(57)【要約】  本発明は、キメラ莢膜多糖を含むコンジュゲートなどのキメラ莢膜多糖を提供する。本発明はまた、キメラ莢膜多糖及びそのコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。さらなる態様は、本発明のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、感染に対して患者を免疫する方法を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）第1のストレプトコッカス・アガラクチア（GBS）莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位及び第2のストレプトコッカス・アガラクチア（GBS）莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されているキメラ多糖であることを特徴とする、細菌莢膜多糖。
【請求項２】
第3のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位をさらに含む、請求項1に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項３】
第1のGBS莢膜多糖血清型がIa型であり、第2のGBS莢膜多糖血清型がIb型である、請求項1又は2に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項４】
請求項2に従属するとき、第3のGBS莢膜多糖血清型がIII型である、請求項3に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項５】
第1のGBS莢膜多糖血清型がV型であり、第2のGBS莢膜多糖血清型がIX型である、請求項1又は2に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項６】
請求項2に従属するとき、第3のGBS莢膜多糖血清型がVII型である、請求項5に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項７】
第1及び第2のGBS莢膜多糖血清型の繰返し単位の比が1:1であり、且つ/又は、第1、第2及び第3のGBS莢膜多糖血清型の繰返し単位の比が1:1:1である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細菌莢膜多糖。
【請求項８】
（i）請求項1〜7のいずれか一項に記載の莢膜多糖、及び（ii）キャリアタンパク質を含むコンジュゲート。
【請求項９】
キャリアタンパク質が、莢膜多糖に共有結合されている、請求項8に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
キャリアタンパク質が、リンカーを用いて莢膜多糖に共有結合されている、請求項8に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
リンカーが、アジピン酸ジヒドラジドである、請求項9に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、GBS80、GBS67及びGBS59からなる群から選択される、請求項8から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
B群連鎖球菌により引き起こされる動物における全身感染を防止するのに有効な量の請求項8から12のいずれか一項に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
ワクチンである、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ワクチンが、出産可能年齢の女性、妊婦及び高齢患者から選択されるヒトへの投与用である、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
S.アガラクチアにより引き起こされる疾患の予防及び/又は治療用であり、特に疾患が、新生児敗血症、菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎又は敗血症性関節炎である、請求項13から15のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)由来のキメラ莢膜糖に関し、これは、前記キメラ莢膜多糖及びキャリアタンパク質を含むコンジュゲートを含む。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス・アガラクチア(「B群連鎖球菌」又は「GBS」としても知られている)は、健常な女性の25〜30％の肛門性器管にコロニー形成している、β溶血性の莢膜グラム陽性微生物である。この細菌は、特にこれを保菌する母親が産んだ乳幼児における新生児敗血症及び髄膜炎の主因である。この病原体はまた、基礎疾患に罹患した成人、特に高齢者に感染する可能性もあり、ウシ乳房炎も引き起こしうる。肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)(「S. pneumo」又は「肺炎球菌」としても知られている)は、健常な保菌者の鼻咽頭に無症状で存在する、アルファ溶血性の莢膜グラム陽性微生物である。感染しやすい個体、たとえば高齢者、小児及び免疫不全の個体では、この細菌は病原性になる場合があり、疾患、たとえば肺炎、髄膜炎又は敗血症を引き起こしうる。
【０００３】
GBS莢膜は、細菌がヒト自然免疫防御を回避することを可能にする主要な病原性因子である。これは、4から7個の単糖からなる複数の同一の繰返し単位(RU、repeating unit)により構成される、高分子量ポリマーからなる。GBSは、化学組成及びそれらの莢膜多糖繰返し単位のグリコシド結合のパターンが異なる10種の血清型(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、及びIX)に分類できる。同様に、肺炎連鎖球菌の莢膜は、複数の同一の繰返し単位により構成される高分子量ポリマーからなる、主要な病原性因子である。しかしながら、GBSとは対照的に、90を超える異なる肺炎連鎖球菌の血清型が、これまでに同定されてきた。
【０００４】
GBS及び肺炎連鎖球菌の莢膜糖は、ワクチンにおける使用のために研究されている。しかしながら、糖はT非依存性抗原であり、一般に免疫原性が低い。したがって、キャリアとのコンジュゲーションは、T非依存性抗原をT依存性抗原へと変換でき、そのことにより、メモリー応答を増強し、防御免疫の発現を可能にする。したがって、最も有効な糖ワクチンは、糖コンジュゲートに基づく。GBS莢膜多糖ワクチンに関する研究の多くは、Dennis Kasperらにより実施されており、参考文献1から9などの文献に記載されている。GBS血清型Ia、Ib、II、III、及びVのそれぞれのためのコンジュゲートワクチンは、ヒトにおいて安全で免疫原性であると示されている[10]。肺炎連鎖球菌感染防御における使用のための複数のワクチンが知られており、一般に、23種の主要な血清型(1、2、3、4、5、6b、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、及び33F)から選択される精製多糖からなり、たとえば、Prevnar 7(登録商標)、Synflorix(登録商標)及びPrevnar 13(登録商標)が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、莢膜多糖は体液性防御応答を誘導できる一方で、その防御は特定の血清型(すなわち、Ia、Ib、III等)に高度に特異的であり、他の血清型に対する交差防御は付与しない。したがって、GBSに対するさらなる改善されたコンジュゲートワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第1の態様では、本発明は、第1の血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位及び第2の異なる血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されている、キメラ莢膜多糖を提供する。キメラ莢膜多糖は、細菌莢膜多糖である。特に、キメラ莢膜多糖は、高分子量ポリマーであり、より特定すると、>30kDaの分子量(MW、molecular weight)、たとえば、約50kDaまで若しくはそれを超える、約100kDaまで若しくはそれを超える、約140kDaまで若しくはそれを超える、約200kDaまで若しくはそれを超える、約230kDaまで若しくはそれを超える、約260kDaまで若しくはそれを超える又はそれらの間の任意の範囲のMWを有し、たとえば、50〜200kDa、80〜150kDa、150〜300kDa、175〜275kDa又は175〜250kDaの範囲のMWを有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、第1のGBS血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位及び第2の異なるGBS血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されている、キメラ莢膜多糖を提供する。特に、これらの繰返し単位は平衡のとれたエピトープ比で存在し、より一層詳細には、繰返し単位は、1:1の比で存在する。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、第1のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位、第2のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位及び第3のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つの繰返し単位を含み、第1、第2及び第3の繰返し単位は、異なるGBS莢膜多糖血清型に由来し、繰返し単位がグリコシド結合により結合されている、キメラ莢膜多糖を提供する。
【０００９】
野生型GBS莢膜多糖は、グリコシド結合により結合している同一の繰返し単位から形成されるホモポリマーである。対照的に、本発明のキメラ莢膜多糖は、少なくとも2種の異なるGBS血清型の繰返し単位から形成されるヘテロポリマーである。より特定すると、キメラ多糖は個々の細菌細胞によりインビボで生成されるので、本発明の莢膜多糖は、少なくとも2種の異なるGBS血清型に由来する繰返し単位の構造を有する繰返し単位から形成されるヘテロポリマーである。
【００１０】
特定のキメラ多糖は、GBS莢膜血清型Ia+III、Ia+Ib+III、Ib+III、VII+IX、V+VII+IX、IV+V、V+VII及びIV+V+VIIに由来する繰返し単位の構造を有する繰返し単位を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は少なくとも5つの異なるタイプのグリコシド結合により結合された繰返し単位を含む、キメラ莢膜多糖を提供する。特に、グリコシド結合は、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAc、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-Glcp、β-d-Glcp-(1→2)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→4)-α-d-Glcpからなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、第1の肺炎連鎖球菌血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位及び第2の異なる肺炎連鎖球菌血清型の少なくとも1つの莢膜多糖繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されている、キメラ莢膜多糖を提供する。
【００１３】
第2の態様では、本発明は、（i）第1の態様のキメラ莢膜多糖及び（ii）キャリアタンパク質を含むコンジュゲートを提供する。好ましくは、キャリアタンパク質は、莢膜多糖に共有結合している。特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、莢膜多糖にリンカー、たとえばアジピン酸ジヒドラジドを介して共有結合している。好ましくは、コンジュゲートは、少なくとも2種の異なるGBS血清型、少なくとも3種の異なる血清型又はそれ以上に対する免疫応答を誘導可能な免疫原性コンジュゲートである。好ましくは、免疫応答は、防御免疫応答、たとえば交差防御免疫応答である。
【００１４】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、GBS80、GBS59及びGBS59 (6xD3)-1523からなる群から選択される。
【００１５】
第3の態様では、本発明は、第1の態様に記載のキメラ多糖及び/又は第2の態様に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。特に、キメラ多糖及び/又はコンジュゲートは、B群連鎖球菌により引き起こされる動物における全身感染を防止するのに有効な量である。特に、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む。より一層詳細には、本発明の医薬組成物は、B群連鎖球菌に対する免疫応答を惹起可能なワクチン組成物である。
【００１６】
第4の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートを患者に投与することを含む、B群連鎖球菌による感染に対して患者を免疫する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】cpsオペロンの一般化された構造を提供する図である。CPSアセンブリ遺伝子は、多くの他の莢膜細菌、たとえば肺炎連鎖球菌において概ね保存されている、長いポリシストロン性オペロンに位置する。
【図２】ストレプトコッカス・アガラクチア血清型III型及び肺炎連鎖球菌血清型14型のcpsオペロンの一般化された構造の比較を提供する図である。
【図３】GBS莢膜多糖Ia、Ib、IIIの繰返し単位の構造を示す図である。
【図４】GBS莢膜多糖IV、V及びVIの繰返し単位の構造を示す図である。
【図５】GBS莢膜多糖VII及びVIIIの繰返し単位の構造を示す図である。
【図６】GBS莢膜多糖IX及びIIの繰返し単位の構造を示す図である。
【図７】β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAcグリコシド結合により結合されたIa型繰返し単位及びIII型繰返し単位を含む、Ia/III型キメラ多糖を例示する図である。
【図８】β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAcグリコシド結合により結合されたIa型、III型及びIb型繰返し単位を含む、Ia/Ib/III型キメラ多糖の一例を提供する図である。
【図９】cps5Oを発現する血清型IX細菌から得られるキメラ繰返し単位を例示する図である。追加の側鎖を太字で示す。
【図１０】ストレプトコッカス・アガラクチアの異なる血清型に由来するCPSオペロンの概略図を提供する図である。各cps遺伝子を矢印で示す。
【図１１ａ】野生型血清型V及びIX GBS株をそれぞれ形質転換するために使用されるpAM-V及びpAM-IXの構造の図である。cps5M、cps5O及びcps5Iを、pAM401-p80/t80内にクローニングし、pAM-Vを得た。pAM401-p80/t80内へのcps9M及びcps9Iのクローニングを実施し、pAM-IXを得た。
【図１１ｂ】pAM-IX-Vの概略構造の図である。
【図１２】V型(pAM-IX)株がV型及びIX型特異的mAbの両方により特異的に認識される繰返し単位を含有するキメラ莢膜多糖鎖を産生することを示す、ポジティブなシグナルをPS V-IXが与える図である。cps9M及びcps9Iの異種イントランス(in-trans)発現は、GBS 2603 (V)が、V型及びIX型CPS特異的抗血清の両方と反応する莢膜多糖を構築することを可能にする。
【図１３】cps5M、cps5O及びcps5Iの異種イントランス発現は、GBS IT-NI-016 (IX)が、IX型及びV型CPS特異的抗血清の両方と反応する莢膜多糖を構築することを可能にする図である。
【図１４】PS V-IX及びPS V-IXbの1H NMRスペクトルの比較の図である。スペクトルは、PS V及びPS IXのものと高度に類似し、両方の莢膜多糖に特徴的な特性を含有する。PS V-IXbスペクトルは、PS V-IXよりもPS Vのものと類似する。
【図１５】PS V-IX及びPS V-IXbの平均繰返し単位組成を、DEPT NMRにより推定した図である。キメラV-IX型多糖の繰返し単位の約75％がIX型である一方で、残りの25％がV型である。キメラV-IXb型多糖の繰返し単位の約50％がIX型である一方で、残りの50％がV型である。
【図１６−１】血清型IaバックグラウンドでのPS-Ia-Ib-III又はPS-Ia-III作製のためのベクターの図である。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１７】V型(pAM-IX-V)株がV型及びIX型特異的mAbの両方により特異的に認識される繰返し単位を含有する15個のキメラ莢膜多糖鎖を産生することを示す、ポジティブなシグナルをPS V-IXbが与える図である。cps9M、cps9I、cps5M、cps5O及びcps5Iの組合せ異種イントランス発現は、GBS 2603 (V)が、V型及びIX型CPS特異的抗血清の両方と反応する莢膜多糖を構築することを可能にする。
【図１８】PS V-IX及びPS V-IXbのサンドイッチドットブロット解析の図である。
【図１９】同じ濃度のネイティブ多糖の半分の効率で、PSV-IXbが型特異的mAbと結合することを、競合ELISAが確認した図である。PSV-IXbは、均等にPS V及びPS IX RUにより構成されるようである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜糖に基づく。
【００１９】
GBSの莢膜糖は、ペプチドグリカン骨格に共有結合されており、これは、ペプチドグリカン骨格に結合されている別の糖であるB群抗原とは異なる。GBS莢膜多糖(CPS、capsular polysaccharides)の合成及び細胞壁結合を担うすべての遺伝子が、cpsオペロンにクラスター化している。このオペロンは、16〜18個の遺伝子から構成され、その配列は血清型間で異なる(図1)。いくつかの肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖アセンブリ経路は、GBSのものと非常に類似する。なぜなら、それらは両方がポリメラーゼ依存性だからである。詳細には、ポリメラーゼ依存性CPS合成機構を有する血清型内で、cpsオペロンは、同じ構成を有する(図2)。いくつかの肺炎連鎖球菌血清型では、CPSの化学構造までも、いくつかのGBS血清型のものと類似する。たとえば、肺炎連鎖球菌血清型14のCPS及びGBS血清型IIIの化学構造は非常に類似し、それらのcpsオペロンによりコードされるホモログタンパク質間のアミノ酸配列同一性率は、39.5％である。したがって、本発明が、GBSを特に強調して下に記載される一方で、本発明者らの知見はまた、肺炎連鎖球菌のキメラ多糖の調製にも適用できる。
【００２０】
GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及びIX莢膜多糖の正確な化学構造が、十分に記載されている(13〜20)。それらは、骨格及び1つ又は2つの側鎖を伴う、4から7個の単糖からなる繰返し単位から構成されている。4個の単糖(すなわち、Glcp、Galp、GlcpNAc、及びNeupNAc)が、10個の記載の血清型すべてに存在し、NeupNAc残基は、それらの側鎖のうちの1つの末端に常に見出される。しかしながら、グリコシド結合のパターンは、各血清型に固有である。したがって、サブユニット又は繰返し単位(RU、repeating unit)は、莢膜多糖の一部であり、繰返し単位を共に連続的に結合することによるその繰返しが、完全な多糖をもたらす。特に、繰返し単位は、オリゴ糖繰返し単位である。GBS莢膜多糖Ia、Ib、IIIのRUの構造を図3に示す。GBS莢膜多糖IV、V及びVIのRUの構造を図4に示す。GBS莢膜多糖VII及びVIIIのRUの構造を図5に示す。GBS莢膜多糖IX及びIIのRUの構造を図6に示す。
【００２１】
本発明者らは、外来性又は外因性cps遺伝子を発現する組換えGBS株が、キメラ莢膜多糖を産生できることを発見した。そのようなキメラ莢膜多糖は、2種以上の異なる血清型に由来する繰返し単位の構造を有する、2種以上の異なる繰返し単位を含む。キメラ莢膜多糖を、多価コンジュゲートワクチンの製造を単純化するために使用できる。
【００２２】
本発明のキメラ莢膜多糖はまた、GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX並びに肺炎連鎖球菌血清型1、2、3、4、5、6b、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、及び33Fのネイティブの野生型莢膜多糖に存在しない、新規エピトープを含んでいてもよい。莢膜多糖は、ワクチン接種の主要な標的のうちの1つであるので、GBS及び肺炎連鎖球菌の両方について主要なワクチン関連の関心の一つは、血清型間での莢膜スイッチング(capsular switching)の可能性である。莢膜多糖ベースのワクチン接種は、病原性遺伝子型に莢膜を切り替えてワクチンの範囲を逃れさせるような選択圧を及ぼしうる。結果として、新規エピトープを含むそのようなキメラ莢膜多糖の使用が、新しい莢膜血清型の出現を予防することによる莢膜スイッチングの防止又は低減という点において有利でありうる。
【００２３】
細菌
本発明のキメラ莢膜多糖は、遺伝子改変により少なくとも1種の外因性cps遺伝子を発現するストレプトコッカス・アガラクチアから調製される。したがって、本明細書において提供されるのは、キメラ莢膜多糖の作製のための遺伝子操作ストレプトコッカス・アガラクチア細菌であり、この細菌は、内因性莢膜多糖遺伝子クラスター及び少なくとも1つの外来性又は外因性cps遺伝子を含む。
【００２４】
cpsオペロンのDNA領域は、異なるGBS血清型の16個から18個の遺伝子から構成される[149]。5' cpsABCD遺伝子が、莢膜合成の調節に関与すると予測される。cpsEからcpsLに至るその中心領域は、多糖繰返し単位の合成、輸送、及び重合を担う酵素をコードする。最後に、neuBCDA遺伝子が、すべてのGBS莢膜多糖に存在する糖成分である活性化シアル酸の合成を担う[150]。図10は、各cps遺伝子を有するcpsオペロンの概略図を提供する。血清型Vに由来するcps遺伝子は、名称cps5G、cps5H、cps5M、cps5O等を使用して同定される。血清型IXに由来するcps遺伝子は、名称cps9G、cps9H、cps9M等を使用して同定される。他の血清型に由来するcps遺伝子は、同様の名称及び識別子、1a、1b、2、3、4、6、7及び8を使用して同定される。同様のcpsオペロンが、肺炎連鎖球菌に存在する。
【００２５】
「内因性」という用語は、生物のゲノムのその生来の位置にあるネイティブ遺伝子を指す。「外来性」又は「外因性」遺伝子は、形質転換される細胞に通常は存在しないか、又はおそらく、単に形質転換するDNA断片若しくは遺伝子に見出されるのと同じ形態、構造等では存在しない、DNA配列又は遺伝子を指し、たとえば、宿主細胞の血清型には通常見出されないが、遺伝子導入により導入されるcps遺伝子である。したがって、この意味での「外因性cps遺伝子」という用語の使用は、遺伝子操作細菌が、たとえばGBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IXから選択される第1の血清型のものであり、少なくとも1つの外因性cps遺伝子が、第2の異なる血清型に由来することを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌は、第2及び/又は第3、第4の異なる血清型に由来する、少なくとも2つの外因性cps遺伝子を発現する。少なくとも1つの外因性cps遺伝子は、cpsE、cpsF、cpsG、cpsH、cpsM、cpsO、cpsI、cpsJ、cpsP、cpsQ、cpsK及びcpsLからなる群から選択できる。特定の外因性cps遺伝子には、cpsM、cpsO及びcpsIが含まれる。少なくとも1つの外因性cps遺伝子は、遺伝子操作ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌細胞内に導入された外因性(たとえば組換え)核酸によりコードされる。
【００２６】
核酸は、ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌細胞における発現のための発現ベクター上に導入できる。発現ベクターは、一般に、導入核酸によりコードされる、内因性cps遺伝子を発現可能なシグナルを含む。たとえば、発現ベクターは、細菌細胞において機能する開始、プロモーター及び終止配列を含む、制御配列の完全なセットを含んでいてもよい。好適な発現ベクターは、目的の配列に機能的に連結される5'及び3'調節配列を含んでいてもよい。発現コンストラクトに提供される任意の調節配列の性質は、所望の発現パターンに依存する。調節配列のタイプは、当業者に知られているであろう。ベクターはまた、事前選択された位置での宿主細胞ゲノム内への遺伝子の挿入を可能にするよう、1つ以上の制限部位又は相同組換え部位を含有していてもよい。ヌクレオチド配列の場合には、これを、発現が改変される遺伝子配列に機能的に連結できる。発現ベクター上にまた提供されるのは、入ってくる遺伝子の発現を可能にする転写及び翻訳開始領域、転写及び翻訳終止領域、及び調節配列である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、相同及び/又は部位特異的組換えにより細菌染色体に送達され、組み込まれる。そのような遺伝子及び/又はオペロンを送達するために使用される組込み型ベクターは、条件的複製又は自殺プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン又は制限加水分解若しくはPCR増幅により得られる線状DNA断片でありうる。組込みは、好ましくは、インビトロでの成長に不要な染色体領域を標的にする。代わりに、発現ベクターは、非組込み型、たとえば、エピソームベクター、たとえば環状/線状複製プラスミド、コスミド、ファージミド（phasmid）、溶原性バクテリオファージ又は細菌人工染色体でありうる。組換え現象の選択は、選択可能な遺伝子マーカー、たとえば抗生物質(たとえばカナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、又はゲンタマイシン)耐性を付与する遺伝子、重金属及び/若しくは毒性化合物耐性を付与する遺伝子又は栄養要求突然変異を補完する遺伝子により選択できる。好適なベクター及び形質転換系は、当該技術分野において知られており、下に例示される。
【００２８】
目的のcps遺伝子は、単一の発現ベクターにコードされても、異なる発現ベクターにコードされてもよい。後者の場合には、異なる発現ベクターは、同時に又は連続的にのいずれかで、ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌細胞内に共トランスフェクトできる。「共トランスフェクション」は、ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌細胞に2つ以上の発現ベクターをトランスフェクトするプロセスを意味する。細胞に、1つ以上の第1のcps遺伝子を発現可能な発現ベクター及び1つ以上の第2のcps遺伝子を発現可能なベクターを共トランスフェクトするとき、ベクターは、独立に選択可能なマーカーを含有していてもよい。2つ以上の目的のcps遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、単一の発現ベクター内に含有される場合、いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、共通の制御エレメント(たとえばプロモーター)に機能的に連結されると考えられ、たとえば、共通の制御エレメントは、単一の発現ベクター上でヌクレオチド配列をコードするすべてのcps遺伝子の発現を制御する。いくつかの実施形態では、異なるcps遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、異なる制御エレメント(たとえばプロモーター)に機能的に連結される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列のうちの1つを、誘導性プロモーターに機能的に連結でき、他のヌクレオチド配列のうちの1つ以上を、構成的プロモーターに機能的に連結できる。
【００２９】
cps産生の下流工程を触媒する酵素の基質としての代替的繰返し単位間の競合は、同種又は異種繰返し単位の合成に有利となりうる。したがって、効率的なキメラ莢膜多糖産生は、内因性及び外因性cps遺伝子の適切に平衡のとれた発現を必要としうる。発現の平衡をとるために、当業者は、多くの選択肢を認識するであろう。これらには、非限定的な例として、（i）プロモーター置換、（ii）遺伝子付加、及び/又は（iii）遺伝子置換が含まれうる。
【００３０】
プロモーター置換では、1つ以上の内因性cps遺伝子の発現を制御するプロモーターを、より低い又はより高い発現レベルを提供するプロモーターと置換できる。本発明における使用のための特定のプロモーターは、GBS P80プロモーターである(Buccato S.ら (2006) J. Infect. Dis. 194、331〜340頁)。他のプロモーターが当該技術分野において知られており、バクテリオファージT7 R Aポリメラーゼプロモーター、trpプロモーター、lacオペロンプロモーター、ハイブリッドプロモーター、たとえば、lac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター等が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、目的のcps遺伝子は、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターに機能的に連結される。誘導性及び構成的プロモーターは、当業者によく知られている。
【００３１】
遺伝子付加では、内因性cps遺伝子をすでに発現する細菌が、関連遺伝子の第2のコピーを受け取る。この第2のコピーは、細菌染色体内に組み込めるか、又はエピソームエレメント、たとえばプラスミド上にありうる。遺伝子付加の効果は、遺伝子コピー数を増加させることにより、発現を相加的に増加させることである。プラスミドが使用される場合、それは理想的には、たとえば10を超える、又はさらには100を超える高いコピー数を有するプラスミドである。遺伝子置換では、遺伝子付加が生じるが、遺伝子の既存のコピーの除去を伴う。たとえば、少なくとも1つの内因性cps遺伝子が除去され、プラスミドにコードされたコピーに置換されてもよい。置換コピーからの発現は、使用されるプロモーターに応じて、以前のコピーからの発現より高くも低くもありうる。 したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作ストレプトコッカス・アガラクチア又は肺炎連鎖球菌細菌は、内因性莢膜多糖遺伝子クラスターの1つ以上の遺伝子の除去又は不活性化を含む。1つ以上の除去される遺伝子は、cpsE、cpsF、cpsG、cpsM、cpsI及びcpsJ、cpsM、cpsO及びcpsI遺伝子のうちの1つ以上を含んでいてもよい。置換コピーは、外因性cps遺伝子及び/又はネイティブの内因性cps遺伝子のコピーであってよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、2つ以上の遺伝子付加又は遺伝子置換現象が生じてもよく、結果として、目的のcps遺伝子の複数のコピーからの発現又は目的の異なるcps遺伝子の過剰若しくは過小発現の組合せが生じてもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、細菌は、外因性cpsO遺伝子、特にcps5O遺伝子を発現し、特に細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチア血清型IXである。図9は、cps5Oを発現する細菌から得られるキメラ血清型IX繰返し単位を例示し、追加の側鎖を太字で示す。
【００３４】
いくつかの実施形態では、細菌は、外因性cpsM及びcpsI遺伝子、特にcps9M及びcps9I遺伝子を発現し、特に細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチア血清型Vである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細菌は、外因性cpsM、cpsO及びcpsI遺伝子、特にcps5M、cps5O及びcps5I遺伝子を発現し、特に細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチア血清型IXである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、細菌は、GBS莢膜多糖血清型Iaの少なくとも1つの繰返し単位、GBS莢膜多糖血清型Ibの少なくとも1つの繰返し単位及びGBS莢膜多糖血清型IIIの少なくとも1つの繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されているキメラ莢膜多糖を産生する。特に、Ia、Ib及びIIIの繰返し単位の比は、約1:1:1である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、細菌は、GBS莢膜多糖血清型Vの少なくとも1つの繰返し単位及びGBS莢膜多糖血清型IXの少なくとも1つの繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されているキメラ莢膜多糖を産生する。特に、VのIXに対する繰返し単位の比は、約1:1である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、細菌は、GBS莢膜多糖血清型Vの少なくとも1つの繰返し単位、GBS莢膜多糖血清型IXの少なくとも1つの繰返し単位及びGBS莢膜多糖血清型VIIの少なくとも1つの繰返し単位を含み、繰返し単位がグリコシド結合により結合されているキメラ莢膜多糖を産生する。特に、V、IX及びVIIの繰返し単位の比は、約1:1:1である。
【００３９】
特に、「少なくとも1つの繰返し単位」への言及は、少なくとも2個、10個、20個、50個、60個、70個、80個、90個、100個の繰返し単位、少なくとも150個、200個、250個、500個、1000個以上の繰返し単位を指していてもよい。特に、繰返し単位の比は、約1:1又は1:1:1である。
【００４０】
本明細書に記載の核酸コンストラクト及びベクターを製造する方法は、当業者によく知られており、詳細な方法は実施例に示す。クローニング及び細菌形質転換方法、DNAベクター並びに調節配列の使用は、当業者によく知られており、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら、Wiley Interscience、2004年に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
キメラ莢膜多糖
本発明のキメラ莢膜多糖は、2種以上の異なるGBS又は肺炎連鎖球菌血清型に由来する繰返し単位の構造を有する、2種以上の異なる繰返し単位を含む。本発明のキメラ莢膜多糖はまた、第1の繰返し単位内の分子と第2の繰返し単位内の分子との間の少なくとも1つのグリコシド結合又は連結を含む。非限定的な例として、これらの分子は、一般に、炭水化物分子、たとえば糖分子である。第1の繰返し単位内の分子は、β-d-Glcpであってもよい。第2の繰返し単位内の分子は、β-d-Galp、β-d-GlcpNAc、β-d-Glcp又はα-d-Glcpであってよい。糖分子は、キメラ莢膜多糖における、第1の繰返し単位の1つの糖の炭素原子番号1(C1)と、第2の繰返し単位の1つの糖の第4の炭素原子(C4)との間の結合(1→4と表示)により、キメラ莢膜多糖における、第1の繰返し単位の1つの糖の炭素原子番号1(C1)と、第2の繰返し単位の1つの糖の第2の炭素原子(C2)との間の結合(1→2と表示)により、又は、キメラ莢膜多糖における、第1の繰返し単位の1つの糖の炭素原子番号1(C1)と、第2の繰返し単位の1つの糖の第6の炭素原子(C6)との間の結合(1→6と表示)により、結合できる。1→4、1→2及び1→6の使用は、糖において異なる番号の位置にある炭素原子間の共有結合を指す。莢膜多糖において繰返し単位間に生じる異なるグリコシド結合の特定の例には、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAc、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-Glcp、β-d-Glcp-(1→2)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→4)-α-d-Glcpが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも2つの異なるタイプのグリコシド結合により結合されたオリゴ糖繰返し単位を含む、キメラ莢膜多糖を提供する。特に、キメラ莢膜多糖は、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAc、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-Glcp、β-d-Glcp-(1→2)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→4)-α-d-Glcpからなる群から選択される少なくとも2つの異なるタイプのグリコシド結合により結合されるオリゴ糖繰返し単位を含んでいてもよい。
【００４２】
GBSのIa型及びIII型繰返し単位は、ほぼ同一であり、1→3結合により連結される二糖及び可変的な三糖を含有する。GBS血清型Ia及びIIIの野生型莢膜多糖間の唯一の違いは、ある繰返し単位を次のものと連結するグリコシド結合である。Ia型では、繰返し単位は、二糖のβ-d-Galpを通じて1→4結合される。III型繰返し単位では、可変的な三糖のβ-d-GlcpNAcを通じて1→6結合される。したがって、GBS血清型Ia及びIIIのキメラ莢膜多糖は、二糖のβ-d-Galpを通じて1→4結合された繰返し単位及び可変的な三糖のβ-d-GlcpNAcを通じて1→6結合された繰返し単位を含む。より詳細には、GBS血清型Ia及びIIIのキメラ莢膜多糖は、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAcグリコシド結合により結合されたオリゴ糖RUを含む。例として、Ia/III型キメラ多糖は、図7に示す配置で、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAcグリコシド結合により結合されたIa型RU及びIII型RUを含んでいてもよい。当業者は、他のRUの配置及び結合が可能なことを認識するであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は少なくとも5つの異なるタイプのグリコシド結合により結合されたオリゴ糖RUを含む、キメラ莢膜多糖を提供する。特に、グリコシド結合は、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAc、β-d-Glcp-(1→6)-β-d-Glcp、β-d-Glcp-(1→2)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→4)-α-d-Glcpからなる群から選択される。図8は、β-d-Glcp-(1→4)-β-d-Galp及びβ-d-Glcp-(1→6)-β-d-GlcpNAcグリコシド結合により結合されたIa型、III型及びIb型RUを含む、Ia/Ib/III型キメラ多糖の一例を提供する。当業者は、これらのRUの他の配置及び結合が可能なことを認めるであろう。
【００４４】
第1の莢膜多糖血清型のオリゴ糖RUの、第2の異なる莢膜多糖血清型のオリゴ糖RUに対する比は、変化してもよい。たとえば数又は質量により決定される好適な比は、1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1又は4:1を含んでいてもよい。一般に好ましい比は、平衡のとれたものであり、おおよそ1:1であるが、精確な比を正確に制御するのは困難でありうる。代わりに、第1の莢膜多糖血清型のオリゴ糖RU及び第2の異なる莢膜多糖血清型のオリゴ糖RUの含有量は、たとえば数又は質量により決定されるパーセンテージ(％)によって提示されてもよい。キメラ莢膜多糖が2種の異なる型のRUを含む場合、好ましくはRUの約50％が、一方の型のものであり、結合の約50％が、他方の型のものである。当業者は、そのようなパーセンテージが常に精確なわけではなく、これらの数値に一定の変動がありうることを認識するであろう。たとえば、約X％の第1のタイプ及び約Y％の第2のタイプのRUが存在し、Y=100-X、たとえば、X=30％のときY=70％、X=35％のときY=65％、X=40％のときY=60％等であってもよい。プラス又はマイナス10％、11％、12％、13％、14％、15％の変動は予測されうる。キメラ多糖が少なくとも3種の異なる型のRUを含む場合、好適な比としては、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:2:1、1:3:1、1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:4:1、1:4:2、1:4:3、1:4:4、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:1:4、2:2:1、2:3:1、2:4:1、4:1:1、4:1:2、4:1:3、4:1:4、4:2:1、4:3:1及び4:4:1が含まれる。同様に、好適な比率は、次のパターンX％+Y％+Z％=100％などであり得る。
【００４５】
キメラ莢膜多糖が2つの異なる種類のグリコシド結合を含む場合、好ましくはグリコシド結合の約50％が、一方の種類のものであり、結合の約50％が、他方の種類のものである。当業者は、そのようなパーセンテージが常に精確なわけではなく、これらの数値に一定の変動がありうることを認識するであろう。たとえば、約X％の一方の種類のグリコシド結合及び約Y％の他の種類が存在し、ここでY=100-Xである。たとえば、X=30％のときY=70％、X=35％のときY=65％、X=40％のときY=60％等であってもよい。
【００４６】
本発明のキメラ莢膜多糖は、天然形態であってもよいし又は改変されていてもよい。例えば、多糖は、本発明で用いるために、例えば弱酸中での加水分解によって、加熱によって、サイズ選別クロマトグラフィー（sizing  chromatography）などによって解重合させて、より短い断片を得ることができる。鎖長は、ウサギにおいてGBS糖の免疫原性に影響を及ぼすことが報告されている[4]。
【００４７】
特に、キメラ莢膜多糖は高分子量ポリマーである。GBSのためには、MW>30kDa、例えばおよそ50kDaまで、約100kDa、約140kDa、約200kDa、約230kDa、約260kDaのMV、又はこれらの間の任意の範囲、例えば50〜200kDa、80〜150kDa、150〜300kDa、175〜275kDa若しくは175〜250kDaの範囲のMWを有するキメラ莢膜多糖を用いることが好ましい。分子質量は、Polymer Standard Serviceから入手可能なものなどのデキストラン標準と比較してゲル濾過によって測定することができる[11]。
【００４８】
キメラ莢膜多糖は、化学的に修飾することができる。例えば、糖は、脱O-アセチル化（部分的若しくは完全に）、脱N-アセチル化（部分的若しくは完全に）、N-プロピオン酸化（N-propionated）（部分的若しくは完全に）などを受け得る。脱アセチル化は、コンジュゲートする前、その間、又はその後に起こり得るが、コンジュゲートする前に起こることが好ましい。特定の糖に応じて、脱アセチル化は免疫原性に影響を及ぼす場合と影響を及ぼさない場合がある。種々の血清型のGBS糖に対するO-アセチル化の関連性は参考文献12において論じられており、いくつかの実施形態では、7位、8位及び／又は9位のシアル酸残基のO-アセチル化が、コンジュゲートする前、その間及びその後で、例えば、保護／脱保護によって、再アセチル化によってなどで保持される。しかし、典型的には、本発明において使用されるキメラ莢膜多糖は、7位、8位及び／又は9位のシアル酸残基のO-アセチル化を実質的に有さない。特に、キメラ莢膜多糖が、後述するように塩基抽出によって精製された場合には、O-アセチル化は典型的には失われる（参考文献12）。脱アセチル化などの影響は、慣用のアッセイによって評価することができる。
【００４９】
キメラ莢膜多糖は、参考文献、例えば参考文献2及び13などに記載の公知の技法によって精製することができる。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、RNase/DNase処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、アニオン交換クロマトグラフィー、及びさらなる限外濾過を含む。GBS細胞を、細菌の細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素であるムタノリシン（mutanolysin）で処理することも有用である。
【００５０】
別の方法として、参考文献14に記載の精製プロセスを用いることができる。このプロセスは、塩基抽出、エタノール／CaCl2処理、CTAB沈殿、及び再可溶化を含む。別の代替のプロセスが参考文献15に記載されている。
【００５１】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来の莢膜多糖は、例えばEP497524及びEP497525に開示されているような、当技術分野で公知の標準的技法により調製することができる。
【００５２】
本発明のキメラ莢膜多糖はまた、その交差反応性の点で説明又は特定され得る。本明細書で用いる「交差反応性」という用語は、本発明のキメラ莢膜多糖により誘導される、少なくとも2つの異なるGBS又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型と反応可能な抗体の産生を刺激する免疫応答の能力を意味する。本明細書で用いる「交差防御性」という用語は、本発明のキメラ莢膜多糖により誘導される、少なくとも2つの異なるGBS又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型による感染症又は疾患を予防又は軽減する免疫応答の能力を意味する。本開示の特定の実施形態において、本開示のキメラ莢膜多糖は、複数のGBS又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型、例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の血清型に対して交差反応性及び／又は交差防御性である。交差反応性は、交差防御性の指標であるとみなされる。当業者であれば、本発明により、複数の感染性GBS又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型に対する防御を付与することができる1つのキメラ莢膜多糖の生成を可能にすることによりワクチン製造が容易になるということを容易に理解するだろう。
【００５３】
キメラ莢膜多糖のコンジュゲーション
本発明のキメラ莢膜多糖は、（i）キメラ莢膜多糖、及び（ii）キャリアタンパク質を含むコンジュゲートの形態で提供され得る。したがって、特定の実施形態において、（i）莢膜多糖、及び（ii）キャリアタンパク質を含むコンジュゲートは、上記莢膜多糖が、第1のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RU、及び第2のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RU、及び場合により、第3のGBS莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RUを含み、上記オリゴ糖RUはグリコシド結合により結合されていることを特徴とする。他の実施形態において、（i）莢膜多糖、及び（ii）キャリアタンパク質を含むコンジュゲートは、上記莢膜多糖が、第1の肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RU、及び第2の肺炎連鎖球菌莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RU、及び場合により、第3の肺炎連鎖球菌莢膜多糖血清型の少なくとも1つのオリゴ糖RUを含み、上記オリゴ糖RUはグリコシド結合により結合されていることを特徴とする。一般に、糖とキャリアの共有結合性コンジュゲーションにより、糖の免疫原性がT非依存性抗原からT依存性抗原に変換されるので、糖の免疫原性が増強され、したがって免疫記憶が刺激される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり［例えば、参考文献16］、これは周知の技法である［例えば、参考文献17〜25に概説されている］。したがって、本発明のプロセスは、精製された糖をキャリア分子とコンジュゲートするさらなるステップを含み得る。
【００５４】
「コンジュゲート」という用語は、キャリアタンパク質と共有結合により連結されたキメラ莢膜糖を意味する。いくつかの実施形態において、キメラ莢膜糖はキャリアタンパク質と直接的に連結される。他の実施形態において、キメラ莢膜糖は、スペーサー又はリンカーを介してタンパク質と間接的に連結される。本明細書で用いられる「直接的に連結」という用語は、2つの物質が化学結合、好ましくは共有結合を介して接続していることを意味する。本明細書で用いられる「間接的に連結」という用語は、2つの物質が、（直接共有結合とは対照的に）連結部分を介して接続していることを意味する。いくつかの実施形態において、リンカーはアジピン酸ジヒドラジドである。本発明において代表的なコンジュゲートとしては、キメラ莢膜多糖とキャリアタンパク質を一緒に結合することによって形成されたものが挙げられる。
【００５５】
多糖とタンパク質との共有結合は当技術分野で公知であり、一般的にリジンのアミン、アスパラギン酸/グルタミン酸のカルボキシル基、又はシステインのスルフヒドリルを標的化することにより行われる。例えば、糖ヒドロキシルからランダムに形成されたシアネートエステルを、タンパク質のリジン又はスペーサーのヒドラジンと反応させ、それを次いでカルボジイミド化学によりキャリアタンパク質のカルボン酸に縮合させることができる。あるいは、ランダム過ヨウ素酸酸化によって精製された多糖に生成させたアルデヒドを、キャリアタンパク質のアミンへの還元アミノ化に直接使用することができ、又はチオエーテル若しくはアミド結合形成を介したタンパク質へのコンジュゲーションステップを可能にするスペーサーの挿入を後で行うためにアミンに変換することができる。これらの方法によって得られた糖コンジュゲートは、複雑な架橋構造を示す。最終コンジュゲートの構造を単純化することを目的とする戦略は、精製された莢膜多糖の部分的加水分解と、その後の中間鎖長の集団を選択するための分画を利用する。その後、タンパク質へのコンジュゲーションの準備ができているジエステル又は二官能性リンカーのいずれかの挿入のために最終的に使用されるオリゴ糖還元末端に第一級アミノ基を導入することができる。
【００５６】
「キャリアタンパク質」という用語は、典型的には免疫系による抗原の検出を増強する又は簡便にする目的で、キメラ多糖を結合又は付着又はコンジュゲートさせるタンパク質を意味する。莢膜多糖は、免疫原性に乏しいT非依存性抗原であり、長期の防御免疫応答を生じない。多糖抗原とタンパク質キャリアとのコンジュゲーションによって、免疫エフェクター細胞が多糖に応答する状況が変化する。キャリアタンパク質という用語は、小さなペプチド及び大きなポリペプチド（>10 kDa）の両方を包含することが意図される。キャリアタンパク質は、1又は複数のTヘルパーエピトープを含み得る。ペプチドは、任意の手段により、例えば化学コンジュゲーションにより、キャリアタンパク質に結合させ得る。
【００５７】
有用なキャリアタンパク質としては、細菌毒素（トキシン）又はトキソイド、例えばジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイドなどが挙げられる。毒素又はトキソイドの断片、例えば、破傷風トキソイドの断片Cも用いることができる[26]。ジフテリア毒素のCRM197変異体[27-29]は、本発明に特に有用である。他の適切なキャリアタンパク質としては、髄膜炎菌（N.meningitidis）の外膜タンパク質[30]、合成ペプチド[31,32]、熱ショックタンパク質[33,34]、百日咳タンパク質[35,36]、サイトカイン[37]、リンフォカイン[37]、ホルモン[37]、増殖因子[37]、ヒト血清アルブミン（組換え型であることが好ましい）、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質[38]、例えば、N19[48]、インフルエンザ菌（H. influenzae）由来のプロテインD[40,41]、肺炎球菌の表面タンパク質PspA[42]、ニューモリシン[43]、鉄取り込みタンパク質[44]、C.ディフィシル（C.difficile）由来の毒素A又は毒素B[45]、組換え型の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の細胞外タンパク質（exoprotein）A（rEPA）[46]、GBSタンパク質[123]などが挙げられる。
【００５８】
特に好適なキャリアタンパク質としては、CRM197、破傷風トキソイド（TT）、破傷風トキソイド断片C、プロテインD、破傷風毒素及びジフテリアトキソイド（DT）の非毒性変異体が挙げられる。キャリアへの予備曝露は、ある場合には、糖コンジュゲートワクチンに対する抗炭水化物免疫応答の低減を生じることが観察されている（キャリアエピトープ抑制）。DT、TT及びCRM197（現在市場にある大部分の糖コンジュゲートワクチンの製造に通常使用されている）の代替物の使用がこの可能性を回避する1方法となり得る。他の好適なキャリアタンパク質としては、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）由来のタンパク質抗原GBS80、GBS67及びGBS59が挙げられる。他の好適なキャリアタンパク質としては、融合タンパク質、例えばGBS59(6xD3)（WO2011/121576に開示）及びGBS59(6xD3)-1523（EP14179945.2に開示）が挙げられる。このようなGBSタンパク質抗原の使用はGBSワクチンにとって有利であり得る。なぜなら、CRM197のような異種キャリアとは対照的に、このタンパク質が、多糖の免疫原性を増大する一方でまた防御免疫応答を引き起こすという2つの役割を有するためである。したがって、キャリアに対して誘起された免疫学的応答は、GBS、特にGBSタンパク質に対する追加的な防御免疫学的応答を提供し得る。
【００５９】
GBS糖のコンジュゲーションは、広く報告されている。例えば、参考文献1を参照されたい。GBS糖をコンジュゲートするための典型的な先行技術のプロセスは、典型的には、精製された糖の、破傷風トキソイド（TT）又はCRM197などのキャリアタンパク質との還元アミノ化を含む[2]。還元アミノ化には、キャリアのアミノ酸の側鎖上のアミン基及び糖のアルデヒド基が関与する。コンジュゲーション前に、糖のシアル酸残基の一部（例えば5〜40％の間、特に10〜30％の間、好ましくは約20％）を酸化（例えば、過ヨウ素酸酸化）することによってアルデヒド基を生成する[2,47]。別のコンジュゲーションプロセスは、参考文献48に記載の通り、糖の-NH2基（脱N-アセチル化によるものか、又はアミンの導入後のもの）を、二官能性リンカーと併せて用いることを含む。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートのうちの1又は複数はこのように調製されたものである。別の代替のプロセスがWO96/40795及びMichon et al. (2006) Clin Vaccine Immunol 2006 August; 13(8):936-43に記載されている。
【００６０】
キャリアへの結合は、-NH2基、例えば、キャリアタンパク質のリジン残基の側鎖の-NH2基、又はアルギニン残基の側鎖の-NH2基、又はN末端の-NH2基を介することが好ましい。結合は、-SH基、例えばシステイン残基の側鎖の-SH基を介してもよい。
【００６１】
典型的には、糖：タンパク質比（w/w）が1：5（すなわちタンパク質過剰）から5：1（すなわち糖過剰）の間、特に1：5から2：1の間、典型的には、約1：1から1：2の間、特に約1：1.3、約1：1から1：2の間、特に約1：1.3、約3：1から1：1の間、特に約2：1、約1：1〜1：5、特に約1：3.3、約2：1から1：1、特に約1.1：1の比率であるコンジュゲートを用いる。したがって、特に、長い糖鎖では、糖の重量過剰が典型的である。
【００６２】
組成物は、少量の遊離のキャリアを含み得る[49]。所与のキャリアタンパク質が本発明の組成物中に遊離形態及びコンジュゲート形態の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形態は、全体として、組成物中のキャリアタンパク質の総量の5％以下であることが好ましく、2重量％未満で存在することがより好ましい。
【００６３】
コンジュゲートした後、遊離の糖とコンジュゲートした糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどの多くの適切な方法がある［参考文献50及び51なども参照されたい］。好ましい方法は参考文献52に記載されている。
【００６４】
免疫原性組成物
一実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせた本発明のキメラ莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、1より多いコンジュゲートを含み得る。本発明の実施形態は、異なる種類のキメラ莢膜多糖を含む2種、3種、4種、5種又は6種のコンジュゲートを含み得る。
【００６５】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、具体的に記載されているもの以外のコンジュゲートを含まない。しかし、いくつかの実施形態では、組成物は他のコンジュゲートを含んでよい。免疫原性組成物は、単位用量あたり任意の適切な量のキメラ莢膜糖（複数可）を含んでよい。莢膜糖（複数可）の適切な量は、単位用量あたり0.1〜50μgであり得る。典型的には、各キメラ莢膜糖は、1〜30μg、例えば2〜25μg、特に5〜20μgの量で存在する。キメラ莢膜糖（複数可）の適切な量としては、単位用量あたり5、10及び20μgを挙げることができる。
【００６６】
本発明の免疫原性組成物を投与する方法を以下に論じる。簡単に述べると、本発明の免疫原性組成物は、単回用量又は複数回用量で投与することができる。本発明者らは、本発明の免疫原性組成物を単回用量で投与することが有効であることを見出した。あるいは、1つの単位用量の後に第2の単位用量を続けることが有効であり得る。典型的には、第2（又は第3、第4、第5など）の単位用量は第1の単位用量と同一である。第2の単位用量は、第1の単位用量の後の任意の適切な時間、特に1カ月後、2カ月後又は3カ月後に投与することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、筋肉内に、例えば下記の通り大腿又は上腕への筋肉内投与により、投与される。
【００６７】
本発明の免疫原性組成物は、1又は複数のアジュバントを含んでよい。しかし、アジュバントを含まない組成物の使用も想定され、例えば、潜在的な毒性を低下させるために、アジュバントを除くことが有利なこともある。したがって、いかなるアジュバントも含有しない又はいかなるアルミニウム塩アジュバントも含有しない免疫原性組成物が想定される。
【００６８】
コンジュゲートと他の抗原との組み合わせ
本発明の免疫原性組成物は、1又は複数の別の抗原を含んでよい。
【００６９】
別の抗原（複数可）は、別のGBSコンジュゲートを含んでよい。異なるGBSコンジュゲートは同じGBS血清型由来の異なる種類のコンジュゲート及び／又は異なるGBS血清型由来のコンジュゲートを含んでよい。組成物は、典型的には、別々のコンジュゲート（例えば、各血清型に対して異なるコンジュゲート）を調製し、次いでコンジュゲートを組み合わせることによって生成される。
【００７０】
別の抗原（複数可）は、下に詳述されているGBSのアミノ酸配列を含んでよい。
【００７１】
別の抗原（複数可）は、非GBS病原体由来の抗原を含んでよい。したがって、本発明の組成物は、追加的な細菌性抗原、ウイルス性抗原又は寄生生物性抗原を含めた1又は複数の非GBS抗原をさらに含んでよい。これらは以下から選択することができる：
【００７２】
−髄膜炎菌（N.meningitidis）血清群B由来のタンパク質抗原、例えば参考文献53〜59中のものなど。タンパク質「287」（以下を参照されたい）及び誘導体（例えば「ΔG287」）が特に好ましい。
−髄膜炎菌（N.meningitidis）血清群B由来の外膜小胞（OMV）調製物、例えば参考文献60、61、62、63などに開示されているものなど。
−髄膜炎菌（N.meningitidis）血清群A、C、W135及び／又はY由来の糖抗原、例えば参考文献64に開示されている血清群C由来のオリゴ糖又は参考文献65のオリゴ糖。
−肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来の糖抗原［例えば参考文献66〜68；参考文献75の第22章及び第23章］。
−A型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば不活化ウイルス［例えば69、70；参考文献75の第15章］。
−B型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば表面抗原及び／又はコア抗原など［例えば70、71；参考文献75の第16章］。
−C型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば72］。
−百日咳菌（Bordetella pertussis）由来の抗原、例えば百日咳菌由来の百日咳ホロ毒素（PT）及び線維状赤血球凝集素（FHA）、必要に応じてパータクチン並びに／又は凝集原2及び凝集原3とも組み合わせて［例えば参考文献73及び74；参考文献75の第21章］。
−ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイド［例えば、参考文献75の第13章］。
−破傷風抗原、例えば破傷風トキソイド［例えば、参考文献75の第27章］。
−インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）B由来の糖抗原［例えば参考文献75の第14章］
−N.ゴノロエ（N.gonorrhoeae）由来の抗原［例えば53、54、55］。
−クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）由来の抗原［例えば76、77、78、79、80、81、82］。
−クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）由来の抗原［例えば83］。
−ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）由来の抗原［例えば84］。
−ポリオ抗原（複数可）［例えば85、86；参考文献75の第24章］、例えばIPV。
−狂犬病抗原（複数可）［例えば87］、例えば凍結乾燥不活化ウイルス［例えば88、RabAvert(商標)］。
−麻疹抗原、ムンプス抗原及び／又は風疹抗原［例えば参考文献75の第19章、第20章及び第26章］。
−インフルエンザ抗原（複数可）［例えば参考文献75の第17章及び第18章］、例えば赤血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来の抗原［例えば89］。
−ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（A群連鎖球菌）由来の抗原［例えば90、91、92］。
−黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の抗原［例えば93］。
【００７３】
糖抗原又は炭水化物抗原を用いる場合、免疫原性を増強するために、その抗原をキャリアとコンジュゲートすることが好ましい。インフルエンザ菌B、髄膜炎菌及び肺炎球菌の糖抗原のコンジュゲーションが周知である。毒性のタンパク質抗原は、必要な場合、解毒することができる（例えば、化学的手段及び／又は遺伝的手段による百日咳毒素の解毒[74]）。
【００７４】
組成物にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原及び少なくとも1つの百日咳抗原も含まれ得る。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原及び百日咳抗原も含まれ得る。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原及び破傷風抗原も含まれ得る。
【００７５】
抗原をアルミニウム塩に吸着させることができる。組成物中に1より多いコンジュゲートが存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。
【００７６】
ある種類の好ましい組成物は、性感染病原体、例えばヘルペスウイルス、N.ゴノローエ、C.トラコマチスなどに由来する別の抗原を含む。別の種類の好ましい組成物は、高齢者及び／又は免疫無防備状態に影響を及ぼす別の抗原を含み、したがって、本発明のGBS抗原を、以下の非GBS病原体由来の1又は複数の抗原と組み合わせることができる：インフルエンザウイルス、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、及びパラインフルエンザウイルス。
【００７７】
組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも1μg/mlの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するために十分なものである。
【００７８】
本発明の組成物にタンパク質抗原を用いる代わりに、抗原をコードする核酸を用いることができる［例えば参考文献94〜102］。したがって、本発明の組成物のタンパク質成分を、そのタンパク質をコードする核酸（DNA、例えば、プラスミドの形態のDNAであることが好ましい）で置き換えることができる。
【００７９】
実用の点で、本発明の組成物に含める抗原の数には上限がある場合がある。本発明の組成物中の抗原（GBS抗原を含む）の数は、20未満、19未満、18未満、17未満、16未満、15未満、14未満、13未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、又は2未満であってよい。本発明の組成物中のGBS抗原の数は、6未満、5未満、4未満、3未満、又は2未満であってよい。
【００８０】
薬学的方法及び用途
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。典型的な「薬学的に許容される担体」としては、それ自体は、組成物を受け取る個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体が挙げられる。適切な担体は、典型的には、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、スクロース[103]、トレハロース[104]、ラクトース、及び脂質凝集体（例えば、油滴又はリポソーム）である。そのような担体は当業者に周知である。ワクチンは、例えば、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有してよい。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などが存在してよい。滅菌された、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤の詳細な論述は、参考文献105において入手可能である。
【００８１】
本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液若しくは懸濁液）又は乾燥した形態（例えば、凍結乾燥したもの）であってよい。乾燥ワクチンを用いる場合には、注射する前に液体媒体中に再構成する。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は当技術分野で公知であり、例えば、Menjugate(商標)製品が凍結乾燥した形態で存在している。本発明の免疫原性組成物が1より多い種類のキメラ莢膜糖を含むコンジュゲートを含む場合、コンジュゲートを別々に調製し、混合し、次いで凍結乾燥することが典型的である。このように、本明細書に記載のコンジュゲートの2種、3種又は4種などを含む凍結乾燥した組成物を調製することができる。凍結乾燥の間、コンジュゲートを安定化するために、糖アルコール（例えば、マンニトール）及び／又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を、例えば、1mg/mlから30mg/mlの間（例えば、約25mg/ml）で組成物に含めることが好ましい場合がある。スクロースの使用は、GBSコンジュゲートワクチンの安定剤として推奨されている（参考文献106）。しかし、本発明の安定剤はマンニトールであることが典型的である。乾燥ワクチンを、注射する前に液体媒体中に再構成する場合、残留するマンニトールの濃度は、典型的には、約2〜20mg/ml、例えば3.75mg/ml、7.5mg/ml又は15mg/mlになる。マンニトールの使用は、マンニトールがGBS莢膜糖の単糖繰り返し単位とは化学的に別個であるので有利である。これは、例えば品質管理分析のための莢膜糖の検出は、マンニトールに干渉されない上記糖の繰り返し単位の存在に基づき得ることを意味する。対照的に、スクロースのような安定剤は、グルコースを含有し、これは上記糖におけるグルコース繰り返し単位の検出に干渉し得る。
【００８２】
組成物はバイアル中に存在してよく、又は組成物は充填済み注射器中に存在してよい。注射器は、針を伴って、又は伴わずに供給することができる。注射器は、組成物の単回用量を含み、一方バイアルは、単回用量又は複数回用量を含むことができる。
【００８３】
本発明の水性組成物は、他のワクチンを凍結乾燥した形態から再構成するためにも適している。本発明の組成物がそのような即時の再構成のために用いるものである場合、本発明は、バイアル2つを含み得るキット、又は、充填済み注射器1つとバイアル1つを含み、注射する前に注射器の内容物を用いてバイアルの内容物を再活性化することができるキットを提供する。
【００８４】
本発明の組成物は、単位用量剤形又は複数回用量剤形に包装することができる。複数回用量剤形には充填済み注射器よりもバイアルの方が好ましい。有効な投与体積は常套的に確立することができるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射するためには、体積0.5mlである。
【００８５】
組成物のpHは、6から8の間であることが好ましく、約7であることが好ましい。安定なpHは、緩衝液を用いることによって維持することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物はリン酸二水素カリウム緩衝液を含む。リン酸二水素カリウム緩衝液は、約1〜10mM、例えば1.25mM、2.5mM又は5.0mMのリン酸二水素カリウムを含んでよい。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を用いることが好ましい[107]。組成物は、滅菌され得、かつ／又は発熱物質が不含であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００８６】
本発明の組成物は免疫原性であり、ワクチン組成物であることがより好ましい。本発明に係るワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するためのもの）又は治療的（すなわち、感染を処置するためのもの）のいずれかであり得るが、典型的には、予防的である。ワクチンとして用いる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）、並びに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、その量を個体に単回用量又はシリーズの一部として投与することが、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康及び身体の状態、処置される個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置にあたる医師による医学的な状況に関する評価、及び他の関連因子に応じて変動する。常套的な試行によって決定することができる量は比較的広範囲に入ることが予想される。
【００８７】
各用量の中で、個々の糖抗原の量は、一般に、0.1μgから50μgの間（糖の質量として測定する）、特に、1μgから50μgの間又は0.5μgから25μgの間、より詳細には、2.5〜7.5μg、例えば約1μg、約2.5μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg又は約25μgになる。各用量の中で、キメラ莢膜糖の総量は、一般に≦70μg（糖の質量として測定する）、例えば、≦60μgである。特に、総量は、≦40μg（例えば≦30μg）又は≦20μg（例えば≦15μg）であってよい。潜在的な毒性を低下させるために、単位用量あたりのキメラ莢膜糖（複数可）の総量を最小限にすることが有利であり得る。したがって、総量は≦20μg、例えば≦15μg、≦7.5μg又は≦1.5μgを用い得る。
【００８８】
GBS及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）は、体の種々の領域に影響を及ぼし、したがって、本発明の組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、注射剤として、液剤又は懸濁剤のいずれかとして調製することができる。組成物は、肺への投与のために、例えば、微粉又は噴霧剤を用いて吸入器（inhaler）として調製することができる。組成物は、坐薬又は膣坐薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳又は眼に投与するために、例えば、噴霧剤、点滴薬、ゲル剤又は散剤として調製することができる［例えば参考文献108及び109］。肺炎球菌の糖［110、111］、Hibの糖［112］、MenCの糖［113］、及びHib糖とMenC糖のコンジュゲートの混合物［114］の経鼻投与での成功が報告されている。
【００８９】
本発明の組成物は、特に複数回用量形式で包装する場合には、抗菌薬を含んでよい。本発明の組成物は、洗浄剤、例えば、Tween80などのTween（ポリソルベート）を含んでよい。洗浄剤は、一般に、低レベルで、例えば＜0.01％で存在する。本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでよい。10±2mg/mlのNaClの濃度が典型的である。いくつかの実施形態では、4〜10mg/ml、例えば9.0mg/ml、7.0mg/ml、6.75mg/ml又は4.5mg/mlのNaClの濃度を用いることができる。本発明の組成物は、一般に、バッファを含む。リン酸バッファが典型的である。本発明の組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。特に、組成物は、1又は複数のアジュバントを含んでよい。そのようなアジュバントは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、アルミニウム塩、例えばAlum（ミョウバン）及びMF59が挙げられる。
【００９０】
治療方法
本発明は、好適な哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法であって、本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体を伴うことが好ましい。より具体的には、免疫応答は、少なくとも2つの異なるGBS血清型に対して防御的であり、少なくとも2つのGBS血清型に対する抗体を伴うことが好ましい。この方法により、追加免疫応答（ブースター応答）を生じさせることができる。
【００９１】
好適な哺乳動物はヒトであることが好ましい。ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは、子ども（例えば幼児又は乳児）又はティーンエイジャーであることが好ましく、ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、ヒトは、成人であることが好ましい。例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために小児用ワクチンを成人に投与することもできる。処置するために好ましいヒトのクラスは、妊娠可能な年齢の女性（例えばティーンエイジャー以上）である。別の好ましいクラスは妊婦である。高齢の患者（例えば50歳超、60歳超、70歳超、80歳超又は90歳超など、特に65歳超の高齢の患者）、特に、GBS感染の危険性が増す可能性があるナーシングホームで生活している高齢の患者（[115]）は、処置するために好ましい別のヒトのクラスである。検出不可能なレベル（複数可）のGBS莢膜糖（複数可）に対する抗体を有する女性の新生児のGBS感染率はより高い可能性がある。これは、このGBS莢膜糖に対する母性抗体のレベルが高いことが、新生児における疾患リスクの低下と相関するからである［参考文献116及び117］。したがって、これらの女性への投与が本発明において具体的に想定される。
【００９２】
本発明は、医薬、例えばワクチンとして使用するための本発明の組成物も提供する。医薬は、好適な哺乳動物において免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、好適な哺乳動物において免疫応答を生じさせるための医薬の製造における本発明の組成物の使用も提供する。
【００９３】
これらの使用及び方法は、ストレプトコッカス・アガラクチア（S.agalactiae）によって引き起こされる疾患、例えば、新生児敗血症又は菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎などを予防及び／又は治療するためのものであり得る。これらの使用及び方法は、肺炎連鎖球菌（S.pneumoniae）によって引き起こされる疾患、例えば、気管支炎、鼻炎、急性副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂窩織炎及び脳膿瘍を予防及び／又は治療するためのものであり得る。
【００９４】
疾患を予防する被験体は、本発明のコンジュゲートを受ける被験体と同じでなくてよい。例えば、子を保護するために、女性（妊娠前又は妊娠中の）にコンジュゲートを投与することができる（いわゆる「母体免疫」[118-120]）。
【００９５】
治療的処置の効力を調査する1つの方法は、本発明の組成物を投与した後に、GBS感染をモニターすることを含む。予防的処置の効力を調査する1つの方法は、組成物を投与した後に、例えばGBS抗原に対する免疫応答をモニターすることを含む。
【００９６】
本発明の好ましい組成物は、各抗原性成分に対する血清保護（seroprotection）の基準よりも優れている抗体価を、ヒト被験体の許容できる百分率で患者に付与することができる。関連する抗体価が、宿主が抗原に対してセロコンバージョンすると考えられる抗体価を超える抗原は周知であり、そのような力価は、WHOなどの組織により公開されている。被験体の統計的に有意なサンプルの80％超、より好ましくは90％超、さらに好ましくは93％超、最も好ましくは96〜100％がセロコンバージョンすることが好ましい。
【００９７】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接的な送達は、非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、若しくは組織の間質腔へ）、又は直腸投与、経口投与、膣への投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺への投与又は他の粘膜投与によって実現することができる。大腿又は上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介してよいが、その代わりに無針注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。本発明は、全身免疫及び／又は粘膜免疫を惹起するために用いることができる。
【００９８】
投薬処置は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであってよい。複数回用量は、一次免疫スケジュール及び／又は追加免疫スケジュールで用いることができる。一次用量スケジュールの後に、追加免疫用量スケジュールを続けることができる。初回刺激用量の間（例えば、4〜16週の間）、及び初回刺激と追加免疫との間の適切なタイミングは、常套的に決定することができる。
【００９９】
GBSタンパク質抗原
上記の通り、GBSに対する防御について、GBSタンパク質を本発明の組成物に含めることができる。GBSタンパク質は、本発明のコンジュゲートのためのキャリアタンパク質、他のコンジュゲートのためのキャリアタンパク質、又はコンジュゲートしていないタンパク質抗原として用いることができる。
【０１００】
本発明で用いるためのGBSタンパク質抗原としては、参考文献90及び121〜123に開示されているものが挙げられる。本発明で用いるための2種の特定のGBSタンパク質抗原はGBS67及びGBS80として公知である［参考文献90を参照されたい］。本発明で用いるためのさらに好ましいGBSタンパク質抗原は、Spb1として公知である［参考文献124を参照されたい］。本発明で用いるための具体的なGBS融合タンパク質としては、GBS59(6xD3)及びGBS59(6xD3)-1523が挙げられる。これらの抗原のさらなる詳細は下に示されている。
【０１０１】
これらのタンパク質の配列は、本明細書の配列番号1〜22に示す。したがって、本発明の組成物は、（a）配列番号1〜22から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b）（i）配列番号1〜22のうちの1又は複数に対する配列同一性を有するアミノ酸配列及び／若しくは（ii）配列番号1〜22の断片を含むポリペプチドを含み得る。
【０１０２】
本発明の組成物はまた、これらのGBSタンパク質抗原の混合物を含んでよい。
【０１０３】
具体的には、本発明の組成物は、
（a1）配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b1）（i）配列番号1に対して配列同一性を有するアミノ酸配列及び／若しくは（ii）配列番号1の断片を含むポリペプチド、
（a2）配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b2）（i）配列番号7に対して配列同一性を有するアミノ酸配列及び／若しくは（ii）配列番号7の断片を含むポリペプチド、
（a3）配列番号13のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b3）（i）配列番号13に対して配列同一性を有するアミノ酸配列及び／若しくは（ii）配列番号13の断片を含むポリペプチド、
（a4）配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b3）（i）配列番号17に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（a5）配列番号22のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに／又は（b3）（i）配列番号22に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
を含み得る。
【０１０４】
特定の配列番号に応じて、（i）における配列同一性の程度は、50％（例えば60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上）を超えることが好ましい。これらのポリペプチドは、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子バリアント及び機能的変異体を含む。典型的には、2つのポリペプチド配列間の50％以上の同一性が、機能的同等性の指標になると考えられる。ポリペプチド間の同一性は、MPSRCHプログラム（Oxford Molecular）で実行されるSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムにより、ギャップオープンペナルティ＝12及びギャップ伸長ペナルティ＝1のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を用いて決定することが好ましい。
【０１０５】
特定の配列番号に応じて、（ii）の断片は、該配列由来の少なくともn個の連続したアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、nは、7以上（例えば8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100以上）である。断片は、該配列の少なくとも1つのT細胞エピトープ、又は、好ましくはB細胞エピトープを含んでよい。T細胞エピトープ及びB細胞エピトープは経験的に同定することができる（例えば、PEPSCAN[125,126]又は同様の方法を用いて）、又はT細胞エピトープ及びB細胞エピトープは、予測することができる（例えば、Jameson-Wolf抗原性指標[127]、マトリックスベースの手法[128]、TEPITOPE[129]、ニューラルネットワーク[130]、OptiMer & EpiMer[131,132]、ADEPT[133]、Tsites[134]、親水性[135]、抗原性指標[136]又は参考文献137に開示されている方法などを用いて）。N末端シグナルペプチド、リーダー配列領域若しくはシグナル配列領域、膜貫通領域、細胞質領域又は細胞壁アンカーモチーフなどの1又は複数のドメインの除去を用いることができる。
【０１０６】
これらのポリペプチドは、配列番号1〜22と比較して、1又は複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の保存的アミノ酸置換、すなわち、1つのアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸との置き換えを含んでよい。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、4つのファミリー：（1）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（2）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時には、一緒に芳香族アミノ酸に分類される。一般に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物活性に対して主要な影響を有さない。ポリペプチドは、配列番号1〜22と比較して、1又は複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の単一のアミノ酸の欠失を含んでもよい。ポリペプチドは、配列番号1〜22と比較して、1又は複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の挿入（例えば1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸又は5アミノ酸のそれぞれ）を含んでもよい。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、多くの方法で、例えば、化学合成によって（全体的又は部分的に）、長いポリペプチドをプロテアーゼを用いて消化することによって、RNAからの翻訳によって、細胞培養物から（例えば、組換え発現体から）、生物体自体から（例えば、細菌培養後に、若しくは患者から直接）精製することによってなどで調製することができる。＜40アミノ酸長のペプチドを生成するための好ましい方法は、in vitro化学合成を含む[138,139]。tBoc又はFmoc[140]化学に基づく方法などの固相ペプチド合成が特に好ましい。酵素的合成[141]も一部又は全部に用いることができる。化学合成の代替として、生物学的合成を用いることができ、例えば、ポリペプチドを翻訳によって生成することができる。これは、in vitro又はin vivoで行うことができる。生物学的方法は、一般に、L-アミノ酸に基づくポリペプチドの生成に限られるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルtRNA分子）の操作を用いて、D-アミノ酸（又は他の非天然アミノ酸、例えば、ヨードチロシン又はメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン（azidohomoalanine）など）の導入を可能にすることができる[142]。しかし、D-アミノ酸が含まれる場合、化学合成を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドは、C末端及び／又はN末端に共有結合による修飾を有してよい。
【０１０８】
これらのGBSタンパク質が本発明の組成物に含まれる場合には、これらのGBSタンパク質は種々の形態をとることができる（例えば、天然の形態、融合形態、グリコシル化された形態、グリコシル化されていない形態、脂質付加された形態、脂質付加されていない形態、リン酸化された形態、リン酸化されていない形態、ミリストイル化された形態、ミリストイル化されていない形態、単量体の形態、多量体の形態、粒子形態、変性した形態など）。これらのGBSタンパク質は、精製された形態又は実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）、特に、他のGBSポリペプチド又は宿主細胞ポリペプチドを含まない）形態で用いることが好ましい。
【０１０９】
GBS67
血清型Vの2603V/R株から配列決定されたGBS67のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、参考文献90に配列番号3745及び3746として記載されている。このアミノ酸配列は、本明細書では配列番号1である：
【０１１０】
【化１】
2018522978.tif 000002
【０１１１】
GBS67は、C末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号1のC末端に最も近い下線が引かれている領域によって示されている。膜貫通領域から1又は複数のアミノ酸を除去することができ、又はアミノ酸を膜貫通領域の前で切断することができる。そのようなGBS67断片の例は、配列番号2として下に記載されている。
【０１１２】
【化２】
2018522978.tif 000003
【０１１３】
GBS67は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号1においてイタリック体で示されている。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えGBS67タンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、本発明において用いるためのGBS67の1つの好ましい断片では、上記膜貫通及び上記細胞壁アンカーモチーフをGBS67から除去する。そのようなGBS67断片の例は下に配列番号3として記載されている。
【０１１４】
【化３】
2018522978.tif 000004
【０１１５】
あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現させたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、又は組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞又は細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。
【０１１６】
保存されたリジン残基を含有する3つのピリンモチーフがGBS67において同定されている。保存されたリジン残基は、アミノ酸残基478及び488、アミノ酸残基340及び342、及びアミノ酸残基703及び717にある。ピリン配列、特に保存されたリジン残基は、GBS67のオリゴマーのピリ線毛様構造の形成に重要であると考えられている。GBS67の好ましい断片は、少なくとも1つの保存されたリジン残基を含む。保存されたグルタミン酸残基を含有する2つのEボックスもGBS67において同定されている。GBS67の好ましい断片は、少なくとも1つの保存されたグルタミン酸残基を含む。GBS67は、アルファヘリックス構造を形成することが予測されるいくつかの領域を含有する。そのようなアルファヘリックス領域は、コイルドコイル構造を形成する可能性があり、またGBS67のオリゴマー形成に関与する可能性がある。GBS67は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）コラーゲン結合表面タンパク質（pfam05738）のCna_Bドメインと相同な領域も含有する。この領域は、ベータサンドイッチ構造を形成し得る。GBS67は、フォンウィルブランド因子（vWF）タイプAドメインと相同な領域を含有する。
【０１１７】
血清型IbのH36B株から配列決定されたGBS67のアミノ酸配列が参考文献143に配列番号20906として記載されている。このアミノ酸配列は、本明細書では配列番号4である：
【０１１８】
【化４】
2018522978.tif 000005
【０１１９】
いくつかの実施形態では、GBS67のこのバリアントを用いることができる。したがって、本明細書において、配列番号1を参照することによって本発明の実施形態が定義されている場合、配列番号1への参照は、配列番号4への参照で置き換えることができる。
【０１２０】
血清型Vの2603V/R株から配列決定されたGBS67と同様に、血清型IbのH36B株から配列決定されたGBS67は、C末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号2のC末端に最も近い下線が引かれている領域によって示されている。膜貫通領域から1又は複数のアミノ酸を除去することができ、又はアミノ酸を膜貫通領域の前で切断することができる。そのようなGBS67断片の例は下に配列番号5として記載されている。
【０１２１】
【化５】
2018522978.tif 000006
2018522978.tif 000007
【０１２２】
血清型Vの2603V/R株から配列決定されたGBS67と同様に、血清型IbのH36B株から配列決定されたGBS67は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号4においてイタリック体で示されている。したがって、本発明において用いるためのGBS67の1つの好ましい断片では、上記膜貫通及び上記細胞壁アンカーモチーフをGBS67から除去する。そのようなGBS67断片の例は下に配列番号6として記載されている。
【０１２３】
【化６】
2018522978.tif 000008
【０１２４】
GBS80
GBS80とは、推定上の細胞壁表面アンカーファミリータンパク質をいう。血清型Vの2603V/R分離株から配列決定されたGBS80のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、参考文献90において配列番号8779及び8780として記載されている。このアミノ酸配列は下に配列番号7として記載されている：
【０１２５】
【化７】
2018522978.tif 000009
【０１２６】
GBS80は、N末端のリーダー配列領域又はシグナル配列領域を含有し、それは、上記の下線が引かれている配列によって示されている。GBS80のリーダー配列領域又はシグナル配列領域から1又は複数のアミノ酸を除去することができる。そのようなGBS80断片の例は下に配列番号8として記載されている：
【０１２７】
【化８】
2018522978.tif 000010
【０１２８】
GBS80は、C末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号7の末端近くの下線が引かれている配列によって示される。1又は複数のアミノ酸を膜貫通領域及び／又は細胞質領域から除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号9として記載されている：
【０１２９】
【化９】
2018522978.tif 000011
【０１３０】
GBS80は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号7においてイタリック体で示されている。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えGBS80タンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、膜貫通領域及び／又は細胞質領域並びに細胞壁アンカーモチーフを、GBS80から除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号10として記載されている。
【０１３１】
【化１０】
2018522978.tif 000012
【０１３２】
あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現させたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、又は組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞又は細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。一実施形態では、リーダー配列領域若しくはシグナル配列領域、膜貫通領域及び細胞質領域及び細胞壁アンカーモチーフをGBS80配列から除去する。そのようなGBS80断片の例は下に配列番号11として記載されている：
【０１３３】
【化１１】
2018522978.tif 000013
【０１３４】
GBS80の特定の免疫原性断片はタンパク質のN末端に向かって位置し、本明細書では配列番号12として示される：
【０１３５】
【化１２】
2018522978.tif 000014
【０１３６】
Spb1
血清型IIIのCOH1株由来の野生型SpbI配列は、本明細書では配列番号13である：
【０１３７】
【化１３】
2018522978.tif 000015
【０１３８】
野生型SpbIは、N末端のリーダー配列領域又はシグナル配列領域を含有し、それは、上記の下線が引かれた配列によって示されている（アミノ酸1〜29）。SpbIのリーダー配列領域又はシグナル配列領域由来の1又は複数のアミノ酸を除去することができる。そのようなSpbI断片の例は下に配列番号14として記載されている：
【０１３９】
【化１４】
2018522978.tif 000016
【０１４０】
野生型SpbI配列は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフ（LPSTG）を含有する。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えSpbIタンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、細胞壁アンカーモチーフ及びこのモチーフのC末端側の配列を、SpbIから除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号15として記載されている：
【０１４１】
【化１５】
2018522978.tif 000017
【０１４２】
あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現されたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、又は組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞又は細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。一実施形態では、リーダー配列領域若しくはシグナル配列領域、細胞壁アンカーモチーフ及びこのモチーフのC末端側の配列をSpbIから除去する。そのようなSpbI断片の例は下に配列番号16として記載されている：
【０１４３】
【化１６】
2018522978.tif 000018
【０１４４】
保存されたグルタミン酸残基を含有するEボックスもSpbIにおいて同定されており（下線が引かれている）、残基423（太字）に保存されたグルタミン酸を有する。Eボックスモチーフは、オリゴマーのピリ線毛様構造の形成に重要である可能性があり、したがって、SpbIの有用な断片は保存されたグルタミン酸残基を含んでよい。
【０１４５】
野生型Spb1配列は、シャイン−ダルガルノ配列のコア配列（下線が引かれている）を含む上流の12merのTAATGGAGCTGT配列を有する内部メチオニンコドン（Met-162）を含む。このシャイン−ダルガルノ配列は、切断されたSpb1配列の翻訳が開始することが見出されている。この部位における翻訳の開始を妨げるために、シャイン−ダルガルノ配列を、発現のために用いられるSpb1コード配列において破壊することができる。任意の適切なヌクレオチドを変異させてリボソームの結合を妨げることができるが、この配列は、シャイン−ダルガルノコア及び内部メチオニンコドンを有するインフレームの両者の一部であるGGAグリシンコドンを含む。コードされるグリシンを変化させず、それにより、Spb1配列のいかなる変化も回避しながら、このコドンの3番目の塩基をC、G又はTに変異させることができる。
【０１４６】
GBS59(6xD3)
いくつかの好適なGBS59(6xD3)融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す：
配列番号17（融合物E）
【化１７】
2018522978.tif 000019
【０１４７】
配列番号18（融合物F）
【化１８】
2018522978.tif 000020
【０１４８】
配列番号19（融合物G）
【化１９】
2018522978.tif 000021
【０１４９】
配列番号20（融合物H）
【化２０】
2018522978.tif 000022
2018522978.tif 000023
【０１５０】
配列番号21（融合物I）
【化２１】
2018522978.tif 000024
【０１５１】
さらなる好適な配列はWO2011/121576号に示されている。
【０１５２】
GBS59(6xD3)-1523
GBS59(6xD3)-1523配列は、本明細書において配列番号22である：
【化２２】
2018522978.tif 000025
【０１５３】
さらなる好適な配列はEP14179945に示されている。
【０１５４】
一般
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」並びに「からなる（consisting）」を包含し、例えば、Xを「含む（comprising）」組成物は、Xから独占的になるものである、又は、追加的な何か、例えばX＋Yを含んでよい。
【０１５５】
「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語を本発明の定義から除くことができる。
【０１５６】
いくつかの実施において、「含む（comprising）」という用語は、列挙されたポリペプチドのような示された活性物質の包含、並びに他の活性物質、並びに製薬業界では公知のものとしての薬学的に許容される担体、賦形剤、皮膚軟化剤、安定剤などの包含を意味する。いくつかの実施において、「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、その有効成分のみが示された有効成分（複数可）である組成物を指すが、製剤の安定化、保存などのためであるが、示された有効成分の治療効果に直接関与していない他の化合物が含まれてもよい。「から本質的になる」という移行句の使用は、請求項の範囲が、請求項に記載された特定の材料又はステップを含むと解釈されるべきであり、請求される発明の基本的及び新規な特徴に重大な影響を及ぼさないものであることを意味する。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)（原文の強調）を参照のこと。MPEP§2111.03も参照のこと。したがって、本発明の請求項において使用される場合、用語「から本質的になる」は、「含む」と同等であると解釈されることを意図しない。用語「からなる」及びその変形は、他に明示的に指定されていない限り、含まれかつ限定されることを含む。数値xに関して「約」という用語は、例えば、x＋10％、x＋5％、x＋4％、x＋3％、x＋2％、x＋1％を意味する。「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語を本発明の定義から除くことができる。
【０１５７】
糖環は、開いた形態及び閉じた形態で存在できること、並びに、本明細書の構造式において閉じた形態が示されていても、開いた形態も本発明に包含されることが理解されよう。同様に、糖は、ピラノース型及びフラノース型で存在できること、並びに、本明細書の構造式においてピラノース型が示されていても、フラノース型も包含されることが理解される。糖の異なるアノマー形態も包含される。
【０１５８】
具体的に規定されていない限り、2つ又はそれより多くの成分を混合するステップを含むプロセスは、いかなる特定の混合の順序も必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。3つの成分が存在する場合には、2つの成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組み合わせ物を、第3の成分と組み合わせることができるなどである。
【０１５９】
抗体は、一般に、それらの標的に特異的である。したがって、抗体は、標的に対して、無関連の対照タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンに対する親和性よりも高い親和性を有する。
【０１６０】
別段の指定のない限り、ポリペプチド配列間の同一性は、MPSRCHプログラム（Oxford Molecular）において実行されるSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ＝12及びギャップ伸長ペナルティ＝1のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を用いて決定することが好ましい。
【０１６１】
発明を実施するための形態
細菌株及び増殖条件
GBS IX型IT-NI-016株(新生児早発性疾患症例から単離)は、Alberto Berardi(Policlinico di Modena、イタリア)の好意により提供され、これを、DEVANI研究の枠組みでラテックス及び分子アプローチにより単離及び分類した(144)。IX型単離物の莢膜遺伝子型を、ゲノム解析により確認した(下を参照のこと)。2603 V/R株(血清型V)を、Dennis Kasper(Harvard Medical School、Boston、MA)から得た。CJB111株(血清型V)を、Carol Baker(Baylor College of Medicine、Houston、TX)から得た。GBS野生型株を、37℃でトッド・ヘヴィット・ブロス(Difco Laboratories)又は5％ヒツジ血を添加したトリプチケースソイ寒天中で増殖させた。プラスミド「pAM-IX」及び「pAM-IX-V」(下を参照のこと)を有する形質転換クローンを選択し、クロラムフェニコール(Chl)(10μg/ml)を添加した前述の培地中で増幅させた。プラスミドクローニングのために、大腸菌HB101コンピテントセル(Promega)を使用した。細胞を37℃で、オービタル振盪培養器(180rpm)内で、ルリア・ベルターニ(LB、Difco laboratories)培地中又は15g/L寒天板(LBA)上で増殖させた。Chlを、陽性クローンの選択のために使用した(20μg/ml)。
【０１６２】
GBS IX型、V型及びVII型の遺伝子操作
プラスミドを、キメラCPS発現株を得るよう設計した。cpsオペロンIX型特異的遺伝子(cps9M及びcps9I)からなるDNA断片を、S.アガラクチアIT-NI-016ゲノムDNAから、特異的に設計されたプライマー(配列番号23:pAM-IX-F:'GCGGCGCGGCCGCGACATATTTGCTCTGATATGGCAG'、及び配列番号24:pAM-IX-R:'GCGGCAGATCTGGGATAATGATACTAATCATCTTC')並びに以下の反応サイクルを使用して、PCRにより増幅した。すなわち、98℃で1分;98℃で10秒、55℃で20秒、72℃で3分(30サイクル);72℃で7分。得られた断片(cps9M-9Iインサート、配列番号43)を、NotI/BglIIを用いて消化し、発現ベクターpAM-p80(145)(配列番号44)にライゲーションし、プラスミドpAM-cps9MI(cps9M及びcps9I、「pAM-IX」、配列番号45、図11)を得た。このプラスミドを、HB101選択クローンから精製し、シーケンシングし、以前に記載されたとおり(146)、1,800Vでのエレクトロポレーションにより、エレクトロコンピテントGBS 2603 V/R細胞又はCJB111細胞を形質転換するために使用した。この構成は、血清型V特異的遺伝子cps5MOIの単一コピー及びIX型特異的遺伝子の複数コピーからなるグリコシルトランスフェラーゼレパートリーを有する株をもたらす。
【０１６３】
cpsV型特異的遺伝子(cps5M、cps5O、及びcps5I、配列番号40、41及び42)からなるDNA断片を、S.アガラクチアCJB111ゲノムDNAから、特異的に設計されたプライマー:
配列番号25:pAM-V-F GCGGCGCGGCCGCGCTCTGATATGGCAGGAGGTAAGG 37
配列番号26:pAM-V-R GCGGCAGATCTGGGATAATGATACTAACTTTATCC 35)並びに以下の反応サイクルを使用して、PCRにより増幅した。すなわち、98℃で1分;98℃で10秒、55℃で20秒、72℃で3分(30サイクル);72℃で7分。得られた断片(cps5MOIインサート、配列番号53)を、発現ベクターpAM-p80(26)内にクローニングし、プラスミドpAM-cps5MOI(cps5M、cps5O、及びcps5Iを含有、「pAM-V」、配列番号52、図11)を得た。プラスミドを精製し、GBSをエレクトロポレーションにより形質転換するために使用した。IT-NI-016株(血清型IX)を、pAM-Vを用いて形質転換した。両方のプラスミドもまた、血清型VII CZ-PW-045株を形質転換するために使用した
【０１６４】
血清型特異的cps遺伝子の用量の変化がCPS構造に及ぼす効果を、cps5MOI領域をpAM-IXのcps9MI領域の下流に置く新規ベクターを構築することにより研究した。これは、より平衡のとれたキメラCPS V-IXを発現する新規株、すなわちPS V-IXbをもたらした。これを達成するため、cpsオペロンV型特異的遺伝子(cps5M、cps5O及びcps5I)からなるDNA断片を、S.アガラクチアCJB111ゲノムDNAから、特異的に設計されたプライマー:
pAM-V-IX-F(配列番号54):
'GCGGCAGATCTGTAAGGAAGGAAAATGATACCTAAAGTTAT'、及び
pAM-V-R:(配列番号26):
'GCGGCAGATCTGGGATAATGATACTAACTTTATCC')並びに以下の反応サイクルを使用して、PCRにより増幅した。すなわち、98℃で1分;98℃で10秒、55℃で20秒、72℃で3分(30サイクル);72℃で7分。得られた断片を、BglIIを用いて消化し、前に生成したベクターpAM-cps9MIにライゲーションし、プラスミドpAM-cps9MI-cps5MOI(cps9M、cps9I、cps5M、cps5O及びcps5Iインサート、配列番号56、「pAM-IX-V」、配列番号55)を得た。この得られたプラスミドを、HB101選択クローンから精製し、シーケンシングし、以前に記載されたとおり(146)、1,800Vでのエレクトロポレーションにより、エレクトロコンピテントGBS 2603 V/R細胞を形質転換するために使用した。
【０１６５】
血清及びモノクローナル抗体試薬
CRM197がコンジュゲートされたGBS PS IX及びPS Vに対するマウスモノクローナル抗体(mAb)を、Areta Internationalにより、標準的プロトコルを使用して生成した。簡潔に述べると、B細胞ハイブリドーマクローンを、CRM197にコンジュゲートされた各精製莢膜多糖を用いて免疫化されたCD1マウスの脾臓細胞から単離した。まず、陽性クローンをELISAにより選択し、次に、培養上清を、フローサイトメトリーにより対応基準株の表面との結合についてスクリーニングした。陽性初代ハイブリドーマクローンを、限界希釈によりシングルセルクローニング及びサブクローニングに供した。クローンの単クローン性は、増殖細胞を有するマイクロタイタープレートのすべてのウェルが、反復サブクローニング後に間接ELISAで陽性反応をもたらすときにのみ許容した。選択されたmAbは、プロテインGアフィニティークロマトグラフィーにより最終的に精製した。モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、IsoQuick Mouse Monoclonal Isotyping Kit(Sigma)により決定した。
【０１６６】
キメラ多糖の免疫化学的検出について、モノクローナル抗体の一部を、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Thermo Scientific)を製造者の指示に従い使用して、ビオチン化した。イタリアの法規を遵守し、Novartis Vaccines and Diagnostics、Siena、イタリアの機関審査委員会(動物倫理委員会)により承認されて、動物処置を実施した。
【０１６７】
CPS血清型決定及びフローサイトメトリー解析
ラテックス凝集アッセイによるGBS血清型決定を、Strep-B-Latexキット(Statens Serum Institut)を製造者の指示に従い使用して実行した。特異的抗莢膜多糖抗体を使用してフローサイトメトリーを実施した。THB中で対数期まで増殖させた細菌を回収し、0.1％(w/v)のPFAを含有するPBS中1h、37℃で固定した。固定細胞をPBSを用いて洗浄し、1h、室温で、V型又はIX型精製多糖に対して抗体産生させた免疫マウス血清とともにインキュベートし、0.1％のBSAを含有するPBS中1:200で希釈した。細胞を1時間、23℃で、R-フィコエリトリンがコンジュゲートされたF(ab)2ヤギ抗マウス免疫グロブリンGとともにインキュベートし、0.1％のBSAを含有するPBS中1:100に希釈した。すべてのデータを、BD FACS Calibur及びBD FACS CANTO II(BD Bioscience)を使用して、10,000事象を取得することにより収集し、Flow-Joソフトウェア(v.8.6、TreeStar Inc.)を用いてデータ解析を実施した。V型(pAM-IX)株がV型及びIX型特異的mAbの両方により特異的に認識される繰返し単位を含有するキメラ莢膜多糖鎖を産生することを示す、ポジティブなシグナルをPS V-IXは与える(図12)。cps9M及びcps9Iの異種イントランス発現は、GBS 2603 (V)が、V型及びIX型CPS特異的抗血清の両方と反応する莢膜多糖を構築することを可能にする(図12)。cps5M、cps5O及びcps5Iの異種イントランス発現は、GBS IT-NI-016 (IX)が、IX型及びV型CPS特異的抗血清の両方と反応する莢膜多糖を構築することを可能にする(図13)。V型(pAM-IX-V)がV型及びIX型特異的mAbの両方により特異的に認識される繰返し単位を含有するキメラ莢膜多糖鎖を産生するという事実の血清学的確証が得られた(図17)。
【０１６８】
cps莢膜生合成クラスターのDNA配列解析
アラインメント比較のため、V型基準株に由来するcps血清型特異領域のヌクレオチド配列を、NCBIデータベースから検索した(2603V/R、アクセッション番号NC_004116)。IX型単離物(IT-NI-016)に由来するcps血清型特異領域を、ゲノム配列から抽出した(147)。多重及びペアワイズ配列アラインメントを、Geneiousバージョン7.05(Biomatters、http://www.geneious.com/)を使用したMUSCLEを用いて実施した。
【０１６９】
キメラV-IX型莢膜多糖の単離及び精製
GBS遺伝子操作株2603 V/R(pAM-IX)を、クロラムフェニコール(10μg/ml)を伴うTHB中で静止期まで増殖させた8リットルの細菌培養からのキメラCPS V-IXの調製のために使用した。多糖を精製するため、4,000rpmで30分間の遠心分離により細菌ペレットを回収し、PBS中で洗浄し、0.8NのNaOHとともに37℃で36時間インキュベートした。4,000rpmでの30分間の遠心分離後、1Mのトリスバッファー(1:9 v/v)を上清に添加し、3NのHClを用いて中性pHに到達するまで希釈した。キメラV-IX型CPSをさらに精製するため、2MのCaCl2(最終濃度で0.1M)及びエタノール(最終濃度で30％ v/v)を溶液に添加した。4,000rpmでの30分間の遠心分離後、上清を、10kDa MWカットオフ(Hydrosart Sartorius、0.2m2表面)で、16単位量の50mMトリス/500mM NaCl pH8.8、及び10単位量の10mMリン酸ナトリウムpH7.2に対して、タンジェント流濾過に供した。
【０１７０】
次に試料を、ロータリーエバポレーター(Rotavapor(登録商標)、Buchi)を使用して濃縮し、3mlのアリコートに分け、それらを、100mM NaPO4/1M NaCl pH7.2中で事前に平衡化されたsephacryl(登録商標)S-500樹脂充填カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC、Size Exclusion Chromatography)により別々に精製した。クロマトグラフィー分離を、AKTA pureシステム(GE Healthcare)上で、10mM NaPO4/150mM NaCl pH7.2中0.3ml/分の流量で実施した。UV吸収を214nm、254nm、及び280nmで測定することにより多糖を検出し、主に単一の大きなピークとして現れる最初の溶出ピークにおいて画分で収集した。多糖溶液を、Sephadex(登録商標) G-15(GE Healthcare)樹脂充填カラムを通じ、水中1ml/分の流量で脱塩工程に供した。
【０１７１】
場合によって存在するGlcpNAc及びNeupNAc残基の完全N-アセチル化を再構成するため、エタノール中4.15μL/mL無水酢酸の1:1希釈溶液を試料に添加し、反応物を室温で2hインキュベートした。Rotavaporを使用して試料を濃縮し、Sephadex(登録商標) G-15充填カラム内に注入し、再アセチル化多糖を精製した。多糖調製物の純度を比色アッセイにより評価し、これは、残余タンパク質及び核酸の含有量が1％ w/w未満であることを示した。 高精製GBS V型、IX型及びV-IX型CPSを、上述のものと同様の精製プロセスをキメラPS V-IXに適用することにより得た。
【０１７２】
キメラ多糖の免疫化学的検出
サンドイッチELISA
マイクロタイターウェルを、一晩、4℃で、PBS中2.5μg/mlの各コーティングmABを100μl用いて、実験スキームに従いコーティングした。追加のタンパク質結合部位をブロッキングするため、ウェルを2h、室温で、PBS中3％のBSAを350μl用いて処理した。次に、プレートを2h、37℃で、漸減量の多糖を実験デザインに従い用いてインキュベートした。PBS/0.05％のTween(PBST)/1％のBSA中1:100で希釈された特異的ビオチン化標識モノクローナル抗体を、ウェルに添加し、続いて、37℃で振盪しながら1hインキュベートした。十分に洗浄したのち、プレートを45分間、PBST/1％のBSA中1:200で希釈された、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたストレプトアビジン(Thermo Scientific)を100μl用いてインキュベートした。洗浄後、発色性基質を結合コンジュゲートされた酵素に添加し、450nmでの吸光度を決定した。
【０１７３】
サンドイッチドットブロット
多糖分子のキメラ性を明らかにするため、多糖を、ネイティブPS Vに対する特異的mAbでコーティングされた膜上に捕捉し、次に、PS IXと高い親和性で結合する第2のmAbを用いて明らかにする、サンドイッチドットブロットを準備した。結果(図18)は、得られたキメラ多糖(PS V-IX及びPS V-IXb)の両方が、陰性対照であるネイティブPS V及びPS IXとは異なり、このアプローチにより陽性だと明らかになったことを示した。このデータは、PS V-IX及びPS V-IXbが、V型及びIX型の特徴的エピトープを受け継ぐ高分子量ハイブリッド鎖からなるキメラ莢膜多糖(cCPS)であることを実証する。なぜなら、それは、血清型特異的mAbの両方と、高い親和性及び特異性で結合するからである。
【０１７４】
ニトロセルロース膜に、PBS中0.45mg/mlに濃縮された5μlの各コーティングmAbを、実験スキームに従いスポットした。追加のタンパク質結合部位をブロッキングするため、膜を一晩4℃で、PBST/5％ブロッキング試薬(BioRad)とともに、振盪しながらインキュベートした。膜を切断し、元のmAbスポットに分離した。次に、得られたニトロセルロースディスクのそれぞれを、細胞培養プレート(Coster)の12個のウェルのうちの1つの中に分離した。各ウェルを、実験デザインに従い、PBST/3％ブロッキング試薬中25μg/mlに希釈された500μlの特異的多糖で満たした(図18)。プレートを2h、室温で、軽く振盪しながらインキュベートした。500μlのPBST/3％ブロッキング試薬中1:100で希釈された特異的ビオチン化標識抗PS-IXモノクローナル抗体を、各ウェルに添加し、続いて、室温で振盪しながら1hインキュベートした。十分に洗浄したのち、プレートを45分間、PBST/3％ブロッキング試薬中1:5000で希釈された、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたストレプトアビジン(Thermo Scientific)を500μl用いてインキュベートした。SuperSignal(登録商標) West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)を製造者の指示に従い使用して、ブロットを発色させた。
【０１７５】
競合ELISA
CPS特異的mAbのcCPSに対する結合効率を測定し、それらの構造特性のより定量的な推定を得るため、競合ELISAを準備した。結果(図19)は、PS V-IXbが、抗V型特異的mAb及び抗IX型特異的mAbの両方と、同じ濃度のネイティブ多糖の半分の効率で結合することを確認した。逆に、PS V-IXは、ネイティブ多糖に対して、抗V型特異的mAbとは15％で、抗IX型特異的mAbとは75％で結合可能である。これらの発見は、血清型特異的遺伝子コピー数の平衡が、最終cCPSにおける平衡のとれたエピトープ比をもたらすことを確認する。
【０１７６】
HAS-adhにコンジュゲートされたGBS PS V又はIXを用いたコーティング
・PBS pH7.4中のV及びIX(100μl/ウェル)について、PBS pH7.4中1μg/ml(100μl/ウェル)
・4℃で一晩のインキュベーション
・洗浄バッファー(1×PBS中0.05％のTween 20)での3×洗浄
コーティング後
・(1×PBS中2％のBSA、0.05％のTween 20)の250μl/ウェルの分注
・1.5時間、37℃でのインキュベーション
・吸引
PSを用いたmAbプレインキュベーション
mAb α-CRM-V
・分離されたポリプロピレンマイクロタイタープレート内でのPS希釈(17希釈、希釈バッファー)、
・IX:2段階工程(プレート内での第1の希釈:25μg/mLのPS)
・V-IX:2段階工程(プレート内での第1の希釈:25μg/mLのPS)
・V-IXb:2段階工程(プレート内での第1の希釈:25μg/mLのPS)
・V:2段階工程(プレート内での第1の希釈:0.3μg/mLのPS)
mAb α-CRM-IX
・分離されたポリプロピレンマイクロタイタープレート内でのPS希釈(9希釈、希釈バッファー)、
・IX:3段階工程(プレート内での第1の希釈:0.3μg/mLのPS)
・V-IX:3段階工程(プレート内での第1の希釈:0.75μg/mLのPS)
・V-IXb:3段階工程(プレート内での第1の希釈:0.75μg/mLのPS)
・V:3段階工程(プレート内での第1の希釈:0.75μg/mLのPS)
・固定濃度のmAbを各ウェルに添加した(等量の試験PS):12F1/H8(α-CRM-V)について0.03μg/mL、17B2/F6(α-CRM-IX)について0.1μg/mL。
・20分間、室温でのインキュベーション
mAbに対する結合の競合
・プレインキュベーション混合物を、コーティング及び飽和したプレートに移した
・1時間、37℃でのインキュベーション
・洗浄バッファー(1×PBS中0.05％のTween 20)での3×洗浄
二次抗体
・希釈バッファーで1:2000に希釈された、APがコンジュゲートされた抗マウスIgGの溶液を、各ウェルに100μL分注した
・1.5時間、37℃でのインキュベーション
・洗浄バッファー(1×PBS中0.05％のTween 20)での3×洗浄
基質添加
・基質バッファー中1.0mg/mLのp-ニトロフェニルリン酸(p-NPP)を100μL添加
・30分間、室温でのインキュベーション
・酵素反応を停止するため、100μLのEDTA7％を添加。
405〜620nmでプレートを読む。
【０１７７】
核磁気共鳴分光法
1H NMR実験を、高精度温度調節器を備えたBruker Avance III 400MHz分光計上で、5mm広帯域プローブ(Bruker)を使用し、記録した。TopSpinバージョン2.6ソフトウェア(Bruker)を、データ取得及び処理のために使用した。
【０１７８】
スペクトルを、25又は35+/-0.1℃で、10ppmのスペクトル幅にわたって32kのデータ点を用いて収集し、128のスキャンが蓄積した。スペクトルを、0.2Hzの線広がりを用いて重みづけし、フーリエ変換した。基準信号として使用される水の周波数に送信機を設定した(4.79ppm)。
【０１７９】
すべての一次元プロトンNMRスペクトルを、各信号の完全な回復を保証する総リサイクル時間(5×縦緩和時間T1)を使用して、定量的に得た。2つの得られたcCPS(PS V-IX及びPS V-IXb)間の差をより良好に解析するため、キメラ及びネイティブ多糖の両方に対して、炭素NMR分光法実験を実施した。
【０１８０】
PS V-IX 1H NMRスペクトルは、PS V及びPS IXのものと高度に類似し、両方の莢膜多糖に特徴的な特性を含有する。PS V-IXb 1H NMRスペクトルは、PSV-IXに対して、PS Vシグネチャーピーク(PS V-signature peaks)の強度がより高い(図14)。2つのキメラ多糖(PS V-IX及びPS V-IXb)の平均繰返し単位組成を、DEPT NMRにより推定した。およそ21.5から23ppmに及ぶスペクトルの領域では、GlcpNAc及びNeupNAcのN-アセチル基のCH3炭素が共鳴する。PS IX分枝GlcpNAc CH3の化学シフトは、PS Vスペクトルにおいて対応するものとは異なる(それぞれ22.55及び22.61ppm)。さらに、PS IX DEPTスペクトルにおける21.8ppmでの信号は、骨格GlcpNAc CH3に割り当てられ、したがって、PS Vスペクトルには存在しない。
【０１８１】
これらの観察から始めて、両方のcCPSについて、PS V構造特性のPS IX構造特性に対する相対比を、これらのCH3信号に関するピーク面積の積分から推定することが可能だった。拡大スペクトルを重ねたもの(図15)から明らかなとおり、V型及びIX型特性比は、PS V-IXにおいておよそ1:3であり、これはIX型の強度のおよそ4分の1である一方で、PS V-IXbにおける比は1:1に近い。これらの観察は、より高用量のcps5遺伝子の付加が、血清型V特異的グリコシルトランスフェラーゼのより高い活性、究極的には、PS V-IXに対して、PS V物理化学的特性のIX物理化学的特性に対するより平衡のとれた比をおそらくもたらすことを示唆する。キメラV-IX型多糖の繰返し単位の約75％がIX型である一方で、残りの25％がV型である(図15)。キメラV-IXb型多糖の繰返し単位の約50％がIX型である一方で、残りの50％がV型である(図15)。
【０１８２】
コンジュゲート生成
遺伝子操作ストレプトコッカス・アガラクチア血清型V及びIXに由来する精製キメラ莢膜多糖を、一部改変した参考文献2に開示の手順に従い、過ヨウ素酸酸化とそれに続く還元的アミノ化により、キャリアタンパク質にコンジュゲートした。CRM197をキャリアタンパク質として使用したが、このプロセスは、他のキャリアタンパク質、たとえば破傷風トキソイド、GBS80、GBS59、GBS59(6xD3)等に応用可能である。
【０１８３】
(1)酸化反応
シアル酸残基のC8に、C8-C9ジオール結合の酸化的開裂によりアルデヒド基を生成するため、酸化反応を実施した。この反応を、0.1Mの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を精製キメラ莢膜多糖溶液に添加し、撹拌しながら暗下で少なくとも2時間維持することにより実施した。
【０１８４】
この溶液を、反応中に生成されるホルムアルデヒド及び過ヨウ素酸ナトリウム副産物、たとえばヨウ素酸イオンを除去する限外濾過工程により、直ちに精製した。限外濾過は、30kD UF再生セルロース膜(1つの膜はHydrosart 30kD 0.1sm)を13単位量のリン酸ナトリウム100mM pH7.2バッファーに対して使用した、タンジェント流透析濾過/濃縮を用いて実施した。30kD膜は多糖を保持し、コンジュゲートはUF残余分において回収された。酸化多糖を、0.2μmで濾過し、2℃〜8℃で7日以内貯蔵した。
【０１８５】
(2)コンジュゲーション反応
コンジュゲーション反応は、酸化反応により生成されたいくつかのアルデヒド基と、タンパク質キャリアのリジンのいくつかのε-アミノ基との間で、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で還元的アミノ化により生じる。過ヨウ素酸処理キメラ莢膜多糖を、リン酸ナトリウム100mMを用いて希釈し、CRM197濃縮バルクを、PS濃度として6.35mg/mLの最終濃度を得るために添加した。CPS-CRMコンジュゲーションの標的反応条件は、以下のとおりである。すなわち、
- 多糖/CRM比(0.75/1 w/w)、
- 糖濃度(6.35 mg/mL)
- NaCNBH3(6.35 mg/mL)。
【０１８６】
多糖CRM比を使用して、多糖の変換をほぼ完了することを保証した。室温(RT)で、少なくとも10時間だが、28時間以内、pH7.2で、少なくとも45％のCRM変換(インプロセスSEC-HPLC試験によりモニタリングした)が達成されるまで、反応を実施した。
【０１８７】
(3)未精製コンジュゲートの希釈
コンジュゲーション反応の最後に、注射用蒸留水(WFI、water for injection)をリン酸ナトリウム35mMの最終バッファー濃度を得るために添加した。生成物を、0.2μmで濾過し、2℃〜8℃で、直ちに使用しない場合でも24時間以内で貯蔵した。
【０１８８】
(4)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
糖コンジュゲートを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより非コンジュゲートCRMから分離した。
【０１８９】
糖コンジュゲートはフロースルー中で回収され、一方で、CRMは樹脂と結合し、除去される。カラムは、ヒドロキシルアパタイトI型樹脂が充填されており、精製条件は以下のとおりである。すなわち、
1)平衡化: 35mMリン酸ナトリウムpH=7.2(5カラム量)
2)ローディング: 35mMリン酸ナトリウムpH=7.2(2.9カラム量)
3)ストリッピング: 400mMリン酸ナトリウムpH=6.8(2カラム量)
【０１９０】
生成物を、0.2μmで濾過し、2℃〜8℃で24時間以内貯蔵した。
【０１９１】
(5)失活反応
失活工程を、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)との反応により残留糖アルデヒド基を除去するために利用した。10mg/mLの水素化ホウ素ナトリウム溶液を、推定酸化シアル酸(すなわち総シアル酸の20％)に対して25:1のモル過剰で使用して、失活反応を実施した。少なくとも2時間反応を実施し、500mMリン酸ナトリウムの添加によりpHを8.3±0.2に維持した。最終30kD限外濾過を、コンジュゲーション及び失活低分子量試薬及び副産物を除去し、それを糖濃度で約1.0から1.5mg/mLの範囲まで濃縮するために使用した。
【０１９２】
免疫化及び免疫誘発（チャレンジ）
PS V-IX
GBS感染のマウス免疫誘発モデルを、抗原の保護効率を検証するために、以前に記載されたとおり(148)使用した。簡潔に述べると、8から16匹のCD-1メスマウス群(6〜8週齢)を、キメラ多糖コンジュゲート又はAlum（ミョウバン）アジュバントを配合したバッファー(PBS)を用いて免疫した。保護値を、[(対照死亡％-ワクチン死亡％)/対照死亡％]×100として算出した。
【０１９３】
【表１】
2018522978.tif 000026
【０１９４】
【表２】
2018522978.tif 000027
【０１９５】
V-IX型キメラ莢膜多糖を含むコンジュゲートを用いたマウスのワクチン接種は、GBS血清型IXを用いた免疫誘発に対してマウスを保護し、キメラ多糖コンジュゲートが、ネイティブ野生型IX多糖コンジュゲートと同等に有効であることを実証した。
【０１９６】
PS V-IXb
上述のGBS感染のマウス免疫誘発モデルを、PS V-IXbの保護効率を検証するために使用した。8から16匹のCD-1メスマウス群(6〜8週齢)を、新規キメラ多糖コンジュゲート、非キメラPS V若しくはIX又はAlum（ミョウバン）アジュバントを配合したバッファー(PBS)を用いて免疫した。保護値を、[(対照死亡％-ワクチン死亡％)/対照死亡％]×100として算出した。下の表に示すとおり、PS V-IXbを含むコンジュゲートを用いたマウスのワクチン接種は、GBS血清型IX及びVを用いた免疫誘発に対してマウスを保護し、この新規キメラ多糖コンジュゲートが、キメラに含有される2種の血清型の株に対して有効であることを実証した。
【０１９７】
【表３】
2018522978.tif 000028
【０１９８】
血清型Iaバックグラウンドでのキメラ多糖Ia-Ib-IIIの作製のためのプライマー及びベクター
3つのプラスミドが、「二価」Ia-IIキメラ多糖及び「三価」Ia-Ib-IIIキメラCPS発現株を得るために設計された。cpsオペロンIa型、Ib型及びIII型特異的遺伝子(cps1aH、cps1bJ、cps1bK及びcps3H)からなるDNA断片を、PCRにより、S.アガラクチアゲノムDNAから、特異的に設計された以下のフォワード及びリバースプライマーを使用して増幅した。
【０１９９】
【表４】
2018522978.tif 000029
【０２００】
以下の反応サイクルを使用した。すなわち、98℃で1分;98℃で10秒、55℃で20秒、72℃で3分(30サイクル);72℃で7分。
【０２０１】
得られた断片(cps3H-cps1bJ-cps1bKインサート、配列番号49;cps3H-cps1bjインサート、配列番号51;cps3H-cps1aHインサート、配列番号47)を、発現ベクターpAM-p80(145)(配列番号44)にライゲーションし、プラスミドpAM-Tris-L(配列番号48)、pAM-Tris-S(配列番号50)及び pAM-III-Ia-cpsH(配列番号46)を得た。このプラスミドを、選択クローンから精製し、シーケンシングし、以前に記載されたとおり(146)、1,800Vでのエレクトロポレーションにより、エレクトロコンピテントGBS血清型Ia細胞(090株)を形質転換するために使用した。ベクターを図16に示す。pAM-Tris-L又はpAM-Tris-Sのいずれかを用いて形質転換した細胞は、血清型Ia、Ib及びIIIの繰返し単位を含むキメラ多糖を産生する。pAM-III-Ia-cpsHを用いて形質転換した細胞は、血清型Ia及びIIIの繰返し単位を含むキメラ多糖を産生する。cps1aH、cps3H、cps1bJ、cps1bKの各配列はそれぞれ、配列番号36、37、38及び39に記載されている。
【０２０２】
本発明の特定の実施形態が上に記載及び詳細に例示された一方で、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなしに、様々な改変を加えることができる。
【０２０３】
参考文献
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2018522978.tif 000031
2018522978.tif 000032
2018522978.tif 000033
【図１】
2018522978.tif 000034
【図２】
2018522978.tif 000035
【図３】
2018522978.tif 000036
【図４】
2018522978.tif 000037
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018522978.tif 000056
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