(57)【要約】  固体支持体上に親和性捕捉プローブを用いて試料から特異的核酸を捕捉及び精製するための、並びに鎖置換ポリメラーゼを用いて前記核酸を複製するための方法及びキットであって、それにより、捕捉プローブによって結合されるものとは異なる標的核酸のそれぞれにおける配列と相補的な第2のプライマーはまた、核酸標的に結合し、各標的上のプライマーの1つの伸長は、固体支持体からの、コピーされた核酸鎖の分離を生じる、方法及びキット。ユニバーサル核酸配列のそれらの複製時の組み込みは、アーチファクトの最小限の精製を有する複数の核酸標的配列の同時かつ高度に特異的な増幅を可能にする。【選択図】図1
2018512136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から少なくとも1つの標的核酸(1)を精製及び複製する方法であって、以下:
(a)前記試料を、5'テールを有するリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)と接触させ、インキュベートして、標的核酸(1)上の配列(17)にハイブリダイズするリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)をアニールさせるステップ;
(b)前記試料を、リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)と接触させ、インキュベートして、標的核酸(1)上の配列(18)にハイブリダイズするリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)をアニールさせ、標的核酸(1)に結合した、リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)の複合体を形成させるステップ;
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)上のリガンドを固体支持体(4)に結合させることによって固体支持体(4)上に複合体を結合させ、過剰なリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)、並びに複合体以外の試料成分を洗い流すステップ;
5'テールを有するリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)を標的核酸(1)上で伸長させて、鎖(5)を形成させ、標的核酸(1)上のリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)を核酸鎖置換ポリメラーゼで伸長させるステップであって、リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)の伸長が、標的核酸(1)から、伸長されたリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)を分離させ、標的核酸(1)のコピーであり、固体支持体(4)に結合している一本鎖コピー(5)を与える、ステップ;
一本鎖コピー(5)を含む媒体を、一本鎖コピー(5)上の配列(20)にハイブリダイズするテール5'を有するフォワードプライマー(7)及び一本鎖コピー(5)上の配列(19)にハイブリダイズするフォワード鎖置換プライマー(8)の混合物と接触させ、インキュベートして、フォワードプライマー(7)及びフォワード鎖置換プライマー(8)を一本鎖コピー(5)にアニールさせ、複合体を形成させ、過剰なフォワードプライマー(7)及びフォワード鎖置換プライマー(8)を洗い流すステップ;
核酸鎖置換ポリメラーゼを用いて、固体支持体(4)上に固定された一本鎖コピー(5)上のテール5'を有するフォワードプライマー(7)及びフォワード鎖置換プライマー(8)を伸長させるステップであって、鎖置換プライマー(8)の伸長は、一本鎖コピー(5)から分離する伸長されたフォワードプライマー鎖(9)を分離させる、ステップ;
固体支持体(4)を含む媒体から、フォワードプライマー(7)の尾部5'テール配列及びリバースプライマー捕捉プローブ(2)の5'テールの相補的配列を含む伸長されたフォワードプライマー鎖(9)を回収するステップ;及び
結合したテール5'配列の一方又は両方を用いて、伸長されたフォワードプライマー鎖(9)を増幅するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)を、標的核酸に同時にハイブリダイズさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)を、標的核酸に別々にハイブリダイズさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複合体を核酸鎖置換ポリメラーゼと接触させる前に、固体支持体(4)を洗浄して、固体支持体(4)上に固定された標的核酸(1)にハイブリダイズしていない過剰なリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料から少なくとも1つの標的核酸(1)を精製及び複製する方法であって、
前記試料をリバースプライマー(11)の混合物と接触させ、インキュベートして、リバースプライマー(11)を標的核酸(1)中の配列(22)にアニールさせて、複合体を形成させるステップ;
複合体を、テール付きリバースプライマー(11)によって結合される配列(22)に対して3'位置で標的核酸(1)上の配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)を用いて固体支持体(4)上に結合させ、過剰なプライマー(11)、及び標的配列(1)以外の試料成分を洗い流すステップ;
鎖置換ポリメラーゼを用いて標的核酸(1)上のリバースプライマー(11)及び捕捉プローブ/プライマー(12)を伸長させ、それにより、核酸標的(1)の一本鎖コピー(14)を固体支持体(4)から分離させ、標的核酸/伸長された捕捉プローブ/プライマーハイブリッド(13)は固体支持体(4)上に残る、ステップ;及び
一本鎖コピー(14)上の配列(24)にハイブリダイズする標的特異的テール付きフォワードプライマー(7)及び2つのユニバーサルプライマー(15及び16)の混合物を、核酸標的(1)の一本鎖コピー(14)に添加し、ポリメラーゼ反応を用いて標的核酸(1)の伸長産物(14)を増幅するステップ
を含む、方法。
【請求項６】
配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)が、メッセンジャーRNAのポリアデニル化部位を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)が、標的核酸ごとに異なる標的特異的配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
捕捉プローブ/プライマー(12)及びリバースプライマー(11)を、標的核酸に同時にハイブリダイズさせる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
捕捉プローブ/プライマー(12)及びリバースプライマー(11)を、標的核酸に別々にハイブリダイズさせる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
試料から少なくとも1つの標的核酸(1)を精製及び複製する方法であって、
前記試料を、前記標的核酸(1)中の配列に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド捕捉プローブ(12)と接触させるステップ;
前記標的核酸(1)を固体支持体(4)上で精製するステップ;
捕捉プローブ(12)が結合する配列とは異なる標的核酸(1)の核酸配列に第2のオリゴヌクレオチド(11)をハイブリダイズさせ、標的核酸(1)、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ(12)及び第2のオリゴヌクレオチド(11)からなる複合体を形成させるステップ;
複合体を、鎖置換核酸ポリメラーゼと接触させるステップであって、それにより、新たに合成された鎖及びその鋳型鎖(1)からなる二重鎖(13)を、鋳型(1)に相補的な一本鎖核酸鎖(14)から分離させ、それにより、二重鎖(13)は固体支持体(4)に結合したままとなり、一本鎖コピー(14)は固体支持体(4)から分離する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを、標的核酸に同時にハイブリダイズさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを、標的核酸に別々にハイブリダイズさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複合体を核酸ポリメラーゼと接触させる前に、固体支持体を洗浄して、固体支持体上に捕捉された核酸にハイブリダイズしていない過剰な第2のオリゴヌクレオチドを除去する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
捕捉プローブが、第2のオリゴヌクレオチドを標的核酸から分離させ、5'末端に第2のオリゴヌクレオチドを有する標的核酸の一本鎖コピーの固体支持体からの分離をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
第2のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの標的特異的部分のテール配列5'を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
テール配列が、その後の増幅のためのプライミング部位を提供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増幅が、鎖置換増幅反応を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
テール配列が、その後の増幅のためのプロモーター部位を提供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
増幅が、転写媒介増幅又はNASBAによって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固体支持体が、フロースルーチップである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
第2のオリゴヌクレオチドが標的核酸配列上で伸長され、捕捉プローブが第2のオリゴヌクレオチドの伸長産物から標的核酸を分離させ、固体支持体を浸す媒体中の結合していない標的核酸の一本鎖レプリカをもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
捕捉プローブ及び第2のオリゴヌクレオチドを、標的核酸に同時にハイブリダイズさせる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
捕捉プローブ及び第2のオリゴヌクレオチドを、標的核酸に別々にハイブリダイズさせる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
第2のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの標的特異的部分のテール配列5'を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
分離された一本鎖核酸が、核酸ハイブリッドを破壊する変性条件を使用せずに、固体支持体を浸す溶液中に回収される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
分離された一本鎖核酸が、化学的切断法を使用せずに、固体支持体を浸す溶液中に回収される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
テール配列が、その後の増幅のためのプライミング部位を提供する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
増幅が、鎖置換増幅反応を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
テール配列が、その後の増幅のためのプロモーター部位を提供する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
増幅が、転写媒介増幅又はNASBAによって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
核酸標的配列が、界面活性剤及び/又はカオトロピック剤を含有する粗溶解物から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１０〜３３の方法のいずれかを実施するための試薬を含むキット。
【請求項３５】
増幅産物が、固体支持体上に固定されたプローブへのハイブリダイゼーションによって分析される、請求項１〜９、１７、１８、１９、２０、２９、３０、３１又は３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
増幅産物が、ビーズの集合体上に固定されたプローブへのハイブリダイゼーションによって分析される、請求項１、５、１７、１８、１９、２０、２９、３０、３１又は３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
増幅産物が、PCR増幅によって分析される、請求項１、５、１７、１８、１９、２０、２９、３０、３１又は３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
増幅産物が、増幅産物の配列を決定することによって分析される、請求項１、５、１７、１８、１９、２０、２９、３０、３１又は３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
プライマーのテール配列が、その後の配列決定反応に必要とされるアダプター配列又は特定の試料若しくは核酸標的を同定するためのタグを含む、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的試料中の複数の核酸標的配列を定性的及び/又は定量的に検出するための核酸試験に必要とされる方法に関する。核酸標的配列は、無関係の核酸配列の大きなバックグラウンドにおいて非常に少量で存在することが多く、信頼性のある検出には広範かつ高度に特異的な増幅が必要である。本開示の方法は、穏やかな条件下で鎖分離を行うために、鎖置換ポリメラーゼを使用するプロセスにおいて、ユニバーサルプライミング配列の、標的配列への結合を提供する。これらの方法は、比較的単純な装置を用いた自動化に適している。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析のためのほとんどの方法は、限られた多重化能力を提供する - 例えば、標準的なマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法は、高濃度でのプライマーの複雑な混合物間の相互作用のために、いくつかの異なる標的に限定される。マルチプレックスPCRは、一般的に、同じサンプルから複数の標的を増幅するために使用されるが、非特異的な増幅、優先的な標的増幅、及びプライマー-ダイマーアーチファクトの可能性があるため、注意深い最適化が必要とされる。プライマー-ダイマーアーチファクトは、効率的に増幅され、増幅の特異性を低下させるだけでなく、PCR試薬を消費し、アンプリコン収率を低下させる(Elnifro et al., Clin Microbiol Rev. 13:559, 2000;  Shum and Paul, Anal Biochem 388: 266, 2009)。例えば、遺伝子型アッセイでは、31の異なる遺伝子座を増幅するために、選択されたプライマー対のプールを用いた6つの別個のPCR反応が必要であった(Pastinen et al., Genome Res. 10:1031, 2000)。
【０００３】
マルチプレックスPCR反応の一貫性が改善され、増幅にユニバーサルプライマーを使用することにより、プライマー-ダイマーの有害な影響が最小限に抑えられている。
【０００４】
米国特許第5,422,252号、同第5,470,723号及び同第5,648,211号は、ユニバーサル配列を、標的特異的アダプタープライマーを用いて複数の標的配列に付加し得る方法を開示しており、これにより、鎖置換増幅(SDA)と呼ばれる等温法においてプライマーの単一対を用いて増幅を行うことができる。複数対の標的特異的アダプタープライマーによって産生されたプライマー-ダイマーアーチファクトは、ユニバーサル増幅プライマーよりも実質的に低い濃度でそれらを使用することによって最小化された。
【０００５】
米国特許第5,882,856号及び同第6,207,372号は、各標的に対して最適化する必要がない標準的な条件下での単一ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における優先的標的増幅を回避した多重増幅のためのユニバーサルプライマーの使用を開示している。ユニバーサルプライマーの使用により、標的配列のより均一な増幅が実証された。
【０００６】
ユニバーサルプライマーの使用は、標的特異的プライマーによるプライマー-ダイマーの形成を減少させる傾向があるが、PCRの初期相において必然的に形成するプライマー-ダイマーの増幅は、アンプリコンの両方の鎖上の単一プライマー配列を用いることによって最小化されている(Brownie et al., Nucleic Acids Res. 25:3235, 1997)。小さなプライマー-ダイマー分子の末端の間に形成されたハイブリッドは、パンハンドル構造を形成し、これはそれらの増幅の相対的抑制をもたらす。パンハンドルの形成がPCRプライマーのアニーリングと競合するためである。
【０００７】
米国特許第5,759,773号は、核酸標的、捕捉プローブ及び二元検出プローブからなる複合体を固体支持体上で効率的に単離することができる方法を開示した。Tyagi et al., Proc Natl Acad Sci 9: 5395, 1996及びHsuih et al., J Clin Microbiol. 34, 501, 1996も参照のこと。固体支持体を洗浄した後、RNase Hによる捕捉プローブの酵素的消化によるその後のライゲーション増幅のために、標的と二元検出プローブとの複合体を固体支持体から解離させた。この方法は、捕捉プローブが、該酵素によって効率的に消化されるRNA/DNAハイブリッド配列からなることを必要とし、したがって、異なるタイプの標的分子及び捕捉配列に対する一般的な有用性を欠いている。さらに、この方法では単一の標的のみが検出された。
【０００８】
米国特許第7,955,794号は、標的分子が固体支持体上に捕捉され、二元検出プローブと複合体形成され、続いて二元プローブのライゲーション及びライゲーションされたプローブのPCRによる増幅が行われる点で、米国特許第5,759,773号における方法と似ている方法を開示した。この方法は、非常に多数(数千)の標的配列を単一反応で多重増幅するのに適していることが示されている。Fan et al., Genome Res. 14:878, 2004及びFan et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 68:69, 2003を参照のこと。この方法の成功は、多数の二元検出プローブ(それぞれがユニバーサルプライマー配列を含む)の、固体支持体上の標的分子へのハイブリダイゼーション、及びユニバーサルプライマーを用いたライゲーション及び増幅の前の過剰な検出プローブの洗浄に依存する。これは、そうでなければポリメラーゼ反応において多量のプライマー-ダイマーアーチファクトを産生する、ユニバーサルプライマー配列を有する多数の非結合オリゴヌクレオチドプローブを効果的に除去する。
【０００９】
上記の方法は、多数の標的配列の信頼性のある効率的な増幅における重大な制限を克服するが、このプロセスは、臨床分析において日常的に使用するのに適した単純でコンパクトな装置での自動化には適していない。それは、後の増幅のために第2の固体支持体から生成物を回収するために、2つの別個のタイプの固体支持体の使用及び95℃での変性工程を必要とする。「http://support.illumina.com/」の「wgdasl_assay_guide_11322443_b」を参照のこと。核酸は、1つのタイプの固体支持体上で精製され、次いで、コピーされ、酵素反応においてリガンドでタグ付けされなければならない。次いで、タグ付き核酸をオリゴヌクレオチドプールにハイブリダイズさせ、第2のタイプの固体支持体上に捕捉する。洗浄後、固体支持体上で2つの酵素反応が行われる。固体支持体を洗浄した後、ライゲーションされた二元プローブを、PCR増幅のために95℃で変性させることによって固体支持体から溶出させる。
【００１０】
ユニバーサルプライミング配列の取り込みを伴ってコピーされた核酸標的は、複数の標的がユニバーサルプライマーで増幅され得るいくつかの異なる増幅方法で増幅され得る。これらの方法としては、SDAの鎖置換増幅(米国特許第5,422,252号)、転写媒介増幅又はTMA(米国特許第5,399,491号)及び核酸配列に基づく増幅又はNASBA(Kievits et al., J Virol Methods 35:273, 1991)がある。
【００１１】
これらの方法は、その後の増幅のために標的核酸中の目的の配列の両端にプライマー及び/又はプロモーター配列を導入する必要があり、これは標的配列の二本鎖コピーの生成を必要とする。増幅に必要な5'テール配列を有するプライマーを用いてDNAコピーの合成をプライミングするために、異なる戦略が使用されている。
【００１２】
SDA法(米国特許第5,422,252号)は、鎖置換プライマーを利用して、元の核酸標的の一本鎖コピーを作製し、これに、他のプライマーがハイブリダイズし、増幅に必要な各末端のアダプター配列を有する二本鎖コピーを生成することができる。その後の増幅は、二本鎖DNA分子中にニックを形成するための制限酵素に依存し、この二本鎖DNA分子からDNA標的がDNAポリメラーゼによってコピーされる。
【００１３】
増幅のTMA法(米国特許第5,399,491号)は、RNA標的配列を増幅するために使用されており、転写に必要とされる二本鎖DNAを生成するために、逆転写後に元のRNA標的を消化して、プライマーのハイブリダイゼーションのためにDNAコピーの一本鎖領域を生成するRNase Hの活性に依存する。RNA標的の二本鎖コピーを生成するためのRNase Hへのこの依存性のために、元のTMA法はDNA標的には不適当である。米国特許第7,713,697号及び同第8,183,359号は、ディスプレーサーオリゴヌクレオチドを利用してDNAの一本鎖コピーを提供する、DNA標的にTMAを適合させる方法を開示しており、このDNAの一本鎖コピーは、次いで、異なるプライミング配列からコピーされて、TMA増幅に必要な二本鎖プロモーター配列を含む二本鎖DNAを生成することができる。
【００１４】
米国特許第8,198,027号は、標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いた固体支持体上のRNA標的の捕捉、及び第3のオリゴヌクレオチドに結合された核酸標的への逆転写プライマーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの方法を開示した。標的RNA上の逆転写プライマーの伸長、及び伸長産物上にプライミング部位を生成するためのRNase HによるRNA鋳型鎖の分解の後、第3のオリゴヌクレオチドは、伸長産物にハイブリダイズし、二本鎖DNA生成物を産生するように伸長される。この生成物は、その後のTMA増幅に必要なプライミング及びプロモーター配列を含む。逆転写プライマーオリゴヌクレオチド及び第3のオリゴヌクレオチドは、共有又は非共有結合を提供し得る様々なポリマーリンカーによって結合され得る。リンカーは、ヌクレオチド及び/又は非ヌクレオチド残基で構成されてよく、2つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション複合体であり得る。
【００１５】
転写媒介増幅は、特定のRNA標的配列を効率的に増幅するために使用されているが、この方法は注意深い最適化を必要とする(米国特許第5,399,491号)。RNaseはRNA鋳型にハイブリダイズしたRNA鋳型を完全に分解せず、RNase活性は配列依存性である。RNA標的配列のいくつかの領域のみがTMAに適しており、アッセイの有効性は、特定の配列と共に使用されるRNase Hのタイプ及び濃度に依存する。これらの特性は、特に高度に多重化されたアッセイの場合、その有用性を制限する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第5,422,252号
【特許文献２】米国特許第5,470,723号
【特許文献３】米国特許第5,648,211号
【特許文献４】米国特許第5,882,856号
【特許文献５】米国特許第6,207,372号
【特許文献６】米国特許第5,759,773号
【特許文献７】米国特許第7,955,794号
【特許文献８】米国特許第5,399,491号
【特許文献９】米国特許第7,713,697号
【特許文献１０】米国特許第8,183,359号
【特許文献１１】米国特許第8,198,027号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Elnifro et al., Clin Microbiol Rev. 13:559, 2000
【非特許文献２】Shum and Paul, Anal Biochem 388: 266, 2009
【非特許文献３】Pastinen et al., Genome Res. 10:1031, 2000
【非特許文献４】Brownie et al., Nucleic Acids Res. 25:3235, 1997
【非特許文献５】Tyagi et al., Proc Natl Acad Sci 9: 5395, 1996
【非特許文献６】Hsuih et al., J Clin Microbiol. 34, 501, 1996
【非特許文献７】Fan et al., Genome Res. 14:878, 2004
【非特許文献８】Fan et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 68:69, 2003
【非特許文献９】Kievits et al., J Virol Methods 35:273, 1991
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本開示は、日常的な臨床分析のための単純なコンパクトな装置での自動化に適したプロセスを用いた、多くの核酸標的の多重増幅のための頑強な方法を提供する。
【００１９】
本開示は、核酸の事前の精製なしに試料中の複数の核酸標的配列の高度に特異的な単離及び増幅を提供する方法に関する。ユニバーサルプライミング配列は、単一の固体支持体マトリックスの使用、並びに核酸鎖分離及び固体支持体からのコピーの回収のための穏やかな条件を必要とするプロセスにおいて、標的のコピーに導入される。この方法は、試料、洗浄溶液及び試薬を、自動化された流体工学によって一連のリザーバから単一の固体支持体マトリックスに導入する、比較的単純な装置で実施することができる。
【００２０】
一実施形態では、試料から少なくとも1つの標的核酸を精製及び複製する方法であって、
前記試料を、前記標的核酸中の配列に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させるステップ;
前記標的核酸を固体支持体上で精製するステップ;
捕捉プローブが結合する配列とは異なる標的核酸の核酸配列に第2のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、標的核酸、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ及び第2のオリゴヌクレオチドからなる複合体を形成させるステップ;
複合体を、鎖置換核酸ポリメラーゼと接触させるステップであって、それにより、新たに合成された鎖及びその鋳型鎖からなる二重鎖を、鋳型に相補的な一本鎖核酸鎖から分離させ、それにより、二重鎖は固体支持体に結合したままとなり、一本鎖コピーは固体支持体から分離する、ステップ
を含む方法が提供される。
【００２１】
本明細書中に開示される実施形態は、試料から少なくとも1つの標的核酸を精製及び複製する方法であって、以下を含む方法を提供する:
(a)前記試料を、5'テールを有するリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチドと接触させ、インキュベートして、標的核酸上の配列にハイブリダイズするリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチドをアニールさせるステップ;
(b)前記試料を、リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドと接触させ、インキュベートして、標的核酸上の配列にハイブリダイズするリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドをアニールさせ、標的核酸に結合した、リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドの複合体を形成させるステップ;
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド上のリガンドを固体支持体に結合させることによって固体支持体上に複合体を結合させ、過剰なリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド、並びに複合体以外の試料成分を洗い流すステップ;
5'テールを有するリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチドを標的核酸上で伸長させて、鎖を形成させ、標的核酸上のリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを核酸鎖置換ポリメラーゼで伸長させるステップであって、リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドの伸長が、標的核酸から、伸長されたリバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチドを分離させ、標的核酸のコピーであり、固体支持体に結合している一本鎖コピーを与える、ステップ;
一本鎖コピーを含む媒体を、一本鎖コピー上の配列にハイブリダイズするテール5'を有するフォワードプライマー及び一本鎖コピー上の配列にハイブリダイズするフォワード鎖置換プライマーの混合物と接触させ、インキュベートして、フォワードプライマー及びフォワード鎖置換プライマーを一本鎖コピーにアニールさせ、複合体を形成させ、過剰なフォワードプライマー及びフォワード鎖置換プライマーを洗い流すステップ;
核酸鎖置換ポリメラーゼを用いて、固体支持体上に固定された一本鎖コピー上のテール5'を有するフォワードプライマー及びフォワード鎖置換プライマーを伸長させるステップであって、鎖置換プライマーの伸長は、一本鎖コピーから分離する伸長されたフォワードプライマー鎖を分離させる、ステップ;
固体支持体を含む媒体から、フォワードプライマーの尾部5'テール配列及びリバースプライマー捕捉プローブの5'テールの相補的配列を含む伸長されたフォワードプライマー鎖を回収するステップ;及び
結合したテール5'配列の一方又は両方を用いて、伸長されたフォワードプライマー鎖を増幅するステップ。
【００２２】
この実施形態において、リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを、標的核酸に同時にハイブリダイズさせてもよい。
【００２３】
リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを、標的核酸に別々にハイブリダイズさせてもよい。
【００２４】
複合体を核酸鎖置換ポリメラーゼと接触させる前に、固体支持体を洗浄して、固体支持体上に固定された標的核酸にハイブリダイズしていない過剰なリバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチドを除去してもよい。
【００２５】
また、試料から少なくとも1つの標的核酸を精製及び複製する方法であって、
前記試料をリバースプライマーの混合物と接触させ、インキュベートして、リバースプライマーを標的核酸中の配列にアニールさせて、複合体を形成させるステップ;
複合体を、テール付きリバースプライマーによって結合される配列に対して3'位置で標的核酸上の配列にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマーを用いて固体支持体上に結合させ、過剰なプライマー、及び標的配列以外の試料成分を洗い流すステップ;
鎖置換ポリメラーゼを用いて標的核酸上のリバースプライマー及び捕捉プローブ/プライマーを伸長させ、それにより、核酸標的の一本鎖コピーを固体支持体から分離させ、標的核酸/伸長された捕捉プローブ/プライマーハイブリッドは固体支持体上に残る、ステップ;及び
一本鎖コピー上の配列にハイブリダイズする標的特異的テール付きフォワードプライマー及び2つのユニバーサルプライマーの混合物を、核酸標的の一本鎖コピーに添加し、ポリメラーゼ反応を用いて標的核酸の伸長産物を増幅するステップ
を含む方法が開示される。
【００２６】
この実施形態では、配列にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマーは、メッセンジャーRNAのポリアデニル化部位を含む。
【００２７】
配列にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマーは、標的核酸ごとに異なる標的特異的配列を含む。
【００２８】
本開示の機能的な及び有利な態様のさらなる理解は、以下の詳細な説明及び図面を参照することによって実現することができる。
【００２９】
実施形態は、単なる例として、図面を参照して、以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は、2つの鎖置換ステップを利用して、各コピーの両端に取り込まれたユニバーサルプライミング配列を有する標的配列の一本鎖コピーを生成し、その後の処理のためにそれらを固体支持体から分離する、本開示の実施形態を説明する模式図である。
【図２】図2は、1つの鎖置換ステップを利用して、各コピーの一端に組み込まれたユニバーサルプライミング配列を有する標的配列の一本鎖コピーを生成し、その後の処理のためにそれらを固体支持体から分離する、本開示の実施形態を説明する模式図である。
【図３】図3は、本明細書に開示された方法を用いて、少量の3種の合成RNA分子を検出した実験の結果を示す。
【図４】図4は、本明細書に開示された方法を用いて、少量のHIV RNAを検出した実験の結果を示す。
【図５】図5は、本明細書に開示された方法を用いて、培養された乳がん細胞から少量(33〜300pg)のヒトメッセンジャーRNAを検出した実験の結果を示す。
【図６】図6は、本明細書に開示される方法を用いて、血液から単離された少数の乳がん細胞からのメッセンジャーRNAを検出した実験の結果を示す。具体的には、log10スケールを用いた、4つの遺伝子のシグナル強度。3つのサンプルタイプの6つの複製物：回収された対照血液細胞(最も低密度の網掛け)、10個のSKBR3細胞を有する回収された血液細胞(より高密度の網掛け)、及び100個のSKBR3細胞を有する回収された血液細胞(最も高密度の網掛け)。実線の棒は複製物の平均を示す。
【図７】図7は、本明細書に開示される方法を用いて、培養乳がん細胞からの少量(0.05〜500pg)のヒトメッセンジャーRNAを定量した実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示の様々な実施形態及び態様を、以下に論じる詳細を参照して説明する。以下の説明及び図面は、本開示を例示するものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。多数の特定の詳細が、本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、ある場合には、本開示の実施形態の簡潔な議論を提供するために、周知又は従来の詳細は記載されていない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」は、包含的かつオープンエンドであると解釈され、排他的と解釈されない。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」及びそれらの変形は、指定された特徴、ステップ又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ又は構成要素の存在を排除するものと解釈されるべきではない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「例示的」は、「例、事例、又は実例として機能すること」を意味し、本明細書に開示される他の構成よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、特性、パラメータ及び大きさの変化などの、値の範囲の上限及び下限に存在し得る変形を包含することを意味する。1つの非限定的な例において、用語「約」及び「およそ」は、プラス又はマイナス10パーセント又はそれ未満を意味する。
【００３５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。例えば、オリゴヌクレオチドの又はオリゴヌクレオチド上の5'テールの5'若しくは3'末端への言及は、ポリマー鎖の骨格を構成する糖部分上の炭素原子の番号付けを指し、鎖の方向性を示す。本開示の好ましい実施形態は、図1に示されている。図示される方法の構成要素は、以下のように識別される：
(1) - 精製及び増幅される標的核酸
(2) - リバースプライマー、及び固定化のためのリガンドを含むテール5'を有する捕捉プローブの両方である、リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド
(3) - リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド
(4) - リガンド結合剤を有する固体支持体
(5) - 固体支持体上に固定された一本鎖DNAコピー
(6) - 分離された伸長産物/標的ハイブリッド
(7) - 5'テールを有するフォワードプライマー
(8) - フォワード鎖置換プライマー
(9) - フォワード及びリバーステール配列を有する分離されたDNAコピー
(10) - 固体支持体に結合したままの二本鎖DNA
(17) - リバースプライマー/捕捉プローブオリゴヌクレオチド(2)がハイブリダイズする、標的核酸(1)上の標的特異的配列
(18) - 標的核酸(1)上の配列(17)に対して5'方向に位置する、配列(17)とは異なる標的特異的配列。リバース鎖置換プライマーオリゴヌクレオチド(3)はこの配列にハイブリダイズする。
(19) - 固体支持体(4)上に固定された一本鎖DNAコピー(5)上の配列
(11) - 配列(19)とは異なる、固体支持体(4)に固定された一本鎖DNAコピー(5)上の配列
(12) - 5'テールを有するリバースプライマーオリゴヌクレオチド捕捉プローブ(2)の配列の相補的配列を含む一本鎖DNAコピー(5)上のテール5'を有するフォワードプライマー(7)の伸長
【００３６】
図1に示す方法のステップは、以下の通りである：
A.精製及び増幅される各標的核酸(1)についての2つのオリゴヌクレオチド(2,3)の混合物を試料溶解物に加え、インキュベートして、オリゴヌクレオチド(2,3)を標的核酸(1)にアニールさせ複合体を形成させる。
【００３７】
B.リバースプライマー(2)上のリガンドを固体支持体(4)に結合させることによって、固体支持体(4)上に複合体を捕捉し、過剰なオリゴヌクレオチド(2,3)、及び標的配列以外の試料成分を洗い流す。リバースプライマー(2)上のリガンドの、固体支持体(4)への結合は、リバースプライマー(2)上のリガンドと、固体支持体(4)上に予め固定された化学物質との、例えば、オリゴヌクレオチド上のビオチンと、固体支持体(4)上のストレプトアビジンとの間の固有の親和性のために、自発的に生じ得る。あるいは、リバースプライマー(2)は、共有結合又は非共有結合性手段によって予め固体支持体(4)に結合させてもよい。当業者であれば、この捕捉はいずれかの方法で実施できることが理解されよう。
【００３８】
C.標的核酸(1)上の5'テールを有するリバースプライマー(2)を伸長させて鎖(5)を形成させ、標的核酸(1)上のリバース鎖置換プライマー(3)を鎖置換ポリメラーゼを用いて伸長させる。鎖置換ポリメラーゼは、その固有の活性のためにこれを達成する。この活性は、天然に見出される特定の核酸ポリメラーゼの、又はそれらから改変されたポリメラーゼにおける特性である。リバース鎖置換プライマー(3)の伸長は、標的核酸(1)から、固体支持体(4)に結合した、伸長されたリバースプライマー(2)(すなわち、標的(1)のコピーである鎖(5))を分離させる。したがって、二本鎖の伸長産物/標的ハイブリッド(6)は、固体支持体(4)から分離され、ポリメラーゼ反応後に洗い流される。二本鎖の伸長産物/標的ハイブリッド(6)は、標的核酸(1)、及び標的核酸(1)上のオリゴヌクレオチドプライマー(3)の伸長物からなる。2つの鎖の一方は標的(1)であり、他方の鎖(5)はプライマー(3)の伸長による標的(1)のコピーである。
【００３９】
D.テール5'を有するフォワードプライマー(7)及びフォワード鎖置換プライマー(8)を、固体支持体(4)上に固定された標的核酸の一本鎖コピー(5)にアニールさせ、アニーリング後に過剰なオリゴヌクレオチド(7,8)を洗い流す。
【００４０】
E.鎖置換ポリメラーゼで、固体支持体(4)上に固定された一本鎖DNAコピー(5)上の5'テールを有するフォワードプライマー(7)及びフォワード鎖置換プライマー(8)を伸長させる。鎖置換プライマー(8)の伸長は、伸長されたフォワードプライマー鎖(9)を一本鎖DNAコピー(5)から分離させる。フォワードプライマー(7)の尾部5'テール配列、及びリバースプライマー捕捉プローブ(2)の5'テールの相補的配列を含む、伸長されたフォワードプライマー鎖(9)は、固体支持体(4)を浸す媒体から回収され、結合したテール配列5'の一方又は両方を用いて増幅され得る。鎖(9)は、図1に示されており、左側に5'テール、右側に3'テールがある。右側の3'テールは、プライマー(2)の5'テールの相補的配列である。
【００４１】
したがって、本明細書に、試料から少なくとも1つの標的核酸(1)を精製及び複製する方法が開示され、この方法は、試料を、標的核酸(1)における配列(17)に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド捕捉プローブ(2)と接触させるステップ、固体支持体(4)上で標的核酸(1)を精製するステップ、第2のオリゴヌクレオチド(3)を、捕捉プローブ(2)が結合する配列(17)とは異なる標的核酸(1)の核酸配列(18)にハイブリダイズさせるステップ、及び標的核酸(1)及び2つオリゴヌクレオチド(2,3)からなる複合体を鎖置換核酸ポリメラーゼ(図1には示されていない)と接触させ、それにより、新たに合成された鎖(19)及びその鋳型鎖(1)からなる二重鎖(6)を、鋳型(1)と相補的な別個の新たに合成された核酸鎖(5)から分離するステップを含む。
【００４２】
捕捉プローブ(2)及び第2のオリゴヌクレオチド(3)を、標的核酸(1)に同時にハイブリダイズさせてもよい。固体支持体(4)は、標的核酸(1)、捕捉プローブ(2)及び第2のオリゴヌクレオチド(3)からなる複合体を核酸ポリメラーゼ(図示せず)と接触させる前に、固体支持体(4)上に捕捉された標的核酸(1)にハイブリダイズしていない過剰な第2のオリゴヌクレオチド(3)を除去するために、洗浄され得る。捕捉プローブ(2)は、標的核酸配列(1)上で伸長されてよく、第2のオリゴヌクレオチド(3)は、捕捉プローブ(2)の伸長産物(5)から標的核酸(1)を分離させて、固体支持体(4)上に固定された標的核酸(1)の一本鎖レプリカ(5)をもたらし得る。捕捉プローブ(2)は、標的核酸(1)の配列(17)に相補的な標的特異的配列のテール配列5'を含み得る。
【００４３】
第2のオリゴヌクレオチド(3)は、標的核酸(1)から捕捉プローブ(2)を分離させて、標的核酸(1)及び標的(1)のレプリカ(19)からなる二本鎖ハイブリッド(6)の固体支持体(4)からの分離をもたらし得る。
【００４４】
この方法において、第3のオリゴヌクレオチド(7)を、標的核酸(1)の一本鎖レプリカ(5)の配列(20)にハイブリダイズさせてもよく、核酸ポリメラーゼによって伸長してもよく、ポリメラーゼは図1に示されていない。固体支持体(4)は、複合体を核酸ポリメラーゼと接触させる前に、標的核酸(1)の一本鎖レプリカ(5)にハイブリダイズしていない過剰な第3のオリゴヌクレオチド(7)を除去するために、洗浄され得る。
【００４５】
第3のオリゴヌクレオチド(7)は、標的核酸(1)の一本鎖レプリカ(5)の配列(20)の相補的配列である、オリゴヌクレオチドの標的特異的部分のテール配列5'を含み得る。この方法において、第4のオリゴヌクレオチド(8)を、第3のオリゴヌクレオチド(7)が結合する配列(20)とは異なる標的核酸(1)の一本鎖レプリカ(5)上の配列(19)にハイブリダイズさせてもよく、この第4のオリゴヌクレオチド(8)は、鎖置換核酸ポリメラーゼにより伸長され、第3のオリゴヌクレオチド(7)の伸長産物(21)からなる一本鎖核酸分子(9)を固体支持体(4)から分離させ得る。
【００４６】
別の実施形態が図2に示されている。図示される方法の構成要素は、以下のように識別される：
1- 標的核酸
4- 固体支持体
7- テール5'を有するフォワードプライマー
11- テール5'を有するリバースプライマー
12- 標的核酸配列に相補的なその末端3'及び固体支持体マトリックス(4)に結合することができるそのテール末端5'を有するリバースプライマー/捕捉プローブ。図2のプライマー/捕捉プローブ(12)は、図1のプライマー/捕捉プローブ(2)とは異なる数を有する。図2のプライマー/捕捉プローブ(12)が、テール付きプライマー(11)の右側に配置され、固体支持体(4)からテール付きプライマー(11)の伸長産物を分離させるためである。
13- 固体支持体(4)上に保持された二本鎖の伸長産物/標的ハイブリッド
14- 固体支持体(4)から分離された一本鎖DNAコピー
15- リバースユニバーサルプライマー
16- フォワードユニバーサルプライマー
22- リバースプライマー(11)がハイブリダイズする標的核酸(1)上の標的特異的配列
23- 標的核酸(1)上の標的特異的配列(22)に対して3'方向に位置する、配列(22)とは異なる標的核酸上の配列。この配列(23)は、試料中の2個以上の標的配列上に存在する配列、例えば真核生物mRNA上のポリA部位であってもよい。
24- テール5'を有するフォワードプライマー(7)がハイブリダイズする固体支持体(4)から分離された一本鎖DNAコピー(14)上の配列
【００４７】
図2に示す方法のステップは、以下の通りである：
I.標的(1)を含む試料にテール付きリバースプライマー(11)(各標的について1つのプライマー)の混合物を添加し、それらを標的核酸(1)の配列(22)にアニールさせる。
【００４８】
J.テール付きリバースプライマー(11)によって結合される配列(22)に対して3'位置における標的上の配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)で、固体支持体(4)上に複合体を捕捉し、過剰なプライマー(11)、及び標的配列(1)以外の試料成分を洗い流す。
【００４９】
K.標的核酸(1)上のリバースプライマー(11)及び捕捉プローブ/プライマー(12)を鎖置換ポリメラーゼ(図示せず)で伸長させ、それによって核酸標的(1)の一本鎖コピー(14)を固体支持体(4)から分離させる。標的核酸/捕捉プローブ/プライマーハイブリッド(13)は固体支持体(4)上に残る。
【００５０】
L.一本鎖コピー(14)上の配列(24)にハイブリダイズする標的特異的テール付きフォワードプライマー(7)及び2つのユニバーサルプライマー(15及び16)の混合物を、核酸標的(1)の一本鎖コピー(14)に添加し、ポリメラーゼ反応により標的核酸(1)の伸長産物(14)を増幅する。
【００５１】
図2のフォワード標的特異的テール付きプライマー(7)は、図2のフォワードユニバーサルプライマー(16)よりも実質的に低い濃度で存在し得る。図2のフォワードテール付きプライマー(7)の標的特異的5'部分はまた、フォワードユニバーサルプライマー(16)と比較してより低い融解温度を有し得る。
【００５２】
本明細書に開示された実施形態では、分離された標的核酸配列(1)の一本鎖若しくは二本鎖レプリカ及び組み込まれた5'テール配列は、核酸ハイブリッドを破壊する変性条件を使用せずに、固体支持体(4)を浸す溶液中に回収され得る。
【００５３】
さらに、分離された標的核酸配列の一本鎖若しくは二本鎖レプリカ及び組み込まれた5'テール配列は、化学的切断法を使用せずに、固体支持体(4)を浸す溶液中に回収され得る。
【００５４】
フォワード及びリバース標的特異的プライマー(図1の7及び2並びに図2の7及び11)のテール5'配列は、その後の増幅のためのプライミング部位を提供し得る。この増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行ってもよい。あるいは、増幅は、鎖置換増幅反応を用いて行ってもよい。
【００５５】
テール配列は、その後の増幅のためのプロモーター部位を提供してよく、この増幅は、転写媒介増幅又はNASBAによって行われてよい。
【００５６】
増幅産物は、マイクロアレイなどの固体支持体上又は様々なビーズ上に固定された複数の異なるプローブ上のハイブリダイゼーションによる、リアルタイムPCRによる、又は産物の完全な配列の決定によることを含む様々な方法によって分析され得る。産物の配列決定のために、プライマー上の5'テールは、その後の配列決定反応に必要とされるアダプター配列、又は特定の試料若しくは核酸標的を同定するためのタグを含み得る。
【００５７】
固体支持体(4)は、磁性ビーズ、膜又は多孔性フロースルーチップであってもよい。
【００５８】
配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)は、メッセンジャーRNAのポリアデニル化部位を含み得る。配列(23)にハイブリダイズする捕捉プローブ/プライマー(12)は、標的核酸ごとに異なる標的特異的配列を含む。
【００５９】
本方法において、核酸標的配列は、界面活性剤及び/又はカオトロピック剤を含有する粗溶解物から単離され得るので、標的核酸は、核酸の事前の精製なしに本明細書に開示される方法によって単離され得る。
【００６０】
図2の方法は、図1の方法よりも単純であるが、図1の方法は、図2の方法よりもプライマーダイマーの影響に対してより耐性があり得る。図2の方法は、各標的配列に対してより少ないオリゴヌクレオチドを必要とし、図1の方法よりも少ないステップを伴う。図1の方法におけるフォワードプライマーは、固体支持体に固定されながら、標的核酸の一本鎖コピーにハイブリダイズするため、過剰なフォワードプライマーは、後続のポリメラーゼ反応の前に洗い流すことができる。図2の方法におけるフォワードプライマーは、固体支持体から分離された後に標的核酸の一本鎖コピーにハイブリダイズするため、過剰なプライマーを洗い流すことができない。この場合、プライマー-ダイマーは、異なる遺伝子特異的フォワードプライマー間に形成し得る。しかし、これらのプライマー-ダイマーアーチファクトの形成は、それらの濃度を最小化することによって制限される。さらに、フォワード遺伝子特異的プライマーから形成されたプライマー-ダイマーの全てが5'末端に同じテール配列を有し、3'末端に5'テール配列の相補的配列を有するので、それらはヘアピン構造を形成し、効率的に増幅されないため、それらの増幅は制限される。
【００６１】
本方法を実施するための試薬を含むキットを製造してもよい。
【実施例】
【００６２】
図1に概略を示した方法を、合成RNA(任意のランダム配列及びHIV配列)並びに乳がん細胞及び全血由来の全RNAを含む異なるタイプの試料で試験した。図2に概要を示した本開示の方法を、乳がん細胞からの全RNAで試験した。
【００６３】
合成RNA(任意のランダム配列及びHIV 5'LTR配列)
図1に概略を示した方法を合成RNA標的で試験した。3つの異なる合成RNA標的(それぞれ約400塩基)のプールを界面活性剤含有溶解/ハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、5'末端にユニバーサル配列を含むそれぞれの鎖置換プライマー及びビオチン化捕捉プローブをアニールさせた。複合体をストレプトアビジン磁気ビーズ上に捕捉し、逆転写/鎖置換反応の前に、過剰のプローブ及びプライマーを洗い流した。逆転写後、分離された二本鎖RNA：cDNA複合体を洗い流し、プライマーの第2セットを捕捉プローブの伸長産物に加え、第2の鎖置換反応によって5'末端に別のユニバーサル配列を導入した。上清を、ユニバーサルフォワードプライマー及びビオチン化ユニバーサルリバースプライマーを含むPCRミックスに加え、標的を増幅した。ビオチン化PCR産物をフロースルーオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Quinn et al, J Transl Med. 7:55,2009)上にハイブリダイズさせ、続いて、洗浄し、ストレプトアビジン-HRPとインキュベートし、さらに洗浄した。化学発光によって標的の存在を検出した。同じ溶解/ハイブリダイゼーション緩衝液に添加された全ての3つの合成RNA標的について、10フェムトグラム(fg)に低下するまでシグナルが検出された(図3)。
【００６４】
同様に、HIV 5'LTR配列(約600塩基)を有する合成RNAを用いて、図1に概略を示した方法を試験した。この実験では、HIV配列の2つの異なる領域を標的とする、2つの異なるセットのビオチン化捕捉プローブ及びプライマーを、合成HIV RNAにハイブリダイズさせ、前述の方法を用いて処理した。溶解/ハイブリダイゼーション法に添加された合成HIV RNA標的について100fgに低下するまでシグナルが検出された(図4)。
【００６５】
SKBR3乳がん細胞株及びユニバーサルヒト参照全RNA
哺乳動物SKBR3乳がん細胞株由来の全RNAを用いて、本方法による多重標的検出の実行可能性を試験した。10種の異なる細胞株に由来するRNAからなるユニバーサルヒト参照(UHR)全RNAを対照として使用した。乳がんに関連するいくつかの関連遺伝子(ERBB2、EPCAM、KRT9、CCND1)及びハウスキーピング遺伝子ACTG1をmRNA標的として選択した。ビオチン化捕捉プローブ及びプライマーをこれらの標的のそれぞれについて設計し、サンプルを界面活性剤含有溶解/ハイブリダイゼーション緩衝液中に添加し、図1に概略を示した方法を用いて処理した。
【００６６】
SKBR3乳がん細胞からの全RNAの異なる量を試験し、ハウスキーピング遺伝子ACTG1及び乳がん遺伝子のサブセットについて33.3pgに低下するまでシグナルが検出された(図5)。KRT9は、この細胞株で発現されないので、いずれの試料においても検出されなかった。ハウスキーピング遺伝子ACTG1は5pgに低下するまでのUHR全RNAに検出されたが、乳がん遺伝子は検出されなかった。おそらく、それらは、このサンプルを生成するために使用された細胞株のいずれにも発現されなかったためである。
【００６７】
血液に添加されたSKBR3乳がん細胞
血液から回収した少数の腫瘍細胞におけるmRNAレベルの測定の実行可能性を試験するために、SKBR3乳がん細胞の10又は100個の細胞を10mLの血液に添加し、細胞の物理的特性に基づいて血液細胞から腫瘍細胞を部分的に精製した装置を用いて血液から腫瘍細胞を回収した。次いで、細胞からの全RNAを上記のように処理した(図1に概略を示す)。回収された細胞は主に白血球であり、一部の場合のみ、白血球由来のRNAを対照として用いた。
【００６８】
各試料の6つの複製物を試験した：腫瘍細胞のない血液、10個の腫瘍細胞を有する10mLの血液、及び100個の腫瘍細胞を有する10mLの血液(図6の各棒グラフで左から右に配置)。ハウスキーピング遺伝子に加えて、3つの異なる遺伝子(ERBB2、EPCAM及びCCND1)のmRNA転写物は、100個の腫瘍細胞が10mLの血液に添加された場合、明白に検出された。ERBB2遺伝子の転写物は、100個の腫瘍細胞が血液に添加されたときよりも、約10倍低いレベルで、10個の細胞のみが10mLの血液に添加されたときに検出された。ERBB2遺伝子は、SKBR3細胞において比較的高いレベルで発現されることが知られている。
【００６９】
SKBR3乳がん細胞からのmRNA定量
図2に概略を示した方法を使用して、SKBR3がん細胞由来の少量の全RNAからmRNAを捕捉し、フロースルーオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて特定の遺伝子を増幅及び定量した。8つの標的遺伝子のそれぞれの3つの異なる領域を、遺伝子の各領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットを用いて、同時に増幅し、定量した。この24重試験の目的は、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットをスクリーニングして、最高の感度を提供するものを発見することであった。8つの遺伝子のそれぞれについて1つのプローブセットの結果を図7に示す。シグナル強度は、アッセイで使用した全RNAの量に依存した。いくつかの遺伝子転写物は、わずか1ピコグラム(pg)の全RNAで検出可能であった(log10プロットの軸上でゼロ)。点線の垂直線は、単一の哺乳動物細胞から予想される全RNAの範囲を示す(Roozemond, Histochem J. 8:625, 1976; Uemura, Brain Res Bull 5, 117, 1980; Brady,Yeast 17:211, 2000を参照)。この結果は、本開示の方法が、単一細胞における複数のmRNA転写物の発現レベルの評価を可能にすることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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