(57)【要約】本発明は、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、その組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの作製方法、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用によりＢ型肝炎ウイルスを持続的に複製するｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボモデルを樹立するための方法、ならびに抗ＨＢＶ薬の評価のための方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項２】
サイト−ハイブリッドインサートがａｔｔＲ部位である、請求項１に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項３】
ａｔｔＲ部位が、ｐｒｅＳ１遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置する、請求項１または２に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項４】
ａｔｔＲ部位が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２８４７位と２８４８位の間に位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項５】
ＨＢＶゲノムが完全長ゲノム、特に遺伝子型Ｂまたは遺伝子型Ｄのゲノム、より特別にはＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１、Ｘ０２４９６、ＡＹ２１７３７０、ＡＹ２２０６９８、ＧＱ２０５４４０またはＨＰＢＨＢＶＡＡに特定されたゲノム、最も特別にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３により表わされるゲノムであり；あるいは遺伝子型Ｄの過剰長ゲノム、特に１．１単位または１．３単位のゲノム、より特別にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９により表わされる１．３単位ゲノムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項６】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ中のＨＢＶゲノムのフラグメントが、ＨＢＶのエンベロープタンパク質、コア／プレコアタンパク質、ｘタンパク質および／またはポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子を複製または発現することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡであって、その配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に挙げたものである、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項８】
細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項９】
細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはＨｅｐＧ２またはＨｅｐａＲＧであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、請求項８に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１０】
抗ＨＢＶ薬の評価のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１１】
抗ＨＢＶ薬がＥＴＶ、ＨＡＰ  １２、ＨＡＰ  ２、ＰｅｇａｓｙｓまたはＲ８４８である、請求項９に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１２】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含むｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１３】
樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも３０日間、特に肝実質細胞において少なくとも３７日間、４２日間、４４日間、４９日間、５１日間、５６日間、７０日間、１０４日間、１２０日間または１３４日間、ＨＢＶ抗原を発現する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１４】
動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１５】
動物がマウスである、特にマウスがＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣＢＡ／Ｊマウスである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１６】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを含む組成物またはキット。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造するための、下記の工程を含む方法：
ａ）  ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親ＨＢＶサークル構築体を形成し；
ｂ）その親ＨＢＶサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを産生させる。
【請求項１９】
ミニサークル産生体が微生物、好ましくは細菌、より特別にはエシェリキア属菌種(Escherichia sp.)、最も特別には大腸菌(E.coli)、特に株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターが、組換え基質部位、特にリコンビナーゼに対して特異的な、より特別にはインテグラーゼ、最も特別にはφＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、φＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、φＦＣ１のインテグラーゼに対して特異的な、組換え基質部位を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
組換え基質部位がａｔｔＰおよびａｔｔＢである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターがｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
親ＨＢＶサークル構築体のＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に挙げたものである、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬の評価における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは請求項１７に記載の組成物もしくはキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサート(site-hybrid insert)を含む組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、その組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの作製方法、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用によりＢ型肝炎ウイルスを持続的に複製するｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボモデルを樹立するための方法、ならびに抗ＨＢＶ薬の評価のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は最も危険なヒト病原体のひとつである。安全かつ有効なワクチンが２０年以上前に得られているが、世界中でおおよそ２０億人がＨＢＶに感染し、３億５０００万人以上が慢性的に感染している(Liaw, et al., 2009, Lancet, 373: 582-92)。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染は、肝硬変および肝細胞癌を含めた重篤な肝疾患の素因となる。ＨＢＶ感染症は世界中で最上位の優先健康事項にランクされ、2010 Global Burden of Disease study(Lozano, et al., 2012, Lancet, 380: 2095-128)によれば死亡の１０番目の主因（年間７８６０００人の死亡）であった。現在承認されている薬物はＣＨＢの治療を実質的に前進させたが、治癒率は依然として１０％未満である(Kwon, et al., 2011, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 8: 275-84)。
【０００３】
ＨＢＶは部分二本鎖ＤＮＡウイルスである。ヒト肝実質細胞(hepatocyte)に感染すると、共有結合閉環状ＤＮＡ(covalently closed circular DNA)（ｃｃｃＤＮＡ）が形成されて感染細胞核内に維持され、それはそこに安定エピソームとして存続し、全ウイルス遺伝子の転写のための鋳型として使われる(Levrero, et al., 2009, J Hepatol, 51: 581-92)。現在の療法の主な限界は、既存のｃｃｃＤＮＡプールを排除できないことである。したがって、ｃｃｃＤＮＡを直接ターゲティングする新規療法薬の開発に対する差し迫ったニーズがある(Fletcher, et al., 2013, Semin Liver Dis, 33: 130-7)。
【０００４】
ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡベースのインビトロおよびインビボモデルの樹立に関するこれまでの試みは、満足すべき結果を生じることができなかった。たとえば、ＰＣＲ作製したモノマー線状ＨＢＶゲノムのトランスフェクションは肝実質細胞においてｃｃｃＤＮＡを産生できた(Gunther, et al., 1995, J Virol, 69: 5437-44, Pollicino, et al., 2006, Gastroenterology, 130: 823-37)が、効率が低く、オリゴマーが形成される可能性がある。この方法を改善するために、ＰＣＲ作製したモノマー線状ＨＢＶゲノムをトランスフェクション前に環化することができたが、複雑なプロセスおよび低い収率のため、ＤＮＡ製造をインビボ試験用にスケールアップするのはきわめて困難である(Cavallone, et al., 2013, J Virol Methods, 189: 110-7, Qin, et al., 2011, J Clin Microbiol, 49: 1226-33)。
【０００５】
最近、部位特異的分子内組換え法に基づくミニサークル技術が十分に確立され、それは高収率で再現性のある高品質を備えたミニサークルＤＮＡ(minicircle DNA)を効率的に製造することができる(Kobelt, et al., 2013, Mol Biotechnol, 53: 80-9)。しかし、そのような技術を組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの製造のために用いて成功したことがない。
【０００６】
したがって、ｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボモデルの樹立に使用するために機能できる効率的な組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、および大量のその組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを効率的に作製する方法に対するニーズがある。
【０００７】
さらに、抗ＨＢＶ薬を見出すことは簡便で生理学的に妥当なインビトロおよびインビボモデルが無いことにより妨げられてきた。初代ヒト肝実質細胞(primary human hepatocyte)（ＰＨＨ）、分化したＨｅｐａＲＧ細胞およびＨｅｐＧ２細胞など、安定ＮＴＣＰタンパク質発現を伴う幾つかのインビトロＨＢＶ自然感染系はあるが、抗ＨＢＶ分子についてこれらの系を用いたハイスループットスクリーニング(high throughput screening)（ＨＴＳ）を実施するのはきわめて困難である。たとえば、新鮮なＰＨＨはＨＢＶ薬物を見出すために生理学的に最も妥当なインビトロモデルであるが、ＰＨＨは単離されるとＨＢＶ感染に対するそれの感受性を急速に失う(Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049)。さらに、制限された供給量、高い代謝レベルおよびドナー間バリエーションは、この系を著しく非効率的なものにしている。ＨｅｐａＲＧはＨＢＶ感染を支持できた最初の細胞系であるが、分化およびアッセイの時間が長いことがＨＴＳへのそれの利用を制限している(Gripon, et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 15655-60)。ＨＢＶ侵入レセプター(HBV entry receptor)としてのＮＴＣＰの発見に伴って、ＮＴＣＰを安定発現するように遺伝子工学操作したＨｅｐＧ２細胞系はＨＢＶ感染されやすく、直ちに、ＨＢＶを研究して薬物を見出すためのきわめて有用なツールとなった(Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049)。しかし、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅｐＡＤ３８、ＨｅｐＤＥ１９およびＨｅｐＤＥＳ１９のように、ＨｅｐＧ２由来の細胞系はすべてインターフェロン（ＩＦＮ）仲介による抗ＨＢＶ応答に欠陥があり、それはＩＦＮ経路関連の免疫調節物質を同定および試験するのに適さない(Marozin, et al., 2008, Mol Ther, 16: 1789-97, Keskinen, et al., 1999, Virology, 263: 364-75)。
【０００８】
ＨＢＶは宿主範囲がきわめて狭く、ヒト、チンパンジーおよびツパイ(tree shrew)(コモンツパイ(Tupaia belangeri))のみが感受性である。遺伝学的および免疫学的に十分に特性解明されたＨＢＶ感染可能な実験動物が無く、これはＨＢＶ免疫病原性および持続性のメカニズムに関する研究だけでなく抗ＨＢＶ薬の開発をも著しく制限している。この制限を克服するために、ヒト肝実質細胞を導入してヒト化肝臓をもつキメラマウスを作製するか、あるいはＨＢＶ  ＤＮＡをマウス肝臓にトランスジェニック、トランスダクションまたはハイドロダイナミックインジェクション(hydrodynamic injection)（ＨＤＩ）により導入することによって、幾つかのマウスモデルが樹立された(Dandri, et al., 2014, J Immunol Methods)。キメラマウスモデル、たとえばｕＰＡ−ＳＣＩＤマウスおよびＦＲＧマウスは、侵入、ｃｃｃＤＮＡ形成および伝播を含めてＨＢＶの全ライフサイクルを支持するが、それらは遺伝学的に免疫欠損性であり、獲得免疫応答を研究するのには適さない(Dandri, et al., 2001, Hepatology, 33: 981-8, Azuma, et al., 2007, Nat Biotechnol, 25: 903-10)。ＨＢＶ  ＤＮＡをマウスの肝臓に直接導入すれば侵入工程を迂回でき、免疫コンピテント（免疫適格）(immunocompetent)バックグラウンド下のマウス肝臓における持続的なＨＢＶ複製が可能になるであろう。しかし、これらのモデルの主な限界は、ＨＢＶ複製がｃｃｃＤＮＡによって推進されず、それらを生理学的関連性がより少ないものにすることである。最近、Qiらは革新的なＨＤＩベースの組換えｃｃｃＤＮＡマウスモデルを開発し、その場合、ｃｃｃＤＮＡがインビボでＣｒｅ／ｌｏｘＰ仲介ＤＮＡ組換えにより産生された(Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56)。しかし、ウイルス複製レベルが低く、インビボ持続時間が短かった(Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56)。
【０００９】
まとめると、既存のＨＢＶ細胞培養モデルは重大な限界をもつ。たとえば、ＰＨＨは供給量およびドナー間バリエーションの問題をもち、ＨｅｐａＲＧは分化およびアッセイ時間が長いという問題をもち、ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞はインターフェロン（ＩＦＮ）仲介による抗ＨＢＶ応答に欠陥をもつ。既存のＨＢＶ動物モデルも重大な限界をもつ。たとえば、ヒト化肝臓キメラマウスモデルは機能性である獲得免疫をもたない。トランスダクションおよびＨＤＩマウスモデルにおいては、ＨＢＶ複製がｃｃｃＤＮＡによって推進されず、それらを生理学的関連性がより少ないものにしている。抗ＨＢＶ薬を見出してＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ関連の生物学的問題に対処するためには、これらの限界を改善するためにｃｃｃＤＮＡベースのモデル、特にｃｃｃＤＮＡ推進による持続的ＨＢＶ複製を支持できる免疫コンピテントマウスモデルを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Liaw, et al., 2009, Lancet, 373: 582-92
【非特許文献２】2010 Global Burden of Disease study (Lozano, et al., 2012, Lancet, 380: 2095-128)
【非特許文献３】Kwon, et al., 2011, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 8: 275-84
【非特許文献４】Levrero, et al., 2009, J Hepatol, 51: 581-92
【非特許文献５】Fletcher, et al., 2013, Semin Liver Dis, 33: 130-7
【非特許文献６】Gunther, et al., 1995, J Virol, 69: 5437-44
【非特許文献７】Pollicino, et al., 2006, Gastroenterology, 130: 823-37
【非特許文献８】Cavallone, et al., 2013, J Virol Methods, 189: 110-7
【非特許文献９】Qin, et al., 2011, J Clin Microbiol, 49: 1226-33
【非特許文献１０】Kobelt, et al., 2013, Mol Biotechnol, 53: 80-9
【非特許文献１１】Yan, et al., 2012, Elife, 1: e00049
【非特許文献１２】Gripon, et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 15655-60
【非特許文献１３】Marozin, et al., 2008, Mol Ther, 16: 1789-97, Keskinen, et al., 1999, Virology, 263: 364-75
【非特許文献１４】Dandri, et al., 2014, J Immunol Methods
【非特許文献１５】Dandri, et al., 2001, Hepatology, 33: 981-8
【非特許文献１６】Azuma, et al., 2007, Nat Biotechnol, 25: 903-10
【非特許文献１７】Qi, et al., 2014, J Virol, 88: 8045-56
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、および組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製する方法を提供する。組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡは種々のヌクレオチド配列、たとえばいずれかの遺伝子型のＨＢＶゲノム、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含むことができる。さらに、この方法を用いて大量の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製することも本発明の目的のひとつである。
【００１２】
本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを培養細胞にトランスフェクトすると、それは天然ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡと同じ挙動をし、それはエピソーム形態で細胞核内に存在してＨＢＶ複製を支持することができる。この細胞培養モデルを用いると、侵入およびｃｃｃＤＮＡ形成などの制約工程を迂回して、簡単なトランスフェクションプロセスによりＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡをあらゆる初代細胞および細胞系に簡便に導入することができる。
【００１３】
本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡをマウスに送達し、インジェクトされたマウスの肝実質細胞にトランスフェクトすると、それは天然ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡと同じ挙動をし、それはエピソーム形態でマウスの肝実質細胞に少なくとも３０日間、特に肝実質細胞に少なくとも３７日間、４４日間または５１日間、存在することができ、ウイルス抗原、複製中間体、および成熟ビリオンの産生のためのＨＢＶ転写鋳型として使うことができ、インジェクトされたマウスの血流中にそれらが放出される。本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡは、慢性肝炎のメカニズムの評価および解明ならびに抗ウイルス薬を見出す研究のために使用できる。
【００１４】
さらに、本発明はまた、そのｃｃｃＤＮＡを含む組成物、およびそのｃｃｃＤＮＡを含むキットに関するものであり、それはｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボＨＢＶモデルを樹立するために有用である。
【００１５】
他の態様において、本発明はまた、ｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボＨＢＶモデルを樹立するための、下記を含む方法に関する：
（ｉ）ミニサークル技術を用いて組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製し；そして
（ｉｉ）その組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを、細胞系もしくは初代細胞、または動物、特にマウスに送達する。
【００１６】
他の態様において、本発明はまた、ｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボＨＢＶモデルを樹立するための、あるいはｃｃｃＤＮＡベースのインビトロまたはインビボＨＢＶモデルを樹立する方法に使用するキットまたは組成物の調製のための、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用に関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡによる、抗ＨＢＶ薬の評価またはＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価に関する。
さらなる態様において、本発明はまた、抗ＨＢＶ薬の評価またはＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価のための方法に関する。
【００１８】
具体的には、本発明は下記の項目に関する：
１．  ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００１９】
２．  サイト−ハイブリッドインサートがａｔｔＲ部位である、項目１に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
３．  ａｔｔＲ部位が、ｐｒｅＳ１遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置する、項目１または２に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２０】
４．  ａｔｔＲ部位が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２８４７位と２８４８位の間に位置する、項目１〜３のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
５．  ＨＢＶゲノムが完全長ゲノム(full length genome)、特に遺伝子型Ｂまたは遺伝子型Ｄのゲノム、より特別にはＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１、Ｘ０２４９６、ＡＹ２１７３７０、ＡＹ２２０６９８、ＧＱ２０５４４０またはＨＰＢＨＢＶＡＡに特定されたゲノム、最も特別にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３により表わされるゲノムであり；あるいは遺伝子型Ｄの過剰長ゲノム(over length genome)、たとえば１．１単位または１．３単位のゲノム（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９により表わされる１．３単位ゲノム）である、項目１〜４のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２１】
６．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ中のＨＢＶゲノムのフラグメントが、ＨＢＶのエンベロープタンパク質、コア／プレコアタンパク質、ｘタンパク質および／またはポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子を複製または発現することができる、項目１〜５のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２２】
７．  その配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に挙げたものである、項目１に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
８．  細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目１〜６のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２３】
９．  細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはＨｅｐＧ２またはＨｅｐａＲＧであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、項目８に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２４】
１０．  抗ＨＢＶ薬の評価のための、項目１〜９のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
１１．  抗ＨＢＶ薬がＥＴＶ、ＨＡＰ  １２、ＨＡＰ  ２、ＰｅｇａｓｙｓまたはＲ８４８である、項目９に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２５】
１２．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含む、ｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法に使用するための、項目１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２６】
１３．  樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも３０日間、特に肝実質細胞において少なくとも３７日間、４２日間、４４日間、４９日間、５１日間、５６日間、７０日間、１０４日間、１２０日間または１３４日間、ＨＢＶ抗原を発現する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２７】
１４．  動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、項目１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
１５．  動物がマウスである、特にマウスがＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣＢＡ／Ｊマウスである、項目１〜１４のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
【００２８】
１６．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ。
１７．  項目１〜１６のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを含む組成物またはキット。
【００２９】
１８．  項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造するための、下記の工程を含む方法：
ａ）  ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを、ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親ＨＢＶサークル構築体を形成し；
ｂ）その親ＨＢＶサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを産生させる。
【００３０】
１９．  ミニサークル産生体が微生物、好ましくは細菌、より特別にはエシェリキア属菌種(Escherichia sp.)、最も特別には大腸菌(E.coli)である、項目１８に記載の方法。
２０．  大腸菌が株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔである、項目１９に記載の方法。
【００３１】
２１．  ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターが、組換え基質部位、特にリコンビナーゼに対して特異的な、より特別にはインテグラーゼ、たとえばφＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、φＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、φＦＣ１のインテグラーゼに対して特異的な、組換え基質部位を含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
２２．  組換え基質部位がａｔｔＰおよびａｔｔＢである、項目１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．  ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターがｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターである、項目１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【００３３】
２４．  親ＨＢＶサークル構築体のＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に挙げたものである、項目１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．  ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントが組換え基質部位間に位置する、項目１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【００３４】
２６．  項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを含み、所望によりさらに生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液、生理食塩水を含むことができる、組成物またはキット。
【００３５】
２７．  細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキットの使用。
【００３６】
２８．  細胞系または初代細胞にトランスフェクトするための、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキット。
【００３７】
２９．  細胞系または初代細胞にトランスフェクトするために使用するキットまたは組成物の調製における、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用。
【００３８】
３０．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを細胞系または初代細胞に送達する工程、特にトランスフェクトする工程を含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキットを使用してＨＢＶの抗原およびＤＮＡをインビトロで発現させるための方法。
【００３９】
３１．  ｃｃｃＤＮＡベースのインビトロＨＢＶモデルを樹立するための、下記を含む方法：
（ｉ）項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製するか、あるいは項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法に従って組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造し；
（ｉｉ）その組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを細胞系または初代細胞に送達する。
【００４０】
３２．  細胞系が肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはＨｅｐＧ２またはＨｅｐａＲＧであり、あるいは初代細胞が初代肝細胞、特に初代肝実質細胞である、項目２７もしくは２９に記載の使用、または項目２８に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、または項目３０もしくは３１に記載の方法。
【００４１】
３３．  Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬の評価における、または抗ＨＢＶ薬の評価における、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキットの使用。
【００４２】
３４．  Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価のための、または抗ＨＢＶ薬の評価のための、組成物またはキットの調製における、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用。
【００４３】
３５．  Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬の評価または抗ＨＢＶ薬の評価に使用するための、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキット。
【００４４】
３６．  医薬または薬物がヌクレオシドアナログ、ＨＢＶカプシド阻害薬、インターフェロンまたはＴＬＲ７／８アゴニスト、たとえば、ＥＴＶ、ＨＡＰ  １２、ＨＡＰ  ２、ＰｅｇａｓｙｓまたはＲ８４８を含む（ただし、これらに限定されない）、項目３３もしくは３４に記載の使用、または項目２６に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡもしくは組成物もしくはキット。
【００４５】
３７．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含むｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法に使用するための、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキット。
【００４６】
３８．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達する工程を含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキットを用いてＨＢＶの抗原およびＤＮＡをインビボで発現させるための方法。
【００４７】
３９．  ｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶモデルを樹立するための、下記を含む方法：
（ｉ）項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製するか、あるいは項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法に従って組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造し；
（ｉｉ）その組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達する。
【００４８】
４０．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含むｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法に使用するキットまたは組成物の調製における、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの使用。
【００４９】
４１．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含むｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法のための、項目１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡまたは項目２６に記載の組成物もしくはキットの使用。
【００５０】
４２．  樹立した動物モデルが、肝実質細胞において少なくとも３０日間、特に肝実質細胞において少なくとも３７日間、４２日間、４４日間、４９日間、５１日間、５６日間、７０日間、１０４日間、１２０日間または１３４日間、ＨＢＶ抗原を発現する、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、または項目２６に記載の組成物もしくはキット、または項目３８もしくは３９に記載の方法、または項目４０もしくは４１もしくは４２に記載の使用。
【００５１】
４３．  動物が、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、または項目２６もしくは４２に記載の組成物もしくはキット、または項目３８もしくは３９もしくは４２に記載の方法、または項目４０もしくは４１もしくは４２に記載の使用。
【００５２】
４４．  動物がマウスである、特にマウスがＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣＢＡ／Ｊマウスである、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、または項目２６もしくは４２もしくは４３に記載の組成物もしくはキット、または項目３８もしくは３９もしくは４２もしくは４３に記載の方法、または項目４０〜４３のいずれか１項に記載の使用。
【００５３】
４５．  組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物にハイドロダイナミックインジェクションにより送達する、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、または項目２６もしくは４２もしくは４３もしくは４４に記載の組成物もしくはキット、または項目３８もしくは３９もしくは４２もしくは４３もしくは４４に記載の方法、または項目４０〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【００５４】
本発明を下記の態様の説明および例においてさらに説明する。ただし、下記のものが本発明の範囲を限定するとみなすべきではなく、本発明の精神および特許請求の範囲内にある改変を行なうのは当業者には容易であろうと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ＨＢＶサークル構築体のデザインおよび製造を示す。（Ａ）ＨＢＶサークルをミニサークル技術で作製するプロセス。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位によりフランキングされたＨＢＶ配列をミニサークル親プラスミドベクター内へクローニングした。この組換え親ＨＢＶサークル構築体を次いでミニサークル産生体である大腸菌株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ内へトランスフォームした。アラビノースの添加によりφＣ３１インテグラーゼおよびＩ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)が発現すると、φＣ３１インテグラーゼがａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位の間の組換えを触媒して、スモールａｔｔＲ部位、およびプラスミドバックボーンサークル(backbone circle)を保有するＨＢＶサークルが生成した。Ｉ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を消化することにより非組み換え−親ＤＮＡおよびプラスミドバックボーンサークルの破壊を開始した。ＨＢＶサークルＤＮＡを次いでミニサークル産生体である大腸菌から抽出した。（Ｂ）ＨＢＶサークルのデザイン。ａｔｔＲ部位の配列はｐｒｅＳ１遺伝子の開始コドンの直前の２８４７位と２８４８位の間、かつポリメラーゼ遺伝子のＴＰドメインとスペーサーの間に位置する。（Ｃ）ＨＢＶサークル−ＣＭＶ−ＨＢＶ１．１、ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３およびＨＢＶサークルのデザインおよび製造。これら３種類のＨＢＶサークル構築体のデザインを上パネルに示した。ミニサークルの製造後、制限酵素消化により親ＤＮＡおよびミニサークルＤＮＡを線状にし、電気泳動を実施した。
【図２】図２は、トランスフェクトした細胞においてＨＢＶサークルが高レベルのＨＢＶ複製を支持することを示す。親およびＨＢＶサークルＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞に一過性トランスフェクトし、上清を（Ａ）ＨＢｅＡｇ、（Ｂ）ＨＢｓＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡについて、ＥＬＩＳＡおよびｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。（Ｄ）細胞を溶解し、ｃｃｃＤＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲを用いて定量した。（Ｅ）ＨＢＶサークルＤＮＡのトランスフェクション後、ＨｅｐＧ２細胞を固定し、免疫蛍光分析のために抗ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｅＡｇ抗体で染色した。細胞核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色で視覚化した。
【図３−１】図３−１は、ＨＢＶサークルの野生型およびＨＢｃ（−）変異体のインビトロ特性解明を示す。ＨＢｃ発現プラスミドの存在下または非存在下で野生型または変異体ＨＢＶサークルＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞に一過性トランスフェクトし、上清を（Ａ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｂ）ＨＢｓＡｇの量について、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。（Ｃ）細胞を溶解し、細胞溶解物にカプシド被包ＨＢＶ  ＤＮＡ検出のためのサザンブロット分析、およびＨＢＶカプシドについてのウェスタンブロット分析、特異的抗体によるＨＢｃおよびベータ−アクチンの検出を施した。
【図３−２】図３−２は、ＨＢＶサークルの野生型およびＨＢｃ（−）変異体のインビトロ特性解明を示す。野生型または変異体ＨＢＶサークルＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞に一過性トランスフェクトした。上清を（Ａ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｂ）ＨＢｓＡｇの量について、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。（Ｃ）細胞を溶解し、細胞溶解物にＨＢＶカプシドについてのウェスタンブロット分析、特異的抗体によるＨＢｃ、ＨＢｓおよびベータ−アクチンの検出を施した。
【図４】図４は、ＨＢＶサークルが天然ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの代替であることを示す。（Ａ）親およびＨＢＶサークルＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞に一過性トランスフェクトし、細胞を溶解し、ｃｃｃＤＮＡをハート法(Hirt method)により調製し、サザンブロットにより検出した。ＨＢＶサークルをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からの、（Ｂ）ｃｃｃＤＮＡまたは（Ｃ）ＲＬ３０に付随する、ヒストンＨ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃを、ＣＨＩＰにより検出した。
【図５】図５は、ＨＢＶサークルによるインビトロでの抗ＨＢＶ薬の評価を示す。（Ａ）ＨｅｐＧ２細胞にまずＨＢＶサークルをトランスフェクトし、次いで指示した濃度のＥＴＶまたはＨＡＰで１２または６日間処理した。上清を採集し、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびアルブミンＥＬＩＳＡを実施した。細胞を溶解し、細胞溶解物に、カプシド被包ＨＢＶ  ＤＮＡ検出のためのサザンブロット分析、ならびにＨＢＶカプシド、ＨＢｃおよびベータ−アクチンの検出のための特異的抗体によるウェスタンブロット分析を施した。（Ｂ）増殖性ＨｅｐａＲＧ細胞にＨＢＶサークルをトランスフェクトし、種々の濃度のＰｅｇａｓｙｓで６日間、前記に従って処理した。上清を採集し、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびアルブミンＥＬＩＳＡを実施した。
【図６】図６は、ＨＢＶサークルによる持続的ＨＤＩマウスモデルの樹立を示す。指示したＤＮＡ構築体をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で、（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーの検査のための血液試料を採集した。（Ｄ）指示した時点でマウスの体重を測定した。
【図７】図７は、ｃｃｃＤＮＡ推進によるインビボでのＨＢＶ持続性を示す。種々の量のＨＢＶサークルＤＮＡまたは１０μｇのｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３  ＤＮＡをＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにハイドロダイナミックインジェクションした。マウスを５１日間モニターし、指示した時点で血清試料を採集し、（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーを検査した。（Ｄ）３日目および３０日目に、ＨＢＶサークル１０μｇグループから各時点で２匹のマウスをランダムに選択し、と殺した。マウス肝臓中のｃｃｃＤＮＡをサザンブロットにより検出した。
【図８】図８は、ｃｃｃＤＮＡ推進によるインビボでのＨＢＶ持続性を肝臓ＩＨＣ染色によって示す。ＨＤＩインジェクション後、１２０目に、指示したマウスからの肝臓切片を抗ＨＢｃ抗体で染色した。中実矢印はＨＢｃ陽性染色細胞を示し、中空矢印はＨＢｃ陰性染色細胞を示す。
【図９】図９は、インビボでの抗ＨＢＶ薬の有効性評価を示す。（Ａ）０日目に、１０μｇのＨＢＶサークルをＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにハイドロダイナミックインジェクションした。２１日目の血清ＨＢｓＡｇレベルに基づいてマウスをグループ分けし、ＨＤＩ後の２３日目から開始して５１日目まで、抗ウイルス化合物処理を経口的に施した。指示した時点で血清試料を採集し、（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーを検査した。
【図１０】図１０は、ＣＢＡ／Ｊマウスにおける持続的ＨＤＩマウスモデルの樹立を示す。指示したＤＮＡ構築体をＣＢＡ／Ｊマウスの尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で、（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーの検査のための血液試料を採集した。（Ｄ）指示した時点でマウスの体重を測定した。（Ｅ）血清ＨＢｓＡｇ検査結果に基づいてＨＢｓＡｇ陽性マウスのパーセントをプロットした。
【図１１】図１１は、他の遺伝子型配列をもつＨＢＶサークルを用いた持続的ＨＤＩマウスモデルの樹立を示す。指示したＤＮＡ構築体をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーの検査のための血液試料を採集した。（Ｄ）指示した時点でマウスの体重を測定した。
【図１２】図１２は、ＨＢＶサークル変異体を用いたインビボでのＨＢＶ複製の評価を示す。指示したＤＮＡ構築体をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で、（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーの検査のための血液試料を採集した。（Ｄ）指示した時点でマウスの体重を測定した。
【図１３】図１３は、肝臓ＩＨＣ染色によるインビボでのＨＢＶ複製の評価を示す。（Ａ）ＨＤＩインジェクション後、５６日目に、指示したマウスからの肝臓切片を抗ＨＢｃ抗体で染色した。中実矢印はＨＢｃ陽性染色細胞を示し、中空矢印はＨＢｃ陰性染色細胞を示す。（Ｂ）表４からの累積した染色スコアをプロットした。
【図１４】図１４は、ＨＢＶサークル変異体を用いたインビボでのＨＢＶ複製の評価を示す。指示したＤＮＡ構築体をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で（Ａ）ＨＢｓＡｇ、（Ｂ）ＨＢｅＡｇおよび（Ｃ）ＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーの検査のための血液試料を採集した。（Ｄ）指示した時点でマウスの体重を測定した。（Ｅ）血清ＨＢｓＡｇ検査結果に基づいてＨＢｓＡｇ陽性マウスのパーセントをプロットした。（Ｆ）野生型グループおよびＨＢｅ（−）変異体グループのマウスについて個々のＨＢｓＡｇレベルをプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
別に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似の方法および材料は本質的にいずれも本発明の実施または試験に使用できるが、代表的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的について、下記の用語を以下に定義する。
【００５７】
本明細書中で用いる“Ｂ型肝炎ウイルス”または“ＨＢＶ”は、おおよそ３，２００塩基対の小分子二本鎖ＤＮＡゲノムおよび肝臓の細胞に対する指向性をもつヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)のメンバーを表わす。“ＨＢＶ”には、いずれかの多様な哺乳動物（たとえば、ヒト、非ヒト霊長類など）および鳥類（アヒルなど）宿主に感染するＢ型肝炎ウイルスが含まれる。“ＨＢＶ”には、いずれか既知のＨＢＶ遺伝子型、たとえば血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ；いずれかのＨＢＶ血清型またはＨＢＶサブタイプ；いずれかのＨＢＶ分離株；ＨＢＶバリアント、たとえばＨＢｅＡｇ陰性バリアント、薬物耐性ＨＢＶバリアント（たとえば、ラミブジン(lamivudine)耐性バリアント；アデホビル(adefovir)耐性変異体；テノホビル(tenofovir)耐性変異体；エンテカビル(entecavir)耐性変異体;など）などが含まれる。
【００５８】
本明細書中で用いる“ＨＢＶゲノム”は、完全長ゲノム（１単位ゲノム）だけでなく、完全長を超えるＨＢＶゲノム（＞１単位ゲノム、言い換えると、過剰長ＨＢＶゲノム）をも表わす。ＨＢＶゲノムはＨＢＶ複製を構築および維持するのに必要なすべての情報を含む。そのようなゲノム配列は、それぞれの遺伝子型について文献およびＧｅｎｅＢａｎｋにおいて入手できる。“完全長を超えるＨＢＶゲノム”は、完全長ゲノム−プラス−そのゲノムの一部を含む配列を表わす。“完全長を超えるＨＢＶゲノム”の配列は、希望するゲノム単位および個々のＨＢＶ株に基づいて異なる。さらに、完全長を超えるＨＢＶゲノムを得る方法およびそのゲノムの配列を決定する方法は、先行技術文献、たとえばEuropean Patent EP1543168に記載されている。
【００５９】
本明細書中で用いる“ＨＢＶゲノムのフラグメント”または“ＨＢＶゲノムフラグメント”は互換性をもって使用でき、ＨＢＶゲノムの一部を表わす。そのフラグメントは、ＨＢＶゲノムの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００または３２００個の連続ヌクレオチドであってもよい。フラグメントはＨＢＶゲノムに含まれる１以上の遺伝子を含む部分ゲノムであってもよい；たとえば、フラグメントはＨＢＶのエンベロープタンパク質、コア／プレコアタンパク質、ｘタンパク質および／またはポリメラーゼタンパク質をコードする核酸であってもよい。さらに、フラグメントはＨＢＶのエンベロープタンパク質、コア／プレコアタンパク質、ｘタンパク質および／またはポリメラーゼタンパク質の１以上の部分をコードする核酸であってもよい。
【００６０】
ＨＢＶゲノムの位置について述べる際に本明細書中で用いるヌクレオチドのナンバリングは、H. Norder et al. (Virology 1994, 198, 489-503 , 本明細書に援用する；この報文の図１は、遺伝子型Ｃ、ＥおよびＦを表わす種々のＨＢＶクローンのゲノムと３２２１ヌクレオチド長さのクローンｐＨＢＶ−３２００の配列とのアラインメントを提示している）に公開された全ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列、またはＧｅｎｅＢａｎｋにアクセス番号ＪＮ６６４９１７．１で公開された遺伝子型Ｄ  ＨＢＶのもの（本明細書に援用する）を参照している。種々のＨＢＶのゲノムの長さは変更できる。すなわち、ヌクレオチドのナンバリングは例示態様にすぎないとみなすべきである。
【００６１】
本明細書中で用いる用語 “バリアント”または“変異体”は、互換性をもって使用でき、親ポリペプチド配列または親ポリヌクレオチドに対してある程度のアミノ酸／ヌクレオチド配列同一性をもつポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して用いられる。バリアントは親配列に類似するが、それらのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列中にそれらを親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドと異なる配列にする少なくとも１カ所または数カ所またはそれ以上の置換、欠失または挿入をもつ。場合により、バリアントはそれらのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列においてそれらを親と異なる配列にする少なくとも１カ所の置換、欠失または挿入を含むように操作および／または工学処理されている。さらに、バリアントは親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドの機能特性または活性を保持することができる；たとえば、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドの生物活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生物活性を維持する。
【００６２】
本明細書中で用いる用語 “核酸構築体”は、自然界で一緒にみられることのない１以上の機能単位を含むように構築された核酸配列を表わす。例には、非天然核酸配列を含む
環状、線状、二本鎖状の、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含むプラスミド）、ウイルスゲノムなどが含まれる。
【００６３】
本明細書中で用いる用語“ベクター”は、核酸配列をターゲット細胞へ伝達できるビヒクルを表わす。たとえば、ベクターはターゲット細胞において発現できるコード配列を含むことができる。本発明の目的について、“ベクター構築体”は一般に、目的とする遺伝子の発現を指向させることができ、目的遺伝子をターゲット細胞に伝達するのに有用である、いずれかの核酸構築体を表わす。よって、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクルならびに組込みベクター(integrating vector)を含む。
【００６４】
本明細書中で互換性をもって用いられる“ミニサークルベクター”または“ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクター”は、ベクターに導入すべき目的配列、すなわちポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードすることができる目的配列を、少なくとも実質的に発現カセット配列および方向に関係なく持続的に高レベル発現する小型の二本鎖環状ＤＮＡ分子を表わす。目的配列は、ミニサークルベクター上に存在する調節配列、すなわち目的配列の発現を制御する調節配列に、作動可能な状態で連結している。そのようなミニサークルベクターは、たとえば公開されたU.S. Patent Application US20040214329に記載されており、それを具体的に本明細書に援用する。
【００６５】
対象となるミニサークルベクターの全長は後記の目的エレメントを収容するのに十分であり、ただし、たとえばターゲット細胞を含む宿主に対する全身投与により細胞と接触した際に、ベクターがその細胞に進入する能力を阻止するかまたは許容できないレベルにまで実質的に阻害するほど長くはない。よって、ミニサークルベクターは一般に少なくとも約０．３ｋｂの長さ、しばしば少なくとも約１．０ｋｂの長さであり、その際、ベクターは１０ｋｂ以上の長さであってもよいが、ある態様においてはこの長さを超えない。
【００６６】
ミニサークルベクターは、複製起点を欠如し、かつ細菌プラスミドに一般的にみられる薬物選択マーカー、たとえばβ−ラクタマーゼ、ｔｅｔなどを欠如するという点で、細菌プラスミドベクターと異なる。たとえばプラスミドバックボーン中に、たとえばそれからミニサークルベクターを切り取った親プラスミドバックボーン核酸配列中に、発現サイレンシング配列も存在しない。ミニサークルは、リコンビナーゼハイブリッド生成物配列および目的配列、すなわち転写配列、および発現のために必要な調節配列以外のベクター配列を実質的に含まなくてもよい。
【００６７】
ミニサークルベクターは、一方向部位特異的リコンビナーゼのサイト−ハイブリッド配列(site-hybrid sequence)（プロダクト−ハイブリッド配列(product hybrid sequence)としても知られる）を含む。本明細書中で用いる“サイト−ハイブリッド配列”または“サイト−ハイブリッドインサート”または“プロダクト−ハイブリッド配列”は互換性をもって使用でき、当技術分野で既知の２つの組換え基質部位、たとえばａｔｔＢおよびａｔｔＰ基質配列の一方向部位特異的リコンビナーゼ仲介による組換えの結果であり(Smith et al., Nucleic Acid Research, 2004, 33:8:2607-2617)、ａｔｔＲまたはａｔｔＬサイト−ハイブリッド配列のいずれかであってもよい。“サイト−ハイブリッド配列”は、用いるリコンビナーゼに従って当業者が決定できる。一般に、サイト−ハイブリッド配列は約１０ｂｐから約３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐおよび５００ｂｐまでの長さの範囲である。本明細書中で用いる“リコンビナーゼ”は遺伝子組換え酵素であり、それは通常は細菌および真菌に由来し、各リコンビナーゼに特異的な短い（３０〜４０ヌクレオチド）ターゲット部位配列間の方向感受性(directionally sensitive)ＤＮＡ交換反応を触媒する。リコンビナーゼの例にはインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体が含まれるが、これらに限定されず、着目される具体的な代表的インテグラーゼにはφＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、φＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、φＦＣ１などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書中で用いる用語“組換え”ＤＮＡ分子は、複数の供給源に由来する遺伝子材料を一緒にして他の場合には生物中にみられない配列を作製するための実験室的な遺伝子組換え法（たとえば、分子クローニング）により形成されるＤＮＡ分子を表わす。組換えＤＮＡが可能なのは、あらゆる生物に由来するＤＮＡ分子が同じ化学構造を共有するからである。それらは同一の全般的構造内のヌクレオチド配列のみが異なる。
【００６９】
本明細書中で用いる用語“部位特異的組換え”は、それぞれが少なくとも１つの認識部位を含む２つのヌクレオチド配列間の組換えを表わす。“部位特異的”は、特定のヌクレオチド配列におけるということを意味し、それは宿主細胞のゲノム内の特定位置であってもよい。そのヌクレオチド配列は、宿主ゲノム中のそれの自然位置またはゲノム中の他のある位置で宿主細胞に内在してもよく、あるいはそれは多様な既知方法のいずれかにより予め宿主細胞のゲノム内へ挿入されたヘテロロガスヌクレオチド配列であってもよい。
【００７０】
本明細書中で用いる“ミニサークル産生体”は、ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターを増幅でき、かつリコンビナーゼの発現に際してミニサークルＤＮＡを産生できる微生物を表わす。先行技術において既知のミニサークル産生体には、細菌、たとえばエシェリキア属菌種、たとえば大腸菌が含まれる。当技術分野におけるミニサークル産生体の具体例のひとつは、株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔである。
【００７１】
本明細書中で用いる“ＨＢＶサークル”または“組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ”は、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含むミニサークルベクターを表わす。
【００７２】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを細胞内へ送達する方法は当技術分野で既知である。たとえば、組換えｃｃｃＤＮＡをトランスフェクションにより細胞内へ送達することができる。細胞にトランスフェクトする方法は当技術分野で周知である。“トランスフェクトした”とは、細胞において外来核酸、通常はＤＮＡの取込みから生じる変化を意味する。用語“トランスフェクション”の使用は外来核酸の導入をいずれか特定の方法に限定することを意図したものではない。適切な方法には、ウイルス感染／トランスダクション、コンジュゲーション、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、パーティクルガン(particle gun)法、リン酸カルシウム沈殿、直接注入などが含まれる。方法の選択は一般に、トランスフェクトされる細胞のタイプおよびトランスフェクションが行なわれる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の全般的考察は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995中にある。
【００７３】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物内へ送達する方法は当技術分野で既知である。“送達する”とは、肝臓のプラスミド送達およびトランスフェクションの技術分野で周知であるいずれかの方法を意味するが、本発明の範囲を限定すると考えるべきではない。たとえば、既知の技術のひとつとしてハイドロダイナミックインジェクション(Zhang et al.により開発：Hum Gene Ther 1999,10 (10): 1735-1737)をプラスミド送達に使用できる。
【００７４】
本明細書中で用いる“ＨＢＶマーカー”は、ＨＢＶウイルス感染を表示できるいずれかのマーカーを表わす。当技術分野で一般に用いられる既知のＨＢＶマーカーには“ＨＢＶのＤＮＡ”、または“ＨＢＶのタンパク質”、たとえばＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇなどが含まれるが、これらに限定されない。ＨＢＶマーカーのレベルを判定する方法は、たとえば、ＨＢＶタンパク質のレベルについてのＥＬＩＳＡ、またはＨＢＶ  ＤＮＡのレベルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ分析のように、当技術分野で既知である。
【００７５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびサイト−ハイブリッドインサートを含む組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ、ならびにその組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造する方法を提供する。そのような組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡは、部位特異的組換え後のサイト−ハイブリッドインサート、およびＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。特に、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントはサイト−ハイブリッドインサートによりフランキングされている。
【００７６】
１態様において、ＨＢＶゲノムはいずれかの遺伝子型の完全長ゲノム、またはいずれかの遺伝子型の過剰長ゲノムである。好ましい態様において、ゲノムの遺伝子型はＤである。より好ましい態様において、遺伝子型Ｄの完全長ゲノムはＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１、Ｘ０２４９６、ＡＹ２１７３７０、またはＨＰＢＨＢＶＡＡに明記されている。さらなる態様において、過剰長ゲノムは１．１単位ゲノムまたは１．３単位ゲノムである。特定の態様において、本発明に使用するＨＢＶゲノムはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１）により表わされる配列をもつか、あるいはその配列からなる。
【００７７】
１態様において、ＨＢＶゲノムのフラグメントはＨＢＶゲノムの一部である。好ましい態様において、フラグメントはいずれかの遺伝子型のＨＢＶゲノム、特に遺伝子型ＤのＨＢＶゲノム（たとえば、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１、Ｘ０２４９６、ＡＹ２１７３７０、またはＨＰＢＨＢＶＡＡに明記されるもの）、より特別にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３により表わされる遺伝子型ＤのＨＢＶゲノムのフラグメントである。特に、ＨＢＶゲノムのフラグメントは、ＨＢＶのエンベロープタンパク質、コア／プレコアタンパク質、ｘタンパク質および／またはポリメラーゼタンパク質をコードする１以上の遺伝子を複製または発現することができる。
【００７８】
１態様において、ＨＢＶゲノムのバリアントは、ヌクレオチド配列中にその親ＨＢＶゲノムまたはフラグメントと比較して少なくとも１カ所または数カ所の置換、欠失もしくは挿入をもつバリアントであってもよい。たとえば、本発明のＨＢＶゲノムのバリアントは、ＨＢＶコアタンパク質をコードする遺伝子上にそのバリアントが複製できないかまたはそのタンパク質を発現できないものにする１カ所または数カ所の変異をもつものであってもよい；すなわち、ＨＢＶゲノムのバリアントは、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃ）をコードする遺伝子を含まないＨＢＶゲノムであってもよい。たとえば、変異はＨＢｃのコード配列の開始コドン上にあってもよい。１態様において、ＨＢＶゲノムのバリアントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４により表わすことができる。
【００７９】
さらなる態様において、“サイト−ハイブリッドインサート”は、組換え基質、たとえばａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位を収容したいずれか市販のミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターから作製できる。ある態様において、組換え基質はリコンビナーゼ、特にインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体（φＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、φＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、φＦＣ１などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない）に対して特異的である。特に、“サイト−ハイブリッドインサート”はａｔｔＲ部位である。最も特別には、ａｔｔＲ部位はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４により表わされる。さらなる態様において、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおけるａｔｔＲ部位はｐｒｅＳ１遺伝子の開始コドンの直前に、ポリメラーゼ遺伝子の末端タンパク質ドメインとスペーサーの間に位置し、特にａｔｔＲ部位はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２８４７位と２８４８位の間に位置する。
【００８０】
さらなる態様において、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを製造する方法は下記を含む：
ａ）  ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントをミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターの組換え基質部位に挿入し、それらによりフランキングして、親ＨＢＶサークル構築体を形成し；
ｂ）その親ＨＢＶサークル構築体をミニサークル産生体内へトランスフォームして、部位特異的組換えにより組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを産生させる。
【００８１】
１態様において、ミニサークル産生体は、ミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターを増幅できかつリコンビナーゼが発現した際にミニサークルＤＮＡを産生できる微生物であってもよい。特に、微生物は細菌、より特別にはエシェリキア属菌種、最も特別には大腸菌、たとえば株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔである。１態様において、ミニサークル産生体はリコンビナーゼを内在発現できる微生物である。あるいは、ミニサークル産生体は、リコンビナーゼまたはそのリコンビナーゼをコードする遺伝子が導入されてそこで発現している微生物であってもよい。
【００８２】
１態様において、本発明のミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターは当技術分野で既知のいずれか、たとえばＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から販売されているベクターであってもよい。特に、本発明に用いるミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターは、組換え基質、たとえばリコンビナーゼ、特にインテグラーゼ、たとえば野生型ファージインテグラーゼまたはその変異体（φＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、φＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、φＦＣ１などのインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない）に対して特異的な組換え基質を含む。より特別には、本発明に用いるミニサークルＤＮＡ製造用の親ベクターはｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターであり、それはＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入できる（カタログ番号ＭＮ５０１Ａ１）。
【００８３】
さらなる態様において、親ＨＢＶサークル構築体においてＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは組換え基質部位の間に位置する。ミニサークル産生体（たとえば、大腸菌）における部位特異的組換えの後、得られた組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ中のＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、依然としてそれの複製または発現する能力を保持している。特に、組換え基質部位は特にａｔｔＰまたはａｔｔＢから選択されるリコンビナーゼまたはインテグラーゼ結合部位であり、より特別には、本発明に用いるａｔｔＰはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５により表わされ、および／または本発明に用いるａｔｔＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６により表わされる。
【００８４】
最も好ましい態様において、前記のＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、ｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターのａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位に挿入され、それらによりフランキングされて、そのプラスミドに既に存在していたＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡフラグメントを置換する。こうして構築された組換えプラスミドは親ＨＢＶサークルと表示され、そのＤＮＡ配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として挙げる。
【００８５】
前記の親ＨＢＶサークルを用いて組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを作製するためには、組換え親構築体を次いでミニサークル産生体である大腸菌株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃから販売，カタログ番号ＭＮ９００Ａ−１）内へトランスフォームする。アラビノースの添加によりφＣ３１インテグラーゼおよびＩ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼが発現すると、φＣ３１インテグラーゼはａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位間の組換えを触媒して、小さなａｔｔＲ部位を保有するＨＢＶサークルおよびプラスミドバックボーンサークルを産生する。Ｉ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を消化することにより、組換えられなかった親ＤＮＡおよびプラスミドバックボーンサークルの破壊を開始する。組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを次いでミニサークル産生体である大腸菌から抽出する。こうして作製された組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡをＨＢＶサークルと表示し、そのＤＮＡ配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として挙げる。
【００８６】
１態様において、本発明は、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを細胞系（たとえば、肝細胞に由来する細胞系、特に肝実質細胞に由来するもの、より特別にはＨｅｐＧ２またはＨｅｐａＲＧ）または初代細胞（たとえば、初代肝細胞、特に初代肝実質細胞）に送達することを含む、ＨＢＶ抗原をインビトロで発現させるための方法、またはｃｃｃＤＮＡベースのインビトロＨＢＶモデルを樹立するための方法に関する。
【００８７】
前記で製造した組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを用いてＨＢＶ抗原をインビトロで発現させるために、当技術分野で既知のいずれかの手段を用いて組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを培養細胞内へ送達し、結果的に培養細胞にその組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを導入する（たとえば、トランスフェクトする）ことができる。したがって、侵入およびｃｃｃＤＮＡ形成などの制約工程を迂回して、簡単なトランスフェクションプロセスによりＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡをあらゆる初代細胞および細胞系に簡便に導入することができる。樹立した細胞培養モデルをｃｃｃＤＮＡ研究、および抗ＨＢＶ薬、たとえばＥＴＶ、ＨＡＰ  １２、ＰｅｇａｓｙｓまたはＲ８４８の評価に使用できる。
【００８８】
１態様において、本発明はまた、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達することを含む、ＨＢＶ抗原および／またはＤＮＡをインビボで発現させる方法、あるいはｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立するための方法に関する。
【００８９】
１態様において、ｃｃｃＤＮＡベースのＨＢＶ動物モデルを樹立する方法は、組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物に送達してその動物の肝実質細胞にトランスフェクトする工程を含む。
【００９０】
前記の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを用いてＨＢＶ抗原をインビボで持続的に発現させるために、当技術分野で既知のいずれかの手段を用いて組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物（たとえば、マウス）に送達することができ、結果的に、インジェクトされた動物（たとえば、マウス）の肝実質細胞にその組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡがトランスフェクトされる。
【００９１】
１態様において、動物は哺乳動物または鳥類、たとえばマウスであってもよく、特にマウスはＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスである。より特別には、本発明に用いるマウスは機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである。
【００９２】
組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの送達方法に関して、プラスミド送達および肝臓の細胞のトランスフェクションの技術分野で周知のいずれかの方法を本発明に適用できるが、その方法が本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。本発明において、たとえばハイドロダイナミックインジェクションなど既知の手段がプラスミド送達のための方法のひとつであってもよい。より具体的には、本発明の例において、組換えプラスミドによるマウスの肝臓の細胞のトランスフェクションは、組換えプラスミドをマウスの尾静脈内へハイドロダイナミックインジェクションすることにより達成される。組換えプラスミドをマウスの尾静脈内へ容易にインジェクトできるようにするために、前記のプラスミドを生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液中に調製するが、それが本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。
【００９３】
さらなる態様において、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡをマウスに送達し、インジェクトされたマウスの肝実質細胞にトランスフェクトすると、それは天然ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡと同じ挙動をし、それはエピソーム形態でマウスの肝実質細胞中に少なくとも３０日間、肝実質細胞中に特に少なくとも３７日間、４４日間または５１日間、存在することができ、それはウイルス抗原、複製中間体、および成熟ビリオンの産生のためのＨＢＶ転写鋳型として使うことができ、それらはインジェクトされたマウスの血流中に放出される。さらなる態様において、ＨＢＶ抗原の発現は、マウスの肝実質細胞中で少なくとも３０日間、肝実質細胞中で特に少なくとも３７日間、４４日間または５１日間、持続する。この組換え形ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡと自然感染ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡの特性はきわめて類似するので、したがって本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡは（慢性）肝炎のメカニズムの評価および解明、ならびに抗ウイルス薬を見出す研究に使用できる。特に、本発明の動物モデルは、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置のための医薬、特にＥＴＶ、ＨＡＰ  ２およびＲ８４８の評価に際して有用である。
【００９４】
さらなる態様において、本発明の動物（たとえば、マウス）モデルは、機能性をもつ自然免疫および獲得免疫について免疫コンピテントである動物に基づくものであり、よって誘導された肝臓の組織学的および血清学的状態は健康なＨＢＶキャリアのものと類似する。したがって、本発明の動物モデルは慢性肝炎機構の肝炎メカニズム研究および薬物評価のための理想的なモデルである。
【００９５】
さらに、本発明はまた、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを含むキットまたは組成物に関する。さらなる態様において、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを含む組成物またはキットはさらに、生体適合性かつ非免疫原性の溶液、たとえばリン酸緩衝液を含有することができる。
【００９６】
さらに、本発明はまた、細胞培養培地における抗ＨＢＶ薬のインビトロ評価のための、またはＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬のインビトロ評価のための、下記を含む方法に関する：
（１）本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを細胞（たとえば、細胞系（たとえば、肝細胞由来の細胞系、特に肝実質細胞由来のもの、より特別にはＨｅｐＧ２またはＨｅｐａＲＧ）または初代細胞（たとえば、初代肝細胞、特に初代肝実質細胞））に送達し、
（２）評価すべき薬物または医薬で細胞を１〜３０日間、特に２〜１０日間処理し、
（３）細胞におけるＨＢＶマーカーのレベルを検出し、そして
（４）その薬物または医薬で処理した細胞におけるＨＢＶマーカーの低減は、その薬物が有効な抗ＨＢＶ薬であること、またはその医薬がＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
【００９７】
さらに、本発明はまた、抗ＨＢＶ薬のインビボ評価のための、またはＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に用いる医薬のインビボ評価のための、下記を含む方法に関する：
（１）本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを動物（たとえば、マウス、特にＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス）に送達し、
（２）評価すべき薬物または医薬を動物に投与し、
（３）動物の血液（たとえば、血清）中のＨＢＶマーカーのレベルを検出し、そして
（４）その薬物または医薬を投与された動物の血液中のＨＢＶマーカーのレベルの低減は、その薬物が有効な抗ＨＢＶ薬であること、またはその医薬がＢ型肝炎ウイルス感染症の処置に有効であることの指標となる。
【００９８】
１態様において、Ｂ型肝炎ウイルス感染症は慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症である。
【実施例】
【００９９】
本発明を実施および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために以下の実施例を提示する。実施例はまた、本発明の純粋な例示のためのものであり、したがって決して本発明を限定するとみなすべきではなく、前記に考察した本発明の側面および態様を記載および詳述する。実施例は、以下の実験が実施したすべておよび唯一の実験であることを示すためのものではない。
【０１００】
材料および方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989の記載に従い、標準法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って用いた。
【０１０１】
遺伝子合成
目的とする遺伝子セグメントを、化学合成により作製したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位によりフランキングされた１００〜６００ｂｐ長さの遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含めたオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより組み立て、続いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から，米国）内へＡ−オーバーハング(A-overhang)によりクローニングした。これらのサブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１０２】
細胞系
ヒトヘパトーマ由来の細胞系ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣから購入，ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＢ−８０６５）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）中、３７℃で５％  ＣＯ２を含有する加湿空気下に培養した。増殖性ＨｅｐａＲＧ細胞をＢｉｏｐｒｅｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（フランス、レンヌ）から購入した。ＨｅｐａＲＧ細胞を製造業者のプロトコルに従って増幅および分化させた。
【０１０３】
動物試験
この試験のすべての操作は地域の動物保護法および適切なガイドラインに従って行なわれた。
【０１０４】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（雄，４〜６週齢）をＶｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（中国北京）から入手した。ＣＢＡ／Ｊマウス（雄，４〜６週齢）をＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国北京）から入手した。コーンコブ（トウモロコシ穂軸）(corncob)床敷を備えたポリカーボネートケージに、制御した温度（２１〜２５oＣ）、湿度（４０〜７０％）、および１２時間明／１２時間暗サイクル（７：００  ＡＭ〜７：００  ＰＭ  点灯）下で、マウスを収容した。マウスに普通食（Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃５００１，ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ，米国インディアナ州）および無菌水を任意摂取できる状態で供給した。
【０１０５】
動物を−１日目の体重に基づいてグループ分けした。０日目に、すべての動物に体重（ｇ）の８％に等しい体積（ｍＬ）の生理食塩水中における２．５〜２０μｇのＤＮＡを、５秒以内に尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした(Liu, et al., 1999, Gene Ther, 6: 1258-66, Zhang, et al., 1999, Hum Gene Ther, 10: 1735-7)。ハイドロダイナミックインジェクションの技術的失敗または１日目もしくは３日目の低いＨＢＶマーカー発現のため動物を除外した後、残りのマウスを長期評価用に維持した。ＨＤＩインジェクション後の指示した時点で、血清調製用の血液試料を採集した。
【０１０６】
化合物処理のために、ＨＤＩ後２０日目（化合物処理の−３日目）に、２０日目の血清ＨＢｓＡｇレベルおよび体重に基づいてＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを４グループに分けた。処理当日にＥＴＶおよびＲ８４８を原液から生理食塩水中に希釈した。ビヒクルはＲＣ５９１であった。すべての被験化合物を指示した用量および頻度で経口投与した。
【０１０７】
一過性トランスフェクション
Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅから）をトランスフェクションに用いた。トランスフェクションの１日前に、細胞をトリプシン処理し、プレートに播種した。ＨｅｐＧ２および増幅ＨｅｐａＲＧ細胞系については０．８×１０５／ウェルで２４ウェルプレートに、分化したＨｅｐａＲＧ細胞系については３×１０５／ウェルで２４ウェルプレートに、細胞を播種した。
【０１０８】
ＨＢＶ抗原の検出
ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇを、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏから）を用いて製造業者の指示に従って測定した。
【０１０９】
ＨＢＶ  ＤＮＡの検出
細胞培養上清またはマウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅから）を用いて抽出した。ＨＢＶ  ＤＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより判定した。プライマーおよびプローブの配列を以下に示す：
フォワードプライマー：  ５’−ＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣ−３’（３７２−３８９）；
リバースプライマー：  ５’−ＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣ−３’（４５９−４７９）；
プローブ：  ５’−ＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−ＢＨＱ−２−３’（４０９−４３６）
適宜希釈したプラスミドｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をＲＴ−ＰＣＲのための標準品として用いた。
【０１１０】
細胞生存率アッセイ
Ａｌｂｕｍｉｎ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｉｍｅｒから）を用いて、上清中に分泌されたアルブミンの量により細胞生存率を決定した。
【０１１１】
ＤＮａｓｅ消化
細胞溶解物を、ＤＮａｓｅ  Ｉキット（Ｓｉｇｍａから）を用いて製造業者の指示に従って消化した。
【０１１２】
Ｈｉｒｔ  ＤＮＡ抽出
Ｈｉｒｔ  ＤＮＡを、先の記載をわずかに改変したものに従って調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。簡単に述べると、ＨｅｐＧ２細胞（１×１０６）またはホモジナイズした肝臓組織（５０ｍｇ）を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）５００μｌに懸濁した。次いで１２０μｌの１０％  ＳＤＳを添加し、１００μｌの２．５Ｍ  ＫＣｌを添加し、穏やかに混合した。４℃で１０分間の遠心の後、上清をフェノールおよびフェノール：クロロホルム：イソフミルアルコール（２５：２４：１）およびフェノールでそれぞれ抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、核酸をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。
【０１１３】
ｃｃｃＤＮＡリアルタイムＰＣＲ
ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプローブのセットを用いてｃｃｃＤＮＡを検出した：
ｃｃｃＤＮＡ−Ｆ；  ５’−ＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴ−３’（１５４５−１５６３）；
ｃｃｃＤＮＡ−Ｒ：  ５’−ＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧ−３’（１８８３−１９００）；
ｃｃｃＤＮＡ−プローブ：  ５’−ＴＡＲＭＡ＋ＣＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＲＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣ＋ＢＨＱ−２−３’（１６０２−１６２８）。
【０１１４】
ＨＢＶヌクレオカプシドの検出
トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞を、細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＣＡ−６３０，１×ＥＤＴＡフリー  プロテイナーゼ阻害薬）を用いて溶解した。４℃で１時間、撹拌しながらインキュベートした後、細胞質溶解物を遠心により澄明にした。溶解物を１．５％アガロースゲル中での電気泳動により分離し、次いでそれぞれカプシドタンパク質およびカプシド被包ＤＮＡの検出のために、ＰＶＤＦ膜（ウェスタンブロット法について）または正に荷電したナイロン膜（サザンブロット法について）上へ移した。
【０１１５】
ウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ｉｂｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を用いてゲルをＰＶＤＦ膜へ移した。ブロッキングの後、膜を一次抗体、ウサギ抗ＨＢＶコア抗原（Ｄａｋｏから）およびマウスモノクローナル抗アクチン（Ｓｉｇｍａから）と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にカップリングした適宜な二次抗体（ＫａｎｇＣｈｅｎから）と共に膜をインキュベートした。洗浄の後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｉｃｏ  Ｓｕｐｅｒ  ＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅから）を用いて信号を視覚化した。
【０１１６】
サザンハイブリダイゼーション
試料を１×ＴＡＥ緩衝液中１．５％アガロースゲルに装填し、２〜３時間電気泳動した。変性および中和の後、ＤＮＡを２０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから）にブロットし、ＤＩＧ標識ＨＢＶ  ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをアルカリホスファターゼ結合した抗ＤＩＧ抗体と共にインキュベートした後、ハイブリダイゼーション信号を標準的な化学発光反応で検出した。
【０１１７】
免疫蛍光
細胞をチャンバースライド(chamber slide)（Ｐｅｒｍａｎｏｘから）上で培養し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過用緩衝液（５％  ＢＳＡ＋０．５％トリトン，ＰＢＳ中）で透過処理した。細胞をウサギ抗ＨＢＶコア抗原（Ｄａｋｏから）およびマウスモノクローナル抗ＨＢＶ表面抗原（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）で染色した。５％のＦＢＳを含有するＰＢＳ中に抗体を希釈した。ＰＢＳで洗浄した後、結合した抗体を二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ｎｍヤギ抗ラットおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ｎｍロバ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）で標識した。数回の追加洗浄の後、細胞をＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）で染色し、Ｎｉｋｏｎ倒立ＩＦ顕微鏡下で観察した。
【０１１８】
クロマチン免疫沈降
ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｃｈｉｐ  Ｏｎｅ−Ｄａｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから）を用い、製造業者が提示した方法をわずかに改変したものに従って、ＣｈＩＰアッセイを実施した。細胞を１％ホルムアルデヒド中、３７℃で１０分間、固定した。固定を停止した後、細胞を８００ｇ、４℃で１０分間ペレット化し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを補足した免疫沈降用細胞溶解緩衝液の添加により再懸濁した。５００マイクロリットルの細胞溶解物を、カップホーン(cup horn)（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ＸＬ２０２０，Ｍｉｓｏｎｉｘ）により、２６Ｗで２秒間のオンおよび１５秒間のオフ、合計時間につき１６秒間（ラウンド当たり８回）、９ラウンドのセッティングで超音波処理した。この超音波処理条件は細胞ＤＮＡを５００〜８００ｂｐのフラグメントに着実に破断することが示されている。予備澄明化(pre-clear)、免疫沈降およびＤＮＡ抽出については、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＣｈＩＰ  Ｏｎｅ−Ｄａｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから）に備えられた指示に厳密に従った。得られたＤＮＡに、特異的ｃｃｃＤＮＡプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによる定量分析を施した：
フォワード，  ５’−ＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣ−３’  （１４４１−１４６０ｎｔ）；
リバース，  ５’−ＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧ−３’  （１８８９−１８６９ｎｔ）
免疫組織化学染色
切除した肝臓組織試料を直ちに４％ホルマリンに浸漬し、１８〜２４時間固定し、パラフィン包埋した。組織切片について抗ＨＢｃマルチクローナル抗体（Ｄａｋｏから）を用いた免疫組織化学染色を実施してコア抗原発現を検出した。ＨＢｃ陽性細胞の割合および染色強度を評価するために免疫反応スコア(Immunoreactive score)（ＩＲＳ）半定量スコアリング方式を用いる。染色強度を０（陰性）、１（弱）、２（中）、および３（強）と等級付けした；陽性細胞のパーセントを０（陰性）、１（＜２５％）、２（２５％〜５０％）、３（５０％〜７５％）、４（＞７５％）と採点した。２つのスコアを掛け算してＩＲＳを決定した。
【０１１９】
実施例１
ＨＢＶサークルのデザインおよび製造
１．３単位の過剰長遺伝子型Ｄ  ＨＢＶゲノム（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＪＮ６６４９１７．１）を収容したプラスミドｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３およびそのプラスミドの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として挙げる。親ミニサークルＤＮＡベクタープラスミド、ｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（カタログ番号ＭＮ５０１Ａ１，配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として挙げる）。
【０１２０】
親ＨＢＶサークル−ＣＭＶ−ＨＢＶ１．１構築体を得るために、遺伝子型Ｄ  ＨＢＶゲノムのヌクレオチド１８０５−３１８２および１−１９９０から出発して１．１単位の過剰長ＨＢＶゲノムをｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３からＰＣＲにより回収し、次いでＳａｌＩおよびＮｈｅＩ部位を利用してｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクター内へクローニングした。この親ＨＢＶサークル−ＣＭＶ−ＨＢＶ１．１構築体の配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として挙げる。
【０１２１】
親ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３構築体を得るために、ｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターをＳｍａＩおよびＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌｔｄから購入）で消化した。１．３単位の過剰長ＨＢＶゲノムインサート（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として挙げる）を作製するために、ＳｍａＩ部位を含むフォワードプライマー
５’−ＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＣＴＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＣＴ−３’
およびＫｐｎＩ部位を含むリバースプライマー
５’−ＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡ−３’
を用い、ｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３を鋳型として用いて、ＰＣＲにより４．２ｋｂフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として挙げる）を作製した。このＰＣＲフラグメントをＳｍａＩおよびＫｐｎＩで制限処理し、同じ酵素により消化したｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターとライゲートさせて、親プラスミドを得た。親ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３構築体の配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として挙げる。
【０１２２】
親ＨＢＶサークル構築体を得るために、ｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターをＳｍａＩおよびＫｐｎＩで消化した。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位ならびにＳｍａＩおよびＫｐｎＩ部位によりフランキングされた遺伝子型Ｄ  ＨＢＶゲノムのヌクレオチド２８４８−３１８２および１−２８４７から出発した完全長ＨＢＶゲノムインサートを、直接に遺伝子合成し（配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として挙げる）、消化し、同じ酵素により消化したｐＭＣ．ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターとライゲートさせて、親プラスミドを得た。親ＨＢＶサークル構築体の配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として挙げる。
【０１２３】
ＭＣ−ＥａｓｙミニサークルＤＮＡ製造キットを用い、製造業者の指示に従って（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＮ９２５Ａ−１）、ミニサークルＤＮＡを製造した。ＨＢＶサークル、ＨＢＶサークル−ＣＭＶ−ＨＢＶ１．１およびＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３のＤＮＡが、それぞれ前記に挙げたそれらの対応する親プラスミドから、ミニサークル産生体である大腸菌株ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２ＴにおいてφＣ３１インテグラーゼおよびＩ−ＳｃｅＩ遺伝子発現が起動した際に産生された（図１Ａ）。ＨＢＶサークルＤＮＡについては、ＨＢＶサークル中の３９ヌクレオチドのａｔｔＲ部位インサーション（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２８４７位と２８４８位の間、ｐｒｅＳ１遺伝子の開始コドンの直前、ポリメラーゼ遺伝子のＴＰ(terminal protein)（末端タンパク質)ドメインとスペーサーの間に位置する（図１Ｂ）。ＨＢＶサークルの全配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として挙げる。ＨＢＶサークルＤＮＡのサイズおよび配列を、それぞれアガロースゲル電気泳動およびサンガーシーケンシング(Sanger sequencing)により確認した（図１Ｃ）。
【０１２４】
実施例２
インビトロでのＨＢＶサークルトランスフェクション後のＨＢＶ複製の査定
ＨＢＶサークル、ＨＢＶサークル−ＣＭＶ−ＨＢＶ１．１およびＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３ならびにそれらの親プラスミドを、ウイルス複製試験のためにＨｅｐＧ２細胞に一過性トランスフェクトした。トランスフェクション後、７２時間目に細胞培養上清を採集し、ＥＬＩＳＡおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡが上清中に多量に存在し、これは健全なウイルス複製を示唆した（図２Ａ、ＢおよびＣ）。細胞を溶解し、総ＤＮＡを抽出し、ｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプローブのセットによるリアルタイムＰＣＲを用いてｃｃｃＤＮＡを定量した（図２Ｄ）。従来の１．３単位ＨＢＶゲノム過剰長デザインをもつ親ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３プラスミドと比較して、ＨＢＶサークルは少なくともそれに匹敵するかまたはそれより高いＨＢＶマーカー発現を示した。
【０１２５】
さらに、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶコア（ＨＢｃ）タンパク質は、ＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞において、免疫蛍光染色で容易に検出できた（図２Ｅ）。ＨＢｃ欠失がＨＢＶ複製に及ぼす影響を判定するために、ＨＢｃの開始コドンを変異させたＨＢｃ（−）  ＨＢＶサークルをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５として構築した。これら２種類の構築体をＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした場合、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ発現は同様に発現した（図３−１Ａおよび３−１Ｂ）。細胞内ＨＢＶカプシドおよびカプシド被包ＨＢＶ  ＤＮＡは野生型のみに検出されたが、ＨＢｃ（−）  ＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞には検出されなかった。ＨＢｃをトランスで補足した場合、これらの欠損の救済に成功した（図３−１Ｃ）。さらに他のＨＢＶ変異体も作製し、図３−２Ａ、３−２Ｂおよび３−２Ｃに示すようにＨＢＶ複製マーカーを検査した。これらの変異体は下記のものを含む；ＨＢＶサークルＰｏｌ（−）、すなわちＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の開始コドンが変異したもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）は、そのウイルスをポリメラーゼ発現欠損にし、ウイルスＲＮＡをパッケージできなかった(Nguyen et al., J Virol. 2008;82:6852-6861)；ＨＢＶサークル  Ｐｏｌ（Ｙ６３Ｄ）、すなわちＨＢＶポリメラーゼにＹ６３Ｄ変異があるもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）は、そのウイルスをＤＮＡ合成欠損にしたが、ＲＮＡパッケージングにおいては完全に機能性であった(Lanford et al., J Virol. 1997;71:2996-3004)；ＨＢＶサークルＨＢｓ（−）、すなわち２つの未成熟停止コドンをｐｒｅＳ２およびＳコーディング領域に導入したもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；ＨＢＶサークルＨＢｅ（−）、すなわち未成熟停止コドン変異Ｇ１８９６Ａをプレコア遺伝子に導入したもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）。
【０１２６】
これらのデータは、肝細胞に導入されるとＨＢＶサークルが高レベルＨＢＶ複製の支持について十分にコンピテントであることを明瞭に立証した。
実施例３
インビトロでのｃｃｃＤＮＡマーカー査定
核内にｃｃｃＤＮＡが存在するのはＨＢＶのユニークな特徴のひとつである。ＨＢＶサークルが肝細胞の核内でｃｃｃＤＮＡを形成できるかどうかを判定するために、サザンブロットおよびＣＨＩＰ分析を実施した。サザンブロット分析のために、親ＨＢＶサークルまたはＨＢＶサークルをまずＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトし、次いでＨｉｒｔ  ＤＮＡを調製した(Cai, et al., 2013, Methods Mol Biol, 1030: 151-61)。ＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞においてのみスーパーコイルド耐熱性ｃｃｃＤＮＡバンドがサザンブロット上にみられたが、親ＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞にはみられなかった。ＥｃｏＲＩ線状化すると、ｃｃｃＤＮＡバンドは消失した（図４Ａ，ＲＣ：弛緩した環状(relaxed circle)；ＤＳＬ：二本鎖線状(double strand linear)；ＣＣＣ：ｃｃｃＤＮＡ）。ＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞を用いてＣＨＩＰ分析も実施した。先の刊行物と一致して、トリメチル化リジン９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）およびアセチル化リジン２７（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）を含むエピジェネティック修飾がｃｃｃＤＮＡに付随していた(Liu, et al., 2013, PLoS Pathog, 9: e1003613)。一方で、類似レベルの総Ｈ３(Pan H3)がＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡと宿主ＲＬ３０遺伝子の間にみられた（それぞれ図４ＢおよびＣ）。合わせると、これらのデータはＨＢＶサークルをトランスフェクトした細胞に基準ｃｃｃＤＮＡがミニ染色体として存在することを立証し、これはさらにＨＢＶサークルを天然ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ研究のための代替として使用できることを支持した。
【０１２７】
実施例４
ＨＢＶサークルを用いたインビトロでの抗ＨＢＶ薬の評価
次に、細胞培養モデルにおいてＨＢＶサークル系を用いた抗ＨＢＶ薬の評価の可能性を査定した。ＨｅｐＧ２細胞または増殖性ＨｅｐａＲＧ細胞をＨＢＶサークルで一過性トランスフェクトし、指示した濃度のＥＴＶ、ＨＡＰ  １２（ＨＢＶカプシドアセンブリー阻害薬，これはヘテロアリールジヒドロピリミジン(heteroaryldihydropyrimidine)（ＨＡＰ）化学物質シリーズに属し、Bourne et al., J Virol. Oct 2008; 82(20): 10262-10270に例12として公表された）またはＰｅｇａｓｙｓで６日間処理した。上清を採集し、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびアルブミンＥＬＩＳＡを実施した。細胞を溶解し、細胞溶解物にカプシド被包ＨＢＶ  ＤＮＡ検出のためのサザンブロット分析、ならびに特異的抗体によるＨＢＶカプシド、ＨＢｃおよびベータ−アクチン検出のためのウェスタンブロット分析をそれぞれ施した。
【０１２８】
ＨＢＶサークルをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞において、Ｅｎｔｅｃａｖｉｒ（ＥＴＶ）、すなわちＣＨＢ処置用として承認されたヌクレオシドアナログは用量依存性でＨＢＶ  ＤＮＡ複製を効果的にブロックしたが、他のウイルスタンパク質発現には影響を及ぼさなかった（図５Ａ，上左パネルおよび右パネル）。他方で、ＨＡＰ  １２はカプシド形成をブロックして、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製の抑止をもたらした(Bourne, et al., 2008, J Virol, 82: 10262-70)。本発明者らはＨＡＰ  １２が用量依存性で特異的にＨＢｅＡｇ分泌を低減するが、ＨＢｓＡｇまたはアルブミンには影響を及ぼさないことも観察した（図４Ａ，下左パネルおよび右パネル）。
【０１２９】
Ｐｅｇａｓｙｓ（ｐｅｇ化インターフェロンアルファ−２ａ）はＣＨＢ処置用として承認されたもうひとつの薬物であり、多数の宿主メカニズムを活性化してＨＢＶ複製を抑制することができる。ＨＢＶサークルをトランスフェクトしたＨｅｐａＲＧ細胞をＰｅｇａｓｙｓで処理すると、ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの両方の産生が用量依存性で阻害された（図５Ｂ）。これらの結果は、種々のクラスの抗ＨＢＶ薬をインビトロで細胞培養モデルにおいて評価するためにＨＢＶサークルを使用できることを示唆する。
【０１３０】
実施例５
ＨＢＶサークルを用いた持続的ＨＤＩマウスモデルの樹立
ＨＢＶ複製および持続時間をインビボで試験するために、１０μｇのＨＢＶサークル、すなわちＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３を、ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３の親プラスミドと共に、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（雄，４〜６週齢）の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーを検査するために血液試料を採集した（図６）。図６の指示した時点での動物数を表１に示した。ＨＢＶサークルをインジェクトしたＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、他のグループと比較してきわめて高いレベルの安定したＨＢＶマーカー発現を示した。すべてのＨＢＶマーカーが、インジェクション後、７週を超えて持続した。対照的に、ｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３構築体のように古典的なＨＢＶ１．３デザインをもつ親ＨＢＶサークル−ＨＢＶ１．３構築体はＨＢＶ持続性を支持することができなかった；ＨＢｓＡｇが急速に低減して１４日を過ぎると検出できなくなったからである。その間に、全実験期間中、マウスの体重をモニターし、各系統のすべてのグループ間に有意差がなかった（図６Ｄ）。
【０１３１】
ＨＤＩに際してのＤＮＡ量がＨＢＶ持続性に及ぼす影響を理解するために、４種類の異なる用量のＨＢＶサークルを対照プラスミドｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３と共にＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにインジェクトした。血清中のＨＢＶマーカーを５１日間モニターした。図７の指示した時点における動物数を表２に示した。図７に示すように、２．５μｇ、５μｇおよび１０μｇグループのすべてのマウスが高レベルのウイルス複製を少なくとも５１日間持続して維持し、初期の用量依存性パターンのウイルスマーカー発現がみられたにもかかわらず、その後の３０日を過ぎた時点では有意差がなかった。異なるプラスミドバックボーンおよび１．３過剰長ＨＢＶゲノムを保有するｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３グループは、良好に持続しなかった。
【０１３２】
次に、マウス肝臓中のｃｃｃＤＮＡを検出するために、３日目および３０日目の各時点でＨＢＶサークル１０μｇグループから２匹のマウスをと殺した。マウス肝臓を採取し、サザンブロット分析用のＨｉｒｔ  ＤＮＡを調製した。図７Ｄに示すように、ＨＤＩ後３日目に耐熱性ｃｃｃＤＮＡを明瞭に検出できた。そして３０日目にはｃｃｃＤＮＡレベルは低減したが、なお検出可能であった。ＥｃｏＲＩ消化により線状化すると、速やかに移動するスーパーコイルドｃｃｃＤＮＡバンドは予想どおり消失していた。これらの結果は、マウス肝臓において持続性表現型が基準ｃｃｃＤＮＡにより推進されたことを示唆する。
【０１３３】
表３および図８に示すように、選択したマウスについてＨＤＩインジェクション後１２０日目にＨＢｃの免疫組織化学(Immunohistochemistry)（ＩＨＣ）染色も実施した。結果は、これらのマウスにおいてＨＢＶ複製が少なくとも１２０日間持続し、ＨＢｃが主に、ＨＢＶを複製する肝実質細胞の核に存在することを立証した；これは、ＨＢＶ慢性感染者において免疫寛容期にみられるものに類似する表現型である(Hsu, et al., 1987, J Hepatol.;5(1):45-50)。
【０１３４】
【表１】
2018502604.tif 000003
【０１３５】
【表２】
2018502604.tif 000004
【０１３６】
【表３】
2018502604.tif 000005
【０１３７】
（１）陽性染色パーセントスコア：０（陰性）；１（陽性細胞＜２５％）；２（陽性細胞２５％〜〜５０％）；３（陽性細胞５０％〜７０％）；４（陽性細胞＞７５％）．
（２）染色強度，弱から強まで：０〜３．
（３）ＩＲＳ：陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア．
（４）累積ＩＲＳ：５回の反復ＩＲＳの和．
（５）ＮＤ：判定しなかった．
（６）ＨＢｓＡｇについてのＬＬＯＱは１０ＩＵ／ｍｌである；ＨＢｅＡｇについてのＬＬＯＱは５ＮＣＵ／ｍｌである；ＨＢＶ  ＤＮＡについてのＬＬＯＱは４．３０Ｌｏｇ１０（コピー／ｍｌ）である。
【０１３８】
実施例６
ＨＢＶサークルを用いたインビボでの抗ＨＢＶ薬の評価
免疫コンピテントマウスにおけるＨＢＶサークルによる持続的な高レベルＨＢＶ複製の樹立は、異なる作用メカニズム(mechanism of action)（ＭｏＡ）をもつ抗ＨＢＶ薬を評価できる可能性もある。これを調べるために、まずＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに１０μｇのＨＢＶサークルをインジェクトし、２２日間待った後、抗ウイルス薬処理を開始した。２３日目に、マウスを６〜７匹／グループの４グループに分け、ビヒクル、ＥＴＶ（０．０３ｍｇ／ｋｇ，ＱＤ）、ヘテロアリールジヒドロピリミジン（ＨＡＰ）化合物系列に属するＨＡＰ  ２（ＨＢＶカプシドアセンブリー阻害薬，WO2014/037480の例2に公表，１０ｍｇ／ｋｇ，ＱＤ）、およびＲ８４８（レシキモド(Resiquimod)，ＴＬＲ７アゴニスト，その構造はHemmi et al., Nature Immunology 3, 196 - 200 (2002)に公表された，０．５ｍｇ／ｋｇ，ＱＯＤ）を各グループのマウスに２９日間、経口投与した。図９に示すように、ＥＴＶ、ＨＡＰ  ２およびＲ８４８処理は血清中のＨＢＶ  ＤＮＡを検出できないレベルにまで効果的に低減した。さらに、Ｒ８４８はＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇをも著しく低減し、４４日目（処理の２２日目）からは３種類すべてのＨＢＶ血清マーカーを検出できないレベルにまで低減した。この例の結果は、本発明の組換えＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにより樹立したモデルが薬物評価に用いる効果的方法であることを明瞭に示した。
【０１３９】
実施例７
さらに他のマウス系統およびＨＢＶ遺伝子型を用いた持続的ＨＤＩマウスモデルの樹立
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスのほかに、他の免疫コンピテントマウス系統であるＣＢＡ／Ｊを、それらが持続的ＨＢＶ複製を支持する能力について同様に評価した。図１０に示す実験において、ＨＢＶサークルまたはｐＢＲ３２２−ＨＢＶ１．３をＣＢＡ／Ｊマウス（雄，４〜６週齢）の尾静脈にハイドロダイナミックインジェクションした。ＨＤＩ後の指示した時点で、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡを含めたＨＢＶマーカーを検査するための血液試料を採集した。ＨＢＶ複製はＨＤＩインジェクトしたマウスの６０％において少なくとも５６日間持続した。
【０１４０】
遺伝子型Ｄ  ＨＢＶ配列のほかに、遺伝子型Ｂ  ＨＢＶ配列をもつ２種類のＨＢＶサークル構築体を同様に評価した。図１１に示すように、ＨＢＶサークルＧｔ  Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２，ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＹ２２０６９８に由来）およびＨＢＶサークルＧｔ  Ｂｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３，ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＧＱ２０５４４０に由来）の両方が、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて元のＨＢＶサークルに匹敵する持続性を示した。
【０１４１】
実施例８
ＨＢＶサークルを用いたインビボでのＨＢＶ変異体の特性解明
一連のＨＢＶサークル変異体を作製し、それの持続性をインビボで評価した。ＨＢｃ欠失はウイルスを複製不能にし、したがって血清中のＨＢＶ  ＤＮＡを検出不能にした。しかし、それはＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの持続性には影響を及ぼさなかった。同様に、ＨＢｘ欠失（開始コドン変異，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０）またはＲ９６Ｅ変異（ＤＤＢ１結合の欠失，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）(Leupin, et al., J Virol. 2005 Apr; 79(7): 4238-4245)はいずれもＨＢＶの持続性には影響を及ぼさなかった（図１２）。野生型グループと比較した血清中のＨＢＶ  ＤＮＡおよび抗原のレベル低減により指摘されるように、ＨＢＶ複製レベルの低減がみられた（図１２）。この所見と一致して、マウス肝臓ＩＨＣ染色結果も肝実質細胞におけるＨＢｃレベル低減を立証した（表４および図１３）。
【０１４２】
別の実験で、ＨＢｅ（−）、ＨＢｓ（−）、Ｐｏｌ（−）およびＰｏｌ（Ｙ６３Ｄ）を含めたさらに他のＨＢＶ変異体を検査した。図１４に示すように、ＨＢｅ（−）変異体はＨＢｓＡｇの持続性の低減を示した。
【０１４３】
【表４】
2018502604.tif 000006
【０１４４】
（１）陽性染色パーセントスコア：０（陰性）；１（陽性細胞＜２５％）；２（陽性細胞２５％〜〜５０％）；３（陽性細胞５０％〜７０％）；４（陽性細胞＞７５％）．
（２）染色強度，弱から強まで：０〜３．
（３）ＩＲＳ：陽性染色パーセントスコア×染色強度スコア．
（４）累積ＩＲＳ：５回の反復ＩＲＳの和．
（５）ＨＢｓＡｇについてのＬＬＯＱは１０ＩＵ／ｍｌである；ＨＢｅＡｇについてのＬＬＯＱは５ＮＣＵ／ｍｌである；ＨＢＶ  ＤＮＡについてのＬＬＯＱは４．３０Ｌｏｇ１０（コピー／ｍｌ）である。
【図１】
2018502604.tif 000007
【図２】
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【図３−１】
2018502604.tif 000009
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018502604.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2018502604.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2018502604000001.app
【国際調査報告】
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2018502604.tif 000023
2018502604.tif 000024
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