(57)【要約】【課題】精子の運動性と生存性を増加させるリン脂質組成物を提供する。【解決手段】  生体外受精または人工受精の前に、リン脂質水溶液に精子を入れることによって、精子の運動性および卵母細胞の受胎が強化される。リン脂質水溶液は、精子の貯蔵または凍結保存の間に使用することもできる。また、産生または射精される精子の運動性および当該精子が置かれる環境は、雄性または雌性によるリン脂質組成物の摂取、またはリン脂質を含有する組成物の膣への配置により、強化することができる。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄性哺乳動物、雌性哺乳動物、または雄性および雌性両方の哺乳動物に、イヌリンおよびリン脂質混合物を含む組成物を送達することを含む、精子運動性を強化する方法。
【請求項２】
前記リン脂質混合物が、
ホスファチジルグリセロールと、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、
リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物を、以下ａ、ｂのいずれかの形態で送達することを特徴とする請求項１に記載の方法：
ａ．錠剤、カプセルまたは粉末であって、該粉末は食品に加えられ、飲料にブレンドされ、または咀嚼錠に圧縮される、
ｂ．０．１〜４％の膣クリーム、ゼリー、フォーム、ゲル、または滑沢剤または坐剤として提供される。
【請求項４】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
５〜１１％の他のリン脂質と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
イヌリンおよびリン脂質混合物を含む組成物を、哺乳類の雄、雌または雄雌両方に送達することを含む、精子細胞による雌性卵母細胞の受精の可能性を増加する方法。
【請求項６】
前記リン脂質混合物が、
ホスファチジルグリセロールと、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、
リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物を、以下ａ、ｂのいずれかの形態で送達することを特徴とする請求項５に記載の方法：
ａ．錠剤、カプセルまたは粉末であって、該粉末は食品に加えられ、飲料にブレンドされ、または咀嚼錠に圧縮される、
ｂ．０．１〜４％の膣クリーム、ゼリー、フォーム、ゲル、または滑沢剤または坐剤として提供される。
【請求項８】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
５〜１１％の他のリン脂質と、を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
イヌリンおよびリン脂質混合物を含む水溶液中に精子を沈着させることを含む、精子の運動性を増加する方法。
【請求項１０】
前記リン脂質混合物が、
ホスファチジルグリセロールと、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、
リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記イヌリンおよび前記リン脂質混合物が、０．１〜４％の水溶液を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
５〜１１％の他のリン脂質と、を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
イヌリンおよびリン脂質混合物の水溶液を含む精子運動性強化組成物。
【請求項１４】
アミノ酸、ビタミンおよび無機塩をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項１５】
前記リン脂質混合物が、
ホスファチジルグリセロールと、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、
リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項１３に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項１６】
抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項１７】
前記抗酸化剤が、ビタミンＣ、セレン、ビタミンＥ、Ｌカルニチン、ビタミンＡ、亜鉛およびブドウ種子エキスの１種以上を含むことを特徴とする請求項１６に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項１８】
前記イヌリンおよび前記リン脂質混合物が、０．１〜４％の水溶液を含むことを特徴とする請求項１３に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項１９】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
５〜１１％の他のリン脂質と、を含むことを特徴とする請求項１３に記載の精子運動性強化組成物。
【請求項２０】
イヌリンおよびリン脂質混合物を含む水性組成物中に精子細胞を置くことを含む、生体外で精子細胞により雌性卵母細胞の受精の可能性を増加する方法。
【請求項２１】
前記リン脂質混合物が、
ホスファチジルグリセロールと、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、
リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記イヌリンおよび前記リン脂質混合物が、０．１〜４％の水溶液を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／２４５，８６８号および２０１５年９月９日に出願された米国特許仮出願第６２／２１６，２６９号の両方の利益を主張しており、これらは、いずれも「精子の運動性および生存性強化のためのリン脂質組成物およびその使用」と題している。本出願は、また、２０１５年７月３１日に出願された米国特許出願第１４／８１５，８４１号の一部継続出願（以下「ＣＩＰ」という。）である。そして、当該米国特許出願第１４／８１５，８４１号は、さらに、２０１４年１月１０日に出願された米国特許出願第１４／１５２，９３８号（２０１５年８月４日に発行された米国特許第９，０９５，５０７号（以下「'５０７特許」という。））のＣＩＰであり、当該米国特許出願第１４／１５２，９３８号は、さらに、２０１１年８月１１日に出願された米国特許出願第１３／２０８，２５５号（２０１４年１１月４日に発行された米国特許第８，８７７，２３９号（以下「'２３９特許」という。））のＣＩＰである。これらの特許図面、チャート、回路図、図および関連する記載を含むその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、精子の運動性を維持または強化し、老化および精子の運動性を低下させうる環境要因への曝露の影響を打ち消し、子宮内または生体外におけるより好都合な環境を提供し、これにより、膣経由でのまたは生体外授精での卵母細胞の受精の可能性を増加させる方法に関する。また、本発明は、例えば、家畜の繁殖などにおける、ヒトおよび動物の授精のための哺乳類の精子の保存にも関する。
【背景技術】
【０００３】
精子の運動性は、卵母細胞の受精（すなわち、受胎）の成功のための決定的な要因である。精子の原形質膜の組成は、精子の運動性に影響を及ぼす要因の１つである。老化、酸化体への暴露、および膜脂質組成の変化の影響は、雄性稔性に影響する重要な要因である。精子膜脂質組成の変化は、運動性および受精の可能性の低下をもたらす重要な要因であることも示されている。膜脂質の過酸化もまた、成人期および個々の年齢の精子の健康に影響する重要な要因である。
【０００４】
精子細胞は、独自の構造および機能を有している。精子細胞は、その起源とは異なる体、すなわち女性の体内で生存可能であり、卵巣から放出された卵を受精させるために膣および子宮を通り抜けることができる。さらに、精子細胞の原形質膜は、他の大部分の細胞膜とは異なる脂質組成を有する。精子細胞の原形質膜は、多量の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、特にｄｉＰＵＦＡ（２つのＰＵＦＡでエステル化されたリン脂質）を含有する。ＰＵＦＡは、膜の流動性および柔軟性に寄与することが知られている。精子細胞の特定の膜脂質組成は、精子が卵母細胞を通り抜け、卵母細胞に浸透して融合するのに必要な、異なる流動性、膜融合性、および透過性の特性を有するミクロドメインの形成を促進する特定の精子機能にとって重要であることが見出されている。
【０００５】
リン脂質は、精子細胞膜の脂質画分の主要構成成分であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびスフィンゴミエリンを主成分とする。精子細胞の脂質および脂肪酸組成は、動物および種によって異なり、また、同じ種であっても受胎性の精子の数と低受胎性の精子の数によって異なる。したがって、非ヒト精子の生存能力に関する公表されたデータは、ヒト精子の能力または生存率に転用できない可能性がある。
【０００６】
凍結保存は、非ヒト精子の精子膜に影響し得ることが知られている。また、凍結および融解は脂質の変化をもたらし、さらに、精子頭部の原形質膜の領域ごとに凍結保存に対する反応が異なる。さらに、イノシシおよび雄牛の精液中の精子細胞が、生体外における培養の期間中に、周囲の環境から脂質成分または脂肪酸を取り込むための能力を調べる研究も行われている。
【０００７】
（Ｖａｓｑｕｅｚ  ａｎｄ  Ｒｏｌｄａｎ、１９９７）、さらにＢｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）は、イノシシの精液の凍結保存の成功と元の希釈液中における脂質と脂肪酸の混合物の存在との間の関連性を示唆している。ここでも、精子細胞の希釈液中に存在する脂質の特定の役割またはかかる資質と精子との間のやり取りが示される。このデータはまた、精子細胞が脂質の取り込みの役割を持つだけでなく、この取り込みが新鮮な精液の質に関連していることを示している。ホスホリパーゼ活性は、この脂質代謝に対して、全体的または部分的に媒介することがある（詳細については、Ｒｏｌｄａｎ，１９９８参照）。  Ｂｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）は、卵黄の存在下でのイノシシ精子の凍結保存中におけるリン脂質、特にホスファチジルコリンの含有量の増加を報告している。卵黄成分の正確な役割はまだ明らかにされていない。ホスファチジルコリン（レシチンとも呼ばれる）は、凍結中の保護成分として提案されている（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。これは、超微細構造的損傷を防ぎ、運動性および呼吸に資したからである（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。これとは対照的に、ホスファチジルコリンはイノシシの精子の損傷に効果がなく（Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）、−５８℃での低温ショックおよび貯蔵中の運動損失を防止しなかったことが研究によって示されている（Ｗａｔｓｏｎ，１９８１）。ホスファチジルセリンは、イノシシの保護剤としても提案されている（Ｂｕｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９７５；  Ｆｏｕｌｋｅｓ，１９７７）。卵黄のカチオン性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、特定の脂質、すなわち、タンパク質比が２．７であることを特徴とし、低温ショックに対する雄牛の精子の保護において最も有効であることが判明した。ＬＤＬ複合体のカチオン性タンパク質部分は、負に荷電した精子原形質膜に強く結合し、脂質部分は保護作用の原因となった」（Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。「Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｉｎ  Ｓｐｅｒｍ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｏａｒ  Ｓｅｍｅｎ」  Ｓ  Ｃｅｒｏｌｉｎｉ，  Ａ  Ｍａｌｄｊｉａｎ，  Ｆ  Ｐｉｚｚｉ，  ＴＭ  Ｇｌｉｏｚｚｉ  −  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  ２００１  −  Ｓｏｃ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．
【０００８】
精子細胞の凍結保存に関連する主要な問題は、凍結および凍結の結果としての生存率の喪失である。生存率の低下は、精子リン脂質過酸化によって誘発される膜漏出に関連している。
【０００９】
不妊症の問題は、受胎しようとする全てのカップルの約１５％に影響を及ぼしている男性の不妊症は、これらの症例の約半分に寄与する要因となっており、高濃度の酸化ストレスを引き起こす薬剤が、不妊症男性の３０〜８０％において確認されている。ビタミンサプリメントおよびアミノ酸の送達に関する研究によれば、特定の精子特性（カウント、形態、運動性）の向上が示されている。これらのビタミンＣ、セレン、ビタミンＥ、Ｌカルニチン、ビタミンＡ、亜鉛およびブドウ種子エキスのような抗酸化剤は、健康な精子数、精子の形態および精子の運動性を促進する一方、酸化ストレスを引き起こす薬剤、遊離基、または生物学的相互作用に起因する酸化損傷を軽減することが示されている。（Ｄａｗｓｏｎ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．アスコルビン酸が雄の受精能に及ぼす影響  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９８７；  ４９８：３１２−２３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＮＴ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（以下「ＮＴＦＬ」という。）は、米国特許第８，８７７，２３９号（'２３９特許）、米国特許第９，０９５，５０７号（'５０７特許）および米国特許出願第１４／８１５，８４１号に記載されているように、イヌリンおよび精製膜グリセロールリン脂質を含有する組成物であり、抗酸化療法および細胞膜修復のための強力な栄養素である。これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。'２３９特許は、人体または人体内の特定の臓器系における細胞およびミトコンドリアの健康を維持または回復させるため、または人体内の特定の疾患またはリン脂質欠乏症を治療するための、かかるリン脂質組成物の処方および送達を記載しており、当該組成物は、特に錠剤、カプセルまたは粉末の形態で、適当な担体媒体を含むリン脂質またはリン脂質前駆体の混合物を含む。'５０７特許および米国特許出願第１４／８１５，８４１号は、チュアブルウェハーまたは錠剤の形態のＮＴＦＬ組成物の送達を記載し、かつ、クレームしている。しかしながら、これらの特許は、本明細書で「ＮＴＦＬ」または「ＮＴ因子脂質」と呼ばれるリン脂質組成物が男性によって摂取されたときに、男性の生殖器官または精液内の環境を増強し、その男性によって産生される精子細胞の活性および運動性を向上させることを記載も示唆もしていない。また、これらの特許は、当該リン脂質組成物を女性が摂取したときに、女性の性器または子宮頸管粘液内の環境を増強し、その結果として精子を受け取り、精子の運動性を高めて、受胎の可能性を高めることを記載も示唆もしていない。さらに、これらの特許は、凍結保存において、体外受精において、または卵母細胞の受精をもたらすことを意図した正常な性的活動の前または間において使用される場合に、溶液中のＮＴＦＬリン脂質がより適切な受精環境および増強された精子運動性を提供することを記載も示唆もしていない。
【発明の効果】
【００１１】
本明細書では、健康人ドナーからの成熟精子を、ＮＴＦＬリン脂質を含む溶液により培養した結果を示す。出願人らは、精子のＮＴＦＬリン脂質への曝露は、曝露された精子への損傷を低減および／または逆転させ、特に、最も可動性の高い精子における精子運動性を増加させ、結果として卵子受精の可能性を増加させることを見出した。動物精子の保存に関するデータは、ヒトに直接的に適用可能ではないかもしれないが、ヒトのデータは、動物育種における人工授精に使用される家畜からの精子の保存に関連すると言われており、同様の利益が見出されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図１は、精子運動性の要素を示す。
【００１３】
図２は、ヒト精子の運動性のグラフ表示である。
【００１４】
図３Ａおよび図３Ｂは、管理精子サンプルの精子速度特性（図３Ａ）を３時間１％濃度ＮＴＦＬ曝露した後の同じ精子サンプルの精子速度特性（図３Ｂ）と比較する２つの円グラフを含む。
【００１５】
図４Ａおよび図４Ｂは、管理精子サンプル（図４Ａ）を１％ＮＴＦＬ処置精子（図４Ｂ）と比較する２つの３軸棒グラフを含む。
【００１６】
図５は、管理サンプルおよび１％ＮＴＦＬ溶液中での培養後（１％ＮＴＦＬ）の両方における精子の横方向頭部変位の平均振幅およびビートクロス頻度を比較する表である。
【００１７】
図６は、管理サンプルおよび１％ＮＴＦＬ溶液中での培養後（１％ＮＴＦＬ）の両方における精子頭部面積（μ２）を比較する表である。
【００１８】
図７は、管理サンプルにおける精子頭部サイズの正規分布を１％ＮＴＦＬで培養したサンプル（１％ＮＴＦＬ）と比較したグラフである。
【００１９】
図８は、約２％までのＮＴＦＬ濃度の関数としての精子頭部面積の増加を示す半対数グラフである。
【００２０】
図９Ａおよび図９Ｂは、精子の遠心分離したサンプルに対する０．１ＮＴＦＬ溶液の効果を示す、円グラフ（図９Ａ）および３次元棒グラフ（図９Ｂ）である。
【００２１】
図１０は、０．１％ＮＴＦＬに曝露した後の遠心分離した精子サンプルの精子速度特性を示す表である。
【００２２】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、全般的な運動性および最も速い精子細胞の運動性に関する用量反応曲線を示すグラフである。
【００２３】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、精子運動性に対する低温の効果を示す円グラフである。
【００２４】
図１２Ｃおよび図１２Ｄは、精子運動性に対する低温の効果を示す３次元棒グラフである。
【００２５】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、精子の運動性に対する酸化の影響を示す円グラフである。
【００２６】
図１３Ｃおよび図１３Ｄは、精子の運動性に対する酸化の効果を示す３次元棒グラフである。
【００２７】
図１４Ａは、０．３％ＮＴＦＬが、低温への暴露によって引き起こされる運動性の低下を改善することを示す円グラフである。
【００２８】
図１４Ｂは、０．３％ＮＴＦＬが、酸化への暴露によって引き起こされる運動性の低下を改善することを示す円グラフである。
【００２９】
図１４Ｃは、０．３％ＮＴＦＬへの暴露が、低温への暴露によって引き起こされる運動性の低下を改善することを示す３次元棒グラフである。
【００３０】
図１４Ｄは、０．３％ＮＴＦＬへの暴露が、過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）への暴露によって引き起こされる運動性の低下を改善することを示す３次元棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ＮＴＦＬは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，８８７，２５９号として発行された米国特許出願第１３／２０８，２５５号に記載されるリン脂質組成物である。当該リン脂質組成物は、イヌリンと、ホスファチジルグリセロールを含むリン脂質と、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１つ以上のリン脂質と、リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含んでいる。好ましい実施形態において、ＮＴＦＬリン脂質成分は、１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、３．５〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）、１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、１０〜２０％の糖脂質、および５〜１１％の他のリン脂質を含む。本明細書に係る研究では、この組成物をイヌリンとともに使用した。別の好ましい組成物では、約２５％〜約２９％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、約６８％〜約７２％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、約５％までのホスファチジルエタノラミン（ＰＥ）、および約１％〜約５％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）を含むことができる。
【００３２】
生体外における精子運動性を強化するリン脂質を含有するＮＴＦＬ組成物の水溶液の能力および体内のミトコンドリアの健康および機能を改善するために摂取したＮＴＦＬリン脂質組成物の能力に関して収集されたデータに基づいて、該ＮＴＦＬ組成物を男性に投与して当該男性の精液に強化されたリン脂質環境を作り、または、該ＮＴＦＬ組成物を女性に投与して当該女性の膣液または子宮頸管粘液中に強化されたリン脂質環境を作り出すことによって、精子の運動性を強化することができる。ＮＴＦＬ組成物は、米国特許第８，８７７，２３９号に記載されているように、錠剤、カプセルまたは粉末の形態で送達することができる。一実施形態では、粉末ＮＴＦＬは、食品中に組み込まれてもよく、または適切な液体にブレンドされ、冷たいまたは加熱されてもよい飲料として消費されてもよい。代替的には、上述した米国特許出願第１４／８１５，８４１号および米国特許第９，０９５，５０７号、またはそれらの分割出願またはＣＩＰに記載のとおり、ＮＴＦＬ粉末は、例えば錠剤プレスでの圧縮によって、食用のウエハーまたは錠剤に形成されてもよい。さらなる実施形態では、リン脂質混合物は、以下に記載されるように、性交前または直後に送達される膣座薬または膣潤滑剤、クリーム、ゼリー、フォームまたはゲルに含まれていてもよい。さらに、リン脂質を含有するＮＴＦＬ組成物は、人工授精および体外受精のためのヒトおよび動物からの生きた精子の採取、貯蔵および保存（凍結保存を含む）のための溶液中の有益な添加物でもある。これらのビタミンＣ、セレン、ビタミンＥ、Ｌカルニチン、ビタミンＡ、亜鉛およびグレープシード抽出物のような１種または複数の抗酸化剤をＮＴＦＬリン脂質組成物に添加することは、ＮＴＦＬの使用によって実証される精子運動性の増加をさらに強化する上で有益である。
【００３３】
以下に、精子の運動性に対するＮＴＦＬリン脂質組成物の有益な効果の評価を記載する。増加した精子の運動性、他のすべての要因が一定のままであれば、生体内であっても生体外であっても、卵子が精子によって浸透される可能性が高まり、卵子受精の可能性が高まる。
【００３４】
（比較試験）
不妊症の症状がない健康な２０歳から５１歳までの男性協力者が精子サンプルを寄贈した（ｎ＝１２）。スイムアップ法を用いてサンプルを処理して生存可能な精子を得た。次いで、以下に記載する比較評価のために、生存可能な精子の複数の比較可能な部分を採取した。
【００３５】
精子サンプルをＨａｍＦ１０（表１）の管理溶液および異なる濃度（０．１〜３％ｇ／ｍｌ）のＮＴＦＬを含有するＨａｍＦ１０に入れ、５％ＣＯ２雰囲気を含む培養器中で１〜４時間培養した。精子頭部面積とＮＴＦＬ％との間の相関に基づいて、少なくとも約２時間の培養でＮＴＦＬグリセロールリン脂質が精子膜に取り込まれることが見出された。培養後、サンプルを低速（１０ｃｍの遠心で約５００−１０００ＲＰＭ、好ましくは８００ＲＰＭ）で遠心分離し、後にコンピュータ支援精子分析（ＣＡＳＡ）で検査するためにＬｅｊａ  Ｃｈａｍｂｅｒで観察した（Ｈｉｒａｎｏ  Ｙ，  Ｓｈｉｂａｈａｒａ  Ｈ，  Ｏｂａｒａ  Ｈ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．「Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ：  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｐｅｒｍ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  Ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｓｐｅｒｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＣＡＳＡ）  Ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ」  Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ  （２００１）；  １８：  ２１５−２２０）。  ３７℃で１０回の処理の平均を評価した（ＳＣＡ、Ｍｉｃｒｏｐｔｉｃｓ）。他のサンプルは低温（２４℃または３０℃）で処理して温度などのストレス条件下でＮＴＦＬの効果を試験した。化学酸化ストレス剤としてＨ２Ｏ２を用いて３７℃で培養したサンプルでも同じ手順を実行した。
【表１】
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【００３６】
図１は、精子運動性の要素を示す：
●ＶＣＬ  −  曲線速度  ―  進行方向の軌道における精子の速度
●ＶＳＬ  −  進行性速度  −  進行のための軸直線における精子の速度
●ＶＡＰ  −  平均速度  −  平均精子進行軌道において測定された速度
速度はすべて、μＭ／秒の単位で測定される。
●ＬＩＮ  −  直進性  −  軸直線速度と曲線軌道速度の比（ＳＴＲ／ＶＣＬ）
●ＳＴＲ  −  直線性  −  直線と平均軌道速度の比（ＶＳＬ／ＶＡＰ）
●ＷＯＢ  −  振動指数  −  振動空間平均経路に関する軌道の数。
これらの指標は、％で表現される。
●ＡＬＨ  −  平均軸直線からの頭部の横方向変位の振幅（μＭ）
●ＢＣＦ  −  ビートクロス頻度  −  精子が１秒間に平均軸直線を横切る回数（Ｈｚ）
図１は、ヒトの精子の運動性および速度（通常、μＭ／秒の単位で測定される）の特徴を示している。実線の曲線（ＶＣＬ）は単一の運動性精子細胞の実際の曲線速度またはトラックを表し、破線曲線は多くの精子細胞の平均速度（ＶＡＰ）を表す。移動は、平均軸直線からの精子頭部の横方向運動または変位の振幅（ＡＬＨ）と、進行性（順方向または直線）運動（ＶＳＬ）からなる。移動の直線性（ＳＴＲ）はＶＳＬ／ＶＡＰｘ１００と定義することができる。当図は、妊娠に関連する精子研究に関するＷＨＯマニュアルに示されている全ての運動性パラメータを示している。
【００３７】
図２は、３つの分類、すなわち、低速、中速および迅速に分類された典型的な収集サンプル（「モバイル」として識別される）における精子運動性の分布および各分類における曲線速度（ＶＣＬ）および平均速度（ＶＰＡ）の分布を示すグラフ表示である。
【００３８】
また、これらの運動性の違いについては、ＷＨＯ検査機関マニュアル「ヒト精液の検査と処理（第５版）」（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２０１０）で説明されている。当マニュアルによれば、精子の運動性を議論する際には、全運動性（ＰＲ＋ＮＰ）または進行運動性（ＰＲ）を特定することが重要である。進行性または非進行性の運動性を有する精子と不動精子とを区別し運動性を格付けするための単純なシステムが推奨される。各精子の運動性は次のように格付けされる。
ａ：進行運動性（ＰＲ）：スピードに関係なく、直線的にまたは大きな円で活発に動く精子。  
ｂ：非進行運動性（ＮＰ）：進行のない他の全ての運動パターン。例えば、小さな円で泳ぐ、鞭毛の力が頭をほとんど動かさない、または鞭毛の鼓動のみが観察される場合が該当する。  
ｃ：不動性（ＩＭ）：動きなし。
このマニュアルの前の版では、進行運動性精子は迅速または定速に分類されるべきであり、３７℃で２５μＭ／秒超の速度の精子を「格付けａ」精子と定義すべきであることが推奨されている。しかし、技術者が偏見なく順方向進行を正確に定義することは困難である（Ｃｏｏｐｅｒ＆Ｙｅｕｎｇ、２００６）。
【００３９】
図２は、典型的な実験および平均運動性（すべての運動性または可動性の精子）および精子の運動性をいくつかの速度カテゴリー、具体的には低速、中速および高速運動性精子に分けた精子運動性の様々なパラメータの分析から得られたデータを示す。
【００４０】
図３の円グラフは、進行運動性を、高速精子、中速精子、低速精子および非進行運動性精子、不動性（静的）精子のパーセンテージで示している。遅い進行運動性の精子は、低速精子または中速精子として表されている。図３Ａおよび３Ｂは、管理精子サンプル（図３Ａ）を１％のＮＴＦＬ濃度に３時間曝露した後の同じ精子サンプル（図３Ｂ）と比較した精子活性の分布を示す。このデータは精子運動性の有意な改善を示すが、これは、ＮＴＦＬミセルの精子との衝突の結果としてＮＴＦＬミセルが精子の運動性を妨げない低いＮＴＦＬ濃度でのみ見られる。例えば、０．０１〜０．３％、特に０．１〜０．３％の濃度で、超音波処理されたマイクロ乳化ＮＴＦＬサンプルの精子の運動性は増加した。これは、精子が短時間の遠心分離によってＮＴＦＬミセルから分離された、より高いＮＴＦＬ濃度（１％）の精子サンプルにおいても見られた。換言すれば、１％ＮＴＦＬのサンプルでは精子の運動性が実際に有意に増加したが、ＮＴＦＬミセルと精子との衝突のためにその増加を適切に測定できなかった。
【００４１】
図４Ａおよび４Ｂは、図３Ａおよび３Ｂにおけるように、同じ管理精子サンプルを１％ＮＴＦＬ処置した精子と比較する３つの軸棒グラフである。ＮＴＦＬ濃度が１％近くになると、ミセルの衝突および運動性の干渉のために、サンプル中の精子全体の速度が低下した。チャートの右の列の棒は、比較的大きな脂質ミセルとの衝突に関与する可動性があり迅速に動く精子を示す。しかし、運動性精子は、１８±４％の速度（ＶＣＬ、ＶＳＬ、ＶＡＰ、ＬＩＮ、ＳＴＲ、ＷＯＢ）の平均増加を示した（ｐ＜０．０５独立ｔ検定）。
【００４２】
図５は、管理溶液中および１％ＮＴＦＬ溶液中で培養後の両方における精子の横方向頭部変位の平均振幅（ＡＬＨ）およびビートクロス頻度（ＢＣＦ）を比較する表である。ＮＴＦＬリン脂質の存在は、精子サンプルにおける受精能予測に重要なＡＬＨおよびＢＣＦを増加させる。妊娠中の浸透の強さを示す鞭毛活動、特にＢＣＦに関連するこれらのパラメータもまた、ほぼ同じ量および同じ有意水準で増加した。
【００４３】
ＮＴＦＬ組成物が精子膜に組み込まれるかどうかを試験するために、精子頭部領域の変化を測定した。図６は、管理サンプルおよび１％ＮＴＦＬリン脂質溶液中での培養後（１％ＮＴＦＬ）の両方における精子頭部面積（μ２）を比較する表である。精子頭部速度の統計的に有意な増加が、サンプル中のＮＴＦＬ培養精子細胞のすべてにおいて起こることが見出され、ＮＴＦＬを各精子細胞に取り込むことの有意性を示している。あるいは、ＮＴＦＬ０．０２％溶液中の１２３ローダミン染色管理精子サンプルと染色された精子サンプルとを比較すると、３００μＭのＨ２Ｏ２に暴露した場合でさえ、同じ濃度で播種した精子の共焦点場における細胞質液滴の有意な増加を示したことが見出された（１２％から７２％への増加、ｐ＜０．０５）。１２３ローダミンは、精子細胞の中央部、頚部、および下位頚部のほとんどのミトコンドリア膜および原形質膜領域を染色する。Ｘｕ、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、細胞質液滴の存在が健康で運動性を有する精子を示すことを指摘している（Ｈｕｉ  Ｘｕ、Ｓｈｕｉ−Ｑｉａｏ  Ｙｕａｎ、Ｚｈｉ−Ｈｏｎｇ  Ｚｈｅｎｇ、Ｗｅｉ  Ｙａｎ、"Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍａｙ  Ｂｅ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｓｐｅｒｍ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉｓ"Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ（２０１３年１１月）、１５（６）：７９９−８０５）。
【００４４】
図７は、管理サンプル溶液中の精子頭部面積の値の分布を、１％ＮＴＦＬ溶液中で培養した同等の精子サンプルと比較したグラフである。管理サンプルにおける平均１６μｍからＮＴＦＬ溶液中の平均１９μｍまでの精子頭部の有意な増加（ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）およびＮＴＦＬ溶液における精子頭部面積の値のより大きな分布は、ＮＴＦＬが精子頭部に取り込まれることを示している。
【００４５】
図８は、濃度が増加するにつれて精子頭部面積が増加することを示す、溶液中の約２％までの濃度のＮＴＦＬ溶液濃度の関数としての精子頭部面積の増加を示すグラフ（半対数）である。
【００４６】
図９Ａおよび図９Ｂは、精子の遠心分離したサンプルに対する０．１ＮＴＦＬ溶液の効果を示す、円グラフ（図９Ａ）および３次元棒グラフ（図９Ｂ）である。ＮＴＦＬが精子頭部に取り込まれているとの認識のもと、精子を脂質ミセルから分離させるために遠心分離を施した精子サンプルを用意することによって、ミセルの存在に起因する干渉は減少した。より低いＮＴＦＬ濃度では、すべての精子の速度が増加することが見出された。低速遠心分離による脂質ミセルからの精子細胞の分離は、少量のＮＴＦＬの存在によっても精子細胞の運動性を向上させた。さらに、ＮＴＦＬの超音波処理およびマイクロ乳化は、ＮＴＦＬ濃度０．０１〜０．３％で有意に改善した。
【００４７】
図１０は、０．１％ＮＴＦＬに曝露した後の遠心分離した精子サンプルの精子速度特性を示す表である。遠心分離は管理サンプルの特性を向上させたが、ＡＬＨおよびＢＣＦは、遠心分離した精子サンプルを０．１％ＮＴＦＬに暴露することにより、さらに上昇した。
これにより、ＮＴＦＬへの暴露は、これらの濃度において、受精率および精子の健全性の向上につながる過活動状態を促進（ＢＣＦの上昇）する有用性を示した。この効果は最も速い精子でさらに顕著であり、ＮＴＦＬの存在はすべての精子を改善するが、卵子授精を引き起こすための最良の精子である最も速い精子においてさらに効果的であることを意味する。
【００４８】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、全般的な運動性および最も速い精子細胞の運動性における用量反応曲線を示す。両方の速度は遠心分離により増加する。しかしながら、濃度が１％に近づくと、ミセル干渉のために運動性が低下する傾向があり、鞭毛が適切に機能するには精子頭部が重すぎると考えられる。その効果は、より顕著であり、全運動性精子と比較して最も速い精子について約０．５％のＩＣ５０（半数阻害濃度）を有する。細胞が分離したとき脂質ミセルから低速遠心分離によって、ＮＴＦＬ濃度の増加に伴う精子細胞の運動性の向上は、全般的運動性（図１１Ａ）および最速運動性（図１１Ｂ）のいずれにおいても明白であった。  
【００４９】
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃおよび図１３Ｄは、低温または酸化のそれぞれが精子運動性に及ぼす影響を示す。過酸化水素による酸化ストレスや体温低下などの物理的手段によるストレスの増加は、精子の運動性を低下させ、このため全ての精子速度は低下した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。また、静的または非可動性の精子の割合が増加した。
【００５０】
図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃおよび図１４Ｄは、ＮＴＦＬが、低温への曝露または過酸化水素水Ｈ２Ｏ２への曝露によって引き起こされる運動性の低下を緩和し、また、ＮＴＦＬが、男性不妊の主な原因である酸化損傷から精子を保護する有効な薬剤であることを示している。
【００５１】
図面に記載され、上記のとおり議論されたデータに基づいて、健常ドナーから得られた精液中の活性精子の運動性および能力は、ＮＴＦＬへの曝露によって改善されると結論付けられる。精子との衝突を引き起こす大きなＮＴＦＬミセルを除去するための遠心分離がなければ、１％近くの濃度のＮＴＦＬを使用する利点は容易に見られないが、１％未満のＮＴＦＬ濃度への精子の曝露は現実的かつ再現性があることが示された。ＮＴＦＬに曝露された場合、精子速度パラメータ（ＶＣＬ、ＶＳＬ、ＶＡＰ、ＬＩＮ、ＳＴＲ、ＷＯＢ）の平均増加は１８．４％であった。受精中に卵子に浸透する能力の指標である鞭毛活性に関連する精子運動性パラメータ（ＡＬＨおよびＢＣＦ）も、ほぼ同程度に増加した。
【００５２】
ＮＴＦＬが精子膜に取り込まれたことは、ＮＴＦＬによる培養中における精子頭部サイズの増加（精子頭部膜面積の増加）により確認することができる。ＮＴＦＬ濃度に伴い、精子頭部の平均サイズは、１６μＭから１９μＭに増加した。精子細胞を低速（約５００−１０００ＲＰＭ）遠心分離によって脂質ミセルから分離すると、精子細胞の運動性の向上は、全精子集団においてより明白であった。
【００５３】
全般的運動性の効果を表す用量反応曲線は、０．１％〜０．３％のＮＴＦＬへの曝露による運動性の増加とともに、約０．５％のＩＣ５０（半数阻害濃度）を示した。低温または酸化（過酸化水素）曝露によって生じるストレス下でさえ、０．１％ＮＴＦＬ溶液に曝露された精子について得られたスイムアップ結果は全般的運動性および速度を維持しており、また、鞭毛の評価は、受精に主に関与する精子集団を含む高運動性精子の約２０％の増加を示している。
【００５４】
ＮＴＦＬ組成物を含む溶液に曝露されるか、またはＮＴＦＬ組成物を含有する溶液中に保存されるヒト精子は、物理的または酸化的ストレスによる損傷に対する精子機能性を保護するのに有効である。当該ＮＴＦＬ組成物は、イヌリンと、正常な精子細胞膜リン脂質組成物を維持または強化するように選択された膜グリセロールリン脂質と、の特定の組み合わせである。好ましいＮＴＦＬ組成物は、イヌリンとリン脂質混合物を含み、当該リン脂質混合物は、ホスファチジルグリセロールと、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される１種以上のリン脂質と、リノール酸（ＬＡ）およびホスファチジン酸の少なくとも一方と、を含む。より好ましい実施形態では、ＮＴＦＬリン脂質成分は、１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、３．５〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）、１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、１０〜２０％の糖脂質、および５〜１１％の他のリン脂質を含む。あるいは、リン脂質の好ましい組成物混合物は、約２５％〜約２９％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、約６８％〜約７２％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、および約５％までのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含み、あるいは、さらに約１％〜約５％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）を含んでもよい。
【００５５】
従って、グリセロールリン脂質を含むＮＴＦＬ組成物の摂取は、体内の細胞膜へのグリセロールリン脂質の拡散および取り込みをもたらすことが示されているので、リン脂質を含むＮＴＦＬ組成物の男性による摂取は、ＮＴＦＬリン脂質を精子細胞に導入し、体内で精子が産生されて貯蔵される環境で精液中の精子の運動性を高める。
【００５６】
さらに、それに基づいて、男性における精子の発達、産生（精子形成）、貯蔵または成熟の期間におけるＮＴＦＬ組成物への精子の曝露は、精子の質および運動性、特に受精に関与する可能性が最も高く、最も活発で運動性を有する一部の精子の質および運動性を増加させると結論づけられる。したがって、男性の精子運動性の低下により不妊症であると考えられる場合、または老化、酸化ストレス、周囲温度の変化または悪化した炎症またはその他の状態のような物理的状態の結果として精子の運動性を損なう場合でも、リン脂質を含むＮＴＦＬ組成物は、精液の質を高め、射精された精子の運動性を高めると期待されている。
【００５７】
ある期間にわたって男性にリン脂質を含むＮＴＦＬ組成物を投与することは、その個体によって産生される精子の質の改善をもたらすと予想される。ある期間にわたって女性にリン脂質を含むＮＴＦＬ組成物を投与すると、同様に、精子が置かれる環境が強化され、女性の産卵も増加し、これにより受胎の可能性が増す。したがって、男性および女性の両方によるＮＴＦＬ組成物の使用は、受胎能力および成功裏な妊娠の可能性をさらに強化する。かかる結果は、特にウシにおける人工的手段による家畜繁殖にも適用できると考えられる。
【００５８】
さらに、例えば、座薬を含むＮＴＦＬを使用して、ＮＴＦＬ組成物を女性に摂取または他の形態で送達することは、性交または人工授精の前に膣内にＮＴＦＬの溶液を置くことによって、続いて膣に導入される精子の運動性が向上する。
【００５９】
例えば、ノノキシノール−９または他の殺精子剤を膣殺精子クリーム、ゼリー、フォーム、ゲルおよび座薬中のＮＴＦＬで置換することによって、またはＮＴＦＬを膣潤滑剤に添加することにより、妊娠可能な膣内で送達可能なＮＴＦＬ組成物を形成することができる。
【００６０】
ＮＴＦＬをある期間にわたって男性に投与すると、その個体によって産生される精子の質が改善され、ある期間にわたって女性にＮＴＦＬを投与すると、同様に精子が置かれる環境が増強され、また増加し得る妊娠の可能性を高め、男性と女性の両方によるＮＴＦＬ組成物の使用は、精子受精および卵母細胞の可能性をさらに強化するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年5月9日(2018.5.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項２３】
前記リン脂質混合物が、
１９〜２９％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と、
１５〜２５％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と、
３．５％〜１０％のホスファチジン酸（ＰＡ）と、
１０〜１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と、
２〜１０％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と、
１０〜２０％の糖脂質と、
５〜１１％の他のリン脂質と、を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【国際調査報告】
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