(57)【要約】  本願は、一般的に、癌などの腫瘍性疾患に対する好適なワクチンである遺伝子改変アレナウイルスに関する。本明細書に記載されるアレナウイルスは、腫瘍性疾患のワクチン及び/若しくは治療並びに/又は免疫療法で使用するのに好適であり得る。特に、本明細書に提供されるのは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて遺伝子改変アレナウイルスを投与することにより腫瘍性疾患を治療する方法及び組成物であり、該アレナウイルスは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むように改変されている。【選択図】図1
2018533604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象にアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、前記アレナウイルス粒子が:
(i)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び
(ii)前記アレナウイルス粒子の糖タンパク質（「GP」）、核タンパク質（「NP」）、マトリックスタンパク質Z（「Zタンパク質」）又はRNA依存性RNAポリメラーゼL（「Lタンパク質」）をコードしているORFの野生型の位置以外の位置にある少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(「ORF」);
を含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されている、前記方法。
【請求項２】
前記腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原が、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれ以上の腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫;脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫;髄芽腫;髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫;乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer);中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍性疾患を患っているか、それを起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記アレナウイルス粒子及び前記免疫チェックポイント阻害剤が、同時に共投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記アレナウイルス粒子が、前記免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記アレナウイルス粒子が、前記免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記アレナウイルス粒子及び前記免疫チェックポイント阻害剤の投与間隔が、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約1週間、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約9週間、約10週間、約11週間、約12週間、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、又はそれ以上である、請求項7又は請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記アレナウイルス粒子及び前記免疫チェックポイント阻害剤が、治療有効量で投与される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記対象に第1のアレナウイルス粒子を投与することを含み、ある期間後に、前記対象に第2のアレナウイルス粒子を投与することを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記第1のアレナウイルス粒子及び前記第2の粒子が、異なるアレナウイルス種に由来し、かつ/又は異なる腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'非翻訳領域(「UTR」)の制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記アレナウイルスの3'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3'UTRであり、前記アレナウイルスの5'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5'UTRである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記アレナウイルス粒子がSセグメント及びLセグメントを含むように、前記アレナウイルス粒子が第2のアレナウイルスゲノムセグメントを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記アレナウイルス粒子が弱毒化される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記アレナウイルス粒子が、感染性であるが、非相補細胞においてさらなる感染性子孫を生成することができない、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記アレナウイルス粒子が感染性で、複製可能である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化されている少なくとも1つのアレナウイルスORFを含み、前記ORFが、前記アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードする、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
前記GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFが、除去されており、かつ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列と置換されている、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする前記4つのORFのうちの1つのみが除去されている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
GPをコードするORFが除去されている、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
NPをコードするORFが除去されている、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
Zタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
Lタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記アレナウイルス粒子が、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントのいずれかを含む三セグメントアレナウイルス粒子である、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記アレナウイルス粒子が1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記アレナウイルス粒子が、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104 PFUの前記三セグメントアレナウイルス粒子に感染させたマウスにおける持続感染の70日後に、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
2つの別々のセグメントの代わりに、一方のみに2つのアレナウイルスORFを結合させた2つのSセグメント又は2つのLセグメントのセグメント間の組換えが、ウイルスプロモーター活性を抑制する、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記2つのSセグメントのうちの1つが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
からなる群から選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
前記2つのLセグメントのうちの1つが:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
前記2つのSセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３５】
前記2つのLセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３６】
前記アレナウイルス粒子が、さらに、免疫調節ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が:
（i）カルレティキュリン(CRT)又はその断片;
（ii）ユビキチン又はその断片;
（iii）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)又はその断片;
（iv）インバリアント鎖(CD74)又はその抗原性断片;
（v）結核菌熱ショックタンパク質70又はその抗原性断片;
（vi）単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22又はその抗原性断片;
（vii）CD40リガンド又はその抗原性断片;及び
（viii）Fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド又はその抗原性断片;
からなる群から選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記アレナウイルス粒子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（「LCMV」）又はフニンウイルス（「JUNV」）由来である、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記アレナウイルス粒子がLCMV由来である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記LCMVが、MP株、WE株、アームストロング株、又はアームストロングクローン13株である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記アレナウイルス粒子がJUNV由来である、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
前記JUNVが、JUNVワクチンCandid #1株、又はJUNVワクチンXJクローン3株である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記アレナウイルス粒子の増殖又は感染性が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列によって影響されない、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
アレナウイルス粒子、免疫チェックポイント阻害剤及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、前記アレナウイルス粒子が:
(i)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び
(ii)前記アレナウイルス粒子の糖タンパク質（「GP」）、核タンパク質（「NP」）、マトリックスタンパク質Z（「Zタンパク質」）又はRNA依存性RNAポリメラーゼL（「Lタンパク質」）をコードしているORFの野生型の位置以外の位置にある少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(「ORF」);
を含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されており、
前記免疫チェックポイント阻害剤が、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する、前記医薬組成物。
【請求項４５】
前記腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原が、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される、請求項44記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記ヌクレオチド配列が、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれ以上の腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする、請求項44又は請求項45記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092からなる群から選択される、請求項44〜46のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項４８】
急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫; 脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫;髄芽腫;髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫; 乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer); 中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫; 形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織��腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍性疾患の治療に使用するための、請求項44〜47のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'非翻訳領域(「UTR」)の制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項44〜48のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記アレナウイルスの3'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3'UTRであり、前記アレナウイルスの5'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5'UTRである、請求項49記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記アレナウイルス粒子がSセグメント及びLセグメントを含むように、前記アレナウイルス粒子が第2のアレナウイルスゲノムセグメントを含む、請求項44〜50のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記アレナウイルス粒子が弱毒化される、請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記アレナウイルス粒子が、感染性であるが、非相補細胞においてさらなる感染性子孫を生成することができない、請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記アレナウイルス粒子が感染性で、複製可能である、請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化されている少なくとも1つのアレナウイルスORFを含み、前記ORFが、前記アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードする、請求項53記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFが、除去されており、かつ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列と置換されている、請求項53記載の医薬組成物。
【請求項５７】
GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする前記4つのORFのうちの1つのみが除去されている、請求項56記載の医薬組成物。
【請求項５８】
GPをコードするORFが除去されている、請求項57記載の医薬組成物。
【請求項５９】
NPをコードするORFが除去されている、請求項57記載の医薬組成物。
【請求項６０】
Zタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項57記載の医薬組成物。
【請求項６１】
Lタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項57記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記アレナウイルス粒子が、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントのいずれかを含む三セグメントアレナウイルス粒子である、請求項44〜61のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記アレナウイルス粒子が1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む、請求項62記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記アレナウイルス粒子が、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む、請求項62記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項62〜64のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104 PFUの前記三セグメントアレナウイルス粒子に感染させたマウスにおける持続感染の70日後に、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項62〜64のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項６７】
2つの別々のセグメントの代わりに、一方のみに2つのアレナウイルスORFを結合させた2つのSセグメント又は2つのLセグメントのセグメント間の組換えが、ウイルスプロモーター活性を抑制する、請求項62〜66のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記2つのSセグメントのうちの1つが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
からなる群から選択される、請求項63記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記2つのLセグメントのうちの1つが:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項64記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記2つのSセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項63記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記2つのLセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項64記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記アレナウイルス粒子が、さらに、免疫調節ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項44〜71のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が:
（i）カルレティキュリン(CRT)又はその断片;
（ii）ユビキチン又はその断片;
（iii）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)又はその断片;
（iv）インバリアント鎖(CD74)又はその抗原性断片;
（v）結核菌熱ショックタンパク質70又はその抗原性断片;
（vi）単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22又はその抗原性断片;
（vii）CD40リガンド又はその抗原性断片;及び
（viii）Fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド又はその抗原性断片;
からなる群から選択される、請求項72記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記アレナウイルス粒子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（「LCMV」）又はフニンウイルス（「JUNV」）由来である、請求項44〜73のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記アレナウイルス粒子がLCMV由来である、請求項74記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記LCMVが、MP株、WE株、アームストロング株、又はアームストロングクローン13株である、請求項75記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記アレナウイルス粒子がJUNV由来である、請求項74記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記JUNVが、JUNVワクチンCandid #1株、又はJUNVワクチンXJクローン3株である、請求項77記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記アレナウイルス粒子の増殖又は感染性が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列によって影響されない、請求項44〜78のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項８０】
1以上の容器及び使用説明書を含むキットであって、前記1以上の容器が、請求項44〜79のいずれか一項記載の前記医薬組成物を含む、前記キット。
【請求項８１】
2以上の容器及び使用説明書を含むキットであって、前記容器の1つがアレナウイルス粒子を含み、前記容器の別のものが免疫チェックポイント阻害剤を含み、前記アレナウイルス粒子が:
a.腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び
b.前記アレナウイルス粒子の糖タンパク質（「GP」）、核タンパク質（「NP」）、マトリックスタンパク質Z（「Zタンパク質」）又はRNA依存性RNAポリメラーゼL（「Lタンパク質」）をコードしているORFの野生型の位置以外の位置にある少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(「ORF」);
を含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されており、
前記免疫チェックポイント阻害剤が、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する、前記キット。
【請求項８２】
前記腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原が、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される、請求項81記載のキット。
【請求項８３】
前記ヌクレオチド配列が、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれ以上の腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする、請求項81又は請求項82記載のキット。
【請求項８４】
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092からなる群から選択される、請求項81〜83のいずれか一項記載のキット。
【請求項８５】
急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫; 脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫;髄芽腫;髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫; 乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer); 中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫; 形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織��腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍性疾患の治療に使用するための、請求項81〜84のいずれか一項記載のキット。
【請求項８６】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'非翻訳領域(「UTR」)の制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項81〜85のいずれか一項記載のキット。
【請求項８７】
前記アレナウイルスの3'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3'UTRであり、前記アレナウイルスの5'UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5'UTRである、請求項86記載のキット。
【請求項８８】
前記アレナウイルス粒子がSセグメント及びLセグメントを含むように、前記アレナウイルス粒子が第2のアレナウイルスゲノムセグメントを含む、請求項81〜87のいずれか一項記載のキット。
【請求項８９】
前記アレナウイルス粒子が弱毒化される、請求項88記載のキット。
【請求項９０】
前記アレナウイルス粒子が、感染性であるが、非相補細胞においてさらなる感染性子孫を生成することができない、請求項88記載のキット。
【請求項９１】
前記アレナウイルス粒子が感染性で、複製可能である、請求項88記載のキット。
【請求項９２】
前記アレナウイルスゲノムセグメントが、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化されている少なくとも1つのアレナウイルスORFを含み、前記ORFが、前記アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードする、請求項90記載のキット。
【請求項９３】
前記GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFが、除去されており、かつ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列と置換されている、請求項90記載のキット。
【請求項９４】
GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする前記4つのORFのうちの1つのみが除去されている、請求項93記載のキット。
【請求項９５】
GPをコードするORFが除去されている、請求項94記載のキット。
【請求項９６】
NPをコードするORFが除去されている、請求項94記載のキット。
【請求項９７】
Zタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項94記載のキット。
【請求項９８】
Lタンパク質をコードするORFが除去されている、請求項94記載のキット。
【請求項９９】
前記アレナウイルス粒子が、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントのいずれかを含む三セグメントアレナウイルス粒子である、請求項81〜98のいずれか一項記載のキット。
【請求項１００】
前記アレナウイルス粒子が1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む、請求項99記載のキット。
【請求項１０１】
前記アレナウイルス粒子が、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む、請求項99記載のキット。
【請求項１０２】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項99〜101のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０３】
前記三セグメントアレナウイルス粒子の増殖が、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104 PFUの前記三セグメントアレナウイルス粒子に感染させたマウスにおける持続感染の70日後に、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない、請求項99〜101のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０４】
2つの別々のセグメントの代わりに、一方のみに2つのアレナウイルスORFを結合させた2つのSセグメント又は2つのLセグメントのセグメント間の組換えが、ウイルスプロモーター活性を抑制する、請求項99〜103のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０５】
前記2つのSセグメントのうちの1つが:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)LをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
からなる群から選択される、請求項100記載のキット。
【請求項１０６】
前記2つのLセグメントのうちの1つが:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される、請求項101記載のキット。
【請求項１０７】
前記2つのSセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項100記載のキット。
【請求項１０８】
前記2つのLセグメントが、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む、請求項101記載のキット。
【請求項１０９】
前記アレナウイルス粒子が、さらに、免疫調節ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項81〜108のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１０】
前記免疫調節ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が:
（i）カルレティキュリン(CRT)又はその断片;
（ii）ユビキチン又はその断片;
（iii）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)又はその断片;
（iv）インバリアント鎖(CD74)又はその抗原性断片;
（v）結核菌熱ショックタンパク質70又はその抗原性断片;
（vi）単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22又はその抗原性断片;
（vii）CD40リガンド又はその抗原性断片;及び
（viii）Fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド又はその抗原性断片;
からなる群から選択される、請求項109記載のキット。
【請求項１１１】
前記アレナウイルス粒子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（「LCMV」）又はフニンウイルス（「JUNV」）由来である、請求項81〜110のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１２】
前記アレナウイルス粒子がLCMV由来である、請求項111記載のキット。
【請求項１１３】
前記LCMVが、MP株、WE株、アームストロング株、又はアームストロングクローン13株である、請求項112記載のキット。
【請求項１１４】
前記アレナウイルス粒子がJUNV由来である、請求項111記載のキット。
【請求項１１５】
前記JUNVが、JUNVワクチンCandid #1株、又はJUNVワクチンXJクローン3株である、請求項114記載のキット。
【請求項１１６】
前記アレナウイルス粒子の増殖又は感染性が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする前記ヌクレオチド配列によって影響されない、請求項81〜115のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１７】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する、請求項1記載の方法。
【請求項１１８】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム細胞死1（PD1）に結合するか、又はその活性を阻害する抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１１９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3）、又はIg及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）に結合するか、又はその活性を阻害する抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１２０】
前記アレナウイルス粒子がネオ抗原をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項１２１】
前記ネオ抗原が、R203M変異を有するADP依存性グルコキナーゼ（Adpgk）である、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
前記アレナウイルス粒子が黒色腫抗原をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項１２３】
前記黒色腫抗原が糖タンパク質100（GP100）である、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
前記黒色腫抗原がチロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1）である、請求項122記載の方法。
【請求項１２５】
前記黒色腫抗原がチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2）である、請求項122記載の方法。
【請求項１２６】
前記対象が結腸癌を患っている、請求項120又は121記載の方法。
【請求項１２７】
前記対象が黒色腫を患っている、請求項122〜125のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム細胞死1（PD1）に結合するか、又はその活性を阻害する抗体である、請求項120〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
対象における腫瘍性疾患を治療する方法におけるアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤の使用であって、前記方法が、前記対象に前記アレナウイルス粒子及び前記免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、前記アレナウイルス粒子が:
（i）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び
（ii）前記アレナウイルス粒子の糖タンパク質（「GP」）、核タンパク質（「NP」）、マトリックスタンパク質Z（「Zタンパク質」）又はRNA依存性RNAポリメラーゼL（「Lタンパク質」）をコードしているORFの野生型の位置以外の位置にある少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(「ORF」);
を含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されている、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2015年11月12日に出願された米国仮出願第62/254,654号、及び2015年11月12日に出願された米国仮出願第62/254,651号からの優先権の恩典を主張するものであり、それらの全体の内容は、それぞれ引用により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本願は、EFS-Web経由のASCII形式で提出された配列表を含有し、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。2016年11月2日に作成された前記ASCIIコピーは、13194-017-228_Sequence_Listing.txtと名付けられ、サイズは112,465バイトである。
【背景技術】
【０００３】
(1. 序論)
本願は、一般的に、癌などの腫瘍性疾患に対する好適なワクチンである遺伝子改変アレナウイルスに関する。本明細書に記載されるアレナウイルスは、ワクチン及び/又は腫瘍性疾患の治療及び/又は免疫療法で使用するのに好適であり得る。特に、本明細書に提供されるのは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて遺伝子改変アレナウイルスを投与することにより腫瘍性疾患を治療する方法及び組成物であり、該アレナウイルスは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むように改変されている。
【０００４】
(2. 背景)
(2.1 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスの研究及びヒトの疾患)
アレナウイルス科のメンバーであるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）は、ウイルス感染の研究における原型のマウスモデルウイルスである。1930年代のその単離（Rivers及びMcNair Scottの文献, 1935, Science, 81(2105): 439-440）以来、このウイルスを用いた研究は、ウイルスの免疫学及び病原性において多くの重要な概念を明らかにした(Zinkernagelの文献, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:1-5; Oldstoneの文献, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:83-117にまとめられている)。LCMVは、特に持続感染との関連でウイルスの分子生物学及び免疫応答を調べるために広く使用されている。LCMVの自然宿主はマウスであるが、LCMVはまだ調べられていないヒト病原体でもある可能性をいくつかの報告が明らかにした(Bartonの文献, 1996, Clin. Infect. Dis, 22(1):197; Wrightらの文献 , 1997, Pediatrics 100(1): E9)。さらに、アレナウイルス科の多数の他のメンバーは、世界中の齧歯類集団で発見されている。アフリカで見つけることができる旧世界アレナウイルスのラッサウイルス（LASV）に加えて、フニン、グアナリト又はマチュポのようないくつかの新世界アレナウイルスが、南米の多様な齧歯類集団に蔓延している(Johnsonらの文献, 1966, Am J Trop Med Hyg, 15(1): 103-106; Teshらの文献, 1993, Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235; Millsらの文献, 1994, Trop Med Hyg 51(5): 554-562)。ヒトへの感染時に、これらのウイルスの多くは、高い死亡率と関連するウイルス性出血熱を引き起こし得る(Geisbert及びJahrlingの文献, 2004, Nat Med 10(12 Suppl): S110-121)。
【０００５】
(2.2 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスのゲノム構成)
アレナウイルスはエンベロープウイルスである。そのゲノムは、ネガティブセンスの一本鎖RNAの2つのセグメントからなる(L: 7.2kb, S: 3.4kb)。各セグメントは、反対方向に2つのウイルス遺伝子をコードしている。短いセグメント（Sセグメント）は、ウイルス糖タンパク質（GP）前駆体(GP-C; 75kDa)及び核タンパク質(NP; 63kDa)をコードしている(Salvatoらの文献,1988, Virology 164(2): 517-522)。長いセグメント（Lセグメント）は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp; Lタンパク質; 約200kDa)及びマトリックスタンパク質Z（タンパク質Z）、RINGフィンガータンパク質（11kDa）を発現する（図1A）（Salvatoらの文献, 1988, Virology 164(2): 517-522）。GP前駆体GP-Cは、翻訳後にGP-1及びGP-2に開裂し、非共有結合の状態にある(Buchmeier及びOldstoneの文献, 1979, Virology 99(1): 111-120)。GP-1及びGP-2の三量体は、ビリオンの表面上でスパイクとしてアセンブルし、細胞表面受容体との相互作用によって、宿主細胞への侵入を媒介するのに必須である。ウイルスの結合及び宿主細胞への侵入は、LCMVの唯一の細胞受容体としての細胞受容体α-ジストログリカンとLCMV GPの相互作用によって媒介されると長い間主張された(Caoらの文献, 1998, Science, 282(5396):2079-2081)。ごく最近、3つの追加のヒト分子（TAMファミリーからのAxl及びTyro3並びに樹状細胞特異的細胞内接着分子3-結合ノンインテグリン）が、α-ジストログリカンと独立して細胞内へのLCMVの侵入を可能にする、LCMV及びLCMVに密接に関連するLASVの追加の受容体と仮定された(Shimojima及びKawaokaの文献, 2012, J Vet Med, 74(10):1363-1366; Shimojimaらの文献, 2012, J Virol 86(4):2067-2078)。NPは、ウイルスRNAに結合し、ヌクレオカプシドを形成し、ウイルスLタンパク質の鋳型として機能する。ウイルスLタンパク質と結合したヌクレオカプシドは、いわゆるリボ核タンパク質複合体を形成し、これは、複製と転写の両方で活性があり、ウイルス感染の最小単位を表す。NP及びLタンパク質が、ウイルスRNAの転写及び複製に必要である最小トランス作用因子であることが示されている(Leeらの文献, 2000, J Virol 74(8): 3470-3477)。各セグメント上の2つの遺伝子は、非コード遺伝子間領域（IGR）によって隔てられており、5'及び3'非翻訳領域（UTR）が隣接している。IGRは、安定なヘアピン構造を形成し、ウイルスmRNA転写の構造依存的終結に関与することが示されている(Pinschewerらの文献, 2005, J Virol 79(7): 4519-4526)。UTRの末端ヌクレオチドは、高度の相補性を示し、二次構造の形成をもたらす。これらのパンハンドル構造は、転写及び複製のためのウイルスプロモーターとして機能することが知られており、部位特異的突然変異誘発によるそれらの分析は、マイナーな配列変化でさえ許容されない配列依存性及び構造依存性を明らかにした(Perez及びde la Torreの文献, 2003, Virol 77(2): 1184-1194)。
【０００６】
(2.3 逆遺伝学的システム)
LCMV様マイナス鎖ウイルスの単離及び精製されたRNAは、mRNAとして直接機能することができない、すなわち、細胞に導入された時に、翻訳され得ない。その結果、ウイルスRNAでの細胞のトランスフェクションは、感染性ウイルス粒子の生成をもたらさない。培養された許容細胞においてcDNAからマイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を作製するために、ウイルスRNAセグメント（複数可）は、転写及び複製に必要な最小限の因子でトランス補完されなければならない。数年前に公開されたミニゲノムシステムの助けを借りて、ウイルス粒子の転写、複製及び形成に関与するウイルスのシス作用エレメント及びトランス作用因子は、最終的に分析することができた(Leeらの文献, 2000, J Virol 74(8): 3470-3477; Leeらの文献, 2002, J Virol 76(12): 6393-6397; Perez及びde la Torreの文献,  2003, J Virol 77(2): 1184-1194; Pinschewerらの文献, 2003, J Virol 77(6): 3882-3887; Pinschewerらの文献, 2005, J Virol 79(7): 4519-4526)。LASV及びタカリベウイルスのような他のアレナウイルスについても逆遺伝学システムが確立された(Lopezらの文献, 2001, J Virol 75(24): 12241-12251; Hassらの文献, 2004, J Virol 78(24): 13793-13803)。2つの刊行物が、それぞれpol-I/-II又はT7/pol-II駆動型プラスミドを使用して、cDNAからの感染性LCMVの完全回収（「ウイルスレスキュー」と呼ばれる）を示した(Flatz らの文献, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103(12): 4663-4668; Sanchez及びde la Torreの文献, 2006, Virology 350(2): 370-380)。
【０００７】
(2.4 対象となる組換えLCMV発現遺伝子)
対象となる外来遺伝子を発現する組換えマイナス鎖RNAウイルスの作製が、長い間追求されてきた。他のウイルスについて様々な戦略が公表されている(Garcia-Sastreらの文献, 1994, J Virol 68(10): 6254-6261; Percyらの文献, 1994, J Virol 68(7): 4486-4492; Flick及びHobomの文献, 1999, Virology 262(1): 93-103; Machadoらの文献, 2003, Virology 313(1): 235-249)。過去に、二セグメントLCMV粒子のゲノムに追加の外来遺伝子を導入することが可能であることが示されている(Emonetらの文献, 2009, PNAS, 106(9):3473-3478)。対象となる2つの外来遺伝子が、LCMVの二セグメントゲノムに挿入されると、2つのSセグメント及び1つのLセグメントを有する三セグメントLCMV粒子(r3LCMV)が得られた。Emonetらの文献,(2009)によって公表された三セグメントウイルスにおいて、NPとGPの両方は、Sセグメント内でそれぞれの天然位置に保持されるため、隣接UTRの中のそれらの天然のプロモーター下で発現した。
【０００８】
(2.5 複製欠損アレナウイルス)
最近、感染性アレナウイルス粒子は、感染細胞中でその遺伝物質を増幅及び発現する能力を有するゲノムを含有するが、遺伝子改変されていない正常細胞ではさらなる子孫を生成することができないように改変することはできる（すなわち、感染性複製欠損アレナウイルス粒子）ことが示された（国際公開番号：WO 2009/083210及び国際公開番号:WO 2014/140301）。
【０００９】
(2.6 対象となる遺伝子を発現する複製欠損アレナウイルスベクター)
抗原の発現用のベクターとしての感染性複製欠損アレナウイルスの使用が報告されている(Flatzらの文献, 2010, Nat. Med.,16(3):339-345; Flatzらの文献, 2012, J. Virol., 86(15), 7760-7770参照)。これらの感染性複製欠損アレナウイルスは、宿主細胞に感染する、すなわち、宿主細胞に付着し、宿主細胞にその遺伝物質を放出することができる。しかしながら、それらは、複製能を欠損している、すなわち、該アレナウイルスは、GPタンパク質などのウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の欠失又は機能的不活化により、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができない。代わりに、該ORFは、対象となる抗原のヌクレオチド配列と置換されている。2010年のFlatzらの文献において、著者らは、OVA（SIINFEKLエピトープ）を発現させるために、ベクターとして感染性複製欠損アレナウイルスを使用した。2012年のFlatzらの文献において、著者らは、HIV/SIV Envを発現させるために、ベクターとして複製欠損アレナウイルスを使用した。
【発明の概要】
【００１０】
(3. 発明の概要)
本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子を使用して腫瘍性疾患を治療する方法及び組成物である。また、本明細書に提供されるのは、免疫チェックポイント阻害剤を使用して腫瘍性疾患を治療する方法及び組成物である。そのような免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉することができる。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子、及び負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を使用して腫瘍性疾患を治療する方法である。また、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子、及び負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物である。
【００１１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有するアレナウイルスゲノムセグメント、及びORFの野生型の位置以外の位置に少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム（「ORF」）を含有するように改変されている。ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。他の実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、複製欠損であるか、又は複製可能であり得る三セグメントアレナウイルス粒子である。さらに他の実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、増殖した時に、複製可能二セグメントウイルス粒子を生じない。
【００１２】
(3.1 非天然オープンリーディングフレームを有するアレナウイルス粒子)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、そのゲノム中のORFが再配列され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有するアレナウイルスである。特定の実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントを含む。したがって、ある特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び少なくとも1つのアレナウイルスORFを前記ORFの野生型の位置以外の位置に含み、該ORFが、アレナウイルス粒子の糖タンパク質（「GP」）、核タンパク質（「NP」）、マトリックスタンパク質Z（「Zタンパク質」）又はRNA依存性RNAポリメラーゼL（「Lタンパク質」）をコードするアレナウイルスゲノムセグメントである。また、本明細書に提供されるのは、そのようなアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されたアレナウイルス粒子である。
【００１３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入することができる。あるより具体的な実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入し、その後、宿主細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性複製欠損アレナウイルス粒子であるように改変される、すなわち、感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を有するゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができない。
【００１４】
本明細書に提供されるアレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされる腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン(Lengsin)、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ(Meloe)、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン(secernin)1、SOX1O、STEAP1(前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン(survivinn)、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス(synaptophysis)、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原のうちの1以上であり得る。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれより多くの腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の抗原性断片は、アレナウイルス内に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１５】
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスゲノムセグメントである。ある実施態様において、該ゲノムセグメントは、ORFの野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFを担持するために改変される。いくつかの実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントは、
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される。
【００１６】
ある実施態様において、該アレナウイルスの3'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3'UTRである。ある実施態様において、該アレナウイルスの5'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5'UTRである。
【００１７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、該アレナウイルス粒子がSセグメント及びLセグメントを含むように第2のアレナウイルスのゲノムセグメントを含む。
【００１８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入することができる。あるより具体的な実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入し、その後、宿主細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させることができる。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を有するゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変された感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、複製可能であり、遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成することができる。あるより具体的な実施態様において、そのような複製可能粒子は、複製可能粒子が由来する野生型ウイルスに比べて弱毒化される。
【００１９】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子を含む、本明細書に提供されるアレナウイルスゲノムセグメントは、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化されている少なくとも1つのアレナウイルスORFを含む。該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードすることができる。さらに、ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFは、除去されており、かつ本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの1つのみが除去されている。したがって、ある実施態様において、GPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、NPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Zタンパク質をコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは除去されている。
【００２０】
ある実施態様において、本明細書に提供される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子は、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化された少なくとも1つのアレナウイルスORFを含む。該ORFは、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードすることができる。さらに、ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFは、除去されており、かつ本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列で置換されている。ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの1つのみが除去されている。したがって、ある実施態様において、GPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、NPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Zタンパク質をコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは除去されている。
【００２１】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子は、さらに、少なくとも1つの免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、カルレティキュリン(CRT)又はその断片;ユビキチン又はその断片;顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)又はその断片;インバリアント鎖(CD74)又はその抗原性断片;結核菌(Mycobacterium tuberculosis)熱ショックタンパク質70又はその抗原性断片;単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22又はその抗原性断片;CD40リガンド又はその抗原性断片;Fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド又はその抗原性断片である。
【００２２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（「LCMV」）又はフニンウイルス（「JUNV」）などの特定のアレナウイルス種に由来する。言い換えれば、アレナウイルス粒子をコードするゲノム情報は、アレナウイルスの特定の種に由来する。したがって、ある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、LCMVに由来する。他の実施態様において、該アレナウイルス粒子はJUNVに由来する。さらに、具体的な実施態様において、該LCMVは、MP株、WE株、アームストロング株、又はアームストロングクローン13株である。他の具体的な実施態様において、該JUNVは、JUNVワクチンCandid #1株、又はJUNVワクチンXJクローン3株である。
【００２３】
(3.2 三セグメントアレナウイルス)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含むことができる。ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能二セグメントアレナウイルス粒子に組換えを起こさない。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104 PFUの三セグメントアレナウイルス粒子を感染させたマウスにおける持続感染の70日後に、複製可能二セグメント粒子をもたらさない。本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、ある実施態様において、遺伝的安定性が改善され、持続的な導入遺伝子発現を確実にするように改変することができる。さらに、ある実施態様において、2つの別々のセグメントの代わりに、一方のみに2つのアレナウイルスのORFを結合している2つのSセグメント又は2つのLセグメントのセグメント間の組換えは、ウイルスプロモーター活性を抑制する。
【００２４】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入することができる。あるより具体的な実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性である、すなわち、宿主細胞に侵入するか、又は宿主細胞にその遺伝物質を注入し、その後、宿主細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させることができる。ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を有するゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変された感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能であり、遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成することができる。あるより具体的な実施態様において、そのような複製可能粒子は、複製可能粒子が由来する野生型ウイルスに比べて弱毒化される。
【００２５】
本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされる腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原のうちの1以上であり得る。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれより多くの腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の抗原性断片は、三セグメントアレナウイルス内に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、それらのゲノム中のORFが再配列され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有する三セグメントアレナウイルスである。特定の実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFを担持するように改変されている。したがって、ある特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び少なくとも1つアレナウイルスORFを前記ORFの野生型の位置以外の位置に含み、該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードする。
【００２７】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子に含まれる2つのSセグメントのうちの1つは:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるSセグメント;
からなる群から選択される。
【００２８】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子に含まれる2つのLセグメントのうちの1つは:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
からなる群から選択される。
【００２９】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子の3'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3'UTRである。他の実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子の5'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5'UTRである。
【００３０】
ある実施態様において、2つのSセグメントは、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
ある実施態様において、2つのLセグメントは、(i)それぞれ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ若しくは2つのヌクレオチド配列;又は(ii)1つ若しくは2つの重複アレナウイルスORF;又は(iii)腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及び1つの重複アレナウイルスORFをコードする1つのヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、少なくとも部分的に除去されているか、又は機能的に不活化されている少なくとも1つのアレナウイルスORFを含む。該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードすることができる。さらに、ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFは、除去されており、かつ本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列で置換されている。ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの1つのみが除去されている。したがって、ある実施態様において、GPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、NPをコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Zタンパク質をコードするORFは除去されている。ある実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは除去されている。
【００３３】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（「LCMV」）又はフニンウイルス（「JUNV」）などの特定アレナウイルス種に由来する。言い換えれば、三セグメントアレナウイルス粒子をコードするゲノム情報は、アレナウイルスの特定の種に由来する。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、LCMVに由来する。他の実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子はJUNVに由来する。さらに、具体的な実施態様において、該LCMVは、MP株、WE株、アームストロング株、又はアームストロングクローン13株である。他の具体的な実施態様において、該JUNVは、JUNVワクチンCandid #1株、又はJUNVワクチンXJクローン3株である。
【００３４】
(3.3 腫瘍性疾患を治療する方法)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法である。このような方法は、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含むことができる。
【００３５】
ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、感染性複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子若しくは複製可能三セグメントアレナウイルス粒子を含む、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、本方法で使用される、三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子は、複製欠損であり、該アレナウイルス粒子は:（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を有するゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。また、ある実施態様において、本方法で使用される三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能であり、該三セグメントアレナウイルス粒子は、（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力;及び（3）遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成する能力を含むゲノムを含有するように改変されている。ある実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する。ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、本方法で使用される感染性複製欠損アレナウイルス粒子は:（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。ある実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する。
【００３６】
ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子を含む、アレナウイルス粒子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされる腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72��TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原のうちの1以上であり得る。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれより多くの腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片は、三セグメントアレナウイルスを含むアレナウイルス内に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を投与することにより、対象における腫瘍性疾患を治療する方法である。ある実施態様において、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092からなる群から選択される。
【００３８】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法を使用して治療される対象は、腫瘍性疾患を患っているか、それを起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている。したがって、いくつかの実施態様において、該対象は、腫瘍性疾患を患っている。いくつかの実施態様において、該対象は、腫瘍性疾患を起こしやすい。いくつかの実施態様において、該対象は、腫瘍性疾患のリスクに曝されている。ある実施態様において、対象が本明細書に提供される方法により治療可能である腫瘍性疾患は、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫;脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫;髄芽腫;髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫;乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer);中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００３９】
ある実施態様において、本明細書に提供される本方法で使用される、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルスを含むアレナウイルス粒子、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、異なる種々の組み合わせで投与することができる。したがって、ある実施態様において、該アレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に共投与される。他の実施態様において、該アレナウイルス粒子は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。さらに他の実施態様において、該アレナウイルス粒子は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。アレナウイルス粒子と免疫チェックポイント阻害剤の投与間の間隔は、数時間、数日、数週間又は数ヶ月であり得る。したがって、いくつかの実施態様において、該間隔は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約1週間、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約9週間、約10週間、約11週間、約12週間、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、又はそれ以上である。
【００４０】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、治療有効量の本明細書に提供される三セグメントアレナウイルスを含むアレナウイルス粒子及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、治療有効量のアレナウイルス粒子及び治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、該アレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及びORFの野生型の位置以外の位置に少なくとも1つのアレナウイルスORFを含むゲノムセグメント含有するように改変されており、該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードし、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する、前記方法である。
【００４１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、治療有効量の二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子及び治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、該アレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されており、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する、前記方法である。
【００４２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、本明細書に提供され、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する三セグメントアレナウイルスを含む2以上のアレナウイルスを該対象に投与することを含む、前記方法である。より具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法は、第1のアレナウイルス粒子を該対象に投与し、ある期間後に、第2のアレナウイルス粒子を該対象に投与することを含む。さらに別の実施態様において、第1のアレナウイルス粒子及び第2のアレナウイルス粒子は、異なるアレナウイルス種に由来し、かつ/又は異なる腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、ネオ抗原をコードするアレナウイルス粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施態様において、該ネオ抗原は、R203M変異を有するADP依存性グルコキナーゼ（Adpgk）である。いくつかの実施態様において、該対象は結腸癌を有する。いくつかの実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死1（「PD1」）に結合するか、又はその活性を阻害する抗体である。したがって、一実施態様において、本明細書に開示されるのは、対象における結腸癌を治療する方法であって、アレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、該アレナウイルス粒子は、（i）ネオ抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び（ii）ORFの野生型の位置以外の位置に少なくとも1つのアレナウイルスORFを含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されており、該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードし、該ネオ抗原は、R203M変異を有するAdpgkであり、該免疫チェックポイント阻害剤は、PD1に結合するか、又はそれを阻害する抗体であり、該アレナウイルス粒子は、LCMVに由来し、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子であり、2つのSセグメントのうちの1つにおいて、GPをコードするORFはアレナウイルス3' UTRの制御下にあり、2つのSセグメントの各々は、ネオ抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
【００４４】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、黒色腫抗原をコードするアレナウイルス粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施態様において、黒色腫抗原は、糖タンパク質100（「GP100」）、チロシナーゼ関連タンパク質1（「TRP1」）又はチロシナーゼ関連タンパク質2（「TRP2」）である。いくつかの実施態様において、該対象は黒色腫を有する。いくつかの実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、PD1に結合するか、又はその活性を阻害する抗体である。したがって、一実施態様において、本明細書に開示されるのは、対象における黒色腫を治療する方法であって、アレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、該アレナウイルス粒子は、（i）黒色腫抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び（ii）ORFの野生型の位置以外の位置に少なくとも1つのアレナウイルスORFを含むアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されており、該ORFは、アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードし、該黒色腫抗原は、GP100、TRP1及びTRP2からなる群から選択され、免疫チェックポイント阻害剤は、PD1に結合するか、又はそれを阻害する抗体であり、該アレナウイルス粒子は、LCMVに由来し、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子であり、2つのSセグメントのうちの1つにおいて、GPをコードするORFはアレナウイルス3' UTRの制御下にあり、2つのSセグメントの各々は、黒色腫抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法である。
【００４５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される対象における腫瘍性疾患の治療方法における、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤の使用である。
【００４６】
(3.4 医薬組成物及びキット)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤、及び医薬として許容し得る担体を含む組成物、例えば、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物である。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
【００４７】
ある実施態様において、該組成物内に含有されるアレナウイルス粒子は、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。ある実施態様において、該組成物内に含有されるアレナウイルス粒子は、感染性複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子又は複製可能三セグメントアレナウイルス粒子を含む本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物を含む、本明細書に提供する組成物は、複製欠損である三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子を含み、該アレナウイルス粒子は、（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。また、ある実施態様において、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物を含む、本明細書に提供する組成物は、複製可能である三セグメントアレナウイルス粒子を含み、該三セグメントアレナウイルス粒子は、（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力、及び（3）遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成する能力を含むゲノムを含有するように改変されている。ある実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する。
【００４８】
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。具体的なある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。さらなる実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する。
【００４９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされる腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン��P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原のうちの1以上であり得る。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれより多くの腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の抗原性断片は、アレナウイルス内に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００５０】
ある実施態様において、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物を含む、本明細書に提供される組成物は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を含む。ある実施態様において、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092からなる群から選択される。
【００５１】
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物は、本明細書に記載される方法において使用することができる。したがって、ある実施態様において、該組成物は、腫瘍性疾患の治療のために使用することができる。具体的なある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫; 脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌; 胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫; 髄芽腫; 髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫; 乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer); 中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫; 形質細胞���瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍性疾患の治療のために使用することができる。
【００５２】
また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される方法を実行するために使用することができるキットである。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、1以上の容器及び使用説明書を含み、該1以上の容器は、本明細書に提供される組成物（例えば、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物）を含む。他のある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、それぞれが本明細書に記載される方法を実行するための活性成分を含有する容器を含む。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、2以上の容器及び使用説明書を含み、容器の1つは、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子を含み、別の容器は、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、2以上の容器及び使用説明書を含み、容器の1つは、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子を含み、別の容器は、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含み、該アレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。さらに、ある実施態様において、容器の1つは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力、及び遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成する能力を含むゲノムを含有するように改変されている三セグメントアレナウイルス粒子を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、2以上の容器及び使用説明書を含み、容器の1つは、本明細書に提供される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子を含み、別の容器は、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、2以上の容器及び使用説明書を含み、容器の1つは、本明細書に提供される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子を含み、別の容器は、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含み、該アレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。ある実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する。
(3.5 慣例及び略語)
【表１】
2018533604.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５３】
(４. 図面の簡単な説明)
【図１】二セグメント及び三セグメントLCMVのゲノム構成の概略図。野生型LCMVの二セグメントゲノムは、GP及びNPをコードする1つのSセグメント並びにZタンパク質及びLタンパク質をコードする1つのLセグメントからなる(i)。両方のセグメントには、それぞれ5'UTR及び3'UTRが隣接している。組換え三セグメントLCMV(r3LCMV)のゲノムは、Sセグメントの各1つに対象となる遺伝子(ここでは、代替的に本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片であり得るGFP)を挿入するための1つの位置を有する1つのLセグメント及び2つのSセグメントからなる。r3LCMV-GFP天然(nat)は、それらの天然位置に全てのウイルス遺伝子を有する(ii)が、r3LCMV-GFP人工(art)中のGP ORFは、3'UTRに人為的に並置され、3'UTRの制御下で発現する(iii)。
【００５４】
【図２】野生型アレナウイルスのゲノムは、短い(1;約3.4kb)RNAセグメント及び大きい(2;約7.2kb)RNAセグメントからなる。短いセグメントは、核タンパク質(3)及び糖タンパク質(4)をコードするオープンリーディングフレームを担持する。大きいセグメントは、RNA依存性RNAポリメラーゼL(5)及びマトリックスタンパク質Z(6)をコードする。野生型アレナウイルスは、糖タンパク質遺伝子を欠失させ、該糖タンパク質遺伝子の代わりに、それに対する免疫応答が誘導されることになる本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片(7)を挿入することにより、複製欠損ワクチンベクターにすることができる。
【００５５】
【図３】図3A〜3Bは、腫瘍成長（図3A）及び生存率（図3B）についての、OVA抗原（r3LCMV-OVA）をコードする三セグメント複製可能アレナウイルスベクター及び抗PD1抗体（aPD1）で処置したMC-38 OVAマウス癌モデル（MC-38 OVADim腫瘍細胞を移植したC57BL/6マウス）の例示的な結果を示す。シンボルは、グループあたり5匹（未処置）又は6匹（他のグループ）のマウスの平均値±SEMを表す。
【００５６】
【図４】図4A〜4Cは、AdpgK変異抗原特異的CD8+細胞傷害性T細胞の誘導（図4A）、腫瘍成長（図4B）及び生存率（図4C）についての、Adpgk変異抗原(Adpgk変異)をコードする三セグメント複製可能（r3LCMV）又は二セグメント複製欠損（r2LCMV）アレナウイルスベクター、及び抗-PD1抗体（α-PD-1又はPD1）で処置したMC-38マウス癌モデル（MC-38腫瘍細胞を移植したC57BL/6マウス）の例示的な結果を示す。
【００５７】
【図５】図5Aは、黒色腫マウスモデルの例示的な治療計画を表す図である。
【００５８】
図5B〜5Dは、腫瘍成長（図5B）、動物の生存率（図5C）及び生存の日数（図5D）について、図5Aの治療計画を用いて、黒色腫抗原をコードする三セグメント複製可能（r3LCMV）又は二セグメント複製欠損（rLCMV）アレナウイルスベクター、及び抗PD1抗体（α-PD-1）で処置した黒色腫マウスモデル（B16F10黒色腫細胞を注射したC57BL/6マウス）の例示的な結果を示す。Gr.1は、r3LCMV及びα-PD-1で処置したグループを示す。Gr.2は、rLCMV及びα-PD-1で処置したグループを示す。Gr.3は、緩衝液及びα-PD-1で処置したグループを示す。Gr.4は、r3LCMVのみで処置したグループを示す。Gr.5は、rLCMVのみで処置したグループを示す。Gr.6は、緩衝液のみで処置したグループを示す。シンボルは、グループ当たり5匹のマウスの平均値±SEMを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
(5. 発明の詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、癌などの腫瘍性疾患を治療するための免疫療法である。用語「腫瘍性」又は「腫瘍」は、細胞又は組織の異常な新たな成長を指す。この異常な新たな成長は、腫瘍(tumor)又は腫瘍(neoplasia)としても知られている塊を形成することができる。腫瘍は、良性腫瘍、非浸潤性腫瘍、悪性腫瘍、及び不確か又は未知の挙動の腫瘍を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物を用いて治療される腫瘍性疾患は癌である。
【００６０】
本明細書に提供される免疫療法は、種々の方法及び組成物を含む。より具体的には、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子又はウイルスベクターである。これらの遺伝子改変ウイルスは、癌などの腫瘍性疾患の治療のために対象に投与することができる。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に提供されるアレナウイルスの詳細な説明は、第5.1節、第5.2節、第5.3節、及び第5.4節に見出すことができる。さらに、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するためのアレナウイルス粒子又はウイルスベクターの作製方法は、第5.5節及び第5.6節により詳細に記載されている。
【００６１】
対象にアレナウイルス粒子又はウイルスベクターを投与することに加えて、本明細書に提供される腫瘍性疾患を治療するための免疫療法は、免疫チェックポイント修飾因子を含むことができる。用語「免疫チェックポイント修飾因子」（「チェックポイント修飾因子」又は「チェックポイント調節因子」とも呼ばれる）は、1以上のチェックポイント分子の機能を調節（例えば、完全に又は部分的に低減、阻害、干渉、活性化、刺激、増加、強化若しくは支持）する分子又は化合物を指す。したがって、免疫チェックポイント修飾因子は、免疫チェックポイント阻害剤又は免疫チェックポイント活性化因子であり得る。
【００６２】
「免疫チェックポイント阻害剤」は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する分子を指す。ある実施態様において、本明細書に開示される方法及び組成物と共に使用するための免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を直接阻害するか、又は負のチェックポイント調節因子の発現を低下させるか、又は負のチェックポイント調節因子と結合パートナー（例えば、リガンド）の相互作用に干渉することができる。本明細書に開示される方法及び組成物と共に使用するための免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の発現を標的にするタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、又は阻害性RNA分子を含む。
【００６３】
「負のチェックポイント調節因子」は、リガンド又はカウンター受容体による結合後に、T細胞へ負のシグナルを送達することによって、免疫応答（例えば、T細胞活性化）を下方制御する分子を指す。負のチェックポイント調節因子の例示的な機能は、調和がとれていない免疫活性化を防止し、付随的な損傷を最小限にし、かつ/又は末梢自己寛容を維持することである。ある実施態様において、負のチェックポイント調節因子は、抗原提示細胞が発現するリガンド又は受容体である。ある実施態様において、負のチェックポイント調節因子は、T細胞が発現するリガンド又は受容体である。ある実施態様において、負のチェックポイント調節因子は、抗原提示細胞とT細胞の両方が発現するリガンド又は受容体である。
【００６４】
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子又はウイルスベクター及び免疫チェックポイント阻害剤を使用して、腫瘍性疾患を治療する方法及び組成物である。そのような免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉することができる。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子又はウイルスベクター、及び負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を使用して、腫瘍性疾患を治療する方法である。また、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子又はウイルスベクター、及び負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか又は干渉する免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子又はウイルスベクターは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と、ORFの野生型の位置以外の位置に少なくとも1つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム（「ORF」）とを有するアレナウイルスゲノムセグメントを含有するように改変されている。ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子又はウイルスベクターは、感染性複製欠損アレナウイルス粒子又はウイルスベクターである。他の実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、複製欠損又は複製可能であり得る三セグメントアレナウイルス粒子又はウイルスベクターである。さらに他の実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子又はウイルスベクターは、増殖した場合に、複製可能二セグメントウイルス粒子を生じない。アレナウイルス粒子又はウイルスベクター及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を使用するための方法及び組成物は、第5.8節及び第5.9節に詳細に記載されている。
【００６５】
(5.1 非天然位置にオープンリーディングフレームを有するアレナウイルス)
本明細書に提供されるのは、ORFを再配列させ、かつ本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有するアレナウイルスである。ある実施態様において、そのようなアレナウイルスは、複製可能であり、感染性である。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、アレナウイルスゲノムセグメントであり、該アレナウイルスゲノムセグメントは、それぞれの遺伝子が、ORFのLCMV-MP（「野生型位置」と本明細書で呼ぶ）などの野生から単離されたウイルスで見出されている位置以外の位置（すなわち、非天然位置）にアレナウイルスORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されている。
【００６６】
野生型アレナウイルスゲノムセグメント及びORFは、当技術分野で公知である。特に、該アレナウイルスゲノムは、Sセグメント及びLセグメントからなる。該Sセグメントは、GP及びNPをコードするORFを担持する。該Lセグメントは、Lタンパク質及びZタンパク質をコードする。両方のセグメントは、それぞれ5'UTR及び3'UTRに隣接する。
【００６７】
ある実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントは、野生型の位置以外の位置に2以上のアレナウイルスORFを担持するように改変することができる。他の実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントは、野生型の位置以外の位置に2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORFを担持するように改変することができる。
【００６８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルスゲノムセグメントは、
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
であり得る。
【００６９】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、アレナウイルスの3'UTR又はアレナウイルスの5'UTRの制御下に置くことができる。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスの3'UTRは、アレナウイルスSセグメントの3'UTRである。別の具体的な実施態様において、該アレナウイルスの3'UTRは、アレナウイルスLセグメントの3'UTRである。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスの5'UTRは、アレナウイルスSセグメントの5'UTRである。他の具体的な実施態様において、5'UTRは、Lセグメントの5'UTRである。
【００７０】
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、アレナウイルスの保存された末端配列エレメントの制御下に置くことができる(5'-及び3'-末端19〜20ヌクレオチド領域)(例えば、Perez＆de la Torreの文献, 2003, J Virol., 77(2): 1184-1194参照)。
【００７１】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、5'UTRプロモーターエレメントの制御下に置くことができる(例えば、Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。別の実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、3'UTRプロモーターエレメントの制御下に置くことができる(例えば、Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。より具体的な実施態様において、5'UTRプロモーターエレメントは、Sセグメント又はLセグメントの5'UTRプロモーターエレメントである。別の具体的な実施態様において、3'UTRプロモーターエレメントは、Sセグメント又はLセグメントの3'UTRプロモーターエレメントである。
【００７２】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、切断型アレナウイルスの3'UTR又は切断型アレナウイルスの5'UTRの制御下に置くことができる(例えば、Perez＆de la Torreの文献, 2003, J Virol., 77(2):1184-1194;Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。より具体的な実施態様において、該切断型3'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの3'UTRである。より具体的な実施態様において、該切断型5'UTRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの5'UTRである。
【００７３】
また本明細書に提供されるのは、アレナウイルス粒子がSセグメント及びLセグメントを含むように、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変された第1のゲノムセグメント及び第2アレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、ORFの野生型の位置以外の位置にあるORFは、アレナウイルスORFのうちの1つである。
【００７４】
ある具体的な実施態様において、該アレナウイルス粒子は、全4つのアレナウイルスORFの完全な相補体を含むことができる。具体的な実施態様において、該第2のアレナウイルスゲノムセグメントは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変されている。別の具体的な実施態様において、該第2のアレナウイルスゲノムセグメントは、野生型ゲノムセグメントであり得る(すなわち、セグメント上のORFを野生型の位置に含む)。
【００７５】
ある実施態様において、該第1のアレナウイルスゲノムセグメントはLセグメントであり、該第2のアレナウイルスゲノムセグメントはSセグメントである。他の実施態様において、該第1のアレナウイルスゲノムセグメントはSセグメントであり、該第2のアレナウイルスゲノムセグメントはLセグメントである。
【００７６】
ORFの野生型の位置以外の位置にORFを有するゲノムセグメント及び第2のゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子の非限定的な例を表1に示す。
表１
アレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある。
【表２】
2018533604.tif 000004
【００７７】
また本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAである。より具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、表1に記載のアレナウイルスゲノムのcDNA又はcDNAのセットである。
【００７８】
ある実施態様において、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込まれている。具体的な実施態様において、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントの生成を促進するDNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込まれている。別の実施態様において、本明細書に記載されるcDNAは、プラスミドに組み込むことができる。cDNA又は核酸及び発現系のより詳細な説明は、第5.7節に提供されている。cDNAの生成のための技術は、分子生物学並びにDNAの操作及び生成の日常的な従来技術である。当業者に公知の任意のクローニング技術を使用することができる。そのような技術は周知であり、当業者は、Sambrook及びRussellの文献、「分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory Manual)」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)などの実験室マニュアルで利用可能である。
【００７９】
ある実施態様において、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、宿主細胞に導入(例えば、トランスフェクト)される。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNA(すなわち、該ゲノムセグメントのcDNA)を含む宿主細胞である。他の実施態様において、本明細書に記載されるcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入することができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、ベクターに組み込まれる、本明細書に記載されるcDNAを含む宿主細胞である。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントは、宿主細胞に導入される。
【００８０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスゲノムセグメントを生成する方法であって、アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを転写することを含む、前記方法である。ある実施態様において、ウイルスポリメラーゼタンパク質は、インビトロ又はインビボでアレナウイルスゲノムセグメントの転写中に存在することができる。
【００８１】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、二方向性プロモーターを使用して行われる。他の実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、二方向性発現カセットを使用して行われる(例えば、Ortiz-Rianoらの文献, 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6):1175-1188参照)。より具体的な実施態様において、該二方向性発現カセットは、それぞれ挿入されるアレナウイルスゲノムセグメントの両側から2つの末端へ読むポリメラーゼI及びポリメラーゼIIプロモーターの両方を含む。さらにより具体的な実施態様において、pol-I及びpol-IIプロモーターを有する二方向性発現カセットは、両側からLセグメント及びSセグメントへ読む。
【００８２】
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAの転写はプロモーターを含む。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター又はT3プロモーターが挙げられる。
【００８３】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントを生成する方法はさらに、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを宿主細胞に導入することを含むことができる。ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントを生成する方法はさらに、アレナウイルスゲノムセグメントの生成のための全ての他の成分を発現する宿主細胞に、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを導入すること、及び該宿主細胞の上清から該アレナウイルスゲノムセグメントを精製すること、を含むことができる。そのような方法は、当業者に周知である。
【００８４】
本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される核酸、ベクター、及び組成物に感染した細胞株、培養物及び細胞を培養する方法である。本明細書に記載される核酸、ベクター系及び細胞株のより詳細な説明は、第5.7節に提供されている。
【００８５】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は、感染性で複製可能なアレナウイルス粒子をもたらす。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は弱毒化される。特定の実施態様において、該アレナウイルス粒子は、ウイルスが、依然として少なくとも部分的に広がることができ、インビボで複製できるが、不顕レベルの非病原性感染をもたらす低いウイルス負荷しか発生させることができないように弱毒化される。そのような弱毒化ウイルスは、免疫原性組成物として使用することができる。本明細書に提供されるのは、第5.9節に記載される、非天然位置にあるORFを有するアレナウイルスを含む免疫原性組成物である。
【００８６】
(5.1.1 非天然位置にオープンリーディングフレームを有する複製欠損アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)ORFが該ORFの野生型の位置以外の位置にある;かつ(ii)得られるウイルスがさらなる感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードするORFが除去されているか又は機能的に不活化されたアレナウイルス粒子である。1以上のORFが欠失した又は機能的に不活化された遺伝子改変ゲノムを含むアレナウイルス粒子は、相補細胞(すなわち、欠失した又は機能的に不活化されたアレナウイルスORFを発現する細胞)で生成することができる。得られるアレナウイルス粒子の遺伝物質は、宿主細胞の感染時に宿主細胞に移され、その中で該遺伝物質は発現及び増幅することができる。さらに、本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルス粒子のゲノムは、アレナウイルス粒子以外の生物からの異種ORFをコードすることができる。
【００８７】
ある実施態様において、アレナウイルスのORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化され、本明細書に記載される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列で置換されている。具体的な実施態様において、該アレナウイルスの糖タンパク質GPをコードするORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されている。ある実施態様において、遺伝子の機能的不活化は、任意の翻訳産物を排除する。ある実施態様において、機能的不活化は、ある程度の翻訳を可能にする遺伝的変化を指し、しかしながら、翻訳産物は、もはや機能的ではなく、野生型タンパク質と置換することはできない。
【００８８】
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。別の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORF、少なくとも2つのORF、少なくとも3つのORF、又少なくとも4つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換することができる。具体的な実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの1つのみが、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換される。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのGPをコードするORFは、除去される。別の具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのNPをコードするORFは、除去される。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのZタンパク質をコードするORFは、除去される。さらに別の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは、除去される。
【００８９】
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、(i)非天然位置にORFを担持するように改変され、(ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去され;(iii)除去されるORFが、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されているゲノムセグメントを含む。
【００９０】
ある実施態様において、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の断片は、（i）宿主（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ又はヒト）における抗体の免疫応答を誘発することができ、生じた抗体が腫瘍細胞（例えば、癌細胞）内又は腫瘍細胞上で発現する免疫原性タンパク質に特異的に結合する場合、かつ/又は（ii）特異的なT細胞免疫応答を誘発することができる場合に抗原性である。
【００９１】
ある実施態様において、本明細書に提供される抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、8〜100ヌクレオチド長、15〜100ヌクレオチド長、25〜100ヌクレオチド長、50〜200ヌクレオチド長、50〜400ヌクレオチド長、200〜500ヌクレオチド長、又は400〜600ヌクレオチド長、500〜800ヌクレオチド長である。他の実施態様において、本明細書に提供される抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、750〜900ヌクレオチド長、800〜100ヌクレオチド長、850〜1000ヌクレオチド長、900〜1200ヌクレオチド長、1000〜1200ヌクレオチド長、1000〜1500ヌクレオチド又は10〜1500ヌクレオチド長、1500〜2000ヌクレオチド長、1700〜2000ヌクレオチド長、2000〜2300ヌクレオチド長、2200〜2500ヌクレオチド長、2500〜3000ヌクレオチド長、3000〜3200ヌクレオチド長、3000〜3500ヌクレオチド長、3200〜3600ヌクレオチド長、3300〜3800ヌクレオチド長、4000ヌクレオチド長〜4400ヌクレオチド長、4200〜4700ヌクレオチド長、4800〜5000ヌクレオチド長、5000〜5200ヌクレオチド長、5200〜5500ヌクレオチド長、5500〜5800ヌクレオチド長、5800〜6000ヌクレオチド長、6000〜6400ヌクレオチド長、6200〜6800ヌクレオチド長、6600〜7000ヌクレオチド長、7000〜7200ヌクレオチド長、7200〜7500ヌクレオチド長、又は7500ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、5〜10アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、150〜200アミノ酸長、200〜250アミノ酸長、250〜300アミノ酸長、300〜400アミノ酸長、400〜500アミノ酸長、500〜750アミノ酸長、750〜1000アミノ酸長、1000〜1250アミノ酸長、1250〜1500アミノ酸長、1500〜1750アミノ酸長、1750〜2000アミノ酸長、2000〜2500アミノ酸長、又は2500以上のアミノ酸長であるペプチド又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2500アミノ酸長を超えないポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は終止コドンを含まない。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列はコドン最適化されている。ある実施態様において、ヌクレオチド組成、ヌクレオチド対組成又はその両方を最適化することができる。そのような最適化のための技術は、当技術分野で公知であり、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を最適化するために適用することができる。
【００９２】
ある実施態様において、該アレナウイルス粒子の増殖及び感染は、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列に影響されない。
【００９３】
当業者に公知の技術は、野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子を生成するために使用されてよい。例えば、逆遺伝学技術を使用して、そのようなアレナウイルス粒子を作製してよい。他の実施態様において、該複製欠損アレナウイルス粒子(すなわち、野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントであって、GP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFが欠失している)は、相補細胞で生成することができる。
【００９４】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子又はアレナウイルスゲノムセグメントは、さらに、少なくとも1つの免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、カルレティキュリン(CRT)若しくはその断片、ユビキチン若しくはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)若しくはその断片、インバリアント鎖(CD74)若しくはその抗原性断片、結核菌熱ショックタンパク質70若しくはその抗原性断片、単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22若しくはその抗原性断片、CD40リガンド若しくはその抗原性断片、又はFms-関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド若しくはその抗原性断片である。
【００９５】
ある実施態様において、本願に従って使用されるアレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子は、旧世界ウイルス、例えば、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、モバラウイルス、モペイアウイルス、又はイッピウイルス、又は新世界ウイルス、例えば、アマパリウイルス、フレキサル(Flexal)ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラテンウイルス、マチュポウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピリタルウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、ベアキャニオン(Bear Canyon)ウイルス、又はホワイトウォーターアロヨウイルスであり得る。
【００９６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は、ワクチンとして使用するのに好適であり、腫瘍性疾患、例えば、癌のためのワクチン接種及び治療におけるそのようなアレナウイルス粒子を使用する方法が提供される。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、第5.8節に提供されている。
【００９７】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は、医薬組成物として使用するのに好適であり、腫瘍性疾患、例えば、癌のためのワクチン接種及び治療におけるそのようなアレナウイルス粒子を使用する方法が提供される。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、第5.9節に提供されている。
【００９８】
(5.2 三セグメントアレナウイルス粒子)
本明細書に提供されるのは、そのORFを再配列させ、かつ本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を有する三セグメントアレナウイルス粒子である。一態様において、本明細書に提供されるのは、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子である。ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能な二セグメントアレナウイルス粒子に組み込まれない。より具体的には、ある実施態様において、ゲノムセグメントの2つ（例えば、それぞれ、2つのSセグメント又は2つのLセグメント）は、2つの親セグメントと置換することができる単一のウイルスセグメントを生成するように組み込むことができない。具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを含む。さらに別の具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、全4つのアレナウイルスORFを含む。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能であり、感染性である。他の実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFのうちの1つを欠いている。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性であるが、非相補細胞でさらなる感染性子孫を生成することができない。
【００９９】
ある実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、アレナウイルスの3'UTR又はアレナウイルスの5'UTRの制御下に置くことができる。より具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルスの3'UTRは、アレナウイルスSセグメント(複数可)の3'UTRである。別の具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルスの3'UTRは、三セグメントアレナウイルスLセグメント(複数可)の3'UTRである。より具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルスの5'UTRは、アレナウイルスSセグメント(複数可)の5'UTRである。他の具体的な実施態様において、該5'UTRは、Lセグメント(複数可)の5'UTRである。
【０１００】
他の実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、アレナウイルスの保存された末端配列エレメント(5'及び3'末端の19〜20ヌクレオチド領域)の制御下に置くことができる(例えば、Perez＆de la Torreの文献, 2003, J Virol.77(2):1184-1194参照)。
【０１０１】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードするORFは、5'UTRプロモーターエレメントの制御下に置くことができる(例えば、Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。別の実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFは、3'UTRプロモーターエレメントの制御下に置くことができる(例えば、Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。より具体的な実施態様において、5'UTRプロモーターエレメントは、Sセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の5'UTRプロモーターエレメントである。別の具体的な実施態様において、3'UTRプロモーターエレメントは、Sセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の3'UTRプロモーターエレメントである。
【０１０２】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質又はLタンパク質をコードするORFは、切断型アレナウイルスの3'UTR又は切断型アレナウイルスの5'UTRの制御下に置くことができる(例えば、Perez＆de la Torreの文献, 2003, J Virol., 77(2): 1184-1194; Albarinoらの文献, 2011, J Virol., 85(8):4020-4参照)。より具体的な実施態様において、該切断型3'UTRは、該アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの3'UTRである。より具体的な実施態様において、該切断型5'UTRは、該アレナウイルスSセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の5'UTRである。
【０１０３】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAである。より具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、表2又は表3に記載の三セグメントアレナウイルス粒子をコードするDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットである。
【０１０４】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルスゲノムをコードする核酸は、1以上のDNA発現ベクターの一部であるか又は1以上のDNA発現ベクターに組み込まれている。具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子のゲノムをコードする核酸は、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子の生成を促進する1以上のDNA発現ベクターの一部であるか又は1以上のDNA発現ベクターに組み込まれている。別の実施態様において、本明細書に記載されるcDNAは、プラスミドに組み込むことができる。cDNA及び発現系のより詳細な説明は、第5.7節に提供されている。cDNA生成のための技術は、分子生物学並びにDNAの操作及び生成の日常的な従来技術である。当業者に公知の任意のクローニング技術を使用することができる。そのような技術は周知であり、当業者は、Sambrook及びRussellの文献、「分子クローニング、実験室マニュアル」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)などの実験室マニュアルで利用可能である。
【０１０５】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルスのcDNAは、宿主細胞に導入(例えば、トランスフェクト)される。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、該三セグメントアレナウイルス粒子のcDNA(すなわち、該三セグメントアレナウイルス粒子のゲノムセグメントのcDNA)及び本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞である。他の実施態様において、本明細書に記載されるcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入することができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、ベクターに組み込まれる、本明細書に記載されるcDNAを含む宿主細胞である。他の実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルスゲノムセグメント(すなわち、Lセグメント及び/又はSセグメント又は複数のそれらのセグメント)は、宿主細胞に導入される。
【０１０６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、該三セグメントアレナウイルス粒子を生成する方法であって、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAを転写することを含む、前記方法である。ある実施態様において、ウイルスポリメラーゼタンパク質は、インビトロ又はインビボで該三セグメントアレナウイルス粒子の転写中に存在することができる。ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、二方向性プロモーターを使用して行われる。
【０１０７】
他の実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、二方向性発現カセットを使用して行われる(例えば、Ortiz-Rianoらの文献, 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188参照)。より具体的な実施態様において、該二方向性発現カセットは、それぞれ挿入されるアレナウイルスゲノムセグメントの両側から2つの末端へ読むポリメラーゼIとポリメラーゼIIプロモーターの両方を含む。
【０１０８】
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAの転写は、プロモーターを含む。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、又はT3プロモーターが挙げられる。
【０１０９】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子を生成する方法はさらに、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAを宿主細胞に導入することを含むことができる。ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子を生成する方法はさらに、該三セグメントアレナウイルス粒子の生成のための全ての他の成分を発現する宿主細胞に、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAを導入すること、及び該宿主細胞の上清から該三セグメントアレナウイルス粒子を精製することを含むことができる。そのような方法は、当業者に周知である。
【０１１０】
本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される核酸、ベクター、及び組成物に感染した細胞株、培養物及び細胞を培養する方法である。本明細書に記載される核酸、ベクター系及び細胞株のより詳細な説明は、第5.7節に提供されている。
【０１１１】
ある実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性複製可能アレナウイルス粒子をもたらす。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は弱毒化される。特定の実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、ウイルスが、依然として少なくとも部分的に複製可能であり、インビボで複製できるが、不顕レベルの非病原性感染をもたらす低いウイルス負荷しか発生させることができないように弱毒化される。そのような弱毒化ウイルスは、免疫原性組成物として使用することができる。
【０１１２】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、該二セグメントアレナウイルス粒子と同じ親和性を有する。
【０１１３】
また本明細書に提供されるのは、第5.8節及び第5.9節に記載される三セグメントアレナウイルス粒子を含む組成物である。
【０１１４】
(5.2.1 1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子)
一態様において、本明細書に提供されるのは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子である。ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。具体的な実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子(RAG1)を欠き、104 PFUの三セグメントアレナウイルス粒子(第5.10.14節参照)に感染させたマウスにおける持続感染の少なくとも10日、少なくとも20日、少なくとも30日、少なくとも40日、少なくとも50日、少なくとも60日、少なくとも70日、少なくとも80日、少なくとも90日、又は少なくとも100日後に、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。他の実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、少なくとも10継代、少なくとも20継代、少なくとも30継代、少なくとも40継代、又は少なくとも50継代後に複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。
【０１１５】
それぞれの野生型の位置に全てのウイルス遺伝子を有する三セグメントアレナウイルス粒子は、当技術分野で公知である(例えば、Emonetらの文献, 2011, J. Virol., 85(4):1473; Popkinらの文献, 2011, J. Virol, 85(15):7928)。特に、該三セグメントアレナウイルスゲノムは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントからなり、その中の本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、各Sセグメント上の1つの位置に挿入される。より具体的には、1つのSセグメントは、それぞれ、GP及び腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする。他のSセグメントは、それぞれ、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片及びNPをコードする。該Lセグメントは、Lタンパク質及びZタンパク質をコードする。全てのセグメントは、それぞれ5'UTR及び3'UTRに隣接している。
【０１１６】
ある実施態様において、2つの別々のセグメントの代わりに1つのセグメント上に2つのアレナウイルスORFを結合している、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子の2つのSセグメントのセグメント間の組換えは、非機能的なプロモーター(すなわち、構造:5'UTR----5'UTR又は3'UTR----3'UTRのゲノムセグメント)をもたらし、その中で、ゲノムの一端を形成する各UTRは、同一ゲノムの他端の逆方向反復配列である。
【０１１７】
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、ORFの野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されている。他の実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、野生型の位置以外の位置に2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORF、又は5つのアレナウイルスORF、又は6つのアレナウイルスORFを担持するように改変されている。具体的な実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、全4つのアレナウイルスORFの完全相補体を含む。したがって、いくつかの実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性複製可能三セグメントアレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子の2つのSセグメントは、野生型の位置以外の位置にそれらのORFのうちの1つを担持するように改変されている。より具体的な実施態様において、2つのSセグメントは、SセグメントのORFの完全相補体を含む。ある具体的な実施態様において、該Lセグメントは、野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変されているか、又は該Lセグメントは、野生型ゲノムセグメントであり得る。
【０１１８】
ある実施態様において、2つのSセグメントのうちの1つは:
(i)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(ii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
であり得る。
【０１１９】
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、重複ORF(すなわち、2つの野生型SセグメントのORF、例えば、GP又はNP)を含むことができる。具体的な実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、1つの重複ORF(例えば、(GP、GP))又は2つの重複ORF(例えば、(GP、GP)及び(NP、NP))を含むことができる。
【０１２０】
以下の表2Aは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子のゲノム構成を示し、該三セグメントアレナウイルスゲノム中の2つのSセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、得られる組換えSセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの3'UTRから構成されている)。
表2A
1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子
位置1は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある。
*ORFは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列が挿入されていることを示す。
【表３】
2018533604.tif 000005
【０１２１】
ある実施態様において、位置1と位置2と間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。具体的な実施態様において、位置1と位置2の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。ある実施態様において、他の組み合わせも可能である。例えば、三セグメントアレナウイルス粒子は、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含み、該三セグメントアレナウイルスゲノム中の2つのSセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、得られる組換えSセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの5'UTRで構成されている)。
【０１２２】
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子中のSセグメントとLセグメントのセグメント間の組換えは、2つの別々のセグメントの代わりに、1つのみのセグメント上に2つのウイルス遺伝子を有する機能的セグメントを復元する。他の実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子中のSセグメントとLセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。
【０１２３】
以下の表2Bは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子のゲノム構成を示し、該三セグメントアレナウイルスゲノム中の1つのSセグメントと1つのLセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、得られる組換えSセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの3'UTRから構成されている)。
表2B
1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子
位置1は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある。
*ORFは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列が挿入されていることを示す。
【表４】
2018533604.tif 000006
【０１２４】
ある実施態様において、位置1と位置2と間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。具体的な実施態様において、位置1と位置2の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。ある実施態様において、他の組み合わせも可能である。例えば、三セグメントアレナウイルス粒子は、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含み、該三セグメントアレナウイルスゲノム中の2つのSセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、得られる組換えSセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの5'UTRで構成されている)。
【０１２５】
ある実施態様において、当業者は、表2A又は2Bに示され、かつ本明細書に記載される構成でアレナウイルスゲノムを構築し、次いで、第5.10節に記載されるアッセイを使用して、該三セグメントアレナウイルス粒子が遺伝的に安定であるかどうか、すなわち、本明細書で論じられる複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさないかどうかを決定する。
【０１２６】
(5.2.2 2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子)
一態様において、本明細書に提供されるのは、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子である。ある実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。具体的な実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104 PFUの三セグメントアレナウイルス粒子(第5.10.14節参照)に感染させたマウスにおける少なくとも10日、少なくとも20日、少なくとも30日、少なくとも40日、又は少なくとも50日、少なくとも60日、少なくとも70日、少なくとも80日、少なくとも90日、少なくとも100日の持続後に、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。他の実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子の増殖は、少なくとも10継代、20継代、30継代、40継代、又は50継代後に複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。
【０１２７】
ある実施態様において、2つの別々のセグメントの代わりに、1つのセグメント上に2つのアレナウイルスORFを結合している、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子の2つのLセグメントのセグメント間の組換えは、非機能的なプロモーター(すなわち、構造:5'UTR----5'UTR又は3'UTR----3'UTRのゲノムセグメント)をもたらし、その中で、ゲノムの一端を形成する各UTRは、同一ゲノムの他端の逆方向反復配列である。
【０１２８】
ある実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、ORFの野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されている。他の実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、野生型の位置以外の位置に2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORF、又は5つのアレナウイルスORF、又は6つのアレナウイルスORFを担持するように改変されている。具体的な実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、全4つのアレナウイルスORFの完全相補体を含む。したがって、いくつかの実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、感染性複製可能三セグメントアレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子の2つのLセグメントは、野生型の位置以外の位置にそれらのORFのうちの1つを担持するように改変されている。より具体的な実施態様において、2つのLセグメントは、LセグメントのORFの完全相補体を含む。ある具体的な実施態様において、該Sセグメントは、野生型の位置以外の位置にそれらのORFのうちの1つを担持するように改変されているか、又は該Sセグメントは、野生型ゲノムセグメントであり得る。
【０１２９】
ある実施態様において、2つのLセグメントのうちの1つは:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの5'UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルスの3'UTRの制御下にあるLセグメント;
であり得る。
【０１３０】
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、重複ORF(すなわち、2つの野生型LセグメントのORF、例えば、Zタンパク質又はLタンパク質)を含むことができる。具体的な実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、1つの重複ORF(例えば、(Zタンパク質、Zタンパク質))又は2つの重複ORF(例えば、(Zタンパク質、Zタンパク質)及び(Lタンパク質、Lタンパク質))を含むことができる。
【０１３１】
以下の表3は、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子のゲノム構成を示し、該三セグメントアレナウイルスゲノム中の2つのLセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、Sセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの3'UTRから構成されている)。表3に基づいて、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの5'UTRから構成されているアレナウイルス粒子を作製するために、同様の組み合わせを予測することができる。
表3
2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある。
*ORFは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列が挿入されていることを示す。
【表５】
2018533604.tif 000007
【０１３２】
ある実施態様において、位置1と位置2と間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。具体的な実施態様において、位置1と位置2の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。ある実施態様において、他の組み合わせも可能である。
【０１３３】
ある実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子からのLセグメントとSセグメントのセグメント間の組換えは、2つの別々のセグメントの代わりに、1つのみのセグメント上に2つのウイルス遺伝子を有する機能的セグメントを復元する。他の実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子中のLセグメントとSセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさない。
【０１３４】
以下の表3Bは、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子のゲノム構成を示し、該三セグメントアレナウイルスゲノム中のLセグメントとSセグメントのセグメント間の組換えは、複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさず、アレナウイルスプロモーター活性を抑制する(すなわち、得られる組換えセグメントは、3'UTR及び5'UTRの代わりに、2つの3'UTRから構成されている)。
表3B
2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメントの5'UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメントの3'UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスSセグメントの5'UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスSセグメントの3'UTRの制御下にある。
*ORFは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列が挿入されていることを示す。
【表６】
2018533604.tif 000008
【０１３５】
ある実施態様において、位置1と位置2と間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。具体的な実施態様において、位置1と位置2の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。位置2と位置3の間のIGRは、アレナウイルスLセグメントのIGRであり得る。位置5及び位置6の間のIGRは、アレナウイルスSセグメントのIGRであり得る。ある実施態様において、他の組み合わせも可能である。
【０１３６】
ある実施態様において、当業者は、表3A又は3Bに示され、本明細書に記載される構成でアレナウイルスゲノムを構築し、次いで、第5.10節に記載されるアッセイを使用して、三セグメントアレナウイルス粒子が遺伝的に安定であるかどうか、すなわち、本明細書で論じられる複製可能二セグメントウイルス粒子をもたらさないかどうかを決定する。
【０１３７】
(5.2.3 複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)ORFが該ORFの野生型の位置以外の位置にある;かつ(ii)得られるウイルスがさらなる感染性子孫ウイルス粒子を生成することができない(すなわち、複製欠損である)ように、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去されているか、又は機能的に不活化されている三セグメントアレナウイルス粒子である。ある実施態様において、該第3のアレナウイルスセグメントはSセグメントであり得る。他の実施態様において、該第3のアレナウイルスセグメントはLセグメントであり得る。より具体的な実施態様において、該第3のアレナウイルスセグメントは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変することができるか、又は該第3のアレナウイルスセグメントは、野生型アレナウイルスゲノムセグメントであり得る。さらにより具体的な実施態様において、該第3のアレナウイルスセグメントは、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするアレナウイルスORFを欠く。
【０１３８】
ある実施態様において、三セグメントゲノムセグメントは、S又はLセグメントハイブリッド(すなわち、SセグメントとLセグメントの組み合わせであり得るゲノムセグメント)であり得る。他の実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、LセグメントのIGRを含むSセグメントである。別の実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、SセグメントのIGRを含むLセグメントである。他の実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、LセグメントのIGRを有するSセグメントのUTRである。別の実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、SセグメントのIGRを有するLセグメントのUTRである。具体的な実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、LセグメントのIGRを有するSセグメントの5'UTRであるか、又はLセグメントのIGRを有するSセグメントの3'UTRである。他の具体的な実施態様において、該ハイブリッドセグメントは、SセグメントのIGRを有するLセグメントの5'UTR又はSセグメントのIGRを有するLセグメントの3'UTRである。
【０１３９】
1以上のORFが欠失しているか、又は機能的に不活化されている遺伝子改変ゲノムを含む三セグメントアレナウイルス粒子は、相補細胞(すなわち、欠失しているか、又は機能的に不活化されているアレナウイルスORFを発現する細胞)で生成することができる。得られるアレナウイルス粒子の遺伝物質は、宿主細胞の感染時に宿主細胞に移ることができ、その中で該遺伝物質は発現及び増幅することができる。さらに、本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルス粒子のゲノムは、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１４０】
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。別の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORF、少なくとも2つのORF、少なくとも3つのORF、又は少なくとも4つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換することができる。具体的な実施態様において、GP、NP、Zタンパク質及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの1つのみが、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのGPをコードするORFは除去される。別の具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのNPをコードするORFは除去される。より具体的な実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントのZタンパク質をコードするORFは除去される。さらに別の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは除去される。
【０１４１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含み、その中で、(i)ORFが該ORFの野生型の位置以外の位置にある;かつ(ii)得られるウイルスが複製欠損で、感染性ではないように、GP又はNPをコードするORFが除去されているか、又は機能的に不活化されている三セグメントアレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、1つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。別の具体的な実施態様において、2つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。他の具体的な実施態様において、3つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。具体的な実施態様において、GPをコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。他の具体的な実施態様において、NPをコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。さらにより具体的な実施態様において、NPをコードするORF及びGPをコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1つ又は2つのヌクレオチド配列と置換されている。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、(i)1つのLセグメント及び2つのSセグメント;(ii)ORFの野生型の位置以外の位置にあるORF;(iii)本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1以上のヌクレオチド配列を含む。
【０１４２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含み、その中で、(i)ORFが該ORFの野生型の位置以外の位置にある;かつ(ii)得られるウイルスが複製欠損で、感染性ではないように、Zタンパク質及び/又はLタンパク質をコードするORFが除去されているか、又は機能的に不活化されている三セグメントアレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、1つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。別の具体的な実施態様において、2つのORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。具体的な実施態様において、Zタンパク質をコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。他の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。さらにより具体的な実施態様において、Zタンパク質をコードするORF及びLタンパク質をコードするORFは、除去され、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されている。したがって、ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、(i)2つのLセグメント及び1つのSセグメント;(ii)ORFの野生型の位置以外の位置にあるORF;(iii)本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１４３】
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、i)非天然位置にORFを担持するように改変され、ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去され;iii)除去されるORFが本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1以上のヌクレオチド配列と置換されている三セグメントアレナウイルス粒子(すなわち、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメント)を含む。
【０１４４】
ある実施態様において、本明細書に提供される抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、8〜100ヌクレオチド長、15〜100ヌクレオチド長、25〜100ヌクレオチド長、50〜200ヌクレオチド長、50〜400ヌクレオチド長、200〜500ヌクレオチド長、又は400〜600ヌクレオチド長、500〜800ヌクレオチド長である。他の実施態様において、本明細書に提供される抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、750〜900ヌクレオチド長、800〜100ヌクレオチド長、850〜1000ヌクレオチド長、900〜1200ヌクレオチド長、1000〜1200ヌクレオチド長、1000〜1500ヌクレオチド又は10〜1500ヌクレオチド長、1500〜2000ヌクレオチド長、1700〜2000ヌクレオチド長、2000〜2300ヌクレオチド長、2200〜2500ヌクレオチド長、2500〜3000ヌクレオチド長、3000〜3200ヌクレオチド長、3000〜3500ヌクレオチド長、3200〜3600ヌクレオチド長、3300〜3800ヌクレオチド長、4000ヌクレオチド長〜4400ヌクレオチド長、4200〜4700ヌクレオチド長、4800〜5000ヌクレオチド長、5000〜5200ヌクレオチド長、5200〜5500ヌクレオチド長、5500〜5800ヌクレオチド長、5800〜6000ヌクレオチド長、6000〜6400ヌクレオチド長、6200〜6800ヌクレオチド長、6600〜7000ヌクレオチド長、7000〜7200ヌクレオチド長、7200〜7500ヌクレオチド長、又は7500ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、5〜10アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、150〜200アミノ酸長、200〜250アミノ酸長、250〜300アミノ酸長、300〜400アミノ酸長、400〜500アミノ酸長、500〜750アミノ酸長、750〜1000アミノ酸長、1000〜1250アミノ酸長、1250〜1500アミノ酸長、1500〜1750アミノ酸長、1750〜2000アミノ酸長、2000〜2500アミノ酸長、又は2500以上のアミノ酸長であるペプチド又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2500アミノ酸長を超えないポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は終止コドンを含有しない。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列はコドン最適化されている。ある実施態様において、ヌクレオチド組成、ヌクレオチド対組成又はその両方を最適化することができる。そのような最適化のための技術は、当技術分野で公知であり、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を最適化するために適用することができる。
【０１４５】
本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする任意のヌクレオチド配列が、三セグメントアレナウイルス粒子に含まれてよい。一実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、免疫応答を誘発することができる。
【０１４６】
ある実施態様において、該アレナウイルス粒子の増殖及び感染は、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列に影響されない。
【０１４７】
当業者に公知の技術を使用して、野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFと、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子を生成することができる。例えば、逆遺伝学技術を使用して、そのようなアレナウイルス粒子を生成することができる。他の実施態様において、該複製欠損アレナウイルス粒子(すなわち、GP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFが欠失しているアレナウイルスORFを野生型の位置以外の位置に担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメント)は、相補細胞で生成することができる。
【０１４８】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子は、さらに、少なくとも1つの免疫調節ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、カルレティキュリン(CRT)若しくはその断片、ユビキチン若しくはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)若しくはその断片、インバリアント鎖(CD74)若しくはその抗原性断片、結核菌熱ショックタンパク質70若しくはその抗原性断片、単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22若しくはその抗原性断片、CD40リガンド若しくはその抗原性断片、又はFms-関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド若しくはその抗原性断片である。
【０１４９】
本明細書に提供される方法及び組成物と共に使用するためのアレナウイルスは、旧世界ウイルス、例えば、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、モバラウイルス、モペイアウイルス、又はイッピウイルス、又は新世界ウイルス、例えば、アマパリウイルス、フレキサル(Flexal)ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラテンウイルス、マチュポウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピリタルウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、ベアキャニオンウイルス、又はホワイトウォーターアロヨウイルスであり得る。
【０１５０】
ある実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子は、ワクチンとして使用するのに好適であり、腫瘍性疾患、例えば、癌のためのワクチン接種及び治療におけるそのようなアレナウイルス粒子を使用する方法が提供される。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、第5.8節に提供されている。
【０１５１】
ある実施態様において、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子は、医薬組成物として使用するのに好適であり、腫瘍性疾患、例えば、癌のためのワクチン接種及び治療におけるそのようなアレナウイルス粒子を使用する方法が提供される。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、第5.9節に提供されている。
【０１５２】
(5.3 感染性複製欠損アレナウイルス粒子)
本明細書に提供される遺伝子改変アレナウイルスは、
・感染性である;
・非相補細胞（すなわち、複製欠損アレナウイルスから欠落している機能性を発現せず、それを複製欠損にさせる細胞）で感染性子孫ウイルスを形成することができない;
・そのゲノムを複製し、その遺伝情報を発現することができる;かつ
・腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする;
アレナウイルスを含む。
【０１５３】
本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルスは、感染性である、すなわち、宿主細胞に付着し、その遺伝物質を宿主細胞内に放出することができる。本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルスは、複製欠損である、すなわち、該アレナウイルスは、非相補細胞でさらなる感染性子孫ウイルスを形成することができない。特に、該アレナウイルスのゲノムは、改変されたゲノムを担持するウイルスが、感染性子孫ウイルスをもはや生成することができないように（例えば、ORFの除去又は機能的不活化により）改変されている。非相補細胞は、ウイルスゲノムの改変によって複製欠損アレナウイルスから除去された機能性を提供しない細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFは、除去されているか、又は機能的に不活化されている場合、非相補細胞はGPタンパク質を提供しない)。しかしながら、本明細書に提供される遺伝子改変アレナウイルスは、相補細胞で感染性子孫ウイルスを生成することができる。相補細胞は、ウイルスゲノムの改変によって複製欠損アレナウイルスから除去された機能性を(トランスに)提供する細胞である（例えば、GPタンパク質をコードするORFが、除去されているか、又は機能的に不活化されている場合、相補細胞はGPタンパク質を提供する）。相補機能性(例えば、GPタンパク質)の発現は、当業者に公知の任意の方法(例えば、一過性の又は安定的な発現)によって達成することができる。本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルスは、ウイルスが感染した細胞内で増幅し、その遺伝情報を発現することができる。本明細書に提供される遺伝子改変アレナウイルスは、限定されないが、第5.4節に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片などの腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１５４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、得られるウイルスが非相補細胞でさらなる感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように、該アレナウイルスゲノムのORFが除去されているか、又は機能的に不活化されている遺伝子改変アレナウイルスである。ORFが除去されているか、又は機能的に不活化されている遺伝子改変ゲノムを含むアレナウイルス粒子は、相補細胞で(すなわち、除去されているか、又は機能的に不活化されているアレナウイルスORFを発現する細胞で)生成することができる。得られるアレナウイルス粒子の遺伝物質は、宿主細胞の感染時に宿主細胞に移動し、その中で遺伝物質を発現及び増幅することができる。さらに、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする、本明細書に提供される遺伝子改変アレナウイルス粒子のゲノムは、宿主細胞内で発現することができる。
【０１５５】
ある実施態様において、該アレナウイルスのORFは、欠失しているか又は機能的に不活化されており、本明細書に記載される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチドで置換されている。具体的な実施態様において、アレナウイルスの糖タンパク質GPをコードするORFは、欠失しているか又は機能的に不活化されている。ある実施態様において、遺伝子の機能的不活化は、任意の翻訳産物を除去する。ある実施態様において、機能的不活化は、ある程度の翻訳を可能にする遺伝的変化を指すが、翻訳産物は、もはや機能せず、野生型タンパク質と置換することはできない。
【０１５６】
ある実施態様において、該アレナウイルスの糖タンパク質（GP）をコードするORFは、本明細書に提供される方法及び組成物で使用するための複製欠損アレナウイルスを作製するために欠失している。具体的な実施態様において、該複製欠損アレナウイルスは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むゲノムセグメントを含む。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供される遺伝子改変アレナウイルス粒子は、a）ゲノムセグメントの野生型形態で存在するORFの欠失又は機能的不活化を有し、かつb）（センス又はアンチセンスのいずれかで）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするゲノムセグメントを含む。
【０１５７】
ある実施態様において、複製欠損アレナウイルスのゲノムに挿入されるヌクレオチドがコードする抗原は、例えば限定されないが、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1を含む腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片、又は腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片の組み合わせをコードすることができる。本明細書に記載される抗原の詳細な説明は、第5.4節に提供されている。
【０１５８】
本明細書に提供される方法及び組成物と共に使用するためのアレナウイルスは、旧世界ウイルス、例えば、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、モバラウイルス、モペイアウイルス、又はイッピウイルス、又は新世界ウイルス、例えば、アマパリウイルス、フレキサル(Flexal)ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラテンウイルス、マチュポウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピリタルウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、ベアキャニオン(Bear Canyon)ウイルス、又はホワイトウォーターアロヨウイルスであり得る。
【０１５９】
野生型アレナウイルスゲノムは、短い（約3.4kb）RNAセグメント及び大きい（約7.2kb）RNAセグメントからなる。短いセグメントは、核タンパク質NP及び糖タンパク質GP遺伝子をコードするORFを担持する。大きいセグメントは、RNA依存性RNAポリメラーゼL及びマトリックスタンパク質Z遺伝子を含む。野生型アレナウイルスを複製欠損にさせて、それに対する免疫応答が誘導されることになる1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片と糖タンパク質遺伝子を置換することによってワクチンベクターを作製することができる。
【０１６０】
本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、若しくはその抗原性断片、又は腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片の組み合わせを発現する感染性複製欠損アレナウイルス粒子を用いて、本明細書に記載される腫瘍性疾患を有する対象を（免疫治療方法で）治療することができる。
【０１６１】
野生型アレナウイルス感染におけるアレナウイルス疾患及び免疫抑制は、チェックを免れたウイルスの複製から生じることが知られている。それらのゲノムから、例えば、粒子放出に必要であるZ遺伝子又は標的細胞の感染に必要であるGP遺伝子を欠失することによって、アレナウイルス粒子の複製、すなわち、感染性子孫ウイルス粒子を生成する能力を無くすことにより、感染細胞の総数は、例えば、ワクチンの受け手に投与されるか、又は医療若しくはバイオテクノロジーの適用に関わる担当者、若しくは動物に偶発的に感染される接種物によって制限することができる。したがって、アレナウイルス粒子の複製を無くすと、ベクター粒子の意図的又は偶発的な感染の結果としての病原性を防止する。本発明においては、1つの重要な態様は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する目的に有利な方法で、上記の複製廃止の必要性を活用することからなる。ある実施態様において、アレナウイルス粒子を、そのゲノムの遺伝的改変により複製欠損にさせる。ゲノムへのそのような改変には:
・ORFの欠失（例えば、GP、NP、L、又はZタンパク質をコードするORF）;
・ORF（例えば、GP、NP、L、又はZタンパク質をコードするORF）の機能的不活化
が含まれ得る。
例えば、これは、ミスセンス又はナンセンス変異の導入;
・ORFの配列の変更（例えば、別のプロテアーゼの切断部位とS1P切断部位の交換）;
・ゲノムセグメントのうちの1つの5' 又は3' 末端の1つの変異誘発;
・遺伝子間領域の（すなわち、L又はSゲノムセグメントの）変異誘発
によって達成することができる。
【０１６２】
ある実施態様において、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）であり、そのウイルスのSセグメントは、GPタンパク質をコードするORFと、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするORFを置換することによって改変されている。
【０１６３】
ある実施態様において、野生型アレナウイルスベクターゲノムは、両方のセグメントの5'及び3'非翻訳領域（UTR）上の少なくとも基本的な調節要素、及び/又はさらに遺伝子間領域（IGR）を保持するように設計することができる。理論に束縛されるものではないが、感染した細胞での遺伝子発現のための最小トランス作用因子は、発現させることができるORFとしてベクターゲノム中に保持され、なおそれらはゲノム中に別々に配置することができ、天然プロモーターとは異なるプロモーターの制御下に置くことができるか、又は内部リボソーム進入部位から発現させることができる。ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする核酸は、内因性アレナウイルスプロモーター（すなわち、Sセグメントの5' UTR、3' UTR、Lセグメントの5' UTR、3' UTR）のうちの1つから転写される。他の実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする核酸は、それぞれウイルスUTRに天然で見出されるウイルスプロモーター配列の重複、28SリボソームRNAプロモーター、β-アクチンプロモーター又は5SリボソームRNAプロモーターなどのウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞のRNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIによって読み取られ得る異種導入プロモーター配列から発現される。ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするリボ核酸は、単独で又はアレナウイルスタンパク質ORFへの融合によるリードスルーとして転写及び翻訳され、宿主細胞内でのタンパク質の発現は、ウイルス転写産物配列中の好適な場所（複数可）に1以上、例えば、2つ、3つ又は4つの内部リボソーム進入部位を導入することによって増強することができる。
【０１６４】
ある実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるベクターは、LCMVの特異的な株に基づくことができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。ある実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるベクターは、LCMVクローン13に基づくことができる。他の実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるベクターは、LCMV MP株に基づくことができる。
【０１６５】
ある実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるベクターは、フニンウイルスの特定株に基づくことができる。フニンウイルスの株としては、ワクチン株XJ13、XJ#44、及びCandid#1並びにIV4454、ヒト分離株が挙げられる。ある実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるベクターは、フニンウイルスCandid#1株に基づく。
【０１６６】
(5.4 腫瘍抗原、腫瘍関連抗原及び抗原性断片)
ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、癌細胞若しくは悪性腫瘍などの腫瘍性の細胞若しくは腫瘍の中又はその上で発現する免疫原性タンパク質である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、非特異的な変異体、過剰発現又は異常発現したタンパク質であり、それらは腫瘍細胞又は腫瘍組織と正常細胞又は正常組織の両方に存在することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞に限定される腫瘍特異的抗原である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原は、癌細胞に限定される癌特異的抗原である。
【０１６７】
ある実施態様において、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、以下の特徴:過剰発現/蓄積（すなわち、正常組織と腫瘍組織の両方で発現するが、腫瘍内で高度に発現している）、癌胎児性（すなわち、通常は胎児組織及び癌性体細胞でのみ発現している）、オンコウイルス又は発癌ウイルス（すなわち、腫瘍形成性形質転換ウイルスによってコードされている）、精巣癌（すなわち、癌細胞及び成人の生殖組織、例えば、精巣でのみ発現している）、系統制限（すなわち、単一癌組織型で主に発現している）、変異（すなわち、遺伝子変異又は転写における変更の結果として腫瘍組織でのみ発現している）、翻訳後改変（例えば、グリコシル化における腫瘍関連変更）、又はイディオタイプ（すなわち、B又はTリンパ球の悪性クローン増殖から発展した）の1つ、2つ、3つ、又はそれ以上（全ても含む）を示すことができる。
【０１６８】
ある実施態様において、本明細書に記される方法及び組成物と共に使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫;脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫;髄芽腫;髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫;乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer);中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍を含む腫瘍性疾患に由来する抗原を含む。
【０１６９】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG���BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1を含む。
【０１７０】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物で使用するための腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、発癌ウイルス抗原を含み、該発癌ウイルス抗原は、ヒトパピローマウイルス（HPV）抗原、潜伏期関連核抗原などのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの抗原、EBV-EA、EBV-MA、又はEBV-VCAなどのエプスタイン-バーウイルスの抗原、MCV T抗原などのメルケル細胞ポリオーマウイルスの抗原、又はHTLV-1 Tax抗原などのヒトTリンパ好性ウイルスの抗原である。
【０１７１】
ある実施態様において、該腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、ネオ抗原である。本明細書で使用される「ネオ抗原」は、腫瘍細胞中の変異によって生じる抗原を意味し、そのような抗原は、一般に、正常な細胞又は組織において発現していない。理論に束縛されるものではないが、健康な組織は、一般的にこれらの抗原を保有していないため、ネオ抗原は好ましい標的を表す。さらに、理論に束縛されるものではないが、ネオ抗原を認識するT細胞は負の胸腺選択を受けていない可能性があるので、本発明の文脈において、そのような細胞は、抗原に対する高い親和性を有し、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始することができるが、正常組織の破壊及び自己免疫損傷を誘発する危険性を欠いている。ある実施態様において、該ネオ抗原は、MHCクラスI拘束ネオ抗原である。ある実施態様において、該ネオ抗原は、MHCクラスII拘束ネオ抗原である。ある実施態様において、患者の腫瘍細胞の変異により、ネオ抗原を生成する新規タンパク質が生じる。
【０１７２】
ある実施態様において、該腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、ヒト腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原に対する抗原オルソログ、例えば、哺乳動物(すなわち、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ネコ、又は馬)であり得る。
【０１７３】
ある実施態様において、本明細書に記載される腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の抗原性断片は、アレナウイルス内に含まれるヌクレオチド配列によってコードされている。ある実施態様において、断片は、（i）宿主（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ又はヒト）において抗体免疫応答を誘発することができ、生じた抗体が腫瘍細胞(例えば、癌細胞)内又は腫瘍細胞上で発現する免疫原性タンパク質に特異的に結合する場合、かつ/又は（ii）特異的なT細胞免疫応答を誘発することができる場合に抗原性である。
【０１７４】
ある実施態様において、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、8〜100ヌクレオチド長、15〜100ヌクレオチド長、25〜100ヌクレオチド長、50〜200ヌクレオチド長、50〜400ヌクレオチド長、200〜500ヌクレオチド長、又は400〜600ヌクレオチド長、500〜800ヌクレオチド長である。他の実施態様において、該ヌクレオチド配列は、750〜900ヌクレオチド長、800〜100ヌクレオチド長、850〜1000ヌクレオチド長、900〜1200ヌクレオチド長、1000〜1200ヌクレオチド長、1000〜1500ヌクレオチド又は10〜1500ヌクレオチド長、1500〜2000ヌクレオチド長、1700〜2000ヌクレオチド長、2000〜2300ヌクレオチド長、2200〜2500ヌクレオチド長、2500〜3000ヌクレオチド長、3000〜3200ヌクレオチド長、3000〜3500ヌクレオチド長、3200〜3600ヌクレオチド長、3300〜3800ヌクレオチド長、4000ヌクレオチド長〜4400ヌクレオチド長、4200〜4700ヌクレオチド長、4800〜5000ヌクレオチド長、5000〜5200ヌクレオチド長、5200〜5500ヌクレオチド長、5500〜5800ヌクレオチド長、5800〜6000ヌクレオチド長、6000〜6400ヌクレオチド長、6200〜6800ヌクレオチド長、6600〜7000ヌクレオチド長、7000〜7200ヌクレオチド長、7200〜7500ヌクレオチド長、又は7500ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、5〜10アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、150〜200アミノ酸長、200〜250アミノ酸長、250〜300アミノ酸長、300〜400アミノ酸長、400〜500アミノ酸長、500〜750アミノ酸長、750〜1000アミノ酸長、1000〜1250アミノ酸長、1250〜1500アミノ酸長、1500〜1750アミノ酸長、1750〜2000アミノ酸長、2000〜2500アミノ酸長、又は2500以上のアミノ酸長であるペプチド又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、該ヌクレオチド配列は、2500アミノ酸長を超えないポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は終止コドンを含まない。ある実施態様において、該ヌクレオチド配列はコドン最適化されている。ある実施態様において、ヌクレオチド組成、ヌクレオチド対組成又はその両方を最適化することができる。そのような最適化のための技術は、当技術分野で公知であり、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原のヌクレオチド配列を最適化するために適用することができる。
【０１７５】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメント、該アレナウイルス粒子又は該三セグメントアレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする1以上のヌクレオチド配列を含むことができる。他の実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメント、該アレナウイルス粒子又は該三セグメントアレナウイルス粒子は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする少なくとも2つのヌクレオチド配列、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする少なくとも3つのヌクレオチド配列、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするより多くのヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１７６】
腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする核酸配列は、糖タンパク質GP、マトリックスタンパク質Z、核タンパク質NP、又はポリメラーゼタンパク質LのORFの核酸配列の置換によって、二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスのゲノムに導入することができる。他の実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする核酸配列は、糖タンパク質GP、マトリックスタンパク質Z、核タンパク質NP、又はポリメラーゼタンパク質LのORFに融合される。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスのゲノムに挿入されると、4つのアレナウイルスプロモーター（Sセグメントの5' UTR及び3' UTR、及びLセグメントの5' UTR及び3' UTR）、並びにそれぞれウイルスUTRに天然で見出されるウイルスプロモーター配列の重複、28SリボソームRNAプロモーター、β-アクチンプロモーター又は5SリボソームRNAプロモーターなどのウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞のRNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIによって読み取られ得る調節要素と共に挿入することができるリボ核酸の制御下で転写および/又は発現させることができる。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする核酸は、単独で若しくはそれぞれアレナウイルスORF及び遺伝子への融合によるリードスルーとして、及び/若しくは1以上、例えば、2つ、3つ又は4つの内部リボソーム進入部位と組み合わせて転写並びに/又は発現させることができる。
【０１７７】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルス粒子は、さらに、少なくとも1つの免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、カルレティキュリン(CRT)若しくはその断片、ユビキチン若しくはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)若しくはその断片、インバリアント鎖(CD74)若しくはその抗原性断片、結核菌熱ショックタンパク質70若しくはその抗原性断片、単純ヘルペスウイルス1タンパク質VP22若しくはその抗原性断片、CD40リガンド若しくはその抗原性断片、又はFms-関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド若しくはその抗原性断片である。
【０１７８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子は、a）ゲノムセグメントの野生型形態で存在するORFの除去又は機能的不活化を有し、b）（i）本明細書に提供される1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び（ii）本明細書に提供される1以上の免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を（センス又はアンチセンスで）コードするゲノムセグメントを含む。
【０１７９】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの同じ位置にある。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの異なる位置にある。
【０１８０】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、スペーサー配列によって隔てられている。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする配列、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、内部リボソーム進入部位、又はプロテアーゼ切断部位をコードする配列によって隔てられている。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、リンカー又は自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって隔てられている。当業者に公知の任意のリンカーペプチド又は自己切断ペプチドは、本明細書に提供される組成物及び方法で使用することができる。ペプチドリンカーの非限定的な例としては、GSGが挙げられる。自己切断ペプチドの非限定的な例としては、豚テシオウイルス-1 2Aペプチド、トセアアシグナウイルス2Aペプチド、又は口蹄疫ウイルス2Aペプチドが挙げられる。
【０１８１】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、直接互いに融合されている。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、ペプチドリンカーを介して共に融合されている。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、自己切断ペプチドによって互いに隔てられている。ペプチドリンカーの非限定的な例としては、GSGが挙げられる。自己切断ペプチドの非限定的な例としては、豚テシオウイルス-1 2Aペプチド、トセアアシグナウイルス2Aペプチド、又は口蹄疫ウイルス2Aペプチドが挙げられる。
【０１８２】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、同一のアレナウイルス粒子上で発現する。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、異なるアレナウイルス粒子上で発現する。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、同じ系統の異なるウイルス上で発現する。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片、及び本明細書に提供される免疫調節ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、異なる株の異なるウイルス上で発現する。
【０１８３】
ある実施態様において、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするように作製されるアレナウイルス粒子は、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードする1以上のヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片は、本明細書に記載される様々な1以上のリンカー、スペーサー、又は切断部位によって隔てられている。
【０１８４】
(5.5 アレナウイルス粒子及び三セグメントアレナウイルス粒子の作製)
通常、アレナウイルス粒子は、標準的な逆遺伝学技術により、LCMVについて記載されている通りに、組換えによって生成することができる(引用により本明細書中に組み込まれるFlatzらの文献, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668; Sanchezらの文献, 2006, Virology 350:370; Ortiz-Rianoらの文献, 2013 J Gen Virol.94:1175-88参照)。本明細書に提供されるアレナウイルス粒子を作製するために、これらの技術は、以下に記載する通りに適用することができる。本明細書に記載される通りに、ウイルスのゲノムを改変することができる。
【０１８５】
(5.5.1 非天然位置のオープンリーディングフレーム)
ORFの野生型の位置以外の位置にウイルスORFと、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子の作製は、当業者に公知の任意の逆遺伝学的技術により組換えによって生成することができる。
【０１８６】
((i)感染性複製可能アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、アレナウイルス粒子を作製する方法は、(i)第1のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを宿主細胞にトランスフェクトすること;(ii)第2のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを宿主細胞にトランスフェクトすること;(iii)アレナウイルスの最小限のトランス作用因子NP及びLを発現するプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトすること；(iv)ウイルス形成に好適な条件下で該宿主細胞を維持すること;及び(v)アレナウイルス粒子を収集することを含む。特定のより具体的な実施態様において、該cDNAはプラスミド中に含まれる。
【０１８７】
cDNAから作製すると、アレナウイルス粒子(例えば、感染性で、複製可能)は増やすことができる。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、本明細書に記載されるウイルスの使用を可能にする力価まで、ウイルスが成長するのを可能にする任意の宿主細胞で増やすことができる。一実施態様において、該宿主細胞は、対応する野生型について決定される力価に匹敵する力価まで、アレナウイルス粒子が成長するのを可能にする。
【０１８８】
ある実施態様において、該アレナウイルス粒子は、宿主細胞で増やしてよい。使用することができる宿主細胞の具体例としては、BHK-21、HEK 293、VERO又はその他を含む。具体的な実施態様において、該アレナウイルス粒子は、細胞株で増やしてよい。
【０１８９】
ある実施態様において、該宿主細胞は、培養で維持され、1以上のプラスミド(複数可)をトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における発現に好適な、例えば、ポリメラーゼIのプロモーター及びターミネーターからなる1以上の発現カセットの制御下で作製されるアレナウイルスゲノムセグメント(複数可)を発現する。
【０１９０】
アレナウイルス粒子の作製に使用することができるプラスミドは、i)Sゲノムセグメント、例えば、pol-I Sをコードするプラスミド、ii)Lゲノムセグメント、例えば、pol-I Lをコードするプラスミドを含むことができる。ある実施態様において、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成を導くアレナウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドは、トランスフェクション混合物に組み込むことができる。例えば、Lタンパク質をコードするプラスミド及び/又はNPをコードするプラスミド(それぞれpC-L及びpC-NP)は存在することができる。Lタンパク質及びNPは、ウイルスRNAの転写及び複製に必要な最小限のトランス作用因子である。或いは、NP及びLタンパク質と一緒の、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成は、それぞれ、両側から2つの別々のプラスミドのL及びSセグメントのcDNAへ読むpol-I及びpol-IIプロモーターを有する発現カセットを使用して行うことができる。
【０１９１】
ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントは、プロモーターの制御下にある。通常、RNAポリメラーゼI駆動性発現カセット、RNAポリメラーゼII駆動性カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ駆動性カセットを使用することができる。ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントをコードするプラスミド(複数可)は同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、1個のプラスミドからプロモーターによって転写することができる。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター又はT3プロモーターが挙げられる。
【０１９２】
さらに、該プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞での遺伝子発現に好適な発現カセット、例えば、上記のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下にある哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とすることができるか、又はウイルス遺伝子転写物(複数可)の後ろに、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位などの内部リボソーム進入部位があり、その後ろに、哺乳動物耐性マーカーがある。大腸菌内での生成のために、該プラスミドはさらに、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
【０１９３】
プラスミド(複数可)での宿主細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般的に使用される戦略のいずれかを使用して行うことができる。数日後、適切な選択薬剤、例えば、ピューロマイシンを漸増濃度で添加する。生存クローンを単離し、標準的な手順に従ってサブクローニングし、対象となるウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体とともにウェスタンブロット法又はフローサイトメトリー法を使用して高発現クローンを同定する。
【０１９４】
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の回収のために、以下の手順が想定される。第1日目:上記のように、通常、M6ウェルプレート中で80％コンフルエントの細胞に、プラスミドの混合物をトランスフェクトする。このために、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの任意の一般的に使用される戦略を利用することができる。
【０１９５】
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を収集し、分注し、使用前にアレナウイルスベクターが保存されるべき長さに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保存する。該アレナウイルスベクター調製物の感染力価を、イムノフォーカスアッセイにより評価する。或いは、トランスフェクトした細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目に大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)で継代することができ、培養上清を継代後5日までに収集する。
【０１９６】
本願はさらに、ゲノムセグメントをコードするプラスミドが、異種ORFを組み込むように改変される異種ORFの発現に関する。該異種ORFは、制限酵素を使用してプラスミドに組み込むことができる。
【０１９７】
((ii)感染性複製欠損アレナウイルス粒子)
感染性複製欠損アレナウイルス粒子は、上記のようにレスキューすることができる。しかしながら、cDNAから作製されると、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルスは、相補細胞で増殖することができる。相補細胞は、そのゲノムの改変により、複製欠損アレナウイルスから除去された機能性を提供する細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFが欠失しているか又は機能的に不活化されている場合、相補細胞がGPタンパク質を提供する)。
【０１９８】
アレナウイルスベクター中のORFのうちの1以上が除去されているか又は機能的に不活化されている(ここでは、糖タンパク質GPの欠失を例に取る)ため、アレナウイルスベクターを、欠失したウイルス遺伝子(複数可)、例えば、本例では、GPをトランスに提供する細胞で作製し、増やすことができる。以後、C細胞と呼ぶそのような相補細胞株は、BHK-21、HEK 293、VERO、又はその他などの細胞株に、対象となるウイルス遺伝子(複数可)の発現のための1以上のプラスミド遺伝子(複数可)(C-プラスミドと呼ばれる相補性プラスミド)をトランスフェクトすることにより作製される。C-プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞での発現に好適な1以上の発現カセット、例えば、ポリアデニル化シグナルを有するEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、作製されるアレナウイルスベクターで欠失しているウイルス遺伝子(複数可)を発現する。さらに、相補性プラスミドは、哺乳動物細胞での遺伝子発現に好適な発現カセット、例えば、上記のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下にある、哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルス遺伝子転写物(複数可)の後ろに、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位などの内部リボソーム進入部位があり、その後ろに、哺乳動物耐性マーカーがある。大腸菌内での生成のために、該プラスミドはさらに、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
【０１９９】
使用することができる細胞、例えば、BHK-21、HEK 293、MC57G又はその他を、培養下で保持し、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを使用して、相補性プラスミド(複数可)をトランスフェクトする。数日後、好適な選択薬剤、例えば、ピューロマイシンを漸増濃度で添加する。生存しているクローンを単離し、標準的な手順に従ってサブクローニングし、対象となるウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体とともにウェスタンブロット法又はフローサイトメトリー法を使用して高発現C細胞クローンを同定する。安定にトランスフェクトされたC細胞の使用の代替法として、正常細胞の一過性トランスフェクションは、C細胞を使用する以下の工程の各々において、失われたウイルス遺伝子(複数可)を補足することができる。さらに、ヘルパーウイルスを使用して、失われた機能性をトランスに提供することができる。
【０２００】
プラスミドは、2つのタイプのもの:i)本例では、例えば、LCMVのNP及びLタンパク質に由来する、アレナウイルスの最小限のトランス作用因子をC細胞で細胞内発現させるためのTF-プラスミドと呼ばれる2つのプラスミド;及びii)アレナウイルスベクターゲノムセグメント、例えば、設計された改変を有するセグメントをC細胞で細胞内発現させるためのGS-プラスミドと呼ばれるプラスミドであり得る。TF-プラスミドは、それぞれのアレナウイルスベクターのNP及びLタンパク質を、哺乳動物細胞でのタンパク質発現に好適な発現カセット、通常、例えば、CMV又はEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、これらのうちのどちらか一方をポリアデニル化シグナルと優先的に組み合わせて発現する。GS-プラスミドは、該ベクターの小さい(S)ゲノムセグメント及び大きい(L)ゲノムセグメントを発現する。通常、ポリメラーゼI駆動性発現カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7-)駆動性発現カセットを使用することができ、後者は、3'末端リボザイムを一次転写物のプロセシングに優先的に使用して、正確な末端を生じさせる。T7系システムを使用する場合、C細胞でのT7の発現が、TF-プラスミドと類似した形で構築され、T7を提供するさらなる発現プラスミドをリカバリープロセスに含めることによってもたらされなければならないか、又はC細胞が、安定な様式でT7をさらに発現するように構築される。ある実施態様において、TFプラスミドとGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。
【０２０１】
該アレナウイルスベクターの回収のために、以下の手順を使用することができる。第1日目:M6ウェルプレートで通常80％コンフルエントのC細胞に、2つのTF-プラスミドと2つのGS-プラスミドの混合物をトランスフェクトする。ある実施態様において、TF及びGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。このために、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを利用することができる。
【０２０２】
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を収集し、分注し、使用前にアレナウイルスベクターが保存されるべき長さに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保存する。その後、該アレナウイルスベクター調製物の感染力価をC細胞に対するイムノフォーカスアッセイにより評価する。或いは、トランスフェクトした細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目に大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)で継代することができ、培養上清を継代後5日までに収集する。
【０２０３】
本発明は、さらに、抗原を発現する感染性複製欠損アレナウイルスが感染した細胞培養物における抗原の発現に関する。培養細胞における抗原の発現に使用する場合、以下の2つの手順を使用することができる:
i)対象となる細胞型に、本明細書に記載されるアレナウイルスベクター調製物を、1以上、例えば、2、3、又は4の感染多重度(MOI)で感染させると、感染直後に既に全ての細胞で抗原が生成される。
ii)或いは、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンをそのウイルス駆動性抗原発現レベルについて選択することができる。その後、アレナウイルスベクターの細胞非溶解性のために、個々のクローンを無限に増殖させることができる。その手法に関係なく、その後、抗原を、生成される抗原の特性に応じて、培養上清又は細胞自体のどちらかから回収(及び精製)することができる。しかしながら、本発明は、これら2つの戦略に限定されるものではなく、感染性複製欠損アレナウイルスをベクターとして使用して抗原の発現を駆動する他の方法を考慮してよい。
【０２０４】
(5.5.2 三セグメントアレナウイルス粒子の作製)
引用により本明細書中に組み込まれる、例えば、Emonetらの文献, 2008, PNAS, 106(9):3473-3478; Popkinらの文献, 2011, J. Virol., 85 (15):7928-7932により記載されるように、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子は、当技術分野で公知の逆遺伝学的技術により組換えによって生成することができる。本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子の作製は、第5.2節に記載されている通りに改変することができる。
【０２０５】
((i)感染性複製可能三セグメントアレナウイルス粒子)
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子を作製する方法は、(i)1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントのcDNAを宿主細胞にトランスフェクトすること;(ii)該アレナウイルスの最小限のトランス作用因子のNP及びLを発現するプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトすること;(iii)ウイルス形成に好適な条件下で該宿主細胞を維持すること;並びに(iv)アレナウイルス粒子を収集することを含む。
【０２０６】
cDNAから作製すると、該三セグメントアレナウイルス粒子(すなわち、感染性で、複製可能)は増やすことができる。ある実施態様において、三セグメントアレナウイルス粒子は、本明細書に記載される通りに、ウイルスの使用を可能にする力価まで、ウイルスが成長するのを可能にする任意の宿主細胞で増やすことができる。一実施態様において、該宿主細胞は、対応する野生型について決定される力価に匹敵する力価まで、三セグメントアレナウイルス粒子が成長するのを可能にする。
【０２０７】
ある実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、宿主細胞で増やしてよい。使用することができる宿主細胞の具体例としては、BHK-21、HEK 293、VERO又はその他を含む。具体的な実施態様において、該三セグメントアレナウイルス粒子は、細胞株で増やしてよい。
【０２０８】
ある実施態様において、該宿主細胞は、培養で維持され、1以上のプラスミド(複数可)をトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における発現に好適な、例えば、ポリメラーゼIのプロモーター及びターミネーターからなる1以上の発現カセットの制御下で、作製されるアレナウイルスゲノムセグメント(複数可)を発現する。
【０２０９】
具体的な実施態様において、該宿主細胞は、培養で維持され、1以上のプラスミド(複数可)をトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における発現に好適な、例えば、ポリメラーゼIのプロモーター及びターミネーターからなる1以上の発現カセットの制御下で、作製されるウイルス遺伝子(複数可)を発現する。
【０２１０】
1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルスの作製に使用することができるプラスミドは、i)Sゲノムセグメント、例えば、pol-I Sをそれぞれコードする2つのプラスミド、ii)Lゲノムセグメント、例えば、pol-I Lをコードするプラスミドを含むことができる。2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む三セグメントアレナウイルスに必要なプラスミドは、i)Lゲノムセグメント、例えば、pol-Lをそれぞれコードする2つのプラスミド、ii)Sゲノムセグメント、例えば、pol-I Sをコードするプラスミドである。
【０２１１】
ある実施態様において、ウイルスL及びSセグメントの細胞内合成を導くアレナウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドを、トランスフェクション混合物に組み込むことができる。例えば、Lタンパク質をコードするプラスミド及びNPをコードするプラスミド(それぞれpC-L及びpC-NP)。Lタンパク質及びNPは、ウイルスRNAの転写及び複製に必要な最小限のトランス作用因子である。或いは、NP及びLタンパク質と一緒の、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成は、それぞれ、両側から2つの別々のプラスミドのL及びSセグメントのcDNAへ読むpol-I及びpol-IIプロモーターを有する発現カセットを使用して行うことができる。
【０２１２】
さらに、該プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における遺伝子発現に好適な発現カセット、例えば、上記のポリメラーゼII発現カセットの制御下で、哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルス遺伝子転写物(複数可)の後ろに、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位などの内部リボソーム進入部位があり、その後ろに、哺乳動物耐性マーカーがある。大腸菌内での生成のために、該プラスミドはさらに、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
【０２１３】
プラスミド(複数可)でのBHK-21細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを使用して行うことができる。数日後、好適な選択薬剤、例えば、ピューロマイシンを漸増濃度で添加する。生存しているクローンを単離し、標準的な手順に従ってサブクローニングし、対象となるウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体とともにウェスタンブロット法又はフローサイトメトリー法を使用して高発現クローンを同定する。
【０２１４】
通常、RNAポリメラーゼI駆動性発現カセット、RNAポリメラーゼII駆動性カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ駆動性カセットを使用することができ、後者は、3'末端リボザイムを一次転写物のプロセシングに優先的に使用して、正確な末端を生じさせる。ある実施態様において、該アレナウイルスゲノムセグメントをコードするプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。
【０２１５】
該三セグメントアレナウイルスベクターの回収のために、以下の手順が想定される。第1日目:上記のように、M6ウェルプレートで通常80％コンフルエントの細胞に、プラスミドの混合物をトランスフェクトする。このために、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを利用することができる。
【０２１６】
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を収集し、分注し、使用前にアレナウイルスベクターが保存されるべき長さに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保存する。該アレナウイルスベクター調製物の感染力価をイムノフォーカスアッセイにより評価する。或いは、トランスフェクション後3〜5日目に、トランスフェクトした細胞及び上清をより大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)で継代し、継代後5日までに培養上清を収集する。
【０２１７】
ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列の発現が提供され、ゲノムセグメントをコードするプラスミドは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を組み込むように改変される。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列は、制限酵素を使用してプラスミドに組み込むことができる。
【０２１８】
((ii)感染性複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子)
感染性複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子を、上記のようにレスキューすることができる。しかしながら、cDNAから作製されると、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルスは、相補細胞で増殖することができる。相補細胞は、そのゲノムの改変により、複製欠損アレナウイルスから除去された機能性を提供する細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFが欠失しているか又は機能的に不活化されている場合、相補細胞がGPタンパク質を提供する)。
【０２１９】
アレナウイルスベクター中のORFのうちの1以上が除去されているか又は機能的に不活化されている(ここでは、糖タンパク質GPの欠失を例に取る)ため、アレナウイルスベクターを、欠失したウイルス遺伝子(複数可)、例えば、本例では、GPをトランスに提供する細胞で作製し、増やすことができる。以後、C細胞と呼ぶそのような相補細胞株は、BHK-21、HEK 293、VERO又はその他(ここでは、BHK-21を例に取る)などの哺乳動物細胞株に、対象となるウイルス遺伝子(複数可)の発現のための1以上のプラスミド遺伝子(複数可)(C-プラスミドと呼ばれる相補性プラスミド)をトランスフェクトすることにより作製される。C-プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞での発現に好適な1以上の発現カセット、例えば、ポリアデニル化シグナルを有するCMV又はEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、作製されるアレナウイルスベクターで欠失しているウイルス遺伝子(複数可)を発現する。さらに、該相補性プラスミドは、哺乳動物細胞での遺伝子発現に好適な発現カセット、例えば、上記のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下にある、哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルス遺伝子転写物(複数可)の後ろに、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位などの内部リボソーム進入部位があり、その後ろに、哺乳動物耐性マーカーがある。大腸菌内での生成のために、該プラスミドはさらに、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
【０２２０】
使用することができる細胞、例えば、BHK-21、HEK 293、MC57G又はその他を、培養下で保持し、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを使用して、相補性プラスミド(複数可)をトランスフェクトする。数日後、好適な選択薬剤、例えば、ピューロマイシンを漸増濃度で添加する。生存しているクローンを単離し、標準的な手順に従ってサブクローニングし、対象となるウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体とともにウェスタンブロット法又はフローサイトメトリー法を使用して高発現C細胞クローンを同定する。安定にトランスフェクトされたC細胞の使用の代替法として、正常細胞の一過性トランスフェクションは、C細胞を使用する以下の工程の各々において、失われたウイルス遺伝子(複数可)を補足することができる。さらに、ヘルパーウイルスを使用して、失われた機能性をトランスに提供することができる。
【０２２１】
2つのタイプのプラスミド:i)本例では、例えば、LCMVのNP及びLタンパク質に由来する、アレナウイルスの最小限のトランス作用因子をC細胞で細胞内発現させるためのTF-プラスミドと呼ばれる2つのプラスミド;並びにii)アレナウイルスベクターゲノムセグメント、例えば、設計された改変を有するセグメントをC細胞で細胞内発現させるためのGS-プラスミドと呼ばれるプラスミドを使用することができる。TF-プラスミドは、それぞれのアレナウイルスベクターのNP及びLタンパク質を、哺乳動物細胞でのタンパク質発現に好適な発現カセット、通常、例えば、CMV又はEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、これらのうちのどちらか一方をポリアデニル化シグナルと優先的に組み合わせて発現する。GS-プラスミドは、該ベクターの小さい(S)ゲノムセグメント及び大きい(L)ゲノムセグメントを発現する。通常、ポリメラーゼI駆動性発現カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7-)駆動性発現カセットを使用することができ、後者は、3'末端リボザイムを一次転写物のプロセシングに優先的に使用して、正確な末端を生じさせる。T7系システムを使用する場合、C細胞でのT7の発現が、TF-プラスミドと類似した形で構築され、T7を提供するさらなる発現プラスミドをリカバリープロセスに含めることによってもたらされなければならないか、又はC細胞が、安定な様式でT7をさらに発現するように構築される。ある実施態様において、TFプラスミドとGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。
【０２２２】
該アレナウイルスベクターの回収のために、以下の手順を使用することができる。第1日目:M6ウェルプレートで通常80％コンフルエントのC細胞に、2つのTF-プラスミドと2つのGS-プラスミドの混合物をトランスフェクトする。ある実施態様において、TF及びGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。このために、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを利用することができる。
【０２２３】
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を収集し、分注し、使用前にアレナウイルスベクターが保存されるべき長さに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保存する。その後、該アレナウイルスベクター調製物の感染力価をC細胞に対するイムノフォーカスアッセイにより評価する。或いは、トランスフェクトした細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目に大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)で継代することができ、培養上清を継代後5日までに収集する。
【０２２４】
本発明はさらに、抗原を発現する感染性複製欠損三セグメントアレナウイルスが感染した細胞培養物における抗原の発現に関する。培養細胞中のCMV抗原の発現に使用される場合、以下の2つの手順を使用することができる:
i)対象となる細胞型に、本明細書に記載されるアレナウイルスベクター調製物を、1以上、例えば、2、3、又は4の感染多重度(MOI)で感染させると、感染直後に既に全ての細胞で、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片が生成される。
ii)或いは、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンを、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片のウイルス駆動性発現レベルについて選択することができる。その後、アレナウイルスベクターの細胞非溶解性のために、個々のクローンを無限に増殖させることができる。その手法に関係なく、その後、該腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を、生成される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又は抗原性断片の特性に応じて、培養上清又は細胞自体のどちらかから回収(及び精製)することができる。しかしながら、本発明は、これら2つの戦略に限定されるものではなく、感染性複製欠損アレナウイルスをベクターとして使用して腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片の発現を駆動する他の方法を考慮してよい。
【０２２５】
(5.6 腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する感染性複製欠損アレナウイルスの作製)
一般に、アレナウイルス粒子は、LCMVについて記載したように、標準的な逆遺伝学的技術によって組換え生成することができる(L. Flatz, A. Bergthaler, J. C. de la Torre,及びD. D. Pinschewerの文献, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668, 2006; A. B. Sanchez及びJ. C. de la Torreの文献, Virology 350:370, 2006; E. Ortiz-Riano, B.Y. Cheng, J. C. de la Torre, L. Martinez-Sobridoの文献, J Gen Virol. 94:1175-88, 2013)。本発明で使用するための感染性複製欠損アレナウイルスを作製するために、これらの技術を使用することができるが、レスキューされるウイルスのゲノムは、本明細書に記載されるように改変されている。これらの改変は、i）アレナウイルスベクターに感染した宿主細胞において、依然として遺伝子発現は可能であるが、正常細胞において感染性粒子の形成を防止するために、4つのアレナウイルスのORF（糖タンパク質（GP）;核タンパク質（NP）;マトリックスタンパク質Z;RNA依存性RNAポリメラーゼL）のうちの1以上、例えば、2つ、3つ又は4つは、除去されているか、又は機能的に不活化されており、かつii）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチドを導入することができるというものであり得る。本明細書に記載される感染性複製欠損ウイルスは、国際特許出願公開WO 2009/083210(出願番号PCT/EP2008/010994)及び国際特許出願公開WO 2014/140301(出願番号PCT/EP2014/055144)に記載されているように生成することができ、これらの各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０２２６】
cDNAから作製されると、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルスは、相補細胞中で増殖することができる。相補細胞は、そのゲノムの改変によって複製欠損アレナウイルスから除去された機能性を提供する細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFが、欠失しているか、又は機能的に不活化されている場合、相補細胞がGPタンパク質を提供する)。
【０２２７】
アレナウイルスベクター中のウイルス遺伝子のうちの1以上が除去されているか又は機能的に不活化されている(ここでは、糖タンパク質GPの欠失を例に取る)ため、アレナウイルスベクターを、欠失したウイルス遺伝子(複数可)、例えば、本例では、GPをトランスに提供する細胞で作製し、増やすことができる。以後、C細胞と呼ぶそのような相補細胞株は、BHK-21、HEK 293、VERO、又はその他（ここでは、BHK-21を例に取る）などの哺乳動物細胞株に、対象となるウイルス遺伝子(複数可)の発現のための1以上のプラスミド(複数可)(C-プラスミドと呼ばれる相補性プラスミド)をトランスフェクトすることにより作製される。C-プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞での発現に好適な1以上の発現カセット、例えば、ポリアデニル化シグナルを有するCMV又はEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、作製されるアレナウイルスベクターで欠失しているウイルス遺伝子(複数可)を発現する。さらに、相補性プラスミドは、哺乳動物細胞での遺伝子発現に好適な発現カセット、例えば、上記のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下にある、哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルス遺伝子転写物(複数可)の後ろに、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位などの内部リボソーム進入部位があり、その後ろに、哺乳動物耐性マーカーがある。大腸菌内での生成のために、該プラスミドはさらに、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
【０２２８】
使用することができる細胞、例えば、BHK-21、HEK 293、MC57G又はその他を、培養下で保持し、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを使用して、相補性プラスミド(複数可)をトランスフェクトする。数日後、好適な選択薬剤、例えば、ピューロマイシンを漸増濃度で添加する。生存しているクローンを単離し、標準的な手順に従ってサブクローニングし、対象となるウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体とともにウェスタンブロット法又はフローサイトメトリー法を使用して高発現C細胞クローンを同定する。安定にトランスフェクトされたC細胞の使用の代替法として、正常細胞の一過性トランスフェクションは、C細胞を使用する以下の工程の各々において、失われたウイルス遺伝子(複数可)を補足することができる。さらに、ヘルパーウイルスを使用して、失われた機能性をトランスに提供することができる。
【０２２９】
使用され得るプラスミドは、2つのタイプのもの:i)本例では、例えば、LCMVのNP及びLタンパク質に由来する、アレナウイルスの最小限のトランス作用因子をC細胞で細胞内発現させるためのTF-プラスミドと呼ばれる2つのプラスミド;及びii)アレナウイルスベクターゲノムセグメント、例えば、設計された改変を有するセグメントをC細胞で細胞内発現させるためのGS-プラスミドと呼ばれるプラスミドであり得る。TF-プラスミドは、それぞれのアレナウイルスベクターのNP及びLタンパク質を、哺乳動物細胞でのタンパク質発現に好適な発現カセット、通常、例えば、CMV又はEF1αプロモーターなどの哺乳動物ポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、これらのうちのどちらか一方をポリアデニル化シグナルと優先的に組み合わせて発現する。GS-プラスミドは、該ベクターの小さい(S)ゲノムセグメント及び大きい(L)ゲノムセグメントを発現する。通常、ポリメラーゼI駆動性発現カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7-)駆動性発現カセットを使用することができ、後者は、3'末端リボザイムを一次転写物のプロセシングに優先的に使用して、正確な末端を生じさせる。T7系システムを使用する場合、C細胞でのT7の発現が、TF-プラスミドと類似した形で構築され、T7を提供するさらなる発現プラスミドをリカバリープロセスに含めることによってもたらされなければならないか、又はC細胞が、安定な様式でT7をさらに発現するように構築される。ある実施態様において、TFプラスミドとGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。
【０２３０】
該アレナウイルスベクターの回収のために、以下の手順を使用することができる。第1日目:M6ウェルプレートで通常80％コンフルエントのC細胞に、2つのTF-プラスミドと2つのGS-プラスミドの混合物をトランスフェクトする。ある実施態様において、TF及びGSプラスミドは同じであり得、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、T7、polI、及びpolIIプロモーターによって1つのプラスミドから転写され得る。このために、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーションなどの一般に使用される戦略のいずれかを利用することができる。
【０２３１】
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を収集し、分注し、使用前にアレナウイルスベクターが保存されるべき長さに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保存する。その後、該アレナウイルスベクター調製物の感染力価をC細胞に対するイムノフォーカスアッセイにより評価する。
【０２３２】
本発明は、さらに、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を発現する二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスが感染した細胞培養物における腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片の発現に関する。培養細胞における腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片の発現に使用する場合、以下の2つの手順を使用することができる:
i)対象となる細胞型に、本明細書に記載されるアレナウイルスベクター調製物を、1以上、例えば、2、3、又は4の感染多重度(MOI)で感染させると、感染直後に既に全ての細胞で腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片が生成される。
ii)或いは、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンを、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のウイルス駆動性発現レベルについて選択することができる。その後、アレナウイルスベクターの細胞非溶解性のために、個々のクローンを無限に増殖させることができる。その手法に関係なく、その後、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を、生成される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片の特性に応じて、培養上清又は細胞自体のどちらかから回収(及び精製)することができる。しかしながら、本発明は、これら2つの戦略に限定されるものではなく、感染性複製欠損アレナウイルスをベクターとして使用して腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片の発現を駆動する他の方法を考慮してよい。
【０２３３】
或いは、3つのプラスミドからなるレスキューシステムを使用することができる:(1)第1のプラスミドが、トランスフェクト細胞においてポリメラーゼIIを介した転写、その後の翻訳によってタンパク質NPを発現する;(2)第2のプラスミドが、ポリメラーゼIを介した転写によりLCMVゲノムの(マイナス鎖の)L-セグメントと、ポリメラーゼIIを介した、ポリメラーゼIプロモーターの反対方向での同じテンプレートからの転写によりLタンパク質とを生じさせる;(3)第3のプラスミドが、ポリメラーゼIによる転写を介して、(LCMV糖タンパク質の代わりに、抗原コード配列をコードする)LCMVゲノムのS-セグメントを生じさせる。各プラスミド3μgを、C-細胞のエレクトロポレーションに使用し、その後、6ウェルプレートに細胞を播種し、37℃でインキュベートする。インキュベーション後、トランスフェクションからの細胞及び上清を、新たに播種したC細胞と組み合わせ、感染後の定義した時点でベクターを収集し、細胞及び残骸を取り除く。ベクターが作製されると、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードする核酸は、感染性複製欠損ベクターのゲノムセグメントが当業者に公知の任意の技術によって転写されるプラスミドに挿入することができる。
【０２３４】
アレナウイルスベクター中のウイルス遺伝子のうちの1以上が除去されているか又は機能的に不活化されている(ここでは、糖タンパク質GPの欠失を例に取る)ため、アレナウイルスベクターを、欠失した又は機能的に不活化されたウイルス遺伝子(複数可)(例えば、GP)をトランスに提供する細胞で作製し、増やすことができる。得られるウイルス自体は感染性であるが、欠失した又は機能的に不活化されたウイルス遺伝子(複数可)(例えば、GP)を欠いているため、非相補細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成することができない。相補細胞は、安定なトランスフェクション、一過性のトランスフェクションによるか、又は失われた機能性を発現するヘルパーウイルスの感染によって、失われた機能性を提供することができる。
【０２３５】
ある実施態様において、該相補細胞は、アレナウイルスベクターゲノムから欠失しているか又は機能的に不活化されているウイルス遺伝子を提供する。具体的な実施態様において、該相補細胞は、アレナウイルスベクターのゲノムを作製するために使用されたウイルス株と同じウイルス株からのウイルス遺伝子を提供する。別の実施態様において、該相補細胞は、アレナウイルスベクターのゲノムを作製するために使用されたウイルス株とは異なるウイルス株からのウイルス遺伝子を提供する。例えば、相補細胞に提供されるウイルス遺伝子は、LCMVのMP株から得られる。別の例において、相補細胞に提供されるウイルス遺伝子は、LCMVのクローン13株から得られる。別の例において、相補細胞に提供されるウイルス遺伝子は、LCMVのWE株から得られる。
【０２３６】
具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのMP株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。さらにより具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのMP株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、LCMVクローン13から得られ、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。
【０２３７】
具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのクローン13株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。さらにより具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのクローン13株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、LCMV MP株から得られ、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。
【０２３８】
具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのWE株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。さらにより具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのWE株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、LCMV クローン13株から得られ、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。
【０２３９】
具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのWE株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。さらにより具体的な実施態様において、該相補細胞は、LCMVのWE株のGPを提供し、該アレナウイルスベクターは、LCMV MP株から得られ、GPタンパク質をコードするORFの代わりに、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片のORFを含む。
【０２４０】
(5.7 核酸、ベクター系及び細胞株)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメント又は三セグメントアレナウイルス粒子を含むか、又はそれからなるcDNAである。
【０２４１】
(5.7.1 非天然位置のオープンリーディングフレーム)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、第5.1節に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントをコードする核酸である。より具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、表1に記載されるDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットである。そのような核酸を含む宿主細胞はまた、第5.1節に提供されている。
【０２４２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAであり、該アレナウイルスゲノムセグメントは、第5.1節に記載される異種ORFをコードする。
【０２４３】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントをコードするDNA発現ベクター系である。具体的には、本明細書に提供されるのは、1以上のベクターが、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の2つのアレナウイルスゲノムセグメント、すなわち、Lセグメント及びSセグメントをコードするDNA発現ベクター系である。そのようなベクター系は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列をコードすることができる。
【０２４４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、野生型の位置以外の位置にORFと、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスSセグメントのcDNAである。他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、野生型の位置以外の位置にORFと、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスLセグメントのcDNAである。ある実施態様において、（i）ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、（ii）除去され、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されているGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFとを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAである。
【０２４５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるcDNAは、LCMVの特定の株に由来することができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。具体的な実施態様において、該cDNAは、LCMVクローン13に由来する。他の具体的な実施態様において、該cDNAは、LCMV MP株に由来する。
【０２４６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子をコードするように作製されたベクターは、LCMVの特定株に基づくことができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子は、LCMVクローン13に基づくことができる。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子をコードするように作製されたベクターは、LCMV MP株に基づくことができる。
【０２４７】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、この節の上記のcDNA又はベクター系を含む細胞である。そのような細胞由来の細胞株、そのような細胞を含む培養物、感染したそのような細胞を培養する方法も、本明細書に提供される。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFと、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含む細胞である。いくつかの実施態様において、該細胞は、Sセグメント及び/又はLセグメントを含む。
【０２４８】
(5.7.2 三セグメントアレナウイルス粒子)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、第5.2節に記載される三セグメントアレナウイルス粒子をコードする核酸である。より具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表2又は表3に記載されるDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットである。そのような核酸を含む宿主細胞も、第5.2節に提供されている。
【０２４９】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変された三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAからなるcDNAである。他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、（i）ORFの野生型の位置以外の位置にアレナウイルスORFを担持するように改変された三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAであり、（ii）該三セグメントアレナウイルス粒子は、第5.2に記載される異種ORFをコードする。
【０２５０】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む三セグメントアレナウイルス粒子をまとめてコードするDNA発現ベクター系である。具体的には、本明細書に提供されるのは、1以上のベクターが、本明細書に記載される三セグメントアレナウイルス粒子の3つのアレナウイルスゲノムセグメント、すなわち、1つのLセグメント及び2つのSセグメント又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントをコードするDNA発現ベクター系である。そのようなベクター系は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードすることができる。
【０２５１】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、野生型の位置以外の位置にORFと、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスSセグメント（複数可）のcDNAである。他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、野生型の位置以外の位置にORFと、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列とを担持するように改変されたアレナウイルスLセグメント（複数可）のcDNAである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、（i）ORFの野生型の位置以外の位置にORFを担持するように改変され、かつ（ii）GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去され、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列で置換されている三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAである。
【０２５２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるcDNAは、LCMVの特定の株に由来することができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。具体的な実施態様において、該cDNAは、LCMVクローン13に由来する。他の具体的な実施態様において、該cDNAは、LCMV MP株に由来する。
【０２５３】
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子をコードするように作製されたベクターは、LCMVの特定株に基づくことができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子は、LCMVクローン13に基づくことができる。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子をコードするように作製されたベクターは、LCMV MP株に基づくことができる。
【０２５４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、この節の上記のcDNA又はベクター系を含む細胞である。そのような細胞に由来する細胞株、そのような細胞を含む培養物、及び感染したそのような細胞を培養する方法も本明細書に提供される。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、三セグメントアレナウイルス粒子のcDNAを含む細胞である。いくつかの実施態様において、該細胞は、Sセグメント及び/又はLセグメントを含む。
【０２５５】
(5.7.3 複製欠損アレナウイルス)
一実施態様において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの大きなゲノムセグメント（Lセグメント）のcDNAである核酸配列であり、該ゲノムセグメントの1つのORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されており、該ゲノムセグメントは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２５６】
一実施態様において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの短いゲノムセグメント（Sセグメント）をコードする核酸配列であり、該ゲノムセグメントの1つのORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されており、該短いゲノムセグメントは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの短いゲノムセグメント（Sセグメント）をコードする核酸配列であり、糖タンパク質遺伝子のORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されており、該短いゲノムセグメントは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。あるより具体的な実施態様において、該腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片は、第5.4節に記載される抗原である。
【０２５７】
ある実施態様において、本明細書に提供される核酸配列は、LCMVの特定の株に由来することができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille #12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及びこれらの派生物が挙げられる。具体的な実施態様において、該核酸は、LCMVクローン13に由来する。他の具体的な実施態様において、該核酸は、LCMV MP株に由来する。
【０２５８】
より具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、アレナウイルスゲノムセグメントを含む核酸、及び（ii）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列である。
【０２５９】
一実施態様において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子のゲノムをまとめて含む1以上のベクターを含むベクター系である。具体的には、本明細書に提供されるのは、1以上のベクターが本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの2つのアレナウイルスゲノムセグメント、すなわち、Lセグメント及びSセグメントを含むベクター系である。そのようなベクター系は、
・この改変されたSゲノムセグメントを担持するアレナウイルス粒子が感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように改変されているアレナウイルスSゲノムセグメント、及び腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を(センス又はアンチセンスで)コードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスLゲノムセグメント;
・この改変されたLゲノムセグメントを担持するアレナウイルス粒子が感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように改変されているアレナウイルスLゲノムセグメント、及び腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を(センス又はアンチセンスで)コードするヌクレオチド配列を含むアレナウイルスSゲノムセグメント;
・この改変されたSゲノムセグメントを担持するアレナウイルス粒子が感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように改変されており、かつ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を(センス又はアンチセンスで)コードするヌクレオチド配列を含み、かつ野生型アレナウイルスLゲノムセグメントを含むアレナウイルスSゲノムセグメント;又は
・この改変されたLゲノムセグメントを担持するアレナウイルス粒子が感染性子孫ウイルス粒子を生成することができないように改変されており、かつ腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片を(センス又はアンチセンスで)コードするヌクレオチド配列を含み、かつ野生型アレナウイルスSゲノムセグメントを含むアレナウイルスLゲノムセグメント
を(1以上の別々のDNA分子上に)を含むことができる。
【０２６０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、SゲノムセグメントのGPをコードするORFが、発癌ウイルス抗原、癌精巣抗原、癌胎児性抗原、組織分化抗原、変異型タンパク質抗原、ネオ抗原、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKKI、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、モロエ、MMP-2、MMP-7、MUCl、MUC5AC、p53（非変異）、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX1O、STEAP1 (前立腺6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100又はgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras (V-Ki-ras2 カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SSX、SSX2、SYT-SSXl又はSYT-SSX2融合タンパク質、TGF-βRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子変異体III)、イディオタイプ、GD2、ガングリオシドG2)、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG (TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、For-関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、グロス嚢胞性疾患流体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、Myo-D1、筋肉特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス、サイログロブリン、甲状腺転写因子1、ピルビン酸キナーゼアイソザイム型M2の二量体形態（腫瘍M2-PK）、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物/ガングリオシドGM2（癌胎児性抗原-免疫原性-1 OFA-I-1)、GM3、CA 15-3 (CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン-バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、(精子タンパク質)SP17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、プロステイン、TARP(T細胞受容体γ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3 (CD61)、ガラクチン、又はRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、及びROR1からなる群から選択される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列と置換されているアレナウイルス（例えば、LCMV）ゲノムセグメントを含む核酸配列である。
【０２６１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、SゲノムセグメントのGPをコードするORFが、1以上の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片（例えば、上の段落に記載されたもののうちの1以上）をコードするヌクレオチド配列で置換されているアレナウイルス（例えば、LCMV）ゲノムセグメントを含む核酸配列である。
【０２６２】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、この節の上記の核酸又はベクター系を含む細胞である。そのような細胞に由来する細胞株、そのような細胞を含む培養物、及び核酸又はベクター系を感染させたそのような細胞を培養する方法も本明細書に提供される。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの大きなゲノムセグメント（Lセグメント）を含む核酸を含む細胞であり、該ゲノムセグメントの1つのORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されており、該ゲノムセグメントは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２６３】
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスの短いゲノムセグメント（Sセグメント）を含む核酸配列を含む細胞であり、該ゲノムセグメントの1つのORFは、欠失しているか、又は機能的に不活化されており、該短いゲノムセグメントは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２６４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される2つの核酸又はベクター系を含む細胞である。そのような細胞に由来する細胞株、そのような細胞を含む培養物、及び核酸又はベクター系を感染させたそのような細胞を培養する方法も本明細書に提供される。
【０２６５】
(5.8 使用方法)
ワクチンは、ポリオウイルス及び麻疹のものなどの感染症を予防及び/又は治療するのに成功してきた。しかしながら、癌を含む確立された慢性疾患の状況での治療免疫は、あまり成功していない。免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用されるアレナウイルス粒子を作製する能力は、新たな新規のワクチン戦略を表す。
【０２６６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法である。そのような方法は、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含むことができる。ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、感染性複製欠損三セグメントアレナウイルス粒子又は複製可能三セグメントアレナウイルス粒子を含む、本明細書に提供される三セグメントアレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、本方法で使用される三セグメントアレナウイルス粒子を含むアレナウイルス粒子は、複製欠損であり、該アレナウイルス粒子は:（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、及び（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。また、ある実施態様において、本方法で使用される三セグメントアレナウイルス粒子は、複製可能であり、該三セグメントアレナウイルス粒子は、（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力;及び（3）遺伝子改変されていない正常細胞でさらなる感染性子孫粒子を生成する能力を含むゲノムを含有するように改変されている。ある実施態様において、本方法で使用されるアレナウイルス粒子は、二セグメント感染性複製欠損アレナウイルス粒子である。したがって、ある実施態様において、本方法で使用される感染性複製欠損アレナウイルス粒子は:（1）腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列;及び（2）感染した細胞でその遺伝情報を増幅し、それを発現させる能力を含むゲノムを含有するが、非相補細胞ではさらなる感染性子孫粒子を生成することができないように改変されている。ある実施態様において、該免疫チェックポイント阻害剤は、負のチェックポイント調節因子の活性を阻害するか、低下させるか、又は干渉する。
【０２６７】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現する1以上のアレナウイルス粒子又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を該対象に投与することを含む、前記方法である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される腫瘍性疾患を治療する方法は、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現する治療有効量の1以上のアレナウイルス粒子又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。該対象は、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、ロバなどの家畜動物などの哺乳動物であり得る。具体的な実施態様において、該対象はヒトである。
【０２６８】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における癌細胞又は腫瘍などの腫瘍性細胞又は組織に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を該対象に投与することを含む、前記方法である。
【０２６９】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤が投与される対象は、腫瘍性疾患を有するか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている。
【０２７０】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤が投与される対象は、癌などの腫瘍性疾患を有するか、起こしやすいか、若しくはその発症のリスクに曝されているか、又は前癌組織病変を呈する。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤が投与される対象は、癌などの腫瘍性疾患と診断されるか、又は前癌組織病変を呈する。
【０２７１】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤が投与される対象は、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病（成人/子供）;副腎皮質癌;エイズ関連癌;エイズ関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;胆管癌、肝外（胆管細胞癌）;膀胱癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳腫瘍（成人/子供）;脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人/子供）;脳腫瘍、脳星状細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍;脳腫瘍、上衣腫;脳腫瘍、髄芽腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫;脳幹神経膠腫;乳癌;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児癌;カルチノイド胃腸腫瘍;カルチノイド腫瘍;成人の癌、原発部位不明;原発不明癌;中枢神経系胎児性腫瘍;中枢神経系リンパ腫、原発性;子宮頸癌;小児副腎皮質癌;小児癌;小児大脳星状細胞腫; 脊索腫、小児;慢性リンパ性白血病;慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia);慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia);慢性骨髄増殖性障害;大腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;胆嚢癌;胃(gastric)（胃(stomach)）癌; 胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍：頭蓋外性腺外、又は卵巣妊娠性絨毛腫瘍;妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明;神経膠腫;脳幹の神経膠腫;神経膠腫、小児期の視覚的経路及び視床下部;ヘアリーセル白血病;頭頸部癌;心臓癌;肝細胞（肝臓）癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視経路神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌（内分泌膵臓）;カポジ肉腫;腎臓癌（腎細胞癌）;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇及び口腔の癌;脂肪肉腫;肝臓癌（原発性）;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、原発中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;男性の乳癌;骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫; 髄芽腫; 髄上皮腫;黒色腫;黒色腫、眼内（眼）;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;中皮腫、成人悪性;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉症、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性（骨髄の癌）;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔及び副鼻腔の癌;鼻咽頭癌;神経芽腫、非小細胞肺癌;非ホジキンリンパ腫; 乏突起神経膠腫;口腔癌(oral cancer);口腔癌(oral cavity cancer); 中咽頭癌;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;上皮性卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍）;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;膵臓癌、膵島細胞;乳頭腫症;副鼻腔及び鼻腔の癌;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;下垂体腺腫; 形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞癌（腎臓癌）;腎盂及び尿管、移行上皮癌;第15染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;セザリー症候群;皮膚癌（黒色腫）;皮膚癌（非黒色腫）;小細胞肺癌;小腸癌軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮癌;原発不明転移性扁平上皮頸部癌;胃(stomach)（胃(gastric)）癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉腫及びセザリー症候群）;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌、小児;腎盂及び尿管の移行上皮癌;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍性疾患を患っているか、それを起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている。
【０２７２】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はその発症のリスクに曝されている任意の年齢群の対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、免疫不全の対象、妊娠している対象、臓器若しくは骨髄移植を受けた対象、免疫抑制薬を服用している対象、血液透析を受けている対象、癌を有する対象、又は腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている対象に投与される。より具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は17歳の子供である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている乳児である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12ヶ月の幼児である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍性疾患を患っているか、起こしやすいか、又はそのリスクに曝されている高齢対象に投与される。より具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、又は90歳のシニア対象である対象に投与される。
【０２７３】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、癌転移のリスクが高い対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、新生児の、従って未熟な免疫系を有する新生児期の対象に投与される。
【０２７４】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、グレード0（すなわち、非浸潤性腫瘍）、グレード1、グレード2、グレード3若しくはグレード4の癌又はグレード3A、3B、又3Cなどのサブカテゴリ、又はその等価物を有する対象に投与される。
【０２７５】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍T1、T2、T3、及びT4、及びノードN0、N1、N2、又はN3、及び転移M0及びM1から選択される任意の組合せの腫瘍、リンパ節、転移（TNM）ステージの癌を有する対象に投与される。
【０２７６】
癌患者の治療の成功は、予想される生存期間の延長、抗腫瘍免疫応答の誘導、又は癌の特定の特性の改善として評価することができる。改善される可能性のある癌の特徴の例としては、腫瘍の大きさ（例えば、T0、Tは、又はT1-4である）、転移の状態（例えば、M0、M1）、観察可能な腫瘍の数、リンパ節病変（例えば、NO、N1-4、Nx）、グレード（すなわち、グレード1、2、3、又は4）、ステージ（例えば、0、I、II、III、又はIV）、細胞上若しくは体液中のあるマーカー（例えば、AFP、B2M、β-HCG、BTA、CA 15-3、CA 27.29、CA 125、CA 72.4、CA 19-9、カルシトニン、CEA、クロモグラニンA、EGFR、ホルモン受容体、HER2、HCG、免疫グロブリン、NSE、NMP22、PSA、PAP、PSMA、S-100、TA-90、及びサイログロブリン）の存在又は濃度、及び/又は関連する病状（例えば、腹水若しくは浮腫）又は症状（例えば、悪液質、発熱、食欲不振、又は疼痛）が挙げられる。改善は、パーセントによって測定可能な場合に、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、又は90％（例えば、腫瘍の生存、又は体積又は直線寸法）であり得る。
【０２７７】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、休眠癌を有する対象（例えば、寛解中である対象）に投与される。したがって、本明細書に提供されるのは、癌の再活性化を防止する方法である。
【０２７８】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、再発癌を有する対象に投与される。
【０２７９】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、癌の遺伝的素因を有する対象に投与される。別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、リスク要因を有する対象に投与される。例示的なリスク要因としては、高齢、タバコ、太陽への露出、放射線被曝、化学物質曝露、家族の病歴、アルコール、貧しい食生活、運動不足、又は太り過ぎが挙げられる。
【０２８０】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、1種以上の癌を患う対象に投与される。他の実施態様において、本明細書に記載される組成物での治療に感受性である癌などの任意の種類の腫瘍性疾患が、標的となり得る。
【０２８１】
別の実施態様において、提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子又はその組成物の対象への投与は、癌の細胞又は腫瘍などの腫瘍性細胞又は腫瘍に対する細胞媒介性免疫（CMI）を与える。理論に束縛されるものではないが、別の実施態様において、提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子又はその組成物は、宿主（例えば、マクロファージ）に感染し、主要組織適合性抗原（MHC）クラスI及びII上での抗原の直接提示のために、宿主の抗原提示細胞（APC）において対象となる抗原を発現する。別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物の対象への投与は、腫瘍性疾患を治療するために、多機能(plurifunctional)IFN-γ及びTNF-αを共生成する癌特異的CD4+及びCD8+T細胞応答を高度に誘導する（IFN-γは、CD4+及びCD8+T細胞によって生成され、TNF-αは、CD4+T細胞によって生成される）。
【０２８２】
別の実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤の投与は、癌治療のための1以上の臨床転帰を増加又は改善する。そのような転帰の非限定的な例としては、全生存期間、無増悪生存期間、無憎悪期間、治療の失敗までの時間、無再発生存期間、次の治療までの時間、全体的な応答率及び応答の持続時間が挙げられる。臨床転帰の1以上の増加又は改善は、そのような治療の非存在下での同じ腫瘍性疾患を有する患者又は患者群と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又はそれ以上であり得る。
【０２８３】
提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物を投与することによって対象において誘導される、癌細胞又は腫瘍を含む腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞媒介性免疫（CMI）応答機能の変化を、フローサイトメトリー(例えば、Perfetto S.P.らの文献, Nat Rev Immun. 2004; 4(8):648-55参照)、リンパ球増殖アッセイ(例えば、Bonilla F.A.らの文献, Ann Allergy Asthma Immunol. 2008; 101:101-4;及びHicks M.J.らの文献, Am J Clin Pathol. 1983; 80:159-63参照)、Tリンパ球のサイトカイン測定の活性化後の表面マーカー発現変化の決定を含むリンパ球活性化を測定するためのアッセイ(例えば、Caruso A.らの文献, Cytometry. 1997;27:71-6参照)、ELISPOTアッセイ(例えば、Czerkinsky C.C.らの文献, J Immunol Methods. 1983; 65:109-121;及びHutchings P.R.らの文献, J Immunol Methods. 1989; 120:1-8参照)、又はナチュラルキラー細胞の細胞傷害性アッセイ(例えば、Bonilla F.A.らの文献, Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 May; 94(5 Suppl 1):S1-63参照)を含むが、これらに限定されない当業者に公知の任意のアッセイによって測定することができる。
【０２８４】
本明細書に記載される方法及び組成物で使用することができる免疫チェックポイント阻害剤は、任意の負のチェックポイント調節因子を標的とすることができる。ある実施態様において、そのような負のチェックポイント調節因子は、T細胞活性化に関与するタンパク質である。あるより具体的な実施態様において、そのような負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性T-リンパ球抗原-4（CTLA-4）、CD80、CD86、プログラム細胞死1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3;CD223としても知られる）、ガレクチン-3、B及びTリンパ球アテニュエータ（BTLA）、T細胞膜タンパク質3（TIM3）、ガレクチン-9（GAL9）、B7-H1、B7-H3、B7-H4、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9）、T細胞活性化VドメインIgサプレッサー（VISTA）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連（GITR）タンパク質、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052、及びCGEN-15092である。それらを標的にするそのようなチェックポイント調節因子及び薬物の概要は、表4に記載されている。
表４
【表７】
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【０２８５】
ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及び本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくは、複数回の注射で（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40、45、又は50回の注射）又は連続注入によって（例えば、ポンプを使用して）、複数の部位（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、又は14の部位）に投与される。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物は、6ヶ月の期間、12ヶ月の期間、24ヶ月の期間、又は48ヶ月の期間にわたって、2回以上の別々の注射で投与される。ある実施態様において、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物は、選択された日に最初の用量を、最初の投与後の少なくとも2ヶ月の時点で第2の用量を、及び最初の投与後6ヶ月の時点で第3の用量で投与される。
【０２８６】
一例において、皮膚の注射は、局所皮膚反応の程度を低減するために、複数の身体部位に行われる。所与のワクチン接種日に、患者に割り当てられた総用量の投与を、1つのシリンジから3〜5回の別々の用量（例えば、少なくとも0.4 ml、0.2 ml、又は0.1 ml）の皮下注射に分けて行う。それぞれの皮下注射は、肢において最も近くに隣接した注射部位から少なくとも5 cm（例えば、少なくとも4.5、5、6、7、8、又は9 cm）間隔をとった針刺入部位で行う。その後のワクチン接種日に、該注射部位は、時計回り又は反時計回りで異なる四肢に回転される。
【０２８７】
ある実施態様において、本方法はさらに、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子と免疫チェックポイント阻害剤の共投与を含む。ある実施態様において、共投与は同時である。別の実施態様において、該アレナウイルス粒子は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。他の実施態様において、該アレナウイルス粒子は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子と免疫チェックポイント阻害剤の投与の間の間隔は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、又は約12時間である。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子と免疫チェックポイント阻害剤の投与の間の間隔は、約1日、約2日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約1週間、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約9週間、約10週間、約11週間、約12週間である。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子の投与と免疫チェックポイント阻害剤との間の間隔は、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、又は約6ヶ月である。いくつかの実施態様において、本方法はさらに、少なくとも1種類の追加の治療法を施すことを含む。
【０２８８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、本明細書に提供される1以上のアレナウイルス粒子及びインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（「IDO」）阻害剤を対象に投与することを含む、前記方法である。対象における腫瘍性疾患を治療する方法は、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現する1以上のアレナウイルス粒子、又はその組成物、及びIDO阻害剤を該対象に投与することを含むことができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における癌細胞又は腫瘍などの腫瘍性細胞又は組織に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に提供される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原若しくはその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子、又はその組成物、及びIDO阻害剤を該対象に投与することを含む、前記方法である。ある実施態様において、本方法は、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子とIDO阻害剤の共投与を含む。ある実施態様において、本方法は、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤とIDO阻害剤の共投与を含む。
【０２８９】
別の実施態様において、２種類のアレナウイルス粒子は、特に、1：1の比、1：2の比、1：5の比、1：10の比、1：20の比、1：50の比、1：100の比、1：200の比、1：300の比、1：400の比、1：500の比、1：600の比、1：700の比、1：800の比、1：900の比、1：1000の比を含む約1：1〜1：1000の範囲のモル比の治療計画で投与される。
【０２９０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍性疾患を治療する方法であって、第1のアレナウイルス粒子は、「初回刺激」として最初に投与され、第2のアレナウイルス粒子は、「追加免疫」として投与される。第1及び第2のアレナウイルス粒子は、同じ又は異なる腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現することができる。或いは、又は追加的に、いくつかのある実施態様において、「初回刺激」及び「追加免疫」投与は、異なる種由来のアレナウイルス粒子で行われる。ある具体的な実施態様において、「初回刺激」投与は、LCMV由来のアレナウイルス粒子で行われ、「追加免疫」は、フニンウイルス由来のアレナウイルス粒子で行われる。ある具体的な実施態様において、「初回刺激」投与は、フニンウイルス由来のアレナウイルス粒子で行われ、「追加免疫」は、LCMV由来のアレナウイルス粒子で行われる。
【０２９１】
ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第1のアレナウイルス粒子の投与に続く、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第2のアレナウイルス粒子の投与は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する単一アレナウイルス粒子の投与よりも高い抗原特異的CD8+T細胞応答をもたらす。ある実施態様において、抗原特異的CD8+T細胞数は、第1の投与と比較して、第2の投与後に50％、100％、150％又は200％増加する。ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第3のアレナウイルス粒子の投与は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現するアレナウイルス粒子の2回の連続投与よりも高い抗原特異的CD8+T細胞応答をもたらす。ある実施態様において、抗原特異的CD8+T細胞数は、第1の投与と比較して、第3の投与後に約50％、約100％、約150％、約200％又は約250％増加する。
【０２９２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍性疾患を治療する方法であって、2種以上のアレナウイルス粒子を投与することを含み、該2種以上のアレナウイルス粒子が相同であり、各投与間隔が、約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約18ヶ月、又は約24ヶ月である、前記方法である。
【０２９３】
ある実施態様において、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第1のアレナウイルス粒子及び腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第2の異種のアレナウイルス粒子の投与は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第1のアレナウイルス粒子及び腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する第2の同種のアレナウイルス粒子の投与よりも高いCD8+T細胞応答を誘発する。
【０２９４】
(5.9 組成物、投与、及び投与量)
また、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子を含むワクチン、免疫原性組成物（例えば、ワクチン製剤）、及び医薬組成物、及びある実施態様において、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤である。そのようなワクチン、免疫原性組成物及び医薬組成物は、当技術分野の標準的な手順に従って製剤化することができる。
【０２９５】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される感染性複製欠損アレナウイルス粒子を含む組成物、及びある実施態様において、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤である。そのような組成物は、腫瘍性疾患を治療する方法において使用することができる。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物を使用して、該組成物が投与される宿主に免疫応答を誘導することができる。本明細書に記載される免疫原性組成物は、ワクチンとして使用することができ、それに応じて、医薬組成物として製剤化することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載される免疫原性組成物は、腫瘍性疾患対象（例えば、ヒト対象）の治療に使用される。他の実施態様において、該ワクチン、免疫原性組成物又は医薬組成物は、動物及び/又はヒトへの投与に適している。
【０２９６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子（又は異なるアレナウイルス粒子の組み合わせ）を含む免疫原性組成物である。ある実施態様において、そのような免疫原性組成物はさらに、医薬として許容し得る賦形剤を含む。ある実施態様において、そのような免疫原性組成物はさらに、アジュバントを含む。本明細書に記載される組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記組成物の投与前、投与と同時、又は投与後に投与することができる。いくつかの実施態様において、「アジュバント」という用語は、本明細書に記載される組成物と組み合わせて又は本明細書に記載される組成物の一部として投与した時に、感染性複製欠損アレナウイルス粒子に対する免疫応答を高める、増強する、及び/又はブーストするが、該化合物が単独で投与された場合には、感染性複製欠損アレナウイルス粒子に対する免疫応答をもたらさない化合物を指す。いくつかの実施態様において、該アジュバントは、感染性複製欠損アレナウイルス粒子に対する免疫応答をもたらし、アレルギー又は他の有害反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増強することができる。本発明のワクチン組成物又は免疫原性組成物が、アジュバントを含むか又は1種以上のアジュバントと一緒に投与される場合、使用することができるアジュバントとしては、無機塩アジュバント又は無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、及び免疫刺激アジュバントを挙げることができるが、これらに限定されない。アジュバントの例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3De-O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)(GB 2220211参照)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80; ICL Americas社)、イミダゾピリジン化合物(国際公開番号WO2007/109812として公開された国際出願PCT/US2007/064857参照)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開番号WO2007/109813として公開された国際出願PCT/US2007/064858参照)、及びQS21などのサポニン(Kensilらの文献、ワクチンデザイン:サブユニット及びアジュバントアプローチ(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach (Powell＆Newman編集、Plenum Press、NY、1995);米国特許第5,057,540号参照)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、該アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、必要に応じて、モノホスホリルリピドAなどの免疫刺激剤と組み合わせた水中油型エマルジョン(スクアレン又はピーナッツ油など)である(Stouteらの文献, N.Engl.J.Med.336、86-91(1997)参照)。
【０２９７】
該組成物は、単独で、又は医薬として許容し得る担体と共に、本明細書に記載される感染性複製欠損アレナウイルス粒子及び/又は免疫チェックポイント阻害剤を含む。遺伝子改変アレナウイルス粒子、とりわけ等張水性懸濁液若しくは分散液の懸濁液又は分散液を使用することができる。該医薬組成物は、滅菌することができ、かつ/又は賦形剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤並びに/又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧及び/若しくは緩衝液を調節するための塩を含んでよく、それ自体既知の方法で、例えば、従来の分散剤及び懸濁プロセスによって調製される。ある実施態様において、そのような分散液又は懸濁液は、粘度調節剤を含んでよい。該懸濁液又は分散液は、約2〜8℃の温度に保たれるか、又は好ましくは、長期保存については、凍結した後、使用直前に解凍してよい。注射については、ワクチン又は免疫原性製剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液で製剤化してよい。該溶液は、懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤などの処方剤を含有してよい。
【０２９８】
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物はさらに、防腐剤、例えば、水銀誘導体のチメロサールを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、防腐剤を含まない。
【０２９９】
該医薬組成物は、約103〜約1011フォーカス形成単位の遺伝子改変アレナウイルスを含む。非経口投与のための単位用量形態は、例えば、アンプル又はバイアル、例えば、約103〜1010フォーカス形成単位又は105〜1015個の物理的粒子の遺伝子改変アレナウイルス粒子を含有するバイアルである。
【０３００】
別の実施態様において、本明細書に提供されるワクチン組成物又は免疫原性組成物は、限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、局所、皮下、経皮、鼻腔内及び吸入経路を含む経路により、並びにスカリフィケーション(例えば、二股針を使用して、皮膚の最上層から傷を付けること)により、対象に投与される。具体的には、皮下、筋肉内又は静脈内経路を使用することができる。
【０３０１】
鼻腔内への又は吸入による投与のために、本発明による使用のための調製物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適なガスを使用して、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達され得る。加圧エアロゾルの場合には、投薬量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより決定してよい。吸入器又は注入器で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又はデンプンなどの好適な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤化してよい。
【０３０２】
活性成分の投薬量は、ワクチン接種の種類によって、並びに対象及びその年齢、体重、個々の状態、個々の薬物動態データ、及び投与様式によって決まる。
【０３０３】
ある実施態様において、該組成物は、治療有効量のアレナウイルス粒子及び/又は治療有効量免疫チェックポイント阻害剤を含む単回投与量で患者に投与することができる。いくつかの実施態様において、該アレナウイルス粒子は、それぞれ治療有効量でアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤を含む単回用量で患者に投与することができる。
【０３０４】
ある実施態様において、該組成物は、単回用量として患者に投与され、続いて、3〜6週間後に第2の用量で投与される。これらの実施態様によれば、ブースター接種は、第2の接種後6〜12ヶ月の間隔で対象に投与することができる。ある実施態様において、ブースター接種は、異なるアレナウイルス粒子又はその組成物を利用することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される同じ組成物の投与が、繰り返され、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、又は少なくとも6ヶ月間隔をあけることができる。
【０３０５】
ある実施態様において、アレナウイルス粒子を含むワクチン、免疫原性組成物、又は医薬組成物は、生ワクチンとして使用することができる。生アレナウイルス粒子の例示的な用量は、用量あたり10〜100 PFU、又はそれ以上の生ウイルスで変化し得る。いくつかの実施態様において、アレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子の好適な投与量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012 pfuであり、必要な頻度で間隔をあけて1回、2回、3回又はそれ以上対象に投与することができる。別の実施態様において、生アレナウイルスは、0.2mLの用量が106.5-107.5蛍光フォーカス単位の生アレナウイルス粒子を含有するように製剤化される。別の実施態様において、不活化ワクチンは、それが約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約15μg〜約50μg、又は約15μg〜約30μgのアレナウイルスを含有するように製剤化される。
【０３０６】
また提供されるのは、活性成分としてアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬製剤の形態のワクチンの製造のためのプロセス並びにアレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤の使用である。さらに提供されるのは、本明細書に記載される腫瘍性疾患の治療に使用するための、本明細書に提供されるアレナウイルス粒子と本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせである。ある実施態様において、該組み合わせは、同一の医組成物中にある。ある実施態様において、該組み合わせは、アレナウイルス粒子及び免疫チェックポイント阻害剤が別々に投与される場合などに、同じ医薬組成物中に存在しない。本願の医薬組成物は、それ自体既知の方法で、例えば、従来の混合及び/又は分散のプロセスによって調製される。
【０３０７】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法及び組成物は、個別化医療と組み合わせて使用される。個別化医療は、異なる治療に対する患者の反応を予測し、どの治療が効果的である可能性が高いかを特定するため、患者の特有の遺伝的及び/又はエピジェネティックなプロファイルからの情報を使用することによって患者に恩恵をもたらそうとするものである。患者の特有の遺伝的及び/又はエピジェネティックなプロファイルを得るために、本明細書に提供される方法及び組成物と組み合わせて使用することができる技術としては、ゲノム配列決定、RNA配列決定、遺伝子発現解析及び腫瘍抗原（例えば、ネオ抗原）、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片の特定を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法及び組成物で使用するためのアレナウイルスの腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の選択は、患者の遺伝子プロファイルに基づいて行われる。ある実施態様において、本明細書に提供される方法及び組成物で使用するためのアレナウイルスの腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の選択は、腫瘍又は腫瘍細胞の遺伝子プロファイルに基づいて行われる。
【０３０８】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される方法を実行するために使用することができるキットである。ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、1以上の容器を含むことができる。これらの容器は、本明細書に提供される組成物（例えば、医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物）の貯蔵用に保持することができる。使用のための指示書もキットに含まれる。これらの説明書は、その中に含有される組成物を使用するための治療プロトコルについて十分詳細に記載している。例えば、該説明書は、腫瘍性疾患を治療する方法のための、本明細書に提供される投薬及び投与の説明書を含むことができる。
【０３０９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、それぞれが本明細書に記載される方法を実行するための活性成分を含有する容器を含む。したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるキットは、2以上の容器及び使用説明書を含み、容器の1つが本明細書に提供される感染性複製欠損アレナウイルス粒子を含み、別の容器は本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含む。
【０３１０】
(5.10 アッセイ)
(5.10.1 アレナウイルス検出アッセイ)
当業者は、当技術分野で公知の技術を使用して、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメント又は三セグメントアレナウイルス粒子を検出することができる。例えば、RT-PCRをアレナウイルスに特異的なプライマーと共に使用して、ORFの野生型の位置以外の位置にORFを、又は三セグメントアレナウイルス粒子を担持するように改変されたアレナウイルスゲノムセグメントを検出及び定量化することができる。ウェスタンブロット、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、免疫細胞化学、又はFACSと組み合わせた免疫細胞化学を用いて、アレナウイルスゲノムセグメント又は三セグメントアレナウイルス粒子の遺伝子産物を定量化することができる。
【０３１１】
(5.10.2 感染力を測定するためのアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイをアレナウイルスベクター調製物の感染力を測定するために使用することができる。例えば、ウイルス/ベクター力価の決定は、「フォーカス形成単位アッセイ」(FFUアッセイ)により行うことができる。簡潔に述べると、相補細胞、例えば、必要に応じて、LCMV GPタンパク質を発現するMC57又はHEK293細胞をプレーティングし、ウイルス/ベクター試料の異なる希釈物を接種する。インキュベーション期間の後、細胞に単層を形成させ、ウイルスを細胞に付着させるために、単層をメチルセルロースで覆う。プレートをさらにインキュベートすると、もとの感染した細胞はウイルス子孫を放出する。メチルセルロースが重層されるため、新しいウイルスの拡散は、隣接する細胞に制限される。結果として、各々の感染性粒子は、フォーカスと呼ばれる感染した細胞の円形のゾーンをもたらす。そのようなフォーカスを、LCMV-NP又はアレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子が発現する別のタンパク質に対する抗体及びHRPベースの呈色反応を使用して見えるようにし、それにより、数えられるようにすることができる。ウイルス/ベクターの力価は、1ミリリットル当たりのフォーカス形成単位(FFU/mL)で計算することができる。
【０３１２】
(5.10.3 アレナウイルス粒子の増殖)
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の増殖は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法により評価することができる(例えば、細胞培養）。ウイルス増殖は、細胞培養物(例えば、Vero細胞又はBHK-21細胞）に、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の連続希釈物を接種することによって決定することができる。指定された時間ウイルスをインキュベーションした後、ウイルスを標準的な方法を使用して単離する
【０３１３】
(5.10.4 血清ELISA)
動物(例えば、マウス、モルモット)のワクチン接種時の液性免疫応答の決定は、抗原特異的血清ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)により行うことができる。簡潔に述べると、プレートを抗原(例えば、組換えタンパク質)でコーティングし、抗体の非特異的結合を避けるためにブロッキングし、血清の連続希釈物とともにインキュベートする。インキュベーション後、結合した血清-抗体を、例えば、酵素が結合した(全IgG又はIgGサブクラスを検出する)抗種(例えば、マウス、モルモット)特異的抗体及びその後の呈色反応を使用して検出することができる。抗体力価を、例えば、終点幾何平均力価として決定することができる。
【０３１４】
免疫捕捉ELISA（IC-ELISA）も行うことができ(Shanmughamらの文献, 2010, Clin. Vaccine Immunol. 17(8):1252-1260参照)、その中の捕捉剤はビーズに架橋されている。
【０３１５】
(5.10.5 誘導された抗体の中和活性を測定するアッセイ)
血清中の中和抗体の決定は、ATCCからのARPE-19細胞とGFPタグ化ウイルスとを使用する以下の細胞アッセイを使用して行う。さらに、外因性補体の源としての補足血清(例えば、モルモット血清)を使用する。このアッセイは、中和に使用する1日又は2日前に、384ウェルプレートに6.5×103細胞/ウェル(50μl/ウェル)を播種することにより開始する。中和は、細胞を含まない96ウェル滅菌組織培養プレートで、37℃で1時間行う。中和インキュベーション工程の後、混合物を細胞に添加し、プレートリーダーによるGFP検出のために、さらに4日間インキュベートする。陽性の中和ヒト血清を各々のプレートでアッセイ陽性対照として使用して、全ての結果の信頼性を確認する。4パラメータロジスティック曲線フィッティングを使用して、力価(EC50)を決定する。追加の検査として、ウェルを蛍光顕微鏡で確認する。
【０３１６】
(5.10.6 プラーク減少アッセイ)
簡潔に述べると、LCMVについてのプラーク減少(中和)アッセイを、緑色蛍光タンパク質がタグ付けされている複製可能又は複製欠損LCMVを使用して行い、5％ウサギ血清を外因性補体の源として使用することができ、プラークを蛍光顕微鏡観察により数えることができる。中和力価を、対照(免疫前)血清試料における希釈と比較して、プラークの50％、75％、90％又は95％減少をもたらす血清の最大希釈と定義することができる。
【０３１７】
qPCR LCMV RNAゲノムを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、QIAamp Viral RNAミニキット(QIAGEN)を使用して単離する。LCMV RNAゲノム相当物を、SuperScript(登録商標) III Platinum(登録商標) One-Step qRT-PCRキット(Invitrogen)並びにLCMV NPコード領域又はアレナウイルス粒子若しくは三セグメントアレナウイルス粒子の別のゲノムストレッチの一部に特異的なプライマー及びプローブ(FAMレポーター及びNFQ-MGBクエンチャー)を使用するStepOnePlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で実施される定量的PCRにより検出する。反応の温度プロファイルは: 60℃で30分、95℃で2分の後、95℃で15秒、56℃で30秒を45サイクルであり得る。RNAを、試料の結果と、プライマー及びプローブ結合部位を含むLCMV NPコード配列の断片又はアレナウイルス粒子若しくは三セグメントアレナウイルス粒子の別のゲノムストレッチに対応する、分光光学的に定量されたインビトロ転写RNA断片のlog10希釈系列から作成された標準曲線との比較により定量することができる。
【０３１８】
(5.10.7 モルモット肺線維芽細胞(GPL)細胞における中和アッセイ)
簡潔に述べると、試験血清及び対照(ワクチン接種前)血清の連続希釈物を、補足のウサギ血清(1％)を外因性補体の源として含むGPL完全培地中で調製した。希釈系列は、1:40から1:5120に及んだ。血清希釈物をeGFPタグ化ウイルス(1ウェル当たり100〜200pfu)と共に37℃で30分間インキュベートし、その後、コンフルエントなGPL細胞を含む12ウェルプレートに移した。試料を3連で処理した。37℃で2時間のインキュベーションの後、細胞をPBSで洗浄し、GPL完全培地を再供給し、37℃/5％CO2で5日間インキュベートした。プラークを蛍光顕微鏡観察により可視化し、計数し、対照ウェルと比較した。対照と比較したプラーク数の50％減少をもたらすその血清希釈を中和力価と表す。
【０３１９】
(5.10.8 ウェスタンブロッティング)
組織培養フラスコ中又は懸濁下で成長させた感染細胞を、示された感染後の時点でRIPA緩衝液(Thermo Scientific)を使用して溶解させるか、又は細胞溶解なしでそのまま使用する。試料を還元剤及びNuPage LDS試料緩衝液(NOVEX)と共に99℃に10分間加熱し、室温に冷却した後、電気泳動のために4-12％SDS-ゲルに充填する。タンパク質を、Invitrogens iBlot Gel転写装置を使用して膜上にブロッティングし、ポンソー染色により可視化する。最後に、調製物を対象となるタンパク質に対する一次抗体及びアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体でプロービングし、その後、1-Step NBT/BCIP溶液(INVITROGEN)で染色する。
【０３２０】
(5.10.9 抗原特異的CD8+T細胞増殖の検出のためのMHC-ペプチド多量体染色アッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、抗原特異的CD8+T細胞応答を試験することができる。例えば、MHC-ペプチド四量体染色アッセイを使用することができる(例えば、Altman J.D.らの文献, Science 1996; 274:94-96;及びMurali-Krishna K.らの文献, Immunity 1998;8:177-187参照)。簡潔に述べると、このアッセイは、以下の工程を含み、四量体アッセイを使用して、抗原特異的T細胞の存在を検出する。T細胞がそれに対して特異的なペプチドを検出するために、T細胞は、ペプチドと(通常、蛍光標識されている)定義した抗原特異性及びMHCハプロタイプのT細胞用の特別仕様のMHC分子の四量体の両方を認識しなければならない。その後、四量体を、蛍光標識を介してフローサイトメトリーにより検出する。
【０３２１】
(5.10.10 抗原特異的CD4+T細胞増殖の検出のためのELISPOTアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、抗原特異的CD4+T細胞応答を試験することができる。例えば、ELISPOTアッセイを使用することができる(例えば、Czerkinsky C.C.らの文献, J Immunol Methods. 1983; 65:109-121;及びHutchings P.R.らの文献, J Immunol Methods. 1989; 120:1-8参照)。簡潔に述べると、このアッセイは、以下の工程を含む:免疫スポットプレートを抗サイトカイン抗体でコーティングする。細胞を免疫スポットプレート中でインキュベートする。細胞はサイトカインを分泌し、その後、洗い落とされる。その後、プレートを第2のビオチン化抗サイトカイン抗体でコーティングし、アビジン-HRPシステムで可視化する。
【０３２２】
(5.10.11 CD8＋及びCD4+T細胞応答の機能性の検出のための細胞内サイトカインアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、CD8＋及びCD4+T細胞応答の機能性を試験することができる。例えば、フローサイトメトリーと組み合わせた細胞内サイトカインアッセイを使用することができる(例えば、Suni M.A.らの文献, J Immunol Methods. 1998; 212:89-98; Nomura L.E.らの文献, Cytometry 2000; 40:60-68;及びGhanekar S.A.らの文献, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8:628-63参照)。簡潔に述べると、このアッセイは、以下の工程を含む:特異的ペプチド又はタンパク質による細胞の活性化、タンパク質輸送の阻害(例えば、ブレフェルジンA)を加えて、サイトカインを細胞内に保持する。インキュベーションの定義した期間、典型的には5時間後に、洗浄工程が続き、他の細胞マーカーに対する抗体を細胞に添加することができる。その後、細胞を固定し、透過処理する。蛍光色素結合抗サイトカイン抗体を添加し、細胞をフローサイトメトリーにより解析することができる。
【０３２３】
(5.10.12 ウイルスベクターの複製欠損を確認するためのアッセイ)
感染性でかつ複製可能なウイルス粒子の濃度を決定する当業者に公知の任意のアッセイも使用して、試料中の複製欠損ウイルス粒子を測定することができる。例えば、非相補細胞を使用するFFUアッセイをこの目的で使用することができる。
【０３２４】
さらに、プラークベースのアッセイは、ウイルス試料中のプラーク形成単位(PFU)に関してウイルス濃度を決定するために使用される標準的な方法である。具体的には、非相補宿主細胞のコンフルエントな単層に様々な希釈のウイルスを感染させ、寒天などの半固形培地で覆って、ウイルス感染が無制限に拡大するのを防ぐ。ウイルスが感染し、固定された細胞単層内の細胞でそれ自体を複製し、周囲の細胞に広がるのに成功すると、ウイルスプラークが形成される(例えば、Kaufmann、S.H.; Kabelitz、D.の文献(2002)、微生物学の方法(Methods in Microbiology) 第32巻:感染の免疫学(Immunology of Infection)、Academic Press. ISBN 0-12-521532-0参照)。プラーク形成は、解析されているウイルスによって、2〜14日間かかることがある。プラークを全体的に手作業で計数し、その結果を、プレートを調製するために使用した希釈係数と組み合わせて使用して、試料単位容量当たりのプラーク形成単位の数(PFU/mL)を計算する。PFU/mLの結果は、試料中の感染性複製可能粒子の数を表す。C細胞を使用する場合、同一のアッセイを用いて、複製欠損アレナウイルス粒子又は三セグメントアレナウイルス粒子を滴定することができる。
【０３２５】
(5.10.13 ウイルス抗原の発現についてのアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを、ウイルス抗原の発現を測定するために使用することができる。例えば、FFUアッセイを実施することができる。検出のために、それぞれのウイルス抗原に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体調製物(複数可)を使用する(導入遺伝子特異的FFU)。
【０３２６】
(5.10.14 動物モデル)
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の組換え及び感染力を調べるために、インビボ動物モデルを使用することができる。ある実施態様において、三セグメントアレナウイルス粒子の組換え及び感染力を調べるために使用することができる動物モデルは、マウス、モルモット、ウサギ、及びサルを含む。好ましい実施態様において、アレナウイルスの組換え及び感染力を調べるために使用することができる動物モデルは、マウスを含む。より具体的な実施態様において、アレナウイルス粒子の組換え及び感染力を調べるために使用することができるマウスは、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体及び組換え活性化遺伝子1（RAG1）の3つを欠損している。
【０３２７】
ある実施態様において、動物モデルを用いて、アレナウイルスの感染力及び導入遺伝子の安定性を決定することができる。いくつかの実施態様において、ウイルスRNAは、動物モデルの血清から単離することができる。技術は、容易に当業者によって知られている。ウイルスRNAを逆転写することができ、アレナウイルスORFを担持するcDNAを、遺伝子特異的プライマーを用いてPCR増幅することができる。フローサイトメトリーも用いて、アレナウイルスの感染力及び導入遺伝子の安定性を調べることができる。
【０３２８】
本明細書に記載される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又はその抗原性断片を発現する二セグメント感染性複製欠損アレナウイルスを含むワクチン又はその組成物の安全性、忍容性及び免疫原性効果を動物モデルで試験することができる。ある実施態様において、本明細書で使用されるワクチン及びその組成物の安全性、忍容性及び免疫原性効果を試験するために使用することができる動物モデルとしては、マウス、モルモット、ラット、サル、及びチンパンジーが挙げられる。好ましい実施態様において、本明細書で使用されるワクチン及びその組成物の安全性、忍容性及び免疫原性効果を試験するために使用することができる動物モデルとしては、マウスが挙げられる。
【０３２９】
(5.10.15 免疫チェックポイント阻害剤アッセイ)
いくつかのアッセイが、例えば、Lechnerらの文献, J. Immunother. 36(9), 477-89 (2013)に記載されているように、提案されたチェックポイント阻害剤の特性を評価するために考案されている。本明細書に記載される方法及び組成物を試験するために使用することができる腫瘍モデルは、Colon26（CT26）、MC38（マウス結腸腺癌）、B16F10（B16）、ルイス肺癌（LLC）、Madisonl09（MAD 109）、EMT-6（マウス乳癌）、4T1（4T1）（マウス乳癌）、及び（RENCA）（マウス腎臓癌）を含む。
【０３３０】
ある実施態様において、これらのモデル系において、「移植腫瘍」は、齧歯類、例えば、メスの成体マウスにおいて、腫瘍細胞株の皮下接種（例えば、CT26、4T1、MAD109、RENCA、LLC、又はB16）又は脳内接種（例えば、GL261、ONC26M4）によって作製することができる。腫瘍は、例えば、数日間、所定の時間間隔をかけて発症し得る。これらの腫瘍は、同系、免疫適格性齧歯類、例えば、マウスの系統で成長する。例えば、CT26、4T1、MAD109、及びRENCAは、BALB/cマウスで成長させることができ、LLC、B16、及びGL261は、C57BL/6マウスで成長させることができ、ONC26M4は、FVBNマウスで成長させることができる。「自然発生腫瘍」は、内因性脳細胞を形質転換するために、いくつか（例えば、1、2、3又はそれ以上）の癌遺伝子をコードし、かつ1以上のレポーター、例えば、ホタルルシフェラーゼレポーターをコードするDNAプラスミドを新生児C57BL/6又はFVBNマウスへ脳内注射することによって作製することができる。神経膠腫の成長は、当技術分野で公知の技術、例えば、生物発光イメージングによって監視することができる。皮下腫瘍の成長は、当技術分野で公知の技術、例えば、指定した時間間隔での三次元キャリパー測定によって監視することができる。
【０３３１】
(6. 同等物)
ウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び本明細書に開示される組成物は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲を限定されるべきではない。実際、記載されるものに加えて、ウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び組成物の様々な改変は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０３３２】
様々な刊行物、特許及び特許出願が本明細書に引用されており、これらの開示は、その全体が引用により組み込まれる。
【０３３３】
様々な刊行物、特許及び特許出願が本明細書に引用されており、これらの開示は、その全体が引用により組み込まれる。
【実施例】
【０３３４】
(7. 実施例)
この節の実施例は、例示のために提供され、制限されるものではない。
【０３３５】
(7.1 結腸腺癌腫瘍モデルにおける三セグメントアレナウイルスベクター及び免疫チェックポイント阻害剤での処置)
この実施例は、例示的な腫瘍特異的抗原（オボアルブミン（OVA））及び免疫チェックポイント阻害剤（抗PD1抗体）をコードするアレナウイルスベクターでの処置が、腫瘍成長及び生存率に対して相乗効果をもたらしたことを実証する。
【０３３６】
オボアルブミン（OVA）（r3LCMV-OVA）をコードする三セグメント複製可能LCMVベクター及び抗PD1チェックポイント阻害剤（抗PD1抗体）での処置の効果を決定するために、皮下MC38-OVAマウスモデルを用いた。0日目に、MC38-OVAdim結腸癌腫瘍細胞（5×105）を、C57BL/6マウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍が（7日目に）触診可能になったとき、マウスを、処置しない（グループ1）か、13、17、20及び24日目に12.5mg/kgの抗PD1抗体（クローンRMP1-14、BioXCell）（腹腔内投与）で処置する（グループ2）か、7日目に105 PFU r3LCMV-OVAを静脈内注射する（グループ3）か、又は同じ処置レジメンを用いてr3LCMV-OVAと抗PD1抗体の組み合わせで処置した（グループ4）。5匹のマウスを処置せず、他の全てのグループは、グループごとに6匹のマウスを含んでいた。時間をかけて腫瘍の成長だけでなく、動物の生存を監視した。
【０３３７】
上記の実験から、OVAを発現するMC38結腸腺癌細胞から確立された腫瘍が、抗PD1抗体又はr3LCMV-OVAのいずれかの単独処置に対して限定された応答を示したが、抗PD1抗体とr3LCMV-OVAの組み合わせの免疫療法では、腫瘍成長の有意な低下（図3A）及び生存率の増加（図3B）につながる相乗効果をもたらしたことが示された。
【０３３８】
(7.2. 結腸腺癌腫瘍モデルにおける腫瘍ネオ抗原をコードする三セグメント又は二セグメントアレナウイルスベクター及び免疫チェックポイント阻害剤での処置)
本実施例は、ネオ抗原（MC-38 Adpgkmut）をコードするアレナウイルスベクター及び免疫チェックポイント阻害剤（抗PD1抗体）での処置が、抗原特異的CD8+T細胞の誘導、腫瘍成長及び生存率に対して相乗効果をもたらしたことを実証する。
【０３３９】
腫瘍ネオ抗原をコードする複製可能及び複製欠損アレナウイルスベースのベクター（例えば、MC-38 Adpgkmut(ADP依存性グルコキナーゼ（Adpgk）におけるR204M変異)）; Yadavらの文献, 2014, Nature 515:572-576)の免疫原性及びその処置の効果を決定するために、MC-38腫瘍細胞を移植したマウスを、Adpgkmutをコードする三セグメント複製可能（r3LCMV-Adpgkmut）又は複製欠損二セグメント（r2LCMV-Adpgkmut）アレナウイルスベクター及びPD1チェックポイント阻害（抗PD1抗体）での処置後に評価した。
【０３４０】
実験の-7日目に、MC-38腫瘍細胞（1×106）をC57BL/6マウスの脇腹に皮下移植した。7日後、実験の0日目に、マウスを、合計5.5×l05のウイルス粒子（グループ3及び4）に対応する5.5×l05 PFUのr2LCMV-Adpgkmut（グループ1及び2）若しくは5.5×l04 PFUのr3LCMV-Adpgkmut又は緩衝液（グループ5及び6）の静脈内注射により一回免疫した。グループ1、3及び5の動物をさらに、0、3、6及び9日目に、6.8mg/kgの抗PD1抗体クローンRMP1-14の腹腔内注射によって処置した。その後、Adpgkmut特異的CD8+T細胞の誘導を、ワクチン接種後7及び14日目に、末梢血試料中のMC-38 Adpgkmut特異的ペンタマー（F4B-E-H-2Db-ASMTNMELM、ProImmune）を用いて分析した。
【０３４１】
上記の実験により、Adpgkmut発現LCMVベクターで処置したいくつかの動物（グループ1〜4）において、かなりの大きさのネオ抗原特異的CD8+T細胞応答が誘導されたことが示された（図4A）。しかしながら、二セグメント複製欠損ベクター（グループ1及び2）と比較して、有意により高いCD8+T細胞頻度が三セグメント複製ベクターで処置した動物（グループ3及び4）において観察された（図4A）。最高のネオ抗原特異的CD8+T細胞応答が、Adpgkmut発現複製可能LCMVベクター及び抗PD1抗体で処置したマウス（グループ3）において誘導され、ネオ抗原の免疫原性に対する併用処置の相乗効果が示された(図4A）。最高レベルの腫瘍制御及び最良の生存率が、r3LCMV-Adpgkmutと抗PD1抗体の組み合わせで処置した動物において観察された（図4B及び4C）
【０３４２】
(7.3. 黒色腫モデルにおける三セグメント又は二セグメントアレナウイルスベクター及び免疫チェックポイント阻害剤での処置)
この実施例は、免疫チェックポイント阻害剤（抗PD1抗体）を含める場合又は含めない場合での、黒色腫抗原（糖タンパク質100（「GP100」）、チロシナーゼ関連タンパク質1（「TRP1」）及びチロシナーゼ関連タンパク質2（「TRP2」）をコードする三セグメントアレナウイルスベクターの混合物での処置が、腫瘍サイズの減少及び動物生存（生存率及び生存した全体の日数）の増加をもたらしたことを実証する。
【０３４３】
黒色腫抗原をコードする複製可能及び複製欠損アレナウイルスベースのベクター並びにPD1チェックポイント阻害での処置の効果を決定するために、マウスB16F10黒色腫モデルを用いた。
【０３４４】
実験の0日目に、B16F10黒色腫細胞（1×105）を、C57BL/6マウスの脇腹に皮下移植した（図5A）。実験の7日目に、マウスに1.2×105 RCV PFU（合計）の複製可能三セグメントアレナウイルスベクターの混合物(それぞれ4×104 PFUのr3LCMV-GP100、r3LCMV-Trp1及びr3LCMV-Trp2)（グループ1及び4）、1.2×106 PFU（合計）の複製欠損二セグメントアレナウイルスベクターの混合物(それぞれ4×105 PFUのrLCMV-GP100、rLCMV-Trp1及びrLCMV-Trp2)（グループ2及び5）、又は緩衝液のみ（グループ3及び6）を7日目に静脈内注射した。実験の10、13、16、19及び22日目に、グループ1、2及び3のマウスに、さらに200μgの抗PD1抗体（クローン29F.1A12、BioXCell）で腹腔内投与により処置した。時間をかけて腫瘍の成長だけでなく、動物の生存率及び生存日数を監視した。グループあたり5匹のマウスであった。
【０３４５】
上記の実験により、対照動物と比較した腫瘍体積の減少（図5B）及び生存率の増加（グループ6）（図5C及び5D）によって示されるように、確立された黒色腫腫瘍は黒色腫抗原GP100、Trp1及びTrp2を発現する三セグメント複製可能LCMVベクターの混合物での単一処置に応答することが示された（グループ4）。対照的に、チェックポイント阻害の有無に依存せず、同一の黒色腫抗原を発現する二セグメント複製欠損LCMVベクターの混合物での処置に対する応答はなかった（グループ2及び5）（図5B〜5D）。抗PD1遮断単独でも、動物の腫瘍成長又は生存に対する効果はなかった（グループ3）（図5B〜5D）。しかしながら、三セグメント複製可能LCMVベクターの混合物単独で処置した動物と比較して、抗PD1抗体と組み合わせた黒色腫抗原発現三セグメント複製可能LCMVベクターで処置したマウス（グループ1）において、腫瘍体積の減少と相関する生存率の増加が観察され、これらの治療法の相乗効果が示された（図5B〜5D）
【０３４６】
(8. 配列)
表5の配列は、本明細書に記載される方法及び組成物と共に使用することができる例示的なアミノ酸配列並びにヌクレオチド配列である。場合によっては、DNA配列を使用して、ウイルスゲノムセグメントのRNA配列を説明する。RNA配列は、DNA配列から容易に推測することができる。
表5
【表８】
2018533604.tif 000010
2018533604.tif 000011
2018533604.tif 000012
2018533604.tif 000013
2018533604.tif 000014
2018533604.tif 000015
2018533604.tif 000016
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2018533604.tif 000018
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2018533604.tif 000020
2018533604.tif 000021
2018533604.tif 000022
2018533604.tif 000023
2018533604.tif 000024
2018533604.tif 000025
2018533604.tif 000026
2018533604.tif 000027
【図１】
2018533604.tif 000028
【図２】
2018533604.tif 000029
【図３Ａ】
2018533604.tif 000030
【図３Ｂ】
2018533604.tif 000031
【図４Ａ】
2018533604.tif 000032
【図４Ｂ−１】
2018533604.tif 000033
【図４Ｂ−２】
2018533604.tif 000034
【図４Ｂ−３】
2018533604.tif 000035
【図４Ｃ】
2018533604.tif 000036
【図５Ａ】
2018533604.tif 000037
【図５Ｂ】
2018533604.tif 000038
【図５Ｃ】
2018533604.tif 000039
【図５Ｄ】
2018533604.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月19日(2018.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018533604000001.app
【国際調査報告】
2018533604.tif 000041
2018533604.tif 000042
2018533604.tif 000043