(57)【要約】  本発明は、α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体における炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞であって、上記幹細胞は、（ii）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物に作動可能に連結された、（i）α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする領域を含む外因性核酸を含む、医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体における炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞であって、前記幹細胞は、（ii）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物に作動可能に連結された、（i）α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする領域を含む外因性核酸を含む、医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞。
【請求項２】
前記外因性核酸が、ウイルスベクター若しくはレトロウイルスベクターからなる、又は該ベクターを含む、請求項1に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項３】
前記ウイルスベクターが、ガンマレトロウイルスベクターである、請求項2に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項４】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物が、構成的プロモーターである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項５】
前記構成的プロモーターが、EFSプロモーター、PGKプロモーター又はEF1αプロモーターである、請求項4に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項６】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物が、誘導性プロモーターである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項７】
前記プロモーターが、投与後に前記細胞の分化に際して誘導可能である、請求項6に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項８】
前記プロモーターが、炎症特異的プロモーターであり、又は、該プロモーターは、炎症性メディエーター若しくはサイトカインによって誘導され、及び／又は前記遺伝子改変された間葉系幹細胞が炎症を起こした組織に近づいた時に誘導される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項９】
前記プロモーターが、Tie2プロモーターである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１０】
前記プロモーターが、RANTESプロモーターである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１１】
前記プロモーターが、HSP70プロモーターである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、治療的に有効な数の細胞を患者の血流中へ若しくは静脈注射を介して血流中へ導入することによって投与される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１３】
前記炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態が、肺疾患若しくは肺の炎症性疾患である、請求項12に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１４】
前記肺疾患が、呼吸器疾患である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の肺疾患の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１５】
前記肺疾患が、急性肺損傷、慢性気管支炎を含む慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺気腫、気管支拡張及び細気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、類肉腫症、過敏性肺炎及び／又は肺線維症である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の肺疾患の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、治療的に有効な数の細胞を吸入によって患者の肺へと導入することによって投与される、又は、前記細胞が、治療的に有効な数の細胞を吸入によって患者の肺へと導入することと該細胞を患者の血流中へと導入することとを組み合わせることによって投与される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の肺疾患の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１７】
前記炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態が痛風である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１８】
前記炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態が慢性線維症である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項１９】
炎症性疾患及び／又は慢性線維性疾患が、被験体の腎臓、肝臓及び／又は結腸の疾患である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項２０】
前記炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態が、血管炎、腎炎、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎及び／又は対宿主性移植片病から選択される炎症性疾患である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項２１】
前記炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態が自己免疫疾患である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が1型糖尿病である、請求項21に記載の医薬として使用するための遺伝子改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体（subject：対象）における炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞であって、前記幹細胞は、（ii）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物に作動可能に連結された、（i）α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする領域を含む外因性核酸を含む、医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（MSC）は骨髄及び他の組織にある非造血性由来の細胞である。MSCは通常、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞等の限られた数の細胞系譜に分化する能力を有する多能性成体前駆細胞であると考えられている。骨修復の促進又は増大及び軟骨欠損の修復のためのMSCの使用を含む、上記の最終段階の表現型に直接分化するこの能力に基づいた治療物（therapeutic entity）としてMSCを使用する試験が行われている（非特許文献1及び非特許文献2）。多くの治療適応症のためのMSCの単離及び培養については、炎症関連障害の治療に対する有望なアプローチとして報告され、またそのようなアプローチとして存在している（例えば、特許文献1）。
【０００３】
MSCは、患者に投与した後に免疫回避性を示すことが知られている。MSCは、同種ドナー材料を移植した場合、有益な免疫調節作用を示すことがわかっており（非特許文献3）、これにより発病の可能性のある同種反応及び拒絶反応を減少させる。さらに、MSCは、抗腫瘍形成作用、例えばカポジ肉腫に対する抗腫瘍形成作用を示すことが知られている（非特許文献4）。MSC治療はまた、創傷治癒の治療的な役割を果たし得る。MSCの治療的送達が全身注射により行われた後、損傷部位へのMSCホーミング（homing：集積）及び傷害部位内の生着が行われ得る（非特許文献5）。MSCが損傷組織に対して再生効果を有することは明らかであるものの、それらを対象となる治療用トランスジェニックタンパク質のための送達ビヒクル（vehicle：運搬体）として使用することは、まだ十分に探求されてはいない。
【０００４】
炎症性疾患及び不所望の免疫応答と関連した疾患は、世界的な健康問題及び死亡率の重大な原因である。例えば、肺疾患又は自己免疫疾患のような免疫性疾患は、効果的な治療をもたらすために炎症の調節の改善が必要となる医学的状態を表す。
【０００５】
肺の疾患（例えば呼吸器疾患）は、患者の健康状態に深刻な影響を及ぼすことがあり、かつ肺の器官及び組織を冒す数多くの病理学的状態を含む。肺疾患の一例としての呼吸器疾患は、上部呼吸道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜及び胸腔並びに呼吸の神経及び筋肉の状態を含む。呼吸器疾患は、世界的に主な死因に数えられる。肺感染症（例えば肺炎及び結核）、肺がん及び慢性閉塞性肺疾患（COPD）は合わせて、2008年度の世界的な950万人、つまり世界総計の六分の一の死の原因となった。世界保健機関によれば、世界的な死因の上位10位に4種の呼吸器疾患のカテゴリーが見られることに加えて、死亡数の6人に1人の原因となるだけでなく、失われた障害調整生存年数の10年のうち1年の原因となる。欧州連合の28カ国では、これらの疾患は、死亡数の8人に1人の原因となる。治療は、一般的には、炎症を減らすために、抗炎症薬、例えばコルチコステロイド類の使用に向けられる。肺疾患の罹患率を考慮すれば、それらの治療のための新規の施策が必要とされる。
【０００６】
自己免疫疾患は、個体自身の身体の細胞、物質又は組織に対する免疫応答と関連した医学的状態である。一般人口の実質的少数が、急性又は慢性であり得る自己免疫疾患を患っており、しばしば長時間をかけて衰弱していく。自己免疫疾患及び炎症性疾患の両方において、その医学的状態は、一般的にヒトの適応免疫系及び／又は自然免疫系の反応、例えば自己免疫疾患では自分の身体の組織又はタンパク質に対する反応によって引き起こされる。
【０００７】
かなり重要となる自己免疫状態の一例は、1型糖尿病である。1型糖尿病は、全ての糖尿病の事例の5 %〜10 %を占めている。世界中で年間約80000人の若者が診断され、米国では合計300万人が1型糖尿病を患っていると見積もられている（非特許文献6）。1型糖尿病を患う患者においては、膵β細胞は、β細胞自己抗原、マクロファージ、樹状細胞、Bリンパ球及びT細胞リンパ球の関与する自己免疫反応によって破壊される。これらの患者における膵β細胞の不全のため、インスリン産生が低減され、こうして血中及び尿内でのグルコース濃度の上昇が生ずる。現在の治療でのアプローチは、一般的に、根本的な免疫系の病理に直接対処するのではなく、インスリン濃度を調整することに頼っている。
【０００８】
かなり重要となる炎症性疾患の一例は、関節炎、例えば痛風（痛風関節炎）である。痛風は、一般的に、特定の位置における再発性の急性炎症性関節炎を特徴とする医学的状態であり、関節に腫脹及び痛みをもたらす。親指の根本の中足指節関節が通常冒される領域である。痛風は、通常は血中の尿酸濃度が高められ、こうして尿酸の結晶化に導かれ、該結晶が患者の身体における関節、腱及び周辺組織中に沈着されることによって引き起こされると認められている。治療は、一般的に抗炎症薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）若しくはコルチコステロイド類又は尿酸産生を遮断する薬剤を使用することに向けられている。
【０００９】
関節炎のような状態の治療に使用されるステロイド剤及び非ステロイド剤のような数多くの抗炎症剤が知られている。しかしながら、これらの多くの薬剤は、特に長期の使用後にしばしば不所望な副作用をもたらす。更なる抗炎症剤が必要とされることは、特に炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に関して、緩慢な治療若しくは短期間の治療に対する応答が不十分であること、及び／又は長期間の治療を必要とする患者において不所望な副作用をもたらすことから明らかである。
【００１０】
α1-アンチトリプシン（A1AT、AAT、PI、SERPINA1）は、約52 kDaの糖タンパク質であり、それは、最も豊富にある内因性セリンプロテアーゼインヒビター（SERPINスーパーファミリー）の一つである。AATは、急性期タンパク質であるとみなされ、そのためAAT濃度は、急性炎症時に何倍も高まることがある。
【００１１】
α1-アンチトリプシン欠乏症（α1-アンチトリプシン欠乏症、A1AD）は、α1-アンチトリプシン（A1AT）の産生不良をきたし、それにより血中及び肺内でのA1AT活性の低下並びに肝細胞中での過剰な異常A1ATタンパク質の堆積をもたらす医学的障害である。SERPINA1には75を超える既知の異なる突然変異が存在し、AATDの事例の90 %は、PI*Zミスセンス突然変異：Glu342Lysによるものである。AATの欠乏は、慢性的な際限のない組織破壊をもたらし、それによって好中球エラスターゼは、肺胞間質エラスチンを制限無く分解するため、気道炎症及び肺気腫のような呼吸器合併症が引き起こされる。
【００１２】
AAT欠乏症の治療は、機能的AATの再構築のために遺伝子治療のアプローチが提案されているものの、依然として難題である。例えば、特許文献2は、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を基礎とするベクターを使用して、AATの発現を増大させることによる、AAT欠乏症治療のための遺伝子治療法を記載している。
【００１３】
Liら（非特許文献7）、Ghaediら（非特許文献8）及びLiら（非特許文献9）は、AATを発現する遺伝子改変された間葉系肝細胞を記載し、間葉系幹細胞のAAT欠乏症の治療のための利用可能性を、特に肝臓の疾患の治療に関して議論している。A1ADによって引き起こされる疾患の重症度を考慮すれば、罹患した被験体においてAAT産生を増大させるために新たな方策が必要とされる。
【００１４】
AAT欠乏症の治療における最近の先行した進展にかかわらず、AAT欠乏症を患っていない被験体においては、細胞治療的アプローチにおけるAATの治療可能性は、ほぼ未開拓のままである。Ghaediら（非特許文献10）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）でのAATを発現する間葉系幹細胞の細胞毒性効果を実証し、それらの血管新生阻害剤としての使用可能性を議論している。炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療において、MSCを介したトランスジェニックAATの発現を基礎とする細胞治療を使用することは、本発明者らの知る限りは、今までに提案されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第2010/119039号
【特許文献２】米国特許出願公開第2014/0142161号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Vilquin and Rosset, Regenerative Medicine 2006: 1, 4, p 589
【非特許文献２】Veronesi et al, Stem cells and Development 2013; 22, p 181
【非特許文献３】Le Blanc et al, Lancet 2004: 363, p 1439
【非特許文献４】Khakoo et al, J Exp Med 2006: 203, p 1235
【非特許文献５】Kidd et al, Stem Cells 2009: 27, p 2614
【非特許文献６】Chiang et al., Diabetes Care 2014: 37, pp 2034-55
【非特許文献７】J Hepatol 2011: 54, pp 930-8
【非特許文献８】Tissue and Cell 2010: 42, pp 181-9
【非特許文献９】Mol Ther 2010: 18, pp 1553-8
【非特許文献１０】J Gene Med 2011: 13, pp 171-80
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従来技術を考慮すれば、本発明の基礎を成す技術的課題は、炎症性疾患及び不所望な免疫応答と関連した疾患の治療のための代替的な及び／又は改善された手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この課題は独立クレームの特徴により解決される。本発明の好ましい実施の形態は従属クレームにより示される。
【００１９】
それゆえ、本発明は、α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体における炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した医学的状態の治療における医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞であって、上記幹細胞は、（ii）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物に作動可能に連結された、（i）α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする領域を含む外因性核酸を含む、医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。そのようなMSCは、「AAT改変MSC」と呼ぶことができる。
【００２０】
好ましい一実施の形態においては、本発明は、α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体における炎症及び／又は不所望な免疫応答と関連した、肺の炎症性疾患、痛風、慢性線維症、自己免疫疾患、特に1型糖尿病からなる群から選択される医学的状態の治療における医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞（AAT改変MSC）に関する。
【００２１】
本発明によるAAT改変MSCで治療される様々な医学的適応症（特に、肺の炎症性疾患、痛風、慢性線維症、自己免疫疾患、特に1型糖尿病）は、α1-アンチトリプシン（AAT）欠乏症を伴わない被験体における炎症及び／又は不所望な免疫応答という共通の特徴によってまとめられる。AAT改変MSCの使用が、今までにα1-アンチトリプシン（AAT）欠乏に関連しない医学的障害の治療において提案されていなかったことを考慮して、本発明の様々な使用は、まとまった一群の医学的適応症に対応する。
【００２２】
AAT改変MSCが、AAT欠乏症を示さない被験体における不所望な炎症及び／又は免疫応答と関連した医学的状態を治療することができることは、特に驚くべきことであった。
【００２３】
AAT欠乏症を伴う被験体におけるAATの補充は提案されており、機能的AATの濃度の減少によって引き起こされる数多くの病理学的状態を治療することに対して有用なアプローチであるように思われる。しかしながら、機能的AATを保有する患者において、MSCを媒介した送達によってAATを炎症部位に局所的に高めて送達することで、不所望な炎症又は免疫応答に対する治療策を提供することができることは、以前には提案されていなかった。むしろ当業者であれば、AAT欠乏症を伴わない被験体にMSC-AATを投与することによって、過剰なAATのため副作用が引き起こされる可能性があると考えたであろう。さらに、本発明によって達成される有益な効果は、AAT欠乏症を伴う被験体におけるAAT補充療法を考慮すれば、過剰のAATの供給自体が、機能的AATを保有する患者において治療効果をもたらすとは推測しないであろうから、明らかであるとみなされることとはならない。
【００２４】
本発明によれば、α1-アンチトリプシン欠乏症（α1-アンチトリプシン欠乏症、A1AD）という用語は、α1-アンチトリプシン（A1AT）の産生不良をきたすあらゆる状態、例えば、血中及び肺内でのA1AT活性の低下並びに肝細胞中での過剰な異常A1ATタンパク質の堆積をもたらすこれらの遺伝子疾患を指す。例えば、AAT欠乏症は、SERPINA1における75の既知の異なる突然変異のうちの1つ以上によって特徴付けることができ、AATDの事例の90 %は、PI*Zミスセンス突然変異：Glu342Lysによるものである。
【００２５】
したがって、そのようなAAT欠乏症を伴わない被験体が、本明細書に記載される医学的治療のための好ましい意図された被験体である。
【００２６】
その炎症領域へと遊走する能力のため、MSCは、治療剤を送達するために適したツールである。理論によって縛られるものではないが、本発明のMSCは、そのMSC中の外因性核酸から発現される治療剤、すなわちAATタンパク質の効果的な送達のための薬剤送達ビヒクルである。さらに、MSCとAATとの組み合わせは、予想外の相乗効果をもたらす。MSC自体が、炎症を起こした組織へのホーミングの後に、及び／又は炎症を起こした組織内での生着の後に、炎症領域に抗炎症作用に関する有益な特性を示し、治療用導入遺伝子としてのAATと協働した場合には、増強された抗炎症性機能がもたらされる。
【００２７】
驚くべきことに、本明細書に記載されるMSCの投与は、該細胞の全身投与、好ましくは静脈内投与の後に、MSCの炎症部位への遊走をもたらす。MSCは、炎症を起こした組織領域において遊走及び／又は生着することができ、それにより、AAT改変MSC中に存在する導入遺伝子の発現からのAATの増強された局所的抗炎症作用に加えて、MSC自体からの抗炎症性シグナルが提供される。本発明で使用されるMSCは、全身投与又は静脈内投与の後に血流内で循環することもでき、体内の炎症を起こした領域に生着又は結合することができ、それによって局所的にそれらの機能が発揮される。不所望な炎症及び／又は不所望な免疫応答によって定義される医学的状態の治療において、高められたAAT発現（AAT導入遺伝子のため）を示すMSCを組み合わせることで、予想外の相乗作用が得られ、それにより、炎症が高まった領域へのMSCのホーミングは、MSC自体及びAAT導入遺伝子の両方の抗炎症特性に加えて、別々にみなした場合のそれぞれ個別の効果の合計よりも大きな相乗的な治療効果をもたらす。
【００２８】
例えば、AATが治療用タンパク質として全身投与される場合、又は遺伝子治療においてウイルスベクター中で投与される場合に、体内の炎症を起こした領域が標的とされないため限られた利益しか達成されず、オフターゲット効果のため不所望な副作用が生ずる可能性がある。MSCが全身投与される場合に、それらの炎症を起こした組織での局在化のためMSC自体から幾つかの有利な効果を得ることができるが、改変されていないMSCによって誘導された抗炎症性応答の強度は、有意の治療効果を示すには不十分なことがある。構成的プロモーター又は条件的プロモーターのいずれかのもとで、導入遺伝子としてAATを発現するMSCを組み合わせることで、狙い通りかつ効果的に、AAT及びMSCの固有の特性の相乗的な組み合わせが可能となる。例えば、AATの局所的作用は、様々な炎症性疾患、例えば不所望な免疫反応によって特徴付けられる炎症性疾患を治療するにあたり有用である。AATは、炎症性細胞の酵素から組織を保護することができ、そして炎症性サイトカインの産生を減らすことができる。
【００２９】
過剰なAATをMSCによる局所的な送達を介して供給することで、AAT欠乏症を伴わない患者において所望の治療効果が得られる一方で、過剰なAATのオフターゲット効果による副作用の可能性は最小限となる。この過程において、MSCの免疫調節特性は、AATの抗炎症作用とともに相乗的に作用し、こうしてAATの治療的に有効な用量が与えられる。それにより、AAT改変MSCは、AATタンパク質又はAATをコードする核酸ベクターの全身投与による副作用の可能性を回避し、及び／又は最小に抑える。AAT投与のためのビヒクルとしてのMSCの使用は、MSCの炎症を起こした組織に向かってのホーミング能力のため、身体の罹患領域でのAATの局所的産生をもたらす。
【００３０】
AATをコードする領域は、好ましくはAAT機能を示し、ヒトAATと比べて低減された活性、同じ活性、同様の活性若しくは高められた活性を有するか、又はAATと機能的に類似した、天然に存在する又は合成のAATタンパク質配列をコードするあらゆる核酸である。AATのアミノ酸配列は、NCBIデータベースからアクセッション番号1313184Bとして入手することができる。分子生物学又は遺伝学における当業者によれば、AATをコードする相応の核酸配列を得ることができる。改変されていないヒト型のAATと機能的類似性を示すAATの配列多様体の使用は、本発明に包含される。
【００３１】
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000295.4で公表されているSERPINA1コーディング配列（CDS）は、好ましい一実施の形態であり、全配列の塩基262〜1518（配列番号1）：
262 ATGCCGTCT TCTGTCTCGT GGGGCATCCT CCTGCTGGCA
301 GGCCTGTGCT GCCTGGTCCC TGTCTCCCTG GCTGAGGATC CCCAGGGAGA TGCTGCCCAG
361 AAGACAGATA CATCCCACCA TGATCAGGAT CACCCAACCT TCAACAAGAT CACCCCCAAC
421 CTGGCTGAGT TCGCCTTCAG CCTATACCGC CAGCTGGCAC ACCAGTCCAA CAGCACCAAT
481 ATCTTCTTCT CCCCAGTGAG CATCGCTACA GCCTTTGCAA TGCTCTCCCT GGGGACCAAG
541 GCTGACACTC ACGATGAAAT CCTGGAGGGC CTGAATTTCA ACCTCACGGA GATTCCGGAG
601 GCTCAGATCC ATGAAGGCTT CCAGGAACTC CTCCGTACCC TCAACCAGCC AGACAGCCAG
661 CTCCAGCTGA CCACCGGCAA TGGCCTGTTC CTCAGCGAGG GCCTGAAGCT AGTGGATAAG
721 TTTTTGGAGG ATGTTAAAAA GTTGTACCAC TCAGAAGCCT TCACTGTCAA CTTCGGGGAC
781 ACCGAAGAGG CCAAGAAACA GATCAACGAT TACGTGGAGA AGGGTACTCA AGGGAAAATT
841 GTGGATTTGG TCAAGGAGCT TGACAGAGAC ACAGTTTTTG CTCTGGTGAA TTACATCTTC
901 TTTAAAGGCA AATGGGAGAG ACCCTTTGAA GTCAAGGACA CCGAGGAAGA GGACTTCCAC
961 GTGGACCAGG TGACCACCGT GAAGGTGCCT ATGATGAAGC GTTTAGGCAT GTTTAACATC
1021 CAGCACTGTA AGAAGCTGTC CAGCTGGGTG CTGCTGATGA AATACCTGGG CAATGCCACC
1081 GCCATCTTCT TCCTGCCTGA TGAGGGGAAA CTACAGCACC TGGAAAATGA ACTCACCCAC
1141 GATATCATCA CCAAGTTCCT GGAAAATGAA GACAGAAGGT CTGCCAGCTT ACATTTACCC
1201 AAACTGTCCA TTACTGGAAC CTATGATCTG AAGAGCGTCC TGGGTCAACT GGGCATCACT
1261 AAGGTCTTCA GCAATGGGGC TGACCTCTCC GGGGTCACAG AGGAGGCACC CCTGAAGCTC
1321 TCCAAGGCCG TGCATAAGGC TGTGCTGACC ATCGACGAGA AAGGGACTGA AGCTGCTGGG
1381 GCCATGTTTT TAGAGGCCAT ACCCATGTCT ATCCCCCCCG AGGTCAAGTT CAACAAACCC
1441 TTTGTCTTCT TAATGATTGA ACAAAATACC AAGTCTCCCC TCTTCATGGG AAAAGTGGTG
1501 AATCCCACCC AAAAATAA
を含む。
【００３２】
本発明の幾つかの実施の形態においては、CDSは、タンパク質産生が増大するようにコドン最適化されている。コドン最適化後のそのコーディング配列は、好ましくは以下の通りである（配列番号2）：
ATGCCCAGCAGCGTGTCCTGGGGAATTCTGCTGCTGGCCGGCCTGTGTTGTCTGGTGCCTGTGTCTCTGGCCGAGGACCCTCAGGGGGATGCCGCCCAGAAAACCGATACCAGCCACCACGACCAGGACCACCCCACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCCGAGTTCGCCTTCAGCCTGTACAGACAGCTGGCCCACCAGAGCAACAGCACCAACATCTTTTTCAGCCCCGTGTCTATCGCCACCGCCTTCGCCATGCTGAGCCTGGGCACAAAGGCCGACACCCACGACGAGATCCTGGAAGGCCTGAACTTCAACCTGACCGAGATCCCCGAGGCCCAGATCCACGAGGGCTTCCAGGAACTGCTGCGGACCCTGAACCAGCCCGATAGCCAGCTGCAGCTGACAACCGGCAACGGCCTGTTTCTGAGCGAGGGACTGAAGCTGGTGGACAAGTTTCTGGAAGATGTGAAGAAGCTGTATCACAGCGAGGCCTTCACCGTGAACTTCGGCGACACCGAGGAAGCCAAGAAGCAGATCAACGACTACGTGGAAAAGGGCACCCAGGGCAAGATCGTGGACCTCGTGAAAGAGCTGGACCGGGACACCGTGTTCGCCCTCGTGAACTACATCTTCTTCAAGGGCAAGTGGGAGCGGCCCTTCGAAGTGAAGGACACAGAGGAAGAGGACTTTCACGTGGACCAAGTGACCACCGTGAAGGTGCCCATGATGAAGAGACTGGGCATGTTCAACATCCAGCACTGCAAGAAACTGAGCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAGTACCTGGGCAACGCTACCGCCATATTCTTTCTGCCCGACGAGGGCAAGCTGCAGCACCTGGAAAACGAGCTGACCCACGACATCATCACCAAATTTCTGGAAAATGAGGACCGGCGGAGCGCCAGCCTGCATCTGCCTAAGCTGTCTATCACCGGCACCTACGACCTGAAGTCCGTGCTGGGACAGCTGGGCATCACCAAGGTGTTCAGCAACGGCGCCGATCTGAGCGGCGTGACAGAAGAGGCCCCTCTGAAGCTGTCCAAGGCCGTGCACAAAGCCGTGCTGACCATCGACGAGAAGGGCACCGAAGCCGCTGGCGCCATGTTTCTGGAAGCCATCCCCATGAGCATCCCCCCTGAAGTGAAGTTCAACAAGCCCTTCGTGTTCCTGATGATCGAGCAGAACACCAAGAGCCCCCTGTTCATGGGCAAGGTCGTGAACCCCACCCAGAAA
【００３３】
配列番号1及び／又は配列番号2によるヌクレオチド配列は、本発明において好ましい配列番号3：
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK
によるアミノ酸配列のヒトAATタンパク質をコードしている。
【００３４】
したがって、本発明は、本明細書に記載される遺伝子改変されたMSCであって、
a）AATタンパク質、例えば配列番号3によるAATタンパク質を、好ましくは配列番号1又は2によるヌクレオチド配列によってコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b）a）によるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子、
c）a）若しくはb）によるヌクレオチド配列と機能的に類似／等価であるために十分な配列同一性を有する、好ましくはa）若しくはb）によるヌクレオチド配列に対する少なくとも70 %の、80 %の、好ましくは90 %の、より好ましくは95 %の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子、
d）遺伝暗号の結果として、a）〜c）によるヌクレオチド配列へと縮重される核酸分子、並びに、
e）a）〜d）のヌクレオチド配列であって、欠失、付加、置換、転位、逆位及び／又は挿入によって修飾され、かつa）〜d）によるヌクレオチド配列と機能的に類似／等価であるヌクレオチド配列による核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子を含む、MSCを包含する。
【００３５】
したがって、本発明は、配列番号3によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載の遺伝子改変されたMSCを包含する。更に本発明は、配列番号3の配列多様体、特に配列番号3に対して少なくとも70 %の配列同一性の、好ましくは配列番号3に対して少なくとも80 %、85 %、90 %又は少なくとも95 %の配列同一性の配列多様体を包含する。そのような配列多様体は、好ましくは、本明細書に開示されるヒトAATと機能的に類似しているか、又は機能的に等価である。タンパク質の長さの変動も本発明に包含されるが、その場合には、配列番号3のヒトAATの機能的等価性が維持されているものとする。タンパク質の長さの切断又は伸長、例えば50アミノ酸、40アミノ酸、30アミノ酸、20アミノ酸又は10アミノ酸までの切断又は伸長は、AAT活性を維持し得るため、それらは本発明に包含される。
【００３６】
機能的に類似の配列とは、機能的なAAT遺伝子産物をコードして、ヒトAATと同じ又は同様の機能的作用を可能にする能力を指す。AAT機能は、様々なプロテアーゼ、例えばトリプシンをin vitroで阻害するその能力によって、又は好中球エラスターゼ（以下に記載する）を阻害するその能力によって決定され得る。プロテアーゼ活性を測定するための、又は好中球エラスターゼ活性を測定するための適切なアッセイは、当業者に既知である。
【００３７】
アミノ酸配列及びそのような分子をコードする核酸配列における置換によって生じ得るAATタンパク質へのタンパク質修飾も本発明の範囲内に含まれる。本明細書で定義される置換は、タンパク質のアミノ酸配列になされる修飾であり、それにより1つ以上のアミノ酸が、同数の（種々の）アミノ酸と置き換えられて、本来のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質が生成される。幾つかの実施の形態においては、この修正は、タンパク質の機能を大きく変更しないであろう。付加と同様に、置換は、天然のものであっても人工的なものであってもよい。当該技術分野においては、アミノ酸置換が、タンパク質の機能を大きく変更することなく行われ得ることは、よく知られている。これは、特に、該修飾が、あるアミノ酸の類似の特性の別のアミノ酸への置換である「保存的」アミノ酸置換に関連する場合に当てはまる。そのような「保存された」アミノ酸は、サイズ、電荷、極性及びコンフォメーションのため、タンパク質の構造及び機能に大きな影響を及ぼすことなく置換することができる天然アミノ酸又は合成アミノ酸であってよい。しばしば、多くのアミノ酸は、タンパク質の機能に有害な影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸によって置換され得る。一般的に、非極性アミノ酸のGly、Ala、Val、Ile及びLeu、非極性芳香族アミノ酸のPhe、Trp及びTyr、中性極性アミノ酸のSer、Thr、Cys、Gln、Asn及びMet、正に荷電したアミノ酸のLys、Arg及びHis、負に荷電したアミノ酸のAsp及びGluは、保存的アミノ酸の群を表す。この一覧は、網羅的なものではない。例えば、Ala、Gly、Ser及び時としてCysは、それらが異なる群に属しているが、互いに置換することができることはよく知られている。
【００３８】
MSCの遺伝子改変のための方法は、当業者に既知である。MSCの遺伝子改変のために適した方法の例は、特許文献1及び国際公開第2008/150368号に開示されている。
【００３９】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞は、それらの細胞が、骨髄、臍帯、脂肪組織又は羊水から得られることを特徴としている。
【００４０】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞は、それらの細胞が、CD34陰性であることを特徴としている。
【００４１】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞は、それらの細胞が、ヒト細胞であることを特徴としている。
【００４２】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、外因性核酸が、ウイルスベクターを、例えばウイルス発現構築物の形で、より好ましくはレトロウイルスベクター、特にガンマレトロウイルスベクターの形で含むことを特徴としている。
【００４３】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、外因性核酸が、非ウイルス発現構築物であるか、又はそれを含むことを特徴としている。
【００４４】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、それらの細胞が、（iv）構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物に作動可能に連結された、（iii）選択マーカー遺伝子を更に含むことを特徴としている。
【００４５】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物が、構成的プロモーターであることを特徴としている。
【００４６】
別の実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物が、CMV及びEF2プロモーターであることを特徴としている。
【００４７】
好ましい実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、構成的プロモーターが、EFSプロモーターであることを特徴としている。
【００４８】
好ましい実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、構成的プロモーターが、PGKプロモーターであることを特徴としている。
【００４９】
好ましい実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、構成的プロモーターが、EF1αプロモーターであることを特徴としている。
【００５０】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、上記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組合せ物が、誘導性又は条件的プロモーターであることを特徴としている。
【００５１】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーターが、投与後に上記細胞の分化に際して誘導可能であることを特徴としている。一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーターが、Tie2プロモーターであることを特徴としている。
【００５２】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーターが炎症特異的プロモーターであり、好ましくは、上記プロモーターは、炎症性メディエーター若しくはサイトカインによって誘導され、及び／又は該遺伝子改変された間葉系幹細胞が炎症を起こした組織に近づいた時に誘導されることを特徴とする。
【００５３】
誘導形態のプロモーターは、AATタンパク質の炎症特異的発現及び／又は局所的発現を示すように設計される。MSCのホーミング特性及び／又は遊走特性と組み合わされて、相乗作用が達成されるため、被験体の体内の罹患した組織又は器官とは異なる領域には非常に僅かなAATタンパク質しか発現又は産生されない。
【００５４】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーターが、RANTESプロモーターであることを特徴としている。
【００５５】
一実施の形態においては、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、プロモーターが、HSP70プロモーターであることを特徴としている。
【００５６】
従来技術を考慮すれば、本明細書で述べられる誘導性プロモーターの発現が、炎症部位での適切な刺激に際して、治療用タンパク質AATの十分な発現に導くことは驚くべきことであった。本明細書で提供されるプロモーターは、炎症を起こした組織に近づいた時にAATの迅速かつ強力な発現のために適した誘導特性を示す。さらに、組織に対するAATの抗炎症作用及び免疫調節作用は、AATの発現が上述の誘導性プロモーターによって制御される場合に特に顕著である。これは相乗作用をもたらし、それにより不所望な炎症及び／又は免疫応答と関連する医学的状態を伴う患者の治療は、Tie2及び／又はRANTESの制御下でAATを発現する遺伝子改変されたMSCを投与する場合に特に有効である。
【００５７】
更なる態様においては、本発明は、特定の医学的利用に制限されることなく、AAT改変された細胞自体に関する。これに関して、本明細書に記載されるAAT改変細胞の様々な構造的特徴、例えば導入遺伝子配列、プロモーター、以下と実施例とで記載される追加のベクター構成要素及びそれらの組み合わせは、今までに記載されていない現存の技術分野への貢献を表す。
【００５８】
更なる態様においては、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。
【００５９】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、該細胞が、治療的に有効な数の細胞を患者の血流中へと導入することによって投与されることを特徴としている。
【００６０】
更なる態様においては、本発明は、肺疾患の治療における医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。
【００６１】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、肺疾患が肺の炎症性疾患であることを特徴としている。
【００６２】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、肺疾患が呼吸器疾患であることを特徴としている。
【００６３】
更なる実施の形態では、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、肺疾患が急性肺傷害、慢性の気管支炎、肺気腫、気管支拡張症及び細気管支炎を含む慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、喘息、類肉腫症、過敏性肺炎及び／又は肺線維症であることを特徴としている。
【００６４】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、それらの細胞が、治療的に有効な数の細胞を吸入によって患者の肺へと導入することを、任意に該細胞を患者の血流中へと導入することと組み合わせることによって投与されることを特徴としている。
【００６５】
本発明による肺疾患は、急性気管支炎、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、石綿症、喘息、気管支拡張症、細気管支炎、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎（BOOP）、気管支肺異形成症、綿肺症、慢性気管支炎、コクシジオイデス症（Cocci）、COPD、特発性器質化肺炎（COP）、嚢胞性線維症、肺気腫、ハンタウイルス肺症候群、ヒストプラズマ症、ヒトメタニューモウイルス、過敏性肺炎、インフルエンザ、リンパ管腫症、中皮腫、中東呼吸器症候群、非結核性抗酸菌、百日咳、塵肺症（炭塵肺）、肺炎、原発性線毛機能不全症、原発性肺高血圧症、肺動脈性高血圧症、肺線維症、肺血管疾患、呼吸器合胞体ウイルス、類肉腫症、重症急性呼吸器症候群、ケイ肺症、睡眠時無呼吸、乳児突然死症候群、又は肺結核の1つ以上に関連するものであり得るが、それらに限定されない。
【００６６】
好ましい実施の形態においては、肺疾患は、炎症性肺疾患若しくは拘束性肺疾患、呼吸道感染症及び／又は肺血管疾患若しくは肺血管状態から選択される。
【００６７】
炎症性肺疾患は、一般的に、高い好中球数によって特徴付けられ、例えば喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患又は急性呼吸窮迫症候群である。拘束性肺疾患は、肺コンプライアンスの低下により、肺伸展不良及び肺の硬直の増大が、例えば呼吸窮迫症候群を伴う乳幼児において引き起こされることによって特徴付けられる呼吸器疾患の一つのカテゴリーである。
【００６８】
呼吸道感染症は、呼吸器系のあらゆる部分で冒され得る。呼吸道感染症は、伝統的に、上部呼吸道感染症と下部呼吸道感染症とに分類される。最も一般的な上部呼吸道感染症は、感冒である。しかしながら、上部呼吸道の特定器官の感染症、例えば副鼻腔炎、扁桃炎、中耳炎、咽頭炎及び喉頭炎も、上部呼吸道感染症とみなされる。最も一般的な下部呼吸道感染症は、肺炎、つまり細菌、特に西欧諸国ではストレプトコッカス・ニューモニエによって通常引き起こされる肺の感染症である。世界的には、結核は、肺炎の一つの重大な原因である。ウイルス及び真菌のようなその他の病原体が、肺炎、例えば重症急性呼吸器症候群及びニューモシスチス肺炎を引き起こすことがある。肺炎は、肺膿瘍、つまり感染により引き起こされる肺中の円形空洞のような合併症を起こすことがあるか、又は胸腔にまで広がることがある。
【００６９】
本発明の一態様は、本明細書に記載される遺伝子改変されたAAT改変MSCを使用する血管系疾患の治療に関する。肺血管疾患は、肺循環を冒す状態である。その例は、肺塞栓症、つまり血栓が静脈内で形成され、剥がれて、心臓を通過し、肺中に留まること（血栓塞栓症）である。大きな肺塞栓は致死的であり、突然死を引き起こす。脂肪塞栓症（例えば骨損傷後）、羊水塞栓症（陣痛及び分娩の合併症を伴う）又は空気塞栓症（医原性、侵襲性の医療処置によって引き起こされる）のように数多くのその他の物質が、肺に塞栓を起こす（血流を移動する）こともあるが、それらはまれである。以下の肺疾患：肺動脈高血圧症、つまり肺動脈における血圧の上昇、肺水腫、つまり肺の毛細血管から肺胞（又は気腔）中への液の漏洩、肺出血、つまり肺中の毛細血管への炎症及び損傷により引き起こされる肺胞中への血液の漏洩も本発明により治療することができる。
【００７０】
本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、α1-アンチトリプシン欠乏症を伴う患者又は伴わない患者でのα1-アンチトリプシン欠乏（α1-アンチトリプシン欠乏症、A1AD）と関連する医学的状態の治療における医薬として使用することもできる。
【００７１】
α1−アンチトリプシン欠乏症に関連する医学的状態の例は硬変症、COPD、気胸症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症、膵炎、胆石症、気管支拡張症、骨盤臓器脱、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、主に下葉を冒し、水疱を生じさせる肺気腫、及び続発性膜性増殖性糸球体腎炎である。
【００７２】
更なる態様においては、本発明は、炎症性疾患の治療における医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。
【００７３】
更なる実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、炎症性疾患が、血管炎、腎炎、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎及び／又は対宿主性移植片病であることを特徴としている。
【００７４】
一実施の形態においては、医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞は、治療されるべき炎症性疾患が痛風であることを特徴としている。痛風は、一般的に、特定の位置における再発性の急性炎症性関節炎を特徴とする医学的状態であり、関節に腫脹及び痛みをもたらす。親指の根本の中足指節関節が通常冒される領域である。痛風は、通常は血中の尿酸濃度が高められ、こうして尿酸の結晶化に導かれ、該結晶が患者の身体における関節、腱及び周辺組織中に沈着することによって引き起こされると認められている。痛風は、一部の事例では、痛風結節、腎臓結石又は痛風腎症として現れることがある。
【００７５】
驚くべきことに、本発明のAAT改変MSCは、冒された領域の腫脹及び痛みの軽減に導く痛風治療のための一つの効果的な治療オプションを可能にする。炎症の軽減及び滑液中の尿酸結晶の減少を通じて、好結果な治療を認めることができる。更なる態様においては、本発明は、慢性線維症の治療における医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変された間葉系幹細胞に関する。
【００７６】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、炎症性疾患及び／又は慢性線維性疾患が、被験体の腎臓、肝臓及び／又は結腸の疾患であることを特徴としている。
【００７７】
線維症は、一般的に、器官又は組織における過剰な線維性結合組織の形成であるとみなされる。線維症は、反応性状態、良性状態又は病的状態であってよい。結合組織の不所望な堆積は、下にある器官又は組織の構造及び機能を覆い隠すことがあり、それによって病的状態に導かれる。線維症は、一般的に、炎症又は不所望な炎症及び／又は免疫応答と潜在的に関連した損傷の結果として、体内の多くの組織に生ずることがある。線維症の例としては、肺の線維症（肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症）、肝臓の線維症（肝硬変）、心臓の線維症（心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、心房線維症）又は他の病因による線維症（縦隔線維症（隔膜の軟組織）、骨髄線維症（骨髄）、後腹膜線維症（後腹膜の軟組織）、進行性塊状線維症（肺）；炭坑夫塵肺の合併症、腎性全身性線維症（皮膚）、クローン病（腸）、ケロイド（皮膚）、強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）、関節線維症（膝、肩、他の関節）、デュピュイトラン拘縮（手指）又は癒着性関節包炎（肩））が挙げられる。
【００７８】
線維領域での局在化したAATの発現が、増強された治療効果をもたらし得ることは、驚くべきことであった。MSCは、線維性組織に向かう予想外の遊走特性を示すことができ、AATの発現を介して線維性組織の形成の減少をもたらすことができた。この過程で、AAT-MSCは、特に抗炎症性及び／又は免疫調節性の治療剤として作用する。
【００７９】
本明細書に記載されるAAT改変MSCを使用する1型糖尿病の治療は、本発明の更なる一態様に相当する。したがって、1型糖尿病の合併症の治療も本発明に包含される。1型糖尿病と関連した考えられる合併症には、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の加速的進行並びに心臓発作及び／又は心発作、腎症、神経障害及び網膜症の高められたリスクが含まれる。
【００８０】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、被験体がヒトであることを特徴としている。
【００８１】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、上記遺伝子改変された細胞が、被験体に対して同種異系であることを特徴としている。
【００８２】
一実施の形態においては、本明細書に記載される医薬として使用するための遺伝子改変された間葉系幹細胞は、上記遺伝子改変された細胞が、被験体に対して自家であることを特徴としている。
【００８３】
本発明の更なる態様は、治療されるべき疾患の群から癌を除外した、本明細書に記載されるような炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療のための、本明細書に記載されるAAT改変MSCに関する。
【００８４】
本発明の更なる態様においては、遺伝子改変されたMSC又は遺伝子改変されていないMSCは、肺疾患の治療における医薬として使用するために提供される。本明細書でAAT改変MSCに関して述べられる細胞の特徴は、本発明のこの更なる実施の形態にも当てはまる。この実施の形態によれば、MSCは、AATをコードする核酸を含まない。遺伝子改変は存在しなくてもよいし、又はMSCが、AATのような治療用タンパク質をコードする外因性核酸を含んでもよい。したがって、本発明は、MSCの改変が行われたかどうか、又は行われた特定の遺伝子改変とは無関係に、MSCを使用した肺疾患の治療に関する。MSCの抗炎症特性は、本明細書に記載される肺疾患の治療において驚くほど良好な効力をもたらす。本明細書でAAT改変MSCでの治療に関して述べられる、治療されるべき潜在的な肺疾患は、この本発明の特定の実施の形態に適用することもできる。
【００８５】
本発明の更なる態様においては、本明細書に記載されるMSCは、タンパク質のCXCR4をコードする外因性核酸と組み合わせて、上記タンパク質の発現のために適した更なる核酸配列を含んでよい。CXCR4は、MSCの動員に関係している細胞表面ケモカイン受容体であり、少ない割合のMSCの表面で発現される。CXCR4の発現は、組織損傷に向かうMSCのホーミングの効果に関与することが示唆されている。最新の成果によれば、MSC中でのCXCR4の発現が、in vitroで細胞の走化性及び傍分泌特性を増強し、かつin vivoで改善されたMSCホーミング及び損傷した肺組織のコロニー形成を増強することが裏付けられた。CXCR4をコードする配列は、AATをコードするのと同じ外因性核酸分子中か、又は別個の外因性核酸中のいずれかに存在してよい。対象となる1つ以上の遺伝子、例えば治療用遺伝子、例えばAAT又は細胞の動員に関与するその他の遺伝子、例えばCXCR4をそれぞれ有する多重に統合された核酸構築物又は核酸カセットが、本発明のMSC中に存在してよい。
【００８６】
発明の詳細な説明
特許文献及び非特許文献の全ての引用された文書は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００８７】
本明細書に開示の「間葉系細胞」（幾つかの実施の形態において「間葉系幹細胞」又は「MSC」とも呼ばれる）は、結合組織、骨、軟骨並びに循環系及びリンパ系の細胞に成長することができる。間葉系幹細胞は、疎充状（loosely packed）、紡錘状又は星状の未分化細胞からなる中胚葉の一部である間葉に見つかる。本明細書において使用される間葉系幹細胞は、CD34陰性幹細胞を含むが、それらに限定されない。
【００８８】
本発明の1つの実施の形態において、間葉系細胞は、プラスチック接着性線維芽細胞様細胞であり、いくつかの実施の形態において、多能性間葉系間質細胞と定義され、また、CD34陰性細胞を含む。
【００８９】
何らかの誤解を避けるため、間葉系細胞という用語は、間葉系細胞、MSC及びそれらの前駆細胞の部分集合（in vivoにおいて多数の細胞型に分化可能な多能性又は万能性自己再生細胞から構成される）も含む多能性間葉系間質細胞を包含する。
【００９０】
本明細書において使用されるCD34陰性細胞は、細胞表面にCD34を欠失している、又はCD34の発現量がほんのわずかしかない細胞を意味するものとする。CD34陰性細胞及びこのような細胞を単離する方法は、例えば、Lange C. et al., "Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine". J. Cell Physiol. 2007, Apr. 25.に記載されている。
【００９１】
間葉系細胞は多くの指標物質により造血幹細胞（HSC）から分化することができる。例えば、HSCは培養液に浮遊し、プラスチック表面に接着しないことが知られている。対照的に、間葉系細胞はプラスチック表面に接着する。本発明のCD34陰性間葉系細胞は培養液中で接着する。
【００９２】
本明細書に記載の遺伝子改変型細胞（複数の場合もある）は、固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるかに応じて、また注射液のような投与経路において滅菌する必要があるかに応じて様々な種類の担体を含むことができる。本発明を、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞体内、粘膜内、心膜内、臍下、眼球内、経口、局所、局所的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸漬させる局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームにおいて、脂質組成物（例えばリポソーム）において、又は当業者にとって既知である他の方法又は上記の任意の組合せによって投与することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照のこと）。
【００９３】
本発明は、被験体の血流に治療に有効な細胞数を導入することによる患者の治療を包含する。本明細書において使用される「被験体の血流」に細胞を「導入する」とは、上記の細胞を、注射を介して被験体の静脈又は動脈の一方に導入することを含むものとするが、それらに限定されない。このような投与は、例えば1回、複数回及び／又は1回若しくは複数回の長期間にわたり行うこともできる。単回の注射が好ましいが、いくつかの例において、経時的に複数回の注射（例えば、年4回、年2回又は年1回）は必要であってもよい。このような投与はまた、CD34陰性細胞と薬学的に許容可能な担体との混合物を用いて行われることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は当業者にとって既知であり、0.01 M〜0.1 M、好ましくは0.05 Mのリン酸緩衝液又は0.8 %の生理食塩水及び通常使用される専用の凍結保存媒体を含むが、それらに限定されない。
【００９４】
投与は、例えば被験体の体内の炎症部位に近傍の領域に注射によって局所的に行うこともできる。MSCが炎症に向かって遊走することがわかっている。間葉系幹細胞（MSC）は、組織損傷の部位及び腫瘍の微小環境に向性を示す。創傷によって分泌される同じ炎症性メディエーターの多くは、腫瘍の微小環境中で見出され、MSCのこれらの部位への誘引に関与していると考えられている。細胞遊走は、損傷細胞及び／又は応答性免疫細胞によって分泌される増殖因子からケモカインにまで及ぶ多数のシグナルに依存する。MSCは、おそらく、損傷及び炎症部位に応答するその他の免疫細胞と同様の走化特性を有している。それに関わらず、本明細書に記載の細胞の局所投与は、そのような作用部位にて細胞を高濃度にすることができる。
【００９５】
さらに、このような薬学的に許容可能な担体は、水溶液又は非水溶液、懸濁液及び乳濁液、最も好ましくは水溶液であってよい。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む水、アルコール／水溶液、乳濁液及び懸濁液がある。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液並びに不揮発性油がある。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤、例えばブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖リンゲル液をベースとしたもの等がある。i.v.投与に通常使用される流体は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., p. 808, Lippincott Williams S-Wilkins （2000）に見つかる。防腐剤及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等も含むことができる。
【００９６】
本明細書において使用される「治療に有効な細胞数」は、以下の量及び量の範囲を含むがそれらに限定されない：（i）約1×102細胞／体重kg〜約1×108細胞／体重kg；（ii）約1×103細胞／体重kg〜約1×107細胞／体重kg；（iii）約1×104細胞／体重kg〜約1×106細胞／体重kg；（iv）約1×104細胞／体重kg〜約1×105細胞／体重kg；（v）約1×105細胞／体重kg〜約1×106細胞／体重kg；（vi）約5×104細胞／体重kg〜約0.5×105細胞／体重kg；（vii）約1×103細胞／体重kg；（viii）約1×104細胞／体重kg；（ix）約5×104細胞／体重kg；（x）約1×105細胞／体重kg；（xi）約5×105細胞／体重kg；（xii）約1×106細胞／体重kg；及び（xiii）約1×107細胞／体重kg。想定されるヒト体重には、約5 kg、10 kg、15 kg、30 kg、50 kg、約60 kg、約70 kg、約80 kg、約90 kg、約100 kg、約120 kg及び約150 kgが含まれるが、それらに限定されない。これらの数値は、CD34+造血幹細胞の移植の前臨床動物実験及びヒト試験及び標準的なプロトコルに基づく。単核細胞（CD34+細胞を含む）は通常1:23000〜1:300000のCD34陰性細胞を含有する。
【００９７】
本明細書において使用される、炎症のような障害に罹患している被験体を「治療する」とは、障害の進行を遅らせ、停止させ又は好転させることを意味するものとする。好ましい実施の形態において、障害に罹患した被験体を治療することは、障害の進行を、理想的には障害そのものを排除するという点で好転させることを意味する。本明細書において使用される、障害を改善することと障害を治療することとは、等価のことである。本発明の治療も又は代替的に上記の細胞の予防的な投与に関し得る。このような予防的な投与は、炎症の予防等の任意の所与の医学的障害の予防又は上記の障害の発症の予防に関し得ることであり、この予防又は予防法は絶対的な予防として全ての状態下において狭義に解釈されるものではない。予防又は予防法はまた、任意の所与の病態を発症する被験体の、特に上記の病態の危険にある被験体における危険を低減させることに関し得る。
【００９８】
一般的に、その技術分野で認識される意味において使用される用語「炎症」は、有害試剤及び損傷した組織から被験体を保護する役割を果たす、組織の損傷、感染又は破壊によって惹起される局所性又は全身性の保護的応答に関連している。炎症は、好ましくは、制限されない一連の痛み、熱、赤み、腫脹及び機能喪失をもたらし得る、微小血管の開窓、間質空間への血液要素の漏洩及び炎症を起こした組織への白血球の遊走によって特徴付けられる。
【００９９】
炎症は急性又は慢性のいずれかに分類することができる。急性炎症は有害な刺激に対する身体の初期応答であり、血液から損傷組織への血漿及び白血球（特に顆粒球）の移動の増大によって達成される。生化学的事象のカスケードが伝播し、局所血管系、免疫系及び損傷組織内の様々な細胞が関与する炎症応答となる。慢性炎症として知られる長期の炎症は炎症部位に存在する細胞型の漸進的変化をもたらし、炎症過程の組織の同時の破壊及び治癒を特徴とする。
【０１００】
用語「不所望な炎症」とは、好ましくは、生理学的な有益な炎症反応の水準を超え、その炎症部位で細胞、組織及び／又は器官の損傷に導く、被験体における炎症を指す。
【０１０１】
用語「不所望な免疫応答」とは、好ましくは、健康に有害な影響を有し、かつサイトカインの刺激及び／又は産生並びに免疫細胞の動員に関与し得る、被験体における免疫系の反応性の変化を指す。不所望な免疫応答は、例えば自己免疫疾患、移植拒絶反応、アレルギー又は炎症性疾患において見られる。
【０１０２】
したがって、不所望な炎症及び／又は免疫応答によって定義される医学的状態は、特に、限定されるものではないが、血管炎、腎炎、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、対宿主性移植片病、痛風性関節炎、慢性線維症、肺の炎症性疾患又は自己免疫疾患を含む数多くの疾患及び／又は障害を指す。
【０１０３】
肺の炎症性疾患の例には、限定されるものではないが、肺損傷、慢性気管支炎を含む慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺気腫、気管支拡張症及び細気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、類肉腫症、過敏性肺炎及び／又は肺線維症が含まれる。本発明の幾つかの実施の形態においては、本明細書に記載されるMSCは、疾患状態に冒された生理学的ニッチ、例えば炎症領域に向かって遊走することで、それらの治療効果が、例えば局所的に与えられる。
【０１０４】
更に本発明は、自己免疫疾患、特に炎症成分を伴う自己免疫疾患の治療に関する。これらの疾患は、リウマチ性疾患とも呼ぶことができる。このような病態は、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多発性動脈炎、皮膚型（cutaneous）結節性多発動脈炎、肝炎関連動脈炎、ベーチェット症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ−ストラウス症候群、顕微鏡的多発性血管炎、結合組織疾患の脈管炎、ヘノッホ（Henoch）−シェーンライン紫斑病、クリオグロブリン血症性脈管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、熱帯大動脈炎（Tropical aortitis）、類肉腫症、コーガン症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、癩腫の動脈炎、CNSの原発性血管炎、閉塞性血栓性血管炎、腫瘍随伴性動脈炎（arteritis）、蕁麻疹、デゴス病、骨髄異形成症候群、持久性（Erythema）隆起性紅斑、高免疫グロブリンD、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、歯周炎、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、アミロイドーシス、クローン病（Morbus Chron）、潰瘍性大腸炎、自己免疫性筋炎、真性糖尿病、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、組織球症、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、歯周炎、慢性副鼻腔炎、乾癬、乾癬性関節炎、顕微鏡的大腸炎、肺線維症、糸球体腎炎、ホイップル病、スティル病、結節性紅斑、耳炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、再生不良性貧血、骨骨髄線維症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、木村病、全身性硬化症、慢性大動脈周囲炎、慢性前立腺炎、特発性肺線維症、慢性肉芽腫症、特発性アカラシア、ブレオマイシン誘導肺炎症、シタラビン誘導肺炎症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、シャガス病、慢性自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、萎縮性（atrophic）甲状腺炎、グレーブス病（disease）、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性アディソン症候群、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑症、抗リン脂質症候群、重症筋無力症、スティッフ−マン症候群、グッドパスチャー症候群、交感性眼炎、毛包炎、シャープ症候群（Sharp syndrome）及び／又はエバンス症候群から選択されることが好ましい。
【０１０５】
本明細書において使用される「細胞の遊走」は特定の化学的シグナル又は物理的シグナルに向かって細胞が移動することを意味することが意図される。細胞は多くの場合、化学的シグナル及び機械的シグナルを含む特定の外因性シグナルに応じて遊走する。走化性は、化学的な刺激に対する応答における細胞遊走の一例である。ボイデンチャンバーアッセイ等のin vitroでの走化性アッセイを用いて、細胞遊走が任意の所与の細胞に生じているかを求めることができる。例えば、目的の細胞を精製し、分析することができる。走化性アッセイ（例えば、Falk et al., 1980 J. Immuno. Methods 33:239-247による）を、プレート（目的の細胞及び通過する細胞に対して特定の化学的シグナルを配置する）を用いて行った後、回収し、分析することができる。例えば、ボイデンチャンバーアッセイは、走化性の挙動の正確な決定に対するツールとして使用され、フィルターによって分けられたチャンバーを用いることを必要とする。これらのチャンバーの先駆的な型は、ボイデンにより構築された（Boyden (1962) "The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes". J Exp Med 115 (3): 453）。運動性細胞を上部のチャンバーに入れ、同時に試験物質を含有する液体を下部のチャンバーに充填する。試験する運動性細胞の大きさで、フィルターの孔の大きさを決定するが、必然的に、能動的に通過する直径が選択される。in vivo条件のモデル化において、いくつかのプロトコルは、フィルターと細胞外マトリクスの分子（コラーゲン、エラスチン等）を含むことが好ましい。測定の効率は、マルチウェルチャンバーの開発により向上することができ（例えばニューロプローブ）、この場合24個、96個、384個の試料が同時に評価される。この変形例の利点は、いくつか並行して同一の条件でアッセイすることである。
【０１０６】
その一方で、組織試料は、被験体（例えば齧歯類モデル）から細胞移植後に得ることができ、対象となる特定の組織型の細胞の存在についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、核酸配列に基づき細胞を同定する分子的性質のものであっても、又は抗体標識後に蛍光マーキングに基づいて細胞を評価する組織学的性質のものであってもよい。そのようなアッセイは、移植された細胞の生着を評価するためにも特に有用である。生着のためのアッセイは、細胞遊走についての情報を提供し得る。それというのも、生着は、ある程度、生着前の細胞局在化に依存しているからである。
【０１０７】
本発明の幾つかの実施の形態においては、本明細書に記載されるMSCは、疾患状態に冒された生理学的ニッチ、例えば炎症領域中に生着することで、それらの治療効果が、例えば局所的に与えられる。
【０１０８】
本明細書において使用される「生着」は、グラフト又は移植した組織又は細胞の宿主体内への組込みのプロセスに関する。生着はまた、移植した細胞の宿主組織への組込み、及びそれらの生存率並びにいくつかの条件での非幹細胞状態への分化に関し得る。
【０１０９】
生着と、それによる或る程度のMSCの遊走及び生体分布の両方とを評価する技法は、in vivo又はex vivoのいずれかの方法を包含することができる。in vivoでの方法の例として、生物発光（細胞を形質導入して、ルシフェラーゼを発現させた後、発光を生じるルシフェリンの代謝により画像処理することができる）、蛍光発光（細胞に蛍光染料の負荷又は形質導入のいずれかを行い、蛍光レポーターを発現させた後、これを画像処理することができる）、放射性核種標識（細胞に放射性核種を負荷し、シンチグラフィーを用いて局在させる）、ポジトロン断層法（PET）又は単一光子放射断層撮影（SPECT）及び核磁気共鳴画像法（MRI）（常磁性化合物（例えば、酸化鉄ナノ粒子）を負荷した細胞を、MRIスキャナーを用いてトレースする）がある。生体分布を評価するex vivoの方法には、定量PCR、フローサイトメトリー及び組織学的方法がある。組織学的方法には、蛍光標識した細胞のトラッキング；例えば、Y染色体及びヒト特異的ALU配列のin situのハイブリダイゼーション；並びに種特異的又は遺伝子導入したタンパク質、例えば細菌のβ-ガラクトシダーゼの組織化学染色がある。これらの免疫組織化学的方法は、生着の位置を識別するのに有用であるが、組織の切除を必要とする。これらの方法及び用途の更なる総括は、Kean et al., MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation, Stem Cells International, Volume 2013 (2013)を参照されたい。
【０１１０】
したがって、本発明の間葉系細胞等の前駆細胞又は多能性細胞を、被験体の体内の特定の組織又は領域における治療遺伝子産物の局在及び発現を必然的に可能にするタンパク質送達ビヒクルとして説明することができる。このような治療用の細胞は、他の治療に不応性の疾患の細胞療法となる可能性をもたらす。各種類の治療用の細胞において、最終的な目標は同じであり、細胞が遺伝子の特定のレパートリー、好ましくは治療遺伝子産物をコードする外因性核酸を発現し、それにより上記遺伝子産物を発現する細胞特性を改変し、抗炎症効果等の治療効果を得るものとする。本発明の細胞は、in vitroで増殖したとき、CD34等のほとんどの分化マーカーを発現しない間葉系（間質）細胞子孫の複数の世代を含む、異種の集団を表す。これらの集団は、間葉系及び非間葉系系譜に沿って増殖能並びに末端分化及び成熟に対する応答が限定されていることを保持することができる。
【０１１１】
本明細書において使用される「誘導性発現」又は「条件付き発現」は、遺伝子発現の状態、複数の状態又は系に関し、この場合、1つ又は複数の分子（誘導因子）が存在し又は遺伝子発現させる細胞の他の一連の条件下にない限り、治療用導入遺伝子等の目的の遺伝子を好ましくは発現しない、又はいくつかの実施の形態において、取るに足らないレベル若しくは比較的低いレベルにて発現する。誘導性プロモーターは、特定の生物学的状態下において比較的高いレベルにて発現する天然のプロモーター又は任意の所与の誘導性要素を含む他の合成プロモーターのいずれかに関し得る。誘導性プロモーターは、特定の組織環境若しくは微小環境により誘導されるもの又は特定の組織環境若しくは微小環境に存在する生物学的シグナルの組合せ又は外部因子、例えば小型の薬剤分子若しくは他の外部から適用されるシグナル分子の投与により誘導されたプロモーターを指し得る。
【０１１２】
本明細書において使用される組織に「近傍の」は、例えば、組織の5 mm以内、1 mm以内、組織の0.5 mm以内及び組織の0.25 mm以内を含む。
【０１１３】
幹細胞が正常な及び疾患の状況における異なる組織の微小環境に対して選択的遊走を示すことができるとすると、動員された幹細胞において開始される分化経路に結合する組織特異的プロモーターの使用は本発明に包含され、理論的にこのプロモーターを使用して、生物学的に定義された内容においてのみ治療遺伝子の選択的発現を誘導することができる。他の組織ニッチに動員されたが、同じ分化プログラムを行わない幹細胞は、治療遺伝子を発現しないはずである。このアプローチは、定義された微小環境内において治療遺伝子の選択的発現の可能性をかなりの程度制御することが可能であり、血管新生中の治療遺伝子の発現の調節に適用することに成功している。このような遺伝子改変に対するアプローチの可能性については、国際公開第2008/150368号及び特許文献1に開示され、これらはその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１１４】
本明細書において使用される、「核酸」は、DNA、RNA及びそれらのハイブリッド又は改変変異体を含むが、それらに限定されない任意の核酸分子を意味するものとする。「外因性核酸」又は「外因性遺伝因子」は、細胞に導入される任意の核酸に関連するが、この核酸は細胞の「元々の」又は「天然の」ゲノムの一構成要素ではない。外因性核酸は組み込まれてもよく若しくは組み込まれることはなく、又は核酸を安定して形質導入することに関連する。
【０１１５】
任意の所与の遺伝子送達法は本発明に包含され、好ましくはウイルスベクター又は非ウイルスベクター及びトランスフェクションの生物学的若しくは化学的方法に関する。本方法は、使用される系における安定した又は一時的な遺伝子発現のいずれかを得ることができる。
【０１１６】
遺伝子改変型ウイルスは遺伝子の幹細胞への送達に広く適用されている。本明細書に記載されるMSCの遺伝子改変のために好ましいウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、特にガンマレトロウイルスベクターに関連する。ガンマレトロウイルス（時々、哺乳類レトロウイルスC型と呼ばれる）は、レンチウイルスクレードの姉妹属であり、レトロウイルス科のオルソレトロウイルス亜科の一員である。マウス白血病ウイルス（MLV又はMuLV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（XMRV）及びテナガザル白血病ウイルス（GALV）は、ガンマレトロウイルス属の一員である。当業者は、MSCの遺伝子改変におけるガンマレトロウイルスの利用に必要な技術を認識している。例えばMaetzigら（Gammaretroviral vectors: biology, technology and application, 2001, Viruses Jun;3(6):677-713）によって記載されたベクター又は同様のベクターを使用することができる。例えば、マウス白血病ウイルス（MLV）といった、単純ガンマレトロウイルスは、ガンマレトロウイルスで改変されたMSCが生成され、被験体へと送達した後に上記MSCから治療用導入遺伝子が発現されるという点で、遺伝子治療薬の効果的なビヒクルへと変えることができる。
【０１１７】
アデノウイルス又はRNAウイルス、例えばレンチウイルス又は他のレトロウイルスを適用することができる。アデノウイルスを使用して、遺伝子導入細胞工学のための一連のベクターを作製している。アデノウイルスベクターの初代を（ウイルス複製に必要とされる）El遺伝子を欠失させ、4 kbのクローニング能を有するベクターを作製することによって作製した。更にE3（宿主の免疫応答に関与）を欠失させて、8 kbのクローニング能を可能にした。更なる世代は、E2及び／又はE4の欠失を含むよう作製された。レンチウイルスは、レトロウイルス科のメンバーのウイルスである（M. Scherr et al., Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 2002 Feb; 2(1): 45-55）。レンチウイルスベクターを、LTR及びcisが作用するパッケージングシグナルを除き、ウイルス配列全体を欠失することによって作製する。得られたベクターは約8 kbのクローニング能を有する。レトロウイルスベクター由来のこれらのベクターの顕著な特徴の1つは、分裂する細胞及び分裂していない細胞並びに最終分化細胞を形質導入する能力である。
【０１１８】
従来のプラスミド移行及びインテグラーゼ又はトランスポザーゼ技術の使用による標的遺伝子組込みの適用を含む代替的方法といった非ウイルス法も使用することができる。これらの方法は、組込みにおいて効率的及び多くの場合部位特異的の両方の利点を有するベクター形質転換アプローチを示す。ベクターを細胞に導入する物理的な方法は当業者に知られている。一例として、静電容量を超えることにより膜に一時的な孔を作製する短時間の高電圧電気パルスの使用によるエレクトロポレーションに関する。この方法の利点の1つは、ほとんどの細胞型における安定し、かつ一過性の遺伝子発現に対して利用することができることである。代替法は、リポソーム又はタンパク質形質導入ドメインの使用に関する。適切な方法は当業者に知られており、本発明の実施の形態を限定することを意図しない。
【０１１９】
図面
以下の図は、本発明の範囲又は本明細書に記載の概念を制限することなく、本発明の実施を示すことにより本発明の特定の実施の形態を説明するために示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明の好ましい発現カセットを示す図である。
【図２】レトロウイルス上清のHT1080細胞に対する力価測定を示す図である。
【図３】ウイルス発現構築物が形質導入された初代ヒトMSCの細胞内フローサイトメトリー分析を示す図である。
【図４】トランスジェニックAAT発現のELISAによる評価を示す図である。
【図５】形質導入されたMSCから発現されたAATによる好中球エラスターゼの阻害を示す図である。
【図６】BLM誘発性肺線維症モデルの実験デザインを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
図面の詳細な説明
図1：本発明の好ましい発現カセット。
【０１２２】
本発明の好ましい発現カセットの略図。図面中に示した番号は、apceth社の内部的なプラスミド名称を表し、本明細書では簡素化のために使用されるものとする。プロモーターは、小文字のpによって示されている。LTRエレメントは、使用されるガンマレトロウイルスベクターの長鎖末端反復に関連する。内部リボソーム導入部位は、IRESと略記される。転写後調節エレメントは、oPREとして略記される。ピューロマイシン耐性遺伝子（pac）は、選択のために使用される。
【０１２３】
図2：レトロウイルス上清のHT1080細胞に対する力価測定。
【０１２４】
より大きい構築物（SERPINA1のcDNAが全長EF1aプロモーターによって駆動される161及び164）は、より小さい構築物、例えばEFSプロモーターを含む構築物（例えば159又は194）と比べて低下されているが十分な力価をもたらす。本実験においては、最も高い力価は、レンチウイルス構築物215を用いて得られる。
【０１２５】
図3：ウイルス発現構築物が形質導入された細胞の細胞内フローサイトメトリー分析。
【０１２６】
図3a：ウイルス発現構築物が形質導入された初代ヒトMSCの細胞内フローサイトメトリー分析（AAT陽性細胞の%ic）。図3aは、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスの異なる発現構築物で形質導入した後の細胞内AATについて陽性の染色されたMSCのパーセンテージを示している。図3b：ウイルス発現構築物が形質導入された初代ヒトMSCの細胞内フローサイトメトリー分析（平均蛍光強度（MFI））。図3bは、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスの異なる発現構築物で形質導入されたMSCの平均蛍光強度（MFI）値を示している。全ての試験されたベクター構築物は初代ヒトMSCに形質導入することができ、トランスジェニックAATは、全ての形質導入された試料において細胞内フローサイトメトリーによって検出される。AAT陽性細胞の%icによって測定される形質導入効率の差は、大抵は形質導入のために使用されるウイルス上清の異なる出発力価によるものである。MFIによって分析される異なる発現レベルは、利用される異なるプロモーター及び様々な遺伝子カセットの配置の結果である。
【０１２７】
図4：トランスジェニックAAT発現のELISAによる評価。
【０１２８】
初代ヒトMSCにおけるトランスジェニックAAT発現を、全ての試料においてELISAによって確認する。発現された量の差は、ベクター中で利用される異なるプロモーター及び様々な遺伝子カセットの配置によるものである。
【０１２９】
図5：形質導入されたMSCから発現されたAATによる好中球エラスターゼの阻害。
【０１３０】
形質導入された初代ヒトMSCから発現されたAATは、機能的であり、かつ好中球エラスターゼを、10 %の血清又は約1.5 μMのSPCKを含有する培地と同等の水準で阻害する。
【０１３１】
図6：BLM誘発性肺線維症モデルの実験デザイン（出典Tashiro et al., 2015）。
【実施例】
【０１３２】
本発明を、以下の実施例によって更に説明する。これらは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実験例は、遺伝子改変されたMSCからのα1-アンチトリプシン（AAT）発現を可能にする技術の発展に関連する。更に実施例は、肺の状態の治療を含む治験に関連する。
【０１３３】
好ましい実施形態においては、実施例は、炎症性肺疾患の治療のための、α1-アンチトリプシン（AAT）の抗炎症性効果と初代ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性とを兼ね備えた新規の遺伝子治療製品の前臨床的開発に関連する。
【０１３４】
1.  レトロウイルスベクター構築物の設計及びクローニング：
導入遺伝子発現カセットは、Julia Lodge, Peter Lund, Steve Minchin (2007) Gene Cloning, New York: Tylor and Francis Groupに記載される標準的クローニング技術を使用して構築する。これらの構築物によって発現される遺伝子は、ヒトSERPINA1のcDNAである（ホモサピエンスセルピンペプチダーゼインヒビター、クレードA（α1-アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー1（SERPINA1）、転写多様体1、mRNA;NCBI参照配列：NM_000295.4、α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする）。配列番号2による上記のコドン最適化されたcDNAも評価した。
【０１３５】
本明細書に記載されるSERPINA1遺伝子は、異なる構成的プロモーター、例えばヒトEEF1A1真核性翻訳伸長因子1α1プロモーター（pEF1a）、ヒトEEF1A1真核性翻訳伸長因子1α1プロモーターの短縮型（pEFS）又はヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（pPGK）の活性化によって発現される。それらのプロモーターは、Tie2プロモーター、RANTESプロモーター又はHSP70プロモーターのような誘導性プロモーターであってもよい。
【０１３６】
遺伝子は、後に行う発現の検出が容易となるよう、タグ配列（例えば、ヘマグルチニンタグ又はHISタグ等のマーカータンパク質／ペプチド）と融合させてもよく、又は融合させなくてもよい（Hinrik Garoff, 1985, Annual Review of Cell Biology, Vol. 1: 403-445）。
【０１３７】
発現カセットは、プロセスの後半において遺伝子改変型細胞を富化させるよう、選択可能なマーカー遺伝子、例えば細胞表面マーカー又は耐性遺伝子（例えばピューロマイシン耐性となるpac遺伝子）からなる第2の導入遺伝子カセットを含んでもよく又は含まなくてもよい（David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, 2009, Biotechnology: Applying the Genetic Revolution, London: Elsevier）。該遺伝子は、別個のプロモーターによって駆動されるか、又はSERPINA1発現カセット内のIRES配列の3'側に配置される。
【０１３８】
考えられる位置的効果を評価するために、SERPINA1及びpacカセットを、異なる配置でクローニングする（SERPINA1カセットをpacカセットの5'側及びその逆にクローニング）。図1を参照のこと。
【０１３９】
図1に開示される発現カセットを、次いで適切なベクター系、例えばガンマレトロウイルス骨格（例えばpSERS11、欧州特許出願公開第2019134号）又はレンチウイルス骨格（例えば、米国特許第8,846,385号、参照により本明細書にその全体が援用される）中に標準的なクローニング技術によって挿入する。
【０１４０】
ガンマレトロウイルス構築物において、発現カセット（複数の場合もある）の3'側にoPRE配列が存在する。レトロウイルス骨格は、カセットの5'末端及び3'末端に配置される長鎖末端反復（LTR）を含む。5'-LTRは、SV40エンハンサー、RSVプロモーター、SFFVp R及びU5領域を含む。3'-LTRは、欠失を含むためベクターに自己不活性化（SIN）を与えるSFFVp U3領域、SFFV R及びU5領域並びにポリAシグナルを含む。
【０１４１】
レンチウイルス構築物において、また発現カセット（複数の場合もある）の3'側にoPRE配列が存在する。レンチウイルス骨格は、カセットの5'末端及び3'末端に配置される長鎖末端反復（LTR）を含む。5'-LTRは、CMVプロモーター及びHIV-1 R及びU5領域を含む。3'-LTRは、欠失を含むためベクターに自己不活性化（SIN）を与えるHIV-1 U3領域、HIV-1 R及びU5領域並びにポリAシグナルを含む。
【０１４２】
2.  レトロウイルス上清の力価測定：
示されたベクターをコードするウイルス粒子は、293T細胞の一過性トランスフェクションによって生成される（Soneoka et al., Nucleic Acids Research, 1995）。ウイルス力価を測定するために、HT1080線維肉腫細胞を1日目に12ウェルプレート中に播種し、2日目に細胞に種々の希釈でウイルス上清を添加し、そして3つの対照ウェルを使用して1ウェル当たりの細胞数を測定する。形質導入の3日後に、形質導入効率を、AATタンパク質を検出する細胞内フローサイトメトリーアッセイによって分析する。タンパク質の検出を高めるために、細胞を、染色前にサイトゾルタンパク質の分泌を抑えるために16時間〜24時間にわたってGolgiPlugタンパク質輸送阻害剤（GolgiPlug Protein Transport Inhibitor）（BD、555029）で処理する。細胞を、BD社のCytofix/Cytoperm固定／透過処理溶液（Cytofix/Cytoperm Fixation and Permeabilization Solution）（BD、554722）を使用して製造業者の指示に従って透過処理し、そしてAAT発現細胞を、FITC結合型の抗α1アンチトリプシン抗体（abcam、ab19170;100 μLの染色反応当たりに1 μLの抗体で、1×106細胞まで、暗所で4℃において20分〜30分にわたってインキュベート）で染色する。細胞を、Beckman社のCoulter FC500フローサイトメーターで分析する。力価計算において、わずか25 %未満の値のAAT陽性細胞が含まれているにすぎない。結果については図2を参照のこと。
【０１４３】
3.  ヒト間葉系幹細胞（MSC）の調製：
ヒトMSCを、骨髄からプラスチック付着性によって単離し、増殖培地、例えばFBSを含有するDMEM中でPittinger, M.F. (2008) Mesenchymal stem cells from adult bone marrow, In D.J. Prockop, D.G. Phinney, B.A. Bunnell, Methods in Molecular Biology 449, Mesenchymal stem cells, Totowa: Humana Pressによって記載されるように培養する。
【０１４４】
4.  MSCの遺伝子改変：
初代MSCの形質導入を、Murray et al., 1999 Human Gene Therapy. 10(11): 1743-1752及びDavis et al., 2004 Biophysical Journal Volume 86 1234-1242によって記載される改変によって行う。詳細には、6ウェル又は12ウェルの細胞培養プレート（例えばCorning）を、ポリ-L-リジン（PLL）（例えば、Sigma-Aldrich、P4707-50 mL）でコーティングし、PLL溶液（0.01 %）を、最終濃度0.001 %までPBSで希釈する。1 mL〜2 mLの希釈されたPLLを各々のウェルのために使用する。そのプレートを、室温で少なくとも2時間にわたってインキュベートする。インキュベートした後に、プレートをPBSで1回洗浄する。（希釈された）ウイルス上清を、各々のPLLコーティングされたウェルへと最終容量0.8 mL〜2 mLで添加する。仕込まれたプレートを、2000×gで4℃で30分間にわたって遠心分離する。次いで上清を捨て、1×105のMSCを、6ウェルプレートの1つのウェル中に2 mLの容量で播種するか、又は4×104個の細胞を、12ウェルプレートの1つのウェル中に1 mLの容量で播種する。それらのプレートを、更なる使用のために5 %のCO2と一緒に37℃でインキュベートする。
【０１４５】
5.  トランスジェニックAAT発現の細胞内フローサイトメトリーによる評価：
初代ヒトMSCにおける形質導入効率及びAAT発現を評価するために、細胞を調製し、上記のように感染多重度（MOI）0.25〜10で形質導入する。形質導入された細胞を、ピューロマイシン（Sigma Aldrich、P9620-10 mL、［10 mg/mL］、最終濃度：1 μg/mL〜5 μg/mL）を用いて5日〜8日にわたって選抜する。選抜された細胞を、細胞内フローサイトメトリーによって上記のように分析する。
【０１４６】
全ての試験されたベクター構築物は、初代ヒトMSCに形質導入することができ、トランスジェニックAATは、全ての形質導入された試料において細胞内フローサイトメトリーによって検出される。AAT陽性細胞の%icによって測定される形質導入効率の差は、大抵は形質導入のために使用されるウイルス上清の異なる出発力価によるものであり、更なる単離及び培養に際して提供される全ての細胞集団も適切なAAT発現を提供することができる。MFIによって分析される異なる発現レベルは、利用される異なるプロモーター及び様々な遺伝子カセットの配置の結果である。
結果については図3を参照のこと。
【０１４７】
6.  トランスジェニックAAT発現のELISAによる評価：
ヒトMSCを、AAT及びpac遺伝子を発現する示されたレトロウイルス構築物で形質導入する。それらの細胞を、上記のようにピューロマイシンで選抜し、1×105の細胞を6ウェルプレート又は12ウェルプレートに播種する。上清（1 mL〜2 mL）を48時間後に回収し、そしてELISA（alpha 1 Antitrypsin (SERPINA1) Human ELISAキット、abcam、ab108799）によって製造業者の指示に従って分析する。生成したデータを、1×105細胞及びベクターコピー数（VCN）に正規化する。
【０１４８】
初代ヒトMSCにおけるトランスジェニックAAT発現を、全ての試料においてELISAによって確認する。発現された量の差は、ベクター中で利用される異なるプロモーター及び様々な遺伝子カセットの配置によるものであり、提供される実施例のそれぞれが、所望の効果を得るのに十分なタンパク質レベルでのAAT発現を可能にする。
結果については図4を参照のこと。
【０１４９】
7.  形質導入されたMSCから発現されたAATによる好中球エラスターゼの阻害
ヒトMSCを、AAT及びpac遺伝子を発現する示されたレトロウイルス構築物で形質導入する。それらの細胞を、ピューロマイシンで選抜し、選抜された細胞を6ウェルプレート又は12ウェルプレートに血清を含まないDMEM中で播種する。上清（1 mL〜2 mL）を48時間後に回収し、そしてNeutrophil Elastase Inhibitor Screeningキット（abcam、ab118971）によって製造業者の指示に従って分析する。形質導入されたMSCの上清を、非希釈（1:1）から1:16までに及ぶ血清を含まないDMEM中での種々の希釈で分析する。種々の濃度及び血清を含む媒体（Bio-M及びBio-1）中のSPCKは、陽性対照として含まれ、DMEMは陰性対照として使用される。
【０１５０】
好中球エラスターゼの阻害は、in vitroでAAT活性を検出するための機能的なアッセイである。本明細書で提供される構築物は、好中球エラスターゼの効果的な阻害を示し、それにより実施例の改変されたMSCからの機能的なAATの発現を示している。
結果については図5を参照のこと。
【０１５１】
8.  MSCから発現されたAATの単球に対する免疫調節効果の評価：
末梢血単核細胞（PBMC）を、ヒト血液からficoll密度勾配遠心法を使用してIvan J. Fuss, Marjorie E. Kanof, Phillip D. Smith, Heddy Zola, 2009 Curr. Protoc. Immunol. 85: 7.1.1-7.1.8によって記載されるように単離する。in vitroでのAAT-MSCの免疫調節効果を評価するために、LPS誘導性ヒト単球活性化のアッセイを、Janciauskiene et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004に記載されるように実施する。簡潔には、単球をリポ多糖（LPS）で刺激し、MSCから発現されるAATの、炎症促進性サイトカイン、例えばTNFα及びIL-1βの分泌に対する効果並びに抗炎症性サイトカイン、例えばヒト単球由来のIL-10の発現に対する効果を、上清中でELISAによって評価する。
【０１５２】
ヒト初代単球が遺伝子改変されたMSCから分泌されたAAT（AATを発現するように形質導入されたMSCからの上清）の存在下で培養されるときに、単球培養から採集された上清中での炎症促進性サイトカイン（TNFα、IL-1β）の発現は著しく低下するが、IL-10のような抗炎症性サイトカインのレベルは増大する。
【０１５３】
9.  動物モデルにおけるAAT-MSC投与の免疫調節効果の評価：
in vivo実験で使用される細胞を調製し、上記のように遺伝子改変させる。形質導入された細胞を選抜し、凍結保存又は投与のための採集のいずれかの前に更に増殖させる。細胞を融解させ、PBS若しくは任意のその他の適切なバッファーで洗浄し、その中に再懸濁させてから注射するか、又は培養フラスコから剥離し、PBS若しくは任意のその他の適切なバッファーで洗浄し、その中に再懸濁してから注射するかのいずれかを行う。
【０１５４】
10.  ブレオマイシン（BLM）誘発性肺線維症：
in vivoでのAAT-MSCの免疫調節効果及び抗線維化効果を試験するために、ブレオマイシン誘発性肺線維症のマウスモデルにTashiro et al., Translational Science 2015に記載されるように実施される。
【０１５５】
簡潔には、BLM肺線維症を、C57BL/6マウスにおいて誘発する。麻酔投与後に、50 μLの滅菌生理食塩水中に溶解させたBLM硫酸塩（Sigma-Aldrich）を体重1 kg当たりに2.5 Uで挿管法を通じて直接気管内点滴によって投与する。BLM投与の24時間〜72時間の後に、それぞれの動物に、200 μLのPBS（対照）、200 μLのPBS中の1×106の形質導入されていないMSC又は200 μLのPBS中の1×106のAATで形質導入されたMSCのいずれかを、尾静脈注射又は気管内投与によって与える。血清AATレベルを、2日毎に後眼窩採血に引き続き、ELISAによってAATタンパク質を検出することによってモニタリングする。
【０１５６】
マウスを、BLM投与の14日〜21日の後に屠殺する。
【０１５７】
左肺葉を、タンパク質分析及びメッセンジャーRNA（mRNR）分析のためにマウスから採集する。形態計測及び組織学的研究のために、右肺葉を、10 %の中性緩衝ホルマリン中に浸漬することによって24時間にわたって固定化し、次いで4℃のPBSに移す。試料をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン-エオシン染色及びマッソントリクローム染色のために切片を得る。肺線維症は、マッソントリクローム染色されたスライドガラスにおける半定量的Ashcroft法を使用して評価する（Ashcroft et al., Journal of Clinical Pathology 1988）。
【０１５８】
実験デザインの概要については図6を参照のこと。
【０１５９】
21日目の屠殺の時点で、MSCで処置されていないBLMマウスは、Ashcroftスコアによる肺線維症を示しているが、MSC又はAAT-MSCのいずれかで処置されたマウスは、線維症の低下を示している。その低下は、AATを発現するMSCを与えた群ではより顕著であった。
【０１６０】
11.  シクロホスファミドで加速された1型糖尿病：
in vivoでのAAT-MSCの糖尿病の発生に対する効果を評価するために、シクロホスファミドで加速された1型糖尿病のマウスモデルに実施される（出典Brode et al., The Journal of Immunology 2006）。
【０１６１】
雌のマウスにおける糖尿病発生率が40週齢までに75 %であるNODマウスが得られる。糖尿病を加速させ一致させるために、雌の8週齢のNODマウスを、シクロホスファミド（CY）（0.9 %生理食塩水中で体重1 kg当たり200 mg）の単独の腹腔内（i.p.）注射で処置する。次いでマウスを無作為に処置群及び対照群に分ける。シクロホスファミド処置の1日〜5日の後に、それぞれの動物に、200 μLのPBS（対照）、200 μLのPBS中の1×106の形質導入されていないMSC又は200 μLのPBS中の1×106のAATで形質導入されたMSCのいずれかを、尾静脈注射又は腹腔内注射によって与える。マウスを、2日連続の（24時間より長く離す）非空腹時血糖値が240 mg/dlを超えることによって定義される糖尿病になるまで高血糖について毎週モニタリングする。
【０１６２】
CY及びPBSを与えた全ての対照マウスは、30日以内に糖尿病を発生するが、MSC又はAAT-MSCのいずれかで処置されたマウスでの糖尿病の徴候は遅延された。興味深いことに、AAT-MSCで処置されたマウスにおいては、糖尿病の発生の遅延が、改変されていないMSCと比べて2週間だけ増えた。
【０１６３】
12.  MSU/C16.0誘発痛風性関節炎：
in vivoでのAAT-MSCの痛風性関節炎に対する抗炎症性効果を評価するために、MSU/C16.0誘発痛風性関節炎のマウスモデルに実施される（出典Joosten et al., Annals of the Rheumatic Diseases 2015）。
【０１６４】
雄C57Bl/6マウスを、Jackson Laboratories（米国、メイン州、バーハーバー）から取得し、10週目〜12週目で使用する。痛風性関節炎の誘発1日〜3日前に、それぞれの動物に、200 μLのPBS（対照）、200 μLのPBS中の1×106の形質導入されていないMSC又は200 μLのPBS中の1×106のAATで形質導入されたMSCのいずれかを、腹腔内投与によって与える。関節炎は、10 μLのPBS中での300 μgのMSU結晶と200 μMのC16.0／ウシ血清アルブミン（BSA）との混合物をナイーブマウスの右膝関節中に関節内注射することによって誘発する。関節内注射の4時間後に、巨視的な関節腫脹が認められる。滑液組織を単離し、37℃で組織培養培地中で2時間にわたって培養するか、又は200 μLのTriton×100（PBS中0.5 %）中に直接移すかのいずれかを行う。さらに、膝関節を組織学検査のために取り出す。
【０１６５】
改変されていないMSC又はAAT-MSCのいずれかでの処置は、MSCU/C16.0誘発関節炎を抑制したが、マウスをAAT-MSCで処置した場合の方がより顕著に炎症が減少した。
【０１６６】
13.  MHC適合、マイナー抗原不適合マウス移植モデルにおけるAAT-MSCのGvHD抑止に対する効果：
AAT-MSCの考えられる抗GvHD効果の評価のために、マウス移植モデル（MHC適合、マイナー抗原不適合）に実施される（出典Marcondes et al., Blood 2011）。
【０１６７】
平均体重28 gを有する10週齢〜14週齢のC57/BL6Jマウス（H-2b; The Jackson Laboratory）に、1000 cGyでの単回全身照射を受けさせた後に、C3H.SW-H2b/SnJドナー（H-2bc; The Jackson Laboratory）由来のT細胞欠乏骨髄（5×106細胞）及びCD8+脾臓リンパ球（0.2×106細胞）の尾静脈内注射を行う。マウスを無作為に処置群及び対照群に分ける。実験群のマウスに、200 μLのPBS中の1×106の形質導入されていないMSC又は200 μLのPBS中の1×106のAATで形質導入されたMSCのいずれかを、照射及びドナー細胞注入の前に腹腔内注射又は尾静脈内注射によって与える。対照群のマウスに、また腹腔内又は静脈内で、200 μLのPBSを注射する。GvHDを、標準的な評点システム（Cooke et al., Blood 1996）によって評価する：0日目及びその後に毎週体重を取得し、記録する。週間臨床指標は、5つの基準スコア：体重の変化のパーセンテージ、姿勢（背を丸める）、活動度、毛の質感及び皮膚の完全性（最高スコア＝10）の合計によって生成される。血液試料を、サイトカインアッセイのために連続的に回収する。
【０１６８】
改変されていないMSC又はAAT-MSCのいずれかでの処置により、対照マウスと比べて、GvHDの減弱又は抑止がもたらされ、より多くが生存する。興味深いことに、有益な効果は、AAT-MSCでは、元のMSCと比べてより際立っていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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