(57)【要約】【課題】血液凝固障害の診断およびリスク階層化を目的としたマーカータンパク質を同定するための方法、ならびに、患者（試験対象）の血液に実行され、血小板の活性化の程度および活性化の能力を決定する方法を提供する。【解決手段】血液凝固障害の診断およびリスク階層化のためにマーカータンパク質を同定する方法では、血小板を含有する血液、全血液、血清または血漿が提供される。そして、少なくとも二つのアリコートにアリコーティングされる。そして、血小板活性剤および／または血小板阻害剤がアリコートに添加される。そして、細胞、特にアリコート中の血小板が溶解される。そして、タンパク質が抽出され、かつ、プロテアーゼを用いてそれらを消化してペプチドが形成される。そして、リン酸化ペプチドが濃縮されて分離される。そして、リン酸化の増加または減少が定量的質量分析を用いて分析および評価される。【選択図】図1.4
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．）血小板を含有する血液、全血液、血清または血漿を提供することと、
ｉｉ．）少なくとも二つのアリコートにアリコーティングすることと、
ｉｉｉ．）Ａ．少なくとも第１アリコートに血小板活性剤に添加すること、Ｂ．少なくとも第２アリコートに血小板阻害剤を添加し、１回またはそれ以上の添加を任意に繰り返すこと、および、場合により、Ｃ．少なくとも第３アリコートに血小板活性剤を添加しそして血小板阻害剤を添加するか、またはその逆をし、必要に応じて、それぞれの添加を一回以上繰り返すことと、
ｉｖ．）細胞を、特に、ｉｉｉ．）のＡ、ＢおよびＣのそれぞれのアリコート中の血小板を、溶解させることと、
ｖ．）タンパク質を抽出し、かつ、プロテアーゼを用いてそれらを消化してペプチドを形成することと、
ｖｉ．）リン酸化ペプチドを濃縮して分離することと、
ｖｉｉ．）リン酸化ペプチドが選択され、同時に、時間とともにｉｉｉ．）Ａからのリン酸化が増加または減少することを示し、時間とともにｉｉｉ．）Ｂからのリン酸化が逆に減少または増加することを示し、場合によっては、ｉｉｉ．）Ｃからのリン酸化ペプチドとの比較において、リン酸化の増加または減少を示す、分析および評価を、定量的質量分析を用いて実行することとを含む、血液凝固障害の診断およびリスク階層化のためにマーカータンパク質を同定する方法。
【請求項２】
活性化の程度および血小板の活性化の能力を決定する方法であって、請求項１に記載の方法が患者の血液に対して行われることを特徴とする、方法。
【請求項３】
血液凝固障害、および、特に、血栓症、脳卒中、心臓発作、循環器障害および心臓血管疾患のような（関連）疾患の、リスクが高い、および／または、好ましくない予後を有する患者の同定、診断およびリスク階層化のための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者が症候性および／または無症候性の患者、特に緊急患者である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
同定、診断、リスク階層化のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
特に、集中治療または救急医療において、血液凝固障害ならびに（関連）疾患、特に、血栓症、脳卒中、心臓発作、循環器障害および心臓血管疾患の治療管理ための方法。
【請求項６】
特に、集中治療または救急医療において、特に、医薬品を用いたさらなる処置および治療に関して、患者の入院に関する決定を含む臨床的決定をするための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
予後、鑑別診断早期検出および同定、重症度の評価、ならびに、治療に伴う予後評価のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固障害の診断およびリスク階層化を目的としたマーカータンパク質の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な治療を提供するためには、特に救急医療において、血液凝固障害の早期診断と差別化とを行うことが、臨床判断をする必要性とともに必要とされている。
【０００３】
さまざまな物質（コラーゲン、トロンビン、免疫複合体等）の作用に起因して、血小板は、顆粒（脱顆粒）に貯蔵される血小板因子を分泌し、その上、血小板因子がとりわけ血液凝固系または体に固有の止血を活性化させ、これにより、血栓が形成される。しかしながら、血小板の活性化は、特に遺伝的理由または病理学的理由により破壊され得る。これは、通常、深刻な心血管性リスクまたは副作用の増加に関係している。したがって、血小板の活性化の程度および活性化能力（ＡａＡ）を決定することが必要である。これは、血小板（たとえばＶＡＳＰ）のタンパク質のリン酸化の程度に関連していて、キナーゼ活性の対象である。
【０００４】
個別的な血小板のＡａＡの決定は、より正確な患者のリスクグループへの分類と個人に合った治療（準備、投薬、期間、組み合わせ）とを提供しさらにこの治療を制御する能力に寄与するように意図されている。
【０００５】
従来技術において、血小板のＡａＡが多数の血小板機能試験で分析され、そこにおいて、血小板はアゴニストによって、または、剪断力を介して活性化され、そして、たとえばクロピドグレルのような薬物による治療後に血小板の活性化能力（応答）を決定するように、たとえば、凝集が決定される。
【０００６】
これらの機能試験は、特に３つの主要なタイプ：(i)透過光血小板凝集検査法（ＬＴＡ：Light Transmission Aggregometry）等の凝集に基づく試験、(ii)剪断力依存試験、そして、(iii)スルーフローサイトメトリーで構成されている。通常、多数の異なる方法および低い標準化の試験（そして、事前分析）の理由で、一方では、様々な試験間の相関は低いことが、他方では、薬物応答および治療管理を予測することに関する個々の試験の妥当性が実施には不十分であることが見出されている（Ｋｒｉｓｈａその他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１２、１２８８―１３０３）。遺伝子タイピングを用いた治療管理も述べられおり、したがって、両方法は現在批判的に見られる（Ｋｒｉｓｈａその他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１２、１２８８―１３０３）。リン酸化型特異的抗体を経たＶＡＳＰタンパク質のリン酸化の程度を決定するＶＡＳＰ分析（環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼの活性を検出するための試験システム、特許文献１）は、現在、少量の血液から血小板機能状況／活性化状況を点検するための標準の１つである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】独国特許出願公開第１００２９２１０Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大部分の試験において用いられている個々のキナーゼ基質またはパラメータの測定が、特に血小板において知られている異なる活性化および阻害シグナル経路の状況において、血小板のＡａＡを決定するのに十分でないように思われる。
【０００９】
したがって、周知の診断方法の不利な点は、危険な状態にある患者の早めのおよび完全な検出が不十分であるということであり、そのため、リスク階層化および治療管理が不十分であることである。したがって、以下の本発明の一つの目的は、危険な状態にある患者の、改良された検出を可能にするように、血液凝固障害のリスク階層化を開発することであり、さらなる目的は、対応するマーカータンパク質を同定することである。
【００１０】
マーカータンパク質の不十分な感度または特異性だけが通常達成されることも、従来技術における不利な点である。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、血液凝固障害の診断およびリスク階層化を目的としたマーカータンパク質を同定するための方法、ならびに、患者（試験対象）の血液に実行され、血小板の活性化の程度および活性化の能力を決定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は請求項１に係る方法により達成され、この方法は、
ｉ．）血小板を含有する血液、全血液、血清または血漿を提供することと、
ｉｉ．）少なくとも二つのアリコートにアリコーティングすることと、
ｉｉｉ．）場合により、Ａ．少なくとも第１アリコートに血小板活性剤に添加すること、Ｂ．少なくとも第２アリコートに血小板阻害剤を添加し、１回またはそれ以上の添加を任意に繰り返すこと、および、場合により、Ｃ．少なくとも第３アリコートに血小板活性剤を添加しそして血小板阻害剤を添加するか、またはその逆をし、必要に応じて、それぞれの添加を一回以上繰り返すことと、
ｉｖ．）細胞を、特に、ｉｉｉ．）のＡ、ＢおよびＣのそれぞれのアリコート中からの血小板を、溶解させることと、
ｖ．）タンパク質を抽出し、かつ、プロテアーゼを用いてそれらを消化してペプチドを形成することと、
ｖｉ．）リン酸化ペプチドを濃縮して分離することと、
ｖｉｉ．）リン酸化ペプチドが選択され、同時に、時間とともにｉｉｉ．）Ａからのリン酸化が増加または減少することを示し、時間とともにｉｉｉ．）Ｂからのリン酸化が逆に減少または増加することを示し、場合によっては、ｉｉｉ．）Ｃからのリン酸化ペプチドとの比較において、リン酸化の増加または減少を示す、分析および評価を、定量的質量分析を用いて実行することとを含む。
（以下：本発明に係る方法）
ステップｉｉｉ．）〜ｖｉｉ．）は、個別にまたは連帯的に必要なだけ頻繁に繰り返されることができる。ｉｉｉ．）Ｃにおける添加は、３０秒間隔で実行することができる。さらに、これらのステップは、全て自動化されてもよいし、個別に自動化されてもよい。
【００１３】
診断またはリスク階層化のために、ｉｉｉ．）Ａおよびｉｉｉ．）Ｂにより違いを示し、より具体的には反対のリン酸化を示し、より具体的には、ｉｉｉ．）Ａ（血小板活性剤の存在下）におけるリン酸化の増加（減少）、ｉｉｉ．）Ｂ（血小板阻害剤の存在下）におけるリン酸化の減少（増加）またはその逆（イタリック体の括弧内に示す）を示す１または複数のマーカータンパク質が同定されることが必要である。いずれのサンプルにおいても、全タンパク質の約１％が本発明によるこの挙動を示す。
【００１４】
ステップｉ．）：血液は、好ましくは、たとえば、血液採取過程（指を刺す）の間に、患者または試験対象からの新鮮な血液の形態で採取される。
【００１５】
ステップｉｉ．）：アリコーティング（サンプルを分割すること）は、任意の数のアリコート（チューブ）（たとえば、３６０以上）を生成するように実行される。
【００１６】
ステップｉｉｉ．）において、適した血小板活性剤は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、免疫複合体、血小板凝集阻害剤、とりわけ、クロピドグレル、プラスグレルまたはアセチルサリチル酸である。
【００１７】
ステップｉｉｉ．）において、適した血小板阻害剤は、イロプロスト（プロスタサイクリン類似体）および、モルシドミンまたはニトロプルシドなどのＮＯ（一酸化窒素）供与体のようなそれらである。
【００１８】
第３アリコートｉｉｉ．）Ｃは、結果をさらに検証するためのもので、任意に考慮されることができる。暗試料Ｄ（ｉｉ．からのアリコート）は、ステップｉｉｉ．）において血小板活性剤および血小板阻害剤の添加を行わないが、ステップｉｖ．）〜ｖｉｉ）を実行することにより、対照として保持することもできる。
【００１９】
ステップｉｖ．）では、溶解は、任意の方法を用いて行うことができ、特に、Ｂｅｃｋその他、Ｂｌｏｏｄ  ２０１４、１２３（５）：ｅ１−ｅ１０による正確な組成の溶解緩衝液（ホスファターゼ阻害剤を含む２％のＳＤＳ）を用いることが好ましい。溶解は、細胞シグナル応答を停止させるか、または血小板活性を「凍結」させる。
【００２０】
ステップｖ．）では、抽出は、任意の方法で行うことができ、特に、エタノール沈殿またはフィルタアシストによる試料調製（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉその他、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ、（２００９）  ３５９−３６２）を用いることが好ましい。タンパク質消化は、たとえば、トリプシン（Ｄｉｃｋｈｕｔその他，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０１４，６；１３（６）：２７６１−７０）を用いることによって実行されることができ、これによって、質量分析（７〜３５アミノ酸の好ましい範囲）を用いて容易に検出および定量することができる平均１４アミノ酸長のペプチドが得られる。
【００２１】
ステップｖｉ．）における定量的質量分析の目的で、得られたペプチドを濃縮するために、ぺプチドは、ラベルされたものまたはラベルフリーのものを使用することができる。適切なラベル、特に、同位体標識は、たとえば、ｉＴＲＡＱ（Ｒｏｓｓその他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ２００４；３：１１５４−１１６９）、ＩＣＰＬ（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｊその他，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；８９３：１４３−５３）またはジメチルラベリング（Ｈｓｕその他、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３；７５：６９４３−６８５２）を用いて生成されることができる。もちろん、アリコートは、個々に定量することができる。標識されたまたは標識されていないリン酸化ペプチドは、二酸化チタン（Ｄｉｃｋｈｕｔその他、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４；１１５６：４１７-３０）を用いて分離され、あるいは、ＥＲＬＩＣ（Ｌｏｒｏｃｈその他、  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ２０１５，  ３；８７（３）：１５９６−６０４）やＴｉ４＋−ＩＭＡＣ（Ｄｅ  Ｇｒａａｆ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ２０１４；１３（９）：２４２６−３４）のようなホスホペプチド濃縮の別の方法も用いることができる。
【００２２】
このように分離されたリン酸化パプチドは、定量的分析に供給され、好ましくは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳが用いられる。
【００２３】
本発明の範囲内において、「定量的質量分析」は、ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析も）が使用されているものを意味する。ここで、ＭＳ１スキャンは、まず、存在するペプチドイオンの質量／電荷比（ｍ／ｚ）を記録する質量分析計で取得され、次いで、これらのペプチドイオンは、たとえば、不活性ガス分子（Ｎ２またはＡｒ）との衝突によるエネルギー移動によって断片化される。そして、イオンは非常に特異的に崩壊し、ＭＳ／ＭＳスキャンで読み取られる他の（より軽い）イオンを形成する。トリプルクワッド（ＱｑＱ）、ＱｑＴＯＦ（Quadruple-quadruple-ＴＯＦ）、ＴＯＦ−ＴＯＦおよびＴＲＡＰ−オービトラップ、そしてさらにハイブリッド質量分析計などの多くの分析器の組み合わせを用いることができる。従来のＭＳ／ＭＳおよびＭＳ３（Ｔｉｎｇその他，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ，  ８（１１），  ９３７−９４０  （２０１１））の他に、ＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）やＰＲＭ（Parallel Reaction Monitoring）を用いることもできる。さらに、本発明によれば、液体クロマトグラフィーとのカップリング、特に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの形態が好ましい。特に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ステップｖｉ．）からリン酸化ペプチドの時間分解定量質量分析を許容する。かなりのデータ量（１０，０００ｅスペクトル、１０００ｅ定量化リン酸化ペプチド）のため、評価は、生物情報学的に実行されなければならない。この目的で、このデータは、一方では、検出されたペプチド配列を同定する（すなわち、アミノ酸配列を決定し、元々のたんぱく質に割り当て、配列内のリン酸化部位を局在化させる）ために定性的に評価され、他方では、定量的に評価される（ペプチドの量の尺度としての質量分析計におけるシグナル強度の読み取り）。この同定は、Ｍａｓｃｏｔ（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＤＮその他，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  １９９９；２０：３５５１）のような検索アルゴリズムを使用して行われ、リン酸化部位の局在化は、ｐｈｏｓｐｈｏＲＳ（Ｔａｕｓその他，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２０１１；１０（１２）：５３５４−６２．）等によって実行される。ここで、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンからの情報は、タンパク質配列データベースからの（たとえば、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇから入手可能な）配列情報と比較される。定量化は、最終的に使用する方法に依存する。レポーターイオン依存的な方法（ｉＴＲＡＱ、ＴＭＴ）の場合、ラベルに基づいて生成されるレポーター信号が、異なるサンプルのペプチドの相対量の尺度として、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて用いられる（図１）。非同重体標識方法（ＩＣＰＬ、ジメチル）およびラベルフリー定量化の場合、定量的情報は、ＭＳスキャンレベルで読み込まれる（図１）。信号は、生物情報学的に強度値（たとえば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて）に変換され、したがって、試料間の変化を定量化することができる。
【００２４】
本発明に係る用語である「血液凝固障害」は、特に止血障害に基づいておりかつ血液凝固を低減または増加させる全ての手順及びプロセスを含む。特に、外科的介入の場合、そのような血液凝固障害は、生命を脅かす合併症を引き起こす。本発明に係る「血液凝固障害」は、疾患、状態、ならびに血栓症、脳卒中、心臓発作、循環器障害および心臓血管疾患のような関連疾患を含む。
【００２５】
述べられた全ての適応症は、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ，  Ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、  ２６６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、  Ｂｅｒｌｉｎ  ２０１５に記載されている。
【００２６】
本発明に係る「リスク階層化」という用語は、血液凝固障害、ならびに、特に、血栓症、脳卒中、心臓発作、循環器障害および心臓血管疾患のような関連疾患の診断および治療／処置のために、最も好ましい経過を可能とすることを目的として、患者、特に、緊急患者、危険な状態にある、予後不良の患者を発見することを含む。本発明に係るリスク階層化は、結果的に、たとえば、標的治療の管理につながる効率的な処置方法を可能とする。
【００２７】
したがって、本発明は、増加する危険な状態にあり、および／または、血液凝固障害の好ましくない予後の患者、より詳しくは、症候性および／または無症候性の患者、特に、緊急患者の同定にも関連する。
【００２８】
特に、緊急、および／または、集中治療の場合、本発明に係る方法を用いることによって、確実な階層化が特に有利に行われる。したがって、本発明に係る方法は、治療の迅速な成功および死の回避に結びつく臨床的決定を可能にする。このような、臨床的決定は、血液凝固障害の処理または治療のための医薬品、特に、アブシキシマブ、アセチルサリチル酸、アセチルサリチル酸およびジピリダモールの組み合わせ、クロピドグレル、エプチフィバチド、イロプロスト、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン、チロフィバンのような血小板凝集阻害剤（ＴＡＩｓ：Thrombocyte Aggregation Inhibitors）を用いるさらなる処置を含む。
【００２９】
したがって、本発明は、患者による入院決定を含む臨床的決定、たとえば、医薬品による治療、好ましくは緊急を要する集中治療または救急医療において、医薬品によるさらなる処置および治療のような臨床的決定を行うために、血液凝固障害から患者を診断および／またはリスク階層化するための方法にも関連する。
【００３０】
したがって、さらに好ましい実施形態において、本発明に係る方法は、血液凝固障害の治療管理に関連する。
【００３１】
本発明に係る方法のさらに好ましい実施形態において、この方法は、予後の診断および／またはリスク階層化、鑑別診断早期検出および同定、重症度の評価、ならびに、治療に伴う予後評価に使用される。
【００３２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、検査すべき患者へのまたは検査すべき患者からの血液凝固障害の早期または鑑別診断または予後のための生体外（in vitro）診断のための方法に関する。
【００３３】
本発明に係る方法の一実施形態では、血液は、検査すべき患者から、場合により全血液または血清または利用可能な血漿から採血され、診断は、生体外（in vitroまたはex vivo）、すなわち人体外または動物の体外で行われる。
【００３４】
本発明に係る方法によるリン酸化ペプチドの決定により、高感度および特異性が達成され（実施例および図参照）、本発明の方法による少なくとも１つの患者のサンプル中に存在する、対応するリン酸化タンパク質の量に基づいて、診断またはリスク層別化が行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１．１】図１．１は、血小板の単離および刺激（活性化）後の実験手順を示す図である。
【図１．２】図１．２は、血小板の単離および刺激（活性化）後の実験手順を示す図である。
【図１．３】図１．３は、血小板の単離および刺激（活性化）後の実験手順を示す図である。
【図１．４】図１．４は、血小板の単離および刺激（活性化）後の実験手順を示す図である。
【図２】図２は、本発明に係る方法の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下の実施例および図面は、本発明を限定することなく説明するためのものである。
【００３７】
新鮮な血液が採取されると、血小板は、まず、分画遠心分離によって分離される（Ｂｅｃｋその他，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１４，  １２３（５）：ｅ１−ｅ１０）。次に、試料がアリコートに分割され、（ｉ）アリコートの１つを無治療対照として、（ｉｉ−ｉｉｖ）ＡＤＰまたはトロンビンのような活性化アゴニストで１０秒間、３０秒間、および６０秒間でアリコートの３つが刺激され、（ｖ−ｖｉｉ）たとえば、イロプロストやジエチルアミンノノエートを添加することによって１０秒間、３０秒間、および６０秒間でアリコートの３つが阻害され、（ｖｉｉｉ）１つの試料が３０秒間活性化されてから３０秒間阻害される。
【００３８】
適切なマーカータンパク質を系統的に調べるためには、異なる濃度、活性剤／阻害剤、時間が選択されるべきである。各試料は、刺激後に、溶解緩衝液（たとえば、２％ＳＤＳ、ホスファターゼ阻害剤カクテル）にすぐに素早く溶解される。溶解が実行されると、エタノール沈殿またはフィルタアシストによる試料調製を用いて、タンパク質が抽出される（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉその他、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ、（２００９）  ３５９−３６２）。次に、トリプシンを用いたタンパク質消化が実行される（Ｄｉｃｋｈｕｔその他，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０１４，６；１３（６）：２７６１−７０）。
【００３９】
次に、生成されたペプチド試料は、安定同位体標識（たとえば、ＡＢ  ＳｃｉｅｘによるｉＴＲＡＱ  Ｌａｂｅｌ）を用いて化学的にラベル付けされ、その後混合され、または、ラベルフリー分析として知られているものによって個別に処理および分析される。分析にとって重要なリン酸化ペプチドを、大過剰の非リン酸化ペプチドから分離し、それらを質量分析にアクセス可能にするために、リン酸化ペプチドが二酸化チタンを用いて濃縮される（Ｄｉｃｋｈｕｔその他、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４；１１５６：４１７-３０）。
【００４０】
次に、個別に分析（ラベルフリー解析）されたリン酸化ペプチド試料、または、（ｉＴＲＡＱで）混合された試料は、ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析される（図１．１〜図１．４参照）。
【００４１】
図１．１〜図１．４：血小板の単離および刺激（活性化）後の実験手順。
【００４２】
リン酸化ペプチド、ひいては活性化または阻害に対する血小板のシグナル応答は、結果的に定量化される（左下：化学標識からのレポーターイオンによる定量化、右下：それぞれの試料中のホスホペプチドのシグナル強度に基づく「ラベルフリー」定量化）。（Ａ）潜在的な新しいマーカータンパク質の例示的な例。ＡＤＰ１、ＡＤＰ２およびＡＤＰ３のシグナルの増加は、対照と比較して、ＡＤＰ刺激後のリン酸化の増加を示し、一方、Ｉｌｏ１、Ｉｌｏ２およびＩｌｏ３シグナルが阻害後のリン酸化の減少を示す。ＡＤＰ刺激による増加は、イロプロスト（ＡＤＰ／Ｉｌｏ）の添加で最終的に埋め合わせられる。原則として、対照的に、ＡＤＰが減少を引き起こし、イロプロストが増加を引き起こすことも可能である。
【００４３】
図２：本発明に係る方法の例。
【００４４】
（ｉ）血小板は、止血の生理学的方法での鍵となる役割を引き受ける。換言すると、血管が損傷する場合、血小板は、これを認識し、これにより、活性化され凝集し、これにより、傷口を塞ぐ安定した血栓を形成し、これにより、失血を防ぎ、そして、病原体および異物の侵入を防ぐ。このプロセスは、数秒から数分の間に実行される。血流には、阻害的な挙動をする化合物、特に、この血小板の活性化の自発的な発生を防止することを意図する化合物が存在する。この敏感なシステムが破壊された場合、血管を塞ぐ血栓症を引き起こす可能性があるので、組織への血液の供給が阻害されて最終的に梗塞を引き起こし得る。（ｉｉ）血小板の活性化は、リン酸化連鎖反応として知られているものを介して起こる。血液系からの活性化合物または阻害化合物は、膜受容体に結合し、その結果、「下流シグナル伝達」を引き起こす。換言すると、酵素が、タンパク質（キナーゼ）への共有結合を介してリン酸残基に選択的に結合し、あるいはそれら（ホスファターゼ）を除去する。リン酸基は、タンパク質表面で電荷の変化を引き起こし、その結果、タンパク質の三次元構造の変化を引き起こす。後者は、（ａ）どのタンパク質が互いに相互作用するか、タンパク質が最終的に有する（ｂ）機能および（ｃ）活性を定義する。したがって、リン酸化は、細胞プロセスの迅速な制御のための、可逆的でかつ微調整されたシステムである。（ｉｉｉ）定量的質量分析（ＭＳ）によって、数百または数千のタンパク質のタンパク質リン酸化の変化は、現在測定可能である。この目的を達成するために、健康なドナーからの血小板が好ましくは新鮮な血液から単離され、約４０００〜５０００存在するタンパク質が生成され、より小さい断片、またはペプチドとして知られているものに、タンパク質分解的に切断される。これらのペプチドは、１つ以上のリン酸残基を含むもののみが分析に供給されるように、濃縮の対象となる。最後に、定量的ＭＳは、活性化合物（ＡＤＰ）または阻害化合物（イロプロスト）による血小板の刺激の後に、リン酸化の違いを検出するために用いられる。時間分解定量的データは、「ネットワーク」（シグナル経路の全体）への情報を得るために、生物情報学的に評価される。（ｉｖ）時間分解定量的質量分析データは、特定のタンパク質において有意に異なる（すなわち反対の）リン酸化過程を検出するために使用される。たとえ、タンパク質の特定のリン酸化部位の正確な機能は、知られていなくても、反対の過程は、血小板の平衡（恒常性）において中心的な役割を示す。活性化によって増加し、逆に阻害によって減少し、またはこの逆であるリン酸化部位は、両方のプロセスにおいて中心的な役割を示し、したがって、診断および治療の目的のために潜在的な候補（標的）を表し、血液凝固障害のリスク階層化、および、活性化の程度および血小板の活性能の決定に用いることができる。
【図１．１】
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【図１．２】
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【図１．３】
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【図１．４】
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【図２】
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【国際調査報告】
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