(57)【要約】  本発明は、タンパク質が富化された微細藻類のバイオマスから単離されるペプチド単離物に関する。本発明は、−  １〜２０ｋＤａの分子量を有する可溶性ペプチド、−  ９５％超のＮ  ６．２５で表されるタンパク質含量、−  実質的に、アルギニンおよびグルタミン酸を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質に富む微細藻類のバイオマスから単離されるペプチド単離物であって、
−  １〜２０ｋＤａの分子量を有する可溶性ペプチド、
−  ９５％超のＮ．６．２５として表されるタンパク質含量、
−  実質的に、アルギニンおよびグルタミン酸
を有することを特徴とするペプチド単離物。
【請求項２】
前記微細藻類が、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載の単離物。
【請求項３】
全アミノ酸に対して表される、アルギニンおよびグルタミン酸の含量が、８０、８５、９０または９５重量％超であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の単離物。
【請求項４】
全アミノ酸に対して表される、アルギニンおよびグルタミン酸の含量が、
少なくとも４０％のアルギニン、特に４０％〜６０％、好ましくは約５０％；および
少なくとも４０％のグルタミン酸、特に４０％〜６０％、好ましくは約５０％
であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の単離物。
【請求項５】
全アミノ酸に対して表される、アルギニンおよびグルタミン酸の含量が、
−  アルギニンについては４７〜４８％
−  グルタミン酸については４９〜５０％
であることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の単離物。
【請求項６】
−  発酵槽の播種の後、１５〜２５ｇ／ｌ、好ましくは約２０ｇ／ｌの量のグルコースを一度に供給することによって特徴付けられる「バッチ」発酵段階、
−  グルコースが徐々に供給され、ＮＨ３／ＫＯＨ混合物によって最初に行われるｐＨ調節が、ＮＨ３単独での調節に置き換えられた指数関数的流加段階
を含む発酵方法によって調製されるタンパク質に富む微細藻類のバイオマスから得られるまたは得ることができることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の単離物。
【請求項７】
−  任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するように前記バイオマスを洗浄する工程、
−  約１０秒間〜約５分間の時間、好ましくは約１０秒間〜約１分間の時間にわたる、５０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１５０℃の温度での前記バイオマスの熱透過化、
−  可溶性画分を得るための、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過、凝集および遠心分離、より特定的には、多段階遠心分離によって形成される群から好ましくは選択される固液分離の技術によってこのように透過化される前記バイオマスの除去、
−  任意選択的に、残留不溶性物質を取り除くような精密ろ過によってこのように得られる前記可溶性画分の回収および浄化、
−  ペプチド単離物を得るような、沈殿による前記可溶性画分の精製、および
−  前記タンパク質単離物の蒸発、低温殺菌および微粒子化
を含む方法によって調製されるタンパク質に富む微細藻類の前記バイオマスから得られるまたは得ることができることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の単離物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質に富む微細藻類、およびクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類のバイオマスに由来するペプチド単離物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大型藻類および微細藻類は、ほとんど調査されないままである固有の豊富さ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｉｃｈｎｅｓｓ）を有する。食品、化学またはバイオエネルギー目的のためのそれらの利用は、依然として非常にわずかである。しかしながら、これらは、豊富さおよび存在量の両方に関して、大きな価値を有する成分を含有する。
【０００３】
実際に、微細藻類は、ビタミン、脂質、タンパク質、糖、色素および酸化防止剤の供給源である。
【０００４】
したがって、藻類および微細藻類は、それらが、補助食品、機能性食品、化粧品および薬剤を製造するために、または水産養殖のために使用される工業部門において関心を集めている。
【０００５】
微細藻類は、光に曝される全ての生息空間にコロニーを形成する第一の光合成微生物である。
【０００６】
工業規模で、そのモノクローナル培養は、光バイオリアクター中で行われるか（独立栄養条件：ＣＯ２を用いて、光を受けて）、または、場合によっては、それは、発酵槽中で行われる（従属栄養条件：炭素源の存在下で、暗所で）。
【０００７】
これは、微細藻類のいくつかの種：クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）が、光の非存在下で成長することができるためである。
【０００８】
さらに、従属栄養条件下における培養は、光栄養条件下より１０倍安価であると推定されるが、その理由は、当業者にとって、これらの従属栄養条件が以下のことを可能にするためである：
−  全ての培養パラメータを制御することを可能にする、細菌および酵母に使用されるものと同一の発酵槽の使用、
−  光による培養によって得られるものよりはるかに多い量のバイオマスの生成。
【０００９】
微細藻類の有益な利用は、一般に、発酵条件を制御することを必要し、それにより、以下のものなどの対象となるそれらの成分を蓄積することが可能になる：
−  注目すべき酸化防止剤特性のためおよび食品用の天然色素の提供のために需要が増加している色素（クロロフィルａ、ｂおよびｃ、β−カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、フィコシアニン、キサントフィル、フィコエリトリンなど）、
−  脂肪酸のそれらの含量（それらの固形分の重量で最大で６０％、あるいは８０％）を最適化するための脂質、特に：
・バイオ燃料用途だけでなく、
・選択された微細藻類が、「必須の」（すなわち、ヒトまたは動物によって自然に生成されないため、食事によって供給される）多価不飽和脂肪酸またはＰＵＦＡを生成する場合、ヒトの飲食または動物飼料用の食品における用途
にも向けた脂質、または
−  その栄養価を最適化するため、または、例えば、ペプチドに富む画分を調製する手段によって対象となるアミノ酸の供給を促進するためのタンパク質。
【００１０】
ペプチド画分は、多くの分野における機能性薬剤または補助食品として改良され得る。
【００１１】
対象となるアミノ酸を供給する状況において、アルギニンおよびグルタミン酸に富む利用可能なペプチド源を有することが実際に有利であり得る。
【００１２】
アルギニンは、動物界において多くの機能を有するアミノ酸である。
【００１３】
アルギニンは、分解されることで、それを吸収する細胞のためのエネルギー、炭素および窒素の供給源として働くことができる。
【００１４】
哺乳動物を含む様々な動物において、アルギニンは、オルニチンおよび尿素に分解される。後者は、動物有機体の細胞中に存在する含窒素化合物の量を調節するように（尿の排泄によって）除去され得る含窒素分子である。
【００１５】
アルギニンは、ＮＯ合成酵素を介して一酸化窒素（ＮＯ）の合成を可能にし、動脈の血管拡張に関与し、それにより、血管の硬直を低減し、血流を増加させて、血管の機能を向上させる。
【００１６】
アルギニンを含有する補助食品は、心臓の健康、血管機能を促進するため、「血小板凝集」（血栓の形成のリスク）を防ぐため、および動脈圧を低下させるために推奨される。
【００１７】
創傷の治癒におけるアルギニンの関与は、コラーゲン合成における別の重要なアミノ酸であるプロリンの形成におけるその役割に関連している。
【００１８】
最後に、アルギニンは、特にスポーツをする人によって、栄養飲料中でよく使用される成分である。
【００１９】
グルタミン酸に関して、それは、タンパク質合成に使用される基礎材料（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂｒｉｃｋ）の１つであるだけでなく、中枢神経系（脳髄＋脊柱）で最も広範囲にわたる興奮性神経伝達物質でもあり、ＧＡＢＡ作動性ニューロン中のＧＡＢＡ前駆体である。
【００２０】
コードＥ６２０下で、グルタメートは、食品中の旨味調味料として使用される。グルタメートは、食品の味を強化するために食品調製物に添加される。
【００２１】
グルタメートに加えて、国際食品規格委員会（ｔｈｅ  Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）は、旨味調味料として、そのナトリウム塩（Ｅ６２１）、カリウム塩（Ｅ６２２）、カルシウム塩（Ｅ６２３）、アンモニウム塩（Ｅ６２４）およびマグネシウム塩（Ｅ６２５）も認めている。
【００２２】
グルタメート（またはその塩）は、調理済みの食料（スープ、ソース、クリスプス（ｃｒｉｓｐｓ）および調理済みの料理）中に存在することが多い。グルタメート（またはその塩）は、アジアの料理にも一般的に使用される。
【００２３】
グルタメート（またはその塩）は、現在、食前酒中の香味料（ベーコン風味、チーズ風味）と組み合わせてよく使用される。これにより、ベーコン、チーズなどの風味を強化することが可能になる。何も含まない食前酒を見つけるのは稀である。
【００２４】
グルタメート（またはその塩）は、その味覚機能のためではなく、特定の薬剤カプセル中でも見られる。
【００２５】
最後に、グルタメート（またはその塩）は、料理の補助食品（固形スープの素、ソースのベース、ソースなど）の主成分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
しかしながら、微細藻類ペプチド画分の食品用途における開発は、前記画分中の望ましくない化合物（色素など）の存在のため、重要とされていなかった。これらの化合物は、それらを含有する食品組成物の色、味および構造の望ましくない変化をもたらす。
【００２７】
したがって、食品用途におけるそれらの可能性を高め、それらの商業的価値も高めるために、これらのペプチドは、
−  窒素の豊富さ、
−  対象となるアミノ酸の豊富さ、
−  色素の低含量
に関して、必要な組成を有する微細藻類から抽出されなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、タンパク質に富む微細藻類、およびクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類のバイオマスに由来するペプチド単離物に関する。
【００２９】
より特定的には、本発明は、アルギニンおよびグルタミン酸のその著しく高い含量によって特徴付けられる微細藻類単離物に関する。
【００３０】
本発明は、タンパク質に富む微細藻類のバイオマス自体にも関し、このバイオマスは、前記ペプチド単離物を調製するのに特に好適である。
【００３１】
本発明は、微細藻類の、より特定的には、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種のバイオマスを富化し、脱色するための方法にも関する。
【００３２】
最後に、本発明は、タンパク質に富む脱色された微細藻類のバイオマスからこのペプチド単離物を調製するための方法に関する。
【００３３】
特に、微細藻類、より特定的には、それらのペプチド画分の代謝的な豊富さ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｉｃｈｎｅｓｓ）を利用することができるように、本出願人の会社は、
−  １〜２０ｋＤａの分子量を有する可溶性ペプチド、
−  ９５％超のＮ．６．２５として表されるタンパク質含量、
−  本質的に、アルギニンおよびグルタミン酸
を有するペプチド単離物を提供することを提案する。
【００３４】
本発明の趣旨では、「アルギニンおよびグルタミン酸から実質的に構成される」という
表現は、全アミノ酸に対して表される８０、８５、９０または９５重量％超のアルギニンおよびグルタミン酸の含量として理解され得る、アルギニンおよびグルタミン酸の豊富さを意味する。特に、これらの２つのアミノ酸は、全アミノ酸に対して８５〜９９％、好ましくは、全アミノ酸に対して９０〜９８％間、特に、９５〜９８％を占める。
【００３５】
より正確には、本発明の趣旨では、「アルギニンおよびグルタミン酸から実質的に構成される」という表現は、全アミノ酸に対して表される、
−  少なくとも４０％のアルギニン、特に４０％〜６０％、好ましくは約５０％の含量；および
−  少なくとも４０％のグルタミン酸、特に４０％〜６０％、好ましくは約５０％の含量
として理解され得る、アルギニンおよびグルタミン酸の豊富さを意味する。
【００３６】
特に、アルギニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸の含量は、１０％未満、好ましくは５％未満、特に３％未満である。
【００３７】
特定の一実施形態において、単離物含量は、全アミノ酸に対して表される、
−  ４７〜４８％のアルギニンの含量；
−  ４９〜５０％のグルタミン酸の含量
であり；これは、３％未満のアルギニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸の含量に反映される。
【００３８】
「約」という用語は、示される値の±１０％、好ましくはその±５％を含む値の範囲を意味することが意図される。例えば、「約１０」は、９〜１１、好ましくは９．５〜１０．５を意味する。
【００３９】
このペプチド単離物は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類のバイオマスから調製されてもよく、脱色された微細藻類は、Ｎ．６．２５として表される、６０％超、例えば６５％超のタンパク質含量を有する。
【００４０】
微細藻類を発酵させるための好ましい方法は、
−  窒素不足で、ｐＨ調節をＮＨ３／ＫＯＨ混合物を用いて行う、第１の発酵工程、次に、
−  ＮＨ３単独で行われるｐＨ調節によってこの窒素不足を除去する第２の工程
を含む２工程方法である。
【００４１】
これらの動作条件は、Ｎ．６．２５の６０％超の、Ｎ．６．２５の約６５％のタンパク質含量、および低着色を有するバイオマスを迅速に得ることを可能にする。収率は、固形分濃度で４５〜５０重量％であり、バイオマスの最終濃度は、８０〜１２０ｇ／ｌである。
【００４２】
さらに、発酵液の可溶性画分の残留塩の含量は、６ｇ／ｌを超えない。
【００４３】
次に、このように調製されたバイオマスは、洗浄されて、その細胞間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）可溶性物質（特に、可溶性塩）を取り除くように精製され、１５〜３０％の固形分、好ましくは２０〜３０％の固形分にされ、次に、５秒間〜５分間の時間にわたって５０〜１５０℃の温度で熱処理される。
【００４４】
細胞膜を透過化し、自由拡散による細胞内区画の可溶性成分の放出を可能にするこの処
理の終了時に、残留バイオマスが除去され、次に、回収された可溶性画分が、浄化され、沈殿され、濃縮され、次に、乾燥されて、本発明に係るペプチド単離物を構成する。
【００４５】
したがって、本発明は、本明細書に記載される発酵方法によって調製されるタンパク質に富む微細藻類のバイオマスから得られるまたは得ることができる単離物に関する。本発明は、本明細書に記載されるようにバイオマスを処理するための方法によって、タンパク質に富む微細藻類のバイオマスから得られるまたは得ることができる単離物にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明に係るペプチド単離物の特性評価
本発明は、タンパク質中でそれを富化するように培養された微細藻類のバイオマスから調製されるペプチド単離物に関し、微細藻類は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、より特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）から得られる。
【００４７】
このタンパク質に富むバイオマスから得られる、本発明に係るペプチド単離物は、
−  １〜２０ｋＤａの分子量を有する可溶性ペプチド、
−  ９５％超のＮ．６．２５として表されるタンパク質含量、
−  実質的に、アルギニンおよびグルタミン酸
を含むことを特徴とする。
【００４８】
単離物の定義のこの文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、単離物が、これらのペプチドによって実質的に形成されるが、他の微量成分をわずかに含むことを意味する。ここで、「実質的に形成される」という用語は、乾燥重量で少なくとも９０、９５または９９％の単離物を意味する。
【００４９】
前記ペプチドの分子量は、以下の方法にしたがって、クロマトグラフィーによって測定される：
クロマトグラフィー条件：
−  連続して取り付けられた２つのカラム：ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００ＨＲ１０／３０カラムおよびＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）ペプチドＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）
−  流量：０．３ｍｌ／分
−  ２１４ｎｍにおけるＵＶ検出器
−  溶離剤：ＮａＣｌ  ０．０５Ｍ
−  分析時間：２４０分
試料が、ＨＰＬＣグレードの水中０．５％で溶解される。
【００５０】
カラムは、
−  サイログロブリン：Ｍｗ＝６７０ＫＤａ
−  ウシグロブリン：Ｍｗ＝１５８ＫＤａ
−  オボアルブミン：Ｍｗ＝４４ＫＤａ
−  ミオグロビン：Ｍｗ＝１７ＫＤａ
−  ビタミンＢ１２：Ｍｗ＝１．３５ＫＤａ
から構成されるＢｉｏｒａｄ対照混合物ｒｅｆ．１５１−１９０１を用いて調整される。次に、様々な画分のパーセンテージが、各対照の保持時間に基づいて計算される。
【００５１】
タンパク質含量の測定は、従来、一般に知られているＮ．６．２５を測定することによって決定される。
【００５２】
最後に、アミノ酸組成は、ＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  １３９０３（２００５年１１月）にしたがって決定される。
【００５３】
単離物のアルギニンおよびグルタミン酸含量は、本明細書に上述されるとおりである。
【００５４】
アルギニンおよびグルタミン酸の高含量は、本明細書において、例えば、全アミノ酸に対して表される、
−  ４７〜４８％のアルギニンの含量
−  ４９〜５０％のグルタミン酸の含量
を意味するものと理解され、これは、３％未満のアルギニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸の含量に反映される。
【００５５】
任意選択的に、ペプチド単離物は、全糖（炭水化物）の３％未満を占める。
【００５６】
本発明に係るペプチド単離物を調製するための方法
本発明に係るペプチド単離物は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類のバイオマスから調製されてもよく、脱色された微細藻類は、Ｎ．６．２５として表される、６０％超のタンパク質含量を有する。
【００５７】
タンパク質の最大の生産性および収率を得るために、本出願人は、その最近出願された特許出願の１つの中の他の箇所で保護されている新規な方法を使用した。
【００５８】
先行技術において、高細胞密度（ＨＣＤと略記される）を得るための第１の発酵方法が、広範囲に研究された。
【００５９】
これらのＨＣＤ培養の目的は、可能な限り短い期間で所望の生成物の可能な限り高い濃度を得ることであった。
【００６０】
しかしながら、その最高速度（μ、時−１）における増殖の維持は、対象となる生成物の高い生産性に必ずしも相関しているとは限らない。
【００６１】
そのため、生成物の形成が、高いまたは最大の細胞増殖に相関していない場合、細胞増殖の速度を制御するのが賢明である。
【００６２】
一般に、当業者は、「流加」と呼ばれる半連続的な条件下で、発酵条件（温度、ｐＨ）を制御することによって、または発酵培地への栄養成分（窒素または炭素源）の調節された供給によって、微細藻類の増殖を制御することを選択する。
【００６３】
実際に、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）は、最良の油生成微細藻類の１つであることが認められている。
【００６４】
従属栄養条件下で、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）は、炭水化物をトリグリセリドに迅速に転化する（その固形分の５０％超）。
【００６５】
トリグリセリドのこの生成を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境に影響を与えることによって、油生成に向かう炭素流れを最適化する必要がある。
【００６６】
ここで、窒素不足の条件下であるが、炭素の十分な供給がある場合、油が蓄積すること
が知られている。
【００６７】
したがって、Ｃ／Ｎ比は、本明細書における決定要因であり、グルコース含量は制限要因ではなく、窒素含量に直接影響を与えることによって最良の結果が得られることが認められる。
【００６８】
しかしながら、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）はまた、タンパク質を生成するその能力のために使用され得る。
【００６９】
したがって、タンパク質に富むバイオマスの生成のために、当業者は、微細藻類が、貯蔵脂質を天然に生成し、すなわち、低いＣ／Ｎ比を促進する代わりに発酵条件を変更し、ひいては：
−  タンパク質へと転化されることになる炭素源原料を一定に保持しながら、大量の窒素源を発酵培地に供給し、
−  微細藻類の増殖を刺激する
ことを可能にするために代謝制御と逆のことを行う必要がある。
【００７０】
これは、貯蔵脂質生成を損ねるタンパク質（ひいてはバイオマス）生成に向かう炭素流れを変更することを含む。
【００７１】
本発明の文脈において、本出願人は、他方、当業者によって従来想定されるものに対する代替的な解決策を提供することによって、新規な経路を探求することを選択した。
【００７２】
次に、バイオマスのタンパク質含量を増加させるために本出願人によって開発された、前記微細藻類の従属栄養培養のための方法は、以下を含む：
−  発酵槽の播種の後、１５〜２５ｇ／ｌ、好ましくは約２０ｇ／ｌの量のグルコースを一度に供給することによって特徴付けられる「バッチ」発酵段階、
−  グルコースが徐々に供給され、ＮＨ３／ＫＯＨ混合物によって最初に行われるｐＨ調節が、ＮＨ３単独での調節に置き換えられた指数関数的流加段階。
【００７３】
以下に示されるように、ＮＨ３の供給は、細胞内で合成されるタンパク質のレベルの著しく迅速な増加を引き起こし、これは、細胞内Ｎ．６．２５のレベルの、６０％を超える値への増加に反映される。
【００７４】
次に、バイオマス中に存在するアミノ酸の完全解析が、ｐＨ調節を変更する直前に取られた試料において、および前記変更の後に取られた、いくつかの他の試料において行われた。
【００７５】
変更の前、アミノ酸の合計は少なく（およそ１５〜２５％）、様々なアミノ酸の間で優位性がないことが観察される。
【００７６】
調節の変更の後、以下のことが注目される：
−  アミノ酸の合計が、４０％を超え、
−  合計して、全アミノ酸に対するグルタミン酸およびアルギニンの含量が、４５％を超え、
−  最も増加するアミノ酸は、グルタミン酸であり、続いてアルギニンである。他のアミノ酸の含量も、はるかに低い程度であるが増加する。
【００７７】
したがって、Ｎ．６．２５の増加は、グルタミン酸およびアルギニン合成の増加に直接相関している。
【００７８】
さらに、このｐＨ調節方法は、
−  発酵培地の塩供給を制限し、
−  ＮＨ３の初期含量がより制限されるほど、それに比例して黄色になる、バイオマスの色を調節する
ことを可能にする。
【００７９】
結論として、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の、さらにより特定的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種のものであるタンパク質に富む微細藻類のバイオマスは、
−  ８０〜９０ｇ／ｌの濃度、
−  ６０％超のＮ．６．２５含量、
−  その培養上清中の６ｇ／ｌ未満の塩の量、
−  低着色、および
−  全アミノ酸に対して４５重量％超のアミノ酸およびグルタミンの含量
を有する。
【００８０】
このバイオマスは、以下の方法を行うことによって、本発明に係るペプチド単離物を調製するのに特に好適である：
−  任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するようにバイオマスを洗浄する工程、
−  約１０秒間〜約５分間の時間、好ましくは、約１０秒間〜約１分間の時間にわたる、５０〜１５０℃、好ましくは、約８０〜１５０℃の温度でのバイオマスの熱透過化、
−  可溶性画分を得るための、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過、凝集および遠心分離、より特定的には、多段階遠心分離によって形成される群から好ましくは選択される固液分離の技術によってこのように透過化されるバイオマスの除去、
−  任意選択的に、残留不溶性物質を取り除くような精密ろ過によってこのように得られる可溶性画分の回収および浄化、
−  ペプチド単離物を得るような、沈殿による可溶性画分の精製、および
−  前記ペプチド単離物の蒸発、低温殺菌および微粒子化。
【００８１】
上に列挙される条件下での発酵の後、バイオマスは、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過、または当業者にさらに公知の任意の手段による固液分離によって収集される。
【００８２】
任意選択的に、本出願人は、バイオマスの連続した濃縮（遠心分離による）／希釈によって細胞間可溶性化合物を除去するようにバイオマスを洗浄することを推奨している。
【００８３】
本発明の趣旨では、「細胞間可溶性化合物」という用語は、発酵培地の全ての可溶性有機汚染物質、例えば、可溶性塩、残留グルコース、２または３の重合度（またはＤＰ）を有するオリゴ糖、またはペプチドなどの水溶性化合物を意味する。
【００８４】
次に、その細胞間可溶性化合物のこのように精製されるこのバイオマスは、１５〜３０重量％の固形分に、好ましくは２０〜３０％の固形分に優先的に調整される。
【００８５】
熱処理は、約５秒間〜約５分間の時間、好ましくは約１０秒間〜約１分間の時間にわたって、５０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１５０℃の温度で行われる。好ましくは、熱処理は、約１０秒間の時間にわたって約１４０℃の温度で行われる。別の好ましい代替例において、熱処理は、約１分間の時間にわたって約８５℃の温度で行われる。
【００８６】
この処理は、細胞内成分が、反応媒体中に拡散するのを可能にする。
【００８７】
最後に、これらの工程の終了時に、バイオマスは、４０℃未満の温度に冷却され、好ましくは、およそ４℃の温度で冷蔵される。
【００８８】
特定の理論によって制約されることを望むものではないが、本出願人は、これらの動作条件下で行われる熱処理が、細胞内区画、あるいは細胞外基質の可溶性成分の自然放出を可能にする膜弱化プロセスとしてこのように働き得ると考える。
【００８９】
イオン性物質に加えて、炭水化物（主に、ＤＰ１およびＤＰ２）、ペプチドおよびポリペプチドなどの有機物質が、細胞から排出される。
【００９０】
逆に、脂質および疎水性有機化合物は、細胞内に残り、それによって、細胞が透過化され、溶解または破壊されないことを明らかに示す。
【００９１】
したがって、本発明に係る方法は、エマルジョンの形成をもたらさず、実際に水性懸濁液の形成をもたらす。
【００９２】
透過化された膜を通した全てのこれらの可溶性物質の放出は、透析タイプの自由拡散のプロセスと類似している。
【００９３】
そのため、膜を透過化する熱処理後の十分な拡散を可能にするために、遅延時間が必要であり得る。
【００９４】
文献において、タンパク質を酵母膜から抽出するための酵母膜のパルス電場透過化のための方法は、４時間〜６時間を必要とする（Ｇａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１５，７７−８４）。
【００９５】
本発明によれば、５秒間〜５分間のはるかに短い反応時間が使用される。
【００９６】
次に、規模（時間／温度）の増加は、溶解度および可溶物抽出の収率の増加をもたらす。
【００９７】
本発明の方法は、有利なことに、残留バイオマスからこのように溶解されたペプチド画分を抽出するための熱透過化の現象を利用する。
【００９８】
したがって、次に、残留バイオマスは、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過、凝集、遠心分離または当業者にさらに公知の任意の手段による固液分離の技術によって除去され、それによって、微細藻類細胞から解放された可溶性画分を容易に回収することが可能になる。
【００９９】
この分離工程の収率および品質は、透過化された細胞を希釈することによって（例えば希釈／多段階遠心分離によって）向上され得る。
【０１００】
必要であれば、このように得られた可溶性画分は、残留不溶物を取り除くような精密ろ過によって浄化され得、その固形分に応じて、蒸発または当業者にさらに公知の任意の他の手段による濃縮が、後続の精製の前に行われ得る。
【０１０１】
得られた可溶性画分は、最終的に、タンパク質（５０〜８０％  ｗ／ｗ）および炭水化物（１０〜２５％  ｗ／ｗ）から実質的に構成される。
【０１０２】
可溶性タンパク質を回収するための従来の方法は、一般に、トリクロロ酢酸（１０％重量／体積）または硫酸アンモニウムを用いて前記タンパク質を沈殿させる工程に基づく。
【０１０３】
しかしながら、沈殿によるこれらの単離は、（通常、超音波処理または均質化による）非常に破壊的な細胞破壊方法の後に続く。それらは実際に抽出収率を高めることを可能にするが、変性された低溶解性のタンパク質を特にもたらす。
【０１０４】
次に、化学的手段（水酸化ナトリウムによる溶解）、物理的手段（高温処理）または酵素的手段（タンパク質分解酵素）による、（ペプチドへの）加水分解のそれらの生成物のみによって、その再機能化（ｒｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を想定することが可能である。
【０１０５】
次に、本発明の方法は、培地の特性を変更することによって、沈殿によって、対象となるタンパク質の単離をもたらす。
【０１０６】
ここで、本出願人は、以下のような手順を推奨している：
−  培地の物理化学的特性を変更することによって、タンパク質画分の全てまたは一部の沈殿を促進すること。
【０１０７】
前の工程に記載されるように得られた粗可溶物の冷却は、可溶性ペプチドの一部の沈殿の現象を引き起こす。沈殿が、より高い分子量に対してむしろ選択的であることが観察される。冷却温度は、１０℃未満、好ましくは４℃未満である。
【０１０８】
特定の動作条件は、この現象を促進することを可能にする：温度に加えて、ｐＨは、２．５〜６．５でなければならず、好ましくはこのｐＨｉに近く、すなわち、３〜５である。
【０１０９】
同様に、培地のイオン強度は、沈殿を促進するように適合されてもよい。したがって、イオン強度を大幅に低下させることによって、「塩溶（ｓａｌｔｉｎｇ−ｉｎ）」の現象が軽減され得、ひいては（溶媒和層を減少させることによって）タンパク質の溶解度が減少され得る。したがって、沈殿の前の脱塩操作が追加され得る。これは、カチオン性およびアニオン性樹脂を用いて、透析、ろ過または当業者にさらに公知の任意の手段によって行われる。
【０１１０】
逆に、イオン強度を大幅に高めることによって、利用可能な水が、「塩析（ｓａｌｔｉｎｇ−ｏｕｔ）」の現象によって減少し、このように、タンパク質は、沈殿する傾向を有する。次に、このように抽出されたタンパク質単離物において著しい脱塩が必要であり得るため、この方法は好ましくない。
【０１１１】
溶媒和層を変更するのと同じ観点で、培地の極性が、エタノールなどの溶媒を加えることによって（培地の脱水により）低下され得、これは、溶解度を大幅に低下させることによってタンパク質画分のより定量的な沈殿を生じることを可能にする。
【０１１２】
−  次に、乾燥前に任意選択的に濃縮される沈殿された画分を回収する。
【０１１３】
沈殿された画分の分離は、簡単なデカンテーションおよび重質相の回収によって、または任意選択的に、最適な温度条件下での遠心分離によって行われる。
【０１１４】
ｐＨは、乾燥前に任意選択的に再調整され得る。
【０１１５】
乾燥は、微粒子化、凍結乾燥によって、または当業者にさらに公知の任意の他の手段によって行われる。
【０１１６】
乾燥の前に、蒸発による濃縮の工程の組み込みが、エネルギーの点で操作を最適化することを可能にし得る。エタノールなどの溶媒がその再循環を行うのに使用される場合、それは特に正当化され得る。
【０１１７】
これらの手法を利用することにより、残留塩および糖からペプチドおよびポリペプチドの高含量を有する画分を精製することが可能になる。
【０１１８】
次に、アルギニンおよびグルタミン酸に富む可溶性タンパク質単離物が、９０重量％超で得られる。
【０１１９】
本発明は、例示的であり、非限定的であることが意図される以下の実施例からより明らかに理解されるであろう。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：グルタミン酸およびアルギニンの高含量を有するタンパク質に富むＣ．プロトセコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のバイオマスの調製
使用される菌株は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（菌株ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）である。
【０１２１】
前培養：
−  ５００ｍＬの三角フラスコ中の１５０ｍＬの培地；
−  培地の組成：４０ｇ／Ｌのグルコース＋１０ｇ／Ｌの酵母エキス。
【０１２２】
インキュベーションが、以下の条件下で行われる：
−  時間：７２時間；
−  温度：２８℃；
−  振とう：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）。
【０１２３】
バッチおよび次に流加方式での培養
調製および初期バッチ培地
−  ２０％  ｖ／ｖ（５９％）で、４００ｇ／ｌ（４１％）／ＮＨ３で、ＫＯＨの混合物を調製およびろ過し；
−  １２１℃／２０分で、２０Ｌの発酵槽を滅菌し；
−  ２つの三角フラスコに、５００ｍＬの前培養物（１５のＯＤ６００ｎｍ）を接種し；
−  ２０％（ｖ／ｖ）ＮＨ３ＯＨを用いて、ｐＨ４．５にし、
−  ３００ｒｐｍの振とう速度を開始する；
−  通気量：２０Ｌ／分の空気；
−  ３０％におけるｐＯ２調節；
原料
−  グルコース：５００ｇ／Ｌ
−  硫酸アンモニウム：５ｇ／Ｌ
−  リン酸二アンモニウム：２０ｇ／Ｌ
−  リン酸：１６ｇ／Ｌ
−  硫酸マグネシウム七水和物：１２ｇ／Ｌ
−  硫酸鉄：１７０ｍｇ／Ｌ
−  硝酸カルシウム：６１０ｍｇ／Ｌ
−  微量元素の溶液：４５ｍＬ／Ｌ
−  ビタミンの溶液：４．５ｍＬ／Ｌ
【０１２４】
アンモニウム塩、マグネシウム塩およびリン酸の原料が、発酵培地の塩含量を制限するように開発され、最終的な脱色されたバイオマスのＮ．６．２５含量を維持するように最適化されたことに留意するのが重要である。
【０１２５】
【表１】
2018502895.tif 000002
【０１２６】
【表２】
2018502895.tif 000003
【０１２７】
発酵手順
−  接種前に、２０ｇ／Ｌの当量を提供し、
−  グルコース濃度が＝０ｇ／Ｌである場合、指数関数的プロファイル（μ＝０．０７時−１）で供給を開始し；
−  ４１％のＫＯＨ／５９％のＮＨ３混合物を用いて、ｐＨを５．２に調節し、
−  ２ｋｇのグルコースが、微細藻類によって消費された場合、系を、ＮＨ３単独でのｐＨ調節に切り替える。
【０１２８】
結果：
この発酵手順は、Ｎ．６．２５として表される、６５％超のタンパク質を含むバイオマスを得ることを可能にする。
【０１２９】
実施例２：タンパク質が富化されたバイオマスの熱透過化および「粗」可溶物の回収のための方法
実施例１にしたがって得られたバイオマスは、８０％の純度（全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度）で、１０５ｇ／Ｌの細胞固形分で採取される。
【０１３０】
次に、それが、
−  洗浄され、インライン希釈［１：１］（ＶｗａｔｅｒＶｍｕｓｔ）によって濃縮され、
−  Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ  ５１０プレート遠心分離機において遠心分離され、２２０ｇ／ｌの固形分および９３％の純度（全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度）にされる。
【０１３１】
ｐＨは、水酸化カリウムで７に調整され、バイオマスは、７０℃での予熱を伴い、ＵＨＴによって熱処理され、その後、１４０℃で約１０秒間の規模での蒸気の直接噴射および減圧下での４０℃へのフラッシュ冷却が続く。
【０１３２】
熱処理は、バイオマスの部分溶解を最大化するように高い規模にされ、その純度は、５３％に減少する。
【０１３３】
定義により、細胞外培地中の可溶物の塩析は、全固形分に対する細胞固形分の画分を減少させる。
【０１３４】
この段階で、バイオマスの組成は、以下のとおりである：
−  全アミノ酸：４８．４％
−  全糖：２７．２％
−  全脂肪酸：１５．１％
−  灰：２．５％
−  他の残渣：６．８％。
【０１３５】
バイオマスの熱透過化による塩析から得られる可溶物の分離は、遠心分離によって行われる。
【０１３６】
分離の収率および品質を最適化するために、わずかな希釈［０．５：１］（ＶｗａｔｅｒＶｍｕｓｔ）が、第２の段階から第１の段階への上清の再循環を伴い、第２の段階で（連続した２つのＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ  ５１０遠心分離機を用いた形態で）インラインで行われる。
【０１３７】
第１の段階からの上清が、ここで回収され、浄化された可溶物が濃縮される。
【０１３８】
この「粗」可溶物は、以下の組成を有する：
−  全アミノ酸：７７．３％
−  全糖：１７．６％
−  灰：４．３％
−  他の残渣：０．８％。
【０１３９】
実施例３：タンパク質単離物の精製および生成
タンパク質画分を選択的に沈殿させるために、１１．４％の固形分を有する５ｋｇの粗可溶物が、撹拌しながらジャケット型反応器に入れられる。
【０１４０】
粗可溶物のｐＨは、リン酸で４．５に調整される。
【０１４１】
撹拌を停止した後、温度は、４℃に低下される。
【０１４２】
これらの条件は、８時間維持される。
【０１４３】
ここで、より高い分子量のペプチドが富化された重質相のデカンテーションが行われる。
【０１４４】
次に、重質相は、２６％の質量収率で、分液漏斗における簡単な相分離によって抽出され、３６．３％の固形分を有する。
【０１４５】
この抽出物は、９７％の固形分になるように凍結乾燥される。
【０１４６】
この単離物の組成は、以下のとおりである：
−  全アミノ酸：９５．９％
−  全糖：２．４４％
−  灰：１．６６％。
【０１４７】
全アミノ酸中のアミノ酸分布の分析は、以下のとおりである：
−  グルタミン酸：４９．７８％
−  アルギニン：４７．２１％
−  他のアミノ酸：３．０１％。
【０１４８】
単離物は、（全アミノ酸の分布分析に基づいて）アルギニンおよびグルタミン酸によって実質的に形成されるアミノ酸のおよそ９５％の豊富さによって特徴付けられる。
【０１４９】
この画分の分子量は、実質的に、１ｋＤａ〜２０ｋＤａである。
【国際調査報告】
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2018502895.tif 000005
2018502895.tif 000006
2018502895.tif 000007
2018502895.tif 000008
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