(57)【要約】  種々の嗜癖、障害および疾患状態の処置のためのＧＡＢＡ−ＡＴ阻害剤としてのシクロペンテンカルボン酸関連化合物。
2018531941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2018531941.tif 000017
〔式中、Ｒ１およびＲ２の各々は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択され、
ただしＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはその塩。
【請求項２】
前記アミノ置換基が（Ｓ）立体化学配置を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方がＦである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
式
【化２】
2018531941.tif 000018
〔式中、
Ｒ１およびＲ２の各々は独立して、ＨおよびＦから選択され、
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＦである〕
の化合物またはその塩。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２の各々がＦである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
前記アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
式
【化３】
2018531941.tif 000019
〔式中、
Ｒ１およびＲ２の各々は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択され、
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはその塩を提供すること；および
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ活性を調節するために十分な量の前記化合物をγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含む培地と接触させること
を含む、ＧＡＢＡ−ＡＴ活性を調節する方法。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方がＦである。請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記接触がインビボである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
嗜癖物質の摂取に応答性のドーパミンレベルを調節する方法であって、
請求項７に記載の化合物を提供すること；および
嗜癖物質の摂取に応答性のドーパミンレベルを調節するために十分な量の前記化合物をγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含む細胞培地と接触させ、それにより前記培地中のγ−アミノ酪酸を増加させること
を含む、方法。
【請求項１８】
Ｒ１およびＲ２の各々がＦである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記接触が前記細胞培地を含む哺乳動物対象との接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
処置を必要とする哺乳動物対象における過剰のドーパミン放出の処置を提供する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項７に記載の化合物を処置を必要とする哺乳動物対象に投与することを含み、
前記化合物は前記対象の海馬におけるγ−アミノ酪酸レベルを増加させ、ドーパミンレベルを調節し、それにより前記海馬におけるグルコース代謝を減少させるために十分な量である、物質嗜癖を処置するための方法。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ２の各々がＦである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
前記アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
コカイン、ヘロイン、アルコール、バルビツレート、アンフェタミン、カンナビス、メサドン、オピオイド、覚醒剤およびニコチン嗜癖の少なくとも１つについての前記対象の処置を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を調節する方法であって、
式
【化４】
2018531941.tif 000020
〔式中、
Ｒ１およびＲ２の各々は独立して、Ｈ、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはその塩を提供すること；および
オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を調節するために十分な量で、オルニチンアミノトランスフェラーゼを含む培地と接触させること
を含む、方法。
【請求項２９】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方がＦである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基およびそれらの組合せから選択される置換基を含む塩である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３１】
前記アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
前記接触がインビボである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ヒト肝細胞癌により発現されるオルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を減少させる方法であって、
式
【化５】
2018531941.tif 000021
〔式中、
Ｒ１およびＲ２はＨおよびＦから選択され、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＦである〕
の化合物またはその塩を提供すること；および
オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を減少させるために有効な量の前記化合物とオルニチンアミノトランスフェラーゼを発現する肝細胞癌を含む細胞培地と接触させ、それにより前記細胞培地におけるグルタミン酸産生を減少させること
を含む、方法。
【請求項３４】
Ｒ１およびＲ２の各々がＦである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が医薬組成物において提供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触がインビボである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触がヒト対象との接触である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるγ−アミノ酪酸レベルを増加させるために十分な量の請求項７に記載の化合物を、処置を必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、精神障害および神経障害の処置のための方法。
【請求項３９】
前記神経障害がてんかん、部分発作、複合部分発作、二次的全身痙攣、強直間代発作、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損（ＳＳＡＤＨＤ）、ウエスト症候群における乳児けいれん、レノックス・ガストー症候群、結節性硬化症、トゥレット症候群、運動障害、線維筋痛症、神経障害性疼痛、てんかん関連片頭痛、むずむず脚症候群および心的外傷後ストレス障害、嗜癖、肥満、強迫観念障害およびアルツハイマー病ならびにそれらの組合せから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
精神障害が全般性不安障害、病的または強迫性賭博障害、過食症、身体醜形障害、心気症、病的身だしなみ状態、窃盗症、放火症、注意欠陥多動性障害および衝動制御障害ならびにそれらの組合せから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１およびＲ２の各々がＦである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が医薬組成物で提供される、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月９日に出願された出願番号第６２／２３９，３３０号の優先権およびその利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に包含させる。
【０００２】
本発明は国立衛生研究所により与えられたＲ０１  ＤＡ０３０６０４の下、政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
中枢神経系における主な阻害性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、シナプス前抑制ニューロンから放出され、クロライド選択的イオンチャネル受容体（ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＣ）およびＧタンパク質共役受容体（ＧＡＢＡＢ）に結合してシナプス後膜を過分極化させ、それによりニューロン活性を下方制御する。低レベルのＧＡＢＡは、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびコカイン嗜癖を含む多くの神経障害と関連する。
【０００４】
ＧＡＢＡ作動性薬物はＧＡＢＡの分泌および伝達を改善する薬物である。ファミリーとしてのこれらの薬物は線維筋痛症、ニューロパシー、てんかん関連片頭痛、むずむず脚症候群および心的外傷後窮迫障害を含む広範な種々の神経障害を処置するために使用される。ＧＡＢＡ作動性薬物はＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢ受容体リガンド、ＧＡＢＡ再取り込み阻害剤、ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼ阻害剤、ＧＡＢＡアナログまたはＧＡＢＡ自体を含む分子を含む。
【０００５】
１９９８年、ＧＡＢＡを分解するピリドキサル５’−ホスフェート（ＰＬＰ）依存性酵素、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ−ＡＴ）の活性を阻害することによるコカイン嗜癖の処置のための新規な戦略が開発された。ＧＡＢＡ−ＡＴ阻害はＧＡＢＡ量を上昇させ、コカインおよび他の乱用薬物に対する神経化学的応答である核側坐（ＮＡｃｃ）におけるドーパミンの迅速な放出と拮抗する。それ以来、抗てんかん薬物として現在使用されるＦＤＡに承認された唯一のＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化剤であるビガバトリンはコカイン、ニコチン、メタンフェタミン、ヘロインおよびアルコールについての動物モデルにおける嗜癖の処置において成功を収めている。ビガバトリンはまた、ヒトにおけるコカイン嗜癖の治療に有効であり、９週間の二重盲検試験において、最大２８％の患者が離脱を達成した。しかしながら、てんかんの患者の２５〜４０％でビガバトリンの長期投与から生じる永久的な失明が報告されているため、一般的な治療用途のためのビガバトリンの可能性には問題があり得る。
【０００６】
近年、現在ＣＰＰ−１１５と称される（１Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ジフルオロメチレニル−１−シクロペンタン酸がデザインされ、合成され、ＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化においてビガバトリンより１８６倍有効であることが見出された（Pan, Y.; Qiu, J.; Silverman, R. B.  J. Med. Chem.  2003, 46 (25), 5292 5293）。乳児けいれんのマルチプル・ヒット（multiple-hit）ラットモデルにおいて試験したとき、ＣＰＰ−１１５はビガバトリンで使用した用量より＞１００倍低用量でけいれんを抑制し、より長期のけいれん抑制をもたらした。ＣＰＰ−１１５はまた、ビガバトリンよりもはるかに大きな安全域および極めて低い網膜毒性傾向を有する。自由行動ラットにおいて試験したとき、２０ｍｇ／ｋｇのコカイン投与後、ＣＰＰ−１１５は、ＮＡｃｃにおけるドーパミン放出の減少においてビガバトリンより＞３００倍強力であった（Silverman, R. B.  J. Med. Chem.  2012, 55 (2), 567-575; Pan, Y.; Gerasimov, M. R.; Kvist, T.; Wellendorph, P.; Madsen, K. K.; Pera, E.; Lee, H.; Schousboe, A.; Chebib, M.; Braeuner-Osborne, H.; Craft, C. M.; Brodie, J. D.; Schiffer, W. K.; Dewey, S. L.; Miller, S. R.; Silverman, R. B. J. Med. Chem. 2012, 55 (1), 357-366）。また、コカイン嗜癖のラットに対して、コカインとともにＣＰＰ−１１５を１ｍｇ／ｋｇで投与すると、嗜癖行動の排除において、コカインとともに３００ｍｇ／ｋｇのビガバトリンを投与したときと同様の効果を示した。
【０００７】
最初は、ＣＰＰ−１１５は酵素との共有結合付加体をもたらすであろうマイケル付加機構によりＧＡＢＡ−ＡＴを不活性化するようにデザインされた。しかしながら、後にＣＰＰ−１１５は、得られた代謝物における２つのカルボキシレート基と活性部位のＡｒｇ１９２およびＡｒｇ４４５の強力な静電相互作用により酵素と強固に結合した錯体を形成することにより、酵素を不活性化することが発見された（スキーム１）（Lee, H.; Doud, E. H.; Wu, R.; Sanishvili, R.; Juncosa, J. I.; Liu, D.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B. J. Am. Chem. Soc., 2015, 137 (7), 2628-2640）。代謝はＣＰＰ−１１５とリシン結合ＰＬＰのシッフ塩基形成から始まり、γ−プロトン除去および互変異性化が続き、マイケルアクセプターを生じる。但し、Ｌｙｓ−３２９がこのマイケルアクセプターの攻撃が可能となる前に、ジフルオロメチレニル基の触媒的加水分解が起こり、コンホメーション変化してＡｒｇ１９２およびＡｒｇ４４５と強固に結合するＰＬＰ結合ジカルボキシレート代謝物をもたらす（スキーム１）。さらに、分子モデリングは互変異性化によるジフルオロメチレニル基の動きを示し、当該基はＬｙｓ−３２９から離れて曲がり、求核攻撃のためには遠くなり過ぎる（スキーム１）。その代わりに、酵素が恐らく当該ジフルオロメチレニル基の加水分解を触媒する。
【化１】
2018531941.tif 000003
【発明の概要】
【０００８】
前記を考慮して、本発明の目的はＧＡＢＡ−ＡＴの選択的阻害のための化合物、組成物および関連する使用方法を提供し、それにより上記で説明した欠点および短所を含む先行技術の種々の欠点および短所を克服することである。本発明の１以上の態様は特定の目的を達成し得るが、１以上の他の態様は特定の他の目的を達成し得ると当業者により理解される。それぞれの目的は、あらゆる点で、本発明の全ての態様に同等に適用されないことがある。従って、以下の目的は本発明の何れかの態様に関して他の方法で見ることができる。
【０００９】
本発明の目的は、選択的アミノトランスフェラーゼ阻害を示す１以上の小分子、非ペプチド化合物を提供することであり得る。
【００１０】
本発明の別の目的は、１以上の哺乳動物の疾患状態を示す条件下、インビトロでの使用および試験のために１以上のこのような化合物を提供することであり得る。
【００１１】
あるいは、本発明の目的はまた、このような疾患状態のインビボ処置を可能にする１以上のこのような化合物を提供することである。
【００１２】
本発明の目的はまた、単独でまたは１以上の前記目的と合わせて、ＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化、阻害もしくは調節および／または嗜癖および関連適応症の処置のための化合物または組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の目的はまた、単独でまたは１以上の前記目的と合わせて、ＯＡＴ不活性化、阻害もしくは調節および／または限定されないが、肝細胞癌を含む悪性病的増殖障害の処置のための化合物または組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の目的はまた、単独でまたは１以上の前記目的と合わせて、本明細書に記載の神経障害または精神障害を含む広範な神経障害または精神障害の処置のための化合物または組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的、特徴、利益および利点は本概要およびこのような化合物、組成物および／または方法の特定の実施態様の以下の記載から明らかであり、本明細書に記載の合成技術を有する当業者に容易に明らかである。このような目的、特徴、利益および利点は上記から、本明細書に包含される添付の実施例、データ、図面および引用文献を、そこから導き出される全ての推論とともに合わせて明らかとなる。
【００１６】
一部において、本発明は式
【化２】
2018531941.tif 000004
〔式中、
Ｒ１およびＲ２は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはこのような化合物の塩に関し得る。限定されないが、特定の実施態様において、アミノ置換基を含む立体中心は（Ｓ）立体化学配置を有し得る。
【００１７】
一部において、本発明は式
【化３】
2018531941.tif 000005
〔式中、
Ｒ１およびＲ２はＨおよびＦから選択でき、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＦであり得る〕
の化合物またはこのような化合物の塩に関し得る。特定の実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。限定されないが、特定のこのような実施態様において、アミノ置換基を含む立体中心は（Ｓ）立体化学配置を有し得る。
【００１８】
一部において、本発明は式
【化４】
2018531941.tif 000006
〔式中、
Ｒ１およびＲ２はＨおよびＦから選択でき、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＦであり得る〕
の化合物またはこのような化合物の塩に関し得る。ある非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００１９】
あるいは、本発明の化合物または本発明と合わせて有用な化合物は、立体化学的または立体配置的な制限がない。下に説明するおよび記載するように、このような化合物および／またはそれらの誘導体は、一塊のエナンチオマーまたはラセミ混合物として利用可能であり、そこから異性体が分割され得る。従って、任意の立体中心は（Ｓ）または（Ｒ）であり得る。分離考察として、モノ置換メチレニルの実施態様に関して、このような化合物はＺまたはＥ配置を有し得る。別の分離考察として、種々の化合物は一部または完全にプロトン化された酸塩として存在し得る。特定のこのような実施態様において、アンモニオ置換基に関して、対イオンはプロトン酸の共役塩基であり得る。特定のこのようなまたは他の実施態様において、カルボキシレート置換基に関して、対イオンはアルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムカチオンであり得る。さらに、任意の１以上の本発明の化合物は、処置方法または医薬に関する使用のための薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物の一部として提供され得ると当業者に理解される。
【００２０】
一部において、本発明はＧＡＢＡ−ＡＴ活性を減少させ、阻害し、調節し、またはその他の方法でそれに作用する方法に関し得る。このような方法は式
【化５】
2018531941.tif 000007
〔式中、Ｒ１およびＲ２は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはこのような化合物の塩を提供すること；およびγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含む培地とそのような化合物を接触させることを含む方法を含み得て、このような化合物はアミノトランスフェラーゼ活性を減少させ、阻害し、調節し、またはその他の方法でそれに作用するために十分な量であり得る。このような方法は、このような化合物をこのようなアミノトランスフェラーゼに結合させ、および／または不活性化し、このような培地中でγ−アミノ酪酸レベルを上昇または調節し得る。そのような接触はインビトロまたはインビボであり得る。あるいは、本発明は嗜癖による負荷を有する処置を必要とする対象における低レベルのγ−アミノ酪酸を処置するための方法であると考えられ得る。いずれにしても、特定の非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００２１】
一部において、本発明はまた、嗜癖物質の摂取に応答性のドーパミンの放出または上昇を減少させ、阻害し、調節し、またはその他の方法でそれに作用する方法に関し得る。このような方法は、式
【化６】
2018531941.tif 000008
〔式中、Ｒ１およびＲ２は独立してＨおよびＦから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＦであり得る〕
の化合物またはこのような化合物の塩を提供すること；およびγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含む細胞培地に化合物を接触させることを含み得て、このような化合物はこのような嗜癖物質の成分または嗜癖行動に応答性のドーパミンレベルを減少させ、阻害し、調節し、またはその他の方法でそれに作用するために十分な量である。このような方法はそれによりγ−アミノ酸レベルを上昇させ、ドーパミンレベルを調節および／または制御し得る。あるいは、本発明は嗜癖により誘発されたおよび／またはその他により処置の必要がある対象における過剰なドーパミン放出を処置するための方法として考えられ得る。いずれにしても、特定の非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００２２】
一部において、本発明は処置を必要とする哺乳動物対象における物質嗜癖、例として、限定されないが、コカイン、ヘロイン、アルコール、バルビツレート、アンフェタミン、カンナビス、メサドン、オピオイド、覚醒剤およびニコチン嗜癖ならびにそれらの組合せを処置する方法もまた示し得る。このような方法は式
【化７】
2018531941.tif 000009
〔式中、Ｒ１およびＲ２はＨおよびＦから選択でき、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はＦである〕
の化合物またはこのような化合物の塩をこのような対象に投与することを含み得て、このような化合物は、コカイン、ヘロイン、アルコール、バルビツレート、アンフェタミン、カンナビス、メサドン、オピオイド、覚醒剤およびニコチンならびにそれらの組合せを摂取した対象の海馬におけるγ−アミノ酪酸レベルを増加させおよび／またはドーパミンレベルを調節／制御するのに十分な量である。このような方法はそれにより海馬グルコース代謝を減少させ得る。特定の非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００２３】
一部において、本発明はＯＡＴ活性を減少させる、阻害する、調節するまたあるいはそれに作用する方法に関し得る。このような方法は式
【化８】
2018531941.tif 000010
〔式中、Ｒ１およびＲ２は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＨではない〕
の化合物またはこのような化合物の塩を提供すること；およびオルニチンアミノトランスフェラーゼを含む培地とこのような化合物を接触させることを含み得て、このような化合物はアミノトランスフェラーゼ活性を減少させ、阻害し、調節するまたあるいはそれに作用するために十分な量であり得る。このような接触はインビトロまたはインビボであり得る。いずれにしても、特定の非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００２４】
一部において、本発明はまた、肝細胞癌により発現されるルニチンアミノトランスフェラーゼの活性を減少させる方法に関し得る。このような方法は式
【化９】
2018531941.tif 000011
〔式中、Ｒ１およびＲ２は独立してＨおよびＦから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＦであり得る〕
の化合物またはこのような化合物の塩を提供すること；およびオルニチンアミノトランスフェラーゼを発現した肝細胞癌を含む細胞培地にこのような化合物を接触させることを含み得て、このような化合物はオルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を調節するまたは減少させるために十分な量である。そのような方法はそれによりこのような培地におけるグルタミン酸産生を減少させる。いずれにしても、特定の非限定的な実施態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【００２５】
一部において、本発明はまた、精神障害および神経障害の処置のための方法に関し得る。このような方法は式
【化１０】
2018531941.tif 000012
〔式中、Ｒ１およびＲ２は独立してＨおよびＦから選択でき、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方はＦであり得る〕
の化合物またはこのような化合物の塩を処置を必要とする哺乳動物に投与することを含み得て、このような化合物はこのような対象におけるγ−アミノ酪酸レベルを上昇させるために十分な量である；限定されないが、精神障害および神経障害は本明細書に記載されるものから選択され得る。特定の非限定的態様において、Ｒ１およびＲ２はＦであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】互変異性化後のＰＬＰ−ＣＰＰ−１１５付加体（右）およびＰＬＰ−１付加体（左）ならびに重要な近位残基のイン・シリコモデル。
【図２Ａ−Ｂ】（Ａ）１によるＧＡＢＡ−ＡＴの時間および濃度依存的阻害。（Ｂ）１のｋｉｎａｃｔおよびＫＩ値を決定するための濃度に対するｋｏｂｓの二次的プロット。
【図３Ａ−Ｂ】２４時間インキュベート後のＣＰＰ−１１５（Ａ）および４時間インキュベート後の１（Ｂ）による不活性化ＧＡＢＡ−ＡＴの再活性化。
【図４】１によるＡｓｐ−ＡＴの濃度依存的阻害。
【図５】１によるＡｌａ−ＡＴの濃度依存的阻害。
【図６Ａ−Ｂ】（Ａ）１によるＯＡＴの時間および濃度依存的阻害。各濃度に対するｋｏｂｓ（傾斜）値を得るための各阻害剤濃度でのプレインキュベートに対して残存ＯＡＴ活性の自然対数をプロットした。ｋｏｂｓは各阻害剤濃度での不活性化を表す速度定数である。（Ｂ）１についてのミカエリス・メンテンプロット。非線形回帰分析を用いてｋｏｂｓ値を適合させ、阻害定数（ＫＩ）および酵素不活性化の速度定数（ｋｉｎａｃｔ）を得た。
【図７】１によるｈＥＲＧチャネルの阻害（ｈＥＲＧ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、検出方法：自動化パッチクランプ）：試験濃度、上０Ｅ−７Ｍ；中間０Ｅ−６Ｍ；および下０Ｅ−５Ｍ。
【図８】１によるミクロソームシトクロムＰ４５０の阻害。
【図９Ａ−Ｂ】ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）における（Ａ）テルフェナジンおよび（Ｂ）１の時間依存的減少。
【図１０Ａ−Ｃ】対照（Ａ）；および１１Ｃ−ラクロプリド摂取に対するコカインまたはニコチン（Ｂ）ならびに１の急性投与およびコカインまたはニコチン（Ｃ）の効果のＰＥＴデジタル画像
【図１１Ａ−Ｂ】海馬における代謝要求の増加に対する（Ａ）コカインおよび（Ｂ）コカインおよび１の効果を示すＰＥＴデジタル画像の統計的パラメーターマップ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
特定の実施態様の詳細な説明
本発明の特定の実施態様に関連して、ＧＡＢＡ−ＡＴを用いたコンピューターモデリングは、シクロペンタン環立体配座が環内二重結合の導入により固定されると、互変異性化後にＣＰＰ−１１５のジフルオロメチレニル基がＬｙｓ−３２９に近接する（ＣＰＰ−１１５が７．０Åに対して、１については５．４Å、図１）ことを予想外に示した。従って、本発明は（Ｓ）−３−アミノ−４−（ジフルオロメチレニル）シクロペント−１−エン−１−カルボン酸（１）およびその構造変化体、ＧＡＢＡ−ＡＴおよび非ＧＡＢＡ作動性オフターゲットを用いたその生物学的評価およびＮＡｃｃにおけるドーパミン放出に関する自由行動ラットにおけるインビボ活性、ならびに神経グルコース代謝に対するその効果に関し得る。
【００２８】
ＣＰＰ−１１５ヒドロクロライドから出発する１の合成をスキーム２に示す。カルボン酸およびアミノ基をまず保護し、その後メチルエステルのα−プロトンをＫＨＭＤＳにより脱プロトン化し、フェニルセレニルクロライドの付加により、分離不能な７：３のジアステレオマー混合物（４）を得た。保護基を除去して６を得た。６の純度が１の最終純度に重要であることが分かった。温和な条件下での６のフェニルセレニル基の酸化的脱離は、綺麗な１０：６の１および２異性体混合物を与えた。クロマトグラフィーによる２から１を分離する多数の試みは成功しなかったが、その過程で２は１よりも不安定であることが分かった。穏やかなチオール求核試薬（２−メルカプト安息香酸）を用いた反応性の高い２を選択的に修飾および除去する戦略はうまく進行した。１９Ｆ  ＮＭＲにより反応が完了したことを確認した後、Ｃ−１８逆相カラムクロマトグラフィーを使用して純粋な１を得た。本発明の種々の他の化合物または本発明と合わせて有用な化合物は、当業者によりおよび本発明を知る者により理解されるように、スキーム２に提供される種類の合成技術またはその単純な変法を用いて対応する３−アミノ−４−メチレニルシクロペンタン−１−カルボン酸から製造され得る。
【化１１】
2018531941.tif 000013
【００２９】
インビトロ予備試験の結果は、１が極めて強力なＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化剤であることを示した。不活性化が極めて迅速に起こるため、１によるＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化についての阻害定数（ＫＩ）および酵素不活性化の速度定数（ｋｉｎａｃｔ）は、ＣＰＰ−１１５について元々報告された非最適条件下であっても、従来のキッツ−ウィルソンレプロットを用いて正確に決定できなかった。代わりに、最近開発された進度曲線分析法を用いて動力学定数を測定したが、これは最適条件下での測定を可能とした（Salminen, K. A.; Leppaenen, J.; Venaelaeinen, J. I.; Pasanen, M.; Auriola, S.; Juvonen, R. O.; Raunio, H.  Drug Metab. Dispos.  2011, 39 (3), 412-418）。基準としてＣＰＰ−１１５の速度定数を測定するために同様の方法を用いた。結果は１がＣＰＰ−１１５よりも高いＧＡＢＡ−ＡＴに対する結合親和性を有し（１およびＣＰＰ−１１５のＫＩ値はそれぞれ、９．７μＭおよび５９μＭであった）、１はＣＰＰ−１１５よりも速い速度でＧＡＢＡ−ＡＴを不活性化する（１およびＣＰＰ−１１５のｋｉｎａｃｔ値はそれぞれ、３．３２ｍｉｎ−１および２．０５ｍｉｎ−１であった）ことを示した。全体で、１についての効率定数（ｋｉｎａｃｔ／ＫＩ＝３４２ｍＭ−１ｍｉｎ−１）はＣＰＰ−１１５（ｋｉｎａｃｔ／ＫＩ＝３４．９ｍＭ−１ｍｉｎ−１）についての効率定数より９．８倍大きく；従って、１はＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化剤としてＣＰＰ−１１５より９．８倍有効である。
【００３０】
１はＬｙｓ−３２９と不可逆的な共有結合を形成するようにデザインされたため、機構が不可逆的および／または可逆的阻害を含むかどうかを試験するためにＧＡＢＡ−ＡＴの時間依存的再活性化を実施した。１０当量の１を４時間インキュベートすることによりＧＡＢＡ−ＡＴを完全に不活性化した後、不活性化酵素を透析し、種々の時間間隔で一定量を回収し、酵素活性の回復をアッセイした。透析の７２時間後、１により不活性化されたＧＡＢＡ−ＡＴの酵素活性は一部回復し、２０％で安定化した（図３Ｂ）。ＧＡＢＡ−ＡＴの同じ時間依存的再活性化がＣＰＰ−１１５について先に実施されており、１００当量のＣＰＰ−１１５で２４時間インキュベートすることによりＧＡＢＡ−ＡＴを完全に不活性化させ、その後透析したとき、酵素活性は４０％まで回復した（図３Ａ）。１０倍濃度およびはるかに長いインキュベーション時間であっても、ＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化では、ＣＰＰ−１１５は１よりもはるかに効果が低かった。１により不活性化されたＧＡＢＡ−ＡＴからの少量の酵素活性の回復は、不活性化が不可逆的要素および可逆的要素の双方を含み得ることを示す。
【００３１】
ビガバトリンと異なり、ＣＰＰ−１１５はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐ−ＡＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａ−ＡＴ）のようなオフターゲット酵素を不活性化および阻害しないと報告されており、これがビガバトリンよりもはるかに大きな安全域に貢献できたはずである。従って、これらのオフターゲット酵素に対する１の活性を試験した。結果は、１がＩＣ５０＞４ｍＭを有する、Ａｓｐ−ＡＴおよびＡｌａ−ＡＴ双方の極めて弱い可逆性阻害剤であることを示した（図４および５）。別の重要なＰＬＰ依存性オフターゲット酵素はオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）であり；高レベルのＯＡＴは尿素経路によるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼによるアンモニアの解毒を障害する。ＣＰＰ−１１５は０．１１６ｍＭのＫＩ値および０．０９７ｍｉｎ−１のｋｉｎａｃｔ値を有する中程度のＯＡＴの不活性化剤であると報告されている。化合物１は０．００３３ｍＭのＫＩ値および０．０２５ｍｉｎ−１のｋｉｎａｃｔ値を有する強力な不活性化剤であることもまた示された（図６）。１のｋｉｎａｃｔ／ＫＩ値（７．６ｍＭ−１ｍｉｎ−１）をＣＰＰ−１１５のｋｉｎａｃｔ／ＫＩ値（０．８４ｍＭ−１ｍｉｎ−１）と比較することにより、１はＣＰＰ−１１５よりも９．０倍有効なＯＡＴ不活性化剤であり、ＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化剤としてのより高い効率と一致する。
【００３２】
ｈＥＲＧは、心拍を調整する心臓の電気的活動に寄与するカリウムイオンチャネルである。このチャネルは薬物結合に対して感受性であり、細胞膜を通して電流を流すその能力が損なわれたとき、潜在的に致命的な心臓への悪影響をもたらし得る；従って、薬物開発の間に、ｈＥＲＧ阻害を回避することが重要である。ＣＰＰ−１１５と同様、１はｈＥＲＧチャネル活性を阻害しない（図７）。
【００３３】
ミクロソームシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は全ての薬物代謝の約７５％を占める薬物代謝に関与する主要な酵素である。従って、ミクロソーム安定性試験はしばしば、薬物開発の間に薬物の排出が急速過ぎるかどうかを予測するために実施される。ＣＰＰ−１１５のように、１は薬物代謝（図８）における反応の約９５％に関与する７種の最も一般的なＣＹＰ（１Ａ、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６および３Ａ）を阻害または誘導しない。血漿タンパク質結合はわずか２７％であり、血漿中の高い割合の遊離薬物を示す。
【００３４】
化合物１はヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）におけるその代謝安定性についてもまた、評価された。これは１をミクロソームとともにインキュベートし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて経時的消失をモニタリングすることにより達成した。陽性対照として、テルフェナジンを同様の条件で評価した。結果は１がＨＬＭ中で９０分間安定であったことを示した（図９）。
【００３５】
薬物嗜癖は、嗜癖物質が摂取されたときのＮＡｃｃにおけるドーパミン放出により生じる。自由行動ラットにおけるドーパミン放出に対する１の効果は、インビボマイクロ陽電子放出断層撮影（ｍｉｃｒｏＰＥＴ）画像診断を用いて決定した（図１０）（Dewey, S. L.; Morgan, A. E.; Ashby, C. R.; Horan, B.; Kushner, S. A.; Logan, J.; Volkow, N. D.; Fowler, J. S.; Gardner, E. L.; Brodie, J. D. Synapse 1998, 30 (2), 119 129）。中枢神経系、特に高濃度のドーパミンＤ２受容体（図１０の各画像の中央の２つの灰色陰影のスポットにより確認される）が存在する場所である線条体において、［１１Ｃ］−ラクロプライドはシナプス後ドーパミン末端上に位置する同一の受容体部分に対してドーパミンと競合する。シナプスドーパミンレベルにおけるコカイン誘導性またはニコチン誘導性増加により引き起こされるドーパミン受容体からの微量の［１１Ｃ］−ラクロプライドの解離を測定するために、ＭｉｃｒｏＰＥＴを使用した（コカインおよびニコチンを用いて同様の画像が得られた）。動物がコカイン（ｎ＝８）またはニコチン（ｎ＝６）を受けたとき、線条体ドーパミンレベルが急速に上昇した（Dewey, S. L.; Chaurasia, C. S.; Chen, C. E.; Volkow, N. D.; Clarkson, F. A.; Porter, S. P.; Straughter-Moore, R. M.; Alexoff, D. L.; Tedeschi, D.; Russo, N. B.; Fowler, J. S.; Brodie, J. D.  Synapse 1997, 25 (4), 393-398）。図１０Ｂに見られるように（中間枠；スポットは灰色陰影がはるかに少ない）、この上昇により［１１Ｃ］−ラクロプライドは効率的に受容体から外される。同一の動物が（異なる日に）コカインまたはニコチンの前に１を受けたならば、結合している［１１Ｃ］−ラクロプライドにおける変化はなく（図１０Ｃ、下枠）；スポットの陰影の程度は対照と同等であり（図１０Ａ、上枠）、結合している［１１Ｃ］−ラクロプライドと効率的に競合するドーパミンレベルにおける増加が存在しなかったことを示す。従って、１はドーパミンにおけるコカイン誘導性またはニコチン誘導性増加の双方をブロックする。
【００３６】
標識ラクロプライド試験に加えて、［１８Ｆ］−２’−フルオロ−２’−デオキシ−Ｄ−グルコース（１８ＦＤＧ）およびｍｉｃｒｏＰＥＴはまた、グルコース代謝におけるコカイン誘導性増加に対する１の局所的効果を試験するためにも使用された。１８ＦＤＧは、グルコースと同様ニューロン（またはヒト身体のあらゆる細胞）に取り込まれるグルコースのアナログである。しかしながら、１８ＦＤＧがリン酸化された後、対応する６’−ホスフェートは解糖経路においてさらに代謝を受けることができず、細胞内に残存する。結果的に、ヒトＰＥＴ試験は脳をマッピングするために１８ＦＤＧを数十年間使用している。例えば、ＰＥＴスキャナー中の個体が、１８ＦＤＧの静脈内点滴を受けながら、特定の課題を片手で実施するならば、脳内のその課題を実施するその手の能力の根底となるニューロンは、この放射性標識された糖を取り込むが、他の周辺のニューロンは取り込まない。ヒトまたはラットがコカインのような精神刺劇薬を摂取したとき、ドーパミンがシナプスからあふれ、シナプス後ニューロンを激しく興奮させる。この神経的興奮はグルコースの形態でエネルギーを必要とし、結果として特定の脳領域で脳グルコース代謝が増加する。自由行動ラットにおけるグルコース代謝におけるコカイン誘導性増加に対する１の効果は、統計的パラメトリックマッピングを用いて決定され、コカインのみの動物に由来する全ての画像を一緒に合わせ、その後１およびコカインを摂取した動物から得られた画像と比較した。統計的閾値（ｐ＜０．００００１）を設定し、２つの条件の間で統計的に異なる全ての画素を示す画像である統計的パラメトリックマップを作成し、ラット脳のＭＲＩに重ねた（図１１）。コカインのみの動物において、海馬における高い活性化、左右対称構造が各側に１つの大きな灰色のスポットとともに観察された（図１１Ａ、左）。コカイン／１の動物においては、海馬の活性化が全く起こらなかった（図１１Ｂ、右）。これは本試験および関連試験のもとで観察された化合物の摂取による最も大きな減衰である：ビガバトリンおよびＣＰＰ−１１５は以前に同様の試験で調べられており、それらは双方とも線条体ドーパミンにおけるコカイン誘導性増加をブロックしたが、１のように海馬代謝を完全にはブロックしなかった。
【００３７】
線条体ドーパミンのコカイン誘導性およびニコチン誘導性増加は、動物が特定の環境を当該動物が受ける薬物と関連付ける「学習」をもたらす条件付け場所嗜好性（ＣＰＰ）を生じさせることが知られている。線条体が（コカインまたはニコチン暴露後）ドーパミンレベルの上昇により活性化されたとき、海馬への投射によりそれが活性化される。海馬は空間記憶において極めて重要な役割を果たし；従って、それは薬物曝露中に環境条件をエンコードするために重要である。１は線条体ドーパミンのコカイン誘導性増加をブロックするため、海馬における増加した代謝要求もまた阻害することは驚くべきことではない。
【００３８】
本発明の種々の他の実施態様と関連付けできるように、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）は、ＰＬＰ依存性酵素のＧＡＢＡ−ＡＴと同一の進化的サブグループに属する。これらの２つの酵素は高い構造同一性を共有し、全てのアミノトランスフェラーゼと同様、極めて類似した触媒機構もまた有する。同時係属の出願番号１４／９３６，１５３でより詳細に記載されるように、ＯＡＴは肝臓、腎臓、小腸、脳および眼を含む多くの組織で発現され、オルニチンおよびα−ケトグルタル酸のＬ−グルタミン酸セミアルデヒド（これはΔ１−ピロリン−５−カルボン酸へ環化する）およびＬ−グルタミン酸への可逆的変換を触媒する。Ｌ−グルタミン酸はその後、グルタミンシンセターゼによりＬ−グルタミンへ変換される。
【００３９】
グルタミンは体内で最も豊富な遊離アミノ酸であり；正常細胞および新生物細胞双方の増殖に不可欠である。しかしながら、腫瘍細胞は正常細胞より効率的にグルタミンを取り込み、グルタミンにより腫瘍増殖が促進される（例えば、Souba, W. W. Glutamine and cancer.  Ann. Surgery 1993, 218, 715-728; Medina, M. A. Glutamine and cancer.  J. Nutr. 2001, 131 (9 Suppl), 2539S-2542Sを参照）。グルタミンに関して、癌細胞は増殖を刺激する同化プロセスを支えるためのグルタミンに対する増加した要求を有する点で、それら自体を正常細胞と区別する（前記の２０１５年１１月９日に出願された’１５３出願は、その全体を参照により本明細書に包含させる）。
【００４０】
ＯＡＴとＧＡＢＡ−ＡＴ間の構造類似性のため、ＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化剤の一部はまたＯＡＴも不活性化することが示されている。以下に示すとおり、本発明の化合物はまた、ＯＡＴ活性を調節する、減少させるおよび／または阻害するために使用できる。より具体的には、このような化合物が、限定されないが、肝細胞癌を含む悪性病的増殖障害の処置に有用であることを示すために、前記の、包含される’１５３出願に詳述された方法およびプロトコルが使用され得る。
【００４１】
本発明の種々の他の実施態様と関連付けできるように、ＧＡＢＡ−ＡＴ阻害剤は、限定されないが、全般性不安障害、病的もしくは強迫性賭博障害、過食症（肥満）、身体醜形障害、心気症、病的身だしなみ状態、窃盗症、放火症、注意欠陥多動性障害および衝動制御障害を含む精神障害ならびに限定されないが、てんかん、乳児けいれん、てんかん、部分発作、複合部分発作、二次的全身発作、強直間代発作、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損（ＳＳＡＤＨＤ）、ウエスト症候群における乳児けいれん、レノックス・ガストー症候群、結節性硬化症、トゥレット症候群、運動障害、線維筋痛症、ニューロパシー、てんかん関連片頭痛、むずむず脚症候群、心的外傷後ストレス障害およびアルツハイマー病を含む神経障害ならびにそれらの組合せの処置に有効であることが示されており、このような処置はおよびその全体を参照により本出願に包含させる米国特許出願番号８，９６９，４１３号に記載されている。従って、本発明の化合物はまた、そのような障害を処置するために使用され得る。より具体的には、限定されないが、このような化合物が上記の神経障害および精神障害を含む神経障害および精神障害の処置に有用であることを示すために、’４１３特許に詳細に記載され、包含される方法およびプロトコルが使用され得る。
【００４２】
当業者により理解されるように、本発明の方法はまた、本明細書に記載の種類の化合物および生理学的にまたは他の面で適切な製剤を含む医薬組成物を使用するか、またはそれと連動する方法に拡張されるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書で担体として集合的に称する１以上の生理学的に耐容されるまたは許容される希釈剤、担体、アジュバントまたは溶媒とともに組成物に製剤化された１以上の上記ＧＡＢＡ−ＡＴまたはＯＡＴ不活性化剤化合物を含む。このような接触または投与に適切な組成物は生理学的に耐容される無菌水溶液もしくは非水溶液、分散剤、懸濁剤またはエマルジョン剤を含み得る。得られる組成物は、本明細書に記載の様々な方法と合わせて、投与するまたは細胞培地および／またはその中に発現したあるいは他の方法で存在するＧＡＢＡ−ＡＴまたはＯＡＴと接触させるためであり得る。医薬組成物と併用であろうとなかろうと、「接触（contacting）」は、ＧＡＢＡ−ＡＴまたはＯＡＴと１以上の不活性化剤化合物が、このような不活性化剤化合物を酵素に結合させるおよび／または複合させる目的で合わせられることを意味する。このようなアミノトランスフェラーゼに対して有効な化合物の量は経験的に決定でき、そのような決定をすることは当分野の技術の範囲内である。ＧＡＢＡ−ＡＴまたはＯＡＴ活性の調節、阻害あるいは他の方法で影響を与えることは、ＧＡＢＡ−ＡＴ活性および／またはドーパミン放出、あるいはＯＡＴ活性と、グルタミン酸産生、細胞増殖および／または腫瘍増殖の減少および／または軽減ならびに消失の双方を含む。
【００４３】
投与量は特定の不活性化剤化合物の活性、疾患状態、投与経路、処置期間および医療および医薬分野で既知の同様の要因とともに変化することは、当業者により理解される。一般に、適切な用量は、治療的または予防的効果を生ずるために最も低い有効用量である。所望ならば、そのような化合物、その薬学的に許容される塩または関連組成物の有効用量は、適切な時期にわたり別個に投与される、２以上の分割用量で投与され得る。
【００４４】
医薬製剤または組成物の製造方法は、１以上の不活性化剤化合物を担体および場合により１以上のさらなるアジュバントまたは成分と混合する段階を含む。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されているような標準的な医薬製剤技術が利用され得る。
【００４５】
組成物であるか製剤であるかにかかわらず、当業者は医薬を投与に適切なものとすると考えられる対応する要因およびパラメーターとともに、医薬投与のための種々の方法を認識する。従って、１以上の非限定的な実施態様について、本発明は種々の疾患状態の処置、特にＧＡＢＡ−ＡＴについては、嗜癖および物質嗜癖ならびに関連する適応症を含む神経障害および精神障害、またはＯＡＴについては肝細胞癌の処置またはその予防における治療的使用のための医薬の製造のための、１以上の不活性化剤化合物の使用を提供する。
【実施例】
【００４６】
本発明の実施例
以下の非限定的な実施例およびデータは、種々のＧＡＢＡ−ＡＴおよび／またはＯＡＴ不活性化剤化合物を含む本発明の化合物／組成物および／または方法に関する種々の態様および特徴を示し、本明細書に記載の合成方法により利用可能である。先行技術と比較して、本発明の化合物および方法は、それらに対して驚くべき、予期しないおよび正反対の結果およびデータを提供する。本発明の有用性は、本発明に包含され得る数種の化合物および置換基の使用により説明されるが、本発明の範囲に相応し、結果は種々の他の化合物および置換基でも同等の結果が得られると当業者により理解される。
【００４７】
一般的方法
ＣＰＰ−１１５はCatalyst PharmaceuticalsのためにIRIX Pharmaceuticalsで合成されており、それが恵与され；他の化学物質はSigma-Aldrichから入手し、特に明記しない限り、受領したまま使用した。全ての合成は、特に断らない限り、火炎乾燥した器具を用いておよび空気に敏感な物質の取扱における標準的な技術を利用して、アルゴン雰囲気中、無水条件下で実施した。全ての溶媒は使用前に蒸留し、アルゴンまたは窒素雰囲気下で保存した。1H NMRおよび13C NMRスペクトルは、26℃でAgilent 5mm HFX プローブを用いて、Bruker AVANCE III 500 スペクトロメーター、Agilent DDR2 400MHz スペクトロメーターまたはAgilent DD2 500MHz スペクトロメーターでDMSO-d6またはD2Oを溶媒として用いて測定し、δ(ppm)で記録し、DMSO-d6(1H NMRについては2.50ppm、13C NMRについては39.52ppm)またはD2O(1H NMRについては4.79ppm)を基準とした。高分解能質量スペクトル(HRMS)はAgilent 6210 LC-TOF (ESI, APCI, APPI)質量スペクトロメーターで測定した。
【００４８】
実施例１
メチル  （１Ｓ，３Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（ジフルオロメチレニル）シクロペンタン−１−カルボキシレート（３）
０℃で、乾燥メタノール（２７ｍＬ）にアセチルクロリド（２．４９ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）を添加して１０分間撹拌した。得られた溶液にＣＰＰ−１１５塩酸塩（１、１．５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間撹拌した。その後トリエチルアミン（６．８ｍＬ、４９ｍｍｏｌ）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．９ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに再溶解した。有機溶液を２Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて白色固体（１．９９ｇ、６．８３ｍｍｏｌ、９７％）として３を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ６．８９（ｓ、１Ｈ）、４．５７（ｓ、１Ｈ）、３．６３（ｓ、３Ｈ）、２．８６（ｍ、１Ｈ）、２．５５−２．５１（ｍ、１Ｈ）、２．２３（ｄｄｔ、Ｊ＝１０．０、７．１、２．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．７９（ｍ、１Ｈ）、１．３９（ｓ、９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７３．７４、１５４．７８、１５２．８０、１５０．５４、１４８．２７、９２．１２、９１．９８、９１．８４、７７．８６、５１．７２、４９．４５、４０．３１、３６．５１、２８．３１、２８．１６．；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  −８９．４９（ｄ、Ｊ＝５５．９Ｈｚ）、−９２．８９（ｄ、Ｊ＝５７．７Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）Ｃ１３Ｈ１９Ｆ２ＮＮａＯ４についての計算値３１４．１１７４、実測値３１４．１１７９。
【００４９】
実施例２
メチル（３Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（ジフルオロメチレニル）−１−（フェニルセレニル）シクロペンタン−１−カルボキシレート（４）。
−７８℃で、ＫＨＭＤＳ（１Ｍ  ＴＨＦ溶液、１４．９６ｍＬ、１４．９６ｍｍｏｌ）および乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に３（１．９８ｇ、６．８０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液をシリンジでゆっくりと滴下した。反応混合物を−７８℃で９０分間撹拌した。フェニルセレニルクロリド（１．４３ｇ、７．４８ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）溶液を添加し、−７８℃で７５分間撹拌した。その後反応混合物を０℃に昇温し、０℃で３時間撹拌し、室温に昇温し、室温で２時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを添加した。有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、蒸発させて粗製の混合物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、淡褐色シロップ状物質（４、２．１２ｇ、４．７５ｍｍｏｌ、７０％）として５：２  ジアステレオマー混合物を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．５８−７．３７（ｍ、５Ｈ）、６．９７（ｓ、１Ｈ）、４．８３（ｓ、０．７Ｈ）、４．４７（ｓ、０．３Ｈ）、３．６４（ｓ、２．２Ｈ）、３．５７（ｓ、０．８Ｈ）、２．９６−２．８８（ｍ、１Ｈ）、２．６８−２．６３（ｍ、０．７Ｈ）、２．４３−２．３６（ｍ、０．７Ｈ）、２．２３−２．１４（ｍ、１．３Ｈ）、２．００−１．９５（ｍ、０．３Ｈ）、１．３９（ｓ、９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７２．０９、１７１．９６、１５４．４１、１５３．７６、１５１．４８、１５０．６４、１４９．２１、１３６．７９、１３６．７６、１２９．４８、１２９．２８、１２８．９１、１２８．８４、１２６．５３、１２６．２０、９１．００、９０．９１、９０．８５、９０．７６、９０．７０、９０．６１、７７．８８、５９．３８、５２．１１、５１．８５、５１．８４、５０．０１、４８．６４、４２．７２、４０．６７、３５．７６、３４．１７、３４．１５、２７．９０、２７．５５．；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  −８８．２９（ｄ、Ｊ＝５１．２Ｈｚ）、−８９．３４（ｄ、Ｊ＝５２．９Ｈｚ）、−９１．００（ｄ、Ｊ＝５４．８Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）  Ｃ１９Ｈ２３Ｆ２ＮＮａＯ４Ｓｅについての計算値４７０．０６５４、実測値４７０．０６６０（最も豊富なＳｅ同位体を選択した）。
【００５０】
実施例３
（３Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（ジフルオロメチレニル）−１−（フェニルセレニル）シクロペンタン−１−カルボン酸（５）
０℃で、４（１．４０ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）のメタノール（１４ｍＬ）および水（４ｍＬ）溶液に、水酸化リチウム（２２５ｍｇ、９．３９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温し、２０時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機溶液を１０％クエン酸および塩水で洗浄した。有機層をその後Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗製の混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）に供し、５を白色粉末（１．２５ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、９２％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １２．６１（ｓ、１Ｈ）、７．６４−７．５４（ｍ、２Ｈ）、７．４６−７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．４１−７．３５（ｍ、２Ｈ）、６．９４（ｓ、１Ｈ）、４．８１（ｓ、０．７Ｈ）、４．４８（ｓ、０．３Ｈ）、２．９７−２．８３（ｍ、１Ｈ）、２．６７−２．５６（ｍ、０．７Ｈ）、２．３５（ｄｄ、Ｊ＝１６．９、２．７Ｈｚ、０．７Ｈ）、２．２０−２．１０（ｍ、１．３Ｈ）、１．９１（ｄｄ、Ｊ＝１２．９、８．３Ｈｚ、０．３Ｈ）、１．４２−１．３５（ｍ、９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７３．７６、１７３．５６、１５４．７１、１５４．６４、１５３．９３、１５１．６５、１５０．６９、１４９．３８、１３６．８７、１３６．８１、１２９．６０、１２９．３９、１２９．２０、１２９．１４、１２７．０６、１２６．５５、９１．６７、９１．５２、９１．４０、９１．３７、９１．２６、９１．１１、７８．０６、５２．３８、４９．９９、４８．６９、４８．４２、４２．９５、４０．６８、３６．０８、３４．２６、２８．１５；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ、６０℃、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  −８８．５２（ｄ、Ｊ＝５２．９Ｈｚ）、−８９．５３（ｄ、Ｊ＝５３．２Ｈｚ）、−９１．２５（ｄ、Ｊ＝５３．２Ｈｚ）、−９１．４５（ｄ、Ｊ＝５５．３Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）  Ｃ１８Ｈ２１Ｆ２ＮＮａＯ４Ｓｅについての計算値４５６．０５０２、実測値４５６．０４９８（最も豊富なＳｅ同位体を選択した）。
【００５１】
実施例４
（３Ｓ）−３−アミノ−４−（ジフルオロメチレニル）−１−（フェニルセレニル）シクロペンタン−１−カルボン酸（６）
０℃で、５（１．３１ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１３ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（３．２ｍＬ）を添加し、反応物を同じ温度で４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、乾燥させた。粗製の残渣をカチオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８、溶出剤として５％ピリジン水溶液）に供し、灰白色固体（９９０ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ、９８％）として６を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  ７．７０−７．６３（ｍ、２Ｈ）、７．５３−７．４６（ｍ、１Ｈ）、７．４５−７．４０（ｍ、２Ｈ）、４．６１（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、０．７Ｈ）、４．４４（ｍ、０．３Ｈ）、３．０２−２．８４（ｍ、１．３Ｈ）、２．７１−２．５７（ｍ、１Ｈ）、２．４９（ｄｄ、Ｊ＝１４．７、７．８Ｈｚ、０．７Ｈ）、２．２９（ｄｄ、Ｊ＝１４．７、７．４Ｈｚ、０．７Ｈ）、２．０９（ｄｄ、Ｊ＝１４．４、５．３Ｈｚ、０．３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  １８２．３６、１８１．６３、１５８．５２、１５８．０５、１５６．２３、１５５．７６、１５３．９３、１５３．４６、１４０．１８、１３９．９９、１３２．６１、１３２．５５、１３２．２５、１３２．２０、１２９．９６、１２９．６５、９１．４８、９１．４２、９１．３３、９１．２６、９１．２２、９１．１３、９１．０７、６０．００、５８．３９、５２．１３、５２．０９、５２．０３、４４．２８、４３．３８、３８．９１、３８．３０；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  −８４．０６（ｄ、Ｊ＝４２．６Ｈｚ）、−８４．３８  −  −８４．５８（ｍ）、−８４．７２（ｄｄｄ、Ｊ＝４５．２、４．５、２．４Ｈｚ）、−８５．０８（ｄｄｄ、Ｊ＝４４．６、５．８、２．７Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）  Ｃ１３Ｈ１４Ｆ２ＮＯ２Ｓｅについての計算値３３４．０１５８、実測値３３４．０１５５（最も豊富なＳｅ同位体を選択した）。
【００５２】
実施例５
（Ｓ）−３−アミノ−４−（ジフルオロメチレニル）シクロペント−１−エン−１−カルボン酸ヒドロクロリド（１）
０℃で、６（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（５５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の水（２ｍＬ）溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム（７１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、６時間撹拌した。反応混合物をカチオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８、溶出剤：２Ｎ  ＨＣｌ）にアプライし、粗製の混合物を得た。粗製の混合物をＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（水／メタノール）に供し、１および２の混合物を白色粉末（６２ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、９６％）として得た（注意：サンプルを濃縮するとき、溶液が強酸性であることを確実にするために一定量の２Ｎ  ＨＣｌを添加した）。０℃で、１および２の混合物（５１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のメタノール（２ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）溶液に、チオサリチル酸（１１２ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温に昇温させ、５時間撹拌した。反応が完了したことを１９Ｆ  ＮＭＲにより確認した後、反応混合物を濃縮し、水を添加した。懸濁液を綿栓によりろ過し、ろ液をＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（水／メタノール）に供し、白色粉末（２３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、先の異性体混合物における１の含有量から７６％）として１を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  ６．２９（ｓ、１Ｈ）、５．１６（ｓ、１Ｈ）、３．３７（ｍ、２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  １７４．４２、１５８．０５、１５５．７６、１５３．４６、１５０．０８、１３２．０６、８９．８０、８９．６４、８９．５９、８９．４３、５７．８４、５７．７９、３４．８５．；１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  −８３．８６（ｄｄｄ、Ｊ＝４２．８、６．０、３．２Ｈｚ）、−８４．１２（ｄｄｄ、Ｊ＝４３．０  ４．９、２．７Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｍ−Ｈ−）  Ｃ７Ｈ６Ｆ２ＮＯ２についての計算値１７４．０３７２、実測値１７４．０３７４；ＨＰＬＣ純度（２１０ｎｍのＵＶ吸光度より１００％、ＥＬＳＤより１００％）。
【００５３】
実施例６
ＨＰＬＣによるサンプル純度の分析
可変波長検出器（Ｇ１３１４Ａ）、サーモスタット付きカラムコンパートメント（Ｇ１３１６Ａ）、オートサンプラー（Ｇ１３２９Ｂ）、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ、Ｇ４２６１Ａ）、クォータナリポンプ（Ｇ１３１１Ｂ）およびＣ−１８逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０、２．７μｍ、４．６ｍｍｘ５０ｍｍ）から成るＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣ系を使用した。実験は５μＬ（水に０．５ｍｇ／ｍＬ）注入で実施し、サンプル溶出を２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によりおよび線形勾配実験（０．０５％  トリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリル、勾配系：開始２％アセトニトリル〜１００％アセトニトリル（７分）、その後１００％アセトニトリル（３分））のＥＬＳＤによりモニタリングした。
【００５４】
実施例７
分子モデリング
全てのレンダリングはPyMol.（Koo, Y. K.; Nandi, D.; Silverman, R. B.  Arch. Biochem. Biophys.  2000, 374 (2), 248 254）において実施された。コンピュータシミュレーションは先に記載のようにして実施した（Silverman, R. B.; Bichler, K. A.; Leon, A. J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118 (6), 1241 1252）。手短に言えば、リガンド（共因子との付加体として）をR.E.D.サーバーを用いて調製し、ＡＭＢＥＲプログラムのＡｎｔｅｃｈａｍｂｅｒモジュールを用いてトポロジーファイルに変換した（Yuan, H.; Silverman, R. B.  Bioorganic Med. Chem.  2006, 14 (5), 1331-1338）。次いで非互変異性化分子を、Ａｕｔｏｄｏｃｋ  ４．２を用いて可動性側鎖としてのＬｙｓ３２９を有するＧＡＢＡ−ＡＴ（ｐｄｂエントリー１ＯＨＷから調製）の活性部位とドッキングさせた。最良のドッキング構造をその後、ＧＲＯＭＡＣＳ  ４．５を用いて精密化した。シーケンスは、エネルギー最小化、分子力学（４ｎｓ）、および最終エネルギー最小化を含んだ。この段階で、構造は互変異性化が起こり、分子力学シークエンスを再び実施した。最終アウトプット構造を、さらなる精密化をすることなく評価に使用した。
【００５５】
実施例８
酵素およびアッセイ
先に記載の方法（Koo, Y. K.; Nandi, D.; Silverman, R. B.  Arch. Biochem. Biophys.  2000, 374 (2), 248 254）により、ＧＡＢＡ−ＡＴ（１．４８ｍｇ／ｍＬ）をブタの脳から精製した。既知の方法を用いて、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）を商業的に入手可能なＳＳＤＨおよびＧＡＢＡ−ＡＴの混合物であるＧＡＢアーゼから精製した（Silverman, R. B.; Bichler, K. A.; Leon, A. J.  J. Am. Chem. Soc.  1996, 118 (6), 1241 1252）。公知の方法を用いて、ＧＡＢＡ−ＡＴ活性をアッセイした（Scott, E. M.; Jakoby, W. B.  J. Biol. Chem.  1959, 234 (4), 932-936）。ＧＡＢアーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens））およびコハク酸セミアルデヒドをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。最終アッセイ溶液は１０ｍＭ  ＧＡＢＡ、１．２ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および過剰のＳＳＤＨ（５０ｍＭ  ピロリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５）から構成された。３４０ｎｍ、２５℃でＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの変換により引き起こされるＵＶ吸光度の変化をモニタリングした。ｋｉｎａｃｔおよびＫＩ値の決定のための酵素アッセイを、幅１ｍｍ、経路長１０ｍｍ、高さ４５ｍｍのマイクロクォートキュベットを用いて、島津ＵＶ−１８００  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で記録した。ＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化および透析実験についての酵素アッセイをＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダーで記録した。
【００５６】
実施例９
ｋｉｎａｃｔおよびＫＩ値の決定
１については１〜２００μＭの範囲、およびＣＰＰ−１１５については５０〜１６００μＭの範囲で、種々の濃度の不活性化剤存在下、酵素およびアッセイのセクションに記載の条件下でＧＡＢＡ−ＡＴ活性を測定した。不活性化によりもたらされたＧＡＢＡ−ＡＴ活性の曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ＴＭソフトウェアを用いて式（１）：
【数１】
2018531941.tif 000014
〔式中、
ｖｉは初期速度であり、
ｖｓは定常速度であり、
ｔは時間であり、
ａ０は初期吸光度であり、そして
ｋｏｂｓは観測された不活性化速度である〕
に適合され、各不活性化剤濃度でｋｏｂｓ値を得た（Salminen, K. A.; Leppanen, J.; Venalainen, J. I.; Pasanen, M.; Auriola, S.; Juvonen, R. O.; Raunio, H. Drug Metab. Dispos. 2011, 39 (3), 412 418）。ｋｏｂｓ値を化合物濃度に対してプロットし、最良に適合する曲線を、その後式（２）：
【数２】
2018531941.tif 000015
〔式中、
［Ｉ］は不活性化剤濃度であり、
Ｓは適用される基質（ＧＡＢＡ）濃度であり、
Ｋｍは当該基質（ＧＡＢＡ）のミカエリス−メンテン定数である〕
に適合させてＫＩおよびｋｉｎａｃｔ値を得た。計算に用いたＧＡＢＡ−ＡＴのＧＡＢＡのＫｍ値は１．３ｍＭであった（Yuan, H.; Silverman, R. B., Bioorganic Med. Chem. 2006, 14 (5), 1331-1338）。
【００５７】
実施例１０
１によるＧＡＢＡ−ＡＴの不活性化および不活性化酵素の透析
先に報告の方法（Lee, H.; Doud, E. H.; Wu, R.; Sanishvili, R.; Juncosa, J. I.; Liu, D.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B.  J. Am. Chem. Soc.  2015, 137 (7), 2628-2640）に従って、透析実験を行った。ＧＡＢＡ−ＡＴおよび不活性化剤の最終濃度をそれぞれ１μＭおよび１０μＭにするために、ＧＡＢＡ−ＡＴ緩衝液（０．１４８ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ）に５０μＬの１６μＭの不活性化剤緩衝溶液（５０ｍＭ  ピロリン酸カリウム、ｐＨ８．５、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を添加した。対照としての別の実験において、不活性化剤を含まない同量のＧＡＢＡ−ＡＴ緩衝液溶液を調製した。サンプル溶液を暗所で、室温で４時間インキュベートした。溶液から５μＬ採取することにより、残りの酵素活性を測定した。不活性化および対照ＧＡＢＡ−ＡＴ溶液をＤ−ＴｕｂｅＴＭ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ（ＭＷＣＯ  １２−１４ｋＤａ）に移し、４℃で透析緩衝液（３５０ｍＬ、５０ｍＭ  ピロリン酸カリウム、ｐＨ８．５、０．１ｍＭ  α−ケトグルタル酸、０．１ｍＭ  ピリドキサル５’−ホスフェート）に透析した。透析緩衝液を４時間、８時間および２４時間で３回交換した。酵素活性を４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間で測定した。
【００５８】
実施例１１
１によるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの阻害
マイクロタイタープレートウェルに、ｐＨ７．４の１００ｍＭ  リン酸カリウム、５．５５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、１．１１ｍＭ  ＮＡＤＨ、５．５５ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸塩、１１．１単位のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、および種々の濃度の１を含むアッセイ混合物（９０μＬ）を入れた。室温で数分間混合物をインキュベートした後、１０μＬのＡｓｐ−ＡＴ（ｐＨ７．４の１００ｍＭ  リン酸カリウムに３．０単位／ｍＬ）を添加した。プレートを室温で１分間振盪し、吸光度を６秒ごとに９０分間、３４０ｎｍで測定した。全てのアッセイは二連で実施した（図４）。
【００５９】
実施例１２
１によるアラニンアミノトランスフェラーゼの阻害
Ｌ−アラニンが基質として使用され、乳酸デヒドロゲナーゼが酵素であったことを除いて、アッセイはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いたアッセイと同一であった（図５）。
【００６０】
実施例１３
１によるオルニチンアミノトランスフェラーゼの時間依存的および濃度依存的阻害
これらのアッセイはＪｕｎｃｏｓａ、ＬｅｅおよびＳｉｌｖｅｒｍａｎによる方法を変更して実施した。ＯＡＴ（０．２５μｇ）を、総容積２０μＬで１ｍＭ  α−ケトグルタル酸を含むｐＨ８．０の１００ｍＭ  ピロリン酸カリウム緩衝液中の種々の濃度（０．５μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）の１と、室温でインキュベートした。一定時間間隔で、ｐＨ８．０の１００ｍＭ  ピロリン酸カリウム緩衝液中のＰＹＣＲ１（０．５  μｇ）、１２．５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．０３ｍＭ  ＰＬＰおよび２５ｍＭ  Ｌ−オルニチンを含む、３７℃で１０分間プレインキュベートしたアッセイ溶液（８０μＬ）を、インキュベート混合物に添加し、３７℃で２０分間、ＯＡＴ活性についてアッセイした。全てのアッセイは二連で実施し、各阻害剤濃度で、各プレインキュベーション時間の残存ＯＡＴ活性を平均化した。残存ＯＡＴ活性の割合の自然対数を各阻害剤濃度でプレインキュベーション時間に対してプロットして、各濃度に対するｋｏｂｓ（傾斜）値を得た。ｋｏｂｓは各阻害剤濃度での不活性化を表す速度定数である。非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ＴＭ；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて、ｋｏｂｓを阻害剤濃度に対して再プロットした。ＫＩおよびｋｉｎａｃｔを式（３）から概算した（図６）。
【数３】
2018531941.tif 000016
〔式中、
不活性化の最大速度であり、
ＫＩは半最大不活性化に必要な阻害剤濃度であり、
［Ｉ］は１のプレインキュベーション濃度である〕
【００６１】
実施例１４
ｈＥＲＧチャネルの阻害
本実験はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐａｎｌａｂｓ社（レドモンド、ＷＡ９８０５２、アメリカ合衆国）により実施された。ｈＥＲＧ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を使用した。試験濃度は０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭであった。インキュベーション時間は室温で累計５分であった。検出方法は自動化ホールセルパッチクランプを使用した。本実験は二連で実施し、テール電流の％阻害を平均化した（図７）。
【００６２】
実施例１５
ミクロソームシトクロムＰ４５０の阻害
本実験はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐａｎｌａｂｓ社（レドモンド、ＷＡ９８０５２、アメリカ合衆国）により実施された。ＣＹＰ１Ａ阻害（ＨＬＭ、フェナセチン基質）、ＣＹＰ２Ｂ６阻害（ＨＬＭ、ブプロピオン基質）、ＣＹＰ２Ｃ８阻害（ＨＬＭ、パクリタキセル  基質）、ＣＹＰ２Ｃ９阻害（ＨＬＭ、ジクロフェナク基質）、ＣＹＰ２Ｃ１９阻害（ＨＬＭ、オメプラゾール基質）、ＣＹＰ２Ｄ６阻害（ＨＬＭ、デキストロメトルファン基質）およびＣＹＰ３Ａ阻害（ＨＬＭ、ミダゾラムおよびテストステロン基質）を試験した。試験濃度は１０μＭであった。インキュベーション時間は３７℃で１０分間であった。検出方法はＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳであった。本実験は二連で実施し、対照値の％阻害を平均化した（図８）。
【００６３】
実施例１６
ＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング
成熟雄性ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２５０グラム、ｎ＝１６）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社から入手した。動物を１２／１２明暗サイクルに維持した。Ｓｉｅｍｅｎ社のＩｎｖｅｏｎを用いてスキャンを実施した。全ての放射スキャンを減衰に対して補正した。動物は先に記載のように１１Ｃ−ラクロプライドまたは１８ＦＤＧを用いてベースラインｍｉｃｒｏＰＥＴスキャンを受けた（Patel, V. D.; Lee, D. E.; Alexoff, D. L.; Dewey, S. L.; Schiffer, W. K. Neuroimage 2008, 41 (3), 1051-1066）。動物が覚醒し、自由に動いている間に、両方の放射性追跡子の取り込みが起こった。ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャンの直前に、全ての動物に麻酔をかけ、イソフルラン下で維持した。
【００６４】
示されるとおり、本発明は強力なＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化剤を提供する。インビトロ結果は、特に、１が、コカイン嗜癖に対する処置として高い治療上の可能性を有する現在最も強力なＧＡＢＡ−ＡＴ不活性化剤であるＣＰＰ−１１５よりも９．８倍有効な不活性化剤であることを示す。自由行動ラットにおけるインビボ試験は、１がコカインまたはニコチン曝露後のＮＡｃｃにおけるドーパミン放出の抑制においてＣＰＰ−１１５に優ることを示した。化合物１はまた、ドーパミンの薬物誘導性増加に関連する環境の空間条件をコードすることが先に示された脳領域である海馬内の代謝要求におけるドーパミン誘導性増加を減弱させる。
【図１】
2018531941.tif 000022
【図２Ａ】
2018531941.tif 000023
【図２Ｂ】
2018531941.tif 000024
【図３Ａ】
2018531941.tif 000025
【図３Ｂ】
2018531941.tif 000026
【図４】
2018531941.tif 000027
【図５】
2018531941.tif 000028
【図６Ａ】
2018531941.tif 000029
【図６Ｂ】
2018531941.tif 000030
【図７】
2018531941.tif 000031
【図８】
2018531941.tif 000032
【図９Ａ】
2018531941.tif 000033
【図９Ｂ】
2018531941.tif 000034
【図１０】
2018531941.tif 000035
【図１１】
2018531941.tif 000036
【国際調査報告】
2018531941.tif 000037
2018531941.tif 000038
2018531941.tif 000039
2018531941.tif 000040