(57)【要約】  本発明は、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本発明はさらに、このようなＣＡＲを含む操作された免疫細胞、ＣＡＲ−コード核酸、ならびにこのようなＣＡＲ、操作された免疫細胞、および核酸を作製する方法に関する。本発明はさらに、ＢＣＭＡを発現する悪性細胞に関連した状態（例えば、がん）を処置するためのこれらのＣＡＲおよび操作された免疫細胞の使用のための治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外ドメインは、配列番号３３、７２、３９、７６、８３、９２、２５、または８に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域由来の３種のＣＤＲを含むＶＨ領域、および配列番号３４、７３、４０、７７、８４、９３、１８、または８０に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域由来の３種のＣＤＲを含むＶＬ領域を含む、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
ＶＨ領域が、配列番号３３、７２、３９、７６、８３、９２、２５、もしくは８に示した配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、かつ／あるいはＶＬ領域が、配列番号３４、７３、４０、７７、８４、９３、１８、もしくは８０に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、請求項１に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項３】
ＶＨ領域が、配列番号１５０、１５１、もしくは１５２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８７もしくは１８８に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１５５に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、ならびに、ＶＬ領域が、配列番号２４９に示した配列を含む軽鎖可変ＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２２５に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１または２に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項４】
ＶＨ領域が、配列番号７２に示したアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号７３に示したアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項５】
各ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義およびＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義されている、請求項１または２に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項６】
細胞内シグナリングドメインが、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項７】
細胞内シグナリングドメインが、４−１ＢＢドメインを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項８】
第２の細胞内シグナリングドメインをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項９】
第２の細胞内シグナリングドメインが、４−１ＢＢドメインを含む、請求項８に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１０】
細胞外リガンド結合ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にストークドメインをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１１】
ストークドメインが、ヒトＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαヒンジからなる群から選択される、請求項１０に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１２】
ＣＤ２０エピトープをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１３】
ＣＤ２０エピトープが、配列番号３９７または配列番号３９８に示したアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１４】
配列番号３９６に示したアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１５】
第１の膜貫通ドメインが、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１６】
ＢＣＭＡに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１７】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインが、単一ポリペプチド上にある、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１８】
第２の膜貫通ドメインをさらに含み、第１の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインは、第１のポリペプチド上にあり、第２の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナリングドメインは、第２のポリペプチド上にあり、第１の膜貫通ドメインは、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項１９】
共刺激分子由来の細胞内シグナリングドメインに融合した第３の膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドをさらに含み、第３の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１８に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２８３４を有するベクターの核酸配列によってコードされるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３９９に示した核酸配列を含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２０から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
細胞表面膜において、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞。
【請求項２５】
ＢＣＭＡに特異的でない別のＣＡＲをさらに含む、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２６】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２４または２５に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２７】
自殺ポリペプチドがＲＱＲ８である、請求項２６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２８】
炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
破壊的な１種または複数の内在性遺伝子をさらに含み、内在性遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、または例えば、プログラム死−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３０】
健康ドナーから得られる、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
患者から得られる、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３２】
医薬としての使用のための、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３３】
医薬が、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、炎症に関連したびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性カストルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、ならびに他のＢ細胞関連リンパ腫からなる群から選択されたＢ細胞関連がんの処置における使用のためである、請求項３２に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３４】
免疫細胞を操作する方法であって、
ａ．免疫細胞を準備することと、
ｂ．細胞の表面において、請求項１から１９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現させることと
を含む、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
ａ．免疫細胞を準備することと
ｂ．前記ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを細胞内に導入することと、
ｃ．前記ポリヌクレオチドを細胞内に発現させることと
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
ａ．免疫細胞を準備することと、
ｂ．前記ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを細胞内に導入することと、
ｃ．ＢＣＭＡに特異的でない少なくとも１種の他のＣＡＲを導入することと
を含む、方法。
【請求項３７】
必要とする対象を処置する方法であって、
ａ．表面において、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を準備することと、
ｂ．前記患者に前記免疫細胞を投与することと
を含む、方法。
【請求項３８】
請求項２４から３１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３９】
対象におけるＢＣＭＡを発現する悪性細胞に関連した状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
状態が、がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
がんが、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、炎症に関連したびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性カストルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、ならびに他のＢ細胞関連リンパ腫からなる群から選択されたＢ細胞関連がんである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＢＣＭＡを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３８に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４３】
対象におけるＢＣＭＡを発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３８に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４４】
ＢＣＭＡを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３８に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
対象にヌクレオシド類似体療法を投与することをさらに含む、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ヌクレオシド類似体療法が、フルダラビンまたはクロファラビンである、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ＣＡＲは、免疫細胞特異性および反応性をリガンド結合ドメイン性質を活用して選択された標的にリダイレクトすることができる。特に、本発明は、Ｂ細胞成熟抗原に特異的に結合するＣＡＲ（ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ）に関する。本発明はさらに、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、および自己の表面でＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する単離細胞に関する。本発明はさらに、自己の表面でＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を操作するための方法に関する。本発明は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病の処置に特に有用である。本発明はさらに、ＢＣＭＡを発現する悪性細胞に関連した状態（例えば、がん）を処置するための、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを含む免疫細胞（ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物、およびＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫は、クローン性形質細胞の蓄積によって特徴付けられる悪性腫瘍である（例えば、Ｌｏｎｉａｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７７（６）：１２６４〜１２７７（２０１１）を参照）。ＭＭの現在の療法は、緩解をもたらすが、ほとんどすべての患者は、最終的に再発し、死亡することが多い（例えば、Ｒａｊｋｕｍａｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ、５（８）：４７９〜４９１（２０１１）を参照）。
【０００３】
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝的に修飾されたＴ細胞の養子移入は、がんを処置する新しい手法としての将来性を示している（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２（２）：２５１〜２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、８（４）：２９９〜３０８（２００８）を参照）。Ｔ細胞は、抗原認識部分およびＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質である、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に修飾することができる（例えば、Ｅｓｈｈａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（２）：７２０〜７２４（１９９３）、およびＳａｄｅｌａｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１（２）：２１５〜２２３（２００９）を参照）。
【０００４】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、またはＴＮＦＲＳＦ１７）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、ｔ（４；１６）転座を含有する悪性ヒトＴ細胞リンパ腫において同定された。その遺伝子は、Ｂ細胞系統において選択的に発現され、形質芽球および形質細胞、抗体分泌細胞において最高に発現される。ＢＣＭＡは、それぞれ１μＭならびに１６ｎＭの親和性を伴って、２つのリガンド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（Ｂリンパ球刺激物質（ＢＬｙＳ）およびＡＰＯＬ関連白血球発現リガンド（ＴＡＬＬ−１）とも呼ばれる）ならびに増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を結合させる。ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦがＢＣＭＡに結合すると、ＮＦ−カッパＢ、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ、およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼを伴うシグナリングカスケードが促進され、それにより、細胞生存および増殖のためのシグナルが生じる。ＢＣＭＡは、悪性Ｂ細胞、ならびに多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキンリンパ腫、および慢性リンパ球性白血病を含めたＢリンパ球を伴ういくつかのがんでも発現される。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチなどの形質芽球が関与する自己免疫疾患では、ＢＣＭＡ発現抗体産生細胞は、自分自身を攻撃する自己抗体を分泌する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多発性骨髄腫の場合では、毎年、約２４，０００の新しい症例が米国において新たに診断されており、この数は、米国において新たに診断される血液がんの約１５％を占める。毎年、平均で１１，０００の死亡例が多発性骨髄腫から生じ、平均５年生存率は、約４４％であり、生存期間中央値は、５０〜５５カ月である。多発性骨髄腫の現在の処置は、形質細胞アポトーシスおよび／または破骨細胞活性の低下に焦点が置かれている（例えば、化学療法、サリドマイド、レナリドミド、ビスホスホネート、および／またはプロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））もしくはカルフィルゾミブなど）。しかし、多発性骨髄腫は、不治の疾患のままであり、ほとんどすべての患者は、これらの作用物質に対する耐性を発生させており、最終的には再発する。したがって、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲおよびＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む抗ＢＣＭＡアンタゴニストの使用などの多発性骨髄腫の代替の処置は、優れた治療剤をもたらすはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＢＣＭＡに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。ある特定のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現されてＢＣＭＡと接触するとＴ細胞を活性化する場合、有効であることが実証される。本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、ヒトおよびカニクイザルＢＣＭＡを結合させることが有利である。本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞と接触すると、脱顆粒活性、インターフェロンガンマ産生の増大、および／または細胞傷害活性を呈することも有利である。
【０００７】
一態様では、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲであって、細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列ＳＹＸ１ＭＸ２（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＰであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｎ、もしくはＳである）（配列番号３０１）、ＧＦＴＦＸ１ＳＹ（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＳである）（配列番号３０２）、またはＧＦＴＦＸ１ＳＹＸ２ＭＸ３（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＳであり、Ｘ２は、ＡもしくはＰであり、Ｘ３は、Ｔ、Ｎ、もしくはＳである）（配列番号３０３）を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＤＸ９Ｘ１０ＫＧ（式中、Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｌ、Ａ、もしくはＣであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、もしくはＶであり、Ｘ３は、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ａ、Ｓ、もしくはＭであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｆ、もしくはＷであり、Ｘ５は、ＧもしくはＴであり、Ｘ６は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｙ、Ｗ、もしくはＦであり、Ｘ７は、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｖ、Ｋ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、もしくはＧであり、Ｘ９は、Ｖ、Ｒ、もしくはＬであり、Ｘ１０は、ＧもしくはＴである）（配列番号３０５）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、もしくはＭであり、Ｘ２は、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ａ、Ｓ、もしくはＭであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、Ｆ、もしくはＷであり、Ｘ４は、ＧもしくはＳであり、Ｘ５は、ＧもしくはＴであり、Ｘ６は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｙ、もしくはＷである）（配列番号３０６）を含むＶＨ  ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列ＶＳＰＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＹであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、Ｇ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、もしくはＥである）（配列番号３０７）、またはＹＷＰＭＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｓ、Ｔ、もしくはＡであり、Ｘ２は、Ｉ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、もしくはＤである）（配列番号３０８）を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／あるいは（ｂ）（ｉ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（式中、Ｘ１は、Ｒ、Ｇ、Ｗ、Ａ、もしくはＣであり、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｌ、Ｃ、もしくはＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、もしくはＲであり、Ｘ４は、Ｑ、Ｃ、Ｅ、Ｖ、もしくはＩであり、Ｘ５は、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｒ、もしくはＤであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｇ、もしくはＩであり、Ｘ７は、Ｓ、Ｅ、Ｄ、もしくはＰであり、Ｘ８は、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｅ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、もしくはＹであり、Ｘ９は、Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｍ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、もしくはＲであり、Ｘ１０は、ＹもしくはＦであり、Ｘ１１は、Ｌ、Ｗ、もしくはＰであり、Ｘ１２は、Ａ、Ｓ、もしくはＧである）（配列番号３０９）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列Ｘ１ＡＳＸ２ＲＡＸ３（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＤであり、Ｘ２は、ＳもしくはＩであり、Ｘ３は、ＴもしくはＰである（配列番号３１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列ＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ（式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、もしくはＹであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ａ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｋ、もしくはＣであり、Ｘ３は、Ｗ、Ｆ、もしくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ、もしくはＩである）（配列番号３１１）、またはＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４（式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｒ、Ｋ、もしくはＹであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ａ、Ｈ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｆ、もしくはＹであり、Ｘ３は、Ｗ、Ｓ、もしくはＦであり、Ｘ４は、ＬもしくはＩである（配列番号３１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲであって、細胞外ドメインは、配列番号３３、７２、３９、７６、８３、９２、２５、または８に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域由来の３種のＣＤＲを含むＶＨ領域、および配列番号３４、７３、４０、７７、８４、９３、１８、または８０に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域由来の３種のＣＤＲを含むＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３３、７２、３９、７６、８３、９２、２５、もしくは８に示した配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み得、かつ／あるいはＶＬ領域は、配列番号３４、７３、４０、７７、８４、９３、１８、もしくは８０に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するそのバリアントを含みうる。
【０００９】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５０、１５１、１５２、１５６、１５７、１２９、１３０、もしくは１３１に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１５３、１５４、１８７、１８８、１６５、１６６、１６２、１５９、１９０、１９１、１６９、１５４、１３９、１４０、１３２、もしくは１３３に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５、１６１、１３４、もしくは１３７に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）配列番号２０９、２４９、２２６、２５１、２６２、２７１、２１７、もしくは３７７に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２２１、２５２、もしくは２１０に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２２、２２５、２２７、２５３、２６３、２７２、２１６、もしくは２１４に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５０、１５１、もしくは１５２に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１５３もしくは１５４に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２０９に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２２１に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２２に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５０、１５１、もしくは１５２に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１８７もしくは１８８に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２４９に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２２１に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２５に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５０、１５１、もしくは１５２に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１６５もしくは１６６に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２２６に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２２１に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２７に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５６、１５１、もしくは１５７に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１６２もしくは１５９に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６１に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２５１に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２５２に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２５３に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５６、１５１、もしくは１５７に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１９０もしくは１９１に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６１に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２６２に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２５２に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２６３に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１５０、１５１、もしくは１５２に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１６９もしくは１５４に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２７１に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２２１に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２７２に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１２９、１３０、もしくは１３１に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１３９もしくは１４０に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３４に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２１７に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２１０に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１６に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１２９、１３０、もしくは１３１に示した配列を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１３２もしくは１３３に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３７に示した配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３７７に示した配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２１０に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１４に示した配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、別の細胞内シグナリングドメインをさらに含む。一部の実施形態では、追加の細胞内シグナリングドメインは、４−１ＢＢドメインを含みうる。
【００１９】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にストークドメインを含みうる。一部の実施形態では、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαヒンジからなる群から選択されうる。
【００２０】
一部の実施形態では、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含みうる。
【００２１】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０エピトープを含みうる。
【００２２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインを含みうる。
【００２３】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、配列番号３９６に示したアミノ酸配列を含みうる。
【００２４】
ＣＡＲの一部の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインは、単一ポリペプチド上にある。
【００２５】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、第２の膜貫通ドメインを含むことができ、第１の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインは、第１のポリペプチド上にあり、第２の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナリングドメインは、第２のポリペプチド上にあり、第１の膜貫通ドメインは、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激分子由来の細胞内シグナリングドメインに融合された第３の膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドを含むことができ、第３の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、その細胞表面膜において本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、ＢＣＭＡに特異的でない別のＣＡＲを含みうる。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＲＱＲ８である。
【００２９】
一部の実施形態では、免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来しうる。
【００３０】
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、破壊的な１種または複数の内在性遺伝子を含むことができ、内在性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、または例えば、プログラム死−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする。
【００３１】
一部の実施形態では、免疫細胞は、健康ドナーから得られる。一部の実施形態では、免疫細胞は、患者から得られる。
【００３２】
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、その細胞表面膜において本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、医薬は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、炎症に関連したびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性カストルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、ならびに他のＢ細胞関連リンパ腫からなる群から選択されたＢ細胞関連がんの処置における使用のためである。
【００３３】
別の態様では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、細胞の表面において本明細書に記載の少なくとも１種のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現させることとを含む、方法を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、方法は、免疫細胞を準備することと、前記ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを細胞内に導入することと、細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させることとを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、方法は、免疫細胞を準備することと、前記ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを細胞内に導入することと、ＢＣＭＡに特異的でない少なくとも１種の他のＣＡＲを導入することとを含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、悪性細胞に関連した状態に罹患している対象を処置する方法であって、表面において本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を準備することと、前記患者に前記免疫細胞を投与することとを含む、方法を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、対象におけるＢＣＭＡを発現する悪性細胞に関連した状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む請求項に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、状態は、がんである。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、炎症に関連したびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性カストルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、ならびに他のＢ細胞関連リンパ腫からなる群から選択されたＢ細胞関連がんである。
【００３９】
別の態様では、本発明は、ＢＣＭＡを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、対象におけるＢＣＭＡを発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、ＢＣＭＡを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物の有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
一部の実施形態では、上記方法のいずれも、１種または複数の追加の療法、例えば、モノクローナル抗体および／または化学療法剤などを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などに結合する抗体でありうる。一部の実施形態では、上記方法のいずれも、対象に、ヌクレオシド類似体療法、例えば、フルダラビンまたはクロファラビンなどを投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＭＭ１．Ｓ腫瘍モデルにおけるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔでの処置の結果を要約するグラフを表す。
【図２】Ｍｏｌｐ８腫瘍モデルにおけるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔでの処置の結果を要約するグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書に開示の発明は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲを含む免疫細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を提供する。本発明は、これらのＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物、ならびにこれらのＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞を作製および使用する方法も提供する。本発明は、がんなどの対象における悪性ＢＣＭＡ発現に関連した状態を処置するための方法も提供する。
【００４５】
一般的な技法
本発明の実施は、別段に示されていない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣例的な技法を使用することになる。このような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などに完全に説明されている。
【００４６】
定義
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書では、リガンドを結合させることができるオリゴまたはポリペプチドを指す。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることになる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。
【００４７】
用語「ストークドメイン」または「ヒンジドメイン」は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを指すのに本明細書で互換的に使用される。特に、ストークドメインは、細胞外リガンド結合ドメインにより大きな柔軟性および近接性をもたらすのに使用される。
【００４８】
用語「細胞内シグナリングドメイン」は、エフェクターシグナル機能シグナル（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を伝達し、細胞に特殊機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。
【００４９】
「共刺激分子」は、本明細書では、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってそれだけに限らないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体が含まれる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３や、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどがある。
【００５０】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激シグナル分子を特異的に結合させ、それによって、例えば、ペプチドを負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、それだけに限らないが、増殖活性化、分化などを含めたＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとして、それだけに限らないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体を結合させるアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、それだけに限らないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３や、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどと特異的に結合する抗体も包含する。
【００５１】
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置した、少なくとも１つの抗原認識部位を通じて標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書では、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、ならびにドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構成も包含する。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭなど（またはそのサブクラス）の抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置は、周知である。
【００５２】
抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、本明細書では、所与の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片によって果たされうる。用語の抗体の「抗原結合断片」内に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６、１９８９）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。
【００５３】
標的（例えば、ＢＣＭＡタンパク質）に「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体、抗体コンジュゲート、またはポリペプチドは、当技術分野でよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を判定する方法も、当技術分野で周知である。分子が特定の細胞または物質と、それが代替の細胞または物質と反応または会合するより、頻繁に、急速に、大きい継続時間および／または大きい親和性で、反応または会合する場合、分子は、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、標的に、それが他の物質に結合するより大きい親和性、結合活性で、より容易に、かつ／またはより大きい継続時間で結合する場合、「特異的に結合し」または「優先的に結合する」。例えば、ＢＣＭＡエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、抗体であって、それが他のＢＣＭＡエピトープ、非ＢＣＭＡエピトープに結合するより、大きい親和性、結合活性で、より容易に、かつ／またはより大きい継続時間でこのエピトープを結合させる、抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合してもよく、結合しなくてもよいことも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも要求しない（しかし、それは、排他的結合を含むことができる）。一般に、しかし必ずしもではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。
【００５４】
抗体の「可変領域」は、単独または組合せで、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で公知であるように、重および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一緒に保持されており、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを判定するための少なくとも２つの技法：（１）異種間配列変異性に基づく手法（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））、および（２）抗原抗体複合体の結晶学的スタディに基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７〜９４８）が存在する。本明細書では、ＣＤＲは、いずれかの手法によって、または両手法の組合せによって定義されるＣＤＲを指すことができる。
【００５５】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、ならびに／もしくはコンホメーション定義、または当技術分野で周知のＣＤＲ判定の任意の方法の定義に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって元来定義された超可変領域として同定される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらによって元来記述された構造的ループ構造として同定することもできる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３、１９８９を参照。ＣＤＲ同定の他の手法としては、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の妥協案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（現在、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導出される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５、１９９６に示された、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」がある。ＣＤＲの「コンホメーション定義」として本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置を、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６、２００８を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わない場合があるが、それにもかかわらず、これらは、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しくインパクトを与えないという予測または実験的所見を踏まえると短くまたは長くすることができるとはいえ、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになる。本明細書では、ＣＤＲは、手法の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかによって定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義されうる。
【００５６】
本明細書では、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に向けられて、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に向けられている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈されるべきでない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４、１９９０に記載された技法を使用して作られるファージライブラリーから単離することもできる。
【００５７】
本明細書では、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲ由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列内にも見出だされないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するのに含められる残基を含みうる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことになる。ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾されたＦｃ領域を有する抗体が好適である。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更されている１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、またはＣＤＲ  Ｈ３）を有し、これらのＣＤＲは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
【００５８】
本明細書では、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する、かつ／または当業者に公知もしくは本明細書に開示のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。１つのこのような例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して生成されうる。一実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、この場合ファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４、１９９６；Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９５：６１５７〜６１６２、１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座が内因性遺伝子座の代わりに遺伝子導入で導入された動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウスの免疫化によって作製することもできる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、および同第５，６６１，０１６号に記載されている。代わりに、ヒト抗体は、標的抗原に向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製されてもよい（このようなＢリンパ球は、個体からもしくはｃＤＮＡの単細胞クローニングから回収することができ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫されうる）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５、１９９１、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照。
【００５９】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指すように意図されている。
【００６０】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、好ましくは相対的に短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すのに本明細書で互換的に使用される。鎖は、直鎖状であっても分枝状であってもよく、これは、修飾アミノ酸を含むことができ、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然に、あるいは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他のマニピュレーションもしくは修飾、例えば、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどによって修飾されたアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１種または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在しうることが理解される。
【００６１】
「一価抗体」は、１分子当たり１つの抗原結合部位を含む（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）。一部の事例では、一価抗体は、１つを超える抗原結合部位を有しうるが、結合部位は、異なる抗原由来である。
【００６２】
「二価抗体」は、１分子当たり２つの抗原結合部位を含む（例えば、ＩｇＧ）。一部の事例では、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は、二重特異性でありうる。
【００６３】
「二重特異性」、「デュアル特異性」または「二重機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体の２つの抗原結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、これらのエピトープは、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在しうる。
【００６４】
本発明の抗体は、当技術分野で周知の技法、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、もしくはこのような技術の組合せ、または当技術分野において容易に分かる他の技術を使用して生成することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４５：１６２８〜５０、１９９９、およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、３７３（４）：９２４〜４０、２００７を参照）。
【００６５】
当技術分野で公知であるように、本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に組み込まれうる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびこれらの類似体などを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖を集合させる前または後に授けることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどによって重合後にさらに修飾されてもよい。修飾の他のタイプとしては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を有するものおよび荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）など、ならびにポリヌクレオチドの無修飾形態がある。さらに、糖の中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えられ、標準的な保護基によって保護され、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結をもたらすように活性化され得、または固体支持体にコンジュゲートされうる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化し、またはアミン、もしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化されうる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、アルファ−またはベータ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似型も含有することができる。１個または複数のホスホジエステル連結を代替の連結基によって置き換えることができる。これらの代替の連結基としては、それだけに限らないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである）によって置き換えられている実施形態がある。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前記記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めて本明細書に言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００６６】
当技術分野で公知であるように、抗体の「定常領域」は、単独または組合せで抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００６７】
本明細書では、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【００６８】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを取り込むためのベクターのレシピエントでありうる、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合がある（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体において）。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００６９】
本明細書では、「免疫細胞」は、自然および／または適応的免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血起源の細胞を指す。
【００７０】
当技術分野で公知であるように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、位置Ｃｙｓ２２６におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端に伸びるように通常定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００７１】
当技術分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合させるもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有し、その細胞質ドメインが主に異なる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４、１９９４；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１、１９９５に総説されている。「ＦｃＲ」には、新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれ、これは、母体ＩｇＧの胎仔への移動を担う（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７、１９７６；およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９、１９９４）。
【００７２】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体またはその抗原結合断片（もしくは部分）が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合と十分同様の様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に低下することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に低下する残された選択は、当てはまりうるが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかし、各抗体が、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ、より大きい、またはより少ない程度であってもなくても検出可能に阻害する場合、抗体は、これらのそれぞれのエピトープの結合を互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合する抗体はともに、本発明によって包含されている。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に提供される教示に基づいて、このような競合および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書に開示の方法に有用でありうることを理解するはずである。
【００７３】
本明細書では、「自己の」は、患者を処置するのに使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに源を発することを意味する。
【００７４】
本明細書では、「同種間の」は、患者を処置するのに使用される細胞または細胞の集団が前記患者に源を発しないが、ドナーに源を発することを意味する。
【００７５】
本明細書では、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、それだけに限らないが、以下：新生物もしくはがん性細胞の増殖の低減（もしくはこれらの細胞の破壊）、新生物細胞の転移の阻害、ＢＣＭＡ発現腫瘍のサイズの縮小もしくは低下、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）の緩解、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）から生じる症状の低下、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）に罹患している者の生活の質の増大、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）を処置するのに要求される他の薬物療法の用量の低下、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）の進行の遅延、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）の治癒、および／またはＢＣＭＡ関連疾患（例えば、がん）を有する患者の生存期間の延長のうちの１つまたは複数がある。
【００７６】
「寛解させること」は、ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ抗体コンジュゲートを投与しないことと比較した１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。「寛解させること」は、症状の継続時間の短縮または低減も含む。
【００７７】
本明細書では、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、疾患、その合併症、および疾患の発生中に提示する中間病理学的表現型の生化学的な、組織学的な、および／または行動上の症状を含めた疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発症の遅延がある。治療的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、臨床結果、例えば、様々なＢＣＭＡ関連疾患または状態（例えば多発性骨髄腫など）の発生率の低減または１つもしくは複数の症状の寛解、疾患を処置するのに要求される他の薬物療法の用量の低下、別の薬物療法の効果の増強、および／あるいは患者のＢＣＭＡ関連疾患の進行の遅延などがある。有効投与量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接的または間接的に予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されているように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて実現されてもよく、または実現されなくてもよい。よって、「有効投与量」は、１種または複数の治療剤の投与との関連で考慮することができ、単剤は、１種または複数の他の作用物質と併せて、望ましい結果が実現され得、または実現される場合、有効量で与えられていると見なすことができる。
【００７８】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜、競技動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが含まれる。
【００７９】
本明細書では、「ベクター」は、宿主細胞内に目的の１種または複数の遺伝子または配列を送達し、好ましくは宿主細胞内でこれらを発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞がある。
【００８０】
本明細書では、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーでありうる。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
【００８１】
本明細書では、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わされたとき、成分が生物活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任意の材料が含まれる。例として、それだけに限らないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤のいずれかが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与に好適な希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５を参照）。
【００８２】
用語「ｋｏｎ」は、本明細書では、抗体の抗原への会合に関する速度定数を指す。
【００８３】
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書では、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数を指す。
【００８４】
用語「ＫＤ」は、本明細書では、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
【００８５】
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に向けられた実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、範囲を定義している数値を含む。
【００８６】
実施形態が言い回し「含む」を用いて本明細書に記載されている場合は必ず、「からなる」および／または「から本質的になる」の観点から記載されている別段の類似の実施形態も提供されていることが理解される。
【００８７】
本発明の態様または実施形態が選択肢のマーカッシュ群または他の分類の観点から記載されている場合、本発明は、個々に群の各メンバーおよび主群のすべての可能性がある亜群のほかに全体として列挙された群全体だけでなく、群メンバーの１つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明は、主張した発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明確な除外も想定する。
【００８８】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が定義を含めて支配する。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べた整数または整数の群を含むことを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しない。脈絡による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００８９】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載したものと同様のまたは等価な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および実施例は、例示的なだけであり、限定的であるように意図されていない。
【００９０】
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲおよびこれらを作製する方法
本発明は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ（例えば、配列番号３５４または受託番号Ｑ０２２２３−２））に結合するＣＡＲを提供する。本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲには、単鎖ＣＡＲＳおよび多鎖ＣＡＲが含まれる。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合性質を活用して非ＭＨＣ制限様式でＴ細胞特異性および反応性をＢＣＭＡにリダイレクトする能力を有する。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに依存しない抗原を認識し、よって腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する能力を与える。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインは、１つのポリペプチド中、すなわち、単鎖中にある。多鎖ＣＡＲおよびポリペプチドも、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、多鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチド、ならびに膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインを含む第２のポリペプチドを含み、ポリペプチドは、一緒に集合させて多鎖ＣＡＲを形成する。
【００９２】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的多鎖ＣＡＲは、ＩｇＥの高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）に基づく。肥満細胞および好塩基球上で発現されるＦｃεＲＩは、アレルギー反応を誘発する。ＦｃεＲＩは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニット、および２つのジスルフィド連結γサブユニットから構成される四量体複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するＩＴＡＭを含有する。一部の実施形態では、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインが欠失され、ＢＣＭＡ特異的細胞外リガンド結合ドメインによって置き換えられている。一部の実施形態では、多鎖ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ、およびＦｃＲβ鎖のＩＴＡＭを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＦｃＲγ鎖を含んでも、含まなくてもよい。
【００９３】
一部の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することにより、軽および／または重鎖可変領域を連結することによって作製される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８）。連結ペプチドの一例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３３３）を有するＧＳリンカーであり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーも設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記）。一般に、リンカーは、短い柔軟なポリペプチドであり得、好ましくは、約２０またはそれ未満のアミノ酸残基から構成されうる。リンカーは、ひいては、追加の機能、例えば、薬物の付着または固体支持体への付着などのために修飾することができる。単鎖バリアントは、組換えで、または合成的に生成されうる。ｓｃＦｖの合成生産のために、自動シンセサイザーを使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の適当な宿主細胞内に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの慣例的なマニピュレーションによって作製することができる。結果として生じるｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
【００９４】
一部の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは（ｉ）配列ＳＹＸ１ＭＸ２（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＰであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｎ、もしくはＳである）（配列番号３０１）、４ＧＦＴＦＸ１ＳＹ（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＳである）（配列番号３０２）、またはＧＦＴＦＸ１ＳＹＸ２ＭＸ３（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＳであり、Ｘ２は、ＡもしくはＰであり、Ｘ３は、Ｔ、Ｎ、もしくはＳである）（配列番号３０３）を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＤＸ９Ｘ１０ＫＧ（式中、Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｌ、Ａ、もしくはＣであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、もしくはＶであり、Ｘ３は、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ａ、Ｓ、もしくはＭであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｆ、もしくはＷであり、Ｘ５は、ＧもしくはＴであり、Ｘ６は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｙ、Ｗ、もしくはＦであり、Ｘ７は、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｖ、Ｋ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、もしくはＧであり、Ｘ９は、Ｖ、Ｒ、もしくはＬであり、Ｘ１０は、ＧもしくはＴである）（配列番号３０５）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、もしくはＭであり、Ｘ２は、Ｇ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ａ、Ｓ、もしくはＭであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、Ｆ、もしくはＷであり、Ｘ４は、ＧもしくはＳであり、Ｘ５は、ＧもしくはＴであり、Ｘ６は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｙ、もしくはＷである）（配列番号３０６）を含むＶＨ  ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列ＶＳＰＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＹであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、Ｇ、Ｑ、Ｌ、Ｐ、もしくはＥである）（配列番号３０７）、またはＹＷＰＭＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｓ、Ｔ、もしくはＡであり、Ｘ２は、Ｉ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、もしくはＤである）（配列番号３０８）を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む（ａ）ＶＨ領域、ならびに／または（ｉ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（式中、Ｘ１は、Ｒ、Ｇ、Ｗ、Ａ、もしくはＣであり、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｌ、Ｃ、もしくはＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、もしくはＲであり、Ｘ４は、Ｑ、Ｃ、Ｅ、Ｖ、もしくはＩであり、Ｘ５は、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｒ、もしくはＤであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｇ、もしくはＩであり、Ｘ７は、Ｓ、Ｅ、Ｄ、もしくはＰであり、Ｘ８は、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｅ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、もしくはＹであり、Ｘ９は、Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｍ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、もしくはＲであり、Ｘ１０は、ＹもしくはＦであり、Ｘ１１は、Ｌ、Ｗ、もしくはＰであり、Ｘ１２は、Ａ、Ｓ、もしくはＧである）（配列番号３０９）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列Ｘ１ＡＳＸ２ＲＡＸ３（式中、Ｘ１は、ＧもしくはＤであり、Ｘ２は、ＳもしくはＩであり、Ｘ３は、ＴもしくはＰである）（配列番号３１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列ＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ（式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、もしくはＹであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ａ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｋ、もしくはＣであり、Ｘ３は、Ｗ、Ｆ、もしくはＳであり、Ｘ４は、ＬもしくはＩである）（配列番号３１１）、またはＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４（式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｒ、Ｋ、もしくはＹであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ａ、Ｈ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｆ、もしくはＹであり、Ｘ３は、Ｗ、Ｓ、もしくはＦであり、Ｘ４は、ＬもしくはＩである）（配列番号３１２）を含むＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、可動性リンカーによって一緒に連結される。一部の実施形態では、可動性リンカーは、配列番号３３３に示したアミノ酸配列を含む。
【００９５】
別の態様では、ＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲであって、ＣＡＲは、配列番号２、３、７、８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８３、８７、９２、７８、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０６、１１０、１１２、１１４、７６、１１８、１２０、１２２、１１２、１２５、１２７、３１３、もしくは３１４に示したＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または配列番号１、４、５、６、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３６、３８、４０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、３１７、８１、８２、８４、８５、８６、８８、８９、９０、９１、９３、９４、９６、９８、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０８、１０９、１１１、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１２６、１２８、３１５、もしくは３１６に示したＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む、ＣＡＲが提供されている。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、可動性リンカーによって一緒に連結される。一部の実施形態では、可動性リンカーは、配列番号３３３に示したアミノ酸配列を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、表１に列挙した部分的軽鎖配列のいずれか１つおよび／または表１に列挙した部分的重鎖配列のいずれか１つを有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。表１において、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ配列に下線が引かれており、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ配列が太字である重鎖ＣＤＲ２配列を除いて、下線を引いた配列は、ＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太字は、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ配列である。
【００９７】
【表１−１】
2018512153.tif 000002
【００９８】
【表１−２】
2018512153.tif 000003
【００９９】
【表１−３】
2018512153.tif 000004
【０１００】
【表１−４】
2018512153.tif 000005
【０１０１】
【表１−５】
2018512153.tif 000006
【０１０２】
【表１−６】
2018512153.tif 000007
【０１０３】
【表１−７】
2018512153.tif 000008
【０１０４】
【表１−８】
2018512153.tif 000009
【０１０５】
【表１−９】
2018512153.tif 000010
【０１０６】
【表１−１０】
2018512153.tif 000011
【０１０７】
【表１−１１】
2018512153.tif 000012
【０１０８】
【表１−１２】
2018512153.tif 000013
【０１０９】
【表１−１３】
2018512153.tif 000014
【０１１０】
【表１−１４】
2018512153.tif 000015
【０１１１】
【表１−１５】
2018512153.tif 000016
【０１１２】
【表１−１６】
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【０１１３】
【表１−１７】
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【０１１４】
【表１−１８】
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【０１１５】
【表１−１９】
2018512153.tif 000020
【０１１６】
【表１−２０】
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【０１１７】
【表１−２１】
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【０１１８】
【表１−２２】
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【０１１９】
【表１−２３】
2018512153.tif 000024
【０１２０】
【表１−２４】
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【０１２１】
【表１−２５】
2018512153.tif 000026
【０１２２】
【表１−２６】
2018512153.tif 000027
【０１２３】
【表１−２７】
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【０１２４】
【表１−２８】
2018512153.tif 000029
【０１２５】
【表１−２９】
2018512153.tif 000030
【０１２６】
【表１−３０】
2018512153.tif 000031
【０１２７】
【表１−３１】
2018512153.tif 000032
【０１２８】
【表１−３２】
2018512153.tif 000033
【０１２９】
【表１−３３】
2018512153.tif 000034
【０１３０】
【表１−３４】
2018512153.tif 000035
【０１３１】
ＢＣＭＡに対するＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインのＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、およびＣＤＲ接触領域を含む）も、本明細書に提供されている。ＣＤＲ領域の判定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの組合せ（「組み合わせたＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）でありうることが理解される。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。言い換えれば、１つを超えるＣＤＲを有する実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組合せＣＤＲ、またはこれらの組合せのいずれかでありうる。表２は、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の例を提供するものである。
【０１３２】
【表２−１】
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【０１３３】
【表２−２】
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【０１３４】
【表２−３】
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【０１３５】
【表２−４】
2018512153.tif 000039
【０１３６】
【表２−５】
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【０１３７】
【表２−６】
2018512153.tif 000041
【０１３８】
【表２−７】
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【０１３９】
【表２−８】
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【０１４０】
【表２−９】
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【０１４１】
【表２−１０】
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【０１４２】
【表２−１１】
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【０１４３】
【表２−１２】
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【０１４４】
【表２−１３】
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【０１４５】
【表２−１４】
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【０１４６】
【表２−１５】
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【０１４７】
【表２−１６】
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【０１４８】
【表２−１７】
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【０１４９】
【表２−１８】
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【０１５０】
【表２−１９】
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【０１５１】
【表２−２０】
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【０１５２】
【表２−２１】
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【０１５３】
【表２−２２】
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【０１５４】
【表２−２３】
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【０１５５】
【表２−２４】
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【０１５６】
【表２−２５】
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【０１５７】
【表２−２６】
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【０１５８】
【表２−２７】
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【０１５９】
【表２−２８】
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【０１６０】
【表２−２９】
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【０１６１】
【表２−３０】
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【０１６２】
【表２−３１】
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【０１６３】
【表２−３２】
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【０１６４】
【表２−３３】
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【０１６５】
【表２−３４】
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【０１６６】
【表２−３５】
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【０１６７】
【表２−３６】
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【０１６８】
【表２−３７】
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【０１６９】
【表２−３８】
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【０１７０】
【表２−３９】
2018512153.tif 000074
【０１７１】
本発明は、ＣＡＲの性質に著しく影響しない修飾を有する機能的に等価なＣＡＲ、ならびに活性および／または親和性が増強または低下したバリアントを含めた、表１に示した本発明のバリアントのＣＡＲおよびポリペプチドへの修飾を包含する。例えば、アミノ酸配列を突然変異させて、ＢＣＭＡへの所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野で日常の行為であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を著しく有害に変化させない、もしくはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１個もしくは複数の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドがある。
【０１７２】
アミノ酸配列挿入には、１残基〜１００またはそれ超の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体がある。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、抗体のＮまたはＣ末端への、酵素または血液循環中の抗体の半減期を増大させるポリペプチドの融合物がある。
【０１７３】
置換バリアントは、抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されている。置換突然変異誘発にとって最も興味深い部位としては、超可変領域があるが、ＦＲ変化も企図されている。保存的置換は、「保存的置換」の表題の下で表２．１に示されている。このような置換が生物活性を変化させる場合、表２．１に「例示的置換」と命名された、またはアミノ酸クラスへの言及において以下でさらに記載されるより実質的な変化を導入することができ、生成物をスクリーニングすることができる。
【０１７４】
【表３】
2018512153.tif 000075
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡに結合し、Ｐ６Ｅ０１／Ｐ６Ｅ０１、Ｐ６Ｅ０１／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｐ６Ｅ０１；Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＬ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＰ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＡＰ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＬ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＰ、Ｌ１．ＬＧＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＬ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＰ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＫＷ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＬ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＰ、Ｌ１．ＧＤＦ／Ｌ３．ＮＹ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＫＷ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＮＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｐ６Ｅ０１、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＳ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＡＨ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＦＦ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ１．ＰＨ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＱＲ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＨＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＹ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ２．ＤＹ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ２．ＹＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ２．ＬＴ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ２．ＱＬ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ３．ＹＡ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ３．ＡＥ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ３．ＡＱ、Ｌ３．ＰＹ／Ｌ３．ＫＦ／Ｈ３．ＴＡＱ、Ｐ５Ａ２＿ＶＨＶＬ、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０６、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０９、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１６、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０３、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２６、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２５、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２２、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１９、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０３、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０７、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２３、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１８、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１０、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０５、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１０、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０４、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２６、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１３、Ａ０２＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０１、Ａ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０８、Ｐ５Ｃ１＿ＶＨＶＬ、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２４、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２６、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１０、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２７、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２０、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１２、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１６、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０９、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０９、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０３、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０６、Ｃ０１＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０４、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２２、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２１、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１０、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０４、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２５、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２１、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１１、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２０、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０９、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０８、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１９、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０２、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２３、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２９、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０９、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ１２、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ３０、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１４、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０７、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０２、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ０５、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１７、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ２２、ＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ１１、またはＣＯＭＢＯ＿Ｒｄ４＿０．６ｎＭ＿Ｃ２９を含めた本明細書に記載のＣＡＲとＢＣＭＡへの結合を競合する細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【０１７６】
一部の実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲであって、ＣＡＲは、配列番号３３に示した配列を含むＶＨ領域および／または配列番号３４に示した配列を含むＶＬ領域を含む、ＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲであって、ＣＡＲは、配列番号３３、７２、３９、７６、８３、９２、２５もしくは８に示した配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号３４、７３、４０、７７、８４、９３、１８もしくは８０に示した配列を含むＶＬ領域を含む、ＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ接触領域に基づくＢＣＭＡ抗体に対する抗体のＣＤＲ部分を含むＣＡＲも提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原について抗体に特異性を植え付ける抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域は、抗体の適切なループ構造を維持して特異的抗原を結合させるために束縛されているＣＤＲおよびバーニアゾーン内に残基位置を含む。例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８３：１１５６〜１１６６、２００７を参照。ＣＤＲ接触領域の判定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。
【０１７７】
ＢＣＭＡ（ヒトＢＣＭＡ（例えば、（配列番号３５４）など）に対する本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの結合親和性（ＫＤ）は、約０．００２〜約６５００ｎＭでありうる。一部の実施形態では、結合親和性は、約６５００ｎＭ、６０００ｎＭ、５９８６ｎＭ、５５６７ｎＭ、５５００ｎＭ、４５００ｎＭ、４０００ｎＭ、３５００ｎＭ、３０００ｎＭ、２５００ｎＭ、２１３４ｎＭ、２０００ｎＭ、１５００ｎＭ、１０００ｎＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１９３ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００２ｎＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、６５００ｎＭ、６０００ｎＭ、５５００ｎＭ、５０００ｎＭ、４０００ｎＭ、３０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭのいずれか未満である。
【０１７８】
本発明によるＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合し、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらした後、細胞内シグナリングを担う。細胞内シグナリングドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解性活性またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性でありうる。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナリングドメインは、例えば、限定することなく、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列でありうる。細胞内シグナリングドメインは、２つの別個のクラスの細胞質シグナリング配列：抗原依存性一次活性化を開始するものおよび抗原非依存性様式で作用して二次または共刺激シグナルをもたらすものを含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含みうる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能を果たす様々な受容体の細胞質内尾部中に見つかる明確に定義されたシグナリングモチーフである。本発明で使用されるＩＴＡＭの例として、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを挙げることができる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、配列番号３２４に示したアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナリングドメインを含みうる。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、配列番号３２３および配列番号３２７に示したアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を構成するアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上で発現される。よって、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含みうる。本明細書に開示のＣＡＲの適当な膜貫通ドメインは、（ａ）細胞、好ましくは免疫細胞、例えば、限定することなく、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの表面で発現される、ならびに（ｂ）免疫細胞の細胞応答を既定の標的細胞に向けるためにリガンド結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインと相互作用する能力を有する。膜貫通ドメインは、天然または合成源に由来しうる。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来しうる。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット、例えば、α、β、γ、もしくはδなど、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ−２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩ、またはＣＤタンパク質でありうる。代わりに、膜貫通ドメインは、合成であり得、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンなどを含みうる。一部の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にストークドメインをさらに含みうる。ストークドメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含みうる。ストーク領域は、天然に存在する分子のすべてもしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部など、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来しうる。代わりに、ストークドメインは、天然に存在するストーク配列に対応する合成配列であり得、または完全に合成のストーク配列でありうる。一部の実施形態では、前記ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、前記膜貫通型およびヒンジドメインは、好ましくは配列番号３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を構成するヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲは、ＢＣＭＡを特異的に結合させる細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナリングドメイン、ならびに４−１ＢＢシグナリングドメインを含みうる。
【０１８２】
表３は、本明細書に開示のＣＡＲにおいて使用することができるドメインの例示的な配列を提供する。
【０１８３】
【表４−１】
2018512153.tif 000076
【０１８４】
【表４−２】
2018512153.tif 000077
【０１８５】
標的抗原の下方調節または突然変異は一般に、がん細胞内で観察され、抗原喪失エスケープバリアントを創製する。よって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、標的中の異なるエレメントを同時に結合させ、それによって免疫細胞活性化および機能を高めるための１つまたは複数の追加の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上に相前後して配置することができ、リンカーによって分離されてもよい。一部の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを構成している異なる膜貫通ポリペプチド上に配置することができる。一部の実施形態では、本発明は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、ＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、細胞の表面において、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を発現させることとを含む、方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、それぞれのものが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することとを含む、方法に関する。ＣＡＲの集団とは、それぞれのものが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも２、３、４、５、６、またはそれ超のＣＡＲを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なるエレメントを同時結合させ、それによって免疫細胞活性化および機能を高めることができる。本発明はまた、それぞれのものが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む単離免疫細胞に関する。
【０１８６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＣＡＲおよびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製し、発現させることができる。
【０１８７】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞のいずれかを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含む。さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３６７および配列番号３６８に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む：
Ｐ５Ａ重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＮＡＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３６７）
Ｐ５Ａ軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号３６８）
【０１８８】
他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３６９および配列番号３７０に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む：
Ｐ５ＡＣ１重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３６９）
Ｐ５ＡＣ１軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号３７０）
【０１８９】
他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３７１および配列番号３７２に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む：
ＰＣ１重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３７１）
ＰＣ１軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号３７２）。
【０１９０】
他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３７３および配列番号３７４に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む：
ＰＣ１Ｃ１２重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３７３）
ＰＣ１Ｃ１２軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号３７４）。
【０１９１】
他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３７５および配列番号３７６に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む：
ＣＯＭ２２重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＣＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３７５）
ＣＯＭ２２軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号３７６）。
【０１９２】
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書でさらに記載されている。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１９４】
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明によって包含されている。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成）またはＲＮＡ分子でありうる。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡがある。追加のコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在しうるが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材に連結されている場合があるが、その必要はない。
【０１９５】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、抗体もしくはその部分をコードする内在性配列）を含み得、またはこのような配列のバリアントを含みうる。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性が天然免疫反応性分子と比べて減少されないような１個または複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は一般に、本明細書に記載した通りに査定されうる。バリアントは、好ましくは、天然抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を呈する。
【０１９６】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載するように最大対応に関して整列されるとき同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、本明細書では、少なくとも約２０の連続した位置、通常３０〜約７５、または４０〜約５０のセグメントを指し、このウィンドウでは、配列が、同じ数の連続した位置の参照配列と、２つの配列が最適に整列された後比較されうる。
【０１９７】
比較のための配列の最適な整列は、デフォルトのパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ一式中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓに記載されたいくつかの整列スキームを具現化する。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．、１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：７２６〜７３０において。
【０１９８】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって判定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列について、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を判定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１９９】
バリアントも、または代わりに、天然遺伝子またはその部分もしくは相補体に実質的に相同でありうる。このようなポリヌクレオチドバリアントは、天然抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補配列）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０２００】
適当な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×  ＳＳＣで、一晩のハイブリダイジング；その後の、０．１％  ＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×  ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分にわたる２回の洗浄を含む。
【０２０１】
本明細書では、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃で、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに、ｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを使用し；または（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃での、および５５℃での５０％ホルムアミド中の洗浄、その後の５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を伴って、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用するものである。当業者は、プローブ長などの因子に対応する必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識するであろう。
【０２０２】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を担持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図されている。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１個または複数の突然変異の結果として変更されている内在性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有しうるが、その必要はない。対立遺伝子は、標準技法（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【０２０４】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに論じられるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適当なベクター中に挿入することができ、次にベクターを、複製および増幅のために適当な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞内に挿入されうる。細胞は、直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合、または電気穿孔によって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持され、または宿主細胞ゲノム内に一体化されうる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照。
【０２０５】
代わりに、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
【０２０６】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離したＤＮＡを使用し、それを適当な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡへと転写されたとき、ＲＮＡを、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されているように当業者に周知の方法を使用して単離することができる。
【０２０７】
適当なクローニングベクターは、標準技法に従って構築することができ、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されるように意図された宿主細胞によって変動しうるが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有することになり、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一標的を有することができ、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカーの遺伝子を持つことができる。適当な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターがある。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、市販供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから入手可能である。
【０２０８】
発現ベクターは一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞内で複製可能でなければならないことが暗示される。適当な発現ベクターとしては、それだけに限らないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターがある。ベクターコンポーネントとして一般に、それだけに限らないが、以下：シグナル配列；複製起点；１種もしくは複数のマーカー遺伝子；適当な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）のうちの１種または複数を挙げることができる。発現（すなわち、翻訳）のために、１種または複数の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなども通常要求される。
【０２０９】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、宿主細胞の特徴に依存することになることが多い。
【０２１０】
本明細書に開示のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞内に導入するためのプラスミド、または昆虫宿主細胞をトランスフェクトするためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトするためのプラスミドもしくはレンチウイルスなどのウイルスベクター）内に存在しうる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば、限定することなく、２Ａペプチドをコードする配列などを含みうる。ピコルナウイルスのアフタウイルス亜群中で同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２個のアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、１つのコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＥｌｌｉｏｔｔ、２００１；Ａｔｋｉｎｓ、Ｗｉｌｌｓら、２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕら、２００８）を参照）。「コドン」とは、リボソームによって１個のアミノ酸残基に翻訳されるｍＲＮＡ上（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３個のヌクレオチドを意味する。よって、２つのポリペプチドは、ポリペプチドが、インフレームである２Ａオリゴペプチド配列によって分離されているとき、ｉｍＲＮＡ内の単一の連続したオープンリーティングフレームから合成することができる。このようなリボソームスキップ機構は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパク質を発現させるために、いくつかのベクターによって使用されることが知られている。
【０２１１】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に向けるために、一部の実施形態では、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知）がポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通型核酸配列に作動可能に連結されており、すなわち、２つの配列は、正しい読み枠内で連結されており、新しく合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に向けるように配置されている。分泌シグナル配列は一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列中の他の場所に配置される場合がある（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３１８または３２９に示したアミノ酸配列を含む。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、相当な配列バリエーションがこれらのポリヌクレオチド分子の中で可能であることを認識するであろう。一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現、好ましくはヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、所与の種の高度に発現される遺伝子内で一般に稀有であるコドンの、このような種の高度に発現される遺伝子内で一般に頻繁であるコドンによる目的の配列中の交換を指し、このようなコドンは、交換されているコドンと同様のアミノ酸をコードする。
【０２１２】
一部の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１３９７からなる群から選択される核酸配列を含む。本発明は、配列番号１３９７からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０２１３】
免疫細胞を操作する方法
免疫療法で使用するための免疫細胞を調製する方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、本方法は、本発明によるＣＡＲを免疫細胞内に導入することと、細胞を増やすこととを含む。一部の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を準備することと、細胞の表面において、上述した少なくとも１種のＣＡＲを発現させることとを含む、方法に関する。免疫細胞を操作するための方法は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ／２０１４／０３９５２３号、同第ＷＯ／２０１４／１８４７４１号、同第ＷＯ／２０１４／１９１１２８号、同第ＷＯ／２０１４／１８４７４４号、および同第ＷＯ／２０１４／１８４１４３号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一部の実施形態では、方法は、細胞に上述したＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをトランスフェクトすることと、細胞内でポリヌクレオチドを発現させることとを含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内での安定な発現のためにレンチウイルスベクター内に存在する。
【０２１５】
一部の実施形態では、方法は、例えば、限定することなく、ＴＣＲのコンポーネント、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／または免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４などを発現する少なくとも１種の遺伝子を不活化することによって細胞を遺伝的に修飾する工程をさらに含みうる。遺伝子を不活化するとは、目的の遺伝子が機能タンパク質形態で発現されないことを意図する。一部の実施形態では、不活化される遺伝子は、例えば、限定することなく、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、選択的なＤＮＡ切断により遺伝子を選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼを細胞内に導入することによって１種または複数の遺伝子を不活化することを含む。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ）またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼでありうる。
【０２１６】
一部の実施形態では、追加の触媒ドメインが、レアカッティングエンドヌクレアーゼとともに、標的遺伝子を不活化するその能力を増強するために使用される。例えば、追加の触媒ドメインは、ＤＮＡ末端プロセシング酵素でありうる。ＤＮＡ末端プロセシング酵素の非限定的な例としては、５−３’エキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素、および鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼがある。このような触媒ドメインの非限定的な例は、ｈＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＨＵＭＡＮ）、酵母ＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＹＥＡＳＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択されるタンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの触媒活性誘導体から構成される。一部の実施形態では、追加の触媒ドメインは、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を有することができ、一部の実施形態では、前記追加の触媒ドメインは、ＴＲＥＸ、より好ましくはＴＲＥＸ２触媒ドメインである（ＷＯ２０１２／０５８４５８）。一部の実施形態では、前記触媒ドメインは、単鎖ＴＲＥＸポリペプチドによってコードされる。追加の触媒ドメインは、ヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合されうる。一部の実施形態では、追加の触媒ドメインは、例えば、ペプチドリンカーを使用して融合される。
【０２１７】
一部の実施形態では、方法は、相同的組換えが標的核酸配列と外因性核酸との間で起こるように、標的核酸配列の部分に相同の少なくとも１つの配列を含む外因性核酸を細胞内に導入する工程をさらに含む。一部の実施形態では、前記外因性核酸は、それぞれ標的核酸配列の５’および３’の領域に相同である第１および第２の部分を含む。外因性核酸は、標的核酸配列の５’および３’の領域と相同性を含まない、第１と第２の部分との間に配置された第３の部分も含みうる。標的核酸配列の切断の後、相同的組換え事象が標的核酸配列と外因性核酸との間で刺激される。一部の実施形態では、少なくとも約５０ｂｐ、約１００ｂｐ超、または約２００ｂｐ超の相同配列を、ドナーマトリックス内で使用することができる。外因性核酸は、例えば、限定することなく、約２００ｂｐ〜約６０００ｂｐ、より好ましくは約１０００ｂｐ〜約２０００ｂｐでありうる。共有される核酸相同性は、ブレイクの部位の上流および下流にフランキングする領域内に位置しており、導入される核酸配列は、２本のアーム間に位置している。
【０２１８】
一部の実施形態では、核酸は、前記切断の上流の配列と相同性の第１の領域、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、および例えば、プログラム死−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される標的遺伝子を不活化する配列；ならびに切断の下流の配列と相同性の第２の領域を連続的に含む。ポリヌクレオチド導入工程は、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入または発現と同時、その前、または後でありうる。ブレイク事象が起こった標的核酸配列の場所に応じて、このような外因性核酸は、例えば、外因性核酸が遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置しているとき、遺伝子をノックアウトするのに、または目的の新しい配列もしくは遺伝子を導入するのに使用することができる。このような外因性核酸を使用することによる配列挿入は、遺伝子の補正もしくは置き換えによって既存の標的遺伝子を修飾するのに（非限定的な例として対立遺伝子スワップ）、標的遺伝子の発現（非限定的な例としてプロモータースワップ）、標的遺伝子補正もしくは置き換えを上方もしくは下方調節するのに使用することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される遺伝子の不活化は、特異的ＴＡＬＥヌクレアーゼによって標的にされる正確な遺伝子位置で行うことができ、前記特異的ＴＡＬＥヌクレアーゼは、切断を触媒し、外因性核酸は、相同性の少なくとも１つの領域、および相同的組換えによって組み込まれているＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１種の標的遺伝子を不活化する配列を連続的に含む。一部の実施形態では、いくつかの遺伝子を、それぞれいくつかのＴＡＬＥヌクレアーゼを使用し、特定の遺伝子を不活化するための１種の規定された遺伝子およびいくつかの特異的なポリヌクレオチドを特異的に標的にすることによって連続的に、または同時に不活化することができる。
【０２１９】
一部の実施形態では、方法は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１種または複数の追加の遺伝子の不活化を含む。一部の実施形態では、遺伝子の不活化は、レアカッティングエンドヌクレアーゼが細胞ゲノムの標的配列中の切断を特異的に触媒するように、少なくとも１種のレアカッティングエンドヌクレアーゼを細胞内に導入し、任意選択で、切断の上流の配列と相同性の第１の領域、細胞のゲノム内に挿入される配列、および切断の下流の配列と相同性の第２の領域を連続的に含む外因性核酸を細胞内に導入することによって達成することができ、導入される外因性核酸は、遺伝子を不活化し、目的の少なくとも１種の組換えタンパク質をコードする少なくとも１種の外因性ポリヌクレオチド配列を組み込む。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子内に組み込まれる。
【０２２０】
別の態様では、細胞を遺伝的に修飾する工程は、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１種の遺伝子を不活化することによってＴ細胞を修飾することと、任意選択で免疫抑制剤の存在下で、細胞を増やすこととを含みうる。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの１つによって免疫機能を抑制する作用物質である。免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または貪欲さを減少させることができる。免疫抑制剤の非限定的な例としては、カルシニュリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン−２α−鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイド、および免疫抑制代謝拮抗剤がある。一部の細胞毒性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することによって作用する。他のものは、Ｔ細胞の活性化を通じて、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用しうる。本発明による方法は、Ｔ細胞内の免疫抑制剤の標的を不活化することによって免疫療法のためのＴ細胞に免疫抑制耐性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、限定することなく、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、およびサイクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなどでありうる。
【０２２１】
一部の実施形態では、本方法の遺伝的修飾は、レアカッティングエンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子内の切断を特異的に触媒し、それによって標的遺伝子を不活化するように、操作するために提供された細胞内で１種のレアカッティングエンドヌクレアーゼを発現させる。一部の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程：細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備する工程、免疫抑制剤の標的を発現するＴ細胞内の遺伝子を選択する工程、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に導入する工程、および任意選択で免疫抑制剤の存在下で、細胞を増やす工程のうちの少なくとも１つを含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、方法は、細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備することと、免疫抑制剤の標的を発現するＴ細胞内の遺伝子を選択することと、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸をＴ細胞にトランスフェクトすることと、レアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に発現させることと、任意選択で免疫抑制剤の存在下で、細胞を増やすこととを含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＣＤ５２またはＧＲを特異的に標的にする。一部の実施形態では、不活化のために選択される遺伝子は、ＣＤ５２をコードし、免疫抑制処置は、ＣＤ５２抗原を標的にするヒト化抗体を含む。一部の実施形態では、不活化のために選択される遺伝子は、ＧＲをコードし、免疫抑制処置は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドを含む。一部の実施形態では、不活化のために選択される遺伝子は、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーまたはそのバリアントであり、免疫抑制処置は、タクロリムスまたはフジマイシンとしても公知のＦＫ５０６を含む。一部の実施形態では、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーは、ＦＫＢＰ１２またはそのバリアントである。一部の実施形態では、不活化のために選択される遺伝子は、サイクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはそのバリアントであり、免疫抑制処置は、シクロスポリンを含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）でありうる。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０２２５】
免疫療法に適した、Ｔ細胞を操作する方法であって、少なくとも免疫チェックポイントタンパク質を不活化することによってＴ細胞を遺伝的に修飾することを含む、方法も本明細書に提供されている。一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４である。一部の実施形態では、細胞を遺伝的に修飾する方法は、少なくとも１種の免疫チェックポイントタンパク質を不活化することによってＴ細胞を修飾することと、細胞を増やすこととを含む。免疫チェックポイントタンパク質としては、それだけに限らないが、プログラム死１（ＰＤ−１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても公知、受託番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知、受託番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知、受託番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＴＭ３としても公知、受託番号：ＮＭ＿１７３７９９）、Ｂ７Ｈ５（Ｃ１０ｏｒｆ５４としても公知、マウスｖｉｓｔａ遺伝子の相同体、受託番号：ＮＭ＿０２２１５３．１）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても公知、受託番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）があり、これらは、免疫細胞を直接的に阻害する。例えば、ＣＴＬＡ−４は、ある特定のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞上で発現される細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上でそのリガンド（Ｂ７−１およびＢ７−２）によって会合されるとき、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。
【０２２６】
一部の実施形態では、細胞を操作する前記方法は、以下の工程：細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備する工程、免疫チェックポイントタンパク質をコードする１種の遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に導入する工程、および細胞を増やす工程のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備することと、免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記Ｔ細胞にトランスフェクトすることと、レアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に発現させることと、細胞を増やすこととを含む。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＴＣＲα、およびＴＣＲβからなる群から選択される遺伝子を特異的に標的にする。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼでありうる。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０２２７】
一部の実施形態では、本発明は、同種間の免疫療法に特に適している場合がある。このような実施形態では、細胞は、Ｔ細胞内のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコンポーネントをコードする少なくとも１種の遺伝子を不活化することと、Ｔ細胞を増やすこととを含む方法によって修飾されうる。一部の実施形態では、本方法の遺伝的修飾は、レアカッティングエンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子内の切断を特異的に触媒し、それによって標的遺伝子を不活化するように、操作するために提供された細胞内で１種のレアカッティングエンドヌクレアーゼを発現させることを利用する。一部の実施形態では、細胞を操作する前記方法は、以下の工程：細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備する工程、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコンポーネントをコードする少なくとも１種の遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に導入する工程、および細胞を増やす工程のうちの少なくとも１つを含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、方法は、細胞培養物または血液試料などからＴ細胞を準備することと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコンポーネントをコードする少なくとも１種の遺伝子をＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖ブレイクによって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記Ｔ細胞にトランスフェクトすることと、レアカッティングエンドヌクレアーゼをＴ細胞内に発現させることと、自己の細胞表面上でＴＣＲを発現しない形質転換Ｔ細胞を選別することと、細胞を増やすこととを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼでありうる。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードする配列を認識および切断する。一部の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、または３４１に示したアミノ酸配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
ＴＡＬＥヌクレアーゼポリペプチド配列：
リピートＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｌ
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リピートＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｒ
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号３３５）
リピートＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｌ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号３３６）
リピートＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｒ
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リピートＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｌ
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号３３８）
リピートＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｒ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ
（配列番号３３９）
リピートＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｌ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号３４０）
リピートＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｒ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ
（配列番号３４１）
【０２３０】
別の態様では、細胞を遺伝的に修飾する１つの別の工程は、ｐＴα（ｐｒｅＴＣＲαとしても公知）またはその機能性バリアントをＴ細胞内に導入することと、任意選択でＣＤ３複合体の刺激によって、細胞を増やすこととを含む、ＴＣＲα欠損Ｔ細胞を増やす方法でありうる。一部の実施形態では、方法は、ａ）ＣＤ３表面発現を支持するためにｐＴαの少なくとも断片をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることと、ｂ）前記ｐＴαを細胞内に発現させることと、ｃ）任意選択でＣＤ３複合体の刺激によって、細胞を増やすこととを含む。
【０２３１】
免疫療法のためのＴ細胞を準備する方法であって、Ｔ細胞を増やすための方法の工程を含む、方法も提供されている。一部の実施形態では、ｐＴαポリヌクレオチド配列は、ランダムに、または相同的組換えによって導入することができる。一部の実施形態では、挿入は、ＴＣＲα遺伝子の不活化と関連しうる。
【０２３２】
ｐＴαの異なる機能性バリアントを使用することができる。ペプチドの「機能性バリアント」は、ペプチド全体またはその断片と実質的に同様の分子を指す。ｐＴαまたはその機能性バリアントの「断片」は、分子の任意のサブセット、すなわち、全長ｐＴαより短いペプチドを指す。一部の実施形態では、ｐＴαまたは機能性バリアントは、例えば、全長ｐＴαまたはＣ末端トランケート型ｐＴαバージョンでありうる。Ｃ末端トランケート型ｐＴαは、１個または複数の残基をＣ末端において欠く。非限定的な例として、Ｃ末端トランケート型ｐＴαバージョンは、タンパク質のＣ末端から１８、４８、６２、７８、９２、１１０、または１１４個の残基を欠く。ペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ペプチドをコードするＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。このような機能性バリアントは、例えば、アミノ酸配列内の残基からの欠失、またはこれらの挿入もしくは置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せも、最終構築物に到達するために行うことができ、ただし、最終構築物は、所望の活性、特に、機能的ＣＤ３複合体の復活を有する。好適な実施形態では、少なくとも１種の突然変異が、二量体化に影響するように上述した異なるｐＴαバージョン中に導入される。非限定的な例として、突然変異される残基は、ヒトｐＴαタンパク質の少なくともＷ４６Ｒ、Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２Ａ、もしくはＲ１１７Ａであり得、またはｐＴαファミリーもしくは相同体メンバーに対してＣＬＵＳＴＡＬＷ法を使用して位置を整列させることができる。好ましくは、上述したｐＴαまたはそのバリアントは、突然変異残基Ｗ４６Ｒ、または突然変異残基Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２Ａ、およびＲ１１７Ａを含む。一部の実施形態では、前記ｐＴαまたはバリアントは、シグナル形質導入ドメイン、例えば、非限定的な例として、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ８などにも融合される。上述したｐＴαまたはバリアントの細胞外ドメインは、ＴＣＲαタンパク質の断片、特に、ＴＣＲαの膜貫通型および細胞内ドメインに融合することができる。ｐＴαバリアントは、ＴＣＲαの細胞内ドメインにも融合されうる。
【０２３３】
一部の実施形態では、ｐＴαバージョンは、細胞外リガンド結合ドメインに融合することができる。一部の実施形態では、ｐＴαまたはその機能性バリアントは、可動性リンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽および重可変断片を含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に融合される。
【０２３４】
用語「ＴＣＲα欠損Ｔ細胞」は、機能的ＴＣＲα鎖の発現を欠く単離Ｔ細胞を指す。これは、異なる手段によって、非限定的な例として、Ｔ細胞がその細胞表面でいずれの機能的ＴＣＲαも発現しないようにＴ細胞を操作することによって、またはＴ細胞がその表面上でごく少量の機能的ＴＣＲα鎖を産生するようにＴ細胞を操作することによって、またはＴＣＲα鎖の突然変異もしくはトランケート型を発現するようにＴ細胞を操作することによって、達成されうる。ＴＣＲα欠損細胞は、ＣＤ３複合体によってもはや増やすことができない。よって、この問題を克服し、ＴＣＲα欠損細胞の増殖を可能にするために、ｐＴαまたはその機能性バリアントが細胞内に導入され、こうして機能的ＣＤ３複合体を復活させる。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１種のコンポーネントをコードする１種の遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼを前記Ｔ細胞内に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０２３５】
別の態様では、本明細書に記載の方法によって得られる操作されたＴ細胞は、二重特異性抗体と接触させることができる。例えば、Ｔ細胞は、患者に投与する前にｅｘ  ｖｉｖｏで、または患者に投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで二重特異性抗体と接触させることができる。二重特異性抗体は、操作された細胞を標的抗原に近接させるのを促進する別個の抗原性質を有する２つの可変領域を含む。非限定的な例として、二重特異性抗体は、腫瘍マーカーおよびリンパ球抗原、例えば、限定することなく、ＣＤ３などに向けることができ、腫瘍に対して任意の循環Ｔ細胞をリダイレクトおよび活性化する潜在性を有する。
【０２３６】
一部の実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり得、これは、例えば、電気穿孔によって細胞内に直接的に導入される。一部の実施形態では、ｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を使用して、材料を細胞内に送達するために生細胞を一過性に透過化することができる。パラメータは、最小限の死亡率を伴った高トランスフェクション効率のための条件を決定するために改変することができる。
【０２３７】
Ｔ細胞をトランスフェクトする方法も本明細書に提供されている。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、（ａ）１センチメートル当たり約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルス；（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅；（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）の電気パルス間の約０．２〜１０ｍｓのパルス間隔；（ｄ）約１００ｍｓのパルス幅および工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の第１の電気パルスとの間の約１００ｍｓのパルス間隔を伴った約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルス；ならびに（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４回の電気パルスのそれぞれの間の２ｍｓのパルス間隔を伴った約３２５Ｖの電圧を有する４回の電気パルスからなるアジャイルパルスシーケンスをＴ細胞に印加することとを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞をトランスフェクトする方法であって、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、（ａ）１センチメートル当たり約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００Ｖの電圧を有する電気パルス；（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅；（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）の電気パルス間の約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｓのパルス間隔；（ｄ）１００ｍｓのパルス幅および工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の第１の電気パルスとの間の１００ｍｓのパルス間隔を伴った約２２５０、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００Ｖの電圧範囲を有する１回の電気パルス；ならびに（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４回の電気パルスのそれぞれの間の約２ｍｓのパルス間隔を伴った約３２５Ｖの電圧を有する４回の電気パルスを含むアジャイルパルスシーケンスをＴ細胞に印加することとを含む、方法。上述した値の範囲内に含まれる任意の値が本願において開示されている。電気穿孔培地は、当技術分野で公知の任意の適当な培地でありうる。一部の実施形態では、電気穿孔培地は、約０．０１〜約１．０ミリシーメンスにおよぶ範囲内の伝導性を有する。
【０２３８】
一部の実施形態では、非限定的な例として、ＲＮＡは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ、半ＴＡＬＥヌクレアーゼなどのレアカッティングエンドヌクレアーゼの１種のモノマー、ＣＡＲ、多鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１種のコンポーネント、ｐＴαまたはその機能性バリアント、外因性核酸、および／または１つの追加の触媒ドメインをコードする。
【０２３９】
操作された免疫細胞
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞も提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞内に導入されうる。一部の実施形態では、プラスミドベクターは、例えば、ベクターを受け入れた細胞の同定および／または選択をもたらす選択マーカーも含有しうる。
【０２４０】
ＣＡＲポリペプチドは、細胞内にＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入した後、細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕで合成することができる。代わりに、ＣＡＲポリペプチドは、細胞の外側で生成され、次いで細胞内に導入されてもよい。細胞内にポリヌクレオチド構築物を導入するための方法は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、安定形質転換法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム内に組み込むことができる。他の実施形態では、一過性形質転換法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を一過性に発現させることができ、ポリヌクレオチド構築物は、細胞のゲノム内に組み込まれない。他の実施形態では、ウイルス媒介法を使用することができる。ポリヌクレオチドは、任意の適当な手段、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞内に導入されうる。一過性形質転換法としては、例えば、限定することなく、マイクロインジェクション、電気穿孔、または粒子ボンバードメントがある。ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなどの中に含められる場合がある。
【０２４１】
本明細書に提供される細胞を操作する上述した方法によって得られる単離細胞および細胞株も本明細書に提供されている。一部の実施形態では、単離細胞は、上述した少なくとも１種のＣＡＲを含む。一部の実施形態では、単離細胞は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、ＣＡＲの集団を含む。
【０２４２】
上述した方法のいずれか１つに従って得られる単離免疫細胞も本明細書に提供されている。異種ＤＮＡを発現することができる任意の免疫細胞を、目的のＣＡＲを発現させる目的に使用することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、例えば、限定することなく、幹細胞に由来しうる。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より特定すれば、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞でありうる。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。単離細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞でありうる。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球からなる群に由来しうる。
【０２４３】
エクスパンションおよび遺伝的修飾の前に、細胞源は、様々な限定されない方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めたいくつかの限定されない供給源から得ることができる。一部の実施形態では、入手可能な、かつ当業者に公知の任意の数のＴ細胞株を使用することができる。一部の実施形態では、細胞は、健康ドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者に由来しうる。一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型特性を提示する細胞の混合集団の一部でありうる。
【０２４４】
上述した方法のいずれかに従って形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も本明細書に提供されている。免疫抑制処置に耐性の修飾細胞も本明細書に提供されている。一部の実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２４５】
本発明の免疫細胞は、例えば、限定することなく、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に一般に記載された方法を使用して、Ｔ細胞の遺伝的修飾の前または後に活性化および増やすことができる。Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増やすことができる。一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞の表面上でＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞の活性化シグナルを創製する作用物質との接触によって増やされうる。例えば、化学物質、例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、または分裂促進レクチン様フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などを使用してＴ細胞の活性化シグナルを創製することができる。
【０２４６】
一部の実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激されうる。Ｔ細胞の表面上の集合分子の同時刺激のために、アクセサリー分子を結合させるリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件には、血清（例えば、胎児ウシもしくはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ、または当業者に公知の細胞を増殖するための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含有しうる適切な培地（例えば、最小必須培地もしくはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞を増殖するための他の添加剤としては、それだけに限らないが、界面活性剤、プラズマネート、または還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどがある。培地として、無血清の、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）、または規定されたセットのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の増殖およびエクスパンションに十分な量のサイトカインを補充された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加された、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養においてのみ含められ、対象中に注入される細胞の培養において含められない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％  ＣＯ２）下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を呈しうる。
【０２４７】
一部の実施形態では、本発明の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増やされうる。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、対象中に細胞を投与した後の対象の血液中で増やすこともできる。
【０２４８】
一部の実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲα、およびＴＣＲβからなる群から選択される１種の不活化された遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴα導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、単離細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ−１およびＴＣＲα、ＰＤ−１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、Ｔｉｍ３およびＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβＢ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβからなる群から選択される２種の不活化された遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、およびｐＴα導入遺伝子を発現する。
【０２４９】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を不活化することによって、本発明による細胞内で機能的でないようにされている。一部の実施形態では、個体に由来する修飾細胞を得るための方法であって、細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）シグナリング経路とは独立に増殖することができる、方法が提供されている。本方法によって得られやすい、ＭＨＣシグナリング経路とは独立に増殖しうる修飾細胞は、本発明の範囲内に包含される。本明細書に開示の修飾細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を処置するのに使用することができ、したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を処置する方法であって、前記患者に、不活化されたＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子を含む有効量の修飾細胞を投与することによって前記患者を処置することを含む、方法は、本発明の範囲内である。
【０２５０】
一部の実施形態では、免疫細胞は、１種または複数の化学療法薬に対して耐性であるように操作されている。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）であり得、よって免疫細胞を養子免疫療法および化学療法を組み合わせるがん処置に適したものにする。例示的なＰＮＡとしては、例えば、単独または組合せで、クロファラビン、フルダラビン、およびシタラビンがある。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によって代謝されてモノ、ジ、およびトリリン酸ＰＮＡになる。これらのトリリン酸形態は、ＡＴＰとＤＮＡ合成を競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。不活化されたｄＣＫ遺伝子を含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、ｄＣＫノックアウト細胞は、例えば、ｍＲＮＡの電気穿孔によりｄＣＫ遺伝子に向けられた特異的ＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用するＴ細胞のトランスフェクションによって作製される。ｄＣＫノックアウトＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、クロファラビンおよび／またはフルダラビンを含めたＰＮＡに耐性であり、ＢＣＭＡ発現細胞に向けたＴ細胞の細胞傷害活性を維持する。
【０２５１】
一部の実施形態では、本発明の単離細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能性バリアントを含みうる。一部の実施形態では、単離細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を不活化することによってさらに遺伝的に修飾することができる。
【０２５２】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、ＲＱＲ８などの自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照。ポリヌクレオチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面で発現される。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号３４２に示したアミノ酸配列を含む。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号３４２）
【０２５３】
自殺ポリペプチドは、アミノ末端でシグナルペプチドも含みうる。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号４００に示したアミノ酸配列を含む。
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号４００）
【０２５４】
自殺ポリペプチドがＣＡＲ−Ｔ細胞の表面で発現される場合、リツキシマブがポリペプチドのＲエピトープに結合すると、細胞の溶解が起こる。リツキシマブの１つを超える分子が、細胞表面で発現されるポリペプチド１つ当たりに結合しうる。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、リツキシマブの別個の分子を結合させることができる。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の欠失は、例えば、患者にリツキシマブを投与することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こりうる。導入された細胞を欠失させる決定は、例えば、容認できないレベルの毒性が検出されるときなど、導入された細胞に帰する、患者において検出されている望ましくない効果から生じうる。
【０２５５】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、特異的抗体によって認識される特異性を有するｓｃＦｖ内の選択されたエピトープを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年１月２５日に出願されたＰＣＴ出願「ｍＡｂ−ＤＲＩＶＥＮ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＳＯＲＴＩＮＧ／ＤＥＰＬＥＴＩＮＧ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＩＭＭＵＮＥ  ＣＥＬＬＳ」を参照。このようなエピトープは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の選別および／または枯渇を促進する。エピトープは、当技術分野で公知の任意の数のエピトープから選択することができる。一部の実施形態では、エピトープは、医療上の使用のために承認されたモノクローナル抗体の標的、例えば、限定することなく、リツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープなどでありうる。一部の実施形態では、エピトープは、配列番号３９７に示したアミノ酸配列を含む。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ（配列番号３９７）
【０２５６】
一部の実施形態では、エピトープは、ＣＡＲ内に位置している。例えば、限定することなく、エピトープは、ＣＡＲのｓｃＦｖとヒンジとの間に位置しうる。一部の実施形態では、リンカーによって分離された同じエピトープの２個の事例がＣＡＲにおいて使用されうる。例えば、配列番号３９８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを、軽鎖可変領域とヒンジとの間に位置したＣＡＲ内で使用することができる。
ＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９８）
【０２５７】
一部の実施形態では、エピトープ特異的抗体を細胞傷害性薬とコンジュゲートすることができる。補体系のコンポーネントが移植された操作された抗体を使用することによってＣＤＣ細胞傷害性を促すことも可能である。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、エピトープを認識する抗体を使用して細胞を枯渇させることによってモジュレートすることができる。
【０２５８】
治療用途
上述した方法によって得られる単離細胞、またはこのような単離細胞に由来する細胞株は、医薬として使用することができる。一部の実施形態では、このような医薬は、がんを処置するのに使用されうる。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、炎症に関連したびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性カストルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、または他のＢ細胞関連リンパ腫を含めたＢ細胞関連がんでありうる。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明による単離細胞、または単離細胞に由来する細胞株は、それを必要とする患者におけるがんを処置するための医薬の製造において使用することができる。
【０２６０】
患者を処置するための方法も本明細書に提供されている。一部の実施形態では、方法は、必要とする患者に本発明の免疫細胞を提供することを含む。一部の実施形態では、方法は、必要とする患者に本発明の形質転換免疫細胞を投与する工程を含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明のＴ細胞は、ロバストなｉｎ  ｖｉｖｏＴ細胞エクスパンションを起こすことができ、延長期間（extended amount of time）にわたって持続しうる。
【０２６２】
本発明の処置の方法は、寛解的、治癒的、または予防的でありうる。本発明の方法は、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部でありうる。本発明は、同種間の免疫療法に特に適している。ドナー由来のＴ細胞を、標準プロトコールを使用して形質転換して非アロ反応性細胞にし、必要に応じて複製し、それによって１人または数人の患者に投与されうるＣＡＲ−Ｔ細胞を生成することができる。このようなＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「既製の」治療製品として利用可能にすることができる。
【０２６３】
開示した方法を用いて使用されうる細胞は、先のセクションに記載されている。処置は、例えば、がんと診断された患者を処置するのに使用することができる。処置されうるがんとしては、例えば、限定することなく、上記に列挙したがんのいずれも含めたＢリンパ球を伴うがんがある。本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されるがんのタイプとしては、それだけに限らないが、ある特定の白血病またはリンパ悪性腫瘍がある。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。一部の実施形態では、処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法からなる群から選択されるがんに対する１つまたは複数の療法と組み合わせたものでありうる。
【０２６４】
一部の実施形態では、処置は、免疫抑制処置を経ている患者に投与することができる。実際に、本発明は、好ましくは、少なくとも１種の免疫抑制剤に、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活化に起因して耐性にされた細胞または細胞の集団を利用する。この態様では、免疫抑制処置は、患者内で本発明によるＴ細胞の選択およびエクスパンションを助けるはずである。本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、インプランテーション、またはトランスプランテーションによるものを含めた任意の好都合な様式で実行することができる。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に投与されうる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０２６５】
一部の実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、例えば、範囲内の細胞数のすべての整数値を含めた体重１ｋｇ当たり約１０４〜約１０９細胞の投与を含みうる。一部の実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、範囲内の細胞数のすべての整数値を含めた体重１ｋｇ当たり約１０５〜約１０６細胞の投与を含みうる。細胞または細胞の集団は、１回または複数回の用量で投与することができる。一部の実施形態では、前記有効量の細胞を単回用量として投与することができる。一部の実施形態では、前記有効量の細胞は、ある時間にわたって１回を超える用量として投与されうる。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得ることができる。個々のニーズは変動するが、特定の疾患または状態について所与の細胞型の有効量の最適な範囲を判定することは、当技術分野の技術の範囲内である。有効量は、治療的または予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば同時の処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の特質に依存することになる。一部の実施形態では、有効量の細胞またはこれらの細胞を含む組成物が非経口的に投与される。一部の実施形態では、投与は、静脈内投与でありうる。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内に注射によって直接的に行うことができる。
【０２６６】
本発明の一部の実施形態では、細胞は、それだけに限らないが、作用物質を用いた処置、例えば、モノクローナル抗体療法、ＣＣＲ２アンタゴニスト（例えば、ＩＮＣ−８７６１）、抗ウイルス療法、シドフォビル、およびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処理などを含めた任意の数の妥当な処置モダリティーと併せて（例えば、前に、同時に、後に）患者に投与される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、以下：抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、もしくはＰＦ−０６８０１５９１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、もしくはデュルバルマブ）、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＰＦ−０４５１８６００）、抗４−１ＢＢ抗体（例えば、ＰＦ−０５０８２５６６）、抗ＭＣＳＦ抗体（例えば、ＰＤ−０３６０３２４）、抗ＧＩＴＲ抗体、および／または抗ＴＩＧＩＴ抗体のうちの１種または複数と併せて患者に投与される。一部の実施形態では、配列番号３９６に示したアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブと併せて患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６など、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体療法などの他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに／または照射など組み合わせて使用されうる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニュリンを阻害し（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導シグナリングに重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｙａら、１９９１；Ｌｉｕ、Ａｌｂｅｒｓら１９９２；Ｂｉｅｒｅｒ、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、１９９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法剤、例えば、フルダラビン、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体などを使用するＴ細胞除去療法と併せて（例えば、前に、同時、または後に）患者に投与され、一部の実施形態では、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法、例えば、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどの後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置、その後の末梢血幹細胞トランスプランテーションを経ることができる。ある特定の実施形態では、トランスプラントの後、対象は、本発明の増やされた免疫細胞の注入を受ける。一部の実施形態では、増やされた細胞は、手術の前または後に投与される。
【０２６７】
キット
本発明は、本方法で使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、またはＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞を含む１つまたは複数の容器、および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上述した治療的処置のための操作された免疫細胞の投与の記述を含む。
【０２６８】
本明細書に記載の操作された免疫細胞の使用に関する指示書は一般に、意図された処置のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、またはサブユニット用量でありうる。本発明のキットに供給される指示書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上の書面による指示書であるが、機械可読な指示書（例えば、磁気または光記憶ディスクに収容される指示書）も許容できる。
【０２６９】
本発明のキットは、適当な包装内に存在する。適当な包装としては、それだけに限らないが、バイアル、瓶、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などがある。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）、またはミニポンプなどのインフュージョンデバイスなどと組み合わせて使用するためのパッケージも企図されている。キットは、滅菌したアクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルでありうる）。容器も、滅菌したアクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、ＢＣＭＡ抗体である。容器は、第２の医薬活性剤をさらに含みうる。
【０２７０】
キットは、追加のコンポーネント、例えば、緩衝液および解釈情報などを提供してもよい。通常、キットは、容器および容器上のまたは容器に付随したラベルまたは添付文書を含む。
【０２７１】
以下の実施例は、例示的な目的のみのために提供されており、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。実際に、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な改変が、上記の記述から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【０２７２】
本発明の代表的な材料は、２０１６年２月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）において寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２８３４を有する生物学的寄託物は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項とその下の規制（ｔｈｅ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ）（ブダペスト条約）の下で行われた。これは、寄託の日付から３０年間の寄託物の生存培養の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下で、かつＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の同意を条件として、ＡＴＣＣによって利用可能にされることになり、この同意は、関係する米国特許の発行の後、またはいずれか早くなる任意の米国もしくは外国特許出願が公衆に公開された後、公衆に寄託物の培養物の子孫の永続的かつ非制限的利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびそれに準じた長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照して連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含む）に従って権利を与えられていると米国特許商標庁長官によって判定された者への子孫の利用可能性を保証するものである。
【０２７３】
本願の代理人は、寄託中の材料の培養物が、適当な条件下で培養されたときに、死に、または失われ、または破壊された場合、材料を、別の同じものと通知時に即座に置き換えることに同意した。寄託した材料の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って与えられた権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０２７４】
（実施例１）
２５℃および／または３７℃におけるＢＣＭＡ／ヒトＩｇＧ相互作用の動態および親和性の判定
本実施例は、２５℃および３７℃における様々な抗ＢＣＭＡ抗体の動態および親和性を判定する。
【０２７５】
すべての実験は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で実施した。抗ＢＣＭＡ抗体のアレイを、Ａｂｄｉｃｈｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４１１、１３９〜１５１（２０１１）に記載されたものと同様にＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＬＣセンサーチップ上でアミンカップリング法を使用して調製した。固定化についての分析温度は、２５℃であり、ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−Ｔ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）であった。１ｍＭ  ＥＣＤおよび０．２５ｍＭ  ＮＨＳの混合物を３０μＬ／分の流量で３分間注入することによって分析物（水平）方向にチャネルを活性化した。ＩｇＧを、１０ｍＭアセテート  ｐＨ４．５緩衝液中２０μｇ／ｍＬで、３０μＬ／分で１．５分間リガンド（垂直）方向にこれらを注入することによって活性化されたスポット上に固定化した。活性化された表面は、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５を３０μＬ／分で３分間分析物方向に注入することによってブロックした。
【０２７６】
ＢＣＭＡ結合分析の分析温度は、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを補充したＨＢＳ−Ｔ＋のランニング緩衝液中３７℃または２５℃であった。速度論的滴定法をＡｂｄｉｃｈｅらに記載されたように相互作用分析に使用した。ヒトＢＣＭＡ（ｈｕＢＣＭＡ）またはカニクイザルＢＣＭＡ（ｃｙＢＣＭＡ）分析物を、低〜高濃度の一連の注入を使用して分析物方向に注入した。使用した濃度は、０．０８ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭ、および５０ｎＭ（５倍希釈係数および５０ｎＭのトップ濃度を用いた５メンバーシリーズ）であった。所与の分析物希釈液の会合時間は、２分であった。５０ｎＭ  ＢＣＭＡ注入直後に、解離を２時間モニターした。ＢＣＭＡ分析物注入の前に、緩衝液をＢＣＭＡ分析物サイクルにおける同じ会合および解離時間を使用して５回注入して、二重参照目的（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、１２、２７９〜２８４（１９９９）に記載された二重参照）のための緩衝液ブランクセンサーグラムを準備した。
【０２７７】
センサーグラムを二重参照し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１．１（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中の質量輸送速度論的滴定（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）モデルを用いて１：１ラングミュアにフィッティングした。本発明の様々な抗ＢＣＭＡ抗体の動態および親和性パラメータを表４Ａ〜４Ｃに示す。表４Ａ〜４Ｃに示した抗体は、同じ名称を有する表１に示したＣＡＲと同じＶＨおよびＶＬ領域を共有する。
【０２７８】
【表５】
2018512153.tif 000078
【０２７９】
【表６−１】
2018512153.tif 000079
【０２８０】
【表６−２】
2018512153.tif 000080
【０２８１】
【表６−３】
2018512153.tif 000081
【０２８２】
【表６−４】
2018512153.tif 000082
【０２８３】
【表７−１】
2018512153.tif 000083
【０２８４】
【表７−２】
2018512153.tif 000084
【０２８５】
【表７−３】
2018512153.tif 000085
【０２８６】
（実施例２）
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞
本実施例は、ＢＣＭＡ陽性（ＢＣＭＡ＋）腫瘍細胞に対するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能活性を実証する。
【０２８７】
生成したすべてのＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ分子の中で、８種を、ＢＣＭＡに対する親和性、ヒトＢＣＭＡおよびカニクイザルＢＣＭＡに対する交差反応性、ならびにエピトープに基づいてさらなる活性試験のために選択した。試験したＣＡＲ分子は、Ｐ５Ａ、Ｐ５ＡＣ１、Ｐ５ＡＣ１６、ＰＣ１、ＰＣ１Ｃ１２、ＣＯＭ２２、Ｐ６ＤＹ、およびＰ６ＡＰを含んでいた。３つの異なる構造を設計した。バージョン１（ｖ１）は、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジを含み、バージョン２（ｖ２）は、ＣＤ８αヒンジを含み、バージョン３（ｖ３）は、ＩｇＧ１ヒンジを含む。表５に示したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を調製し、ＢＣＭＡ＋細胞に向けたこれらの脱顆粒活性について使用および査定した。脱顆粒活性は、ヒトＴ細胞における各ＣＡＲの一過性発現の際に判定した。
【０２８８】
【表８−１】
2018512153.tif 000086
【０２８９】
【表８−２】
2018512153.tif 000087
【０２９０】
【表８−３】
2018512153.tif 000088
【０２９１】
【表８−４】
2018512153.tif 000089
【０２９２】
【表８−５】
2018512153.tif 000090
【０２９３】
【表８−６】
2018512153.tif 000091
【０２９４】
【表８−７】
2018512153.tif 000092
【０２９５】
【表８−８】
2018512153.tif 000093
【０２９６】
【表８−９】
2018512153.tif 000094
【０２９７】
【表８−１０】
2018512153.tif 000095
【０２９８】
【表８−１１】
2018512153.tif 000096
【０２９９】
【表８−１２】
2018512153.tif 000097
【０３００】
【表８−１３】
2018512153.tif 000098
【０３０１】
【表８−１４】
2018512153.tif 000099
【０３０２】
【表８−１５】
2018512153.tif 000100
【０３０３】
【表８−１６】
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【０３０４】
【表８−１７】
2018512153.tif 000102
【０３０５】
活性アッセイのために、１３人の健康ドナー（ドナー１〜１３）由来のＴ細胞を得た。簡単に言えば、Ｔ細胞を、バフィーコート試料から精製し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。細胞に、活性化後Ｄ１１／１２において異なるＣＡＲ分子をコードするｍＲＮＡを一過性にトランスフェクトした。ＣＡＲ活性は、（ａ）ＢＣＭＡを発現する細胞（ＭＭ１Ｓ、ＫＭＳ１２ＢＭ、およびＬ３６３）、または（ｂ）ＢＣＭＡタンパク質を発現しない細胞（Ｋ５６２）とともに共培養したときのこれらの脱顆粒能力、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）放出、および細胞傷害活性を測定することによって査定した。ＣＡＲを発現しないＴ細胞のベースライン活性を判定するために、モックトランスフェクトＴ細胞（緩衝液中のＴ細胞）も各アッセイについて含めた。
【０３０６】
ＣＡＲ検出は、ヒトＢＣＭＡタンパク質の細胞外ドメインをマウスＩｇＧ１由来Ｆｃ断片に融合させた融合タンパク質を使用して行った。細胞表面におけるＣＡＲの、融合タンパク質のＢＣＭＡ部分との結合を、抗Ｆｃ  ＰＥ−コンジュゲート抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３０７】
材料および方法
初代Ｔ細胞培養
Ｔ細胞を、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ、Ｐａｒｉｓ、フランス）によって提供されたバフィーコート試料から、フィコール勾配密集培地（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。ＰＢＭＣ層を回収し、Ｔ細胞を、市販のＴ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。精製Ｔ細胞を、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５％ヒト血清（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびビーズ：細胞比が１：１のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で活性化した。活性化後、細胞を、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および５％ヒト血清（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させ、維持した。
【０３０８】
ＣＡＲ  ｍＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションを、Ｔ細胞精製および活性化後４／５日目または１１／１２日目に行った。細胞５００万個に、異なるＣＡＲ構築物をコードするｍＲＮＡ  １５μｇをトランスフェクトした。ＣＡＲ  ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。トランスフェクションは、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（商標）Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ技術を使用して、最終体積２００μｌの「Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ」（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）中で、０．４ｃｍギャップキュベット内で３０００Ｖ／ｍの２回の０．１ｍＳパルス、その後３２５Ｖ／ｃｍの４回の０．２ｍＳパルスを印加することによって行った。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）で直ちに希釈し、５％  ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製ＩＬ−２を電気穿孔の２時間後に２０ｎｇ／ｍＬで添加した。
【０３０９】
脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａ動員）
Ｔ細胞を、ＢＣＭＡタンパク質を発現するまたは発現しない等量の細胞と一緒に９６ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）中でインキュベートした。共培養を、最終体積１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、５％  ＣＯ２とともに３７℃で６時間維持した。ＣＤ１０７ａ染色を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、および１×モネンシン溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と一緒に、共培養の開始時に蛍光性抗ＣＤ１０７ａ抗体（コンジュゲートされたＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製）を添加することによって、細胞刺激中に行った。６時間のインキュベーション期間後、細胞を、ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＦｌｕｏｒ  ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）および蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ８（コンジュゲートされたＰＥ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脱顆粒活性を、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、かつＣＤ８＋細胞の中のＣＤ１０７ａ染色について平均蛍光強度シグナル（ＭＦＩ）を判定することによって判定した。脱顆粒アッセイは、ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に実行した。結果を以下の表６Ａ〜９Ｈおよび９Ａ〜９Ｃに要約する。表では、第２の列（標識された「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）は、トランスフェクトＴ細胞内で発現されているＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを示す。
【０３１０】
細胞上のＣＤ１０７ａ発現は、抗原特異的活性化のマーカーである。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａのパーセントおよびＭＦＩは、ＢＣＭＡ高（Ｈ９２９）、中（ＭＭ１Ｓ）、および低（ＫＭＳ１２ＢＭ、Ｌ３６３）発現細胞とともにインキュベートしたとき増大するが、ＢＣＭＡ陰性細胞（Ｋ５６２およびダウディ）とともにインキュベートしたとき増大しない（表６Ａ〜９Ｈおよび９Ａ〜９Ｃ）。ＣＤ１０７ａ発現レベルは、ＢＣＭＡと接触したモックトランスフェクトＴ細胞で増大しなかった。よって、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞の存在下で活性化されるが、ＢＣＭＡを発現しない細胞の存在下で活性化されない。
【０３１１】
これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞とともにインキュベートされたとき活性化され、活性化は、抗原特異的であることを実証する。
【０３１２】
ＩＦＮγ放出アッセイ
Ｔ細胞を、（ａ）ＢＣＭＡを発現する細胞（ＭＭ１Ｓ、ＫＭＳ１２ＢＭ、およびＬ３６３）、または（ｂ）ＢＣＭＡタンパク質を発現しない細胞（Ｋ５６２）と一緒に、９６ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）中でインキュベートした。共培養を、最終体積１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、５％  ＣＯ２とともに３７℃で２４時間維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養物上清中のＩＦＮγ検出を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮγ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）によって行った。ＩＦＮγ放出アッセイは、ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に細胞共培養を開始することによって実行した。結果を以下の表８Ａ〜８Ｄおよび１０に要約する。
【０３１３】
表８Ａ〜８Ｄおよび１０に示したように、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞は、中ＢＣＭＡ発現細胞（ＭＭ１Ｓ）または低ＢＣＭＡ発現細胞（ＫＭＳ１２ＢＭ、Ｌ３６３）とともにインキュベートされたときＩＦＮγを産生する。対照的に、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（Ｋ５６２）とともにインキュベートされたときごくわずかなＩＦＮγを産生する。
【０３１４】
これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞とともにインキュベートされたとき活性化され、活性化は、抗原特異的であることを実証する。
【０３１５】
−  細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞を、同じウェル中で１０，０００標的細胞（ＢＣＭＡを発現する）および１０，０００対照（ＢＣＭＡｎｅｇ）細胞と一緒に、９６ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）中でインキュベートした。標的および対照細胞を蛍光細胞内色素（ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で標識した後、これらをＣＡＲ＋  Ｔ細胞とともに共培養した。共培養物を、５％  ＣＯ２とともに３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、細胞を、ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＦｌｕｏｒ  ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはＢＣＭＡｎｅｇ対照細胞）の生存能を判定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害性アッセイをｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に実行した。結果を以下の表７Ａ〜７Ｈに要約する。表では、細胞傷害性データは、パーセント生存細胞として示されており、次いで生ＢＣＭＡ陽性細胞／生ＢＣＭＡ陰性細胞の比として計算されている。細胞溶解は、１００−モックトランスフェクトＴ細胞として計算されている。
【０３１６】
表７Ａ〜７Ｈに示したように、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、中ＢＣＭＡ発現細胞（ＭＭ１Ｓ）または低ＢＣＭＡ発現細胞（Ｌ３６３）とともにインキュベートされたとき殺傷活性を呈する。対照的に、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（Ｋ５６２）とともにインキュベートされたとき殺傷活性を呈さない。
【０３１７】
要約すると、表５に示した選択されたＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞と接触すると選択的に活性化される。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲのすべてのバージョンがＢＣＭＡ特異的活性化を呈したが、ＣＤ８αヒンジ（ｖ２）を含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、ＦｃγＲＩＩＩα（ｖ１）ヒンジまたはＩｇＧ１（ｖ３）ヒンジを含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲと比較して増大した活性化レベルを呈した。
【０３１８】
【表９】
2018512153.tif 000103
【０３１９】
【表１０】
2018512153.tif 000104
【０３２０】
【表１１】
2018512153.tif 000105
【０３２１】
【表１２】
2018512153.tif 000106
【０３２２】
【表１３−１】
2018512153.tif 000107
【０３２３】
【表１３−２】
2018512153.tif 000108
【０３２４】
【表１４−１】
2018512153.tif 000109
【０３２５】
【表１４−２】
2018512153.tif 000110
【０３２６】
【表１５−１】
2018512153.tif 000111
【０３２７】
【表１５−２】
2018512153.tif 000112
【０３２８】
【表１６−１】
2018512153.tif 000113
【０３２９】
【表１６−２】
2018512153.tif 000114
【０３３０】
【表１７】
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【０３３１】
【表１８】
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【０３３２】
【表１９】
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【０３３３】
【表２０】
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【０３３４】
【表２１】
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【０３３５】
【表２２】
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【０３３６】
【表２３】
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【０３３７】
【表２４】
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【０３３８】
【表２５−１】
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【０３３９】
【表２５−２】
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【０３４０】
【表２６−１】
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【０３４１】
【表２６−２】
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【０３４２】
【表２７−１】
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【０３４３】
【表２７−２】
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【０３４４】
【表２８−１】
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【０３４５】
【表２８−２】
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【０３４６】
【表２９−１】
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【０３４７】
【表２９−２】
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【０３４８】
【表３０−１】
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【０３４９】
【表３０−２】
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【０３５０】
【表３１−１】
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【０３５１】
【表３１−２】
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【０３５２】
【表３２−１】
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【０３５３】
【表３２−２】
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【０３５４】
（実施例３）
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＭ１．Ｓ腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を誘導する
本実施例は、ＭＭ１．Ｓ腫瘍モデルを使用してＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた腫瘍の処置を例示する。
【０３５５】
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ効力スタディを、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するＭＭ１．Ｓ正所性モデルを用いて実施した。５００万個のＭＭ１．Ｓ  Ｌｕｃ２ＡＧＦＰ細胞を、生後６〜８週の雌Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒｇ−／−（ＮＳＧ）動物中に尾静脈を通じて静脈内注射した。Ｄ−ルシフェリン（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を腹腔内注射し（１５ｍｇ／ｍＬで動物１匹当たり２００μＬ）、その後イソフルオランで麻酔し、引き続いて全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行って、全身腫瘍組織量のモニタリングを可能にする。腫瘍細胞によって発現されるルシフェラーゼとルシフェリンとの相互作用によって放出される生物発光シグナルを、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用してイメージングによって捕捉し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．４（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用してトータルフラックス（光子／秒）として定量化した。
【０３５６】
３種の異なるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を本スタディで使用した。Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ構築物Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２、ＰＣ１Ｃ１２−Ｖ２、またはＣＯＭ２２−Ｖ２を発現する（上記表５を参照）。非形質導入対照Ｔ細胞を陰性対照として使用した。すべてのＴ細胞をＴＣＲα欠損であるように操作した。
【０３５７】
トータルフラックスがすべての動物について４５Ｅ６の平均に到達したとき（腫瘍インプラント後２０日目）、動物を４つの群にランダム化した。単回用量のヒトＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞または非形質導入対照Ｔ細胞をボーラス尾静脈注射によって投与した。動物が後肢麻痺または２０％の体重の減少、ＭＭ１．Ｓ正所性モデルのエンドポイントを呈したとき、動物を殺した。
【０３５８】
本スタディの結果を図１に要約する。図１では、トータルフラックス［ｐ／ｓ］が腫瘍進行を表す。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（三角形、菱形、正方形）での処置は、陰性対照（円）と比較してより低いトータルフラックスをもたらした。よって、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置は、陰性対照と比較して腫瘍進行を阻害した。
【０３５９】
これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍退縮を誘導するのに有効であることを実証する。
【０３６０】
（実施例４）
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞での多発性骨髄腫の処置
本実施例は、Ｍｏｌｐ８正所性モデルを使用してＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた多発性骨髄腫の処置を例示する。
【０３６１】
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ効力スタディを、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するＭｏｌｐ８正所性モデルを用いて実施した。２００万個のＭｏｌｐ８  Ｌｕｃ２ＡＧＦＰ細胞を、生後６〜８週の雌ＮＳＧ動物中に尾静脈を通じて静脈内注射した。Ｄ−ルシフェリン（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を腹腔内注射し（１５ｍｇ／ｍＬで動物１匹当たり２００μＬ）、その後イソフルオランで麻酔し、引き続いて全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行って、全身腫瘍組織量のモニタリングを可能にする。腫瘍細胞によって発現されるルシフェラーゼとルシフェリンとの相互作用によって放出される生物発光シグナルを、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用してイメージングによって捕捉し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．４（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用してトータルフラックス（光子／秒）として定量化した。
【０３６２】
トータルフラックスがすべての動物について３０Ｅ６の平均に到達したとき（腫瘍インプラント後８日目）、動物を３つの群にランダム化した。各群に、以下の細胞：１）対照として使用した非形質導入Ｔ細胞ＴＣＲ  ＫＯ（「ＴＣＲ  ＫＯ」）、２）Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２．１を発現するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（「Ｐ５ＡＣ１  Ｖ２  Ｒ２  ＴＣＲ  ＫＯ」）、または３）Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２およびＲＱＲ８自殺ポリペプチドを発現するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（「Ｐ５ＡＣ１  Ｖ２  ＲＱＲ８  ＴＣＲ  ＫＯ」）のうちの１種を投与した。細胞１〜３のすべては、ＴＣＲα欠損である。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を上記実施例で記載したように調製した。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ構築物Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２．１およびＰ５ＡＣ１−Ｖ２は、上記表５に示されている。単回用量の３００万個の対照（ＴＣＲ  ＫＯ）またはＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ（Ｐ５ＡＣ１  Ｖ２  Ｒ２  ＴＣＲ  ＫＯもしくはＰ５ＡＣ１  Ｖ２  ＲＱＲ８  ＴＣＲ  ＫＯ）細胞をボーラス尾静脈注射によって投与した。動物が、Ｍｏｌｐ８正所性モデルのエンドポイントである、全身体重の１５％超を失ったとき、動物を殺した。
【０３６３】
スタディからの結果を図２に要約する。単回用量の３００万個のＰ５ＡＣ１  Ｒ２  ＴＣＲＫＯ  ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（正方形）またはＰ５ＡＣ１  ＲＱＲ８  ＴＣＲＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（三角形）ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、陰性対照（円）と比較して、腫瘍インプラント後１０〜３５日目により低いトータルフラックスをもたらした（図２）。よって、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置は、陰性対照と比較して腫瘍進行を阻害した。
【０３６４】
これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍進行を阻害するのに有効であることを実証する。
【０３６５】
（実施例５）
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた多発性骨髄腫の処置
本実施例は、多発性骨髄腫の正所性マウスモデルにおけるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療活性を例示する。
【０３６６】
２つのヒト化マウスモデルを使用して、ＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株に対するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を評価した。生後六（６）〜八（８）週の雌Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物をＲｉｎａｔにおける病原体のない動物施設設備に収容し、実験を施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）指針に従うプロトコールに従って行った。
【０３６７】
ＭＭ１．ＳおよびＭｏｌｐ−８細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ．ｏｒｇ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ．ｄｅ）から購入した。細胞株を、レンチウイルス粒子（ａｍｓｂｉｏ）を使用してＬｕｃ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するように操作した。細胞を、ＭＭ１．Ｓについて１０％ウシ胎児血清、またはＭｏｌｐ−８細胞について２０％  ＦＣＳを補充したＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％二酸化炭素（ＣＯ２）中３７℃で培養した。指数増殖期中に増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種に使用した。
【０３６８】
治療的ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を記載したように生成した。健康ヒトドナー細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または精製汎Ｔ細胞を、ＥＦ−１ａプロモーターによって推進されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲおよびＲＱＲ８をコードするレンチウイルス粒子で活性化および形質導入する。３種の異なるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを本スタディで使用した：Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２、ＰＣ１Ｃ１２−Ｖ２、およびＣＯＭ２２−Ｖ２（上記表５を参照）。Ｔ細胞をＴＣＲα遺伝子の欠失のために遺伝子編集した。細胞を１４〜１７日間培養し、次いで９０％  ＦＣＳ／１０％  ＤＭＳＯ中で凍結保存した。Ｔ細胞注射のために、Ｔ細胞を３７℃の水浴中で急速解凍し、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。細胞を、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ１６４０  ０．２ｍｌで、担腫瘍動物の尾静脈内に注射した。
【０３６９】
ＮＳＧマウスに、腫瘍細胞接種の１日前に１Ｇｙ全身照射（ＲＡＤ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を照射した。５×１０６個のＭＭ１．Ｓ／Ｌｕｃ２−ＥＧＦＰ細胞または２×１０６個のＭｏｌｐ−８／Ｌｕｃ２−ＥＧＦＰ細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）０．１ｍｌで尾静脈内に注射した。全身腫瘍組織量を、生物発光イメージングを使用して毎週２回測定した。マウスに、ＰＢＳ  ０．２ｍｌ中に溶解したＤ−ルシフェリン３μｇを注射し、イソフルオランを使用して麻酔した。注射の７分後に、動物を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＩＶＩＳスペクトルカメラシステムを使用してイメージングした。マウスの尾を除いて全身ルミネセンスを測定し、全身腫瘍組織量をトータルフラックス（１秒当たりの光子）として報告する。腫瘍を指数関数的増殖が起こるまで確立させた。動物を、トータルフラックスに基づいて処置群にランダム化し、同じドナー由来のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞または未形質導入対照Ｔ細胞で処置した。ＣＡＲ−Ｔ処置の効果を、生物発光イメージングおよび体重測定を使用して毎週２回査定した。スタディエンドポイントは、最初の動物が、体重減少（初期体重の２０％超）、後肢麻痺、または動物の苦痛の他の徴候によって示される末期疾患を呈したとき到達した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用して実施した。チューキーの補正を伴った反復測定一元配置ＡＮＯＶＡを使用してすべての群間の抗腫瘍効力を比較した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【０３７０】
結果を以下の表１１（ＭＭ１．Ｓ）および表１２（Ｍｏｌｐ−８）に要約する（１秒あたりの光子でのトータルフラックスのｌｏｇ１０値＋／−ＳＥＭ）。準最適なＣＡＲ−Ｔ細胞用量を使用して異なるｓｃＦｖを有するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を比較した。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞群は、Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２、ＰＣ１Ｃ１２−Ｖ２、およびＣＯＭ２２−Ｖ２である（上記表５を参照）。ＭＭ１．Ｓモデルでは、３．５×１０６個のＣＡＲ発現Ｔ細胞を腫瘍インプランテーション後１７日目に注射した。ＩＭｏｌｐ８モデルでは、４×１０６個のＣＡＲ発現Ｔ細胞を腫瘍インプランテーション後７日目に注射した。形質導入効率は、ＭＭ１．Ｓマウスモデルで投薬したＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について１９％〜２９％、およびＭｏｌｐ８マウスモデルで投薬したＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について３１％〜３６％の範囲であった。等価な総用量の未形質導入Ｔ細胞を対照群に使用した。対照Ｔ細胞処置群は、スタディエンドポイントに、ＭＭ１．Ｓについて３５日目およびＭｏｌｐ８について２３日目に到達するまで進行性腫瘍増殖を呈した。ダネットの補正を伴ったＲＭ−ＡＮＯＶＡ検定を使用する全身腫瘍組織量の統計分析は、３つすべてのＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ処置群において、全身腫瘍組織量が対照群における全身腫瘍組織量と比較して有意に低かったことを示した（ｐ＜０．０１）（表１１および１２）。例えば、ＭＭ１．Ｓ腫瘍モデルでは、Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２  ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した動物における平均トータルフラックスは、対照Ｔ細胞を与えた動物における９．２２  ｌｏｇ１０光子／秒と比較して、２５日目に６．４４  ｌｏｇ１０光子／秒であった（表１１）。腫瘍インプランテーション後３５日目において、Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２  ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した動物における平均トータルフラックスは、対照Ｔ細胞を与えた動物における１０．１８  ｌｏｇ１０光子／秒と比較して、６．８２  ｌｏｇ１０光子／秒であった（表１１）。Ｍｏｌｐ８腫瘍モデルでは、Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２  ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した動物における平均トータルフラックスは、対照Ｔ細胞を与えた動物における９．３９  ｌｏｇ１０光子／秒と比較して、１４日目に７．８８  ｌｏｇ１０光子／秒であった（表１２）。腫瘍インプランテーション後２３日目において、Ｐ５ＡＣ１−Ｖ２  ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した動物における平均トータルフラックスは、対照Ｔ細胞を与えた動物における１０．３７  ｌｏｇ１０光子／秒と比較して、９．２９  ｌｏｇ１０  光子／秒であった（表１２）。
【０３７１】
これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置が、腫瘍退縮を誘導するのに有効であることを実証する。
【０３７２】
【表３３】
2018512153.tif 000139
【０３７３】
【表３４−１】
2018512153.tif 000140
【０３７４】
【表３４−２】
2018512153.tif 000141
【０３７５】
（実施例６）
ＴＣＲα／ｄＣＫノックアウトＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた多発性骨髄腫の処置
本実施例は、多発性骨髄腫の正所性マウスモデルにおけるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療活性を例示する。
【０３７６】
ヒト化マウスモデルを使用して、ＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株に対するＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を評価した。生後６〜８週の雌Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物をＲｉｎａｔにおける病原体のない動物施設設備に収容し、実験を施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）指針に従うプロトコールに従って行った。
【０３７７】
ＭＭ１．Ｓ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ．ｏｒｇ）から購入した。細胞株を、レンチウイルス粒子（ａｍｓｂｉｏ）を使用してＬｕｃ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するように操作し、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼを使用して遺伝子編集して、デオキシシチジン（ｄＣＫ）遺伝子を無効にした。細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％二酸化炭素（ＣＯ２）中３７℃で培養した。指数増殖期中に増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種に使用した。
【０３７８】
治療的ＣＡＲ−Ｔ細胞を上述した通り生成した。健康ヒトドナー細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または精製汎Ｔ細胞を、ＥＦ−１ａプロモーターの制御下でＲＱＲ８遺伝子とともにＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通型、４１ＢＢ、およびＣＤ３ζをコードするレンチウイルス粒子で活性化および形質導入する。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＴＣＲαおよびｄＣＫ  ＴＡＬＥＮの組合せ、またはＴＣＲα  ＴＡＬＥＮ単独を使用して、ＴＣＲαおよび／またはｄＣＫ遺伝子を欠失させるように遺伝子編集した。すべてのＴ細胞の形質導入効率は、７０％であった。ＴＣＲαノックアウトＴ細胞を、ＣＤ３−陽性細胞の磁気選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して精製し、ｄＣＫノックアウトＴ細胞を、０．５μＭクロファラビンの存在下でのエクスパンションによって精製した。細胞を１４〜１７日間培養し、次いで９０％  ＦＣＳ／１０％  ＤＭＳＯ中で凍結保存した。Ｔ細胞注射のために、Ｔ細胞を３７℃の水浴中で急速解凍し、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。処置のために、Ｔ細胞を、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ１６４０  ０．２ｍｌで、担腫瘍動物の尾静脈内に注射した。
【０３７９】
マウス腫瘍モデルについて、動物にＭＭ１．Ｓ／ｄＣＫ  ＫＯ腫瘍細胞を注射した。次いでマウスを、腫瘍細胞インプランテーション後１８日目に、２．５×１０６個のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。ＴＣＲαおよびｄＣＫ  ＴＡＬＥＮを受けた等価な用量の未形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。動物を、Ｔ細胞注射後５日間、クロファラビンまたはビヒクルで処置した。
【０３８０】
結果：対照Ｔ細胞処置群は、スタディエンドポイントに、３５日目に到達するまで進行性腫瘍増殖を呈した（表１３、群１）。対照と比較して、ＴＣＲαノックアウトＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞およびビヒクルで処置した群は、クロファラビンを同時投与（ｐ＜０．０５）すると減少した全身腫瘍組織量の有意な低下を呈した（ｐ＜０．０５）（表１３、群２および３）。全身腫瘍組織量は、動物がビヒクルまたはクロファラビンを受けたかに関係なく、ＴＣＲα／ｄＣＫダブルノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した動物において有意に低減された（ｐ＜０．０５）（表１３、群４および５）。ＴＣＲα／ｄＣＫダブルノックアウトＴ細胞を受けている群における全身腫瘍組織量の低減は、ＴＣＲαシングルノックアウトＴ細胞およびビヒクルを受けている群と異ならなかった（ｐ＞０．１）（表１３、群２、４、および５）。
【０３８１】
これらの結果は、ＴＣＲα／ｄＣＫダブルノックアウトＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置が、フルダラビンおよびクロファラビンなどのヌクレオシド類似体療法の存在下で腫瘍退縮を誘導するのに有効であることを実証する。
【０３８２】
【表３５−１】
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【０３８３】
【表３５−２】
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【０３８４】
開示した教示を、様々な用途、方法、キット、および組成物を参照して記載してきたが、様々な変更および改変を、本明細書の教示および以下の請求項に係る発明から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。上記の実施例は、開示した教示をより良好に例示するために提供されており、本明細書に提示した教示の範囲を限定するように意図されていない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から記載してきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数の変形および改変が過度の実験を用いることなく可能であることを容易に理解するであろう。すべてのこのような変形および改変は、本教示の範囲内である。
【０３８５】
特許、特許出願、論文、教科書などを含めた本明細書に引用されたすべての参考文献、およびこれらに引用された参考文献は、これらが既に組み込まれていない程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。それだけに限らないが、定義された用語、用語使用法、記載した技法などを含めて、組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が本願と異なり、または矛盾する事象では、本願が支配する。
【０３８６】
上記の記載および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図したベストモードを記載する。しかし、どんなに詳述される上記事項がテキストに現れることがあっても、本発明は、多くのやり方で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびこれらの任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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