(57)【要約】本発明は、ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質が免疫応答をモジュレートするという有力な発見に基づく。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡシグナル伝達を強化するＢＴＬＡに結合する融合タンパク質を提供する。本発明は、がんならびに免疫性および炎症性疾患および障害を本明細書に記載されるＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質で処置する方法をさらに提供する。一局面において、天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質が提供され、この融合タンパク質は、上記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよび上記Ｆｃタンパク質を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよび前記Ｆｃタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２】
ＢＴＬＡアゴニストである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記変異が、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＨＶＥＭタンパク質に、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＨＶＥＭタンパク質に、
ａ）  Ｓ５８Ｒ；
ｂ）  Ｓ５８Ｋ；
ｃ）  Ｓ５８Ｑ；
ｄ）  Ｌ７０Ｄ；
ｅ）  Ｌ７０Ｅ；
ｆ）  Ｌ７０Ｎ；
ｇ）  Ｌ９０Ａ；
ｈ）  Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；
ｉ）  Ｓ５８ＲおよびＧ８６Ｔ；
ｊ）  Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；
ｋ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；
ｌ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；
ｍ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；
ｎ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；ならびに
ｏ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質がヒトのものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記融合タンパク質がＢＴＬＡアゴニストである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記変異が、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、
ａ）  Ｓ５８Ｒ；
ｂ）  Ｓ５８Ｋ；
ｃ）  Ｓ５８Ｑ；
ｄ）  Ｌ７０Ｄ；
ｅ）  Ｌ７０Ｅ；
ｆ）  Ｌ７０Ｎ；
ｇ）  Ｌ９０Ａ；
ｈ）  Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；
ｉ）  Ｓ５８ＲおよびＧ８６Ｔ；
ｊ）  Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；
ｋ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；
ｌ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；
ｍ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；
ｎ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；ならびに
ｏ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質がヒトのものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＢＴＬＡ関連障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質を投与し、それによって前記ＢＴＬＡ関連障害を処置することを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＢＴＬＡ関連障害ががんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己免疫性疾患または障害が、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、クッシング症候群、真性糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、ギランバレー症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性エリテマトーデス、移植拒絶および血管炎からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記がんが、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部および尿生殖器管からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＴＬＡシグナル伝達が増加する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質がＢＴＬＡアゴニストである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸残基３９〜１６１およびＦｃタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択される、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質がヒトのものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記変異が、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、
ａ）  Ｓ５８Ｒ；
ｂ）  Ｓ５８Ｋ；
ｃ）  Ｓ５８Ｑ；
ｄ）  Ｌ７０Ｄ；
ｅ）  Ｌ７０Ｅ；
ｆ）  Ｌ７０Ｎ；
ｇ）  Ｌ９０Ａ；
ｈ）  Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；
ｉ）  Ｓ５８ＲおよびＧ８６Ｔ；
ｊ）  Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；
ｋ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；
ｌ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；
ｍ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；
ｎ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；ならびに
ｏ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
免疫応答モジュレータまたは化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫応答モジュレータが、エイコサノイド、サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、ケモカイン、チェックポイント調節因子、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーおよびインターフェロンからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫応答モジュレータが、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２０、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤ１Ｌ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２００、ＣＤ５２、ＬＴα、ＬＴαβ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ｏｘ４０Ｌ、Ａｐｒｉｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＡＰＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、Ｆａｓ、Ｏｘ４０、ＡＩＴＲ、ＤＲ３、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、Ｆｎ１４、ＣＤ４０、ＥＤＡＲ  ＸＥＤＡＲ、ＤＲ６、ＤｃＲ３、ＮＧＦＲ−ｐ７５、およびＴａｊからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫応答モジュレータが、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｉｍｚｉａ）、エンテラセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｅｂｉｆ、ＲｅｃｉＧｅｎ、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、ＢＧ１２、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａおよびアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記化学療法剤が、アクチノマイシン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パニツママブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、デノスマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、リツキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオキソガミシン）、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリキシマブ）、ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ（テクネチウム（９９ｍＴｃ）ファノレソマブ）、トシリズマブ、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（インジウム−ＩＩＩ標識カプロマブペンデチド）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イットリウム９０にコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８））、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、ＬｅｕｋｏＳｃａｎ（スレソマブ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（アルシツモマブ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（ノフェツモマブ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ８７０およびナタリズマブからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、前記対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質を投与し、それによって前記免疫応答をモジュレートすることを含む、方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質がＢＴＬＡアゴニストである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記変異が、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、
ａ）  Ｓ５８Ｒ；
ｂ）  Ｓ５８Ｋ；
ｃ）  Ｓ５８Ｑ；
ｄ）  Ｌ７０Ｄ；
ｅ）  Ｌ７０Ｅ；
ｆ）  Ｌ７０Ｎ；
ｇ）  Ｌ９０Ａ；
ｈ）  Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；
ｉ）  Ｓ５８ＲおよびＧ８６Ｔ；
ｊ）  Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；
ｋ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；
ｌ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；
ｍ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；
ｎ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；ならびに
ｏ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質がヒトのものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＢＴＬＡシグナル伝達が増加する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象がＢＴＬＡ関連疾患または障害を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＢＴＬＡ関連疾患ががんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
細胞におけるＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートする方法であって、ＢＴＬＡ発現細胞を天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質と接触させ、それによってＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートすることを含む、方法。
【請求項５８】
前記ＢＴＬＡシグナル伝達が増加する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記変異が、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記融合タンパク質が前記ＨＶＥＭタンパク質に、
ａ）  Ｓ５８Ｒ；
ｂ）  Ｓ５８Ｋ；
ｃ）  Ｓ５８Ｑ；
ｄ）  Ｌ７０Ｄ；
ｅ）  Ｌ７０Ｅ；
ｆ）  Ｌ７０Ｎ；
ｇ）  Ｌ９０Ａ；
ｈ）  Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；
ｉ）  Ｓ５８ＲおよびＧ８６Ｔ；
ｊ）  Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；
ｋ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；
ｌ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；
ｍ）  Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；
ｎ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；ならびに
ｏ）  Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｆｃタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質がヒトのものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１５年６月３０日に出願された米国出願第６２／１８７，１０５号への利益を主張する。この先の出願の開示は、この出願の開示の一部とみなされ、この出願の開示においてその全体が参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金第Ｒ０１ＣＡ１６４６７９号の下、政府の支援をうけて一部なされた。米国政府は、この発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の援用
添付の配列表中の材料は、参考としてこの出願に援用される。添付の配列表のテキストファイル（名称  ＢＵＲＮ１６８０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ）は、２０１６年６月２９日に作成され、１９ｋｂである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＯＳを使用するコンピュータ上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（登録商標）を使用して評価され得る。
【０００４】
本発明は、一般的に融合タンパク質に、より具体的にはＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質の開発および使用、ならびに免疫応答をモジュレートし、疾患および障害を処置するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ；ＴＮＦＲＳＦ１４）は、ウイルス病原体による操作ならびにがんおよび自己免疫での変異のための焦点である。ヒトでは、ＨＶＥＭはＴＮＦスーパーファミリーサイトカインＬＩＧＨＴおよびリンフォトキシンαと、ならびに受容体ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）およびＣＤ１６０を含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）ファミリーと相互作用する。膜関連ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０の全ては受容体係合の後にＨＶＥＭの下流のＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化するが、ＨＶＥＭは受容体ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０を活性化して隣接細胞の間で双方向性シグナル伝達をもたらす。ＨＶＥＭとＢＴＬＡまたはＣＤ１６０を共発現する細胞は、立体的障害のために細胞外リガンドへのこれらの受容体のアクセス性を阻止するこれらのタンパク質の細胞内因性の複合体を形成することもできる。
【０００６】
ＢＴＬＡ媒介阻害は、ＴおよびＢ細胞で抗原受容体シグナル伝達を含むいくつかの異なる細胞経路を調節することが示されている。Ｔ細胞では、ＢＴＬＡは、ＳＨ２−ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ）−１および２の活性化を含む阻害性シグナル伝達経路に従事することが最初に示された。最近、ＢＴＬＡが樹状細胞でｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達を、およびγδＴ細胞でＩＬ−７シグナル伝達を調節することが示された。しかし、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞では、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）への宿主対抗手段として、ＨＶＥＭはＣＤ１６０を通して細胞溶解および炎症促進性経路を促進することもできる。さらに、マウスのＣＤ１６０欠乏を記載する近年の研究は、ＮＫ細胞におけるその炎症促進性機能を確証する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
移植片対宿主病または自己免疫性疾患などの免疫媒介病理を患っている患者でリンパ球活性を阻害するように設計された新規療法に対する、満たされていない大きな必要性がある。多くのタイプのこれらの疾患では、限定的な群の承認処置があるか、または、一部の個体は利用可能な処置に応答することができない。新規療法のための魅力的な標的は、自己免疫性疾患の原因である病原性リンパ球によって発現される阻害性受容体のアゴニスト活性化である。ヒト阻害性受容体を活性化するように設計された抗体ベース療法を開発する試みは、動物モデルでの有望な結果にもかかわらずほとんど失敗に終わっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質が免疫応答をモジュレートするという有力な発見に基づく。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡシグナル伝達を強化するＢＴＬＡに結合する融合タンパク質を提供する。本発明は、がんならびに免疫性および炎症性疾患および障害を本明細書に記載されるＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質で処置する方法をさらに提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。
【００１０】
追加の実施形態では、本発明は、融合タンパク質、例えば天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ＢＴＬＡ関連障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質を投与し、それによってＢＴＬＡ関連障害を処置することを含む方法を提供する。一態様では、ＢＴＬＡ関連障害は、がんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である。追加の態様では、自己免疫性疾患または障害は、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、クッシング症候群、真性糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、ギランバレー症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性エリテマトーデス、移植拒絶または血管炎である。別の態様では、がんは、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部または尿生殖器管である。さらなる態様では、ＢＴＬＡシグナル伝達が増加する。別の態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。
【００１２】
一態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。追加の態様では、融合タンパク質は配列番号２のアミノ酸残基３９〜１６１およびＦｃタンパク質を含む。さらなる態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。ある特定の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異は、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。
【００１３】
一態様では、本方法は、免疫応答モジュレータまたは化学療法剤を投与することも含む。別の態様では、免疫応答モジュレータは、エイコサノイド、サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、ケモカイン、チェックポイント調節因子、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーおよび／またはインターフェロンである。追加の態様では、免疫応答モジュレータは、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２０、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤ１Ｌ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２００、ＣＤ５２、ＬＴα、ＬＴαβ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ｏｘ４０Ｌ、Ａｐｒｉｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＡＰＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、Ｆａｓ、Ｏｘ４０、ＡＩＴＲ、ＤＲ３、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、Ｆｎ１４、ＣＤ４０、ＥＤＡＲ  ＸＥＤＡＲ、ＤＲ６、ＤｃＲ３、ＮＧＦＲ−ｐ７５、および／またはＴａｊである。ある特定の態様では、免疫応答モジュレータは、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｉｍｚｉａ）、エンテラセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｅｂｉｆ、ＲｅｃｉＧｅｎ、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、ＢＧ１２、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａおよび／またはアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）である。
【００１４】
さらなる態様では、化学療法剤は、アクチノマイシン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パニツママブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、デノスマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、リツキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオキソガミシン）、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリキシマブ）、ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ（テクネチウム（９９ｍＴｃ）ファノレソマブ（ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ））、トシリズマブ、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（インジウム−ＩＩＩ標識カプロマブペンデチド）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イットリウム９０にコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８））、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、ＬｅｕｋｏＳｃａｎ（スレソマブ（ｓｕｌｅｓｏｍａｂ））、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（アルシツモマブ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ））、Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ８７０および／またはナタリズマブである。一態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。別の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質を投与し、それによって免疫応答をモジュレートすることを含む方法を提供する。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、ＢＴＬＡシグナル伝達は増加する。別の態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。追加の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。さらなる態様では、対象はＢＴＬＡ関連疾患または障害を有する。ある特定の態様では、ＢＴＬＡ関連疾患は、がんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、細胞におけるＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートする方法であって、ＢＴＬＡ発現細胞を天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質と接触させ、それによってＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートすることを含む方法を提供する。１つでは、ＢＴＬＡシグナル伝達は増加する。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。別の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ＵＬ１４４のＢＴＬＡ結合表面の同定を示す。図１Ａは、変異した表面残基を示すヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４の画像を示す。図１Ｂは、示したＵＬ１４４変異体の結合曲線を示す。図１Ｃは、ＵＬ１４４タンパク質へのＢＴＬＡ−Ｆｃ結合のＫｄを示す。
【００１８】
【図２】図２Ａ〜Ｈは、ヒトリンパ腫でのＨＶＥＭ−リガンド結合変異体の同定を示す。図２Ａは、変異した表面残基を示すヒトＨＶＥＭの画像を示す。図２Ｂは、ＬＩＧＨＴで形質導入された細胞におけるＨＶＥＭ結合を示す。図２Ｃは、ＢＴＬＡ−Ｆｃで形質導入された細胞におけるＨＶＥＭ結合を示す。図２Ｄは、ＣＤ１６０−Ｆｃで形質導入された細胞におけるＨＶＥＭ結合を示す。図２Ｅは、ＨＶＥＭ変異体タンパク質へのＬＩＧＨＴ結合のＫｄを示す。図２Ｆは、ＨＶＥＭ変異体タンパク質へのＢＴＬＡ−Ｆｃ結合のＫｄを示す。図２Ｇは、ＨＶＥＭ変異体タンパク質へのＣＤ１６０−Ｆｃ結合のＫｄを示す。図２Ｈは、多数の個々のＤＬＢＣＬ生検を示し、各欄は１つのＤＬＢＣＬ試料を表す。
【００１９】
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ＨＶＥＭおよびＵＬ１４４がＢＴＬＡの同じ表面に結合することを示す。図３Ａは、ＢＴＬＡの２つの画像を示す。図３Ｂは、ヒトＨＶＥＭ−Ｆｃの注射の後の代表的トレースを示す。図３Ｃは、ヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４−Ｆｃの注射の後の代表的トレースを示す。図３Ｄは、ＢＴＬＡで形質導入したＢＪＡＢ細胞を抗ＢＴＬＡとインキュベートし、次にＨＶＥＭ−Ｆｃで染色したことを示す。図３Ｅは、ＢＴＬＡで形質導入し、抗ＢＴＬＡとインキュベートし、次にヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４−Ｆｃで染色したＢＪＡＢ細胞を示す。
【００２０】
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ＣＤ１６０がＢＴＬＡのＨＶＥＭ活性化を制限することを示す。図４Ａ〜Ｃは、示したＨＶＥＭリガンドで形質導入し、Ｆｃタンパク質のあるなしで抗ＣＤ３にカップリングしたマイクロスフェアと培養したＪＴＡｇ細胞を示す。図４Ａは、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）について染色した細胞を示す。図４Ｂは、ホスホ−ＺＡＰ７０／Ｓｙｋ（Ｙ３１９／Ｙ３５２）について染色した細胞を示す。図４Ｃは、ホスホ−チロシンについて染色した細胞を示す。
【００２１】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、選択的ＢＴＬＡアゴニストがＩＬ−２シグナル伝達を阻害することを示す。図５Ａは、ホスホ−ＪＡＫ１、ホスホ−ＳＴＡＴ５およびアクチンの全細胞抽出物のウェスタンブロットを示す。図５Ｂは、アクチンに正規化したバンド強度の定量化を示すグラフである。
【００２２】
【図６】図６Ａ〜Ｃは、新規の変異体ＨＶＥＭがＺＡＰ７０／Ｓｙｋ活性化を阻害することを示す。図６Ａ〜Ｃは、ＨＶＥＭリガンドで形質導入し、Ｆｃタンパク質のあるなしで抗ＣＤ３にカップリングしたマイクロスフェアと培養したＪＴＡｇ細胞を示す。図６Ａは、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）についての染色を示す。図６Ｂは、ホスホ−ＺＡＰ７０／Ｓｙｋ（Ｙ３１９／Ｙ３５２）についての染色を示す。図６Ｃは、ホスホ−ＳＨＰ２（Ｙ５４２）についての染色を示す。
【００２３】
【図７】図７Ａ〜Ｅは、ＢＴＬＡへのＵＬ１４４結合を生じる変異を示す。図７Ａは、ヒトＨＶＥＭおよびヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４の細胞外ドメインを示す。図７Ｂは、抗ＵＬ１４４（２Ｆ１１）で染色した野生型または変異したヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４で形質導入した２９３Ｔ細胞のヒストグラムを示す。図７Ｃは、ＬＩＧＨＴで染色した野生型もしくは変異したヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４またはＨＶＥＭで形質導入した２９３Ｔ細胞を示す。図７Ｄは、ＢＴＬＡ−Ｆｃで染色した野生型もしくは変異したヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４またはＨＶＥＭで形質導入した２９３Ｔ細胞を示す。図７Ｅは、ＣＤ１６０−Ｆｃで染色した野生型もしくは変異したヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４またはＨＶＥＭで形質導入した２９３Ｔ細胞を示す。
【００２４】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ヒトリンパ腫でのＨＶＥＭ−リガンド結合変異体の同定を示す。図８Ａは、ヒトＦＬおよびＤＬＢＣＬ生検で観察されたＴＮＦＲＳＦ１４変異（ドット）の要約を示す。図８Ｂは、抗ＨＶＥＭで染色した野生型または変異したヒトＨＶＥＭで形質導入した２９３Ｔ細胞を示す。
【００２５】
【図９】図９Ａ〜Ｆは、ＨＶＥＭおよびＵＬ１４４がＢＴＬＡの同じ表面に結合することを示す。図９Ａは、抗ＢＴＬＡによる６Ｆ４、Ｊ１６８またはＭＩＨ２６の比ＭＦＩ染色を示す。図９Ｂは、ＨＶＥＭ−ＦｃまたはＵＬ１４４−Ｆｃによる比ＭＦＩ染色を示す。図９Ｃは、ＨＶＥＭ−Ｆｃで染色した、ＢＴＬＡ単独を、またはＨＶＥＭもしくはヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４と一緒にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。図９Ｄは、ＣＭＶ  ＵＬ１４４−Ｆｃで染色した、ＢＴＬＡ単独を、またはＨＶＥＭもしくはヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４と一緒にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。図９Ｅは、ＢＴＬＡ−Ｆｃで染色した、ＨＶＥＭをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。図９Ｆは、ＢＴＬＡ−Ｆｃで染色した、ＨＶＥＭヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を示す。
【００２６】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ＣＤ１６０がＢＴＬＡのＨＶＥＭ活性化を制限することを示す。図１０Ａは、抗ヒトＢＴＬＡ（上）、抗ヒトＣＤ１６０（中央）またはＨＶＥＭ−Ｆｃで、続いて種特異的二次（下）で染色した、示したＨＶＥＭリガンドまたは対照ベクターで形質導入したＪＴＡｇ細胞を示す。図１０Ｂは、細胞内染色の前に、滴定されたＦｃタンパク質のあるなしで抗ＩｇＭにカップリングしたマイクロスフェアと培養したＢＪＡＢ細胞を示す。
【００２７】
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、選択的ＢＴＬＡアゴニストがＩＬ−２シグナル伝達を阻害することを示す。図１１Ａは、示したＦｃタンパク質で前処置した、ＰＢＭＣ中のＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６ｄｉｍおよびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現のパーセントを示すグラフである。図１１Ｂは、滴定されたＩＬ−２で刺激されたＮＫ９２細胞のウェスタンブロットを示す。図１１Ｃは、滴定されたＩＦＮ−βで刺激したＮＫ９２細胞のウェスタンブロットを示す。
【００２８】
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、新規の変異体ＨＶＥＭがＺＡＰ７０／Ｓｙｋ活性化を阻害することを示す。図１２Ａ〜Ｂは、示したＨＶＥＭリガンドで形質導入したＪＴＡｇ細胞を、Ｆｃタンパク質のあるなしで抗ＣＤ３にカップリングしたマイクロスフェアと培養したことを示す。図１２Ａは、ホスホ−ＮＦ−κＢについての染色を示す。図１２Ｂは、ホスホ−チロシンについての染色を示す。
【００２９】
【図１３】図１３Ａ〜Ｇは、多様な病原体関連のおよび新規の生体工学的に操作したＨＶＥＭ変異タンパク質ＢＴＬＡアゴニストが、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害することを示す。示したＨＶＥＭリガンドで形質導入したＪＴＡｇ細胞を、Ｆｃタンパク質のあるなしで抗ＣＤ３にカップリングしたマイクロスフェアと培養した。図１３Ａ〜Ｂは、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）についての染色を示す。図１３Ｃは、ホスホ−ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｓ５２９）についての染色を示す。図１３Ｄは、ホスホ−ＢＴＫ／ＩＴＫ（Ｙ５５１／Ｙ５１１）についての染色を示す。図１３Ｅは、ホスホ−ＰＬＣγ１（Ｙ７８３）についての染色を示す。図１３Ｆは、ホスホ−ＺＡＰ７０／Ｓｙｋ（Ｙ３１９／Ｙ３５２）についての染色を示す。図１３Ｇは、ホスホ−チロシンについての染色を示す。
【００３０】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、ＢＴＬＡアゴニストがＢ細胞シグナル伝達を阻害することを示す。ＢＪＡＢ細胞を、滴定されたＦｃタンパク質のあるなしで抗ＩｇＭにカップリングしたマイクロスフェアと培養した。図１４Ａは、１０分間の培養を示す。図１４Ｂは、６０分間の培養を示す。
【００３１】
【図１５】図１５Ａ〜Ｄは、ＢＴＬＡアゴニストがＢ細胞のインターフェロン活性化を阻害することを示す。対照免疫グロブリンまたはＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質にカップリングしたマイクロスフェアの存在下で、インターフェロン−βで刺激したヒトＢ細胞。図１５Ａは、ＨＶＥＭ−Ｆｃカップリング型のマイクロスフェアを示す。図１５Ｂは、ＵＬ１４４  Ｆｃカップリング型のマイクロスフェアを示す。図１５Ｃは、ＨＶＥＭＲ１０９ｗ  Ｆｃカップリング型のマイクロスフェアを示す。図１５Ｄは、ＨＶＥＭＲＴＷＡ  Ｆｃカップリング型のマイクロスフェアを示す。
【００３２】
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、選択的ＢＴＬＡアゴニストがＮＫ細胞でＩＬ−２シグナル伝達を制限することを示す。図１６Ａは、ホスホ−ＪＡＫ１、ホスホ−ＳＴＡＴ５およびアクチンの全細胞抽出物のウェスタンブロットを示す。図１６Ｂは、アクチンに正規化したバンド強度の定量化のグラフを示す。
【００３３】
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、マウスＨＶＥＭにおけるリガンド選択性の同定を示す。ＬＩＧＨＴ（ＢＴＬＡ／ＣＤ１６０−ｓｐ）またはＢＴＬＡおよびＣＤ１６０の両方（ＬＩＧＨＴ−ｓｐ）への結合をブロックした改変体を含むＨＶＥＭ−Ｆｃ変異タンパク質を、２９３Ｔ細胞に滴定した。図１７Ａは、ＣＤ１６０をトランスフェクトした細胞を示す。図１７Ｂは、マウスＢＴＬＡをトランスフェクトした細胞を示す。図１７Ｃは、マウスＬＩＧＨＴをトランスフェクトした細胞を示す。
【００３４】
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、選択的ＨＶＥＭ−Ｆｃが皮膚炎症をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することを示す。皮膚炎症のモデルとしてのイミキモド処置動物に、マウスＨＶＥＭ−Ｆｃ変異タンパク質を腹腔内に注射した。図１８Ａは、組織学的分析を示す。図１８Ｂ〜Ｃは、表皮の肥厚を示す。
【００３５】
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、ヒトＨＶＥＭの核酸およびアミノ酸配列を示す。図１９Ａは、ヒトＨＶＥＭの核酸配列を示す。図１９Ｂは、ヒトＨＶＥＭのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質が免疫応答をモジュレートするという有力な発見に基づく。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡシグナル伝達を強化するＢＴＬＡに結合する融合タンパク質を提供する。本発明は、がんならびに免疫性および炎症性疾患および障害を本明細書に記載されるＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質で処置する方法をさらに提供する。
【００３７】
本組成物および方法を記載する前に、記載される特定の組成物、方法および実験条件は変更することができるので、この発明はそのような組成物、方法および条件に限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲だけにおいて限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することだけのためであり、限定するものではないことも理解すべきである。
【００３８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記載する。下に示す定義は、本開示の理解のためであるが、当業者が抱く用語の理解に代わるものであると考えてはならない。
【００３９】
この明細書および添付の特許請求の範囲で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば「方法」への言及には、この開示その他を読むことによって当業者に明らかになる、本明細書に記載されるタイプの１つまたは複数の方法および／またはステップが含まれる。
【００４０】
抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、およびその他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインに整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインに整列する。軽鎖と重鎖の可変ドメインの間で、特定のアミノ酸残基が界面を形成すると考えられている。各可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含み、可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは４つのＦＲ領域を各々含み、その多くはβシート構成を採用し、３つのＣＤＲによって接続され、それらは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲによって非常に近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接的に関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００４１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従い、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
【００４２】
抗体のＦｃ領域は、細胞表面受容体および補体系の一部のタンパク質と相互作用する、抗体のテール領域である。この特性は、抗体が免疫系を活性化することを可能にする。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体のアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片で構成される。ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含有する。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を有する。Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ受容体媒介活性のために必須である。この部位に付着するＮ−グリカンは、主に複合タイプのコアフコシル化二分岐（ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造である。さらに、少量のこれらのＮ−グリカンは、二分するＧｌｃＮＡｃおよびα−２，６連結シアル酸残基も有する。
【００４３】
本明細書で使用する用語「抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体断片を指す。
【００４４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合性または可変性の領域を含む。抗体断片の例には、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）など；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれる。
【００４５】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量存在するかもしれない可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、各モノクローナル抗体は、抗原の上の単一の決定因子に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって、組換えＤＮＡ方法によって作製するか、またはファージ抗体ライブラリから単離することができる
【００４６】
用語「融合分子」および「融合タンパク質」は互換的に使用され、さらなるエフェクター分子、通常組換え、化学的または他の適する方法によって共有結合的に連結した（すなわち、融合した）タンパク質またはペプチド配列のあるなしの生物学的に活性なポリペプチド、例えばＨＶＥＭまたは抗体もしくはその断片（例えば、Ｆｃ領域）を指すものである。所望により、融合分子は、ペプチドリンカー配列を通して１つまたはいくつかの部位で融合させることができる。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子の構築を支援するために使用することができる。具体的には、好ましい融合分子は融合タンパク質である。一般的に、融合分子は、コンジュゲート分子を含むこともできる。
【００４７】
Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃキメラ融合タンパク質、Ｆｃ−Ｉｇ、Ｉｇをベースとしたキメラ融合タンパク質およびＦｃ−タグタンパク質としても公知である）は、目的のペプチドまたはタンパク質に遺伝子的に連結されたＩｇＧのＦｃドメインで構成される。Ｆｃ融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のための価値ある試薬になっている。
【００４８】
Ｆｃ融合結合パートナーは、単一のペプチドから、細胞表面受容体との結合後に活性化するリガンド、シグナル伝達分子、二量体化の後に活性化される、またはタンパク質マイクロアレイにおける結合パートナーを同定するために使用されるベイトタンパク質としての受容体の細胞外ドメインと様々であってよい。
【００４９】
Ｆｃドメインのｉｎ  ｖｉｖｏで最も価値ある特徴の１つは、それが目的のタンパク質の血漿中半減期を劇的に延長することができることであり、そのことは生物治療薬のために、改善された治療的効能をもたらし；それは、Ｆｃ融合タンパク質を魅力的な生物治療剤にしている属性である。
【００５０】
Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質および薬学的に許容される担体賦形剤または担体を含む医薬組成物の一部であってよい。薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤は当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年））。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；単糖、二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。
【００５１】
本明細書で使用するように、用語「免疫応答をモジュレートする」は、免疫応答を強化または阻害することを指す。一部の態様では、本発明の融合タンパク質は、免疫応答を阻害または低減する。
【００５２】
本明細書で使用するように、用語「ＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートする」は、ＢＴＬＡシグナル伝達を増加または減少させることを指す。一部の態様では、本発明の融合タンパク質は、ＢＴＬＡシグナル伝達を増加する。
【００５３】
本明細書で使用するように、用語「処置する」または「処置」または「軽減」は、治療的処置、予防措置的および／または予防的手段を指し、ここで、目的は標的化病的状態または障害を予防または遅くする（少なくする）ことである。処置を必要とする者には、障害を既に有する者だけでなく、障害を起こしやすい者または障害を予防すべき者が含まれる。
【００５４】
本明細書で使用するように用語「治療剤」は、患者または対象に投与されるときに所望の治療効果を誘導することが可能な化合物または組成物を含む。本発明の治療剤の一例は、ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質である。
【００５５】
本明細書で使用するように、疾患を処置するために使用される薬物の「有効量」または「治療有効量」という用語は、疾患の重症度を低減すること、疾患もしくはその処置に関連した１つもしくは複数の症状の重症度を低減すること、または、処置した状態の後に多少の頻度で起こることがあるより重篤な症状もしくはより重篤な疾患の開始を遅延させることができる量である。明記された目的に関して、「有効量」は経験的に、および慣例的な方法で決定することができる。
【００５６】
治療剤は、対象を処置するために、局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、静脈内および／または病変内投与を含む任意の適する手段によって投与することができる。しかし、例示的な実施形態では、治療剤は局所適用のために、例えば液体、クリーム、ゲル、軟膏、フォームスプレーなどの形で製剤化される。
【００５７】
本明細書で使用するように、用語「ＢＴＬＡ関連障害」または「ＢＴＬＡ関連疾患」は、ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質による処置が有益であろう任意の状態を指す。ＢＴＬＡアゴニスト融合タンパク質処置が有益であろう疾患および障害の例には、がん、免疫性、自己免疫性および炎症性疾患および障害が含まれる。
【００５８】
免疫性疾患または障害は、免疫系の機能不全である。これらの障害は、いくつかの異なる方法で特徴付けることができる：影響を受ける免疫系の構成要素（複数可）によって；免疫系が過敏性であるかまたは不活発であるかによって、および状態が先天性であるかまたは後天性であるかによって。自己免疫性疾患は、体に通常存在する物質および組織に対する体の異常な免疫応答（自己免疫）から生じる。自己免疫性疾患の基礎をなす病態生理の主要な理解は、自己免疫性疾患の間の遺伝子共有の著しい程度を同定したゲノムワイド関連スキャンの適用であった。
【００５９】
自己免疫性障害には、限定されずに、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛、筋萎縮性側索硬化症（別名ルーゲーリック病）、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗シンテターゼ症候群、アトピー性アレルギー、アトピー皮膚炎、自己免疫性無形成性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性ポリエンドクリン症候群（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円硬化症、ベーチェット病、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、慢性閉塞性肺疾患、慢性再発性多病巣性骨髄炎、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、補体成分２欠乏、接触性皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、ドゴー病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、散在性皮膚全身性硬化症、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、薬物性ループス、湿疹、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型寒冷グロブリン血、エバンズ症候群、進行性骨化性線維形成異常症、線維化性肺胞炎（または、特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名、妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、ヒューズ−ストービン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性の血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋肉炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート−イートン筋無力症症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患、ルポイド肝炎、別名、自己免疫肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、ミラー−フィッシャー症候群、混合型結合組織病、限局性強皮症、ムハ−ハーバーマン病、別名、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋肉炎、メニエール病、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、眼の瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌス筋クローヌス症候群、オードの甲状腺炎（Ｏｒｄ’ｓ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連した小児自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴小脳変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、扁平部炎、パーソナージ−ターナー症候群、尋常天疱瘡、静脈周囲の脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多筋痛、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原��性硬化性胆管炎、進行性の炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、ラスムセン脳炎、レイノー現象、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、全身硬直症候群、スチル病、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スイート症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少、トロサ−ハント症候群、横断脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用するように用語「免疫モジュレータ」は、免疫系をモジュレートする任意の治療剤を指す。免疫モジュレータの例には、エイコサノイド、サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、ケモカイン、チェックポイント調節因子、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーおよびインターフェロンが含まれる。免疫モジュレータの具体例には、ＰＧＩ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−ε、ＩＮＦ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤ１Ｌ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２００、ＣＤ５２、ＬＴα、ＬＴαβ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ｏｘ４０Ｌ、Ａｐｒｉｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＡＰＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、Ｆａｓ、Ｏｘ４０、ＡＩＴＲ、ＤＲ３、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、Ｆｎ１４、ＣＤ４０、ＥＤＡＲ  ＸＥＤＡＲ、ＤＲ６、ＤｃＲ３、ＮＧＦＲ−ｐ７５、およびＴａｊが含まれる。免疫モジュレータの他の例には、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｉｍｚｉａ）、エンテラセプト（ｅｎｔｅｒａｃｅｐｔ）（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｚｉｍａｂ）（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｅｂｉｆ、ＲｅｃｉＧｅｎ、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、ＢＧ１２、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａおよびアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）が含まれる。
【００６１】
がんは、体の他の部分に侵入または拡散する潜在性を有する、異常な細胞増殖を含む一群の疾患である。国立がん研究所によって記載される例示的ながんには、以下のものが含まれる：急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ＡＩＤＳ関連悪性疾患；肛門がん；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児脳；胆管がん、肝臓外；膀胱がん；膀胱がん、小児；骨がん、骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児；脳腫瘍、上衣細胞腫、小児；脳腫瘍、髄芽細胞腫、小児；脳腫瘍、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；脳腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、小児；脳腫瘍、小児（他）；乳がん；乳がんおよび妊娠；乳がん、小児；乳がん、男性；気管支腺腫／カルチノイド、小児：カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；癌腫、副腎皮質；癌腫、島細胞；未知原発性の癌腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児；子宮頸がん；小児がん；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸がん；結腸直腸がん、小児；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮体がん；上衣細胞腫、小児；上皮がん、卵巣；食道がん；食道がん、小児；腫瘍のユーイングファミリー；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管がん；目のがん、眼内メラノーマ；目のがん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃部（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん；胃部（胃）がん、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠期栄養膜腫瘍；神経膠腫。小児期脳幹；神経膠腫。小児期視覚路および視床下部；毛様細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん、成人（原発性）；肝細胞（肝臓）がん、小児（原発性）；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；妊娠中のホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視覚路神経膠腫、小児；眼内メラノーマ；島細胞癌（内分泌膵臓）；カポジ肉腫；腎臓がん；喉頭がん；喉頭がん、小児；白血病、急性リンパ芽球、成人；白血病、急性リンパ芽球、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、毛様細胞；唇および口腔がん；肝がん、成人（原発性）；肝がん、小児（原発性）；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ球性白血病、慢性；リンパ腫、ＡＩＤＳ関連；リンパ腫、中枢神経系（原発性）；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン；小児；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；リンパ腫、非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；男性乳がん；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；悪性胸腺腫；髄芽細胞腫、小児；メラノーマ；メラノーマ、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；不顕性原発性の転移性扁平上皮頸部がん；多発性内分泌腫瘍症候群、小児；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；鼻咽頭がん、小児；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺がん；口のがん、小児；口腔および口唇がん；口腔咽頭がん；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん、小児；卵巣上皮がん；卵巣の胚細胞腫瘍；境界悪性卵巣腫瘍；膵臓がん；膵臓がん、小児、膵臓がん、島細胞；副鼻腔および鼻腔がん；副甲状腺がん；陰茎がん；褐色細胞腫；松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；妊娠および乳房のがん；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝がん、成人；原発性肝がん、小児；前立腺がん；直腸がん；腎臓細胞（腎臓）がん；腎臓細胞がん、小児；腎盤および尿管、移行細胞がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺がん；唾液腺がん、小児；肉腫、腫瘍のユーイングファミリー；肉腫、カポジ；肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児；セザリー症候群；皮膚がん；皮膚がん、小児；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児；不顕性原発性の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（胃部）がん；胃（胃部）がん、小児；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；精巣がん；胸腺腫、小児；胸腺腫、悪性；甲状腺がん；甲状腺がん、小児；腎盤および尿管の移行細胞がん；栄養膜腫瘍、妊娠期；未知の原発部位、がんの、小児；小児期の稀ながん；尿管および腎盤、移行細胞がん；尿道がん；子宮肉腫；膣がん；視覚路および視床下部神経膠腫、小児；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍。
【００６２】
本明細書で使用するように用語「化学療法剤」は、がんを処置するために使用される任意の治療剤を指す。化学療法剤の例には、限定されずに以下のものが含まれる：アクチノマイシン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パニツママブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、デノスマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、リツキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオキソガミシン）、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリキシマブ）、ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ（テクネチウム（９９ｍＴｃ）ファノレソマブ）、トシリズマブ、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（インジウム−ＩＩＩ標識カプロマブペンデチド）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イットリウム９０にコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８））、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、ＬｅｕｋｏＳｃａｎ（スレソマブ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（アルシツモマブ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（ノフェツモマブ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ８７０およびナタリズマブである。
【００６３】
本発明の融合タンパク質は、例えば、免疫モジュレータまたは化学療法剤と併用することができる。本発明の融合タンパク質による処置は、例えば、免疫モジュレータまたは化学療法剤などの他の処置の前、後、またはそれと実質的に同時を含む。
【００６４】
免疫系は、疾患から保護する、生体内の生物学的構造および過程の系である。この系は、体を病原体および他の外来物質から保護し、感染したおよび悪性の細胞を破壊し、細胞残渣を取り除く、相互作用する細胞、細胞生成物および細胞形成組織の散在性の複雑なネットワークである。系は、胸腺、脾臓、リンパ節およびリンパ組織、幹細胞、白血球、抗体ならびにリンホカインを含む。Ｂ細胞またはＢリンパ球は、適応性免疫系の体液性免疫におけるリンパ球のタイプであり、免疫監視機構にとって重要である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫で中心的役割を演ずるリンパ球のタイプである。Ｔ細胞の２つの主要なサブタイプがある：キラーＴ細胞およびヘルパーＴ細胞。さらに、免疫応答をモジュレートする役割を有するサプレッサーＴ細胞がある。キラーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子にカップリングした抗原だけを認識し、ヘルパーＴ細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子にカップリングした抗原だけを認識する。抗原提示のこれらの２つの機構は、２つのタイプのＴ細胞の異なる役割を反映する。第３のマイナーなサブタイプは、ＭＨＣ受容体に結合していないインタクトな抗原を認識するγδＴ細胞である。対照的に、Ｂ細胞抗原特異的受容体は、Ｂ細胞表面の抗体分子であり、抗原プロセシングを必要とせずに完全な病原体を認識する。Ｂ細胞の各系統は異なる抗体を発現し、したがってＢ細胞抗原受容体の完全なセットは、体が製造することができる全ての抗体を表す。
【００６５】
ＢおよびＴ細胞アテニュエータ（ＢＴＬＡまたはＣＤ２７２）は、免疫系の不可欠の部分である。ＢＴＬＡ発現はＴ細胞の活性化の間に誘導され、ＢＴＬＡはＴｈ１細胞の上で発現されたままであるがＴｈ２細胞ではそうでない。プログラム細胞死１（ＰＤ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）のように、ＢＴＬＡは阻害経路を活性化し、Ｔ細胞活性化を調節する。しかし、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４と異なり、ＢＴＬＡは細胞表面受容体のＢ７ファミリーでなく腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）との相互作用を通してＴ細胞阻害を提示する。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）としても公知の腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドである。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。
【００６６】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦＲＳＦ）ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）（ＴＮＦＲＳＦ１４）は、正規のＴＮＦ関連リガンド、リンフォトキシン−α（ＬＴ−α）およびＬＩＧＨＴに結合する。しかし、ＨＶＥＭの際立った特徴は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）ならびにＣＤ１６０の関与である。異なる構成の複数のリガンドと相互作用するＨＶＥＭの能力は、固有で双方向性のシグナル伝達経路の機能的に多様なセットを形成する。これらの異なるリガンドに結合する能力は、ＨＶＥＭの細胞外ドメイン中の２つの異なる組織分布的領域（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に存在する。これらの異なる部位は、炎症促進性および阻害性経路の両方を活性化するＨＶＥＭの能力を付与する。ＨＶＥＭはいくつかのシグナル伝達経路と関連しているので、それがＴ細胞同時刺激、樹状細胞（ＤＣ）ホメオスタシスの調節、自己免疫媒介炎症応答ならびに病原体に対する宿主防御などの免疫系で重要な役割を演ずることは意外でない。ＨＶＥＭは免疫系の外でも、感覚ニューロン発生および脂肪細胞代謝の調節において有意な役割を演ずることができる。ヒトＨＶＥＭタンパク質は、２８３アミノ酸（配列番号２）を有する。細胞外ドメインは、１６４アミノ酸残基、例えばアミノ酸３９〜２０２を含む。本発明の融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質（配列番号２）の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０またはそれを超える残基を含む。本発明の融合タンパク質は、例えば、ＨＶＥＭタンパク質（配列番号２）のアミノ酸残基１〜２８３、１〜２０２、１〜１８４、１〜１６１、３９〜２０２または３９〜１６１を含むことができる。
【００６７】
本明細書で使用するように、用語「天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質」は、少なくとも１つまたは複数の変異を含有するＨＶＥＭタンパク質（配列番号２、図１９Ｂ）を指す。本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せを含む。本発明の融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの追加の変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せを含む。本発明の融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはそれらの組合せを含むことができる。本発明の融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｇ６８Ｔ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ７０Ｗ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。
【００６８】
ＢＴＬＡは、ＨＶＥＭと相互作用するために異なる表面を使用する。ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路は、免疫寛容の維持および自己免疫性疾患の予防において重要な役割を演ずる。ＢＴＬＡ欠損マウスは、関節リウマチ、リンパ球浸潤、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）様疾患およびＥＡＥを起こす。ＨＶＥＭ欠損マウスは、ＭＯＧペプチド誘導ＥＡＥへの感受性の増加、ならびに増加したＴ細胞増殖およびサイトカイン生成を示す。アンタゴニストＨＶＥＭ−Ｉｇは、ＤＢＡ１バックグラウンドマウスでコラーゲン誘導関節炎において自己免疫を悪化させる。したがって、活性化Ｔ細胞でのＢＴＬＡの強制的発現は、自己免疫性疾患の処置のための有望な戦略になるだろう。
【００６９】
腫瘍免疫に関して、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＢＴＬＡを持続的に発現するようである。ＣｐＧワクチン接種は腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でＢＴＬＡの発現を部分的に下方制御し、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ媒介阻害シグナルをブロックすると報告されている。ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路をブロックすることはエフェクターＴ細胞機能を強化する手段として妥当であるようであるが、ＨＶＥＭ相互作用分子の複雑性に注意深く注目すべきである。ＩｇＳＦ阻害性受容体のＣＤ１６０も、ＨＶＥＭに結合する。さらに、ＴＮＦファミリーメンバーＬＩＧＨＴは、ＨＶＥＭとの係合の際に共刺激シグナルを送達する。これらの複数の経路は、悪性疾患のために新規の治療的介入を確立することを困難にする。
【００７０】
ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路の操作は、感染症患者を処置するための有望な戦略になることができる。ＢＴＬＡは、マウスでＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ感染の間に誘導され、抗ＢＴＬＡアンタゴニストｍＡｂは、原生動物によって引き起こされる大脳マラリアの発病率を有意に低減する。したがって、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路を混乱させる病原体は、抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ免疫療法の理想的な標的となることができる。
【００７１】
阻害性受容体シグナル伝達の成功裏の活性化は、活性化受容体−リガンド構成と類似する、活性化状態の阻害性受容体の構成に係合する受容体アゴニストの能力に依存する。抗体の形の受容体アゴニストは、この活性化構成を促進して強化されたＢＴＬＡシグナル伝達をもたらすことができるＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）などの、阻害性受容体の特定のエピトープに係合する。これらの抗体のエピトープは、ＢＴＬＡ受容体ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）の結合部位と重ならない。これらの抗体は、ＢＴＬＡ細胞質ドメインのリン酸化、ならびに、ＳＨＰ１および２、活性化マーカーとしてＢＴＬＡの細胞質ドメインに動員される他のシグナル伝達タンパク質を含む関連タンパク質の動員およびリン酸化を活性化することによってシグナル伝達を強化するよう機能する。ＢＴＬＡの下流での阻害性シグナル伝達の活性化は、Ｔ細胞でのＴ細胞受容体およびＢ細胞でのＢ細胞受容体の下流で正常なシグナルトランスダクション経路を負に調節すると予測される。さらに、ＢＴＬＡ阻害性シグナル伝達は、γδＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの生得的細胞において、ＩＬ−７およびＩ型インターフェロンサイトカインシグナル伝達を負に調節する。
【００７２】
β−ヘルペスウイルスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、そのゲノムの多くを宿主免疫応答の回避に充て、これらの遺伝子の多くは、潜伏感染の確立に向けてウイルスが進行するに従って使用される。ＣＭＶは、ＢＴＬＡに結合してＴ細胞増殖をＨＶＥＭより大きな程度で阻害する、ＨＶＥＭ（ＯＲＦ  ＵＬ１４４）の模倣物を発現する。ＵＬ１４４はＨＶＥＭ受容体ＣＤ１６０に結合せず、ＮＫ細胞活性化を回避することが最近示された。細胞溶解性細胞の活性化はがんに対する免疫応答でも重大であり、免疫認識経路に変異を有する腫瘍はより攻撃的な腫瘍増生および死亡率と関連する。ヒト濾胞性リンパ腫（ＦＬ）では、最も一般的な二次性変異はＴＮＦＲＳＦ１４で起こり、散在性の大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）でもＴＮＦＲＳＦ１４が頻繁に変異を起こし、遺伝子欠失または発現の喪失をもたらす。しかし、リンパ腫のサブセットでは、いくつかの変異がＨＶＥＭリガンド結合に影響を与えると予測された。これらの変異または変更されたリガンド相互作用が腫瘍微小環境の中でリンパ腫適応度にどのように影響することができるかは依然として不明である。
【００７３】
ウイルスのＵＬ１４４タンパク質と類似して、いくつかのリンパ腫ＨＶＥＭ変異体は、ＣＤ１６０結合なしでＢＴＬＡへのリガンド選択を示す。ＣＤ１６０の発現は、ＢＴＬＡとの野生型ＨＶＥＭの係合およびＴ細胞受容体シグナル伝達の阻害を阻止する。対照的に、ウイルスおよび変異体ＨＶＥＭで誘発されるＢＴＬＡ活性化は、ＣＤ１６０発現によって妨害されない。最後に、ＢＴＬＡ活性化が、ＣＤ１６０発現ＮＫ細胞で転写のサイトカイン誘導シグナルトランスデューサおよび活性化因子（ＳＴＡＴ）リン酸化を阻害すること、ならびにウイルスのＵＬ１４４タンパク質が野生型ＨＶＥＭより強力にサイトカインシグナル伝達を阻害することが判明した。したがって、リガンド競合はＨＶＥＭが阻害性シグナルに均一に係合することを妨げ、リガンド選択性はウイルスおよび変異体ＨＶＥＭが阻害機能を固有に駆動することを可能にし、ＢＴＬＡ選択的アゴニストの発生に向けての経路を示す。まとめると、これらのデータは、感染症およびがんで阻害性および制限性炎症性シグナル伝達を促進する、ＣＭＶでのＵＬ１４４の進化への、ならびにリンパ腫での体細胞性ＴＮＦＲＳＦ１４変異の獲得のための潜在的選択圧を示す。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質を含む融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。
【００７５】
追加の実施形態では、本発明は、融合タンパク質、例えば天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、ＢＴＬＡ関連障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質を投与し、それによってＢＴＬＡ関連障害を処置することを含む方法を提供する。一態様では、ＢＴＬＡ関連障害は、がんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である。追加の態様では、自己免疫性疾患または障害は、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、クッシング症候群、真性糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、ギランバレー症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性エリテマトーデス、移植拒絶または血管炎である。別の態様では、がんは、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部または尿生殖器管である。さらなる態様では、ＢＴＬＡシグナル伝達が増加する。別の態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。
【００７７】
一態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。追加の態様では、融合タンパク質は配列番号２のアミノ酸残基３９〜１６１およびＦｃタンパク質を含む。さらなる態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。ある特定の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異は、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。一態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。
【００７８】
一態様では、本方法は、免疫応答モジュレータまたは化学療法剤を投与することも含む。別の態様では、免疫応答モジュレータは、エイコサノイド、サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、ケモカイン、チェックポイント調節因子、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーおよび／またはインターフェロンである。追加の態様では、免疫応答モジュレータは、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２０、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤ１Ｌ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２００、ＣＤ５２、ＬＴα、ＬＴαβ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ｏｘ４０Ｌ、Ａｐｒｉｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＡＰＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、Ｆａｓ、Ｏｘ４０、ＡＩＴＲ、ＤＲ３、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、Ｆｎ１４、ＣＤ４０、ＥＤＡＲ  ＸＥＤＡＲ、ＤＲ６、ＤｃＲ３、ＮＧＦＲ−ｐ７５、および／またはＴａｊである。ある特定の態様では、免疫応答モジュレータは、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｉｍｚｉａ）、エンテラセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｋｉｎｅｒｅｔ、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｅｂｉｆ、ＲｅｃｉＧｅｎ、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、ＢＧ１２、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａおよび／またはアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）である。
【００７９】
さらなる態様では、化学療法剤は、アクチノマイシン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パニツママブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、デノスマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、リツキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオキソガミシン）、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリキシマブ）、ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ（テクネチウム（９９ｍＴｃ）ファノレソマブ）、トシリズマブ、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（インジウム−ＩＩＩ標識カプロマブペンデチド）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イットリウム９０にコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８））、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、ＬｅｕｋｏＳｃａｎ（スレソマブ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（アルシツモマブ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（ノフェツモマブ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ８７０および／またはナタリズマブである。一態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。別の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。
【００８０】
さらなる実施形態では、本発明は、対象で免疫応答をモジュレートする方法であって、対象に天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質を投与し、それによって免疫応答をモジュレートすることを含む方法を提供する。一態様では、融合タンパク質はＢＴＬＡアゴニストである。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、ＢＴＬＡシグナル伝達は増加する。別の態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。追加の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。さらなる態様では、対象はＢＴＬＡ関連疾患または障害を有する。ある特定の態様では、ＢＴＬＡ関連疾患は、がんまたは自己免疫性疾患もしくは障害である。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、細胞でＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートする方法であって、ＢＴＬＡ発現細胞を天然に存在しないＨＶＥＭタンパク質およびＦｃタンパク質などの融合タンパク質と接触させ、それによってＢＴＬＡシグナル伝達をモジュレートすることを含む方法を提供する。１つでは、ＢＴＬＡシグナル伝達は増加する。別の態様では、融合タンパク質は、ＨＶＥＭタンパク質の細胞外ドメインおよびＦｃタンパク質を含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異を含む。追加の態様では、変異はＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せである。追加の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せをさらに含む。別の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異、例えばＳ５８Ｒ、Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｑ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｗ、Ｌ９０Ａまたはその組合せを含む。ある特定の態様では、融合タンパク質はＨＶＥＭタンパク質に少なくとも１つの変異、例えばＳ５８Ｒ；Ｓ５８Ｋ；Ｓ５８Ｑ；Ｌ７０Ｄ；Ｌ７０Ｅ；Ｌ７０Ｎ；Ｌ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８ＲおよびＧ６８Ｔ；Ｓ５８ＲおよびＬ７０Ｗ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８ＴおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａ；Ｓ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＤおよびＬ９０Ａ；またはＳ５８Ｒ、Ｇ６８Ｔ、Ｌ７０ＷおよびＬ９０Ａを含む。一態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。別の態様では、Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。具体的な態様では、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質はヒトのものである。一態様では、ＥＲＫ１／２および／またはＺＡＰ７０／Ｓｙｋのリン酸化が低減される。別の態様では、全体の細胞リン酸化およびＳＨＰ２のリン酸化が誘導される。
【００８２】
本発明は、全てのその態様において、以下の実施例でさらに例示される。しかし、実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
ＨＶＥＭに相同性のＵＬ１４４残基は、ＢＴＬＡへの結合のために必要とされる
ヒトＣＭＶにコードされたＵＬ１４４は、ＢＴＬＡに選択的に結合するがＣＤ１６０には結合せず、ＨＶＥＭタンパク質より高い程度でＴ細胞受容体シグナル伝達によって活性化されるＴ細胞増殖を阻害する。ＵＬ１４４によるＢＴＬＡへの選択がこれらの２つのタンパク質の表面の間での固有の相互作用からもたらされたかどうか決定するために、ＵＬ１４４のＢＴＬＡ接触面の構造を、以前に解かれたＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ共結晶上でモデル化した（図１Ａ）。次に、潜在的ＢＴＬＡ結合表面をスクリーニングするアラニンおよび相同性走査変異誘発によってＨＶＥＭから発散していた、ＵＬ１４４表面残基を標的化した（図１）。いくつかのＵＬ１４４残基の変異が、ＨＶＥＭのＢＴＬＡ結合表面と類似のＣＲＤ１領域の１つの面に中心をおいた表面を画定するＢＴＬＡの結合を破壊または低減することが観察された。表面に発現されることが実証された最も重大な変異は、Ｇｌｙ４１およびＴｙｒ４２で起こり、ＨＶＥＭでのＧｌｙ６０およびＴｙｒ６１に相同的である（図７）。ＵＬ１４４での相同性走査変異のいずれも、ＣＤ１６０またはＴＮＦＳＦリガンドＬＩＧＨＴへのさらなるリガンド結合を明らかにしなかったが、Ｇ４６ＫおよびＮ６１Ａ変異体はＢＴＬＡへの結合を強化した（図１Ｂ、Ｃおよび図７）。したがって、いかなる単一の変異もＵＬ１４４タンパク質へのＣＤ１６０結合を回復せず、おそらくＣＭＶが複数の遺伝子改変を通してＢＴＬＡ結合を選択するようにＵＬ１４４を進化させたことを示す。特異的残基がＢＴＬＡ結合に影響を与える：Ｇｌｕ２７、Ｇｌｎ３３、Ｐｒｏ３６、Ｇｌｙ４１、Ｔｙｒ４２、Ｔｈｒ５２、Ｌｅｕ６８が、必要とされるようである；Ａｒｇ４３、Ｔｈｒ４５は結合を低減した；Ａｓｎ３２、Ｇｌｎ４７、Ｇｌｙ４９、Ｇｌｎ５０は、影響がないようである；Ｇｌｙ４６、Ａｓｎ６１は結合を増加させる。
【００８４】
細胞および表面タンパク質発現：ＥＬ４および２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、抗生物質、Ｌ−グルタミンおよび５０μＭ  ２−ＭＥを含むＤＭＥＭで維持した。ＮＫ９２細胞は、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を追加した８％熱不活化ＦＢＳ、８％ウマ血清、抗生物質、Ｌ−グルタミンおよび５０μＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩで維持した。ＢＪＡＢおよびＪｕｒｋａｔ  ＴＡｇ（ＪＴＡｇ）細胞は、１０％熱不活化ＦＢＳ、抗生物質、Ｌ−グルタミンおよび５０μＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩで維持した。ＢＴＬＡ発現細胞の頻度を増加させるために、野生型および変異体ヒトＢＴＬＡを含有するレトロウイルスで形質導入したＥＬ４細胞およびＢＪＡＢ細胞（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００３年）；Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４巻：６７０頁）をＧＦＰ発現について選別した。以前に記載されるように（Ｓｅｄｙら（２００５年）、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ６巻：９０頁）、レトロウイルスプラスミド、ｐＣＧ  ＶＳＶｇエンベロープタンパク質およびＨｉｔ６０  ｇａｇ−ｐｏｌの同時トランスフェクションによって、偽型化した単一の感染レトロウイルスを生成した。ＵＬ１４４およびＢＴＬＡ変異体は、ｒｏｕｎｄ−ｔｈｅ−ｗｏｒｌｄのＰＣＲ変異誘発によって生成した。変異体または野生型ＵＬ１４４を含有するｐＮＤベクターによるリン酸カルシウムトランスフェクションによって形質導入した２９３Ｔ細胞を、Ｆｃ結合研究のために使用した。ＰＣＲ増幅および部位特異的変異誘発のために使用された全てのオリゴヌクレオチドは、表１に掲載する。ＪＴＡｇでのＨＶＥＭリガンドの一時的発現のために、Ｔ８２０矩形波エレクトロポレータを使用して２３０Ｖで６５ｍｓの間、細胞を、対照ベクターを含む示したＤＮＡ構築物の１０μｇでエレクトロポレーションした。
【００８５】
抗体およびＦｃ融合タンパク質：抗ヒトＨＶＥＭは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのものであった。抗ヒトＢＴＬＡ抗体クローンＭＩＨ２６およびＪ１６８は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られた。抗ヒトＢＴＬＡクローン６Ｆ４および抗ＵＬ１４４クローン２Ｆ１１は、以前に記載されるように生成した（Ｃｈｅｕｎｇら（２００５年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ１０２巻：１１３１８頁；Ｃｈｅｕｎｇら（２００９年ａ）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１８３巻：７２８６頁）。ロバ抗ヒトＦｃγおよび抗ＦｃμＦ（ａｂ’）２は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈからのものであった。ヒトＰＢＭＣ集団を同定する抗体には、ＣＤ１９  ＦＩＴＣ、ＣＤ５６  ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８  ＰＥ、ＣＤ３  ＰＥ６１０、ＣＤ４  ｅＦｌｕｏｒ４５０およびＣＤ６９  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５が含まれる。ホスホ特異的抗体には、ホスホ−チロシンＰＥ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）ＰＥ、およびホスホ−ＳＨＰ−２（Ｙ５４２）Ａｌｅｘａ６４７、ホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）ＰｅｒＣＰ−ｅ７１０およびホスホ−ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｓ５２９）ＰＥが含まれる。Ｆｃ融合タンパク質は、以下の通りに設計し、生成した：ヒトＨＶＥＭの天然のシグナル配列を含む外部ドメイン（残基１〜１８４）を、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列に３’末端で融合した。ヒトＢＴＬＡおよびＣＭＶ  ＵＬ１４４のために、残基２６〜１５０および１９〜１３２を、ヒトＩｇシグナル配列に５’末端でおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に３’末端でそれぞれ融合した。ＣｅｌｌＧｒｏ  Ｆｒｅｅ無血清培地で増殖させたトランスフェクトした２９３Ｔ細胞でＦｃ融合タンパク質を生成し、プロテインＡカラムの上で親和性クロマトグラフィーによって精製した。対照ヒトＩｇＧ１タンパク質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。以下の通りに３回の変異誘発を通して、ＢＴＬＡ選択的ＨＶＥＭ変異体タンパク質を新規に工学的に操作した：先ず、リガンド結合性ホットスポットを同定するための表面曝露残基のアラニン変異誘発；第２に、リガンド結合の標的化を最適化するためのホットスポットでの飽和変異誘発；第３に、ＢＴＬＡ選択性を達成して親和性を強化するためのコンビナトリアル変異誘発。
【００８６】
結合アッセイ：以前に記載されるように（Ｓｅｄｙら、２０１３年）、フローサイトメトリー結合アッセイを実行した。簡潔には、細胞を緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中の氷上で３０分間Ｆｃリガンドとインキュベートし、２回洗浄し、緩衝液中の氷上で１５分間抗Ｆｃ二次とインキュベートし、２回洗浄し、分析した。実験の細胞性ＭＦＩを対照の細胞性ＭＦＩから引き算することによって、比平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。
【００８７】
表面プラズモン共鳴動態親和性測定：アミンカップリングを使用して、ヒトＢＴＬＡ−Ｆｃリガンドを１５０応答単位までＣＭ５センサーチップの上に固定化した。流速３０μｌ／分、２５℃でセンサグラムを収集した。リガンドチャネルからの対照の減算によって、特異的結合を決定した。示した濃度の分析物を、７℃に冷却したバイアルから注射した。データ収集は、３分間の９０μｌ分析物と、続く１５分間の解離を含む。各サイクルの後の再生は、１５μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ２．５の３０秒間のパルス投与（ｐｕｌｓｅ）によるものであった。分析物注射および解離に続く最初の１０秒間は、ＬａｎｇｍｕｉｒおよびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）動態解析モジュールの二価フィットモデルの両方による親和性測定のために適用された。
【００８８】
マイクロスフェア活性化細胞のＰｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ分析：以前に記載されるように（Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（１９９８年）、Ｊ  ｉｍｍｕｎｏｌ１６１巻：６４５９頁）、アルデヒド／スルフェートラテックスマイクロスフェア（５μｍ）を、１００μｇ／ｍｌの抗ＦｃμＦ（ａｂ’）２に単独で、または示した濃度のヒトＩｇＧ１、ＨＶＥＭ−ＦｃもしくはＵＬ１４４−Ｆｃと一緒に共有結合によりカップリングさせた。簡潔には、マイクロスフェアをＰＢＳで洗浄し、示したタンパク質と３７℃で９０分間インキュベートし、緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％グリシンを含むＰＢＳ）でブロックし、２回洗浄し、培地に再懸濁させ、数えた。ＪＴＡｇおよびＢＪＡＢ細胞を刺激するために、マイクロスフェアを３：１の比で使用した。９６ウェル平底プレートにマイクロスフェアを先ず加え、続いて細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞数１．５×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁させた。プレートを短時間遠心回転させ、３７℃で示した時間インキュベートし、続いてＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定し、３７℃で１０分間さらにインキュベートした。細胞を緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄し、氷上で３０分間Ｐｅｒｍ  ＩＩＩ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理し、２回洗浄し、氷上で３０分間ホスホ特異的抗体とインキュベートし、２回洗浄し、分析した。
【００８９】
ウェスタンブロッティング：示した濃度のＩＬ−２またはインターフェロン−βを使用して、ＩＬ−２依存性ＮＫ９２モデル細胞系を活性化した。ＩＬ−２応答を試験する実験では、基底シグナル伝達を再確立するために、ＮＫ９２細胞をＩＬ−２なしで一晩培養した。融合タンパク質および抗体を使用する実験では、活性化の前に、ＮＫ９２細胞を、対照ヒトＩｇＧ１、ＨＶＥＭ−Ｆｃ、またはＵＬ１４４−Ｆｃまたは対照マウスＩｇＧ２ａまたは抗ＢＴＬＡにより氷上で少なくとも１５分間コーティングした。ＮＫ９２細胞を１００μｌに各条件あたり細胞数２×１０６でアリコートに分け、示した時間３７℃で活性化し、氷冷ＰＢＳでクエンチし、４℃のＲＩＰＡ緩衝液で２０分間溶解し、続いて４℃において１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。１％β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳローディング緩衝液で抽出物を５分間煮沸させ、１０％ビス−トリスゲルの上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。タンク方法を使用してタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中の１％オボアルブミンでブロックし、ホスホ−ＪＡＫ１、ホスホ−ＳＴＡＴ５、ホスホ−ＳＴＡＴ１、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）および全アクチンに対する抗体でブロットし、続いて抗ウサギＨＲＰまたは抗マウスＨＲＰでブロットし、強化した化学発光によって可視化した。
【００９０】
ヒトＰＢＭＣのサイトカイン活性化：以前に記載されるように（Ｓｅｄｙら、２０１３年）、新鮮なヒト血液を健康なドナーから収集し、調製した。簡潔には、Ｆｉｃｏｌｌ勾配バフィーコートから単離されたＰＢＭＣを、氷上で１５分間示したＦｃタンパク質と細胞数１０６／ｍｌでインキュベートし、続いて５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃγＦ（ａｂ’）２で６時間架橋させた後、フローサイトメトリー分析にかけた。
【００９１】
（実施例２）
リンパ腫標的リガンド結合における体細胞性ＴＮＦＲＳＦ１４変異
ＦＬおよびＤＬＢＣＬで獲得された体細胞性ＴＮＦＲＳＦ１４変異が、そのリガンドとの保存されたＨＶＥＭ相互作用および以降の機能を妨害する可能性を有する点に注目された（図８）。ＨＶＥＭ構造を破壊するとは予測されないリンパ腫関連の変異を選択し、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０およびＬＩＧＨＴへの変異体受容体結合を評価した。表面発現されると実証されたＨＶＥＭ変異体は、リガンド結合へのそれらの効果に従って３つの群に分類することができた（図８）。Ｐ５９Ｓ、Ａ１０２ＰまたはＲ１０９Ｗを含有する変異は、ＣＤ１６０単独との相互作用を破壊した。Ｙ６１ＣおよびＧ７２Ｄ変異は、ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０の両方との相互作用を抑止したが、ＬＩＧＨＴ結合にはあまり影響しなかった。最後に、変異体Ｇ６０ＤおよびＴ８２Ｐ、またはＳｅｒ９１とＬｙｓ９２の間へのＩｌｅの挿入は、全てのリガンド相互作用を破壊した（図２）。ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０の両方の結合のために、ＨＶＥＭ  Ｔｙｒ６１が重大であると同定された。全体として、これらの体細胞性変異は、ＣＤ１６０およびＢＴＬＡとの相互作用、ならびにＬＩＧＨＴとの損なわれていないかまたは影響を受けてもいる相互作用の優先的喪失によるリガンド結合の階層を規定する。ＴＮＦＳＦ１４での遺伝子変更がＤＬＢＣＬのさらなるコホートでさらに確認され、ＢＴＬＡまたはＴＮＦＳＦ１４に欠失を有するさらなる腫瘍を同定した（図２Ｈ）。ヒトＦＬおよびＤＬＢＣＬの中のＨＶＥＭネットワークでの複数の遺伝的病変の存在は、これらの経路が腫瘍微小環境の中での細胞選択に顕著に寄与することができることを示す。特異的残基が、リガンド結合にとって重要である：Ｐｒｏ５９、Ａｌａ１０２、Ａｒｇ１０９−ＣＤ１６０と結合しない；Ｔｙｒ６１およびＧｌｙ７２  ＢＴＬＡともＣＤ１６０とも結合しない；Ｇｌｙ６０、Ｔｈｒ８２およびｉｎｓ９１Ｉ（Ｓｅｒ９１およびＬｙｓ９２に示す）−ＬＩＧＨＴともＢＴＬＡともＣＤ１６０とも結合しない（図２Ｃ〜Ｈ）。
【００９２】
（実施例３）
ＨＶＥＭおよびＵＬ１４４はＢＴＬＡの重複表面に結合する
ウイルスのＵＬ１４４または変異体ＨＶＥＭによる変更されたＢＴＬＡ活性が異なる表面の係合によるものかどうか決定するために、これらのアゴニストのための接触面におけるＢＴＬＡ残基を比較した。アゴニスト活性を有することが以前に示された抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローンＭＩＨ２６）の結合はＧｌｕ５７またはＰｒｏ５９での変異によって破壊されるが、競合的抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローンＪ１６８）の結合はＡｒｇ４２での変異によって破壊されることが判明した（図３Ａおよび図９Ａ）。注目すべきことに、ＭＩＨ２６結合性残基Ｇｌｕ５７はマウスＢＴＬＡのＧｌｎ６３に相同的であり、それは、アゴニスト抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローン６Ａ６）のエピトープの中に含有される。比較において、ＨＶＥＭ−ＦｃおよびＵＬ１４４−Ｆｃの両方のＧｌｎ３７、Ａｒｇ４２、Ｐｒｏ５９およびＨｉｓ１２７への結合のために類似の要件が観察され、ヒトおよびマウスＢＴＬＡでの以前の研究と矛盾しない。ＨＶＥＭまたはＵＬ１４４へのＢＴＬＡの類似の親和性が表面プラズモン共鳴を使用して確認された（図３Ｂ、Ｃ）。ＢＴＬＡへのＵＬ１４４−Ｆｃのアビディティ（ＫＤ、１：１の結合モデル）（２９５ｎＭ）は、ＨＶＥＭ−Ｆｃ（１７７ｎＭ）よりわずかに小さかった（表２）。ＨＶＥＭとＵＬ１４４の間でかすかなアビディティおよび結合の差が観察されたが、全体として、ヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４はＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合を緊密に模倣する。図９Ａ〜Ｂは、野生型または変異体ヒトＢＴＬＡで形質導入したＥＬ４細胞が、抗ヒトＢＴＬＡポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で、またはＨＶＥＭ−ＦｃもしくはヒトＣＭＶ  ＵＬ１４４−Ｆｃで、続いて種特異的二次で染色されたことを示す。上から下にかけて、グラフは、ＧＦＰ発現についてゲート制御した細胞での、６Ｆ４、Ｊ１６８もしくはＭＩＨ２６抗ＢＴＬＡ（Ａ）の比ＭＦＩ染色、またはＨＶＥＭ−ＦｃもしくはＵＬ１４４−Ｆｃ（Ｂ）染色を示す。
【００９３】
リンパ球でのＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ共発現は、トランスの外因性リガンドによる活性化を競合的にブロックする細胞表面にシスで位置する内在性の複合体の形成につながる。ＢＴＬＡと共発現されるＵＬ１４４がシスで複合体を形成してトランスでリガンドアクセスを予防するかどうか、または、トランスでのＢＴＬＡのＵＬ１４４ライゲーションがＨＶＥＭによるＢＴＬＡアクセスの立体的障害を回避するかどうかについて決定した。ＢＴＬＡと共発現されるＨＶＥＭおよびＵＬ１４４の両方は、ＨＶＥＭ−ＦｃおよびＵＬ１４４−Ｆｃの両方への結合をブロックし、ＨＶＥＭおよびＵＬ１４４がシスでＢＴＬＡと類似の複合体を形成すること、ならびにＵＬ１４４が細胞表面で予め形成されたＢＴＬＡシス複合体を凌ぐことができないことを示した（図９Ｃ、Ｄ）。しかし、ＢＴＬＡ  Ｒ４２Ｄ変異体の共発現はシス発現ＨＶＥＭがトランスでＢＴＬＡ−Ｆｃに結合することを阻止したがＵＬ１４４は阻止せず、単一の変異がＢＴＬＡ−ＵＬ１４４シス複合体を破壊するのに十分でないかもしれないことを示した（図９Ｅ、Ｆ）。
【００９４】
ｍＡｂ  Ｊ１６８およびＭＩＨ２６によって認識される抗体エピトープは、四量体非対称単位のＨＶＥＭ分子によって塞がれるＢＴＬＡの表面と重複し、ＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合をブロックすることが予測された（図３Ａ）。これらの抗ＢＴＬＡクローンの両方の滴定はＢＴＬＡへのＨＶＥＭ−ＦｃおよびＵＬ１４４−Ｆｃの結合を妨害したが、第３の抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローン６Ｆ４）はＢＴＬＡへのＨＶＥＭ−Ｆｃの結合を強化したが、ＵＬ１４４−Ｆｃの結合に影響しなかった（図３Ｄ、Ｅ）。そのエピトープはこれらのＢＴＬＡ変異体を使用して同定されず、このクローンはＨＶＥＭへのいかなる反応性も示さない。全体として、これらのデータは、ＢＴＬＡの同じ表面はＨＶＥＭおよびＵＬ１４４に結合するために使用されるようであるが、リガンド結合に寄与するさらなる構造的エレメントがあるかもしれないことを示す。さらに、ＢＴＬＡ抗体のエピトープマッピングは、アゴニスト活性がヒトＢＴＬＡ（クローンＭＩＨ２６のために）の上のＧｌｕ５７またはＰｒｏ５９およびマウスＢＴＬＡ（クローン６Ａ６のために）の上のＧｌｎ６３に連結していることを示す。図３では、左の画像の特異的残基は、抗体結合のための要件を示す：Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ５７、Ｐｒｏ５９はＭＩＨ２６結合のために必要とされ、Ａｒｇ４２はＪ１６８結合のために必要とされる。図３では、右の画像の特異的残基は、ＨＶＥＭ／ＵＬ１４４結合エピトープを示す：Ｇｌｎ３７、Ａｒｇ４２、Ｐｒｏ５９、Ｈｉｓ１２７はＨＶＥＭ／ＵＬ１４４結合のために必要とされるようであり、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ５７、Ｐｈｅ１１９、Ｓｅｒ１２１はＨＶＥＭ／ＵＬ１４４結合のために必要とされないようである。
【００９５】
（実施例４）
ＣＤ１６０は、ＨＶＥＭに関する競合を通してＢＴＬＡ媒介阻害を制限する
多様なリンパ球サブセットでのＣＤ１６０およびＬＩＧＨＴの発現は、ＢＴＬＡ阻害性シグナル伝達に関与するウイルスおよびがん変異体のＨＶＥＭの能力に影響を与えることができる。ＨＶＥＭリガンドの発現を変更することがＢＴＬＡアゴニズムに影響するかどうかについて評価するために、異所性ＢＴＬＡまたはＣＤ１６０アイソフォームを発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を活性化させた（図４および図１０Ａ）。固定化抗ＣＤ３で活性化した対照細胞は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１／２、ゼータ鎖関連プロテインキナーゼ７０ｋＤ（ＺＡＰ７０）／Ｓｙｋおよび全細胞性チロシンのリン酸化を誘導したが、共固定化抗ＣＤ３およびＨＶＥＭまたはＵＬ１４４−Ｆｃで活性化した細胞ではＥＲＫ１／２リン酸化が低減された（約５０〜７０％の低減）。異所性ＢＴＬＡ発現はＥＲＫ１／２リン酸化をバックグラウンドレベルまで阻害するＨＶＥＭおよびＵＬ１４４の能力を強化し、有意に低減されたＺＡＰ７０／Ｓｙｋリン酸化（約１５〜２５％）と相関した（図４Ａ、Ｂ）。チロシンリン酸化はＨＶＥＭまたはＵＬ１４４による刺激の後に増加し、ＢＴＬＡおよび関連シグナル伝達タンパク質の活性化を反映した（図４Ｃ）。重要なことに、異所性ＣＤ１６０（グリコホスホイノシチドまたは膜貫通アイソフォーム）を発現する細胞では、ＢＴＬＡがさらに存在しない限り、ＨＶＥＭはＥＲＫ１／２リン酸化を阻害することができなかった。対照的に、ＵＬ１４４は、ＣＤ１６０アイソフォーム発現に関係なく、ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害した。ＨＶＥＭおよびＵＬ１４４のアゴニスト活性は、他のＨＶＥＭリガンドの不在下で高レベルのヒトＢＴＬＡを発現し、ＩｇＭ刺激に応答してＳｙｋ依存性ＥＲＫおよびＡｋｔリン酸化を活性化する、ヒト非ホジキンリンパ腫ＢＪＡＢで確認された（図１０Ｂ）。具体的には、共固定化抗ＩｇＭおよび滴定されたＨＶＥＭまたはＵＬ１４４−Ｆｃで活性化された細胞では、対照細胞と比較して、ＥＲＫ、Ａｋｔおよび細胞性ホスホチロシンのリン酸化の概ね５０％の低減が観察された。全体として、これらの結果は、ＢＴＬＡシグナル伝達を活性化するＨＶＥＭの能力が、ＢＴＬＡ対ＣＤ１６０の相対比に依存すること、およびウイルス模倣物による受容体選択性が妨害されないＢＴＬＡアゴニズムをもたらすことを例示する。
【００９６】
（実施例５）
ＢＴＬＡのアゴニスト活性化は炎症促進性サイトカイン刺激を阻害する
サイトカインまたはＣＭＶ感染線維芽細胞とｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＰＢＭＣでは、可溶性ＨＶＥＭ−ＦｃがＣＤ１６０発現ＮＫ細胞の活性化を固有に共刺激したが、ＵＬ１４４−Ｆｃはそうではないことが以前に示された。並行研究では、多様なＰＢＭＣサブセットでのＨＶＥＭおよびＵＬ１４４−ＦｃによるＩＬ−２誘導ＣＤ６９発現の阻害が観察され、それはＢＴＬＡの発現と相関していた（図１１Ａ）。ＣＤ１６０の存在下でＩＬ−２シグナル伝達を阻害する細胞およびウイルスのＨＶＥＭの能力を、さらに調べた（図５）。ヒトＮＫ細胞系ＮＫ９２は、ＳＴＡＴ５、ＡｋｔおよびＥＲＫ経路の活性化につながるキナーゼＪＡＫ１のリン酸化により、ＩＬ−２に滴定可能な様式で応答する。ＩＬ−２で処理した細胞では、ＨＶＥＭ−ＦｃではなくＵＬ１４４−Ｆｃまたは抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローンＭＩＨ２６）によるＢＴＬＡの活性化の後に、ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ５およびＡｋｔタンパク質のリン酸化の減少が観察され、ＢＴＬＡのＵＬ１４４標的化が過剰なＣＤ１６０の存在によって妨害されなかったことを示した（図５Ａ、５Ｂおよび図１１Ｂ）。この経路はＳＨＰ−１阻害によっても調節されるので、ＢＴＬＡがＩ型インターフェロンシグナル伝達を調節するかどうかについてさらに調べた。抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ（クローンＭＩＨ２６）は初期および後期のＳＴＡＴ１リン酸化の大きさを低減し、ＳＨＰ−１感受性のサイトカインシグナル伝達経路では、ＢＴＬＡが広い阻害性機能を示すことを実証した（図１１Ｃ）。さらに、ＣＤ１６０はＨＶＥＭがＢＴＬＡに結合して活性化することを制限したが、そのウイルス模倣物を制限しなかった。図１１は、細胞性サブセットの中でのＣＤ６９発現についての染色の前に、示したＦｃタンパク質で前処理し、ＩＬ−２の示した濃度で６時間刺激したＰＢＭＣを示す。グラフは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６ｄｉｍおよびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現のパーセントを示す。Ｂ．〜Ｃ．抗ＢＴＬＡ（ＭＩＨ２６）または対照Ｉｇで前処理した後の示した時間に、ＮＫ９２細胞を滴定されたＩＬ−２（Ｂ．）およびＩＦＮ−β（Ｃ．）で刺激した。ウェスタンブロットは、ＩＬ−２シグナル伝達をモニタリングするためにホスホ−ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ５およびＡｋｔ（Ｓ４７３）の、またはＩＦＮ−βシグナル伝達をモニタリングするためにホスホ−ＳＴＡＴ１の、ならびに全タンパク質レベルを制御するためのアクチンの全細胞抽出物を示す。
【００９７】
（実施例６）
生体工学的に操作したＨＶＥＭはＢＴＬＡシグナル伝達を選択的に活性化する
ＵＬ１４４のリガンド結合選択性およびリンパ腫変異は、ＨＶＥＭの新規工学操作がＢＴＬＡ特異的アゴニストを与えるはずであることを示唆した。変異体ＨＶＥＭ−Ｆｃタンパク質は、アラニン走査、飽和およびコンビナトリアル変異誘発を通して工学的に操作した。Ｓ５８ＲおよびＬ９０Ａに変異を含有するＨＶＥＭ変異タンパク質（ＨＶＥＭ−ＲＡ）はＢＴＬＡへの選択性を付与するが、Ｇ６８ＴおよびＬ７０Ｗのさらなる変異はＢＴＬＡ親和性を１０倍強化することが判明した（ＨＶＥＭ−ＲＴＷＡ）。注目すべきことに、ＲＡおよびＲＴＷＡ変異体の両方は対照細胞で親のＨＶＥＭ−Ｆｃタンパク質より高い程度で抗ＣＤ３誘導ホスホ−ＥＲＫ１／２を阻害し、全てのＨＶＥＭ−Ｆｃタンパク質は、ＢＴＬＡを異所的に発現する細胞でＥＲＫ１／２リン酸化をバックグラウンドレベルまで低減した（図６Ａ）。高親和性ＨＶＥＭ−ＲＴＷＡ変異体だけが、全ての細胞でＺＡＰ−７０／Ｓｙｋリン酸化をバックグラウンドレベルまで有意に低減した（図６Ｂ）。異所性ＢＴＬＡを発現する細胞では、ＨＶＥＭ−ＲＡおよびＨＶＥＭ−ＲＴＷＡ変異体の阻害活性は、ホスホ−ＳＨＰ２シグナルならびに全細胞ホスホ−チロシンの劇的な誘導と相関した（図６Ｃおよび図１２Ｂ）。したがって、生体工学的に操作したＨＶＥＭ−Ｆｃは、ウイルスおよび変異体のＨＶＥＭの選択的かつ妨害されていないアゴニズムを再現する。
【００９８】
（実施例７）
多様な病原体関連のおよび新規の生体工学的に操作したＨＶＥＭ変異タンパク質ＢＴＬＡアゴニストはＴ細胞シグナル伝達を阻害する
ＨＶＥＭ変異タンパク質ＢＴＬＡアゴニストは、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害することが示された。活性化の前にＪＴＡｇ細胞をエレクトロポレーションによって対照ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０−ＧＰＩ、ＣＤ１６０−ＴＭ、ＢＴＬＡ  ＣＤ１６０−ＧＰＩおよびＢＴＬＡＣＤ１６０−ＴＭ  ＨＶＥＭリガンドで形質導入して４８時間静置するか、または示したＨＶＥＭリガンドを発現するレトロウイルスにより安定して形質導入した。ＪＴＡｇ細胞を活性化するために、アルデヒドスルフェートマイクロスフェアを、３７℃で９０分間、ＰＢＳ中の１μＭの示したＨＶＥＭまたはＵＬ１４４  Ｆｃタンパク質のあるなしで１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３とカップリングさせた。マイクロスフェアを２回洗浄し、４：１のマイクロスフェア対細胞比でＪＴＡｇ細胞と５分間インキュベートした。２％パラホルムアルデヒドで細胞を直ちに固定し、９０％メタノールで透過処理し、示したホスホ特異的抗体で染色した。次に、細胞をホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（図１３Ａ．、Ｂ．）、ホスホ−ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｓ５２９）（図１３Ｃ．）、ホスホ−ＢＴＫ／ＩＴＫ（Ｙ５５１／Ｙ５１１）（図１３Ｄ．）、ホスホ−ＰＬＣγ１（Ｙ７８３）（図１３Ｅ．）、ホスホ−ＺＡＰ７０／Ｓｙｋ（Ｙ３１９／Ｙ３５２）（図１３Ｆ．）およびホスホ−チロシン（図１３Ｇ．）の細胞内染色について調べた。図１３Ａは、染色細胞のＭＦＩのグラフを示す。図１３Ａ．〜Ｇ．は、染色細胞のパーセント陽性を示す。（３件の実験を代表する平均±ＳＥＭ）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００９９】
（実施例８）
ＢＴＬＡアゴニストはＢ細胞シグナル伝達を阻害する
ＢＴＬＡアゴニストは、Ｂ細胞シグナル伝達を阻害することが示された。ＢＪＡＢ細胞を活性化するために、アルデヒドスルフェートマイクロスフェアを、３７℃で９０分間、ＰＢＳ中の１μＭの示したＨＶＥＭまたはＵＬ１４４  Ｆｃタンパク質のあるなしで１００μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭとカップリングさせた。マイクロスフェアを２回洗浄し、４：１のマイクロスフェア対細胞比でＢＪＡＢ細胞と１０または６０分間インキュベートした。２％パラホルムアルデヒドで細胞を直ちに固定し、９０％メタノールで透過処理し、示したホスホ特異的抗体で染色した。次に、ＢＪＡＢ細胞を、ホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）またはホスホ−チロシンの細胞内染色について調べた（図１４Ａ〜Ｂ）。図１４Ａ〜Ｂは、ホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）またはホスホ−チロシンに陽性の細胞のパーセントを示す。
【０１００】
ＢＴＬＡアゴニストはＢ細胞のインターフェロン活性化を阻害する。ヒトＢ細胞を活性化するために、アルデヒドスルフェートマイクロスフェアを、３７℃で９０分間、ＰＢＳ中の１μＭの示したＨＶＥＭまたはＵＬ１４４  Ｆｃタンパク質とカップリングさせた。マイクロスフェアを２回洗浄し、４：１のマイクロスフェア対細胞比で、正常なヒトドナー血液ＰＢＭＣから精製されたヒトＢ細胞とインキュベートし、溶解およびＲＮＡ単離の前に１０Ｕ／ｍｌのインターフェロン−βで６時間刺激した。図１５は、細胞を対照と比較してＢＴＬＡアゴニスト（ＨＶＥＭ、ＵＬ１４４  Ｆｃ、ＨＶＥＭＲ１０９Ｗ  ＦｃおよびＨＶＥＭＲＴＷＡ  Ｆｃ）の各々で処理したときの、示したインターフェロン刺激遺伝子の各々のレベルの低減倍率を示す。（平均±ＳＥＭ、２つの実験からのプールされたデータ）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【０１０１】
ＢＴＬＡアゴニストは、ＮＫ細胞でＩＬ−２シグナル伝達を制限することが見出された。ＮＫ９２細胞を血清なしで少なくとも４時間培養し、次に、２μｇ／ｍｌの示したＦｃおよび抗体により氷上で１５分間前処理してから０、１、５、１５、３０および６０分後に、２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２で刺激した（図１６）。活性化後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、タンパク質リン酸化をウェスタンブロットによって分析した。図１６Ａは、、ホスホ−ＪＡＫ１、ホスホ−ＳＴＡＴ５および全タンパク質レベルを制御するためのアクチンの全細胞抽出物のウェスタンブロットを示す。図１６Ｂは、アクチンに正規化したバンド強度の定量化を示すグラフを示す。
【０１０２】
（実施例９）
マウスＨＶＥＭにおけるリガンド選択性の同定
リガンドの選択性を、マウスＨＶＥＭで決定した。野生型ＨＶＥＭ、およびヒトＨＶＥＭとの相同性に基づいてＬＩＧＨＴ（ＢＴＬＡ／ＣＤ１６０−ｓｐ）またはＢＴＬＡとＣＤ１６０の両方（ＬＩＧＨＴ−ｓｐ）への結合をブロックすると予測された単一のアミノ酸変化を含有する２つの改変体を含む、一群のマウスＨＶＥＭ−Ｆｃ変異タンパク質を、２９３Ｔ細胞への一時的トランスフェクションによって生成した（図１７）。マウスＣＤ１６０（図１７Ａ）、マウスＢＴＬＡ（図１７Ｂ）およびマウスＬＩＧＨＴのいずれかを一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上でＨＶＥＭ−Ｆｃタンパク質を滴定し、抗ヒトＦｃを使用して結合を検出した。特異的結合は、フローサイトメトリー分析で測定した（図１７Ｃ）。グラフは、リガンド発現細胞でのＨＶＥＭ−Ｆｃタンパク質の染色のＭＦＩを示す。
【０１０３】
（実施例１０）
選択的ＨＶＥＭ−Ｆｃは皮膚炎症をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する
ＨＶＥＭ−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏで皮膚炎症を阻害することが示された。皮膚炎症のイミキモド処置動物モデルに、マウスＨＶＥＭ−Ｆｃ変異タンパク質を腹腔内に注射した。処置の各日に各動物の剃られた背中への５０ｍｇのイミキモド（Ａｌｄａｒａ製剤）の３回塗布の後に皮膚組織を収集し、組織学的分析のために切片にした。表皮厚は、各組織の長さにわたって１０部位のＨ＆Ｅ染色皮膚切片において定量化した。代表的画像は、ＨＶＥＭ変異タンパク質で処置した異なる動物群における表皮の肥厚を示す（図１８Ａ）。図１８Ｂは、表皮厚の定量化を示す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【０１０４】
（実施例１１）
要約
本明細書に提示されるデータは、ＢＴＬＡ選択的アゴニストのウイルスおよびがん細胞発現が、ＨＶＥＭシグナル伝達ネットワークを標的化する一般的な戦略であることを示す。ＣＤ１６０結合を回避するＨＶＥＭにおけるウイルスの進化および変異は、病原体およびがん細胞のために選択有利性を提供するようである。ＣＭＶでのウイルスのＨＶＥＭ模倣物の活性がＨＶＥＭと比較してＣＤ１６０発現細胞において妨害されず、リンパ球での抗原受容体刺激の後にＺＡＰ７０／Ｓｙｋおよび下流ＥＲＫ１／２経路の活性化を直接的に阻害することが示される。さらに、ＣＤ１６０発現ＮＫ細胞では、ウイルスのＨＶＥＭ模倣物によるＢＴＬＡの活性化は、炎症性サイトカインシグナル伝達を直接的に制限する。全体として、これらのデータは、阻害性受容体により炎症性シグナル伝達を制限する潜在性がどのようにウイルスおよび腫瘍などの多様な細胞内病原体のための選択圧を提供することができるかを例示する。ウイルスおよび腫瘍変異のこの基礎知識は、ＢＴＬＡへの選択性および高親和性を達成するためのＨＶＥＭの生物工学を促したが、それは炎症性および増殖性プロセスの変更で有用性を示すことができる。
【０１０５】
ＵＬ１４４タンパク質は、当初、一部それらの相同性のためにＨＶＥＭの解かれた構造を使用してモデル化された（図１Ａ）。しかし、ＵＬ１４４とＨＶＥＭの間には、ある特定のＢＴＬＡ変異体、６Ｆ４抗体に結合したＢＴＬＡ、およびシスでのＢＴＬＡへの結合にわずかな差があり、同一でない相互作用を示した（図３、４）。ＵＬ１４４は個々の点変異を通してＣＤ１６０結合性タンパク質に戻すことができず、おそらく、ウイルス−宿主進化の間に生じた複数の特異性変化を反映する。その結果、菌株にわたるＢＴＬＡ結合の保持にもかかわらず、ＵＬ１４４タンパク質は高度に抗原性である。対照的に、腫瘍関連のＨＶＥＭは、全てのＣＤ１６０結合を単独で無効にすることができない１つの変異だけを各々含有する。例えばＮＧＦＲｐ７５とＬｏｎｇｏ１のように、Ｉｇドメインと相互作用するＴＮＦ受容体の他の例がある。注目すべきことに、ＨＶＥＭそれ自体は、当初、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ＤのＩｇドメインとのその相互作用を通して同定された。ＣＭＶは別のタンパク質ＯＲＦ  ＵＬ１４１を発現するが、それはＴＮＦ関連アポトーシスを誘導するリガンド受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）に結合する。これらの２つのタンパク質の共複合体は最近解かれ、ＵＬ１４１がＩｇドメインとして折り畳まれることを示したが、これらのタンパク質の間の接触は、リガンドＴＲＡＩＬがＴＲＡＩＬ−Ｒと係合する表面で起こり、ＢＴＬＡまたはＣＤ１６０とのＨＶＥＭ相互作用とは異なる。いくつかのタンパク種のリガンドを採択することにおいてＨＶＥＭは固有で有り得、ＴＮＦＲタンパク質のＮ末端のシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）とＩｇドメインの間の複合体は、真核生物の間の好まれるタイプのタンパク質間相互作用のようではない。多様なウイルスによるこれらの非従来型の相互作用のより頻繁な使用に注目することは興味深く、免疫受容体をモジュレートすることが病原体の生存を強化することができるという魅力的な示唆につながる。
【０１０６】
ＢＴＬＡがヒトＮＫ細胞でＩＬ−２およびＩ型インターフェロンシグナル伝達を阻害することが判明し、ＴおよびＢ細胞の受容体シグナル伝達を調節する免疫チェックポイント阻害剤としてのＢＴＬＡの役割を確認した。ＢＴＬＡの下流の阻害性シグナル伝達の機構は、ＳＨＰ−１または２の活性化を含むと考えられ、さらなる経路がおそらく関与する。ＺＡＰ７０／Ｓｙｋリン酸化に対する、生体工学的に操作したＨＶＥＭ−ＲＴＷＡの阻害効果は、ＣＤ３ζおよびＳｙｋがＴおよびＢ細胞でのＢＴＬＡ活性の直接的標的であることを実証した以前の研究と矛盾しない。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＳＨＰ−１の活性化ならびにＪＡＫキナーゼおよびＳＴＡＴタンパク質を含む標的タンパク質の脱リン酸によって一部調節される。ＢＴＬＡアゴニストは、ＳＨＰ−１動員を通して、または未知の阻害性経路の関与を通してサイトカインシグナル伝達を直接的に標的化することができる。
【０１０７】
選択的ウイルスおよび変異体ＢＴＬＡアゴニストと対照的に、ＨＶＥＭは活性化Ｔ細胞でＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴおよびＣＤ１６０と相互作用するが、ＮＫ細胞では、ＣＤ１６０の豊富な発現はＨＶＥＭを隔離し、炎症促進性シグナル伝達を潜在的に活性化する。リンパ腫との関連で、変異したＴＮＦＲＳＦ１４は非機能的対立遺伝子としばしば対になり、より悪い予後をもたらす。上記の実験は、ＣＤ１６０結合から離れたＨＶＥＭ変異が細胞溶解性細胞の活性化を阻止するが、ＢＴＬＡ結合の保持は近隣細胞で阻害性シグナル伝達を活性化すると予測する。ともにトランスでＨＶＥＭシグナル伝達を活性化することができるＬＩＧＨＴおよびＢＴＬＡでのＤＬＢＣＬ欠失の同定は、主要な選択因子が腫瘍浸潤リンパ球の活性化であるとの仮説をさらに支持する。さらに、腫瘍自体は、ＬＩＧＨＴおよびＢＴＬＡに応答してＨＶＥＭの下流の生存シグナルを活性化することができる。注目すべきことに、濾胞性ヘルパーＴ細胞はＢＴＬＡおよびＬＩＧＨＴを顕著に発現し、リンパ腫の中でＨＶＥＭ機能性の維持に寄与することができる。継続調査は、ＨＶＥＭがリガンド選択を通して腫瘍微小環境内でリンパ腫適応度にどのように寄与するかについて決定することが確実である。ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴおよびＣＤ１６０の発現は、異なる細胞型、活性化および分化状態の間で大いに異なる。したがって、ＨＶＥＭリガンドの動的調節は、細胞状況による活性化および阻害性シグナルの制御のための機構を提供する。受容体およびリガンド発現を調節する因子の決定は、免疫応答におけるこれらのタンパク質の役割、ならびにこれらの経路を治療的介入のためにどのように操作することができるかについてのより優れた理解を可能にする。ＢＴＬＡまたは他の阻害性受容体への標的化アゴニストの開発は、炎症性疾患のための処置のレパートリーを増加させる役目をすることができる。
【０１０８】
本発明を上記の実施例を参照して記載したが、修正変更が本発明の精神および範囲の中に包含されることが理解されよう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲だけによって限定される。
【表１−１】
2018521999.tif 000002
【表１−２】
2018521999.tif 000003
【表１−３】
2018521999.tif 000004
【表１−４】
2018521999.tif 000005
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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