(57)【要約】  本発明は、天然海洋バイオマテリアル、またはアコヤガイ、特にPinctada maxima、margaritifera、およびシャコガイ、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層に由来する、粉末形態の、不溶性および可溶性の生体高分子および炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムを添加した、粉末半合成材料に関する；本発明はまた、その調製方法およびその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性および可溶性の生体高分子ならびに炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムを添加した、天然海洋バイオマテリアルから得られる、粉末半合成材料。
【請求項２】
天然海洋バイオマテリアルがアコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層であることを特徴とし、該霰石層が粉末状である、請求項１に記載の半合成材料。
【請求項３】
粉末形態の天然バイオマテリアルが5nm〜100μm、好ましくは20nm〜50μm、さらにより好ましくは50nm〜20μmの粒度分布を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の半合成材料。
【請求項４】
不溶性および可溶性の生体高分子が、アコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層から抽出されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の半合成材料。
【請求項５】
炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムが、天然陸生生物、天然海洋生物、もしくは沈降炭酸カルシウムから、または不溶性および可溶性の生体高分子の抽出後に霰石層の無機質画分から得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の半合成材料。
【請求項６】
生体吸収性であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の半合成材料。
【請求項７】
粉砕された天然バイオマテリアル、アコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層から抽出される不溶性および可溶性の生体高分子、ならびに炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムを混合することを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の材料の調製方法。
【請求項８】
粉砕された天然バイオマテリアルがアコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層を粉砕することにより得られることを特徴とする、請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
粉砕後に球状化工程を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の調製方法。
【請求項１０】
不溶性および可溶性の生体高分子がそれぞれ、超遠心分離によって、および加水分解後の逆浸透と連結されたタンジェンシャル限外濾過によって抽出されることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層が抽出前に架橋されていることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層が抽出前に粉砕され、250μm〜50μmの粒度分布にふるい分けされることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
即席調合用骨代用物としての、喪失部の回復および再生のための、熱傷、ただれ、潰瘍、もしくは紅斑性皮膚病変の治療のための、またはデバイスもしくは成形インプラントの製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粉末半合成材料、または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法により得られる粉末半合成材料の使用。
【請求項１４】
経時的に時差的な生体吸収性を有する縫合糸を含む制御された生体吸収性を有するデバイスまたは成形インプラントの製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粉末半合成材料、または請求項７〜１２のいずれか一項の方法に従って得られる粉末半合成材料の使用。
【請求項１５】
即席使用のための骨代用物の調製のための、押出可能な骨代用物、特に真空下でシリンジに詰められた骨代用物のための、多孔性のコラーゲン担体を有する骨代用物、動物もしくはヒト由来の無機構造を有する骨代用物、制御された生体吸収性を有するデバイス、内部補綴を封止するためのセメント、ならびに椎体形成術および椎骨形成術における低侵襲手術のための注射可能なセメントのための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粉末半合成材料、または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる粉末半合成材料の使用。
【請求項１６】
カルシウム塩、天然もしくは合成ポリマー、コラーゲン、ならびに動物もしくはヒト由来の骨組織の無機構造を含む組成物における、可塑性の成型可能な接着性の添加剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の材料に用いられる炭酸塩化を受けた炭酸カルシウムの使用。
【請求項１７】
カルシウム塩、天然もしくは合成ポリマー、コラーゲン、ならびに動物もしくはヒト由来の骨組織の無機構造を含む粉末組成物における添加剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の材料に用いられる不溶性および可溶性の抽出生体ポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にアコヤガイ（Pinctadines）、特にピンクタダ・マキシマ（Pinctada maxima）、マルガリティフェラ（margaritifera）およびシャコガイ（Tridacnes）：トリダクナ・ギガス（Tridacna gigas）、マキシマ（maxima）、デラサ（derasa）、テバロア（tevaroa）、スクアモサ（squamosa）、クロセア（crocea）、ヒポプス・ヒポプス（Hippopus hippopus）、ヒポプス・ポルセラヌス（Hippopus porcelanus）のような二枚貝軟体動物の殻に由来する天然海洋バイオマテリアルから得られる、粉末半合成生体吸収性材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、外傷性、腫瘍性、ジストロフィー性または変性性の起源の骨物質の損失を充填するために使用される材料は、リン酸カルシウムセメント、バイオコポリマー、および動物由来もしくはヒト由来の材料である。
【０００３】
補綴を封止するためには、ポリメチルメタクリレート（PMMA）のみが、必要に応じて抗生物質、開始剤、活性化剤、乳白剤または着色剤と組み合わせて、使用されている。内部補綴は一般にPMMAセメントで封止されるが、その欠点、特にセメントの重合中に生じる発熱反応、それに起因する骨細胞の壊死、経時的なセメントの収縮およびその老化がよく知られており、これらはほとんどの場合、補綴の可動化と、手術後10〜15年以内にそれを繰り返す必要を生じさせる。
【０００４】
これらの材料はすべて生体適合性であり、そしてリン酸カルシウムセメントのようなそれらのいくつかは骨伝導性を主張している；ほとんどは生物活性がなく、大部分は不活性である。
【０００５】
注入可能なセメントは、無機物相と、リン酸、HPMCの水溶液またはゲル、0.1モル化学量論の水、硫酸またはクエン酸であり得る液相から成る。
【０００６】
骨代用物として使用される合成またはウシ由来のバイオマテリアルは、基本的に骨伝導性を示し、一般に完全に生体吸収性ではない。
【０００７】
それらのうちのいくつか、特にポリマーについては、分解産物の放出があり、これは長期的には周囲または全身の疾患組織に有害な影響を及ぼし得ることが見出されている。この生体吸収は、患者依存的である。
【０００８】
さらに、ほぼすべての骨代用物には生物活性がない；これは動物由来のコラーゲンまたは、レシピエントにおいて生物学的に吸収されて、生理学的反応よりも大きく且つ異なる、大きな炎症反応を誘発する他の物質とそれらを組み合わせることを必要とする。
【０００９】
粉末または顆粒の形態の骨代用物の主な欠点は、その使用中、自己血液、生理食塩水またはその他の液体担体のいずれと共にかかわらず、それらが部位上および部位中におけるそれらの凝集と維持を促進する接着性および可塑性を有する「凝固物」を形成しないことである。
【００１０】
ヒトの骨は、43％の無機成分、32％の有機成分、および25％の水から成ることが知られている。有機成分は、90％のコラーゲンタンパク質（I型、III型、IV型およびV型コラーゲンを97％含む）、ならびにオステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオグリカン、フィブロネクチン、増殖因子、および形態形成タンパク質に代表される10％の非コラーゲンタンパク質から成る。これらの非コラーゲンタンパク質は、骨形成および損傷組織修復のプロセスにおいて本質的な役割を果たす。
【００１１】
無機画分は主に、リン酸カルシウムの結晶形態にあるヒドロキシアパタイトから成る；この画分には、ナトリウム、カリウム、銅、亜鉛、ストロンチウム、フッ素、アルミニウム、ケイ素などの他の無機物もごく少量含まれている。これらの元素はすべて、細胞代謝ならびに回復および骨再生において重要な役割を果たす。
【００１２】
一般にアコヤガイ、特にPinctada maxima、margaritifera、およびシャコガイ、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusなどの二枚貝軟体動物の殻の構造および組成の研究はそれが、基本的に不溶性および可溶性の生体高分子であるコラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質からそれ自身が成る、3〜5％の有機画分で構成された真珠様の内層を含むことを示している。真珠様の内層はまた、本質的に炭酸カルシウム、ミネラルおよび金属イオンから成る95％から97％を占める無機画分、ならびに3％の水も含有する。本発明が関連する軟体動物の殻の構造のこの研究はまた、それが、霰石の内層とは構造的に異なるが、同様に不溶性および可溶性の生体高分子から構成される有機画分を含む、方解石の外層から成ることを示している。
【００１３】
いくつかの刊行物は、上記の海洋軟体動物の霰石層に由来する天然バイオマテリアルの骨誘導性および骨伝導性を実証している。
【００１４】
これらの特性は、歯、骨、皮膚、筋肉、粘膜などのような器官の構造に寄与するものと同様な構造タンパク質がその中に同定されている有機画分に含まれる生体高分子の存在に起因する。代謝および生化学プロセス（酵素学、免疫学、膜受容体、シグナル分子など）に関与するものと同様な機能性タンパク質も存在している。コラーゲンは、特にこれらの構造タンパク質の中で代表的である：このように、I型、II型、III型および関連するコラーゲンが同定されている。
【００１５】
遊離アミノ酸とは別に、BMP、TNFβ、TGFβ、PGFなどに関連する成長因子と一般にみなされる、低分子の糖タンパク質を含むプロテオグリカン（小ペプチドに結合した炭水化物） と糖タンパク質（コラーゲンと炭水化物の結合）が同定されている。
【００１６】
さらに、ある種の非コラーゲン分子は、生理学的回復プロセスならびに細胞および組織の再生において基本的な役割を果たすことが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述の軟体動物の殻の内層の有機−無機複合体の回復、再生、血管新生および骨誘導の特性、これらの様々なコラーゲンおよび成長因子の存在に関連する特性がin vitroおよびin vivoで実証された。
【００１８】
骨組織の物理化学的組成と問題の軟体動物の殻の霰石のものとを比較すると、骨組織では32％の割合、霰石では3〜5％の割合で存在する有機成分が非常に類似していることが注目される。無機相、骨の43％、本質的にリン酸カルシウムが炭酸カルシウムの形で、霰石中の95〜97％を占めている；他の無機物の割合は非常に類似している。
【００１９】
天然海洋バイオマテリアルの有機画分に含まれる生体高分子の役割を考慮して、本発明者らは、新規の半合成ハイブリッドバイオマテリアルの組成におけるこれらの生体高分子の割合を増加させることによって、その組成を改変することが適切であることを見出した。
【００２０】
問題の軟体動物の殻の霰石内層および方解石外層の有機画分は、石灰化組織のミネラル化および成長に関与する骨形成性を有する、可溶性の拡散性分子を含有することが知られている。霰石の準結晶および層間エンベロープにおける不溶性構造タンパク質の存在も実証された。
【００２１】
さらに、殻の方解石外層の有機画分に含まれる分子は、本発明が関連する軟体動物の殻の霰石内層に含まれるものと同様である。
【００２２】
これが、生体結晶および真珠様の殻の霰石を構成する結晶間薄膜に密接に結合した有機分子だけでなく、問題の軟体動物の殻の方解石外層に含まれるものも抽出して濃縮することが適切であると思われた理由である。
【００２３】
バイオマテリアルの有機画分の生体高分子の抽出は、可溶性および不溶性の分子を供給することを目的とする。目的は、そのようにして得られたバイオマテリアルの細胞および組織の再生、回復、骨誘導、および血管新生の特性を最適化するために、抽出された不溶性および可溶性の生体高分子を補うことによって、有機−無機構造比を増加できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
こうして、本発明者らは、トリダクナ・マキシマ（Tridacna maxima）、トリダクナ・ギガス（Tridacna gigas）、トリダクナ・デラサ（Tridacna derasa）、トリダクナ・テバロア（Tridacna tevaroa）、トリダクナ・スクアモサ（Tridacna squamosa）、トリダクナ・クロセア（Tridacna crocea）、ヒポプス・ヒポプス（Hippopus hippopus）、ヒポプス・ポルセラヌス（Hippopus porcelanus）、ピンクタダ・マキシマ（Pinctada maxima）、ピンクタダ・マルガリティフェラ（Pinctada margaritifera）、および他のアコヤガイ（Pinctadines）から選択される軟体動物の殻から開始して、可溶性および不溶性の両生体高分子および炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムをそれに添加することによって、これらの要件を満たす材料を得ることが可能であることを見出した。
【００２５】
このように改変された、本発明に従う新規の粉末半合成生体吸収性材料は、例えば骨代用物、内部補綴を封止するための注入可能セメントもしくはセメントの製造、または生体吸収性の骨接合デバイスおよび成形インプラントの製造向きのものである。
【００２６】
よって、第1の態様によれば、本発明は、天然海洋バイオマテリアルに由来し、不溶性および可溶性の生体高分子ならびに炭酸塩化によって変化された炭酸カルシウムを添加した、粉末半合成材料に関する。
【００２７】
本発明はまた、この半合成材料の調製方法にも関する。
【００２８】
本発明はまた、半合成材料に用いられる、可溶性および不溶性の生体高分子または炭酸塩化により変換されたまたは炭酸カルシウムを含む組成物にも関する。
【００２９】
最後に、本発明は、例えば骨代用物、内部補綴を封止するための注入可能なセメントもしくはセメントを製造するため、または生体吸収性の骨接合デバイスおよび成形インプラントを製造するための、半合成材料または組成物の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
第1の態様によれば、本発明は、天然海洋バイオマテリアルに由来し、不溶性および可溶性の生体高分子ならびに炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムを添加した、粉末半合成材料に関する。
【００３１】
本発明に従う材料は、天然海洋バイオマテリアル、すなわちアコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層に由来し、前記霰石層は粉末状である。
【００３２】
本発明に従う粉末状の半合成材料は生体吸収性である。
【００３３】
一実施形態によれば、粒度分布は5nm〜100μm、好ましくは20nm〜50μm、さらにより好ましくは50nm〜20μmである。
【００３４】
不溶性および可溶性の生体高分子は、アコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層から抽出される。
【００３５】
これらのポリマーの抽出方法について以下に説明する。
【００３６】
特定の実施形態によれば、抽出された可溶性生体高分子および不溶性生体高分子は、出発生体物質中に存在するものに対応する可溶性生体高分子と不溶性生体高分子の比で添加される。
【００３７】
本発明の半合成材料に使用される炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムは、天然の陸生生物、海洋生物もしくは沈降炭酸カルシウム、または不溶性および可溶性の生体高分子の抽出後の霰石層の無機画分から得られ、炭酸塩化によって変換されたものである。斜方晶系または菱面体晶系で結晶化した炭酸カルシウムは、800〜1100℃の熱処理に供されると、熱分解および酸化により、容易な成型を可能とする、かなりの接着力および可塑性に反映される新たな特性を示すことが知られている。この現象は、次の反応に従う炭酸塩化である：
CaCO3 ＋ 熱処理 → Ca(OH)2 ＋ CO2 → CaCO3 ＋ H2O
【００３８】
温度が上昇し、20〜40分間維持されるこの反応において、炭酸カルシウムは、化学的に石灰に変換され、次いでCO2および周囲の湿気の作用の下で、非晶質炭酸カルシウムとなる。この化学変換を周囲の湿度測定に依存して数日間にわたって行う。
【００３９】
よって、本発明に従う粉末半合成材料は、その有機画分に抽出された不溶性および可溶性の生体高分子が補充され、その無機物画分には、炭酸塩化プロセスによって変換された、堆積物もしくは海洋イシサンゴ由来の炭酸カルシウム、 または堆積もしくは沈殿した陸生起源の炭酸カルシウムが補充されている、天然海洋材料に由来する粉末を含む。
【００４０】
特定の実施形態によれば、本発明に従う粉末半合成材料は、5nm〜100μm、好ましくは20nm〜50μm、さらにより好ましくは50nm〜20μmの粒度分布を有する粉末形態の霰石、不溶性および可溶性の 抽出された生体高分子、および炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムを含む。
【００４１】
不溶性および可溶性の抽出された生体高分子を添加することによって、初期の材料の有機画分の割合は、好ましくは出発材料中に存在する不溶性生体高分子と可溶性生体高分子との間の割合に応じて、1％〜10％の範囲で増加する。炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムを添加することによって、初期の材料の無機画分の割合は、所望の物理化学的特性に依存して、1％〜10％の範囲で増加する。
【００４２】
特定の実施形態によれば、本発明に従う半合成材料は、
100gに対して、5nm〜100μm、好ましくは20nm〜50μm、さらにより好ましくは50nm〜20μmの粒度分布を有する粉末形態の霰石；
1g〜50g、好ましくは5g〜25g、さらにより好ましくは10g〜15gの不溶性および可溶性の抽出生体高分子；ならびに
炭酸塩化により変換された炭酸カルシウム0.5g〜50g、好ましくは1g〜25g、さらにより好ましくは2g〜10g
を含む。
【００４３】
生体高分子の抽出の際、本発明者らは、本発明の実施に使用される軟体動物の霰石内層および方解石外層における、不溶性生体高分子の割合は全重量の2.6％〜4.3％を占め、可溶性生体高分子の割合は0.4％〜0.7％を占めることを示した 。可溶性生体高分子と不溶性生体高分子の比が元の天然産物中の比と同様となるように、生体高分子が本発明の材料に添加される。
【００４４】
本発明はまた、上記のように、粉末半合成材料の調製方法にも関する。
【００４５】
本発明の方法によれば、構成要素は別々に調製され、次いで本発明に従う材料を得るために混合される。かくして、天然海洋バイオマテリアルから得られる粉末材料、天然海洋バイオマテリアルから抽出される不溶性および可溶性の生体高分子、ならびに炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムが調製される。
【００４６】
より具体的には、調製方法は、粉砕された天然バイオマテリアル、アコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群から選択される二枚貝軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層から抽出される不溶性および可溶性の生体高分子、ならびに炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムを混合することを含む。
【００４７】
特定の実施形態において、粉砕された天然バイオマテリアルは、軟体動物の殻の霰石内層である。粉砕は20nm〜50μmの平均粒度を得るように実施する。得られた粒子は、粉末の流動性および圧縮性を改善するために球状化されてもよい。
【００４８】
本発明に従う方法では、不溶性および可溶性の生体高分子はそれぞれ、超遠心分離によって、および加水分解後の逆浸透と連結されたタンジェンシャル限外濾過によって抽出される。抽出の前に、軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層は架橋されていてもよい。抽出を容易にするために、軟体動物の殻の霰石内層および／または方解石外層を粉砕し、250μm〜50μmの間の粒度分布で篩い分けする。
【００４９】
これらの種々の工程を以下に続けて記載する。
【００５０】
原料として用いられる天然の海洋バイオマテリアルは、アコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritiferaおよびシャコガイ（Tridacnes）、特にTridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusを含む群より選択される。
【００５１】
成分の各々は、同じ海洋生物材料から、または異なる海洋生物材料から得ることができる。
【００５２】
選択された殻を清浄化し、汚染除去し、必要に応じて架橋し、そして方解石層を内層から分離する。内層は粉砕する。粉砕された内層の一部は、本発明に従う材料のベース成分を構成する。可溶性および不溶性の生体高分子は、方解石層および／または内層から抽出される。生体高分子の抽出後に回収される無機部分に由来してもよい炭酸カルシウムは、炭酸化によって変換される。このようにして抽出された生体高分子および炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムを、前に得られたベース成分に添加する。
【００５３】
本発明に従う方法の特定の実施形態を以下に詳細に記載する。もちろん、当業者は、この方法の条件を特定の出発生体材料および所望の最終用途に適合させることができるであろう。
【００５４】
Ｉ．構成成分の調製：
表在生物をこすり落として除去した後、選択された海洋バイオマテリアルから得られた殻に以下の処理を行う：
【００５５】
Ｉ．１）殻の汚染除去：
殻を活性塩素2％の次亜塩素酸溶液を添加した水道水の水槽に浸漬することによって、汚染除去する。
【００５６】
Ｉ．２）殻の超音波処理：
次いで、殻をすすぎ、127部の水に対して1部の溶液の希釈で洗浄消毒液を加えた微生物学的に検査された水道水を満たしたタンク内において、例えば55℃の温度で超音波により処理する。処理時間は約40kHzの周波数で約30分である。
【００５７】
Ｉ．３）殻のすすぎと乾燥：
次いで、殻を90℃の温度で脱塩水の水浴中で例えば20分間すすぎ、2％の希釈度でCalbenium（登録商標）を添加して30分間すすぐ。 次いで、それらをすすぎ、乾燥させる。
【００５８】
Ｉ．４）殻の架橋：
別の実施形態によれば、特に細胞代謝の最適化および抗ラジカル特性の強化の観点から、天然起源のバイオマテリアルに強化された生物学的特性を付与するために、殻を以下のようにして架橋することができる：
【００５９】
種々の容量の半透明のガラスまたはプラスチックの容器中に10％リボフラビンを添加した水道水の混合物を調製する；全体を20℃以上の温度に維持し、混合物を攪拌することにより、UVA放射に対して垂直な流れを生成する。
【００６０】
殻をその中に垂直に配置し、365ナノメートル/秒の波長を有するUVAランプを用いて、2300マイクロジュール/cm2の強度で180分間、両側に照射を行う。処理中、全体を真空下に保つ。
【００６１】
次いで、殻をすすぎ、40℃の高温空気流中で乾燥させる。
【００６２】
2014年1月10日に出願された特許出願FR1450204に記載されている方法を使用することも可能である。
【００６３】
Ｉ．５）方解石外層の除去：
殻の方解石外層をきめ細かい砥石で研削することによって除去する。生成物を片側に置き、「方解石外層からの生体高分子の抽出するためのバッチ」を構成する。
【００６４】
Ｉ．６）粉砕後に露出した真珠質の殻の凍結：
本発明によれば、真珠質の殻を−18℃の温度で120分間凍結する。
【００６５】
Ｉ．７）真珠質の殻の粉砕とバッチの回収：
次いで、真珠質の殻の粉砕を例えばタングステンカーバイド顎を有する破砕機で吸引しながら行って、ナノ粒子も含有する懸濁粒子を回収する。
【００６６】
破砕操作を少なくとも3回繰り返し、ふるい分け後、2つのバッチを脇に置く：
−  20ミクロンから50ナノメートルまでのランダム粒度を有する第１のバッチは、以下「霰石混合バッチ」と呼ぶ本発明に従う生成物の霰石混合部分を構成する。「霰石混合バッチ」は、2つの有機および無機成分を含む、粉砕後に得られる粉末形態を意味する。
【００６７】
250から50ミクロンの粒度分布を有する第2のバッチを不溶性および可溶性のバイオポリマーの抽出のために片側に置く。これを「霰石内層からの生体高分子の抽出のためのバッチ」と呼ぶ。
【００６８】
得られた粉末の粒度およびサイズ範囲を決定するためにレーザー粒度計を使用する。
【００６９】
Ｉ．８）霰石混合バッチの球状化：
霰石混合バッチは、球状化によって粒子を均一にすることを目的とした機械的処理を受けるが、その目的は摩耗によって粒子の角および端を丸めることである。
【００７０】
この処理は、本発明に従う材料を、特に骨代用物、封止セメント、注入可能セメント、生体吸収性骨接合デバイスおよび成形インプラントとして使用する場合、得られる粉末の流動性および圧縮性を促進し、よって、緻密化および粒子間結合を促進する効果を有する 。
【００７１】
この球状化工程のために、以下の手順を採用することができる：霰石混合バッチからの粉末材料と、オートクレーブ中で滅菌した例えばオークなどの硬質木材の数mm2のチップとの等分の混合物を、例えば水平回転軸を有する可変幅のガラスブレードを備えたガラスもしくはジルコニウム製の円筒状の容器に入れる。
【００７２】
容器を容器サイズおよび処理される生成物の量に依存的な可変時間および可変速度で回転させる。
【００７３】
球状化処理の終わりに、混合物の全体、霰石混合バッチおよびチップを、十分な量の水を満たした不活性容器中に回収し、これを約15分間連続的に撹拌する。静置後、表面に浮遊している木片を吸引によって除去する。
【００７４】
次いで、この溶液を、直径20ミクロンのメッシュを有するナイロンフィルターで濾過し、次いで、残留物をRotavapor（登録商標）中40℃で乾燥し、ひとまとめにする。
【００７５】
別の実施形態によれば、等量の1〜3mmの範囲のランダムな直径を有する粒子の形態の塩化ナトリウムを、霰石混合バッチに添加してもよい。処理後、塩化ナトリウムを90℃の温水で溶解し、ナイロンフィルター上で濾過した後、90℃の温水で洗浄し、40℃の温風の流れで乾燥させることにより除去する。
【００７６】
ＩＩ．生体高分子の抽出
ＩＩ．１  不溶性生体高分子の抽出：
本発明によれば、工程Ｉ．５）で得られた霰石内層からの生体高分子の抽出のためのバッチ由来の適切な量の粉末を、十分な量の脱塩水と混合して、加水分解反応器中に注入し、これに規定量の25％クエン酸を添加する；全体を4〜5℃の間で変動する温度で冷却し、連続的に撹拌する。本発明者らはクエン酸の使用を、そのpHおよび表面張力を低下させる特性のために支持する。
【００７７】
pHをpHメーターでモニターし、生体高分子の分解を防ぐために2.5Nの水酸化ナトリウムを添加することによって4.5より上に維持する；次いで、100リットルの加水分解物あたり0.1リットルの5N水酸化ナトリウムを添加することによって、この工程の最後に7に戻す。
【００７８】
粉末が完全に溶解した後、加水分解物を貯蔵タンクに移し、さらに連続的に攪拌し、次いで、遠心分離機に移し、そのサイクロン内で18,000から20,000Gの力を加える。
【００７９】
温度を4〜5℃に維持しながら、溶液を濁度測定によって確認し、必要に応じてクエン酸で補正した後、必要に応じて、この操作を繰り返す。
【００８０】
濁度測定から得られた結果に応じて、加水分解物を再び超遠心分離にかけてもよい。
【００８１】
超遠心分離の各サイクルにおいて、収集された不溶性生体高分子の残留物を洗浄し、脇に置く。残留物の洗浄からの水をシュウ酸で処理して、カルシウムの存在または非存在をチェックする。
【００８２】
その結果、最後の超遠心分離の終わりに、湿った茶色がかった固まりの形態のすべての不溶性生体高分子を含む残留物が得られ、これを凍結乾燥もしくはゼオドレーション（Zeodratation；沸石を用いた水和）によって乾燥させ、そして、処理の終わりには、遠心力の作用下でのタンパク質のコイリングの結果として、2〜3mmの直径を有する灰色の球状体が得られる。
【００８３】
抽出された不溶性生体高分子を5ミクロンから100ナノメートルのランダムな粒度分布を有する粉末が得られるまで例えば遊星ミル中で粉砕し、ふるい分け後に回収する。
【００８４】
ＩＩ．２  可溶性生体高分子の抽出：
透過物および洗浄水を、例えば1kDのカットオフ点を有するカセットを用いたタンジェンシャル限外濾過デバイスにおける脱塩のために送る。
【００８５】
十分な量の硫酸を2.0モル/ Lで透過液に添加して、硫酸カルシウム塩を沈殿させる。
【００８６】
溶液を濾過し、そして透過物を33℃の沸点の真空下でRotavapor（登録商標）中で濃縮し、結晶の形態のクエン酸を除去する。
【００８７】
低分子量タンパク質ならびに一価および多価のイオンを含む留出物を拡張する。
【００８８】
カセットのカットオフ点はタンパク質の全て、特に非常に低分子量のものを保持しないことから、留出物を逆浸透に供する。
【００８９】
留出物を40〜80barの圧力勾配の影響下で、例えば膜孔径が0.0001ミクロンの半選択性膜を透過させることによる液相分離処理に移す。
【００９０】
鉄、マグネシウム、亜鉛などの一価および多価のイオンをすべて保持するために、留出物を通過させる。
【００９１】
逆浸透膜上に回収された保持液を収集し、非発熱性水で希釈した後、40℃の真空下で例えばRotavapor（登録商標）中で濃縮し、次いで、ゼオドレーション（Zeodratation）または昇華乾燥により凍結乾燥させる。
【００９２】
非常に細かい灰色がかった白色の粉末が得られ、それを一方の脇に置き、次に例えば遊星ミル中で粉砕し、ふるい分け後、5ミクロンから100ナノメートルの範囲のランダムな粒度を有する粉末を得る。
【００９３】
透過物を、ブラッドフォード比色法によって処理される溶液の一部を採取することによって、タンパク質の存在または非存在をチェックする。
【００９４】
ＩＩ．３  方解石外層から生体高分子を抽出するためのバッチからの生体高分子の抽出
別の実施形態によれば、方解石外層からの生体高分子の抽出は、霰石内層からの生体高分子の抽出と同様にして行われる。
【００９５】
ＩＩＩ．炭酸カルシウムの炭酸塩化：
斜方晶系または菱面体晶系で結晶化した炭酸カルシウムは、800〜1100℃の熱処理に供されると、熱分解および酸化により、容易な成型を可能とする、かなりの接着力および可塑性に反映される新たな特性を示すことが知られている。この現象は、次の反応に従う炭酸塩化である：
CaCO3 ＋ 熱処理 → Ca(OH)2 ＋ CO2 → CaCO3 ＋ H2O
【００９６】
温度が上昇し、20〜40分の時間維持されるこの反応において、炭酸カルシウムは、化学的に変換されて石灰となり、次いでCO2および周囲の湿気の作用の下で、非晶質炭酸カルシウムとなる。この化学変換を周囲の湿度測定に依存して数日間にわたって行う。
【００９７】
他の実施形態によれば、炭酸カルシウム以外の全てのカルシウム塩は、沈殿の化学反応によって、炭酸塩化によって変換され得る炭酸カルシウムを生じることができる。したがって、例えば、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはクエン酸カルシウムから出発して炭酸塩化された炭酸カルシウムを得ることが可能である；これらの沈殿の既知の化学プロセスを実施することは、当業者の技術の範囲内である。
【００９８】
炭酸カルシウムはまた、一般にアコヤガイ（Pinctadines）、特にPinctada maxima、margaritifera、およびシャコガイ（Tridacnes）、Tridacna gigas、maxima、derasa、tevaroa、squamosa、crocea、Hippopus hippopus、Hippopus porcelanusのような二枚貝軟体動物の霰石内層殻から、生体高分子の抽出後に得ることもできる。それはまた、イシサンゴ由来のものでもよい。
【００９９】
ＩＶ．霰石混合バッチ、不溶性および可溶性の生体高分子、および炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムから出発する混合物の調合
有機画分の所望の割合に従って決定された量の内層霰石および外層方解石の2つのバッチから抽出された不溶性および可溶性の生体高分子と、決定された量の炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムとを、規定量の霰石混合バッチと混合して、 本発明に従う生成物の調合を構成する。
【０１００】
均質な粉末が得られるまで混合を例えばナイフミキサー中で行い、次いで、これをひとまとめにする。
【０１０１】
別の態様によれば、本発明は、熱傷、ただれ、潰瘍、もしくは紅斑性皮膚病変の治療のための、またはデバイスもしくは成形インプラントの製造における、即席調合用骨代用物としての本発明に従う材料の使用に関する。
【０１０２】
本発明に従う粉末半合成材料は、経時的に時差的な生体吸収性を有する縫合糸を含む制御された生体吸収性を有するデバイスまたは成形インプラントの製造に使用されてもよい。
【０１０３】
これはまた、即席使用のための骨代用物、多孔性のコラーゲン担体を有する骨代用物、動物もしくはヒト由来の無機構造を有する骨代用物、制御された生体吸収性を有するデバイス、内部補綴を封止するためのセメント、ならびに椎体形成術、椎骨形成術および腫瘍の手術における低侵襲手術のための注射可能なセメントの調製のために使用されてもよい。
【０１０４】
別の実施形態によれば、本発明に従う生成物は、細菌およびウイルスの汚染除去、顔料の除去、および免疫原性の中和を目的とした機械的および熱化学的処理を受けたスポンギア・オフィシナリス（Spongia officinalis）のような多孔性コラーゲン担体と組み合わせることができる。Spongia officinalisはさらに、コラーゲンに関連する炭酸化硬タンパク質の繊維からなるスポンジンで構成されていることが知られている。このタンパク質は低溶解性であり、結合組織、腱、骨組織、筋肉繊維、皮膚、毛髪および爪の、すべての組織の保護および支持の役割を果たしている。スポンジンは、構造的および貯蔵的なコラーゲンタンパク質である；それは不活性で、水不溶性で、疎水性であり、容易に変性しない。これは、骨伝導に適した多孔性の支持体を構成する。したがって、これを本発明に従う材料と組み合わせて骨代用物を製造するために用いることができる。
【０１０５】
本発明に従う材料は、脱水または半水和硫酸カルシウム、方解石、無水ヒドロキシリン酸カルシウム、β-TCP、および水酸化カルシウムなどのカルシウム塩と組み合わせてもよい。本発明に従う材料は、動物またはヒト由来の骨組織の無機構造と組み合わせることができる。
【０１０６】
それはまた、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、デンプン、アルギン酸塩のような生体吸収性ポリマー、またはポリグリコリド、ポリ（DL-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド）のような吸収性合成ポリマー、またはポリヒドロキシエチル、メチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレートのようなアクリルポリマー、ならびに非ステロイド性抗炎症薬、抗生物質、抗有糸分裂薬もしくは治療目的を有する他の物質のような粉末形態の医薬物質と組み合わせて使用することもできる。
【０１０７】
本発明者らは、メチルメタクリレート封止セメントの使用に関連する欠点を考慮して、本来的に放射線不透過性であり、第一に、その接着特性のために内部補綴の機械的な保持を行い、第二に、その骨模倣性、骨誘導性、骨伝導性、および生物活性特性のために、生体内鉱質形成の開始剤であるシグナル分子の存在によって誘導される組織の統合を導く、本発明に従う生成物で製造された封止セメントを提案する。
【０１０８】
これらのシグナル分子はin situの生体内鉱質形成の局所的内在性因子を刺激し、化生性骨の形成をもたらす。
【０１０９】
別の目的によれば、本発明は、本発明に従う材料に用いられる、またはカルシウム塩、天然または合成ポリマー、 コラーゲン、動物もしくはヒト由来の骨組織の無機構造体を含む組成物において、上記の方法の工程ＩＩＩに従って調製される、炭酸塩化を経た炭酸カルシウムの使用に関する。
【０１１０】
それはまた、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、デンプン、アルギン酸塩のような生体吸収性ポリマー、またはポリグリコリド、ポリ（DL-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド）のような吸収性合成ポリマー、またはポリヒドロキシエチル、メチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレートのようなアクリルポリマー、ならびに非ステロイド性抗炎症薬、抗生物質、抗有糸分裂薬もしくは治療目的を有する他の物質のような粉末形態の医薬物質と組み合わせて使用することもできる。
【０１１１】
霰石および方解石層の有機画分に含まれる不溶性および可溶性の生体高分子は、骨および軟骨などの硬組織、ならびに皮膚、筋肉および粘膜などの軟組織の両方の回復特性および再生特性を有することが知られている。これらの非コラーゲン生体高分子、特に低分子量糖タンパク質のいくつかは、BMP、TNFβ、EGPF、TGFβ、IGF、FGFなどの成長因子、ならびにサイトカイン、炎症のメディエーターに結合しうる。
【０１１２】
本発明はまた、本発明に従う材料において使用される、または上記の方法の工程ＩＩによって抽出される、可溶性および不溶性の生体高分子のカルシウム塩、天然もしくは合成ポリマー、コラーゲン、動物もしくはヒト由来の骨組織の無機構造を含む粉末組成物のための添加剤としての使用に関する。 それらはまた、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、デンプン、アルギン酸塩のような生体吸収性ポリマー、またはポリグリコリド、ポリ（DL-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド）のような吸収性合成ポリマー、またはポリヒドロキシエチル、メチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレートのようなアクリルポリマー、ならびに非ステロイド性抗炎症薬、抗生物質、抗有糸分裂薬もしくは治療目的を有する他の物質のような粉末形態の医薬物質と組み合わせて使用することもできる。それらは、炭酸塩化によって変換された炭酸カルシウムと組み合わせることもできる。
【０１１３】
本発明は、単に例示のために与えられる以下の実施例および添付の図面を参考にして、ここに、より詳細に説明される：
図1および図2は、
−  真珠質粉末および炭酸カルシウムと全血（No.1）、ならびに
−  真珠質粉末および炭酸塩化した炭酸カルシウムと全血（No.2）
の混合物の写真である。全血を添加してから2分後、次いで15分後にそれぞれ撮影した。
【実施例】
【０１１４】
本発明に従う製品の薬理学的特性を確認するために、本発明者らは、治療目的で製剤を調合し、臨床観察を記録するためにそれらを使用した。
【０１１５】
実施例１：
本発明に従う粉末状半合成材料を以下のようにして調製した：
【０１１６】
Ｉ．構成成分の調製：
表在生物をこすり落として除去した後、殻に以下の処理を行う：
【０１１７】
Ｉ．１）殻の汚染除去：
殻を活性塩素2％の次亜塩素酸溶液が添加された水道水の水槽に浸漬することによって、汚染除去する。
【０１１８】
Ｉ．２）殻の超音波処理：
次いで、殻をすすぎ、127部の水に対して1部の溶液の希釈で洗浄消毒液を加えた微生物学的に検査された水道水を満たしたタンク内において55℃の温度で超音波により処理する。処理時間は40kHzの周波数で30分である。
【０１１９】
Ｉ．３）殻のすすぎと乾燥：
次いで、殻を90℃の温度で脱塩水の水浴中で20分間すすぎ、2％の希釈度でCalbenium（登録商標）を添加して30分間すすぐ。 次いで、それらをすすぎ、乾燥させる。
【０１２０】
Ｉ．４）方解石外層の除去：
殻の方解石外層をきめ細かい砥石で研削することによって除去する。生成物を片側に置き、「方解石外層からの生体高分子の抽出するためのバッチ」を構成する。
【０１２１】
Ｉ．５）研削後に露出した真珠質殻の凍結：
工程Ｉ．４）で得られた真珠質殻を−18℃の温度で120分間凍結させる。
【０１２２】
Ｉ．６）真珠質殻の粉砕とバッチの回収：
次いで、真珠質殻をESSA（登録商標）タイプのタングステンカーバイド顎を有する破砕機で吸引しながら粉砕して、ナノ粒子も含有する懸濁粒子を回収する。
【０１２３】
破砕操作を少なくとも3回繰り返し、ふるい分け後、2つのバッチを脇に置く：
−  20ミクロンから50ナノメートルまでのランダムな粒度を有する第１のバッチは、以下「霰石混合バッチ」と呼ぶ、本発明に従う生成物の霰石混合部分を構成する。「霰石混合バッチ」は、2つの有機および無機成分を含む、粉砕後に得られる粉末形態を意味する。
【０１２４】
250から50ミクロンの粒度分布を有する第2のバッチを不溶性および可溶性のバイオポリマーの抽出のために片側に置く。これを「霰石内層からの生体高分子の抽出のためのバッチ」と呼ぶ。
【０１２５】
得られた粉末の粒径と範囲はレーザー粒度計を用いて測定する。
【０１２６】
Ｉ．７）霰石混合バッチの球状化：
霰石混合バッチは、球状化によって粒子を均一にすることを目的とした機械的処理を受けるが、その目的は摩耗によって粒子の角および端を丸めることである。
【０１２７】
霰石混合バッチからの粉末材料と、オートクレーブ中で滅菌した例えばオークなどの硬質木材の5mm2チップとの等分の混合物を、水平回転軸を有する可変幅のガラスブレードを備えたジルコニウム製の円筒状の容器に入れる。
【０１２８】
容器を容器サイズおよび処理される生成物の量に依存的な可変時間および可変速度で回転させる。
【０１２９】
球状化処理の終わりに、混合物の全体、霰石混合バッチおよびチップを、十分な量の水を満たした不活性容器中に回収し、これを15分間連続的に撹拌する。30分の静置後、表面に浮遊している木片を吸引によって除去する。
【０１３０】
次いで、この溶液を、直径20ミクロンのメッシュを有するナイロンフィルターで濾過し、次いで、残留物をRotavapor（登録商標）中40℃で乾燥し、ひとまとめにする。
【０１３１】
ＩＩ．生体高分子の抽出
ＩＩ．１  不溶性生体高分子の抽出：
霰石内層からの生体高分子の抽出のためのバッチ由来の適切な量の粉末を、ゾーンIの供給タンクにおいて吸引し、十分な量の脱塩水と混合して、ゾーンIIの加水分解反応器に注入し、これに規定量の25％クエン酸を添加する；全体を4〜5℃の間で変動する温度で冷却し、連続的に撹拌する。pHをpHメーターでモニターし、生体高分子の分解を防ぐために2.5Nの水酸化ナトリウムを添加することによって4.5より上に維持する；次いで、100リットルの加水分解物あたり0.1リットルの5N水酸化ナトリウムを添加することによって、この工程の最後に7に戻す。
【０１３２】
粉末が完全に溶解した後、加水分解物を貯蔵タンクに移し、さらに連続的に攪拌し、次いで、遠心分離機に移し、そのサイクロン内で18,000から20,000Gの力を加える。
【０１３３】
温度を4〜5℃に維持し、溶液を濁度測定によって確認し、必要に応じてクエン酸で補正した後、必要に応じて、この操作を繰り返す。
【０１３４】
濁度測定によって得られた結果に応じて、加水分解物を再び超遠心分離にかける。超遠心分離の各サイクルにおいて、収集された不溶性生体高分子の残留物を洗浄し、脇に置く。残留物の洗浄からの水をシュウ酸で処理して、カルシウムの存在または非存在をチェックする。
【０１３５】
その結果、最後の超遠心分離の終わりに、湿った茶色がかった固まりの形態のすべての不溶性生体高分子を含む残留物が得られ、これを凍結乾燥によって乾燥させ、そして、処理の終わりには、遠心力の作用下でのタンパク質のコイリングの結果として、2〜3mmの直径を有する灰色の球状体が得られる。
【０１３６】
抽出された不溶性生体高分子を5ミクロンから100ナノメートルのランダムな粒度分布を有する粉末が得られるまで遊星ミル中で粉砕し、ふるい分け後に回収する。
【０１３７】
ＩＩ．２  可溶性生体高分子の抽出：
透過物および洗浄水を、15m2の表面積を与えるように直列に取り付けられた接線方向限外濾過カセットアセンブリ（それぞれ1kDaのMillipore（登録商標）の装置における、5barの圧力および1時間あたり10〜15リットルの流量、40℃の温度での脱塩のために送る。
【０１３８】
十分な量の硫酸を2.0モル/Lで透過液に添加して、硫酸カルシウム塩を沈殿させる。
【０１３９】
溶液を濾過し、透過物を33℃の沸点の真空下でRotavapor（登録商標）中で濃縮し、結晶の形態のクエン酸を除去する。
【０１４０】
低分子量タンパク質ならびに一価および多価のイオンを含む留出物を拡張する。
【０１４１】
カセットのカットオフ点はタンパク質の全て、特に非常に低分子量のものを保持しないことから、留出物を逆浸透に供する。
【０１４２】
留出物を次いで、40〜80barの圧力勾配の影響下で、膜孔径が0.0001ミクロンの半選択性膜を透過させることによる液相分離処理に移す。
【０１４３】
鉄、マグネシウム、亜鉛などの一価および多価のイオンをすべて保持するために、留出物を通過させる。
【０１４４】
逆浸透膜上に回収された保持液を収集し、非発熱性水で希釈した後、40℃の真空下でRotavapor（登録商標）中で濃縮し、次いで、Zeodratationにより凍結乾燥させる。
【０１４５】
非常に細かい灰色がかった白色の粉末が得られ、それを一方の脇に置き、次に遊星ミル中で粉砕し、ふるい分け後、5ミクロンから100ナノメートルの範囲のランダムな粒度を有する粉末を得る。
【０１４６】
透過物中のタンパク質の存在または非存在は、ブラッドフォード比色法によって処理される溶液の一部を採取することによってチェックする。
【０１４７】
ＩＩＩ．炭酸カルシウムの炭酸塩化：
上記生体高分子の抽出後に回収された炭酸カルシウムを800〜1100℃の熱処理にかけ、20〜40分間持続し、次いで、外気中でゆっくりと冷却する。この現象は、次の反応に従う炭酸塩化である：
CaCO3 ＋ 熱処理 → Ca(OH)2 ＋ CO2 → CaCO3 ＋ H2O
【０１４８】
この反応において、炭酸カルシウムは化学的に変換されて石灰となり、その後、CO2と湿気の作用の下で再び非晶質の炭酸カルシウムとなる。この化学変換を周囲の湿度測定に依存して数日間にわたって行う。
【０１４９】
ＩＶ．霰石混合バッチ、不溶性および可溶性の生体高分子、および炭酸塩化により変換された炭酸カルシウムから出発する混合物の調合
生体高分子の抽出中、使用された殻の霰石内層および方解石外層における不溶性生体高分子の割合は2.6％〜4.3％を占め、可溶性生体高分子の割合は0.4％〜0.7％を占めることが示された 。
【０１５０】
本発明に従う材料を、霰石混合バッチ、工程ＩＩ．１で得られた不溶性高分子、工程ＩＩ．２で得られた可溶性高分子、および上記工程ＩＩＩで得られた炭酸塩化を受けた炭酸カルシウムを混合することによって調製した。各種成分の具体的な量は、以下の実施例のそれぞれにおいて特定されている。
【０１５１】
均質な粉末が得られるまで混合をナイフミキサー中で行い、次いで、これをひとまとめにする。
【０１５２】
実施例２：
以下に記載する架橋工程を工程I.3の最後に追加する点以外は、上記の実施例１の手順に従う。
【０１５３】
10％リボフラビンを添加した水道水の混合物を、半透明のガラスまたはプラスチックの容器中に調製する；全体を20℃以上の温度に維持し、混合物を攪拌することにより、UVA放射に対して垂直な流れを生成する。
【０１５４】
殻をその中に垂直に配置し、365ナノメートル/秒の波長を有するUVAランプを用いて、2300マイクロジュール/cm2の強度で180分間、両側に照射を行う。処理中、全体を真空下に保つ。
【０１５５】
次いで、殻をすすぎ、40℃の高温空気流中で乾燥させる。
【０１５６】
実施例３：
炭酸塩化した炭酸カルシウムの接着性および凝集性は、以下のようにして確認する：
実施例１の手順の工程Ｉ．７の終わりに得られた粉末真珠層1gをそれぞれ含むダッペンNo.1およびNo.2と名付けた2つのダッペン皿に以下を加える：
−  0.1gの天然炭酸カルシウム（ダッペンNo.1）、
−  実施例１の手順の工程ＩＩＩから得られた0.1gの炭酸塩化を受けた天然炭酸カルシウム（ダッペンNo.2）。
【０１５７】
混合後、各ダッペン皿の内容物を2ccの全血と混合する。
【０１５８】
全血と混合した後、2分後（図1）と次いで15分後（図2）にダッペン皿の写真を撮影する。
【０１５９】
図1（1）に示すように、ダッペンNo.1の混合物は赤色粉末のままである；血塊は形成されていない。15分後、血塊は形成されなかった（図2（1））。
【０１６０】
図1（2）に示すように、ダッペンNo.2の混合物は速やかに血塊を形成し、赤から茶色に徐々に変色し、固まり、成型可能であり、粘着性となり、15分後には硬化する（図2 ））。
【０１６１】
実施例４：即席骨代用物の調合
重大な臨床事例は、骨接合によって処置された1歳の雌の子馬の脚砲骨の斜骨折であった。4つのボルトの破損に反映される骨接合の失敗の後、敗血症を伴う偽関節症に続いて、小断片を伴う細分化二次骨折が起こり、動物の安楽死が唯一の選択肢として残され、以下の調合の本発明に従う材料を使用することが決断された：
【０１６２】
−  実施例１の工程Ｉ．８から得られた、50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する40ｇの霰石混合バッチ；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.070gの不溶性抽出生体高分子;
−  実施例１の工程ＩＩ．１で得られた0.010gの可溶性抽出生体高分子;
−  実施例１の手順の工程ＩＩＩから得られた2gの炭酸塩化された炭酸カルシウム;
−  10cmの長さと2cmの直径を有するシリンダーの形状に成型され、骨壊死片の切除後に喪失部に設置される、血塊を形成するための10mlの自己静脈血。
【０１６３】
脚を圧迫で保護し、石膏に入れた。術後のX線撮影では、本発明に従う骨代用物の存在および付着が示され、次いで4ヶ月間の固化が行われた後には、その子馬はギャロップして障害物を飛び越えることができた。その後のX線写真では、髄腔の再建を伴う骨軸の完全な修復が示された。
【０１６４】
同様の調合が室温で2.5mlの注射用水（WFI）と共にも使用され、凝塊が即時的に作製された。
【０１６５】
実施例５：皮膚回復クリームの調合
本発明に従う生成物の調製は、以下の割合の調合で行った：
−  実施例2に従って得られた50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する10ｇの霰石混合バッチ;
−  実施例1の工程II.2で得られた0.035gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例1の工程II.2で得られた0.005
gの可溶性抽出生体高分子；
−  0.5gの炭酸塩化されたカルシウム炭酸カルシウム；
−  100mlにつき以下を含む、15滴のエッセンシャルオイルの複合体：
Lavandula spica：1 ml
Salvia officinalis：2 ml
Rosa rubiginosa：10 ml
Helichrysum italicum：1.5 ml
小麦麦芽植物油：50 ml
イブニングプリムローズ油：10 ml
スイートアーモンド油：20 ml
O/Wエマルジョン、q.s. 100ｇ
【０１６６】
この調製物を馬の胸骨胸板、頸の基部から膝蓋骨までの皮膚壊死部、高さ32cm、幅18cmに塗布した。臨床観察では、種々の腱膜、皮下および皮膚面の再建と、同時の変色のない毛の再増殖を伴う、高さおよび幅の1cm/日の例外的な回復が示され、28日間で外皮が完全に治癒した。
【０１６７】
実施例６：乾癬を治療するための皮膚科調製物の調合
よく知られているように、乾癬は、アポトーシスを伴わずに加速された細胞再生を特徴とする皮膚の炎症性障害であり、プラークとしての厚い外皮の形成をもたらす。結果が定まらず期待外れなコルチコステロイド療法ならびにコールタールおよびPUVA療法に基づく局所治療とは別に、患者にとって危険な副作用を伴う、より劇的な治療法がある。
【０１６８】
本発明に従う生成物の調製は、以下の割合の調合で行う：
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた3gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.45gの可溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩＩで得られた0.5gの炭酸塩化されたカルシウム炭酸カルシウム;
−  100mlにつき以下を含む、10滴のエッセンシャルオイルの複合体：
Lavandula spica：1ml
Salvia officinalis：2ml
Rosa rubiginosa：10ml
Helichrysum italicum：1.5ml
小麦麦芽植物油：50 ml
イブニングプリムローズ油：10ml
スイートアーモンド油：20ml
O/Wエマルジョン、q.s. 100g
【０１６９】
このエマルジョンを胴体、背中、腕および脚のレベルで重度の乾癬の病変部に毎日塗布する。3回目の塗布後、発赤の消失が観察され、顕著な外観の改善を伴う炎症現象の緩和、皮膚の白点、および掻痒および重複感染の軽減が示される。臨床徴候の改善は、不溶性及び可溶性の生体高分子の富栄養性、消炎性および再生性を反映している。
【０１７０】
実施例７：熱傷のための皮膚ドレッシングの調合
実施例１の工程ＩＩに従って抽出された不溶性および可溶性の生体高分子の軟組織再生の例外的な特性が、ケラチノサイト移植の失敗後の深達性2度および3度熱傷の症例において、以下の調合を用いて示された：
【０１７１】
100gにつき：
−  実施例２に従って得られた50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する50gの霰石混合バッチ;
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.174gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.026gの可溶性抽出生体高分子；
−  セイヨウバクチノキ水を伴うコールドクリーム（Cerat de Galien） q.s. 100g。
【０１７２】
この調製物を密封包帯下のすべての火傷領域に塗布し、これを72時間ごとに繰り返す。
反復臨床試験では、滲出現象の緩和、著しい血管形成、痛みの緩和、血液の含浸領域の再上皮化、および線維性張力の顕著な減少が示されている。
【０１７３】
実施例８：生体吸収性成形骨代用物の調合
本発明に従う材料は、生体吸収性の骨接合デバイスおよび成形インプラントの製造に使用することができる。
【０１７４】
本発明によれば、100gにつき以下が調製される：
−  実施例１の工程Ｉ．８から得られた、50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する80gの霰石混合バッチ；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.139gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.021gの可溶性抽出生体高分子；
−  20gのマクロゴール400;
−  実施例１の工程ＩＩＩで得られた4gの炭酸塩化されたカルシウム炭酸カルシウム。
【０１７５】
押出可能かつ成形可能な均質なプラスチックペーストが得られるまで、室温で全体を10分間ミキサーで混合する。
【０１７６】
適切な形状の型穴を骨接合デバイスおよび／またはインプラントの挿入の可能な領域の解剖学的構造のデジタルモデリングによって生成する。
【０１７７】
先に得られた十分な量のペーストを1つ以上の型穴を含む型の圧縮チャンバーに射出する。
【０１７８】
次いで、全体を100から220Nまで圧力を徐々に増加させて圧縮する；可変の時間の間、圧力を維持し、徐々に0まで減少させる。
【０１７９】
デバイスを一旦、型から取り出し、40℃で乾燥させ、二重包装に包み、25kGyの電離放射線で滅菌する。
【０１８０】
実施例９：生体吸収性が制御された骨代用物の調製
骨代用物または生体吸収性デバイスの生体吸収は、血管新生および骨リモデリングに関与する細胞によるそのコロニー形成を可能にするために、相互接続された細孔の直径に直接関連し、それは5ミクロンから100ミクロンまでで変動しなければならないことが見出されている。
【０１８１】
これが、本発明者らが、制御された相互接続された多孔性を有する骨代用物または成形インプラントの製造を提案する理由である。
【０１８２】
この目的のために、100gに対して、以下の調製物を作製する：
−  実施例２において得られた50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する80ｇの霰石混合バッチ;
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.139gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.021gの可溶性抽出生体高分子；
−  ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）の50％溶液20ml。
−  長さ5mm、直径5/0から12/0の範囲の吸収性合成モノフィラメント縫合糸のストランド20mm3。
【０１８３】
これらの吸収性糸は、グリコール酸、グリコールコポリマー、εーカプロラクトンポリグラクチン（Vicryl Rapideまたは照射）、キトサンなどのポリマーである。これらの糸は12〜90日の時差的な吸収を示す。
【０１８４】
先の例と同様に、ペーストを型穴に射出し、次いで圧縮する。次いで、デバイスまたはインプラントを型から取り出し、乾燥させ、二重包装で包み、以前と同様に25kGyで滅菌する。
【０１８５】
実施例１０：注射可能な骨代用物および内部補綴封止セメントの調製
セメントを100gに対して以下の組成で調製する：
−  80gの本発明に従う材料は、以下から成る：
−  実施例1の工程I.8の終わりに得られた、50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する73ｇの霰石混合バッチ；
−  実施例1の工程II.2で得られた2.702gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例1の工程II.2で得られた0.405gの可溶性抽出生体高分子；
−  実施例1の工程IIIで生じた3.699gの炭酸塩化されたカルシウム炭酸カルシウム;
−  50％の高粘度水溶液中の20gのHPMC。
【０１８６】
このようにして得られた生成物を、例えば0.5cm3から1cm3の可変容量の真っ直ぐまたは傾斜した先端を有するシリンジ中に真空下または制御された雰囲気下で詰め、約4℃の温度で冷蔵保存する。
【０１８７】
この調製物は、封止セメントとしても使用可能であり、例えば髄腔内の補綴の尾部を封止する際に封止生成物が循環系に移動することをの回避を可能とする。
さらに、その組成のために、肺系に影響を及ぼす危険性がある揮発性物質の放出を引き起こさない。
【０１８８】
このような組成物は、低侵襲手術における椎骨形成術および椎骨形成術のためにも提案される。
【０１８９】
実施例１１：コラーゲン担体を伴う骨代用物の調製
骨代用物を以下の組成で作製する：
調製物100gにつき：
−  実施例１の工程Ｉ．８から得られた、50ナノメートルから20ミクロンの粒度分布を有する50ｇの霰石混合バッチ；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.087gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.013gの可溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩＩで得られた2.5gの炭酸塩化されたカルシウム炭酸カルシウム;
−  50gのマクロゴール400;
【０１９０】
約10Pa-sの粘度を有するゲルが得られるまで、全体を混合する。
【０１９１】
2mmの大きさの断片に切り詰めた30gのSpongia officinalisをこのゲルに加える。
【０１９２】
約108Pa-sの粘度を有する均質なペーストが得られるまで、全体を混合する。骨接合デバイスまたはインプラントのための型穴を含む型に全体を注入する。型から外した後、デバイスまたはインプラントを40℃の熱風下で乾燥させ、二重包装で包み、現在のプロトコールに従って滅菌する。
【０１９３】
実施例１２：骨代用物の調製
別の実施形態によれば、霰石画分のみ及び/若しくは方解石画分から抽出された生体高分子を合成または天然由来の任意の他のバイオマテリアルに添加して、特定の特性、特にそれらが欠いている骨誘導性または骨模倣性を最適化または誘発することができる。
【０１９４】
よって、100gにつき以下の調合に従って、特定のカルシウム塩のような骨伝導性の代用物に、霰石層から抽出されたバイオポリマーを補充した：
−  粒度分布が50〜250ミクロンのβTCPの顆粒95g；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた4.4gの不溶性抽出生体高分子；
−  実施例１の工程ＩＩ．２で得られた0.6gの可溶性抽出生体高分子。
【０１９５】
この調製物を自己血液と混合し、上中央切歯頂部の嚢胞の捻除によって形成された骨欠損部に挿入する。
【０１９６】
同時に、上犬歯の歯根尖周囲肉芽腫の捻除によって形成された喪失部にβTCPのみを詰める。
【０１９７】
2週間目に行われた放射線検査では、βTCP＋不溶性および可溶性の抽出生体高分子で処理した嚢胞腔の骨緻密化が、βTCPの顆粒が識別でき骨伝導のみが呈される第2の腔よりも大きく且つ速く、一方、嚢胞腔では骨誘導が骨伝導と同時に生じ、βTCPが新しい特性を獲得したことが示された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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