(57)【要約】  この発明は、製剤として再構成され得る１以上の核酸活性剤の固体の凍結乾燥物を作製するための組成物を提供する。組成物は、薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液を含み得、ここで脂質ナノ粒子は、核酸活性剤、デキストリン化合物、およびサッカライド化合物の１以上を封入する。核酸活性剤は、ＲＮＡ干渉を仲介することが可能なＲＮＡｉ分子ならびに他のＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドであり得る。
2018521083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の核酸活性剤を含む脂質ナノ粒子の固体の凍結乾燥物を作製するための組成物であって、
薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液、ここで、脂質ナノ粒子は１以上の核酸活性剤を封入する；
デキストリン化合物；および
サッカライド糖化合物
を含む、前記組成物。
【請求項２】
デキストリンおよび糖化合物の総量が、組成物の２％〜２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜７０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜５５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜４５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
組成物の凍結乾燥および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、元の組成物におけるそれらの大きさの１０％以内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物の凍結乾燥、保存および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、元の組成物におけるそれらの大きさの１０％以内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
凍結乾燥された組成物が、５℃で少なくとも１ヶ月間保存される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
凍結乾燥された組成物が、−２０℃で少なくとも１ヶ月間保存される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ナノ粒子が、４５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均的な直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸活性剤の濃度が、１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
脂質ナノ粒子が、化合物Ａ６、化合物Ａ９、化合物ＡＡ、化合物ＡＢ、化合物Ｃ２、化合物Ｆ５、化合物Ｆ７、および化合物Ｃ２４から選択される化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
１以上の核酸活性剤が、ＲＮＡ干渉を仲介することが可能なＲＮＡｉ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＮＡｉ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｒａｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１以上の核酸活性剤が、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、プラスミド、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはアプタマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容可能な溶液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する緩衝液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
デキストリン化合物がシクロデキストリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
シクロデキストリン化合物が、スルホアルキル、ベンゼンスルホアルキル、アセトアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルスクシナート、ヒドロキシアルキルマロナート、ヒドロキシアルキルグルタラート、ヒドロキシアルキルアジパート、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルマレアート、ヒドロキシアルキルオキサラート、ヒドロキシアルキルフマラート、ヒドロキシアルキルシトラート、ヒドロキシアルキルタルトラート、ヒドロキシアルキルマラート、またはヒドロキシアルキルシトラコナート基で置換された１以上の２，３および６ヒドロキシル位置を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
シクロデキストリン化合物が、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンスクシナート、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン、または２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンスクシナートである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
シクロデキストリン化合物が、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンまたはスルホブチルエーテルγ−シクロデキストリンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
シクロデキストリン化合物が、メチル−β−シクロデキストリンまたはメチル−γ−シクロデキストリンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
シクロデキストリン化合物が、ポリマー鎖またはネットワークに結合されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
シクロデキストリン化合物が吸着化合物を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
吸着化合物が、コレステロール、ラノステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、７−デヒドロコレステロール、ＰＥＧ化コレステロール、コレステリルアセタート、コレステリルアラキドナート、コレステリルブチラート、コレステリルヘキサノアート、コレステリルミリスタート、コレステリルパルミタート、コレステリルベヘナート、コレステリルステアラート、コレステリルカプリラート、コレステリルｎ−デカノアート、コレステリルドデカノアート、コレステリルネルボナート、コレステリルペラルゴナート、コレステリルｎ−バレラート、コレステリルオレアート、コレステリルエライダート、コレステリルエルカート、コレステリルヘプタノアート、コレステリルリノレライダート、コレステリルリノレアート、ベータ−シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラッシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、およびデルタ−７−アベナステロールから選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
サッカライド糖化合物が、モノサッカライドまたはジサッカライド糖化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
糖化合物が、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コウジビオース、サケビオース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、イソマルツロース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、およびキシロビオースから選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物を凍結乾燥することを含む、１以上の核酸活性剤の固体の凍結乾燥物を作製するためのプロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプロセスによって作製された、固体の凍結乾燥物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の固体の凍結乾燥物を再構成することを含む、製剤を作製するためのプロセス。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプロセスによって作製された、製剤。
【請求項３１】
脂質ナノ粒子を合成すること、ここで脂質ナノ粒子は１以上の核酸活性剤を封入する；
薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液を提供すること；
デキストリン化合物を脂質ナノ粒子を含有する溶液に加えること；
サッカライド糖化合物を脂質ナノ粒子を含有する溶液に加えること；
脂質ナノ粒子を含有する溶液を凍結乾燥し、それによって固体の凍結乾燥物を形成すること；
薬学的に許容可能な担体において凍結乾燥物を再構成し、それによって核酸製剤を形成すること
を含む、核酸製剤を作製するためのプロセス。
【請求項３２】
デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量が、脂質ナノ粒子を含有する溶液の２％〜２０％（ｗ／ｖ）である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜７０％（ｗ／ｖ）である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３４】
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜５５％（ｗ／ｖ）である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３５】
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜４５％（ｗ／ｖ）である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３６】
再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、合成されたときのそれらの大きさの１０％以内である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３７】
再構成前に凍結乾燥物を保存することをさらに含む、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３８】
凍結乾燥物の保存および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが合成されたときのそれらの大きさの１０％以内である、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
凍結乾燥物が５℃で少なくとも１ヶ月間保存される、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４０】
凍結乾燥物が−２０℃で少なくとも１ヶ月間保存される、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４１】
ナノ粒子が４５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均的な直径を有する、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項４２】
核酸活性剤の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項４３】
１以上の核酸活性剤が、ＲＮＡ干渉を仲介することが可能なＲＮＡｉ分子である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項４４】
薬学的に許容可能な溶液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する緩衝液である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項４５】
デキストリン化合物がシクロデキストリンである、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項４６】
シクロデキストリン化合物が、スルホアルキル、ベンゼンスルホアルキル、アセトアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルスクシナート、ヒドロキシアルキルマロナート、ヒドロキシアルキルグルタラート、ヒドロキシアルキルアジパート、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルマレアート、ヒドロキシアルキルオキサラート、ヒドロキシアルキルフマラート、ヒドロキシアルキルシトラート、ヒドロキシアルキルタルトラート、ヒドロキシアルキルマラート、またはヒドロキシアルキルシトラコナート基で置換された１以上の２，３および６ヒドロキシル位置を有する、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
シクロデキストリン化合物が、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンスクシナート、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン、または２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンスクシナートである、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４８】
シクロデキストリン化合物が、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンまたはスルホブチルエーテルγ−シクロデキストリンである、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４９】
シクロデキストリン化合物が、メチル−β−シクロデキストリンまたはメチル−γ−シクロデキストリンである、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項５０】
シクロデキストリン化合物が吸着化合物を含む、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項５１】
サッカライド糖化合物が、モノサッカライドまたはジサッカライド糖化合物である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項５２】
薬学的に許容可能な担体が、滅菌水、注射用水、滅菌通常生理食塩水、注射用静菌水、またはネブライザー溶液である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項５３】
薬学的に許容可能な担体が薬学的に許容可能な溶液である、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項５４】
再構成された核酸製剤が、０．００１％（ｗ／ｖ）未満の０．２μｍ超の大きさを有する凝集粒子を有する、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項５５】
核酸製剤が３〜３０秒の時間で再構成される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項５６】
核酸製剤が、６ヶ月間の保存後に再構成され、核酸剤の８０％の活性を保持する、請求項３１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１５年７月２２日に出願された、ナノ粒子凍結乾燥形態のための組成物および方法と題された米国仮特許出願番号６２／１９５，３５６に対して優先権を主張し、その内容はここにその全体において参照によって取り込まれる。
発明の技術分野
この発明は、核酸ベースの分子から構成される生物学的製剤および治療の分野に関する。より具体的には、この発明は、核酸治療用組成物の凍結乾燥形態のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸化合物に基づく治療は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの様々なＲＮＡ形態、ならびにＤＮＡおよびプラスミドの様々な形態、中でもハイブリッドオリゴヌクレオチド、およびアプタマーを含む。
核酸治療および他の剤のトランスフェクションは、活性分子を脂質ナノ粒子に封入することによって達成されている。この方法論の欠点は、ナノ粒子またはそれらの封入された積荷の分解のため、後の使用のために組成物を保存不能であることを含む。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を封入する脂質ナノ粒子の組成物は、２５℃でほんのわずかな分または時間、４℃でほんのわずかな日または週、安定であり得る。さらなる欠点は、脂質ナノ粒子組成物の極めて低い温度の保存について需要を含む。
【０００３】
治療用組成物の長期間の保存を提供するための１つの方法は、治療の投与のための処方物を提供するために保存および再構成され得る、凍結乾燥形態を調製することである。
しかしながら、一般に、脂質ナノ粒子が、封入された核酸剤とともに再生され、安定な処方物を形成し得るように、核酸剤を含有する脂質ナノ粒子の凍結乾燥形態を生成することは可能ではない。凍結乾燥プロセスはナノ粒子および／または核酸剤を破壊し得る。いくつかの方法は、脂質ナノ粒子または核酸剤に対する、化学結合する保護基または成分に関与するが、これは不利である。他の方法は、核酸剤の封入を提供することなく、リポソームをアジュバントとして使用し得る。
【０００４】
トランスフェクション活性、粒子の大きさ、保存時間、および様々な核酸剤を送達するための血清安定性を含む有利な特性とともに再構成され得るナノ粒子の凍結乾燥形態を提供するための組成物および方法について継続的な需要がある。
必要とされるものは、（ナノ粒子が核酸剤を封入する）固体の凍結乾燥形態において保存され得る脂質ナノ粒子の安定な溶液または懸濁液を形成するための組成物および化合物である。
【発明の概要】
【０００５】
簡潔な概要
この発明は、核酸ベースの分子から構成される治療のための方法および組成物を提供する。より具体的には、この発明は、核酸ベースの治療用組成物の凍結乾燥形態のための方法および組成物を提供する。
この発明は、トランスフェクションのための治療用核酸剤を送達するために使用され得る、有効な治療用組成物に再構成され得るナノ粒子の凍結乾燥形態をさらに提供する。
【０００６】
いくつかの側面において、この発明は、凍結乾燥プロセスにおいて安定である治療用脂質ナノ粒子の溶液または懸濁液を形成するための組成物および化合物を提供する。治療用脂質ナノ粒子は、核酸剤を封入し得、固体の凍結乾燥形態において変形および保存され得る。凍結乾燥形態は、封入された核酸剤を有する治療用脂質ナノ粒子を提供するために再構成され得る。再構成された脂質ナノ粒子は、驚くほど有利なトランスフェクション特性（粒子の大きさおよび分布を含む）を有し得る。
この発明の態様は、核酸治療の長期間の保存のための安定な固体の凍結乾燥形態を提供するための、凍結乾燥プロセスに耐え得る治療用脂質ナノ粒子の溶液または懸濁液を形成するための、組成物および化合物の範囲を含む。
【０００７】
この発明の態様は、以下を含む：
１以上の核酸活性剤を含む、脂質ナノ粒子の固体の凍結乾燥物を作製するための組成物であって、
薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液、ここで、脂質ナノ粒子は１以上の核酸活性剤を封入する；
デキストリン化合物；および
サッカライド糖化合物
を含む、前記組成物。
【０００８】
デキストリンおよび糖化合物の総量が、組成物の２％〜２０％（ｗ／ｖ）である、上記の組成物。
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜７０％（ｗ／ｖ）である、上記の組成物。
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜５５％（ｗ／ｖ）である、上記の組成物。
デキストリン化合物が、デキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜４５％（ｗ／ｖ）である、上記の組成物。
組成物の凍結乾燥および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、元の組成物におけるそれらの大きさの１０％以内である、上記の組成物。
組成物の凍結乾燥、保存および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、元の組成物におけるそれらの大きさの１０％以内である、上記の組成物。
【０００９】
凍結乾燥された組成物が、５℃で少なくとも１ヶ月間保存される、上記の組成物。
凍結乾燥された組成物が−２０℃で少なくとも１ヶ月間保存される、上記の組成物。
ナノ粒子が、４５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均的な直径を有する、上記の組成物。
核酸活性剤の濃度が、１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、または３ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの濃度である、上記の組成物。
１以上の核酸活性剤が、ＲＮＡ干渉を仲介することが可能なＲＮＡｉ分子である、上記の組成物。ＲＮＡｉ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｒａｓｉＲＮＡである、上記の組成物。
１以上の核酸活性剤が、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、プラスミド、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはアプタマーである、上記の組成物。
【００１０】
薬学的に許容可能な溶液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する緩衝液である、上記の組成物。
デキストリン化合物がシクロデキストリンである、上記の組成物。
シクロデキストリン化合物が、スルホアルキル、ベンゼンスルホアルキル、アセトアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルスクシナート、ヒドロキシアルキルマロナート、ヒドロキシアルキルグルタラート、ヒドロキシアルキルアジパート、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルマレアート、ヒドロキシアルキルオキサラート、ヒドロキシアルキルフマラート、ヒドロキシアルキルシトラート、ヒドロキシアルキルタルトラート、ヒドロキシアルキルマラート、またはヒドロキシアルキルシトラコナート基で置換された１以上の２，３および６ヒドロキシル位置を有する、上記の組成物。
【００１１】
シクロデキストリン化合物が、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンスクシナート、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン、または２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンスクシナートである、上記の組成物。
シクロデキストリン化合物が、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンまたはスルホブチルエーテルγ−シクロデキストリンである、上記の組成物。
シクロデキストリン化合物が、メチル−β−シクロデキストリンまたはメチル−γ−シクロデキストリンである、上記の組成物。
シクロデキストリン化合物が、ポリマー鎖またはネットワークに結合されている、上記の組成物。
シクロデキストリン化合物が吸着化合物を含む、上記の組成物。
【００１２】
吸着化合物が、コレステロール、ラノステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、７−デヒドロコレステロール、ＰＥＧ化コレステロール、コレステリルアセタート、コレステリルアラキドナート、コレステリルブチラート、コレステリルヘキサノアート、コレステリルミリスタート、コレステリルパルミタート、コレステリルベヘナート、コレステリルステアラート、コレステリルカプリラート、コレステリルｎ−デカノアート、コレステリルドデカノアート、コレステリルネルボナート、コレステリルペラルゴナート、コレステリルｎ−バレラート、コレステリルオレアート、コレステリルエライダート、コレステリルエルカート、コレステリルヘプタノアート、コレステリルリノレライダート、コレステリルリノレアート、ベータ−シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラッシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、およびデルタ−７−アベナステロールから選択される、上記の組成物。
【００１３】
サッカライド糖化合物が、モノサッカライドまたはジサッカライド糖化合物である、上記の組成物。
糖化合物が、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コウジビオース、サケビオース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、イソマルツロース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、およびキシロビオースから選択される、上記の組成物。
１以上の核酸活性剤の固体の凍結乾燥物を作製するためのプロセスであって、上記の組成物を凍結乾燥することを含む、前記プロセス。この発明は、さらに、上記のプロセスによって作製された固体の凍結乾燥物、ならびに上記の固体の凍結乾燥物を再構成することによって作製された製剤を意図する。
【００１４】
この発明は、
脂質ナノ粒子を合成すること、ここで、脂質ナノ粒子は１以上の核酸活性剤を封入する；
薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液を提供すること；
デキストリン化合物を脂質ナノ粒子を含有する溶液に加えること；
サッカライド糖化合物を脂質ナノ粒子を含有する溶液に加えること；
脂質ナノ粒子を含有する溶液を凍結乾燥し、それによって固体の凍結乾燥物を形成すること；
薬学的に許容可能な担体において凍結乾燥物を再構成し、それによって核酸製剤を形成すること
を含む、核酸製剤を作製するためのプロセスをさらに含む。
【００１５】
デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量が、脂質ナノ粒子を含有する溶液の２％〜２０％（ｗ／ｖ）である、上記のプロセス。
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜７０％（ｗ／ｖ）である、上記のプロセス。
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜５５％（ｗ／ｖ）である、上記のプロセス。
デキストリン化合物が、デキストリンおよびサッカライド糖化合物の総量の４０％〜４５％（ｗ／ｖ）である、上記のプロセス。
【００１６】
再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、合成されたときのそれらの大きさの１０％以内である、上記のプロセス。
凍結乾燥物を再構成前に保存することをさらに含む、上記のプロセス。
凍結乾燥物の保存および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさが、合成されたときのそれらの大きさの１０％以内である、上記のプロセス。
凍結乾燥物が５℃で少なくとも１ヶ月間保存される、上記のプロセス。
凍結乾燥物が−２０℃で少なくとも１ヶ月間保存される、上記のプロセス。
ナノ粒子が４５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均的な直径を有する、上記のプロセス。
核酸活性剤の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである、上記のプロセス。
【００１７】
１以上の核酸活性剤が、ＲＮＡ干渉を仲介することが可能なＲＮＡｉ分子である、上記のプロセス。ＲＮＡｉ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｒａｓｉＲＮＡである、上記のプロセス。
１以上の核酸活性剤が、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、プラスミド、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはアプタマーである、上記のプロセス。
薬学的に許容可能な担体が、滅菌水、注射用水、滅菌通常生理食塩水、注射用静菌水、またはネブライザー溶液である、上記のプロセス。
薬学的に許容可能な担体が薬学的に許容可能な溶液である、上記のプロセス。
薬学的に許容可能な溶液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する緩衝液である、上記のプロセス。
デキストリン化合物がシクロデキストリンである、上記のプロセス。
【００１８】
シクロデキストリン化合物が、スルホアルキル、ベンゼンスルホアルキル、アセトアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルスクシナート、ヒドロキシアルキルマロナート、ヒドロキシアルキルグルタラート、ヒドロキシアルキルアジパート、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルマレアート、ヒドロキシアルキルオキサラート、ヒドロキシアルキルフマラート、ヒドロキシアルキルシトラート、ヒドロキシアルキルタルトラート、ヒドロキシアルキルマラート、またはヒドロキシアルキルシトラコナート基で置換された１以上の２，３および６ヒドロキシル位置を有する、上記のプロセス。
【００１９】
シクロデキストリン化合物が、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンスクシナート、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン、または２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンスクシナートである、上記のプロセス。
シクロデキストリン化合物が、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンまたはスルホブチルエーテルγ−シクロデキストリンである、上記のプロセス。
シクロデキストリン化合物が、メチル−β−シクロデキストリンまたはメチル−γ−シクロデキストリンである、上記のプロセス。
シクロデキストリン化合物が吸着化合物を含む、上記のプロセス。
【００２０】
サッカライド糖化合物が、モノサッカライドまたはジサッカライド糖化合物である、上記のプロセス。
薬学的に許容可能な担体が、滅菌水、注射用水、滅菌通常生理食塩水、注射用静菌水、またはネブライザー溶液である、上記のプロセス。
薬学的に許容可能な担体が薬学的に許容可能な溶液である、上記のプロセス。
再構成された核酸製剤が、０．００１％（ｗ／ｖ）未満の０．２μｍ超の大きさを有する凝集粒子を有する、上記のプロセス。
核酸製剤が、３〜３０秒の時間で再構成される、上記のプロセス。
核酸製剤が、６ヶ月の保存時間後に再構成され、核酸剤の８０％の活性を保持する、上記のプロセス。
【００２１】
再構成された核酸製剤が、０．００１％（ｗ／ｖ）未満の０．２μｍ超の大きさを有する凝集粒子を有する、上記のプロセス。
再構成された核酸製剤が低減されたサイトカイン活性化を有する、上記のプロセス。
核酸製剤が３〜３０秒の時間で再構成される、上記のプロセス。
核酸製剤が、６ヶ月の保存時間後に再構成され、核酸剤の８０％の活性を保持する、上記のプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡潔な記載
【図１】図１は、核酸剤のin vivoでの有効性についての実験結果を示す。核酸製剤は、最終的な製剤（ｓｉＲＮＡの固体の凍結乾燥されたナノ粒子処方物の再構成された溶液）で得られた、Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を抑制するように標的化されたｓｉＲＮＡであった。再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）誘導性肝線維症ラットモデルにおいて使用された。図１に示されるとおり、再構成されたｓｉＲＮＡナノ粒子薬物処方物は、in vivoでＨｓｐ４７（ＧＰ４６）の遺伝子サイレンシングについて重大かつ驚くほどの有効性を示した。in vivoでの有効性は、核酸剤を含有する凍結乾燥され再構成されたナノ粒子の実行可能性についての厳格な試験である。凍結乾燥されたｓｉＲＮＡのナノ粒子処方物は、１０％（ｗ／ｖ）の総保護剤含量を含み、４０％（ｗ／ｖ）の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンおよび６０％のスクロースから構成された。
【００２３】
【図２】図２は、凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡナノ粒子処方物のin vivoでの血漿濃度の薬物動態についての実験結果を示す。Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を標的とするｓｉＲＮＡはリポソームのナノ粒子において処方された。ナノ粒子処方物は、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥された。凍結乾燥されたｓｉＲＮＡのナノ粒子処方物は、１２．５％（ｗ／ｖ）の総保護剤含量を含み、４０％（ｗ／ｖ）の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンおよび６０％のスクロースから構成された。血漿ＰＫプロファイルは、凍結乾燥された処方物を単一用量レベルで静脈内投与後、Sprague Dawleyラットにおいて、凍結された処方物との比較で評価された。血漿試料におけるｓｉＲＮＡ濃度は、ハイブリダイゼーションベースのＥＬＩＳＡ方法によって決定された。図２に示されるとおり、凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物の血漿濃度の薬物動態は、凍結されたに過ぎなかった比較コントロール処方物と本質的に同じであった。
【００２４】
発明の詳細な記載
この発明は、核酸ベースの分子から構成される治療のための方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、この発明は、核酸剤を含有する治療用組成物の凍結乾燥形態を作製するための方法および組成物を提供する。
いくつかの側面において、この発明は、有効な治療用組成物に再構成され得るナノ粒子の凍結乾燥形態を提供する。ナノ粒子は、積荷として核酸剤を封入し得る。この発明の凍結乾燥形態は、トランスフェクションのための治療用核酸剤を封入するナノ粒子処方物を再構成し、送達するために使用され得る。
【００２５】
さらなる側面において、この発明は、凍結乾燥プロセスにおいて安定である治療用脂質ナノ粒子の溶液または懸濁液を形成するための化合物および方法を提供する。この発明の凍結乾燥プロセスは、核酸剤を封入し得る治療用脂質ナノ粒子の安定な凍結乾燥形態を提供し得る。凍結乾燥形態は、所定の時間保存され、封入された核酸剤を有する治療用脂質ナノ粒子を提供するために再構成され得る。
いくつかの態様において、この発明は、核酸治療の長期間の保存のための安定な固体の凍結乾燥形態を提供するための、凍結乾燥プロセスに耐え得る脂質ナノ粒子の溶液または懸濁液のための、所定の範囲の組成物および化合物を含む。この発明の組成物およびプロセスは、再構成され得、有利な活性、粒子の大きさ、保存時間、および血清安定性を提供し得る凍結乾燥形態を提供し得る。
【００２６】
さらなる側面において、この発明は、活性剤または薬物化合物を対象、組織、および臓器へ送達し、分布させるためのナノ粒子を提供するための化合物、組成物および方法に関する。
この発明は、活性剤を細胞へ送達するための所定の範囲の脂質化合物およびイオン化可能化合物を提供する。この開示の脂質化合物およびイオン化可能化合物は、活性剤を送達し、分布させるためのナノ粒子を形成させるために使用され得る。
この発明は、例えば、ナノ粒子の懸濁液の凍結乾燥およびナノ粒子の懸濁液への再構成によって調製され得るｓｉＲＮＡ剤を含有する脂質ナノ粒子薬物処方物を意図する。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、脂質／エタノール溶液のｓｉＲＮＡ緩衝液への高速注射によって合成され得る。第２の緩衝液は、透析ろ過され、ＴＦＦカートリッジを通じた最終的な産物の水性懸濁液を作製するための外部緩衝液として使用され得る。
【００２７】
いくつかの態様において、ナノ粒子は４５ｎｍ〜１１０ｎｍの平均的な直径を有し得る。核酸活性剤の濃度は１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであり得る。
懸濁液が保護された組成物中に作製されたとき、脂質ナノ粒子が懸濁液の凍結乾燥を生き残り得ることが驚くことに見出された。
いくつかの態様において、この発明の保護された組成物は、薬学的に許容可能な溶液における脂質ナノ粒子の水性懸濁液、デキストリン化合物、およびサッカライド糖化合物から構成され得る。脂質ナノ粒子は、１以上の核酸活性剤などの活性剤を封入し得る。
【００２８】
保護された懸濁液の凍結乾燥は、脂質ナノ粒子の懸濁液に再構成され得る固体の凍結乾燥物産物を提供し得る。
再構成された懸濁液は、活性剤を封入し、凍結乾燥前の脂質ナノ粒子に匹敵する脂質ナノ粒子を含有し得る。
一定の態様において、再構成された懸濁液は、封入された剤の活性を提供し得、これは凍結乾燥前の懸濁液のそれに匹敵する。
さらなる側面において、再構成された懸濁液は、凍結乾燥前の懸濁液のそれに匹敵する安定なナノ粒子を提供し得る。一定の側面において、ナノ粒子の平均的な粒子の大きさは、凍結乾燥前の懸濁液におけるナノ粒子の大きさにほとんど等しいものであり得る。
【００２９】
この発明の組成物およびプロセスは、封入された剤を有するナノ粒子から構成される再構成された懸濁液の驚くほどの活性および安定性を提供し得る。
さらなる側面において、凍結乾燥され再構成され得る保護された懸濁液は、凍結乾燥のための保護剤組成物を含有し得る。この発明の保護剤組成物は、デキストリン化合物およびサッカライド糖化合物から構成され得る。デキストリンおよび糖化合物の総量は、保護された懸濁液の２％〜２０％（ｗ／ｖ）であり得る。
【００３０】
いくつかの態様において、デキストリン化合物は、保護剤組成物におけるデキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜７０％（ｗ／ｖ）であり得る。一定の態様において、デキストリン化合物は、保護剤組成物におけるデキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜５５％（ｗ／ｖ）であり得る。さらなる態様において、デキストリン化合物は、保護剤組成物におけるデキストリンおよび糖化合物の総量の４０％〜４５％（ｗ／ｖ）であり得る。これらの組成物は、再構成されたナノ粒子懸濁液の予想外に有利な特性（例えば、ナノ粒子の大きさまたは活性のわずかな変化）を提供し得る。
いくつかの側面において、ナノ粒子の保護された懸濁液の凍結乾燥および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさは、凍結乾燥前の元の組成物におけるそれらの大きさの１０％以内であり得る。一定の側面において、ナノ粒子の保護された懸濁液の凍結乾燥および再構成時、ナノ粒子の平均的な大きさは、凍結乾燥前の元の組成物におけるそれらの大きさの５％以内であり得る。
【００３１】
この発明は、例えば、ナノ粒子の懸濁液の凍結乾燥および所定の保存期間後のナノ粒子の懸濁液への再構成によって調製され得るｓｉＲＮＡ剤を含有する脂質ナノ粒子薬物処方物を意図する。再構成された懸濁液は、封入された剤の活性を提供し得、これは凍結乾燥前の懸濁液のそれに匹敵する。
所定の保存期間後に調製された再構成された懸濁液は、活性剤を封入し、凍結乾燥前の脂質ナノ粒子に匹敵する脂質ナノ粒子を含有し得る。
一定の態様において、所定の保存期間後に調製された再構成された懸濁液は、封入された剤の活性を提供し得、これは凍結乾燥前の懸濁液のそれに匹敵する。
さらなる側面において、所定の保存期間後に調製された再構成された懸濁液は、凍結乾燥前の懸濁液のそれに匹敵する安定なナノ粒子を提供し得る。一定の側面において、ナノ粒子の平均的な粒子の大きさは、凍結乾燥前の懸濁液におけるナノ粒子の大きさにほとんど等しいものであり得る。
いくつかの態様において、凍結乾燥された組成物は、５℃で少なくとも１ヶ月間保存され得る。さらなる態様において、凍結乾燥された組成物は−２０℃で少なくとも１ヶ月間保存され得る。
【００３２】
活性剤
この発明の組成物および方法は、遺伝子発現を抑制するための剤を分布させるために使用され得る。遺伝子発現を抑制するための剤の例は、リボザイム、アンチセンス核酸、およびＲＮＡ干渉分子（ＲＮＡｉ分子）を含む阻害性の核酸分子を含む。
この発明の治療用組成物は、阻害性の核酸分子を含み得る。ＲＮＡ干渉を仲介することが可能な核酸分子の例は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、ｄｄＲＮＡ（ＤＮＡ指向性ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、またはｒａｓｉＲＮＡ（リピート関連ｓｉＲＮＡ）、およびその改変された形態などの２本鎖ＲＮＡを含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ分子）で有効な分子を含む。
この発明の有効な治療の例は、ＤＮＡ、プラスミド、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはアプタマーを含む。
この開示の凍結前の乾燥処方物において有効な核酸分子の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、この開示の処方物において有効な核酸分子の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、または２ｍｇ／ｍＬ〜４ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００３３】
凍結前の乾燥脂質ナノ粒子処方物
この発明の態様は、凍結乾燥プロセスのための保護剤化合物を含有する、脂質ナノ粒子の組成物を提供し得る。
脂質ナノ粒子は、当該技術分野で知られた任意の組成物を有し得る。脂質ナノ粒子は、当該技術分野で知られたプロセスを含む任意のプロセスによって、合成され、封入された積荷で負荷され得る。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は水浸注射プロセスによって調製され得る。脂質ナノ粒子のためのプロセスのいくつかの例は、US 2013/0115274に与えられる。
リポソームを調製するためのいくつかの例は、Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1に与えられる。
一般に、脂質ナノ粒子は、有機溶媒において有効な核酸剤を含有する水性緩衝液とともに脂質成分を混合することによって合成され得る。リポソームはろ過または押出しによって大きさで分類され得る。リポソーム懸濁液または溶液は透析ろ過によってさらに変形され得る。
【００３４】
凍結乾燥プロセスのために安定化された、この発明の脂質ナノ粒子組成物は、懸濁液において核酸剤などの１以上の活性剤を封入する脂質ナノ粒子を含有し得る。懸濁液は、水性であり得、およびエタノールなどの水混和性溶媒を含有し得る。凍結乾燥プロセスのために安定化された組成物は、凍結乾燥プロセスにおいてリポソームを安定化するために保護剤化合物をさらに含有し得る。
合成された脂質ナノ粒子の平均的な大きさは、４０ｎｍ〜１２０ｎｍ、または４５ｎｍ〜１１０ｎｍ、または８５ｎｍ〜１０５ｎｍであり得る。
この発明の脂質ナノ粒子組成物における活性剤の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬにおよび得る。いくつかの態様において、この発明の脂質ナノ粒子組成物における活性剤の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ〜８ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬ〜６ｍｇ／ｍＬ、または２ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、または３ｍｇ／ｍＬ〜４ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００３５】
保護剤化合物の例はデキストリン化合物を含む。
デキストリン化合物の例は、マルトデキストリン、およびベータ−およびガンマ−シクロデキストリンを含む。
デキストリン化合物の例は、メチル化されたベータ−およびガンマ−シクロデキストリン化合物、およびスルホアルキルエーテルベータ−およびガンマ−シクロデキストリン化合物を含む。
デキストリン化合物の例は、スルホアルキル、ベンゼンスルホアルキル、アセトアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルスクシナート、ヒドロキシアルキルマロナート、ヒドロキシアルキルグルタラート、ヒドロキシアルキルアジパート、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルマレアート、ヒドロキシアルキルオキサラート、ヒドロキシアルキルフマラート、ヒドロキシアルキルシトラート、ヒドロキシアルキルタルトラート、ヒドロキシアルキルマラート、またはヒドロキシアルキルシトラコナート基で置換された１以上の２，３および６ヒドロキシル位置を有するシクロデキストリン化合物を含む。
【００３６】
デキストリン化合物の例は、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンスクシナート、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン、および２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンスクシナートを含む。
デキストリン化合物の例は、ヒドロキシエチルβ−シクロデキストリンを含む。
デキストリン化合物の例は、ジメチルβ−シクロデキストリンおよびトリメチルβ−シクロデキストリンを含む。
デキストリン化合物の例は、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルγ−シクロデキストリンを含む。
【００３７】
デキストリン化合物の例は、メチル−β−シクロデキストリンおよびメチル−γ−シクロデキストリンを含む。
デキストリン化合物の例は、ヒドロキシプロピル−スルホブチル−β−シクロデキストリンを含む。
デキストリン化合物の例は、H107 SIGMAシクロデキストリン（Sigma-Aldrich Corp.）を含む。
デキストリン化合物の例は、CAVAMAX、CAVASOL、およびCAVATRONシクロデキストリン（Ashland Inc.）を含む。
デキストリン化合物の例は、KLEPTOSEおよびCRYSMEBシクロデキストリン（Roquette America Inc.）を含む。
デキストリン化合物の例は、CAPTISOLシクロデキストリン（Ligand Pharmaceuticals, Inc.）を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、デキストリン化合物の例は、ポリマー鎖またはネットワークに結合したデキストリン化合物を含む。例えば、シクロデキストリン分子はポリアクリル酸のポリマーに結合され得る。さらなる態様において、シクロデキストリン分子は、アクリロイル基などの架橋化合物で一緒に連結され得る。一定の態様において、結合されたシクロデキストリン化合物を有するアクリル酸ビニルハイドロゲル形態が使用され得る。
いくつかの側面において、この発明の脂質ナノ粒子組成物において使用されるデキストリン化合物は、脂質ナノ粒子組成物中に導入される前に吸着化合物と組み合わされ得る。任意の特定の理論に縛られることを望むことなく、デキストリン化合物によるステロール化合物の予備吸着は、再構成された製剤における活性剤の活性の喪失を予防し得る包接錯体を形成し得る。
【００３９】
吸着化合物の例は、コレステロール、ラノステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、７−デヒドロコレステロールを含む。
吸着化合物の例は、ＰＥＧ化コレステロール、およびコレスタン３−オキソ−（Ｃ１〜２２）アシル化合物、例えば、コレステリルアセタート、コレステリルアラキドナート、コレステリルブチラート、コレステリルヘキサノアート、コレステリルミリスタート、コレステリルパルミタート、コレステリルベヘナート、コレステリルステアラート、コレステリルカプリラート、コレステリルｎ−デカノアート、コレステリルドデカノアート、コレステリルネルボナート、コレステリルペラルゴナート、コレステリルｎ−バレラート、コレステリルオレアート、コレステリルエライダート、コレステリルエルカート、コレステリルヘプタノアート、コレステリルリノレライダート、およびコレステリルリノレアートを含む。
【００４０】
吸着化合物の例は、植物ステロール、ベータ−シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラッシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、およびデルタ−７−アベナステロールを含む。
保護剤化合物の追加の例はサッカライド化合物を含む。サッカライド化合物の例は糖化合物を含む。
保護剤糖化合物の例は、Ｃ（５〜６）アルドースおよびケトースなどのモノサッカライド、ならびにスクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コウジビオース、サケビオース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、イソマルツロース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、およびキシロビオースなどのジサッカライドを含む。
【００４１】
保護剤サッカライド化合物の例は、フィコールなどのポリサッカライドを含む。
凍結前の乾燥処方物における保護剤化合物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）であり得る。
いくつかの態様において、凍結前の乾燥処方物における保護剤化合物の濃度は、２％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）〜１６％（ｗ／ｖ）、または５％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）、または６％（ｗ／ｖ）〜１４％（ｗ／ｖ）、または８％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）であり得る。
一定の態様において、凍結前の乾燥処方物における保護剤化合物の濃度は、６％（ｗ／ｖ）、または８％（ｗ／ｖ）、または１０％（ｗ／ｖ）、または１２％（ｗ／ｖ）、または１４％（ｗ／ｖ）、または１６％（ｗ／ｖ）、または１８％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ）、または２２％（ｗ／ｖ）、または２４％（ｗ／ｖ）であり得る。
【００４２】
凍結乾燥プロセス
凍結乾燥プロセスは、医薬の技術分野において知られている、ガラス容器（または例えばガラスバイアル）または二室式容器などの任意の好適な容器において行われ得る。
保護剤化合物を含有する安定化されたこの発明の脂質ナノ粒子組成物はガラス容器中に導入され得る。容器に加えられる組成物の体積は、０．１〜２０ｍＬ、または１〜１０ｍＬであり得る。
任意の凍結乾燥プロセス（医薬の技術分野において知られたものを含む）が使用され得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990)を参照。
【００４３】
凍結乾燥プロセスは、保護剤によって安定化された脂質ナノ粒子組成物を約−４０℃〜約−３０℃の温度で凍結することを含み得る。凍結された組成物は凍結乾燥された組成物の乾燥した形態であり得る。
いくつかの態様において、凍結工程は、数分にわたって温度を室温から最終的な温度まで徐々に上げ得る。温度勾配は約１℃／分であり得る。
いくつかの態様において、乾燥工程は、約０〜２５０ｍＴｏｒｒ、または５０〜１５０ｍＴｏｒｒの圧力で、約−１５℃〜約−３８℃の温度で行われ得る。乾燥工程は、室温までの高温域で、数日間までの所定の期間にわたって継続され得る。固体の凍結乾燥物における残余の水のレベルは、約５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満（ｗ／ｖ）であり得る。
【００４４】
保護剤によって安定化された、この発明の脂質ナノ粒子組成物は、凍結乾燥後、医薬の技術分野において知られた方法によって再構成され得る。
いくつかの側面において、この発明は、凍結乾燥後に、保護剤によって安定化されたこの発明の脂質ナノ粒子組成物から再構成され、作製された製剤における凝集した粒子のレベルを阻害するための方法を提供する。
いくつかの態様において、凍結乾燥後に、保護剤によって安定化されたこの発明の脂質ナノ粒子組成物から再構成され、作製された製剤は、凝集粒子の低減されたレベルを有し得る。
一定の態様において、凍結乾燥後に、保護剤によって安定化されたこの発明の脂質ナノ粒子組成物から再構成され、作製された製剤は、約０．２μｍ超、または約０．５μｍ超、または約１μｍ超の大きさを有する凝集粒子の低減されたレベルを有し得る。
【００４５】
再構成された製剤
凍結乾燥物は薬学的に許容可能な担体において再構成され得る。
薬学的に許容可能な担体の例は、滅菌水、注射用水、滅菌通常生理食塩水、注射用静菌水、およびネブライザー溶液を含む。
薬学的に許容可能な担体の例は薬学的に許容可能な溶液を含む。
薬学的に許容可能な溶液の例はＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する緩衝液を含む。
薬学的に許容可能な溶液の例は薬学的に許容可能な緩衝液を含む。
薬学的に許容可能な溶液の例は、マレイン酸、酒石酸、乳酸、酢酸、炭酸水素ナトリウム、およびグリシンの緩衝液を含む。
再構成された凍結乾燥物は製剤として使用され得る。
再構成された凍結乾燥物は、投与のためのあらかじめ決定された濃度を提供するために等張食塩水または他の賦形剤でさらに希釈され得る。
賦形剤の例は浸透圧増強剤（tonicifier）を含む。
【００４６】
賦形剤の例は、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ａ−カゼイン、グロブリン、ａ−ラクトアルブミン、ＬＤＨ、リゾチーム、ミオグロビン、オボアルブミン、およびＲＮａｓｅ Ａなどの安定剤を含む。
賦形剤の例は、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、および炭酸水素ナトリウムなどの緩衝剤を含む。
賦形剤の例は、グリシン、アラニン、アルギニン、ベタイン、ロイシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、アラノピン、オクトピン、ストロンビン、およびトリメチルアミンＮ−オキシドなどのアミノ酸を含む。
賦形剤の例は、polysorbate 20、polysorbate 80、およびpoloxamer 407などの非イオン性界面活性剤を含む。
賦形剤の例は、ホスホチジルコリン、エタノールアミン、アセチルトリプトファナート、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール、グリセリン、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、デキストラン、およびゼラチンなどの分散剤を含む。
【００４７】
賦形剤の例は、アスコルビン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、およびグルタチオンなどの抗酸化剤を含む。
賦形剤の例は、ジチオスレイトール、チオール、およびチオフェンなどの還元剤を含む。
賦形剤の例は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などのキレート剤を含む。
いくつかの態様において、凍結乾燥物は、注射針を使用して栓付きバイアルを通じて再構成され得る。凍結乾燥物はバイアルを振とうさせるか、または振とうさせずに再構成され得る。
再構成のための時間は３〜３０秒またはより長いものであり得る。
いくつかの態様において、再構成された核酸製剤は、０．２μｍ超の大きさを有する０．００１％（ｗ／ｖ）未満の凝集粒子を有し得る。
【００４８】
一定の側面において、再構成された核酸製剤は低減されたサイトカイン活性化を有し得る。
追加の側面において、核酸製剤は６ヶ月の保存時間後に再構成され、核酸剤の８０％の活性を保持し得る。
いくつかの態様において、核酸製剤は６ヶ月の保存時間後に再構成され得、脂質ナノ粒子の平均的な粒子の大きさは凍結乾燥前の２５％超未満であり得る。
一定の態様において、核酸製剤は２４ヶ月の保存時間後に再構成され、核酸剤の９０％の活性を保持し得る
さらなる態様において、核酸製剤は２４ヶ月の保存時間後に再構成され得、脂質ナノ粒子の平均的な粒子の大きさは凍結乾燥前の２５％超未満であり得る。
【００４９】
ＲＮＡｉ分子
本発明の組成物において処方された有効なＲＮＡ干渉を誘導する配合成分の量は、投与の利益を上回る副作用を引き起こさない量であり得る。かかる量は、培養された細胞を使用するin vitro試験、またはモデル動物またはマウス、ラット、イヌ、またはブタなどの哺乳動物などにおける試験によって決定され得、かかる試験方法は当業者に知られている。この発明の方法は、ヒトを含む任意の動物に適用可能である。
処方された有効な配合成分の量は、剤または組成物が投与される様式にしたがって変わり得る。例えば、１投与について複数の単位の組成物が使用されるとき、１単位の組成物において処方される有効な配合成分の量は、１投与に必要な有効な配合成分の量を複数の単位によって除すことによって決定され得る。
【００５０】
この発明の核酸分子およびＲＮＡｉ分子は、リポソーム処方物における該分子の直接的な適用によって、細胞中への侵入を助長し、促進しまたは容易にするために、細胞、組織、臓器、または対象に送達または投与され得る。
この発明の核酸分子およびＲＮＡｉ分子は、カチオン性脂質と複合体を形成し得、リポソーム内に包装され得、標的細胞または組織に送達され得る。核酸または核酸複合体は、関連組織にex vivoで、または直接的な皮膚適用、経皮的適用、または注射を通じてin vivoで局所的に投与され得る。
この発明の阻害性の核酸分子または組成物は、単位投与形態において投与され得る。従来の医療行為は、疾患を患う患者に化合物を投与するための好適な処方物または組成物を提供するために用いられ得る。任意の適切な投与の経路が用いられ得る、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、脳内、眼窩内、目、脳室内、肝内、関節内、髄腔内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬、または経口投与であり得る。
【００５１】
この開示の組成物および方法は、核酸分子の発現を可能にする様式でこの発明の少なくとも１つのＲＮＡｉ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含み得る。
この発明の核酸分子およびＲＮＡｉ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現され得る。組み換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
例えば、ベクターは、２本鎖のＲＮＡｉ分子の両方の鎖、または自己相補的であり、したがってＲＮＡｉ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列を含有し得る。発現ベクターは２以上の核酸分子をコードする核酸配列を含み得る。
【００５２】
核酸分子は細胞内で真核性プロモーターから発現され得る。当業者は、真核細胞において任意の核酸が適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現され得ると理解する。
脂質処方物は、静脈内、筋肉内、または腹腔内の注射、または経口で、または吸入または当該技術分野で知られた他の方法によって、動物に投与され得る。
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容可能な処方物が知られており、使用され得る。
上記の方法の一態様において、阻害性の核酸分子は、約５〜５００ｍｇ／ｍ２／日、例えば、５、２５、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で投与される。
【００５３】
いくつかの態様において、この発明の阻害性の核酸分子は、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１、５、１０、２０、２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｋｇの投与量で全身投与される。
さらなる態様において、投与量は約２５〜５００ｍｇ／ｍ２／日におよび得る。
当該技術分野で知られた処方物を作製するための方法は、例えば、“Remington: The Science および Practice of Pharmacy” Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000に見出される。
【００５４】
非経口投与のための処方物は、例えば、賦形剤、滅菌水、または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、野菜起源の油、または水素化ナフタレンを含有し得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出をコントロールするために使用され得る。阻害性の核酸分子のための他の潜在的に有用な非経口の送達システムは、エチレン−ビニルアセタートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な点滴システム、およびリポソームを含む。吸入のための処方物は、賦形剤、例えばラクトースを含有し得、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココラートおよびデオキシコラートを含有する水性溶液であり得、または点鼻液の形態で、またはゲルとしての投与のために油性溶液であり得る。
【００５５】
処方物は、腫瘍性の疾患または症状のための治療を提供するために、治療上の有効量（例えば、病的症状を予防する、除く、または低減する量）でヒト患者に投与され得る。本発明のヌクレオチドオリゴマーの好ましい投与量は、障害の種類および程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の処方物、および投与のその経路などの変数に依存し得る。
【００５６】
脂質組成物の例
一定の態様において、４種の脂質様成分、すなわち、１以上のイオン化可能脂質分子、構造的脂質、１以上の安定剤脂質、および組成物の免疫原性を低減するための１以上の脂質は、組成物の脂質成分の１００％であり得る。
脂質ナノ粒子組成物の例は表１に示される。
【００５７】
【表１】
2018521083.tif 000003
【００５８】
イオン化可能脂質様分子
イオン化可能分子の例は式Ｉに示される構造を有する化合物を含む：
【化１】
2018521083.tif 000004
ここで、Ｒ１およびＲ２は、
【化２】
2018521083.tif 000005
であり、
ここで、ｎおよびｍは各々独立して１〜２であり；Ｒ４およびＲ５は独立して各出現についてＣ（１２〜２０）アルキル基、またはＣ（１２〜２０）アルケニル基であり；
ここで、Ｒ３は、１−アゼチジン、１−ピロリジン、１−ピペリジン、４−モルホリン、および１，４−ピペラジン、ここで、環は任意の炭素原子の位置で置換され得る、
【化３】
2018521083.tif 000006
から選択され、（置換され得る）アミノおよびアミノアルキル基、
【化４】
2018521083.tif 000007
からも選択され得、
ここで、
各Ｒ６は、独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、およびアミノアルキルから選択され；
各Ｒ７は、独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアミノアルキルから選択され；
各Ｒ８は、独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアミノアルキルから選択され、任意の２のＲ８は環を形成し得る；
ｑは０〜４であり；
ＱはＯまたはＮＲ７であり；
ｐは１〜４である。
【００５９】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
（（２−（（３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−イル）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）である、化合物Ａ６
【化５】
2018521083.tif 000008
【００６０】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
（（２−（３−（ヒドロキシメチル）アゼチジン−１−イル）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートである、化合物Ａ９
【化６】
2018521083.tif 000009
【００６１】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
（（２−（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）である、化合物ＡＡ
【化７】
2018521083.tif 000010
【００６２】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
（（２−（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）である、化合物ＡＢ
【化８】
2018521083.tif 000011
【００６３】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
２−（（１−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−ヘプタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オキシ）−５−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オキシ）−１，５−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル２−オキソエタン−１−アミニウムである、化合物Ｃ２
【化９】
2018521083.tif 000012
【００６４】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）オクタデカ−９，１２−ジエンアミド）エチル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアートである、化合物Ｆ５
【化１０】
2018521083.tif 000013
【００６５】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル３−（（９Ｚ，１２Ｚ）−Ｎ−（２−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル）オキシ）エチル）オクタデカ−９，１２−ジエンアミド）プロパン−１−アミニウムである、化合物Ｆ７
【化１１】
2018521083.tif 000014
【００６６】
イオン化可能脂質の例は、以下の化合物を含む：
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル２−（（（Ｓ）−３−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オキシ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンアミド）−３−オキソプロピル）アミノ）−２−オキソエタン−１−アミニウムである、化合物Ｃ２４。
【化１２】
2018521083.tif 000015
【００６７】
構造的脂質
構造的脂質の例は、コレステロール、ステロール、およびステロイドを含む。
構造的脂質の例は、コラン、コレスタン、エルゴスタン、カンペスタン、ポリフェラスタン、スチグマスタン、ゴルゴスタン、ラノスタン、ゴナン、エストラン、アンドロスタン、プレグナン、およびシクロアルタンを含む。
構造的脂質の例は、コレステロール、ラノステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、および７−デヒドロコレステロールなどのステロールおよび動物ステロールを含む。
【００６８】
構造的脂質の例は、ＰＥＧ化コレステロール、およびコレスタン３−オキソ−（Ｃ１〜２２）アシル化合物、例えば、コレステリルアセタート、コレステリルアラキドナート、コレステリルブチラート、コレステリルヘキサノアート、コレステリルミリスタート、コレステリルパルミタート、コレステリルベヘナート、コレステリルステアラート、コレステリルカプリラート、コレステリルｎ−デカノアート、コレステリルドデカノアート、コレステリルネルボナート、コレステリルペラルゴナート、コレステリルｎ−バレラート、コレステリルオレアート、コレステリルエライダート、コレステリルエルカート、コレステリルヘプタノアート、コレステリルリノレライダート、およびコレステリルリノレアートを含む。
構造的脂質の例は、植物ステロール、ベータ−シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラッシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、およびデルタ−７−アベナステロールなどのステロールを含む。
【００６９】
安定剤脂質
安定剤脂質の例は、双性イオン性脂質を含む。
安定剤脂質の例は、リン脂質などの化合物を含む。
リン脂質の例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよび／またはジリノレオイルホスファチジルコリンを含む。
安定剤脂質の例は、ホスファチジルエタノールアミン化合物およびホスファチジルコリン化合物を含む。
安定剤脂質の例は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
安定剤脂質の例は、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）および１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を含む。
【００７０】
安定剤脂質の例は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
安定剤脂質の例は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＬＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＭＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＳＧ）；１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−Ｏ−エチル−３−ホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−リソ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐ−Ｌｙｓｏ−ＰＣ）；および１−ステアロイル−２−リソ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−Ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含む。
【００７１】
免疫原性を低減するための脂質
免疫原性を低減するための脂質の例は、ポリマー化合物およびポリマー−脂質コンジュゲートを含む。
免疫原性を低減するための脂質の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）領域を有するＰＥＧ化脂質を含む。ＰＥＧ領域は任意の分子量のものであり得る。いくつかの態様において、ＰＥＧ領域は、２００、３００、３５０、４００、５００、５５０、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、３５００、４０００または５０００Ｄａの分子量を有し得る。
免疫原性を低減するための脂質の例は、メトキシポリエチレングリコール領域を有する化合物を含む。
免疫原性を低減するための脂質の例は、カルボニル−メトキシポリエチレングリコール領域を有する化合物を含む。
【００７２】
免疫原性を低減するための脂質の例は、分岐したＰＥＧ領域を有する化合物を含む。
免疫原性を低減するための脂質の例は、ポリグリセリン領域を有する化合物を含む。
免疫原性を低減するための脂質の例は、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ｍＰＥＧ、ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ、およびＤＯＰＥ−ｍＰＥＧなどのポリマー脂質を含む。
免疫原性を低減するための脂質の例は、ＰＥＧ−リン脂質およびＰＥＧ−セラミドを含む。
【００７３】
カチオン性脂質
カチオン性脂質の例は、US 2013/022665 A1に記載されたＨＥＤＣ化合物、およびUS 2013/0330401 A1およびUS 2013/0115274 A1に記載された他の化合物を含む。カチオン性脂質の追加の例は当該技術分野で知られている。
【００７４】
ナノ粒子処方物
この発明の態様はリポソームナノ粒子組成物を提供し得る。
一定の態様において、この発明のイオン化可能分子は、脂質様分子の二層を有し得るリポソーム組成物を形成するために使用され得る。
ナノ粒子組成物は、リポソームの構造、二層構造、ミセル、層状構造、またはその混合物において、この発明の１以上のイオン化可能分子を有し得る。
いくつかの態様において、組成物は１以上の液体ビヒクル成分を含み得る。この発明の活性剤の送達に好適な液体ビヒクルは、薬学的に許容可能な液体ビヒクルであり得る。液体ビヒクルは、有機溶媒、または水および有機溶媒の組み合わせを含み得る。
【００７５】
この発明の態様は、１０〜１０００ｎｍの大きさを有する脂質ナノ粒子を提供し得る。いくつかの態様において、リポソームナノ粒子は１０〜１５０ｎｍの大きさを有し得る。
一定の態様において、この発明のリポソームナノ粒子は、ＲＮＡｉ分子を封入し得、ヒト血清への暴露から１時間後に少なくとも８０％の封入されたＲＮＡｉ分子を保持し得る。この発明は、細胞、組織または臓器、生体、および対象において活性剤を分布させることにおける使用のための組成物を提供し得、ここで、該組成物は、この発明の１以上のイオン化可能脂質分子を含む。
【００７６】
この発明の組成物は、構造的脂質、１以上の安定剤脂質、および組成物の免疫原性を低減するための１以上の脂質とともに１以上のイオン化可能脂質分子を含み得る。
この発明のイオン化可能脂質分子は、この発明の組成物の任意のｍｏｌ％であり得る。
この発明の組成物のイオン化可能脂質分子は、組成物の脂質成分の１５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％であり得る。一定の態様において、組成物のイオン化可能脂質分子は、組成物の脂質成分の２０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり得る。さらなる態様において、組成物のイオン化可能脂質分子は組成物の脂質成分の２５ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％であり得る。
【００７７】
この発明の組成物の構造的脂質は、組成物の脂質成分の２５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％であり得る。一定の態様において、組成物の構造的脂質は、組成物の脂質成分の３０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり得る。
この発明の組成物の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質成分の２５ｍｏｌ％〜４０％ｍｏｌ％であり得る。一定の態様において、組成物の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質成分の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％であり得る。
いくつかの態様において、この発明の組成物は、２以上の安定剤脂質を含み得、各々の安定剤脂質は、個々に組成物の脂質成分の５ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり得る。一定の態様において、この発明の組成物は２以上の安定剤脂質を含み得、各々の安定剤脂質は、個々に組成物の脂質成分の１０ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％であり得る。
【００７８】
一定の態様において、１以上の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質の２５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％であり得、各々の安定剤脂質は個々に５ｍｏｌ％〜３５％ｍｏｌ％であり得る。
一定の態様において、１以上の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％であり得、各々の安定剤脂質は、個々に１０ｍｏｌ％〜３０％ｍｏｌ％であり得る。
組成物の免疫原性を低減するための１以上の脂質は、組成物の脂質成分の１ｍｏｌ％〜８ｍｏｌ％の総計であり得る。一定の態様において、組成物の免疫原性を低減するための１以上の脂質は、組成物の脂質成分の１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％の総計であり得る。
【００７９】
追加の側面において、この発明の組成物はカチオン性脂質をさらに含み得、これは組成物の脂質成分の５ｍｏｌ％〜２５ｍｏｌ％であり得る。一定の態様において、この発明の組成物はカチオン性脂質をさらに含み得、これは組成物の脂質成分の５ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％であり得る。これらの側面において、カチオン性脂質のこの発明の組成物のイオン化可能脂質分子に対する濃度のｍｏｌ比は５：３５〜２５：１５であり得る。
この発明の組成物において、脂質成分の全体は、１以上のイオン化可能脂質分子成分、１以上の構造的脂質、１以上の安定剤脂質、および組成物の免疫原性を低減するための１以上の脂質を含み得る。
【００８０】
いくつかの態様において、組成物は、イオン化可能脂質化合物Ａ６、構造的脂質コレステロール、安定剤脂質ＤＯＰＣおよびＤＯＰＥ、および免疫原性を低減するための脂質ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧを含有し得る。一定の態様において、化合物Ａ６は組成物の１５〜２５ｍｏｌ％であり得；コレステロール、ＤＯＰＣ、および組み合わされたＤＯＰＥは、組成物の７５〜８５ｍｏｌ％であり得；ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧは組成物の５ｍｏｌ％であり得る。
一態様において、化合物Ａ６は組成物の２５ｍｏｌ％であり得；コレステロールは組成物の３０ｍｏｌ％であり得、ＤＯＰＣは組成物の２０ｍｏｌ％であり得、ＤＯＰＥは組成物の２０ｍｏｌ％であり得；ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ（２０００）は組成物の５ｍｏｌ％であり得る。
【００８１】
医薬組成物
この発明は、さらに、この発明の組成物を対象に投与することによって、活性剤を、疾患を処置するための対象の臓器へ分布させるための方法を意図する。処置され得る臓器は、肺、肝臓、膵臓、腎臓、結腸、骨、皮膚、および腸を含む。
さらなる側面において、この発明は、所定の範囲の医薬処方物を提供する。
医薬処方物は、ここで、活性剤、ならびに薬物担体、またはこの発明の脂質を、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とともに含み得る。一般に、この記載の活性剤は、任意の阻害性の核酸分子および任意の低分子薬物を含む、悪性腫瘍のための任意の活性剤を含む。阻害性の核酸分子の例は、リボザイム、アンチセンス核酸、およびＲＮＡ干渉分子（ＲＮＡｉ分子）を含む。
【００８２】
この発明の医薬処方物は、以下の各々の１以上を含有し得る：界面活性剤、希釈剤、賦形剤、保存剤、安定剤、色素、および沈殿防止剤。
医薬処方物のための、いくつかの医薬担体、希釈剤および成分、ならびにこの発明の化合物および組成物を処方および投与するための方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990)に記載されている。
保存剤の例は、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。
界面活性剤の例は、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコールを含む。
【００８３】
賦形剤の例は、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、酸性炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、およびカルボキシメチルセルロースカルシウムを含む。
沈殿防止剤の例は、ヤシ油、オリーブ油、ゴム油、ピーナッツ油、ソーヤ、酢酸フタル酸セルロース、メチルアセタート−メタクリラートコポリマー、およびエステルフタラートを含む。
遺伝子サイレンシングに有効な１以上の分子の送達のためのこの発明の治療上の処方物は、それを必要とする哺乳動物に投与され得る。リポソームに封入され得る処方物および活性剤の治療上の有効量は、悪性腫瘍を予防または処置するために、哺乳動物に投与され得る。
投与の経路は、局所または全身であり得る。
この発明の治療上有効な処方物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、および経口を含む様々な経路によって投与され得る。
投与の経路は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、髄内の注射、ならびに髄腔内、脳室内直接、腹腔内、鼻腔内、または眼内の注射を含む、非経口の送達を含み得る。
【００８４】
処方物は、あらかじめ決定された速度での、長期および／またはタイミングのとれたパルス投与のためのデポー注射、浸透圧ポンプなどを含む、持続またはコントロールされた放出投与形態でも投与され得る。
本発明の組成物は、経口および非経口の両方の経路を含む様々な経路を介して投与され得、その例は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、鼻、直腸、動脈内、門脈内、脳室内、髄内、リンパ節内、リンパ内、脳内、髄腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、および子宮内の経路を含むが、これらに限定されず、それは各投与経路に好適な投与形態に処方され得る。かかる投与形態および処方の方法は、任意の知られた投与形態および方法から適切なものとして選択され得る。例えば、Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003を参照。
【００８５】
経口投与に好適な投与形態の例は、粉末、グラニュール、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、エマルジョン、ゲル、およびシロップを含むが、これらに限定されず、非経口投与に好適な投与形態の例は、注射可能な溶液、注射可能な懸濁液、注射可能なエマルジョン、および使用準備済の注射などの注射を含む。非経口投与のための処方物は、水性または非水性の等張滅菌溶液または懸濁液などの形態であり得る。
例えばボーラス注射または継続的な点滴による非経口投与のための医薬処方物は、水溶性形態の有効な処方物の水性溶液を含む。活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射懸濁液として調製され得る。水性の注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有し得る。任意に、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増加させる好適な安定剤または剤も含有し得る。
【００８６】
注射用処方物は、加えた保存剤とともに、単位投与形態、例えば、アンプルまたは複数用量の容器で存在し得る。処方物は、油性または水性ビヒクルの懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、懸濁、安定化および／または分散剤などの処方剤を含有し得る。代替的に、有効な配合成分は、好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水での使用前の構成のための粉末形態であり得る。
既に記載された調製物に加えて、処方物は、デポー調製物としても処方され得る。かかる長期に作用する処方物は、筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、処方物は、好適なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容可能な油のエマルジョン、またはイオン交換樹脂、またはわずかに溶性の誘導体（例えば、わずかに溶性の塩））で処方され得る。
この発明の組成物および処方物は、局所送達のためにも処方され得、局所送達ビヒクルの適用のための任意の好適なプロセスを使用して対象の皮膚に適用され得る。例えば、処方物は、アプリケーターを使用して、または両方に関与するプロセスによって手動で適用され得る。適用後、処方物は例えばこすることによって対象の皮膚中に働き得る。適用は、１日複数回または１日１回ベースで行われ得る。例えば、処方物は対象の皮膚に、１日１回、１日２回、または１日複数回、適用され得、または２日毎に１回、３日毎に１回、または１週毎に約１回、２週毎に１回、または数週毎に１回適用され得る。
【００８７】
ここに記載された処方物または医薬組成物は、任意の好適な手段によって対象に投与され得る。投与の方法の例は、点滴ポンプ送達を含む、中でも、（ａ）皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼窩内、関節内、脊髄内、または胸骨内などの注射を介した投与；（ｂ）腎臓または心臓の範囲における直接的な注射によるもの、例えば、デポー移植によるものなどの局所投与；ならびに活性化合物を生体組織と接触させるために当業者によって適切と考えられるものを含む。
【００８８】
医薬組成物のための投与および投与量の正確な処方、経路は、患者の症状を考慮して個々の医師によって選ばれ得る。例えば、Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Sec. 1, 2011を参照。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、患者の体重の約０．５〜約１０００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与量は、１以上の日程において患者に必要とされる単一のものかまたは２以上の一連のものであり得る。化合物のヒト投与量が少なくともいくつかの症状について確立されている場合、投与量はそれと同程度か、または確立されたヒト投与量の約０．１％〜約５００％、より好ましくは約２５％〜約２５０％である投与量であろう。ヒト投与量が確立されていない場合、新たに発見された医薬組成物の場合にあるように、好適なヒト投与量は、動物における毒性の検討および効能の検討によって認定されるように、ＥＤ５０またはＩＤ５０値、またはin vitroまたはin vivoの検討から導かれる他の適切な値から推測され得る。
【００８９】
例
例１：凍結乾燥および再構成によるｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子薬物処方物の調製。
脂質／エタノール溶液をｓｉＲＮＡ緩衝液に約１０分間高速注射して、脂質ナノ粒子を合成した。その後、クエン酸緩衝液ｐＨ６．１、ＰＢＳ ｐＨ７．０、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２およびＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４から選択された第２の緩衝液を透析ろ過し、ＴＦＦカートリッジを通じて外部緩衝液として使用して、最終的な産物の水性懸濁液を作製した。
様々な量の保護剤化合物を最終的な産物の水性懸濁液に加え、その後０．２／０．８マイクロメーターろ過に供した。脂質ナノ粒子は、５００ｍＬまたは１０００ｍＬのバッチのいずれかで調製した。
結果：脂質ナノ粒子が凍結乾燥プロセスを生き残ったこと、および、凍結乾燥物が、元の懸濁液中に存在した大きさに近い平均的な粒子の大きさを有する脂質ナノ粒子の再構成された懸濁液を提供したことが驚くことに見出された。
【００９０】
例２：この発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、製剤に使用するのに好適である、安定な粒子の大きさおよびｓｉＲＮＡ封入を示す。この発明のｓｉＲＮＡ処方物の驚くほどのレベルの安定性は、保護された凍結乾燥組成物の特性から生じる。
この検討では、Ｈｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを、以下の概略組成を有するリポソームのナノ粒子に処方した：イオン化可能脂質 ４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥ ３０ｍｏｌ％、コレステロール ２５ｍｏｌ％、およびＰＥＧ−ＤＭＰＥ ５．０ｍｏｌ％。
【００９１】
ナノ粒子処方物を、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥させた。組成物の総保護剤含量は１０％（ｗ／ｖ）であった。使用量は、６％のスクロースおよび４％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンであった。したがって、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの含量は、スクロースに（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを足した総量の４０％（ｗ／ｖ）であった。
【００９２】
脂質／エタノール溶液をｓｉＲＮＡ緩衝液に高速注射して脂質ナノ粒子を合成し、最終的な産物の水性懸濁液を作製した。ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子の初期バルク処方物は、９９〜１０１ｎｍの平均的なナノ粒子の大きさの範囲を有していた。
凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物を、粒子の大きさの安定性およびｓｉＲＮＡの封入について試験した。
【００９３】
一般に、ｓｉＲＮＡナノ粒子処方物は、凍結乾燥前の状態と凍結乾燥され再構成された状態との間の平均的な粒子の大きさの変化が約１０％未満であることが最も好ましい。さらに、ｓｉＲＮＡナノ粒子処方物が、凍結乾燥され再構成された状態の少なくとも約８５％のｓｉＲＮＡ封入効率を示すことが最も好ましい。
再構成されたｓｉＲＮＡナノ粒子産物の安定性を表２に示す。表２において、凍結乾燥および再構成後（ＡＬ）の平均的な粒子の大きさおよびｓｉＲＮＡ封入効率を、凍結乾燥前（ＢＬ）の凍結融解溶液から得られた同様な結果とともに示す。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
表２において、すべての保護剤組成物は、最終的に再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物の好適な安定性を示した。ｓｉＲＮＡ濃度および総保護剤の最高レベル（１５％）での試料を除いて、ｓｉＲＮＡナノ粒子処方物は、凍結乾燥前の状態と凍結乾燥され再構成された状態との間の平均的な粒子の大きさの変化が１０％未満、ならびに凍結乾燥され再構成された状態の少なくとも８５％のｓｉＲＮＡ封入効率を示した。
表２の結果は、６０％のスクロースおよび４０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物からの凍結乾燥によってナノ粒子処方物から調製された、この発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物が、平均的な粒子の大きさおよびｓｉＲＮＡ封入効率において有利に安定であったことを示す。
【００９６】
例３：ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）誘導性肝線維症ラットモデル。
この発明の再構築されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoでの遺伝子サイレンシングについて重大かつ驚くほどの有効性を示した。凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ処方物でin vivoノックダウンが観察された。リポソーム処方物に封入されたｓｉＲＮＡは、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）誘導性肝線維症ラットモデルにおいて使用された。
Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を標的とするｓｉＲＮＡを、以下の概略組成を有するリポソームのナノ粒子に処方した：イオン化可能脂質 ４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥ ３０ｍｏｌ％、コレステロール ２５ｍｏｌ％およびＰＥＧ−ＤＭＰＥ ５．０ｍｏｌ％。
【００９７】
ナノ粒子処方物を、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥させた。総保護剤含量は１０％（ｗ／ｖ）であった。（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの含量は２０％〜４０％（ｗ／ｖ）で変化させた。
試料は、−８０℃で保存された新鮮な同日の凍結乾燥ケーキとして得られた。試料を生理食塩水で再構成し、０．１７ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの濃度まで生理食塩水でさらに希釈した。再構成時間は３ｍＬの体積で約２０秒であった。
Ｈｓｐ４７ ｓｉＲＮＡの、最終的な製剤の再構成した溶液を、in vivoでの有効性について試験した。これは、核酸剤を含有する凍結乾燥され再構成されたナノ粒子の実行可能性についての厳格な試験である。
【００９８】
この検討では、１８０〜２００ｇの体重範囲を有する７〜８匹の雄の１０群のナイーブSprague Dawleyラットを使用した。ｐＨ７．４のＰＢＳを有する液体の投与形態を使用した。投薬日に、投与前に処方物を再構成し、食塩水を使用して群毎に濃度に希釈した。凍結されたコントロール処方物を投与の１日前に解凍し、希釈した。注射の日に５ｍｇ／ｍＬの透明な投薬溶液を達成するためのＤＭＮの量を、ｐＨ７．４のＰＢＳに加えた。投与は腹腔内注射によるものであった。投薬は３日連続で１〜３日目に１日４回（ＱＤ）であった。用量は、０．１７〜０．５ｍｇ／ｍＬの処方物濃度範囲を使用し、３ｍＬ／ｋｇの投与体積で、０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）であった。ラットをＤＭＮ投与前に量り、動物に２ｍＬ／ｋｇの投薬体積で１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＮ（５ｍｇ／ｍｌの溶液）を１〜３日目に腹腔内注射した。４〜６日目に、動物に１ｍＬ／ｋｇの投薬体積でＤＭＮを注射した。５日目に、ＤＭＮ処置動物を薬物投与前の体重（５日目）に基づいて複数の群に無作為化した。試験物質を６日目に投与した（ＤＭＮ注射の第１日目が１日目であった）。７日目に、ラットの肝臓を得、クリップで留めた肝門脈を通じてＰＢＳ ｐＨ７．４で直ちに洗い流した（２０ｍＬ／分の速度で４０ｍＬ）。厚さ２ｍｍの横断肝臓切片の１つを左側葉から採取した。
【００９９】
ｇｐ４６ ｍＲＮＡノックダウン評価。RNeasyカラム（Qiagen）を使用してラット肝臓からの総ＲＮＡを抽出した。Nanodrop分光光度計を使用してＲＮＡを定量した。
図１に示すように、４０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンで保護されたこの発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoでのＨｓｐ４７（ＧＰ４６）の遺伝子サイレンシングに重大かつ驚くほどの有効性を示した。
特に、４０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンで保護された処方物のin vivoでのＨｓｐ４７（ＧＰ４６）遺伝子サイレンシングの有効性は、本質的に１００％であった。
【０１００】
反対に、２０％〜３０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する処方物のin vivoでの有効性は、許容できないほど低い遺伝子ノックダウンを示し、それぞれたった４７％および３２％に過ぎなかった。
要するに、予想外に有利な結果は、この発明のリポソームのｓｉＲＮＡ処方物の凍結乾燥のための保護剤組成物が、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する組成物中の少なくとも４０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンで作製され得ることを示す。
【０１０１】
物理的特徴付けは、約４０％〜約７０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンおよび残りのスクロースを含有する保護剤組成物からの凍結乾燥によってナノ粒子処方物から調製された、この発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物が、平均的な粒子の大きさにおいて有利に安定であったことを示した。約４０％未満の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンでは、処方物は、望ましくない構造的な変化の指標である異常に増加した封入値を有する傾向があった。したがって、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン成分の好ましい範囲は、約４０％〜約７０％であった。
結論として、この発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoで核酸薬物剤について驚くほどの有効性を有する４０％〜７０％の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを用いる。
【０１０２】
例４：この発明の再構築されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoでの遺伝子サイレンシングに十分な血漿濃度を示した。凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ処方物の血漿薬物動態はin vivoで観察された。
Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を標的とするｓｉＲＮＡを、以下の概略組成を有するリポソームのナノ粒子に処方した：イオン化可能脂質 ４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥ ３０ｍｏｌ％、コレステロール ２５ｍｏｌ％およびＰＥＧ−ＤＭＰＥ ５．０ｍｏｌ％。
ナノ粒子処方物を、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥させた。総保護剤含量は１２．５％（ｗ／ｖ）であった。（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの含量は、総保護剤の４０％（ｗ／ｖ）であり、残りはスクロースであった。
【０１０３】
血漿ＰＫプロファイルは、凍結乾燥された処方物の単一用量レベルでの静脈内投与後、Sprague Dawleyラットにおいて凍結された処方物と比較して評価した。血漿試料中のｓｉＲＮＡ濃度は、ハイブリダイゼーションベースのＥＬＩＳＡ法によって決定した。Sprague-Dawleyラットを二重頸静脈カテーテルで準備した。動物に、１日目に１５秒かけて１つの頸静脈カテーテルを介して試験材料の単一ボーラス静脈内用量注射を与えた。各動物の頸静脈カテーテルからおよそ０．３０ｍＬの全血を各時点でＫ２ＥＤＴＡ試験管に採取した。
図２に示されるように、凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物の血漿濃度の薬物動態は、凍結されただけの比較コントロール処方物と本質的に同じであった。凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ核酸薬物処方物は、血漿中の驚くほどに効率的なレベルの薬物剤を提供した。
この実験のために、単一用量後の、時間−濃度曲線下面積（ＡＵＣ）およびピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
結論として、この実験は、凍結乾燥され再構成された核酸薬物処方物の血漿濃度の薬物動態が、凍結されただけの比較ポジティブコントロール処方物と本質的に同じであったことを示している。したがって、凍結乾燥され再構成されたｓｉＲＮＡ核酸薬物処方物は、血漿中で驚くほどに効率的なレベルの薬物剤を提供し、非凍結乾燥組成物と比較して分解されなかった。
【０１０６】
例５：１００ｎｍの大きさの範囲の脂質ナノ粒子を保護する。
脂質／エタノール溶液をｓｉＲＮＡ緩衝液中に分散させて脂質ナノ粒子を合成し、最終的な産物の水性懸濁液を作製した。ナノ粒子は、１０５〜１０６ｎｍの平均的な大きさを有した。ナノ粒子は、化合物ＨＥＤＣをイオン化可能脂質として使用して合成した（例えば、US 2013/022665 A1を参照）。ナノ粒子は、Ｈｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを封入した。
表４は、凍結乾燥前のナノ粒子の特徴を示し、ここで最終的な産物の水性懸濁液は単に凍結し、次いで解凍した。表５は、凍結乾燥後のナノ粒子の特徴を示す。
表４〜表５の平均的な粒子の大きさの増加はわずか６．７％である。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
追加の試験では、６％（ｗ／ｖ）のスクロース、４％（ｗ／ｖ）の（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンおよび２ｍｇ／ｍＬの濃度のＨｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを含有する９つの最終的な産物の溶液を、凍結乾燥および再構成の時の平均的な粒子の大きさの増加について試験した。凍結乾燥後、再構成された製剤は、驚くことに、凍結乾燥前の最終的な産物の溶液と比較して、１０２ｎｍ〜１０７ｎｍの５％未満の平均的な粒子の大きさのわずかな増加しか示さなかった。
【０１１０】
例６：脂質ナノ粒子を５０ｎｍの大きさの範囲で保護する。
脂質／エタノール溶液をｓｉＲＮＡ緩衝液中に高速注射して脂質ナノ粒子を合成し、最終的な産物の水性懸濁液を作製した。ナノ粒子は、４８〜５０ｎｍの平均的な大きさを有した。化合物Ａ６をイオン化可能脂質として使用してナノ粒子を合成した。ナノ粒子はＨｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを２ｍｇ／ｍＬで封入した。
表６は、５０ｎｍの範囲のナノ粒子の凍結乾燥前（ＢＬ）および凍結乾燥後（ＡＬ）のナノ粒子の特徴を示す。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
例７：長期間の保存のためにｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を保護する。
この発明の再構成されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoで遺伝子サイレンシングについて長期間の安定性を示した。
Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を標的とするｓｉＲＮＡを、以下の概略組成を有するリポソームのナノ粒子に処方した：イオン化可能脂質 ４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥ ３０ｍｏｌ％、コレステロール ２５ｍｏｌ％およびＰＥＧ−ＤＭＰＥ ５．０ｍｏｌ％。
【０１１３】
ナノ粒子処方物を、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥した。総保護剤含量は１０％〜１２．５％〜１５％（ｗ／ｖ）であった。（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの含量は４０％（ｗ／ｖ）、スクロースは６０％であった。シクロデキストリンはCAVITRON W7 HP5 PHARMAシクロデキストリンであった。
バイアルを表７に示す温度で４週間保存した。保存および再構成の後、表７に示すように、ナノ粒子の平均的な大きさ（ＰＳ、Ｚ−平均）は驚くほどに安定であった。
表７に示されるように、ｓｉＲＮＡナノ粒子の大きさは、元の組成物におけるそれらの大きさの４％以内であった。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
例８：長期間の保存のためにｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を保護する。
この発明の再構築されたｓｉＲＮＡ薬物処方物は、in vivoで遺伝子サイレンシングについて長期間の安定性を示した。
Ｈｓｐ４７（ＧＰ４６）を標的とするｓｉＲＮＡを、以下の概略組成を有するリポソームのナノ粒子に処方した：イオン化可能脂質 ４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥ ３０ｍｏｌ％、コレステロール ２５ｍｏｌ％およびＰＥＧ−ＤＭＰＥ ５．０ｍｏｌ％。
【０１１６】
ナノ粒子製剤を、スクロースおよび（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンを含有する保護剤組成物で凍結乾燥させた。総保護剤含量は１０％〜１２．５％〜１５％（ｗ／ｖ）であった。（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの含量は４０％（ｗ／ｖ）、スクロースは６０％であった。シクロデキストリンは、CAVITRON W7 HP7 PHARMAシクロデキストリンであった。
バイアルを表８に示す温度で４週間保存した。保存および再構成後、表８に示すように、ナノ粒子の平均的な大きさ（ＰＳ、Ｚ−平均）は驚くほどに安定であった。
表８に示すように、ｓｉＲＮＡナノ粒子の大きさは、元の組成物のそれらの大きさの５％以内であった。
【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
ここで具体的に言及されたすべての刊行物、特許および文献は、すべての目的のためにそれらの全体において参照によって取り込まれる。
この発明は、説明された特定の方法論、プロトコル、材料、および試薬に限定されず、これらは変わり得ることが理解される。ここで使用する用語は、特定の態様のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲および精神から逸脱することなく、ここに開示された説明に対して様々な置換および改変を行うことができ、これらの態様がこの説明および添付のクレームの範囲内にあることは、当業者に容易に明らかであろう。
【０１１９】
ここでおよび添付のクレームで使用されるとおり、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（または「an」）、「１以上」および「少なくとも１つ」は、ここでは互換的に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」および「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
【０１２０】
ここで値の範囲の列挙は、ここで別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法としての役割を果たすことを意図するにとどまり、各別個の値は、ここで個々に列挙されるように明細書中に取り込まれる。マーカッシュ群については、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュ群のメンバーのサブ群を含むことを認識するであろう。
さらなる詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
この明細書に開示された特徴のすべては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。この明細書で開示された各特徴は、同一、等価、または同様の目的を果たす代替的な特徴と置き換えることができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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