(57)【要約】ネイティブに対合したＴ細胞受容体配列のハイスループットＴ細胞受容体標的識別のための方法および組成物が、本明細書に提供される。一態様では、処置の方法であって、本明細書に記載されている方法に従って決定された抗原を含むタンパク質に対して標的化された治療薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この対象はヒトである。一部の実施形態では、この治療薬は、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその断片、細胞療法または免疫療法である。
2018533920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；
（ｄ）前記複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、前記反応性の操作されたＡＰＣが、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして／または前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；および
（ｅ）選択されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；
（ｄ）前記複数の操作されたＡＰＣのうちの活性化している操作されたＡＰＣを識別するステップであって、前記活性化している操作されたＡＰＣが、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞を活性化する、ステップ；および
（ｅ）選択され操作されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；
（ｄ）前記複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、前記反応性の操作されたＡＰＣが、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして／または前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；および
（ｅ）選択され操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；
（ｄ）前記複数の操作されたＡＰＣのうちの活性化している操作されたＡＰＣを識別するステップであって、前記活性化している操作されたＡＰＣが、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞を活性化する、ステップ；および
（ｅ）選択され操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項５】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；
（ｄ）前記複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、前記反応性の操作されたＡＰＣが、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして／または前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；ならびに
（ｅ）選択されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項６】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；
（ｄ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドを決定するステップ、
（ｅ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する応答を示す、前記操作されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項７】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；
（ｄ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップ；
（ｅ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する応答を示す、前記操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項８】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；
（ｄ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドを決定するステップ；
（ｅ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する前記操作されたＡＰＣの前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項９】
（ａ）ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、前記ＴＣＲポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；
（ｄ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップ；
（ｅ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する前記操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する前記複数のＡＰＣのうちのＡＰＣの反応性についてアッセイするステップ；
（ｃ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有するＡＰＣを選択するステップ；および
（ｄ）前記選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による前記複数のＡＰＣのうちのＡＰＣの活性化についてアッセイするステップ；
（ｃ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化するＡＰＣを選択するステップ；および
（ｄ）前記選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のＡＰＣのうちのＡＰＣによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；および
（ｃ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のＡＰＣのうちの前記ＡＰＣによって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される前記複数のＡＰＣのうちの活性化されたＡＰＣによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；および
（ｃ）天然ＴＣＲ鎖ペアの標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される前記複数のＡＰＣのうちの前記活性化されたＡＰＣによって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、疾患と関連する抗原ポリペプチドを提示する複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のＡＰＣのうちの操作されたＡＰＣを決定するステップ；
（ｃ）前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または前記１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のＡＰＣのうちの前記操作されたＡＰＣを選択するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性と、前記複数の細胞のうちの細胞の前記複数の細胞を含む前記試料中の細胞に対する反応性とについてアッセイするステップ；
（ｃ）前記複数の細胞を含む前記試料から、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有する細胞を選択するステップ；および
（ｄ）前記選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、ステップ；
（ｂ）ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による前記複数の細胞のうちの細胞の活性化と、前記複数の細胞を含む前記試料中の細胞による前記複数の細胞のうちの細胞の活性化とについてアッセイするステップ；
（ｃ）前記複数の細胞を含む前記試料から、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する細胞を選択するステップ；および
（ｄ）前記選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）前記複数の細胞を含む前記試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、
（ｃ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、前記複数の細胞を含む前記試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
（ａ）１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；
（ｂ）前記複数の細胞を含む前記試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、
（ｃ）前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、前記複数の細胞を含む前記試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する前記１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する前記細胞によって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
前記複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖が、同時に、または単一の反応から識別される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＰＣが、操作されたＡＰＣである、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＣＲポリペプチドが、外因性ポリヌクレオチドから発現される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原ポリペプチドが、外因性ポリヌクレオチド配列から発現される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原をコードする外因性ポリヌクレオチド配列から発現される抗原ポリペプチドを含む、請求項１から９および１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の操作された細胞が、外因性ポリヌクレオチド配列からＴＣＲポリペプチドを発現する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記外因性ポリヌクレオチド配列が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および第２のＴＣＲ鎖をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２のＴＣＲ鎖が、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の前記少なくとも１つのペアを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記操作された細胞によって活性化されるか、または前記操作されたＡＰＣに対する反応性を有する前記操作されたＡＰＣが、免疫療法薬としての使用のためである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記操作されたＡＰＣが、複数の操作された細胞を認識する複数の操作されたＡＰＣを含む、請求項１４または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の操作されたＡＰＣが、少なくとも１つのＭＨＣ型を発現する、請求項１４、２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の操作されたＡＰＣが、少なくとも２つのＭＨＣ型を発現する、請求項１４または２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記操作された細胞によって活性化されるか、または前記操作された細胞に対する反応性を有する前記操作されたＡＰＣが、前記操作された細胞の前記ＴＣＲポリペプチドに特異的なＭＨＣ型を発現する、請求項１４または２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の操作された細胞が、前記複数の操作されたＡＰＣ中の前記操作されたＡＰＣによって発現されるＭＨＣ型に特異的なＴＣＲポリペプチドを発現する、請求項１４または２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
疾患と関連する前記抗原ポリペプチドが既知である、請求項１４または２７から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つまたは複数の操作された細胞が、第１の対象由来の第１の複数の操作された細胞と第２の対象由来の第２の複数の操作された細胞とを含み、前記複数の操作されたＡＰＣが、第１の複数の操作されたＡＰＣと第２の複数の操作されたＡＰＣとを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の複数の操作された細胞を、前記第１の複数のＡＰＣに接触させるステップ、および前記第２の複数の操作された細胞を、前記第２の複数のＡＰＣに接触させるステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の複数の操作されたＡＰＣと第２の複数の操作されたＡＰＣとが、同じ抗原ポリペプチドを提示する、請求項３３または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の複数の操作されたＡＰＣが、第１のＭＨＣ型を発現し、前記第２の複数の操作されたＡＰＣが、第２のＭＨＣ型を発現する、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の複数の操作された細胞が、前記第１の複数の操作されたＡＰＣによって発現される前記第１のＭＨＣ型に特異的な第１のＴＣＲポリペプチドを発現し、前記第２の複数の操作された細胞が、前記第２の複数の操作されたＡＰＣによって発現される前記第２のＭＨＣ型に特異的な第２のＴＣＲポリペプチドを発現する、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＣＲポリペプチドが、免疫療法薬としての使用のためである、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップであって、前記複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖が、同時に、または単一の反応から識別される、ステップをさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
同時に、または単一の反応から識別された前記識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つを発現する１つまたは複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＡＰＣが、罹患対象由来である、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料細胞が、対象由来である、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料細胞が細胞株である、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料細胞が、罹患対象由来である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗原提示細胞が、がんを有する対象由来である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗原提示細胞が、ウイルスが感染した対象由来である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞と同じ対象由来である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象のＭＨＣレパートリーと類似の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レパートリーを有する対象由来である、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象のＭＨＣハプロタイプと類似の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを有する対象由来である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象と適合性の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レパートリーを有する対象由来である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記操作されたＡＰＣが、前記対象とマッチしたＭＨＣ遺伝子を発現するように操作される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記操作されたＡＰＣが、Ｋ５６２細胞株に由来する、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に由来する、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗原提示細胞が初代細胞である、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗原提示細胞が細胞株である、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
対象由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有する、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
対象由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、前記ＴＣＲポリペプチドを発現する前記操作された細胞によって活性化される、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記選択され操作されたＡＰＣを単離するステップをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記操作されたＡＰＣの前記抗原を決定する前記ステップが、前記操作されたＡＰＣによって提示される抗原をコードする前記操作されたＡＰＣの配列を配列決定することを含む、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記操作されたＡＰＣが、蛍光活性化セルソーティングによって単離される、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および第２のＴＣＲ鎖をコードする前記外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
異なる抗原をコードする前記外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記操作されたＡＰＣの細胞表面に異なる抗原を添加するステップをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記接触させるステップの前に、前記対象由来の前記単一の免疫細胞の前記ネイティブに対合したＴＣＲ鎖配列を決定するステップをさらに含む、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の各々の前記標的抗原を決定するステップをさらに含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記操作された細胞が、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖配列の異なるペアを各々が発現する複数の操作された細胞を含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記操作された細胞が、内因性ＴＣＲポリペプチドを発現しない操作されたＴ細胞である、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記操作された細胞が、内因性ＴＣＲ遺伝子を転写しない操作されたＴ細胞である、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記操作された細胞が、内因性ＴＣＲ遺伝子を含まない操作されたＴ細胞である、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記操作された細胞が、ＴＣＲノックアウト細胞である操作されたＴ細胞である、請求項１から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗原提示細胞が、異なる抗原を各々が提示する複数の抗原提示細胞を含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記アッセイするステップの前記抗原提示細胞が、別々のベッセル中にある、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記操作された細胞がＴ細胞である、請求項１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記操作された細胞が、ＣＤ４を発現する、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記操作された細胞が、ＣＤ８を発現する、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡＰＣが、外因性レポーター配列を含む、請求項１から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＡＰＣが、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む、請求項１から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記レポーター遺伝子が、細胞表面タンパク質をコードする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
細胞表面に発現されたタンパク質リガンドの、前記操作されたＡＰＣ上の合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体への結合が、前記レポーター遺伝子の発現を引き起こす、請求項７８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞表面に発現されたタンパク質リガンドが、前記操作された細胞によって発現される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞表面に発現されたタンパク質リガンドが、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記誘導性プロモーターがＮＦＡＴプロモーターである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体が切断され、ＧＡＬ４−ＶＰ６４ドメインなどの転写アクチベータードメインが生成される、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記転写アクチベータードメインが、前記レポーター遺伝子の発現を誘導する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記転写アクチベータードメインが、ＧＡＬ４−ＵＡＳ活性化性配列などの活性化性配列への結合によって、前記レポーター遺伝子の発現を誘導する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記レポーター遺伝子の発現が、前記ＡＰＣによる前記操作された細胞の活性化を示す、請求項７８から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記レポーター遺伝子の発現が、前記操作された細胞に対する前記操作されたＡＰＣの反応性を示す、請求項７８から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記アッセイするステップが、前記レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることを含む、請求項１から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記アッセイすることが、ｃＤＮＡアレイ、ｍＲＮＡ検出またはタンパク質検出を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記操作されたＡＰＣが、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む、請求項１から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記レポーター遺伝子が、細胞表面タンパク質をコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記レポーター遺伝子が、ＩＬ６、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＬ−２３、ＩＬ−１、ＴＮＦまたはＩＬ−１０をコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８α、ＯＸ４０−Ｌ、ＩＣＯＳ−１またはＣＤ４０である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記レポーター遺伝子が、前記操作された細胞上のＣＤ２８への、前記操作されたＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６の結合に応答して活性化される、請求項９３から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記レポーター遺伝子が、前記操作されたＡＰＣ中のＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化の下流で活性化される、請求項９３から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記レポーター遺伝子が、前記操作されたＡＰＣ中のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達活性化の下流で活性化される、請求項９３から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記レポーター遺伝子が、ＮＦ−κＢ経路またはＮＯＴＣＨ１シグナル伝達経路の下流で活性化される、請求項９３から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記レポーター遺伝子が、第２の受容体の下流で活性化される、請求項９３から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第２の受容体が、前記操作された細胞によって分泌されるリガンドを結合した後に活性化される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記リガンドの発現が、前記操作されたＡＰＣ上の合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体の結合後に誘導される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記操作されたＡＰＣが、内因性ＭＨＣポリペプチドを発現しない、請求項１から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記操作されたＡＰＣが、内因性ＭＨＣ遺伝子を転写しない、請求項１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記操作されたＡＰＣが、内因性ＭＨＣ遺伝子を含まない、請求項１から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１のＴＣＲ鎖が、ＴＣＲ−アルファ鎖を含み、前記第２のＴＣＲ鎖が、ＴＣＲ−ベータ鎖を含む、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第１のＴＣＲ鎖が、ＴＣＲ−ガンマ鎖を含み、前記第２のＴＣＲ鎖が、ＴＣＲ−デルタ鎖を含む、請求項１から１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
処置の方法であって、請求項１から１１０のいずれか一項の方法に従って決定された前記抗原を含むタンパク質に対して標的化された治療薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１２】
前記対象がヒトである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記治療薬が、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその断片、細胞療法または免疫療法である、請求項１１１または１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞療法が、養子細胞療法を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
請求項１から１１０のいずれか一項に記載の方法に従って識別された前記複数のＴＣＲ鎖のうちの１つまたは複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を発現するように操作されたＴ細胞を投与するステップを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、疾患または病状を有する、請求項１１１から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記疾患または病状ががんである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
請求項３８の前記第１のＴＣＲポリペプチドおよび前記第２のＴＣＲポリペプチドを含むＴＣＲポリペプチドのライブラリー。
【請求項１１９】
前記第１のＴＣＲポリペプチドが、前記抗原ポリペプチドと前記第１のＭＨＣ型のＭＨＣとを含む複合体に特異的であり、前記第２のＴＣＲポリペプチドが、前記抗原ポリペプチドと前記第２のＭＨＣ型のＭＨＣとを含む複合体に特異的である、請求項１１８に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年９月２５日に出願された米国仮出願番号第６２／２３２，５１１号に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｔリンパ球またはＴ細胞は、ヒトおよび他の動物における適応免疫系の不可欠な成分である。これらは、生物内の細胞媒介性免疫の重要な部分を構成する。細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞を含む、多くのＴ細胞サブセットが存在する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞としても既知）は、異常な細胞、例えば、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を死滅させる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞としても既知）は、他の免疫細胞の活性化および成熟を助ける。
【０００３】
細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞は共に、そのそれぞれの応答を誘発する特異的標的抗原の認識に引き続いて、それらの機能を実行する。Ｔ細胞の抗原特異性は、Ｔ細胞の表面上で発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって規定される。Ｔ細胞受容体は、最も一般的にはアルファおよびベータ鎖である２つのポリペプチド鎖から構成されるヘテロ二量体タンパク質であるが、少数のＴ細胞は、ガンマおよびデルタ鎖を発現する。ＴＣＲの特定のアミノ酸配列および結果として生じる三次元構造が、ＴＣＲの抗原特異性および親和性を規定する。任意の個々のＴ細胞についてのＴＣＲ鎖のアミノ酸およびコードするＤＮＡの配列は、ほとんどの場合、生物のＴＣＲレパートリー全体において固有であるまたは非常に低い存在量であるが、それは、膨大な数の可能なＴＣＲ配列が存在するからである。この大きい配列多様性は、いくつかの細胞機構を介したＴ細胞の発生の間に達成され、多様な潜在的抗原に応答する免疫系の能力の重要な一局面である。
【０００４】
ＴＣＲ標的抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるペプチドである。ＡＰＣの細胞表面上で、ペプチドは、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体中でＴ細胞に提示される。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ペプチド抗原を細胞傷害性Ｔ細胞に提示し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ペプチド抗原をヘルパーＴ細胞に提示する。ＭＨＣ遺伝子は、高度に多型であり、したがって、任意の生物についてのＭＨＣタンパク質の特定のセットは、その種内のほとんどまたは全ての他の生物とは実質的に異なる場合が多い。
【０００５】
ＴＣＲ−抗原認識が生じるために、Ｔ細胞は、ＴＣＲの同族ペプチドを提示するＡＰＣと相互作用する。このペプチドは、ＴＣＲによって認識されるＭＨＣ分子との複合体中になければならず、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではＭＨＣ−Ｉタンパク質またはＣＤ４＋Ｔ細胞ではＭＨＣ−ＩＩタンパク質のいずれかで、Ｔ細胞型と適合性である。適切なＴＣＲ−抗原／ＭＨＣ認識の際に、Ｔ細胞は活性化されて、種々の細胞効果をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
ハイスループット単一細胞分析に由来する多数のＴＣＲの抗原特異性をスクリーニングおよび決定するための方法および組成物が、本明細書で開示されている。一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、この反応性の操作されたＡＰＣが、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；および選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【０００７】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；複数の操作されたＡＰＣのうちの活性化している操作されたＡＰＣを識別するステップであって、この活性化している操作されたＡＰＣが、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞を活性化する、ステップ；および選択され操作されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【０００８】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、この反応性の操作されたＡＰＣが、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；および選択され操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【０００９】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；複数の操作されたＡＰＣのうちの活性化している操作されたＡＰＣを識別するステップであって、この活性化している操作されたＡＰＣが、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞を活性化する、ステップ；および選択され操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１０】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；複数の操作されたＡＰＣのうちの反応性の操作されたＡＰＣを識別するステップであって、この反応性の操作されたＡＰＣが、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する応答を示す、ステップ；および選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１１】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップ、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１２】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして／またはＴＣＲポリペプチドを発現する１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１３】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップ；ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１４】
一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップ；１つまたは複数の操作された細胞においてＴＣＲポリペプチドを発現させるステップであって、このＴＣＲポリペプチドが、識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む、ステップ；１つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたＡＰＣの細胞表面上に提示される抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１５】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する複数のＡＰＣのうちのＡＰＣの反応性についてアッセイするステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有するＡＰＣを選択するステップ；および選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１６】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による複数のＡＰＣのうちのＡＰＣの活性化についてアッセイするステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化するＡＰＣを選択するステップ；および選択されたＡＰＣの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１７】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちの１つまたは複数に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する複数のＡＰＣのうちのＡＰＣによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；およびネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する複数のＡＰＣのうちのＡＰＣによって提示される決定された抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１８】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される複数のＡＰＣのうちの活性化されたＡＰＣによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ；および天然ＴＣＲ鎖ペアの標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される複数のＡＰＣのうちの活性化されたＡＰＣによって提示される決定された抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１９】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、疾患と関連する抗原ポリペプチドを提示する複数の操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する複数のＡＰＣのうちの操作されたＡＰＣを決定するステップ；１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または１つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する複数のＡＰＣのうちのその操作されたＡＰＣを選択するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２０】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性と、複数の細胞のうちの細胞の複数の細胞を含む試料中の細胞に対する反応性とについてアッセイするステップ；複数の細胞を含む試料から、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞を選択するステップ；および選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２１】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、ステップ；ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による複数の細胞のうちの細胞の活性化と、複数の細胞を含む試料中の細胞による複数の細胞のうちの細胞の活性化とについてアッセイするステップ；複数の細胞を含む試料から、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する細胞を選択するステップ；および選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２２】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；複数の細胞を含む試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、複数の細胞を含む試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される決定された抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２３】
一態様では、１つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、１つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現する、ステップ；複数の細胞を含む試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の標的抗原を決定するステップであって、この決定された標的抗原が、複数の細胞を含む試料中の、ＴＣＲポリペプチドを発現する１つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する細胞によって提示される決定された抗原ポリペプチドである、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２４】
一部の実施形態では、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖は、同時に、または単一の反応から識別される。
【００２５】
一部の実施形態では、このＡＰＣは、操作されたＡＰＣである。
【００２６】
一部の実施形態では、このＴＣＲポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドから発現される。一部の実施形態では、この抗原ポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチド配列から発現される。一部の実施形態では、複数の操作されたＡＰＣの各操作されたＡＰＣは、異なる抗原をコードする外因性ポリヌクレオチド配列から発現される抗原ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作された細胞は、外因性ポリヌクレオチド配列からＴＣＲポリペプチドを発現する。
【００２７】
一部の実施形態では、この外因性ポリヌクレオチド配列は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および第２のＴＣＲ鎖をコードする。一部の実施形態では、この第１および第２のＴＣＲ鎖は、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つのペアを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、操作された細胞によって活性化されるか、または操作されたＡＰＣに対する反応性を有する操作されたＡＰＣは、免疫療法薬としての使用のためである。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、複数の操作された細胞を認識する複数の操作されたＡＰＣを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、複数の操作されたＡＰＣは、少なくとも１つのＭＨＣ型を発現する。一部の実施形態では、複数の操作されたＡＰＣは、少なくとも２つのＭＨＣ型を発現する。一部の実施形態では、操作された細胞によって活性化されるか、または操作された細胞に対する反応性を有する操作されたＡＰＣは、操作された細胞のＴＣＲポリペプチドに特異的なＭＨＣ型を発現する。一部の実施形態では、複数の操作された細胞は、複数の操作されたＡＰＣ中の操作されたＡＰＣによって発現されるＭＨＣ型に特異的なＴＣＲポリペプチドを発現する。
【００３０】
一部の実施形態では、疾患と関連する抗原ポリペプチドは既知である。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作された細胞は、第１の対象由来の第１の複数の操作された細胞と第２の対象由来の第２の複数の操作された細胞とを含み、複数の操作されたＡＰＣは、第１の複数の操作されたＡＰＣと第２の複数の操作されたＡＰＣとを含む。一部の実施形態では、この方法は、第１の複数の操作された細胞を、第１の複数のＡＰＣに接触させるステップ、および第２の複数の操作された細胞を、第２の複数のＡＰＣに接触させるステップを含む。一部の実施形態では、第１の複数の操作されたＡＰＣと第２の複数の操作されたＡＰＣとは、同じ抗原ポリペプチドを提示する。一部の実施形態では、第１の複数の操作されたＡＰＣは、第１のＭＨＣ型を発現し、第２の複数の操作されたＡＰＣは、第２のＭＨＣ型を発現する。
一部の実施形態では、第１の複数の操作された細胞は、第１の複数の操作されたＡＰＣによって発現される第１のＭＨＣ型に特異的な第１のＴＣＲポリペプチドを発現し、第２の複数の操作された細胞は、第２の複数の操作されたＡＰＣによって発現される第２のＭＨＣ型に特異的な第２のＴＣＲポリペプチドを発現する。一部の態様では、第１のＴＣＲポリペプチドおよび第２のＴＣＲポリペプチドを含むＴＣＲポリペプチドのライブラリーが提供される。一部の実施形態では、第１のＴＣＲポリペプチドは、抗原ポリペプチドと第１のＭＨＣ型のＭＨＣとを含む複合体に特異的であり、第２のＴＣＲポリペプチドは、抗原ポリペプチドと第２のＭＨＣ型のＭＨＣとを含む複合体に特異的である。
【００３１】
一部の実施形態では、このＴＣＲポリペプチドは、免疫療法薬としての使用のためである。
【００３２】
一部の実施形態では、この方法は、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を識別するステップであって、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖が、同時に、または単一の反応から識別される、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、同時に、または単一の反応から識別されたこの識別されたネイティブに対合したＴＣＲ鎖の少なくとも１つを発現する１つまたは複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む。
【００３３】
一部の実施形態では、このＡＰＣは、罹患対象由来である。
【００３４】
一部の実施形態では、この試料細胞は、対象由来である。一部の実施形態では、この試料細胞は細胞株である。一部の実施形態では、この試料細胞は、罹患対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、がんを有する対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、ウイルスが感染した対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、単一の免疫細胞と同じ対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、単一の免疫細胞を含む対象のＭＨＣレパートリーと類似の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レパートリーを有する対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、単一の免疫細胞を含む対象のＭＨＣハプロタイプと類似の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを有する対象由来である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、単一の免疫細胞を含む対象と適合性の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レパートリーを有する対象由来である。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、対象とマッチしたＭＨＣ遺伝子を発現するように操作される。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、Ｋ５６２細胞株に由来する。一部の実施形態では、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に由来する。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は初代細胞である。一部の実施形態では、この抗原提示細胞は細胞株である。一部の実施形態では、対象由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞に対する反応性を有する。一部の実施形態では、対象由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＴＣＲポリペプチドを発現する操作された細胞によって活性化される。
【００３５】
一部の実施形態では、この方法は、操作されたＡＰＣを単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、操作されたＡＰＣの抗原を決定するステップは、操作されたＡＰＣによって提示される抗原をコードする操作されたＡＰＣの配列を配列決定することを含む。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、蛍光活性化セルソーティングによって単離される。
【００３６】
一部の実施形態では、この方法は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および第２のＴＣＲ鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、異なる抗原をコードする外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、操作されたＡＰＣの細胞表面に異なる抗原を添加するステップをさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、この方法は、接触させるステップの前に、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したＴＣＲ鎖配列を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖の各々の標的抗原を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この操作された細胞は、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖配列の異なるペアを各々が発現する複数の操作された細胞を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、この操作された細胞は、内因性ＴＣＲポリペプチドを発現しない操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、この操作された細胞は、内因性ＴＣＲ遺伝子を転写しない操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、この操作された細胞は、内因性ＴＣＲ遺伝子を含まない操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、この操作された細胞は、ＴＣＲノックアウト細胞である操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、この操作された細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、この操作された細胞は、ＣＤ４を発現する。一部の実施形態では、この操作された細胞は、ＣＤ８を発現する。
【００３９】
一部の実施形態では、この抗原提示細胞は、異なる抗原を各々が提示する複数の抗原提示細胞を含む。一部の実施形態では、このアッセイするステップの抗原提示細胞は、別々のベッセル中にある。
【００４０】
一部の実施形態では、このＡＰＣは、外因性レポーター配列を含む。一部の実施形態では、このＡＰＣは、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、細胞表面タンパク質をコードする。一部の実施形態では、細胞表面に発現されたタンパク質リガンドの、操作されたＡＰＣ上の合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体への結合は、レポーター遺伝子の発現を引き起こす。一部の実施形態では、この細胞表面に発現されたタンパク質リガンドは、操作された細胞によって発現される。一部の実施形態では、この細胞表面に発現されたタンパク質リガンドは、誘導性プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、この誘導性プロモーターはＮＦＡＴプロモーターである。一部の実施形態では、このｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体が切断され、ＧＡＬ４−ＶＰ６４ドメインなどの転写アクチベータードメインが生成される。一部の実施形態では、この転写アクチベータードメインは、レポーター遺伝子の発現を誘導する。一部の実施形態では、この転写アクチベータードメインは、ＧＡＬ４−ＵＡＳ活性化性配列などの活性化性配列への結合によって、レポーター遺伝子の発現を誘導する。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子の発現は、ＡＰＣによる操作された細胞の活性化を示す。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子の発現は、操作された細胞に対する操作されたＡＰＣの反応性を示す。一部の実施形態では、アッセイするステップは、レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、アッセイすることは、ｃＤＮＡアレイ、ｍＲＮＡ検出またはタンパク質検出を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、このＡＰＣは、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、細胞表面タンパク質をコードする。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、ＩＬ６、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＬ−２３、ＩＬ−１、ＴＮＦまたはＩＬ−１０をコードする。一部の実施形態では、この細胞表面タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８α、ＯＸ４０−Ｌ、ＩＣＯＳ−１またはＣＤ４０である。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、操作された細胞上のＣＤ２８への、操作されたＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６の結合に応答して活性化される。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、ＡＰＣ中のＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化の下流で活性化される。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、ＡＰＣ中のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達活性化の下流で活性化される。一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、ＮＦ−κＢ経路またはＮＯＴＣＨ１シグナル伝達経路の下流で活性化される。
【００４３】
一部の実施形態では、このレポーター遺伝子は、第２の受容体の下流で活性化される。一部の実施形態では、この第２の受容体は、操作された細胞によって分泌されるリガンドを結合した後に活性化される。一部の実施形態では、リガンドの発現は、操作されたＡＰＣ上の合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体の結合後に誘導される。
【００４４】
一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、内因性ＭＨＣポリペプチドを発現しない。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、内因性ＭＨＣ遺伝子を転写しない。一部の実施形態では、この操作されたＡＰＣは、内因性ＭＨＣ遺伝子を含まない。
【００４５】
一部の実施形態では、この第１のＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ−アルファ鎖を含み、第２のＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ−ベータ鎖を含む。一部の実施形態では、この第１のＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ−ガンマ鎖を含み、第２のＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ−デルタ鎖を含む。
【００４６】
一態様では、処置の方法であって、本明細書に記載されている方法に従って決定された抗原を含むタンパク質に対して標的化された治療薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この対象はヒトである。一部の実施形態では、この治療薬は、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその断片、細胞療法または免疫療法である。一部の実施形態では、この細胞療法は、養子細胞療法を含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書に記載されている方法に従って識別された複数のＴＣＲ鎖のうちの１つまたは複数のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を発現するように操作されたＴ細胞を投与するステップを含む。一部の実施形態では、この対象は、疾患または病状を有する。一部の実施形態では、この疾患または病状はがんである。
【００４７】
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書に記載されている新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解は、本明細書に記載されている特徴の原理が利用されている説明例が示されている以下の詳細な記載および添付の図面を参照することにより得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、患者由来ＴＣＲの初期腫瘍反応性をスクリーニングするための方法の例示のフローチャートを示す。
【００５０】
【図２】図２は、患者由来ＴＣＲの標的を識別するための方法の例示のフローチャートを示す。
【００５１】
【図３】図３は、ヒト由来抗原特異的ＴＣＲを発見するための方法の例示的フローチャートを示す。
【００５２】
【図４】図４は、エマルジョン内での単一免疫細胞バーコード付与方法の結果を例示する。
【００５３】
図４Ａは、細胞および溶解／反応（ＬＲ）混合物を含有する２つの水性流動を油内に通して、毎時８００万液滴を超えて単分散エマルジョンを生成する例示の図である。
【００５４】
図４Ｂは、ベッセル内の細胞が溶解され、単一反応で分子特異的および液滴特異的バーコード付与に供されることを示す例示の図である。
【００５５】
図４Ｃは、標的ｍＲＮＡが逆転写され、ユニバーサルアダプター配列で鋳型スイッチタグ化されることを示す例示の図である。その後、初めに１液滴当たり約１分子に希釈された液滴バーコード鋳型のＰＣＲ増幅が起こる。増幅されたバーコードを、相補的オーバーラップ伸長法により、鋳型スイッチしたｃＤＮＡに追加する。エマルジョンから産物を回収し、追加のライブラリー処理ステップおよびハイスループット配列決定の前に、ＲＴプライマーのビオチンを使用して精製する。
【００５６】
図４Ｄは、二重バーコード付与により、配列決定読み取りをそれらの由来分子および由来液滴にクラスター化することが可能になり、配列決定エラーおよび増幅バイアスを最小限に抑えつつ、ネイティブ受容体鎖対合が再構築されることを示す例示の図である。
【００５７】
【図５】図５は、単離された健常Ｂ細胞からＢＣＲを回収するための方法の結果を例示する。
【００５８】
図５Ａは、３００万個のＢ細胞が細胞０．２個／液滴でエマルジョン内を通過し、占領細胞の約９０％が単一細胞を含有する結果となった液滴の例示の図である。
【００５９】
図５Ｂは、ＶＨＶＬ対合精度の例示の図である。エマルジョンバーコード付与および配列決定後、データを、単一細胞液滴に由来するデータについて濃縮し、ＶＨＶＬ対合精度を、増殖クローン中の対の一貫性を使用して評価した。
【００６０】
図５Ｃは、液滴バーコードパーセント対Ｉｇアイソタイプの例示のグラフである。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬ対の重鎖アイソタイプ（各液滴内の最も多量なアイソタイプ）および軽鎖遺伝子座使用率が示されている。
【００６１】
図５Ｄは、６つの独立エマルジョン画分の各々の、１００個の最高頻度重鎖のクローンのランク存在量の例示のグラフである。０．０５％の全体頻度に印が付けられている。
【００６２】
図５Ｅは、各液滴バーコード内の捕捉ｍＲＮＡの数により評価した、細胞内でのＶＨ対ＶＬ発現の例示のグラフである。アイソタイプ毎に、５，０００個の点が示されている。
【００６３】
図５Ｆは、ＢＣＲ対のＶＨ対ＶＬ突然変異相関性および各アイソタイプ内の密度分布の例示のグラフである。
【００６４】
【図６】図６は、ＨＩＶ広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を発見するための方法の結果を例示する。
【００６５】
図６Ａは、エマルジョンに入れられたＨＩＶ長期非進行者のＢ細胞に由来する３８，６２０個の回収したＶＨＶＬ対の重鎖アイソタイプ分布の例示のグラフである。既に既知のｂＮＡｂ（「ＰＧＴ様」）と良好にアラインするＩｇＧ鎖の割合はわずかである。
【００６６】
図６Ｂは、既知のｂＮＡｂ（黒色）＋新たに回収されたもの（赤色、液滴バーコードで標識されている）の完全なＶＤＪアミノ酸配列の系統樹の例示の図である。重鎖（左）および軽鎖（右）は別々にプロットされている。ミスマッチの可能性のある抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は青色である。
【００６７】
図６Ｃは、ＰＧＴ１２１の対照ストックと比較した、１０株のＨＩＶに対する、８つの新たに発見されたＰＧＴ様バリアントの中和活性（ＩＣ５０、μｇ／ｍＬ）の例示の図である。
【００６８】
【図７】図７は、卵巣腫瘍に由来するＴＩＬを特徴付けるための方法の結果を例示する。
【００６９】
図７Ａは、卵巣腫瘍に由来する４００，０００個のソーティングされていない剥離細胞がエマルジョンに入れられ、ＢＣＲおよびＴＣＲ対が、エマルジョンバーコード付与により同時に回収された液滴の例示の図である。
【００７０】
図７Ｂは、フィルタリング後に液滴バーコード内で観察された全てのＶＨ／ＶＬおよびＶα／Ｖβ組合せの数を示す、液滴バーコード対受容体鎖組合せの例示のグラフである。
【００７１】
図７Ｃは、回収したＢＣＲ対の液滴バーコードパーセント対重鎖アイソタイプ分布の例示のグラフである。
【００７２】
図７Ｄは、ＢＣＲ対のＶＨ対ＶＬ突然変異相関性および各アイソタイプ内の密度分布の例示のグラフである。
【００７３】
図７Ｅは、全体の（上段）ＴＣＲ対およびＢＣＲ対の、および異なるアイソタイプ（下段）の捕捉ｍＲＮＡの数の例示のグラフを示す。
【００７４】
図７Ｆは、６つの独立エマルジョン画分の各々における、３０個の最高頻度のＢＣＲ重鎖クローン（上段）および３０個の最高頻度のＴＣＲベータ鎖クローンのランク存在量を示すクローン分析の例示のグラフを示す。１％および１０％の全体頻度レベルが示されている。
【００７５】
【図８Ａ】図８Ａは、追加のｍＲＮＡおよびタンパク質標的を有する免疫受容体配列の例示の同時捕捉を示す。表面タンパク質標的は、エマルジョン配列決定の前に、細胞をＤＮＡ標識染色抗体と共に事前にインキュベートすることにより定量化される。
【００７６】
【図８Ｂ】図８Ｂは、健常ヒトＴ細胞から生成された３，６８２個の液滴バーコードＴＣＲ  ＶαＶβ対の、例示のＣＤ４およびＣＤ８  ｍＲＮＡならびにタンパク質測定を示す。
【００７７】
【図８Ｃ】図８Ｃは、ｍＲＮＡとタンパク質測定との例示の合致を示す（各点は、ＴＣＲ  ＶαＶβ対に関連する液滴バーコードである）。
【００７８】
【図８Ｄ】図８Ｄは、エマルジョン内でのソーティングされていないＴ細胞に由来するＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡおよびタンパク質の同時検出の例示の表を示す。３０，０００個のインプットＴ細胞から、３，６８２個のＴＣＲ対が回収された。ｍＲＮＡ対タンパク質（分子計数、多数決原理に基づく）によりＣＤ４＋またはＣＤ８＋とみなされたＴＣＲ対の頻度が、マトリックスで示されている。
【００７９】
【図９Ａ】図９Ａは、本明細書に記載されている方法のベッセルの例示の模式図を示す。
【００８０】
【図９Ｂ】図９Ｂは、抗体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドタグの例示の設計を示す。各有色ブロックは、完全なオリゴヌクレオチド配列の部分を表わす。融合配列は、エマルジョン反応内での液滴特異的ＤＮＡバーコードの酵素的付着に使用される。配列の１つの考え得る配置のみが示されているが、他の配置も本記載の方法と適合する。
【００８１】
図１０は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用してイムノフェノタイピングするための方法を例示する。
【００８２】
【図１０Ａ】図１０Ａは、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されている単一細胞を各々が含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。（ＤＢ１−液滴バーコード１；ＤＢ２−液滴バーコード２；ＭＢ１−分子バーコード１；ＭＢ２−分子バーコード２；ＡＩＤ−抗原ＩＤバーコード；ＡＭＢ１−抗体分子バーコード１；ＡＭＢ２−抗体分子バーコード２）。
【００８３】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図９Ａのベッセルの溶解細胞に由来するＲＮＡ分子を各々が含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。ＲＮＡ分子が逆転写され、逆転写により創出されたｃＤＮＡ分子の末端に非鋳型ヌクレオチドが付加されている。逆転写により創出されたｃＤＮＡ分子の末端に付加された非鋳型ヌクレオチドに、分子バーコードがハイブリダイズされている。
【００８４】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、増幅され、図１０ＢのベッセルのｃＤＮＡにハイブリダイゼーションにより付着されている、各々が鋳型バーコード化ポリヌクレオチドを含有する２つのベッセルを示す例示の模式図を示す。ｃＤＮＡは、伸長されている（上段）。その後、伸長されたｃＤＮＡが増幅される（下段）。
【００８５】
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、同じ同一ＲＮＡ配列に付着されている同じ分子バーコード（ＭＢ）を有するＲＮＡ−ＭＢ−ＤＢ種が、ＰＣＲ複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ同一ＲＮＡ配列に付着されている２つの異なるＭＢを有するＲＮＡ−ＭＢ−ＤＢ種（ＲＮＡ１−ＭＢ１−ＤＢおよびＲＮＡ１−ＭＢ２−ＤＢ）は、２つの当初の独立ＲＮＡ分子であり、ＰＣＲ複製由来ではない。
【００８６】
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、同じ液滴バーコード（ＤＢ）および抗原ＩＤバーコード（ＡＩＤ）を有する配列に付着されている、同じ抗体分子バーコード（ＡＭＢ）を有するＤＢ−ＡＭＢ−ＡＩＤ種が、ＰＣＲ複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ液滴バーコード（ＤＢ）および抗原ＩＤバーコード（ＡＩＤ）を有する配列に付着されている、２つの異なるＡＭＢを有するＤＢ１−ＡＭＢ１−ＡＩＤ１およびＤＢ１−ＡＭＢ２−ＡＩＤ１種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着された同じ標的抗原に特異的に結合する抗体を各々が有する２つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来し、ＰＣＲ複製由来ではない２つの独立オリゴヌクレオチド分子である。同じ液滴バーコード（ＤＢ）および同じまたは異なる抗体分子バーコード（ＡＭＢ）を有する配列に付着されている、２つの異なるＡＩＤを有するＤＢ１−ＡＭＢｎ−ＡＩＤ１およびＤＢ１−ＡＭＢｎ−ＡＩＤ２種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着されている２つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来する２つの独立オリゴヌクレオチド分子であり、抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の一方は、第１の標的抗原と特異的に結合する抗体を有し、他方の抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、第２の標的抗原と特異的に結合する抗体を有する。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
詳細な説明
いくつかの態様が、例示のために、例となる適用に関連して、以下に記載される。多くの具体的な詳細、関連性および方法が、本明細書に記載される特色の完全な理解を提供するために示されていることを理解すべきである。しかし、当業者は、本明細書に記載される特色が、具体的な詳細のうち１つもしくは複数を伴わずに、または他の方法を伴って実施され得ることを容易に認識する。一部の行為は、他の行為もしくは事象とは異なる順序でおよび／またはそれらと同時に生じ得るので、本明細書に記載される特色は、行為または事象の例示された順序付けによっては限定されない。さらに、全ての例示された行為または事象が、本明細書に記載される特色に従って方法論を実行するために必要とされるわけではない。
【００８８】
本明細書で使用される用語法は、特定の場合のみを記載することを目的としているのであって、限定を意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはそれらの異形は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む（comprising）」と類似の様式で包括的である意図である。
【００８９】
用語「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されるか、即ち、測定系の限界に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し得る。例えば、「約」は、当技術分野の実務に従って、１または１よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％または最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、ある値の５倍以内、より好ましくは２倍以内のオーダーの大きさ以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、その特定の値についての許容される誤差範囲内であることを意味する用語「約」を前提とすべきである。
【００９０】
（例えば、エマルジョン中の）単一の細胞（免疫細胞）を、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用してフェノタイピングするための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。
【００９１】
ＴＣＲ特異性は、そのＴＣＲ鎖の両方（アルファおよびベータまたはガンマおよびデルタ）のアミノ酸配列によって決定される。さらなる特徴付けのためにＴＣＲを再現するためには、両方の鎖の配列が決定されることが所望される。これらのポリペプチド鎖は、Ｔ細胞内で固有の遺伝子座から独立して発現される。バルクＴ細胞集団を使用するＴＣＲ配列決定アプローチは、多くの鎖配列を生じるが、同じ元の細胞に由来するＴＣＲ鎖の天然の対合を決定することは、困難なままである。したがって、個々のＴ細胞由来の、完全な適切に対合したＴＣＲ鎖配列を決定するために、単一細胞分析法が重要である。
【００９２】
単一細胞ＴＣＲ配列決定法は、何年もの間存在してきたが、これらは歴史的に、非常に低いスループット（１回の実験当たり細胞１〜１００個）を有する。最近、研究者らは、莫大な数の単一のＴ細胞の対合したＴＣＲのレパートリーをプロファイリングする新たな方法を発明し、数千〜数百万のネイティブに対合したＴＣＲ配列を得ている。残念ながら、多数のＴＣＲの抗原特異性を決定するためのわかりやすく効率的な方法は存在しない。
【００９３】
一態様では、方法は、どのＴＣＲが目的の特定の組織型（例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞）に対して反応性であるかを決定するステップを含む（図１）。最初の配列決定の後、対合したＴＣＲ鎖は、適切な発現ベクターまたはレンチウイルスベクター中にクローニングされ得、適切なＴ細胞株内で共発現され得る。Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）は、実験の目的に依存して、内因性ＴＣＲを発現せずＣＤ４またはＣＤ８共受容体を発現するように操作され得る。したがって、これらのＴ細胞の抗原特異性は、導入されたＴＣＲによって決定され得る。さらに、これらのＴ細胞は、ＴＣＲ−抗原認識および引き続くＴ細胞活性化の際にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質）を発現するレポーターＤＮＡ構築物を含有し得る。これには、例えば、Ｔ細胞活性化の際に上方調節されるＮＦＡＴタンパク質応答性プロモーターが関与し得る。
【００９４】
これらの操作されたＴＣＲ発現Ｔ細胞は、初代細胞または細胞株のいずれかの目的のＡＰＣと共にインキュベートされ得る。これらのＡＰＣ細胞は、ＴＣＲを得た元の宿主または類似のＭＨＣレパートリーを有する別の宿主に由来し得る。これは、ＭＨＣ対立遺伝子が、調査中のＴＣＲによって認識され得ることを確実にし得る。
【００９５】
Ｔ細胞活性化／ＴＣＲ反応性は、操作されたレポーター遺伝子発現または免疫関連サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ガンマ）の分泌のいずれかによって決定され得る。
【００９６】
一態様では、方法は、候補ＴＣＲヒットの抗原を識別するステップをさらに含む（図２）。一部の実施形態では、ＴＣＲ発現ベクターは、上記と類似のＴ細胞株中にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、ＴＣＲ発現ベクターは、活性化レポーターなしに、上記と類似のＴ細胞株中にトランスフェクトされる。
【００９７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞ベースの人工ＡＰＣまたは操作されたＡＰＣ（それぞれ、ａＡＰＣまたはｅＡＰＣ）と混合される。一部の実施形態では、これらのａＡＰＣ細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞株に基づく）は、内因性ＭＨＣタンパク質を発現しない。一部の実施形態では、これらのａＡＰＣ細胞は、調査中のＴＣＲの供給源生物のものとマッチしたＭＨＣ遺伝子（複数可）でトランスフェクトされる。ＭＨＣは、本明細書で、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、Ｔ細胞による抗原認識の際にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、表面タンパク質）を発現するレポーター構築物を含有するようにも操作される。
【００９８】
一部の実施形態では、抗原発現ベクターのライブラリーが、ａＡＰＣ中にトランスフェクトされる。抗原コード配列は、目的のペプチド、ミニ遺伝子構築物、またはＭＨＣ−Ｉ結合および表面提示の前にペプチドへと適切にプロセシングされ得るｃＤＮＡコード配列全体をコードし得る。ペプチドはまた、ＭＨＣ負荷のためにａＡＰＣに直接添加され得る。この抗原ライブラリーは、目的の標的細胞由来のタンパク質コード領域の不偏のセットから構成され得、またはより狭く定義され得る（例えば、エクソーム配列決定によって決定されたるネオ抗原、ウイルス由来遺伝子）。
【００９９】
一部の実施形態では、ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、抗原提示ａＡＰＣと共にインキュベートされる。首尾よいＴＣＲ−抗原／ＭＨＣ認識は、Ｔ細胞の活性化をもたらし、ａＡＰＣレポーター遺伝子を発現させる。一部の実施形態では、ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、内因性ＭＨＣを発現する操作されていないＡＰＣおよび／または非人工ＡＰＣと共にインキュベートされる。一部の実施形態では、内因性ＡＰＣは、標的抗原のライブラリーでパルスされる。
【０１００】
この方法の利点は、単一のＴＣＲを発現するＴ細胞集団を、潜在的抗原の大きいライブラリーに対して調べることができることである。Ｔ細胞ＴＣＲの標的抗原を提示するａＡＰＣは、レポーター遺伝子を発現し得る。このレポーター遺伝子の発現は、ａＡＰＣの単離を可能にし得る。例えば、このレポーター遺伝子の発現は、蛍光活性化セルソーティングまたは表面マーカーベースの方法によるａＡＰＣの単離を可能にし得る。提示された抗原、したがってＴＣＲの標的の正体を明らかにする、各単離されたａＡＰＣにおいて発現される抗原のコード配列が決定され得る。これは、最終的に、潜在的抗原の大きいライブラリーに対する多くのＴＣＲの特異性のロバストな決定を可能にする。
【０１０１】
本明細書に記載されている方法および組成物は、疾患標的に対する治療的に適切なＴＣＲの発見を可能にする。一部の実施形態では、代表的なヒト集団由来のＴＣＲ配列が取得される。一部の実施形態では、これらのライブラリーは、Ｔ細胞中にトランスフェクトまたは形質導入される。一部の実施形態では、これらのＴ細胞は、特定のＭＨＣおよび標的抗原を発現するａＡＰＣの異なるセットと共にインキュベートされる。一部の実施形態では、このＴ細胞は、抗原認識およびＴ細胞活性化の際に発現されるレポーター遺伝子構築物を含有する。一部の実施形態では、このレポーターは、蛍光または表面マーカーベースのソーティングを介した、集団からの活性化された細胞の単離を可能にする。一部の実施形態では、疾患関連標的に対して反応性のかかるＴＣＲは、疾患の処置において有用であり得、適用可能であり得る。ヒト集団内のＭＨＣ配列における多様性に起因して、同じ抗原に対して反応性であるが、特定の比較的一般的なＭＨＣと適合性の複数のＴＣＲを発見することは、好都合である。
【０１０２】
末梢血由来の数百万の未刺激のナイーブＢ細胞および静止メモリーＢ細胞、ならびに数十万の解離した腫瘍細胞が評価されて、血液試料由来の全長の対合したＢＣＲ、ならびに腫瘍中のＴＩＬ由来のＢＣＲおよびＴＣＲの両方の、レパートリーレベルのデータセットが得られた。Ｔ細胞は伝統的に、ＴＩＬ研究の主要な焦点であったが、腫瘍におけるＢ細胞の役割が、ますます注目を浴びている。広い科学コミュニティからの、ＴＩＬにおける新たな興味は、細胞移入免疫療法における革新的な開発、固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔの開発、ならびにチェックポイント阻害剤および腫瘍成長に対するそれらの影響の発見に起因し得る。これらの研究分野は全て、応答性患者対非応答性患者においてＴＩＬの変動および進化をモニタリングするため、またはＴＩＬ受容体をツールとして使用する新規腫瘍抗原の発見のために、関与するＴＩＬの理解を必要とする。この研究分野を進捗させることに対する主要な障壁は、腫瘍中の小さい百分率のＴＩＬのみが、全般的炎症に起因して存在する非特異的免疫細胞の大きい背景を伴って、抗原特異的であり得ることである。
【０１０３】
したがって、腫瘍環境において特異的に富化されたものを識別するためには、十分な数のＴＣＲおよびＢＣＲを試料採取することが重要であり、これは、プレートベースのＴＩＬ分析によって得られる小さい数ではなく、何千もの細胞を必要とする可能性が高い作業である。さらに、ＴＩＬは、非カノニカルな表面表現型を示すことが報告されているので、マーカーベースのソーティングは、重要なＴＩＬ集団を失う可能性がある。
【０１０４】
いくつかの最近の研究が、単一細胞トランスクリプトーム分析のスケールアップにおける説得力のある進歩を報告しているが、今日まで、これらは、不均一な試料からの免疫レパートリーの有意義なＶ（Ｄ）Ｊ捕捉に必要な読み取り長さ、または１試料当たり数十万細胞のスループットを実証してこなかった。特に、Ｋｌｅｉｎらの方法（ＩｎＤｒｏｐ）およびＭａｃｏｓｋｏらの方法（Ｄｒｏｐｓｅｑ）は、数千細胞からのエマルジョンベースの全トランスクリプトーム配列決定を可能にした。しかし、全長免疫受容体遺伝子の捕捉は、実質的に異なる課題を提示するだけでなく、適切な免疫レパートリー特徴付けのための、実験１回当たり、それらの報告において示されたものよりも数十倍〜数百倍多い細胞を必要とする。本明細書に記載されている方法は、ＤｒｏｐｓｅｑおよびＩｎＤｒｏｐのものよりも１５分の１〜７５分の１少ないエマルジョン液滴の使用によって得られる、そのより高いスループット、ならびにスプリット−プール合成によるバーコード化ビーズの事前の合成の必要性を除去するＰＣＲによるエマルジョン内のクローン性液滴バーコードの生成に起因して、本出願に十分適している。さらに、本明細書で提示される方法には、元のエマルジョン液滴中での逆転写およびＰＣＲの両方が関与するので、より大きい範囲の標的型が、バーコード間のポスト−エマルジョン交差汚染の危険性もまた最小化しつつ、単一の細胞からｍＲＮＡ、標識されたタンパク質および潜在的にはゲノムＤＮＡが同時に捕捉されるのを可能にすることを目的とし得る。
【０１０５】
今日まで、標的化されたＢＣＲまたはＴＣＲ配列決定のための全ての方法は、以下の制限のうち少なくとも１つに悩まされている：対合していない受容体鎖、対合した鎖の低いスループット（実験１回当たり＜１０４）、または部分的な配列回収。対照的に、本明細書で提示されるエマルジョン法は、これらの制限を克服し、いくつかのさらなる利点を示す。第１に、Ｄｅｋｏｓｋｙらによって実行されたような長いアンプリコンへの物理的スプライシングではなく、鎖を短い配列バーコードと連結することが、完全Ｖ（Ｄ）Ｊ可変領域の配列決定を可能にし、体細胞変異の網羅的分析を確実にし、完全に正確な機能的再構築を可能にする。第２に、単一の細胞由来のｍＲＮＡ自体および全ての産物の両方を二重バーコード化することによって、ＰＣＲおよび配列決定エラーが最小化され得、特に、各クローン性系譜中の細胞の数は、そのクローンの細胞内の発現レベルからデコンボリューションされ得る。免疫レパートリー分析に本明細書で初めて適用されたこの特色は、クローンの存在量ではなく全体的発現を測定するバルクｍＲＮＡからの免疫配列決定の制限、ならびにクローンの存在量を明らかにするが発現については何も明らかにしないゲノムＤＮＡからの免疫配列決定の制限を克服する。第３に、このバーコード化アプローチは、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で表現型的に価値のあるさらなる遺伝子に拡張され得、各受容体配列を発現するＴ細胞およびＢ細胞のサブタイプについての重要な情報を付け加える。本明細書で提示される方法は、エマルジョン中の単一の細胞からのタンパク質測定との同時ＲＮＡ配列決定の最初の実証を示す。このアプローチは、フローサイトメトリーによって収集された情報の型を、免疫配列決定のデジタル分解能と組み合わせて、その全長受容体配列への、各細胞の表現型の直接的な結びつけを可能にする。したがって、方法は、どのＴ細胞系譜およびＢ細胞系譜が特定の細胞サブタイプを示すかを明らかにすることによって、腫瘍受容体プロファイリングへの強力な追加である見込があり、免疫抑制または「疲弊」などの状態は、抗腫瘍反応性の重要な指標である場合が多い。アプローチは、エマルジョンの単離および分析の前に、Ｂ細胞をＤＮＡ−バーコード化標的抗原と共にインキュベートすることによって、所望の抗原に特異的な抗体の発見にも適用できる。
【０１０６】
まとめると、ネイティブに対合したＢＣＲおよびＴＣＲを、解離された腫瘍試料中の数千のＴＩＬから回収して、変異されクラススイッチされ細胞によって高度に発現されるクローン的に拡大増殖された多数の受容体系譜の識別をもたらしたが、これは、機能的に活性なＢ細胞およびＴ細胞の、腫瘍部位への特異的動員を強く示唆している。このおよび他の腫瘍において見出されるＴＩＬ受容体の標的を識別するための相補性アプローチと共に、本明細書に記載されている技術は、新規腫瘍抗原の発見を可能にし、腫瘍免疫生物学についての我々の基本的理解をさらに可能にし、新興の免疫療法の免疫効果を調査するための強力なツールを提供するはずである。
【０１０７】
天然に対合ネイティブに対合したＴ細胞受容体鎖の決定
Ｔ細胞受容体鎖対および抗体免疫グロブリン鎖対は、免疫受容体の両方の型であり、進化的に関連している。ハイスループット配列決定および診断学のためのポリヌクレオチドライブラリーを生成することが、本発明の目的である。特定の共通の性状を有する患者またはコホートからの抗体および／またはＴＣＲ発見のためのヒト由来のライブラリーパネルを開発することもまた、本発明の目的である。出発材料は、免疫細胞が包括的に単離される、または所望の場合にはナイーブ、メモリーおよびＡＳＣについてサブソーティングされる、末梢血であり得る、または組織生検由来であり得る。開示された発明は、複数の異なる型の対合した可変配列、例えば、Ｔ細胞受容体鎖対および抗体免疫グロブリン鎖対に適用され得る。
【０１０８】
免疫細胞などの単離された細胞は、液滴１つ当たり単一の免疫細胞またはそれ未満を含有する個々のピコリットル区画を創出するような方法で、油中水エマルジョン（液滴）などのベッセル中にカプセル化され得る。数百万の細胞が、対象由来の生物学的試料などの各試料について処理されて、単一細胞配列決定技術におけるハイスループットを可能にし得る。ビーズなどの固体支持体の使用は、本明細書に記載されている方法を使用して回避され得る。ベッセルの２つの別々の集団を生成する必要性もまた、本明細書に記載されている方法を使用して回避され得る。例えば、配列のライブラリーは、同じもしくは単一の反応において、または単一の複数のベッセルもしくはベッセルの集団中で生成され得る。細胞ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、例えば、ＶＨおよびＶＬ抗体鎖ならびに／またはＶα／ＶβおよびＶγ／ＶδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖は、ベッセルの形成の間に導入される。ベッセルバーコードを有するポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る。これらのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセルバーコードを含有する各細胞ポリヌクレオチドが、それが存在するベッセルに対応する固有の正体コードを含有するように、ディジェネレートバーコードを保有し得る。分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る。これらの分子バーコード化ポリヌクレオチドは、分子バーコードを含有する各細胞ポリヌクレオチド分子が、それらが由来する単一の細胞ポリヌクレオチド分子に対応する固有の正体コードを含有するように、ディジェネレートバーコードを保有し得る。数百万の単一の免疫細胞が、エマルジョンの内側で溶解され得、細胞転写物、例えば、ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖転写物は、プライマーを使用して逆転写またはコピーされ得、その後、ベッセルバーコードおよび分子バーコードでタグ化され得、バーコード化ポリヌクレオチドがＰＣＲ増幅され得る。単一の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）から生じる各ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖は事実上、同じベッセルバーコード正体を有して、互いに連結され得る。
【０１０９】
次いで、ＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）タグを付加するために、ベッセルから回収され得、ＰＣＲ富化され得る。ライブラリーは、ハイスループット配列決定プラットフォームを使用して配列決定され得、その後、レパートリー多様性の分析、抗体頻度、ＣＤＲ３特徴付け、体細胞超変異系統発生分析などがなされ得る。正確にマッチさせたＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδペアのデータベースは、ベッセルおよび分子バーコード配列をデコンボリューションすることによって生成され得る。各単一の免疫細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離されるので、２回観察された各ベッセルバーコードについて、配列決定された転写物は、同じエマルジョン液滴に起源し、したがって、固有の単一の細胞に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観察された各異なる分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の異なる転写物分子に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観察された各同じ分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の同じ転写物分子（例えば、ＰＣＲ重複）に起源した。
【０１１０】
配列決定と並行して、ベッセルから回収されたＶＨおよびＶＬならびに／またはＶα／Ｖβおよび／もしくはＶγ／Ｖδ鎖のライブラリーは、抗体発現ベクター中にクローニングされ得、酵母ディスプレイスクリーニングのために共トランスフェクトされ得る。この同一のライブラリープールをクローニングすることは、開始時に生物学的試料を分割することと比較して好ましい方法であるが、それは、一部の稀な免疫細胞が、一方のアッセイまたは他方のアッセイのみにおいて捕捉されるからである。ヒト由来のＶＨおよびＶＬならびに／またはＶαおよびＶβならびに／またはＶγおよびＶδ鎖のライブラリーは、古典的なディスプレイアッセイと同様、対のマッチングが正確か不正確かに関わらず発現され得る。次いで、酵母ディスプレイが、潜在的抗体候補について富化するために、１つまたは複数の抗原標的に対して実行され得る。
【０１１１】
酵母ディスプレイなどのディスプレイ技術から出現する陽性候補抗体は、配列決定され得、マッチさせた対のバーコードデータベースに対して問い合わせされ得る。各酵母ディスプレイされたＶＨおよび／またはＶαおよび／またはＶγ鎖は、それぞれ、そのそれぞれのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖に再びマッチされ得、各酵母が提示したＶＬおよび／またはＶβおよび／またはＶδ鎖は、それぞれ、そのそれぞれのＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖に再びマッチされ得る。これらの正確に対合した候補は、哺乳動物細胞株において合成および発現され、目的の標的に対して機能的に検証される遺伝子であり得る。これらの候補は、完全ヒト抗体および／またはＴＣＲであり得る。
【０１１２】
したがって、本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、これには、断片抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む単鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む、インタクトな抗体およびその機能的（抗原結合性）抗体断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／または他の方法で改変された形態、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多特異性、例えば二特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖを包含する。特記しない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体断片を包含すると理解すべきである。この用語は、ＩｇＧならびにそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトな抗体または全長抗体もまた包含する。
【０１１３】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接配列を指すことが、当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域中の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）および各軽鎖可変領域中の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）が存在する。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが、当技術分野で公知である。一般に、各全長重鎖可変領域中の４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４）、および各全長軽鎖可変領域中の４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４）が存在する。
【０１１４】
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabatら（１９９１年）、「Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest」、第５版  Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら、（１９９７年）JMB  ２７３巻、９２７〜９４８頁（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、MacCallumら、J.  Mol.  Biol.  ２６２巻：７３２〜７４５頁（１９９６年）、「Antibody-antigen  interactions:  Contact  analysis  and  binding  site  topography」、J.  Mol.  Biol.  ２６２巻、７３２〜７４５頁（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Lefranc  MPら、「IMGT  unique  numbering  for  immunoglobulin  and  T  cell  receptor  variable  domains  and  Ig  superfamily  V-like  domains」、Dev  Comp  Immunol、２００３年１月；２７巻（１号）：５５〜７７頁（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、ならびにHonegger  AおよびPluckthun  A、「Yet  another  numbering  scheme  for  immunoglobulin  variable  domains:  an  automatic  modeling  and  analysis  tool」、J  Mol  Biol、２００１年６月８日；３０９巻（３号）：６５７〜７０頁、（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）によって記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。
【０１１５】
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、識別に使用されるスキームに依存して変動し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方についての番号付けは、一部の抗体において現れる、挿入文字によって提供される挿入、例えば「３０ａ」および欠失を伴う、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。２つのスキームは、異なる位置においてある特定の挿入および欠失（「インデル」）を配置して、示差的な番号付けを生じる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体の結晶構造の分析に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに多くの点で類似している。
【０１１６】
以下の表Ａは、それぞれＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＣｏｎｔａｃｔのスキームによって識別された場合の、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の境界の例示の位置を列挙する（Kabat  et  al.  (1991),  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  5th  Ed.  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  MD;および  Al-Lazikani  et  al.,  (1997)  JMB  273,927-948を参照）。ＣＤＲ−Ｈ１については、残基番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して列挙されている。ＦＲは、ＣＤＲ間に位置する、例えば、ＦＲ−Ｌ１は、ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２との間に位置する、など。示されたＫａｂａｔ番号付けスキームは、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するので、示されたＫａｂａｔ番号付け慣習を使用して番号付けした場合のＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに依存して、Ｈ３２とＨ３４との間で変動することに留意されたい。
【表Ａ】
2018533920.tif 000003
【０１１７】
したがって、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」、または個々の特定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、上述のスキームのいずれかによって規定される、ある（または特定の）相補性決定領域を包含すると理解すべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列中の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含むと述べられる場合、かかるＣＤＲは、上述のスキームのいずれかによって規定される、可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）の配列を有すると理解される。一部の実施形態では、特定されたＣＤＲ配列が特定される。
【０１１８】
同様に、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域のＦＲまたは個々の識別されたＦＲ（単数または複数）（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２）は、公知のスキームのいずれかによって規定される、ある（または特定の）フレームワーク領域を包含すると理解すべきである。一部の例では、特定のＣＤＲ、ＦＲ、またはＦＲ（複数）もしくはＣＤＲ（複数）の識別のためのスキームは、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔの方法によって規定されるＣＤＲのように、特定される。他の場合には、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
【０１１９】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindtら  Kuby  Immunology、第６版、W.H.  Freeman  and  Co.、９１頁（２００７年）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、その抗原と結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J.  Immunol.  １５０巻：８８０〜８８７頁（１９９３年）；Clarksonら、Nature  ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照のこと。
【０１２０】
提供される抗体の中でも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、これらの抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。
【０１２１】
特記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、完全ＴＣＲならびにその抗原結合性部分または抗原結合性断片（ＭＨＣ−ペプチド結合性断片とも呼ばれる）を包含すると理解すべきである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、インタクトなまたは全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、全長ＴＣＲ未満であるが、ＭＨＣ分子に結合した（即ち、ＭＨＣ分子との関連での）特異的抗原性ペプチド、即ち、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する、抗原結合性部分である。一部の場合には、ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部分だけを含み得るが、それでもなお完全ＴＣＲが結合するエピトープ（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）と結合することが可能である。一部の場合には、ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含み、ここで、例えば一般に、各鎖は３つの相補性決定領域を含む。抗原結合性ドメインであるまたは抗原結合性ドメインと相同である結合性ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体およびＴＣＲならびに他のヒト化抗体およびＴＣＲ（ＣＤＲ改変およびフレームワーク領域改変を含む）もまた、これらの用語によって企図される。免疫グロブリン鎖（例えば、重鎖および軽鎖）のみに対して言及がなされ得るが、開示された発明は、複数の他の異なる型の対合した配列、例えば、Ｔ細胞受容体鎖ペア（ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖ならびにＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖）に適用され得、免疫グロブリンに限定されないことに留意すべきである。
【０１２２】
種々のがんまたは感染性生物と関連する抗原を認識するＴ細胞の能力は、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖の両方またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖の両方から構成されるそのＴＣＲによって付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの極めて大きい多様性を生成するために固有の機構を使用するＤＮＡによってコードされる。この多サブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩタンパク質によって提示されるペプチドと結合する。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞活性化における中心的な事象であり、これは、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点の免疫シナプスにおいて生じる。
【０１２３】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたは他のＭＨＣ−ペプチド結合分子は、ＭＨＣクラスＩ分子との関連でＴ細胞エピトープを認識するまたは潜在的に認識する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、高等脊椎動物の全ての有核細胞において発現される。ＭＨＣクラスＩ分子は、１２ｋＤａの軽鎖β−２ミクログロブリンと非共有結合的に会合した４６ｋＤａ重鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、いくつかのＭＨＣ対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５およびＨＬＡ−Ｃｗ８などが存在する。ＭＨＣ対立遺伝子の配列は既知であり、例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａにおいて利用可能なＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子は、一部の集団ではその集団のおよそ５０％によって発現されるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子である。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、＊０２０２、＊０２０３、＊０２０６または＊０２０７遺伝子産物であり得る。一部の場合には、異なる集団間で、サブタイプの頻度における差異が存在し得る。例えば、一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２陽性コーカサス人集団の９５％よりも多くがＨＬＡ−Ａ＊０２０１であるが、中国人集団では、この頻度は、およそ２３％のＨＬＡ−Ａ＊０２０１、４５％のＨＬＡ−Ａ＊０２０７、８％のＨＬＡ−Ａ＊０２０６および２３％のＨＬＡ−Ａ＊０２０３であると報告されている。
【０１２４】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたは他のＭＨＣ−ペプチド結合分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連でＴ細胞エピトープを認識するまたは潜在的に認識する。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と一般に呼ばれる、有核脊椎動物細胞のサブセットにおいて発現される。ヒトでは、いくつかのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子、例えば、ＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ５２、ＤＱ１、ＤＱ２、ＤＱ４、ＤＱ８およびＤＰ１などが存在する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１である。ＭＨＣ対立遺伝子の配列は既知であり、例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａにおいて利用可能なＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースにおいて見出すことができる。
【０１２５】
各ＴＣＲは、可変相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。αおよびβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列は、それぞれ、β鎖遺伝子座における可変（Ｖβ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄβ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊβ）遺伝子セグメントの間での組換え、ならびにα鎖遺伝子座における類似のＶα遺伝子セグメントとＪα遺伝子セグメントとの間での組換えから生じる、αβＴ細胞の配列多様性を主に決定する。ＴＣＲのαおよびβ鎖遺伝子座における複数のかかる遺伝子セグメントの存在は、多数の別個のＣＤＲ３配列がコードされることを可能にする。ＴＣＲ遺伝子再配置のプロセスの間のＶβ−Ｄβ、Ｄβ−ＪβおよびＶα−Ｊα接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、ＣＤＲ３配列の多様性をさらに増加させる。これに関して、免疫適格性は、ＴＣＲの多様性に反映される。
【０１２６】
Ｂ細胞によって発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）は、一部の態様では、Ｈ２Ｌ２構造を形成する４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（ＩｇＨ）および２つの軽鎖（ＩｇＬ）からなるタンパク質である。ＩｇＨ鎖およびＩｇＬ鎖の各ペアは、ＶＬおよびＶＨ領域からなる超可変ドメイン、ならびに定常ドメインを含む。ＩｇのＩｇＨ鎖は、いくつかの型、μ、δ、γ、αおよびβのものである。個体内のＩｇの多様性は、超可変ドメインによって主に決定される。ＴＣＲと同様に、ＩｇＨ鎖のＶドメインは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントのコンビナトリアル連結によって創出される。Ｉｇ遺伝子再配置のプロセスの間のＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨおよびＶＨ−ＪＨ接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、超可変ドメイン配列の多様性をさらに増加させる。ここで、免疫適格性は、Ｉｇの多様性に反映される。
【０１２７】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindtら  Kuby  Immunology、第６版、W.H.  Freeman  and  Co.、９１頁（２００７年）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原と結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J.  Immunol.  １５０巻：８８０〜８８７頁（１９９３年）；Clarksonら、Nature  ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照のこと。
【０１２８】
「親和性部分」とは、標的抗原と相互作用する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの部分を指す。例示の親和性部分には、抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマー、小分子、薬物、細胞などが含まれる。
【０１２９】
「超可変領域」とは、抗原結合を担う、抗体またはＴＣＲのアミノ酸残基を指す。この超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基を含む。フレームワークまたはＦＲ残基は、本明細書で定義されるように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１３０】
提供される抗体のなかでも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。
【０１３１】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分、または抗体の軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。
【０１３２】
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組換え宿主細胞による産生が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。一部の実施形態では、これらの抗体は、組換え産生された断片、例えば、天然に存在しない配置を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された２もしくはそれよりも多くの抗体領域もしくは鎖を有する断片、および／または天然に存在するインタクトな抗体の酵素消化によっては産生されない可能性がある断片である。一部の態様では、これらの抗体断片は、ｓｃＦｖである。
【０１３３】
抗原結合性断片を含むＴＣＲ断片もまた提供される。一部の実施形態では、ＴＣＲは、その抗原結合性部分、例えば、完全可溶性ＴＣＲと呼ばれ得る、その膜貫通および／または細胞質領域（単数または複数）を含まない全長ＴＣＲのバリアントである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）、例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０３／０２０７６３、ＷＯ０４／０３３６８５またはＷＯ２０１１／０４４１８６に記載されるような構造を有するｓｃＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ベータ鎖可変領域に連結されたアルファ鎖可変領域を含む単鎖ＴＣＲ断片、例えば、ｓｃＴｖである。一部の実施形態では、ｓｃＴｖは、ｓｃＦｖとも呼ばれる。
【０１３４】
単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖとは、一部の態様では、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、またはＴＣＲの可変アルファもしくはガンマ鎖（ＶαもしくはＶγ）および可変ベータもしくはデルタ鎖（ＶβもしくはＶδ）ドメインを含む抗体またはＴＣＲ断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造をｓＦｖが形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間、またはＶαドメインとＶβドメインとの間、またはＶγドメインとＶδドメインとの間にさらに含む。
【０１３５】
ダイアボディとは、一部の態様では、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体および／またはＴＣＲ断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中のＶＬに接続されたＶＨ、または同じポリペプチド鎖（Ｖα−Ｖβ）中のＶβに接続されたＶα、または同じポリペプチド鎖（Ｖγ−Ｖδ）中のＶδに接続されたＶγを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を創出するように強いられる。例示のダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７およびＷＯ９３１１１１６１中により完全に記載されている。
【０１３６】
二特異性抗体または二特異性ＴＣＲとは、一部の態様では、２つの異なる型の抗原に対する特異性を示す抗体またはＴＣＲを指す。これらの用語には、本明細書で使用する場合、標的抗原に対する、および特定の組織への送達を促進する別の標的に対する結合特異性を示す抗体およびＴＣＲが具体的に含まれるがこれらに限定されない。同様に、多特異性抗体およびＴＣＲは、２またはそれよりも多くの結合特異性を有する。
【０１３７】
直鎖抗体または直鎖ＴＣＲとは、一部の態様では、抗原結合性領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１またはＶα−Ｃα１−Ｖα−Ｃα１）の対を指す。直鎖抗体およびＴＣＲは、例えば、Zapataら、Protein  Eng.  ８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁（１９９５年）に記載されるように、二特異性または単一特異性であり得る。
【０１３８】
抗原結合性ドメインとは、一部の態様では、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体またはＴＣＲの１つまたは複数の断片を指す。かかる用語内に含まれる抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）ｓｃＦｖを含む、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Wardら、（１９８９年）Nature  ３４１巻：５４４  ５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。さらに、単一の重鎖および単一の軽鎖を含む抗体、または単一のアルファ鎖もしくは単一のベータ鎖を有するＴＣＲが、この定義に含まれる。
【０１３９】
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」部分は、ペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼでＩｇを処理することによって産生され得、これらには、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することによって生成される抗体断片が含まれる。例えば、パパインは、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬおよびＣＬから構成される軽鎖ならびにＶＨおよびＣＨγ１（重鎖の定常領域中のγ１領域）から構成される重鎖断片が、それらのＣ末端領域においてジスルフィド結合を介して接続される、２つの相同な抗体断片を生成する。これら２つの相同な抗体断片の各々は、’Ｆａｂ’と呼ばれる。ペプシンもまた、２つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、２つの上述の’Ｆａｂ’がヒンジ領域において接続される断片よりも、わずかに大きい抗体断片を生成する。この抗体断片は、Ｆ（’ａｂ’）２と呼ばれる。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。’Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステイン（単数または複数）を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生される。
【０１４０】
Ｆｖとは、一部の態様では、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む抗体またはＴＣＲ断片を指す。この領域は、緊密に非共有結合的に会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインまたは１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖または１つのＴＣＲγ鎖および１つのＴＣＲδ鎖の二量体からなる。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体またはＶα−Ｖβ二量体またはＶγ−Ｖδ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、ＶＨおよびＶＬ鎖またはＶα−Ｖβ鎖またはＶγ−Ｖδ鎖の各々由来のＣＤＲのうち１つまたは複数の組合せは、抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与する。例えば、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３は、レシピエントの選択された抗体、ＴＣＲまたはそれらの抗原結合性断片のＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖またはＶγ−Ｖδ鎖に移入された場合に、抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与するのに十分であり得、ＣＤＲのこの組合せは、結合、親和性などについて試験され得ることが理解される。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し抗原と結合する能力を有するが、第２の可変ドメインと組み合わせた場合よりも低い親和性である可能性が高い。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、ＶＬおよびＶＨまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ鎖領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；Birdら（１９８８年）Science  ２４２巻：４２３〜４２６頁；Hustonら（１９８８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびOsbournら（１９９８年）Nat.  Biotechnol.  １６巻：７７８頁）としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用して連結され得る。かかるｓｃＦｖもまた、抗体の用語「抗原結合性部分」内に包含される意図である。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列は、完全なＩｇ（例えば、ＩｇＧ）分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、Ｆｃ領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結され得る。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用する、Ｆａｂ、ＦｖまたはＩｇの他の断片の生成においても使用され得る。
【０１４１】
抗原結合性ポリペプチドには、例えば、ラクダ科動物およびサメ由来の抗体などの、重鎖二量体もまた含まれ得る。ラクダ科動物抗体およびサメ抗体は、Ｖ様およびＣ様ドメインの２つの鎖のホモ二量体対を含む（どちらも軽鎖を有さない）。ラクダ科動物における重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用しないので、軽鎖と通常接触する重鎖中の領域は、ラクダ科動物では親水性アミノ酸残基に変化される。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと呼ばれる）および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。ラクダ科動物では、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域中のＣＤＲ１、２および３によって決定される。ラクダＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸の、その比較的長い長さを特徴とする（Muyldermansら、１９９４年、Protein  Engineering  ７巻（９号）：１１２９頁）。
【０１４２】
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、全てまたは実質的に全てのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を典型的には低減させるためにヒト化を受けた非ヒト抗体のバリアントを指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１４３】
提供される抗体のなかでも特に、ヒト抗体が挙げられる。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体ライブラリーなどの他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合性領域を含む非ヒト抗体のヒト化形態、例えば、全てまたは実質的に全てのＣＤＲが非ヒトであるものを排除する。
【０１４４】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含む。かかるトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活化されている。ヒト抗体はまた、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含む、ファージディスプレイライブラリーおよび無細胞ライブラリーを含むヒト抗体ライブラリーに由来し得る。
【０１４５】
提供される抗体のなかでも特に、モノクローナル抗体断片を含むモノクローナル抗体が挙げられる。用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団に由来する抗体またはかかる集団内の抗体を指す、即ち、集団を構成する個々の抗体は、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能なバリアントを除いて同一であり、かかるバリアントは一般に、微量で存在する。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対するものである。この用語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマからの生成、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイおよび他の抗体ディスプレイ法が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。
【０１４６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に使用され、最小の長さに制限されない。提供される抗体および抗体鎖ならびに他のペプチド、例えばリンカーおよび結合性ペプチドを含むポリペプチドは、天然および／または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化などもまた含む。一部の態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブまたは天然の配列に対する改変を含んでもよい。これらの改変は、部位特異的変異誘発などを介して計画的であり得、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因したエラーなどを介して偶発的であり得る。
【０１４７】
「生殖系列配列」とは、生殖系列（一倍体配偶子およびそれらが形成される二倍体細胞）由来の遺伝子配列を指す。生殖系列ＤＮＡは、単一のＩｇ重鎖もしくは軽鎖、または単一のＴＣＲαもしくはＴＣＲβ鎖、または単一のＴＣＲγもしくはＴＣＲδ鎖をコードする複数の遺伝子セグメントを含む。これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞中に保有されるが、機能的遺伝子へと配置されるまで、転写および翻訳することができない。骨髄におけるＢ細胞およびＴ細胞の分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、１０８よりも大きい特異性を生じることが可能なダイナミックな遺伝子系によってランダムにシャッフルされる。これらの遺伝子セグメントのほとんどは、生殖系列データベースによって公開および収集されている。
【０１４８】
親和性とは、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、ＫＤとして表される。リガンドに対する結合性タンパク質の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル濃度（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル濃度（ｆＭ）であり得る。用語「アビディティー」とは、希釈後の解離に対する、２またはそれよりも多くの薬剤の複合体の抵抗性を指す。
【０１４９】
エピトープとは、一部の態様では、抗体またはＴＣＲの可変領域結合ポケットとの結合相互作用を形成することが可能な、抗原または他の高分子の一部分を指す。かかる結合相互作用は、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化され得る。抗原結合には、例えば、ＣＤＲ３、ＣＤＲ３対、または一部の例では、ＶＨおよびＶＬ鎖の最大で６つ全てのＣＤＲの相互作用が関与し得る。エピトープは、直鎖ペプチド配列であり得る（即ち、「連続的」）、または非隣接アミノ酸配列から構成され得る（即ち、「コンフォメーション」または「不連続的」）。抗体またはＴＣＲは、１つまたは複数のアミノ酸配列を認識できる；したがって、エピトープは、１つよりも多くの別個のアミノ酸配列を規定できる。一部の態様では、ＴＣＲは、ＭＨＣとの関連で１つまたは複数のアミノ酸配列またはエピトープを認識できる。抗体およびＴＣＲによって認識されるエピトープは、当業者に周知のペプチドマッピングおよび配列分析技術によって決定され得る。結合相互作用は、ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化される。
【０１５０】
一部の実施形態では、特異的結合を有する抗体またはＴＣＲに対する言及は、ある抗体またはＴＣＲが、抗体またはＴＣＲによって認識されるエピトープを含む抗原以外の分子に対するいずれの顕著な結合も示さない状況を指す。この用語は、例えば、抗原結合性ドメインが、いくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、選択された抗体、ＴＣＲ、または抗原結合性ドメインを保有するそれらの抗原結合性断片は、エピトープを保有する種々の抗原に結合できる。用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片が、無関係のアミノ酸配列に結合する場合よりも高い親和性でエピトープに結合し、このエピトープを含む他のポリペプチドと交差反応性である場合には、ヒト使用への投与のために製剤化されるレベルにおいてそれらが毒性でないことを意味する。一態様では、かかる親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍大きい。用語「結合」とは、例えば、生理的条件下での共有結合、静電、疎水性、ならびにイオン性および／または水素結合相互作用に起因する２つの分子間の直接的会合を指し、これには、相互作用、例えば、塩架橋および水架橋、ならびに結合の任意の他の従来の手段が含まれる。
【０１５１】
薬学的に許容されるとは、生理的に容認可能であり、ヒトに投与した場合にアレルギー反応または類似の有害な反応、例えば、胃の不調、眩暈などを典型的には生じない、分子実体および組成物を指す。
【０１５２】
治療的組成物に言及して使用される場合、単位用量とは、ヒトへの単位的投薬量として適切な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤；即ち、担体またはビヒクルと関連して、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性材料を含有する。
【０１５３】
包装材料とは、キットの成分を収容する物理的構造を指す。この包装材料は、成分を無菌で維持でき、かかる目的のために一般に使用される材料（例えば、紙、波板（corrugated  fiber）、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）で製造され得る。標識または添付文書は、適切な書面の指示書を含み得る。したがって、キットは、本発明の任意の方法においてキット成分を使用するための標識または指示書をさらに含み得る。キットは、本明細書に記載されている方法において化合物を投与するための指示書と共に、パックまたはディスペンサー中の化合物を含み得る。
【０１５４】
「予防（prevention）」とは、予防（prophylaxis）、症状の発症の予防（prevention）、過剰なレベルのタンパク質と関連するまたはタンパク質活性と相関する疾患または障害の進行の予防（prevention）を指す。
【０１５５】
「阻害」、「処置」および「処置すること」は、相互交換可能に使用され、例えば、症状の停滞、生存の延長、症状の部分的または完全な寛解、および過剰なレベルのタンパク質と関連するまたはタンパク質活性と相関する状態、疾患または障害の部分的または完全な根絶を指す。例えば、がんの処置には、がん性成長または腫瘍の停滞、部分的または完全な排除が含まれるがこれらに限定されない。処置または部分的排除には、例えば、成長または腫瘍のサイズおよび／もしくは体積における所定倍率の低減、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれらの間の任意の倍率の低減が含まれる。同様に、処置または部分的排除には、成長または腫瘍のサイズおよび／もしくは体積における、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれらの間の任意の百分率の低減の、パーセント低減が含まれ得る。
【０１５６】
中和抗体または中和ＴＣＲとは、一部の態様では、中和が達成される機構に関わりなく、ウイルスまたは細菌などの病原体の複製を阻害する任意の抗体またはＴＣＲを指す。
【０１５７】
抗体レパートリーまたはＴＣＲレパートリーとは、抗体、ＴＣＲまたはそれらの断片の収集を指す。抗体レパートリーは、例えば、特定の抗体を選択するため、または特定の特性、例えば、結合能、結合特異性、胃腸輸送の能力、安定性、親和性などについてスクリーニングするために使用され得る。この用語は、例えば、ナイーブ、合成および半合成ライブラリーを含む、任意の供給源由来の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ抗体ファージディスプレイライブラリーが限定なしに含まれる抗体ファージディスプレイライブラリーなどのコンビナトリアルライブラリーの全ての形態を含む、抗体およびＴＣＲライブラリーを具体的に含む。
【０１５８】
「標的核酸分子」、「標的分子」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド分子」とは、目的の任意の核酸を指す。
【０１５９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖の同時プライマー伸長によるポリヌクレオチド配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅反応を指す。ＰＣＲ反応は、プライマー結合部位が隣接する鋳型ポリヌクレオチドのコピーを生成する。２つのプライマーを用いた結果は、各サイクルによって両方の鎖が複製されることによる、各サイクルによる両方の鎖の鋳型ポリヌクレオチドコピー数における指数関数的増加である。ポリヌクレオチド二重鎖は、使用されるプライマーの末端に対応する末端を有する。ＰＣＲは、鋳型ポリヌクレオチドを変性させること、プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせること、およびヌクレオチドの存在下でＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってプライマーを伸長させることの、１または複数回の反復を含み得る。特定の温度、各ステップにおける持続時間、およびステップ間の変化の速度は、当業者に周知の多くの因子に依存する（McPhersonら、IRL  Press、Oxford（１９９１年および１９９５年））。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、＞９０℃の温度で変性され得、プライマーは、５０〜７５℃の範囲の温度でアニーリングされ得、プライマーは、７２〜７８℃の範囲の温度で伸長され得る。一部の実施形態では、ＰＣＲは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲなどを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲを含まない（米国特許第５，１６８，０３８号、同第５，２１０，０１５号、同第６，１７４，６７０号、同第６，５６９，６２７号および同第５，９２５，５１７号；Mackayら、Nucleic  Acids  Research、３０巻：１２９２〜１３０５頁（２００２年））。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写反応が先行するＰＣＲ反応を含み、得られたｃＤＮＡが増幅され、ネステッドＰＣＲは、第１のセットのプライマーを使用する第１のＰＣＲ反応のアンプリコンが、それらのうち少なくとも一方が第１のＰＣＲ反応のアンプリコンの内部位置に結合する第２のプライマーセットを使用する第２のＰＣＲ反応のための試料になる、二段階ＰＣＲを含む。多重ＰＣＲは、複数のポリヌクレオチド配列が同じ反応混合物中で同時にＰＣＲに供されるＰＣＲ反応を含む。ＰＣＲ反応体積は、０．２ｐＬ〜１０００μＬの間のいずれかであり得る。定量的ＰＣＲは、試料中の１つまたは複数の配列の絶対量もしくは相対量、存在量、または濃度を測定するために設計されたＰＣＲ反応を含む。定量的測定は、１つまたは複数の参照配列または標準を目的のポリヌクレオチド配列と比較することを含み得る（Freemanら、Biotechniques、２６巻：１１２〜１２６頁（１９９９年）；Becker-Andreら、Nucleic  Acids  Research、１７巻：９４３７〜９４４７頁（１９８９年）；Zimmermanら、Biotechniques、２１巻：２６８〜２７９頁（１９９６年）；Diviaccoら、Gene、１２２巻：３０１３〜３０２０頁（１９９２年）；Becker-Andreら、Nucleic  Acids  Research、１７巻：９４３７〜９４４６頁（１９８９年））。
【０１６０】
他の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キットおよび組成物は、支持体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キット、および組成物は、支持体を含まない。典型的には、固体支持体は、１つまたは複数の剛性または半剛性表面を含む１つまたは複数の材料を含む。一部の実施形態では、この支持体は非固体支持体である。この支持体または基材は、膜、紙、プラスチック、被覆表面、平坦表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体の１つまたは複数の表面は実質的に平坦であるが、一部の実施形態では、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、またはエッチングされた溝などを有する、様々な化合物のための合成領域が物理的に分離されていることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成を含む。あるいは、固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、およびアレイを含んでいてもよい。この固体支持体は、マイクロウェルでの自己集合可能なビーズの使用を含み得る。例えば、この固体支持体は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＡｒｒａｙ技術を含む。あるいは、この固体支持体は、Ａｂｂｏｔｔ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＢｅａｄ  Ａｒｒａｙ技術、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙのＦｌｅｘｉＰｌｅｘ（商標）システムを含む。あるいは、この固体支持体は、プレートである。プレートの例としては、これらに限定されないが、ＭＳＤマルチアレイプレート、ＭＳＤ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）プレート、マイクロプレート、ＰｒｏｔｅＯｎマイクロプレート、ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡプレート、ＩｓｏＰｌａｔｅ、およびＬｕｍａＰｌａｔｅが挙げられる。一部の実施形態では、支持体は、複数のビーズを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体は、アレイを含んでいてもよい。一部の実施形態では、支持体は、ガラススライドを含んでいてもよい。ポリマーに適用可能な方法、基材および技法（米国特許第５，７４４，３０５号、同第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号および同第６，４２８，７５２号；米国���許出願公開第２００９０１４９３４０号、同第２００８００３８５５９号、同第２００５００７４７８７号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５８５１６、ＷＯ９９／３６７６０およびＷＯ０１／５８５９３）。支持体へのポリヌクレオチドの付着は、アミン−チオール架橋、マレイミド架橋、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｚｅｎｏｎ、またはＳｉｔｅＣｌｉｃｋを含んでいてもよい。支持体への標識核酸の付着は、ビオチンを複数のポリヌクレオチドに付着させること、および１つまたは複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングすることを含んでいてもよい。一部の実施形態では、この固体支持体は、ビーズである。ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられる。ビーズの直径は、約５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、または５０μｍであってもよい。この固体支持体は、アレイまたはマイクロアレイであってもよい。この固体支持体は、個別の領域を含んでいてもよい。この固体支持体は、アレイ、例えば、アドレス可能なアレイであってもよい。
【０１６１】
「ヌクレオチド」、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド残基」および「ヌクレオシド残基」とは、本明細書で使用する場合、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド残基、または増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）における使用に適切なプライマーの成分として機能することが可能な他の類似のヌクレオシドアナログを意味し得る。かかるヌクレオシドおよびその誘導体は、特記した場合を除き、本明細書に記載されるプライマーの構成要素として使用され得る。化学的改変が、必要に応じて、ポリメラーゼによる、デオキシグアニン、デオキシシトシン、デオキシチミジンまたはデオキシアデニンとしてのそれらの認識を妨害しないことを条件として、増幅反応におけるそれらの安定性または有用性を増強するために化学改変されたヌクレオシド誘導体または塩基の利用を妨げることを意味するものは、本出願中には存在しない。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリッド形成を安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリッド形成を不安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションの特異性を増強し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションの特異性を低減させ得る。
【０１６２】
「核酸」または文法的等価物とは、単一のヌクレオチド、または共有結合によって一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドのいずれかを指す。
【０１６３】
「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または文法的等価物とは、共有結合によって一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、２またはそれよりも多くのヌクレオチドを含む分子を含む。ポリヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的に改変されたもしくは生化学的に改変された非天然のヌクレオチド塩基、またはヌクレオチド塩基の誘導体を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、他の分子、例えば、別のハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはその両方の配列を含む。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡが限定なしに含まれる）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ある配列の単離されたＤＮＡ、ある配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離された、組換えの、または人工的に合成されたものであり得る。
【０１６４】
ポリヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドアナログまたは改変ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形成を安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形成を不安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの特異性を増強し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの特異性を低減させ得る。非標準ヌクレオチド改変の例には、２’Ｏ−Ｍｅ、２’Ｏ−アリル、２’Ｏ−プロパルギル、２’Ｏ−アルキル、２’フルオロ、２’アラビノ、２’キシロ、２’フルオロアラビノ、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート（phosphoroamidate）、２’アミノ、５−アルキル置換ピリミジン、３’デオキシグアノシン、５−ハロ置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ハロ置換プリン、二環式ヌクレオチド、２’ＭＯＥ、ＰＮＡ分子、ＬＮＡ−分子、ＬＮＡ様分子、ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（xantine）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０１６５】
「対象」、「個体」、「宿主」または「患者」とは、哺乳動物などの生きた生物を指す。対象および宿主の例には、ウマ、雌ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス（例えば、ヒト化マウス）、スナネズミ、非ヒト霊長類（例えば、マカク）、ヒトなど、例えば、非哺乳動物脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）、魚類（例えば、サメ）またはカエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ）、および非哺乳動物無脊椎動物を含む非哺乳動物、ならびにそれらのトランスジェニック種が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の態様では、対象とは、単一の生物（例えば、ヒト）を指す。ある特定の態様では、あるいは、研究のための共通の免疫因子および／もしくは疾患を有する小さいコホート、ならびに／または疾患を有さない個体のコホート（例えば、陰性／正常対照）を構成する個体の群が提供される。試料が取得される対象は、疾患および／または障害（例えば、１つまたは複数のアレルギー、感染、がんまたは自己免疫障害など）に苦しみ得、疾患に罹患していない陰性対照対象に対して比較され得る。
【０１６６】
「キット」とは、本明細書に開示される方法を実行するために材料または試薬を送達するための送達系を指す。一部の実施形態では、キットには、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または支持材料（例えば、アッセイを実行するための緩衝液、書面の指示書など）の貯蔵、１つの位置から別の位置へのそれらの輸送または送達を可能にする系が含まれる。例えば、キットは、適切な反応試薬および／または支持材料を含む１つまたは複数のエンクロージャー（例えば、箱）を含む。かかる内容物は、意図したレシピエントに一緒にまたは別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含み得るが、第２の容器は、複数のプライマーを含む。
【０１６７】
ポリペプチドとは、一部の態様では、少なくとも２つのアミノ酸を含む分子を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、単一のペプチドからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、２またはそれよりも多くのペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００のペプチドまたはアミノ酸を含み得る。ポリペプチドの例には、アミノ酸鎖、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ポリペプチド、サッカライド、脂質、糖脂質、リン脂質、抗体、酵素、キナーゼ、受容体、転写因子およびリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６８】
試料とは、一部の態様では、生物学的、環境的、医学的な、対象の、もしくは患者の試料、または標的ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含む試料を指す。
【０１６９】
試料
ポリヌクレオチドを含有する任意の生物学的試料が、本明細書に記載されている方法において使用され得る。例えば、試料は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含有する対象由来の生物学的試料であり得る。これらのポリヌクレオチドは、生物学的試料から抽出され得、またはこの試料は、ポリヌクレオチドの抽出も精製もなしに、この方法に直接供され得る。この試料は、抽出または単離されたＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。試料はまた、生物学的検体から抽出された総ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡであり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、種々の他の成分、例えば、タンパク質、脂質および非鋳型核酸を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌または任意の他の細胞性生物から取得される任意の細胞性材料から取得され得る。ある特定の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、単一の細胞から取得される。ポリヌクレオチドは、生物から直接、または生物から取得された生物学的試料から取得され得る。任意の組織または体液検体は、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。ポリヌクレオチドが、培養細胞、例えば、初代細胞培養物または細胞株からも単離され得る。鋳型核酸が取得される細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染し得る。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、抗体またはＴＣＲ産出免疫細胞を、免疫されているか、または感染症、がん、自己免疫状態、もしくは任意の他の疾患を罹患しているヒトまたは他の動物等の、ヒトまたは他の動物等の対象または宿主の血液または他の生物学的試料から単離して、臨床的に重要である可能性がある、病原体特異的、腫瘍特異的、および／または疾患特異的な抗体またはＴＣＲを識別することができる。例えば、ヒトは、疾患を有すると診察されていてもよく、疾患の症状を示しているが、疾患を有すると診察されていなくてもよく、または疾患の症状を示していなくてもよい。例えば、ヒトは、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に曝されたヒト、および／または感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に対する有用な抗体またはＴＣＲを作ることができるヒトであってもよい。例えば、動物は、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に曝された動物、および／または感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等）、抗原、もしくは疾患に対する有用な抗体またはＴＣＲを作ることができる動物であってもよい。免疫された宿主に由来するある特定の免疫細胞は、問題となっている１つもしくは複数の標的抗原および／または１つもしくは複数の未知抗原に対する抗体またはＴＣＲを作る。本発明では、リンパ球プールは、抗体鎖が配列決定されるか、抗体が作られるか、または発現ライブラリーが作られる前に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を使用した細胞のスクリーニングおよびソーティング、パニング法、または免疫細胞ライブラリー等の、試料に由来する複数の免疫細胞を生成するための他のスクリーニング方法等の、任意の好適な方法により所望の免疫細胞を濃縮することができる。異なる抗体を発現する免疫細胞のほんの少数のサブセット、したがって可変ドメインのほんの少数の天然由来の組合せを提供するに過ぎない従来技術の濃縮方法とは対照的に、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはＴＣＲを発現する個々の免疫細胞の少なくとも２つのサブセットを含有する。例えば、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはＴＣＲを発現する個々の免疫細胞の、少なくとも５、１０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、２５０００００、５００００００、７５０００００、または１０００００００個のサブセットを含有していてもよい。本発明の方法は、免疫細胞回収を最大化し、非常に高度な多様性をもたらす。
【０１７１】
一部の実施形態では、非免疫ヒトドナーまたは非ヒトドナーに由来する免疫細胞が利用される。動物のナイーブレパートリー（抗原負荷前のレパートリー）は、中程度の親和性（約１×１０−６〜１×１０−７ＭのＫＡ）で本質的にあらゆる非自己分子に結合することができる抗体またはＴＣＲを動物に提供する。抗体またはＴＣＲ結合部位の配列多様性は、生殖系列に直接にはコードされていないが、Ｖ遺伝子セグメントからコンビナトリアル様式でアセンブルされる。免疫処置は、上述のような、免疫原に結合して増殖し（クローン拡大）、対応する抗体を分泌するＶＨ−ＶＬまたはＶα−ＶβまたはＶγ−Ｖδ組合せを作る任意の免疫細胞を誘発する。しかしながら、免疫されていない対象に由来する脾臓細胞および／または免疫細胞もしくは他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用することにより、考え得る抗体またはＴＣＲレパートリーのより良好な提示を提供することができ、また、その後、任意の動物種を使用してＢ細胞またはＴ細胞抗体またはＴＣＲライブラリーを構築することを可能にする。
【０１７２】
一部の場合では、試験に十分な核酸を得るため、少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＬの血液容積を採取する。
【０１７３】
一部の場合では、出発物質は末梢血である。末梢血細胞は、特定の細胞タイプ（例えば、単核細胞、赤血球細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞等）を濃縮することができる。また、末梢血細胞は、特定の細胞タイプ（例えば、単核細胞、赤血球細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞等）を選択的に枯渇させることができる。
【０１７４】
一部の場合では、出発物質は、固形組織を含む組織試料であってもよく、非限定的な例としては、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃が挙げられる。他の場合では、出発物質は、核酸を含有する細胞、免疫細胞、および特にＢ細胞またはＴ細胞であってもよい。一部の場合では、出発物質は、遺伝物質を得ることができる、任意の生物に由来する、核酸を含有する試料であってもよい。一部の場合では、試料は、流体、例えば、血液、唾液、リンパ液、または尿である。
【０１７５】
試料は、ある状態を有する対象から採取することができる。一部の場合では、試料が採取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一部の場合では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん専門医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
【０１７６】
一部の場合では、非核酸物質を、酵素処理（プロテアーゼ消化等）を使用して出発物質から除去してもよい。
【０１７７】
一部の場合では、ＥＤＴＡを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有する装置内に血液を収集し、４℃で保管する。任意選択で、ＥＧＴＡを含むがそれに限定されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。別の場合では、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解阻害剤を血液に添加する。
【０１７８】
一部の場合では、抽出された物質が、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む場合、これら分子は、本分野で公知の技法を使用して二本鎖ＤＮＡに変換することができる。例えば、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡ分子からＤＮＡを合成してもよい。一部の場合では、ＲＮＡのＤＮＡへの変換は、リンカー断片をＲＮＡにライゲーションさせる事前ライゲーションステップを必要とする場合があり、ユニバーサルプライマーを使用することにより、逆転写の開始が可能になる。他の場合では、例えば、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールを使用して、逆転写を開始させることができる。ＤＮＡへの変換後、一部の場合では、本明細書に詳述されている方法を使用して、所望の配列をさらに捕捉、選択、タグ化、または単離することができる。
【０１７９】
核酸分子としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸分子は、合成であってもよく、または天然由来の供給源に由来していてもよい。一実施形態では、核酸分子は、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸等の様々な他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞性生物から得される任意の細胞性物質から得ることができる。ある特定の実施形態では、核酸分子は、単一細胞から得られる。本発明で使用される生物学的試料としては、ウイルス粒子または調製物が挙げられる。核酸分子は、直接的に生物から、または生物から得られる生物学的試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便、および組織から得ることができる。任意の組織または体液検体を、本発明で使用される核酸の供給源として使用することができる。また、核酸分子は、初代細胞培養または細胞株等の培養細胞から単離してもよい。鋳型核酸がそこから得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染していてもよい。
【０１８０】
また、試料は、生物学的検体から抽出される全ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、またはゲノムＤＮＡであってもよい。ある特定の実施形態では、核酸分子は、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合材、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等の他の標的分子に結合されている。一般的に、核酸は、SambrookおよびRussell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（２００１年）に記載されているもの等の様々な技法により生物学的試料から抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であってもよい。
【０１８１】
ＤＮＡ抽出法は、当技術分野で周知である。古典的なＤＮＡ単離プロトコールは、フェノールおよびクロロホルムの混合物等の有機溶媒を使用して抽出し、その後エタノールで析出させることに基づく（J.  Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、１９８９年、第２版、Cold  Spring  Harbour  Laboratory  Press:  New  York、N.Y.）。他の方法としては、以下のものが挙げられる：塩析ＤＮＡ抽出法（P.  Sunnucksら、Genetics、１９９６年、１４４巻：７４７〜７５６頁；S.  M.  Aljanabiら、Nucl.  Acids  Res.、１９９７年、２５巻：４６９２〜４６９３頁）、トリメチルアンモニウム臭化物塩ＤＮＡ抽出法（S.  Gustincichら、BioTechniques、１９９１年、１１巻：２９８〜３０２頁）、およびグアニジウムチオシアネートＤＮＡ抽出法（J.  B.  W.  Hammondら、Biochemistry、１９９６年、２４０巻：２９８〜３００頁）。生物学的試料からＤＮＡを抽出するための様々なキットが、商業的に入手可能である（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）；Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ミネソタ州）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．（ボセル、ワシントン州）；Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（ダーラム、ノースカロライナ州）；およびＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（バレンシア、カリフォルニア州））。
【０１８２】
また、ＲＮＡ抽出法は、当技術分野で周知であり（例えば、J.  Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、１９８９年、第２１１版、Cold  Spring  Harbour  Laboratory  Press:  New  York）、および体液からＲＮＡを抽出するためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（オースティン、テキサス州）；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ピスカタウエイ、ニュージャージー州）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）；ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（レークサクセス、ニューヨーク州）；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）；Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ミネソタ州）；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールズバッド、カリフォルニア州）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．（ボセル、ワシントン州）；Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（ダーラム、ノースカロライナ州）；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．（マディソン、ウィスコンシン州）；およびＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（バレンシア、カリフォルニア州））。
【０１８３】
１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の供給源に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、２つまたはそれよりも多くの供給源に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の対象に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、２つまたはそれよりも多くの対象に由来していてもよい。１つまたは複数の試料は、同じ対象に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、同じ種に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、異なる種に由来していてもよい。１つまたは複数の対象は、健常であってもよい。１つまたは複数の対象は、疾患、障害、または状態により影響を受けていてもよい。  
【０１８４】
一部の実施形態では、試料は、血液、唾液、リンパ液、尿、脳脊髄液、精液、痰、糞便、または組織ホモジネート等の流体である。
【０１８５】
試料は、ある状態を有する対象から採取されてもよい。一部の実施形態では、試料が採取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一部の実施形態では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん専門医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
【０１８６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合材、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等の他の標的分子に結合されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合されていない。核酸は、様々な技法により生物学的試料から抽出することができる（Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（２００１年））。
【０１８７】
一部の実施形態では、試料は唾液である。一部の実施形態では、試料は全血である。一部の場合では、試験に十分な量のポリヌクレオチドを得るため、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＬの血液容積を採取する。一部の実施形態では、血液は、ＥＤＴＡを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有する装置内に収集することができ、４℃で保管される。任意選択で、ＥＧＴＡを含むがそれに限定されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。
【０１８８】
一部の実施形態では、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解阻害剤を血液に添加する。一部の実施形態では、非核酸物質を、酵素処理（プロテアーゼ消化等）を使用して出発物質から除去してもよい。
【０１８９】
複数の試料は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００個の試料、９０００、または１０，０００個の試料、または１００，０００個の試料、または１，０００，０００個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約１０，０００個の試料を含んでいてもよい。  
【０１９０】
第１の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、第２の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。第１の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、複数の試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を含んでいてもよい。一部の実施形態では、試料中の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ未満のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。複数の試料の１つまたは複数の試料中の複数のポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの同一配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数中の総ポリヌクレオチドの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、同じ配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数の試料中の複数のポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる配列を含んでいてもよい。複数の試料の１つまたは複数中の総ポリヌクレオチドの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、少なくとも２つの異なる配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、互いのバリアントである。例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、遺伝子多型または他のタイプの突然変異を含有していてもよい。別の例では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、スプライスバリアントである。
【０１９１】
第１の試料は、１つまたは複数の細胞を含んでいてもよく、第２の試料は、１つまたは複数の細胞を含んでいてもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、第２の試料の１つまたは複数の細胞と同じ細胞タイプであってもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、複数の試料の１つまたは複数の異なる細胞と異なる細胞タイプであってもよい。
【０１９２】
複数の試料は、同時的に得てもよい。複数の試料は、同時に得ることができる。複数の試料は、順次得ることができる。複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから年単位の経過にわたって、例えば、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年、または１年にわたって得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約１年以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、４か月、３か月、２か月、または１か月以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから３０日、２８日、２６日、２４日、２１日、２０日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから約６０秒、４５秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以内に得ることができる。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を得てから１秒未満以内に得ることができる。
【０１９３】
試料の異なるポリヌクレオチドは、異なる濃度または量（例えば、異なる数の分子）で試料中に存在していてもよい。例えば、１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の別のポリヌクレオチドの濃度または量よりも多くてもよい。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはそれよりも大きな倍率で多くてもよい。別の例では、１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の別のポリヌクレオチドの濃度または量よりも少なくてもよい。試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
【０１９４】
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの試料は、異なる量または濃度のポリヌクレオチドを含有していてもよい。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、異なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも多くてもよい。例えば、血液試料は、尿試料よりも多くの量の特定のポリヌクレオチドを含有する場合がある。あるいは、単一の試料は、２つまたはそれよりも多くのサブ試料に分けることができる。サブ試料は、異なる量または濃度の同じポリヌクレオチドを含有していてもよい。１つの試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、別の試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはそれよりも大きな倍率で多くてもよい。あるいは、１つの試料中の１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、異なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも少なくてもよい。例えば、１つの試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、別の試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
【０１９５】
標的ポリヌクレオチド
一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子、例えば、細胞由来のポリヌクレオチド分子の増幅および配列決定に向けられる。一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子の２またはそれよりも多くの領域の増幅および配列決定に向けられる。一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、２またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチド分子の増幅および配列決定に向けられる。一態様では、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一態様では、標的ポリヌクレオチドはゲノム核酸である。特定の生物の染色体中の遺伝子材料に由来するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであり得る。好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体またはＴＣＲの可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体の重鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体の軽鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるＴＣＲのアルファ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるＴＣＲのベータ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるＴＣＲのガンマ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるＴＣＲのデルタ鎖の可変領域を含む配列を含む。
【０１９６】
標的ポリヌクレオチドは、事実上任意の供給源から得ることができ、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、生物または細胞（例えば、免疫細胞）からゲノムＤＮＡの断片またはｍＲＮＡを抽出して、標的ポリヌクレオチドを得ることを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の方法を使用して、増幅せずに直接単離してもよい。また、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）から逆転写ＰＣＲにより生成されるｃＤＮＡを包含することができる。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子またはそのｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡである。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来するｍＲＮＡ分子またはそのｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来するｍＲＮＡ分子またはそれらｍＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、抗体可変配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変軽鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗体配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、無細胞性の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖ＴＣＲ配列をコードするｍＲＮＡ分子である。
【０１９７】
本明細書に記載されている方法は、配列決定のために、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドのライブラリーを生成するために使用され得る。標的ポリヌクレオチドは、増幅反応の産物ではない、任意の目的のポリヌクレオチドを含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料中のポリヌクレオチドを含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応の産物を含まない。例えば、標的ポリヌクレオチドは、増幅反応の産物を生成するために使用されるポリヌクレオチド鋳型を含み得るが、増幅産物自体は含まない。例えば、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応の産物を生成するために使用されるポリヌクレオチド鋳型を含み得、逆転写反応またはプライマー伸長反応産物自体もまた含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応に供され得る目的のポリヌクレオチドを含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリアデニル化される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドである。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、エクソン、イントロン、非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１９８】
一部の実施形態では、ライブラリーは、標的ポリヌクレオチドの２またはそれよりも多くの領域から生成され得る。一部の実施形態では、方法ライブラリーは、２またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチドから生成され得る。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、染色体に由来するゲノム核酸またはＤＮＡである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、多型または変異などのバリアントを含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含みＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含みＤＮＡを含まない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの単一の鎖である。
【０１９９】
標的ポリヌクレオチドは、任意の生物学的試料から得ることができ、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、増幅せずに直接単離される。直接単離するための方法は、当技術分野で公知である。非限定的な例としては、生物学的試料、生物、または細胞からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することが挙げられる。
【０２００】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料から精製される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、それが含有されている生物学的試料から精製されていない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料から単離される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、それが含有されている生物学的試料から単離されていない。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、無細胞性の核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、断片化核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、転写された核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドである。
【０２０１】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、単一の細胞由来のポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、個々の細胞由来である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、複数の細胞を含有する試料由来のポリヌクレオチドである。
【０２０２】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個、またはそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。
【０２０３】
一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン配列のパネルを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、ＴＣＲ配列のパネルを含む。例えば、免疫グロブリン配列のパネルは、ＶＨおよび／またはＶＬ配列であってもよい。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のパネルは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２個の免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のパネルは、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２個の免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のパネルは、約１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜５０００、１０００〜６０００、１０００〜７０００、１０００〜８０００、１０００〜９０００、１０００〜１００００、５０００〜６０００、５０００〜７０００、５０００〜８０００、５０００〜９０００、５０００〜１００００、１〜１×１０５、１〜２×１０５、１〜３×１０５、１〜４×１０５、１〜５×１０５、１〜６×１０５、１〜７×１０５、１〜８×１０５、９×１０５、１〜１×１０６、１〜２×１０６、１〜３×１０６、１〜４×１０６、１〜５×１０６、１〜６×１０６、１〜７×１０６、１〜８×１０６、９×１０６、１×１０７、１〜２×１０７、１〜３×１０７、１〜４×１０７、１〜５×１０７、１〜６×１０７、１〜７×１０７、１〜８×１０７、１〜９×１０７、１〜１×１０８、１〜２×１０８、１〜３×１０８、１〜４×１０８、１〜５×１０８、１〜６×１０８、１〜７×１０８、１〜８×１０８、１〜９×１０８、１〜１×１０９、１〜２×１０９、１〜３×１０９、１〜４×１０９、１〜５×１０９、１〜６×１０９、１〜７×１０９、１〜８×１０９、１〜９×１０９、１〜１×１０１０、１〜２×１０１０、１〜３×１０１０、１〜４×１０１０、１〜５×１０１０、１〜６×１０１０、１〜７×１０１０、１〜８×１０１０、１〜９×１０１０、１〜１×１０１１、１〜２×１０１１、１〜３×１０１１、１〜４×１０１１、１〜５×１０１１、１〜６×１０１１、１〜７×１０１１、１〜８×１０１１、１〜９×１０１１、１〜１×１０１２、１〜２×１０１２、１〜３×１０１２、１〜４×１０１２、１〜５×１０１２、１〜６×１０１２、１〜７×１０１２、１〜８×１０１２、または１〜９×１０１２個の免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列を含有する。
【０２０４】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜５０００、１０００〜６０００、１０００〜７０００、１０００〜８０００、１０００〜９０００、１０００〜１００００、５０００〜６０００、５０００〜７０００、５０００〜８０００、５０００〜９０００、または５０００〜１００００塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはそれらの断片の平均の長さは、約１００、２００、３００、４００、５００、もしくは８００塩基対未満であってもよく、または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ヌクレオチド未満であってもよく、または約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００キロベース未満であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを含有する試料等の、相対的に短い鋳型に由来する標的配列は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基である。ある特定の実施形態では、配列決定データは、疾患または状態に関連する配列または免疫グロブリンもしくはＴＣＲ配列を含有するデータベースを使用して、既知のまたは予想される配列に対してアラインされる。
【０２０５】
Ｂ細胞ライブラリー遺伝子材料のクローニングおよび発現
一部の態様では、「抗体発現ライブラリー」または「ＴＣＲ発現ライブラリー」または「発現ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質レベルのいずれかでの分子のコレクション（つまり２つまたはそれよりも多くの分子）を指す場合がある。したがって、一部の実施形態では、この用語は、複数の抗体またはＴＣＲ分子をコードする発現ベクターのコレクション（つまり、核酸レベル）を指していてもよく、かつ／またはそれらが適切な発現系で発現された後の抗体またはＴＣＲ分子のコレクション（つまり、タンパク質レベル）を指していてもよい。あるいは、発現ベクター／発現ライブラリーは、それらが発現され得る好適な宿主細胞に含有されていてもよい。本発明の発現ライブラリー中のコードまたは発現されている抗体分子は、任意の適切な形式であってもよく、例えば、抗体またはＴＣＲ分子全体であってもよく、抗体またはＴＣＲ断片、例えば単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ抗体）、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２断片、ダイアボディ等であってもよい。用語「コードする（encoding）」および「コードする（coding  for）」、例えば、特定の酵素を「コードする」／「コードする」核酸配列、または特定の酵素のＤＮＡコード配列、または特定の酵素を「コードする」／「コードする」ヌクレオチド配列など、ならびに他の同義的な用語は、適切な調節配列の制御下に置かれると酵素に転写および翻訳されるＤＮＡ配列を指す。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、下流（３’方向）コード配列の転写を開始可能であるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、その３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要なエレメントを有する最小数の塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼがこの配列に結合し、転写が開始コドン（プロモーターを有する３’末端）から開始されると、転写は、３’方向の下流に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより便利に規定される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されることになる。
【０２０６】
本発明の抗体またはＴＣＲ発現ライブラリーにより特定される、に由来する、から選択される、またはから得ることができる抗体またはＴＣＲ分子は、本発明のまたさらなる態様を形成する。この場合も、これら抗体またはＴＣＲ分子は、抗体またはＴＣＲ分子をコードするタンパク質または核酸であってもよく、次いで、核酸は、適切な発現ベクターに組み込まれてもよく、および／または好適な宿主細胞に含有されてもよい。
【０２０７】
ｃＤＮＡプールは、抗体遺伝子の重鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ遺伝子のＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。ｃＤＮＡプールは、抗体またはＴＣＲ遺伝子の重鎖またはアルファもしくはガンマ鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＨまたはＶαまたはＶγ鎖領域の領域５’〜５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。また、ＰＣＲ反応は、例えばカッパおよびラムダクラスのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖プールを増幅するように設定してもよい。ｃＤＮＡプールは、抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ遺伝子のＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。ｃＤＮＡプールは、抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖領域の領域５’〜５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にＰＣＲ反応に供してもよい。そのようなオリゴヌクレオチドまたはプライマーは、既知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列データベース情報に基づいて設計することができる。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列は、重鎖または軽鎖遺伝子に、特にＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的ではない１つまたは複数のプライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、Ｃ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマー、およびＣ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーである第２のプライマーまたは複数の第２のプライマーを有するプライマーセットを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマーおよびユニバーサル配列に特異的な第２のプライマーを有するプライマーセットを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。
【０２０９】
一部の実施形態では、逆転写時に、得られたｃＤＮＡ配列を、免疫グロブリン遺伝子に特異的な、特にＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的な１つまたは複数のプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅してもよい。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ配列は、Ｖ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＶ遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅により産生されるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列のライブラリーから得ることができ（Nichollsら、J.  Immunol.  Meth.、１９９３年、１６５巻：８１頁；ＷＯ９３／１２２２７）、または入手可能な情報に基づき、標準的な当技術分野で公知の方法に従って設計される。（ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列を、通常は介在スペーサー配列（例えば、インフレーム可撓性ペプチドスペーサーをコードする）とライゲーションさせて、単鎖抗体をコードするカセットを形成することができる）。Ｖ領域配列は、免疫グロブリン発現細胞のｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物として便利にクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ領域は、任意選択で、本明細書に記載されている方法で、特に、言及されているある特定のステップ後（例えば、単一細胞ＰＣＲ後、哺乳動物または他の細胞表面ディスプレイ後、およびＦＡＣＳスクリーニング後等）に配列決定される。他の理由の中でも、多様性のレベルが許容可能なレベルにあることを確認するために、配列決定を使用してもよい。配列決定は、ハイスループット配列決定、ディープシーケンシング（複数の個々の試料に由来する同じ遺伝子を配列決定して、配列の差異を識別する）、またはこの２つの組合せを含んでいてもよい。
【０２１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、天然のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ組合せを、物理的に連結することは必要とされない。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ、バーコード化ポリヌクレオチド、またはＰＣＲ増幅バーコード化ｃＤＮＡは、物理的に連結されていない。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ、バーコード化ポリヌクレオチド、またはＰＣＲ増幅バーコード化ｃＤＮＡは、同じ反応またはベッセルでは、物理的に連結されていない。
【０２１１】
一部の実施形態では、天然のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ組合せは、ｃＤＮＡプライマーに加えて、ＶＨまたはＶαまたはＶγ遺伝子の５’末端に対する１つのプライマーまたは複数のプライマー、およびＶＬまたはＶβまたはＶδ遺伝子の５’末端に対する別のプライマーまたは複数のプライマーを使用して、物理的に連結される。また、これらプライマーは、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ遺伝子の自己集合を可能にするための追加的な配列である相補的尾部を含有する。増幅および連結反応は各細胞内で実施されたため、ＰＣＲ増幅および連結後に、混合産物、言い換えれば混合可変領域を得る可能性は最小限である。混合のリスクは、Ｖ領域ｃＤＮＡ対が細胞区画の外に出て相互混合せず、ＰＣＲ増幅および連結のために細胞内に残留することを更に保証するために、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド等の嵩高い試薬を利用することによりさらに低減させることができる。増幅された配列は、相補的末端配列のハイブリダイゼーションにより連結される。連結後、配列は、本明細書に記載のさらなる方法ステップで使用される細胞から回収することができる。例えば、回収されたＤＮＡは、必要に応じて末端プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、下記に詳述されているような、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルスベクター、またはそれらの組合せであってもよいベクターにクローニングすることができる。ハイブリダイズされた配列に便利な制限酵素部位を組み込んで、クローニングを容易にしてもよい。また、こうしたベクターは、後に使用するための、連結された可変領域のライブラリーとして保存してもよい。
【０２１２】
さらなるＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδの組合せを提供することが所望される一部の実施形態では、発現系は、これを促進するように選択される。例えば、バクテリオファージ発現系は、重鎖および軽鎖の配列のランダムな組合せを可能にする。他の適切な発現系が、当業者に既知である。
【０２１３】
非ヒトに由来するＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列の場合、一部の実施形態では、これら配列を完全ヒトＦｃとキメラ化することが好ましい場合があることが留意されるべきである。本明細書で使用される場合、「キメラ化」は、重鎖および軽鎖可変領域またはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ領域がヒト由来ではなく、重鎖および軽鎖またはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ鎖の定常領域がヒト由来である免疫グロブリンまたはＴＣＲを指す。これは、可変ドメインをヒトＦｃに増幅およびクローニングすることにより達成される。ヒトＦｃは、ベクターの一部であってもよく、または別々の分子にあってもよく、Ｆｃのライブラリーを使用することもできる。好ましい実施形態では、キメラ化分子をＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞で成長させ、ＦＡＣＳで２回スクリーニングして、細胞集団を、目的の抗体を発現する細胞について濃縮する。キメラ化抗体またはＴＣＲは、配列決定してから機能的に特徴付けるか、または直接的な機能特徴付けもしくは動力学のいずれかにより特徴付けられる。成長、スクリーニング、および特徴付けは、下記に詳細に記載されている。
【０２１４】
上述のＰＣＲ反応は、ＩｇＧ形態の抗体をクローニングするために記載されていることに留意することが重要である。ＩｇＧ形態の抗体は、一般的により成熟した免疫応答と関連しており、一般的にＩｇＭ抗体よりも高い親和性を示し、ある特定の治療または診断応用により望ましいため、好ましい。しかしながら、明らかに、所望であるかまたは適切である場合、免疫グロブリン分子の他の形態、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤの１つまたは複数のクローニングを可能にすることになるポリヌクレオチドを設計することができる。
【０２１５】
抗体またはＴＣＲを識別し、前記細胞の適切な集団を一旦適切な時点で単離し、任意選択で上述のように濃縮した後、細胞に含有されている遺伝物質の完全性を維持することができ、それにより後日ライブラリーを作ることが可能である場合、抗体またはＴＣＲ発現ライブラリーを直ちに生成する必要はない。したがって、例えば、細胞、細胞溶解物、または核酸、例えばＲＮＡまたはそれに由来するＤＮＡは、適切な方法、例えば凍結により後日まで保管し、後日に所望となった時点で、発現ライブラリーを生成してもよい。
【０２１６】
発現ベクターのライブラリーが生成されたら、コードされた抗体分子を、適切な発現系で発現し、周知であり当技術分野で記録されている適切な技法を使用してスクリーニングすることができる。したがって、上記で規定されている本発明の方法は、下記さらに詳述するように、適切な発現系で発現ベクターのライブラリーを発現すること、および発現されたライブラリーを所望の特性を有する抗体についてスクリーニングすることをさらに含んでいてもよい。
【０２１７】
本明細書に示されているように、抗体またはＴＣＲ配列をコードするポリヌクレオチドを含む、本開示の方法により調製されるポリヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、それ自体が抗体またはＴＣＲ断片のアミノ酸配列をコードするもの、抗体もしくはＴＣＲ全体またはその部分の非コード配列、抗体またはＴＣＲ、断片または部分のコード配列、ならびに上述の追加のコード配列を有するまたは有していない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列等の、非コード５’および３’配列を含むがこれらに限定されない追加の非コード配列を共に有する、少なくとも１つのイントロン等の、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングに役割を果たす転写された未翻訳配列等の、追加の配列；追加の機能性を提供するもの等の、追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列が挙げられる。したがって、抗体をコードする配列は、抗体またはＴＣＲ断片または部分を含む融合抗体またはＴＣＲの精製を容易にするペプチドをコードする配列等のマーカー配列に融合されていてもよい。
【０２１８】
その後、任意選択で、一次ＰＣＲ産物を、抗体またはＴＣＲ可変ドメインＶＨ、ＶＬカッパおよびＶＬラムダまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδの５’および３’末端にハイブリダイズする新しいポリヌクレオチドセットが用いられる二次ＰＣＲ反応に供してもよい（適宜、新しいポリヌクレオチドセットが使用される一次ＰＣＲ反応が、重鎖または軽鎖抗体遺伝子またはＶαもしくはＶβ  ＴＣＲ遺伝子またはＶγもしくはＶδ  ＴＣＲ遺伝子の部分を増幅するように設計されていたか否かに応じて）。これらポリヌクレオチドは、後にクローニングするための規定セットの制限酵素に特異的なＤＮＡ配列（つまり、制限酵素部位）を含むことが有利である。選択された制限酵素は、ヒト抗体またはＴＣＲ  Ｖ遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。しかしながら、含まれる好ましい制限酵素部位は、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩである。そのような二次ＰＣＲ反応の産物は、種々のＶ重鎖、Ｖ軽鎖カッパ、およびＶ軽鎖ラムダ抗体断片／ドメインのレパートリーである。したがって、目的の発現ライブラリー形式が、ｓｃＦｖまたはＦｖ形式であり、抗体またはＴＣＲのＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδドメインのみが存在する場合、一般的に、このタイプの二次ＰＣＲ反応が実施される。
【０２１９】
また、ＰＣＲ産物は、バーコード化ポリヌクレオチドの５’および３’末端にハイブリダイズする新しいプライマーセットを用いたＰＣＲ反応に供してもよい。これらポリヌクレオチドは、有利には、後にクローニングするための、規定セットの制限酵素に特異的なＤＮＡ配列（つまり、制限酵素部位）を含むことができる。選択された制限酵素は、ヒト抗体またはＴＣＲ  Ｖ遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。しかしながら、導入される好ましい制限酵素部位は、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩである。そのような二次ＰＣＲ反応の産物は、種々のＶＨ、ＶＬカッパ、およびＶＬラムダ抗体断片／ドメイン、またはＶαおよびＶβもしくはＶγおよびＶδ  ＴＣＲ断片／ドメインのレパートリーである。
【０２２０】
当業者は、重鎖もしくは軽鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または単鎖抗体もしくはＴＣＲを、この系と共に使用することもできることを認識する。重鎖もしくは軽鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖に突然変異を誘発させ、その後、相補鎖を溶液に添加してもよい。その後、２つの鎖を組み合わせて、機能性抗体断片を形成することが可能である。ランダムで非特異的な軽鎖もしくは重鎖またはＶαもしくはＶβ鎖またはＶγもしくはＶδ鎖配列を添加することにより、多様なメンバーのライブラリーを生成するためのコンビナトリアル系を産生することが可能になる。
【０２２１】
本明細書で規定されている免疫負荷宿主のＢまたはＴリンパ球に由来する抗体またはＴＣＲ遺伝子の可変重鎖もしくはＶα鎖もしくはＶγ鎖領域またはそれらの断片、および／あるいは可変軽鎖もしくはＶβ鎖もしくはＶδ鎖領域またはそれらの断片を含む、クローニングされた断片のそのようなレパートリーのライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。クローニングされた可変領域を含むこうしたライブラリーを、任意選択で発現ベクターに挿入して、発現ライブラリーを形成してもよい。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＰＣＲ反応は、単離された免疫細胞集団に含有されている種々の抗体またはＴＣＲ鎖の定常領域の全体または一部を保持するように設定することができる。これは、発現ライブラリー形式がＦａｂ形式であり、重鎖またはアルファ鎖またはガンマ鎖成分が、ＶＨまたはＶαまたはＶγおよびＣＨまたはＣαまたはＣγドメインを含み、軽鎖またはＶβ鎖またはＶδ鎖成分が、ＶＬまたはＶβまたはＶδ鎖およびＣＬまたはＣβまたはＣδドメインを含む場合に望ましい。この場合も、抗体またはＴＣＲ鎖の定常領域の全体または一部を含むそのようなクローニングされた断片のライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。
【０２２３】
こうした核酸は、本発明のポリヌクレオチドの他の配列を含むことができるため便利である。例えば、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多重クローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を支援することができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、翻訳された本発明のポリヌクレオチドの単離を支援することができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。任意選択で、コード配列を除く本発明の核酸は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび／または発現するためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
【０２２４】
追加の配列を、そのようなクローニングおよび／または発現配列に付加して、クローニングおよび／または発現時のそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を支援し、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当技術分野で周知である。（例えば、Ausubel、上記；またはSambrook、上記を参照）。
【０２２５】
本明細書で開示されているライブラリーは、様々な用途で使用することができる。本明細書で使用される場合、ライブラリーは、複数の分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のプライマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、１つまたは複数のポリヌクレオチド、アンプリコン、またはアンプリコンセットに由来する複数の配列読み取りを含む。ライブラリーは、保管し、分析用の試料を生成するために複数回使用することができる。一部の用途としては、例えば、遺伝子多型を遺伝子型決定すること、ＲＮＡプロセシングを研究すること、および本明細書で提供されている方法により配列決定するための代表的クローンを選択することが挙げられる。配列決定または増幅のためのプライマーまたはライブラリー等の複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを生成することができ、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個、またはそれよりも多くの分子バーコードまたはベッセルバーコードを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個、またはそれよりも多くの固有のポリヌクレオチドを含み、各固有のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを含む。
【０２２６】
バーコード
バーコードは、分子バーコードまたはベッセルバーコードであり得る。一部の実施形態では、バーコード、例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、２〜３６ヌクレオチド、４〜３６ヌクレオチド、または６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、または６〜２０ヌクレオチドの範囲内の長さを各々有し得る。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに１０℃以内、互いに５℃以内、または互いに２℃以内である。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに１０℃以内、互いに５℃以内、または互いに２℃以内ではない。他の態様では、バーコードは、最小限に交差ハイブリダイズするセットのメンバーである。例えば、かかるセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、セットの全ての他のメンバーのヌクレオチド配列とは十分に異なり得、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で任意の他のメンバーの相補体と安定な二重鎖を形成できるメンバーは存在しない。一部の実施形態では、最小限に交差ハイブリダイズするセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、全ての他のメンバーのヌクレオチド配列とは、少なくとも２つのヌクレオチドが異なる。バーコード技術は、Winzelerら（１９９９年）Science  ２８５巻：９０１頁；Brenner（２０００年）Genome  Biol.１巻：１頁；Kumarら（２００１年）Nature  Rev.  ２巻：３０２頁；Giaeverら（２００４年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０１巻：７９３頁；Easonら（２００４年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０１巻：１１０４６頁；およびBrenner（２００４年）Genome  Biol.  ５巻：２４０頁に記載されている。
【０２２７】
本明細書で使用する場合、分子バーコードは、単一の細胞由来のもしくは単一のベッセル由来の単一の分子、あるいは２もしくはそれよりも多くの単一の細胞由来のまたは２もしくはそれよりも多くの単一のベッセル由来の複数の分子または分子のライブラリーのうちの２またはそれよりも多くの分子に固有の情報を含む。本明細書で使用する場合、ベッセルバーコードは、異なる単一の細胞由来のまたは異なる単一のベッセル由来のポリヌクレオチドと比較して、単一の細胞由来のまたは単一のベッセル由来のポリヌクレオチドに固有の情報を含む。一部の実施形態では、この固有の情報は、ヌクレオチドの固有の配列を含む。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードの配列は、分子バーコードまたはベッセルバーコードを構成するヌクレオチドの固有の配列またはランダム配列の正体および順序を決定することによって決定され得る。一部の実施形態では、この固有の情報は、標的ポリヌクレオチドの配列を識別するためには使用できない。例えば、分子バーコードは、１つの標的ポリヌクレオチドに付着され得るが、分子バーコードは、それが付着される標的ポリヌクレオチドを決定するためには使用できない。一部の実施形態では、この固有の情報は、標的ポリヌクレオチドの配列の正体に関連付けられた既知の配列ではない。例えば、ベッセルバーコードは、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドに付着され得るが、このベッセルバーコードは、そのうちの、それが付着される１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを決定するためには使用できない。一部の実施形態では、この固有の情報は、ヌクレオチドのランダム配列を含む。一部の実施形態では、この固有の情報は、ポリヌクレオチド上のヌクレオチドの１つまたは複数の固有の配列を含む。一部の実施形態では、この固有の情報は、ディジェネレートヌクレオチド配列またはディジェネレートバーコードを含む。ディジェネレートバーコードは、可変ヌクレオチド塩基の組成または配列を含み得る。例えば、ディジェネレートバーコードは、ランダム配列であり得る。一部の実施形態では、分子バーコードまたはベッセルバーコードの相補体の配列もまた、分子バーコードまたはベッセルバーコードの配列である。
【０２２８】
分子バーコードまたはベッセルバーコードは、任意の長さのヌクレオチドを含み得る。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを含み得る。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、多くて約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、特定の長さのヌクレオチドを有する。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド長であり得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも約２ヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、多くて約１０００ヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、多くて約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、同じ長さのヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の各分子バーコードまたはベッセルバーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、異なる長さのヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の１つまたは複数の第１の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドまたは少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドを有し得、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコード中の１つまたは複数の第２の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを有し得、ここで、１つまたは複数の第１の分子バーコードまたはベッセルバーコードのヌクレオチドの数は、１つまたは複数の第２の分子バーコードまたはベッセルバーコードとは異なる。
【０２３０】
分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。ベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍であってもよい。
【０２３１】
異なる分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、異なる分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
【０２３２】
単一ベッセル中の異なる分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中の異なる分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
【０２３３】
異なるベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、多くとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分の１である。
【０２３４】
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に由来する増幅産物分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に由来する増幅産物分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である。
【０２３５】
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、多くとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分の１である。
【０２３６】
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１つの分子であってもよい。単一ベッセル中の増幅されていないベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１つの分子であってもよい。
【０２３７】
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、同じ濃度を有する。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、同じ濃度を有する。
【０２３８】
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、異なる濃度を有する。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％は、異なる濃度を有する。
【０２３９】
分子バーコードまたはベッセルバーコードの集団中の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれよりも多くの異なる配列を有し得る。例えば、集団中の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００またはそれよりも多くの異なる配列を有し得る。したがって、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、標的ポリヌクレオチドなどの１つまたは複数のポリヌクレオチドとは異なる、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれよりも多くの配列を生成するために使用され得る。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、標的ポリヌクレオチドなどの１つまたは複数のポリヌクレオチドとは異なる、少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれよりも多くの配列を生成するために使用され得る。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチドとは異なる、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれよりも多くの配列を生成するために使用され得る。
【０２４０】
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、アンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチド分子に由来していた。
【０２４１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子に由来していた。
【０２４２】
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコードおよび同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用せずに、配列をアラインする。
【０２４３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用せずに、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用せずに、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をアラインする。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。
【０２４４】
一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は、アンプリコンセットに由来する２つまたはそれよりも多くの配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチド分子に由来していた。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一細胞または単一ベッセルに由来していた。
【０２４５】
液滴生成
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、バイオマーカー配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。
【０２４６】
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、生物のトランスクリプトームのパーセントを表す配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。例えば、配列のレパートリーは、生物のトランスクリプトームの少なくとも約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である複数の配列を含んでいてもよい。
【０２４７】
免疫細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の免疫細胞の個々の免疫細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、重鎖および軽鎖配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。また、こうした方法は、バーコード化配列に基づいて配列決定した後、重鎖および軽鎖の対合を可能にし得る。また、本明細書に記載のように試料を小さな反応容積に分割することは、試薬使用量を低減し、それにより分析の材料費の削減を可能にし得る。
【０２４８】
一部の場合では、逆転写反応および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）は、液滴デジタルＰＣＲ等のように、液滴中で実施される。ある特定の態様では、本発明は、標的物質の全体または部分を含有する流体区画を提供する。一部の実施形態では、区画は、液滴である。明細書の全体にわたって「液滴」が参照されているが、この用語は、別様の指定がない限り、流体区画および流体分配と同義的に使用される。別様の指定がある場合を除き、便宜的に「液滴」を使用し、任意の流体分配または区画を使用することができる。本明細書で使用される液滴は、米国特許第７，６２２，２８０号に記載のもの等の、エマルジョン組成物（または、２つまたはそれよりも多くの不混和性流体の混合物）を含んでいてもよい。液滴は、ＷＯ２０１０／０３６３５２に記載のデバイスにより生成することができる。用語「エマルジョン」は、本明細書で使用される場合、不混和性液体（油および水等の）の混合物を指す場合がある。油相および／または油中水型エマルジョンは、水性液滴内での反応混合物の区画化を可能にする。エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含むことができる。本明細書で提供されるエマルジョンは、液滴が連続水相内の油液滴である水中油型エマルジョンであってもよい。本明細書で提供される液滴は、区画間の混合を防止し、各区画が、その内容物を、蒸発および他の区画の内容物との凝集から保護するように設計される。
【０２４９】
本明細書に記載されている混合物またはエマルジョンは、安定であってもよく、または不安定であってもよい。エマルジョンは、比較的安定しており、凝集は最小限である。小液滴が組み合わさって次第により大きな液滴を形成する場合、凝集が生じたという。一部の場合では、液滴生成装置から生成された液滴の０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満が、他の液滴と凝集する。また、エマルジョンは、フロキュレーションが限定的であってもよく、フロキュレーションとは、分散相が懸濁液からフレーク状に沈殿するプロセスである。
【０２５０】
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンの、または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロン未満の、または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンよりも大きな、または少なくとも約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、もしくは５００ミクロンの平均直径を有する液滴を生成することができる。液滴は、約０．００１〜約５００、約０．０１〜約５００、約０．１〜約５００、約０．１〜約１００、約０．０１〜約１００、または約１〜約１００ミクロンの平均直径を有していてもよい。マイクロチャネルクロスフローフォーカシング（microchannel  cross-flow  focusing）または物理的な撹拌を使用して、単分散または多分散エマルジョンのいずれかが生成される、エマルジョン液滴を生成するためのマイクロ流体法が既知である。液滴は、単分散液滴であってもよい。液滴は、液滴のサイズが、液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス５％を超えて変動しないように生成することができる。一部の場合では、液滴は、液滴のサイズが、液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス２％を超えて変動しないように生成される。液滴生成装置は、単一試料から液滴の集団を生成することができ、液滴はいずれも、液滴の全集団の平均サイズのプラスまたはマイナス約０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を超えてサイズが変動しない。
【０２５１】
より高い機械的安定性は、マイクロ流体の操作、およびより高剪断での流体処理（例えば、マイクロ流体毛細管での、または流体経路中のバルブ等の９０度屈曲による）に有用であり得る。熱処理前または熱処理後の液滴またはカプセルは、標準的ピペット操作および遠心分離に対して機械的に安定であり得る。
【０２５２】
液滴は、油相を水性試料に通して流動させることにより形成することができる。水相は、細胞、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子バーコード化ポリヌクレオチド、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および／または逆転写酵素等の酵素を含む、増幅反応を実施するための緩衝溶液および試薬を含んでいてもよい。
【０２５３】
水相は、ビーズ等の固体表面を用いてまたは用いずに増幅反応を実施するための緩衝溶液および試薬を含んでいてもよい。緩衝溶液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭの、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭよりも多くの、または約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、もしくは２００ｍＭ未満のＴｒｉｓを含んでいてもよい。一部の場合では、塩化カリウムの濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭよりも高いか、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ未満であってもよい。緩衝溶液は、約１５ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび５０ｍＭ  ＫＣｌを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、濃度が、各々、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍの、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍよりも高い、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｍ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を含んでいてもよい。一部の場合では、ｄＵＴＰは、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍの、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍよりも高い、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００、８００、９００、もしくは１０００μｍ未満の濃度になるように水相内に添加される。一部の場合では、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム（ＭｇＣｌ２）は、約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭの、約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭよりも高い、または約１．０、２．０、３．０、４．０、もしくは５．０ｍＭ未満の濃度で水相に添加される。ＭｇＣｌ２の濃度は、約３．２ｍＭであってもよい。一部の場合では、酢酸マグネシウムまたはマグネシウムが使用される。一部の場合では、硫酸マグネシウムが使用される。
【０２５４】
ＢＳＡまたはウシ皮膚に由来するゼラチン等の非特異的ブロッキング剤を使用することができ、ゼラチンまたはＢＳＡは、およそ０．１〜０．９％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。他の考え得るブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、または他の一般的のブロッキング剤を挙げることができる。一部の場合では、ＢＳＡおよびゼラチンの好ましい濃度は、約０．１％ｗ／ｖである。
【０２５５】
水相内の増幅用プライマーは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍの、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍよりも高い、または約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、もしくは２．０μｍ未満の濃度を有していてもよい。水相内のプライマー濃度は、約０．０５〜約２、約０．１〜約１．０、約０．２〜約１．０、約０．３〜約１．０、約０．４〜約１．０、または約０．５〜約１．０μｍであってもよい。プライマーの濃度は、約０．５μｍであってもよい。ＰＣＲにおける標的核酸濃度の許容範囲は、限定されないが、約１ｐｇ〜約５００ｎｇの間が挙げられる。
【０２５６】
また、一部の場合では、水相は、添加剤を含んでいてもよく、添加剤としては、これらに限定されないが、非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオプリザバティブ（biopreservative）（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲエンハンサー（例えば、ベタイン、トレハロース等）、および阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）が挙げられる。他の添加剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝［カルボキシ（caroxy）−メチル］トリメチルアンモニウム、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（tetraethyammonium  chloride）（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑを挙げることができる。一部の場合では、水相は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含んでいてもよい。他の場合では、水相は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含んでいてもよい。
【０２５７】
一部の場合では、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１．０％の濃度で水相に添加してもよい。一般的なバイオサーファクタント（biosurfactant）としては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ、およびＺｏｎｙｌ  ＦＳＮ等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、約０．５％ｗ／ｖの濃度で存在していてもよい。
【０２５８】
一部の場合では、塩化マグネシウムの代わりに、硫酸マグネシウムを同様の濃度で用いることができる。種々の供給業者から市販されている広範な一般的ＰＣＲ緩衝液を、緩衝溶液の代わりに用いることができる。
【０２５９】
エマルジョンは、加熱することにより固体様界面フィルムを有するマイクロカプセルへと変換することができる液体様界面フィルムを有する高度に単分散性の液滴を生成するように調合することができる。そのようなマイクロカプセルは、ＰＣＲ増幅等の反応プロセス中にわたって内容物を保持することが可能なバイオリアクターとして働くことができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱時に生じてもよい。例えば、そのような変換は、約５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または９５℃よりも高い温度で生じてもよい。一部の場合では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して生じる。加熱プロセス中、流体または鉱油オーバーレイを使用して、蒸発を防止してもよい。過剰な連続相油は、加熱前に除去してもよく、または除去しなくてもよい。生体適合性カプセルは、幅広い熱的および機械的処理で凝集および／またはフロキュレーションに耐性であってもよい。変換後、カプセルは、約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃で、約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃よりも高い温度で、または約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、もしくは４０℃未満で保管することができる。こうしたカプセルは、巨大分子、特に、核酸またはタンパク質または両方一緒の混合物を含有する水性生物学的流体の安定デジタル化封入；薬物およびワクチン送達；生体分子ライブラリー；および臨床イメージング用途等の、生物医学的用途に有用であり得る。
【０２６０】
マイクロカプセルは、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有していてもよく、特に高温で凝集に耐性であってもよい。したがって、ＰＣＲ増幅反応は、非常に高い密度（例えば、１単位容積当たりの反応数）で生じてもよい。一部の場合では、１ｍｌ当たり１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００よりも多くの別個の反応が生じてもよい。一部の場合では、反応は、単一のウェルにて、例えば、マイクロタイタープレートのウェルにて、反応容積間で相互混合を生じさせずに生じる。また、マイクロカプセルは、逆転写、プライマー伸長、および／またはＰＣＲ反応が生じることを可能にするために必要な他の成分、例えばプライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ等を含有していてもよい。こうしたカプセルは、幅広い熱的および機械的処理で凝集およびフロキュレーションに耐性を示す。
【０２６１】
一部の場合では、増幅ステップは、マイクロ流体に基づくデジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ等のデジタルＰＣＲを実施することにより行われる。
【０２６２】
液滴は、マイクロ流体システムまたはデバイスを使用して生成することができる。本明細書で使用される場合、「マイクロ」という接頭辞（例えば、「マイクロチャネル」または「マイクロ流体」の）は、一般的に、約１ｍｍ未満の、一部の場合では、約１００ミクロン（マイクロメートル）未満の幅または直径を有する要素または物品を指す。一部の場合では、要素または物品は、流体が流動し得るチャネルを含む。加えて、「マイクロ流体」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのマイクロスケールチャネルを含むデバイス、装置、またはシステムを指す。
【０２６３】
マイクロ流体システムおよびデバイスは、様々な状況で、典型的には小型実験室（例えば、臨床）分析の状況で記載されている。他の使用も同様に記載されている。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ０１／８９７８８、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００８／０６３２２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５、およびＷＯ２００８／０６３２２７。
【０２６４】
液滴は、一般的に、第２のキャリア流体内に、ある量の第１の試料流体を含む。当技術分野で既知の、液滴を形成するための任意の技法を、本発明の方法と共に使用することができる。例示の方法は、標的物質（例えば、免疫細胞）を含有する試料流体の流動を、流動中のキャリア流体の２つの対向流動と交差するように流動させることを含む。キャリア流体は、試料流体と不混和性である。試料流体を、流動中のキャリア流体の２つの対向流動と交差させることにより、標的物質を含有する個々の試料液滴内への試料流体の分配がもたらされる。
【０２６５】
キャリア流体は、試料流体と不混和性である任意の流体であってもよい。例示のキャリア流体は、油である。ある特定の実施形態では、キャリア流体は界面活性剤を含む。
【０２６６】
同じ方法を適用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多重鎖置換増幅等の非ＰＣＲ系増幅反応、または当業者に既知の他の方法等の増幅反応用の試薬等の他の試薬を含有する個々の液滴を創出することができる。ＰＣＲに基づく増幅反応の実施に好適な試薬は当業者に既知であり、これらに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ならびに１つまたは複数の緩衝液が挙げられる。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、流体区画は、標的物質（例えば、免疫細胞および／またはビーズ等の固体支持体）を含む第１の流体分配（例えば、液滴）および第２の流体（例えば、流体流動として、または液滴内）を提供することにより形成される。第１および第２の流体を合流させて、液滴を形成する。合流は、２つの流体に電場をかけることにより達成してもよい。ある特定の実施形態では、第２の流体は、ポリメラーゼ連鎖反応または増幅反応等の増幅反応を実施するための試薬を含有する。
【０２６８】
ある特定の態様では、本発明は、固有にバーコード化された重鎖および軽鎖抗体配列ならびに／またはアルファおよびベータ鎖ＴＣＲ配列ならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ＴＣＲ配列のライブラリーを作製するための方法であって、各構築物が固有のＮ量体および機能性Ｎ量体を含む複数の核酸構築物を得ることを含む方法を提供する。機能性Ｎ量体は、ランダムＮ量体、ＰＣＲプライマー、ユニバーサルプライマー、抗体、粘着末端、または任意の他の配列であってもよい。上記方法は、各々が固有の構築物の１つまたは複数のコピーを含有するＮ数の流体区画のＭ個のセットを作製することを含んでいてもよい。上記方法は、追加の構築物をセット内の各区画に添加し、これを各セットについて繰り返して、各々が固有な１対の構築物を含有するＮ×Ｍ個の区画を生成することにより、より高度な複雑さを有するバーコードライブラリーを創出することができる。これらの対をハイブリダイズまたはライゲーションして、新しい構築物を生成してもよい。バーコードライブラリー内の各構築物では、各固有Ｎ量体は、配列決定、プローブハイブリダイゼーション、他の方法、または方法の組合せにより識別するのに適していてもよい。
【０２６９】
液滴ライブラリー
一般的に、液滴ライブラリーは、単一コレクション内に共にプールされているいくつかのライブラリー要素で構成される。ライブラリーは、複雑さが、単一のライブラリー要素から１×１０１５個またはそれよりも多くのライブラリー要素まで、様々であってもよい。各ライブラリー要素は、一定濃度の１つまたは複数の所与の成分である。要素は、これらに限定されないが、細胞、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、または小分子化合物であってもよい。要素は、分子バーコード、ベッセルバーコード、または両方等の識別子を含有していてもよい。
【０２７０】
細胞ライブラリー要素としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、初代細胞、培養細胞株、がん細胞、幹細胞、または任意の他の細胞タイプを挙げることができる。細胞ライブラリー要素は、１個から数万個までの数の細胞を個々の液滴に封入することにより調製される。封入細胞の数は、通常、細胞の数密度および液滴の容積からポアソン統計により求められる。しかしながら、一部の場合では、個数は、Eddら、“Controlled  encapsulation  of  single-cells  into  monodisperse  picolitre  drops.”  Lab  Chip、８巻（８号）：１２６２〜１２６４頁、２００８年に記載されているようにポアソン統計から逸脱する。細胞は性質が分散性であるため、ライブラリーを、全てが単一の開始培地に存在する、各々が１つの抗体またはＴＣＲを産生する免疫細胞等の複数の細胞バリアントを有する集団に調製することが可能であり、その後、その培地を、多くとも１つの細胞を含有する個々の液滴カプセルに分ける。その後、個々の液滴カプセル内の細胞を溶解し、溶解細胞に由来する重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドならびに／またはアルファおよびベータ鎖ポリヌクレオチドならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ポリヌクレオチドを、分子バーコードおよびベッセルでバーコード化し、増幅し、その後組み合わせ、またはプールして、重鎖および軽鎖ならびに／またはアルファおよびベータ鎖ならびに／またはガンマおよびデルタ鎖ライブラリー要素で構成されるライブラリーを形成する。
【０２７１】
ビーズに基づくライブラリー要素は、１つまたは複数のビーズを含有し、また、抗体、酵素、または他のタンパク質等の他の試薬を含んでいてもよい。全てのライブラリー要素が異なるタイプのビーズを含有するが、周囲媒体が同じである場合、ライブラリー要素は全て、単一の開始流体から調製されていてもよく、または様々な開始流体を有していてもよい。バリアントのコレクションから集団に調製する細胞のライブラリーの場合、ライブラリー要素は、様々な開始流体から調製されることになる。複数の細胞から開始する場合、１液滴当たり正確に１つの細胞を有しており、１つよりも多くの細胞を含有する液滴が極少数であることが望ましい。一部の場合では、１液滴当たり正確に１つの細胞を含有する液滴がより多くなり、空の液滴または１つよりも多くの細胞を含有する液滴が少数の例外になるように、ポアソン統計からの変動を実現して、液滴の積み込み強化を提供することができる。
【０２７２】
一部の実施形態では、複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドから開始する場合、１液滴当たり正確に１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを有しており、１つよりも多くのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含有する液滴が極少数であることが望ましい。一部の場合では、１液滴当たり正確に１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを有する液滴がより多くなり、空の液滴または１つよりも多くのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む液滴が少数の例外になるように、ポアソン統計からの変動を実現して、液滴の積み込み強化を提供することができる。
【０２７３】
液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、ＤＮＡ、プライマー、抗体、およびバーコード化ポリヌクレオチド等の様々な異なる内容物を有する液滴のコレクションである。液滴のサイズは、直径が、およそ０．５ミクロンから５００ミクロンまでの範囲であり、これは、約１ピコリットル〜１ナノリットルに対応する。しかしながら、液滴は、５ミクロンと小さくてもよく、５００ミクロンと大きくてもよい。好ましくは、液滴は、直径が、１００ミクロン未満、約１ミクロン〜約１００ミクロンである。最も好ましいサイズは、直径が、約２０〜４０ミクロン（１０〜１００ピコリットル）である。液滴ライブラリーの検討される好ましい特性としては、浸透圧バランス、均一なサイズ、およびサイズ範囲が挙げられる。
【０２７４】
本発明により提供される液滴ライブラリー内に含まれる液滴は、サイズが、好ましくは均一である。すなわち、ライブラリー内の任意の液滴の直径は、同じライブラリー内の他の液滴の直径と比較して、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満しか変動しないだろう。ライブラリーの液滴のサイズが均一であることは、液滴の安定性および完全性を保つために重要である場合があり、また、後に、本明細書に記載されている種々の生物学的および化学的アッセイのために、ライブラリー内の液滴を使用するために不可欠である場合がある。
【０２７５】
本発明は、不混和性流体内に複数の水性液滴を含み、各液滴が、好ましくはサイズが実質的に均一であり、異なるライブラリー要素を含む液滴ライブラリーを提供する。本発明は、液滴ライブラリーを形成するための方法であって、異なるライブラリー要素を含む単一の水性流体を準備すること、各ライブラリー要素を不混和性流体内の水性液滴内に封入することを含む方法を提供する。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、異なるタイプの要素（例えば、細胞またはビーズ）を、同じ培地に含有される単一供給源にプールする。初期プールを行った後、要素を液滴に封入して、液滴のライブラリーを生成し、異なるタイプのビーズまたは細胞を有する各液滴は、異なるライブラリー要素である。初期溶液を希釈することにより、封入プロセスが可能になる。一部の実施形態では、形成される液滴は、単一の要素を含有することになるか、または何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。封入されている要素は、一般的に、あるタイプのバリアントである。一例では、要素は、血液試料の免疫細胞であり、各免疫細胞は、免疫細胞内の抗体のヌクレオチド配列を増幅およびバーコード化するために封入される。
【０２７７】
例えば、１つのタイプのエマルジョンライブラリーには、異なる粒子、つまり異なる培地内の細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドを有し、プールする前に封入されているライブラリー要素が存在する。一例では、指定数のライブラリー要素、つまりｎ数の異なる細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドが、異なる培地内に含有されている。ライブラリー要素の各々は、別々に乳化およびプールされ、その地点で、ｎ数のプールされた異なるライブラリー要素の各々が組み合わされ、単一プールにプールされる。その結果として得られるプールは、各々が異なるタイプの粒子を含有する複数の油中水型エマルジョン液滴を含有する。
【０２７８】
一部の実施形態では、形成される液滴は、単一のライブラリー要素を含有することになるか、または何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。ビーズの内容物は、ポアソン分布に従い、事象が既知の平均率で生じ、その直前の事象と時間的に独立している場合、ある一定期間にいくつかの事象が生じる確率を表す離散確率分布が存在する。ライブラリーを創出するために使用される油および界面活性剤は、ライブラリーの内容物が液滴間で交換されることを防止する。
【０２７９】
プライマー
一般的に、１対または複数対のプライマーを増幅反応に使用することができる。プライマー対の１つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。
【０２８０】
一部の場合では、第１の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第１の対の１つのプライマーは、第１の標的ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第１の対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよく、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的であってもよく、第１の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子座は、ＶＨまたはＶαまたはＶγ配列を含む。
【０２８１】
一部の場合では、第２の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第２の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の標的遺伝子座は、ＶＬまたはＶβまたはＶδ配列を含む。
【０２８２】
一部の場合では、第３の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第３の対の１つのプライマーは、第３の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第３の対の１つのプライマーは、第３の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第３の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第３の標的遺伝子座は、分子バーコードまたはベッセルバーコード等のバーコードを含む。
【０２８３】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さは、標的ポリヌクレオチドおよび標的遺伝子座の配列に依存していてもよい。例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さおよび／またはＴＭは、最適化することができる。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個よりも多くの、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１５〜約２０、約１５〜約２５、約１５〜約３０、約１５〜約４０、約１５〜約４５、約１５〜約５０、約１５〜約５５、約１５〜約６０、約２０〜約２５、約２０〜約３０、約２０〜約３５、約２０〜約４０、約２０〜約４５、約２０〜約５０、約２０〜約５５、約２０〜約６０個のヌクレオチドである。
【０２８４】
プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、一本鎖ＤＮＡであってもよい。一部の場合では、プライマーは、初期には二本鎖配列を含む。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存していてもよいが、約６から約５０個までのヌクレオチド、または約１５から約３５個までのヌクレオチドの範囲であってもよい。短いプライマー分子の場合、一般的には、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度が必要とされる場合ある。一部の実施形態では、プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はなく、鋳型とのハイブリダイズに十分な程度に相補的であればよい。一部の場合では、プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、部分的に二本鎖であってもよい。二本鎖配列を有するプライマーは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個よりも多くの、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個未満の塩基のヘアピンループを有していてもよい。プライマーの二本鎖部分は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個の、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個よりも多くの、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個未満の、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個の塩基対であってもよい。所与の標的配列を増幅するための好適なプライマーの設計は、当技術分野で周知である。
【０２８５】
プライマーには、プライマーの検出または固定化を可能にするが、プライマーの基本的な特性（例えば、ＤＮＡ合成開始地点として作用すること）を変更しない追加の特徴を組み込むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、クローニングまたはさらなる増幅または増幅産物の配列決定を容易にする追加の核酸配列を５’末端に含有していてもよい。例えば、追加の配列は、ユニバーサルプライマー結合部位等のプライマー結合部位を含んでいてもよい。鋳型とハイブリダイズするのに十分な相補性を有するプライマーの領域は、本明細書では、ハイブリダイズ領域と呼ばれる場合がある。
【０２８６】
別の場合では、本明細書に記載されている方法および組成物に利用されるプライマーは、１つまたは複数のユニバーサルヌクレオシドを含んでいてもよい。ユニバーサルヌクレオシドの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００９／０３２５１６９号および第２０１０／０１６７３５３号に記載されている５−ニトロインドールおよびイノシンである。
【０２８７】
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。異なるプライマー対は、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の場合では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００個、またはそれよりも多くのプライマーが、初期に使用される。そのようなプライマーは、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
【０２８８】
プライマーは、これらに限定されないが、適切な配列のクローニング、および当技術分野で周知の方法を使用した直接的化学合成を含む様々な方法により調製することができる（Narangら、Methods  Enzymol.、６８巻：９０頁（１９７９年）；Brownら、Methods  Enzymol.、６８巻：１０９頁（１９７９年））。また、プライマーは、商業的供給源から得ることができる。プライマーは、同一の融解温度を有していてもよい。プライマーは、非同一の融解温度を有していてもよい。プライマーの長さを、５’末端または３’末端で伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマー対のプライマーの一方は、他方のプライマーよりも長くてもよい。プライマー対内の、プライマーの３’アニーリング長は、異なっていてもよい。また、各プライマー対のアニーリング位置は、プライマー対の配列および長さが、所望の融解温度をもたらすように設計することができる。２５塩基対よりも短いプライマーの融解温度を決定するための式は、ウォーレスのルール（ＴＭ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。また、コンピュータプログラムを使用して、プライマーを設計してもよい。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）は、ソフトウェアプログラムを使用して算出することができる。プライマーのアニーリング温度は、これらに限定されないが、１、２、３、４、５サイクル目、６〜１０サイクル目、１０〜１５サイクル目、１５〜２０サイクル目、２０〜２５サイクル目、２５〜３０サイクル目、３０〜３５サイクル目、または３５〜４０サイクル目を含む、任意の増幅サイクル後に再計算し、増加させてもよい。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’側半分を、各目的遺伝子座に由来する産物に組み込んでもよく、したがって、ＴＭは、各プライマーの５’側半分および３’側半分の両配列に基づいて再計算してもよい。
【０２８９】
本明細書で開示されている方法の１つまたは複数の反応を実施することは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。本明細書で使用する場合、プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分に相補的な、二本鎖、一本鎖または部分的に一本鎖のポリヌクレオチドを含む。プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドを結合する前は一本鎖ＤＮＡであり得る。一部の実施形態では、このプライマーは、最初に二本鎖配列を含む。プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズする鋳型の領域を含む。一部の実施形態では、プライマーは、鋳型指向核酸合成の開始点として作用することが可能である。例えば、プライマーは、４つの異なるヌクレオチド、およびＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素等の重合剤または酵素が存在する場合、鋳型指向核酸合成を開始させることができる。プライマー対は２つのプライマー：鋳型配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマー、および鋳型配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマーを含む。プライマーセットは、２つまたはそれよりも多くのプライマー：鋳型配列または複数の鋳型配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマーまたは第１の複数のプライマー、および鋳型配列または複数の鋳型配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマーまたは第２の複数のプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーは、標的特異的配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、試料バーコード配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ユニバーサルプライミング配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲプライミング配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅を開始させるために使用されるＰＣＲプライミング配列を含む。（Dieffenbach,  PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、第２版（Cold  Spring  Harbor  Press、New  York（２００３年））。ユニバーサルプライマー結合部位または配列は、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンへのユニバーサルプライマーの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、−４７Ｆ（Ｍ１３Ｆ）、アルファＭＦ、ＡＯＸ３’、ＡＯＸ５’、ＢＧＨｒ、ＣＭＶ−３０、ＣＭＶ−５０、ＣＶＭｆ、ＬＡＣｒｍｔ、ラムダ（ｌａｍｇｄａ）ｇｔ１０Ｆ、ラムダｇｔ１０Ｒ、ラムダｇｔ１１Ｆ、ラムダｇｔ１１Ｒ、Ｍ１３リバース、Ｍ１３フォワード（−２０）、Ｍ１３リバース、メール（male）、ｐ１０ＳＥＱＰｐＱＥ、ｐＡ−１２０、ｐｅｔ４、ｐＧＡＰフォワード、ｐＧＬＲＶｐｒ３、ｐＧＬｐｒ２Ｒ、ｐＫＬＡＣ１４、ｐＱＥＦＳ、ｐＱＥＲＳ、ｐｕｃＵ１、ｐｕｃＵ２、リバースＡ、ｓｅｑＩＲＥＳｔａｍ、ｓｅｑＩＲＥＳｚｐｅｔ、ｓｅｑｏｒｉ、ｓｅｑＰＣＲ、ｓｅｑｐＩＲＥＳ−、ｓｅｑｐＩＲＥＳ＋、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ＋、ｓｅｑｒｅｔｒｏ＋ＰＳＩ、ＳＰ６、Ｔ３−ｐｒｏｍ、Ｔ７−ｐｒｏｍ、およびＴ７−ｔｅｒｍＩｎｖが挙げられる。本明細書で使用される場合、付着は、共有結合による相互作用および非共有結合によ���相互作用の両方またはいずれかを指すことができる。ユニバーサルプライマー結合部位へのユニバーサルプライマーの付着を、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンの増幅、検出、および／または配列決定に使用してもよい。ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別の例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、１〜１０、１０〜２０、１０〜３０、または１０〜１００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、約１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、２〜９０、２〜８０、２〜７０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、１〜９００、１〜８００、１〜７００、１〜６００、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００、１〜１００、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１０、５〜９００、５〜８００、５〜７００、５〜６００、５〜５００、５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００個のヌクレオチドまた���塩基対を含む。
【０２９０】
プライマーは、プライマー伸長産物の合成におけるその使用と適合する長さを有していてもよい。プライマーは、長さが８〜２００個のヌクレオチドであるポリヌクレオチドであってもよい。プライマーの長さは、鋳型ポリヌクレオチドおよび鋳型遺伝子座の配列に依存していてもよい。例えば、プライマーまたはプライマーセットの長さおよび／または融解温度（ＴＭ）は最適化することができる。一部の場合では、プライマーは、長さが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個よりも多くの、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、プライマーは、長さが約８〜１００個のヌクレオチド、例えば、長さが１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０、７〜９、１２〜１５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、または２０〜６０個の、およびそれら間の任意の長さのヌクレオチドである。一部の実施形態では、プライマーは、長さが、多くとも約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のヌクレオチドである。
【０２９１】
一般的に、１対または複数対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができる。プライマー対の１つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の１つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。一部の実施形態では、第１の対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができる。第１の対の１つのプライマーは、第１の鋳型ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第１の対の１つのプライマーは、第１の鋳型ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第１の鋳型遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第２の対の１つのプライマーは、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第２の標的遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第２の標的遺伝子座は、可変軽鎖抗体配列を含む。一部の実施形態では、第３の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第３の対の１つのプライマーは、第３の鋳型ポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第３の対の１つのプライマーは、第３の鋳型ポリヌクレオチド分子の第２の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第３の鋳型遺伝子座は、第１の配列と第２の配列との間に存在していてもよい。
【０２９２】
１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも部分にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの３’末端および／または５’末端にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの内部領域にアニーリングすることができる。内部領域は、複数の鋳型ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端から、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個のヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、一定のパネルのプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の特注プライマーは、ＳＢＣ、標的特異的領域、それらの相補体、またはそれらの任意の組合せにアニーリングする。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマー伸長、逆転写、線形伸長、非指数関数的増幅、指数関数的増幅、ＰＣＲ、または１つもしくは複数の標的もしくは鋳型ポリヌクレオチドの任意の他の増幅法を増幅または実施するように設計することができる。
【０２９３】
標的特異的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、標的特異的領域は、約５〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１５〜３０、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０、７〜９、１２〜１５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０２９４】
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。一部の実施形態では、異なるプライマー対は、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形態では、複数のプライマーの１つまたは複数のプライマーは、ほぼ同じ温度で、例えば、複数のプライマー中の別のプライマー対の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形態では、複数中の１つまたは複数のプライマーは、複数のプライマー中の別のプライマーとは異なる温度でアニーリングおよび融解してもよい。
【０２９５】
本明細書に記載されている方法の１つまたは複数のステッブのための複数のプライマーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００個の異なるプライマーを含む複数のプライマーを含んでいてもよい。例えば、複数のプライマーの各プライマーは、異なる標的または鋳型特異的領域または配列を含んでいてもよい。
【０２９６】
逆転写
一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、逆転写によりＲＮＡから調製される。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ等を使用して、プライマー伸長によりＤＮＡから調製される。
【０２９７】
本明細書に記載されている方法は、逆転写−ＰＣＲ併用法（coupled  reverse  transcription-PCR）（逆転写−ＰＣＲ）で使用することができる。例えば、逆転写およびＰＣＲは、２つの個別ステップで実施してもよい。最初に、ポリヌクレオチドｄＴプライマー、配列特異的プライマー、ユニバーサルプライマー、または本明細書に記載の任意のプライマーのいずれかを使用して、試料ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを合成してもよい。
【０２９８】
逆転写およびＰＣＲは、単一の閉鎖ベッセル反応で実施してもよい。例えば、１つは逆転写用、２つはＰＣＲ用の３つのプライマーを用いてもよい。逆転写用のプライマーは、ＰＣＲアンプリコンの位置に対して３’側でｍＲＮＡと結合してもよい。必須ではないが、逆転写プライマーは、ＲＮＡ残基、またはｍＲＮＡにハイブリダイズしてもＲＮａｓｅＨの基質を形成することがない２’−ＯメチルＲＮＡ塩基等の修飾類似体を含んでいてもよい。
【０２９９】
逆転写反応を実施する温度は、使用されている逆転写酵素に依存する。一部の場合では、熱安定性逆転写酵素が使用され、逆転写反応は、約３７℃〜約７５℃で、約３７℃〜約５０℃で、約３７℃〜約５５℃で、約３７℃〜約６０℃で、約５５℃〜約７５℃で、約５５℃〜約６０℃で、または約３７℃〜約６０℃で実施される。一部の場合では、３つまたはそれよりも多くの非鋳型末端ヌクレオチドを転写産物の末端に移動させる逆転写酵素が使用される。
【０３００】
本明細書に記載の逆転写反応およびＰＣＲ反応は、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロ流体デバイス、または好ましくは液滴内等の、当技術分野で公知の種々の形式で実施することができる。
【０３０１】
逆転写反応は、５μＬから１００μＬまでの範囲の容積で、または１０μＬ〜２０μＬの反応容積で実施することができる。液滴の場合、反応容積は、１ｐＬから１００ｎＬまで、または１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲であってもよい。一部の場合では、逆転写反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する液滴中で実施される。一部の場合では、ＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまで、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する液滴中である。一部の場合では、ＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する液滴中で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する同じ液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、約１ｎＬもしくはそれ未満の容積、または約１ｐＬもしくはそれ未満の容積を有する液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、異なる液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、各々が、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、各々が約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
【０３０２】
一部の場合では、第１のＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲の反応容積を有する第１に液滴内であり、第２のＰＣＲ反応は、１ｐＬから１００ｎＬまでの、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの範囲の反応容積を有する第２の液滴内である。一部の場合では、第１のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する第１の液滴内であり、第２のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する第２の液滴内である。
【０３０３】
一部の場合では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、各々が、１ｐＬから１００ｎＬまでの、または１０ｐＬから１ｎＬの反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施される。一部の場合では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、各々が約１ｎＬまたはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
【０３０４】
ＲＮＡ等の標的ポリヌクレオチドを、１つまたは複数の逆転写プライマーを使用してｃＤＮＡへと逆転写してもよい。１つまたは複数の逆転写プライマーは、定常領域等の、ＲＮＡの領域に相補的な領域（例えば、ｍＲＮＡの重鎖もしくは軽鎖定常領域またはポリＡテール）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および第２のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第２の逆転写プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、それぞれ、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および１つまたは複数のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する１つまたは複数の逆転写プライマーを含んでいてもよい。
【０３０５】
一部の実施形態では、逆転写プライマーは、バーコードを含まない。
【０３０６】
逆転写プライマーは、ＲＮＡの領域に相補的でない領域をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なプライマーの領域に対して５’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なプライマーの領域に対して３’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、５’突出領域である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または配列決定反応用のプライミング部位を含む。本明細書に記載の１つまたは複数のプライマーを使用し、当技術分野で公知の好適な試薬を使用して、ＲＮＡ分子を逆転写する。
【０３０７】
ＲＮＡ分子の逆転写反応を実行した後に、得られたｃＤＮＡ分子は、分子バーコードおよびベッセルバーコードでバーコード化され得、１つまたは複数のＰＣＲ反応、例えば、第１および／または第２のＰＣＲ反応によって増幅され得る。この第１および／または第２のＰＣＲ反応は、プライマーの１つのペアまたは複数のプライマー対を利用し得る。この第１および／または第２のＰＣＲ反応は、複数のフォワード／リバースプライマーおよび１つのリバースプライマーを利用し得る。この第１および／または第２のＰＣＲ反応は、複数のフォワード／リバースプライマーおよび１つのフォワードプライマーを利用し得る。複数のフォワード／リバースプライマーのうちの第１および／または第２のプライマーは、ｃＤＮＡ分子またはバーコード化ｃＤＮＡ分子と相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであり得る。複数のフォワード／リバースプライマーのうちの第１および／または第２のプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡ分子と相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであり得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマーのフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるＶセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
【０３０９】
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるＣセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
【０３１０】
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆる分子バーコードのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
【０３１１】
一部の実施形態では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマー、バーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマー、およびバーコード化ｃＤＮＡのベッセルバーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー等を含む。複数のフォワード／リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫Ｂ細胞またはＴ細胞等の細胞により発現されるあらゆるベッセルバーコードのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
【０３１２】
複数のフォワード／リバースプライマー中のフォワード／リバースプライマーは、ＲＮＡの領域に相補的でない領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なフォワード／リバースプライマーの領域に対して５’側である（つまり、Ｖセグメントの上流または下流領域）。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、ＲＮＡに相補的なフォワード／リバースプライマーの領域に対して３’側である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、５’突出領域である。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または第２の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、増幅および／または第３の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡの領域に相補的でない領域は、第２および第３の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、第２および第３の配列決定反応用のプライミング部位の配列は、同じである。本明細書に記載の１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーおよびリバースプライマーを使用し、当技術分野で公知の好適な試薬を使用して、ｃＤＮＡ分子を増幅する。一部の実施形態では、領域は、ｍＲＮＡの定常領域またはポリＡテール等のＲＮＡの領域に相補的である。
【０３１３】
増幅
標的ポリヌクレオチドを含有する試料は、増幅され得るｍＲＮＡまたはその断片を含み得る。一部の場合には、ｍＲＮＡまたはその断片の平均長さは、約１００、２００、３００、４００、５００もしくは８００塩基対未満、または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００ヌクレオチド未満、または約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００キロ塩基未満であり得る。一部の場合には、比較的短い鋳型、例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００塩基である鋳型を含有する試料由来の標的配列が、増幅される。
【０３１４】
増幅反応は、１つまたは複数の添加剤を含んでいてもよい。一部の場合では、１つまたは複数の添加剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝カルボキシ−メチル］トリメチルアンモニウム、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑである。一部の場合では、増幅反応は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含む。他の場合では、増幅反応は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる添加剤を含む。
【０３１５】
反応容積（例えば、液滴）に含有されている試料に対して、熱サイクル反応を実施することができる。液滴は、多分散であってもよく、または好ましくは単分散であってもよく、当業者であれば、撹拌、超音波処理、またはマイクロ流体的にＴ型チャネル接合部を通過させること、または他の手段により生成することができる。密度は、２０，０００液滴／４０ｕｌ（１ｎＬ液滴）、２００，０００液滴／４０ｕｌ（１００ｐＬ液滴）を超えていてもよい。液滴は、熱サイクル中、完全性を保つことができる。液滴は、約１０，０００液滴／μＬ、１００，０００液滴／μＬ、２００，０００液滴／μＬ、３００，０００液滴／μＬ、４００，０００液滴／μＬ、５００，０００液滴／μＬ、６００，０００液滴／μＬ、７００，０００液滴／μＬ、８００，０００液滴／μＬ、９００，０００液滴／μＬ、または１，０００，０００液滴／μＬを超える密度で、熱サイクル中に完全性を保つことができる。他の場合では、２つまたはそれよりも多くの液滴が、熱サイクル中に凝集しない。他の場合では、１００個よりも多くのまたは１，０００個よりも多くの液滴が、熱サイクル中に凝集しない。
【０３１６】
これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）、ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼを含む、プライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一部の場合では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。また、ポリメラーゼを添加する前に反応を２分間９５℃に加熱するか、または１サイクル目の最初の加熱ステップまでポリメラーゼを不活性にしておくことができるホットスタートＰＣＲを実施してもよい。ホットスタートＰＣＲを使用すると、非特異的増幅を最小限に抑えることができる。任意の回数のＰＣＲサイクル、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回のサイクル、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回よりも多くのサイクル、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５回未満のサイクルを使用してＤＮＡを増幅することができる。増幅サイクルの回数は、約１〜４５、１０〜４５、２０〜４５、３０〜４５、３５〜４５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、または３５〜４０であってもよい。
【０３１７】
標的核酸の増幅は、当技術分野で公知の任意の手段により実施することができる。標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温ＤＮＡ増幅により増幅してもよい。使用することができるＰＣＲ技法の例としては、これらに限定されないが、定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／逆転写−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ブリッジＰＣＲ、ピコリットルＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲが挙げられる。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、転写増幅法、分子反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ法、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応法（ＣＰ−ＰＣＲ；consensus  sequence  primed  polymerase  chain  reaction）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応法（ＡＰ−ＰＣＲ；arbitrarily  primed  polymerase  chain  reaction）、ディジェネレートポリヌクレオチドプライムドＰＣＲ法（ＤＯＰ−ＰＣＲ；degenerate  polynucleotide-primed  PCR）、および核酸に基づく配列増幅法（ＮＡＢＳＡ；nucleic  acid  based  sequence  amplification）挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号、および第６，５８２，９３８号に記載されているもの、ならびにＱベータレプリカーゼ媒介性ＲＮＡ増幅法が挙げられる。増幅は、等温増幅、例えば等温線形増幅であってもよい。
【０３１８】
一部の実施形態では、増幅は、固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅は、液滴内の固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅が液滴内でない場合、増幅は、固体支持体で生じる。
【０３１９】
増幅反応は、１種または複数の添加剤を含み得る。一部の実施形態では、この１種または複数の添加剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝［カルボキシ（caroxy）−メチル］トリメチルアンモニウム）、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ−Ｃｌ）および塩化テトラプロピルアンモニウム（ＴＰｒＡ−Ｃｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０））またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑである。一部の実施形態では、増幅反応は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含み得る。他の場合には、増幅反応は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含み得る。
【０３２０】
配列決定
本明細書に記載されている方法または方法ステップの１つまたは複数を実施した後、生成されたポリヌクレオチドのライブラリーを配列決定してもよい。
【０３２１】
配列決定は、当技術分野で公知の任意の配列決定法により実施することができる。一部の実施形態では、配列決定は、ハイスループットで実施することができる。好適な次世代シークエンシング技術としては、４５４ライフサイエンスプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ、ブランフォード、コネティカット州）（Marguliesら、Nature、４３７巻、３７６〜３８０頁（２００５年））；Ｉｌｌｕｍｉｎａのゲノムアナライザー、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅメチル化アッセイ、またはＩｎｆｉｎｉｕｍメチル化アッセイ、つまりＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ２７Ｋ  ＢｅａｄＡｒｒａｙ、またはＶｅｒａＣｏｄｅ  ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅメチル化アレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州、Bibkovaら、Genome  Res.、１６巻、３８３〜３９３頁（２００６年）、および米国特許第６，３０６，５９７号、第７，５９８，０３５号、第７，２３２，６５６号）、またはライゲーションによるＤＮＡ配列決定、ＳＯＬｉＤシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国特許第６，７９７，４７０号、第７，０８３，９１７号、第７，１６６，４３４号、第７，３２０，８６５号、第７，３３２，２８５号、第７，３６４，８５８号、および第７，４２９，４５３号）；またはＨｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ配列決定技術（Harrisら、Science、３２０巻、１０６〜１０９頁（２００８年）；および米国特許第７，０３７，６８７号、第７，６４５，５９６号、第７，１６９，５６０号、および第７，７６９，４００号）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一分子リアルタイム（ＳＭＲＴＴｍ）技術および配列決定法（Soniら、Clin.  Chem.、５３巻、１９９６〜２００１頁（２００７年））が挙げられる。こうしたシステムは、試料から単離された多数のポリヌクレオチドのマルチプレックス並列配列決定を可能にする（Dear、Brief  Funct.  Genomic  Proteomic、１巻（４号）、３９７〜４１６頁（２００３年）、およびMcCaughanら、J.  Pathol.、２２０巻、２９７〜３０６頁（２０１０年））。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、色素修飾プローブのライゲーションによる配列決定法、ピロシーケンス法、または一分子配列決定法により配列決定される。ポリヌクレオチドの配列の決定は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）一分子配列決定法、ナノポアＤＮＡ配列決定法、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ）、４５４ピロシーケンス法、一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定法、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定法、ＳＯＬｉＤ配列決定法、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定法、一分子ＳＭＲＴ（商標）配列決定法、ポロニー配列決定法、ＤＮＡナノボール配列決定法、およびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ手法等の配列決定法により実施することができる。あるいは、ポリヌクレオチドの配列の決定には、これらに限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａが提供するゲノムアナライザーＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ、およびＭｉＳｅｑ；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア）が提供するＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステム���よびＳｏｌｅｘａシーケンサー等の一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術；Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｉｎｃ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）が提供するＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）等のＴｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（商標））技術を含む配列決定プラットフォームを使用してもよい。配列決定は、ＭｉＳｅｑ配列決定を含んでいてもよい。配列決定は、ＨｉＳｅｑ配列決定を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの配列の決定は、ペアエンド配列決定法、ナノポア配列決定法、ハイスループット配列決定法、ショットガン配列決定法、色素ターミネーター配列決定法、多重プライマーＤＮＡ配列決定法、プライマーウォーキング法、サンガー式ジデオキシ配列決定法、マクシム−ギルバート配列決定法、ピロシーケンス法、ｔｒｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ配列決定法、またはそれらの任意の組合せを含む。あるいは、ポリヌクレオチドの配列は、電子顕微鏡または化学感応性電界効果トランジスター（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイにより決定してもよい。
【０３２２】
方法は、ライブラリー中の１つまたは複数のポリヌクレオチドを配列決定することをさらに含んでいてもよい。方法は、ライブラリー中の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列、配列読み取り、アンプリコン配列、またはアンプリコンセット配列を互いにアラインすることをさらに含んでいてもよい。
【０３２３】
本明細書で用いられる場合、アラインメントは、配列読み取り等の試験配列を、１つまたは複数の他の試験配列、参照配列、またはそれらの組合せと比較することを含む。一部の実施形態では、アラインメントを使用して、複数の配列またはアラインされた配列からコンセンサス配列を決定してもよい。一部の実施形態では、アラインメントは、各々が同一の分子バーコードまたはベッセルバーコードを有する複数の配列からコンセンサス配列を決定することを含む。一部の実施形態では、比較目的でアラインされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。２つまたはそれよりも多くの配列の実際の比較は、周知の方法により、例えば数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin,  S.およびAltschul,  S.、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻−５８７３〜５８７７頁（１９９３年）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul,  S.ら、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）に記載されているＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の任意の関連パラメータを使用してもよい。例えば、配列比較のパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してもよく、または様々であってもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、MyersおよびMiller、CABIOS（１９８９年）のアルゴリズム、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡが挙げられる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ケンブリッジ、英国）のＧＡＰプログラムを使用して達成することができる。
【０３２４】
配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。他の場合では、配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。
【０３２５】
配列決定は、１実行当たり、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれよりも多くの配列決定読み取りを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、配列読み取りは、配列決定技法により生成されるデータの配列またはストリームから決定されるヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、配列決定は、１実行当たり、少なくとも約１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、またはそれよりも多くの配列決定読み取りを含む。配列決定は、１実行当たり、約１，０００，０００，０００個よりも多くの、約１，０００，０００，０００個未満の、または約１，０００，０００，０００個に等しい配列決定読み取りを含んでいてもよい。配列決定は、１実行当たり、約２００，０００，０００個よりも多くの、約２００，０００，０００個未満の、または約２００，０００，０００個に等しい配列決定読み取りを含んでいてもよい。
【０３２６】
一部の実施形態では、コンセンサス配列を決定するために使用される配列読み取りの数は、約２〜１０００の配列読み取りである。例えば、コンセンサス配列を決定するために使用される配列読み取りの数は、約２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００または９００〜１０００の配列読み取りであり得る。一部の実施形態では、コンセンサス配列を決定するために使用される配列読み取りの数は、少なくとも約１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００，３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００、６５０，０００、７００，０００、７５０，０００、８００，０００、８５０，０００、９００，０００、９５０，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００または１００，０００，０００の読み取りである。一部の実施形態では、コンセンサス配列を決定するために使用される配列読み取りの数は、多くて約１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００，３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００、６５０，０００、７００，０００、７５０，０００、８００，０００、８５０，０００、９００，０００、９５０，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００または１００，０００，０００の読み取りである。
【０３２７】
方法は、配列決定ミスリードを含み得る。方法は、例えば、反応条件を決定するため、またはプライマー配列を設計するために、ミスリードの数を決定するステップを含み得る。１つまたは複数の第１の条件または条件セットの下で生成されたミスリードの数を比較することは、好ましい条件または条件セットを決定するために使用され得る。例えば、第１の方法は、ＰＣＲ反応の間に高い塩濃度で実施され得、第２の方法は、ＰＣＲ反応の間に低い塩濃度で実施され得、この第１および第２の方法は、塩濃度の差異を除き、実質的に同じに実施される。第１の方法が、より高い数のミスリード、例えば、特定の標的ポリヌクレオチド配列またはプライマーについてより高い数のミスリードを生じる場合、その特定の標的ポリヌクレオチド配列またはプライマーにとって好ましい、より低い塩反応条件が決定され得る。
【０３２８】
酵素
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の酵素を含んでいてもよい。酵素の例としては、これらに限定されないが、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられる。
【０３２９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに対するアダプターの付着は、１つまたは複数のリガーゼを使用することを含む。リガーゼの例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼ；ならびにＴ４  ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼＩＩ等のＲＮＡリガーゼが挙げられる。
【０３３０】
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の逆転写酵素を使用することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、およびテロメラーゼ逆転写酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【０３３１】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数のプロテアーゼを使用することを含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数のポリメラーゼを使用することを含む。ポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＶである。商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されないが、Ｂｓｔ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＷａｒｍＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、スルフォロブスＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ（商標）ｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（商標）高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＫＡＰＡ  ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０３３３】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ｐｈｉ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼである。
【０３３４】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）およびＡＰＣレポーター
本明細書で操作されたＡＰＣ（ｅＡＰＣ）とも呼ばれる人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、内因性ＭＨＣタンパク質を発現しないＡＰＣ細胞（一部の実施形態では、Ｋ５６２細胞株に基づく細胞）を指し得る。一部の実施形態では、これらのａＡＰＣ細胞は、調査中のＴＣＲの供給源生物のものとマッチしたＭＨＣ遺伝子（複数可）でトランスフェクトされる。ａＡＰＣは、目的のペプチド抗原をコードする発現ベクターでさらにトランスフェクトされ得る、または標的抗原のライブラリーでパルスされ得る。
【０３３５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、Ｔ細胞による抗原認識の際にレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、表面タンパク質）を発現できるレポーター遺伝子構築物を含有するようにさらに操作される。一部の態様では、Ｔ細胞による認識および／またはＴ細胞との係合の際にレポーターを発現するＡＰＣ（およびａＡＰＣ）は、Ｔ細胞に対する反応性を有すると思われる。これらのレポーター遺伝子の発現は、Ｔ細胞へのａＡＰＣの結合を検出し、それによって、目的のＴＣＲの標的抗原の識別を可能にする方法であり得る。一部の実施形態では、この標的抗原は、既知ではない。一部の実施形態では、このＴＣＲは、既知の可変領域配列を有するＴＣＲを含む。例えば、本明細書に記載されている方法は、目的の既知の可変領域配列を有するＴＣＲの未知の標的抗原を識別するステップを含み得る。
【０３３６】
一部の実施形態では、ＴＣＲへのＭＨＣ−ペプチド複合体の結合によって活性化されたａＡＰＣの検出は、レポーター遺伝子の発現を生じ得る。一部の実施形態では、このレポーターは、蛍光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質誘導体、または任意の操作された蛍光タンパク質である。さらなる実施形態では、この蛍光レポーターの検出は、蛍光技術を使用して検出され得る。例えば、蛍光タンパク質の発現は、蛍光プレートリーダー、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を使用して測定され得る。一部の実施形態では、活性化されたＡＰＣは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して、蛍光レポーターの発現に基づいてソーティングされ得る。
【０３３７】
一部の実施形態では、ＴＣＲへのＭＨＣ−ペプチド複合体の結合によって活性化されるａＡＰＣの検出は、細胞表面マーカーをコードするレポーターの発現を生じ得る。ＡＰＣは、ＴＣＲを係合する際に種々の細胞表面マーカーを上方調節または下方調節し得る。一部の実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８α、ＯＸ４０−Ｌ、ＩＣＯＳ−１またはＣＤ４０などの細胞表面タンパク質の発現のレベルは、ＴＣＲへのＭＨＣ−ペプチド複合体の結合後に、変化（例えば、増加または減少）し得る。一部の実施形態では、この細胞表面レポーターの検出は、免疫組織化学、蛍光染色、およびフローサイトメトリーによる定量などの技術を使用して、またはｃＤＮＡアレイもしくはｍＲＮＡ定量を用いて遺伝子発現における変化についてアッセイして、検出され得る。一部の実施形態では、活性化されたＡＰＣは、磁気活性化セルソーティングを使用して、細胞表面レポーターの発現に基づいて単離され得る。
【０３３８】
一部の実施形態では、ＴＣＲへのＭＨＣ−ペプチド複合体の結合によって活性化されるａＡＰＣの検出は、ＩＬ６、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＬ−２３、ＩＬ−１、ＴＮＦまたはＩＬ−１０などの分泌因子をコードするレポーター遺伝子の発現を生じ得る。さらなる実施形態では、これらの分泌因子は、ｍＲＮＡ定量、ｃＤＮＡアレイ、または酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）などのアッセイによる発現されたタンパク質の定量によって検出され得る。
【０３３９】
一部の実施形態では、ａＡＰＣにおけるレポーター遺伝子の発現は、Ｔ細胞活性化の間の、操作されたＴ細胞によるシグナルの結合によって誘発され得る。例えば、目的の抗原を提示するＡＰＣは、合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体もまた発現するように操作され得る。一部の実施形態では、このｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体は、外部および内部ドメインを有する経細胞タンパク質である。一部の実施形態では、ｓｙｎＮｏｔｃｈは、ＭＨＣ−ペプチドＴＣＲ複合体の形成と同時に、標的抗原に結合できる。なお他の実施形態では、ｓｙｎＮｏｔｃｈは、ＭＨＣ−ペプチドＴＣＲ複合体の形成後に、標的抗原に結合できる。標的抗原へのｓｙｎＮｏｔｃｈの結合の際に、この受容体の内部ドメインは、切断されて、核に移動する転写活性化ドメインを生じさせ、ＡＰＣによるレポーター遺伝子の発現を促進する。一部の態様では、ＡＰＣによって発現される合成Ｎｏｔｃｈ受容体は、そのＴ細胞が（例えば、適切なＭＨＣ−ペプチド複合体とのＴＣＲ係合によって）活性化されるときにだけ標的Ｔ細胞によって発現されるタンパク質リガンドおよび／または抗原を認識する。
【０３４０】
一部の実施形態では、ＡＰＣおよび／または操作された／人工ＡＰＣによって発現されるレポーター系は、操作されたＴ細胞がその同族抗原を認識する（例えば、ＡＰＣ上に提示されたＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する）場合に分泌される１つまたは複数のエフェクター剤（例えば、酵素）によって切断されることができる成分を含むシグナリング系を含む。一部の実施形態では、この系は、ＦＲＥＴベースの検出系である。例示の系は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５１４３５５８において見出され得る。一部の態様では、ａＡＰＣと操作されたＴ細胞との係合は、Ｔ細胞の活性化、ならびに／または酵素、サイトカインおよび／もしくはケモカインの放出を生じる。一部の態様では、これらの酵素、サイトカインおよび／またはケモカインは、細胞傷害性シグナルおよび／またはエフェクター機能を示す。一部の態様では、エフェクター剤としては、これらに限定されないが、グランザイム、パーフォリンおよびグラニュライシンが含まれるがこれらが挙げられる。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体とＭＨＣ−エピトープ複合体との接触および特異的認識の際に、操作されたＴ細胞は活性化され、グランザイムプロテアーゼおよびパーフォリンを含む種々のエフェクター剤を含有する顆粒を産生する。一部の態様では、活性化された操作されたＴ細胞の顆粒は、細胞表面に輸送され、ａＡＰＣに隣接する細胞間環境中に放出される。一部の態様では、パーフォリンは、レポーター細胞の細胞膜を通る孔を形成し、それによって、レポーター細胞（例えば、ａＡＰＣ）の細胞質ゾルにグランザイムおよび他のエフェクター剤が進入するのを可能にする。一部の実施形態では、このシグナリング系および／またはレポーター構築物は、シグナルを生成するために蛍光部分を放出するペプチド連結の酵素的切断（例えば、グランザイム切断）によってクエンチされ得るクエンチされた蛍光タンパク質を含み得る。一部の態様では、このレポーター構築物は、操作されたＴ細胞によってａＡＰＣに送達されたエフェクター剤によって切断される（例えば、酵素的に切断される）場合に蛍光シグナルを生じるＦＲＥＴベースの蛍光タンパク質シグナリング系を含む。一態様では、このレポーター構築物は、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）切断可能なリンカーによって分離された、遺伝子にコードされたＣＦＰ−ＹＦＰ融合ＦＲＥＴ対を含む。
【０３４１】
一部の実施形態では、ＡＰＣ活性化を測定するための系は、合成Ｎｏｔｃｈ受容体などの合成レポーターを含む操作されたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、この合成レポーターは、細胞内ドメインを含む受容体である。この細胞内ドメインは、転写アクチベータータンパク質を含み得る。例えば、この細胞内ドメインは、ＧＡＬ４−ＶＰ６４ドメインを含み得る。一部の実施形態では、この合成レポーターは、操作されたＡＰＣにおいて構成的に発現される。
【０３４２】
一部の実施形態では、ＡＰＣ活性化を測定するための系は、ＮＦＡＴプロモーターなどの誘導性プロモーターの制御下に細胞表面発現されたタンパク質リガンドをコードする遺伝子を含む操作されたＴ細胞を含む。合成Ｎｏｔｃｈ受容体などの合成レポーターは、操作されたＴ細胞の細胞表面上の細胞表面発現されたタンパク質リガンドを特異的に結合できる。
【０３４３】
一部の実施形態では、ＡＰＣ活性化を測定するための系は、ＡＰＣ内で活性化性配列の下流に蛍光レポーターを含む。例えば、この活性化性配列は、ＧＡＬ４−ＵＡＳであり得る。本明細書に記載されているＡＰＣ活性化を測定するための系では、非刺激条件下では、Ｔ細胞は、その表面上にタンパク質リガンドを発現しない。Ｔ細胞上で発現されたＴＣＲの、同族ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示するＡＰＣとの接触およびそれによる引き続く刺激の際に、このＴ細胞のレポーターは活性になり、細胞表面リガンドが発現される。例えば、このタンパク質リガンドは、ＡＰＣ上の合成Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞外ドメインと相互作用し、細胞内ＧＡＬ４−ＶＰ６４ドメインがＡＰＣ内で切断されるようにする。切断の際に、このＧＡＬ４−ＶＰ６４ドメインは、核に移行し、ＧＡＬ４−ＵＡＳ配列の下流の蛍光レポーターを活性化する。
【０３４４】
ＴＣＲ抗原標的を同定識別する
目的のネイティブに対合したＴＣＲ鎖は、発現ベクターを使用してＴ細胞中にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞株は、内因性ＴＣＲ発現を欠如するように操作される。一部の態様では、例示のＴ細胞株として、Ｊｕｒｋａｔ細胞株が挙げられる。一部の態様では、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞は、目的のＴＣＲが由来した宿主生物とマッチするＭＨＣ分子上の抗原のライブラリーを提示するａＡＰＣ（上記）と共に培養される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲを介したＭＨＣ−ペプチド複合体の係合を介してａＡＰＣを結合し、上記のように、ＡＰＣによるレポーター遺伝子の発現を生じる。活性化されたＡＰＣは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用して単離され得る。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、酸および／または逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による処理によって、ＭＨＣ分子から溶出され得る。さらなる実施形態では、この抗原性ペプチドは、配列決定され得るまたは質量分析によって分析され得る。この方法は、目的のＴＣＲに対する標的抗原の大きいパネルの迅速かつ同時のスクリーニングを可能にし、それによって、ＴＣＲの標的抗原の正確な識別を可能にする。
【０３４５】
一部の実施形態では、抗原のプールは、デコンボリューションされ得る。例えば、対象由来のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、複数の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣを含む操作されたＡＰＣのプールと接触させられ得る。例えば、対象由来のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣのプールと接触させられ得る。例えば、対象由来のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの第１のプールと接触させられ得、ＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第３の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第４の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの第２のプールと接触させられ得る。
【０３４６】
例えば、対象由来の第１のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣのプールと接触させられ得、対象由来の第２のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣのプールと接触させられ得る。
【０３４７】
例えば、対象由来の第１のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣのプールと接触させられ得、対象由来の第２のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの別のプールと接触させられ得る。
【０３４８】
例えば、対象由来の第１のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの第１のプールと接触させられ得、第１のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第３の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第４の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの第２のプールと接触させられ得；対象由来の第２のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第１の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第２の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの別の第１のプールと接触させられ得、第２のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、第３の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣと第４の抗原標的を発現する操作されたＡＰＣとを含む操作されたＡＰＣの別の第２のプールと接触させられ得る。
【０３４９】
活性化されたＡＰＣを含有するウェルなどのベッセル中のＡＰＣは、２またはそれよりも多くのベッセルが、それらが由来するベッセル由来のＡＰＣのサブセットを含有するように、２またはそれよりも多くのウェルなどのベッセル中に再プレートされ得る。例えば、活性化されたＡＰＣを含有するウェルなどのベッセル中のＡＰＣは、２またはそれよりも多くのベッセルが、それらが由来するベッセルよりも少ない数のＡＰＣを含有するように、２またはそれよりも多くのウェルなどのベッセル中に再プレートされ得る。一部の実施形態では、活性化されたＡＰＣを含有するウェルなどのベッセル中のＡＰＣは、２またはそれよりも多くのベッセルが単一のＡＰＣを含有するように、２またはそれよりも多くのウェルなどのベッセル中に再プレートされ得る。
【０３５０】
次いで、再プレートされたＡＰＣは、対象由来の１つまたは複数のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞による活性化についてアッセイされ得る。次いで、活性化される再プレートされたＡＰＣの抗原が識別され得る。例えば、活性化される再プレートされたＡＰＣ中の抗原をコードする遺伝子が、次いで、増幅および配列決定され得る。
【０３５１】
一部の実施形態では、次世代配列決定が、抗原を識別するために使用され得る。例えば、「ｍ」個の抗原のうち１つを各々が発現するＡＰＣの集団のサブプールは、任意のウェル中で発現される「ｎ」個の抗原が存在し、「ｎ」が「ｍ」未満であるように、「ｏ」個のウェル中にプレートされ得る。例えば、このサブプールのサイズおよびウェルの数は、複数のウェルが「ｍ」個の抗原の各々を発現するＡＰＣを含有するように、バランスがとられ得る。次いで、各ウェルは、目的のＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞を用いてアッセイされ得る。次いで、活性化されたＡＰＣを含有するウェルが収集され得る。次いで、収集されたＡＰＣの抗原が識別され得る。例えば、収集されたＡＰＣにおいて発現される抗原をコードするＤＮＡは、増幅され得、例えば、次世代配列決定法によって、引き続いて配列決定され得る。活性化されたＡＰＣを含有する第１のウェル中の抗原のセットは、活性化されたＡＰＣを含有する第２のウェル中の抗原のセットと比較され得る。例えば、活性化されたＡＰＣを含有するウェル中の抗原のセットは、活性化されたＡＰＣを含有する各他のウェル中の抗原のセットと比較され得る。別のウェル中の抗原の第２のセット中の識別された抗原と同じである、活性化されたＡＰＣを含有するウェル中の抗原の第１のセットから識別された抗原は、ＴＣＲの標的抗原として識別され得る。例えば、各他のウェル中の抗原のセットの各々中の識別された抗原と同じである、活性化されたＡＰＣを含有するウェル中の抗原のセットから識別された抗原は、ＴＣＲの標的抗原として識別され得る。
【０３５２】
抗原特異的ＴＣＲを同定識別する
本開示は、目的の抗原に対して反応性であるヒト由来ＴＣＲを識別し、それによって、治療的に適切なＴＣＲの発見を可能にする方法を提供する。一部の実施形態では、目的の抗原は、がんなどの疾患状態を代表し得る。一部の実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球の種々のＴＣＲが、ＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現するＴ細胞株中にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、このＴ細胞株は、内因性ＴＣＲ発現を欠如するように操作される。一部の態様では、例示のＴ細胞株として、Ｊｕｒｋａｔ細胞株が挙げられる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞の複数の集団を与える、複数の患者のＴ細胞から単離され得る。目的の種々のＴＣＲを発現するＴ細胞は、目的の標的抗原を提示するａＡＰＣと共に培養され得る。一部の実施形態では、これらのａＡＰＣは、ａＡＰＣの複数の集団で構成され、ここで、各集団は、同じ標的抗原を全てが提示する、共培養物中に存在する各Ｔ細胞集団とマッチするＭＨＣ分子でトランスフェクトされ得る。一部の態様では、ａＡＰＣにおいてこのレポーター遺伝子の発現を誘導するＴＣＲ発現Ｔ細胞が単離され、目的の抗原に対して反応性のＴＣＲを決定するために分析される。
【０３５３】
一部の実施形態では、疾患状態を代表する標的抗原に対して反応性である識別されたＴＣＲが、Ｔ細胞において操作され得、免疫療法として使用され得る。ある特定の実施形態では、このＴ細胞免疫療法は、その病状を処置するために、それを必要とする対象に投与され得る。
処置の方法
【０３５４】
本開示は、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の識別された標的抗原に対する治療薬を用いた、それを必要とする対象の処置のための方法を提供する。一部の実施形態では、それを必要とする対象は、ヒトであり得る。この対象は、標的抗原が発現される疾患を有し得る。例えば、この疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（消化管）、原発不明癌、中枢神経系、リンパ腫、原発性、子宮頚がん、胆管細胞癌、慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）、慢性骨髄性白血病（ｃｍｌ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ｄｃｉｓ）、子宮内膜がん、食道、ユーイング肉腫、性腺外生殖細胞腫瘍、眼がん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の線維性組織球腫、悪性、および骨肉腫、胆嚢がん、胃（gastric）（胃（stomach））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、生殖細胞腫瘍、性腺外、卵巣、精巣、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頚部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん、白血病、口唇および口腔（oral  cavity）がん、肝臓がん（原発性）、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、黒色腫、眼内（眼）、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、口こうがん、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物および慢性骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病、慢性（ｃｍｌ）、骨髄性白血病、急性（ＡＭＬ）、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔（oral）がん、口唇および口腔（oral  cavity）がんならびに中咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵がんおよび膵神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、妊娠および乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部がん、転移性、胃（stomach）（胃（gastric））がん、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿管および腎盂、移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜および子宮肉腫、腟がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン���症、またはウィルムス腫瘍を含むがんであり得る。
【０３５５】
一部の実施形態では、標的抗原は、任意のがんと関連し得る。一部の実施形態では、試料は、患者から採取され得、上記方法を使用して、ＴＣＲに対してスクリーニングされ得る。本開示で提供されている方法を使用して、標的抗原は、操作されたＴ細胞の反応性によって識別され得る。ある特定の実施形態では、患者は次いで、標的抗原に対する治療薬で処置され得る。例えば、患者には、識別された抗原に標的化された小分子、抗体、ペプチドもしくはタンパク質生物製剤、または免疫療法の有効用量が投与され得る。一部の実施形態では、この免疫療法は、標的抗原に特異的なＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を含み得る。
【０３５６】
一部の実施形態では、標的抗原に対する治療剤は、ＴＣＲまたはＴＣＲ様キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。一部の態様では、ＴＣＲ様ＣＡＲは、ＭＨＣとの関連でタンパク質エピトープに特異的に結合および／またはそれを特異的に認識する。ＣＡＲを含む例示の抗原受容体、ならびにかかる受容体を操作するための方法およびそれを細胞中に導入するための方法として、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されるもの、ならびに／またはSadelainら、Cancer  Discov.  ２０１３年４月；３巻（４号）：３８８〜３９８頁；Davilaら（２０１３年）PLoS  ONE  ８巻（４号）：ｅ６１３３８頁；Turtleら、Curr.  Opin.  Immunol.、２０１２年１０月；２４巻（５号）：６３３〜３９頁；Wuら、Cancer、２０１２年３月１８巻（２号）：１６０〜７５頁によって記載されるものが挙げられる。ＣＡＲの例としては、上述の刊行物のいずれか、例えば、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ８，３３９，６４５、ＵＳ７，４４６，１７９、ＵＳ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Kochenderferら、２０１３年、Nature  Reviews  Clinical  Oncology、１０号、２６７〜２７６頁（２０１３年）；Wangら（２０１２年）J.  Immunother.  ３５巻（９号）：６８９〜７０１頁；およびBrentjensら、Sci  Transl  Med.  ２０１３年５巻（１７７号）で開示されているようなＣＡＲが挙げられる。ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ８，３３９，６４５、ＵＳ７，４４６，１７９、ＵＳ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号および米国特許第８，３８９，２８２号もまた参照のこと。ＴＣＲ様ＣＡＲなどのキメラ受容体としては、一般に、細胞外抗原結合性ドメイン、例えば、抗体分子の一部分、一般に、抗体の可変重（ＶＨ）鎖領域および／または可変軽（ＶＬ）鎖領域、例えば、ｓｃＦｖおよび／またはｓｃＴｖ抗体断片が挙げられる。ＭＨＣとの関連でのペプチドエピトープなどの、ＴＣＲによって一般に認識されるエピトープに特異的に結合するおよび／またはかかるエピトープを特異的に認識する抗体断片、例えば、ＴＣＲ様ｓｃＦｖおよび／またはｓｃＴｖの操作が関与する方法、ならびに／あるいは、例えばその１つもしくは複数のＣＤＲを含有するかかるＴＣＲ様ｓｃＦｖおよび／もしくはｓｃＴｖなどのｓｃＦｖのある特定の特色を有するＴＣＲの生成および／または操作のための方法もまた、提供される。
【０３５７】
一部の実施形態では、ＴＣＲ様キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメインを含む細胞内ドメインと、抗体のＴＣＲ様抗原結合性部分、例えば、抗体のＴＣＲ様ｓＦｖおよび／またはｓｃＴｖを含む細胞外部分とを含み得る。一般に、キメラ受容体（例えば、ＴＣＲ様ＣＡＲ）は、抗原結合性部分と膜貫通ドメインとの間に、リンカーまたはスペーサードメインを含む。一部の実施形態では、このリンカーまたはスペーサーは、免疫グロブリンヒンジ領域に由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメインを含む細胞内ドメインと、抗体の抗原結合性部分、例えば、抗体のｓＦｖ、および／またはｓｃＴｖを含む細胞外部分とをコードすることに加えて、ＴＣＲ様ＣＡＲ構築物、一部の実施形態ではＴＣＲ様ＣＡＲベクターをコードする核酸は、プロモーターを含み得る。例えば、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと共に改変型ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーターであり得る。他の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターまたはＥＦ１プロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体の共刺激ドメインおよび細胞内ドメインを含む細胞内ドメインと、単鎖抗体またはその断片であり得る、本明細書で提供される１つまたは複数の抗体などの抗体を含む細胞外部分とを含み得る。一部の実施形態では、この抗体は、ｓＶ、ｓｃＦｖおよび／もしくはｓｃＴｖである、またはｓＶ、ｓｃＦｖおよび／もしくはｓｃＴｖを含む。一部の実施形態では、このＴＣＲ様ＣＡＲは、さらなる細胞外部分（複数可）、例えば、スペーサーおよび／またはヒンジ領域をさらに含み得る。
【０３５８】
一部の態様では、グリシンおよびセリン（および／またはスレオニン）に富んだリンカーは、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％のかかるアミノ酸（複数可）を含む。一部の実施形態では、これらは、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％でグリシン、セリンおよび／もしくはスレオニンを含み、または約５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％のグリシン、セリンおよび／もしくはスレオニンを含む。一部の実施形態では、このリンカーは、グリシン、セリンおよび／またはスレオニンから実質的に完全に構成される。これらのリンカーは一般に、約５アミノ酸長と約５０アミノ酸長との間、典型的には、１０アミノ酸長と３０アミノ酸長との間、または約１０アミノ酸長と約３０アミノ酸長との間、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０アミノ酸長、一部の例では、１０アミノ酸長と２５アミノ酸長との間である。例示のリンカーとしては、種々の数のリピートの配列ＧＧＧＧＳ（４ＧＳ）またはＧＧＧＳ（３ＧＳ）、例えば、２、３、４および５リピートの間のかかる配列を有するリンカーが挙げられる。例示のリンカーとしては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有するものまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなるものが挙げられる。例示のリンカーとしては、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧを有するものまたは配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧからなるものがさらに挙げられる。
【０３５９】
一部の実施形態では、この細胞内シグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ）、ＯＸ４０および／またはＩＣＯＳなどの共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる。一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子（複数可）は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、またはＣＤ３ゼータに由来する配列を含有する。
【０３６０】
一部の実施形態では、方法には、提供される抗体、ＴＣＲ様ＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲ、またはそれらの断片を発現する遺伝子操作された細胞が対象に投与される、養子細胞療法が含まれる。かかる投与は、疾患または障害の細胞が破壊のために標的化されるような標的化された様式で、細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞活性化）を促進できる。
【０３６１】
したがって、提供される方法および使用としては、養子細胞療法のための方法および使用が挙げられる。一部の実施形態では、方法には、細胞または細胞を含有する組成物の、疾患、病状もしくは障害を有する、疾患、病状もしくは障害のリスクがある、または疾患、病状もしくは障害を有する疑いがあるものなどの、対象、組織または細胞への投与が含まれる。一部の実施形態では、これらの細胞、集団および組成物は、例えば、養子細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法を介して処置される特定の疾患または病状を有する対象に投与される。一部の実施形態では、これらの細胞または組成物は、疾患もしくは病状を有するまたは疾患もしくは病状のリスクがある対象などの対象に投与される。一部の態様では、処置する方法は、例えば、疾患または病状の１つまたは複数の症状を寛解させる。
【０３６２】
養子細胞療法のための細胞の投与の方法は、既知であり、提供された方法および組成物と併せて使用され得る。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらに対する米国特許出願公開番号２００３／０１７０２３８；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号；Rosenberg（２０１１年）Nat  Rev  Clin  Oncol.  ８巻（１０号）：５７７〜８５頁に記載されている。例えば、Themeliら（２０１３年）Nat  Biotechnol.  ３１巻（１０号）：９２８〜９３３頁；Tsukaharaら（２０１３年）Biochem  Biophys  Res  Commun  ４３８巻（１号）：８４〜９頁；Davilaら（２０１３年）PLoS  ONE  ８巻（４号）：ｅ６１３３８頁を参照のこと。
【０３６３】
一部の実施形態では、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法は、自家移入によって実施され、このとき、細胞は、細胞療法を受けることになる対象から、またはかかる対象に由来する試料から、単離されるおよび／または他の方法で調製される。したがって、一部の態様では、これらの細胞は、処置を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理の後に、これらの細胞は、同じ対象に投与される。
【０３６４】
一部の実施形態では、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法は、同種移入によって実施され、このとき、細胞は、細胞療法を受けることになる対象または細胞療法を最終的に受ける対象、例えば第１の対象以外の対象から単離されるおよび／または他の方法で調製される。かかる実施形態では、これらの細胞は次いで、同じ種の異なるペア象、例えば第２の対象に投与される。一部の実施形態では、この第１および第２の対象は、遺伝的に同一である。一部の実施形態では、この第１および第２の対象は、遺伝的に類似である。一部の実施形態では、この第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプ（supertype）を発現する。
【０３６５】
一部の実施形態では、細胞、細胞集団または組成物が投与される対象は、霊長類、例えばヒトである。一部の実施形態では、この霊長類は、サルまたは類人猿である。この対象は、雄性または雌性であり得、乳幼児、若年、青年期、成体および老齢の対象を含む、任意の適切な齢であり得る。一部の実施形態では、この対象は、非霊長類哺乳動物、例えば、げっ歯類である。一部の例では、患者または対象は、疾患、養子細胞療法のための、および／またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの毒性転帰を評価するための、検証された動物モデルである。
【０３６６】
追加の試薬
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の試薬を使用することを含んでいてもよい。試薬の例としては、これらに限定されないが、ＰＣＲ試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、親和性捕捉試薬、ビーズ等の固体支持体、ならびに核酸精製および／または単離用の試薬が挙げられる。
【０３６７】
固体支持体は、事実上あらゆる不溶性または固体材料を含むことができ、水に不溶性である固体支持体組成物が選択されることが多い。例えば、固体支持体は、シリカゲル、ガラス（例えば、細孔制御ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、セルロース、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素、および銅）、磁性材料、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、およびポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ））等を含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよい。本実施形態により使用されるビーズの例としては、ビーズと核酸分子との相互作用を可能にする親和性部分を挙げることができる。固相（例えば、ビーズ）は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含んでいてもよい。例えば、ビーズは、ストレプトアビジンがコーティングされたビーズであってもよく、ビーズに固定する核酸分子は、ビオチン部分を含んでいてもよい。一部の場合では、各ポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ビオチン等の２つの親和性部分を含んでいてもよい。ビーズは、核酸の固定に使用するための、または下流でのスクリーニングまたは選択プロセスで使用することができる追加の特徴を含んでいてもよい。例えば、ビーズは、結合性部分、蛍光標識、または蛍光クエンチャーを含んでいてもよい。一部の場合では、ビーズは、磁性であってもよい。一部の例では、支持体はビーズである。ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられる。ビーズまたは粒子は、膨潤可能であってもよく（例えば、Ｗａｎｇ樹脂等のポリマー性ビーズ）、または膨潤不能であってもよい（例えば、ＣＰＧ）。一部の実施形態では、固相は、実質的に親水性である。一部の実施形態では、固相（例えば、ビーズ）は、実質的に疎水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含み、実質的に疎水性または実質的に親水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体）を含み、固体支持体１ｍｇ当たり約１３５０ピコモルの遊離捕捉剤（例えば、遊離ビオチン）よりも高い結合能を有する。一部の実施形態では、結合対のメンバーを含む固相の結合能は、固体支持体１ｍｇ当たり、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１８００、２０００ピコモルの遊離捕捉剤よりも高い。本発明に好適なビーズの他の例は、金コロイド、またはポリスチレンビーズもしくはシリカビーズ等のビーズである。実質的に任意のビーズ半径を使用することができる。ビーズの例としては、１５０ナノメートルから１０ミクロンまでの範囲の半径を有するビーズを挙げることができる。他のサイズも使用することができる。
【０３６８】
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の緩衝液を使用することを含んでいてもよい。緩衝液の例としては、これらに限定されないが、洗浄緩衝液、ライゲーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、増幅緩衝液、および逆転写緩衝液が挙げられる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ＴＭＡＣ  Ｈｙｂ溶液、ＳＳＰＥハイブリダイゼーション溶液、およびＥＣＯＮＯ（商標）ハイブリダイゼーション緩衝液等の商業的に入手可能な緩衝液である。本明細書で開示されている緩衝液は、１つまたは複数の洗剤を含んでいてもよい。
【０３６９】
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の担体を使用することを含んでいてもよい。担体は、本明細書で開示されている１つまたは複数の反応（例えば、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション）の効率を増強または向上させることができる。担体は、分子またはそれらの任意の産物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコン）の非特異性の喪失を減少または防止することができる。例えば、担体は、表面への吸収によるポリヌクレオチドの非特異性の喪失を減少させることができる。担体は、表面または基材（例えば、容器、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ、ピペットチップ）へのポリヌクレオチドの親和性を減少させることができる。あるいは、担体は、表面または基材（例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ）へのポリヌクレオチドの親和性を増加させることができる。担体は、ポリヌクレオチドの分解を防止することができる。例えば、担体は、リボヌクレアーゼからＲＮＡ分子を保護することができる。あるいは、担体は、ＤＮａｓｅからＤＮＡ分子を保護することができる。担体の例としては、これらに限定されないが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ等のポリヌクレオチド、またはポリペプチドが挙げられる。ＤＮＡ担体の例としては、プラスミド、ベクター、ポリアデニル化ＤＮＡ、およびＤＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体の例としては、ポリアデニル化ＲＮＡ、ファージＲＮＡ、ファージＭＳ２  ＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、哺乳動物ｔＲＮＡ、短鎖ポリアデニル化合成リボヌクレオチド、およびＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体は、ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。あるいは、ＲＮＡ担体は、非ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、担体は、細菌、酵母、またはウイルスに由来する。例えば、担体は、細菌、酵母、またはウイルスに由来するポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。例えば、担体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するタンパク質である。別の例では、担体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するポリヌクレオチドである。あるいは、担体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、またはウサギ）、トリ、両生類、または爬虫類に由来するポリヌクレオチドまたはペプチドである。
【０３７０】
本明細書で開示されている方法およびキットは、１つまたは複数の対照物質を使用することを含んでいてもよい。対照物質としては、対照ポリヌクレオチド、不活性酵素、非特異的競合物質を挙げることができる。あるいは、対照物質は、ブライトハイブリダイゼーション（bright  hybridization）、ブライトプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン対照、ＰＣＲ増幅対照を含む。ＰＣＲ増幅対照は、陽性対照であってもよい。他の例では、ＰＣＲ増幅対照は、陰性対照である。核酸鋳型対照は、既知の濃度であってもよい。対照物質は、１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
【０３７１】
スパイクイン対照は、反応または試料に添加される鋳型であってもよい。例えば、スパイクイン鋳型を、増幅反応に添加してもよい。スパイクイン鋳型は、最初の増幅サイクル後の任意の時点で増幅反応に添加してもよい。一部の実施形態では、スパイクイン鋳型は、サイクル数が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０回に達した後で、増幅反応に添加される。スパイクイン鋳型は、最後の増幅サイクル前の任意の時点で増幅反応に添加してもよい。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含んでいてもよい。スパイクイン鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
【０３７２】
本明細書で開示されているものは、本明細書で開示されている方法および組成物に使用することができる、方法および組成物と共に使用することができる、方法および組成物を調製するために使用することができる、分枝、材料、組成物および成分であり、または方法および組成物の産物である。これら物質の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合、これら分子および化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せおよび順列に対する具体的な参照を明示的に開示することができない場合でも、各々は、本明細書にて具体的に企図および記載されていることが理解される。例えば、ヌクレオチドまたは核酸が開示および考察され、そのヌクレオチドまたは核酸を含むいくつかの分子になすことができるいくつかの修飾が考察されている場合、特に別様の指示がない限り、ヌクレオチドまたは核酸のありとあらゆる組合せおよび順列ならびに考え得る修飾が、具体的に企図されている。この概念は、本開示の方法および組成物を作製および使用するための方法のことを含むがそれらに限定されない、本出願の全ての態様に当てはまる。したがって、実施することができる様々な追加ステップが存在する場合、そうした追加ステップの各々は、本開示の方法の任意の特定の実施形態でまたは実施形態を組み合わせて実施することができ、各々のそのような組合せは、具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることが理解される。
【０３７３】
本明細書に記載されている一部の実施形態が、本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は、例示のために提供されているに過ぎない。今や、当業者であれば、本明細書で提供されている開示から逸脱せずに、多数の変異、変更、および置換を起想するだろう。本明細書に記載されている実施形態の種々の代替を、本明細書に記載されている方法の実行に用いることができることが理解されるべきである。
【０３７４】
別様に説明されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本明細書で使用することができる方法および組成物の実施形態を含む：The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy、第１８版、Merck  Research  Laboratoriesから出版、２００６年（ＩＳＢＮ０−９１１９１０２）；Benjamin  Lewin、Genes  IX、Jones  &  Bartlett  Publishingから出版、２００７年（ＩＳＢＮ−１３：９７８０７６３７４０６３４）；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Mol.  Biology、Blackwell  Science  Ltd.から出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびRobert  A.  Meyers（編）、Mol.  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、VCH  Publishers,  Inc.から出版、１９９５年（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）。
【０３７５】
本開示の標準的手順は、以下に記載されている：例えば、Maniatisら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（１９８２年）；Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（第２版）、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（１９８９年）；Davisら、Basic  Methods  in  Molecular  Biology、Elsevier  Science  Publishing,  Inc.、New  York、USA（１９８６年）；またはMethods  in  Enzymology:  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、１５２巻、S.  L.  BergerおよびA.  R.  Kimmerl（編）、Academic  Press  Inc.、San  Diego、USA（１９８７年）。Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (CPMB)（Fred  M.  Ausubelら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、Current  Protocols  in  Protein  Science  (CPPS)（John  E.  Coliganら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、Current  Protocols  in  Immunology  (CPI)（John  E.  Coliganら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.），Current  Protocols  in  Cell  Biology  (CPCB)（Juan  S.  Bonifacinoら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique  、R.  Ian  Freshney著、出版社：Wiley-Liss；第５版（２００５年）、およびAnimal  Cell  Culture  Methods（Methods  in  Cell  Biology、５７巻、Jennie  P.  MatherおよびDavid  Barnes編、Academic  Press、第１版、１９９８年）。
【実施例】
【０３７６】
以下の例は、本開示の一部の態様をさらに説明するために含まれており、本発明の範囲を限定するために使用されるべきでない。
【０３７７】
（実施例１）
ＢＣＲおよびＴＣＲのハイスループット識別
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、抗がん免疫応答に重要であるが、それらの存在量、表現型、および機能は予測不能であるため、研究は困難である。本発明者らは、細胞ソーティング、刺激、または培養を行う必要なく、ＴＩＬを高深度で特徴付けるための方法を開発した。エマルジョンに基づく単一細胞バーコード付与法により、数百万個のインプット細胞中のリンパ球の中から、ネイティブに対合したＢ細胞およびＴ細胞受容体（ＢＣＲおよびＴＣＲ）配列が捕捉される。以前の手法とは対照的に、回収される可変領域は全長であり、さらなるｍＲＮＡおよびタンパク質標的が付随し得る。卵巣腺癌に由来する４００，０００個のソーティングされていない細胞を処理し、１１，０００個を超えるＴＩＬから対合したＢＣＲおよびＴＣＲを回収する前に、健常ヒト血液に由来する３００万個のＢ細胞およびＨＩＶ患者に由来する３５０，０００個のＢ細胞で本方法を検証した。本発明者らの結果は、任意の対合したＢＣＲまたはＴＣＲレパートリーの最も高深度のサンプリングであると共に、エマルジョン中での単一細胞の同時ＲＮＡ配列決定およびタンパク質測定を最初に実証するものである。
【０３７８】
（実施例２）
単一細胞のバーコード付与
免疫レパートリーの配列決定は、基礎免疫学、自己免疫、感染症、および腫瘍学において幅広い応用を有する。多くの研究では、循環血液中のＢＣＲおよびＴＣＲ多様性が調査されているが、ＴＩＬの免疫受容体に対する関心が高まっている。その機能は、がん成長または退縮に高度に関連しているが、その程度は様々であり、特徴付けされていないことが多い。ＴＩＬのより良好な理解に向かって重要なことは、新しい腫瘍関連抗原の識別を可能にし得るため、ＴＩＬのＢＣＲおよびＴＣＲの回収および機能的な特徴付けである。腫瘍抗原は、がんワクチンを開発するために、チェックポイント阻害剤の役割を理解するために、および固形腫瘍のキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法を進歩させるために、非常に必要とされている。しかしながら、免疫配列決定における数十年に及ぶ技術的進歩にも関わらず、全長のネイティブに対合したＢＣＲ（重鎖および軽鎖）およびＴＣＲ（アルファおよびベータ鎖）を、観察されるレパートリーを制限および偏向するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養または細胞ソーティングを行わずに、腫瘍等の不均質試料から回収した研究はない。初代未培養免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激細胞の１００分の１未満の受容体ＲＮＡを含み得るため、技術的な困難性が非常に高い。複雑な不均質試料に由来するネイティブに対合したＢＣＲおよびＴＣＲの包括的な分析を可能にするため、多数の単一細胞を並列単離およびＤＮＡバーコード付与するためのマイクロ流体エマルジョンに基づく方法を開発した（図４）。毎時最大１００万個の細胞が、個々の約６５ピコリットルエマルジョン液滴中で単離される。液滴内で細胞を溶解し、標的特異的プライマーを用いて標的ｍＲＮＡを逆転写し、二段階ＤＮＡバーコード付与プロセスにより、分子特異的および液滴特異的バーコードをｃＤＮＡに付着する。その後の回収および次世代シークエンシングの後、この二重バーコード付与戦略は、配列読み取りを、それらの当初の分子および細胞の両方にクラスター化することを可能にする。これより、エラーおよび増幅バイアスの広範な矯正、ｍＲＮＡおよび細胞の両レベルでのクローン計数、重鎖アイソタイプの決定、ならびに、重要なことには、ＢＣＲおよびＴＣＲの全長のネイティブに対合したＶ（Ｄ）Ｊ配列を超ハイスループットで同時に回収することが可能になる。
【０３７９】
（実施例３）
健常血液試料からのＢ細胞ＶＨＶＬペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常ボランティアの末梢血から単離された３００万個のＢ細胞でアセスメントした。エマルジョンを６つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかった。エマルジョンを、１液滴当たり０．２細胞になるように装填した。これは、占有液滴の約９０％が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観察と一致していた（図５Ａ）。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップを行った後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いて、ペアエンド３２５＋３００ｂｐ配列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使用して、元々の各ｍＲＮＡ分子からＰＣＲ複製読み取りを収集し、各ｍＲＮＡについてコンセンサスを決定して、少なくとも２つの読み取りから組み立てられたｍＲＮＡ配列のみを維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、５’ＵＴＲ、完全Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。ＩＭＧＴ  Ｈｉｇｈ−ＶＱｕｅｓｔおよび／またはＩｇＢＬＡＳＴを用いて、再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
【０３８０】
得られたデータセットは、少なくとも１つの重鎖（ＶＨ）および１つの軽鎖（ＶＬ）ｍＲＮＡと関連していた３２４，９８８個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析で評価して２２９，８６９個の異なるＶＨクローン系列が存在していた。この生セットは、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単一細胞液滴に由来するデータを濃縮した（図５Ｂ）。このことを実施することが可能であるのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、２つのランダム細胞に由来するＶＨまたはＶＬ  ｍＲＮＡがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得られた濃縮データセットは、２５９，３６８個のＶＨＶＬ液滴バーコードを含み、１８２，７４５個のＶＨのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関連する細胞は、それらのＶＨＶＬ対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発生を識別することにより、ＶＨＶＬ対合の精度を直接的に評価した。１つよりも多くのエマルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された２，６０４個のＶＨクローンが識別された。これらＶＨクローンと対合したＶＬ配列は、画分間の一貫性が非常に高く、９６．１％の対合精度を示した。これにより、２５９，３６８個のＶＨＶＬペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。交差画分ＶＨおよびＶＬ配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連することが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のＢ細胞は複数の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬ液滴バーコードまたは「ＶＨＶＬペア」の７５．０％は、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤを含有していた（図５Ｃ）。これは、未感作ナイーブＢ細胞は典型的にはＩｇＭ＋ＩｇＤ＋表現型であることを考慮すると、予想通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のＩｇＡ（１８．３％）およびＩｇＧ（６．６％）ＶＨＶＬペアも見出された。ＶＨアイソタイプは全て、約３：２の比率でＩｇκまたはＩｇλのいずれかと対合した。１８２，７４５個のＶＨクローン系列中のクローン拡大を２つの方法でアセスメントした：クローンに関連する液滴バーコードの数；およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコードでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコード液滴を反映する場合もある。初期λ＝１であったこと、つまり液滴内へのバーコードの分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約３７％で複数バーコード液滴が予想された。しかしながら、＞８つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て、間違いなく拡大性である可能性が高い（単一液滴中のポアソン確率は、＜１０−６）。全体でクローンの６．０％が１つよりも多くの画分で見られたが、８つよりも多くの液滴バーコードで見���れたクローン（全体で０．７％）の場合、それらの９９％は、１つよりも多くの画分で見られた。１００個の最も高頻度のクローン（各々３０〜１３７個の液滴バーコード、図５Ｄ）は全て、６つの画分の少なくとも５つで見られた。したがって、バーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバックグラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も多量の拡大したクローンでさえ、１０００個に１個未満の細胞にしか存在していなかったことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例示している。
【０３８１】
発現レベルの推定としての、ペア内の各ＶＨおよびＶＬ鎖の捕捉ｍＲＮＡの数（図５Ｅ）。概して、１液滴バーコード当たり１０個未満の重鎖（平均２．０）および軽鎖（平均４．０）ｍＲＮＡが捕捉され、１細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖ｍＲＮＡを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にＩｇＧおよびＩｇＡ発現細胞から観察された。興味深いことには、ペア内のＶＨおよびＶＬ突然変異の程度は、各アイソタイプ（例えば、ＩｇＧの場合は、ＶＨ対ＶＬ）内、およびアイソタイプ間（例えば、ＩｇＧ対ＩｇＭ）の両方で、強い相関性を示した（図２Ｆ）。さらに、ＩｇＧおよびＩｇＡ対はほとんど全てが、ＶＨおよびＶＬ鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、ＩｇＭおよびＩｇＤペアはほとんどが、ＶＨまたはＶＬ突然変異をほとんど示さなかった。こうした結果は、Ｂ細胞活性化の機序と一致し、ＩｇＭおよびＩｇＤからＩｇＧまたはＩｇＡへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたＶＨ鎖は、高度に突然変異を起こしたＶＬ鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は、休止ヒトＢ細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したＢＣＲを生成することが可能である。
【０３８２】
（実施例４）
ＨＩＶ長期非進行者からの公既知の低頻度ＶＨＶＬ対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な（１０，０００個の細胞中、＜１個の細胞）ネイティブＶＨＶＬ対合が既に既知である試料を処理した。ＨＩＶ長期非進行患者から末梢Ｂ細胞を得た。この患者のメモリＢ細胞は、ＨＩＶ中和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。３５０，０００個のＢ細胞を処理して、合計３８，６２０個のフィルタリングされたＶＨＶＬペアを生成した。興味深いことには、この個体は、以前の健常試料（図３Ａ）または典型的な健常末梢Ｂ細胞レパートリーよりも高い割合のＩｇＧを示した。このデータセットに由来するＶＨ配列を、ＰＧＴ１２１を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体（ｂＮＡｂ）と比較し、８つの類似または同一のＶＨ配列を見出した。これは、ｂＮＡｂのこのファミリーが循環Ｂ細胞の０．０３％未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全ての軽鎖は、予想される同様に希少のｂＮＡｂ系列のものであり、以前に報告されているように、同じＩｇλ−Ｖ３−２１／Ｊ３再配置および特徴的な３コドン挿入を示し、本発明者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、全ての既知の新らたに生成されたＰＧＴ１２１様ＶＨＶＬペアの系統樹（図３Ｂ）では、ＶＨおよびＶＬツリーは、鏡像様位置を占める対合したＶＨおよびＶＬ配列と非常に類似したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味深いことには、２つの発表されている抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は、例外であると考えられ、これら２つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、ＰＧＴ１２２ＶＨ：ＰＧＴ１２３ＶＬ様のおよびＰＧＴ１２３ＶＨ：ＰＧＴ１２２ＶＬ様のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。８つの新規なＰＧＴ様ＶＨＶＬペアの完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードするＤＮＡを合成し、抗体を完全ＩｇＧとして発現させ、複数のＨＩＶ擬似系統を中和する能力を試験した（図６Ｃ）。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連する生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明者らの手法の有用性が実証された。
【０３８３】
（実施例５）
腫瘍浸潤リンパ球に由来するＢ細胞およびＴ細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離された切除卵巣腺癌試料を得、４００，０００個のソーティングされていない細胞をエマルジョンに入れた。別々の等量の試料をＣＤ３／ＣＤ１９染色することにより、かなりの数の浸潤性Ｂ（約５％）およびＴ細胞（約２０％）が物質中に存在することが示唆された。エマルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった（図７Ａ）。
【０３８４】
Ｔ細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前に使用されたＢＣＲプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィルタリング後に、ＢＣＲまたはＴＣＲ産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の４つの標的遺伝子座（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）のあらゆる考え得る組合せを計数した（図７Ｂ）。
【０３８５】
１つよりも多くの標的鎖を有する液滴バーコードの大部分（９７．９％）は、生物学的に予想されるＢＣＲ  ＶＨ＋ＶＬまたはＴＣＲ  Ｖα＋Ｖβの対合を含有し、混合ＢＣＲ−ＴＣＲ組合せは２．１％しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがないため、この結果は、得られた６，０５６個のＢＣＲ  ＶＨＶＬおよび５，２１７個のＴＣＲ  ＶαＶβペアの信頼性を高度化することが可能である。ＢＣＲでは、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ（＞８０％）が著しく優勢であったが（図７Ｃ）、全てが存在した（ＩｇＥ＜０．０５％のみ）ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血データセットと同様の比率で存在した。
【０３８６】
末梢血と同様に、ＢＣＲアイソタイプとＶＨおよびＶＬ鎖の両方の突然変異レベルとの間に相関性が観察され、ＩｇＧおよびＩｇＡペアは、ＩｇＤおよびＩｇＭよりも大きなＶＨおよびＶＬ突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのＶＨおよびＶＬ間の突然変異の一般的相関性を示した（図７Ｄ）。興味深いことには、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＡペアは、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した（図５Ｆ）。また、腫瘍ＩｇＧ画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していないかまたは全く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。ＴＣＲの場合、およびＩｇＤを含有するＢＣＲの場合、１液滴バーコード当たり、末梢血のＢＣＲ結果と同様の数の捕捉ｍＲＮＡが観察された（図７、ほとんどが１液滴バーコード当たり＜１０）。極めて対照的だが、腫瘍由来のＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＧペアは、１０〜１００倍の平均発現レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的ｍＲＮＡが捕捉された。その後、捕捉ＴＩＬ−ＴＣＲおよびＢＣＲレパートリーの多様性をアセスメントした（図７Ｆ）。５，２１７個の合計ＴＣＲペアの中で、２，４２３個の異なるＴＣＲベータクローンが観察された。７つのクローンが、＞１％の頻度で存在し、上位クローンは、全ての液滴バーコードの１６．９％に相当した。６，０５６個の合計ＢＣＲペア中で、１，５１８個の異なる重鎖クローンが観察され、１５個のクローンが＞１％の頻度であったが、＞５％の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢ＢＣＲレパートリーよりも実質的により制限されていることを表わしているが（０．０６％を超える頻度で存在するクローンはなかった）、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現されたクローンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、ＴＩＬを特徴付けるためには、高深度で高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたＴＩＬ集団を事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、ＢおよびＴ細胞の両方から同時に、多数のＴＩＬ免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
【０３８７】
（実施例６）
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に入る健常Ｔ細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの２０，０００個の細胞を別々のエマルジョンに入れ、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡを用いて実験を行った。配列決定後、ＣＤ４＋単離細胞に由来するＴＣＲ  ＶαおよびＶβ（「ＴＣＲペア」）を含有する３，８６１個の液滴バーコードの４７．０％は、ＣＤ４  ｍＲＮＡに関連していたが、ＣＤ８  ｍＲＮＡに関連したものは０．３％に過ぎなかった。反対に、ＣＤ８＋単離細胞に由来する２，２３５個のＴＣＲペアの５０．６％が、ＣＤ８  ｍＲＮＡにリンクしていたが、ＣＤ４  ｍＲＮＡにリンクしていたものは０．６％に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を決定するためのｍＲＮＡに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードｍＲＮＡよりも非常に大きな数（１細胞当たり１，０００〜１００，０００個）で存在し、検出がより容易である可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドＤＮＡ標識を、抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、３０，０００個の細胞をエマルジョンに入力する前に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の未分離混合物と共にインキュベートした（図８Ａ）。ＤＮＡ標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、ｍＲＮＡでの実施と同様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。ＤＮＡ標識、ならびにＴＣＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８  ｍＲＮＡを、同時に標的とした。配列決定およびフィルタリング後、３，６８２個の液滴バーコードを、高い信頼性でＴＣＲ  ＶαＶβペアであると識別した。以前の実験と一致して、ＴＣＲペアのおよそ半分（５２％）を、ｍＲＮＡに基づいてＣＤ４またはＣＤ８ステータスに帰属させることができた（図８Ｂ）。しかしながら、液滴バーコードの９５％超は、タンパク質ステータスに基づいてＣＤ４またはＣＤ８に帰属させることができ、１液滴当たりの平均分子計数は、ＣＤ４／８タンパク質（平均２０．５）が、ＣＤ４／８  ｍＲＮＡ（平均１．０）よりもかなり高かった。ｍＲＮＡおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、ｍＲＮＡとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く（図８Ｃ）、液滴の９６．０％だった。一部の希少な例では、ＣＤ４およびＣＤ８タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、２つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のｍＲＮＡおよびタンパク質マーカーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法をＴＩＬに応用するこ���は、保証されている。
【０３８８】
（実施例７）
ヒト試料
健常レパートリー検証用の血液試料を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔの承認に基づいて収集した。ＨＩＶ  ｂＮＡｂ実験用のＰＢＭＣを、ＩＡＶＩプロトコールＧコホートのＨＩＶ−１感染ドナーであるドナー１７から得た。ヒトＨＩＶ試料は全て、ルワンダ共和国国立倫理委員会、エモリー大学内治験審査委員会、ザンビア大学研究倫理委員会、チャリングクロス研究倫理委員会、ＵＶＲＩ科学および倫理委員会、ニューサウスウェールズ大学研究倫理委員会、聖ビンセント病院および東シドニー地区ヘルスサービス、ケニヤッタ国立病院倫理調査委員会、ケープタウン大学倫理委員会、国際施設内治験審査委員会、マヒドン大学倫理委員会、ウォルターリード陸軍研究所（ＷＲＡＩＲ）施設内治験審査委員会、およびコートジボアール委員会「Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｎｔｅ」（ＣＮＥＳＶＳ）により承認された臨床試験プロトコールに基づいて書面によるインフォームドコンセントを得たうえで収集した。凍結保存され、解離され、切除された、単一ドナーに由来する卵巣腺癌を、ＩＲＢ承認プロトコールに基づいて、書面によるインフォームドコンセントを得たうえで、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得た。
【０３８９】
（実施例８）
細胞調製
３００万個の健常Ｂ細胞に関する研究では、ヘパリンナトリウム（ＢＤ）を有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ細胞調製チューブに５０ｍＬの血液を採取し、１８００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞調製緩衝液（２％ウシ胎仔血清および２ｍＭ  ＥＤＴＡで補填された１×ＰＢＳ）で２回洗浄し、２００×ｇのスピンを使用して血小板を除去し、得られたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋２０％ウシ胎仔血清＋１０％ＤＭＳＯに、必要になるまで−８０℃で凍結保存した。エマルジョン生成の前に、ＰＢＭＣを解凍し、細胞調製緩衝液で２回洗浄し、計数した。ネガティブ選択に基づくヒトＢ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｂ細胞を単離した。２０μｍ細胞ストレーナーに細胞を通し、細胞調製緩衝液で６．２×１０６細胞／ｍＬ（３００万個のＢ細胞での実験）または３．１×１０６細胞／ｍＬ（ＰＧＴドナーおよび卵巣腫瘍での実験）に希釈した。
【０３９０】
（実施例９）
エマルジョン内での免疫受容体バーコード付与
エマルジョン生成プラットフォームは、親フッ素性にコーティングされた石英Ｄｏｌｏｍｉｔｅ小型２試薬チップ内への、２つの水相および１つの親フッ素性油連続相のコンピュータ制御流動が可能になるように、単一の空気圧縮機により駆動され、各々がＭｉｔｏｓ流速センサを有する３つのＭｉｔｏｓ  Ｐポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を備えていた。１つの水性インプットチャネルは、所望の１液滴当たりの細胞占有レベルをもたらすように、必要とされる密度の細胞を含有し、第２の水性のチャネルは、ＡｂＰａｉｒ（商標）反応緩衝液およびオリゴヌクレオチド（ｗｗｗ．ａｂｖｉｔｒｏ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ  ＡＶ２０７０−１ＳおよびＡＶ２０８０−１Ｓ）、５単位／μＬのＭｕＭＬＶに基づく逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および０．１単位／μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  ＰＣＲポリメラーゼを含む溶解および反応混合物を含有していた。１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒシリンジを使用して、１００μＬ内部径ＰＥＥＫチューブ試料ループに、各々約１００μＬのＬＲミックスを２回のインジェクションで負荷した。１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジを使用して、約１００μＬの０．２ｍｍ内部径ＦＥＰチューブループに、約１１０μＬの細胞懸濁液を負荷した。エマルジョンは、チップの２つの油チャネルから油を同時に流動させた２試薬チップに、水相を同一の流速で集中流噴射することにより形成した。チップ出口チャネルを出るエマルジョンを、冷却ブロックに配置した０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内に滴下させ、その後、過剰な油を、ピペットでチューブの底部から取り除き、４０μＬのオーバーレイ溶液（２５ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し、チューブを、転写タグ化反応のために標準的サーモサイクラーに移した。４５分間の逆転写（ＲＴ）ステップ中、標的特異的ＲＴプライマーを用いて、ランダム化分子バーコードを含有するユニバーサルアダプター配列の鋳型スイッチに基づく付加により、ＲＮＡを４２℃で逆転写した。ＲＴ後、エマルジョンを、４０サイクルの熱サイクル（各サイクル：８２℃で１０秒間、６５℃で２５秒間）にかけて、液滴バーコード鋳型のＰＣＲ増幅を実施し、それを、初期溶解および反応混合物中で３０，０００ｃｐ／μＬに希釈し、１５，０００ｃｐ／μＬまたは約６５ｐｌ液滴当たり約１個の最終混合物中での濃度を生成した。液滴バーコードの一方の末端は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り２（「Ｐ７」）プライマー部位を含み、他方の末端は、ユニバーサルアダプターオリゴヌクレオチドの共通配列とマッチングする。したがって、ＰＣＲ中、鋳型スイッチしたｃＤＮＡは、増幅された液滴バーコード鎖にアニーリングし、オーバーラップ伸長によりスプライスされて、標的、分子バーコード、および液滴バーコード配列を含有する全長産物を産生することができる。
【０３９１】
（実施例１０）
エマルジョン破壊、クリーンアップ、下流ＰＣＲ、プール化、および配列決定
熱サイクル後、オーバーレイ溶液を、ピペットで取り除き、４０μＬエマルジョン破壊溶液（１：１  ＦＣ−４０：パーフルオロオクタノール）を、１５μＬ溶解物クリアリング溶液（１２．５μＬ  Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ、２．５μＬの０．５Ｍ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と共に添加した。１０回反転させてエマルジョンを破壊した後、混合物を５０℃で１５分間、および９５℃で３分間インキュベートして、プロテアーゼを不活化した。１５，０００×ｇで１分間遠心分離して水相を単離した後、回収した物質を徹底的に精製して、オリゴヌクレオチド、試薬、および過剰な液滴バーコードＰＣＲ産物を除去した。全長産物は、ＲＴプライマーの５’ビオチン化によりビオチンを含有するため、ストレプトアビジンビーズをクリーンアップすることにより、それらは、過剰な液滴バーコードＰＣＲ産物から効率的に分離することができ、したがって、オーバーラップ伸長法に共通の問題である下流ＰＣＲ組換えアーティファクトが最小限に抑えられる。まず、製造業者の説明書を使用して１：１比のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用し、その後、この場合も製造業者の説明書を使用してストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してクリーンアップし、その後、９５℃の脱イオン水で溶出させ、その後１：１比のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズで第２のクリーンアップを行うことにより、産物を精製した。その後、産物を、標的濃縮ＰＣＲに入れ、ＢまたはＴ細胞受容体標的の定常領域に特異的なプライマーを、液滴バーコード配列のユニバーサル末端に特異的なプライマーと共に使用した。このリバースプライマーは、製造業者の説明書に従ってＭｉＳｅｑ機器でマルチプレックス配列決定するための６塩基インデックスバーコードも含んでいた。したがって、このステップでは、全長液滴バーコード化標的配列のみが増幅される。まず、反応開始時に２分間の９８℃ポリメラーゼ活性化ステップを含む製造業者の推奨条件下で、Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、全ての標的を、９８℃で１０秒間；６４℃で２０秒間；７２℃で１５秒間の７サイクルで一緒に増幅した。この後、１．５：１のビーズ：ＰＣＲ比でＡＭＰｕｒｅ  ＸＰクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件を以前と同様に使用して、各鎖（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）を別々に標的とする第２の７サイクルを実施し、その後、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件および５〜１５サイクル（ｑＰＣＲにより判断される収量に応じて）で、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターを付加し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  Ｄ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）定量化に十分な物質を生成する最終ＰＣＲを実施した。その後、ライブラリーをプールし、Ｖ３  ２×３００ｂｐ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
【０３９２】
（実施例１１）
ＭｉＳｅｑプラットフォームの改変
ＢＣＲまたはＴＣＲの完全な可変Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の再構成には、２つのペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａ読み取りを繋ぎ合わせることが必要である。このプロセスを向上させるため、２×３００ｂｐキットのフォワード読み取りを３２５ｂｐに延長した。免疫受容体ライブラリーは、定常領域プライマー部位の多様性を制限するため、１０％ｐｈｉＸスパイクインを使用して、ライブラリー多様性の制限という問題を軽減した。
【０３９３】
（実施例１２）
読み取りのバイオインフォマティクス処理の概要
ｐＲＥＳＴＯパッケージ（バージョン０．４）の周辺に組み立てた特注パイプラインを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ読み取りを処理して、各液滴からｍＲＮＡ分子の全長コンセンサス配列を生成し、ＩｇＢＬＡＳＴおよび／またはＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴで注釈を付け、特注スクリプトおよびＣｈａｎｇｅ−Ｏパッケージを用いて、さらにアラインし、フィルタリングし、および処理して、統計情報を生成した。
【０３９４】
（実施例１３）
読み取り処理および注釈、アイソタイプ帰属。
生読み取り処理、Ｖ（Ｄ）Ｊ注釈、およびクローンの帰属は、ｐＲＥＳＴＯおよびＣｈａｎｇｅ−Ｏパッケージを利用して特注パイプラインで実施した。手短に言えば、生Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンド３２５＋３００ｂｐ読み取りを品質管理し、プライマートリミングし、液滴特異的（ＤＢ）および分子特異的バーコード（ＭＢ）を、プライマー部位のファジーマッチングにより識別した。まとめると、ＤＢおよびＭＢにより由来分子が固有に識別され、この固有な分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、同じ分子から生じる一致ＰＣＲ複製読み取り（最小で２つ）をグループ化し、各ｍＲＮＡ配列のコンセンサスを生成する。アイソタイプ特異的プライミングは、プライマートリミングされた配列内の既知のアイソタイプ特異的定常領域のファジーマッチングにより確認した。Ｖ（Ｄ）Ｊ生殖系列セグメントおよび再配置構造を、ＩｇＢＬＡＳＴを使用して決定し、ＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴで確認し、適切な場合は、Ｃｈａｎｇｅ−Ｏおよび特注スクリプトで解析した。マッチングするＩＧＨＶ遺伝子、ＩＧＨＪ遺伝子、および接合部長を有する機能性Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を、Ｃｈａｎｇｅ−Ｏに実装されているように、グループ内で単一連鎖クラスター化することにより、クローンを帰属させた。３００万個の循環細胞データセットでは、対称化トランジション／トランスバージョンモデルを使用して、４．０の重みが加えられたクローン内距離を、クローン内の最近傍距離カットオフとして使用した。
【０３９５】
（実施例１４）
液滴免疫受容体含有フィルタリングおよび対合フィデリティー算出
液滴からＢ細胞配列を回収する精度は、本バーコード付与法により２つのやり方：液滴内ｍＲＮＡ配列一致および交差画分対合一致を使用してアセスメントすることができる。各液滴内では、１遺伝子座当たり複数のｍＲＮＡが捕捉され、１つの細胞に由来する発現Ｖ（Ｄ）Ｊ配列は、一致するはずである。配列一致を規定する、複数のアラインされたＶ（Ｄ）Ｊセグメントの２％配列多様性（平均のペアを成すヌクレオチド差ｐｉ５５＜０．０２）のカットオフを使用して、１液滴当たり１つよりも多くの生産的ＶＤＪおよび１つの生産的ＶＪ配列の存在を、推定免疫受容体含有または複数細胞占有として、バイオインフォマティクス的に目印を付ける。対立遺伝子排除的な液滴毎に重鎖および軽鎖コンセンサス配列を組み立て、クローン規定および交差画分対合分析に使用した。３００万個の循環Ｂ細胞データセットでは、各ＶＨ系列は、データセット中の＞２０，０００個の軽鎖クローンの１つ（理想的な場合）と関連している。ＶＨＶＬペアを有する２５９，３６８個の免疫遺伝子座排除的な液滴中、１０，８７０個のＶＤＪ重鎖遺伝子座再配置クラスターが、少なくとも６つの物理的に分離されたエマルジョン画分の２つに存在していた。これらクラスターは、増殖系列であるか、または同じＶＪエクソンの、独立しているが類似の再配置であるかのいずれかを表わす。ＶＤＪ再配置が、２つの複製で一貫したＶＪ再配置と対合している場合、両実験は、独立して真の陽性をもたらした（より希少な再配置を有する２，６０４個のクローンの３５，９２２個の考え得るペアを成す比較のうち３３，１５７個）。したがって、各複製の精度は、９６．１％（０．９２３＾０．５）である。
【０３９６】
（実施例１５）
ＨＩＶ  ｂＮＡｂ候補配列の発見
本発明者らの３８，６２０個のＶＨＶＬペアを、ｔｂｌａｓｔｘ、ＭＵＳＣＬＥ、およびＰｈｙＭＬを使用して文献から選別した既知のｂＮＡｂ  ＨＣＤＲ３、ＶＤＪ配列、およびドナー１７系列との類似性について探索することにより、ＨＩＶの新しいネイティブに対合した広域中和抗体（ＢＮＡｂ）を発見し、その後、完全なＶ（Ｄ）Ｊアミノ酸配列の系統樹を手作業で検査して、既知のｂＮＡｂ配列で分散されている抗体候補を選択した。
【０３９７】
（実施例１６）
ＨＩＶ  ｂＮＡｂタンパク質発現および精製
抗体配列を合成し、以前に記載されている重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコールに従って２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞に同時トランスフェクトした（１：１比）。抗体上清を、トランスフェクトの４日後に採集し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した抗体を、さらなるアッセイで使用する前にＰＢＳで緩衝液交換した。
【０３９８】
（実施例１７）
擬似ウイルス産生および中和アッセイ
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ発現プラスミドおよびＥｎｖ欠損ゲノムバックボーンプラスミド（ｐＳＧ３ΔＥｎｖ）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより、擬似ウイルスを生成した。トランスフェクション７２時間後に、擬似ウイルスを、中和アッセイで使用するために採集した。単一ラウンドの複製擬似ウイルスアッセイおよびＴＺＭ−Ｂｌ標的細胞を使用して、中和活性をアセスメントした。手短に言えば、ＴＺＭ−Ｂｌ細胞を、９６ウェル平底プレートに播種した。このプレートに、擬似ウイルスを添加し、それを、抗体の系列希釈物と共に３７℃で１時間、事前にインキュベートした。感染７２時間後に溶解し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を定量化した。ＩＣ５０値を決定するために、用量反応曲線を非線形回帰法でフィッティングした。
【０３９９】
（実施例１８）
卵巣腫瘍標的鎖の同定識別
エマルジョン中の卵巣解離腫瘍組織からＢＣＲおよびＴＣＲを同時に捕捉した後、以前に記載されるように分子および液滴バーコードを使用して読み取りをフィルタリングしたが、その後、４つの考え得る標的鎖タイプ（ＢＣＲ  ＶＨ、ＢＣＲ  ＶＬ、ＴＣＲ  Ｖα、ＴＣＲ  Ｖβ）の各々の存在を探した。各々が少なくとも２つの配列決定読み取りを有する少なくとも２つのｍＲＮＡにより支持されていた場合、標的鎖を保持した。ＢＣＲ  ＶＨＶＬまたはＴＣＲ  ＶαＶβペアのみを含有する全ての液滴バーコードを、さらに分析した。ＢＣＲ重鎖およびＴＣＲベータ鎖クローンを、個別のＣＤＲ３アミノ酸配列に基づいてコールした。
【０４００】
（実施例１９）
ＤＮＡ標識抗体染色によるエマルジョン内のタンパク質検出
一本鎖２００ｂｐ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、固有の５ｂｐ抗原ＩＤ配列を含有するように設計し、５’アミノ基で修飾した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００５１６）およびＣＤ８ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０１０１８）抗体を、製造業者のプロトコールに従ってＴｈｕｎｄｅｒ−Ｌｉｎｋキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグにコンジュゲートした。エマルジョン前の細胞標識化では、末梢血に由来する２００万個のネガティブ選択されたＴ細胞を、４００μＬ細胞緩衝液＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した。一本鎖サケ精子ＤＮＡを、２００μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に添加し、細胞を室温で５分間回転させた。ＣＤ４およびＣＤ８ａ  ＤＮＡ標識抗体の混合物（各々、５ｎＭの最終濃度）を細胞に添加し、３０分間室温でインキュベートした。細胞を、細胞緩衝液＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム＋２００μｇ／ｍＬ一本鎖サケ精子ＤＮＡで３回洗浄した。エマルジョン分析に入る前に、細胞を、細胞緩衝液＋０．０５％アジ化ナトリウムに再懸濁した。３０，０００個の細胞を、エマルジョン配列決定に使用した。
【０４０１】
（実施例２０）
ＴＣＲ抗原標的の識別
【０４０２】
一部の場合では、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖を、ＴＣＲ鎖、およびＡＰＣによる活性化の際に発現されるルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ構築物をコードする発現ベクターにクローニングする。内因性ＴＣＲ鎖を発現しないように遺伝子操作されている、Ｊｕｒｋａｔ細胞等のＴリンパ球細胞株に、目的の対合したＴＣＲ鎖をコードする発現ベクターをトランスフェクトする。ＣＤ４またはＣＤ８共受容体を、Ｔリンパ球細胞株により発現させる。ＴＣＲを、同系ＡＰＣまたは腫瘍細胞と共にインキュベートすることにより初期スクリーニングする。それらは、初代細胞またはＭＨＣマッチング細胞株である。ＴＣＲ反応性は、レポーター遺伝子により、またはＩＦＮγ等のサイトカインをＥＬＩＳＰＯＴにより測定することにより決定し、目的の候補ＴＣＲを識別する。
【０４０３】
目的のネイティブに対合したＴＣＲ鎖候補、一部の場合では、上述のように初期スクリーニングを使用して識別した目的のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を、発現ベクターにクローニングする。Ｔリンパ球細胞に、目的のＴＣＲをコードする発現ベクターをトランスフェクトする。一部の場合では、Ｔリンパ球細胞は、内因性ＴＣＲ発現を欠如していてもよい。別々に、Ｋ５６２細胞株等の、内因性ＭＨＣ受容体を発現しないＡＰＣ細胞株に、ＴＣＲ鎖が由来する生物とマッチングするＭＨＣ遺伝子をトランスフェクトすることにより、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を生成する。また、ａＡＰＣを、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子で遺伝子操作する。抗原発現ベクターのライブラリーを、抗原提示細胞にトランスフェクトする。抗原をコードする配列は、目的のペプチドの正確な配列、ミニ遺伝子構築物、またはｃＤＮＡコード配列全体であってもよい。あるいは、ＡＰＣを、目的のペプチドのライブラリーで直接パルスする。
【０４０４】
目的のネイティブに対合したＴＣＲ鎖を発現するＴ細胞を、抗原のライブラリーを提示するａＡＰＣと共に共培養する。ＴＣＲをＭＨＣ−ペプチド複合体と結合させることによるＴリンパ球のａＡＰＣとの絡み合い（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、Ｔ細胞の活性化およびａＡＰＣレポーターの活性化をもたらす。例えば、ＴＣＲをＭＨＣ−ペプチド複合体と結合させることは、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質のａＡＰＣ発現に至る。活性化されたａＡＰＣを、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）等のソーティング技法により単離する。弱酸性処理および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）等の標準的技法により、ペプチドをＭＨＣタンパク質から解離する。質量分析または配列決定を実施して、ネイティブに対合したＴＣＲ鎖の抗原標的を識別する。
【０４０５】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に表示および記載されているが、当業者には、そのような実施形態は、例示のために提供されているに過ぎないことは明らかである。今や、当業者であれば、本発明から逸脱せずに、多数の変異、変更、および置換を起想し得る。本明細書に記載されている本発明の実施形態の種々の代替を、本発明の実施に用いることができることが理解されるべきである。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定され、特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物は、それにより網羅されることが意図されている。
【図１】
2018533920.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【国際調査報告】
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