(57)【要約】オリゴヌクレオチド、ペプチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、本明細書に提供される。また、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、ペプチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療する方法が、本明細書に提供される。本明細書に記載されるペプチドは、これの対応するペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートに毒性の低下を付与し、オリゴヌクレオチドの活性を向上させ、薬物動態及び組織内分布を改善し、細胞デリバリーを改善し、信頼でき、制御可能なｉｎ  ｖｉｖｏ分布を付与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１１４】
2018521970.tif 000122
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩であって、
式中、Ａ’が、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１１５】
2018521970.tif 000123
から選択され、
式中、Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが、３〜１０であり、それぞれのアルキル基が、出現ごとに独立してＣ２−６−アルキルであり、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）Ｒ６、−（Ｃ１−６ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化１１６】
2018521970.tif 000124
から選択され；
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択され、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、固体支持体に共有結合され；
それぞれのＲ１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から独立して選択され、式中、それぞれのＲ３及びＲ４が、出現ごとに独立して−Ｃ１−６アルキルであり；
それぞれのＲ２が、Ｈ、核酸塩基、及び化学的保護基で官能化された核酸塩基から独立して選択され、式中、前記核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６複素環式環を含み；
ｚが、８〜４０であり；
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化１１７】
2018521970.tif 000125
から選択され、
式中、Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、
Ｒ１１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から選択され、式中、Ｌが、アミド結合によってＪのカルボキシ末端に共有結合され、Ｌが、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、及び
【化１１８】
2018521970.tif 000126
から選択され；
ｔが、４〜９であり；
それぞれのＪが、出現ごとに独立して構造
【化１１９】
2018521970.tif 000127
のアミノ酸から選択され、式中、ｒ及びｑそれぞれが、独立して０、１、２、３、または４であり；それぞれのＲ９が、出現ごとに独立してＨ、アミノ酸側鎖、及び化学的保護基で官能化されたアミノ酸側鎖から選択され、式中、Ｒ９の２個以上のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立して硫黄を含み、式中、２個の前記硫黄原子が、これらが結合される原子とともに、構造
【化１２０】
2018521970.tif 000128
を形成し；式中、ｄが、０または１であり、Ｍが、
【化１２１】
2018521970.tif 000129
【化１２２】
2018521970.tif 000130
から選択され、
式中、それぞれのＲ１０が、出現ごとに独立してＨまたはハロゲンであり；Ｇが、Ｊのアミノ末端に共有結合され、Ｇが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、式中、以下の条件の少なくとも１つが、真である：
１）Ａ’が、
【化１２３】
2018521970.tif 000131
である；２）Ｅ’が、
【化１２４】
2018521970.tif 000132
である；または３）Ｅ’が、
【化１２５】
2018521970.tif 000133
である、前記式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２】
式中、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化１２６】
2018521970.tif 000134
から選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項３】
式中、Ａ’が、
【化１２７】
2018521970.tif 000135
である、またはＥ’が、
【化１２８】
2018521970.tif 000136
である、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項４】
式中、Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１２９】
2018521970.tif 000137
から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項５】
式中、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、及び
【化１３０】
2018521970.tif 000138
から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項６】
式中、Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１３１】
2018521970.tif 000139
から選択され；Ｅ’が、
【化１３２】
2018521970.tif 000140
である、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項７】
式中、Ａ’が、
【化１３３】
2018521970.tif 000141
あり、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項８】
式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、
【化１３４】
2018521970.tif 000142
から選択されるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項９】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式（Ｉａ）であり、Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨである、請求項１または８に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１０】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式（Ｉｂ）であり、Ｅ’が、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１または８に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１１】
式中、それぞれのＲ１０が、フッ素である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１２】
式中、Ｍが、
【化１３５】
2018521970.tif 000143
である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１３】
式中、Ｊが、システイン及びアルギニンから独立して選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１４】
式中、２個のＪ基が、システインである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１５】
式中、ｚが、８〜２５である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１６】
式中、それぞれのＲ１が、Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１７】
式中、それぞれのＲ２が、出現ごとに独立してアデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である、請求項１から１６、のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１８】
式中、Ｌが、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−、及び
【化１３６】
2018521970.tif 000144
から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項１９】
式中、Ｌが、グリシン及び
【化１３７】
2018521970.tif 000145
から選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２０】
式中、Ｌが、グリシンである、請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２１】
式中、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２２】
式中、Ｇが、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２３】
式中、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２４】
式中、ｄが、１である、請求項１から２３に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２５】
式中、ｄが、０である、請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２６】
式中、
【化１３８】
2018521970.tif 000146
が、
【化１３９】
2018521970.tif 000147
【化１４０】
2018521970.tif 000148
【化１４１】
2018521970.tif 000149
【化１４２】
2018521970.tif 000150
【化１４３】
2018521970.tif 000151
【化１４４】
2018521970.tif 000152
【化１４５】
2018521970.tif 000153
【化１４６】
2018521970.tif 000154
から選択される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２７】
式中、前記ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、
【化１４７】
2018521970.tif 000155
【化１４８】
2018521970.tif 000156
【化１４９】
2018521970.tif 000157
【化１５０】
2018521970.tif 000158
【化１５１】
2018521970.tif 000159
【化１５２】
2018521970.tif 000160
【化１５３】
2018521970.tif 000161
【化１５４】
2018521970.tif 000162
【化１５５】
2018521970.tif 000163
【化１５６】
2018521970.tif 000164
【化１５７】
2018521970.tif 000165
【化１５８】
2018521970.tif 000166
【化１５９】
2018521970.tif 000167
【化１６０】
2018521970.tif 000168
【化１６１】
2018521970.tif 000169
【化１６２】
2018521970.tif 000170
から選択され、式中、Ｇが、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択され、Ｅ’が、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される、請求項１から２４及び２６のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩。
【請求項２８】
式中、Ｇが、Ｈである、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【請求項２９】
式中、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【請求項３０】
式中、Ｅ’が、Ｈである、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【請求項３１】
式中、Ｅ’が、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【請求項３２】
式中、Ｅ’及びＧが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【請求項３３】
式中、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｅ’が、Ｈである、請求項２７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／１６３，９６０号、及び、２０１６年５月１７日に出願された、米国特許仮出願第６２／３３７，５３６号に対する優先権を主張する。これらの明細書の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、コンピュータ可読フォーマット中の配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが４，２２７バイトであり、２０１６年５月１３日に作成された５８１４３２＿ＳＰＴ−００１−２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられたファイルとして提供される。配列表のコンピュータ可読フォーマット中の情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
アンチセンス技術、代わりのスプライス生成物を含む１つ以上の特異的遺伝子生成物の発現を調節すること手段を提供し、多くの治療、診断、及び研究用途に特有的に有用である。アンチセンス技術の背景の原理は、アンチセンス化合物、例えば、オリゴヌクレオチドが、標的核酸にハイブリダイズし、多くのアンチセンス機序のいずれか１つによって遺伝子発現作用、例えば、複写、スプライシングまたは翻訳を調節することである。アンチセンス化合物の配列特異性により、それらは疾患に関与している遺伝子の発現を選択的に調節するターゲットバリデーション及び遺伝子機能、ならびに治療ためのツールとして興味を引くものになる。
【０００４】
アンチセンス技術の分野で有意な進展がみられたが、アンチセンスまたは抗原性能の改善とともにオリゴヌクレオチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートの技術分野での必要性が残っている。かかるアンチセンスまたは抗原性能の改善としては、少なくとも、例えば、毒性の低下、配列選択性を損なわないＤＮＡ及びＲＮＡへの親和性の増大、薬物動態及び組織内分布の改善、細胞デリバリーの改善、及び信頼でき、制御可能なｉｎ  ｖｉｖｏ分布が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、本明細書に提供される。また、本明細書に記載されるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。
【０００６】
したがって、１つの態様では、式Ｉ：
【化１】
2018521970.tif 000002
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供される。１つの実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉａ：
【化２】
2018521970.tif 000003
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩である。
【０００７】
別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｂ：
【化３】
2018521970.tif 000004
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩である。
【０００８】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｃ：
【化４】
2018521970.tif 000005
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩である。
【０００９】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｄ：
【化５】
2018521970.tif 000006
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩である。
【００１０】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｅ：
【化６】
2018521970.tif 000007
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩である。
【００１１】
別の態様では、式ＩＶ：
【化７】
2018521970.tif 000008
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供される。
【００１２】
別の態様では、式Ｖ：
【化８】
2018521970.tif 000009
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供される。
【００１３】
さらに別の態様では、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療する方法が、本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フローサイトメトリー実験に基づいて、選択されたオリゴヌクレオチド、ペプチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのＨｅＬａ細胞中への透過性の程度を示す。
【図２−１】ＰＰＭＯ  ５の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図２−２】ＰＰＭＯ  ６の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図２−３】ＰＰＭＯ  ８の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図２−４】ＰＰＭＯ  １０の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図３−１】ＰＰＭＯ  ５の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図３−２】ＰＰＭＯ  ７の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図３−３】ＰＰＭＯ  ９の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図３−４】ＰＰＭＯ  １１の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルを示すウエスタンブロットである。
【図４−１】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図４−２】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ６の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図４−３】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す。
【図４−４】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ６の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【図５−１】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ８の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図５−２】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  １０の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図５−３】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ８の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【図５−４】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  １０の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【図６−１】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図６−２】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ７の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図６−３】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す。
【図６−４】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ７の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【図７−１】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ９の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図７−２】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  １１の投与後のマウス四頭筋組織中のジストロフィンレベルの定量を示す。
【図７−３】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  ９の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【図７−４】ＰＰＭＯ  ５（同じアッセイの２回繰り返し）またはＰＰＭＯ  １１の投与後のマウス四頭筋組織中のＥｘｏｎ２３スキッピング（％）の定量を示す；対照として野生型及びｍｄｘマウスを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、本明細書に提供される。また、本明細書に記載されるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、及びこれによるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、天然または非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、配列選択性を損なわないＤＮＡ及びＲＮＡへの親和性の増大を示す。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ｈによる開裂を最少化する、またはこれを阻止する。いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化しない。
【００１６】
本明細書に記載されるペプチドは、これの対応するペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートに毒性の低下を付与し、オリゴヌクレオチドの活性を向上させ、薬物動態及び組織内分布を改善し、細胞デリバリーを改善し、信頼でき、制御可能なｉｎ  ｖｉｖｏ分布を付与する。
【００１７】
定義
本開示を記載するために用いられるさまざまな用語の定義が、以下に示される。これらの定義は、個々にまたは大きな群の一部として特定の例で限定しない限り、本明細書及び特許請求全体を通して用いられるとおり、用語にあてはまる。
【００１８】
用語「約」は、当業者によって理解され、ある程度、それが用いられる文脈で、変わる。本明細書に用いられる場合、計測可能な値、例えば、量、一時的な持続期間などを指す場合、用語「約」が、特定の値からの変化が開示された方法を実施するのに好適であるように、±５％、±１％、及び±０．１％を含む±２０％または±１０％の特定の値からの変化を包含することを意味する。
【００１９】
用語「アルキル」は、ある特定の実施形態では、それぞれ１〜６個、または１〜８個の炭素原子を含有する、飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素部分を指す。Ｃ１−６−アルキル部分の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分が挙げられるが、これらに限定されない；及びＣ１−８−アルキル部分の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、及びオクチル部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
アルキル置換基中の炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｘ−ｙ」によって示すことができ、ｘが、置換基中の炭素原子の最少数であり、ｙが、最大数である。同様に、Ｃｘ鎖は、ｘ個の炭素原子を含有するアルキル鎖を意味する。
【００２１】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体または別の用語と組み合わせて、特に示されない限り、示される数の炭素原子、及びＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１または２個のヘテロ原子からなる安定直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、窒素及び硫黄原子は、任意で酸化してよく、窒素ヘテロ原子は、任意で四級化してよい。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の残基、及びそれが結合されるフラグメント、ならびにヘテロアルキル基中の最も遠位の炭素原子に結合されるフラグメントの間を含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に、位置してよい。例としては、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３が挙げられる。最大２個のヘテロ原子が連続してよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３などである。
【００２２】
用語「アリール」は、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられ、特に示されない限り、１個以上の環（典型的には１、２、または３個の環）を含有する炭素環式芳香系を意味し、かかる環は、ペンダント型でともに結合してよく、例えば、ビフェニルであり、または縮合してよく、例えば、ナフタレンである。アリール基の例としては、フェニル、アントラシル、及びナフチルが挙げられる。さまざまな実施形態では、アリール基の例としては、フェニル（例えば、Ｃ６−アリール）及びビフェニル（例えば、Ｃ１２−アリール）を挙げてよい。いくつかの実施形態では、アリール基が、６〜１６個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アリール基が、６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−１２−アリール）。いくつかの実施形態では、アリール基が、６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−アリール）。
【００２３】
本明細書に用いられる場合、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、芳香族特性を有する複素環を指す。ヘテロアリール置換基は、炭素原子の数によって定義してよく、例えば、Ｃ１−９−ヘテロアリールは、ヘテロ原子の数を含まないヘテロアリール基中に含有される炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ１−９−ヘテロアリールは、追加的に１〜４個のヘテロ原子を含む。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和されている１個以上の環を含んでよい。ヘテロアリールの非限定例としては、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（例えば、２−及び４−ピリミジニルを含む）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（例えば、２−ピロリルを含む）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（例えば、３−及び５−ピラゾリルを含む）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル及び１，３，４−オキサジアゾリルが挙げられる。
【００２４】
多環式複素環及びヘテロアリールの非限定例としては、インドリル（例えば、３−、４−、５−、６−及び７−インドリルを含む）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（例えば、１−及び５−イソキノリルを含む）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（例えば、２−及び５−キノキサリニルを含む）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（例えば、３−、４−、５−、６−及び７−ベンゾフリルを含む）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチエニル（例えば、３−、４−、５−、６−、及び７−ベンゾチエニルを含む）、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（例えば、２−ベンゾチアゾリル及び５ベンゾチアゾリルを含む）、プリニル、ベンゾイミダゾリル（例えば、２−ベンゾイミダゾリルを含む）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル、及びキノリジジニルが挙げられる。
【００２５】
用語「保護基」または「化学的保護基」は、保護基が除去されるまで、化合物の反応部分のいくつかまたは全てを遮断し、かかる部分が化学反応に関与することを阻止する化学部分を指し、例えば、この部分は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３ｒｄ  ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）に示され、記載されている。異なる保護基を用いる場合、それぞれ（異なる）保護基が異なる手段によって除去可能であるというのは、有利である可能性がある。完全に異なる反応条件下で開裂される保護基では、かかる保護基の除去に差が生じる。例えば、酸、塩基、及び水素化分解によって保護基を除去することができる。トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、アセタール及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は、酸不安定性であり、水素化分解によって除去可能なＣｂｚ基、及び塩基不安定性であるＦｍｏｃ基で保護されるアミノ基の存在下でカルボキシ及びヒドロキシ反応部分を保護するために用いてよい。カルボン酸部分は、塩基不安定性基、例えば、限定するものではないが、メチル、またはエチルで遮断してよく、ヒドロキシ反応部分は、酸不安定性基、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート、または酸及び塩基安定であるが加水分解で除去可能なカルバメートで遮断されるアミンの存在下で、塩基不安定性基、例えば、アセチルで遮断してよい。
【００２６】
カルボン酸及びヒドロキシル反応部分は、また、加水分解で除去可能な保護基、例えば、ベンゾイル基で遮断してよく、一方、アミン基は、塩基不安定性基、例えば、Ｆｍｏｃで遮断してよい。式（Ｉ）の化合物の合成に有用な特定のアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応部分は、酸化で除去可能な保護基例えば、２，４−ジメトキシベンゾイルで遮断してよく、一方、共存しているアミノ基は、フルオリド不安定性シリルカルバメートで遮断してよい。
【００２７】
アリル遮断基は、酸及び塩基保護基の存在下で有用である、これは、前者が、安定しており、その後、金属またはπ酸触媒によって除去することができるからである。例えば、アリル遮断カルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカルバメートまたは塩基不安定性アセテートアミン保護基の存在下で、パラジウム（０）触媒反応で脱保護することができる。保護基のさらに別の形態が、化合物または中間体を結合してよいレジンである。残基が、レジンに結合されている限り、官能基が、遮断され、反応できない。一旦、レジンから解放されると、官能基が、反応可能となる。
【００２８】
用語「核酸塩基」、「塩基対部分」、「核酸塩基対部分」、または「塩基」は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び／またはモルホリノサブユニットの複素環式環部分を指す。核酸塩基は、天然のもの、または修飾してよく、またはこれらの天然の核酸塩基の類似体としてよく、例えば、核酸塩基の１個以上の窒素原子は、出現ごとに独立して炭素によって置換してよい。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）；２、６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル−修飾ピリミジン；１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−ｃｌａｍｐ）などが挙げられる。
【００２９】
さらに塩基対部分の例としては、これらに限定されないが、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン及びヒポキサンチンが挙げられ、それらのそれぞれのアミノ基がアシル保護基、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体、例えば、プソイドイソシトシン及びプソイドウラシル及び他の修飾核酸塩基、例えば、８−置換プリン、ザンチン、またはヒポキサンチン（後者２つは、自然分解生成物である）によって保護される。その内容が参照によって本明細書に組み込まれるＣｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ、ＲＮＡ、２００３、９、１０３４−１０４８、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２２、２１８３−２１９６及びＲｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．７、３１３に開示された修飾核酸塩基が、また、検討される。
【００３０】
さらに塩基対部分の例としては、１個以上のベンゼン環が付加された膨張サイズ核酸塩基が挙げられるが、これに限定されない。その内容が参照によって本明細書に組み込まれるＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；ＫｒｕｅｇｅｒＡＴ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２００７、４０、１４１−１５０；Ｋｏｏｌ、ＥＴ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２００２、３５、９３６−９４３；Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２００５、６、５５３−５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ、Ｆ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００３、７、７２３−７３３；Ｈｉｒａｏ、Ｉ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００６、１０、６２２−６２７に記載された核塩基置換が、本明細書に記載されたオリゴマーの合成に有用なものとして検討される。膨張サイズ核酸塩基の例が、以下に示されている。
【化９】
2018521970.tif 000010
【００３１】
用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、複数の結合ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオシド及びヌクレオチドの組み合わせを含む化合物を指す。本明細書に提供される特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
語句「モルホリノオリゴヌクレオチド」または「ＰＭＯ」は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’−環外炭素に結合するホスホラミデートまたはホスホロジアミデート結合によってともに結合されるモルホリノサブユニットを有する修飾オリゴヌクレオチドを指す。それぞれのモルホリノサブユニットが、核酸塩基特異的水素結合によって、標的中の核酸塩基に結合するのに効果的な核酸塩基対部分を含む。
【００３３】
用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンス化合物」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、サブユニットの配列を指し、それぞれが塩基対部分を保有し、サブユニット間結合によって結合され、ワトソン−クリック塩基対によって塩基対部分を核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズし、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成する。オリゴマーは、標的配列に対して正確な（完全な）または近い（十分な）配列相補性を有してよい；オリゴマーの末端近くの配列の変化は、一般に内部の変化に優る。
【００３４】
かかるアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断もしくは抑制する、または天然もしくは異常前ｍＲＮＡスプライスプロセッシングを抑制する／変えるように設計することができ、それがハイブリダイズする標的配列に「向けられる」または標的配列を「標的にする」と言ってよい。標的配列が、典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、または前プロセスｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、前プロセスｍＲＮＡ中の正常スプライスアクセプター部位の１〜約２５個の塩基対下流にその５’末端を有するｍＲＮＡ配列を含んでよい。さまざまな実施形態では、標的配列は、スプライス部位を含む、またはエキソンコード配列内に完全に含有される、またはスプライスアクセプターもしくはドナー部位に及ぶ前プロセスｍＲＮＡの任意の領域としてよい。オリゴマーは、それが、上記に記載された方法で標的の核酸を標的にする場合、さらに一般に、生物学的に関連する標的、例えば、タンパク質、ウイルス、または細菌「を標的にする」と言われている。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及び標的ＲＮＡは、それぞれの分子中の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができ、その結果、安定した特異的結合がオリゴヌクレオチド及び標的の間で生じるヌクレオチドによって占められる場合、互いに相補的である。このため、「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」は、安定した特異的結合がオリゴヌクレオチド及び標的の間で生じる十分な程度の相補性をまたは正確な対を示すために用いられる用語である。当該技術分野では、オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列と１００％相補的であることを必要としないと理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合が、標的ＲＮＡの正常機能を妨げ、特異的結合が、所望される条件下で、すなわち、アッセイが実施される条件下で、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療処置の場合、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合の生理的条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である、
【００３６】
また、オリゴヌクレオチドとしては、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を挙げてよい。修飾または置換塩基を含有するオリゴヌクレオチドとしては、核酸中に最も一般的にみられる１個以上のプリンまたはピリミジン塩基が、一般的でない、または非天然塩基で置換されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸塩基が、プリン塩基のＮ９原子で、またはピリミジン塩基のＮ１原子で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのモルホリン環に共有結合される。
【００３７】
プリン塩基は、一般式：
【化１０】
2018521970.tif 000011
によって記載されるとおり、イミダゾール環に縮合されるピリミジン環を含む。
アデニン及びグアニンは、核酸中に最も一般にみられる２個のプリン核酸塩基である。これらは、限定されないが、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチン、及び７−メチルグアニンを含む他の天然プリンで置換してよい。
【００３８】
ピリミジン塩基は、一般式：
【化１１】
2018521970.tif 000012
によって記載されるとおり、６員環ピリミジン環を含む。
シトシン、ウラシル、及びチミンは、核酸中に最も一般にみられるピリミジン塩基である。これらは、限定されないが、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウラシル、及び４−チオウラシルを含む他の天然ピリミジンで置換してよい。１つの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
【００３９】
他の修飾または置換塩基としては、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−ｃｌａｍｐ及びその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ、Ｓｕｐｅｒ  Ａ、及びＮ４−エチルシトシン、またはこれらの誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、及びＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、プソイドウラシルまたはこれらの誘導体；及び縮重またはユニバーサル塩基、例えば、２，６−ジフルオロトルエンまたは欠失塩基、例えば、無塩基部位（例えば１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、ｌ−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素（アザリボース）で置換されているピロリジン誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない。プソイドウラシルが、ウリジン中のように通常のＮ−グリコシドではなく、Ｃ−グリコシドを有するウラシルの天然異性化バージョンである。
【００４０】
ある特定の修飾または置換核酸塩基が、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。さまざまな実施形態では、核酸塩基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２°Ｃ増大させることが示されている５−メチルシトシン置換を含んでよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、修飾または置換核酸塩基が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を促進するのに有用である。例えば、ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３個以上の（例えば、３、４、５、６個以上の）連続グアニン塩基を含有してよい。ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、３個以上の連続グアニン塩基のストリングの結果、オリゴヌクレオチドが凝集し、精製が困難になる可能性がある。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、ヒポキサンチンで１個以上の連続グアニンを置換することができる。３個以上の連続グアニン塩基のストリング中の１個以上のグアニンに対するヒポキサンチンの置換では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの凝集を減少させ、これにより精製を促進することができる。
【００４２】
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、合成され、生体由来のアンチセンス組成物を含まない。本開示の分子は、また、混合、カプセル化、コンジュゲートしてよい、またはそうではなく他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物、例えば、リポソーム、レセプター標的分子、摂取、分布、もしくは吸収またはこれらの組み合わせを助けるための経口、直腸、局所または他の製剤と結合させてよい。
【００４３】
用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対合則によって関連づけられるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」と相補的である。相補性は、塩基対合則に従って核酸の塩基の一部だけが一致する場合、「部分的」としてよい。または、核酸間に「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」、「全て」、または「完全（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％）相補性があるとしてよい。核酸ストランド間の相補性の程度には、核酸ストランド間のハイブリダイゼーションの有効性及び強さに有意な効果がある。完全相補性が、所望されることが多いが、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに対して１個以上、好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含むことができる。かかるハイブリダイゼーションでは、標的配列に対してアンチセンスオリゴマーの「近い」または「実質的」相補性、ならびに正確な相補性が生じてよい。いくつかの実施形態では、オリゴマーを、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％相補性で標的配列にハイブリダイズしてよい。オリゴマー内の任意の位置での変化が含まれる。ある特定の実施形態では、オリゴマーの末端の近くの配列の変化が、一般に内部の変化より好ましく、典型的には、５’−末端、３’−末端、または両末端の約６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド内に存在する場合が、好ましい。
【００４４】
用語「ペプチド」は、複数の結合アミノ酸を含む化合物を指す。本明細書に提供されるペプチドは、細胞透過性ペプチドであると考えることができる。
【００４５】
用語「細胞透過性ペプチド」及び「ＣＰＰ」は、交換可能に用いられ、陽イオン細胞透過性ペプチドを指し、また、輸送ペプチド、キャリアペプチド、またはペプチド形質導入ドメインと称される。本明細書に提供されるペプチドは、所与の細胞培養集団の１００％の細胞内に細胞透過性を誘発する能力を有し、全身投与時のｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の組織内で高分子輸送が可能になる。さまざまな実施形態では、本開示のＣＰＰ実施形態が、さらに以下に記載されるとおり、アルギニンリッチペプチドを含んでよい。
【００４６】
用語「治療」は、疾患の改善のために用いられる１つ以上の特定の方法の適用を指す。ある特定の実施形態では、当該特定の方法が、１つ以上の医薬品の投与である。個体（例えば哺乳動物、例えば、ヒト）または細胞の「治療」は、個体または細胞の自然経過を変えるために用いられる任意の型の介入である。治療としては、医薬組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されず、治療は、予防的にまたは病的事象の開始後にまたは病原体との接触後に実施してよい。治療は、疾患または状態の症状または病状への任意の好ましい効果を含み、例えば、治療される疾患または状態の１つ以上の計測可能なマーカーの最少の変化または改善を含んでよい。また、治療される疾患または状態の進行の速度を減少させること、疾患または状態の発症を遅らせること、またはその発症の重症度を減少させることを対象とすることができる「予防的」治療が含まれる。「有効量」または「治療有効量」は、所望の治療的効果を生じさせるのに有効である単一用量として、または一連の用量の一部として、哺乳動物対象に投与される治療的化合物、例えば、アンチセンスオリゴマーの量を指す。
【００４７】
用語「改善」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度の軽減を意味する。ある特定の実施形態では、改善が、状態または疾患の１つ以上の指標の進行の遅延または減速を含む。指標の重症度は、当業者に知られる主観的または客観的測定によって決定してよい。
【００４８】
「製剤的に許容可能な塩」は、本明細書に用いられる場合、親オリゴヌクレオチドが、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって、修飾される開示したオリゴヌクレオチドの誘導体を指す。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、ｐ．１４１８及びＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、２（１９７７）にみられ、それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート
１個以上の部分、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞摂取を向上させる細胞透過性ペプチドに化学的に結合されるオリゴヌクレオチドが、本明細書に提供される。オリゴヌクレオチドは、さらに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞摂取をさらに向上させる１個以上のヘテロアルキル部分（例えば、ポリエチレングリコール）に化学的に結合させることができる。１つの例示的な実施形態では、アルギニンリッチポリペプチドが、そのＮ−末端またはＣ−末端残基で、アンチセンス化合物のいずれかの末端、または両末端に共有結合される。
【００５０】
このため、１つの態様では、式Ｉ：
【化１２】
2018521970.tif 000013
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供され、
式中、
Ａ’が、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１３】
2018521970.tif 000014
から選択され、式中、
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが、３〜１０であり、それぞれのアルキル基が、出現ごとに独立してＣ２−６−アルキルであり、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）Ｒ６、−（Ｃ１−６ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化１４】
2018521970.tif 000015
から選択され；
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択され、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、固体支持体に共有結合され；
それぞれのＲ１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から独立して選択され、式中、それぞれのＲ３及びＲ４が、出現ごとに独立して−Ｃ１−６アルキルであり；
それぞれのＲ２が、Ｈ、核酸塩基、及び化学的保護基で官能化された核酸塩基から独立して選択され、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６複素環式環を含み；
ｚが、８〜４０であり；及び
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化１５】
2018521970.tif 000016
から選択され、
式中、
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ１１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から選択され、
式中、Ｌが、アミド結合によってＪ、及びＬのカルボキシ末端に共有結合され、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、及び
【化１６】
2018521970.tif 000017
から選択され；
ｔが、４〜９であり；
それぞれのＪが、出現ごとに独立して構造
【化１７】
2018521970.tif 000018
のアミノ酸から選択され、
式中、ｒ及びｑそれぞれが、独立して０、１、２、３、または４であり；及び、
それぞれのＲ９が、出現ごとに独立してＨ、アミノ酸側鎖、及び化学的保護基で官能化されたアミノ酸側鎖から選択され、
式中、Ｒ９の２個以上のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立して硫黄を含み、式中、硫黄原子の２つが、これらが結合される原子とともに、構造
【化１８】
2018521970.tif 000019
を形成し；
式中、ｄが、０または１であり、Ｍが、
【化１９】
2018521970.tif 000020
から選択され、式中、それぞれのＲ１０が、出現ごとに独立してＨまたはハロゲンであり；及び
Ｇが、Ｊのアミノ末端に共有結合され、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、
式中、以下の条件の少なくとも１つが、真である：１）Ａ’が、
【化２０】
2018521970.tif 000021
である；２）Ｅ’が、
【化２１】
2018521970.tif 000022
である；または３）Ｅ’が、
【化２２】
2018521970.tif 000023
である。
【００５１】
１つの実施形態では、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化２３】
2018521970.tif 000024
から選択される。
【００５２】
別の実施形態では、Ａ’のうちの１つだけが、
【化２４】
2018521970.tif 000025
であり、Ｅ’が、
【化２５】
2018521970.tif 000026
である、またはＥ’が、
【化２６】
2018521970.tif 000027
である。
【００５３】
さらに別の実施形態では、Ａ’が、
【化２７】
2018521970.tif 000028
である、またはＥ’が、
【化２８】
2018521970.tif 000029
である。
【００５４】
さらに別の実施形態では、Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２９】
2018521970.tif 000030
から選択される。
【００５５】
別の実施形態ではＥ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイルベンゾイル、ステアロイル、及び
【化３０】
2018521970.tif 000031
から選択される。
【００５６】
さらに別の実施形態では、Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化３１】
2018521970.tif 000032
から選択され；及び
Ｅ’が、
【化３２】
2018521970.tif 000033
である。
【００５７】
さらに別の実施形態では、Ａ’が、
【化３３】
2018521970.tif 000034
である。
【００５８】
別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイルベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００５９】
さらに別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００６０】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉａ：
【化３４】
2018521970.tif 000035
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００６１】
式Ｉ及びＩａの１つの実施形態では、Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、式中、それぞれのアルキル基が、それぞれの出現Ｃ２−６−アルキルについて独立している。
【００６２】
式Ｉ及びＩａの別の実施形態では、Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨである。
【００６３】
別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｂ：
【化３５】
2018521970.tif 000036
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００６４】
式Ｉ及びＩｂの１つの実施形態では、Ｅ’が、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００６５】
式Ｉ及びＩｂの別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００６６】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの１つの実施形態では、それぞれのＲ１０が、独立してフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンである。
【００６７】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、それぞれのＲ１０が、フッ素である。
【００６８】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｍが、
【化３６】
2018521970.tif 000037
である。
【００６９】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、２個のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立してシステインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である。
【００７０】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、それぞれのＪが、出現ごとに独立してα−アミノ酸、β２−アミノ酸、及びβ３−アミノ酸から選択される。
【００７１】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、ｒ及びｑそれぞれが、０である。
【００７２】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｊが、システイン及びアルギニンから独立して選択される。
【００７３】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、２個のＪ基が、システインである。
【００７４】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、ｚが、８〜２５である。
【００７５】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、ｚが、１５〜２５である。
【００７６】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、ｚが、１０〜２０である。
【００７７】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、それぞれのＲ１が、独立してＮＲ３Ｒ４であり、式中、それぞれのＲ３及びＲ４が出現ごとに独立してＣ１−３−アルキルである。
【００７８】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ１が、Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００７９】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ２が、核酸塩基であり、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ４−６−複素環式環を含む。
【００８０】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、それぞれのＲ２が、核酸塩基であり、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリミジン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ４−６−複素環式環を含む。
【００８１】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ２が、出現ごとに独立してアデニン、２、６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００８２】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ２が、出現ごとに独立してアデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００８３】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｌが、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−、及び
【化３７】
2018521970.tif 000038
から選択される。
【００８４】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｌが、グリシン及び
【化３８】
2018521970.tif 000039
から選択される。
【００８５】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｌが、グリシンである。
【００８６】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００８７】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇが、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００８８】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００８９】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、ｄが、１である。
【００９０】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、ｄが、０である。
【００９１】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、
【化３９】
2018521970.tif 000040
が、
【化４０】
2018521970.tif 000041
【化４１】
2018521970.tif 000042
から選択される。
【００９２】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｃ：
【化４２】
2018521970.tif 000043
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００９３】
さらに別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｄ：
【化４３】
2018521970.tif 000044
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００９４】
別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、式Ｉｅ：
【化４４】
2018521970.tif 000045
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００９５】
別の態様では、式ＩＶ：
【化４５】
2018521970.tif 000046
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供され、式中、Ａ’が、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化４６】
2018521970.tif 000047
から選択され、式中、
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが、３〜１０であり、それぞれのアルキル基が、出現ごとに独立してＣ２−６−アルキルであり、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）Ｒ６、−（Ｃ１−６ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化４７】
2018521970.tif 000048
から選択され；
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択され、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、固体支持体に共有結合され；
それぞれのＲ１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から独立して選択され、式中、それぞれのＲ３及びＲ４が、出現ごとに独立して−Ｃ１−６アルキルであり；
それぞれのＲ２が、Ｈ、核酸塩基、及び化学的保護基で官能化された核酸塩基から独立して選択され、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６複素環式環を含み；
ｚが、８〜４０であり；及び
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイルベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化４８】
2018521970.tif 000049
から選択され、式中、Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ１１が、ＯＨ及び−ＮＲ３Ｒ４から選択され、式中、Ｌが、アミド結合によってＪ、及びＬのカルボキシ末端に共有結合され、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−、及び
【化４９】
2018521970.tif 000050
から選択され；
ｔが、４〜９であり；
それぞれのＪが、出現ごとに独立して構造
【化５０】
2018521970.tif 000051
のアミノ酸から選択され、
式中、ｒ及びｑそれぞれが、独立して０、１、２、３、または４であり；及び、
それぞれのＲ９が、出現ごとに独立してＨ、アミノ酸側鎖、及び化学的保護基で官能化されたアミノ酸側鎖から選択され、
式中、Ｒ９の２個以上のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立して硫黄を含み、式中、硫黄原子の２つが、これらが結合される原子とともに、構造
【化５１】
2018521970.tif 000052
を形成し；
Ｇが、Ｊのアミノ末端に共有結合され、Ｇが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、
式中、以下の条件の少なくとも１つが、真である：１）Ａ’が、
【化５２】
2018521970.tif 000053
である；２）Ｅ’が、
【化５３】
2018521970.tif 000054
である；または３）Ｅ’が、
【化５４】
2018521970.tif 000055
である。
【００９６】
式ＩＶの１つの実施形態では、ｄが、１である。
【００９７】
式ＩＶの別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及び
【化５５】
2018521970.tif 000056
から選択される。
【００９８】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化５６】
2018521970.tif 000057
から選択され；
Ｅ’が、
【化５７】
2018521970.tif 000058
である。
【００９９】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、Ａ’が、
【化５８】
2018521970.tif 000059
である。
【０１００】
式ＩＶの別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【０１０１】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、Ｍが、
【化５９】
2018521970.tif 000060
である。
【０１０２】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、それぞれのＪが、出現ごとに独立してα−アミノ酸、β２−アミノ酸、及びβ３−アミノ酸から選択される。
【０１０３】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、ｒ及びｑそれぞれが、０である。
【０１０４】
式ＩＶの別の実施形態では、Ｊが、システイン及びアルギニンから独立して選択される。
【０１０５】
式ＩＶの別の実施形態では、ｚが、１５〜２５である。
【０１０６】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、ｚが、１０〜２０である。
【０１０７】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ１が、Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１０８】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、それぞれのＲ２が、出現ごとに独立してアデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【０１０９】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、Ｌが、グリシンである。
【０１１０】
式ＩＶの別の実施形態では、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【０１１１】
式ＩＶのさらに別の実施形態では、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１１２】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ標的との配列相補性を有する標的配列を含む。１つの特定の実施形態では、ＲＮＡ標的が、細胞ＲＮＡ標的である。別の特定の実施形態では、標的配列が、ＲＮＡ標的に結合する十分な配列相補性を有する。さらに別の特定の実施形態では、標的配列が、ＲＮＡ標的との完全配列相補性を有する。
【０１１３】
本開示の代表的な
【化６０】
2018521970.tif 000061
部分としては、特に、以下の式：
【化６１】
2018521970.tif 000062
【化６２】
2018521970.tif 000063
【化６３】
2018521970.tif 000064
【化６４】
2018521970.tif 000065
【化６５】
2018521970.tif 000066
【化６６】
2018521970.tif 000067
【化６７】
2018521970.tif 000068
【化６８】
2018521970.tif 000069
の部分が挙げられる。
【０１１４】
本開示の代表的なペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートとしては、特に、以下の
構造：
【化６９】
2018521970.tif 000070
【化７０】
2018521970.tif 000071
【化７１】
2018521970.tif 000072
【化７２】
2018521970.tif 000073
【化７３】
2018521970.tif 000074
【化７４】
2018521970.tif 000075
【化７５】
2018521970.tif 000076
【化７６】
2018521970.tif 000077
【化７７】
2018521970.tif 000078
【化７８】
2018521970.tif 000079
【化７９】
2018521970.tif 000080
【化８０】
2018521970.tif 000081
【化８１】
2018521970.tif 000082
【化８２】
2018521970.tif 000083
【化８３】
2018521970.tif 000084
【化８４】
2018521970.tif 000085
【化８５】
2018521970.tif 000086
のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩が挙げられ、
式中、
Ｇが、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択され、
Ｅ’が、Ｈ及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【０１１５】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートの１つの実施形態では、Ｇが、Ｈである。
【０１１６】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートの別の実施形態では、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１１７】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのさらに別の実施形態では、Ｅ’が、Ｈである。
【０１１８】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのさらに別の実施形態では、Ｅ’が、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１１９】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのさらに別の実施形態では、Ｅ’及びＧが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１２０】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのさらに別の実施形態では、Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｅ’が、Ｈである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、非溶媒和である。他の実施形態では、１個以上のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、溶媒和形態である。当該技術分野で知られるとおり、溶媒は、任意の製剤的に許容可能な溶媒、例えば、水、エタノールなどとすることができる。
【０１２２】
式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、及びＩＶのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、その中性形態で示されるが、いくつかの実施形態では、これらのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、製剤的に許容可能な塩形態で用いられる。
【０１２３】
オリゴヌクレオチド
モルホリノ系サブユニットの重要な特性としては、１）安定、非荷電または陽電荷主鎖結合によってオリゴマー形態で結合される能力；２）形成されるポリマーが、比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５塩基）中の約４５℃を越えるＴＭ値、標的ＲＮＡを含む、相補的塩基標的核酸とハイブリダイズすることができるようにヌクレオチド塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシン及びヒポキサンチン）を支持する能力；３）哺乳動物細胞中に能動的にまたは受動的に輸送されるオリゴヌクレオチドの能力；及び４）ＲＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅ  Ｈ分解に抵抗するオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖のそれぞれの能力が挙げられる。
【０１２４】
オリゴマー及び標的配列の間に形成される二本鎖の安定性は、ＴＭを結合する機能及び二本鎖の細胞酵素的開裂への感受性である。相補的配列ＲＮＡに関してのオリゴマーのＴＭは、従来の方法によって、例えば、Ｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５、ｐｐ．１０７−１０８に記載されるもの、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  ＷａｌｌａｃｅＲ．Ｂ．、１９８７、Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４ｐｐ．９４−１０７に記載されるとおり、測定してよい。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーが、相補的配列ＲＮＡに関して、身体温度を越える結合ＴＭ及び、いくつかの実施形態では、約４５℃または５０℃を越える結合ＴＭを有してよい。６０〜８０℃またはそれ以上の範囲のＴＭも含まれる。公知の原理に従って、オリゴマーのＴＭは、相補ベースＲＮＡハイブリッドに関して、二本鎖中のＣ：Ｇ対塩基の割合を増大させることによって、またはヘテロ二本鎖の長さ（塩基対中）を増大させることによって、または双方によって増大させることができる。同時に、細胞摂取を最適化するために、オリゴマーのサイズを制限するのは、利点がある可能性がある。このため、本開示の化合物は、２５塩基以下の長さで高いＴＭ（４５〜５０℃以上）を示す化合物を含む。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドの長さは、前ｍＲＮＡ分子内の所期の位置に選択的に結合することができるかぎり、変えてもよい。かかる配列の長さは、本明細書に記載される選択方法に従って決定することができる。一般に、オリゴヌクレオチドの長さは、約８ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチド（ｚ）の長さは、８〜３８、８〜２５、１５〜２５、１７〜２１、または約１８とすることができる。しかし、本明細書に記載される方法で、この範囲内の任意の長さのヌクレオチドを用いてよいと理解される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、塩基修飾または置換を含有する。例えば、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるように、ある特定の核−塩基を選択してよい。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン及び２，６−ジアミノプリンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃によって核酸二本鎖安定性を増大させることが示され、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組み込んでよい。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのピリミジン塩基が、５−置換ピリミジン塩基を含み、当該ピリミジン塩基は、シトシン、チミン及びウラシルからなる群から選択される。１つの実施形態では、５−置換ピリミジン塩基が、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのプリン塩基が、Ｎ−２、Ｎ−６置換されプリン塩基を含む。１つの実施形態では、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基が、２，６−ジアミノプリンである。
【０１２７】
モルホリノ系オリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；５，２１７，８６６号；５，１４２，０４７号；５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，５２１，０６３号；５，５０６，３３７号及び係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号；；１２／２７１，０４０号；；及びＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ／２００９／０６４４７１及びＷＯ／２０１２／０４３７３０及びＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、７、１８７−１９５、７、１８７−１９５に詳細が記載されており、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
したがって、１つの態様では、式ＩＩ：
【化８６】
2018521970.tif 000087
のオリゴヌクレオチドまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供され、式中、
Ａが、ＯＨ、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、及び
【化８７】
2018521970.tif 000088
からなる群から選択され；
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、式中、ｘが、３〜１０であり、それぞれのアルキル基が、出現ごとに独立して−Ｃ２−６−アルキルであり、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ１−６−ヘテロアルキル−Ｒ６、−アリール−Ｒ６、−ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、及び−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６からなる群から選択され；
Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２からなる群から選択され、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、固体支持体に共有結合され；
それぞれのＲ１が、独立してＯＨまたは−ＮＲ３Ｒ４であり；
それぞれのＲ３及びＲ４が、独立して出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
それぞれのＲ２が、Ｈ、核酸塩基、及び化学的保護基で官能化された核酸塩基からなる群から独立して選択され、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンからなる群から選択されるＣ３−６−複素環式環を含み；
ｚが、８〜４０であり；
Ｅが、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化８８】
2018521970.tif 000089
からなる群から選択され；
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり；
Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｒ１２が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１−６−アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６−アルキルであり；
Ｒ１３が、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、及びトリメトキシトリチルからなる群から選択される。
【０１２９】
式ＩＩの１つの実施形態では、Ａが、
【化８９】
2018521970.tif 000090
であり；
Ｅが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルからなる群から選択され；
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、それぞれのアルキル基が、出現ごとに独立して−Ｃ２−６−アルキル、トリチル、及び４−メトキシトリチルであり；
それぞれのＲ２が、独立して核酸塩基であり、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリジン、ピリミジン、プリン、及びデアザ−プリンからなる群から選択されるＣ４−６−複素環式環を含む。
【０１３０】
式ＩＩの別の実施形態では、Ｒ５が、Ｃ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＨであり；
それぞれのＲ２が、独立して核酸塩基であり、式中、核酸塩基が、出現ごとに独立してピリミジンまたはプリンを含む。
【０１３１】
さらに別の実施形態では、式ＩＩのオリゴヌクレオチドが、式ＩＩａ：
【化９０】
2018521970.tif 000091
のオリゴヌクレオチドである。
【０１３２】
式ＩＩ及びＩＩａの１つの実施形態では、Ｒ２が、出現ごとに独立してアデニン、２、６−ジアミノプリン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンであり；
それぞれのＲ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１３３】
表１に本明細書に記載されるとおりのヌクレオチド部分のさまざまな実施形態が提供される。
【表１】
2018521970.tif 000092
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが、非溶媒和である。他の実施形態では、１個以上のオリゴヌクレオチドが、溶媒和形態である。当該技術分野で知られるとおり、溶媒は、任意の製剤的に許容可能な溶媒、例えば、水、エタノールなどとすることができる。
【０１３５】
式ＩＩ及びＩＩａのオリゴヌクレオチドは、その中性形態で示されるが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドが、製剤的に許容可能な塩形態で用いられる。
【０１３６】
ペプチド
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰにコンジュゲートされるオリゴヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、細胞中への化合物の輸送を向上させるのに有効なアルギニンリッチペプチド輸送部分とすることができる。当該輸送部分は、いくつかの実施形態では、オリゴマーの末端に結合される。当該ペプチドは、所与の細胞培養集団の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（この間の全整数を含む）の細胞内に細胞透過性を誘発する能力を有し、全身投与時のｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の組織内で高分子輸送が可能になる。１つの実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アルギニンリッチペプチドトランスポーターとしてよい。さまざまな実施形態では、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが、ＣＰＰ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの間のリンカーとしてグリシンを使用してよい。
【０１３７】
上記に記載されるとおりの輸送部分は、結合された輸送部分の欠如下でのオリゴマーの摂取と比較して、結合されたオリゴマーの細胞移入を非常に向上させることが示されている。摂取が、非コンジュゲート化合物と比較して、少なくとも１０倍向上し、いくつかの実施形態では、２０倍向上する可能性がある。
【０１３８】
アルギニンリッチペプチドトランスポーター（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本開示を実施するのに特に有用である。ある特定のペプチドトランスポーターが、筋肉細胞を含む一次細胞中へのアンチセンス化合物のデリバリーで非常に有効であることが示されている。さらに、他の公知のペプチドトランスポーター、例えば、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ及びＴａｔペプチドと比較して、本明細書に記載されるペプチドトランスポーターは、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートされる場合、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変える能力の向上を示す。
【０１３９】
このため、１つの態様では、式ＩＩＩ：
【化９１】
2018521970.tif 000093
のペプチドまたはその製剤的に許容可能な塩が、本明細書に提供され、式中、
Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルからなる群から選択され；
それぞれのＪが、出現ごとに独立して構造
【化９２】
2018521970.tif 000094
のアミノ酸から選択され；
それぞれのＲ９が、出現ごとに独立してＨ、アミノ酸側鎖、及び化学的保護基で官能化されたアミノ酸側鎖からなる群から選択され；
式中、Ｒ９の２個以上のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立してチオールまたは化学的保護基で官能化されたチオールを含み；
ｒ及びｑが、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｌが、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及び
【化９３】
2018521970.tif 000095
からなる群から選択され、それぞれを固体支持体に共有結合してよく；
ｔが、４〜９である。
【０１４０】
１つの実施形態では、２個のアミノ酸側鎖基が、式中、２個のアミノ酸側鎖基のそれぞれが独立して、硫黄を含み、これらが結合される原子とともに、構造
【化９４】
2018521970.tif 000096
を形成し；
Ｍが、
【化９５】
2018521970.tif 000097
からなる群から選択され；
ｄが、０または１である。
【０１４１】
別の実施形態では、Ｍが、
【化９６】
2018521970.tif 000098
である。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、２個のアミノ酸側鎖基が、出現ごとに独立してシステインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である
【０１４３】
さらに別の実施形態では、それぞれのＪが、出現ごとに独立してα−アミノ酸、β２−アミノ酸、及びβ３−アミノ酸から選択される。
【０１４４】
別の実施形態では、ｒ及びｑそれぞれが、０である。
【０１４５】
別の実施形態では、Ｊが、システイン及びアルギニンから独立して選択される。
【０１４６】
さらに別の実施形態では、２個のＪ基が、システインである。
【０１４７】
さらに別の実施形態では、Ｌが、−ＮＨ（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）ＯＨ及び
【化９７】
2018521970.tif 000099
から選択される。
【０１４８】
別の実施形態では、Ｌが、
【化９８】
2018521970.tif 000100
である。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、Ｌが、ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
【０１５０】
さらに別の実施形態では、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルからなる群から選択される。
【０１５１】
さらに別の実施形態では、Ｇが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３またはステアロイルである。
【０１５２】
別の実施形態では、Ｇが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１５３】
さらに別の実施形態では、Ｇが、Ｊのアミノ末端に共有結合される。さらに１つの実施形態では、Ｌが、アミド結合によって、Ｊのカルボキシ末端に共有結合される。
【０１５４】
別の実施形態では、ｄが、０である。
【０１５５】
さらに別の実施形態では、ｄが、１である。
【０１５６】
表２に本明細書に記載されるとおりの代表的なペプチドが提供される。
【表２−１】
2018521970.tif 000101
【表２−２】
2018521970.tif 000102
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドが、非溶媒和である。他の実施形態では、１個以上のペプチドが、溶媒和形態である。当該技術分野で知られるとおり、溶媒は、任意の製剤的に許容可能な溶媒、例えば、水、エタノールなどとすることができる。
【０１５８】
式ＩＩＩのペプチドは、その中性形態で示されるが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドが、製剤的に許容可能な塩形態で用いられる。
【０１５９】
一般的合成スキーム
スキームＩａ：ペプチドのステープリング
【化９９】
2018521970.tif 000103
スキームＩｂ：ペプチドのＰＭＯの３’末端へのコンジュゲーション
【化１００】
2018521970.tif 000104
スキームＩｃ：ペプチドのＰＭＯの５’末端へのコンジュゲーション
【化１０１】
2018521970.tif 000105
スキームＩＩａ：ジスルフィドペプチドのＰＭＯの３’末端へのコンジュゲーション
【化１０２】
2018521970.tif 000106
スキームＩＩａのプロセスは、ほぼ同じ条件下で、ペプチドのＰＭＯの５’末端へのコンジュゲーションに適用できる（スキームＩｃを参照）。
スキームＩＩｂ：ペプチド−ＰＭＯ−コンジュゲートのステープリング
【化１０３】
2018521970.tif 000107
スキームＩＩｂのプロセスは、同様の条件下で、ペプチドのＰＭＯの５’末端へのコンジュゲーションに適用できる。
スキームＩＩＩａ：ペプチド及びＰＭＯによるワンポットコンジュゲーション及びステープリング
【化１０４】
2018521970.tif 000108
スキームＩＩＩｂ：ペプチド及びＰＭＯによるワンポットコンジュゲーション及びステープリング
【化１０５】
2018521970.tif 000109
【０１６０】
方法
式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＶのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療する方法が、本明細書に提供される。
【０１６１】
したがって、１つの態様では、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、治療が必要な対象の筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療する方法が、本明細書に提供される。
【０１６２】
１つの実施形態では、筋肉疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
【０１６３】
別の実施形態では、ウイルス感染が、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、及びデング熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって生じる。
【０１６４】
別の実施形態では、細菌感染が、結核菌によって生じる。
【０１６５】
本明細書で考えられる対象は、典型的にはヒトである。しかし、対象は、治療が所望される任意の哺乳動物とすることができる。このため、本明細書に記載される方法は、ヒト及び動物用途の双方に適用することができる。
【０１６６】
投与／用量
治療用組成物の製剤及びこれに続く投与（投薬）は、当業者の技術内にある。投薬は、治療される疾患状態の重症度及び反応性に依存し、数日〜数ヶ月継続、または疾患状態の十分な減少が達成されるまでの投与期間で行われる。最適な投薬スケジュールは、患者の身体中の薬物蓄積の測定値から計算することができる。
【０１６７】
当業者は、最適な用量、投薬方法及び繰り返し数を容易に決定することができる。最適な用量は、個体オリゴマーの相対力価に応じて変えてよく、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル中で有効であるとわかったＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、用量は、体重の０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇであり、１日あたり、１週間あたり、１ヶ月あたりもしくは１年あたりに１回以上、または２〜２０年あたりに１回与えてよい。当業者は、測定された滞留時間及び体液または組織中の薬物の濃度に基づいて投薬の繰り返し数を容易に推定することができる。成功した治療後に、患者に維持療法を実施し、疾患状態の再発を阻止することが好ましく、体重の０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇの範囲の維持用量で、１日に１回以上〜２０年に１回、オリゴマーを投与する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド）が、単独で投与される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、治療有効量または用量で投与される。「治療有効量」は、それ自体を患者に投与した場合、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を有効に治療する式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量である。特定の対象に対して所与の例で「治療有効量」であると判明している量は、かかる用量が、当業者によって「治療有効量」と考えられても、考察中の疾患または状態が同様に治療される１００％の対象に有効でない可能性がある。治療有効量に一致するオリゴヌクレオチドの量は、疾患の型、疾患のステージ、治療される患者の年齢、及び他の事実にきわめて依存する。
【０１７０】
異なる実施形態では、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド及び用いられる有効量に応じて、オリゴヌクレオチドが、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染に関与する遺伝子の発現を調節することができる。
【０１７１】
式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量は、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染の有効な治療とならなければならず、一方、当該量は、患者に過度に毒性がないことが好ましい（すなわち、当該量は診療ガイドラインによって確立された毒性限度内が好ましい）。いくつかの実施形態では、過度な毒性を阻止すること、または筋肉疾患、ウイルス感染、もしくは細菌感染のさらに有効な治療をもたらすことのいずれか、または双方のために、総投与用量の限度が、提供される。典型的には、本明細書で考えられる量は、１日当たりである；しかし、半日及び２日または３日サイクルがまた、本明細書で考えられる。
【０１７２】
筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療するために、さまざまな用量計画を用いてよい。いくつかの実施形態では、１日当たりの用量、例えば、上記に記載された例示的な用量のいずれかが、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間に、１日当たり１回、２回、３回、または４回投与される。治療される疾患のステージ及び重症度に応じて、高用量でより短い治療時間（例えば、最長５日）を用いてよく、または低用量でより長い治療時間（例えば、１０日以上、または週、または１ヶ月以上）を用いてよい。いくつかの実施形態では、１日に１回または１日に２回の用量が、隔日で投与される。
【０１７３】
式ＩＩ及びＩＩａのオリゴヌクレオチド、またはその製剤的に許容可能な塩または溶媒形態は、純粋形態または好適な医薬組成物で、当該技術分野で知られる投与または薬剤の許容される方法のいずれかによって投与することができる。例えば、経口で、経鼻で、非経口で（静脈内、筋肉内、または皮下）、局所に、経皮で、膣内に、膀胱内に、脳槽内に、または直腸に、オリゴヌクレオチドを投与することができる。剤形は、例えば、正確な用量の単純投与に好適な単位剤形で、例えば、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形、例えば、錠剤、丸薬、軟カプセルまたは硬ゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁、座薬、エアゾールなどとすることができる。特定の投与経路が、経口であり、特に、治療される疾患の重症度の程度に従って簡便な毎日の用量計画を調節することができるものである。
【０１７４】
補助剤及び補薬が、例えば、保存薬、浸潤剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳化剤、及び調剤を含んでよい。微生物の作用の阻止は、一般に、さまざまな抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタトール、フェノール、ソルビン酸などによって提供される。等張薬剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなども、含んでよい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって、注入可能医薬形態の吸収を延長させてよい。補助剤は、また、浸潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝薬、及び抗酸化剤、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化ヒドロキシトルエンなどを含むことができる。
【０１７５】
固体剤形は、コーティング及びシェル、例えば、エンテリックコーティング及び当該技術分野で公知の他のもので調製することができる。これは、ペーシング剤を含有することができ、遅延させる方法で消化管のある特定の部分中で、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを放出する組成物とすることができる。用いることができる包埋組成物の例は、高分子物質及びワックスである。活性オリゴヌクレオチドは、また、好適であれば、１つ以上の上記記載の賦形剤とのマイクロカプセル化形態とすることができる。
【０１７６】
経口投与のための液体剤形としては、製剤的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が挙げられる。かかる剤形は、例えば、本明細書に記載される陽性剤またはレチノイン酸またはその製剤的に許容可能な塩、及び、キャリア、例えば、水、生理食塩水、水性ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの中の任意の医薬補助物質；溶解補助剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンゾイルアルコール、ベンゾイルベンゾエート、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物、などを溶解、分散すること等によって調製され、これにより溶液または懸濁液を形成する。
【０１７７】
一般に、所期の投与方法に応じて、製剤的に許容可能な組成物は、約１重量％〜約９９％重量の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、またはその製剤的に許容可能な塩、及び９９重量％〜１重量％の製剤的に許容可能な賦形剤を含有する。１つの例では、当該組成物は、約５重量％〜約７５重量％の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、またはその製剤的に許容可能な塩であり、残りが好適な医薬賦形剤である。
【０１７８】
かかる剤形を調製する実際の方法が知られている、または、当業者に明らかである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０）を参照。
【０１７９】
キット
他の実施形態では、キットが提供される。本開示に従ったキットが、本開示のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、または組成物を含むパッケージ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、キットが、式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＶに従ったペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその製剤的に許容可能な塩を含む。他の実施形態では、キットが、式ＩＩまたはＩＩａに従ったオリゴヌクレオチド、またはその製剤的に許容可能な塩を含む。さらに他の実施形態では、キットが、式ＩＩＩに従ったペプチドまたはその製剤的に許容可能な塩を含む。
【０１８０】
語句「パッケージ」は、本明細書に示されるオリゴヌクレオチドまたは組成物を含有する任意の容器を意味する。いくつかの実施形態では、パッケージは、箱またはラッピングとすることができる。医薬生成物を放送する際に使用される包装材料は、当業者に知られている。医薬包装材料の例としては、ボトル、チューブ、インヘラー、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤及び所期の投与方法及び治療に好適な任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
キットは、また、パッケージ内に含有されないが、パッケージ、例えば、ピペットの外側に結合されるものを含有することができる。
【０１８２】
キットは、さらに、本開示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を患者に投与するための指示書を含有することができる。キットは、また、規制当局、例えば、米国食品医薬品局によって本明細書のオリゴヌクレオチドの使用が承認される指示書を含むことができる。キットは、また、オリゴヌクレオチドのためのラベルまたは添付文書を含有することができる。パッケージ（複数可）もしくは任意の添付文書（複数可）、または双方は、規制当局によって承認されてよい。キットは、パッケージ中の固体相または液体相（例えば、提供される緩衝剤）中にオリゴヌクレオチドを含むことができる。キットは、また、当該方法を実施するための溶液を調製するための緩衝剤、及び液体１つコンテナから別のコンテナへ移すためのピペットを含むことができる。
【実施例】
【０１８３】
実施例は、例示の目的のため及び本開示のある特定の実施形態を記載するために以下に記載されている。しかし、特許請求の範囲は、本明細書に記載される実施例によって、いずれの方法でも限定されるものではない。開示される実施形態へのさまざまな変化及び変更は、当業者に明らかであり、限定するものではないが、本開示の化学的構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関連するものを含む、かかる変化及び変更は、本開示の趣旨及び添付の特許請求の範囲から逸脱することなく行ってよい。本明細書のスキーム中の構造の変数の定義は、本明細書に示される式中のそれらの対応する位置と対応している。
【０１８４】
実施例１：ヘキサフルオロベンゼンとのペプチドステープリングのためのプロトコール
【化１０６】
2018521970.tif 000110
ガラスバイアル中の環状ジスルフィドペプチドＡｃ−ＣＲＲＲＣＲＲＲＧ−ＯＨ（７４．８ｍｇ、３８．５μｍｏｌ）（配列番号：３）に、トリス塩基（８ｍＬ、ＤＭＦ中の５０ｍＭ）及びヘキサフルオロベンゼン（１１１μＬ、９６２μｍｏｌ）の溶液を添加する。この溶液に、Ｈ２Ｏ（１３６μＬ、０．７１Ｍ、ｐＨ＝８）中のＴＣＥＰ溶液を添加し、ジスルフィド結合を減少させ、反応を開始する。室温で７時間、反応混合物を撹拌し、ＬＣ−ＭＳによってモニターする。水中の４０ｍＬの０．１％ＴＦＡで得られた混合物を希釈し、遠心分離し、濾過し、ＨＰＬＣによって精製する。ペプチド生成物（ＬＣ−ＭＳによって分析される）を含有するフラクションを混合し、凍結乾燥し、所望のペルフルオロアリールペプチド（１９．９ｍｇ、８．９μｍｏｌ、２３％収率）が与えられる。
【０１８５】
実施例２：デカフルオロビフェニルとのペプチドステープリングのためのプロトコール
【化１０７】
2018521970.tif 000111
ガラスバイアル中で、ＤＭＦ（８ｍＬ、５０ｍＭ）中のトリス塩基の溶液中に環状ジスルフィドペプチドＡｃ−ＣＲＲＲＣＲＲＲＧ−ＯＨ（７４．５ｍｇ、３８．４μｍｏｌ）（配列番号：３）及びデカフルオロビフェニル（２５．６ｍｇ、７６．７μｍｏｌ）を溶解する。ジスルフィド結合を減少させ、反応を開始するために、この溶液にＨ２Ｏ中のＴＣＥＰ溶液（１３５μＬ、０．７１Ｍ、ｐＨ約８）を添加する。室温で７時間、反応混合物を撹拌し、ＬＣ−ＭＳによってモニターする。水中のＴＦＡ（４０ｍＬの０．１％）で得られた混合物を希釈し、遠心分離し、濾過し、ＨＰＬＣによって精製する。ペプチド生成物を含有するフラクションをＬＣ−ＭＳによって分析し、混合し、凍結乾燥し、最終ペルフルオロアリールペプチド（２０ｍｇ、８．９μｍｏｌ、２３％収率）が与えられる。
【０１８６】
実施例３：ペプチドコンジュゲーションのためのプロトコール
【化１０８】
2018521970.tif 000112
プラスチックエッペンドルフチューブ中のＰＭＯ（核酸塩基配列（Ｒ２）：ＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号：９）；１０．７ｍｇ、１．７２μｍｏｌ）及びデカフルオロビフェニルペプチドＡｃ−ＣＲＲＲＣＲＲＲＧ−ＯＨ（５．９ｍｇ、２．６４ｕｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）、ＤＭＳＯ中のＨＡＴＵ（６．６μＬ、２．６４μｍｏｌ、０．４Ｍ）、及びＤＩＰＥＡ（２．３μＬ、１３．２μｍｏｌ）を添加する。チューブの内容物を混合し、室温で２時間、放置する。水（８ｍＬ）で得られた混合物を希釈し、連続的に、弱陽イオン交換（ＣＭセファロース）及び固体相抽出（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ  ３００Ｍ）を行う。得られた生成物をＬＣ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析し、凍結乾燥し、ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲート（９．８ｍｇ、１．２６μｍｏｌ、７３％収率）が与えられる。
【０１８７】
実施例４：環状ジスルフィドペプチドとのＰＭＯとのシングルポットコンジュゲーション、続いてペプチドステープリングのためのプロトコール
【化１０９】
2018521970.tif 000113
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＰＭＯ（８５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１ｅｑ；核酸塩基配列（Ｒ２）：ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号：９））、ペプチド（Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨまたはＡｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ、３７ｍｇ、それぞれジスルフィドブリッジを有する、２ｅｑ）及びＨＡＴＵ（８ｍｇ、２ｅｑ）の溶液にジイソプロピルエチルアミン（９μＬ、５ｅｑ）を添加する。室温で５時間、反応物を撹拌する。ＤＭＳＯ溶液（１ｍＬ、５ｅｑ）中の５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＤＭＳＯ溶液（１ｍＬ、５ｅｑ）中の５０ｍＭのトリスを添加後、続いてヘキサフルオロベンゼン（６０μＬ、２５ｅｑ）を添加し、さらに５時間、反応溶液を撹拌する。弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−セファロース）、続いて固体相抽出（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ３００Ｍ）によって脱塩し、最終的に凍結乾燥して、所望の生成物を得る。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ）：計算値：９９７５；実測値：９９７６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１８８】
実施例５：ＨｅＬａ細胞アッセイ
図１中のグラフ（表３も参照）が、ｙ軸に、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターによってそれぞれの個体細胞から読み取られ、プロセッシングソフトウエアによって合計されるｅ−ＧＦＰタンパク質緑色蛍光放射の「平均蛍光強度」を示す。緑色蛍光シグナル棒の高さは、細胞が試験化合物で処理される、または処理されないにかかわらず、ＨｅＬａ−６５４細胞の核中で生じるエキソンスキッピングのレベルに基づいて異なる強度を示す。シグナル強度または棒の大きさは、また、細胞摂取（すなわち、細胞中へのデリバリー）の有効性に対応する。ｘ軸は、さまざまな異なる治療計画で試験される試験化合物を示す。さまざまな治療計画は、経時的なＨｅＬａ−６５４細胞の連続処理、または、試験化合物を細胞とインキュべートし、その後、一定時間（３時間）後に細胞から洗い落とし、新鮮な試験化合物非含有培地を添加するパルスチェイス処理を含む。
【０１８９】
結果：非コンジュゲートＰＭＯ及び未処理細胞のベースライン活性が、示される。本開示のペプチド／ＰＭＯ（ＰＰＭＯ）コンジュゲート全てが、１）非コンジュゲートＰＭＯ、及び２）未処理細胞（緑色蛍光バックグラウンドシグナルを示す）より細胞摂取が多いことを示す。本発明のペプチド／ＰＭＯコンジュゲート及びバックグラウンドまたは非コンジュゲート−ＰＭＯの間の蛍光強度のこの差は、ステープルペプチド／ＰＭＯコンジュゲートの有意な薬理学的活性を示す。
【０１９０】
それぞれの場合で、ＰＭＯは、以下の構造：
【化１１０】
2018521970.tif 000114
であり、核酸塩基配列（Ｒ２のそれぞれの出現が、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴから選択される核酸塩基から独立して選択されることを含む）が、ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号：９）である。
【表３】
2018521970.tif 000115
【０１９１】
ＰＰＭＯ  ３は、以下の構造：
【化１１１】
2018521970.tif 000116
を指し、核酸塩基配列（Ｒ２のそれぞれの出現が、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴから選択される核酸塩基から独立して選択されることを含む）が、ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号：９）である。
【０１９２】
ＰＰＭＯ  ４は、以下の構造：
【化１１２】
2018521970.tif 000117
を指し、核酸塩基配列（Ｒ２のそれぞれの出現が、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴから選択される核酸塩基から独立して選択されることを含む）が、ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号：９）である。
【０１９３】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質及びエキソンスキッピング
以下に記載されるとおり、マウス５匹の１４群それぞれ（計７０マウス；６５ｍｄｘ、５ｗｔ）を処理し、その後、ジストロフィンタンパク質及びエキソンスキッピングについて分析した。
【０１９４】
尾静脈注入によってマウスに２００μＬボーラスの化合物を与え、その後、注入後８日に安楽死させた。四頭筋、横隔膜、心臓及び脳組織（個々の構造）を採集し、溶解し、通常のウエスタンブロットを用いてジストロフィンタンパク質について分析し、ＲＴ−ＰＣＲ及びキャリパーを用いてエキソンスキッピングについて分析した（図２〜７を参照）。
【０１９５】
ｍＲＮＡ及びタンパク質リモデリングをもたらすｉｎ  ｖｉｖｏでの本開示の化合物の実施形態の能力について、これらを試験した。当該事象では、これらの試験した化合物が、それぞれＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロットによって示されるとおり、エキソン２３スキッピング及びジストロフィンタンパク質発現を実質的に増大させるｍｄｘマウス中の活性を示した。ｍｄｘマウスに生理食塩水を投与した陰性対照実験のバックグラウンド、本質的にゼロのエキソン２３スキッピング及びジストロフィンを生成した状態に対して測定される場合、この活性が、特に明らかである（図４Ｄ、５Ｃ、５Ｄ、６Ｄ、７Ｃ、及び７Ｄ）。公知の活性化合物Ａｃ−Ｒ６−Ｇｌｙ−Ｍ２３Ｄ（＋７−１８）（ＰＰＭＯ  ５）を投与した２匹の陽性対象、野生型マウス及びｍｄｘマウスを比較した場合、試験した化合物には明らかに活性があった。いくつかの場合では、活性が対照を越えた；例えば、ＰＰＭＯ  １１（表４）では、陽性対照化合物より低用量でエキソンスキッピング及びジストロフィン発現の反応よりはるかに大きな反応がもたらされた（図７Ｂ及び７Ｄ）。このため、試験した化合物が、７日ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイの文脈で、陽性薬理学的反応を誘発する条件に合った。
【０１９６】
これらの試験で用いられる本開示の化合物（ＰＰＭＯ）の実施形態は、式Ｖ：
【化１１３】
2018521970.tif 000118
に従った構造を有し；式中、
核酸塩基配列（Ｒ２のそれぞれの出現が、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴから選択される核酸塩基から独立して選択されることを含むが、５’−ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  Ｔ−３’（配列番号：１４）であり；
Ｒ１４は、表４に．定義されるとおりである。
【０１９７】
表４の化合物は、上記の実施例１〜４に従って調製した。
【表４】
2018521970.tif 000119
【０１９８】
ジストロフィンウエスタンブロットプロトコール：
１．−８０℃から組織を除去し、手で小片に切り刻み、組織型に応じて４００〜８００μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加した。
ａ．ＴＡ：４００μＬ、ＱＣ：８００μＬ、心臓：４００μＬ
ｂ．溶解緩衝液：ＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ＃８９９０１）及びプロテイナーゼ抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ＃０４６９３１２４００１）
【０１９９】
２．約１０個の２．０ｍｍジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ、Ｃａｔ＃１１０７９１２４ｚｘ）をチューブに添加し、組織をＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で以下のように溶解した：
ａ．５，０００ｒｐｍ、３０〜４０ｓ、氷上で２分間、冷却した。組織が完全に溶解するまで当該サイクルを繰り返した。
【０２００】
ジルコニアビーズの代わりに、金属ビーズ（３〜５ビーズ）を用いた。サイクル毎に３０００ｒｐｍ、２０ｓ（サイクル間に３〜５分間または触れられるほど冷たくなるまで氷上で冷却した）。
【０２０１】
３．溶解後、試料を１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄みを新鮮チューブに移し、ＢＣＡアッセイを実施し、タンパク質レベルを定量化した。
【０２０２】
４．ゲル電気泳動：
ａ．レーン毎にマーカーを入れ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｐ／ＮＬＣ５６９９）、１００μｇのタンパク質を入れ、３〜８％トリスアセテートゲル（ｍｉｄｉゲル、Ｂｉｏｒａｄ、ｃａｔ＃３４５−０１３０）上で、５０ｖで、５分間；１５０ｖで、１時間、その後、２００ｖで１．５時間、試料に実行した（７１ｋＤマーカーは、ゲルの底にあった）。
【０２０３】
５．転写：
４℃で一晩ウェット式転写（１６〜１８時間）、一定１００ｍＡ（約２５ｖ）、０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ、ｃａｔ＃１６２０２６１）。
【０２０４】
６．ＴＢＳＴ中で５分間、膜を洗浄し、１〜２時間、室温（ＲＴ）で、ＴＢＳＴ中の１０％ミルク（Ｂｉｏｒａｄ、ｃａｔ＃１７０−６４０４）中で遮断した。
【０２０５】
７．ＴＢＳＴで、２〜３回、ＰＶＤＦ膜を洗浄し、その後、一晩、４℃で、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ中の一次抗体とインキュべートした。
ａ．Ｄｙｓ２（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ｃａｔ＃ＮＣＬ−ＤＹＳ２）１：３０
ｂ．Ｄｙｓ１（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ｃａｔ＃ＮＣＬ−ＤＹＳ１）１：１０００
ｃ．Ｍａｎｄｙｓ８（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｄ８１６８）１：３０００。
【０２０６】
８．ＴＢＳＴで膜を洗浄し（各回１０分間、３回）、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ＃１７０６５１６、１：１００００）二次抗体を添加し、１時間、ＲＴでインキュべートし、その後、ＴＢＳＴで洗浄した（各回１０分間、３回）。
【０２０７】
９．Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  基質（Ｂｉｏｒａｄ）を添加し、５分間、ＲＴで、インキュべートし、その後、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ｔｏｕｃｈイメージングシステムで視覚化した。
【０２０８】
１０．０．２Ｎ  ＮａＯＨで、７分間、膜を除去し、その後、ＴＢＳＴ中で少なくとも１０分間、平衡させた。ＴＢＳＴ中の１０％ミルクで１時間、ＲＴで、ブロットを遮断した。
【０２０９】
１１．α−アクチニン２抗体（Ａｂｃａｍ、ウサギ、ｃａｔ＃ａｂ６８１６８、１：１５０００）を添加し、１時間、ＲＴで、インキュべートした。
【０２１０】
１２．ＴＢＳＴで洗浄し（各回１０分間、３回）、その後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ＃１７０６５１５、１：１００００）二次抗体と１時間、ＲＴで、インキュべートした。
【０２１１】
１３．広範囲にわたってＴＢＳＴで膜を洗浄し、その後、上記に記載されるとおり、画像化した。
【０２１２】
マウス組織のＲＮＡ抽出（Ｅｘｔｒａｔｉｏｎ）方法：
１．組織がよく溶解するまで、３０００ｒｐｍで、サイクル毎に２０、ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ及び金属ビーズと全組織小片（半分の四頭筋、半分の心臓、全体ＴＡ…）を均質化した（サイクル間に３〜５分間または触れられるほど冷たくなるまで氷上で冷却した）。新しい９６ウェルプレート中に５０〜１００μＬの全ライゼートを移し、同じ容積のＲＡ４緩衝液（ＧＥ  ＲＮＡｓｐｉｎキットから）と混合し、その後、残りの精製ステップのためにライゼート混合物を９６ウェルＲＮＡｓｐｉｎプレート中に入れた。キットプロトコールに従って、−８０℃で１年間、未使用ライゼート（ＲＡ１緩衝液中）を保存した。
【０２１３】
２．２分間、５２００ｇで試料を遠心分離した。ＲＮＡ結合プレートのそれぞれのウェルに５００μＬ  ＲＡ３を添加し、２分間、５２００ｇでプレートを遠心分離した。フロースルーを廃棄した。
【０２１４】
３．ＲＮＡ結合プレートのそれぞれのウェルに５００μＬ  ＲＡ２を添加することによって膜を洗浄し、２分間、５２００ｇで遠心分離した。
【０２１５】
４．それぞれのウェルに８００μＬ  ＲＡ３を添加し、２分間、５２００ｇで遠心分離した。
【０２１６】
５．それぞれのウェルに５００μＬ  ＲＡ４を添加し、１０分間、５２００ｇで遠心分離した。
【０２１７】
６．５０μＬ  ＲＮａｓｅ非含有水をそれぞれのウェルの底中にピペットで移し、確実に膜を完全に湿らせることによって、ＰＣＲプレート（コニカルウェルを有する）中に試料を溶離した。２分間、ＲＴで、試料をインキュべートし、５２００ｇで３分間、遠心分離した。ウェル中に残っている液体があった場合、さらに２分間、ＲＴで、試料をインキュべートし、５２００ｇで、３分間、再び遠心分離した。
【０２１８】
７．その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計上で、ＲＮＡ濃度を測定した。
【０２１９】
ＲＴ−ＰＣＲプロトコール：
ＲＴ−ＰＣＲのために用いられるプライマーは、以下のとおりであった：ジストロフィンアウターフォワード：５’−ＣＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：１０）；ジストロフィンアウターリバース：５’−ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：１１）；ジストロフィンインナーフォワード：５’−ＣＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１２）；及びジストロフィンインナーリバース：５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号：１３）。
【０２２０】
ＲＴ−ＰＣＲ及び一次増幅のために２５μＬ反応物（表５）を調製した。表６に従ってＲＴ−ＰＣＲプログラムを実施した。
【表５】
2018521970.tif 000120
【表６】
2018521970.tif 000121
【０２２１】
キャリパープロトコール：
ＲＴ−ＰＣＲが完了した後、２５ｕＬのＰＣＲ緩衝液を添加し、キャリパープレート中に計５０ｕＬの反応混合物を移した。製造者の推奨プロトコールに基づいてキャリパーＬａｂＣｈｉｐ生体分析を実施した。完全長ジストロフィン転写物からのＰＣＲ生成物は、エキソン２３スキップｍＲＮＡからの４４５ｂｐｓ、及び２３２ｂｐｓである。
【０２２２】
参照による組み入れ
本明細書全体を通じて記載された全参考文献（文献、発行された特許、公開された特許明細書、及び同時係属中の特許明細書を含む）の内容は、その全体が明白に本明細書に組み込まれる。別段定義しない限り、本明細書に用いられる全専門用語および科学用語は、当業者に一般に知られる意味と一致する。
【０２２３】
均等物
当業者であれば、通常の実験だけを用いて、本明細書に記載した本開示の特定の実施形態と均等である多くのものを認識する、または確かめることができる。かかる均  等物は、以下の特許請求に包含されることを意図している。
【図１】
2018521970.tif 000171
【図２−１】
2018521970.tif 000172
【図２−２】
2018521970.tif 000173
【図２−３】
2018521970.tif 000174
【図２−４】
2018521970.tif 000175
【図３−１】
2018521970.tif 000176
【図３−２】
2018521970.tif 000177
【図３−３】
2018521970.tif 000178
【図３−４】
2018521970.tif 000179
【図４−１】
2018521970.tif 000180
【図４−２】
2018521970.tif 000181
【図４−３】
2018521970.tif 000182
【図４−４】
2018521970.tif 000183
【図５−１】
2018521970.tif 000184
【図５−２】
2018521970.tif 000185
【図５−３】
2018521970.tif 000186
【図５−４】
2018521970.tif 000187
【図６−１】
2018521970.tif 000188
【図６−２】
2018521970.tif 000189
【図６−３】
2018521970.tif 000190
【図６−４】
2018521970.tif 000191
【図７−１】
2018521970.tif 000192
【図７−２】
2018521970.tif 000193
【図７−３】
2018521970.tif 000194
【図７−４】
2018521970.tif 000195
【配列表】
2018521970000001.app
【国際調査報告】
2018521970.tif 000196
2018521970.tif 000197