(57)【要約】  本開示は、肺サーファクタントが存在する器官又は組織における抗生物質の殺菌活性を回復又は増加させる方法に関する。より具体的に、本開示は、呼吸上皮などの器官又は組織における肺サーファクタントの存在などの環境因子に起因する抗生物質の阻害が回避又は克服でき、その環境における抗生物質の有効性が抗生物質と溶解素の共投与によって回復又は増加することを記載する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺サーファクタントが存在する器官又は組織の細菌感染症を患う対象を治療する方法であって、前記方法が、順序に関係なく以下のステップ：
ａ．前記対象に、第１の量の、活性が前記肺サーファクタントによって阻害される、前記感染症の原因である前記細菌に対する抗細菌活性を有する抗生物質を投与すること；
ｂ．前記対象に第２の量の溶解素ポリペプチドを共投与すること
を含み、
前記第１及び第２の量が相まって前記感染症の原因である前記細菌を死滅させるのに有効であり、それによって前記感染症を治療する方法。
【請求項２】
前記溶解素が、前記感染症の原因である前記細菌に対する抗細菌活性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の量が、もし前記抗生物質が単独療法として投与された場合に前記感染症を治療するのに効果がないと思われるようなものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗生物質が環状リポペプチド又はアミノグリコシドである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解素ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列又はStaphylococcus aureusに対する抗細菌活性及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性をもつそのバリアントを有し、且つ前記感染症の原因である前記細菌がStaphylococcus aureusである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記S. aureusが、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、又はＶＩＳＡである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗生物質が環状リポペプチドである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記抗生物質がダプトマイシンである請求項３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記抗生物質がトブラマイシンである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の量が閾値以下の量である前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の量が閾値以下の量である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解素ポリペプチドが非経口的に又は吸入によって投与される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗生物質が経口的若しくは非経口的に又は吸入によって投与される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が哺乳類対象である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶解素ポリペプチドが、ＰＡＬ又はＣｐｌ−１であり、前記感染症の原因である前記細菌がStreptococcus pneumoniaeである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記感染症の原因である前記細菌がグラム陰性である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌がP. aeruginosaである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗生物質が環状リポペプチドである請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質がコリスチンである請求項１６、１７、又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗生物質がトブラマイシンである請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶解素が、１つ以上の以下の特許出願：米国特許出願公開第２０１４０１２００７４号、国際公開第２０１５／０７０９１２号；国際公開第２０１５／０７１４３６号；国際公開第２０１５／０７０９１１号；国際公開第２０１５／０７１４３７号；米国特許出願公開第２０１５０１１８７３１号、及び国際公開第２０１２／０８５２５９号に記載されている一群のエンドリシン融合タンパク質並びに配列ＧＮ３７（配列番号６）；ＧＮ２（配列番号７）；ＧＮ４（配列番号８）；ＧＮ１４（配列番号９）；ＧＮ４３（配列番号１０）；ＰＧＮ４（配列番号１１）；ＦＧＮ４−１（配列番号１２）；ＦＧＮ４−２（配列番号１３）；ＦＧＮ４−３（配列番号１４）；及びＦＧＮ４−４（配列番号１５）を有する以下のグラム陰性溶解素ポリペプチドから選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
肺サーファクタントが存在する下気道のレンサ球菌感染症又はブドウ球菌感染症を患う対象を治療する方法であって、前記方法が、順序に関係なく以下のステップ：
ｂ．前記対象に、第１の量の、活性が前記肺サーファクタントによって阻害される、前記感染症の原因である前記細菌に対する抗細菌活性を有する抗生物質を投与すること；
ｉ．前記対象に、第２の量の、ＣＦ−３０１、ＣｌｙＳ、リソスタフィン、ＬｙｓＫ、Ｓａｌ−２００、ＬｙｓＧＨ１５、ＰｌｙＶ１２、ＣｌｙＨ、ＭＶ−Ｌ、Ｐｌｙ、ＰｌｙＰｌｙ、ＰｌｙＧＢＳ、ＬａｍｂｄａＳａ１、ＬａｍｂｄａＳａ２、Ｃｐｌ１、Ｐａｌ、それらの活性断片、及び前述の溶解素又は断片の１つの結合ドメインが別の溶解素又は断片の触媒ドメインに融合されているそれらのキメラ結合体からなる群より選択される少なくとも１つの溶解素ポリペプチドを共投与すること
を含み、
前記第１及び第２の量が相まって前記感染症の原因である前記細菌を死滅させるのに有効であり、それによって前記感染症を治療する方法。
【請求項２３】
前記抗生物質がダプトマイシンである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
肺サーファクタントが細菌感染症に対する抗生物質の活性を阻害する、又は阻害すると思われる量で存在する器官又は組織における前記抗生物質の殺菌活性を前記器官又は組織において回復させる方法であって、前記方法が、前記器官又は組織の感染症を患う対象に、第１の量の前記抗生物質を投与すること及び前記対象に第２の量の、前記感染症の原因である前記細菌に対する抗細菌活性を有する溶解素ポリペプチドを共投与することを含み、前記量が相まって前記細菌を死滅させるのに有効であり、それによって前記感染症を治療する方法。
【請求項２５】
肺サーファクタントが存在する下気道のグラム陽性細菌感染症又はグラム陰性細菌菌感染症を患う対象治療する方法であって、その対象が既に前記感染症を治療するのに適した抗生物質を投与されており、前記対象への前記抗生物質の投与を続けること、及び殺菌活性を回復させる量の、前記対象における前記感染症の原因である前記細菌に対する活性をもつ溶解素ポリペプチドの前記対象への共投与を開始すること、及びそれによって前記対象の下気道の前記感染症の原因である前記細菌に対する前記抗生物質の殺菌活性を回復させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本特許出願は、２０１５年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２２０，２１２号及び２０１５年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２４７，６１９号の優先権を主張し、これらの仮出願の内容は参照により本願明細書に組み込まれる。
本開示は、細菌感染症と闘うことに関する分野、具体的には呼吸器の分野、より具体的には下気道、とりわけ上皮に肺サーファクタントが存在することを特徴とする組織及び器官の分野に関する。さらに本開示は、抗生物質耐性をもつようになるよりむしろ、肺サーファクタントなどの感染症の環境における因子に起因して、感染症との闘いにおける抗生物質の有効性が減少する問題に対処する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージ溶解素ポリペプチドＣＦ−３０１は、Staphylococcus aureus菌血症及び心内膜炎を治療するための、開発中のファースト・イン・クラスの抗菌剤である。ＣＦ−３０１の顕著な特徴としては、急速な病原菌特異的溶菌、耐性がないこと、標準治療抗生物質との相乗作用、及び抗バイオフィルム活性が挙げられる（Schuch et al., J Infect Dis.;209(9):1469-78 (2014). doi: 10.1093/infdis/jit637. Epub 2013 Nov 28.）。ＣＦ−３０１はＦＤＡ管轄治験（FDA-regulated clinical trial）に入る最初の溶解素である。ＣＦ−３０１（ＰｌｙＳｓ２）は配列番号１（ジェンバンク受託ＺＰ０３６２５５２９）に示されるアミノ酸配列をもち、米国特許第９０３４３２２号に記載されている。
【０００３】
気道又は呼吸器感染症の原因であるStaphylococci属細菌に対して活性がある他の溶解素としては、限定されないが、ＰｌｙＣ、ＰｌｙＧＢＳ、ＬｙｓＫ、リソスタフィン、キメラ溶解素ＣｌｙＨが挙げられる（Cheng et al. Antimicrob Agents Chemother. 49(1): 111-117 (2005); McGowan et al. Proc Natl Acad Sci U S A.,109(31):12752-7 (2012), Becker et al. FEMS Microbiol Lett., 287(2):185-91 (2008), Yang et al. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58(1):536-42 (2014)）。Streptococcus pneumoniaeに対して活性がある溶解素ポリペプチドとしては、国際公開第２００８／００１３２号（キメラ化のためのＣＨＡＰドメインの配列を含む）及び中国特許第１０２０２１１６１号（CN 102021161）にそれぞれ記載されているＰＡＬ溶解素及びＣｐｌ１溶解素が挙げられる（Garcia et al. J Virol. 61(8):2573-80 (1987); Varea et al. J Biol Chem.,279(42):43697-707. (2004)）。前述の特許及び参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。気道及びより具体的に下気道の感染症の原因である細菌を含むさまざまな細菌病原体に対して活性がある溶解素が他にいくつか同定されている。溶解素のリストは、http://www.rockefeller.edu/vaf/phagelist.phpで見ることができる。
【０００４】
環状リポペプチド抗生物質ダプトマイシンは、皮膚・皮膚組織感染症に対して承認されている。ダプトマイシンはグラム陽性（Ｇ＋）細菌に対して即効性の殺菌作用があり、Ｇ＋細胞膜に入ってＧ＋細胞膜の機能的完全性を破壊することによってその活性を発揮し、そのメカニズムは生理的レベルの遊離カルシウムの存在に強く依存する。しかし、ダプトマイシンは重症市中肺炎の治験において評価項目を満たすことができなかった。この欠陥はダプトマイシンと肺サーファクタントとの相互作用に起因することが示されている。肺サーファクタントは、特に肺環境において、より一般的に肺サーファクタントが存在する気道環境においてこの抗生物質の活性を阻害する。Surfactant Inhibition of Daptomycin, Silverman, J. A. et al, JID, 191: 2149-2152 (2005)。したがって、ダプトマイシンは、肺及びより一般的に、気道（特に、下気道）感染症の治療には適応されず、当業者なら、そのような感染症を治療するのにダプトマイシンを含む治療レジメンを使わないであろう。ダプトマイシンが肺サーファクタントの存在下で感染症と闘うことができないことは、Koplowicz et al.  Clin Infect Dis. 49(8):1286-7 (2009)において非常に顕著に示されている。最近の研究では、構造的に関連のあるリポペプチドＡ５４１４５のハイブリッド分子の抗細菌活性を試験及び評価することによってサーファクタント存在下でのダプトマイシン不活性を克服することに重点が置かれている（Nguyen et al. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Apr; 54(4): 1404-1413）。
【０００５】
上皮被覆液の主要構成成分である肺サーファクタントは、気道の内面を被覆し、肺胞内の表面張力を下げる複合脂質タンパク質混合物である。サーファクタントは主にジパルミトイルホスファチジルコリン（哺乳類種すべてにおいて〜８０％）から成り、それにくわえて、相当量のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及び少量の少数のリン脂質、中性脂質、及びコレステロールを含む。４つのタンパク質構成成分：親水性タンパク質ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄ並びに疎水性タンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃが存在する。Goerke J. Pulmonary surfactant: functions and molecular composition. Biochim Biophys Acta 1998; 1408:79-89。ダプトマイシンは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びＰＣ／ＰＧから成る人工膜小胞に挿入される。Lakey JH, et al: Fluorescence indicates a calcium-dependent interaction between the lipopeptide antibiotic LY146032 and phospholipid membranes. Biochemistry 1988; 27:4639-45; Jung D, et al. Structural transitions as determinants of the action of the calcium-dependent antibiotic daptomycin. Chem Biol 2004; 11:949-57。
【０００６】
医学における大きな問題は、より多くの抗生物質がさまざまな病気及び他の状態に使用されるにつれて薬剤耐性菌がでてくることである。病院感染は米国で８番目に多い死因であり、その主因は薬剤耐性及び新興病原体である。例えば、米国では年間５００，０００例を超えるStaphylococcus aureusの症例があり、６５％を超える株が多剤耐性であり、例えば、メチシリン耐性S. aureus（ＭＲＳＡ）のいくつかの株も多剤耐性でもある。より多くの抗生物質の使用及び耐性を示す細菌の数が、治療期間をより長いものにしている。さらに、患者に有害な影響をもつものがいくつかあるが、広いスペクトラムの抗生物質が高い頻度で今日使用されている。この使用の増加に関連する問題は、多くの抗生物質は容易に粘膜内層に浸透しないことや上記のようにこれらの内層に存在する因子によって阻害されることである。くわえて、抗生物質にアレルギーをもつ人の数は増加しているようである。それ故に、新規の抗菌方法、特に、新しいモダリティーを介してそう察したり、新たな手段若しくは改良手段を提供したりして、病原菌を死滅させ、それによって感染症を治療するものに対して商業上のニーズが存在する。
【０００７】
溶解素ポリペプチドは、細菌細胞壁又は外膜を貫通でき、直接細菌を溶解できる又は細菌をホスト免疫系及び／若しくは抗生物質などの殺菌作用物質に曝露できるバクテリオファージ由来の酵素であり、その発見は感染症の分野で大きな進歩であった。特に、抗生物質と併せて投与された溶解素は、それらの抗生物質と相乗作用があり、耐性病原菌に対してでも抗生物質の有効性の増加をもたらすことが見出されている。この相乗作用は、抗生物質及び／又は溶解素の投与量を減らして使用し、副作用の可能性を減らす道を開いている。例えば、米国特許第９，０３４，３２２号を参照されたい。
【０００８】
しかし、抗生物質が、環境因子がなければ感受性がある病原菌によって引き起こされる特定の感染症の治療において、耐性よりむしろサーファクタント阻害などの環境因子に起因して効果がないことがみられた場合に、これまで溶解素の使用が提案されたことはなかった。実際、肺サーファクタントによる阻害に直面して溶解素が抗生物質の有効性を上げることになると考える理由はなかった。それゆえに、下で開示される方法の効果は予期せぬものであった。
【０００９】
グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖類を含有する細胞壁に囲まれている。グラム陽性細菌細胞壁は、厚さが２０〜８０ｎｍの幅の広いち密な壁として現れ、ペプチドグリカンの相互に連結した多数の層からなる。グラム陽性細胞細胞壁の６０％〜９０％はペプチドグリカンであり、細胞の形、剛構造、及び浸透圧衝撃に対する耐性をもたらす。細胞壁はグラム染色クリスタルバイオレットを遮断せず、細胞が紫色に染色され、したがって「グラム陽性」であることを可能にする。グラム陽性細菌としては、Actinomyces属、Bacillus属、Listeria属、Lactococcus属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Enterococcus属、Mycobacterium属、Corynebacterium属、及びClostridium属が挙げられるが、これらに限定されない。医学的に関連する種としては、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、及びEnterococcus faecalisが挙げられる。Bacillus属の種は芽胞を形成し、炭疽及び胃腸炎を引き起こす。芽胞形成クロストリジウム属の種は、ボツリヌス中毒症、破傷風、ガス壊疽、及び偽膜性大腸炎の原因である。Clostridium属の種はジフテリアを引き起こし、リステリア属の種は髄膜炎を引き起こす。Staphylococcus aureus及びStreptococcus pneumoneaeは、市中肺炎、院内肺炎、誤嚥に続く肺炎、又は日和見性の肺炎に関係なく、肺炎の２大原因病原菌である。
【００１０】
したがって、肺又は他の気道の感染症及びより一般的に呼吸器の感染症の場合に、普通なら有効な抗生物質が、感染症の部位である器官又は組織に存在する因子、例えば肺サーファクタントによって阻害される範囲内において、そのような抗生物質の活性を回復させる且つ増大させさえすると思われる治療レジメンは、商業的かつ公衆衛生的に大いに価値があると思われる。
【００１１】
上記のダプトマイシンの他に、肺サーファクタントによって阻害されることが知られている他の抗生物質としては、限定されないが、以下が挙げられる。肺炎の一般的な原因であるグラム陰性細菌Pseudomonas aeruginosaによって起こる感染症を治療するのに使用されるアミノグリコシドであるトブラマイシン（van 't Veen A et al. Antimicrob. Agents Chemother. 39:329-333 (1995)）及びP. aeruginosaを含むグラム陰性菌に対して幅広く活性がある環状リポペプチド（ポリミキシン（polymixin））であるコリスチン。Schwameis, R. et al, Effect of Pulmonary Surfactant on Antimicrobial Activity In Vitro, October 2013 Volume 57 Number 10 Antimicrobial Agents and Chemotherapy p. 5151-5154。
【発明の概要】
【００１２】
１つの態様では、本開示は、肺サーファクタントが存在する器官又は組織の細菌感染症を患う対象を治療する方法に関し、その方法は、順序に関係なく以下のステップ：
ａ．対象に、第１の量の、活性が肺サーファクタントによって阻害される、感染症の原因である細菌に対する抗細菌活性を有する抗生物質を投与すること；
ｂ．対象に第２の量の溶解素ポリペプチドを共投与すること
を含み、
前記第１及び第２の量は相まって感染症の原因である細菌を死滅させるのに有効であり、それによって感染症を治療する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、溶解素は感染症の原因である細菌に対する抗細菌活性を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の量は、もし抗生物質が単独療法として投与された場合に感染症を治療するのに効果がないと思われるようなものである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗生物質は環状リポペプチド又はアミノグリコシドである。
【００１６】
さらに具体的な実施形態では、溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はStaphylococcus aureusに対する抗細菌活性及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性をもつそのバリアントを有し、かつ感染症の原因である細菌はStaphylococcus aureusである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、S. aureusは、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、又はＶＩＳＡである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗生物質は、環状リポペプチド、例えば、ダプトマイシンである。
【００１９】
他の実施形態では、抗生物質は、アミノグルコシド（aminoglucoside）、例えば、トブラマイシンである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第２の量若しくは第１の量は閾値以下の量である（又はそれらの量は共に閾値以下である）。
【００２１】
いくつかの実施形態では、溶解素ポリペプチドは非経口的に又は吸入によって投与され、いくつかの実施形態では、抗生物質は経口的若しくは非経口的に又は吸入によって投与される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、対象は哺乳類対象である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、溶解素ポリペプチドはＰＡＬ又はＣｐｌ−１であり、感染症の原因である細菌はStreptococcus pneumoniaeである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、感染症の原因である細菌はグラム陰性、例えば、P. aeruginosaである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、溶解素は、１つ以上の以下の特許出願：米国特許出願公開第２０１４０１２００７４号、国際公開第２０１５／０７０９１２号、国際公開第２０１５／０７１４３６号、国際公開第２０１５／０７０９１１号、国際公開第２０１５／０７１４３７号、米国特許出願公開第２０１５０１１８７３１号、及び国際公開第２０１２／０８５２５９号に記載されているａｒｔｉｌｙｓｉｎであり、１つ以上の以下の特許出願：米国特許出願公開第２０１４０１２００７４号、国際公開第２０１５／０７０９１２号、国際公開第２０１５／０７１４３６号、国際公開第２０１５／０７０９１１号、国際公開第２０１５／０７１４３７号、米国特許出願公開第２０１５０１１８７３１号、及び国際公開第２０１２／０８５２５９に記載されている一群のＡｒｔｉｌｙｓｉｎｓから選択される配列をもつＧＮ溶解素、並びに写しがこの特許出願に付属書類Ａとして添付され、参照によりその全体が組み込まれる、２０１５年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２４７，６１９号に開示されている以下のグラム陰性溶解素：ＧＮ３７（配列番号６）、ＧＮ２（配列番号７）、ＧＮ４（配列番号８）、ＧＮ１４（配列番号９）、ＧＮ４３（配列番号１０）、ＰＧＮ４（配列番号１１）、ＦＧＮ４−１（配列番号１２）、ＦＧＮ４−２（配列番号１３）、ＦＧＮ４−３（配列番号１４）、及びＦＧＮ４−４（配列番号１５）である。
【００２６】
さまざまなより具体的な実施形態では、抗生物質は、コリスチンなどの環状リポペプチド又はトブラマイシンなどのアミノグリコシドである。
【００２７】
別の態様では、本開示は、肺サーファクタントが存在する下気道のレンサ球菌感染症又はブドウ球菌感染症を患う対象を治療する方法に関し、その方法は、順序に関係なく以下のステップ：
ａ．対象に、第１の量の、活性が肺サーファクタントによって阻害される、感染症の原因である細菌に対する抗細菌活性を有する抗生物質を投与すること；
ｉ．その対象に、第２の量の、ＣＦ−３０１、ＣｌｙＳ、リソスタフィン、ＬｙｓＫ、Ｓａｌ−２００、ＬｙｓＧＨ１５、ＰｌｙＶ１２、ＣｌｙＨ、ＭＶ−Ｌ、Ｐｌｙ、ＰｌｙＰｌｙ、ＰｌｙＧＢＳ、ＬａｍｂｄａＳａ１、ＬａｍｂｄａＳａ２、Ｃｐｌ１、Ｐａｌ、それらの活性断片、及び前述の溶解素又は断片の１つの結合ドメインが別の溶解素又は断片の触媒ドメインに融合されているそれらのキメラ結合体からなる群より選択される少なくとも１つの溶解素ポリペプチドを共投与すること
を含み、
前記第１及び第２の量が相まって感染症の原因である細菌を死滅させるのに有効であり、それによって感染症を治療する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗生物質はダプトマイシンである。
【００２９】
肺サーファクタントが細菌感染症に対する抗生物質の活性を阻害する、又は阻害すると思われる量で存在する器官又は組織における前記抗生物質の殺菌活性を前記器官又は組織において回復させる方法であって、その方法が、前記器官又は組織の感染症を患う対象に、第１の量の前記抗生物質を投与すること及び前記対象に第２の量の、前記感染症の原因である細菌に対する抗細菌活性を有する溶解素ポリペプチドを共投与することを含み、前記量が相まって前記細菌を死滅させるのに有効であり、それによって感染症を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＣＦ−３０１はウシ由来サーファクタント中で活性がある一方で、ＤＡＰは活性がないことを示す。図１は、ＭＲＳＡ株ＭＷ２（図１Ａ）、ＭＳＳＡ株ＡＴＣＣ２９２１３（図１Ｂ）、及びＶＩＳＡ株ＡＴＣＣ７００６９９（図１Ｃ）に対するＣＦ−３０１及びＤＡＰのＭＩＣ値を示す。
【００３１】
【図２】図２は、ＣＦ−３０１が７．５％サーファクタント中でＭＲＳＡへのボディピー−ＤＡＰ（ＤＡＰＢＤ）結合を促進することを示す画像を含む。倍率１０００倍。
【００３２】
【図３】図３は、ＣＦ−３０１が７．５％サーファクタント中でＶＩＳＡへのＤＡＰＢＤ結合を促進することを示す画像を含む。倍率２０００倍。
【００３３】
【図４】図４は、ＣＦ−３０１とＤＡＰが相まって作用して、７．５％サーファクタント中でS. aureusを死滅させ、バイオフィルム様構造体を減らすことを示すＴＥＭ（図４Ａ）及びＳＥＭ（図４Ｂ）分析画像を含む。図４Ａではスケールバーは０．５μｍである。図４Ｂでは、スケールバーは２μｍ（５，０００倍像）及び１μｍ（２０，０００倍像）。
【００３４】
【図５】図５Ａは、５×１０８ＣＦＵのS. aureus（ＭＲＳＡ株ＡＴＣＣＢＡＡ−４２）に鼻腔内感染させ、生理食塩水、ＣＦ−３０１（静脈内）、ＤＡＰ（皮下）、又はＣＦ−３０１／ＤＡＰで治療したマウスの生存曲線である。（ｎ＝１０頭のマウス／群；ｐ＜０．０５対ＤＡＰ）。図５Ｂは、感染の１日後及び３日後の肺あたりＣＦＵの対数のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明においては、従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技法が、当業者の技能範囲内で用いることができる。そのような技法は文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)を参照されたい。
定義
【００３６】
以下の用語及び句は、文脈が明らかなにそうではないと示されない限り、下で与えられる意味を包含する。
【００３７】
「治療」という用語は、いずれの方法、行為、適用、療法などを指し、そこにおいて、ヒトを含む対象は、障害に対する治療を提供する若しくは傷害を治癒させる目的、又は病原体を死滅させる若しくは根絶する目的、又は対象の病気を直接的若しくは間接的に改善する目的で医学的な助けに供される。治療はまた、発生を減らすこと、又は症状を緩和すること、再発をなくすこと、再発を予防すること、発生を予防すること、症状を改善すること、予後を改善すること、又はそれらの組み合わせを指す。さらに「治療」は、対象における細菌の集団、増殖速度、又は病原性を減少させること及びにそれによって対象における細菌感染又は器官若しくは組織若しくは環境の細菌混入を制御する又は減らすことを包含する。したがって、発生を減らす「治療」は、特定の環境において、それが対象であろうと環境であろうと少なくとも１つのグラム陽性菌の増殖又は少なくとも１つのグラム陰性菌の増殖を阻害するのに有効である。他方では、既存の感染症又は雑菌混入の「治療」は、集団を減らすこと又は感染症又は雑菌混入であるグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌を根絶することも含めて、それら細菌を死滅させることを指す。
【００３８】
「予防すること」は、細菌感染症などの疾患の発生、再発、蔓延、発症、又は定着の予防を含む。本開示が完全な予防又は感染症の定着の予防に限定されることを意図しない。いくつかの実施形態では、発症が遅らされ、又は続いて罹患する疾患の重症度が下がり、そのようなことは予防の例を構成する。本開示との関連で罹患疾患は、臨床症状又は不顕性症状が現れているもの、例えば、かかる病状に関連する症状がまだ現れていないときの細菌病原体の検出及び細菌病原体の増殖の検出などを包含する。
【００３９】
「有効量」という用語は、適切な頻度又は投与レジメンで適用又は投与されたときに、細菌増殖を予防若しくは阻害する、治療される疾患（ここでは、細菌病原体増殖若しくは感染症）の発症、重症度、期間、若しくは進行を予防、軽減、若しくは改善する、治療される疾患の進行を予防する、治療される疾患の退縮を引き起こす、又は抗生物質若しくは静菌治療などの別の治療の予防効果若しくは治療効果を増大若しくは向上させるのに充分である量を指す。
【００４０】
「共投与する」は、溶解素ポリペプチドと抗生物質若しくは他の抗菌剤を順次別々に投与すること、又は単一混合物／組成物又は別々に与えられるが、それでもなお実質的に同時に対象に、例えば、同じ日又は２４時間（又は抗生物質の投与が溶解素の共投与に利する限りそれより短い間隔若しくは長い間隔）における異なる時点で投与される適用量などで実質的に同時にこれらの薬剤を投与すること包含することを意図する。溶解素ポリペプチドと１つ以上の抗生物質などの追加の抗菌剤とのそのような共投与は、最高で数日、数週間、又は数か月続く継続的な治療として提供することができる。くわえて、肺サーファクタントによる投与抗生物質の阻害が弱まり、肺サーファクタントが存在する器官又は組織の感染症の治療における抗生物質の有効性が回復又は増加する限り、共投与は継続される又はともに延長される必要はない。
【００４１】
「対象」は治療される対象を指し、とりわけ、哺乳類を含み、例えば、限定されないが、ヒト、植物、下等動物、単細胞生物、又は細胞培養物が挙げられる。例えば、「対象」という用語は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌に感染しやすい又は感染する生物、例えば、原核生物及び真核生物を包含することを意図する。対象の例としては、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。ある実施形態では、対象は、ヒト、例えば、細菌感染症が、全身性であるか特定の器官又は組織に限られるかに関係なく、細菌感染症を患うヒト、細菌感染症罹患のリスクがあるヒト、又は感染症に罹患しやすいヒトである。
【００４２】
「ポリペプチド」は、「タンパク質」や「ペプチド」という用語と交換可能に用いられ、アミノ酸残基からなり、少なくとも約３０個のアミノ酸残基をもつポリマーを指す。その用語は、単離された形でのポリペプチドだけではなく、（下で定義される）その活性断片や誘導体も包含する。「ポリペプチド」という用語はまた、下に記載の溶解素ポリペプチドを含み、かつ溶解素機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドを包含する。ポリペプチドは天然ポリペプチドであることもでき、組換えポリペプチド又は合成的に作られたポリペプチドであることもできる。特定の溶解素ポリペプチドは、例えば、酵素的切断若しくは化学的切断によって天然タンパク質から派生できる若しくは取り外すことができ、又は従来のペプチド合成技術（例えば、固相合成）又は分子生物学的技術（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示のもの）を用いて作製でき、又は例えば、本明細書において、ＧＮ４の両親媒性ドメインを含むＧＮ４の断片及び同じ標的細菌又は少なくとも１つの共通する標的細菌に対する溶解素活性を維持するそのトランケート型（付属書類Ａを参照されたい）で例示されるように、戦略的にトランケート又は断片化して活性断片を得ることができる。天然溶解素ポリペプチドと、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性をもつ天然溶解素ポリペプチドのバリアント（上述したように、天然溶解素タンパク質の活性断片を含む）も包含される。
【００４３】
薬剤又は化合物に関連して「殺菌性」とは、細菌の死を引き起こす性質又は細菌の最初の集団のうち少なくとも３ログ（3-log）（９９．９％）若しくはより大きな減少の程度まで細菌を死滅できる性質を有することを慣習的に意味する。
【００４４】
本開示の文脈の中で「増加させること」とは、抗生物質抗の抗菌活性の程度は、肺サーファクタントの存在した場合に考えられる程度と比べて高いことを意味する。例えば、本開示に関連して抗生物質活性は、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍、少なくとも２４倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、１０倍を超えて、２０倍を超えて、５０倍を超えて、１００倍を超えて回復又は増加することができる。くわえて、本開示に関連して溶解素の活性は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、最大で１０倍、最大で１６倍、最大で２０倍、２倍を超えて、４倍を超えて、８倍を超えて、１０倍を超えて、２０倍を超えて増加することができる。
【００４５】
「吸入可能な」は、組成物を通常呼吸又は補助呼吸の間又はそれに併せて呼吸器に直接送達する方法（例えば、気管気管支内投与、肺内投与、及び／又は経鼻投与による）を指す。吸入可能製剤としては、微粒化製剤、噴霧製剤、乾燥粉末製剤、及び／又はエアロゾル製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「バイオフィルム」は、多糖類、糖タンパク質、又は核酸の自己形成マトリックス内にぎっしりと取り囲まれた細菌の凝集体を指す。この状態において、細菌は抗生物質に対する耐性が高い。
［発明を実施するための形態］
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＦ−３０１を抗生物質ダプトマイシン（ＤＡＰ）と組み合わせて、両薬物の適応を、肺サーファクタントが存在する器官又は組織の感染症、例えば、気道の感染症に拡大することを記載する。いくつかの実施形態では、肺サーファクタントは呼吸器系以外の器官又は組織に発現する（Madsen et al. Am J Respir Cell Mol Biol., 29(5):591-7 (2000)）。ＤＡＰは菌血症及び心内膜炎に対する強力な治療選択肢である一方で、肺サーファクタントによる選択的阻害のため肺感染症に対しては使用することができない（Silverman et al., J Infect Dis.,191(12):2149-52. (2005)）。ＤＡＰのサーファクタントによって媒介される阻害に伴う臨床上の限界を鑑みて、本開示は、ＤＡＰ活性が普通は肺サーファクタントによって阻害される肺（及び肺サーファクタントが存在する呼吸器の他の部分、例えば、気管支経路だけでなく気管や咽頭も含む）において、ＣＦ−３０１がＤＡＰ活性を回復又は増加させることを記載し、すなわち、ブドウ球菌肺炎、気管支肺炎、肺炎球菌肺炎、及び非定型肺炎などの気道感染症、とりわけ下気道感染症を治療するための新しい選択肢を提供する。
【００４８】
より広義には、本開示は、呼吸上皮などの器官又は組織における肺サーファクタントの存在などの環境因子に起因する抗生物質の阻害が回避又は克服でき、その環境における抗生物質の有効性が抗生物質と溶解素の共投与によって回復又は増加すること記載する。
【００４９】
抗生物質は、治療される感染症の原因病原菌が通常は感受性のあるものでありうる。溶解素は同じ生物に対して活性があるものでありうる。抗生物質は実質的にサーファクタントによる干渉から免れ、かつ相乗作用を与えるよう利用できることになるので、抗生物質は典型的には、サーファクタントの非存在下で単独療法として使用される場合の有効量と思われる量又はそれより少ない量、例えば、ある実施形態では、閾値以下の量などの第１の量で投与されることになる。したがって、使用される抗生物質量は、充分に当業者の技能範囲内である微調整に供されることになる。溶解素と抗生物質は相乗作用を示すので、溶解素は典型的には、溶解素が単独療法として用いられたら使用されると思われる量又はそれより少ない量、例えば、ある実施形態では、閾値以下の量などの第２の量で投与される。やはり、溶解素の量は充分に当業者の技能範囲内である最適化に供されることになる。第１及び第２の量は、少なくとも相まって（そうでなければ個々でも）、感染症の原因である細菌を死滅させ、それによって感染症を治療するのに有効であることになり、それによって、感染症を根絶する又は感染症の部分的若しくは完全な根絶に寄与するようなものである。
【００５０】
１つの実施形態では、溶解素は第１の量で投与され、抗生物質は第２の量で投与される。
【００５１】
抗生物質は、非経口、経口などのいずれの適切な経路によっても、ある特定の場合では、吸入によっても投与されうる。溶解素は、いずれの適切な経路によっても、（非経口的に）注射によっても、又は吸入によっても投与されうる。治療の期間は、治療の有効性の評価によって、例えば、症状の減衰及び／又は消失、病原菌の力価の減少又は消滅、治療対象の健康状態の改善など並びに１つ以上のそのような評価パラメーターの改善の速度によって決定されることになる。年齢、感染症の種類、随伴合併症、や患者の全身健康状態などの因子に応じて対象によってさまざまでありうる。抗生物質単独療法の通常の期間が、本開示による併用治療の期間を決めるための基準になるであろう。
【００５２】
肺サーファクタントの存在に起因して、気道の内部は体内で独特の環境をもつ。研究により、ある特定の例では、抗生物質の器官特異的阻害が起こることがあり、その特有の器官において特定の抗生物質の効力がなくなりうることが示されている。そのような器官特異的阻害がダプトマイシン（ＤＡＰ）の場合において見られ、少量の肺サーファクタントがStaphylococcus aureusに対するＤＡＰ活性を阻害でき、ＤＡＰがこの病原菌によって引き起こされる肺感染症の治療に適さないものにする（Silverman et al., J Infect Dis.,191(12):2149-52. (2005)）。Studies by Silverman et al.による研究は、S. aureusに起因する気管支肺胞肺炎に対してＤＡＰで治療した患者（Koplowicz et al.  Clin Infect Dis. 49(8):1286-7（2009)）においてさらに裏付けられた。両研究は（Silverman et al., and Koplowicz et al.）、肺サーファクタントの存在がＤＡＰの抗微生物作用を損なうことを確立した。これに基づいて、ＤＡＰが、肺サーファクタントの非存在下で（例えば、インビトロ又は感染症が、肺サーファクタントがない若しくは実質的にない器官又は組織で罹病した場合に）他の病原菌に対して活性があるならば、ＤＡＰは活性があり、そのような呼吸器病原菌に起因する感染症を治療するのに利用可能であることが予想される。そのような病原菌の非限定的な例は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属細菌、Streptococcus pneumoniae、及びStreptococcus pyogenesである。
【００５３】
環状リポペプチド抗生物質の類に属するＤＡＰにくわえて、肺サーファクタントによって誘導される抗生物質活性の阻害は、リポペプチドであるコリスチンやアミノグリコシドであるトブラマイシンなどのさらなる抗生物質についても見られている。したがって、本開示の方法は、肺サーファクタントが存在する器官又は組織に感染する感受性がある細菌病原体に対するこれらの抗生物質の活性を回復又は増加させるのに使用することができる。
【００５４】
現在、ＤＡＰは以下のグラム陽性細菌の感受性がある分離株によって引き起こされる複雑性皮膚・皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）の治療に適応がある。Staphylococcus aureus（メチシリン耐性分離株を含む）、Streptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis、及びEnterococcus faecalis（バンコマイシン感受性分離株のみ）。また、ＤＡＰはメチシリン感受性やメチシリン耐性分離株によって引き起こされる右心系感染性心内膜炎を伴うものを含むStaphylococcus aureus血流感染症の治療にも使用される。さらに、インビトロの研究により、ペニシリン耐性Streptococcus pneumoniaeがＤＡＰによって阻害されることが示されている（Piper et al. J Infect Chemother（2005）11:207-209)。
【００５５】
１つの実施形態では、本開示は、溶解素と１つ以上の抗生物質の組み合わせを肺サーファクタントが存在する器官又は組織に投与することを含む、サーファクタントによって阻害される抗生物質活性を回復また増加させる方法を提供する。肺サーファクタントは肺組織で存在し、本開示は、サーファクタントによって阻害される抗生物質の抗菌活性を回復させる溶解素の能力に関するインビトロ及び生体内での証拠を提供するので、下気道の感染症を引き起こす他の細菌が、これらの細菌に対して活性があるＤＡＰ及び溶解素の組み合わせによって死滅するであろうことが予想される。
【００５６】
表１から表３を含む本明細書において例示される溶解素が、その活性断片及び１つの溶解素の結合ドメインと別の溶解素の触媒ドメインのキメラ結合体で代替できることが理解されよう。例えば、Cheng et al. Appl Microbiol Biotechnol. 74(6):1284-91 (2007)を参照されたい。
実際に、いくつかの例は既に溶解素ポリペプチドの断片やキメラである。表１．（肺サーファクタントの非存在における）ＤＡＰ治療に感受性がある細菌、肺サーファクタントの存在下で起こる感染症の種類、及び列挙された各細菌を死滅できる又はその増殖を阻害できる溶解素化合物の例
【００５７】
【表１】
2018534247.tif 000003
【００５８】
上表に引用された全文献の開示はすべて、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が組み込まれる。
【００５９】
アミノグリコシド系抗生物質には、多くのさまざまな薬剤が含まれる。ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、及びパロモマイシンが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。トブラマイシンは、限定されないが、P. aeruginosa、E. coli、Acinetobacter spp.、Citrobacter spp.、Enterobacter spp.などを含むさまざまなグラム陰性細菌に対して活性がある。特に、トブラマイシンは、市中肺炎と院内肺炎の両方の共通病原菌であるP. aeruginosaに対して高い活性を示す。
【００６０】
グラム陽性細菌に関して、トブラマイシンは狭いスペクトルの活性を示し、S. aureus及びS. epidermidisを除いて、大部分のグラム陽性細菌はトブラマイシンに耐性がある。しかし、ＤＡＰと同様に、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、S. aureus、及びS. pneumoniaeに対するトブラマイシン活性は、サーファクタントの存在下で低下する（van 't Veen A et al. Antimicrob. Agents Chemother. 39:329-333 (1995)）。Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、S. aureus、及びS. pneumoniaeに関連する感染症並びにこれらの細菌に対して活性がある溶解素を表２に列挙する。
【００６１】
したがって、本開示の方法は、グラム陽性細菌、又はグラム陰性細菌、又は両方によって引き起こされる感染症を治療するために、サーファクタントによって阻害される抗生物質活性を回復又は増加させるために使用することができる。一般に、感染症はグラム陽性種とグラム陰性種が混じった複数の微生物による（Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828（2007)）。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、複数の微生物による感染症を治療するために、サーファクタントによって阻害される抗生物質活性を回復又は増加させるために使用することができる。表２．（サーファクタントの非存在における）トブラマイシン治療に感受性がある細菌、肺サーファクタントの存在下で起こる感染症の種類、及び列挙された各細菌を死滅できる又はその増殖を阻害できる溶解素化合物の例
【００６２】
【表２】
2018534247.tif 000004
【００６３】
上表に引用された全文献の開示はすべて、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が組み込まれる。
【００６４】
コリスチン（ポリミキシンＥとしても知られる）はポリミキシン系の抗生物質に属する。コリスチンは狭い抗菌性物質スペクトルをもち、主にP. aeruginosa及びA. baumanniiによる感染症に使用される。P. aeruginosa及びA. baumanniに関連する感染症及びこれらの細菌に対して活性のある溶解素を表３に列挙する。表３．（サーファクタントの非存在における）トブラマイシン治療に感受性がある細菌、肺サーファクタントの存在下で起こる感染症の種類、及び列挙された各細菌を死滅できる又はその増殖を阻害できる溶解素化合物の例
【００６５】
【表３】
2018534247.tif 000005
【００６６】
上表に引用された全文献の開示はすべて、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が組み込まれる。
【００６７】
S. aureusに起因する肺感染症は、病院外地域（community）又は病院環境のいずれかにおける個人間で起こる可能性がある。さらに、S. aureusに起因する肺感染症は、皮膚又は鼻孔にS. aureusを保菌する個人間で発症する可能性がある。多くの場合、S. aureusに起因する肺感染症は挿管又は他の呼吸器具の使用という状況の中で起こる。また、S. aureus肺炎は、ウイルス性肺炎の後又は肺塞栓を伴う右心系心内膜炎の状態においても起こる可能性がある。
【００６８】
通常の宿主における細菌性肺感染症の最も一般的な病原菌としては、Streptococcus pneumoniae、Haemophilus属の種、Staphylococcus aureus、及びMycobacterium tuberculosisが挙げられる。
【００６９】
嚢胞性線維症（ＣＦ）をもつ患者における罹病及び死亡の主因は、気管支拡張症及び閉塞性肺疾患である。ＣＦ患者が成人するときまでにその９８％に肺疾患がある。この疾患の管理における大きな進歩にもかかわらず、大部分の患者が呼吸器合併症のために死亡する。S. aureusは、ＣＦ患者の気道に最もよく見られる病原菌の１つである。したがって、１つの実施形態では、本開示は、ダプトマイシンと、ＣＦ−３０１などのその病原菌に対して活性がある溶解素を投与することによるＣＦをもつ対象のS. aureus肺感染症治療を対象とする。
【００７０】
上述したように、本開示は、溶解素と１つ以上の抗生物質の組み合わせを肺サーファクタントが存在する器官又は組織に投与することを含む、サーファクタントによって阻害される抗生物質活性を回復又は増加させる方法を提供する。
【００７１】
１つの実施形態では、本開示は、対象に第１の量の通常肺サーファクタントによって阻害される抗生物質を投与すること及びその対象に第２の量の溶解素ポリペプチドを共投与することを含む、肺又はより一般的に呼吸器などの、肺サーファクタントが存在する器官又は組織の細菌感染症を患う対象の治療方法を提供し、第１及び第２の量は相まって感染症を治療するのに有効である（この記載は、組み合わせの個々の構成要素がそれ自体の効果をもつことを排除しない）。溶解素は好ましくは感染症の原因である細菌を標的にする、すなわち、溶解素は感染症の原因である細菌に対して活性がある。感染症の原因である病原菌は、少なくとも１つの標準治療抗生物質耐性があってもよいが、溶解素と組み合わせて使用される抗生物質に感受性がなければならない。
【００７２】
別の実施形態では、本開示は、対象に第１の量の溶解素ポリペプチドを投与すること及びその対象に第２の量の通常肺サーファクタントによって阻害される抗生物質を共投与することを含む、肺又はより一般的に呼吸器などの、肺サーファクタントが存在する器官又は組織の細菌感染症を患う対象の治療方法を提供し、第１及び第２の量は相まって感染症を治療するのに有効である（この記載は、組み合わせの個々の構成要素がそれ自体の効果をもつことを排除しない）。
【００７３】
別の実施形態では、気道の感染症は、ブドウ球菌関連疾患又は状態（例えば、ブドウ球菌感染症によって起こるもの又はブドウ球菌感染症が移植若しくはがん若しくは化学療法などのがん治療などの別の疾患又は状態の続発症であるものを含むStaphylococcus属細菌の存在に関連する疾患又は状態）である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示は、肺サーファクタントが、対象における細菌感染症に対する抗生物質の活性を阻害する量又は阻害すると思われる量で存在する器官又は組織の細菌感染症を患う対象における抗生物質の殺菌活性を回復又は増加させる方法を提供し、その方法は、前記器官又は組織の感染症を患う対象に、第１の量の前記抗生物質を投与すること及びその対象に第２の量の、感染症の原因である細菌に対する抗細菌活性溶解素ポリペプチドを共投与することを含み、それらの量は相まってその細菌を死滅させるのに有効であり、それによって感染症を治療する。
【００７５】
本開示はさらに、抗生物質と溶解素の組み合わせ（例えば、ＤＡＰ及びＣＦ−３０１溶解素）を投与することを含む、ＣＦ−３０１などの溶解素の活性を回復又は増加させる方法を提供する。その態様において、溶解素ＣＦ−３０１溶解素の活性は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、最高で１０倍、最高で１６倍、最高で２０倍、又はそれを超えて増強される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
肺サーファクタント中でＣＦ−３０１は活性があり、ＤＡＰは活性がない
サーファクタントの存在下におけるStaphylococcus aureusのさまざまな株に対するＣＦ−３０１及びＤＡＰの個々の活性を決定するために、発明者らは、３つの異なるS. aureus株を調べ、ヒトサーファクタントの機能的等価物であるウシ由来サーファクタント（Survanta, AbbVie Inc）を使用した。漸増濃度のサーファクタントの存在下でメチシリン耐性株（ＭＲＳＡ）ＭＷ２（図１Ａ）、メチシリン感受性（ＭＳＳＡ）株ＡＴＣＣ２９２１３（図１Ｂ）、及びバンコマイシン低度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）株ＡＴＣＣ７００６９９（図１Ｃ）を用いて最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定を前もって形成した（preformed）（図１）。ＭＩＣ値は、Clinical and Laboratory Standards Institute. M07-A9. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. 8th ed.Wayne, PA: CLSI, 2012に従って微量液体希釈で決定した。簡潔に説明すると、細菌の各株をカルシウム調整ミューラー・ヒントン液体培地を用いて５×１０５コロニー形成単位［ＣＦＵ］／ｍＬの濃度に成長培地に懸濁し、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（Becton, Dickinson, and Company）中にて一連の２倍段階希釈でＣＦ−３０１又はＤＡＰに曝露した。３５℃にて周囲空気中で２４時間インキュベーションした後、ＭＩＣ値を、各株の細菌増殖を阻害した各化合物（ＣＦ−３０１又はＤＡＰ）の最大希釈濃度として記録した（Schuch et al, J Infect Dis.; 209(9):1469-78 (2014)）。ＣＦ−３０１及びＤＡＰの開始ＭＩＣ値（すなわち、サーファクタントなし）は（それぞれ）、ＭＷ２に対しては３２及び１μｇ／ｍｌ（図１Ａ）、ＡＴＣＣ２９２１３に対しては１６及び１μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）、並びにＡＴＣＣ７００６９９に対しては６４及び２μｇ／ｍｌ（図１Ｃ）であった。
【００７７】
図１Ａ〜Ｃに示されるように、ＣＦ−３０１は、試験した株の各々において肺サーファクタントの存在下で抗菌活性を示したが、ＤＡＰは示さなかった。１．２５〜１５％のサーファクタント濃度範囲にわたって、ＣＦ−３０１のＭＩＣは、最高で２倍（ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ株に対して）及び４倍（ＶＩＳＡに対して）に増加した（図１Ａ〜Ｃ）。しかし、ＣＦ−３０１試験に用いた範囲と同じサーファクタントの範囲にわたって、ＤＡＰのＭＩＣは２５６倍増加した。まとめると、これらの結果は、ＣＦ−３０１はサーファクタントの存在下でS. aureusのＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、及びＶＩＳＡ株に対して活性があり、その一方でＤＡＰは活性がないことを示す。
実施例２
肺サーファクタントにおけるＤＡＰ活性はＣＦ−との併用時に可能になる
【００７８】
ＤＡＰがサーファクタントの存在下で活性がないという結果に続いて、発明者らは、ＣＦ−３０１がサーファクタントの存在下でＤＡＰ活性を促進し、ＤＡＰが肺サーファクタントの存在下でもその抗菌機能を発揮できる可能性を評価しようとした。サーファクタントの存在下でのＣＦ−３０１とＤＡＰの相まった抗菌活性を２つの異なる方法：組み合わせＭＩＣアッセイ及びチェッカーボードアッセイで評価した。チェッカーボード希釈試験は、複数の化合物間のインビトロ相乗作用を試験するために広く使用されている方法である（White et al. Antimicrob Agents Chemother. 40(8):1914-8 (1996)）。チェッカーボードは、７．５％サーファクタント中でＭＩＣを超えないＣＦ−３０１とＭＩＣを超えないダプトマイシンの組み合わせを用いて２０個のＭＲＳＡ株と２０個のＭＳＳＡ株のパネルに対して作製した。組み合わせＭＩＣアッセイは微量希釈法の変形であり、（単一化合物よりむしろ）２つの化合物を組み合わせて９６ウェルプレートのｘ軸にわたって２倍に希釈して（Schuch et al, J Infect Dis.; 209(9):1469-78 (2014)）、細菌の発育を阻止するのに要する化合物の組み合わせ（この例では、ＣＦ−３０１とＤＡＰ）の最低濃度を決定する。
実験デザインのために、相乗作用は、２つの化合物を一緒に加えることによって予想されるであろうものより大きい阻害活性（すなわち、最小分別阻止濃度（fractional inhibitory concentration）［ＦＩＣｍｉｎ］≦０．５）として定義された（Moody J. 2007. Synergism testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 1-23 In Garcia LS, Isenberg HD, editors. (ed), Clinical microbiology procedures handbook, 2nd ed. ASM Press, Washington, DC）。
【００７９】
表４に示されるように、７．５％サーファクタントの存在下でＣＦ−３０１とＤＡＰとを組み合わせることにより、単剤として使用した場合と比べて、それぞれ１６〜３２倍及び５１２〜１０２４倍低い発育阻止濃度がもたらされた。重要なことには、ＣＦ−３０１とＤＡＰとを組み合わせることは、サーファクタントが存在するにもかかわらずＤＡＰの活性を回復させ、溶解素の添加がなければサーファクタントによって阻害される抗生物質に、溶解素を加えることがそのような抗生物質の阻害を克服することを示した。該結果は、ＭＲＳＡの５つの株（ＭＷ２、ＢＡＡ−１７２０、ＮＲＳ−１９２、ＮＲＳ−２６５、ＮＲＳ−２５５）、並びにＭＳＳＡの５つの株（ＡＴＣＣ−２９２１３、ＮＲＳ−１３１、ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ４９５２１、及びＮｅｗｍａｎ）を含むさまざまな株の間で一致した（表４、データは各薬物単独のＭＩＣ値及び併用でのＭＩＣ値である）。
【００８０】
さらに、７．５％サーファクタントを補充したＭＨＢを用いたチェッカーボードアッセイによって明らかなように、ＭＩＣを超えない濃度のＣＦ−３０１及びＤＡＰは、２０個のＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ株のパネルに対して強力な相乗作用（ＦＩＣ≦０．５）を示した（表５及び表６）。表２及び表３に列挙されている値については、個々のＭＩＣ及び組み合わせ分別阻止濃度（ＦＩＣ）が示されており、ＦＩＣ値≦０．５が強い相乗作用を示す。
まとめると、これらの結果は、ＣＦ−３０１が肺サーファクタントの存在下でＤＡＰ活性を回復及び促進させることを示す。
表４  ＣＦ−３０１とＤＡＰの併用はサーファクタントの存在下でＤＡＰ活性を回復させ、７．５％サーファクタント中でＣＦ−３０１とＤＡＰは相まってS. aureusに対して高い活性がある。
【００８１】
【表４】
2018534247.tif 000006
表５  ＣＦ−３０１は７．５％サーファクタント中でＭＲＳＡ分離株に対してＤＡＰと相乗作用を示す。
【００８２】
【表５】
2018534247.tif 000007
表６  ＣＦ−３０１は７．５％サーファクタント中でＭＳＳＡ分離株に対してＤＡＰと相乗作用を示す。
【００８３】
【表６】
2018534247.tif 000008
実施例３
ＣＦ−３０１はＤＡＰのStaphylococcus aureusへの結合を促進（又は可能に）する
【００８４】
ＣＦ−３０１がサーファクタントの存在下でＤＡＰの活性を回復させるということ（実施例２）から、発明者らは、ＣＦ−３０１がStaphylococcus aureusへのＤＡＰ結合を促進すると推論した。以前に報告（Tran et al. MBio.,23;4(4) (2013)）されているように、ボディピー標識ダプトマイシン（ＢＤＰ−ＤＡＰ）アッセイを使ってＤＡＰの細菌細胞膜（ＣＭ）との相互作用を評価した。簡潔に説明すると、対数期中期のＭＲＳＡ  ＭＷ２（図２）及びＶＩＳＡＡＴＣＣ７００６９９（図３）株細胞をＤＡＰＩで染色し、洗浄して、５０μｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２及び７．５％サーファクタントを含むｐＨ７．２の２５ｍＭトリスに再懸濁した。次いでボディピー−ＤＡＰを加え（４μｇ／ｍｌ）、続いてＣＦ−３０１を加えた（４又は８μｇ／ｍｌ）。対照にはＣＦ−３０１を入れなかった。室温で３０分間又は６０分間インキュベーションした後、０．０１％リジンをコーティングしたスライド上で、細胞を希釈、洗浄、固定、及び播種し、蛍光顕微鏡観察で視覚化した（図２、１０００倍；図３、倍率２０００倍）。
【００８５】
図２に示されるように、ＣＦ−３０１（８μｇ／ｍｌ）は、７．５％サーファクタントの存在下で、ＭＲＳＡへのボディピー−ＤＡＰ（ＤＡＰＢＤ）結合を促進した。同様に、ＣＦ−３０１（４μｇ／ｍ）は、７．５％サーファクタント中で、ＶＩＳＡへのＤＡＰＢＤ結合を促進した（図３、ＤＡＰＩで標識し、緩衝液（図３Ａ）、ＤＡＰＢＤ（４μｇ／ｍｌ；１／６４ＭＩＣ）（図３Ｂ）、又はＤＡＰＢＤ及びＣＦ−３０１（４μｇ／ｍｌ；１／１２８ＭＩＣ）（図３Ｃ〜Ｇ）で３０分間処理したＶＩＳＡ株ＡＴＣＣ７００６９９）。まとめると、これらの結果はＣＦ−３０１が細菌ＣＭへのＤＡＰ結合を促進することを示す。
実施例４
ＣＦ−３０１及びＤＡＰは一緒に作用して、７．５％サーファクタント中で、S. aureusを死滅させ、バイオフィルム様構造体を減少／崩壊させる
【００８６】
次に、発明者らは、ＣＦ−３０１とＤＡＰが一緒になって、（５０μｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２及び７．５％サーファクタントを含む）ｐＨ７．２の２５ｍＭトリス中のサーファクタントの存在下で、S. aureusを死滅させ、且つバイオフィルム様構造体を減少及び崩壊させる能力を調べた。ＶＩＳＡ株ＡＴＣＣ７００６９９を、単独（対照）、ＤＡＰ（４μｇ／ｍｌ；１／６４ＭＩＣ）、ＣＦ−３０１（４μｇ／ｍｌ；１／１２８ＭＩＣ）、又はＤＡＰとＣＦ−３０１の組み合わせで２０分間処理した。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析（図４Ａ）及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（図４Ｂ）分析は、ＣＦ−３０１とＤＡＰを組み合わせた場合に、効率的にS. aureusを死滅させること（図４Ａ）及びバイオフィルム形成（図４Ｂ）を減少させることを示す。したがって、先の例で見られたのと同様に、これらの観察結果は、ＣＦ−３０１は、ＤＡＰがサーファクタントの阻害効果を克服できるようにすることを示す。
実施例５
S. aureus肺炎のマウスモデルにおいてＣＦ−３０１とＤＡＰとの併用療法は単独療法に優る
【００８７】
ＣＦ−３０１とＤＡＰを組み合わせたときインビトロで見られた利点を考慮して、ＣＦ−３０１とＤＡＰを生体内で一緒に使用することの効果を評価した。この問題に取り組むために、マウスを５×１０８ＣＦＵのS. aureus（ＭＲＳＡ株ＡＴＣＣＢＡＡ−４２）に鼻腔内感染させ、感染の開始後４時間後から、生理食塩水、ＣＦ−３０１（静脈内）、ＤＡＰ（皮下）、又はＣＦ−３０１／ＤＡＰ併用で１日１回治療した（ｎ＝１０頭のマウス／群；ｐ＜０．０５対ＤＡＰ）。実験は感染後１４日間行なった。ＣＦ−３０１とＤＡＰの組み合わせでの治療は１４日で７０％の生存の結果をもたらし、併用療法がどちらの薬物単独より優れたことを示した（Ｐ＜０．０５対ＤＡＰ）。
【００８８】
図５Ａに示されるように、S. aureus肺炎のマウスモデルにおいて、ＣＦ−３０１とＤＡＰでの併用療法は単独療法より優れた。生体外で見られたのと同様に、ＤＡＰにくわえてＣＦ−３０１を使用することは、ＤＡＰ抗菌活性の回復をもたらした。ここで得られた生体内データはそれらの結果をさらに支持する。例えば、ＤＡＰ単独で治療した動物は生理食塩水で治療した動物（対照）と同じ生存パターンを示す。しかし、ＣＦ−３０１をＤＡＰ治療に追加することにより、ＣＦ−３０１の抗菌活性が回復する。
【００８９】
さらに、４頭の感染動物群の各々の肺における細菌ＣＦＵの総数（感染の１日後及び３日後に測定）は、ＣＦ−３０１とＤＡＰの組み合わせで治療した後に著しく減少した（図５Ｂ）。
【００９０】
本明細書に記載の実施例によって示されるように、ＣＦ−３０１はＤＡＰ活性を促進し、サーファクタントの存在下でその抗菌効果が達成できるようになる。これらの知見はインビトロと生体内の両方で裏付けられた。
【００９１】
要約すれば、発明者らは、ウシ肺サーファクタント（ヒトサーファクタント機能的等価物）有り無し両方で、最小値（及びいくつかの実験では最小値を超えない）濃度（ＭＩＣ）及びチェッカーボードアッセイを用いて、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、及びＶＩＳＡStaphylococcus aureus分離株に対するＣＦ−３０１とＤＡＰの間の強力な相乗相互作用を示した。最高で１０２４倍のＭＩＣの減少がサーファクタント中のＣＦ−３０１の存在下でＤＡＰについて観察された。さらに、生存及びＣＦＵレベルに続いて、ＣＦ−３０１及び／又はＤＡＰの効力がＢＡＬＢ／ｃマウス肺感染症モデルで示された。
実施例１〜５に示されたインビトロ及び生体内結果は、ＤＡＰとＣＦ−３０１の組み合わせがS. aureus肺感染症を標的とする有効な治療でありうることを示唆する。
【００９２】
ＭＩＣを超えないレベルにおいて、ＣＦ−３０１はＤＡＰと相乗作用を示して肺サーファクタント（ＤＡＰの阻害剤）の存在下でさまざまなＭＳＳＡ及びＭＲＳＡ分離株を死滅させる。結果から、ＣＦ−３０１の存在下における細菌細胞内のＤＡＰの急速な蓄積が示される。特に注意すべきは、併用療法は感染マウスの肺環境で非常に有効であり、ＣＦ−３０１とＤＡＰが、両方の薬物の新規適応症であるブドウ球菌肺炎を治療するのに有効であることを示唆する。これらの薬剤の相補的且つ相乗的な活性は、ＣＦ−３０１の新規特徴によって強化される。該新規特徴としては、急速な溶菌、S. aureusに対する特異性、耐性がないこと、及び強力な抗バイオフィルム活性が挙げられる。
【００９３】
本明細書において引用されている参考文献はすべて、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。前述の例は例示かつ非限定的である。特定の実施形態が上で記載されているが、当業者なら、均等なものを含む下記特許請求の範囲内の追加実施形態、修正、及び変形をすべて想定することが容易に可能であろう。
配列番号１（ＣＦ−３０１、ジェンバンク受託番号：ＺＰ＿０３６２５５２９）
【化１】
2018534247.tif 000009
配列番号２（ＣｌｙＳ）
【化２−１】
2018534247.tif 000010
【化２−２】
2018534247.tif 000011
配列番号３（ＰｌｙＶ１２）
MTRRYTKMNVPQSLVNWFVNHRNLLTYSMYGSRNGSDGTADCSGSMSQALKEAGIPIQGLPSTVTLGQQLAKNGFYR ISRNEDWNAETGDIVLMSWGADMASSGGAGGHVGVMMDSVNFISCDYSTQGAAGQAINTYPWNDYYEANKPAYIEVW RYSESAPQTKNQANTAVTPQQKAYYEANEVKYVNGIWQIKCDYLSPIGFDYLENGIPVTMVNWVDKDGNDLPDGADQ DLKAGMYFSFSSDETNIVDTGNGGYYGGYYWRLFEFGQFGPVWLSCWNKDDLVNYFQ
配列番号４（ＬｙｓＫ）
MAKTQAEINK RLDAYAKGTV DSPYRVKKAT SYDPSFGVME AGAIDADGYY 
HAQCQDLITD YVLWLTDNKV RTWGNAKDQI KQSYGTGFKI HENKPSTVPK 
KGWIAVFTSG SYEQWGHIGI VYDGGNTSTF TILEQNWNGY ANKKPTKRVD 
NYYGLTHFIE IPVKAGTTVK KKTAKKSASK TPAPKKKATL KVSKNHINYT 
MDKRGKKPEG MVIHNDAGRS SGQQYENSLA NAGYARYANG IAHYYGSEGY 
VWEAIDAKNQ IAWHTGDGTG ANSGNFRFAG IEVCQSMSAS DAQFLKNEQA 
VFQFTAEKFK EWGLTPNRKT VRLHMEFVPT ACPHRSMVLH TGFNPVTQGR 
PSQAIMNKLK DYFIKQIKNY MDKGTSSSTV VKDGKTSSAS TPATRPVTGS 
WKKNQYGTWY KPENATFVNG NQPIVTRIGS PFLNAPVGGN LPAGATIVYD 
EVCIQAGHIW IGYNAYNGNR VYCPVRTCQG VPPNQIPGVA WGVFK
配列番号５（Ｃｐｌ−１）
MVKKNDLFVD VSSHNGYDIT GILEQMGTTN TIIKISESTT YLNPCLSAQVEQSNPIGFYH FARFGGDVAE AEREAQFFLD NVPMQVKYLV LDYEDDPSGD AQANTNACLR FMQMIADAGYKPIYYSYKPF THDNVDYQQI LAQFPNSLWI AGYGLNDGTA NFEYFPSMDG IRWWQYSSNP FDKNIVLLDDEEDDKPKTAG TWKQDSKGWW FRRNNGSFPY NKWEKIGGVW YYFDSKGYCL TSEWLKDNEK WYYLKDNGAMATGWVLVGSE WYYMDDSGAM VTGWVKYKNN WYYMTNERGN MVSNEFIKSG KGWYFMNTNG ELADNPSFTKEPDGLITVA
配列番号６
ＧＮ３７
ポリペプチド配列
MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGLRSVSRQKEL VAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRWDWPLYDAIAVAVKAAAKELG VAIVWGGDWTTFKDGPHFELDRSKYR
配列番号７
ＧＮ２
ポリペプチド配列
MKISLEGLSLIKKFEGCKLEAYKCSAGVWTIGYGHTAGVKEGDVCTQEEAEKLLRGDIFKFEEYVQDSVKVDLDQSQFDALVAWTFNLGPGNLRSSTMLKKLNNGEYESVPFEMRRWNKAGGKTLDGLIRRRQAESLLFESKEWHQV
配列番号８
ＧＮ４
ポリペプチド配列
MRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS
配列番号９
ＧＮ１４
ポリペプチド配列
MNNELPWVAEARKYIGLREDTSKTSHNPKLLAMLDRMGEFSNESRAWWHDDETPWCGLFVGYCLGVAGRYVVREWYRARAWEAPQLTKLDRPAYGALVTFTRSGGGHVGFIVGKDARGNLMVLGGNQSNAVSIAPFAVSRVTGYFWPSFWRNKTAVKSVPFEERYSLPLLKSNGELSTNEA
配列番号１０
ＧＮ４３
ポリペプチド配列
MKRTTLNLELESNTDRLLQEKDDLLPQSVTNSSDEGTPFAQVEGASDDNTAEQDSDKPGASVADADTKPVDPEWKTITVASGDTLSTVFTKAGLSTSAMHDMLTSSKDAKRFTHLKVGQEVKLKLDPKGELQALRVKQSELETIGLDKTDKGYSFKREKAQIDLHTAYAHGRITSSLFVAGRNAGLPYNLVTSLSNIFGYDIDFALDLREGDEFDVIYEQHKVNGKQVATGNILAARFVNRGKTYTAVRYTNKQGNTSYYRADGSSMRKAFIRTPVDFARISSRFSLGRRHPILNKIRAHKGVDYAAPIGTPIKATGDGKILEAGRKGGYGNAVVIQHGQRYRTIYGHMSRFAKGIRAGTSVKQGQIIGYVGMTGLATGPHLHYEFQINGRHVDPLSAKLPMADPLGGADRKRFMAQTQPMIARMDQEKKTLLALNKQR
配列番号１１
ＰＧＮ４
ポリペプチド配列
NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRASQSRESQC
配列番号１２
ＦＧＮ４−１
ポリペプチド配列
NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS
配列番号１３
ＦＧＮ４−２
ポリペプチド配列
NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRA
配列番号１４
ＦＧＮ４−３
ポリペプチド配列
NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRK
配列番号１５
ＦＧＮ４−４
ポリペプチド配列
NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSC
配列番号１６：ＰＡＬ配列
【化３−１】
2018534247.tif 000012
【化３−２】
2018534247.tif 000013
【化３−３】
2018534247.tif 000014
【図１】
2018534247.tif 000015
【図２】
2018534247.tif 000016
【図３】
2018534247.tif 000017
【図４】
2018534247.tif 000018
【図５】
2018534247.tif 000019
【配列表】
2018534247000001.app
【国際調査報告】
2018534247.tif 000020
2018534247.tif 000021
2018534247.tif 000022
2018534247.tif 000023
2018534247.tif 000024
2018534247.tif 000025
2018534247.tif 000026
2018534247.tif 000027