(57)【要約】本出願は、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物に関し、組成物は、アリールプロピンアミド誘導体である治療有効量のカスパーゼ−６阻害剤を含む。組成物は、経口または局所投与、皮下、静脈内、または筋肉内注射、注入、吸入、またはくも膜下腔内注射のために製剤化することができる。ある特定の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置のための医薬組成物として記載することができ、組成物は、カスパーゼ−６阻害剤および１種または複数の医薬担体または賦形剤を含む。
2018522812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物であって、カスパーゼ−６阻害活性を有する治療有効量の活性剤および１種または複数の薬学的に許容される賦形剤を含み、前記活性剤は、下記の構造ＩもしくはＩＩの１つを有するか、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグである、
【化４４】
2018522812.tif 000054
式中、ＲａおよびＲｂは、独立に、直鎖状または分岐状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、またはアルケニル、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアリール、Ｃ１〜Ｃ９置換アルキルアリール、またはＣ１〜Ｃ９アルキルヘテロアリールであり、
フェニル基は、０個、１個もしくは２個のハロゲンで置換されており、さらに前記ハロゲンは、クロリド、フルオリドまたはブロミドである、医薬組成物。
【請求項２】
経口もしくは局所投与、皮下、静脈内、もしくは筋肉内注射、注入、吸入、または中枢神経系中への直接のくも膜下腔内注射のために製剤化される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記神経系疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、認知症、軽度認知機能低下、または記憶喪失である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
神経系疾患を処置する方法であって、このような処置を必要としている被験体に、有効用量の請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、認知症、軽度認知機能低下、または記憶喪失である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物が、神経系疾患の処置において有用な１種または複数のさらなる薬物と組み合わせて投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数のさらなる薬物が、Ｌ−ＤＯＰＡ、ラサギリン、メマンチン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、リバスチグミン、ガランタミンおよびテトラベナジンから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有効用量の請求項１に記載の医薬組成物の投与が、前記被験体における前記神経系疾患の症状の出現の前に開始される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体の細胞が変異ｈｔｔ遺伝子を発現している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体の神経細胞が、カスパーゼ−６ｍＲＮＡを過剰発現している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が、ヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
図３ＡにおいてＰＧ−３ａとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１２】
図３ＢにおいてＰＧ−３ｂとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１３】
図３ＣにおいてＰＧ−３ｃとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１４】
図３ＤにおいてＰＧ−３ｄとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１５】
図３ＥにおいてＰＧ−３ｅとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１６】
図３ＦにおいてＰＧ−３ｆとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１７】
図３ＧにおいてＰＧ−３ｇとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１８】
図３ＨにおいてＰＧ−３ｈとして命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項１９】
図３においてＰＧ−３として命名されている構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物。
【請求項２０】
医薬として使用するための、請求項１から３または１１から１９に記載の医薬組成物のいずれかの使用。
【請求項２１】
ハンチントン病、アルツハイマー病、認知症、軽度認知機能低下、または記憶喪失から選択される神経系疾患の処置のための、請求項１から３または１１から１９に記載の医薬組成物のいずれかの使用。
【請求項２２】
組成物１が、神経系疾患の処置において有用な１種または複数のさらなる薬物と組み合わせて使用される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記１種または複数のさらなる薬物が、Ｌ−ＤＯＰＡ、ラサギリン、メマンチン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、リバスチグミン、ガランタミンおよびテトラベナジンから選択される、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
処置が、前記被験体における前記神経系疾患の症状の出現の前に開始される、請求項２１から２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
処置が、変異ｈｔｔ遺伝子を発現している被験体を対象とする、請求項２１から２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
処置が、カスパーゼ−６ｍＲＮＡを過剰発現している神経細胞を有する被験体を対象とする、請求項２１から２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
処置が、ヒト被験体を対象とする、請求項２１から２６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
該当なし
【０００２】
本発明は、神経変性疾患のための治療の分野に関する。より特定すると、化合物、およびカスパーゼ−６活性をモジュレートする化合物を使用する方法。
【背景技術】
【０００３】
ハンチントン病（ＨＤ）は、成人中期において通常顕在化する舞踏病、認知低下および行動の変化によって特徴付けられる、常染色体優性遺伝様式を有する進行性神経変性障害である。ＨＤは、ポリグルタミン領域をコードするタンデムＣＡＧ反復を含有する変異ＨＤ遺伝子（ｍｈｔｔ）によってもたらされる。ＣＡＧ反復の数は、疾患の発症の年齢と逆相関する。神経変性は最初に最も激しくは線条体の中型有棘ニューロンにおいて起こり、後に皮質において起こる。アポトーシスがＨＤにおいて観察される神経変性において役割を果たしていることを示唆する有力な証拠が存在する。ｍｈｔｔのタンパク質分解的切断は、ＨＤの病態形成における重大な要因である。
【０００４】
Ｈｔｔは、カスパーゼによってタンパク分解的に切断され、グルタミン鎖を含有するアミノ末端フラグメントを放出する（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、２０００年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７５巻（２６号）：１９８３１〜８頁）。特に、拡張されたポリグルタミンリピートを含有するｍｈｔｔフラグメントの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで有毒であり、ｍｈｔｔのＮ末端がトランケートされた産物の蓄積が、ヒトおよびマウスのＨＤ脳において観察される。カスパーゼ−６（Ｃ６）は、活性化されたとき、ｈｔｔおよびｍｈｔｔを切断するシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼである。マウスにおける研究は、Ｃ６切断に耐性である（Ｃ６Ｒ）ｍｈｔｔの発現が、ｈｔｔ毒性を有意に低減させ、かつ表現型の劇的な改善をもたらし、一方、カスパーゼ−３（Ｃ３）およびカスパーゼ−２（Ｃ２）による切断に耐性であるｍｈｔｔを発現しているマウスは保護されなかったことを示した（Ｇｒａｈａｍら、２００６年、Ｃｅｌｌ、１２５巻（６号）：１１７９〜９１頁）。劇的に、Ｃ６Ｒ  ｍｈｔｔを発現しているマウスは、Ｃ６活性化の増加を示さない。Ｃ６ＲマウスにおいてＣ６活性化が存在しないことは、５８６ａａ  ｈｔｔフラグメントがＨＤにおけるＣ６活性化のフォワード増幅サイクルの一部であり得ることを示唆する（Ｇｒａｈａｍ，  Ｒ．Ｋ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１０年、３０巻（４５号）：１５０１９〜２９頁）。これらのデータは、Ｃ６切断によって生じたｍｈｔｔフラグメントがＨＤにおけるニューロンの機能障害および神経病理的異常をもたらす有毒なサイクルを開始させるのに必要とし得ることを示唆する（Ｇｒａｈａｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１１年、３４巻（１２号）：６４６〜５６頁）。
【０００５】
カスパーゼ−６（Ｃ６）ｍＲＮＡは、対照組織と比較して初期グレード（０〜２）のヒトＨＤ尾状核および運動皮質において増加しており（Ｈｏｄｇｅｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２００６年、１５巻（６号）：９６５〜７７頁）、活性Ｃ６はまた、症状が出る前および初期グレードのヒトおよびマウスのＨＤ脳において存在し、他の遂行物質として、カスパーゼ、例えば、Ｃ３はこれらの段階において活性化していない。興味深いことに、活性Ｃ６レベルは、ヒトＨＤ脳におけるＣＡＧサイズと相関し、発症の年齢と逆相関する。この証拠は、Ｃ６およびｈｔｔの間の関係を暗示し、ＣＡＧ鎖のサイズはＣ６活性化のレベルに影響を与え、それによって疾患過程に寄与する。
【０００６】
ｈｔｔと同様に、そのフラグメントが蓄積して、アルツハイマー病（ＡＤ）において病気を起こすと考えられるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）はまた、アポトーシスの間にカスパーゼによって切断される（Ａｙａｌａ−Ｇｒｏｓｓｏ，  Ｃ，ら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ、２００２年、１２巻（４号）：４３０〜４１頁）。Αβのアミノ末端における２つの特性決定された部位は、Ｖ（ＫまたはＮ）（ＭまたはＬ）Ｄ６５３およびＶＥＶＤ６６４を含み、これらの両方は、Ｃ６認識モチーフに対応する（Ｇｅｒｖａｉｓら、Ｃｅｌｌ、１９９９年、９７巻（３号）Ｌ３９５〜４０６頁）。Ｄ６６４部位におけるＡＰＰの切断は、ヒトＡＤ脳組織において早期に検出され、核のｐ２１活性化キナーゼシグナル伝達（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、２００８年、２２巻（３号）：７０３〜１２頁）ならびにＡＤの病態生理において観察されるシナプス伝達、シナプス可塑性および学習における欠陥のための必要要件である（Ｓａｇａｎｉｃｈら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、２６巻（５２号）：１３４２８〜３６頁）。重要なことに、ＡＤの病因学におけるこの部位における切断の重要性についての原理証明を提供して、ａａ６６４におけるＡＰＰの切断を阻害することは、ＡＤマウスモデルにおける行動の欠陥および神経病理からのある程度の救済を実現する（Ｚｈａｎｇら、Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、２０１０年、２０６巻（２号）：２０２〜２０７頁；Ｇａｌｖａｎら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻（１８号）：７１３０〜５頁）。
【０００７】
ＡＤ患者の脳組織はまた、対照および活性Ｃ６と比較して、Ｃ６ｍＲＮＡにおける有意な増加を示す（Ｐｏｍｐｌら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ、２００３年、６０巻（３号）：３６９〜３７６頁）。Ｃ６切断されたタウおよびＣ６切断されたα−チューブリンは、ＡＤ脳の神経絨毛糸、神経原線維変化および老人斑において高度に豊富である（Ｇｕｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６５巻（２号）：５２３〜５３１頁；Ｋｌａｉｍａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００８年、７巻（８号）：１５４１〜５５頁）。興味深いことに、Ｃ６切断されたタウのレベルは、高齢の非認知的に障害のある個体の脳における包括的認知スコア、陳述記憶および意味記憶と逆相関し、これはＣ６の活性がＡＤの臨床診断および病理学的診断に先行することを示唆する（Ａｌｂｒｅｃｈｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００７年、１７０巻（４号）：１２００〜９頁；ＬｅＢｌａｎｃら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２０１４年、２１巻：６９６〜７０６頁）。
【０００８】
ニューロンの機能障害、特に軸索変性におけるＣ６の役割は、他の研究によって支持され、栄養因子除去後の変性したニューロンおよび軸索においてＣ６が活性化されることを示す（Ｐａｒｋら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１０年、１３巻（５号）：５５９〜６６頁）。さらに、Ｃ６は活性化され、虚血侵襲に続く神経変性のために必要とされる（Ａｋｐａｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１１年、３１巻（２４号）：８８９４〜９０４頁）。総合すれば、これらの研究は、神経系疾患についての治療方針としてＣ６の阻害剤を支持する。
疾患過程におけるカスパーゼの役割を検証するために使用される大部分のカスパーゼ阻害剤はペプチドをベースとするものであり、カスパーゼ基質中に存在する切断部位を模倣する。非ペプチド阻害剤はＣ６について記載されており、ＨＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルにおいて試験したとき、Ｌｅｖｙａおよび共同研究者によって記載された汎カスパーゼ阻害剤は、ｍｈｔｔ毒性からの保護を示した（Ｌｅｙｖａら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、２０１０年、１７巻（１１号）：１１８９〜２００頁）。より最近では、Ｍｕｒｒａｙおよび同僚は、アロステリック部位におけるプロカスパーゼ６を結合する小分子について記載している（Ｍｕｒｒａｙら、Ｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２０１４年、９巻（１号）：７３〜７７頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、２０００年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７５巻（２６号）：１９８３１〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）の処置のための医薬組成物として記載することができ、組成物は、カスパーゼ−６阻害剤および１種または複数の医薬担体または賦形剤を含む。カスパーゼ−６阻害剤は、小分子、例えば、アリールプロピンアミド（ａｒｙｌｐｒｏｐｙｎａｍｉｄｅ）誘導体でよく、下記の構造ＩもしくはＩＩの１つを有することができ、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグ：
【化１】
2018522812.tif 000003
【００１１】
式中、ＲａおよびＲｂは、独立に、直鎖状または分岐状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、またはアルケニル、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアリール、Ｃ１〜Ｃ９置換アルキルアリール、またはＣ１〜Ｃ９アルキルヘテロアリールであり、
【００１２】
フェニルは、０個、１個もしくは２個のハロゲンで置換されており、
【００１３】
さらに、ハロゲンは、クロリド、フルオリドまたはブロミドである。
【００１４】
本開示はまた、ある特定の実施形態では、神経系疾患を処置する方法であって、このような処置を必要としている被験体に、治療有効量の本明細書に記載のような構造ＩもしくはＩＩの構造のいずれかを有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含む有効用量の医薬組成物を投与することを含み、疾患は、ハンチントン病、アルツハイマー病、認知症、軽度認知機能低下、または記憶喪失である、方法として記載することができる。組成物は、単独で、または神経系疾患の処置において有用な１種もしくは複数の薬物もしくは薬剤の投与との補助療法もしくは併用療法として投与することができる。薬物の組合せは、同じ製剤中で、または別々に投与することができ、同時または逐次的に投与することができる。神経系疾患の処置のために有用な例示的な薬物は、Ｌ−ＤＯＰＡ、ラサギリン、メマンチン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、リバスチグミン、ガランタミン、テトラベナジン（ｔｅｔｒａｂｅｎｚｉｎｅ）である。
【００１５】
本明細書に記載されている処置の方法は、被験体における症状の発症の後に開始することができるか、あるいは処置を、神経系疾患に感受性であるか、または感受性であると疑われている被験体における神経系疾患の症状が提示される前に始めることができる。神経系疾患に感受性であるか、または感受性であると疑われている被験体は、被験体における変異ｈｔｔ遺伝子の発現の存在によって、健康な被験体におけるカスパーゼ−６ｍＲＮＡの発現に対する被験体の神経細胞におけるカスパーゼ−６ｍＲＮＡの過剰発現によって、または磁気共鳴イメージング上での白色部分の喪失によって証明されるような被験体における軸索変性の存在によって、同定することができる。
【００１６】
用語「被験体」は、本明細書において使用する場合、ヒト被験体または獣医学的被験体を指すことができることが理解される。
【００１７】
ある特定の実施形態では、開示した組成物は、神経系疾患の処置または回復のための医薬組成物を含むことができ、組成物は、図３に示されているような構造を有する治療有効量の活性剤、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグを含み、活性剤は、ＰＧ−３ａ〜ｈまたはＰＧ−３の１つとして命名されている構造を有する。
【００１８】
本開示はさらに、神経変性疾患、例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、認知症、軽度認知機能低下、または記憶喪失の処置のための組成物および方法として定義することができる。神経変性の処置のために、開示した組成物は製剤化して、経口的、局所的または非経口的に投与することができる。全身投与、例えば、経口投与または非経口経路、例えば、全身循環への注射または注入が可能である一方、脳および中枢神経系を標的とした活性剤についてこのような経路の使用は、ＣＮＳにおける治療レベルを達成するために望ましくなく高い血清レベルを必要とし得る。したがって、開示した組成物はまた、側脳室内もしくは実質内注射による脳への直接の導入のために、または例えば、嗅球もしくは三叉神経を介した鼻腔内送達のために製剤化することができる。
【００１９】
注射のために、治療量の開示したカスパーゼ−６阻害剤または薬学的に許容されるその塩の製剤は、皮下、静脈内、または筋肉内注射のために調製されるか、あるいは製剤は、側脳室内、実質内またはくも膜下腔内注射による脳またはＣＳＦ中への直接の導入のために調製される。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、ｐＨを３．５〜７の範囲に維持する緩衝液、およびまた塩、例えば、塩化ナトリウムを含有することができ、また等張を調節するためのマンニトールまたはソルビトールを含有することができる。ある特定の実施形態では、ＤＭＳＯまたは別の有機溶媒を加えることができる。
【００２０】
組成物が例えば、注入または注射による、静脈内、腹腔内または皮下投与のために製剤化されるとき、活性化合物またはその塩の溶液は、水中で調製して、界面活性剤と任意選択で混合することができる。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物性油、無毒性グリセリルエステル、および適切なこれらの混合物を含む溶媒または液体分散媒でよい。このような組成物はまた、等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウム、および任意選択で吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、セルロースエーテル、およびゼラチンを含むことができる。
【００２１】
製剤がＣＮＳの組織への組成物の浸透を容易にする脂質をまた含み得ることは製剤の別の態様である。開示した組成物のために有用な例示的な脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリンおよびコレステロールが含まれる。開示した組成物はまた、水中油型エマルジョンとして投与することができ、油は、例えば、オリーブ油、ダイズ油、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、アボカド油、ピーナッツ油、クルミ油、アーモンド油またはヘーゼルナッツ油を含めた合成油または植物油から選択される。
【００２２】
リポソーム調製品としてのある特定の実施形態では、開示した組成物をまた調製することができ、リポソームは、大きな単膜小胞（ＬＵＶ）、多重膜小胞（ＭＬＶ）、または小さな単膜小胞（ＳＵＶ）である。ＬＵＶは、約２００〜約１０００ｎｍの範囲の粒子系を有する。ＭＬＶは、約４００〜約３５００ｎｍの範囲の粒子系を有する。ＳＵＶは、約２０〜約５０ｎｍの範囲の粒子系を有する。
【００２３】
リポソームを形成するための脂質の例には、リン脂質、コレステロール、または窒素脂質が含まれる。リン脂質は、天然起源のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、ダイズレシチン、リゾレシチン、または対応する水素添加リン脂質もしくは合成リン脂質、例えば、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、およびエレオステアロイルホスファチジルセリンから選択することができる。
【００２４】
脳および中枢神経系への医薬品の送達は、循環血から脳への小分子および大分子の送達を阻害または防止する血液脳関門（ＢＢＢ）のために難易度の高いものであることは周知である。したがって、開示した製剤は、吸入、または脳への鼻腔内送達のために製剤化することができる。治療剤がＣＮＳにおいて適切な吸収およびバイオアベイラビリティーを有するために、溶解補助剤を必要とし得る。ある特定の実施形態では、活性成分は、ＣＮＳへの鼻腔内送達のための担体、例えば、シクロデキストリン、マイクロエマルジョン、またはナノ粒子中にカプセル化される。親水性シェルによって囲まれた疎水性キャビティを含有するシクロデキストリン包接錯体は、乏しい水溶性の薬物の溶解性を改善し、このように鼻腔内投与後の脳への取込みを増強させることができる。ポリ乳酸（ＰＬＡ）の疎水性コアおよびメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ＭＰＥＧ）の親水性シェルを有するポリマーナノ粒子がまた、溶解性およびＣＮＳへの鼻腔内の薬物標的化を改善させるために、開示した組成物中の使用のために企図される。
【００２５】
膜透過性を改善することは、嗅覚神経および三叉神経に沿ったＣＮＳへの輸送を増強させることができるため、鼻腔内投与に続くＣＮＳへの効率的な送達はまた膜透過性によって決まる。さらに、組成物は、浸透増強剤、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、脂質、シクロデキストリン、ポリマー、およびタイトジャンクションモディファイヤーと併せて使用し得る。
【００２６】
ある特定の実施形態では、開示した組成物は、経口投与のために製剤化することができる。このような製剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、またはビーズ、または液体、ゲル剤、またはシロップ剤の形態でよい。経口送達組成物の形態および強度は、吸収度の特徴、容認できるまたは安全な血清薬物濃度および有効量の薬物をＣＮＳに送達する能力によって決定される。
【００２７】
固体経口組成物は、錠剤、散剤またはビーズとして調製することができ、例えば、胃腸系の選択した部分における放出を達成するか、より長い期間に亘り有効用量を維持するか、または特定の時間に選択した用量範囲を送達するために、即時放出、持続放出もしくは制御放出、遅延放出またはこれらの組合せのために製剤化することができる。持続放出、制御放出および遅延放出製剤は、活性医薬成分（ＡＰＩ）コアまたは層の上のコーティング層の使用を必要とすることが多い。
【００２８】
経口的に投与される錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤または甘味剤、緩衝液、塩、糖、およびポリマーのコーティング（水溶性および水不溶性の両方）、皮膜形成剤ならびに可塑剤を含有することができる。
【００２９】
液体製剤は、溶液、エマルジョン、懸濁液、またはコロイド懸濁液中、例えば、適当な溶媒および賦形剤中に薬物を含有することができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、必要に応じて、さらなる濃厚剤または増粘剤を含有することができる。
【００３０】
局所適用または注入のための組成物は、水溶液、ローション、ゼリーまたは油性溶液または懸濁液として製剤化することができる。水溶液の形態の組成物は、カスパーゼ−６阻害剤を溶媒および緩衝溶液および任意選択でポリマーバインダーに溶解することによって得られる。局所適用のための油性製剤は、カスパーゼ−６阻害剤を油に懸濁させ、膨潤剤、例えば、ステアリン酸アルミニウムおよび／または界面活性剤を任意選択で添加することによって得られる。吸収度増強剤、例えば、ＤＭＳＯをまた、経皮的投与のために局所組成物に加えることができる。
【００３１】
他に特定しない限り、または使用する文脈で定義しない限り、全ての用語は、本明細書において、それぞれの技術分野において使用されるような、および下記で考察するようなそれらの通常の意味を伝えることを意味する。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、これらに限定されないが、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収に影響を与える薬剤などを含めたありとあらゆる非活性または不活性な成分を含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物中でのその使用が企図される。補助的活性成分をまた、組成物中に組み込むことができる。
【００３３】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、記載されているような無毒性の薬学的に許容される塩を指す（Ｒｅｆ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．、１９８６年、３３巻、２０１〜２１７頁；Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、１９９７年（１月）、８６巻、１号、１頁）。しかし、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸またはトリフルオロ酢酸を含めて、当業者に周知の他の塩は、本開示の組成物の調製において有用であり得る。代表的な有機塩基または無機塩基には、これらに限定されないが、塩基性塩またはカチオン塩、例えば、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛が含まれる。
【００３４】
本開示の組成物および活性剤は、「有効量」、「有効用量」または「治療有効量もしくは用量」で投与される。薬物または薬理学的活性剤の「有効」量または「治療有効量」もしくは用量とは、所望の効果を実現する、薬物または薬剤の無毒性ではあるが十分な量を意味する。本開示において、「有効量」は、処置される状態の１つまたは複数の症状を改善、回復または予防するのに有効なその組成物または活性剤の量である。「有効」である量は、個体の年齢、体重および全身状態、または特定の活性剤によって、被験体毎に変化する。治療量または有効用量もしくは量は医師が決定し、利益対副作用の最良のバランスに達するまで増加する用量を投与することによって得られる実験によって得られるデータに基づくことが多い。
【００３５】
用語「非経口」は、本明細書において使用する場合、経皮的投与、皮下注射、静脈内、筋内または胸骨内注射、くも膜下腔内注射（ＣＮＳ中に直接）または注入技術を含めた全ての非経口送達技術を含む。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「リポソーム」は、水性または親水性の中心を囲い込む両親媒性脂質二重層構造を記載することを意味し、ここでは脂質「テイル」が二重層のエンベロープを形成し、より親水性の「ヘッド」が、媒体の内部および外部インターフェースにおいて整列している。典型的なリン脂質は、リン脂質またはコレステロールである。リポソームは、両親媒性脂質、すなわち、リン脂質またはコレステロールの１つまたは複数の脂質二重層からなる非常に単純な構造である。親水性および疎水性の両方の薬物は、それぞれ、リポソーム中、コア中もしくは二重層中で運搬することができるか、または負に帯電している薬剤は、例えば、カチオン性リポソームによって運搬されることができる。用語リポソームは、２０ｎｍ〜数μｍの範囲のサイズのリポソームを指すために使用することができる。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「混合ミセル」は、液体コロイドに分散していている界面活性剤の粒子の凝集物である。例示的な洗剤または界面活性剤の構造は、胆汁酸塩、リン脂質、トリ、ジおよびモノグリセリド、脂肪酸、遊離コレステロールならびに脂溶性微量栄養素の凝集であり得る。ミセル溶液は、水および有機溶媒中で自発的に形成される熱力学的に安定的な系である。ミセルおよび疎水性／親油性薬物の間の相互作用は、混合ミセル（ＭＭ）の形成をもたらす。
【００３８】
本明細書において使用する場合、用語「脂質微粒子」は、脂質ナノ球体およびミクロスフィアを含むことを意味する。ミクロスフィアは一般に、任意の材料からできた、約０．２〜１００μｍの範囲の小さな球状粒子と定義される。２００ｎｍ未満のより小さな球体は通常、ナノ球体と称される。脂質ミクロスフィアは、市販の脂肪エマルジョンと同様の均一な油／水マイクロエマルジョンであり、集中的超音波処理手順または高圧乳化方法（粉砕方法）によって調製される。
【００３９】
用語「ポリマーナノ粒子」は、ナノポリマーマトリックスに溶解したか、または粒子表面上に捕捉もしくは吸着された活性剤、例えば、カスパーゼ−６阻害剤を指すことを意味する。有機ナノ粒子の調製に適したポリマーは、セルロース誘導体およびポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびこれらのコポリマーを含む。これらの小さなサイズ、これらの大きな表面積／容量比、およびインターフェースの機能化の可能性によって、ポリマーナノ粒子は有利な担体および放出系である。粒径が約５０ｎｍ未満である場合、粒子は免疫応答を回避することができ、膜障壁を横切って薬物をより良好に送達することができる。
【００４０】
様々な水溶性ポリマーを、開示した組成物中に使用することができる。このようなポリマーには、これらに限定されないが、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレンオキシド−酸化プロピレンコポリマー、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール（例えば、ポロキサマー）、カルボマー、ポリカルボフィル、キトサン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシアルキルセルロース、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリレート、例えば、カルボマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファジン、ポリオキサゾリジン、ポリヒドロキシアルキルカルボン酸、アルギン酸およびその誘導体、例えば、カラギネートアルギネート（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｔｅ  ａｌｇｉｎａｔｅｓ）、アルギン酸アンモニウムおよびアルギン酸ナトリウム、デンプンおよびデンプン誘導体、多糖、カルボキシポリメチレン、ポリエチレングリコール、天然ガム、例えば、グアーガム、アラビアゴム、トラガカントガム、カラヤガムおよびキサンタンガム、ポビドン、ゼラチンなどが含まれる。
【００４１】
遅延放出、または胃腸管における下部におけるある特定の実施形態では、少なくとも遅延放出層は、１種または複数のポリマー、例えば、これらに限定されないが、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０Ｄ−５５、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）４１３５Ｆ、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳを含めた、アクリルポリマー、アクリルコポリマー、メタクリルポリマーまたはメタクリルコポリマー、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルコポリマー、エトキシメタクリル酸エチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、メタクリル酸アルキルアミンコポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリル酸無水物、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸無水物およびメタクリル酸グリシジルコポリマー、アルキルセルロース、例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ある特定の置換セルロースポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、および酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、および酢酸トリメリット酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ  ｔｒｉｍａｌｅａｔｅ）、酢酸フタル酸ポリビニル、ポリエステル、ワックス、シェラック、ゼインなどを含むことができる。
【００４２】
Ｅｕｄｒａｇｉｔｓは、制御放出用途のために有用な周知のポリマーおよびコポリマーである。腸溶性コーティングのためのＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）グレードは、メタクリル酸およびメタクリレートのアニオン性ポリマーをベースとする。これらは官能基として−ＣＯＯＨを含有する。これらはｐＨ５．５〜ｐＨ７の範囲で溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ３０Ｄは、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルおよびメタクリル酸をベースとするアニオン性コポリマーの水性分散液である。これは酸性媒体中で不溶性であるが、ｐＨ７．０超の塩の形成によって溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５およびＬ３０−５５は、５．５超のｐＨで溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００およびＳ１００は、６．０超のｐＨで溶解する。
【００４３】
持続放出ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）製剤は多くの経口剤形のために用いられ、活性成分の時間制御放出を可能とする。薬物送達は、治療効果の増加および患者の薬剤服用順守のために、全消化管を通して制御することができる。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ（容易に透過性）およびＲＳ（乏しい透過性）グレードの異なるポリマーの組合せは、目的に合わせて作られた放出プロファイルを可能とし、所望の薬物送達性能を達成する広範囲の代替物を可能とする。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＮＥポリマーは、可塑剤を必要としない中性エステル分散物であり、マトリックス錠剤および持続放出コーティングの製造における顆粒化プロセスに特に適している。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「浸透圧性薬剤」は、活性成分の膨潤および製剤からの活性成分の排除をもたらすために使用されることが多い、環境から水を吸収する化合物を意味することを意図する。例示的なオスマジェント（ｏｓｍａｇｅｎｔｓ）または浸透圧性薬剤には、有機および無機化合物、例えば、塩、酸、塩基、キレート剤、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸リチウム、塩化カリウム、亜硫酸ナトリウム、炭酸水素カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、ｄ−マンニトール、尿素、酒石酸、ラフィノース、スクロース、アルファ−ｄ−ラクトース一水和物、グルコース、これらの組合せ、ならびに当技術分野において広範に公知である他の同様または同等の材料が含まれる。
【００４５】
本明細書において使用する場合、用語「崩壊剤」は、より容易に分散または溶解するより小さな粒子への固体塊（層）の撹乱を促進するために固体剤形中で使用される化合物を意味することを意図する。例示的な崩壊剤には、例として、これらに限定されないが、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、そのアルファ化および加工デンプン、甘味剤、粘土、ベントナイト、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ）、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、セルロースポラクリリンカリウム（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐｏｌｙａｃｒｉｌｉｎ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標））、アルギネート、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、トラガント、クロスポビドンおよび当業者には公知の他の材料が含まれる。超崩壊剤は、急速に作用する崩壊剤である。例示的な超崩壊剤は、クロスポビドンおよび低置換度ＨＰＣを含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、可塑剤がまた経口剤形中に含まれる。本組成物中での使用に適した可塑剤には、これらに限定されないが、低分子量ポリマー、オリゴマー、コポリマー、油、小さな有機分子、脂肪族ヒドロキシルを有する低分子量ポリオール、エステルタイプの可塑剤、グリコールエーテル、ポリ（プロピレングリコール）、マルチブロックポリマー、単一ブロックポリマー、低分子量ポリ（エチレングリコール）、クエン酸エステルタイプの可塑剤、トリアセチン、プロピレングリコールおよびグリセリンが含まれる。このような可塑剤はまた、エチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、２，３−ブチレングリコール、スチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコールおよび他のポリ（エチレングリコール）化合物、モノプロピレングリコールモノイソプロピルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、乳酸ソルビトール、乳酸エチル、乳酸ブチル、グリコール酸エチル、セバシン酸ジブチル、アセチルクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリエチル、クエン酸トリブチルおよびグリコール酸アリルを含むことができる。
【００４７】
本開示の組成物はまた、１種または複数の機能的賦形剤、例えば、滑沢剤、熱滑沢剤、抗酸化剤、緩衝剤、アルカリ化剤（ａｌｋａｌｉｎｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、結合剤、希釈剤、甘味剤、キレート剤、着色剤、フレーバー剤、界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、安定剤、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、ワックス、親油性材料、吸収増強剤、保存剤、吸収剤、架橋剤、生体付着性ポリマー、遅延剤、ポア形成剤、および香料を含むことができる。
【００４８】
開示した組成物において有用な滑沢剤または熱滑沢剤には、これらに限定されないが、脂肪エステル、モノオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、ワックス、カルナウバワックス、蜜蝋、コハク酸ビタミンＥ、ステアリン酸塩、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、水酸化カルシウム、タルク、ステアリルフマル酸ナトリウム、水素添加植物性油、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｐａｔｅ）、ステアリン酸マグネシウム、カルシウムおよびナトリウム、ステアリン酸、タルク、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＤＬ−ロイシン、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、またはラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【００４９】
本明細書において使用する場合、用語「抗酸化剤」は、酸化を阻害し、したがって組成物中の酸素フリーラジカルまたは遊離金属の存在による酸化による調製物の変質を防止するために使用される薬剤を意味することを意図する。このような化合物には、例として、これらに限定されないが、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、次亜リン酸（ｈｙｐｏｐｈｏｐｈｏｒｏｕｓ  ａｃｉｄ）、モノチオグリセロール、アスコルビン酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムならびに当業者には公知の他のものが含まれる。他の適切な抗酸化剤には、例えば、ビタミンＣ、亜硫酸水素ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、没食子酸プロピルまたはスルフィット誘導体が含まれる。
【００５０】
開示した組成物（ｃｏｍｐｏｓｔｉｏｎｓ）中での使用に適した結合剤には、蜜蝋、カルナウバワックス、パルミチン酸セチル、ベヘン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、水素添加ヒマシ油、マイクロクリスタリンワックス、パラフィンワックス、ステアリン酸、ステアリンアルコール（ｓｔｅａｒｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）、ステアレート６０００ＷＬ１６４４、ｇｅｌｕｃｉｒｅ５０／１３、ポロキサマー１８８、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００、３０００、６０００、８０００、１００００または２００００が含まれる。
【００５１】
緩衝剤は、希釈、または酸もしくはアルカリの添加によるｐＨの変化に抵抗するために使用される。このような化合物には、例として、これらに限定されないが、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム、一塩基性酢酸ナトリウム（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）およびクエン酸ナトリウム無水物および二水和物、無機酸または有機酸の塩、無機塩基または有機塩基の塩ならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００５２】
本明細書において使用する場合、用語「アルカリ化薬剤（ａｌｋａｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、生成物の安定性のためのアルカリ性媒体を提供するために使用される化合物を意味することを意図する。このような化合物には、例として、これらに限定されないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、およびトロラミンならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００５３】
開示した組成物中で使用するための例示的な結合剤には、ポリエチレンオキシド；ポリプロピレンオキシド；ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン−ｃｏ−ビニルアセテート；アクリレートおよびメタクリレートコポリマー；ポリエチレン；ポリカプロラクトン；ポリエチレン−ｃｏ−ポリプロピレン；アルキルセルロースおよびセルロース誘導体、例えば、低置換度ＨＰＣ（Ｌ−ＨＰＣ）、メチルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシブチルセルロース；ヒドロキシアルキルアルキルセルロース、例えば、ヒドロキシエチルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース；デンプン、ペクチン；ＰＬＡおよびＰＬＧＡ、ポリエステル（シェラック）、ワックス、例えば、カルナウバワックス、蜜蝋；多糖、例えば、セルロース、トラガント、アラビアゴム、グアーガム、およびキサンタンガムが含まれる。
【００５４】
例示的なキレート剤には、ＥＤＴＡおよびその塩、アルファヒドロキシ酸、例えば、クエン酸、ポリカルボン酸、ポリアミン、その誘導体ならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００５５】
本明細書において使用する場合、用語「着色剤」は、固体（例えば、錠剤）医薬調製物に色を与えるために使用される化合物を意味することを意図する。このような化合物には、例として、これらに限定されないが、ＦＤ＆Ｃ赤色３号、ＦＤ＆Ｃ赤色２０号、ＦＤ＆Ｃ黄色６号、ＦＤ＆Ｃ青色２号、Ｄ＆Ｃ緑色５号、Ｄ＆Ｃオレンジ色５号、Ｄ＆Ｃ赤色８号、カラメル、および酸化鉄、赤色、他のＦＤ＆Ｃ色素および天然着色剤、例えば、ブドウの皮の抽出物、ビートレッド粉末、ベータカロテン、アンナット（ａｎｎａｔｏ）、カルミン、ウコン、パプリカ、ならびに当業者には公知の他の材料が含まれる。使用される着色剤の量は、所望の通り変化する。
【００５６】
本明細書において使用する場合、用語「フレーバー剤」は、医薬調製物に好ましいフレーバーおよびしばしば匂いを与えるために使用される化合物を意味することを意図する。例示的な香味剤またはフレーバー剤には、合成フレーバー油および香味付け芳香族化合物および／または天然油、植物、葉、花、果物などからの抽出物、ならびにこれらの組合せが含まれる。これらはまた、桂皮油、冬緑油、ハッカ油、チョウジ油、ベイ油、アニス油、ユーカリ、タイム油、ニオイヒバ油、ナツメグの油、セージの油、苦扁桃油およびカッシア油を含み得る。他の有用なフレーバーは、バニラ、レモン、オレンジ、ブドウ、ライムおよびグレープフルーツを含めた柑橘油、ならびにリンゴ、セイヨウナシ、モモ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、アンズを含めたフルーツエッセンスなどを含む。特に有用であることが見出されてきたフレーバーは、市販のオレンジ、ブドウ、サクランボおよび風船ガムフレーバーならびにこれらの混合物を含む。香味付け剤の量は、所望の感覚受容性効果を含めたいくつかの要因によって決まり得る。フレーバーは、当業者によって所望の通りの任意の量で提示される。特定のフレーバーは、ブドウおよびサクランボフレーバーおよび柑橘類フレーバー、例えば、オレンジである。
【００５７】
適切な界面活性剤は、ポリソルベート８０、モノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシマー（ｐｏｌｙｏｘｙｍｅｒ）、ラウリル硫酸ナトリウムまたは当技術分野において公知の他のものを含む。セッケンおよび合成洗剤は、界面活性剤として用い得る。適切なセッケンには、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が含まれる。適切な洗剤には、陽イオン洗剤、例えば、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム、ハロゲン化アルキルピリジニウム、およびアルキルアミンアセテート；陰イオン洗剤、例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドスルフェート、およびスルホスクシネート；非イオン洗剤、例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリ（オキシエチレン）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；ならびに両性洗剤、例えば、アルキルβ−アミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン第四級アンモニウム塩；ならびにこれらの混合物が含まれる。
【００５８】
湿潤剤は、液体の表面張力を減少させる薬剤である。湿潤剤には、アルコール、グリセリン、タンパク質、ペプチド水混和性溶媒、例えば、グリコール、親水性ポリマーポリソルベート８０、モノオレイン酸ソルビタン、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム、ハロゲン化アルキルピリジニウム、およびアルキルアミンアセテート；陰イオン洗剤、例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドスルフェート、およびスルホスクシネート；非イオン洗剤、例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリ（オキシエチレン）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；ならびに両性洗剤、例えば、アルキルβ−アミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン第四級アンモニウム塩；ならびにこれらの混合物が含まれる。
【００５９】
可溶化剤には、シクロデキストリン、ポビドン、これらの組合せならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６０】
例示的なワックスには、カルナウバワックス、蜜蝋、マイクロクリスタリンワックスならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６１】
例示的な吸収増強剤には、ジメチルスルホキシド、ビタミンＥ  ＰＧＳ、コール酸ナトリウムならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６２】
保存剤は、微生物の成長を防止するために使用される化合物を含む。適切な保存剤には、例として、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサールならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６３】
吸収剤の例には、デンプングリコール酸ナトリウム（Ｅｘｐｌｏｔａｂ（商標）、Ｐｒｉｍｏｊｅｌ（商標））およびクロスカルメロースナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（商標））、架橋ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）ＸＬ１０）、ｖｅｅｇｕｍ、粘土、アルギネート、ＰＶＰ、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ）、ポラクリリン（ｐｏｌａｃｒｉｌｌｉｎ）カリウム（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標））、アルギン酸ナトリウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルファ化デンプン、加工デンプン、セルロース剤（ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ａｇｅｎｔ）、モンモリロナイト粘土（ｍｏｎｔｍｏｒｒｉｌｏｎｉｔｅ  ｃｌａｙｓ）（例えば、ベントナイト）、ガム、寒天、イナゴマメガム、カラヤガム、ペクチン、トラガント、ならびに当業者には公知の他の崩壊剤が含まれる。
【００６４】
架橋剤は、ポリマーの部分の間で架橋を形成する任意の化合物と定義される。架橋剤は、例として、これらに限定されないが、有機酸、アルファ−ヒドロキシ酸、およびベータ−ヒドロキシ酸を含むことができる。適切な架橋剤には、酒石酸、クエン酸、フマル酸、コハク酸ならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６５】
生体付着性ポリマーには、ポリエチレンオキシド、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標）（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ、ポリカルボフィル、ＧＡＮＴＲＥＺ、ポロキサマー、およびこれらの組合せならびに当業者には公知の他のものが含まれる。
【００６６】
遅延剤は、プロセシングのために必要とされる他のポリマーおよび他の賦形剤を含めた製剤中の他の薬剤によって可塑化される前に、４５℃超、または５０℃超のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する不溶性または微溶性のポリマーである薬剤である。賦形剤は、ワックス、アクリル樹脂、セルロース系材料、脂質、タンパク質、グリコールなどを含む。
【００６７】
例示的なポア形成剤には、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマーおよびポビドン；結合剤、例えば、ラクトース、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムなど；塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムなど；これらの組合せ、ならびに当技術分野において広範に公知の他の同様または同等の材料が含まれる。
【００６８】
本明細書において使用する場合、用語「甘味剤」は、調製物に甘さを与えるために使用される化合物を意味することを意図する。このような化合物には、例として、これらに限定されないが、アスパルテーム、デキストロース、グリセリン、マンニトール、サッカリンナトリウム、ソルビトール、スクロース、フルクトースおよび当業者には公知の他のこのような材料が含まれる。
【００６９】
医薬製剤の技術分野で使用される化合物は一般に、種々の機能または目的を果たすことを理解すべきである。このように、本明細書において挙げる化合物が１度のみ言及されるか、または本明細書において複数の用語を定義するために使用される場合、その目的または機能は、その示した目的または機能にもっぱら限定されると解釈すべきではない。
【００７０】
下記の図面は、本明細書の部分を形成し、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれる。本開示は、本明細書において提示する特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによってより良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａは、化合物８ａ〜ｆについての合成スキームを示す。図１Ｂは、化合物８ａ〜ｆの可能な互変異性形態を示す。
【００７２】
【図２】図２は、化合物８〜化合物９の加水分解性開環、および化合物９ｅ〜化合物１０の脱カルボキシル化を示す。
【００７３】
【図３】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ａ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｂ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｃ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｄ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｅ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｆ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｇ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【図３ｈ】図３および図３ａ〜ｈは、ＰＧ３化合物およびその類似体の構造を示す。
【００７４】
【図４】図４は、ＰＧ３化合物がカスパーゼ６酵素を用量依存的な方式で阻害することを示す。異なる濃度のＰＧ３化合物を、Ｈｔｔタンパク質およびカスパーゼ−６酵素と共にインキュベートした。ＣＯＳ−７細胞ライセートからのＨｔｔ基質は、カスパーゼ６によって切断され、フラグメントは、アミノ酸５８６に対するＮ末端ＢＫＰ１抗体およびネオ−エピトープ抗体の間のＦＲＥＴによって検出される。（Ａ）は、化合物ＰＧ３、ＰＧ３ａおよびＰＧ３ｂについての用量反応曲線を示す。（Ｂ）は、化合物ＰＧ３ｃ、ＰＧ３ｄおよびＰＧ３ｅについての用量反応曲線を示す。（Ｃ）は、化合物ＰＧ３ｆ、ＰＧ３ｇおよびＰＧ３ｈについての用量反応曲線を示す。
【００７５】
【図５】図５は、ウエスタンブロットアッセイにおいて、ＰＧ３ｄ化合物の存在がカスパーゼ−６によるＨｔｔの切断を阻害することを示す。ｈｔｔ−４Ｃコンストラクト、およびプロドメインを欠いているヒトカスパーゼ−６を同時トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、未処理のままであるか、１０ｕＭのＰＧ３ｄ化合物で処理したか、または３ｕＭの汎カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−Ｏｐｈ）で処理した。（Ａ−上のパネル）５８６アミノ酸フラグメントを生じさせるＨｔｔタンパク質の切断を、汎ＨＴＴ  ＢＫＰ１抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。ＰＧ３ｄ阻害剤または汎カスパーゼ阻害剤の存在は、Ｈｔｔタンパク質の切断の低減をもたらした。（Ａ、下のパネル）ＰＧ３ｄ化合物または汎カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−Ｏｐｈ）の存在はまた、活性カスパーゼ−６酵素のレベルの低減をもたらした。（Ｂ）は、ウエスタンブロット分析からのアクチンレベルと比較した、５８６アミノ酸フラグメントのレベルのグラフ図を示す。Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングソフトウェアを使用してタンパク質レベルを定量化した。アクチン発現に対するＨｔｔ−５８６フラグメントの発現を、ｙ軸上に示す。１０ｕＭのＰＧ３ｄ化合物の存在は、未処理の細胞と比較してＨｔｔ切断フラグメントの発現の有意な低減をもたらした。スチューデントｔ検定＊＊：ｐ＜０．０１
【００７６】
【図６】図６は、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ＥＬＩＳＡ方法によって定量化するように、ＰＧ３化合物が、ＨＥＫ２９３細胞中のカスパーゼ−６によるラミンＡの切断を阻害することを示す。（Ａ）は、化合物ＰＧ３ａ、ＰＧ３ｂ、ＰＧ３ｄおよびＰＧ３ｄについての用量反応曲線を示す。（Ｂ）は、化合物ＰＧ３ｅ、ＰＧ３ｇおよびＰＧ３ｈについての用量反応曲線を示す。
【００７７】
【図７】図７は、ＰＧ３ｄがカスパーゼ−６のニューロン内活性化を阻害することを示す。ＦＶＢ／Ｎマウスからの一次皮質ニューロンを、１０ｕＭのＰＧ３ｄの存在下または非存在下で１０ｕＭのカンプトテシンで３０時間処理した。カンプトテシン処理はカスパーゼ−６の活性化をもたらし、これはラミンＡの切断を測定することによって定量化することができる（Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、６巻（１１号）：ｅ２７６８０頁）。ニューロン培地中のＰＧ３ｄの存在は、カスパーゼ−６活性を有意に低減させる。スチューデントｔ検定、＊＊：ｐ＜０．０１。
【００７８】
【図８】図８は、ＰＧ３ｄが興奮毒性ストレスの間のニューロン生存率を改善させることを示す。ＦＶＢ／Ｎマウスからの一次皮質ニューロンを、培地中で異なる量のＮＭＤＡで２０時間処理したが、これは生存率の尺度である細胞内のＡＴＰレベルの喪失をもたらす。１０ｕＭのＰＧ３ｄの存在は、このパラダイムにおいてニューロン生存率を有意に改善させる。二元配置ＡＮＯＶＡ：ＮＭＤＡ処理ｐ＜０．０００１、ＰＧ３ｄ処理ｐ＝０．０００１。事後ボンフェローニ検定：＊＊＝ｐ＜０．０１。
【００７９】
【図９】図９は、ＣＯＳ−７細胞におけるカスパーゼ−６とＨｔｔフラグメントとの相互作用を示す細胞研究の結果である。トランスフェクションに続いて、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＭＳＯ、汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−Ｏｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）またはＰＧ３ｄ化合物（ＰＧ３ｄ）に曝露させた。２４時間のインキュベーション期間の後、細胞ライセートをウエスタンブロットによって加工するか、またはカスパーゼ−６抗体により免疫沈降させ、それに続いてウエスタンブロット分析を行った。（Ａ）ＤＭＳＯ（ｎ．ｔ）で処理し、３ｕＭの汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−Ｏｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）に曝露させたか、または１０ｕＭのＰＧ３ｄ化合物（ＰＧ３ｄ）で処理した、同時トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞からのライセートのウエスタンブロット分析。上のパネルは、Ｈｔｔ抗体２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるウエスタンブロット分析を示す。下のパネルは、カスパーゼ６の完全長および活性形態を検出する、カスパーゼ−６抗体ＨＤ９１によるウエスタンブロット分析を示す。（Ｂ）カスパーゼ−６酵素の結合パートナーを同定するカスパーゼ−６抗体による免疫沈降法に続く、図９Ａからの細胞ライセートのウエスタンブロット分析。上のパネルは、Ｈｔｔ抗体２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるウエスタンブロット分析を示し、下のパネルは、ＨＤ９１カスパーゼ−６抗体によるウエスタンブロット分析を示す。
【００８０】
【図１０】図１０は、濃度測定分析によって図９Ｂに示す同時沈殿データを定量化する棒グラフである。一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０３１、事後チューキー検定＊：ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
配列：
配列番号１（ｈｔｔ−４Ｃ）。配列番号１は、発現したポリペプチドのプロセシングを可能とするＨｉｓ−タグを含む、Ｎ末端（野性型ハンチンチンに対して）においてさらなる１０個のアミノ酸を有する。Ｈｔｔ−４Ｃは、アミノ酸１２１２（野性型ハンチンチン配列による番号付け）においてトランケートされており、太字の下線を引いたテキストによってマークされた、アミノ酸５１３、５３０、５５２および５８９（野性型ハンチンチン配列による番号付け）において４つのＤからＡのアミノ酸置換を有する。ＩＶＬＤカスパーゼ−６切断部位は、二重下線でマークする。
【化２−１】
2018522812.tif 000004
【化２−２】
2018522812.tif 000005
【００８２】
配列番号２（カスパーゼ−６デルタプロドメイン）。配列番号２は、ヒトカスパーゼ−６のアミノ酸２４〜２９３を含み、プロドメイン（ａａ１〜２３）が欠失している。この欠失は、トランスフェクション後の酵素のより速い細胞内の自己活性化をもたらす（Ｋｌａｉｍａｎら、ＢＢＡ、２００９年、１７９３巻（３号）：５９２〜６０１頁）。タンパク質は、発現したポリペプチドの検出を可能とするＤＤＫ−タグを含む、Ｃ末端（野性型カスパーゼ−６に対して）においてさらなる３１個のアミノ酸を有する。
【化３】
2018522812.tif 000006
【００８３】
配列番号３（ｗｔ  ｈｔｔ）。配列番号３は、発現したポリペプチドのプロセシングを可能とするＨｉｓ−タグを含む、Ｎ末端（野性型ハンチンチンに対して）においてさらなる１０個のアミノ酸を有する。Ｗｔ  Ｈｔｔは、アミノ酸１２１２（野性型ハンチンチン配列による番号付け）においてトランケートされている。
【化４−１】
2018522812.tif 000007
【化４−２】
2018522812.tif 000008
【００８４】
配列番号４（完全長カスパーゼ−６）。配列番号４は、ヒトカスパーゼ−６のアミノ酸１〜２９３を含む。タンパク質は、発現したポリペプチドの検出を可能とするＤＤＫ−タグを含む、Ｃ末端（野性型カスパーゼ−６に対して）においてさらなる３１個のアミノ酸を有する。
【化５】
2018522812.tif 000009
細胞トランスフェクションおよび細胞溶解
【００８５】
ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．５％グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。メーカーの説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクトされたＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの制御下で１５グルタミンおよびＣ末端ＨＡ−タグを有するヒトＨｔｔタンパク質のアミノ酸１〜１２１２をコードする（Ｗａｒｂｙ、２００８年、上述；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、２０００年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７５巻：１９８３１〜１９８３８頁）。トランスフェクトされたコンストラクトは、アミノ酸５１３、５３０、５５２および５８９においてＤからＡの変異を含有する４ｃ  Ｈｔｔである（配列番号１）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、溶解緩衝液（１×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）および４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃを補充した５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ）中の懸濁液によって溶解した。ライセートを氷上で１０分間インキュベートし、ボルテックスし、４秒間超音波処理し、その後、４℃にて１０分間の２１，０００×ｇでの遠心分離を行った。上清を保存し、タンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ  ＤＣアッセイで決定し、−８０℃にて使用するまで貯蔵した。
【００８６】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．５％グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。メーカーの説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクションを行った。トランスフェクトされたＤＮＡは、ＣＭＶプロモーター（ベクターｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６）の制御下でＣ末端ＤＤＫタグを有するヒトカスパーゼ６酵素のアミノ酸２４〜２９３をコードする（配列番号２）。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３を使用して、ラミン基質の切断によって証明されるようなカスパーゼ−６の細胞内活性を測定した（下で記載する）。
ＣＯＳ−７細胞ライセートからのＨｔｔの精製
【００８７】
５０μｌのＨＡ−アガロースビーズ（ＥＺ−Ｖｉｅｗ、Ｓｉｇｍａ）を１ｍｌの溶解緩衝液と混合し、８２００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を廃棄した。ビーズを溶解緩衝液中で０．５μｇ／μｌに希釈した２００μｌの細胞ライセートと混合し、回転ホイール上で４℃にて２時間インキュベートした。希釈した細胞ライセートの一定分量を、インプット画分として保存した。試料を８２００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を保存し、ビーズを１００μｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、上清を洗浄画分として保存した。ＲＩＰＡ緩衝液中の１００μｌのＨＡペプチド（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）をビーズ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）に加え、３７℃にて１０分間インキュベートすることによって溶出を行った。溶出ステップを５回繰り返し、全ての溶出液を保存した。次いで、ビーズをＳＤＳ添加色素と混合し、熱変性後に、３〜８％ＮｕＰａｇｅトリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上の１０μｌ分量の全ての画分と一緒に操作した。ゲルを、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉ−ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＢＫＰ１（Ｋａｌｃｈｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６年）、２７１巻（３２号）：１９３８５頁））およびＨＡ抗体による検出のためにブロットするか、または総タンパク質の検出のためにクーマシー色素で染色した。
ウエスタンブロットによるＨｔｔ切断のアセスメント
【００８８】
２５μｇのタンパク質に対応する４ｃ  Ｈｔｔを発現している一定分量のＣＯＳ−７ライセートを、切断緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール）および所望の量の組換えカスパーゼ−６（ＢｉｏＭｏｌ）で１０μｌに希釈した。カスパーゼ−６阻害剤化合物を含む実験のために、所望の量の阻害剤を、ＣＯＳ−７ライセートへの添加の前に、カスパーゼと混合した。試料を３７℃にて１時間インキュベートし、３〜８％ＮｕＰａｇｅトリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分析し、それに続いてウエスタンブロッティング、ならびにＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉ−ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＢＫＰ１およびネオ−５８６抗体による検出を行った。ＢＫＰ１およびネオ−５８６抗体については、従前記載されてきた（Ｗａｒｂｙら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ、２００８年、１７巻（１５号）：２３９０〜４０４頁）。
ＦＲＥＴによるＨｔｔ発現の定量化
【００８９】
細胞ライセートの希釈系列を、試料緩衝液（１×ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を有さないＰＢＳ、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））中で調製し、Ｔｂ−標識ＢＫＰ１抗体およびＤ２−標識ＨＡ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ）を、抗体希釈用緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中で１ｎｇ／μｌ（Ｔｂ）および１０ｎｇ／μｌ（Ｄ２）まで希釈した。抗体を１：１比で事前混合し、次いで、１０μｌの細胞ライセートおよび２μｌの抗体ミックスを、ホワイト３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェル中にピペットで移した。プレートを短時間遠心分離し、下記の設定によりＶｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でＦＲＥＴを測定した。励起：３４０ｎｍ、発光１：６１５ｎｍ、発光２：６６５ｎｍ、５０μｓの遅延、２００μｓのウィンドウ時間、２０００μｓのサイクル時間。最終ＦＲＥＴシグナルを得るために、発光２／発光１（Ｄ２／Ｔｂシグナル）の間の比を計算した。
ＦＲＥＴによる同時のカスパーゼ−６切断および５８６フラグメント検出
【００９０】
細胞ライセートおよびカスパーゼ−６（２．２×最終濃度）の希釈系列を、ＦＲＥＴ切断緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ゼラチン、０．１％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭのＤＴＴ）中で調製した。これは、この緩衝液が、希釈形態のカスパーゼ−６を室温にて最良に安定化させることが従前に見出されたためである。陰性対照のために、２２μΜのｚＶＡＤ−ｆｍｋを、カスパーゼ−６希釈物に加えた。
【００９１】
Ｔｂ−標識ＢＫＰ１抗体およびＤ２−標識５８６抗体（Ｃｉｓｂｉｏ）を、ＦＲＥＴ切断緩衝液中で１ｎｇ／μｌ（Ｔｂ）および１０ｎｇ／μｌ（Ｄ２）に希釈し、１：１比で事前混合した。
【００９２】
ホワイト３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルにおいて、１０μｌの細胞ライセートを、１０μｌのカスパーゼおよび２μｌの抗体ミックスと混合し、プレートを短時間遠心分離し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において３７℃にてインキュベートした。ＦＲＥＴを、下記の設定で２時間まで３０分毎に測定した。励起：３４０ｎｍ、発光１：６１５ｎｍ、発光２：６６５ｎｍ、５０μｓの遅延、２００μｓのウィンドウ時間、２０００μｓのサイクル時間。最終ＦＲＥＴシグナルを得るために、発光２／発光１（Ｄ２／Ｔｂシグナル）の間の比を計算した。２時間後３７℃にて、アッセイプレートを密封し、４℃にて２０時間のさらなるインキュベーションの後、ＦＲＥＴシグナルを再び読んだ。
ウエスタンブロットによる細胞内のＨｔｔ切断のアセスメント
【００９３】
ＣＯＳ−７細胞に、４ｃ  ｈｔｔフラグメント、およびプロドメインを欠いているヒトカスパーゼ−６を同時トランスフェクトしたが、これはカスパーゼ−６酵素の速い自己活性化、および５８６ａａ  Ｈｔｔ切断フラグメントの生成をもたらす。同時トランスフェクトされた細胞を、１０ｕＭのＰＧ３ｄ化合物、３ｕＭのＱ−ＶＤ−Ｏｐｈ汎カスパーゼ阻害剤に曝露させるか、または未処理のままとした。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として含み、精製された５８６ａａ  Ｈｔｔフラグメントを陽性対照として含んだ。細胞ライセートをウエスタンブロッティングに供し、細胞内に生じた５８６ＡＡフラグメントを、Ｈｔｔ抗体２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で検出した。カスパーゼ−６の発現および活性化を、抗体ＨＤ９１を使用してウエスタンブロッティングによってアセスメントした（Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒら、ＨＭＧ、２０１４年、２３巻（３号）：７１７〜２９頁）。
カスパーゼ−６を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるラミン切断のアセスメント
【００９４】
カスパーゼ−６トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における細胞内のラミン切断の定量的アセスメントを、従前に記載されているように行った（Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、６巻（１１号）：ｅ２７６８０頁）。手短に言えば、ＨＥＫ２９３細胞ライセートを溶解緩衝液中で１μｇタンパク質／μｌに調節し、ＰＢＳ中で０．２μｇ／μｌに希釈し、５μｌをマルチアレイ高結合９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に加えた。室温にて１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ中の１５０μｌの５％ＢＳＡを加えることによってウェルをブロックし、それに続いて室温にて１時間さらにインキュベートした。次いで、ウェルを１５０μｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、２５μｌの抗体ミックスを加えた（１：１００希釈でのＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃２０３６、１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中１：５００希釈でのＭｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙヤギ−抗ウサギスルホ−タグ）。室温にて１時間のインキュベーションの後、ウェルを１５０μｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１５０μｌ／ウェル２×読取り試薬（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を加えた。プレートをＳｅｃｔｏｒ  ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。
一次ニューロン培養物中のラミン切断のアセスメント
【００９５】
ＦＶＢマウスからの皮質ニューロン培養物を記載されているように調製した（Ｍｅｔｚｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００７年）２７巻（９号）：２２９８頁）。１０日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞をカンプトテシンで処理し、３０時間後に１×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）および４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃを補充したＰＢＳ中でかき落とすことによって収集した。溶解緩衝液（１×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）および４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃを補充した５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ）中の懸濁液によって細胞を溶解した。ライセートを氷上で１０分間インキュベートし、ボルテックスし、４秒間超音波処理し、その後、４℃にて２１０００×ｇでの１０分間の遠心分離を行った。上清を保存し、Ｂｉｏｒａｄ  ＤＣアッセイでタンパク質濃度を決定し、ニューロンのライセート中の切断されたラミンＡの定量的アセスメントを、Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、６巻（１１号）：ｅ２７６８０頁に記載されているようにＭｅｓｏｓｃａｌｅ  ＥＬＩＳＡ方法によって行った。
興奮毒性ストレスの間のニューロン生存率のアセスメント
【００９６】
ＦＶＢマウスからの皮質ニューロン培養物を、記載されているように調製した（Ｍｅｔｚｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００７年）２７巻（９号）：２２９８頁）。１０日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞を１０ｕＭのＰＧ３ｄまたは陰性対照としてＤＭＳＯで処理し、次いで、２５ｎＭのＮＭＤＡ、５０ｕＭのＮＭＤＡで処理するか、あるいは２０時間未処理のままとした。細胞内ＡＴＰの測定を、メーカーの説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏキットを使用して、従前に記載されているようにニューロン生存率のアセスメントとして使用した（Ｕｒｉｂｅら、ＨＭＧ、２０１２年、２１巻（９号）：１９５４〜６７頁）。
ｈｔｔおよびカスパーゼ６の間の結合相互作用のアセスメント。
【００９７】
ＣＯＳ−７細胞に、１２１２アミノ酸ＨＴＴフラグメント（配列番号３）および完全長ヒトカスパーゼ−６酵素（配列番号４）を同時トランスフェクトした。同時トランスフェクトされた細胞を、１０ｕＭのＰＧ３ｄ化合物、３ｕＭのＱ−ＶＤ−Ｏｐｈ汎カスパーゼ阻害剤に曝露させるか、または対照としてＤＭＳＯで処理した。細胞ライセートの一定分量をウエスタンブロッティングに供し、Ｈｔｔ抗体２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＨＴＴフラグメントを検出し、ＨＤ９１抗体を使用してカスパーゼ−６の存在を検出した（Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒら、ＨＭＧ、２０１４年、２３巻（３号）：７１７〜２９頁）。残った細胞ライセート（５００ｕｇのタンパク質）を、５ｕｇのカスパーゼ−６抗体により４Ｃにて１６時間免疫沈降させた。次いで、免疫沈降したタンパク質をアクリルアミドゲルに加え、免疫ブロットして、上記の抗体を使用してＨＴＴフラグメントまたは活性カスパーゼ６酵素の存在を検出した。
ＰＧ３化合物およびその類似体についての合成法。
【００９８】
表１に記載するように、３−フェニルプロパ−２−イナミド（１ａ）を、３−フェニルプロパ−２−イン酸エステルとアンモニア水溶液との反応によって、文献の手順に従って高収率で調製した（Ｓｔｒｕｅｂｉｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００５年）６１巻：１１３３３頁）。この手順に従って、対応するアリールプロピンアミド１ｂ〜ｅを、粗アリールプロピン酸エチルエステル（ａｒｙｌｐｒｏｐｙｎｏｉｃ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）のアンモノリシスによって良好な収率で得たが、これはエタノールによる対応するアリールプロピン酸のエステル化からもたらされた。
【表１−１】
2018522812.tif 000010
【表１−２】
2018522812.tif 000011
【００９９】
０〜５℃でのジエチルエーテル中の一置換されたマロニルクロリド（６ａ〜ｆ）または（クロロカルボニル）エチルケテン（７ａ、ｂ）による３−フェニルプロパ−２−イナミド（１ａ）の処理は、４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ａ〜ｆ）を６１〜８７％収率で送達した（表２および図１Ａにおいて示されるように）。
【０１００】
理論的に、複素環８（Ｒ１＝Ｃ≡ＣＰｈ）は、互変異性形態Ａ〜Ｃをとることができる（図１Ｂ）。同様の４−ヒドロキシ−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（Ｒ１＝アリール；Ｒ２＝Η、Ｍｅ）の質量スペクトルは、４−ヒドロキシ−６−オキサの存在を示したが、両性イオン性およびジオキソは気相中で混合物を形成する。ベンゼン環のパラ位における置換基の存在は、互変異性比に対して強い影響を有する。量子化学計算は、気相中で最も好ましい１，３−オキサジン互変異性体として構造Ａを明らかにした。テトラヒドロフランおよびジメチルスルホキシド−ｄ６に溶解して、これらの化合物は、互変異性体Ａとして主に存在する。（Ｓｔａｎｏｖｎｉｋら、Ａｄｖ．  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ  Ｃｈｅｍ（２００６年）６１巻：１頁；Ｚａｋｈｓら、Ｋｈｉｍ．  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌ．  Ｓｏｅｄｉｎ（１９９０年）５５２巻；Ｃｈｅｍ．  Ａｂｓｔｒ（１９９０年）１１３巻：２１１２４７頁；Ｚａｋｈａら、Ｋｈｉｍ  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌ（１９８７年）３８６巻：Ｃｈｅｍ．  Ａｂｓｔｒ．（１９８８年）１０８巻：５９３８頁）。４−ヒドロキシ−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（Ｒ１＝Ｂｎ、ＭｅおよびＲ２＝Ｐｈ）の場合、Ｓｈｅｉｂａｎｉらは、ＮＭＲ分光法によって、主要な互変異性体Ａと共に互変異性体Ｂを検出することができた。（Ｓｈｅｉｂａｎｉら、ＡＲＫＩＶＯＣ（２００５年）（ｘｖ巻）、８８頁）。
【０１０１】
本明細書において記載する４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ａ〜ｆ）の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、互変異性体Ａと一致するシグナルのみを示したが、これは８ｄの場合、Ｘ線結晶構造分析によって明白に立証することができた。
【０１０２】
調製した４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン８ａ〜ｆは、ジメチルスルホキシド溶液中で不安定であることが立証された。ジメチルスルホキシド−ｄ６溶液中で２４時間周囲温度にて保持してきた８ａ〜ｆの試料のＮＭＲスペクトルは、１，３−オキサジン−６−オン８ａ〜ｆについてのシグナルに加えて、加水分解生成物９ａ〜ｆに属するさらなる一式のシグナルを示した（図２）。８ｅの場合、中間体９ｅは、自発的脱カルボキシル化を起こして、イミド１０が最終生成物として得られた（図２）。イミド１０はまた、沸騰水による４−ヒドロキシ−５−フェニル−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｅ）の処理によって得た。単離したイミド１０のシグナルは、ジメチルスルホキシド−ｄ６溶液中に保持されてきた、８ｅのＮＭＲスペクトルにおけるさらなるシグナルと同一である。これらの結果によると、１，３−オキサジン−６−オン８ａ〜ｆは、ジメチルスルホキシド溶液中の微量の水によって加水分解されると結論付けることができる（図２）。
【表２】
2018522812.tif 000012
３−フェニルプロパ−２−イナミド（１ａ）
【０１０３】
文献の手順によって無色の結晶としてエチルフェニルプロピノエート（ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｎｏａｔｅ）（８．７１ｇ、８．２６ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）から調製；（Ｓｔｒｕｅｂｉｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００５年）６１巻：１１３３３頁）］収率：６．７０ｇ（９２％）；ｍｐ１００〜１０２℃。
【０１０４】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３８３および３１７９（ＮＨ２）、２２２３（Ｃ≡Ｃ）、１６５４ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１０５】
【化６】
2018522812.tif 000013
【０１０６】
【化７】
2018522812.tif 000014
【０１０７】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝１４５（６４）［Ｍ］＋、１２９（１００）［Ｍ−ＮＨ２］＋、７５（１３）、他のピークなし＞１０％。
【０１０８】
分析、Ｃ９Ｈ７ＮＯについての計算値：Ｃ、７４．４７；Ｈ、４．８６；Ｎ、９．６５。実測値：Ｃ、７４．５９；Ｈ、４．８４；Ｎ、９．５７。
３−アリールプロパ−２−イナミド（１ｂ〜ｅ）；一般手順
【０１０９】
対応するアリールプロピン酸（１５ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（６０ｍｍｏｌ）と共にＨ２ＳＯ４の存在下で５時間加熱還流させた。過剰なＥｔＯＨを減圧下で除去し、残渣をＨ２Ｏおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮し、エチル３−アリールプロパ−２−イノエートを油性残渣として得て、これをそれに続いて２５％ＮＨ３水溶液（６０ｍｍｏｌ）に溶解し、室温にて２４時間撹拌した。このように得られた固体生成物１ｂ〜ｄを濾別し、再結晶させた。
３−（２−クロロフェニル）プロパ−２−イナミド（１ｂ）（Ｍａｒｉｅｌｌａら、Ｃａｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ（１９６５年）４３巻：２４２６頁；Ｕｎａｎｇｓｔら、Ｊ．  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ  Ｃｈｅｍ．（１９７３年）１０巻：３９９頁）
【０１１０】
無色の結晶；収率：１．９４ｇ（７２％）；ｍｐ１２１〜１２２℃（ＥｔＯＨ−Ｈ２Ｏ、１：１）。
【０１１１】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３１８および３１６２（ＮＨ２）、２２２５（Ｃ≡Ｃ）、１６５５ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１１２】
【化８】
2018522812.tif 000015
【０１１３】
【化９】
2018522812.tif 000016
【０１１４】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝１８１／１７９（１３／４６）［Ｍ］＋、１６５／１６３（３４／１００）［Ｍ−ＮＨ２］＋、１３６（１０）、９９（１６）、７５（１３）、７４（１５）、他のピークなし＞１０％。
【０１１５】
分析、Ｃ９Ｈ６ＣｌＮＯについての計算値：Ｃ、６０．１９；Ｈ、３．３７；Ｃｌ、１９．７４；Ｎ、７．８０。実測値：Ｃ、６０．０７；Ｈ、３．３８；Ｃｌ、１９．７５；Ｎ、７．８７。
３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−イナミド（１ｃ）（Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｊ．  ＦＲ、１３０５３４０頁（１９６２年）；Ｃｈｅｍ  Ａｂｓｔｒ．（１９６３年）５８巻：４６５３８頁）
【０１１６】
無色の結晶；収率：２．１０ｇ（７８％）；ｍｐ１８６〜１８８℃（ＭｅＣＮ）。
【０１１７】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３９９および３１７２（ＮＨ２）、２２１８（Ｃ≡Ｃ）、１６５６ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１１８】
【化１０】
2018522812.tif 000017
【０１１９】
【化１１】
2018522812.tif 000018
【０１２０】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝１８１／１７９（１７／５３）［Ｍ］＋、１６５／１６３（３２／１００）［Ｍ−ＮＨ２］＋、９９（１５）、７５（１３）、他のピークなし＞１０％。
【０１２１】
分析、Ｃ９Ｈ６ＣｌＮＯについての計算値：Ｃ、６０．１９；Ｈ、３．３７；Ｃｌ、１９．７４；Ｎ、７．８０。実測値：Ｃ、６０．２９；Ｈ、３．３７；Ｃｌ、１９．６４；Ｎ、７．９２。
３−（４−ブロモフェニル）プロパ−２−イナミド（１ｄ）
【０１２２】
無色の結晶；収率：２．５５ｇ（７６％）；ｍｐ２０２〜２０４℃（セ氏温度）（ＭｅＣＮ）。
【０１２３】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３８６および３１７２（ＮＨ２）、２２１６（Ｃ≡Ｃ）、１６５５ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１２４】
【化１２】
2018522812.tif 000019
【０１２５】
【化１３】
2018522812.tif 000020
【０１２６】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２２５／２２３（６４／６５）［Ｍ］＋、２０９／２０７（９５／１００）［Ｍ−ＮＨ２］＋、１２８（２１）［Ｍ−ＮＨ２−Ｂｒ］＋、９９（１５）、７５（２９）、７４（５０）、他のピークなし＞１０％。
【０１２７】
分析、Ｃ９Ｈ６ＢｒＮＯについての計算値：Ｃ、４８．２５；Ｈ、２．７０；Ｂｒ、３５．６６；Ｎ、６．２５。実測値：Ｃ、４８．０４；Ｈ、２．８３；Ｎ、６．２４。
３−（４−ニトロフェニル）プロパ−２−イナミド（１ｅ）
【０１２８】
無色の結晶；収率：１．９１ｇ（６７％）；ｍｐ１９２〜１９４℃（セ氏温度）（ＭｅＣＮ）。
【０１２９】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４０６および３１５５（ＮＨ２）、２２２０（Ｃ≡Ｃ）、１６６２ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１３０】
【化１４】
2018522812.tif 000021
【０１３１】
【化１５】
2018522812.tif 000022
【０１３２】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝１９０（８４）［Ｍ］＋、１７４（１００）［Ｍ−ＮＨ２］＋、１２８（７０）［Ｍ−ＮＨ２−ＮＯ２］＋、１１６（２６）、１０１（１６）、１００（２８）、９８（１３）、８９（５０）、７７（１５）、７５（３０）、７４（５４）、６３（１９）、６２（２０）、５１（２３）、５０（２３）、他のピークなし＞１０％。
【０１３３】
分析、Ｃ９Ｈ６Ｎ２Ｏ３についての計算値：Ｃ、５６．８５；Ｈ、３．１８；Ｎ、１４．７３。実測値：Ｃ、５６．６４；Ｈ、３．２４；Ｎ、１４．５９。
一置換されたマロニルクロリド（６ａ〜ｆ）；一般手順
【０１３４】
一置換されたマロニルクロリド（６ａ〜ｆ）は、対応するマロン酸をＳＯＣｌ２と共に還流し、それに続く蒸留によって得た。フェニル−６ｅおよびベンジルマロニルクロリド６ｆの場合、対応する（クロロカルボニル）エチルケテン７ａ、ｂが副生成物として形成され、これは文献の報告と合致する。（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｏｒｇ  Ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｃｅｄ．  Ｉｎｔ．（１９７５年）７巻：１５５頁；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．  Ｂ．  Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（１９８２年）３７巻：２２２頁；Ｃｈｅｍ．  Ａｂｓｔｒ（１９８２年）９６巻：１９９６２４頁）。
２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ａ〜ｆ）；一般手順
【０１３５】
対応するマロニルクロリド［（クロロカルボニル）エチルケテン］６ａ〜ｆ（７ａ、ｂ）（３．１ｍｍｏｌ）を、撹拌した３−フェニルプロパ−２−イナミド（１ａ、０．４４ｇ、３ｍｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ（３０ｍＬ）溶液に室温で加えた。混合物を冷蔵庫中で１２〜１４時間冷却した。この時間の間に、固体が沈着し、これを濾別し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、乾燥させ、純粋な８ａ〜ｆを得た。
【０１３６】
生成物のさらなる部分について、濾液を減圧下室温にて蒸発させ、残りの残渣を再結晶させた（ＭｅＣＮ）。
４−ヒドロキシ−５−メチル−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ａ）（化合物ＰＧ−３ａとも称される）
【０１３７】
黄色がかった結晶；収率：０．３２ｇ（７４％）；ｍｐ１８４〜１８６℃。
【０１３８】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２１５（Ｃ≡Ｃ）、１７４７（Ｃ＝Ｏ）、１６３５ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１３９】
【化１６】
2018522812.tif 000023
【０１４０】
【化１７】
2018522812.tif 000024
【０１４１】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２２７（１４）［Ｍ］＋、１７１（２０）、１３０（１１）、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１２８（１２）、８３（１４）、７７（１３）［Ｐｈ］＋、７５（２９）、７４（１４）、７０（１２）、６３（１１）、他のピークなし＞１０％。
【０１４２】
分析、Ｃ１３Ｈ９ＮＯ３についての計算値：Ｃ、６８．７２；Ｈ、３．９９；Ｎ、６．１６。実測値；Ｃ、６８．７２；Ｈ、４．０１；Ｎ、６．２６。
５−エチル−４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｂ）（化合物ＰＧ−３ｂとも称される）
【０１４３】
黄色がかった結晶；収率：０．５１ｇ（７０％）；ｍｐ１７７〜１７８℃。
【０１４４】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２１（Ｃ≡Ｃ）、１７４４（Ｃ＝Ｏ）、１６３３ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１４５】
【化１８】
2018522812.tif 000025
【０１４６】
【化１９】
2018522812.tif 000026
【０１４７】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２４１（２８）［Ｍ］＋、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１２８（１９）、７５（１５）、５１（１０）、他のピークなし＞１０％。
【０１４８】
分析、Ｃ１４Ｈ１１ＮＯ３についての計算値：Ｃ、６９．７０；Ｈ、４．６０；Ｎ、５．８１。実測値；Ｃ、６９．４２；Ｈ、４．５３；Ｎ、５．８４。
４−ヒドロキシ−５−イソプロピル−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｃ）（化合物ＰＧ−３ｃとも称される）
【０１４９】
無色の結晶；収率：０．４７ｇ（６２％）；ｍｐ２０２〜２０３℃。
【０１５０】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２６（Ｃ≡Ｃ）、１７４４（Ｃ＝Ｏ）、１６２７ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１５１】
【化２０】
2018522812.tif 000027
【０１５２】
【化２１】
2018522812.tif 000028
【０１５３】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２５５（３５）［Ｍ］＋、２４０（５４）［Ｍ−ＣＨ３］＋、１７２（１１）、１３０（１０）、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１２８（２０）、７５（１１）、６９（１６）、他のピークなし＞１０％。
【０１５４】
分析、Ｃ１５Ｈ１３ＮＯ３についての計算値：Ｃ、７０．５８；Ｈ、５．１３；Ｎ、５．４９。実測値：Ｃ、７０．３８；Ｈ、５．３２；Ｎ、５．４３。
５−ブチル−４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｄ）（化合物ＰＧ−３とも称される）
【０１５５】
黄色い結晶；収率：０．５３ｇ（６５％）；ｍｐ１５７〜１５９℃。
【０１５６】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２２（Ｃ≡Ｃ）、１７４３（Ｃ＝Ｏ）、１６２８ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１５７】
【化２２】
2018522812.tif 000029
【０１５８】
【化２３】
2018522812.tif 000030
【０１５９】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２６９（１０）［Ｍ］＋、２２６（１８）［Ｍ−Ｃ３Ｈ７］＋、１６５（１４）、１３０（１０）、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１２８（２０）、他のピークなし＞１０％。
【０１６０】
分析、Ｃ１６Ｈ１５ＮＯ３についての計算値：Ｃ、７１．３６；Ｈ、５．６１；Ｎ、５．２０。実測値：Ｃ、７０．９７；Ｈ、５．４６；Ｎ、５．１４。
４−ヒドロキシ−５−フェニル−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｅ）（Ｋｏｍａｒｏｖら、Ｒｕｓｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｃｈｅｍ（２００５年）７５巻：７７０頁）（化合物ＰＧ−３ｅとも称される）
【０１６１】
黄色い結晶；収率：０．７６ｇ（８７％）；ｍｐ１８７〜１８９℃。
【０１６２】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２０（Ｃ≡Ｃ）、１７４７（Ｃ＝Ｏ）、１６２０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１６３】
【化２４】
2018522812.tif 000031
【０１６４】
【化２５】
2018522812.tif 000032
【０１６５】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２８９（３５）［Ｍ］＋、２１８（１４）、１９０（１２）、１７２（１２）、１３０（１０）、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１１８（１８）、８９（１６）、７７（１１）［Ｐｈ］＋、７５（１３）、５１（１０）［Ｃ４Ｈ３］＋、他のピークなし＞１０％。
【０１６６】
分析、Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ３についての計算値：Ｃ、７４．７３；Ｈ、３．８３；Ｎ、４．８４。実測値：Ｃ、７４．７９；Ｈ、４．０１；Ｎ、４．７５。
５−ベンジル−４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｆ）（ＰＧ−３ｄとも称される）
【０１６７】
黄色い結晶；収率：０．５５ｇ（６１％）；ｍｐ１７９〜１８１℃。
【０１６８】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２１（Ｃ≡Ｃ）、１７４６（Ｃ＝Ｏ）、１６２７ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１６９】
【化２６】
2018522812.tif 000033
【０１７０】
【化２７】
2018522812.tif 000034
【０１７１】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝３０２（５５）［Ｍ］＋、１７６（２８）、１５８（７４）、１３１（１５）、１３０（６５）、１２９（１００）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１２８（２０）、１０３（１２）、１０２（１５）、９１（２７）［ＰｈＣＨ２］＋、７７（２２）［Ｐｈ］＋、７５（１３）、５１（１２）［Ｃ４Ｈ３］＋、他のピークなし＞１０％。
【０１７２】
分析、Ｃ１９Ｈ１３ＮＯ３についての計算値：Ｃ、７５．２４；Ｈ、４．３２；Ｎ、４．６２。実測値：Ｃ、７５．２７；Ｈ、４．３２；Ｎ、４．６５。
２−［（４−クロロフェニル）エチニル］−４−ヒドロキシ−５−フェニル−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（ＰＧ−３ｇとも称される）
【０１７３】
黄色い結晶；収率：０．８７ｇ（９０％）；ｍｐ１８５〜１８７℃（セ氏温度）。
【０１７４】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２０（Ｃ≡Ｃ）、１７６７（Ｃ＝Ｏ）、１６２０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１７５】
【化２８】
2018522812.tif 000035
【０１７６】
【化２９】
2018522812.tif 000036
【０１７７】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝３２５／３２４／３２３（１５／９／４７）［Ｍ］＋、２５４／２５２（９／２２）、２２５（１０）、２２４（２２）、２０６（１６）、１６５／１６３（３２／１００）［４−Ｃｌ−Ｃ６Ｈ４Ｃ≡ＣＣＯ］＋、１１８（２８）、９９（１８）、９０（１７）、８９（２１）、７７（１２）［Ｐｈ］＋、他のピークなし＞１０％。
【０１７８】
分析、Ｃ１８Ｈ１０ＣｌＮＯ３についての計算値：Ｃ、６６．７８；Ｈ、３．１１；Ｎ、４．３３。実測値：Ｃ、６６．８９；Ｈ、３．１０；Ｎ、４．３９。
２−［（２−クロロフェニル）エチニル］−４−ヒドロキシ−５−メチル−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（ＰＧ−３ｆとも称される）
【０１７９】
黄色がかった結晶；収率：０．４６ｇ（５９％）；ｍｐ１７５〜１７８℃。
【０１８０】
ＩＲ（ＫＢｒ）：２２２５（Ｃ≡Ｃ）、１７４７（Ｃ＝Ｏ）、１６２７ｃｍ−１（Ｃ＝Ｎ）。
【０１８１】
【化３０】
2018522812.tif 000037
【０１８２】
【化３１】
2018522812.tif 000038
【０１８３】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２６３／２６２／２６１（９／４／２６）［Ｍ］＋。
【０１８４】
分析、Ｃ１３Ｈ８ＣｌＮＯ３についての計算値：Ｃ、５９．６７；Ｈ、３．０８；Ｎ、５．３５。
３−オキソ−３−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）アミノ］プロパン酸（９ａ〜ｆ）；一般手順
【０１８５】
化合物８ａ〜ｆのＤＭＳＯ−ｄ６溶液を室温にて２４時間保持した後、４−ヒドロキシ−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン８ａ〜ｆの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、対応する加水分解生成物９ａ〜ｄ、ｆおよび１０の新たなシグナルを示した（図２に示す）。
２−メチル−３−オキソ−３−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）アミノ］プロパン酸（９ａ）
【０１８６】
【化３２】
2018522812.tif 000039
【０１８７】
【化３３】
2018522812.tif 000040
２−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）カルバモイル］ブタン酸（９ｂ）
【０１８８】
【化３４】
2018522812.tif 000041
【０１８９】
【化３５】
2018522812.tif 000042
３−メチル−２−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）カルバモイル］ブタン酸（９ｃ）
【０１９０】
【化３６】
2018522812.tif 000043
【０１９１】
【化３７】
2018522812.tif 000044
２−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）カルバモイル］ブタン酸（９ｄ）
【０１９２】
【化３８】
2018522812.tif 000045
【０１９３】
【化３９】
2018522812.tif 000046
２−ベンジル−３−オキソ−３−［（３−フェニルプロパ−２−イノイル）アミノ］プロパン酸（９ｆ）
【０１９４】
【化４０】
2018522812.tif 000047
【０１９５】
【化４１】
2018522812.tif 000048
３−フェニル−Ｎ−（フェニルアセチル）プロパ−２−インアミド（１０）（化合物ＰＧ−３ｈとも称される）
【０１９６】
４−ヒドロキシ−５−フェニル−２−（フェニルエチニル）−６Ｈ−１，３−オキサジン−６−オン（８ｅ、０．３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２０ｍＬ）懸濁液を、８ｅの色が黄色から白色に変わるまで３０分間加熱還流させた。固体化合物１０を濾別し、再結晶させ（トルエン）、無色の結晶を得た。収率：７１ｍｇ（９０％）；ｍｐ１３２〜１３４℃。
【０１９７】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３２１９（ＮＨ）、２２１３（Ｃ≡Ｃ）、１７０５（Ｃ＝Ｏ）、１６８３ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１９８】
【化４２】
2018522812.tif 000049
【０１９９】
【化４３】
2018522812.tif 000050
【０２００】
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ（％）＝２６３（２６）［Ｍ］＋、１４７（１８）、２５１（１５）、１３０（１０）、１２９（９４）［ＰｈＣ≡ＣＣＯ］＋、１１８（１００）、１１７（１２）、１０５（１５）、９１（３０）［ＰｈＣＨ２］＋、９０（２２）、７５（１３）、６５（１１）、他のピークなし＞１０％。
【０２０１】
分析、Ｃ１７Ｈ１３ＮＯ２についての計算値：Ｃ、７７．５５；Ｈ、４．９８；Ｎ、５．３２。実測値：Ｃ、７７．４９；Ｈ、５．０７；Ｎ、５．２５。
【実施例】
【０２０２】
（実施例１）
ＦＲＥＴアッセイによって測定すると、ＰＧ３化合物はカスパーゼ−６を阻害する
図３は、ＦＲＥＴアッセイによって用量反応曲線において試験した化合物（ＰＧ３ａ〜ｈと称される）を示す。図４Ａ〜Ｃに示すように、増加する濃度のいくつかのＰＧ３類似体が存在することは、無細胞系において組換えカスパーゼ−６酵素の阻害の増加をもたらした。表３は、ＦＲＥＴアッセイによって測定した、カスパーゼ−６酵素の阻害についての計算したＩＣ５０値を示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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（実施例２）
ウエスタンブロットによって測定すると、ＰＧ３化合物は細胞内のカスパーゼ−６を阻害する。
【０２０３】
ＣＯＳ−７細胞に、４ｃ  ｈｔｔフラグメント、およびプロドメインを欠いているヒトカスパーゼ−６を同時トランスフェクトしたが、これはカスパーゼ−６酵素の速い自己活性化、および５８６ａａ  Ｈｔｔ切断フラグメントの生成をもたらす。図５Ｂに示すように、同時トランスフェクトされた細胞を、１０ｕｍのＰＧ−３ｄ化合物、３ｕＭのＱ−ＶＤ−Ｏｐｈ汎カスパーゼ阻害剤に曝露させるか、または未処理のままとした。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として含み、精製された５８６ａａ  Ｈｔｔフラグメントを陽性対照として含んだ。ＰＧ−３ｄ化合物に曝露された細胞は、５８６ＡＡフラグメントの生成の有意な低減を示す。図５Ｂの下のパネルにおいて示すように、細胞ライセートをまた、活性カスパーゼ６酵素のレベルについてアッセイした。ＰＧ−３ｄ化合物の存在は、活性酵素の量の減少をもたらしたが、これはまた汎カスパーゼ阻害剤の存在下で達成された。図５Ａは、ウエスタンブロットからのグラフ図を示すが、ＰＧ−３ｄの存在が５８６ａａフラグメントの産生の低減をもたらしたことを示した。
（実施例３）
ラミン切断によって測定すると、ＰＧ３化合物は細胞内のカスパーゼ−６を阻害する。
【０２０４】
ＰＧ３類似化合物をまた、培養細胞内のカスパーゼ−６を阻害するこれらの能力について試験した。ＨＥＫ２９３細胞に、プロドメインを欠いているヒトカスパーゼ６をトランスフェクトし、増加する濃度のＰＧ３類似体と共にインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、過剰な化合物を洗い流し、細胞を溶解し、切断されたラミンＡタンパク質の量をＭｅｓｏｓｃａｌｅ  ＥＬＩＳＡ方法によって定量化した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、ＰＧ３化合物のいくつかは、ラミンのカスパーゼ−６が媒介する切断を阻害する用量依存的な能力を示した。表４は、ＰＧ３類似体についてのカスパーゼ−６の細胞内の阻害についての計算したＩＣ５０値を示す。
【表４】
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（実施例４）
ラミン切断によって測定すると、ＰＧ３化合物はニューロンのカスパーゼ−６を阻害する。
【０２０５】
次に、ＰＧ−３ｄ化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロン系において神経細胞内のカスパーゼ−６を阻害することができるかどうかを決定したが、これは神経変性についての治療剤の試験のためにより関連性があり得る。手短に言えば、ＦＶＢ／Ｎマウスからの一次皮質ニューロン培養物を、１０ｕＭのＰＧ−３ｄ化合物の存在下または非存在下で、ＤＩＶ１０から開始して１０ｕＭのカンプトテシンで３０時間処理した。カンプトテシン処理は、カスパーゼ−６の活性化をもたらし、これを次いでラミンＡの切断によって定量化した。図７に示すように、ニューロン培地中のＰＧ３ｄ化合物の存在は、切断されたラミンの低減によって証明されるように、カスパーゼ−６活性のレベルを有意に低減させる。
（実施例５）
ＰＧ３化合物は、興奮毒性ストレスの間の神経細胞の生存率を改善させる。
【０２０６】
ＨＤ動物モデルにおいて、ｍＨＴＴを発現している神経細胞は興奮毒性ストレスに対して増加した脆弱性を有し（Ｇｒａｈａｍら、２００５年、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ｄｉｓ．２１巻：４４４〜４５５頁）、これがカスパーゼ６によって媒介し得る（Ｇｒａｈａｍら、２００６年、Ｃｅｌｌ、６巻（１３号）：１１７９〜１１９１頁およびＵｒｉｂｅら、ＨＭＧ、２０１２年；２１巻（９号）：１９５４〜６７頁）ことが従前に示されてきた。ＮＭＤＡが誘発する毒性および他の神経変性疾患の間のリンクは、Ｌｉｐｔｏｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００６年、５巻：１６０〜１７０頁によって論評されてきた。したがって、カスパーゼ−６酵素を阻害する神経細胞の能力によって興奮毒性ストレスの間に生存する神経細胞の能力に対するＰＧ−３ｄ化合物の存在の効果を調査した。図８に示すように、細胞培養培地におけるＰＧ−３ｄ化合物の存在は、ＮＭＤＡ（２５ｕＭまたは５０ｕＭ）に曝露された神経細胞における細胞生存率の有意な改善をもたらした。
（実施例６）
ＰＧ３ｄは、哺乳動物細胞においてカスパーゼ−６およびＨｔｔの間の相互作用を阻害する。
【０２０７】
Ｃｏｓ−７細胞をＨｔｔ１−１２１２ＡＡ（配列番号３）および完全長ヒトカスパーゼ−６（配列番号６）を同時トランスフェクトし、汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、ＰＧ３ｄ化合物または陰性対照としてＤＭＳＯに曝露させた。図９Ａの上のパネルにおいて示すように、ＤＭＳＯ単独を受けた対照細胞（ｎ．ｔ．と標識されたレーン）は、Ｈｔｔ１２１２ＡＡタンパク質、ならびに５８６、５５２および５１３アミノ酸フラグメントを含めたＨｔｔタンパク質分解的切断フラグメントの存在を示す。予想どおりに、汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処理した細胞は、Ｈｔｔ切断フラグメント、最も著しくはカスパーゼ３活性に由来する５１３ＡＡフラグメントの量の低減を示す。ＰＧ３ｄ化合物で処置された細胞は、カスパーゼ６活性に由来する５８６ＡＡフラグメントのレベルの低減を示す（図９Ａ、上のパネル）。
【０２０８】
図９Ｂは、カスパーゼ−６抗体による免疫沈降に続く結果を示す。予想どおりに、ＤＭＳＯ対照ライセートは、カスパーゼ−３切断によって生じる５１３ＡＡフラグメント、カスパーゼ−６切断によって生じる完全長１２１２ＡＡ  Ｈｔｔおよび５８６ＡＡフラグメントを含めた免疫複合体内の種々のＨｔｔフラグメントを明らかにする。細胞が汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処理されたとき、カスパーゼ−６と相互作用するＨｔｔ切断フラグメントの量は低減し、カスパーゼ−６は１２１２ＡＡ  Ｈｔｔと主に相互作用することは明らかである。１０ｕＭのＰＧ３ｄによる処理は、１２１２ＡＡ  Ｈｔｔおよびカスパーゼ−６の間の相互作用を有意に低減させ、これはまた、同時免疫沈降したＨｔｔタンパク分解フラグメントの量の低減をもたらす。これらの知見を図９Ｂにおける免疫ブロット結果の濃度測定分析によって分析したが、ＰＧ３ｄのその存在が、陰性対照ＤＭＳＯ処理された細胞またはＱ−ＶＤ−ＯＰｈペプチド阻害剤で処理された細胞と比較して、カスパーゼ−６抗体を使用して同時免疫沈降するＨｔｔ１２１２ＡＡの量の有意な低減をもたらすことが確認される。
【０２０９】
本明細書において開示および特許請求されている組成物および方法の全ては、本開示に鑑みて、過度の実験なしに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきた一方で、組成物および／または方法に対して、および本明細書に記載の方法のステップまたは一連のステップにおいて、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、バリエーションを適用し得ることは当業者には明らかである。さらに具体的には、同じまたは同様の結果を達成する一方で、化学的または生理学的に関連する特定の薬剤で、本明細書に記載されている薬剤を置換し得ることは明らかである。当業者には明らかな全てのこのような同様の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神、範囲および概念内であると見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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