(57)【要約】本明細書では、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の２以上のコピーを有する組換え微生物であって、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列が外因性核酸である組換え微生物が提供される。任意に、組換え微生物は、キシルロースキナーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列及び／またはキシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。提供される組換え微生物は、炭素源としてキシロース上で増殖することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の２以上のコピーを含む組換え微生物であって、前記キシロースイソメラーゼをコードする核酸が外因性核酸である前記組換え微生物。
【請求項２】
更に、キシルロースキナーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列が外因性核酸配列である、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
更に、キシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記キシロース輸送体をコードする核酸配列が外因性核酸配列である、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が更に、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２以上のコピー、及びキシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列は異種核酸配列である、請求項１〜６の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする前記外因性核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含んでいる、請求項１〜７の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９０％同一である、請求項１〜８の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記微生物は、前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含んでいる、請求項２〜９の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
キシルロースキナーゼをコードする前記核酸配列は異種核酸である、請求項４〜１０の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記キシルロースキナーゼをコードする異種核酸配列は配列番号５に対して少なくとも９０％同一である、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記微生物は前記キシロース輸送体をコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む、請求項５〜１２の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記キシロース輸送体をコードする核酸が異種核酸である、請求項５〜１３の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記異種核酸によってコードされるキシロース輸送体がカンジダ・インターメディア由来のＧＸＳ１である、請求項１４に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記キシロース輸送体をコードする異種核酸配列が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一である、請求項１４に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記組換え微生物は、非組換え対照微生物と比較したときに増大したキシロース輸送体活性、非組換え対照微生物と比較したときに増大したキシロースイソメラーゼ活性、非組換え対照微生物と比較したときに増大したキシルロースキナーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１〜１６の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記組換え微生物は、唯一の炭素源としてのキシロースを用いて増殖する、請求項１〜１７の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
前記キシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列はプロモータに動作可能に結合される、請求項１〜１８の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列はプロモータに動作可能に結合される、請求項１１〜１９の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記キシロース輸送体をコードする核酸配列はプロモータに動作可能に結合される、請求項１４〜２０の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記プロモータはチューブリンプロモータである、請求項１９〜２１の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記プロモータは配列番号２５または配列番号２６に対して少なくとも８０％同一である、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記キシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列はターミネータを含む、請求項１〜２３の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列はターミネータを含む、請求項１１〜２４の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記キシロース輸送体をコードする核酸配列はターミネータを含む、請求項１４〜２５の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
前記ターミネータはチューブリンターミネータである、請求項２４〜２６の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記ターミネータは配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３０に対して少なくとも８０％同一である、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
前記微生物は更に選択マーカーを含む、請求項１〜２８の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
前記選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である、請求項２９に記載の組換え微生物。
【請求項３１】
前記抗生物質はゼオシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシンまたはネオマイシンである、請求項３０に記載の組換え微生物。
【請求項３２】
前記微生物はスラウストキトリウム微生物またはシゾキトリウム微生物の何れかである、請求項１〜３１の何れか１項に記載の組換え微生物。
【請求項３３】
前記微生物はＯＮＣ−Ｔ１８である、請求項３２に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
組換えキシロース代謝微生物を作製する方法であって、
キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列、及びキシロース輸送体をコードする核酸配列を含む１以上の核酸構築物を準備することと、
前記微生物を前記１以上の核酸構築物で形質転換することと、
前記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の少なくとも２以上のコピーを含む微生物を単離すること
を含む前記方法。
【請求項３５】
更に、前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む微生物を単離することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記キシロース輸送体の少なくとも１つのコピーを含む微生物を単離する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１以上の核酸構築物が更に選択マーカーを含む、請求項３４〜３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記準備することが、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物、及びキシロース輸送体をコードする核酸配列を含む第３の核酸構築物を準備することを含む、請求項３４〜３７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１、第２及び第３の核酸構築物が同じ選択マーカーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の核酸構築物がプロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の核酸構築物がプロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む、請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第３の核酸構築物がプロモータ、前記キシロース輸送体をコードする核酸配列、２Ａペプチドをコードする核酸配列、選択マーカー、及びターミネータを含む、請求項３８〜４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項３７〜４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗生物質がゼオシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシンまたはネオマイシンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記プロモータがチューブリンプロモータである、請求項４０〜４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
配列番号２５または配列番号２６に対して少なくとも８０％同一である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ターミネータがチューブリンターミネータである、請求項４０〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ターミネータが配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３０に対して少なくとも８０％同一である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離された組換え微生物は、前記キシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む、請求項３４〜４８の何れか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記キシロースイソメラーゼは異種キシロースイソメラーゼである、請求項３４〜４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列は配列番号２に対して少なくとも９０％同一である、請求項３４〜４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記単離された組換え微生物は、前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む、請求項３４〜５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記キシルロースキナーゼは異種キシルロースキナーゼである、請求項３４〜５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項３４〜５２の何れか１項に記載の方法であって、前記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列は配列番号５に対して少なくとも９０％同一である前記方法。
【請求項５５】
前記単離された組換え微生物は、前記キシロース輸送体をコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む、求項３４〜５４の何れか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キシロース輸送体が異種キシロース輸送体である、請求項３４〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記キシロース輸送体がカンジダ・インターメディア由来のＧＸＳ１である、請求項３４〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記キシロース輸送体をコードする核酸配列が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一である、請求項３４〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記単離された組換え微生物が、対照の非組換え微生物と比較して増大したキシロース輸送活性、対照の非組換え微生物と比較して増大したキシロースイソメラーゼ活性、対照の非組換え微生物と比較して増大したキシルロースキナーゼ活性、またはそれらの組み合わせを有する、請求項３４〜５８の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記単離された組換え微生物は唯一の炭素源としてのキシロースを用いて増殖する、請求項３４〜５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物が、スラウストキトリウムまたはシゾキトリウム微生物の何れかである、請求項３４〜６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記微生物がＯＮＣ−Ｔ１８である、請求項３４〜６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６３】
油を製造する方法であって、
請求項１〜３３の何れか１項に記載の組換え微生物であって、唯一の炭素源としてのキシロース上で増殖する微生物を準備することと、
前記微生物を、適切な条件下において培養培地中で培養して前記油を製造すること
を含む前記方法。
【請求項６４】
前記油がトリグリセリドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記油がアルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
更に、前記油を単離することを含む、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１５年７月１３日に出願された米国仮出願第６２／１９１，９８３号及び２０１６年６月２４日に出願された米国仮出願第６２／３５４，４４４号の優先権の利益を主張するものであり、これら仮出願の全体を本明細書の一部として援用する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の従属栄養発酵は、高価値の油及びバイオマス生成物を生成する効率的な方法である。一定の培養条件下において微生物は細胞内油を合成し、該油は抽出されて燃料（例えば、バイオディーゼル、バイオジェット燃料など）及び栄養脂質（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡ及びＤＰＡなどの多価不飽和脂肪酸）を製造するために使用することができる。幾つかの微生物のバイオマスは、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及びタンパク質の高含量のために栄養価が大きく、動物飼料用の栄養補助食品として使用することができる。スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）は真核生物の単細胞微生物であり、このような発酵プロセスで脂質を産生するために使用できる。スラウストキトリドを用いた従属栄養発酵は、増殖培地中に提供される有機炭素を脂質に変換し、該脂質は上記発酵プロセスの最後に上記バイオマスから収穫される。しかしながら、既存の微生物発酵は、主にグルコース等の高価な炭水化物を炭素源として使用する。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の２以上のコピーを有する組換え微生物が提供され、ここでの上記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列は外因性核酸である。任意に、上記組換え微生物は、キシルロースキナーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列及び／またはキシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。この提供される組換え微生物は、炭素源としてのキシロース上で増殖することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】キシロース代謝経路の概略図である。
【図２】グルコース飢餓サイクルの際のＷＴ  ＯＮＣ−Ｔ１８におけるキシロースイソメラーゼの発現を示すグラフである。
【図３】グルコース飢餓のサイクルの際のＷＴ  ＯＮＣ−Ｔ１８における推定キシルロースキナーゼの発現を示すグラフである。
【図４】アルファ−チューブリンｂｌｅ−イソメラーゼプラスミド構築物を示す概略図である。
【図５】アルファ−チューブリンｈｙｇｒｏ−ｘｙｌＢプラスミド構築物を示す概略図である。
【図６】アルファ−チューブリンプロモータ、ｂｌｅ配列、２Ａ配列、キシロースイソメラーゼ配列及びアルファ−チューブリンターミネータを有する核酸構築物を示す概略図である。
【図７】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「６」及び「１６」内のキシロースイソメラーゼＨｉｓタグ付けされた遺伝子をプローブするためのサザンブロットの画像である。
【図８】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株におけるキシロースイソメラーゼＨｉｓタグ付けされた遺伝子挿入数のｑＰＣＲ測定を示すグラフである。
【図９】当該グラフ中では「７−３」及び「７−７」と称するキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼの両方を含む組換えＯＮＣ−Ｔ１８株内においてｘｙｌＢ遺伝子をプローブするためのサザンブロットの画像である。
【図１０】組換え７−３及び７−７  ＯＮＣ−Ｔ１８株における、ｘｙｌＢ遺伝子挿入数のｑＰＣＲ決定のグラフである。
【図１１】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「６」及び「１６」における、キシロースイソメラーゼ遺伝子転写物の発現を示すグラフである。
【図１２】Ｗｔ  ＯＮＣ−Ｔ１８及び組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「６」及び「１６」におけるインビトロでのキシロースイソメラーゼ活性を示すグラフである。
【図１３】キシロースイソメラーゼのみをコードする組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」並びにキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼをコードする組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「７−３」及び「７−７」の、インビトロでの組み合わされたキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼ活性を示すグラフである。
【図１４Ａ】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」（四角）におけるキシロース取り込みの改善及び減少したキシリトール産生を示すグラフである。野生型（ＷＴ）株は菱形で表される。
【図１４Ｂ】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」（四角）におけるキシロース取り込みの改善及び減少したキシリトール産生を示すグラフである。野生型（ＷＴ）株は菱形で表される。
【図１５Ａ】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」（四角）、並びに組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「７−３」（三角）及び「７−７」（アスタリスク）におけるキシロース使用の改善及び減少したキシリトール産生を示すグラフである。野生型（ＷＴ）株は菱形で表される。
【図１５Ｂ】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」（四角）、並びに組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「７−３」（三角）及び「７−７」（アスタリスク）におけるキシロース使用の改善及び減少したキシリトール産生を示すグラフである。野生型（ＷＴ）株は菱形で表される。
【図１６】組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「１６」及び組換えＯＮＣ−Ｔ１８株「７−７」を用いた、グルコース：キシロース発酵の際のキシリトールの蓄積を示すグラフである。
【図１７】ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換のために使用される構築物の異なるバージョンの概略図である。
【図１８−１】Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のｘｙｌＢ配列（配列番号２０）とＥ．  ｃｏｌｉｘｙｌＢのコドン最適化バージョン（配列番号５）とのアラインメントを示すグラフである。
【図１８−２】Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のｘｙｌＢ配列（配列番号２０）とＥ．  ｃｏｌｉｘｙｌＢのコドン最適化バージョン（配列番号５）とのアラインメントを示すグラフである。
【図１９Ａ】キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及び糖輸送体Ｇｘｓ１を含んだ株におけるキシロース使用（図１９Ａ）を示すグラフである。ＷＴは野生型である。ＩｓｏＨｉｓ  ＸｙｌＢ「７−７」はキシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列を含んでおり、３６−２，３６−９及び３６−１６はＧｘｓ１、キシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列（キシルロースキナーゼ）を含む形質転換体である。
【図１９Ｂ】キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及び糖輸送体Ｇｘｓ１を含んだ株におけるグルコース使用（図１９Ｂ）を示すグラフである。ＷＴは野生型である。ＩｓｏＨｉｓ  ＸｙｌＢ「７−７」はキシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列を含んでおり、３６−２，３６−９及び３６−１６はＧｘｓ１、キシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列（キシルロースキナーゼ）を含む形質転換体である。
【図１９Ｃ】キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及び糖輸送体Ｇｘｓ１を含んだ株における製造されたパーセントキシリトール（図１９Ｃ）を示すグラフである。ＷＴは野生型である。ＩｓｏＨｉｓ  ＸｙｌＢ「７−７」はキシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列を含んでおり、３６−２，３６−９及び３６−１６はＧｘｓ１、キシロースイソメラーゼ及びｘｙｌＢ配列（キシルロースキナーゼ）を含む形質転換体である。
【図２０Ａ】Ｔ１８（図２０Ａ）由来のイソメラーゼ活性に対する、キシロース（菱形）及びキシルロース（四角）を用いた温度インキュベーションの影響を示すグラフである。
【図２０Ｂ】Ｅ．  ｃｏｌｉ（図２０Ｂ）由来のイソメラーゼ活性に対する、キシロース（菱形）及びキシルロース（四角）を用いた温度インキュベーションの影響を示すグラフである。
【図２１Ａ】Ｔ１８（図２１Ａ）由来のイソメラーゼのキシロース（菱形）及びキシルロース（四角）を用いた容量依存性を示すグラフである。
【図２１Ｂ】Ｅ．  ｃｏｌｉ（図２１Ｂ）由来のイソメラーゼのキシロース（菱形）及びキシルロース（四角）を用いた容量依存性を示すグラフである。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、キシロースイソメラーゼ（「１６」（四角）、「Ｂ」（ｘ）及び「６」（十字））で操作されたＴ１８Ｂ株における、キシロースの使用（図２２Ａ）、並びにキシリトール産生の減少（図２２Ｂ）を示すグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、キシロースイソメラーゼ（「１６」（四角）、「Ｂ」（ｘ）及び「６」（十字））で操作されたＴ１８Ｂ株における、キシロースの使用（図２２Ａ）、並びにキシリトール産生の減少（図２２Ｂ）を示すグラフである。
【図２２Ｃ】図２２Ｃ（キシロース）及び図２２Ｄ（キシリトール産生）は、第４日（灰色）及び第７日（黒）における野生型（菱形）と比較して表された同じデータを示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｃ（キシロース）及び図２２Ｄ（キシリトール産生）は、第４日（灰色）及び第７日（黒）における野生型（菱形）と比較して表された同じデータを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、キシロースイソメラーゼ「１６」（四角）で操作されたＴ１８Ｂ株、並びにキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼを発現するように操作された株「７−７」及び「７−３」（三角）における、キシロースの使用及びキシリトール産生の減少を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、キシロースイソメラーゼ「１６」（四角）で操作されたＴ１８Ｂ株、並びにキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼを発現するように操作された株「７−７」及び「７−３」（三角）における、キシロースの使用及びキシリトール産生の減少を示すグラフである。
【図２３Ｃ】図２３Ｃ（キシロース）及び図２３Ｄ（キシリトール産生）は、第４日（灰色）及び第１１日（黒）における野生型（菱形）と比較して表された同じデータを示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｃ（キシロース）及び図２３Ｄ（キシリトール産生）は、第４日（灰色）及び第１１日（黒）における野生型（菱形）と比較して表された同じデータを示す。
【図２４】発酵において、キシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼ「７−７」を発現するように操作されたＴ１８Ｂ株における改善されたキシロース使用及び減少したキシリトール産生を示すグラフである。野生型株は菱形及び点線で表され、「７−７」株は丸で表される。
【図２５】α−チューブリンａｓｐＴｘ−ｎｅｏ及びα−チューブリンｇｘｓ１−ｎｅｏ構築物を示す概略図である。
【図２６Ａ】キシロース輸送体Ｇｘｓ１で操作された「７−７」Ｔ１８Ｂ株内において、Ｇｘｓ１遺伝子をプローブするためのサザンブロットの画像である。
【図２６Ｂ】キシロース輸送体ＡｓｐＴｘで操作された「７−７」Ｔ１８Ｂ株内において、ＡｓｐＴｘ遺伝子をプローブするためのサザンブロットの画像である。
【図２７Ａ】キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ、及びＧｘｓ１輸送体（三角）またはＡｓｐＴｘ輸送体（丸）の何れかで操作されたＴ１８株におけるキシロースの使用を示すグラフである。株「７−７」は菱形で表される。
【図２７Ｂ】３つの改変株のそれぞれについて、キシリトール産生対キシロース使用の比率の棒グラフである。
【図２７Ｃ】株「７−７」に対するキシロース使用を示す棒グラフである。
【図２７Ｄ】株「７−７」に対して製造されたキシリトール産生を示す棒グラフである。
【図２８】唯一の炭素源としてキシロースを含有する培地中における、野生型（ＷＴ）（菱形）、ｉｓｏｈｉｓ株「１６」（四角）、株「７−７」（ｘ）、並びに輸送体株Ｇｘｓ１（アスタリスク）及びＡｓｐＴｘ（三角）の成長を示すグラフである。
【図２９Ａ】ＷＴ（四角）、株「７−７」（三角）、並びに輸送体株Ｇｘｓ１（アスタリスク）及びＡｓｐＴｘ（十字）の成長の際の、グルコース及びキシロースを含有する代替供給原料中の残存グルコースを示すグラフである。
【図２９Ｂ】ＷＴ（四角）、株「７−７」（三角）、並びに輸送体株Ｇｘｓ１（アスタリスク）及びＡｓｐＴｘ（十字）を、グルコース及びキシロースを含有する代替供給原料上で増殖させたときの経時的な残存キシロース及びキシリトール産生を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
スラウストキトリド等の微生物は、キシロースの代謝に必要な遺伝子をコードする。しかしながら、微生物の本来の代謝経路は多量の糖アルコールであるキシリトールを産生し、これは分泌されて、潜在的に微生物の増殖を妨げる（図１４Ａ及び図１４Ｂ、ＷＴ参照）。更に、キシリトールへと隔離される炭素原子は、この過程での目的生成物、即ち脂質生成物から逸脱した原子である。本来的に、キシロースレダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路と、キシロースイソメラーゼ／キシルロースキナーゼ経路の２つのキシロース代謝経路が存在する（図１）。スラウストキトリドは、両方の経路において活性なタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかし、キシロース培地中で増殖させたときのキシリトール蓄積により証明されるように、前者の経路が支配的なようである。他の生物において、キシリトールの蓄積は、キシロースレダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路に必要とされる酸化還元補因子の不均衡に起因することが示されている。イソメラーゼ／キナーゼ経路は酸化還元補因子に依存しないので、イソメラーゼ遺伝子の過剰発現は、キシロースからキシルロースへの変換における補因子依存性を除去する。本明細書に示すように、ＯＮＣ−Ｔ１８を用いたトランスクリプトーム研究により、そのキシロースイソメラーゼ及び推定キシルロースキナーゼ遺伝子は、殆どがグルコース飢餓の際に発現されることが示された（図２及び図３）。他方、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする推定的に同定された遺伝子は、構成的に発現される。全ての成長段階を通じてイソメラーゼ及びキナーゼの発現を増加させるために、構成的に発現されるプロモータ及びターミネータ、例えばα−チューブリンプロモータ及びターミネータの制御下にあるようにした、ＯＮＣ−Ｔ１８イソメラーゼ遺伝子及びＥ．  ｃｏｌｉキシルロースキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）を含めるように微生物を操作した。任意に、これら遺伝子は誘導性のプロモータ及び／またはターミネータの制御下にあってもよい。
【０００６】
上記提供された組換え微生物は、組み込まれた導入遺伝子のコピー数を介して、目的遺伝子の発現量のあるレベルの制御を示す。以下の実施例に示すように、８つの導入遺伝子コピーを有する組換えＯＮＣ−Ｔ１８株（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６）は、単一の導入遺伝子コピーを有する株（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃６）よりも高いレベルのキシロースイソメラーゼ転写物の発現、酵素活性及びキシロース代謝を示す。Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６を更に改変してｘｙｌＢ遺伝子が組み込まれると、同様の現象が観察される。ｘｙｌＢ遺伝子の複数のコピーは、単一の挿入と比較して、より大きな酵素活性及びキシロース代謝生産性を与えた。従って、予期しないことに、キシロース代謝経路を再形成することが必要なだけでなく、必要な導入遺伝子の複数のコピーを用いてこれを行うことが必要であった。スラウストロキトリドゲノムが、複数の導入遺伝子コピーを収容し、且つ生存したままであることは予期されなかった。従って、形質転換株間における発現レベルのそのような変動性を観察することは予想されなかった。しかし、本明細書で提供されるように、特定の経路、例えばキシロース経路の代謝工学のために最適化された特定の発現レベルに「調整された」導入遺伝子コピー数を有する形質転換株の中から選択することにより、導入遺伝子の制御された発現レベルを間接的に可能にする組換え微生物を作製することができる。
【０００７】
本明細書では、キシロース代謝に関与する１以上の遺伝子をコードする核酸が提供される。本願は、キシロースを代謝できる組換え微生物、該微生物を作製するための方法、及び該微生物を用いて油を製造するための方法を提供する。具体的には、本明細書では、キシロース代謝及び／または唯一の炭素源としてのキシロース上で増殖可能であるように微生物を改変するための、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体をコードする核酸及びポリペプチドが提供される。従って、キシロースイソメラーゼをコードする核酸が提供される。該核酸配列は、微生物に対して内因性であってよく、または異種性であってもよい。キシロースイソメラーゼの例示的な核酸配列には、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．及びスラウストキトリド由来のものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、キシロースイソメラーゼをコードする例示的な核酸配列には、配列番号２及び配列番号１５が含まれるが、これらに限定されない。また、キシロースイソメラーゼの例示的なポリペプチド配列としては配列番号１６が挙げられるが、これに限定されない。キシルロースキナーゼの例示的な核酸配列としては、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．が含まれるが、これらに限定されない。例えば、キシルロースキナーゼをコードする例示的な核酸配列には、配列番号５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０が含まれるが、これらに限定されない。糖輸送体、例えばキシロース輸送体をコードする例示的な核酸配列には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｇｆｘ１、Ｇｘｓ１及びＳｕｔ１由来のものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、キシロース輸送体をコードする例示的な核酸配列には、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びは配列番号２４が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
核酸とは、本明細書中で使用されるとき、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、並びにそのポリマー及び相補物をいう。この用語は、一本鎖または二本鎖の何れかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む。該用語は、公知のヌクレオチド類似体、または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含するものであり、これらは合成されたもの、天然のもの、及び非天然のものであり、またこれらは参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ参照ヌクレオチドと同様の仕方で代謝される。そのような類似体の例には、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。他に示さない限り、核酸配列の保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列を、本明細書中に列挙された特定の核酸配列の代わりに使用することができる。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。核酸の用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【０００９】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれたときに、動作可能に結合される。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに対して動作可能に結合されており；プロモータまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響するならば、コード配列に対して動作可能に結合されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に対して動作可能に結合されている。一般に、動作可能に結合されているとは、結合されているＤＮＡ配列が相互に近くにあり、分泌リーダーの場合には隣接しており、読取り相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。例えば、第２の核酸配列に対して動作可能に結合された核酸配列は、そのような第２の配列に対して直接的または間接的に共有結合されるが、任意の有効な３次元会合が許容される。単一の核酸配列が、複数の他の配列に動作可能に結合することができる。例えば、単一のプロモータは、複数のＲＮＡ種の転写を指令することができる。結合は、手頃な制限部位でのライゲーションによって達成できる。そのような部位が存在しなければ、従来のプラクティスに従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００１０】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同一または同一性パーセントの用語は、以下で述べるデフォルトパラメータと共にＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、または手動のアラインメント及び目視検査（例えばＮＣＢＩウエブサイト等を参照のこと）により測定したときに、同じであるか、または同じである特定のパーセンテージ（即ち、比較ウインドウまたは指定領域に亘る最大一致について比較及びアラインメントされたときに、特定の領域に亘って約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高い同一性）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２以上の配列または部分配列を言う。この時そのような配列は実質的に同一であると言われる。この定義はまた被験配列の相補物にも言及し、または適用される。該定義には、欠失及び／または付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。後述するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチド、より好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域に亘って存在する。
【００１１】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、それに対して被験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、上記プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００１２】
本明細書で使用される比較ウインドウは、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数の何れか一つの切片に対する参照を含んでおり、その中では、ある配列が同じ数の連続的な位置の参照配列に対して、これら２つの配列が最適にアラインメントされた後に比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８５：２４４４  （１９８８）の類似方法についての研究によって；これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）；または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  １９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ参照）によって行うことができる。
【００１３】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９７７），及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載のパラメータと共に使用して、核酸またはタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、当該技術分野で知られているように、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の選択された長さ（Ｗ）の短いワードを特定することにより、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントされたときに、幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか、またはこれを満たすものである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するための種として働く。該ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ減少したときに；該累積スコアが、その１以上の負のスコアの残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるときに；または何れかの配列の末端に到達したときに；停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、該アラインメントの感度及び速度を決定する。期待値（Ｅ）は、偶然にデータベース検索で発生すると予想されるスコアと同等またはそれ以上のスコアを持つ異なるアラインメントの数を表す。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  （１９８９）参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を用いる。
【００１４】
本明細書で使用するポリペプチドの用語は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーの当該技術分野で認識されている意味を有し、またペプチド及びタンパク質を含むことが意図されている。しかしながら、この用語はまた、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ等のようなポリペプチドの特定の機能的種類を指称するためにも使用される。このような種類の各々について、本開示は、そのようなポリペプチドの既知の配列の幾つかの例を提供する。しかしながら、当業者は、ポリペプチドという用語が、本明細書（または本明細書に具体的に言及される参照文献またはデータベース）に記載の完全な配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、このような完全なポリペプチドの機能的断片（即ち、少なくとも１つの活性を保持する断片）を表すポリペプチドを包含するように、十分に一般的であることを意図していると理解するであろう。更に、当業者であれば、タンパク質配列は一般に、活性を破壊することなく幾つかの置換を許容することを理解する。従って、活性を保持し、少なくとも約３０〜４０％、しばしば約５０％、６０％、７０％、または８０％の全体の配列同一性を共有し、更に、通常は遥かに高い同一性、しばしば１以上のより高い保存された、通常は少なくとも３〜４個、しばしば最大２０個またはそれ以上のアミノ酸を包含する領域において９０％よりも大きく、更には９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含む如何なるポリペプチドも、同じクラスの別のポリペプチドと共に、本明細書で使用されるポリペプチドの関連用語の範囲内に包含される。当業者は、本明細書に記載される様々なポリペプチドの配列の分析によって、他の領域の類似性及び／または同一性を決定することができる。当業者に知られているように、同一性及び／または類似性の程度を評価するために、様々な戦略が知られており、またアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の比較を行うためのツールが利用可能である。これらの戦略には、例えば、手動アラインメント、コンピュータ支援配列アラインメント、及びそれらの組み合わせが含まれる。配列アラインメントを実施するための多くのアルゴリズム（一般にコンピュータで実施される）が広く利用可能であるか、または当業者によって作製され得る。代表的なアルゴリズムには、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  １９８１，  ２：  ４８２）の局所相同性アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９７０，  ４８：  ４４３）の相同性アラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  １９８８，  ８５：  ２４４４）の類似性検索方法；及び／またはこれらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（例えば、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）が含まれる。このようなアルゴリズムを組み込んだ容易に利用可能��コンピュータプログラムには、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＩＬＥＵＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等が含まれる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときは、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。或いは、実施者は自分の実験的要件及び／または他の要件に応じて、デフォルト以外のパラメータを使用することができる（例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを有するウエブサイトを参照のこと）。
【００１５】
上記で述べたように、キシロース輸送体、キシルロースキナーゼ及びキシロースイソメラーゼをコードする核酸は、プロモータ及び／またはターミネータに結合させることができる。プロモータ及びターミネータの例としては、チューブリンプロモータ及びターミネータが含まれるが、これらに限定されない。一例として、プロモータはチューブリンプロモータ、例えばアルファ−チューブリンプロモータである。任意に、該プロモータは、配列番号２５または配列番号２６と少なくとも８０％同一である。任意に、ターミネータはチューブリンターミネータである。任意に、ターミネータは、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３０と少なくとも８０％同一である。
【００１６】
本明細書で使用するとき、プロモータ、プロモータエレメント、及び調節配列の用語は、プロモータに動作可能に結合された選択されたポリヌクレオチド配列の発現を調節し、また細胞内において該選択されたポリヌクレオチド配列の発現をもたらすポリヌクレオチドを指す。本明細書中で使用されるスラウストキトリウムプロモータの用語は、スラウストキトリウム細胞において機能するプロモータを指す。幾つかの実施形態において、プロモータエレメントは、コード配列の５’位の非翻訳領域（ＵＴＲ）であるか、またはそれを含む。５’ＵＴＲはｍＲＮＡ転写物の一部を形成し、従って真核生物におけるタンパク質発現の不可欠な部分である。転写後、５’ＵＴＲは、転写レベル及び翻訳レベルの両方でタンパク質発現を調節することができる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、ターミネータの用語は、細胞内において、該ターミネータに動作可能に結合された選択されたポリヌクレオチドの発現を抑制し、成熟のためにターゲッティングし（例えば、ポリＡテールを付加する）、またはｍＲＮＡ安定性を付与するポリヌクレオチドを指す。ターミネータ配列は、遺伝子中において終止コドンの下流にあってよい。本明細書中で使用するスラウストキトリウムターミネータの用語は、スラウストキトリウム細胞において機能するターミネータを指す。キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体をコードする核酸配列、並びにプロモータ、ターミネータ、選択マーカー、２Ａペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物もまた、本明細書において提供される。一例としては、プロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む第一の核酸構築物が提供される。また、プロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む第２の核酸構築物も提供される。更に、プロモータ、キシロース輸送体をコードする核酸配列、２Ａペプチドをコードする核酸配列、選択マーカー、及びターミネータを含む第３の核酸構築物が提供される。これらの構築物は例示的であり、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるプロモータの制御下で同じ構築物に含めることができる。任意に、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体をコードする核酸配列の各々は同じ構築物上にあり、例えば配列番号６に示すように、２Ａポリペプチド配列によって分離される。従って、一例として、核酸構築物はチューブリンプロモータ、配列番号６をコードする核酸配列によって分離されたキシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ、及びキシロース輸送体をコードする核酸配列、チューブリンターミネータ及び選択マーカーを含むことができる。任意に、上記選択マーカーはｂｌｅ遺伝子である。任意に、上記選択マーカーは配列番号２９を含む。
【００１８】
本明細書で使用する選択マーカーの語句は、選択を可能にする産物（ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、例えば遺伝子、または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）自体の何れかを指す。選択マーカーの用語は、本明細書中では当該技術分野で一般に理解されている通りに用いられ、それが細胞または生物体内に存在することにより、特定の規定された培養条件（選択的条件）下において細胞または生物に対して成長または生存の著しい利点または欠点を与えるマーカーを言う。例えば、上記条件は、特定の化合物の存在もしくは非存在、または特別な環境条件、例えば温度の上昇、放射線の増加、該マーカーの非存在下では有毒な化合物の存在等であり得る。このような化合物（複数可）または環境条件（複数可）の存在または不存在は、選択的条件（複数可）と称される。成長の利点とは、強化された生存能力（例えば、成長の利点を有する細胞または生物は、他の点では同一の細胞と比較して寿命が平均して増加する）、そうでなければ同一の細胞または生物と比較して増加した増殖速度（ここでは成長速度とも言う）、或いはその両方を意味する。一般に、成長の利点を有する細胞の集団は、本来であれば同一である上記成長の利点を欠いた細胞の集団よりも死滅したまたは生存しない細胞が少ないこと、及び／または細胞増殖率が高いことを示す。典型的には、選択マーカーは細胞に対して成長の利点を与えるが、一定の選択マーカーは細胞に対して成長の欠点を与える。例えば、それらは該細胞を、マーカーを発現しない別の同一細胞に比較して、特定の化合物または環境条件の有害な影響をより受け易くする。抗生物質耐性マーカーは、マーカーを発現する細胞を選択するために使用され得る選択マーカー類の非限定的な例である。適切な濃度の抗生物質（選択的条件）の存在下で、このようなマーカーは、該マーカーを発現する細胞に対して成長の利点を与える。従って、抗生物質耐性マーカーを発現する細胞は、抗生物質の存在下で生存及び／または増殖できるのに対して、抗生物質耐性マーカーを発現しない細胞は、抗生物質の存在下では生存すること及び／または増殖することができない。
【００１９】
選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールなどの一般的な細菌抗生物質、並びに微細藻類で機能することが知られている選択化合物が含まれ；例としては、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＲ５３８−１から単離できるｒｒｎＳ及びＡａｄＡ（アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ）が挙げられるが、これらはそれぞれ大腸菌プラスミドＲ５３８−１から単離され、それぞれ大腸菌及び幾つかの微細藻類においてスペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与する（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｖａｐｎｅｋ，  Ｐｌａｓｍｉｄ  １３：１７−３０，  １９８５；  Ｍｅｓｌｅｔ−Ｃｌａｄｉｅｒｅ  ａｎｄ  Ｖａｌｌｏｎ，  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．  １０（１２）：１６７０−８  ２０１１）。別の例は２３Ｓ  ＲＮＡタンパク質ｒｒｎＬであり、これはエリスロマイシンに対する耐性を付与する（Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １２６：８７５−８８８  １９９０；  Ｒｏｆｆｅｙ，  Ｇｏｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：９１２２−９１２６  １９９１）。別の例はＢｌｅであり、これはゼオシンに対する耐性を付与するＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓから単離されたＧＣリッチ遺伝子である（Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２５１：２３−３０  １９９６）。Ａｐｈ７は更に別の例であり、これはヒグロマイシンＢに対する耐性を与えるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子である（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｉｓｔ  １５３（４）：４０１−４１２  ２００２）。更なる例には下記ものが含まれる：ＡｐｈＶＩＩＩ、即ち、Ｅ．  ｃｏｌｉ及び幾つかの微細藻類においてパロマイシンに対する耐性を付与するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ由来のアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼＶＩＩＩ型（Ｓｉｚｏｖａ，  Ｌａｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １８１（１−２）：１３−１８  １９９６；  Ｓｉｚｏｖａ，  Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２７７（１−２）：２２１−２２９  ２００１）；Ｎａｔ＆Ｓａｔ−１、これはノウルセオトリシンに対する耐性を付与するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ由来のノウルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ、及びＥ．  ｃｏｌｉ由来のストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ，  Ｌｉｐｐｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  ３６（２）：３７９−３８６，  ２０００）；Ｎｅｏ、即ち、アミノグリコシド類であるカナマイシン、ネオマイシン、及びアナログＧ４１８に対する耐性を付与するアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼである（Ｈａｓｎａｉｎ，  Ｍａｎａｖａｔｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１２）：３６４７−３６５０，  １９８５）；及��Ｃｒｙ１、即ち、エメチンに対する耐性を付与するリボソームタンパク質Ｓ１４である（Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｓａｖｅｒｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４（６）：４０１１−４０１９，  １９９４）。
【００２０】
他の選択マーカーとしては、栄養マーカー（独立栄養マーカーまたは栄養要求マーカーとも呼ばれる）が挙げられる。これらには、光合成生物内での光合成活性の回復に基づいて選択を課す光独立栄養マーカーが含まれる。光独立栄養マーカーには、ＡｔｐＢ、ＴｓｃＡ、ＰｅｔＢ、ＮｉｆＨ、ｐｓａＡ及びｐｓａＢ（Ｂｏｙｎｔｏｎ，  Ｇｉｌｌｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０（４８５８）：１５３４−１５３８  １９８８；  Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９（１５）：４０８３−４０８９，  １９９１；  Ｋｉｎｄｌｅ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８８（５）：１７２１−１７２５，  １９９１；  Ｒｅｄｄｉｎｇ，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １７（１）：５０−６０，  １９９８；  Ｃｈｅｎｇ，  Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３２９（３）：９６６−９７５，  ２００５）が含まれるが、これらに限定されない。代替または追加の栄養マーカーには次のものが含まれる；ＡＲＧ７、これはアルギニン生合成の重要な工程であるアルギニノコハク酸リアーゼをコードする（Ｄｅｂｕｃｈｙ，  Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ８（１０）：２８０３−２８０９，  １９８９）；ＮＩＴ１、これは窒素代謝に必須の硝酸還元酵素をコードする（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８６（１７）：６４４９−６４５３，  １９８９）；ＴＨＩ１０、これはチアミン生合成に必須である（Ｆｅｒｒｉｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４１（２）：５４３−５４９，  １９９５）；及びＮＩＣ１、これはニコチンアミド生合成における必須の工程を触媒する（Ｆｅｒｒｉｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４１（２）：５４３−５４９，  １９９５）。そのようなマーカーは、一般に、生合成経路において機能し、細胞増殖または生存に必要な化合物を産生する酵素である。一般に、非選択的条件下では、必要な化合物は環境中に存在するか、または細胞内の別の経路によって生成される。選択的条件下において、マーカーが関与する生合成経路の機能は、化合物を産生するために必要とされる。
【００２１】
本明細書で使用される選択剤の語句は、選択マーカーを有する細胞または細胞集団に有利にまたは不利に、細胞または細胞集団に対して選択的圧力を導入する薬剤を指す。例えば、選択剤は抗生物質であり、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。任意に、選択剤としてゼオシンが使用される。
【００２２】
キシロース代謝に関与する遺伝子をコードする提供される核酸及びこれを含む核酸構築物を用いて形質転換され得る適切な微生物には、藻類（例えば微細藻類）、真菌類（酵母を含む）、細菌、または原生生物が含まれるが、これらに限定されない。任意に、該微生物は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のスラウストキトリド、より具体的にはスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）が含まれる。任意に、上記微生物の集団には、米国特許第５，３４０，５９４号及び同第５，３４０，７４２号に記載されているスラウストキトリアレスが含まれ、これら特許の全体を本明細書の一部として援用する。該微生物は、スラウストキトリウム種、例えば米国特許第８，１６３，５１５号に記載されているＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６２４５（即ち、ＯＮＣ−Ｔ１８）として寄託されたスラウストキトリウム種であってよく、上記特許の全体を本明細書の一部として援用する。従って、上記微生物は１８ｓ・ｒＲＮＡ配列を有することができ、該配列は配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上（例えば、１００％を含む）の配列同一性を有する。
【００２３】
微細藻類は、多様な生物群を表わす分野で認められている。この文書の目的のために、微細藻類の用語は、水生環境及び／または陸生環境に由来する単細胞微生物を記述するために使用される（幾つかの藍藻類は陸生／土壌棲息）。水環境は、海洋環境から淡水湖及び河川に及んでおり、河口及び川口などの汽水環境も含まれる。微細藻類は光合成性であり得る；任意に、微細藻類は従属栄養性である。微細藻類は、真核生物または原核生物であってよい。微細藻類は、運動性でなくても運動性であってもよい。
【００２４】
本明細書で使用されるスラウストキトリドの用語は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の何れかのメンバーを指称し、これにはスラウストキトリアエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科が含まれる。スラウストキトリドとして記載されている株には、以下の生物が含まれる；目：スラウストキトリアレス；科：スラウストキトリアセアエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）；属：スラウストキトリウム（種：アルジメンターレ［ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ］、オーレウム［ａｕｒｅｕｍ］、ベンチコラ［ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ］、グロボスム［ｇｌｏｂｏｓｕｍ］、キネイ［ｋｉｎｎｅｉ］、モチバム［ｍｏｔｉｖｕｍ］、マルチルディメンターレ［ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ］、パキデムム［ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ］、プロリフェルム［ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ］、ロセウム［ｒｏｓｅｕｍ］、ストリアトゥム［ｓｔｒｉａｔｕｍ］種）、ウルケニア（種：アモエボイデア［ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ］、ケルグエレンシス［ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ］、ミヌタ［ｍｉｎｕｔａ］、プロフンダ［ｐｒｏｆｕｎｄａ］、ラジアータ［ｒａｄｉａｔａ］、セイレンズ［ｓａｉｌｅｎｓ］、サルカリアナ［ｓａｒｋａｒｉａｎａ］、シゾキトプス［ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ］、ビスルゲンシス［ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ］、ヨルケンシス［ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ］種）、シゾキトリウム［Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ］（種：アグレガツム［ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ］、リムナセム［ｌｉｍｎａｃｅｕｍ］、マングロベイ［ｍａｎｇｒｏｖｅｉ］、ミヌツム［ｍｉｎｕｔｕｍ］、オクトポルニ［ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ］種）、ジャポノキトリウム［Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ］（種：マリナム［ｍａｒｉｎｕｍ］種）、アプラノキトリウム［Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ］（種：ハリオティディス［ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ］、ケルゲレンシス［ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ］、プロファンダ［ｐｒｏｆｕｎｄａ］、ストーチノイ［ｓｔｏｃｃｈｉｎｏｉ］種）、アルトルニア［Ａｌｔｈｏｒｎｉａ］（種：クロウチイ［ｃｒｏｕｃｈｉｉ］種）、またはエリナ［Ｅｌｉｎａ］（種：マリザルバ［ｍａｒｉｓａｌｂａ］、シノリフィカ［ｓｉｎｏｒｉｆｉｃａ］種）。ウルケニア内に記載されている種は、スラウストキトリウム属のメンバーであると考えられる。スラウトキトリウム属に属すると記載された株は、シゾキトリウム属と共通の形質を有し、シゾキトリウム属に属すると記載されてもよい。例えば、幾つかの分類学的な分類では、ＯＮＣ−Ｔ１８はトラウトキトリウム属に属すると考えられ、他の分類では、それは両方の属を示す形質を含むのでシゾキトリウム属として記載され得る。
【００２５】
本明細書で使用する形質転換の用語は、外因性または異種の核酸分子（例えば、ベクターまたは組換え核酸分子）を、レシピエント細胞または微生物に導入するプロセスを指す。この外因性または異種核酸分子は、宿主細胞または微生物のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれてもよく（即ち、共有結合する）、または組み込まれなくてもよい。例えば、外因性または異種ポリヌクレオチドは、エピソームエレメント、例えばプラスミド上に維持されることができる。或いは、代替的または追加的に、この外因性または異種ポリヌクレオチドは、それが染色体複製によって娘細胞に遺伝されるように、染色体中に組み込まれることができる。形質転換のための方法には、リン酸カルシウム沈殿法；Ｃａ２＋処理；レシピエント細胞及び組換え核酸を含む細菌プロトプラストの融合；組換え核酸を含むリポソームによるレシピエント細胞の処理；ＤＥＡＥデキストラン；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた融合；エレクトロポレーション；磁気ポレーション；遺伝子銃デリバリー；レトロウイルス感染；リポフェクション；細胞への直接的なＤＮＡの微量注入が含まれる。
【００２６】
細胞に関して使用するとき、形質転換されたの用語は、細胞が外因性または異種の遺伝物質（例えば、組換え核酸）を有するように、本明細書に記載の形質転換を受けた細胞を指す。また、形質転換されたの用語は、外因性または異種の遺伝物質を含んだ微生物、微生物の株、組織、生物などを指すために使用することができる。
【００２７】
導入の用語は、細胞または生物への核酸の導入に関して本明細書で使用されるとき、その最も広い意味を有し、例えば形質転換法（例えば、塩化カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、粒子衝撃）、並びに形質導入、接合、及び交配を含む他の方法による導入を包含することが意図される。任意に、核酸を細胞または生物に導入するために構築物が利用される。
【００２８】
本明細書に記載の方法で使用するための微生物は、様々な脂質化合物を産生することができる。本明細書で使用するとき、脂質の用語には、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸のエステル、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロチノイド、キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド）、炭化水素、及び当業者に公知の他の脂質が含まれる。任意に、脂質化合物には不飽和脂質が含まれる。不飽和脂質は、多価不飽和脂質（即ち、少なくとも２つの不飽和炭素−炭素結合、例えば二重結合を含む脂質）または高度に不飽和の脂質（即ち、４以上の不飽和炭素−炭素結合を含む脂質）を含み得る。不飽和脂質の例には、オメガ−３及び／またはオメガ−６多価不飽和脂肪酸、例えばドコサヘキサエン酸（即ちＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（即ち、ＥＰＡ）、及び他の天然の不飽和、多価不飽和及び高度不飽和化合物が含まれる。
【００２９】
本明細書では、キシロースのようなＣ５炭素糖を代謝するためのポリペプチドを発現するように操作された組換え微生物が提供される。具体的には、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の１つ以上のコピーを有する組換え微生物が提供され、ここでのキシロースイソメラーゼをコードする核酸は外因性核酸である。場合により、上記組換え微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の２以上のコピーを含む。任意に、上記組換え微生物はまた、キシロースイソメラーゼをコードする内因性核酸配列の１または２のコピーを含む。一例として、上記組換え微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする内因性核酸配列の１つまたは２つのコピー及びキシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列の１つのコピーを含むことができる。任意に、上記組換え微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の３つのコピーを含み、そのうちの1つは外因的に導入され、他の２つは内因性である。組換えの用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等に関して使用されるときには、当該細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等が改変されているか、または実験室方法の結果であり、天然には存在しないものであることを示す。従って、例えば、組換え微生物には実験方法、例えば、核酸を微生物に導入するための形質転換方法によって製造され、または改変された微生物が含まれる。組換え微生物は、天然の（非組換え）形態の微生物中には見出されない核酸配列を含むことができ、または改変された核酸配列、例えば非天然のプロモータに結合された核酸配列を含むことができる。
【００３０】
本明細書中で使用されるとき、外因性の用語は、細胞または生物に人工的に導入された、及び／またはそれが存在する細胞中に天然には存在しない核酸（例えば、調節配列及び／または遺伝子を含む核酸）またはポリペプチドのような物質を指す。換言すれば、該物質、例えば核酸またはポリペプチドは、それが導入される細胞または生物の外部に由来する。外因性核酸は、細胞内に天然に存在する核酸と同一であるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、スラウストキトリド細胞は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム調節配列を有する核酸を含むように操作することができる。特定の例において、内因性のスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム調節配列は、天然条件下では制御配列が関与しない遺伝子に動作可能に結合される。スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム調節配列は宿主細胞内に天然に存在し得るが、導入された核酸は本開示に従って外因性である。外因性核酸は、細胞内に天然に存在する何れの核酸とも異なるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、外因性核酸は、異種核酸、即ち、異なる種または生物由来の核酸であることができる。従って、外因性核酸は、供給源生物には天然に存在するが、外因性核酸が導入される細胞とは異なる核酸と同一である核酸配列を有することができる。本明細書で使用するとき、内因性の用語は、細胞に固有の核酸配列を指す。本明細書で使用するとき、異種の用語は、細胞に固有ではない、即ち細胞とは異なる生物に由来する核酸配列を指す。外因性及び内因性または異種性の用語は、互いに排他的ではない。従って、核酸配列は外因性且つ内因性であることができ、当該核酸配列は細胞に導入され得るが、細胞内に天然に存在する核酸の配列と同じか、または類似の配列を有することができることを意味する。同様に、核酸配列は外因性且つ異種であることができ、当該核酸配列は細胞中に導入され得るが、該細胞に固有のものではないこと、例えば異なる生物由来の配列を有することができることを意味する。
【００３１】
上述のように、上記提供される組換え微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む。この提供される微生物はまた、任意に、キシルロースキナーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。任意に、該組換え微生物は、キシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。上記キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ、及び／またはキシロース輸送体をコードする核酸配列は、任意に、外因性核酸配列である。任意に、上記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列は、内因性核酸配列である。任意に、上記キシルロースキナーゼ及び／またはキシロース輸送体をコードする核酸配列は、異種核酸である。任意に、当該微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の少なくとも２つのコピー、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２つのコピー、キシロース輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。任意に、上記キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一である。任意に、上記キシルロースキナーゼをコードする異種核酸配列は、配列番号５と少なくとも９０％同一である。上記のように、任意に、上記キシロース輸送体をコードする核酸は、異種核酸である。任意に、上記異種核酸によりコードされるキシロース輸送体は、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）由来のＧＸＳ１である。任意に、上記キシロース輸送体をコードする異種核酸配列は、配列番号２３と少なくとも９０％同一である。
【００３２】
上記提供される組換え微生物は、キシロース代謝に関与する遺伝子をコードする核酸配列を含むだけでなく、そのような配列の複数のコピーを含むことができる。従って、当該微生物は、上記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む。任意に、上記微生物は、上記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０コピーを含む。任意に、上記微生物は、上記キシロース輸送体をコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含んでいる。
【００３３】
上記提供される微生物において、核酸、例えば、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼまたはキシロース輸送体は、プロモータ及び／またはターミネータに動作可能に結合されることができる。任意に、キシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列は、プロモータに動作可能に結合される。任意に、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列及び／またはキシロース輸送体をコードする核酸配列もまた、プロモータに動作可能に結合される。任意に、プロモータはチューブリンプロモータである。任意に、該プロモータは、配列番号２５または配列番号２６と少なくとも８０％同一である。任意に、キシロースイソメラーゼをコードする外因性核酸配列はターミネータを含む。任意に、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列は、ターミネータを含む。任意に、キシロース輸送体をコードする核酸配列は、ターミネータを含む。任意に、上記ターミネータはチューブリンターミネータである。任意に、上記ターミネータは、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３０と少なくとも８０％同一である。
【００３４】
上記提供される微生物は、目的の遺伝子の形質転換を確認するための選択マーカーを含むことができる。従って、上記微生物は、選択マーカーを更に含むことができる。任意に、該選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。任意に、抗生物質は、ゼオシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシンまたはネオマイシンである。任意に、上記微生物は、スラウストキトリウムまたはシゾキトリウム微生物の何れかである。任意に、上記微生物はＯＮＣ−Ｔ１８である。
【００３５】
上記提供される微生物は、野生型微生物に対して区別される特徴を有している。例えば、上記組換え微生物は、非組換え対照（または野生型）微生物と比較して増大したキシロース輸送活性、非組換え対照（または野生型）微生物と比較して増大したキシロースイソメラーゼ活性、非組換え対照（または野生型）微生物と比較して増大したキシルロースキナーゼ活性、またはこれら活性の任意の組み合わせを有することができる。任意に、上記組換え微生物は、唯一の炭素源としてキシロースを用いて増殖する。
【００３６】
上記組換え微生物を作製する方法もまた提供される。従って、組換えキシロース代謝微生物を作製する方法であって、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列、及びキシロース輸送体をコードする核酸配列を含む１以上の核酸構築物を提供すること、上記微生物を上記１以上の核酸構築物で形質転換すること、及び上記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む微生物を単離することを含む方法が提供される。任意に、該方法は更に、上記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む微生物を単離することを含む。任意に、該方法は、キシロース輸送体の少なくとも１つのコピーを含む微生物を単離することを含む。任意に、上記１以上の核酸構築物は更に、選択マーカーを含む。
【００３７】
上記提供される方法において、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体をコードする上記核酸配列は、同じかまたは異なる構築物上に位置することができる。任意に、上記方法は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物、及びキシロース輸送体をコードする核酸配列を含む第３の核酸構築物を提供することを含む。任意に、上記第１、第２及び第３の核酸構築物は同じ選択マーカーを含む。任意に、上記第１の核酸構築物は、プロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む。任意に、上記第２の核酸構築物は、プロモータ、選択マーカー、２Ａペプチドをコードする核酸配列、キシルロースキナーゼをコードする核酸配列、及びターミネータを含む。任意に、上記第３の核酸構築物は、プロモータ、キシロース輸送体をコードする核酸配列、２Ａペプチドをコードする核酸配列、選択マーカー、及びターミネータを含む。上記のように、選択マーカーとしては抗生物質耐性遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。任意に、上記抗生物質は、ゼオシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシンまたはネオマイシンである。上記構築物に使用されるプロモータには、チューブリンプロモータが含まれるが、これに限定されない。任意に、上記プロモータは、配列番号２５または配列番号２６と少なくとも８０％同一である。上記構築物に使用されるターミネータには、限定されないが、チューブリンターミネータが含まれる。任意に、上記ターミネータは、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号３０と少なくとも８０％同一である。
【００３８】
上記提供される方法において、上記単離された組換え微生物は、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体の１以上のコピーを含むことができる。任意に、上記単離された組換え微生物は、キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む。任意に、上記キシロースイソメラーゼは、内因性キシロースイソメラーゼまたは異種キシロースイソメラーゼである。任意に、上記キシロースイソメラーゼをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一である。任意に、上記単離された組換え微生物は、上記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む。任意に、上記キシルロースキナーゼは異種キシルロースキナーゼである。任意に、上記キシルロースキナーゼをコードする核酸配列は、配列番号５と少なくとも９０％同一である。任意に、上記単離された組換え微生物は、上記キシロース輸送体をコードする核酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のコピーを含む。任意に、上記キシロース輸送体は、異種キシロース輸送体である。任意に、上記キシロース輸送体はカンジダ・インターメディア由来のＧＸＳ１である。任意に、上記キシロース輸送体をコードする核酸配列は、配列番号２３と少なくとも９０％同一である。任意に、上記微生物は、スラウストキトリウムまたはシゾキトリウム微生物の何れかである。任意に、上記微生物はＯＮＣ−Ｔ１８である。
【００３９】
上記のように、上記単離された組換え微生物は、対照非組換え微生物と比較して増大したキシロース輸送体活性、対照非組換え微生物と比較して増大したキシロースイソメラーゼ活性、対照非組換え微生物と比較して増大したキシルロースキナーゼ活性、またはそれらの組み合わせを有することができる。任意に、上記単離された組換え微生物は、唯一の炭素源としてキシロースを用いて増殖する。
【００４０】
本明細書に記載するとき、対照または標準対照とは、被験サンプル、測定結果または値と比較するための、参照（通常は既知の参照）として役立つサンプル、測定または値を指す。例えば、被験微生物、例えばキシロースを代謝するための遺伝子をコードする核酸配列で形質転換された微生物は、既知の正常な（野生型の）微生物（例えば、標準対照微生物）と比較することができる。標準対照はまた、唯一の炭素源としてのキシロース上で生育しないか、または僅かしか生育しない微生物集団、或いは最小レベルのキシロースイソメラーゼ活性、キシルロースキナーゼ活性及び／またはキシロース輸送体活性を有さないか、または有する微生物集団（例えば、標準対照微生物）から集められた平均測定結果もしくは値を表すことができる。当業者は、標準対照は任意の数のパラメータ（例えば、ＲＮＡレベル、ポリペプチドレベル、特定の細胞タイプなど）の評価のために設計できることを理解するであろう。
【００４１】
本明細書では、上記組換え微生物を用いて油を産生する方法もまた提供される。この方法は、上記組換え微生物を提供し、該微生物は唯一の炭素源としてのキシロース上で増殖することと、該微生物を、油を製造するために適した条件下において培養培地中で培養することを含んでいる。任意に、上記油はトリグリセリドを含む。任意に、上記油はアルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸またはそれらの組み合わせを含む。任意に、この方法は更に、上記油を単離することを含む。
【００４２】
上記提供される方法は、当該技術分野で既知の方法に従って微生物を培養するための追加の工程を含むか、またはそれと共に使用することができる。例えば、スラウストキトリド、例えばスラウストキトリウム属は、米国特許公開第２００９／０１１７１９４号または同第２０１２／０２４４５８４号に記載の方法に従って培養することができ、これら公開公報は本明細書で使用される方法の各工程または組成物について、それらの全体を本明細書の一部として援用する。
【００４３】
微生物は増殖培地（培養培地としても知られている）の中で増殖される。種々の培地の何れかが、本明細書に記載の微生物の培養に使用するために適する可能性がある。任意に、該培地は微生物のために、炭素源及び窒素源を含む様々な栄養成分を供給する。スラウストキトリド培養のための培地は、様々な炭素源の何れかを含むことができる。炭素源の例には、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール、アミノ糖、及び任意の種類のバイオマスまたは廃棄物流が含まれる。脂肪酸には、例えば、オレイン酸が含まれる。炭水化物には、グルコース、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（トウモロコシまたはコムギ）、アセテート、ｍ−イノシトール（例えば、コーンスティープリカー由来）、ガラクツロン酸（例えば、ペクチン由来）、Ｌ−フコース（例えば、ガラクトース由来）、ゲンチオビオース、グルコサミン、アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（例えば、グルコース由来）、セロビオース、デキストリン、アルファ−シクロデキストリン（例えば、デンプン由来）、及びスクロース（例えば、糖蜜に由来）が含まれるが、これらに限定されない。ポリオールとしては、マルチトール、エリスリトール、及びアドニトールが含まれるが、これらに限定されない。アミノ糖には、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−マンノサミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
任意に、本明細書で提供される微生物は、バイオマス及び／または目的の化合物（例えば、油または全脂肪酸（ＴＦＡ）含量）の生成を増加させる条件下で培養される。スラウストキトリドは、例えば、典型的には生理食塩水培地中で培養される。任意に、スラウストキトリドは、約０．５ｇ／Ｌ〜約５０．０ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養することができる。任意に、スラウストキトリドは、約０．５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ（例えば、約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地中で培養される。任意に、本明細書に記載のスラウストキトリドは、低塩条件下で成長させることができる。例えば、スラウストキトリドは、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地中で培養することができる。該培養培地は、任意にＮａＣｌを含む。任意に、該培地は、天然または人工の海塩、及び／または人工の海水を含むことができる。
【００４５】
上記培養培地は、ナトリウム源として非塩化物含有ナトリウム塩を含むことができる。本方法による使用に適した非塩化物ナトリウム塩の例としては、ソーダ灰（炭酸ナトリウム及び酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。例えば、それらの各々の全体の内容を本明細書の一部として援用する米国特許第５，３４０，７４２号及び同第６，６０７，９００号を参照されたい。例えば、培養培地中の全ナトリウムの約１００％未満、７５％未満、５０％未満、または２５％未満が塩化ナトリウムによって供給されるように、全ナトリウムのかなりの部分が非塩化物塩によって供給され得る。
【００４６】
スラウストキトリド培養用培地は、様々な窒素源の何れかを含むことができる。例示的な窒素源には、アンモニウム溶液（例えば、Ｈ２Ｏ中のＮＨ４）、アンモニウムまたはアミン塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、（ＮＨ４）３ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＯＯＣＨ２ＣＨ３（ＮＨ４Ａｃ））、ペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、大豆エキス、カザミノ酸及び蒸留穀粒が含まれる。適切な培地中の窒素源の濃度は、典型的には約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの範囲である。
【００４７】
培地は、任意にリン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムのようなリン酸塩を含む。培地中の無機塩及び微量栄養素には、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化カルシウム及びＥＤＴＡが含まれる。塩酸ピリドキシン、塩酸チアミン、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸及びビタミンＢ１２などのビタミン類を含めることができる。
【００４８】
培地のｐＨは、適切な場合には酸または塩基を使用して、及び／または窒素源を使用して、３．０〜１０．０の間に調節することができる。任意に、培地は滅菌することができる。
【００４９】
一般に、微生物の培養に用いられる培地は液体培地である。しかし、微生物の培養に用いられる培地は固体培地であってもよい。本明細書で述べる炭素源及び窒素源に加えて、固体培地は構造的支持を提供し、及び／または該培地が固体形態であることを可能にする１以上の成分（例えば、寒天またはアガロース）を含むことができる。
【００５０】
任意に、得られたバイオマスは、該バイオマス中に存在する望ましくない物質を不活性化するために低温殺菌される。例えば、バイオマスを低温殺菌して、化合物分解物質を不活性化することができる。低温殺菌工程のために、バイオマスは発酵培地中に存在してもよく、または発酵培地から単離されてもよい。低温殺菌工程は、バイオマス及び／または発酵培地を昇温状態に加熱することにより行うことができる。例えば、バイオマス及び／または発酵培地は、約５０℃〜約９５℃（例えば、約５５℃〜約９０℃または約６５℃〜約８０℃）の温度に加熱することができる。任意に、該バイオマス及び／または発酵培地は、約３０分〜約１２０分（例えば、約４５分〜約９０分、または約５５分〜約７５分）加熱することができる。この低温殺菌は、例えば直接蒸気注入のような適切な加熱手段を用いて行うことができる。
【００５１】
任意で、低温殺菌工程は行われない。別の言い方をすれば、本明細書で教示される方法は、任意に低温殺菌工程を欠いている。
【００５２】
任意に、上記バイオマスは、当業者に現在知られたものを含む種々の方法に従って収穫することができる。例えば、上記バイオマスは、例えば遠心分離（例えば、固体排出遠心分離機で）または濾過（例えば、クロスフロー濾過）を使用して、発酵培地から収集することができる。任意に、該収穫工程には、細胞バイオマスの収集促進のための沈殿剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは塩化カルシウム）の使用が含まれる。
【００５３】
任意に、上記バイオマスは水で洗浄される。任意に、上記バイオマスは約２０％固形分まで濃縮することができる。例えば、上記バイオマスは、約５％〜約２０％固形分、約７．５％〜約１５％固形分、もしくは約固形分〜約２０％固形分、または列挙された範囲内の任意のパーセンテージにまで濃縮することができる。任意に、上記バイオマスは、固形分約２０％以下、固形分約１９％以下、固形分約１８％以下、固形分約１７％以下、固形分約１６％以下、固形分約１５％以下、固形分約１４％以下、固形分約１３％以下、固形分約１２％以下、固形分約１１％以下、固形分約１０％以下、固形分約９％固形分以下、固形分約８％以下、固形分約７％以下、固形分約６％以下、固形分約５％以下、固形分約４％以下、固形分約３％以下、固形分約２％以下、または固形分約１％以下に濃縮することができる。
【００５４】
上記提供される方法は、任意に、上記バイオマスまたは微生物から多価不飽和脂肪酸を単離することを含む。多価不飽和脂肪酸の単離は、当業者に現在知られたものを含む１以上の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、多価不飽和脂肪酸を単離する方法は米国特許第８，１６３，５１５号に記載されており、その全体を本明細書の一部として援用する。任意に、上記培地は、多価不飽和脂肪酸の単離前には滅菌されていない。任意に、滅菌は温度の上昇を含む。任意に、微生物によって産生され、また提供された方法から単離された多価不飽和脂肪酸は、中鎖脂肪酸である。任意に、上記１以上の多価不飽和脂肪酸は、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５５】
本明細書に記載の方法に従って製造された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及び他の脂質を含有する油は、それらの生物学的、栄養的または化学的特性を利用する様々な用途の何れかで利用することができる。従って、上記提供される方法は、任意に、上記閾値容量の採取された部分から油を単離することを含む。任意に、上記油は燃料、例えばバイオ燃料を製造するために使用される。任意に、上記油は、医薬品、食品補助食品、動物飼料添加物、化粧品等において使用できる。本明細書に記載の方法に従って製造された脂質はまた、他の化合物の製造における中間体として使用することもできる。
【００５６】
一例として、上記提供される方法を用いて培養された微生物により産生される油は、脂肪酸を含むことができる。任意に、該脂肪酸は、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。任意に、該油はトリグリセリドを含む。任意に、該油は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１（ｎ−７））、シス−バクセン酸（Ｃ１８：１（ｎ−７））、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５７】
任意に、本明細書に記載の方法に従って製造された脂質は、最終製品（例えば、食品または栄養補助食品、乳幼児用調合乳、医薬品、燃料等）に組み込むことができる。脂質を組み込むことができる適切な食物または飼料補助食品には、ミルク、水、スポーツ飲料、エネルギー飲料、茶及びジュースなどの飲料；キャンデー、ゼリー、ビスケットなどの菓子類；乳製品などの脂肪含有食品及び飲料；ソフト米（またはおから）等の加工食品；乳児用調合乳；朝食用シリアル；等が含まれる。任意に、１種以上の製造された脂質を、例えばビタミンまたはマルチビタミン等の栄養補助食品に組み込むことができる。任意に、本明細書に記載の方法に従って製造された脂質は、栄養補助食品に組み込むことができ、また任意に、食品または飼料の成分（例えば、栄養補助食品）の中に組み込むことができる。
【００５８】
本明細書に記載の方法により製造された脂質を組み込むことができる飼料の例としては、ネコ食品；イヌ食品；水槽魚、養殖魚または甲殻類等のための餌；飼育場で飼育された動物（飼育場で飼育された家畜、魚または甲殻類を含む）の飼料が含まれる。本明細書に記載の方法に従って製造された脂質をその中に組み込むことができる食品または飼料材料は、好ましくは、意図されたレシピエントである生物にとって美味である。この食品または飼料材料は、食品材料について現在知られている任意の物理的特性（例えば、固体、液体、軟質）を有することができる。
【００５９】
任意に、1以上の製造された化合物（例えば、ＰＵＦＡ）は、機能性食品または医薬品に組み込むことができる。このような機能性食品または医薬品には、様々なタイプの錠剤、カプセル剤、飲用剤等が含まれる。任意に、該機能性食品または医薬品は、局所適用に適している。投与形態は、例えば、カプセル、油、顆粒、細粒、粉末、錠剤、小さな丸薬、トローチ等を含むことができる。
【００６０】
本明細書に記載の方法に従って製造された油または脂質は、様々な他の薬剤の何れかと組み合わせて、本明細書に記載した生成物に組み込むことができる。例えば、そのような化合物は、１以上の結合剤または充填剤、キレート剤、顔料、塩、界面活性剤、モイスチャライザー、粘度調整剤、増粘剤、皮膚軟化剤、香料、防腐剤等、またはそれらの任意の組み合わせと併せることができる。
【００６１】
上記開示された方法及び組成物のために使用することができ、関連して使用することができ、調製において使用することができ、またはその製品である材料、組成物及び成分が開示される。これらの材料及び他の材料が本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されているときは、これらの化合物の様々な個別の及び集合的な組合せ及び順列の具体的な参照が明示的に開示されなくても、本明細書において各々が具体的に考慮され、記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示され、議論され、また該方法を含む多くの分子に対してなされ得る多数の改変が議論されるならば、該方法の各組み合わせ及び順列、並びに可能な変更は、特にそうでないと明示されない限り具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた具体的に考慮され、開示されている。この概念は、開示された組成物を使用する方法における工程（これに限定されない）を含めて、本開示の全ての態様に適用される。従って、様々な実施できる追加の工程が存在する場合には、これら追加の工程の各々が、開示された方法の任意の特定の方法工程または該方法工程の組み合わせと共に実行され得ること、及びそのような各組み合わせまたは組合せのサブセットが開示されたと具体的に考慮され、また開示されたと看做されるべきであると理解される。
【００６２】
本明細書に引用された刊行物、及びそれらが引用される資料は、その全体を、本明細書の一部として具体的に本明細書に援用する。
【００６３】
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の態様を更に説明することを意図しており、特許請求の範囲の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１．組換えスラウストキトリドによるＣ５炭素代謝
本来、キシロースレダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路と、キシロースイソメラーゼ／キシルロースキナーゼ経路の２つのキシロース代謝経路が存在する（図１）。ＯＮＣ−Ｔ１８は両方の経路由来の遺伝子をコードし、また上記の通り、キシロース培地中で成長させたときのキシリトールの蓄積によって証明されるように、キシロースレダクターゼ／キシリトールデヒドロゲナーゼ経路が支配的である。イソメラーゼ／キナーゼ経路は酸化還元補因子に依存しないので、ＯＮＣ−Ｔ１８イソメラーゼ遺伝子の過剰発現は、キシロースからキシルロースへの変換における補因子依存性を除去する。図２及び３に示すように、ＯＮＣ−Ｔ１８を用いたトランスクリプトーム研究により、そのキシロースイソメラーゼ及び推定キシルロースキナーゼ遺伝子が、グルコース飢餓の間に主に発現されることを示した；一方、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする推定で同定された遺伝子は構成的に発現された。
【００６５】
Ｔ１８イソメラーゼを、酵母ＩＮＶＳｃ１におけるｈｉｓタグ付加及び過剰発現の後、金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。陽性対照として、Ｅ．  ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０由来のｈｉｓタグ付加ＸｙｌＡを、Ｅ．  ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳから過剰発現及び精製した。精製されたタンパク質のタンパク質濃度は、標準ブラッドフォードアッセイによって決定した。Ｔ１８イソメラーゼ及びＥ．  ｃｏｌｉイソメラーゼの活性に対する温度の影響を、５ｍＭのＭｇＡＴＰ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中の５μｇのタンパク質、及び０．７５ｇ／Ｌのキシロースまたはキシルロースの何れかを用いて測定した。反応を１０℃、２５℃、３０℃、３７℃、５０℃、６０℃及び８０℃で一晩インキュベートした。９５℃で５分間の熱不活性化により反応を停止させた。反応をＨＰＬＣで分析し、存在する糖の濃度を、標準曲線に対するピーク下の面積から決定した。Ｔ１８イソメラーゼは、３７℃以上の温度において、キシロース及びキシルロースの両方に対してより高い活性を示した（図２０Ａ）。これは、２５℃〜３０℃の温度でより高い活性を有するＥ．ｃｏｌｉイソメラーゼとは対照的である（図２０Ｂ）。
【００６６】
用量依存性は、５ｍＭのＭｇＡＴＰ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中に、０．７５ｇ／Ｌのキシロースまたはキシルロースと共にイソロメラーゼのタンパク質濃度を増加させながらインキュベートすることにより決定した。反応物を３０℃（Ｅ．  ｃｏｌｉ）または５０℃（Ｔ１８）で一晩インキュベートした後、９５℃で５分間熱不活性化させて停止させた。反応をＨＰＬＣで分析し、存在する糖の濃度を、標準曲線に対するピーク下の面積から決定した。キシロース及びキシルロースの両方に対する、Ｔ１８イソメラーゼの用量依存性が観察された（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。
【００６７】
この実施例は、ＯＮＣ−Ｔ１８を含むスラウストキトリド種において内因性及び／または異種キシロース代謝導入遺伝子を発現させるための、スラウストキトリウムＯＮＣ−Ｔ１８−由来（ＯＮＣ−Ｔ１８）α−チューブリンプロモータの使用を記載する。しかし、全体を通して議論されるように、他の調節エレメントを使用することができる。図４及び５は、それぞれキシロースイソメラーゼ遺伝子及びキシルロースキナーゼ遺伝子を含むプラスミドの構築物を示す。本明細書に記載したように、キシロース代謝導入遺伝子は、宿主のゲノム内に複数（≧８）コピーで存在した。ＯＮＣ−Ｔ１８の場合、当該改変された生物は、野生型（ＷＴ）細胞と比較して増大したキシロースの代謝を示した。例えば、内因性キシロースイソメラーゼ遺伝子（配列番号２）を発現するように改変された株（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６株）、並びに内因性キシロースイソメラーゼ遺伝子（配列番号２）及びキシルロースキナーゼ遺伝子（配列番号５）を発現するように改変された株（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＋ｘｙｌＢ、７−７株）は両方共、ＷＴ株よりも４０％多いキシロースを使用した。Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６及び７−７は両者共にＷＴ株よりも少ないキシロースをキシリトールに変換し、それぞれ４０％及び４２０％少なかった。ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換に使用した構築物を図４及び５に示す。ＯＮＣ−Ｔ１８形質転換体は、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の遺伝子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システムに記載された標準的な遺伝子銃プロトコルを用いて作製した。簡単に言えば、０．６μｍの金粒子を、２．５μｇの直線化したプラスミドＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ、３７℃、一晩）で被覆した。該コーティングされた金粒子を使用して、１．０のＯＤ６００で１ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８細胞を予め広げたプレートに衝突させた。衝突パラメータは、３または６ｃｍの標的距離を有する１３５０または１１００ｐｓｉのヘリウム圧力を用いることを含んでいた。一晩で回収の後、細胞をプレートから洗い出し、選択抗生物質（Ｚｅｏ２５０μｇ／ｍＬ及びハイグロ４００μｇ／ｍＬ）を含む培地上にプレーティングした。プレートを２５℃で１週間インキュベートして、耐性コロニーを同定した。得られた形質転換体を、ＰＣＲ及びサザンブロットによりスクリーニングした。
【００６８】
標準的なプロトコルを用いてサザンブロットを行った。簡単に言えば、約２０μｇのゲノムＤＮＡを、４０単位のＢａｍＨＩ制限酵素を用いて総容量５０μＬで３７℃で一晩消化した。７．２μｇの各消化されたサンプルを、１．０％アガロースゲル上においてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて５０Ｖで約１．５分間泳動させた。ゲルを２５０ｍＭのＨＣｌ中に１５分間浸漬することにより、ＤＮＡをゲル中で脱プリン化した。０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５ＭのＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ７．５）中で、１５分間の２回の洗浄のためのインキュベーションによってゲルを更に変性させた。次いで、２回の１５分間の洗浄のために、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でのインキュベーションによって反応を中和した。最後に、ゲルを２０×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液中で１５分間平衡化させた。ＤＮＡを、標準的な転写装置を用いて正に帯電したナイロン膜に転写した。１２０，０００μＪの暴露でＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）を用いてＤＮＡを膜に固定した。ＰＣＲ・ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してサザンブロットプローブを作製して、製造業者の指示に従ってＤＩＧ標識プローブを作製した。ナイロン膜に付着したＤＮＡを、２０ｍＬのＤＩＧイージーＨｙｂ溶液（ＤＩＧ  ＥａｓｙＨｙｂ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてプレハイブリダイズさせた。該ＤＩＧ標識プローブは、４０μＬのｂｌｅ−プローブ反応混合物を３００μＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、９９℃で５分間インキュベートすることにより変性した。次いで、この溶液を２０ｍＬのＤＩＧハイブリダイゼーション溶液に添加して、プローブ溶液を作製した。次いで、プローブ溶液をＤＮＡ固定ナイロン膜に加え、５３℃で一晩インキュベートした。翌日、該膜を、室温において２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。更にこの膜を０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において、６８℃で１５分間２回洗浄した。検出のために、ＤＩＧ洗浄及びブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の指示に従って使用し、膜を洗浄及びブロックした。検出のために、ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの抗ＤＩＧ−ＡＰ接合抗体を使用した。２μＬの抗体溶液を２０ｍＬの検出溶液に加え、上記膜と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、ブロットを、キットと共に提供された洗浄バッファーに浸した。可視化のために、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。１０μＬのＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液が１ｍＬの検出用溶液中において膜上でインキュベートされ、これを上記溶液を上記膜に保持させるために「シートプロテクター」プラスチックの層で覆った。シグナルは、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて直ちに検出された。
【００６９】
コドン最適化されたｂｌｅ遺伝子を、Ｔ１８Ｂα−チューブリンプロモータ及びターミネータエレメントの制御下でクローニングした（図６）。イソメラーゼ遺伝子は、発現されたタンパク質（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ）のＮ末端に６−ヒスチジンタグを付加するように、Ｔ１８Ｂからクローン化された。キシロースイソメラーゼ酵素活性は、酵母におけるヒスチジンタグ付きタンパク質の過剰発現及び精製によって確認された。イソメラーゼ遺伝子（導入された６−ヒスチジンタグと共に）は、ｂｌｅ遺伝子及び２Ａ配列の下流の遺伝子をクローニングすることによって、α−チューブリンプロモータ及びターミネータの制御下でクローニングされた（図４及び図６）。このプラスミド（ｐＡＬＰＨＴＢ−Ｂ２Ｇ−ｈｉｓＩｓｏ）によるＴ１８Ｂの遺伝子銃形質転換は、ゼオシン（ｚｅｏ）耐性の形質転換体をもたらした。多くの形質転換株がこの手順で得られた。これらの菌株のうちの２つは、導入遺伝子の１コピーを含む実施例＃６、及び導入遺伝子の８コピーを含む実施例＃１６として示されている（図７）。
【００７０】
Ｔ１８Ｂゲノム内へのＩｓｏ−Ｈｉｓ導入遺伝子の挿入は、ＰＣＲ及びサザンブロット分析によって確認された（図７）。定性的には、これらのデータは、菌株＃６における導入遺伝子の単一コピーの存在、及び菌株＃１６の単一部位における複数の鎖状体導入遺伝子コピーの存在を示した。Ｉｓｏ−Ｈｉｓトランスジーン挿入の正確な数は、ゲノムＤＮＡ上のｑＰＣＲによって決定した（図８）。これらのデータは、株＃６における導入遺伝子の１コピーと、株＃１６における導入遺伝子の８コピーの存在を示した（図８）。コピー数の増加が発現レベルの増加と相関するかどうかを試験するために、ｍＲＮＡをＷＴ、Ｉｓｏ−ｈｉｓ＃６及びＩｓｏ−Ｈｉｓ＃１６Ｔ１８Ｂ細胞から単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。図１１は、導入遺伝子の単一コピーを含有する＃６株と比較して、導入遺伝子の８コピーを含有する株＃１６細胞におけるＩｓｏ−Ｈｉｓ転写物の顕著に増加した発現を示す。Ｉｓｏ−Ｈｉｓの転写物は、ＷＴ細胞では検出できない（図１１）。増加したｍＲＮＡ発現が増加したイソメラーゼ酵素活性と相関するかどうかを評価するために、ＷＴ細胞、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃６細胞及びＩｓｏ−Ｈｉｓ＃１６細胞から細胞抽出物を採取した。株＃６及びＷＴ細胞と比較して、株＃１６細胞では増強されたイソメラーゼ酵素活性が観察される（図１２）。最後に、キシロースを代謝する菌株＃１６の能力をキシロース枯渇アッセイで調べ（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、ＷＴ細胞と比較した。これらのフラスコ発酵は、キシロースを代謝し、キシリトールに変換されたキシロースの量を定量することができることを実証した。従って、図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＷＴ細胞と比較したＩｓｏ−Ｈｉｓ株＃１６におけるキシロース代謝の増加、及び著しく少ないキシリトールの産生を示す。
【００７１】
フラスコアッセイのために、細胞を培地中で２〜３日間増殖させた。ペレットは、糖を含まない培地２（９ｇ／ＬのＮａＣｌ、４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１００ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ３、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．８６グラム／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１５０μｇ／ＬのビタミンＢ１２、３０μｇ／Ｌのビオチン、６ｍｇ／Ｌのチアミン塩酸塩、１．５ｍｇ／Ｌの塩化コバルト（ＩＩ）、３ｍｇ／Ｌの塩化マンガン）中で２回洗浄した。次に、２０ｇ／Ｌのグルコース及び５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する最小培地に、洗浄した細胞を用いてＯＤ６００が０．０５になるように接種した。様々な時点でサンプルを採取し、上清中に残存する糖の量をＨＰＬＣで分析した。図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ及び図２２Ｄに示されるように、キシロースイソメラーゼ遺伝子コピー数が増加するに伴い、ＷＴと比較して４０％までキシロース使用が増大し、キシリトール産生は２０％減少した。
【００７２】
次いで、Ｅ．  ｃｏｌｉｘｙｌＢ遺伝子を導入するための第２ラウンドの形質転換の親株として、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ株＃１６を使用した。この遺伝子は、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）選択下で導入された。ｐＣｈｌａｍｙ＿３由来のｈｙｇｒｏ遺伝子、２Ａ配列、及びＴ１８Ｂコドン最適化Ｗ３１１０  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｘｙｌＢ遺伝子を、Ｔ１８Ｂ・ｉｓｏ−ｈｉｓ＃１６における発現のために、Ｔ１８Ｂα−チューブリンプロモータ及びターミネータエレメントの制御下でクローニングした（図５）。Ｔ１８Ｂイソメラーゼと協調して作用するＥ．  ｃｏｌｉキシルロースキナーゼのインビトロでの能力は、酵母におけるヒスチジンタグ付きタンパク質の過剰発現及び精製、それに続くキシロース及びキシルロースとの酵素反応によって確認された。ｘｙｌＢプラスミド（ｐＪＢ４７）を用いたＴ１８Ｂ  ｉｓｏ−ｈｉｓ株＃１６の遺伝子銃による形質転換により、ｈｙｇｒｏ及びゼオ耐性形質転換体がもたらされた。Ｔ１８Ｂゲノム内でのｈｙｇｒｏ−２Ａ−ｘｙｌＢ遺伝子の挿入は、ＰＣＲ及びサザンブロット分析によって確認された（図９）。定性的には、これらのデータは、菌株＃７−３における導入遺伝子の単一のコピーの存在、及び菌株＃７−７の単一部位における複数の鎖状体導入遺伝子コピーの存在を示した。ｘｙｌＢ遺伝子挿入の数は、ゲノムＤＮＡ単離についてのｑＰＣＲによって決定した（図１０）。図１０は、株７−７における導入遺伝子の１６個の挿入と、株７−３における１個のコピーを示す。導入遺伝子の複数のコピーが、インビトロにおいて増強されたキシロース代謝を与えるかどうかを決定するために、細胞抽出物アッセイを行い、該細胞抽出物がキシロースを代謝する能力を分析した（図１３）。キシロースを代謝する形質転換体細胞の能力を、フラスコベースのキシロース枯渇アッセイによって調べた（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。この実験では、ＷＴ細胞は最も少ない量のキシロースを消費し、最も多くのキシリトールを産成した。菌株Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６，７−３及び７−７は全て同様の量のキシロースを消費した。しかし、ｘｙｌＢ導入遺伝子の複数のコピーを含む７−７のみがかなり量のキシリトールを産成しなかった。最後に、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６株及び７−７株を、５Ｌ発酵容器中において、グルコース及びキシロースを含有する培地中で試験した。７７時間の発酵に際して、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６株はキシロースの約８％をキシリトールに変換し、一方、７−７株はキシロースの約２％をキシリトールに変換した。この発酵におけるキシリトール蓄積を図１６に示す。
【００７３】
フラスコアッセイのために、培地中で細胞を２〜３日間増殖させた。ペレットを、糖を含まない培地で２回洗浄した。２０ｇ／Ｌ：５０ｇ／Ｌグルコース：キシロースを含有する培地に、洗浄した細胞を０．０５のＯＤ６００まで接種した。種々の時点でサンプルを採取し、上清中に残存する糖の量をＨＰＬＣで分析した。図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ及び図２３Ｄに示すように、ＷＴと比較して、キシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼの両方を過剰発現する株では、キシロースは最大５０％多く使用され、キシリトールの８０％の減少が観察された。
【００７４】
これらの菌株を更に分析するために、該菌株を並列の５Ｌのザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）発酵槽において増殖させた。初期培地は、他の基礎培地成分とともに、２０ｇ／Ｌのグルコース及び５０ｇ／Ｌのキシロースを含有していた。両方の培養物を２８℃及び５．５ｐＨに維持し、７２０ＲＰＭで一定に混合し、１Ｌｐｍの環境空気で一定の通気を行った。これらの培養物にグルコースを１６時間供給し、その後に８時間の飢餓期間を与えた。このサイクルは３回で完了した。飢餓期間中、１０ｍＬのサンプルを０．５時間ごとに採取した。グルコース、キシロース及びキシリトール濃度は、これらのサンプル中においてＨＰＬＣにより定量した。更なるバイオマス及び油含量の定量のために、より大きい５０ｍＬサンプルを定期的に採取した。グルコース供給速度はグルコース消費速度と一致し、これは培養排ガス中に検出されるＣＯ２により定量された。図２４に示すように、７−７株は、これらの条件下において、ＷＴよりも５２％多くキシロースを使用した。
【００７５】
サザンブロット分析により、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６株はイソメラーゼ導入遺伝子の８個の挿入を含むことが観察された（図８）。この予期せぬ複数の挿入は、単一コピーを保有する株に対してイソメラーゼ遺伝子の発現の増加を（図１１）、及び増加したイソメラーゼインビトロ活性（図１２）もたらした。株Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６は、イソメラーゼ導入遺伝子の単一コピーを保有する株よりも、増大したキシロース生産性を示した（図１４）。
【００７６】
同様に、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＋ｘｙｌＢ形質転換体内では、クローンの１つ（Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＋ｘｙｌＢ７−７）はｘｙｌＢ遺伝子の複数の挿入を有し（図１０）、これは該細胞内においてキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼの増大したインビボ活性をもたらした（図１３）。このクローンは、親株Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＃１６よりも多量のキシロースを使用することができる一方、著しく少ないキシリトールを産生した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。更に、Ｉｓｏ−Ｈｉｓ＋ｘｙｌＢ７−７は、キシロースの存在下においてＷＴよりも多くのバイオマスを産生した。これらの２つの株は、イソメラーゼ遺伝子及びキナーゼ遺伝子の両方の存在が重要であるだけでなく、挿入数も重要であることを示した。
【００７７】
「７−７」株を含有するｉｓｏ−ｈｉｓ＆ｘｙｌＢを更に最適化するために、この株をキシロース輸送体で形質転換した。図１７は、形質転換のための例示的構築物を示している。使用されるキシロース輸送体の例には、Ａｔ５ｇｌ７０１０及びＡｔ５ｇ５９２５０（シロイヌナズナ）、Ｇｆｘ１及びＧＸＳ１（カンジダ）、ＡｓｐＴｘ（アスペルギルス）並びにＳｕｔ１（ピキア）が含まれるが、これらに限定されない。Ｇｘｓ１（配列番号２３）を形質転換のために選択した。結果を図１９Ａ、図１９Ｂ及び図１９Ｃに示す。ＧＸＳ１を含む形質転換体３６−２、３６−９及び３６−１６は、７−７及びＷＴ株よりも多くのキシロースを使用する。それらはまた、ＷＴ及び７−７株よりも遅くグルコースを使用する。該データは、キシロース及びグルコースの両方が、ＧＸＳ１含有株によって初期段階で使用されることを示している。更に、ＧＸＳ１含有株により製造されたキシリトールのパーセントは、ＷＴ及び７−７株の両方よりも低い。
【００７８】
キシロースの代謝に対する糖輸送体の効果を更に分析するために、アスペルギルス由来のＡｓｐＴＸ（Ａｎ１１ｇ０１１００）及びカンジダ由来のＧｘｓ１を７−７株（ｉｓｏｈｉｓ＋ｘｙｌＢ）に導入した。図２５は、α−チューブリンａｓｐＴｘ−ｎｅｏ及びα−チューブリンｇｘｓ１−ｎｅｏ構築物を示す。Ｔ１８形質転換体を、ＢｉｏＲａｄの遺伝子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システムにより記載された標準的な遺伝子銃プロトコルを用いて作製した。簡単に述べると、０．６μｍの金粒子を、２．５μｇの直線状プラスミドＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ、３７℃、ｏ／ｎ）で被覆した。該被覆した金粒子を、予め１ｍＬのＴ１８細胞を１．０のＯＤ６００で広げたＷＤプレートに衝突させた。衝突パラメータは、３または６ｃｍの標的距離を有する１３５０または１１００ｐｓｉのヘリウム圧力を用いることを含んでいた。一晩での回収の後、細胞をプレートから洗い出し、選択抗生物質（２ｍｇ／ｍＬでのＧ４１８）を含む培地上にプレーティングした。プレートを２５℃で１週間インキュベートして、耐性コロニーを同定した。得られた形質転換体を、ＰＣＲ及びサザンブロットによりスクリーニングした（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。
【００７９】
標準的なプロトコルを用いてサザンブロットを行った。簡単に言うと、約２０μｇのゲノムＤＮＡを、３７℃において、４０単位のＢａｍＨＩ制限酵素で５０μＬｏ／ｎ／の総容積で消化した。７．２μｇの各消化されたサンプルを、１．０％アガロースゲル上においてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて５０Ｖで約１．５分間泳動させた。ゲルを２５０ｍＭのＨＣｌ中に１５分間浸漬することにより、該ゲル中のＤＮＡを脱プリン化した。２回の１５分間洗浄の間、０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液中でのインキュベーションによりゲルを更に変性させた。次いで、２回の１５分間洗浄の間、０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でのインキュベーションによって反応を中和した。最後に、ゲルを２０×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液中で１５分間平衡化させた。標準的な転写装置を用いて、ＤＮＡを正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）に転写した。ＤＮＡを、ＵＶストラタリンカーを用いて１２０，０００μＪの露光量で膜に固定した。サザンブロットプローブをＰＣＲ・ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて作製し、製造業者の指示に従ってＤＩＧ標識プローブを作製した。ナイロン膜に付着させたＤＮＡを、２０ｍＬのＤＩＧ・ＥａｓｙＨｙｂ溶液（ＤＩＧ  ＥａｓｙＨｙｂ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ、Ｒｏｃｈｅ）を用いてプレハイブリダイズさせた。ＤＩＧ標識されたプローブは、４０μＬのｂｌｅ−プローブ反応混合物を３００μＬのｄｄＨ２Ｏに加えることにより変性させ、９９℃で５分間インキュベートした。次いで、この溶液を２０ｍＬのＤＩＧハイブリダイゼーション溶液に添加して、プローブ溶液を作製した。次いで、該プローブ溶液をＤＮＡ固定ナイロン膜に加え、５３℃で一晩インキュベートした。翌日、この膜を室温にて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。該膜を、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において、６８℃で１５分間更に２回洗浄した。検出のために、ＤＩＧ洗浄及びブロック緩衝液セット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造者の指示に従って上記膜を洗浄し、ブロックした。ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ）からの抗ＤＩＧ−ＡＰ接合抗体を検出のために使用した。２μＬの抗体溶液を２０ｍＬの検出溶液に添加し、室温で３０分間膜と共にインキュベートした。次いで、該ブロットを、キットと共に提供された洗浄バッファーに浸した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を可視化のために使用した。１０μＬのＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液が１ｍＬの検出用溶液中において膜上でインキュベートされ、これを上記溶液を上記膜に保持させるために「シートプロテクター」プラスチックの層で覆った。シグナルは、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムを用いて直ちに検出された。
【００８０】
フラスコアッセイのために、細胞を培地中で２〜３日間増殖させた。ペレットを、糖を含まない培地２（９ｇ／ＬのＮａＣｌ、４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１００ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ３、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．８６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１５０μｇ／ＬのビタミンＢ１２、３０μｇ／Ｌのビオチン、６ｍｇ／Ｌのチアミン塩酸塩、１．５ｍｇ／Ｌの塩化コバルト（ＩＩ）、３ｍｇ／Ｌの塩化マンガン）中で２回洗浄した。次に、２０ｇ／Ｌのグルコース及び２０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地２に、洗浄した細胞を、０．０５のＯＤ６００にまで接種した。図２７Ａ、図２７Ｂ、図２７Ｃ及び図２７Ｄに示すように、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼ及びキシロース輸送体の発現は、親株７−７よりも、キシロースを７１％までより多く使用させ、キシリトールを４０％少なく産生させた。
【００８１】
フラスコアッセイのために、細胞を培地中で２〜３日間増殖させた。ペレットを生理食塩水で２回洗浄した。次に、グルコースの代わりに６０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地に、洗浄された細胞を０．０５のＯＤ６００まで接種した。種々の時点でサンプルを採取し、上清中に残留する糖の量をＨＰＬＣで分析した。図２８は、主な炭素源としてキシロースを含有する培地中でのＴ１８増殖が、イソメラーゼ及びキナーゼの両方の過剰発現を必要とすることを示す。この背景における輸送体の発現は、この培地におけるキシロース使用を著しく増加させなかった。
【００８２】
Ｔ１８・７−７及び輸送体株による増大したキシロースの使用が、代替供給原料からの炭素を含む培地で観察された。フラスコアッセイのために、細胞を培地中で２〜３日間増殖させた。ペレットを０．９％生理食塩水で２回洗浄した。実験室等級のグルコースの組み合わせとしての２０ｇ／Ｌのグルコース：５０ｇ／Ｌのキシロース、並びに林業からの代替供給原料に由来するグルコース及びキシロースを含有する培地２に、洗浄した細胞を０．０５のＯＤ６００ｎｍまで接種した。種々の時点でサンプルを採取し、上清中に残留する糖の量をＨＰＬＣで分析した。図２９Ａ及び図２９Ｂに示されるように、代替供給原料からの糖を含有する培地において、輸送体をコードするＴ１８・７−７株は、野生型またはＴ１８・７−７よりも多くのキシロースを使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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