(57)【要約】ＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドに関する組成物および方法が開示されている。融合ポリペプチドは、ＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはＡｐｏＡ−１ミメティックに対応する第１のポリペプチドセグメントを含み、例えば、典型的には、可動性リンカーを介して第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に連結された、Ｆｃ領域等の二量体形成ドメインを含むこともできる。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、第２の生物学的活性を付与する第２のポリペプチドセグメント（例えば、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、コレステロールエステル転送タンパク質、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼまたはアミロイドベータに特異的に結合するポリペプチド）をさらに含む。
2018531622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄを含む融合ポリペプチドであって、
ＡｐｏＡ１が、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドセグメントであり、前記第１のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、
Ｌ１が、第１のポリペプチドリンカーであり、
Ｄが、二量体形成ドメインである、
融合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｌ１が、少なくとも２個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｌ１が、少なくとも１６個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｌ１が、２〜６０個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｌ１が、５〜４０個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｌ１が、１５〜４０個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｌ１が、１６〜３６個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｌ１が、１６個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基または３６個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｌ１が、配列番号２２の残基２６８〜２８３、配列番号２６の残基２６８〜２８８、配列番号２の残基２６８〜２９３、配列番号５４、または配列番号２４の残基２６８〜３０３に示すアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチドセグメントが、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｄが、免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記Ｆｃ領域が、ヒトＦｃ領域である、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒト配列と比べて１個または複数のアミノ酸置換を含むＦｃバリアントである、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｆｃ領域が、ヒトγ１  Ｆｃ領域またはヒトγ３  Ｆｃ領域である、請求項１３または１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｃ２２０がセリンによって置き換えられた、ヒトγ１  Ｆｃバリアントである、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｅｕ残基Ｃ２２６およびＣ２２９がそれぞれ、セリンによって置き換えられた、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｅｕ残基Ｐ２３８が、セリンによって置き換えられた、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｐ３３１がセリンによって置き換えられた、ヒトγ１  Ｆｃバリアントである、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
Ｅｕ残基Ｐ３３１が、セリンによって置き換えられた、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｆｃバリアントが、野生型ヒト配列と比べてグリコシル化を低下させるアミノ酸置換を含む、請求項１４および１６〜２０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｅｕ残基Ｎ２９７が、別のアミノ酸により置き換えられた、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｆｃバリアントが、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項１４および１６〜２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｆｃバリアントが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのうち少なくとも１種に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
Ｆｃバリアントが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項２３または２４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｆｃ領域が、（ｉ）配列番号２の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４または（ｉｉ）配列番号１３の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、
（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、
（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、
（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、
（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９、または
（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４
と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、
（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、
（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、
（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、
（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９、または
（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４
に示すアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントをさらに含む融合ポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドセグメントが、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含む融合ポリペプチドであって、
ＡｐｏＡ１が、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドセグメントであり、前記第１のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、
Ｌ１が、第１のポリペプチドリンカーであり、
Ｄが、二量体形成ドメインであり、
Ｌ２が、第２のポリペプチドリンカーであり、Ｌ２が、任意選択で存在し、
Ｐが、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される第２のポリペプチドセグメントである、
融合ポリペプチド。
【請求項３１】
Ｌ１が、少なくとも２個のアミノ酸残基を含む、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
Ｌ１が、少なくとも１６個のアミノ酸残基を含む、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
Ｌ１が、２〜６０個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
Ｌ１が、５〜４０個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
Ｌ１が、１５〜４０個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
Ｌ１が、１６〜３６個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
Ｌ１が、１６個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基または３６個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
Ｌ１が、配列番号２２の残基２６８〜２８３、配列番号２６の残基２６８〜２８８、配列番号２の残基２６８〜２９３、配列番号５４、または配列番号２４の残基２６８〜３０３に示すアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記第１のポリペプチドセグメントが、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９５％同一性を有する、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
Ｄが、免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記Ｆｃ領域が、ヒトＦｃ領域である、請求項４１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒト配列と比べて１個または複数のアミノ酸置換を含むＦｃバリアントである、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記Ｆｃ領域が、ヒトγ１  Ｆｃ領域またはヒトγ３  Ｆｃ領域である、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｃ２２０がセリンによって置き換えられた、ヒトγ１  Ｆｃバリアントである、請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
Ｅｕ残基Ｃ２２６およびＣ２２９がそれぞれ、セリンによって置き換えられた、請求項４５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
Ｅｕ残基Ｐ２３８が、セリンによって置き換えられた、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｐ３３１がセリンによって置き換えられた、ヒトγ１  Ｆｃバリアントである、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
Ｅｕ残基Ｐ３３１が、セリンによって置き換えられた、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記Ｆｃバリアントが、野生型ヒト配列と比べてグリコシル化を低下させるアミノ酸置換を含む、請求項４１および４３〜４９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
Ｅｕ残基Ｎ２９７が、別のアミノ酸により置き換えられた、請求項５０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５２】
前記Ｆｃバリアントが、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項４１および４３〜５１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５３】
前記Ｆｃバリアントが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのうち少なくとも１種に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項５２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５４】
Ｆｃバリアントが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、請求項５２または５３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５５】
前記Ｆｃ領域が、配列番号２の残基２９４〜５２５または配列番号１３の残基２９４〜５２５に示すアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５６】
Ｌ２が、存在し、配列番号４の残基５２６〜５４１に示すアミノ酸配列を有する、請求項３０〜５５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５７】
配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドセグメントであって、コレステロール流出活性を有する第１のポリペプチドセグメントと、
前記第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントであって、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される第２のポリペプチドセグメントと
を含む融合ポリペプチド。
【請求項５８】
前記第１のポリペプチドセグメントが、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７に示すアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５９】
前記第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、前記第２のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項５７または５８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６０】
前記第２のポリペプチドセグメントが、ＲＮａｓｅである、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６１】
前記ＲＮａｓｅが、配列番号４のアミノ酸残基５４２〜６７５と少なくとも９５％同一性を有する、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６２】
前記ＲＮａｓｅが、配列番号４の残基５４２〜６７５に示すアミノ酸配列を有する、請求項６１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６３】
（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、または
（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５
と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６４】
（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、または
（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５
に示すアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６５】
前記第２のポリペプチドセグメントが、パラオキソナーゼ（paraxonase）である、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６６】
前記パラオキソナーゼが、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜３５５、配列番号４２のアミノ酸残基１６〜３５５または配列番号４４のアミノ酸残基１６〜３５５と少なくとも９５％同一性を有する、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６７】
前記パラオキソナーゼが、配列番号１２の残基１６〜３５５、配列番号４２の残基１６〜３５５または配列番号４４の残基１６〜３５５に示すアミノ酸配列を有する、請求項６６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６８】
（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、
（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、
（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または
（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３
と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６９】
（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、
（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、
（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または
（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３
に示すアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７０】
前記第２のポリペプチドセグメントが、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼである、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７１】
前記血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、配列番号３２のアミノ酸残基２２〜４４１と少なくとも９５％同一性を有する、請求項７０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７２】
前記血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、配列番号３２の残基２２〜４４１に示すアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７４】
配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３に示すアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７５】
前記第２のポリペプチドセグメントが、コレステロールエステル転送タンパク質である、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７６】
前記コレステロールエステル転送タンパク質が、配列番号３０のアミノ酸残基１８〜４９３と少なくとも９５％同一性を有する、請求項７５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７７】
前記コレステロールエステル転送タンパク質が、配列番号３０の残基１８〜４９３に示すアミノ酸配列を有する、請求項７６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７８】
配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９に示すアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８０】
二量体形成ドメインをさらに含む、請求項５７〜６２、６５〜６７、７０〜７２および７５〜７７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８１】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤に連結された、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８２】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤に連結された、請求項１〜５６、６３、６４および８０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８３】
第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、請求項１〜５６、６３、６４および８０のいずれか一項に規定されている融合ポリペプチドである、二量体タンパク質。
【請求項８４】
第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、請求項８２に規定されている融合ポリペプチドである、二量体タンパク質。
【請求項８５】
請求項１〜８０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８６】
次に挙げる作動可能に連結されたエレメント、
転写プロモーター、
請求項１〜８０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、および
転写ターミネーター
を含む発現ベクター。
【請求項８７】
請求項８６に記載の発現ベクターが導入された培養細胞であって、前記ＤＮＡセグメントを発現する細胞。
【請求項８８】
融合ポリペプチドを作製する方法であって、
請求項８６に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記ＤＮＡセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、産生されるステップと、
前記融合ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
【請求項８９】
二量体タンパク質を作製する方法であって、
請求項８６に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記ＤＮＡセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、二量体タンパク質として産生されるステップと、
前記二量体タンパク質を回収するステップと
を含む方法。
【請求項９０】
請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
【請求項９１】
請求項８３または８４に記載の二量体タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
【請求項９２】
粥状動脈硬化によって特徴付けられる心血管疾患を処置するための方法であって、
前記心血管疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項９３】
前記心血管疾患が、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記冠動脈心疾患が、急性冠症候群によって特徴付けられる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
神経変性疾患を処置するための方法であって、
前記神経変性疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項９６】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記神経変性疾患が、認知症によって特徴付けられる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患を処置するための方法であって、
アミロイド沈着物によって特徴付けられる前記疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項９９】
前記疾患が、アルツハイマー病である、請求項９５、９７および９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
自己免疫性疾患を処置するための方法であって、
前記自己免疫性疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項１０１】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および１型糖尿病からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
炎症性疾患を処置するための方法であって、
前記炎症性疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項１０３】
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記炎症性疾患が、炎症性肺疾患である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記炎症性肺疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、特発性肺線維症、過酸素症、低酸素症および急性呼吸促迫症候群からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
感染性疾患を処置するための方法であって、
前記感染性疾患を有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項１０７】
前記感染性疾患が、細菌感染によって特徴付けられる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
硫黄マスタードガスまたは有機リン酸エステルへの曝露を処置するための方法であって、
前記硫黄マスタードガスまたは前記有機リン酸エステルに曝露された対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項１０９】
がんを処置するための方法であって、
がんを有する対象に、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項８３もしくは８４に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
【請求項１１０】
前記がんが、悪性メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記がん処置が、併用療法である、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記併用療法が、非ＡｐｏＡ１媒介性免疫調節療法を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記非ＡｐｏＡ１媒介性免疫調節療法が、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法、抗ＣＴＬＡ−４治療法またはその両方を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記併用療法が、放射線療法を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記併用療法が、化学療法を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記併用療法が、標的化療法を含む、請求項１１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月８日に出願された米国仮出願第６２／２１５，２５６の利益を主張し、当該出願はその全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。２０１６年８月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＴＲＰ＿０１１０ＰＣ＿２０１６０８３１＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と命名され、サイズは１６１，１３２バイトである。
【背景技術】
【０００３】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−１）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
心血管疾患は、多くの国における死亡率の主因であり、世界中で毎年およそ１６７０万名の死亡を構成する。心血管疾患の最も一般的な帰結は、心筋梗塞および脳卒中であり、これらは、粥状動脈硬化に共通の根底にある病因を有する。
【０００４】
１９７０年代以来、疫学的研究は、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が、心筋梗塞のリスク増加に関連することを示してきた。この研究により、ＨＤＬを標的とする新たな治療法のための複数のアプローチ（Kingwellら、Nature  Reviews  Drug  Discovery  １３巻：４４５〜６４頁、２０１４年を参照）が導かれると共に、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）のプロセスが、ＲＣＴなしの単純なＨＤＬの増加よりもむしろ、有益なＨＤＬ活性にとって中心的であるという一致した見解が導かれた。例えば、今までのところ臨床治験において、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）の阻害剤によるＲＣＴの阻害によってＨＤＬを増加させる薬物は、効果的ではない。さらに、より最近では、ＨＤＬは、化学療法の際および神経変性障害の患者におけるものを含む、酸化およびグリケーションによって損傷されるため、ＨＤＬのレベルの測定が、患者におけるその機能の決定に十分ではないことが了解されている。Keeneyら、Proteomics  Clin  Appl.７巻：１０９〜１２２頁、２０１３年を参照されたい。
【０００５】
アポリポタンパク質Ａ−１（ＡｐｏＡ−１）は、ＨＤＬの主要タンパク質成分である。Phillips、Journal  of  Lipid  Research  ５４巻：２０３４〜２０４８頁、２０１３年。ヒトＡｐｏＡ−１は、２４３アミノ酸のタンパク質であり、残基４４〜２４３にまたがる、一連の８個の２２−ｍｅｒおよび２個の１１−ｍｅｒの両親媒性α−ヘリックスを有する。Lund-KatzおよびPhillips、Subcell  Biochem.５１巻：１８３〜２２７頁、２０１０年。この分子のアミノ末端３分の２におけるヘリックスは、ヘリックスバンドル構造を形成する一方、カルボキシル末端領域は、脂質結合に重要な別々の相対的に無秩序なドメインを形成する。Ｃ末端セグメントと脂質との相互作用は、ＡｐｏＡ−１構造に立体構造変化を誘導し、分子のα−ヘリックス含量を増加させ、Ｎ末端ヘリックスバンドルのその後の開口を可能にする。同文献参照。ＡｐｏＡ−１の脂質親和性は、洗剤に似た特性を付与し、リン脂質を可溶化して、リン脂質二重層のセグメントを含有する円盤状ＨＤＬ粒子、およびこの円盤の縁に巻き付いて逆平行ダブルベルト（double-belt）立体構造に配置された２個のＡｐｏＡ−１分子を形成することができる。Phillips、上記参照。ＡｐｏＡ−１の立体構造適応性は、異なるサイズの円盤状粒子と共に球状ＨＤＬ粒子を含むＨＤＬ粒子に安定性も付与する。同文献参照。これらの特徴は、ＡｐｏＡ−１が、細胞のリン脂質およびコレステロールの流出の媒介ならびに安定したＨＤＬ粒子の産生においてＡＢＣＡ１とパートナーを組むことを可能にする。Phillips、上記参照；Lund-KatzおよびPhillips、上記参照。
【０００６】
ＨＤＬ粒子形成および機能におけるその重要な役割のため、ＡｐｏＡ−１は、いくつかのＨＤＬ標的化治療戦略の焦点になった。しかし、ＡｐｏＡ−１の合成を増加させるナイアシンおよびフィブレートを含む薬物は、また、ＶＬＤＬの濃度を減少させるため、ＨＤＬに特異的ではない。ナイアシンの臨床治験は、有効性の欠如のために停止された一方、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）を活性化するフィブレートは、メタ解析において主要心血管事象の１０％低下（ｐ＜０．０５）および冠血管事象の１３％低下（ｐ＜０．０００１）を引き起こすことが見出された。Junら、Lancet  ３７５巻：１８７５頁、２０１０年を参照されたい。より有効な治療法が必要とされるため、前臨床開発においてＡｐｏＡ−１を増加させるいくつかの他の経口活性薬物が存在する。Kingwellら、上記参照。
【０００７】
ＡｐｏＡ−１を増加させるための代替アプローチは、精製されたタンパク質の直接的注射によって為される。例えば、Kingwellら、Circulation  １２８巻：１１１２頁、２０１３年を参照されたい。ＡｐｏＡ−１は、ヒト血漿から精製され（再構成されたＨＤＬ）、臨床治験において検査された。組換えＡｐｏＡ−１も、細菌および哺乳動物発現系の両方において発現され、臨床治験において検査された。これらの研究は、リン脂質と共にプレβ  ＨＤＬへと再構成されたＡｐｏＡ−１の注入が、小規模の（４７〜６０名の患者）臨床治験後に血管内超音波（ＩＶＵＳ）によって測定される通り、プラーク体積の低下およびプラーク形態の改善を引き起こすことを示した。有望ではあるが、天然または組換えＡｐｏＡ−１の使用には、短いＡｐｏＡ−１半減期による毎週投与の必要性および高い製造コストを含む、いくつかの制約がある。
【０００８】
高度活性型ＡｐｏＡ−１突然変異体である組換えＡｐｏＡ−１ミラノ（Milano）を、細菌細胞において発現させ、急性冠症候群患者の臨床治験において検査したところ（Nissenら、JAMA  ２９０巻：２２９２頁、２００３年を参照）、プラーク体積の低下が観察された。この研究は、最初にＨＤＬ仮説を直接検査および確認したと考慮されるが、細菌系において産生されたＡｐｏＡ−１は、低い発現レベルおよび高い製造コストのせいで進展しなかった。哺乳動物細胞において産生された組換えＡｐｏＡ−１は、近年完了した第ＩＩ相研究を含む臨床治験においてさらに進展した。Ｃｅｒｅｎｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによる開発中のＣＥＲ−００１は、哺乳動物細胞によって産生され、特異的脂質と共に製剤化されて、プレβ様ＨＤＬ粒子を形成した組換えＡｐｏＡ−１である。Ｃｅｒｅｎｉｓによれば、ＣＥＲ−００１は、ＭＯＤＥ治験（ＮＣＴ０１４１２０３４）において、家族性高コレステロール血症患者におけるＭＲＩによって測定される頸動脈プラーク体積低下のその主要エンドポイントを満たした。ＣＨＩ−ＳＱＵＡＲＥ治験（ＮＣＴ０１２０１８３７）において、Ｃｅｒｅｎｉｓは、ＣＥＲ−００１が、急性冠症候群患者において、対ベースラインでプラーク体積を低下させたが、低下は対プラセボで有意ではなかったと公表した。
【０００９】
マカクにおける別の研究では、脂質（ＰＯＰＣ）と共に再構成されたＡｐｏＡ−１ミラノは、１日おきに２１回の注入で、相対的に高用量（３０、１００および３００ｍｇ／ｋｇ）で注入された。Kempenら、J.  Lipid.  Res.５４巻：２３４１〜２３５３頁、２０１３年。薬物注入は、内在性コレステロールエステル化率を急速に減少させ、ＬＣＡＴ活性化の欠如による大型のＡｐｏＥリッチ粒子の形成を増加させ、ＡＢＣＡ１媒介性流出の刺激持続による遊離コレステロールの大幅な増加を引き起こした。同文献参照。これらの結果は、大量の再構成されたＡｐｏＡ−１ミラノの注入が、正常な代謝経路を経て処理する能力を伴わずにコレステロール流出を増強することにより、ＨＤＬ代謝を破壊することを示す。
【００１０】
ＨＤＬ注入治療法の見通しは、非常に有望ではあるが、現在のアプローチの制約のいくつかを克服する、改善された組換えＡｐｏＡ−１分子の必要性が存在する。精製を単純化するためのＨｉｓタグと共に細菌において産生されたＡｐｏＡ−１を含む、いくつかの組換えＡｐｏＡ−１融合タンパク質が産生された。例えば、Prietoら、Protein  J.３１巻：６８１〜６８８頁、２０１２年；Ryanら、Protein  Expr.  Purif.２７巻：９８〜１０３頁、２００３年を参照されたい。別の例では、ＩＦＮαが、３ａａ（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ）リンカーを介してＡｐｏＡ−１のアミノ末端に取り付けられた。Fioravantiら、J.  Immunol.１８８巻：３９８８〜３９９２頁、２０１２年を参照されたい。この構築物におけるリンカーは、制限酵素の選択によって作製され、融合タンパク質は、アデノウイルス送達によって検査されて、肝臓へと標的化し、ＩＦＮα治療法の毒性を低下した。ＡｐｏＡ−１は、また、Ｆｃドメインと融合され（ＡｐｏＡ−１−Ｉｇ）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ（ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰＯＡ−１−３３Ｈ）およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｔ＃１０６８６−ＨＯ２Ｈ−５）から市販された。しかし、このＡｐｏＡ−１−Ｉｇ分子は、非常に低い機能活性を有する（実施例１を参照）。
【００１１】
追加的な組換えＡｐｏＡ−１融合タンパク質は、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ−ＡｐｏＡ−１（Crosbyら、Biochem.  Cell  Biol.１０巻：１１３９／ｂｃｂ、２０１５年）、ＩＬ−１５−ＡｐｏＡ−１（Ochoaら、Cancer  Res.７３巻：１３９〜１４９頁、２０１３年）、およびヒトテトラネクチン（tetranectin）の三量体形成ドメインの付加により作製された三量体ＡｐｏＡ−１融合タンパク質（Graversenら、J.  Cardiovascular  Pharmacol.５１巻：１７０〜７７頁、２００８年）を含む。これらの例では、融合は、ＡｐｏＡ−１のＮ末端で為された。
【００１２】
三量体テトラネクチン−ＡｐｏＡ−１（ＴＮ−ＡｐｏＡ−１）は、コレステロール逆流出において有効であり、マウスにおけるその半減期は、単量体ＡｐｏＡ−１の３時間と比べて、１２時間まで増加した。Gaversenら、上記参照。粥状動脈硬化の高悪性度モデルにおいて（高脂肪食を与えたＬＤＬＲ−／−マウス）、三量体ＴＮ−ＡｐｏＡ−１は、大動脈起始部における病変の進行を遅らせた。同文献参照。しかし、非ヒト霊長類における近年の研究は、脂質付加されたＴＮ−ＡｐｏＡ−１の複数の注入が、耐容性が良くなく、高い免疫原性および脂質蓄積をもたらしたことを示した。Regeness-Lechnerら、Toxilogical  Sciences  １５０巻：３７８〜８９頁、２０１６年を参照されたい。三量体融合タンパク質は、リン脂質と複合体形成させられ、４日毎に３週間、１００ｍｇ／ｋｇおよび４００ｍｇ／ｋｇの濃度で注射され、続いて、６週間の回復期間を置いた。脂質付加されたＴＮ−ＡｐｏＡ−１の複数の注入後に、臨床状態が悪化し、進行性炎症応答、サイトカイン、Ｃ反応性タンパク質のレベル増加、および複数の組織における血管／血管周囲浸潤を示す変化を伴った。抗薬物抗体の急速形成が、脂質付加されたＴＮ−ＡｐｏＡ−１を与えた全動物において起こった。同文献参照。処置された動物の組織における三量体ＴＮ−ＡｐｏＡ−１の蓄積は、Ｎ末端付近に突然変異を有する患者におけるＡｐｏＡ−１の原線維形成および沈着に似ている。Mizuguchiら、J.  Biol.  Chem.２９０巻：２０９４７〜２０９５９頁、２０１５年；Dasら、J.  Mol.  Biol.２０１５．１０．０２９；Obiciら、Amyloid  １３巻：１９１〜２０５頁、２００６年を参照されたい。
【００１３】
脂質の非存在下におけるＡｐｏＡ−１の半減期は非常に短いため、臨床開発におけるＡｐｏＡ−１の現在の形態は、注入に先立ち、特異的な脂質とのプレβ様ＨＤＬ粒子への製剤化を必要とする。Nanjeeら、Arterioscler  Thromb  Vasc  Biol  １６巻：１２０３〜１２１４頁、１９９６年（脂質不含ＡｐｏＡ−１が、ヒトにおけるボーラスまたは緩徐注入のいずれかの後に僅か２〜２．３時間の半減期を有することを示す）を参照されたい。脂質製剤化後に、半減期は、約４８時間まで増加するが、頻繁な（毎週）投与が依然として必要とされる。
【００１４】
ＡｐｏＡ−１治療法は、インスリン感受性およびグルコース取り込みの改善における有意な利益も示し（Drewら、Nature  Reviews  Endocrinology  ８巻：２３７頁、２０１２年を参照）、糖尿病およびＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）の患者において有用となり得る。加えて、ＡｐｏＡ−１は、アミロイド−ベータに結合し、培養された海馬神経細胞における神経毒性を予防する。Koldamovaら、Biochemistry  ４０巻：３５５３頁、２００１年；Paula-Limaら、Int.  J.  Biochem.  Cell  Biol.４１巻：１３６１頁、２００９年を参照されたい。さらに、ＡｐｏＡ−１多型は、アルツハイマー病のリスクに関係づけられており、ＡｐｏＡ−１は、神経変性障害患者において減少したレベルで見出される。Keeneyら、Proteomics  Clin.  Appl.７巻：１０９〜１２２頁、２０１３年を参照されたい。
【００１５】
ＡｐｏＡ−１治療法の有効性は、がんの動物モデルにおいても実証された。ある一研究は、マウスにおける腫瘍の成長におけるＡｐｏＡ−１注入の効果を試験した。Zamanian-Daryoushら、J.  Biol.  Chem.２８８巻：２１２３７〜２１２５２頁、２０１３年を参照されたい。Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈらは、ＡｐｏＡ−１が、Ｂ１６Ｆ１０Ｌ悪性メラノーマおよびルイス肺癌を含む、複数の同一遺伝子腫瘍モデルにおいて腫瘍成長および転移を強力に抑制することを見出した。ＡｐｏＡ−１の効果は、免疫応答のモジュレーションによるものであった。腫瘍における骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の動員および増大が阻害された。腫瘍血管新生およびマトリックス分解プロテアーゼＭＭＰ−９の阻害も見られた。対照的に、ＡｐｏＡ−１治療法は、ＣＤ１１ｂマクロファージを増加させ、Ｔ細胞活性化を支持するＴｈ１応答のマーカーであるＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｂおよびＣＸＣＬ１０の量を増加させた。著者らは、Ｔ細胞が、腫瘍成長におけるＡｐｏＡ−１の強力な抑制効果に必要とされ、ＡｐｏＡ−１治療法が、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的増加を引き起こしたことを示した。同文献参照。Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈらの結果は有望であるが、この研究は、観察された効果を達成するために高用量の脂質不含ＡｐｏＡ−１を使用し（マウス当たり１日おきに１５ｍｇ）、これは、ＡｐｏＡ−１の短い半減期のせいで必要とされる可能性があった、同文献参照。
【００１６】
別のがん研究は、ＡｐｏＡ−１およびミメティックペプチド（Ｌ−４Ｆ、Ｄ−４Ｆ、Ｌ−５Ｆ）が、卵巣癌のマウスモデルにおける腫瘍発達を阻害することを示した。Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０７巻：１９９９７〜２０００２頁、２０１０年を参照されたい。Ｓｕらは、トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏＡ−１過剰発現、またはペプチドミメティック投与が、刺激性リン脂質を低下させたことを見出し、これは、腫瘍成長の阻害のための追加的な機構を関係づける。同文献参照。
【００１７】
研究は、多発性硬化症（ＭＳ）の病理発生におけるＡｐｏＡ−１の役割も示唆した。特に、ＡｐｏＡ−１発現は、健康対照と比較して、ＭＳ患者においてより低いことが示され、原発性進行性ＭＳ患者は、他の形態のＭＳを有する患者よりも少ない血漿ＡｐｏＡ−１を有した。Meyersら、J.  Neuroimmunol.２７７巻：１７６〜１８５頁、２０１４年を参照されたい。ＭＳのモデルとして実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を使用すると、ＡｐｏＡ−１を欠損したマウスは、野生型動物と比較して、より悪化した臨床疾患およびより多くの神経変性を示した。著者らは、ＡｐｏＡ−１レベルを増加させる薬剤が、ＭＳに可能な治療法であることを示唆する。同文献参照。別のＭＳ研究は、ＡｐｏＡ−１レベル上昇に関連するＡｐｏＡ−１プロモーター多型Ａ−対立遺伝子が、ＭＳ患者における認知能力改善と相関することを見出した；Ａ−対立遺伝子キャリアは、全体的に優れた認知能力を呈し、認知機能障害の全体的リスクが３分の１に減少した。Koutsisら、Mult.  Scler.１５巻：１７４〜１７９頁、２００９年を参照されたい。
ペプチドミメティック
【００１８】
ＡｐｏＡ−１ミメティックペプチドは、疾患の多数の動物モデルにおける有効性を示し、潜在的治療剤として魅力的な特性を有する。例えば、Reddyら、Curr.  Opin.  Lipidol.２５巻：３０４〜３０８頁、２０１４年およびWhiteら、J.  Lipid.  Res.５５巻：２００７〜２０２１頁、２０１４年を参照されたい。ペプチド４Ｆは、冠動脈疾患の高リスク患者において検査された。酸化に対し抵抗性であるいくつかのＡｐｏＡ−１ミメティックペプチドについて過去数年間に記載された。これらのα−ヘリックスペプチドは、動物モデルにおいて活性を示すが、その短い半減期のために毎日の投薬を必要とする。加えて、筋肉毒性を含む毒性および高トリグリセリド血症が、ペプチド処置された動物において見られた（これらの毒性は、ＡｐｏＡ−１で処置されたマウスに見られた）。配列設計によって毒性を低下させ、ペプチド産生のコストを低下させるための進歩について記載された。例えば、Bielicki、Curr.  Opin.  Lipidol.２７巻：４０〜４６頁、２０１６年を参照されたい。別のアプローチは、大いに研究されたＤ−４Ｆペプチドを含むＤ−ペプチドを合成することであった。これは、より長い半減期を有し、経口で与えることができるが、高い製造コストおよび組織におけるＤ−ペプチドの蓄積は、このペプチドが、初期臨床検査を通過することを妨げている可能性がある。
ＲＮａｓｅ
【００１９】
ＲＮａｓｅは、がんおよび自己免疫性疾患の治療法として研究されてきた。がん治療法のため、天然（オンコナーゼ（onconase）、カエルＲＮａｓｅ）、および細胞質阻害剤による阻害に対し抵抗性の組換えヒトＲＮａｓｅ  １（米国特許第８，５６９，４５７号を参照）の両方が報告されている。加えて、抗腫瘍抗体への細胞傷害性ＲＮａｓｅ（オンコナーゼ）のコンジュゲーションによる、腫瘍細胞へのＲＮａｓｅの標的化が報告されている。Luiら、Mol.  Cancer  １３巻：１１８６頁、２０１４年；Newtonら、Blood  ９７巻：５２８〜５３５頁、２００１年を参照されたい。
【００２０】
ＲＮａｓｅ治療法は、心血管疾患のマウスモデルにおいても研究された。Simsekyilmazら、Circulation  １２９巻：５９８〜６０６頁、２０１４年を参照されたい。この著者らおよび他の研究者らは、細胞外ＲＮＡが、血管性傷害の部位に蓄積すること、および細胞外ＲＮＡが、炎症性サイトカインの産生を引き起こすことを示す。Fischerら、Thromb.  Haemost.１０８巻：７３０〜７４１頁、２０１２年を参照されたい。ＲＮａｓｅ治療法は、加速させた心血管疾患のマウスモデルにおける新生内膜形成を低下させ、プラークマクロファージ含量を低下させ、ｉｎ  ｖｉｖｏで傷害された頸動脈への白血球動員を阻害した。Simsekyilmazら、上記参照。
【００２１】
ＲＮａｓｅ治療法は、急性脳卒中のモデルにおいても研究されており、それによると、これが梗塞サイズを低下させることが見出された。Walbererら、Curr.  Neurovasc.  Res.６巻：１２〜１９頁、２００９年を参照されたい。よって、ＲＮａｓｅ  １による全身性処置は、動脈性血栓性閉塞からマウスをレスキューして、脳浮腫を限定し、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗炎症性レジメンとして機能した。これらのＲＮａｓｅ治療法研究では、ＲＮａｓｅ  １の半減期は非常に短いため、ＲＮａｓｅは、皮下に植え込まれた浸透圧ミニポンプを使用した持続注入によって与えられた。
【００２２】
ＲＮａｓｅ治療法は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルにおいても研究された。Sunら、J.  Immunol.１９０巻：２５３６〜２５４３頁、２０１３年を参照されたい。ＲＮＡセンサーであるＴＬＲ７の過剰発現は、自己抗体によるループス様疾患、腎臓疾患および早期死亡率を引き起こす。このようなマウスを、導入遺伝子としてＲＮａｓｅ  Ａを過剰発現するマウスと交雑すると、生存性が増加し、リンパ球活性化が低下し、ＩｇＧおよびＣ３の腎臓沈着物が低下し、肝臓の炎症および壊死が低下した後代が生じた。
【００２３】
細胞外一本鎖ウイルスＲＮＡは、マウスへのくも膜下腔内投与後に広汎な神経変性を引き起こし、神経細胞損傷は、ＴＬＲ７によって媒介された。Lehmannら、J.  Immunol.１８９巻：１４４８〜５８頁、２０１２年を参照されたい。
【００２４】
ヒトＲＮａｓｅ  １が、ｐ２３８ｓおよびｐ３３１ｓ突然変異を含む突然変異したヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合された、ＲＮａｓｅ−Ｉｇ（米国特許第８，９３７，１５７号を参照）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者において、Ｒｅｓｏｌｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって臨床開発中である。
パラオキソナーゼ
【００２５】
ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）は、効率的なエステラーゼ活性を有し、有機リン酸エステルを加水分解することができる、リポラクトナーゼである。ＰＯＮ１は、ＬＤＬおよび細胞膜酸化を予防し、粥状保護性（atheroprotective）であると考慮される。ＰＯＮ１は、ＨＤＬに排他的に会合し、ＨＤＬの抗酸化機能に寄与する。例えば、Macknessら、Gene  ５６７巻：１２〜２１頁、２０１５年を参照されたい。ＨＤＬ−ＰＯＮ１活性の低下は、多種多様な炎症性疾患において存在し、そこでは、ＰＯＮ１活性の喪失が、炎症および粥状動脈硬化を促進し得る機能障害性ＨＤＬをもたらす。例えば、Erenら、Cholesterol.７９２０９０  ｄｏｉ  １０．１１５５／２０１３／７９２０９０、２０１３年を参照されたい。ＰＯＮ１活性は、アルツハイマー病および他の認知症の患者においても減少され、ＰＯＮ１の可能な神経保護的役割を示唆する。Meniniら、Redox  Rep.１９巻：４９〜５８頁、２０１４年を参照されたい。
【００２６】
ＰＯＮ１は、複数の動物モデルにおいて保護的活性を示した。ヒトＰＯＮ１の過剰発現は、メタボリックシンドロームのモデルである組み合わせたレプチンおよびＬＤＬ受容体欠乏によるマウスにおける粥状動脈硬化の発症を阻害した。Macknessら、Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.２６巻：１５４５〜５０頁、２００６年を参照されたい。
【００２７】
別の研究では、ＳＴＺ誘導性糖尿病に先立つマウスへの組換えＰＯＮ１の注射は、低下した糖尿病発生率およびより高い血清インスリンレベルをもたらした。ＰＯＮ１と同時のＨＤＬの添加は、インスリン分泌に相加効果を有した。Koren-Gluserら、Atherosclerosis  ２１９巻：５１０〜５１８頁、２０１１年を参照されたい。
【００２８】
別の研究では、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含有するＰＯＮ１融合タンパク質を使用して、細胞および組織にＰＯＮ１を形質導入した。ＰＯＮ１形質導入は、酸化ストレス誘導性炎症応答からｉｎ  ｖｉｔｒｏでマイクログリア細胞を保護し、パーキンソン病モデルにおいてドーパミン作動性神経細胞死に対して保護した。Kimら、Biomaterials  ６４巻：４５〜５６頁、２０１５年を参照されたい。
【００２９】
別の研究では、組換えＰＯＮ１をマウスに投与したところ、コレステロール質量の有意な低下およびコレステロール生合成速度の阻害が見られ、これは、おそらく粥状動脈硬化の減弱をもたらし得る効果であった。Rosenblatら、Biofactors  ３７巻：４６２〜４６７頁、２０１１年を参照されたい。
【００３０】
別の研究では、マウスに、組換えアデノウイルスＰＯＮ１またはＰＯＮ３を与えたところ、どちらも、ＣＣｌ（４）誘導性肝臓傷害から保護することが示された。ヒトＰＯＮ１またはヒトＰＯＮ３のいずれかの過剰発現は、肝臓酸化ストレスを低下させ、肝臓における抗酸化能力を強化した。Pengら、Toxicol.  Lett.１９３巻：１５９〜１６６頁、２０１０年を参照されたい。
【００３１】
別の研究では、ＰＯＮ１は、ＦｃドメインのＣ末端に融合され、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対する抗体を使用した二重特異性分子として発現された。ＨＩＲＭＡｂ−ＰＯＮ１と命名されたこの分子は、ＣＨＯ細胞における発現後に安定しており、アカゲザルにおいて、高い血液脳関門透過性を有することが示されたが、肝臓によって急速に排除された。Boadoら、Biotechnol.  Bioeng.１０８巻：１８６〜１９６頁、２０１１年を参照されたい。
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ
【００３２】
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）は、血小板活性化因子等、リン脂質の短鎖アシル基を加水分解する、ＬＤＬおよびＨＤＬ関連酵素であり、リン脂質を酸化して、その炎症性特性を低下させた。Watsonら、J.  Clin.  Invest.９５巻：７７４〜７８２頁、１９９５年；Stafforini、Cardiovasc.  Drugs  Ther.２３巻：７３〜８３頁、２００９年を参照されたい。アデノウイルス媒介性遺伝子送達を介したＰＡＦ−ＡＨによる治療法は、ラットモデルにおいて蛋白尿および糸球体硬化症を寛解することが報告された。Iso-Oら、Molecular  Therapy  １３巻：１１８〜１２６頁、２００６年を参照されたい。ＰＡＦ−ＡＨは、また、ラットにおいてパラセタモール中毒後の肝臓回復を増強し、ＰＡＦは、高用量のアセトアミノフェン由来の肝臓毒性に関連する。Grypiotiら、Dig.  Dis.  Sci.５２巻：２５８０〜２５９０頁、２００７年；Grypiotiら、Dig.  Dis.  Sci.５３巻：１０５４〜１０６２頁、２００８年を参照されたい。機能喪失を引き起こすＰＡＦ−ＡＨにおける突然変異は、日本人の４％に存在し、ＰＡＦ−ＡＨは、そのような個体における心血管疾患および脳卒中の独立リスク因子であることが見出された。Blankenbergら、J.  Lipid  Res.４４巻：１３８１〜１３８６頁、２００３年を参照されたい。組換えＰＡＦ−ＡＨは、第ＩＩＩ相臨床治験において、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）患者および敗血症患者において検査された。Karabinaら、Biochim.  Biophys.  Acta  １７６１巻：１３５１〜１３５８頁、２００６年を参照されたい。
コレステリルエステル転送タンパク質
【００３３】
コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）から低密度および超低密度リポタンパク質（ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）へとコレステリルエステルを輸送する。多くのＣＥＴＰ阻害剤が開発され、臨床治験において検査された。トルセトラピブ（Torecetrapib）は、後期臨床治験へと進行した最初のＣＥＴＰ阻害剤であり、血漿リポタンパク質レベルにおける有意な効果を示し、アテローム産生抑制性ＨＤＬコレステロールレベルを高めつつ、アテローム生成促進的ＬＤＬコレステロールレベルを低めた。トルセトラピブは、ＣＥＴＰ内深くに結合し、疎水性トンネルのＮ末端ポケットにおける結合しているコレステリルエステルをシフトし、ポケットからリン脂質を移す。Liuら、J.  Biol.  Chem.２８７巻：３７３２１〜３７３２９頁、２０１２年を参照されたい。ＣＥＴＰ阻害剤が、心血管疾患の治療法に有用となるであろうという初期の期待は、実現されていない；４種の阻害剤が、後期臨床治験に達したが、心血管事象の低下を示すことができなかった。Kosmasら、Clinical  Medical  Insights:  Cardiology  ２０１６年：１０巻  ３７〜４２頁  ｄｏｉ：１０．４１３７／ＣＭＣ．Ｓ３２６６７）を参照されたい。
ＣＥＴＰ阻害剤および心血管疾患の代替的な見解が出現した。例えば、Miller、F100Research  ３巻：１２４頁、２０１４年を参照されたい。ＣＥＴＰの保護的役割に関しては証拠がますます増えている。例えば、ヒトにおける複数の研究は現在、心血管疾患が、ＣＥＴＰレベルと逆相関することを示す。加えて、肝臓分泌が低下したＣＥＴＰ対立遺伝子は、心筋梗塞のリスク増加に関連する。Miller、上記参照。ＣＥＴＰ阻害剤が、ＨＤＬコレステロールレベルを増加させ、したがって、心血管疾患の低下において有益となるであろうという本来の考えは、正しくない可能性がある。ＨＤＬコレステロールは、その脂質輸送機能のため有益であり、ＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへのコレステリルエステルのＣＥＴＰ媒介性転移が、この機能の重要な成分である可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Kingwellら、Nature  Reviews  Drug  Discovery  １３巻：４４５〜６４頁、２０１４年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
一態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄを含む融合ポリペプチドであって、式中、ＡｐｏＡ１は、コレステロール流出活性を有する第１のポリペプチドセグメントであり、これは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７、２５〜２６７または１〜２６７と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択され；Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは、二量体形成ドメインである、融合ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、少なくとも２個のアミノ酸残基、少なくとも３個のアミノ酸残基または少なくとも１６個のアミノ酸残基を含む。例えば、特定の変種では、Ｌ１は、２〜６０個のアミノ酸残基、３〜６０個のアミノ酸残基、５〜４０個のアミノ酸残基、１５〜４０個のアミノ酸残基または１６〜３６個のアミノ酸残基からなる。より特異的な変種では、Ｌ１は、１６個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基または３６個のアミノ酸残基からなり；一部のこのような実施形態では、Ｌ１は、配列番号２２の残基２６８〜２８３、配列番号２６の残基２６８〜２８８、配列番号２の残基２６８〜２９３、配列番号５４、または配列番号２４の残基２６８〜３０３に示すアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７に示すアミノ酸配列を含む。
【００３６】
上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｄは、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域等、免疫グロブリン重鎖定常領域である。二量体形成ドメインが免疫グロブリンＦｃ領域である、ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、野生型ヒト配列と比べて１個または複数のアミノ酸置換を含むヒトＦｃバリアント等、ヒトＦｃ領域である。特に適したＦｃ領域は、ヒトγ１およびγ３  Ｆｃ領域を含む。一部の変種では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ残基Ｃ２２０がセリンによって置き換えられたヒトγ１  Ｆｃバリアントである；一部のこのような実施形態では、Ｅｕ残基Ｃ２２６およびＣ２２９はそれぞれ、セリンによって置き換えられている、および／またはＥｕ残基Ｐ２３８は、セリンによって置き換えられている。上述のＦｃ領域を含むさらなる変種では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ残基Ｐ３３１がセリンによって置き換えられたヒトγ１  Ｆｃバリアントである。Ｆｃバリアントは、野生型ヒト配列と比べてグリコシル化を低下させるアミノ酸置換を含むことができ；一部のこのような実施形態では、Ｅｕ残基Ｎ２９７は、別のアミノ酸により置き換えられている。上述のＦｃ領域を含むさらなる変種では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのうち少なくとも１種に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換）を含むＦｃバリアントである。ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む。適したＦｃ領域は、（ｉ）配列番号２の残基２９４〜５２５または２９４〜５２４に示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域、および（ｉｉ）配列番号１３の残基２９４〜５２５または２９４〜５２４に示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。
【００３７】
上述の融合ポリペプチドのある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９、または（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特異的な変種では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９、または（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４に示すアミノ酸配列を含む。
【００３８】
上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントをさらに含む。特定の変種では、第２のポリペプチドセグメントは、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、または例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである。上述の第２のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドは、式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ（アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと）によって表すことができ、式中、ＡｐｏＡ１、Ｌ１およびＤはそれぞれ、上述通りに定義されており、Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、任意選択で存在し、Ｐは、第２のポリペプチドセグメントである。Ｌ２が存在する融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４の残基５２６〜５４１に示すアミノ酸配列を有する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、コレステロール流出活性を有し、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択される第１のポリペプチドセグメントと、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントであって、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、および例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータに特異的に結合するポリペプチドから選択される第２のポリペプチドセグメントとを含む融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７に示すアミノ酸配列を有する。一部の変種では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、第２のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインをさらに含む。
【００４０】
第２のポリペプチドセグメントとしてＲＮａｓｅを含む上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＲＮａｓｅは、ヒトＲＮＡｓｅ  １またはその機能的バリアントもしくは断片である。ある特定の実施形態では、ＲＮａｓｅは、配列番号４のアミノ酸残基５４２〜６７５と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。特異的な変種では、ＲＮａｓｅは、配列番号４の残基５４２〜６７５に示すアミノ酸配列を有する。ＲＮａｓｅを含み、上述の式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを有する融合ポリペプチドの特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５に示すアミノ酸配列を含む。
【００４１】
第２のポリペプチドセグメントとしてパラオキソナーゼを含む上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、パラオキソナーゼは、ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）またはその機能的バリアントである。ある特定の実施形態では、パラオキソナーゼは、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜３５５、配列番号４２のアミノ酸残基１６〜３５５、または配列番号４４のアミノ酸残基１６〜３５５と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。特異的な変種では、パラオキソナーゼは、配列番号１２の残基１６〜３５５、配列番号４２の残基１６〜３５５、または配列番号４４の残基１６〜３５５に示すアミノ酸配列を含む。パラオキソナーゼを含み、上述の式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを有する融合ポリペプチドの特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３に示すアミノ酸配列を含む。
【００４２】
第２のポリペプチドセグメントとして血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）を含む上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼは、ヒトＰＡＦ−ＡＨまたはその機能的バリアントである。ある特定の実施形態では、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼは、配列番号３２のアミノ酸残基２２〜４４１と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。特異的な変種では、パラオキソナーゼは、配列番号３２の残基２２〜４４１に示すアミノ酸配列を含む。血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを含み、上述の式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを有する融合ポリペプチドの特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３に示すアミノ酸配列を含む。
【００４３】
第２のポリペプチドセグメントとしてコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を含む上述の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、コレステロールエステル転送タンパク質は、ヒトＣＥＴＰまたはその機能的バリアントである。ある特定の実施形態では、コレステロールエステル転送タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸残基１８〜４９３と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。特異的な変種では、コレステロールエステル転送タンパク質は、配列番号３０の残基１８〜４９３に示すアミノ酸配列を含む。血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを含み、上述の式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを有する融合ポリペプチドの特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９に示すアミノ酸配列を含む。
【００４４】
上述の融合ポリペプチドのある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤に連結される。
【００４５】
別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、上述の通りの二量体形成ドメインを含む融合ポリペプチドである、二量体タンパク質を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、上述の通りの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
また別の態様では、本発明は、次に挙げる作動可能に連結されたエレメントを含む発現ベクターを提供する：転写プロモーター、上述の通りの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、および転写ターミネーター。上述の発現ベクターが導入された培養細胞であって、ＤＮＡセグメントを発現する細胞も提供される。
【００４８】
別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドを作製する方法を提供する。本方法は一般に、上述の通りの発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、細胞がＤＮＡセグメントを発現し、コードされた融合ポリペプチドが産生されるステップと、融合ポリペプチドを回収するステップとを含む。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、二量体タンパク質を作製する方法を提供する。本方法は一般に、上述の通りの発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、細胞がＤＮＡセグメントを発現し、コードされた融合ポリペプチドが二量体タンパク質として産生されるステップと、二量体タンパク質を回収するステップとを含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、上述の通りの融合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、上述の通りの二量体タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００５２】
また別の態様では、本発明は、粥状動脈硬化によって特徴付けられる心血管疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、心血管疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、心血管疾患は、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される。ある特定の変種では、冠動脈心疾患は、急性冠症候群によって特徴付けられる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、神経変性疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、神経変性疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病および多発性硬化症からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、神経変性疾患は、認知症によって特徴付けられ；一部のこのような変種では、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
【００５４】
別の態様では、本発明は、アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、疾患は、アルツハイマー病である。
【００５５】
別の態様では、本発明は、自己免疫性疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、自己免疫性疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および１型糖尿病からなる群から選択される。
【００５６】
さらに別の態様では、本発明は、炎症性疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、炎症性疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される。他の実施形態では、炎症性疾患は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、特発性肺線維症、過酸素症、低酸素症または急性呼吸促迫症候群等、炎症性肺疾患である。
【００５７】
また別の態様では、本発明は、感染性疾患を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、感染性疾患を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、感染性疾患は、細菌感染によって特徴付けられ；一部のこのような実施形態では、細菌感染は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染である。
【００５８】
別の態様では、本発明は、ネフローゼ症候群（ＮＳ）を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、ネフローゼ症候群を有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。特異的な変種では、対象のネフローゼ症候群は、原発性腎臓疾患（例えば、微小変化型ネフローゼ、巣状糸球体硬化症、膜性腎症またはＩｇＡ腎症）、アミロイドーシス、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される疾患に関連する。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、硫黄マスタードガスまたは有機リン酸エステルへの曝露を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、硫黄マスタードガスまたは有機リン酸エステルに曝露された対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。
【００６０】
また別の態様では、本発明は、がんを処置するための方法を提供する。本方法は一般に、がんを有する対象に、上述の通りの融合ポリペプチドまたは二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、がんは、悪性メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される。ある特定の変種では、がん処置は、併用療法である。一部の併用療法実施形態では、併用療法は、例えば、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法、抗ＣＴＬＡ−４治療法またはその両方を含む免疫調節療法等、非ＡｐｏＡ１媒介性免疫調節療法を含む。他の併用療法実施形態では、併用療法は、放射線療法または化学療法を含む。一部の併用療法実施形態では、併用療法は、標的化療法を含み；一部のこのような実施形態では、標的化療法は、（ｉ）特異的な細胞表面もしくは細胞外抗原（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１）を標的とする治療用モノクローナル抗体または（ｉｉ）例えば、細胞内酵素（例えば、プロテアソーム、チロシンキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）またはＭＥＫキナーゼ）等、細胞内タンパク質を標的とする小分子を含む。
【００６１】
本発明の上述および他の態様は、本発明の次の詳細な説明の参照により明らかとなるであろう。
定義
【００６２】
他に定義されていなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、記載されている方法および組成物に関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、他に規定がなければ、次の用語および語句は、それらに帰する意味を有する。
【００６３】
用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそれ以外のことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００６４】
「ポリペプチド」は、天然に産生されたか合成により産生されたかにかかわらず、ペプチド結合によって連接されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは一般的に、「ペプチド」と称される。
【００６５】
「タンパク質」は、１本または複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、炭水化物基等、非ペプチド性成分を含むこともできる。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質を産生した細胞によってタンパク質に付加されてよく、細胞の種類により変動するであろう。タンパク質は、そのアミノ酸骨格構造の観点から本明細書において定義されている；炭水化物基等の置換基は一般に、特定されていないが、そうであっても存在し得る。
【００６６】
用語「アミノ末端」（または「Ｎ末端」）および「カルボキシル末端」（または「Ｃ末端」）は、ポリペプチド内の位置を表示するように本明細書で使用されている。文脈が許すのであれば、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を参照しつつ、近接または相対的位置を表示するように使用されている。例えば、ポリペプチド内で参照配列に対しカルボキシル末端側に位置するある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全ポリペプチドのカルボキシル末端に存在しているとは限らない。
【００６７】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同義的に使用されており、５’から３’末端へと読まれる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然の供給源から単離しても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成しても、または天然および合成分子の組合せから調製してもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（「ｂｐ」と省略）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）またはキロベース（「ｋｂ」）として表現される。文脈が許すのであれば、後者の２つの用語は、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを記載することができる。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖の長さが僅かに異なる場合があり、それらの末端が、酵素による切断の結果としてずらして配置されている場合があり；よって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全ヌクレオチドが、対形成している必要はないことを認識するであろう。このような対形成していない末端は、一般に、２０ｎｔの長さを超えないであろう。
【００６８】
「セグメント」は、特定された特質を有するより大型の分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の部分である。例えば、特定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’方向に読まれると、特定されたポリペプチドのアミノ酸の配列をコードするプラスミドまたはプラスミド断片等、より長いＤＮＡ分子の部分である。また、本発明に従った融合ポリペプチドの文脈において、「コレステロール流出活性を有し」および「配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む」ポリペプチドセグメントは、コレステロール流出活性を有する特定されたポリペプチドセグメントに加えて、本明細書に記載されている他のポリペプチドセグメント（例えば、リンカー（複数可）、二量体形成ドメイン）を含む、より長いポリペプチド融合分子の部分である。
【００６９】
用語「発現ベクター」は、その転写をもたらす追加的なセグメントに作動可能に連結した目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む、直鎖状または環状のＤＮＡ分子を表示するように使用されている。そのような追加的なセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、１種または複数の複製起点、１種または複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含むこともできる。発現ベクターは一般に、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡに由来する、またはその両方のエレメントを含有することができる。
【００７０】
用語「プロモーター」は、その本技術分野で認識されている意味のため、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始をもたらすＤＮＡ配列を含有する遺伝子の部分を表示するように、本明細書で使用されている。プロモーター配列は、一般的に、遺伝子の５’非コード領域に存在するが、必ずしもそうであるとは限らない。
【００７１】
「分泌性シグナル配列」は、より大型のポリペプチドの成分として、これを合成する細胞の分泌性経路を介してこのより大型のポリペプチドを方向づけるポリペプチド（「分泌性ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列である。より大型のポリペプチドは一般的に、切断されて、分泌性経路の通過の際に分泌性ペプチドを除去する。
【００７２】
「作動可能に連結された」は、２個またはそれを超える実体が、それらの意図される目的のために協調して機能するように、一体に連接されていることを意味する。ＤＮＡセグメントを参照する場合、この語句は、例えば、コード配列が、正しい読み枠で連接されており、転写が、プロモーターにおいて開始し、コードセグメント（複数可）を経てターミネーターまで前進することを示す。ポリペプチドを参照する場合、「作動可能に連結された」は、共有結合により（例えば、ジスルフィド結合による）および非共有結合により（例えば、水素結合、疎水性相互作用または塩橋相互作用による）連結された配列の両方を含み、その場合、配列の所望の機能（複数可）は保持されている。
【００７３】
用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターを参照しつつ使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変更によって修飾されていること、あるいは細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。よって、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）型の細胞内には存在しない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異常に発現される、過小発現されるもしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。本明細書における用語「組換え核酸」とは、一般に、自然には正常には存在しない形態における、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用した核酸の操作によって、本来ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された核酸を意味する。このようにして、異なる配列の作動可能な連結が達成される。よって、直鎖形態の単離された核酸、または正常では連接されていないＤＮＡ分子のライゲーションによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは両者共に、本明細書に開示されている目的のため、組換えと考慮される。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、これは、非組換え的に、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作ではなく宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を使用して複製するであろうことが理解される；しかし、このような核酸は、ひとたび組換えにより産生されると、その後に非組換え的に複製されても、本明細書に開示されている目的のため、組換えであると依然として考慮される。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技法を使用して、すなわち、上に描写されている組換え核酸の発現により作製されたタンパク質である。
【００７４】
用語「異種」は、核酸の部分を参照しつつ使用される場合、核酸が、自然において互いに同じ関係性で正常には存在しない２個またはそれを超えるサブ配列（subsequence）を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換えにより産生され、例えば、新たな機能的核酸を作製するために配置された無関係の遺伝子に由来する２個またはそれを超える配列、例えば、ある供給源由来のプロモーターと、別の供給源由来のコード領域を有する。同様に、「異種」は、タンパク質の部分を参照して使用される場合、タンパク質が、自然において互いに同じ関係性では存在しない２個またはそれを超えるサブ配列（例えば、融合ポリペプチドの２個のセグメント）を含むことを示す。
【００７５】
「免疫グロブリン」は、脊椎動物生物において抗体として機能する血清タンパク質である。５クラスの「免疫グロブリン」または抗体、タンパク質（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）が、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧは、主要クラスを構成する；これは通常、血漿中に存在する２番目に豊富なタンパク質として存在する。ヒトでは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と命名される４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ記号γにより識別される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含有する。各免疫グロブリン重鎖は、ある種における所定のサブクラスに対して基本的にインバリアントな、定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる定常領域を保有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は、本技術分野で公知である。例えば、Ellisonら、DNA  １巻：１１〜１８頁、１９８１年；Ellisonら、Nuc.  Acids  Res.１０巻：４０７１〜４０７９頁、１９８２年；Kentenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７９巻：６６６１〜６６６５頁、１９８２年；Senoら、Nuc.  Acids  Res.１１巻：７１９〜７２６頁、１９８３年；Riechmannら、Nature  ３３２巻：３２３〜３２７頁、１９８８年；Amsterら、Nuc.  Acids  Res.８巻：２０５５〜２０６５頁、１９８０年；RusconiおよびKohler、Nature  ３１４巻：３３０〜３３４頁、１９８５年；Bossら、Nuc.  Acids  Res.１２巻：３７９１〜３８０６頁、１９８４年；Bothwellら、Nature  ２９８巻：３８０〜３８２頁、１９８２年；van  der  Looら、Immunogenetics  ４２巻：３３３〜３４１頁、１９９５年；Karlinら、J.  Mol.  Evol.２２巻：１９５〜２０８頁、１９８５年；Kindsvogelら、DNA  １巻：３３５〜３４３頁、１９８２年；Breinerら、Gene  １８巻：１６５〜１７４頁、１９８２年；Kondoら、Eur.  J.  Immunol.２３巻：２４５〜２４９頁、１９９３年；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２２８を参照されたい。免疫グロブリン構造および機能の総説については、Putnam、The  Plasma  Proteins、Ｖ巻、Academic  Press,  Inc.、４９〜１４０頁、１９８７年；およびPadlan、Mol.  Immunol.３１巻：１６９〜２１７頁、１９９４年を参照されたい。
【００７６】
「免疫グロブリンヒンジ」は、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインを接続する免疫グロブリン重鎖の部分である。ヒトγ１のヒンジ領域は、およそＥｕ残基２１６〜２３０に対応する。
【００７７】
用語「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書において使用される場合、同義であり、細胞における抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合の原因となる免疫グロブリンの部分を指す（このような結合活性を除去するための、天然起源の配列と比べたいかなるアミノ酸変化もなく）。Ｆｃは、「断片結晶性（fragment  crystalline）」の略語であり、タンパク質結晶を容易に形成するであろう抗体の断片である。本来はタンパク質分解性消化によって描写された別個のタンパク質断片により、免疫グロブリンタンパク質の全体的一般構造を定義することができる。文献において本来定義される通り、Ｆｃ断片は、ジスルフィド連結された重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる。本明細書において使用される場合、この用語は、ＣＨ３、ＣＨ２、および第２のこのような鎖とのジスルフィド連結された二量体の形成に十分なヒンジの少なくとも部分からなる単鎖も指す。本明細書において使用される場合、用語Ｆｃ領域は、天然起源の配列のバリアントをさらに含み、このバリアントは、二量体を形成することができ、増加または減少したＦｃ受容体結合または補体結合活性を有するようなバリアントを含むことができる。
【００７８】
「二量体形成ドメイン」は、本明細書において使用される場合、２個のポリペプチドが生理的条件下で会合して二量体を形成するような、第２のポリペプチドに対し親和性を有するポリペプチドを指す。典型的には、第２のポリペプチドは、同じポリペプチドであるが、一部の変種では、第２のポリペプチドは異なる。ポリペプチドは、共有結合および／または非共有結合的会合（複数可）により互いと相互作用することができる。二量体形成ドメインの例として、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１もしくはＣＬドメイン；ロイシンジッパードメイン（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパードメイン、例えば、Kostelneyら、J.  Immunol.、１４８巻：１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照；または酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパードメイン）；イソロイシンジッパードメイン；二量体形成細胞表面受容体（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；またはＬＦＡ−１もしくはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ等のインテグリンヘテロ二量体）の二量体形成領域；分泌される二量体形成リガンド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；例えば、Arakawaら、J.  Biol.  Chem.２６９巻：２７８３３〜２７８３９頁、１９９４年およびRadziejewskiら、Biochem.３２巻：１３５０頁、１９９３年を参照）の二量体形成領域；ならびにポリペプチドと少なくとも１個のシステイン残基を含む第２のポリペプチド（以降「合成ヒンジ」）の間にジスルフィド結合（複数可）を形成することができるような、少なくとも１個のシステイン残基（例えば、約１、２または３〜約１０個のシステイン残基）を含むポリペプチドが挙げられる。本発明に従って好まれる二量体形成ドメインは、Ｆｃ領域である。
【００７９】
用語「二量体」または「二量体タンパク質」は、本明細書において使用される場合、二量体形成ドメインを介して一体に連結された、本明細書に開示されている２個（「第１の」および「第２の」）融合ポリペプチドの多量体を指す。文脈がそれ以外のことを明らかに示さない限り、「二量体」または「二量体タンパク質」は、二量体形成された第１および第２の融合ポリペプチドと存在し得る別のＡｐｏＡ−１ポリペプチドとの相互作用による（例えば、天然起源の内在性ＡｐｏＡ−１タンパク質との相互作用による）等、球状ＨＤＬ粒子において形成し得るより高次の多量体（例えば、三量体）の文脈における、このような二量体形成された第１および第２の融合ポリペプチドの参照を含む。この用語は、第１または第２の融合ポリペプチドにおける追加的な二量体形成ドメインの包含によって作製され得るより高次の多量体の文脈における（例えば、免疫グロブリン軽鎖を含む第１の融合ポリペプチドと、免疫グロブリン重鎖を含む第２の融合ポリペプチドは、ＣＨ１とＣＬドメインの間の相互作用によりヘテロ二量体形成することができ、２個のこのようなヘテロ二量体は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域によりさらに二量体形成することができ、これにより、四量体を形成する）、二量体形成された第１および第２の融合ポリペプチドの参照も含む。
【００８０】
用語「リンカー」または「ポリペプチドリンカー」は、ペプチド結合（複数可）によって連接され、２個の個別の別々のポリペプチド領域を連結する、２個またはそれを超えるアミノ酸を示すように本明細書で使用されている。リンカーは、典型的には、別々のポリペプチド領域が、それらの別々の機能を行うことを可能にするように設計される（例えば、他のポリペプチド領域に連結された二量体形成ドメインが、別の対応する二量体形成ドメインと会合して、二量体を形成する場合等）。リンカーは、ネイティブ配列、そのバリアントまたは合成配列の部分となることができる。リンカーはまた、本明細書において、略語「Ｌ」を使用して参照される。添字（例えば、「１」または「２」）と「Ｌ」の使用は、ポリペプチド鎖内の複数のリンカーを区別するために本明細書で使用されており、このリンカーは、アミノ酸配列に関して同じであっても異なっていてもよい。
【００８１】
文脈がそれ以外のことを明らかに示さない限り、本明細書において、「ＡｐｏＡ−１」の参照は、天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチド、ならびにその機能的バリアント、機能的断片およびミメティックを含むものと理解される。「ＡｐｏＡ１」、「Ａｐｏ  Ａ−１」、「ａｐｏＡ−１」および「ａｐｏ  Ａ−１」は、本明細書において「ＡｐｏＡ１」と同義に使用される。
【００８２】
文脈がそれ以外のことを明らかに示さない限り、本明細書において、「ＲＮａｓｅ」（例えば、「ＲＮａｓｅ  １」）、「パラオキソナーゼ」（例えば、「ＰＯＮ１」）、「血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ」（「ＰＡＦ−ＡＨ」）、「コレステロールエステル転送タンパク質」（「ＣＥＴＰ」）または「レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ」（「ＬＣＡＴ」）の参照は、前述のうちいずれかの天然起源のポリペプチド、ならびにその機能的バリアントおよび機能的断片を含むものと理解される。
【００８３】
用語「対立遺伝子バリアント」は、同じ染色体座を占める遺伝子の２種またはそれを超える代替型のいずれかを表示するように本明細書で使用される。対立遺伝子変種は、突然変異により天然に生じ、集団内に表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントとなり得る（コードされるポリペプチドに変化なし）、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。用語、対立遺伝子バリアントはまた、遺伝子の対立遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質を表示するように本明細書で使用される。
【００８４】
本開示のＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドは、本明細書において、例えば、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ」、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ」、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］」、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ」、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１」、「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ」または「ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１」等の式によって参照することができる。このような事例のそれぞれにおいて、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、融合ポリペプチドの特定のセグメント（例えば、「ＡｐｏＡ１」、「Ｄ」（二量体形成ドメインのため）、「Ｌ１」（第１のポリペプチドリンカーのため）、「Ｆｃ領域」、「ＲＮａｓｅ」、「パラオキソナーゼ」等）を指す用語は、本明細書におけるそのような用語に帰する意味を有するものと理解され、本明細書に記載されている様々な実施形態を包括する。
【００８５】
本明細書に記載されている通りの対象への可溶性融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質の投与による疾患の処置の文脈における用語「有効量」は、疾患の１種または複数の症状の出現の阻害または寛解に十分な、そのような分子の量を指す。例えば、本明細書に記載されている通りの対象への二量体ＡｐｏＡ１融合タンパク質の投与による自己免疫性疾患の処置の特異的な文脈において、用語「有効量」は、自己免疫性疾患の１種または複数の症状の出現を阻害または寛解することができるような、対象における自己免疫応答のモジュレートに十分な、そのような分子の量を指す。有効量の薬剤は、「有効レジーム（regime）」において本発明の方法に従って投与される。用語「有効レジーム」は、疾患の処置または予防の達成に適切な、投与される薬剤の量および投薬頻度の組合せを指す。
【００８６】
本明細書に記載されている通りの疾患または障害の処置の文脈における用語「患者」または「対象」は、例えば、ヒトおよび他の霊長類等、哺乳動物を含む。この用語は、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌおよびネコ等、飼い慣らされた動物も含む。
【００８７】
用語「併用療法」は、示される治療効果を達成するための、少なくとも２種の別個の治療法の提供が関与する治療レジメンを指す。例えば、併用療法は、２種またはそれを超える化学的に別個の活性成分または薬剤、例えば、本発明に係る可溶性ＡｐｏＡ１融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質、および例えば、別の抗炎症または免疫調節剤等の別の薬剤の投与が関与し得る。あるいは、併用療法は、本発明に係る可溶性ＡｐｏＡ１融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質の、単独での、または別の薬剤と併せた投与と共に、別の治療法（例えば、放射線療法）の送達が関与し得る。併用療法を構成する別個の治療法は、例えば、同時の、重複するまたは逐次の投薬レジメンとして送達することができる。２種またはそれを超える化学的に別個の薬剤の投与の文脈において、活性成分を、同じ組成物の一部としてまたは異なる組成物として投与することができることが理解される。別々の組成物として投与される場合、異なる活性成分を含む組成物は、同じまたは異なる時点で、同じまたは異なる経路により、同じまたは異なる投薬レジメンを使用して投与することができ、これらは全て、要求される特定の文脈の通り、また、担当医によって決定される通りに為される。
【００８８】
がん処置の文脈における用語「非ＡｐｏＡ１媒介性免疫調節療法」は、ＡｐｏＡ−１またはＡｐｏＡ−１媒介性シグナル伝達経路を特異的に標的としない免疫調節療法を意味する。
【００８９】
がん処置の文脈における用語「標的化療法」は、治療剤を使用して、特異的な種類のがん細胞を同定および攻撃し、典型的には、正常細胞には害が少ない、ある種の処置を指す。一部の実施形態では、標的化療法は、がん細胞の成長および伝播に関与する酵素または他の分子の作用を遮断する。他の実施形態では、標的化療法は、免疫系ががん細胞を攻撃するのを助ける、または有毒物質を直接的にがん細胞に送達するのいずれかである。ある特定の変種では、標的化療法は、小分子薬物またはモノクローナル抗体を治療剤として使用する。
【００９０】
最大一致のために整列されたときに２種のアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じである場合、この２種のアミノ酸配列は、「１００％アミノ酸配列同一性」を有する。ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって生産されているＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピュータ処理一式に含まれるもの等、標準ソフトウェアプログラムを使用して、配列比較を行うことができる。最適整列を決定することによってアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、PeruskiおよびPeruski、The  Internet  and  the  New  Biology:  Tools  for  Genomic  and  Molecular  Research（ASM  Press,  Inc.１９９７年）；Wuら（編）、「Information  Superhighway  and  Computer  Databases  of  Nucleic  Acids  and  Proteins」、Methods  in  Gene  Biotechnologyの１２３〜１５１頁（CRC  Press,  Inc.１９９７年）；Bishop（編）、Guide  to  Human  Genome  Computing（第２版、Academic  Press,  Inc.１９９８年）を参照）。２種のアミノ酸配列が、互いと比べて少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を有する場合、この２配列は、「実質的配列同一性」を有すると考慮される。
【００９１】
パーセント配列同一性は、従来の方法によって決定される。例えば、Altschulら、Bull.  Math.  Bio.４８巻：６０３頁、１９８６年ならびにHenikoffおよびHenikoff、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：１０９１５頁、１９９２年を参照されたい。例えば、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ１、および表１に示す（アミノ酸は、標準１文字コードによって示されている）HenikoffおよびHenikoff、上記参照の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを使用して、２種のアミノ酸配列を整列して、整列スコアを最適化することができる。続いて、次の通りにパーセント同一性が計算される：（［同一マッチの総数］／［長い方の配列の長さプラス２配列を整列するために長い方の配列に導入されたギャップの数］）（１００）。
【表１】
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【００９２】
当業者であれば、２種のアミノ酸配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されているアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルの試験に適したタンパク質整列方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、PearsonおよびLipman、Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁、１９８８年ならびにPearson、Meth.  Enzymol.１８３巻：６３頁、１９９０年によって記載されている。簡潔に説明すると、ＦＡＳＴＡは先ず、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、同一性の最高密度（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または同一性の対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する、問い合わせ配列（例えば、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７）および被験配列によって共有される領域を同定することによって、配列類似性を特徴付ける。次に、同一性の最高密度を有する１０個の領域が、アミノ酸置換マトリックスを使用して、対形成されたアミノ酸の全ての類似性を比較することにより再度スコアリングされ、領域の末端が、最高スコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」される。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づく既定の式によって計算される）よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、トリミングされた初期領域が試験されて、領域を連接して、ギャップを有するおよその整列を形成することができるか決定する。最後に、２種のアミノ酸配列の最高スコアリング領域が、アミノ酸挿入および欠失を可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.４８巻：４４４頁、１９７０年；Sellers、SIAM  J.  Appl.  Math.２６巻：７８７頁、１９７４年）の修正版を使用して整列される。ＦＡＳＴＡ解析のための説明目的のパラメータは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップエクステンションペナルティ＝１および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Pearson、Meth.  Enzymol.１８３巻：６３頁、１９９０年の付録２に説明される通り、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修飾することによってＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【００９３】
このような値が、「約」Ｘまたは「およそ」Ｘと表現される場合、記述されている値のＸは、±１０％まで正確であると理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＡｐｏＡ−１分子およびその組換え融合体による、ＢＨＫ細胞培養物におけるコレステロール流出を図解する。ＡｐｏＡ−１とＦｃ領域の間に２６アミノ酸リンカーを含有するＡｐｏＡ−１−Ｆｃ融合タンパク質（ＡｐｏＡ−１（２６）Ｆｃ）は、２アミノ酸リンカーを有するＡｐｏＡ−１−Ｆｃ融合タンパク質（ＡｐｏＡ−１（２）Ｆｃ（Ｔｈｅｒｉｐｉｏｎ））またはリンカーなしのＡｐｏＡ−１−Ｆｃ融合タンパク質（ＡｐｏＡ−１（０）Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌ））のいずれかと比較して増加したコレステロール流出を実証し、野生型ヒトＡｐｏＡ−１（対照ＡｐｏＡ−１）と同様の活性を有した。ＡｐｏＡ−１分子は、ＡＢＣＡ１発現のために誘導されたＨ３−コレステロール標識ＢＨＫ細胞と共に２時間インキュベートした。Ｆｃタンパク質は、二量体であると予測された；しかし、示されている濃度は、分子当たりのＡｐｏＡ−１の質量に基づき計算および正規化された。
【００９５】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、成分機能ドメインを含む、本開示に従った融合タンパク質のある特定の実施形態の模式図を示す。図２Ａは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域へと、リンカーを介してそのカルボキシル末端において連接されたヒトＡｐｏＡ−１の略図を描写する（本明細書において、「ＴＨＥＲ融合タンパク質」または「ＴＨＥＲ分子」とも称される）。図２Ｂは、酵素領域へと、リンカーを介してそのカルボキシル末端においてさらに連接された、ＴＨＥＲ融合タンパク質の略図を描写する（このような融合体は、本明細書において、「二機能性酵素脂質輸送」または「ＢＥＬＴ」分子とも称される；ＢＥＬＴ分子は、本明細書において全般的に、ＴＨＥＲ融合タンパク質または分子と称することもできる）。融合タンパク質のカルボキシル末端に存在するリンカー配列およびドメインは、構築物に応じて変動する。
【００９６】
【図３】図３は、５種の異なるＴＨＥＲ分子を発現する一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来の培養上清（無血清）のウエスタンブロットを示す。トランスフェクションおよびウエスタンブロット解析は、実施例３、下記に記載されている通りに行われた。左から右に：偽  −  偽トランスフェクション陰性対照；ＣＤ４０ＩｇＧ  −  ＣＤ４０ＩｇＧ  ＤＮＡトランスフェクション陽性対照；ＴＨＥＲ０  −  ２個のアミノ酸のリンカーを有するＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＨＥＲ２  −  １６個のアミノ酸のリンカーを有するＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＨＥＲ４  −  ２６個のアミノ酸のリンカーを有するＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＨＥＲ６  −  ３６個のアミノ酸のリンカーを有するＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＨＥＲ４ＲＮＡ  −  ３６個のアミノ酸のリンカーを有するＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質、これは、ヒトＲＮａｓｅ１へと第２の１８アミノ酸リンカーを介してさらに連結されている。
【００９７】
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｅは、ＴＨＥＲ０（図４Ａ）、ＴＨＥＲ２（図４Ｂ）、ＴＨＥＲ４（図４Ｃ）、ＴＨＥＲ６（図４Ｄ）およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２（図４Ｅ）ＡｐｏＡ−１融合タンパク質を発現する安定したＣＨＯクローンの初期スクリーニング、ならびに９６ウェル培養上清からの融合タンパク質の相対的発現レベルを要約する円柱グラフを示す（実施例４、下記を参照）。
【図４−２】図４Ａ〜図４Ｅは、ＴＨＥＲ０（図４Ａ）、ＴＨＥＲ２（図４Ｂ）、ＴＨＥＲ４（図４Ｃ）、ＴＨＥＲ６（図４Ｄ）およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２（図４Ｅ）ＡｐｏＡ−１融合タンパク質を発現する安定したＣＨＯクローンの初期スクリーニング、ならびに９６ウェル培養上清からの融合タンパク質の相対的発現レベルを要約する円柱グラフを示す（実施例４、下記を参照）。
【図４−３】図４Ａ〜図４Ｅは、ＴＨＥＲ０（図４Ａ）、ＴＨＥＲ２（図４Ｂ）、ＴＨＥＲ４（図４Ｃ）、ＴＨＥＲ６（図４Ｄ）およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２（図４Ｅ）ＡｐｏＡ−１融合タンパク質を発現する安定したＣＨＯクローンの初期スクリーニング、ならびに９６ウェル培養上清からの融合タンパク質の相対的発現レベルを要約する円柱グラフを示す（実施例４、下記を参照）。
【００９８】
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｃは、培養６および１０日後の、その細胞成長パターン（図５Ａ）、相対的細胞生存率（図５Ｂ）および融合タンパク質の発現（図５Ｃ）を評価する、より高いレベルの融合タンパク質を発現したＴＨＥＲクローンのサブセットの解析の結果を示す（実施例４、下記を参照）。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｃは、培養６および１０日後の、その細胞成長パターン（図５Ａ）、相対的細胞生存率（図５Ｂ）および融合タンパク質の発現（図５Ｃ）を評価する、より高いレベルの融合タンパク質を発現したＴＨＥＲクローンのサブセットの解析の結果を示す（実施例４、下記を参照）。
【００９９】
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＨＯクローン使用済みの（spent）培養上清から精製されたＴＨＥＲ融合タンパク質の非還元（図６Ａ）および還元（図６Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す（実施例４、下記を参照）。
【０１００】
【図７】図７は、精製されたＴＨＥＲ融合タンパク質のネイティブＰＡＧＥゲル解析を示す。実施例４、下記に記載されている通りに試料を調製し、ＢＬＵＥネイティブＰＡＧＥゲルを泳動し、染色した。
【０１０１】
【図８】図８は、融合タンパク質の抗ＩｇＧ捕捉およびＨＲＰコンジュゲート抗ＡｐｏＡ−１抗体による検出ステップを使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける異なる融合タンパク質の相対的結合を要約するグラフを示す（実施例５、下記を参照）。
【０１０２】
【図９】図９は、精製されたＡｐｏＡ１−ＩｇＧ−ＲＮａｓｅ二重特異性融合タンパク質（ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２）の系列希釈の試料に存在するＲＮａｓｅ活性を測定する動態酵素アッセイの結果を示す。陽性対照としてＲＮａｓｅ  Ａ（「ＲＮａｓｅ」）および陰性対照としてＡｐｏＡ−１−ｌｎｋ２６−ｈＩｇＧ（「ＴＨＥＲ４」）を使用して、実施例６、下記に記載されている通りに、ＲＮＡＳＥＡＬＥＲＴ（商標）アッセイ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を行った。各ボックスは、ＲＮＡの消化により蛍光シグナルを生成する非蛍光ＲＮＡ基質の固定された濃度による、４５分間アッセイの経過における時間の関数として、観察された相対蛍光単位を表す。
【０１０３】
【図１０】図１０は、４ｐｍｏｌ／μｌタンパク質希釈におけるＲＮａｓｅ酵素活性を比較する、図９に示すデータのサブセットを示す。
【０１０４】
【図１１】図１１は、精製された融合タンパク質および分化したヒト単球細胞株、ＴＨＰ−１を使用した、ＢＯＤＩＰＹ−コレステロール流出アッセイの結果を示す。実施例７、下記に記載されている通りに９６ウェルプレートフォーマットでアッセイを行い、データを、５回の複製から観察された平均流出として表し、全試料からベースライン流出（培地単独）を減算した。
【０１０５】
【図１２】図１２は、マウス単球・マクロファージ細胞株Ｊ７７４  Ａ．１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用したコレステロール流出アッセイの結果を示す。実施例７、下記に記載されている通りに、ベースラインおよびｃＡＭＰ刺激流出の両方を評価した。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
Ｉ．概観
本発明は、コレステロール流出活性を有し、ＡｐｏＡ１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片、あるいはＡｐｏＡ−１ミメティックのいずれかである、第１のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドに関する組成物および方法を提供する。一部の態様では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインのアミノ末端側の末端とＡｐｏＡ−１ポリペプチド、バリアント、断片またはミメティックのカルボキシル末端側の末端との間のペプチドリンカーを有する二量体形成ドメインをさらに含み、これにより、融合ポリペプチドが、安定した二量体を形成することを可能にする。他の相互排他的でない態様では、融合ポリペプチドは、ＡｐｏＡ−１ポリペプチド、バリアント、断片またはミメティックに対しカルボキシル末端側にあり、第２の生物学的活性を付与する、第２のポリペプチドセグメントをさらに含む二重特異性構築物である。例示的な第２のポリペプチドは、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、およびアミロイドベータに特異的に結合するポリペプチドを含み、これらのいずれも、天然起源のタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片となることができる。
【０１０７】
本発明の融合分子を使用して、例えば、対象におけるコレステロール逆転送を増加させて、様々な疾患の処置に治療利益をもたらすことができる。ＨＤＬの主要タンパク質であるＡｐｏＡ−１は、急性冠症候群患者の臨床治験において有益な活性を既に示した。本発明のＡｐｏＡ−１融合分子を使用して、冠動脈心疾患、急性冠症候群、および例えば、脳卒中等の粥状動脈硬化によって特徴付けられる他の心血管疾患を処置することができる。本発明の融合分子は、例えば、自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、炎症性疾患、２型糖尿病、肥満および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の処置にも有用である。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質が使用されて、例えば、１型糖尿病および認知症の処置における等、欠損したＡｐｏＡ−１を置き換える。ある特定の変種では、本明細書に開示されている融合タンパク質が使用されて、多発性硬化症（ＭＳ）を処置する。ＡｐｏＡ−１レベルは、ＭＳ患者において低いことが示されており、ＡｐｏＡ−１欠損マウスは、ＭＳのモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、野生型動物よりも多くの神経変性およびより悪化した疾患を示すことが示された。Meyersら、J.  Neuroimmunol.２７７巻：１７６〜１８５頁、２０１４年を参照されたい。データは、中枢神経系におけるＡｐｏＡ−１のプラスの神経保護効果をさらに示唆する。Gardnerら、Frontiers  in  Pharmacology：２０１５年１１月２０日、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．００２７８を参照されたい。
【０１０８】
いくつかの研究は、自己免疫性疾患に対するＡｐｏＡ−１治療法の使用を支持する。例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者は、低いＨＤＬ−コレステロールレベルを有し、存在するＨＤＬは多くの場合、ＡｐｏＡ−１のミエロペルオキシダーゼ媒介性メチオニン酸化およびチロシン塩素付加によって損傷され、これは、ＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出活性の喪失をもたらす。Shaoら、J.  Biol.  Chem.２８１巻：９００１〜４頁、２００６年；Hewingら、Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.３４巻：７７９〜８９頁、２０１４年を参照されたい。これは、ＳＬＥ患者に見られる抗炎症特性の喪失および炎症促進性ＨＤＬの生成を促進する。Skaggsら、Clin.  Immunol.１３７巻：１４７〜１５６頁、２０１０年；McMahonら、Athritis  Rheum.６０巻：２４２８〜２４３７頁、２００９年を参照されたい。ＡｐｏＡ−１に対する自己抗体は、多くのＳＬＥ患者に存在し、ＳＬＥＤＡＩによって評価されるＳＬＥ疾患活動性およびＳＬＩＣＣ／ＡＣＲ損傷指標によって評価されるＳＬＥ疾患関連の臓器損傷は、抗ＡｐｏＡ−１抗体と正に相関する。Batuklaら、Ann.  NY  Acad.  Sci.１１０８巻：１３７〜１４６頁、２００７年；Ahmedら、EXCLI  Journal  １２巻：７１９〜７３２頁、２０１３年を参照されたい。さらに、増加したＡｐｏＡ−１濃度は、ループス易発性ＳＬＥ１、２、３マウスにおける自己免疫および糸球体腎炎を減弱した。Blackら、J.  Immunol.  １９５巻：４６８５〜４６９８頁、２０１５年を参照されたい。
【０１０９】
ＨＤＬのコレステロール流出能力は、高い疾患活動性を有する関節リウマチ患者においても損なわれ、全身性炎症およびＨＤＬ抗酸化活性の喪失と相関する。Charles-Schoemanら、Arthritis  Rheum.６０巻：２８７０〜２８７９頁、２００９年；Charles-Schoemanら、Ann.  Rheum.  Dis.７１巻：１１５７〜１１６２頁、２０１２年を参照されたい。ＡｐｏＡ−１および再構成されたＨＤＬによるＬｅｗｉｓラットにおける関節炎の処置は、急性および慢性の関節炎症を低下させ、マクロファージＴＬＲ２発現および活性化を減少させた。Wuら、Arterioscler.  Thromb.  Basc.  Biol.３４巻：５４３〜５５１頁、２０１４年を参照されたい。プラバスタチンと組み合わせたＡｐｏＡ−１ミメティックペプチドＤ−４Ｆによるラットにおけるコラーゲン誘導性関節炎の治療法は、疾患活動性を有意に低下させた。Charles-Schoemanら、Clin.  Immunol.１２７巻：２３４〜２４４頁、２００８年を参照されたい。
【０１１０】
本発明の融合分子は、感染性疾患の処置において使用することもできる。感染および内毒血症において、ＡｐｏＡ−１の低下ならびにＨＤＬ組成およびサイズの変化を含む、脂質代謝およびリポタンパク質組成の有意な変更が起こる。ＨＤＬは、グラム陰性ＬＰＳおよびグラム陽性リポテイコ酸に結合しこれを中和し、これらの炎症性産物のクリアランスを促進することができる。薬理学的研究は、細菌感染における組換えＡｐｏＡ−１の利益を支持する。例えば、Pirilloら、Handb  Exp  Pharmacol.２２４巻：４８３〜５０８頁、２０１５年を参照されたい。
【０１１１】
パラオキソナーゼ（例えば、ＰＯＮ１）を含有する本発明の二機能性ＡｐｏＡ−１融合分子は、グラム陰性細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染した患者の治療法に特に有用である。これは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染が一般的な、免疫低下した患者に特に重要である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、病原性因子を分泌し、クオラムセンシング（ＱＳ）と呼ばれる濃度依存性プロセスにおいて、アシル−ホモセリンラクトンと呼ばれる小型のシグナル伝達分子に応答してバイオフィルムを形成する。パラオキソナーゼ（Paroxonase）１は、アシル−ホモセリンラクトンを分解し、内在性ＰＯＮホモログが存在しないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのトランスジェニックｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる致死性から保護することが示された。Estinら、Adv.  Exp.  Med.  Biol.６６０巻：１８３〜１９３頁、２０１０年を参照されたい。
【０１１２】
本発明の融合分子は、炎症性疾患の処置において使用することもできる。例えば、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質は、好中球、マクロファージおよび／または抗原提示細胞の表現型を変更して、炎症促進性応答を低下させることができる。本発明の分子は、例えば、ＡＢＣＡ１等のトランスポーター分子によって媒介される、細胞膜からのコレステロールの流出を引き起こす。マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞からのコレステロールの流出は、これらの細胞によって媒介される炎症促進性応答を阻害し、炎症性サイトカインの産生低下をもたらすことができる。研究は、抗炎症性効果の媒介におけるＡｐｏＡ−１の利益を支持する。例えば、ＡｐｏＡ−１による処置は、脂質ラフトの組成を変更することにより、ＣＤ４０の刺激後に、マクロファージにおける炎症促進性シグナル伝達を阻害することが示された。Yinら、J.  Atherosclerosis  and  Thrombosis  １９巻：９２３〜３６頁、２０１２年を参照されたい。ＡｐｏＡ−１は、脂質ラフトへのＴＲＡＦ−６動員の減少、およびＮＦ−ｋＢの活性化の減少を引き起こすことも示された。同文献参照。別の研究は、ＡｐｏＡ−１またはＡｐｏＡ−１ミメティック４Ｆによるヒト単球およびマクロファージの処置が、ＬＰＳに対するそれらの応答を変更し、炎症性サイトカインＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６およびＴＮＦαの産生減少をもたらしたが、ＩＬ−１０の産生を増加させたことを示した。Smythiesら、Am.  J.  Physiol.  Cell  Physiol.２９８巻：Ｃ１５３８〜４８頁、２０１０年．ｄｏｉ：１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００４６７．２００９を参照されたい。別の研究は、ＡｐｏＡ−１による処置が、ＴＨＰ−１細胞からのＬＰＳ誘導性ＭＣＰ−１放出を有意に減少させ、ＣＤ１１ｂおよびＶＣＡＭ−１の発現を阻害したことを示した。Wangら、Cytokine  ４９巻：１９４〜２０００頁、２０１０年を参照されたい。よって、ＡｐｏＡ−１は、ヒト単球およびマクロファージの活性化および接着を阻害し、抗炎症性表現型への分化による著明な機能変化を誘導する。
【０１１３】
炎症性肺疾患は、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子により処置することができる炎症性疾患の１種である。血清ＡｐｏＡ−１は、アトピーおよび喘息の組合せを有する患者においてＦＥＶ１と正に相関するが、喘息がないアトピー性および非アトピー性対象においては正に相関しないことが見出された。Barochiaら、Am.  J.  Respir.  Crit.  Care  Med.１９１巻：９９０〜１０００頁、２０１５年を参照されたい。別の研究では、特発性肺線維症患者は、対照と比較して（Ｐ＜０．０１）、細気管支洗浄液に低レベルのＡｐｏＡ−１を有した。Kimら、Am.  J.  Respir.  Crit.  Care  Med.１８２巻：６３３〜６４２頁、２０１０年を参照されたい。さらに、ブレオマイシンで処置したマウスにおけるＡｐｏＡ−１による鼻腔内処置は、肺における炎症性細胞の数およびコラーゲン沈着の低下において非常に有効であった。同文献参照。
【０１１４】
肥満は、本発明に従ったＡｐｏＡ−１融合分子による処置を受け入れられる別の炎症性疾患である。証拠は、肥満と戦うためのＡｐｏＡ−１およびＨＤＬの使用を支持する。例えば、Mineoら、Circ.  Res.１１１巻：１０７９〜１０９０頁、２０１２年を参照されたい。例えば、ＡｐｏＡ−１の過剰発現またはＡｐｏＡ−１ミメティックペプチドＤ−４Ｆの投与は、高脂肪食を与えたマウスにおいて、白色脂肪質量およびインスリン抵抗性を減少させ、エネルギー支出を増加させることが示された。さらに、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＡｐｏＡ−１ミメティックＬ−４Ｆは、脂肪症および炎症を低め、耐糖能を改善することが示された。同文献（Id.）。
【０１１５】
本発明に従ったＡｐｏＡ−１融合分子により処置することができるなお別の障害は、患者における心血管疾患のより高いリスクを伴うネフローゼ症候群（ＮＳ）である。濾過可能なＨＤＬ（すなわち、ＨＤＬ３）の尿中消耗および脂質が不十分なａｐｏ  Ａ１は、ネフローゼ症候群患者の共通の特色である。これは、典型的には、腎近位尿細管におけるキュビリン（cubulin）／メガリン受容体を介したこれらの分子の再取り込み減少によるものである。Barthら、Trends  Cardiovasc.  Med.１１巻：２６〜３１頁、２００１年を参照されたい。本明細書に記載されているＦｃ領域を含むＡｐｏＡ−１融合分子は、Ｆｃドメインの存在によりＦｃＲｎを介してリサイクルされているため、この通常の様式における再取り込みの必要を迂回するであろう。
【０１１６】
本明細書に記載されている融合分子は、がん患者の治療法に使用することもできる。本発明のＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質が、炎症促進性応答を低下させつつ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および腫瘍浸潤を増強することが予想される。研究は、がんの動物モデルにおけるＡｐｏＡ−１治療法の有効性を支持し、ＡｐｏＡ−１治療法が、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的な増加を引き起こし得ることを示した。例えば、Zamanian-Daryoushら、J.  Biol.  Chem.２８８巻：２１２３７〜２１２５２頁、２０１３年を参照されたい。一部の態様では、本発明のＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、抗がん免疫療法等、１種または複数の他の抗がん療法との組合せにおいて有用である。
【０１１７】
ある特定の態様では、本発明は、二量体形成ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）とＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアント、断片もしくはミメティックのＣ末端の間に可動性リンカーを配置することにより、活性ＡｐｏＡ−１二量体を安定化する仕方を提供する一方で、プレ−ベータ粒子から円盤状粒子および球状粒子への成熟化の制御も行う。リンカーを含有しない以前のＡｐｏＡ−１−Ｉｇ分子は、野生型ＡｐｏＡ１と比較して、コレステロール流出アッセイにおける低い活性を示す。対照的に、本発明の二量体形成融合ポリペプチドは、コレステロール流出アッセイにおいてＡｐｏＡ−１活性を保持し、例えば、二量体形成ドメインに対しＣ末端へのＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  １）または他のポリペプチドセグメントの融合等のさらなる改善も可能にする。ある特定の好まれる実施形態では、二量体形成ドメインとしてのＦｃ領域の使用も、二量体の半減期増加を可能にする。
【０１１８】
理論による制約を意図するものではないが、リンカーの長さが、コレステロールを吸収するにつれて拡大する安定したＡｐｏＡ−１二量体の能力を制御することが考えられる。本発明は、ＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはそのバリアント、断片もしくはミメティックのＣ末端と例えば、Ｆｃドメイン等の二量体形成ドメインのＮ末端の間に可動性リンカーを含有するＡｐｏＡ−１融合分子を提供する。リンカーは、ＡｐｏＡ−１またはその機能的バリアント、断片もしくはミメティックが、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）における初期のかつ重大な意味を持つステップである、細胞からのコレステロール流出を媒介することを可能にするのに十分な長さのものである。リンカーは、典型的には、２〜６０アミノ酸の間の長さである。代替的なリンカーの長さを有するＡｐｏＡ−１融合分子は、ＡｐｏＡ−１のＣ末端の制約によりＨＤＬ粒子の成熟化を制御することにより、別個の機能特性を有することが考えられる。中間サイズのＨＤＬ円盤状粒子は、改善された粥状保護特性を有することができ、改善されたＣＮＳ輸送特性を有することができる。本発明の分子は、このような中間円盤状ステージにおけるＨＤＬ成熟化の進行を変化させ、これにより、野生型ＡｐｏＡ−１タンパク質と比べて、本発明の融合タンパク質の有効性を改善することができる。本発明の分子は、三量体ＡｐｏＡ−１粒子で構成された球状ＨＤＬ粒子の構造および組成に影響を与える可能性がある（Silvaら、Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０５巻：１２１７６〜１２１８１頁、２００８年を参照）。本発明の分子は、より大型の球状ＨＤＬ粒子の形成において天然ＡｐｏＡ−１と相互作用する可能性がある。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、二量体形成ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域である。本発明のＡｐｏＡ−１−Ｆｃ融合分子は、ＡｐｏＡ−１コレステロール逆流出を保持し、大規模な脂質製剤化の必要性を排除しながら、ＡｐｏＡ−１半減期を延長する。加えて、Ｆｃ領域の存在は、抗体およびＦｃ融合タンパク質製造における標準的な慣例に従って、固定化されたプロテインＡを使用した精製を可能にする。
【０１２０】
ＡｐｏＡ−１の構造研究（例えば、Gogonea、Frontiers  Pharmacol.６巻：３１８頁、２０１６年を参照されたい）は、ＡｐｏＡ−１が、脂質不含単量体からより高次の形態へと成熟するにつれて、複数の立体構造を仮定することを示す。小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）に由来する近年のデータは、スーパーダブルヘリックス（ＤＳＨ）モデルと呼ばれる、脂質コアを取り巻く開放型立体配置のＡｐｏＡ−１二量体の低分解能構造を示す。ＳＡＮＳ研究による他の構造は、脂質コアの組成に応じて、異なる開放型立体配置のＡｐｏＡ−１を示す；これらの構造において、ＡｐｏＡ−１単量体のＣ末端は、互いと比べて異なる位置にある。同様に、第３のＡｐｏＡ−１単量体を取り込む球状ＡｐｏＡ−１粒子は、二量体円盤状ＡｐｏＡ−１における位置と比較して、異なる位置における各単量体のＣ末端を示す。例えば、Gogonea、上記を参照されたい。本開示の可動性リンカーは、ＡｐｏＡ−１が立体構造制約なしでこれらの位置を仮定するのに十分な長さのものである。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｐｏＡ−１−［リンカー］−［二量体形成ドメイン］分子は、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端に融合された追加的なポリペプチドセグメントを含む。このような変種は、ＡｐｏＡ−１機能活性および第２の生物学的活性を有する二重特異性分子の作製を可能にする。
【０１２２】
本発明の一部の態様では、（ｉ）コレステロール逆転送活性を有し、ＡｐｏＡ１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片、あるいはＡｐｏＡ１ミメティックのいずれかである、第１のポリペプチドセグメントと、（ｉｉ）第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端にある第２のポリペプチドセグメントであって、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、およびアミロイドベータに特異的に結合するポリペプチドから選択される第２のポリペプチドセグメントとを含む、二重特異性融合分子が提供される。このような第２のポリペプチドは、天然起源のタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片となることができる。一部の実施形態では、リンカーおよび二量体形成ドメインが、上に要約されている第１および第２のポリペプチドの間に含まれる。代替的な実施形態では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインを欠く。
【０１２３】
Ｆｃ領域を欠く本ＡｐｏＡ−１融合分子の一部の実施形態では、融合分子は、ＰＥＧにコンジュゲートして、延長された半減期をもたらすことができる。このような変種は、例えば、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、またはアミロイドベータに特異的に結合するポリペプチドを含む融合分子等、本明細書に記載されている二重特異性分子を含むことができる。
【０１２４】
上に要約されている二重特異性分子の一部の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、ＲＮａｓｅである。好まれるＲＮａｓｅは、ヒトＲＮａｓｅ  １またはその機能的バリアントもしくは断片である。特定の変種では、ＲＮａｓｅは、細胞質阻害剤による阻害に対するその感受性を保持し、細胞にとって非常に低い毒性を有するが、細胞外で高度に活性がある。ＲＮａｓｅは、炎症性細胞外ＲＮＡの消化による抗炎症特性を有し、心血管疾患（例えば、冠動脈疾患、脳卒中）、自己免疫性疾患、炎症性疾患、２型糖尿病、感染性疾患および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を含む様々な疾患の処置のための追加的な治療利益をもたらす。
【０１２５】
例えば、本明細書に記載されているＲＮａｓｅセグメントを含む二重特異性ＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、炎症性肺疾患等、例えば、炎症性疾患の処置に使用することができる。一研究は、ＲＮＡセンサーであるＴＬＲ３が、ウイルス性病原体の非存在下におけるＡＲＤＳ様病理の発症において主要な役割を有することを示した。Murrayら、Am.  J.  Respir.  Crit.  Care  Med.１７８巻：１２２７〜１２３７頁、２００８年を参照されたい。酸素療法は、ＡＲＤＳにおける主要な治療介入であるが、さらなる肺損傷およびウイルス感染に対する感受性に寄与する。酸素療法は、培養されたヒト上皮細胞における増加したＴＬＲ３発現および活性化のための主要な刺激であり、ＴＬＲ３の非存在または遮断は、高酸素条件への曝露後の肺傷害および炎症からマウスを保護した。Murrayら、上記参照。別の研究は、細胞外ＲＮＡによるＴＬＲ３活性化が、急性低酸素に応答して起こり、ＲＮａｓｅＡによるマウスにおける治療法が、急性低酸素後の肺炎症を縮小したことを示した。Biswasら、Eur.  J.  Immunol.４５巻：３１５８〜３１７３頁、２０１５年を参照されたい。本明細書に記載されているＲＮａｓｅセグメントを含む二重特異性ＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等、例えば、自己免疫性疾患の処置に使用することもできる。研究は、例えば、ＳＬＥ疾患病理発生におけるＴＬＲ７を含むＲＮＡ免疫複合体およびＲＮＡ受容体の役割、ならびにＳＬＥのマウスモデルにおけるＲＮａｓｅ過剰発現の保護効果を示す。例えば、Sunら、J.  Immunol.１９０巻：２５３６〜２５４３頁、２０１３年を参照されたい。
【０１２６】
上に要約されている二重特異性分子の他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、パラオキソナーゼである。好まれるパラオキソナーゼは、ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）またはその機能的バリアントもしくは断片である。パラオキソナーゼ二重特異性融合分子は、例えば、その粥状保護、抗酸化、抗炎症および／または神経保護特性によるものを含む、ＡｐｏＡ−１媒介性治療法を受け入れられる疾患の処置のための追加的な治療利益をもたらす。一部の代替的な実施形態では、ＰＯＮ１は、ＡｐｏＡ−１に対するその天然の高い親和性結合により、本発明のＡｐｏＡ−１融合分子に取り付けることができ、その結合は、ＰＯＮ１のＴｙｒ７１によって媒介される（Huangら、J.  Clin.  Invest.１２３巻：３８１５〜３８２８頁、２０１３年を参照）。投与に先立つ組換えまたは天然ＰＯＮ１とＡｐｏＡ−１融合分子とのインキュベートは、ＡｐｏＡ−１融合分子へのＰＯＮ１の「負荷」に十分であろう。
【０１２７】
本明細書に記載されているパラオキソナーゼセグメントを含む二重特異性ＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、自己免疫性疾患または炎症性疾患の処置に使用することができる。例えば、研究は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等、自己免疫性疾患の処置のためのパラオキソナーゼの使用を支持する。多くの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者における自己抗体力価は、ＰＯＮ１の活性の喪失と相関し（Batuklaら、Ann.  NY  Acad.  Sci.１１０８巻：１３７〜１４６頁、２００７年を参照）、ＳＬＥＤＡＩによって評価されるＳＬＥ疾患活動性およびＳＬＩＣＣ／ＡＣＲ損傷指標によって評価されるＳＬＥ疾患関連の臓器損傷は、ＰＯＮ１活性とマイナスに相関する（Ahmedら、EXCLI  Journal  １２巻：７１９〜７３２頁、２０１３年を参照）。ＰＯＮ１活性は、ＳＬＥ患者において有意に低下し、粥状動脈硬化のリスク因子である。Kissら、Ann.  NY  Acad.  Sci.１０８巻：８３〜９１頁、２００７年を参照されたい。加えて、他の研究は、炎症性肺疾患等、炎症性疾患の処置のためのパラオキソナーゼの使用を支持する。一研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および気管支拡張症を含む、硫黄マスタードガス（ＳＭ）に曝露してからかなり経った後の後期（late）肺疾患の患者が、細気管支洗浄液において有意に低下したレベルのＰＯＮ１を有する（ｐ＜０．０００１）ことを示した。Golmaneshら、Immunopharmacol.  Immunotoxical.３５巻：４１９〜４２５頁、２０１３年を参照されたい。別の研究は、２０年前にＳＭに曝露したイラン人の退役軍人が依然として、ＰＯＮ１活性の有意に低い血清レベルを有し、低いＰＯＮ１が、肺疾患重症度と相関したことを示した。Taravatiら、Immunopharmacol.  Immunotoxicol.３４巻：７０６〜７１３頁、２０１２年を参照されたい。
【０１２８】
本明細書に記載されているＲＮａｓｅセグメントまたはパラオキソナーゼセグメントのいずれかを含む二重特異性ＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、神経学的疾患の処置に使用することもできる。このような二重特異性分子は、脳に輸送され、そこで、保護性パラオキソナーゼまたはＲＮａｓｅ酵素を送達する。例えば、ＰＯＮ１は、その抗酸化特性のため、脳において保護性であり、ＲＮａｓｅは、ＴＬＲ７および他のＲＮＡ受容体の刺激により炎症を促進する細胞外ＲＮＡを消化することにより保護性である。本発明のＡｐｏＡ−１／パラオキソナーゼまたはＡｐｏＡ１／ＲＮａｓｅ二重特異性分子を使用した処置を受け入れられる例示的な神経学的疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む。
【０１２９】
本発明のＡｐｏＡ−１融合分子へのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤の取り付けは、ＭＰＯによって媒介される酸化による不活性化からＡｐｏＡ−１を保護する仕方として特に望ましくなることができ、ＰＯＮ１等のパラオキソナーゼを含む二重特異性融合ポリペプチドの文脈においては、ＭＰＯ媒介性酸化および不活性化からパラオキソナーゼを同様に保護することもできる。ＡｐｏＡ−１のミエロペルオキシダーゼ媒介性酸化は、ＡｐｏＡ−１の架橋を促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏでアテローム硬化性プラークにおいてアミロイド沈着をもたらす機構に関係づけることができる。Chanら、J.  Biol.  Chem.２９０巻：１０９５８〜７１頁、２０１５年を参照されたい。ＭＰＯ阻害剤の総説については、Malleら、Br  J  Pharmacol.１５２巻：８３８〜８５４頁、２００７年を参照されたい。本発明の分子へのＭＰＯ阻害剤の取り付けは、ＭＰＯ阻害を局在化して、抗菌活性において重要なＭＰＯ活性を保存しつつ、酸化からＡｐｏＡ−１を選択的に保護することもできる。
【０１３０】
上に要約されている二重特異性分子の他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）およびレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）から選択される。ＣＥＴＰは、ＨＤＬ粒子が、特に、コレステロールを取り外しＬＤＬに転移し、続いてＬＤＬ受容体を介して肝臓にコレステロールを戻し輸送することにより、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）のプロセスにおいて肝臓にコレステロールを送達することができる、主要な機構の１種に関与する。この取り外しプロセスは、ＣＥＴＰを必要とする。本明細書に提供されるもの等、改善されたＡｐｏＡ−１分子の送達によりＲＣＴ経路の初期部分を改善することにより、他のＲＣＴ成分の付加は、魅力的なかつ潜在的に相乗的な治療アプローチをもたらすことができる。ＡｐｏＡ−１を含有する二重特異性融合分子の形態でより多くの外因的ＣＥＴＰを提供することは、ＣＥＴＰ活性および全体的コレステロール逆転送を増強することができる。
【０１３１】
ＬＣＡＴを含有する二重特異性融合体は、内在性ＣＥＴＰを増強する代替手段をもたらすことができる。レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）は、ＨＤＬに会合し、遊離コレステロールをコレステリルエステルに変換し、続いてこれをＨＤＬ粒子内に隔離し、その球形の形成を可能にする酵素である。ＬＣＡＴを欠くマウスに与えたヒト組換えＬＣＡＴは、ＨＤＬ−Ｃレベルを有意に改善し、ヒトＡｐｏＡ−１トランスジェニックマウスに与えた場合、ＨＤＬ−Ｃの増加は８倍であり、相乗作用を示唆する。Roussetら、J  Pharmacol  Exp  Ther.３３５巻：１４０〜８頁、２０１０年を参照されたい。Ｆｃへの組換えヒトＬＣＡＴ融合が報告されており（Spahrら、Protein  Sci.２２巻：１７３９〜５３頁、２０１３年を参照）、ＡｐｏＡ−１およびＬＣＡＴの両方を含有する二重特異性分子は、どちらか単独の単一特異性タンパク質よりも効率的にＲＣＴを改善することもできる。
【０１３２】
上に要約されている二重特異性分子の他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである。特異的な変種では、第２のポリペプチドは、例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、Ａβ特異的単鎖抗体である。アミロイドベータペプチドに特異的なｓｃＦｖは、例えば、Cattepoelら、PLoS  One  ６巻：ｅ１８２９６頁、２０１１年によって記載されている。このような実施形態では、Ａβ結合ポリペプチドは、典型的に、ＡｐｏＡ−１に対しＣ末端に、または存在する場合は二量体形成ドメインに対しＣ末端に融合される。この二重特異性融合分子は、アルツハイマー病患者の治療法のための改善された特性を有する。
ＩＩ．融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質
【０１３３】
したがって、一態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄを含む融合ポリペプチドであって、式中、ＡｐｏＡ１は、コレステロール流出活性を有する第１のポリペプチドセグメントであり、これは、（ｉ）天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片および（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択され；Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは、二量体形成ドメインである、融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントをさらに含む。特定の変種では、第２のポリペプチドセグメントは、（ａ）天然起源のＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）もしくはレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；（ｂ）（ａ）に特定されている天然起源のタンパク質のいずれかの機能的バリアントもしくは断片；または（ｃ）例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである。第２のポリペプチドセグメントを含むこのような融合ポリペプチドは、式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ（アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと）によって表すことができ、式中、ＡｐｏＡ１、Ｌ１およびＤはそれぞれ、以前に定義された通りであり、Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、任意選択で存在し、Ｐは、第２のポリペプチドセグメントである。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、コレステロール流出活性を有する第１のポリペプチドセグメントであって、（ｉ）天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片および（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択される第１のポリペプチドセグメントと、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントであって、（ａ）天然起源のＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）もしくはレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；（ｂ）（ａ）に特定されている天然起源のタンパク質のいずれかの機能的バリアントもしくは断片；または（ｃ）例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである第２のポリペプチドセグメントとを含む融合ポリペプチドを提供する。一部の変種では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、第２のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、例えば、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、第２のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置する二量体形成ドメインをさらに含む。
【０１３５】
上に特定されている特定の天然起源のタンパク質の機能的バリアントは、天然タンパク質に対応する関連性のある生物学的または生化学的活性に関してバリアントを評価するためのルーチンアッセイを使用して容易に同定することができる。例えば、ＡｐｏＡ−１の場合は、バリアントは、本明細書に記載されているもの等、公知のコレステロール流出アッセイを使用して、コレステロール流出を誘導するその能力に関してアッセイすることができる。例えば、Tangら、J  Lipid  Res.４７巻：１０７〜１４頁、２００６年を参照されたい。ヒトＲＮａｓｅ  １等、ＲＮａｓｅの場合は、バリアントは、リボヌクレアーゼ活性を評価するための公知のアッセイによって、一本鎖または二本鎖ＲＮＡを消化するその能力に関してアッセイすることができる。例えば、LibonatiおよびSorrentino、Methods  Enzymol.３４１２３４〜２４８頁、２００１年を参照されたい。パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）バリアントは、基質としてジエチルｐ−リン酸ニトロフェノール（パラオクソン）を使用してホスホトリエステラーゼ活性に関して、または基質として酢酸フェニルを使用してアリールエステラーゼ活性に関してアッセイすることができる。例えば、GravesおよびScott、Curr  Chem  Genomics  ２巻：５１〜６１頁、２００８年を参照されたい。関連性のあるＣＥＴＰおよびＬＣＡＴ活性を評価するためのアッセイも公知である。例えば、ＬＣＡＴおよびＣＥＴＰ酵素活性を測定するためのアッセイは、市販されており、例えば、ＬＣＡＴについてはＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＴＡ−６１５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＫ１０７およびＲｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＢ−ＬＣＡＴ、ならびにＣＥＴＰについてはＡｂｃａｍ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ６５３８３およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＫ１０６を含む。
【０１３６】
Ａβ結合活性の場合は、例えば、単鎖抗体等のポリペプチドは、様々な公知のアッセイのいずれかを使用して、結合活性に関して評価することができる。例えば、あるアッセイ系は、市販のバイオセンサー機器（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用い、それによると、結合タンパク質（例えば、抗体等のＡβ結合候補）が、センサーチップの表面に固定化され、可溶性抗原（例えば、Ａβペプチド）を含有する被験試料が、セルを通過させられる。固定化されたタンパク質は、抗原に対し親和性を有する場合、抗原に結合し、媒体の屈折率に変化を引き起こし、これは、金膜の表面プラズモン共鳴の変化として検出されるであろう。この系は、オンおよびオフレートの決定を可能にし、そこから結合親和性を計算することができ、結合の化学量論の評価ができる。この機器の使用は、例えば、Karlsson（J.  Immunol.  Methods  １４５巻：２２９〜２４０頁、１９９１年）ならびにCunninghamおよびWells（J.  Mol.  Biol.２３４巻：５５４〜５６３頁、１９９３年）によって開示されている。Ａβ結合ポリペプチドは、本技術分野で公知の他のアッセイ系内で使用することもできる。そのような系は、結合親和性の決定のためのＳｃａｔｃｈａｒｄ解析（Scatchard、Ann.  NY  Acad.  Sci.５１巻：６６０〜６７２頁、１９４９年を参照）および熱量測定アッセイ（Cunninghamら、Science  ２５３巻：５４５〜５４８頁、１９９１年；Cunninghamら、Science  ２５４巻：８２１〜８２５頁、１９９１年を参照）を含む。
【０１３７】
本発明に従った使用のための天然起源のポリペプチドセグメント（例えば、天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチド、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼまたは血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）は、例えば、本開示と一貫した対立遺伝子バリアントおよび種間ホモログ等、天然起源のバリアントを含む。
【０１３８】
特定の参照ポリペプチド（例えば、野生型ヒトＡｐｏＡ−１）の機能的バリアントは一般に、参照ポリペプチドと比べて１個または複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、主要でない性質のものであり、これは、保存的アミノ酸置換（例えば、いくつかの例示的な保存的アミノ酸置換を収載する表２、下記を参照されたい）およびタンパク質またはポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意に影響を与えない他の置換；小型の欠失、典型的には、１〜約３０アミノ酸の；ならびにアミノ末端メチオニン残基等、小型のアミノもしくはカルボキシル末端伸長、小型のリンカーペプチド、またはポリヒスチジントラクト（tract）、プロテインＡ（Nilssonら、EMBO  J.４巻：１０７５頁、１９８５年；Nilssonら、Methods  Enzymol.１９８巻：３頁、１９９１年）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene  ６７巻：３１頁、１９８８年）、もしくは他の抗原性エピトープもしくは結合ドメイン等、精製を容易にする小型の伸長（親和性タグ）である（全般的には、Fordら、Protein  Expression  and  Purification  ２巻：９５〜１０７頁、１９９１年を参照）。親和性タグをコードするＤＮＡは、商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手することができる。保存的置換は、次から選択することもできる：１）アラニン、グリシン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン；４）アルギニン、リシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン；６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；７）セリン、スレオニン；および８）システイン、メチオニン（例えば、Creighton、Proteins（１９８４年）を参照されたい）。
【表２】
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【０１３９】
天然起源のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発等、本技術分野で公知の手順に従って同定することができる（CunninghamおよびWells、Science  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁、１９８９年；Bassら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８８巻：４４９８〜４５０２頁、１９９１年）。後者の技法では、単一のアラニン突然変異が、分子中の全ての残基に導入され、その結果得られる突然変異体分子が、生物学的活性（例えば、ＡｐｏＡ−１バリアントのコレステロール流出）に関して検査されて、分子の活性にとって重大な意味を持つアミノ酸残基を同定する。加えて、関連性のあるタンパク質相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識等の技法によって決定される結晶構造の解析によって決定することができる。必須アミノ酸の同一性は、関連タンパク質（例えば、同じタンパク質機能を保持する種オルソログ）との相同性の解析から推論することもできる。
【０１４０】
Reidhaar-OlsonおよびSauer、Science  ２４１巻：５３〜５７頁、１９８８年またはBowieおよびSauer、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：２１５２〜２１５６頁、１９８９年によって開示されている方法等、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を使用して、複数のアミノ酸置換を作製し検査することができる。簡潔に説明すると、これらの著者らは、ポリペプチドにおける２個またはそれを超える位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、続いて突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置における許容可能な置換の範囲を決定するための方法を開示する。使用することができる別の方法は、領域指定突然変異誘発である（Derbyshireら、Gene  ４６巻：１４５頁、１９８６年；Nerら、DNA  ７巻：１２７頁、１９８８年）。
【０１４１】
バリアントヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ＤＮＡシャッフリングにより生成することもできる（例えば、Stemmer、Nature  ３７０巻：３８９頁、１９９４年；Stemmer、Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA  ９１巻：１０７４７頁、１９９４年；国際公開番号ＷＯ９７／２００７８を参照）。簡潔に説明すると、バリアントＤＮＡ分子は、親ＤＮＡをランダムに断片化し、続いてＰＣＲを使用して再集合し、ランダムに導入された点突然変異をもたらすことによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換えによって生成される。この技法は、対立遺伝子バリアントまたは異なる種由来のＤＮＡ分子等、親ＤＮＡ分子のファミリーを使用することにより修飾して、このプロセスに追加的な可変性を導入することができる。所望の活性の選択またはスクリーニングと、続く突然変異誘発およびアッセイの追加的な反復は、望ましい突然変異を選択しつつ、同時に有害な変化を除外選択することにより、配列の急速な「進化」をもたらす。
【０１４２】
以前に記述された通り、本発明に従ったポリペプチド融合体は、特定のポリペプチドの「機能的断片」に対応するポリペプチドセグメントを含むことができる。核酸分子のルーチンの欠失解析を行って、所定のポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。例証として、配列番号１の残基７０〜８１６のヌクレオチド配列を有するＡｐｏＡ−１コードＤＮＡ分子は、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、一連のネステッド（nested）欠失を得ることができる。次に、断片を適正な読み枠で発現ベクターに挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、コレステロール流出を誘導する能力に関して検査する。エキソヌクレアーゼ消化の代替の１つは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を使用して、欠失または終止コドンを導入して、所望の断片の産生を特定することである。あるいは、ポリペプチドをコードする遺伝子の特定の断片は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成することができる。
【０１４３】
したがって、上に記す等の方法を使用して、当業者は、（ｉ）参照ポリペプチド（例えば、ヒト野生型ＡｐｏＡ−１ポリペプチドについては、配列番号２の残基１９〜２６７または２５〜２６７）と実質的に同一であり、（ｉｉ）参照ポリペプチドの所望の機能特性を保持する、様々なポリペプチドを調製することができる。
【０１４４】
本発明で使用されるポリペプチドセグメント（例えば、ＡｐｏＡ−１、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、例えば、Ｆｃ断片等の二量体形成ドメインに対応するポリペプチドセグメント）は、様々な種から得ることができる。タンパク質が、ヒトにおいて治療用に使用されるべきである場合、ヒトポリペプチド配列が用いられることが好まれる。しかし、バリアント配列と同様に、非ヒト配列を使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断使用および獣医学使用を含む他の使用のために、ヒトまたは非ヒト動物由来のポリペプチド配列を用いることができるが、患者と同じ種由来の配列が、ｉｎ  ｖｉｖｏ獣医学使用または分子間反応の種特異性が存在する場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に好まれることがある。よって、本発明の使用のためのポリペプチドセグメントは、限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ類および鳥類ポリペプチドならびにこれらのバリアントとなることができる。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、ヒト野生型ＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、配列番号２のアミノ酸残基１９〜２６７または２５〜２６７と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特異的な変種では、成熟ヒト野生型ＡｐｏＡ−１の位置１５６に対応するアミノ酸位置におけるバリンは、リシンによって置き換えられている、および／または成熟ヒト野生型ＡｐｏＡ−１の位置１７３に対応するアミノ酸位置におけるアルギニンは、システインによって置き換えられている（それぞれ本明細書において、Ｖ１５６ＫおよびＲ１７３Ｃバリアントまたは突然変異とも称される）。成熟ヒト野生型ＡｐｏＡ−１の位置１５６は、配列番号２のアミノ酸位置１８０に対応し、成熟ヒト野生型ＡｐｏＡ−１の位置１７３は、配列番号２のアミノ酸位置１９７に対応する。Ｖ１５６ＫおよびＲ１７３Ｃ突然変異は、野生型ＡｐｏＡ−１と比較して、アテローム硬化性マウスにおいて改善された活性および半減期を有する。Choら、Exp  Mol  Med  ４１巻：４１７頁、２００９年を参照されたい。
【０１４６】
他の実施形態では、第１のポリペプチドセグメントは、例えば、４Ｆペプチド等、ＡｐｏＡ−１ミメティックである（Songら、Int.  J.  Biol.  Sci.５巻：６３７〜６４６頁、２００９年を参照）。ＡｐｏＡ−１ミメティックは、一般に、本技術分野で公知であり、Reddyら、Curr.  Opin.  Lipidol.２５巻：３０４〜３０８頁、２０１４年に総説が記載されている。
【０１４７】
第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側（例えば、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側）の第２のポリペプチドセグメントを含むある特定の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、ＲＮａｓｅである。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅは、ヒトＲＮＡｓｅ  １またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号４のアミノ酸残基５４２〜６７５と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号４のアミノ酸残基５４２〜６７５と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号４のアミノ酸残基５４２〜６７５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側（例えば、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側）の第２のポリペプチドセグメントを含む他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、パラオキソナーゼである。一部の実施形態では、パラオキソナーゼは、ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜３５５、配列番号４２のアミノ酸残基１６〜３５５または配列番号４４のアミノ酸残基１６〜３５５と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜３５５、配列番号４２のアミノ酸残基１６〜３５５または配列番号４４のアミノ酸残基１６〜３５５と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜３５５、配列番号４２のアミノ酸残基１６〜３５５または配列番号４４のアミノ酸残基１６〜３５５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側（例えば、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側）の第２のポリペプチドセグメントを含むなお他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）である。一部の実施形態では、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼは、ヒトＰＡＦ−ＡＨまたはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３２のアミノ酸残基２２〜４４１と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３２のアミノ酸残基２２〜４４１と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３２のアミノ酸残基２２〜４４１と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側（例えば、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側）の第２のポリペプチドセグメントを含むさらに他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）である。一部の実施形態では、コレステロールエステル転送タンパク質は、ヒトＣＥＴＰまたはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３０のアミノ酸残基１８〜４９３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３０のアミノ酸残基１８〜４９３と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、第２のポリペプチドセグメントは、配列番号３０のアミノ酸残基１８〜４９３と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
本発明に従った使用のためのポリペプチドリンカーは、天然起源、合成または両者の組合せとなることができる。リンカーは、２個の別々のポリペプチド領域（例えば、二量体形成ドメインおよびＡｐｏＡ−１ポリペプチド）を連接し、より長いポリペプチドの別々のかつ個別のドメインとして連結されたポリペプチド領域を維持する。リンカーは、別々の個別のドメインが、別々の特性を維持しながら、協働することを可能にすることができる（例えば、ＡｐｏＡ−１ポリペプチドに連結されたＦｃ領域二量体形成ドメインの場合は、Ｆｃ領域のためにＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ）結合を維持することができる一方で、ＡｐｏＡ−１ポリペプチドの機能特性（例えば、脂質結合）が維持されるであろう）。異種ポリペプチドを接続するための天然起源および人工のペプチドリンカーの使用の例については、例えば、Hallewellら、J.  Biol.  Chem.２６４巻、５２６０〜５２６８頁、１９８９年；Alfthanら、Protein  Eng.８巻、７２５〜７３１頁、１９９５年；RobinsonおよびSauer、Biochemistry  ３５巻、１０９〜１１６頁、１９９６年；Khandekarら、J.  Biol.  Chem.２７２巻、３２１９０〜３２１９７頁、１９９７年；Faresら、Endocrinology  １３９巻、２４５９〜２４６４頁、１９９８年；Smallshawら、Protein  Eng.１２巻、６２３〜６３０頁、１９９９年；米国特許第５，８５６，４５６号を参照されたい。
【０１５２】
典型的には、リンカーポリペプチド内の残基は、全体的な親水性特徴をもたらし、非免疫原性および可動性となるように選択される。本明細書において使用される場合、「可動性」リンカーは、溶液における実質的に安定したより高次の立体構造を欠くリンカーであるが、局所的安定性の領域は容認できる。一般に、小型、極性および親水性の残基が好まれ、かさばったおよび疎水性の残基は望ましくない。局所的電荷の区域は回避するべきである；リンカーポリペプチドが、荷電残基を含む場合、これは通常、ポリペプチドの小型の領域内に正味の中性電荷をもたらすように配置されるであろう。したがって、荷電残基を反対の電荷の残基に隣接して置くことが好まれる。一般に、リンカーポリペプチド内の包含に好まれる残基は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎを含み；より好まれる残基は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒを含み；最も好まれる残基は、ＧｌｙおよびＳｅｒである。一般に、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基は回避されるであろう（リンカーの免疫グロブリンヒンジ領域内に存在する場合を除き）、その理由として、Ｐｒｏ残基は、その疎水性および可動性の欠如のため、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基は、潜在的な免疫原性のためである。リンカーの配列は、また、望まれないタンパク質分解を回避するように設計されるであろう。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、リンカーＬ１は、少なくとも２または少なくとも３個のアミノ酸残基（例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１６、少なくとも２６または少なくとも３６個のアミノ酸残基）を含む。特定の変種では、Ｌ１は、２〜６０個のアミノ酸残基、３〜６０個のアミノ酸残基、５〜４０個のアミノ酸残基または１５〜４０個のアミノ酸残基からなる。他の変種では、Ｌ１は、２〜５０、２〜４０、２〜３６、２〜３５、２〜３０、２〜２６、３〜５０、３〜４０、３〜３６、３〜３５、３〜３０、３〜２６、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３６、５〜３５、５〜３０、５〜２６、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３６、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２６、１５〜６０、１５〜５０、１５〜３６、１５〜３５、１５〜３０または１５〜２６個のアミノ酸残基からなる。他の変種では、Ｌ１は、１６〜６０、１６〜５０、１６〜４０または１６〜３６個のアミノ酸残基からなる。なお他の変種では、Ｌ１は、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３６、２５〜６０、２５〜５０、２５〜４０または２５〜３６個のアミノ酸残基からなる。さらに他の変種では、Ｌ１は、２６〜６０、２６〜５０、２６〜４０または２６〜３６個のアミノ酸残基からなる。より特異的な変種では、Ｌ１は、１６個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基または３６個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２の残基２６８〜２９３、配列番号２６の残基２６８〜２８８、配列番号２２の残基２６８〜２８３、配列番号５４、または配列番号２４の残基２６８〜３０３に示すアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０１５４】
例示的なＬ２リンカーは、少なくとも３個のアミノ酸残基を含み、典型的には、最大６０個のアミノ酸残基である。ある特定の変種では、Ｌ２リンカーは、Ｌ１に関する上述の通りの配列長さの範囲を有する。式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含み、式中、Ｌ２が存在し、ＰがＲＮａｓｅであるポリペプチドの特異的な実施形態では、Ｌ２は、配列番号４の残基５２６〜５４１に示すアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン残基（reside）を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、Ｌ１）は、複数のグリシン残基および任意選択で、少なくとも１個のセリン残基を含む。特定の変種では、ポリペプチドリンカー（例えば、Ｌ１）は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１５）を含み、例えば、配列番号１５のアミノ酸配列の２個またはそれを超えるタンデムリピート等が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（［配列番号１５］ｎ）を含み、式中、ｎは、例えば、１〜５、２〜５、３〜５、１〜６、２〜６、３〜６または４〜６の整数等、正の整数である。式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎを含むポリペプチドリンカーの特異的な変種では、ｎは、４である。式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎを含むポリペプチドリンカーの別の特異的な変種では、ｎは、３である。式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎを含むポリペプチドリンカーのさらに別の特異的な変種では、ｎは、５である。式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎを含むポリペプチドリンカーのさらに別の特異的な変種では、ｎは、６である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカー（例えば、本明細書に記載されているポリペプチドリンカー配列のいずれか）の２個の他の配列の間に挿入された、一連のグリシンおよびセリン残基（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ、式中、ｎは、上述の通りに定義されている）を含む。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカー（例えば、本明細書に記載されているポリペプチドリンカー配列のいずれか）の別の配列の一方または両方の末端に取り付けられた、グリシンおよびセリン残基（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ、式中、ｎは、上述の通りに定義されている）を含む。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、上部ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）の少なくとも部分、中央ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）の少なくとも部分、ならびに一連のグリシンおよびセリンアミノ酸残基（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ、式中、ｎは、上述の通りに定義されている）を含む。
【０１５６】
別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、非天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、免疫グロブリンに天然に存在しないヒンジ領域、および／または天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域とはアミノ酸配列が異なるように変更されたヒンジ領域を含む。一実施形態では、突然変異をヒンジ領域に作製して、ポリペプチドリンカーを作製することができる。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、天然起源の数のシステインを含まないヒンジドメインを含む、すなわち、ポリペプチドリンカーは、天然起源のヒンジ分子よりも少ないシステインまたはより多い数のシステインのいずれかを含む。
【０１５７】
様々な二量体形成ドメインが、本明細書に記載されている融合ポリペプチドおよび二量体融合タンパク質に従った使用に適している。ある特定の実施形態では、二量体形成ドメインは、Ｆｃ領域等、免疫グロブリン重鎖定常領域である。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域となることができる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、１種または複数のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の一方または両方）を欠く。
【０１５８】
一部の実施形態では、二量体形成ドメインは、Ｎ２９７（ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のためのＥＵナンバリング）（配列番号２のアミノ酸位置３７５に対応）が挙げられるがこれに限定されない、分子がグリコシル化されないようにＣＨ２領域に突然変異を有するヒト抗体のＦｃ領域である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の３個のシステイン（Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９）をそれぞれセリンに変化させ、ＣＨ２ドメインの位置２３８におけるプロリンをセリンに変化させた、ヒトＩｇＧ１（γ１）である。別の好まれる実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７を他の任意のアミノ酸に変化させた、ヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ位置２９２〜３００の間に１個または複数のアミノ酸置換を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、残基２９２〜３００の間の任意の位置に１個または複数のアミノ酸付加または欠失を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＣＣヒンジ（すなわち、システインＣ２２０がセリンに変化され、Ｅｕ位置２２６および２２９のそれぞれにシステインを有する）またはＳＳＳヒンジ（すなわち、Ｅｕ位置２２０、２２６および２２９における３個のシステインのそれぞれが、セリンに変化された）を有するヒトγ１である。さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＣＣヒンジおよびＰ２３８突然変異を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、半減期に重要なＦｃＲｎ結合に影響を与えることなく、Ｆｃガンマ受容体（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）による結合を変更する突然変異を有するヒトγ１である。さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、EhrhardtおよびCooper、Curr.  Top.  Microbiol.  Immunol.２０１０年８月３日（Immunoregulatory  Roles  for  Fc  Receptor-Like  Molecules）；Davisら、Ann.  Rev.  Immunol.２５巻：５２５〜６０頁、２００７年（Fc  receptor-like  molecules）；またはSwainsonら、J.  Immunol.１８４巻：３６３９〜４７頁、２０１０年に開示されている通りである。
【０１５９】
Ｆｃ二量体形成ドメインを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、融合タンパク質の抗原非依存性エフェクター機能を変更するアミノ酸置換を含む。一部のこのような実施形態では、Ｆｃ領域は、その結果得られる分子の循環半減期を変更するアミノ酸置換を含む。このような抗体誘導体は、そのような置換を欠く抗体と比較して、ＦｃＲｎへの結合の増加または減少のいずれかを示し、したがって、それぞれ増加または減少した血清中半減期を有する。ＦｃＲｎに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、より長い血清半減期を有することが期待され、このような抗体は、投与された抗体の長い半減期が所望される場合の、哺乳動物を処置する方法において有用な適用を有する。対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントは、より短い半減期を有することが予想され、このような抗体は、また、例えば、短縮された循環時間が有利となり得る場合の、例えば、出発抗体が、循環中に延長された期間存在すると有毒な副作用を有する場合の、哺乳動物への投与に有用である。減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントは、また、胎盤を通過する可能性が低いことから、妊婦における疾患または障害の処置においても有用である。加えて、低下したＦｃＲｎ結合親和性が所望され得る他の適用は、脳、腎臓および／または肝臓への局在化が所望される適用を含む。例示的な一実施形態では、本発明の抗体は、脈管構造から腎臓糸球体の上皮を越えた輸送の低下を示す。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、脳から血管空間への血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた輸送の低下を示す。一実施形態では、変更されたＦｃＲｎ結合を有する融合タンパク質は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１個または複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。ＦｃＲｎ結合活性を変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込む、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４７３２７に開示されている。
【０１６０】
他の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、例えば、野生型Ｆｃ領域と比較して、ポリペプチドの抗原依存性エフェクター機能、特に、ＡＤＣＣまたは補体活性化を変更するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。例示的な実施形態では、このような融合ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ、例えば、ＣＤ１６）への結合の変更を示す。このような融合ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、ＦｃγＲへの結合の増加または減少のいずれかを示し、したがって、それぞれ増強または低下したエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、エフェクター機能を増強することが期待され、このような融合タンパク質は、標的分子破壊が所望される場合の、哺乳動物を処置する方法における有用な適用を有する。対照的に、減少したＦｃγＲ結合親和性を有するＦｃバリアントは、エフェクター機能を低下させることが予想され、このような融合タンパク質も、例えば、正常細胞が標的分子を発現し得る場合の、または抗体の慢性投与が望まれない免疫系活性化をもたらし得る場合の、例えば、標的細胞破壊が望ましくない状態の処置に有用である。一実施形態では、Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、オプソニン作用、ファゴサイトーシス、補体依存性細胞傷害、抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）またはエフェクター細胞モジュレーションからなる群から選択される少なくとも１種の変更された抗原依存性エフェクター機能を示す。
【０１６１】
一実施形態では、Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合の変更を示す。別の実施形態では、融合タンパク質は、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）に対する結合親和性の変更を示す。ＦｃＲまたは補体結合活性を変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込む、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０６３８１５に開示されている。
【０１６２】
Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含むこともできる。例えば、融合タンパク質のＦｃドメインは、グリコシル化（例えば、ＮまたはＯ結合型グリコシル化）の低下をもたらす突然変異を有することができる、または野生型Ｆｃドメインの変更されたグリコフォーム（例えば、低フコースまたはフコース不含グリカン）を含むことができる。別の実施形態では、分子は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ結合型グリコシル化モチーフの付近にまたはその内にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低下または変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込む、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０１８５７２および米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号に開示されている。
【０１６３】
当業者であれば、文脈がそれ以外のことを明らかに示さない限り、本明細書に記載されているＦｃバリアントの様々な実施形態を、本発明の融合ポリペプチドにおいて組み合わせることができることを理解できよう。
【０１６４】
一部の実施形態では、二量体形成ドメインは、（ｉ）配列番号２の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４または（ｉｉ）配列番号１３の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４に示す配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域である。なお他の実施形態では、Ｆｃ領域は、（ｉ）配列番号２の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４または（ｉｉ）配列番号１３の残基２９４〜５２５もしくは２９４〜５２４に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
上述の通りのＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９または（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０の残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２の残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２６の残基１９〜５２０、１９〜５１９、２５〜５２０もしくは２５〜５１９または（ｖｉ）配列番号２４の残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
上述の通りのＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含み、式中、Ｐが、ＲＮａｓｅである融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
上述の通りのＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含み、式中、Ｐが、パラオキソナーゼである融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３または（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８の残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３または（ｉｖ）配列番号４８の残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
上述の通りのＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含み、式中、Ｐが、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）である融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３４の残基１９〜９６３または２５〜９６３に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
上述の通りのＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含み、式中、Ｐが、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）である融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４０の残基１９〜１０１９または２５〜１０１９に示すアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
本発明は、上述の通りの第１および第２のポリペプチド融合体を含む二量体タンパク質も提供する。したがって、別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、第１および第２のポリペプチド融合体のそれぞれが、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄを含み、式中、ＡｐｏＡ１は、コレステロール流出活性を有する第１のポリペプチドセグメントであり、これは、（ｉ）天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片および（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択され；Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは、二量体形成ドメインである、二量体タンパク質を提供する。一部の実施形態では、第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側に位置する第２のポリペプチドセグメントをさらに含む。特定の変種では、第２のポリペプチドセグメントは、（ａ）天然起源のＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）もしくはレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；（ｂ）（ａ）に特定されている天然起源のタンパク質のいずれかの機能的バリアントもしくは断片；または（ｃ）例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである。第２のポリペプチドセグメントを含むこのような融合ポリペプチドは、式ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ（アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと）によって表すことができ、式中、ＡｐｏＡ１、Ｌ１およびＤはそれぞれ、以前に定義された通りであり、Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、任意選択で存在し、Ｐは、第２のポリペプチドセグメントである。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、第１のポリペプチドセグメント、第２のポリペプチドセグメントおよび二量体形成ドメインを含み、第１のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、（ｉ）天然起源のＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片および（ｉｉ）ＡｐｏＡ−１ミメティックから選択され、第２のポリペプチドセグメントが、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、（ａ）天然起源のＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）もしくはレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、（ｂ）（ａ）に特定されている天然起源のタンパク質のいずれかの機能的バリアントもしくは断片または（ｃ）例えば、Ａβ特異的ｓｃＦｖ等、アミロイドベータ（Ａβ）に特異的に結合するポリペプチドである、二量体タンパク質を提供する。一部の実施形態では、二量体形成ドメインは、第１のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、第２のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置する。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはＡｐｏＡ−１ミメティックに対しカルボキシル末端側に連結された免疫グロブリン重鎖を含む第１の融合ポリペプチドと、（ｂ）ＡｐｏＡ−１ポリペプチドまたはＡｐｏＡ−１ミメティックに対しカルボキシル末端側に連結された免疫グロブリン軽鎖を含む第２の融合ポリペプチドを提供する。第１および第２の融合ポリペプチドを同時発現させて、２個のダブルベルトＡｐｏＡ−１二量体で構成された安定した四量体であって、ＡｐｏＡ−１と重鎖の間およびＡｐｏＡ−１と軽鎖の間のリンカーが、コレステロール流出およびコレステロール逆転送を可能にするのに十分な長さのものである、四量体を作製することができる。
【０１７３】
二量体融合タンパク質を含む本発明の融合ポリペプチドは、エフェクター部分にさらにコンジュゲートすることができる。エフェクター部分は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識等の標識部分、ＴＬＲリガンドもしくは結合ドメイン、酵素、または治療部分を含む、任意の数の分子となることができる。特定の実施形態では、エフェクター部分は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤である。ＭＰＯ阻害剤は、一般に公知であり（例えば、Malleら、Br  J  Pharmacol.１５２巻：８３８〜８５４頁、２００７年を参照）、本明細書に記載されている通り融合ポリペプチドに容易にコンジュゲートすることができる。例示的なＭＰＯ阻害剤は、３−アルキルインドール誘導体に基づく阻害剤（Soubhyeら、J  Med  Chem  ５６巻：３９４３〜５８頁、２０１３年を参照；ＭＰＯの高度かつ選択的な阻害（ＩＣ５０＝１８ｎＭ）を有する化合物を含む、選択的かつ高度に強力なミエロペルオキシダーゼ阻害剤としての３−アルキルインドール誘導体の研究について記載）；３−（アミノアルキル）−５−フルオロインドールに基づく阻害剤（Soubhyeら、J  Med  Chem  ５３巻：８７４７〜８７５９頁、２０１０年を参照）；２Ｈ−インダゾールおよび１Ｈ−インダゾロンに基づく阻害剤（Rothら、Bioorg  Med  Chem  ２２巻：６４２２〜６４２９頁、２０１４年を参照；２Ｈ−インダゾールおよび１Ｈ−インダゾロンの評定ならびにＩＣ５０値＜１μＭを有する化合物の同定について記載）；ならびに安息香酸ヒドラジド含有化合物（Huangら、Arch  Biochem  Biophys  ５７０巻：１４〜２２頁、２０１５年を参照；エステル結合の切断によってより大型の重鎖からＭＰＯの軽鎖サブユニットが取り除かれる、安息香酸ヒドラジド含有化合物によるＭＰＯの不活性化を示す）を含む。
【０１７４】
別の実施形態では、二量体融合タンパク質を含む本発明の融合ポリペプチドは、例えば、血清半減期を延長するために融合タンパク質に少なくとも１分子を取り付けることによる等、半減期を延長するように修飾される。取り付けのためのこのような分子は、例えば、ポリエチレン（polyethlyene）グリコール（ＰＥＧ）基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、またはこれらの組合せを含むことができる。このような修飾のための方法は、本技術分野で一般に周知である。本明細書において使用される場合、単語「取り付けた」は、共有結合によりまたは非共有結合によりコンジュゲートされた物質を指す。コンジュゲーションは、遺伝子工学または化学的手段によるものであり得る。
ＩＩＩ．ポリペプチド融合体および二量体タンパク質を作製するための材料および方法
【０１７５】
本発明は、上に開示されている融合ポリペプチドをコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチド分子も提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖分子の両方を含む。核酸の組換え操作のための公知の方法を使用して、融合ポリペプチドの様々なセグメント（例えば、Ｆｃ断片等、二量体形成ドメイン；ＡｐｏＡ１およびＰポリペプチドセグメント）をコードするポリヌクレオチドを生成し、一体に連結して、本明細書に記載されている融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを形成することができる。
【０１７６】
ＡｐｏＡ−１、ＲＮａｓｅｓ（例えば、ＲＮａｓｅ  １）、パラオキソナーゼ（例えば、ＰＯＮ１）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）およびレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）をコードするＤＮＡ配列は、本技術分野で公知である。様々な二量体形成ドメイン（例えば、Ｆｃ断片等、免疫グロブリン重鎖定常領域）をコードするＤＮＡ配列も公知である。組換え抗体発現ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ発現ライブラリー）のスクリーニング等、本技術分野で周知の技法を使用して、例えば、ｓｃＦｖを含むＡβ結合抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドも容易に同定可能である。これらのポリペプチドのいずれかをコードする追加的なＤＮＡ配列は、当業者であれば、遺伝暗号に基づき容易に生成することができる。対応するＲＮＡ配列は、Ｔに代えてＵを置換することによって生成することができる。当業者であれば、遺伝暗号の縮重を考慮して、所定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の間で相当な配列変種が可能であることを容易に認識するであろう。このようなポリペプチドの機能的バリアントおよび断片をコードするＤＮＡおよびＲＮＡを、ポリヌクレオチド配列に変種を導入するための公知の組換え方法を使用して得ることもでき、コードされたポリペプチドの発現と、適切なスクリーニングアッセイを使用した機能活性（例えば、コレステロール流出）の決定が続く。
【０１７７】
ＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法は、本技術分野で周知である。例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンは、目的のポリペプチドをコードする大量のＲＮＡを産生する組織または細胞から単離されたＲＮＡから調製することができる。全ＲＮＡは、グアニジンＨＣｌ抽出に続くＣｓＣｌ勾配における遠心分離による単離を使用して調製することができる（Chirgwinら、Biochemistry  １８巻：５２〜９４頁、１９７９年）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、AvivおよびLeder（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ６９巻：１４０８〜１４１２頁、１９７２年）の方法を使用して、全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡは、公知の方法を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製される。代替法において、ゲノムＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを同定および単離するための方法は、周知かつ当業者のレベルの範囲内にあり、ライブラリーをプローブ探索またはプライマー探索するための本明細書に開示されている配列またはその一部の使用を含む。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、Mullis、米国特許第４，６８３，２０２号）によって同定および単離される。目的のポリペプチドに対する抗体、受容体断片または他の特異的結合パートナーにより、発現ライブラリーをプローブ探索することができる。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドは、自動合成によって調製することもできる。短い二本鎖セグメント（６０〜８０ｂｐ）の産生は、技術的に単純明快であり、相補鎖を合成し、続いて両鎖をアニーリングすることにより達成することができる。より長いセグメント（典型的には＞３００ｂｐ）は、２０〜１００ヌクレオチドの長さの一本鎖断片からモジュラー形態にアセンブルされる。ポリヌクレオチドの自動合成は、当業者のレベルの範囲内にあり、適した機器および試薬は、商業的供給業者から入手できる。全般的には、GlickおよびPasternak、Molecular  Biotechnology,  Principles  &  Applications  of  Recombinant  DNA、ASM  Press、Washington,  D.C.、１９９４年；Itakuraら、Ann.  Rev.  Biochem.５３巻：３２３〜３５６頁、１９８４年；ならびにClimieら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８７巻：６３３〜６３７頁、１９９０年を参照されたい。
【０１７９】
別の態様では、融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質を含む、本発明のポリペプチド融合体を産生するための材料および方法が提供される。融合ポリペプチドは、従来の技法に従って遺伝子操作された宿主細胞において産生することができる。適した宿主細胞は、外因的ＤＮＡにより形質転換またはトランスフェクトし、培養下で育成することができる細胞型であり、細菌、真菌細胞および培養高等真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に、培養哺乳動物細胞を含む。クローニングされたＤＮＡ分子を操作し、外因的ＤＮＡを様々な宿主細胞に導入するための技法は、Sambrookら、Molecular  Cloning:    A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、１９８９年およびAusubelら編、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Green  and  Wiley  and  Sons、NY、１９９３年によって開示されている。
【０１８０】
一般に、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内で、転写プロモーターおよびターミネーターを一般に含む、その発現に必要とされる他の遺伝的エレメントに作動可能に連結される。ベクターは、１種または複数の選択可能マーカーおよび１種または複数の複製起点も一般的に含有するであろうが、当業者であれば、ある特定の系の内において、選択可能マーカーを別々のベクターに配置することができ、外因的ＤＮＡの複製は、宿主細胞ゲノムへの組込みによって行うことができることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者のレベルの範囲内にあるルーチンの設計の問題である。多くのこのようなエレメントは、文献に記載されており、商業的供給業者を介して入手できる。
【０１８１】
宿主細胞の分泌性経路へとＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドを方向づけるために、分泌性シグナル配列が、発現ベクターに配置される。分泌性シグナル配列は、ネイティブＡｐｏＡ−１ポリペプチドのものであっても、または別の分泌タンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ；米国特許第５，６４１，６５５号を参照）に由来しても、ｄｅ  ｎｏｖｏで合成してもよい。操作された切断部位が、分泌性ペプチドとポリペプチド融合体の残り部分の間の接合部に含まれて、宿主細胞におけるタンパク質分解性プロセシングを最適化することができる。分泌性シグナル配列は、ポリペプチド融合体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結される、すなわち、この２配列は、正しい読み枠で連接され、宿主細胞の分泌性経路へと新たに合成されたポリペプチド融合体を方向づけるように位置する。分泌性シグナル配列は一般的に、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し５’に位置するが、ある特定のシグナル配列は、目的のＤＮＡ配列中の他の部分に位置することがある（例えば、Welchら、米国特許第５，０３７，７４３号；Hollandら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）。本発明に従った使用に適した分泌性シグナル配列は、例えば、配列番号２のアミノ酸残基１〜１８をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１８２】
宿主細胞分泌性経路を経た、二量体形成ドメインを含む融合ポリペプチドの発現は、二量体タンパク質の産生をもたらすことが予想される。したがって、別の態様では、本発明は、上述の通りの第１および第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質（例えば、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドのそれぞれが、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、本明細書に記載されているＡｐｏＡ１−Ｌ１−ＤまたはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐを含む、二量体タンパク質）を提供する。二量体は、適した条件下での成分ポリペプチドのインキュベーションにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルすることもできる。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアセンブリは、変性および還元条件下でタンパク質混合物をインキュベートし、続いてポリペプチドをリフォールディングおよび再酸化して、二量体を形成することを含むであろう。細菌細胞において発現されたタンパク質の回収およびアセンブリは、下に開示されている。
【０１８３】
培養哺乳動物細胞は、本発明での使用に適した宿主である。哺乳動物宿主細胞に外因的ＤＮＡを導入するための方法は、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Wiglerら、Cell  １４巻：７２５頁、１９７８年；CorsaroおよびPearson、Somatic  Cell  Genetics  ７巻：６０３頁、１９８１年：GrahamおよびVan  der  Eb、Virology  ５２巻：４５６頁、１９７３年）、エレクトロポレーション（Neumannら、EMBO  J.１巻：８４１〜８４５頁、１９８２年）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ausubelら、上記参照）およびリポソーム媒介性トランスフェクション（Hawley-Nelsonら、Focus  １５巻：７３頁、１９９３年；Ciccaroneら、Focus  １５巻：８０頁、１９９３年）を含む。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinsonら、米国特許第４，７１３，３３９号；Hagenら、米国特許第４，７８４，９５０号；Palmiterら、米国特許第４，５７９，８２１号；およびRingold、米国特許第４，６５６，１３４号によって開示されている。適した培養哺乳動物細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６３２）、ＢＨＫ  ５７０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １５７３；Grahamら、J.  Gen.  Virol.３６巻：５９〜７２頁、１９７７年）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ６１；ＣＨＯ−ＤＧ４４、Urlaubら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７７巻：４２１６〜４２２０頁、１９８０年）細胞株を含む。追加的な適した細胞株は、本技術分野で公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ等の公共の寄託機関から入手できる。ＳＶ−４０、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルス由来のプロモーター等、強い転写プロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号および米国特許出願公開第２００３０１０３９８６号を参照されたい。他の適したプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＵＳＡにそれぞれ受託番号９８６６９、９８６６８およびＰＴＡ−５２６６で寄託された、ｐＺＰ−１、ｐＺＰ−９およびｐＺＭＰ２１、ならびにこれらのベクターの誘導体を含む。
【０１８４】
薬物選択は一般に、外来性ＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために使用される。このような細胞は一般的に、「トランスフェクタント」と称される。選択的薬剤の存在下で培養され、その後代に目的の遺伝子を受け渡すことができる細胞は、「安定したトランスフェクタント」と称される。例示的な選択可能マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性をコードする遺伝子である。選択は、Ｇ−４１８またはその類似物等、ネオマイシン型の薬物の存在下で行われる。選択系を使用して、目的の遺伝子の発現レベルを増加させることもでき、これは、「増幅」と称されるプロセスである。増幅は、低レベルの選択的薬剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、続いて選択的薬剤の量を増加させて、導入された遺伝子の高レベルの産物を産生する細胞を選択することにより行われる。例示的な増幅可能な選択可能マーカーは、メトトレキセートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬物抵抗性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン抵抗性、多剤抵抗性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。細胞表面マーカーおよび他の表現型選択マーカーを使用して、トランスフェクトされた細胞の同定を容易にすることができ（例えば、蛍光標識細胞分取によって）、そのようなものとして、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、神経増殖因子受容体、緑色蛍光タンパク質その他が挙げられる。
【０１８５】
昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む、他の高等真核細胞を宿主として使用することもできる。植物細胞において遺伝子を発現させるためのベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用は、Sinkarら、J.  Biosci.（Bangalore）１１巻：４７〜５８頁、１９８７年によって総説が記載されている。昆虫細胞の形質転換およびその中での外来性ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第５，１６２，２２２号およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３によって開示されている。
【０１８６】
昆虫細胞を、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に一般的に由来する組換えバキュロウイルスに感染させることができる。KingおよびPossee、The  Baculovirus  Expression  System:    A  Laboratory  Guide、Chapman  &  Hall、London；O'Reillyら、Baculovirus  Expression  Vectors:    A  Laboratory  Manual、Oxford  University  Press.、New  York、１９９４年；ならびにRichardson編、Baculovirus  Expression  Protocols.  Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press、Totowa,  NJ、１９９５年を参照されたい。組換えバキュロウイルスは、Luckowら（J.  Virol.６７巻：４５６６〜４５７９頁、１９９３年）によって記載されたトランスポゾンに基づく系の使用により産生することもできる。移入ベクターを利用するこの系は、キット形態で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。移入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大型のプラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉ中に維持されるバキュロウイルスゲノムに目的のタンパク質をコードするＤＮＡを移動するためのＴｎ７トランスポゾンを含有する。Hill-PerkinsおよびPossee、J.  Gen.  Virol.７１巻：９７１〜９７６頁、１９９０年；Bonningら、J.  Gen.  Virol.７５巻：１５５１〜１５５６頁、１９９４年；ならびにChazenbalkおよびRapoport、J.  Biol.  Chem.２７０巻：１５４３〜１５４９頁、１９９５年を参照されたい。本技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド融合体をコードする移入ベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞へと形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す中断されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドに関して細胞をスクリーニングする。共通技法を使用して、組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡを単離し、Ｓｆ９細胞等、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクトに使用する。ポリペプチド融合体を発現する組換えウイルスがその後に産生される。本技術分野で一般的に使用される方法によって、組換えウイルスストックを作製する。
【０１８７】
タンパク質産生のため、組換えウイルスを使用して、典型的には、ツマジロクサヨトウ（fall  armyworm）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に由来する細胞株である宿主細胞を感染させる。全般的には、GlickおよびPasternak、上記参照。米国特許第５，３００，４３５号も参照されたい。無血清培地を使用して、細胞を育成および維持する。適した培地製剤は、本技術分野で公知であり、商業的供給業者から得ることができる。細胞を、接種密度およそ２〜５×１０５細胞から密度１〜２×１０６細胞まで育成し、この時点で、組換えウイルスストックを、感染多重度（ＭＯＩ）０．１〜１０、より典型的には３付近で添加する。使用される手順は一般に、利用できる実験室マニュアルに記載されている（例えば、KingおよびPossee、上記参照；O'Reillyら、上記参照；Richardson、上記参照）。
【０１８８】
本発明で酵母細胞を含む真菌細胞を使用することもできる。この点に関して特に興味深い酵母種は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを含む。外因的ＤＮＡでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を形質転換し、そこから組換えポリペプチドを産生するための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第４，５９９，３１１号；Kawasakiら、米国特許第４，９３１，３７３号；Brake、米国特許第４，８７０，００８号；Welchら、米国特許第５，０３７，７４３号；およびMurrayら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換された細胞は、一般的に、薬物抵抗性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で成長する能力である、選択可能マーカーによって決定される表現型によって選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける使用のための例示的なベクター系は、Kawasakiら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されたＰＯＴ１ベクター系であり、これは、形質転換された細胞が、グルコース含有培地における成長によって選択されることを可能にする。酵母における使用に適したプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第４，５９９，３１１号；Kingsmanら、米国特許第４，６１５，９７４号；およびBitter、米国特許第４，９７７，０９２号を参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するものを含む。米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号；および同第４，６６１，４５４号も参照されたい。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａを含む他の酵母のための形質転換系は、本技術分野で公知である。例えば、Gleesonら、J.  Gen.  Microbiol.１３２巻：３４５９〜３４６５頁、１９８６年；Cregg、米国特許第４，８８２，２７９号；およびRaymondら、Yeast  １４巻：１１〜２３頁、１９９８年を参照されたい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞は、McKnightら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用することができる。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換するための方法は、Suminoら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換するための方法は、Lambowitz、米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の産生は、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号；および同第５，８８８，７６８号に開示されている。
【０１８９】
細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよび他の属の系統を含む原核生物の宿主細胞も、本発明で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、その中でクローニングされた外来性ＤＮＡ配列を発現させるための技法は、本技術分野で周知である（例えば、Sambrookら、上記参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌において融合ポリペプチドを発現すると、ポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質中に保持され得る、または細菌分泌配列によって細胞膜周辺腔へと方向づけされ得る。前者の場合、細胞が溶解され、顆粒が回収され、例えば、グアニジンＨＣｌまたは尿素を使用して変性される。次に、尿素ならびに還元および酸化型グルタチオンの組合せの溶液に対する透析と、それに続く緩衝食塩水溶液に対する透析による等、変性剤を希釈することにより、変性されたポリペプチドをリフォールディングおよび二量体形成させることができる。代替法において、タンパク質は、可溶性形態で細胞質から回収することができ、変性剤を使用せずに単離することができる。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝食塩水における水性抽出物として細胞から回収される。目的のタンパク質を捕捉するために、抽出物を、固定化された抗体またはヘパリン−セファロースカラム等、クロマトグラフィー媒体に直接的にアプライする。分泌されたポリペプチドは、細胞を破壊し（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）、タンパク質を回収することにより、可溶性かつ機能的な形態で細胞膜周辺腔から回収し、これにより、変性およびリフォールディングの必要を取り除くことができる。例えば、Luら、J.  Immunol.  Meth.２６７巻：２１３〜２２６頁、２００２年を参照されたい。
【０１９０】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の成長に必要とされる栄養素および他の成分を含有する培養培地において、従来の手順に従って培養される。限定培地および複合培地を含む様々な適した培地は、本技術分野で公知であり、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを一般に含む。培地は、必要に応じて増殖因子または血清等の成分を含有することもできる。成長培地は一般に、例えば、発現ベクター上に存するまたは宿主細胞にコトランスフェクトされた選択可能マーカーによって補完される薬物選択または必須栄養素の欠乏により、外因的に加えられたＤＮＡを含有する細胞を選択するであろう。
【０１９１】
本発明のタンパク質は、従来のタンパク質精製方法、典型的には、クロマトグラフィー技法の組合せによって精製される。全般的には、Affinity  Chromatography:  Principles  &  Methods、Pharmacia  LKB  Biotechnology、Uppsala、Sweden、１９８８年；およびScopes、Protein  Purification:    Principles  and  Practice、Springer-Verlag、New  York、１９９４年を参照されたい。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化されたプロテインＡにおける親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ゲル濾過等、追加的な精製ステップを使用して、所望のレベルの純度を得ることができる、または脱塩、バッファー交換その他をもたらすことができる。
【０１９２】
例えば、分画および／または従来の精製方法を使用して、組換え宿主細胞から精製された本発明の融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質を得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出を試料の分画に使用することができる。例示的な精製ステップは、ヒドロキシアパタイト、分子ふるい、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを含むことができる。適したクロマトグラフィー媒体は、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカその他を含む。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が適する。例示的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル−セファロースＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）、オクチル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）その他等、フェニル、ブチルもしくはオクチル基により誘導体化された培地；またはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ  ７１（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）その他等、ポリアクリル酸樹脂を含む。適した固体支持体は、使用される条件下で不溶性である、ガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂その他を含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によるタンパク質の取り付けを可能にする反応性の基により修飾することができる。
【０１９３】
カップリング化学の例として、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体が挙げられる。上述および他の固体培地は、本技術分野で周知であり、広く使用されており、商業的供給業者から入手できる。ポリペプチド単離および精製のための特定の方法の選択は、ルーチンの設計の問題であり、部分的には、選択された支持体の特性によって決定される。例えば、Affinity  Chromatography:  Principles  &  Methods（Pharmacia  LKB  Biotechnology  １９８８年）；およびDoonan、Protein  Purification  Protocols（The  Humana  Press  １９９６年）を参照されたい。
【０１９４】
タンパク質単離および精製における追加的な変種は、当業者であれば考案することができる。例えば、本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ＡｐｏＡ−１に対応するポリペプチドセグメントに特異的に結合する抗体）を使用して、免疫親和性精製により大量のタンパク質を単離することができる。
【０１９５】
本発明のタンパク質は、特定の特性の活用によって単離することもできる。例えば、固定化された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーを使用して、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質を含む、ヒスチジンリッチタンパク質を精製することができる。簡潔に説明すると、ゲルに先ず、二価金属イオンを充填して、キレートを形成する（Sulkowski、Trends  in  Biochem.３巻：１頁、１９８５年）。ヒスチジンリッチタンパク質は、使用した金属イオンに応じて異なる親和性でこのマトリックスに吸着され、競合的溶出、ｐＨの低下または強いキレート剤の使用によって溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を含む（例えば、M.  Deutscher（編）、Meth.  Enzymol.１８２巻：５２９頁、１９９０年を参照）。本発明の追加的な実施形態内で、目的のポリペプチドおよび親和性タグ（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体を構築して、精製を容易にすることができる。さらに、融合ポリペプチドまたはその二量体の受容体またはリガンド結合特性は、精製に活用することができる。例えば、Ａβ結合ポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドは、親和性クロマトグラフィーを使用することにより単離することができ、それによると、標準クロマトグラフィー方法を使用して、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドがカラムに結合され、融合ポリペプチドが結合され、その後に溶出される。
【０１９６】
本発明のポリペプチドは、典型的には、混入高分子、特に、他のタンパク質および核酸に関して、少なくとも約８０％純度まで、より典型的には、少なくとも約９０％純度まで、好ましくは、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％純度まで精製され、感染性および発熱性因子を含まない。本発明のポリペプチドは、９９．９％純粋を超える、薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。ある特定の調製物において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に、動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
ＩＶ．使用方法および医薬組成物
【０１９７】
本発明の融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質を使用して、様々な疾患または障害の処置のためのＡｐｏＡ−１媒介性治療法を提供することができる。本明細書に記載されている第２のポリペプチドセグメント（例えば、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）またはレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ））をさらに含む二重特異性融合体に関する一部の態様では、融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質は、このような処置のための１種または複数の追加的な生物学的活性をさらに提供することができる。
【０１９８】
特定の態様では、本発明は、粥状動脈硬化によって特徴付けられる心血管疾患、神経変性疾患、アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、肥満、メタボリックシンドローム、ネフローゼ症候群、熱傷、硫黄マスタードガスへの曝露、有機リン酸エステルへの曝露、およびがんから選択される疾患または障害を処置するための方法を提供する。本方法は一般に、疾患または障害を有する対象に、有効量の本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を投与するステップを含む。
【０１９９】
本発明に従った処置を受け入れられるアテローム硬化性心血管疾患は、例えば、冠動脈心疾患および脳卒中を含む。冠動脈心疾患の処置の一部の変種では、冠動脈心疾患は、急性冠症候群によって特徴付けられる。一部の実施形態では、アテローム硬化性心血管疾患は、大脳動脈疾患（例えば、頭蓋外大脳動脈疾患、頭蓋内大脳動脈疾患）、動脈硬化性大動脈疾患、腎動脈疾患、腸間膜動脈疾患および末梢動脈疾患（例えば、大動脈腸骨動脈閉塞性疾患）から選択される。
【０２００】
本発明に従った処置を受け入れられる神経変性疾患は、例えば、アミロイド沈着物および／または認知症によって特徴付けられる神経変性疾患を含む。アミロイド沈着物によって特徴付けられる例示的な神経変性疾患は、アルツハイマー病である。認知症によって特徴付けられる例示的な神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および筋萎縮性（amylotrophic）側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。一部の実施形態では、神経変性疾患は、例えば、ＣＮＳの脱髄性炎症性疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）であり、これは、例えば、脊髄−視覚（spino-optical）ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）を含む）等、炎症性疾患である。
【０２０１】
神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）を処置するための方法の一部の実施形態では、神経変性疾患処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）もしくはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２０２】
本発明に従った処置を受け入れられる自己免疫性疾患は、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および１型糖尿病を含む。他の実施形態では、自己免疫性疾患は、セリアック病、神経炎、多発性筋炎、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、白斑、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、ループス腎炎、強皮症、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、重症筋無力症、アジソン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎（opthalmia）、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症および特発性肺線維症から選択される。一部の変種では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、乾癬、シェーグレン症候群、１型糖尿病、抗リン脂質症候群および自己免疫性血管炎から選択される。
【０２０３】
一部の実施形態では、自己免疫性疾患の処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）もしくはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４、（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｘ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｘ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｘｉ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。関節リウマチ（ＲＡ）を処置するための方法の一部の特定の変種では、ＲＡ処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、または（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を処置するための方法の一部の特定の変種では、ＳＬＥ処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）もしくはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための方法の一部の特定の変種では、ＭＳ処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２０４】
本発明に従った処置を受け入れられる炎症性疾患は、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病および肥満を含む。一部の実施形態では、炎症性疾患は、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病等、神経変性炎症性疾患である。他の実施形態では、炎症性疾患は、アテローム硬化性疾患（例えば、冠動脈心疾患または脳卒中）である。なお他の変種では、炎症性疾患は、肝炎（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎）、強直性脊椎炎、関節炎（例えば、変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および腎炎から選択される。他の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性肺疾患であり；一部のこのような実施形態では、炎症性肺疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、特発性肺線維症、過酸素症、低酸素症および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される。一部の変種では、炎症性肺疾患を有する患者は、硫黄マスタードガス（ＳＭ）に曝露された患者である。他の変種では、炎症性肺疾患を有する患者は、殺虫剤または他の神経毒等、有機リン酸エステルに曝露された患者である。
【０２０５】
一部の実施形態では、炎症性疾患（例えば、炎症性肺疾患）の処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）もしくはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４、（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｘ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｘ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｘｉ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。特発性肺線維症を処置するための方法の一部の特定の変種では、特発性肺線維症処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、または（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。硫黄マスタードガス（ＳＭ）または有機リン酸エステルに曝露された患者における炎症性肺疾患を処置するための方法の一部の特定の変種では、処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、低酸素症または過酸素症を処置するための方法の一部の特定の変種では、処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、または（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。ある特定の実施形態では、このようなＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ変種は、延長された期間、酸素で処置されている未熟児の処置に使用される。
【０２０６】
一部の実施形態では、硫黄マスタードガス（ＳＭ）への曝露または有機リン酸エステルへの曝露の処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２０７】
本発明に従った処置を受け入れられる感染性疾患は、例えば、細菌感染および寄生虫感染を含む。一部の実施形態では、寄生虫感染は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ感染である。他の実施形態では、細菌感染は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染である。
【０２０８】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染を処置するための方法の一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２０９】
一部の実施形態では、感染性疾患（例えば、炎症性肺疾患）の処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、または（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２１０】
本発明に従って処置することができるがんは、例えば、次のものを含む：頭頸部のがん（例えば、口腔、中咽頭（orophyarynx）、上咽頭、下咽頭、鼻腔または副鼻腔、喉頭、口唇または唾液腺のがん）；肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞癌または中皮腫（mesothelimia））；胃腸管がん（例えば、結腸直腸がん、胃がん、食道がんまたは肛門がん）；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；膵臓腺癌；膵腺房細胞癌；小腸のがん；肝臓または胆樹のがん（例えば、肝臓細胞腺腫、肝細胞癌、血管肉腫、肝外または肝内胆管肉腫（cholangiosarcoma）、ファーター膨大部のがん、または胆嚢がん）；乳がん（例えば、転移性乳がんまたは炎症性乳がん）；婦人科がん（例えば、子宮頸部がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜癌、腟がん、外陰部がん、妊娠性トロホブラスト腫瘍、または子宮内膜がんもしくは子宮肉腫を含む子宮がん）；尿路のがん（例えば、前立腺がん；膀胱がん；陰茎がん；尿道がん、または例えば、腎細胞癌もしくは移行細胞癌等の腎臓がん、これは腎盂および尿管を含む）；精巣がん；頭蓋内腫瘍（例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、退形成乏突起膠腫、上衣腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、髄芽腫、胚細胞腫瘍、松果体新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍（例えば、シュワン腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脈絡叢（chloroid  plexus）腫瘍（例えば、脈絡叢癌）；または神経細胞もしくはグリア起源の他の頭蓋内腫瘍）または脊髄の腫瘍（例えば、シュワン腫、髄膜腫）等、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん；内分泌新生物（例えば、甲状腺癌、髄様がんもしくは甲状腺リンパ腫等、例えば、甲状腺がん；例えば、インスリノーマもしくはグルカゴノーマ等、膵内分泌腫瘍；例えば、褐色細胞腫等、副腎癌；カルチノイド腫瘍；または副甲状腺癌）；皮膚がん（例えば、扁平上皮癌；基底細胞癌；カポジ肉腫；または例えば、眼球内メラノーマ等の悪性メラノーマ）；骨がん（例えば、骨肉腫、骨軟骨腫またはユーイング肉腫等、例えば、骨の肉腫）；多発性骨髄腫；緑色腫；軟部組織肉腫（例えば、線維性腫瘍または線維組織球腫瘍）；平滑筋または骨格筋の腫瘍；血管またはリンパ管の管周囲腫瘍（例えば、カポジ肉腫）；滑膜腫瘍；中皮腫瘍；神経腫瘍；傍神経節腫瘍；骨外性軟骨性または骨様腫瘍；および多能性間葉系腫瘍。一部のこのような実施形態では、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子は、例えば、非ＡｐｏＡ１媒介性免疫調節療法（例えば、免疫チェックポイント阻害剤を含む治療法）、放射線療法または化学療法を含む併用療法等、併用療法の別個の治療法の１つとして、がん患者に投与される。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、併用がん療法は、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子と、例えば、特異的な細胞表面もしくは細胞外抗原を標的とする治療用モノクローナル抗体、または細胞内タンパク質（例えば、細胞内酵素）を標的とする小分子等の標的化療法とを含む。例示的な抗体標的化療法は、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ）および抗ＰＤ−Ｌ１（例えば、ペムブロリズマブ）を含む。例示的な小分子標的化療法は、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば、セリシクリブ（seliciclib））；ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）；およびＭＥＫキナーゼ阻害剤（例えば、トラメチニブ（trametnib））を含む。
【０２１２】
免疫チェックポイント阻害剤を含む一部のがん併用療法変種では、併用療法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法、抗ＣＴＬＡ−４治療法、またはその両方を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子は、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法のいずれかに対する奏効率と共に、抗ＣＴＬＡ−４プラス抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法の組合せに対する奏効率を増加させることができる。本発明の融合分子は、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはこれらの組合せに伴う毒性の低下に有用となることもできる。
【０２１３】
ある特定の変種では、本発明に従って処置されるがんは、悪性メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんおよび頭頸部がんから選択される。これらのがんは、免疫チェックポイント阻害剤の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４に対する応答を示した。Grimaldiら、Expert  Opin.  Biol.  Ther.１６巻：４３３〜４１頁、２０１６年；Gunturiら、Curr.  Treat.  Options  Oncol.１５巻：１３７〜４６頁、２０１４年；Topalianら、Nat.  Rev.  Cancer  １６巻：２７５〜８７頁、２０１６年を参照されたい。よって、一部のより特異的な変種では、これらのがんのいずれかは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療法、抗ＣＴＬＡ−４治療法、またはその両方と組み合わせて、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子で処置される。
【０２１４】
一部の実施形態では、がんの処置のための融合分子は、構造ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］）、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−ＲＮａｓｅ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＲＮａｓｅ１）もしくはＡｐｏＡ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−パラオキソナーゼ（例えば、ＡｐｏＡ１−Ｌ１−［Ｆｃ領域］−Ｌ２−ＰＯＮ１）を有するポリペプチド、または前述の融合ポリペプチドのいずれかの二量体形成によって形成された二量体タンパク質であり；一部のこのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基１９〜５０１、１９〜５００、２５〜５０１もしくは２５〜５０１、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸残基１９〜５１５、１９〜５１４、２５〜５１５もしくは２５〜５１４、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸残基１９〜５３５、１９〜５３４、２５〜５３５もしくは２５〜５３４、（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜６７５もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基１９〜６５７もしくは２５〜６７５、（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、（ｉｘ）配列番号３８のアミノ酸残基１９〜８７３もしくは２５〜８７３、（ｘ）配列番号４６のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３、または（ｘｉ）配列番号４８のアミノ酸残基１９〜８８３もしくは２５〜８８３と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【０２１５】
治療目的の使用のため、本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質は、処置が探究されている疾患または障害の管理に関連する従来の方法論と一貫した様式で送達される。本明細書における開示に従って、有効量の融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質は、疾患または障害の予防または処置に十分な時間および条件下、このような処置を必要とする対象に投与される。
【０２１６】
本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質の投与のための対象は、特定の疾患または障害を発症するリスクが高い患者と共に、現存する疾患または障害を呈する患者を含む。ある特定の実施形態では、対象は、処置が探究されている疾患または障害を有すると診断された。さらに、対象は、疾患または障害の任意の変化に関して（例えば、疾患または障害の臨床症状の増加または減少に関して）処置の経過においてモニターすることができる。また、一部の変種では、対象は、ＡｐｏＡ−１タンパク質の投与が関与する処置を必要とする別の疾患または障害を患わない。
【０２１７】
予防目的の適用において、医薬組成物または医薬物は、疾患のリスクの排除もしくは低下またはその発症遅延に十分な量で、特定の疾患に対して感受性があるまたは他の点でそのリスクがある患者に投与される。治療目的の適用において、組成物または医薬物は、疾患およびその合併症の症状の治癒または少なくとも部分的な抑止に十分な量で、このような疾患が疑われるまたはこれを既に患う患者に投与される。このような達成に適切な量は、治療または薬学的有効用量または量と称される。予防および治療レジームの両方において、薬剤は通常、十分な応答（例えば、冠動脈心疾患における粥状動脈硬化退縮または現存するプラークの安定化）が達成されるまで、いくつかの投薬量で投与される。典型的には、応答はモニターされ、所望の応答が衰え始めたら、反復した投薬量が与えられる。
【０２１８】
本発明の方法に従った処置のための対象患者を同定するために、認容されるスクリーニング方法を用いて、特異的な疾患に関連するリスク因子を決定することができる、または対象における同定された現存する疾患の状態を決定することができる。このような方法は、例えば、個体が、特定の疾患と診断された親族を有するか決定するステップを含むことができる。スクリーニング方法は、例えば、遺伝性成分を有することが公知の特定の疾患の家族性状態を決定するための従来の精密検査を含むこともできる。この目標に向けて、ヌクレオチドプローブをルーチンに用いて、目的の特定の疾患に関連する遺伝的マーカーを保有する個体を同定することができる。加えて、特異的な疾患のマーカーの同定に有用な、多種多様な免疫学的方法が本技術分野で公知である。スクリーニングは、公知の患者症候学、年齢因子、関連するリスク因子等によって示される通りに実行することができる。これらの方法は、臨床医が、処置のために本明細書に記載されている方法を必要とする患者をルーチンに選択することを可能にする。これらの方法に従って、本発明の融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を使用した処置は、独立した処置プログラムとして、または経過観察、補助剤もしくは他の処置に対する協調的処置レジメンとして実行することができる。
【０２１９】
投与のため、本発明に従った融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質は、医薬組成物として製剤化される。本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それによって、治療用分子は、薬学的に許容される担体との混合物において組み合わされる。その投与が、レシピエント患者による耐容性を示すことができる場合、組成物は、「薬学的に許容される担体」と言われる。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適した担体は、当業者に周知である。例えば、Gennaro（編）、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（Mack  Publishing  Company、第１９版、１９９５年）を参照されたい。製剤は、１種または複数の賦形剤、保存料、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面におけるタンパク質損失を予防するためのアルブミン等をさらに含むことができる。
【０２２０】
本発明の融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を含む医薬組成物は、有効量で対象に投与される。融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口的、鼻腔内、肺内、経皮的、胸膜内、くも膜下腔内および経口経路の投与を含む様々な投与機序によって対象に投与することができる。予防および処置目的で、融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質は、単一ボーラス送達において、延長した期間にわたる持続的送達（例えば、持続的経皮的送達）により、または反復投与プロトコール（例えば、毎時間、毎日または毎週ベースで）において、対象に投与することができる。
【０２２１】
この文脈における有効投薬量の決定は、典型的には、動物モデル研究とそれに続くヒト臨床治験に基づき、モデル対象における対象疾患または障害の出現または重症度を有意に低下させる有効投薬量および投与プロトコールを決定することによりガイドされる。本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、処置が予防的であるか治療的であるか、ならびに組成物それ自体の特異的活性および個体において所望の応答を誘発するその能力を含む多くの異なる因子に応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、一部の疾患では、患者は、非ヒト哺乳動物であり得る。典型的には、投薬量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように、すなわち、安全性および有効性を最適化するように調整される。したがって、治療または予防有効量は、有益な効果が、任意の望まれない付帯的効果を上回る量でもある（例えば、アテローム硬化性心血管疾患の処置の場合は、ＨＤＬの増加、粥状動脈硬化退縮および／またはプラーク安定化等、任意の有益な効果が、任意の望まれない付帯的効果を上回る）。本発明の融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質の投与のため、投薬量は、典型的には、約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より通常には、１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ対象体重に及ぶ。より特異的な実施形態では、有効量の薬剤は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの間または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの間である。この範囲内の投薬量は、例えば、１日当たり複数の投与、または毎日、毎週、隔週もしくは毎月の投与を含む、単一または複数の投与によって達成することができる。例えば、ある特定の変種では、レジメンは、初期投与と、それに続く毎週または隔週の間隔での複数のその後の投与からなる。別のレジメンは、初期投与と、それに続く毎月または隔月の間隔での複数のその後の投与からなる。あるいは、疾患もしくは障害の臨床症状のモニタリングおよび／または疾患バイオマーカーもしくは他の疾患相関因子（例えば、アテローム硬化性心血管疾患の場合は、ＨＤＬレベル）のモニタリングによって示される通り、投与は、不規則な基準で行うことができる。
【０２２２】
粥状動脈硬化の処置のための本発明のＡｐｏＡ−１組成物の有効性を評定するための特に適した動物モデルは、例えば、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）またはＡｐｏＥが欠損した公知のマウスモデルを含む。ＬＤＬＲ欠損マウスは、１２週間高脂肪食を食べた後に、アテローム硬化性プラークを発症し、ヒトＡｐｏＡ−１（脂質により再構成）は、このモデルにおけるプラークの低下に有効である。ＡｐｏＥ欠損マウスも、粥状動脈硬化の研究に一般的に使用され、ヒトＡｐｏＡ−１（脂質により再構成）は、このモデルにおいて急速に機能する。肝臓リパーゼに関してトランスジェニックであるウサギは、ＡｐｏＡ−１組成物を検査するための別の公知の粥状動脈硬化モデルである。
【０２２３】
アルツハイマー病のモデルの１種は、マウスにおける突然変異体アミロイド−β前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリン１の過剰発現を使用する。このようなマウスにおいて、ヒトＡｐｏＡ−１の過剰発現は、記憶および学習欠陥を予防した。Lewisら、J  Biol.  Chem.２８５巻：３６９５８〜３６９６８頁、２０１０年を参照されたい。
【０２２４】
関節リウマチ（ＲＡ）のコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルも公知である。ＣＩＡは、ＲＡと同様の免疫学的および病理学的特色を共有し、これにより、ＡｐｏＡ−１組成物の有効性を評定するための理想的なモデルとなる。例えば、Charles-Schoemanら、Clin  Immunol.１２７巻：２３４〜４４頁、２００８年（ＣＩＡモデルにおけるＡｐｏＡ−１ミメティックペプチド、Ｄ−４Ｆの有効性を示す研究について記載）を参照されたい。ＲＡの別の公知のモデルは、雌ＬｅｗｉｓラットにおけるＰＧ−多糖（ＰＧ−ＰＳ）誘導性関節炎である。これらのマウスにおいて、ＡｐｏＡ−１タンパク質または再構成されたＨＤＬの投与は、急性および慢性の関節炎症を低減させた。Wuら、Arterioscler  Thromb  Vasc  Biol  ３４巻：５４３〜５５１頁、２０１４年。
【０２２５】
多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルは、例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを含み、これは、炎症、脱髄および脱力をもたらす、ＣＮＳ抗原（ＥＡＥの文脈において「脳炎誘発物質」とも称される）による免疫化によるＣＮＳにおける自己免疫応答の誘導に頼る。ＡｐｏＡ−１欠損マウスは、このモデルにおいて野生型動物よりも多くの神経変性およびより悪化した疾患を示すことが示された。Meyersら、J.  Neuroimmunol.２７７巻：１７６〜１８５頁、２０１４年を参照されたい。
【０２２６】
本発明の融合分子は、例えば、不十分に免疫原性の腫瘍であるＢ１６メラノーマ等、動物腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性に関して評定することができる。腫瘍免疫療法の複数のモデルについて研究されている。Ngiowら、Adv.  Immunol.１３０巻：１〜２４頁、２０１６年を参照されたい。Ｂ１６メラノーマモデルは、チェックポイント阻害剤の抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１およびこれらの組合せにより大規模に研究された。抗ＣＴＬＡ−４単独は、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入腫瘍ワクチンと組み合わせたまたは抗ＰＤ−１と組み合わせた場合においてのみ、このモデルにおいて強力な治療効果を有する。Weber、Semin.  Oncol.３７巻：４３０〜４３９頁、２０１０年；Aiら、Cancer  Immunol.  Immunother.６４巻：８８５〜９２頁、２０１５年；Haanenら、Prog.  Tumor  Res.４２巻：５５〜６６頁、２０１５年を参照されたい。悪性メラノーマの処置のためのＡｐｏＡ−１融合分子の有効性は、例えば、触知できる皮下腫瘍小結節を形成したＢ１６メラノーママウスへの投与後に、遅くなった腫瘍成長によって示される。ＡｐｏＡ−１融合分子の有効性は、単独で、あるいは、別の抗がん治療法（例えば、腫瘍ワクチンありもしくはなし、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ありもしくはなしの、抗ＣＴＬＡ−４）と組み合わせて、Ｂ１６メラノーママウスにおいて評定することができる。例えば、腫瘍ワクチンの非存在下における、本明細書に記載されているＡｐｏＡ−１融合分子および抗ＣＴＬＡ−４の組合せを使用した、Ｂ１６メラノーママウスにおける腫瘍拒絶は、ＡｐｏＡ−１治療法を使用した、抗ＣＴＬＡ−４に対する応答増強を実証する。マウスにおいて機能的に活性を有するが、これらのモデルにおいて免疫原性であることが予想される（これにより、７〜１０日後に中和抗体の形成をもたらす可能性がある）、ヒトタンパク質配列を含むＡｐｏＡ−１融合分子を評定するための例示的な研究において、マウスに、本発明の融合分子を短い期間（例えば、１週間、例えば、３日間あけた２用量の約４０ｍｇ／ｋｇで投与される）投与することができ、次に、典型的には、融合分子による注射後２〜３週間、腫瘍成長をモニターすることができる。
【０２２７】
医薬組成物の投薬量は、標的部位における所望の濃度を維持するために、担当臨床医によって変動され得る。例えば、静脈内送達機序が選択される場合、標的組織における血流中の薬剤の局所的濃度は、対象の状態および推定される測定される応答に応じて、１リットル当たり約１〜５０ナノモルの間の組成物、場合により、１リットル当たり約１．０ナノモル〜１リットル当たり１０、１５または２５ナノモルの間であり得る。送達機序、例えば、経皮送達対粘膜表面への送達に基づき、より高いまたはより低い濃度を選択することができる。投薬量は、また、投与された製剤の放出速度、例えば、点鼻薬対粉末、持続放出経口または注射粒子、経皮的製剤等に基づいて調整されるべきである。同じ血清濃度レベルを達成するために、例えば、５ナノモルの放出速度（標準条件下で）を有する緩徐放出粒子は、１０ナノモルの放出速度を有する粒子の投薬量の約２倍投与されるであろう。
【０２２８】
本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を含む医薬組成物は、液体形態で、エアロゾルでまたは固体形態で供給することができる。液体形態は、注射用溶液、エアロゾル、液滴、位相幾何学的溶液および経口懸濁液によって例証されている。例示的な固体形態は、カプセル、錠剤および放出制御形態を含む。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプおよびインプラントによって例証される。例えば、Bremerら、Pharm.  Biotechnol.１０巻：２３９頁、１９９７年；Ranade「Implants  in  Drug  Delivery」、Drug  Delivery  Systems内９５〜１２３頁（RanadeおよびHollinger編、CRC  Press  １９９５年）；Bremerら「Protein  Delivery  with  Infusion  Pumps」Protein  Delivery:  Physical  Systems内２３９〜２５４頁（SandersおよびHendren編、Plenum  Press  １９９７年）；Yeweyら「Delivery  of  Proteins  from  a  Controlled  Release  Injectable  Implant」、Protein  Delivery:  Physical  Systems内９３〜１１７頁（SandersおよびHendren編、Plenum  Press  １９９７年）を参照されたい。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相幾何学的適用その他を含む。
【０２２９】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療用タンパク質の高い全身性レベルを維持するように設計された。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）等の分解性ポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーから調製され、タンパク質は、ポリマー中に封入されている。例えば、GombotzおよびPettit、Bioconjugate  Chem.６巻：３３２頁、１９９５年；Ranade「Role  of  Polymers  in  Drug  Delivery」、Drug  Delivery  Systems内５１〜９３頁（RanadeおよびHollinger編、CRC  Press  １９９５年）；RoskosおよびMaskiewicz「Degradable  Controlled  Release  Systems  Useful  for  Protein  Delivery」、Protein  Delivery:  Physical  Systems内４５〜９２頁（SandersおよびHendren編、Plenum  Press  １９９７年）；Bartusら、Science  ２８１巻：１１６１頁、１９９８年；PutneyおよびBurke、Nature  Biotechnology  １６巻：１５３頁、１９９８年；Putney、Curr.  Opin.  Chem.  Biol.２巻：５４８頁、１９９８年を参照されたい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングされたナノスフェアは、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を提供することもできる。例えば、Grefら、Pharm.  Biotechnol.１０巻：１６７頁、１９９７年を参照されたい。
【０２３０】
例えば、AnselおよびPopovich、Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  Systems（Lea  &  Febiger、第５版、１９９０年）；Gennaro（編）、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（Mack  Publishing  Company、第１９版、１９９５年）ならびにRanadeおよびHollinger、Drug  Delivery  Systems（CRC  Press  １９９６年）によって示される通り、当業者であれば他の剤形を考案することができる。
【０２３１】
本明細書に記載されている医薬組成物は、併用療法の文脈において使用することもできる。用語「併用療法」は、対象に、少なくとも１つの治療有効用量の本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質および別の治療剤が投与されることを表示するように本明細書で使用されている。
【０２３２】
医薬組成物は、本明細書に記載されている融合ポリペプチドまたは二量体タンパク質を含む容器を含むキットとして供給することができる。治療用分子は、例えば、単一もしくは複数用量のための注射用溶液の形態で、または注射前に再構成されるであろう無菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、治療用タンパク質の投与のための、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生器またはネブライザーを含むことができる。このようなキットは、医薬組成物の効能および使用に関する書面の情報をさらに含むことができる。
【０２３３】
本発明を、次の非限定例によってさらに例証する。
【実施例】
【０２３４】
（実施例１）
分子設計および調製：２種のＡｐｏＡ−１−Ｆｃ  ｃＤＮＡ構築物を設計し、合成し、ＣＯＳ７細胞の一過的トランスフェクションによって発現させ、次に、発現されたタンパク質をプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。一方の構築物は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有し、配列番号２の融合ポリペプチドをコードし、本明細書において、ＡｐｏＡ−１（２６）ＦｃまたはＴＨＥＲ４とも称される。この構築物は、ヒトＡｐｏＡ−１（配列番号２の残基１〜２６７）のＣ末端側の末端とヒトγ１  Ｆｃバリアント（配列番号２の残基２９４〜５２５）の間に、２６アミノ酸リンカー（配列番号２の残基２６８〜２９３）をコードするＤＮＡセグメントを含有した。哺乳動物細胞における発現および分泌性シグナルペプチド（残基１〜１８）の切断、およびプロペプチド（残基１９〜２４）の任意の潜在的な切断後に、この融合ポリペプチドは、配列番号２の残基１９〜５２５、１９〜５２４、２５〜５２５もしくは２５〜５２４（Ｆｃ領域のＣ末端リシンは、Ｆｃ含有タンパク質の産生において高頻度で切断されることが公知である）に対応する予測されるアミノ酸配列を有した。他方の構築物は、ＡｐｏＡ−１（２６）Ｆｃ構築物と同一のＡｐｏＡ−１およびＦｃ領域を含有したが、ヒトＡｐｏＡ−１とＦｃ領域の間に（ｇｌｙ４ｓｅｒ）リンカーを欠いた；この構築物は、本明細書において、ＡｐｏＡ−１（２）Ｆｃ（Ｔｈｅｒｉｐｉｏｎ）またはＴＨＥＲ０（（ｇｌｙ４ｓｅｒ）反復単位なしのため）とも称される。この構築物は、ＡｐｏＡ−１領域とヒトＩｇＧ１のヒンジ領域の間の重複する制限部位の挿入により、２アミノ酸リンカーを含有した。
【０２３５】
コレステロール流出：ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＡｐｏＡ−Ｉ融合タンパク質のコレステロール流出活性を測定した。Tangら、J  Lipid  Res.４７巻：１０７〜１４頁、２００６年を参照されたい。放射標識されたコレステロールおよびミフェプリストン（mifespristone）誘導性ヒトＡＢＣＡ１を発現するＢＨＫ細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏコレステロール流出アッセイを行った。処理２４時間前に、細胞コレステロールを標識するためにＨ３−コレステロールを成長培地に添加し、１０ｎＭミフェプリストンを１６〜２０時間使用して、ＡＢＣＡ１が誘導される。融合タンパク質ありまたはなしで細胞を２時間３７℃でインキュベートし、氷上で冷却し、培地および細胞を分離して、放射標識されたコレステロールを測定することにより、コレステロール流出を測定した。野生型ヒトＡｐｏＡ−１タンパク質を陽性対照として使用した。ＡｐｏＡ−１とＦｃ領域の間にいかなるリンカーも含まずＦｃへと直接的に連結された、市販のＡｐｏＡ−１−Ｆｃタンパク質（ＡＰＯＡ１組換えヒトタンパク質、ｈＩｇＧ１−Ｆｃタグ；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）も検査し、これは本明細書において、ＡｐｏＡ−１（０）Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌ）と称される。このアッセイの結果を図１に示す。コレステロール流出は、２アミノ酸リンカーを有するＡｐｏＡ−１−Ｆｃ（ＡｐｏＡ−１（２）Ｆｃ（Ｔｈｅｒｉｐｉｏｎ））またはリンカーなしのＡｐｏＡ−１−Ｆｃ（ＡｐｏＡ−１（０）Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌ））のいずれかと比較して、２６アミノ酸リンカーを有するＡｐｏＡ−１−Ｆｃ（ＡｐｏＡ−１（２６）Ｆｃ）を含有する培養物において増加した。ＡｐｏＡ−１（２６）Ｆｃは、また、野生型ヒトＡｐｏＡ−１（対照ＡｐｏＡ−１）と同様の活性を有した。
（実施例２）
融合構築物の生成および配列検証
【０２３６】
追加的なＡｐｏＡ１融合構築物を設計し、融合遺伝子配列を遺伝子合成のためにＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）に提出した。ＡｐｏＡ１融合タンパク質の設計のための、機能ドメインの位置の基礎的な模式化を図２Ａおよび図２Ｂに示す。ｐＵＣに基づくベクターに挿入された融合遺伝子構築物を、制限酵素消化によって単離し、融合遺伝子をコードする断片を哺乳動物発現ベクターｐＤＧにサブクローニングした。簡潔に説明すると、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩフランキング制限部位を、ベクターからの各発現遺伝子の除去に使用し、ゲル電気泳動によって細断片を単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製カラムを使用してＤＮＡを抽出し、３０マイクロリットルＥＢバッファー中に溶出した。断片をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ消化ｐＤＧベクターにライゲーションし、ライゲーション反応物をＮＥＢ  ５−アルファ、化学的コンピテント細菌に形質転換した。クローンを１００μｇ／ｍｌアンピシリン入りの３ｍｌ  ＬＢブロスに接種し、２００ｒｐｍで振盪しつつ、３７℃で一晩育成し、ＱＩＡＧＥＮスピンプラスミドミニプレップキットをメーカーの説明書に従って使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。ＩＤＴ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から配列決定プライマーを得、これらは、次の配列を含んだ：
ｐｄｇＦ−２：５’−ｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇ−３’（配列番号１６）；
ｐｄｇＲ−２：５’−ｃｔａｔｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｔｃｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１７）；
ｈｉｇｇｒａｓ：５’−ａｃｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔａｃｔｃｃｔｔ−３’（配列番号１８）。
【０２３７】
プラスミドＤＮＡ（８００ｎｇ）および配列決定プライマー（２５ｐｍｏｌまたは５μｌの５ｐｍｏｌ／μｌストック）を混合し、ＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によるＤＮＡ配列決定のために提出した。次に、クロマトグラムを解析し、配列をコンティグにアセンブルし、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｔｉ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．５ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して配列を検証した。
（実施例３）
一過的ＨＥＫ  ２９３Ｔトランスフェクション系における融合タンパク質の発現
【０２３８】
本実施例は、プラスミド構築物のトランスフェクションおよび哺乳動物の一過的トランスフェクション系における本明細書に記載されている融合タンパク質の発現を例証する。正しい配列を有するＩｇ融合遺伝子断片を哺乳動物発現ベクターｐＤＧに挿入し、ＱＩＡＧＥＮプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、陽性クローン由来のＤＮＡを増幅した。５種の異なる構築物を生成した。これらはそれぞれ、ヒトＡｐｏＡ−１遺伝子（配列番号３６に示すアミノ酸配列をコードする、配列番号３５に示すヌクレオチド配列）のネイティブコード配列を含んだ。各配列は、アポリポタンパク質Ａ−１の野生型シグナルペプチド（配列番号３６のアミノ酸１〜１８をコードする配列番号３５のヌクレオチド１〜５４）およびプロペプチド配列（配列番号３６のアミノ酸１９〜２４をコードする、配列番号３５のヌクレオチド５５〜７２）を含んだ。ＡｐｏＡ−１配列のＣ末端Ｑ（Ｇｌｎ）残基を、可変的な長さのリンカーセグメントを介して、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結して、単鎖（ＡｐｏＡ−１）−ｌｎｋ−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合遺伝子／タンパク質を作製した。ヒトＩｇＧ１のヒンジ配列は、３個のシステインがセリン残基に置換されて、融合タンパク質の適正なフォールディングを損なう可能性がある、この領域におけるジスルフィド結合形成または対形成していないシステインを排除するように、突然変異している。ＣＨ２のＰ２３８およびＰ３３１残基も、セリンに突然変異して、ＡＤＣＣおよび補体固定等のエフェクター機能を排除する。各構築物は、アポリポタンパク質Ａ−１（配列…ＴＫＫＬＮＴＱ（配列番号３５残基２６１〜２６７）で終わる）のカルボキシル末端とヒトＦｃ（モチーフ…ＥＰＫＳＳＤＫＴ…（配列番号２残基２９４〜３０１）から始まる）のヒンジ配列の初めの間に挿入されたリンカー配列も含んだ。このリンカー配列は、構築物に応じて、２個のアミノ酸（またはフランキングドメインとの重複が含まれる場合は４個）〜３６個のアミノ酸の長さに及んだ。
【０２３９】
最短リンカーは、２個の重複する制限部位（ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ）のみを含み、６個の追加的なヌクレオチドまたは２個の追加的な非ネイティブアミノ酸のリンカー長さを有した。必要とされる２個の追加的なアミノ酸のみがアミノ酸配列に付加されるように、分子のコード配列に制限部位を取り込んだ。リンカーのＢｇｌＩＩ部位は、ＡｐｏＡ−１のＣ末端グルタミンのコドンと重複し、ＸｈｏＩ部位をコードするヌクレオチドのうち３個が、ヒンジの最初のアミノ酸（Ｅ−グルタミン酸）のコドンを形成する。リンカーアミノ酸配列（２個の重複するアミノ酸を含む）は、配列番号２０の残基２６７〜２７０に示されており、これは、配列番号１９のヌクレオチド８１６〜８２５によってコードされる。この構築物の融合遺伝子およびタンパク質は、ＴＨＥＲ０（（ｇｌｙ４ｓｅｒ）反復単位が存在しないため）またはａｐｏＡ−１−ｌｎｋ（２）ｈＩｇＧとして同定される。ＴＨＥＲ０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１９および配列番号２０として収載されている。図面は、この構築物を特定するためにＴＨＥＲ０命名法を使用する。
【０２４０】
第２の構築物は、制限部位で挟まれた２個の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）配列をコードするリンカー（１６アミノ酸リンカー）を含み、この構築物の融合遺伝子およびタンパク質は、ＴＨＥＲ２（またはａｐｏＡ−１−ｌｎｋ（１６）−ｈＩｇＧ１またはａｐｏＡ−１−（ｇ４ｓ）２−ｈＩｇＧ１）として同定される。ＴＨＥＲ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１および配列番号２２として収載されている。（ｇｌｙ４ｓｅｒ）２リンカー配列は、配列番号２２の残基２６８〜２８３に示されており、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）２リンカーのコードヌクレオチド配列は、配列番号２１の残基８１７〜８６４に示されている。
【０２４１】
第３の構築物は、制限部位で挟まれた４個の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）配列をコードするリンカー（２６アミノ酸リンカー）を含み、この構築物の融合遺伝子およびタンパク質は、ＴＨＥＲ４（またはａｐｏＡ−１−（ｇ４ｓ）４−ｍｔｈＩｇＧまたはａｐｏＡ−１−ｌｎｋ（２６）−ｍｔｈＩｇＧ）として同定され、「ＴＨＥＲ４」の「４」は、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）反復単位の数を指し、数２６は、非ネイティブの導入されたリンカー配列においてコードされるアミノ酸の総数を指す。ＴＨＥＲ４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２として収載されている。（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４リンカー配列は、配列番号５０（配列番号２の残基２６８〜２９３）に示されており、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４リンカーのコードヌクレオチド配列は、配列番号４９（配列番号１の残基８１７〜８９４）に示されている。
【０２４２】
第４の構築物は、制限部位で挟まれた６個の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）配列をコードするリンカー（３６アミノ酸リンカー）を含み、この構築物の融合遺伝子およびタンパク質は、ＴＨＥＲ６（またはａｐｏＡ−１−（ｇ４ｓ）６−ｍｔｈＩｇＧまたはａｐｏＡ−１−ｌｎｋ（３６）−ｍｔｈＩｇＧ）として同定される。ＴＨＥＲ６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３および配列番号２４として収載されている。（ｇｌｙ４ｓｅｒ）６リンカー配列は、配列番号５２（配列番号２４の残基２６８〜３０３）に示されており、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）６リンカーのコードヌクレオチド配列は、配列番号５１（配列番号２３の残基８１７〜９２４）に示されている。
【０２４３】
第５の構築物は、制限部位で挟まれた４個の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）配列をコードするリンカー（３６アミノ酸リンカー）を含んだが、それに加えて、構築物は、ＩｇＧ１ドメインのカルボキシル末端に第２のリンカーおよび酵素配列を含んだ。（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４リンカー配列は、ＴＨＥＲ４に関する上述の通りである（それぞれ配列番号４９および配列番号５０に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。第２のリンカーは、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む、１８アミノ酸長配列（ＶＤＧＡＳＳＰＶＮＶＳＳＰＳＶＱＤＩ；配列番号７のヌクレオチド１〜５４によってコードされる、配列番号８のアミノ酸残基１〜１８）であり、その後にヒトＲＮａｓｅ１酵素活性をコードする配列が続く。リンカー配列は、配列番号７の最初の５４ヌクレオチドまたは配列番号８の最初の１８アミノ酸として収載されており、その後にＲＮａｓｅ配列が続く。ＡｐｏＡ−１−ｌｎｋ−ｈＩｇＧ１セグメントは、ＮＬＧ−ＲＮａｓｅに融合され、この構築物は、ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２として同定される。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４として同定される。
【０２４４】
５種の構築物のそれぞれのミニプレップＤＮＡを調製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ解析によって濃度をチェックした。
【０２４５】
トランスフェクション前日に、およそ１．２×１０６個の２９３Ｔ細胞を６０ｍｍディッシュに蒔いた。ミニプラスミド調製物（６０ｍｍプレートに対し４．０μｇ  ＤＮＡ）を、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＯＬＹＦＥＣＴ（登録商標）試薬（カタログ＃３０１１０５／３０１１０７）を使用してメーカーの説明書に従った２９３Ｔトランスフェクションに使用した。トランスフェクション４８〜７２時間後に培養上清を採取した。大部分のトランスフェクションに関して、トランスフェクション２４時間後に培地を無血清培地に交換し、採取に先立ちさらに４８時間培養物をインキュベートした。
【０２４６】
さらなる解析のために培養上清を直接的に使用した。一過的にトランスフェクトした細胞由来の７μｌの各無血清培養上清を、ゲルに負荷し、４×ＬＤＳ試料バッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の４×希釈を各試料に添加して、１×ＬＤＳローディングバッファーの最終濃度を得た。還元ゲルのため、１／１０最終容量まで試料還元剤を添加した。試料を７２℃で１０分間加熱し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に負荷した。ゲルを、１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥランニングバッファー（ＮＰ０００１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）における１８０ボルトで１．５時間の電気泳動に付し、ＸＣｅｌｌ  ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（カタログ＃ＥＩ００２／ＥＩ９０５１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、タンパク質をニトロセルロースに３０ボルトで１時間転写した。５％脱脂乳を含有するＰＢＳにおいてブロットを一晩４℃でブロッキングした。西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−０３６−０９８、Ｌｏｔ＃１２２３０１）の１：２５０，０００×希釈物と共にブロットをインキュベートした。ブロットを３０分間に３回、それぞれＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０において洗浄し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＥＣＬ試薬（カタログ＃３２１０６）において１分間発色させた。ブロットをオートラジオグラフフィルムに、ブロットに応じて３０秒間〜２分間露光させた。図３は、代表的２９３Ｔ一過的トランスフェクション由来の培養上清のウエスタンブロット解析を示す。陽性および陰性対照（それぞれＣＤ４０ＩｇＧおよび偽トランスフェクション／ＤＮＡなし）を各トランスフェクションシリーズに含めた。トランスフェクトされた試料は、図３に示されている通りである；左から右に、レーンは次の通りである：レーン＃１  −  偽トランスフェクション；レーン＃２  −  ＣＤ４０ＩｇＧ；レーン＃３  −  ＭＷマーカー；レーン＃４  −  ＴＨＥＲ０；レーン＃５  −  ＴＨＥＲ２；レーン＃６  −  ＴＨＥＲ４；レーン＃７  −  ＴＨＥＲ６；レーン＃８  −  ＭＷマーカー；レーン＃９  −  ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２。
【０２４７】
ＴＨＥＲ０、ＴＨＥＲ２、ＴＨＥＲ４およびＴＨＥＲ６融合タンパク質は、５０ｋＤａ分子量マーカーより上の位置に泳動された。これらの融合タンパク質に予測される分子量は、それぞれおよそ５５、５６、５６．６および５７ｋＤａとなる筈である。増加するリンカー長さは、融合タンパク質毎の移動度変更によって明らかである。ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２分子は、およそ７３．２ｋＤａであると予測される一方、ＡｐｏＡ−１は、２８．６ｋＤａに泳動されると予測される。ＣＤ４０ＩｇＧ対照は、およそ５５ｋＤａに泳動されると予想される。
（実施例４）
安定したＣＨＯ細胞株におけるＴＨＥＲｍｔｈＩｇＧおよびマルチサブユニットＩｇ融合構築物および融合タンパク質の発現
【０２４８】
本実施例は、真核細胞株における本明細書に記載されている異なるＩｇ融合遺伝子の発現、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによる発現された融合タンパク質の特徴付けを例証する。
融合タンパク質を発現する安定した細胞株のトランスフェクションおよび選択
【０２４９】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞への、ＣＭＶプロモーターの制御下におけるＴＨＥＲ−ｍｔｈＩｇＧ  ｃＤＮＡ（変動する長さのリンカーによってヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃドメインから分離された、ヒトａｐｏ  Ａ−１型）を含有する選択可能で増幅可能なプラスミドｐＤＧのエレクトロポレーションによって、Ｉｇ融合タンパク質の安定した産生を達成した。
【０２５０】
ｐＤＧベクターは、プラスミドの淘汰圧を増加させるために減弱されたプロモーターを有するＤＨＦＲ選択可能マーカーをコードするｐｃＤＮＡ３の修飾バージョンである。ＱＩＡＧＥＮ  ＨＩＳＰＥＥＤ（登録商標）マキシプレップ（maxiprep）キットを使用してプラスミドＤＮＡ（２００μｇ）を調製し、精製されたプラスミドを特有のＡｓｃＩ部位において直鎖化し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、カタログ＃Ｒ０５５８）、フェノール抽出（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって精製し、エタノール沈殿し、洗浄し、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２組織培養培地（カタログ＃１４３２４、ＳＡＦＣ／Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁した。フェノール抽出およびエタノール沈殿の直前に、キャリアＤＮＡとしてサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。プラスミドおよびキャリアＤＮＡを共沈殿させ、４００μｇを使用して、エレクトロポレーションによって２×１０７個のＣＨＯ  ＤＧ４４細胞をトランスフェクトした。
【０２５１】
グルタミン（４ｍＭ）、ピルビン酸塩、組換えインスリン（１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび２×ＤＭＥＭ非必須アミノ酸（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ製）を含有するＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地（カタログ＃１３４２４Ｃ、ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（以降、「ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２完全」培地と称される）において、トランスフェクションのため、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を対数期まで育成した。未トランスフェクト細胞およびトランスフェクトしようとする細胞のための培地も、ＨＴ（ヒポキサンチンおよびチミジンの１００×溶液から希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有した。キャパシタンスエクステンダを備えるＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）ＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲ（登録商標）エレクトロポレーションユニットを使用して、２８０ボルト、９５０マイクロファラッドでエレクトロポレーションを行った。０．４ｃｍギャップ無菌使い捨てキュベットにおいてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、培養物をＴ７５フラスコ内の非選択的ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２完全培地に移す前に、エレクトロポレーションされた細胞を５分間インキュベートした。
【０２５２】
トランスフェクトされた細胞を、非選択的培地において一晩回復させ、その後、２５０細胞／ウェル（２５００細胞／ｍｌ）〜２０００細胞／ウェル（２０，０００細胞／ｍｌ）に及ぶ変動する系列希釈で、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において選択的プレーティングを行った。細胞クローニングのための培養培地は、５０ｎＭメトトレキセートを含有するＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２完全培地であった。トランスフェクションプレートに、５日間の間隔で、８０μｌの新鮮培地を与えた。最初の２回の培地供給後に、培地を除去し、新鮮培地で置き換えた。プレートをモニターし、クローンの増殖物（outgrowth）がほとんどコンフルエントとなるまで、クローンの入った個々のウェルに培地を与え、その後、１ｍｌ培地を含有する２４ウェルディッシュへとクローンを増大させた。２４ウェルプレートにおいて細胞を移し増大させる前に、本来の９６ウェルプレート由来の培養上清のアリコートを第２の９６ウェルプレートに採取した。ＩｇＧ濃度を推定するためのＥＬＩＳＡ解析まで、この第２のプレートを凍結した。
組換え融合タンパク質の産生レベルに関する培養上清のスクリーニング
【０２５３】
初期トランスフェクタントのクローンの増殖物が十分なものになったら、マスターウェル由来の培養上清の系列希釈物を解凍し、この希釈物を、ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡの使用により、Ｉｇ融合タンパク質の発現に関してスクリーニングした。簡潔に説明すると、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）プレートを、ＰＢＳにおける２μｇ／ｍｌ  Ｆ（ａｂ’２）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ；カタログ＃１０９−００６−０９８）で４℃にて一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ／３％ＢＳＡにおいてブロッキングし、培養上清の系列希釈物を室温で２〜３時間または一晩４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０において３回洗浄し、ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡにおける１：７５００〜１：１０，０００の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートＦ（ａｂ’２）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、カタログ＃１０９−０３６−０９８）と共に１〜２時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０において５回洗浄し、ＳＵＲＥＢＬＵＥ  ＲＥＳＥＲＶＥ（商標）ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；カタログ＃５３−００−０２）により結合を検出した。等容量の１Ｎ  ＨＣｌの添加により反応を停止し、各プレートにおけるウェル当たりの吸光度を、ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）において４５０ｎＭで読み取った。培養上清の希釈物のＯＤ４５０を、公知標準である、ＴＨＥＲクローンと同一のＩｇ尾部を有するプロテインＡ精製されたヒトＩｇＧ融合タンパク質の系列希釈を使用して作成された検量線と比較することにより、濃度を推定した。データを収集し、ＧＥＮ５（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ＥＸＣＥＬ（登録商標）表計算ソフトウェアを使用して解析した。
【０２５４】
ＣＨＯトランスフェクタントの初期スクリーニングの結果は、表３および図４Ａ〜図４Ｅおよび図５Ａ〜図５Ｃに要約されている。表３は、スクリーニングされたクローンの数、初期９６ウェル培養物から観察された発現レベルの範囲、ならびに初期Ｔ２５および／または２４ウェル使用済みの培養物から観察された発現の概要を示す。図４Ａ〜図４Ｅは、トランスフェクションシリーズの各ＣＨＯクローンから得られる産生レベルを表す一連の円柱グラフを示す。ＴＨＥＲ０、ＴＨＥＲ２、ＴＨＥＲ４、ＴＨＥＲ６およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２トランスフェクション由来のクローンは、図示されている５枚のパネルのそれぞれにおける群として表される。各クローンを、ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによって少なくとも１回スクリーニングして、融合タンパク質の発現レベルを評価した。図５Ａ〜図５Ｃは、初期スクリーニング後に最高の発現量を有するＣＨＯトランスフェクタントからの融合タンパク質発現の６および１０日間アッセイの結果を示す３枚のパネルを示す。Ｔ２５フラスコに１×１０５生細胞／ｍｌ（５×１０５初期接種材料）の５ｍｌ培養物を設置することにより、６および１０日間アッセイを行った。培養物を６日間育成し、その後、１ｍｌアリコートを除去し、生および死細胞を計数した。次に、細胞を遠心分離し、ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡおよび他の解析によるさらなる解析のために培養上清を確保した。１０日目まで、培養物の残りをさらに４日間インキュベートし、細胞数、生存率のために細胞を計数し、ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡのために上清試料を採取した。６日目および１０日目の細胞数、生存率および融合タンパク質の濃度のグラフに示す通り、結果をクローン毎に円柱形式で作表する。
【表３】
2018531622.tif 000005
【０２５５】
融合タンパク質の最高の産生量を有するクローンをＴ２５、次いでＴ７５フラスコにおいて増大して、凍結および融合タンパク質産生のスケールアップに適切な数の細胞をもたらした。メトトレキセート含有培養培地における漸進的な増幅によって、４個の最良のクローン由来の培養物における産生レベルをさらに増加させた。連続的細胞継代のそれぞれにおいて、ＤＨＦＲプラスミドを増幅した細胞のみが生存し得るように、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２完全培地は、増加した濃度のメトトレキセートを含有した。選択的増幅下でのトランスフェクションのための培地は、達成された増幅の程度に応じて、５０ｎＭ〜１μＭに及ぶ変動レベルのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を選択的薬剤として含有した。
培養上清からの融合タンパク質の精製
【０２５６】
Ａｐｏ  Ａ−１−ｌｎｋ−ｍｔｈＩｇＧ１構築物を発現する使用済みのＣＨＯ細胞培養物から上清を収集し、０．２μｍ  ＰＥＳエクスプレスフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ．Ｙ．）を通して濾過し、プロテインＡ−アガロース（ＩＰＡ  ３００架橋アガロースまたはＩＰＡ  ４００ＨＣ架橋アガロース）カラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）上で重力流親和性クロマトグラフィーに付した。カラムを０．１Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ２．２で条件付けし、続いて上清を０．５Ｍ  ＮＨＣＯ３でｐＨ８．０に調整し、重力流によって負荷して、融合タンパク質の結合を可能にした。次に、溶出に先立ち、数カラム容量のカラム洗浄バッファー（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．７）またはダルベッコ変法ＰＢＳ、ｐＨ７．４でカラムを洗浄した。０．１Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ３．２を使用して、結合したタンパク質を溶出させた。画分（０．８〜０．９ｍｌ）を０．２ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣＯ３−ＮａＨＣＯ３バッファーに収集して、各画分を中和した。各画分由来のアリコート（２μｌ）のタンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）微量試料分光光度計を使用して２８０ｎＭにおいて決定し、１０：１のｖ：ｖ比の０．１Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ３．２、０．５Ｍ  ＮａＣＯ３を使用してブランクを決定した。融合タンパク質を含有する画分をプールし、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｇ２（Ｒａｎｃｈ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、カタログ＃Ｇ２３５０５７、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃０８−６０７−００７）ＦＬＯＡＴ−Ａ−ＬＹＺＥＲ（登録商標）ユニット（ＭＷＣＯ  ２０ｋＤａ）を使用したＤ−ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、ｐＨ７．４に対する透析によってバッファー交換を行った。無菌２．２リットルＣｏｒｎｉｎｇローラーボトルにおいて４℃で一晩透析を行った。
【０２５７】
透析後に、０．２μＭフィルターユニットを使用してタンパク質を濾過し、ＰＹＲＯＴＥＬＬ（登録商標）ＬＡＬゲルクロット（gel  clot）システム単一検査バイアル（ＳＴＶ）（カタログ＃Ｇ２００６、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ、Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を使用して、内毒素混入に関してアリコートを検査した。ＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩ（登録商標）バージョン１１．５ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）内のタンパク質解析ツールおよびオンラインＥｘＰＡＳｙタンパク質解析ツール由来の予測される切断部位を使用して、ＴＨＥＲ４融合タンパク質の１ｍｇ／ｍｌ溶液の予測されるＯＤ２８０は、１．１９（シグナルペプチドまたは６アミノ酸プロペプチドのいずれかを含まない成熟タンパク質）または１．２７（６アミノ酸プロペプチドを含む）と決定された。ＣＨＯ細胞から分泌される融合タンパク質が、組換え分子からのプロペプチドの完全切断に関して均一であるかは不明である。これらのツールを使用して、精製された融合タンパク質毎のＯＤ２８０を補正した。
ａｐｏ  Ａ−１  Ｉｇ融合タンパク質の還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
【０２５８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）における電気泳動によって、精製された融合タンパク質を解析した。ジスルフィド結合の還元ありおよびなしで、ＬＤＳ試料バッファー中で融合タンパク質試料を７２℃で１０分間加熱し、４〜１２％  ＢＩＳ−Ｔｒｉｓゲル（カタログ＃ＮＰ０３０１、ＬＩＦＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）にアプライした。５マイクログラムの各精製されたタンパク質をゲルに負荷した。ＩＭＰＥＲＩＡＬ（商標）タンパク質染色剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｐｅｒｉａｌタンパク質染色試薬、カタログ＃２４６１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって、電気泳動後にタンパク質を可視化し、蒸留水中で脱染した。同じゲルに分子量マーカーを含めた（ＫＡＬＥＩＤＯＳＣＯＰＥ（商標）着色済み標準、カタログ＃１６１−０３２４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。代表的な非還元および還元ゲルの結果をそれぞれ図６Ａおよび図６Ｂに示す。レーンは左から右に次の通りである：レーン＃１  −  ＫＡＬＥＩＤＯＳＣＯＰＥ着色済みＭＷマーカー；レーン＃２  −  ＴＨＥＲ０；レーン＃３  −  ＴＨＥＲ２；レーン＃４  −  ＴＨＥＲ４；レーン＃５  −  ＴＨＥＲ６；レーン＃６  −  ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２；レーン＃７  −  ＫＡＬＥＩＤＯＳＣＯＰＥ着色済みＭＷマーカー。およその分子量を図面に示す。
【０２５９】
重ねて、異なる融合タンパク質の間のリンカーの長さの差は、還元および非還元ゲルの両方で明らかであり、ＴＨＥＲ０タンパク質は、５０ｋＤａの少し上に泳動される。ヒンジジスルフィドの非存在は、還元または非還元条件下で電気泳動した際の、それぞれのタンパク質の同様の移動度によって明らかである。
ａｐｏ  Ａ−１  ＩｇＧ融合タンパク質のネイティブゲル電気泳動
【０２６０】
プロテインＡ精製された融合タンパク質を、ネイティブＰＡＧＥ解析に付した。４〜１６％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓネイティブＰＡＧＥ（商標）ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と、メーカーの説明書に従って調製された陰極および陽極バッファーを使用して、ＢＬＵＥネイティブＰＡＧＥゲルを泳動した。加熱せずに、洗剤を含まない４×試料バッファーを使用して、試料（４．５μｇの各融合タンパク質）を調製した。ゲルを３０分間１５０ボルトで、次いで１時間１８０ボルトで、最後の１時間は２２０ボルトで泳動した。ゲルを蒸留水中で洗浄し、ＩＭＰＥＲＩＡＬ（商標）タンパク質染色剤中で２時間インキュベートした。蒸留水における反復した洗浄により、ゲルを一晩大規模に脱染して、ゲル泳動に使用した陰極バッファーに存在する青色色素を除去した。図７は、これらの条件を使用した代表的なネイティブゲルを示す。分子量マーカーは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高分子量較正マーカーであり、これは、やはり洗剤が添加されていない試料に使用されるローディングバッファーに再懸濁された、６種の大型の多成分タンパク質の混合物である。試料を次の通りに負荷した：レーン＃１  −  ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）（アバタセプト；ＣＴＬＡ４ｈＩｇＧ）；レーン＃２  −  抗マウスＣＤ４０モノクローナル抗体１Ｃ１０；レーン＃３  −  ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２；レーン＃４  −  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高ＭＷ較正マーカー；レーン＃５  −  ＴＨＥＲ６；レーン＃６  −  ＴＨＥＲ４；レーン＃７  −  ＴＨＥＲ２；レーン＃８  −  ＴＨＥＲ０；レーン＃９  −  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ高ＭＷマーカー；レーン＃１０  −  Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｐｏ  Ａ−１。
【０２６１】
ネイティブＡｐｏＡ１−ＩｇＧ融合タンパク質は、１４０〜２３３ｋＤａマーカーの間のいずれかの位置のおよその分子量に泳動され、同じヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質であるＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）（アバタセプト）と同様の移動度を有した。ＴＨＥＲ４ＲＮａｓｅ二重特異性融合タンパク質は、ＩＭＰＥＲＩＡＬ染色剤で十分に染色されず、これはおそらく、ＲＮａｓｅドメインの高度に塩基性の組成によるものであるが、より拡散したパターンで移動すると思われ、優勢な可視バンドは、２３３〜４４０ｋＤａ標準の間を移動する。
（実施例５）
ＴＨＥＲ  Ａｐｏ  Ａ−１融合タンパク質の結合を評価するためのＩｇＧ／Ａｐｏ  Ａ−１サンドイッチＥＬＩＳＡの使用
【０２６２】
抗原結合ＥＬＩＳＡを行って、結合する固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）によって捕捉され、ヒトアポリポタンパク質Ａ−１に特異的な西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗体によって検出される、Ｉｇ融合タンパク質の能力を評価した。高タンパク質結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）プレート、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でコーティングした。プレートをＰＢＳ／３％  ＢＳＡにより一晩４℃でブロッキングした。５μｇ／ｍｌから開始した各ＴＨＥＲ融合タンパク質の系列希釈物を一晩４℃でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、続いて１：１５００希釈した西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトアポリポタンパク質Ａ−１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃ＰＡＩ−２８９６５）と共にインキュベートした。プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、続いてＳＵＲＥＢＬＵＥ  ＲＥＳＥＲＶＥ（商標）ＴＭＢ基質（カタログ＃：５３−００−０２、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を８０μｌ／ウェルでプレートに添加した。８０μｌ／ウェル１Ｎ  ＨＣｌの添加により発色を停止した。ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して４５０ｎｍで試料を読み取り、ＧＥＮ５（商標）２．０ソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０２６３】
図８は、代表的なＡｐｏ  Ａ−１結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。融合タンパク質の濃度に対してＯＤ４５０をプロットする。ＴＨＥＲ  ０、２、４、６およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２融合タンパク質は全て、同様の用量応答曲線を示し、分子はそれぞれ、Ｉｇ尾部への結合によって捕捉することができ、ヒトＡｐｏ  Ａ−１に標的化された抗体へのＡｐｏ  Ａ−１ドメインの結合によって検出することができることを示す。ヒトアポリポタンパク質Ａ−１（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃１６−１６−１２０１０１）を対照として含め、これは、抗ヒトＦｃ特異的抗体によって捕捉されなかった。より高い濃度では、分子は、Ａｐｏ  Ａ−１に標的化された抗体による弱い結合を示し、Ａｐｏ  Ａ−１が、抗Ｆｃ抗体によって捕捉されることなく、プラスチックに弱く結合した可能性を示す。
（実施例６）
ＲＮａｓｅ二機能性酵素脂質輸送融合分子の発現および検査
【０２６４】
Ａｐｏ  Ａ−１  ＩｇＧ  ＲＮａｓｅ融合タンパク質（ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２）のため、ＲＮａｓｅ活性をアッセイして、融合構築物のカルボキシル末端への酵素の融合が、ＲＮＡを消化する分子の能力に干渉したか決定した。図９および図１０は、ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）ＨＴプレートリーダーの蛍光および動態アッセイ機能を使用して行われたＲＮＡＳＥＡＬＥＲＴ（商標）アッセイ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）の結果を示す。ＲＮＡＳＥＡＬＥＲＴ（商標）基質は、一方の末端にフルオレセイン（Ｒ）を有し、他の末端にダーククエンチャー（dark  quencher）（Ｑ）を有する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。インタクトである場合、基質は、蛍光がほとんどまたは全くないが、ＲＮａｓｅによって切断された場合、基質は、緑色の蛍光を発し（４９０ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光）、適切に装備された蛍光プレートリーダーにより検出することができる。このアッセイにおける陽性シグナルは、試料（複数可）中に存在するＲＮａｓｅによる基質の切断により、時間と共に増加する蛍光シグナルを示す。９６ウェルプレートの各ウェルに添加されたＲＮＡＳＥＡＬＥＲＴ基質（固定濃度の２０ｐｍｏｌ／μｌ）、１×ＲＮＡＳＥＡＬＥＲＴバッファーおよび融合タンパク質または酵素対照希釈物と共に、マイクロプレートをインキュベートした。試料毎に３回酵素活性アッセイを行い、動態アッセイを４５分間進め、６０秒間毎に連続的読み取りを行った。各時点における増加する蛍光は、図９において、時間の関数としてのＲＦＵ／ウェルのトレースとしてウェル毎に表される。酵素／融合タンパク質の系列希釈物は、２０ｐｍｏｌ／μｌ、１３．４ｐｍｏｌ／μｌ、８．９ｐｍｏｌ／μｌ、６ｐｍｏｌ／μｌ、４ｐｍｏｌ／μｌ、２．７ｐｍｏｌ／μｌ、１．８ｐｍｏｌ／μｌおよび酵素なしを含んだ。ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２融合タンパク質と比較するために、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ａｍｂｉｏｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃ＡＭ２２７０）を陽性対照として含め、ＴＨＥＲ４（ａｐｏ  Ａ−１−ｌｎｋ２６−ｈＩｇＧ）を陰性対照として含めた。４ｐｍｏｌ／μｌ酵素を使用して作成されたトレースの重ね合せを図１０に示す。２回複製のＲＮａｓｅＡ、ＴＨＥＲ４ＲＮＡ２およびＴＨＥＲ４を示す。全酵素は４ｐｍｏｌ／μｌであり、基質は２０ｐｍｏｌ／μｌで存在する。
（実施例７）
融合タンパク質アクセプターへのコレステロール流出の測定
【０２６５】
２種の別々のアッセイを使用して、ＴＨＥＲ０、ＴＨＥＲ２、ＴＨＥＲ４、ＴＨＥＲ６およびＴＨＥＲ４ＲＮＡ２融合タンパク質を、予め負荷された単球／マクロファージ哺乳動物細胞株からのコレステロール逆転送のためのアクセプター分子として作用するその能力に関して評価した。第１のアッセイは、ヒト単球／マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１および蛍光標識されたコレステロール誘導体であるＢＯＤＩＰＹ−コレステロールまたはＴＯＰＦＬＵＯＲ−コレステロール（ステロール炭素−２４に連結された蛍光ボロンジピロメタン（dipyrromethene）二フッ化物を有するコレステロール化合物）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）を使用した。ＴＨＰ−１細胞を、４ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩにおいて育成し、プレーティングに先立ち中期（mid）対数増殖に維持した。Sankaranararyananら（J.  Lipid  Res.５２巻：２３３２〜２３４０頁、２０１１年）およびZhangら（ASSAY  and  Drug  Development  Technologies：１３６〜１４６頁、２０１１年）に概要を述べる手順からプロトコールを適応させた。細胞を採取し、３３ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡを含有する１００μｌ  ＲＰＭＩ培地において２×１０６細胞／ｍｌまたは２×１０５細胞／ウェルとなるよう９６ウェル平底組織培養プレートに蒔いた。細胞を培養に３６〜４８時間維持して、アッセイに先立ち分化を起こさせた。培養培地を吸引し、プレートを１×ＰＢＳにおいて洗浄した。次の成分（培地サプリメントを含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ、０．２％  ＦＢＳとＡＣＡＴ阻害剤２μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｄｏｚ  ５８−０３５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、ＬＸＲアゴニストＴＯ−９０１３１７、２．５μＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、３５ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１．２５ｍＭメチルベータ−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５０ｕＭコレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および２５μＭ  ＴＯＰＦＬＵＯＲコレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ））からなる標識培地を１００μｌ／ウェルの容量で添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて１０〜１２時間インキュベートした。平衡化培地、ＲＰＭＩ完全と１０％ＦＢＳ、３３ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（１００ｕｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、８時間インキュベートし、その後、アクセプターとのインキュベーションを行った。標識／平衡化培地をプレートから吸引し、プレートを２００μｌ／ウェルＰＢＳ＋０．１５％  ＢＳＡで２回洗浄した。流出アクセプター試薬を流出バッファー中、個々のウェルに添加し、アッセイに先立ち２時間インキュベートした。アクセプターを、アッセイに応じて１００ｎＭ〜５００ｎＭに及ぶ濃度で流出バッファーに添加した。流出バッファーは、成長サプリメントおよび０．１５％  ＢＳＡを含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩであった。試料を条件／アクセプター当たり６〜１２のセットにおいて実行し、最小で５回の複製を統計解析に使用した。ＡＰＯ  Ａ−１を陽性対照として実行��、流出培地単独をバックグラウンド陰性対照（ベースライン流出）として使用した。流出反応を２時間進め、その後、培養培地を黒色平底９６ウェルプレート（培地読み取り値）に採取した。流出プレートの各ウェルへの１００ｕｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加と、４℃のプレート振盪機における１５分間インキュベーションによって、細胞ライセートを調製した。細胞ライセートを黒色９６ウェルプレート（ライセート読み取り値）に移し、励起４８５ｎｍおよび発光５２８ｎｍによるＳＹＮＥＲＧＹ（商標）ＨＴプレートリーダーを使用して、培地およびライセート試料の蛍光を測定した。蛍光測定値の比として流出を計算した：（培地／（培地＋ライセート）×１００）。被験アクセプター毎に、総流出／試料からアクセプターが存在しない試料のベースライン読み取り値を減算することにより、特異的流出を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．０ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、データ解析を行った。アッセイ結果を図１１に示す。
【０２６６】
第２のアッセイは、マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用して、Sankaranararyananら（J.  Lipid  Res.５２巻：２３３２〜２３４０頁、２０１１年）およびYanceyら（J.  Lipid  Res.４５巻：３３７〜３４６頁、２００４年）によって記載されているコレステロールの放射性誘導体である［３Ｈ］−コレステロールを使用して、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）を評価した。簡潔に説明すると、５％  ＦＢＳ、ＡＣＡＴ阻害剤Ｓａｎｄｏｚ  ５８−０３５（２μｇ／ｍｌ）および４μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−コレステロールを補充した０．２５ｍｌのＲＰＭＩ培地において、Ｊ７７４細胞（２４ウェルプレートにおけるウェル当たり３．５×１０５個）を２４時間インキュベートした。ＡＣＡＴ阻害剤は、アッセイにおいて全時点で存在した。アクセプターとのインキュベーションに先立ち、ｃＡＭＰ（０．３ｍＭ）ありまたはなしの培地において細胞を１６〜２４時間平衡化した。ｃＡＭＰの存在は、ＡＢＣＡ１分子を上方調節する。標識された細胞を、１％  ＢＳＡを含有する培地において洗浄し、続いてアクセプター分子をＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ培地において５０、１００および２００ｎＭで添加し、測定に先立ち４時間インキュベートした。全処理を３回行った。次に、１００μｌの培地における［３Ｈ］コレステロールを液体シンチレーションカウントによって測定した。パーセンテージ流出は、流出インキュベーション前の細胞（ｔ０試料）に存在する総［３Ｈ］コレステロールに基づいた。細胞に存在する［３Ｈ］コレステロールを測定するために、イソプロパノール中で細胞単層を一晩インキュベートすることにより、細胞脂質を抽出した。脂質抽出後に、脂質抽出物中に存在する総［３Ｈ］コレステロールを液体シンチレーションカウントによって測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア４．０（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータ解析を行った。アッセイ結果を図１２に示す。
（実施例８）
ＰＯＮ１二機能性酵素脂質輸送融合分子の構築
【０２６７】
上述のａｐｏＡ−１−ＩｇＧ−ＲＮａｓｅ発現構築物に加えて、他の酵素ドメインの活性部位にＡｐｏＡ−１リン脂質輸送機能を物理的に連結する追加的な分子が構築される。このような分子の１種は、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に示すヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列を有する、ヒトパラオキソナーゼ（paraoxanase）１（ＰＯＮ１）に対応するセグメントを含有する。このアリールエステラーゼ酵素は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と排他的に会合して、ヒト血清中に存在し、低密度リポタンパク質分子の酸化を阻害する。このような酸化からの保護は、血管性および冠血管疾患の発症も阻害する。ＰＯＮ１の成熟タンパク質型は、分泌後にそのアミノ末端シグナルペプチド（配列番号１１のヌクレオチド残基１〜４５によってコードされる、配列番号１２のアミノ酸残基１〜１５）を保持するという点において特有である。切断可能アミノ末端を有するＰＯＮ１の突然変異体型の発現は、ＰＯＮ１が、先ずＡｐｏＡ−１に結合するのではなく直接的にリン脂質に結合することにより、そのアミノ末端を介してリポタンパク質と会合することを実証した。Sorensonら、Arteriosclerosis,  Thrombosis,  and  Vascular  Biology  １９巻：２２１４〜２２２５頁、１９９９年を参照されたい。シグナル配列の除去は、リン脂質、プロテオリポソームおよび血清リポタンパク質へのＰＯＮ１部分の結合を排除することが見出された。その上、リン脂質の非存在下において、野生型ＰＯＮ１は、ＡｐｏＡ−１に直接的に結合しない。Sorensonら、上記参照。このようなＰＯＮ１シグナル配列突然変異体は、おそらく、最適なリン脂質基質に結合することができないことから、低下した酵素活性を示した。そうであるにもかかわらず、このシグナル配列を失っている、組換え活性型のヒトＰＯＮ１が細菌において発現された。Stevensら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０５巻：１２７８０〜１２７８４頁、２００８年を参照されたい。ＡｐｏＡ−１の存在は、酵素のアリールエステラーゼ活性を安定化するものと思われる。
【０２６８】
ＰＯＮ１のアミノ末端シグナル配列（およびしたがって、リン脂質結合部分）の除去、およびヒトａｐｏＡ−１−ｌｎｋ−ＩｇＧによるこの領域の置換は、酵素活性とＡｐｏＡ−１のリン脂質結合ドメインを直接的に連結し、ＡｐｏＡ−１ドメインに結合した最適な基質をもたらしつつ、アリールエステラーゼ酵素活性を安定化する。このような分子は依然として往来し、ＡｐｏＡ−１によって結合されたリン脂質により輸送され、代替リン脂質結合ドメインによるシグナル配列ドメインの置換により酵素活性を保持する。加えて、これら２個のドメインを融合する二機能性分子は、改善された発現を示し、ａｐｏ  Ａ−１の活性な結合により脈絡叢へのＰＯＮ１活性の標的化を容易にする。ＰＯＮ１は、インスリン受容体標的化抗体のカルボキシル末端で発現された（Boadoら、Mol.  Pharm.５巻：１０３７〜１０４３頁、２００８年；Boadoら、Biotechnology  and  Bioengineering  １０８巻：１８６〜１９６頁、２０１１年を参照）；しかし、アミノ末端シグナルペプチドは、この融合タンパク質に含まれた。本明細書に記載されている融合遺伝子およびタンパク質は、ａｐｏ  Ａ−１ドメインへのトランケートされた酵素の直接的物理的カップリングによりシグナルペプチドの必要性を排除し、これにより、ＰＯＮ１の結合機能およびアリールエステラーゼ活性の両方を保存および安定化する、ＰＯＮ１融合タンパク質発現の新規方法を提供する。
【０２６９】
融合遺伝子およびタンパク質の配列は、ＴＨＥＲ４ＰＯＮ１については配列番号２７および配列番号２８（それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列）、ならびにＴＨＥＲ２ＰＯＮ１については配列番号３７および配列番号３８（それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に示されている。同様の融合遺伝子およびタンパク質は、ｈＩｇＧ１−リンカー−ＰＯＮ１セグメント（複数可）に融合されたＡｐｏＡ−１の代替リンカー型を含有する。ＴＨＥＲ４ＰＯＮ１およびＴＨＥＲ２ＰＯＮ１分子内のＰＯＮ１配列は、ヒトＰＯＮ１のＱ１９２対立遺伝子に対応する。
【０２７０】
ＰＯＮ１の代替型も、ＰＯＮ１をＡｐｏ  Ａ−１に連結する二機能性融合分子の構築に使用される。異なる基質に対する酵素活性に影響を与える配列多型は、ＰＯＮ１配列の１９２位に存在する。Stevenら、上記参照。この位置におけるアミノ酸は、ヒトではグルタミン（Ｑ）もしくはアルギニン（Ｒ）、またはウサギではリシン（Ｋ）となることができる。１９２位におけるアルギニン対立遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでより高い触媒活性を有することが報告された。同様に、１９２位にリシンを有するＰＯＮ１のウサギ型は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでより安定した触媒活性を有することが報告された（Stevenら、上記参照；Richterら、Circulation  Cardiovascular  Genetics  １巻：１４７〜１５２頁、２００８年を参照）。これらの代替ＰＯＮ１配列は、ＰＯＮ１  Ｑ１９２Ｋ型については配列番号４１（ヌクレオチド）および配列番号４２（アミノ酸）、ならびにＰＯＮ１  Ｑ１９２Ｒ型については配列番号４３（ヌクレオチド）および配列番号４４（アミノ酸）に示されている。これらの代替ＰＯＮ１型とＴＨＥＲ４配列（ａｐｏＡ−１（ｇ４ｓ）４ｈＩｇＧＮＬＧ−…）の間の融合構築物は、ＰＯＮ１配列のアミノ酸１９２（または配列番号４６および配列番号４８に示すＴＨＥＲ４ＰＯＮ１Ｑバリアントのアミノ酸７２０）においてＰＯＮ１配列に存在する多型に応じて、ＴＨＥＲ４ＰＯＮ１  Ｑ１９２Ｋ（それぞれ配列番号４５および配列番号４６に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列）またはＴＨＥＲ４ＰＯＮ１  Ｑ１９２Ｒ（それぞれ配列番号４７および配列番号４８に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列）と命名される。同様に、融合遺伝子／タンパク質のＴＨＥＲ２型は、ＴＨＥＲ２ＰＯＮ１  Ｑ１９２ＫまたはＴＨＥＲ２ＰＯＮ１Ｑ１９２Ｒと示される。これらの融合構築物の全てに関して、ＰＯＮ１アミノ末端シグナル配列（配列番号１２のアミノ酸１〜１５）が除去される。
【０２７１】
ＰＯＮ１を含む二重特異性酵素リポタンパク質転送タンパク質は、無毒性基質４−（クロロメチル）酢酸フェニル（ＣＭＰＡ）および酢酸フェニルを使用して、アリールエステラーゼ／ＰＯＮ１活性に関してスクリーニングされる（Richterら、上記参照）。基質および反応産物は、有機リン酸エステル駆除薬と比較して相対的に無毒性であるため、これらの基質は、活性のスクリーニングに好ましい。ＣＭＰＡ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、融合タンパク質の系列希釈物と共にインキュベートされ、ＣＭＰＡ加水分解の速度が、紫外線透過的９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）を使用して、２８０ｎｍで４分間、２５℃にてアッセイされる。希釈物を３回または４回アッセイを実行し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２における３ｍｍｏｌ／Ｌに基質濃度を固定する。同様に、アリールエステラーゼアッセイは、基質としての酢酸フェニルにおいて行われる。ＰＡ加水分解の速度は、高および低塩条件下の両方で、２７０ｎｍで４分間測定される。
（実施例９）
ＰＡＦＡＨまたはＣＥＴＰ二機能性酵素脂質輸送融合分子の構築
【０２７２】
上述のａｐｏＡ−１−ＩｇＧ−ＲＮａｓｅおよびａｐｏＡ−１−ＩｇＧ−ＰＯＮ１発現構築物に加えて、他の酵素ドメインの活性部位にＡｐｏＡ−１リン脂質輸送機能を物理的に連結する追加的な分子が構築される。
【０２７３】
このような分子の１種は、それぞれ配列番号３１および配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０８４（転写物バリアント１）も参照）に示すヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列を有する、ヒトＰＡＦＡＨ（リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２、ヒトホスホリパーゼＡ２群ＶＩＩ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）に対応するセグメントを含有する。ＰＡＦＡＨアミノ酸配列は、ヌクレオチド１５９３〜１５９５に終止コドンを有する、配列番号３１のヌクレオチド２７０〜１５９２によってコードされる。融合遺伝子およびタンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を有するヒトＩｇＧのカルボキシル末端においてＰＡＦＡＨコード配列を融合して、この２分子の間にリンカーを挿入して、設計される。ＴＨＥＲ４ＰＡＦＡＨヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３３および配列番号３４として示されている。２１アミノ酸シグナルペプチド（ＭＶＰＰＫＬＨＶＬＦＣＬＣＧＣＬＡＶＶＹＰ；配列番号３２の残基１〜２１）を含まないＰＡＦＡＨ配列は、配列番号３４のアミノ酸位置５４４においてＮＬＧリンカーに融合される。
【０２７４】
別のこのような分子は、それぞれ配列番号２９および配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７８も参照）に示すヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列を有する、ヒトＣＥＴＰまたはコレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、転写物バリアント１に対応するセグメントを含有する。ＣＥＴＰタンパク質は、配列番号２９のヌクレオチド５８〜１５３７によってコードされる。融合遺伝子およびタンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を有するヒトＩｇＧのカルボキシル末端においてＣＥＴＰコード配列を融合して、この２分子の間にリンカーを挿入して、設計される。ＴＨＥＲ４ＣＥＴＰ（またはヒトａｐｏ  Ａ−１−（ｇ４ｓ）４−ｈＩｇＧ−ＮＬＧ−ＣＥＴＰ）ヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９および配列番号４０として示されている。ＮＬＧリンカー配列とＣＥＴＰ成熟ペプチドの間の融合遺伝子を作製するために、シグナルペプチド（配列番号３０のアミノ酸１〜１７）をコードするヌクレオチド（配列番号２９の５７〜１０７）は除去される。これら２個のタンパク質ドメインの間の融合接合部は、配列番号４０のアミノ酸５４４に位置する。
【０２７５】
前述から、本発明の特異的な実施形態について本明細書において例証目的で記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが認められよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のため、これらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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