(57)【要約】タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを始めとする生体分子をエステル化する方法及び試薬。Ｒが、水素、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、ＲＡが、示されたフェニル環上の１〜５つの置換基を表し、ＲＭが、有機基であり、有機基としては、数ある中でも、標識、細胞浸透性基、細胞標的化基、又は標識、細胞浸透性基、若しくは細胞標的化基に結合させる反応のための反応性基若しくは潜在的反応性基が挙げられる、式（Ｉ）のジアゾ化合物は、生体分子のエステル化に有用である。二官能性及び三官能性カップリング試薬であるジアゾ化合物、並びに式（Ｉ）の化合物を合成するための試薬も提供される。【選択図】  図１
2018512424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2018512424.tif 000051
又はその塩
［式中、
Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル基、又は水素であり、
ＲＡは、示されたフェニル環上の１〜５つの置換基を表し、
ＲＭは、１〜１００個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する非ポリマー有機基Ｍ若しくはＭ１であり、又は−Ｌ−Ｍ若しくは−Ｌ１−Ｍ１であり、−Ｌ−及び−Ｌ１−は、独立に、１〜３０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する二価のリンカー部分であり、又は
ＲＭは、前記化合物に直接結合している、又は前記化合物に前記二価リンカー−Ｌ−によって結合しているポリマーである］。
【請求項２】
ＲＭが、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアリール基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＲＭが、標識、細胞浸透性基、細胞標的化基、又は反応性基若しくは潜在的反応性基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記細胞標的化基が、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記細胞標的化基が、抗体又はその機能性断片である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＲＡが、各フェニル環位置における水素を表し、又は前記フェニル環上の１〜３つの非水素置換基を表し、前記非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、及びＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−からなる群から選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜３つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、
ＲＭ又はＲＭ１が、独立に、１〜１００個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する、任意選択により置換されている有機基、それぞれＭ若しくはＭ１であり、又はそれぞれ−Ｌ−Ｍ若しくは−Ｌ１−Ｍ１であり、−Ｌ−及び−Ｌ１−は、独立に、１〜３０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する二価のリンカー部分であり、又は
ＲＭ又はＲＭ１が、ポリマーであり、又はこれを含み、前記ポリマーは、前記化合物に直接結合している、又はリンカーを介して結合している、
請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＲＭ又はＲＭ１が、カーゴ分子である、又はこれを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ＲＭ又はＲＭ１が、親水性ポリマーである、又はこれを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ＲＭ又はＲＭ１が、ポリエチレングリコールである、又はこれを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ＲＡが、少なくとも１つの非水素基を有するパラ環位置又はメタ環位置での環置換を表す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＲＡが、−０．２〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する非水素基である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
ＲＡが、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
ＲＡが、フェニル環上のパラ位にあるメチル基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
ＲＡが、ＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−基であり、ＲＰは、ＲＭ１又はＭ１である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ＲＰが、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
ＲＭが、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
ＲＭ又はＲＭ１が、任意選択によりリンカーによって間接的に結合している標識若しくはレポーター分子である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
ＲＭ又はＲＭ１が、任意選択によりリンカーによって間接的に結合しているビオチン若しくはその誘導体である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
ＲＭ又はＲＭ１が、任意選択によりリンカーによって間接的に結合している細胞浸透性基である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
ＲＭ又はＲＭ１が、細胞標的化基である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記細胞標的化基が、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
ＲＭ又はＲＭ１が、反応性基若しくは潜在的反応性基である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
ＲＭ又はＲＭ１が、アミン若しくはチオール反応性基である、又はこれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
ＲＭが、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
ＲＡが、フェニル環上のパラ位において置換されたアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
ＲＭが、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、又は２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒが水素又はメチル基である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をエステル化する方法であって、前記有機分子又は生体分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２９】
有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をエステル化する方法であって、前記有機分子又は生体分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含み、前記有機分子又は生体分子は、カーゴ分子である、方法。
【請求項３０】
有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基を標識する方法であって、前記有機分子又は生体分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含み、前記化合物は、標識を含む、方法。
【請求項３１】
有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をビオチン化する方法であって、前記有機分子又は生体分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含み、前記化合物は、ビオチン又はその誘導体を含む、方法。
【請求項３２】
有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をペグ化する方法であって、前記有機分子又は生体分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含み、前記化合物は、ポリエチレングリコールを含む、方法。
【請求項３３】
カーゴ分子を細胞に標的化する方法であって、前記カーゴ分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物でエステル化するステップを含み、前記化合物は、標的化基を含む、方法。
【請求項３４】
１つ又は複数のカルボキシレート基を有するカーゴ分子の細胞内取込みを強化する方法であって、前記カーゴ分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物でエステル化するステップを含み、前記化合物は、細胞浸透性基を含む、方法。
【請求項３５】
１つ又は複数のカルボキシレート基を有するカーゴ分子の細胞内取込みを強化する方法であって、前記カーゴ分子を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物でエステル化するステップを含み、前記細胞浸透性基が、フルオレニル基又はフェニルボロネート基である、方法。
【請求項３６】
式：
【化２】
2018512424.tif 000052
の化合物又はその塩
［式中、
ＲＡは、示されたフェニル環上の１〜５つの置換基を表し、
ＡＣは、活性化エステルの脱離基を表す］。
【請求項３７】
式：
【化３】
2018512424.tif 000053
［式中、Ｅが水素又は−ＳＯ３−（スルホ）塩である］
である、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
ＲＡが、各フェニル環位置における水素を表し、又は前記フェニル環上の１〜３つの非水素置換基を表し、前記非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、及びＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−からなる群から選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜３つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、
ＲＭ１は、１〜１００個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する、任意選択により置換されている有機基、それぞれＭ若しくはＭ１であり、又はそれぞれ−Ｌ−Ｍ若しくは−Ｌ１−Ｍ１であり、−Ｌ−及び−Ｌ１−は、独立に、１〜３０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する二価のリンカー部分であり、又は
ＲＭ１は、ポリマーであり、又はこれを含み、前記ポリマーは、前記化合物に直接結合している、又はリンカーを介して結合している、請求項３６又は３７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連技術の相互参照］
[001]本出願は、それぞれ参照により全体が本明細書に援用される、２０１５年４月９日出願の米国特許仮出願第６２／１４５，１９３号及び２０１６年４月６日出願の米国特許仮出願第６２／３１９，１５３号の権益を主張する。
【０００２】
［政府支援に関する記述]
[002]本発明は、米国国立保健研究所より与えられたＧＭ０４４７８３及びＧＭ００７２１５のもとで政府支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の背景］
[003]化学選択的変換［１〜３］は、現代の化学生物学において枢要な重要性を有する。タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸は、側鎖中及びＣ末端にカルボキシル基を有する。効率的であり、高い収率が得られ、緩衝水溶液中で実施することのできる、このようなカルボキシル基、詳細には、ポリペプチド及びタンパク質中のカルボキシル基の選択的なエステル化の方法及び試薬は、特に重要である。触媒を必要としないエステル化反応も、特に重要である。タンパク質エステル化を用いると、たとえば、タンパク質標識（同位体、放射標識、又は蛍光標識）を行うことができ、またタンパク質上で制御可能及び効率的にタンパク質親油性を増大又は正電荷を増加させ、したがって細胞内取込みを促進する道筋を得ることもできる。［２０］
【０００４】
[004]また、生成するエステルが「生体内可逆性」であるために、エステル基がエステラーゼによって除去可能となる、ある特定の適用例も重要である。詳細な適用例では、タンパク質を特定の細胞型に向かわせる、及び／又はタンパク質の細胞内取込みを促進する部分でタンパク質を官能化するのに、エステル化を用いることができる。エステル化が生体内可逆性である場合、タンパク質を細胞に向ける、又はタンパク質の細胞への取込みを強化するために付加された基は、細胞において内因性酵素によって除去されて、未変性タンパク質を再生させることができる。
【０００５】
[005]ジアゾ基は、合成有機化学において最も多用途の官能基の１つである。［２３ａ〜ｅ、４、２４］最近では、ジアゾ化合物は、アルキンとの１，３−双極付加環化反応における１，３−双極子としてアジ化物の代わりに用いることができると報告されている。［４］速度は、類似アジ化物の速度を大いに上回る場合があり［４］、反応は、哺乳動物細胞の存在下で化学選択的である。［２４］このような反応におけるジアゾ化合物の使用は、ホスフィノエステルを使用してアジ化物をジアゾ化合物に変換する方法が利用可能な状況で、少なくともある程度は実施可能になった。［５］こうした方法は、このような方法についてのその説明及びその方法によって調製されたジアゾ化合物について、参照により全体が本明細書に援用される米国特許第８，３５０，０１４号に記載されている。加えて、ジアゾ化合物は、Ｃ−Ｈ及びＮ−Ｈ挿入反応を介したタンパク質の標識にも使用されている。［２５ａ、ｂ］
【０００６】
[006]ジアゾメタンでのカルボン酸のエステル化は、生物学上の可能性を秘めているが、チロシン側鎖上のヒドロキシル基及びリシン側鎖上のアミノ基との非特異的な反応性を欠点として有する。［６］加えて、この過程は、生物学的環境中に存在する種々のエステラーゼに対して非特異的に不安定であるために生体系において特に有用ではないメチルエステルへの接近手段にしかならない。［７］共通の生体機能性部分を標的とした特異性を有する、有害な副反応を伴わない化合物が特に有用である。［８］
【０００７】
[007]安定化させたジアゾ化合物が、合成有機化学において普及している。［９］これは主として、こうした化合物が、金属カルベノイドを形成することによりカルボン酸及びアミドと反応して［１０］、それぞれＯ−Ｈ又はＮ−Ｈ結合挿入を促進しうるためである。［１１、１２］毒性金属の使用を回避する努力の中で、フッ素系有機溶媒［１３］は、極性が強く求核性が弱いために、反応促進の十分な助けとなったことが報告された。［１４］加えて、現場で生成される種々の非安定化ジアゾ化合物も、カルボン酸のエステル化をなしうることが示されたが［１５］、性質が不安定であるために、その生物学的有用性は限定される。
【０００８】
[008]生物学的状況における安定化させたジアゾ化合物の初期の使用は、タンパク質上の反応性カルボン酸を見分けるために、ジアゾグリシンアミド［１６］、ジフェニルジアゾメタン［１７］、又はジアゾアセトアミド［１８、１９］を加えるものであった。こうした方法ではすべて、適度の標識を実現するのに、ジアゾ化合物をおびただしく過剰に加え、反応ｐＨを長々とモニターする必要があった。その上、アミノ、スルフヒドリル、及びフェノール側鎖がアルキル化されたので、反応は、化学選択的でなかった。このような修飾は、タンパク質機能にとって潜在的に有害であり、生体内可逆性でない。［３０］
【０００９】
[009]最近では、９−ジアゾフルオレンの塩基性度の恩恵で、このジアゾ化合物が、水性環境中でタンパク質のカルボキシル基を標識する能力を得ていることが報告されている。［４］アセトニトリル及びアセトニトリル／水性緩衝液（３：１ｖ／ｖ）中で、９−ジアゾフルオレンの種々のカルボン酸との反応性を、Ｎ−ベンジル−２−ジアゾアセトアミドの反応性と比較すると、有機溶媒中では両方のジアゾ化合物で所望のエステルが得られたが、水性媒質中では９−ジアゾフルオレンでしか所望のエステルが得られなかったことが示された。対照的に、２−ジアゾマロン酸ジエチルは、有機又は水性媒質中でのエステル生成について、非反応性であることがわかった。ジアゾ化合物が水性媒質中で所望のエステルを生成する反応性は、ジアゾ化合物がカルボン酸からプロトンを抜き取る能力と関連することが報告されている。さらに、プロトンを抜き取るこの能力は、（ジアゾ基に結合した有機部分の共役酸についてジメチルスルホキシド［２１］中で測定されるｐＫａ（たとえば、ジエチルマロネート（ｐＫａ＝１６．４）、フルオレン（ｐＫａ＝２２．６）、及びジエチルアセトアミド（ｐＫａ３５）の共役酸）と関連することが報告されている。９−ジアゾフルオレンは、（１０当量で）ＲＮアーゼＡにおける１１のうち平均３つのカルボキシレートに対して標識する働きをすることが報告されている。
【００１０】
[0010]タンパク質標識及び他の有用なタンパク質修飾のために、カルボン酸から生物学的エステルを化学選択的に生成する試薬及び方法の開発において、多少の成功が収められてはいるものの、タンパク質及び他の生物学的存在物（たとえば、核酸）のための、生体内可逆性のエステル生成をもたらす、より効率のよい化学選択的エステル化試薬は、当業界で依然として求められている。加えて、生物学的に有用な存在物での修飾に合成上適用できる化学選択的エステル化試薬も、当業界で依然として求められている。
【００１１】
［発明の概要］
[0011]本発明は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを始めとする生体分子をエステル化する方法及び試薬を提供する。本発明は、式Ｉのある特定のジアゾ化合物を提供する。
【化１】
2018512424.tif 000003
式中、ＲＡは、示されたフェニル環上の１〜５つの置換基を表し、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、ＲＭは、有機基であり、有機基としては、数ある中でも、標識、細胞浸透性基、細胞標的化基、又は標識、細胞浸透性基、若しくは細胞標的化基に結合させる反応のための反応性基若しくは潜在的反応性基が挙げられる。ＲＭは、スペーサー又はリンカー基を任意選択により含む。詳細な一実施形態では、細胞標的化基は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである。詳細な一実施形態では、細胞標的化基は、抗体又はその機能性断片である。式Ｉのジアゾ化合物は、生体分子のカルボン酸基、特に、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの側鎖及びＣ末端のカルボン酸基を、ジアゾ基の反応によってエステルに変換するのに有用である。詳細な実施形態では、エステル化は、緩衝水性溶媒中にて、５〜７の範囲のｐＨ、好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで実施され、触媒の使用を必要としない。詳細な実施形態では、ＲＭは、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、又はアリール基である。詳細な実施形態では、Ｒ及びＲＭは、これらが結合している窒素と一緒になって、任意選択により置換されている５〜１０員の環系を形成しており、この環系は、Ｎに加えて１個又は２個のヘテロ原子を任意選択により含んでいる。詳細な実施形態では、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有する、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルである。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルであり、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有する、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルであり、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。アルキル、アルケニル、又はアルキニル基の任意選択による置換には、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシから選択される非水素置換基での置換が含まれる。
【００１２】
[0012]詳細な一実施形態では、ジアゾ化合物は、
Ｒが、水素、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、
ＲＡが、各フェニル環位置における水素を表し、又はフェニル環上の１〜５つの非水素置換基を表し（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）、非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、スルフヒドリル（−ＳＨ）、チオアルキル（−Ｓ−アルキル）、−ＮＨ２、及び−ＮＨ−ＣＯ−ＲＰからなる群から選択され、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜３つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、
ＲＭ又はＲＭ１が、独立に、１〜１００個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する、任意選択により置換されている有機基、それぞれＭ若しくはＭ１であり、又はそれぞれ−Ｌ−Ｍ若しくは−Ｌ１−Ｍ１であり、−Ｌ−及び−Ｌ１−は、独立に、１〜３０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する二価のリンカー部分であり、又は
ＲＭ又はＲＭ１が、ポリエチレングリコールなどのポリマーであり、又はこれを含み、ポリマーは、化合物に直接結合している、又はリンカー（−Ｌ−及び−Ｌ１−）を介して結合している、
式Ｉの化合物である。
【００１３】
[0013]詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、カーゴ分子である。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、両方がカーゴ分子である。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、親水性ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、数平均分子量が１０，０００以下である親水性ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、１０，０００未満の数平均分子量を有する。
詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１〜３つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１又は２つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。
【００１４】
[0014]本発明はまた、有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をエステル化する方法であって、有機分子又は生体分子を式Ｉのジアゾ化合物と接触させるステップを含む方法を提供する。式Ｉのジアゾ化合物を用いるエステル化では、ＲＭ及び／又はＲＭ１に応じて、エステル化される種（たとえば、タンパク質）の標識、細胞標的化、及び／又は細胞浸透を促進することができる。ＲＭ及び／又はＲＭ１が反応性基若しくは潜在的反応性基である又はこれを含む式Ｉの化合物は、たとえば、標識、細胞浸透性基、又は細胞標的化基である他のＲＭ及び／又はＲＭ１基を、式Ｉのジアゾ部分に結合するための二官能性又は三官能性試薬として用いることができる。より詳細には、ＲＭ及び／又はＲＭ１が反応性基若しくは潜在的反応性基である又はこれを含む式Ｉの化合物は、反応性及び潜在的反応性基が直交型反応性を有する場合では、ヘテロ二官能性又はヘテロ三官能性試薬として用いることができる。
【００１５】
[0015]詳細な実施形態では、本発明は、式ＩＩの化合物を提供する。
【化２】
2018512424.tif 000004
式中、ＲＡは、上記式Ｉについてのとおりに規定され、ＡＣは、活性化エステルの脱離基を表す。式Ｖの化合物は、少なくとも、式Ｉの化合物の調製における試薬として有用である。活性化エステルとしては、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＮＨＳエステル）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、フェニルエステル［フェニル基は、１つ又は複数の電子吸引性基（たとえば、ニトロ基又はハロゲン）で置換されている］、任意選択により置換されているアルキル又はアリールスルホン酸エステル（たとえば、トシルエステル、メシルエステル、又はトリフレートエステル）が挙げられる。こうした化合物は、少なくとも、本発明のジアゾエステル化試薬の調製に有用である。
【００１６】
[0016]式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、示された環の、フェニル環上での１〜５つの非水素置換基での置換を表し（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）、非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、スルフヒドリル（−ＳＨ）、チオアルキル（−Ｓ−アルキル）、−ＮＨ２、及び−ＮＨ−ＣＯ−ＲＰからなる群から選択され、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜５つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、ＲＭ１は、式Ｉについて規定したとおりである。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上のパラ位にある。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メチルである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルオキシである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メトキシである。
【００１７】
[0017]詳細な実施形態において、本発明は、式ＩＩＡの試薬を提供する。
【化３】
2018512424.tif 000005
式中、ＲＡは、式Ｉについて規定したとおりであり、Ｅは、水素又は−ＳＯ３−（スルホ）塩（たとえば、ナトリウム塩）である。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上のパラ位にある。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メチルである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルオキシである。詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メトキシである。
【００１８】
[0018]本発明のその他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び非限定的な実施例を吟味することで当業者に明白となろう。
【００１９】
［図面の簡単な説明］
［図１］  図１は、パネルＡにおいて、ジアゾ化合物の反応性及び選択性を試験するための骨格を示す。図１は、パネルＢにおいて、ジアゾ化合物１〜６の合成経路を示し、ステップは、ａ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ、ｂ）ＮａＮ３、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ、ｃ）ＮＨＳ、ＤＣＣ、ＴＨＦ、ｄ）ＰｈＣＨ２ＮＨ２、ＤＣＭ、ｅ）Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート、次いでＮａＨＣＯ３又はＤＢＵ［５ａ、ｂ］、ｆ）イミダゾール−１−スルホニルアジド塩酸塩、ＤＢＵ、ＣｕＳＯ４、ＭｅＯＨ［２９］である。
【００２０】
［図２］  図２は、パネルＡにおいて、ＣＤ３ＣＮ中でのジアゾ化合物１〜６によるＢｏｃＧｌｙＯＨのエステル化の二次速度定数の表を示す。図２は、パネルＢにおいて、パネルＡのデータのハメットプロットを示す。σｐの値は、Ｈａｎｓｃｈら［３２］からのものである。ρ＝−２．７。
【００２１】
［図３］  図３は、図の上部において、エステル又はアルコールを生成する反応を示す。図３には、図の下部において、１：１の緩衝液：アセトニトリル中でのジアゾ化合物１〜６の化学選択性（エステル／アルコール生成物比）に対するσｐ値の影響を示すグラフも提供する。
【００２２】
［図４］  図４は、図の上部において、エステル又はアルコール生成物を生成する、ジアゾ化合物２の酸ａ〜ｃとの反応を示す。図４には、図の下部において、酸ａ〜ｃの構造も示し、水溶液中でのジアゾ化合物２のエステル化反応の化学選択性の例証となる生成物比の表も提供する。
【００２３】
［図５］  ９−ジアゾフルオレン（パネルＡ）及びジアゾ化合物２（パネルＢ）を用いたＲＮアーゼＡのエステル化についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データを示すグラフである。
【００２４】
［図６］  ０．８〜５０ｍＭの濃度範囲にわたって測定したジアゾ化合物２の紫外スペクトルを示すグラフである（パネルＡ）。パネルＢには、ε＝３０．５Ｍ−１ｃｍ−１を与えるλｍａｘ＝４３５ｎｍでのジアゾ化合物２の吸光度の濃度依存性のプロットを提供する（０．８〜５０ｍＭ）。
【００２５】
［図７］  図７に、ある特定のジアゾ化合物によるＧＦＰの標識効率の定量化を報告する。パネルＡには、ある特定のジアゾ化合物の化合物構造及びｌｏｇ  Ｐを示す。図７パネルＢは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定した、ＧＦＰに付加された標識の数を各ジアゾ化合物について示すグラフである。
【００２６】
［図８］  蛍光強度中央値を測定するフローサイトメトリーを使用した、ＣＨＯ  Ｋ１細胞による標識対非標識ＧＦＰの内部移行の定量化を示すグラフである。前方散乱−側方散乱測定に基づき単一細胞を選別し、７ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）染色を使用して生細胞を選別した。
【００２７】
［図９］  エステル化されたＧＦＰ（緑色）のＣＨＯ  Ｋ１細胞による取込みの顕微鏡像を示す図である。（パネルＡ）エステル化していないもの。（パネルＢ）α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミド１０でエステル化したもの（パネルＣ）α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドでエステル化したもの。細胞核は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（青色）で染色している。
【００２８】
［発明の詳細な説明］
[0028]本発明は、ある特定のジアゾ化合物の、その構造及び電子特性に応じたカルボン酸基のエステル化についての反応性の研究を、少なくとも部分的に根拠とする。ジアゾ化合物は、カルボン酸をエステル化する働きをしうる。この反応性は、化学生物学に無類の機会をもたらしうる。たとえば、他の官能基のアルキル化とは異なり、カルボキシル基のＯ−アルキル化は、哺乳動物細胞が非特異的なエステラーゼを含んでいるために、生体内可逆性である。［７、２６ａ〜ｃ］しかし、タンパク質及び他の生体分子中のカルボキシル基のエステル化は、溶媒である水が、求電子性のアシル基を巡ってアルコールと有力に競合するため、実現することが難しい。対照的に、ジアゾ基を介したエステル化反応は、求核基として働くカルボキシル基に依拠する（スキーム１）。［２７ａ、ｂ］
【化４】
2018512424.tif 000006
【００２９】
[0029]ジアゾ化合物を使用してタンパク質を標識する試みがなされている。［１９、２８ａ〜ｃ］加水分解による分解を克服するのに、（１０３倍もの）大幅にモル過剰のジアゾ化合物が必要となった。その上、アミノ、スルフヒドリル、及びフェノール側鎖がアルキル化されたので、反応は、化学選択的でなかった。このような修飾は、タンパク質機能にとって潜在的に有害であり、生体内可逆性でない。［３０］本発明は、水性環境においてカルボキシル基のエステル化の改善を示すジアゾ化合物に関する。フェニルグリシンアミドの誘導体（図１、パネルＡを参照されたい）を調査した。この骨格は、Ｃαにおける電子密度をアミドのカルボニル基並びにフェニル基へと非局在化させ、そのため、エステル化反応のハメット分析［３１ａ〜ｄ］が可能になる。
【００３０】
[0030]本発明は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを始めとする生体分子をエステル化する方法及び試薬を提供する。本発明は、式Ｉのある特定のジアゾ化合物を提供する。
【化５】
2018512424.tif 000007
式中、ＲＡは、示されたフェニル環上の１〜５つの置換基を表し、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、ＲＭは、一般に有機基であり、有機基としては、数ある中でも、標識、細胞浸透性基、細胞標的化基、又は標識、細胞浸透性基、若しくは細胞標的化基に結合させる反応のための反応性基若しくは潜在的反応性基を挙げることができる。ＲＭは、スペーサー又はリンカー基を任意選択により含む。詳細な一実施形態では、細胞標的化基は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである。詳細な一実施形態では、細胞標的化基は、抗体又はその機能性断片である。式Ｉのジアゾ化合物は、生体分子のカルボン酸基、特に、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの側鎖及びＣ末端のカルボン酸基を、ジアゾ基の反応によってエステルに変換するのに有用である。詳細な実施形態では、エステル化は、緩衝水性溶媒中にて、５〜７の範囲のｐＨ、好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで実施され、触媒の使用を必要としない。詳細な実施形態では、ＲＭは、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、又はアリール基である。詳細な実施形態では、Ｒ及びＲＭは、これらが結合している窒素と一緒になって、任意選択により置換されている５〜１０員の環系を形成しており、この環系は、Ｎに加えて１個又は２個のヘテロ原子を任意選択により含んでいる。詳細な実施形態では、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有する、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルである。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルであり、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有する、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。詳細な実施形態では、Ｒは、水素、メチル、又はエチルであり、ＲＭは、１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、又はアルキニル基である。アルキル、アルケニル、又はアルキニル基の任意選択による置換には、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシから選択される非水素置換基での置換が含まれる。
【００３１】
[0031]詳細な一実施形態では、本発明において有用なジアゾ化合物は、
Ｒが、水素、任意選択により置換されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、
ＲＡが、各フェニル環位置における水素を表し、又はフェニル環上の１〜５つの非水素置換基を表し（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）、非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、スルフヒドリル（−ＳＨ）、チオアルキル（−Ｓ−アルキル）、−ＮＨ２、及び−ＮＨ−ＣＯ−ＲＰからなる群から選択され、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜３つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、
ＲＭ又はＲＭ１が、独立に、１〜１００個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する、任意選択により置換されている非ポリマー有機基、それぞれＭ若しくはＭ１であり、又はそれぞれ−Ｌ−Ｍ若しくは−Ｌ１−Ｍ１であり、−Ｌ−及び−Ｌ１−は、独立に、１〜３０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、若しくは硫黄原子とを有する二価のリンカー部分であり、又は
ＲＭ又はＲＭ１が、ポリエチレングリコールなどのポリマーであり、又はこれを含み、ポリマーは、化合物に直接結合している、又はリンカー（−Ｌ−及び−Ｌ１−）を介して結合している、
式の化合物である。
【００３２】
[0032]詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、カーゴ分子である。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、両方がカーゴ分子である。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、親水性ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、数平均分子量が１０，０００以下である親水性ポリマーである、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、１０，０００未満の数平均分子量を有する。
【００３３】
[0033]詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１〜３つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１又は２つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上の１つの非水素置換基を表す（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）。
【００３４】
[0034]詳細な実施形態では、ＲＡは、少なくとも１つの上で挙げたような非水素基を有するパラ環位置での環置換を表す。詳細な実施形態では、ＲＡは、少なくとも１つの上で挙げたような非水素基を有するメタ環位置での環置換を表す。
【００３５】
[0035]式Ｉの化合物は、フェニル環上のＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−基（上記構造の左）、又はフェニル環上のＲＭ（上記構造の右）を介したさらなる官能化のための１つ又は２つの部位を任意選択により有する。
【００３６】
[0036]詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．２〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での環置換を含む。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での環置換を含む。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．０５のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での環置換を含む。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜０のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での環置換を含む。
【００３７】
[0037]詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．２〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．０５のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜０のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での置換である。
【００３８】
[0038]詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．２〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での、パラ、メタ、又は両方の環位置における置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．１のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での、パラ、メタ、又は両方の環位置における置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜＋０．０５のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での、パラ、メタ、又は両方の環位置における置換である。詳細な実施形態では、ＲＡは、−０．１７〜０のハメットσｐ（パラ−シグマ）又はσｍ（メタ−シグマ）値を有する基での、パラ、メタ、又は両方の環位置における置換である。
【００３９】
[0039]詳細な実施形態では、ＲＡは、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個の二重結合及び２個〜４個の炭素原子を有するアルケニル基、非置換フェニル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルキルチオ基（−Ｓ−アルキル）、−ＮＨＣＯＲＮ基（ＲＮは、Ｈ又はメチル基である）、フッ素、又は−ＮＨ２から選択される１つ又は複数の置換基での置換を表す。詳細な実施形態では、ＲＡは、環上での、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個の二重結合及び１個〜４個の炭素原子を有するアルケニル基、フッ素、アルキルチオ基、フェニル基、−ＮＨＣＯＨ基、又は−ＮＨＣＯＣＨ３基によるパラ位での置換を表す。詳細な実施形態では、ＲＡは、環上での、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、フェニル基、又は−ＮＨ２基によるメタ位での置換を表す。
【００４０】
[0040]詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のパラ位にある単一の基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のメタ位にある単一の基である。
【００４１】
[0041]詳細な実施形態では、ＲＡは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。より詳細な実施形態では、ＲＡは、メチル又はエチルである。詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のパラ位にある、１〜６個の炭素原子を有する単一のアルキル基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のパラ位にある単一のメチル又はエチル基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のパラ位にあるメチル基である。
【００４２】
[0042]詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環に窒素を介して結合しているヘテロシクリル基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、式Ｉのフェニル環上のパラ位に窒素を介して結合しているヘテロシクリル基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環に、基の環上Ｎを介して結合している単一のピペラジニル基又はモルホリノ基である。詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環のパラ位に、基の環上Ｎを介して結合している単一のピペラジニル基又はモルホリノ基である。
【００４３】
[0043]詳細な一実施形態では、ＲＡは、ＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−基であり、ＲＰは、ＲＭ１又はＭ１である。詳細な実施形態では、単一のＲＰ−ＣＯ−ＮＨ−基が、式Ｉのフェニル環のパラ位において結合している。
【００４４】
[0044]諸実施形態において、ＲＭ及びＲＭ１は、独立に、１〜２０個、１〜３０個、１〜４０個、又は１〜５０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、又は硫黄原子とを有する有機基である。詳細な実施形態では、ＲＭ及び／又はＲＭ１は、窒素、酸素、又は硫黄から選択される１、２、３、４、又は６個のヘテロ原子を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１〜６個、１〜１０個、又は１〜２０個の炭素原子と、任意選択により窒素、酸素、又は硫黄原子とを有するリンカー部分である。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１〜４個の酸素原子（−Ｏ−）を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１〜４つの−ＣＯ−部分を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１〜４つの−Ｎ−ＲＮ−部分を有し、−ＲＮは、水素、又は１〜３個の炭素原子を有するアルキル基である。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１〜４つの−Ｓ−部分を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１つの−Ｓ−Ｓ−部分を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１又は２つの−ＣＯ−、−ＮＲＮ−、又は−ＮＲＮ−ＣＯ−部分を有する。諸実施形態において、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、１又は２つの−ＣＯ−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＯ−部分を有する。
【００４５】
[0045]詳細な実施形態では、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、アルケニレン部分−（ＣＨ２）ｑ−であり、又はこれを含み、ｑは、１〜６、１〜１２、又は１〜２０の整数である。詳細な実施形態では、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、アルコキシアルキル又はエーテル基、たとえば、−［Ｏ］ａ−［（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−］ｒ−（ＣＨ２）ｃ−であり、又はこれを含み、ａは、０又は１であり、ｂ及びｃは、独立に、０〜６の整数であり（ｂ又はｃの一方は０でない）、ｒは、０、又は１〜３、１〜６、若しくは１〜１０の整数である。詳細な実施形態では、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、アルコキシアルキル又はエーテル基、たとえば、−［Ｎ−ＲＮ］ｄ−［（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−］ｒ−（ＣＨ２）ｃ−であり、又はこれを含み、ｄは１であり、ｂ及びｃは、独立に、０〜６の整数であり（ｂ又はｃの一方は０でない）、ｒは、０、又は１〜３、１〜６、若しくは１〜１０の整数である。詳細な実施形態では、ＲＮは、水素であり、ｂは、２又は３であり、ｒは、１〜３又は１〜６であり、ｃは、０又は１である。詳細な実施形態では、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、アミノ部分、たとえば、−［ＮＲＮ］ａ−［（ＣＨ２）ｂ−ＮＲＮ−］ｒ−（ＣＨ２）ｃ−であり、又はこれを含み、ａは、０又は１であり、ｂ及びｃは、独立に、０〜６の整数であり（ｂ又はｃの一方は０でない）、ｒは、０、又は１〜３、１〜６、若しくは１〜１０の整数である。詳細な実施形態では、各ＲＮは、水素であり、ｂは、２又は３であり、ｒは、１〜３又は１〜６であり、ｃは、０、２、又は３である。詳細な実施形態では、−Ｌ−及び／又は−Ｌ１−は、この部分のいずれかの端に、このスペーサーを連結する働きをする１つ又は２つのＸ部分を含み、Ｘは、−ＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲＮ−、又は−ＲＮ−ＣＯ−から選択される。
【００４６】
[0046]一実施形態では、ＲＭは、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である。一実施形態では、ＲＭは、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である。
【００４７】
[0047]一実施形態では、ＲＰは、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である。一実施形態では、ＲＰは、１つ又は複数のアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基で任意選択により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基である。
【００４８】
[0048]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、独立に、標識又はレポーター分子（たとえば、蛍光標識、同位体標識、イメージング剤、量子ドットなど）を含む、又はこれである。一実施形態では、標識又はレポーターは、式Ｉのジアゾ化合物に、−Ｌ−又は−Ｌ１−を介して間接的に結合している。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方だけが、標識又はレポーターである、又はこれを含む。
【００４９】
[0049]詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ビオチン又はその誘導体である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、ビオチン又はその誘導体は、式Ｉの化合物に直接結合しているか、又はリンカーを介して間接的に結合している。
【００５０】
[0050]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ペプチド性カチオン種（たとえば、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ペネトラチン、ポリアルギニン（たとえば、ノナ−アルギニン）、より一般には、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）とも呼ばれる細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ））又は非ペプチド性カチオン種（たとえば、ＰＡＭＡＭデンドリマーやポリエチレンイミン）、グアニジウム、正電荷を有するアミン、任意選択により−アルキレン−ＣＯ２−を介して結合されるフルオレニル又はピレンなどの疎水性基（たとえば、ピレンブチレート）、任意選択により置換されているフルオレニル基、又は任意選択により置換されているフェニルボロネートを始めとするカチオン性ドメインなどの細胞浸透性基を含む、又はこれである。一実施形態では、細胞浸透性基は、式Ｉのジアゾ化合物に、−Ｌ−又は−Ｌ１−を介して間接的に結合している。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方だけが、細胞浸透性基である、又はこれを含む。
【００５１】
[0051]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、細胞表面受容体のリガンド（たとえば、ステロイド、葉酸、サブスタンスＰ、ＲＧＤトリペプチド）や他の標的化種、たとえば核局在化ペプチドなどの、細胞標的化基を含む、又はこれである。標的化基は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである場合がある。標的化基は、抗体又はその機能性断片でもよい。一実施形態では、細胞標的化基は、式Ｉのジアゾ化合物に、−Ｌ−又は−Ｌ１−を介して間接的に結合している。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方だけが、細胞標的化基である、又はこれを含む。
【００５２】
[0052]例となる細胞標的化基は、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｒｃｏら［３８］に記載されている。この参考文献を、細胞標的化用のリガンドの記述について、参照により本明細書に援用する。詳細な一実施形態では、細胞標的化に用いられるリガンドは、解離定数１０ｎＭ以下という、その受容体に対する親和性を示すべきである。詳細な一実施形態では、所与の式Ｉの化合物において、１種を超える細胞標的化基を用いてもよい。
【００５３】
[0053]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、アミン又はチオールと反応する基などの反応性基を含む、又はこれである。詳細な一実施形態では、ＲＭは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基  Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドエステル基などのアミン反応性基である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、ＲＭは、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル基などのアミン反応性基である、又はこれを含む。別の詳細な実施形態では、ＲＭは、ｐ−ニトロフェニルエステル基やペンタフルオロフェニルエステル基などのアミン反応性活性化エステルである。別の詳細な実施形態では、ＲＭは、２−ピリジルジチオ基などのチオール反応性基又はやヨードアセチル基である。一実施形態では、この官能基は、式Ｉのジアゾ化合物に、−Ｌ−又は−Ｌ１−を介して間接的に結合している。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方が、アミン反応性基などの反応性基である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、ＲＭとＲＭ１の両方が、反応性基であり、又はこれを含み、特に、２つの反応性基の反応性は、直交であり、たとえば、一方はアミン反応性基であり、他方はチオール反応性基である。
【００５４】
[0054]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、アミン、チオール、アルコール、又はカルボキシレートとの反応のために活性化されうる潜在的反応性基を含む、又はこれである。一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、反応に向けて潜在的反応性基を活性化するために選択的に除去可能である保護基を有する潜在的反応性基を含む、又はこれである。一実施形態では、潜在的反応性基は、式Ｉのジアゾ化合物に、−Ｌ−又は−Ｌ１−を介して間接的に結合している。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方が、潜在的反応性基である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、ＲＭとＲＭ１の両方が、潜在的反応性基である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１の一方が、アミン反応性基などの反応性基であり、又はこれを含み、他方が、保護されたアミン反応性基などの潜在的反応性基である。詳細な一実施形態では、ＲＭとＲＭ１の両方が、反応性基若しくは潜在的反応性基であり、又はこれを含み、特に、２つの反応性基の反応性は、直交型であり、たとえば、一方はアミン反応性基であり、他方は、保護されたチオール反応性基である。
【００５５】
[0055]一実施形態では、式Ｉのジアゾ化合物が反応性基及び／又は潜在的反応性基を含む場合において、本発明は、式の化合物のジアゾ部分を種々のＲＭ又はＲＭ１基に結合させるための二官能性又は三官能性、特にヘテロ二官能性又はヘテロ三官能性試薬を提供する。一実施形態では、反応性基又は潜在的反応性基は、式Ｉのジアゾ化合物のジアゾ基に対して直交型である反応性を有する。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、アミン反応性基を含む。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、潜在的アミン反応性基を含む。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、ジアゾ基以外のアミン反応性基と潜在的アミン反応性基とを含む。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、チオール反応性基を含む。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、ジアゾ基以外のアミン反応性基とチオール反応性基とを含み、そのいずれかは、潜在的反応性基である。詳細な実施形態では、ジアゾ化合物は、カルボキシレート反応性基又は潜在的カルボキシレート反応性基（すなわち、保護されたカルボキシレート反応性基）であるＲＭ又はＲＭ１基を含む。
【００５６】
[0056]本発明はまた、式ＩＩの化合物を提供する。
【化６】
2018512424.tif 000008
式中、ＲＡは、上記式Ｉについてのとおりに規定され、ＡＣは、活性化エステルの脱離基を表す。式ＩＩの化合物は、少なくとも、式Ｉの化合物の調製における試薬として有用である。活性化エステルとしては、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＮＨＳエステル）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、フェニルエステル（フェニル基は、１つ又は複数の電子吸引性基で置換されている）、任意選択により置換されているアルキル又はアリールスルホン酸エステル（たとえば、トシルエステル、メシルエステル、又はトリフレートエステル）が挙げられる。
【００５７】
[0057]電子吸引性基としては、たとえば、ハロゲン及びニトロ基が挙げられる。詳細な活性化エステルは、フッ素化、塩素化、若しくは臭素化フェニルエステル、又はニトロ置換フェニルエステルである。より詳細には、ｐ−Ｆフェニル、メタ，メタ−ジフルオロフェニル、メタ，メタ，パラ−トリフルオロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｐ−クロロフェニル、及びｐ−ブロモフェニル活性化エステルを用いることができる。
【００５８】
[0058]式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、示された環の、フェニル環上での１〜５つの非水素置換基での置換を表し（残りのいずれかの環位置は、水素を有する）、非水素置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロシクリル、スルフヒドリル（−ＳＨ）、チオアルキル（−Ｓ−アルキル）、−ＮＨ２、及び−ＮＨ−ＣＯ−ＲＰからなる群から選択され、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、及びヘテロシクリル基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキル、又はハロアルコキシ基から選択される１〜５つの非水素置換基で任意選択により置換されており、ＲＰは、水素、アルキル基、又はＲＭ１であり、ＲＭ１は、式Ｉについて規定したとおりである。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上のパラ位にある。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルである。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メチルである。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルオキシである。式ＩＩの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メトキシである。
【００５９】
[0059]式ＩＩの詳細な実施形態において、本発明は、式ＩＩＡの試薬を提供する。
【化７】
2018512424.tif 000009
式中、ＲＡは、式Ｉについて規定したとおりであり、Ｅは、水素又は−ＳＯ３−（スルホ）塩（たとえば、ナトリウム塩）である。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上のパラ位にある。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルである。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メチルである。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルオキシである。式ＩＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メトキシである。式ＩＩＡの化合物の詳細な関連実施形態では、ＮＨＳエステル基を、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル基で置き換えることができる。
【００６０】
[0060]式ＩＩ、より詳細には式ＩＩＡの化合物は、少なくとも、式Ｉの化合物の調製において有用である。実施例で説明されるとおり、式ＩＩ及びＩＩＡの化合物をアミンと反応させて、式Ｉの化合物を生成することができる。
【００６１】
[0061]本発明は、有機分子又は生体分子中の１つ又は複数のカルボン酸基をエステル化する方法であって、有機分子又は生体分子を式Ｉのジアゾ化合物と接触させるステップを含む方法を提供する。詳細な一実施形態では、反応は、水溶液中で実施する。詳細な一実施形態では、反応は、水／有機溶媒混合物中で実施する。詳細な実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ＴＨＦ、又は関連したエーテル類である。詳細な実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルである。詳細な実施形態では、反応は、有機溶媒と共に７０％までの緩衝液を含有する溶媒中で実施する。詳細な実施形態では、反応は、有機溶媒と共に１０〜７０（体積）％の水又は緩衝液を含有する溶媒中で実施する。詳細な実施形態では、反応は、水又は緩衝液中に０．１〜１０％の有機溶媒を含有する溶媒中で実施する。詳細な実施形態では、反応は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ＴＨＦ、又は関連したエーテル類から選択される有機溶媒中で実施する。溶媒の組成は、ジアゾ化合物の水への溶解性に応じて決まる。詳細な一実施形態では、ジアゾ化合物の溶解性に応じて、緩衝水溶液中で反応を実施する。詳細な一実施形態では、反応は、５〜７、より好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで実施する。詳細な一実施形態では、反応は、およそ室温〜約４０℃の範囲の温度で実施する。詳細な一実施形態では、反応は、周囲温度で実施する。詳細な一実施形態では、反応は、３０〜３７℃の範囲の温度で実施する。詳細な一実施形態では、反応は、２５〜３０℃の範囲の温度で実施する。
【００６２】
[0062]式Ｉのジアゾ化合物を用いるエステル化では、ＲＭ及び／又はＲＭ１に応じて、エステル化される種（たとえば、タンパク質）の標識、細胞標的化、及び／又は細胞浸透を促進することができる。ＲＭ及び／又はＲＭ１が反応性基若しくは潜在的反応性基である又はこれを含む式Ｉの化合物は、たとえば、標識、細胞浸透性基、又は細胞標的化基である他のＲＭ及び／又はＲＭ１基を、式Ｉのジアゾ部分に結合するための二官能性又は三官能性試薬として用いることができる。より詳細には、ＲＭ及び／又はＲＭ１が反応性基若しくは潜在的反応性基である又はこれを含む式Ｉの化合物は、反応性及び潜在的反応性基が直交型反応性を有する場合では、ヘテロ二官能性又はヘテロ三官能性試薬として用いることができる。
【００６３】
[0063]したがって、本発明は、分子（１つ又は複数のカルボキシレート基を有する、特に生体分子）を、ＲＭ及び／又はＲＭ１が標識、特に蛍光標識、同位体標識、放射標識、イメージング剤、若しくは量子ドットである又はこれを含む式Ｉのジアゾ化合物で分子のカルボキシレート基（複数可）をエステル化して分子に標識を共有結合させることにより、標識する方法をさらに提供する。
【００６４】
[0064]したがって、本発明は、（１つ又は複数のカルボキシレート基を有する）カーゴ分子の細胞内取込みを、ＲＭが細胞浸透性基、特にグアニジウム、正電荷を有するアミン、任意選択により−アルキレン−ＣＯ２−を介して結合されるフルオレニルやピレンなどの疎水性基（たとえば、ピレンブチレート）、任意選択により置換されているフルオレニル基、若しくは任意選択により置換されているフェニルボロネートである又はこれを含む式Ｉのジアゾ化合物でカーゴ分子をエステル化してカーゴ分子に細胞浸透性基を共有結合させることにより、強化する方法をさらに提供する。
【００６５】
[0065]したがって、本発明は、（１つ又は複数のカルボキシレート基を有する）カーゴ分子を、ＲＭ及び／又はＲＭ１が細胞標的化基、特に、細胞表面受容体のリガンド（たとえば、ステロイド、葉酸、サブスタンスＰ、ＲＧＤトリペプチド）や他の標的化種、たとえば核局在化ペプチドである又はこれを含む式Ｉのジアゾ化合物でカーゴ分子をエステル化して細胞標的化基をカーゴ分子に共有結合させることにより、標的化する方法をさらに提供する。
【００６６】
[0066]関連態様では、式Ｉの化合物は、標的化基のエステル化に用いられ、１つ又は複数のカーゴ分子が、式Ｉの化合物に別な形で結合しており、たとえば、ＲＭ若しくはＲＭ１がカーゴ分子である若しくはこれを含み、又はＲＭとＲＭ１両方がカーゴ分子である若しくはこれを含む。この実施形態では、カーゴ分子は、たとえば、標的化基以外のタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドであり、又はタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチド以外のカーゴ分子である。たとえば、この実施形態において、１つ又は複数のカーゴ分子は、１つ又は複数の核酸でよい。
【００６７】
[0067]カーゴ分子という用語は、細胞に標的化する、又は細胞に導入することが望ましい任意の分子を指すのに本明細書で一般に使用する。詳細な実施形態では、カーゴ分子は、１つ又は複数のカルボキシレート基を有するタンパク質である。詳細な実施形態では、カーゴ分子は、１つ又は複数のカルボキシレート基を有する核酸である。
【００６８】
[0068]式Ｉの化合物を用いたエステル化では、式Ｉの化合物のＲＭ及びＲＭ１基に応じて、エステル化される種の標識、細胞浸透の強化、又は標的化の組合せが実現される。したがって、本発明は、選択されたカーゴ分子を標識し、これに細胞浸透性基を付加する方法を提供する。加えて、本発明は、選択されたカーゴ分子を標識し、これに標的化基を付加する方法を提供する。加えて、本発明は、選択されたカーゴ分子に標的化基及び細胞浸透性基を付加する方法を提供する。加えて、本発明は、選択されたカーゴ分子に、標識、標的化基、及び細胞浸透性基を付加する方法を提供する。こうした方法は、カーゴ分子を、標識、標的化基、又は細胞浸透性基の所望の導入がなされるようにＲＭ及びＲＭ１が選択されている本明細書における式Ｉの化合物でエステル化することにより実現される。したがって、本発明は、細胞浸透の強化と組み合わせて標識する方法、細胞標的化と組み合わせて標識する方法、細胞標的化と細胞浸透の強化が組み合わされた方法、又は標識と細胞浸透の強化と細胞標的化が組み合わされた方法を提供する。
【００６９】
[0069]ＲＭ又はＲＭ１がポリエチレングリコールなどのポリマーであるとき、本発明は、式Ｉの化合物を用いるエステル化によって、タンパク質などのカーゴ分子をポリマーで官能化する方法を提供する。ＲＭ又はＲＭ１がポリエチレングリコールであるとき、本発明は、式Ｉの化合物を用いるエステル化によって、タンパク質などのカーゴ分子をペグ化する方法を提供する。
【００７０】
[0070]ＲＭ又はＲＭ１がビオチン又はその誘導体であるとき、本発明は、式Ｉの化合物を用いるエステル化によって、タンパク質などのカーゴ分子をビオチン化する方法を提供する。ビオチン誘導体が標識されたビオチンであるとき、本発明は、カーゴ分子、特に、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドのビオチン化及び標識の方法を提供する。
【００７１】
[0071]本発明はまた、一つには、カーゴ分子の細胞内取込みを、ＲＭが細胞浸透性基である式Ｉのジアゾ化合物でカーゴ分子をエステル化することにより強化する方法に関する。そのような細胞浸透性基は、いくつかが当業界で公知であり、特に、ある特定のペプチドがこれに含まれる。詳細な一実施形態では、細胞内取込みは、細胞質ゾルへの少なくとも部分的な取込みを包含する。細胞内取込みは、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。本発明の方法は、１つ又は複数のカルボキシレート基を有する所望のいずれかの分子を細胞に送達するのに一般に有用であり、詳細には、核酸及びその類似体、ヌクレオチド及びその類似体、ペプチド及びタンパク質、薬物（たとえば、抗がん薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞傷害性薬物、抗生物質など）、レポーター分子又は標識（たとえば、蛍光標識、同位体標識、イメージング剤、量子ドットなど）を包含する。詳細な一実施形態では、カーゴは、アミノ官能基を有する量子ドットを含む。カーゴ分子は、上で挙げた種の組合せを含む場合もあり、種は、互いに結合しており、特に、種は、互いに共有結合している。たとえば、カーゴ分子は、ＣＰＰや核局在化シグナルなどのペプチドを核酸と兼有してもよいし、又は蛍光、同位体、若しくは他の標識を核酸及び若しくはペプチドと兼有してもよい。詳細な一実施形態では、カーゴ分子は、遺伝子発現を阻害若しくは低減する分子又は遺伝子発現を始動若しくは増強する分子を含めて、細胞における遺伝子発現に影響を及ぼす、それを調節する、若しくは変調する分子である、又はこれを含む。詳細な一実施形態では、カーゴ分子は、ペプチド又はタンパク質、たとえば、酵素である。詳細な実施形態では、カーゴ分子取込みを強化するために、ＲＭは、グアニジウム、任意選択により置換されているフルオレニル基、又は任意選択により置換されているフェニルボロネートである。本発明のジアゾ化合物は、最も一般的には、上で規定したとおりの変項を有する式Ｉの化合物である。
【００７２】
[0072]例となる追加の式Ｉの化合物について、以下でより詳細に述べる。式ＩＩ及びＩＩＡの化合物を用いてこうした追加の化合物を合成できることは注目される。詳細な実施形態では、式Ｉの化合物は、式ＩＡを有する場合があり、
【化８】
2018512424.tif 000010
Ｒ及びＲＡは、式Ｉについて規定したとおりであり、ｙ及びｚは、０又は１であり、−Ｌ１−及び−Ｌ２−は、本明細書で規定するとおりのリンカー構造を有する二価リンカーであり、Ｅは、水素又は−ＳＯ３−（スルホ）塩（たとえば、ナトリウム塩）である。リンカー−Ｌ１及びＬ２−は、一実施形態では、１〜２０、１〜１２、１〜６、又は１〜３個の炭素原子と、任意選択により１個又は複数の酸素原子とを含みうる。式ＩＡの詳細な実施形態では、−Ｌ１−が存在し、−ＣＨ２−であり、−Ｌ２−は、不在である。式ＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、フェニル環上のパラ位にある。式ＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルである。式ＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メチルである。式ＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−アルキルオキシである。式ＩＡの詳細な実施形態では、ＲＡは、ｐ−メトキシである。
【００７３】
[0073]より詳細な実施形態では、本発明の化合物は、式ＩＢを有し、
【化９】
2018512424.tif 000011
変項は、式Ｉについて上で規定したとおりである。式ＩＢの詳細な実施形態では、Ｒは、水素又はメチルである。式ＩＢの詳細な実施形態では、ＲＭは、１〜６個の炭素原子を有するアルキルである。式ＩＢの詳細な実施形態では、ＲＭは、３又は４個の炭素原子を有するアルキニルである。
【００７４】
[0074]式Ｉの一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、式ＩＩＩのグアニジウム基：
【化１０】
2018512424.tif 000012
若しくはその塩である、又はこれを含み、
ＸＧ及びＹＧは、独立に、−ＮＲＮ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＲＮ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＮ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、又は−Ｓ−ＣＯ−から選択される任意選択の結合性部分（ｂ及びｄは、独立に、０又は１である）であり、
ＬＧは、１〜１０個の炭素原子と、任意選択により１〜５個の酸素又は窒素原子とを有する任意選択のスペーサー基（ｃは、０又は１である）である。グアニジウム基は、プロトン化されていても、適切なアニオンとの塩の形態であってもよい。式ＩＩＩの詳細な一実施形態では、ｂは、１であり、ＸＧは、Ｏである。式ＩＩＩの詳細な一実施形態では、ｃは、１であり、ＬＧは、−（ＣＨ２）Ｇ−であり、Ｇは、１〜１２、１〜６、又は１〜３の範囲の整数であり、より特定すると、Ｇは、２である。式ＩＩＩの詳細な一実施形態では、ｄは、１であり、ＹＧは、ＮＨである。式ＩＩＩの詳細な一実施形態では、ｂは、１であり、ＸＧは、Ｏであり、ｃは、１であり、ＬＧは、−（ＣＨ２）Ｇ−であり、Ｇは、２又は３であり、より特定すると、Ｇは、２である。式ＩＩＩの詳細な一実施形態では、ｂは、１であり、ｃは、１であり、ｄは、１であり、ＸＧは、Ｏであり、ＹＧは、ＮＨであり、ＬＧは、−（ＣＨ２）Ｇ−であり、Ｇは、２又は３であり、より特定すると、Ｇは、２である。ＲＭ１が式ＩＩＩのグアニジウム基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＭは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、又はＲＭは、３〜４個の炭素原子を有するアルキニル基である。ＲＭが式ＩＩＩのグアニジウム基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＡは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、より詳細には、フェニル環のパラ位において置換されたメチル基である。
【００７５】
[0075]詳細な一実施形態では、式ＩＩＩのグアニジウムである又はこれを含むＲＭ又はＲＭ１を有する式Ｉの試薬は、式ＩＶのアミンを用いて調製することができる。
【化１１】
2018512424.tif 000013
式中、Ｇは、１〜１２、１〜６、又は１〜３であり、より特定すると、Ｇは、２である。
【００７６】
[0076]式Ｉの詳細な一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、式Ｖのフルオレニル基：
【化１２】
2018512424.tif 000014
若しくはその塩である、又はこれを含み、
ＸＦは、−ＮＲＮ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＲＮ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＮ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、又は−Ｓ−ＣＯ−から選択される任意選択による結合性部分（ｇは、０又は１である）であり、
ＬＦは、１〜１０個の炭素原子と、任意選択により１〜５個の酸素又は窒素原子とを有する任意選択のスペーサー基（ｆは、０又は１である）であり、
ＲＦは、水素又はアルキル基であり、
Ｒ３〜Ｒ１０は、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケノキシ、アルキニル、アルキノキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、炭素環式、カルボシクリルオキシ、ヘテロ環式、又はヘテロシクリルオキシ基から選択され、これらはそれぞれ、任意選択により置換されており、又は
Ｒ３〜Ｒ１０は、ハロゲン（たとえば、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｃｌ−、Ｆ−）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、ニトロ基（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、イソシアノ（−ＮＣ）、チオシアノ（−ＳＣＮ）、イソチオシアノ（−ＮＣＳ）、スルフリル（−ＳＯ２）、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＯＲ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮ（Ｒ’）２、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）２−、−ＣＯ−ＳＲ’、−ＳＯ２−ＮＲ’２、−ＯＲ’、又は−ＳＲ’を含めた非水素置換基から選択され、各Ｒ’は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環基から選択され、これらの基はそれぞれ、特に１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、又はジアルキルアミノ基で任意選択により置換されており、又は
Ｒ３〜Ｒ１０の２つが連結し合って、任意選択により置換されている炭素環式、アリール、ヘテロ環式、又はヘテロアリール環を形成しており、環の１つ又は複数の炭素は、−ＣＯ−で置き換えられている場合があり、炭素環式又はヘテロ環式の環は、飽和又は不飽和の場合がある。
【００７７】
[0077]詳細な一実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０は、すべてが水素である。詳細な一実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０は、１つを除いてすべてが水素である。詳細な一実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０の１つ又は複数は、水素、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＯＲ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮ（Ｒ’）２、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）２−、−ＣＯ−ＳＲ’、−ＳＯ２−ＮＲ’２、−ＯＲ’、又は−ＳＲ’から選択され、各Ｒ’は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環基から選択され、これらの基はそれぞれ、特に１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、又はジアルキルアミノ基で任意選択により置換されている。詳細な一実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０の１つ又は複数は、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’基である。
【００７８】
[0078]式ＶのＲＭ又はＲＭ１基の詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０は、水素、ハロゲン、又は１〜３個の炭素原子を有するアルキル基から独立に選択される。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０は、水素、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、又は１〜３個の炭素原子を有するアルキル基から独立に選択される。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０は、水素、ハロゲン、又はメチル基から独立に選択される。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０の１つ又は２つは、非水素置換基から独立に選択され、残りのＲ基は、水素である。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０の１つ又は２つは、ハロゲン、又は１〜３個の炭素原子を有するアルキル基から選択され、残りのＲ基は、水素である。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０の１つ又は２つは、ハロゲン又はメチル基から選択され、残りのＲ基は、水素である。
【００７９】
[0079]式ＶのＲＭ又はＲＭ１基の詳細な実施形態では、Ｒ４及びＲ９の一方又は両方が、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’基である。詳細な実施形態では、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’基は、−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’基であり、Ｒ’は、アルキル基又はハロアルキル基であり、より特定すると、Ｒ’は、メチル基又はトリフルオロエチル基である。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０はいずれも、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’基でない。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０はいずれも、アミン又はアミド基でない。詳細な実施形態では、Ｒ３〜Ｒ１０はいずれも、イソシアネート基でない。詳細な実施形態では、フルオレニル基は、それ自体が蛍光を示す。
【００８０】
[0080]ＲＭ１が式Ｖのフルオレニル基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＭは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、又はＲＭは、３〜４個の炭素原子を有するアルキニル基である。ＲＭ１が式Ｖのフルオレニル基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＡは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、より詳細には、フェニル環のパラ位において置換されたメチル基である。
【００８１】
[0081]米国特許出願公開第２０１６／００６７３４２号（０３／１０／２０１６公開）は、カーゴ分子の細胞のアップデートを強化するための、カーゴ分子のフルオレニル基での誘導体化を記載している。この出願は、細胞内取込みの方法についての記述、及び本発明において使用するフルオレニル基についての記述に関して、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００８２】
[0082]詳細な実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、式ＶＩＡ又はＶＩＢのものなどのフェニルボロン酸：
【化１３】
2018512424.tif 000015
（ＶＩＢは、ベンゾボロキソール構造であることに留意）又はその塩であり、
これらのＲＭ又はＲＭ１基は、環位置３、４、若しくは５で、又は式ＶＩＢについては環位置４若しくは５で、式Ｉ又は式ＩＡの化合物に結合しており、
ｔは、１又は２であり、
ＸＢ及びＹＢは、−ＮＲＮ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＲＮ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＮ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、又は−Ｓ−ＣＯ−から選択される任意選択の結合性部分（ｕ及びｗは、独立に、０又は１である）であり、
ＬＢは、１〜１０個の炭素原子と、任意選択により１〜５個の酸素又は窒素原子とを有する任意選択のスペーサー基（ｖは、０又は１である）であり、
Ｒ１２〜Ｒ１４及びＲ１６は、水素、１〜８個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐脂肪族基、脂環基、アリール基、ヘテロ環基、ヘテロアリール基、−ＣＯ２Ｒ２０基、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ２０基、−ＣＯＮ（Ｒ２１）２基、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ２１）２基、−Ｎ（Ｒ２１）２基、−ＯＲ２０基、−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ基、−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ（Ｒ２１）２基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、−ＳＯ２−ＯＲ２０基から独立に選択され、又は近接する２つのＲ１２〜Ｒ１４及びＲ１６が、これらが結合している環炭素と一緒になって、５〜８員の脂環式、ヘテロ環式、アリール、若しくはヘテロアリール環部分を任意選択により形成しており、これらの基又は部分はそれぞれ、任意選択により置換されており、
各Ｒ１７及びＲ１８は、水素又は任意選択により置換されているＣ１〜Ｃ３アルキル基から独立に選択され、
各Ｒ２０は、水素、１〜８個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐脂肪族基、脂環基、アリール基、ヘテロ環基、又はヘテロアリール基から独立に選択され、これらの基はそれぞれ、任意選択により置換されており、
各Ｒ２１は、水素、１〜８個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐脂肪族基、脂環基、アリール基、ヘテロ環基、ヘテロアリール基から独立に選択され、又は２つのＲ２１が、これらが結合している窒素と一緒になって、５〜８員のヘテロ環式若しくはヘテロアリール環部分を形成している場合もあり、これらの基又は部分はそれぞれ、任意選択により置換されており、
ｍは、１〜８の整数であり、
任意選択による置換は、ハロゲン、オキソ基（＝Ｏ）、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、脂環式３〜７員環［１つ又は２つの環炭素が−ＣＯ−で任意選択により置き換えられており、１つ又は２つの二重結合を含んでいてもよい］、６〜１４個の環炭素原子を有するアリール基、フェニル基、ベンジル基、１〜３個のヘテロ原子を有するヘテロ環式５又は６員環基［１個又は２個の環炭素が−ＣＯ−で任意選択により置き換えられており、１つ又は２つの二重結合を含んでいてもよい］、１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、又はＳ）を有するヘテロアリール基、−ＣＯ２Ｒ２３基、−ＯＣＯ−Ｒ２３基、−ＣＯＮ（Ｒ２４）２基、−ＯＣＯＮ（Ｒ２４）２基、−Ｎ（Ｒ２４）２基、−ＳＯ２−ＯＲ２３基、−ＯＲ２３基、−（ＣＨ２）ｍ−ＯＲ２３基、−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ（Ｒ２４）２から選択される１つ又は複数の非水素置換基による置換であり、ｍは、１〜８であり、各Ｒ２３又はＲ２４は、独立に、水素、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、６〜１４個の炭素原子を有する非置換アリール基、非置換フェニル基、非置換ベンジル基、１〜３個のヘテロ原子を有する非置換ヘテロ環式５若しくは６員環基［１つ又は２つの環炭素が−ＣＯ−で任意選択により置き換えられており、１つ又は２つの二重結合を含んでいてもよい］、又は１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、又はＳ）を有するヘテロアリール基であり、加えて、２つのＲ２４が、これらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロ環式又はヘテロアリール環部分を形成している場合もあり、これらの基又は部分はそれぞれ、任意選択により置換されており、
さらには、こうしたＲ２３及びＲ２４基はそれぞれ、１つ又は複数の非置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、ハロゲン、オキソ基（＝Ｏ）、ニトロ基、シアノ基、−ＣＯ２Ｒ２５基、−ＯＣＯ−Ｒ２５基、−ＣＯＮ（Ｒ２６）２基、−ＯＣＯ−Ｎ（Ｒ２６）２基、−Ｎ（Ｒ２６）２基、−ＳＯ２−ＯＲ２５基、−ＯＲ２５基、−（ＣＨ２）ｍ−ＯＲ２５基、−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ（Ｒ２６）２で任意選択で置換されており、ｍは、１〜８であり、各Ｒ２５又はＲ２６は、独立に、水素、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、６〜１４個の環炭素原子を有する非置換アリール基、非置換フェニル基、非置換ベンジル基、１〜３個のヘテロ原子を有する非置換ヘテロ環式５若しくは６員環基［環炭素が−ＣＯ−で任意選択により置き換えられており、１つ又は２つの二重結合を含んでいてもよい］、又は１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、又はＳ）と合計５〜１４個の環原子とを有するヘテロアリール基であり、加えて、２つのＲ２６が、これらが結合している窒素と一緒になって、非置換のヘテロ環式又はヘテロアリール環部分を形成している場合もある。
【００８３】
[0083]詳細な実施形態では、−［ＸＢ］ｕ−［ＬＢ］ｖ−［ＹＢ］ｗ−は、式ＶＩＡの環位置４にある。詳細な実施形態では、−［ＸＢ］ｕ−［ＬＢ］ｖ−［ＹＢ］ｗ−は、式ＶＩＢの環位置４にある。
【００８４】
[0084]式ＶＩＡ又はＶＩＢの基であるＲＭ１を有する式Ｉの詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＭは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル又は３若しくは４個の炭素原子を有するアルキニルである。式ＶＩＡ又はＶＩＢの基であるＲＭを有する式Ｉの詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＡは、フェニル環上のパラ位において置換された、１〜６個の炭素原子を有するアルキルである。
【００８５】
[0085]式Ｉの追加の実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、式ＶＩＩのフェニルボロネート基であり、
【化１４】
2018512424.tif 000016
ＰＢは、フェニルボロネート基（本明細書において上で規定したとおり、また米国特許出願公開第２００３／０１９６４３３号及び米国特許仮出願第６２／０２９，３９１号にあるとおり）６６６であり、
Ｙ４、Ｙ５、及びＹ６は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲｃ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−ＮＲｃ−、−ＯＣＯ−ＮＲｃ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−ＮＲｃ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＲｃ（ＯＨ）−ＣＲｃ（ＯＨ）−から独立に選択され、Ｒｃは、水素又はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｌ５は、上で−Ｌ１−及び／又は−Ｌ２−について規定したとおりの二価のスペーサー部分である。
【００８６】
[0086]このようなフェニルボロネート基は、式Ｉの化合物に、式ＶＩＩＩのものなどのホウ素化（ｂｏｒｏｎａｔｉｏｎ）試薬を用いて導入することができる。
【化１５】
2018512424.tif 000017
式中、変項は、式ＶＩＩについて規定したとおりであり、Ｘ６は、脱離基であり、−Ｙ６−Ｘ６は、合わせて、反応性基であり、より詳細には、活性化エステル−ＣＯ２ＡＣ（上で式ＩＩにおいて規定したとおり）である。
【００８７】
[0087]ＲＭ１が式ＶＩＩＩの基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＭは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、又はＲＭは、３〜４個の炭素原子を有するアルキニル基である。ＲＭが式ＶＩＩＩの基である又はこれを含む式Ｉの化合物の詳細な実施形態において、Ｒは、水素又はメチルであり、ＲＡは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、より詳細には、フェニル環のパラ位において置換されたメチル基である。
【００８８】
[0088]米国特許出願公開第２００３／０１９６４３３号及び第２０１６／００２４１２２号は、本発明において細胞浸透を強化するのに有用なフェニルボロネート基の構造についての記述に関して、その全体が参照により本明細書にそれぞれ援用される。これらの参考文献は、式１の化合物に結合させることのできるフェニルボロネート基の作製方法も提供している。
【００８９】
[0089]本明細書における式の詳細な実施形態では、二価リンカーは、次の二価部分：
−Ｙ１−Ｌ１−Ｙ３−（Ｙ１及びＹ３は、任意選択によるものであり、同じでも異なってもよい）、
−Ｙ１−Ｌ１−Ｌ２−Ｙ３−（Ｙ１及びＹ３は、任意選択によるものであり、同じでも異なってもよく、Ｌ１及びＬ２は、異なっている）、又は−Ｙ１−Ｌ１−［Ｌ２−Ｙ２］ｙ−Ｌ３−Ｙ３−（Ｙ１及びＹ３は、任意選択によるものであり、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、同じでも異なってもよく、Ｌ１及びＬ３は、任意選択によるものであり、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、同じでも異なってもよく、ｙは、示された部分が繰り返される数を示す整数である）
から選択され、
各Ｌ１−Ｌ３は、１〜３０個の原子を有する、任意選択により置換されている二価の脂肪族、脂環式、ヘテロ環式、アリール、又はヘテロアリール部分から独立に選択され、各Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲｃ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−ＮＲｃ−、−ＯＣＯ−ＮＲｃ−、−ＮＲｃ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−ＮＲｃ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＲｃ（ＯＨ）−ＣＲｃ（ＯＨ）−から独立に選択され、Ｒｃは、水素又はＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【００９０】
[0090]詳細な実施形態では、二価リンカーは、
アルキレンリンカー（−（ＣＨ２）ｙ−）［式中、ｙは、１〜１２、好ましくは１〜４である］、
アルコキシアルキルリンカー−［（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ａ−［式中、ｑ及びｒは、０、又は１〜４の整数、好ましくは、０、１、２、又は３であり、但し、ｑ及びｒの一方は０でなく、ａは、１〜６、好ましくは２〜４である］、
又は
アミノアルキルリンカー−［（ＣＨ２）ｓ−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｔ］ｂ−［式中、ＲＮは、水素又はＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、ｓ及びｔは、０、又は１〜４の整数、好ましくは、０、１、又は２であり、但し、ｓ及びｔの一方は、０でなく、ｂは、１〜３、好ましくは１である］
から選択される。
【００９１】
[0091]式ＶＩＩ及びＶＩＩＩＩの詳細な実施形態では、Ｌ５は、−（ＣＨ２）２−である。
【００９２】
[0092]式ＶＩＩＩの試薬の詳細な実施形態では、Ｙ６−Ｘ６は、合わせて、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質のアミン基、カルボン酸基若しくはそのエステル、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アジド基、チオエステル基、ホスフィノチオエステル基、アルデヒド基、又はケトン基の１つ又は複数と反応する反応性基である。
【００９３】
[0093]式ＶＩＩＩの詳細な実施形態では、ホウ素化試薬は、式ＩＸを有し、
【化１６】
2018512424.tif 000018
ｐ−ＰＢは、ホウ素が−ＣＨ２−Ｏ−に対してパラ位にあるフェニルボロネートであり、Ｘ６は、脱離基である。本発明において有用な他のホウ素化剤は、米国特許出願公開第２０１６／００６７３４２号に記載されており、この参考文献を、式ＶＩＩの追加のフェニルボロネート基及び式ＶＩＩＩの試薬についての記述に関して参照により本明細書に援用する。
【００９４】
[0094]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、反応性基、より詳細にはアミン反応性基を含む、又はこれである。詳細な実施形態では、ＲＭは、１つ又は複数のアミン基を含むカーゴ分子に対して１つ又は複数のアミド結合を形成するための、アミン反応性基、又はアミン反応性基で置換されているスペーサー部分である。詳細な実施形態では、ＲＭは、潜在的反応性基、又は潜在的反応性基で置換されているスペーサー部分を含み、又はこれであり、潜在的反応性基は、式Ｉの化合物又は化合物中の他のいずれかの基におけるいかなる反応性基とも反応せず、適時、選択的に反応性となり、又は反応に対して選択的に活性化しうる。潜在的反応性基は、たとえば、細胞内部での酵素作用によって、細胞内部で反応に対して活性化しうる。潜在的反応性基は、たとえば、式Ｉの化合物が細胞に送達された後、たとえば、エステラーゼの作用によって活性化しうる。詳細な実施形態では、ＲＭは、反応性基で置換されているスペーサー部分である。より詳細には、ＲＭは、潜在的反応性基を含み、且つカーゴ分子に対して結合を形成するための反応性基で置換されているスペーサー部分であり、潜在的反応性基は、反応性基又はカーゴ分子と反応せず、カーゴ分子が式Ｉの化合物に結合した後に選択的に反応し、又は反応に対して活性化しうる。詳細な実施形態では、このＲＭの反応性基は、アミン反応性基である。詳細な実施形態では、式Ｉの化合物は、反応性基と潜在的反応性基とを含む。
【００９５】
[0095]本明細書における詳細な一実施形態では、式Ｉの化合物を用いるエステル化を用いて、カーゴ分子を、エステル生成を介して、タンパク質又はポリペプチドに共有結合させることができる。この場合では、カーゴ分子は、たとえば、共有結合しているタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドによって、細胞に標的化されることが望ましい。この実施形態では、式Ｉの化合物がエステル化されているタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドが、細胞標的化の働きをする。標的化タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、抗体又はその機能性断片でよい。タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、細胞表面受容体のリガンドでもよい。カーゴ分子は、それ自体を、標的化タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド以外のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドとしてよい。カーゴ分子は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド以外の種でもよい。カーゴ分子は、本明細書に記載のエステル化方法を用いて、標識及び／又は細胞浸透性基をさらに含みうる。この実施形態では、エステル化されたタンパク質又はポリペプチドが細胞と接触して、細胞への取込みが強化される。
【００９６】
[0096]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、血流中のタンパク質を保護する、又はタンパク質の薬物動態を向上させる働きをしうるポリマーである、又はこれを含む。一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ポリエチレングリコールである、又はこれを含む。より詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、平均分子量が２００〜１０，０００の範囲である。より詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、平均分子量が１，０００〜１０，０００の範囲である。より詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、平均分子量が２，０００〜１０，０００の範囲である。より詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、平均分子量が２，０００〜６，０００の範囲である。より詳細な実施形態では、ポリエチレングリコールは、２００〜１０，０００、１，０００〜１０，０００、２，０００〜１０，０００、又は２，０００〜６，０００の範囲の数平均分子量（Ｍｎ）を有する。式１の化合物の調製に有用な官能化ポリエチレングリコールポリマーは、市販品として入手可能であり、又は周知の方法によって調製することができる。たとえば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのカタログを参照されたい。
【００９７】
[0097]一実施形態では、ＲＭ又はＲＭ１は、ビオチン又はその誘導体である、又はこれを含む。詳細な実施形態では、ビオチン誘導体は、当業界で公知のいずれかのビオチン誘導体であり、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどの化学種又は生化学種のビオチン化に有用である。ビオチン誘導体としては、放射標識ビオチン、同位体標識ビオチン、蛍光色素又は他の色素で標識されたビオチンなどの標識ビオチンが挙げられる。ビオチン又はその誘導体を含んでいる式Ｉの化合物の調製において有用なアミン官能化ビオチンなどの官能化ビオチンは、当業界で公知の、及び／又は市販品として入手可能である。（たとえば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのカタログを参照されたい。）ビオチン又はその誘導体（たとえば、標識ビオチン）を含む式Ｉの化合物でタンパク質などのカーゴ分子をエステル化することで、カーゴ分子を、既知のいずれかの目的のためにビオチン化することができる。たとえば、タンパク質のビオチンでの官能化は、タンパク質の捕捉又は単離、たとえば、タンパク質プルダウン又はビオチンアフィニティー精製に用いることができる。したがって、本発明は、ＲＭ又はＲＭ１がビオチン又はその誘導体である又はこれを含む式Ｉの化合物を用いて、カーゴ分子、又はより単純なタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドをビオチン化する方法を提供する。
【００９８】
[0098]式Ｉのジアゾ化合物は、本明細書及び米国特許第８，３５０，０１４号に記載の実施例を考慮して、さらに当業界で公知の事項を考慮して合成することができる。本明細書における方法は、当業界で公知の出発材料、溶媒、及び試薬の選択によって、詳細に例示されていない式Ｉの化合物が調製されるように型通りに適合させることができる。標識、細胞浸透性基、又は細胞標的化基を含むＲＭ及びＲＭ１基は、たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（第２版）２００８  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  英国ロンドンにおいて見られるようなバイオコンジュゲーション法を用いて、式Ｉの化合物に導入することができる。この参考文献は、式Ｉの化合物のＲＭ１及びＲＭ基を共有結合によって取り付けるのに用いることのできるホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋試薬についての詳細な説明も収載している。米国特許第８，３５０，０１４号は、ジアゾ化合物の合成についての記述に関して、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９９】
[0099]１つ又は複数の反応性基又は潜在的反応性基を有する式Ｉのジアゾ化合物は、本明細書にある方法及び当業界で公知の事項に照らして調製することができる。たとえば、Ｊｏｓａ−Ｃｕｌｌｅｒｅ（２０１４）［３９］及びＭａ，Ｍ．ら（２００５）［４０］に記載されているような方法を用いて、ＮＨＳエステルを有する式Ｉの化合物を調製することができる。
【０１００】
[00100]アルキル又はアルキル基という用語は、直鎖又は分岐飽和炭化水素のモノラジカルを指す。アルキル基は、直鎖及び分岐アルキル基を包含する。別段指摘しない限り、アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し（Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基）、好ましいのは、１〜１０個の炭素原子を含むもの（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）であり、より好ましいのは、１〜６個の炭素原子を含むもの（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）及び１〜３個の炭素原子を含むもの（Ｃ１〜Ｃ３アルキル基）である。アルキル基は、本明細書に記載のとおりに１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されている。例となるアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、分岐ペンチル、ｎ−ヘキシル、分岐ヘキシルが挙げられ、これらはすべて、任意選択により置換されている。置換アルキル基には、１個又は複数の水素が１個又は複数のフッ素原子、塩素原子、臭素原子、及び／又はヨウ素原子で置き換えられているアルキル基などの、全ハロゲン化又は半ハロゲン化アルキル基が含まれる。置換アルキル基として、全フッ素化又は半フッ素化アルキルが挙げられる。
【０１０１】
[00101]カルボシクリル基とは、１つ又は複数の飽和又は不飽和炭素環を有する基である。カルボシクリル基は、たとえば、１つ又は複数の二重結合を含んでいる。炭素環式の環における１個又は複数の炭素は、−ＣＯ−基でもよい。カルボシクリル基には、３〜１２個の炭素原子を有し、１又は２個の炭素原子が−ＣＯ−基で任意選択により置き換えられており、１、２、又は３つの二重結合を任意選択により有するものが含まれる。カルボシクリル基には、５〜６つの環炭素を有するものが含まれる。カルボシクリル基は、それぞれが飽和又は不飽和である１つ又は複数の環を含んでいる場合がある。カルボシクリル基には、二環式又は三環式の基が含まれる。好ましい炭素環基は、単一の５又は６員環を有する。カルボシクリル基は、本明細書に記載のとおりに任意選択により置換されている。詳細には、炭素環基は、１つ又は複数のアルキル基で置換されていてよい。カルボシクリル基としては、特に、シクロアルキル及びシクロアルケニル基が挙げられる。
【０１０２】
[00102]シクロアルキル基には、１つの環を有するもの、又は二環式若しくは三環式であるものが含まれる。詳細な実施形態では、シクロアルキル基は、５〜８個の炭素原子を有する１つの環を有し、好ましくは５又は６個の炭素原子を有する。
【０１０３】
[00103]シクロアルケニル基には、１つの環を有する、又は二環式若しくは三環式であり、１〜３つの二重結合を含んでいるものが含まれる。詳細な実施形態では、シクロアルケニル基は、５〜８個の炭素原子を有する１つの環を有し、好ましくは５又は６個の炭素原子を有し、１つの二重結合を有する。
【０１０４】
[00104]アルケニル基には、１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含んでいる一価の直鎖、分岐、及び環式アルケニル基が含まれる。別段指摘しない限り、アルケニル基には、２〜２０個の炭素原子を有するものが含まれる。アルケニル基には、２〜４個の炭素原子を有するもの、及び５〜８個の炭素原子を有するものが含まれる。環式アルケニル基には、１つ又は複数の環を有し、少なくとも１つの環が二重結合を含んでいるものが含まれる。環式アルケニル基には、１、２、又は３つの環を有し、少なくとも１つの環が二重結合を含んでいるものが含まれる。環式アルケニル基には、３〜１０個の炭素原子を有するものも含まれる。環式アルケニル基には、５、６、７、８、９、又は１０員炭素環を有するもの、特に５又は６員環を有するものが含まれる。環式アルケニル基の炭素環は、直鎖又は分岐アルキル又はアルケニル基置換基を有する場合もある。環式アルケニル基には、少なくとも１つの環が二重結合を含んでいる二環式及び三環式アルキル基を含めることができる。アルケニル基は、本明細書に記載のとおりに１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されている。詳細なアルケニル基としては、エチレン、プロペニル、シクロプロペニル、ブテニル、シクロブテニル、ペンテニル、ペンタジエニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、ヘキシレニル、ヘキサジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルが、そのすべての異性体を含めて挙げられ、これらはすべて、任意選択により置換されている。置換アルケニル基には、全ハロゲン化又は半ハロゲン化アルケニル基が含まれる。
【０１０５】
[00105]アルキニル基には、１つ又は複数の炭素−炭素三重結合を含んでいる一価の直鎖、分岐、及び環式アルキニル基が含まれる。別段指摘しない限り、アルキニル基には、２〜２０個の炭素原子を有するものが含まれる。アルキニル基には、２〜４個の炭素原子を有するもの、及び５〜８個の炭素原子を有するものが含まれる。環式アルキニル基には、１つ又は複数の環を有し、少なくとも１つの環が三重結合を含んでいるものが含まれる。環式アルキニル基には、１、２、又は３つの環を有し、少なくとも１つの環が三重結合を含んでいるものが含まれる。環式アルキニル基には、３〜１０個の炭素原子を有するものも含まれる。環アルキニル基には、５、６、７、８、９、又は１０員炭素環を有するもの、特に５又は６員環を有するものが含まれる。
【０１０６】
[00106]環式アルキニル基の炭素環は、直鎖又は分岐アルキル、アルケニル、又はアルキニル基置換基を有する場合もある。環式アルキニル基には、少なくとも１つの環が三重結合を含んでいる二環式及び三環式アルキル基を含めることができる。アルキニル基は、本明細書に記載のとおりに１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されている。
【０１０７】
[00107]アルコキシ基とは、上で大まかに論じたとおりのアルキル基（シクロアルキルを含める）が酸素に結合したもの、すなわち一価の−Ｏ−アルキル基である。アリールオキシ基とは、上で論じたとおりのアリール基が酸素に結合したもの、すなわち一価の−Ｏ−アリールである。ヘテロアリールオキシ基とは、上で論じたとおりのヘテロアリール基が酸素に結合したもの、すなわち一価の−Ｏ−ヘテロアリールである。アルケノキシ、アルキノキシ、アリシクロキシ、ヘテロシクロキシ基も、似たように定義される。こうした基はすべて、任意選択により置換されている。
【０１０８】
[00108]本明細書で使用する脂肪族基とは、一価の非芳香族炭化水素基を指し、これには、直鎖、分岐、又は環式炭化水素基が含まれ、飽和又は１つ若しくは複数の二重結合若しくは１つ若しくは複数の三重結合を伴う不飽和の場合がある。脂肪族基は、直鎖又は分岐した部分を１つ又は複数の炭素環と組み合わせて含んでいてもよい。脂肪族基の炭素環は、１つ又は複数の二重結合又は１つ又は複数の三重結合を含んでいてもよい。脂肪族基の炭素環は、３〜１０員の環を含みうる。そのような炭素環は、縮合していてもよく、二環式若しくは三環式でもよい。脂肪族基は、１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されており、任意選択による置換については、本明細書で記載している。別段指定しない限り、脂肪族基は、１〜２０個の炭素原子を含んでいてよく、又は１〜１０個の炭素原子を含んでいてよい。脂肪族基には、１〜３個、１〜６個、及び１〜８個の炭素原子を含んでいるものが含まれる。脂肪族基としては、特に、脂環基、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基が挙げられる。
【０１０９】
[00109]ヘテロ脂肪族基とは、一般に、１個又は複数のヘテロ原子（Ｃ及びＨ以外）を有する脂肪族基を指す。詳細には、ヘテロ脂肪族基のヘテロ原子は、Ｎ、Ｐ、Ｂ、Ｏ、又はＳから選択される。より詳細な実施形態では、ヘテロ脂肪族基は、１個又は複数の酸素、窒素、又は硫黄原子を含んでいる。
【０１１０】
[00110]本明細書で使用する脂環基とは、一価の非芳香族環式炭化水素基を指し、飽和又は１つ若しくは複数の二重結合若しくは１つ若しくは複数の三重結合を伴う不飽和の場合がある。脂環式の環には、３〜１０員の炭素環を含んでいるものが含まれる。脂環基には、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の環を含んでいるものが含まれ、環は、縮合していてもよく、又は直鎖若しくは分岐アルキレン、アルケニレン、若しくはアルキニレン部分によって結合していてもよい。脂環基には、二環式又は三環式の環が含まれる。脂環基には、１つ又は複数の炭素環が直鎖又は分岐アルキル、アルケニル、又はアルキニル基で置換されているものが含まれる。原子価要件を満たすために、環原子は、水素で、又は任意選択により本明細書に記載のとおりに非水素置換基で置換されていてもよい。脂環基の１個又は複数の炭素は、−ＣＯ−基である場合もある、すなわち、炭素がオキソ（＝Ｏ）部分で置換されている場合もある。脂環基は、１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されており、任意選択による置換については、本明細書で記載している。別段指定しない限り、脂環基は、３〜２０個の炭素原子を含んでいてよく、又は３〜１２個の炭素原子を含んでいてよい。脂環基には、３〜６個及び３〜８個の炭素原子を含んでいるものが含まれる。脂環基としては、特に、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、及びシクロヘキサジエニル基が挙げられ、これらはすべて、任意選択により置換されている。
【０１１１】
[00111]アルキル基などの所与の基における炭素原子の数は、本明細書では、表示「Ｃｍ」を使用して示す場合があり、ｍが、炭素原子の数である。したがって、所与の化学基を修飾する表示「Ｃｍ１〜Ｃｍ２」は、ｍ１〜ｍ２個の炭素原子を含みうる基を示す。たとえば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、アルキル基上にある置換基の炭素を除いて、１〜６個の炭素原子を含んでいる。同様の表示を使用して、所与の基におけるＮ（窒素）、Ｏ（酸素）、又は他の元素の原子数も示すことができる。
【０１１２】
[00112]ヘテロシクリル（又はヘテロ環式）基とは、１つ又は複数の飽和又は不飽和炭素環を有し、環あたり１個〜３個のヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ又はＳ）を含んでいる基である。こうした基は、１つ、２つ、又は３つの二重結合を任意選択により含んでいる。原子価要件を満たすために、環原子は、本明細書に記載のとおりに置換されていてもよい。ヘテロ環式の環における１個又は複数の炭素は、−ＣＯ−基でもよい。ヘテロシクリル基には、３〜１２個の炭素原子と１〜６個のヘテロ原子とを有し、１又は２個の炭素原子が−ＣＯ−基で置き換えられているものが含まれる。ヘテロシクリル基には、３〜１２個又は３〜１０個の環原子を有し、そのうち３つまでが炭素以外のヘテロ原子でよいものが含まれる。ヘテロシクリル基は、それぞれが飽和又は不飽和である１つ又は複数の環を含んでいる場合がある。ヘテロシクリル基には、二環式又は三環式の基が含まれる。好ましいヘテロシクリル基は、５又は６員環を有する。ヘテロシクリル基は、本明細書に記載のとおりに任意選択により置換されている。詳細には、ヘテロ環基は、１つ又は複数のアルキル基で置換されていてよい。ヘテロシクリル基には、１個又は２個の窒素と１つ又は２つの二重結合とを有する５員及び６員環を有するものが含まれる。ヘテロシクリル基には、酸素又は硫黄と１つ又は２つの二重結合とを有する５員及び６員環を有するものが含まれる。ヘテロシクリル基には、５又は６員環と、２個の異なるヘテロ原子、たとえば、Ｎ及びＯ、Ｏ及びＳ、又はＮ及びＳとを有するものが含まれる。詳細なヘテロシクリル基としては、特に、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピロリル、ピロリニル、フリル、チエニル、モルホリニル、オキサゾリル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、インドリル、トリアゾリル、及びトリアジニル基が挙げられる。
【０１１３】
[00113]アリール基には、１つ又は複数の５又は６員芳香族環を有する基が含まれる。アリール基は、１つ、２つ、又は３つの６員芳香族環を含んでいる場合がある。アリール基は、縮合した２つ以上の芳香族環を含んでいる場合がある。アリール基は、縮合した２つ又は３つの芳香族環を含んでいる場合がある。アリール基は、１つ又は複数の非水素置換基で任意選択により置換されている。置換アリール基には、特に、任意選択により置換されていてよいアルキル又はアルケニル基で置換されているものが含まれる。詳細なアリール基としては、フェニル基、ビフェニル基、及びナフチル基が挙げられ、これらはすべて、本明細書に記載のとおりに任意選択により置換されている。置換アリール基には、１個又は複数の水素が１個又は複数のフッ素原子、塩素原子、臭素原子、及び／又はヨウ素原子で置き換えられているアリール基などの、全ハロゲン化又は半ハロゲン化アリール基が含まれる。置換アリール基には、１個又は複数の水素が１個又は複数のフッ素原子で置き換えられているアリール基などの、全フッ素化又は半フッ素化アリール基が含まれる。
【０１１４】
[00114]ヘテロアリール基には、少なくとも１つの環がヘテロ原子（非炭素環原子）を含んでいる１つ又は複数の芳香族環を有する基が含まれる。ヘテロアリール基は、１、２、又は３個のヘテロ原子を有する１つ又は２つのヘテロ芳香族環を有するものを包含し、任意選択により１つの６員芳香族環を有する。ヘテロアリール基は、５〜２０個、５〜１２個、又は５〜１０個の環原子を含んでいる場合がある。ヘテロアリール基には、ヘテロ原子を含んでいる１つの芳香族環と、炭素環原子を含んでいる１つの芳香族環とを有するものが含まれる。ヘテロアリール基には、１つ又は複数の５又は６員芳香族ヘテロ芳香族環と、１つ又は複数の６員炭素芳香族環とを有するものが含まれる。ヘテロ芳香族環は、環において、１個又は複数のＮ、Ｏ、又はＳ原子を含んでよい。ヘテロ芳香族環には、１個、２個、若しくは３個のＮを有するもの、１個若しくは２個のＯを有するもの、及び１個若しくは２個のＳ、又は１個、２個若しくは３個のＮ、Ｏ、若しくはＳの組合せを有するものを含めることができる。詳細なヘテロアリール基としては、フリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、及びプリニル基が挙げられる。本明細書における詳細な実施形態では、アリール基は、アリール環中にヘテロ原子を含んでいない。ヘテロアリールを含めたアリール基は、任意選択により置換されている。
【０１１５】
[00115]ヘテロ原子には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、又はＢが含まれる。より特定すると、ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、又はＳである。詳細な実施形態では、１個又は複数のヘテロ原子は、芳香族環又は炭素環中の炭素に取って代わっている。原子価を満たすために、そのような芳香族環又は炭素環中にあるヘテロ原子は、Ｈ、又は置換基、たとえばアルキル基若しくは他の置換基に結合していてもよい。
【０１１６】
[00116]ヘテロアリールアルキル基とは、１つ又は複数のヘテロアリール基で置換されているアルキル基であり、アルキル基は、任意選択により追加の置換基を有し、アリール基は、任意選択により置換されている。
【０１１７】
[00117]アルキルアリール基とは、１つ又は複数のアルキル基で置換されているアリール基であり、アルキル基は、任意選択により追加の置換基を有し、アリール基は、任意選択により置換されている。詳細なアルキルアリール基は、メチルフェニルなどの、アルキル置換されたフェニル基である。
【０１１８】
[00118]アリールアルキル基とは、１つ又は複数のアリール基、通常は１つのアリール基で置換されているアルキル基である。アリール基は、任意選択により置換されている。詳細なアリールアルキル基としては、ベンジル、任意選択により置換されているベンジル、フェネチル、及び任意選択により置換されているフェネチルが挙げられる。
【０１１９】
[00119]アルキルヘテロアリール基とは、１つ又は複数のアルキル基で置換されているヘテロアリール基であり、アルキル基は、任意選択により追加の置換基を有し、アリール基は、任意選択により置換されている。
【０１２０】
[00120]アルコキシ基とは、上で大まかに論じたとおりのアルキル基が酸素に結合したもの（Ｒアルキル−Ｏ−）である。アリールオキシ基とは、上で論じたとおりのアリール基が酸素に結合したもの（Ｒアリール−Ｏ−）である。ヘテロアリールオキシ基とは、上で論じたとおりのヘテロアリール基が酸素に結合したもの（Ｒヘテロアリール−Ｏ−）である。カルボシクリルオキシ基とは、上で大まかに論じたとおりのカルボシクリル基が酸素に結合したもの（Ｒカルボシクリル−Ｏ−）である。ヘテロシクリルオキシ基とは、上で大まかに論じたとおりのカルボシクリル基が酸素に結合したもの（Ｒヘテロシクリル−Ｏ−）である。
【０１２１】
[00121]アシル基とは、Ｒ’−ＣＯ基であり、Ｒ’は、一般に、水素、上述のとおりのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はヘテロアリール基である。詳細な実施形態では、アシル基は、１〜２０個、１〜１２個、又は１〜６個の炭素原子と、任意選択により１〜３個のヘテロ原子とを有し、任意選択により１つ二重結合又は１つの三重結合を有する。詳細な実施形態では、Ｒは、カルボニル官能基を介して親構造に結合しているＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、若しくはアルキニル基、環式立体配置、又はこれらの組合せである。例としては、アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、又はオキサリルが挙げられる。アシル基のＲ’基は、上述のとおりに任意選択により置換されている。Ｒ’が水素であるとき、基は、ホルミル基である。アセチル基は、ＣＨ３−ＣＯ−基である。例となる別のアシル基は、ベンジルオキシ基である。
【０１２２】
[00122]アルキルチオ基とは、上で大まかに論じたとおりのアルキル基が硫黄に結合したもの（Ｒアルキル−Ｓ−）である。アリールチオ基とは、上で論じたとおりのアリール基が硫黄に結合したもの（Ｒアリール−Ｓ−）である。ヘテロアリールチオ基とは、上で論じたとおりのヘテロアリール基が硫黄に結合したもの（Ｒヘテロアリール−Ｓ−）である。カルボシクリルチオ基とは、上で大まかに論じたとおりのカルボシクリル基が酸素に結合したもの（Ｒカルボシクリル−Ｓ−）である。ヘテロシクリルチオ基とは、上で大まかに論じたとおりのカルボシクリル基が酸素に結合したもの（Ｒヘテロシクリル−Ｓ−）である。
【０１２３】
[00123]アミノ基という用語は、種−Ｎ（Ｈ）２−を指す。アルキルアミノという用語は、種−ＮＨＲ”を指し、ここで、Ｒ”は、アルキル基、特に、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基である。ジアルキルアミノという用語は、種−ＮＲ”２を指し、ここで、各Ｒ”は、独立に、アルキル基、特に、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基である。
【０１２４】
[00124]本明細書における基は、最も一般には、１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリールで任意選択により置換されており、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリル基は、たとえば、１つ又は複数のオキソ基、チオキソ基、ハロゲン、ニトロ、シアノ、シアネート、アジド、チオシアノ、イソシアノ、イソチオシアノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、アルキニルオキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、カルボシクリル、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、チオヘテロアリール、チオヘテロアリール、チオカルボシクリル、チオヘテロシクリル、−ＣＯＲ、−ＣＯＨ、−ＯＣＯＲｓ、−ＯＣＯＨ、−ＣＯ−ＯＲｓ、−ＣＯ−ＯＨ、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｒｓ、−ＣＯＮ（Ｒｓ）２、−ＣＯＮＨＲｓ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＲｓ−ＣＯＲｓ、−ＮＨＣＯＲｓ、−ＮＨＲｓ、−Ｎ（Ｒｓ）２、−Ｏ−ＳＯ２−Ｒｓ、−ＳＯ２−Ｒｓ、−ＳＯ２−ＮＨＲｓ、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒｓ）２、−ＮＲｓ−ＳＯ２−Ｒｓ、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒｓ、−ＮＲｓＣＯ−Ｎ（Ｒｓ）２、−ＮＨｓ−ＣＯ−ＮＨｓＲ、−Ｏ−ＰＯ（ＯＲｓ）２、−Ｏ−ＰＯ（ＯＲｓ）（Ｎ（Ｒｓ）２）、−Ｏ−ＰＯ（Ｎ（Ｒｓ）２）２、−Ｎ−ＰＯ（ＯＲｓ）２、−Ｎ−ＰＯ（ＯＲｓ）（Ｎ（Ｒｓ）２）、−Ｐ（Ｒｓ）２、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｂ（ＯＨ）（ＯＲｓ）、−Ｂ（ＯＲｓ）２で置換されている場合があり、ここで、各Ｒｓは、独立に、有機基であり、より詳細には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、若しくはヘテロシクリル基であり、又は同じ置換基内の２つのＲｓが、一緒になって、３〜１０個の環原子を有する炭素環又はヘテロ環を形成している場合もある。非水素置換基の有機基は、さらにまた、１つ又は複数のハロゲン、ニトロ、シアノ、イソシアノ、イソチオシアノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキル、非置換アルキル、非置換アルケニル、非置換アルキニル  アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシルアリール、アルキルアリール、非置換アリール、非置換炭素環、ハロ置換された炭素環、ヒドロキシル置換された炭素環、アルキル置換された炭素環、非置換ヘテロ環、非置換ヘテロアリール、アルキル置換されたヘテロアリール、又はアルキル置換されたヘテロ環で任意選択により置換されている。詳細な実施形態では、置換基のＲ基は、アルキル基、ハロアルキル基、フェニル基、ベンジル基、並びにハロ置換されたフェニル及びベンジル基から独立に選択される。詳細な実施形態では、非水素置換基は、１〜２０個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、１〜７個の炭素原子、１〜５個の炭素原子、又は１〜３個の炭素原子を有する。詳細な実施形態では、非水素置換基は、１〜１０個のヘテロ原子、１〜６個のヘテロ原子、１〜４個のヘテロ原子、又は１、２、若しくは３個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子としては、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｂ、及びＳｅが挙げられ、Ｏ、Ｎ、又はＳであることが好ましい。
【０１２５】
[00125]詳細な実施形態では、任意選択による置換は、１〜１２個（又は１〜３個、１〜３個、若しくは１〜６個）の非水素置換基での置換である。詳細な実施形態では、任意選択による置換は、１〜６個の非水素置換基での置換である。詳細な実施形態では、任意選択による置換は、１〜３個の非水素置換基での置換である。詳細な実施形態では、任意選択の置換基は、６個以下の炭素原子を含んでいる。詳細な実施形態では、任意選択による置換は、１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、オキソ基、チオキソ基、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、又は非置換アリール基による置換である。オキソ基及びチオキソ基という用語は、それぞれ−ＣＯ−（カルボニル）又は−ＣＳ−（チオカルボニル）基を生じる、ａ＝Ｏ又はａ＝Ｓでの炭素原子の置換を指す。
【０１２６】
[00126]詳細な実施形態では、任意選択による置換のための非水素置換基として、アルキル、アルコキシ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ、好ましくはＣｌ又はＦ）、ハロアルキル、又はハロアルコキシが挙げられる。詳細な実施形態では、任意選択による置換のための非水素置換基として、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、Ｆ、Ｃｌ、及びトリフルオロメチルが挙げられる。
【０１２７】
[00127]詳細な置換アルキル基としては、ハロアルキル基、特に、トリハロメチル基、詳細には、トリフルオロメチル基が挙げられる。詳細な置換アリール基としては、モノ、ジ、トリ、テトラ、及びペンタハロ置換フェニル基；モノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、及びヘプタハロ置換ナフタレン基；３又は４−ハロ置換フェニル基、３又は４−アルキル置換フェニル基、３又は４−アルコキシ置換フェニル基、３又は４−ＲＣＯ置換フェニル、５又は６−ハロ置換ナフタレン基が挙げられる。より詳細には、置換アリール基として、アセチルフェニル基、特に、４−アセチルフェニル基、フルオロフェニル基、特に、３−フルオロフェニル及び４−フルオロフェニル基、クロロフェニル基、特に、３−クロロフェニル及び４−クロロフェニル基、メチルフェニル基、特に、４−メチルフェニル基、並びにメトキシフェニル基、特に、４−メトキシフェニル基が挙げられる。
【０１２８】
[00128]１つ又は複数の置換基を含んでいる上記基のいずれに関しても、このような基は、立体配置上実現不可能及び／又は合成上実行不可能である置換又は置換パターンを含んでいないと理解される。加えて、本発明の化合物は、こうした化合物が置換されて生じるすべての立体化学異性体を包含する。
【０１２９】
[00129]本発明の化合物は、塩の形でもよい化学基（酸性又は塩基性の基）を含んでいる場合もある。例となる酸付加塩としては、酢酸塩（酢酸又はトリハロ酢酸に対して形成されるものなど、たとえば、トリフルオロ酢酸）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸に対して形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素に対して形成される）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸に対して形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸に対して形成される）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸に対して形成されるものなど）、スルホン酸塩（本明細書で言及するものなど）、酒石酸、チオシアン酸塩、トシル酸塩などのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。
【０１３０】
[00130]例となる塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基（たとえば、有機アミン）との塩、たとえば、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン［Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロ−アビエチル）エチレンジアミンに対して形成される］、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミン、並びにアルギニンやリシンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。塩基性含窒素基は、ハロゲン化低級アルキル（たとえば、塩化、臭化、及びヨウ化メチル、エチル、プロピル、及びブチル）、硫酸ジアルキル（たとえば、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル）、長鎖ハロゲン化物（たとえば、塩化、臭化、及びヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリル）、ハロゲン化アラルキル（たとえば、臭化ベンジル及びフェネチル）他などの薬剤で四級化されていてもよい。
【０１３１】
[00131]本発明の塩には、遊離塩基又は遊離酸の生物学的な有効性及び特性を保持しており、生物学的又は他の意味で望ましい塩をいう「薬学的に許容される塩」が含まれる。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容されるアニオン及び／又はカチオンを含む。
【０１３２】
[00132]本発明の化合物及びその塩は、水素原子が分子の他の部分に転移し、その結果分子の原子間の化学結合が再編成される、その互変異性体の形で存在してもよい。存在しうる限り、すべての互変異性体型が本発明の範囲内に含まれると理解すべきである。
【０１３３】
[00133]加えて、発明化合物は、トランス及びシス異性体を有する場合もあり、また１つ又は複数のキラル中心を含んでおり、したがって、鏡像異性体及びジアステレオ異性体の形で存在する場合もある。本発明は、すべてのこのような異性体、並びにシス及びトランス異性体の混合物、ジアステレオ異性体の混合物、及び鏡像異性体（光学異性体）のラセミ混合物を包含する。化合物（又は不斉炭素）の立体配置（シス、トランス、又はＲ若しくはＳ）に詳細に言及しないとき、異性体又は１種を超える異性体の混合物の任意の１つが意図される。調製過程では、ラセミ体、鏡像異性体、又はジアステレオ異性体を出発材料として使用することができる。鏡像異性体又はジアステレオ異性体生成物を調製するとき、これらは、従来の方法、たとえば、クロマトグラフィー又は分別結晶によって分離することができる。発明化合物は、遊離又は水和形態である場合もある。種々の本発明の化合物に関して、化合物中の原子は、様々な同位体形態をとることもでき、たとえば、水素の同位体として、ジュウテリウム及びトリチウムが挙げられる。本発明の化合物のすべての同位体変形形態が本発明の範囲内に含まれ、特に、ジュウテリウム及び１３Ｃ同位体変形形態が含まれる。このような同位体変形形態が、種々の化学的及び生物学的分析、反応機序の調査などを行うのに有用となりうることは理解されよう。同位体変形形態の作製方法は、当業界で公知である。
【０１３４】
[00134]本明細書における方法の諸実施形態では、カーゴ分子を、本明細書における式Ｉの化合物でエステル化し、細胞又は組織を、エステル化されたカーゴ分子と接触させる。細胞又は組織との接触は、細胞又は組織に適する水性緩衝液中で通常は実施する。接触は、当業者が容易に選択することのできる適切なｐＨの水性緩衝液中で通常は実施される。通常、接触は、５〜８の範囲のｐＨで実施される。接触には、生物又は個体への投与を含めることができる。本明細書における方法では、適切などんな投与形態を用いてもよい。本発明のエステル化されたカーゴ分子は、たとえば、製薬業者に周知の適切ないずれかの剤形で、経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内投与することができる。エステル化されたカーゴ分子は、任意選択により、選択された投与経路、並びに、たとえば、適切な投与及び担体に関してその全体が参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ａｌｆｏｎｏｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルヴェニア州イーストン（１９８５）に記載されているような標準の製薬業務に基づいて選択された医薬担体と共に投与される。
【０１３５】
[00135]カーゴ分子としては、特に、核酸、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、レポーター及び標識（たとえば、蛍光標識又は同位体標識）、イメージング剤、造影剤、反応性官能基を有する粒子、反応性官能基を有する量子ドットが挙げられる。一般に、本発明の方法では、細胞に導入することが所望されるどんなカーゴ分子も用いることができる。カーゴ分子には、生物活性を有するものが含まれる。詳細な実施形態では、カーゴ分子の目的の生物活性は、エステル化されても保持され、又は細胞に送達された後選択的にエステル化が解除されて回復する。詳細な一実施形態では、エステル化されたカーゴ分子は、エステル化前のカーゴ分子の選択された生物活性の少なくとも１０％を保持する。他の詳細な実施形態では、エステル化されたカーゴ分子は、エステル化前のカーゴ分子の選択された生物活性の少なくとも５０％を保持する。さらなる詳細な一実施形態では、エステル化されたカーゴ分子は、エステル化前のカーゴ分子の活性の少なくとも８０％を保持する。
【０１３６】
[00136]詳細な一実施形態では、カーゴタンパク質は、酵素である。詳細な一実施形態では、カーゴタンパク質は、グリコシル化されている（すなわち、糖タンパク質である）。詳細な一実施形態では、カーゴタンパク質は、グリコシル化されていいない（すなわち、糖タンパク質でない）。詳細な一実施形態では、エステル化されたカーゴペプチド又はタンパク質は、エステル化前のタンパク質の選択された生物活性の少なくとも１０％を保持する。他の詳細な実施形態では、エステル化されたカーゴペプチド又はタンパク質は、エステル化前のタンパク質の選択された生物活性の少なくとも５０％を保持する。さらなる詳細な一実施形態では、エステル化されたカーゴペプチド又はタンパク質は、エステル化前のペプチド又はタンパク質の活性の少なくとも８０％を保持する。ペプチド及びタンパク質には、酵素活性を有するものが含まれる。
【０１３７】
[00137]カーゴペプチドとしては、特に、ペプチドリガンド、細胞傷害性ペプチド、生理活性ペプチド、診断薬が挙げられる。カーゴペプチドには、２〜１０００のアミノ酸、２〜５００のアミノ酸、２〜２５０のアミノ酸、２〜１００のアミノ酸、２〜５０のアミノ酸、２〜２５のアミノ酸、及び２〜１０のアミノ酸を有するものが含まれる。
【０１３８】
[00138]ペプチド及びタンパク質には、抗体及びその機能性断片が含まれ、抗体という用語は、本明細書では大まかに使用する。より詳細には、抗体には、特に、当業界で公知のいずれかの方法による、ヒト化抗体、ヒト抗体、種間抗体（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、種間抗体を始めとする、モノクローナル抗体が含まれる。抗体の機能性断片には、特に、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、並びにハイブリッド断片が含まれる。加えて、抗体には、免疫グロブリンの高頻度可変性の抗原結合領域を保持し、好ましくは、Ｆａｂ’断片と同様又はそれより小さい大きさを有する細断片も含まれる。単鎖断片又は多重鎖断片を含めて、抗原結合部位を内蔵し、抗体機能を示す、このような断片及び細断片は、当業界で公知であり、組換えタンパク質の調製方法を始めとして、当業界で周知の方法によって調製することができる。抗体及びその断片には、当業界で公知の治療用抗体が含まれる［３５］。この参考文献は、本発明において用いることのできる治療用抗体についての記述に関して、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３９】
[00139]詳細な一実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい核酸、又はペプチド核酸、ロックト核酸、若しくはホスホルアミデート−モルホリノオリゴマーとされうる核酸類似体である。当業界で公知の他の核酸類似体として、カルバメートに連結されたＤＮＡ、ホスホロチオエートに連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホトリエステルに連結されたＤＮＡ、又はメチルホスホネートに連結されたＤＮＡが挙げられる。カーゴ核酸は、一本鎖又は二本鎖でよい。核酸は、２〜１００、２〜５０、又は２〜２５塩基を有するオリゴヌクレオチド又はその類似体でよい。核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド、又は小円などの他の核酸構造でよい。核酸及びその類似体は、市販品供給元から入手可能であり、天然供給源から単離することができ、又は当業界で周知の方法によって調製することができる。
【０１４０】
[00140]詳細な一実施形態では、エステル化されたカーゴ核酸は、エステル化前の核酸の選択された生物活性の少なくとも１０％を保持する。他の詳細な実施形態では、エステル化されたカーゴ核酸は、エステル化前の核酸の選択された生物活性の少なくとも５０％を保持する。さらなる詳細な一実施形態では、エステル化された核酸は、エステル化前の核酸の活性の少なくとも８０％を保持する。詳細な一実施形態では、保持されている核酸の生物活性は、相補的な核酸に結び付いており、又は別の生体分子（たとえば、ペプチド又はタンパク質）に結び付いている。
【０１４１】
[00141]カーゴ核酸には、２〜１０００の塩基、２〜５００の塩基、２〜２５０の塩基、２〜１００の塩基、２〜５０の塩基、２〜２５の塩基、及び２〜１０塩基を有するものが含まれる。核酸には、ヌクレオシド及びその類似体が含まれる。
【０１４２】
[00142]詳細な実施形態では、ＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡへの転写に影響を及ぼし、したがって１つ又は複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす転写因子（タンパク質）が、カーゴ分子として挙げられる。詳細な実施形態では、転写因子は、１つ又は複数のＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子としては、特に、腫瘍抑制因子が挙げられる。臨床上重要となる可能性のある詳細な転写因子は、アポトーシスの引き金として機能するＦＯＸＯ３である（３６）。式Ｉの１種又は複数のジアゾ化合物を、ＦＯＸＯ転写因子を始めとする転写因子、より詳細にはＦＯＸＯ３のエステル化に用いると、その細胞内取込みを促進することができる。本明細書における可逆性のジアゾエステル化試薬を用いると、エステル化された基は、細胞内取込み後に除去される。
【０１４３】
[00143]詳細な実施形態では、腫瘍抑制因子として機能するタンパク質が、カーゴ分子として挙げられる。たとえば、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスホスフェート３−ホスファターゼであるＰＴＥＮ、カーゴ分子として挙げられる（Ｈｏｐｋｉｎｓら、２０１３、７）。ＰＴＥＮは、テンシン様ドメインに加えてホスファターゼ触媒ドメインを含んでいる。ＰＴＥＮは、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路を負に調節して、腫瘍抑制因子として機能する。細胞浸透性基を有する本発明の１種又は複数のジアゾ化合物をＰＴＥＮのエステル化に用いると、その細胞内取込みを促進することができる。本明細書における可逆性のエステル化試薬を用いると、エステル化された基は、細胞内取込み後に除去される。
詳細な一実施形態では、カーゴ分子は、細胞遊走、細胞極性、及び細胞増殖に関与する足場タンパク質であるＳＣＲＩＢである［３７］。フルオレニルなどの細胞浸透性基を有する本発明の１種又は複数のジアゾ化合物をＳＣＲＩＢのエステル化に用いると、その細胞内取込みを促進することができる。本明細書における可逆性のエステル化試薬を用いると、エステル化された基は、細胞内取込み後に除去されて、細胞の細胞質ゾルへの侵入が容易になる。
【０１４４】
[00144]本明細書で例示する詳細な実施形態では、本発明のジアゾ化合物を用いて、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を、１つ又は複数の細胞浸透性基と共にエステル化して、蛍光タンパク質の細胞内取込みを促進することができる。本明細書におけるジアゾ化合物は、当業界で公知の種々の蛍光タンパク質と共に用いて、その細胞への取込みを促進することができる。
【０１４５】
[00145]本発明は、標識、又は標的化及び細胞内取込みのために、１つ若しくは複数又は２つ以上のカルボキシレート基を有するカーゴ分子を可逆的にエステル化する方法であって、エステル基は、細胞内取込み後にエステル切断によって除去可能である、方法を提供する。
【０１４６】
[00146]細胞内取込みは、少なくともある程度、細胞質ゾルへの取込みを包含する。詳細な実施形態では、方法は、エステルを生成するカーゴ分子上のカルボキシレート基との反応に、式Ｉのジアゾ化合物を用いる。カーゴ分子の２つ以上のカルボキシレート基が反応して、たとえばエステル結合を介して、細胞浸透性基に共有結合性に取り付けられることが好ましい。エステル化された後、カーゴ分子は、細胞又は組織と接触した状態に置かれ、エステル化されたカーゴ分子は、細胞へ、また少なくともある程度は細胞質ゾルへと吸収される。細胞に取り込まれた後、エステル基は、たとえば、細胞内酵素（たとえばエステラーゼ）の作用によって、細胞内で除去される。
【０１４７】
[00147]本明細書全体にあるすべての参考文献、たとえば、発行又は譲渡された特許又は均等物を含めた特許文書、特許出願公開、及び非特許文献文書又は他の原資料は、個々に参照により援用されるかの如く、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１４８】
[00148]本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する業界の技術者の技量のレベルを示すものである。本明細書で引用する参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用されて、一部の場合ではその出願日現在の、技術の状態を示しており、この情報を本明細書で用いて、必要なら、先行技術にある詳細な実施形態を排除する（たとえば、放棄する）ことができるものとする。たとえば、化合物が請求の対象であるとき、本明細書で開示する参考文献（特に、参考文献として挙げられた特許文書）で開示されているある特定の化合物を含めて、先行技術において公知の化合物は、特許請求の範囲に含まれるものではないことを理解すべきである。
【０１４９】
[00149]本明細書において置換基の群を開示するとき、こうした群、及び群メンバーの任意の異性体及び鏡像異性体を含めたすべての下位群の個々の全メンバーと、置換基を使用して形成されうる化合物の部類は、別々に開示されると理解される。化合物を請求の対象とするとき、本明細書で開示する参考文献において開示されている化合物を含めて、当業界で公知の化合物は、含まれるものではないと理解すべきである。本明細書においてマーカッシュ群又は他の組分けを使用するとき、群の個々の全メンバー並びに群の可能なすべての組合せ及びサブコンビネーションが、個々に開示に含まれるものとする。
【０１５０】
[00150]別段言明しない限り、記載又は例示した成分のあらゆる配合又は組合せを使用して本発明を実践することができる。化合物の詳細な名称は、当業者によって同じ化合物が異なって命名されうることがわかっているので、例示的なものとする。本明細書において、化合物の特定の異性体又は鏡像異性体を指定しないように、化合物を、たとえば式又は化学名で記載するとき、その記載は、個々に又はいずれかに組み合わされて記載された化合物の各異性体及び鏡像異性体を包含するものとする。
【０１５１】
[00151]当業者なら、本発明を実践する際、詳細に例示したもの以外の方法、装置要素、出発材料、及び合成方法を、必要以上の実験に頼ることなく使用できることがわかるであろう。そのような任意の方法、装置要素、出発材料、及び合成方法の、当業界で公知のすべての機能均等物が、本発明に含まれるものとする。本明細書において範囲、たとえば、温度範囲、時間範囲、又は組成範囲を示すときは常に、すべての中間範囲及び下位範囲、並びに示した範囲に含まれる個々のすべての値が、開示に含まれるものとする。
【０１５２】
[00152]本明細書で使用するとき、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、又は「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ」と同義であり、包含的又は開放型であり、列挙されていない追加の要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で使用するとき、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」は、クレーム要素に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。本明細書で使用するとき、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」は、請求項の基本的及び新奇な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップを除外しない。特に、組成物の成分についての記述、又は装置の要素についての記述において、本明細書における用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の記述は、列挙された成分又は要素から本質的になる、及びそれからなる組成物及び方法を包含すると理解される。本明細書において説明的に記載する本発明は、本明細書において詳述していない任意の１つ又は複数の要素、制限なしでも適切に実施することができる。
【０１５３】
[00153]特定の説に拘りたくはないが、本発明に関する根源的な原理についての意見又は見解を本明細書において論じることはできる。いずれかの機構的な説明又は仮説の最終的な正確さにかかわらず、本発明の実施形態は、それでもなお、有効且つ有用となりうると認識される。
【０１５４】
[00154]用いてきた用語及び表示は、限定ではなく説明の用語として使用しており、そうした用語及び表示の使用には、表示及び記載した特色のいずれかの均等物又はその部分を除外する意図はなく、請求項に係る本発明の範囲内で種々の改変は可能であると認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択の特色によって詳細に開示してきたはいえ、本明細書で開示された構想が当業者によって改変及び変更されてもよいこと、並びにそのような改変及び変更は、本発明の範囲内にあると考えられることを理解すべきである。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：一般実験
[00155]材料。シリカゲル（４０μｍ、２３０〜４００メッシュ）は、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅのものとした。試薬は、市販品供給元から入手し、さらに精製せずに使用した。ジクロロメタン（ＤＭＣ）及びテトラヒドロフランは、アルミナカラムで乾燥させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭＤ  ２５０μｍシリカ６０−Ｆ２５４のプレートで行った。
【０１５６】
[00156]溶媒除去。「減圧下で濃縮」という表現は、ロータリーエバポレーターを、水浴を４０℃未満に保ちながら水吸引圧力（＜２０トル）において使用して、溶媒及び他の揮発性材料を除去することを指す。残りの溶媒は、高真空（＜０．１トル）でサンプルから除去した。
【０１５７】
[00157]ＮＭＲ分光法。すべての化合物についての１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、マディソンのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙにあるＢｒｕｋｅｒ分光計によって、４００、５００、６００、又は７５０ＭＨｚで稼働させて取得した。化学シフトデータは、内部標準（残留溶媒又はＴＭＳ）を基準としてδ（ｐｐｍ）の単位で報告する。
【０１５８】
[00158]質量分析。小分子特性決定のためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、ウィスコンシン大学マディソン校の化学部にあるＭａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴによって行った。タンパク質特性決定のためのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−時間飛行型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析は、ウィスコンシン大学マディソン校にあるＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ計測器によって行った。
【０１５９】
[00159]略語：  ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロイソニトリル）、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’，ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＤＣＭ（ジクロロメタン）。
【０１６０】
実施例２：合成及び特性決定データ
[00160]α−ブロモ酸Ｓ１の調製
【化１７】
2018512424.tif 000019
４−メトキシフェニル酢酸（５．０００ｇ、３０．１０ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４（５０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ、５．６２５ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（０．９８５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られる溶液を８０℃に加熱し、終夜還流させた。濾過によってスクシンイミド副生物を除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１（５．７０５ｇ、７８％）を白色の固体として得た。
Ｓ１についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、５．３６（ｓ，１Ｈ）、３．８２（ｓ，１Ｈ．）１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７３．４、１６０．５、１３０．２、１２６．８、１１４．３、５５．４、４５．９、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ９ＢｒＯ３［Ｍ−Ｈ］−の計算値２４２．９６６２；実測値、２４２．９６６０。
【０１６１】
[00161]α−アジド酸Ｓ２の調製
【化１８】
2018512424.tif 000020
α−ブロモ−４−メトキシフェニル酢酸Ｓ１（０．８０２ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ）に溶解させた。アジ化ナトリウム（０．４２９ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を終夜撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させた。得られる溶液を０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、Ｓ２（０．４１２ｇ、６２％）を白色の固体として得た。
【０１６２】
[00162]Ｓ２についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、６．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、５．００（ｓ，１Ｈ）、３．８３（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７３．５、１６０．５、１２９．１、１２５．２、１１４．６、６４．６、５５．４、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ９Ｎ３Ｏ３［Ｍ−Ｈ］−の計算値２０６．０５７１；実測値、２０６．０５７７。
【０１６３】
[00163]α−アジド４−メトキシフェニル酢酸アミドＳ３の調製
【化１９】
2018512424.tif 000021
α−アジド−４−メトキシフェニル酢酸Ｓ２（０．４１２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．２３０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＣＣ（０．４５３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。得られる溶液を周囲温度に温め、終夜撹拌した。濾過によってスラリーを除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、３：７のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、直ちに使用した。ＮＨＳエステル（０．４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解させた。ベンジルアミン（０．１０ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下し、得られる溶液を終夜撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解させ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×１０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、Ｓ３（０．２５５ｇ、４３％）を白色の固体として得た。
【０１６４】
[00164]Ｓ３についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．３４〜７．３０（ｍ，４Ｈ）、７．２７〜７．２３（ｍ，３Ｈ）、６．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、４．９９（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｍ，２Ｈ）、３．８０（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６９．４、１６１．０、１３９．８、１３０．２、１２９．４、１２８．４、１２８．２、１２８．０、１１５．１、６６．６、５５．９、４３．６。ＨＲＭＳ  ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２９７．１３４７；実測値、２９７．１３４６。
【０１６５】
[00165]α−ジアゾアミド１の調製
【化２０】
2018512424.tif 000022
α−アジドアミドＳ３（０．３５６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を２０：３のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１２ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（０．４４０ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を周囲温度に温め、すべてのアジドが消費されるまで撹拌した（ＴＬＣによってモニターしながら約１２時間）。ＤＢＵ（０．２１ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１時間撹拌した。次いで、溶液をブライン（１０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、１（０．０９５ｇ、２８％）を橙色の固体として得た。
【０１６６】
[00166]１についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．３４〜７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．２６〜７．２３（ｍ，１Ｈ）、４．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、３．８０（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６５．４、１５９．７、１３８．４、１３０．３、１２８．７、１２７．７、１１７．５、１１５．３、６３．１、５５．４、４４．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１５Ｎ３Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２８２．１２３８；実測値、２８２．１２３２。
【０１６７】
[00167]α−アジド酸Ｓ４の調製
【化２１】
2018512424.tif 000023
イミダゾール−１−スルホニル−アジド塩酸塩を、以前に報告されているとおりに調製した。［２９］分光データ及び収率が、以前に報告されたものと一致した。α−アミノ−４−メチルフェニル酢酸（２．０００ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２４ｍＬ）に溶解させた。ＤＢＵ（３．６１ｍＬ、２４．２ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（０．３００ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、及びアジド（３．０３０ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られる溶液を４０℃に加熱し、終夜撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解させ、１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（２×３０ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させた。溶液を減圧下で濃縮した。残留物をベンゼンに溶解させ、ベンゼン及びヘキサンから再結晶させて、Ｓ４（０．３９０ｇ、１７％）を白色の固体として得た。
【０１６８】
[00168]Ｓ４についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．０１（ｓ，１Ｈ）、２．３７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７３．４、１３９．７、１３０．２、１２９．９、１２７．６、６４．９、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ９Ｎ３Ｏ２［Ｍ−Ｈ］−の計算値１９０．０６２２；実測値、１９０．０６２５。
【０１６９】
[00169]α−アジド−メチルフェニル酢酸アミドＳ５の調製
【化２２】
2018512424.tif 000024
α−アジド４−メチルフェニル酢酸Ｓ４（２．２０４ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解させ、氷浴で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．３３４ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＣＣ（２．６３７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。得られる溶液を周囲温度に温め、終夜撹拌した。濾過によってスラリーを除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解させた。得られる溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮し、直ちに使用した。ＮＨＳエステル（２．５ｇ、８．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させた。ベンジルアミン（０．９８ｍＬ、９．６ｍｍｏｌ）を滴下し、得られる溶液を終夜撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解させ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×３０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、Ｓ５（１．９８８ｇ、６１％）を白色の固体として得た。
【０１７０】
[00170]Ｓ５についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．３３〜７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２６〜７．２２（ｍ，５Ｈ）、５．００（ｓ，１Ｈ）、４．３６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．８，６．２Ｈｚ）、２．３５（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６９．２、１４０．０、１３９．８、１３３．５、１３０．４、１２９．４、１２８．８、１２８．０、６６．９、４３．６、２１．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２８１．１３９７；実測値、２８１．１３９５。
【０１７１】
[00171]α−ジアゾ−メチルフェニル酢酸アミド２の調製
【化２３】
2018512424.tif 000025
α−アジド４−メチルフェニル酢酸アミドＳ５（１．９９５ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を２０：３のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（２．７６９ｇ、７．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を周囲温度に温め、すべてのアジドが消費されるまで撹拌した（ＴＬＣによってモニターしながら約２４時間）。ＤＢＵ（１．２７ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を４５分間撹拌した。次いで、溶液をブライン（１０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、４：６のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、２（１．０３８ｇ、５５％）を橙色の固体として得た。
【０１７２】
[00172]２についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．３３〜７．２３（ｍ，９Ｈ）、６．６３（ｓ，１Ｈ）、４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６５．５、１４０．７、１３８．１、１３０．９、１２９．３、１２８．２、１２８．１、１２７．９、１２４．１、６３．７４、４４．０、２１．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１５Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２６６．１２８８；実測値、２６６．１２９２。
【０１７３】
[00173]アジドＳ６〜Ｓ８を調製するための一般手順
【化２４】
2018512424.tif 000026
各α−ブロモフェニル酢酸（２３．３ｍｍｏｌ）を、１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ溶液（２４ｍＬ）に溶解させた。アジ化ナトリウム（１．５１２ｇ、４６．５ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を終夜撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮した。残基をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、白色の固体（Ｓ６：４．０７６ｇ、９９％；Ｓ７：４．０１６ｇ、８９％；Ｓ８：３．７６１ｇ、７７％）を得た。
【０１７４】
[00174]アジドＳ６についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．４３（ｍ，５Ｈ）、５．０５（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７４．０、１３３．１、１２９．６、１２９．２、１２７．７、６５．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ８Ｈ７Ｎ３Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値１７７．０５３３；実測値、１７７．０５３８。
【０１７５】
[00175]アジドＳ７についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．４１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１，８．５Ｈｚ）、７．１２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．０５（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７５．０、１６３．５（ｄ，Ｊ＝２４９．６Ｈｚ）、１２９．８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）１２９．１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、１１６．５（ｄ，Ｊ＝２２．１Ｈｚ）、６４．５．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ  Ｃ８Ｈ６ＦＮ３Ｏ２［Ｍ−Ｈ］−の計算値１９４．０３７１；実測値、１９４．０３７８。
【０１７６】
[00176]アジドＳ８についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、５．０６（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７４．７、１３５．８、１３１．５、１２９．５、１２９．０、６４．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ  Ｃ８Ｈ６ＣｌＮ３Ｏ２［Ｍ−Ｈ］−の計算値２１０．００７５；実測値、２１０．００７８。
【０１７７】
[00177]アミドＳ９〜Ｓ１１を調製するための一般手順
【化２５】
2018512424.tif 000027
各α−アジド酢酸（Ｓ６〜Ｓ８）（１５．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１．７７２ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＣＣ（３．１７７ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。溶液を周囲温度に温め、終夜撹拌した。濾過によってスラリーを除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。次いで、得られる溶液を減圧下で濃縮し、直ちに使用した。ＮＨＳエステル（１０．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０５ｍＬ）に溶解させた。ベンジルアミン（１．１６ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）を滴下し、得られる溶液を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、白色の固体を得た（Ｓ９：２ステップで２．３８４ｇ、５８％；Ｓ１０：２ステップで２．０６２ｇ、４７％；Ｓ１１：２ステップで２．１７９ｇ、４７％）。
【０１７８】
[00178]アミドＳ９についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４３〜７．４２（ｍ，５Ｈ）、７．３１〜７．２９（ｍ，２Ｈ）、７．２６〜７．２２（ｍ，３Ｈ）、５．０６（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６７．８、１３７．５、１３４．９、１２９．２、１２９．１、１２８．８、１２７．８、１２７．７３、１２７．６７、６７．４、４３．７。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１４Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２６７．１２４１；実測値、２６７．１２４１。
【０１７９】
[00179]アミドＳ１０についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４５〜７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４，８．７Ｈｚ）、７．２３〜７．３０（ｍ，２Ｈ）、７．２６〜７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．１８〜７．１５（ｍ，２Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．０，６．２Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６７．６、１６３．１（ｄ，Ｊ＝２４９．２Ｈｚ）、１３７．５、１３０．９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、１２９．５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、１２８．８、１２７．８、１１６．２（ｄ，Ｊ＝２１．８Ｈｚ）、１０５．０、６６．６、４３．７。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１３ＦＮ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２８５．１１４７；実測値、２８５．１１５０。
【０１８０】
[00180]アミドＳ１１についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４４〜７．３９（ｍ，４Ｈ）、７．３３〜７．２７（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．２２（ｍ，３Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、４．３６（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６８．８、１３９．７、１３５．５、１３５．２、１３０．４、１２９．９、１２９．４、１２８．２、１２８．０、６６．３、４３．６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１３ＣｌＮ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３０１．０８５１；実測値、３０１．０８５０。
【０１８１】
[00181]ジアゾ化合物３〜５を調製するための一般手順
【化２６】
2018512424.tif 000028
各α−アジドベンジルアミド（Ｓ９〜Ｓ１１）（７．３ｍｍｏｌ）を、２０：３のＴＨＦ：Ｈ２Ｏ溶液（７５ｍＬ）に溶解させ、氷浴で冷却した。Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（２．７３４ｇ、７．７ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。得られる溶液を周囲温度に温め、すべてのアジドが消費されるまで撹拌した（ＴＬＣによってモニターしながら６〜１２時間）。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（７３ｍＬ）を加え、溶液を終夜撹拌した。次いで、溶液をブライン（５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×７０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、橙色の固体（３：１．０１２ｇ、５５％；４：０．８８７ｇ、４５％；５：０．８７７ｇ、４２％）を得た。
【０１８２】
[00182]ジアゾ３についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４６〜７．４１（ｍ，４Ｈ）、７．３４〜７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２８〜７．２３（ｍ，２Ｈ）、６．７３（ｓ，１Ｈ）、４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６５．１、１４０．６、１３０．２、１２９．３、１２８．２、１２７．８、１２７．７、１２７．６、１２７．４、６４．０、４３．９。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１３Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２５２．１１３２；実測値、２５２．１１２５。
【０１８３】
[00183]ジアゾ４についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４９〜７．４６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４，８．６Ｈｚ）、７．３４〜７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．２６〜７．２３（ｍ，１Ｈ）、７．２０〜７．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．８）、６．７０（ｓ，１Ｈ）、４．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６５．２、１６２．５（ｄ，Ｊ＝２４４．９Ｈｚ）、１４０．６、１３０．２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、１２９．２、１２８．１、１２７．８、１２３．４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ）、１１６．９（ｄ，Ｊ＝２２．１Ｈｚ）、６２．９９、４３．８。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１２ＦＮ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２７０．１０３８；実測値、２７０．１０３２。
【０１８４】
[00184]ジアゾ５についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．４２（ｄ，２Ｈ，８．９Ｈｚ）、７．３５〜７．３０（ｍ，４Ｈ）、７．２８〜７．２６（ｍ，１Ｈ）、６．７９（ｓ，１Ｈ）、４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６４．１、１３８．１、１３３．５、１２９．９、１２８．８、１２８．５、１２７．８、１２７．７、１２４．７、６３．５、４４．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１２ＣｌＮ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２８６．０７４２；実測値、２８６．０７４８。
【０１８５】
[00185]エステルＳ１２の調製
【化２７】
2018512424.tif 000029
４−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸（５．０００ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．８１８ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＣＣ（５．０４７ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を周囲温度に温め、終夜撹拌した。濾過によってスラリーを除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１２（７．３０１ｇ、９９％）を白色の固体として得た。
【０１８６】
[00186]エステルＳ１２についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９９Ｈｚ）、７．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝  ７．９２Ｈｚ）、４．００（ｓ，２Ｈ）、２．８４（ｓ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６８．９、１６６．１、１３５．２７、１３０．２（ｑ，Ｊ＝３２．６Ｈｚ）、１２９．７、１２５．８（ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）、１２３．９（ｑ，Ｊ＝２７２．１Ｈｚ）、３７．４、２５．６。ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１３Ｈ１０Ｆ３ＮＯ４［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３０１．０５５７；実測値、３０１．０５６５。
【０１８７】
[00187]α−ブロモエステルＳ１３の調製
【化２８】
2018512424.tif 000030
エステルＳ１２（３．７６３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４（２５ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ブロモスクシンイミド（３．３２９ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（０．３９４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えた。得られる溶液を８０℃に加熱し、終夜還流させた。濾過によってスクシンイミド副生物を除去し、溶液を減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１３（２．０３７ｇ、４３％）を白色の固体として得た。
【０１８８】
[00188]Ｓ１３についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、５．６８（ｓ，１Ｈ）、２．８６（ｓ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６８．２、１６３．８、１３７．７、１３１．９（ｑ，Ｊ＝３２．８Ｈｚ）、１２９．２、１２６．１（ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）、１２３．６（ｑ，Ｊ＝２７２．５Ｈｚ）、４０．７、２５．６。ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１３Ｈ９ＢｒＦ３ＮＯ４［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３７８．９６６２；実測値、３７８．９６６７。
【０１８９】
[00189]α−ブロモアミドＳ１４の調製
【化２９】
2018512424.tif 000031
α−ブロモエステルＳ１３（３．２９７ｇ、８．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）に溶解させた。ベンジルアミン（０．９１ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を滴下し、得られる溶液を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させた。溶液を０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１４（１．４５６ｇ、４５％）を白色の固体として得た。
【０１９０】
[00190]Ｓ１４についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２Ｈ）、７．５１（ｓ，１Ｈ）、７．３５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、５．５９（ｓ，１Ｈ）、４．４０（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６６．２、１４１．２、１３７．１、１３１．１（ｑ，Ｊ＝３２．８Ｈｚ）、１２８．９、１２８．８、１２８．０、１２７．８、１２５．９（ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）、１２３．７（ｑ，Ｊ＝２７２．３Ｈｚ）、４９．８、４４．６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１３ＢｒＦ３ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３７２．０２０６；実測値、３７２．０２１０。
【０１９１】
[00191]α−アジドアミドＳ１５の調製
【化３０】
2018512424.tif 000032
α−ブロモアミドＳ１４（１．８２３ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏに溶解させた。アジ化ナトリウム（０．６３７ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を０．１Ｍ  ＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、Ｓ１５（１．０１８ｇ、６２％）を白色の固体として得た。
【０１９２】
[00192]Ｓ１５についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．４２（ｓ，１Ｈ）、７．３１（ｍ，２Ｈ）、７．２４（ｍ，３Ｈ）、５．１９（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７０．２、１４２．８、１４１．４、１３２．９（ｑ，Ｊ＝３２．３Ｈｚ）、１３１．２、１３１．１、１３０．０、１２９．８、１２８．５（ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ）、１２６．９（ｑ，Ｊ＝２７１．３Ｈｚ）、６８．２、４５．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（Ｃ１６Ｈ１３Ｆ３Ｎ４Ｏ）［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３３５．１１１５；実測値、３３５．１１１２。
【０１９３】
[00193]α−ジアゾアミド６の調製
【化３１】
2018512424.tif 000033
α−アジドアミドＳ１５（１．００２ｇ、２．９９ｍｍｏｌ）を２０：３のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）に溶解させ、得られる溶液を氷浴で冷却した。Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（１．１１５ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を周囲温度に温め、すべてのアジドが消費されるまで撹拌した（ＴＬＣによってモニターしながら約５時間）。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）を加え、溶液を終夜撹拌した。溶液をブライン（３０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、６（０．３８２ｇ、４０％）を橙色の固体として得た。
【０１９４】
[00194]６についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．３８〜７．３１（ｍ，５Ｈ）、５．７０（ｓ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６４．２、１４０．４、１３２．９、１２８．３、１２７．９、１２７．６（ｑ，Ｊ＝３２．４Ｈｚ）、１２６．５（ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ）、１２６．３、１２５．３（ｑ，Ｊ＝２７０．８Ｈｚ）、６４．０、４３．９。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１２Ｆ３Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３２０．１００６；実測値、３２０．０９９３。
【０１９５】
実施例３：反応速度定数の測定
[00195]各ジアゾ化合物及びＢｏｃＧｌｙＯＨを、５０ｍＭの濃度で別々にＣＤ３ＣＮに溶解させた。ＮＭＲ管において溶液を等モル比で合わせ、混合し、次いでＮＭＲ分光計に直ちに挿入した。１０分毎に１６走査の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを取得した。いくつもの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルピークを積分することで求められる出発材料の消失と生成物の出現によって、変換パーセントをモニターした。１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって明らかになった他の生成物はなかった。時間に対する１／［ジアゾ］のプロットの線形回帰分析によって、二次の速度定数の値を求めた（データは示さず）。全反応を三通りに実施した。
【０１９６】
実施例４：ＢｏｃＧｌｙＯＨのエステル化
【化３２】
2018512424.tif 000034
[00196]アセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液の１：１の溶液に、ジアゾ化合物１（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０１９７】
[00197]Ｓ１６についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６０（ｓ，１Ｈ）、７．３７〜７．２２（ｍ，７Ｈ）、６．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．９１（ｓ，１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、４．４３〜４．３１（ｍ，２Ｈ）、３．９４〜３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｓ，３Ｈ）、１．３８（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７０．４、１６９．３、１６１．１、１５７．４、１３９．９、１２９．９、１２９．３、１２８．６、１２８．１、１２７．９、１１４．８、８０．３、７６．７、５５．９、４３．２、２８．４  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値４２９．２０２１；実測値、４２９．２０２１。
【０１９８】
[00198]Ｓ１７についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４７（ｓ，１Ｈ）、７．３３〜７．２５（ｍ，４Ｈ）、７．２３〜７．２１（ｍ，３Ｈ）、６．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、４．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、４．４０〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、４．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、３．７８（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７３．３、１６０．４、１４０．３、１３３．８、１２９．３、１２９．０、１２８．１、１２７．８、１１４．５、７４．３、５５．８、４３．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２７２．１２８２；実測値、２７２．１２７８。
【化３３】
2018512424.tif 000035
【０１９９】
[00199]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ化合物２（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０２００】
[00200]Ｓ１８についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６５（ｓ，１Ｈ）、７．３３〜７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２５〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、５．９２（ｓ，１Ｈ）、５．７７（ｓ，１Ｈ）、４．４２〜４．３１（ｍ，２Ｈ）、３．９２〜３．８２（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．３８（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７０．４、１６９．２、１５７．４、１４０．０、１３９．８、１３３．７、１３０．１、１２９．３、１２８．３、１２８．１、１２７．９、８０．３、７６．８、４３．２、４３．２、２８．４、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５［Ｍ＋ＮＨ４］＋の計算値４３０．２３３７；実測値、４３０．２３３６。
【０２０１】
[00201]Ｓ１９についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４６（ｓ，１Ｈ）、７．３１〜７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，３Ｈ）、７．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）、４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）、４．４０〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、４．１８（ｄ，１Ｈ）、Ｊ＝４．５Ｈｚ）、２．３２（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７３．３、１４０．３、１３８．７４、１３８．７１、１２９．８、１２９．３、１２８．１、１２７．９、１２７．６、７４．６、４３．１、２１．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２５６．１３３３；実測値、２５６．１３３０。
【化３４】
2018512424.tif 000036
【０２０２】
[00202]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ化合物３（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００４ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０２０３】
[00203]Ｓ２０についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（７５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６５（ｓ，１Ｈ）、７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．４０（ｍ，３Ｈ）、７．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．２３（ｍ，３Ｈ）、５．９９（ｓ，１Ｈ）、５．７８（ｓ，１Ｈ）、４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３，１５．２Ｈｚ）、４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，１５．２Ｈｚ）、３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１７．９Ｈｚ）、３．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７，１８．０Ｈｚ）、１．４０（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６８．７、１６８．０、１５６．４、１３７．９、１３５．０、１２９．１、１２８．８、１２８．６、１２７．８、１２７．５、１２７．４、８０．６、７６．２、４３．４、４３．０、２８．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２６Ｎ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３９９．１９１５；実測値、３９９．１９１７。
【０２０４】
[00204]Ｓ２１についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（７５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４８（ｓ，１Ｈ）、７．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．３１（ｍ，３Ｈ）、７．２４（ｍ，３Ｈ）、５．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）、４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７３．１、１４１．６、１４０．３、１２９．３、１２９．２、１２８．８、１２８．１、１２７．９、１２７．６、７４．７、４３．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１５ＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２４２．１１７６；実測値、２４２．１１６９。
【化３５】
2018512424.tif 000037
【０２０５】
[00205]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ４（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０２０６】
[00206]Ｓ２２についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６６（ｓ，１Ｈ）、７．４８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４，８．６Ｈｚ）、７．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２５〜７．２０（ｍ，３Ｈ）、７．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．９７（ｓ，１Ｈ）、５．７７（ｓ，１Ｈ）、４．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３，１５．２Ｈｚ）、４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，１５．２Ｈｚ）、３．９４〜３．８４（ｍ，２Ｈ）、１．３８（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６８．６、１６７．９、１６３．１（ｄ，Ｊ＝２４８．２Ｈｚ）、１５６．４、１３７．８、１３１．０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）、１２９．４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、１２７．８、１２７．５、１１５．８（ｄ，Ｊ＝２１．８Ｈｚ）、８０．７、７５．５、４３．４、４３．０、２８．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２５ＦＮ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値４１７．１８２１；実測値、４１７．１８１６。
【０２０７】
[00207]Ｓ２３についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．５３（ｓ，１Ｈ）、７．４５〜７．４２（ｍ，２Ｈ）、７．３２〜７．２８（ｍ，２Ｈ）、７．２４〜７．２０（ｍ，３Ｈ）、７．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．０４（ｓ，１Ｈ）、４．４１〜４．３１（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７４．７、１６５．０（ｄ，Ｊ＝２４３．７Ｈｚ）、１４２．０、１３９．６、１３１．３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、１３１．１．、１２９．８、１２９．６、１１７．６（ｄ，Ｊ＝２１．７Ｈｚ）、７５．７、４４．８。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１４ＦＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２６０．１０８２；実測値、２６０．１０８０。
【化３６】
2018512424.tif 000038
【０２０８】
[00208]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ５（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０２０９】
[00209]Ｓ２４についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６１（ｓ，１Ｈ）、７．４５〜７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．３１〜７．２９（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，３Ｈ）、５．９８（ｓ，１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、４．４２〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、３．９０（ｍ，２Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６８．５、１６７．６、１５６．４、１３７．７、１３５．１、１３５．６、１２８．９、１２８．８、１２８．６、１２７．８、１２７．５、８０．８、７５．４、４３．４、４３．０、２８．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２５ＣｌＮ２Ｏ５［Ｍ＋ＮＨ４］＋の計算値４５０．１７９１；実測値、４５０．１７８５。
【０２１０】
[00210]Ｓ２５についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．４７（ｓ，１Ｈ）、７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．３７（ｄ，２Ｈ，８．６Ｈｚ）、７．３２〜７．２９（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，３Ｈ）、５．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、４．３６（ｍ，２Ｈ）、４．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７２．７、１４０．５、１４０．２、１３４．０、１２９．３、１２９．２１、１２９．１８、１２８．１、１２７．９、７３．９、４３．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ１４ＣｌＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２７６．０７８６；実測値、２７６．０７８９。
【化３７】
2018512424.tif 000039
【０２１１】
[00211]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ６（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＧｌｙＯＨ（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。
【０２１２】
[00212]Ｓ２６についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．７３〜７．７１（ｍ，３Ｈ）、７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．３１〜７．２８（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．２０（ｍ，３Ｈ）、６．０６（ｓ，１Ｈ）、５．７７（ｓ，１Ｈ）、４．４２〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、３．９７〜３．８７（ｍ，２Ｈ）、１．３８（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７０．３、１６８．４、１５７．４、１４１．１、１３９．７、１３１．１（ｑ，Ｊ＝３２．４Ｈｚ）、１２９．４、１２８．８、１２８．１、１２８．０、１２６．３（ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ）、１２５．１（ｑ，Ｊ＝２７１．３Ｈｚ）、８０．４、７６．１、４３．４、４３．２、２８．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ２５Ｆ３Ｎ２Ｏ５［Ｍ＋ＮＨ４］＋の計算値４８４．２０３７；実測値、４８４．２０５４。
【０２１３】
[00213]Ｓ２７についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．６９〜７．６２（ｍ，４Ｈ）、７．５６（ｓ，１Ｈ）、７．３１〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、５．５４（ｓ，１Ｈ）、５．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）、４．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）、４．３７〜４．３５（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７２．３、１４６．０、１４０．１、１３０．１（ｑ，Ｊ＝３２．３Ｈｚ）、１２９．３、１２８．１、１２８．９、１２６．２（ｑ，Ｊ＝４１．３Ｈｚ）、１２５．３（ｑ，Ｊ＝２７１．３Ｈｚ）、７４．０、４３．１。ＨＲＭＳ（Ｃ１６Ｈ１４Ｆ３ＮＯ２）［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３１０．１０５０；実測値、３１０．１０４３。
【０２１４】
実施例５：他の小分子のエステル化
【化３８】
2018512424.tif 000040
[00214]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ化合物２（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＳｅｒＯＨ（０．００４ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。Ｓ１９についてのデータは、上で報告しており、Ｓ２８についてのデータを以下で報告する（両方のジアステレオ異性体）。ＴＬＣ又は１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって認められた他の生成物はなかった。
【０２１５】
[00215]Ｓ２８についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオマーＡ，δ）：７．７２（ｓ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．９６（ｓ，１Ｈ）、５．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、４．３８〜４．３３（ｍ，２Ｈ）、４．３２〜４．２９（ｍ，１Ｈ）、４．０８〜４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．７７〜３．６９（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．４０（ｓ，９Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオマーＢ，δ）：７．６４（ｓ，１Ｈ）、７．３６〜７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２５〜７．１７（ｍ，５Ｈ）、５．９５（ｓ，１Ｈ）、５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．４１〜４．３０（ｍ，２Ｈ）、４．２８〜４．２５（ｍ，１Ｈ）、３．８６〜３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７９〜３．７２（ｍ，１Ｈ）、３．４１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．３６（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオマーＡ，δ）：１７１．３、１６９．７、１５７．０、１４０．２、１３９．６、１３３．２、１３０．２、１２９．３、１２８．５、１２８．１、１２８．０、８０．３、７７．０、６３．３、５７．１、４３．４、２８．４、２１．２。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオマーＢ，δ）：１７１．２、１６９．３、１５６．７、１３９．９、１３９．８、１３３．６、１３０．１、１２９．３、１２８．４、１２８．１、１２７．９、８０．３、７７．０、６２．８、５７．１、４３．３、２８．４、２１．１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２４Ｈ３０Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値４４３．２１７７；実測値、４４３．２１８５（ジアステレオマーＡ）、４４３．２１８３（ジアステレオマーＢ）。
【化３９】
2018512424.tif 000041
【０２１６】
[00216]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ化合物２（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．００３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。Ｓ１９についてのデータは、上で報告しており、Ｓ２９についてのデータを以下で報告する。ＴＬＣ又は１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって認められた他の生成物はなかった。
【０２１７】
[00217]Ｓ２９についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．７６（ｓ，１Ｈ）、７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．３９（ｓ，１Ｈ）、７．２９〜７．１８（ｍ，７Ｈ）、６．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．０６（ｓ，１Ｈ）、４．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．３５（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１６９．７、１６５．８、１６２．６、１４０．０、１３９．８、１３４．２、１３３．０、１３０．１、１２９．３、１２８．３、１２８．０、１２７．９、１２１．９、１１６．１、７６．８、４３．１、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ２１ＮＯ４［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３７６．１５４４；実測値、３７６．１５３９。
【化４０】
2018512424.tif 000042
【０２１８】
[00218]１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液に、ジアゾ化合物２（０．００５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及び３−メルカプトプロパン酸（０．００２ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、得られる溶液を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのピークを積分することにより生成物の比を求めた。Ｓ１９についてのデータは、上で報告しており、Ｓ３０についてのデータを以下で報告する。ＴＬＣ又は１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって認められた他の生成物はなかった。
【０２１９】
[00219]Ｓ３０についてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：７．３８（ｓ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２５〜７．１９（ｍ，５Ｈ）、５．９１（ｓ，１Ｈ）、４．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．８０〜２．７０（ｍ，４Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，δ）：１７１．５、１６９．４、１３９．９、１３９．８、１３３．９、１３０．１、１２９．３、１２８．３、１２８．１、１２７．９、７６．６、４３．１、３９．１、２１．１、２０．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（Ｃ１９Ｈ２１ＮＯ３Ｓ）［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値３４４．１３１５；実測値、３４４．１３１５。
【０２２０】
実施例６：タンパク質標識
【化４１】
2018512424.tif 000043
ここで、ｎは、タンパク質中に生成されたエステルの数を示す。
[00220]
９−ジアゾフルオレンを、以前に記載されているとおりに調製した。［５］収率及びスペクトルが、発表されているデータと一致した。リボヌクレアーゼＡ（０．０１０ｇ、０．７３μｍｏｌ）をｐＨ５．５の１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液１ｍＬに溶解させた。９−ジアゾフルオレン（０．００７ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解させた。１００μＬ分割量のＲＮアーゼＡ保存液に１００μＬ分割量のジアゾ保存液を加えた。得られる混合物を、転頭撹拌（ｎｕｔａｔｉｏｎ）によって３７℃で４時間混合した。次いで、１０μＬの１７．４Ｍ酢酸を加えて、残存するジアゾ化合物を失活させた。減圧下で濃縮してアセトニトリルを除去し、標識されたタンパク質の水溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した（図５）。
【化４２】
2018512424.tif 000044
ここで、ｎは、タンパク質中に生成されたエステルの数を示す。
【０２２１】
[00221]リボヌクレアーゼＡ（０．０１０ｇ、０．７３μｍｏｌ）をｐＨ５．５の１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液１ｍＬに溶解させた。ジアゾ化合物２（０．０９５ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解させた。１００μＬ分割量のＲＮアーゼＡ保存液に１００μＬ分割量のジアゾ保存液を加えた。得られる混合物を、転頭撹拌（ｎｕｔａｔｉｏｎ）によって３７℃で４時間混合した。次いで、１０μＬの１７．４Ｍ酢酸を加えて、残存するジアゾ化合物を失活させた。減圧下で濃縮してアセトニトリルを除去し、標識されたタンパク質の水溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した（図５）。
【０２２２】
実施例７：タンパク質標識
[00222]アンジオゲニンをモデルタンパク質として使用して、標識の効率及び可逆性を試験した。アンジオゲニンを化学量論量の式１のジアゾ化合物、特に、化合物２、３、及び４で処理すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって明らかにされる６つまでの標識が付加される（データは示さず）。標識されたタンパク質をＨｅＬａ細胞抽出物で処理すると、すべての標識が完全に除去され、標識の生体内可逆性が実証された。
【０２２３】
[00223]詳細な一例では、ジアゾ３を２ｍＬのＭｅＣＮに溶解させて、ジアゾ３の保存液（１９．１ｍｇ、７６μｍｏｌ）を調製した。２００μＬ分量の保存液を、２００μＬのＦＬＡＧ−アンジオゲニン（１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６．０中２．９ｍｇ／ｍＬ）に加えた。得られる混合物を、２５℃で１２時間転頭撹拌した。標識の程度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって明らかにした（データは示さず）。
【０２２４】
[00224]ジアゾ４を２ｍＬのＭｅＣＮに溶解させて、ジアゾ４の保存液（２０．４ｍｇ、７６μｍｏｌ）を調製した。２００μＬ分量の保存液を、２００μＬのＦＬＡＧ−アンジオゲニン（１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６．０中２．９ｍｇ／ｍＬ）に加えた。得られる混合物を、２５℃で１２時間転頭撹拌した。標識の程度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって明らかにした（データは示さず）。
【０２２５】
[00225]ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ２皿で成長させて集密にした後、収集し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＭ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬を使用して溶解させた。ｐ−ニトロフェニル酢酸を使用する比色検定によって、エステラーゼ活性を検証した。ジアゾ３又はジアゾ４いずれかで標識したＦＬＡＧ−アンジオゲニン１０μＬを、１０μＬの細胞可溶化液に加え、２５℃で終夜インキュベートした。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２磁気ビーズを使用して、ＦＬＡＧ−アンジオゲニンを単離し直した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、すべての標識の除去を確認した（データは示さず）。
【０２２６】
実施例８：ジアゾ化合物２の紫外スペクトル
[00226]ジアゾ化合物２の紫外スペクトルを０．８〜５０ｍＭの濃度範囲にかけて測定しており、図６、パネルＡを参照されたい。λｍａｘ＝４３５ｎｍでのジアゾ化合物２の吸光度の濃度依存性のプロット（０．８〜５０ｍＭ）（図６、パネルＢ）から、ε＝３０．５Ｍ−１ｃｍ−１が得られた。
【０２２７】
実施例９：結果の概要
[00227]ジアゾ化合物１〜６を、フェニル酢酸の誘導体から、上記実施例に記載したとおりに取得した（図１、パネルＢ）。簡潔に述べると、ブロミドの置換によって、又は存在するアミンに対するジアゾ移転によって、酸のベンジル位にアジドを挿入した。結果として生じるα−アジド酸を、次いでベンジルアミンに結合させ、ホスフィノエステルを使用する脱イミド化（ｄｅｉｍｉｄｏｇｅｎａｔｉｏｎ）によってジアゾ化合物に変換した［５ａ、ｂ］。
【０２２８】
[00228]最初の実験において、アセトニトリル中でのエステル化の速度を測定することにより、電子分布がジアゾ基の反応性に及ぼす影響を評価した。まず、ジアゾ化合物１〜６をＢｏｃＧｌｙＯＨと反応させ、１Ｈ  ＮＭＲ分光法を使用して二次速度定数を測定した。電子分布が反応速度に及ぼす影響は劇的であり、速度定数は、２桁に届き、フェニル置換基の電子供与特性と共に増大した（図２、パネルＡ）。こうした速度定数のハメット分析から、ρ＝−２．７の傾きが得られた（図２、パネルＢ）。この値は、典型的なＳＮ１についての値に匹敵し、エステル化反応が置換基に対して非常に敏感であること、並びに、中間体ジアゾニウムイオンが関与する機序から予想されるとおり（スキーム１、［２７ａ、ｂ］）、その経過中に実質的な正電荷が蓄積することが示唆される［３３］。
【０２２９】
[00229]次に、水性環境におけるエステル化の加水分解と比較した選択性を評価した。そのために、アセトニトリルと２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．５）の１：１混合物中で、ジアゾ化合物１〜６を等モル濃度のＢｏｃＧｌｙＯＨと反応させ、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって、エステル対アルコールの生成物の比を明らかにした。驚いたことに、エステル：アルコール比は、最大で１．４：１に達し、置換基によって電子吸引が増大していくにもかかわらず変化しないままとなった（図３）。この結果は、クーロン相互作用によって溶媒ケージ内に保たれているカルボキシレート・ジアゾニウム密接イオン対中間体の生成の急激な中断と一致する（スキーム１）［２７ａ、ｂ、３４］。
【０２３０】
[00230]水性環境において化学選択性を保持した化合物の中で最も速い速度を示したジアゾ化合物２で、追加の実験を行った。ある特定のジアゾ化合物は、Ｏ−Ｈ及びＳ−Ｈ挿入反応を被る［２３ｃ、２５ａ、ｂ］。ジアゾ化合物２を評価して、タンパク質側鎖上に見出されるスルフヒドリル、ヒドロキシル、又はフェノール性部分の存在下で酸を選択的にエステル化するかどうかを明らかにした。ジアゾ化合物２は、１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液中で、ＢｏｃＳｅｒＯＨ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、及び３−メルカプトプロピオン酸をエステル化し、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって観察可能となった他のカップリング生成物はなかった。
【０２３１】
[00231]加えて、ジアゾ化合物２のタンパク質標識能を、９−ジアゾフルオレンと比較した。周知のモデルタンパク質リボヌクレアーゼＡ［２１］を、１０当量の各ジアゾ化合物で処理した。１：１のアセトニトリル／ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液中にて、３７℃で４時間、反応を進行させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、両方のジアゾ試薬でのエステル化の程度を明らかにした。ジアゾ化合物２は、エステル化の遂行において、９ジアゾフルオレンのおよそ２倍有効であった（図５）。代表的なジアゾ化合物２を使用すると、水性環境においてタンパク質を非常に効率よくエステル化することができる。
【０２３２】
実施例１０：α−ジアゾＮＨＳエステルの調製
【化４３】
2018512424.tif 000045
[00232]α−アジド−４−メチルフェニルＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（７）を上述のとおりに合成した。この化合物７（３．４ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を、２０：３のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ２（気体）中でＮ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（４．５ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５時間撹拌した。トリエチルアミン（２．３ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１時間撹拌した。溶液をブライン（２０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、３：７のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、α−ジアゾＮＨＳエステル８（０．３１ｇ、１０％）を橙色の固体として得た。
【０２３３】
[00233]α−ジアゾＮＨＳエステルについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．２２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、２．８８（ｓ，４Ｈ）、２．３５（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６９．４、１６０．５、１３７．１、１２９．９、１２４．６、１１９．８、２５．６、２１．０８  ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ−ＭＳ）ｍ／ｚ  Ｃ１３Ｈ１１Ｎ３Ｏ４［Ｍ−Ｎ２＋Ｈ］＋の計算値２４６．０７６１；実測値２４６．０７６４。
【０２３４】
[00234]化合物８は、式Ｉの化合物の合成に使用することのできる、典型的な式ＩＩの化合物である。
【０２３５】
実施例１１：付加的なα−ジアゾアセトアミドの調製
[00235]Ａ．α−アジド−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミド
【化４４】
2018512424.tif 000046
【０２３６】
[00236]α−アジド−４−メチルフェニルＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル７（１．１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させた。プロパルギルアミン（０．２ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮して、α−アジド−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミド９（０．６ｇ、７５％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０２３７】
[00237]α−アジド−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミドについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、７．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、６．６４（ｓ，１Ｈ）、５．０３（ｓ，１Ｈ）、４．０８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，５．２５Ｈｚ）、２．３６（ｓ，３Ｈ）、２．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６７．８、１３９．３、１３１．６、１２９．８、１２７．７、７９．９、７２．１、６７．０、２９．４、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１２Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２２９．１０８４；実測値２２９．１０８５。
【０２３８】
[00238]Ｂ．α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミドの調製
【化４５】
2018512424.tif 000047
【０２３９】
[00239]α−アジド−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミド（０．６ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、２０：３のＴＨＦ／Ｈ２Ｏの溶液（１６ｍＬ）に溶解させた。Ｎ２（気体）中でＮ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート（１．１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５時間撹拌した。１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ；０．８ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を終夜撹拌した。溶液をブライン（２０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４（固体）で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を、３：７のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、α−ジアゾ−Ｎ−プロパルギルアセトアミド（０．１７６ｇ、３０％）を赤色の固体として得た。
【０２４０】
[00240]α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミドについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．２８〜７．２４（ｍ，４Ｈ）、５．５２（ｓ，１Ｈ）、４．１５〜４．１４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５，５．４Ｈｚ）、２．３８（ｓ，３Ｈ）、２．２３（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６４．９、１３８．３、１３０．５、１２８．０、１２２．６、７９．６、７１．６、６４．０、２９．７、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１１Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値２１４．０９７５；実測値２１４．０９７５。
【０２４１】
実施例１２：式ＩＩの化合物を使用する式Ｉの化合物の調製：
[00241]Ａ．α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−メチルアセトアミド
【化４６】
2018512424.tif 000048
【０２４２】
[00242]α−ジアゾＮＨＳエステル８（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３７ｍＬ）に溶解させた。メチルアミン（２．０Ｍ  ＴＨＦ溶液０．２ｍＬ、０．４１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；１４３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解させた。残留物を、３：７のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、α−ジアゾ−４−メチフェニル−Ｎ−メチルアセトアミド（３４ｍｇ、４９％）を赤色の固体として得た。
【０２４３】
[00243]α−ジアゾ−４−メチフェニル−Ｎ−メチルアセトアミドについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．２６〜７．２５（ｍ，４Ｈ）、５．３６（ｓ，１Ｈ）、２．９０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）、２．３７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６５．８、１３８．０、１３０．４、１２７．９、１２３．２、６３．７、２７．０、２１．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ１１Ｎ４Ｏ［Ｍ−Ｎ２＋Ｈ］＋の計算値１６２．０９１３；実測値１６２．０９１５。
【０２４４】
[00244]Ｂ．α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの調製
【化４７】
2018512424.tif 000049
【０２４５】
[00245]α−ジアゾＮＨＳエステル８（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３７ｍＬ）に溶解させた。ジメチルアミン（２．０Ｍ  ＴＨＦ溶液０．２ｍＬ、０．４１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１４３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解させた。残留物を、３：７のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（２４ｍｇ、３２％）を赤色の固体として得た。
【０２４６】
[00246]α−ジアゾ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、２．９５（ｓ，６Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６６．１、１３５．６、１２９．９、１２４．７、１２４．４、６２．４、３７．８、２１．０。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ１３Ｎ３Ｏ［Ｍ−Ｎ２＋Ｈ］＋の計算値１７６．１０７０；実測値１７６．１０７１。
【０２４７】
[00247]Ｃ．α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−ペンチルアセトアミドの調製
【化４８】
2018512424.tif 000050
【０２４８】
[00248]α−ジアゾＮＨＳエステル８（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３７ｍＬ）に溶解させた。ペンチルアミン（３５．４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１４３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解させた。残留物を、１：４のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−ペンチルアセトアミド（６５ｍｇ、７２％）を赤色の固体として得た。
【０２４９】
[00249]α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−ペンチルアセトアミドについてのデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．２６〜７．２３（ｍ，４Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、３．３６〜３．３２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、２．３８（ｓ，３Ｈ）、１．５３〜１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．３３〜１．２８（ｍ，４Ｈ）、０．９０〜０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６４．９、１３７．９、１３０．４、１２７．８、１２３．３、６３．８、４０．２、２９．６、２９．０、２２．３、２１．２、１４．０。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  Ｃ１４Ｈ１９Ｎ３Ｏ［Ｍ−Ｎ２＋Ｈ］＋の計算値２１８．１５３９；実測値２１８．１５４１。
【０２５０】
実施例１３：タンパク質のエステル化及び内部移行
[00250]ＧＦＰを５種の典型的なジアゾ化合物２、１０〜１３で上述のとおりにエステル化した（図７、パネルＡ）。これらの実験で使用したＧＦＰ変異体及びその賛成については、以前に記載されている［２４］。質量分析を使用して、タンパク質１種あたり平均約３〜１１の標識が見出された（図７、パネルＢ）。極性の弱いジアゾ化合物の方が、満遍なく標識される傾向があった。
未標識又は標識ＧＦＰいずれか（１５μＭ）を含有する（ペニシリン／ストレプトマイシンで補充した）Ｆ−１２Ｋ培地において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、図８に示すように、ＧＦＰの内部移行を、フローサイトメトリーによって、生きた単一細胞だけをカウントして定量化した。満遍なく標識されたＧＦＰの方が、効率よく内部移行する傾向があった。ジアゾ化合物の２種について、共焦点顕微鏡法によって個々の細胞を撮像した。図９に示されるとおり、ジアゾ化合物１１又は１２いずれかでのエステル化によって、ＧＦＰのＣＨＯ  Ｋ１細胞への取込みは強化された。示した像から、標識されたタンパク質が細胞内部にあることが証明される。
【０２５１】
[00251]これらのデータは、本発明のジアゾ化合物でエステルを生成することにより、タンパク質内部移行が強化されることを示唆している。
【０２５２】
[00252]細胞へのタンパク質の細胞内侵入にとっての１つの障壁は、タンパク質上の負電荷を有するアミノ酸残基と負電荷を有する細胞膜成分との間のクーロン反発である。特定の説に拘りたくはないが、図８及び９の結果によれば、タンパク質上の負電荷をエステル化によってマスキングすることで、細胞浸透が促進されることが現時点では考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】図１は、パネルＡにおいて、ジアゾ化合物の反応性及び選択性を試験するための骨格を示す。図１は、パネルＢにおいて、ジアゾ化合物１〜６の合成経路を示し、ステップは、ａ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ、ｂ）ＮａＮ３、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ、ｃ）ＮＨＳ、ＤＣＣ、ＴＨＦ、ｄ）ＰｈＣＨ２ＮＨ２、ＤＣＭ、ｅ）Ｎ−スクシンイミジル３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオネート、次いでＮａＨＣＯ３又はＤＢＵ［５ａ、ｂ］、ｆ）イミダゾール−１−スルホニルアジド塩酸塩、ＤＢＵ、ＣｕＳＯ４、ＭｅＯＨ［２９］である。
【図２】図２は、パネルＡにおいて、ＣＤ３ＣＮ中でのジアゾ化合物１〜６によるＢｏｃＧｌｙＯＨのエステル化の二次速度定数の表を示す。図２は、パネルＢにおいて、パネルＡのデータのハメットプロットを示す。σｐの値は、Ｈａｎｓｃｈら［３２］からのものである。ρ＝−２．７。
【図３】図３は、図の上部において、エステル又はアルコールを生成する反応を示す。図３には、図の下部において、１：１の緩衝液：アセトニトリル中でのジアゾ化合物１〜６の化学選択性（エステル／アルコール生成物比）に対するσｐ値の影響を示すグラフも提供する。
【図４】図４は、図の上部において、エステル又はアルコール生成物を生成する、ジアゾ化合物２の酸ａ〜ｃとの反応を示す。図４には、図の下部において、酸ａ〜ｃの構造も示し、水溶液中でのジアゾ化合物２のエステル化反応の化学選択性の例証となる生成物比の表も提供する。
【図５】９−ジアゾフルオレン（パネルＡ）及びジアゾ化合物２（パネルＢ）を用いたＲＮアーゼＡのエステル化についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データを示すグラフである。
【図６】０．８〜５０ｍＭの濃度範囲にわたって測定したジアゾ化合物２の紫外スペクトルを示すグラフである（パネルＡ）。パネルＢには、ε＝３０．５Ｍ−１ｃｍ−１を与えるλｍａｘ＝４３５ｎｍでのジアゾ化合物２の吸光度の濃度依存性のプロットを提供する（０．８〜５０ｍＭ）。
【図７】図７に、ある特定のジアゾ化合物によるＧＦＰの標識効率の定量化を報告する。パネルＡには、ある特定のジアゾ化合物の化合物構造及びｌｏｇ  Ｐを示す。図７パネルＢは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定した、ＧＦＰに付加された標識の数を各ジアゾ化合物について示すグラフである。
【図８】蛍光強度中央値を測定するフローサイトメトリーを使用した、ＣＨＯ  Ｋ１細胞による標識対非標識ＧＦＰの内部移行の定量化を示すグラフである。前方散乱−側方散乱測定に基づき単一細胞を選別し、７ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）染色を使用して生細胞を選別した。
【図９】エステル化されたＧＦＰ（緑色）のＣＨＯ  Ｋ１細胞による取込みの顕微鏡像を示す図である。（パネルＡ）エステル化していないもの。（パネルＢ）α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ−プロパルギルアセトアミド１０でエステル化したもの（パネルＣ）α−ジアゾ−４−メチルフェニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドでエステル化したもの。細胞核は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（青色）で染色している。
【０２５４】
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（１７）Ｄｅｌｐｉｅｒｒｅ，Ｇ．Ｒ．；Ｆｒｕｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．Ｐ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９６５，５４，１１６１．
（１８）Ｄｏｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｉｌｃｏｘ，Ｐ．Ｅ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９６１，２３６，１３２８．
（１９）Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．；Ｐｒｅｓｓｍａｎ，Ｄ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９６０，８２，５４７８．
（２０）Ｌａｚｎｉｃｅｋ，Ｍ．；Ｌａｚｎｉｃｋｏｖａ，Ａ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．  １９９５，１３，８２３．
（２２）Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ（１９８８）  Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２１，４５６，４６３．  Ａ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｐＫａ  ｄａｔａ  ｏｆ  ａｃｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ＤＭＳＯ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ｃｈｅｍ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ  ／ａｒｅａｓ／ｒｅｉｃｈ／ｐｋａｔａｂｌｅ／；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９７５，９７，７００６；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９８０，４５，３３２５；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９８１，４６，６３２；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９８３，１０５，６１８８；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９９０，５５，３３３０；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９９１，５６，４２１８；Ｆ．Ｇ．Ｂｏｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．  １９９０，６８，１７１４．
（２３）（ａ）Ｒｅｇｉｔｚ，Ｍ．；Ｍａａｓ，Ｇ．Ｄｉａｚｏ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９８６．（ｂ）Ｐａｄｗａ，Ａ．；Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ，Ｍ．Ｄ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  １９９６，９６，２２３−２６９．（ｃ）Ｄｏｙｌｅ，Ｍ．Ｐ．；ＭｃＫｅｒｖｅｙ，Ｍ．Ａ．；Ｙｅ，Ｔ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｚｏ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；  Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８．（ｄ）Ｄａｖｉｅｓ，Ｈ．Ｍ．Ｌ．；Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｒ．Ｅ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  ２００３，１０３，２８６１−２９０４．（ｅ）Ｃａｎｄｅｌａｓ，Ｎ．Ｒ．；Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｃ．Ａ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  ２００９，１３，７６３−７８７．
（２４）Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ａ．；Ａｒｏｎｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；ＭｃＧｒａｔｈ，Ｎ．Ａ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２０１５，１３７，２４１２−２４１５．
（２５）（ａ）Ａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍ．Ｂ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００４，１２６，１０２５６−１０２５７．（ｂ）Ａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．；ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．；Ｌａｖａｒｏｎｅ，Ａ．Ｔ．；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍ．Ｂ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００９，１３１，６３０１−６３０８．
（２６）（ａ）Ｔｅｓｔａ，Ｂ．；Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ：  Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００３．（ｂ）Ｌｉｅｄｅｒｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ２００６，９５，１１７７−１１９５．（ｃ）Ｌａｖｉｓ，Ｌ．Ｄ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  ２００８，３，２０３−２０６．
（２７）（ａ）Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｗ．；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｒ．Ｅ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９５１，７３，７６０−７６５．（ｂ）Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｗ．；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｒ．Ｅ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９５１，７３，２５２１−２５２３．
（２８）（ａ）Ｄｏｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｉｌｃｏｘ，Ｐ．Ｅ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９６１，２３６，１３２８−１３３７．（ｂ）Ｒｉｅｈｍ，Ｊ．Ｐ．；Ｓｈｅｒａｇａ，Ｈ．Ａ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６５，４，７７２−７８２．（ｃ）Ｄｅｌｐｉｅｒｒｅ，Ｇ．Ｒ．；Ｆｒｕｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９６５，５４，１１６１−１１６７．
（２９）Ｇｏｄｄａｒｄ−Ｂｏｒｇｅｒ，Ｅ．Ｄ．，Ｓｔｉｃｋ，Ｒ．Ｖ．  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ  ２００７，９，３７９７．
（３０）Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．；Ｃｈｅｓｓ，Ｒ．Ｂ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２００３，２，２１４−２２１．
（３１）（ａ）Ｈａｍｍｅｔｔ，Ｌ．Ｐ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  １９３５，１７，１２５−１３６．（ｂ）Ｈａｍｍｅｔｔ，Ｌ．Ｐ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９３７，５９，９６−１０３．（ｃ）Ｈａｍｍｅｔｔ，Ｌ．Ｐ．  Ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，  １９４０，ｐｐ  １８４−２２８．（ｄ）Ｓｈｏｒｔｅｒ，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｌｉｓｔｙ  ２０００，９４，２１０−２１４．
（３２）Ｈａｎｓｃｈ，Ｃ．；Ｌｅｏ，Ａ．；Ｔａｆｔ，Ｒ．Ｗ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  １９９１，９１，１６５−１７５．
（３３）Ａｎｓｌｙｎ，Ｅ．Ｖ．；Ｄｏｕｇｈｔｅｒｙ，Ｄ．Ａ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ：Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，ＣＡ，２００６．
（３４）Ｓｚｅｌｅ，Ｉ．；Ｔｅｎｃｅｒ，Ｍ．；Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．  Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９８３，６６，１６９１−１７０３．
（３５）Ｃｈａｍｅｓ，Ｐ．Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，Ｅ．＆Ｂａｔｙ，Ｄ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ，  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｈｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００９  Ｍａｙ；１５７（２）：２２０−２３３．
（３６）Ｍａｉｅｓｅ，Ｋ．；Ｃｈｏｎｇ，Ｚ．Ｚ．；Ｓｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．；Ｈｏｕ，Ｊ．Ｌ．“ＦＯＸＯ”  ｉｎ  ｓｉｇｈｔ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆｏｘｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ”  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．  ２００９，２９，３９５−４１８．
（３７）Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｆ．；Ｐｅｒｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，２３−３８．
（３８）Ｓｒｉｎｉｖａｓａｒａｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １４：２０３−２１９．
（３９）Ｊｏｓａ−Ｃｕｌｌｅｒｅ，ｌ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ４：５２２４１．
（４０）Ｍａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（４３）１５０１６−１５０１７．
【図１】
2018512424.tif 000054
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018512424.tif 000058
【図６】
2018512424.tif 000059
【図７】
2018512424.tif 000060
【図８】
2018512424.tif 000061
【図９Ａ】
2018512424.tif 000062
【図９Ｂ】
2018512424.tif 000063
【図９Ｃ】
2018512424.tif 000064
【国際調査報告】
2018512424.tif 000065
2018512424.tif 000066