(57)【要約】  本発明は、医療用途または化粧料用途のための、走磁性細菌によって合成されるナノ粒子を含む非発熱原性調製物に関する。本発明によるナノ粒子は、主として酸化鉄を含む結晶化鉱物の中心部分ならびに走磁性細菌由来の物質を有するものでない周囲被覆で構成されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの合成ナノ粒子を含む調製物であって、前記ナノ粒子が：
−生存生物体によって合成される、主として酸化鉄を含む結晶化鉱物の中心部分、および
−前記生存生物体に由来する物質を含まない周囲被覆
を含む調製物。
【請求項２】
前記生存生物体が細菌である、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
前記中心部分がマグヘマイトおよび／またはマグネタイトを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
前記合成ナノ粒子が非発熱原性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項５】
前記合成ナノ粒子に含まれるエンドトキシン量が、医療用デバイス、薬物または化粧品に適用され得る有効な少なくとも１つの品質規格または規制基準に従い、特にＩＳＯ品質規格または現行の薬局方に適合する量である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項６】
前記ナノ粒子の周囲被覆が前記ナノ粒子の鎖状の配列を可能にするものであり、前記鎖が、前記鎖の伸長方向に配向された結晶軸を有する少なくとも２つの合成ナノ粒子からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項７】
前記被覆が、前記合成ナノ粒子の中心部分との弱い相互作用または共有結合を確立することができる少なくとも１種類の化合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項８】
前記被覆が、前記中心部分のＦｅ２＋またはＦｅ３＋イオン、ヒドロキシルＯＨ−、オキシドＯ２−、結晶欠陥との相互作用または結合を確立することができる少なくとも１種類の化合物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項９】
前記被覆が炭素化合物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１０】
前記被覆が、キレート剤、両親媒性分子、分極または荷電ポリマー、金属酸化物または酸化ケイ素、金属またはケイ素の水酸化物、酸、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体、およびこれらの化合物または誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１１】
前記被覆が、多糖、脂肪酸、リン脂質、アミノ酸のポリマー、高分子または非高分子シリカおよび脂肪族アミノポリマー、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体ならびにこれらの化合物または誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１２】
前記被覆が、カルボン酸、リン酸、スルホン酸、エステル、アミド、ケトン、アルコール、フェノール、チオール、アミン、エーテル、スルフィド、酸無水物、ハロゲン化アシル、アミジン、ニトリル、ヒドロペルオキシド、イミン、アルデヒド、ペルオキシド、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体、およびこれらの化合物または誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの官能部を含む、
請求項１〜１１のうちの少なくとも１つに記載の調製物。
【請求項１３】
特に例えば磁気温熱療法による腫瘍の処置における薬物または診断用薬剤としての使用のための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１４】
化粧料用途のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の調製物の使用。
【請求項１５】
有効成分として請求項１〜１３のうちの１項に記載の調製物および任意選択で、少なくとも１種類の薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物または医薬用薬物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のうちの１項に記載の調製物を備えた医療用デバイス。
【請求項１７】
請求項１〜１３のうちの１項に記載の調製物を含む診断用組成物。
【請求項１８】
化粧料有効成分として請求項１〜１３のうちの１項に記載の調製物を含む化粧料組成物。
【請求項１９】
以下のシーケンス：
（ｉ）主として酸化鉄で構成された結晶化鉱物の中心部分と生物学的周囲被覆とを含む、生存生物体によって合成されるナノ粒子の調製物から、前記鉱物中心部分を単離すること；
（ｉｉ）得られた調製物を、前記中心部分が周囲被覆で覆われるように処理すること；
（ｉｉｉ）任意選択で、前記調製物を、優先的にはシーケンス（ｉ）の後、場合によってはシーケンス（ｉｉ）の後に滅菌すること
を含む、請求項１〜１３のうちの１項に記載の調製物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬または化粧料に有用な修飾された、細菌起源の合成ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
当該技術分野の水準
走磁性細菌は、マグネトソームと称される酸化鉄ナノ粒子を合成し、このナノ粒子は、一方において好都合なフェリ磁性特性をもたらす典型的には２０〜１２０ｎｍ程度の直径の大径の結晶化鉱物の中心部分の存在のため、および他方において該粒子の鎖状の配列によりマグネトソームの凝集が抑制されるため、傑出した特性を有する。細菌起源のこのようなナノ粒子は、化学合成により得られるナノ粒子と比べて好都合な磁気特性を示す。例えば、同等の鉄濃度で交流磁場の印加に曝露された場合、走磁性細菌から抽出されるマグネトソーム鎖の懸濁液では、磁気温熱療法に一般的に使用されている化学的ナノ粒子、例えば、化学的超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）および化学的フェリ磁性酸化鉄ナノ粒子（ＦＩＯＮ）よりも多くの熱が生じる。かかる懸濁液を、マウスの皮下に異種移植した乳がん腫瘍に投与し、数回の交流磁場の印加に曝露した場合、これにより抗腫瘍活性が誘導される（非特許文献１）。また、同等の鉄濃度では、この抗腫瘍活性はＳＰＩＯＮまたはＦＩＯＮで観察されるものより大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｌｐｈａｎｄｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＡｃｓＮａｎｏ，Ｖ．５，Ｐ．６２７９（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、このようなマグネトソーム鎖はグラム陰性菌に由来するものであり、したがって、一部の場合では、高いエンドトキシン濃度ならびに生物材料を有する場合があり得、これは、厳密に特性評価することが困難である。したがって、本発明は、このような問題を解決することを可能にするマグネトソームの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
説明
本発明は、本発明者らにより、マグネトソームの天然の周囲被覆を別の被覆で置き換え、保健、診断および／または化粧料において使用され得る非発熱原性の合成ナノ粒子を得ることが可能であることが予期せずに示されたことによってもたらされた。
【０００６】
したがって、本発明は、少なくとも１つの合成ナノ粒子を含む調製物であって、該ナノ粒子が：
−生存生物体によって合成される、主として酸化鉄を含む結晶化鉱物の中心部分、および
−該生存生物体に由来する物質を含まない周囲被覆
を含む、調製物に関する。
【０００７】
本発明による調製物は、１μｍ３、１ｍｍ３または１ｄｍ３の容量内に含まれた少なくとも１、２、３、５、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個の合成ナノ粒子を含み得る。これは、優先的には液体媒体中に含まれた合成ナノ粒子の懸濁液であり得るか、または液体媒体、固体媒体もしくは気体媒体中に含まれた合成ナノ粒子の集合体であり得る。
【０００８】
また、本発明は、生存生物体によって合成される主として酸化鉄を含むものであり、被覆を全く含まない結晶化された中心部分に関する。
【０００９】
合成ナノ粒子は、そのサイズの少なくとも１つの寸法が１０、５、２、５または１μｍ未満、優先的には７５０、５００、４００または３００ｎｍ未満、最も優先的には２００または１００ｎｍ未満であり、優先的には固体状態であり、そのサイズがとりわけ透過型電子顕微鏡使用（ＴＥＭ）によって測定可能な粒子である。文言「合成の」とは、ナノ粒子が、人間が関与する少なくとも１つの工程を用いて、特に生物学的または化学的プロセスを用いて製造されたことを示す。
【００１０】
本発明による合成ナノ粒子は、少なくとも１つの磁気特性を有する、例えば：
−反磁性、超常磁性、優先的にはフェリ磁性もしくは強磁性である、
−少なくとも１つの磁区を有する、
−少なくとも１つのゼロでない磁気モーメントを有する、
−０、１０、１００、２７３、３１０、３７３もしくは１０００Ｋより高い温度で０．５、１、１０、１００もしくは１０００Ｏｅより大きい保磁力を有する、または
−０、１０、１００、２７３、３１０、３７３もしくは１０００Ｋより高い温度で０．０１、０．１、０．２、０．５、０．７、０．９、０．９５もしくは０．９９より大きい、残留（ｒｅｍａｎａｎｔ）磁化と飽和磁化との比を有する
ものであり得、このような特性は優先的には、その中心部分の特性による。
【００１１】
本発明による合成ナノ粒子は優先的には単一の磁区を有するナノ粒子であり、これにより、いくつかの磁区を有するナノ粒子と比べてより良好な磁気特性がもたらされ得る。
【００１２】
本発明による合成ナノ粒子は優先的には、フェリ磁性または強磁性のナノ粒子、特に、磁気モーメントが生理学的温度で熱的に安定である、および／またはサイズが１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ｎｍより大きいナノ粒子である。
【００１３】
本発明による合成ナノ粒子は超常磁性ナノ粒子、特に、磁気モーメントが生理学的温度で熱的に不安定である、および／またはサイズが１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ｎｍより小さいナノ粒子であってもよい。
【００１４】
本発明による合成ナノ粒子の平均直径は、透過型電子顕微鏡使用（ＴＥＭ）を用いて、または動的もしくは非動的光散乱法の補助を伴って測定され得る。
【００１５】
合成ナノ粒子の中心部分は主として酸化鉄を含むもの、すなわち、少なくとも１０または２５％、優先的には少なくとも５０、７５、９５、９７、９９、９９．５または９９．９％の鉄の酸化物を含む。酸化鉄のこのパーセンテージは、特に、該中心部分の酸化鉄中に含まれた原子の数を合成ナノ粒子の酸化鉄中に含まれた原子の数で除算したもの、または該中心部分に含まれた酸化鉄の質量を合成ナノ粒子に含まれた酸化鉄の質量で除算したものに対応する。
【００１６】
優先的には、酸化鉄はマグヘマイト、マグネタイトまたはマグヘマイトとマグネタイトの間の中間的な組成である。
【００１７】
優先的には、本発明による合成ナノ粒子の中心部分を合成する生存生物体は真核生物細胞または細菌、より優先的には磁性ナノ粒子を合成する細菌、さらにより優先的には走磁性細菌である。最も優先的には、本発明による細菌は走磁性菌株に属するもの、特に、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ種ＭＣ−１、Ｍａｇｎｅｔｏｖｉｒｒｉｕｍ  ｂｌａｋｅｍｏｒｅｉ  ＭＶ−１、ＭＶ−２およびＭＶ−４、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ  ＭＳ−１、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ  ＭＳＲ−１、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＭＧＴ−１ならびにＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ  ＲＳ−１である。
【００１８】
また、本発明による合成ナノ粒子は、その被覆中に走磁性細菌に由来する有機物質が存在しないことで、走磁性細菌から抽出される通常、鎖状に配列されたマグネトソームとは異なることは認識されよう。該被覆は優先的には、非変性有機物質を含まない。変性は、ここでは、生物学的巨大分子（例えば、核酸またはタンパク質）によって通常の３次元立体構成が損なわれることと定義する。実際には、合成ナノ粒子にはその被覆中に、走磁性細菌に由来する変性有機物が含まれている場合があり得る。この変性有機物質は、ナノ粒子を精製することが意図された処理の後、例えば、化学的、熱的もしくは磁気的処理またはこれらの処理の組合せの後にみられ得る。
【００１９】
一実施形態では、該被覆は、５０％、２５％、１０％または１％未満の走磁性細菌に由来する非変性有機物質、例えば、走磁性細菌に由来する脂質、エンドトキシンおよび／または非変性タンパク質を含む。非変性有機物質のこのパーセンテージは、特に、被覆中に含まれたこの物質の質量を合成ナノ粒子中の質量で除算したものに対応する。細菌に由来するこの少量の有機物質は、精製された該中心部分の表面または内部の化学的官能基、例えば、ホスフェートまたはアミンの質量によって特性評価され得、これは、該中心部分のすべての鉄１ｍｇあたり１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．００１ｍｇ、０．０００１ｍｇまたは４０ｎｇ未満である。このように非変性有機物質の量が少ないことにより、特に、ヒトまたは動物への投与を可能にするための有効な規格に従う充分に低いレベルの発熱原性を有する合成ナノ粒子の懸濁液を作製することが可能になり得る。
【００２０】
一実施形態では、本発明による調製物は、接続物質によって互いに結合している少なくとも２、５、１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、５００、１００００、５００００または１０００００個の合成ナノ粒子を含む。接続物質は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有するものであり得る：ｉ）少なくとも一部が、合成ナノ粒子の被覆のものと同じ物質（１種類または複数種）で作製されている、ｉｉ）少なくとも２つの合成ナノ粒子を一体に、１ｍｍ、１００μｍ、１０μｍ、１μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、２ｎｍまたは１ｎｍより短い、または長い距離にわたって連結する、ｉｉｉ）細胞内への内在化を増進させる、ｉｖ）正電荷もしくは負電荷を有するか、または中性である、ｖ）治療効果または診断効果を有する、または有していない、ｖｉ）調製物が液体媒体、物理的媒体、気体媒体もしくは生物学的媒体中に存在している場合、または滅菌後、もしくは例えば、とりわけ生物体への投与のための調製物の製剤化に使用される溶液もしくは媒体の補助を伴う物理的、生物学的もしくは化学的処理の後のいずれかにおいて、少なくとも２つの合成ナノ粒子間の連結を確実にするのに充分に耐久性である、ｖｉｉ）含まれる生存生物体由来の炭素物質が２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、０．１％、０．０１％または０．００１％未満である、ｖｉｉｉ）生存生物体由来のものではない。
【００２１】
合成ナノ粒子は：直鎖、円形、正方形、長方形、三角形、五角形、六角形、七角形、八角形、多角形または多面体であり得る幾何的形態で配列されたものであり得る。このような形態は、透過型電子顕微鏡によって観察することができる。
【００２２】
幾何的形態に従う少なくとも２つの合成ナノ粒子の配列は：ｉ）優先方向に配向された結晶軸、ｉｉ）平行もしくは垂直であるか、または１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、１８０、２２５、２５０、３００、３２５、３５０もしくは３７９度より大きい、もしくは小さい角度をなしている２つの異なる合成ナノ粒子に属する少なくとも２つの側面または面、ｉｉｉ）このようなナノ粒子が磁場の印加、特に、１０−１０Ｔ、１０−９Ｔ、１０−８Ｔ、１０−７Ｔ、１０−６Ｔ、１０−５Ｔ、１０−４Ｔ、１０−３Ｔ、１０−２Ｔ、１０−１Ｔ、１Ｔより大きな強度の磁場の印加に曝露されたとき、磁場に対して平行な整列、またはｉｖ）少なくとも２つの合成ナノ粒子を一体に連結する連結物質を有するこのようなナノ粒子の配列に対応するものであり得る。
【００２３】
幾何的形態の状態の少なくとも２つの合成ナノ粒子の配列は、ｐＨの関数としてのゼータ電位の変動によって特性評価され得、これは、ｐＨを１から１４まで、２から１２まで、３から１１まで、４から１０まで、５から９まで、または６から８まで上げた場合の連続変動、例えば、連続的な低減または増大、優先的には連続的な低減であり、このとき、連続的な低減または増大は、低減または増大のいずれかである１より大きい、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４異なるｐＨ単位間で測定される変動に対応するものであり得る。
【００２４】
対照的に、幾何的形態の状態でない、例えば凝集体の少なくとも２つの合成ナノ粒子の配列は、ｐＨを１から１４まで、２から１２まで、３から１１まで、４から１０まで、５から９まで、または６から８まで上げた場合の一連の少なくとも１、２、３、４、５、７、９、１０、１２、１５、２０の低減（１回または複数回）および増大（１回または複数回）であるｐＨの関数としてのゼータ電位の変動によって特性評価され得る。
【００２５】
幾何的形態の状態の配列は、固体、液体または気体媒体中で、すなわち、特に、合成ナノ粒子を囲んでいる媒体中で、例えば、試験または特性評価中に合成ナノ粒子またはこのナノ粒子を囲んでいるものの製剤化のために使用される媒体中で起こり得る。
【００２６】
本発明によれば、合成ナノ粒子の中心部分を合成する生存生物体が走磁性細菌である場合、本発明による合成ナノ粒子は、化合物で被覆されたマグネトソームの中心部分を含むことが好ましい。
【００２７】
優先的には、該本発明による合成ナノ粒子の中心部分は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：
（α）少なくとも１、２、５、１０、５０、１００、１５０または２００の結晶面を提示し、優先的には鉱物形態であり、主として酸化鉄、優先的にはマグヘマイト（とりわけ、該中心部分が酸素と接触する場合）、マグネタイト（とりわけ、該中心部分が酸素と接触しない場合）またはマグヘマイトとマグネタイトの混合物を含む結晶性の部分、
（β）フェリ磁性または強磁性の挙動（とりわけ、生理学的温度で）、
（χ）単一の磁区または磁性モノドメイン、
（δ）磁性微細構造、これは、優先方向に配向され得る磁力線（磁化容易軸など）または合成ナノ粒子の中心部分の結晶方位（［１１１］など）の存在によって特性評価され得、ここで、かかる磁性微細構造は、一定の条件下で、とりわけ電子ホログラフィによって観察可能であり得る。
（ε）１ｎｍ〜２μｍ、５ｎｍ〜１μｍ、５〜５００ｎｍ、５〜２５０ｎｍ、５〜１００ｎｍ、５〜８０ｎｍ、５〜６０ｎｍ、１０ｎｍ〜１μｍ、１０〜５００ｎｍ、１０〜２５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、１５ｎｍ〜１μｍ、１５〜５００ｎｍ、１５〜２５０ｎｍ、１５〜１００ｎｍ、１５〜８０ｎｍ、１５〜６０ｎｍ、２０ｎｍ〜１μｍ、２０〜５００ｎｍ、２０〜２５０ｎｍ、２０〜１００ｎｍ、２０〜８０ｎｍまたは２０〜６０ｎｍのサイズ、
（φ）１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ｎｍより大きいサイズ、
（γ）２０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１２０、１００、９５、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ｎｍより小さいサイズ、
（η）考えられ得るゼータ電位、電荷、表面電荷の存在、
（ι）等電点、優先的には、７以下、６、５、４、３、２または１のｐＨの酸性、
（ιι）等電点、これは、該中心部分の表面に残存している有機物質の量が最も少ない場合、７に最も近く；残存している有機物質の量が少ないとき、等電点はｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、ｐＨ６．２〜ｐＨ７．１またはｐＨ６．１〜ｐＨ７．１であり得る。
【００２８】
当業者には理解されるように、ゼータ電位、電荷、表面電荷は通常、ｐＨ、塩分濃度、合成ナノ粒子の中心部分を合成する細菌の種、凝集状態、この中心部分の表面上の有機物質のパーセンテージに依存する。これらは：（１）酸性ｐＨである７、６、５、４、３、２または１以下のｐＨではプラスであり得る、（２）塩基性ｐＨである１３、１２、１１、１０、９、８、７以上のｐＨではマイナスであり得る、（３）ｐＨの関数として、−１０〜１０ｍＶ、−２０〜２０ｍＶ、−３０〜３０ｍＶ、−４０〜４０ｍＶ、−５０〜５０ｍＶ、−６０〜６０ｍＶ、−７０〜７０ｍＶ、−８０〜８０ｍＶ、−９０〜９０ｍＶ、−１００〜１００ｍＶ、−１５０〜１５０ｍＶまたは−２００〜２００ｍＶで構成される範囲内で変動し得る、（４）ｐＨ値の関数として、このような合成ナノ粒子の中心部分の表面に残存している有機物質、優先的には炭素物質の量が最も少ない場合に最も有意に変動し得る。
【００２９】
優先的には、合成ナノ粒子の中心部分に含まれる有機物質は５０、２５、１０、５、２、１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０１または０．００１％未満である。本明細書で用いる場合、有機物質のこのパーセンテージは、原子の質量もしくは数での、または有機物質中に含まれている任意の化学元素もしくは化学元素の組合せ、例えば、炭素、窒素、リンの容積でのパーセンテージを表す。このパーセンテージは元素分析機器を用いて、例えば、全有機体炭素（ＴＯＣ）または炭素、水素、窒素、イオウ、酸素（ＣＨＮＳ／Ｏ）分析装置を用いて測定され得る。
【００３０】
一実施形態では、本発明による被覆は、周囲被覆とも表示しており、固体、液体または気体の物質、優先的には固体状態であり、該中心部分を、とりわけ層の形態で囲んでおり、結晶化状態のもの、またはそうでないものであり、とりわけ、該中心部分の中心から測定される距離が１００μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ、１０ｎｍまたは１ｎｍより小さい。この被覆は特に、該中心部分を安定化させる機能または合成ナノ粒子を一体に連結させる機能を果たし得る。
【００３１】
該被覆は、該中心部分と共通する少なくとも１つの特性を有するものであってもよく、該中心部分とは異なる少なくとも１つの特性を有するものであってもよい。
【００３２】
本発明によれば、周囲被覆は優先的には、生存生物体に由来する非変性物質を含まない。周囲被覆に含まれるこの物質は、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．１、０．０５、０．０１、０．００１または０．０００１％未満であり得る。このパーセンテージは、該被覆中に含まれる生存生物体に由来する原子の数を該被覆中に含まれる原子の総数で除算した比、または該被覆中に含まれる生存生物体に由来する原子の質量を該被覆中に含まれる原子の総質量で除算した比と定義され得る。このパーセンテージは、炭素または有機物質のパーセンテージに対応するものであり得る。
【００３３】
合成ナノ粒子は、本発明によれば非発熱原性であり、ここで、非発熱原性は、優先的には１ミリリットルの調製物中に含まれる合成ナノ粒子１ミリグラムあたりのエンドトキシンの量を測定することにより定義され得、これは、１０９、１０８、１０７または１０６以下、優先的には１０４または１０３以下、最も優先的には１００、５０、１０、５または１以下のエンドトキシン単位（ＥＵ）である。当業者にはわかるように、１ＥＵは、大腸菌由来のエンドトキシン１ｍＬあたり１００μｇの量に対応するものであり得る。
【００３４】
優先的には、合成ナノ粒子は、その被覆または中心部分が非発熱原性である場合、優先的には、その被覆と中心部分が非発熱原性である場合、非発熱原性であり、ここで、非発熱原性はこの場合、優先的には１ミリリットルの調製物中に含まれる合成ナノ粒子の中心部分および／または被覆１ミリグラムあたりのエンドトキシンの量を測定することにより定義され得、これは、１０９、１０８、１０７または１０６以下、優先的には１０４または１０３以下、最も優先的には１００、５０、１０、５または１以下のエンドトキシン単位（ＥＵ）である。
【００３５】
本明細書で用いる場合、調製物は、該調製物中に含まれた合成ナノ粒子以外の物質、例えば、該調製物の賦形剤および／または溶媒中および／または合成ナノ粒子を囲んでいるマトリックス中に含まれた物質が非発熱原性である場合、非発熱原性である。
【００３６】
優先的には、非発熱原性調製物は、５０、２０、１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８または１０−９％以下のエンドトキシンパーセンテージによって特性評価され、ここで、このパーセンテージは：（ｉ）エンドトキシンの質量を該調製物の総質量で除算したもの、（ｉｉ）エンドトキシンが占める容量を該調製物の総容量で除算したもの、（ｉｉｉ）該調製物のエンドトキシン中に含まれた原子の数を該調製物中に含まれた原子の総数で除算したものであり得る。
【００３７】
優先的には、非発熱原性調製物は、１０９、１０８、１０７または１０６以下、優先的には１０４または１０３以下、最も優先的には１００、５０、１０、５もしくは１以下のＥＵまたは酸化鉄１ミリグラムあたりのＥＵまたはミリリットルあたりのＥＵまたは１ミリリットルあたりの酸化鉄１ミリグラムあたりのＥＵのエンドトキシン量によって特性評価される。
【００３８】
一実施形態では、非発熱原性調製物は、個体または動物などの生物体に投与される薬物である。これは優先的には：（ｉ）非髄腔内投与では、投与１時間あたりこの生物体の体重１キログラムあたり５ＥＵ、（ｉｉ）髄腔内投与では、投与１時間あたりこの生物体の体重１キログラムあたり０．２ＥＵより少ないエンドトキシン量を含む。
【００３９】
一実施形態では、非発熱原性調製物は医療用デバイス、特に観血的デバイスである。そこで、これは優先的には：（ｉ）該調製物が脳脊髄液と接触しない場合は該調製物１ミリリットルあたり０．５ＥＵおよび、（ｉｉ）該調製物が脳脊髄液と接触する場合は該調製物１ミリリットルあたり０．０２ＥＵより少ないエンドトキシン量、優先的には、医療用デバイスの表面で測定されるエンドトキシン量を含む。
【００４０】
優先的には、本発明による非発熱原性調製物に含まれるエンドトキシン量が、薬物、医療用デバイスまたは化粧品に適用可能な適用可能な規制基準に従う、特に薬局方、最も優先的にはヨーロッパ薬局方および／または米国薬局方に従う。
【００４１】
非発熱原性調製物は任意選択で、生物体に、以下の値：１、３０または６０秒間、１、３０または６０分間、１、１５または２４時間、１または５日間、１または４週間以上の投与時間内で投与され得る。非発熱原性調製物が生物体にこのような値以上の投与時間内で投与される場合、該調製物中に含まれたエンドトキシンの量は、同じ調製物をこのような値より少ない時間内で投与する場合より多くなり得る。
【００４２】
優先的には、該調製物中のエンドトキシンの量は、カブトガニ血球抽出液での試験（ＬＡＬ）によって測定される。当業者には理解されるように、該ナノ粒子が、特に回収率を測定することによる試験を妨害しないことを確実にすることが好まれる。この率はＣ全／Ｃ１＋Ｃ２と等しいと定義され得、ここで、Ｃ全は、合成ナノ粒子を既知量、例えば０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンと混合した懸濁液のエンドトキシン濃度である。この例では、Ｃ１は、合成ナノ粒子の異なる懸濁液中のエンドトキシンの濃度であり、Ｃ２＝０．５ＥＵ／ｍＬである。この回収比が１０または３０以上、優先的には５０、１００または１５０％である場合、妨害はないとみなされ得る。
【００４３】
本発明による調製物の発熱原性は、特に、米国薬局方またはヨーロッパ薬局方のＩＳＯ  １０９９３−１１，第１５１章によるウサギ発熱原性試験によって評価され得る。この試験は、該調製物を１匹または数匹、優先的には３匹のウサギに、優先的には、典型的には（必ずしもそうとは限らないが）１ｍｇ以上の合成ナノ粒子量を用いて静脈内投与することにより行なわれ得る。特に、該調製物が医療用デバイスである場合、かかる量は好適であると思われ、それは、合成ナノ粒子１ｍｌまたは１ｍｇあたり、特にＩＳＯ  １０９９３−１２規格によって推奨される６ｃｍ２より大きいためである。実際、一辺が５０ｎｍである立方体の合成ナノ粒子の表面が１５．１０−１１ｃｍ２であること、および主としてマグヘマイトで構成された１ｍｇの合成ナノ粒子が１．６  １０−１２個の合成ナノ粒子を含むことを考慮すると、１ｍｇの合成ナノ粒子は、６ｃｍ２より大きい９４ｃｍ２の表面積を有すると推定され得る。次いで、該調製物に発熱原性がないことを、３匹のウサギの体温上昇の和（これは、ヨーロッパ薬局方に基づいて、１０、５、２もしくは１℃、優先的には２．６５℃を超えてはならない）を測定すること、または各ウサギの対応上昇（これは、米国薬局方に基づいて、もしくは１つ以上の薬局方、特にヨーロッパ薬局方および米国薬局方の推奨に従って、１０、５、２、１もしくは０．１℃、優先的には０．５℃を超えてはならない）を測定することのいずれかによって実証する。
【００４４】
優先的には、本発明による調製物は非発熱原性または非免疫原性である。特に、免疫原性または発熱原性は、非鉱物の生物学的物質、脂質、タンパク質、酵素、ＤＮＡまたはＲＮＡ（このような物質が、ヒトとは異なる生存生物体によって生成されるものであれ、少なくとも一部がヒトにより合成されたものであれ）によって引き起こされ得る。
【００４５】
優先的には、本発明による調製物は、含まれる生物学的分子、例えば、タンパク質、脂質、酵素、ＤＮＡまたはＲＮＡが１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１または１個未満である場合、非発熱原性または非免疫原性である。
【００４６】
一実施形態では、本発明による調製物は、それ自体が免疫機構の有意な応答を誘導しない場合、すなわち、有意な薬学的または医学的活性を有していない場合、特に、該調製物それ自体がなんら抗腫瘍活性を有していない場合、非発熱原性または非免疫原性とみなされ得る。当業者には理解されるように、該調製物は、放射線、例えば磁場、優先的には交流磁場の印加に曝露されると、薬学的または医学的活性、例えば抗腫瘍活性を有し得る。
【００４７】
一実施形態では、該調製物、合成ナノ粒子、その中心部分および／または被覆は、非発熱原性であり免疫原性であり得るか、または非発熱原性であり非免疫原性であり得る。発熱原性は、エンドトキシンによって引き起こされる免疫原性であるとみなされ得る。
【００４８】
優先的には、本発明による合成ナノ粒子は、有する凝集が低レベルであり、所与の媒体中、優先的には、該調製物中および／または投与対象の生物体内で均一な分布を有する。この均一な分布は：（ｉ）この媒体の０．１、１、５、１０、２５または５０％におけるこの合成ナノ粒子の存在、ここで、このパーセンテージは、合成ナノ粒子が占める容量を、媒体とみなされる総容量で除算したものと定義され得る、（ｉｉ）合成ナノ粒子の沈降が１時間を過ぎてから、優先的には１週間を過ぎてから、最も優先的には１５日間を過ぎてから起こること、（ｉｉｉ）合成ナノ粒子の沈降が、生物体において該調製物の投与時間より長い時間を過ぎてから起こることによって特性評価される。合成ナノ粒子の沈降は、優先的には液体中で沈降し、光学顕微鏡または分光計測（特に吸光度による）によって裸眼で視認可能な凝集体の存在によって示され得る。
【００４９】
優先的には、本発明による合成ナノ粒子は懸濁液中において安定であるか、または本発明による調製物が安定である。安定性は、合成ナノ粒子が沈降せずに懸濁液中に留まることができる能力と定義される。安定性は特に、合成ナノ粒子に吸収される（典型的には４００ｎｍ〜６００ｎｍ、最も典型的には４８０ｎｍの）波長、１、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、６００または８００ｎｍ、１、５または１０μｍより長い波長、１０、５または１μｍ、８００、６００、５００、４５０、４００、３００、２００、１００、５０または１ｎｍより短い波長での経時的な吸光度の測定、優先的には吸光度の差の測定によって測定され得る。優先的には、安定性は、合成ナノ粒子の懸濁液の光学密度または吸光度が５０、２５、１０、５、２、１または０．１％より大きく低下しないようなものであり、ここで、この低下パーセンテージは［ａｂｓ（ｔ０）−ａｂｓ（ｔ）］／ａｂｓ（ｔ０）であると定義され得、ここで、ａｂｓ（ｔ０）およびａｂｓ（ｔ）は、それぞれ測定の開始時および終了時に測定された吸光度である。特に、この低下は、１．５、１５、２５、４５または６０秒間、２、５、１０、３０、４５または６０分間より長い時間、２、５、１０、５０、１００または１０００回、合成ナノ粒子の懸濁液を生物体に投与するために必要とされる回数、経時的に測定され得る。これは、該調製物作製直後、該調製物作製の数日、数週間、数ヶ月、数年後に測定してもよい。これは、優先的には、特に超音波処理、振動、アジテーションによる該調製物の均一化後に測定される。
【００５０】
一実施形態によれば、本発明による調製物は、０．０１、０．０５、１、５、１０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００または９００ｍｇ／ｍＬ、１、２、５または１０ｇ／ｍＬより高い合成ナノ粒子の鉄濃度で安定である。
【００５１】
一実施形態では、合成ナノ粒子は分布の均一性、安定性を有するものであり、これ（ら）は、生存生物体、優先的には走磁性細菌から抽出される合成ナノ粒子のものより大きいか、または該合成ナノ粒子の中心部分もしくはＳＰＩＯＮもしくはＦＩＯＮのものより大きい。
【００５２】
一実施形態では、合成ナノ粒子は：
−その中心部分と共通の特性、優先的には、特性（α）、（β）、（χ）、（δ）、（η）（５〜６頁参照）、
−その中心部分および／または被覆のサイズよりも０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４  ５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、７５、１００、２５０または５００ｎｍ、１、５、１０、５０または１００μｍ大きいサイズ、
−等電点、特に、その中心部分および／または被覆のものと異なる等電点、
−ゼータ電位、電荷、表面電荷、特に、その中心部分および／または被覆のもの（１つまたは複数）と異なるこれらの３つのパラメータのうちのいずれかおよび／またはｐＨの関数としての変動、
−その中心部分および／または被覆のものより低い、より高いまたは同程度の非発熱原性、
を有するものであり得る。
【００５３】
一実施形態では、本発明による被覆は、合成ナノ粒子の物質への付着に有利であり、毒性を制限することが可能であり、特定の組織化、例えば：（ｉ）鎖状配列、すなわち、一体に連結された少なくとも２つの合成ナノ粒子の配列、場合によっては、このようなナノ粒子の結晶軸または力線の整列、（ｉｉ）幾何的形態の配列、（ｉｉｉ）規則正しく、幾何的パターン、例えば円形、長方形、ひし形、正方形、楕円（ｅｃｌｉｐｓｅ）形の存在によって特性評価されるものをもたらす。かかる組織化は、ＴＥＭ測定によって、特に、集合状態の合成ナノ粒子の配列を観察することができる適当な濃度の合成ナノ粒子の調製物の液滴を成膜させることによって強調表示され得る。
【００５４】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子の中心部分を合成する生物体に由来するものではなく、これにより、特に、該被覆の構造または組成が既知、単純、同定可能または容易に特性評価可能な場合、特性評価が容易になり得る。
【００５５】
一実施形態では、該被覆は非発熱原性物質である。
【００５６】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子の中心部分との弱い相互作用または共有結合を確立することができる少なくとも１種類の化合物、特に酸化鉄を含む。
【００５７】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子の中心部分上に化学吸着または物理吸着され得る少なくとも１種類の化合物を含む。
【００５８】
一実施形態では、該被覆は、該中心部分のＦｅ２＋またはＦｅ３＋イオン、ヒドロキシルＯＨ−、オキシドＯ２−、結晶欠陥（これらは、合成ナノ粒子の中心部分内に存在していても、該中心部分の表面上に存在していてもよい）との相互作用または結合を確立することができる少なくとも１種類の化合物を含む。一実施形態では、該被覆は、少なくとも１種類の化合物、原子、イオンまたは化学的官能部、例えば酸、カルボン酸、リン酸もしくはスルホン酸官能部を含むものであり、ここで、該被覆中に含まれる該化合物、原子またはイオンは、該中心部分または該中心部分の少なくとも１個の原子、該中心部分の化学的官能部、該中心部分のイオン、例えばＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、ヒドロキシルＯＨ−、オキシドＯ２−もしくは該中心部分の結晶欠陥との相互作用または結合を確立することができる。
【００５９】
該中心部分の原子、化学的官能部またはイオンは、合成ナノ粒子の中心部分内に存在していても、中心部分の表面上に存在していてもよい。
【００６０】
一実施形態では、該被覆は、ＳＰＩＯＮまたはＦＩＯＮよりも合成ナノ粒子での方が良好な加熱特性をもたらす化合物から選択される。したがって、該被覆は、良好な熱伝導体である物質を含むことが好ましい。
【００６１】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子に対する放射線または磁場、例えば交流磁場の効果に有利な、このような合成ナノ粒子同士の組織化特性または集合特性をもたらす化合物から選択される。放射線または磁場の効果は、特に、このようなナノ粒子の運動、振動、回転または変形であり得る。
【００６２】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子の中心部分の平均直径より小さい厚さ、該直径の半分、４分の１より小さい厚さ、１０、５、２．５または１μｍ、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１または０．５ｎｍ未満の厚さを有する。かかる厚さでは、特に、毒性を制限することが可能になり得る。
【００６３】
一実施形態では、該被覆は、典型的には合成ナノ粒子の中心部分の平均直径より大きい厚さ、この直径の２分の１、４分の１より大きい厚さ、０．１、０．５、１、２、４、８、１０、１５、２０または２５ｎｍより大きい厚さを有する。かかる厚さでは、特に、合成ナノ粒子を一体に連結させること、または凝集体の形成を抑制することが可能になり得る。好都合には、充分に厚い被覆の存在により、特に、合成ナノ粒子が互いに最密状態になった場合に互いに影響を及ぼし、その強度が最高になる磁力効果の下において、このような合成ナノ粒子が互いに固着するのを抑制することが可能になる。
【００６４】
一実施形態では、該被覆の厚さの差のパーセンテージは、該調製物中の合成ナノ粒子（１個または複数）において特にＴＥＭを用いて測定され得る該被覆の最小の厚さを最大のもので除算したものと定義される。第１の場合では、該被覆の厚さは均一である。そのときの厚さの差のパーセンテージは優先的には１０６、１０５、１０４、１０３、５００、１００、５０、１０、５、１または０．１％未満である。均一な厚さにより、特に、合成ナノ粒子の均一な分布が可能になり得る。第２の場合では、該被覆の厚さは不均一である。そのときの厚さの差のパーセンテージは０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５または１０６％より大きい。不均一な厚さにより、特に、種々の強さの磁力の分布がもたらされ得る。
【００６５】
一実施形態では、該被覆は、該合成ナノ粒子の中心部分の１、２、５、１０、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６倍以下の鉄含量を有する。
【００６６】
別の実施形態では、該被覆は、鉄および酸素以外の少なくとも１種類の原子において、合成ナノ粒子の中心部分の１、２、５、１０、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６倍以上の含量を有する。
【００６７】
一実施形態では、該被覆は、合成ナノ粒子の表面において、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１、１、５、１０、２０、５０または１００％より大きい表面張力の差を誘導する界面活性剤であり、ここで、このパーセンテージは、ＴＳ（ＣＰ）−ＴＳ（ＳＮ）／ＴＳ（ＣＰ）であると定義され、ここで、ＴＳ（ＣＰ）およびＴＳ（ＳＮ）は、それぞれ該中心部分および合成ナノ粒子の表面張力である。一実施形態では、該被覆は炭素化合物を含む。
【００６８】
一実施形態では、該被覆は、キレート剤、両親媒性分子、分極または荷電ポリマー、金属酸化物または酸化ケイ素、金属またはケイ素の水酸化物、酸、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体、およびこれらの化合物または誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む。
【００６９】
一実施形態では、該被覆は、多糖、脂肪酸、リン脂質、アミノ酸のポリマー、高分子または非高分子シリカおよび脂肪族アミンポリマー、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体、ならびにこれらの化合物または誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む。
【００７０】
一実施形態では、該被覆は、細菌起源、細胞起源もしくは生物学的起源のリン脂質もしくはタンパク質もしくはＲＮＡもしくはＤＮＡもしくは化合物または走磁性細菌に由来する化合物を含まない。
【００７１】
一実施形態では、該被覆は、リン酸、カルボン酸、スルホン酸、エステル、アミド、ケトン、アルコール、フェノール、チオール、アミン、エーテル、スルフィド、酸無水物、ハロゲン化アシル、アミジン、ニトリル、ヒドロペルオキシド、イミン、アルデヒド、ペルオキシド、これらの化合物の酸性、塩基性、酸化型、還元型、中性、正電荷を有する、負電荷を有する誘導体、およびこれらの化合物またはその誘導体のいくつかの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの官能部を含む。
【００７２】
一実施形態では、本発明による被覆は、滅菌可能な物質（優先的には、オートクレーブ処理によって）、生体適合性で生分解性の物質（これは、代謝的、免疫学的、細胞毒性的、薬理学的効果を誘導せず、静脈内および／または免疫学的経路によって投与され得る）から選択される。かかる物質はポビドン、ＰＥＧ４００、ポロキサマー１８８、デキストラン、ホスファチジルコリン、ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、またはこれらの物質の誘導体であり得る。
【００７３】
被覆の型は、以下のパラメータ：
（ｉ）合成ナノ粒子の投与経路：例えば、静脈内投与では、マクロファージが合成ナノ粒子、例えばＰＥＧまたはデキストランを捕捉するのを抑制することを可能にする被覆が最終的に選択され得る、
（ｉｉ）細胞内への内在化：これを補助するため、正電荷を有する被覆（ポリ−Ｌ−リシンなど）が「最終的に」選択され得る、
に従って選択され得る。
【００７４】
一実施形態では、本発明による調製物は薬物または診断用薬剤として、特に、例えば磁気温熱療法が使用される腫瘍の処置の状況において使用され得る。
【００７５】
一実施形態では、この調製物を用いた医学的、獣医学的または化粧的介入または操作は、以下のシーケンスのうちの少なくとも１つを、優先的には、表示した時系列順で伴う：
（ｉ）特に、局所経路、経粘膜皮膚、経腸、非経口、腫瘍内、静脈内または動脈内による生物体への該調製物の投与、
（ｉｉ）生物体の一部分、例えば器官、腫瘍、血管への合成ナノ粒子の標的化、
（ｉｉｉ）該生物体の該一部分の処置または検出。
【００７６】
一実施形態では、本発明による調製物は化粧料用途のために使用され得る。
【００７７】
一実施形態では、本発明による調製物は、走磁性細菌から抽出されたマグネトソーム鎖を含む懸濁液が投与され得る最大濃度よりも高い濃度で、優先的には鉄が１４ｍｇ／ｍＬの濃度で投与される。また、０．０１、０．０５、１、５、１０または１５ｍｇ／ｍＬ以上、優先的には２５、５０、１００または１５０ｍｇ／ｍＬ、最も優先的には２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００または９００ｍｇ／ｍＬ、１、２、５または１０ｇ／ｍＬ以上の鉄濃度で投与してもよい。これは、走磁性細菌から抽出されたマグネトソーム鎖および／またはＳＰＩＯＮおよび／またはＦＩＯＮと比べて合成ナノ粒子の可溶性が大きいこと、または沈降が遅いことによって可能となり得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明による調製物は、１ｋｇ／ｍＬ、５００、２５０、１００、５０、１０、５、２または１ｇ／ｍＬ以下、優先的には９００、７００、５００または４００ｍｇ／ｍＬ以下、最も優先的には３００、２００、１５０、１００、１０、１または０．１ｍｇ／ｍＬ以下の鉄濃度で投与され得る。
【００７９】
一実施形態では、処置は、一般的に磁気温熱療法と称される手法である交流磁場の印加によって行なわれ得るとともに、検出は特に、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって行なわれ得る。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、有効成分として上記の調製物および任意選択で、少なくとも１種類の薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物または医薬用薬物に関する。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、本発明による調製物を備えた医療用デバイスに関する。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、本発明による調製物を含む診断用組成物に関する。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、化粧料有効成分として本発明による調製物を含む化粧料組成物に関する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、治療活性量の本発明による調製物を投与する、個体または動物の腫瘍の処置方法に関する。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、以下のシーケンス：
（ｉ）主として酸化鉄で構成された結晶化鉱物の中心部分と生物学的周囲被覆とを含む、生存生物体によって合成されるナノ粒子の調製物から、該鉱物中心部分を単離すること；
（ｉｉ）得られた調製物を、該中心部分が周囲被覆で覆われるように処理すること；
（ｉｉｉ）任意選択で、該調製物を、優先的にはシーケンス（ｉ）の後、場合によってはシーケンス（ｉｉ）の後に滅菌すること
を含む、上記の調製物の製造方法に関する。
【００８６】
一実施形態では、マグネトソームの中心部分は、この中心部分に属していない化合物（１種類もしくは複数種）または物質（１種類もしくは複数種）で囲まれているか、または囲まれていない。
【００８７】
一実施形態では、処理されたマグネトソームは、処理を受けた、特に細菌による発酵のシーケンス後のマグネトソームに関連する。
【００８８】
一実施形態では、シーケンス（ｉ）および／または（ｉｉ）は以下のことを伴うものであり得る：
（ａ）その目的が特に化学的方法によってマグネトソームの中心部分の周囲の物質の全部または一部を除去することである化学的精製プロセス（前記化学的精製プロセスと称する）。これは、シーケンス（ｉ）または（ｉｉ）の任意の懸濁液を化学溶液と混合することからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｉｎ）ものであり得、前記化学溶液は、優先的には０．００１、０．０１、０．１、１、１０または１００μＭ、１、１０または１００ｍＭ、１Ｍより高い濃度、優先的には１０００、１００、５０、１０、５、２または１Ｍ、５００、１００、５０、１０、５または１ｍＭ、１００、５０、１０、５または１μＭより低い濃度と指定される。この化学溶液は、低浸透圧溶液、溶解バッファー、マグネトソームを特定の表面から脱着または剥離するための溶液、マグネトソームの中心部分内または該中心部分の表面上に存在しているものでないすべての物質、特に有機物質を除去するための溶液、デタージェントのいくらかの残留物を除去するための溶液であり得る。この化学溶液は以下の化学物質を含むものであり得る：（ｉ）化学的変性剤、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは中性、酸性もしくは塩基性ｐＨの溶液、（ｉｉ）有機溶媒、例えば、トルエン、エーテル、アルコール、フェニルエチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベンゼン、メタノール、クロロホルム、（ｉｉｉ）カオトロピック剤、例えば、尿素、フェノール、グアニジン、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム（ｇｕａｎｄｉｎｉｕｍ）、これらは特に、水の構造を変更することによって疎水性化合物を水溶液にすることができる、（ｉｖ）キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（ｖ）脱パイロジェンに使用される物質、例えば、水酸化ナトリウム、尿素、過酸化水素（エンドトキシンを除去または中和することを可能にする）、（ｖｉ）抗生物質、例えば、チオニン、（ｖｉｉ）界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊ、Ｄｕｐｏｎａｌ、（ｖｉｉｉ）還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオグリコレート、βメルカプトエタノール（これらは、特に、結合またはジスルフィド結合の破壊が可能になり得る）、（ｉｘ）デタージェント、疎水性炭化水素基と電荷を有する親水性の先端部とを有する化合物、（ｘ）界面活性剤。中でも、使用され得るデタージェントは、イオン系、陽イオン系または陰イオン系デタージェント、非イオンデタージェント、両性イオンデタージェント、カオトロープ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デゾキシコレート、コレート、Ｔｒｉｔｏｎ、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｎ−ドデシル１β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ジギトニン、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、尿素、グアニジン塩酸塩、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）である。また、前記化学溶液は、水または前述の化学物質（１種類もしくは複数種）の任意の誘導体（１種類もしくは複数種）を含むものであってもよい；
（ｂ）その目的が特に生物学的プロセスによってマグネトソームの中心部分の周囲の物質の全部または一部を除去することである生物学的精製プロセス（前記生物学的精製プロセスと称する）。これは特に、生存生物体またはかかる生物体に由来する物質、例えば酵素、特に、溶菌酵素、ファージ、タンパク質、例えばプロテアーゼもしくはマンナーゼを伴うものであり得る；
（ｃ）化学的被覆プロセス、該化学的被覆プロセスは、マグネトソームの中心部分を含む懸濁液を、マグネトソームの中心部分の被覆に使用される任意の物質または物質の組合せと混合することからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｉｎ）ことであるものがそのように称され、ここで、前記物質（１種類または複数種）は前記被覆物質（１種類または複数種）のことである；
（ｄ）シーケンス（ｉ）もしくは（ｉｉ）において得られた任意の懸濁液を、特に１０、２５、５０、１００、１５０、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００もしくは５０００℃以上の温度勾配に曝露すること、および／またはシーケンス（ｉ）および／または（ｉｉ）において得られた任意の懸濁液を、優先的には１００、５０、１０、０、−１０、−４０、−７０、−７７、−１５０、−２５０℃、５０、３０、１０もしくは１Ｋ以下である温度、優先的には１、５、２５、５０Ｋ、−２５０、−７０、−７７、−５０、−２０、０、５、２０、４０、１００、２００、５００、１０００、２０００、４０００もしくは５０００℃以上である温度にすることからなる熱的プロセス（前記熱的プロセスと称する）；
（ｅ）シーケンス（ｉ）および／または（ｉｉ）において得られた任意の懸濁液に：（１）圧力、優先的には１、１０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９気圧より高い、優先的には１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、５００、１００、１０または１気圧より低い、特に、機器、例えば、高圧ホモジナイザー、フレンチプレス、破壊ボムまたはボールミルを使用することにより、（２）超音波処理、特に、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、４０、１００、５００または１０００ワットより大きな出力で、１０００、５００、１００、４０、２０、１０、７、５、２、１、０．５、０．１または０．０１ワットより小さな出力で、ここで、超音波処理の時間の長さは、優先的には１、２、５、１０、２０、３０、４５または６０秒間より長い、２、５、１０、２０、３０、４５、６０または１２０分間より長い、２、３、４または５時間より長い、優先的には６０、３０、１５、５または１分間より短い、６０、４５、３０、１５、１０または１秒間より短い、（３）照射（特に電離放射線を使用）を適用することからなる機械的プロセス（前記機械的プロセスと称する）；
（ｆ）マグネトソームの中心部分または処理したマグネトソームを、シーケンス（ｉ）または（ｉｉ）の任意の懸濁液に含まれた磁性がないかもしくは低い物質（細菌残屑であると定義する）、非溶解細菌、溶存鉄、溶存マグネトソームまたは任意の物質（含まれるマグネトソームがないかもしくは量が少ない、優先的には、調製物１ミリリットルあたり１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２または１０個未満のマグネトソーム）から単離することからなる磁気的選択のプロセス（前記磁気的選択プロセスと称する）。この目的のため、磁場勾配がシーケンス（ｉ）または（ｉｉ）の任意の懸濁液に対して印加され得、このとき、かかる懸濁液は優先的には、優先的にはガラスまたは修飾されたマグネトソームもしくはマグネトソームの中心部分を吸着しない材質で構成された容器内、例えば、チューブまたはボトル内に入れられる。この磁場勾配により特に磁性物質、優先的にはマグネトソームの中心部分または修飾されたマグネトソームが磁場の最も強い領域に向かって、例えば容器の壁に向かって移動し、これらをこの領域に濃縮させ、したがって単離することが可能になる。この磁場勾配は優先的には、地球の磁場の強さより強度が大きく、０．１、１、１０または１００μＴ、０．１、１、１０または１００ｍＴ、０．１、１、１０、５０または１００Ｔである。これは、特に、磁性物質、例えばマグネトソームの中心部分または修飾されたマグネトソームが、磁性がないか、または低い物質から分離されることが可能であるのに充分な強度である。この磁場勾配は優先的には、１００または５０Ｔ、最も優先的には５または１Ｔ、１００、５０、１０または１ｍＴより低い強さである。特に、これは、磁性がないか、または低い物質を誘引することが回避されるのに充分に低い強さのものであり得る。かかる磁場勾配は磁石によって、例えば、ネオジム磁石、電磁石または強度が優先的には空間的および／または時間的に変化する磁場を発生させることができる任意の機器もしくは物質によって印加され得る。磁場勾配は、１．５、１０、３０、４５または６０秒間、５、１０、３０、４５または６０分間、２、５、１０、１５または２０時間、１、２または５日間、１、２、３または４週間、２、４または６ヵ月間より長い間、印加され得る。磁場勾配の印加後、懸濁液の上清みは、マグネトソームの中心部分または修飾されたマグネトソームを含まないか、または少量で含み、除去され、優先的には非発熱原性の物質で、例えば溶媒、例えば非発熱原性の水と交換され得る；
（ｇ）プロセス中に、マグネトソームの中心部分または修飾されたマグネトソームが細菌残屑から、特に、細菌残屑の通過は可能であるがマグネトソームの中心部分の通過は可能でないか、またはマグネトソームの中心部分の通過は可能であるが細菌残屑の通過は可能でないかのいずれかであるサイズの細孔を有するカラムを有するタンジェンシャルフィルトレーションシステムを使用することにより単離され得る別の選択プロセス（前記別の選択プロセスと称する）。このサイズはとりわけ、１００、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０２、０．０１、０．００５または０．０００１μＭより小さい。このサイズは優先的には０．０２μｍ〜２μｍ、優先的には０．２μｍ〜１μｍ、最も優先的には０．２μｍ〜０．４μｍであり得る；
【００８９】
一実施形態では、シーケンス（ｉ）の前に、マグネトソームを合成する生存生物体、例えば走磁性細菌の培養のシーケンスが行なわれる。
【００９０】
一実施形態では、生存生物体の培養シーケンスは、完全に制御されていない条件下、例えば、ボトル内での走磁性細菌ＡＭＢ−１の培養条件下で行なわれる。
【００９１】
別の実施形態では、生存生物体の培養のシーケンスは制御された条件下、例えば、発酵槽内でのＭＳＲ−１走磁性細菌の培養条件で行なわれ、これは：（ａ）細菌の増殖中、増殖培地のｐＨを一定に維持するための鉄含有酸性栄養溶液、および（ｂ）細菌の増殖中、この増殖を増進させるための空気供給、この間、マグネトソームの合成を可能にするために培養培地の酸素濃度を低値に、優先的には２０ｍｂａｒ未満、最も優先的には２ｍｂａｒ未満に維持することを伴う。
【００９２】
一実施形態では、シーケンス（ｉ）は、優先的には（必ずしもそうとは限らないが）互いに表示した順に従う３つのシーケンス：（ｉ１）走磁性細菌の溶解、（ｉ２）マグネトソームの中心部分の一部ではなく、ｉ１で除去され得なかった物質、特に有機物質の除去、（ｉ３）マグネトソームの中心部分を含む懸濁液の回収および洗浄に細分される。これらのシーケンスはすべて、前記のプロセス（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せを用いて、１回または数回反復して行なわれ得る。
【００９３】
一実施形態では、シーケンス（ｉ１）は、特に１０００〜１００００ｇで遠心分離することおよび／または前記別の選択プロセスを使用すること、優先的には、タンジェンシャルフィルトレーションシステム（ここで、孔のサイズは走磁性細菌のサイズより小さい）を使用することによる走磁性細菌の濃縮から開始され得る。このシーケンスの終了時の細菌の濃度は、（ｉ１）の開始時に測定された細菌濃度よりも１．１〜１０４倍高いものであり得る。次いで、走磁性細菌（濃縮または非濃縮）が溶解され得る。溶解は、浸透圧ショックにより、前記化学溶液が優先的には溶解バッファーである前記化学的プロセスを用いて行なわれ得る。これは、細菌容量よりも大容量、優先的には細菌容量ライセートの２〜１００倍、最も優先的には細菌容量の４倍の溶解バッファーを添加することにより行なわれ得る。このシーケンスの終了時、処理したマグネトソームの懸濁液は、細菌から抽出されたものであり、細菌残屑および場合によっては一定量の非溶解走磁性細菌と混合状態である。
【００９４】
別の実施形態では、シーケンス（ｉ２）は、残留物質、特に有機物質を除去するために（ｉ１）の終了時に得られたマグネトソーム懸濁液を、優先的には前記化学溶液を用いて、優先的にはデタージェント、例えばフェノールまたはジクロロメタンを用いて処理し、処理したマグネトソームの周囲の膜または物質、特に有機物質が除去されることを可能にすることからなる。
【００９５】
別の実施形態では、シーケンス（ｉ３）は、（ｉ２）で得られた懸濁液を数回洗浄し、デタージェントに由来するすべての残渣を除去すること、およびマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を得ることからなる。
【００９６】
一実施形態では、シーケンス（ｉｉ）は、マグネトソームの中心部分を、優先的には非発熱原性の被覆で覆うことからなる。これは、前記化学的被覆プロセスを用いて、特に、（ｉ３）の終了時に得られたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を、該被覆を含む懸濁液と混合することにより行なわれ得る。この混合は、均一化、超音波処理（優先的には５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５、２または１ワット未満の低出力超音波処理、特に、超音波処理フィンガーまたは超音波処理浴を使用する）、撹拌、加熱、放射線によって行なわれ得、かくして、該被覆がマグネトソームの中心部分の表面に付着または付随することが可能になる。混合は、中性、酸性または塩基性のｐＨで、優先的には、被覆とマグネトソームの中心部分間の結合をもたらす化学的相互作用および／または化学反応を増進させることが可能なｐＨで行なわれ得る。使用される被覆の質量は優先的にはマグネトソームの中心部分の質量の１０００分の１倍から１０００倍、優先的にはこの質量の１００分の１倍から１００倍、最も優先的にはこの質量の１０分の１倍から１０倍である。シーケンス（ｉｉ）の終了時、非発熱原性被覆で覆われたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液が得られる。
【００９７】
一実施形態では、シーケンス（ｉ３）の終了時に得られたマグネトソームの中心部分は、優先的には、この中心部分を変性させない方法、例えばオートクレーブ処理を用いて滅菌される。次いで、シーケンス（ｉｉ）の終了時に非発熱原性調製物を得るために、シーケンス（ｉｉ）が優先的には滅菌環境で行なわれる。
【００９８】
一実施形態では、シーケンス（ｉｉ）の終了時に得られた懸濁液は、優先的には、被覆およびマグネトソームの中心部分を破壊しないγ線などの方法を用いて滅菌される。
【００９９】
一実施形態では、マグネトソームの被覆された中心部分を含む懸濁液が得られる収率は、この懸濁液中に含まれた鉄の量を、溶解シーケンス前の走磁性細菌懸濁液中に含まれた最初の鉄の量で除算したと概算される。この収率は優先的には、１、２、５、１０、２５、５０、７５％より大きくまたは１００％である。この収率は、前記のプロセスのいくつかを互いに組み合わせること、および／または前記のプロセスの１つまたはそれ以上を繰り返すことにより最適化され得る。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
実験による実施例：
表の説明：
表１および２：
ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈ、全菌体、非被覆マグネトソームの中心部分、ポリ−Ｌ−リシン、キトサン、カルボキシ−メチル−デキストラン、クエン酸、オレイン酸、シリカ、葉酸、ＤＯＰＣ、アレンドロネート、ネリドロネート、ＰＥＩ、Ａｌ（ＯＨ）３で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む種々の型の懸濁液の特性、ここで、走磁性細菌の種はＡＭＢ−１およびＭＳＲ−１である。表１において：懸濁液１ミリリットルあたり鉄１ミリグラムあたりのＥＵの単位で測定したエンドトキシン濃度、４８０ｎｍで測定した１ｍｇの該種々の懸濁液の２０分後の吸光度の低下パーセンテージ、条件３に従って処理したＧＬ−２６１細胞と接触させた懸濁液での温度差（ΔＴ）およびこの差の初期傾斜（δＴ／δｔ）、磁場なし（−Ｂ）の条件１に従って処理したＧＬ−２６１細胞と接触させた懸濁液での生細胞のパーセンテージ、および磁場ありで４５℃の最大温度上昇を伴う条件２による，％生細胞（＋Ｂ）。生細胞のパーセンテージは、３７℃での、条件１または２で処理した生細胞の数を非処理生細胞数の数で除算した。ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈでの最初の試験では、生細胞のパーセンテージは、４５℃での、条件１または２で処理した生細胞の数を非処理生細胞の数で除算した。表２において：被覆厚さ（単位：ｎｍ）、等電点（単位：ｐＨ単位）、流体力学的サイズ（単位：ｎｍ）、単位：ｍＶで、ｐＨの関数として測定した、該種々の懸濁液中に含まれた被覆合成ナノ粒子または非被覆合成ナノ粒子のゼータ電位、被覆合成ナノ粒子または非被覆合成ナノ粒子中の窒素（％Ｎ）、炭素（％Ｃ）、水素（％Ｈ）、イオウ（％Ｓ）のパーセンテージ。
表３：異なる被覆での該中心部分同士の結合特性。
【０１０１】
材料および方法：
異なるナノ粒子懸濁液の鉄濃度の測定：ナノ粒子をまず１２Ｎ塩酸によって溶解させ、Ｆｅ２＋イオンを過酸化水素でＦｅ３＋イオンに酸化させる。次いで、チオシアン酸カリウムを用いてＦｅ３＋イオンを錯体化し、Ｆｅ３＋濃度を、４７６ｎｍでの錯体の吸光度を測定することにより求める。
【０１０２】
透過型電子顕微鏡使用（ＴＥＭ）：ＴＥＭは、サイズ、異なるナノ粒子のサイズ分布、ナノ粒子の被覆厚およびナノ粒子の組織の型を測定するために使用される。ＴＥＭ試験を行なうため、該異なる懸濁液をＭｉｌｌｉＱオートクレーブ処理水中で２回洗浄し、これに再懸濁させ、３００μｇ／ｍｌの鉄濃度を得る。５μｌの各懸濁液をカーボングリッドの上面に載せる。グリッドを室温で少なくとも２時間の間乾燥させ、次いでＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ＬａＢ６  ＪＥＭ−２１００）下で観察する。
【０１０３】
カブトガニ血球抽出液での試験（ＬＡＬ）：ＬＡＬ試験は、滅菌条件下で、“Ｐｉｅｒｃｅ  ＬＡＬ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”と称されるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃキット８８２８２を用いて行なう。１ｍｌの各懸濁液（超音波処理によってホモジナイズし、非発熱原性水で洗浄）をまず７０℃で１０分間、乾式浴中で加熱し、ＬＡＬ試験の結果を歪める可能性がある残留タンパク質（あれば）を変性させる。次いで、１０μｇの鉄を含む２５μｌの各懸濁液を、実験期間中を通して３７℃の温度に維持したマイクロプレートのウェル内に導入する。２５μｌのＬＡＬキット溶液を添加し、反応を開始させる。１０分間の反応後、５０μｌの発色基質をウェル内に６分間導入し、エンドトキシン量の検出を可能にさせる。最後に、２５μｌの酢酸を添加し、反応を停止させる。得られた懸濁液の光学密度を４０５ｎｍで、マイクロプレートリーダーを用いて測定する。次いで、エンドトキシン濃度を、キットに備えられた標準範囲を用いて推定する。ＬＡＬ試験がナノ粒子に干渉していないことを確認するため、Ｃ全／Ｃ１＋Ｃ２であると定義される回収率を測定する。ここで、Ｃ全は、既知量０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンと混合されたナノ粒子懸濁液のエンドトキシン濃度であり、Ｃ１は、異なるナノ粒子懸濁液中のエンドトキシンの濃度であり、Ｃ２＝０．５ＥＵ／ｍＬである。異なる測定において推定される回収率は５０％より大きく、ナノ粒子がＬＡＬ試験に干渉していないことを示す。
【０１０４】
炭素、水素、窒素およびイオウ（ＣＨＮＳ）の元素分析装置：測定は、ＣＨＮＳ分析装置（Ｆｌａｓｈ  ＥＡ  １１１２  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用し、各凍結乾燥懸濁液の１０ｍｇの鉄を用いて行なうと、このような懸濁液中の炭素、窒素、水素およびイオウのパーセンテージを測定することが可能である。
【０１０５】
散乱計測：該種々のナノ粒子のゼータ電位および流体力学的サイズ（球体の場合は流体力学的直径）を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いて測定する。球体は、相関関数の漸減指数関数的プロフィールにより同定する。測定のため、ナノ粒子の懸濁液は３０μｇ／ｍｌの鉄を含むものにし、塩酸および水酸化ナトリウムの溶液を用いて２〜１２に調整したｐＨにする。
【０１０６】
吸光度の測定：該異なるナノ粒子懸濁液の吸光度の経時的な変動を４８０ｎｍで、ＵｖｉＬｉｎｅ９４００  Ｓｅｃｏｍａｍ吸光度分光光度計を用いて測定する。
【０１０７】
合成ナノ粒子の中心部分の懸濁液の鉄が１ｍｇでの第１級アミン濃度の測定：該中心部分の純度を制御するための方法は、第１級アミンと反応する特定性を有するＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼン酸スルホン酸）によるアミンの投入である。第１工程は、該中心部分の１ｍｇの鉄を０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ８．５）に添加し、次いでＴＮＢＳＡ（Ｒ’−ＳＯ３Ｈ）を添加することであり、これにより、以下の反応：Ｒ−ＮＨ２  ＋  Ｒ’−ＳＯ３Ｈ＜＝＞Ｈ２ＳＯ３  ＋  Ｒ’−ＮＨ−Ｒがもたらされる。この反応は３７℃で２時間行ない、得られた化合物は黄色であり（Ｒ’−ＮＨ−Ｒ）、そのアミン濃度を４０５ｎｍでの吸光度によって測定する。この濃度は該中心部分のものと同等である。検量線は、第１級アミン官能部を有するグリシンを用いて作成する。
【０１０８】
合成ナノ粒子の中心部分の懸濁液の鉄が１ｍｇでのホスフェート濃度の測定：該中心部分のリン酸基のアッセイは比色分析によって行なう。モリブデン酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＭｏＯ４）をまず、ホスフェート（検量のためのストック溶液（ＤＯＰＣ）由来またはアッセイ対象の試料由来、１３０℃で２時間の７０％の過塩素酸での消化後）の存在下で反応させる。モリブデン酸塩の沈殿物は黄色であり、不安定である。非常に素早くアスコルビン酸を添加し、これにより、この錯体が還元されて青色のモリブデン酸塩が得られ、これは安定な化合物であり（乾式浴中で１００℃にて５分間加熱するとこの還元が活性化される）、錯体化ホスフェートの量を８００ｎｍでの吸光度によって測定する。
【０１０９】
交流磁場の印加に曝露された、または曝露されていない該種々のナノ粒子の細胞への毒性および温度の測定：ＧＬ２６１細胞をＴ１７５フラスコ内に７０〜８０％のコンフルエンスに達するまで播種し、上清みを除去し、４ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）を細胞に添加し、細胞を５分間インキュベートし、次いで剥離する。トリプシンを３０ｍｌの細胞様培地を添加することによって失活させる。次いで、４℃で１０分間、７００ｒｐｍでの遠心分離後、細胞を１．２５  １０６個の細胞／ミリリットルの濃度まで希釈する。４００μｌの細胞をエッペンドルフチューブ内に、約５．１０＋５個の細胞／条件に達するように導入する。合成ナノ粒子の該種々の懸濁液をチューブに、鉄が１ｍｇ／ｍｌの終濃度で添加した。次いで、エッペンドルフチューブを３７℃で１０分間加熱する。３つの条件に従う。処理条件１では、チューブを、乾式加熱浴を用いて３７℃に３０分間維持する。処理条件２では、チューブを、周波数１９８ｋＨｚおよび４５℃の温度が維持されるように２３〜４６ｍＴに調整した平均強さの交流磁場を印加することにより４５℃に３０分間維持する。処理条件３では、チューブを、周波数１９８ｋＨｚおよび３２ｍＴの平均強さの交流磁場の印加に３０分間曝露する。経時的な温度変動を、エッペンドルフチューブ内に入れた熱電対プローブを用いて測定する。処理後、チューブの内容物をフラスコＴ２５内に導入し、これに６ｍｌのＲＰＭＩ培地および１０％のウシ胎仔血清を添加する。細胞を５％ＣＯ２の存在下で２４時間インキュベートする。２４時間後、トリパンブルーを用いて細胞のバイアビリティ試験を行なうと、無色の生細胞を着色された死細胞と区別することが可能になる。
【実施例１】
【０１１０】
ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈを含む懸濁液の特性評価
Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社によって化学合成された、ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈ（整理番号：１０−００−１０２）と称されるナノ粒子を試験する。この酸化鉄ナノ粒子はヒドロキシエチルデンプンによって囲まれており、１１９ｎｍの流体力学的直径を有する。これは、ｐＨ９．５の等電点、ｐＨ２での７ｍＶからｐＨ１２での−２０ｍＶまで変化するゼータ電位およびＣＨＮＳでの測定時８．７％の炭素パーセンテージを有する。ＴＥＭ測定により、該被覆の厚さを１から４ｎｍまでで推定することが可能である。１ｍｇのＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈを含む懸濁液の経時的な吸光度の差（４８０ｎｍで測定）は２０分経過時も減少しておらず、この懸濁液の安定性を示す。これらの懸濁液に対して実施したＬＡＬ試験により、エンドトキシンが低レベルである（＜５０ＥＵ／ｍｇ／ｍｌ）ことが示された。第１の一連の測定について、表１は、ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈの懸濁液とＧＬ−２６１細胞の混合物を条件３の処理に供した場合、混合物の温度が、磁場印加前の３６．５℃から３０分間の磁場印加後の４２．７℃まで６．２℃、わずかに上昇していることを示す。温度差の初期傾斜は０．００９℃／秒であると推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、表１は、生細胞のパーセンテージが７８±５％であり、磁場なしの処理条件１で得られる７１±５％と同様であることを示す。これは、４５℃まで加熱された細胞との比較により、処理条件２の存在下ではＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈによって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性が低いことを示す。第２の一連の測定において、この混合物を処理条件２に供した場合、表１は、生細胞のパーセンテージが３１％であり、磁場なしの処理条件１（このとき、このパーセンテージは３７℃における生細胞の数との比較により推定される）で得られる８６％より低いことを示す。これは、３７℃まで加熱された細胞と比べて、条件２による処理の存在下ではＢＮＦ−ＳｔａｒｃｈによってＧＬ２６１細胞に対して細胞毒性が誘導されることを示す。
【実施例２】
【０１１１】
菌株ＡＭＢ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖
調製：Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ＡＭＢ−１菌（ＡＴＣＣ，菌株７９０２４）をまず、走磁性細菌の増殖とマグネトソームの生成に必要な栄養分と添加剤を含む滅菌培養培地（培地ＡＴＣＣ  １６５３）中に導入し、次いで、この培地を３０℃のインキュベータ内に７日間入れる。７日後、培地を遠心分離し、菌体ペレットを洗浄し、走磁性細菌を、磁石を使用することによって濃縮し、１ｍＬのＴＲＩＳ  ０．０５Ｍを入れたチューブ内に導入し、３０℃、０℃で２時間、超音波処理フィンガーを用いて超音波処理し、次いで、磁石を用いて滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）水で１７回洗浄する。走磁性細菌から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含む懸濁液が得られる。
【０１１２】
特性評価：ＴＥＭ測定により、この懸濁液中に、５０〜８００ｎｍの長さ、５ｎｍ〜６０ｎｍのマグネトソームサイズを有するマグネトソーム鎖の存在が示された。被覆の厚さは１〜５ｎｍである。１ｍｇの鉄を含むこの懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分後、３０％低下しており、これは、この懸濁液の沈降が少ないことを示す。この鎖の光散乱計測により３つの鎖集団の存在が示され、流体力学的サイズ（ＨＳ）１７６ｎｍを有するものが５％、ＨＳ  ９８６ｎｍを有するものが８１％、およびＨＳ  ４３６３ｎｍを有するものが１４％である。これらは、ｐＨ４．２の等電点、ｐＨ２での２０ｍＶからｐＨ１２での−３８ｍＶまで変化するゼータ電位を有する。ＣＨＮＳ分析により、この鎖において１３．９％の炭素パーセンテージが示される。この懸濁液のエンドトキシン濃度（ＬＡＬ試験によって測定）は、高値の１８，０００〜１５０，０００ＥＵ／ｍｌ／ｍｇ酸化鉄である推定された。また、エンドトキシンの存在は、フーリエ変換赤外線吸収の測定（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＦＴ−ＩＲモデル３８０分光計を使用）によっても示唆された。このスペクトルは１２５０ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１におけるピークの存在を示し、これらは、リポ多糖とリン脂質のリン酸基の振動に起因するものであり得る。第１の一連の測定では、ＡＭＢ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は、磁場印加前の３６℃から３０分間の磁場印加後の５６．５℃まで２０．５℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０４３℃／秒と推定される。この温度上昇は、ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈで観察されるものより大きい。第２の一連の測定において、この混合物を磁場の存在下の処理条件２に供した場合、表１は、生細胞のパーセンテージが低値の１０％であり、磁場なしの条件１の処理で得られた５５％よりも低いことを示す。これは、条件１および２での処理の存在下で、この発熱原性マグネトソームによって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示し、条件１（磁場なし）よりも条件２（磁場の存在下）の方が、細胞毒性が高い。
【０１１３】
マウスの脳に移植したＵ８７−Ｌｕｃ腫瘍に対する抗腫瘍有効性：有効性の実験を、Ｕ８７−Ｌｕｃ脳内腫瘍を増殖させた（１〜２９ｍｍ３の体積）１０匹のマウスの７つの群において行なった。この実験中、マウスには、有効な手順に従って給餌し、随意に水分摂取させる。動物の一般健康状態を毎日モニタリングし、マウスを２日毎に体重測定し、１５％より大きい体重減少、痛みの徴候、普通でない姿勢が観察されたとき、安楽死させる。７つの異なる群のマウスに、Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞の注射後８日目、腫瘍細胞の注射部位（２．２．０）に：２μＬの０．９％ＮａＣｌ（第１群と第２群）；２μＬのマグネトソームの懸濁液、マグヘマイトは２０ｍｇ／ｍＬ（第３、４および５群）；２μＬのＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈの懸濁液、マグヘマイトは２０ｍｇ／ｍＬ（第６群と第７群）の溶液を投与した。Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞の注射後８日目、第１、２、３、４、５、６および７群の平均腫瘍体積はそれぞれ、２９、１０、５、３、２５、１０および２ｍｍ３である。第２、４、５および７群のマウスを週に３回、５週間、平均強さ２５ｍＴおよび周波数１９８ｋＨｚの交流磁場に３０分間曝露する。組織学的試験を第４群のマウスに対して行ない、マグネトソーム鎖の投与後１５０日目に腫瘍が完全に消失しているかどうかを調べる。組織学的検査で試験する組織は、安楽死させたマウスから採取し、脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、２ｍｍ厚の横断薄片に切断し、３μｍ厚のパラフィンブロック中に含め、ガラススライド上に集め、次いで、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、健常領域と腫瘍領域を識別する。最後に、異なる処置中、赤外線カメラを用いて体温を測定する。
【０１１４】
腫瘍のみを含むマウス、ナノ粒子単独（マグネトソーム鎖およびＢＮＦ）の投与によって処置したマウス、または交流磁場の反復印加によって処置したマウスでは、腫瘍体積は急速に増大し、腫瘍細胞の投与後、４０日未満で平均体積１５０ｍｍ３に達する。第１、２および６群に属するマウス平均生存期間は平均で３８日間と推定された。この結果により、交流磁場の印加もＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈまたはマグネトソーム鎖の単独投与もどちらも、Ｕ８７−Ｌｕｃ腫瘍に対してなんら有意な抗腫瘍効果を有しなかったことが示唆される。
【０１１５】
マグネトソーム鎖の投与と磁場の反復印加によって処置したマウスでは、最初の３回の磁場印加施術期間中にわずかな体温上昇が観察され、これは、第４群と第５群のマウスと同様であり、４℃（第１施術期間）、２℃（第２施術期間）および０．５℃（第３施術期間）である。以降の磁場印加施術期間では、第４群と第５群に属するマウスにおいて体温上昇は観察されなかった。その他のすべての群では、体温上昇は観察されなかった。大きな腫瘍（約２５ｍｍ３）を有する第５群に属するマウスでは、マグネトソーム鎖の投与後７日間で、６４％の腫瘍体積の有意な縮小が観察されている。全体的には、腫瘍体積の増大は、マグネトソーム鎖の投与後２８日間で、第５群では第１、２、３および６群よりも有意に小さかった。また、第５群に属するマウスは、第１、２および６群のマウスよりも平均１週間長く生きている。小さい腫瘍（約３ｍｍ３）を有する第４群に属するマウスの４０％では、平均腫瘍体積が、マグネトソーム鎖の投与後５１日間で腫瘍が完全に消失するまで縮小している。これらのマウスは完全に治癒している。実際、これらのマウスは、マグネトソーム鎖の投与後１４３日目もなお、生存している（Ｊ１４３）。これらのマウスの完治は、Ｄ１４３に採取した脳の組織学的切片の検査で腫瘍および病変部の非存在が示されることによって確認した。ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈで処置した第７群のマウスでは、平均腫瘍体積の増大および４５日間の平均生存期間は、第１、２および６群のマウスのものと同様であった。抗腫瘍効果は観察されなかった。
【０１１６】
本発明者らは：（ｉ）平均体積が３ｍｍ３の被処理Ｕ８７−Ｌｕｃ腫瘍を有する４０％のマウスでは、ＡＭＢ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖の懸濁液をマグヘマイトが４０μｇでこのような腫瘍に投与することと、このような腫瘍を、平均強さが２５ｍＴおよび周波数が１９８ｋＨｚの交流磁場の反復印加に曝露することにより、このような腫瘍を完全に破壊することが可能であると結論付けることができよう。
【実施例３】
【０１１７】
菌株ＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖
調製：ＭＳＲ−１菌をまず、３０℃で５〜７日間、寒天ゲル上で、鉄および低濃度の酸素（０．５％Ｏ２）の存在下で培養する。磁性コロニーを収集し、空気の存在下で３０℃にて数日間、炭素源、窒素源、ミネラル、微量元素および酵母エキスを含む無鉄予備培養培地中で培養する。この予備培養で得られた走磁性細菌を５０リットル容の発酵槽内で３０℃にて、予備培養培地と同様の培地中で増殖させる。増殖中、鉄供給源を含む酸性栄養培地を添加することによりｐＨを６．８〜７に維持し、圧縮空気を培養培地中に導入して細菌の増殖を増進させ、この間、マグネトソームの合成が可能となるように酸素濃度を０．２％より下に維持する。発酵でのＭＳＲ−１菌を、５６５ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ５６５ｎｍ）が１１０〜１２０になるまで濃縮する。次いで、１００ｍｌのこの細菌濃縮液を４００ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨと混合し、６０℃で１時間３０分〜２時間加熱し、細菌を溶解させる。次いで、処理されたマグネトソームを細菌残屑から、溶解された菌体の懸濁液が入った槽の壁に対してネオジム磁石を一晩配置すること、および水酸化ナトリウムと細菌残屑を含む上清みを１×ＰＢＳで交換することにより単離する。次いで、得られた懸濁液を１×ＰＢＳの存在下で１０Ｗにて２０秒間超音波処理し、ネオジム磁石に対して１５分間配置し、上清みを除去し、処理したマグネトソームを１×ＰＢＳ中に再懸濁させる。この超音波処理と磁気的分離のシーケンスを４回繰り返す。ＭＳＲ−１菌株から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖がかくして得られる。
【０１１８】
特性評価：ＴＥＭ測定により、この懸濁液中に、２００〜１５００ｎｍの長さ、２０ｎｍ〜６０ｎｍのマグネトソームサイズを有するマグネトソーム鎖の存在が示された。１ｍｇの鉄を含むこの鎖の懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分後、８６％低下しており、これは、この懸濁液の安定性が低いことを示す。この鎖に対して行なった光散乱計測により、５３５ｎｍ〜２８２２ｎｍの流体力学的サイズを有する２つの鎖集団の存在が示される。これらは、ｐＨ６．４の等電点、ｐＨ２での１５ｍＶからｐＨ１２での−３１ｍＶまで低下するゼータ電位を有する。ＣＨＮＳ分析により、この鎖において４．１％の炭素パーセンテージが示される（最初の測定からの推測および以降の９回の測定での平均１２．２％からの推測）。第２の一連の測定において、この懸濁液のエンドトキシン濃度（ＬＡＬ試験によって測定）は２０００〜１７０００ＵＥ／ｍｌ／ｍｇ鉄であると推定された。また、エンドトキシンの存在は、フーリエ変換赤外線吸収の測定（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＦＴ−ＩＲモデル３８０分光計を使用）によっても示唆された。このスペクトルは１１５０ｃｍ−１および１０３０ｃｍ−１におけるピークの存在を示し、これらは、リポ多糖とリン脂質のリン酸基の振動に起因するものであり得る。第１の一連の測定では、ＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、磁場印加前の３６．２℃から３０分間の磁場印加後の４５．６℃まで９．４℃上昇する。温度差の初期傾斜は、第１測定時では０．０１２℃／秒および第２測定時では０．０１９℃／秒と推定される。この温度上昇はＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈで観察されるものより大きい。この混合物を処理条件２に供した場合、表１は、生細胞のパーセンテージが第１測定では低値の５％および第２測定では１２％であり、磁場なしの条件１の第１および第２測定での処理で得られた３９％より低いことを示す。これは、処理条件１と２の存在下においてこの発熱原性マグネトソームによって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示し、条件１（磁場なし）よりも条件２（磁場の存在下）の方が、細胞毒性が高い。
【実施例４】
【０１１９】
ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：実施例３で得られたＭＳＲ−１菌株から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含む１００μｌの懸濁液を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１％ＳＤＳを含む２００ｍｌの溶液と混合し、混合物を５０℃で一晩加熱し、ネオジム磁石に対して配置し、上清みを除去し、８０ｍｌのフェノール（ｐＨ８）と交換する。得られた懸濁液を超音波処理下で６０℃にて２時間加熱し、超音波処理なしで６０℃にて一晩維持し、磁石に対して配置する。懸濁液の上清みを除去し、８０ｍｌのクロロホルムと交換した。クロロホルムを含む懸濁液をネオジム磁石に対して配置し、上清みを除去し、処理したマグネトソームの表面上に吸着された残留クロロホルムを、このマグネトソームをフード下で２時間加熱することにより除去する。最後に、マグネトソームの得られた中心部分を、これが入ったチューブのガラス壁面から、超音波処理浴中で６０℃にて１時間加熱した８０ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより脱着させる。マグネトソームの中心部分を含む懸濁液をネオジム磁石に対して配置し、上清みを除去し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水と交換し、懸濁液を１０Ｗで２０秒間超音波処理する。この洗浄シーケンスを４回繰り返す。酸化を回避するためにマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を窒素で脱気し、オートクレーブ処理によって滅菌し、−８０度で保存する。
【０１２０】
特性評価：ＴＥＭ測定により、マグネトソームの中心部分の周囲に被覆が存在しないことが示される。マグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分後、６０〜８０％低下しており、これは、この懸濁液の安定性が低いことを示す。この懸濁液のエンドトキシン濃度は、１０〜１００ＥＵ／ミリリットル／ｍｇ酸化鉄であると推定された。これは、この懸濁液の発熱原性の性質を示す。この懸濁液の等電点は酸性ｐＨの３．５であると測定された。さらに、ｐＨ４〜ｐＨ６において、本発明者らは、−８ｍＶから−１．５ｍＶまでのゼータ電位の上昇を観察しており、ｐＨ６〜ｐＨ８において、本発明者らは、−１．５ｍＶから−２７ｍＶまでのゼータ電位低下を観察しており、これは、凝集体の存在に特徴的なことのようである。ゼータサイザーを用いた光散乱計測により、流体力学的球形サイズ３０７６ｎｍの７９％の凝集体および流体力学的球形サイズ６７７ｎｍの２１％の凝集体の存在が示されている。この懸濁液のＣＨＮＳ分析により３．３％の炭素濃度、０．２％の窒素が示された。これらの濃度は、ＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖で測定されたもの（％Ｎ＝０．７および％Ｃ＝４．１）ならびに凍結乾燥全菌体ＭＳＲ−１で測定されたもの（％Ｎ＝１１および％Ｃ＝４９）より低い。この結果により、マグネトソームの中心部分の周囲の有機物質の量は、マグネトソームの中心部分を含む試料では、全菌体ＭＳＲ−１またはＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含むものよりも有意に少ないことが示唆される。アミンアッセイでは、該中心部分の鉄１ｍｇを含む懸濁液中において該中心部分内またはその表面上に２６０ｎｇ〜１．２μｇのアミン官能部が存在していることが示されている。ホスフェートアッセイでは、該中心部分の鉄部分１ｍｇを含む懸濁液中において該中心部分内またはその表面上に１０μｇのホスフェート官能部が存在していることが示されている。第２の一連の測定において、マグネトソームの中心部分をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、３０分間の磁場印加後９．８℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０１２℃／秒と推定される。この混合物を処理条件２に供した場合、表１は、生細胞のパーセンテージが低値の０〜９％であり、磁場なしの処理条件１で得られる７７％より低いことを示す。
【実施例５】
【０１２１】
ＡＭＢ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：ＡＭＢ−１走磁性細菌の培養は、実施例３に記載の方法に従って行なう。７日間の培養後、１リットルの容量でタンジェンシャルフィルトレーション（５００ｋＤａカラム，８００ｒｐｍ）を用いて細菌を２５℃で濃縮する。次いで、これを、撹拌下で、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３０μｇ／ｍＬのプロタミンを含む溶液（ｐＨ＝７．４）中で混合し、液体媒体を細菌からタンジェンシャルフィルトレーションによって分離し、次いで、得られた細菌をＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）と混合し、液体媒体を再度、細菌からタンジェンシャルフィルトレーション分離する。次いで、得られた細菌懸濁液をＰＢＳ中で、細菌の溶解が可能な光学密度（５６５ｎｍで測定時）まで希釈する。得られた懸濁液を、１３ｍｍの直径を有するチタン超音波処理プローブを用いて７０Ｗで０℃にて３０分間、超音波処理する。かくして得られた懸濁液を、１回目は、該懸濁液が入った容器の壁面に対して磁石を配置し、上清みを除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む６℃の溶液と交換し、３０Ｗで３パルスの連続によって２秒間、超音波処理することにより洗浄する。これを、同様の方法を用いてさらに４回洗浄し、ＨＥＰＥＳとＮａＣｌの混合物を非発熱原性滅菌水と交換した。洗浄の終了時、マグネトソーム鎖を含む懸濁液が得られ、これはＴＥＭによって確認される。マグネトソーム鎖を上清みから、磁石を使用することによって単離し、上清みを３０ｍｌ容量のＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｓｉｇｍａ，整理番号：Ｔ９４２４）と交換し、得られた溶液を５０℃で２時間、超音波処理加熱浴中で超音波処理する。次いで、得られた懸濁液に対して４℃で１時間、磁石を配置し、上清みを除去し、ナトリウムエタノエート溶液と交換し、混合物を３７℃で３０分間、超音波処理用音波加熱浴を用いて超音波処理する。次いで、処理したマグネトソームを、１回目は、磁石を用いて上清みを単離すること、上清みを除去すること、これをナトリウムエタノエート溶液と交換すること、次いで、懸濁液を３７℃で３０分間、超音波処理加熱浴中で超音波処理することにより洗浄する。この洗浄工程を同じ様式で３回繰り返す。特に、脂質二重層を除去するため、懸濁液を磁石に対して配置し、上清みを除去し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４、１％のデオキシコレートおよび４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液と交換する。次いで、懸濁液を４℃で１時間、機械的に撹拌し、磁石に対して配置し、上清みを除去し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４、１％のデオキシコレートおよび４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液と交換する。混合物は３７度で１時間撹拌する。次いで、懸濁液を、１回目は、該懸濁液が入った槽の壁に対して磁石を配置し、上清みを除去し、これをメタノール／リン酸バッファー（ｖ／ｖ，１／１）混合物と交換することにより洗浄する。次いで、得られた懸濁液を、磁石に対して配置し、上清みを除去し、これをメタノールとリン酸バッファーを含む混合物と交換し、次いで、得られた懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗで５分間、超音波処理することにより洗浄する。２回目の洗浄を同じ様式で行なう。懸濁液を、磁石に対して懸濁液を配置し、上清みを除去し、これを非発熱原性滅菌水と交換し、超音波処理浴を用いて３７℃で１時間、超音波処理することにより再度洗浄する。水でのさらに５回の洗浄を同じ様式で行なう。次いで、得られた懸濁液を１２１℃でのオートクレーブ処理によって滅菌し、ＡＭＢ−１由来のマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を得る。
【０１２２】
特性評価：ＴＥＭにより、マグネトソームの中心部分の周囲に被覆が存在しないことが示される。この懸濁液のＣＨＮＳ分析により４．９％の炭素パーセンテージが示され、これは、全菌体のもの（これは３２％であった）および発熱原性マグネトソーム鎖のもの（１３．９％）よりも有意に少なかった。この中心部分のエンドトキシンレベルは２０〜１００ＥＵ／ｍｇ／ｍＬである。マグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分後、８０〜９０％低下しており、これは、この懸濁液の安定性が低いことを示す。この懸濁液のゼータ電位は全体的には、ｐＨ２での３８ｍＶからｐＨ１２での−６０ｍＶまで低下する。この懸濁液の等電点は酸性ｐＨの４．９であると測定された。第２の一連の測定において、マグネトソームの中心部分をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、３０分間の磁場印加後２３．８℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０２４℃／秒と推定される。この混合物を処理条件２と１に供した場合、生細胞のパーセンテージはそれぞれ４８％および３０％である。
【実施例６】
【０１２３】
ポリ−Ｌ−リシンで被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：実施例４に記載のＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分を、層流フード下、滅菌条件下にてポリ−Ｌ−リシンで被覆する。分子量２１０００ｇ／ｍｏｌのポリ（Ｌ−リシン臭化水素酸塩）溶液（Ｇｍａｃ，ＣＡＳ：２５９８８−６３−０）は、非発熱原性水で調製され、０．４５μｍのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターで濾過され、−８０℃で保存された４０ｍｇ／ｍｌのポリ（Ｌ−リシン臭化水素酸塩）を含む。被覆シーケンスにおいて、使用するポリ−Ｌ−リシンの質量はマグネトソームの中心部分の質量よりも７倍多くする。３ｍｇ／ｍＬの鉄濃度のマグネトソームの中心部分を含む２５ｍＬの懸濁液をガラスチューブ内に導入し、このチューブを１．３ＴのＮｄＦｅＢ磁石に対して配置し、上清みを除去し、次いで、ポリ（Ｌ−リシン臭化水素酸塩）の２５ｍｌの懸濁液をチューブ内に２０ｍｇ／ｍｌの終濃度で導入する。次いで、得られた懸濁液を１０℃の超音波処理フィンガーを用いて４℃で６分間、超音波処理する。チューブを１３回転／分の速度で４〜８℃の温度のホイール上で、２５℃で２４時間撹拌し、懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて１０Ｗで１０秒間、超音波処理する。１回目の洗浄を行なうため、次いで、チューブを同じ磁石に対して配置し、上清みを除去し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水と交換する。懸濁液をこの様式で１〜４回洗浄する。最後に、得られた懸濁液を、加熱を回避するために４℃より下の温度の氷中で、２４Ｗで２分間、超音波処理し、濾過したＫＯＨによりｐＨを６．８〜７．２に調整する。ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液がかくして得られる。
【０１２４】
特性評価：ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分後、およそ５０％低下した。これは、この懸濁液の安定性が、非被覆マグネトソームの中心部分を含む懸濁液と比べて大きいことを示す。ＴＥＭ画像により、このマグネトソームの中心部分の周りに、４〜１６ｎｍの厚さ、８ｎｍの平均厚さを有するポリ−Ｌ−リシン被覆の存在およびこの合成ナノ粒子の一部における鎖状配列が示された。この懸濁液に対して行なったＬＡＬアッセイにより、７８ＥＵ／ミリリットル／ｍｇ鉄の低いエンドトキシン濃度が示された（回収率１１９％）。ゼータサイザーを用いて行なった光散乱計測により、流体力学的球形サイズ２４８９ｎｍの９２％の凝集体および流体力学的直径１３７ｎｍ（これは、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分の流体力学的直径に相当し得る）を有する８％の球体の存在が示されている。ＣＨＮＳ分析により、ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの１０ｍｇの中心部分を含む試料は窒素０．４％、炭素３．６％、水素０．６％、イオウ０．０３％のパーセンテージを含むことが示された。１０ｍｇの凍結乾燥ポリ−Ｌ−リシンを含む試料は１３％の窒素、３３％の炭素、３．２％の水素、０．０３％のイオウを含む。この結果は、ポリ−Ｌ−リシンで被覆された、または被覆されていないマグネトソームの中心部分を含む懸濁液中の炭素濃度は、全菌体またはＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含むものよりも低いことを示す。これにより、被覆された、または被覆されていないマグネトソームの中心部分を含む懸濁液中の有機物質の存在は、全菌体またはＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含むものよりも少ないことが示唆される。マグネトソームの中心部分の周りのポリ−Ｌ−リシン被覆の存在は、非被覆マグネトソームの中心部分を含む試料の炭素のパーセンテージ（％Ｃ＝３．３％）が、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む試料のもの（％Ｃ＝３．６％）より少ないことによって示唆される。ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む１．５ｍｇの懸濁液を１００μｌの１％寒天と混合し、得られた混合物を平均強さ３２ｍＴおよび周波数１９８ｋＨｚの交流磁場の印加に供した場合、混合物は１７５秒後、４３℃の加熱温度に達する。１００μｌの１％寒天と混合した１．５ｍｇの化学的ナノ粒子（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈ，整理番号１０−００−１０２、およびＭｉｃｒｏｍｏｄ  Ｍ−ＰＥＩ，整理番号１７−００−１５２）を含むゲルを同じ交流磁場に供する。これらは６００秒後に４３℃の温度に達し、これは、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液では、化学的ナノ粒子ＢＮＦ−Ｓｔａｒｃｈを含むものおよびＭ−ＰＥＩを含むものよりも加熱特性が良好であることを示す。ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を条件３に供した場合、混合物の温度は、磁場印加前の３７℃から３０分間の磁場印加後の４８．５℃まで１１．５℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０２４℃／秒と推定される。同���混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは５３％であるが、磁場印加なし（処理条件１）ではわずか２３％である。これは、磁場の存在下において、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。
【０１２５】
細胞毒性：ＩＳＯ  １０９９３−５によるＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈテトラゾリウム）細胞毒性試験を、承認された組織で、滅菌条件下でＬ９２９マウス線維芽細胞において、ＥＭＥＭ１０培地中に含まれた鉄の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を用いて行なう。この懸濁液をまず、Ｌ９２９細胞とともに３７℃で５％ＣＯ２の存在下、２４〜２６時間インキュベートする。インキュベーション後、ＭＴＳおよびフェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）薬剤を含む２０μＬの染色溶液を細胞に添加する。次いで細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で１２０〜１３５分間、再度インキュベートする。４９２ｎｍでの吸光度をもたらすこの染色により、細胞のバイアビリティを示すことが可能になる。顕微鏡下での細胞の観察結果により、細胞のバイアビリティを確認または無効とすることが可能である。得られた結果は、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液について、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬの鉄濃度で１００％、９２％および８９％の生細胞のパーセンテージが示され、これは、これらの濃度ではこの懸濁液に細胞毒性がないことを示す。１ｍｇ／ｍｌの濃度では、結論を出すことができなかった。
【０１２６】
発熱原性：ＬＡＬ試験の結果によって示唆されたように、ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分を含む懸濁液に発熱原性がないことを確認するため、発熱原性試験をウサギにおいて、ＩＳＯ  １０９９３−１１に従い、承認された団体で行なった。この目的のため、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む５ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の懸濁液を超音波処理浴中に２分間入れ、１ｍｌのこの懸濁液を１１９ｍｌのＮａＣｌ（０．９％）中で希釈した。懸濁液の温度を３７℃に３０分間維持し、懸濁液をホモジナイズし、３匹のウサギに１０ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内投与した。この３匹のウサギの体温を３０分間毎に３時間測定した。体温は０．０２℃（第１のウサギ）、０℃（第２のウサギ）および０．２２℃（第３のウサギ）上昇する。３匹のウサギのうちいずれも０．５℃より大きな体温上昇を示さず、３匹のウサギの体温上昇の総和は０．２４℃であり、２．６５℃より少ない。したがって、試験した製剤品は、ヨーロッパ薬局方および米国薬局方の基準に従う発熱原性でない。
【０１２７】
急性毒性：急性全身性毒性試験を、６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて、ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分を含む０ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇおよび８ｍｇの鉄濃度の１００μｌの懸濁液をマウスの尾部に投与することにより行なう。各マウスの体重（注射後１２日間、毎日測定）は安定なままであり、マウスが耐えられる最大用量は８ｍｇより多い、すなわち約４００ｍｇ／ｋｇであることを示す。
【０１２８】
マウスに皮下移植したＧＬ２６１腫瘍に対する抗腫瘍有効性：
１ｍＬ容２５ｇのシリンジを使用し、２．１０６個のマウス膠芽腫ＧＬ２６１細胞を含む５０μｌ容量を、黒色の６  Ｃ５７ＢＬ／Ｊ雌マウスの左脇腹の足と背部の間に皮下投与する。腫瘍を１０〜１５日間、約４０〜１５０ｍｍ３のサイズに達するまで増殖させる。腫瘍がこのサイズに達したら、マウスをイソフルランガスで麻酔し、ホットプレートによって３７℃に維持する。２５０μｌ容のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用し：（１）５％グルコース、（２）５％グルコースと混合し、５０ｍｇ／ｍＬの鉄濃度の、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む５０μｌの２種類の異なる非発熱原性懸濁液を腫瘍の中心に投与する。懸濁液２は、鉄（単位：μｇ）の測定時、２０．ｔである量で投与し、ここで、ｔは処理した腫瘍のサイズ（単位：ｍｍ３）である。次いでマウスを、周波数１９８ｋＨｚおよび平均強度が９ｍＴ〜２８ｍＴの強さの交流磁場に３０分間曝露し（または曝露しない）、最初の３回の磁場施術期間中、腫瘍内温度を４３℃〜４６℃の値に維持する。以降の磁場印加施術期間中は、交流磁場の平均強さを２８ｍＴに固定する。腫瘍内温度を、熱電対を用いて測定する。磁場印加の施術期間は週に３回、合計１５回繰り返す。２回の加熱施術期間後も腫瘍が増大し続けているマウスは、懸濁液（２）の２回目の投与を受ける。腫瘍サイズをカリパスで測定し、式Ｖ腫瘍＝０．５（Ｌ．ｌ２）（式中、Ｌおよびｌはそれぞれ、腫瘍の長さおよび幅を表す）を用いて腫瘍体積を推定する。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたとき、および／またはマウスの体重が先の測定から次の測定時に２０％より大きく減少したとき、マウスを安楽死させる。このプロトコルに従い、ナノ粒子懸濁液の投与後７１日間の生存率と腫瘍体積のモニタリング曲線を作成する。
【０１２９】
ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分と数回の磁場印加で処置した１０匹のマウスのうち５匹は、加熱施術期間の開始後１５日目、完全に治癒していることが観察される。これらのマウスでは、腫瘍の視認可能な痕跡またはその後遺症（痂皮もしくは瘢痕）がみられない。完全に治癒していない、被覆されたマグネトソームの中心部分と磁場印加で処置した残りの５匹のマウスは、処置開始後、約３０日目に安楽死させる。磁場印加なしでポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分で処置したマウスはすべて、処置開始後、約１２日目に安楽死させる。生存率は、処置開始後５０日目で、被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液と交流磁場印加で処置したマウスでは６０％、被覆された中心部分を含む懸濁液で磁場印加なしで処置したマウスでは０％である。磁場印加なしでは、マウスはすべて、処置開始後２０日未満で死亡した。
【０１３０】
マウスの脳に移植したＵ８７腫瘍に対する抗腫瘍有効性：
腫瘍細胞の投与およびマウスのモニタリングのためのプロトコルは実施例３に記載のものと同一である。マウスの脳内へのＵ８７−Ｌｕｃ腫瘍細胞の投与後６日目、腫瘍が０．８〜２ｍｍ３のサイズに達している場合、２μｌの２種類の異なる懸濁液を麻酔したマウスの脳内の座標（０．２．２）に投与する。各々９匹のマウスを含む第１群と第２群では、マウスに、ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分を含む、５％グルコースと混合した２５０ｍｇ／ｍＬの鉄濃度の懸濁液を投与した。各々９匹のマウスを含む第３群と第４群では、マウスに、５％グルコースを含む懸濁液を投与した。第１群と第３群のマウスは磁場に曝露しない。第２群と第４群は、平均強さ２５ｍＴおよび周波数１９８ＫＨｚの交流磁場に３０分間、週に３回、６週間曝露する。腫瘍が腫瘍再発した第２群、第４群のマウスには、Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞の移植後８週に、ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分を含む、５％グルコースと混合した１４７ｍｇ／ｍＬの鉄濃度の２μｌの懸濁液の２回目の投与と、週に３回で３週間の平均強さ２５ｍＴおよび周波数１９８ＫＨｚの交流磁場印加とからなるさらなる処置を投与する。体温の変動を、異なる処置中、赤外線カメラを用いて測定する。
【０１３１】
ポリ−Ｌ−リシン被覆マグネトソームの中心部分を含む懸濁液の投与と交流磁場の反復印加とによって処置したマウスでは、体温上昇が最初の１６回の磁場印加施術期間中に第２群のマウスで観察され、これは平均８℃（最初の３回の施術期間）、５℃（以降の１２回の施術期間）、および１℃（１６回目の施術期間）である。以降の磁場印加施術期間では、第２群のマウスに体温上昇は観察されなかった。腫瘍の完全な消失のために１６回目の加熱施術期間後、さらに処置した第２群の４匹のマウスでは、さらに９回の磁場印加施術期間中、５．５℃の体温上昇が観察される。第１、３および４群では、体温上昇は観察されなかった。
【０１３２】
第３群と第４群のマウスでは、腫瘍体積が急速に増大し、腫瘍細胞の投与後４５日未満で平均体積２００ｍｍ３に達する。第３群と第４群のマウスの平均生存期間は、腫瘍細胞の投与後、平均４０日間であると推定された。これにより、交流磁場の印加だけでは抗腫瘍効果を有しないことが示唆される。第１群のマウスでは、腫瘍体積が１週間で平均５ｍｍ３増大し、第３群と第４群よりもずっと少なかった。また、Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞の移植後１３週目、第１群のマウスのうち５０％が生存しており、５６ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する。第１群のマウスを、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の単独投与で処置すると、腫瘍の増殖を低速化させること、および第３群と第４群のマウスと比べて生存率を改善することが可能になる。平均腫瘍体積は、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の投与後８５日間の間に腫瘍が完全に消失するまで縮小し、これは、この懸濁液の投与後４２日目（Ｊ４２）、マウスの６６％で観察される。腫瘍が消失していないため２回目の処置を受けた第２群の４匹のマウスでは、腫瘍は、２回目の処置の開始後２０日目、完全に消失した。全体的には、Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞の投与後９１日目、第２群のマウスはすべて、まだ生存しており、生物発光シグナルを示さず、治癒が示唆される。
【０１３３】
本発明者らは：（ｉ）ポリ−Ｌ−リシンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＵ８７−Ｌｕｃ腫瘍内に投与した場合、腫瘍の増殖は低速化し、これは、ポリ−Ｌ−リシンの高い濃度またはその存在によって説明され得る、（ｉｉ）この同じ懸濁液をＵ８７−Ｌｕｃ腫瘍内に投与し、１９８ｋＨｚの周波数および平均強さ２５ｍＴの交流磁場の反復印加に供した場合、このような腫瘍を完全に消去することが可能であると結論付けることができる。
【実施例７】
【０１３４】
キトサンで被覆されたＭＳＲ−１由来のマグネトソーム中心部分
調製：非発熱原性滅菌水と混合したマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて５Ｗの出力で、０．１秒間隔の０．１秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。０．２５ｍｇのキトサン（キトサン塩酸塩ＣＲＳ，ｓｉｇｍａ整理番号Ｙ００００１０４）をマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液と混合し、懸濁液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで６．２に調整する。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて５Ｗの出力で、０．１秒間隔の０．１秒間のパルスにより４５℃で６０分間、次いで６０℃で１５分間、次いで７０℃で１５分間、超音波処理する。得られた懸濁液を、１回目は、該懸濁液が入ったガラスチューブの壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、これを非発熱原性滅菌水と交換することにより洗浄する。これに２回目の洗浄を同じ様式で行なう。
【０１３５】
特性評価：キトサンで被覆されたこのマグネトソームのエンドトキシンレベルは２５ＥＵ／ｍｇ／ｍＬである。キトサンで被覆されたマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は、２０分間の測定中に３％低下し、これは、この懸濁液の安定性を示す。キトサンで被覆されたマグネトソームの中心部分に対して行なったＴＥＭ測定により、この合成ナノ粒子の鎖状の配列、凝集体の存在およびマグネトソームの中心部分を囲んでいる平均厚さが６ｎｍの被覆が示される。キトサンで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は８．５℃上昇する。温度差の初期傾斜は、第１の一連の測定時では０．００９℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは０〜５％であるが、磁場なし（処理条件１）では２０％である。これは、処理条件２における、キトサンで被覆されたマグネトソームの中心部分による腫瘍細胞の破壊有効性を示す。このマグネトソームの等電点はｐＨ１１と推定される。ゼータ電位は、ｐＨ２での４６ｍＶとｐＨ１２での−５５ｍＶの間で変化する。このマグネトソームの流体力学的サイズは、その７％が２７３ｎｍおよび９３％が１９０８ｎｍと推定される。ＣＨＮＳ分析は、炭素パーセンテージが３．２％であり、非被覆マグネトソームで測定された炭素パーセンテージの３．３％に近いことを示す。
【実施例８】
【０１３６】
カルボキシ−メチル−デキストランで被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：非発熱原性滅菌水と混合したマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて５Ｗの出力で、０．１秒間隔の０．１秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。４ｍｇのカルボキシ−メチル−デキストラン（ＳＩＧＭＡ整理番号８６５２４−１０Ｇ−Ｆ）を、マグネトソームの１ｍｇの中心部分と混合し、混合物のｐＨを１Ｍ塩酸で３．５に調整する。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて５Ｗの出力で、０．１秒間隔の０．１秒間のパルスにより４５度で６０分間、超音波処理する。得られた懸濁液を３回洗浄する。最初の洗浄では、磁石をチューブの壁面に対して配置し、上清みを除去し、非発熱原性滅菌水と交換する。得られた懸濁液に２回目、次いで３回目の洗浄を同じ様式で行なう。
【０１３７】
特性評価：第１の一連の測定では、カルボキシ−メチル−デキストランで被覆されたマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は、２０分間の測定中で低下せず、これは、この懸濁液の安定性を示す。ＴＥＭ測定により、マグネトソームの中心部分を囲んでいる被覆の厚さを２〜２０ｎｍの間で推定することが可能である。カルボキシ−メチル−デキストランで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の光散乱計測により、流体力学的直径が１３５９ｎｍの７９％の球体（集団１）、流体力学的直径が５１２４ｎｍの６％の球体（集団２）および流体力学的直径が３３１ｎｍの１５％の球体（集団３）の存在が示される。集団３のサイズは、カルボキシ−メチル−デキストランで被覆されたマグネトソームの中心部分のものに相当し得る。等電点はｐＨ＝３．４であると推定され、ゼータ電位はｐＨ＝２での２０ｍＶからｐＨ＝１２での−３１ｍＶまで低下する。カルボキシ−メチル−デキストランで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は２９℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０２３℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは１１％であるが、磁場なし（処理条件１）では６３％である。これは、処理条件２の使用時の、クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分による腫瘍細胞の破壊有効性を示す。ＣＨＮＳで測定時されたこのマグネトソームの炭素のパーセンテージは３．７％である。
【実施例９】
【０１３８】
クエン酸で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：４．５ｍｌの非発熱原性滅菌水と混合されたマグネトソームの５０ｍｇの中心部分を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。１．８ｍｌ容量に含めた２０ｍｇのこの懸濁液を、８ｍｌの非発熱原性滅菌水中に含めた３５ｍｇのクエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ整理番号３３１１４−５００Ｇ）と混合する。この調製物では、鉄の質量がクエン酸の質量より１．７５倍多い。懸濁液のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムで６に調整し、得られた混合物を９０℃で１時間、超音波処理する。得られた懸濁液を、１回目は、ガラスチューブの壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、これを非発熱原性滅菌水と交換することにより洗浄する。これに２回目の洗浄を同じ様式で行なう。
【０１３９】
特性評価：クエン酸で被覆されたマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分経過時、およそ１５％低下しており、これは、この懸濁液の安定性を示す。この合成ナノ粒子のＴＥＭ画像により、数多くの鎖の存在、この合成ナノ粒子の良好な分散、少ない凝集およびこのマグネトソームの中心部分の周りに１〜１５ｎｍの厚さの被覆の存在が示される。この懸濁液に対して行なったＬＡＬ試験により、１９ＥＵ／ミリリットル／ｍｇ鉄の低いエンドトキシン濃度が示された（回収率１８８％）。この凍結乾燥懸濁液に対して行なったＣＨＮＳ分析により、窒素０．８％、炭素３．７％、水素０．３％およびイオウなしのパーセンテージが示された。凍結乾燥クエン酸のみを含む試料は、窒素０％、炭素３６％、水素４．７％およびイオウなしのパーセンテージを含む。この結果は、マグネトソーム（クエン酸で被覆されていようが、そうでなかろうが）の中心部分を含む懸濁液中の炭素のパーセンテージが、全菌体またはＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含むものより少ないことを示す。また、これにより、マグネトソーム（クエン酸で被覆されていようが、そうでなかろうが）の中心部分を含む懸濁液中の有機物質の存在は、全菌体またはＭＳＲ−１から抽出された発熱原性マグネトソーム鎖を含むものより少ないことが示唆され得る。クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分の周りの被覆の存在は、マグネトソームの中心部分を含む凍結乾燥懸濁液中の炭素のパーセンテージ（％Ｃ＝３．３％）が、クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む凍結乾燥懸濁液中のもの（％Ｃ＝３．７％）より少ないことによって示唆される。クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は、磁場印加前の３５℃から磁場印加後の６０℃まで２５℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０３８℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは２６％であるが、磁場なし（条件１の処理）では５７％である。これは、処理条件２での、クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分による腫瘍細胞の破壊有効性を示す。この懸濁液の光散乱計測により、流体力学的サイズが７８８ｎｍの非球体（これは鎖に相当し得る）の存在が示される。等電点はｐＨ＝３．７であると推定され、ゼータ電位はｐＨ＝２での２５ｍＶからｐＨ＝１２での−３８ｍＶまで低下する。
【実施例１０】
【０１４０】
第１プロトコルに従って調製された、オレイン酸で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：本発明者らは、マグネトソームの５ｍｇの中心部分を含む１ｍｇ／ｍＬの鉄濃度の５ｍＬの懸濁液に、ｐＨ１０〜１１が得られるように１０μｌのアンモニアＮＨ４ＯＨ溶液（分子量の２５％）を添加する。得られた懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて６〜７Ｗの出力で、互いの間隔が０．５秒間の休止の０．２秒間のパルスにより、水浴中で８０℃にて１５分間、超音波処理する。次いで、２６７μｌの２１１ｍＭオレイン酸溶液（条件１）または５０μｌの３２ｍＭ（０．４ｍｇ）のオレイン酸溶液（条件２）のいずれかを添加する。次いで混合物を、超音波処理フィンガーを用いて１時間、６〜７Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．５秒間の０．２秒間のパルスにより超音波処理する。次いで、得られた懸濁液を、該懸濁液が入ったガラスチューブに対して配置したネオジム磁石を用いて洗浄し、上清みを除去し、非発熱原性滅菌水と交換する。懸濁液に２回目、次いで３回目および４回目の洗浄を同じ様式で行なう。最後の洗浄後、種々の特性評価試験を行なうためにアリコートを採取する。懸濁液を使用まで４℃に維持した。
【０１４１】
特性評価：オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間で低下せず、その安定性を示す。条件２に従って調製された、オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分のＴＥＭ画像により、ナノ粒子凝集体およびマグネトソームの中心部分を囲んでいる厚さが０．５〜５ｎｍの被覆の存在が示された。条件２に従って合成したこの被覆マグネトソームに対して行なった光散乱計測により、流体力学的直径が１２３ｎｍ（これは、この被覆マグネトソームの流体力学的直径に相当し得る）の非凝集状態の安定な球体の存在が示される。等電点はｐＨ＝３．５と推定され、ゼータ電位は２つの集団の存在を示し、そのゼータ電位は、一方の集団ではｐＨ＝２での３０ｍＶからｐＨ＝１２での−６０ｍＶまで、他方の集団ではｐＨ＝６での−１０ｍＶからｐＨ＝１２での−３５ｍＶまで低下する。オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は２８℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０５１℃／秒と推定される。
【実施例１１】
【０１４２】
第２プロトコルに従って調製された、オレイン酸で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：該中心部分はオレイン酸で以下の様式で被覆され得る。本発明者らは、マグネトソームの１０ｍｇの中心部分を含む１ｍｇ／ｍＬの鉄濃度の１ｍＬの懸濁液に、１０ｍｇ／ｍＬの１００ｍｇのオレイン酸溶液（ｐＨ１１）を添加した。得られた懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて２０Ｗの出力で、連続的に周囲温度で５分間、超音波処理する。次いで、懸濁液を−８０℃で３０分間凍結し、次いで８０℃で５分間加熱する。次いで混合物を、超音波処理フィンガーを用いて１．５時間、１０Ｗの出力で、パルス間の間隔が３秒間の３秒間のパルスにより超音波処理する。次いで、得られた懸濁液を、該懸濁液が入ったガラスチューブに対して配置したネオジム磁石を用いて洗浄し、上清みを除去し、非発熱原性滅菌水と交換する。懸濁液の２回目と３回目の洗浄を同じ様式で行なう。最後の洗浄後、種々の特性評価試験を行なうためにアリコートを採取する。懸濁液を使用まで４℃に維持した。
【０１４３】
特性評価：オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分の特性は以下のとおりであり得る。オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分の１ｍｇの鉄を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間で低下せず、その安定性を示す。オレイン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は５℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０１２℃／秒と推定される。この混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは１４％であるが、磁場なし（処理条件１）では５３％である。このマグネトソーム中の炭素のパーセンテージは３．４％である。
【実施例１２】
【０１４４】
葉酸で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：４．５ｍＬの非発熱原性滅菌水と混合したマグネトソームの中心部分の５０ｍｇの鉄を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、パルス間の間隔が１０秒間の３０秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。マグネトソームの中心部分の２０ｍｇの鉄を含む１．８ｍＬ容量を、磁石に対して配置した１０ｍＬ容の滅菌ガラスチューブ内に導入し、上清みを除去し、事前に１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．５に調整し、濾過（フィルター０．４５μｍ）滅菌した、非発熱原性滅菌水と混合した２ｍｇ／ｍＬの葉酸（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，整理番号：５９−３０−３）の８ｍＬの溶液と交換する。この調製物では、鉄の質量は葉酸の質量より１．２５倍多い。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、パルス間の間隔が１０秒間の３０秒間のパルスにより１．５時間、超音波処理する。得られた８ｍＬ容量の懸濁液を１０ｍＬ容ガラスチューブ内に入れる。これを１回、ガラスチューブの壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これをパイクレロティック（ｐｙｃｌｅｒｏｔｉｃ）ＨｙＣｌｏｎｅ水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。これをさらに４回、同じ様式で洗浄する。
【０１４５】
特性評価：葉酸で被覆されたマグネトソームの１ｍｇの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間で低下せず、これは、この懸濁液の安定性を示す。この懸濁液の拡散測定により、流体力学的直径が２８７６ｎｍの９０％の球形凝集体および流体力学的直径が２３５ｎｍの１０％の球体（これは、葉酸で被覆されたマグネトソームに相当し得る）の存在が示される。この懸濁液の等電点はｐＨ７．９であると推定され、ゼータ電位はｐＨ２での４５ｍＶからｐＨ１２での−４３ｍＶまで低下した。このマグネトソームの中心部分を囲んでいる被覆の厚さは１〜４ｎｍであると測定された。クエン酸で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は２０℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０４２℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは９％であるが、磁場なし（処理条件１）では９３％である。これは、処理条件２での、葉酸で被覆されたマグネトソームの中心部分による腫瘍細胞の破壊有効性を示す。このマグネトソーム中の炭素のパーセンテージは３．９％と推定される。
【実施例１３】
【０１４６】
ＤＯＰＣで被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：４０ｍｇのＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン，整理番号Ｓｉｇｍａ：Ｐ６３５４）を、１０ｍＬ容ガラスチューブ内の１００μＬのクロロホルム中に可溶化させ、次いで、溶媒を、不活性ガス（窒素）を用いて１０分間蒸発させ、チューブ内に均一な脂質膜を形成させた。８ｍｌの非発熱原性滅菌水と混合した２０ｍｇの鉄を有するマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を、この脂質膜を含むチューブ内に導入し、次いで、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、０．５秒間隔の１０秒間のパルスにより１．５時間、超音波処理する。この調製中、ＤＯＰＣの質量は鉄の質量より２倍多い。得られた懸濁液を、１回目は、ガラスチューブ壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これを非発熱原性の滅菌水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。これをさらに５回、同じ様式で洗浄する。
【０１４７】
特性評価：第１の一連の測定では、ＤＯＰＣで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は、２０分間の測定中で低下せず、これは、この懸濁液の安定性を示す。ＴＥＭ画像により、このマグネトソームの中心部分を囲んでいる厚さ０．６〜３ｎｍの被覆の存在が示される。この懸濁液に対して行なった光散乱計測により、流体力学的直径が１８７１ｎｍの８７％の球形凝集体および流体力学的直径が２７８ｎｍ（これは、ＤＯＰＣで被覆されたマグネトソームの中心部分のサイズに相当し得る）の１３％の球体の存在が示される。等電点はｐＨ３であると測定され、ゼータ電位はｐＨ２での１０ｍＶからｐＨ１２での−３５ｍＶまで低下する。ＤＯＰＣで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は３３．５℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０５℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは０〜５％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では１３％である。これは、交流磁場の存在下で、ＤＯＰＣ被覆マグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。このマグネトソーム中の炭素のパーセンテージは７．５％と推定される。
【実施例１４】
【０１４８】
ＤＯＰＣで被覆された、ＡＭＢ−１由来のマグネトソームの中心部分．
調製：３５ｍＬ容ガラス製コニカルチューブ内で、２８０ｍｇのＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン，整理番号Ｓｉｇｍａ：Ｐ６３５４）を５００μＬのクロロホルム中に可溶化させ、次いで、溶媒を、窒素を用いて１５分間蒸発させ、チューブ内に均一な脂質膜を形成させる。１５ｍｌの非発熱原性滅菌水と混合した１０ｍｇの鉄を有するマグネトソームの中心部分を含む懸濁液を、この脂質膜を含むチューブ内に導入し、次いで、超音波処理フィンガーを用いて２０Ｗの出力で、パルス間の間隔が２０秒間の１０秒間のパルスにより３０分間、超音波処理する。この調製中、ＤＯＰＣの質量は鉄の質量より２８倍多い。得られた懸濁液を、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて精製した。褐色の懸濁液を収集し、次いで、ガラスチューブ壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清み部分を除去して非発熱原性滅菌水と交換し、試料を３０Ｗで１分間、超音波処理することにより濃縮する。
【０１４９】
特性評価：この懸濁液のＴＥＭ画像により被覆厚を５０〜１５０ｎｍで推定することが可能である。
【実施例１５】
【０１５０】
アレンドロネートで被覆された、ＡＭＢ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：１０ｍｇの鉄を含む２ｍＬ容量を２５ｍＬ容（非発熱原性）ガラスチューブ内に導入し、次いで磁石に対して配置した。上清みを除去し、次いで、事前に０．１Ｍ塩酸溶液でｐＨ２．５に調整し、濾過（０．４５μｍフィルター）によって滅菌した、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水と混合した１１．６ｍｇ／ｍｌのアレンドロネートを含む１０ｍｌの溶液と交換した。この調製中、アレンドロネートの質量は鉄の質量より１１．６倍多い。得られた混合物を、超音波処理フィンガーで３０Ｗの出力にて連続的に１５分間、超音波処理する。次いで懸濁液を、７０Ｗのマイクロ波で３回、５分間隔（このとき、試料を氷浴中で冷却する）で１分間、加熱する。懸濁液を、１回目は、ガラスチューブ壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これを滅菌ＭｉｌｌｉＱ水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。これを同じ様式で１０回、ガラスチューブ壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これを滅菌ＭｉｌｌｉＱ水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。
【０１５１】
特性評価：ＬＡＬ試験の測定により、この懸濁液中のエンドトキシン量を５３〜１４４ＥＵ／ｍｇ／ｍＬで推定することが可能である。１ｍｇの鉄を含む、アレンドロネートで被覆されたマグネトソームの懸濁液の中心部分の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間の測定で１％低下し、この懸濁液の安定性が示された。ＴＥＭ測定により、このマグネトソームがマトリックスによって囲まれていることが示される。このマグネトソームは、ｐＨ３．５の等電点、その１４％が５２７ｎｍおよび８６％が２７３５ｎｍの流体力学的サイズ、ｐＨ２での２５ｍＶからｐＨ１２での−４７ｍＶまで変化するゼータ電位を有する。アレンドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、混合物を処理条件３に供した場合、混合物の温度は１８．３℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．２８℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは２％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では１７％である。これは、交流磁場の存在下で、アレンドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。このマグネトソーム中の炭素のパーセンテージは９％であると推定される。
【実施例１６】
【０１５２】
ネリドロネートで被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：４．５ｍＬの非発熱原性滅菌水と混合した、マグネトソームの中心部分の５０ｍｇの鉄を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、パルス間の間隔が１０秒間の３０秒間パルスにより、５分間、超音波処理する。得られた懸濁液の２０ｍｇの鉄を含む１．８ｍＬ容量を１０ｍＬ容ガラスチューブ内に導入し、磁石に対して配置し、懸濁液の上清みを除去し、非発熱原性滅菌水と混合してｐＨ２．５に調整した２０ｍｇ／ｍＬのネリドロネートを含む８ｍＬの溶液と交換する。この調製物では、ネリドロネートの質量は鉄の質量より８倍多い。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、１０秒間隔の３０秒間のパルスにより２時間、超音波処理する。懸濁液を、１回目は、ガラスチューブの壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これを、事前にｐＨ１１に調整した非発熱原性滅菌水と交換することにより洗浄する。これをさらに５回、同様に洗浄する。
【０１５３】
特性評価：ネリドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間で低下せず、この懸濁液の安定性を示す。ＴＥＭ測定により、マグネトソームの中心部分の周りに厚さが１９〜２００ｎｍの被覆の存在が示される。この懸濁液に対して行なった光散乱計測により、流体力学的直径が５５６０ｎｍの１％の球形凝集体、流体力学的直径が７１０ｎｍの５９％の球形凝集体、および流体力学的直径が２０７ｎｍの４０％の球体（これは、ネリドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分に相当し得る）の存在が示される。ネリドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、磁場印加前の３７．２℃から３０分間の磁場印加後の４３．９℃まで上昇する。温度差の初期傾斜は０．０１７℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは２８％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では４４％である。これは、処理条件２の存在下での、ネリドロネートで被覆されたマグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。ネリドロネートで被覆されたこの合成ナノ粒子の等電点はｐＨ３．５と推定され、ゼータ電位はｐＨ２での４０ｍＶからｐＨ１２での−４２ｍＶまで低下する。このマグネトソームの炭素パーセンテージは１８．１％と推定される。
【実施例１７】
【０１５４】
ＰＥＩで被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：４．５ｍＬの非発熱原性滅菌水と混合した５０ｍｇの鉄を含むマグネトソーム鉱物の懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、１０秒間隔の３０秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。この懸濁液の２０ｍｇの鉄を含む１．８ｍＬ容量を１０ｍＬ容ガラスチューブ内に導入し、磁石に対して配置する。上清みを除去し、ｐＨを９．５に調整した非発熱原性滅菌水と混合した濃度２５ｍｇ／ｍＬの８ｍＬのＰＥＩ溶液と交換する。この調製物では、ＰＥＩの質量は鉄の質量より１０倍多い。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗの出力で、１０秒間隔の３０秒間のパルスにより２時間、超音波処理する。得られた懸濁液を、１回目は、ガラスチューブ壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、これを非発熱原性滅菌水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。これをさらに５回、同じ様式で洗浄する。
【０１５５】
特性評価：ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間の測定中で低下せず、これは、この懸濁液の安定性を示す。ＴＥＭ測定により８〜１０ｎｍの被覆厚が示される。この懸濁液の光散乱計測により、１７５ｎｍの流体力学的直径の球体の存在が示され、これは、ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分に相当し得る。等電点は１１と推定され、ゼータ電位はｐＨ２での４２ｍＶからｐＨ１２での−１６ｍＶまで低下する。ＣＨＮＳ測定は、１．１％の窒素パーセンテージおよび４．５％の炭素パーセンテージを示し、どちらも、非被覆マグネトソームの中心部分における窒素および炭素パーセンテージのそれぞれ０．２％および３．３％より大きく、被覆の存在を示唆する。第２の一連の測定において、ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は磁場印加前の３７℃から３０分間の磁場印加後の４３℃まで上昇する。温度差の初期傾斜は０．０１４℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは１５％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では４０％である。これは、処理条件２の存在下での、ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。
【実施例１８】
【０１５６】
ＰＥＩで被覆された、ＡＭＢ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：１０ｍＬの非発熱原性滅菌水と混合した、マグネトソームの中心部分の１０ｍｇの鉄を含む懸濁液を、超音波処理フィンガーを用いて３０Ｗで、１０秒間隔の３０秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。この懸濁液を磁石に対して配置し、上清みを除去し、次いで、ｐＨ９．５の非発熱原性滅菌水と混合した２０ｍｇ／ｍＬの１０ｍＬのＰＥＩ溶液と交換する。この調製中、ＰＥＩの質量は鉄の質量より２倍多い。得られた混合物を、超音波処理フィンガーを用いて２０Ｗの出力で、パルス間の間隔が２０秒間の１０秒間のパルスにより３０分間、超音波処理する。懸濁液を２分毎に氷浴中で冷却する。これを、１回、ガラスチューブの壁面に対してネオジム磁石を配置し、上清みを除去し、次いで、これをパイクレロティックＨｙＣｌｏｎｅ水と交換し、３０Ｗで１分間、超音波処理することにより洗浄する。これをさらに１０回、同じ様式で洗浄する。
【０１５７】
特性評価：  ＬＡＬ試験により、この懸濁液中のエンドトキシン濃度が５０ＥＵ／ｍｇ／ｍＬ未満であることが示される。ＴＥＭ測定により、このマグネトソームの中心部分を囲んでいる該被覆の厚さを４〜１８ｎｍで推定することが可能である。１ｍｇの鉄を含む、ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分の懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間の測定中に６４％低下した。この懸濁液の光散乱計測により、６％が１２５ｎｍ、１％が５４４５ｎｍおよび９３％が１０６７ｎｍの流体力学的サイズのものの存在が示される。等電点は１１．３と推定され、ゼータ電位はｐＨ２での５０ｍＶからｐＨ１２での−１０ｍＶまで低下する。ＣＨＮＳ測定により６．６％の炭素パーセンテージが示される。ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、３０分間の磁場印加後１２℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０４℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは１２％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では２６％である。これは、処理条件２の存在下での、ＰＥＩで被覆されたマグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。
【実施例１９】
【０１５８】
Ａｌ（ＯＨ）３で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：７ｍｇ／ミリリットルのマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をまず、５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。マグネトソームの２ｍｇの中心部分を含む懸濁液を８ｍＬ容ガラスチューブ内に導入し、懸濁液をネオジム磁石に対して配置し、上清みを除去し、１０ｍｇ／ｍＬの６００μｌの水酸化アルミニウムと交換する。混合物を、２０Ｗで９０分間、連続的に超音波処理する。１回目の洗浄を、磁石に対して懸濁液を配置し、上清みを除去し、これをＨｙＣｌｏｎｅ水と交換することにより行なう。さらに３回の洗浄を同じ様式で行なった。
【０１５９】
特性評価：Ａｌ（ＯＨ）３で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間の測定中で低下せず、これは、この懸濁液の安定性を示す。ＴＥＭ測定により、このマグネトソームの中心部分を囲んでいるゲルの存在が示される。この懸濁液の光散乱計測により、５％が２０４ｎｍおよび９５％が１８１０ｎｍの流体力学的サイズのものの存在が示される。等電点はｐＨ２．５であると推定され、ゼータ電位はｐＨ２での５ｍＶからｐＨ１２での−３０ｍＶまで低下する。ＣＨＮＳ測定により３．３％の炭素パーセンテージが示される。Ａｌ（ＯＨ）３で被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、３０分間の磁場印加後２１．３℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．０３４℃／秒と推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは２６％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では９１％である。これは、処理条件２の存在下での、Ａｌ（ＯＨ）３で被覆されたマグネトソームの中心部分の中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。
【実施例２０】
【０１６０】
シリカ（ＡＰＴＳ）で被覆された、ＭＳＲ−１由来のマグネトソームの中心部分
調製：７ｍｇ／ミリリットルのマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をまず、５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより５分間、超音波処理する。マグネトソームの１０ｍｇの中心部分を含む懸濁液を８ｍＬ容ガラスチューブ内に導入し、懸濁液をネオジム磁石に対して配置し、上清みを除去し、ヘキサンと無水エタノール（１：１；ｖ／ｖ）の２ｍＬの混合物と交換する。懸濁液を数分間、超音波処理した後、２００μＬのＡＰＴＳ（（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン，ＡＰＴＳ；Ｓｉｇｍａ整理番号：４４０１４０）、すなわち２１１ｍｇおよび５００μＬの５Ｍ  ＮａＯＨを添加する。混合物を８５℃で１０分間、５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより超音波処理する。１回目の洗浄を、磁石に対して懸濁液を配置し、上清みを除去し、これをヘキサンと無水エタノール（１／１；ｖ／ｖ）の１．５ｍＬ容量の混合物と交換することにより行なう。次いで、懸濁液を、５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより３０秒間、超音波処理する。さらに３回の洗浄を同じ様式で行なった。次いで、１ミリリットル容量の５Ｍ水酸化ナトリウムをナノ粒子の懸濁液に添加し、次いで混合物を８０℃で１５分間、５Ｗの出力で、パルス間の間隔が０．１秒間の０．１秒間のパルスにより超音波処理する。１回目の洗浄を、磁石に対して懸濁液を配置し、上清みを除去し、これをＨｙＣｌｏｎｅ水と交換することにより行なう。さらに２回の洗浄を同じ様式で行なった。
【０１６１】
特性評価：１ｍｇの鉄を含む、シリカで被覆されたマグネトソームの中心部分の懸濁液の吸光度（４８０ｎｍで測定）は２０分間の測定中に９０％低下する。ＴＥＭ測定により、このマグネトソームの中心部分を囲んでいるゲルの存在が示される。この懸濁液の光散乱計測により、１０％が２３５ｎｍ、７％が２７７ｎｍおよび９３％が１９８６ｎｍの流体力学的サイズのものの存在が示される。等電点はｐＨ６．７であると推定され、ゼータ電位はｐＨ２での３９ｍＶからｐＨ１２での−３１ｍＶまで低下する。ＣＨＮＳ測定により７．４％の炭素パーセンテージが示される。シリカで被覆されたマグネトソームの中心部分を含む懸濁液をＧＬ−２６１細胞と混合し、処理条件３に供した場合、混合物の温度は、３０分間の磁場印加後２６．９℃上昇する。温度差の初期傾斜は０．１℃／秒であると推定される。この同じ混合物を処理条件２に供した場合、生細胞のパーセンテージは２．５％であるが、磁場印加なし（処理条件１）では４０％である。これは、処理条件２の存在下での、シリカで被覆されたマグネトソームの中心部分によって誘導されたＧＬ２６１細胞に対する細胞毒性を示す。
【実施例２１】
【０１６２】
実施例２１：種々の被覆プロトコル
実施例６〜２０に記載のプロトコルにより、マグネトソームの中心部分を被覆剤ポリ−Ｌ−リシン、キトサン、カルボキシ−メチル−デキストラン、クエン酸、オレイン酸、シリカ、葉酸、ＤＯＰＣ、アレンドロネート、ネリドロネート、ＰＥＩ、Ａｌ（ＯＨ）３で、該中心部分と被覆剤の混合物に対して１０−９〜１０９、１０−６〜１０６もしくは１０−２〜１０２の被覆質量と中心部分質量の比、１０−９〜１０９秒間、１０−６〜１０６秒間もしくは１０−２〜１０２秒間の超音波処理時間または１０−９〜１０９Ｗ、１０−６〜１０６Ｗもしくは１０−２〜１０２Ｗの超音波処理出力を用いて被覆することが可能であり得る。
【実施例２２】
【０１６３】
中心部分間の結合特性
種々の被覆（ＰＥＩ、ＤＯＰＣ、ネリドロネート、キトサン、クエン酸、デキストラン、ＡｌＯＨ３、シリカ、葉酸）で被覆された中心部分に対して行なったＴＥＭ測定により、結合物質によって隔てられた２つの中心部分の外側表面同士が離れている距離は０〜４００ｎｍより大きいこと、結合物質によって一体に連結された中心部分の数は２個〜１０，０００個より多いこと、結合物質によって一体に連結された中心部分は、異なる形状、例えば鎖状、円形、ひし形、四辺形（表３）を構成していること、鎖状は、その面が平行であり、異なる中心部分の結晶軸の該鎖の伸長方向の整列が示唆される該異なる中心部分の存在によって特性評価されることが示される。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【国際調査報告】
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