(57)【要約】  本発明は、以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド、(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む組成物を提供する。本発明は、グレーブス病における活性化自己抗体形成の予防又は抑制のためのそのような組成物の使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド：
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む組成物。
【請求項２】
治療に使用するための、請求項1に記載のペプチド、並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/若しくはβ遮断薬、又は請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための、請求項1又は2に記載の組成物又は使用のためのペプチド。
【請求項４】
対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防するための、請求項1又は2に記載の組成物又は使用のためのペプチド。
【請求項５】
TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための医薬の製造における、請求項1又は2に記載のペプチド又は組成物の使用。
【請求項６】
グレーブス病を治療する及び/又は予防するための医薬の製造における、請求項1又は2に記載のペプチド又は組成物の使用。
【請求項７】
対象においてTSHR自己抗体の産生を抑制する又は予防するための方法であって、対象に請求項1又は2に記載のペプチド又は組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
対象においてグレーブス病を治療するための方法であって、対象に請求項1又は2に記載のペプチド又は組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項９】
対象がHLA-DR3である、請求項3〜8のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
対象がHLA-DR4である、請求項3〜8のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１１】
組成物が用量漸増プロトコルに従って投与される、請求項3〜10のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１２】
以下のTSHRペプチド：
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、同時、別々又は逐次投与のためのキット。
【請求項１３】
グレーブス病の予防又は治療における同時、別々又は逐次投与のための、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
TSHR抗体の産生と関連する疾患の動物モデルであって、動物がヒトHLA-DR3のトランスジェニックであり、前記動物においてTSHRのレベルが対照動物と比べて増加している、動物モデル。
【請求項１５】
TSHR抗体の産生と関連する疾患がグレーブス病である、請求項14に記載の動物モデル。
【請求項１６】
TSHRがヒトTSHRである、請求項14又は15に記載の動物モデル。
【請求項１７】
TSHRがヒトTSHR Aサブユニットである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の動物モデル。
【請求項１８】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項14〜17のいずれか一項に記載の動物モデル。
【請求項１９】
アデノウイルスが筋肉内注射により投与される、請求項18に記載の動物モデル。
【請求項２０】
動物がマウスである、請求項18又は19に記載の動物モデル。
【請求項２１】
マウスがHLA-BRD1*0301トランスジェニックマウスである、請求項20に記載の動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)由来のペプチドを含む組成物に関する。本組成物又はペプチドはTSHR自己抗体の産生の予防及び/又は抑制に有用で有り得、それはグレーブス病の治療及び/又は予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
グレーブス病は、甲状腺に影響を及ぼす自己免疫疾患である。グレーブス病は過活動性の甲状腺を特徴とし、これにより甲状腺ホルモンが過剰量産生され甲状腺が拡大する(甲状腫)。こうして生じる甲状腺機能亢進の状態が広範囲な神経心理学的症状及び身体症状を引き起こし得る。グレーブス病は甲状腺機能亢進の最も一般的な原因であり(あらゆる症例の60〜90%)、通常中年期に現われるが、子供、青年、及び高齢者にも現われる。グレーブス病は女性人口の最大で2%までを冒し、女性では男性の5倍〜10倍好発する。小児グレーブス病は、米国(US)では約6000人の子供、欧州連合(EU)では6000人が罹患している。グレーブス病は重症甲状腺機能亢進の最も一般的な原因でもあり、重症甲状腺機能亢進はより穏やかな形態の甲状腺機能亢進と比べて多くの臨床徴候及び症状並びに検査所見異常を伴う。
【０００３】
グレーブス病には強い遺伝的要素が関連している。グレーブス病に関する最近の人口調査はないが、甲状腺機能亢進に関する少数の準人口調査は存在し、したがって、グレーブス病の発生率及び有病率についての概算値はすべて近似している。甲状腺機能亢進の発生率は26:100,000から93:100,000までの変動幅があり、全体の有病率は1.3%で、症例の40%が顕性で60%が不顕性であると推定されている。
【０００４】
グレーブス病に罹っている人の約30〜50%が、片目又は両目が突出するグレーブス眼症(グレーブス眼窩疾患又は甲状腺眼症としても知られる)(GO)にも罹る。GOの多くの症例が軽度で自然治癒するが、症例の20%が著しい/中等度〜重篤な疾患を抱え、これらの少なくとも半数がステロイドを必要とし、GO患者の3〜5%が甲状腺性視神経症のある有痛性の視力を脅かす疾患を抱えている。眼が膨隆すると夜に瞼が閉じることができないので角膜の重度の乾燥を引き起こすことがある。視神経への圧力が増すと視野欠損及び視力喪失をもたらす可能性がある。GOは脛骨前粘液水腫とも関連があり得る。
【０００５】
グレーブス病の症状及び兆候はほぼすべてが甲状腺機能亢進の直接的及び間接的効果から生じ、主な例外はGO、甲状腺腫及び脛骨前粘液水腫である。甲状腺機能亢進の症状には、不眠症、手の震え、運動亢進、脱毛、多汗、熱不耐及び食欲亢進にもかかわらず体重減少が含まれ得る。さらなる徴候は、最も一般的には散在性肥大(通常対称性)非圧痛性甲状腺、閉眼遅延、GOによる過剰流涙、心臓の不整脈及び高血圧である。甲状腺中毒患者は、精神病、激越、及び鬱などの行動及び人格変化を経験することがある。より穏やかな甲状腺機能亢進では、患者は顕性の少ない所見、例えば、不安、落ち着きのなさ、易刺激性及び情緒不安定を経験することがある。
【０００６】
グレーブス病に利用可能な治療法は現在存在せず、したがって、現在の治療は主症状を標的にすることに向けられている。グレーブス病には3つの治療様式、経口抗甲状腺薬(ATD)、放射性ヨード(RAI)及び甲状腺摘除術がある。後の2つのアプローチを用いれば甲状腺ホルモンを生涯補給することになる。RAIを用いた療法は米国では最も一般的な治療であり、ATDは欧州、日本及び世界の他の大半で第一選択治療となっている。
【０００７】
ATD療法はいくつかの希な副作用と関連しており、50〜60%の寛解率を有する。RAIは活性なGOを誘起する又は悪化させることがあることが益々認識されてきており、米国でATDを用いて治療される患者の数は増加している。
【０００８】
それぞれの治療選択の成功の度合いがばらついているため、最初に試みた治療が完全に成功だと判明しなければ、患者は２つ以上のアプローチを受けることが多い。再発又はそれに続く甲状腺機能亢進のリスクはかなりあり、グレーブス病についての利用可能な治療の全体的有効性は望ましいレベルには達していない。
【０００９】
グレーブス病についての代替療法の開発は、候補療法の潜在的有効性を評価するための適切なモデル、特に動物モデルがないために妨げられてきた。グレーブス病についての既知のBALB/cマウスモデルは、メチマゾール及びメチルプレドニゾロンなどのグレーブス病について承認された薬物を用いて有効性について試験されていない。
【００１０】
したがって、グレーブス病などのTSHR自己抗体の産生と関連する疾患を治療及び予防するための代替療法の必要性が存在する。したがって、グレーブス病を治療するのに及びこの疾患の症状を緩和する又は減らすのに効果的である代替療法が必要とされている。候補グレーブス病療法の潜在的有効性を評価するための代替モデルの必要性も存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、2つのTSHRペプチドの「カクテル」が、TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防すること、及びグレーブス病を治療することに特に効果的であることを見出した。
【００１２】
したがって、第1の態様では、本発明は、以下のTSHRペプチド：
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列
を含む組成物を提供する。
【００１３】
KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)は本明細書ではRNB-5D-K1とも呼ばれる。GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)は本明細書ではRNB-9Bとも呼ばれる。
【００１４】
本発明に従った組成物は、本明細書に記載される本発明の治療態様において使用することができる。
【００１５】
第2の態様では、本発明は、TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するのに使用するための本明細書に記載される本発明のペプチドを提供する。
【００１６】
第3の態様では、本発明は、対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防するための本明細書に記載される本発明のペプチドを提供する。
【００１７】
第4の態様では、本発明は、TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明のペプチドの使用を提供する。
【００１８】
第5の態様では、本発明は、グレーブス病を治療する及び/又は予防するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明のペプチドの使用に関する。
【００１９】
第6の態様では、本発明は、対象においてTSHR自己抗体の産生を抑制する又は予防するための方法であって、配列番号1のペプチドの全体若しくは一部、又はそれと少なくとも60%の配列同一性を有するペプチド、及び配列番号2のペプチドの全体若しくは一部又はそれと少なくとも60%の配列同一性を有するペプチドを対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００２０】
第7の態様では、本発明は、対象においてグレーブス病を治療するための方法であって、配列番号1のペプチドの全体若しくは一部、又はそれと少なくとも60%の配列同一性を有するペプチド、及び配列番号2のペプチドの全体若しくは一部又はそれと少なくとも60%の配列同一性を有するペプチドを対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００２１】
一態様では、本組成物は以下のペプチド：
RNB-4K-GKK:  KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK
を含有しないか又は含まない。
【００２２】
本発明に従ったペプチド組成物は本明細書に記載される本発明に従ったアミノ酸配列を含むことができる。一態様では、ペプチド組成物は本明細書に記載される本発明に従ったアミノ酸配列のみを含む。
【００２３】
対象はHLA-DR3でもよい。対象はHLA-DR4でもよい。
【００２４】
本明細書に記載される本発明のペプチド、又は本発明の組成物は、用量漸増プロトコルに従って投与することができる。
【００２５】
第8の態様では、本発明は、以下のTSHRペプチド：
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列
を含む、同時、別々又は逐次投与のためのキットに関する。
【００２６】
本キットは、グレーブス病などの、TSHR自己抗体の産生を伴う状態の治療又は予防のためのものであってよい。
【００２７】
本発明の第9の態様では、本発明のペプチド又は組成物はグレーブス病の治療、予防又は管理に使用されるさらなる治療薬と組み合わされる。例えば、そのペプチド又は組成物は抗甲状腺薬、又はβ遮断薬と組み合わせることができる。
【００２８】
第9の態様では、本発明は、TSHR抗体の産生と関連する疾患の動物モデルであって、動物がヒトHLA-DR3のトランスジェニックであり、動物においてTSHRのレベルが適切な対照動物と比べて増加している、動物モデルに関する。一態様では、TSHRのレベルは、TSHRペプチドをコードする核酸分子を含むウイルスベクターの投与により増加する。
【００２９】
TSHR抗体の産生と関連する疾患はグレーブス病であってよい。
【００３０】
TSHRはヒトTSHRであってよい。例えば、TSHRはヒトTSHR Aサブユニット又は細胞外ドメイン(ECD)であってもよい。
【００３１】
ウイルスベクターはアデノウイルスベクター又はアデノウイルス構築物であってもよい。
【００３２】
アデノウイルスベクター又は構築物は3週間間隔で投与することができる。アデノウイルスベクター又は構築物は2回又は3回の逐次投与で投与することができる。
【００３３】
アデノウイルスベクター又は構築物は109〜1011ウイルス粒子の用量で投与される。アデノウイルスベクター又は構築物は筋肉内注射により投与することができる。
【００３４】
動物はマウスであってよい。マウスはHLA-BRD1*0301トランスジェニックマウスであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】5D-K1処置はDR3tgマウスにおいてTSHR誘導増殖を減少させることを示す図である。DR3tgマウスは、100μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、5D-K1(GLS)又は対照(HLA-DR3結合ペプチド;GLS)で前処置した(n=10/群)。動物はCFA中50μgの5D(GLS)の免疫を受け、10日後にLN及び脾臓を収穫して、TSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス(赤線)及びペプチド処置マウス(青線)についての刺激指数(SI)値の平均±標準偏差(standard error of the mean; SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の平均比率減少がグラフに示される。SI：刺激指数、LN：リンパ節。
【図２】9B-N処置はDR3tgマウスにおいてTSHR誘導増殖を減少させることを示す図である。DR3tgマウスは、33μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、9B-N(PPL)又はPBSで前処置した(n=10/群)。動物はCFA中50μgの9B(GLS)の免疫を受け、10日後にLN及び脾臓を収穫して、TSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス(赤線)及びペプチド処置マウス(青線)についての刺激指数(SI)値の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の平均比率減少がグラフに示される。SI：刺激指数、LN：リンパ節。
【図３】ATX-GD-59処置はDR3tgマウスにおいてTSHR誘導増殖を減少させることを示す図である。DR3tgマウスは、ペプチドごとに15nmolの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、ATX-GD-59(PPL)又はHIP-15F-GKK対照ペプチド(GLS)で前処置した(n=10/群)。動物はCFA中親ペプチド5D(Severn)及び9B(PPL)それぞれ30nmolの免疫を受け、10日後にLN及び脾臓を収穫して、TSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス(赤線)及びペプチド処置マウス(青線)についての刺激指数(SI)値の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の平均比率減少がグラフに示される。SI：刺激指数、LN：リンパ節。データは2つの独立した実験を表す。
【図４】ATX-GD-59処置はAd-TSHR免疫DR3tgマウスにおいてTSHR特異的脾細胞増殖を減少させることを示す図である。DR3tgマウス(n=11/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に22.5nmol/ペプチドのATX-GD-59又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0日目と21日目)で2回、1010個のAd-TSHR又はAd-LacZを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させ、脾臓を収穫して、TSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス(赤線)及びペプチド処置マウス(青線)についての分あたりの絶対カウント数(cpm;左図)又は刺激指数(SI;右図)値の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の全体的平均比率減少がグラフに示される。データは2つの独立した実験を表す。
【図５】予防的ATX-GD-59処置は抗TSHR抗体レベルを減少させることを示す図である。DR3tgマウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59(n=11)又は対照処置(n=11)を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目にATX-GD-59又は対照処置において22.5nmolのそれぞれのペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0日目と21日目)で2回、1010個のAd-TSHR又はAd-LacZを筋肉内に注射した(n=7)。血液は処置前、最初の免疫の前並びにその2及び5週間後に採取して、ELISAにより抗TSHR総IgGレベルを測定した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、群平均±SEMを示している。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。データは2つの独立した実験を表す。
【図６】予防的ATX-GD-59処置は異なる抗TSHR抗体アイソタイプレベルを減少させることを示す図である。DR3tgマウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59(n=11)又は対照処置(n=11)を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目にATX-GD-59又は対照処置において22.5nmolのそれぞれのペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHR又はAd-LacZを筋肉内に注射した(n=7)。血液は処置前並びに最初の免疫の前及び2及び5週間後に採取して、ELISAにより2週目に抗TSHRアイソタイプIgGレベルを測定した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、群平均±SEMを示している。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。データは2つの独立した実験を表す。
【図７】Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおける刺激性抗TSHR抗体の誘発率を示す図である。DR3tgマウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59(n=11)又は対照処置(n=11)を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目にATX-GD-59又は対照処置において22.5nmolのそれぞれのペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHR又はAd-LacZを筋肉内に注射した(n=7)。血清は最初の免疫の5週間後に採取しCHO細胞アッセイにおいて分析した。それぞれのドットは5週目の1匹のマウスのデータを表し、群ごとに平均±SEMを示している。マン・ホイットニー検定を使用して刺激性TSHR抗体レベルの違いを測定した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。結果は3つよりも多い独立した実験を表している。RLUは相対発光量(relative light units)(刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)。
【図８】MMI及びATX-GD-459共薬物療法(co-medication)研究の模式的概観を示す図である。マウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは皮下植込み浸透圧ポンプを介してビヒクル又はメチマゾール処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、109個のAd-TSHR粒子を筋肉内に注射した。血液は、処置の2週間前に及び処置直前に次に最初の免疫の2、4及び5週間後に採取した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させて血液、甲状腺及び脾臓試料を得た。
【図９】プロプラノロール及びATX-GD-459共薬物療法研究の模式的概観を示す図である。マウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは毎日腹腔内注射を介してビヒクル又はプロプラノロール処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、1010個のAd-TSHR粒子を筋肉内に注射した。血液は、処置の2週間前に及び処置直前に、そして最初の免疫の2、4及び5週間後に採取した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させて血液、甲状腺及び脾臓試料を得た。
【図１０】Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるTSHR特異的脾細胞増殖を示す図である。DR3tgマウス(n=7〜10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは皮下植込み浸透圧ポンプを介してビヒクル(黒塗記号)又はMMI(白抜き記号)処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、109個のAd-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させ、脾臓を収穫してTSHR特異的増殖を評価した。データは、分あたりの絶対カウント数(cpm;左図)、刺激指数値(SI;中央図)又は補正カウント数(△cpm;右図)の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定し、ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差は本文に記載されている。
【図１１】ATX-GD-459は抗TSHR IgG抗体レベルを減少させるがMMI処置は減少させないことを示す図である。DR3tgマウス(n=7〜10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは皮下植込み浸透圧ポンプを介してビヒクル又はMMI処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、Ad-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１２】ATX-GD-459は抗TSHR IgG2b及びIgG2c抗体レベルを減少させるがMMI処置は減少させないことを示す図である。DR3tgマウス(n=7〜10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは皮下植込み浸透圧ポンプを介してビヒクル又はMMI処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、Ad-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置開始前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは2週目に測定された1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgG1、IgG2b及びIgG2cレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１３】MMI処置は血清T4レベルを有意に減少させることを示す図である。DR3tgマウス(n=7〜10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのそれぞれのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは皮下植込み浸透圧ポンプを介してビヒクル又はMMI処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、Ad-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、T4レベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは5週目に測定された1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用してT4レベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１４】Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるTSHR特異的脾細胞増殖を示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは毎日腹腔内注射を介してビヒクル(黒塗記号)又はプロプラノロール(白抜き記号)処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させ、脾臓を収穫してTSHR特異的増殖を評価した。データは、分あたりの絶対カウント数(cpm;左図)、刺激指数値(SI;中央図)又は補正カウント数(△cpm;右図)の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定し、ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差は本文に記載されている。
【図１５】ATX-GD-459は抗TSHR IgG抗体レベルを減少させるがプロプラノロール処置は減少させないことを示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは毎日腹腔内注射を介してビヒクル(黒塗記号)又はプロプラノロール(白抜き記号)処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１６】ATX-GD-459は抗TSHR IgG2b及びIgG2c抗体レベルを減少させるがプロプラノロール処置は減少させないことを示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは毎日腹腔内注射を介してビヒクル(黒塗記号)又はプロプラノロール(白抜き記号)処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgG1、IgG2b及びIgG2cレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１７】総T4レベルはプロプラノロール又はATX-GD-459処置の影響を受けないことを示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。-15日目に開始して、マウスは毎日腹腔内注射を介してビヒクル(黒塗記号)又はプロプラノロール(白抜き記号)処置も受けた。次に、マウスは3週間間隔(0日目と3日目)で2回、1010個のAd-TSHRを筋肉内に注射した。実験は最初の免疫の5週間後に終了させた。血液は、処置前、最初の免疫の前並びにその2、4及び5週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは5週目に測定された1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用してT4レベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用し、有意差は、存在する場合、グラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図１８】プロプラノロールの血漿レベルは薬理学的用量を確認することを示す図である。血漿プロプラノロールのレベルを対照マウス並びにペプチド及びプロプラノロールを投与していたマウスにおいてアッセイした。血漿は0週目及び5週目に試験し、その結果を示している。
【図１９】模式的T細胞寛容化プロトコルを示す図である。マウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に最高用量のペプチド(ATX-GD-459単一ペプチド又はカクテル)を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量、及びそれに対応した用量漸増用量は実験によって異なることがある。0日目、マウスは、完全フロイントアジュバント(CFA)中に乳化させたペプチドで尾の基部に皮下的に免疫する。実験は免疫の10日後に終了させ、TSHR又はペプチド再刺激によるリンパ節(LN)細胞及び脾細胞の増殖を測定する。
【図２０】ATX-GD-459処置はHLA-DR3マウスにおけるTSHR誘導増殖を効果的に減少させることを示す図である。(A)HLA-DR4マウスは100μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、RNB-4K-GKK又はPBS(n=10/群)で前処置した。(B)HLA-DR3マウスは100μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、RNB-5D-K1又はHIP-16E(HLA-DR3結合対照ペプチド)(n=10/群)で前処置した。(C)HLA-DR3マウスは33μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、RNB-9B又はPBS(n=10/群)で前処置した。動物はCFA中の親ペプチドの免疫を受け、10日後にLN及び脾臓を収穫してTSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス及びペプチド処置マウスについての刺激指数(SI)値の平均±標準偏差(SEM)を表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の平均比率減少がグラフに示される。SI：刺激指数、LN：リンパ節。(D)HLA-DR3マウスはペプチドごとに75μgの最高用量での用量漸増スケジュールに従って、ATX-GD-459又はPBS(n=10/群)で前処置した。動物はCFA中に乳化された4K/5D/9B免疫を受け、10日後にLN及び脾臓を収穫してTSHR特異的増殖を評価した。データは、対照処置マウス及びペプチド処置マウスについての刺激指数(SI)値の平均±SEMを表す。二元配置分散分析(ANOVA)を使用してT細胞増殖に対する全体的処置効果を測定した。p値はグラフに書き込まれている。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。ペプチド処置により誘導されるT細胞増殖の平均比率減少がグラフに示される。SI：刺激指数、LN：リンパ節。
【図２１】アデノウイルス性グレーブス病モデル及び検証の模式的概観を示す図である。(A)マウスは、TSHR-Aサブユニットを発現するアデノウイルスベクター(Ad-TSHR)又はβガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスベクター(Ad-LacZ)を用いた筋肉内免疫を介して免疫した。1010個のアデノウイルス粒子を3週間間隔で2回注射した。このプロトコルの偏差は実験ごとに示されている。血液は最初の免疫の前、その2及び4週間後に採取した。実験は最初の免疫の4週間後に終了させ、血液、脾臓及び甲状腺をグレーブス病様症状調査のために採取した。(B)マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、Ad-TSHRを用いて免疫した。処置は最初の免疫の日に皮下ポンプ挿入を介して開始し、実験終了まで4週間続いた。血液は最初の免疫の前、その2及び4週間後に採取した。マウスは最初の免疫の4週間後に安楽死させ、血液及び脾臓試料を得た。(C)マウスに、-15日目、-13日目及び-11日目に0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μgのペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0週目と3週目)で2回、Ad-TSHR又はAd-LacZを筋肉内に注射した。血液は処置前、最初の免疫の前並びにその2及び5週間後に採取した。マウスは最初の免疫の5週間後に安楽死させ、血液及び脾臓試料を得た。
【図２２】BALB/cマウスにおけるAd-TSHR免疫による経時的なT4及び抗TSHR IgGレベルの進化を示す図である。BALB/cマウス(n=6〜7/群)は、TSHR-Aサブユニットを発現する(Ad-TSHR)又はβガラクトシダーゼを発現する(Ad-LacZ)1010又は1011個のアデノウイルスベクターを用いた筋肉内免疫を介して免疫した。1010又は1011個のアデノウイルス粒子を3週間間隔(0週目、3週目及び6週目)で3度注射した。血清は最初の免疫の前に並びにその4及び10週間後に採取した。(A)T4レベルはELISAにより分析される。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。甲状腺機能亢進マウスの数はグラフに示されている。公表されているデータに即して、甲状腺機能亢進のカットオフは、Ad-LacZ免疫対照マウスにおける正常範囲のマウスT4レベルの平均±2標準偏差として定義された。(B)抗TSHR IgGレベルはELISAにより分析される。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図２３】DR3tgマウスにおけるAd-TSHR免疫による経時的なT4、刺激性TSHR抗体及び抗TSHR抗体力価の進化を示す図である。(A)DR3tgマウスは、TSHR-Aサブユニット(Ad-TSHR)(n=10)又はβガラクトシダーゼ(Ad-LacZ)(n=12)を発現する109のアデノウイルスベクターを用いた筋肉内免疫により免疫した。アデノウイルス粒子を3週間間隔(0週目及び3週目)で2回注射した。血清は最初の免疫の前に並びにその2及び4週間後に採取し、T4レベルはELISAにより分析した。それぞれのドットは4週目の1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。マン・ホイットニー検定を使用してT4レベルの違いを測定した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。結果は3つよりも多い独立した実験を表している。(B)DR3tgマウス(n=10/群)は、TSHR-Aサブユニット(Ad-TSHR)又はβガラクトシダーゼ(Ad-LacZ)を発現する109のアデノウイルスベクターを用いた筋肉内免疫により免疫した。アデノウイルス粒子を3週間間隔(0週目及び3週目)で2回注射した。血清は最初の免疫の前に並びにその2及び4週間後に採取し、T4レベルはCHOルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより分析した。それぞれのドットは4週目の1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。マン・ホイットニー検定を使用して刺激性TSHR抗体レベルの違いを測定した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。結果は3つよりも多い独立した実験を表している。RLU、相対発光量(刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)。(C)BALB/cマウス(n=10;左パネル)及びDR3tgマウス(n=7;右パネル)は、TSHR-Aサブユニットを発現する1010のアデノウイルスベクター(Ad-TSHR)を用いた筋肉内免疫により免疫した。アデノウイルス粒子を3週間間隔(0週目、3週目及び6週目)で3度注射した。血清は最初の免疫の前に並びにその4、7及び10週間後に採取し、抗TSHR IgGレベルをELISAにより分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。(D)DR3tgマウスは、TSHR-Aサブユニットを発現する1010若しくは1011のアデノウイルスベクター(Ad-TSHR)又はβガラクトシダーゼを発現する1010のアデノウイルスベクター(Ad-LacZ)を用いた筋肉内免疫により免疫した。アデノウイルス粒子を3週間間隔(0週目、3週目及び6週目)で3度注射した。10週間後、脾臓を採取しTSHR誘導脾細胞増殖をトリチウム標識チミジン取り込みにより測定した。結果は群ごとの平均±SEMとして示している。Cpm: 分あたりのカウント数、SI:刺激指数。
【図２４】Ad-TSHR免疫に続くDR3tgマウスにおけるT4及び抗TSHRレベルに対するメチマゾール処置の効果を示す図である。DR3tgマウス(n=7〜8/群)は0週目及び3週目にAd-TSHRで免疫した。メチマゾール処置(50又は500μg/マウス/日)又はビヒクル処置は皮下ポンプ挿入を介して施され、最初の免疫の日に開始して実験の終了までの4週間続いた。血清は最初の免疫の前に並びにその2及び4週間後に採取された。(A)T4レベルはELISAによって分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用してT4レベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。(B)抗TSHR IgGレベルはELISAによって分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図２５】抗TSHR IgGレベルはメチルプレドニゾロン処置により減少することを示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)は0週目及び3週目に1010のAd-TSHRで免疫した。メチルプレドニゾロン(Mpred)処置(7mg/kg/日)又はビヒクル処置は皮下ポンプ挿入を介して施され、最初の免疫の3日前に開始して実験の終了までの4週間続いた。血清は最初の免疫の前に並びにその2及び4週間後に採取され、抗TSHR IgGレベルはELISAによって分析した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、平均±SEMは群ごとに示されている。マン・ホイットニー検定を使用して抗TSHR IgGレベルの違いを測定した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図２６】ATX-GD-459処置は抗TSHR抗体レベルを減少させることを示す図である。DR3tgマウス(n=10/群)に、-15日目、-13日目及び-11日目に0.1μg、1μg及び10μgのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μgのATX-GD-459又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。次に、マウスは3週間間隔(0日目及び3日目)で2回、Ad-TSHR又はAD-lacZを筋肉内に注射した。血液は処置前に、最初の免疫の前に並びにその2及び5週間後に採取し、抗TSHR総IgGレベルをELISAにより測定した。それぞれのドットは1匹のマウスのデータを表し、群平均±SEMが示されている。一元配置分散分析を使用して抗TSHR IgGレベルの全体的な違いを測定した。ボンフェローニ事後検定を使用した。有意差がグラフに示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
【図２７】RNB-5D-K1及びRNB-4K-GKKへのハイブリドーマクローン応答を示すAPIPSアッセイを示す図である。RNB-5(クローン50+35)又はRNB-4(クローン164+455)及びTSHRに特異的な5×104のT細胞ハイブリドーマクローンを、5×104のヒトDR3発現抗原提示B細胞(VAVY)(クローン50)と又はDR4発現抗原提示B細胞(BM14)(クローン35、164、455)と組み合わせてTSHR及びRNB-5D-K1又はRNB-4K-GKKの存在下で培養した。抗原提示細胞(APC)は生存していたか又は培養ウェルへの添加に先立って既に0.5%パラホルムアルデヒドで固定されていた。共培養の48時間後、上清を収集しELISAによって分析してIL-2分泌のレベルを評価した。代表的クローンからの結果を提示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、グレーブス病の治療及び/又は予防において有用である、TSHR自己抗体の産生を予防する又は抑制するための新しい代替治療選択肢を提供する。本出願の実施例1において示されるように、配列番号1と2のペプチドの組合せはグレーブス病のモデルにおいてTSHRへの寛容をもたらす。
【００３７】
したがって、本発明の第1の態様は、TSHR由来の複数のペプチド、すなわち、本明細書で定義される本発明のペプチド、好ましくは配列番号1及び2のペプチドを含む組成物に関する。
【００３８】
甲状腺刺激ホルモン受容体
グレーブス病は主要自己抗原である甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)を標的にする自己反応性T及びBリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患である。
【００３９】
TSHRは、甲状腺における甲状腺濾胞細胞上のGタンパク質結合受容体であり、この受容体はそのリガンド、すなわち、甲状腺刺激ホルモン(TSH)が結合するとcAMPシグナルカスケードを介してチロキシン(T4)及びトリヨードチロニン(T3)の産生を刺激する。APCによりTSHRが内部移行し、分解され、提示されると、T細胞が活性化され自己反応性B細胞と相互作用して、順にB細胞はTSHRに向けられる刺激性アゴニスト(stimulating agonistic)自己抗体を産生する。甲状腺刺激性免疫グロブリンはTSHと同じ受容体ポケットに結合し、それがTSHR媒介シグナル伝達を活性化し、甲状腺からの過剰な甲状腺ホルモンの産生及び甲状腺増大をもたらす。
【００４０】
TSHRは、サイロトロピン受容体としても知られるが、甲状腺上皮細胞上で主に発現される。
【００４１】
TSHRホロ受容体(holoreceptor)は764残基を有し、TSHが結合するN末端細胞外ドメイン、セルペンチン(又は膜貫通ドメイン)及びC末端細胞内ドメインを含む。
【００４２】
TSHRは高度に保存されたCys残基群を有する大きな細胞外ドメイン(418アミノ酸)を含み、このCys残基群がリガンド結合と不活性受容体立体構造の両方に重要になり得る細胞外ドメイン三次構造の形成を促進する。細胞外ドメインは全タンパク質長の半分超を含み、高親和性リガンド結合に十分である。細胞表面に輸送された後、受容体分子は分子内切断を受け、残基316と366の間の50アミノ酸配列が取り除かれる。結果として、受容体は、ジスルフィド結合で一つに結合されている2つのサブユニット、すなわち、細胞外リガンド結合ドメインを含むαサブユニットと膜貫通ドメイン及び短いC末端配列を含むβサブユニットとを含む。それに続くステップでは、αサブユニットは脱離し、細胞膜上にはリガンド結合ドメイン除去βサブユニットが過剰になる。
【００４３】
循環TSHがTSHRに結合した後、Gタンパク質シグナル伝達カスケードがアデニリルシクラーゼを活性化し、cAMPの細胞間レベルが上昇する。cAMPは、ヨウ素ポンピング、サイログロブリン合成、ヨウ素化、エンドサイトーシス及びタンパク質分解、甲状腺ペルオキシダーゼ活性並びにホルモン遊離を含む甲状腺細胞のあらゆる機能面を活性化する。
【００４４】
成熟TSHRのアミノ酸配列を以下に示す(配列番号3)。
2018502093.tif 000002
【００４５】
寛容
T細胞エピトープは、自己であれ外来であれ、あらゆる抗原への適応免疫応答において中心的役割を果たしている。過敏性疾患(アレルギー、自己免疫疾患及び移植拒絶反応を含む)においてT細胞エピトープが果たしている中心的役割は、実験モデルの使用を通じて実証されてきた。アジュバントと組み合わせた合成ペプチド(T細胞エピトープの構造に基づく)の注射により炎症性疾患又はアレルギー疾患を誘導することが可能である。
【００４６】
これとは対照的に、可溶性形態のペプチドエピトープを投与することにより特定の抗原に対する免疫原性寛容を誘導することが可能であることが示されてきている。可溶性のペプチドを投与することは実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE -多発性硬化症(MS)のモデル)(Metzler and Wraith(1993) Int. Immunol. 5:1159〜1165ページ;Liu and Wraith(1995) Int. Immunol. 7:1255〜1263ページ;Anderton and Wraith(1998) Eur. J. Immunol. 28:1251〜1261ページ)において、並びに関節炎、糖尿病及び網膜ブドウ膜炎の実験モデル(上と同じAnderton and Wraith(1998)においてレビューされている)において疾病を阻害する効果的な手段として実証されてきた。これはEAEにおいて進行中の疾患を治療する手段としても実証されている(上と同じAnderton and Wraith(1998))。
【００４７】
寛容は免疫系が抗原に対して応答できないことである。自己抗原に対する寛容は免疫系の本質的な特徴であり、これが失われると、自己免疫疾患が生じ得る。適応免疫系は、それ自体の組織内に含有される自己抗原の自己免疫攻撃を回避しつつきわめて多種多様な感染因子に応答する能力を維持しなければならない。これは大部分が、胸腺におけるアポトーシス細胞死に対する未熟Tリンパ球の感受性により制御されている(中枢性寛容)。しかし、すべての自己抗原が胸腺において検出されるわけではなく、したがって自己反応性胸腺細胞の死は不完全なままである。このように、末梢組織において寛容が成熟自己反応性Tリンパ球により獲得される機序(末梢性寛容)も存在する。中枢性及び末梢性寛容の機序のレビューはAndertonら、(1999)(Immunological Reviews 169:123〜137ページ)に記載されている。
【００４８】
グレーブス病は、TSHRに結合してこれを活性化し、それによって甲状腺ホルモン合成と分泌、及び甲状腺増大を刺激するTSHR刺激性自己抗体により引き起こされると現在考えられている。本発明の組成物は、対象に投与された場合、TSHR自己タンパク質に対する寛容を回復させて病原性免疫応答を抑制することができるように、TSHRに対する寛容を誘導することができる。
【００４９】
アピトープ(apitope)
適応免疫応答では、Tリンパ球はタンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。APCはタンパク質抗原を取り込んでそれを短いペプチド断片に分解する。ペプチドは細胞内部の主要組織適合性分子に結合して細胞表面に運ばれ得る。MHC分子と共に細胞表面に提示されると、ペプチドはT細胞により認識される(T細胞受容体(TCR)を介して)ことができ、その場合にはそのペプチドはT細胞エピトープである。
【００５０】
したがって、エピトープは抗原から引き出しうるペプチドであって、MHC分子のペプチド結合グルーブに結合してT細胞により認識されることができるペプチドである。
【００５１】
最小エピトープはエピトープから引き出しうる最も短い断片であって、MHC分子のペプチド結合グルーブに結合してT細胞により認識されることができる断片である。所与の免疫原性領域では、典型的には、エピトープとして作用する重複しているペプチドの「入れ子セット」であって、そのすべてが最小エピトープを含有するがその隣接する領域は異なる「入れ子セット」を作成することが可能である。
【００５２】
同様に、末端切断型ペプチドへの応答を測定することにより、特定のMHC分子:T細胞組合せに対する最小エピトープを同定することが可能である。例えば、重複しているライブラリーにおいて残基1〜15を含むペプチドへの応答が得られる場合、両端で末端切断されているセット(すなわち、1〜14、1〜13、1〜12等及び2〜15、3〜15、4〜15等)を使用して最小エピトープを同定することが可能である。
【００５３】
本発明者らは以前、さらなるプロセシングなしでMHC分子に結合してT細胞に提示されるペプチドの能力とin vivoで寛容を誘導するペプチドの能力の間には関連があることを決定した(WO 02/16410)。ペプチドが長すぎてさらなるプロセシング(例えば、トリミング)なしではMHC分子のペプチド結合グルーブに結合できない、又は不適切な立体構造で結合する場合は、ペプチドはin vivoでは免疫寛容原性にはならない。一方、ペプチドがMHCペプチド結合グルーブに直接結合しT細胞に提示されるのに適切なサイズ及び立体構造である場合は、このペプチドは寛容誘導に有用であると予測することが可能である。
【００５４】
したがって、ペプチドがin vitroでのさらなる抗原プロセシングなしでMHC分子に結合してT細胞に提示されることが可能かどうかを調べることによりペプチドの免疫寛容原性能力を調べることが可能である。
【００５５】
TSHRアピトープ(抗原プロセシング独立エピトープ)はさらなる抗原プロセシングなしでMHC分子に結合してTSHR特異的T細胞からの応答を刺激することができる。そのようなアピトープはWO 02/16410に記載されるルールベースの方法に従ってTSHRに対する寛容を引き起こすと予測することが可能である。
【００５６】
MHCクラスI分子に結合するペプチドは典型的には7〜13、より一般的には、8〜10アミノ酸長である。ペプチドの結合は、ペプチドの主鎖の原子とすべてのMHCクラスI分子のペプチド結合グルーブの不変部位の間の接触によりその2つの末端で安定化される。ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端に結合するグルーブの両末端には不変部位がある。ペプチド長の変動は、多くの場合、柔軟性を与えるプロリン又はグリシン残基での、ペプチド骨格のねじれにより調整される。
【００５７】
MHCクラスII分子に結合するペプチドは典型的には、8〜20アミノ酸長、より一般的には10〜17アミノ酸長であり、さらに長くなる(例えば、40アミノ酸長まで)ことが可能である。これらのペプチドは、(MHCクラスIペプチド結合グルーブとは異なって)両末端で開いているMHC IIペプチド結合グルーブに沿って引き伸ばされた立体構造で存在する。ペプチドは、主に、ペプチド結合グルーブに沿って並ぶ保存された残基との主鎖原子接触により、定位置に保たれる。
【００５８】
好ましい実施形態では、ペプチドはさらなるプロセシングなしでMHCクラスII分子に結合することができる。
【００５９】
ペプチド
用語「ペプチド」は通常の意味で使用され、典型的には隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により互いに連結された典型的にはL-アミノ酸の一連の残基を意味する。この用語には改変ペプチド及び合成ペプチド類似体が含まれる。
【００６０】
ペプチドは化学的方法を使用して作成することができる(Peptide Chemistry、A practical Textbook. Mikos Bodansky、Springer-Verlag、Berlin)。例えば、ペプチドは固相技法(Roberge JYら、(1995) Science 269: 202〜204ページ)により合成し、樹脂から切断し、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製することが可能である(例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles、WH Freeman and Co、New York、NY)。自動化合成は、例えば、ABI 43 1Aペプチド合成装置(Perkin Elmer)を製造業者が提供する説明書に従って使用して達成することができる。
【００６１】
ペプチドは、代わりに、組換え手段により、又はより長いポリペプチドからの切断により作製することができる。例えば、ペプチドは、サイロトロピン受容体タンパク質からの切断、それに続く一方の又は両方の末端の改変により得ることができる。ペプチドの組成はアミノ酸解析又は配列決定(例えば、エドマン分解法)により確かめることができる。
【００６２】
本発明において使用するペプチドは以下の通りである。
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列。
【００６３】
本発明に従ったペプチドは、配列番号1又は2のペプチドと少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、70%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなることができる。一態様では、ペプチドは配列番号1又は2と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する。
【００６４】
好ましい態様では、ペプチドは配列番号1及び2を含む。さらに好ましい態様では、ペプチドは配列番号1及び2からなる。
【００６５】
配列同一性は任意の都合の良い方法により評価することができる。しかし、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、配列の多重アライメントを作るコンピュータプログラム、例えば、Clustal W(Thompsonら、(1994) Nucleic Acids Res.22:4673〜4680ページ)が有用である。ALIGN(Myersら、(1988) CABIOS、4:1〜17ページ)、FASTA(Pearsonら、(1988) PNAS、85:2444〜2448ページ;Pearson(1990)、Methods Enzymol.183:63〜98ページ)及びギャップ付BLAST(Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res.25:3389〜3402ページ)のような配列の対を比較し整列させるプログラムもこの目的には有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のダリサーバーは、タンパク質配列の構造ベースのアライメントを提供する(Holm(1993) J. Mol. Biol.233:123〜38ページ;Holm(1995) Trends Biochem. Sci.20: 478〜480ページ;Holm(1998) Nucleic Acid Res.26: 316〜9ページ)。
【００６６】
複数の配列アライメント及びパーセント同一性の計算は、標準BLASTパラメータ(入手可能なあらゆる生物由来の配列を使用して、matrix Blosum 62、gap costs: existence 11、extension 1)を使用して決定することができる。
【００６７】
代わりに、以下のプログラム及びパラメータを使用することができる：プログラム:Align Plus 4、version 4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)；DNA比較: Global comparison、Standard Linear Scoring matrix、Mismatch penalty=2、Open gap penalty=4、Extend gap penalty=1；アミノ酸比較:Global comparison、BLOSUM 62 Scoring matrix。
【００６８】
したがって、変異体が親の機能的活性を保持している、すなわち、変異体が機能的に等価である、言い換えると、変異体が本明細書において定義される親ペプチドの活性を有する又は示す限りにおいて、述べられた又は所与の配列の変異体は本発明の範囲に含まれる。そのような変異体は、親配列の、例えば、1つ以上、例えば、1〜14アミノ酸のアミノ酸置換、付加又は欠失(1つ又は両方の末端での末端切断を含む)を含むことができる。
【００６９】
アミノ酸の1つ以上が化学的に誘導体化されている、例えば、化学基で置換されている機能的に等価な誘導体も含まれる。
【００７０】
このように、本発明のペプチドは、そのペプチドが必要な活性を保持している前提で、配列番号1〜3の一部又は断片を含むことが可能である。配列番号1〜3の断片又は一部は、例えば、6〜14残基長、例えば、6、7、8、9、10、11、12又は13残基長であり得る。
【００７１】
本発明のペプチドは8〜30アミノ酸の間、例えば、8〜25アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜15アミノ酸又は8〜12アミノ酸を含むことができる。一態様では、本発明のペプチドは、したがって、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。
【００７２】
TSHRペプチドは組成物、好ましくは医薬組成物の形態であってよい。
【００７３】
TSHRペプチドは中性又は塩形態として組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基と形成される)が含まれ、酸付加塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマレイン酸などのそのような有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインなどの有機塩基由来でもよい。
【００７４】
組合せ
本発明者らは、驚くべきことに、本発明に従ったペプチド及び/又は組成物をグレーブス病の治療又は管理に使用される他の療法と、本発明のペプチド/組成物ともう一方の治療薬の両方の治療効果を維持したままで、組み合わせて施すことが可能であることを見出した。
【００７５】
したがって、一態様では、本発明のペプチド又は組成物は、グレーブス病の治療又は予防に使用されるさらなる治療薬と組み合わせることができる。
【００７６】
例えば、このペプチド又は組成物は抗甲状腺薬、又はβ遮断薬と組み合わせることができる。
【００７７】
実施例2に示されるように、配列番号1及び配列番号2のペプチドを抗甲状腺薬と組み合わせて投与しても、TSHRペプチドに起因する抗TSHR抗体産生の減少に影響せず、抗甲状腺作用(antithyrotic action)(T4産生により測定される)は減少しなかった、すなわち、両治療作用は維持された。本発明に従った組成物をβ遮断薬と併用した組合せでも類似の結果が達成された。このように、本発明者らは、本発明に従ったペプチドがグレーブス病の治療及び管理のための既存の療法と組み合わせて使用可能であることを実証した。
【００７８】
本発明に従った組合せは、それがグレーブス病における自己免疫応答、すなわち、根底にある機序の減少を促進し、同時にグレーブス病の症状の治療又は管理を可能にするという点で有利である。
【００７９】
「抗甲状腺薬」は甲状腺ホルモンに作用するホルモンアンタゴニストである。抗甲状腺薬はグレーブス病の治療に使用される。抗甲状腺薬は、甲状腺ホルモン合成に対するその阻害効果、それによるそのチロキシン(T4)レベルの直接減少のためにグレーブス病患者に与えられる。
【００８０】
一実施形態では、抗甲状腺薬は、カルビマゾール、メチマゾール(MMI)、プロピルチオウラシル(PTU)及び過塩素酸カリウムから選択される。好ましい実施形態では、抗甲状腺薬はメチマゾール(MMI)である。
【００８１】
β遮断薬は、(この疾患の免疫性化合物を処置することなく)甲状腺機能亢進のβアドレナリン作動の結果と戦うためにグレーブス病患者に与えられる。
【００８２】
β遮断薬は不整脈の管理のために使用されるクラスの薬物である。β遮断薬は、特に交感神経系のアドレナリン作動性β受容体上で内在性カテコールアミンエピネフリン(アドレナリン)及びノルエピネフリン(ノルアドレナリン)の作用を遮断する。
【００８３】
本発明に従ったβ遮断薬には、プロプラノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール及びチモロールが含まれる。好ましい実施形態では、β遮断薬はプロプラノロールである。
【００８４】
β遮断薬の薬学的に許容される塩を使用することができる。好ましい実施形態では、β遮断薬は塩酸プロプラノロールである。
【００８５】
抗甲状腺薬及びβ遮断薬の適切な用量は当業者が決めることが可能である。例として、抗甲状腺薬は10〜1000μgの間、例えば、20〜900、30〜800、40〜700、50〜600、60〜500、70〜400、80〜300、又は90〜200μgの間の用量で投与してもよい。好ましい実施形態では、300〜700μgの間、例えば、約500μg及び好ましくは500μgの用量が投与される。
【００８６】
好ましい実施形態では、抗甲状腺薬は毎日、例えば、20〜28時間ごとに、好ましくは24時間ごとに投与される。
【００８７】
抗甲状腺薬はあらゆる適切な経路によって投与することができ、これは当業者には公知であろう。好ましい実施形態では、抗甲状腺薬は皮下に投与される。
【００８８】
β遮断薬は、例えば、1〜100mg/kgの間、例えば、5〜90、10〜80、15〜75、20〜70、25〜60、30〜55、35〜50、及び40〜45mg/kgの間の用量で投与することができる。好ましい実施形態では、β遮断薬は5〜20mg/kg、好ましくは約10mg/kg、さらに好ましくは10mg/kgの用量で投与される。
【００８９】
好ましい実施形態では、β遮断薬は毎日、例えば、20〜28時間ごとに、好ましくは24時間ごとに投与される。
【００９０】
β遮断薬はあらゆる適切な経路によって投与することができ、これは当業者には公知であろう。好ましい実施形態では、β遮断薬は腹腔内に投与される。
【００９１】
一実施形態では、本発明に従ったペプチド又は組成物は、抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬と同時に投与される。代わりの実施形態では、本発明に従ったペプチド又は組成物は、抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬とは異なる時間に投与される。
【００９２】
本発明の一態様では、ペプチド/組成物が投与される(又は投与することが意図される)対象は既に抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬を服用している。したがって、本発明は、対象が抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬を現在服用している、又は既に服用してきた本発明の使用を包含する。
【００９３】
本発明のさらなる態様では、対象はグレーブス病のいかなる治療薬も現在服用していない、及び/又はこれまで服用していない。
【００９４】
本明細書で考察される本発明の一態様では、第1ステップとして、グレーブス病に罹っている又はこれを発症するリスクのある対象が同定される。
【００９５】
本発明に従ったペプチド又は組成物は、予防的使用又は治療的使用のためのものでもよい。
【００９６】
予防的使用のために投与される場合、ペプチド又は組成物はTSHRに対する免疫応答の誘発を減少させる又は予防することができる。その免疫応答のレベルは、患者を組成物で処置しなかった場合に得られたであろうよりも低い。用語「減少」は、患者が組成物で処置されなかった場合に観察されていたと考えられる応答の(又は同じ期間にわたる非処置患者において観察される応答の)50%、70%、80%又は90%減少などの免疫応答の部分的減少が観察されることを示す。用語「予防」はTSHRに対する認識可能な免疫応答が観察されないことを示す。
【００９７】
治療的使用のために投与される場合、ペプチド又は組成物はTSHRに対する既に進行中の免疫応答を抑制することができる。用語「抑制」は、ペプチド処置前のレベル、又は処置が与えられなかった場合に同じ時点で観察されたと考えられるレベルと比べて、進行中の免疫応答のレベルの減少を示している。
【００９８】
本発明のペプチド又は組成物を用いて処置すれば、以下：
i)TSHR自己抗体
ii)TSHRに特異的なCD4+T細胞
iii)TSHR自己抗体を分泌するB細胞
のうちのいずれか又はすべてのレベルの減少を引き起こし得る。
【００９９】
その因子のすべての検出は、ELISA、フローサイトメトリーなどの当技術分野で公知の技法により実行することが可能である。
【０１００】
本発明のペプチド又は組成物を用いて処置すれば、TSHRに特異的なCD4+T細胞においてアネルギーを引き起こすこともできる、或いは引き起こす。アネルギーは、例えば、in vitroでのTSHRを用いたその後のチャレンジにより検出することが可能である。
【０１０１】
製剤化
本ペプチド又は組成物は、注射液として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射に先立つ液体中の溶液、又は液体中の懸濁液に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化することもできるし、又はペプチドをリポソームに封入することもできる。活性成分は、薬学的に許容可能であり活性成分と適合する賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水(例えば、リン酸緩衝食塩水)、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど及びその組合せである。
【０１０２】
さらに、必要であれば、組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤及び/又はpH緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。緩衝塩には、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩が含まれる。塩酸及び/又は水酸化ナトリウムはpH調整のために使用することができる。安定化のためには、スクロース又はトレハロースなどの二糖類を使用することができる。
【０１０３】
組成物中、ペプチド(RNB-5D-K1及びRNB-9B)の相対比率はおおよそ1対1であってよい。あるいは、例えば、免疫寛容原性応答を特定のサブセットの自己反応性T細胞に集中させるために又は1つのペプチドが他のペプチド、特にHLAタイプよりもよく機能することが見出される場合には、それぞれのペプチドの相対比率は変えることができる。
【０１０４】
製剤化後、ペプチド又は組成物は無菌容器に収めることができ、これはその後密封され低温、例えば、4℃で保存されるか、又は凍結乾燥することができる。
【０１０５】
都合がよいことに、ペプチド又は組成物は凍結乾燥(フリーズドライ)粉末として調製される。凍結乾燥すれば安定化した形態での長期保存が可能になる。凍結乾燥手順は当技術分野では周知であり、例えば、http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html.を参照されたい。マンニトール、デキストラン若しくはグリシン、又はトレハロースなどの糖などの充填剤が凍結乾燥に先立って一般に使用されている。
【０１０６】
ペプチド又は組成物は、経口、静脈内(水溶性の場合)、筋肉内、皮下、舌下、鼻腔内、皮内又は坐薬経路又は移植(例えば、緩効性分子を使用して)によるなどの便利な様式で投与することができる。
【０１０７】
ペプチド又は組成物は、有利なことに、鼻腔内、皮下又は皮内経路を介して投与することができる。
【０１０８】
本発明の方法、ペプチド及び組成物を使用してヒト対象を処置することができる。典型的には、医者が個々の対象に最も適している実際の投与量を決定することになり、その投与量は特定の患者の年齢、体重及び応答と共に変わる。
【０１０９】
本発明のペプチド及び組成物を使用してヒト対象を処置することができる。対象はグレーブス病に罹っていてもよい。対象はTSHR自己抗体を有し得る。
【０１１０】
対象は阻害性THSR自己抗体を発症する素因と関連するHLAハプロタイプであってよい。対象は、HLA-DR3又はHLA-DR4を発現していてよい。個体のHLAハプロタイプを決定するための方法は当技術分野では公知である。
【０１１１】
好ましい実施形態では、複数の用量が上昇濃度で患者に与えられる「用量漸増」プロトコルに従うことができる。そのようなアプローチは、例えば、ハチ毒アレルギーに対する免疫療法適用においてホスホリパーゼA2ペプチドについて使用されてきた(Mullerら、(1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747〜754ページ及びAkdisら、(1998) J. Clin. Invest. 102:98〜106ページ)。
【０１１２】
キット
都合の良いことに、2つのTSHRペプチドは、混合した組成物又はカクテルの形態で一緒に投与することができる。しかし、同時、別々、逐次又は組合せ投与のために、ペプチドをキットの形態で別々に提供することが好ましい状況があり得る。
【０１１３】
例えば、キットは2つのペプチドを別々の容器に含むことができる。容器の内容物は投与に先立って組み合わせてもよいし、組み合わせなくてもよい。
【０１１４】
キットは混合及び/又は投与手段(例えば、鼻腔内投与のための気化器、又は皮下/皮内投与のための注射器と針)も含むことができる。キットは使用説明書も含むことができる。
【０１１５】
本発明の医薬組成物又はキットを使用すれば疾患を治療する及び/又は予防することができる。
【０１１６】
特に、組成物/キットを使用すればTSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防することができる。組成物/キットを使用すれば、対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防することができる。
【０１１７】
動物モデル
グレーブス病の現在の動物モデルは種々の欠点と関連している。例えば、現在使用されている動物モデルはグレーブス病と関係する症状又は特徴を発症しない。さらに、利用可能な動物モデル、例えば、BALB/cマウスで開発されたモデルは、グレーブス病の承認された治療法に対する応答について試験されていない。
【０１１８】
したがって、グレーブス病の現在の動物モデルは潜在的な治療法の研究には最適ではない。
【０１１９】
本発明者らは、驚くべきことに、ヒトHLA-DR3に関してトランスジェニックである動物が潜在的治療法の研究に適切なバックグラウンドを提供することを見出した。したがって、さらなる態様では、本発明は、動物がヒトHLA-DR3のトランスジェニックであり対照動物と比べて増加したレベルのTSHRを含む、TSHR抗体の産生に関連する疾患の動物モデルを提供する。
【０１２０】
用語「増加したレベルのTSHR」は、完全長TSHR配列のいずれか、例えば、TSHRペプチドの増加したレベルを包含することが意図されている。
【０１２１】
TSHRのレベルは適切な対照動物(例えば、ヒトHLA-DR3のトランスジェニックであるがTSHRが増加していない動物)よりも増加している。TSHRのレベルは、あらゆる適切な手段によって、例えば、TSHRペプチドをコードする核酸を含むベクターを投与することにより増加させることができる。好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０１２２】
さらなる実施形態では、本発明は、TSHR抗体の産生と関連する疾患の動物モデルを作製するための方法であって、ヒトHLA-DR3のトランスジェニックである動物においてTSHRのレベルを増加させることを含む前記方法を提供する。
【０１２３】
好ましい実施形態では、その方法は、TSHRペプチドをコードする核酸を含むベクターを導入することによりTSHRのレベルを増加させることを含む。さらに好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０１２４】
動物モデルはTSHR抗体の産生に関連する疾患に関係する特徴を有する。例えば、本動物モデルでは、TSHR抗体のレベルは、TSHRのレベルが増加していない同等な対照動物と比べて増加している。TSHR抗体のレベルは、TSHR抗体のレベルが増加していない同等な対照動物と比べて少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、100倍又は1000倍増加してもよい。
【０１２５】
TSHR抗体のレベルは、当技術分野で公知である標準法、例えば、ELISAアッセイを使用して決定することができる。TSHR抗体のレベルは、試料においてin vitroで決定することができる。例えば、試料は血清試料であってよい。
【０１２６】
「ヒトHLA-DR3のトランスジェニック」とは、動物がヒトMHCクラスII細胞表面分子HLA-DR3を発現していることを意味する。トランスジェニック動物は当技術分野では周知である適切な方法を使用して作製することができる。
【０１２７】
「TSHR抗体の産生に関連する」とは、TSHR抗体が疾患病因に寄与していることを意味する。例えば、TSHR抗体のレベルは、疾患の非存在下でのレベルと比べて疾患において増加し得る。TSHR抗体に関連する疾患はグレーブス病であってよい。
【０１２８】
TSHRはヒトTSHRであってよい。例えば、TSHRはヒトTSHR Aサブユニット又はその一部であってよい。
【０１２９】
TSHRをコードする核酸は、例えば、本明細書に記載されるTSHR配列に基づいて、当技術分野で周知の方法を使用して提供することができる。
【０１３０】
核酸は天然でも合成でも組換えでもよい。核酸は二本鎖でも一本鎖でもよく、DNAでもRNAでもその組合せでもよい。例えば、核酸はcDNA、PCR産物、ゲノム配列又はmRNAでもよい。
【０１３１】
ヌクレオチド配列は、選ばれた宿主/宿主細胞における産生のために最適化されたコドンであってよい。
【０１３２】
TSHRをコードするヌクレオチド配列の送達はウイルス感染により媒介することができる。適切なウイルスベクターは当技術分野では周知である。例えば、ウイルスベクターはアデノウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスでもよい。
【０１３３】
特に、ウイルスベクターはアデノウイルスであってよい。
【０１３４】
動物モデルの作製はベクターの複数の投与を含むことができる。
【０１３５】
ベクター、例えば、アデノウイルスは3週間間隔で投与することができる。例えば、ベクターは18〜25、18〜23、19〜23又は20〜22日の間隔で投与することができる。ベクターは20、21又は22日の間隔で投与することができる。
【０１３６】
動物モデルは少なくとも2回アデノウイルスベクターを投与することを含み得る。例えば、アデノウイルスベクターは2回又は3回投与してもよい。特に、動物モデルはアデノウイルスベクターを2回投与することを含み得る。
【０１３７】
動物モデルは、投与間の間隔が3週間で2回ベクターを投与することを含み得る。
【０１３８】
ベクター、例えば、アデノウイルスは投与当たり108〜1011個のウイルス粒子の用量で投与することができる。特に、アデノウイルスは投与当たり109〜1011個のウイルス粒子の用量で投与することができる。アデノウイルスは投与当たり109個のウイルス粒子の用量で投与することができる。
【０１３９】
ベクターはあらゆる適切な手段によって投与することができる。例えば、アデノウイルスベクターの場合、ベクターは筋肉内注射により投与することができる。
【０１４０】
動物は哺乳動物であってよい。例えば、動物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット又は霊長類でもよい。好ましくは、動物はマウスである。
【０１４１】
一実施形態では、マウスは混合型遺伝的背景のHLA-DRA1*01:01及びHLA-DRB1*03:01トランスジェニックマウスである。そのようなマウスを作成するための手段は当業者には公知であろう。
【０１４２】
例としては、実施例のセクションに記載されるマウスモデルは以下のアプローチを使用して作製した。pUC中のHLA-DRAゲノムクローンの6kb NdeI断片とB遺伝子を含有するcos4.1の24kb ClaI×SalI断片をC57BL/6雄と交配させた(C57BL/6×DBA/2)F1ドナー由来の受精卵に同時注入した。子孫は後に、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)へと育種した。これらのDR3tgマウスはHLA-DR3分子を発現するが、マウスMHC-II分子は発現しない。この方法は網羅的ではなく、例えば、C57BL/10背景のHLA-DR3トランスジェニックマウスを作製するための代替方法が当技術分野では公知である。
【０１４３】
本発明はここで実施例によりさらに説明されるが、この実施例は当業者が本発明を実施するのを支援するために役立つことを意味しており、本発明の範囲を限定することを決して意図していない。
【実施例】
【０１４４】
[実施例1]
ATX-GD-59はTSHR特異的T細胞寛容を誘導しHLA-DR3トランスジェニックマウスの動物モデルにおいて抗TSHR抗体力価を減少させる
材料、方法及び手順
マウス
DR3tgマウスは外部のCharles River、UK又はInnoSer、NLにおいて特定病原体不含条件下で飼育された。DR3tg系統はもともとStrauβらにより作り出された。簡単に説明すると、使用されたゲノム構築物は、pUC13中のHLA-DRAゲノムクローンの6kb NdeI断片及びDRB1*0301のB遺伝子を含むコスミド(pTCF)であるcos4.1の24kb ClaI×SalI断片であった。それぞれの構築物を1〜2μg/mL含有する溶液を、C57Bl/6雄と交配した(C57Bl/6×DBA/2)F1ドナー由来の受精卵への同時注入のために使用した。子孫は、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)へと育種した。これらのDR3tgマウスはヒトMHCクラスIIであるHLA-DR3分子を発現するが、マウスMHCクラスII分子は発現しない。トランスジェニックマウスは、DRA cDNAの1.35kb Bam HI断片及びDRB1*0301 cDNAの1.25kb Bam HI断片でプローブされた、Eco RIで消化された尾部DNAのサザンブロット分析により特定された。このMHCクラスII分子がグレーブス病に対する増加した感受性と関連があることが示唆されてきたことから、DR3tgマウスはこれらの実験のために使用された。
【０１４５】
動物実験はハッセルト(Hasselt)大学の「動物実験倫理委員会」により承認され、無菌施設において標準ケアを用いて実施された。
【０１４６】
抗原
ペプチドはPolyPeptide Laboratories(PPL;ストラスブール、フランス)により合成され、-20℃でPBS中8mg/mlのストック溶液にて保存された。製造工程は、ペプチドの構築において構成要素(building block)としてN-α-Fmoc保護アミノ酸を利用する固相ペプチド合成に基づいている。C末端残基はFmoc-lys(Boc)-MPPAリンカーの一部としてMBHA樹脂に結合される。その他のアミノ酸は、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込まれる。図面の説明はPPLペプチドがいつ使用されたかを示している。
【０１４７】
あるいは、ペプチドはGL Biochemistry Ltd(GLS;上海、中国)により又はSevern Biotech Ltd(Severn、Kidderminster、Worcs.、UK)により合成され、-80℃でDMSO(Sigma-Aldrich)中20mg/mLのストック溶液にて保存された。ペプチドは、N末端遊離アミンとC末端アミドを用いたF-moc化学を使用して合成された。異なるペプチド供給業者が実験ごとに示されている。
【０１４８】
ペプチドは、単一ペプチド(9B-N、5D-K1)として又はペプチドカクテルATX-GD-59としての処置のために使用された。ATX-GD-59は9B-Nと5D-K1の等モル混合物であり、ATX-GD-59の指定された用量は個々のペプチド含有量を指しており、すなわち、投与される総ペプチド量は指定された処置用量の２倍である。
【０１４９】
TSHRのヒト組換え細胞外ドメイン(TSHR-ECD、AA19-417)は、Chesapeake PERL(Savage、USA)によるChesapeake PERL technology PERLXpressを使用してイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)幼虫発現系において産生された。それぞれのロットのTSHR-ECDのタンパク質品質はSDS-PAGEゲル及びウェスタンブロット分析により評価された。
【０１５０】
アデノウイルスベクターはViraquest(North Liberty、IA、USA)から購入した。TSHRアミノ酸残基1〜289を含有するアデノウイルス(Ad-TSHR)の構築及び精製は以前に記載されている。簡単に説明すると、アデノウイルスAd-TSHR、及びβガラクトシダーゼを発現する対照構築物(Ad-LacZ)はHEK293細胞中で増殖させ、CsCL密度勾配遠心分離により精製した。ウイルス粒子濃度は260nmでの吸光度を測定することにより決定された。
【０１５１】
Ex vivo寛容化実験
DR3tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μg(最高用量/ペプチド)の可溶性ペプチド(5D-K1又は9B-N)を3回注射した(用量漸増スケジュール)。ATX-GD-59はペプチド5D-K1(配列番号1)と9B-N(配列番号2)の等モル混合物であり、言及されている最高用量(nmol)はカクテル中のペプチド当たりである。100μgのペプチド用量は約45nmolに相当するがそれは両システムが異なる実験において使用されたからである。ペプチドはPBS中皮下に投与された。最高用量/ペプチドの変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは、完全フロイントアジュバント(CFA;不完全フロイントアジュバント(Difco)中2mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco Laboratories、ミシガン、US))中に乳化させた親ペプチド(非改変5D及び/又は9B)に相当する50μgを用いて尾の基部に皮下的に免疫した(100μl CFA(100μg H37RA)中50μgペプチド/注射)。免疫の10日後、所属リンパ節(LN)(draining LN)及び脾臓を収穫した。LN細胞及び脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいて2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza、Verviers、ベルギー)を補充したX-vivo15培地で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、濃度範囲0〜25μg/mLのTSHR-ECDと一緒に、又は12.5μg/mLの精製タンパク質誘導体(PPD;免疫対照;Statens serum institut、コペンハーゲン、デンマーク)と一緒に72時間培養した(200μL/ウェル)。5% CO2の37℃インキュベーター中で72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃及び5% CO2でインキュベートし、16時間後プレートを凍らせた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)で読み取って細胞増殖を評価した。
【０１５２】
GDのアデノウイルス動物モデル
DR3tgマウスに、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59又は対照処置を側腹領域に皮下的に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に22.5nmolのATX-GD-59(最高用量/ペプチド)又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。
【０１５３】
0日目、マウスはAd-TSHR又はAd-LacZ(1010ウイルス粒子)を大腿筋の筋肉内に注射した。すべてのマウスは実験ごとに同じバッチのアデノウイルスを使用して同時に免疫した。マウスは3週間間隔(0週目及び3週目)で2回注射し、図2に示されるプロトコルに従って異なる時点で採血した。マウスは最初の免疫の5週間後に安楽死させ血液、脾細胞及び甲状腺を得た。脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいて2mMのグルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza、Verviers、ベルギー)を補充したX-vivo15培地で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる濃度のTSHR-ECD(0〜25μg/ml)と一緒に72時間培養した(200μl/ウェル)。5% CO2の37℃インキュベーターにおいて72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)上で読み取って細胞増殖を評価した。
【０１５４】
抗TSHR抗体の検出
精製組換えTSHR-ECD(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)はELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温(RT)で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tween20で洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1% BSA(w/v)でブロックし、被験血清(1対50又は1対500希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体のを検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジン(TMB)を用いて発色させた。光学密度(OC)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)で測定した。
【０１５５】
刺激性抗TSHR抗体(TSAb)の検出
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞は、M. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された9。細胞は、2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン、50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%チャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地を取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(relative light units(RLU); 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
【０１５６】
甲状腺機能亢進の検出
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。
【０１５７】
結果
単一ペプチド処置はTSHR特異的T細胞寛容を誘導する
単一ペプチド5D-K1及び9B-Nの免疫寛容原性効果を判定するため、HLA-DRトランスジェニックマウスを、先ずペプチドのうちの1つを単独で用いて用量漸増スケジュールに従って処置した。第1の実験では、DR3tgマウスは、方法のセクションに記載される通りに5D-K1又は対照処置を受けた。この改変されたアピトープを用いた前処置により、TSHR誘導T細胞増殖は、対照処置動物と比べた場合、脾臓試料で43%、LN試料で60%減少した(図1及び2参照)。
【０１５８】
ペプチド9B-Nの免疫寛容原性能力を調べるため、DR3tgマウスを9B-N又はPBSで処置した。この研究により、9B-Nを用いた前処置がTSHRに対するT細胞増殖を脾臓及びLN試料においてそれぞれ41%及び33%有意に減少させることが示された。
【０１５９】
組合せペプチド処置はTSHR特異的T細胞寛容を誘導する
個々のペプチド5D-K1又は9B-Nを用いたペプチド処置がマウスにおいてTSHR特異的リンパ球増殖を減少させるという知見は、組合せ処置が、すなわちペプチドをカクテルとして投与することにより、TSHR特異的応答を同様に減少させることが可能かどうかを調べることにつながった。DR3tgマウスを用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-59で処置し、CFA中の両方の親非改変ペプチドを含む乳濁液で免疫した。3種のATX-GD-59最高用量(15、22.5及び45nmol/ペプチド)をその潜在的に異なる寛容化能(tolerizing capacity)について試験したが、処置用量間では差を観察することはできなかった(データは示していない)。代表的な結果は図3に示されており、ATX-GD-59処置が有意なレベルのTSHR特異的寛容を誘導することが示された。TSHR誘導増殖は、脾細胞及びLN細胞においてそれぞれ58%及び54%減少した。
【０１６０】
組合せペプチド処置はアデノウイルスベースのグレーブス病動物モデルにおいて抗TSHR抗体産生を減少させる
ATX-GD-59の治療効果を実証するため、ATX-GD-59を用いたペプチド処置がTSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体の誘発などのグレーブス病パラメータの存在を抑制することができるかどうかを調べた。DR3tgマウスは用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-59又は対照処置を受け、続いてAd-LacZ又はAd-TSHRウイルス粒子を用いて2回免疫された。先ず、TSHR特異的脾細胞増殖に対するATX-GD-59処置の効果を調べた。Ad-LacZ免疫マウスの脾細胞はin vitro TSHR再刺激しても増殖しない(データは示していない)。対照処置Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるTSHR特異的脾細胞の絶対増殖値は低いが用量依存的に増加する。図4に示されているように、22.5nmol最高用量/ペプチドを用いたATX-GD-59処置ではTSHR特異的脾細胞増殖を40%超、顕著に減少させることができた。15nmolのそれぞれのペプチドを用いたATX-GD-59処置では類似の結果を示した(データは示していない)。繰り返し実験ではATX-GD-59処置の類似する寛容化効果が観察され(データは示していない)、それによってこれらの結果の再現性が確かめられた。
【０１６１】
次に、抗TSHR抗体誘発に対するATX-GD-59処置の効果を調べた。血清試料を採取してELISAにより抗THSR IgGレベルを測定した。ATX-GD-59ペプチド前処置の前(W-2、データは示していない)及び後(W0)に抗TSHR IgG抗体は存在していなかった(図5)。増殖データと一致して、Ad-LacZ対照免疫マウスにおいて抗TSHR抗体は検出されなかった。最初のAd-TSHR免疫後の2週間でペプチド対照処置マウスにおいて高い抗TSHR IgGレベルが観察された。ATX-GD-59処置は、Ad-TSHR免疫の際にペプチド対照処置マウスにおいて見られる抗TSHR抗体の増加を2週目に95%減少させた。さらに、抗TSHR IgGレベルはATX-GD-59ペプチド処置により5週目でもまだ93%減少していた。
【０１６２】
抗TSHR抗体レベルの減少をさらに調べるため、異なる抗TSHRアイソタイプ抗体に対するATX-GD-59処置の効果を調べた。1010ウイルス粒子でのAd-TSHR免疫は、アイソタイプIgG2b及びIgG2cの高レベルの抗TSHR抗体を誘導した。図6は、ATX-GD-59がAd-TSHR免疫マウスにおいてIgG1、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体を有意に減少させ、それにより図5に示される総IgG抗体レベルのパターンと相関していることを示している。ATX-GD-59処置の15nmolと22.5nmol用量処置レジームの両方が2つの独立した実験で2回試験され、それらは抗TSHR総IgG及びIgGアイソタイプレベルを有意に減少させ(15nmol用量のデータは示されていない)、それによって両方の用量がアデノウイルスベースのGDモデルにおいて効力を有することを示した。
【０１６３】
総合すると、これらの結果は、予防的ATX-GD-59処置が、ex vivo寛容モデルにおいてTSHR特異的T細胞寛容を誘導し、アデノウイルス性グレーブス病モデルにおいて抗TSHR抗体レベルを減少させるのに効果的であることを示している。
【０１６４】
[実施例2]
ATX-GD-459と臨床的に使用されているグレーブス病薬の共薬物療法
材料及び方法
マウス
DR3tgマウスは外部のCharles River、UKにおいて特定病原体不含条件下で飼育された。DR3tg系統はもともとStraussらにより作り出された(Straussら、1994、Immunogenetics 3、104〜108ページ)。簡単に説明すると、使用されたゲノム構築物は、pUC13中のHLA-DRAゲノムクローンの6kb NdeI断片及びDRB1*0301のB遺伝子を含むコスミド(pTCF)であるcos4.1の24kb ClaI×SalI断片であった。それぞれの構築物を1〜2μg/mL含有する溶液を、C57BL/6の雄と交配した(C57BL/6×DBA/2)F1ドナー由来の受精卵への同時注入のために使用した。子孫は、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)に後に育種された。これらのDR3tgマウスはHLA-DRB1*0301分子を発現するが、マウスMHC-II分子を発現しない。マウスはC57BL/6へ及びB10.Qへ戻し交配することにより維持した。トランスジェニックマウスは、DRA cDNAの1.35kb BamHI断片及びDRB1*0301 cDNAの1.25kb BamHI断片でプローブされた、Eco RIで消化された尾部DNAのサザンブロット分析により特定された。このMHCクラスII分子が個体がグレーブス病を発症するリスクの増加と関連があることが示唆されてきたことから、DR3tgマウスはこれらの実験のために使用された。
【０１６５】
DR4マウス系統は、もともとLars Fuggerら(PNAS 1994 91巻:6151〜55ページ)により作り出され、その際はHLA-DRA*0101/HLA-DRB1*0401構築物及びmCD3-huCD4c/g構築物を(DBA/1×A/CA)F1交配由来の胚に同時マイクロインジェクションし、生きた胚を偽妊娠雌(BALB/c×129)F1内に出産予定日まで成長させるために移入した。子孫は、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウト遺伝的背景(AB0マウス)に後に育種された。したがって、これらのDR4マウスにおいて発現される唯一のMHCクラスII分子はヒトHLA DR4分子である。
【０１６６】
BALB/cJOlaHsdマウスはHarlan Laboratories(Venray、オランダ)から入手した。
【０１６７】
動物実験はハッセルト(Hasselt)大学の「動物実験倫理委員会」(ECD)により承認され、無菌施設において実施された。
【０１６８】
抗原
単一ペプチドはすべてGL Biochem Ltd(上海、中国)により合成され、-80℃でDMSO(Sigma-Aldrich)中20mg/mlのストック溶液で保存された。ペプチドは、N末端遊離アミンとC末端アミドを用いて合成された。
【０１６９】
ATX-GD-459ペプチド(これらのペプチドの考察については実施例3を参照)はPolyPeptide Laboratories(ストラスブール、フランス)により合成され、-20℃でPBS中8mg/mlのストック溶液で保存された。製造工程は、ペプチドの構築において構成要素としてN-α-Fmoc保護アミノ酸を利用する固相ペプチド合成に基づいている。C末端残基はFmoc-lys(Boc)-MPPAリンカーの一部としてMBHA樹脂に結合される。その他のアミノ酸は、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルにより組み込まれる。
【０１７０】
TSHRのヒト組換え細胞外ドメイン(TSHR-ECD、AA19-417)は、Chesapeake PERL(Savage、USA)によるChesapeake PERL technology PERLXpressを使用してイラクサギンウワバ幼虫発現系において産生された。それぞれのTSHR-ECDロットのタンパク質品質はSDS-PAGEゲル及びウェスタンブロット分析により評価された。
【０１７１】
アデノウイルスベクターはViraquest(North Liberty、IA、USA)から購入した。TSHRアミノ酸残基1〜289を含有するアデノウイルス(Ad-TSHR)の構築及び精製は以前に記載されている(Chenら、1999 J Clin Endocrinol Metab 84:3182〜3186ページ)。簡単に説明すると、アデノウイルスAd-TSHR及びβガラクトシダーゼを発現する対照アデノウイルス(Ad-LacZ)はHEK293細胞中で増殖させ、CsCL密度勾配遠心分離により精製した。ウイルス粒子濃度は260nmでの吸光度を測定することにより決定された。
【０１７２】
アデノウイルスベースのGD動物モデルにおけるATX-GD-459と臨床的に使用されるGD薬の共薬物療法
DR3tgマウス(n=9〜10/群)は、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459ペプチド(最高用量)又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応して用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。最初のペプチド処置の日に開始して実験の終了まで、マウスはMMI又はプロプラノロールで処置された。MMI(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)は所望の濃度で減菌水に溶解され、ALZET浸透圧ポンプ(model 1004、0.11μL/時;Charles River、フランス)により皮下投与により1日量500μgをマウスに与えた。新しい浸透圧ポンプは4週間後に植え込まれた。塩酸プロプラノロール(Sigma-Aldrich)は0.9%生理食塩水に新たに溶解され、10mg/kg/日の用量で毎日腹腔内(IP)注射を介して投与された。0日目、マウスは、109又は1010Ad-TSHRウイルス粒子を用いた筋肉内注射により免疫され、免疫は3週間後に繰り返された。体重は毎週ベースで記録されてマウスの健康状態を測定した。マウスは最初の免疫の5週間後に安楽死させ血液、甲状腺及び脾臓試料を得た。TSHR誘導脾細胞増殖、サイトカイン分泌及び抗TSHR抗体レベルは下記の通りに評価された。
【０１７３】
抗TSHR抗体の検出
精製組換えTSHR-ECD(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)はELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温(RT)で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tween20で洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1% BSA(w/v)でブロックし、被験血清(1対50又は1対500希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体を検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジンを用いて発色させた。光学密度(OC)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)で測定した。
【０１７４】
刺激性抗TSHR抗体(TSAb)の検出
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞はM. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された6。細胞は、2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン、50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%のチャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地は取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(RLU; 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
【０１７５】
甲状腺機能亢進の検出
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。
【０１７６】
脾細胞増殖アッセイ
脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいて2mMのグルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza、Verviers、ベルギー)を補充したX-vivo15培地で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる濃度のTSHR-ECD(0〜25μg/ml)と一緒に72時間培養した(200μL/ウェル)。5% CO2の37℃インキュベーターにおいて72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
【０１７７】
結果
アデノウイルスベースGDモデルにおけるMMIとATX-GD-459の共薬物療法
ATX-GD-459処置をMMIと組み合わせてGD症状を治療することができるかどうかを検証するため、MMI及びATX-GD-459の共薬物療法の効果を、アデノウイルスベースのGD動物モデルにおいて調べた(モデルのさらなる考察につては実施例4及び5参照)。この実験では、DR3tgマウスはMMIとATX-GD-459の以下の組合せ：ビヒクル+対照ペプチド、MMI+対照ペプチド、ビヒクル+ATX-GD-459又はMMI+ATX-GD-459を用いて処置した。ATX-GD-459又は対照ペプチドを用いた処置は、用量漸増スケジュールに従って実験の最初の2週間に投与された(図8)。皮下ビヒクル又はMMI処置は同時に開始したが実験の終了まで続いた。この実験デザインは、GD様疾患パラメータに対するMMIとATX-GD-459処置の互恵的影響を調べることを可能にした。
【０１７８】
第1に、TSHR特異的脾細胞増殖に対するMMI及びATX-GD-459処置の効果を調べた。絶対TSHR特異的脾細胞増殖値は対照処置マウスでは比較的低かった(図10)。しかし、これらの値は、以前実施された実験(データは示していない)又はプロプラノロール実験の他のすべての対照群よりもこの実験においてはるかに高かった。したがって、図10に描かれているような、MMI又はATX-GD-459処置により引き起こされるTSHR特異的脾細胞増殖の有意な減少は慎重に解釈するべきである。
【０１７９】
TSHR誘導脾細胞増殖の次に、抗TSHR IgG血清レベルをすべてのマウスで測定した。実験開始前、マウスのいずれにおいても抗TSHR IgG抗体は検出されなかった(データは示していない)。0週目で測定した場合、ATX-GD-459の用量漸増処置は抗TSHR抗体のいかなる産生も誘導しなかった(図11)。Ad-TSHR免疫は対照ペプチド処置マウスでは抗TSHR抗体の産生を誘起したが、ATX-GD-459処置マウスでは誘起しなかった。対照処置マウス間のかなりの変動のせいで有意に異なってはいなかったが、ATX-GD-459前処置は平均抗TSHR抗体産生を90%以上減少させた。これとは対照的に、MMI処置は抗TSHR抗体レベルに対して何の効果もなかった。さらに、MMI処置はATX-GD-459ペプチド処置の抗体低減能力に影響を及ぼさなかった。
【０１８０】
抗TSHR抗体プロファイルを、特定のIgGアイソタイプを測定することによりさらに調べた。図12に示されるように、Ad-TSHR免疫マウスはどれもIgG1アイソタイプの抗TSHR抗体を産生しない。Ad-TSHR免疫は対照ペプチド処置マウスでは抗TSHR IgG2b及びIgG2c抗体の産生を誘導したが、ATX-GD-459処置マウスでは誘導しなかった。ATX-GD-459前処置は抗TSHR IgG2b及びIgG2c抗体両方の産生を90%以上減少させた。これとは対照的に、MMI処置は抗TSHR IgGアイソタイプのいずれに対しても効果はなく、ATX-GD-459処置の抗体低減能力に影響を及ぼさなかった。これらのデータは抗TSHR総IgG抗体について観察されたプロファイルと完全に一致している。
【０１８１】
アイソタイプ測定に加えて、抗TSHR抗体の生物活性及びそれに対するMMI又はATX-GD-459の潜在的効果を調べた。Ad-TSHR免疫マウスのいずれによっても刺激性抗体の閾値を超えなかったので(データは示していない)、刺激性抗体の発生率に対するMMI又はATX-GD-459処置の効果に関して結論は出なかった。刺激性抗体の低発生率は以前に記載された実験(report ATX-GD-15-003)と一致している。
【０１８２】
最後に、T4レベルに対するMMI及びATX-GD-459処置の効果を調べた。この実験では免疫対照としてAd-LacZ免疫を使用しなかったので、甲状腺機能亢進の発生率を決定することができなかった。甲状腺機能亢進のレベルに関する情報は入手できないが、MMI処置がT4レベルを有意に減少させたことは結果が明白に示した(図13)。しかし、ATX-GD-459前処置は血清T4レベルに何の効果もなかった。さらに、ATX-GD-459前処置はMMIのT4低減能力に何の影響も及ぼさなかった。
【０１８３】
総合すると、これらのデータは、MMIとATX-GD-459処置は互いの機能を妨害せず、アデノウイルスベースのGDモデルにおいて安全に組み合わせることが可能であることを示している。
【０１８４】
アデノウイルスベースGDモデルにおけるプロプラノロールとATX-GD-459の共薬物療法
GD患者は多くの場合β遮断薬を使用して甲状腺機能亢進のアドレナリン性症状と戦っている。したがって、アデノウイルスベースGDモデルにおけるATX-GD-459とβ遮断薬プロプラノロールを用いた共薬物療法の効果をこの実験では調べた。先ず、TSHR特異的脾細胞増殖を調べた。図14に示されるように、プロプラノロールもATX-GD-459処置もTSHR特異的脾細胞増殖に対して有意な効果を誘導しなかった。プロプラノロールとATX-GD-459の併用処置も増殖応答に何の効果もなかった。
【０１８５】
次に、抗TSHR抗体誘発に対するプロプラノロール及びATX-GD-459処置の効果を調べた。血清試料を採取してELISAにより抗THSR IgGレベルを測定した。ATX-GD-459ペプチド前処置の前(W-2)及び後(W0)に抗TSHR IgG抗体は存在しなかった(図15)。Ad-TSHR免疫は対照ペプチド処置マウスでは抗TSHR抗体の強力な産生を誘導したが、ATX-GD-459処置マウスではより少ない程度しか誘導しなかった。注目すべきことに、この実験で使用された1010ウイルス粒子を使用するAd-TSHR免疫は以前の実験で使用した109Ad-TSHR免疫よりも高い抗TSHR抗体価を引き起こした(データは示していない)。ATX-GD-459処置は、免疫後のW2とW5で測定した場合は両方とも、抗TSHR抗体産生を90%以上減少させた。これとは対照的に、プロプラノロール処置は抗TSHR抗体レベルに対し何の効果もなかった。さらに、プロプラノロール処置はATX-GD-459ペプチド処置の抗体低減能力に影響を及ぼさなかった。
【０１８６】
次に、抗体プロファイルをさらに調べるために、抗TSHR IgGアイソタイププロファイルを決定した。IgG2b及びIgG2cレベルよりも低いが、抗TSHR IgG1抗体は明らかにAd TSHR免疫により誘導された。これらのデータは以前の実験における抗TSHR IgG1抗体の非存在と対照的である(データは示していない)が、免疫で使用された109から1010へのアデノウイルス粒子用量の増加により説明することが可能である。図16に示されるように、ATX-GD-459処置は抗TSHR IgG2b及びIgG2c抗体レベルを有意に減少させた。抗TSHR IgG1抗体価もペプチド処置により減少したが、有意なレベルではなかった。ペプチド処置とは対照的に、プロプラノロール処置は抗TSHR IgGアイソタイプのいずれに対しても効果はなかった。さらに、プロプラノロール処置はATX-GD-459処置の抗体低減能力に影響を及ぼさず、それにより抗TSHR総IgG抗体について観察されたプロファイルに完全に一致していた。
【０１８７】
総合すると、ATX-GD-459処置はこの動物モデルでは抗TSHR抗体価を有意に減少させた。しかし、いかなるGD様疾患パラメータに対してもプロプラノロール処置の効果は観察されなかった。毎日のIP投与がマウス血液中のプロプラノロールの薬理学的レベルを誘導したかどうかを検証するため、マウス血漿中のプロプラノロールレベルをLC-MSMS(Anacura)により測定した。血液試料は投与後の60分と90分の間に採取し、W0とW5の間で個々の血漿レベルを比較した。結果は図18に示している。
【０１８８】
[実施例3]
ATX-GD-459を用いたEx vivo T細胞寛容化
RNB-4K-GKK及びRNB-5D-K1ペプチドがアピトープであるかどうかを判定するためにRNB-4K及びRNB-5Dに特異的なハイブリドーマクローンを選択した。「抗原プロセシング独立提示(antigen processing independent presentation)」(APIPS)アッセイを実施し、RNB-4K-GKK及びRNB-5D-K1ペプチドがアピトープであることが確かめられた(図27)。
【０１８９】
表1に示されるペプチド群(ATX-GD-459と名付けられる)を含む組成物、又は単独で投与される個々のペプチドの、TSHRに対する寛容を誘導する能力を判定した。ex vivo寛容化プロトコルは図19に示されている。
【０１９０】
【表１】
2018502093.tif 000003
【０１９１】
HLA-DR3マウスは用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-459を用いて処置しCFA中の親ペプチド4K/5D/9Bを一緒に用いて免疫した。結果は、ATX-GD-459処置が、脾臓とLN細胞の両方で有意なレベルのTSHR特異的寛容を誘導したことを示した(図20)。ATX-GD-459処置により誘導される寛容の方が個々のペプチドの投与により誘導される寛容よりも大きかった(図20)。
【０１９２】
[実施例4]
アデノウイルスベースのグレーブス病モデルの確立
ATX-GD-459ペプチド処置の治療効果を検証するため、アデノウイルスベースの動物モデルを先ず野生型BALB/cマウスにおいて確立した。TSHR誘導脾細胞増殖、抗TSHR IgG抗体、T4の血清レベル及び甲状腺組織の病理変化を疾患症状のパラメータとして調べた。第1の実験では、BALB/cマウスを108個のAd-TSHRウイルス粒子を用いて免疫した。このウイルス用量は、甲状腺機能亢進及び抗TSHR抗体産生を誘導すると記載された(Chenら、2004、Endocrinology 145(11):4927〜4933ページ)が、2/10のマウスのみが(ボーダーライン)甲状腺機能亢進と考えられ、抗TSHR IgG抗体を産生したマウスはいなかった(データは示していない)。
【０１９３】
増加したウイルス粒子用量を使用する第2の実験では、Ad-TSHR免疫マウスの約30%が最初の免疫の4週間後に測定された血清T4レベルが上昇していた(図22)。しかし、10週目に観察された発生率はわずか15%であった。免疫後の数週間での最初の増加に続く野生型BALB/cマウスにおける上昇T4レベルのこの経時的な低下は以前記載されていた(McLachlanら、2012、Thyroid 8:1〜7ページ)。にもかかわらず、個々のマウスにおける明白な甲状腺機能亢進は、甲状腺上皮細胞の肥大化又はリンパ球浸潤などの甲状腺組織における組織病理学的所見とよく一致していた(データは示していない)。
【０１９４】
文献は、C57BL/6の遺伝的背景を持つマウス又はDR3tgマウスがグレーブス病様症状の発症に抵抗性のままであるという証拠を提供しているが、発明者らは混合型C57BL/10、DBA/2、C57BL/6非MHCクラスII遺伝的背景を持つDR3tgマウスにおいてグレーブス病様症状を誘導するAd-TSHR免疫化の能力を試験した。
【０１９５】
図23AはAd-LacZ及びAd-TSHR免疫DR3tgマウスにおける血清T4レベルを示している。4匹のAd-TSHR免疫マウスは、Ad-LacZ免疫マウスの平均+2SDよりも高いT4レベルを示したが、これらのマウスはボーダーラインの甲状腺機能亢進にすぎず、T4レベルの増加はペプチド処置効力の有効性を研究する場合に疾患パラメータとして使用するには低すぎると考えられた。
【０１９６】
Ad-TSHR免疫はDR3tgマウスの血清において高い抗TSHR IgG力価を誘導した(図11、右パネル)。最も高い抗TSHR IgGレベルには4週間で到達し、その後7週目及び10週目に抗体レベルは低下し、これはBALB/cマウスにおいて観察された安定した抗TSHR IgGレベルとは対照的である(図23C、左パネル)。DR3tgマウスの抗TSHR IgGレベルが最初の免疫の2週間後の方が4週間後よりもさらに高いという知見(データは示していない)により、アデノウイルス性グレーブス病モデルは10週間ではなく4週間で終了させることになった。
【０１９７】
[実施例5]
アデノウイルス性グレーブス病モデルの検証
DR3tgアデノウイルス性グレーブス病モデルを検証するため、アデノウイルス性グレーブス病モデルにおける抗TSHR抗体産生に対する異なる免疫調節薬の効果を調べた。抗甲状腺薬メチマゾール(MMI)は、グレーブス病患者において甲状腺ホルモンレベルを直接減少させるために現在使用されている。したがって、Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるMMI処置の効果が判定された。マウスにおけるMMIの甲状腺機能亢進誘導効果を記載している文献(Jeongら、2012、Endocrinology 153:683〜689ページ;Mozesら、1998、J. Clin Immunology 18(2):106〜113ページ)に基づいて、2つの異なるMMI用量(50〜500μg/マウス/日)を試験した。日用量500μgのMMIは最初の免疫後の2週間と4週間の両方でT4レベルを有意に減少させたが、一方で50μg用量はT4レベル減少傾向を示しただけであった(図24A)。Ad-TSHR免疫はこの実験(Ad-LacZ免疫マウスのデータは示していない)及び以前の実験において甲状腺機能亢進症を誘導しなかったが、MMI処置により誘導されるT4レベルの減少は、DR3tgマウスの甲状腺によるホルモン産生に影響を及ぼすことが可能であることを示している。
【０１９８】
その抗甲状腺機能に加えて、MMIは免疫調節効果も発揮する(Mozesら、1998、上記;Wangら、2003、J. Leukoc. Biol. 73:57〜64ページ)。したがって、MMI処置がAd-TSHR免疫マウスにおいて抗TSHR IgG産生を減少させることが可能かどうかを判定した。MMI処置はT4レベルを有意に減少させたが、抗TSHR IgGレベルの変化は観察されなかった(図24B)。
【０１９９】
グレーブス病患者、特にGO患者は、多くの場合、グルココルチコイドを用いた免疫抑制治療を必要とする。Ad-TSHR免疫マウスにおける抗TSHR抗体産生に対する合成グルココルチコイド薬であるメチルプレドニゾロンの効果を試験した。7mg/kg/日のメチルプレドニゾロンの処置はAd-TSHR免疫DR4tgマウスにおいて抗TSHR IgGレベルを有意に減少させ、一方で1mg/kg/日の用量は抗体価を下げるのに十分ではなかった(データは示していない)。Ad免疫DR3tgマウスの7mg/kg/日のメチルプレドニゾロン処置は、最初の免疫後の2週間で測定した場合は抗TSHR IgGレベルを有意に減少させたが、非処置マウスにおける抗TSHR抗体レベルの時間経過による自然な減少のせいで4週間では減少させていなかった。メチルプレドニゾロン処置は胸腺及び脾臓細胞数も減少させ、それはアデノウイルス性グレーブス病モデルにおける十分な薬理学的用量レベルを示していた(図25)。
【０２００】
これらのデータは、病気のDR3tgマウスにおけるアピトープの効力は、抗TSHR IgG抗体の減少を測定することにより判定することができることを示している。
【０２０１】
[実施例6]
アデノウイルス性グレーブス病モデルにおけるATX-GD-459の治療効果の実証
RNB-4K-GKK、RNB-5D-K1及びRNB-9Bペプチドの組合せ(ATX-GD-459)が抗TSHR抗体の誘発を抑制することができるかどうかを判定するため、DR3tgマウスは用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-459又は対照処置を受け、続いてAd-LacZ又はAd-TSHR免疫された。血清試料を採取してELISAにより抗THSR IgGレベルを測定した。ATX-GD-459ペプチド処置前(W-2、データは示していない)及び後(W0)に抗TSHR IgG抗体は存在しなかった(図25)。最初のAd-TSHR免疫後の2週間でPBS処置マウスにおいて高い抗TSHR IgGレベルが観察される。ATX-GD-459処置は、2週目及び5週目にAd-TSHR免疫の際に抗TSHR IgG抗体の増加をそれぞれ72%及び65%減少させた。これらの結果は、ATX-GD-459がこのアデノウイルス性グレーブス病モデルにおいて有効であることを示している。
【０２０２】
Ad-TSHR免疫すると高い抗TSHR IgGレベルが観察された。したがって、この疾患パラメータを使用してアデノウイルス性グレーブス病モデルにおける免疫調節薬又はATX-GD-459ペプチド処置の効果を調べた。メチルプレドニゾロン処置はAd-TSHR免疫DR3tgマウスにおいて抗TSHR IgGレベルを減少させることに成功したことが示された。さらに、用量漸増スケジュールに従ったATX-GD-459ペプチド処置は抗TSHR IgG抗体形成の増加を70%減少させた。
【０２０３】
材料及び方法
マウス
マウスは実施例2に記載された通りであった。
【０２０４】
抗原
抗原は実施例2に記載された通りであった。
【０２０５】
抗原プロセシング独立提示システム(APIPS)アッセイ
抗原特異的T細胞ハイブリドーマを、固定又は非固定VAVY又はBM14細胞(= APC)により提示されるペプチドに対するその反応性について試験した。個々のクローン由来の5×104細胞を25μg/mlのペプチド及び5×104細胞の固定又は新鮮なAPCと一緒に培養した。APCを固定するため、細胞は室温(RT)で5分間0.5%のパラホルムアルデヒド(Merck、Darmstadt、ドイツ)(pH7)と一緒にインキュベートした。固定化反応は0.4Mのグリシン(Sigma-Aldrich)を添加し細胞をRPMI-10%FCS中で洗浄することにより停止させた。さらに、ヒトTSHR-ECDタンパク質(Chesapeake-PERL、Savage、Maryland、USA)に対する反応性を測定してエピトープを同定した。48時間後、抗原誘導IL-2産生をELISAにより測定した。
【０２０６】
Ex vivo寛容化実験
DR3tg又はDR4tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に33、75又は100μgのペプチド(最高用量に応じて、図面説明文参照)を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは、CFAに乳化させた50μgの抗原(非改変親15マーペプチド)(ペプチド/CFA)で尾の基部に皮下的に免疫した。免疫10日後、所属リンパ節(LN)及び脾臓を収穫した。LN細胞及び脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいてX-vivo15培地(2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン;Lonza を補充した)で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる抗原濃度(0〜25μg/ml)と一緒に、又は12.5μg/mlの精製タンパク質誘導体(PPD;プライミング対照;Statens serum institut、Copenhagen、デンマーク)と一緒に72時間培養した(200μl/ウェル)。72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
【０２０７】
グレーブス病のアデノウイルス動物モデル
ヒトTSHR Aサブユニットを発現しているアデノウイルス(アミノ酸残基1〜289;Ad-TSHR)及びβガラクトシダーゼを発現している対照アデノウイルス(Ad-LacZ)はViraquest (North Liberty、IA、USA)から購入した。6週齢の雌BALB/cJOlaHsdマウス(Harlan Laboratories、Venray、オランダ)又はDR3tgマウスにAd-TSHR又はAd-LacZ(109、1010又は1011個のウイルス粒子)を大腿筋の筋肉内に注射した。すべてのマウスは実験ごとに同じバッチのアデノウイルスを使用して同時に免疫した。マウスには3週間間隔(0週目、3週目及び6週目)で2又は3回注射し、最初の免疫の前及び2回目の免疫の1週間後に採血した。マウスは最初の免疫の4、5又は10週間後に安楽死させ、血液、脾細胞及び甲状腺を得た。脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいてX-vivo15培地(グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン;Lonza を補充した)で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる抗原濃度(0〜25μg/ml)と一緒に72時間培養した(200μl/ウェル)。72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
【０２０８】
抗TSHR抗体の検出
精製TSHR-ECDタンパク質(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)をELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tweenで洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1%ウシ血清アルブミン(BSA)(w/v)でブロックし、被験血清(2つのアリコート、1対50希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体を検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジン(TMB)を用いて発色させた。光学密度(OD)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)において測定した。
【０２０９】
刺激性抗TSHR抗体(TSAb)の検出
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞はM. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された。細胞は、2mMのL-グルタミン(Lonza)、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(Lonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza、Verviers、ベルギー)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%のチャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー) を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地を取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(RLU; 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
【０２１０】
甲状腺機能亢進の検出
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。血清T4測定に加えて、甲状腺組織像を甲状腺機能亢進についてのパラメータとして使用した。甲状腺は10%中性緩衝ホルマリン(pH7.5)に固定し、薄片に加工し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。薄片は病理変化(肥大化、上皮細胞の過形成及びリンパ球の浸潤)について観察し、スコア化した(KWS Biotest、Bristol、UK)。
【０２１１】
グレーブス病動物モデルの検証
DR3tgマウスは3週間間隔(0日目及び21日目)で2回、Ad-TSHRで筋肉内に免疫した。最初の免疫の日に開始して実験の終了まで、マウスはMMI又は6α-メチルプレドニゾロン21ヘミコハク酸ナトリウム塩(メチルプレドニゾロン)のいずれかで処置した。すべての化合物はALZET浸透圧ポンプ(model 1004、0.11μL/時;Charles River、フランス)により皮下に投与した。MMI(Sigma)は所望の濃度で減菌水に溶解し、マウスには日用量50又は500μgを与えた。メチルプレドニゾロン(Sigma)は減菌水に溶解し1mg/kg/日又は7mg/kg/日の用量でマウスに投与した。体重は毎週ベースで記録されてマウスの健康状態を測定した。マウスは最初の免疫の4週間後に安楽死させ血液及び脾臓試料を得た。TSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体レベルは上記の通りに評価された。
【０２１２】
予防的グレーブス病動物モデル
DR3tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μgのATX-GD-459(最高用量)又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは109個のAd-TSHR又はAd-LacZウイルス粒子を用いて筋肉内注射により免疫し、免疫は3週間後に繰り返された。最初の免疫の5週間後、血液及び脾臓を採取した。TSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体レベルは上記の通りに評価された。
【０２１３】
記載された発明の種々の改変及びバリエーションは本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連で説明されてきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことは理解されるべきである。実際、化学又は生物学又は関連する分野の当業者に明らかである本発明を実行するための記載された様式の種々の改変を本発明がカバーしていることが意図されている。上の明細書で言及されるすべての出版物は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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