(57)【要約】  本発明は、ヒドロゲルの製造方法であって、下記のステップを連続して含む、  少なくとも一つのアニオン性ポリマー（Ａ）の粉末と、アミン官能基（−ＮＨ２）を含む少なくとも一つのキトサン（Ｂ）の粉末とを提供する第１ステップ（ｉ）と、  粉末混合物を形成するために、少なくとも前記第１ステップから得られる前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を乾式混合することからなる第２ステップ（ｉｉ）と、  前記第２ステップから得られる前記粉末混合物を、前記キトサン（Ｂ）を溶解することなく前記アニオン性ポリマー（Ａ）を溶解させることを可能にすることができるｐＨを有する水性媒体中に懸濁させる第３ステップ（ｉｉｉ）と、  前記ヒドロゲルを形成するために、前記第３ステップから得られる前記懸濁液に酸を添加する第４ステップ（ｉｖ）、または、  前記第３ステップ（ｉｉｉ）および第４ステップ（ｉｖ）は、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも１つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む酸性化水性媒体を、前記第２ステップ（ｉｉ）から得られる前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を少なくとも含む前記混合物と混合することを含む第５の混合ステップ（ｖ）で置換される、ことを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲルの製造方法であって、
下記のステップを連続して含む、
少なくとも一つのアニオン性ポリマー（Ａ）の粉末と、アミン官能基（−ＮＨ２）を含む少なくとも一つのキトサン（Ｂ）の粉末とを提供する第１ステップ（ｉ）と、
粉末混合物を形成するために、少なくとも前記第１ステップから得られる前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を乾式混合することからなる第２ステップ（ｉｉ）と、
前記第２ステップから得られる前記粉末混合物を、前記キトサン（Ｂ）を溶解することなく前記アニオン性ポリマー（Ａ）を溶解させることを可能にすることができるｐＨを有する水性媒体中に懸濁させる第３ステップ（ｉｉｉ）と、
前記ヒドロゲルを形成するために、前記第３ステップから得られる懸濁液に酸を添加する第４ステップ（ｉｖ）、または、
前記第３ステップ（ｉｉｉ）および第４ステップ（ｉｖ）は、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも１つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む酸性化水性媒体を、前記第２ステップ（ｉｉ）から得られる前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を少なくとも含む前記混合物と混合することを含む第５の混合ステップ（ｖ）で置換される、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１ステップにおける前記（Ａ）粉末および／もしくは前記（Ｂ）粉末ならびに／または少なくとも前記第２ステップにおける（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む前記粉末混合物を、５００μｍ以下、特に１５０μｍ以下のメッシュを有する篩で篩別することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２ステップの前記混合を、少なくとも前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末の乾式同時粉砕によって実施することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性ポリマーが、硫酸官能基（−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨもしくは−ＳＯ４Ｈ）および／または前記硫酸官能基の塩、ならびに／あるい、はスルホン酸官能基（−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨもしくは−ＳＯ３Ｈ）および／または前記スルホン酸官能基の塩、ならびに／あるいは、リン酸官能基（−Ｏ−Ρ（＝Ｏ）２−ＯＨもしくは−ＰＯ４Ｈ）および／または前記リン酸官能基の塩、ならびに／あるいは、カルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）および／または前記カルボン酸官能基の塩を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アニオン性ポリマー（Ａ）が、少なくとも一つのシクロデキストリンおよび／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン包接複合体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体の包接複合体を含む混合物と、
少なくとも一つの（ポリ）カルボン酸および／またはその対応する（ポリ）カルボン酸無水物（Ａ１）、あるいは、
少なくとも一つのピロリン酸塩（Ａ２）、あるいは、
少なくともエピクロロヒドリン、との重合反応によって得られるシクロデキストリンポリマーであって、得られたポリマーが、カルボン酸官能基（Ａ３）をグラフトするなどの方法でカルボキシアルキル化ステップを受けることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）またはステップ（ｖ）における前記水性媒体が、前記水性媒体の総体積に対して、少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも４重量％の、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも一つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
粉末形態の少なくとも一つの無機充填剤を、前記第２ステップで製造される前記粉末混合物に添加することを含み、無機充填材の重量（ｇ）の前記粉末混合物の総重量に対する比が好ましくは３０％以上であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記無機充填剤が、バイオセラミック、特にリン酸カルシウム、例えば、ヒドロキシアパタイト、ベータ三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、ガラス、ガラスイオノマー、二酸化チタン、および、それらの混合物を含むリストから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒドロゲルを得るために請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒドロゲルを製造する方法を含み、そして、細胞性物質を形成するために前記第４ステップ（ｉｖ）または前記第５ステップ（ｖ）から得られる前記ヒドロゲル上で実施する凍結乾燥のためのステップをさらに含むことを特徴とする、細胞性物質の製造方法。
【請求項１０】
細孔形成剤を粉末形態で、前記ヒドロゲルの製造方法の前記第２ステップ（ｉｉ）の間に前記粉末混合物に添加することを特徴とする請求項９に記載の細胞性物質の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞性物質を１００℃以上の温度で少なくとも５分間処理する熱処理ステップを含むことを特徴とする請求項９または１０のいずれかに記載の細胞性物質の製造方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの機能的薬剤および／または少なくとも一つの生細胞を含む溶液中に細胞性物質を含浸させるステップを含むことを特徴とし、ここで、前記機能的薬剤が、抗凝固剤、抗血栓剤、抗有糸分裂薬、抗増殖剤、抗接着剤、抗遊走薬、細胞接着促進剤、増殖因子、抗寄生虫分子、抗炎症剤、ビタミン、ホルモン、タンパク質、抗真菌剤、抗菌分子、防腐剤、抗生物質、特にシプロフロキサシン、ニコチン、一つ以上の精油、ならびに、それらの混合物を含む第１リスト（Ｉ）から選択され、前記少なくとも一つの生細胞が、ヒト細胞、動物および植物細胞を含む第２リスト（ＩＩ）から選択されることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞性物質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって得られる前記ヒドロゲル、または、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法を実施することによって得られる細胞性物質を含む、機能的薬剤の吸収および排出および／または遊離のため、および／または、生細胞を支持するための機器であって、前記機器は、所定の体積のヒドロゲルを受容するための少なくとも一つのリザーバ、少なくとも一つの機能的薬剤の送達、および／または、創傷の排出が可能なドレッシング材、ニコチンなどの少なくとも一つの機能的薬剤を送達できるパッチから選択される機器である、機器。
【請求項１４】
ヒドロゲルを製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実施するための機器であって、ステップ（ｉｉ）から得られる前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）を少なくとも含む前記混合物を受容する第１シリンジと、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも一つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む酸性化水性媒体の所定の体積を受容する第２シリンジとを備え、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも一つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む前記酸性化水性媒体が、前記（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を少なくとも含む前記混合物と組み合わされることを可能にするような方法で、前記第１および第２シリンジを流体連通にするための手段を備える、機器。
【請求項１５】
少なくとも一つのシクロデキストリンおよび／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン包接複合体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体の包接複合体を含む混合物を、
少なくとも一つの（ポリ）カルボン酸および／またはその対応する（ポリ）カルボン酸無水物（Ａ１）、または、
少なくとも一つのピロリン酸塩（Ａ２）、または、
少なくともエピクロロヒドリンと重合反応させることによって得られるシクロデキストリンポリマー（Ａ）であって、得られる前記ポリマーは、カルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）（Ａ３）をグラフトするためのカルボキシアルキル化ステップを受ける、シクロデキストリンポリマー（Ａ）と、
アミン官能基（ＮＨ２）を含むキトサンポリマー（Ｂ）、とを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法を実施することによって得ることができるヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲル、特に移植可能なヒドロゲルの製造方法の技術分野、ならびに前記ヒドロゲルを介して得られる細胞性物質の製造方法の技術分野、特に物理的ヒドロゲルの製造方法の技術分野に関する。
【０００２】
本発明はまた、ヒドロゲル、前記ヒドロゲルから得られる細胞性物質（特にスポンジ）、およびそのようなヒドロゲルまたは細胞性物質を含む医療機器の技術分野にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒドロゲル、すなわち、通常、水を主に含む高分子ゲルは、大量の水によって膨張したポリマーのマトリックスである。前記高分子は相互結合して、前記ゲルに粘弾性を有する材料の特性を提供するスカフォールドを構成するネットワークを形成する。
【０００４】
ポリマー鎖間の結合は二つの形態、すなわち、永久的形態または可逆的形態を有し得る。結合が永久的である場合、共有結合が存在するのが観察され、これらは化学的ヒドロゲルとして知られている。前記鎖間の前記結合が可逆的である場合、前記高分子は水素性、イオン性もしくは疎水性、または、双極子−双極子型の非共有結合を介して相互作用し、これらは物理的ヒドロゲルとして知られている。
【０００５】
ヒドロゲルは生体材料として、すなわち、医療機器として、特に埋め込み型機器として使用することができる。そのようなヒドロゲルは、天然の多糖類（例えば、デンプン、セルロース、カラギーナン、アルギネートなど）、タンパク質（ゼラチン）に基づくか、または合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリアクリレート（「カーボマー」）に基づくポリマーネットワークを含んでもよく、共有結合によって（不可逆的もしくは永久的化学的ゲル）または水素結合、疎水結合、双極子結合（双極子−双極子）、あるいは静電結合（可逆的物理的ゲル）によって安定化された、絡み合った三次元高分子ネットワークを形成する。
【０００６】
天然に入手可能な多糖類のファミリーに属するキトサン（ＣＨＴ）は、現在までに知られている唯一の天然起源のカチオン性ポリマー（正に帯電した高分子電解質、ＰＥ＋として表される）である。それは、キチンの脱アセチル化によって産生されるか、または、真菌から直接抽出される。キトサンは、ランダムに分布したβ−１，４連結Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成されるコポリマーである。キトサンは、その高分子鎖上のグルコサミン繰り返しユニットのパーセンテージを表す脱アセチル化度によって特徴づけられる。
【０００７】
キチンは、節足動物（甲殻類）の外骨格または頭足動物の内骨格の構成要素である。キトサンは、その高いアミン官能基含有量（脱アセチル化度（通常、６０％から９０％の範囲内）に応じて、１グラムあたり５ミリモル（ｍｍｏｌ）程度）によって特徴づけられる。ＣＨＴは、その生体適合特性、生体吸収性（bioresorbability）、血液適合性、治癒力特性、および、細菌株の発生に対するその作用のために、生物医学的用途で大いに用いられている。
【０００８】
キトサンは、粉末形態または様々な粒子サイズを有するフレークとして利用可能なポリマーである。キトサンは、粉末形態である唯一の天然のアミンポリマーであり、純水中には溶けないが、少なくとも１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃酢酸によって水が酸性化されると直ちに可溶性になる。第１アミン官能基（−ＮＨ２）を含む他のポリアミン、例えばポリビニルアミン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンが存在するが、それらは濃縮された水溶液または（非常に吸湿性であるため）ガムの形態の固体の状態でのみ利用可能であり、流動性を有するかまたは自由流動を示す粉末を構成しない。
【０００９】
ヒドロゲルを得るためのイオン経路によるＣＨＴの架橋は、加熱や触媒なしで自発的に起こるので、実施するのが容易な穏やかな方法である。したがって、アニオン性架橋剤を硫酸塩、クエン酸塩、リン酸塩もしくはポリリン酸塩、ポリオキシアニオン、またはカルシウム塩とともに使用する。前記方法は、水と同時に前記ＣＨＴ「物品」中に拡散する前記架橋剤を含有する水溶液中に前記ＣＨＴ「物品」（フィルム、モノリスなど）を浸漬することからなり、これによって膨潤してゲルを形成する。別の方法は、希酢酸溶液（例えば少なくとも０．５％の酢酸を含むことが多い）中に溶解させておいたキトサンの酢酸水溶液に前記架橋剤を添加すること、または反対に、前記ＣＨＴ溶液を、例えばシリンジを用いて前記架橋剤溶液中に滴下することを含む（J．Berger他、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 (2004) 19-34（非特許文献１））。
【００１０】
同様に前記多糖ファミリーに属するシクロデキストリンは、多くの活性成分、特に親油性成分と可逆的包接複合体を形成できるかご状分子である。シクロデキストリンはデンプンの酵素分解から誘導される環状多糖類である。シクロデキストリンは、ヒドロキシ官能基を多く含む周辺部を有する大員環を形成する６から８個のα−（１，４）結合グルコピラノースユニットの連鎖によって構成され、このためにそれらは水中に可溶性になり、その一方で、内部は無極性で疎水性の空洞を形成し、包接複合体を形成することによって親油性活性成分と錯化形成する特性（complexing properties）有するシクロデキストリンに提供する。シクロデキストリンを、架橋剤として使用したエピクロロヒドリン、ジエポキシド、ジイソシアン酸、ピロメリト酸二無水物、トリメタリン酸ナトリウム、または、ＥＤＴＡで架橋することによって得られるシクロデキストリンに基づく化学的ゲル（不可逆的）が知られている。これらの架橋または「超分岐」したシクロデキストリンポリマーは、治療薬を含む、不溶性巨視的ゲルまたは有機分子の捕捉およびベクター化（vectoring）特性を有する可溶性ナノゲルのいずれかを形成する（Progress in Polymer Science, Volume 38, Issue 2, February 2013, Pages 344-368（非特許文献２）、Advanced Drug Delivery Review 65 （2013） 1188-1203（非特許文献３）、Belstein Journal of Organic Chemistry, 2014, 10, 2586-2593（非特許文献４））。
【００１１】
シクロデキストリンとキトサンとを結合させる以前の研究が公開されている。しかしながら、それらの研究は、シクロデキストリンポリマーとキトサンとの混合物から巨視的物理的ゲルを得ることからなるものではなかった。一例として、Auzely（C. R. Chimie 14（2011）167-177（非特許文献５））は、まず、シクロデキストリン（ＣＤ）をキトサン（＝ＣＨＴ−ＣＤ）上に共有結合によりグラフトし、次にアダマンタン（ａｄａ）をキトサン上にグラフトした（＝ＣＨＴ−ａｄａ）。一旦混合して溶液にすると、シクロデキストリンとアダマンタンとの間の包接複合体の自発的形成によって起こる、それら二種のポリマーによって形成されるネットワークを形成することにより、それら二つのポリマーは超分子巨視的ゲルを形成し、ＣＨＴ−ａｄａおよびＣＨＴ−ＣＤの相互貫入ネットワーク間の超分子型相互作用によって安定化されたヒドロゲルを形成する。加えて、ＣＤ／ａｄａの化学量論（またはモル比）が１未満である場合、前記ＣＤ−ａｄａ複合体の非常に高い安定性は、治療薬などの第３分子をシクロデキストリンの空洞中の包接混合物（inclusion mixture）中に侵入させないが、これは前記空洞がすべてアダマンタン基と不可逆的に複合体形成するためである。
【００１２】
医療機器として市販されているほとんどのゲルはすぐに使える状態である、すなわち、すでに水和され、それらは無機充填剤、例えばリン酸カルシウムまたはベータリン酸三カルシウム、または活性な治療用分子を含む。ヒドロキシアパタイトを含むＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）に基づく注入可能なゲルであるIn‘oss（商標）は骨移植に関して記載され、または、各々歯周病学での応用のための活性成分を含む、ゼラチンおよびＰＬＡポリマー（ポリ乳酸）に基づくPeriochip（登録商標）もしくはAtridox（登録商標）も挙げることができる。ヒアルロン酸もしくはコラーゲンに基づくしわ充填用のゲルも存在し、またＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）に基づく織物パネル（textile panel）上のゲルコーティングであって、場合によって活性成分を充填してもよく、創傷の水和を維持するため、もしくは活性成分を遊離させるために作用するドレッシング材を製造するために使用されるものもある。Ｂｉｏｍ’Ｕｐは、ベータリン酸三カルシウム粉末充填剤を含むコラーゲンに基づくスポンジの形態の骨充填材料（Matribone（登録商標））を販売している。
【００１３】
陰性高分子電解質と陽性高分子電解質との間の相互作用から生じるイオン複合体によって形成される物理的ヒドロゲルも存在する。“International Journal of Biological Macromolecules”、表題“Recent development of chitosan-based polyelectrolyte complexes with natural polysaccharides for drug delivery” 、著者はYangchao LuoおよびQin Wang, 64 (2014) 353-367（非特許文献６）による開示は、そのようなイオン複合体を形成するために過去１０年にわたってキトサンを用いて実施された様々な研究を列挙している。キトサンと混合されたポリアニオンは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ペクチン、カラギーナン、キサンタンガム、ジェランガム、カシューガム、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、グルコマンナン、およびコンダゴグ（kondagogu）ガムである。
【００１４】
そのような高分子電解質複合体から形成されたヒドロゲルはまた、双極子−双極子結合、ファンデアワールスおよび水素結合などのより低エネルギーでの物理的相互作用によりそれらのヒドロゲル形態を獲得する。化学的架橋によって得られるヒドロゲルと比較して、イオン複合体によって形成されたヒドロゲルは、有毒でなく、生存生物に耐容性良好であり、そして生体適合性であるという利点を有する。具体的には、化学的架橋剤は、それらが有する反応性官能基に由来するある特定量の毒性を誘導する可能性がある。したがって、前記ゲル中の架橋剤を完全に除去するために、水または溶媒で洗浄することによって医療全般用の移植可能なゲルを精製するためのステップが、化学的に架橋したヒドロゲルには必要である。しかしながら、そのようなステップはそれらのヒドロゲルの前記構造を分解させる可能性がある。さらに、そのような化学的に架橋したヒドロゲルが活性成分を含む場合、形成された前記ヒドロゲルを精製するステップは、前記微量の架橋剤を抽出する働きをする前記媒体中への拡散により活性成分の損失を引き起こす可能性がある。
【００１５】
物理的ゲル（可逆的）は、温度を上昇させることによって、イオン強度を増加させることによって、または溶媒の極性もしくｐＨを変えることによって破壊される可能性があり、その一方で、化学的ゲルは共有結合によって明確に安定化される。
【００１６】
表題“Chitosan/cyclodextrin nanoparticles as macromolecular drug delivery system",のA.H. KraulandおよびM.J. Alonsoによる, International Journal of Pharmaceutics 340 (2007) 134-142（非特許文献７）の刊行物は、封入された分子をゆっくりと遊離できるキトサンおよびカルボキシメチル化β−シクロデキストリンモノマーに基づくナノゲルとして提示されるナノ粒子の合成を記載している。したがって、巨視的状態のゲルよりもむしろナノゲルが得られた。ナノゲルは、２０ナノメートル（ｎｍ）から数百ｎｍまでの範囲内にあることが多いサイズを有する、強力に水和された球状形態の「物品」として定義することができる。
【００１７】
刊行物"Chemically cross-linked and grafted cyclodextrin hydrogels: from nanostructures to drug-eluting medical devices"、A. Concheiro, C. Alvarez-Lorenzoによる、Advanced Drug Reviews 65 (2013) 1188-1203（非特許文献８）は、シクロデキストリンを有するモノマーの重合によって得られるか、またはジエポキシド、ジイソシアネート、ピロメリト酸二無水物、トリメタリン酸ナトリウム、もしくはＥＤＴＡなどの架橋剤によって架橋された（多くの場合、ポリ（アクリル）タイプの）あらかじめ形成された高分子上に化学的にグラフトされたシクロデキストリンに基づくヒドロゲルの製造を記載している。
【００１８】
刊行物“Chitosan derivatives bearing cyclodextrin cavities as novel adsorbent matrices”、M. PrabaharanおよびJ.F. ManoによるCarbohydrate Polymers 63 (2006) 153-156（非特許文献９）において、その上にシクロデキストリンがアミド結合を介してグラフトされたキトサンの高分子の合成を記載している。
【００１９】
前記物理的ヒドロゲル中に組み入れられた前記活性剤は高分子量の分子（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡなど）であり、高分子電解質複合体の前記高分子ネットワークを通してゆっくりと拡散するので、制御された様式で送達される。これらの活性剤の前記送達はまた、前記ヒドロゲルの前記マトリックスの浸食速度または生体再吸収（bio-resorption）速度にも直接関連する。
【００２０】
対照的に、低分子量の分子は、前記ゲルの前記ポリマーネットワークを通して迅速に拡散する。実際、前記生活性分子が、前記ゲル構造を形成する一つまたは複数の前記ポリマーとの特定の相互作用を示さない場合、それらの低い立体障害は、これらの非常にオープンな高分子ネットワークの格子を通してそれらが自由に拡散できることを意味し（ヒドロゲルは主に水から構成される）、したがって、これらの小分子の前記遊離速度論は前記拡散速度によっても前記ヒドロゲルの浸食速度によっても抑制されず、非常に迅速である。
【００２１】
公知の物理的ヒドロゲルおよびそれらの対応する細胞性物質は、水中に浸漬されている場合、特に前記水が塩を含んでいる場合は、短期間で崩壊（２、３時間後）するか、またはより適切に言えば自発的に崩壊し、このことは、すべての生理液に当てはまる。この最後の特徴は、体内に移植されることを意図するヒドロゲルに関して、それらが充填機能および／または強化機能を果たすことを確実にするためだけでなく、一つ以上の活性成分の制御された、かつ、標的化された遊離を可能にするためにそれらが所定の期間、自身の構造を保持するために重要である。
【００２２】
最後に、現在のところ、移植部位（例えば、骨欠損）上に無機充填剤を隔離または含有できるヒドロゲルはなく、これは、前記ヒドロゲル構造の分解が速すぎ、そのため、前記無機充填剤が前記ヒドロゲルの前記マトリックスから短期間に遊離されるためである。前記無機充填剤は、骨の主な無機成分と類似した構成を有する様々な形態（粉末、モノライト（monolyte）、顆粒など）のリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウムを含む、骨移植に用いられる材料から選択される。具体的には、十分な量の無機充填剤をヒドロゲル中に組み入れ、移植部位上に十分長い期間維持することが、歯科手術、顎顔面手術または整形外科の分野における多くの用途で必要である。しかしながら、大量の無機充填剤を架橋したヒドロゲル中に組み入れることは、ヒドロゲルを物理的に不安定化させ、その崩壊を促進する。
【００２３】
米国特許出願第2010/0221303A1号（特許文献１）および国際公開第2012/028620号（特許文献２）も公知であり、それらは多糖ポリマー由来の細胞性物質の形成に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２２１３０３号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２８６２０号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】J．Berger他、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 (2004) 19-34
【非特許文献２】Progress in Polymer Science, Volume 38, Issue 2, February 2013, Pages 344-368
【非特許文献３】Advanced Drug Delivery Review 65 （2013） 1188-1203
【非特許文献４】Belstein Journal of Organic Chemistry, 2014, 10, 2586-2593
【非特許文献５】C. R. Chimie 14（2011）167-177
【非特許文献６】Yangchao LuoおよびQin Wang、International Journal of Biological Macromolecules、“Recent development of chitosan-based polyelectrolyte complexes with natural polysaccharides for drug delivery” 64 (2014) 353-367
【非特許文献７】A.H. KraulandおよびM.J. Alonso、“Chitosan/cyclodextrin nanoparticles as macromolecular drug delivery system”、International Journal of Pharmaceutics 340 (2007) 134-142
【非特許文献８】A. Concheiro, C. Alvarez-Lorenzo、“Chemically cross-linked and grafted cyclodextrin hydrogels: from nanostructures to drug-eluting medical devices”、Advanced Drug Reviews 65 (2013) 1188-1203
【非特許文献９】M. PrabaharanおよびJ.F. Mano、“Chitosan derivatives bearing cyclodextrin cavities as novel adsorbent matrices”、Carbohydrate Polymers 63 (2006) 153-156
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、したがって、低分子量（１モルあたり約２５０グラム（ｇ／ｍｏｌ）以下）を有する治療用分子を複合体化させ、次いで、それらの持続遊離を確実にするために、少なくとも一つの陰性高分子電解質および少なくとも一つの陽性高分子電解質の複合体から得られるヒドロゲル、特に物理的に架橋したヒドロゲルを提案しようとするものである。
【００２７】
本発明はまた、高分子量、特に約２５０ｇ／ｍｏｌを超える一つ以上の成分をカプセル化し、その遊離を制御するために使用できるヒドロゲルを提案しようとするものである。
【００２８】
本発明はまた、コンパクトで成形可能で均質かつチキソトロピックなヒドロゲル（したがって注入できる）を提案しようとするものである。
【００２９】
さらに、本発明は、安定であり、水中または生理的媒体に浸漬した場合に自発的に崩壊せず、それでも大量の無機充填剤を含む、ヒドロゲルおよび前記ヒドロゲルから得られる細胞性物質を提案しようとするものである。
【００３０】
本発明は、生体液（血液）として、優れた粘稠性、良好な可鍛性および優れた吸収性を保持する一方で、大量の無機充填剤を含むことができる、特にその機器の質量の９０％までの無機充填剤を含むことができる、ヒドロゲルおよび前記ヒドロゲルから得られる細胞性物質であって、細胞分化の生物学的過程を引き起こすことができ、骨芽細胞の発生をもたらすものを提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明の目的と概要
本発明は、第１の態様において、有利には、ヒドロゲルの製造方法であって、
下記のステップを連続して含む、
少なくとも一つのアニオン性ポリマー（Ａ）の粉末とアミン官能基（−ＮＨ２）を含む少なくとも一つのキトサン（Ｂ）の粉末とを提供する第１ステップ（ｉ）と、
粉末混合物を形成するために、少なくとも前記第１ステップから得られる（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を乾式混合することからなる第２ステップ（ｉｉ）、
前記第２ステップから得られる粉末混合物を、前記キトサンを溶解することなく前記アニオン性ポリマー（Ａ）を溶解させることを可能にできるｐＨを有する水性媒体中に、特に撹拌しながら、好ましくは４以上のｐＨで、さらに好ましくは４．５以上のｐＨで、特に５以上のｐＨで懸濁させる第３ステップ（ｉｉｉ）であって、好ましくは、前記水性媒体は水（例えば、蒸留水もしくは超純水）または、少なくとも一つの生細胞、例えばヒトもしくは動物細胞、特に幹細胞の水性懸濁液であり、それに対するｐＨは約７（±０．５）であり、培養培地または生理液のｐＨに対応する、前記第３ステップ（ｉｉｉ）、
前記ヒドロゲルを形成するために、前記第３ステップから得られる懸濁液に酸を添加する第４ステップ（ｉｖ）、または、
前記第３ステップ（ｉｉｉ）および第４ステップ（ｉｖ）は、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または、少なくとも１つの前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む酸性化水性媒体を、前記第２ステップ（ｉｉ）から得られる（Ａ）粉末および前記（Ｂ）粉末を少なくとも含む前記混合物と混合することを含む混合のための第５ステップ（ｖ）と置換する、ヒドロゲルの製造方法を提供することで、上記問題を緩和する。
【００３２】
前記発明者らは、ゲル化プロセスは前記二つのポリマー（Ａ）および（Ｂ）の化学的性質に密接に関連し、そしてそれらが用いられる特定の方法に密接に関連することを見出した。
【００３３】
キトサン粉末（グルコサミンモノマーユニットおよびＮ−アセチルグルコサミンユニットによって構成される）は、４以上、好ましくは４．５以上、特に５以上のｐＨを有する水性媒体中に不溶性である。対照的に、キトサンは、水性媒体が塩酸、酢酸または乳酸などの希酸を含む場合、水性媒体中で溶解する。十分に酸性である水溶液中では、キトサンのアミン官能基−ＮＨ２はプロトン化されてアンモニウム官能基−ＮＨ３＋になり、この性質のために、キトサンは、本発明の関連でポリカチオン（高分子電解質：ＰＥ＋）とみなされる。
【００３４】
刊行物"Chitin and chitosan: Properties and applications", Ms. Rinaudo, Prog. Polym. Sci. 31 (2006) 603-632は、キトサンの溶解を記載し、これは特にそのアセチル化度、そのモル質量、およびキトサンを溶解させる水性媒体のｐＨに依存する。
【００３５】
５以下かつ４以上のｐＨで、キトサン（Ｂ）のアミン官能基は部分的にプロトン化されるが、キトサン（Ｂ）を溶解するために十分な量ではないことに留意すべきである。Rinaudoは、キトサンは、典型的には０．５（すなわち５０％）を上回るグルコサミンユニットのイオン化度で概ね溶解することを報告している。
【００３６】
イオン化グルコサミンユニットの割合（キトサンのイオン化度に対応する）は、酸−塩基定量分析または標準的コロイド滴定によって評価することができ、どちらも当業者に周知である。
【００３７】
水性媒体中に（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む粉末混合物を懸濁させると、前記ポリアニオン（Ａ）が酸官能基（例えばカルボン酸−ＣＯＯＨ）を含む場合、この媒体の前記ｐＨが低下し、その後、前記ｐＨは上昇し、安定化する。しかしながら、粉末混合物の添加前の水性媒体のｐＨが４以上、好ましくは４．５以上、さらに好ましくは５以上である場合、粉末混合物の添加後のｐＨの低下は、キトサンを溶解させるために十分ではない。第４ステップでの酸の添加のみで、前記キトサンを溶解させることを可能にするために十分なｐＨの低下を引き起こす。
【００３８】
本発明の前記アニオン性ポリマー、または、ポリアニオンは、４以上、特に４．５以上、特に５以上のｐＨで可溶性であり、官能基、特に酸性硫酸塩（acid sulfate）官能基（−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＳＯ４Ｈ）および／もしくはそれらの塩、または、スルホン酸官能基（−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈ）および／もしくはそれらの塩、ならびに／または、リン酸官能基（−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＰＯ４Ｈ）および／もしくはそれらの塩、ならびに／またはカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）および／もしくはそれらの塩を有し、これらは、特にプロトンＨ＋を遊離することによって水性媒体中でアニオン性官能基を形成することができ、すなわち、カルボキシレート官能基（−ＣＯＯ−）および／またはスルフェート官能基−ＳＯ４−および／またはスルホネート官能基−ＳＯ３−および／またはホスホネート官能基−ＰＯ４−の形成のための、スルホン酸、酸性硫酸塩、リン酸、または、カルボン酸である。
【００３９】
前記定義の酸官能基およびアミン官能基を有する高分子はイオン化可能であり、高分子電解質と呼ばれる。強力な高分子電解質は、各高分子電解質のｐＫａに依存する、これらの官能基が水溶液中でイオン化しなければならない前記傾向に応じて弱い高分子電解質から区別される。平衡定数Ｋａは（ＡＨ）→←（Ａ−）＋（Ｈ＋）（反対方向の矢印は平衡反応を示す）タイプのものであり、したがって、Ｋａ＝（［Ａ−］×［Ｈ＋］）／［Ｈ＋］であり、したがって、ｐＫａは−ｌｏｇ（Ｋ）として定義され、これは、媒体のｐＨに応じて酸のイオン化を評価するために使用することができる。このように、"Polymer Handbook", 2 volume set, 4th Editionは、それらが有するイオン化可能な官能基のｐＫａに応じて、高分子電解質を強力な高分子電解質と弱い高分子電解質とに分類する。酸性硫酸塩基、スルホン酸基およびリン酸基は強力な高分子電解質であり、すなわち低ｐＨ（２未満）でイオン化し、一方、カルボン酸基を有する高分子電解質は、弱い高分子電解質（多くの場合４よりも高いｐＨでイオン化するので）として分類されるポリアニオンである。第１、第２および第３アミンを有する前記高分子電解質は、（約）５より低いｐＨでイオン化するので、弱い高分子電解質として分類されるポリカチオンである。
【００４０】
高分子電解質の複合体は、前記酸性および塩基性イオン性官能基間の静電相互作用によって形成される。したがって、高分子電解質の複合体形成のために最も好ましいｐＨ条件は、溶液のｐＨが、ポリアニオンのｐＫａよりも高く、ポリカチオンの官能基のｐＫａよりも低いものである。
【００４１】
したがって、本発明の文脈で、「アニオン性ポリマー」または「ポリアニオン」という語は、アニオン性官能基を含む粉末の形態であるか、水性媒体中に、特に４以上のｐＨ、より好ましくは４．５以上のｐＨ、特に５以上のｐＨでいったん溶解したらアニオン性官能基を形成できる任意のポリマーを意味する。
【００４２】
前記第２ステップにおいて、キトサン（Ｂ）（ＰＥ＋）の粉末およびアニオン性ポリマー（Ａ）（ＰＥ−）の粉末を緊密に混合する。したがって、前記ＰＥ＋粒子は、静電相互作用によってＰＥ−粒子と結合する。これらの静電相互作用は、キトサンおよびアニオン性ポリマーが反対の符号のゼータ電位を有するという事実によって説明される。
【００４３】
好ましくは、キトサンのゼータ電位は、＋２０ミリボルト（ｍＶ）から＋５０ｍＶ程度であり、後述する本発明の好ましいシクロデキストリンポリマー（Ａ１）のゼータ電位は、−３０ｍＶ程度である。
【００４４】
有利には、前記第３ステップ（ｉｉｉ）の間、溶解していない前記キトサンは、静電相互作用によってその表面上に吸着されたままである高親水性ＰＥ−の存在により、水性媒体中に懸濁されたままであり、それによって均質な懸濁液を維持できる親水性層を形成する。
【００４５】
「均質な懸濁液」という語は、撹拌を減速または中断した場合に、急速に沈殿しない懸濁液を意味すると理解されるべきである。
【００４６】
「粉末」という語は、周囲温度で小さな粒子に縮小された任意の固体物質を意味すると理解されるべきである。
【００４７】
「周囲温度」という語は、１０℃から３５℃の範囲内の温度、特に１５℃から２５℃の範囲内の温度を意味すると理解されるべきである。
【００４８】
本発明の文脈で示されるｐＨ値は、周囲温度で、ｐＨメータを用いて測定された。
【００４９】
「ポリマー」という語は、特に本発明の文脈で使用する場合、本発明のアニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマー（キトサン（Ｂ））、オリゴマーまたはホモポリマーもしくはコポリマー（すなわち、少なくとも二つの異なる繰り返しユニットを含む）であり得るポリマーを意味すると理解されるべきである。
【００５０】
「キトサンを可溶化せず」という語は、キトサンのアミン官能基がないこと、または前記キトサン粉末を溶解させるために前記水性媒体中でプロトン化される前記キトサンのアミン官能基の数が不十分であることを意味すると理解されるべきである。好ましくは、前記キトサン（Ｂ）を、少なくとも０．５のアルファイオン化度について溶解させる、すなわち前記キトサン（Ｂ）の前記総アミノグルコースユニット数に対する前記キトサン（Ｂ）のアミノグルコースユニット数の少なくとも５０％がイオン化されてグルコースアンモニウムユニットになる。
【００５１】
溶解を引き起こすために得られるべきプロトン化度は、前記キトサンのモル質量および脱アセチル化度（ＤＤＡ）にも依存し、すなわち、前記ＤＤＡが低い場合、高い場合よりも多くのアミン官能基がプロトン化されなければならない。
【００５２】
好ましくは、本発明の前記キトサン（Ｂ）の前記脱アセチル化度は、６０％以上、さらに好ましくは７５％以上、特に９５％以下、さらに好ましくは９０％以下、特に８５％以下である。
【００５３】
本発明の方法の前記第４ステップ（ｉｖ）またはステップ（ｖ）の間に添加される酸は、ポリアニオンとは異なる。
【００５４】
酸を添加すると、懸濁液のｐＨは、特に５以下、さらに詳細には４．５以下、特に４ｓ以下のｐＨまで減少し、これによって、添加される前記酸がそれぞれ酢酸および塩酸である場合、カウンターイオンとしてアセテート基（ＣＨ３ＣＯＯ−）または塩化物（Ｃｌ−）を用いて、そのアミン（−ＮＨ２）をプロトン化してアンモニウム官能基（−ＮＨ３＋）にすることによって前記キトサンを溶解させる。キトサン高分子は、形成されたアンモニウム基（同じ符号の静電荷は反発する）間の分子内静電反発力の影響のもとで展開し、「ねじれた」構造となり、これはその後、水性媒体の全体積を占める。同時に、前記キトサンの前記アンモニウム基（−ＮＨ３＋）と前記アニオン性ポリマーの前記アニオン性官能基（ＣＯＯ−）との間にイオン結合が形成される。
【００５５】
次に、一旦、アミン官能基がプロトン化されると、ヒドロゲルのｐＨは、好ましくは４以上のｐＨ、さらに好ましくは４．５以上のｐＨ、特に５以上のｐＨに上昇してヒドロゲルを安定化させる。
【００５６】
アニオン性ポリマーは次にキトサンのネットワーク中に分散される。これらのイオン相互作用は、ゲルの物理的架橋を引き起こし、そして水性分散液は凝固する。
【００５７】
有利には、本発明の前記ヒドロゲルは、自立性形状を有する粘弾性材料の特徴を有する巨視的ゲルである。
【００５８】
好ましくは、前記第４ステップ（ｉｖ）後の前記酸性化水性媒体のｐＨに関する特徴は、ステップ（ｖ）の水性媒体（本文で定義される化合物（Ｃ）を含む）にも当てはまる。
【００５９】
好ましくは、本発明で使用される「ヒドロゲル」という語は、自立形状を有する粘弾性固体材料を意味すると理解されるべきであり、すなわち、容器から取り出した後に、その中で形成された容器の寸法および形状を保持する（それが置かれた条件に応じて数時間または数日間）。
【００６０】
好ましくは、本発明による前記第１ステップおよび／または前記第２ステップおよび／または前記第３ステップおよび／または前記第４ステップおよび／または前記第５ステップ（ｖ）は周囲温度で実施する。
【００６１】
この実施形態は、数時間周囲温度、すなわち約３７℃で、特に少なくとも４８時間（ｈ）、流動することなく特定の領域にとどまることができる、非常に硬く安定なヒドロゲルを得ることができることを意味するので、前記第３ステップで懸濁させた後に酸を添加することは重要であることが観察された。
【００６２】
さらに、本発明の前記ヒドロゲルは、特に周囲温度すなわち約３７℃で数時間、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、水性媒体中でその形状および完全性を保持する。
【００６３】
先行技術において、キトサンに基づく物理的ヒドロゲルは、キトサンの酸性水溶液をポリアニオンの水溶液と混合することによるか、または、前記ポリアニオン、例えばカルボキシメチルセルロースを、キトサンの前記酸性水溶液（約２から３オーダーのｐＨ）上に散布することによって製造する。どちらの経路においても、得られたヒドロゲルは本発明のヒドロゲルほど堅くなく、また安定ではない。
【００６４】
本発明の前記ヒドロゲル中のキトサンは、ゲルの前記構造を確保し、そして必要とされるレオロジー特性を付与するように作用する。
【００６５】
好ましくは、ヒドロゲル中の水（ｇ）の総重量の、ヒドロゲルの総重量に対する前記比は、５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に８０％以上、なお一層好ましくは８５％以上、特に９０％以上である。
【００６６】
有利には、本発明のヒドロゲルは以下のものをはじめとする一つ以上の特性を有し得る。即ち、生体適合性であること、シリンジを用いて注入可能であること、成形によって得られた特定の形状を少なくとも数時間保持することができること、および／または、流動しないので適用された領域上の所定の場所にとどまること、ならびに、一つ以上の活性物質を遊離できること。
【００６７】
本発明のヒドロゲルは、有利にはチキソトロピックであり、注入できることを意味する。したがって、ヒドロゲルは、ずり減粘挙動（rheofluidifying properties）を有する、すなわち、ポリマーは機械的せん断応力にさらされると流動化し、応力のない静止時にそのゲル状態に戻る。ヒドロゲルをシリンジのシリンダー中に入れると、ピストンを介して適用されたせん断応力の影響下で流動化して、シリンジの出口オリフィスを通ってニードル中へ、そして、続いて、おそらくはカテーテル中へと通過し、最終的にそれが適用された領域上で応力がなくなると、その堅いヒドロゲル形態に戻ることができる。
【００６８】
例えば、シリンジの出口オリフィスと流体連通した標準的ニードルは０．１ミリメートル（ｍｍ）から０．５ｍｍの間の直径を有する。
【００６９】
本発明のヒドロゲルは、多くの医学的用途で、特に矯正的手術（corrective surery）、美容的手術、泌尿器学、歯科手術、眼科、整形外科、または顎顔面外科手術において、組織接着を防止するため、および／または様々な種類の軟組織の生成を促進するため、および／またはそれらが適用された領域上へ一つ以上の活性物質を遊離するために、充填材として使用することができる。
【００７０】
本発明のヒドロゲルが少なくとも一つの機能的薬剤（functional agent）および／または生細胞を含む場合、それらは、例えば、治癒、疾患（がん）の治療、疼痛の軽減（麻酔薬）、炎症の軽減、または感染の予防もしくは抑制のために寄与する。
【００７１】
前記第３ステップ（ｉｉｉ）の間に、前記水性媒体は、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）および／または前記化合物（Ｃ）の少なくとも一つのリン酸塩も含み得る。
【００７２】
「少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む化合物（Ｃ）」という語は、本発明で使用する場合、実験式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するか、または前記実験式から誘導される少なくとも一つのユニットを含む任意の化合物（Ｃ）を意味する。それは、例えばヘキソース、またはグリコシド結合を介して第２のヘキソースに結合した第１のヘキソースであり得、第２のヘキソースは第１のヘキソース（またはヘキソース由来の少なくとも一つのユニット）と同一であっても異なっていてもよい。
【００７３】
好ましくは、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む前記化合物は、グルコース（ＬもしくはＤ形態）、マルトース（ＬもしくはＤ形態）、サッカロース、マンノース（ＬもしくはＤ形態）、フルクトース（ＬもしくはＤ形態）、ラクトース（ＬもしくはＤ形態）、またはそれらの混合物を含む前記リストから選択され、さらに好ましくは、前記化合物はグルコース（ＬまたはＤ形態）である。
【００７４】
本発明の文脈では、「リン酸塩化合物（Ｃ）」という語は、その炭素のうちの少なくとも一つでリン酸塩基（例えば、ホスホリル基（ＰＯ３２−））を担持する、実験式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するか、または前記実験式から誘導される少なくとも一つのユニットを含む任意の化合物を意味する。それは、例えばヘキソースリン酸塩であってもよく、または第１のヘキソース（リン酸塩）と同一であっても異なっていてもよい第２のヘキソース（リン酸塩）にグリコシド結合を介して結合した第１のヘキソース（リン酸塩）であってもよい（ヘキソース（リン酸塩）由来のユニットである）。
【００７５】
特に、前記化合物（Ｃ）のリン酸塩は、ヘキソース−ｎ−リン酸塩またはヘキソース−ｎ−リン酸塩の誘導体（ｎはヘキソースユニットまたはリン酸塩基を担持するヘキソースユニットの誘導体の１から６までの付番された炭素原子のうちの一つである）。
【００７６】
好ましくは、化合物（Ｃ）のリン酸塩は、グルコース−ｎ−リン酸塩（ＬもしくはＤ形態）、特にグルコース−６−リン酸塩またはグルコース−１−リン酸塩、マルトース−ｎ−リン酸塩、サッカロースリン酸塩、マンノース−ｎ−リン酸塩；フルクトース−ｎ−リン酸塩、ラクトース−ｎ−リン酸塩またはそれらの混合物から選択され、さらに好ましくは、前記化合物はグルコース−ｎ−リン酸塩（ＬもしくはＤ形態）である。
【００７７】
好ましくは、前記化合物（Ｃ）または前記化合物（Ｃ）の前記リン酸塩は、最大で１０のヘキソースユニットまたはヘキソース由来のユニット、特に最大で５のヘキソースユニットまたはヘキソース由来のユニット、特に１または２のヘキソースユニットまたはヘキソース由来のユニットを含む。
【００７８】
驚くべきことに、前記酸性化水性媒体が少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）および／または前記化合物（Ｃ）のリン酸塩を含む場合、前記懸濁ステップ（ｉｉｉ）を経る必要なしに、ステップ（ｉｉ）から得られる少なくとも一つの（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む前記混合物を、酸性化水性媒体と混合することが可能であることが見いだされた。
【００７９】
この条件によって、培養培地、例えばＤＭＥＭ中に注入したわずか１時間後であっても、堅くかつ安定なヒドロゲルが形成される。
【００８０】
前記水性媒体中のヘキソースに基づく前記成分（Ｃ）の前記存在は、したがって前記ヒドロゲルにおいて最終的に、前記水性媒体の前記ｐＨを、特に６付近のｐＨまで上昇させることができ、したがってインビトロで測定される細胞適合性をかなり改善することができることも観察された。
【００８１】
本発明者らはまた、驚くべきことに、前記酸性化水性媒体中のヘキソースまたはヘキソースのリン酸塩に基づく化合物を使用して、キトサンに基づくゲルおよびポリアニオンの前記形成を改善できることも見出した。グルコースリン酸塩の使用は、キトサンに基づく溶液の前記安定性を改善するが、キトサンに基づくイオン性ヒドロゲルの前記形成を改善しないゲル化剤として知られている（European journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 88 (2014) 361-373を参照）。
【００８２】
一実施形態において、前記第３ステップから得られる粉末混合物の前記懸濁液を型にキャストするかまたは注入し、次いで酸を添加し、対応して成形して、前記ヒドロゲルを形成する。
【００８３】
一実施形態において、（Ａ）粉末および（Ｂ）を混合する前記第２ステップは、粉末を混合する機器、特に遊星攪拌機を使用して、特に粉砕することなく（すなわち、前記粉末を構成する前記固体粒子の前記サイズを有意に減少させることなく）実施する。
【００８４】
変法において、前記水性媒体は、ステップ（ｉｉｉ）であろうとステップ（ｖ）であろうと、前記水性媒体の前記総体積に対して、少なくとも０．１重量％、好ましくは少なくとも０．５重量％、さらに好ましくは少なくとも１重量％、特に少なくとも２重量％、さらに詳細には少なくとも３重量％、なお一層詳細には少なくとも４重量％、特に少なくとも５重量％の、少なくとも一つのヘキソースユニットまたはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または前記化合物（Ｃ）の少なくとも一つのリン酸塩を含む。
【００８５】
変法では、前記第１ステップにおける粉末（Ａ）および／もしくは（Ｂ）粉末ならびに／または前記第２ステップにおける少なくとも（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む前記粉末混合物を、そのサイズが５００マイクロメートル（μｍ）以下、好ましくは３００μｍ以下、さらに好ましくは２００μｍ以下、特に１５０μｍ以下、さらに詳細には１２５μｍ以下であるメッシュを有する篩で篩別する。
【００８６】
好ましくは、（Ａ）粉末および／もしくは前記（Ｂ）粉末の前記粒子または（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末の前記混合物の前記サイズ分布を、３００ｍｍレンズを使用するMastersizer S（Malvern Instruments，Orsay，France）を使用して測定する。前記サンプルを、４ｂａｒの圧縮空気を用いて乾燥状態で分散させる。
【００８７】
好ましくは、（Ａ）粉末および／もしくは前記（Ｂ）粉末ならびに／または（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末の混合物は、場合によって少なくとも一つの無機充填剤などの（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末とは異なる少なくとも一つの粉末と組み合わせて、以下の参照番号を有する篩別機器で篩別する。Plastic Sieve, Nylon DIN 41p5, No: 948414 W: 0.125 μm, sold by Bioblock Scientificにより販売。
【００８８】
均質な、すなわち塊の存在がなく、前記予想される粘弾性を有するゲルを形成できることを意味するので、ポリカチオンまたはポリアニオンの前記粒子における所定のサイズに適合することは重要である。
【００８９】
（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末はまた、例えばFritschによって販売されているものなどの振動篩を用いて篩別することもできる。
【００９０】
好ましくは、前記第１ステップにおいて、（Ａ）粉末および／または前記（Ｂ）粉末を、好ましくはFritschによって販売され、２００μｍの篩を備えるPulverisette14（登録商標）機械を使用して篩に通す前に、別々に粉砕する。
【００９１】
変法では、少なくとも（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を乾式同時粉砕することによって、前記第２ステップの前記混合物を製造する。
【００９２】
好ましくは、（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を乳鉢中で手作業によって乾式同時粉砕する。
【００９３】
（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末はまた、特にFritschによって販売されているPulverisette遊星マイクロミルなどのビーズミルで同時粉砕することもできる。
【００９４】
粉砕によって固体粒子の前記サイズを減少させることができ、より小さなフラグメントを形成することができる。「同時粉砕」という語は、少なくとも二つの異なる（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末の同時粉砕に言及する。前記変法では、前記同時粉砕および／または粉砕とそれに続く混合によって、前記粉末の前記固体粒子の前記サイズを有利に低減することができ、（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末間の緊密な混合も提供することができ、したがって、前記アニオン性ポリマーおよび前記キトサンの間のより良好な接触表面積を提供することもできる。この条件は、前記第３ステップにおいてこれらの粉末を含む前記水性分散液の前記均一性を促進する。したがって、特に前記ヒドロゲルの前記凝固に関して、前記アニオン性ポリマーと前記キトサンとの間の前記反応性と同様に、前記ヒドロゲルの前記形成における前記再現性も増加する。
【００９５】
変法では、前記アニオン性ポリマーは、酸性硫酸塩官能基（−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＳＯ４Ｈ）および／または前記酸性硫酸塩官能基の塩、および／またはスルホン酸官能基（−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈ）および／または前記スルホン酸官能基の塩、および／またはリン酸官能基（−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）２−ＯＨまたは−ＰＯ４Ｈ）および／または前記リン酸官能基の塩、および／またはカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）および／または前記カルボン酸官能基の塩、好ましくはリン酸官能基および／または前記リン酸官能基の塩、および／またはカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）および／または前記カルボン酸官能基の塩、さらに好ましくはカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）および／または前記カルボン酸官能基の塩、特にカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）を含む。
【００９６】
スルホン酸塩（スルホネート塩−ＳＯ３Ｘ）、酸性硫酸塩（スルフェート塩−ＳＯ４Ｘ）、リン酸塩（ホスホン酸塩−ＰＯ４Ｘ）およびカルボン酸塩（カルボキシレート塩−ＣＯＯＸ）は一価であり、前記塩は、したがって、少なくとも一つの−ＯＸ基（前記酸中に存在する前記ＯＨ基を置換する）を含み、ここで、Ｘは、好ましくはナトリウム、カリウム、リチウム、銀から選択され、さらに好ましくはカリウムまたはナトリウムである。
【００９７】
変法では、前記アニオン性ポリマーは、シクロデキストリンポリマー、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヘパリン酸塩、特にヘパリン酸ナトリウム、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸塩、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、キサンタンガム、ジェランガム（カルボン酸塩）、グルコマンナン、コンダゴグ（ｋｏｎｄａｇｏｇｕ）ガム、アラビアガム、カシューガムを含む前記リストから選択され、さらに好ましくはシクロデキストリンポリマー、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アクリル酸およびアクリル酸塩、さらに好ましくはシクロデキストリンポリマー、アクリル酸、ペクチンおよびアルギン酸ナトリウムを含む前記リストから選択される。
【００９８】
ヘパリン、ヘパリンの塩、カラギーナンは酸性硫酸塩官能基または塩基性硫酸塩官能基の塩を含む。
【００９９】
ヒアルロン酸、ペクチン、アクリル酸またはその塩の前記ポリマー、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、キサンタンガム、ジェランガム、グルコマンナン、コンダゴグガム、アラビアガム、カシューガムおよびシクロデキストリンポリマー（その合成様式に依存する）は、カルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）または前記カルボン酸官能基の塩（塩は、アニオン性ポリマーについて言及する前記段落中の本文で定義する）を含む。
【０１００】
変法では、前記アニオン性ポリマー（Ａ）は、少なくとも一つのシクロデキストリンおよび／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体および／または少なくとも一つのシクロデキストリンの包接複合体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体の包接複合体を含む混合物と、
少なくとも一つの（ポリ）カルボン酸および／またはその対応する（ポリ）カルボン酸無水物（リストＡ１）、または
少なくとも一つのピロリン酸塩（リストＡ２）、または
少なくともエピクロロヒドリンとの重合反応によって得られるシクロデキストリンポリマーであり、得られた前記ポリマーは、カルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）（リストＡ３）をグラフトするなどの方法でカルボキシル化する、特にカルボキシメチル化するステップを受ける。
【０１０１】
有利には、前記シクロデキストリンポリマーの前記親水性ネットワークは前記生態適合性を増加させ、前記生理的媒体中に自発的に溶解することができず、移動できる前記ヒドロゲルの凝集性を保証する。前記親水性ネットワークはまた、前記ゲストと前記シクロデキストリンの前記空洞との間の前記包接複合体に安定性を提供する。前記シクロデキストリンはまた、前記ホスト−ゲスト親和性によって調節されるその吸着特性（リザーバ特性と呼ばれる）を改善し、多少の遅延を伴って遊離させることによって、前記ゲルの前記安定性に貢献する。
【０１０２】
前記ヒドロゲルは、可溶性シクロデキストリンポリマーまたは不溶性シクロデキストリンポリマーまたはそれらの混合物、好ましくは可溶性シクロデキストリンポリマー、さらに詳細には、前記ファミリー（Ａ１）に属するものを含んでもよい。
【０１０３】
前記アニオン性シクロデキストリンポリマーは、イオン相互作用による前記キトサンの架橋を保証し、同時に、包接複合体の形成によって低分子量（約２５０ｇ／ｍｏｌ未満）の治療分子の複合体形成を保証し、次いでそれらがゆっくりと遊離されるのを保証する。
【０１０４】
本発明のシクロデキストリンポリマーは、特に、前記リスト（Ａ１）からの架橋または超分岐したものは、可溶性または不溶性形態であってよい。前記可溶性ポリマーは、ナノメートル寸法を有する（すなわち約１００ｎｍ以下の寸法を有する）ゲル（シクロデキストリンポリマーに基づく球状ナノゲルの写真を示す、刊行物Green Chemistry，2015，17，2444-2454を参照）で構成され、それは水中で透明な溶液を形成する。前記不溶性ポリマーは、マイクロメートル粒子（すなわち１μｍより大きな寸法を有する）、ミリメートルおよびそれ以上に相当し、それは水中で二相系を形成し、溶液はしたがって白濁し、透明ではない。
【０１０５】
好ましくは、前記シクロデキストリンポリマーは前記リスト（Ａ１）に属するものである。このポリマーのファミリー（Ａ１）は、これらのポリマーが非常に親水性であるために、水性媒体中に懸濁させやすいという利点を有する。この条件は、したがって、均質かつ堅いヒドロゲルの形成を促進する。
【０１０６】
有利には、前記シクロデキストリンポリマー、特に前記リスト（Ａ１）に属するものは、キトサンでは不可能な分子、特に小さなサイズを含む分子の保持および制御遊離のその機能を保存する。大きな分子をその三次元高分子ネットワーク内で保持することができ、次いで程度の差はあれ遅延して遊離させることができるので、キトサンは相補的である。
【０１０７】
前記定義の前記リスト（Ａ１）のもの以外のシクロデキストリンポリマーも存在するが、それらの非常に高いカルボキシレート官能基レベル（少なくとも３ミリモル（ｍｍｏｌ）のＣＯＯＨ基／グラム、特に少なくとも約３から５ｍｍｏｌのＣＯＯＨ基／グラム）は他の重合経路またはシクロデキストリンのポリマーの化学修飾を用いて得ることができないので、それらは非常に特異的である。前記定義のリスト（Ａ１）のポリマーの前記ファミリーを用いて、自立形状を有するヒドロゲル、すなわち、堅いテクスチャーを有し、成形、切断することができ、均質かつ耐久性があるものを得ることができる）。
【０１０８】
好ましくは、前記シクロデキストリンポリマー、特に前記リスト（Ａ１）に属するものは、前記塩基性混合物の前記総重量（ｇ）に対するシクロデキストリンおよび／またはシクロデキストリン誘導体および／またはシクロデキストリン（誘導体）包接複合体の前記重量（ｇ）の前記比は４０％以上、好ましくは６５％以上である塩基性混合物から得られる。
【０１０９】
「シクロデキストリン」という語は、任意の天然のシクロデキストリン、特にα−シクロデキストリンまたはβ−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンを意味する。
【０１１０】
「シクロデキストリン誘導体」という語は、任意の天然のシクロデキストリン、特にα−シクロデキストリンまたはβ−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンであって、それについて、少なくとも一つのヒドロキシ基、好ましくは前記ヒドロキシ基の少なくとも半分が置換され、特にアミン置換され、特にアミン官能基（−ＮＨ２）を有し、エステル化、エーテル化、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、カルボキシアルキル化、特にカルボキシメチル化、スルホアルキル化、特にスルホブチル化されているもの、およびその混合物であるものを意味する。
【０１１１】
前記シクロデキストリンの前記少なくとも一つのヒドロキシ基は、直鎖状および／または分岐、不飽和または飽和、置換または非置換であり得、１から１０個の炭素原子、好ましくは１から６個の炭素原子、さらに好ましくは１から４個の炭素原子を含むアルキル鎖、特にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基で置換されていてもよく、前記基の各々は、場合によってそして互いに独立して、一つ以上のヒドロキシ基（−ＯＨ）で置換されている；および／または一つ以上のカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）で置換されている；および／または一つ以上のスルホン酸基で置換されているおよび／または前記スルホン酸官能基の一つ以上の塩で置換されている。前記シクロデキストリンの前記少なくとも一つのヒドロキシ基は、したがって、ヒドロキシプロピル基またはカルボキシメチル基で置換されていてもよい。
【０１１２】
「シクロデキストリンの包接複合体」または「シクロデキストリン誘導体の包接複合体」という語は、本文で定義するような機能性薬剤と複合体形成するか、または本文で定義するような生細胞と複合体形成する、本発明の意味の範囲内の任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を意味する。
【０１１３】
当業者は、前記架橋剤と反応することができる、一つ以上のシクロデキストリンおよび／または一つ以上のシクロデキストリン誘導体および／または一つ以上のシクロデキストリン（誘導体）包接複合体を選択できる。特にシクロデキストリンポリマーの前記リスト（Ａ１）に関して、一つ以上のシクロデキストリン誘導体を使用する場合、前記（ポリ）カルボン酸および／またはそれらの対応する無水物との重縮合反応を実施することができるために十分なヒドロキシ基（−ＯＨ）を有していなければならない。
【０１１４】
欧州特許第1165621B1号は、本発明の実施に理想的に適合した（ポリ）カルボン酸と天然のシクロデキストリン（α、β、γ）または誘導体（メチル、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン）との間の重縮合反応によって得られるシクロデキストリンポリマーの前記合成を開示している。得られるポリマーは、前記重縮合反応の前記進行に応じて、水溶性であるかまたは不溶性であるかのいずれかである。４０重量％から６５重量％の範囲内の高いシクロデキストリン含有量によって特徴づけられ、そしてシクロデキストリンポリマー１グラムあたり３ミリモルから５ミリモル程度のカルボン酸官能基の豊富さを特徴とする。
【０１１５】
本発明の文脈で、「カルボン酸」という語は、−ＣＯＯＨ官能基を含む酸を意味する。本発明の文脈で、「ポリカルボン酸」という語は、少なくとも二つの−ＣＯＯＨ官能基を含む酸を意味し、「その対応する無水物」という語は、少なくとも一つの官能基−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−を含む酸を意味する。
【０１１６】
「ピロリン酸」という語により、特に以下の官能基−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−を含むＰ−Ｏ−Ｐ結合を含む任意の化合物を意味する。
【０１１７】
一実施形態において、エピクロロヒドリンとの反応によって得られるシクロデキストリンポリマーはカルボン酸官能基を含まないので、カルボキシアルキル化反応、特にクロロ酢酸を用いたカルボキシメチル化を受けて、前記ポリマー上に−ＣＨ２ＣＯＯＨをグラフトする。
【０１１８】
前記カルボキシアルキル化は、好ましくは、前記アルキル鎖上で少なくとも一つの塩素、臭素またはヨウ素原子で置換された（ポリ）カルボン酸を用いて実施する。好ましくは、前記アルキル鎖は、直鎖状および／または分岐、不飽和または飽和、置換または非置換であり、１から１０個の炭素原子、好ましくは１から６個の炭素原子、さらに好ましくは１から４個の炭素原子を含み、特に、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、またはｔｅｒｔ−ブチル基である。
【０１１９】
変法では、前記ピロリン酸塩（Ａ２）はトリメタリン酸ナトリウムである。
【０１２０】
変法では、前記（ポリ）カルボン酸またはその対応する酸無水物は、飽和または不飽和または芳香族、直鎖状または分岐または環状（ポリ）カルボン酸およびヒドロキシポリ（カルボン）酸からなるリストから選択され、好ましくは、クエン酸、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル）酸、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸（ＢＴＣＡ）、マレイン酸、シトラコン酸、イタコン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、トランス−アコニット酸、全シス−１，２，３，４−シクロペンタンテトラカルボン酸、メリト酸、ピロメリット酸、エディト酸（editic acid）（エチレンジアミンテトラ酢酸またはＥＤＴＡ）、オキシジコハク酸（oxydisuccinic acid）、チオジコハク酸または前記（ポリ）カルボン酸の前記酸無水物、例えばピロメリット酸二無水物、およびその混合物、好ましくはクエン酸およびＢＴＣＡを含むリストから選択される。
【０１２１】
好ましくは、前記（ポリ）カルボン酸は、非環状酸、さらに好ましくはアミン官能基（−ＮＨ２）を含まない酸、さらに好ましくは、窒素を含まない酸から選択される。これらの酸を用いて得られるシクロデキストリンポリマーは、環状酸を用いて得られるものよりも親水性が高く、そして、例えばその合成をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で実施しなければならないピロメリット酸二無水物を用いて得られるポリマーとは対照的に、水性プロセスによって合成することができる。
【０１２２】
変法では、本発明の前記方法の前記第４ステップの間に前記懸濁液に添加されるか、またはステップ（ｖ）の間に前記水性媒体を酸性化するために使用される前記酸は、酢酸、特に氷酢酸、ギ酸、酒石酸、サリチル酸、グルタミン酸、プロパン酸、塩酸、クエン酸、乳酸、およびそれらの混合物、好ましくは、酢酸、塩酸、乳酸およびそれらの混合物、さらに好ましくは酢酸および塩酸を含む前記リストから選択される。
【０１２３】
好ましくは、前記酢酸は、少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９９％（「純粋な」酢酸、「氷」酢酸として知られる酸）濃縮される。
【０１２４】
好ましくは、概して、酸の少なくとも０．５％、さらに好ましくは少なくとも１体積％を、前記水性媒体の前記総体積に対してステップ（ｉｉｉ）またはステップ（ｖ）の前記水性媒体に添加する。
【０１２５】
従属的変法では、本発明の方法の前記第４ステップ（ｉｖ）またはステップ（ｖ）の間に前記懸濁液に添加される前記酸は、塩酸、酢酸および乳酸から選択され、さらに好ましくは乳酸および塩酸から選択され、特に乳酸である。
【０１２６】
前記注入されたヒドロゲルロープの堅さおよび安定性は、これらの酸、特に乳酸でより良好であることが観察された。
【０１２７】
加えて、塩酸および乳酸は、酢酸と比べて、無臭であるという前記利点を有する。
【０１２８】
有利には、塩酸、酢酸および乳酸、特に乳酸は、特に前記水性媒体中で少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物と組み合わされた場合、インビトロ（ＭＣ３Ｔ３試験細胞）での細胞適合性の点で良好な結果を得るために使用することができることも観察された。
【０１２９】
好ましくは、前記添加された乳酸は、前記水溶液の前記体積に対して少なくとも８５重量％の純粋な乳酸を含む水溶液である。
【０１３０】
変法では、前記アニオン性シクロデキストリンポリマー（Ａ）は、少なくとも２ｍｍｏｌ／ｇのカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）、好ましくは少なくとも３ｍｍｏｌ／ｇのカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）、さらに好ましくは少なくとも３．５ｍｍｏｌ／ｇのカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）を含む。
【０１３１】
シクロデキストリンポリマー１グラムあたりのカルボキシル官能基の前記量は、有色指示薬の存在下での酸−塩基滴定によって測定することができる。
【０１３２】
前記測定方法は、所定量のシクロデキストリンポリマーを所与の体積の水中に有色指示薬、例えばフェノールフタレイン（２、３滴）の存在下で溶解させ、次いで前記溶液に、特に目盛り管を使用して徐々に（１滴ずつ）、０．１モル／リットル（ｍｏｌ／リットル）の水酸化ナトリウム溶液を撹拌しながら（例えばマグネットバーを使用）有色指示薬を含む溶液が変色するまで添加することからなる。添加した水酸化ナトリウムの前記モル数は、中和されたカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）のモル数に相当する。
【０１３３】
変法では、前記第４ステップ（ｉｖ）または前記第５ステップ（ｖ）から得られるヒドロゲルの前記総重量（ｇ）に対する前記少なくとも一つのキトサン（Ｂ）の粉末の前記重量（ｇ）の前記比は、１％以上、好ましくは８％以上、さらに好ましくは５％以上、さらに好ましくは４％以上である。
【０１３４】
変法では、前記第４ステップ（ｖ）または前記第５ステップ（ｖ）から得られるヒドロゲルの前記総重量（ｇ）に対する前記少なくとも一つのアニオン性ポリマー粉末（Ａ）の前記重量（ｇ）の前記比は、１％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に６％以下である。
【０１３５】
変法では、前記キトサン粉末（ｂ）の前記ポリアニオン粉末（Ａ）の前記重量（ｇ）に対する前記重量比（ｇ）は、０．６から１．４の範囲内、さらに好ましくは０．８から１．２の範囲内、さらに好ましくは０．９から１．１の範囲内である。
【０１３６】
変法では、本発明によるヒドロゲルの製造方法は、粉末形態の少なくとも一つの無機充填剤を前記第２ステップで製造された前記粉末混合物に添加することを含み、好ましくは、前記粉末混合物の前記総重量（ｇ）に対する無機充填剤の前記重量（ｇ）の前記比は３０％以上である。前記少なくとも一つの無機充填剤を粉末（Ａ）および粉末（Ｂ）と緊密に混合する。
【０１３７】
好ましくは、前記無機充填剤を、粉末（Ａ）および粉末（Ｂ）に関する前記定義の変動にしたがって、特に篩別された粒子のサイズに関する変動にしたがって篩別および／または（同時）粉砕する。
【０１３８】
変法では、前記少なくとも一つの無機充填剤は、バイオセラミック、特にリン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイトおよびβトリリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、ガラス、ガラス−イオノマー、二酸化チタンおよびそれらの混合物（骨再建のため）を含む前記リストから選択される。
【０１３９】
変法では、ステップ（ｉｉｉ）またはステップ（ｖ）における前記水性媒体は、少なくとも一つの機能的薬剤および／または少なくとも一つの生細胞を含む。
【０１４０】
特に、前記機能的薬剤は生物活性剤であり、さらに詳細には、治療活性を有する分子、高分子または微生物である。この定義は、本文の残りの部分でも当てはまる。
【０１４１】
有利には、前記機能的薬剤は、抗凝固剤、抗血栓剤、抗分裂剤、抗増殖剤、抗接着剤、抗遊走剤、細胞接着促進剤、増殖因子、抗寄生虫剤、抗炎症薬、ビタミン、ホルモン、タンパク質、抗真菌剤、抗菌分子、防腐剤、抗生物質（特にシプロフロキサシンおよびクロルヘキシジン）、ニコチン、一つ以上の精油、およびそれらの混合物を含む第１リスト（Ｉ）から選択され、また、前記少なくとも一つの生細胞は、動物細胞および／またはヒト細胞および／または植物細胞を含む第２リスト（ＩＩ）から選択される。
【０１４２】
好ましくは、前記生細胞は、原核細胞、真核細胞、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、例えば内皮細胞、神経細胞、リンパ芽球、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、幹細胞、胚細胞、脂肪細胞など、および特定の分子を発現するように設計された細胞を含む。
【０１４３】
第２の態様において、本発明はまた、細胞性物質、特にスポンジなどのスポンジ材料の製造方法であって、ヒドロゲルを得るために、本発明の第１の態様に関して提供した前記変法のいずれかに記載するヒドロゲルの製造方法を含み、さらに細胞性物質を形成するために前記第４ステップ（ｉｖ）またはステップ（ｖ）から得られるヒドロゲルに対して実施する凍結乾燥ステップを含む製造方法も提供する。
【０１４４】
好ましくは、前記凍結乾燥ステップは、凍結と、それに続く減圧雰囲気（reduced atmosphere）下で氷の昇華によって水和化合物を完全に乾燥させることができるステップである。
【０１４５】
変法では、粉末形態の孔形成剤を、前記ヒドロゲル製造法の前記第２ステップ（ｉｉ）の間に前記粉末混合物に添加する。
【０１４６】
この種類の孔形成剤は、酸性条件下、５以下のｐＨでガスに変換することができる任意の薬剤であり得、前記孔は、前記ヒドロゲルから漏れ出る二酸化炭素分子によって形成される。この種類の孔形成剤は、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびそれらの混合物であり得る。孔形成剤の前記重量割合は、前記第２ステップの前記粉末混合物の前記総重量に対して１％から１５％の間である。これらの化合物はSigma-Aldrichから入手可能である。
【０１４７】
先行技術において、前記細胞性物質は「多孔性スカフォールド」と呼ばれる。
【０１４８】
孔形成剤の前記濃度は、前記細胞性物質における前記孔の前記サイズに影響を及ぼす。前記細胞性物質における前記平均孔サイズは、好ましくは１μｍ以上かつ１０００μｍ以下であり、さらに好ましくは１００μｍから５００μｍの範囲内である。前記孔密度は４％から７５％の範囲内である。
【０１４９】
好ましくは、前記多孔質細胞性物質は柔軟かつ弾性である、すなわち損傷を受けることなく（特に裂けることなく）あらゆる方向に手で圧縮または伸張することができ、そして前記圧縮または伸張を解除した後、その当初の寸法に（またはその当初の寸法付近に）回復する傾向がある。
【０１５０】
好ましくは、前記細胞性物質は閉鎖した孔を含む。
【０１５１】
好ましくは、前記細胞性物質はフォームなどのスポンジ状構造を有する。
【０１５２】
この凍結乾燥ステップは、当該技術分野で公知である任意の設備を用いて実施することができる。凍結乾燥は、少なくとも９８％の水、少なくとも９９％の水、さらに好ましくは少なくとも９９．５％の水を除去するために十分な時間実施する。
【０１５３】
有利には、この凍結乾燥ステップは、例えば、前記ヒドロゲルを型に入れ、次いで所定の形状を有する前記ヒドロゲルを製造した後に、例えば予備凍結ステップを受けさせることによって実施する。
【０１５４】
変法では、細胞性物質の前記製造方法は、前記細胞性物質を１００℃以上の温度で少なくとも５分間、特に少なくとも６０分間、好ましくは１２０℃以上の温度で少なくとも５分間、特に少なくとも３０分間、さらに好ましくは１４０℃以上の温度で少なくとも５分間処理する熱処理ステップを含む。
【０１５５】
この熱処理ステップは、特に前記凍結乾燥ステップから得られる細胞性物質に対して実施する。
【０１５６】
この条件は、前記細胞性物質の機械的特性を非常に著しく改善し、同様に、特にその可溶化速度を減少させることによって水性媒体における弾性および挙動を非常に著しく改善する。
【０１５７】
有利には、前記圧縮強度も改善されることが観察された。手動で加えられた圧縮応力の影響下で、前記細胞性物質は圧縮されるが、応力が解除されると迅速にその当初の寸法および形状を回復する傾向がある。そのような性質は、前記乾燥細胞性物質に関して観察されるが、前記細胞性物質を水中に含浸させた。
【０１５８】
変法では、前記方法は、少なくとも一つの機能的薬剤および／または少なくとも一つの生細胞を含む溶液中に前記細胞性物質を含浸させるステップを含む。
【０１５９】
前記機能的薬剤は、特に生物活性剤である。
【０１６０】
有利には、前記機能的薬剤は、抗凝固剤、抗血栓剤、抗分裂剤、抗増殖剤、抗接着剤、抗遊走剤、接着促進剤、細胞増殖因子、抗寄生虫分子、抗炎症薬、ビタミン、ホルモン、タンパク質、抗真菌剤、抗菌分子、防腐剤、抗生物質（特に、シプロフロキサシンおよびクロルヘキシジン）、ニコチン、一つ以上の精油、ならびにそれらの混合物を含む第１リストから選択され（Ｉ）、そして前記少なくとも一つの生細胞は、動物細胞および／またはヒト細胞および／または植物細胞を含む第２のリスト（ＩＩ）から選択される。
【０１６１】
好ましくは、前記生細胞には、原核細胞、真核細胞、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、例えば内皮細胞、神経細胞、リンパ芽球、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、幹細胞、胚細胞、脂肪細胞など、および特定の分子を発現するように設計された細胞が含まれる。
【０１６２】
第３の態様において、本発明は、機能的薬剤の吸収および／または排出および／または遊離ならびに／あるいは少なくとも一つの生細胞を支持するための機器であって、
本発明の第１の態様に関する変法のいずれか一つに従って記載した方法を実施することによって得られるヒドロゲル、または、
本発明の第２の態様に関する変法のいずれか一つに従って記載した方法を実施することによって得られる細胞性物質、とを含む機器を提供する。
【０１６３】
有利には、前記機器は、注入されるヒドロゲルの所定の体積を受容する少なくとも一つのリザーバを含むシリンジと、少なくとも一つの機能的薬剤を送達できる、および／または創傷の排液ができるドレッシング材と、ニコチンなどの少なくとも一つの機能的薬剤を送達できるパッチとから選択される。
【０１６４】
特に、前記機能的薬剤は生物活性剤である。
【０１６５】
第４の態様において、本発明は、ヒドロゲルの前記製造のための本発明の第１の態様による前記変法のいずれか一つによる前記方法を実施するための機器であって、少なくとも、前記ステップ（ｉｉ）から得られる（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む前記混合物を受容する第１シリンジと、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）および／または前記化合物（Ｃ）の少なくとも一つのリン酸塩を含む酸性化水性媒体の所定の体積を受容する第２シリンジとを備える機器を提供し、前記機器は、少なくとも一つのヘキソースユニットもしくはヘキソース由来のユニットを含む少なくとも一つの化合物（Ｃ）、および／または前記化合物（Ｃ）の少なくとも一つのリン酸塩を含む前記酸性化水性媒体を、少なくとも（Ａ）粉末および（Ｂ）粉末を含む前記混合物と組み合わせることが可能になるような方法などで、前記第１および第２シリンジを流体連通にする手段を備える。
【０１６６】
前記流体連通の手段は、場合によって、前記第１シリンジおよび前記第２シリンジから取り外し可能であってもよく、好ましくは取り外し可能である。
【０１６７】
有利には、前記第１および第２シリンジはそれらの注入端部で流体連通の手段を介して流体連通し（例えば、Lueurタイプのフィッティング）、これによって前記第２シリンジの前記ピストンを用いて前記第１シリンジ中に少なくとも前記化合物（Ｃ）を含む前記酸性化水性媒体を導入させ、そして前記第１シリンジの前記ピストンによってその逆も同様である。
【０１６８】
前記ピストンを、ヒドロゲルが形成されるまで複数回作動させ、生じるせん断は前記キトサン粉末の溶解および前記アニオン性ポリマーとのイオン相互作用を促進して、安定で堅いヒドロゲルを形成させる。
【０１６９】
第５の態様によると、本発明は、本発明の第１の態様に関して記載した変法のいずれか一つに従った製造方法を実施することによって得られることを許容するヒドロゲルを提供し、前記ヒドロゲルは、有利には、
・少なくとも一つのシクロデキストリンおよび／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン包接複合体および／または少なくとも一つのシクロデキストリン誘導体の包接複合体を含む混合物を、
少なくとも一つの（ポリ）カルボン酸および／またはその対応する（ポリ）カルボン酸無水物（Ａ１）、または
少なくとも一つのピロリン酸塩（Ａ２）、または
少なくともエピクロロヒドリン重合させる反応によって得られるシクロデキストリンポリマー（Ａ）であって、得られたポリマーを次いでカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）（Ａ３）をグラフトするような方法で、カルボキシメチル化ステップに供されるシクロデキストリンポリマー（Ａ）と、
前記アミン官能基（ＮＨ２）を含むキトサン（Ｂ）と
を含む。
【０１７０】
好ましくは、前記シクロデキストリンポリマーは前記ファミリー（Ａ１）に属する。
【０１７１】
別法では、前記アニオン性ポリマー（Ａ）はカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）を含む。
【０１７２】
別法では、前記アニオン性ポリマー（Ａ）は少なくとも３ｍｍｏｌ／ｇのカルボン酸官能基（ＣＯＯＨ）を含む。
【０１７３】
好ましくは、前記ヒドロゲルを特徴とする前記第１から第４の態様のいずれか一つに関連して上記した変法および定義は、本発明の第５の態様による前記ヒドロゲルにもあてはまる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のヒドロゲル製造方法とは異なる方法によって得られたヒドロゲルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のヒドロゲル製造方法とは異なる方法によって得られたヒドロゲルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、前記製造法を実施することによって得られるヒドロゲルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、前記製造法を実施することによって得られるヒドロゲルを示す。
【図３】図３は、本発明の細胞性物質の弾性係数Ｇ’のグラフを示す。
【図４】図４は、縦座標の上方向に、様々な細胞性物１グラムあたりの吸収されたシプロフロキサシン（ＣＦＸ）の量をミリグラムで表したもの（ｍｇ／ｇ）を示すヒストグラムである。
【図５】図５は、図４で言及されているものに対応する、様々な細胞性物質の時間の関数としてのシプロフロキサシンの遊離に関するグラフを示すグラフである。
【図６】図６は、時間（分）の関数として、そして交互に適用される二つの応力ＡおよびＢについての本発明のヒドロゲル例の弾性係数および前記粘性係数Ｇ’およびＧ”における変化のグラフを示す。
【図７】図７は、それぞれ形成された１時間および２４時間後の、本発明のヒドロゲルの写真である。
【図８】図８は、それぞれ形成された１時間および２４時間後の、本発明のヒドロゲルの写真である。
【発明の詳細な説明】
【０１７５】
本発明は、本質的に非限定的である以下の実施例からよりよく理解できる。
【０１７６】
以下の化合物を使用した。
キトサン粉末（ＣＨＴ１）：Sigma Aldrichによって販売されている「キトサン−中間分子量」（中間Ｍｗ：４３１０００ｇ／ｍｏｌ）、ＣＡＳ番号：９０１２−７６−４、粉末形態、前記粘度は、１％酢酸中１％の濃度で、５６３．００ｃｐｓであり、前記脱アセチル化度は７５％以上、特に約７５％であった。
キトサン粉末（ＣＨＴ２）：Sigma Aldrichによって販売されている「キトサン−低分子量」（低Ｍｗ：３９０００ｇ／ｍｏｌ）、ＣＡＳ番号：９０１２−７６−４、粉末および／または顆粒の形態、前記粘度は１％酢酸中１％の濃度で９６ｃｐｓであり、前記アセチル化度は７５％以上であった。
キトサン粉末（ＣＨＴ３）：BioResourcesによって販売されている「キトサン−高分子量」（高Ｍｗ：１２５００００ｇ／ｍｏｌ）、ＣＡＳ番号：９０１２−７６−４、粉末および／または顆粒の形態、前記アセチル化度は７５％以上である。
【０１７７】
シクロデキストリンポリマー：ポリマーは以下のようにして合成した。４００ｇのβ−シクロデキストリン（Kleptose（登録商標）Roquette Freres、Lestrem、France）、４００ｇのクエン酸CAS77-92-9、Sigma Aldrich、Saint Quentin Fallavier、France）、および１２０ｇの次亜リン酸ナトリウム（Sigma Aldrich、Saint Quentin Fallavier、France）を２リットルの水溶液（蒸留水）中に溶解させる。この水溶液中の水を次いで真空下、６０℃にてロータリーエバポレータ中５８ｍｍＨｇ下で、固体混合物を得るために十分な時間、蒸発乾固させる。前記蒸発固体残留物を次いで真空下、１４０℃にて１２０分間加熱した。次いで、前記固体混合物を２リットルの蒸留水中に懸濁させた。この懸濁液を焼結ガラスでろ過した。前記不溶性ポリマーは前記フィルター中で回収され、大量の水で洗浄し、次いで周囲温度で１週間乾燥させた（例えば、６０℃にて２４時間換気オーブン中で乾燥を実施することも可能であった）。前記可溶性ポリマーを含む前記ろ液を６０００〜８０００ダルトン膜で５日透析し、次いで前記透析溶液を、ロータリーエバポレータを用いて濃縮した。前記精製フィルターを凍結し、次いでChrist凍結乾燥機を使用して−６３℃の温度にて真空下、０．０６ｍｂａｒで粉末形態の固体を得るために十分な時間凍結乾燥した。凍結乾燥の代替法として、前記精製ろ液を、例えばBuchi  Ｂ−２９０噴霧器を使用して霧化することもできた。
【０１７８】
７１ｇの可溶性シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）および３２０ｇの不溶性シクロデキストリンポリマー（Ｃｄｉ１）を得た。
【０１７９】
ポリ（アクリル）酸（ＰＡＡ）：Sigma Aldrich（登録商標）によって供給される製品コード（３２３６６７−２５０Ｇ）Ｍｗ＝１，８００およびＭｗ＝４５００００
【０１８０】
アルギン酸ナトリウム：製品コード（１８０９４７−５００Ｇ）、バッチ（０９６１１ＤＤ）、Sigma Aldrich（登録商標）
【０１８１】
リンゴ由来のペクチン（ポリ−Ｄ−ガラクツロン酸メチルエステル）：製品コード（７５２８２−５００Ｇ）、バッチ（ＢＣＢＧ４３９６Ｖ）、Sigma Aldrich（登録商標）
【０１８２】
乳酸：ＣＡＳ番号５０−２１−５、溶液の総容積に対して８５重量％から９０重量％の間の乳酸を含む、ＡＣＳ試薬等級、Sigma Aldrich（登録商標）。
【０１８３】
Ｉ−シクロデキストリンポリマー（Ｃｄｓ１またはＣｄｉ１）のＩＥＣ（イオン交換能）の測定、すなわち、シクロデキストリンポリマー１グラム当たりのミリモルで表したカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）の数の測定のための操作方式の説明
１００ｍｇのポリマー（ＣＤｓ１またはＣｄｉ１）を１００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌ溶液中に溶解させ、次いで標準的０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて着色指示薬としてのフェノールフタレインの存在下で測定した。通常のＩＥＣはポリマー（ＣＤｓ１またはＣｄｉ１）１グラムあたり約４ミリモルである。これは、１グラムあたり約５ミリモルのアミン基（約８０％のアセチル化度）を有するキトサンのＩＥＣに極めて近い。ゲル化現象はキトサンについておよびシクロデキストリンポリマーについての前記ＩＥＣの前記近接性に関連し（ファミリー（Ａ１）において）、あわせて、ゲルを形成するためのキトサンとシクロデキストリンポリマーとの割合に関連する。
【実施例】
【０１８４】
ＩＩ−本発明のヒドロゲルの調製例および比較例
ｗ／ｗで印をつけた割合は、添加した成分のヒドロゲルの総重量に対する重量比を表し、したがって、本発明の方法の第４ステップまたはステップ（ｖ）から得られる。
【０１８５】
実施例１：０．０４ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（２％ｗ／ｗ）および０．０５ｇ（２．５％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕（ｃｏ−ｍｉｌｌ）した。得られた粉末を１．８９ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した（前記溶液の即時ｐＨは３．５であり、これは４．１まで上昇した）。０．０２ｇの氷酢酸溶液を次に懸濁液に添加し（前記ｐＨは酸の添加中に３．２まで降下し、次いで５超まで再上昇した）、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られた。得られたヒドロゲルは８９％の水を含んでいた。
【０１８６】
実施例２：０．０４ｇ（２％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．０６ｇ（３％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．８８ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られた。得られたヒドロゲルは７２％の水を含んでいた。
【０１８７】
実施例３：０．０４ｇ（２％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．２０ｇ（１０％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．７４ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られた。得られたヒドロゲルは６０％の水を含んでいた。
【０１８８】
実施例４：０．０５ｇ（２．５％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．０６ｇ（３％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．８７ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られた。得られたヒドロゲルは９３％の水を含んでいた。
【０１８９】
実施例５：０．０２ｇ（１％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．０４ｇ（２％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．９２ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの１％酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。得られたゲルはコンパクトではなく、ゆっくりと流動する傾向があった。
【０１９０】
実施例６：０．０６ｇ（３％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．０４ｇ（２％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンコポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．８８ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの１％酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。最初の数秒の撹拌中に得られたゲルは非常にコンパクトであり、流動せず、成形することができた。
【０１９１】
実施例７：０．０４ｇ（２％ｗ／ｗ）のキトサン（ＣＨＴ１）および０．０２ｇ（ｌ％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．９２ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの１％酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。得られたゲルは流動する傾向があった。
【０１９２】
実施例８：０．０６ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）および０．０６ｇ（３％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．８６ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られ、これは均質であり、重力下では流動しなかった。
【０１９３】
実施例９：０．０６ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）および０．１ｇ（５％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末を１．８２ｇの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０２ｇの氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを２０秒間ボルテックス混合した。撹拌の最初の数秒後にコンパクトなゲルが得られ、これは均質であり、重力下では流動しなかった。
【０１９４】
実施例１０：キトサンがＣＨＴ２に関するものである以外は実施例８と同様であった。
【０１９５】
実施例１１：キトサンがＣＨＴ３に関するものである以外は実施例８と同様であった。
【０１９６】
実施例１０および１１に関して、得られたヒドロゲルは、堅く、コンパクトで均質であった。ひっくり返しても流動しなかった。
【０１９７】
実施例１２：前記キトサンの量が３％ｗ／ｗであり、前記シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）量が１０％ｗ／ｗである以外は実施例８と同様であった。前記ヒドロゲルは堅くコンパクトであったが、本発明で例示する他のヒドロゲルよりも粘性であり、濃厚であった。
【０１９８】
比較例１３：前記シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を市販のカルボキシメチルβシクロデキストリンナトリウム塩（Aldrich、参照２１９０６）と置換した以外は実施例８と同様であった。前記ヒドロゲルはひっくり返すと流動し、堅くなかった。
【０１９９】
実施例１４：前記シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）をＭｗ１８００のポリアクリル酸ポリマー（上記参照）と置換した以外は、実施例８と同様であった。
【０２００】
実施例１４Ａ：前記シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）をペクチン（上記参照）と置換した以外は、実施例８と同様であった。
【０２０１】
実施例１４Ｂ：前記シクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）をアルギン酸ナトリウム（上記参照）で置換した以外は、実施例８と同様であった。
【０２０２】
図７は、形成１時間後の実施例８、１４、１４Ａおよび１４Ｂの前記ヒドロゲルを示す。
【０２０３】
図８は、２４時間後の実施例８、１４、１４Ａおよび１４Ｂの前記ヒドロゲルを示す。これらのポリアニオンから形成されたヒドロゲルは堅く、形成の２４時間後でさえも流動しないことが観察された。
【０２０４】
実施例１５：前記キトサンポリマーを高分子量のポリアクリル酸ポリマー（Ｍｗ４５００００、上記参照）と置換した以外は、実施例８と同様であった。
【０２０５】
得られた実施例１４および１５のヒドロゲルは堅く、流動しなかった。
【０２０６】
実施例１６、対照：前記β−シクロデキストリンをマルトデキストリン（Ｄ１９のデキストロース当量値（１９繰り返しユニット）を有し、Roquetteにより商標Glucidex（登録商標）Ｄ１９として販売され、その線状分子構造は空洞を形成しない）と置換することによって使用するシクロデキストリンポリマーを合成した以外は実施例８と同様であった。前記形成されたゲルは堅く、流動しなかった。
【０２０７】
比較例１７：粉砕し、１２５μｍのオリフィスを有する篩で篩別した、０．３ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）を９．３ｍＬの体積の超純水（９３％ｗ／ｗ）中に溶解させ、これに０．１ｍＬの氷酢酸を添加し（１％Ｗ／Ｗ）、すべて約１００００回転／分（ｒｐｍ）にてUltra turrax（登録商標）ホモジナイザーで１分間混合した。次に、これもまた粉砕し、１２５μｍのオリフィスを有する篩で篩別した０．３ｇのシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１（３％ｗ／ｗ）を前記酸性キトサン溶液（ＣＨＴ１）に添加し、前記溶液を次いで約１００００ｒｐｍでUltra turrax（登録商標）ホモジナイザーを用いて１分間混合した。Ｇ’およびＧ”値から測定した前記ゲル化時間は５日であった。形成したゲルは、「液体」であり、塊があり、均質ではなく、成形に適していなかった（重力の作用下で流動した）。アニオン性ポリマー（ＣＤｓ１）を酸性キトサン溶液に添加することで、自立性形状を有する堅くコンパクトなヒドロゲルを形成することはできなかった。得られたヒドロゲルを図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａのヒドロゲルをその中で合成したポット中で、前記ヒドロゲルは壁を越えて流れ、従って堅くなかったことに留意されたい。図１Ｂ中、前記ヒドロゲルは、シリンジを用いて水平面上に堆積させた場合に得られるロープの形状を保持しなかった。
【０２０８】
比較例１８：未篩別および未粉砕の０．３ｇのキトサン粉末（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）ならびに未篩別および未粉砕の０．３ｇのシクロデキストリンポリマー粉末（ＣＤｓ１）（３％ｗ／ｗ）を、それらの粒度分布を減少させ、混合するために、乾式同時粉砕した。同時粉砕粉末混合物を９．３ｍＬの超純水（９３％ｗ／ｗ）に添加し、得られた水溶液を次いで２０秒間ボルテックス混合し、次いで０．１ｍｌ（１％ｖ／ｖ）の氷酢酸溶液を添加した。前記Ｇ’およびＧ”値から測定したゲル化時間は２時間半よりも長かった。前記ヒドロゲルの堅さは的確であったが、塊があった。
【０２０９】
比較例１９：粉砕し１２５μｍのオリフィスを有する篩で篩別した、０．３ｇのキトサン粉末（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）および粉砕し１２５μｍのオリフィスを有する篩で篩別した、０．３ｇの前記シクロデキストリンコポリマー粉末（ＣＤｓ１）（３％ｗ／ｗ）を同時粉砕した。同時粉砕粉末混合物を９．３ｍｌの超純水（９３％ｗ／ｗ）中に、Ultra turrax（登録商標）ホモジナイザーを用いて２０秒間約１００００ｒｐｍにて撹拌しながら懸濁させた。次に、０．１ｍｌ（１％ｖ／ｖ）の氷酢酸溶液を次いで前記懸濁液に添加し、Ultra turrax（登録商標）ホモジナイザーを用いて２０秒間、約１００００ｒｐｍでの撹拌下で混合した。Ｇ’およびＧ”値から測定したゲル化時間は２時間半よりも長かった。形成したゲルは良好なテクスチャーを有し、なめらかで、均質であり、堅く、つまり、重力の作用下で流動せず、あらかじめ決められた形状に成形することができた。このヒドロゲルを図２Ａおよび２Ｂに示す。前記ヒドロゲルは、ひっくり返した後に、ヒドロゲルをその中で製造した前記ポットの前記壁上を流動せず、ヒドロゲルはかなり堅いことが図２Ａからわかる。図２Ｂでは、前記ヒドロゲルはシリンジから出たときに付与されたロープ形状を保持したことが分かる。ヒドロゲルは均質で、なめらかで、流動しなかったこともわかる。
【０２１０】
実施例１７、１８および１９について測定されたゲル化時間は、Anton Paarによって販売されているものなどの動的機械的分光計を用いて２５℃の温度で、応力１００％、γ振幅１００％、角周波数ω１０ｓ−１で、時間の関数として確立された弾性係数および粘性係数Ｇ’およびＧ”のグラフから得られた。
【０２１１】
実施例２０：０．３ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）、０．３ｇ（３％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）および０．３ｇのヒドロキシアパタイト（３％ｗ／ｗ）、すなわち、粉末混合物の総乾燥重量の３３．３％を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末混合物を９ｍｌの超純水中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。次いで、０．０１ｍｌ（０．１％Ｗ／Ｗ）の氷酢酸溶液を懸濁液に添加し、これを４５秒間ボルテックス混合した。重力の影響下で流動しない、コンパクトで均質なゲルが得られた。
【０２１２】
グルコースを含む水性媒体を用いた実施例
実施例２７：０．３ｇのキトサン（ＣＨＴ１）（３％ｗ／ｗ）、０．３ｇ（３％ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）および０．３ｇのヒドロキシアパタイト（３％ｗ／ｗ）、すなわち、粉末混合物の総乾燥重量の３３．３％を乳鉢中で１分間同時粉砕した。得られた粉末混合物を、前記水性媒体の前記体積に対して前記グルコース重量の５体積％を含む９ｍｌの水性媒体中に懸濁させ、次いで１５秒間ボルテックス混合した。０．１ｍｌの８５％から９０％の濃乳酸溶液を次いで前記懸濁液に添加し、４５秒間ボルテックス混合した。前記ゲルを、シリンジを用いてＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）およびＰＢＳ型培地中にロープの形態に射出した。前記形成されたロープは堅く（スパチュラを用いて操作できた）かつ安定であった（その形成後１時間まで）。
【０２１３】
実施例２８：この実施例は、前記粉末混合物を受容する第１シリンジと、グルコースを含む前記酸性化水性媒体容積を含む第２シリンジと、前記第１および第２シリンジを流体連通にするための手段とを備えた機器を用いて、乳酸で既に酸性化させた、前記媒体の前記体積に対して５重量％のグルコースを含む前記水性媒体を用いて前記粉末混合物を製造する以外は、実施例２７と同様であった。前記第１および第２シリンジは流体連通し、それによって前記酸性化水性媒体に前記粉末混合物中を通過させることができるか、またはその逆も可能であった。この条件によって、前記粉末と前記水性媒体との混合の間にせん断が生じ、それによりヒドロゲルの前記形成を促進した。前記形成されたゲルを次いで、前記機器（前記第１または第２シリンジのみを保持する）を使用して、ＤＭＥＭ培地および生理的ＰＢＳ型培地中にロープの形態で射出した。前記ロープの堅さおよび安定性は実施例２７と比較して改善された。
【０２１４】
実施例２９：この実施例は、乳酸を塩酸（０．０３６Ｍ）と置換する以外は、実施例２８と同様であった。前記形成されたゲルを次いで、前記機器を使用してＤＭＥＭ培地および生理的ＰＢＳ型培地中にロープの形態で射出した。前記ロープの堅さおよび安定性は、実施例２７と比較して改善されたが、実施例２８について得られたものよりも劣っていた。
【０２１５】
ＩＩＩ-本発明による細胞性物質の製造
実施例２１：フォームなどのスポンジ状細胞性物質を形成するために、Christモデルアルファ１−２／ＬＤ凍結乾燥機を使用し、−６３℃の温度で真空下、０．０６ｍｂａｒにて少なくとも２４時間、実施例８の前記ヒドロゲルを凍結乾燥ステップに供した。膨潤度は、周囲温度の水中で６時間後に１７３９．０％であり、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１Ｍ）中、周囲温度で６時間後に４４５．０％であった（［（湿潤重量−乾燥重量）／乾燥重量］×１００）。
【０２１６】
実施例２２：細胞性物質を形成するために、実施例９の前記ヒドロゲルを、Christモデルアルファ１−２／ＬＤ凍結乾燥機を使用して−６３℃の温度にて真空下、０．０６ｍｂａｒで少なくとも２４時間、凍結乾燥ステップに供した。膨潤度は水中、周囲温度で６時間後に２６２．０％であり、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．３Ｍ）中、周囲温度で６時間後に３３６．０％であった（［（湿潤重量−乾燥重量）／乾燥重量］×１００）。
【０２１７】
実施例２３：実施例２１の前記細胞性物質を、容器中に１４０℃で１時間入れることからなる熱処理に供した。この熱処理によって、前記イオン結合を共有結合に、特にアミド結合に変換することにより前記細胞性物質を架橋させた。次いで、前記圧縮強度、すなわち前記細胞性物質の破砕強度が非常に著しく改善されたことが観察された。これは、実施例２１または２２の前記細胞性物質とは対照的に、実施例２３の前記細胞性物質を二本の指の間で押しつぶし、変形をやめると、その形状を準即時的に（quasi-instantaneously）その形状を回復することによって視覚的に観察された。実施例２２および２１の前記弾性係数Ｇ’のグラフを示す図３から、熱処理を受けた実施例２３の前記弾性係数Ｇ’は、実施例２１の前記弾性係数Ｇ’よりも有意に高かったことが分かる。
【０２１８】
実施例２４：前記ヒドロゲルを、１０％（ｗ／ｗ）のシクロデキストリンポリマー（ＣＤｓ１）を用いて合成したことを除いては実施例２１と同様。
【０２１９】
実施例２５、対照：実施例１６の前記ヒドロゲルを、細胞性物質を形成するために凍結乾燥ステップに供した。
【０２２０】
実施例２６：Christモデルアルファ１−２／ＬＤ凍結乾燥機を使用して細胞性物質を得るために、−６３℃の温度、０．０６ｍｂａｒの減圧下で少なくとも２４時間、実施例２０の前記ヒドロゲルを凍結乾燥ステップに供して、ヒドロキシアパタイト（３３．３％ｗ／ｗ）を含有する細胞性物質を得た。
【０２２１】
ＩＶ−細胞適合性の測定
実施例８で得られたヒドロゲルならびに実施例２１および２２の細胞性物質の細胞適合性をISO standard 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices Part 5 Tests for in vitro cytotoxicityに従って試験した。前記細胞生存度法を、アラマーブルー−抽出試験−Ｌ１３２細胞法（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ５）によって実施した。
【０２２２】
実施例８について測定された前記生存度は、１時間後で８０％であり、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１Ｍ）中で１時間上昇後は８４％であった。実施例２１について測定された値は９１％であり、１時間後の実施例２４については８５％であった。
【０２２３】
細胞毒性を、ＭＣ３Ｔ３細胞で上記したものと同じ標準を使用して測定し、前記対照はＴＣＰＳ（組織培養ポリスチレン）であった。実施例２８についての値は９０％程度であったが、この値は前記水性媒体がグルコースを含んでいない場合には６０％よりも低くなった（約５５％）。有利には、前記水性媒体がグルコースを含んでいた場合、細胞毒性は大幅に改善された。
【０２２４】
Ｖ−細胞性物質の含浸
４０ｍｇの実施例２１、２２、２４および２５の細胞性物質を、２ｍｇ／ｍｌのシプロフロキサシンを含む水溶液中に周囲温度にて２５０ｒｐｍで撹拌しながら４時間含浸させた。
【０２２５】
吸着されたシプロフロキサシンを抽出するために、前記処理した細胞性物質を３７℃で０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に２４時間入れた。前記細胞性物質の各々について吸収されたシプロフロキサシンの前記量（ｍｇ／ｇ）を測定するために、得られた溶液を、２７１ｎｍの波長でＵＶ分光光度法を用いて測定した。前記吸収グラフを図４に示す。各ヒストグラムの前記縦棒は標準偏差を表す。ここで、マルトデキストリンに基づく実施例２５の前記標準偏差は、シクロデキストリンに基づく他の実施例について測定されたものよりも高かったことに留意されたい。このことは、前記使用したデキストリンが疎水例空洞を有さず、したがって包接複合体を形成しない場合、前記活性成分の前記添加量（level of loading）がよりランダムになることを示す。実施例２１、２２および２４は、シクロデキストリンポリマーから得られた前記ヒドロゲルの前記吸着容量は前記ヒドロゲルの調製パラメータの関数として変化するが、相違は有意ではないことを示す。
【０２２６】
５００ｍｌのＰＢＳのリザーバから出発して、３０ｍＬ／分で３７℃の温度のＰＢＳ流れを、シプロフロキサシンで含浸させた細胞性物質３０ｍｇに注入することによって、シプロフロキサシンの遊離条件を閉回路で調査した。前記細胞性物質から出たＰＢＳの流れは、その後、遊離されたシプロフロキサシンの量を測定するＵＶ分光光度計（波長２７１ｎｍ）を通過し、前記流れは次に前記ＰＢＳリザーバへ方向を変えた。シプロフロキサシン遊離度（％）を上記で測定した前記吸着レベルに対して測定し、図４に示した。図５に示した前記シプロフロキサシン遊離度の前記グラフは、シプロフロキサシンの前記遊離プロファイルにおいて非常に有意な相違を示し、マルトデキストリンに基づく前記ポリマー（実施例２５）について非常に速く、そして実施例２１、２２および２４の前記細胞性物質については減速した。
【０２２７】
ＶＩ−本発明のヒドロゲルのrheofluidifying特性（実施例８）
【０２２８】
【表１】
2018519120.tif 000002
【０２２９】
図６に示す前記グラフは、二つの応力サイクルＡおよびＢ、ｔ０でＧ’（２３０Ｐａ）＞Ｇ”（１３０Ｐａ）、次いで応力Ａを４５分間適用して、Ｇ’の値がＧ”の値と一致するまでＧ’を減少させた、実施例８の前記ヒドロゲルの前記弾性係数および粘性係数Ｇ’およびＧ”における変化を示す。応力Ａを停止し、続いて応力Ｂをすぐに適用することで、Ｇ’を即座に増加させ、これによって前記実験の前記開始時の値（２００Ｐａ）に近い値に復帰した。応力Ｂ下で５分後、応力Ａを再度適用し、Ｇ’はその最小値に再度到達した。５分の期間にわたり連続３サイクルにわたる交互応力ＡおよびＢは係数Ｇ’において可逆的変化を示し、前記ヒドロゲルは前記適用された応力に応じて粘性または弾性型挙動を有することを意味する。この特徴は、rheofluidifying挙動を有する（したがってチキソトロピックである）材料の特徴である。この測定によって、前記ヒドロゲルは注入可能である、すなわちシリンジによって適用可能であるとみなす必要がある特徴を有することが示された：前記シリンジの前記ピストンを押す際に、前記ゲルはせん断力の作用によりニードルまたはカテーテル内で流動化し、移植（例えば骨欠損）のための部位で適所にきたら、前記ヒドロゲルは再度凝固し、適所にとどまるために十分な凝集性を回復する。
【０２３０】
ＶＩＩ−実施例２１および２３の前記細胞性物質の動的機械的熱分析（ＤＭＴＡ）
【０２３１】
【表２】
2018519120.tif 000003
【０２３２】
【表３】
2018519120.tif 000004
【０２３３】
上記表３は実施例２１および２３の細胞性物質（スポンジなど）の粘弾性結果を示す。２５℃での分析の２０分後、弾性係数（Ｇ’）は常に粘性係数（Ｇ”）よりも高いことが観察され、このことは、実施例２１および２３の両細胞性物質が弾性挙動を示すことを実証する。実施例２３の二つの係数Ｇ’およびＧ”は実施例２１の係数よりもはるかに高いことにも留意されたい。実施例２３で適用した熱処理はしたがって前記細胞性物質の前記機械的性能を改善した。したがって、この熱処理ステップの間に、前記分子内挙動が、おそらくはイオン結合の共有結合への変換のために修飾され、ある堅さを有する前記細胞性物質が得られると結論づけることができる。
【図１Ａ】
2018519120.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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