(57)【要約】  本発明は、一部では、癌患者からの組織サンプルの視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットの、バイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法に関する。ＰＢＰの値は、免疫療法に対する患者の反応を示すことができる。
2018534564.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
視野に存在する、すべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはり前記サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第４のマスクの総面積を前記第１のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、前記第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、前記第６のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第８のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、前記目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
【請求項２０】
請求項２に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【請求項２２】
癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、前記少なくとも２つのサンプルそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）前記少なくとも第１のＰＢＰの値および前記少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、前記免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、前記減少は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、前記増大は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法において、
前記免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
【請求項２６】
癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、前記少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）前記少なくとも第１のＰＢＰの値および前記少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、前記免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、前記減少は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、前記増大は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法において、
前記免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
【請求項３０】
視野に存在するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）前記視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり前記目的のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第５のマスクの総面積を前記第３のマスクの総面積で割ることにより、前記目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法において、
前記視野は、非腫瘍細胞をさらに含む、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
【請求項３４】
請求項３０に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【請求項３５】
視野に存在するすべての非腫瘍細胞についてバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）前記視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり前記目的のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第５のマスクの総面積を前記第３のマスクの総面積で割ることにより、前記目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、骨髄系細胞を含む、方法。
【請求項４０】
視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはり前記サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第４のマスクの総面積を前記第１のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、
（ａ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｂ）前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーを発現する、
前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、前記第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、前記第６のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることによって、（ａ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または（ｂ）前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーを発現する、すべての細胞の前記第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第８のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記第６および第７のマスクを、
（ａ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカー、前記目的の第１のバイオマーカー、および前記目的の第２のバイオマーカーを発現するか、
（ｂ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｃ）前記視野内で前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、
すべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第８のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第１のバイオマーカーもしくは前記目的の第２のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせ、ならびに前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【請求項４５】
請求項４０に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項４６】
請求項４０に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項４８】
請求項４３に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、前記目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【請求項４９】
請求項４０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
【請求項５０】
請求項４０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
【請求項５３】
請求項５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
【請求項５５】
請求項５０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、骨髄系細胞を含む、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法において、
前記骨髄系細胞は、骨髄由来のサプレッサー細胞である、方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法において、
前記骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである、方法。
【請求項５８】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【請求項５９】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【請求項６０】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
【請求項６１】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
【請求項６２】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
【請求項６３】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、骨髄系細胞において発現される、方法。
【請求項６４】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、骨髄由来のサプレッサー細胞において発現される、方法。
【請求項６５】
請求項４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍関連マクロファージにおいて発現される、方法。
【請求項６６】
請求項４１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
【請求項６７】
請求項４０に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１５年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２４５，８５３号、および２０１６年２月２９日出願の米国仮特許出願第６２／３０１，０３５号の優先日の利益を主張し、これらの仮特許出願のいずれも、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔背景〕
本発明は、概して、癌治療の分野に関する。
【０００３】
〔概要〕
一態様では、視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、
（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、
視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることによって、（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、すべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、列挙されたすべてのオプション工程が実施される。いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）視野内でサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）視野内で目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第８のマスクの総面積で割ることにより、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）第６および第７のマスクを、
（ａ）視野内でサブセットバイオマーカー、目的の第１のバイオマーカー、および目的の第２のバイオマーカーを発現するか、
（ｂ）視野内で目的の第２のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｃ）視野内で目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、
すべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第８のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、目的の第１のバイオマーカーもしくは目的の第２のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせ、ならびにサブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、骨髄系細胞を含む。さらなる実施形態では、骨髄系細胞は、骨髄由来のサプレッサー細胞である。さらなる実施形態では、骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーはＣＤ１９を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、骨髄系細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、骨髄由来のサプレッサー細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、腫瘍関連マクロファージにおいて発現される。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む。いくつかの実施形態では、総面積は、ピクセルで測定される。
【０００８】
別の態様では、視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を、完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、列挙されたすべてのオプション工程が実行される。いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）視野内でサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）視野内で目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第８のマスクの総面積で割ることにより、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む。いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。
【００１２】
別の態様では、癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性（positive effectiveness）を示す。いくつかの実施形態では、この変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。
【００１４】
別の態様では、癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。
【００１６】
別の態様では、視野に存在するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、視野は、非腫瘍細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む。いくつかの実施形態では、総面積は、ピクセルで測定される。
【００１８】
別の態様では、視野に存在するすべての非腫瘍細胞についてバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、骨髄系細胞を含む。
【００２０】
〔詳細な説明〕
さまざまな実施形態を以下で説明する。特定の実施形態は、網羅的な説明、または、本明細書で論じられるさらに広い態様への制限のつもりではないことに注意されたい。特定の実施形態と共に論じられた１つの態様は、必ずしもその実施形態に制限されず、任意の他の実施形態で実行され得る。
【００２１】
本明細書で使用される、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。当業者に明確でない用語が使用されている場合、それが使用されている文脈を考えて、「約」は、特定の用語の±１０％までを意味する。
【００２２】
要素を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の指示物の使用は、本明細書で特に指示のない限り、または、文脈により明確に否定されない限り、単数および複数の両方をカバーすることが理解される。本明細書における値の範囲の詳述は、単に、本明細書で特に指示のない限り、その範囲に含まれる別個の値それぞれに個別に言及する簡略な方法として役立つことを意図したものであり、別個の値はそれぞれ、個別に本明細書に列挙されたかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書で特に指示のない限り、または、文脈により明確に否定されない限り、任意の適切な順序で実行され得る。本明細書に提供される、ありとあらゆる実施例、または例示的な言語（例えば、「〜など」）の使用は、単に実施形態をよりよく際立たせることが意図されており、特に明記しない限り特許請求の範囲に制限を課すものではない。明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない要素を本質的なものとして示していると理解すべきではない。
【００２３】
用語「治療する」または「治療」は、統計的に有意な程度まで、もしくは当業者にとって検出可能な程度まで、疾患に関連する健康状態、症状、もしくはパラメータを改善するか、または疾患の進行を防ぐのに有効な量、方法、またはモードで、療法を施すことを指す。有効な量、方法、またはモードは、被験者によって変化し得、患者に合わせることが可能である。
【００２４】
腫瘍は、それらの免疫構造（immune contexture）に基づいて、「高温（hot）」（炎症）または「低温（cold）」（非炎症）として分類され得る（図３２を参照）。高温腫瘍を有する患者は、特定の免疫療法に反応し、低温腫瘍を有する患者よりも長く生存する可能性があると予測され得るが、どのバイオマーカーが反応および生存と相関しているかに関しては、これまで当業者には不明確であった。
【００２５】
この問題に取り組むため、本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態は、免疫枯渇バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１）の発現を介して１つ以上の免疫療法に反応する癌患者と、免疫抑制を引き起こすことが知られている細胞型（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１）またはＭＨＣクラスＩの発現がない、大いに増殖する腫瘍細胞（例えば、Ｋｉ６７＋、Ｂ２Ｍ−）の存在により反応しない癌患者（すなわち、無反応者）の特定を助ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、特定の免疫抑制または活性化のサインに基づく複合免疫組織化学アッセイ（例えば、複合ＦＩＨＣアッセイ）を使用することを含む。特定の免疫抑制または活性化のサインに基づく複合ＦＩＨＣアッセイの非限定的な例を、以下の表に示す。
【表１】
2018534564.tif 000003
【００２６】
一態様では、癌患者から採取した組織サンプルの視野に存在する、すべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が本明細書で提供される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、特異的バイオマーカーに親和性を有する複数の蛍光タグを用いて染色され得る。染色されたサンプルのデジタル画像を得ることができ、この画像は、蛍光タグの場所に基づいてさらに分析され得る。全画像分析（whole-image analysis）ではなく、視野が、目的の第１のバイオマーカーを発現する細胞の数に基づいて、優先順位を付けられ得る。次に、所定の数の視野が、蛍光信号についてさらに分析され得る。いくつかの実施形態では、４つの異なるタイプの蛍光タグを使用すると、目的の第１のバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、および目的の第２のバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、ならびにすべての細胞により発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、およびサブセットバイオマーカー（例えば、腫瘍細胞により発現されるバイオマーカー）に対応する蛍光信号の画像が生成される。さらなる実施形態では、蛍光信号の画像は、画像内の細胞に対応する蛍光信号の１つ以上のマスクを生成するように操作される。いくつかの実施形態では、蛍光信号の１つ以上のマスクは、画像内のすべての細胞のマスク、画像内のサブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞（例えば、すべての腫瘍細胞）のマスク、画像内のサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞（例えば、すべての非腫瘍細胞）のマスク、画像内の目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞のマスク、ならびに画像内の目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞のマスク、からなる群から選択された１つ以上を含む。これらのマスクの面積は、所望通りにＰＢＰの値を引き出すために使用され得る。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値が導き出される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値が導き出される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値が導き出される。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しない、すべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値が導き出される。
【００２８】
したがって、いくつかの実施形態では、視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が、本明細書で提供され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を、完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、
（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、
視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることによって、（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、すべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、
を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、オプション工程は実施されない。いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第４のマスクの総面積および第１のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第６のマスクの総面積および第４のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１のマスクの総面積、第４のマスクの総面積、および第６のマスクの総面積は、それぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が、本明細書で提供され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を、完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、オプション工程は実施されない。いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第４のマスクの総面積および第１のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第６のマスクの総面積および第４のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１のマスクの総面積、第４のマスクの総面積、および第６のマスクの総面積は、それぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が、本明細書で提供され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を、完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第４のマスクの総面積および第１のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第６のマスクの総面積および第４のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１のマスクの総面積、第４のマスクの総面積、および第６のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第９のマスクの総面積および第４のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）視野内でサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）視野内で目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第８のマスクの総面積で割ることにより、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）第６および第７のマスクを、
（ａ）視野内でサブセットバイオマーカー、目的の第１のバイオマーカー、および目的の第２のバイオマーカーを発現するか、
（ｂ）視野内で目的の第２のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｃ）視野内で目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、
すべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第８のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、目的の第１のバイオマーカーもしくは目的の第２のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせ、ならびにサブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の目的の追加のバイオマーカー（例えば、目的の第３のバイオマーカー）に関して、工程（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉｉ）と類似した工程の追加サイクルをさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第９のマスクの総面積および第８のマスクの総面積はそれぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、腫瘍細胞および非腫瘍細胞にそれぞれ対応するか、または非腫瘍細胞および腫瘍細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、生存細胞および非生存細胞にそれぞれ対応するか、または非生存細胞および生存細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに含まれない生存細胞からなる。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、Ｔ細胞および非Ｔ細胞にそれぞれ対応するか、または非Ｔ細胞およびＴ細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、骨髄系細胞および非骨髄系細胞にそれぞれ対応するか、または、非骨髄系細胞および骨髄系細胞にそれぞれ対応する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、非腫瘍細胞および腫瘍細胞を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、視野内のすべての細胞の第１のサブセットはＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、およびＧＩＴＲＬからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーはＰＤ−Ｌ１を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーは、互いに異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーは、互いに異なり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ８０を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＴＬＡ−４を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ８０を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ２を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＴＬＡ−４を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ８６を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＬＡＧ−３を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＴＩＭ−３を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ガレクチン９を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、４１ＢＢを含み、目的の第２のバイオマーカーは、４．１ＢＢＬを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＯＸ４０を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＯＸ４０Ｌを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ４０を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ４０Ｌを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＩＣＯＳを含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＩＣＯＳＬを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＧＩＴＲを含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＧＩＴＲＬを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＴＣＲを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ２５を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＦｏｘＰ３を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ４を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ８を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ３を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ５６を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＩＤＯ−１を含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ３３を含み、目的の第２のバイオマーカーは、ＡＲＧ１を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーはＣＤ１９を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ４５を含む。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、骨髄系細胞において発現される。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、蛍光信号は、それぞれが異なるバイオマーカーに特異的である４つの蛍光タグに由来する。さらなる実施形態では、第１の蛍光タグが、目的の第１のバイオマーカーと関連付けられ、第２の蛍光タグが、目的の第２のバイオマーカーと関連付けられ、第３の蛍光タグが、目的の第３のバイオマーカーと関連付けられ、第４の蛍光タグが、目的の第４のバイオマーカーと関連付けられる。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第２のバイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第１のバイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含み、目的の第２のバイオマーカーは非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的の第３のバイオマーカーは、すべての細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、目的の第４のバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、目的の第３のバイオマーカーは、すべての細胞によって発現され、目的の第４のバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、目的の第４のバイオマーカーは、サブセットバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、目的の第３のバイオマーカーは、すべての細胞によって発現され、目的の第４のバイオマーカーは、サブセットバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合されたフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する親和性を備えたフルオロフォアである。
【００５０】
フルオロフォアの例としては、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｒｅｄ、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロドール（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−クロム、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）８００、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルａタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、マリーナブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＯＰＡＬ（商標）５２０、ＯＰＡＬ（商標）５４０、ＯＰＡＬ（商標）５７０、ＯＰＡＬ（商標）６２０、ＯＰＡＬ（商標）６５０、ＯＰＡＬ（商標）６９０、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに制限されない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）７、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびクマリンからなる群から選択される。４８８色素の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＯＰＡＬ（商標）５２０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、およびＣＦ（商標）４８８Ａを含むがこれらに制限されない。５５５色素の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５を含むがこれに制限されない。５９４色素の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４を含むがこれに制限されない。
【００５１】
本明細書で使用される、「視野」は、組織サンプルのホールスライドデジタル画像の一部を指す。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、２〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０〜２００所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は３０〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は１０〜１５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は１０〜１００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は１０〜５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は１０〜４０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００の所定の視野を、これらのうちの増分を含めて、有する。
【００５２】
本明細書に開示する方法では、癌患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。さらなる実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、犬、猫、または馬である。
【００５３】
本明細書に開示する方法では、腫瘍組織は癌患者から採取される。癌の種類としては、以下の部位の癌が含まれるが、これらに制限されない：循環系、例えば、心臓（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫）、中隔膜および肋膜、および他の胸腔内器官、血管腫瘍および腫瘍関連の血管組織；気道、例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸系、例えば、食道（扁平細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、腹（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路、例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道（扁平細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓、例えば、肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍（褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸ペプチド腫瘍、膵島腫瘍およびグルカゴノーマなど）；骨、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性外骨症）、良性脊索腫（benign chondroma）、軟骨芽細胞腫、軟骨筋繊維腫、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋癌（skull cancer）（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳癌（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫（glioblastoma multiform）、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖器系、例えば、婦人科、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前（pre-tumor）子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌腫（unclassified carcinoma）］、顆粒膜莢膜細胞腫（granulosa-thecal cell tumors）、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平細胞癌、ブドウ状横紋筋肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌）および女性生殖器に関連する他の部位；胎盤、陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器に関連する他の部位；血液系（hematologic system）、例えば、血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［��性リンパ腫］；口腔、例えば、唇、舌、歯茎、口腔底部、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃、中咽頭、上咽頭、梨状陥凹、下咽頭、および唇、口腔、咽頭の他の部位；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、カポジ肉腫、異形成性母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、および蟹足腫；副腎：神経芽細胞腫；結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、目、眼内黒色腫、および付属器、胸、頭または／および首、肛門領域、甲状腺、副甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連構造を含む他の組織、リンパ節の続発性および詳細不明の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の続発性悪性新生物、他の部位の続発性悪性新生物、またはこれらの１つ以上の組み合わせ。
【００５４】
免疫療法の例は、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブもしくはトラスツズマブ）、結合モノクローナル抗体（例えば、イブリツモマブチウキセタン、ブレンツキシマブベドチン（brentuximab vendotin）、もしくはトラスツズマブエムタンシン（ado-trastuzumab emtansine））、二重特異性モノクローナル抗体（ブリナツモマブ）、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、もしくはデュルバルマブ）、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、およびイミキモド、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに制限されない。いくつかの実施形態では、免疫療法は免疫チェックポイント療法を含む。
【００５５】
別の態様では、視野に存在するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が、本明細書で提供され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、総面積は、ピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第５のマスクの総面積および第３のマスクの総面積は、それぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーはガレクチン９を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーはＭＨＣを含む。いくつかの実施形態では、視野は、非腫瘍細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む。
【００５７】
別の態様では、視野に存在するすべての非腫瘍細胞についてバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法が、本明細書で提供され、この方法は、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第５のマスクの総面積および第３のマスクの総面積は、それぞれピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２８からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーはＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む。
【００５９】
別の態様では、癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、この変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、この変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。
【００６１】
別の態様では、癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法が本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ガレクチン９を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＭＨＣを含む。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。
【００６３】
別の態様では、癌と診断され、免疫療法を受けている患者の免疫細胞改変を監視する方法が、本明細書で開示され、この方法は、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲからなる群から選択されたバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、目的のバイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。
【００６５】
別の態様では、癌治療を必要とする患者において癌を治療する方法が、本明細書で開示され、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の方法に従って、視野に存在するすべての腫瘍細胞またはすべての非腫瘍細胞の第１のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す工程と、（ｉｉ）第１のＰＢＰの値を記録する工程と、（ｉｉｉ）免疫療法の少なくとも第１の用量を患者に投与する工程と、（ｉｖ）少なくとも第１の用量の投与後に、本明細書に記載の方法に従って、視野に存在するすべての腫瘍細胞またはすべての非腫瘍細胞の第２のＰＢＰの値を導き出す工程と、（ｖ）第２のＰＢＰの値を記録する工程と、（ｖｉ）第１のＰＢＰの値と第２のＰＢＰの値との間での変化を計算する工程と、（ｖｉｉ）患者に投与される免疫療法の次の用量を調節する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、次の用量を調節する工程は、免疫療法の用量を増やす工程、免疫療法の用量を減らす工程、免疫療法の投与間の間隔を増やす工程、免疫療法の投与間の間隔を減らす工程、免疫療法を別の免疫療法と置き換える工程、免疫療法を非免疫療法と置き換える工程、および免疫療法を終わらせる工程、からなる群から選択された１つ以上の行動を含む。
【００６６】
別の態様では、癌治療を必要とする患者において癌を治療する方法が、本明細書で開示され、この方法は、（ｉ）本明細書に記載の方法に従って、視野に存在するすべての腫瘍細胞またはすべての非腫瘍細胞について第１のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す工程と、（ｉｉ）第１のＰＢＰの値を記録する工程と、（ｉｉｉ）投与計画の一部として、免疫療法の少なくとも第１の用量を患者に投与する工程と、（ｉｖ）少なくとも第１の用量の投与後に、本明細書に記載の方法に従って、視野に存在するすべての腫瘍細胞またはすべての非腫瘍細胞について第２のＰＢＰの値を導き出す工程と、（ｖ）第２のＰＢＰの値を記録する工程と、（ｖｉ）第１のＰＢＰの値と第２のＰＢＰの値との間での変化を計算する工程と、（ｖｉｉ）投与計画を変更せずに免疫療法の次の用量を投与する工程と、を含む。
【００６７】
図１１は、バイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法の１つの実施形態の工程を描いたフローチャートである。工程１１０１では、画像データが得られ、工程１１０２では、さまざまなタイプの蛍光信号に特異的なデータが異なるチャネルへと分割されるように、画像データが分離される。工程１１０３では、第１のチャネルからのデータを用いて、すべての細胞のマスクを生成する。工程１１０４では、第２のチャネルからのデータを用いて、サブセットバイオマーカーを発現する視野内の領域のマスクを生成し、例えば、このサブセットのマスクは、視野に存在する腫瘍領域のマスクであってよい。工程１１０５では、すべての細胞のマスクおよびサブセットのマスク（例えば、腫瘍領域のマスク）が組み合わせられて、すべてのサブセット細胞のマスクを生成する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセットおよび細胞の非サブセットは、腫瘍細胞および非腫瘍細胞にそれぞれ対応するか、または非腫瘍細胞および腫瘍細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、生存細胞および非生存細胞にそれぞれ対応するか、または非生存細胞および生存細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに含まれない生存細胞からなる。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、Ｔ細胞および非Ｔ細胞にそれぞれ対応するか、または非Ｔ細胞およびＴ細胞にそれぞれ対応する。いくつかの実施形態では、サブセットバイオマーカーにより特定された細胞のサブセット、および細胞の非サブセットは、骨髄系細胞および非骨髄系細胞にそれぞれ対応するか、または、非骨髄系細胞および骨髄系細胞にそれぞれ対応する。
【００６９】
特定の実施形態では、すべての細胞のマスクとサブセットのマスクとを組み合わせることで、すべての腫瘍細胞および／またはすべての非腫瘍細胞を特定することができる。このプロセスは、選択されたタイプの目的の細胞のみで、例えば、腫瘍細胞のみまたは非腫瘍細胞のみで、実行され得る。このプロセスは、これら両方の分析を対象とすることもできる。工程１１０６では、第３のチャネルからのデータを用いて、（特定の目的のバイオマーカーに対して結合する親和性を有する蛍光タグの存在を表す蛍光信号に基づいて）バイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスクを生成する。工程１１０７および１１０８では、工程１１０６で生成されたバイオマーカーマスクが、工程１１０５で生成されたサブセット細胞のマスクと組み合わせられる。工程１１０７は、バイオマーカーマスクをサブセット細胞のマスクと第１の方法で組み合わせて、バイオマーカーに対して陽性であるすべてのサブセット細胞のマスクを生成する。工程１１０８は、バイオマーカーマスクをサブセット細胞のマスクと第２の方法で組み合わせて、バイオマーカーに対して陽性でないサブセット細胞のマスクを生成する。工程１１０７および１１０８のうちの一方または両方を、方法のさまざまな実施形態に従って実行することができる。工程１１０９／１１１０では、目的のサブセット細胞（例えば、工程１１０７でマスクによって特定されたバイオマーカーに対して陽性であるサブセット細胞または工程１１０８でマスクによって特定されたバイオマーカーに対して陽性でないサブセット細胞）の面積を、すべてのサブセット細胞の総面積で割ることによって、ＰＢＰスコアを計算する。工程１１０９および１１１０のうちの一方または両方を、方法のさまざまな実施形態に従って実行することができる。
【００７０】
図１２は、バイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法の第２の実施形態の工程を描いたフローチャートである。工程１２０１では、画像データが得られ、工程１２０２では、さまざまなタイプの蛍光信号に特異的なデータが異なるチャネルへと分割されるように、画像データが分離される。工程１２０３では、第１のチャネルからのデータが用いられ、すべての細胞のマスクを生成する。工程１２０４では、第２のチャネルからのデータが用いられ、（特定の目的のバイオマーカーに対して結合する親和性を有する蛍光タグの存在を表す蛍光信号に基づいて）バイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスクを生成する。工程１２０５では、（工程１２０４で生成されたマスクにより特定された）バイオマーカーに対して陽性である細胞の面積を、（工程１２０３からの）目的のすべての細胞の総面積で割ることにより、ＰＢＰスコアを計算する。図１２のプロセスは、図１１で描かれた方法と別々に行われても、同時に行われてもよい。言い換えれば、ＰＢＰスコアは、すべての細胞、すべての腫瘍細胞、およびすべての非腫瘍細胞、またはそれらの任意の組み合わせについて計算され得、図１１および図１２の方法を組み合わせることができる。
【００７１】
本明細書に開示される方法では、デジタル画像の操作は、例示的な実施形態によると、図１３のブロック図に示されるコントローラなどのコントローラを含む、コンピューターシステムにより実行され得る。コントローラ２００は、通信インターフェース２０２および処理回路２０４を含むことが示されている。通信インターフェース２０２は、さまざまなシステム、デバイス、またはネットワークとデータ通信を行うために有線または無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバー、ワイヤ端子など）を含み得る。例えば、通信インターフェース２０２は、イーサネットに基づく通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカードおよびポート、ならびに／または無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉＦｉトランシーバーを含み得る。通信インターフェース２０２は、ローカルエリア・ネットワークまたは広域ネットワーク（例えば、インターネット、建造物のＷＡＮ（building WAN）など）を介して通信するように構成され得、さまざまな通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用し得る。
【００７２】
通信インターフェース２０２は、コントローラ２００とさまざまな外部システムもしくはデバイス（例えば、撮像デバイス１０２）との間の電子データ通信を促進するように構成されたネットワークインターフェースであってよい。例えば、コントローラ２００は、撮像デバイス１０２から選択された視野の撮像データを受信して、データを分析し、空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算することができる。
【００７３】
さらに図１３を参照すると、処理回路２０４は、プロセッサ２０６およびメモリ２０８を含むことが示されている。プロセッサ２０６は、汎用もしくは特定用途プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ以上のフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、処理構成要素群、または他の適切な処理構成要素であってよい。プロセッサ５０６は、メモリ５０８に記憶されるかまたは他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ、ネットワーク記憶装置、リモートサーバーなど）から受信された、コンピュータコードまたは命令を実行するように構成され得る。
【００７４】
メモリ２０８は、本開示に記載されるさまざまなプロセスを完了し、かつ／または容易にするためにデータおよび／またはコンピュータコードを記憶するための１つ以上のデバイス（例えば、メモリ装置、メモリデバイス、記憶デバイスなど）を含み得る。メモリ２０８は、ソフトウェアオブジェクトおよび／もしくはコンピュータ命令を記憶するための、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ記憶装置、一時記憶装置、不揮発性メモリ、フラッシュメモリ、光学メモリ、または、任意の他の適切なメモリを含み得る。メモリ２０８は、データベース構成要素、オブジェクトコード構成要素、スクリプト構成要素、またはさまざまな活動を支持するための任意の他のタイプの情報構造および本開示に記載される情報構造を含み得る。メモリ５０８は、処理回路２０４を介してプロセッサ２０６に通信可能に接続され得、本明細書に記載する１つ以上のプロセスを（例えば、プロセッサ２０６によって）実行するためのコンピュータコードを含み得る。
【００７５】
さらに図１３を参照すると、コントローラ２００は、撮像デバイス１０２から入力を受信することが示されている。撮像デバイスは、撮像データをすべて取得し、それを説明するすべてのメタデータと共に、その撮像データを記録する。撮像デバイスは次に、データをシリアライズして、コントローラ２００により読み取られ得るストリームにする。このデータストリームは、ファイルシステム、ＲＤＢＭ、または直接ＴＣＰ／ＩＰ通信など、任意のバイナリデータストリームタイプに適応し得る。データストリームの使用のため、コントローラ２００は、スペクトルアンミキサ（spectral unmixer）２１０を含むことが示されている。スペクトルアンミキサ２１０は、撮像デバイス１０２から画像データを受信することができ、これに対してスペクトルアンミキシングを行って、さまざまな波長を示す画像を、波長のバンドごとに個々の別個のチャネルへと分離する。例えば、画像データは、組織サンプル中の目的の細胞またはタンパク質を特定するのに使用されるさまざまなフルオロフォアそれぞれについて別々のチャネルへと「分離され」得る。フルオロフォアは、ほんの一例として、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群のうちの１つ以上であってよい。一実施例では、チャネルのうちの１つが、画像内の核を特定するために、４６１ｎｍの波長（ＤＡＰＩの最大発光波長）を囲む所定のバンドに該当する画像データを含み得る。他のチャネルは、異なるフルオロフォアを用いて組織サンプルの種々の部分を特定するために異なる波長の画像データを含み得る。
【００７６】
コントローラ２００はまた、さまざまなマスカ（maskers）、例えば細胞マスカ２１２、サブセット領域マスカ２１６、およびバイオマーカーマスカ２２２、を含むことが示されている。コントローラ２００に含まれ得るこれらのマスカまたは他のマスカは、他の実施形態では、スペクトルアンミキサ２１０から分離信号（unmixed signal）を受信し、組織サンプル中のある目的の特徴を特定するのに使用されるフルオロフォアに応じて、目的の特定の細胞または領域のマスクを作るために使用される。マスクを作るために、マスカ（細胞マスカ２１２、サブセット領域マスカ２１６、およびバイオマーカーマスカ２２２など）は、視野内の各ピクセルの強度に関連する画像データを受信する。ピクセル強度は、サンプルが発する蛍光の量に正比例し、この蛍光の量は、（特定のバイオマーカーを特定するためにフルオロフォアを使用する場合）サンプル中のタンパク質バイオマーカーの量に正比例する。絶対閾値が、画像ピクセルに存在する値に基づいて設定され得る。閾値以上であるピクセルはすべて、１．０、または「オン」にマッピングされ、他のピクセルはすべて、０．０、または「オフ」にマッピングされる。このように、バイナリマスクは、視野内の目的の細胞または組織部分を特定するように作られる。他の実施形態では、マスクは、下限を用いて作られ、下限以上の強度を有するすべてのピクセルは、マスクのためのピクセル値として許容および使用される。強度が下限を下回る場合、ピクセル値は０．０、または「オフ」に設定される。
【００７７】
図１４に示すマスキングのための例としてのフローダイヤグラムでは、ＤＡＰＩおよび４８８色素のチャネル（または、核および腫瘍領域をそれぞれ特定するための他のフルオロフォア）が下限プロトコルを使用する（工程１４１０、１４１２、１４２０、１４２２）が、Ｃｙ５チャネル（または、目的のバイオマーカーを特定するための他のフルオロフォア）は、閾値プロトコルを使用して（工程１４３０）、マスク出力を提供することが示されている。下限プロトコルに関連して、下限を決定するためのヒストグラム工程もある。具体的には、ヒストグラム閾値（工程１４１２、１４２２）は、入力画像の閾値を作り出すが、閾値化が生じる時点を決定するスライディングスケール（sliding scale）を用いる。入力は、現在の画像およびユーザが定める閾値パーセンテージである。ユーザが定める閾値パーセンテージは、閾値レベルが設定されるべき全強度のパーセントを決定するのに使用される。最初に、各ピクセルの強度が合計されて全強度になる。閾値パーセンテージに、この全強度を掛け合わせて、切り捨て合計（cut-off sum）を得る。最後に、全ピクセルを強度によって（ヒストグラムで）グループ分けし、それらの強度を、切り捨て合計が達成されるまで、最も低いものから最も高いものまで（ビン単位で）合計する。プロセスで現れる最後の最も高いピクセル強度が、現在の画像の閾値である。その値より高い強度を有するピクセルはすべて、それらの強度が最大に設定されているが、他のものはすべて、最小に設定される。
【００７８】
図１４で工程１４１４、１４１６、１４２４、１４２６、１４２８、１４３２、１４３４、１４３６として識別される工程は、細胞マスカ２１２（工程１４１４、１４１６）、サブセット領域マスカ２１６（工程１４２４、１４２６、１４２８）、バイオマーカーマスカ２２２（工程１４３２、１４３４、１４３６）などの初期マスカで行われる中間工程を表す。これらの工程は以下のとおり定められる。
【００７９】
拡張は、画像中の最も明るい領域の面積を増やす。２つの入力が拡張に必要である。第１の入力は、絶対的な現在の画像であり、第２の入力は、拡張させる反復の回数である。バイナリ画像のみが第１の入力に使用されることが想定される。この処置は、連続的な画像に対して効果があるが、出力は、有効な拡張とはならない。拡張プロセスは、最初に、画像中の最大ピクセル強度を見つけることにより始まる。続いて、画像中の各ピクセルが１回調査される。調査中のピクセルが最大強度に等しい強度を有する場合、そのピクセルは、反復半径（iterations radius）を有し、元のピクセル上に中心を置く円として出力画像に描かれる。その円内の全ピクセルは、最大強度に等しい強度を有する。すべての他のピクセルは、修正なしに、出力画像へコピーされる。
【００８０】
穴埋め処置は、画像の「空の」領域を最大強度のピクセルで埋める。これらの空の領域は、最小強度を有し、かつピクセル面積（サイズ）がユーザにより特定された、領域である。現在の画像およびサイズは、必要とされる２つの入力である。拡張と同様に、この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものとする。
【００８１】
侵食は、拡張と同じように画像を処理する。すべての機能性は、第１の工程で画像中の最小強度を決定し、その最低強度に適合するピクセルのみが変更され、見つかった最小強度ピクセルをブルーミングするのに使用される円が、最低強度値で埋められることを除き、拡張と同じである。拡張と同じように、この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものとする。
【００８２】
オブジェクト除去。２つの入力：現在の画像およびオブジェクトサイズ、が求められる。オブジェクト除去は、穴埋め処置とは反対である。入力されたオブジェクトサイズより小さい面積を埋める最大強度のピクセルのみを含むあらゆる領域が、最小強度に設定され、よって「除去される」。この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものであり、連続した画像への適用は、予想外の結果を生じ得る。
【００８３】
工程１４１８、１４２９、１４３８での出力は、それぞれ、結果として得られる細胞のマスク、サブセットのマスク（または、この特定の実施例では、腫瘍領域のマスク）、およびバイオマーカーの細胞のマスクである。図１４は、ＰＢＰスコアの関連領域情報を得るための、これらの結果として得られるマスクの組み合わせをさらに描いている。これらの組み合わせは、図１３に描かれる、コントローラ２００の組み合わせマスカを参照して、以下でさらに説明する。
【００８４】
コントローラ２００は、サブセット細胞マスカ２１８、非サブセット細胞マスカ２２０、組み合わせマスカ２３０などの組み合わせマスカを含むことが示されている。いくつかの実施形態では、マスカ２１８により特定されたサブセット細胞およびマスカ２２０により特定された非サブセット細胞は、それぞれ腫瘍細胞および非腫瘍細胞である。サブセット細胞マスカは、図１４の工程１４５２に示すように、Ａｎｄ操作を行い、（画像中のすべての細胞を表す）細胞マスカ２１２の出力を、サブセット領域マスカ２１６の出力と組み合わせる。したがって、サブセット細胞マスカは、画像中のすべてのサブセット細胞のマスクを生成する。この同じ組み合わせは、図１４の工程１４５４に示すように非サブセット細胞マスカ２２０によって行われるＯｕｔ操作を用いて、サンプル画像中のすべての非サブセット細胞のマスクを生成する。
【００８５】
組み合わせマスカ２３０は、２つの入力マスクを組み合わせるように構成される。図１４に描かれたように、組み合わせマスカ２３０は、バイオマーカーマスクを、（サブセット細胞マスカ２１８からの）サブセット細胞のマスクもしくは（非サブセット細胞マスカ２２０からの）非サブセット細胞のマスクのうちの一方、または、バイオマーカーマスク＋サブセットのマスクおよびバイオマーカーマスク＋非サブセットのマスクの両方、と組み合わせる。点線は、細胞のマスクのうちの一方または両方が、組み合わせマスカ２３０においてバイオマーカーマスクと組み合わせられ得ることを表す。組み合わせマスカ２３０の結果は、バイオマーカーに対して陽性であるすべてのサブセット細胞および／またはバイオマーカーに対して陽性であるすべての非サブセット細胞を表すマスクである。組み合わせマスカ２３０は、マスクを交互に組み合わせることができ、組み合わせマスカ２３０の結果は、バイオマーカーに対して陽性ではない（バイオマーカー陰性）サブセット細胞を表すマスクである。目的の細胞がサブセット、例えば腫瘍もしくは非腫瘍に特に関連せず、むしろすべての細胞に関連する場合、バイオマーカー陽性のマスクは、任意の追加のマスクとは組み合わせられず、修正することなく組み合わせマスカ２３０を通過する。
【００８６】
バイオマーカー陽性率スコア（ＰＢＰ）を計算するため、選択されたサブセット細胞（例えば、すべての腫瘍もしくは非腫瘍）のバイオマーカー陽性マスクまたはバイオマーカー陰性マスク（この場合、スコアはバイオマーカー陰性を表す）の面積が、面積評価器２３２においてピクセルで決定される。（バイオマーカーに対して陽性または陰性である）選択された細胞すべての総面積は、面積評価器２３２においてピクセルで決定される。面積評価器２３２において終端する点線は、総面積の入力が、別々に計算される、すべての細胞のマスク、サブセット細胞のマスク、および非サブセット細胞のマスクのうちの１つ以上であってよいことを示す。バイオマーカー陽性率スコアは、陽性計算器２３６において決定される。一実施形態では、ＢＰＢスコアは、面積評価器２３２からの選択された細胞のバイオマーカー陽性マスクの面積を、面積評価器２３２からのすべての選択された細胞のマスクの面積で割り、１００を掛け合わせることによって、計算される。一実施形態では、相互作用計算器２３６により実行される方程式は以下のとおりであり：
【数１】
2018534564.tif 000004
式中、ＡＰは、選択されたタイプのサブセット細胞（例えば、すべての腫瘍または非腫瘍）のバイオマーカー陽性面積であり、ＡＡは、選択された細胞型（すべての腫瘍、非腫瘍）のすべての細胞の総面積である。同様に、ＡＮは、前述の方程式のＡＰに取って代わり、ＡＮは、選択されたタイプの細胞（例えば、すべての腫瘍または非腫瘍）のバイオマーカー陰性面積であり、そのタイプのサブセット細胞のバイオマーカー陰性率を表すスコアを決定する。
【００８７】
Ａｎｄ処置は、バイナリのＡｎｄ操作をモデルにしているが、著しく異なっている。Ａｎｄは、現在の画像、およびユーザが選択した結果を受け入れる。この出力は、２つの入力画像からの適合するピクセルの正規化された強度の掛け算を実行することで作られた画像である。場合によっては、画像の強度データは、既に正規化されている。したがって、Ａｎｄ処置は、単に２つの画像のピクセルごとの掛け算である。Ｏｕｔに必要な２つの入力は、現在の画像およびユーザが選択した結果である。Ｏｕｔは、式Ａ＊（１−Ｂ／Ｂｍａｘ）に従って第１の画像から第２の画像を除去し、式中、Ａは現在の画像であり、Ｂは、除去されるユーザが選択した画像であり、ＢｍａｘはＢの最大強度である。ＢをＢｍａｘで割ることによりＢを正規化することに留意されたい。
【００８８】
〔実施例〕
実施例１．ヒト患者からの黒色腫組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
サンプル調製。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから、ろうを取り除いた。次にスライドは、蒸留水中でインキュベートする前に、一連のキシレンからアルコールまでの洗浄を通じて再水和された。次に、熱によって誘導された抗原回復が、高温高圧条件を用いて実行され、冷却され、トリス緩衝食塩水へと移された。次に染色が行われ、以下の工程が実行された。まず、内在性ペルオキシダーゼが遮断され、続いて、タンパク質遮断溶液でインキュベートして、非特異的抗体染色を低減した。次に、スライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。その後、スライドは、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートする前に洗浄した。スライドを洗浄し、その後、ＰＤ−１染色が、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出された。次に、残留ＨＲＰが、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素の２回の洗浄を用いて、冷却された。スライドは、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体での染色前に再び洗浄された。スライドを洗浄し、次に、４８８色素で直接標識されたマウス抗Ｓ１００を加えた抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）との混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次に、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＤ−Ｌ１染色を検出した。スライドは、封入剤と共にカバーガラスをかける（cover-slipped）前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。抗体および検出試薬の概要を図１に示す。
【００８９】
サンプル撮像および分析。次に、蛍光画像を、Ｖｅｃｔｒａソフトウェアバージョン２．０．８を用いるＶｅｃｔｒａ  ２  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、取得した。まず、スライドのモノクローム撮像を、ＤＡＰＩを使用して４ｘの倍率で行った。（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化アルゴリズムを使用して、組織を収容するスライドの領域を特定した。
【００９０】
組織を収容していると特定されたスライドの領域を、４ｘの倍率でＤＡＰＩ（青色）、ＦＩＴＣ（緑色）、Ｃｙ（登録商標）５（赤色）に関連付けられたチャネルついて撮像し、ＲＧＢ画像を生成した。これらの４ｘの倍率の画像は、視野セレクター１０４において（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化濃縮アルゴリズムを用いて処理し、最も高いＣｙ（登録商標）５発現に従って可能な２０ｘの倍率の視野を特定およびランク付けした。
【００９１】
上位４０の視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ（登録商標）５の波長にわたって２０ｘの倍率で撮像した。原画像を、受容性について再調査し、焦点が外れた、腫瘍細胞がない、非常に壊死性であった、または、予測された抗体局在と関連のない高いレベルの蛍光信号（すなわち背景染色）を含んだ、画像は、分析前に拒絶された。受容された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理し、各フルオロフォアは、スペクトルアンミキサ２１０によって、個々のチャネルへとスペクトルが分離されて、別ファイルとして保存された。
【００９２】
処理されたファイルを、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて、またはＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いる完全自動化プロセスを通じて、さらに分析した。詳細は以下のとおりであった。
【００９３】
各ＤＡＰＩ画像は、細胞マスカ２１２によって処理し、その画像内にあるすべての細胞核を特定し（図２ａ）、その後、３ピクセルだけ拡張して、完全な細胞の適切なサイズを表した。この結果として得られたマスクは、その画像内のすべての細胞を表した（図２ｂ）。
【００９４】
４８８色素で検出されたＳ１００（黒色腫用の腫瘍細胞マーカー）（図３ａ）を、腫瘍マスカ２１６によって処理し、その画像内のすべての腫瘍領域のバイナリマスクを作成した（図３ｂ）。このマスクと、すべての細胞のマスクとの重なりが、腫瘍細胞の新しいマスクを作成した（図３ｃ）。
【００９５】
同様に、すべての核のマスクと組み合わせた腫瘍細胞マーカーがないことで、すべての非腫瘍細胞の新しいマスクを作成し（図３ｄ）、これは非腫瘍細胞マスカ２２０を用いて行った。
【００９６】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図４ａ）は、バイオマーカーマスカ２２２によって処理し、ＰＤ−Ｌ１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図４ｂ）。組み合わせマスカ２３０を用いて、すべての腫瘍細胞のマスクとすべてのＰＤ−Ｌ１陽性細胞のマスクを重ねることにより、すべてのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の新しいマスクを作成した（図４ｃ）。同様に、組み合わせマスカ２３０を用いて、すべての非腫瘍細胞のマスクとすべてのＰＤ−Ｌ１陽性細胞のマスクを重ねることにより、すべてのＰＤ−Ｌ１陽性非腫瘍細胞の新しいマスクを作成した（図４ｄ）。
【００９７】
各Ｃｙ（登録商標）３．５画像（図５ａ）は、すべての非腫瘍細胞のマスクと重ねられて、ＰＤ−１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図５ｂ）。
【００９８】
ＰＤ−Ｌ１を発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）は、陽性計算器２３６を用いて、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のマスクの総面積（図４ｃ）を、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべての腫瘍細胞のマスクの総面積（図３ｃ）で割ることによって、導き出した。ＰＤ−Ｌ１を発現するすべての細胞のＰＢＰの代表的な値を図６ａに示す（データは、発現の増加に従って分類されている）。
【００９９】
ＰＤ−１を発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰは、ピクセルで測定された、すべてのＰＤ−１陽性非腫瘍細胞のマスクの総面積（図５ｂ）を、ピクセルで測定された、すべての非腫瘍細胞のマスクの総面積（図３ｄ）で割ることによって、導き出した。ＰＤ−１を発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの代表的な値を図６ｂに示す（データは、発現の増加に従って分類されている）。
【０１００】
図７および図８は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ−Ｌ陽性細胞（黄色）、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑色）、およびすべての細胞（ＤＡＰＩ、青色）を示す、上に置かれたマスクの代表的な実施例を示す。免疫療法への陽性反応者では、図７のマスクは、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ−１陽性細胞（黄色）、およびすべての腫瘍細胞（緑色）の存在を容易に示す。対照的に、免疫療法への陰性反応者では、図８のマスクは、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑色）およびすべての細胞（ＤＡＰＩ、青色）の存在を示すが、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤色）またはＰＤ−１陽性細胞（黄色）は皆無かそれに近い。
【０１０１】
実施例２．ヒト患者からの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
４８８色素で直接標識されたマウス抗Ｓ１００を、上皮腫瘍サンプルのために４８８色素で直接標識されたマウス抗パンサイトケラチンと置き換えて、実施例１と同じような処置を行った。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のＰＢＰ値を図９に示す。これらの患者のサブセットは、免疫抑制に似た、高いレベルの受容体リガンド相互作用を示した。
【０１０２】
実施例３．分析技術の比較
対照標本を生成するため、ＰＤ−Ｌ１の先に開発された発現を備える（Ｋａｒｐａｓ  ２９９）か、または発現のない（Ｒａｍｏｓ  ＲＡ＃１）リンパ腫細胞株を、製造業者の説明書に従って培養した。次に細胞を計数し、２つの細胞株をさまざまなパーセンテージで混合し、ＰＤ−Ｌ１発現が０〜１００％の範囲である一連のＦＦＰＥ細胞株ペレットブロックを生成した。次に、これらの細胞株混合物から、また、正常な扁桃腺組織切除部からのコア（６００μｍ）を使用して、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を作成した。次に、このＴＭＡの一部を染色し、撮像し、各コアに、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いてＰＤ−Ｌ１陽性率のスコアを付け（すべての工程は、実施例１で説明したとおりである）、結果を、図１０のＹ軸に示す。ここで、各点は、単一のコア（単一の視野）を表す。
【０１０３】
あるいは、以下のとおり比較用の細胞計数に基づくソフトウェアを用いて、同じ画像を、ＰＤ−Ｌ１発現率について定量化した。ＤＡＰＩを使用して、まず、各細胞核を特定し、次に、特定された細胞核を囲む、形態学的な細胞質を作成した。細胞の細胞質においてＰＤ−Ｌ１発現を有する細胞を特定するために、強度閾値が確立された。次に、この閾値を越えて特定された細胞の総数を、画像中の細胞の総数で割って、各コアにおけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞の割合を決定し、その結果を、図１０のＸ軸上に示した。全体的に、２つの細胞計数方法間には、高レベルの一致があった（Ｒ２＝０．８６、勾配１．１）；しかしながら、図１０にＡ、Ｂ、Ｃとして標識される３つの顕著な外れ値があり、ここでは、ＡＱＵＡ（登録商標）スコア付けによって決定されたＰＤ−Ｌ１陽性率は、細胞計数方法のものよりも著しく高かった。点ＡおよびＢは、１００％の細胞がＫａｒｐａｓ２９９であった細胞株のコアであり、よって、ＡＱＵＡ（登録商標）スコア付けによって決定された値は、予想されたものにはるかに近く、細胞計数方法は、細胞の細胞質をＰＤ−Ｌ１陽性と特定することができなかった。同様に、点Ｃでは、細胞混合物は、理論上の４０％のＫａｒｐａｓ２９９細胞を含み、ＡＱＵＡ（登録商標）スコア付けによって決定された値は、やはり、細胞計数方法よりも、予測されたものにはるかに近かった。これらの結果は、本明細書に開示する方法が、細胞計数に基づくソフトウェアよりも優れていることを証明した。
【０１０４】
実施例４．ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞およびＣＤ８０を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−１の染色および分析を、ＣＤ８０の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１０５】
実施例５．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞およびＣＤ８０を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
サンプル調製。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから、ろうを取り除き、これを再水和し、抗原回復を、高温条件で行った。次に、染色を行い、以下の工程を実施した。まず、組織をＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、約１ｋｂのＣＴＬＡ−４  ｍＲＮＡにわたる２０対のハイブリダイゼーションプローブを使用するＣＴＬＡ−４発現検出にかけた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）３で可視化した。スライドを洗浄し、次に残留ＨＲＰを、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素での２回洗浄を用いて冷却した。スライドは、マウス抗ＣＤ８０一次抗体で染色する前に再び洗浄した。スライドを洗浄し、次に、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＣＤ８０染色を、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。その後、残留ＨＲＰを、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素での２回洗浄を用いて冷却した。スライドは、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色する前に再び洗浄した。スライドを洗浄し、次に、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次に、ＣＤ３染色を、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドを、封入剤と共にカバーガラスをかける前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。
【０１０６】
ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたり撮像する、実施例１と同様の撮像および分析処置を実行した。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０の発現を用いて、２０ｘの画像を得るための濃縮アルゴリズムを確立した。分析を行い、転移性黒色腫の患者から採取した腫瘍サンプル中の、ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の広まりおよびＣＤ８０発現を調べた。結果を図３１ａおよび図３１ｂに示す。
【０１０７】
実施例６．ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞およびＰＤ−１を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１の染色および分析を、ＰＤ−Ｌ２の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１０８】
実施例７．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞およびＣＤ８６を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１０９】
実施例８．ＬＡＧ−３を発現する細胞およびＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＬＡＧ−３およびＨＬＡ−ＤＲの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１０】
実施例９．ＴＩＭ−３を発現する細胞およびガレクチン９を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＴＩＭ−３およびガレクチン９の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１１】
実施例１０．４１ＢＢを発現する細胞および４．１ＢＢＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、４１ＢＢおよび４．１ＢＢＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１２】
実施例１１．ＯＸ４０を発現する細胞およびＯＸ４０Ｌを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１３】
実施例１２．ＣＤ４０を発現する細胞およびＣＤ４０Ｌを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１４】
実施例１３．ＩＣＯＳを発現する細胞およびＩＣＯＳＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＩＣＯＳおよびＩＣＯＳＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１５】
実施例１４．ＧＩＴＲを発現する細胞およびＧＩＴＲＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１６】
実施例１５．ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞およびＴＣＲを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の染色および分析を、ＨＬＡ−ＤＲおよびＴＣＲの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。
【０１１７】
実施例１６．びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者からの組織サンプルのサンプル調製、撮像、ならびにＣＤ３およびＰＤ−１の分析
サンプル調製。ＤＬＢＣＬ患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル（ｎ＝４３）から、ろうを取り除いた。次にスライドは、蒸留水中でインキュベートする前に、一連のキシレンからアルコールまでの洗浄を通じて再水和した。次に、熱によって誘導された抗原回復が、高温高圧条件を用いて実行され、冷却され、トリス緩衝食塩水へと移された。次に染色が行われ、以下の工程が実行された。まず、内在性ペルオキシダーゼが遮断され、続いて、タンパク質遮断溶液でインキュベートして、非特異的抗体染色を低減した。次に、スライドが、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色された。その後、スライドは、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートする前に洗浄された。スライドを洗浄し、その後、ＰＤ−１染色が、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出された。次に、一次および二次抗体試薬を、マイクロ波によって除去した。スライドは、ウサギ抗ＣＤ−３一次抗体での染色前に再び洗浄された。スライドを洗浄し、次に、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）との混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次に、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＣＤ３染色を検出した。スライドは、封入剤と共にカバーガラスをかける前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。抗体および検出試薬の概要を図１５に示す。
【０１１８】
サンプル撮像および分析。次に、蛍光画像を、Ｖｅｃｔｒａソフトウェアバージョン２．０．８を用いるＶｅｃｔｒａ  ２  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、取得した。まず、スライドのモノクローム撮像を、ＤＡＰＩを使用して４ｘの倍率で行った。（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化アルゴリズムを使用して、組織を収容するスライドの領域を特定した。
【０１１９】
組織を収容していると特定されたスライドの領域を、４ｘの倍率でＤＡＰＩ（青色）、Ｃｙ（登録商標）３（緑色）、およびＣｙ（登録商標）５（赤色）に関連付けられたチャネルついて撮像し、ＲＧＢ画像を生成した。これらの４ｘの倍率の画像は、視野セレクター１０４において（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化濃縮アルゴリズムを用いて処理し、最も高いＣｙ（登録商標）３発現に従って可能な２０ｘの倍率の視野を特定およびランク付けした。
【０１２０】
上位４０の視野を、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたって２０ｘの倍率で撮像した。原画像を、受容性について再調査し、焦点が外れた、腫瘍細胞がない、非常に壊死性であった、または、予測された抗体局在と関連のない高いレベルの蛍光信号（すなわち背景染色）を含んだ、画像は、分析前に拒絶された。受容された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理し、各フルオロフォアは、スペクトルアンミキサ２１０によって、個々のチャネルへとスペクトルが分離されて、別ファイルとして保存された。
【０１２１】
処理されたファイルは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて、またはＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いる完全自動化プロセスを通じて、さらに分析した。詳細は以下のとおりであった。
【０１２２】
各ＤＡＰＩ画像は、細胞マスカ２１２によって処理し、その画像内にあるすべての細胞核を特定し（図１６ａ）、その後、２ピクセルだけ拡張して、完全な細胞の適切なサイズを表した。この結果として得られたマスクは、その画像内のすべての細胞を表した（図１６ｂ）。
【０１２３】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図１７ａ）を、バイオマーカーマスカ２２２で処理し、ＰＤ−１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図１７ｂ）。
【０１２４】
各Ｃｙ（登録商標）３画像（図１８ａ）を、バイオマーカーマスカ２２２で処理し、ＣＤ３陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図１８ｂ）。
【０１２５】
ＰＤ−１陽性およびＣＤ３陽性のすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＰＤ−１およびＣＤ３に対して二重陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図１９）。
【０１２６】
ＰＤ−１を発現するすべてのＣＤ３細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）は、陽性計算器２３６を用いて、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＰＤ−１陽性細胞のマスクの総面積（図１７ｂ）を、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＣＤ３陽性細胞のマスクの総面積（図１８ｂ）で割ることによって、導き出した。消耗したＴ細胞（ＣＤ３＋／ＰＤ１＋）の特異的分布（Differential distribution）が、一次部位（低レベル）対二次部位（高レベル）で観察された。結果を図２０ａおよび図２０ｂに示す。
【０１２７】
実施例１７．プラットフォーム比較
実施例１および１６と類似した処置の精度を、フローサイトメトリーで比較して確認した。（ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５の発現に基づく）調節性Ｔ細胞の出現率（frequencies）を、ＩＬ−２、ＴＧＦ  β、およびＣＤ２８で刺激された全血において、５日間、ＣＤ３でコーティングしたプレート上で確認した。
【表２】
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【０１２８】
実施例１８．複数の腫瘍の適応症におけるＣＤ２５／ＦｏｘＰ３  Ｔ細胞の評価
実施例１６と同様の処置を、ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織上でのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の定量的評価のため、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体で検出され、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたって撮像される、抗Ｓ１００または抗サイトケラチン抗体のいずれかを有する腫瘍細胞の追加的特定と共に、行った。組織を、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を認識する抗体で染色し、非腫瘍部位におけるそれらの発現を、発現率として計算した。ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の広まりは、アーカイブの肺、胃、および黒色腫組織標本では、１％〜１０％の範囲であった。結果を図２１および図２２に示す。
【０１２９】
実施例１９．複数の腫瘍の適応症におけるＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞の評価
実施例１６と同様の処置を、ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織に対するＣＤ４およびＣＤ８の定量的評価のため、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体で検出され、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたって撮像される、抗Ｓ１００または抗サイトケラチン抗体のいずれかを有する腫瘍細胞の追加的特定と共に、行った。組織を、ＣＤ４およびＣＤ８を認識する抗体で染色し、非腫瘍部位におけるそれらの発現を、発現率として計算した。広範な発現（１０％〜５０％）が、腫瘍標本の一連の切片中でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について観察された。結果を図２３ａおよび図２３ｂに示す。
【０１３０】
実施例２０．転移性黒色腫または非小細胞肺癌と診断された患者由来の腫瘍サンプル中の骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）様細胞の評価
骨髄系細胞に特徴的な表現型マーカー（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびＨＬＡ−ＤＲ）およびこれらの細胞に抑制機能を与える生化学マーカー（例えば、ＡＲＧ１およびＩＤＯ−１）を発現するＭＤＳＣ様細胞を特定するため、サンプルを、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＩＤＯ、またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびＡＲＧ１のいずれかで染色した。
【０１３１】
ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＩＤＯ−１の差次的発現を利用して、転移性黒色腫患者からの腫瘍生検におけるＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）として知られる抑制骨髄系細胞のサブセットの存在を調べた。癌免疫療法への反応の予測に関連し得る代表的なサブ表現型を、図２４ａ、図２４ｂ、図２５ａ、および図２５ｂに示す。
【０１３２】
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびＡＲＧ−１、またはＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＩＤＯ−１の差次的発現を利用して、進行性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者からの腫瘍標本におけるＭＤＳＣ様細胞およびＴＡＭの存在を調べた。癌免疫療法への反応の予測に関連し得る代表的なサブ表現型を、図２６ａ、図２６ｂ、および図２７に示す。
【０１３３】
サンプル調製。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから、ろうを取り除いた。次にスライドは、蒸留水中でインキュベートする前に、一連のキシレンからアルコールまでの洗浄を通じて再水和した。次に、熱によって誘導された抗原回復が、高温高圧条件を用いて実行され、冷却され、トリス緩衝食塩水へと移された。次に染色が行われ、以下の工程が実行された。まず、内在性ペルオキシダーゼが遮断され、続いて、タンパク質遮断溶液でインキュベートして、非特異的抗体染色を低減した。次に、スライドが、ウサギ抗ＩＤＯ−１またはマウス抗ＣＤ３３一次抗体のいずれかで染色された。その後、スライドは、抗ウサギまたは抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートする前に洗浄された。スライドを洗浄し、その後、抗ＩＤＯ−１または抗ＣＤ３３染色が、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出された。次に、残留ＨＲＰが、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素の２回の洗浄を用いて、冷却された。スライドは、マウス抗ＨＬＡ−ＤＲまたはウサギ抗ＡＲＧ１一次抗体での染色前に再び洗浄された。スライドを洗浄し、次に、抗マウスまたは抗ウサギＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、抗ＨＬＡ−ＤＲまたは抗ＡＲＧ１染色を検出した。一次および二次抗体試薬を、マイクロ波によって除去した。スライドは、ウサギ抗ＣＤ１１ｂ抗体での染色前に再び洗浄された。スライドを洗浄し、次に、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）との混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次に、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて抗ＣＤ１１ｂ染色を検出した。スライドは、封入剤と共にカバーガラスをかける前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。
【０１３４】
実施例１６と同様の処置を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたってサンプル撮像および分析に使用した。４ｘの倍率の画像は、視野セレクター１０４において（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化濃縮アルゴリズムを用いて処理し、最も高いＣｙ（登録商標）３およびＣｙ（登録商標）５の発現に従って可能な２０ｘの倍率の視野を特定およびランク付けした。
【０１３５】
各ＤＡＰＩ画像は、細胞マスカ２１２によって処理し、その画像内にあるすべての細胞核を特定し、その後、拡張して、完全な細胞の適切なサイズを表した。この結果として得られたマスクは、その画像内のすべての細胞を表した。
【０１３６】
各ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）画像を、バイオマーカーマスカ２２２で処理し、ＣＤ１１ｂ陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１３７】
各Ｃｙ（登録商標）３画像を、バイオマーカーマスカ２２２で処理し、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ３３陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１３８】
各Ｃｙ（登録商標）５画像を、バイオマーカーマスカ２２２で処理し、ＩＤＯ−１またはＡＲＧ１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１３９】
ＣＤ１１ｂ陽性およびＨＬＡ−ＤＲ陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂおよびＨＬＡ−ＤＲに対して二重陽性であるか、またはＣＤ１１ｂ陽性でＨＬＡ−ＤＲ陰性である、すべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１４０】
ＨＬＡ−ＤＲの発現がないすべてのＣＤ１１ｂ細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）は、陽性計算器２３６を用いて、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、導き出した。転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍サンプルについては、結果を図２４ａに示す。
【０１４１】
ＣＤ１１ｂ陽性、ＩＤＯ陽性、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性のすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陰性、およびＩＤＯ−１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１４２】
ＩＤＯ−１を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲの発現がないすべてのＣＤ１１ｂ細胞のＰＢＰは、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陰性、ＩＤＯ−１陽性細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、導き出した。結果は、転移性黒色腫と診断された患者から入手した腫瘍サンプルについては、図２４ｂに、非小細胞肺癌と診断された患者については、図２７に示す。
【０１４３】
ＨＬＡ−ＤＲ陽性およびＩＤＯ−１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩＤＯ−１に対して二重陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１４４】
ＩＤＯ−１を発現するすべてのＨＬＡ−ＤＲ細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）は、陽性計算器２３６を用いて、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＩＤＯ−１陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定され面積評価器２３２により決定された、すべてのＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、導き出した。結果は、転移性黒色腫と診断された患者から入手した腫瘍サンプルについて、図２５ａに示す。
【０１４５】
ＣＤ１１ｂ陽性、ＩＤＯ陽性、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、およびＩＤＯ−１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１４６】
ＩＤＯ−１およびＨＬＡ−ＤＲを発現するすべてのＣＤ１１ｂ細胞のＰＢＰは、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、ＩＤＯ−１陽性細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、導き出した。結果は、転移性黒色腫と診断された患者から入手した腫瘍サンプルについては図２５ｂに、非小細胞肺癌と診断された患者から入手した腫瘍サンプルについては図２６ｂに、示す。
【０１４７】
ＣＤ１１ｂ陽性、ＣＤ３３陽性、およびＡＲＧ１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性、ＣＤ３３陽性、およびＡＲＧ１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した。
【０１４８】
ＣＤ３３およびＡＲＧ１を発現するすべてのＣＤ１１ｂ細胞のＰＢＰは、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性、ＣＤ３３陽性、ＡＲＧ１陽性細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定された、すべてのＣＤ１１ｂ陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、導き出した。結果は、非小細胞肺癌と診断された患者から入手した腫瘍サンプルについては図２６ａに示す。
【０１４９】
実施例２１．転移性黒色腫と診断された患者からの腫瘍サンプルにおける活性化Ｔ細胞の評価
ＤＡＰＩ、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＫｉ６７の組み合わせで各サンプルを染色し、活性化Ｔ細胞の部分母集団を特定するために、実施例２０と同様の処置を行った。ＣＤ８＋Ｋｉ６７＋の広まりを、転移性黒色腫と診断された患者から入手した腫瘍生検において調べた（図２８）。
【０１５０】
実施例２２．転移性黒色腫と診断された患者からの腫瘍サンプルにおけるマクロファージの広まりの評価
実施例１６と同様の処置を、黒色腫組織上でのＣＤ１６３およびＣＤ６８の定量的評価のため、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体で検出され、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたって撮像される、抗Ｓ１００抗体を有する腫瘍細胞の追加的特定と共に、行った。組織を、ＣＤ１６３およびＣＤ６８を認識する抗体で染色し、非腫瘍部位におけるそれらの発現を、単一のＰＢＰ発現または二重のＰＢＰ発現として計算した。結果を図２９ａ、図２９ｂ、および図２９ｃに示す。
【０１５１】
実施例２３．びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）と診断された患者からの腫瘍サンプルにおけるＴ細胞抑制の広まりの評価
実施例１と同様の処置を行って、ＤＬＢＣＬおよびＮＥＴ腫瘍標本を、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５で検出される、マウス抗ＬＡＧ−３一次抗体、抗マウスＨＲＰ二次で染色し、残りのＨＲＰを１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素で冷却した。これに続いて、スライドを、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）５で検出される、ウサギ抗ＴＩＭ−３一次抗体、抗ウサギＨＲＰ二次で染色した。次に、一次および二次抗体を、マイクロ波により除去した。次に、組織を、Ｏｐａｌ（商標）５２０で検出される、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体、抗ウサギＨＲＰ二次と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。撮像は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたって、実施例１と同じように行った。分析を、実施例１と同じように行い、それぞれＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３陽性であったＴ細胞のＰＢＰの広まりを決定した。結果を図３０ａおよび図３０ｂに示す。
【０１５２】
段落Ａ．視野に存在する、すべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、
を含む、方法。
【０１５３】
段落Ｂ．段落Ａの方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
【０１５４】
段落Ｃ．段落Ａまたは段落Ｂの方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【０１５５】
段落Ｄ．段落Ａまたは段落Ｂの方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）視野内でサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）視野内で目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第８のマスクの総面積で割ることにより、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【０１５６】
段落Ｅ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１５７】
段落Ｆ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１５８】
段落Ｇ．段落Ｄの方法において、
目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１５９】
段落Ｈ．段落Ｄの方法において、
目的の第２のバイオマーカーは、目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１６０】
段落Ｉ．段落Ａ〜Ｅのいずれかの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
【０１６１】
段落Ｊ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【０１６２】
段落Ｋ．段落Ｊの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
【０１６３】
段落Ｌ．段落Ｋの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
【０１６４】
段落Ｍ．段落Ｋの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
【０１６５】
段落Ｎ．段落Ｋの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
【０１６６】
段落Ｏ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【０１６７】
段落Ｐ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【０１６８】
段落Ｑ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
【０１６９】
段落Ｒ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
【０１７０】
段落Ｓ．段落Ａ〜Ｄのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
【０１７１】
段落Ｔ．段落Ｂの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
【０１７２】
段落Ｕ．段落Ａ〜Ｔのいずれかの方法において、
総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【０１７３】
段落Ｖ．癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
【０１７４】
段落Ｗ．段落Ｖの方法において、
変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【０１７５】
段落Ｘ．段落Ｖの方法において、
変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【０１７６】
段落Ｙ．段落Ｖ〜Ｘのいずれかの方法において、
免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
【０１７７】
段落Ｚ．癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
【０１７８】
段落ＡＡ．段落Ｚの方法において、
変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、減少は、免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【０１７９】
段落ＡＢ．段落Ｚの方法において、
変化は、少なくとも第１のＰＢＰの値と少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、増大は、免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
【０１８０】
段落ＡＣ．段落Ｚ〜ＡＢのいずれかの方法において、
免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
【０１８１】
段落ＡＤ．視野に存在するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０１８２】
段落ＡＥ．段落ＡＤの方法において、
目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１８３】
段落ＡＦ．段落ＡＤの方法において、
視野は、非腫瘍細胞をさらに含む、方法。
【０１８４】
段落ＡＧ．段落ＡＦの方法において、
非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
【０１８５】
段落ＡＨ．段落ＡＤ〜ＡＧのいずれかの方法において、
総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【０１８６】
段落ＡＩ．視野に存在するすべての非腫瘍細胞についてバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり目的のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第５のマスクの総面積を第３のマスクの総面積で割ることにより、目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０１８７】
段落ＡＪ．段落ＡＩの方法において、
目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１８８】
段落ＡＫ．段落ＡＩの方法において、
目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１８９】
段落ＡＬ．段落ＡＩの方法において、
非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
【０１９０】
段落ＡＭ．段落ＡＩの方法において、
非腫瘍細胞は、骨髄系細胞を含む、方法。
【０１９１】
段落ＡＮ．視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはりサブセットバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり目的の第１のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）第４のマスクの総面積を第１のマスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、
（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、
視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、第６のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることによって、（ａ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または（ｂ）目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーを発現する、すべての細胞の第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０１９２】
段落ＡＯ．段落ＡＮの方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
【０１９３】
段落ＡＰ．段落ＡＮまたは段落ＡＯの方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野内のすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、サブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【０１９４】
段落ＡＱ．段落ＡＮまたは段落ＡＯの方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）視野内でサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、第２のマスクを第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）視野内で目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第９のマスクの総面積を第８のマスクの総面積で割ることにより、目的の第２のバイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【０１９５】
段落ＡＲ．段落ＡＮの方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）第６および第７のマスクを、
（ａ）視野内でサブセットバイオマーカー、目的の第１のバイオマーカー、および目的の第２のバイオマーカーを発現するか、
（ｂ）視野内で目的の第２のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｃ）視野内で目的の第１のバイオマーカーの非存在下でサブセットバイオマーカーおよび目的の第２のバイオマーカーを発現する、
すべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）第８のマスクの総面積を第４のマスクの総面積で割ることにより、目的の第１のバイオマーカーもしくは目的の第２のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせ、ならびにサブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
【０１９６】
段落ＡＳ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１９７】
段落ＡＴ．段落ＡＮ〜ＡＱのいずれかの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１９８】
段落ＡＵ．段落ＡＱの方法において、
目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０１９９】
段落ＡＶ．段落ＡＱの方法において、
目的の第２のバイオマーカーは、目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０２００】
段落ＡＷ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
【０２０１】
段落ＡＸ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【０２０２】
段落ＡＹ．段落ＡＸの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
【０２０３】
段落ＡＺ．段落ＡＹの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
【０２０４】
段落ＢＡ．段落ＡＹの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
【０２０５】
段落ＢＢ．段落ＡＹの方法において、
Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
【０２０６】
段落ＢＣ．段落ＡＸの方法において、
視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、骨髄系細胞を含む、方法。
【０２０７】
段落ＢＤ．段落ＢＣの方法において、
骨髄系細胞は、骨髄由来のサプレッサー細胞である、方法。
【０２０８】
段落ＢＥ．段落ＢＣの方法において、
骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである、方法。
【０２０９】
段落ＢＦ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【０２１０】
段落ＢＧ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【０２１１】
段落ＢＨ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
【０２１２】
段落ＢＩ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
【０２１３】
段落ＢＪ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
【０２１４】
段落ＢＫ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、骨髄系細胞において発現される、方法。
【０２１５】
段落ＢＬ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、骨髄由来のサプレッサー細胞において発現される、方法。
【０２１６】
段落ＢＭ．段落ＡＮ〜ＡＲのいずれかの方法において、
サブセットバイオマーカーは、腫瘍関連マクロファージにおいて発現される、方法。
【０２１７】
段落ＢＮ．段落ＡＯの方法において、
目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、視野内のすべての細胞の第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
【０２１８】
段落ＢＯ．段落ＡＮ〜ＢＮのいずれかの方法において、
総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【０２１９】
特定の実施形態を例示および説明してきたが、以下の特許請求の範囲に定められるようなさらに広範な態様におけるテクノロジーから逸脱せずに、当技術分野の通常の知識に従って変更および改変が行われ得ることを理解されたい。
【０２２０】
本明細書で例示的に説明された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の１つ以上の要素、制限がない場合も適切に実施され得る。よって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」などの用語は、制限なしに広く読み取るべきである。さらに、本明細書で使用する用語および表現は、制限する用語ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、図示および説明した特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、さまざまな改変が、特許請求されたテクノロジーの範囲内で可能であることが認識される。さらに、「から本質的になる」という語句は、具体的に列挙された要素、および特許請求されたテクノロジーの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない追加要素を含むことが理解される。「からなる」という語句は、特定されていないいかなる要素も排除する。
【０２２１】
本開示は、本出願に記載された特定の実施形態の点で限定されない。当業者には明らかであるように、多くの改変および変形が、その趣旨および範囲を逸脱せずに、行われ得る。本明細書で列挙されたものに加えて、本開示の範囲内で機能的に等価な方法および組成が、前記の説明から当業者には明らかであろう。このような改変および変形は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。本開示は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に、特許請求の範囲の条件によってのみ制限されるものである。本開示は特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらが当然変化し得ることが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、制限することを意図していないことも理解される。
【０２２２】
さらに、開示の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本開示がこれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でも説明されていることを認識するであろう。
【０２２３】
当業者には理解されるように、ありとあらゆる目的で、特に、書面での説明を提供する点で、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせも含む。列挙された範囲は、その同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分かれることを十分に説明し、かつ可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な実施例として、本明細書で論じた各範囲は、下３分の１、真ん中の３分の１、上３分の１などに容易に分かれ得る。やはり当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「超」、「未満」などのすべての語は、列挙された数を含み、続いて前述したような下位範囲に分かれ得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々の構成要素それぞれを含む。
【０２２４】
本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願、発行特許、および他の文献は、個別の刊行物、特許出願、発行特許、または他の文献それぞれが、参照により全体として組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれるテキストに含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲において排除される。
【０２２５】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載する。
【０２２６】
〔実施の態様〕
（１）  視野に存在する、すべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはり前記サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第４のマスクの総面積を前記第１のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第１のサブセットを表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、前記第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、前記第６のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、
を含む、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第８のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
（５）  実施態様１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０２２７】
（６）  実施態様１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（７）  実施態様４に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（８）  実施態様４に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、前記目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
（１０）  実施態様１に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【０２２８】
（１１）  実施態様１０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
（１２）  実施態様１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
（１３）  実施態様１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
（１４）  実施態様１１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
（１５）  実施態様１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
【０２２９】
（１６）  実施態様１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
（１７）  実施態様１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
（１８）  実施態様１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
（１９）  実施態様１に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
（２０）  実施態様２に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
【０２３０】
（２１）  実施態様１に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
（２２）  癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、前記少なくとも２つのサンプルそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）前記少なくとも第１のＰＢＰの値および前記少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、前記免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
（２３）  実施態様２２に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、前記減少は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
（２４）  実施態様２２に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、前記増大は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
（２５）  実施態様２２に記載の方法において、
前記免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
【０２３１】
（２６）  癌と診断され、免疫療法を受けている患者の進行を監視する方法において、
（ｉ）１回は免疫療法の開始前、１回は免疫療法の開始後の、少なくとも２つの時点にわたって癌患者から採取された腫瘍組織を含む少なくとも２つのサンプルを用いて、前記少なくとも２つのサンプルのそれぞれについて目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出して、少なくとも第１のＰＢＰの値および少なくとも第２のＰＢＰの値を得る工程と、
（ｉｉ）前記少なくとも第１のＰＢＰの値および前記少なくとも第２のＰＢＰの値を記録する工程であって、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での変化は、前記免疫療法の有効性を示す、工程と、を含む、方法。
（２７）  実施態様２６に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での減少であり、前記減少は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
（２８）  実施態様２６に記載の方法において、
前記変化は、前記少なくとも第１のＰＢＰの値と前記少なくとも第２のＰＢＰの値との間での増大であり、前記増大は、前記免疫療法の有益な有効性を示す、方法。
（２９）  実施態様２６に記載の方法において、
前記免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
（３０）  視野に存在するすべての腫瘍細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）前記視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり前記目的のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第５のマスクの総面積を前記第３のマスクの総面積で割ることにより、前記目的のバイオマーカーを発現するすべての腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０２３２】
（３１）  実施態様３０に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣからなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（３２）  実施態様３０に記載の方法において、
前記視野は、非腫瘍細胞をさらに含む、方法。
（３３）  実施態様３２に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
（３４）  実施態様３０に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
（３５）  視野に存在するすべての非腫瘍細胞についてバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）前記視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｉｖ）目的のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す蛍光信号の第４のマスクを構築する工程と、
（ｖ）やはり前記目的のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての非腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第３および第４のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第５のマスクの総面積を前記第３のマスクの総面積で割ることにより、前記目的のバイオマーカーを発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０２３３】
（３６）  実施態様３５に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（３７）  実施態様３５に記載の方法において、
前記目的のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（３８）  実施態様３５に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、免疫細胞および間質細胞を含む、方法。
（３９）  実施態様３５に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、骨髄系細胞を含む、方法。
（４０）  視野に存在するすべての細胞、またはオプションとして、その１つ以上のサブセットのバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を導き出す方法において、
（ｉ）視野に存在するすべての細胞の核を表す第１の蛍光信号の画像を生成し、前記第１の蛍光信号を完全な細胞の核の直径まで拡張して、前記視野に存在するすべての細胞の第１のマスクを構築する工程と、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第２の蛍光信号の第２のマスクを構築する工程と、
（ｉｉｉ）オプションとして、目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第３の蛍光信号の第３のマスクを構築する工程と、
（ｉｖ）やはり前記サブセットバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第４のマスクを提供するように、前記第１および第２のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖ）オプションとして、やはり前記目的の第１のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第５のマスクを提供するように、前記第１および第３のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉ）前記第４のマスクの総面積を前記第１のマスクの総面積で割ることによって、前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、
（ｖｉｉ）オプションとして、
（ａ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｂ）前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーを発現する、
前記視野内のすべての細胞を表す蛍光信号を含む第６のマスクを提供するように、前記第４および第５のマスクを組み合わせる工程と、
（ｖｉｉｉ）オプションとして、前記第６のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることによって、（ａ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または（ｂ）前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーを発現する、すべての細胞の前記第１のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、を含む、方法。
【０２３４】
（４１）  実施態様４０に記載の方法において、
列挙されたすべてのオプション工程が実施される、方法。
（４２）  実施態様４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）やはり前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野にあるすべての細胞の第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第１および第７のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉ）前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野内のすべての細胞の前記第２のサブセットを表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第４および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞の前記第２のサブセットのＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
（４３）  実施態様４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、前記第２のマスクを前記第１のマスクから減じる工程と、
（ｘｉ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞を表す蛍光信号を含む第９のマスクを提供するように、前記第７および第８のマスクを組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第９のマスクの総面積を前記第８のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第２のバイオマーカーを発現するが前記サブセットバイオマーカーを発現しないすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
（４４）  実施態様４０に記載の方法において、
（ｉｘ）目的の第２のバイオマーカーを発現する、前記視野に存在するすべての領域を表す第４の蛍光信号の第７のマスクを構築する工程と、
（ｘ）前記第６および第７のマスクを、
（ａ）前記視野内で前記サブセットバイオマーカー、前記目的の第１のバイオマーカー、および前記目的の第２のバイオマーカーを発現するか、
（ｂ）前記視野内で前記目的の第２のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第１のバイオマーカーを発現するか、または、
（ｃ）前記視野内で前記目的の第１のバイオマーカーの非存在下で前記サブセットバイオマーカーおよび前記目的の第２のバイオマーカーを発現する、
すべての細胞を表す蛍光信号を含む第８のマスクを提供するように、組み合わせる工程と、
（ｘｉｉ）前記第８のマスクの総面積を前記第４のマスクの総面積で割ることにより、前記目的の第１のバイオマーカーもしくは前記目的の第２のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせ、ならびに前記サブセットバイオマーカーを発現するすべての細胞のＰＢＰの値を導き出す工程と、をさらに含む、方法。
（４５）  実施態様４０に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
【０２３５】
（４６）  実施態様４０に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン９、およびＭＨＣから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（４７）  実施態様４３に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＣＲから選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（４８）  実施態様４３に記載の方法において、
前記目的の第２のバイオマーカーは、前記目的の第１のバイオマーカーとは異なり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、およびＣＤ８６から選択されたバイオマーカーを含む、方法。
（４９）  実施態様４０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、腫瘍細胞を含む、方法。
（５０）  実施態様４０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、非腫瘍細胞を含む、方法。
【０２３６】
（５１）  実施態様５０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、Ｔ細胞を含む、方法。
（５２）  実施態様５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する、方法。
（５３）  実施態様５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現する、方法。
（５４）  実施態様５１に記載の方法において、
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する、方法。
（５５）  実施態様５０に記載の方法において、
前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、骨髄系細胞を含む、方法。
【０２３７】
（５６）  実施態様５５に記載の方法において、
前記骨髄系細胞は、骨髄由来のサプレッサー細胞である、方法。
（５７）  実施態様５５に記載の方法において、
前記骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである、方法。
（５８）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
（５９）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞においてのみ発現される、方法。
（６０）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞において発現される、方法。
【０２３８】
（６１）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む、方法。
（６２）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む、方法。
（６３）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、骨髄系細胞において発現される、方法。
（６４）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、骨髄由来のサプレッサー細胞において発現される、方法。
（６５）  実施態様４０に記載の方法において、
前記サブセットバイオマーカーは、腫瘍関連マクロファージにおいて発現される、方法。
【０２３９】
（６６）  実施態様４１に記載の方法において、
前記目的の第１のバイオマーカーは、Ｋｉ６７を含み、前記視野内のすべての前記細胞の前記第１のサブセットは、ＣＤ８陽性細胞を含む、方法。
（６７）  実施態様４０に記載の方法において、
前記総面積は、ピクセルで測定される、方法。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】撮像および分析のための組織サンプルの調製に使用される抗体および検出試薬の概要の非限定的な実施例を示す。
【図２ａ】画像内でＤＡＰＩにより検出されたすべての核の非限定的な実施例を示す。
【図２ｂ】図２ａの画像内のすべての細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図３ａ】４８８色素で検出されたＳ１００の画像の非限定的な実施例を示す。
【図３ｂ】図３ａの画像内のすべての腫瘍領域のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図３ｃ】図３ａの画像内のすべての腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図３ｄ】図３ａの画像内のすべての非腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図４ａ】Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ−Ｌ１の画像の非限定的な実施例を示す。
【図４ｂ】図４ａの画像内のすべてのＰＤ−Ｌ１陽性細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図４ｃ】図４ａの画像内のすべてのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図４ｄ】図４ａの画像内のすべてのＰＤ−Ｌ１陽性非腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図５ａ】Ｃｙ（登録商標）３．５で検出されたＰＤ−１の画像の非限定的な実施例を示す。
【図５ｂ】図５ａの画像内のすべてのＰＤ−１陽性非腫瘍細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図６ａ】増大するＰＤ−Ｌ１発現で分類された、２１人の黒色腫患者からの組織サンプル中のＰＤ−Ｌ１を発現するすべての細胞のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値の非限定的な実施例を示す。
【図６ｂ】増大するＰＤ−１発現で分類された、同じ２１人の黒色腫患者からの組織サンプル中のＰＤ−１を発現するすべての非腫瘍細胞のＰＢＰの値の非限定的な実施例を示す。
【図７】免疫療法に対する陽性反応者のＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ−１陽性細胞（黄色）、すべての腫瘍細胞（緑色）、およびすべての細胞（青色）に対応する蛍光信号のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図８】免疫療法に対する陰性反応者のＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ−１陽性細胞（黄色）、すべての腫瘍細胞（緑色）、およびすべての細胞（青色）に対応する蛍光信号のマスクの非限定的な実施例を示す。
【図９】３８人の非小細胞肺癌患者のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１のバイオマーカー陽性率（ＰＢＰ）の値を示す。
【図１０】自動細胞計数方法と本明細書に記載する方法とにより確認されるような、ＰＤ−Ｌ１陽性率の比較を示す。
【図１１】例示的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すプロセスのフローチャートである。
【図１２】第２の例示的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すプロセスのフローチャートである。
【図１３】例示的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すように構成されたコントローラのブロック図である。
【図１４】例示的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すのに使用される画像処理工程のフローダイヤグラムである。
【図１５】撮像および分析のための組織サンプルの調製において使用される抗体および検出試薬の概要の別の非限定的な実施例を示す。
【図１６ａ】画像内でＤＡＰＩにより検出されたすべての核の非限定的な実施例の非限定的な実施例を示す。
【図１６ｂ】図１６ａの画像内のすべての細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図１７ａ】Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ−１の画像の非限定的な実施例を示す。
【図１７ｂ】図１７ａの画像内のすべてのＰＤ−１陽性細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図１８ａ】Ｃｙ（登録商標）３で検出されたＣＤ３の画像の非限定的な実施例を示す。
【図１８ｂ】図１８ａの画像内のすべてのＣＤ３陽性細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図１９】ＰＤ−１およびＣＤ３に対して二重陽性であるすべての細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。
【図２０ａ】ＤＬＢＣＬ患者からの組織サンプル（ｎ＝４３）中のＣＤ３＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２０ｂ】ＤＬＢＣＬ患者からの組織サンプル（ｎ＝４３）中のＣＤ３＋／ＰＤ１＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２１ａ】ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織におけるＣＤ２５の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２１ｂ】ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織におけるＦｏｘＰ３の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２２】ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織内のＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２３ａ】ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織におけるＣＤ４の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２３ｂ】ＮＳＣＬＣ、胃、および黒色腫組織におけるＣＤ８の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２４ａ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２４ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２５ａ】転移性黒色腫組織におけるＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２５ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２６ａ】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３３＋／ＡＲＧ１＋表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２６ｂ】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＩＤＯ−１＋表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２７】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ−／ＩＤＯ−１＋表現型の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２８】転移性黒色腫組織におけるＣＤ８＋Ｋｉ６７＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２９ａ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１６３＋細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２９ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ６８＋細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図２９ｃ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１６３＋ＣＤ６８＋細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図３０ａ】ＤＬＢＣＬおよびＮＥＴ組織におけるＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図３０ｂ】ＤＬＢＣＬおよびＮＥＴ組織におけるＴＩＭ−３陽性Ｔ細胞の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図３１ａ】黒色腫組織におけるＴ細胞中のＣＴＬＡ−４の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図３１ｂ】黒色腫組織におけるＣＤ８０の定量的評価の非限定的な実施例を示す。
【図３２】免疫構造に基づいた代表的な腫瘍分類を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図２９ｃ】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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