(57)【要約】液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して、試料中のセロトニンを測定するための方法およびシステムが開示されている。この方法は、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；上記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、上記試料を所定期間にわたってインキュベートするステップ；液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および質量分析法によって、上記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、上記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含み得る。
2018511043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；
前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間にわたってインキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記生体試料が、血清試料または血漿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料が、ヘパリンで処置した対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が、ヘパリン起因性血小板減少症を有することが疑われる対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナー血小板が、少なくとも１名の健康と推定される対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料中の前記ドナー血小板が、洗浄され、部分的に精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベートするステップが、室温で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートするステップが、少なくとも３０分間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、０．００１から１Ｕ／ｍＬの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、５０から１０００Ｕ／ｍＬの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記内部標準が、安定な同位体で標識された形のセロトニンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記安定な同位体で標識された形のセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記内部標準がセロトニンｄ４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前にセロトニンと共にインキュベートされた、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前に、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せと共にインキュベートされた、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を部分的に精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分的に精製するステップが、前記インキュベートされた試料を遠心分離することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
液体クロマトグラフィーを使用することが、分析液体クロマトグラフィーを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
分析液体クロマトグラフィーを使用することが、逆相カラムを使用することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
液体クロマトグラフィーを使用することが、少なくとも１つのカラムを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
液体クロマトグラフィーを使用することが、平行な２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することを含み、前記２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムが単一の質量分析計にインライン接続されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
平行な２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することが、前記インキュベートされた試料を、前記２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムに時間をずらして導入することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析するステップが、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、および大気圧光イオン化からなる群から選択されるイオン化技法を使用して、セロトニンをイオン化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析するステップが、四重極質量分析計を使用してセロトニンを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記四重極質量分析計が、三連四重極質量分析計である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析するステップが、第１の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを検出すること；第２の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを断片化することであって、１つまたは複数のセロトニン断片イオンをもたらすこと；および第３の四重極中の１つまたは複数のセロトニン断片イオンを検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分析するステップが、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンをイオン化することであって、１６０．１±０．５の前駆体イオン、または１１５．１±０．５、１３２．１±０．５、１０５．１±０．５、もしくは８９．１±０．５のプロダクトイオンの少なくとも１つを含む質量／電荷比を有する１つまたは複数のセロトニンイオンを生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；
前記血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；
前記血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体で標識されたセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
前記提供するステップの前の前記安定な同位体で標識されたセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するために有用な報告を作成する方法であって、
（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；
（ｄ）質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ；および
（ｅ）前記試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップ
を含む方法。
【請求項３３】
前記疾患または状態が、ヘパリン起因性血小板減少症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、
（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；
（ｂ）前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；
（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および
（ｄ）質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーション
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年３月３日に出願された米国仮出願番号第６２／１２７，５９０号に基づく利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性自己抗体を間接的に測定するための方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）を有することが疑われる患者からの検体で感作させた、ドナーの血小板から放出されたセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンを測定するための方法およびシステムを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）は、ヘパリンまたはその他のポリアニオンと複合体形成した血小板第４因子（ＰＦ４）に対する免疫化によって引き起こされた、ヘパリン療法の潜在的に重篤な抗体媒介性合併症である。ＨＩＴ抗体は、血小板表面のＰＦ４／ヘパリン複合体に結合し、その結果、血小板が活性化して、生命を脅かす血栓症を伴う可能性がある、血小板数の減少をもたらす。この血栓形成促進性障害は、虚血性四肢壊死、肺塞栓症、心筋梗塞、および卒中を含む、壊滅的な血栓塞栓性合併症をもたらす可能性がある。
【０００４】
中等度の血小板減少症は、ヘパリンが投与される臨床設定で一般的であり、ほとんどの症例はＨＩＴによって引き起こされたものではない。ＨＩＴと、血小板減少症のその他の潜在的な原因との区別は、ヘパリン処置された血小板減少症患者の評価において難しい診断的要素であり、臨床的評価と実験室調査との組合せに依拠する。即時診断および管理が、生命を脅かす血栓症のリスクを最小限に抑えるのに極めて重要である。ＨＩＴに罹患していると診断されたまたはその疑いがあると診断された患者からはヘパリンを除去し、可能な限り迅速に代替の非ヘパリン抗凝固薬に代えなければならない。
【０００５】
ＨＩＴの実験室調査は難しく、臨床症状と実験室アッセイとの間に相関関係を必要とする。行われる最も一般的なアッセイは、それらの機能的能力を考慮せずにＨＩＴ抗体の存在を検出する血清学的アッセイである。行うのが比較的容易ないくつかの血清学的アッセイは、商業的に利用可能であり、これらのアッセイは感度が高い。これらのアッセイの結果は、優れた陰性の的中率を有し、陰性結果を使用して、最も抗し難い臨床状況を除く全てでＨＩＴを排除することができる。しかし、これらのアッセイでは特異度が低くなり、臨床的ＨＩＴが存在しない状態で陽性結果を頻繁に与える。特に力価が低い陽性結果は、病原性抗体と臨床的に無関係の抗体とを区別しない。
【０００６】
ＨＩＴを測定する別のアプローチは、血小板機能を測定するアッセイ、即ち機能アッセイを使用することである。ヘパリンの存在下でＨＩＴ抗体による血小板活性化を測定する機能アッセイは、真のＨＩＴである患者において患者の根源的な凝血促進性状態を検出できることから、至適基準の診断実験室試験と見なされる。ある機能アッセイは、血小板により放出されたセロトニンの測定であり、即ちセロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）である。このアッセイでは、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の患者からの血清が、高濃度のヘパリンではなく処置的濃度のヘパリンで、血小板の凝集および分泌を開始する。一般に、そのようなアッセイは、血小板から放出された放射標識セロトニンを測定する。しかし性能の複雑さに起因して、洗浄血小板を使用する機能アッセイは、広く利用されていない。さらに、洗浄血小板を使用するセロトニン放出アッセイは、放射標識セロトニンと共にインキュベートされた血小板を使用して典型的には行われ、したがって、放射性物質を使用することに関連した欠点を伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本明細書では、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性抗体を間接的に測定するための方法およびシステムが記載される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）を有することが疑われる患者からの検体で感作させた、ドナー血小板から放出されたセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンを測定するための方法およびシステムを提供する。本発明の方法およびシステムは、アッセイが放射標識されたセロトニンの使用を必要としないという、その他の方法に勝る利点を有する。加えて、本方法は、ＨＩＴに関してより感度の高い高精度試験をもたらすＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを取り入れる。本方法は、異常なドナー血小板活性化に関連するその他の状態および疾患に役立てることができる。本発明は、様々な方法で具体化されてもよい。
【０００９】
少なくとも１つの態様では、本発明は、試料中の放出されたセロトニンおよび／または安定な標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートすること；液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および質量分析法によってクロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内で利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法を提供する。これらの方法のさらなる実施形態を、以下に詳述する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、生体試料、ヘパリン、およびセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；ならびに質量分析法によってクロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内で利用可能なセロトニンの総量に対する、合わせた試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法を提供する。これらの方法のさらなる実施形態を、以下に詳述する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；ならびに質量分析法によってクロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内で利用可能な安定な同位体で標識されたセロトニンの総量に対する、試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法を提供する。これらの方法のさらなる実施形態を、以下に詳述する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、異常なドナー血小板活性化に関連する疾患または状態を診断するのに有用な報告を作成する方法であって、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；ドナー血小板からセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；質量分析法によってクロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内で利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ；および試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップを含む方法を提供する。これらの方法のさらなる実施形態を、以下に詳述する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステムを提供する。これらのシステムのさらなる実施形態を、以下に詳述する。
【００１４】
本発明のさらなる態様を、以下に詳述する。
【００１５】
本出願は、以下の図面を含む。図面は、本発明のある特定の実施形態および／または特徴を例示するものであり、本発明の任意の記述（単数または複数）を補うものである。図面は、書かれた記述がその通りであることを明らかに示さない限り、本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、非スパイク血小板から放出されたセロトニン（正常）、セロトニンスパイク血小板から放出されたセロトニン（Ｓスパイク）、およびｄ４−セロトニンスパイク血小板から放出されたセロトニン（Ｄ４−Ｓスパイク）に関する放出パーセントを比較するグラフである。破線は、ドナー血小板で利用可能な総セロトニンと比較して２０％の放出を表す。
【００１７】
【図２】図２は、ヘパリン起因性血小板減少症を診断するのに使用される、セロトニン放出アッセイ解釈パターンのグラフ表示である。
【００１８】
【図３】図３は、陽性のＨＩＴ決定をもたらす、本明細書に記載のセロトニン放出アッセイに関するクロマトグラムを示す。左のパネルは内因性セロトニンを示し；中央のパネルは０．２Ｕ／ｍＬヘパリンでのセロトニン放出を示し；右のパネルは１００Ｕ／ｍＬヘパリンでのセロトニン放出を示す。
【００１９】
【図４】図４は、アッセイに関する定量下限（ＬＬＯＱ）（左側）を陽性放出試料（右側）に対して比較するクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
以下の記載は、本発明の様々な態様および実施形態を述べたものである。本発明の範囲を限定しようとする特定の実施形態はない。むしろ実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる非限定的な例の様々な方法およびシステムを単に提供するものである。この記載は、当業者の観点から読み取られ、したがって当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
【００２１】
本出願では様々な略称が使用され得る。全てではないとしてもほとんどの場合、そのような略称の意味は当業者に公知である。これらの略称は、下記の略称を含み、その意味を提示する。
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＬＯＱ＝定量限界
ＬＬＯＱ＝定量下限
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫測定法
ＥＳＩ＝エレクトロスプレーイオン化
ＵＬＯＱ＝定量上限
（ＬＣ）−ＭＳ／ＭＳ＝液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法
【００２２】
（定義）
下記の用語は、他に指示しない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
【００２３】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に記載しない限り、１つまたは複数を指すことができる。
【００２４】
本出願の全体を通して、「約」という用語は、値が、デバイスに関する誤差の固有のばらつき、値を決定するのに用いられる方法、または研究対象の中に存在するばらつきを含むことを示すのに使用される。
【００２５】
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、生物の生理学的状態に関する生体情報を提供し得る、任意の生体分子である。ある特定の実施形態では、バイオマーカーの存在または不在が情報価値あるものになり得る。他の実施形態では、バイオマーカーのレベルが情報価値あるものになり得る。バイオマーカーは、セロトニンなどの神経伝達物質、または神経伝達物質の代謝産物であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用される「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語の使用は、医師などの医療専門家に対するいかなる種類の関係も示唆しない。
【００２７】
本明細書で使用される「生体試料」という用語は、個体から単離することができる任意の流体または組織を指すのに使用される。例えば生体試料は、全血、血漿、血清、その他の血液画分、尿、脳脊髄液、組織ホモジネート、唾液、羊水、胆汁、粘液、腹水、リンパ液、発汗、組織、および組織ホモジネートなどであってもよい。
【００２８】
本発明で使用される「試料」という用語は、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含有する混合物を指すのに使用される。試料は、追加の成分を含有していてもよい。
【００２９】
本明細書で使用される「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」という語句は、試料中の１種または複数の分子または分析物を、試料中のその他の分析物から分離するためのプロセスを指すのに使用される。ＬＣでは、流体の均一性が、微細化された物質のカラム内を移動するにつれて、流体溶液の１種または複数の分析物が遅速化する。遅速化は、１つまたは複数の固定相と移動相との間に混合物の成分が分布することによって起こる。ＬＣには、例えば、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される「分離する」または「精製する」などの用語は、試料マトリックスからの目的の分析物以外の、全ての材料の除去を指すのに必ずしも使用されない。代わりに、一部の実施形態では、この用語は、試料マトリックス中に存在する１種または複数のその他の成分に比べて目的の１種または複数の分析物の量を豊富にする手順を指すのに使用される。一部の実施形態では、「分離」または「精製」は、例えば質量分析法による分析物の検出を妨げる可能性のある、試料からの１種または複数の成分の量を、除去するまたは減少させるのに使用されてもよい。
【００３１】
本明細書で使用される「質量分析法」または「ＭＳ」分析という用語は、試料中の分子の同定および／または定量のための技法を指す。ＭＳは、試料中の分子をイオン化し、荷電分子を形成し；それらの質量対電荷比に従って荷電分子を分離し；荷電分子を検出することを含む。ＭＳは、試料中の分子の定性的および定量的検出の両方を可能にする。分子は、当業者に公知の任意の適切な手段によって、イオン化され検出されてもよい。「タンデム質量分析法」または「ＭＳ／ＭＳ」という語句は、本明細書では、試料中の分子の同定および／または定量のための技法であって、１つ超の質量分析法が、複数の質量分析装置を使用して同時にまたは単一の質量分析装置を使用して逐次行われる技法を指すのに使用される。本明細書で使用される「質量分析計」は、分子をイオン化しかつ荷電分子を検出する手段を含む装置である。
【００３２】
本明細書で使用される「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、分子の断片化を回避しながら試料中の分子をイオン化するのに、質量分析法で使用される技法を指す。試料は、エレクトロスプレーによって微細なエアロゾル中に分散される。試料は、溶媒、通常は水と混合された揮発性有機化合物（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）と、典型的には混合されることになる。次いでエアロゾルを、毛管を通して質量分析計に移し、これを加熱して、荷電液滴からのさらなる溶媒蒸発を助けることができる。
【００３３】
本明細書で使用される「四重極分析装置」は、ＭＳで使用されるあるタイプの質量分析装置である。この分析装置は、互いに高度に平行に設定された４個の円形ロッド（２対）からなる。四重極分析装置は、試料の荷電粒子をそれらの質量対電荷比に基づいて組織する機器の構成要素である。当業者なら、四重極分析装置の使用は、結果の高い特異性をもたらすことができることを理解されよう。１対のロッドは正電位に設定され、他方の対のロッドは負電位にある。検出するには、イオンが、位置合わせされたロッドと境を接しかつ平行な軌道経路の中心を通過しなければならない。四重極が、直流および無線周波電圧の所与の振幅で動作するとき、所与の質量対電荷比のイオンのみが、共鳴することになり、四重極を通過しかつ検出される安定な軌道を有することになる。本明細書で使用される「正のイオンモード」は、正に荷電したイオンが質量分析装置によって検出されるモードを指し、「負のイオンモード」は、負に荷電したイオンが質量分析装置によって検出されるモードを指す。「選択イオンモニタリング」または「ＳＩＭ」の場合、直流および無線周波電圧の振幅は、特定の質量のみを観察するように設定される。
【００３４】
本明細書で使用される「分析カラム」という用語は、試験試料マトリックスの成分の分離を有効にするのに十分なクロマトグラフ板を有する、クロマトグラフィーカラムを指す。好ましくは、分析カラムから溶出した成分は、目的の分析物（単数または複数）の存在または量を決定するのを可能にするような方法で分離される。一部の実施形態では、分析カラムは、平均直径が約５μｍの粒子を含む。一部の実施形態では、分析カラムは、官能化シリカもしくはポリマー−シリカハイブリッド、またはポリマー粒子もしくはモノリシックシリカ固定相、例えばフェニル−ヘキシル官能化分析カラムである。
【００３５】
分析カラムは、さらなる精製または分析のために「精製された」試料が得られるよう、保持される材料を保持されていない材料から分離または抽出するのに典型的には使用される、「抽出カラム」または「分取カラム」と区別することができる。一部の実施形態では、抽出カラムは、官能化シリカもしくはポリマー−シリカハイブリッド、またはポリマー粒子もしくはモノリシックシリカ固定相、例えばＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ＳＢＣ−１８カラムである。
【００３６】
本明細書で使用される「ヘパリン処置」という用語は、対象（例えば、ヒト対象）へのヘパリン薬の投与を含む、処置レジメンを指す。「ヘパリン薬」という用語は、ヘパリン、非分画ヘパリン、ならびにエノキサパリン、ダルテパリン、およびチンザパリンを含む低分子量ヘパリンを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々なヘパリンおよびヘパリン誘導体を指す。そのような薬物は、抗凝固剤を必要とする状態（例えば、心房細動、肺塞栓症、深部静脈血栓症、静脈血栓塞栓症、うっ血性心不全、卒中、心筋梗塞、および遺伝性または後天性凝固性亢進）を含む様々な状態を処置するために使用することができる。
（試料中のセロトニンの存在または量を決定するための方法）
【００３７】
少なくとも１つの態様では、本発明は、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法を提供する。
【００３８】
セロトニンは、血小板活性化のマーカーである。ＨＩＴの患者からの血清は、高濃度のヘパリンではなく処置的濃度のヘパリンで、血小板の凝集および分泌を開始する。本明細書に記載の方法またはアッセイは、２つのヘパリン濃度、即ち低ヘパリン濃度および高ヘパリン濃度で、患者の血清または血漿などの生体試料の存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。セロトニン放出は、放出されたセロトニンの量を測定し、放出されたセロトニンをドナー血小板中の利用可能な総セロトニンと比較することによって、決定される。ドナー血小板中の利用可能な総セロトニンは、内因性セロトニンを含むことができ、血小板にスパイクされるセロトニンも含むことができる。本明細書に記載の本発明の実施形態では、ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料をドナー血小板およびヘパリンの存在下で所定期間の間インキュベートする。次いで、液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離することができる。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、試料中の放出されたセロトニンの量を決定する。また、ある特定の実施形態では、試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成する。
【００３９】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態によるアッセイの、実施例およびグラフ表示を、図２に示す。図２に例示されるように、試料は、低濃度のヘパリンおよび高濃度のヘパリンで、セロトニンの放出パーセントに関する測定値の関係に従って、本明細書に記載の基準に従い「陰性」、「中間」、「低陽性」、または「陽性」と標識される。「陽性」結果は、ＨＩＴの診断を支持する。「陰性」結果は、ＨＩＴの診断と相反するが、それを完全に排除しなくてもよい。「低陽性」または「未確定」の結果は、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリン曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて、解釈すべきである。
【００４０】
一態様では、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法は、（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む。
【００４１】
当業者に公知のように、ヘパリン起因正血小板減少症（ＨＩＴ）の患者からの血清は、高濃度のヘパリンではなく処置的濃度のヘパリンで、血小板の凝集および分泌を開始させる。このように、ＨＩＴの患者からの血清は、高濃度のヘパリンではなく低い処置的濃度のヘパリンでセロトニンの放出を引き起こすので、本明細書に記載の方法は、２つのヘパリン濃度（即ち、低ヘパリン濃度および高ヘパリン濃度）で、血小板からのセロトニンの放出を測定する。このアッセイは、放射標識されたセロトニンの使用を必要としないという、その他の方法に勝る利点を有する。加えて、本方法は、ＨＩＴに関してより感度の高い高精度試験をもたらすＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを取り入れる。本方法は、異常なドナー血小板活性化に関連するその他の状態および疾患に役立てることができる。本方法のステップを、以下にさらに記載する。
（試料の提供）
【００４２】
これらの方法は、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を、提供することを含む。この文脈において、「提供する」という用語は広く解釈される。この用語は、生体試料を提供する対象を排他的に指すものではない。例えば、現場から離れた臨床実験室の技術者は、例えば、試料がクロマトグラフィーによる精製のために調製されるとき、試料を「提供する」と言える。
【００４３】
試料は、任意の特定の試料タイプに限定されない。試料は、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含有するが、一般にその他の成分も含有する。一部の実施形態では、試料は、クロマトグラフィーによる精製のために加工され調製された試料である。そのような加工は、後続の精製ステップの有効性を最適化するのに役立ててもよい。そのような加工方法は、当業者に周知である。
【００４４】
本発明は、試料の取扱いの、任意の特定の手段に限定されない。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにより精製する前に、試料を２つまたはそれ超の画分に分離するのに役立ててもよい。一部のそのような実施形態では、特定のカラム化学に関する分離の感度または選択性を改善するのを助けるため、そのような画分の２つまたはそれ超を異ならせて調製してもよい。一部の実施形態では、本方法は、多数の液体クロマトグラフィーシステム全体にわたって繰り返し注入するための、単一の試料を調製することを含む。本発明は、任意の特定の試料サイズに限定されない。
【００４５】
試料は、生体試料を含む。そのような実施形態では、生体試料は、溶媒、緩衝液、および抗凝固剤などの、その他の成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、組織ホモジネート、唾液、羊水、胆汁、粘液、腹水、またはリンパ液の１種または複数とすることができる。一部の実施形態では、生体試料は、血清または血漿である。一部の実施形態では、生体試料は、薬物で処置した対象から得られる。例えば、生体試料は、ヘパリンで処置した対象またはヘパリン類似体もしくは誘導体で処置した対象から得ることができる。一部の実施形態では、生体試料は、ヘパリン、非分画ヘパリン、ならびにエノキサパリン、ダルテパリン、およびチンザパリンを含む低分子量ヘパリンで予め処置された対象から得られる。一部の実施形態では、生体試料は、異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を有する、またはそれらを発症するリスクのある対象から得られる。例えば、生体試料は、ヘパリン起因性血小板減少症を発症するリスクのある対象から得ることができる。ヘパリン起因性血小板減少症を発症するリスクのある対象は、以前または現在ヘパリンで処置している対象を含むことができる。本発明は、生体試料の任意の特定の体積に限定されない。一部の実施形態では、生体試料は、体積が少なくとも約１〜１００μＬ、少なくとも約１０〜７５μＬ、または少なくとも約１５〜５０μＬである。ある特定の実施形態では、生体試料は、体積が少なくとも約２０μＬである。
【００４６】
試料は、追加としてドナー血小板を含む。一部の実施形態では、ドナー血小板は、少なくとも１名の健康な対象（例えば、ヘパリン起因性血小板減少症または異常な血小板活性化に関連した状態もしくは疾患のない対象）から得られる。例えば、ドナー血小板は、実施例１で以下に記載される方法により、患者からの血漿から得ることができる。一部の実施形態では、ドナー血小板は、試料の使用前に洗浄および／または精製される。ある特定の場合には、アッセイの限定的な態様は、血小板中に存在するセロトニンに内在する量であることが見出されている。このように、一部の実施形態では、提供するステップの前に、ドナー血小板をセロトニンとインキュベートして、インキュベートするステップで放出するのに利用可能な血小板中に存在するセロトニンの量を増加させるようにする。一部の実施形態では、ドナー血小板を標識セロトニンとインキュベートする。標識されたセロトニンは、放出されたセロトニンを測定するための追加の方法として使用することができる。セロトニンの標識は、重水素、炭素１３、窒素１５、および／または酸素１８などの安定同位体を含むことができる。例えば、提供するステップの前に、試料中のドナー血小板を、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、重水素標識セロトニン、またはこれらの標識の組合せと共にインキュベートすることができる。一部の実施形態では、ドナー血小板と共にインキュベートするのに使用することができるセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンの量は、５０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５ｎｇ／ｍＬから４００ｎｇ／ｍＬ、または１５０ｎｇ／ｍＬから３００ｎｇ／ｍＬ）の範囲であり得る。本発明は、ドナー血小板の任意の特定の体積に限定されない。任意選択で、ドナー血小板は、緩衝液（例えば、水性緩衝液）に懸濁させた懸濁液の形で提供される。緩衝液は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）および少なくとも１種の酵素を含むことができる。一部の実施形態では、酵素はアピラーゼ（apryase）、カルシウム活性化原形質膜結合酵素であり、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の蓄積を防止する。一部の実施形態では、ドナー血小板懸濁液は、体積が少なくとも約２５〜２５０μＬ、少なくとも約３５〜２００μＬ、少なくとも約４５〜１５０μＬ、または少なくとも約５０〜１００μＬである。ある特定の実施形態では、ドナー血小板懸濁液は、体積が少なくとも約７５μＬである。
【００４７】
試料はヘパリンも含む。上述のように、アッセイは、２つの濃度のヘパリンを使用して行われる。一部の試料では、ヘパリンが低濃度で提供される。低濃度のヘパリンは、０．００１から１Ｕ／ｍＬ、０．００５から０．５Ｕ／ｍＬ、または０．０１から０．２５Ｕ／ｍＬの量で提供されたヘパリンを含むことができる。一部の実施形態では、ヘパリンは、０．２Ｕ／ｍＬの量で提供される。他の試料では、ヘパリンが高濃度で提供される。高濃度のヘパリンは、５０から１０００Ｕ／ｍＬ、７５から７５０Ｕ／ｍＬ、または１００から５００Ｕ／ｍＬの量で提供されるヘパリンを含むことができる。一部の実施形態では、ヘパリンは、１００Ｕ／ｍＬの量で提供される。本発明は、ヘパリンの任意の特定の体積に限定されない。一部の実施形態では、高濃度のヘパリンまたは低濃度のヘパリンは、体積が少なくとも約０．１〜２５μＬ、少なくとも約０．５〜２０μＬ、または少なくとも約１〜１５μＬの量で、試料に提供される。ある特定の実施形態では、生体試料は、体積が少なくとも約１０μＬである。
（ドナー血小板からのセロトニン放出）
【００４８】
本方法は、ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、インキュベートするステップは、室温で行われる。インキュベートするステップは、少なくとも３０分間（例えば、少なくとも４０分、少なくとも４５分、少なくとも５０分、少なくとも５５分、または少なくとも６０分）行うことができる。インキュベートするステップは、追加として、セロトニンの放出が容易になるように機械的動作を適用することを含むことができる。そのような機械的動作は、撹拌、振動、および振盪などを含むことができる。一部の実施形態では、インキュベートするステップは、セロトニンの放出反応を終わりにするために、試料に試薬を添加することをさらに含むことができる。反応を終わらせる試薬は、本明細書では、「停止試薬」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、停止試薬は、カルシウム（Ｃａ２＋）などの２価のイオンを結合するキレート剤を含む。例えば、停止試薬はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことができる。
【００４９】
本発明の一部の実施形態では、インキュベートされた試料には、クロマトグラフ分離の前に１つまたは複数の加工ステップを行うことができる。例えば、一部の実施形態では、インキュベートされた試料を蒸発させることができる。次いで得られた残留物を、溶媒系に入れて元に戻すことができる。任意の適切な溶媒系を、残留物を元に戻すために使用することができる。一部の実施形態では、溶媒系は、クロマトグラフ分離に適合性のある溶媒系である。一部の実施形態では、元に戻すための溶媒系は、水、メタノール、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の一部の実施形態では、インキュベートされた試料を、クロマトグラフ分離ステップの前に、部分的に精製することができる。例えば、インキュベートされた試料を遠心分離し、上澄みを収集して、試料を部分的に精製することができる。一部の実施形態では、本明細書でさらに記載される内部標準を、クロマトグラフ分離ステップの前に添加することができる。
（セロトニンのクロマトグラフ的分離）
【００５１】
本方法は、液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離することを含んでいてもよい。本発明は、液体クロマトグラフィーを行う任意の特定の手法に限定されない。一般に、クロマトグラフ分離ステップは、少なくとも１つの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムを使用することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、２つもしくはそれ超、または３つもしくはそれ超、または４つもしくはそれ超のＬＣカラムなど、多数のＬＣカラムを使用する。一部のそのような実施形態では、２、３、４、５、６、８、または１０個のＬＣカラムが使用される。一部のそのような実施形態では、これらのＬＣカラムの２つまたはそれ超が互いに平行に配置構成され、同じ質量分析計にインライン接続される。
【００５２】
本発明は、カラムの任意の特定のタイプに限定されない。セロトニンの分離に適切な任意のカラムを使用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の分析カラムが使用される。一部のそのような実施形態では、１つまたは複数の逆相カラムが使用される。一部の実施形態では、本方法は、同じ質量分析計に接続された、平行な２つまたはそれ超の逆相カラムを用いる。
【００５３】
さらに、本発明は、任意の特定の移動相に限定されない。任意の適切な移動相を、移動相が特定のＬＣカラムと共に使用するのに適切である限り、およびＬＣカラム内でセロトニンをクロマトグラフィーで分離するのに適切である限り、使用することができる。一部の実施形態では、移動相は、極性溶媒系である。極性溶媒系は、水、メタノール、アセトニトリル、または前述の２種もしくはそれ超の混合物を含むがこれらに限定されない、１種または複数の極性溶媒を含むことができる。一部のそのような実施形態では、移動相は、２種またはそれ超の溶媒の相対比が経時的に変化するように、勾配を用いる。
【００５４】
上述のように、２つまたはそれ超のＬＣカラム（例えば、逆相カラム）を、平行にかつ同じ質量分析計にインライン接続して、例えばスループットを改善するために使用することができる。一部のそのような実施形態では、セロトニン含有試料（即ち、インキュベートされた試料）を、２つまたはそれ超のＬＣカラムに異なる時間で導入する。一部の実施形態では、２つまたはそれ超のＬＣカラムへの試験試料の導入は互い違いになされ、これは２つまたはそれ超のＬＣカラムへの試料の導入を切り離す、事前に決定された時間間隔があることを意味する。適切な時間間隔は、溶出時間、カラム化学、およびその他のＬＣカラムの１つまたは複数から溶出されたセロトニンの分析の妨害を回避する潜在的な必要性を含む、様々な要因に基づいて選択することができる。
【００５５】
本発明の一部の実施形態では、１つまたは複数のＬＣカラムを、別のカラムと直列に配置することができる。例えば、一部の実施形態では、適切なガードカラムを用いることができる。ガードカラムは、試料中の化学不純物から分析カラムを保護するのに使用される、典型的には分析カラムから上流に取り付けられるカラムである。当業者なら、本発明の方法で使用するのに適切なガードカラムを選択することが可能である。一部の実施形態では、ガードカラムを別のＬＣカラムと平行に配置し、ガードカラムとＬＣカラムとは共に逆相カラムである。そのような直列の２つまたはそれ超のカラムを平行に配置構成して、各直列のカラムが２つまたはそれ超のカラムを含有する、平行に動作する２つまたはそれ超の直列のカラムが存在するようにすることもできる。
（セロトニンの分析）
【００５６】
本方法は、質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析することにより、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、放出されたセロトニンの存在または量を決定することを含む。一部の実施形態では、ＬＣカラムの２つまたはそれ超が、同じ質量分析計に流れ込む。一部のさらなる実施形態では、ＬＣカラムの３つまたはそれ超が同じ質量分析計に流れ込む。一部の実施形態では、質量分析計が、合わせたＬＣ−ＭＳシステムの部分である。
【００５７】
本発明は、質量分析計の任意の特定のタイプに限定されない。任意の適切な質量分析計を使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、タンデム質量分析計を用いる。一部のそのような実施形態では、セロトニンを分析することは、セロトニンまたは標識セロトニンをイオン化すること、イオン化したセロトニンまたは標識セロトニンを分析すること、セロトニンまたは標識セロトニンを２つまたはそれ超のプロダクトイオンに断片化すること、およびプロダクトイオンを分析することを含む。本発明は、任意の特定のイオン化方法を使用する質量分析計に限定されない。任意の適切なイオン化を使用することができる。適切なイオン化方法には、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、大気圧光イオン化、および電子捕獲イオン化が含まれるが、これらに限定されない。断片化を用いる実施形態では、任意の適切な断片化技法を使用することができる。適切な技法には、衝突誘起解離、電子捕獲解離、電子移動解離、赤外多光子解離、放射解離、電子脱離解離、および表面誘起解離が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
一部の実施形態では、タンデム質量分析計が、ＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ５０００三連四重極質量分析計である。一部の実施形態では、タンデム質量分析計は大気圧イオン化源を有し、分析するステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、電子捕獲イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃／液体二次イオン化（ＦＡＢ／ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、および粒子線イオン化からなる群から選択されるイオン化方法を含む。イオン化方法は、陽イオンモードであっても陰イオンモードであってもよい。分析するステップは、多数の反応のモニタリングまたは選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を含んでいてもよく、２つまたはそれ超の生体分子が同時にまたは順次分析される。一部の実施形態では、分析するステップは、四重極分析計を使用する。一部の実施形態では、質量分析計は、三連四重極質量分析計である。三連四重極質量分析計を含む実施形態では、分析するステップは、第１の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを検出すること；第２の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを断片化して、１つまたは複数のセロトニン断片イオンをもたらすこと；および第３の四重極中の１つまたは複数のセロトニン断片イオンを検出することを含むことができる。
【００５９】
一部の実施形態では、分析するステップは、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンをイオン化して、１６０．１±０．５の前駆体イオン、または１１５．１±０．５、１３２．１±０．５、１０５．１±０．５、もしくは８９．１±０．５のプロダクトイオンの少なくとも１つを含む、質量／電荷比を有する１つまたは複数のセロトニンイオンを生成することを含む。一部の実施形態では、分析するステップは、セロトニンに関して、上に列挙したように多数の遷移を同時に測定することを含む。遷移比の測定は、報告される結果の測定値に信頼性を与える。２つの遷移の比を、較正物質の平均比と比較する。
【００６０】
本方法は、一部の実施形態において、内部標準を使用することを含む。そのような実施形態では、内部標準は、クロマトグラフ分離ステップの前の任意の適切な点で導入することができる。任意の適切な内部標準を使用することができる。一部の実施形態では、内部標準は、安定な同位体で標識された形のセロトニンである。一部のそのような実施形態では、内部標準は、炭素１３、窒素１５、および／または重水素によって標識される。内部標準は、例えば、テトラ重水素化セロトニン（即ち、セロトニン−ｄ４）とすることができる。
【００６１】
一部の実施形態では、本方法は、試料中のセロトニンまたは標識セロトニンの存在または不在を決定するのに使用することができる。他の実施形態では、本方法は、試料中のセロトニンまたは標識セロトニンの量を決定するのに使用される。
【００６２】
一部の実施形態では、本方法は、検出の任意の下限および／または上限によって限定されない。一部の実施形態では、本方法は、１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ、または５ｎｇ／ｍＬから７５０ｎｇ／ｍＬ、または１０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬに及ぶ濃度で、試料（例えば、インキュベートされた試料）中のセロトニンまたは標識セロトニンを測定するのに使用することができる。
【００６３】
上で論じたように、ある特定の場合には、アッセイの限られた態様は、血小板中に存在するセロトニンの内在量であることが見出されている。したがって別の態様では、本発明は、血小板にセロトニンが「スパイク」された試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法を提供する。特に、セロトニンまたは標識セロトニンは、提供するステップの前に、ドナー血小板と共にインキュベートすることができる。スパイクしている血小板は、得られるアッセイが高い分析感度を有し、得られるアッセイが既存の商業的に利用可能なセロトニン放出アッセイでの潜在的な誤差を決定することができ、かつアッセイが偽陽性および偽陰性を有効に区別することができるので、有益である。スパイクしている血小板の利益には、アッセイの高い分析感度が含まれる。
【００６４】
一実施形態では、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法は、（ａ）生体試料、ヘパリン、およびセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；（ｂ）血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；ならびに（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む。別の実施形態では、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法は、（ａ）生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；（ｂ）血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定時間の間インキュベートするステップ；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な安定な同位体で標識されたセロトニンの総量に対する、試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む。
【００６５】
全てのステップの特徴および実施形態は、直前に記述されている。上述のように、安定な同位体で標識されたセロトニンは、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、重水素化セロトニン、またはこれらの組合せとすることができる。
【００６６】
図１に、例示的な目的で、３つの方法（即ち、正常と表示された、スパイクされていないもの；Ｓ−スパイクと表示された、セロトニンがスパイクされたもの；Ｄ４−Ｓスパイクと表示された、標識セロトニンがスパイクされたもの）を使用したセロトニンの放出パーセントの比較が示される。図１は、未処理のセロトニンの血小板、スパイクセロトニンの血小板、およびＤ４スパイクセロトニンの血小板を使用してアッセイした１２の試料と、後続の、三重にアッセイされた放出測定（精度バー参照）を表す。試料１および９は、ＨＩＴ陰性であり、したがって全ての方法で一致し、試料１１は、境界低陽性／未確定であり、その他全ての試料はＨＩＴ陽性であった。図１は、ＨＩＴの測定における、非スパイク、セロトニンスパイク、および標識セロトニンスパイクによる手法間での、臨床上の一致点を示す。
（報告を作成する方法）
【００６７】
別の態様では、本発明は、異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するのに有用な報告を作成する方法であって、（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ；および（ｅ）試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステッップを含む方法を提供する。
【００６８】
ステップ（ｅ）以外の全てのステップの特徴および実施形態は、直前に記述されている。上述のように、本方法は、同じ質量分析計に平行にインライン接続された１つ超のカラム、例えば２つまたはそれ超のカラムを用いることができる。
【００６９】
本方法は、試料中のセロトニン（例えば、放出されたセロトニン）の量を述べた報告を作成するステップをさらに含む。放出されたセロトニンの量は、放出パーセントとして伝えることができる。一部の実施形態では、この情報は、ドナー試料中の利用可能な総セロトニンと比較して、生体試料中の放出されたセロトニンの濃度を決定するのに使用することができる。そのような情報から、対照がＨＩＴを有するか否かを評価することができる。
【００７０】
本方法は、対象のヘパリン起因性血小板減少症を診断するために、低濃度のヘパリンおよび高濃度のヘパリンでのセロトニンの放出パーセントを相関させることを含むことができる。試料は、以下にさらに記載するように、「陰性」、「低陽性」、「陽性」、または「未確定」と表示することができる。アッセイは、患者の血清の存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。セロトニン放出は、放出されたセロトニンの量を測定し、放出されたセロトニンとドナー血小板中の利用可能な総セロトニンとを比較することによって決定される。ドナー血小板中の利用可能な総セロトニンは、内因性セロトニンを含むことができ、本明細書に記載されるように血小板にスパイクされるセロトニンを含むこともできる。
【００７１】
陽性結果は、低用量（０．２ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下で＞２０％の放出と、高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下で放出の阻害（低用量のヘパリンで測定された放出の５０％もしくはそれ超の低減または２０％未満）とを必要とする。
【００７２】
試料は、低用量ヘパリンの存在下での放出パーセントが０〜２０％であり、高用量ヘパリンの存在下での放出パーセントが２０％未満である場合、「陰性」と表示される。これらの結果は、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断とは反対の結果を示すが、診断を完全に排除するものではない。
【００７３】
試料は、低用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが２１〜３０％であり、かつ高用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが２０％未満である場合、「低陽性」と表示される。これらの結果は陽性であるが、カットオフの直上にあり、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。
【００７４】
試料は、低用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが３１％超またはそれに等しく、かつ高用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが５０％未満であり、または低用量ヘパリンの放出パーセントがドナー血小板内の利用可能な総セロトニンの２０％未満である場合、「陽性」と表示される。結果は、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断を裏付ける。
【００７５】
試料は、高用量ヘパリンの結果が低用量ヘパリンの５０％未満でない限り、低用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが２０％超またはそれに等しく、かつ高用量ヘパリンの存在下で放出パーセントが２０％超またはそれに等しい場合に「未確定」と表示される。低用量ヘパリンの存在下で＞２０％のセロトニン放出があったが、この反応は、高用量ヘパリンによって適切に阻害されなかった。これらの結果はヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断と一致しないが、診断を完全に排除するものではない。結果は、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。
【００７６】
図２は、対象のヘパリン起因性血小板減少症を診断するための、低濃度のヘパリンおよび高濃度のヘパリンでの、セロトニンの放出パーセントに関する測定値の関係のグラフ表示を提示する。
（試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステム）
【００７７】
別の態様では、本発明は、試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステムを提供する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、（ａ）生体試料、セロトニンとインキュベートされた血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステムを提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、（ａ）生体試料、安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；（ｂ）ドナー血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析して、試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステムを提供する。
【００８０】
そのようなシステムは、試料中のセロトニンの存在または量を決定する方法に関する上述の内容に類似した、様々な実施形態およびサブ実施形態を含むことができる。
【００８１】
これらのシステムは、様々なステーションを含む。本明細書で使用される「ステーション」という用語は、広く定義され、列挙される方法を実施するために適切な、任意の適切な装置または装置の集合体を含む。ステーションは、任意の特定の方法で互いに一体的に接続されまたは据えられる必要はない。本発明は、互いに対してステーションの任意の適切な配置構成を含む。例えばステーションは、同じ室内にある必要もない。一部の実施形態では、ステーションは、一体型ユニット内で互いに接続される。
【００８２】
システムは、本明細書に記載の方法を使用して、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーションを含むことができる。システムは、本明細書に記載の方法を使用して、ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーションを含むことができる。システムは、本明細書に記載の方法を使用して、液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーションを含むことができる。システムは、本明細書に記載の方法を使用して、質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むことができる。システムは、本明細書に記載の方法を使用して、異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するのに有用な報告を作成するためのステーションを含むことができる。
【００８３】
（非限定的な実施形態）
非限定的な実施形態は、下記を含む：
１．試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；
ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
【００８４】
２．生体試料が、血清試料または血漿試料である、パラグラフ１の実施形態。
【００８５】
３．生体試料が、ヘパリンで処置した対象から得られる、パラグラフ１および／または２の実施形態。
【００８６】
４．生体試料が、ヘパリン起因性血小板減少症であることが疑われる対象から得られる、パラグラフ１〜３のいずれかの実施形態。
【００８７】
５．ドナー血小板が、少なくとも１名の健康と推定される対象から得られる、パラグラフ１〜４のいずれかの実施形態。
【００８８】
６．試料中のドナー血小板が、洗浄され、部分的に精製される、パラグラフ１〜５のいずれかの実施形態。
【００８９】
７．インキュベートするステップが、室温で行われる、パラグラフ１〜６のいずれかの実施形態。
【００９０】
８．インキュベートするステップが、少なくとも３０分間行われる、パラグラフ１〜７のいずれかの実施形態。
【００９１】
９．提供するステップにおけるヘパリンが、０．００１から１Ｕ／ｍＬの量で存在する、パラグラフ１〜８のいずれかの実施形態。
【００９２】
１０．提供するステップにおけるヘパリンが、５０から１０００Ｕ／ｍＬの量で存在する、パラグラフ１〜８のいずれかの実施形態。
【００９３】
１１．クロマトグラフィーで分離するステップの前に、インキュベートされた試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、パラグラフ１〜１０のいずれかの実施形態。
【００９４】
１２．内部標準が、安定同位体標識された形のセロトニンである、１１の実施形態。
【００９５】
１３．安定な同位体で標識された形のセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せを含む、パラグラフ１２の実施形態。
【００９６】
１４．内部標準がセロトニン−ｄ４である、パラグラフ１３の実施形態。
【００９７】
１５．提供するステップにおけるドナー血小板が、提供するステップの前にセロトニンとインキュベートされた、パラグラフ１〜１４のいずれかの実施形態。
【００９８】
１６．提供するステップにおけるドナー血小板が、提供するステップの前に、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せと共にインキュベートされた、パラグラフ１〜１４のいずれかの実施形態。
【００９９】
１７．クロマトグラフィーで分離するステップの前に、インキュベートされた試料を部分的に精製するステップをさらに含む、パラグラフ１〜１６のいずれかの実施形態。
【０１００】
１８．部分的に精製するステップが、インキュベートされた試料を遠心分離することを含む、パラグラフ１７の実施形態。
【０１０１】
１９．液体クロマトグラフィーを使用するステップが、分析液体クロマトグラフィーを使用することを含む、パラグラフ１〜１８のいずれかの実施形態。
【０１０２】
２０．分析液体クロマトグラフィーを使用することが、逆相カラムを使用することを含む、パラグラフ１９の実施形態。
【０１０３】
２１．液体クロマトグラフィーを使用することが、少なくとも１つのカラムを使用することを含む、パラグラフ１〜２０のいずれかの実施形態。
【０１０４】
２２．液体クロマトグラフィーを使用することが、平行な２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することを含み、２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムが単一の質量分析計にインライン接続されている、パラグラフ１〜２１のいずれかの実施形態。
【０１０５】
２３．平行な２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することが、インキュベートされた試料を、２つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムに時間をずらして導入することを含む、パラグラフ２２の実施形態。
【０１０６】
２４．分析するステップが、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、および大気圧光イオン化からなる群から選択されるイオン化技法を使用して、セロトニンをイオン化することを含む、パラグラフ１〜２３のいずれかの実施形態。
【０１０７】
２５．分析するステップが、四重極質量分析計を使用してセロトニンを検出することを含む、パラグラフ１〜２４のいずれかの実施形態。
【０１０８】
２６．四重極質量分析計が、三連四重極質量分析計である、パラグラフ２５の実施形態。
【０１０９】
２７．分析するステップが、第１の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを検出すること；第２の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを断片化して、１つまたは複数のセロトニン断片イオンをもたらすこと；および第３の四重極中の１つまたは複数のセロトニン断片イオンを検出することを含む、パラグラフ２６の実施形態。
【０１１０】
２８．分析するステップが、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンをイオン化して、１６０．１±０．５の前駆体イオン、または１１５．１±０．５、１３２．１±０．５、１０５．１±０．５、もしくは８９．１±０．５のプロダクトイオンの少なくとも１つを含む質量／電荷比を有する１つまたは複数のセロトニンイオンを生成することを含む、パラグラフ１〜２７のいずれかの実施形態。
【０１１１】
２９．試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；
血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
【０１１２】
３０．試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ；
血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体標識セロトニンの総量に対する、試料中の放出された、安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
【０１１３】
３１．提供するステップの前の安定な同位体で標識されたセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素１３標識セロトニン、窒素１５標識セロトニン、酸素１８標識セロトニン、またはこれらの組合せである、パラグラフ３０の実施形態。
【０１１４】
３２．異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するのに有用な報告を作成する方法であって、
（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ；
（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ；
（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ；
（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離したセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ；および
（ｅ）試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップを含む方法。
【０１１５】
３３．疾患または状態が、ヘパリン起因性血小板減少症である、パラグラフ３３の実施形態。
【０１１６】
３４．試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、
（ａ）生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション；
（ｂ）ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション；
（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション；および
（ｄ）質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステム。
【実施例】
【０１１７】
下記の実施例は、現在開示されている主題の代表的な実施形態を実施するために、当業者に指針を提供するよう含めている。本開示および当業者の一般的レベルに照らし、当業者なら、下記の実施例は単なる例示であり、現在開示されている主題の範囲から逸脱することなく数多くの変更例、修正例、および代替例を用いることができることを、理解することができる。
（実施例１）
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断で使用されるセロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）
【０１１８】
セロトニンを、同位体希釈およびクロマトグラフ分離の後に、質量分析検出によって測定した。セロトニンに関する安定標識同位体を、内部標準として試料アリコートに添加した。沈殿溶液中の内部標準を試料アリコートに添加した後、試料を混合し、遠心分離し、酢酸エチルでさらに希釈し、次いでＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。陽イオンエレクトロスプレーイオン化モードで動作するＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ５５００三連四重極質量分析計を、検出用に使用した。分析物および内部標準の定量を、選択反応モニタリングモード（ＳＲＭ）で行った。各試料中のセロトニンの逆算量は、公知の量の精製済みセロトニンを、１〜１０００ｎｇ／ｍＬのブランクの活性炭処理血清にスパイクすることによって作成した較正曲線から決定した。セロトニン放出パーセントを、血小板中の総セロトニンと、患者血清およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出とを使用して計算した。
（検体）
【０１１９】
推奨される試料は、０．５ｍＬ〜１．０ｍＬの血清または血漿であった。血漿を、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含有するチューブを使用して、成人または小児のヒトドナーから収集した。血清を、標準サンプリングチューブを使用して、成人または小児のヒト患者から収集した。
（設備および材料）
【０１２０】
下記の備品および機器を使用した：チップを備えたマニュアルピペットまたは有効自動化ピペット分取システム；クラスＡ容量ピペットおよびフラスコ；アソートガラス試薬ボトル；ボルテックスミキサー（ＶＷＲ；Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）；マイクロプレートローターまたは均等物を備えた５８０４−Ｒ遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）；穿孔容易なヒートシール箔（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；サーモマニュアルヒートシーラーＡＬＰＳ２５または均等物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；９６ウェルポリプロピレンディープウェルプレート（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）；ＡＰＩ  ５０００タンデム質量分析計およびＴｕｒｂｏ  Ｖ（商標）イオン源、エレクトロスプレー付き（Ｓｃｉｅｘ；Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）；８  １２００ＳＬシリーズ二元ポンプおよび４  １２００シリーズ真空脱気装置からなるＡｒｉａ  Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ  ＴＸ４システム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；ＨＴＳツインＰＡＬシステムオートサンプラー（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＡＧ、スイス）；アナリストバージョン１．４またはそれ超（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；Ａｒｉａ  ＯＳバージョン１．６またはそれ超（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＩＬＩＣカラム、３ｃｍ×３．０ｍｍ、２．７μｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ヒートプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ガラスＰａｓｔｅｕｒピペット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；タイタープレートシェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｂｉｇ  Ｓｈｏｔ  ＩＩハイブリダイゼーション炉（Ｂｏｅｋｅｌ；Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＰＡ）；ｐＨ計（Ｍｅｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）；ならびに超音波処理機（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
（試薬）
【０１２１】
下記の試薬を使用した：Ｄ４−セロトニン（ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ；Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）；セロトニン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；水酸化ナトリウム１０Ｎ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；ＣＳＳ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ｇｏｌｄ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）；アルファー−Ｄ−グルコース（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；リン酸ナトリウム（モノ）（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；塩化カリウム（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；アピラーゼ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；クエン酸デキストロース溶液（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ヘパリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｏｐｔｉｍａ  Ｗａｔｅｒ  ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；ギ酸、＞９５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；メタノール、ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；酢酸エチル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１２２】
下記の溶液は、液体クロマトグラフィー用の移動相、洗浄緩衝液、および本方法で使用される試薬として調製した：
【０１２３】
針洗浄溶液１（０．１％ギ酸水溶液）：ギ酸（１ｍＬ）を、１Ｌの試薬ボトルに入っているＩ型ミリポア水９９９ｍＬに添加した。ボトルの内容物を十分混合し、室温で保存した。
【０１２４】
針洗浄溶液２（メタノール）：メタノール（１０００ｍＬ）をガラスボトルに移し、室温で保存した。
【０１２５】
ポンプＡ移動相（５０：５０  アセトニトリル：酢酸エチル）：アセトニトリル（１０００ｍＬ）および１０００ｍＬの酢酸エチルを、２Ｌのボトルに添加し、混合した。混合物を室温で保存した。
【０１２６】
ポンプＢ移動相（３％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム）：約１．２６グラムのギ酸アンモニウムを分析用天秤で秤量し、クラスＡの２Ｌ容量フラスコに移した。フラスコの半分まで、ミリポア水を満たした。ギ酸（６０ｍＬ）を添加し、その後、適切な量のミリポア水を添加して、２Ｌの溶液にした。溶液を十分混合し、室温で保存した。
【０１２７】
洗浄緩衝液調製用の溶液１：１．０リットルの容量フラスコに、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．４ｇのＮａＨ２ＰＯ４を添加した。溶液を、Ｏｐｔｉｍａ水で所望の体積にした。
【０１２８】
ＳＲＡ洗浄緩衝液１：洗浄緩衝液１を４００ｍＬ調製するために、洗浄緩衝液１の２つの個別の２００ｍＬフラスコを準備した。１つの２００ｍＬフラスコに関し、５００単位のＡｐｙｒａｓｅボトルの全内容物、約０．２ｇのグルコース、および約０．２４ｇのＨＥＰＥＳを合わせた。適切な量の溶液１を添加して２００ｍＬにした。２００ｍＬのフラスコの両方を合わせ、合わせた溶液を、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．３±０．０５にした。溶液を冷蔵保存した。
【０１２９】
ＳＲＡ洗浄緩衝液２：５００ｍＬのフラスコに、約０．１ｇのＣａＣｌおよび０．１ｇのＭｇＣｌを添加し、その後、適切な量の溶液１を添加して５００ｍＬにした。溶液のｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用して７．４±０．０５に調節した。溶液を冷蔵保存した。
【０１３０】
高濃度ヘパリン溶液−１０５０ＩＵ／ｍＬ：高濃度ヘパリン溶液に関する成分の量を、以下に示す式に従い、使用される特定のヘパリンに関する分析証明書（Ｃ  ｏｆ  Ａ）のデータに基づいて計算した：
（秤量した量）×（Ｕ／ｍｇの数（Ｃ  ｏｆ  Ａ））＝単位の合計数
（単位の合計数）／１０５０ＩＵ／ｍＬ＝ＸｍＬのＯｐｔｉｍａ水
【０１３１】
例えば、秤量された材料の量が１１１．４８ｍｇであり、使用したヘパリンに関するＣ  ｏｆ  Ａが１９３Ｕ／ｍｇであった場合、単位の合計数は２１５１５．６Ｕであり、約２０．５ｍＬのＯｐｔｉｍａ水を使用した。溶液を冷蔵保存した。
【０１３２】
低濃度ヘパリン溶液−２．１ＩＵ／ｍＬ：低濃度ヘパリン溶液を、高濃度（１０５０ＩＵ／ｍＬ）溶液から調製した。低濃度ヘパリン溶液を調製するために、高濃度ヘパリン（１０５０ＩＵ／ｍＬ）０．０５ｍＬを測定し、溶液を、Ｏｐｔｉｍａ水を使用して２５ｍＬの最終体積にした。溶液を冷蔵保存した。
【０１３３】
使用内部標準溶液：ｄ４−セロトニンを秤量して、５０：５０のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏで１ｍｇ／ｍＬの上部ストックを生成した。上部ストック（０．２５ｍＬ）を、１００％アセトニトリル１リットルに添加した。溶液を冷蔵保存した。
【０１３４】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：ＰＢＳ溶液を調製するため、１パックのＰＢＳを、ミリポア水１リットル当たりに使用した。ＰＢＳに０．５％ＥＤＴＡを加えたもの１リットルを調製するために、ＥＤＴＡ  ５ｇをＰＢＳ溶液に添加し、溶液を１５分間超音波処理した。
【０１３５】
ＳＲＡ停止試薬：セロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）用の停止試薬は、０．５％のＥＤＴＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えたものであった。試薬を調製するために、５ｇのＥＤＴＡをフラスコに添加し、ＰＢＳ溶液を添加して、最終体積１リットルにした。溶液を室温で保存した。
（較正）
【０１３６】
較正物質を、メタノールにセロトニン（１ｍｇ／ｍＬ）を溶かしたストック溶液から調製した。下記の濃度（単位ｎｇ／ｍＬ）：活性炭処理血清中、１、２、１０、２５、１００、２５０、および５００を有する標準物質を調製した。標準物質を、−７０℃で保存した場合、栓をしたチューブ内で最長１年保存した。
（品質対照（ＱＣ））
【０１３７】
分析ＱＣ：活性炭処理血清およびプール血清を、品質対照調製の前にスクリーニングした。全てのＱＣの、サブアリコートを計量し、−７０℃で保存した。ＱＣ１（約３ｎｇ／ｍＬ）を調製するために、上部ストック３  ６０μＬをフラスコにピペット分取し、溶液を、活性炭処理血清（ＣＳＳ）を使用して１００ｍＬの最終体積にした。ＱＣ２（約２００〜４００ｎｇ／ｍＬ）を調製するために、上部ストック４  １００μＬをフラスコにピペット分取し、溶液を、活性炭処理血清（ＣＳＳ）を使用して１００ｍＬの最終体積にした。
【０１３８】
生体ＱＣ：生体ＱＣを調製するために、予め実行したＨＩＴ  ＥＬＩＳＡ試料を検討した。１．５ＯＤよりも大きいまたはそれに等しい結果を持つ、ＨＩＴ  ＥＬＩＳＡによって予め分析した試料を選択し、ＱＣ試料Ｐｒｅｐマイクロタイタープレートで実行した。陰性（≦２０％）結果を持つ試料を一緒にプールして、生体ＱＣ１陰性を創出した。高（Ｈｉｇｈ）（≧７５％）の結果を持つ試料を一緒にプールして、生体ＱＣ２高（ＨＩｇｈ）を創出した。全てのＱＣの、サブアリコートを計量し、−７０℃で保存した。
（ドナー手順）
（ドナースクリーニングのための血小板洗浄プロトコール）
【０１３９】
血小板を、ドナースクリーニングのための下記のプロトコールに従い洗浄した：血液をドナーからＡＣＤチューブに引き出し、チューブを反転させて内容物を混合した（８〜１０ｍｌの血小板  プレート当たり約４チューブ）。チューブを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血小板リッチの血漿（ＰＲＰ）を、小型ピペットバルブを備えたガラスパスツールピペットを使用して取り出した。追加のＡＣＤ（１１１μＬ）を、血漿ｍＬごとに添加した。チューブを反転させて内容物を混合した。１６×１００ポリプロピレンチューブを使用して、プレートＱＣ用のＰＲＰチューブを合わせた。ＰＲＰを２４００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ラインをチューブの外に引き出して、血漿の液体レベルを示した。血小板に乏しい血漿を注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液１を添加することにより、ＳＲＡ洗浄緩衝液１に再懸濁した（室温で）。血小板ペレットを再懸濁するために、内容物を、使い捨てピペットを使用して穏やかに吸引し吐出させた。再懸濁した血小板を、３７℃で１５分間インキュベートし、チューブを２４００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上澄みを注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブ上に予め引き出されたラインに洗浄緩衝液を添加することによって、ＳＲＡ洗浄緩衝液２に再懸濁した。チューブを反転させ、使い捨てのピペットを使用して穏やかに吸引し、吐出させて、血小板ペレットを再懸濁した。チューブを４５分間、３７℃でインキュベートした。血小板懸濁液を検査して、凝塊または凝集物の形成がないことを確認した。
（マイクロタイタープレート用のドナー血小板試料の調製）
【０１４０】
予めスクリーニングした試料（２陰性および３陽性）（２５０μＬ）を、清浄なチューブ内に置き、チューブに栓をした。同じステップを、生体ＱＣ（陰性および高（Ｈｉｇｈ））に関して行った。試料体積２５０μＬが、プレート当たりのものであった（例えば、２つのプレートは、患者試料５００μＬを必要とした）。チューブを５６℃で３０分間インキュベートし、３６００ｒｐｍで１０分間回転させた。
【０１４１】
各患者ごとに、下記の成分を１列中３つのウェルに添加することによって、ひと組の測定値を作成した。ひと組のうちの第１および第２のウェルのそれぞれに、低濃度（２．１ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。ひと組のうちの第３のウェルに、高濃度（１０５０ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。次いで試料２０μＬを各ウェルにピペット分取し、チューブの底から引き出されないように注意を払った。試験される各ドナーおよびプレートのＱＣの、陰性（即ち、試料なし）ウェルでは、洗浄緩衝液２を使用した。
【０１４２】
血小板溶液をピペット分取する前に、血小板溶液の品質を、チューブを反転させて溶液を穏やかに混合することにより確かめた。各ドナーごとに準備した血小板（７５μＬ）を全てのウェルにピペット分取した。各ドナーは、個人としておよびプールとして、５名の患者を試験した。ウェルを、箔を使用して封止し、プレートを、回転振盪機上に室温（ＲＴ）および設定５で６０分間置いた。ＳＲＡ停止試薬（１００μＬ）を添加し、ウェルを、箔を使用して封止した。プレートを、回転振盪機上にＲＴおよび設定５で１５秒間置いた。次いで内容物を３７００ｒｐｍで５分間回転させた。次いで以下に記載する分析手順を行った。
（患者手順）
（患者試料に関する血小板洗浄プロトコール）
【０１４３】
血小板を、ドナースクリーニングのための下記のプロトコールに従って洗浄した：血液を、ドナーからＡＣＤチューブに引き出し、チューブを反転させて内容物を混合した（８〜１０ｍｌの血小板  プレート当たり約４チューブ）。チューブを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血小板リッチの血漿（ＰＲＰ）を、小型ピペットバルブを備えたガラスパスツールピペットを使用して取り出した。追加のＡＣＤ（１１１μＬ）を、血漿ｍＬごとに添加した。チューブを反転させて、内容物を混合した。１６×１００ポリプロピレンチューブを使用して、ＰＲＰチューブを、ＡＣＤを添加した後に合わせた。ＰＲＰを２４００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ラインをチューブの外に引き出して、血漿の液体レベルを示した。血小板に乏しい血漿を注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液１をラインに添加することによって、ＳＲＡ洗浄緩衝液１に再懸濁した（室温で）。血小板ペレットを再懸濁するため、内容物を、反転および吸引することによって穏やかに混合した。再懸濁した血小板を、１５分間３７℃でインキュベートし、チューブを２４００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上澄みを注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液を添加することにより、ＳＲＡ洗浄緩衝液２に再懸濁した。チューブを反転させ、穏やかに吸引し、吐出して、血小板ペレットを再懸濁した。チューブを、４５分間、３７℃でインキュベートした。血小板懸濁液を検査して、凝塊または凝集物の形成がないことを確かめた。血小板溶液は、２時間にわたりそのままの状態で、室温で安定であった。
（マイクロタイタープレート用の患者試料の調製）
【０１４４】
患者血清（２００μＬ）を得、清浄なチューブに入れた。チューブに栓をした。同じステップを、ＱＣ試料に行った。チューブを５６℃で３０分間インキュベートし、１０分間、３６００ｒｐｍで回転させた。
【０１４５】
ＱＣ試料では、マイクロタイタープレート内でひと組の測定値（０．２、０．２、および１００）を作成した。各患者ごとに、下記の成分を、１列中４つのウェルに添加した。４つのひと組のうちの第１のウェルのそれぞれに、Ｏｐｔｉｍａ水１０μＬをピペット分取した。ひと組のうちの第２および第３のウェルのそれぞれに、低濃度（２．１ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。ひと組のうちの第４のウェルのそれぞれに、高濃度（１０５０ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。次いで、試料（単数または複数）２０μＬを、患者ウェルおよび生体ＱＣウェルを含む各ウェルにピペット分取し、チューブの底から引き出されないよう注意を払った。陰性（即ち、試料なし）ウェルでは、洗浄緩衝液２を、２０μＬの患者試料の代わりに使用した。
【０１４６】
血小板溶液をピペット分取する前に、血小板溶液の品質を、チューブを反転させて溶液を穏やかに混合することによって確かめた。洗浄緩衝液２（７５μＬ）を、患者試料の組の第１のウェルにピペット分取した。血小板溶液（７５μＬ）を、その他全てのウェルにピペット分取した。ウェルを、箔を使用して封止し、回転振盪機上に６０分間、室温（ＲＴ）および設定５で置いた。ＳＲＡ停止試薬（１００μＬ）を添加し、ウェルを、箔を使用して封止した。プレートを、回転振盪機上に、１５秒間、ＲＴおよび設定５で置いた。次いで内容物を３７００ｒｐｍで５分間回転させた。次いで以下に記載する分析手順を行った。
（分析手順）
【０１４７】
血小板溶液のチューブを、チューブを反転させることによって穏やかに混合した。ブランク、較正物質、品質対照、および血小板溶液（それぞれ１００μＬ）を、適切なウェルにピペット分取した。試料（１００μＬ）をマイクロタイタープレートから除去し、９６ディープウェルプレートに添加した。二重ブランクでは、ブランクマトリックス１００μＬおよびアセトニトリル３００μＬを添加した。次いで２００ｎｇ／ｍＬのセロトニン−ｄ４をアセトニトリルに加えたもの３００μＬを、添加した。内容物を２５００ｒｐｍで１０分間渦動させ、３７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで内容物（１５０μＬ）を、清浄なプレートに移した。酢酸エチル（１５０μＬ）を全てのウェルに添加した。プレートを箔で封止し、２５００ｒｐｍで１０秒間渦動させ、３７００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。得られた試料（２０μＬ）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のためＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
（マイクロタイタープレート用の生体ＱＣ試料の調製）
【０１４８】
患者試料（２００μＬ）を得、清浄なチューブ内に入れ、チューブに栓をした。同じステップを、生体ＱＣ（陰性および高）に関して行った。チューブを５６℃で３０分間インキュベートし、３６００ｒｐｍで１０分間回転させた。ひと組の測定値を、３つのウェルを使用することによって同じ患者に関して作成した。ひと組のうちの第１および第２のウェルのそれぞれに、低濃度（２．１ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。ひと組のうちの第３のウェルのそれぞれに、高濃度（１０５０ＩＵ／ｍＬ）ヘパリン１０μＬをピペット分取した。次いで試料２０μＬを、各ウェルにピペット分取した。
【０１４９】
血小板溶液のチューブを、チューブを反転させることによって穏やかに混合した。準備した血小板（７５μＬ）を、全てのウェルにピペット分取した。ウェルを箔で封止し、回転振盪機上に６０分間、室温および設定５で置いた。ＳＲＡ停止試薬（１００μＬ）を添加し、プレートを箔で封止した。プレートを、回転振盪機上に、１５秒間、ＲＴおよび設定５で置き、３７００ｒｐｍで５分間回転させた。
（結果の報告）
【０１５０】
このアッセイの単位は、放出パーセント（放出％）である。放出パーセントは、血小板中の総セロトニンと、患者血清およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出とを使用して計算する。特に、放出パーセントは、患者試料およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出を、アッセイで使用されたドナー血小板中のセロトニンまたは標識セロトニンの総量で割った比である。
【０１５１】
結果は、０．２ＩＵ／ｍＬおよび１００ＩＵ／ｍＬの放出パーセントとして報告する。
【０１５２】
このアッセイに関する定量下限（ＬＬＯＱ）は１ｎｇ／ｍＬである。定量上限（ＵＬＯＱ）は１０００ｎｇ／ｍＬである。十分な検体が、報告するのに利用できない場合、「ＱＮＳＲ」が示される。この略称は、結果を検証するのに不十分な検体であるという理由を知らしめる。
（結果の解釈）
【０１５３】
結果を、低用量ヘパリンアッセイ（即ち、低ヘパリン放出パーセントまたは低放出）および高用量ヘパリンアッセイ（即ち、高ヘパリン放出パーセントまたは高放出）に関するセロトニン放出パーセント値に基づいて解釈した。低および高ヘパリン放出パーセントに基づく解釈は、表１における表形式で、および図２のグラフで表示される。
【表１】
2018511043.tif 000003
【０１５４】
表１に示されるように、かつ図２に図示されるように、低用量ヘパリンアッセイに関するセロトニン放出パーセント値は、２０パーセントまたはそれ未満であり、その解釈は、高用量ヘパリンアッセイの結果とは無関係に、陰性であった。低用量ヘパリンアッセイに関するセロトニン放出パーセント値が２０パーセント超であった全ての場合、低用量ヘパリンアッセイと高用量ヘパリンアッセイとに関するセロトニン放出パーセント値の関係を使用して、その解釈を決定した。低用量ヘパリンアッセイに関する全ての可能性あるセロトニン放出パーセント値では、対応する陽性対未確定閾値も、表にした。高放出アッセイの結果が表にした数値未満またはそれに等しい場合、その解釈は、「低陽性」（低放出２１〜３０％）または「陽性」（低放出＞３０％）のいずれかであった。高放出アッセイの結果が、測定された低放出アッセイに関して表にされた数値よりも大きい場合、その解釈は「未確定」であった。
（陰性結果）
【０１５５】
上述のように、低ヘパリン放出パーセントが０〜２０％である場合、ＳＲＡ結果は「陰性」であった。これらの結果はヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断と相反するが、診断を完全に排除するものではない。結果は、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、先のヘパリン曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量（０．２ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下での＞２０％放出と、高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下でのセロトニン放出の阻害を必要とする。
（低陽性結果）
【０１５６】
低ヘパリン放出パーセントが２１〜３０％であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが０〜２０％である場合、ＳＲＡ結果は「低陽性」であった。これらの結果は陽性であり、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断を裏付けると考えられるが、それらはカットオフの直上にあり、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。低陽性結果は、低用量（０．２ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下での２１〜３０放出パーセントと、高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下でのセロトニン放出の阻害とからなる。
（陽性結果）
【０１５７】
低ヘパリン放出パーセントが３１〜４０％であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが０〜２０％であった場合、ＳＲＡ結果は「陽性」である。追加として、低ヘパリン放出パーセントが４０％超（即ち、＞４０％）であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが、低ヘパリン放出パーセントに０．５を乗じた値未満またはそれに等しい場合（即ち、≦（低ヘパリン放出パーセント×０．５））、ＳＲＡ結果は「陽性」であった。患者の血清は、ＳＲＡによって陽性と判断され、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断を裏付ける。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量（０．２ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下で２０％超の放出と、高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下での放出の阻害とを必要とする。結果は、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。
（未確定の結果）
【０１５８】
低ヘパリン放出パーセントが２１〜４０％であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが２０％超（即ち、＞２０％）である場合、ＳＲＡ結果は「未確定」であった。追加として、低ヘパリン放出パーセントが４０％超（即ち、＞４０％）であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが、低ヘパリン放出パーセントに０．５を乗じた値よりも大きい場合（即ち、＞（低ヘパリン放出パーセント×０．５））、ＳＲＡ結果は「未確定」であった。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量（０．２ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下で２０％超の放出と、高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）ヘパリンの存在下での放出の阻害とを必要とする。低用量ヘパリンの存在下で２０％超のセロトニン放出があったが、この反応は、高用量ヘパリンによって適切に阻害されなかった。これらの結果はヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の診断と一致しないが、診断を完全に排除するわけではない。結果は、その他のＨＩＴアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。この反応の複合体は、循環する免疫複合体、高力価ＨＬＡクラス１抗体および／またはその他の血小板活性化因子に起因すると考えられる。
（実施例２）
陽性ＨＩＴ決定
【０１５９】
生体試料を、実施例１の手順に従い、ＨＩＴに関して試験した。試料は、生体試料を添加していない本明細書に記載の方法による分析を通して決定された血小板内で利用可能な総セロトニン（１００％）に対し、０．２Ｕ／ｍＬヘパリンでの２７％セロトニン放出と、１００Ｕ／ｍＬヘパリンでの放出の阻害を示した（図３参照）。図３の左上のパネルに示されるように、生体試料および緩衝液中の内因性セロトニンレベルは、１．２ｎｇ／ｍＬである。図３の中上パネルは、生体試料および０．２Ｕ／ｍＬヘパリンを示す。約６０．４ｎｇ／ｍＬのセロトニンを、試料中で測定した。図３の右上のパネルは、生体試料および１００Ｕ／ｍＬヘパリンを示す。約０．２ｎｇ／ｍＬのセロトニンを、試料中で測定した。試料および０．２Ｕ／ｍＬヘパリン中のセロトニン放出パーセントは２７％であった。生体試料は、ＨＩＴに関して陽性と決定された。
【０１６０】
６０．４ｎｇ／ｍＬのセロトニンが存在する場合の陽性放出クロマトグラムを、１ｎｇ／ｍＬのセロトニンが存在する場合のＬＬＯＱクロマトグラムと比較した。図４に示されるように、アッセイは、１ｎｇ／ｍＬ程度に低いレベルのセロトニンを検出することが可能である。
（実施例３）
遷移比の評価
【０１６１】
遷移比の評価は、試料中の、定性的遷移の面積応答を定量的遷移の面積応答で割り（即ち、遷移比）、その値を、同じバッチからの較正物質（較正物質１は除外）で測定された平均遷移比と比較することによって行った。遷移比の評価に関するデータは、定量化された結果の表からまとめた。検証中に確立された合否基準は、分析物に関して提供した（表２参照）。濃度特異的な合否基準を自動化された手法で利用することができない場合には、全ての試料に関して推奨される合否基準（即ち、濃度に依存しない）をバックアップとして提供した。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2018511043.tif 000010
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