(57)【要約】  本開示は、概して、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から多系統造血前駆細胞を提供するための方法及び組成物に関する。ＰＳＣは、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードする発現構築物を含む。また、ヒトなどの哺乳動物で長期生着が可能な造血幹細胞を提供するための方法も提供される。さらに、提供される造血幹細胞及び造血細胞の前駆体を含む治療組成物、並びに対象の処置のためにこのような治療組成物を使用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること；及び
（ｂ）前記多能性幹細胞を、前記造血前駆体プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより造血前駆細胞（ＨＰＣ）を作製すること
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記ＨＰＣが骨髄系及びリンパ系に分化することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）前記ＨＰＣを、前記造血前駆体プログラミング遺伝子が発現されないような条件下で培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発現構築物がトランスポゾンベース又はエピソームベースの発現構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子が単一プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単一プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）の前記培養が約４〜約１０日である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞がヒトのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＰＣが１つ以上の造血前駆体マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５ａ、及びＣＤ４１ａからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ４５、及びＣＤ３４からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＰＣが未成熟ＨＰＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記未成熟ＨＰＣがＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＰＣの少なくとも５０％が未成熟ＨＰＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＰＣの少なくとも７０％が未成熟ＨＰＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＰＣの少なくとも９０％が未成熟ＨＰＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＰＣが間質細胞の非存在下で培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＰＣが無血清培地又は規定された培地で培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＰＣが、形質細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、赤血球、顆粒球、リンパ球、単球、白血球、及び血小板からなる群から選択される２つ以上の細胞型に分化され得る、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンパ球がＢリンパ球及び／又はＴリンパ球である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子がＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子相同体）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組み込み１）、ＥＬＫ３（ＥＴＳドメイン含有タンパク質）、ＥＴＳ１（Ｃ−ｅｔｓ−１）、又はＥＴＳ２（Ｃ−ｅｔｓ−２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子がＥＲＧ又はＥＴＶ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子が標的配列に融合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的配列がＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）の前記ＰＳＣが、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする少なくとも１つの追加的な発現構築物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
（ｃ）前記ＨＰＣを、前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより哺乳動物で長期生着が可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＢＣＬ２、ＢＥＮＤ４、ＢＭＩ１、ＣＩＩＴＡ、ＥＧＲ３、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＬ１、ＨＩＦ３Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ２、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ６、ＨＳＦ５、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＩＳ１、ＭＩＲ２９Ａ、ＭＩＲ２９Ｂ１、ＭＳＩ２、ＭＹＢ、ＭＹＣＮ、ＮＫＸ２−３、ＮＲ４Ａ２、ＰＥＧ３、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１６、ＲＢＡＫ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ３、ＳＥＴＢＰ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ８、ＴＦＥＣ、ＺＢＴＢ１４、ＺＢＴＢ２０、ＺＭＡＴ１、ＺＮＦ１３１、ＺＮＦ１３４、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ２６、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ４１４、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ６６７、及びＺＮＦ６８２からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、ＲＢＡＫ、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＡ７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ６８２、及びＭＳＩ２からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、及びＲＢＡＫからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子の発現が前記ＨＰＣで構成的である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子の発現が前記多能性幹細胞において本質的にサイレンシングされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記造血幹細胞プログラミング遺伝子が標的配列に融合される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的配列がＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単一プロモーターの制御下にある、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードする発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること；
（ｂ）前記多能性幹細胞を、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９が発現されるような条件下で培養し、それにより造血前駆細胞（ＨＰＣ）を作製すること、
を含む、上記方法。
【請求項４２】
多能性幹細胞から造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単一プロモーターの制御下にある、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードする発現構築物、及び１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする少なくとも第２の発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること；及び
（ｂ）前記多能性幹細胞を、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、及び前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより哺乳動物で長期生着が可能なＨＳＣを作製すること、
を含む、上記方法。
【請求項４３】
ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする発現構築物。
【請求項４４】
トランスポゾンベース又はエピソームベースの発現構築物である、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項４５】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子が単一プロモーターの制御下にある、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項４６】
前記単一プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項４７】
前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項４８】
前記ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子がＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子相同体）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組み込み１）、ＥＬＫ３（ＥＴＳドメイン含有タンパク質）、ＥＴＳ１（Ｃ−ｅｔｓ−１）、又はＥＴＳ２（Ｃ−ｅｔｓ−２）である、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項４９】
前記ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子がＥＲＧ又はＥＴＶ２である、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５０】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５１】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５２】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子が標的配列に融合される、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５３】
前記標的配列がＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである、請求項５２に記載の発現構築物。
【請求項５４】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５５】
前記造血前駆体プログラミング遺伝子がＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む、請求項４３に記載の発現構築物。
【請求項５６】
請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の発現構築物を含む細胞。
【請求項５７】
１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする発現構築物。
【請求項５８】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＢＣＬ２、ＢＥＮＤ４、ＢＭＩ１、ＣＩＩＴＡ、ＥＧＲ３、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＬ１、ＨＩＦ３Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ２、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ６、ＨＳＦ５、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＩＳ１、ＭＩＲ２９Ａ、ＭＩＲ２９Ｂ１、ＭＳＩ２、ＭＹＢ、ＭＹＣＮ、ＮＫＸ２−３、ＮＲ４Ａ２、ＰＥＧ３、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１６、ＲＢＡＫ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ３、ＳＥＴＢＰ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ８、ＴＦＥＣ、ＺＢＴＢ１４、ＺＢＴＢ２０、ＺＭＡＴ１、ＺＮＦ１３１、ＺＮＦ１３４、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ２６、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ４１４、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ６６７、及びＺＮＦ６８２からなる群から選択される、請求項５７に記載の発現構築物。
【請求項５９】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、ＲＢＡＫ、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＡ７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ６８２、及びＭＳＩ２からなる群から選択される、請求項５７に記載の発現構築物。
【請求項６０】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、及びＲＢＡＫからなる群から選択される、請求項５７に記載の発現構築物。
【請求項６１】
前記１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある、請求項５７に記載の発現構築物。
【請求項６２】
前記造血幹細胞プログラミング遺伝子が標的配列に融合される、請求項５７に記載の発現構築物。
【請求項６３】
前記標的配列がＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである、請求項６２に記載の発現構築物。
【請求項６４】
請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の発現構築物を含む細胞。
【請求項６５】
哺乳動物の骨髄に生着し、且つ分化されたヒト血液細胞を産生することができる、ヒト多能性幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化された造血幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により両方の全開示内容が本明細書に組み入れられる２０１５年１０月２０日出願の米国仮特許出願第６２／２４４，１０１号明細書及び２０１６年１０月５日出願の同第６２／４０４，４７０号明細書の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、概して、分子生物学、幹細胞、及び分化細胞の分野に関する。より詳細には、本発明は、特定の細胞系統、特に造血細胞及び造血細胞の前駆体への多能性幹細胞（ＰＳＣ）のプログラミングに関する。
【背景技術】
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生存のために自己再生し、全ての血液細胞型に分化し、移植時に造血系全体を再構成する能力を有する唯一の細胞である。これらの細胞は、最終分化した誘導体細胞型（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ）、例えば、赤血球、血小板、顆粒球、及びリンパ系細胞と共に、様々な血液疾患の処置、及び最近では癌の処置において十分に確立された治療用途を有する。しかしながら、ＨＬＡ適合生存ドナーからのＨＳＣの入手が限られているため、診療所での広範な使用が大きく制限されている。従って、代替細胞型からＨＳＣを誘導するためにかなりの努力がなされている。
【０００４】
代替細胞型からＨＳＣを誘導するための１つのアプローチは、非ＨＳＣ体細胞型をＨＳＣに分化転換することである。マウス線維芽細胞を非生着性造血前駆細胞に分化転換させるために、導入遺伝子の様々な組み合わせが使用されている（Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、このアプローチは、開始初代細胞の数及び低い分化転換効率によって制限される。従って、長期生着能を有する造血前駆細胞の無制限の供給を提供する方法が存在しない。
【０００５】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、全ての体細胞型に分化する能力を保持しながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無制限に増殖することができる。従って、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方の適用のために、患者特異的ＨＳＣ及び機能的血液細胞の無制限の供給を潜在的に提供することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＰＳＣの造血系統の細胞への分化は、中胚葉誘導の段階及び多能性造血前駆体の特異化を含む正常なｉｎ  ｖｉｖｏ発生を再現する。従って、フォワードプログラミングにより、ヒトＰＳＣを造血系統に分化させるための多数の方法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、主に造血発生の複雑な性質に起因して、ＰＳＣからの効率的な骨髄系及びリンパ系への分化及び長期生着が可能なＨＳＣの堅牢(robust)な作製を可能にする方法は、現在のところ利用できない。１つの方法では、マウスＰＳＣの造血分化のための導入遺伝子、例えば、ＨｏｘＢ４及びＬｈｘ２の過剰発現が、生着可能なＨＳＣ様細胞を作製することが示されている（Ｋｙｂａ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｋｉｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、これらの導入遺伝子は、ヒトＰＳＣからＨＳＣを作製することができなかった。別の方法では、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒトＰＳＣにおけるＥＲＧ、ＨＯＸＡ９、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、及びＭＹＢ導入遺伝子の組み合わせが、骨髄及び赤血球分化が可能な造血前駆細胞の作製を可能にすることを報告した（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、この方法は、継続的な導入遺伝子の発現に依存した短期生着が可能な細胞のみを作製した。従って、遺伝的プログラミングは、非常に有望なアプローチであることが証明されているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＰＳＣからのリンパ系及び骨髄系への分化能及び長期生着が可能な造血前駆細胞のロバストな作製を可能にする方法は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の実施形態は、ヒト多能性幹細胞の多系統造血前駆細胞への効率的なプログラミングの方法を提供する。第１の実施形態では、多能性幹細胞から造血前駆細胞（ＨＰＣ）を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供され、この方法は、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること、及び多能性幹細胞を、造血前駆体プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより造血前駆細胞を作製することを含む。特定の態様では、ＨＰＣは、骨髄系及びリンパ系に分化することができる。一部の態様では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ある態様では、多能性幹細胞は、ヒトのものである。
【０００８】
ある態様では、発現構築物は、トランスポゾンベース又はエピソームベースの発現構築物である。一部の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、単一プロモーターの制御下にある。特定の態様では、単一プロモーターは、誘導性プロモーターである。特定の態様では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。
【０００９】
さらなる態様では、造血前駆細胞を作製するための方法は、ＨＰＣを、造血前駆細胞プログラミング遺伝子が発現されないような条件下で培養することをさらに含む。ある態様では、ＨＰＣは、間質細胞の非存在下で培養される。一部の態様では、ＨＰＣは、無血清培地又は規定された（defined）培地で培養される。ある態様では、ＨＰＣは、形質細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、赤血球、顆粒球、リンパ球、単球、白血球、及び血小板からなる群から選択される２つ以上の細胞型に分化され得る。ある態様では、リンパ球は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球である。
【００１０】
一部の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子が発現されるような条件下での多能性幹細胞の培養は、約４〜約１０日間である。
【００１１】
ある態様では、ＨＰＣは、１つ以上の造血前駆体マーカーを発現する。一部の態様では、造血前駆体マーカーは、ＣＤ４３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５ａ、及びＣＤ４１ａからなる群から選択される。特定の態様では、１つ以上の造血前駆体マーカーは、ＣＤ４３、ＣＤ４５、及びＣＤ３４からなる群から選択される。一部の態様では、ＨＰＣは未成熟ＨＰＣである。特定の態様では、未成熟ＨＰＣは、ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する。一部の態様では、ＨＰＣの少なくとも５０％、例えば、ＨＰＣの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は未成熟ＨＰＣである。さらなる態様では、ＨＰＣの少なくとも７０％は未成熟ＨＰＣである。さらなる態様では、ＨＰＣの少なくとも９０％は未成熟ＨＰＣである。
【００１２】
ある態様では、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子は、ＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子相同体）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組み込み１）、ＥＬＫ３（ＥＴＳドメイン含有タンパク質）、ＥＴＳ１（Ｃ−ｅｔｓ−１）、又はＥＴＳ２（Ｃ−ｅｔｓ−２）である。特定の態様では、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子は、ＥＲＧ又はＥＴＶ２である。
【００１３】
一部の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。他の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。
【００１４】
ある態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、標的配列に融合される。例えば、標的配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。ある態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む。他の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む。
【００１５】
さらなる態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含むＰＳＣは、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする少なくとも１つの追加的な発現構築物をさらに含む。
【００１６】
なおさらなる態様では、多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ＨＰＣを、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより哺乳動物における長期生着が可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製することをさらに含む。ある態様では、哺乳動物はヒトである。一部の態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＢＣＬ２、ＢＥＮＤ４、ＢＭＩ１、ＣＩＩＴＡ、ＥＧＲ３、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＬ１、ＨＩＦ３Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ２、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ６、ＨＳＦ５、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＩＳ１、ＭＩＲ２９Ａ、ＭＩＲ２９Ｂ１、ＭＳＩ２、ＭＹＢ、ＭＹＣＮ、ＮＫＸ２−３、ＮＲ４Ａ２、ＰＥＧ３、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１６、ＲＢＡＫ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ３、ＳＥＴＢＰ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ８、ＴＦＥＣ、ＺＢＴＢ１４、ＺＢＴＢ２０、ＺＭＡＴ１、ＺＮＦ１３１、ＺＮＦ１３４、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ２６、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ４１４、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ６６７、及びＺＮＦ６８２からなる群から選択される。ある態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、ＲＢＡＫ、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＡ７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ６８２、及びＭＳＩ２からなる群から選択される。特定の態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、及びＲＢＡＫからなる群から選択される。
【００１７】
一部の態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子の発現は、ＨＰＣで構成的である。ある態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子の発現は、多能性幹細胞において本質的にサイレンシングされる。
【００１８】
ある態様では、造血幹細胞プログラミング遺伝子が標的配列に融合される。特定の態様では、標的配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。
【００１９】
別の実施形態では、多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供され、この方法は、単一プロモーターの制御下にある、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードする発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること、及びこの多能性幹細胞を、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９が発現されるような条件下で培養し、それにより造血前駆細胞（ＨＰＣ）を作製することを含む。
【００２０】
さらに別の実施形態では、多能性幹細胞から造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供され、この方法は、単一プロモーターの制御下にある、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードする発現構築物、及び１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする少なくとも第２の発現構築物を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を提供すること、及び多能性幹細胞を、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、及び１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が発現されるような条件下で培養し、それにより哺乳動物で長期生着が可能なＨＳＣを作製することを含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする発現構築物が提供され、このプログラミング遺伝子は、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。一部の態様では、構築物は、トランスポゾンベース又はエピソームベースの発現構築物である。ある態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、単一プロモーターの制御下にある。一部の態様では、単一プロモーターは、誘導性プロモーターである。特定の態様では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。一部の態様では、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子は、ＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子相同体）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組み込み１）、ＥＬＫ３（ＥＴＳドメイン含有タンパク質）、ＥＴＳ１（Ｃ−ｅｔｓ−１）、又はＥＴＳ２（Ｃ−ｅｔｓ−２）である。特定の態様では、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子は、ＥＲＧ又はＥＴＶ２である。一部の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。他の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。ある態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、標的配列に融合される。特定の態様では、標的配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。一部の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む。他の態様では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０を含む。
【００２２】
別の実施形態では、造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする発現構築物を含む細胞が提供され、このプログラミング遺伝子は、ＥＴＳ／ＥＲＧ遺伝子、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする発現構築物が提供される。特定の態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＢＣＬ２、ＢＥＮＤ４、ＢＭＩ１、ＣＩＩＴＡ、ＥＧＲ３、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＬ１、ＨＩＦ３Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ２、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ６、ＨＳＦ５、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＩＳ１、ＭＩＲ２９Ａ、ＭＩＲ２９Ｂ１、ＭＳＩ２、ＭＹＢ、ＭＹＣＮ、ＮＫＸ２−３、ＮＲ４Ａ２、ＰＥＧ３、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１６、ＲＢＡＫ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ３、ＳＥＴＢＰ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ８、ＴＦＥＣ、ＺＢＴＢ１４、ＺＢＴＢ２０、ＺＭＡＴ１、ＺＮＦ１３１、ＺＮＦ１３４、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ２６、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ４１４、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ６６７、及びＺＮＦ６８２からなる群から選択される。ある態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、ＲＢＡＫ、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＡ７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ６８２、及びＭＳＩ２からなる群から選択される。特定の態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、及びＲＢＡＫからなる群から選択される。ある態様では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある。一部の態様では、造血幹細胞プログラミング遺伝子は、標的配列に融合される。１つの特定の態様では、標的配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。
【００２４】
さらなる一実施形態では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする発現構築物を含む細胞が提供される。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、哺乳動物の骨髄に生着し、且つ分化されたヒト血液細胞を産生することができる、ヒト多能性幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化された造血幹細胞が提供される。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び修正形態がこの詳細な説明から当業者に明らかであるため、単なる例として示されることを理解されたい。
【００２７】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の連結された共発現（ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ヒトＰＳＣを未成熟ＣＤ３４＋造血前駆細胞に効率的にプログラミングする。（Ａ）プログラミング遺伝子ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の試験された構成が示されている。
【図１Ｂ】（Ｂ）Ｅ＋Ｇ、ＥＧ、及びＥＧＨ誘導遺伝子構成を、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性遺伝子発現のためにｒｔＴＥＴタンパク質を構成的に発現するようにエンジニアリングされたヒトＰＳＣを用いて試験した。
【図１Ｃ】（Ｃ）ＥＴＶ２及びＥＲＧに基づく遺伝子構成の両方において、８日目に誘導された培養物中の絶対細胞数。
【図１Ｄ】（Ｄ）ＭＳ５間質細胞と共培養した８日目のＤＯＸ誘導細胞の増殖及び分化の可能性を示す。
【図１Ｅ】（Ｅ）ＭＳ５間質細胞との２週間の共培養後の全ＣＤ４３+及び未成熟ＣＤ４３+ＣＤ３４+細胞の絶対数。
【図１Ｆ】（Ｆ）多系統コロニー形成能が、ＭＳ５間質との２週間の共培養後のＥＧＨ誘導細胞で検出された。
【００２９】
【図２】ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）を用いた誘導後の導入遺伝子の発現である。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ及びｐＴｉｇｈｔ−ＥＧ構築物を、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターを用いてｒｔＴＥＴ発現ヒトＰＳＣに導入した。ＣＤ４３+細胞におけるＥＧＦＰの発現は、ＤＯＸ誘導性造血プログラミング後に示されている。
【００３０】
【図３Ａ】原始造血前駆細胞の増殖を改善し、ＣＤ１３３を発現させるＥＧＨ相補導入遺伝子のスクリーニングである。（Ａ）構成的ＨＯＸＡ１０発現（ｐＣＭＶ）を有するＥＧＨ誘導細胞は、ＭＳ５間質細胞との２週間の共培養後、最も原始的な幹細胞様細胞に関連したＣＤ４３+ＣＤ３４+ＣＤ１３３+細胞の小集団を示す。
【図３Ｂ】（Ｂ）改善された原始ＣＤ４３+ＣＤ３４+細胞及びＣＤ４３+ＣＤ３４+ＣＤ１３３+細胞の産生のためのＥＧＨ相補遺伝子を検出するために考案されたスクリーニングモデルの概略図。
【図３Ｃ】（Ｃ）ＥＧＨ誘導性原始前駆細胞の増殖に対して正の効果を実証する遺伝子のスクリーニング結果を示す。スコア＝Ｐ３４×Ｐ１３３×（Ｐ３４／Ｐ４５）であり、式中、Ｐは、内部ＥＧＨ対照の割合として計算された、それぞれのサブセットの産生であり、３４は、ＣＤ４３+ＣＤ３４+細胞であり、１３３は、ＣＤ４３+ＣＤ３４+ＣＤ１３３+細胞であり、４５は、ＣＤ４３／４５+ＣＤ３４-細胞である。
【００３１】
【図４Ａ】ＥＧＨ誘導細胞のリンパ球分化能である。（Ａ）ＥＧＨ誘導細胞からのリンパ系細胞の発生を改善する遺伝子を検出するために考案されたスクリーニングモデルの概略図。
【図４Ｂ】（Ｂ）４週間のＴ／ＮＫ細胞及びＢ細胞の分化培養のフローサイトメトリー分析。
【００３２】
【図５Ａ】ＥＧＨ誘導細胞の生着能である。（Ａ）免疫不全マウスの造血細胞の生着を可能にするＥＧＨ相補遺伝子を検出するために考案されたスクリーニングモデルの概略図。
【図５Ｂ】（Ｂ）注射の１２週後のＮＢＳＧＷマウスの末梢血及び骨髄におけるヒト造血ＣＤ４５+細胞の検出が示されている。
【図５Ｃ】（Ｃ）注射の１２週後のＮＢＳＧＷマウスの末梢血及び骨髄におけるヒト造血ＣＤ４３／４５+細胞の検出が示されている。
【００３３】
【図６】移植細胞対注入細胞における導入遺伝子発現の比を示すグラフである。それぞれの移植／注入の発現比は、細胞移植後の導入遺伝子の増加（正の値）又は減少（負の値）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から多系統造血前駆細胞を作製するための方法及び組成物を提供することにより、現在の技術におけるいくつかの主要な問題を克服する。特に、多系統造血前駆細胞は、長期生着が可能な造血幹細胞にプログラミングすることができる。本発明者らは、多系統造血前駆細胞を達成する１つの方法が、その発現がＰＳＣの多系統造血前駆細胞への「フォワードプログラミング」を加減する少なくとも３つの特定の遺伝子の発現に影響を及ぼす１つ以上の発現ベクターでＰＳＣをトランスフェクトすることであることを見出した。特に、本開示の方法は、例えば胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞を含む任意の型の多能性幹細胞に適用される。特に、多系統造血前駆体は、骨髄系及びリンパ球系細胞に効率的に分化する能力を有する。
【００３５】
好ましくは、造血プログラミング遺伝子は、ＥＴＶ２又はＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９である。特定の態様では、造血プログラミング遺伝子は、単一プロモーター、例えば、誘導性プロモーターの制御下にある。一般に、造血プログラミング遺伝子は、ＰＳＣを造血前駆細胞にフォワードプログラミングするのに十分な期間のみ発現される。
【００３６】
未成熟多系統造血前駆体が形成された時点で、本発明者らは、造血幹細胞の長期生着を可能にするために、１つ又は複数の追加的な工程を行うことが好ましいことを見出した。１つの方法では、その発現により多系統造血前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏでの安定した生着を可能にする１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする１つ以上のさらなる発現構築物でＰＳＣをトランスフェクトする。ある態様では、長期生着のための造血幹細胞プログラミング遺伝子は、未成熟造血前駆細胞では発現されるが、ＰＳＣでは発現されない。
【００３７】
従って、本開示の方法は、広範囲の用途、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの造血前駆体の安定した移植、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化合物のスクリーニング、並びに血液疾患及び傷害の機構解明のために無制限の数の多系統造血前駆体及び造血幹細胞を提供する。
【００３８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される、特定の成分に関する「本質的に含まない」は、本明細書では、特定の成分が組成物に意図的に全く配合されておらず、及び／又は単に汚染物質として若しくは微量で存在するという意味で用いられる。従って、あらゆる意図しない組成物の汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％を遥かに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、特定の成分の量を標準的な分析方法で検出することができない組成物である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書の請求項で、用語「含む」と合わせて使用される場合、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００４０】
請求項における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すことを明示的に示す場合を除いて、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物及び「及び／又は」のみを指すという定義を支持する。本明細書中で使用される「もう１つの」は、少なくとも２番目以上を意味し得る。
【００４１】
本出願を通して、「約」という用語は、値が、装置の固有の誤差のばらつきを含むことを示すために使用され、値又は研究対象間に存在するばらつきを決定するための方法が利用される。
【００４２】
細胞又は生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関して使用される「外因性」という用語は、人工又は天然の手段によって細胞又は生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを指すか、又は細胞に関して、この用語は、単離され、続いて人工又は天然の手段によって他の細胞又は生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物又は細胞由来であってもよく、又は生物若しくは細胞内で自然に発生する核酸の１つ以上のさらなるコピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物に由来してもよく、又は同じ生物に由来してもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞に存在するはずの位置と異なる染色体位置にある核酸、又は天然に存在するものと異なる核酸配列が隣接している核酸である。
【００４３】
「発現構築物」又は「発現カセット」とは、転写を誘導することができる核酸分子である。発現構築物は、最小限でも、１つ以上の所望の細胞型、組織、又は器官において遺伝子発現を誘導する１つ以上の転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの機能的に均等な構造）を含む。追加的な要素、例えば、転写終結シグナルも含まれ得る。
【００４４】
「ベクター」又は「構築物」（ときに遺伝子送達系又は遺伝子導入「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子の複合体を指す。
【００４５】
一般的なタイプのベクターである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは別の、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる染色体外ＤＮＡ分子である。場合により、プラスミドは、環状且つ二本鎖である。
【００４６】
「複製の起点」（「ｏｒｉ」）又は「複製起点」は、細胞内のプラスミド中に存在する場合、プラスミドに及び／又はＤＮＡ合成が開始される部位若しくはその近傍に連結配列を維持することができるＤＮＡ配列、例えば、リンパ球指向性ヘルペスウイルスにおけるものである。一例として、ＥＢＶのｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐ反復の２０の不完全なコピーである）、好ましくはＤＳ配列を含むが、ＥＢＮＡ−１に結合するＥＢＶの他の部位、例えば、Ｒｅｐ＊配列が複製起点としてＤＳを置換することができる（Ｋｉｒｓｈｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９９８）。従って、ＥＢＶの複製起点は、ＦＲ、ＤＳ、又はＲｅｐ＊配列、又は核酸の改変若しくはこれに由来する合成の組み合わせによる任意の機能的に均等な配列を含む。例えば、本方法は、Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に具体的に記載されているように、個々の要素の挿入又は突然変異などによる、ＥＢＶの遺伝子組換え複製起点を使用することもできる。
【００４７】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、又は「導入遺伝子」は、転写された核酸分子であり、任意選択により、適切な調節配列の制御下にある場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに翻訳もされる。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（即ち、センス鎖）又は二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子は、限定されるものではないが、原核又は真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常、遺伝子配列の３’に位置する。
【００４８】
「制御要素」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライス部位などをまとめて指し、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、転写後プロセッシング、及び翻訳をまとめて行う。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳され得る限り、これらの制御要素の全てが存在する必要はない。
【００４９】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用されるその通常の意味では、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。プロモーターは、調節タンパク質及び分子、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子が結合して核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝因子を含み得る。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するために核酸配列に対して正しい機能的な位置及び／又は向きにあることを意味する。
【００５０】
「エンハンサー」とは、プロモーターに近接して配置された場合、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターから生じる転写活性に対して転写活性を増大させる核酸配列を意味する。
【００５１】
核酸分子に関して「機能的に連結された」又は「共発現される」とは、２つ以上の核酸分子（例えば、転写されるべき核酸分子、プロモーター、及びエンハンサー要素）が、核酸分子の転写を可能にするような方法で連結されていることを意味する。ペプチド及び／又はポリペプチド分子に関して「機能的に連結された」又は「共発現される」とは、２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、即ち、融合ポリペプチドを生じるような方法で連結され、融合体の各ペプチド及び／又はポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有することを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラであり、即ち、異種分子から構成される。
【００５２】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の同一性のパーセントを指す。１つの配列と別の配列との間の一致は、当技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させて、容易に利用可能なコンピュータプログラミングを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定することができる。別法では、相同性は、相同領域間の安定な二重鎖の形成、これに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、及び消化された断片のサイズ決定を促進する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定することができる。２つのＤＮＡ配列又は２つのポリペプチド配列は、ヌクレオチド又はアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％がそれぞれ上記の方法を使用して決定される分子の定義された長さにおいて一致する場合、互いに「実質的に相同」である。
【００５３】
「細胞」という用語は、本明細書では、当技術分野のその最も広い意味で使用され、且つ多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製の能力を有し、且つ遺伝子情報及びそれを発現するための機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞又は人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【００５４】
「幹細胞」という用語は、本明細書では、適切な条件下で多様な範囲の特殊化した細胞型に分化することができ、他の適切な条件下では自己複製し、本質的に未分化多能性状態を維持することができる細胞を指す。「幹細胞」という用語は、多能性細胞、多分化能細胞、前駆（プレカーサー）細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、及び前駆（プロジェニター）細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血又は間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、又は胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連するある転写因子の発現によってそれらを多能性状態にリプログラミングすることによって体細胞から産生され得る。これらの細胞は、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」と呼ばれている。
【００５５】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期段階の胚、例えば、胚盤胞期の内部細胞塊から得られるか、又は人工的手段（例えば、核移植）によって作製される未分化多能性細胞であり、生殖細胞（例えば、精子及び卵）を含む、胚又は成体における任意の分化細胞型を生じさせることができる。
【００５６】
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書ではリプログラミング因子と呼ばれる）の組み合わせを発現させるか又は発現を誘導することにより、体細胞をリプログラミングすることによって作製される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年、又は成体の体細胞を用いて作製することができる。ある実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えば、Ｏｃｔ４（ときにＯｃｔ３／４と呼ばれる）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８を含む。一部の実施形態では、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、少なくとも４つのリプログラミング因子、又は少なくとも５つのリプログラミング因子を発現させてことによってリプログラミングされる。
【００５７】
「多能性幹細胞」とは、１つ以上の組織若しくは器官、又は好ましくは３つの胚葉：内胚葉（内側胃粘膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、若しくは外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかを構成する全ての細胞に分化する能力を有する幹細胞である。
【００５８】
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、生殖細胞、例えば、卵細胞又は精子など以外のあらゆる細胞を指し、そのＤＮＡを次世代に直接伝達しない。典型的には、体細胞は、多能性が限られているか又は多能性を有していない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在するものでもよく、又は遺伝子改変されたものでもよい。
【００５９】
「プログラミング」は、細胞が産生できる子孫のタイプを変化させるプロセスである。例えば、細胞がプログラミングなしの同じ条件下で産生できるはずの細胞型と比較して、細胞が培養又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで少なくとも１つの新しい細胞型の子孫を産生できるように変更された場合に細胞はプログラミングされたことになる。これは、プログラミング前に新しい細胞型の表現型特性を有する子孫を本質的に産生できなかったにもかかわらず、十分な増殖後に測定可能な割合のこのような子孫が観察されること；或いは、新しい細胞型の特徴を有する割合がプログラミング前よりもかなり高いことを意味する。このプロセスには、分化、脱分化、及び分化転換が含まれる。
【００６０】
「分化」は、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。「脱分化」は、部分的に又は最終的に分化した細胞が初期発生段階、例えば、多能性又は多分化能に戻る細胞プロセスである。「分化転換」は、１つの分化細胞型を別の分化細胞型に変換するプロセスである。典型的には、プログラミングによる分化転換は、細胞が中間多能性期を経ずに起こる  −  即ち、細胞は、１つの分化細胞型から別の分化細胞型に直接プログラミングされる。ある条件下では、新しい細胞型の特徴を有する子孫の割合は、より好ましくなる順に少なくとも約１％、５％、２５％、又はそれを上回り得る。
【００６１】
「フォワードプログラミング」という用語は、１つ以上の特定の系統決定遺伝子又は遺伝子産物を多分化能細胞又は多能性細胞に提供することによる、多能性を有さない分化体細胞とは対照的な多分化能細胞又は多能性細胞のプログラミングを指す。例えば、フォワードプログラミングは、ＥＳＣ又はｉＰＳＣを造血前駆細胞若しくは他の前駆細胞、又は造血細胞若しくは他の分化体細胞にプログラミングするプロセスを表し得る。
【００６２】
「造血前駆体プログラミング遺伝子」という用語は、単独で又は別のプログラミング遺伝子と組み合わせて発現されると、多能性幹細胞を、リンパ球及び骨髄系細胞を産生することができる造血前駆細胞にフォワードプログラミングすることができる遺伝子である。
【００６３】
「造血幹細胞プログラミング遺伝子」という用語は、単独で又は別のプログラミング遺伝子と組み合わせて発現されると、造血前駆体プログラミング遺伝子と一緒に長期生着可能な造血幹細胞をプログラミングすることができる遺伝子である。
【００６４】
本明細書で使用される「２Ａ配列」は、単一ベクターからの複数のタンパク質の共発現を可能にする短ペプチドを指す。これらの小ペプチドは、２つのタンパク質間のリンカーとして導入され、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを可能にする（例えば、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）；ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：６１６−６２６  （２００４）を参照されたい）。多くの２Ａ要素が当技術分野で公知である。本明細書中に開示される方法及び系において使用され得る２Ａ配列の例には、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号明細書に記載されている、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、及びブタウイルスｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１（Ｐ２Ａ）に由来する２Ａ配列が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される「対象」又は「それを必要とする対象」という用語は、細胞移植又は組織移植を必要とする任意の年齢の雄又は雌の哺乳動物、好ましくはヒトを指す。典型的には、対象は、障害若しくは病的若しくは望ましくない状況、状態、又は症候群、又は細胞若しくは組織移植による処置に適した身体的、形態学的、若しくは生理学的異常が原因で細胞移植若しくは組織移植（本明細書ではレシピエントとも呼ばれる）を必要とする。
【００６６】
「多系統構築物」は、本明細書では、ＥＴＳ遺伝子、ホメオボックス遺伝子、及び造血発生遺伝子を含む少なくとも３つの造血プログラミング遺伝子をコードする構築物を指すために使用される。１つの例示的な構築物は、ＥＴＶ２、又はＥＲＧ、ＧＡＴＡ２及びＨＯＸＡ９をコードする。
【００６７】
本明細書で使用される、造血幹細胞又は造血前駆細胞に関する「生着」という用語は、レシピエントに導入された細胞が、このレシピエントの骨髄に局在して、このレシピエントの骨髄系及びリンパ系細胞の両方の長期再構成を提供し得ることを意味する。
【００６８】
「長期生着」は、本明細書の方法によって提供された造血前駆細胞などの移植された細胞が、宿主血液及び／又は骨髄に１０週間を超えて、好ましくは２０週間を超えて持続するような、このような細胞のレシピエントへの安定した移植として本明細書で定義される。加えて、長期生着は、連続的に移植されたマウスにおける移植細胞の持続性によって特徴付けることができる。
【００６９】
ＩＩ．造血細胞プログラミングに関与する細胞
ある実施形態では、多能性幹細胞から多系統造血前駆細胞を提供するための方法及び組成物が開示される。多能性幹細胞は、限定されるものではないが、誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む幹細胞であり得る。
【００７０】
造血前駆細胞を作製するために本発明の方法に使用される多能性幹細胞は、有糸分裂細胞分裂により自己再生する能力及び広範な特殊細胞型に分化する能力によって特徴付けられる。哺乳動物幹細胞の２つの広い型は、胚盤胞に見られる胚性幹細胞、及び成体組織に見られる成体幹細胞である。発生中の胚では、幹細胞は、特殊化胚組織の全てに分化することができる。成体生物では、幹細胞及び前駆細胞は、体の修復系として機能し、特殊化細胞を補充し、また再生器官、例えば、血液、皮膚、又は腸組織の正常な代謝回転を維持する。
【００７１】
特定の態様では、本明細書で使用される多能性幹細胞は、体の全ての細胞型に分化する能力を保持しながらｉｎ  ｖｉｔｒｏでの長期増殖が可能である、本開示の造血前駆細胞を含むヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。従って、これらの細胞は、薬物の開発及び治療用途の両方のために、患者特異的な機能性造血細胞の無制限の供給を提供できる可能性がある。本開示のある態様は、造血細胞の分化／機能にとって重要なプログラミング遺伝子の組み合わせの発現によるヒトＰＳＣ、例えば、ＥＳＣ及びｉＰＳＣからのフォワードプログラミングにより、多系統造血前駆細胞を提供する。
【００７２】
Ａ．胚性幹細胞
ある態様では、多能性幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、高いｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化能を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで非増殖細胞のフィーダー層上で内部細胞塊を培養することによって単離することができる。再プレーティングされた細胞は増殖し続け、ＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができ、このコロニーを取り出し、分離し、再び再プレーティングし、且つ増殖させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスを多数回繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を産生することができる（米国特許第５，８４３，７８０号明細書；同第６，２００，８０６号明細書；同第７，０２９，９１３号明細書）。ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持しながら増殖する能力を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞及び細胞分化を制御する遺伝子に関する研究に有用である。遺伝子操作及び選択と組み合わせたＥＳ細胞の多能性は、トランスジェニックマウス、キメラマウス、及びノックアウトマウスの作製によるｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子分析研究に使用することができる。
【００７３】
マウスＥＳ細胞を作製するための方法は周知である。１つの方法では、マウスの１２９株の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を取り出し、内部細胞塊を、胎仔ウシ血清を含有する培地中の化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーをウシ胎児血清の存在下においてマウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を作製する。一部の方法では、マウスＥＳ細胞は、血清含有培地（Ｓｍｉｔｈ，２０００）にサイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加することにより、フィーダー層の非存在下で増殖させることができる。他の方法では、マウスＥＳ細胞を骨形成タンパク質及びＬＩＦの存在下において無血清培地中で増殖させることができる（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００７４】
ヒトＥＳ細胞は、既に記載された方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）により、胚細胞を作製するための精子と卵細胞の融合、核移植、病原、又はクロマチンのリプログラミング、及びその後のリプログラミングされたクロマチンの原形質膜への組み込みによって作製された接合体又は胚盤胞期の哺乳動物胚から作製されるか又はこれらに由来し得る。１つの方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解し、マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で培養された内部細胞塊から取り出す。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊を化学的に又は機械的に分離し、再プレーティングし、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、分離し、且つ再プレーティングする。一部の方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下において線維芽細胞のフィーダー層上で培養することによって血清を用いずに増殖させることができる（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下において、タンパク質マトリックス、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はラミニン上で細胞を培養することによってフィーダー細胞層なしで増殖させることができる（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００７５】
ＥＳ細胞は、既に記載された方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００；米国特許第５，８４３，７８０号明細書）によってアカゲザル及びマーモセットを含む他の生物から、及びマウス及びヒト樹立細胞株からも得ることができる。例えば、ヒト樹立ＥＳ細胞株には、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４、及びＡＣＴ３０が含まれる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞株は、マウス株１２９の胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞株を含み、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層なしでＬＩＦの存在下で増殖させることができる。
【００７６】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、又はＲＥＸ１を含むタンパク質マーカーによって検出することができる。
【００７７】
Ｂ．誘導多能性幹細胞
他の態様では、本明細書で使用される多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略される誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。多能性の誘導は、多能性に関連した転写因子の導入による体細胞のリプログラミングにより、２００６年にマウス細胞を用いて最初に達成され（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、２００７年にヒト細胞を用いて達成された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床での使用に関連した倫理的及び実際的問題の大部分を回避し、ｉＰＳＣ由来の自家移植された患者は、移植片拒絶反応を予防するために生涯にわたる免疫抑制治療を必要としないであろう。
【００７８】
生殖細胞を除いて、あらゆる細胞をｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、又は胃細胞であり得る。Ｔ細胞もリプログラミングのための体細胞の供給源として使用することができる（米国特許第８，７４１，６４８号明細書）。細胞分化の程度又は細胞が採取される動物の年齢に制限はない。未分化の前駆細胞（体性幹細胞を含む）及び最終分化成熟細胞でさえも、本明細書中に開示される方法における体細胞の供給源として使用することができる。
【００７９】
当業者に公知の方法を用いて、体細胞をリプログラミングして、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製することができる。当業者であれば、誘導多能性幹細胞を容易に作製することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号明細書、同第２０１０／０２１００１４号明細書、同第２０１２０２７６６３６号明細書；米国特許第８，０５８，０６５号明細書；米国特許第８，１２９，１８７号明細書；米国特許第８，２６８，６２０号明細書；国際公開第２００７／０６９６６６  Ａ１号パンフレット、及び米国特許第８，２６８，６２０号明細書を参照されたい。一般に、核リプログラミング因子が、体細胞から多能性幹細胞を作製するために使用される。一部の実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つ又は少なくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４が利用される。
【００８０】
これらの核リプログラミング物質のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット及び米国特許第８，１８３，０３８号明細書に記載されているＮＣＢＩアクセッション番号の参照により入手可能である。１つ以上のリプログラミング物質又はこれらのリプログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，２６８，６２０号明細書、同第８，６９１，５７４号明細書、同第８，７４１，６４８号明細書、同第８，５４６，１４０号明細書、共に参照により本明細書に組み入れられる公開された米国特許第８，９００，８７１号明細書及び米国特許第８，０７１，３６９号明細書に開示されている。
【００８１】
得られたら、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号明細書に記載されているように、多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地及び技術と共に使用することができる。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子としての白血病抑制因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して行う。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。ｉＰＳＣの培養及び維持のための他の方法は、当業者に公知であるはずであり、本方法と共に使用することができる。
【００８２】
ある実施形態では、規定されていない条件を使用することができる。例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞で、又は線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地で培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線又は抗生物質で処理したマウス胚線維芽細胞の共存下で培養する。別法では、多能性細胞を、規定されたフィーダー依存性培養系、例えば、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）又はＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて、実質的に未分化状態で培養し、維持することができる。
【００８３】
プラスミドは、制御された高コピー数を達成し、細菌中でのプラスミド不安定性の潜在的原因を回避し、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞での使用に適合したプラスミド選択のための手段を提供するなど、多くの目的を考慮して設計されている。ヒト細胞で使用するためのプラスミドの二重の要件に特に注意が払われる。第１に、プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での維持及び発酵に適しているため、大量のＤＮＡを産生させて精製することができる。第２に、プラスミドは、安全であり、ヒト患者及び動物での使用に適している。第１の要件は、細菌の発酵中に比較的容易に選択及び安定に維持できる高コピー数のプラスミドを必要とすることである。第２の要件は、要素、例えば、選択可能なマーカー及び他のコード配列に注意を払う必要があることである。一部の実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択マーカー、例えば、限定されるものではないが、カナマイシンでの抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、及び（４）様々な核酸カセットの組み込みのためのマルチクローニング部位；及び（５）チロシナーゼプロモーターに機能的に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための当技術分野で公知の多数のプラスミドベクターが存在する。これらのプラスミドベクターには、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，１０３，４７０号明細書に開示；米国特許第７，５９８，３６４号明細書；米国特許第７，９８９，４２５号明細書；及び米国特許第６，４１６，９９８号明細書に記載されているベクターが含まれる。
【００８４】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号明細書）、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、又はレンチウイルスベクターであり得る。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡベース又はＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６２９１１号明細書）。
【００８５】
Ｃ．体細胞核移植によって得られる胚性幹細胞
造血前駆細胞を作製するための多能性幹細胞は、ドナー核が紡錘体を含まない卵母細胞に移入される体細胞核移植によって調製することもできる。核移植によって作製される幹細胞は、ドナー核と遺伝子的に同一である。１つの方法では、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）の皮膚線維芽細胞からのドナー線維芽細胞核を、電気融合によって紡錘体を含まない成熟中期ＩＩアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）卵母細胞の細胞質に導入する（Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。融合した卵母細胞をイオノマイシンに暴露することにより活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を作製する。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で複数の細胞型に分化する。
【００８６】
ＩＩＩ．造血前駆（プレカーサー）細胞プログラミング因子
Ａ．造血前駆体（プレカーサー）プログラミング因子
本開示のある態様は、ＰＳＣを多系統造血前駆細胞にプログラミングするための造血前駆体プログラミング遺伝子をコードする構築物を提供する。本開示の多系統造血前駆細胞は、少なくとも３つの造血前駆体プログラミング遺伝子、例えば、ＥＴＳ遺伝子、造血発生遺伝子、及びホメオボックス遺伝子を発現するようにＰＳＣを改変することにより、多能性幹細胞から直接的に作製することができる。少なくとも３つの造血前駆体プログラミング遺伝子は、１つ以上の多系統構築物によってコードすることができる。
【００８７】
造血前駆体プログラミング遺伝子は、造血前駆細胞の増殖のための当技術分野で公知の配列に融合することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８０２９９０９５号明細書）。例示的な配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。
【００８８】
１．ＥＴＳ遺伝子
多系統構築物は、転写因子のＥ２６形質転換特異的（ＥＴＳ）ファミリー由来の少なくとも１つの遺伝子をコードする。全てのＥＴＳファミリーメンバーは、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン、即ち、中央のＧＧＡ（Ａ／Ｔ）ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ部位に結合する翼状のヘリックス−ターン−ヘリックス構造であるＥＴＳドメインによって同定される。ＤＮＡ結合機能と同様に、エビデンスが、ＥＴＳドメインもタンパク質−タンパク質相互作用に関与することを示唆している。ＥＴＳファミリーは、体中に存在し、細胞分化、細胞周期制御、細胞移動、細胞増殖、アポトーシス（プログラミング細胞死）及び血管形成の調節を含む多種多様な機能に関与する。この遺伝子ファミリーのメンバーは、異なる組織の発生及び癌の進行に関与している。
【００８９】
ＥＴＳ遺伝子は、ＥＬＦ、ＥＬＧ、ＥＲＧ、ＥＲＦ、ＥＳＥ、ＥＴＳ、ＰＤＥＦ、ＰＥＡ３、ＥＲ７１、ＳＰＩ、ＴＣＦ、及びＴＥＬを含む１２のサブファミリーに分類されるＥＴＳファミリーの任意の遺伝子であり得る。例えば、ＥＴＳは、ＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子相同体、アクセッション番号ＮＭ＿００１１３６１５４）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２；アクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０）、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組み込み１；アクセッション番号ＮＭ＿００１１６７６８１）、ＥＬＫ３（ＥＴＳドメイン含有タンパク質；アクセッション番号ＮＭ＿００１３０３５１１）、ＥＴＳ１（Ｃ−ｅｔｓ−１；アクセッション番号ＮＭ＿００１１４３８２０）、ＥＴＳ２（Ｃ−ｅｔｓ−２；アクセッション番号ＮＭ＿００１２５６２９５）、Ｅ７４様因子１（ＥＬＦ１；アクセッション番号Ｍ＿００１１４５３５３）、Ｅ７４様因子２（ＥＬＦ２；アクセッション番号ＮＭ＿００１２７６４５７）、ＥＴＳ関連転写因子（ＥＬＦ４；アクセッション番号ＮＭ＿００１１２７１９７）、Ｅｔｓ変異体３（ＥＴＶ３；アクセッション番号ＮＭ＿００１１４５３１２）、又は転写因子ＰＵ．１（ＳＰＩ１；アクセッション番号ＮＭ＿００１０８０５４７）であり得る。特に、ＥＴＳ遺伝子は、ＥＲＧと呼ばれる内皮分化因子であり得、このＥＲＧは、転写制御因子ＥＲＧ、ｅｔｓ関連形質転換タンパク質ＥＲＧ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ前立腺癌特異的、ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子様、ｖ−ｅｔｓニワトリ赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子関連、又は形質転換タンパク質ＥＲＧとしても知られている。一部の実施形態では、ＥＴＳ遺伝子は、ＥＲＧの特定のアイソフォーム、例えば、ＥＲＧアイソフォーム２（ＥＲＧ−２）（アクセッション番号ＮＭ＿００４４４９）又はＥＲＧアイソフォーム３（ＥＲＧ−３）（アクセッション番号ＮＭ＿００１１３６１５４）である。特定の実施形態では、ＥＴＳ遺伝子はＥＴＶ２である。
【００９０】
２．造血発生遺伝子
多系統構築物はまた、少なくとも１つの造血発生遺伝子をコードする。造血発生遺伝子は、造血発生を誘導する任意の遺伝子であり得る。造血発生遺伝子の非限定的な例には、ＧＦＩ１（増殖因子非依存性１転写抑制因子；アクセッション番号ＮＭ＿００１１２７２１５）、ＧＦＩ１Ｂ（成長因子非依存性１Ｂ転写抑制因子；アクセッション番号ＮＭ＿００１１３５０３１）、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ球性白血病；アクセッション番号ＮＭ＿００１２８７３４７）、ＬＹＬ１（リンパ芽球性白血病由来配列１；アクセッション番号ＮＭ＿００５５８３）、ＬＭＯ２（唯一のＬＩＭドメイン２（ｒｈｏｍｂｏｔｉｎ様１）；アクセッション番号Ｍ＿００１１４２３１５）、ＧＡＴＡ２（ＧＡＴＡ結合タンパク質２；アクセッション番号ＮＭ＿００１１４５６６１）、又はＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３；アクセッション番号ＮＭ＿００１００２２９５）が含まれる。特定の実施形態では、造血発生遺伝子はＧＡＴＡ２である。
【００９１】
３．ホメオボックス遺伝子
加えて、多系統構築物は、少なくとも１つのホメオボックス遺伝子をコードする。ホメオボックス遺伝子は、ＤＮＡに結合するタンパク質ドメインをコードする約１８０塩基対長のホメオボックスをコードする。特徴的なホメオドメインタンパク質の折り畳みは、３つのαヘリックスが短いループ領域によって連結された６０のアミノ酸のヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造からなる。Ｎ末端の２つのヘリックスは、逆平行であり、より長いＣ末端のヘリックスが、最初の２つによって確立された軸にほぼ垂直である。この第３のへリックスが、多数の水素結合及び疎水性相互作用によってＤＮＡと直接相互作用し、これらの結合及び相互作用は、ＤＮＡの主要な溝内で特定の側鎖と露出した塩基とチミンメチル基との間で起こる。多くのホメオドメインタンパク質が、個々の組織及び器官を生成するのに必要な共調節遺伝子のカスケードを開始することによって細胞分化を誘導する。
【００９２】
ホメオボックス遺伝子は、ホメオボックスドメインをコードする任意の遺伝子であり得る。例えば、ホメオボックス遺伝子は、ＨＯＸ遺伝子、例えば、ＨＯＸＡ９（アクセッション番号ＮＭ＿１５２７３９）、ＨＯＸＡ１０（アクセッション番号ＮＭ＿０１８９５１）、ＨＯＸＡ３（アクセッション番号ＮＭ＿０３０６６１）、ＨＯＸＡ４（アクセッション番号ＮＭ＿００２１４１）、ＨＯＸＡ５（アクセッション番号ＮＭ＿０１９１０２）、ＨＯＸＡ６（アクセッション番号ＮＭ＿０２４０１４）、ＨＯＸＡ７（アクセッション番号ＮＭ＿００６８９６）、ＨＯＸＢ３（アクセッション番号ＮＭ＿００２１４６）、又はＨＯＸＢ６（アクセッション番号ＮＭ＿０１８９５２）であり得る。ＨＯＸ遺伝子の他の非限定的な例には、活性依存性神経保護ホメオボックス（ＡＤＮＰ；アクセッション番号ＮＭ＿００１２８２５３１）、ホメオボックスタンパク質ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様４（ＡＬＸ４；アクセッション番号ＮＭ＿０２１９２６）、ホメオボックスタンパク質ＤＢＸ１（アクセッション番号ＮＭ＿００１０２９８６５）、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４；ＮＭ＿００１１２７３８６）、ホメオボックスタンパク質ＥＭＸ１（アクセッション番号ＮＭ＿００１０４０４０４）、ＧＢＸ２（アクセッション番号ＮＭ＿００１３０１６８７）、ＥＳ細胞１で発現されるホメオボックス（ＨＥＳＸ１；アクセッション番号ＮＭ＿００３８６５）、ＮＡＮＯＧ（アクセッション番号ＮＭ＿００１２９７６９８）、ＰＡＸ３（アクセッション番号ＮＭ＿０００４３８）、網膜及び前方神経褶ホメオボックス（ＲＡＸ；アクセッション番号ＮＭ＿０１３４３５）、又は亜鉛フィンガーＥ−ｂｏｘ結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１；アクセッション番号ＮＭ＿００１１２８１２８）が含まれる。特定の実施形態では、ホメオボックス遺伝子はＨＯＸＡ９である。
【００９３】
Ｂ．造血幹細胞プログラミング因子
本開示のある態様は、長期生着能のために造血幹細胞プログラミング因子をコードする構築物を提供する。長期生着が可能な造血幹細胞は、造血幹細胞プログラミング遺伝子、特に表１に列挙された遺伝子のレベルを細胞内で増加させることによって本開示の多系統造血前駆細胞から直接的に作製することができる。本発明者らはまた、このセクションに列挙される遺伝子の全てのアイソフォーム及び変異体が本開示に含まれ、あるアイソフォーム又は変異体のアクセッション番号の非限定的な例が示されることも企図する。
【００９４】
表１は、多系統造血前駆体を長期生着が可能な造血幹細胞にプログラミングするための遺伝子のリストを示す。本出願の出願日現在の、列挙された遺伝子ＩＤ及びアクセッション番号によって提供される遺伝子配列及び関連情報の全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【００９５】
【表１】
2018531020.tif 000002
2018531020.tif 000003
2018531020.tif 000004
【００９６】
一部の実施形態では、造血幹細胞プログラミング遺伝子は、表１に含まれる遺伝子のいずれか１つであり、表１は、造血細胞の特異化に関与する遺伝子、造血細胞の維持及び／又は増殖に関与する遺伝子、並びに造血細胞で発現される遺伝子を含む。
【００９７】
ある実施形態では、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、長期生着が可能な造血幹細胞にプログラミングするために組み合わせて使用される。一部の実施形態では、３つ以上、例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、最大２０、又はこれらから導き出せる任意の範囲の造血幹細胞プログラミング遺伝子が、長期生着が可能な造血幹細胞にプログラミングするために組み合わせて使用される。
【００９８】
造血幹細胞プログラミング遺伝子は、造血前駆細胞の増殖のために当技術分野で公知の配列に融合することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８０２９９０９５号明細書）。例示的な配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。
【００９９】
ＩＶ．造血プログラミング遺伝子の送達
ある実施形態では、プログラミング因子をコードする核酸の送達のためのベクターは、これらの因子が多能性幹細胞で発現するように構築される。このようなベクターの成分及び送達方法の詳細は以下に開示される。
【０１００】
さらなる態様では、以下の系及び方法も所望の細胞型、例えば、造血前駆細胞の同定のためのレポーター発現カセットの送達に使用することができる。特に、造血幹細胞又は造血前駆体に特異的な調節要素を用いて、レポーター遺伝子の発現を駆動することができる。従って、プログラミングから得られる造血幹細胞又は前駆体は、レポーターの使用によって特徴付けるか、選択するか、又は濃縮することができる。
【０１０１】
Ａ．核酸送達系
当業者であれば、標準的な組換え技術（例えば、共に参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい）によってベクターを構築するための十分な知識を備えているであろう。ベクターには、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、その複製可能型、複製欠損型、及び無活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）型を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが含まれる。
【０１０２】
１．ウイルスベクター
ウイルスベクターは、本開示のある態様で提供することができる。組換えウイルスベクターの作製では、非必須遺伝子は、典型的には、異種（又は非天然）タンパク質の遺伝子又はコード配列で置換される。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して核酸及び場合によりタンパク質を細胞に導入するある種の発現構築物である。受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に感染する又は細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定且つ効率的に発現させるあるウイルスの能力により、このようなあるウイルスは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移入するための魅力的な候補となる。本開示のある態様の核酸を送達するために使用することができるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【０１０３】
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝子材料を移入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングする能力により、遺伝子送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１０４】
レトロウイルスベクターを構築するために、あるウイルス配列の代わりに核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を作製する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共に、特別な細胞株に導入される場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物のウイルス粒子へのパッケージングを可能にし、これらのウイルス粒子が培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意選択により濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込み及び安定発現には宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。
【０１０５】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び同第５，９９４，１３６号明細書を参照されたい）。
【０１０６】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方の遺伝子導入及び核酸配列の発現のために使用することができる。例えば、適切な宿主細胞が、パッケージング機能、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、さらにｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターでトランスフェクトされた非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９４，１３６号明細書に記載されている。
【０１０７】
２．エピソームベクター
プラスミド又はリポソームベースの染色体外（即ち、エピソーム）ベクターの使用も本開示のある態様で提供することができる。このようなエピソームベクターは、例えば、ｏｒｉＰベースのベクター、及び／又はＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターを含み得る。これらのベクターにより、ＤＮＡの大きい断片を細胞に導入し、染色体外で維持し、細胞周期ごとに１回複製し、効率的に娘細胞に分裂させることができ、免疫応答を実質的に誘発しない。
【０１０８】
特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターの複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、ＭＨＣクラスＩ分子上でのその抗原提示に必要なプロセシングを迂回するための効率的な機構を開発したため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、トランスで作用してクローニングされた遺伝子の発現を増強し、いくつかの細胞株において最大１００倍までクローニングされた遺伝子の発現を誘導することができる（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。最後に、このようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの製造は安価である。
【０１０９】
他の染色体外ベクターには、他のリンパ指向性ヘルペスウイルスベースのベクターが含まれる。リンパ指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）で複製し、その自然のライフサイクルの一部としてプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ指向性ヘルペスウイルスには、限定されるものではないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。エピソームベースのベクターの他の供給源、例えば、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、又はＢＰＶも企図される。
【０１１０】
当業者であれば、標準的な組換え技術（例えば、共に参照により本明細書に組み入れられるＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたい）によってベクターを構築するための十分な知識を備えているであろう。
【０１１１】
ベクターはまた、遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらに調節するか、又はそうではない場合に標的細胞に有益な特性を付与する他の成分若しくは機能性も含み得る。このような他の成分には、例えば、細胞（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む）への結合又は標的化に影響を与える成分；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（例えば、核局在化を媒介する薬剤）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分を含む。
【０１１２】
このような成分はまた、マーカー、例えば、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出又は選択するために使用することができる検出可能なマーカー及び／又は選択マーカーを含み得る。このような成分は、ベクターの天然の特徴（例えば、結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有するあるウイルスベクターの使用）として提供することができ、又はベクターは、このような機能を提供するように改変することができる。様々なこのようなベクターは、当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞内に維持される場合、ベクターは、自律的構造として有糸分裂の間に細胞によって安定に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、又は宿主細胞の核若しくは細胞質に維持され得る。
【０１１３】
３．トランスポゾンベースの系
ある態様では、プログラミング因子の送達は、トランスポゾン−トランスポザーゼ系を使用することができる。例えば、トランスポゾン−トランスポザーゼ系は、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン−トランスポザーゼ系（後者の説明については、例えば、欧州特許第１５０７８６５号明細書を参照されたい）、又はＴＴＡＡ特異的トランスポゾンＰｉｇｇｙＢａｃ系であり得る。
【０１１４】
トランスポゾンは、単一細胞のゲノム内の異なる位置に移動することができるＤＮＡの配列であり、この移動は、転移と呼ばれるプロセスである。このプロセスでは、トランスポゾンは、突然変異を引き起こしてゲノム中のＤＮＡの量を変化させ得る。トランスポゾンは、ジャンプ遺伝子と呼ばれた時期もあり、可動遺伝因子の例である。
【０１１５】
様々な可動遺伝因子が存在し、これらは、その転移機構に基づいて分類することができる。クラスＩ可動遺伝因子、即ち、レトロトランスポゾンは、最初にＲＮＡに転写され、次いで逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写され、次いでゲノム内の別の位置に挿入されることによって自己複製する。クラスＩＩ可動遺伝因子は、それら自体を「カットアンドペースト」するために、トランスポザーゼを用いてゲノム内である位置から別の位置に直接移動する。
【０１１６】
特定の実施形態では、本開示で提供される構築物（例えば、多系統構築物）は、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現系を使用する。ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡトランスポゾンは、トランスポゾン自体によってコードされるトランスポザーゼ酵素（ＰＢトランスポザーゼ）がゲノム内の他の部位でトランスポゾンを切り出して再組み込みする「カットアンドペースト」機構を介して移動する。ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンに隣接するＰＢ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を特異的に認識し、これらの配列に結合し、トランスポゾンの切り出しを触媒する。次いで、ＰＢは、比較的ランダムな様式でゲノム全体にわたってＴＴＡＡ部位に組み込まれる。遺伝子トラップ突然変異の作製のために（又はトランスジェニック動物の作製に適合させるために）、トランスポザーゼは、１つのプラスミドにトランスで供給され、トランスポザーゼの結合部位（ＩＴＲ）に隣接した遺伝子トラップを含む組換えトランスポゾンであるドナートランスポゾンを含むプラスミドと同時にトランスフェクトされる。トランスポザーゼは、プラスミドからのトランスポゾンの切り出し及びその後のゲノムへの組み込みを触媒する。コード領域内での組み込みは、遺伝子トラップ発現に必要な要素を捕捉する。ＰＢは、いくつかの理想的な特性を有する：（１）遺伝子内に選択的に挿入する（挿入の５０〜６７％が遺伝子を攻撃する）、（２）局所的なホッピング（ｌｏｃａｌ  ｈｏｐｐｉｎｇ）（広範囲のゲノムカバー）を示さない、（３）高レベルのトランスポザーゼが転位を減少させるような過剰産生阻害に感受性がない、４）ドナー部位からクリーンに切り出され、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙと異なり、「フットプリント」を残さない。
【０１１７】
４．相同組換え
ある態様では、核酸分子を例えば相同組換えによりゲノム工学のために特定の様式で細胞に導入することができる。上述のように、細胞内で遺伝子を発現させるいくつかのアプローチは、ゲノム中にランダムに組み込まれるウイルスベクター又は導入遺伝子の使用を含む。しかしながら、これらのアプローチは、組み込まれた核酸からの発現を効果的に仲介することができない部位、又は天然遺伝子の破壊を引き起こす部位のいずれかで生じる組み込みの欠点を有する。ランダム組み込みに関連した問題は、標的ゲノム中の特定の遺伝子座、例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に対する相同組換えによってある程度克服することができる。
【０１１８】
相同組換え（ＨＲ）は、一般的な組換えとしても知られる、あらゆる生物で用いられる遺伝子組換えの一種であり、ヌクレオチド配列が２つの同様又は同一のＤＮＡ鎖間で交換される。この技術は、１９８０年代半ばから哺乳動物細胞におけるゲノム工学の標準的方法となっている。このプロセスには、物理的な切断及び最終的なＤＮＡの再結合のいくつかの段階が含まれる。このプロセスは、致死的になり得るＤＮＡの二本鎖の切断の修復に最も広く用いられている。加えて、相同組換えは、真核生物が精子及び卵子のような生殖細胞を産生するプロセスである減数分裂の際にＤＮＡ配列の新しい組み合わせを生み出す。これらのＤＮＡの新しい組み合わせは、集団が時と共に変化する環境条件に進化的に適応することを可能にする子孫の遺伝的ばらつきを表している。相同組換えは、遺伝子の水平伝播にも用いられて、細菌及びウイルスの異なる株間及び種間で遺伝子物質を交換する。相同組換えは、標的生物に遺伝子変化を導入するための分子生物学の技術としても用いられる。
【０１１９】
相同組換えは、標的ゲノム修飾として用いることができる。哺乳動物細胞における標準的なＨＲの効率は、処理された細胞のわずか１０のうちの６〜１０のうちの９である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９９０）。メガヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩの使用は、ＨＲの効率を増加させるために用いられてきた。天然のメガヌクレアーゼ、及び改変された標的特異性を有するエンジニアリングされたメガヌクレアーゼの両方が、ＨＲ効率を増加させるために利用されている（Ｐｉｎｇｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ，２００７；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１２０】
ＨＲの効率を上げる経路は、プログラミング可能なＤＮＡ特異的ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼをエンジニアリングすることである（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩの触媒ドメインに融合したこのようなキメラ分子の一例である（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５で考察されている）。
【０１２１】
このような特異的分子の別のクラスは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩの触媒ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４号明細書）。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所与の目的の部位での部位特異的ゲノム修飾のために設計することができる（Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。部位特異的ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ切断酵素、例えば、Ｆｏｋ  Ｉとの融合タンパク質として発現される。ＤＮＡ結合ドメインは、反復するアミノ酸の骨格である。反復のそれぞれの連結は、ＤＮＡ中で１つのヌクレオチドに結合する２つの可変アミノ酸である。例えば、Ａｓｎ−Ａｓｎはグアノシンに結合し、Ａｓｎ−Ｉｌｅはアデノシンに結合し、Ａｓｎ−Ｇｌｙはチミジンに結合し、Ｈｉｓ−Ａｓｐはシトシンに結合する。これら２つのアミノ酸は、反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）又はＲＶＤとして知られている。多数の異なるＲＶＤが存在し、これらをＴＡＬエフェクター／Ｆｏｋ１タンパク質構築物にエンジニアリングして、特定ＴＡＬＥＮを作製すことができる。次いで、部位特異的ゲノム修飾のために、組換えＴＡＬＥＮをコードするＲＮＡを精製して細胞にトランスフェクトすることができる。ＴＡＬＥＮが二本鎖ＤＮＡを切断すると、ＤＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同指向性修復（ＨＤＲ）により修飾され得る。これにより、ＤＮＡ修復中に、どんな追加的な配列が存在するかによってＤＮＡの変異誘発、欠失、付加が可能となる。
【０１２２】
Ｂ．調節要素
本開示に有用なベクターに含まれる発現カセットは、好ましくは、（５’から３’の方向に）タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列に機能的に連結された真核生物転写プロモーターを含む。
【０１２３】
１．プロモーター／エンハンサー
本明細書で提供される発現構築物は、プログラミング遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を定めるように作用する配列を含む。最もよく知られているこの例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスが欠損した一部のプロモーター、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位自体を覆う別々の要素が開始部位を固定するのに役立つ。追加的なプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含むように示されている。コード配列をプロモーターの制御下に置くために、選択されたプロモーターの「下流」（即ち、３’側）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【０１２４】
プロモーター要素間の間隔は、多くの場合に柔軟であり、それにより要素が互いに反転又は移動してもプロモーター機能が保たれる。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前にプロモーター要素間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに依存して、個々の要素が協同的又は独立に機能して転写を活性化することができるように思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と併用してもよく、併用しなくてもよい。
【０１２５】
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる、核酸配列に自然に結合したプロモーターであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列に自然に結合したエンハンサーであり得る。別法では、その自然環境において核酸配列と通常結合していないプロモーターを指す組換え又は異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを置くことによってある利益が得られる。組換え又は異種エンハンサーも、その自然環境において核酸配列と通常結合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス、若しくは原核細胞若しくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素及び／又は発現を変化させる突然変異を含むプロモーター又はエンハンサーを含み得る。例えば、組換えＤＮＡの構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物に関連した、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて作製することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び同第５，９２８，９０６号明細書を参照されたい）。さらに、非核細胞小器官、例えば、ミトコンドリア及び葉緑体などの中での配列の転写及び／又は発現を誘導する制御配列も利用できると考えられる。
【０１２６】
当然、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に誘導するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の分野の技術者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用を理解している（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９を参照されたい）。利用されるプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を誘導する適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用であり得、従って組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模製造において有利である。プロモーターは、異種性であっても内因性であってもよい。
【０１２７】
加えて、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ワールドワイドウェブ：ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／の真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）を用いて発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７、又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌性連鎖が送達複合体の一部として又は追加的な遺伝子発現構築物として提供される場合、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【０１２８】
プロモーターの非限定的な例には、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーター（Ｎｇ，１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）など；及び連結応答要素プロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、及び最小ＴＡＴＡボックスに近接した応答要素プロモーター（ｔｒｅ）が含まれる。また、ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載のヒト成長ホルモン最小プロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１）又はマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能であり、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ４５００７）を使用することも可能である。
【０１２９】
組織特異的導入遺伝子の発現は、特に、造血細胞及びプログラミングに由来する造血細胞の前駆体でのレポーター遺伝子の発現は、誘導された造血細胞及び前駆体を同定する方法として望ましいであろう。特異性及び活性の両方を高めるために、シス作用性調節要素の使用が企図される。例えば、造血細胞特異的プロモーターを使用することができる。多くのこのような造血細胞特異的プロモーター、例えば、表１に示される造血遺伝子のプロモーターが当技術分野で公知である。
【０１３０】
ある態様では、本方法は、エンハンサー配列、即ち、プロモーターの活性を増大させ、且つそれらの向きに関係なく、たとえ比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロ塩基離れている）であてもシスで作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーの機能は、エンハンサーが所与のプロモーターに密接しても機能し得るため、必ずしもこのような長い距離に限定されるものではない。
【０１３１】
多くの造血細胞プロモーター及びエンハンサー配列が同定されており、これらは、本方法に有用であり得る。例えば、米国特許第５，５５６，９５４号明細書；米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書；同第２００９０１４８４２５号明細書を参照されたい。
【０１３２】
特定の態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの活性は、生物因子又は非生物因子の有無によって誘導することができる。誘導性プロモーターは、誘導性プロモーターに機能的に連結された遺伝子の発現を生物又は特定の組織の発生のある段階でオンオフすることができるため、遺伝子工学において非常に強力なツールである。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）テトラサイクリン耐性オペロンの必須調節成分に基づいたＴｅｔ−Ｏｎ及びＴｅｔ−Ｏｆｆ誘導性遺伝子発現系を使用することができる。開始細胞で樹立されると、誘導物質ドキシサイクリン（Ｄｏｘ、テトラサイクリン誘導体）は、用量依存的に発現系を制御することができ、それによりプログラミング遺伝子の発現レベルの正確な調節が可能となる。例示的な実施形態では、誘導性プロモーターは、ｒｔＴＥＴ誘導性Ｔｉｇｈｔプロモーター（ｐＴｉｇｈｔ）である。従って、ｐＴｉｇｈｔプロモーターを用いて、ＰＳＣの造血前駆細胞へのプログラミングを可能にする十分な期間にわたって多系統プログラミング遺伝子、例えば、ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の発現を誘導することができ、後にその発現を停止させることができる。ｐＴｉｇｈｔプロモーターは、双方向プロモーターであってもよい。
【０１３３】
２．開始シグナル及び連結された発現
特定の開始シグナルは、コード配列の効率的な翻訳のために本方法で提供される発現構築物で使用することもできる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、容易にこれを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームを有する「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって高めることができる。
【０１３４】
ある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素の使用が、多重遺伝子又はポリシストロン性メッセージを生成するために用いられる。ＩＲＥＳ要素は、５□メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）及び哺乳動物メッセージ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）からのＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、それぞれをＩＲＥＳによって分離し、ポリシストロニックメッセージを生成する。ＩＲＥＳ要素により、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子を効率的に発現させて、単一プロモーター／エンハンサーを使用して単一のメッセージを転写することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９２５，５６５号明細書及び同第５，９３５，８１９号明細書を参照されたい）。
【０１３５】
加えて、ある２Ａ配列要素を用いて、本開示で提供される構築物においてプログラミング遺伝子の連結された発現又は共発現を実現することができる。例えば、切断配列を用いて、オープンリーディングフレームを連結して単一シストロンを形成することによって遺伝子を共発現させることができる。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）（Ｍｉｎｓｋａｉａ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２０１３）である。特定の実施形態では、Ｆ２Ａ切断ペプチドが、多系統構築物における遺伝子の発現を連結するために使用される。
【０１３６】
３．複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、１つ以上の複製部位の起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上述したＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又は複製が開始される特定の核酸配列である、プログラミングにおいて類似若しくは高い機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰを含み得る。別法では、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【０１３７】
４．選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカー
ある実施形態では、本開示の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含めることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に与えて発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にするはずである。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであり、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
【０１３８】
通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析であるＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーも企図される。別法では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような陰性選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者であれば、場合によりＦＡＣＳ分析と共に免疫学的マーカーを使用する方法も理解しているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できる限り、重要であるとは考えられない。選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１３９】
Ｃ．核酸の送達
本方法による造血前駆細胞にプログラミングされる多能性幹細胞への核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの導入は、本明細書に記載されるか又は当業者に公知であろう細胞の形質転換のための核酸送達用の任意の適切な方法を使用することができる。このような方法には、限定されるものではないが、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）による、微量注入（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７８９，２１５号明細書）を含む注入（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９４，６２４号明細書；同第５，９８１，２７４号明細書；同第５，９４５，１００号明細書；同第５，７８０，４４８号明細書；同第５，７３６，５２４号明細書；同第５，７０２，９３２号明細書；同第５，６５６，６１０号明細書；同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書）による；エレクトロポレーション（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２５３号明細書；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）による；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）による；ＤＥＡＥ−デキストラン及びそれに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ，１９８５）による；直接音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）による；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８）による；微粒子銃（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ国際特許国際公開第９４／０９６９９号パンフレット及び同９５／０６１２８号明細書；米国特許第５，６１０，０４２号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書、同第５，５６３，０５５号明細書、同第５，５５０，３１８号明細書、同第５，５３８，８７７号明細書、及び同第５，５３８，８８０号明細書）；炭化ケイ素繊維での撹拌（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号明細書及び同第５，４６４，７６５号明細書）による；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９１，６１６号明細書及び同第５，５６３，０５５号明細書）による；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）による、並びにこのような方法の任意の組み合わせによるＤＮＡの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用により、細胞小器官、細胞、組織、又は生物は、安定的に又は一時的に形質転換することができる。
【０１４０】
１．リポソーム媒介トランスフェクション
ある実施形態では、核酸をリポソーム媒介トランスフェクションによって多能性幹細胞に導入することができる。この方法では、核酸は、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められる。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰の水性溶液に懸濁されたときに自然に生じる。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を受け、脂質二重層間に水及び溶解溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）又はＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化された核酸も企図される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質及び使用される細胞に応じて変更することができ、例えば、１００万〜１０００万個の細胞当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが企図され得る。
【０１４１】
外来ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、非常に成功している（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、及び肝癌細胞における外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達及び発現の実現可能性も実証されている（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。
【０１４２】
ある実施形態では、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体化することができる。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソーム封入ＤＮＡの細胞への侵入が促進されることが示されている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化してもよく、又は併用してもよい（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。なおさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合体化してもよく、又は併用してもよい。他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含み得る。
【０１４３】
２．エレクトロポレーション
ある実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞小器官、細胞、組織、又は生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞とＤＮＡとの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的創傷により形質転換しやすくすることができる。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質に応じて変更することができ、例えば、１００万〜１０００万個の細胞当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが企図され得る。
【０１４４】
エレクトロポレーションを用いた真核細胞のトランスフェクションはかなり成功している。このようにして、マウスプレＢリンパ球をヒトκ−免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトし（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、ラット肝細胞をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）でトランスフェクトした。
【０１４５】
Ｖ．造血前駆細胞を作製するための方法
Ａ．多系統造血前駆細胞
本開示は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から多系統造血前駆細胞を作製するための方法を提供する。ＰＳＣ、例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣを、ＰＳＣを多系統造血前駆細胞にフォワードプログラミングする本明細書に記載される造血前駆体プログラミング遺伝子を発現するように遺伝子改変する。特に、多系統造血前駆体は、骨髄系及びリンパ系細胞へ分化する能力を有する。好ましくは、造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＥＴＳ遺伝子、造血発生遺伝子、及びホメオボックス遺伝子を含む。例示的な造血前駆体プログラミング遺伝子には、ＥＶＴ２又はＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９が含まれる。
【０１４６】
さらなる造血前駆体プログラミング遺伝子、例えば、ＨＯＸＡ１０は、フォワードプログラミング効率を高めることができる。一部の態様では、造血プログラミング遺伝子は、造血前駆細胞の増殖のために当技術分野で公知の配列に融合される（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８０２９９０９５号明細書）。例示的な配列は、ＮＵＰ９８又はそのホメオドメインである。１つの例示的方法では、造血前駆体プログラミング遺伝子には、ＥＶＴ２又はＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０が含まれる。
【０１４７】
造血前駆体プログラミング遺伝子は、１つ以上の発現構築物によってコードすることができる。好ましくは、遺伝子は、１つの発現構築物によってコードされる。従って、造血前駆体プログラミング遺伝子の発現を単一プロモーターの制御下に置くことができる。造血プログラミング遺伝子の発現は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列要素などによって機能的に連結することができる。
【０１４８】
好ましくは、３つの造血前駆体プログラミング遺伝子は、ＰＳＣを造血前駆細胞にフォワードプログラミングするのに十分な期間のみ発現される。従って、造血前駆体プログラミング遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。従って、造血前駆体プログラミング遺伝子の発現は、多系統造血前駆細胞にフォワードプログラミングするのに十分な期間にわたってＰＳＣで誘導することができる。この期間は、約１日〜約２０日、例えば、約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日とすることができる。別法では、造血前駆体プログラミング遺伝子は、エピソームベクターによってＰＳＣに導入することができる。従って、造血前駆体プログラミング遺伝子をＰＳＣで一時的に発現させることができる。
【０１４９】
次いで、多系統造血前駆細胞をさらに培養してリンパ系細胞及び骨髄系細胞を作製することができ、且つ生着可能な造血幹細胞にさらにプログラミングすることができる。
【０１５０】
Ｂ．長期生着のための造血細胞
多系統造血前駆細胞は、長期生着が可能な造血幹細胞にさらにプログラミングすることができる。好ましくは、ＰＳＣ又は造血前駆細胞は、その発現が多系統造血前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏでの安定した生着を可能にする、本明細書に記載の１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子（例えば、表１）をコードする１つ以上のさらなる発現構築物でトランスフェクトされる。１つ以上のさらなる発現構築物を多系統構築物と同時に、又はＰＳＣが未成熟造血前駆細胞にフォワードプログラミングされた後にＰＳＣに導入することができる。
【０１５１】
長期生着のための造血幹細胞プログラミング遺伝子を１つ以上の発現構築物によってコードすることができる。好ましくは、複数の遺伝子が発現構築物によってコードされる。従って、１つ以上の造血幹細胞プログラミング遺伝子（即ち、長期生着遺伝子）の発現は、単一プロモーターの制御下に置くことができる。長期生着遺伝子の発現は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列要素などによって機能的に連結することができる。
【０１５２】
ある態様では、長期生着のための造血幹細胞プログラミング遺伝子は、多系統造血前駆体で発現され、ＰＳＣでは発現されない。従って、造血幹細胞プログラミング遺伝子は、ＰＳＣで本質的にサイレンシングされるプロモーターの制御下に置くことができる。１つの例示的方法では、造血幹細胞プログラミング遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある。別法では、造血幹細胞プログラミング遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。従って、造血幹細胞プログラミング遺伝子の発現は、ＰＳＣが多系統造血前駆細胞にフォワードプログラミングされた後に誘導することができる。さらに別の代替法では、造血幹細胞プログラミング遺伝子をコードする構築物を、ＰＳＣからフォワードプログラミングされた後に未成熟造血前駆細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１５３】
Ｃ．細胞培養
多系統造血前駆細胞又は長期生着が可能な造血幹細胞は、当技術分野で公知の造血幹細胞培養の条件下で培養することができる。特に、造血前駆細胞は、特定の造血系統、例えば、骨髄系又はリンパ系細胞を得るための条件下で培養することもできる。
【０１５４】
一般に、本開示の細胞は、細胞増殖を維持することができる栄養豊富な緩衝液である培地で培養される。本明細書に記載の方法に従った、多能性幹細胞の単離、増殖、並びに造血前駆細胞及び造血細胞への分化に適した培養培地には、限定されるものではないが、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１５、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＲＰＭＩ  １６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が含まれる。最小必須培地、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ  Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びマイトジェンが添加されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含む化学的に規定された培地培地も適している。本明細書で使用される「マイトジェン」は、細胞の分裂を刺激する作用物質を指す。作用物質は、細胞分裂の開始を細胞に促し、有糸分裂を誘発する、通常、タンパク質のある種の化学物質であり得る。一実施形態では、無血清培地、例えば、米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書及び国際公開第９６／３９４８７号パンフレットに記載されている無血清培地、及び米国特許第５，４８６，３５９号明細書に記載されている「完全培地」は、本明細書に記載の方法との使用が企図される。一部の実施形態では、培養培地には、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自己血清、ヒトＡＢ血清、又はヘパリンが添加された（２Ｕ／ｍｌ）多血小板血漿が添加される。細胞培養を、例えば、５％〜１２％のＣＯ2雰囲気に維持し、培養液のｐＨを維持し、湿潤雰囲気、３７℃でインキュベートし、８５％未満のコンフルエンスに維持するように継代することができる。
【０１５５】
造血細胞に分化する多能性幹細胞及びその前駆体は、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。本開示のある態様で作製される誘導多能性幹細胞の培養は、米国特許出願公開第２００７０２３８１７０号明細書及び同第２００３０２１１６０３号明細書に記載されているように、霊長類多能性幹細胞、より具体的には、胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地及び手技を使用することができる。例えば、ヒト胚性幹細胞と同様に、誘導多能性幹細胞は、８０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ＃１１３３００３２又は＃１１３２００８２）、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、及びｂＦＧＦ（４〜１００ｎｇ／ｍＬ）（ＰＣＴ国際特許国際公開第９９／２０７４１号パンフレット）で維持することができる。別法では、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、化学的に規定された無血清培地、例えば、ｍＴｅＳＲ１で維持することができる。
【０１５６】
造血細胞及びそれらの前駆体は、細胞の造血前駆細胞へのプログラミングを促進するのに十分な造血プログラミング因子の細胞内レベルを上昇させる条件下において、多能性幹細胞又は他の非造血細胞を培地で培養することによって作製することができる。培地はまた、様々な種類の成長因子のような１つ以上の造血細胞の分化剤及び成熟化剤を含み得る。これらの作用物質は、細胞をより成熟した表現型になるように誘導するのを促進するか、又は成熟細胞の生存を選択的に促進するか、又はこれらの両方の効果の組み合わせを有するかのいずれかであり得る。造血前駆細胞及び造血細胞の分化剤及び成熟化剤は、造血細胞系統の細胞の増殖を促進することができる水溶性成長因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−受容体複合体、及び他の化合物）を含み得る。このような作用物質の非限定的な例には、限定されるものではないが、造血成長因子又は内皮成長因子、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又はこれらのアイソフォーム又は変異体が含まれる。
【０１５７】
ＶＩ．造血前駆細胞及び造血幹細胞の特性
本開示の造血前駆細胞及び造血幹細胞は、多数の表現型基準に従って特徴付けることができる。この基準には、限定されるものではないが、発現細胞マーカーの検出又は定量、機能的活性、並びに形態学的特徴及び細胞間シグナル伝達の特徴付けが含まれる。他の態様では、プログラミングされる細胞は、造血細胞の同定のための造血細胞特異的プロモーターのような、組織又は細胞特異的転写調節要素を含むレポーター遺伝子発現カセットを含み得る。
【０１５８】
本開示のある態様では具現される造血前駆細胞は、天然の造血前駆細胞の特徴的な形態学的特徴を有する。これらの特徴には、このようなものの評価が熟練者によって容易に理解され、円形非接着性細胞を産生する細胞クラスターの検出が含まれる。加えて、造血前駆細胞は、丸い形状及び低い細胞質と核の比率を有する。
【０１５９】
本開示の細胞は、それらが造血細胞系統の細胞に特徴的なあるマーカーを発現するかどうかによって特徴付けることもできる。造血幹細胞と造血細胞前駆体との区別に有用な細胞マーカーの非限定的な例には、ＣＤ４３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ；ＳＣＦの受容体）、ＣＤ７４、及びＣＤ４１ａが含まれる。例えば、骨髄系及びリンパ系に分化することができる未成熟造血前駆細胞は、ＣＤ４３及びＣＤ３４に陽性であることによって区別することができる。多能性開始細胞、例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣから分化した細胞を同定する際、多能性幹細胞又は体細胞、例えば、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ１６６、又はＣＤ１４０ｂ上に存在するあるマーカーを発現しない細胞を同定することが有用であり得る。
【０１６０】
このようなマーカーの発現レベルの評価は、他の細胞と比較して決定することができる。造血前駆細胞又は造血細胞のマーカーの陽性対照には、目的の種の成体造血細胞又は造血幹細胞、及び樹立造血細胞株が含まれる。読者は、永久細胞株又は長期造血細胞培養物が、代謝的に変化し、初代造血細胞及び造血前駆細胞のある特性を発現できない可能性があることに留意されたい。陰性対照には、別個の系統の細胞、例えば、成体線維芽細胞株、成体間葉系幹細胞、又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が含まれる。未分化幹細胞は、以下の実施例に例示されるように、上記の一部のマーカーに対して陽性であるが、造血細胞及び造血前駆細胞のあるマーカーに対して陰性である。
【０１６１】
本開示に列挙された造血特異的タンパク質及びオリゴ糖決定因子は、任意の適切な免疫学的技術  −  例えば、細胞表面マーカー用のフロー免疫細胞化学法、細胞内又は細胞表面マーカー用の免疫組織化学法（例えば、固定細胞又は組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、及び培地に分泌される細胞抽出物又は産物用の酵素結合免疫測定法  −  を用いて検出することができる。細胞による抗原の発現は、任意選択により細胞の固定後且つ任意選択により標識を増幅するために標識二次抗体又は他のコンジュゲート（例えば、ビオチン−アビジンコンジュゲート）を用いて、標準的な免疫細胞化学法又はフローサイトメトリーアッセイにおいて有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合する場合、「抗体−検出可能」であると言われる。
【０１６２】
特異的（例えば、造血前駆細胞特異的）マーカーの発現は、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析により、又は基準増幅方法での配列特異的プライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルで検出することができる（米国特許第５，８４３，７８０号明細書）。本開示に列挙される特定のマーカーの配列データは、公的データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。ｍＲＮＡレベルでの発現は、典型的な制御された実験での標準的な手順に従った細胞試料に対するアッセイの性能が、標準的な時間枠内で明確に識別可能なハイブリダイゼーション又は増幅産物をもたらす場合、本開示に記載された１つのアッセイによって「検出可能」であると言われる。特段の要求がない限り、対応するｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出可能である場合、特定のマーカーの発現が示唆される。タンパク質又はｍＲＮＡレベルで検出される特定のマーカーの発現は、そのレベルが、対照細胞、例えば、未分化多能性幹細胞、線維芽細胞、又は他の無関係な細胞型の少なくとも２倍、好ましくは１０倍又は５０倍を超える場合には陽性であると見なされる。
【０１６３】
細胞はまた、造血系統の細胞に特徴的な機能的活性を示すか否かによって特徴付けることができる。例えば、造血前駆細胞は、自己再生する能力を有し、且つ２種類以上の造血細胞を発生させることができる。特定の実施形態では、得られた造血前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞）、赤血球−巨核球系細胞（例えば、赤血球及び血小板）、及び骨髄系細胞（例えば、顆粒球及び単球など）を効率的に発生させることができる。他の実施形態では、造血幹細胞は、哺乳動物で長期生着することができる。例えば、マウスモデルにおける長期生着は、例えば、生着の６週間後、１２週間後、１８週間後、２０週間後、又は２５週間後に末梢血及び／又は骨髄におけるヒト造血細胞（例えば、ＣＤ４５+及びＨＬＡクラスＩ+である細胞）の存在によって特徴付けることができる。
【０１６４】
本方法に従ったプログラミングによって提供される造血前駆細胞及び造血幹細胞は、これらが発生させようとしている細胞の段階の多くの特徴を有し得る。特定の細胞に存在するこれらの特徴が多いほど、造血細胞系統の細胞として特徴付けることができる。これらの特徴の少なくとも２つ、３つ、５つ、７つ、又は９つを有する細胞は、これらの数が増加するほど好ましい。培養容器又は投与のための調製物中に存在し得る特定の細胞集団に関して、これらの特徴の発現における細胞間の均一性は、多くの場合に有利である。この状況において、細胞の少なくとも約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％が所望の特徴を有する集団は、このパーセンテージが増加するほど好ましい。
【０１６５】
ＶＩＩ．造血前駆細胞及び造血幹細胞の使用
本開示のある態様の方法及び組成物によって提供される造血前駆細胞及び造血幹細胞は、様々な用途に使用することができる。用途には、限定されるものではないが、少数の例を挙げると、ｉｎ  ｖｉｖｏでの造血細胞及び造血前駆体の移植又は注入；ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性化合物、発癌物質、変異原性物質、成長／調節因子、医薬化合物などのスクリーニング；血液病及び傷害の機構の解明；薬物及び／又は成長因子が作用する機構の研究；患者における癌の診断及び監視；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な製品の生産がある。
【０１６６】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本開示のプログラミング由来造血前駆細胞及び造血幹細胞を使用して、本明細書で提供される造血細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件又は操作）をスクリーニングすることができる。
【０１６７】
本開示の特定のスクリーニングの適用は、薬物研究における医薬化合物のテストに関する。読者は、一般に、標準的なテキストＩｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７及び米国特許第５，０３０，０１５号明細書を参照されたい）。ある態様では、造血系統にプログラミングされた細胞は、短期培養での造血細胞及び前駆体に対して既に行われた標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイにおいて試験細胞の役割を果たす。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、ある態様で提供される造血細胞又は前駆体を候補化合物と組み合わせること、この化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、又は代謝活性のあらゆる変化（未処理細胞又は不活性化合物で処理された細胞と比較）を決定すること、次いで、この化合物の影響と観察された変化とを関連付けることを含む。このスクリーニングは、化合物が造血細胞又は前駆体に対する薬理作用を有するように設計されているため、又は他で効果を有するように設計された化合物が造血細胞又は前駆体に対する意図しない効果を有し得るため行うことができる。２つ以上の薬物を（同時又は連続的に細胞と組み合わせることによって）組み合わせて試験して、起こり得る薬物と薬物の相互作用の効果を検出することができる。
【０１６８】
一部の適用では、化合物を造血幹細胞又は造血前駆細胞に対する毒性についてスクリーニングすることができる。
【０１６９】
Ｂ．造血細胞療法
本開示はまた、おそらく血液病又は血液疾患、又は損傷により、そのような治療を必要とする対象にある程度の機能を回復させるための、本明細書で提供される造血幹細胞及び造血前駆細胞の使用を提供する。例えば、本明細書に開示された方法によって誘導される造血細胞及び造血前駆細胞を使用して、血液病及び障害、例えば、異常ヘモグロビン症、貧血などを処置することができる。加えて、造血幹細胞及びそれらの前駆体は、血液又は血液細胞（例えば、赤血球、血小板、及び好中性顆粒球など）を、それを必要とする対象（例えば、輸血を必要とする対象又は血液疾患を有する対象）に供給するのに有用であり得る。このような細胞は、細胞抑制療法、例えば、化学療法によって引き起こされる造血細胞欠損の処置に有用であり得る。
【０１７０】
治療への適用に対する、本明細書で提供される造血幹細胞及び前駆体の適合性を決定する際、細胞を最初に適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルにおいて、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで生存してその表現型を維持する能力について細胞を評価する。本明細書で提供されるプログラミングされた細胞を、免疫不全動物（例えば、ＮＯＧマウス、又は化学的に若しくは照射により免疫不全にされた動物）のさらなる観察に適した部位、例えば、腎臓被膜の下、脾臓の中、肝小葉の中、又は骨髄の中に投与する。数日から数週間以上経過してから組織を採取し、開始細胞型、例えば、多能性幹細胞が依然として存在するか否かについて評価する。これは、投与される細胞に検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質、又はβ−ガラクトシダーゼ）を供給することにより、又は投与されるヒト細胞に特異的な構成的マーカーを測定することにより行うことができる。本明細書で提供されるプログラミングされた細胞がげっ歯類モデルで試験される場合、投与される細胞の存在及び表現型を、ヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学法若しくはＥＬＩＳＡにより、又は増幅がヒトポリヌクレオチド配列に特異的であるようにするプライマー及びハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ−ＰＣＲ分析により評価することができる。ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで遺伝子発現を評価するための適切なマーカーは、本開示の別の箇所に示される。
【０１７１】
本開示の方法によって提供される造血幹細胞及び造血前駆体は、血液疾患及び外傷を処置するそれらの能力について種々の動物モデルで試験することができる。例えば、鎌状赤血球貧血マウスモデル又はＴ／Ｂ細胞欠損Ｒａｇ−２ノックアウトマウスは、本明細書に開示される造血細胞及び造血前駆体の試験に特に有用な動物モデルであり得る。
【０１７２】
動物モデルにおいて望ましい機能的特徴又は有効性を実証する本開示のある態様で提供される造血幹細胞及び造血前駆細胞は、それを必要とするヒト対象への直接投与にも適し得る。止血の目的で、循環への適切なアクセスを有する任意の部位に細胞を投与することができる。造血細胞又はその前駆体はまた、傷害又は疾患の部位で送達することもできる。
【０１７３】
本明細書で提供される細胞は、それを必要とするあらゆる対象の処置に使用することができる。このような処置に適し得るヒトの状態には、種々の貧血及び異常ヘモグロビン症、並びに造血細胞数の減少によって特徴付けられる疾患（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、無顆粒球症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、及び後天性免疫不全症候群）が含まれる。ヒト治療に関して、用量は、一般に、約１０9〜１０12の細胞、典型的には約５×１０9〜５×１０10の細胞であり、対象の体重、苦痛の性質及び重症度、並びに投与される細胞の複製能力に合わせて調整される。処置の方法及び適切な用量を決定する最終的な責任は、管理する臨床医にある。
【０１７４】
Ｃ．商業目的、治療目的、及び研究目的での分配
製造目的、分配目的、及び使用の目的で、本開示の造血前駆細胞及び造血幹細胞が、典型的には、等張性賦形剤又は培地中の細胞培養物又は懸濁物の形態で供給され、任意選択により輸送又は貯蔵を容易にするために凍結される。
【０１７５】
本開示はまた、製造、流通、又は使用中の任意の時点で存在する細胞のセット又は組み合わせを含む異なる試薬系も包含する。細胞のセットは、未分化幹細胞、体細胞由来造血細胞、又は他の分化細胞型と組み合わせられる、例としてはプログラミング由来細胞（造血系列細胞、それらの前駆体及びサブタイプ）であるがこれに限定されない、本開示で説明される２つ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット内の細胞集団は、ときに同じゲノム又はその遺伝的に改変された形態を共有する。セット内の各細胞型は、同一事業体又は取引関係を共有する異なる事業体の管理下において、同じ又は異なる時期に同一の施設内で又は異なる場所でまとめて包装してもよく、別々の容器に入れてもよい。
【実施例】
【０１７６】
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために包含される。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を代表しており、このため、本発明の実践において好ましい方法を構成すると見なすことができることを当業者は理解するであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示から考えて、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に対する多くの変更形態が可能であり、それでもなお同様又は類似の結果が得られることを理解するであろう。
【０１７７】
実施例１  −  ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の連結された発現がヒトＰＳＣを未成熟ＣＤ３４+造血前駆細胞に効率的にプログラミングする
本研究は、骨髄系及びリンパ系分化能を含む多系統分化能を有する造血前駆体を作製するために行った。プログラミング遺伝子の多重構造を、多系統分化能を達成するためのプログラミング効率について試験した（表２）。導入遺伝子のコード領域をｒｔＴＥＴ誘導性Ｔｉｇｈｔプロモーター（ｐＴｉｇｈｔ）の制御下でＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターにクローンニングした。ＥＴＶ２／ＥＲＧ及びＧＡＴＡ２（Ｅ＋Ｇ）をそれぞれ、ブラストサイジン耐性及びジェネティシン耐性を有する別々の発現ベクターにクローニングした。ブラストサイジンとジェネティシンの組み合わせ選択を用いて、トランスフェクト細胞におけるＥＴＶ２／ＥＲＧとＧＡＴＡ２の共発現を達成した。別法では、トランスフェクトされた細胞におけるバランスのとれた均一な発現のために、ＥＴＶ２／ＥＲＧ及びＧＡＴＡ２（ＥＧ）を、１つのｐＴｉｇｈｔ制御発現カセットにおいてＦ２Ａ切断ペプチドを介して連結した。ＥＴＶ２／ＥＲＧとＧＡＴＡ２（ＥＧ）の連結された共発現により、プログラミング効率が有意に改善され、ＥＴＶ２／ＥＲＧとＧＡＴＡ２（Ｅ＋Ｇ）が別々のベクターで発現されたときに見られる中間内皮細胞段階を迂回するようであることが分かった（図１）。
【０１７８】
【表２】
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【０１７９】
次に、ＨＯＸＡ９が骨髄系及びリンパ系分化能を含む多系統分化能を有する造血前駆体を作製するプログラミング効率を改善できるか否かを決定するために、両方向性Ｔｉｇｈｔプロモーター（ｂｉ‐ｐＴｉｇｈｔ）を用いてＨＯＸＡ９をＥＧ発現カセット（ＥＧＨ）に連結した。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性遺伝子発現のためにｒｔＴＥＴタンパク質を構成的に発現するようにエンジニアリングされたヒトＰＳＣを用いて、Ｅ＋Ｇ、ＥＧ、及びＥＧＨ誘導性遺伝子構成を試験した。ＰｉｇｇｙＢａｃ導入遺伝子ベクターをｈＰＢａｓｅ発現ベクターと共に、エレクトロポレーションを用いてｒｔＴＥＴを発現するヒトＰＳＣに導入した。安定したＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン組み込みを有する細胞を、１００μｇ／ｍｌのブラストサイジン及び／又はジェネティシンを用いて培養物中で選択した。導入遺伝子誘導性造血プログラミングでは、トランスフェクトされたＰＳＣを、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて約５〜１０分間解離させ、ＰＳＣ培地（例えば、ＴｅＳＲ又はＥ８（登録商標））に再懸濁し、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤ブレビスタチンが添加されたＰＳＣ培地中のマトリゲル被覆６ウェルプレートに５〜１０×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、ＰＳＣ培地を、０．２５μｇ／ｍｌのドキシサイクリンが添加された３ｍｌ／ウェルの誘導培地（表３）と交換して、導入遺伝子発現及び造血誘導を開始した。誘導培地を２日目ごとに交換し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞解離溶液を用いて誘導の８日目に培養物を回収した。
【０１８０】
【表３】
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【０１８１】
回収された細胞をカウントし、ＣＤ３４+ＣＤ４３-内皮細胞、全ＣＤ４３+造血細胞、及びＣＤ４３+ＣＤ３４+未成熟造血前駆細胞を測定するためにフローサイトメトリーによって分析した。ドットプロット及び画像から、ＥＴＶ２及びＥＲＧベースの遺伝子構成の両方において、別々のＥ＋Ｇ遺伝子での誘導により、ＣＤ３４+ＣＤ４３-内皮細胞とＣＤ４３+造血細胞との混合集団が生じ、一方、連結されたＥＧ遺伝子では、ヒトＰＳＣをＣＤ４３+造血細胞集団に効率的に（＞８０％）プログラミングしたことが実証された。さらに重要なことに、未成熟ＣＤ４３+ＣＤ３４+前駆細胞の割合は、Ｅ＋Ｇ及びＥＧ誘導培養物で同様であり（全ＣＤ４３+細胞の３０〜４０％）、造血細胞で同様の分化比率を示唆したが、ＥＴＶ２／ＥＲＧ−ＧＡＴ２−ＨＯＸＡ９（ＥＧＨ）遺伝子構成は、ＣＤ４３+細胞の９０％超でのＣＤ３４+発現によって示されているように造血前駆細胞の未成熟集団を効率的に誘導し、維持した（図１Ｂ）。８日間のＤＯＸ誘導培養における絶対細胞数により、ＥＴＶ２及びＥＲＧベースの遺伝子構成の両方において、誘導ＣＤ４３+造血細胞の総数が誘導遺伝子（ＥＧ）の連結によって有意に（例えば、５倍超）増加する一方、２倍を超える数の未成熟ＣＤ３４+ＣＤ４３+前駆細胞がＨＯＸＡ９含有ＥＧＨ遺伝子構成により特異的に誘導されたことが実証された（図１Ｃ）。
【０１８２】
ＥＧ及びＥＧＨ誘導造血細胞の機能的特性を調べるために、８日間のＤＯＸ誘導細胞の増殖及び分化能をＭＳ５間質細胞との共培養で試験した。誘導細胞を、４ｍｌ／ウェル共培養培地中のマイトマイシンＣ処理ＭＳ５細胞単層を含む６ウェルプレートに１０4細胞／ウェルでプレーティングした（表４）。培養は、３日ごとに半数の培地を交換して２週間維持した。非接着細胞を収集し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶでの１５分間及びＡｃｃｕｔａｓｅでの１５分間の連続処理により細胞単層を解離させた。非接着細胞の割合と解離性接着細胞の割合とを組み合わせて、絶対細胞数、フローサイトメトリーによる総ＣＤ４３+及び未成熟ＣＤ３４+ＣＤ４３+造血細胞の割合、及びＭｅｔｈｏＣｕｌｔアッセイ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるコロニー形成細胞の分析に使用した。殆どが小さい浮遊細胞クラスターに起因する非常に限定された増殖を示すＥＧ誘導細胞とは対照的に、ＥＧＨ誘導細胞は、非常に原始的な造血前駆細胞の周知の特徴である顕著且つ広範な丸石様増殖領域を有するロバストな増殖を実証した（図１Ｄ）。総ＣＤ４３+及び未成熟ＣＤ４３＋ＣＤ３４+細胞の絶対数により、増殖されたＥＧ誘導細胞における、総ＣＤ４３+細胞のわずか約５倍の増加及び未成熟ＣＤ３４+ＣＤ４３+細胞の欠如が実証された。対照的に、ＥＧＨ誘導細胞では、総ＣＤ４３+造血細胞は３０倍を超えて増加し、ＣＤ４３+ＣＤ３４+未成熟細胞は約５倍増加した（図１Ｅ）。コロニー形成能は、ＥＧ誘導細胞において激減し、少数の骨髄系コロニーのみが検出されたが、ＭＳ５間質細胞との２週間の共培養後にＥＧＨ誘導細胞において多系統コロニー形成能が検出された（図１Ｆ）。
【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
実施例２  −  未成熟造血前駆細胞の多系統分化能の向上
さらなる遺伝子を、ＰＳＣの未成熟造血前駆細胞へのフォワードプログラミング効率を改善するためにスクリーニングした。未成熟ＣＤ４３+ＣＤ３４+及びＣＤ４３+ＣＤ３４+ＣＤ１３３+細胞の作製の改善のための、ＥＴＶ２／ＥＲＧ−ＧＡＴＡ２−ＨＯＸＡ９（ＥＧＨ）に相補的であり得るさらなる遺伝子を検出するためにスクリーニングモデルを考案した。
【０１８５】
ｐＣＭＶは、未分化ヒトＰＳＣでは本質的に抑制され、分化細胞、例えば、ＨＰＣでは活性発現を有することが示されているため、ＣＭＶプロモーターのこの特徴を、誘導ＣＤ４３+細胞における導入後の遺伝子発現に使用できるか否かを明らかにするために試験を行った。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ及びｐＴｉｇｈｔ−ＥＧ構築物を、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターを用いてｒｔＴＥＴを発現するヒトＰＳＣに導入した。ＣＤ４３+細胞でのＥＧＦＰの発現をＤＯＸ誘導造血プログラミング後に監視した。未分化／非誘導ｉＰＳＣにおいて、ＤＯＸ導入の８日目までに、誘導ＣＤ４３+細胞を含む細胞の約２０％で低ＥＧＦＰ発現が検出された。対照的に、さらに４日後（例えば、１２日目）に高ＥＧＦＰ発現が誘導ＣＤ４３+細胞の５０％超で検出された（図２）。従って、ｐＣＭＶプロモーターは、さらなる遺伝子の誘導後導入遺伝子発現に使用することができる。
【０１８６】
さらなる遺伝子をスクリーニングするために、ｒｔＴＥＴを発現するＰＳＣをＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクター中のｐＴｉｇｈｔ−ＥＧＨ（ブラストサイジン抵抗）及び１つの追加的なｐＴｉｇｈｔ−又はｐＣＭＶ−試験遺伝子（ジェネティシン抵抗）でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞におけるＥＧＨとテスト遺伝子の共発現は、ブラストサイジン＋ジェネティシンの組み合わせ選択によって達成した。ＥＧＨ及び試験遺伝子でトランスフェクトしたヒトＰＳＣをＤＯＸにより８日間誘導してＣＤ４３+細胞を作製し、次いで２回連続の２週間のＭＳ５共培養でさらに増殖させた（図３Ｂ）。各試験遺伝子について、増殖培養を通じた合計及び原始造血細胞集団の産生を計算し、内部ＥＧＨ対照の割合として表した。ＥＧＨ誘導原始前駆細胞の増殖に対するプラス効果を実証する遺伝子のスクリーニング結果を図３Ｃに示す。８日後に導入遺伝子発現を可能にするサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるＨＯＸＡ１０をＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９に加えると、ＭＳ−５間質フィーダー細胞における２週間の増殖培養中の誘導細胞の増殖、及びＣＤ４３＋ＣＤ３４+ＣＤ１３３+細胞の作製が大幅に改善されることがわかった（図３Ａ）。
【０１８７】
次に、ＥＧＨ誘導細胞からのリンパ系細胞の発生を改善する遺伝子を検出するためにスクリーニングモデルを考案した（図４Ａ）。Ｔ／ＮＫ細胞では、ＥＧＨ及び試験遺伝子の組み合わせでトランスフェクトした８日目の誘導細胞を、Ｔ／ＮＫ分化培地（例えば、アスコルビン酸、リン酸マグネシウム（９５μＭ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１／１００；Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１／１００；Ｇｉｂｃｏ）、並びにサイトカイン−ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７（各５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））において５×１０3細胞／ｃｍ2でＤＬＬ４−Ｆｃ／レトロネクチン被覆プレート（各０．５μｇ／ｃｍ２）にプレーティングした。培養は、低酸素（例えば、５％Ｏ2）条件に維持し、培地の半量を２日又は３日毎に交換した。２週間後、細胞を新鮮なＤＬＬ４−Ｆｃ／レトロネクチン被覆プレートに移してさらに２週間培養した。４週間後に回収した細胞をＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞及びＣＤ３-ＣＤ８+ＮＫ細胞についてフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ細胞では、ＥＧＨで及び試験遺伝子の組み合わせでトランスフェクトした８日目の誘導細胞をＢ細胞分化培地中において１０3細胞／ｃｍ2でマイトマイシンＣ処理ＭＳ５単分子層にプレーティングした（このＢ細胞分化培地は、例えば、ＦＢＳ（１０％、ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１／１００、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１／１００；Ｇｉｂｃｏ）、モノチオグリセロール（１００□Ｍ）、及びサイトカイン−ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ３（１０ｎｇ／ｍｌ、細胞プレーティングでのみ添加）を添加したＩＭＤＭ；又は例えばＦＢＳ（１０％、ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１／１００、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１／１００；Ｇｉｂｃｏ）、アスコルビン酸（９５μＭ）、並びにサイトカイン−ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌ（各５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ７（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｂ細胞培養の最初の２週間のみ添加）、及びＩＬ３（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｂ細胞培養の最初の週のみ添加）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２である）。培養は４週間維持し、培地の半量を２日又は３日毎に交換した。新鮮な培地を供給する毎に、浮遊する非接着細胞を懸濁して培地と共に除去した。４週間後に回収した細胞をＣＤ４５+ＣＤ１９+Ｂ細胞についてフローサイトメトリーによって分析した。ＥＧＨ、ｐＣＭＶ−ＮＡ９ＨＤ（ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９ホメオドメイン融合タンパク質）、及びｐＣＭＶ−ＮＡ１０（ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ１０融合タンパク質）遺伝子の組み合わせがＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞への効率的な分化を可能にすることが分かった（図４Ｂ）。
【０１８８】
実施例３  −  造血幹細胞プログラミング遺伝子は長期生着能を付与する
造血細胞の長期生着を可能にする、ＥＧＨ発現ベクターと組み合わせることができる造血幹細胞プログラミング遺伝子を検出するためにスクリーニングモデルを考案した。ＥＧＨ及び様々な試験遺伝子（例えば、組み合わせ当たり最大２０遺伝子）の組み合わせでトランスフェクトしたＣＤ３４+細胞を磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって８日目のＤＯＸ導入培養物から精製した（図５Ａ）。誘導注射の直後、４×１０6のＣＤ３４+細胞をＨＳＣ培地（例えば、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＴＰＯ（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ）中において１０6細胞／ｍｌで回復培養物（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）にプレーティングし、１８〜２４時間後に回収し、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｇ-／ｃ−ｋｉｔW41（ＮＢＳＧＷ）マウスに静脈内注射した。次いで、注射したマウスを、ＤＯＸ含有食餌（即ち、６２５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を入れたケージ内で飼育し、７日間、ｉｎ  ｖｉｖｏでの連続的な導入遺伝子の発現のためにＤＯＸ供給量を与えた。ＨＳＣ培養適応細胞の注射のために、０．５×１０6のＣＤ３４+細胞をＨＳＣ培地中のＤＬＬ４−Ｆｃ／レトロネクチン被覆プレートに０．２×１０6細胞／ｍｌでプレーティングし、低酸素（例えば、５％Ｏ2）条件下において、４日目に培地の半量を交換して７日間培養した。培養後、回収した細胞を、８日目のＣＤ３４+細胞を事前に注射した同じマウスに注射し、ＤＯＸ含有食餌を７日間与えた。注射後、マウスを、ＤＯＸを含まない通常の食餌に替え、６週目、１２週目、及び１８週目に末梢血中のヒト造血細胞、２０〜２４週目に骨髄中のヒト造血細胞（即ち、ＣＤ４５+ＨＬＡクラス１+）の存在について試験した。
【０１８９】
ヒト造血ＣＤ４５+細胞は、注射の１２週間後にＮＢＳＧＷマウスの末梢血及び骨髄で検出された（図５Ｂ）。ヒトＣＤ４５+細胞は、ＥＧＨ誘導細胞を注射したマウスでは検出されなかったが、ＥＧＨと追加的な１０のプログラミング遺伝子（表１）との組み合わせでは、末梢血及び骨髄中に検出可能なヒトＣＤ４５+細胞が生じた。注射の１２週間後、ＮＢＳＧＷマウスのマウス骨髄及び末梢血中のＣＤ４３／４５+細胞を検出するためにさらなる分析を行った。これらのＣＤ４３／４５+細胞は、ＥＧＨ誘導細胞を注射したマウスでは検出されなかったが、ＥＧＨと追加的なプログラミング遺伝子との組み合わせでは、マウス骨髄中に４．６４％のＣＤ４３／４５+細胞が生じた（図５Ｃ）。
【０１９０】
次に、Ｈ１−Ａ１６−ＴＥＴ  ＥＳＣを造血誘導ＥＧＨ遺伝子（ブラストサイジン選択ベクター）及びＨＳＣプログラミングのための試験遺伝子の様々な組み合わせ（Ｇ４１８選択ベクター）で同時トランスフェクトした。トランスフェクトＥＳＣをブラストサイジン及びＧ４１８の存在下で２代継代培養して、二重トランスフェクタント（ＥＧＨ＋試験遺伝子の組み合わせ）を選択し、次いで、図５Ａに示されているように、ＣＤ３４+細胞を誘導して、ＮＳＧＷマウスでの生着について試験した。生着したマウス骨髄試料におけるそれぞれ試験された導入遺伝子の発現を、ＥＧＨ特異的プライマーによって検出された全トランスジェニック細胞集団に対して正規化された導入遺伝子特異的ｑＰＣＲによって分析した。この発現を、注射したＣＤ３４+細胞における最初の導入遺伝子の発現と比較した。それぞれの生着／注射発現比は、細胞移植後の導入遺伝子の増加（正の値）又は減少（負の値）を示す（図６）。
【０１９１】
予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングで選択された４０の候補ＨＳＣプログラミング遺伝子を３つの独立した移植実験（ｐＣＭＶ発現ベクターを使用）で試験した。合計２０のヒト導入遺伝子が、細胞の注射から１２週間を超えてから移植マウスの骨髄で検出された。図６に示されているように、骨髄におけるいくつかの導入遺伝子の発現レベルは、注射されたＣＤ３４+細胞と比較して有意に高いか又は低く、移植可能な細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ選択を示した。しかしながら、発現レベルにかかわらず、検出された全てのヒト遺伝子は、生着可能な造血幹細胞／前駆細胞の公知の特徴である、骨髄環境におけるＰＳＣ由来ＣＤ３４+細胞の移動、生存、及び持続に寄与し得る。
【０１９２】
従って、ＮＢＳＧＷマウスにおける組み合わせスクリーニング戦略（ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を用いて、骨髄及び末梢血におけるヒトＰＳＣ由来細胞の長期生着を実現する造血幹細胞プログラミング遺伝子を同定した。
【０１９３】
本明細書で開示され、特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに構築し、実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、変形形態を本明細書に記載の方法及び方法の工程又は一連の工程に適用できることは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的且つ生理学的に関連するある薬剤を本明細書に記載の薬剤の代用とすることができ、同じ又は類似の結果が達成されるはずであることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の代用物及び変更形態は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載の事項を補足する例示的な手順又はその他の詳細を提供する範囲で参照により本明細書に明確に組み入れられる。
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欧州特許第０４１２７００号明細書
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米国特許第６，０１３，５１６号明細書
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米国特許出願公開第２００２／０１０２２６５号明細書
米国特許出願公開第２００３／００４００３８号明細書
米国特許出願公開第２００３／００８２５６１号明細書
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米国特許出願公開第２００７／０１１６６９０号明細書
米国特許出願公開第２００７／０２３８１７０号明細書
米国特許出願公開第２００８／０２６０７０６号明細書
米国特許出願公開第２００９／０１４８４２５号明細書
米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書
米国特許出願第６１／０５８，８５８号明細書
米国特許出願第６１／１７２，０７９号明細書
米国特許出願第６１／１８４，５４６号明細書
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５０９２−５０９６，１９８８．
Ａｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌ．，２９：６７８−８３，１９９８．
Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．，２２７：２７１−２７８，２０００．
Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  （Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，２０７−２４６，１９８７．
Ａｓｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２６）：１７１０７−１２，２００２．
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９６．
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４．
Ｂａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１４．
Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７．
Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１０２８−１０３４，２００１．
Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２２（６）：９４７−５６，２００５．
Ｂｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３９６０−３９６３，１９８８．
Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６９）：４９７−５０２，２００７．
Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６２９７）：１０９，１９９０．
Ｃａｓｓｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１（９）：１２６４−１２７３，１９９６．
Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９（１７）：７８７９，２０１１．
Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３（５）：６４３−５５，２００３．
Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７．
Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔ．，７０（１−２）：３１−３７，２００２．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８６（２）：７５７−７６１，２０１０．
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ．ａｌ．（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００７．
Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１０４４４−１０４５０，１９９４．
Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１８１８８，１９９６．
Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：８４−８７，１９９８．
Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３（４）：４５９−４７０，２０１３．
Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３（１８）：５９７８−５９９０，２００５．
Ｅｌａｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３３０：９５８−９６６，２００５．
Ｅｌｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：４３７２，２０１４．
Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ，８８：２２３−２３４，１９９７．
Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８．
Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，１０５４−１０８７，１９９７．
Ｆａｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６６４−６６８，１９９４．
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７．
Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９．
Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ，５５（６）：１１８９−１１９３，１９８８．
Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，８７−１０４，１９９１．
Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５．
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３．
Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｂｌｏｏｄ，８４（１２）：４１６４４１７３，１９９４．
Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：４０３３−４０３９，１９９１．
Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１（３）：１０９４−１０９９，１９８５．
Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４（８）：９３６−９４３，１９９６．
Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１（２）：４７４−７，２００１．
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７．
Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（２）：２９５−３１２，１９９７．
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２３８（１）：２６５−２７２，１９９８．
Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，８：４１５−４１８，１９９０．
Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９．
Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，３６：３７１−３７９，１９８９．
Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１．
Ｋｉｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，３４：１３０４−１０，２００３．
Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６）：４６５７−４６６６，１９９８．
Ｋｉｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１．
Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，１９８７．
Ｋｙｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０９（１）：２９−３７，２００２．
Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（７）：６１８１−６１８５，１９９８．
Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）：１２６１６−１２６２１，１９９７．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９（１４）：６３１５−６３２５，２０１１．
Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：９９−１０３，２０００．
Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８２（１２）：５６９３−７０２，２００８．
Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１．
Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３（５）：６９７−７０５，１９９９．
Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８．
Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｅｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：１７３３−１７３９，１９９１．
Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３．
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５．
Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１５（３）：２１６−２２１，１９９２．
Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９（２）：１４３−１４８，２０１１．
Ｍｉｎｓｋａｉａ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２９１７３０，２０１３．
Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９．
Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６．
Ｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：６０１−６１５，１９８９．
Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７．
Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，５４：１１６５，２０１０．
Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２−２４８，１９７５．
国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４号明細書
ＰＣＴ国際特許国際公開第０３／０４２４０５号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第０３／０５９９４０号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第０３／０５９９４１号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第９４／０９６９９号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第９５／０６１２８号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第９６／３９４８７号パンフレット
ＰＣＴ国際特許国際公開第９９／２０７４１号パンフレット
Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８．
Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１３．
Ｐｉｍａｎｄａ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｇｅｎｓ，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，５４：１２０１，２０１０．
Ｐｉｎｇｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（７）：７４３−７４４，２００７．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（２）：１６９−１７７，１９８５．
Ｐｏｔｔｅｎ，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ  Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５３：８２１−３０，１９９８．
Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４．
Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５３９−９５４５，１９８９．
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：３９９(４０４，２０００．
Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：２６３−２７２，１９８４．
Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５７（３）：５４９−５６４，２０１４．
Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０．
Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６（１１）：１２５３−７，２０００．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３rd  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（７）７：１９−１７．２９，１９８９．
Ｓａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１１（７５０９）：３１２−３１８，２０１４．
Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３３）：１４６６−７，１９９９．
Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２，１９９９．
Ｓｅａｂｏｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５９：１９１−２０３．２００２．
Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１（１）：１１−２７，２０１１．
Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ：Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０００．
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０１３．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３−７６，２００７．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２，２００７．
Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０（３）：１２９１−８，２００３．
Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  （Ｅｄ．），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１４９−１８８，１９８６．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５，１９９８．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：５３(５７，２０００．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８，１９９５．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５，１９９８．
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６．
Ｖｏｄｙａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０８：２０９５，２００６．
Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７：６６５，２００２．．
Ｗａｔｔ，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５３：８３１，１９９７．
Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６（５）：ｅ１９７２２，２０１１．
Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２４）：１３００３−８，２０００．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１３：５４５６，２００９．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３０：３８５３，２０１０．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９．
Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７．
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：９７１−９７４，２００１．
Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４１４４−４１４８，１９９０．
Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２８１−２９２，２００３．
Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｅ．Ａｍ．，８０（１２）：１７４５−１７５７，１９９８．
Ｙｕ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２２（１５）：１９８７−９７，２００８．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２８）：７９７−８０１，２００９．
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９（２）：１４９−１５３，２０１１．
Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（９）：８７１−８７５，１９９７．
【図１Ａ】
2018531020.tif 000008
【図１Ｂ】
2018531020.tif 000009
【図１Ｃ】
2018531020.tif 000010
【図１Ｄ】
2018531020.tif 000011
【図１Ｅ】
2018531020.tif 000012
【図１Ｆ】
2018531020.tif 000013
【図２】
2018531020.tif 000014
【図３Ａ】
2018531020.tif 000015
【図３Ｂ】
2018531020.tif 000016
【図３Ｃ】
2018531020.tif 000017
【図４Ａ】
2018531020.tif 000018
【図４Ｂ】
2018531020.tif 000019
【図５Ａ】
2018531020.tif 000020
【図５Ｂ】
2018531020.tif 000021
【図５Ｃ】
2018531020.tif 000022
【図６】
2018531020.tif 000023
【国際調査報告】
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