(57)【要約】本発明は、磁性キトサン微粒子を使用し、その後、該微粒子上に捕捉された核酸に対してＰＣＲ反応を行うことによって、核酸を含む生体試料を濃縮する方法に関する。ＰＣＲに適合するｐＨの生体試料に添加されたキトサン微粒子は、機械的に撹拌されて細胞溶解及び同時のＤＮＡ捕捉を提供し、その後、ＰＣＲ反応の間、核酸テンプレートに対する固体支持体としてはたらく。キトサン微粒子が溶解に利用され、ＰＣＲの前に該微粒子から核酸を除去する必要がいないことから、試料調製手順の容易性が劇的に改善される。【選択図】図１１
2018519807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の細胞を含む生体試料から核酸を精製する方法であって、
ＰＣＲ増幅に適合するｐＨを有する前記生体試料に微粒子を添加する工程と、
前記生体試料を機械的に撹拌することにより、前記生体試料中の前記１以上の細胞を溶解する工程と、
放出された核酸を前記微粒子上に捕捉する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記微粒子がキトサンから製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子が磁性微粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キトサン微粒子が、油中にキトサン小滴を作り、その後、該小滴を微粒子へと架橋することによって製造される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記小滴の微粒子への架橋が経時的に微粒子のコアに入る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
磁性ナノ粒子を個々の微粒子内に包埋することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記磁性ナノ粒子が直径２０ｎｍ〜４０ｎｍの鉄ナノ粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記磁性微粒子の表面から前記核酸を精製することに続いて、増幅することを更に含み、該精製が該増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記溶解が、前記磁性微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることを含む、前記生体試料を機械的に撹拌することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料中の前記１以上の細胞を溶解する工程が、前記生体試料を加熱することと、前記生体試料をボルテックスすることとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記キトサン微粒子が、細胞溶解及び同時のＤＮＡ捕捉を提供した後、ＰＣＲ増幅反応の間、ＤＮＡテンプレートに対する固体支持体としてはたらく、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高ｐＨにおいて正に帯電したままである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸がプラスミド、細菌ＤＮＡ、及びヒトゲノムＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生体試料から核酸を増幅する方法であって、
前記生体試料に微粒子を添加する工程と、
前記生体試料を機械的に撹拌して前記生体試料中の細胞を溶解する工程と、
放出された核酸を前記磁性微粒子上に捕捉する工程と、
前記捕捉された核酸に対して直接増幅を行う工程と、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記微粒子がキトサンから製造される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記微粒子が磁性微粒子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料がＰＣＲ増幅に適合するｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記精製が前記増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶解が、前記磁性微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることを含む、前記生体試料を機械的に撹拌することによって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料中の前記１以上の細胞を溶解する工程が、前記生体試料を加熱することと、前記生体試料をボルテックスすることとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高ｐＨにおいて正に帯電したままである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
核酸がプラスミド、細菌ＤＮＡ、及びヒトゲノムＤＮＡからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記キトサン粒子が、油中にキトサン小滴を作り、その後、該小滴を微粒子へと架橋することによって製造され、前記架橋が油水界面で開始し、経時的に前記微粒子のコアへと続く、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記油剤で前記微粒子を２回洗浄することと、
前記油剤中に再懸濁することと、
前記油剤に気流バブリングを通して乾燥させることと、
を更に含み、
前記微粒子を２回洗浄することによって前記油剤を除去する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
磁性ナノ粒子を個々の微粒子内に包埋することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記磁性ナノ粒子が直径２０ｎｍ〜４０ｎｍの鉄ナノ粒子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生体試料から核酸を増幅する微小流体システムであって、
微粒子と合わせた生体試料と、
微粒子と合わされた前記生体試料を機械的に撹拌して前記生体試料中の細胞を溶解するように構成される、溶解ユニットであって、該細胞から放出された核酸が前記磁性微粒子上に捕捉される、溶解ユニットと、
溶解の結果として前記生体試料中に放出された前記核酸を精製するように構成される、精製ユニットと、
前記精製された核酸を受け取って、前記捕捉された核酸に対して直接増幅を行うように構成される、増幅ユニットと、
を含む、微小流体システム。
【請求項３０】
前記微粒子がキトサンから製造される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記微粒子が磁性微粒子である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記キトサン微粒子が、油中にキトサン小滴を作り、その後、該小滴を微粒子へと架橋することによって製造される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３３】
前記小滴の微粒子への架橋が経時的に微粒子のコアに入る、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
ナノ粒子が個々の微粒子内に包埋される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３５】
前記ナノ粒子が直径２０ｎｍ〜４０ｎｍの鉄ナノ粒子である、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記核酸が前記磁性微粒子の表面から増幅され、前記精製が、前記増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項２９のシステム。
【請求項３７】
前記溶解ユニットが、前記磁性微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることによって前記生体試料を機械的に撹拌するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３８】
前記生体試料中での前記１以上の細胞の溶解が、そこに微粒子を有する前記生体試料をボルテックスする前に、前記生体試料を加熱することを含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３９】
前記精製ユニットが、捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４０】
前記キトサン微粒子が細胞溶解及び同時のＤＮＡ捕捉を提供し、その後、ＰＣＲ増幅反応の間、ＤＮＡテンプレートに対する固体支持体としてはたらく、請求項３０に記載のシステム。
【請求項４１】
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高ｐＨにおいて正に帯電したままである、請求項３０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記核酸がプラスミド、細菌ＤＮＡ、及びヒトゲノムＤＮＡからなる群から選択される、請求項２９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１５年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１６４３９４号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３１８８号に対する優先権の利益を主張するものであり、その米国仮特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に対してＤＮＡ試料を濃縮する方法に関する。具体的には、該方法は、ＰＣＲに適合するｐＨを有する溶液中で細胞溶解及び同時のＤＮＡ捕捉を提供する磁性微粒子を利用する。その後、該磁性微粒子は、ＰＣＲの間、ＤＮＡテンプレートに対する固体支持体としてはたらく。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅方法は生物学の研究に関する、また同様に疾患、特に遺伝性疾患及び感染症の診断に関する強力な手段である。増幅工程の多くが自動化されているが、通常は、ＤＮＡ又はＲＮＡの標的が食品、環境、又は臨床試料に由来する複雑な溶解物又は混合物に希釈されていることから、試料調製が複雑となる場合がある。試料ＤＮＡはヌクレアーゼによって消化され、ポリメラーゼはプロテアーゼによって加水分解され、また溶解化学薬品は増幅反応に干渉する可能性があることから、増幅に先立って核酸を精製しなければならない。
【０００４】
図１Ａは、細胞１１６を含む試料中の核酸を精製するための従来の方法を説明するものである。シリカ固相抽出技術を使用して核酸精製を行う（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。最初に、工程１０２において、化学溶解バッファーで細胞試料を溶解し、撹拌してＤＮＡ１２６を放出させる。その後、一連の工程において遠心力により、結合溶液、洗浄溶液、及び溶出溶液を、シリカ膜を備えるスピンカラムに通す。試料中の核酸は、工程１０４においてシリカへの吸着を引き起こす塩酸グアニジン等のカオトロピック（chaotropic）塩によって変性される。その後、工程１０６でアルコールを使用して、洗い流さなければＰＣＲを阻害する可能性がある塩及び細胞片を洗い流す。工程１０８において、精製された核酸は適度な塩バッファー中でシリカから溶出され、ＰＣＲ混合物に添加され、工程１１０で増幅される。曲線１３０は、工程１０２〜工程１０８に従って生体試料から精製された核酸に対して行われたＰＣＲ反応を実証するものである。
【０００５】
核酸を精製するためシリカ膜を使用することに関し、幾つかの特有の不利益がある。一つは、複雑な試料から核酸を抽出するために典型的には３〜４の異なる溶媒が必要なことである。各洗浄工程を行うことは手間がかかるが、洗浄の自動化は、溶媒の数を増すことで更に複雑さを増す。さらに、シリカへのＤＮＡ吸着に必要なカオトロピック剤及びアルコールは、増幅法に対して阻害的である。さらに、市販のスピンカラムは、例えば約５００μＬ程度の比較的少ない試料しか処理することができない。希少な標的に由来する希薄なＤＮＡ又はＲＮＡを捕捉するため、試料体積を増加させなければならならず、スピンカラムに実用的でない体積となる。
【０００６】
別の固相抽出方法が、シリカ微粒子又はマイクロビーズに対して応用されている。マイクロビーズの表面がシリカ膜に取って代わる一方で、マイクロビーズは、細胞を溶解するとともに、高濃度のカオトロピック塩が存在する状況でのボルテックスの下で放出されたＤＮＡを捕捉することにより、プロセスから１つの工程を排除することを可能とする。それにもかかわらず、１つの工程を排除しても、上記方法はなおも比較的複雑であり、かつ手間がかかる。
【０００７】
試料調製工程の数を減少することが報告された追加の方法は、電荷スイッチング（charge switching）である。このアプローチでは、核酸が、適度に低いｐＨ（結合表面を正に帯電させる）でｐＨ反応性材料に吸着された後、適度に高いｐＨ（ＰＣＲと適合する）へ放出されて、結合物質を中和する。したがって、電荷スイッチングの方法論では、阻害的な塩濃度、カオトロピック塩、又はアルコールは必要でない。これまで、ＤＮＡ捕捉はｐＨ８．０で溶出を開始し、ｐＨ７．５未満のみで可能であると考えられていた。
【０００８】
別のＤＮＡ精製アプローチは、ＤＮＡ調製においてキトサンを採用することに基づく。キトサンは、ｐＨによって電荷調節され得るそのアミン基の存在量による、電荷スイッチングに特に有用なポリカチオン（polycation）である。キトサンは、甲殻類の殻から抽出されたキチンの誘導体であることから、容易に入手可能であり、安く、生体適合性である。キトサン上のアミン基はｐＫａ約６．４を有することから、キトサンは６．４未満のｐＨで陽イオン性であり、これらの条件下で負に帯電したＤＮＡを容易に結合させることができる。具体的には、キトサンは、最初に酸性のバッファー中でＤＮＡを捕捉した後、ｐＨの変化に応じて、例えば８．０超へのｐＨ変化に際してＤＮＡを放出する、ｐＨ切り替え可能な材料として使用される。ｐＨ６．４未満のバッファーで優位に正に帯電される場合、核酸の負のリン酸骨格はキトサンに静電気的に引きつけられる。低分子量キトサンで官能化されたシリカビーズは、ＰＣＲに適合する適度に高いｐＨ（約８．５）で効率的にＤＮＡを溶出する。シリカ膜と比較して、電荷スイッチングの使用は工程（溶解、結合、溶出）の減少を伴うものの、自動化を試みるには、工程数は依然複雑である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Boom et al. 1990
【非特許文献２】D. N. Miller et al. 1999
【非特許文献３】Haugland, Brinkman, and Vesper 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、比較的大きな試料体積からＰＣＲに適切な小さい試料体積へと利用可能なゲノムＤＮＡを濃縮しながら、試料調製に必要な負担を軽減する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様では、生体試料に由来する核酸を増幅する方法が提供される。具体的には、該方法は、微粒子、任意に磁性微粒子を生体試料に添加する工程と、該生体試料を機械的に撹拌して細胞溶解を達成する工程とを含む。次に、細胞から放出された核酸を微粒子上に捕捉する。その後、捕捉した核酸に対して直接増幅を行う。一実施の形態では、溶解は、微粒子を含む生体試料をボルテックスすることによって行われてもよい。微粒子は、キトサンから製造されてもよい。更に別の実施の形態では、同じバッファーを試料の精製及び増幅の両方の間で使用する。さらに、試料を加熱すること、キトサン微粒子を添加すること、及び後に生体試料をボルテックスすることによって、生体試料において細胞溶解を行ってもよい。一実施の形態では、核酸は、プラスミド、細菌ＤＮＡ、及びヒトゲノムＤＮＡからなる群から選択される。
【００１２】
本発明の更に別の態様では、生体試料から核酸を増幅する微小流体（microfluidic）システムが提供される。具体的には、該システムは、溶解ユニットと、精製ユニットと、増幅ユニットとを含む。溶解ユニットは、微粒子、任意に磁性微粒子と合わせた生体試料を機械的に撹拌して生体試料中の細胞を溶解するように構成される。細胞から放出された核酸は、微粒子上に捕捉される。精製ユニットは、溶解の結果として生体試料中に放出された核酸を精製するように構成される。最後に、増幅ユニットは、提供される精製された核酸を受け取るように構成される。微粒子上に捕捉された核酸に対して、直接増幅を行う。一実施の形態では、溶解は微粒子を含む生体試料をボルテックスすることにより行われてもよい。微粒子をキトサンから製造してもよい。更に別の実施の形態では、同じバッファーを試料の精製及び増幅の両方の間で使用してもよい。さらに、試料を加熱すること、キトサン微粒子を添加すること、及び後に生体試料をボルテックスすることによって、生体試料において細胞溶解を行ってもよい。一実施の形態では、増幅ユニットで増幅される核酸は、プラスミド、細菌ＤＮＡ、及びヒトゲノムＤＮＡからなる群から選択される。
【００１３】
本明細書の一部をなし、本明細書の一部を形成する添付図面は、本発明の種々の実施形態を示す。図面中、同様の参照符号は同一の要素又は機能が類似する要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａは従来技術によりＰＣＲ反応に対して核酸試料を濃縮する方法を説明するフローチャートである。Ｂは本発明の一実施形態によりＰＣＲ反応に対して核酸試料を濃縮する方法を説明するフローチャートである。Ｃは本発明の一実施形態によるＤＮＡの精製及び増幅のプロセスを説明する図である。
【図２】キトサン（上）及びグルタルアルデヒド（下）の化学構造を提示する図である。
【図３】キトサン微粒子のＳＥＭ画像を提示する図である。
【図４】Ａは陽性対照の増幅曲線と比較して、ビーズ上の精製ＤＮＡ及びヒト細胞溶解物に由来するＤＮＡによる直接ＰＣＲの増幅曲線を示す図である。ＢはＡに示される実験で産生されたアンプリコンの変性曲線を示す図である。
【図５Ａ】本発明の別の実施形態に従う第２の実施形態によりｈｇＤＮＡに対して行ったＰＣＲ反応に対する増幅曲線及び変性曲線を提示する図である。
【図５Ｂ】本発明の別の実施形態に従う第２の実施形態によりｈｇＤＮＡに対して行ったＰＣＲ反応に対する増幅曲線及び変性曲線を提示する図である。
【図６】ｐＨ８．５でのｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡのコピーの抽出を説明するヒストグラムである。
【図７】微粒子を利用する反応（黒丸）、及び微粒子を用いない反応（灰色の円）に対するｐＵＣ１９  ＰＣＲ検量線を提示する図である。
【図８】０．５時間に亘って架橋されたキトサン微粒子とともに吸引されたプライマーから構築されたｐＵＣ１９プラスミドに対するＰＣＲ検量線を提示する図である。
【図９】０．５時間（黒丸）及び２４時間（灰色の逆三角形）に亘って架橋されたキトサン微粒子に対するブリリアントイエロー染料の吸着を実証する図である。
【図１０】架橋時間の関数としてｐＵＣ１９プラスミドの捕捉効率を実証する図である。
【図１１】図１ＢによるＰＣＲ反応に対して核酸試料を濃縮するシステムを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、複数の実施形態を有し、また当業者に既知の詳細については特許、特許出願及び他の引用文献に依拠する。したがって、特許、特許出願又は他の引用文献を本明細書中で引用する又は繰り返す場合、あらゆる目的でまた記載される陳述のため、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすことを理解されたい。
【００１６】
本発明は、ＰＣＲ反応に対して核酸試料を濃縮する方法に関する。具体的には、利用可能な核酸を比較的大きな試料体積からＰＣＲに適した小さい試料体積へと濃縮する。該方法は微粒子を利用する。一実施形態では、該微粒子は磁気を帯びてもよい。別の実施形態では、磁性微粒子はキトサンから製造されてもよい。また更なる実施形態では、微粒子はキトサンで被覆されたコアを含んでいてもよい。当業者は、Ｓｉ及び磁性化合物を含む、本発明の実施に有用な微粒子コアを識別することができる。
【００１７】
キトサンは、限定されないが、約１０００ダルトン〜５００００００ダルトン超に及ぶ種々の重量分子の混合物を含む、様々な形態で市販される多糖ポリ−［１，４］−β−Ｄ−グルコサミンである。キトサン上のアミン基はｐＫａ約６．４を有することから、キトサンは６．４未満のｐＨで陽イオン性であり、これらの条件下で負に帯電したＤＮＡを容易に結合させることができる。低分子量（すなわち、１００００００ダルトン未満）のキトサンは、適度に高いｐＨ（例えば約８．５）においてＤＮＡを効率的に溶出することから、本明細書において更に詳細に記載されるように、本発明の種々の実施形態において有用である。キトサンの市販の調製物を、本明細書に記載される本発明の実施において使用することができる。濃厚なキトサン微小環境では、核酸等の陰イオン性分子が存在する状態でｐＫａがシフトし得る。キトサンに付着している間のＰＣＲ及びＤＮＡの増幅に対して最適化される溶液中でのＤＮＡの吸着を提供するため、この特性は本発明によって利用される。
【００１８】
架橋により又はＳｉ若しくは磁性コアを被覆することにより、本発明に従って製造されたキトサン微粒子は、ＰＣＲに最適なｐＨで（例えばｐＨ８．５で）、低ｐＨの場合と同様に効率的に細胞溶解及び同時の核酸の捕捉を提供する。本発明の目的で、高ｐＨとは、ＤＮＡ捕捉に使用される材料のｐＫａを上回るｐＨレベルを指す。したがって、キトサンの場合、高ｐＨは６．４超のｐＨとなる。幾つかの好ましい実施形態では、好ましい高ｐＨは、約８．０〜９．０等のＤＮＡ増幅が可能なものであり、およそ８．５が最も好ましい。さらに、本発明の目的で、低ｐＨとは、記載される材料（ＤＮＡ捕捉に使用されるものを含む）のｐＫａ未満のｐＨレベルを指す。したがって、キトサンの場合、低ｐＨは６．４未満のｐＨとなる。
【００１９】
本発明の一実施形態では、微粒子がＰＣＲ反応において核酸増幅に対する固体支持体としてはたらくように、捕捉された核酸はなおもポリメラーゼによってアクセス可能である。微粒子が溶解に利用されるため、またＰＣＲの前に微粒子から核酸を除去する必要がないことから、試料調製手順の容易性が劇的に改善される。
【００２０】
さらに、限定されないが、ＰＣＲ増幅、次世代シーケンシング、等温増幅技術、アプタマーに基づくアッセイ、又は酵素アッセイを含む増幅を含む多数の生化学反応に使用される同じバッファーを使用して、試料に対して核酸抽出を行ってもよい。単一のバッファーによるＤＮＡの抽出は、試薬を減少させ、試料調製時間を減少させ、診断システムを単純化し得る。
【００２１】
図１Ｂは、本発明の一実施形態によるＰＣＲ反応に対して核酸試料を濃縮する方法を説明するフローチャートである。具体的には、マイクロチューブ１２２中の高ｐＨ（例えばキトサンのｐＫａを上回るｐＨ、より好ましくは約８．０〜９．０）の試料溶液１２４は、核酸１２６を含む核小体１１８を有する細胞１１６を含む。工程１１２において、キトサン微粒子１１４（以下ビーズと呼ぶ場合がある）をマイクロチューブ１２２中の試料溶液１２４に添加し、機械的に撹拌して試料溶液１２４中の細胞１１６を溶解し、同時に核酸１２６を捕捉する。一実施形態では、キトサンビーズ１１４をボルテックスする。ボルテックスプロセス中、細胞１１６は溶解されて核小体１１８から核酸１２６を放出する。核酸１２６をキトサンビーズ１１４上に捕捉するが、細胞片１２０は試料溶液に残る。一実施形態では、架橋されたキトサンビーズ１１４を、高ｐＨバッファー中で予備洗浄した。ＤＮＡは、高ｐＨバッファーへのプラスミド、細菌ゲノムＤＮＡ、又はｈｇＤＮＡの添加によってビーズ１１４上にロードされた。例として、キトサンビーズ上にＤＮＡを捕捉するため、ｐＨ８．５  Ｔｒｉｓ又はｐＨ８．５  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のバッファーを使用してもよい。したがって、ＰＣＲに使用することが可能であったのと同じバッファーを使用して、試料に対してＤＮＡ抽出を行うことができた。
【００２２】
非限定的な一実施形態では、高ｐＨバッファー溶液中での核酸１２６の精製は、一連のバッファー変動においてキトサンビーズ１１４により核酸１２６を捕捉することによって行われる。バッファー変動は、マイクロチューブ１２２の片側に微粒子を引っ張って保持する磁性チューブスタンド（図示されていない）によって容易になる。各バッファー変動の後、マイクロチューブ１２２をボルテックスする。
【００２３】
試料細胞が、ヒトゲノムＤＮＡ、プラスミド、細菌又はウイルスを含有するヒト細胞であり得ることは、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
更に別の実施形態では、マイクロチューブを加熱することによりマイクロチューブ中の試料細胞１１６を溶解してもよい。非限定的な一例では、マイクロチューブを２０分間加熱する。加熱工程の後、試料にキトサンビーズを添加し、該試料をボルテックスする。その後、キトサンビーズ１１４を試料から分離して洗浄する。
【００２５】
次に、工程１１３において、フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに蛍光染料を含む反応混合物をビーズ１１４上に捕捉された核酸１２６に添加し得る。キトサンビーズ１１４に付着した核酸１２６を増幅するためＰＣＲ反応を行う。図１Ｃに示されるように、キトサンビーズ１１４上に捕捉された核酸１２６を解放せずに、溶解及び精製に使用したのと同じ高ｐＨバッファー１３２中において増幅する。プラスミド、細菌ＤＮＡ、及びｈｇＤＮＡを本発明による方法を使用することによって増幅することができる。
【００２６】
図１Ｂに戻って、曲線１２８及び曲線１３０は、２つのＰＣＲ反応の各サイクルにおける蛍光強度（ＲＦＵ）を表す。曲線１２８によって表されるＰＣＲ反応は、本発明によるキトサンビーズから直接行われたＰＣＲ反応である。曲線１３０によって表されるＰＣＲ反応は、図１Ａに記載さるようなキトサンビーズに付着されていない核酸に対して行われたＰＣＲ反応である。
【００２７】
図１１は、生体試料から核酸を増幅するシステムを説明するものである。具体的には、図１Ｂによる方法の工程を行うため、溶解ユニット１１０２、精製ユニット１１０４、及び増幅ユニット１１０６が設けられている。溶解ユニット１１０２は、ビーズ（微粒子）と合わせた生体試料を機械的に撹拌して生体試料中の細胞を溶解するように構成される。溶解ユニットの例として、低速、中速、及び高速の範囲のボルテックスを提供する、可変速度ボルテクサーが挙げられる。低、中、及び高を規定する具体的なｒｐｍは使用される特定のユニットに依存し、かかる設定は当業者によって容易に決定される。溶解ユニット１１０２が細胞を溶解させるのと同時に、細胞から放出された核酸を磁性ビーズ上に捕捉する。精製ユニット１１０４は、図１Ｂの工程１１２に従って、捕捉された核酸を含むビーズを分離し、洗浄することにより、溶解の結果として生体試料中に放出された核酸を精製するように構成される。最後に、増幅ユニット１１０６は、図１Ｂの工程１１３に従って、精製された核酸を受け取って、捕捉された核酸に対して直接増幅を行うように構成される。
【００２８】
非限定的な例として、増幅ユニット１１０６でキトサンビーズ上に捕捉された核酸の増幅に使用される反応混合物は、限定されないが、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含む染料、並びにフォワードプライマー及びリバースプライマーを含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の実施に有用な可能性のある染料として、核酸の鎖の内にインターカレートするものが挙げられる。かかる染料の典型例は臭化エチジウムである。結合アッセイに対する臭化エチジウムの例示的な使用として、例えば、核酸ターゲット分子への試験分子の結合に起因する臭化エチジウムからの蛍光発光の減少に対するモニタリング（臭化エチジウム置換アッセイ）が挙げられる。例えば、Lee, M. et al.（J Med Chem 36(7): 863-870 (1993)）を参照されたい。変性の測定における核酸挿入剤の使用は、当業者によく知られている。例えば、Haugland（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. (1996)）を参照されたい。また、インターカレーション以外の機構によって核酸に結合する染料を本発明の実施形態において使用することもできる。例えば、二本鎖ＤＮＡの副溝を結合する染料は温度により標的分子の分子アンフォールディング／変性をモニターするために使用することができる。好適な副溝結合染料の例は、Molecular Probes Inc.（米国オレゴン州のユージーン）によって販売されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎファミリーの染料である。例えば、Haugland（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg., USA (1996)）を参照されたい。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料は、任意の二本鎖ＤＮＡ分子に結合する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料が二本鎖ＤＮＡに結合する場合、蛍光発光の強度が増加する。より多くの二本鎖ＤＮＡが温度を増加させることにより変性されるため、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料のシグナルは減少する。別の好適な染料はBioFire Technology, Inc.によって販売されるＬＣＧｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓである。
【００３０】
高ｐＨ（例えば約８．５のｐＨ）での捕捉の後に、ビーズ（微粒子）を高ｐＨローディングバッファーに再懸濁し、ＰＣＲウェルに移してもよい。ローディングバッファーを反応混合物で置き換えた後、ピペットによって吸引してもよい。非限定的な一実施形態では、ウェル中の泡を遠心分離によって除去する。磁石を使用して、遠心分離後にウェル全体に亘って微粒子を分散させて、微粒子が底にきつく詰め込まれないようにすることもできる。ＰＣＲの間、磁石をウェルに隣接して置いてもよく、それはウェルの片側に微粒子を保持し、リアルタイムの蛍光測定を可能とし得る。
【００３１】
本発明の例示的な実施形態によれば、核酸を捕捉するのに使用されるキトサンビーズ（微粒子）は、油中にキトサン小滴を作り、その後、小滴を微粒子へと架橋することによって製造される。アルデヒドはアミンと容易に反応して、不安定なシッフ塩基を形成する。したがって、図２に示されるように、グルタルアルデヒドに曝露された場合、キトサンアミン基間で分子間結合及び分子内結合が形成される。具体的には、キトサン２０２の化学構造とグルタルアルデヒド２０４の化学構造とを反応させることにより、キトサン小滴を微粒子へと架橋することができる。これらの結合は、ＮａＢＨ４等の還元剤により共有結合へと還元される。これらの反応は、グルタルアルデヒドを含む油中に水性キトサン小滴を浸漬することにより利用され得る。したがって、小滴は微粒子へと架橋され、該架橋反応は油水界面から開始し、経時的に微粒子のコアへと続く。キトサン微粒子の外側表面は電荷切り替えが可能であるが、この電荷切り替え可能なシェルの下の微粒子の内部は、正に帯電したままである。ＤＮＡは、最初の細胞溶解に必要な積極的な機械的撹拌により内側シェルの下に捕捉されるが、ＤＮＡはなおも増幅用ポリメラーゼに対してアクセス可能である。
【００３２】
非限定的な例として、キトサン微粒子の製造プロセスは、先に記載される低分子量キトサンを酢酸に溶解させたストック溶液、及び室温で調製され、保存されるＳｐａｎ  ８０をヘキサデカンに溶解させた油剤を利用する。微粒子の製造に先立って、低分子量キトサン及び磁性酸化鉄（ＩＩＩ）ナノ粒子の酢酸水溶液を調製した。酸化鉄（ＩＩＩ）ナノ粒子を使用して、キトサン微粒子の磁性コアを提供する。また、当業者に知られているであろう他の磁性材料を使用してもよい。ホモジナイザーで持続的に混合しながら油剤中へ水溶液を滴らせることにより、ビーカー中でキトサンを乳化した。乳化の後、架橋混合物を滴加し、その後、ホモジナイザーで更に混合した。微粒子はキトサンアミン基と反応するグルタルアルデヒドによって架橋され、シッフ塩基を形成する。次に、微粒子をチューブに移し、旋回装置（nutator）上で所望時間に亘って架橋する。微粒子が遠心分離された後、グルタルアルデヒドを含むヘキサデカンを除去することにより架橋反応を停止してもよい。
【００３３】
ＤＮＡ吸着アッセイ用の微粒子を作製するため、微粒子を最初に油剤で２回洗浄する。その後、微粒子を油剤に再懸濁し、該油剤に一晩気流バブリングを通して乾燥させる。微粒子を、最初にデカノール、その後エタノール、最後に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで２回洗浄することにより、油剤を除去する。その後、微粒子を架橋したシッフ塩基は第二級アミンに還元される。還元後、微粒子を洗浄する。最後に、微粒子を真空下、室温で乾燥する。微粒子を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に保存する。
【００３４】
図３は、図２を参照して記載される本発明の例示的な実施形態に従って製造されたキトサン微粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示すものである。ヘキサデカンにおける架橋中、洗浄中、及び乾燥中に得た画像は分散した微粒子を示す。しかしながら、ヘキサデカン以外の溶媒で洗浄された場合、微粒子はより大きな粒子へと凝集される。さらに、微粒子の大きな塊は、真空下での乾燥後に形成される場合があり、塊を超音波処理によって破壊した。
【００３５】
図３は、より大きな粒子へとクラスター化した個々の微粒子を示す、最終の凍結乾燥キトサン微粒子産物のＳＥＭ画像を含むものである。具体的には、図３Ａは、直径０．５μｍ〜８μｍの範囲の個々の狭い多分散度の微粒子を示す。大多数の微粒子は、１０μｍ程度の粒子へとクラスター化される。図３Ｂは、直径２０ｎｍ〜４０ｎｍの酸化鉄（ＩＩＩ）ナノ粒子を含む微粒子のクラスターを示すものである。微粒子は、近接する磁石に非常に反応性であり、迅速なバッファー変動を可能とする。図３Ｃは、微粒子のキトサンマトリクス内に包埋された酸化鉄（ＩＩＩ）ナノ粒子の拡大図である。
【００３６】
したがって、微粒子のコアは、ＰＣＲに適合するｐＨにおいて正電荷を維持し、それによりボルテックス条件下で捕捉されたゲノムＤＮＡを保持する。本発明による方法には、ポリカチオン性ポリマーキトサンによって密に被覆された磁性微粒子を使用して、手作業の工程（又はロボットによる繰り返し）が完全に排除される可能性がある。本発明による磁性微粒子は、機械的撹拌によって細胞を溶解することができる。同時に、キトサンの緻密層は、溶解中に放出された核酸を静電気的に捕捉する。キトサンのｐＫａを上回るｐＨであっても、高密度のキトサンを有する微粒子は、静電気的に結合する能力を保持する。従来のＰＣＲ試料の調製で典型的に行われる溶解剤、カオトロピック塩、及びアルコールの除去を必要とすることなく、ＤＮＡ増幅を捕捉に続いて直ちに行うことができる。その結果、限定されないが、プラスミド、細菌ＤＮＡ及びｈｇＤＮＡを含む核酸の増幅を溶解及び直接ＰＣＲの単純な二段階プロセスで行うことができる。
【００３７】
更に別の代替的な実施形態では、機械的な溶解を行って細胞からＤＮＡを放出している間に核酸を捕捉するため、キトサン被覆シリカ微粒子を使用してもよい。架橋されたキトサン微粒子と同様に、ＰＣＲ中にＤＮＡテンプレートに対する固体支持体としてはたらくように、キトサン被覆シリカ微粒子を使用してもよい。
【００３８】
まとめると、本発明は、生体試料に由来する核酸を増幅する方法及びシステムに関する。具体的には、微粒子を生体試料に添加する。微粒子を有する生体試料を機械的に撹拌して細胞溶解を達成する。次に、生体試料中の細胞から放出された核酸を、微粒子上に捕捉する。核酸は、プラスミド、細菌ＤＮＡ、及びｈｇＤＮＡのうちの１つであってもよい。後に、捕捉された核酸に対して直接増幅を行い、そこでは微粒子が増幅中にＤＮＡテンプレートに対する固体支持体としてはたらく。
【００３９】
一実施形態では、生体試料中の細胞溶解が、微粒子を含む生体試料をボルテックスすることによって行われてもよい。更に別の実施形態では、細胞溶解は、生体試料を加熱すること、キトサン微粒子を添加すること、及びその後に生体試料をボルテックスすることによって行われてもよい。
【００４０】
微粒子をキトサンから製造してもよい。電荷切り替え可能なシェルの下のキトサン微粒子の内部は、高ｐＨにおいて正に帯電したままである。一実施形態では、キトサン粒子は、油中にキトサン小滴を作り、その後、小滴を微粒子へと架橋することにより製造される。架橋は油水界面で開始し、経時的に微粒子のコアへと続く。次に、微粒子を油剤で２回洗浄し、該油剤中に再懸濁し、該油剤に気流バブリングを通して乾燥させる。微粒子を２回洗浄することにより、油剤を除去する。
【００４１】
一実施形態では、生体試料はＰＣＲ増幅に適合するｐＨを有する。試料の精製を増幅と同じバッファーを用いて行ってもよい。一実施形態では、精製は捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄することを含み得る。
【００４２】
更に別の実施形態では、微粒子は磁性微粒子である。具体的には、磁性ナノ粒子が個々の微粒子内に包埋されていてもよい。例示的な一実施形態では、ナノ粒子は直径２０ｎｍ〜４０ｎｍの鉄ナノ粒子である。
【実施例】
【００４３】
実施例１．キトサン微粒子によるＤＮＡ捕捉
キトサンは正に帯電していることから、適度に低いｐＨでＤＮＡを効率的に捕捉することが当該技術分野においてよく知られている。本発明の非限定的な一実施形態では、マイクロチューブ中の一連のバッファー変動によりＤＮＡ捕捉アッセイを行った。微粒子をチューブの片側に引っ張って保持する磁性チューブスタンドによってバッファー変動を容易にした。上清をｑＰＣＲ分析のために保存した。各バッファー変動の後、チューブを３分間、最高速度でボルテックスに供した。４０μｇの架橋したキトサン微粒子を、低ｐＨロードバッファー（ｐＨ６、１０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で３０分間に亘って２回予備洗浄することにより、低ｐＨ  ＤＮＡ吸着アッセイを行った。９９μＬの低ｐＨロードバッファー、及び脱イオン水で希釈した１μＬのｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡを添加することにより、ＤＮＡを微粒子にロードした。その後、微粒子を１００μＬの低ｐＨロードバッファー中で洗浄した。最後に、該微粒子を１００μＬの溶出バッファー（ｐＨ９、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び５０ｍＭ  ＫＣｌ）中でボルテックスした。各工程の上清中のＤＮＡの量をｑＰＣＲで定量した。反応物は、１０μＬのｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２μＬの２．５μＭフォワードプライマー（ＧＴＣ  ＴＣＡＴＧＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  Ａ）（配列番号２）、２μＬの２．５μＭリバースプライマー（ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＣＧＣ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＴＴ）（配列番号３）、及び６μＬの試料からなるものとした。反応は、９５℃で３分間のホットスタートに続く３０回の熱サイクルであった。各サイクルは、９５℃で３秒間の溶融工程、５６℃で３０秒間のアニール工程からなるものとした。ロードバッファー及び溶出バッファー中のプラスミドｐＵＣ１９の段階希釈を使用して検量線を作成し、未知の試料を定量した。試料から実際のシグナルを検出するのに要するサイクル数として定義される閾値サイクルＣｔに対してテンプレートの開始量の対数をプロットすることにより、検量線を構築した。
【００４４】
予想通り、ｑＰＣＲの結果は、キトサン微粒子が酸性のバッファーからＤＮＡを効率的に捕捉することを証明した。しかしながら、オリゴマーキトサンで官能化された固体支持体で実証されたように、キトサン微粒子全体は高ｐＨでＤＮＡを溶出しなかった。また、溶出バッファーで微粒子を更に複数回、洗浄することは、溶液中にｐＵＣ１９をもたらさなかった。
【００４５】
ホットスタート工程を含む３０回のＰＣＲ熱サイクルに微粒子を供することによって、イオン強度を増すこと、ｐＨを増すこと、及び温度を増すことにより、更に厳しい溶出条件で微粒子からＤＮＡを溶出することを試みた。微粒子にｐＵＣ１９をロードし、微粒子の吸着力を試験するために洗浄した後、これらの試験を行った。ＤＮＡを溶出する可能性を増大させるため、溶出バッファーによる更なる洗浄を行った。高イオン強度条件を、１００μＬのｐＨ８．５、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、最大５００ｍＭのＫＣｌ中で３分間に亘って微粒子をボルテックスすることによって調べた。高ｐＨ条件を、１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ、重炭酸塩、又は水酸化ナトリウムのバッファー中、最高ｐＨ１２．５で３分間に亘って微粒子をボルテックスすることにより調べた。高温溶出を、１００μＬの溶出バッファー中に微粒子を懸濁し、それらをｑＰＣＲプロトコルに従って熱サイクルにかけることにより調べた。バッファーへ溶出されたＤＮＡをｑＰＣＲで定量した。
【００４６】
増強されたいずれの溶出条件も、ｑＰＣＲによって測定可能な遊離ＤＮＡをもたらさなかった。これは、厳しい溶出条件が、キトサン微粒子全体とＤＮＡとの相互作用を減衰させず、相互作用が強かったことを示した。ＤＮＡキトサン相互作用が高ｐＨで維持されたことから、ｐＨ８．５でＤＮＡを捕捉することを試みた。高ｐＨ  ＤＮＡ吸着アッセイは低ｐＨアッセイと同様のものとした。最初に、４０μｇのキトサン微粒子を高ｐＨのローディングバッファー、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２回予備洗浄した。９９μＬの高ｐＨロードバッファー、及び脱イオン水に希釈したｐＵＣ１９  １μＬを添加することにより、ＤＮＡを微粒子にロードした。最後に、微粒子を１００μＬの高ｐＨロードバッファー中で洗浄した。各工程における上清中のＤＮＡ量をｑＰＣＲで定量した。
【００４７】
キトサン微粒子を使用するｐＨ８．５  Ｔｒｉｓバッファー中でのｐＵＣ１９の捕捉は、低ｐＨと同じように効率的であった。図６は、キトサン微粒子の捕捉後に溶液中にＤＮＡが見られなかったこと、及び微粒子洗浄溶液中にＤＮＡが見られなかったことを示す。具体的には、図６は、ｐＨ８．５でｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（配列番号１）の１０８コピーの抽出を示す。ＤＮＡは全て捕捉され、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のｐＨ８．５バッファーのみを使用して溶出することも又は洗い流すこともできなかった。ＤＮＡが１００％捕捉されたように見える。核酸アッセイが約８．５のｐＨで行われることから、高ｐＨでキトサン上に捕捉されたＤＮＡは重要な意義を持つ。この実施例は、ＰＣＲ、次世代シーケンシング、等温増幅技術、アプタマーに基づくアッセイ、又は酵素アッセイを含む核酸アッセイに使用されるのと同じバッファーを使用して、試料に対してＤＮＡ抽出を行うことができることを実証するものである。
【００４８】
実施例２．キトサン微粒子からのＤＮＡの直接増幅
本発明による方法に基づき、キトサン微粒子上に捕捉されたプラスミドＤＮＡを放出せずにＰＣＲによって増幅することができた。非限定的な例として、反応混合物は、１×ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、０．３６ｎＭフォワードプライマー、及び０．３６ｎＭリバースプライマーからなっていてもよい。高ｐＨ捕捉に続いて、微粒子を３０μＬの高ｐＨローディングバッファーに再懸濁し、ＰＣＲウェルに移した。ローディングバッファーを２０μＬの反応混合物で置き換えた後、ピペットで吸引した。リアルタイムＰＣＲの結果を図７に提示する。具体的には、図７は、微粒子を用いて行われたＰＣＲ反応（黒丸）、及び微粒子を用いずに行われたＰＣＲ反応（灰色の円）に対するＰＣＲ検量線を示す。反応物へのキトサン微粒子の添加は、微粒子を用いない反応、Ｅ＝９０．６％よりも効率的ではないＰＣＲ、Ｅ＝６７．６％をもたらした。しかしながら、微粒子からのＤＮＡの増幅を成功させるため、酵素及びプライマーの濃度を僅かに増加した。ＰＣＲ産物を溶融（変性）分析及びゲル電気泳動によって検証した。同じ熱サイクル（cycler）による微粒子ＰＣＲの直後に溶融分析を行った。温度を６５℃から９５℃まで、５秒毎に０．５℃増加させ、蛍光を各温度段階で測定した。また、微粒子ＰＣＲ上清を、１％アガロース、及び１．６×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉゲル上で、７５Ｖで１．５時間に亘って泳動させた。検量線をｐＵＣ１９の標準試料から構築し、４桁超に亘って直線的であることがわかった。プラスミドＤＮＡは増幅したが、ＰＣＲの効率は、酵素及びプライマーは同じ濃度であるが微粒子のない反応で見られる９０．６％に対して６７．６％まで減少した。反応物へのキトサン微粒子の添加によるＰＣＲ効率の減少は、おそらく、反応中のプライマー及び／又はアンプリコンの吸着に起因する可能性が考えられる。プライマーの吸着を、キトサン微粒子と混合したプライマー溶液の上清を用いてＰＣＲ反応を行うことにより測定した。最初に、３０分間架橋した４０μｇのキトサン微粒子を高ｐＨローディングバッファーで２回予備洗浄した。その後、１００μＬのｐＨ８．５の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５μＭフォワードプライマー、２．５μＭリバースプライマー、及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をピペットにより微粒子とともに吸引した。プライマー溶液を除去し、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に使用した。反応混合物は、１０μＬのｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２μＬのプライマー溶液、２μＬの脱イオン水、及び６μＬのｐＵＣ１９スタンダードからなるものとした。微粒子とともに３分間ボルテックスした溶液は、ＤＮＡを増幅しなかった。しかしながら、ウェル内でＰＣＲ反応物を混合するには、通常、ボルテックスではなくピペットによる吸引が使用される。ピペットによって微粒子とともに吸引された溶液は、ｐＵＣ１９を効率的に増幅し、より穏やかな混合が微粒子上に（又はその中に）ＤＮＡが効率的に浸透及び吸収することを防止したことを示した。図８は、０．５時間に亘って架橋されたキトサン微粒子とともに吸引されたプライマーから構築されたＰＣＲ検量線を提示するものである。反応の効率は１１２％であったことから、最��のプライマーが吸収された。キトサン微粒子を用いる熱サイクルに供したＰＣＲ反応物の希釈試料を吸引することにより、また溶液中に残されたアンプリコンを測定するためのｑＰＣＲを使用して、アンプリコンの吸着を測定した。最初に、４０μｇのキトサン微粒子を高ｐＨローディングバッファーで２回予備洗浄した。９９μＬの高ｐＨロードバッファー及び脱イオン水に希釈されたアンプリコン１μＬを添加することによって微粒子上にアンプリコンをロードした。微粒子をボルテックスしない代わりに、ピペットにより吸引した。添加するアンプリコンは、検量線を作成するために使用した標準的なｐＵＣ１９  ＰＣＲから産生し、１０４倍又は１０６倍に希釈した。上清に残ったＤＮＡを、ｑＰＣＲ及びアンプリコンの検量線で定量した。微粒子に添加したアンプリコンの半分は、穏やかな混合であっても捕捉された。アンプリコンはプライマーよりも吸収しやすかったため、微粒子を用いたＰＣＲ反応効率は、微粒子が重合するにつれ吸収されるアンプリコンに起因して失われた。溶液中に代えて、キトサン微粒子上で蛍光の増加を直接測定することにより、ＰＣＲ効率を回復することができるかもしれない。
【００４９】
実施例３．高ｐＨ捕捉機構の調査
高ｐＨでキトサン微粒子へのＤＮＡ吸着機構を調査するため、アニオン染料であるブリリアントイエロー（ＢＹ）の吸着をｐＨの関数として測定した。ＢＹをｐＨ５からｐＨ１２．５までの１０ｍＭバッファー及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解させた溶液をスタンダードとし、試料をロードする。最初に、ＢＹを含まないバッファーで４０μｇのキトサン微粒子を２回予備洗浄した。その後、１００μＬの５μＭ  ＢＹを微粒子上にロードした。３分間ボルテックスした後、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ６０分光光度計による３９７ｎｍでの吸光度をスタンダード溶液と比較することによって、上清に残ったＢＹを定量した。また、０．５時間に亘って架橋されたキトサン微粒子へのメチレンブルー（Sigma）及び金ナノ粒子の吸着（それぞれ６７０ｎｍ及び５３０ｎｍで測定された吸光度）をｐＨ６及びｐＨ８．５で測定した。
【００５０】
キトサン微粒子は、ｐＨ７．５未満で添加された染料のほぼ１００％を捕捉したのに対し、ｐＨ７．５超のＢＹ吸着が減少したことから、キトサン微粒子がまだｐＨ反応性であったことが分かった。図９は、０．５時間（黒丸）及び２４時間（灰色の逆三角形）に亘って架橋されたキトサン微粒子へのブリリアントイエロー染料の吸着を示す。ｐＨ反応は２４時間に亘って微粒子を架橋することによって増強され、８超のｐＨでは、０．５時間に亘って架橋した微粒子よりも著しく少ないＢＹが吸収された。架橋の増加は、可能な静電相互作用を制限し得るプロトン化可能な（protonable）キトサンアミン基を反応により遊離した（reacted away）。また、ｐＨの関数として吸収されたＢＹの量も、６．４から約７．５へと、より高くにシフトしたキトサンアミンのｐＫａを示した。キトサン微粒子へのカチオン染料であるメチレンブルーの吸着も調べた。ｐＨに起因する顕著な吸着も吸着の変動もなく、相互作用は電荷特異的であったことを確認した。おそらくは、キトサン微粒子内の正電荷は、負に帯電したＢＹ及びＤＮＡと相互作用していた。さらに、負に帯電した直径４０ｎｍ〜５０ｎｍの金ナノ粒子の吸着を調べた。ｐＨ８．５で僅か５％の吸収されたナノ粒子と比較すると、ｐＨ６では添加されたナノ粒子の２０％が吸収された。サイズ差のため、低ｐＨでは、ＢＹよりも金ナノ粒子の吸収がかなり少なかった。金ナノ粒子は、包埋された鉄ナノ粒子の架橋キトサンマトリクス中に入り込むことができなかった。代わりに、金ナノ粒子は微粒子の外側表面に制限され、利用可能なプロトン化アミンの数を制限すると考えられる。さらに、微粒子の外側表面上に制限された未反応のアミンはｐＨ８．５で帯電しておらず、吸着の減少をもたらすであろう。キトサン微粒子内の帯電したアミン基は、高ｐＨでＤＮＡの効率的な吸着を可能にし、微粒子内の微小環境はアミン基のｐＫａをシフトさせた。Ma, et al. ("New Insights into Chitosan-DNA Interactions Using Isothermal Titration Microcalorimetry," Biomacromolecules, 10, 1490-1499, 2009）は、キトサンＤＮＡ複合体におけるｐＨ７．４でのプロトン化キトサンの程度を測定し、ｐＨ５．５の溶液中のキトサンと等しいことを見出した。報告されたキトサンアミンのｐＫａ６．４は、薄い水溶液については有効であるが、他のすぐ周りのアミン基及び静電位差を伴う、濃いキトサンメッシュ内では有効ではない。
【００５１】
さらに、微小環境における負に帯電した分子の添加は、静電位を劇的に変動させ、微粒子内のアミン基の帯電を好都合なものとした。ｐＵＣ１９  ＤＮＡは微粒子中に浅く入り込み、静電気的に、また立体的に微粒子に結合したと考えられる。微粒子は、最初に微粒子の外側表面にキトサンを架橋し、経時的に微粒子のコアの内側へと反応することによって産生される。したがって、微粒子がより長い時間に亘って架橋されるにつれて、微粒子の周りの反応したアミンのシェルの厚さが増した。ＤＮＡ吸着は、微粒子内のプロトン化可能なアミンとの静電的相互作用によって生じ、反応したアミンの大きなシェル厚が該相互作用を減衰させると考えられる。ｐＵＣ１９の捕捉効率の減少は、益々架橋されたキトサン微粒子の結果として示される。図１０は、架橋時間の関数としてｐＵＣ１９の捕捉効率を示す。経時的に、アミンのかなりのシェルがキトサン微粒子の周辺で架橋され、ｐＵＣ１９は吸着されなかった。効率は、１６時間の架橋まで高いままであった。最長２２時間のより長時間の架橋は、約５０％のｐＵＣ１９捕捉をもたらし、２４時間の架橋ではｐＵＣ１９捕捉が７％に減少した。１６時間の架橋後の未反応のアミンのシェルは厚すぎて、ｐＵＣ１９が容易に微粒子に入り込んで吸着することができなかった。更なる架橋は、ＤＮＡが微粒子に入り込むことができない距離までシェル厚を増加させ、ｐＵＣ１９  ＤＮＡは溶液に残った。
【００５２】
実施例４
キトサン微粒子の製造プロセスは、室温で調製及び保存される、２％（体積／体積（ｖ／ｖ））の酢酸中の２％（重量／重量（ｗ／ｗ））の先に記載される低分子量キトサンのストック溶液と、ヘキサデカン中の２％（ｗ／ｗ）のＳｐａｎ  ８０の油剤とを利用する。微粒子の製造に先立って、１％（ｖ／ｖ）の酢酸中の１％（ｗ／ｗ）の低分子量キトサン及び０．５％（ｗ／ｗ）の磁性酸化鉄（ＩＩＩ）ナノ粒子の水溶液、並びに油剤中０．４４ｇのグルタルアルデヒド（正：glutaraldehyde）（グレード１、水中７０％、Sigma）の架橋混合物を調製する。１６００ｒｐｍにセットしたホモジナイザーにより持続的に混合しながら、１９ｍＬの油剤中へ１ｍＬの水溶液を滴らせることにより、１００ｍＬビーカー中でキトサンを乳化した。３分間乳化した後、架橋混合物を滴加し、その後、更に５分間、ホモジナイザーにより更に混合した。微粒子は、キトサンアミン基と反応するグルタルアルデヒドによって架橋され、シッフ塩基を形成する。次に、微粒子を５０ｍＬのチューブに移し、旋回装置上で所望時間に亘って架橋する。微粒子を１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、グルタルアルデヒドを含むヘキサデカンを除去することにより架橋反応を停止してもよい。
【００５３】
ＤＮＡ吸着アッセイに対する微粒子を調製するため、微粒子を油剤で最初に２回洗浄する。その後、微粒子を油剤に再懸濁し、該油剤に一晩気流バブリングを通して乾燥させる。微粒子を、最初にデカノール、その後エタノール、最後に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで２回洗浄することにより、油剤を除去する。その後、微粒子を架橋したシッフ塩基は、一晩、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の１％（ｗ／ｗ）ＮａＢＨ４中で第二級アミンに還元される。還元後、微粒子を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで２回洗浄する。最後に、微粒子を真空下、室温にて一晩乾燥させる。微粒子を４℃にて４０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に保存する。
【００５４】
実施例５
図４Ａは、本発明によるＭＣＦ７ヒト乳癌細胞から得られた精製ｈｇＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅に関する。図４Ａ中の増幅曲線は、複数の異なる試料に対する各ＰＣＲサイクルでの蛍光強度（相対蛍光単位すなわちＲＦＵで示される）を表す。キトサンビーズに付着した精製ＭＣＦ７  ＤＮＡを、キトサンビーズの表面から直接増幅する。増幅曲線４０２は、ビーズ表面から直接行われた、精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅を立証するものである。増幅曲線４０４は、ＭＣＦ７細胞を溶解し、ＭＣＦ７  ＤＮＡを抽出するため、キトサンビーズを含むＭＣＦ７試料溶液を機械的に撹拌することによるキトサンビーズに付着したＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅に関する。具体的には、キトサンビーズとＭＣＦ７試料溶液とをボルテックスすることによりキトサンビーズ上にＭＣＦ７  ＤＮＡが捕捉される。曲線４０６は、キトサンビーズを使用せずに従来の技術によって溶液から増幅された陽性対照の精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する増幅曲線である。曲線４０８は、汚染及びプライマー二量体形成をモニタリングすることを可能とする非テンプレート対照曲線である。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーセットを使用することにより増幅を行い、６００塩基対（ｂｐ）長のアンプリコンを産生した。増幅曲線４０２及び増幅曲線４０４は、本発明に従ってビーズ表面から直接行われた精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅を立証するものである。
【００５５】
図４Ｂ中の変性曲線を分析することにより、及び／又はゲル電気泳動を行うことにより、ＰＣＲ産物を確認することができる（図示せず）。図４Ｂを見ると、図４Ａ中の増幅曲線に対応する図４Ｂ中の変性曲線は、複数の異なるＤＮＡ試料に対する変性曲線のマイナス微分プロット−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴとして提供され、ここで、ＲＦＵは、ＤＮＡ変性をもたらすように試料温度Ｔを連続的に増加して測定される蛍光強度である。変性曲線４１０は、精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅曲線４０２に対応するものである。増幅曲線４０６に対応する変性曲線４１２は、キトサンビーズを使用せずに、従来の技術によって溶液から増幅された陽性対照ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性曲線である。増幅曲線４０４に対応する変性曲線４１４は、機械的撹拌によってキトサンビーズに付着され、本発明によるキトサンビーズの表面から増幅されたＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性曲線である。変性曲線４１６は、非テンプレート曲線４０８に対応するものである。特に、両方のビーズ試料（曲線（４０２、４１０）及び（４０４、４１４））に由来するアンプリコンの溶融温度は、陽性対照試料（曲線４０６、曲線４１２）のものと一致する。したがって、本発明によるＤＮＡ増幅プロセスは、従来の増幅技術によってもたらされるアンプリコンと同じアンプリコン（同じ溶融温度を特徴とするをもたらす。
【００５６】
実施例６
図５Ａ及び図５Ｂは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞から得られ、Ｇ６ＰＣプライマーを使用することによって増幅されて４０ｂｐのアンプリコンをもたらす、精製ｈｇＤＮＡに対する増幅曲線（５０２及び５１４）及び対応する変性曲線（５０４及び５１６）を実証するものである。
【００５７】
図５Ａでは、中速で試料溶液をキトサンビーズとともにボルテックスすることにより、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞を溶解した。ボルテックスの後、キトサンビーズを溶液から分離し、その後、低速で洗浄した。溶解プロセスの結果として、ＭＣＦ７  ＤＮＡはキトサンビーズ上に捕捉される。本実施例による溶解プロセスは、３分間のボルテックスに対して最適化された。
【００５８】
増幅曲線５０２は精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅に関し、複数の異なる試料に対する各ＰＣＲサイクルでの蛍光強度を表す。具体的には、曲線５０８は、キトサンビーズ上に捕捉され又はそれから増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する増幅曲線である。曲線５０６は、陽性対照（ＰＣ）である、キトサンビーズを使用せずに溶液から増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する増幅曲線である。曲線５２６及び曲線５２８は、それぞれ０．５％及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ溶液中でキトサンビーズの表面から増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅を示す増幅曲線である。
【００５９】
増幅曲線５０２に対応する変性曲線５０４は、複数の異なるＤＮＡ試料に対する変性曲線のマイナス微分プロット−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴとして提供される。曲線５１０は、キトサンビーズを使用せずに溶液から増幅されたＰＣ  ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性曲線である。増幅曲線５０８に対応する変性曲線５１２は、本発明によりキトサンビーズの表面から増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性曲線である。曲線５３０及び曲線５３２は、それぞれ０．５％及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ溶液中でキトサンビーズ表面から増幅されたＭＣＦ７  ＤＮＡの変性曲線である。
【００６０】
図５Ａとは対照的に、図５Ｂは、図５Ａと同じプライマーセットであるが異なる濃縮プロセスを使用する、精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅に関する。具体的には、曲線５１４は、熱溶解により開始するプロセスにおいて濃縮された試料に対して行われたＰＣＲ増幅に関する。本実施例では、熱溶解が１５分間のインキュベーションに対して最適化される。次の工程では、キトサンビーズを試料に添加し、低速でボルテックスする。その後、ビーズを分離し、低速で洗浄する。曲線５１８は、キトサンビーズを使用せずに溶液から増幅されたＰＣ  ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する増幅曲線である。曲線５２０は、キトサンビーズ上で捕捉され、増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する増幅曲線である。曲線５３４及び曲線５３６は、それぞれ０．５％及び０．１％のＴｒｉｔｏｎバッファー中でキトサンビーズ表面から増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡの増幅を示す増幅曲線である。
【００６１】
増幅曲線５１４に対応する変性曲線５１６は、複数の異なるＤＮＡ試料に対する変性曲線のマイナス微分プロット−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴとして提供される。曲線５２２は、キトサンビーズを使用せずに溶液から増幅されたＰＣ  ＤＮＡに対する変性曲線である。増幅曲線５２０に対応する変性曲線５２４は、本発明に従ってキトサンビーズ表面から直接増幅された精製ＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性曲線である。曲線５３８及び曲線５４０は、それぞれ０．５％及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ溶液中でキトサンビーズ表面から増幅されたＭＣＦ７  ＤＮＡに対する変性である。
【００６２】
したがって、図４並びに図５Ａ及び図５Ｂ（実施例５及び実施例６）は、本発明の方法に従ってｈｇＤＮＡを増幅することができることを確認するものである。同様に、実施例１及び実施例２は、本発明の方法に従ってプラスミドを増幅することができることを確認するものである。
【００６３】
本発明を説明する文脈における（中でも、添付の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（"a" and "an"）」及び「前記／該（"the"）」という用語並びに類似の指示語の使用は、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「挙げられる（含む）（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、特に断りのない限り、非限定（open-ended：オープンエンド）用語（すなわち、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるものとする。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に他に指定のない限り、この範囲内にある各別個の値について個々に言及する省略方法として機能するよう意図されるものに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中に提示されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「等（such as）」）の使用は、他に主張のない限り、単に本発明をより良く明白にする（illuminate）ように意図されるものに過ぎず、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言葉は、特許請求がされていない任意の要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとは解釈されるべきでない。
【００６４】
本開示の主題について、特徴の様々な組合せ及び部分的組合せを含む幾つかの例示的な実施形態を参照してかなり詳細に記載し示したが、当業者は、他の実施形態並びにその変形形態及び変更形態を、本開示の範囲内に包含されるものとして容易に理解するであろう。さらに、こうした実施形態、組合せ及び部分的組合せの記載は、請求項に係る主題が、請求項に明示的に列挙されているもの以外の特徴又は特徴の組合せを必要とするということを意味するようには意図されていない。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に包含される全ての変更形態及び変形形態を含むように意図されている。
【００６５】
本願において引用される全ての文献（「明細書引用文献」）及び明細書引用文献において引用され又は参照される全ての文献は、引用することによりそれら全体が本明細書の一部をなす。さらに、出願書類又は明細書引用文献の各々において引用され又は言及される任意の製品に対する任意の製造業者の使用説明書又はカタログは、引用することによりそれら全体が本明細書の一部をなす。この本文又はそこにある任意の教示に引用することによって一部をなす文献を本発明の実施に使用することができ、引用することにより本明細書の一部をなす各文献における技術を本発明の実施に使用することもできる。この本文への引用によって一部をなす文献は先行技術と認められるものではない。
【図１】
2018519807.tif 000003
【図２】
2018519807.tif 000004
【図３】
2018519807.tif 000005
【図４】
2018519807.tif 000006
【図５Ａ】
2018519807.tif 000007
【図５Ｂ】
2018519807.tif 000008
【図６】
2018519807.tif 000009
【図７】
2018519807.tif 000010
【図８】
2018519807.tif 000011
【図９】
2018519807.tif 000012
【図１０】
2018519807.tif 000013
【図１１】
2018519807.tif 000014
【配列表】
2018519807000001.app
【国際調査報告】
2018519807.tif 000015