(57)【要約】光受容体を作製する方法を開示する。光受容体を含む細胞集団およびその使用も開示する。2018521677.tif 000005
2018521677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患を処置する方法：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で前記分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程；
(c)光受容体について濃縮された細胞集団を作製するように、前記細胞混合集団中の前記光受容体を濃縮する工程；ならびに
(d)前記光受容体について濃縮された細胞集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患を処置する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、光受容体を作製する方法：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で前記分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程；
(c)光受容体について濃縮された細胞集団を作製するように、前記細胞混合集団中の前記光受容体を濃縮する工程；ならびに
(d)前記光受容体について濃縮された細胞集団を増殖させる工程。
【請求項３】
工程(c)が機械的単離によって行われる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患を処置する方法：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で前記分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程であって、該細胞混合集団の少なくとも10％が光受容体である、工程；ならびに
(c)前記細胞混合集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患を処置する工程。
【請求項５】
前記細胞濃縮集団中の全ての細胞の80％未満がRPE細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
工程(a)の前に前記ヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1、2または4に記載の方法。
【請求項７】
工程(c)の後かつ工程(d)の前に前記光受容体の集団を増殖させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
工程(c)の後かつ工程(d)の前に前記光受容体を凍結保存する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
工程(d)の後に前記光受容体を凍結保存する工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)の後かつ工程(c)の前に前記細胞混合集団を凍結保存する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結保存する工程が、90％ヒト血清/10％DMSO、 CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell banker、およびPrime XV(登録商標)FreezISからなる群より選択される培地中で行われる、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化作用物質がニコチンアミドを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程(a)の培地がアクチビンAを欠いている、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記TGFβスーパーファミリーのメンバーが、TGFβ1、TGFβ3、およびアクチビンAからなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程(b)の培地が、ニコチンアミドおよびアクチビンAを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程(b)の後かつ工程(c)の前に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠いている培地中で前記光受容体を培養する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
工程(a)が非接着性条件下で行われる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非接着性条件が非接着性培養プレートを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記非接着性条件が非接着性基質を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
工程(a)が、
(i)非接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を含む細胞のクラスターを作製する工程；および続いて
(ii)接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中で(i)の前記分化細胞を培養する工程
を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程(ii)の前に前記細胞のクラスターを解離させ、細胞の凝集塊または細胞のシングルセル懸濁物を作製する工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
工程(a)が少なくとも1日間行われる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程(b)が少なくとも1日間行われる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養の少なくとも一部が、大気中酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養が、大気中酸素レベルが約10％を上回る条件下で行われる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒト多能性幹細胞がフィーダー細胞上で増殖される、請求項6に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィーダー細胞がヒト臍帯線維芽細胞を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
移植が眼の網膜下腔で行われる、請求項1または4に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、懸濁物の状態で、またはマトリックスもしくは基質上に固定化された細胞の単層として、移植される、請求項1または4に記載の方法。
【請求項３１】
請求項2に記載の方法により作製された光受容体の集団。
【請求項３２】
前記網膜疾患または網膜障害が、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害のうちの少なくとも1つから選択される、請求項1または4に記載の方法。
【請求項３３】
請求項31に記載の光受容体の集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患または網膜障害を処置する工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患または網膜障害を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの態様において、多能性幹細胞から光受容体を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜色素変性および加齢黄斑変性を含む、さまざまな眼疾患は、失明につながる光受容体細胞の欠失によって特徴付けられる。ひとたび光受容体が変性してしまうと、細胞置換または人工器官が唯一の治療選択肢となる。光受容体細胞置換は成熟マウスにおいてですら実現可能性が示されており、ここで、網膜下腔に移植された光受容体は網膜内に統合されかつ機能した(MacLaren et al., 2006)。複数のプロトコール(2Dおよび3D)が、ヒト胚性幹細胞からの網膜前駆体および光受容体の誘導のために開発されている(Osakada et al., 2008; Meyer et al., 2009および2011; Nakano et al., 2012; Gonzalez-Cordero et al., 2013; Zhong et al., 2014)。
【０００３】
さらなる背景技術には、WO 2013/114360、WO 2008/129554およびWO 2013/184809が含まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の1つの局面によれば、以下の工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患を処置する方法が提供される：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程；
(c)光受容体について濃縮された細胞集団を作製するように、細胞混合集団中の光受容体を濃縮する工程；ならびに
(d)光受容体について濃縮された細胞集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患を処置する工程。
【０００５】
本発明の1つの局面によれば、以下の工程を含む光受容体を作製する方法が提供される：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程；
(c)光受容体について濃縮された細胞集団を作製するように、細胞混合集団中の光受容体を濃縮する工程；ならびに
(d)光受容体について濃縮された細胞集団を増殖させる工程。
【０００６】
本発明の1つの局面によれば、本明細書に記載の光受容体の集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患または網膜障害を処置する工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患または網膜障害を処置する方法が提供される。
【０００７】
本発明の1つの局面によれば、以下の工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患を処置する方法が提供される：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程であって、細胞混合集団の少なくとも10％が光受容体である、工程；ならびに
(c)細胞混合集団の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患を処置する工程。
【０００８】
本発明の1つの局面によれば、本明細書に記載のように作製される光受容体の集団が提供される。
【０００９】
本発明の態様によれば、工程(c)は機械的単離によって行われる。
【００１０】
本発明の態様によれば、細胞濃縮集団中の全細胞の80％未満はRPE細胞である。
【００１１】
本発明の態様によれば、方法は、工程(a)の前にヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む。
【００１２】
本発明の態様によれば、方法は、工程(c)の後かつ工程(d)の前に、光受容体の集団を増殖させる工程をさらに含む。
【００１３】
本発明の態様によれば、方法は、工程(c)の後かつ工程(d)の前に、光受容体を凍結保存する工程をさらに含む。
【００１４】
本発明の態様によれば、方法は、工程(d)の後に、光受容体を凍結保存する工程をさらに含む。
【００１５】
本発明の態様によれば、方法は、工程(b)の後かつ工程(c)の前に、細胞混合集団を凍結保存する工程をさらに含む。
【００１６】
本発明の態様によれば、凍結保存する工程は、90％ヒト血清/10％DMSO、CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell bankerおよびPrime XV(登録商標)FreezISからなる群より選択される培地中で行われる。
【００１７】
本発明の態様によれば、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)を含む。
【００１８】
本発明の態様によれば、分化作用物質はニコチンアミドを含む。
【００１９】
本発明の態様によれば、工程(a)の培地はアクチビンAを欠いている。
【００２０】
本発明の態様によれば、TGFβスーパーファミリーのメンバーは、TGFβ1、TGFβ3、およびアクチビンAからなる群より選択される。
【００２１】
本発明の態様によれば、工程(b)の培地はニコチンアミドおよびアクチビンAを含む。
【００２２】
本発明の態様によれば、方法は、工程(b)の後かつ工程(c)の前に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠いている培地中で光受容体を培養する工程をさらに含む。
【００２３】
本発明の態様によれば、工程(a)は非接着性条件下で行われる。
【００２４】
本発明の態様によれば、非接着性条件は、非接着性培養プレートを含む。
【００２５】
本発明の態様によれば、非接着性条件は非接着性基質を含む。
【００２６】
本発明の態様によれば、工程(a)は以下を含む：
(i)非接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を含む細胞のクラスターを作製する工程；および続いて
(ii)接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中で(i)の分化細胞を培養する工程。
【００２７】
本発明の態様によれば、方法は、工程(ii)の前に細胞のクラスターを解離させ、細胞の凝集塊または細胞のシングルセル懸濁物を作製する工程をさらに含む。
【００２８】
本発明の態様によれば、工程(a)は少なくとも1日間行われる。
【００２９】
本発明の態様によれば、工程(b)は少なくとも1日間行われる。
【００３０】
本発明の態様によれば、培養の少なくとも一部は、大気中酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる。
【００３１】
本発明の態様によれば、培養は、大気中酸素レベルが約10％を上回る条件下で行われる。
【００３２】
本発明の態様によれば、方法は、ヒト多能性幹細胞はフィーダー細胞上で増殖される。
【００３３】
本発明の態様によれば、フィーダー細胞はヒト臍帯線維芽細胞を含む。
【００３４】
本発明の態様によれば、移植は眼の網膜下腔で行われる。
【００３５】
本発明の態様によれば、細胞は、懸濁物の状態で、またはマトリックスもしくは基質上に固定化された細胞の単層として、移植される。
【００３６】
本発明の態様によれば、網膜疾患または網膜障害は、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害のうちの少なくとも1つから選択される。
【００３７】
他に定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および/または科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の態様の実施またはテストで用いることができるが、例示的な方法および/または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含む特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は例示のみを目的とし、必ずしも限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の一部の態様が、例示のためにのみ、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。ここで該図面を詳細に具体的に参照して、示されている事項は例示のためでありかつ本発明の態様の例示的説明を目的とすることが強調される。この点について、図面によって行われた説明は、当業者に本発明の態様を実施しうる方法を明らかにする。
【００３９】
【図１】RPE製造プロセス(図1A)および光受容体製造プロセス(図1B)および工程内管理(in-process control)ポイント(黄色い星、工程内管理、IPC 1〜11)の略図である。NUTSPlus、bFGFおよびTGFβを含有するNutristem培地； NUTSMinus、bFGFおよびTGFβを含まないNutristem培地；NIC、ニコチンアミド。
【図２】ニコチンアミドおよびアクチビンAによるhESCの分化後のChx1O(図2A)、Nrl(図2B)、ロドプシン(図2C)、Rax(図2D)、MITF(図2E)およびリカバリン(図2F)の発現の上方制御を図示するグラフである。図2Eは、予想通りに、RPEの増殖時にMITF相対的発現が増大することを図示する。M4、Mock 4；QC、工程内品質管理；HAD102c：HAD-C 102 hESC；huRPE：ヒト胚性RPE (市販、ScienCell)；M4-QC1：手動の継代後のMock 4 HAD-C 102-hESC；M4-QC2：コラゲナーゼ継代後のHAD-C 102-hESC；M4-QC4：ニコチンアミド アクチビンAによる2週間後の Mock 4細胞；M4-QC5：ニコチンアミドおよびアクチビンAによる分化段階の最後でのMock 4 細胞；M4-QC8：継代P0(1増殖サイクル)でのMock 4細胞；M4-QC11：凍結保存後の継代P2でのMock 4細胞(薬物製品)。
【図３】ニコチンアミドおよびアクチビンAによるhESCの分化後のChx1O(図3A)、Nrl(図3B)、MITF(図3C)およびロドプシン(図3D)の上方制御を図示するグラフである。M5、Mock 5；QC、工程内品質管理；HAD102c：HAD-C 102 hESC；huRPE：ヒト胚性RPE (市販、ScienCell)；M5-QC1：機械的増殖後のMock 5 HAD-C 102-hESC；M5-QC5：ニコチンアミドおよびアクチビンAによる分化段階の最後でのMock 5細胞；M5-QC8：継代P0(1増殖サイクル)でのMock 5細胞；M5-QC11：凍結保存後の継代P2でのMock 5細胞(薬物製品)。
【図４】網膜マーカーの評価で用いられたプローブの特異性を図示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の特定の態様の説明
本発明は、そのいくつかの態様において、多能性幹細胞から光受容体細胞を調製する方法に関する。
【００４１】
本発明の少なくとも1つの態様を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に記述されているかまたは実施例により例示されている詳細にその適用が限定される必要がないことが理解されるべきである。本発明は他の態様が可能か、または様々な方法で実施または実行することができる。
【００４２】
ヒト胚性幹細胞は、網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む網膜細胞の作製の細胞供給源として提案されている。
【００４３】
米国特許第8,956,866号は、ニコチンアミドおよびアクチビンAを含むいくつかの因子を用いる分化誘導アプローチを用いてRPE細胞を作製するための方法を提供する。
【００４４】
ここで本発明者らは、米国特許第8,956,866号に開示されたアプローチを用いて、RPE細胞を得ることと同様に、光受容体を得ることが可能であることを示している。そのような光受容体は、無数にある網膜障害の処置に有用である。
【００４５】
したがって、本発明の第1の局面によれば、以下の工程を含む、光受容体を作製する方法が提供される：
(a)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(b)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地を含む培養系で分化細胞を培養し、それによって網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体を含む細胞混合集団を作製する工程；
(c)光受容体について濃縮された細胞集団を作製するように、細胞混合集団中の光受容体を濃縮する工程；ならびに
(d)光受容体について濃縮された細胞集団を増殖させる工程。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「光受容体」は、光伝達の能力を有する生体細胞を指す。本発明のこの局面の光受容体は、桿状体および/または錐状体をとりうる。好ましくは、眼の中に移植したとき、それらは、ネイティブな光受容体のものと類似する機能的活性を示す。
【００４７】
1つの態様によれば、光受容体細胞は、少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つの光受容体細胞のマーカーを発現する。そのようなマーカーには、これらに限定されないが、CHX10/VSX2 (視覚系ホメオボックス2(visual system homeobox 2))、ロドプシン、CRX、アレスチン、オプシン、リカバリンおよびNRL(神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質)が含まれる。
【００４８】
さらに別の態様によれば、光受容体細胞は、黄斑変性などの疾患を処置する能力を有する。
【００４９】
「網膜色素上皮細胞」、「RPE細胞」、「RPE」は、文脈が許す限り互換的に用いることができ、網膜の色素上皮細胞層を形成するネイティブなRPE細胞のものと機能的に類似する細胞型の細胞を指す(例えば、眼の中に移植されると、それらはネイティブなRPE細胞のものと類似する機能的な活性を示す)。
【００５０】
1つの態様によれば、RPE細胞は、成熟RPE細胞の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのマーカーを発現する。そのようなマーカーには、これらに限定されるわけではないが、CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、ベストロフィン、ZO-1、およびチロシナーゼが含まれる。任意で、RPE細胞は、RPE前駆体のマーカー（例えばMITF）も発現する可能性がある。別の態様において、RPE細胞はPAX-6を発現する。別の態様において、RPE細胞は、これらに限定されるわけではないが、Rx、OTX2またはSIX3を含む、網膜前駆体細胞の少なくとも1つのマーカーを発現する。任意で、RPE細胞はSIX6および/またはLHX2のいずれかを発現する。
【００５１】
本明細書で用いられる語句「成熟RPE細胞のマーカー」は、非RPE細胞または未成熟RPE細胞に対して成熟RPE細胞において(例えば、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍)上昇している抗原(例えば、タンパク質)を指す。
【００５２】
本明細書で用いられる語句「RPE前駆体細胞のマーカー」は、非RPE細胞に対してRPE前駆体細胞において(例えば、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍)上昇している抗原(例えば、タンパク質)を指す。
【００５３】
別の態様によれば、RPE細胞は、網膜の色素上皮細胞層を形成するネイティブなRPE細胞のものと類似する、すなわち、色素を有しかつ特徴的な多角形の形状を有する、形態を有する。
【００５４】
さらに別の態様によれば、RPE細胞は黄斑変性などの疾患を処置することができる。
【００５５】
さらに別の態様によれば、RPE細胞は、本明細書において先に挙げた要件の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは全てを満たす。
【００５６】
本明細書で用いられる語句「幹細胞」は、特定の特殊化した機能を有する他の細胞型(例えば、完全に分化した細胞)に分化するように誘導されるまで培養において長期間にわたって未分化の状態のままであることができる細胞(例えば、多能性または複能性幹細胞)を指す。好ましくは、語句「幹細胞」は、胚性幹細胞(ESC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、成体幹細胞、間葉系幹細胞および造血幹細胞を包含する。
【００５７】
特定の態様によれば、光受容体細胞は多能性幹細胞(例えば、ESCまたはiPSC)から作製される。
【００５８】
人工多能性幹細胞(iPSC)は、体細胞の遺伝子操作によって、例えば、Oct-3/4、Sox2、c-Myc、およびKLF4などの転写因子による線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のレトロウイルス形質導入によって体細胞から作製することができる(Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb 14. (印刷物の前に電子出版)；IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451 : 141- 146；K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007；131 :861-872)。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、またはレシピエント細胞が有糸分裂で停止される場合には接合体内への核移植によって作製することができる。加えて、iPSCは、非組み込み方法を用いて、例えば低分子またはRNAを用いて作製され得る。
【００５９】
語句「胚性幹細胞」は、3種類全ての胚性胚葉(すなわち、内胚様、外胚葉および中胚葉)の細胞に分化する能力がある、すなわち未分化状態のままである胚細胞を指す。語句「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚組織(例えば、胚盤胞) から胚の着床前(すなわち、着床前胚盤胞)に得られる細胞、着床後/原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞(EBC) (WO2006/040763を参照)、および妊娠中の任意の時点での、好ましくは妊娠の10週より前の胎仔の生殖組織から得られる胚性生殖(EG)細胞を含みうる。本発明のいくつかの態様の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒトのインビボ着床前胚またはインビトロ受精(IVF)胚から得られる。あるいは、シングルセルヒト胚は胞胚期まで増殖させることができる。ヒトES細胞の単離のために、透明帯は胚盤胞から除去され、かつ内部細胞塊(ICM)は、栄養外胚葉細胞を溶解させ緩やかなピペッティングによってインタクトなICMから取り除く手法によって単離される。ICMは次いで、その外殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ中にプレーティングされる。9から15日後、ICM由来の生成物は、機械的解離または酵素的分解のいずれかによって凝集塊に解離され、次いで、細胞は新鮮な組織培養培地上に再プレーティングされる。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個別に選択し、凝集塊に機械的に解離させ、再プレーティングする。次いで、結果として生じるES細胞を4〜7日毎にルーチン的に分割する。ヒトES細胞調製の方法に対するさらなる詳細については、Reubinoff et al., Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559；Thomson et al., (米国特許第5,843,780号；Science 282: 1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995)；Bongso et al., (Hum Reprod 4: 706, 1989)；and Gardner et al., (Fertil. Steril. 69: 84, 1998)を参照されたい。
【００６０】
市販の幹細胞もまた本発明のいくつかの態様にしたがって用いることができることが理解されよう。ヒトES細胞はNIHヒト胚性幹細胞レジストリ(www.grants (dot) nih (dot) gov/stem_cells/registry/current (dot) htm)または他のhESCレジストリから購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077 (H7)、WA09 (H9)、WA13 (H13)、WA14 (H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNhem19、BJNhem20、SA001、SA001である。
【００６１】
特定の態様によれば、胚性幹細胞株はHAD-C102またはESIである。
【００６２】
加えて、ES細胞は、マウス(Mills and Bradley, 2001)、ゴールデンハムスター(Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7)、ラット(Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92)、ウサギ(Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8；Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33)、複数の家畜種(Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60；Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8；Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67)、および非ヒト霊長類種（アカゲザルおよびマーモセット）(Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8；Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9)を含む、他の種からも入手することができる。
【００６３】
拡張胚盤胞細胞(EBC)は、原腸形成前の段階で受精後少なくとも9日の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、透明帯は消化され(例えば、Tyrode酸性液(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)によって)、内部細胞塊を露出させる。胚盤胞は次いで、受精後少なくとも9日間かつ14日間以下(すなわち、原腸形成事象前に)、標準的な胚性幹細胞培養法を用いて、全胚としてインビトロで培養される。
【００６４】
ES細胞を調製するための別の方法は、Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008に記載される。この方法は、インビトロ受精過程時に胚からシングルセルを取り出すことを含む。胚はこの過程において破壊されない。
【００６５】
EG細胞は、当業者に公知の実験技術を用いて、妊娠の約8〜11週(ヒト胎児の場合)の胎仔から得られた始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は小さな塊に解離および切断され、その後、機械的解離によって細胞に脱凝集される。EG細胞は次いで、適切な培地によって組織培養フラスコ中で成長させる。EG細胞と一致する細胞形態が観察される、典型的には7〜30日後または1〜4継代後まで培地を毎日交換して、細胞を培養する。ヒトEG細胞調製の方法に対するさらなる詳細については、Shamblott et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998)および米国特許第6,090,622号を参照されたい。
【００６６】
ES細胞を調製するためのさらに別の方法は単為生殖によるものである。胚はこの過程でも破壊されない。
【００６７】
現在実施されているES培養法は主に、幹細胞増殖に必要とされる因子を分泌し、同時にそれらの分化を抑制する、フィーダー細胞層の使用に基づく。培養は典型的には、固体表面（例えば、ゼラチンまたはビメンチンでコーティングされた表面）上で行われる。例示的なフィーダー層には、ヒト胚性線維芽細胞、成体卵管上皮細胞、初代マウス胚性線維芽細胞(PMEF)、マウス胚性線維芽細胞(MEF)、マウス胎仔線維芽細胞(MFF)、ヒト胚性線維芽細胞(HEF)、ヒト胚性幹細胞の分化から得られたヒト線維芽細胞、ヒト胎児筋細胞(HFM)、ヒト胎児皮膚細胞(HFS)、ヒト成体皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、ヒト臍帯線維芽細胞、臍帯またはプラセンタから得られたヒト細胞、およびヒト骨髄間質細胞(hMSC)が含まれる。成長因子は、未分化状態でESCを維持するために培地に添加される可能性がある。そのような成長因子にはbFGFおよび/またはTGFβが含まれる。別の態様において、ナイーブな未分化状態でhESCを維持するために培地に作用物質が添加される可能性がある（例えばKalkan et al., 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540を参照されたい）。
【００６８】
ヒト臍帯フィーダー層
ヒト臍帯線維芽細胞は、ヒト血清(例えば20％)およびグルタミンを補充したダルベッコ変法イーグル培地(例えば、DMEM、SH30081.01、Hyclone)において増殖されうる。好ましくは、ヒト臍帯細胞は放射線照射される。これは、当技術分野において公知の方法を用いて行われうる(例えば、Gamma cell, 220 Exel, MDS Nordion 3,500 rad)。十分な細胞が得られると、それらは凍結されうる(例えば、凍結保存される)。ESCの増殖のために、ヒト臍帯線維芽細胞は典型的には、約20％ヒト血清(およびグルタミン)を補充したDMEM(例えばSH30081.01, Hyclone)中で25〜40,000細胞/cm2の濃度でゼラチン(例えば、組換えヒトゼラチン(RhGlOO-001, Fibrogen))などの接着性基質で任意にコーティングされた固体表面(例えばT75またはT175フラスコ)上に播種される。hESCは典型的には、支持培地(例えばヒト血清アルブミンを含むNutristem)において1〜4日後のフィーダー細胞の上部にプレーティングされる。bFGFおよびTGF-βなどの追加的な因子が、ESCの分化を妨げるために培地に添加されうる。十分な量のhESCが得られると、細胞は機械的にばらばらにされうる(例えば、滅菌チップまたは使い捨ての滅菌幹細胞ツールを用いて；14602 Swemed)。あるいは、細胞は酵素処理(例えばコラゲナーゼAまたはTrypLE Select)または化学的処理(例えばEDTA)によって取り出されうる。この工程は、必要な量のhESCに到達するまで複数回繰り返されうる。特定の態様によれば、第1ラウンドの増殖の後、hESCはTrypLE Selectを用いて取り出され、第2ラウンドの増殖の後、hESCはコラゲナーゼAを用いて取り出される。
【００６９】
フィーダー細胞層としてのヒト胚性線維芽細胞または成体卵管上皮細胞
ヒトES細胞は、ヒト胚性線維芽細胞または成体卵管上皮細胞を用いて成長および維持させることができる。これらのヒトフィーダー細胞上で成長させる場合、ヒトES細胞は、正常な核型を呈し、アルカリフォスファターゼ活性を示し、Oct-4ならびにSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、およびGCTM-2を含む他の胚細胞表面マーカーを発現し、インビボでテラトーマを形成し、かつ全ての重要な形態的特徴を保持する(Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. (2002). Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20: 933-6)。
【００７０】
包皮フィーダー層
ヒトES細胞は、米国特許出願第10/368,045号に開示されているようにヒト包皮フィーダー層上で培養することができる。包皮に由来するフィーダー細胞層は、ヒトES細胞を培養するのに適した完全に動物質を含まない環境からなる。加えて、包皮細胞は、それらの誘導から42継代もの間培養中で維持することができ、ES細胞に比較的一定の環境を提供する。これらの条件下では、ヒトES細胞は、代替のプロトコール(例えば、MEF)で成長させた細胞とは機能的に異なることが見出された。分化後、ES細胞は、インビトロで3種類全ての胚性胚葉に関連する遺伝子を発現し、インビボで3種類全ての胚葉から生じる組織からなるテラトーマを形成した。
【００７１】
フィーダー細胞フリーな系はまたES細胞の培養でも用いられており、そのような系は、フィーダー細胞層の代替として、血清代替物、サイトカインおよび成長因子(IL6および可溶性IL6受容体キメラを含む)を補充したマトリックスを利用する。幹細胞は、培養培地（例えばLonza L7系、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8）の存在下で、細胞外マトリックス(例えば、Matrigel(登録商標)またはラミニン)などの固体表面上で成長することができる。フィーダー細胞および幹細胞の同時成長を必要としかつ混合細胞集団をもたらす可能性がある、フィーダーベースの培養とは異なり、フィーダーフリーな系で成長させた幹細胞は、表面から容易に分離される。
【００７２】
ESCは、分化工程の前にフィーダー上で増殖されうる。本発明によって企図される例示的なフィーダー層に基づく培養は、本明細書の上記に記載される。増殖は典型的には、少なくとも2日間、3日間、4日間、5日間、6日間または7日間行われる。増殖は、少なくとも1継代、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9もしくは少なくとも10継代にわたって行われる。
【００７３】
増殖後、多能性幹細胞(例えばESC)は分化作用物質を用いる分化誘導に供される。
【００７４】
1つの例示的な分化プロトコールにおいて、胚性幹細胞は、第1の分化作用物質を用いて網膜細胞系列に向かって分化され、次いで、トランスフォーミング成長因子β(TGFBβ)スーパーファミリーのメンバー(例えば、TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3サブタイプ、ならびにアクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB)、nodal、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、一部の骨形成タンパク質(BMP)、例えばBMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、および増殖分化因子(GDF)を含む相同リガンド)を用いて光受容体細胞に向かってさらに分化される。特定の態様によれば、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバーはアクチビンA（例えば0.01〜1000 ng/ml、0.1〜200 ng/ml、1〜200 ng/ml、例えば140 ng/ml、150 ng/ml、160 ng/mlまたは180 ng/ml）である。
【００７５】
したがって、アクチビンAは0.1 pM〜10 nM、10 pM〜10 nM、0.1 nM〜10 nM、1 nM〜10 nM、例えば5.4 nMの最終モル濃度で添加され得る。特定の態様によれば、第1の分化作用物質はニコチンアミド(NA)（例えば0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば10 mM）である。
【００７６】
別の態様によれば、第1の分化作用物質は3-アミノベンズアミドである。
【００７７】
「ナイアシンアミド」としても公知のNAは、β細胞機能を保ちかつ向上させると考えられるビタミンB3(ナイアシン)のアミド誘導体形態である。NAは化学式C6H6N20を有する。NAは、成長および食料のエネルギーへの変換に必須であり、関節炎の治療ならびに糖尿病の治療および予防に用いられている。
2018521677.tif 000003
【００７８】
特定の態様によれば、ニコチンアミドは、ニコチンアミド誘導体またはニコチンアミド模倣体である。本明細書で用いられる用語「ニコチンアミド(NA)の誘導体」は、天然のNAの化学的に修飾された誘導体である化合物を表す。1つの態様において、化学的修飾は、アミド部分の窒素原子または酸素原子を介する、基本NA構造のピリジン環の置換(該環の炭素または窒素構成要素を介する)でありうる。置換される場合、1つまたは複数の水素原子が置換成分によって置き換えられうる、および/または置換成分はN原子に結合され四価の正電荷を持つ窒素を形成しうる。よって、本発明のニコチンアミドには、置換されたまたは置換されていないニコチンアミドが含まれる。別の態様において、化学的修飾は、1つの基の欠失または交換である可能性があり、例えばNAのチオベンザミド類似体を形成する。これらの全ては有機化学に精通した者によって理解される。本発明の文脈における誘導体にはまた、NAのヌクレオシド誘導体(例えばニコチンアミドアデニン)も含まれる。NAのさまざまな誘導体が記載され、一部はPDE4酵素の阻害活性と関連して記載されるか(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)、またはVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤として記載される(WO01/55114)。例えば、4-アリール-ニコチンアミド誘導体を調製する工程(WO05/014549)。他の例示的ニコチンアミド誘導体はWO01/55114およびEP2128244に開示される。
【００７９】
ニコチンアミド模倣体には、ニコチンアミドの修飾形態、および多能性細胞由来のRPE細胞の分化および成熟においてニコチンアミドの作用を再現するニコチンアミドの化学的類似体が含まれる。例示的なニコチンアミド模倣体には、安息香酸、3-アミノ安息香酸、および6-アミノニコチンアミドが含まれる。ニコチンアミド模倣体として機能しうる別の化合物のクラスは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の阻害剤である。例示的なPARP阻害剤には、3-アミノベンズアミド、イニパリブ(BSI 201)、オラパリブ(AZD-2281)、ルカパリブ(AG014699、PF-01367338)、ベリパリブ(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827、およびBMN-673が含まれる。
【００８０】
さらに企図される分化作用物質には、例えば、ノギン、FGFのアンタゴニスト、(Dkk1またはIWR1e)、nodalアンタゴニスト(Lefty-A)、レチノイン酸、タウリン、GSK3b阻害剤(CHIR99021)、notch阻害剤(DAPT)、レチノイン酸受容体(RAR) アゴニストまたはアンタゴニスト、FGFシグナル伝達経路(aFGF、bFGF)のアゴニスト、ヘッジホッグ経路のアゴニスト(Shh)、インスリン成長因子経路(IGF)のアゴニスト、PI3キナーゼ経路、EGF経路、BMP経路、およびHippo経路のアゴニストが含まれる。
【００８１】
そのような分化作用物質は、分化手法の任意の段階で（例えば、第1の分化工程の前に、第1の分化工程の間に、第2の分化工程の間に、または第2の分化工程の後に）添加されうる。
【００８２】
特定の態様によれば、分化は以下のように行われる：
(a)第1の分化作用物質(例えば、ニコチンアミド)を含む培地中でのESCの培養。この工程は、最低でも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、10日間、2週間、3週間、4週間、5週間、またはさらには6週間にわたって行われうる。
(b)TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えば、アクチビンA)および任意で第1の分化作用物質(例えば、ニコチンアミド)を一緒に含む培地中での、工程(a)から得られた細胞の培養。この工程は、最低でも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、10日間、2週間、3週間、4週間、5週間、またはさらには6週間にわたって行われうる。
【００８３】
好ましくは、工程(a)は、TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えば、アクチビンA)の非存在下で行われる。1つの態様において、培地は、TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えば、アクチビンA)を完全に欠いている。別の態様において、培地中のTGFβスーパーファミリーメンバーのレベルは、20 ng/ml、10 ng/ml、1 ng/ml未満、またはさらには0.1 ng/ml未満である。
【００８４】
上記のプロトコールは、第1の分化作用物質(例えばニコチンアミド)を含むが、TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えばアクチビンA)を欠いている培地中で、工程(b)で得られた細胞を培養することによって続けられうる。この工程は本明細書において工程(b*)と呼ばれる。
【００８５】
上記プロトコールはこれから、追加の態様によってさらに詳細に記載される。
【００８６】
工程(a)：分化プロセスは、十分な量のESCが得られたら開始される。それらは典型的には、(例えば、コラゲナーゼA、ディスパーゼ、TrypLE select、EDTAを用いることによって)細胞培養から取り出され、非接着性の基質(例えば、Hydrocell等の細胞培養プレートまたはアガロースでコーティングした培養ディッシュ、または細菌用ペトリ皿)の上にニコチンアミドの存在下(かつアクチビンAの非存在下)でプレーティングされる。ニコチンアミドの例示的な濃度は、0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mMである。細胞が非接着性の基質(例えば、細胞培養プレート)の上にプレーティングされたら、細胞培養は、細胞懸濁物、好ましくは懸濁培養液中の浮遊性クラスター、すなわち、ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来する細胞の凝集物と呼ばれうる。細胞クラスターは、いずれの基質(例えば培養プレート、担体)にも接着しない。浮遊性幹細胞の供給源は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、WO 06/070370において以前に記載されている。この段階は、最低で1日間、より好ましくは、2日間、3日間、1週間、またはさらには14日間行われうる。好ましくは、細胞は、例えば0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドと一緒に(およびアクチビンAの非存在下で)懸濁物の状態で3週間以下培養される。1つの態様において、細胞は、ニコチンアミド0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドと一緒に(およびアクチビンAの非存在下で)懸濁物の状態で6〜8日間培養される。
【００８７】
1つの態様によれば、細胞は非接着性の基質、例えば細胞培養プレート上で培養される場合、大気中酸素条件は20％である。しかしながら、大気中酸素のパーセントが約20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％未満、またはさらには約5％未満(例えば1％〜20％、1％〜10％または0〜5％)であるような大気中酸素条件の操作も企図される。
【００８８】
特定の態様によれば、細胞は、最初は通常の大気酸素条件下で、次いで通常のものより低い大気中酸素条件下で、非接着性の基質上で培養される。
【００８９】
非接着性の細胞培養プレートの例には、Nuncによって製造されたもの(例えば Hydrocell; Cat No. 174912)が含まれる。
【００９０】
典型的には、クラスターは、少なくとも50〜500,000、50〜100,000、50〜50,000、50〜 10,000、50〜5000、50〜1000個の細胞を含む。1つの態様によれば、クラスター中の細胞は層に組織化されず、不規則な形状を形成する。1つの態様において、クラスターは多能性胚性幹細胞を欠いている。別の態様において、クラスターは少量の多能性胚性幹細胞(例えば、タンパク質レベルでOCT4およびTRA 1-60を共発現する5％以下または3％以下(例えば0.01〜2.7％)の細胞)を含む。典型的には、クラスターは、ニコチンアミドの影響下で部分的に分化されている細胞を含む。そのような細胞は主に、PAX6、Rax、Six3および/またはCHX10などの神経および網膜の前駆体マーカーを発現する。
【００９１】
クラスターは、当技術分野において公知の酵素的または非酵素的方法(例えば、機械的、化学的)を用いて解離されうる。1つの態様によれば、細胞は、クラスター（例えば、2〜100,000個の細胞、2〜50,000個の細胞、2〜10,000個の細胞、2〜5000個の細胞、2〜1000個の細胞、2〜500個の細胞、2〜100個の細胞、2〜50個の細胞の凝集物または凝集塊）の状態となることはないように解離される。特定の態様によれば、細胞はシングルセル懸濁物の状態である。
【００９２】
細胞(例えば、解離された細胞)は次いで、接着性の基質上にプレーティングされ、例えば、0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドの存在下(およびアクチビンAの非存在下)で培養される。この段階は、最低でも1日間、より好ましくは2日間、3日間、1週間、またはさらには14日間行われうる。好ましくは、細胞はニコチンアミドの存在下(およびアクチビンの非存在下)で3週間以下培養される。例示的な態様において、この段階は6〜7日間行われる。
【００９３】
1つの態様によれば、細胞が接着性の基質、例えばラミニン上で培養される場合、大気中酸素条件は20％である。それらは、パーセンテージが、約20％、15％、10％未満、より好ましくは約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満およびより好ましくは約5％(例えば1％〜20％、1％〜10％または0〜5％)となるように操作されうる。
【００９４】
特定の態様によれば、細胞は、最初は通常の大気中酸素条件下で、次いで通常のものより低い大気中酸素条件下で、接着性の基質上で培養される。
【００９５】
接着性の基質の例には、これらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、ポリD-リジン、コラーゲンおよびゼラチンが含まれる。
【００９６】
工程(b)：分化誘導の第1の段階(工程a；すなわち、ニコチンアミド(例えば0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mM)の存在下での培養)の後、半分化(semi-differentiated)細胞を次いで、接着性基質上でのさらなる分化の段階（アクチビンA(例えば100〜200 ng/ml−例えば140 ng/ml、150 ng/ml、160 ng/mlまたは180 ng/ml)の存在下での培養）に供する。ニコチンアミドは、この段階でも添加されうる(例えば0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば 10 mM)。この段階は、1日間から10週間、3日間から10週間、1週間から10週間、1週間から8週間、1週間から4週間、例えば、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間行われうる。
【００９７】
特定の態様によれば、この段階は約2週間行われる。この分化の段階は、本明細書の上記において詳述したように、低いまたは通常の大気中酸素条件で行われうる。
【００９８】
工程(b*)：分化誘導の第2の段階(すなわち、接着性の基質上でのニコチンアミドおよびアクチビンAの存在下での培養；工程(b))の後、さらに分化した細胞は任意で、接着性基質上でのそれに続く分化の段階（ニコチンアミドの存在下(例えば、0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば10 mM)、アクチビンAの非存在下での培養）に供する。この段階は、少なくとも1日間、2日間、5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、またはさらには4週間行われうる。好ましくは、この段階は約1週間行われる。この分化の段階はまた、本明細書の上記において詳述したように、低いまたは通常の大気中酸素条件で行われうる。
【００９９】
ESCが分化される基本培地は、インビトロで細胞成長を支持することが当技術分野において知られている任意の公知の細胞培養培地であり、典型的には、培地は、塩類、糖類、アミノ酸、および生存可能な状態での培養において細胞の維持に必要とされる任意の他の栄養を含む定義された基礎溶液を含む。特定の態様によれば、基本培地は馴化培地ではない。本発明にしたがって利用されうる市販の基本培地の非限定的な例には、Nutristem(ESC分化用にはbFGFおよびTGFβなし、ESC増殖用にはbFGFおよびTGFβあり)、Neurobasal(商標)、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、Cellgro(商標)Stem Cell Growth Medium、またはX-Vivo(商標)が含まれる。基本培地は、細胞培養を扱う技術分野において公知のさまざま作用物質が補充されうる。以下は、本開示にしたがって用いられるべき培養系において含まれ得る種々の補助物質への非限定的な言及である：
−これらに限定されないが、ノックアウト血清代替物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCH(商標)、N2、N2誘導体、もしくはB27または組み合わせなど、血清または血清代替物含有培地；
−これらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびゼラチンなど、細胞外基質(ECM)成分。ECMは次いで、成長因子のTGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを運ぶために用いられうる；
−これらに限定されないが、ペニシリンおよびストレプトマイシンなど、抗菌剤；
−非必須アミノ酸(NEAA)；これらに限定されないが、BDNF、NT3、NT4など、培養中のSCの生存を促進する役割を果たすことが公知である、ニュートロフィン。
【０１００】
好ましい態様によれば、ESCを分化させるために用いられる培地はNutristem培地(Biological Industries, 06-5102-01-1A)である。
【０１０１】
特定の態様によれば、ESCの分化および増殖はゼノフリーな条件下で行われる。
【０１０２】
1つの態様によれば、増殖/成長培地は異種由来成分の混入物を欠いている、すなわち、血清、動物由来の成長因子およびアルブミンなどの動物由来の成分を含まない。よって、この態様によれば、培養は異種由来成分の混入物の非存在下で実施される。
【０１０３】
ゼノフリー条件下でESCを培養するための他の方法は、その内容の全体が組み入れられる、米国特許出願第20130196369号に提供される。
【０１０４】
光受容体細胞を含む調製物は、Good Manufacturing Practices (GMP)にしたがって (例えば、調製物はGMPに適合している)および/または最新のGood Tissue Practices(GTP)にしたがって(例えば、調製物はGTPに適合しうる)調製されうる。
【０１０５】
分化工程時、胚性幹細胞はその分化状態についてモニターされうる。細胞分化は、分化の指標であることが知られている細胞または組織特異的マーカーの検査により判定することができる。
【０１０６】
組織/細胞特異的マーカーは、当技術分野において周知の免疫学的技術を用いて検出することができる(Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7)。例には、これらに限定されないが、膜結合型または細胞内マーカーについてフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーについて免疫組織化学的検査、および分泌分子マーカーについて酵素的免疫アッセイが含まれる。
【０１０７】
本明細書の上記に記載の分化の段階後、多角形/色素細胞および非多角形/非色素細胞(すなわち、光受容体)の両方を含む、混合細胞集団が得られる。1つの態様によれば、混合集団の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、またはさらには90％の細胞が色素を有さない(すなわち、光受容体)。
【０１０８】
プロセスの次の工程において、非色素細胞(すなわち、光受容体)は、RPE細胞(色素細胞)から単離(例えば、分離)または濃縮され、光受容体の濃縮集団が作製される。
【０１０９】
1つの態様によれば、光受容体は、機械的選択または表面マーカーの使用によって濃縮される。
【０１１０】
本発明のこの局面によれば、培養系から取り出される(続いて増殖される)細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはさらに100％は、非色素細胞である。
【０１１１】
本発明のこの局面によれば、培養系における全ての細胞の少なくとも30％、40％ 50％、60％、70％、80％、90％は取り出される(続いて増殖される)。
【０１１２】
1つの態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の90％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の80％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の70％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の60％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の50％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の40％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の30％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の20％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の10％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の5％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の2％未満は色素細胞である。別の態様によれば、取り出される(続いて培養される)細胞の1％未満は色素細胞である。
【０１１３】
本発明者らは、本明細書に記載された分化プロセス後に培養系から取り出された細胞が光受容体のマーカーを発現することを示している。そのような細胞は網膜障害を処置するために用いられうる。
【０１１４】
任意で、光受容体は、より多数の光受容体細胞を得るように培養されうる(すなわち、増殖されうる)。増殖段階時には、そのときの条件が光受容体細胞よりもRPE細胞の増殖を促進しないように注意を払わなければならない。1つの態様において、培養は、光受容体細胞を濃縮する。よって、例えば、1つの態様において、増殖される細胞の5％、10％、15％、20％以下がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の5〜90％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の5〜80％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の5〜70％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の5〜60％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の5〜50％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の10〜50％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の20〜50％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の30〜50％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の10〜40％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の10〜30％がRPE細胞である。別の態様によれば、増殖される細胞の10〜20％がRPE細胞である。
【０１１５】
光受容体を含む細胞の濃縮集団の増殖は、細胞外マトリックス、例えば、ゼラチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン(例えば、ラミニン521)、フィブロネクチンまたはポリ-D-リジン上で行われうる。
【０１１６】
光受容体は、光受容体の分化およびまたは生存をさらに促進することが公知の作用物質で培養されうる。そのような作用物質には、これらに限定されないが、FGF、shh、ノギン、Wntのアンタゴニスト(Dkk1またはIWR1e)、nodalアンタゴニスト(Lefty-A)、レチノイン酸、タウリン、GSK3b阻害剤(CHIR99021)、およびnotch阻害剤(DAPT)が含まれる。
【０１１７】
1つの態様において、増殖させる工程は、ニコチンアミドの存在下(例えば、0.01〜100 mM、0.1〜100 mM、0.1〜50 mM、5〜50 mM、5〜20 mM、例えば10 mM)、かつアクチビンAの非存在下で行われる。
【０１１８】
光受容体細胞の濃縮集団は、懸濁物(微小担体のありまたはなし)の状態でまたは単層で増殖されうる。単層培養または懸濁培養での光受容体細胞の濃縮集団の増殖は、当技術分野に精通した者に周知の方法によってバイオリアクターまたはマルチ/ハイパースタックでの大規模増殖へと改変されうる。
【０１１９】
1つの態様によれば、増殖段階は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、またはさらには10週間にわたって行われる。好ましくは、増殖段階は、1週間〜10週間、より好ましくは2週間〜10週間、より好ましくは3週間〜10週間、より好ましくは4週間〜10週間、または4週間〜8週間にわたって行われる。
【０１２０】
さらに別の態様によれば、光受容体細胞の濃縮集団は、増殖段階中に少なくとも1回、増殖段階中に少なくとも2回、増殖段階中に少なくとも3回、増殖段階中に少なくとも4回または増殖段階中に少なくとも5回または増殖段階中に少なくとも6回継代される。
【０１２１】
本明細書に記載された方法によって作製された光受容体細胞の集団は、いくつかの異なるパラメーターによって特徴付けられうる。
【０１２２】
よって、例えば、得られた光受容体細胞は、細長い細胞体および細胞質の尖部を有しうる。
【０１２３】
光受容体細胞の増殖集団の回収工程は、当技術分野において公知の方法を用いて(例えば、トリプリンなどの酵素、EDTAを用いて)行われうる。
【０１２４】
回収する工程の後、光受容体細胞の集団は任意で、当技術分野において公知の方法を用いて凍結保存されうる。凍結保存に適した培地の例には、これらに限定されないが、90％ヒト血清/10％DMSO、CryoStor 10％、5％および2％、Stem Cell BankerならびにPrime XV(登録商標)FreezISが含まれる。
【０１２５】
本明細書に開示の細胞集団は未分化ヒト胚性幹細胞を欠いていることが理解されよう。1つの態様によれば、例えばFACSによって測定される、1:250,000未満の細胞がOct4＋TRA-1-60＋細胞である。細胞はまた、PCRにより測定されるGDF3またはTDGFの発現が下方制御されている(5,000倍を上回って)。
【０１２６】
本発明のこの局面の光受容体細胞は胚性幹細胞マーカーを発現しない。該1つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、および/またはTRA-1-81でありうる。
【０１２７】
光受容体調製物は、非光受容体細胞に対して実質的に濃縮され、少なくとも約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の光受容体細胞を含みうる。光受容体細胞調製物はRPE細胞を本質的に含まない、または光受容体細胞からなる可能性がある。例えば、光受容体細胞の実質的に濃縮された調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％未満の非光受容体細胞型、例えばRPE細胞を含みうる。例えば、光受容体細胞調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％、または0.0001％未満の非光受容体細胞、例えばRPE細胞を含みうる。
【０１２８】
本明細書に記載の調製物は、これらに限定されないが、HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、パルボウイルスB19、エプスタイン・バーウイルス、またはヘルペスウイルス1および2、SV40、HHV5、6、7、8、CMV、ポリオーマウイルス、HPV、エンテロウイルスの存在を含む、細菌、ウイルスまたは真菌の混入または感染が実質的にない可能性がある。本明細書に記載の調製物は、マイコプラズマの混入または感染が実質的にない可能性がある。
【０１２９】
本明細書に開示された細胞集団を特徴付ける別の手法は、マーカー発現による。よって、例えば、細胞の少なくとも70％、80％、85％、90％、95％または100％が、免疫染色によって測定される、RAXを発現する。1つの態様によれば、細胞の70〜100％がRAXを発現する。好ましくは、RT-PCRによって測定される、本発明の細胞によって発現されるRAXのレベルは、RPE細胞または未分化ESCにおける発現のレベルより少なくとも2倍高い、5倍高い、またはさらには10倍高い。
【０１３０】
別の態様によれば、細胞の少なくとも70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が、免疫染色によって測定される、CHX10を発現する。例えば、細胞の70〜100％はCHX10を発現する。好ましくは、RT-PCRによって測定される、本発明の細胞によって発現されるCHX10のレベルは、RPE細胞または未分化ESCにおける発現のレベルより少なくとも2倍高い、5倍高い、またはさらには10倍高い。
【０１３１】
別の態様によれば、細胞の少なくとも70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が、免疫染色によって測定される、ロドプシンを発現する。好ましくは、RT-PCRによって測定される、本発明の細胞によって発現されるロドプシンのレベルは、RPE細胞または未分化ESCにおける発現のレベルより少なくとも2倍高い、5倍高い、またはさらには10倍高い。
【０１３２】
別の態様によれば、細胞の少なくとも70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％が、免疫染色によって測定される、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質(NRL)を発現する。例えば、免疫染色によって、細胞の70〜100％が発現する。好ましくは、RT-PCRによって測定される、本発明の細胞によって発現されるNRLのレベルは、RPE細胞または未分化ESCにおける発現のレベルより少なくとも2倍高い、5倍高い、またはさらには10倍高い。
【０１３３】
好ましくは、本発明のこの局面の細胞はRPE細胞のマーカーを発現しない。よって、例えば、好ましくは、本発明の細胞は、MITF、RPE65、ベストロフィン1、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)またはCRALBPを発現しない(または細胞の30％、25％、20％、15％、10％未満がそれを発現する)。好ましくは、RT-PCRによって測定される、本発明の細胞によって発現されるRPEマーカーのレベルは、RPE細胞での発現のレベルより少なくとも2倍低い、5倍低い、またはさらには10倍低い。
【０１３４】
光受容体細胞の誘導は大いに役立つことが当技術分野に精通した者によって理解されよう。それらは、その生存、再生および機能を促進する新たな薬物の開発のためのインビトロモデルとして用いられうる。光受容体細胞は、光受容体細胞に対して毒性または再生作用を有する化合物のハイスループットスクリーニングのために機能しうる。それらは、光受容体細胞の発生、分化、維持、生存および機能に重要なメカニズム、新規遺伝子、可溶性または膜結合型因子を明らかにするために用いられうる。
【０１３５】
光受容体細胞はまた、網膜変性における機能不全または変性光受容体細胞の移植、補充および支持のための光受容体細胞の無制限の供給源としても機能しうる。さらに、遺伝的に改変させた光受容体細胞は、移植後に眼および網膜において遺伝子を運びかつ発現させるためのベクターとして機能しうる。
【０１３６】
光受容体細胞が治療として機能しうる眼の状態には、これらに限定されないが、一般的には網膜機能不全、網膜傷害、および/または光受容体機能の欠失に関連する網膜疾患または障害が含まれる。本発明にしたがって処置されうる状態の非限定的なリストには、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、加齢黄斑変性 (AMD)、萎縮型AMD、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーならびにRPEの他のジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害が含まれる。
【０１３７】
本発明者らはさらに、これらに限定されないが、パーキンソン病、ALS、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病およびてんかんを含む神経変性疾患などの他の疾患の処置のための光受容体細胞の使用も企図する。
【０１３８】
処置されうる対象には、霊長類(ヒトを含む)、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ(swine)(例えば、ブタ(pig))、トリ、および他の対象が含まれる。ヒトおよび商業的重要性を有する非ヒト動物(例えば、家畜動物および飼い慣らされた動物)は特に関心対象となる。処置されうる例示的な哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、齧歯類など、および霊長類、特にヒトが含まれる。非ヒト動物モデル、特に哺乳動物、例えば霊長類、ネズミ科、ウサギ目などは、実験的調査のために用いられうる。
【０１３９】
本明細書に記載のように作製される光受容体細胞は、対象の眼内のさまざまな標的部位に移植されうる。1つ態様によれば、光受容体細胞の移植は、眼の網膜下腔に対して行われる。加えて、細胞の遊走能力および/または正のパラクライン作用に依存して、硝子体空間、網膜の内側または外側、網膜周辺部および脈絡膜の内部を含む、さらなる眼内区画内への移植が考慮されうる。
【０１４０】
対象に投与されうる生細胞の数は典型的には1回の注入当たり5000〜10×106個、例えば1回の注入当たり50,000〜5×106個である。
【０１４１】
細胞は典型的には、BSS plus(商標)などの担体(例えば、等張液および/または生理食塩水)中で調剤される。他の企図される溶液には、Cryostor 5またはCryostor 2などの凍結保存溶液が含まれる。担体は任意で、RPEの生着、組み込み、生存、能力等を支持する追加的因子を含みうる。
【０１４２】
移植は、当技術分野において公知のさまざまな技法によって実施されうる。網膜細胞移植を実施するための方法は、例えば、米国特許第5,962,027号、同第6,045,791号、および同第5,941,250号、ならびにEye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997；235(3): 149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb. 24, 2000；268(3): 842-6；Opthalmic Surg February 1991；22(2): 102-8に記載される。角膜移植を実施するための方法は、例えば、米国特許第5,755,785号、およびEye 1995；9 (Pt 6 Su):6-12；Curr Opin Opthalmol August 1992；3 (4): 473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998；29 (4): 305-8；Ophthalmology April 2000；107 (4): 719-24；およびJpn J Ophthalmol November-December 1999；43(6): 502-8に記載される。主にパラクライン作用が利用される場合、半透過性容器内に封入された細胞が、眼中に送達および維持されてもよく、宿主免疫系への細胞の曝露も低減させる(Neurotech USA CNTF delivery system；PNAS March 7, 2006 vol. 103(10) 3896-3901)。
【０１４３】
投与する工程は、その必要がある眼内への光受容体細胞の眼内投与を含みうる。眼内投与は、網膜下腔内への光受容体細胞の注入を含みうる。
【０１４４】
1つの態様によれば、移植は、経扁平部硝子体切除術と、その後に続く網膜の小孔を通って網膜下腔内への細胞の送達または直接注入を介して実施される。
【０１４５】
光受容体細胞はさまざまな形態で移植されうる。例えば、光受容体細胞は、シングルセル懸濁物の形態で、マトリックスにより標的部位に導入されうるか、またはマトリックスもしくは膜、細胞体マトリックス、もしくは生分解ポリマーなどの基質、または組み合わせの上に接着させうる。光受容体細胞はまた、RPE細胞などの他の網膜細胞と一緒に移植されうる(共移植)。
【０１４６】
処置の有効性は、特に、最高矯正視力(BCVA)、暗状態および明順応状態でのペリメトリーまたはマイクロペリメトリーによって測定される光に対する網膜の感度、全視野、多局所、局所またはパターン網膜電図(ERG)、対比感度、読書速度、色覚、臨床的生体顕微鏡検査、眼底写真、光干渉断層撮影(OCT)、眼底自発蛍光画像(FAF)、赤外線多色イメージング、蛍光またはICG血管造影、適応制御光学、および視覚機能および眼球構造を評価するために用いられるさらなる手段を含む、視覚および眼球の機能および構造のさまざま測定によって評価されうる。
【０１４７】
対象は、光受容体細胞の投与の前にまたはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、Predforteなどのコルチコステロイドが投与されうる。
【０１４８】
別の態様によれば、対象は、光受容体細胞の投与の前にまたはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、Predforteなどのコルチコステロイドが投与される。
【０１４９】
免疫抑制薬が、処置の前に、それと同時におよび/またはそれの後に対象に投与されうる。
【０１５０】
免疫抑制薬は以下のクラスに属しうる：グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬(例えば、アルキル化剤または抗代謝物質)、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、イムノフィリンに対して作用する薬物(例えば、シクロスポリン、タクロリムスまたはシクロリムス)。さらなる薬物には、インターフェロン、オピオイド、TNF結合タンパク質、ミコフェノール酸塩および低分子生物剤が含まれる。
【０１５１】
免疫抑制薬の例には以下が含まれる：間葉系幹細胞、抗リンパ球グロブリン(ALG)ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BAS1 L1X1MAB(登録商標)(抗IL-2Ra受容体抗体)、シクロスポリン(シクロスポリンA)、DACLIZUMAB(登録商標)(抗IL-2Ra受容体抗体)、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB(登録商標)(抗CD20抗体)、シロリムス、タクロリムス、タクロリムスおよび/またはミコフェノール酸モフェチル。
【０１５２】
抗生物質は、処置の前に、それと同時におよび/またはそれの後に対象に投与されうる。抗生物質の例には、Oflox、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、Tobrex、Vigamox、または眼での使用について許可されている任意の他の局所用抗菌調製物が含まれる。
【０１５３】
本明細書で用いられる用語「約」は±10％を指す。
【０１５４】
用語「含む(comprise)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(including)」、「有する」およびその活用形は、「限定されないが含むこと」を意味する。
【０１５５】
用語「からなる」は「含みかつ限定されること」を意味する。
【０１５６】
用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および/またはパーツを含んでもよいことを意味するが、追加の成分、工程および/またはパーツが本願発明の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変更しない場合に限る。
【０１５７】
本明細書で用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が他に明確に指示していない限り、複数への言及を含む。例えば、用語「1つの化合物」または「少なくとも1つの化合物」は、その混合物を含む、複数の化合物を含みうる。
【０１５８】
本明細書において数値範囲が示されている場合、それは、示された範囲内の任意の言及された数(分数または正数)を含むことを意味する。第1の示された数字と第2の示された数字との「間の範囲である/範囲」および第1の示された数「から」第2の示された数「までの範囲である/範囲」という語句は、本明細書において互換的に用いられ、第1および第2の示された数ならびにそれらの間にある全ての分数および正数を含むことを意味する。
【０１５９】
本明細書で用いられる用語「方法」は、これらに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学分野の当業者によって公知であるかまたは公知の方式、手段、技術および手法から容易に開発される方式、手段、技術および手法を含む、所与の課題を達成するための方式、手段、技術および手法を指す。
【０１６０】
本明細書で用いられる、用語「処置すること」には、状態の進行を抑制すること、実質的に阻害すること、遅らせることもしくは元に戻すこと、状態の臨床的または審美的症状を実質的に寛解させること、または状態の臨床的または審美的症状の出現を実質的に妨げることが含まれる。
【０１６１】
明確にするために別個の態様の文脈において説明される本発明のある特定の特徴は、1つの態様において組み合わせて提供されうることも理解されよう。逆に、簡略にするために1つの態様の文脈において説明される本発明のさまざまな特徴はまた、別々に、または任意の適したサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載された態様に適したように提供されうる。さまざまな態様の文脈において説明されたある特定の特徴は、該態様がそれらの要素なしに動作不能でない限り、それらの態様の必須な特徴と認識されるべきではない。
【０１６２】
本明細書の上記において描写したまたは添付の特許請求の範囲部分において特許請求した本発明のさまざまな態様および局面は、以下の実施例において実験的な裏付けが分かる。
【実施例】
【０１６３】
次に、以下の実施例について参照して、上記説明と合わせて非限定的に本発明の一部の態様を例示する。
【０１６４】
概して、本明細書において用いられる術語体系および本発明で利用される検査法は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えDNA技術を含む。そのような技術は、文献おいて十分に説明される。例えば、それらの全てが参照により本明細書に全体が記載されているように組み入れられる、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren et al. (編集) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,192,659号および同第5,272,057号に記載の方法論；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley- Liss, N. Y. (1994), Third Edition；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは特許および科学文献に幅広く記載されており、例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；同第4,098,876号；同第4,879,219号；同第5,011,771号および同第5,281,521号；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。その他の一般的な記載はこの文献全体を通じて提供される。それらの文献の手法は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれる全ての情報は参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１６５】
材料および方法
光受容体の作製：ゼノフリーなGMPグレードHAD-C 102 hESCを、放射線照射したゼノフリーなGMPグレードヒト臍帯線維芽細胞フィーダー上でコロニーとして増殖させた(段階I)。増殖したhESCを次いで、懸濁培養に移し、ニコチンアミド存在下で分化誘導を開始させた (段階II)。球状体(SB)が形成され、次いで、神経運命に向かい続いて光受容体細胞運命に向かう連続的な分化誘導条件下(最初にニコチンアミド単独の存在下、続いてニコチンアミドおよびアクチビンAの存在下)で、接着細胞培養としてプレーティングした(段階II)−図1Bを参照されたい。
【０１６６】
RPE細胞の作製：図1Aを参照されたい。
【０１６７】
定量的リアルタイムPCR(QRT-PCR)：QRT-PCRアッセイを、遺伝子特異的TaqManアッセイを用いてTaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Cat. #AB-4366072)により実行した(表1を参照されたい)。PCR反応は、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR装置を用いてOptical 96ウェルFast Thermal Cyclingプレート(Cat. # AB-4314320)中で行われた。リアルタイムPCRの結果の分析は、Applied Biosystems(ABI)プロトコールに基づいた。50 ngのcDNAテンプレートを各アッセイについて三重で用いた。収集は、Sequence Detection System version 2.3(またはversion 2.4 ABI)を用いるReal Time自動マシン7900HTよって実行された。結果として生じたCt値は、各サンプルのPCRシグナルが閾値を上回って検出される時点でのサイクル数である。
【０１６８】
各試験条件内で、各マーカーの発現をハウスキーピング遺伝子(ヒトGUSB; β-グルクロニダーゼ、Hs00939627_m1)内在性対照に対して正規化した。ΔCtは正規化後のサイクル数である。試験したさまざまな条件での各マーカーの相対量を比較するために、RQ Manager Software version 1.2(またはversion 1.2.1 ABI)をΔΔCtアルゴリズム(Livak and Schmittgen, 2001による)と一緒に用いた。平均化した相対的発現を、式：2-ΔΔCtにしたがって自動的に計算した。式中ΔΔCtは、内在性対照および参照対照(各棒グラフで1に設定)に対する正規化後のサイクル数である。コンピュータによる結果のペレット(Computer results pellet)(「増幅データ」読み出しファイル)をさらなる分析のためにエクセルに移した。試験の反復を平均化し、最小および最大エラーバーと共に示した。
【０１６９】
ロドプシンQRT-PCRアッセイを、ハードシェルシンウォール96ウェルPCRプレート(Bio-Rad, Cat. # HSP 9601)およびBio-Rad Fast Real-Time PCR装置を用いて実施した。収集および分析を、CFX Manager Software version 3.1を用いてReal Time自動マシンBio-Rad CFX96によって実施した。Real Time PCR結果の分析はBio-Radプロトコールに基づいた。コンピュータによる結果のペレット(「遺伝子発現結果」読み出しファイル)をさらなる分析のためにエクセルに移した。試験の反復を平均化し、最小および最大エラーバーと共に示した。
【０１７０】
（表１）QRT-PCRアッセイID
2018521677.tif 000004
【０１７１】
網膜細胞について分析したマーカーの特異性を図4に図示する。
【０１７２】
結果
RPE産生プロセスに沿ったさまざまなIPCポイントでの眼領域(eye field)マーカーRax、神経網膜/光受容体前駆体マーカーChx10およびNrl、ならびに光受容体マーカー ロドプシンおよびリカバリンの相対的発現をQRT-PCRによって試験した。図2A〜Fに見られるように、ニコチンアミドおよびアクチビンA処理後の細胞(IPCポイント4/5)は、hESCおよびヒトRPEと比べて、ならびに色素細胞の選択および増殖後の分化プロセスの後期段階での細胞(IPCポイント8、P0での細胞およびIPCポイント11、凍結保存後のP2での細胞) と比べて、Chx1Oを高発現しかつNrl、リカバリンおよびロドプシンを上方制御した。Raxは、部分的に分化したhESCおよびアクチビンA後に(RPEと比べて)ある程度発現した。RPEマーカーMITFは、色素細胞が増殖するにつれ、増大した。
【０１７３】
類似のデータは分化段階の最後の第2の実験でも得られた(図3A〜D)。図3A〜Dに示すように、chx1O、ロドプシンおよびNrlの発現は、色素細胞の単離および増殖後に下方制御された一方で、MITFは上方制御された。
【０１７４】
本発明はその特定の態様と併せて記載されているが、多くの代替方法、変更形態および変形形態が当業者に明白であることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれるそのような代替方法、変更形態および変形形態の全てを包含することが意図される。
【０１７５】
本出願において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度で、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。加えて、本明細書における任意の参考文献の引用または確認は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。項の見出しが用いられる場合、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2018521677.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2018521677.tif 000008
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
2018521677.tif 000014
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2018521677.tif 000017
【図４】
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【国際調査報告】
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