(57)【要約】  4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミドコア構造を有する新規小分子、及びグルコセレブロシダーゼ活性を調節するためにその使用を開示する。また、ゴーシェ病及びパーキンソン病等の神経学的疾患及び障害を含むグルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療する方法において投与され得る小分子を含む医薬組成物を開示する。小分子は、蛍光偏光を介してグルコセレブロシダーゼ活性の新規モジュレーターを同定するためのハイスループットスクリーニング法で使用するための蛍光プローブを調製する目的で、フルオロフォアを含有し得、又はフルオロフォアにコンジュゲートされ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iを有する化合物又はその塩又は溶媒和物：
【化１】
2018522872.tif 000069
（式中、
R1が、水素; C1-C6アルキル基; C2-C6アルケニル基; C2-C6アルキニル基; 1個の5員又は6員環を含む飽和又は不飽和の同素環又は複素環、2個の縮合5員環又は6員環を含む飽和又は不飽和の同素環又は複素環、又はアルキルチオフェンであり; 及び
R1が、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロ基、ハロアルキル基、ハロで任意で置換されたフェニル基、ハロで任意で置換されたベンジル基、カルボキシル基で任意で置換されたトリアゾール基、2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基、アミノ基、アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基、アルキル-アルキルオキシ(alkyoxy)-アミノ基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基、又はアルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基; イミダゾール基; フェノキシ基で任意で置換されたピリジル基; ピロリジニル基; ピペラジニル基、4-アルキルピペラジン基、4-ベンジルピペラジン基、アルキル-4-アルキルピペラジン基; ピペリジニル基; 4-アルキルピペリジン基; 4-N,N,ジアルキルアミノピペリジン基; モルホリニル基; アルキルモルホリン基; アミノ基; アルキルアミノ基; ジアルキルアミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アジド基; ヒドロキシル基; アルキルヒドロキシル基; アルキニルフェニル基; フェニルメタン基; オキシフェニル基; オキシカルボキシル基で、1つ又はそれ以上の位置で任意で置換され、又は
R1が、
【化２】
2018522872.tif 000070
から選択される式を有し、かつR3が、
【化３】
2018522872.tif 000071
から選択される式を有し、かつR4が、H、C1-C8アルキル、フェニル又はスクシンイミジルであり; 及び
R2が、C1-C6アルキル又はピリジニル（例えば、2-イル、3-イル又は4-イル）である）
【請求項２】
R1が、
【化４−１】
2018522872.tif 000072
【化４−２】
2018522872.tif 000073
【化４−３】
2018522872.tif 000074
【化４−４】
2018522872.tif 000075
【化４−５】
2018522872.tif 000076
【化４−６】
2018522872.tif 000077
【化４−７】
2018522872.tif 000078
【化４−８】
2018522872.tif 000079
【化４−９】
2018522872.tif 000080
【化４−１０】
2018522872.tif 000081
からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
式IAを有する請求項1に記載の化合物：
【化５】
2018522872.tif 000082
（式中、
R2が、水素、C1-C6アルキル基; C2-C6アルケニル基; C2-C6アルキニル基; C1-C6アルコキシ基;ハロ基; ハロアルキル基; フェニル基; ベンジル基; カルボン酸基で任意で置換されるトリアゾール基; 2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基; アミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基; イミダゾール基; ピロリジン基; ピペラジン基; 4-アルキルピペラジン基; 4-ベンジルピペラジン基; アルキル-4-アルキルピペラジン基; ピペリジン基; 4-アルキルピペリジン基; 4-N,N,ジアルキルアミノピペリジン基; モルホリン基; アルキルモルホリン基; アミノ基; アルキルアミノ基; ジアルキルアミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アジド基; ヒドロキシル基; アルキルヒドロキシル基; アルキニルフェニル基; フェニルメタン基; オキシフェニル基; 又はオキシカルボン酸基、である）
【請求項４】
式IBを有する請求項1に記載の化合物：
【化６】
2018522872.tif 000083
（式中、
R3が、カルボキシル基、2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基; アルキルアミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基、である）
【請求項５】
R1、R2及びR3のいずれかがフルオロフォアを含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
式IDを有する請求項1に記載の化合物：
【化７】
2018522872.tif 000084
（式中、
Xが、N又はSであり; 及び
R4、R5、R6及びR7が、それぞれ独立して、水素、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ及びハロゲンから選択される）
【請求項７】
請求項1に記載の化合物及び医薬担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
グルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、請求項7に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項９】
前記疾患又は障害が、神経学的疾患又は障害である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経学的疾患又は障害が、神経変性の疾患又は障害である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経変性の疾患又は障害が、ゴーシェ病である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経変性の疾患又は障害が、パーキンソン病である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
請求項5に記載の化合物を含む蛍光プローブ。
【請求項１４】
グルコセレブロシダーゼに結合する化合物をスクリーニングする方法であって、グルコセレブロシダーゼと請求項13に記載の蛍光プローブを接触させ、蛍光偏光を観察することを含む方法。
【請求項１５】
請求項1に記載の化合物に共有結合したグルコセレブロシダーゼを含む活性化グルコセレブロシダーゼ。
【請求項１６】
請求項15に記載の活性化グルコセレブロシダーゼ及び医薬担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
グルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療するための方法であって、請求項16に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記疾患又は障害が、神経学的疾患又は障害である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患又は障害が、神経変性の疾患又は障害である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経変性の疾患又は障害が、ゴーシェ病である、請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願との相互参照
本出願は、2015年７月1日に提出された米国仮特許出願第62/187,463号に35 U.S.C. §119(e)優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、グルコセレブロシダーゼ活性を調節する新規小分子の使用に関する。新規小分子は、置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミドコア構造、例えば、2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミドコア構造等を有し、及び小分子は、例えばゴーシェ病及びパーキンソン病等の神経変性疾患を含む異常なグロセレブロシダーゼ活性に関連する疾患及び障害を治療するために投与され得る。
【０００３】
β-グルコセレブロシダーゼとも呼ばれるグルコセレブロシダーゼ(EC 3.2.1.45)、β-グルコシダーゼ、D-グルコシル-N-アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ、又はGCaseは、グルコシルセラミダーゼ活性を有する酵素である。糖脂質代謝の中間体である化学グルコセレブロシドのβ-グルコシド結合を切断するには、グルコセレブロシダーゼが必要である。グルコセレブロシダーゼは、リソソームに局在し、グルコセレブロシダーゼ(GBA1)遺伝子の無効化突然変異は、リソソーム中の脂質の異常蓄積と関連する。
【０００４】
GBA1の突然変異によって引き起こされる遺伝的疾患は、ゴーシェ病及びパーキンソン病等の神経変性疾患を含む。ゴーシェ病は、GBA1遺伝子突然変異によって引き起こされる稀な遺伝病である。現在、1型ゴーシェ病の治療は、2週間ごとに行われる酵素補充療法（ERT）である。ERTは非常に高価であり、ニューロパシー型のゴーシェ病に有効ではない。GBA1の突然変異はまた、PDのリスクを増加させることによってパーキンソン病（PD）に関連する。GCaseを活性化するために、いわゆる「薬理学的シャペロン戦略」が以前に試みられてきた。しかしながら、薬理学的シャペロン戦略で使用された化合物のいずれも、おそらくGCaseの活性部位を標的化したため、GCaseを活性化することに成功しなかった。
【０００５】
本明細書において、グルコセレブロシダーゼ活性を調節する新規置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物を開示する。本明細書に開示されている置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物は、以前報告された非活性部位GCase阻害剤よりも優れた化学的及び物理的特性を有する(Goldin et al., WO、「グルコセレブロシダーゼ活性化剤としての置換ピラゾロピリミジン」、2010年12月、WO2012078855; 及びPatnaik et al.,「グルコセレブロシダーゼの非阻害性小分子シャペロンの発見、構造活性相関及び生物学的評価」、J. Med. Chem. 2012 Jun 28;55(1`2):5734-48、に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。これら開示されている4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物のより良好な化学的及び物理的特性は、極性表面積、溶解性、回転可能結合の数の増加、及び潜在的水素結合メンバー(members)の数の増加を含む。本研究における置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物のいくつかは、GCaseを高く活性化する可能性がある。例えば、置換された4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物のいくつかは、GCaseに共有結合し、野生型GCaseを15〜30倍まで活性化する。このようにして新規化合物によって活性化されたGCaseは、非活性化GCaseより酸性環境においてより安定であることが観察される。さらに、蛍光偏光アッセイにおいて強い結合親和性を示すピロロピリミジン蛍光プローブを作製するため、置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物が、フルオロフォン(fluorophones)にコンジュゲートされ得ることを見出した。これは、これらのピロロピリミジン蛍光プローブがGCase活性のさらなるモジュレーターを同定するためにハイスループットスクリーニング法に利用され得ることを示唆する。
【発明の概要】
【０００６】
置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミドコア構造を有する新規小分子及びグルコセレブロシダーゼ活性を調節するための小分子の使用が開示される。新規小分子は、好ましくはグルコセレブロシダーゼに結合し、任意で共有結合し、グルコセレブロシダーゼを活性化することによりグルコセレブロシダーゼ活性を調節する。新規小分子は、小分子を含む医薬組成物として、又は小分子に結合された活性化グルコセロブロシダーゼを含む医薬組成物として製剤化され得、この組成物は、ゴーシェ病及びパーキンソン病などの神経学的疾患及び障害を含むグルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療及び/又は予防する方法で投与され得る。開示された小分子はまた、フルオロフォアを含み得、又は蛍光プローブを生成するためにフルオロフォアにコンジュゲートされ得る。本明細書で企図される蛍光プローブは、蛍光偏光を示し得、そしてグルコセレブロシダーゼの新規なモジュレーターを同定するためのハイスループットスクリーニング法において利用され得る。本明細書で企図される蛍光プローブは、蛍光偏光を示し得、及びグルコセレブロシダーゼの新規モジュレーターを同定するためハイスループットスクリーニング方法において利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】GCase活性化剤及びプローブの構造。
【図２】A）4MU-Glc基質; B）赤色基質を用いたGCase活性化剤1、2及び4の用量反応曲線。
【図３】プローブ3のためのFP曲線及び化合物1及び2を用いての競合アッセイ。
【図４】GCaseは、A）4MU-β-glc基質; B）Res-β-glc基質、及び(c)天然基質について時間依存的にプローブ4によって活性化された。
【図５】wt及び予備活性化されたGCaseは、用量依存的にサポシンCによって活性化された。
【図６】pH 4.7緩衝液及びヒト血漿中の活性酵素及びwt酵素の酵素活性。A）pH4.7緩衝液中での4MU-β-glc基質酵素活性アッセイによって試験した活性GCase対wt GCaseの酵素活性; B）pH4.7緩衝液中での酵素活性の標準化; C）ヒト血漿中の4MU-β-glc基質酵素活性アッセイにより試験した活性GCase対wt GCaseの酵素活性; D）ヒト血漿中の酵素活性の標準化。
【図７】細胞アップテイクアッセイ（U937マクロファージ）。A）4MU-β-glc基質酵素活性アッセイによって試験した活性GCase対wt GCaseの酵素活性; B）ウエスタンブロット：内因性、活性化及びwt GCase。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
開示される主題は、以下に定義される用語を利用してさらに説明され得る。
【０００９】
別段の指定がない限り、又は本明細書によって示されない限り、用語「a」、「an」及び「the」は、「1つ又はそれ以上」を意味する。例えば、「グルコセレブロシダーゼ活性のモジュレーター」(a modulator of glucocerebrosidase activity)は、「グルコセレブロシダーゼ活性の1つ又はそれ以上のモジュレーター(one or more modulators of glucocerebrosidase activity)」を意味すると解釈されるべきである。
【００１０】
本明細書で使用する「約」、「およそ」、「実質的に」及び「有意に」は、当業者によって理解され、それらが使用される状況によってある程度変化する。当業者には、それが使用される明細書を考慮して明確ではない用語の使用がある場合、「約」及び「およそ」は特定の用語のプラス又はマイナス≦10％を意味し、「実質的に」及び「有意に」は特定の用語のプラス又はマイナス>10％を意味する。
【００１１】
本明細書で使用される場合、用語「含む(include)」及び「含む(including)」は、用語「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」と同じ意味を有する。用語「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」は、特許請求の範囲に列挙された構成要素にさらに追加の構成要素を含めることを可能にする「開放」暫定用語であると解釈されるべきである。「からなる(consist)」及び「からなる(consisting of)」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素以外の追加の構成要素を含むことを許さない「閉鎖」の暫定用語であると解釈されるべきである。「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」という用語は、部分的に閉鎖されており、主張される主題の性質を根本的に変えない追加の成分のみを含むことを可能にすると解釈されるべきである。
【００１２】
「被験体」、「患者」及び「個体」という用語は、本明細書では交換可能で使用することができる。被験体は、ヒト被験体であり得る。被験体は、異常なグルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾病又は障害を有するか又は獲得するリスクがあるヒト被験体を指し得る本明細書中で使用される場合、用語「異常な」は、正常な健康な被験体と比較して、より高い又はより低い活性を意味する。特定の実施形態において、異常なグルコセレブロシダーゼを示す被験体は、異常なグルコセレブロシダーゼ活性に関連するゴーシェ病及びパーキンソン病等の変性神経学的疾患又は障害を含む神経学的疾患若しくは障害を罹患しているか、又はその危険性がある。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「有効量」という語句は、そのような治療を必要とするかなりの数の患者において薬物が投与される特定の薬理学的応答を提供する薬物投与量を意味するものとする。特定の例において特定の患者に投与される薬物の有効量は、当業者によって治療上有効な量であるとみなされても、本明細書に記載の状態/疾患の治療に常に効果的であるとは限らない。
【００１４】
本明細書で意図される用語「アルキル」は、その全ての異性体形態の直鎖又は分枝アルキル基を含む。同様に、「アルコキシ」という用語は、酸素原子（すなわち、「アルキル-O-*」として表される基）を介して結合している任意のアルキル基を指す。本明細書で使用されるアスタリスク「*」は、任意のラジカル基又は置換基の結合点を示すために使用される。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、活性の低下若しくは阻害、及び/又は活性の増大若しくは上昇を意味する。例えば、グルコセレブロシダーゼ活性を調節することは、グルコセレブロシダーゼ活性を低下若しくは阻害すること、及び/又はグルコセレブロシダーゼ活性を増加若しくは増強することを意味する。本明細書中に開示される化合物は、例えば、阻害剤、シャペロン、又は活性化剤としてグルコセレブロシダーゼ活性を調節するために投与され得る。
【００１６】
本明細書に開示される化合物は、「4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物」と称され得る。化合物又は塩又はその溶媒和物は、以下の式Iを有するものとして記載され得る：
【化１】
2018522872.tif 000002
（式中、
R1は、水素; C1-C6アルキル基; C2-C6アルケニル基; C2-C6アルキニル基; 1個の5員又は6員環を含む飽和又は不飽和の同素環又は複素環; 2個の縮合5員又は6員環を含む飽和又は不飽和の同素環又は複素環、又はアルキルチオフェン（例えば、2-メチルチオフェン）であり; 及びR1は、C1-C6アルキル基; C1-C6アルコキシ基; ハロ基; ハロアルキル基; フェニル基（任意でハロで置換される）; ベンジル基（任意でハロで置換される）; トリアゾール基（任意でカルボキシル基で置換される）; 2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基; アミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アルキル-アルキルオキシ(alkyoxy)-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基; 又はアルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基; イミダゾール基; ピリジル基（例えば、2-イル、3-イル又は4-イル、任意でフェノキシで置換される）; ピロリジニル基; ピペラジニル基; 4-アルキルピペラジン基; 4-ベンジルピペラジン基; アルキル-4-アルキルピペラジン基; ピペリジニル基; 4-アルキルピペリジン基; 4-N,N,ジアルキルアミノピペリジン基; モルホリニル基; アルキルモルホリン基; アミノ基; アルキルアミノ基; ジアルキルアミノ基; アルキル-N,N,ジアルキルアミノ基; アジド基; ヒドロキシル基; アルキルヒドロキシル基; アルキニルフェニル基; フェニルメタン基; オキシフェニル基; オキシカルボキシル基で、1つ又はそれ以上の位置で任意で置換され; 又はR1は、
【化２】
2018522872.tif 000003
から選択される式を有し、及びR3は、
【化３】
2018522872.tif 000004
から選択される式を有し、及びR4は、H、C1-C8アルキル、フェニル、又はスクシンイミジル(例えば、N-スクシンイミジル)であり; 及び
R2は、C1-C6アルキル又はピリジニル（例えば、2-イル、3-イル又は4-イル）である)
R2が、特にメチルである化合物が開示され、2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物として参照され得る。R2が、特に3-イル-ピリジンである化合物が開示され、2-（ピリジン-3-イル）-4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド化合物として参照され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、R1は、
【化４−１】
2018522872.tif 000005
【化４−２】
2018522872.tif 000006
【化４−３】
2018522872.tif 000007
【化４−４】
2018522872.tif 000008
【化４−５】
2018522872.tif 000009
【化４−６】
2018522872.tif 000010
【化４−７】
2018522872.tif 000011
【化４−８】
2018522872.tif 000012
【化４−９】
2018522872.tif 000013
【化４−１０】
2018522872.tif 000014
からなる群から選択される。ここで、アスタリスク（*）は、R1の8-カルボキシイミド窒素原子への結合点を示す。
【００１８】
いくつかの実施形態において、開示化合物は、式IAを有する:
【化５】
2018522872.tif 000015
（式中、
R5は、水素; C1-C6アルキル基; C2-C6アルケニル基; C2-C6アルキニル基; C1-C6アルコキシ基; ハロ基; ハロアルキル基; フェニル基; ベンジル基; トリアゾール基（カルボキシル基、2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基、アミノ基、アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基、アルキル-アルキルオキシ-アミノ基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基、アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基、又はアルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基、で任意で置換される）; イミダゾール基; ピロリジン基; ピペラジン基; 4-アルキルピペラジン基; 4-ベンジルピペラジン基; アルキル-4-アルキルピペラジン基; ピペリジン基; 4-アルキルピペリジン基; 4-N,N,ジアルキルアミノピペリジン基; モルホリン基; アルキルモルホリン基; アミノ基; アルキルアミノ基; ジアルキルアミノ基; アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アジド基; ヒドロキシル基; アルキルヒドロキシル基; アルキニルフェニル基; フェニルメタン基; オキシフェニル基; 又はオキシカルボン酸、である。）
【００１９】
いくつかの実施形態において、開示化合物は、式IBを有する:
【化６】
2018522872.tif 000016
（式中、
R6は、カルボキシル基、2,5-ジオキソピロリジニル-1-イル-カルボキシレート基; アルキルアミノ基;アルキル-N,N-ジアルキルアミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-アミノ基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-モルホリン基 ;アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-1-アルキルピロリジン基; アルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロヘキシル基; 及びアルキル-アルキルオキシ-アルコキシ-カルボキサミド-アルキル-シクロブチル基である。）
【００２０】
開示される化合物は、フルオロフォアを含み得、又はフルオロフォアにコンジュゲートされ得る。開示される化合物のいくつかの実施形態において、置換基R1、R2、R3、R4、R5及びR6のいずれかは、蛍光偏光アッセイにおける使用に適したフルオロフォアを含む、フルオロフォンを含み得る。本明細書で使用される「フルオロフォア」は、蛍光を発するために（例えば、光又は化学反応によって）励起され得る化学基である。いくつかの適切なフルオロフォアは、光によって励起されて燐光を放出することができる。本明細書中で使用される場合、「色素」はフルオロフォアを含み得る。本明細書に記載のジチオ化合物は、限定されないが、以下から選択されるフルオロフォアを含むことができる: 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-メチルウンベリフェロン; 5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン; 5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）; 5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）; 5-FAM（5-カルボキシフルオレセイン）; 5-HAT（ヒドロキシトリプタミン）; 5-ヒドロキシトリプタミン（HAT）; 5-ROX（カルボキシ-X-ローダミン）; 5-TAMRA（5-カルボキシテトラメチルローダミン）; 6-カルボキシローダミン6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-アミノ-4-メチルクマリン; 7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）; 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン; 9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン; ABQ; 酸性フクシン; ACMA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）; アクリジンオレンジ; アクリジンレッド; アクリジンイエロー; アクリフラビン; アクリフラビンフオイルゲンSITSA; Alexa Fluor 350(商標); Alexa Fluor 430(商標); Alexa Fluor 488(商標); Alexa Fluor 532(商標); Alexa Fluor 546(商標); Alexa Fluor 568(商標); Alexa Fluor 594(商標); Alexa Fluor 633(商標); Alexa Fluor 647(商標); Alexa Fluor 660(商標); Alexa Fluor 680(商標); アリザリンコンプレクソン; アリザリンレッド; アロフィコシアニン（APC）; AMC; AMCA-S; AMCA（アミノメチルクマリン）; AMCA-X; アミノアクチノマイシンD; アミノクマリン; アミノメチルクマリン（AMCA）; アニリンブルー; アントラシルステアレート; APC（アロフィコシアニン）; APC-Cy7; APTS; アストラゼンブリリアントレッド4G; アストラゾンオレンジR; アストラゾンレッド6B; アストラゾンイエロー7GLL; アタブリン; ATTO-TAG(商標) CBQCA; ATTO-TAG(商標) FQ; オーラミン; オーロフォスフィンG; オーロフォスフィン; BAO 9（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）; ベルベリン硫酸塩; ベータラクタマーゼ; BFPブルーシフトGFP（Y66H）; 青色蛍光タンパク質; BFP/GFP FRET; ビーマン; ビスベンズアミド; ビスベンズイミド（ヘキスト）; ブランコファーFFG; ブランコファーSV; BOBO(商標)-1; BOBO(商標) -3; ボディパイ492/515; ボディパイ493/503; ボディパイ500/510; ボディパイ505/515; ボディパイ530/550; ボディパイ542/563; ボディパイ558/568; ボディパイ564/570; ボディパイ576/589; ボディパイ581/591; ボディパイ630/650-X; ボディパイ650/665-X; ボディパイ665/676; ボディパイFL; ボディパイFL ATP; ボディパイFl-セラミド; ボディパイR6G SE; ボディパイTMR; ボディパイTMR-X コンジュゲート; ボディパイTMR-X, SE; ボディパイTR; ボディパイTR ATP; ボディパイTR-X SE; BO-PRO(商標)-1; BO-PRO(商標)-3; ブリリアントスルフォフラビンFF; カルセイン; カルセインブルー; カルシウムクリムゾン(商標); カルシウムグリーン; カルシウムオレンジ; カルコフロールホワイト; カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX); カスケードブルー(商標); カスケードイエロー; カテコールアミン; CCF2 (GeneBlazer); CFDA; CFP-シアン蛍光タンパク質; CFP/YFP FRET; クロロフィル; クロモマイシンA; CL-NERF (Ratio Dye, pH); CMFDA; コエレンテラジン f; コエレンテラジンfcp; コエレンテラジンh; コエレンテラジンhcp; コエレンテラジンip; コエレンテラジンn; コエレンテラジンO; クマリンファロイジン; C-フィコシアニン; CPMメチルクマリン; CTC; CTC ホルマザン; Cy2(商標); Cy3.1 8; Cy3.5(商標); Cy3(商標); Cy5.1 8; Cy5.5(商標); Cy5(商標); Cy7(商標); Cyan GFP; サイクリックAMPフルオロセンサー(FiCRhR); ダブシル; ダンシル; ダンシルアミン; ダンシルカダベリン; ダンシルクロライド; ダンシルDHPE; ダンシルフルオライド; DAPI; ダポキシル; ダポキシル2; ダポキシル3; DCFDA; DCFH (ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート); DDAO; DHR (ジヒドロローダミン123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (非ratio); DiA (4-Di-16-ASP); ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH); DiD - 親油性トレーサ; DiD (DiIC18(5)); DIDS; ジヒドロローダミン123 (DHR); DiI (DiIC18(3)); ジニトロフェノール; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DiIC18(7)); DNP; ドーパミン; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; エオシン; エリスロシン; エリスロシンITC; 臭化エチジウム; エチジウムホモダイマー-1 (EthD-1); ユークリシン; ユーコライト; ユーロピウム(III)クロライド; EYFP; ファストブルー; FDA; フオイルゲン(パラローザニリン); FITC; フラゾオレンジ; Fluo-3; Fluo-4; フルオレセイン(FITC); フルオレセインジアセテート; フルオロ-エメラルド; フルオロ-ゴールド(ヒドロキシスチルバミジン); フルオ-ルビー; フルオX; FM 1-43(商標); FM 4-46; フラレッド(商標); フラレッド(商標)/フルオ-3; フラ-2; フラ-2/BCECF; ジェナクリルブリリアントレッドB; ジェナクリルブリリアントイエロー10GF; ジェナクリルピンク3G; ジェナクリルイエロー5GF; GeneBlazer (CCF2); GFP (S65T); GFPレッドシフテッド(rsGFP); GFPワイルドタイプ, 非-UV励起(wtGFP); GFPワイルドタイプ, UV 励起(wtGFP); GFPuv; グロキサリック酸; グラニュラーブルー; ヘマトポルフィリン; ヘキスト33258; ヘキスト33342; ヘキスト34580; HPTS; ヒドロキシクマリン; ヒドロキシスチルバミジン(フルオロゴールド); ヒドロキシトリプタミン; インド-1; インドジカルボシアニン(DiD); インドトリカルボシアニン(DiR); イントラホワイトCf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; ラウロダン; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); ロイコファーPAF; ロイコファーSF; ロイコファーWS; リサミンローダミン; リサミンローダミンB; カルセイン/エチジウムホモダイマー; LOLO-1; LO-PRO-1; ルシファーイエロー; ライソトラッカーブルー; ライソトラッカーブルー-ホワイト; ライソトラッカーグリーン; ライソトラッカーレッド; ライソトラッカーイエロー; ライソセンサーブルー; ライソセンサーグリーン; ライソセンサーイエロー/ブルー; マググリーン; マグダラレッド(フロキシンB); マグ-フラレッド; マグ-フラ-2; マグ-フラ-5; マグ-インド-1; マグネシウムグリーン; マグネシウムオレンジ; マラカイトグリーン; マリナブルー; マキシロンブリリアントフラビン10 GFF; マキシロンブリリアントフラビン8 GFF; メロシアニン; メトキシクマリン; マイトトラッカーグリーンFM; マイトトラッカーオレンジ; マイトトラッカーレッド; ミトラマイシン; モノブロモビマン; モノブロモビマン(mBBr-GSH); モノクロロビマン; MPS (メチルグリーンピロニンスチルベン); NBD; NBDアミ��; ナイルレッド; ニトロベンゾキサジドール; ノルアドレナリン; ヌクレアファストレッド; ヌクレアイエロー; ナイロサンブリリアントイアビンE8G; オレゴングリーン; オレゴングリーン488-X; オレゴングリーン(商標); オレゴングリーン(商標)488; オレゴングリーン(商標)500; オレゴングリーン(商標)514; パシフィックブルー; パラローザニリン(フオイルゲン); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-テキサスレッド[レッド 613]; フロキシンB(マグダラレッド); ホーワイトAR; ホーワイトBKL; ホーワイトRev; ホーワイトRPA; ホスフィン3R; フィコエリトリンB [PE]; フィコエリトリンR [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; ポントクロムブルーブラック; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; プリムリン; プロシオンイエロー; ヨウ化プロピジウム(PI); PyMPO; ピレン; ピロニン; ピロニンB; パイロザルブリリアントフラビン7GF; QSY 7; キナクリンマスタード; レッド613 [PE-テキサスレッド]; レゾルフィン; RH 414; ロード-2; ローダミン; ローダミン110; ローダミン123; ローダミン5 GLD; ローダミン6G; ローダミンB; ローダミンB 200; ローダミンBエキストラ; ローダミンBB; ローダミンBG; ローダミングリーン; ローダミンファリシジン; ローダミンファロイジン; ローダミンレッド; ローダミンWT; ローズベンガル; R-フィコシアニン; R-フィコエリトリン(PE); RsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; サファイアGFP; SBFI; セロトニン; セブロンブリリアントレッド2B; セブロンブリリアントレッド4G; セブロンブリリアントレッドB; セブロンオレンジ; セブロンイエローL; sgBFP(商標); sgBFP(商標)(スーパーグローBFP); sgGFP(商標); sgGFP(商標)(スーパーグローGFP); SITS; SITS (プリムリン); SITS (スチルベンイソチオスルフォン酸); SNAFLカルセイン; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARFカルセイン; SNARF1; ソディウムグリーン; スペクトラムアクア; スペクトラムグリーン; スペクトラムオレンジ; スペクトラムレッド; SPQ (6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル) キノリニウム); スティルベン; スルホローダミンBキャンC; スルホローダミンGエキストラ; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOXブルー; SYTOXグリーン; SYTOXオレンジ; テトラサイクリン; テトラメチルローダミン(TRITC); テキサスレッド(商標); テキサスレッド-X(商標)コンジュゲート; チオジカルボシアニン(DiSC3); チアジンレッドR; チアゾールオレンジ; チオフラビン5; チオフラビンS; チオフラビンTCN; チオライト; チオゾールオレンジ; チノポルCBS (カルコフローホワイト); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; トリカラー(PE-Cy5); TRITC テトラメチルローダミンイソチオシアネート; トゥルーブルー; TruRed; ウルトラライト; ウラニンB; ユビテックスSFC; wt GFP; WW 781; X-ローダミン; XRITC; キシレンオレンジ; Y66F; Y66H; Y66W; イエローGFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; 及びYOYO-3。本明細書で使用される「フルオロフォア」は、フルオロフォアの塩を含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、開示の化合物は式IDを有する:
【化７】
2018522872.tif 000017
（式中、
Xは、N又はSであり; 及び
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立して、水素、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ及びハロゲンから選択される。）
【００２２】
開示される化合物は、リンカーを介して結合された2個の置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド基を含み得る。カルボキサミド基の間のリンカーを介して結合した2個の置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド基を含む化合物は、以下のように例示することができる:
【化８】
2018522872.tif 000018
【００２３】
いくつかの実施形態において、リンカーを介して結合された2個の置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド基を有する開示された化合物は、以下のように式IIを有するものとして記載され得る:
【化９】
2018522872.tif 000019
【００２４】
いくつかの実施形態において、リンカーを介して結合された2個の置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド基を有する開示された化合物は、以下のように式IIIを有するものとして記載され得る:
【化１０】
2018522872.tif 000020
【００２５】
いくつかの実施形態において、リンカーを介して結合された2個の置換4-メチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド基を有する開示された化合物は、以下のように式IVを有するものとして記載され得る:
【化１１】
2018522872.tif 000021
【００２６】
本明細書に開示される化合物は、好ましくはグルコセレブロシダーゼの活性を調節する。調節には、グルコセレブロシダーゼ活性を阻害又は減少させることが含まれ得る。調節には、グルコセレブロシダーゼ活性の活性化又は増加も含まれ得る。グルコセレブロシダーゼ活性は、本明細書中に提供される実施例に開示される方法を含む、当該分野で公知の方法及び本明細書に開示される方法を用いて評価され得る。いくつかの実施形態において、化合物は、コントロールと比較してグルコセレブロシダーゼ活性を減少又は増加させる（例えば、少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、又はそれ以上）。他の実施形態において、グルコセレブロシダーゼの阻害又は活性化に関する化合物のAC50値又はIC50値を決定することができ、好ましくは、化合物は、約10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM、0.005μM、又は0.001μM未満のAC50値又はIC50値を有する。
【００２７】
本明細書に開示される化合物（例えば、式Iの化合物）は、いくつかのキラル中心を有してもよく、立体異性体、エピマー及び鏡像異性体が意図される。前記化合物は、1つ又はそれ以上のキラル中心に関して光学的に純粋であり得る（例えば、キラル中心のいくつか又は全てが完全にS立体配置であってもよく;キラル中心のいくつか又はすべてが完全にR立体配置にあってもよいなど）。付加的に又は代替的に、1つ又はそれ以上のキラル中心は、立体配置の混合物として存在し得る(例えば、R立体配置及びS立体配置のラセミ体又は他の混合物)。実質的に精製された立体異性体、エピマー、又は鏡像異性体、又は類似体若しくはその誘導体を含む組成物が、本明細書において意図される（例えば、少なくとも約90％、95％、又は99％の純粋な立体異性体、エピマー又は鏡像異性体を含む組成物）。本明細書中で使用される場合、1つ又はそれ以上のキラル中心で配向を特定しない式は、すべての配向及びその混合物を包含することを意味する。
【００２８】
本明細書中に開示される組成物及び方法において使用される化合物は、医薬組成物として投与され得、したがって、該化合物を組み込む医薬組成物は、本明細書に開示される組成物の実施形態であると考えられる。このような組成物は、薬学的に許容される任意の物理的形態をとることができる。例示的には、それらは、経口投与される医薬組成物であり得る。そのような医薬組成物は、有効量の開示化合物を含み、有効量は、投与される化合物の1日用量に関連する。各投薬単位は、所与の化合物の1日用量を含み得るか、又は各投薬単位は、1日用量の一部、例えば、用量の半分又は3分の1を含み得る。各投薬単位に含まれる各化合物の量は、部分的には、治療のために選択される特定の化合物の特徴及び所与の兆候などの他の因子に依存し得る。本明細書中に開示される医薬組成物は、周知の手順を使用することにより、患者への投与後に活性成分の迅速、持続、又は遅延放出を提供するように製剤化され得る。
【００２９】
本明細書に開示される方法に従って使用するための化合物は、単一の化合物又は化合物の組み合わせとして投与され得る。例えば、グルクロセロブロシダーゼ活性を調節する化合物は、単一の化合物として、又はグロセレブロシダーゼ活性を調節する若しくは異なる薬理活性を有する別の化合物と組み合わせて投与され得る。
【００３０】
上記に示したように、化合物の薬学的に許容される塩が意図され、開示された方法において利用され得る。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、生物に対して実質的に無毒である化合物の塩を指す。典型的な薬学的に許容される塩には、本明細書に開示される化合物と薬学的に許容される無機若しくは有機酸又は有機若しくは無機塩基との反応によって調製される塩が含まれる。そのような塩は、酸付加塩及び塩基付加塩として知られている。当業者であれば、本明細書中に開示される化合物のほとんど又は全てが塩を形成することができ、その医薬品の塩形態は、遊離酸又は遊離塩基よりもより容易に結晶化及び精製されるため、しばしば一般的に使用される。
【００３１】
酸付加塩を形成するために一般的に使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、及び同様のもの等の無機酸、例えばp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、及び同様のもの等の有機酸を含むことができる。適切な薬学的に許容される塩の例は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸、ピロリン酸、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、塩酸塩、二塩酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオレート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-ジオエート、ヘキシン-1,6-ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブチレート、クエン酸塩、乳酸塩、α-ヒドロキシブチレート、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホネート、ナフタレン-1-スルホネート、ナフタレン-2-スルホネート、マンデレート、及び同様のものを含むことができる。
【００３２】
塩基付加塩には、無機塩基、例えばアンモニウム又はアルカリ又はアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、及び同様のもの等から誘導されるものを含む。このような塩の調製に有用な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び同様のものを含む。
【００３３】
本明細書中に開示される化合物のいずれかの塩の一部を形成する特定のカウンターイオンは、塩全体が薬理学的に許容され、対イオンが塩全体に望ましくない特性をもたらさない限り、化合物の活性にとって重要ではない可能性がある。望ましくない品質は、望ましくない溶解度又は毒性を含み得る。
【００３４】
化合物の薬学的に許容されるエステル及びアミドもまた、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用され得る。適したエステルの例は、アルキル、アリール、及びメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ドデシルエステル、ベンジルエステル等のアラルキルエステル、及び同様のものを含む。適したアミドの例は、非置換アミド、一置換アミド、メチルアミド、ジメチルアミド、メチルエステルアミド等の二置換アミド、及び同様のものを含む。
【００３５】
加えて、本明細書中に開示される方法は、化合物又はその塩、エステル及び/又はアミドの溶媒和化合物形態を用いて実施され得る。溶媒和化合物形態は、エタノール溶媒和物、水和物、及び同様のもの等を含み得る。
【００３６】
医薬組成物は、グルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療する方法において利用され得る。例えば、医薬組成物は、ゴーシェ病及びパーキンソン病などの変性神経学的疾患若しくは障害を含む神経学的疾患又は障害を有するか、又はその危険性がある患者を治療するために利用され得る。適切な患者には、例えば、ヒト及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）又は他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、及びマウス）等の哺乳動物を含む。適切なヒト患者は、例えば、ゴーシェ病及びパーキンソン病等の変性神経学的疾患又は障害を含む、神経学的疾患又は障害を有するか又は発症する危険性があると以前に判定された者を含み得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「治療する(treating)」又は「治療する(to treat)」という用語は、症状を緩和し、一時的又は恒久的な基準で結果的な症状の原因を排除し、及び/又は症状の予防又は遅延、又は指定された疾患又は障害の結果として生じる症状の進行又は重症度を逆転させるために使用することができることをそれぞれ意味する。このように、本明細書に開示される方法は、治療的投与及び予防的投与の両方を包含する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、診断又は治療下の被験体において所望の効果を提供する、被験体への単回投与又は複数回投与時の化合物の量又は投与量を指す。開示された方法は、突然変異形態のスーパーオキシドジスムターゼの発現を阻害する有効量の化合物を投与することを含むスーパーオキシドジスムターゼ突然変異に関連する疾患又は障害を治療するための有効量の開示された化合物（例えば、医薬組成物中に存在するもの）を投与することを含み得る。
【００３９】
有効量は、当業者に知られている技術の使用によって、及び類似の状況下で得られた結果を観察することにより、担当診断医によって容易に決定され得る。投与される化合物の有効量又は用量を決定する際には、例えば：被験体の種; サイズ、年齢、及び一般的な健康状態; 関与する疾患又は障害の関与又は重症度; 個々の被験体の応答; 投与される特定の化合物; 投与様式; 投与された製剤のバイオアベイラビリティ特性; 選択された投与計画; 付随する投薬の使用; 及びその他の関連状況等の多数の要因が、担当診断者によって考慮され得る。
【００４０】
典型的な1日の投与量は、本治療方法で使用される各化合物約0.01mg/kg〜約100mg/kg（例えば、約0.05mg/kg〜約50mg/kg及び/又は約0.1mg/kg〜約25mg/kg）を含み得る。
【００４１】
組成物は、単位投薬形態で製剤化することができ、各投薬量は、各化合物約1〜約500mgを個別に、又は例えば約5〜約300mg、約10〜約100mg、及び/又は約25mg等の単一単位用量剤型で製剤化することができる。「単位用量剤形」という用語は、患者のための単位用量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を適切な医薬担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む。
【００４２】
経口投与は、本明細書に開示される組成物及び方法において使用される化合物を投与する例示的な経路である。他の例示的な投与経路には、経皮(transdermal)、経皮(percutaneous)、静脈内、筋肉内、鼻腔内、頬側、髄腔内、脳内、又は直腸内経路を含み得る。投与経路は、何れかの方法において変化し得、使用される化合物の物理的性質及び被験体及び介護者の便宜によって制限され得る。
【００４３】
当業者には理解されるように、適切な製剤には、1つ以上の投与経路に適した製剤を含む。例えば、製剤は、髄腔内投与及び大脳内投与の両方に適したものであり得る。あるいは、適切な製剤には、1つの投与経路に適しているものだけでなく、1つ又はそれ以上の投与経路に適しているが、1つ又はそれ以上の他の投与経路には適していないものも含まれる。例えば、製剤は、口腔、経皮(transdermal)、経皮(percutaneous)、静脈内、筋肉内、鼻腔内、頬側、及び/又は髄腔内投与に適すが、脳内投与には適さない製剤であり得る。
【００４４】
医薬組成物の不活性成分及び製剤の様式は従来通りである。医薬科学に使用される通常の製剤方法を本明細書で使用することができる。錠剤、チュアブル錠、カプセル、溶液、注射液、鼻腔内スプレー又は粉末、トローチ、坐剤、経皮パッチ及び懸濁液を含む、通常の種類の組成物をすべて使用することができる。一般に、組成物は、所望の用量及び使用される組成物のタイプに応じて、合計で約0.5％〜約50％の化合物を含有する。しかしながら、化合物の量は、「有効量」、すなわち、そのような治療を必要とする患者に所望の用量を提供する化合物の量として最もよく定義される。本明細書中に開示される組成物及び方法において使用される化合物の活性は、組成物の性質に大きく依存するとは考えられず、したがって、組成物は、主に又は単独で便宜と経済性のために選択及び製剤化され得る。
【００４５】
カプセルは、化合物を適当な希釈剤と混合すること、及び適切な量の混合物をカプセルに充填することによって調製される。通常の希釈剤は、不活性粉末物質（デンプン等）、粉末セルロース（特に結晶セルロース及び微結晶セルロース）、糖類（フルクトース、マンニトール及びスクロースなど）、穀物粉及び類似の食用粉末を含む。
【００４６】
錠剤は、直接圧縮、湿式造粒、又は乾式造粒によって調製される。それらの製剤は、通常、希釈剤、結合剤、潤滑剤、及び崩壊剤（化合物に加えて）を取り入れる。典型的な希釈剤には、例えば、種々のタイプのデンプン、ラクトース、マンニトール、カオリン、リン酸カルシウム若しくは硫酸カルシウム、無機塩（塩化ナトリウムなど）及び粉末糖を含む。粉末セルロース誘導体も使用することができる。典型的な錠剤結合剤は、デンプン、ゼラチン、及び糖類（例えば、ラクトース、フルクトース、グルコース、及び同様のもの等）等の物質を含む。アカシア、アルギン酸塩、メチルセルロース、ポリビニルピロリジン、及び同様のもの等を含む天然及び合成ガムも使用することができる。ポリエチレングリコール、エチルセルロース及びワックスもまた結合剤として役立ち得る。
【００４７】
錠剤は、例えば風味増強剤及びシーラントとして糖で被覆することができる。化合物はまた、製剤中にマンニトールのような多量の矯味物質を使用することにより、チュアブル錠剤として製剤化することができる。例えば、患者が剤型を摂取することを確実にするために、及び一部の患者が固形物を嚥下する際に経験する困難性を避けるために、即座に溶解する錠剤様製剤を使用することもできる。
【００４８】
錠剤及びパンチがダイに粘着するのを防止するために、錠剤配合物中に潤滑剤を使用することができる。潤滑剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、及び硬化植物油のような滑りやすい固形物から選択することができる。
【００４９】
錠剤は、崩壊剤を含有することもできる。崩壊剤は、濡れたときに膨潤して錠剤を分解し、化合物を放出する物質である。それらは、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、及びガムを含む。さらなる例として、トウモロコシ及びポテトデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、木材セルロース、粉末天然スポンジ、カチオン交換樹脂、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、ラウリル硫酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースが使用できる。
【００５０】
組成物は、例えば、胃の強酸含有物から活性成分を保護するために、腸溶性製剤として製剤化され得る。そのような製剤は、酸性環境に不溶性であり、塩基性環境に可溶性であるポリマーのフィルムで固体剤形をコーティングすることによって作製することができる。例示的なフィルムには、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートを含む。
【００５１】
坐薬として化合物を投与することが望ましい場合、従来のベースを使用することができる。実例として、カカオバターは伝統的な坐薬ベースである。カカオバターは、融点をわずかに上げるためにワックスを加えることによって変更され得る。様々な分子量のポリエチレングリコール等の水混和性坐薬ベースも坐薬製剤に使用され得る。
【００５２】
経皮パッチも化合物を届けるために使用され得る。経皮パッチには、化合物が溶解するか又は部分的に溶解する樹脂組成物が含まれ得、並びに組成物を保護及び樹脂組成物を皮膚に接触させて保持するフィルムを含み得る。他のより複雑なパッチ組成物、例えば、薬物が浸透作用によってポンプ輸送される複数の細孔が開けられた膜を有するものも使用することができる。
【００５３】
当業者には理解されるように、製剤は、製剤をヒトへの投与に適したものにする特性（例えば、純度）を有する材料（例えば、活性賦形剤、担体（シクロデキストリン等）、希釈剤など）で調製することができる。あるいは、製剤は、非ヒト対象への投与に適しているが、ヒトへの投与には適さないことを示す純度及び/又は他の特性を有する物質で調製され得る。
【００５４】
本出願で開示される化合物は、グルコセレブロシダーゼの活性化剤として機能し得る。例えば、本明細書に開示された化合物は、化合物に共有結合した活性化グルコセレブロシダーゼを調製するため、グルコセレブロシダーゼと反応され得る。このようにして形成された活性化グルコセレブロシダーゼは、当技術分野で知られている酵素補充療法におけるようなグルコセレブロシダーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療及び/又は予防するための医薬組成物として調製され得る。
【００５５】
以下の製剤のリストは例示的なものである。これらの例示的な製剤は、開示された化合物を「有効成分」として含む医薬組成物を調製するために適切であり得る。以下の製剤のリストは例示的なものであり、本開示又は特許請求の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない：
【００５６】
製剤1
硬ゼラチンカプセルは、以下の材料を使用して調製される：
【表１】
2018522872.tif 000022
【００５７】
上記の材料を混合し、460mgの量で硬質ゼラチンカプセルに充填する。
【００５８】
製剤2
【表２】
2018522872.tif 000023
【００５９】
材料を混合し、圧縮して、それぞれ665mgの錠剤を形成する。
【００６０】
製剤3
以下の成分を含有するエアロゾル溶液を調製する：
【表３】
2018522872.tif 000024
【００６１】
活性化合物をエタノールと混合し、混合物をプロペラント22の一部に加え、-30℃に冷却し、充填装置に移す。次いで、必要量をステンレススチール容器に供給し、残りのプロペラントで希釈する。次いで、バルブユニットが容器に取り付けられる。
【００６２】
製剤4
60mgの活性成分を含有する錠剤を以下のように製造する：
【表４】
2018522872.tif 000025
【００６３】
活性成分、デンプン及びセルロースをNo.45メッシュU.S.ふるいに通し、完全に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られた粉末と混合し、次いでこれをNo.14メッシュのU.S.ふるいに通す。このようにして製造した顆粒を50℃で乾燥させ、No.18メッシュのU.S.ふるいに通す。予め60メッシュのU.S.ふるいに通したカルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウム及びタルクを顆粒に加え、混合後、錠剤機で圧縮してそれぞれ150mgの錠剤を得る。
【００６４】
製剤5
各々80mgの薬剤を含むカプセルは、以下のように製造される：
【表５】
2018522872.tif 000026
【００６５】
活性成分、セルロース、デンプン、及びステアリン酸マグネシウムをブレンドし、No.45ふるいに通し、200mgの量で硬質ゼラチンカプセルに充填する。
【００６６】
製剤6
225mgの活性成分をそれぞれ含有する坐薬は、以下のように製造することができる：
【表６】
2018522872.tif 000027
【００６７】
活性成分をNo.60メッシュのU.S.ふるいに通し、必要な最小限の熱で予め溶融した飽和脂肪酸グリセリドに懸濁させる。次いで、この混合物を公称容量2gの坐薬型に注ぎ、冷却する。
【００６８】
製剤7
用量5ml当たり薬剤50mgを含有する懸濁液を以下のように製造する：
【表７】
2018522872.tif 000028
【００６９】
薬剤をNo.45メッシュU.S.ふるいに通し、ナトリウムカルボキシメチル、セルロース及びシロップと混合して滑らかなペーストを形成する。安息香酸溶液、フレーバー及び着色剤を水の一部で希釈し、撹拌しながら加える。次いで十分な水を加えて必要量を生成する。
【００７０】
製剤8
用量5ml当たり薬剤100mgを含有する静脈内製剤は、以下のように調製され得る：
【表８】
2018522872.tif 000029
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、特許請求する主題の範囲を限定するものではない。
【００７２】
グルコセレブロシダーゼモジュレーターとしてのピロロピリミジン化合物及びその用途
【００７３】
化合物は以下のスキームIを使用して調製した：
スキームI
【化１２】
2018522872.tif 000030
【００７４】
実施例1 - N-（4-エチニルフェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（1）の調製
【化１３】
2018522872.tif 000031
【００７５】
a. エチル2-アミノ-1H-ピロール-3-カルボキシレートの調製。カルボエトキシアセトアミジン（390mg、3.0mmol）のドライ酢酸エチル溶液（20mL）に、アルゴン雰囲気下、22℃で激しく撹拌しながら無水クロロアセトアルデヒドを急速に加えた。反応物を10分間撹拌し、20分間加熱還流した。混合物を室温に冷却し、シリカゲル（15g）で濾過した。反応フラスコ中の残留物を酢酸エチル（20mL×5）で抽出し、濾過した。濾液を回収し、減圧下で蒸発させて、ライトイエロー固体として120mg（47％）を得た。
【００７６】
1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.92 (br, 1H), 6.28 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 6.15 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 4.94 (br, 2H), 4.24 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 166.5, 145.4, 110.3, 107.5, 94.5, 59.3, 14.7.
【００７７】
b. エチル2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキシレートの調製。窒素雰囲気下で、ペンタン-2,4-ジオン（14.3mL、139mmol）及びエチル2-アミノ-1H-ピラゾール-3-カルボキシレート（19.5g、127mmol）を、密閉管中で酢酸(200mL)と共に110℃で一晩加熱した。酢酸を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、これをフラッシュクロマトグラフィーで精製し、ライトイエロー粉末として10.0g（36％）を得た。
【００７８】
1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.39 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 2.62 (s, 1H), 2.56 (s, 1H), 1.41 (t, J = 7.1 Hz, 1H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 164.3, 157.6, 142.3, 141.8, 118.0, 109.0, 106.6, 102.3, 59.9, 29.8, 25.2, 18.3, 14.7. ESI-MS m/z: 241 (M+Na+), 219 (M+H+).
【００７９】
c. 2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボン酸の調製。エチル2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキシレート（10.0g、45.9mmol）をEtOH（200mL）に懸濁し、3.4M水酸化ナトリウム（80mL、275mmol）で処理した。混合物を90℃に加熱し、次いで1時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、酢酸（15.7mL、275mmol）でpH6〜7に中和した。スラリーを濾過し、固体残留物を水で洗浄し、真空中で乾燥して、黄色粉末（7.0g、80％）を得た。
【００８０】
1H NMR: (500 MHz, d6-DMSO) δ(ppm): 11.67 (s, 1H), 7.40 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 2.61 (s, 3H), 2.51 (s, 3H). 13C NMR: (125 MHz, d6-DMSO) δ(ppm): 164.1, 156.8, 143.6, 141.3, 117.0, 108.8, 108.5, 101.0, 24.1, 17.6. ESI-MS m/z: 213 (M+Na+), 191 (M+H+).
【００８１】
d. N-（4-エチニルフェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（1）の調製。2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボン酸（1.0g、5.2mmol）、4-エチニルアニリン（0.61g、5.2mmol）及びHATU（2.0g、5.2mmol）をDMF（10mL）で処理し、次いでジイソプロピルエチルアミン（2.75mL、15.8mmol）で処理した。混合物を60℃で一晩撹拌した。混合物を水で希釈し、濾過した。残渣を水（×2）で洗浄し、真空中で乾燥して黄色固体（1.0g、66％）を得た。
【００８２】
1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.87 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 3.04 (s, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.58 (s, 3H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 162.5, 155.7, 142.7, 140.3, 139.6, 133.0, 119.0, 117.3, 116.0, 108.5, 107.2, 105.6, 84.1, 76.2, 24.8, 18.3. ESI-MS m/z: 312 (M+Na+).
【００８３】
実施例2 - N-（4-（1-（2-（2-（2-アミノエトキシ）エトキシ）エチル）-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）フェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（2）の調製
【化１４】
2018522872.tif 000032
【００８４】
N-（4-エチニルフェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（145mg、0.5mmol）、2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エタンアミン（87mg、0.5mmol）及びヨウ化銅（I）（20mg）のクロロホルム(5mL)混合物を、室温で3時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色の泡（130mg、56％）を得た。この生成物は、1,4-二置換された位置異性体と1,5-二置換された位置異性体の混合物（4：1）である。
【００８５】
ここでは、1,4-二置換された位置異性体のデータを報告する。1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.82 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.51 (s, 1H), 4.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.63 - 3.54 (m, 4H), 3.45 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.63 (s, 3H), 2.56 (s, 3H), 2.15 (br, 2H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 162.5, 155.6, 147.8, 142.6, 139.6, 139.5, 128.2, 126.4, 125.5, 120.4, 119.6, 119.3, 117.3, 108.4, 107.1, 105.9, 73.5, 70.8, 70.3, 69.7, 50.4, 41.8, 24.8, 18.3. ESI-MS m/z: 464 (M+H+).
【００８６】
実施例3 - 2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)-5-((2-(2-(2-(4-(4-(2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸(3)の調製
【化１５】
2018522872.tif 000033
【００８７】
N-（4-（1-（2-（2-（2-アミノエトキシ）エトキシ）エチル）-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）フェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（88mg、0.19mmol）、3,6-ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム-9-イル）（82mg、0.19mmol）及びHATU(73mg、0.19mmol)を、DMF(3mL)に懸濁し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（100μL、0.57mmol）で処理した。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を水で希釈し、濾過した。残渣を水（×2）で洗浄し、乾燥させた。得られた固体をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、暗赤色固体（45mg、27％）を得た。
【００８８】
1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.84 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.19 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.46 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.35 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 2H), 4.64 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 4.02 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.71 - 3.61 (m, 8H), 2.96 (s, 12H), 2.64 (s, 3H), 2.59 (s, 3H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 169.2, 166.2, 162.5, 155.7, 153.1, 152.3, 147.8, 142.6, 139.7, 139.5, 136.3, 134.4, 128.8, 128.2, 126.4, 125.3, 124.8, 123.0, 120.5, 119.7, 117.3, 108.9, 108.5, 107.1, 106.3, 105.8, 98.5, 70.6, 70.5, 69.6, 50.4, 40.3, 40.1, 24.8, 18.3. ESI-MS m/z: 876 (M+H+), 898 (M+Na+).
【００８９】
実施例4 - 2,5-ジオキシピロリジン-1-イル3-(2-(2-(4-(4-(2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)エトキシ)エトキシ)プロパノエート(4)
【化１６】
2018522872.tif 000034
【００９０】
N-（4-エチニルフェニル）-2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド（290mg、1.0mmol）、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）プロパノエート（300mg、1.0mmol）、ヨウ化銅（I）（50mg）及びトリス[（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（5.0mg）のクロロホルム(15mL)混合物を、室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色粉末（480mg、82％）を得た。
【００９１】
1H NMR: (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.82 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.83 (s, 4H), 7.56 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 6.52 (s, 1H), 4.59 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.83 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.64 (s, 4H), 2.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.78 (s, 4H), 2.64 (s, 3H), 2.57 (s, 3H). 13C NMR: (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 169.1, 166.9, 162.4, 155.7, 147.7, 142.6, 139.6, 139.5, 126.4, 125.6, 120.6, 119.6, 117.2, 108.4, 107.0, 105.8, 70.9, 70.6, 69.8, 65.9, 50.5, 32.4, 25.7, 24.8, 18.3. ESI-MS m/z: 590 (M+H+), 612 (M+Na+).
【００９２】
実施例5 -青色基質及び赤色基質を用いたグルコセレブロシダーゼ活性アッセイ
【００９３】
DMSO溶液中の化合物0.5μL/ウェルを、96ウェルブラックプレートに移した（最終滴定は24nM〜50μM、12濃度、2倍希釈）。33.5μL酵素溶液（最終濃度7.5nM）を、ウェルに移した。室温で5分間インキュベートした後、酵素反応を、33μL/ウェルの青色基質又は66.5μL/ウェルの赤色基質を加え開始した。青色基質（4MU-Glc）及び赤色基質（Res-Glc）の最終濃度はそれぞれ1.5mM及び30μMであった。赤色基質反応は、Biotek Synergy H1マルチモードプレートリーダーでEx=573nm及びEm=610nmで、37℃で20秒ごとに30分間測定した。37℃で30分間インキュベートした後、33μL/ウェルの停止溶液（1M NaOH及び1Mグリシン混合物、pH10）を加えることによって、青色基質反応を停止させた。次いで、プレートリーダーでEx=365nm及びEm=440nmで蛍光を測定した。
【００９４】
実施例6 -天然基質によるグルコセレブロシダーゼ活性アッセイ
【００９５】
DMSO溶液中の化合物（0.5μL/ウェル）を、96ウェルブラックプレートに移した。最終滴定は24nM〜50μM、12濃度、2倍希釈であった。 33.5μLの酵素溶液をウェルに移した（最終濃度7.5nM）。室温で5分間インキュベートした後、16μL/ウェルの天然基質を加えることによって酵素反応を開始させた。天然基質（グルコシルセラミド）の最終濃度は100μMであった。プレートを37℃で30分間インキュベートし、Amplex Red Glucose / Glucose Oxidase Assay buffer（50μL/ウェル）を添加した。プレートをBiotek Synergy H1マルチモードプレートリーダーで、Ex=573nm及びEm=610nmで37℃で20秒ごとに30分間測定した。
【００９６】
実施例7 - 蛍光偏光アッセイ
【００９７】
蛍光プローブ3（25nL /ウェル、最終濃度50nM）を、Labcyte Echo 550 Liquid Handlerシステムを使用して384ウェルブラックプレートに移した。GCase酵素活性緩衝液を含む25μL/ウェルの酵素希釈液を、プレートに加え、室温暗所で20分間振盪した。最終滴定は5nM〜10μM、10濃度、2倍希釈であった。蛍光偏光を、Molecular Devices Analyst GTを用い、Ex=535nm及びEm=580nm、G因子=1.05で測定した。
【００９８】
実施例8 -蛍光偏光による化合物ハイスループットスクリーニング（HTS）
【００９９】
GCase酵素活性緩衝液中の酵素（25μL/ウェル）を384ウェルブラックプレートに加えた。蛍光プローブ3（25nL/ウェル、最終濃度50nM）を、Labcyte Echo 550 Liquid Handlerシステムを使用して384ウェルブラックプレートに移した。DMSO原液（50nL）中の化合物をプレートに移した。プレートを室温で暗所で20分間振盪した。最終濃度は、19.5nM〜10μM、10濃度、2倍希釈であった。蛍光偏光を、Molecular Devices Analyst GTを用い、Ex=535nm及びEm=580nm、G因子=1.05で測定した。
【０１００】
実施例9 -化合物活性化グルコセレブロシダーゼの調製
【０１０１】
組換え野生型酵素（22μM、95μL、1当量）の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）に、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-（2-（2-（4-（4-（2,4-ジメチルピロロ[1,2-a]ピリミジン-8-カルボキサミド）フェニル）-1H-1,2 、3-トリアゾール-1-イル）エトキシ）エトキシ）プロパノエート（4）のDMSO（0.89mM、5μL、2当量）を一度に加え、すぐに5秒間ボルテックスした。指示時点で、反応溶液（2μL）をサンプリングし、アッセイ緩衝液（50mMクエン酸、176mM K2HPO4、及び0.01％Tween-20、pH5.9）で希釈した（1：3125希釈）。酵素を同じ濃度に調整し、活性のためサンプリングした。化合物を加えることなく、実施例5及び実施例6の方法を用いて、レゾルフィン基質、4-MU基質及び天然基質の3つの基質で希釈溶液をアッセイした。
【０１０２】
実施例10 - 追加の化合物の合成及び試験
【０１０３】
追加の化合物を調製し、上記の実施例に示した手順に従って試験した。IC50又はAC50を決定するために、用量反応曲線を作成した。結果を表1に示す。
【０１０４】
表１
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【表９−２５】
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【表９−２６】
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【表９−２７】
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【表９−２８】
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【０１０５】
実施例11 - 酵素補充療法のための活性化剤修飾グルコセレブロシダーゼ
【０１０６】
導入
ゴーシェ病（GD）は、複数の器官機能不全をもたらすグルコセレブロシダーゼ（酸性β-グルコシダーゼ、GCase）の機能欠損によって引き起こされる、稀な遺伝的リソソーム蓄積障害である（Futerman and van Meer 2004）。GCaseのヘテロ接合性突然変異は、パーキンソン病（PD）の主要な危険因子として見出される(Sidransky, Nalls et al. 2009, Sidransky and Lopez 2012, Lin and Farrer 2014, Schapira, Olanow et al. 2014)。ニューロンにおけるGcaseの基質であるグルコセレブロシドの蓄積は、PDを引き起こす有毒なα-シヌクレインオリゴマーの形成を促進する（Mazzulli, Xu et al. 2011）。GCase活性の増強は、PDを含むGCase関連シヌクレイノパチーの潜在的な治療戦略であると考えられている(Sardi, Clarke et al. 2013, Sybertz and Krainc 2014)。
【０１０７】
GDの治療には、グルコシルセラミド合成酵素の阻害による酵素補充療法（ERT）又は基質還元療法が含まれる(Bennett and Mohan 2013)。受容体相互作用タンパク質キナーゼ-3（RIP3）は最近、GDの新たな治療標的として発見された(Vitner, Salomon et al. 2014)。ERTは20年以上にわたり安全かつ有効であることが証明されており、臓器量の減少、血液学的パラメータの改善及び骨痛の改善により、多くの患者のQOLが劇的に改善されている(Futerman, Sussman et al. 2004, Weinreb, Goldblatt et al. 2013, Souza, Muniz et al. 2014)。現在、GDの治療に利用可能な同様の活性を有する以下3つの組換え酵素がある：イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼα、及びタリグルセラーゼα(Bennett and Mohan 2013) (Tekoah, Tzaban et al. 2013)。しかし、これらのGCaseの有効性が限られており、ERTの費用は年間US10万ドルから25万ドルを超える（Grabowski 2008）ため、患者に負担をかけることになる。より安定した酵素又はより高い触媒活性を有する酵素を設計することにより、注入回数を減らし、潜在的にコストを削減することもできる(Futerman, Sussman et al. 2004)。
【０１０８】
非イミノ糖モジュレーター(Zheng, Padia et al. 2007)及び非阻害モジュレーター1(図1) (Patnaik, Zheng et al. 2012)のいくつかの異なる骨格が2007年以来報告されている。これらのモジュレーターは、活性部位以外の部位に結合し、酵素を安定化させることが示唆される(Zheng, Padia et al. 2007) (Patnaik, Zheng et al. 2012)。モジュレーター1は、5.2μMのAC50及び約100％の最大活性化活性を有する精製wt GCaseを活性化することができる(Patnaik, Zheng et al. 2012)。ERTのためのGCase酵素活性及び安定性を改善するため及びモジュレーターの活性化メカニズムを研究するために、本研究では、まず、高活性化活性化因子及び活性化因子共有結合修飾GCaseを報告する。
【０１０９】
結果
高活性活性化剤の発見。
強力で高い活性化活性化剤を開発するために、1のピラゾロピリミジン環を修飾して、より高い酵素活性を示すピロロピリミジン骨格化合物を得た。フェニル環上のアルキン基をクリック反応によりポリエチレングリコール（PEG2）リンカーを有するアジドとカップリングさせて、2を得た（スキーム1）。4MU-Glc基質酵素活性アッセイ（図2A）において約14倍の最大活性及び6.31μMのAC50を有し、2は、我々が知る限り、まだ同定されていない最も強力な活性化剤である。さらに、Res-β-glc基質酵素活性アッセイにおいて、リード化合物1はいかなる活性化活性を示さなかったのに対し、2は、50μMで高く活性化された（10倍）。以前の報告（Patnaik, Zheng et al.2012）と一致して、これらの化合物のいずれも現在のインビトロ天然基質アッセイでは活性化活性を示さなかった。
【０１１０】
蛍光偏光アッセイのための蛍光プローブの設計。
アクチベータ結合親和性の検出を促進するために、化合物2をフルオロフォアとカップリングさせてプローブ3を得た（スキーム1）。蛍光偏光（FP）シグナルは、酵素の濃度の増加とともに徐々に飽和した（図3A）。プローブ3は、0.71μMのKd値で強力な結合親和性を有することが観察され、プローブ3がGCaseに直接結合できることが示された。活性化剤の結合親和性を測定するために、プローブ3を、それぞれ異なる濃度の化合物1及び2と競合させた。化合物1はこのアッセイでは非常に弱い活性を示したが、化合物2は非常に高い活性を示した（図3B）。
【０１１１】
求電子性プローブ4の設計及び共有結合アッセイ。
プローブ4は、NHSエステルと第1級アミンとの反応によって結合部位を取り囲むリジン残基を標的とするように設計され合成された（スキーム1）。プローブ4はまた、4MU-Glc（20倍）及び赤色基質（10倍）酵素活性アッセイの両方において高い活性化活性を示した（図2A及び2B）。
【０１１２】
プローブ4をGCaseに対する共有結合アッセイに供した。緩衝液のpH値、タンパク質及びプローブの濃度、並びに反応温度を含む反応条件を、最大活性化を達成するために注意深く調整した。最適化された反応条件では、酵素活性は時間依存的に活性化された（図5）。この酵素は、4MU-Glc基質（図5A）及び赤色基質（図5B）の酵素活性アッセイのそれぞれにおいてwt GCaseと比較して、約22及び28倍の活性を有するプローブ4によって活性化されることができた。驚くべきことに、共有結合活性化酵素はまた、天然基質アッセイにおいて16倍の活性向上を示した（図5C）。酵素活性は顕著に低下せず、次いで3つの基質アッセイで透析し、酵素がプローブ4によって共有結合修飾されていることが示された。この結果はまた、高分解能LC-MSスペクトルによっても確認された。これは、タンパク質上に22個のリジン残基が存在するにもかかわらず、1〜3個のリガンドによってGCaseが調節されたことを示している。
【０１１３】
プローブ4で予め活性化されたGCaseでのサポシンC競合アッセイ。
GCaseの天然補因子であるSaposin C(Tamargo, Velayati et al. 2012)は、用量依存的に100nMのAC50値で活性化されることができた（図5）。しかし、サポシンCの結合部位及び結合様式は未知のままである。サポシンCとプローブ4が同じ結合部位を共有するかどうかを調べるために、共有結合活性化GCaseをサポシンCで滴定し、酵素活性を4MU-Glc基質酵素活性アッセイで試験した。予め活性化された酵素は、サポシンCによって、71nMのAC50値で用量依存的にさらに活性化することができた（図5）。シナジーモードで活性化剤とサポシンCによって酵素活性が調節されていると考えられ、プローブ4とサポシンCの結合部位が異なることが示唆された。
【０１１４】
pH4.7緩衝液及びヒト血漿における酵素安定性アッセイ。
プローブ4がGCaseの酵素安定性を変化させるかどうかを試験するために、GCase活性安定性アッセイのために2つの環境を使用した(Tekoah, Tzaban et al. 2013)。最初のものはクエン酸塩/リン酸塩緩衝液であり、これはpH4.7であった。この条件では、wt GCaseは、以前の研究(Tekoah, Tzaban et al. 2013)と同様に、4日目に約15％の活性しか残さなかった（図6A及び6B）。興味深い発見は、10日目でさえ活性化されたGCaseはまだ20％以上の活性を残していたということであった。この結果は、活性化されたGCaseが各日より高い絶対的な（absolute）GCase活性を有するだけでなく、低pH緩衝液中での標準化後に活性低下の強い遅延を示したことを示唆する。低pH緩衝液中での酵素活性がより高い理由の1つは、活性化GCaseが共有化合物によって安定化され、展開（unfold）がより困難であったことである。
【０１１５】
次いで、ヒト血漿（pH7.4）中の活性化GCase及びwt GCaseの両方を試験した。驚くべきことに、活性化されたGCaseは各時点でより高い活性を有していたが、標準化後、活性化されたGCase及びwt GCaseは同様の酵素活性安定性曲線を示した（図6C及び6D）。この結果は、プローブ4がヒト血漿中のGCaseの分解に影響を与えないことを示唆した。
【０１１６】
U937マクロファージ取り込みアッセイ。
ヒトマクロファージ細胞、GDの標的細胞が活性化されたGCaseを正常に取り込むことができるかどうかの問題点の解明を試みた。PMA誘導後、活性化されたGCase及びwt GCaseの両方でU937細胞株を処理した(Tekoah, Tzaban et al. 2013)。活性化されたGCase及びwt GCaseのタンパク質取り込みレベルが同等であったにもかかわらず（図7B）、活性GCaseは内因性GCと比較して25倍以上の活性を示したが、GCaseは約3倍の活性しか示さなかった（図7A）。これらの結果は、プローブ4がマクロファージ細胞へのGCaseの取り込みに影響を与えないが、細胞におけるGCase酵素活性を改善し得ることを示唆した。
【０１１７】
考察
20年以上にわたり、酵素補充療法（ERT）は、例えばゴーシェ病(Futerman, Sussman et al. 2004)、ファブリー病(Pisani, Visciano et al. 2012)及びポンぺ病(Angelini and Semplicini 2012)等の遺伝的リソソーム蓄積症の治療において大きな成功を収めていた。しかし、ERTの主要な問題は、多くの患者がこの療法に利用することを妨げる酵素治療の費用である(Grabowski 2008)。本研究では、高活性化化合物を発見し、酵素活性及び安定性を改善するための組換えグルコセレブロシダーゼの特異的調節にそれらを使用する。
【０１１８】
リード化合物1は、2012年に非阻害性シャペロンとして発見された(Patnaik, Zheng et al. 2012)。強力な活性化剤を発見するために、SAR研究に従い、新規ピロロピリミジン骨格は、1より高い活性化活性及び結合親和性を有することが見出されている。これらの活性剤の水溶液への溶解性が低いため、PEGリンカーを有するトリアゾール環によるフェニル環のパラ位のさらなる修飾は、より高い活性化活性及びより良好な溶解性を示すことが発見された。PEG2リンカーを有する化合物2は、これらの一連の活性化剤において最も高い活性化をもたらすことが見出された。
【０１１９】
これらの活性化剤のSARを評価するために、その結合親和性を評価する結合アッセイが必要である。GCaseと活性化剤の結合について報告された唯一の検出方法は、マイクロスケール熱泳動（MST）である(Patnaik, Zheng et al. 2012)。等温滴定熱量測定（ITC）、表面プラズモン共鳴（SPR）、及び蛍光熱移動等のいくつかの他の生物物理学的技術は、GCase活性化因子の結合を見出すために試みられてきた。残念なことに、これらの方法は、本研究に、いかなるポジティブ（positive）な結果も与えなかった。蛍光偏光（FP）アッセイは、多様な分子相互作用及び酵素活性の迅速かつ定量的分析を可能にする均質な方法である(Rossi and Taylor 2011)。プローブとGCaseとの結合親和性を測定するために、蛍光プローブを設計し、合成した。プローブ3は、約0.71μMのKd値を有すると測定され、このプローブがGCaseと強く結合することを示している。このFPアッセイで、活性化剤、阻害剤又は単に結合剤であるかに関係なく、化合物とGCaseとの結合を検出することが出来た。したがって、この方法は、GCaseのモジュレーターとしてより多様な化合物を発見するためにハイスループットスクリーニング（HTS）においてさらに利用され得る。
【０１２０】
手元に高い活性化活性化剤を有するので、一旦GCaseが本化合物によって共有結合修飾されると、活性化剤の局所濃度が高いので、酵素活性は活性化剤の最大活性まで増強され得ると仮説を立てた。大部分のタンパク質表面に高反応性基が存在するリジン残基の一級アミンは、多くの多様な化学物質によって調節され得る(Nakamura, Kawai et al. 2009, Choi, Connelly et al. 2010)。NHSエステルは、多くの生物学的研究においてリジンと反応するために用いられている(Nanda and Lorsch 2014)。SAR研究に基づいて、PEG2リンカーが、最大の酵素活性を達成するのに適した長さであることを見出した。共有結合アッセイにおいて、WtGCaseはプローブ4によって調節され、時間依存的に活性化された。最大酵素活性は、pH7.2で1時間で2当量の4を使用することによって達成され得た。より高いpH値又は増加したプローブ4の比は、酵素活性を低下させる可能性があり、プローブ4の非特異的結合が酵素活性に影響を及ぼすことを示唆している。共有結合アッセイで使用した条件を考慮し、この結果は、リガンドの骨格由来の酵素活性の上昇及び酵素の特異的共有修飾を示した。
【０１２１】
サポシンC結合様式を研究し、モデル化した(Atrian, Lopez-Vinas et al. 2008)。活性化された酵素がサポシンCによって活性化され得なかった場合、活性化剤とサポシンCの結合部位は同じであると予想する。実際、活性化されたGCaseは、サポシンCによってさらに活性化され得る。活性化因子の修飾は、サポシンC相互作用を妨害せず、活性化因子の結合部位がサポシンCと異なることを示している。その結果、本発明の高活性GCaseは、さらなる活性化のためにサポシンCを必要としないことが示唆された。この酵素は、サポシンC変異を有する患者に使用することができる。
【０１２２】
活性化された酵素がERTに使用できるかどうかを評価するために、酵素の安定性及び細胞摂取特性を試験した。活性化された酵素は、酸性緩衝液中でより一層安定性を示し、ヒト血漿中ではwt GCaseに対して同じ安定性を示した。U937取り込みアッセイにおいて、同じ量の活性化されたGCaseは、wt GCaseと比較してPMA誘導性U937マクロファージ細胞によって吸収され得、化合物修飾がGCase取込みプロセスに影響しないことを示す。この研究で示されているように、酸性条件下で活性化されたGCaseの酵素活性及び安定性が一層高いため、この酵素の注射用量の減少がGDのERTに使用され得ることを示唆し得る。
【０１２３】
加えて、α-1-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼ、N-アセチルガラクトサミン4-スルファターゼ及びイズロネートスルファターゼ等のより多くの異なる組換えリソソーム酵素は、それぞれの欠損症の治療薬として承認されていた（MPS I、ファブリー病、ポンペ病、MPS VI及びMPS II）(Desnick and Schuchman 2012, Valayannopoulos 2013)。活性化剤修飾酵素アプローチの幅広い応用は、他のリソソーム蓄積症の治療法を改善する可能性を秘めている。
【０１２４】
方法
生物学
4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド（4MU-β-glc）、青色蛍光基質、レゾルフィンβ-D-グルコピラノシド（Res-β-glc）、赤色蛍光基質、及び緩衝液成分はSigma-Aldrich（St. Louis、MO）から購入した。天然基質、グルコシルセラミドは、Avanti Polar Lipids, Inc.（Alabaster, Alabama）から購入した。Amplex Red Glucose / Glucose Oxidase Assay Kitは、Invitrogen（Eugene、OR）から購入し、グルコシルセラミドがグルコセレブロシダーゼによって切断されるときに産生されるグルコースの量を測定した。
【０１２５】
組換え野生型GCase酵素であるベラグルセラーゼα(Vpriv（登録商標）, Shire Human Genetic Therapies, Inc.)を、臨床的注入投与後(after clinical infusions)、残留溶液から得た。GCase活性アッセイ緩衝液は、50mMクエン酸、176mM K2HPO4、及び0.01％Tween-20（pH5.9）から構成された。1Mの水酸化ナトリウム及び1Mのグリシンの溶液を、4MU-β-glc基質アッセイの停止溶液として使用した。
【０１２６】
4MU-β-glc基質及びRes-β-glc基質を用いた化合物活性アッセイ。
0.5μL/ウェルのDMSO溶液中の化合物を96ウェルブラックプレートに移した（最終滴定は24nM〜50μM、12濃度であった）。33.5μLの酵素溶液（最終濃度7.5nM）をウェルに移した。室温で5分間インキュベートした後、33μL/ウェルの4MU-Glc基質又は66.5μL/ウェルの赤色基質を加えることにより、酵素反応を開始させた。4MU-Glc基質及びRes-Glc基質の最終濃度は、それぞれ1.5mM及び30μMであった。赤色基質反応は、Biotek Synergy H1マルチモードプレートリーダーで、Ex=573nm及びEm=610nmで、37℃で20秒ごとに30分間測定した。37℃で30分間インキュベートした後、33μL/ウェルの停止溶液（1M NaOH及び1Mグリシン混合物、pH10）を加えることにより、4MU-Glc基質反応を停止させた。次いで、Ex=365nm及びEm=440nmでプレートリーダーで蛍光を測定した。
【０１２７】
天然基質を用いた化合物活性アッセイ。
化合物を、以前に記載された方法をわずかに改変した方法を用いて、天然基質で試験した(Motabar, Goldin et al. 2012)。0.5μL/ウェルのDMSO溶液中の化合物をブラック96ウェルプレートに移した（最終滴定は24nM〜50μM、12濃度であった）。33.5μLの酵素溶液をウェルに移した。室温で5分間インキュベートした後、16μL/ウェルの天然基質を加えることによって酵素反応を開始させた。天然基質（グルコシルセラミド）の最終濃度は100μMであった。プレートを37℃で30分間インキュベートし、Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay buffer（50μL/ウェル）を加えた。プレートをBiotek Synergy H1マルチモードプレートリーダーで、Ex=573nm及びEm=610nmで、37℃で20秒ごとに30分間測定した。
【０１２８】
蛍光偏光（FP）アッセイ。
Labocyte Echo 550 Liquid Handlerシステムを用いて、蛍光プローブ3（25nL/ウェル、最終濃度50nM）を384ウェルブラックプレートに移した。GCase酵素活性緩衝液（最終滴定は5nM〜10μM、10濃度、2倍希釈）中の25μL/ウェルの酵素希釈液をプレートに添加し、暗所で20分間振盪した。蛍光偏光を、Molecular Devices Analyst GTにおいて、Ex=535nm及びEm=580nm、G因子=1.05で測定した。
【０１２９】
FPアッセイによる結合親和性試験。
GCase酵素活性緩衝液中の酵素（25μL/ウェル）を384ウェルブラックプレートに加えた。Labocyte Echo 550 Liquid Handlerシステムを用いて、蛍光プローブ3（25nL /ウェル、最終濃度50nM）を384ウェルブラックプレートに移した。DMSO原液（50nL）中の化合物1及び2（最終滴定は19.5nM〜10μM、10濃度であった）をプレートに移した。プレートを暗所で室温で20分間振とうした。蛍光偏光を、Molecular Devices Analyst GTにおいて、Ex=535nm及びEm=580nm、G因子=1.05で測定した。
【０１３０】
4MU-Glc基質を用いたサポシンC活性化アッセイ。
サポシンC（0.5μL/ウェル）をブラック96ウェルプレートに加えた（最終滴定は1.72nM〜1.76μM、12濃度であった）。アッセイ緩衝液（50mMクエン酸、176mM K2HPO4、0.01％tween-20、0.01％（g/mL）ホスファチジルセリン、pH 4.7）中の化合物4活性化酵素及びwt酵素（33.5μL/ウェル、7.5nM最終濃度）ウェルにそれぞれ加えた。室温で5分間インキュベートした後、33μL/ウェルの4MU-Glc基質を加えることにより、酵素反応を開始させた。4MU-Glc基質の最終濃度は1.5mMであった。37℃で30分間インキュベートした後、33μL/ウェルの停止溶液（1M NaOH及び1Mグリシン混合物、pH10）を加えることによって反応を停止させた。次いで、Ex=365nm及びEm=440nmでプレートリーダーで蛍光を測定した。
【０１３１】
高解像度HPLC-MSスペクトル。
上記のように、酵素を化合物4でpH7.2で60分間処理した。試料を0.1MトリスpH7.2緩衝液で透析し、C8カラムを備えたAgilent 6210A LC-TOF質量分析計で分析した。
【０１３２】
ヒトU937マクロファージ細胞の分化。
ヒト単球細胞系U937は、単球培養物に75ng/mlのPMA(Brumshtein, Salinas et al. 2010)を、3日間加えることにより最適にマクロファージに分化した（75cm2フラスコ中）。マクロファージを、培養プレートへの接着により濃縮し、形態学及び容体染色によって同定した。
【０１３３】
マクロファージ細胞におけるGCase取り込み研究。
アッセイを、報告された方法(Tekoah, Tzaban et al. 2013)に従い、わずかに修正して実施した。酵素を上記のようにpH7.2の化合物4又はDMSOで60分間処理し、次いでPBSで透析した。分化後（〜1.6×106細胞）のU937細胞を、F12K培地中の活性化酵素60μg/ml及びwt酵素を用いて5％CO2、37℃インキュベーターで10分間インキュベートした。次いで、細胞をマンナン(1mg/ml)で富化した氷冷PBSで2回洗浄した。膜に非特異的に結合した任意のタンパク質の放出をさらに確実にするために、細胞の半分を氷冷グリシン緩衝液(0.8% NaCl、0.038% KCl、0.01% MgCl2、0.01% CaCl2、0.7%グリシン[pH 3])で洗浄し、続いてさらに2回、冷PBS洗浄した。残りの半分のウェルを、全酵素活性（結合及び内在化酵素）を測定するためのコントロールとして用いた。β-グルコセレブロシダーゼ活性緩衝液（60mMリン酸クエン酸緩衝液; 0.15％Triton X-100; 0.125％タウロコール酸ナトリウム、pH5.5）を加えることにより細胞を溶解し、続いてピペット操作及び1回の凍結/解凍サイクルを行った。得られた溶解物を上記の比色法を用いて酵素活性の測定に供した。総酵素活性は、ブラッドフォードアッセイによって測定され、全可溶性タンパク質に対して標準化された。効果的な取り込みは、コントロールの全酵素活性に対し細胞内の活性のパーセンテージとして計算した。
【０１３４】
化学的性質
市販の試薬及び溶媒をさらに精製することなく使用した。化合物を合成し、この実施例及び先の実施例に示すように分析した。すべての反応を、0.25mmのSilicycle extra hard 250 μM TLC plate（60F254）を用いた薄層クロマトグラフィー（TLC）によってモニターした。反応生成物の精製は、Silicycle Silica Gelカラム（4g、12g、24g、40g又は80g）を備えたAgilent 971-FPフラッシュ精製システムを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって行った。すべての化合物の純度は95％以上であり、Agilent 1260 Infinity HPLCシステムで分析した。1H NMRスペクトル及び13C NMRは、Bruker Avance III 500MHzシステム（1H NMRについて500MHz及び13C NMRについて125MHz）分光計を使用して得た。ケミカルシフトは、1H NMRについてのクロロホルム(δ = 7.26)及び13C NMRについてのクロロホルム(δ = 77.16)又は1H NMRについてのジメチルスルホキシド(δ = 2.50)及び13C NMRについてのジメチルスルホキシド(δ = 39.52)に関連して報告される。データは、（br =ブロード、s =シングレット、d =ダブレット、t =トリプレット、q =カルテット、m =マルチプレット）として報告される。質量スペクトルはBruker AmaZon SLシステムを用いて得た。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１３５】
【非特許文献１】Angelini, C. and C. Semplicini (2012). "Enzyme replacement therapy for Pompe disease." Curr Neurol Neurosci Rep 12(1): 70-75.
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【０１３６】
実施例12 -追加の置換キナゾリン化合物の合成及び試験
【０１３７】
追加の化合物を調製し、上記の実施例に示した手順に従って試験した。結果を表2に示す。
【０１３８】
表2
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【０１３９】
本発明の範囲及び概念から逸脱することなく、本明細書に開示された発明に対して様々な置換及び修飾を行うことができることは、容易に当業者にとって明らかであると考える。本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素(element)又は要素(elements)、制限(limitation)又は制限(limitations)がない場合に、適切に実施され得る。使用された用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、図示され説明された特徴又はその部分の等価物を排除するような用語及び表現の使用には意図されておらず、本発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。従って、本発明は、特定の実施形態及び任意の特徴によって例示されているが、本明細書に開示された概念の改変及び/又は変形は、当業者に頼ることができ、そのような改変及び変形は本発明の範囲内にあると考えられることが考慮される。
【０１４０】
本明細書において、いくつかの特許及び非特許文献を引用している。引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。引用文献中の用語の定義と比較した明細書中の用語の定義との間に矛盾がある場合、その用語は明細書の定義に基づいて解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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