からのすべての縮小不能な文字列は、同じ状態を生成しなければならない（ステートメント２）。したがって、リコンビナーゼの部分集合、すなわち２Ｎ、より多い状態は、存在し得ない（この証明のより詳細なバージョンについては、例７を参照）。
より一般的には、この証明を拡張して、レジスタ上のリコンビナーゼあたりｋ対の直交attB-attP対を仮定すると、それがアクセスできる状態の数は２ｋＮを超えられない（例８参照）ことが示される。大セリンリコンビナーゼでは、所与のリコンビナーゼについて、ｋ＝６の直交性および方向性attB-attP対の制限がある（３１）。したがって、大セリンリコンビナーゼを使用するＲＳＭの情報容量は、本質的に指数関数的に拘束される。
【０１１７】
例６：この研究で使用したリコンビナーゼの組換え反応の可逆性の試験――ＢｘｂＩ、ＴＰ９０１、およびＡ１１８．
我々の研究で使用したリコンビナーゼ（ＢｘｂＩ、Ａ１１８およびＴＰ９０１）の可逆性を、attL-attRからattB-attPへの転換（turnover）、およびその逆の転換の量を、１６時間のリコンビナーゼ誘導にわたり測定することにより試験した。具体的には、各リコンビナーゼを試験するために、互いに組換えバージョンである２つのプラスミド：attB-attPを有しＧＦＰ発現なしのものと、attL-attRとＧＦＰ発現を有するものとを使用した。これらのプラスミドはそれぞれ、誘導性リコンビナーゼを用いて大腸菌に形質転換した（図Ｓ１Ａ）。attB-attPからattL-attRへの転換は、誘導後に、ＧＦＰを発現しないことからＧＦＰを発現することへと変わった細胞の数によって評価し、逆に、attL-attRからattB-attPへの転換は、誘導後に、ＧＦＰを発現することからＧＦＰを発現しないことへと変わった細胞の数によって評価した。結果を図１Ｂに示す。すべてのリコンビナーゼについて、attB-attPからattL-attRへの＞９５％の変換（conversion）を観察したが、ＴＰ９０１とＡ１１８についてはattL-attRからattB-attPへの変換は観察されず、ＢｘｂＩについては＜１％であった。このデータは、我々の研究で用いたリコンビナーゼシステムの非可逆性を裏付けている。
【０１１８】
例７．Ｎ個のリコンビナーゼを用いて、リコンビナーゼ当たり１対の認識部位に限定される場合、リコンビナーゼベースのステートマシンで最大２Ｎの異なるＤＮＡ状態しか生成できないことの証明。
定理：Ｎ個のリコンビナーゼおよびリコンビナーゼ当たり１対のみの認識部位を有する場合、レジスタ上に任意の初期ＤＮＡ文字列（配列）を与えると、異なるリコンビナーゼ文字列を適用することにより、最大２Ｎの異なるＤＮＡ文字列をそのレジスタ上に生成することができる。
この定理を証明する前に、リコンビナーゼシステムの仮定について明確にする。
仮定１：発生する組換え反応は、一方向性であると仮定する。これは、一旦リコンビナーゼが適用されると、再指向性因子を用いて再度適用することはできず、Ｎの集合の別のリコンビナーゼを用いてその組換え反応を逆転させることもできないことを意味する。
【０１１９】
仮定２：すべての認識部位は極性であり（後端と前端を有する）、２つの認識部位間の組換えは、１つの認識部位の後端を、もう１つの認識部位の前端にペーストする（５’から３’へ）こと（およびその逆）により生じる、と仮定する。この仮定は、大セリンリコンビナーゼシステムにおけるattB-attP組換えと整合する。
仮定３：ＤＮＡがレジスタから切り出されるとそれは失われ、もはやレジスタと相互作用しないと仮定する。
仮定４：リコンビナーゼは特異的であると仮定する。すなわちそれらは、それらの同族認識部位間での組換えを引き起こすことのみができる。
【０１２０】
仮定１および２は、この定理を大セリンリコンビナーゼベースのシステムに適用することを可能にする。
仮定３は、切り出されたＤＮＡは複製されず、したがって複数回の細胞分裂後に失われる、という事実によって動機づけられる。この仮定は、次の状況を排除する：切り出されたＤＮＡ断片が複製起点を含む状況、または、切り出された断片が細胞分裂のために失われる前にレジスタに再組込みされる機会を有するように、十分迅速に連続してリコンビナーゼが適用される状況。
【０１２１】
定理の証明：リコンビナーゼの１対の認識部位内で、１つの認識部位が他方の部位と組換え可能であると仮定する。例えば、大セリンリコンビナーゼを使用する場合、これは、各認識部位対がattB部位およびattP部位から構成されることを意味する。我々はまた、レジスタ上の初期ＤＮＡ文字列が、各リコンビナーゼの認識部位対を有すると仮定する（合計で２Ｎの認識部位）。これらの仮定は、我々の定理の一般性に影響を与えない。何故ならば、より少ない任意の数の活性な（組換え可能な）認識部位は、レジスタ上に生成することができる異なるＤＮＡ文字列の数をさらに制限するだけであるからである。
【０１２２】
。
レジスタ上の初期ＤＮＡ文字列を、２Ｎ＋１個の異なる記号の文字列（ＤＮＡ配列を表す）として表し、ここで各記号接合部は、以下のようにリコンビナーゼ認識部位を表す：
【数６】
2018534921.tif 000008
レジスタの開始と終了は、初期文字列の最初と最後の記号（太字で強調表示）で規定し、ここではAとIである。
【０１２３】
ここでの記号はアルファベット文字である。それらが表すＤＮＡ配列は、すべて一意的であり、（それらの逆相補体（reverse complement）に関して）対称ではないと仮定する。この仮定は、初期ＤＮＡ文字列から生成することができる、レジスタ上の異なるＤＮＡ文字列の数を増加させるだけであり、したがって定理の一般性には影響しない。
認識部位の種類（どのリコンビナーゼに属するかを示す）と極性を追跡し続けることを視覚的に支援するために、ＤＮＡ文字列の記号を、非対称括弧で挟み込んで、記号接合部内に含まれる認識部位の、種類（括弧の形）と極性（括弧の方向）を表す。
【数７】
2018534921.tif 000009
【０１２４】
括弧は、実際のＤＮＡ文字列の一部ではなく、単に視覚的なマーカーであることに注意されたい。例えば、BとCの間の［、およびFとGの間の］は、これら２つの接合部（BCとFG）が、同じリコンビナーゼに属して反対の極性を有する認識部位であることのみを知らせる。
与えられた認識部位のリコンビナーゼは、「r」の後にその認識部位の括弧の種類を記述することによって、参照される。したがって例えば、r[は、[の括弧で表される認識部位を組み換えるリコンビナーゼである。
ＤＮＡ文字列がリコンビナーゼのいかなる認識部位も含まない場合、そのリコンビナーゼが適用されても、ＤＮＡ文字列は変化しない。
【０１２５】
ＤＮＡ文字列があるリコンビナーゼについて１つのみの認識部位を含む場合、そのリコンビナーゼが適用されても、ＤＮＡ文字列は変化しない。
ＤＮＡ文字列があるリコンビナーゼについて両方の認識部位を含む場合、そのリコンビナーゼが適用されると、各認識部位をそれらの２つの記号間の接合部で切断し、１つの認識部位の後端上の記号を他方の前端の記号にペーストし（５’から３’へ）、その逆も同様である。これは、２つの認識部位が反対方向を向いている場合、それらの間のＤＮＡ文字列は、それらが組み換えられると反転することを意味する。そして、２つの認識部位が同じ方向を向いている場合、それらの間のＤＮＡ文字列は、それらが組み換えられると切り出される。
【０１２６】
たとえば、r[を、次のＤＮＡ文字列を有するレジスタに適用すると：
【数８】
2018534921.tif 000010
認識部位の間のＤＮＡは反転されて、文字列：
【数９】
2018534921.tif 000011
を生成し、ここで、B*は、反転を示す（逆相補体）。
別の例として、r[を、次のＤＮＡ文字列を有するレジスタに適用すると：
【数１０】
2018534921.tif 000012
認識部位の間のＤＮＡは環状化し（Bの右端がBの左端にペーストされる）、レジスタから切り出されて、文字列：
【数１１】
2018534921.tif 000013
が残される。
【０１２７】
組換え反応は一方向性であるため、形成された新しい記号接合部は、もはや活性な（組換え可能な）認識部位を表さない（したがって、それらは括弧で視覚的にマークされない）。
リコンビナーゼ文字列は、リコンビナーゼの順序付けられたリストであり、各リコンビナーゼは最大で１回出現する。我々は任意のリコンビナーゼ文字列を適用することができ、例えば（左から右へ読む）：
【数１２】
2018534921.tif 000014
【０１２８】
次の初期ＤＮＡ文字列を、レジスタに適用すると：
【数１３】
2018534921.tif 000015
このリコンビナーゼ文字列は、逐次的なＤＮＡ文字列をレジスタ上に生成する：
【数１４】
2018534921.tif 000016
ここで重要な定義を導入する：リコンビナーゼ文字列が与えられた場合、その文字列中のすべてのリコンビナーゼが、適用されるとレジスタ上で組換え事象（ＤＮＡ部分文字列の切り出しまたは反転のいずれか）を行う場合、「縮小不能」と呼ぶ。したがって、上の例において、r(r[r＜は縮小不能である。一方、例えばリコンビナーゼ文字列r(r＜r{は縮小不能ではなく、なぜならば、r{は適用されても、レジスタに何もしないからである。
【０１２９】
定理を証明するための重要な観察は以下である：
一意性の補助定理：全Ｎ個のリコンビナーゼを含むすべての縮小不能な文字列は、レジスタ上で同じ結果をもたらす。
一意性の補助定理の証明：Sを、長さがＮのリコンビナーゼ文字列とし、Sを縮小不能であるとする。次に、S中のリコンビナーゼを初期ＤＮＡ文字列Yに適用すると、文字列S中の、現在適用されている以外の任意のリコンビナーゼに属する活性な認識部位が削除されることはない。なぜならば、r{を適用した場合にr[認識部位が削除されると仮定する。ここでr[とr{は、S中の任意の２つのリコンビナーゼである。すると、以下の結論を得ることができる：第一に、r[は未だ適用されていない（もし適用されていたら、r[認識部位を組換えしたはずである）；および第２に、もはやr[を適用する意味はない――最大でも１つまでのr[認識部位だけがＤＮＡ文字列に残っているため、何の効果もない。しかしこれは、縮小不能な現在の文字列の任意の連続はr[を削除しなければならず、したがってＮよりも長さが短いことを意味し、これは不可能である。
【０１３０】
したがって、S中のすべてのリコンビナーゼは、適用された場合に２つの事柄のうちの１つを行わなければならない：２つの適切な認識部位の間で部分文字列を反転するか（逆相補体）、または、「良性削除」を実施する、すなわち、２つの適切な認識部位の間の部分文字列を、Sからのリコンビナーゼに属する認識部位の他の任意の活性対に何ら影響を及ぼすことなく、切り出す。
【０１３１】
今ここで、AとBの２つの記号を与えた場合、AとBが次の性質を満たすならば、AをBの「左のソウルメイト（soulmate）」と呼ぶ：長さＮのいくつかの縮小不能文字列をYに適用した後に、レジスタ上または切り出されたＤＮＡ文字列上に、Aが生じ、直後にBが生じなければならない（またはB＊が生じ、直後にA＊が生じなければならない）。一般に、もしAがBの左のソウルメイトであるか、またはBがAの左のソウルメイトであるならば、AとBをソウルメイトと呼ぶであろう。また、Cの記号を与えた場合、長さＮのいくつかの縮小不能文字列をYに適用した後に、切り出されたＤＮＡ文字列上にCがそれ自体で生じれば、Cを「特異的ソウルメイト」と呼ぶ。
【０１３２】
ソウルメイトクレーム：[Aと]Bの両方がYに生じる場合、A＊はBの左のソウルメイトである；A[とB]の両方がYに生じる場合、AはB＊の左のソウルメイトである； A]と]Bの両方がYに生じる場合、AはBの左のソウルメイトである；]AとB]の両方がYに生じる場合、BはAの左のソウルメイトである。]A]がYに生じる場合、Aは特異的ソウルメイトである。
クレームの証明:長さＮの縮小不能なリコンビナーゼ文字列をYに適用すると、結局r[を適用しなければならない。そして、リコンビナーゼ文字列は縮小不能であるので、r[認識部位はそれが起こったときに、まだ存在していなければならない。組換えは、１つの認識部位の後端の記号を他方の認識部位の前端の記号（およびその逆）に隣接させる（５’から３’）という事実により、組換えが起こるときに以下が保証される：[Aと]Bの両方がYに生じる場合、A＊B（またはB＊A）接合部が形成される；A[とB]の両方がYに生じる場合、AB＊（またはBA＊）接合部が形成される； A]と]Bの両方がYに生じる場合、AB（またはB＊A＊）接合部が形成される；]AとB]の両方がYに生じる場合、BA（またはA＊B＊）接合部が形成される；および、]A]がYに生じる場合、Aの右側とAの左側との間に接合部が形成される。記載されているようにこれらの記号が一旦一緒になると、他の活性な認識部位はそれらの間には存在しない（または将来にわたり存在しないであろう）ため、これらを分離するようなことは起こり得ない。これにより、クレームが完了する。
【０１３３】
ソウルメイトクレームの規則により、初期ＤＮＡ文字列内の記号が、長さＮの縮小不能なリコンビナーゼ文字列（これが存在する場合）を適用した後に、どのように相互接続するかを理解することができる。
【０１３４】
例えば、長さＮの少なくとも１つの縮小不能なリコンビナーゼ文字列が存在する、初期ＤＮＡ文字列Y：
【数１５】
2018534921.tif 000017
であって、Ｎ個の認識部位と２Ｎ＋１個の記号を有するものが与えられると、以下のように「ソウルメイトグラフ」を構築することができる。グラフは、各記号（ここではA、B、C、D、E、F、およびG）の左側と右側に対応する、４Ｎ＋２個の頂点を有する。各記号の左側と右側を端部により連結する。また、各記号の左からその左のソウルメイトの右へ（ソウルメイトクレームの規則に従って）端部を描き、ここで反転は、左と右を切り替えることに留意しておく（例えば、Aの左とA＊の右は同じである）。
【０１３５】
説明のために、上記のYを使用すると、ソウルメイトグラフは次の単純なパスで構成される：
【数１６】
2018534921.tif 000018
グラフを読み取ると、３つのリコンビナーゼの任意の縮小不能な文字列がYに適用された後、結果は次のようになるはずである：
【数１７】
2018534921.tif 000019
実際この予測は、（この場合は）一意的な縮小不能文字列r{r(r[によって生じさせられる。
【０１３６】
別の例を挙げると、もしも、
【数１８】
2018534921.tif 000020
である場合、ソウルメイトグラフは、パス：
【数１９】
2018534921.tif 000021
およびサイクル：
【数２０】
2018534921.tif 000022
によって構成される。サイクルは環状化してレジスタから切り出され、レジスタにAC*Eのみを残すＤＮＡを表す。確かにこれは、r[r(文字列またはr(r[文字列のいずれかを適用するときに生じるものである。
【０１３７】
一意性の補助定理の証明を完成させるために：ソウルメイトクレームの規則は常に、初期ＤＮＡ文字列の端部の各記号に対して１つのソウルメイトを見出すことに注意すべきである。各端部記号は、その位置によって１つの接合部を形成するのみであり、したがって、初期ＤＮＡ文字列に長さＮの縮小不能文字列を適用した後、各端部記号は、そのソウルメイトとの接合部を形成するのみである。また、ソウルメイトクレームの規則は常に、ＤＮＡ文字列の端に存在せずそれ自身で環状化しない各記号（例えば、]A]）に対して、２つのソウルメイトを見出す。どの記号も２つより多くの接合部を持つことができないため（両側に１つずつ）、これらの記号は、初期ＤＮＡ文字列に長さＮの縮小不能文字列を適用した後、それらのソウルメイトとの接合部を形成するのみである。続いて、Ｎ個のリコンビナーゼの縮小不能文字列を適用した後の、レジスタ上の最終ＤＮＡ文字列（初期ＤＮＡ文字列の端部記号とその間に残されたすべての記号から作られる）は、ソウルメイトクレームの規則によって完全に決定され、これはＮ個のリコンビナーゼの順序付けに依存しない。これにより、一意性の補助定理の証明が完了する。
【０１３８】
一意性の補助定理は、次の系（corollary）を意味する。
系：ｋ個のリコンビナーゼのすべての部分集合に対して、全ｋ個のこれらのリコンビナーゼが関与するすべての縮小不能文字列は、レジスタ上の同一のＤＮＡ文字列をもたらす。
系の証明：その結合部がｋ個の関連するリコンビナーゼのいずれかに対する認識部位ではない記号のすべての対を連結することによって、元の文字列から得られる、２ｋ＋１個の記号の短いＤＮＡ文字列を考えることができる。例えば、もしr(とr[のみを考えると、
【数２１】
2018534921.tif 000023
は、
【数２２】
2018534921.tif 000024
となり、ここでCDEとGHIはそれぞれ１つの記号となる。次に、より短いＤＮＡ文字列に一意性の補助定理を適用する。これにより、系の証明が完了する。
【０１３９】
しかし系は、以下を意味する：Xが、いくつかのリコンビナーゼ文字列を初期ＤＮＡ文字列Yに適用することによって得られるレジスタ上の任意のＤＮＡ文字列である場合、縮小不能文字列においてYに適用されるべきリコンビナーゼの集合Zを列挙するだけで、Ｎビットのみを使用してXを特定することができる。なぜならば、明らかに、XはYから、いくつかの縮小不能文字列によって得ることができるからである。そして決定的には、集合Z内のリコンビナーゼを適用する順序を列挙する必要はない。なぜなら、系によって、この順序は最終結果とは無関係だからである。これにより、定理の証明が完了する。
したがって、最大２Ｎ個の異なるＤＮＡ文字列を、レジスタ上に生成することができる。ＱＥＤ。
リコンビナーゼ当たり１つの認識部位対という制約なしの、ＲＳＭの上限についてのより一般的な分析については、例８を参照のこと。
【０１４０】
例８：ＲＳＭの上限に関する分析
リコンビナーゼあたりｋ対以下の直交認識部位を使用するＲＳＭを考えると、以下の観察および証明により、２ｋＮより多くの状態は達成できない：
観察：Ｎ個のリコンビナーゼと、しかしリコンビナーゼあたりｋ対の直交認識部位のみが許容されるとする（大セリンリコンビナーゼの場合、ｋ＝６）。次に、初期ＤＮＡ文字列Yがレジスタ上にある場合、異なるリコンビナーゼ文字列を適用することによって、そのレジスタ上に最大２ｋＮの異なる文字列を生成することができる。この観察には、リコンビナーゼシステムに関して例７の定理と同じ仮定を用いる。
観察の証明：確かに、レジスタ上に生成できるＤＮＡ文字列の数は、この場合、自分自身にさらなる自由度（――すなわち、ＤＮＡ文字列中に生じる異なるｋＮ対の認識部位のすべてを、あたかもそれぞれが異なるリコンビナーゼに属しているかのように処理するための）を許容すれば生成することができる数よりも少ない。しかし例７で既に、この場合にレジスタ上で生成できる異なる文字列の数は、２ｋＮが上限であることが証明されている。ＱＥＤ。
【０１４１】
例９．Ｎ個の入力の配列文字列の数の導出。
全部でＮ個の入力が自由である場合、ｈ個の入力の任意の部分集合を取ることができる。与えられたｈに対して、Ｎ個からｈ個を選ぶ数のかかる部分集合があり、各部分集合についてはｈ！個の順列があり、したがって、
【数２３】
2018534921.tif 000025
個の、長さｈの配列文字列が存在する。
【０１４２】
次に、任意の長さｈの部分文字列をＮ個まで取ることができるので、これにより、配列文字列の以下の総数が与えられる：
【数２４】
2018534921.tif 000026
この式の総和項は、自然指数関数ｅで近似することができる。したがって、Ｎ個の入力の配列文字列の総数の式は、ｅＮ！で近似することができる。
【０１４３】
例１０．Ｎ＝７個までの入力のすべての配列文字列に対して、異なる状態をコードするＲＳＭを実装する。
単一のリコンビナーゼの発現をそれぞれが駆動するＮ個の入力を有するＲＳＭが与えられた場合に、Ｎ＝７個までの入力のすべての配列文字列に対して異なる状態をコードするレジスタを設計した（表Ｓ２）。最初の２つのレジスタ（Ｎ＝１およびＮ＝２の場合）は、自明に設計される。Ｎ＞２の場合、モジュラー構築戦略を使用した。
【０１４４】
モジュラー構築戦略：
まず、以下のように配置した異なるリコンビナーゼについて、２つのattB-attP対から構成される認識部位アレイである、「単位モジュール」を定義する：
【数２５】
2018534921.tif 000027
ここで、異なる形状の括弧は異なるリコンビナーゼの認識部位を表す。各括弧の方向は、認識部位の極性を表す。
「(」認識部位は単位モジュールの１位を占め、「[」認識部位は２位を占めると言う。
【０１４５】
単位モジュールは、２位の認識部位を有するリコンビナーゼが適用されたかどうかに関してコードし（別個の状態に入り）、そして、１位の認識部位を有するリコンビナーゼが適用されたかどうかを考慮して、どちらのコンビナーゼが最初に適用されたかをコードする。
その後、Ｎ個の入力のすべての可能な配列文字列（それぞれがリコンビナーゼの発現を駆動する）をコードするレジスタを、リコンビナーゼの各対のすべての組合せについての単位モジュールを連結して以下の２つの規則を守ることにより、作成することができる：
１．すべての単位モジュールは直交でなければならない。
２．各リコンビナーゼについての少なくとも１つの認識部位対は、単位モジュールの２位に現れなければならない。
【０１４６】
この構築戦略は、すべてのリコンビナーゼが単位モジュール内のＮ−１個の他のリコンビナーゼと対になり、かつ各単位モジュールが直交することを必要とするため、戦略は、リコンビナーゼ当たりＮ−１個の直交認識部位対を必要とする。しかし、我々は、大セリンリコンビナーゼ当たり６対までの直交attB-attP対しか作成することができないため、この構築戦略は、最大Ｎ＝７個の入力のすべての配列文字列に対して異なる状態をコードするレジスタのみを可能にする。Ｎ＝７を超えた場合には、約３．９Ｎの状態にアクセスできる異なるレジスタ設計戦略を採用する（例１３）。
【０１４７】
例１１．ＧＲＳＭデータベースを構築するために用いたパーツの考察。
データベース内のパーツは、構成的プロモーター、ターミネーター、および遺伝子から構成される。すべての遺伝子は、それらの３’末端に双方向性ターミネーターを有すると仮定される。表９は、すべてのパーツとそれらを参照するために使用するパーツＩＤ（整数）を示す。非パリンドロームパーツ（表９に示す）は反転して見えることがあり、その場合、パーツＩＤは対応する負の値をとる。例えば、遺伝子のみから構成されるパーツは、表９に示すようにそれがレジスタ上で左から右（５’から３’）を向いている場合には、パーツ「１」と言及し、それがレジスタ上で右から左（５’から３’）を向いている場合には、パーツ「−１」と言及する。以下では、データベースを構築するために使用したパーツが、すべての可能な機能的に異なるパーツの集合であることを示す。
【０１４８】
各パーツは、レジスタの領域に配置されると、次の４つの作業の組み合わせを実行する：
１．構成的に転写された遺伝子を提供すること（自蔵プロモーター遺伝子モジュール、例えばパーツ「１９」を使用）
２．転写のための遺伝子を、左側の領域（例えば、パーツ「１」）、右側の領域（例えば、パーツ「−１」）、または左側の領域と右側の領域の両方（例えば、パーツ「８」）から、提供すること。
３．転写が、左に移動すること（例えば、パーツ「−７」）、右に移動すること（例えば、パーツ「７」）、または左右両方に移動すること（例えば、パーツ「４」）を、防止すること。
４．転写を、左へ（例えば、パーツ「−１０」）、右へ（例えば、パーツ「１０」）、または左右両方（例えば、パーツ「６」）へ、開始すること。
【０１４９】
パーツの機能を、それが実行するこれら４つの作業の組み合わせにより定義する。例えば、パーツ「２」の機能は、転写のための遺伝子を左から提供し、転写が左に移動するのを防止し（遺伝子は３’双方向性ターミネーターを有することを想起せよ）、および、転写を右へ開始することである。より複雑な例では、パーツ「２４」の機能は、遺伝子を構成的に転写し、転写のための遺伝子を左右両方から提供し、転写が左に移動するのを防止し、転写を右へ開始することである。表１０は、データベースを構築するために使用した全３７のパーツ（非パリンドロームパーツの反転を含む）の機能を示す（これには、「１４」、「−１４」、「１５」、「−１５」は含まれない。「材料および方法」の「ＧＲＳＭデータベースおよび検索機能」サブセクションを参照）。表１０から、すべてのパーツが機能的に異なることが分かる。
【０１５０】
これらのパーツがすべての可能な機能も含んでいることを示すために、まず、機能を定義する４つの作業が互いに排他的ではないことに注意されたい。例えば、パーツは、左への転写を開始することはできず、転写が左に移動することを防止できない。別の例として、左への転写を開始せず、右から転写のための遺伝子を提供するパーツは、転写が左に移動することを必然的に阻止しなければならない（再度、遺伝子はその３’末端の双方向性ターミネーターと対になるため）。４つの作業の相互依存性を、２つの規則に要約することができる：（規則＃１）パーツは、転写を同じ方向に開始することも、転写が同じ方向に移動するのを防止することもできない、および（規則＃２）遺伝子（構成的であってもなくても）を提供せず、特定の方向への転写を開始しないパーツは必然的に、転写がその特定の方向に移動するのを防止しなければならない。
【０１５１】
したがって可能な異なる機能の数を見つけるために、作業の組み合わせの合計数を見つけることから始める。これを行うには、作業がないことを含め、作業＃１には２つの可能性、作業＃２には４つの可能性、作業＃３には４つの可能性、および作業＃４には４つの可能性があることを考慮すると、作業の組み合わせの合計数は、２＊４＊４＊４＝１２８となる。
【０１５２】
上記の規則＃１を適用して、５６の許可されていない作業の組み合わせを削除する。上記の規則＃２を適用して、残りのプールから３５の許可されていない作業の組み合わせを削除する。これにより、３７の可能な異なる機能（作業の組み合わせ）が残され、これは、データベースを構築するために使用した機能的に異なるパーツの数と同じである。したがって、我々がデータベースを構築するために使用したパーツは、構成的プロモーター、ターミネーター、および遺伝子（双方向性３’ターミネーターを有する）から構築することができるすべての可能な機能的に異なるパーツを表す。
【０１５３】
実施例１２：調節される遺伝子の数ｒの関数としての、可能な５状態遺伝子調節プログラムの数。
初めに、５つの状態が存在し、それらの状態の各々において任意の特定の遺伝子が発現され得るかまたは発現され得ないと考える。したがって、合計で、１つの遺伝子についてＺ＝２５＝３２の異なる調節プログラムが存在する。次に、遺伝子調節プログラムにｒ個の遺伝子があると考える。各遺伝子は、Ｚ＝３２の単一遺伝子調節プログラムのいずれかを有することができる。したがって、ｒ個の遺伝子についての可能な遺伝子調節プログラムの数、Ｇ（ｒ）の計算は、Ｚ個の可能な調節プログラムのｒ個の組み合わせを選択することに単純化される（反復あり、なぜならば複数の遺伝子が同じ調節プログラムを有することができるため）。
【数２６】
2018534921.tif 000028
この関数は指数関数的に増加する。
【０１５４】
１つの遺伝子に対してＺ＝３２の異なる調節プログラムが存在するにもかかわらず、それらの１つは、いかなる状態においても遺伝子が発現されないプログラムであり、もう１つは、すべての状態で遺伝子が発現されるプログラムである。これらの調節プログラムは自明であるため、ＧＲＳＭデータベースでは考慮しない。したがって、図１４Ｂのデータの計算には、Ｚ＝３０を使用した。
【０１５５】
例１３．Ｎ個の入力に対して約３．９Ｎの状態を達成できるＲＳＭを実装する。
レジスタに置かれた場合に、ＲＳＭがＮ個の入力のすべての配列文字列について異なる状態にアクセスすることを可能にする認識部位の配列を、「Ｎ−置換可能部分配列」と定義する。表Ｓ２では、Ｎ＝７までのＮ−置換可能部分配列を示す。例１０では、我々の設計戦略が、Ｎ＝７を超えるＮ−置換可能部分配列を許可しないことを説明する。
【０１５６】
しかしながら、Ｎ＞７の入力が与えられた場合、入力を、可能な限り多くの相互に排他的な７つの集合（floor(N/7)）に分割することができる。次に、相互に排他的な集合のそれぞれに対して７−置換可能部分配列を作成し、それらを一緒に１つのレジスタに連結することができる。最後に、相互に排他的な７つの集合のいずれにも収まらない残りの入力（Ｎ ｍｏｄ ７）を取り、この集合に対して（Ｎ ｍｏｄ ７）−置換可能部分配列を作製し、それをレジスタ上の残りの部分配列に連結することができる。たとえば、２つの７−置換可能部分配列と１つの３−置換可能部分配列を有する、Ｎ＝１７個の入力のためのレジスタを構築することできる。
例９で得られたように、Ｎ個の入力の配列文字列の数であるm(N)の正確な式は、以下である：
【数２７】
2018534921.tif 000029
【０１５７】
上記のＮ＝１７個の入力例では、レジスタは理論上、m(7)・m(7)・m(3)〜３・１０９個の異なる状態にアクセス可能である。一般に、上述のＮ＞７についての構築戦略は、以下の状態数：f(N)を可能にする。
【数２８】
2018534921.tif 000030
この関数を、次のように近似する：
【数２９】
2018534921.tif 000031
【０１５８】
例１４．データベース
ＧＲＳＭデータベースを含むＭＡＴファイル。ＭＡＴファイルにおいて、３つのデータベースアレイはそれぞれ、別々のMATLAB変数：registerArray、grpArray、およびregister2grpとして格納される。registerArrayは、各行がレジスタであるマトリックスであり、grpArrayは、各列が遺伝子調節プログラムであるマトリックスである。これらのアレイの詳細な説明、およびレジスタと遺伝子調節プログラムがその中でどのように表されているかについては、「材料および方法」の「ＧＲＳＭデータベースおよび検索機能」サブセクションを参照。アレイregister2grpは、registerArrayの各レジスタを、grpArrayの対応する遺伝子調節プログラムのインデックスにマップし、その結果、registerArrayの行ｉのレジスタは、grpArrayの列register2grp(i)の遺伝子調節プログラムに対応する；すなわち、grpArray(:,register2grp(i)）。我々は、例１５のＧＲＳＭデータベースにアクセスするための検索機能を提供する。
【０１５９】
例１５．ＧＲＳＭデータベース検索機能の使用説明。
検索機能はMATLAB R2013bで記述されており、MATLABソフトウェアを実行する必要がある。
説明．この機能は、所望の遺伝子調節プログラムを取り、その遺伝子調節プログラムを実装するレジスタについて、Additional Database S1に含まれるＧＲＳＭデータベースを検索し、それらのレジスタを出力する。
【０１６０】
機能の使用説明。
１．下記の「searchGRSM」スクリプトをテキストファイルにコピーし、「searchGRSM.m」として保存する。
２．下記の「registerRank」スクリプトをテキストファイルにコピーし、「registerRank.m」として「searchGRSM.m」と同じディレクトリに保存する。
３．ＭＡＴファイル（Additional Database S1）をダウンロードする。ファイル名が「grsmDB.mat」であることを確認する。そうでなければ、この名前を「grsmDB.mat」に変更する。次に、これを上記のファイルと同じディレクトリに移動する。
４．MATLABを開き、作業ディレクトリを上記のファイルのディレクトリに移動する。
５．MATLABコマンドに「registers=searchGRSM(grp)」と入力して、関数を使用する；ここで、grpは目的の遺伝子調節プログラムであり、registersは出力が格納される変数である。
【０１６１】
入力の作成方法
grp（遺伝子調節プログラム）を、５ｘＭのマトリクスとして指定する。各行（行１から行５）は、図３Ａに対応する状態Ｓ１からＳ５（それぞれ）を表す。各列は遺伝子を表す。Ｍ＝１４までの遺伝子を任意に指定することができる。マトリクスの各要素は、その状態においてその遺伝子をＯＦＦ（０）またはＯＮ（１）に指定したいかどうかに応じて、「０」または「１」でなければならない。
【０１６２】
出力の解釈
出力registersは、Ｎｘ７のマトリクスである。マトリクスの各行は、grpを実装するために使用できるレジスタを表す。レジスタの各列（列１〜列７）は、図３Ａに対応するＤＮＡ領域「ａ」〜「ｇ」を（それぞれ）表す。
マトリックスの各要素は、そのＤＮＡ領域内のそのレジスタのパーツを指定する。
パーツは、表Ｓ９で定義されているように、数字「１」から「２５」（一部はマイナス表示）である。パーツのより詳細な説明は、「材料および方法」の「ＧＲＳＭデータベースおよび検索機能」のサブセクション、および補足テキストＳ６に見出される。
【０１６３】
出力レジスタは、次の４つのステップで順序付けられる（ランク付けされる）。
１．プロモーターリードスルーを必要とするパーツの数（最小から最大まで）によるランク付け
２．ターミネーターリードスルーを必要とするパーツの数（最小から最大まで）による下位ランク付け
３．空のパーツ（パーツ「５」）の数（最大から最小まで）による下位ランク付け
４．プロモーターの数（最小から最大まで）による下位ランク付け
【０１６４】
例：
【数３０】
2018534921.tif 000032
【０１６５】
さらに多くの例について、表Ｓ８は、この研究での２入力５状態ＧＲＳＭの実装に使用する検索機能への入力とそれからの出力を示す。「searchGRSM」および「registerRank」スクリプトは、以下のとおりである。
【０１６６】
searchGRSMスクリプト：
【数３１】
2018534921.tif 000033
【０１６７】
registerRankスクリプト：
【数３２】
2018534921.tif 000034
【０１６８】
例１６．ＰＳＩＴの使用説明。
ＰＳＩＴはPython 2.7で書かれたプログラムである。
説明。ＳＩＴは、入力されたＤＮＡレジスタの各状態を一意的に識別するプライマー対のすべての可能な集合を返し、また、これらの状態に関する情報も返す。これを行うためには、DNARegisterクラスのoutputFiles関数を呼び出さねばならない。outputFilesは、パラメータname、返されるファイルに関連する名前の文字列、およびパラメータelucidatePP、ユーザーが出力されたプライマー対集合を必要とするかどうかを示すブール値、または単に状態に関する情報をとる。
【０１６９】
使用説明
最初にユーザーは、DNARegisterクラスのインスタンスを、４要素アレイのnumpyアレイを渡すことにより構築しなければならない；ここで各４要素アレイは、リコンビナーゼ認識部位に関する情報を提供する。riをかかる４要素アレイのうちの１つとすると、ri = [ai, bi, ci, di]であって、ここで：
・aiは、その部位のリコンビナーゼ同族体に対応する。
○１≦ai≦Ｎ、ここでＮは、リコンビナーゼ／入力の数である。
・biは、この特定の認識部位がどの認識部位の直交対に対応するかに関する情報を提供する。
○０≦bi≦ｍ−１、ここでｍは、aiによって供給されるリコンビナーゼの直交部位の数である。bi≠bkの場合、ｉ番目とｋ番目の部位は認識部位の異なる対に属し、したがって直交である。
・ciは、認識部位がattP、attB、attLまたはattRのどれであるかを示す。
○ci＝０→attP
○ci＝１→attB
○ci＝２→attL
○ci＝３→attR
・diは、認識部位の極性を提供する。
○di＝１→「順」
○di＝−１→「逆」
【０１７０】
したがって、６つの認識部位を有するDNARegisterを構築するために、ユーザーは次の形式を使用し、ここで上記のように、ri = [ai, bi, ci, di]である。
【数３３】
2018534921.tif 000035
以下では、DNARegister構築のためのテストケースと、続いて、入力されたＤＮＡレジスタの各状態を一意的に識別するプライマー対の集合を解明するための、outputFiles関数の使用について提供する。このテストケースでは、図３Ａの２入力５状態レジスタを使用する。
【数３４】
2018534921.tif 000036
【０１７１】
ＰＳＩＴを使用するには、単に以下のスクリプトをコピーして、実行可能なPythonプログラム（拡張子.py）として保存しなければならない。numpyもインストールしなければならない。Pythonおよびnumpyのパッケージは、オープンソースライセンスのもとで自由に利用可能である。
ＰＳＩＴを.pyファイルとして保存したら、付属の例のように、自身の使用例をファイルの最後に追加することができる（下のスクリプトの一番下を参照）。次に、スクリプトをプログラムエディタまたはターミナルから直接実行することができる。出力されたファイルは、スクリプトと同じディレクトリに保存される。
【０１７２】
出力の解釈
outputFilesを次のように呼び出すと：DNARegister.outputFiles(‘name’, False)、１つのファイルが出力される：name_info.csv。
outputFilesを次のように呼び出すと：DNARegister.outputFiles(‘name’ True)：３つのファイルが出力される：name_info.csv, name_matrix.csv, name_primers.csv。
「_info.csv」ファイルは、初期DNARegisterへの適切な入力のすべての配列文字列から生じるすべての一意的ＤＮＡ状態に関する情報を提供する。具体的には、リコンビナーゼ認識部位間の領域には、整数値が割り当てられる。レジスタの開始領域（最初の認識部位の前）には、整数「０」が割り当てられ、他のすべての領域の極性はその領域に相対的に指定され、正の整数は「順」極性を示し、負の整数は「逆」極性を示す。ＤＮＡ状態には、ラベルs0、s1、．．．が割り当てられ、与えられた状態をもたらす入力の配列文字列も示される。
【０１７３】
「_primers.csv」ファイルは、所定のDNARegisterの各状態を一意的に識別するために使用することができるプライマー対を提供する。ｑＰＣＲに対する有効なプライマー対部分集合は、所与の行の各列から任意の１つのプライマー対を選択することによって、見出すことができる。プライマーは、それらが結合するＤＮＡ領域（「_info.csv」から）に対応する整数値によって表される。正の整数は順方向の結合に対応し、負の整数は逆方向の結合に対応する。
「_matrix.csv」は、どのプライマー対がどの状態を増幅するかを示すプライマー対の各部分集合のマトリックスを与える（「_primers.csv」に表示されるプライマー対部分集合と同じ順序）。マトリックスの各列は、状態（「_info.csv」ファイルからのs0、s1、．．．）を表す。各行はプライマー対を表し、第１行は「_primers.csv」ファイルの第１列から選択されるプライマー対に対応し、第２行は「_primers.csv」ファイルの第２列から選択されるプライマー対に対応し、等々である。マトリックスの各入力は、プライマー対が状態を増幅しない「０」か、またはプライマー対が状態を増幅する「１」のいずれかである。
【０１７４】
ＰＳＩＴスクリプト
【数３５−１】
2018534921.tif 000037
【０１７５】
【数３５−２】
2018534921.tif 000038
【０１７６】
【数３５−３】
2018534921.tif 000039
【０１７７】
【数３５−４】
2018534921.tif 000040
【０１７８】
【数３５−５】
2018534921.tif 000041
【０１７９】
【数３５−６】
2018534921.tif 000042
【０１８０】
【数３５−７】
2018534921.tif 000043
【０１８１】
【数３５−８】
2018534921.tif 000044
【０１８２】
【数３５−９】
2018534921.tif 000045
【０１８３】
【数３５−１０】
2018534921.tif 000046
【０１８４】
【数３５−１１】
2018534921.tif 000047
【０１８５】
【数３５−１２】
2018534921.tif 000048
【０１８６】
【数３５−１３】
2018534921.tif 000049
【０１８７】
【数３５−１４】
2018534921.tif 000050
【０１８８】
【数３５−１５】
2018534921.tif 000051
【０１８９】
【数３５−１６】
2018534921.tif 000052
【０１９０】
【数３５−１７】
2018534921.tif 000053
【０１９１】
【表１】
2018534921.tif 000054
＊ミスマッチのジヌクレオチドを有するＴＰ９０１のattBとattP部位の間の組換えがあった。組換えは、中心ヌクレオチドに直接隣接する同族の３−ヌクレオチド領域に沿って起こるように見られた。
＊＊１対のＴＰ９０１ attB-attPは、想定されないときに組み換えされた。
【０１９２】
表２．Ｎ＝７の入力までの入力のすべての配列文字列ごとに異なる状態にアクセスできるレジスタの設計。それぞれの色は異なるリコンビナーゼの認識部位を表しているため、異なる色の認識部位は直交である。同じ色だが異なる形状の認識部位は、ジヌクレオチドバリアントを表し、これらもまた直交である。同じ色および同じ形状の認識部位は、attB-attP対である。
【表２】
2018534921.tif 000055
【０１９３】
【表３−１】
2018534921.tif 000056
【０１９４】
【表３−２】
2018534921.tif 000057
【０１９５】
【表３−３】
2018534921.tif 000058
【０１９６】
【表３−４】
2018534921.tif 000059
【０１９７】
【表３−５】
2018534921.tif 000060
【０１９８】
【表４−１】
2018534921.tif 000061
【０１９９】
【表４−２】
2018534921.tif 000062
【０２００】
【表４−３】
2018534921.tif 000063
【０２０１】
【表４−４】
2018534921.tif 000064
【表４−５】
2018534921.tif 000065
【０２０２】
【表５】
2018534921.tif 000066
【０２０３】
表６．図３Ａの２入力５状態ＲＳＭの質問に用いる定量的ＰＣＲプライマー。最初の列はプライマーの識別であり、結合するレジスタのＤＮＡ領域（ｒ１〜ｒ７、図１９に対応）および結合する方向（「Ｆ」は順方向、「Ｒ」は逆方向）に基づく。第２の列は、それが属するプライマー対を示す（図１９に対応）。対「ｐｐＮ」のプライマーは正規化に使用され、出力プラスミドの骨格に結合する。
【表６】
2018534921.tif 000067
【０２０４】
表７．図４Ａの３入力１６状態ＲＳＭの質問に用いる定量的ＰＣＲプライマー。最初の列はプライマーの識別であり、結合するレジスタのＤＮＡ領域（ｒ１〜ｒ１３、図２０に対応）および結合する方向（「Ｆ」は順方向、「Ｒ」は逆方向）に基づく。第２の列は、それが属するプライマー対を示す（図２０に対応）。対「ｐｐＮ」のプライマーは正規化に使用され、出力プラスミドの骨格に結合する。
【表７】
2018534921.tif 000068
【０２０５】
表８．２入力５状態ＧＲＳＭの設計に用いるＧＲＳＭデータベース検索機能の入出力オブジェクト。入力はマトリックス（コンマで区切られた列とセミコロンで区切られた行）であり、出力は、例１５のＧＲＳＭ検索関数の指示に従うベクトルである。入力は検索関数に直接ペーストすることができ、レジスタは直接の出力である。
【表８】
2018534921.tif 000069
【０２０６】
表９．ＧＲＳＭデータベースのパーツ。すべてのパーツは、ターミネーター、プロモーター、および遺伝子（３’末端双方向性ターミネーターを有する）で構成される。赤のターミネーターはオプションである；その組込みは、そのパーツが含まれているレジスタの遺伝子調節プログラムに影響を与えない。列２は、データベースに現れる各パーツの識別性（ＩＤ）を示す。「パリンドローム」のないパーツ（列３）が、逆相補体形式（データベース内で、パーツＩＤの前のマイナス記号「−」により識別される）でデータベースに現れることもある。列４および５は、パーツが含まれているレジスタの遺伝子調節プログラムについて、各パーツがターミネーターリードスルー（そのターミネーターを介した反対方向の転写）またはプロモーターリードスルー（そのプロモーター（単数または複数）を介した反対方向の転写）を必要とするかどうか（「Ｙ」または「Ｎ」）を示す。
【０２０７】
【表９】
2018534921.tif 000070
【０２０８】
表１０．ＧＲＳＭデータベースのパーツの機能。すべてのパーツはデータベースを構築するために使用された。パーツは、表９に対応する左の列のＩＤで表示される（負のＩＤは、逆向き配向のパーツを示す）。レジスタ上の各パーツの機能は、列２〜５に指定される。（列２）パーツは、構成的に転写された遺伝子を提供するか：ｎｏ（Ｎ）またはｙｅｓ（Ｙ）。（列３）パーツは、レジスタの別の領域から転写が可能な遺伝子を提供するか：ｎｏ（Ｎ）、左からｙｅｓ（Ｌ）、右からｙｅｓ（Ｒ）、両側からｙｅｓ（Ｂ）。（列４）パーツは、転写がそれから出ていくのを防止するか：ｎｏ（Ｎ）、左へｙｅｓ（Ｌ）、右へｙｅｓ（Ｒ）、両側へｙｅｓ（Ｂ）。（列５）パーツは、それから出る転写を開始するか：ｎｏ（Ｎ）、左へｙｅｓ（Ｌ）、右へｙｅｓ（Ｒ）、両側へｙｅｓ（Ｂ）。
【０２０９】
【表１０】
2018534921.tif 000071
【０２１０】
参考文献
【表１１−１】
2018534921.tif 000072
【０２１１】
【表１１−２】
2018534921.tif 000073
【０２１２】
【表１１−３】
2018534921.tif 000074
【０２１３】
本明細書中に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体が包含され得る。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
明確に逆の指示がない限り、１より多くのステップまたは動作を含む本明細書でクレームされるいずれの方法においても、方法のステップまたは動作の順序は必ずしも、方法のステップまたは動作の順序が説明されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
【０２１４】
特許請求の範囲において、および上記の本明細書において、すべての移行句、例えば「含むこと（comprising）」、「含むこと（including）」、「保有すること」、「有すること」、「含有すること」、「包含すること」、「保持すること」、「構成する」などは、オープンエンドであること、すなわち、それらを含むがそれらに限定されないことを意味すると理解すべきである。「〜からなる」および「〜から本質的になる」という移行句のみが、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に記載されているように、それぞれ閉鎖または半閉鎖移行句であるものとする。
【図１】
2018534921.tif 000075
【図２Ａ−Ｄ】
2018534921.tif 000076
【図３ＡＢ】
2018534921.tif 000077
【図４ＡＢ】
2018534921.tif 000078
【図５】
2018534921.tif 000079
【図５−２】
2018534921.tif 000080
【図６ＡＢ】
2018534921.tif 000081
【図６ＣＤ】
2018534921.tif 000082
【図６Ｅ】
2018534921.tif 000083
【図７Ａ】
2018534921.tif 000084
【図７Ｂ】
2018534921.tif 000085
【図８Ａ】
2018534921.tif 000086
【図８Ｂ】
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【図９ＡＢ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３−２】
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【図１４ＡＢ】
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【図１５】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６ＣＤＥ】
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【図１７Ａ】
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【図１７ＢＣ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２１−１０】
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【図２１−１１】
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【図２１−１２】
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【図２１−１３】
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【図２１−１４】
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【図２１−１５】
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【図２１−１６】
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【図２１−１７】
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【図２１−１８】
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【図２１−１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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