(57)【要約】  本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体が提供される。提供されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体又は抗原結合フラグメントを発現している細胞及び関連するベクター、並びに検出可能に標識された抗体又は抗原結合フラグメントも記載されている。加えて、提供された抗体を使用する方法が記載されている。例えば、提供された抗体を使用して、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断、処置、若しくはモニタすること、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいるため、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受けることができるか否かを判定することができる。
2018534933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
ｌ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、組換え抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｂ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｃ．配列番号１６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｄ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｅ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｆ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｇ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｈ．配列番号３０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｊ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｌ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｍ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｎ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、又は
ｏ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む前記抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記（ａ）の抗体は、配列番号６８に記載された重鎖配列及び配列番号６９に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｂ）の抗体は、配列番号７０に記載された重鎖配列及び配列番号７１に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｃ）の抗体は、配列番号７２に記載された重鎖配列及び配列番号７３に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｄ）の抗体は、配列番号７４に記載された重鎖配列及び配列番号７５に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｅ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号７７に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｆ）の抗体は、配列番号７８に記載された重鎖配列及び配列番号７９に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｇ）の抗体は、配列番号８０に記載された重鎖配列及び配列番号７９に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｈ）の抗体は、配列番号８１に記載された重鎖配列及び配列番号８２に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｉ）の抗体は、配列番号８３に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｊ）の抗体は、配列番号８５に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｋ）の抗体は、配列番号８６に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｌ）の抗体は、配列番号７４に記載された重鎖配列及び配列番号８７に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｍ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号８８に記載された軽鎖配列を含み、
前記（ｎ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号８９に記載された軽鎖配列を含み、又は
前記（ｏ）の抗体は、配列番号９０に記載された重鎖配列及び配列番号９１に記載された軽鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定された場合、約５０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ１は、そのＦｃ領域中に、Ｋ４０９Ｒ置換を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ１は、そのＦｃ領域中に、Ｆ４０５Ｌ置換を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ４は、そのＦｃ領域中に、Ｆ４０５Ｌ置換及びＲ４０９Ｋ置換を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３４Ａ置換、及びＬ２３５Ａ置換を更に含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している組換え細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、ハイブリドーマ又はトランスフェクトーマである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記抗体は、組換え的に生成される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）と、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）と、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、
前記ＨＣ１及び前記ＬＣ１は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するように対を成しており、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するように対を成している、組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
【請求項１９】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１８に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１９及び２０のいずれかに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２１】
ＨＣ１は、配列番号９２又は配列番号９４を含み、ＬＣ１は、配列番号９３又は配列番号９５を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２２】
ＨＣ２は、配列番号６８を含み、ＬＣ２は、配列番号６９を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２３】
ＨＣ２は、配列番号７０を含み、ＬＣ２は、配列番号７１を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２４】
ＨＣ２は、配列番号７２を含み、ＬＣ２は、配列番号７３を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２５】
ＨＣ２は、配列番号７４を含み、ＬＣ２は、配列番号７５を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２６】
ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号７７を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２７】
ＨＣ２は、配列番号７８を含み、ＬＣ２は、配列番号７９を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２８】
ＨＣ２は、配列番号８０を含み、ＬＣ２は、配列番号７９を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２９】
ＨＣ２は、配列番号８１を含み、ＬＣ２は、配列番号８２を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３０】
ＨＣ２は、配列番号８３を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３１】
ＨＣ２は、配列番号８４を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３２】
ＨＣ２は、配列番号８６を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３３】
ＨＣ２は、配列番号７４を含み、ＬＣ２は、配列番号８７を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３４】
ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号８８を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３５】
ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号８９を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３６】
ＨＣ２は、配列番号９０を含み、ＬＣ２は、配列番号９１を含む、請求項２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３７】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定された場合、約３０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、請求項１８〜３６に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３８】
前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト肺がん細胞、ヒト結腸がん細胞、ヒト膵がん細胞、ヒト骨髄異形成症候群がん細胞、ヒト慢性骨髄性白血病、ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、ヒト急性リンパ性白血病細胞、及びヒトＴ細胞白血病／リンパ腫細胞からなる群から選択される細胞の表面でＩＬ１ＲＡＰに結合する、請求項１８〜３７に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３９】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、６．７ｎＭを超える濃度においてＡＰ−１及びＮＦ−κＢ応答性エレメントを介したＩＬ−１β媒介性シグナル伝達を阻害する、請求項１８〜３８に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項４０】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、インビトロでのＩＬ１ＲＡＰ発現細胞のＴ細胞依存性細胞毒性を約１．３ｎＭ未満のＥＣ５０で誘引する、請求項１８〜３９に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項４１】
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）と、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）と、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、
前記ＨＣ１及びＬＣ１は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するように対を成し、かつ、配列番号９６に示されているような重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０２に示されているようなＨＣＤＲ２、配列番号９８に示されているようなＨＣＤＲ３、配列番号９９に示されているような軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１００に示されているようなＬＣＤＲ２、及び配列番号１０１に示されているようなＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣ２及びＬＣ２は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するように対を成し、かつ、配列番号１６又は２２に示されているような重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１７又は２３に示されているようなＨＣＤＲ２、配列番号１８又は２４に示されているようなＨＣＤＲ３、配列番号４６又は６２に示されているような軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４７又は６３に示されているようなＬＣＤＲ２、及び配列番号１０３又は６４に示されているようなＬＣＤＲ３を含む、組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
【請求項４２】
請求項１８〜４１のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している組換え細胞。
【請求項４３】
前記細胞は、ハイブリドーマである、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、組換え的に生成される、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４５】
がんを有する対象を処置するための方法であって、前記方法は、
治療的に有効な量の、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを、それを必要とする患者に、前記がんを処置するのに十分な時間投与する工程を含む、方法。
【請求項４６】
がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、前記方法は、
治療的に有効な量の、請求項１６〜３９のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与して、前記がん細胞の成長又は増殖を阻害する工程を含む、方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞をＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、前記方法は、
治療的に有効な量の、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与して、Ｔ細胞をがんにリダイレクトする工程を含む、方法。
【請求項４８】
前記がんは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、肺がん、大腸直腸がん、又は膵がんである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第２の治療剤を投与する工程を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の治療剤を、前記二重特異性抗体と同時に、連続的に、又は別個に、前記対象に投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法。
【請求項５６】
請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの、前記ＨＣ１、前記ＨＣ２、前記ＬＣ１、又は前記ＬＣ２をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、それを使用するための指示書と、を含む、キット。
【請求項５８】
対象における血管新生を阻害する方法であって、前記方法は、
それを必要とする対象に、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与する工程を含む、方法。
【請求項５９】
前記対象はがんを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんは、１つ又は２つ以上の固体腫瘍を呈する、請求項５９に記載の方法。
【請求項５９】
前記がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんではない、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６１】
対象におけるＭＤＳＣを枯渇させる方法であって、前記方法は、
それを必要とする対象に、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与する工程を含む、方法。
【請求項６２】
前記対象はがんを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記がんは、１つ又は２つ以上の固体腫瘍を呈する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんではない、請求項５９又は６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１１月２日に出願された米国特許仮出願第６２／２４９，４６６号に対する優先権の利益を主張するものであり、その特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、その配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年１０月２７日に作成され、ファイル名はＰＲＤ３３９４ＵＳＮＰ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１２１，８２８バイトである。
【０００３】
本明細書に提供される開示は、インターロイキン−１受容体補助タンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に特異的に結合するモノクローナル抗体、ＩＬ１ＲＡＰとクラスター決定因子３（ＣＤ３）を特異的に結合する多重特異性抗体、並びに記載された抗体の生成方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、白血病性細胞のクローン性増殖を特徴とする、遺伝学的異質性を有する疾患である。ＡＭＬの基礎疾患の生物学的な理解が深まっているにもかかわらず、細胞毒性化学療法を伴う標準処置は過去数十年にわたってほとんど変わらないままであり、５年の全生存期間は３０％未満という低い状態のままである（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８（２２）：２０５９〜２０７４；Ｂｕｒｎｅｔｔ  Ａ，Ｗｅｔｚｌｅｒ  Ｍ，Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ  Ｂ（２０１１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９（５）：４８７〜４９４）。そのため、効果が高くかつ毒性の低い、理想的にはＡＭＬ幹細胞を標的とする、新しい治療法の開発が急務となっている。何故ならば、ＡＭＬ幹細胞は、ＡＭＬの病因において極めて重要な役割を果たしていると見られ、標準治療ではその根絶が不十分であることが、高い再発率の一因になっていると考えられるからである（Ｈｏｐｅ  ＫＪ，Ｊｉｎ  Ｌ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ（２００４）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５（７）：７３８〜７４３；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１３１５〜１３２１）。細胞表面分子を指向する治療抗体がリンパ腫、急性リンパ性白血病、及び固体腫瘍などの悪性疾患の処置に有効であることは実証されているが（Ｈｏｅｌｚｅｒ  Ｄ（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５（６）：７０１〜７０６，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＳＥ，Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＪＤ（２０１５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １３７（２）：２６２〜２６６）、ＡＭＬに対して現在承認されている抗体ベースの療法は存在しない。
【０００５】
インターロイキン１受容体補助タンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、ＩＬ１Ｒ３とも呼ばれ、１型インターロイキン１受容体（ＩＬ１Ｒ１）、インターロイキン−３３受容体（ＩＬ−３３Ｒ。ＳＴ２とも呼ばれる）、及びインターロイキン−３６受容体（ＩＬ−３６Ｒ。ＩＬ−１ＲＬ２とも呼ばれる）の副受容体であり、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、及びＩＬ−３６シグナルの伝達に不可欠である（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ｓ，Ｓｔａｎｓｂｅｒｇ  Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｃ（２００４）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８（５）：４１５〜４２８）。ＩＬ１ＲＡＰは、推定慢性骨髄性白血病幹細胞の生体標識として報告されている（Ｊａｒａｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（３７）：１６２８０〜１６２８５）。最近の研究により、ＩＬ１ＲＡＰは、ＡＭＬ患者の〜８０％において細胞表面上に発現されること、及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって候補ＣＤ３４＋ＣＤ３８−  ＡＭＬ幹細胞をインビトロで選択的に殺傷できることが示されている（Ａｓｋｍｙｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２１（１８）：３７０９〜３７１３）。更に、ＩＬ１ＲＡＰは、第７染色体異常を有する高リスクのＡＭＬにおいて未熟細胞上で発現上昇され、上昇したＩＬ１ＲＡＰの発現は予後不良と相関がある（Ｂａｒｒｅｙｒｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ  １２０（６）：１２９０〜１２９８）。これらの所見は、ＩＬ１ＲＡＰが、ＡＭＬにおける抗体ベースの療法の適切な標的であることを示唆している。
【０００６】
ＡＭＬの処置のための抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の使用は、国際公開第２００９１２０９０３号及び同第２０１１０２１０１４号に言及されている。ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体は、例えば、国際公開第２０１４１００７７２号に記載されている。記載されているＩＬ１ＲＡＰ抗体は、その作用様式としてＡＤＣＣを利用する。残念なことに、治療抗体によってＡＤＣＣをトリガーすることは、複数の制限に直面する。まず第１に、Ｆｃとその受容体との間の親和性が重要な役割を果たしており、集団の８０％が低親和性変異型の受容体を発現するという事実が大きな課題である（Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ，Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ  Ｍ，Ｗｅｉｓｓ  Ｅ，Ｂａｔｙ  Ｄ．（２００９）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．１５７（２）：２２０〜２３３）。第２に、ＩｇＧ１分子は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（Ａｓｎ２９７）内でグリコシル化される。この修飾は、ＡＤＣＣ効率を低下させることが示されている（Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ｙａｍａｎｅ  Ｎ，Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ  Ｅ，Ｋａｎｄａ  Ｙ，Ｓａｋｕｒａｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：３４６６〜３４７３．）。第３の制限は、治療抗体が、ＦｃγＲＩＩＩａに結合するために患者の高濃度のＩｇＧｓと競合しなければならないことにある（Ｐｒｅｉｔｈｎｅｒ  Ｓ，Ｅｌｍ  Ｓ，Ｌｉｐｐｏｌｄ  Ｓ，Ｌｏｃｈｅｒ  Ｍ，Ｗｏｌｆ  Ａ，ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；４３：１１８３〜１１９３）。最後に、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び好中球によって発現される、ＦｃγＲＩＩｂなどの阻害性Ｆｃ受容体に対する治療抗体の親和性が、治療抗体の使用の第４の制限になることがある（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１９：２３９〜２４５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このため、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置には、更なる使用可能な選択肢がまだ必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントが提供される。また、提供されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞、並びに関連するベクター、並びに検出可能に標識された抗体及び抗原結合フラグメントもまた記載されている。加えて、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを使用する方法が記載されている。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントを使用して、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断若しくはモニタし、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいるため、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受けることができるか否かを判定することができる。
【０００９】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に特異的に結合する多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントが更に提供される。提供されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体を発現している細胞、並びに関連するベクター、並びに検出可能に標識された多重特異性抗体もまた記載されている。加えて、提供された多重特異性抗体を使用する方法が記載されている。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を使用して、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断若しくはモニタし、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいるため、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体による処置を受けることができるか否かを判定することができる。
【００１０】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的な組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ１ＲＡＰに結合する。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。
【００１１】
表１に、本明細書に記載された一部のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体の例の概要を提供する。
【００１２】
【表１】
2018534933.tif 000003
【００１３】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。本明細書に記載された一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む抗体又は抗原結合と、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合について競合する。
【００１４】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。本明細書に記載された抗体は、ＩｇＧアイソタイプのいずれかとの組み合わせで、可変ドメインの記載された特徴を有する抗体を含む。同ＩｇＧアイソタイプは、Ｆｃ配列が異なるエフェクター機能をもたらすために改変されている改変版を含む。
【００１５】
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子への結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００１６】
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）ＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／又はＫ４０９Ｒ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、記載された抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合、５０ｎＭ以下の解離定数で、ＩＬ１ＲＡＰに結合可能である。一部の実施形態では、抗体は、上記表１で表わされた抗体のＣＤＲを含む。親和性を測定するためのアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して行われるアッセイを含む。この場合、このアッセイは、室温（例えば、２５℃又は２５℃付近）で行われる。ＩＬ１ＲＡＰに結合可能な抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅセンサチップ上に、抗Ｆｃ抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ＃１０９−００５−０９８）により、７５ＲＵ付近のレベルで捕捉され、続けて、４０μＬ／分の流量において、会合及び解離データが収集される。
【００１９】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントに加えて、記載された抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能なポリヌクレオチド配列もまた提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。同様に、本明細書で提供されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞が提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。
【００２０】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体を使用する方法
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示されている。本節に検討されている方法で使用する特定の抗体には、表１に抗体に対して記載された一連のＣＤＲを有するものが含まれる。例えば、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、１）ＩＬ１ＲＡＰ受容体相互作用を阻害することによって、２）抗体が毒素に接合されている場合、その毒素の標的をＩＬ１ＲＡＰ発現がんにすることによって、又は、３）体の免疫細胞をＩＬ１ＲＡＰ発現がんの部位にリダイレクトすることによって（ＡＤＣＣ、Ｔ細胞リダイレクト）、がんを処置するのに有用であり得る。更に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、生体サンプル、例えば、血液又は血清中におけるＩＬ１ＲＡＰの存在を検出するのに、生体サンプル、例えば、血液又は血清中におけるＩＬ１ＲＡＰの量を定量するのに、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんを診断し、がんで苦しむ対象を処置する方法を決定し、又は対象におけるＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行をモニタするのに、有用であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。記載された方法は、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受ける前に行われてもよい。更に、記載された方法は、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受けた後に行われてもよい。
【００２１】
生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出する記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝すことを含む。
【００２２】
また、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ発現がんを診断する記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝すことを伴う。ただし、この方法は、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を定量する工程と、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を、既知の標準又は参照サンプルと比較する工程と、対象のＩＬ１ＲＡＰレベルががんに関連付けられるＩＬ１ＲＡＰのレベル内に入るかどうかを判定する工程と、を含む。
【００２３】
本明細書において、対象中のＩＬ１ＲＡＰ発現がんをモニタする方法もまた記載されている。記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝す工程と、抗体又はその抗原結合フラグメントに結合したサンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を定量する工程と、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を、既知の標準若しくは参照サンプル、又は対象から以前に得られた類似するサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量のいずれか一方と比較する工程と、比較されたサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量における差異に基づいて、対象のＩＬ１ＲＡＰレベルががんの進行、退行、又は不変を示すかどうかを判定する工程と、を含む。
【００２４】
対象から得られ、又は同対象に由来するサンプルは、生体サンプル、例えば、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、組織会合していない循環腫瘍細胞、組織、外科手術的に切除された腫瘍組織、生検、微小針吸引サンプル、又は組織学的調製物である。
【００２５】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、記載された方法又は当業者に既知の他の方法での使用のために標識されてもよい。例えば、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、若しくはポリヒスチジン、又は当技術分野において既知の類似するこのような標識で標識されてもよい。
【００２６】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体キット
開示されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットが本明細書において記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントと、生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの存在を検出する際の使用のための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、使用していない時に抗体又はフラグメントを収容するための容器と、抗体又はフラグメントを使用するための指示書と、本明細書に記載されたとおり、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び／又は検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
【００２７】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞へのＴリンパ球のリダイレクトは、魅力的な代替アプローチを提示する。Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、及びエータ（η）に標識化されたＣＤ３の不変性サブユニットと細胞表面で共発現した、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）又はＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体のいずれかからなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）に記載されている。従来技術で記載される抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４である（Ｙａｎｇ  ＳＪ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）１３７；１０９７〜１１００）。ＳＰ３４は霊長類とヒトの両方のＣＤ３と反応する。ＳＰ３４はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手できる。従来技術で記載される更なる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１である（国際公開第２００００４１４７４号を参照されたい）。従来技術で記載される更なる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３である（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＧｖＨＤ，Ａｎａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：８４４（１９９２））。ＳＰ３４とＵＣＨＴ−１及びＢＣ−３との間の違いは、ＳＰ−３４がＣＤ３のε鎖上に単独で存在するエピトープを認識する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０４７を参照されたい）のに対して、ＵＣＨＴ−１及びＢＣ−３はε鎖とγ鎖の両方が寄与するエピトープを認識するという点である。抗体ＳＰ３４のものと同じ配列を有する抗体の配列は、国際公開第２００８１１９５６５号、同第２００８１１９５６６号、同第２００８１１９５６７号、同第２０１００３７８３６号、同第２０１００３７８３７号及び同第２０１００３７８３８号に言及されている。抗体ＳＰ３４のＶＨに対して９６％の同一性を有する配列は、米国特許第８２３６３０８号（国際公開第２００７０４２２６１号）に言及されている。
【００２８】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に結合する組換え多重特異性抗体（「ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体」）並びにその多重特異性抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する組換え抗体（又はその抗原結合フラグメント）が提供される。
【００２９】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＩＬ１ＲＡＰ特異性アームは、ヒトＩＬ１ＲＡＰ及び／又はカニクイザルＩＬ１ＲＡＰに結合する。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰ特異性アームは、ヒトＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインに結合する。好ましい実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、二重特異性抗体又は抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）と、ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）と、ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）と、ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、ＨＣ１及びＬＣ１は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するように対を成しており、ＨＣ２及びＬＣ２は、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するように対を成している、組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体、又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメントが提供される。別の実施形態では、抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している組換え細胞が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体のＩＬ１ＲＡＰ結合アーム（又は「ＩＬ１ＲＡＰ特異性アーム」）は、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ抗体から（例えば、表１で列記されたＣＤＲ配列を有する抗体から）得られる。
【００３０】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰ特異性アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、３０ｎＭ以下の解離定数で、ＩＬ１ＲＡＰに結合可能である。一部の実施形態では、記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体はアゴニストではない。一部の実施形態では、記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体は、６．７ｎＭを超える濃度においてＡＰ−１のＩＬ−１β媒介活性化及びＮＦ−κＢ活性化を阻害する。
【００３１】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体のＣＤ３結合アーム（又は「ＣＤ３特異性アーム」）は、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる（Ｋ．Ｒ．Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２〜３８３９）。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体のＣＤ３結合アームは、表２から選択された１つのＶＨドメイン及び１つのＶＬドメインを含む。
【００３２】
【表２】
2018534933.tif 000004
【００３３】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。
【００３４】
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子への結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。
【００３５】
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）ＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞及び／又は初代カニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
【００３７】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体に加えて、記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする単離された合成ポリヌクレオチドが提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。一部の実施形態では、細胞を培養することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法が提供される。
【００３８】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が更に提供される。
【００３９】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を使用する方法
記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示される。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置に有用であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）である。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。
【００４０】
ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置を、それを必要とする対象において行う記載された方法は、この対象に、治療的に有効な量の記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントを投与する工程を含む。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態では、治療的に有効な量のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に、がんを処置するのに十分な時間投与することにより、がんを有する対象を処置するための方法が提供される。
【００４１】
がん細胞の成長又は増殖を阻害するために、治療的に有効な量のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを投与することにより、がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法が更に提供される。
【００４２】
また、本明細書において、Ｔ細胞をがんにリダイレクトするために、治療的に有効な量のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与することにより、Ｔ細胞をＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞にリダイレクトする方法もまた提供される。
【００４３】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３特異性抗体キット
本明細書において、開示されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を含むキットが記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を使用する方法又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体と、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんを処置する際の使用のための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントのうち１つ若しくは２つ以上、使用していない時に抗体又はフラグメントを収容するための容器、並びに／又は抗体若しくはフラグメントを使用するための指示書、本明細書に記載されたとおりの、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び／若しくは検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＩＬ１ＲＡＰ細胞外ドメインをクローニングするのに使用されるｐＤｉｓｐｌａｙベクター。
【図２】ＩＬ１ＲＡＰファージディスプレイ及びＯＭＴ−１ハイブリドーマから結果として生じた上清を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１レポーター細胞内のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性（外因性組換えヒトＩＬ−１βの付加）についてスクリーニングした。値は、１サンプルあたり３つの読み取り値の平均からなる未加工の光学密度（ＯＤ＠６５０ｎｍ）単位として提示されている。
【図３Ａ】ＩＡＰＢ５７エピトープの位置、及びＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との相互作用。（図３Ａ）エピトープの位置の概観。ＩＡＰＢ５７は、ＩＬ１ＲＡＰのＤ２及びＤ３ドメインに結合する（黒い領域）。（図３Ｂ）ＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との間の２Ｄ相互作用マップ。ＣＤＲ−Ｌ１及び−Ｌ２を除いた全てのＣＤＲからの残基がＩＬ１ＲＡＰと接触する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＩＬ１ＲＡＰ、ＬＣ及びＨＣの残基は、灰色のボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた。（Ｃ、Ｄ）Ｆａｂ軽鎖（図３Ｃ）及び重鎖（図４Ｄ）とＩＬ１ＲＡＰとの主要な相互作用の詳細図。水素結合は破線で示されている。
【図３Ｂ】ＩＡＰＢ５７エピトープの位置、及びＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との相互作用。（図３Ａ）エピトープの位置の概観。ＩＡＰＢ５７は、ＩＬ１ＲＡＰのＤ２及びＤ３ドメインに結合する（黒い領域）。（図３Ｂ）ＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との間の２Ｄ相互作用マップ。ＣＤＲ−Ｌ１及び−Ｌ２を除いた全てのＣＤＲからの残基がＩＬ１ＲＡＰと接触する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＩＬ１ＲＡＰ、ＬＣ及びＨＣの残基は、灰色のボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた。（Ｃ、Ｄ）Ｆａｂ軽鎖（図３Ｃ）及び重鎖（図４Ｄ）とＩＬ１ＲＡＰとの主要な相互作用の詳細図。水素結合は破線で示されている。
【図３Ｃ】ＩＡＰＢ５７エピトープの位置、及びＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との相互作用。（図３Ａ）エピトープの位置の概観。ＩＡＰＢ５７は、ＩＬ１ＲＡＰのＤ２及びＤ３ドメインに結合する（黒い領域）。（図３Ｂ）ＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との間の２Ｄ相互作用マップ。ＣＤＲ−Ｌ１及び−Ｌ２を除いた全てのＣＤＲからの残基がＩＬ１ＲＡＰと接触する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＩＬ１ＲＡＰ、ＬＣ及びＨＣの残基は、灰色のボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた。（Ｃ、Ｄ）Ｆａｂ軽鎖（図３Ｃ）及び重鎖（図４Ｄ）とＩＬ１ＲＡＰとの主要な相互作用の詳細図。水素結合は破線で示されている。
【図３Ｄ】ＩＡＰＢ５７エピトープの位置、及びＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との相互作用。（図３Ａ）エピトープの位置の概観。ＩＡＰＢ５７は、ＩＬ１ＲＡＰのＤ２及びＤ３ドメインに結合する（黒い領域）。（図３Ｂ）ＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７との間の２Ｄ相互作用マップ。ＣＤＲ−Ｌ１及び−Ｌ２を除いた全てのＣＤＲからの残基がＩＬ１ＲＡＰと接触する。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＩＬ１ＲＡＰ、ＬＣ及びＨＣの残基は、灰色のボックス、白いボックス、及び楕円の中にそれぞれ示されている。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた。（Ｃ、Ｄ）Ｆａｂ軽鎖（図３Ｃ）及び重鎖（図４Ｄ）とＩＬ１ＲＡＰとの主要な相互作用の詳細図。水素結合は破線で示されている。
【図４】ＩＡＰＢ５７のエピトープ残基及びパラトープ残基。エピトープ残基は、配列の異なる部分が網掛け領域として示されているＩＬ１ＲＡＰアイソフォーム内で下線が付されている。アイソフォーム１及び４の細胞外領域のみが示されている。パラトープ残基は網掛けされており、ＣＤＲ領域は下線が付されている（Ｋａｂａｔ定義）。
【図５】エピトープ群の競合プロファイル：任意の１つのエピトープ群に属するメンバーは同じ競合プロファイルを有する。ベン図内においてエピトープ群が重なり合うと、それらは競合する。そうでなければ、それらはヒトＩＬ１ＲＡＰに対して競合しない。
【図６Ａ】ＭＶ４−１１  ＡＭＬ細胞を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体媒介性Ｔ細胞殺傷アッセイの代表的なデータセット：（６Ａ）最初の９つのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の場合、及び残りの６つの二重特異性のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の場合。ＩＬ１ＲＡＰ陰性／低の細胞株は（ＳＵ−ＤＨＬ−１０）であり、コントロールデータも取得した（図示せず）。アッセイは、抗体の濃度を上げながら５：１のＥ：Ｔ比で汎ヒトＴ細胞（ドナーＤ１０３）を用いて実行された。
【図６Ｂ】ＭＶ４−１１  ＡＭＬ細胞を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体媒介性Ｔ細胞殺傷アッセイの代表的なデータセット：（６Ａ）最初の９つのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の場合、及び残りの６つの二重特異性のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の場合。ＩＬ１ＲＡＰ陰性／低の細胞株は（ＳＵ−ＤＨＬ−１０）であり、コントロールデータも取得した（図示せず）。アッセイは、抗体の濃度を上げながら５：１のＥ：Ｔ比で汎ヒトＴ細胞（ドナーＤ１０３）を用いて実行された。
【図７Ａ】ＮＦ−κＢシグナル伝達評価：（７Ａ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１レポーター細胞内で外因性組換えヒトＩＬ−１βが存在しているときのアンタゴニスト活性について、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、及び対応のｎｕｌｌアーム二重特異性コントロール抗体（ＩＡＰＢ１００、ＩＡＰＢ１０１、及びＣＮＴＯ  ７００８）を分析した。（７Ｂ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１レポーター細胞内で外因性組換えヒトＩＬ−１βが存在しない（０．１ｎｇ／ｍＬ）ときのアゴニスト活性について、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、及び対応のｎｕｌｌアーム二重特異性コントロール抗体（ＩＡＰＢ１００、ＩＡＰＢ１０１、及びＣＮＴＯ  ７００８）を分析した。全てのデータは、１サンプルあたり３つの読み取り値の平均から得られたコントロールのパーセントとして提示されている。
【図７Ｂ】ＮＦ−κＢシグナル伝達評価：（７Ａ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１レポーター細胞内で外因性組換えヒトＩＬ−１βが存在しているときのアンタゴニスト活性について、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、及び対応のｎｕｌｌアーム二重特異性コントロール抗体（ＩＡＰＢ１００、ＩＡＰＢ１０１、及びＣＮＴＯ  ７００８）を分析した。（７Ｂ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１レポーター細胞内で外因性組換えヒトＩＬ−１βが存在しない（０．１ｎｇ／ｍＬ）ときのアゴニスト活性について、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、及び対応のｎｕｌｌアーム二重特異性コントロール抗体（ＩＡＰＢ１００、ＩＡＰＢ１０１、及びＣＮＴＯ  ７００８）を分析した。全てのデータは、１サンプルあたり３つの読み取り値の平均から得られたコントロールのパーセントとして提示されている。
【図８Ａ】ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３のＴ細胞媒介性細胞毒性アッセイ。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞と、細胞バンクサービスから取得したＩＬ１ＲＡＰ＋ＡＭＬ細胞株（８Ａ〜８Ｄ）又はＩＬ１ＲＡＰ陰性／低Ｂ細胞リンパ腫細胞株（８Ｅ）のいずれかとでインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間経過した後、フローサイトメトリーによって総腫瘍細胞毒性が測定された。
【図８Ｂ】ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３のＴ細胞媒介性細胞毒性アッセイ。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞と、細胞バンクサービスから取得したＩＬ１ＲＡＰ＋ＡＭＬ細胞株（８Ａ〜８Ｄ）又はＩＬ１ＲＡＰ陰性／低Ｂ細胞リンパ腫細胞株（８Ｅ）のいずれかとでインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間経過した後、フローサイトメトリーによって総腫瘍細胞毒性が測定された。
【図８Ｃ】ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３のＴ細胞媒介性細胞毒性アッセイ。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞と、細胞バンクサービスから取得したＩＬ１ＲＡＰ＋ＡＭＬ細胞株（８Ａ〜８Ｄ）又はＩＬ１ＲＡＰ陰性／低Ｂ細胞リンパ腫細胞株（８Ｅ）のいずれかとでインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間経過した後、フローサイトメトリーによって総腫瘍細胞毒性が測定された。
【図８Ｄ】ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３のＴ細胞媒介性細胞毒性アッセイ。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞と、細胞バンクサービスから取得したＩＬ１ＲＡＰ＋ＡＭＬ細胞株（８Ａ〜８Ｄ）又はＩＬ１ＲＡＰ陰性／低Ｂ細胞リンパ腫細胞株（８Ｅ）のいずれかとでインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間経過した後、フローサイトメトリーによって総腫瘍細胞毒性が測定された。
【図８Ｅ】ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３のＴ細胞媒介性細胞毒性アッセイ。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９を使用したＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞と、細胞バンクサービスから取得したＩＬ１ＲＡＰ＋ＡＭＬ細胞株（８Ａ〜８Ｄ）又はＩＬ１ＲＡＰ陰性／低Ｂ細胞リンパ腫細胞株（８Ｅ）のいずれかとでインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間経過した後、フローサイトメトリーによって総腫瘍細胞毒性が測定された。
【図９】検査した４つの細胞株のＥＣ５０値のまとめ。
【図１０】単離された自家健常ヒトのＣＤ１４＋単球及びＣＤ３＋Ｔ細胞のＩＣ３Ｂ１８媒介性及びＩＣ３Ｂ１９媒介性の細胞毒性のエクスビボ評価。グラフは、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、ＣＮＴＯ  ７００８（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）、ＩＡＰＢ１００（ＩＡＰＢ６３×Ｂ２３Ｂ４９）、及びＩＡＰＢ１０１（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９）二重特異性抗体のＣＤ１４＋単球細胞毒性のパーセントを示す。
【図１１Ａ】健常ヒト全血（ドナー２７０６７）に外因的に加えられたＳＫＮＯ−１細胞のＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９細胞毒性のエクスビボ評価：２４時間（１１Ａ）及び４８時間（１１Ｂ）の時点での、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９（ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３）二重特異性抗体並びにＣＮＴＯ  ７００８（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）二重特異性抗体を使用した細胞毒性ＳＫＮＯ−１細胞のパーセント。
【図１１Ｂ】健常ヒト全血（ドナー２７０６７）に外因的に加えられたＳＫＮＯ−１細胞のＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９細胞毒性のエクスビボ評価：２４時間（１１Ａ）及び４８時間（１１Ｂ）の時点での、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９（ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３）二重特異性抗体並びにＣＮＴＯ  ７００８（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）二重特異性抗体を使用した細胞毒性ＳＫＮＯ−１細胞のパーセント。
【図１２】Ａ〜Ｅは、新鮮なＡＭＬドナー全血内における芽球のＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９細胞毒性並びにＴ細胞活性化のエクスビボ評価：（１２Ａ）は、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９二重特異性抗体、ＣＮＴＯ  ７００８（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）二重特異性抗体、並びにＩＡＰＢ１００又はＩＡＰＢ１０１（ＩＬ１ＲＡＰ×Ｎｕｌｌ）二重特異性抗体を使用した、ＡＭＬ細胞の総細胞毒性のパーセントを示し、（１２Ｂ）は、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９二重特異性抗体、ＣＮＴＯ  ７００８二重特異性抗体、並びにＩＡＰＢ１００及びＩＡＰＢ１０１二重特異性抗体によって誘引されたＴ細胞活性化を示す。Ｆｃ遮断薬は加えなかった。（１２Ｃ）ＩＣ３Ｂ１９は、初代ＡＭＬ  ＩＬ１ＲＡＰ＋芽球のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（１２Ｄ）及びＣＮＴＯ  ７００８（１２Ｅ）は細胞毒性を誘引しない。
【図１３Ａ】健常ヒト全血内のＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞のＩＣ３Ｂ１９媒介性細胞毒性。
【図１３Ｂ】健常ヒト全血内のＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞のＩＣ３Ｂ１９媒介性細胞毒性。
【図１４Ａ】（１３Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｆ親、（１３Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＦヒトＨＥ２、（１３Ｃ）ＨＥＫ−２９３ＦカニクイザルＣＢ８、（１３Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｆマウスクローン５、及び（１３Ｅ）ＨＥＫ−２９３Ｆラットクローン１のＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ  ＥＣＤ細胞株への結合について、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の代表的なデータを試験した。値は、１試験サンプルあたり２回の読み取り値の平均から得られたＭＳＤ光単位として提示されている。
【図１４Ｂ】（１３Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｆ親、（１３Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＦヒトＨＥ２、（１３Ｃ）ＨＥＫ−２９３ＦカニクイザルＣＢ８、（１３Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｆマウスクローン５、及び（１３Ｅ）ＨＥＫ−２９３Ｆラットクローン１のＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ  ＥＣＤ細胞株への結合について、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の代表的なデータを試験した。値は、１試験サンプルあたり２回の読み取り値の平均から得られたＭＳＤ光単位として提示されている。
【図１４Ｃ】（１３Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｆ親、（１３Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＦヒトＨＥ２、（１３Ｃ）ＨＥＫ−２９３ＦカニクイザルＣＢ８、（１３Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｆマウスクローン５、及び（１３Ｅ）ＨＥＫ−２９３Ｆラットクローン１のＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ  ＥＣＤ細胞株への結合について、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の代表的なデータを試験した。値は、１試験サンプルあたり２回の読み取り値の平均から得られたＭＳＤ光単位として提示されている。
【図１４Ｄ】（１３Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｆ親、（１３Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＦヒトＨＥ２、（１３Ｃ）ＨＥＫ−２９３ＦカニクイザルＣＢ８、（１３Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｆマウスクローン５、及び（１３Ｅ）ＨＥＫ−２９３Ｆラットクローン１のＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ  ＥＣＤ細胞株への結合について、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の代表的なデータを試験した。値は、１試験サンプルあたり２回の読み取り値の平均から得られたＭＳＤ光単位として提示されている。
【図１４Ｅ】（１３Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｆ親、（１３Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＦヒトＨＥ２、（１３Ｃ）ＨＥＫ−２９３ＦカニクイザルＣＢ８、（１３Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｆマウスクローン５、及び（１３Ｅ）ＨＥＫ−２９３Ｆラットクローン１のＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ  ＥＣＤ細胞株への結合について、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の代表的なデータを試験した。値は、１試験サンプルあたり２回の読み取り値の平均から得られたＭＳＤ光単位として提示されている。
【図１５】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおいてＩＣ３Ｂ１９により処置されたＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制。ＮＳＧマウスには、ヒトＰＢＭＣを静脈内に移植し、７日後にＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を皮下に接種し、（矢印で示されている）０、３、５、７、及び１０日目にＩＣ３Ｂ１９を０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図１６】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおいてＩＣ３Ｂ１９により処置されたＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制。ＮＳＧマウスには、ヒトＰＢＭＣを静脈内に移植し、７日後にＭＯＬＭ−１３細胞を皮下に接種し、ついで（矢印で示されている）０、２、５、７、及び９日目にＩＣ３Ｂ１９を０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図１７】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおいてＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９により処置されたＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制。ＮＳＧマウスには、ヒトＰＢＭＣを静脈内に移植し、７日後にＭＯＬＭ−１３細胞を皮下に接種し、ついで（矢印で示されている）０、２、４、７、及び９日目にＩＣ３Ｂ１８又はＩＣ３Ｂ１９を０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図１８】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を皮下に接種し、ついで、腫瘍が確立された時点（平均腫瘍容積＝９３．７ｍｍ３）で、ヒトＰＢＭＣを静脈内に移植した。ついで、マウスには、（黒い矢印で示されている）２８、３１、３３、３５、及び３８日目にＩＣ３Ｂ１９を０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇで、又は（灰色の矢印で示されている）３１、３３、３５、３８、４０、４７、及び５４日目にＩＣ３Ｂ１９を０．０５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図１９】３１日目と３５日目に開始された処置を比較した、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を皮下に接種し、ついで、腫瘍が確立された時点（平均腫瘍容積＝１１１．５ｍｍ３）で、ヒトＰＢＭＣを静脈内に移植した。３１日目からは、（黒い矢印で示されている）３１、３３、３５、３８、及び４０日目において、７つの群に対して、ＰＢＳ、ＩＣ３Ｂ１８、又はＩＣ３Ｂ１９を０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。加えて、３５日目からは、（灰色の矢印で示されている）３５、３８、４１、４２、及び４６日目において、４つの群に対して、ＩＣ３Ｂ１８又はＩＣ３Ｂ１９を０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図２０】実施例２３に記載されたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定されるような、野生型ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ、並びに関連するＩｇＧ４  ＰＡＡ親（二価）及びｎｕｌｌアーム（一価）コントロール抗体の集合体に対してＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９について測定された、ヒトＦｃリガンドＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃＲｎへの結合競合。図２０Ａ）ＦｃγＲＩ競合。図２０Ｂ）ＦｃγＲＩＩａ競合。図２０Ｃ。ＦｃγＲＩＩｂ競合。図２０Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａ競合。図２０Ｅ）ＦｃＲｎ競合。
【図２１Ａ】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目にＳＫＮＯ−１  ＡＭＬ腫瘍フラグメントをｓｃ接種し、ついで、３４日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、５５日目（矢印）にＩＣ３Ｂ１９を０．５又は１ｍｇ／ｋｇでｉｖ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後６０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差
【図２１Ｂ】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目にＳＫＮＯ−１  ＡＭＬ腫瘍フラグメントをｓｃ接種し、ついで、３４日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、５５日目（矢印）にＩＣ３Ｂ１９を０．５又は１ｍｇ／ｋｇでｉｖ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後６０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差
【図２１Ｃ】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目にＳＫＮＯ−１  ＡＭＬ腫瘍フラグメントをｓｃ接種し、ついで、３４日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、５５日目（矢印）にＩＣ３Ｂ１９を０．５又は１ｍｇ／ｋｇでｉｖ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後６０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差
【図２１Ｄ】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目にＳＫＮＯ−１  ＡＭＬ腫瘍フラグメントをｓｃ接種し、ついで、３４日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、５５日目（矢印）にＩＣ３Ｂ１９を０．５又は１ｍｇ／ｋｇでｉｖ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後６０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差
【図２１Ｅ】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目にＳＫＮＯ−１  ＡＭＬ腫瘍フラグメントをｓｃ接種し、ついで、３４日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、５５日目（矢印）にＩＣ３Ｂ１９を０．５又は１ｍｇ／ｋｇでｉｖ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後６０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差
【図２２】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のびまん性ＭＯＬＭ−１３ルシフェラーゼヒトＡＭＬモデルにおけるＩＣ３Ｂ１９の効果。注：ＮＳＧマウスには、０日目にＭＯＬＭ−１３ルシフェラーゼＡＭＬ細胞をｉｖ接種し、ついで、３日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、ｑ３ｄ〜ｑ４ｄで４、８、１１、１４、１７、２１、２４、２８、３１、３５、及び３８日目の合計１１回にわたり、ＩＣ３Ｂ１９を０．０５、０．５、又は１ｍｇ／ｋｇでｉｐ投与した。後肢麻痺、病的状態、又は過剰な触知可能腫瘍量が原因で動物を安楽死させ、生存割合をプロットした。移植後４６日目までのデータのみをグラフで表しており、これは、動物がそれ以降にＧｖＨＤ関連の病的状態によって失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ｉｖ＝静脈内、ｉｐ＝腹腔内、ＧｖＨＤ＝移植片対宿主病
【図２３】ＩＬ１ＲＡＰに対する形質転換後のＲＮＡ発現の分布を要約している箱ひげ図。各組織構造の上部の箱ひげ図は正常な固体組織を表し、下部の箱ひげ図は腫瘍内の発現値を表している。
【図２４】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（total green object area）（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ａ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｂ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｃ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｄ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｅ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｆ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２５Ｇ】ＩＣ３Ｂ１９は、ここに示されている固体腫瘍株内でのカスパーゼ活性の上昇（Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｇ）を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、（Ｃ）ではカスパーゼ活性は上昇していない。以下の固体腫瘍がんタイプが示されている：（Ａ）ＮＳＣＬＣ腺がん、（Ｂ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｃ）ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞がん、（Ｄ）小細胞肺がん、（Ｅ）結腸がん、（Ｆ）膵がん、（Ｇ）前立腺がん。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準の７２時間の時点での未加工値に基づいてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算された曲線下面積に対する、各点（ｎ＝８）の±ＳＥＭ。それぞれの曲線は、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅ、図２４Ｆ、及び図２４ＧではＤｏｎｏｒ＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａを表しており、図２４Ｂ、図２４ＤではＤｏｎｏｒ＃Ｍ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂが示されている。
【図２６Ａ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＣＭＬ細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２６Ｂ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＣＭＬ細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２６Ｃ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＣＭＬ細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２７Ａ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２７Ｂ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２７Ｃ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫細胞株のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２８Ａ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＤＬＢＣＬ細胞株Ｕ−２９４０のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２８Ｂ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＤＬＢＣＬ細胞株Ｕ−２９４０のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２８Ｃ】（Ａ）ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性Ａｂ  ＩＣ３Ｂ１９は、ＤＬＢＣＬ細胞株Ｕ−２９４０のＩＬ１ＲＡＰ＋特異的細胞毒性を引き出す。コントロール抗体ＩＡＰＢ１０１（Ｂ）及びＣＮＴＯ  ７００８（Ｃ）は細胞毒性を誘引しない。
【図２９】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＨ１９７５ヒト非小細胞肺がん異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。ＮＳＧマウスには、０日目に１ｅ６  Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺がん細胞をｓｃ接種し、ついで、１３日目にヒトＴ細胞をｉｐ移植した。マウスには、１４、１７、２０、２３、２７、３０、３５、及び３８日目の合計８回（矢印）にわたり、ＩＣ３Ｂ１９を０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は２．５ｍｇ／ｋｇでｉｐ投与した。週に２度ｓｃ腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±（ＳＥＭ）で表した。移植後３０日目までのデータのみをグラフで表現しているが、これは、腫瘍の大きさが上限に達したことにより、群あたり多数の動物がそれ以降に失われたためである。記号：ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＮＳＧ＝ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水、ｉｖ＝静脈内、ｓｃ＝皮下、ｉｐ＝腹腔内、ＳＥＭ＝標準誤差。
【図３０】エクスビボアッセイｍＭＤＳＣのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性枯渇：新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）。
【図３１Ａ】自家ＭＤＳＣゲーティング戦略及びＭＤＳＣ集団の新鮮全血の定量化。初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団の評価。ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：（Ａ）生存可能である全有核細胞（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性（Ｃ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋ＭＤＳＣ集団（Ｄ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｍ−ＭＤＳＣ（Ｅ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｇ−ＭＤＳＣ。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【図３１Ｂ】自家ＭＤＳＣゲーティング戦略及びＭＤＳＣ集団の新鮮全血の定量化。初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団の評価。ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：（Ａ）生存可能である全有核細胞（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性（Ｃ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋ＭＤＳＣ集団（Ｄ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｍ−ＭＤＳＣ（Ｅ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｇ−ＭＤＳＣ。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【図３１Ｃ】自家ＭＤＳＣゲーティング戦略及びＭＤＳＣ集団の新鮮全血の定量化。初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団の評価。ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：（Ａ）生存可能である全有核細胞（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性（Ｃ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋ＭＤＳＣ集団（Ｄ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｍ−ＭＤＳＣ（Ｅ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｇ−ＭＤＳＣ。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【図３１Ｄ】自家ＭＤＳＣゲーティング戦略及びＭＤＳＣ集団の新鮮全血の定量化。初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団の評価。ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：（Ａ）生存可能である全有核細胞（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性（Ｃ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋ＭＤＳＣ集団（Ｄ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｍ−ＭＤＳＣ（Ｅ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｇ−ＭＤＳＣ。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【図３１Ｅ】自家ＭＤＳＣゲーティング戦略及びＭＤＳＣ集団の新鮮全血の定量化。初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団の評価。ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：（Ａ）生存可能である全有核細胞（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性（Ｃ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋ＭＤＳＣ集団（Ｄ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｍ−ＭＤＳＣ（Ｅ）ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋ＩＬ１ＲＡＰ＋Ｇ−ＭＤＳＣ。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【図３２Ａ】ドナー血液サンプル内で腫瘍に対して変化するＭＤＳＣ濃度。（Ａ）初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団羅患率の評価及び（Ｂ）健常と比較したＭＤＳＣ＋ＩＬ１ＲＡＰ＋受容体密度の定量化。
【図３２Ｂ】ドナー血液サンプル内で腫瘍に対して変化するＭＤＳＣ濃度。（Ａ）初代の新鮮全血の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）／前立腺がん（ＰＣ）におけるＭＤＳＣ集団羅患率の評価及び（Ｂ）健常と比較したＭＤＳＣ＋ＩＬ１ＲＡＰ＋受容体密度の定量化。
【図３３】親血管新生処置及び抗血管新生処置に応答して、時間と共に変化する、単位面積あたりの管状網状組織の数。蛍光標識化したＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦの存在下でガラス上に培養して、管状の伸長及び分岐を促した。スラミンを加えて、ＶＥＧＦの効果を上書きし、網状組織の拡大を阻害した。データは、１つの実験からの３つの技術的複製の平均±ＳＥＭを表している。最初の２４時間の画像は、技術的な理由から欠落している。
【図３４Ａ】健常ドナーＴ細胞（Ｍ２５５０）、がん細胞、Ｈ１９７５（Ａ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｂ）、又はＴ細胞とがん細胞の組み合わせとの共培養に応答して、時間と共に変化する、単位面積あたりの管状網状組織の数。蛍光標識化したＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦの存在下でガラス上に培養して、管状の伸長及び分岐を促した。データは、１つの実験からの３つの技術的複製の平均±ＳＥＭを表している。最初の２４時間の画像は、技術的な理由から欠落している。
【図３４Ｂ】健常ドナーＴ細胞（Ｍ２５５０）、がん細胞、Ｈ１９７５（Ａ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｂ）、又はＴ細胞とがん細胞の組み合わせとの共培養に応答して、時間と共に変化する、単位面積あたりの管状網状組織の数。蛍光標識化したＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦの存在下でガラス上に培養して、管状の伸長及び分岐を促した。データは、１つの実験からの３つの技術的複製の平均±ＳＥＭを表している。最初の２４時間の画像は、技術的な理由から欠落している。
【図３５Ａ】健常有志者から単離されたＴ細胞（Ａ）、並びにＨ１９７５（Ｂ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｃ）細胞株をＩＬ１ＲＡＰ（灰色の線）又は対応するアイソタイプ（黒い線）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＩＬ１ＲＡＰ陽性細胞パーセントがプロット上に示されている。
【図３５Ｂ】健常有志者から単離されたＴ細胞（Ａ）、並びにＨ１９７５（Ｂ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｃ）細胞株をＩＬ１ＲＡＰ（灰色の線）又は対応するアイソタイプ（黒い線）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＩＬ１ＲＡＰ陽性細胞パーセントがプロット上に示されている。
【図３５Ｃ】健常有志者から単離されたＴ細胞（Ａ）、並びにＨ１９７５（Ｂ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｃ）細胞株をＩＬ１ＲＡＰ（灰色の線）又は対応するアイソタイプ（黒い線）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＩＬ１ＲＡＰ陽性細胞パーセントがプロット上に示されている。
【図３６】ＨＵＶＥＣをＮＨＤＦの存在下でガラス上に培養し、示されている処置条件でいくらかのＩＬ１ＲＡＰの発現が見られた。
【図３７Ａ】１０ｎＭのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３（赤い円）、１０ｎＭのＮｕｌｌ×ＣＤ３（緑の三角形）又はビヒクルＰＢＳ（青い正方形）の存在下で、健常ドナーＴ細胞（Ｍ２５５０）、がん細胞、Ｈ１９７５（Ａ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｂ）との共培養に応答して、時間と共に変化する、単位面積あたりの管状網状組織の数。蛍光標識化したＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦの存在下でガラス上に培養して、管状の伸長及び分岐を促した。続いて、培養した細胞に（破線で示されている）薬理学的処置を行い、その後４日間にわたって網状組織密度を測定した。１０ｎＭ用量の処置のみが図示されている。データは、１つの実験からの３つの技術的複製の平均±ＳＥＭを表している。最初の２４時間の画像は、技術的な理由から欠落している。
【図３７Ｂ】１０ｎＭのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３（赤い円）、１０ｎＭのＮｕｌｌ×ＣＤ３（緑の三角形）又はビヒクルＰＢＳ（青い正方形）の存在下で、健常ドナーＴ細胞（Ｍ２５５０）、がん細胞、Ｈ１９７５（Ａ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５（Ｂ）との共培養に応答して、時間と共に変化する、単位面積あたりの管状網状組織の数。蛍光標識化したＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦの存在下でガラス上に培養して、管状の伸長及び分岐を促した。続いて、培養した細胞に（破線で示されている）薬理学的処置を行い、その後４日間にわたって網状組織密度を測定した。１０ｎＭ用量の処置のみが図示されている。データは、１つの実験からの３つの技術的複製の平均±ＳＥＭを表している。最初の２４時間の画像は、技術的な理由から欠落している。
【図３８】Ｈ１９７５腫瘍細胞及びＴ細胞の存在下での、抗体処置後７２時間の管状網状組織に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。ビヒクルコントロール（Ａ）、Ｎｕｌｌ×ＣＤ３（Ｂ）及びＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３（Ｃ）処置条件が図示されている。対応する網状組織マスク（Ｄ，Ｅ及びＦ）は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＺＯＯＭソフトウェアによって生成された。３つの技術的複製のうちの１ウェルからの画像が図示されている。スケールバーは５００μｍである。
【図３９Ａ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞活性化に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現（Ａ及びＣ）又はＩＬ１ＲＡＰ発現（Ｂ及びＤ）について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロールを使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図３９Ｂ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞活性化に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現（Ａ及びＣ）又はＩＬ１ＲＡＰ発現（Ｂ及びＤ）について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロールを使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図３９Ｃ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞活性化に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現（Ａ及びＣ）又はＩＬ１ＲＡＰ発現（Ｂ及びＤ）について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロールを使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図３９Ｄ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞活性化に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現（Ａ及びＣ）又はＩＬ１ＲＡＰ発現（Ｂ及びＤ）について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロールを使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図４０Ａ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞表面マーカー発現に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現及びＩＬ１ＲＡＰ発現について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ及びＣ）及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロール（Ｂ及びＤ）を使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図４０Ｂ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞表面マーカー発現に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現及びＩＬ１ＲＡＰ発現について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ及びＣ）及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロール（Ｂ及びＤ）を使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図４０Ｃ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞表面マーカー発現に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現及びＩＬ１ＲＡＰ発現について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ及びＣ）及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロール（Ｂ及びＤ）を使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図４０Ｄ】がん細胞及びＨＵＶＥＣ培養の存在下でのＴ細胞表面マーカー発現に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の効果。Ｔ細胞をＨＵＶＥＣ及びＨ１９７５腫瘍細胞（Ａ及びＢ）又はＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（Ｃ及びＤ）と共に４日間にわたって培養し、フローによりＣＤ２５発現及びＩＬ１ＲＡＰ発現について分析した。比較分析のために、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ及びＣ）及びＮｕｌｌ×ＣＤ３コントロール（Ｂ及びＤ）を使用した。Ｔ細胞上での活性化及びＩＬ１ＲＡＰ発現の全体的なパターンを伝達するために、選択条件が示されている。
【図４１】ＡＭＬ及びＭＤＳ芽球細胞上のＩＬ１ＲＡＰの細胞表面発現を処置の０日目にフローサイトメトリーによって評価した。細胞を白血病性芽球に対してゲーティングし、ＩＬ１ＲＡＰ（薄い灰色）の発現をアイソタイプコントロール（濃い灰色）と比較した。
【図４２Ａ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプル（ＭＴ００３４）におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体で処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇を実証している。
【図４２Ｂ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプル（ＭＴ００３４）におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体で処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇を実証している。
【図４２Ｃ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプル（ＭＴ００３４）におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体で処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇を実証している。
【図４２Ｄ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプル（ＭＴ００３４）におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体で処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ａ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｂ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｃ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｄ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｅ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｆ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｇ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４３Ｈ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＭＤＳサンプル（ＭＤＳ＿４３３２及びＭＤＳ＿４９５４）のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）及び（Ｅ）グラフはそれぞれ、ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置を行った場合と行わなかった場合のＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示している。（Ｂ）及び（Ｆ）ＭＤＳサンプル４３３２及び４９５４における、ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）及び（Ｇ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５マーカーの発現によって実証されている。（Ｄ）及び（Ｈ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＭＤＳ芽球の枯渇を実証している。
【図４４Ａ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプルＡＭＬ＿５５０３におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、全ての処置群において培養中にＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントが低下していることを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。しかしながら、ＣＤ８＋細胞の数は非常に少なく、また培養内にＣＤ４＋細胞は存在しない。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５の発現によって実証される。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇はないことを実証している。
【図４４Ｂ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプルＡＭＬ＿５５０３におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、全ての処置群において培養中にＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントが低下していることを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。しかしながら、ＣＤ８＋細胞の数は非常に少なく、また培養内にＣＤ４＋細胞は存在しない。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５の発現によって実証される。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇はないことを実証している。
【図４４Ｃ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプルＡＭＬ＿５５０３におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、全ての処置群において培養中にＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントが低下していることを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。しかしながら、ＣＤ８＋細胞の数は非常に少なく、また培養内にＣＤ４＋細胞は存在しない。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５の発現によって実証される。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇はないことを実証している。
【図４４Ｄ】ヒト間質細胞株ＨＳ−５との共培養系での初代ＡＭＬサンプルＡＭＬ＿５５０３におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び芽球枯渇のエクスビボ評価。Ｔ細胞活性化及び芽球の枯渇をフローサイトメトリーによって測定した。（Ａ）グラフは、全ての処置群において培養中にＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントが低下していることを示している。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞の集団内にあるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセント。（Ｃ）プロットは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置したサンプル内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。しかしながら、ＣＤ８＋細胞の数は非常に少なく、また培養内にＣＤ４＋細胞は存在しない。活性化は、両方のＴ細胞集団上でのＣＤ２５の発現によって実証される。（Ｄ）グラフは、細胞のＣＤ４５＋集団内にある芽球のパーセントを比較することにより、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３処置によって誘引されたＡＭＬ芽球の枯渇はないことを実証している。
【図４５Ａ】初代のＡＭＬ及びＭＤＳサンプルにおけるＭＤＳＣ集団の評価。（Ａ）ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性／ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４−。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに右側に示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。（Ｂ）処置に応答するサンプルの中で、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３で処置されたサンプルは、コントロールＡｂで処置されたサンプル又は未処置の細胞と比較して大幅に低いＭＤＳＣ濃度を有する。ＡＭＬ５５０３は、比較的低いかつ全ての処置群において等しい濃度のＭＤＳＣを有する非応答性のサンプルであった。
【図４５Ｂ】初代のＡＭＬ及びＭＤＳサンプルにおけるＭＤＳＣ集団の評価。（Ａ）ＭＤＳＣ集団のゲーティング戦略を示している代表的なプロット：ＨＬＡ−ＤＲ低／細胞系マーカー陰性／ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋／ＣＤ１４−。全てのゲーティングされたＭＤＳＣは、代表的なプロットに右側に示されているようにＩＬ１ＲＡＰを発現する。（Ｂ）処置に応答するサンプルの中で、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３で処置されたサンプルは、コントロールＡｂで処置されたサンプル又は未処置の細胞と比較して大幅に低いＭＤＳＣ濃度を有する。ＡＭＬ５５０３は、比較的低いかつ全ての処置群において等しい濃度のＭＤＳＣを有する非応答性のサンプルであった。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００４６】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わす全ての数字は、「約」という用語により、全ての事例において修飾されていると理解されたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得られるのが求められる所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００４８】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例中で説明された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差を必然的に生じる、一定の誤差を本質的に含有する。
【００４９】
「単離された」は、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」されている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体又は抗原結合フラグメントは、種々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合フラグメントを実質的に含まない抗体又は抗原結合フラグメントを意味することを意図している（例えば、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する単離された抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＩＬ１ＲＡＰのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連する抗原（例えば、ＩＬ１ＲＡＰ種間ホモログ）に対する交差反応性を有してもよい。
【００５０】
「組換え抗体」という用語は、天然の免疫グロブリン又はそのフラグメントの任意の類似物を含めて、組換えＤＮＡ技術の使用を伴う任意のプロセスによって生成される抗体を記述するために使用される。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００５２】
「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。天然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存在するために、いくらかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるであろう。ただし、固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）にはほとんど影響しないか、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４〜４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【００５３】
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味する。他の実施形態は、本明細書に記載された抗体及び抗原結合フラグメントと顕著な同一性を共有しないが、１つ又は２つ以上のＣＤＲ又は結合性を付与するのに必要とされる他の配列を組み込む、フレームワーク、スキャフォールド、又は他の非結合領域を有し、本明細書に記載されたこのような配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを含む。「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメントを操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスのことである。
【００５４】
「クローン」は、有糸分裂により、単一の細胞又は共通する祖先から得られる細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代の間、インビトロにおいて安定して増殖させることができる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞をＤＮＡでトランスフェクションすることにより、形質転換される。
【００５５】
「発現する」及び「生成する」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全ての天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよい。
【００５６】
「処置すること」又は「処置」という用語は、損傷、病理、又は病状の減弱又は改善における、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、寛解、緩解、症状の減少、病状を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は低落速度を遅くすること、変性による最終的な衰弱を和らげること、患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、あるいは生存期間の長さを延長することなどの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。治療は、客観的又は主観的なパラメータにより評価されてもよい。同パラメータには、身体的検査、神経学的検査、又は精神医学評価の結果が挙げられる。
【００５７】
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、必要とされる用量及び期間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体の治療的に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す抗体の能力などの要因に従って変動し得る。治療的に有効な量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害作用より、治療的に有益な作用が上回る量でもある。
【００５８】
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を意味し、種々の単量体、多量体、及びキメラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される。
【００５９】
「抗原結合フラグメント」は、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る、任意のタンパク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペプチド合成、及び組換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖又はＣＤＲと他のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ．；２１（１１）：４８４〜９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４〜５４６（１９８９））、ラクダ又はナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ．；５（１）：１１１〜２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）などが挙げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非抗体タンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、所与の抗原結合フラグメントが、この表現内で参照された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメントを組み込んでいることを示すために使用されてもよい。本明細書で、２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において使用されるとき、「〜と競合する」又は「〜と交差競合する」という用語は、２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントがＩＬ１ＲＡＰへの結合で競合する、例えば、実施例１１に記載されたアッセイにおいてＩＬ１ＲＡＰ結合で競合する、ことを示す。抗体又は抗原結合フラグメントのいくつかのペアについて、一方の抗体がプレート上にコートされ、他方が競合させるために使用される場合、また、その逆の場合、実施例のアッセイにおいて競���又はブロックのみが観察される。文脈において別段に定義されるか、又は否定されない限り、本明細書で使用されるとき、「〜と競合する」又は「〜と交差競合する」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントのこのようなペアに及ぶことも意図している。
【００６０】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、分子の表面グルーピング、例えば、アミノ酸又は糖側鎖からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の荷電特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが、後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異性抗原結合ペプチドにより効果的にブロックされるか、又は覆われるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内にある）とを含んでもよい。
【００６１】
抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「特異的な結合」若しくは「免疫特異的な結合」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子に優先的に結合することなく、対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約１×１０−８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する。「［抗原］特異性」抗体（例えば、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体）等の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「ｋｄ」（秒−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。当該値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「ｋａ」（Ｍ−１秒−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を意味する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「ＫＡ」（Ｍ−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数を意味し、ｋａをｋｄで割ることにより得られる。
【００６６】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態において、対象はヒトである。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「リダイレクト」又は「リダイレクトする」という用語は、Ｔ細胞の活性をその本来の同じ性質の特異性からＩＬ１ＲＡＰ発現細胞に対する反応性に向かって効果的に輸送するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体の能力を意味する。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から単離された、類似する流体、細胞、又は組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）の収集物、並びに対象内に存在する流体、細胞、又は組織を意味する。一部の実施形態では、サンプルは、体液である。体液は、典型的には、生理学的温度において液体であり、対象又は生物学的ソース中に存在し、これらから採取され、これらから外に出され、又は他の方法で抽出された自然発生する流体を含んでもよい。特定の組織、臓器、又は局所的な領域から得られた特定の体液及び特定の他の体液は、対象又は生物学的ソースにおいて、より全体的に又は全身的に適していてもよい。体液の例には、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞、痰、分泌組織及び臓器の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水液、例えば、非固体腫瘍に関連するもの、肋膜、心膜、腹膜、腹部及び他の体腔の流体、気管支洗浄により収集された流体等が挙げられる。体液はまた、対象又は生物学的ソースと接触した溶液、例えば、細胞又は臓器順化培地を含む細胞及び臓器培養培地、洗浄液等を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から取り出された材料又は対象中に存在する材料を包含する。
【００６９】
「既知の標準」は、既知の量又は濃度のＩＬ１ＲＡＰを有する溶液でもよい。この場合、この溶液は、自然発生する溶液、例えば、初期、中期、後期、進行性、又は静的がんを有することが既知の患者からのサンプルでもよく、又はこの溶液は、希釈された既知の量のＩＬ１ＲＡＰを有する緩衝水等の合成溶液でもよい。本明細書に記載された既知の標準は、対象から単離されたＩＬ１ＲＡＰ、組換え若しくは精製されたＩＬ１ＲＡＰタンパク質、又は病態に関連するＩＬ１ＲＡＰ濃度の値を含んでもよい。
【００７０】
「ＣＤ３」という用語は、ヒトＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体を意味する。ＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体は、６つの区別できるポリペプチド鎖から構成される。これらは、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）、及び１つのＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ２０９６３）を含み、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖と会合する。「ＣＤ３」という用語は、特に断らない限り、細胞（Ｔ細胞を含む）により本来発現されているか、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞上に発現され得る任意のＣＤ３変異体、アイソフォーム、及び種間ホモログを含む。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「インターロイキン−１受容体補助タンパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」及び「ＩＬ１−ＲＡＰ」という用語は、具体的には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００２１７３．１及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＰＨ３−１に記載されているような、ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質を含む（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４（２４），１２８２９〜１２８３２も参照されたい）。ＩＬ１ＲＡＰはまた、科学文献においてＩＬ１  Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ−１  ＲＡｃＰ及びＥＧ３５５６としても知られている。
【００７２】
「ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体」は、多重特異性抗体、場合により、二重特異性抗体であり、同二重特異性抗体は、２種類の異なる抗原結合領域を含み、一方の抗原結合領域は、抗原ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合し、もう一方の抗原結合領域は、ＣＤ３に特異的に結合する。多重特異性抗体は、二重特異性抗体、ディアボディ、又は類似する分子であり得る（ディアボディの説明については、例えば、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４〜８（１９９３）を参照のこと）。本明細書で提供された二重特異性抗体、ディアボディ等は、ＩＬ１ＲＡＰの一部に加えて、任意の適切な標的に結合してもよい。「二重特異性抗体」という用語は、異なる抗体配列により定義された、２種類の抗原結合領域を有する抗体と理解されたい。これは、異なる標的結合と理解され得るが、１つの標的中の異なるエピトープに十分結合することを含む。
【００７３】
「参照サンプル」は、別のサンプル、例えば、試験サンプルに対して比較され、比較されたサンプルの特徴を決定することができるサンプルである。参照サンプルは、試験サンプルとの比較の基礎として機能する、いくつかの特徴付けられた特性を有するであろう。例えば、参照サンプルは、がんを有する対象を示すＩＬ１ＲＡＰレベルについてのベンチマークとして使用することができる。参照サンプルは、試験サンプルと平行して分析されることを必ずしも必要としない。このため、一部の例では、参照サンプルは、所与の条件を特徴付けるために予め決定された数値又は範囲、例えば、対象中のがんを示すＩＬ１ＲＡＰレベルでもよい。この用語はまた、生理学的状態又は病態、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんに関連することが既知であるが、未知量のＩＬ１ＲＡＰを有する、比較目的で使用されるサンプルを含む。
【００７４】
ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行の文脈において使用されるとき、「進行」という用語は、より重篤でない状態からより重篤な状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の増大を含むことができる。例えば、「結腸がんの進行」には、このようながんの、より重篤でない状態からより重篤な状態への進行、例えば、ステージＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩＩＩへ等の進行が挙げられる。
【００７５】
ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの退行の文脈において使用されるとき、「退行」という用語は、より重篤な状態からより重篤でない状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の低下を含むことができると考えられる。例えば、「結腸がんの退行」には、このようながんの、より重篤な状態からより重篤でない状態への退行、例えば、ステージＩＩＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩへ等の進行が挙げられる。
【００７６】
安定したＩＬ１ＲＡＰ発現がんの文脈において使用されるとき、「安定した」という用語は、進行性がん又は退行性がんであると考えられる臨床的に関連する期間にわたって有意に十分に変化しない、又は変化していなかった病態を説明するのを意図している。
【００７７】
本明細書に記載された実施形態は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されるものではなく、当然、変動し得る。
【００７８】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメント
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、組換えモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントが記載されている。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにＦｃドメインを含み、補体固定及び結合抗体受容体を含む各種の機能を果たす。
【００７９】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、全てのアイソタイプである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びに４本鎖免疫グロブリン構造の合成多量体を含む。記載された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、雌鳥又はシチメンチョウの血清及び雌鳥又はシチメンチョウの卵黄中に一般的に見出されるＩｇＹアイソタイプも含む。
【００８０】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、任意の種から組換え手法により得ることができる。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそれらのキメラ版でもよい。ヒトへの投与において使用するために、非ヒト由来の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの患者への投与に基づいてほとんど抗原性がないように、遺伝的に又は構造的に改変することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはキメラである。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳類、げっ歯類、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくとも一部の部分を有するが、抗体又はその抗原結合フラグメントの残り部分がヒトに由来する、抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。
【００８２】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列）でもよい。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなる。同可変ドメイン中、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのうち少なくとも一部を含んでもよい。
【００８３】
本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、各種の形態で存在し得るが、表１に示された抗体ＣＤＲのうち１つ又は２つ以上を含むこととなる。
【００８４】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ又はその誘導体である。本明細書で例示されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトであるが、例示された抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ化されてもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００８６】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号６８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号６８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６９と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８７】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４３を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７１と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８８】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１６を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１６を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４６を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０３を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７２と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７２と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７３と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８９】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５１を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７５と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９０】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７７と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９１】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７９と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９２】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２９を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７９と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９３】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３０を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３０を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３２を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５９を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８１と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８１と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８２と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９４】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３５を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８３と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８３と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８４と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９５】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８５と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８５と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８４と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９６】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号８６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８４と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９７】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８７と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９８】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６２を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９９】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６２を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７６と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８９と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【０１００】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６６を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、５０ｎＭ以下の親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合し得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号９０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号９０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号９１と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【０１０１】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＫ４０９Ｒ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。上記段落において検討された、ＣＤＲ及び／又は可変ドメイン配列により定義された特異性抗体は、これらの変形例を含んでもよい。
【０１０２】
ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドもまた開示される。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な組換えポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合フラグメントを生成する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。
【０１０３】
組換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を含む。本発明の文脈において、下記注釈は、別途記載のない限り、変異を説明するのに使用される。ｉ）所与の位置におけるアミノ酸の置換は、例えば、Ｓ２２８Ｐと記載される。Ｓ２２８Ｐは、２２８位におけるセリンのプロリンによる置換を意味する。ｉｉ）特定の変異体について、特定の三文字又は一文字コードは、コードＸａａ及びＸを含めて、アミノ酸残基を示すのに使用される。このため、２２８位におけるプロリンについてのセリンの置換は、Ｓ２２８Ｐと指定され、又は２２８位におけるセリンについての任意のアミノ酸残基の置換は、Ｓ２２８Ｘと指定される。２２８位におけるセリンの欠失の場合には、この欠失は、Ｓ２２８＊により示される。当業者であれば、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を生成することができる。
【０１０５】
これらの変異体としては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されている変異体、（ｂ）１つ又は２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失されている変異体、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した変異体を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体についてのエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などを付与してもよい。本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている変異体を含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらの変異体を得るための手法は、遺伝的（欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
【０１０６】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、複数の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。一部の実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプ、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を変化させることなく、別のアイソタイプに変更することができる。あるいは、抗原特異性を変化させることなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されてきた。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
【０１０７】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、約５０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を含む、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性を有する。記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体、又は抗原結合フラグメント、の親和性は、表面プラズモン共鳴又はＥＬＩＳＡベースの方法など、当技術分野において既知の各種の方法によって決定されることができる。親和性を測定するためのアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して行われるアッセイを含む。この場合、このアッセイは、室温（例えば、２５℃又は２５℃付近）で行われる。ＩＬ１ＲＡＰに結合可能な抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅセンサチップ上に、抗Ｆｃ抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ＃１０９−００５−０９８）により、７５ＲＵ付近のレベルで捕捉され、続けて、４０μＬ／分の流量において、会合及び解離データが収集される。
【０１０８】
本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。ベクターは、発現ベクターであり得る。このため、対象となるポリペプチドをコードする配列を含有する組換え発現ベクターは、本開示の範囲内であると想到される。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の追加配列を含有してもよい。同追加配列には、例えば、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。広い各種の宿主細胞を形質転換するためのベクターは周知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
本説明の範囲内にある組換え発現ベクターは、適切な調節エレメントに操作可能に連結することができる少なくとも１つの組換えタンパク質をコードする、合成的、遺伝的、又はｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。このような調節エレメントには、転写プロモータ、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連結された適切なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フランキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
【０１１０】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳コントロール配列は、ウイルスソースにより提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載されたように構築されてもよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントのコード配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等のためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列は、誘引性プロモータ、例えば、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘引性プロモータ、ドキシサイクリン誘引性プロモータ、１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、例えば、プロテインキナーゼＲ  ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、ＭＸ遺伝子、ＡＤＡＲ１等を含有するプロモータの制御下に置かれる。
【０１１２】
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。同部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネントは、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【０１１３】
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７３８〜１７４３（２０００））が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【０１１４】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生成細胞を生じさせることができる。このため、別の態様は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載され、例示された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特徴とする。
【０１１５】
外来性遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であり、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝子配列を宿主細胞に適切に形質転換されるべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮＡウイルス、組換えＲＮＡウイルス）などが挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９〜９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
【０１１６】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの発現に使用するのに適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞である。これらの細胞には、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において十分確立されている。
【０１１７】
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現について選択され、又はスクリーニングされてもよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより得られる。
【０１１８】
処置のためにＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体を使用する方法
本明細書において、治療に使用するための、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。特に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、がん、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんを処置するのに有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書に記載されたとおりの抗体、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。例えば、使用は、１）ＩＬ１ＲＡＰ受容体相互作用を阻害することによって、２）抗体が毒素に接合されている場合、その毒素の標的をＩＬ１ＲＡＰ発現がんにすることによって、又は、３）抗体を使用して体の免疫細胞をＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞にリダイレクトすることによって（例えば、ＡＤＣＣ、Ｔ細胞リダイレクト）行われ得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。これらの方法において使用する抗体には、本明細書に前述したもの、例えば、表１及びこれらの抗体の更なる検討において列記された特徴、例えば、ＣＤＲ又は可変ドメイン配列を有するＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１１９】
本明細書に記載された一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体の免疫エフェクター特性は、当業者に既知の技術によるＦｃ改変によって向上するか、又はサイレンシングされることができる。例えば、Ｆｃエフェクター機能、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が、これらの活性を担うＦｃ中の残基を改変することにより提供され、かつ／又は制御され得る。の下方制御などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性に関与するＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は調節され得る。
【０１２０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を意味する。
【０１２１】
ＡＤＣＣを誘引するモノクローナル抗体の能力は、そのオリゴ糖成分を操作することにより向上され得る。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７において、Ｎ−グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態にある。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により生成される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に付着した二分岐の複雑なタイプのオリゴ糖からのコアフコースの除去により、改善されたＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩａ結合を介して、抗原結合性又はＣＤＣ活性を変化させることなく、抗体のＡＤＣＣが向上される。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化抗体の成功した発現をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２４９〜６５，２０１２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０，２００２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４），２０１０、Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３，２００３）、アルファ．１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１〜９０８，２００４）、又はベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジアルファ−マンノシダーゼＩＩとの共発現又は強力なアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシン（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：５０３２〜５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３：８５１〜８６１，２００６；Ｘｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９：６５２〜６５，２００８）を使用して達成され得る。
【０１２２】
本明細書において記載された一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ抗体により引き出されたＡＤＣＣはまた、抗体Ｆｃ中の特定の置換によって向上され得る。例示的な置換は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号に記載されたように、アミノ酸位置２５６、２９０、２９８、３１２、３５６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８、又は４３０（ＥＵインデックスに従った残基番号付け）における置換である。
【０１２３】
ＩＬ１ＲＡＰを検出する方法
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出するための方法が提供される。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得ることができる。一部の実施形態では、記載された方法は、サンプルを、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させることにより、生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出することを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、サンプルを、表１に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの２つ以上と接触させてもよい。例えば、サンプルを、第１のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、第２のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよく、この場合、第１の抗体又は抗原結合フラグメントと第２の抗体又は抗原結合フラグメントとは、同じ抗体又は抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、表面、例えば、マルチウェルプレート、チップ又は類似する基材に固定されてもよい。他の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、全く固定されず又は付着されなくてもよい。代替実施形態では、サンプルをＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体と接触させ、ついで、サンプルに結合したＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体を標識化抗体又は他の抗体標的化結合剤によって検出してもよい。
【０１２５】
本節で提供された方法の一部の例示的な実施形態では、適切なＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体には、表１に開示したとおり、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせが以下の抗体のうちのいずれか１つと同じである抗体が挙げられる：ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５。
【０１２６】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、検出可能に標識されてもよい。一部の実施形態では、標識された抗体及び抗原結合フラグメントは、本明細書に記載された方法により、ＩＬ１ＲＡＰの検出を容易にし得る。多くのこのような標識が、当業者に容易に既知である。例えば、適切な標識には、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。より具体的には、記載された標識には、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などが挙げられる。
【０１２７】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出するための各種のアッセイに使用されてもよい。一部の適切なアッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。
【０１２８】
本明細書に記載された一部の実施形態では、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞の検出を使用して、対象がＩＬ１ＲＡＰに向けられる治療剤により処置されてもよいことを判定することができる。
【０１２９】
ＩＬ１ＲＡＰは、血液及び血清サンプル中に、検出可能なレベルで存在する。このため、本明細書において、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、血液から得られたサンプル、例えば、血清サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出するための方法が提供される。血液サンプル又はその派生物は、希釈され、画分され、又は他の方法で処理されて、記載された方法が行われ得るサンプルを生成することができる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰは、当技術分野において既知の任意の回数のアッセイにより、血液サンプル又はその派生物中で検出することができる。例えば、同アッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
がんを診断するための方法
本明細書において、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ発現がんを診断するための方法が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。一部の実施形態では、上記されたように、生体サンプル、例えば、血液サンプル又は血清サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出することは、サンプルが得られた対象中のがんを診断する能力を提供する。あるいは、一部の実施形態では、他のサンプル、例えば、組織学的サンプル、微小針吸引サンプル、切除された腫瘍組織、循環細胞、循環腫瘍細胞等もまた、サンプルが得られた対象ががんを有するかどうかを評価するのに使用されてもよい。一部の実施形態では、サンプルが得られた対象ががんを有することが既に分かっていてもよいが、対象を苦しめているがんの種類は、未だに診断されていなくてもよく、又は予備的診断では未知であるため、対象から得られた生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出することにより、がんの診断を可能にし、又は明確にすることができる。例えば、対象ががんを有することが分かっていてもよいが、分かっていなくてもよく、又は、対象のがんがＩＬ１ＲＡＰを発現しているかどうかが、不明であってもよい。
【０１３１】
一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた生体サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を決定し、観察されたＩＬ１ＲＡＰの量をコントロール又は参照サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量と比較することにより、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいるどうかを評価することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量とコントロール又は参照サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量との間の差は、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいることの指標である。別の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中に観察されたＩＬ１ＲＡＰの量は、特定の形態又はステージのがんに関連することが既知のＩＬ１ＲＡＰのレベルと比較されて、対象のがんの形態又はステージを決定することができる。一部の実施形態では、対象から得られたサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量は、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体と接触させることにより評価される。ＩＬ１ＲＡＰの存在について評価されるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１３２】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんを診断する方法は、対象の生体サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、表１で提供された抗体及びフラグメントから得られたもの）と接触させること、抗体又はその抗原結合フラグメントによって結合したサンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を定量すること、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を既知の標準又は参照サンプルと比較すること、及び対象のＩＬ１ＲＡＰレベルががんに関連するＩＬ１ＲＡＰのレベル内に入るかどうかを判定することを含むであろう。更なる実施形態では、診断方法は、がん特異的処置を投与又は処方する更なる工程が続き得る。別の実施形態では、診断方法は、がんの処置を容易にするために、判定の結果を伝送する更なる工程が続き得る。一部の実施形態では、がん特異的処置は、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体などのＩＬ１ＲＡＰ発現がんに対して向けられてもよい。
【０１３３】
一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた血液又は血清サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を決定することと、観察されたＩＬ１ＲＡＰの量をコントロール又は参照サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量と比較することと、により、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいるかどうかを評価することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量とコントロール又は参照サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量との間の差は、対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいることの指標である。
【０１３４】
一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいない対象から得られてもよい。一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいる対象から得られてもよい。コントロール又は参照サンプルがＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいない対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＩＬ１ＲＡＰの量に対して、試験サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量における観察された増大は、評価された対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいることの指標である。コントロールサンプルがＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいない対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＩＬ１ＲＡＰの量に対して、試験サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量における観察された減少又は類似性は、評価された対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいないことの指標である。コントロール又は参照サンプルがＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいる対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＩＬ１ＲＡＰの量に対して、試験サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量における観察された類似性は、評価された対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいることの指標である。コントロール又は参照サンプルがＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいる対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＩＬ１ＲＡＰの量に対して、試験サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量における観察された減少は、評価された対象がＩＬ１ＲＡＰ発現がんに苦しんでいないことの指標である。
【０１３５】
一部の実施形態では、対象から得られたサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量は、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載された抗体と接触させることにより評価される。ＩＬ１ＲＡＰの存在について評価されるサンプルは、血液サンプル、血清サンプル、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。
【０１３６】
種々の態様において、ＩＬ１ＲＡＰの量は、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する２種類以上の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第１の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記載されたものなどのＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを、この能力において使用してもよい。
【０１３７】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体及び抗原結合フラグメントの種々の組み合わせを使用して、記載された診断方法を行うための「第１」及び「第２」の抗体又は抗原結合フラグメントを提供することができる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰの量は、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。
【０１３９】
記載された診断方法の種々の実施形態では、コントロール又は参照サンプルが使用される。このサンプルは、使用されるアッセイが適切に機能していることを保証する陽性又は陰性のアッセイコントロールでもよい。例えば、この性質のアッセイコントロールは、免疫組織化学アッセイに一般的に使用されてもよいと考えられる。あるいは、サンプルは、健康な対象からの生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量について標準化された参照であってもよい。一部の実施形態では、試験された対象の観察されたＩＬ１ＲＡＰレベルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんを有することが分かっている対象からのサンプル中に観察されたＩＬ１ＲＡＰレベルと比較されてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、対象となる特定のがんに苦しんでいてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、初期段階のがんを有することが既知であり、同初期段階のがんは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんであってもよく、又はＩＬ１ＲＡＰ発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、中間段階のがんを有することが既知であり、同中間段階のがんは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんであってもよく、又はＩＬ１ＲＡＰ発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、後期段階を有することが既知であり、同後期段階は、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんであってもよく、又はＩＬ１ＲＡＰ発現がんでなくてもよい。
【０１４０】
がんをモニタするための方法
本明細書において、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ発現がんをモニタするための方法が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた試験サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を決定することと、観察されたＩＬ１ＲＡＰの量をより早い時点で対象から同様にして得られた生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量と比較することと、により、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんが進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかを評価することを含む。この場合、試験サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量とより早期のサンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量との間の差は、がんが、進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかの指標を提供する。これに関して、より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のＩＬ１ＲＡＰを含む試験サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプルについて観察された量に対して減少した量のＩＬ１ＲＡＰを含む試験サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの退行を示すことができる。
【０１４１】
したがって、より早期のサンプルについて観察された量に対してＩＬ１ＲＡＰの量におけるわずかな差しか有さない試験サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんについて不変の病態を示すことができる。一部の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰの量は、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載された抗体と接触させることにより評価される。ＩＬ１ＲＡＰの存在について評価されるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１４２】
一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんをモニタする方法は、対象の生体サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、表１で提供された抗体及びフラグメントから得られたもの）と接触させることと、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量を定量することと、サンプル中に存在するＩＬ１ＲＡＰの量をより早い時点において同じ対象から同様にして得られた生体サンプル中に存在することが決定されたＩＬ１ＲＡＰの量と比較することと、対象のＩＬ１ＲＡＰレベルが経時的に変化していたかどうかを判定することと、を含むであろう。より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のＩＬ１ＲＡＰを含む試験サンプルは、がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプルについて観察された量に対して減少した量のＩＬ１ＲＡＰを含む試験サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの退行を示すことができる。したがって、より早期のサンプルについて観察された量に対してＩＬ１ＲＡＰの量におけるわずかな差しか有さない試験サンプルは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんについて不変の病態を示すことができる。一部の実施形態では、サンプルのＩＬ１ＲＡＰレベルは、単独で、又はより早い時点において評価されたサンプルについて観察されたＩＬ１ＲＡＰレベルに加えて、既知の標準又は参照サンプルと比較されてもよい。更なる実施形態では、診断方法は、がん特異的処置を投与する更なる工程が続き得る。一部の実施形態では、がん特異的処置は、例えば、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体などのＩＬ１ＲＡＰ発現がんに対して向けられてもよい。
【０１４３】
種々の態様において、ＩＬ１ＲＡＰの量は、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する２種類以上の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第１の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記載されたもの等の抗体を、この能力において使用されてもよい。
【０１４４】
表１で記載された抗体及び抗原結合フラグメントの種々の組み合わせを使用して、記載されたモニタ方法を行うための「第１」及び「第２」の抗体又は抗原結合フラグメントを提供することができる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんとしては、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんには、前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫などでの固体腫瘍が含まれる。
【０１４５】
特定の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰの量は、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。
【０１４６】
ＩＬ１ＲＡＰを検出するためのキット
本明細書において、生体サンプル中のＩＬ１ＲＡＰを検出するためのキットが提供される。これらのキットは、本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、このキットを使用するための指示書とを含む。
【０１４７】
提供されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、溶液の中に存在してもよく、凍結乾燥されていてもよく、基材、キャリア、又はプレートに固着されていてもよく、又は検出可能に標識化されていてもよい。
【０１４８】
記載されたキットはまた、本明細書に記載された方法を行うのに有用な更なる構成要素を含んでもよい。例として、キットは、対象からサンプルを得るための手段、コントロール若しくは参照サンプル、例えば、ゆっくり進行するがんを有する対象及び／若しくはがんを有さない対象からのサンプル、１つ若しくはそれ以上のサンプル区画、及び／又は本発明の方法の実施を説明する指示材料、並びに組織特異的コントロール若しくは標準をも含んでもよい。
【０１４９】
ＩＬ１ＲＡＰのレベルを決定するための手段は、例えば、ＩＬ１ＲＡＰのレベルを決定するためのアッセイに使用するためのバッファ又は他の試薬を更に含み得る。指示書は、例えば、アッセイを行うための印刷された指示書及び／又はＩＬ１ＲＡＰの発現レベルを評価するための指示書であり得る。
【０１５０】
記載されたキットはまた、対象からサンプルを単離するための手段を含んでもよい。これらの手段は、対象から流体又は組織を得るのに使用され得る機器又は試薬のうち１つ又は２つ以上の品目を含み得る。対象からサンプルを得るための手段はまた、血液サンプルから血液成分、例えば、血清を単離するための手段を含んでもよい。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用するために設計されている。
【０１５１】
多重特異性抗体
本明細書に記載された抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合ドメインは、その表面上にＩＬ１ＲＡＰを発現している細胞を認識する。上記されたように、ＩＬ１ＲＡＰの発現は、がん細胞を示し得る。特定の部分集合の細胞に対するより特異的な標的化は、二重特異性又は多重特異性分子、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ及び別の標的に結合する抗体又は抗体フラグメントを作製することにより達成され得る。抗原結合領域は、標的の特異的な認識を可能にする任意の形態を取ることができ、例えば、結合領域は、重鎖可変ドメイン、Ｆｖ（重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいた結合ドメイン（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＣｅｎｔｙｒｉｎ分子など、フィブロネクチン由来、若しくはフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの、又はテネイシン由来、若しくはテネイシン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの。例えば、国際公開第２０１０／０５１２７４号及び同第２０１０／０９３６２７号を参照されたい）であっても、これらを含んでいてもよい。したがって、ＩＬ１ＲＡＰ及び別の抗原にそれぞれに結合する２種類以上の異なる抗原結合領域を含む二重特異性又は多重特異性分子が提供される。
【０１５２】
本明細書に記載された一部の多重特異性抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３にそれぞれ結合する２種類の異なる抗原結合領域を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体（ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体）及びその多重特異性抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために対を成す第１の重鎖（ＨＣ１）及び第１の軽鎖（ＬＣ１）と、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために対を成す第２の重鎖（ＨＣ２）及び第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために対を成す第１の重鎖（ＨＣ１）及び第１の軽鎖（ＬＣ１）を含むＩＬ１ＲＡＰ特異性アームと、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために対を成す第２の重鎖（ＨＣ２）及び第２の軽鎖（ＬＣ２）を含むＣＤ３特異性アームと、を含む二重特異性抗体である。一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、全長抗体構造を有する抗体を含む。本明細書で使用されるとき、「全長抗体」は、２本の全長抗体重鎖と２本の全長抗体軽鎖とを有する抗体を意味する。全長抗体重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、ＣＨＩ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。全長抗体重鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬを含む。全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。「Ｆａｂアーム」又は「半分子」という用語は、抗原に特異的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインのうちの１つは、非抗体ベースの結合ドメイン、例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎなど、フィブロネクチン３型ドメインに基づいた結合ドメインである。
【０１５３】
本明細書で提供された多重特異性抗体のＩＬ１ＲＡＰ結合アームは、上記されたＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体のいずれかから得られてもよい。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載されたとおり抗体から得られた重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載されたとおり抗体から得られた、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、以下のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む：ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、以下のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む：ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載されたとおり抗体から得られた重鎖可変ドメインを含む。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載されたとおり抗体から得られた重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、以下のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体のうちのいずれか１つの重鎖可変ドメインを含む：ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５。このようなＩＬ１ＲＡＰ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する第１の抗原結合領域は、以下のＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体のうちのいずれか１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む：ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５。
【０１５４】
二重特異性抗体の一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ結合アームは、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰ、好ましくは、その細胞外ドメインにも結合する。
【０１５５】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＩＬ１ＲＡＰ結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。ＩＬ１ＲＡＰ結合アームがＩｇＧ１アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ結合アームは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＫ４０９Ｒ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。ＩＬ１ＲＡＰ結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ結合アームは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。
【０１５６】
二重特異性抗体の一部の実施形態では、第２の抗原結合アームは、ヒトＣＤ３に結合する。一部の好ましい実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３特異性アームは、ヒト初代Ｔ細胞及び／又はカニクイザル初代Ｔ細胞に結合し、これらを活性化するＣＤ３特異性抗体から得られる。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＣＤ３εのＮ末端において、エピトープに結合する。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＣＤ３εの６つのＮ末端アミノ酸を含むエピトープと接触する。一部の実施形態では、二重特異性抗体のＣＤ３特異性結合アームは、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、抗体ＳＰ３４のＣＤＲを含む。このようなＣＤ３結合アームは、５×１０−７Ｍ以下、例えば、１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、又は１×１０−９Ｍ以下の親和性で、ＣＤ３に結合し得る。ＣＤ３特異性結合アームは、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４のヒト化版のアームでもよい。ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）は、ＣＤ３特異性アームが得られる抗ＣＤ３抗体をヒト化するのに使用されてもよい。二重特異性抗体の一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、表２から選択される重鎖と軽鎖とのペアを含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。ＣＤ３結合アームがＩｇＧ１アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。ＣＤ３結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代カニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
【０１５８】
一部の実施形態では、抗体ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５のうちのいずれか１つの重鎖を含むＩＬ１ＲＡＰ結合アームを有するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５のうちのいずれか１つの重鎖及び軽鎖を含むＩＬ１ＲＡＰ結合アームを有するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体ＣＤ３Ｂ２２０又はＣＤ３Ｂ２１９の重鎖を含むＣＤ３結合アームを有するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体ＣＤ３Ｂ２２０又はＣＤ３Ｂ２１９の重鎖及び軽鎖を含むＣＤ３結合アームを有するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５のうちのいずれか１つの抗体の重鎖を含むＩＬ１ＲＡＰ結合アームと、抗体ＣＤ３Ｂ２２０又はＣＤ３Ｂ２１９の重鎖を含むＣＤ３結合アームと、を有する、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体ＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ３８、ＩＡＰＢ５７、ＩＡＰＢ６１、ＩＡＰＢ６２、ＩＡＰＢ３、ＩＡＰＢ１７、ＩＡＰＢ２３、ＩＡＰＢ２５、ＩＡＰＢ２９、ＩＡＰＢ９、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、又はＩＡＰＢ６５のうちのいずれか１つの重鎖及び軽鎖を含むＩＬ１ＲＡＰ結合アームと、抗体ＣＤ３Ｂ２２０又はＣＤ３Ｂ２１９の重鎖及び軽鎖を含むＣＤ３結合アームと、を有する、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【０１５９】
好ましいＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体は、表１０及び表１５に提供される。種々のフォーマットの二重特異性抗体が記載されてきており、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２）ＭＡｂｓ（２０１２）４：１８２〜１９７及びＣｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｖ  １２：２７６に近年レビューされた。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明において記載されたもの等の制御されたＦａｂアーム交換により得られたディアボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
【０１６１】
一部の実施形態では、二重特異性抗体には、ヘテロ二量体化する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子（この分子の２つの側面はそれぞれ少なくとも２種類の抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含有する）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体がエクストラＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ディアボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂフラグメントが互いに融合されている）、ＳｃＦｖ及びディアボディベースの抗体並びに重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子若しくは異なるディアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。
【０１６２】
一部の実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子には、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的マッチされた抗体（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランド交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態では、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子には、Ｄｕａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）−Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ−Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＩｇＧ融合分子には、Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）−Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態では、Ｆｃ融合分子には、ＳｃＦｖ／Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ−ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２−Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−−Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
【０１６６】
一部の実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体には、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ−Ａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｂｉｓ−Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ−Ｆｖ（ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ−、ディアボディ−ベース及びドメイン抗体には、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ−ｌｉｋｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＳｃＦｖ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的指向性ナノボディ（dual targeting nanobody）（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的指向性の重鎖のみのドメイン抗体（dual targeting heavy chain only domain antibody）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本発明の全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロでのセルフリー環境において又は共発現を使用するかのいずれか一方において、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の好ましいヘテロ二量体形成のために、各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成されてもよい。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られた生成物は、それぞれ異なるエピトープ、すなわち、ＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープ及びＣＤ３上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体化」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１６９】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体化」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１７０】
「ノブ−ｉｎ−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照されたい）が、全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。
【０１７１】
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載されたように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されたように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ  Ｋ４０９Ｆ  Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）により促進されてもよい。
【０１７２】
上記された方法に加えて、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載された方法に従って、セルフリー環境でのインビトロにおいて、２つの単特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単特異性二価抗体（例えば、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体）及び第２の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作される。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、これにより、Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体が生成される。インキュベーション条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用されてもよい例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びベータ−メルカプトエタノール、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭ  ２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベーションが使用されてもよい。
【０１７３】
記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体に加えて、記載されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。
【０１７４】
多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントを使用する治療組成物及び処置方法
上記で検討されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体、例えば、上記で検討されたＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体は、治療に有用である。特に、ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体は、がんを処置するのに有用である。また、本明細書において、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するための治療組成物が提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態において、前述の医薬組成物はＩＬ１ＲＡＰ発現がんを処置するためのものであり、同がんには以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）などのＩＬ１ＲＡＰ発現血液がん、及び、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の血液がん。別の実施形態では、前述の医薬組成物はＩＬ１ＲＡＰ発現固体腫瘍を処置するためのものであり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍、並びに、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の腫瘍。上記で検討された特異的ながんを含めて、血液がん又は固体腫瘍などのがんを処置するために使用され得る特定の二重特異性抗体には、抗体ＩＣ３Ｂ１、ＩＣ３Ｂ２、ＩＣ３Ｂ３、ＩＣ３Ｂ４、ＩＣ３Ｂ５、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ７、ＩＣ３Ｂ８、ＩＣ３Ｂ９、ＩＣ３Ｂ１０、ＩＣ３Ｂ１１、ＩＣ３Ｂ１２、ＩＣ３Ｂ１３、ＩＣ３Ｂ１４、ＩＣ３Ｂ１５、ＩＣ３Ｂ１６、ＩＣ３Ｂ１７、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９が挙げられる。こうした特異的ながんを含めて、血液がん又は固体腫瘍などのがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の一例は、抗体ＩＣ３Ｂ１８である。こうした特異的ながんを含めて、血液がん又は固体腫瘍などのがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の別の例は、抗体ＩＣ３Ｂ１９である。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、１つ又は２つ以上のＩＬ１ＲＡＰ発現血液がんを処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）を処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）を処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態に���いて、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置するために使用されてもよい。記載された処置方法の一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）を処置するために使用されてもよい。
【０１７５】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体は、血管新生を阻害するために使用されてもよい。また、本明細書において、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む、哺乳類における血管新生を阻害するための治療組成物が提供される。一部の実施形態では、血管新生を阻害するのに有用な多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体、又はその多重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態において、記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体は、がんに関連した血管新生を阻害するために、そのがんがＩＬ１ＲＡＰを発現するかどうかに関係なく、記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体のうちの１つを、血管新生の阻害を必要とする対象に投与することによって使用されてもよい。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、血管新生を阻害するために対象に投与されてもよい。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、血管新生を阻害するために対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、抗体ＩＣ３Ｂ１８又はＩＣ３Ｂ１９のいずれかの投与は、がんを有する対象において血管新生を阻害することとなる。複数のがんが、血管新生を阻害するために、本明細書に記載された二重特異性抗体の投与によって処置され得るが、この種の処置は、固体腫瘍を呈するがん種に対して最も一般的に行われることとなり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍。血管新生の阻害によるがんの処置に使用され得る特定の二重特異性抗体には、抗体ＩＣ３Ｂ１、ＩＣ３Ｂ２、ＩＣ３Ｂ３、ＩＣ３Ｂ４、ＩＣ３Ｂ５、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ７、ＩＣ３Ｂ８、ＩＣ３Ｂ９、ＩＣ３Ｂ１０、ＩＣ３Ｂ１１、ＩＣ３Ｂ１２、ＩＣ３Ｂ１３、ＩＣ３Ｂ１４、ＩＣ３Ｂ１５、ＩＣ３Ｂ１６、ＩＣ３Ｂ１７、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９が挙げられる。血管新生を阻害してがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の一例は、抗体ＩＣ３Ｂ１８である。血管新生を阻害してがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の別の例は、抗体ＩＣ３Ｂ１９である。
【０１７６】
本明細書に記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）集団を枯渇させるために使用されてもよい。記載された二重特異性抗体を使用して対象内のＭＤＳＣを枯渇させると、ＭＤＳＣの抑制因子機能が事実上無効になることにより、所与の刺激に対する対象の免疫応答を高めることができる。一部の実施形態では、記載された二重特異性抗体は、がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得、これにより、同対象の免疫系は、同対象のがんを攻撃するように指向されることが可能になる。一部の実施形態では、ＭＤＳＣを枯渇させるのに有用な多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体、又はその多重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態において、記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体は、がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために、そのがんがＩＬ１ＲＡＰを発現するかどうかに関係なく、記載されたＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体のうちの１つを、免疫系の強化を必要とする対象に投与することによって使用されてもよい。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、対象のＭＤＳＣ集団を枯渇させるために、その対象に投与されてもよい。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、対象のＭＤＳＣ集団を枯渇させるために、その対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、抗体ＩＣ３Ｂ１８又はＩＣ３Ｂ１９のいずれかの投与は、がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させることとなる。複数のがんが、ＭＤＳＣを枯渇させるために、本明細書に記載された二重特異性抗体の投与によって処置され得るが、この種の処置は、固体腫瘍を呈するがん種に対して最も一般的に行われることとなり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍。ＭＤＳＣを枯渇させることによるがんの処置に使用され得る特定の二重特異性抗体には、抗体ＩＣ３Ｂ１、ＩＣ３Ｂ２、ＩＣ３Ｂ３、ＩＣ３Ｂ４、ＩＣ３Ｂ５、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ７、ＩＣ３Ｂ８、ＩＣ３Ｂ９、ＩＣ３Ｂ１０、ＩＣ３Ｂ１１、ＩＣ３Ｂ１２、ＩＣ３Ｂ１３、ＩＣ３Ｂ１４、ＩＣ３Ｂ１５、ＩＣ３Ｂ１６、ＩＣ３Ｂ１７、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９が挙げられる。ＭＤＳＣを枯渇させてがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の一例は、抗体ＩＣ３Ｂ１８である。ＭＤＳＣを枯渇させてがんを処置するのに有用な二重特異性抗体の別の例は、抗体ＩＣ３Ｂ１９である。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１８は、肺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１８は、前立腺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、肺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、前立腺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得る。
【０１７７】
一部の実施形態では、記載された二重特異性抗体を、がんを有する対象に投与することは、対象のＭＤＳＣを枯渇させてがん細胞に対するよりしっかりとした免疫応答を促進させると同時に、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするようにＴ細胞を指向させ得る。複数のＩＬ１ＲＡＰ発現がんが、本明細書に記載された二重特異性抗体の投与によってこのように処置され得るが、この種の処置は、固体腫瘍を呈するがん種に対して最も一般的に行われることとなり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍。ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させ、かつ、ＭＤＳＣを枯渇させるために使用され得る特定の二重特異性抗体には、抗体ＩＣ３Ｂ１、ＩＣ３Ｂ２、ＩＣ３Ｂ３、ＩＣ３Ｂ４、ＩＣ３Ｂ５、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ６、ＩＣ３Ｂ７、ＩＣ３Ｂ８、ＩＣ３Ｂ９、ＩＣ３Ｂ１０、ＩＣ３Ｂ１１、ＩＣ３Ｂ１２、ＩＣ３Ｂ１３、ＩＣ３Ｂ１４、ＩＣ３Ｂ１５、ＩＣ３Ｂ１６、ＩＣ３Ｂ１７、ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９が挙げられる。がんを処置するためにＭＤＳＣを枯渇させながら、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるための有用な二重特異性抗体の一例は、抗体ＩＣ３Ｂ１８である。がんを処置するためにＭＤＳＣを枯渇させながら、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるための有用な二重特異性抗体の別の例は、抗体ＩＣ３Ｂ１９である。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１８は、肺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させると共に、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１８は、前立腺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させると共に、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、肺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させると共に、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるために使用され得る。一実施形態において、抗体ＩＣ３Ｂ１９は、前立腺がんを有する対象においてＭＤＳＣを枯渇させると共に、ＩＬ１ＲＡＰ陽性がん細胞を標的にするように対象のＴ細胞を指向させるために使用され得る。
【０１７８】
本明細書で提供された医薬組成物は、ａ）有効量の本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントと、ｂ）不活性でも又は生理学的に活性でもよい医薬的に許容され得る担体とを含む。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容され得る担体」という用語は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤等を含む。適切な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうち１種又は２種以上、並びにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。特に、適切な担体の関連する例には、（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有又は非含有、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ、抗酸化剤、例えば、トリプタミン及び安定化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）をも含有してもよい。
【０１７９】
本明細書における組成物はまた、処置される特定の障害に応じて、更なる治療剤を含有してもよい。好ましくは、多重特異性抗体又は抗体フラグメントと補助的な活性化合物とは、互いに有害に影響を及ぼさない補完的な活性を有するであろう。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。
【０１８０】
本発明の組成物は、各種の形態でもよい。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は、意図された投与方式及び治療用途により決まる。典型的に好ましい組成物は、注射用液又は注入用液の形態である。好ましい投与方式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、静脈内に、ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的な注入により投与される。別の好ましい実施形態では、本組成物は、局所及び全身性の治療効果を発揮するために、筋肉内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲の経路により投与される。
【０１８１】
非経口投与用の無菌組成物が、本発明の抗体、抗体フラグメント、又は抗体コンジュゲートを、必要とされる量で適切な溶媒に包含させ、続けて、マイクロフィルター法により滅菌することにより調製され得る。溶媒又は媒体として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにこれらの組み合わせを使用することができる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。これらの組成物はまた、補助剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、及び安定化剤を含有してもよい。非経口投与用の無菌組成物はまた、使用時に滅菌水又は任意の他の注射用無菌媒体中に溶解されてもよい、無菌の固体組成物の形態に調製されてもよい。
【０１８２】
多重特異性抗体又は抗体フラグメントはまた、経口投与されてもよい。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、粉末剤（ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤）、又は顆粒剤が使用されてもよい。これらの組成物において、本発明による活性成分は、１つ又は２つ以上の不活性な希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、又はシリカと、アルゴン流下において混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、１つ又は２つ以上の滑材、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク、着色剤、コーティング（糖衣錠）、又はグレーズを含んでもよい。
【０１８３】
経口投与用の液体組成物として、不活性な希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、植物油、又はパラフィンオイルを含有する、医薬的に許容され得る液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が使用されてもよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、着香剤、又は安定化製品を含んでもよい。
【０１８４】
用量は、所望の効果、処置の持続期間、及び使用される投与経路により決まる。用量は、一般的には、成人１日あたりに経口で５ｍｇ〜１０００ｍｇであり、単位用量は、活性物質１ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲である。一般的には、医師は、適切な用量を、処置される対象の年齢、体重、及び同対象に固有の任意の他の要因に応じて決定するであろう。
【０１８５】
また、本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰ＋細胞の細胞毒性を誘引するための方法であって、それを必要とする患者に、ＩＬ１ＲＡＰに結合し、Ｔ細胞を補充して、ＩＬ１ＲＡＰ＋細胞の細胞毒性を誘引すること（すなわち、Ｔ細胞リダイレクト）が可能な多重特異性抗体を投与することにより、ＩＬ１ＲＡＰ＋細胞の細胞毒性を誘引するための方法が提供される。本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントのいずれかは、治療的に使用されてもよい。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。
【０１８６】
好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。より好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち１つは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。一実施形態において、この障害は、がんである。特に、このがんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんであり、同がんには以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）などのＩＬ１ＲＡＰ発現血液がん、及び、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の血液がん。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。
【０１８７】
したがって、本発明の医薬組成物は、各種のがんの処置又は予防に有用であり、同がんには以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）などのＩＬ１ＲＡＰ発現血液がん、及び、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の血液がん。本発明の医薬組成物はまた、ＩＬ１ＲＡＰ発現固体腫瘍の処置及び予防にも有用であり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍、並びに、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の腫瘍。
【０１８８】
同様に、本明細書において、選択された細胞集団の成長を阻害するための方法であって、ＩＬ１ＲＡＰ発現標的細胞又はこのような標的細胞を含有する組織を、有効量の本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントと、単独で、又は他の細胞毒性剤若しくは治療剤との組み合わせにおいてかのいずれか一方で、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下で接触させることを含む、方法が更に提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。選択された細胞集団の成長を阻害するための方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて実施され得る。
【０１８９】
インビトロでの使用例には、疾患細胞又は悪性細胞を殺傷するための同じ患者への移植前の自家骨髄の処置、適格性Ｔ細胞を殺傷し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための移植前の骨髄の処置、標的抗原を発現していない所望の変異体を除く全ての細胞を殺傷し、又は不要な抗原を発現している変異体を殺傷するための細胞培養物の処置が挙げられる。非臨床的なインビトロでの使用条件は、当業者により容易に決定される。
【０１９０】
臨床的なエクスビボでの使用例は、がん処置における自家移植前での、骨髄から腫瘍細胞を除去することである。処置は、下記のように行われ得る。骨髄を、患者又は他の個体から収集し、ついで、本発明の細胞毒性剤を添加された血清含有培地中でインキュベートする。濃度は、約３７℃で約３０分〜約４８時間の間、約１μＭ〜１０μＭの範囲である。インキュベーションの濃度及び時間の精密な条件、すなわち、投与量は、当業者により容易に決定される。インキュベーション後、骨髄細胞を、血清含有培地で洗浄し、既知の方法に従って、ｉ．ｖ．注入により患者に戻す。患者が他の処置、例えば、一連の骨髄破壊的化学療法又は全身照射を受けている状況において、骨髄の収集と処理された細胞の再注入との時間の間、処理された骨髄細胞は、標準的な医療機器を使用して、液体窒素中で凍結保存される。
【０１９１】
臨床的なインビボでの使用について、治療的に有効な量の多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントがそれを必要とする対象に投与される。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんの処置に有用であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは、血液がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク、中リスク、又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）である。一部の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは固体腫瘍であり、同腫瘍には以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺、乳房、肺、大腸直腸、黒色腫、膀胱、脳／ＣＮＳ、頚管、食道、胃、頭／頚、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、及び肉腫の腫瘍、並びに、ＩＬ１ＲＡＰが発現していると今のところ判定される他の腫瘍。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。一部の実施形態では、多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントは、無菌試験済みの溶液として投与されるであろう。
【０１９２】
処置及び使用の上記方法における投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分離用量を、時間をかけて投与してもよく、又は用量を治療状況の緊急性によって示されるように、比例して減少又は増加させてよい。非経口組成物は、投与の容易性及び用量の均一性のための投与形態に製剤化されてもよい。
【０１９３】
多重特異性抗体及びフラグメントの効率的な投与及び投与計画は、処置される疾患又は状態により決まり、当業者により決定されてもよい。本発明の化合物の治療的に有効な量の例示的で非限定的な範囲は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１、約０．０１、約０．１、約１、又は約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１９４】
当技術分野において通常の技能を有する医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を、容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要されるより少ないレベルで医薬組成物中に利用される多重特異性抗体又はフラグメントの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増大させることができる。一般的には、本発明の二重特異性抗体の適切な日量は、治療効果を生じさせるのに有効な最も少ない用量である化合物量であろう。投与は、例えば、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下でもよい。一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、ｍｇ／ｍ２で算出された毎週投与での注入により投与されてもよい。このような用量は、例えば、下記：用量（ｍｇ／ｋｇ）×７０：１．８に従って、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができる。このような投与は、例えば、１〜８回、例えば、３〜５回繰り返されてもよい。投与は、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間の期間にわたる連続的な注入により行われてもよい。一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、毒性の副作用を減少させるために、長期間、例えば、２４時間超にわたるゆっくりとした連続的な注入により投与されてもよい。
【０１９５】
一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、１週間に１回で与えられる場合、最大８回、例えば、４〜６回の固定用量として算出された毎週投与において投与されてもよい。このような計画は、例えば、６ケ月又は１２ケ月後に、必要に応じて１回又は２回以上の回数繰り返されてもよい。このような固定用量は、例えば、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができる。ここで、体重は、７０ｋｇと仮定する。用量は、例えば、生体サンプルを採取し、本発明の多重特異性抗体のＩＬ１ＲＡＰ抗原結合領域を標的にする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、本発明の二重特異性抗体の投与時の血中量を測定することにより、決定又は調節されてもよい。
【０１９６】
一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、維持治療、例えば、６ケ月以上の期間に週一回等により投与されてもよい。
【０１９７】
多重特異性抗体又はフラグメントはまた、がんの進行リスクを低下させ、がんの進行におけるイベントの発生の開始を遅延させ、かつ／又はがんが緩解した際の再発リスクを低下させるために、予防的に投与されてもよい。
【０１９８】
本明細書に記載された多重特異性抗体及びそのフラグメントはまた、組み合わせ治療において投与されてもよい、すなわち、処置される疾患又は状態に関連する他の治療剤と組み合わせられてもよい。したがって、一実施形態において、抗体含有医薬は、１種又は２種以上の他の治療剤、例えば、化学療法剤と組み合わせるためのものである。一部の実施形態では、他の治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。このような組み合わせ投与は、同時、任意の順序において、別々又は連続的でもよい。同時投与について、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物又は別々の組成物として投与されてもよい。
【０１９９】
一実施形態において、対象においてＩＬ１ＲＡＰを発現している細胞が関与する障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体と放射線治療とを投与することを含む方法が提供される。一実施形態において、がんを処置又は予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体と放射線治療とを投与することを含む方法が提供される。放射線治療としては、提供される患者に対する、放射線又は放射性医薬の関連する投与を含んでもよい。放射線源は、処置される患者の外側又は内側のいずれか一方であってもよい（放射線処置は、例えば、放射線外部照射（ＥＢＲＴ）又は組織内照射療法（ＢＴ）の形態でもよい）。このような方法を実施するのに使用されてもよい放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１が挙げられる。
【０２００】
キット
また、本明細書において、例えば、記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、特定の細胞種の細胞毒性のための抗体又はフラグメントを使用するための指示書と、を含むキットも提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。指示書は、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて使用するための指示を含んでもよい。
【０２０１】
典型的には、キットは、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する区画を有するであろう。多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、凍結乾燥状態、液状、又はキットに含ませるのに修正可能な他の形態でもよい。キットはまた、キットの指示書に記載された方法を実施するのに必要とされる、更なる要素を含有してもよい。同要素は、例えば、凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者への投与の前に多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせるための更なる薬剤、及び多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与するのを支援するツールである。
【０２０２】
診断的使用
本明細書に記載された多重特異性抗体及びフラグメントはまた、診断目的に使用されてもよい。このため、本明細書で定義されたような多重特異性抗体又はフラグメントを含む診断組成物及びその使用もまた提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態において、本発明は、二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体と、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体の結合を検出するための１種又は２種以上の試薬と、を含む容器を含む、がんを診断するためのキットを提供する。試薬には、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検出可能なタグを挙げることができる。試薬はまた、酵素反応のための二次若しくは三次抗体又は試薬を含んでもよい。この場合、酵素反応は、可視化することができる生成物を生じる。例えば、本明細書に記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、若しくはポリヒスチジン、又は、当技術分野において公知の類似するこのような標識で標識されてもよい。
【０２０３】
記載された主題の例示的な実施形態
本明細書に記載された主題をより適切かつ詳細に説明するために、本節では、提示された主題の例示的な実施形態を列挙して提供する。
【０２０４】
列挙した実施形態：
請求項１．ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
ｌ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、組換え抗体又はその抗原結合フラグメント。
２．
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｂ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｃ．配列番号１６のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｄ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｅ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｆ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｇ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｈ．配列番号３０のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｊ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｌ．配列番号１９のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｍ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、
ｎ．配列番号２２のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含み、又は
ｏ．配列番号２５のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する前述の重鎖ＣＤＲ３を含む前述の抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
３．
（ａ）の抗体は、配列番号６８に記載された重鎖配列及び配列番号６９に記載された軽鎖配列を含み、
（ｂ）の抗体は、配列番号７０に記載された重鎖配列及び配列番号７１に記載された軽鎖配列を含み、
（ｃ）の抗体は、配列番号７２に記載された重鎖配列及び配列番号７３に記載された軽鎖配列を含み、
（ｄ）の抗体は、配列番号７４に記載された重鎖配列及び配列番号７５に記載された軽鎖配列を含み、
（ｅ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号７７に記載された軽鎖配列を含み、
（ｆ）の抗体は、配列番号７８に記載された重鎖配列及び配列番号７９に記載された軽鎖配列を含み、
（ｇ）の抗体は、配列番号８０に記載された重鎖配列及び配列番号７９に記載された軽鎖配列を含み、
（ｈ）の抗体は、配列番号８１に記載された重鎖配列及び配列番号８２に記載された軽鎖配列を含み、
（ｉ）の抗体は、配列番号８３に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
（ｊ）の抗体は、配列番号８５に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
（ｋ）の抗体は、配列番号８６に記載された重鎖配列及び配列番号８４に記載された軽鎖配列を含み、
（ｌ）の抗体は、配列番号７４に記載された重鎖配列及び配列番号８７に記載された軽鎖配列を含み、
（ｍ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号８８に記載された軽鎖配列を含み、
（ｎ）の抗体は、配列番号７６に記載された重鎖配列及び配列番号８９に記載された軽鎖配列を含み、又は
（ｏ）の抗体は、配列番号９０に記載された重鎖配列及び配列番号９１に記載された軽鎖配列を含む、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
４．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインに結合する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
５．抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又は抗原結合フラグメントである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
６．抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗原結合フラグメント。
７．抗体又はその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定された場合、約５０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
８．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
９．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである、実施形態１〜８のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１０．ＩｇＧ１は、そのＦｃ領域中に、Ｋ４０９Ｒ置換を有する、実施形態９に記載の抗体。
１１．ＩｇＧ１は、そのＦｃ領域中に、Ｆ４０５Ｌ置換を有する、実施形態９に記載の抗体。
１２．ＩｇＧ４は、そのＦｃ領域中に、Ｆ４０５Ｌ置換及びＲ４０９Ｋ置換を有する、実施形態９に記載の抗体。
１３．そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３４Ａ置換、及びＬ２３５Ａ置換を更に含む、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の抗体。
１４．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１５．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している組換え細胞。
１６．細胞は、ハイブリドーマ又はトランスフェクトーマである、実施形態１５に記載の細胞。
１７．抗体は、組換え的に生成される、実施形態１５に記載の細胞。
１８．組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体であって、
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）、及び
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）を含み、
ＨＣ１及びＬＣ１は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するように対を成しており、ＨＣ２及びＬＣ２は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するように対を成している、組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
１９．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプである、実施形態１８に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２０．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである、実施形態１９及び２０のいずれかに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２１．ＨＣ１は、配列番号９２又は配列番号９４を含み、ＬＣ１は、配列番号９３又は配列番号９５を含む、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２２．ＨＣ２は、配列番号６８を含み、ＬＣ２は、配列番号６９を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２３．ＨＣ２は、配列番号７０を含み、ＬＣ２は、配列番号７１を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２４．ＨＣ２は、配列番号７２を含み、ＬＣ２は、配列番号７３を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２５．ＨＣ２は、配列番号７４を含み、ＬＣ２は、配列番号７５を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２６．ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号７７を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２７．ＨＣ２は、配列番号７８を含み、ＬＣ２は、配列番号７９を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２８．ＨＣ２は、配列番号８０を含み、ＬＣ２は、配列番号７９を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２９．ＨＣ２は、配列番号８１を含み、ＬＣ２は、配列番号８２を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３０．ＨＣ２は、配列番号８３を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３１．ＨＣ２は、配列番号８４を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３２．ＨＣ２は、配列番号８６を含み、ＬＣ２は、配列番号８４を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３３．ＨＣ２は、配列番号７４を含み、ＬＣ２は、配列番号８７を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３４．ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号８８を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３５．ＨＣ２は、配列番号７６を含み、ＬＣ２は、配列番号８９を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３６．ＨＣ２は、配列番号９０を含み、ＬＣ２は、配列番号９１を含む、実施形態２１に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３７．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定された場合、約３０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、実施形態１８〜３６に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３８．抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト肺がん細胞、ヒト結腸がん細胞、ヒト膵がん細胞、ヒト骨髄異形成症候群がん細胞、ヒト慢性骨髄性白血病、ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、ヒト急性リンパ性白血病細胞、及びヒトＴ細胞白血病／リンパ腫細胞からなる群から選択される細胞の表面でＩＬ１ＲＡＰに結合する、実施形態１８〜３７に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３９．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、６．７ｎＭを超える濃度においてＡＰ−１及びＮＦ−κＢ応答性エレメントを介したＩＬ−１β媒介性シグナル伝達を阻害する、実施形態１８〜３８に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
４０．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、インビトロでのＩＬ１ＲＡＰ発現細胞のＴ細胞依存性細胞毒性を約１．３ｎＭ未満のＥＣ５０で誘引する、実施形態１８〜３９に記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
４１．組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメントであって、
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）、及び
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）を含み、
ＨＣ１及びＬＣ１は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するように対を成し、かつ、配列番号９６に示されているような重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０２に示されているようなＨＣＤＲ２、配列番号９８に示されているようなＨＣＤＲ３、配列番号９９に示されているような軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１００に示されているようなＬＣＤＲ２、及び配列番号１０１に示されているようなＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣ２及びＬＣ２は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するように対を成し、かつ、配列番号１６又は２２に示されているような重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１７又は２３に示されているようなＨＣＤＲ２、配列番号１８又は２４に示されているようなＨＣＤＲ３、配列番号４６又は６２に示されているような軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４７又は６３に示されているようなＬＣＤＲ２、及び配列番号１０３又は６４に示されているようなＬＣＤＲ３を含む、組換えＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
４２．実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している組換え細胞。
４３．細胞は、ハイブリドーマである、実施形態４２に記載の細胞。
４４．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、組換え的に生成される、実施形態４２に記載の細胞。
４５．がんを有する対象を処置するための方法であって、当該方法は、
治療的に有効な量の、実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを、それを必要とする患者に、がんを処置するのに十分な時間投与する工程を含む、方法。
４６．がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、
治療的に有効な量の、実施形態１６〜３９のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与して、がん細胞の成長又は増殖を阻害する工程を含む、方法。
４７．Ｔ細胞をＩＬ１ＲＡＰ発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、当該方法は、
治療的に有効な量の、実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与して、Ｔ細胞をがんにリダイレクトする工程を含む、方法。
４８．がんは、ＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、実施形態４７に記載の方法。
４９．ＩＬ１ＲＡＰ発現がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、低リスク又は高リスク）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ、全てのサブタイプを含む）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、肺がん、大腸直腸がん、又は膵がんである、実施形態４８に記載の方法。
５０．第２の治療剤を投与する工程を更に含む、実施形態４５に記載の方法。
５１．第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療である、実施形態５０に記載の方法。
５２．化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である、実施形態５１に記載の方法。
５３．第２の治療剤を、二重特異性抗体と同時に、連続的に、又は別個に、対象に投与する、実施形態５２に記載の方法。
５４．実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
５５．実施形態４２〜４５のいずれか１つに記載の細胞を培養することにより、実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法。
５６．実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの、ＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
５７．実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、それを使用するための指示書と、を含む、キット。
５８．対象における血管新生を阻害する方法であって、
それを必要とする対象に、実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与する工程を含む、方法。
５９．対象はがんを有する、実施形態５８に記載の方法。
６０．がんは、１つ又は２つ以上の固体腫瘍を呈する、実施形態５９に記載の方法。
５９．がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６０．がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんではない、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６１．対象におけるＭＤＳＣを枯渇させる方法であって、
それを必要とする対象に、実施形態１８〜４１のいずれか１つに記載のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与する工程を含む、方法。
６２．対象はがんを有する、実施形態５８に記載の方法。
６３．がんは、１つ又は２つ以上の固体腫瘍を呈する、実施形態５９に記載の方法。
６４．がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんである、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６５．がんはＩＬ１ＲＡＰ発現がんではない、実施形態５９又は６０に記載の方法。
【実施例】
【０２０５】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、それらを考慮して種々の改変又は変更が、当業者に明らかであろう。また、本明細書に記載された実施例及び実施形態は、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０２０６】
実施例１：材料
可溶性ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤタンパク質の生成
結合性及び親和性の測定に使用するために、ヒト（ｈ）ＩＬ１ＲＡＰアイソフォーム１（配列番号１）、ｈＩＬ１ＲＡＰアイソフォーム２（配列番号２及び３）、及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号４）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を発現させ、精製した。遺伝子合成手法を使用して、各タンパク質をコードするｃＤＮＡを調製し（米国特許第６，６７０，１２７号、同第６，５２１，４２７号）、標準的な分子生物学的手法を使用して発現用のプラスミドを調製した。更に、精製を容易にするために、各ＥＣＤタンパク質のＮ末端又はＣ末端に６ｘ−Ｈｉｓタグを付加した。Ｎ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを有する構築物にはまた、必要に応じてタグを除去するためのＨＲＶ３Ｃ開裂部位も含めた。全てのＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤタンパク質を、結合性及び親和性の測定並びにエピトープマッピングに使用した。
【０２０７】
加えて、ファージパニング及びスクリーニングで使用するために、組換えｈＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ−Ｈｉｓタグタンパク質（ロット番号ＭＢ０６ＮＯＯ７０４）、（配列番号５）もＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手した。このタンパク質に対しては、使用する前に内毒素の試験を行った。この材料をまた、結合性及び親和性の測定にも使用した。
【０２０８】
ＳｕｒｅＬｉｎｋビオチン化キット（ＫＰＬ  ＃８６−００−０１）を使用し、製造業者の指示書に従って、可溶性ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤタンパク質をビオチン化した。タンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにランして、単量体状態を確認した。
【０２０９】
ＩＬ１ＲＡＰ細胞株の生成
ヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ（配列番号６）、ｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ（配列番号７）、マウスＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ（配列番号８）、及びラットＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ（配列番号９）を提示するｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）ベクターのセットを、抗ＩＬ１ＲＡＰリードを評価するためのスクリーニングツールとして使用するために生成した。細胞表面上におけるタンパク質の提示を可能にする哺乳類の発現ベクターであるｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した（図１）。ｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）から発現されるタンパク質を、Ｎ末端において、マウスＩｇκ鎖リーダー配列（同リーダー配列は、タンパク質を分泌経路に向かわせる）、及びＣ末端において、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン（同ドメインは、タンパク質を細胞膜にアンカーし、そのタンパク質を細胞外側上に提示させる）に融合させる。ｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）から発現される組換えタンパク質は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、及び／又は免疫蛍光法による検出のためのヘマグルチニンＡ及びｍｙｃエピトープを含有する。ＣＭＶプロモータは、配列の発現を駆動させる。
【０２１０】
標準的な方法を使用して、ベクターを、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションされたＨＥＫ−２９３Ｆ付着細胞を安定したプラスミド組み込みのために選択培地内で培養し、ついで、単一細胞を選別又は単離し、ＢａｎｇｓＬａｂｓ  Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）抗マウスＩｇＧ（Ｃａｔａｌｏｇ  ＃８１５、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）又はＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＰＥ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃  ３４０４９５）を使用してＩＬ１ＲＡＰ表面受容体発現をＦＡＣＳにより定量した。各細胞株について、１０個の単一細胞クローンのセットを、スクリーニング用に選択し、ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤ発現について定量した。後続のヒットスクリーニングに使用される細胞株は、細胞１個あたりに約５００，０００個のＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤコピーの表面発現を有した。
【０２１１】
実施例２：ファージディスプレイ技術を用いたＩＬ１ＲＡＰ抗体の生成
Ｖｋ１−３９、３−１１、３−２０、及び４−１軽鎖ライブラリと対を成すＶＨ１−６９、３−２３、及び５−５１重鎖ライブラリからなる、新規なＨｕｍａｎ  Ｆａｂ−ｐＩＸライブラリ［Ｓｈｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０．３９７（２）：ｐ．３８５〜３９６．国際公開第２００９／０８５４６２号］の溶液パニングを、記載されたビオチン化抗原−ストレプトアビジン磁性ビーズ捕捉法（Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２〜１２００，２００８、Ｓｔｅｉｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１３５〜１４４，２００８）を使用して、４回のその後のラウンドで行った。
【０２１２】
ｐＩＸ遺伝子を、４回目のラウンドのパニング後に、ファージミドＤＮＡから切除して、可溶性ｈｉｓタグ付きＦａｂコード領域を生成した。ＦａｂをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ＩＬ１ＲＡＰへの結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。簡潔に、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＦｄ（結合部位＃ＰＣ０７５）で９６ウェルのＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  ＃４３７１１１）を４℃にて一晩かけてコーティングした。ディープウェル培養プレートにおいて、Ｆａｂ発現ベクターを含有する細菌コロニーを４５０μＬの２ｘＹＴ（カルベニシリン（Carbenecillin））中で濁る（ＯＤ６００≒０．６）まで増殖させた。Ｆａｂ発現を、濃度１ｍＭにＩＰＴＧの付加により誘引した。培養物を、３０℃で一晩増殖させ、ついで、遠心分離により分類した。抗ＦｄコートＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＴＢＳ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃７９０３９−１０ＰＡＫ）で１回洗浄し、ウェルあたりに２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％）＋脱脂粉乳（３％）で、室温において１時間ブロッキングした。この工程及び後続の全ての工程において、プレートを、ＴＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃７９０３９−１０ＰＡＫ）で３回洗浄した。各ウェルに、５０μＬのＦａｂ上清を入れ、続けて、室温において１時間インキュベートした。洗浄後、５０ｕＬのビオチン化ＩＬ１ＲＡＰを加え、室温において１時間インキュベートした。洗浄後、５０μＬのストレプトアビジン：ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１１３０）を１：５０００希釈で加え、プレートを室温において１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０ｕＬの化学発光基質ＰｏＤ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１２１−５８２９５００００１）を、製造業者の指示書に従って加えた。ついで、プレートを、発光について、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーにおいて読み取った。バックグラウンドを５倍超上回るシグナルを示すウェルを、ヒットと考えた。
【０２１３】
ＩＬ１ＲＡＰへの結合性を示した抗体を、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域において配列決定した。合計５２個の固有のＦａｂ配列を、ファージパニングにより特定し、４５個を、インフュージョンクローニングにより、ＩｇＧ１アイソタイプに最終的に変換した（表１）。ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃  １０７９０−０２０）を使用して、ＨＣ及びＬＣ可変領域をＰＣＲ増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃  ６３８９０９）を使用して、ＨＣについてｖＤＲ１４９及びＬＣについてｖＤＲ１５７中のＥｓｐ３Ｉ部位にクローニングすることにより、インフュージョンクローニングを行った。
【０２１４】
実施例３：ヒトＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体発現ハイブリドーマの分離
ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ラット系（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）；ＯＭＴ，Ｉｎｃ．）を使用して、ヒトＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体発現ハイブリドーマ細胞を作製した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ座（ラットＣＨ座に連結された天然構成の２２のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を完全なヒトＩｇＬ座（Ｊκ−Ｃκに連結された１２のＶκ及びＪλ−Ｃλに連結された１６のＶλ）と共に含有する。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（４）：１４８１〜１４９０を参照されたい）。したがって、このラットは、ラットＩｇＭ又はκの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生成する。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこうしたラットにより行われるゲノム修正は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらに対する国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
【０２１５】
組換えヒトＩＬ１ＲＡＰ（ｒｈＩＬ１ＲＡＰ）で免疫化されると、この遺伝子導入ラットは、ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的なヒトＩｇＧ抗体を生成する。
【０２１６】
下記のように、２つの免疫化スキームを実行した。第１のスキームでは、４匹のラットをｒｈｕＩＬ１ＲＡＰで免疫化した。３５日間の免疫レジメン後、ラット１０３４４の脾臓及びリンパ節を摘出し、これらを使用してハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマ上清の７６枚の９６ウェルプレートを結合ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、その中から７６のハイブリドーマ上清を選択した。同様に、第２のスキームでは、４匹のラットをｒｈｕＩＬ１ＲＡＰで免疫化した。７７日間の免疫レジメン後、ラット１０４２８、１０４２４、及び１０６００のリンパ節を摘出し、これらのリンパ節を使用してハイブリドーマを生成した。ｒｈｕＩＬ１ＲＡＰへの結合を示したｍＡｂを特定するために、ハイブリドーマ上清の２４枚の９６ウェルプレートをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。更なる確認スクリーニングを行った後、ｒｈｕＩＬ１ＲＡＰ及びｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰ（ｒｃｙｎｏＩＬ１ＲＡＰ）への特異的な結合を示した、両スクリーンからのハイブリドーマ上清を配列決定し、クローンし、小規模に発現させた。
【０２１７】
実施例４：ＩＬ１ＲＡＰへのＭＳＤ細胞結合
ＭＳＤ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）細胞結合アッセイを使用して、操作されたｐＤｉｓｐｌａｙ細胞（ＩＬ１ＲＡＰ発現ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞）に対するＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合性を評価した。スクリーニングアッセイの目的は、ｈＩＬ１ＲＡＰを発現している細胞に結合した抗体を特定すること、並びにｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰを発現している細胞との交差反応性を特定することとした。
【０２１８】
細胞を固定し、ＩＬ１ＲＡＰ抗体サンプルを、トリプリケートでアッセイした。簡潔に、精製ＩＬ１ＲＡＰ抗体の発現上清を１０μｇ／ｍＬに正規化した。ウェルあたりに５０００個の細胞を、３８４ウェルプレート（ＭＡ６０００，ｃａｔ．Ｌ２１ＸＢ，ＭＳＤ）に播種し、２時間付着させた。ついで、細胞を、ＰＢＳ中の２０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で、１５分間ブロッキングした。ついで、抗体上清を加え、ＲＴで１時間放置した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ついで、ルテニウム標識化二次抗体（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、２μｇ／ｍＬで加え、室温において１時間インキュベートした。ついで、更なる洗浄工程を適用し、ついで、ウェルあたり３５μＬの（界面活性剤を含まない）２Ｘ  ＭＳＤリードバッファＴを加え、検出のために、５〜３０分間インキュベートした。ついで、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００（ＭＳＤ）を使用して、プレートを読み取った。データを、コントロールに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５を使用してグラフ化した。陽性のバインダーを、親細胞株バックグラウンドより３倍高いシグナルを有するヒットであると決定した。アッセイを、データ整合性のために繰返し、トップバインダーを、更なる開発のために選択した。
【０２１９】
実施例５：ＳＰＲによる親和性測定
ＰｒｏｔｅＯｎ親和性測定
組換えヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに対する５２個［ファージパニングからの３８個のｍＡｂ、ハイブリドーマセット１からの１１個のｍＡｂ、及び易修飾性配列（sequence liabilities）を除去するように生成された３個の突然変異体（ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、及びＩＡＰＢ６５）］の抗ＩＬ１ＲＡＰ候補の親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。
【０２２０】
ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤの会合及び解離の速度を各変異体について測定した。アミンカップリング化学についての製造業者の指示書を使用して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）の表面に共有結合させることにより、バイオセンサ表面を調製した。約８８００ＲＵ（応答単位）のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ  ＃１０９−００５−０９８）を固定した。固定されたＲＵはまた、他の抗体を捕捉するのに加えられたヤギ抗マウスＦｃ抗体も含んだが、ここで報告したものに含めなかった。１：１で混合したため、これらの固定されたＲＵの約５０％は、ヤギ抗ヒトＦｃであると予測される。動力学実験を、ランニングバッファ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｐ２０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において２５℃で行った。４倍（１：３）系列希釈のヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤを、４００ｎＭで開始して、ランニングバッファにおいて調製した。平均３００ＲＵのｍＡｂ（１７４〜６００）を、センサチップの各チャネルにおいて捕捉した。捕捉された候補を含有していない参照スポット（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−修飾表面）を、参照表面として使用した。ｍＡｂの捕捉後、抗原を４０μＬ／分で３分間注入し（会合相）、続いて、１０分間のバッファフローを行った（解離相）。チップ表面を、１００μＬ／分での、０．８５％リン酸の注入により再生した。機器のソフトウェアにおいてデータを処理した。分析物の注入についてのレファレンスを引いた曲線からバッファ注入によって作成した曲線を減じることによって、レファレンスデータのダブルレファレンスサブトラクションを実施した。グループフィットを有する１：１ラングミュア結合モデルを使用して、データの動力学分析を行った。各ｍＡｂについての結果を、Ｋａ（ｋｏｎ又はｏｎ速度）、Ｋｄ（ｋｏｆｆ又はｏｆｆ速度）、ＫＤ（平衡解離定数）の形式で報告した（表３）。
【０２２１】
ファージヒットの結果を表４に示す。３８個のｍＡｂは全て、ヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに、１．１９〜３０．４ｎＭの範囲の親和性で結合した（表３）。１０個のｍＡｂ（アスタリスクで示されている）は１：１結合モデルに対して精度の低い近似を有することが観察された。そのＣｈｉ２値は２０％  Ｒｍａｘを超えている。結果は、良好な再現性を示唆している（陽性コントロール抗体ＭＡＢ６７６、ｎ＝４に基づく）。陰性コントロール（ＭＡＢ００２、ＣＮＴＯ９４１２、及びＭｏｃｋ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に対しては、試験した最高濃度である４００ｎＭまでにおいて結合は観察されなかった。これは、ヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに結合する抗体が特異的であることを示唆している。
【０２２２】
【表３】
2018534933.tif 000005
【０２２３】
ハイブリドーマヒットの結果を表４に示す。結果は、１１個の抗体のうちの５個が０．１６〜４９．９ｎＭの範囲の親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに結合したことを示した（表４）。陽性コントロール（ＭＡＢ６７６）は２度実行され、良好な再現性を示した。予想どおり、陰性コントロール（ＭＡＢ００２及びＣＮＴＯ７９６７）は、最高試験濃度の４００ｎＭまでにおいて結合を示さなかった。
【０２２４】
【表４】
2018534933.tif 000006
【０２２５】
表５には、３個の突然変異体抗体に対するデータを示した。これらの突然変異体抗体は、易修飾性配列を除去するように生成した。これらの突然変異体を評価し、その親抗体と比較した。結果は、変異体ＩＡＰＢ６３（ＬＣ突然変異体Ｃ９１Ａを有するＩＡＰＢ５４）のみが、親との差が２倍未満の結合親和性を維持したことを示唆している。注意点として、精製済み及び未精製の親ＩＡＰＢ４（ファージヒットＢ４）の親和性は、互いの２倍以内であった（表５：４．７３ｎＭ対表３：５．６６ｎＭ）。対照的に、親抗体ＩＡＰＢ５４（ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡを有する１７Ｂ０４、表５）は、１７Ｂ０４（ラットＩｇＧ１を有するハイブリドーマヒット、表４）よりもはるかに厳しい結合性を示した。この差は、種及びアイソタイプに起因するものと考えられる。
【０２２６】
【表５】
2018534933.tif 000007
【０２２７】
実施例６：中和アッセイ
ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞（ｃａｔ＃  ｈｋｂ−ｉｌｂ）を使用して、ＩＬ１ＲＡＰ抗体のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性について評価した。製造業者によると：「ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞では、ＮＦ−κＢ経路及びＡＰ−１経路の活性化をモニタすることによって生理活性ＩＬ−１βを検出できる。」「それらは、ＴＮＦ−α応答がブロッキングされているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β細胞に由来する。したがって、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞は、ＩＬ−１βに特異的に応答する。それらは、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１誘引性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を発現する。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞の表面上でＩＬ−１βがその受容体ＩＬ−１Ｒに結合すると、シグナル伝達カスケードがトリガーされ、活性化ＮＦ−κＢ及びその後のＳＥＡＰの生成がもたらされる。」全ての抗体上清を、単独、又は１ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１βの存在下のいずれかで、最終濃度１０μｇ／ｍＬにてスクリーニングした。
【０２２８】
ファージヒットの評価の結果を図２に示す。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢレポーター細胞株中のアゴニスト活性（ＩＬ−１βなし）又はアンタゴニスト活性（ＩＬ−１βの存在下）について、ファージ上清を分析した。分析した上清の中で、アゴニスト活性を表示したものはなかった。しかしながら、ＩＡＰＢ５４及びＩＡＰＢ５７（ハイブリドーマ上清）は、組換えヒトＩＬ−１βの存在下でアンタゴニスト活性を表示した。
【０２２９】
実施例７：ヒット評価及び選択
カニクイザルと交差反応性であることが見出され、かつ、Ｐｒｏｔｅｏｎ評価によって測定できるほどの親和性を有した、全てのファージヒット及びハイブリドーマヒットを比較対照した。このリストから、それぞれの特性、及び霊長類のみと交差反応性があり、マウスともラットとも交差反応性がないことに基づいて、６つの候補を選択した（表６中に灰色で強調されている）。また、アンタゴニスト活性を示した２つのハイブリドーマヒットも含めた（表６中に灰色で強調されている）。ＩＡＰＢ４及びＩＡＰＢ５４は、易修飾性配列が原因で選択しなかった。しかしながら、更なる分析のために、これらの親の突然変異体を作製した。突然変異体ＩＡＰＢ６３及びＩＡＰＢ６４はＩＡＰＢ５４の突然変異体であり、ＩＡＰＢ６５はＩＡＰＢ４の突然変異体である。加えて、追加の生物学的な疑問を調査するためにサロゲート分子を持つことの潜在的な欲求があった。したがって、試験用に追加の４つの霊長類／マウス交差反応性抗体も選択した（表６中に灰色で強調されている）。
【０２３０】
【表６】
2018534933.tif 000008
＊汚染された上清、ＮＤ＝決定されず、ＮＡ＝分析せず。
ａ、ｂ、ｃこれらのハイブリドーマは同じ抗体を含有していた。ｄＮＡ＝分析せず、ＮＤ＝決定されず。
ｄこの親の突然変異体を二重特異性フォーマットで分析した（ＩＡＰＢ６５）。
ｅこの親の突然変異体を二重特異性フォーマットで分析した（ＩＡＰＢ６３、及びＩＡＰＢ６４）。
【０２３１】
このため、全体で１５個のＩＬ１ＲＡＰ親（ハイブリドーマスクリーニングからの５個のヒット及びファージパニングからの８個のヒット）及び３個の突然変異体（ＩＡＰＢ６３、ＩＡＰＢ６４、ＩＡＰＢ６５）（全て表７に示されている）のパネルを発現させ、小規模のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性パネルを作製するために精製した。
【０２３２】
【表７】
2018534933.tif 000009
【０２３３】
１５個のＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬを以下の表８に示す。
【０２３４】
【表８−１】
2018534933.tif 000010
【０２３５】
【表８−２】
2018534933.tif 000011
【０２３６】
【表８−３】
2018534933.tif 000012
【０２３７】
【表８−４】
2018534933.tif 000013
【０２３８】
【表８−５】
2018534933.tif 000014
【０２３９】
実施例８：抗ＩＬ１ＲＡＰ  Ｆａｂの結晶構造
抗体／抗原相互作用の特性を原子的に詳細に明らかにし、抗体の作用メカニズムの理解を深め、必要な抗体遺伝子操作の取り組みを支援するために、１つの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＩＡＰＢ５７）の結晶構造を自由ｆａｂ形態で、更にヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに結合したときに、決定した。
【０２４０】
材料
Ｈｉｓタグを付けたＩＡＰＢ５７  ＦａｂをＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。このＦａｂを５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４中に入れた。
【０２４１】
Ｃ末端のＨｉｓタグを有するヒトＩＬ１ＲＡＰ細胞外領域（成熟アイソフォーム１、２、及び４の１〜３４８個の残基、以下単にＩＬ１ＲＡＰとする）を、バキュロウイルス系を使用して発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。このタンパク質を５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中に入れた。
【０２４２】
結晶化
ＩＬ１ＲＡＰ／ＩＡＰＢ５７  Ｆａｂ複合体
２０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６にバッファ交換しながら、ＩＬ１ＲＡＰとＩＡＰＢ５７  Ｆａｂをモル比１．２：１（過剰ＩＬ１ＲＡＰ）で４℃にて２３時間混合することにより、Ｆａｂ／抗原複合体を調製した。ついで、この複合体を、２０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６中の勾配１６〜１９ｍＭ  ＮａＣｌのｍｏｎｏＳ  ５／５０カラムから溶出させ、２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ線回折に適した結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で用いて３．５Ｍギ酸ナトリウム、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５から得た。
【０２４３】
ＩＡＰＢ５７  Ｆａｂ
ＩＡＰＢ５７  Ｆａｂを更なる精製はせずに１４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ線回折に適した結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で用いて、２５％  ＰＥＧ  ３ｋＤａ、０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍ  Ｍｅｓ  ｐＨ６．５から得た。
【０２４４】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集のため、結晶を、２０％グリセロールを添加した対応する母液を含むクライオプロテクタント溶液中に数秒間浸漬した後、液体窒素中で瞬間凍結した。アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のビームライン２２−ＩＤにおいてＲａｙｏｎｉｘ  ３００ＨＳ  ＣＣＤ検出器によって、Ｘ線回析データを収集した。回折データをプログラムＨＫＬで処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．＆Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．（１９９７）．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７６：３０７〜３２６．）。
【０２４５】
構造を、Ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換法（ＭＲ）により解析した（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．（２００１）．Ｐｕｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５７：１３７３〜８２）。自由Ｆａｂ構造の場合は、ＭＲの探索モデルをＩＭＣ−１１Ｆ８  Ｆａｂ（ＰＤＢコード：３Ｂ２Ｕ）にした。ＩＬ１ＲＡＰ／Ｆａｂ複合体の場合は、ＭＲの探索モデルをＩＬ１ＲＡＰ（ＰＤＢコード：４ＤＥＰ）及びＩＡＰＢ５７自由Ｆａｂ構造の結晶構造にした。構造をＰＨＥＮＩＸで精製し（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｏｐａｌ，Ｋ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｉｏｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｎ．Ｗ．，Ｐａｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｏｍｏ，Ｔ．Ｄ．，Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｎ．Ｋ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．＆  Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．（２００４）．Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＨＥＮＩＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ  １１：５３〜５．）、ＣＯＯＴを使用してモデル調整を行った（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ．＆  Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ｃｏｏｔ：Ｍｏｄｅｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２）。他の全ての結晶学的計算をＣＣＰ４プログラムスイートで行った（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，１９９４）。全ての分子グラフィックをＰｙＭｏｌで生成した（ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．（２００２）．Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｄｅｌａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２４６】
ＩＡＰＢ５７自由Ｆａｂ構造と複合体の両方についてデータ統計を表９に示す。
【０２４７】
【表９】
2018534933.tif 000015
【０２４８】
エピトープ、パラトープ、及び相互作用
ＩＡＰＢ５７は、図３及び図４に示されているようにＩＬ１ＲＡＰのＤ２（残基Ｉ１３１、Ｅ１３２、及びＬ１８３〜Ｓ１８５）及びＤ３（残基Ｎ２１９、Ｖ２２４、Ｈ２２６、Ｙ２４９、Ｓ２８３〜Ｒ２８６、及びＤ２８９〜Ｔ２９１）免疫グロブリン様ドメイン内の残基で構成された立体構造エピトープを認識する。ＩＡＰＢ５７エピトープは、ＩＬ１ＲＡＰ上に約７８０Å２の領域を構成する。抗体接触の大半は、ＩＬ１ＲＡＰのＤ３ドメインとによるものである。しかしながら、複数の水素結合相互作用にＤ２が含まれており（図３）、これにより、ＩＬ１ＲＡＰのＩＡＰＢ５７親和性が強化される。アルギニン２８６は、重要なエピトープ残基であり、ＩＡＰＢ５７の軽鎖及び重鎖の残基Ｖ９１Ｌ、Ｎ９２Ｌ、Ｙ９４Ｌ、Ｌ９６Ｌ、Ｅ１００Ｈ、及びＹ１０７Ｈを結ぶ線で囲まれたポケットに挿入される。他の優勢なエピトープ残基はＹ２４９及びＨ２８４であり、これらは、ＩＬ１ＲＡＰ  βシートの両端に位置し、重鎖ＣＤＲとの広範囲のファンデルワールス相互作用及び水素結合相互作用を有する。
【０２４９】
ＩＡＰＢ５７パラトープは、ＣＤＲ−Ｌ１及び−Ｌ２を除く全てのＣＤＲからの残基で構成されている（図３及び図４）。重鎖は、軽鎖よりも５倍多くＩＬ１ＲＡＰとの接触を有する。重鎖ＣＤＲは、Ｄ２残基と相互作用するＣＤＲ−Ｈ２  βストランド（Ｓ５８〜Ｄ６０残基）でＩＬ１ＲＡＰの凸面上にパックされるが、ＣＤＲ−Ｈ２ループ領域（Ｙ５４〜Ｔ５６残基）はＤ３に結合する。ＣＤＲ−Ｈ３はＤ３ドメイン（Ｓ２８３〜Ｒ２８６残基の範囲）のみに結合するが、ＣＤＲ−Ｈ１及び−Ｌ３はＤ２とＤ３の両方に結合する。
【０２５０】
ＩＬ１ＲＡＰ遺伝子の選択的スプライシングは、膜結合型アイソフォーム１及び４並びに可溶性アイソフォーム２及び３をコードする転写変異体をもたらす。膜結合型アイソフォーム１及び４の細胞外領域は、分泌型アイソフォーム２及び３とは配列が異なっている（図３）。細胞外の相違部分は、Ｄ３ドメイン、及び膜貫通ドメインへのリンカー領域内に位置する。６個のＩＡＰＢ５７エピトープ残基（Ｈ２８４、Ｓ２８５、Ｒ２８６、Ｄ２８９、Ｅ２９０、及びＴ２９１）は、アイソフォーム３固有領域内に位置する。したがって、ＩＡＰＢ５７は、アイソフォーム１、２、４には同程度の親和性で結合し、アイソフォーム３には、抗体とアイソフォーム３との間の水素結合相互作用の損失に起因して、より低い親和性で結合することが予測される。具体的には、ＩＡＰＢ５７／アイソフォーム３複合体において、Ｒ２８６−Ｙ９４Ｌ、Ｒ２８６−Ｖ９１Ｌ、Ｄ２８９−Ｙ５４Ｈ、及びＴ２９１−Ｔ３３Ｈ水素結合は破壊されると考えられる。
【０２５１】
実施例９：ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａにおける二重特異性フォーマットのＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３抗体の調製
１５個の単特異性ＩＬ１ＲＡＰ抗体（表６を参照されたい）を、Ｆｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ（ＣＤ３アーム）（ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を有するＩｇＧ４として発現させた。配列番号９２のＶＨ及び配列番号９３のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ２２０も生成した。
【０２５２】
プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法を使用して、単特異性抗体を精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２内へ透析した。
【０２５３】
二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体を、（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載されたような）インビトロでのＦａｂアーム交換において、単特異性ＣＤ３  ｍＡｂと単特異性ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂとを組み合わせることにより生成した。簡潔に、ＰＢＳ、ｐＨ７〜７．４中の約１〜２０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ１ＲＡＰ／抗ＣＤ３抗体（モル比１．０８：１）と、７５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）とを互いに混合し、２５〜３７℃において２〜６時間インキュベートし、続けて、透析、透析ろ過、接線流ろ過、及び／又はスピン細胞ろ過により標準的な方法を使用して２−ＭＥＡを除去した。
【０２５４】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂについての重鎖及び軽鎖を以下の表１０に示す。
【０２５５】
【表１０−１】
2018534933.tif 000016
【０２５６】
【表１０−２】
2018534933.tif 000017
【０２５７】
【表１０−３】
2018534933.tif 000018
【０２５８】
【表１０−４】
2018534933.tif 000019
【０２５９】
【表１０−５】
2018534933.tif 000020
【０２６０】
【表１０−６】
2018534933.tif 000021
【０２６１】
【表１０−７】
2018534933.tif 000022
【０２６２】
【表１０−８】
2018534933.tif 000023
【０２６３】
実施例１０．ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体に対する抗ＩＬ１ＲＡＰ親和性決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト及びｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰに対して１５個のＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂの親和性値を測定した。実施例５に記載したものと同様のプロトコルに従った。結果は、これらのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂが、ヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに対しては３４ｐＭ〜２９．７ｎＭの結合親和性を有し（表１１）、ｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤに対しては８６ｐＭ〜２７．８ｎＭの結合親和性を有する（表１２）ことを示した。しかしながら、１個の分子ＩＣ３Ｂ３は、ヒトＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤとｃｙｎｏ  ＩＬ１ＲＡＰ  ＥＣＤの両方に対して弱い結合を示した。ヒトとｃｙｎｏの親和性を良好な全てのバインダーについて比較すると、両者は互いから５倍の範囲内で結合することが示された（表１３）。
【０２６４】
【表１１】
2018534933.tif 000024
【０２６５】
【表１２】
2018534933.tif 000025
【０２６６】
【表１３】
2018534933.tif 000026
【０２６７】
実施例１１：競合ビニングアッセイ：
このアッセイは、１５個の生成されたＩＬ１ＲＡＰｘＣＤ３二重特異性Ａｂからなるパネルの個々の抗体をそのパネルの残りの抗体との捕捉試薬及び検出試薬として評価することを可能とするものである。互いに有効な捕捉／検出試薬を形成する抗体は、理論上はモノマータンパク質上の空間的に離れたエピトープを認識することで、両方の抗体が標的タンパク質に同時に結合することを可能とする。パネル全体にわたって類似の活性パターンを呈する抗体の群は、類似のエピトープに結合すると仮定される。したがって、異なる群からクローンを選択することによって、異なるエピトープを認識する抗体が与えられるはずである。
【０２６８】
二重特異性ＡｂをＧＬＣセンサ（ＢｉｏＲａｄ）上に直接固定化した。競合するサンプル（３００ｎＭ）を、３０ｎＭのｈＩＬ１ＲＡＰ−ＥＣＤと４時間、予めインキュベートした後、チップ表面全体に５分間注入して会合させた。ついで、解離を５分間モニタした。ほとんどの分子はビン１及び２に分類され、群のメンバー同士は互いと競合しなかった（表１４を参照されたい）。これは、それらの結合エピトープに重なり合う部分がなかったことを示している。ビン３は２つのメンバーを有するが、ビン４〜７はそれぞれ１つのメンバーを有する。ベン図は、エピトープ群の競合プロファイルの概要を示している（図５）。エピトープ群が交差すると、抗体は競合する。そうでなければ、それらはヒトＩＬ１ＲＡＰに対して競合しない。ここで導かれた結論は、主としてセンサ上の集合１（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２、Ｂ１３）との競合から得られたものであり、それらの強い結合親和性により明瞭な結果が得られたことに注意されたい。センサ上の集合２（Ｂ２、Ｂ４、Ｂ８、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１５）からの競合は、それらの弱い結合親和性のため、はるかに弱いものであった。ビン７はこの集合に由来する。
【０２６９】
【表１４】
2018534933.tif 000027
【０２７０】
実施例１２：機能性細胞殺傷アッセイにおける二重特異性抗体の評価
Ｔ細胞媒介性細胞毒性アッセイは、健康なドナーからのＴ細胞を使用して、細胞溶解についてＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂを評価するための機能性アッセイである。
【０２７１】
Ｌａｓｚｌｏ，ｅｔ  ａｌのプロトコルに従った（Ｌａｓｚｌｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ  ２０１４  ＢＬＯＯＤ  １２３：４，５５４〜５６１）。簡潔に、エフェクター細胞を収集し、カウントし、洗浄し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）細胞培地中において、１×１０６個／ｍＬに再懸濁させた。標的細胞（ＭＶ４−１１、ＳＫＮＯ−１、及びＯＣＩ−ＡＭＬ５）を、ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｃ３４５５４）で標識し、１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１００８２−１４７）を含むＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃６１８７０−０３６）中において、２×１０５個／ｍＬに再懸濁させた。エフェクター及びＣＦＳＥ標識化標的細胞を、無菌の９６ウェル丸底プレート中において、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比＝５：１で混合した。種々の濃度を含有する各二重特異性抗体の５μＬアリコートを各ウェルに加えた。培養物を、３７℃において、５％  ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ＃Ｌ１０１１９）を、サンプルに加えた。培養物を、暗所でＲＴにおいて、２０分間インキュベートし、洗浄し、１７０μＬ  ＦＡＣｓバッファ中に再懸濁させた。ＣＡＮＴＯＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、薬剤誘引細胞傷害を決定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア又はＤｉｖｅソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。対象となる集団は、二重陽性ＣＦＳＥ＋／ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋細胞である。
【０２７２】
３７℃、５％  ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後のＡＭＬ細胞株（ＭＶ４−１１、図６）のうちの１つのＴ細胞媒介性細胞溶解の結果を示す。
【０２７３】
ＩＡＰＢ６１及びＩＡＰＢ２５を除く、全てのＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗ＣＤ３抗体と結合されて二重特異性フォーマットになると、３人の異なるＴ細胞ドナーにおいてＩＬ１ＲＡＰ＋  ＭＶ４−１１細胞の、Ｔ細胞にリダイレクトされた細胞毒性を４８時間の時点で引き出す。表１４は、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３多重特異性抗体で生成されたＥＣ５０値をまとめたものである。
【０２７４】
実施例１３：ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂの生化学的特性のまとめ
細胞毒性アッセイ及び生化学的アッセイからの結果を比較対照した（表１５）。計４つの二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ１、ＩＣ３Ｂ１３、ＩＣ３Ｂ３、及びＩＣ３Ｂ１２が、ヒト／ｃｙｎｏのみのバインダーを含めて望ましい特性を有した。選択は３つの異なるエピトープビンにわたっており、ＩＣ３Ｂ１以外の全てがサブｎＭ範囲内のＩＬ１ＲＡＰ親和性を有した。加えて、４つの二重特異性Ａｂのうちの２つは、中和機能を抗体フォーマットで示した。
【０２７５】
【表１５】
2018534933.tif 000028
ａＩＰＡＢ５４親と同じ機能活性を有すると推定される。
ｂ値は２つの測定値の平均である。
【０２７６】
このため、Ｆｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を有するＩｇＧ４として発現させられたこれらのＩＡＰＢ４７、ＩＡＰＢ５５、ＩＡＰＢ６３及びＩＡＰ５７は、配列番号９４のＶＨ及び配列番号９５のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を有するＩｇＧ４定常領域と、を含む抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ２１９と対を成した。
【０２７７】
実施例９と同様に、二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体を、（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載されたような）インビトロでのＦａｂアーム交換において、ＣＤ３Ｂ２１９  ｍＡｂと単特異性ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂとを組み合わせることにより生成した。
【０２７８】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂについての重鎖及び軽鎖を以下の表１６に示す。
【０２７９】
【表１６−１】
2018534933.tif 000029
【０２８０】
【表１６−２】
2018534933.tif 000030
【０２８１】
実施例１４：ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９によるＩＬ１シグナル伝達
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体を任意のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性について評価した。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞を、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−１βの不在下又はその０．１ｎｇ／ｍＬの存在下のいずれかにおいて、濃度１００μｇ／ｍＬ（１０倍希釈）で抗体と共にインキュベートした。「ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞では、ＮＦ−κＢ経路及びＡＰ−１経路の活性化をモニタすることによって生理活性ＩＬ−１βを検出できる。それらは、ＴＮＦ−α応答がブロッキングされているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β細胞に由来する。したがって、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞は、ＩＬ−１βに特異的に応答する。それらは、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１誘引性の分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞の表面上でＩＬ−１βがその受容体ＩＬ−１Ｒに結合すると、シグナル伝達カスケードがトリガーされ、活性化ＮＦ−κＢ及びその後のＳＥＡＰの生成がもたらされる。」
【０２８２】
１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１βの存在下において、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９、並びにそれらの対応のＩＬ１ＲＡＰ  ｎｕｌｌアームコントロールＩＡＰＢ１００（ＩＡＰＢ６３×Ｂ２３Ｂ４９）及びＩＡＰＢ１０１（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９）は、ＮＦ−κＢレポーター活性を２４時間の時点で阻害した。ＣＤ３  ｎｕｌｌアームコントロールＣＮＴＯ  ７００８（Ｂ２３Ｂ３９×ＣＤ３Ｂ２１９）は、試験したいずれの濃度においてもアンタゴニスト活性を有しなかった（図７Ａ）。ＩＣ３Ｂ１８、ＩＣ３Ｂ１９、対応のＩＬ１ＲＡＰ  ｎｕｌｌアームコントロールＩＡＰＢ１００及びＩＡＰＢ１０１、並びにＣＤ３  ｎｕｌｌアームコントロールＣＮＴＯ  ７００８は、ｒｈＩＬ−１βの不在下で試験したときに、ほとんど又は全くアゴニスト活性を有しなかった（図７Ｂ）。加えて、ＩＣ３Ｂ１６及びｎｕｌｌアームコントロールＩＡＰＢ９９は、試験したいずれの濃度においてもアンタゴニスト活性を有しなかった。
【０２８３】
実施例１５：機能性細胞毒性アッセイにおけるＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の評価
ＩＬ１ＲＡＰ陽性発現ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ−１３、ＭＶ４−１１、ＳＫＮＯ−１及びＯＣＩ−ＡＭＬ−５）及びＩＬ１ＲＡＰ陰性／低発現びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株（ＳＵ−ＤＨＬ−１０）を使用して、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９によるＴ細胞媒介性細胞毒性を評価した。実施例１２に前述したプロトコルに従った。
【０２８４】
汎Ｔ細胞ドナーＭ７２８７は、評価した５人の汎Ｔ細胞ドナーのうちの１人として表されている（図８及び図９）。ＩＣ３Ｂ１８とＩＣ３Ｂ１９はいずれもＩＬ１ＲＡＰ＋  ＡＭＬ細胞株Ｍｏｌｍ−１３、ＭＶ４−１１、ＳＫＮＯ−１、ＯＣＩ−ＡＭＬ５のＴ細胞媒介性細胞毒性を誘引するが、ＩＬ１ＲＡＰ陰性／低発現Ｂ細胞リンパ腫株ＳＵ−ＤＨＬ−１０においては誘引しない。コントロール抗体（ＣＮＴＯ  ７００８、ＩＡＰＢ１００、及びＩＡＰＢ１０１）は、全体的なＴ細胞媒介性腫瘍細胞毒性を有しなかった。
【０２８５】
実施例１６：ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９によるエクスビボ細胞毒性
エクスビボ自家単球細胞毒性アッセイ
前には、ＩＬ１ＲＡＰの発現を細胞の表面上に有する正常ヒト単球（ＣＤ１４＋）を示した（Ｊａｒａｓａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ．１０７：１６２８０〜１６２８５）。ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の細胞毒性潜在性を評価するために、単離された自家（同一ドナー）ＣＤ３＋  Ｔ細胞及びＣＤ１４＋単球を５：１のエフェクター（Ｔ細胞）：標的（単球）比で、加えて分子の潜在的な非特異的Ｆｃ結合を低減するためにＦｃ遮断薬も使用して、エクスビボ細胞毒性アッセイを行った。図１０のデータは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９は４８時間後にＩＬ１ＲＡＰ＋単球を特異的に殺傷するが（％  ＣＤ１４＋細胞毒性として示されている）、ｎｕｌｌアームコントロールは細胞毒性をほとんど又は全く有しなかったことを示している。データは、４人の個々の正常ヒト血液ドナーで行われた２つの実験の代表である。
【０２８６】
エクスビボ全血ＳＫＮＯ−１細胞毒性アッセイ
生理学的レベルの可溶性ＩＬ１ＲＡＰの存在下でＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の細胞毒性潜在性を更に評価するために、外因的に加えられたＩＬ１ＲＡＰ＋  ＡＭＬ細胞株ＳＫＮＯ−１と共に健常ヒト全血を使用するエクスビボ細胞毒性アッセイを利用した。図１１のデータは、ＩＣ３Ｂ１８とＩＣ３Ｂ１９のいずれも、２４時間及び４８時間の時点でＳＫＮＯ−１細胞の細胞毒性を特異的に誘引することを示している。加えて、細胞毒性は、２４時間から４８時間までＥＣ５０（ｎＭ）値と同様に増加した。陰性二重特異性抗体コントロールとしてｎｕｌｌアームコントロールＣＮＴＯ  ７００８（ｎｕｌｌ×ＣＤ３）を使用した。ｎｕｌｌアームコントロールは、ＳＫＮＯ−１細胞の細胞毒性活性をほとんど又は全く示さなかった。計７人の異なる健常ヒトドナーによる２つの別個の実験をこれらの分子に対して実行した。図１１のデータは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９が、インビトロで４８時間後にＩＬ１ＲＡＰ＋細胞株を特異的に殺傷することを示している（細胞毒性の％として示されており、データは、異なるＴ細胞ドナーで行われた５つの実験の代表である）。それぞれの細胞株及びドナーに対するＥＣ５０値を表１７に示す。
【０２８７】
【表１７】
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【０２８８】
ＡＭＬ初代サンプルにおけるエクスビボでのＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９媒介性の芽球減少及びＴ細胞活性化
ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の細胞毒性潜在性を評価するために、ＡＭＬドナー全血を使用してエクスビボ細胞毒性アッセイを行った（図１２）。このアッセイはドナーの血液中の自家Ｔ細胞の存在に依存するので、このアッセイでは、ＡＭＬドナーからの希釈された全血に２４時間の期間にわたって追加のＴ細胞を供給せずに種々の二重特異性抗体を加えた。二重特異性抗体の存在下でのフラクション中のＩＬ１ＲＡＰ＋細胞を定量し、それを％細胞毒性として表すことにより、細胞毒性の程度を決定した。ＣＤ６９の発現により、Ｔ細胞活性化を評価した（図示あり）。
【０２８９】
図１２に示されるように、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９は、２４時間後に、Ｔ細胞活性化と相関した、投与量に依存した総細胞毒性の減少を促進した。Ｎｕｌｌアームコントロール抗体は、腫瘍細胞毒性又はＴ細胞活性化を示さなかった。この結果はまた、ＩＣ３Ｂ１８抗体とＩＣ３Ｂ１９抗体のいずれも自家設定において機能することを示している。この実験はまた、別のＡＭＬドナーサンプルでも行った。ＩＣ３Ｂ１９抗体及びｎｕｌｌアームコントロール抗体のみを２４時間と４８時間の両方のＩＬ１ＲＡＰ＋細胞毒性について分析し、結果は〜４０％最大細胞毒性を示し、２４時間及び４８時間の時点においてＣＤ２５及びＣＤ６９の発現上昇をもたらした（データは図示せず）。
【０２９０】
エクスビボでの全血ＯＣＩ−ＡＭＬ５の細胞毒性
ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞株も同じエクスビボ全血アッセイで試験した。図１３は、ＩＣ３Ｂ１９が、インビトロで４８時間後にＩＬ１ＲＡＰ＋  ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を特異的に殺傷することを示している（細胞毒性の％として示されており、データは、異なるＴ細胞ドナーで行われた５つの実験の代表である）。細胞毒性（図１３Ａ）の平均ＥＣ５０値は３．１３２ｎＭであり、活性化（図１３Ｂ）のは５．９９３ｎＭであった。ＮｕｌｌアームコントロールＣＮＴＯ  ７００８（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）及びＩＡＰＢ１０１（ＩＬ１ＲＡＰ×Ｎｕｌｌ）を陰性コントロール抗体として使用した。これらの抗体は、細胞毒性活性をほとんど又は全く示さなかった。計１５人の異なる健常ヒトドナーをこれらの分子に対して実行した（ＥＬＮ  ｒｅｆ：ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性−００４２５）。これらのデータは、外因性ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を含有する全血にＩＣ３Ｂ１９を加えると、ＩＣ３Ｂ１９が、Ｔ細胞を活性化し、リダイレクトして、細胞毒性を誘引することができたことを示している。
【０２９１】
実施例１７：実験に基づくＩＬ１ＲＡＰの交差反応性の評価
実施例４に記載したＭＳＤ細胞結合アッセイを使用して、ＩＬ１ＲＡＰ結合を評価した。スクリーニングアッセイの目的は、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９が、細胞株ＨＥＫ−２９３Ｆヒト（クローンＨＥ２）及びＣｙｎｏ（クローンＣＢ８）のＩＬ１ＲＡＰ全長（ＦＬ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）発現細胞株に特異的に結合したかどうかの特性をＨＥＫ−２９３Ｆ親コントロールと比べて明らかにすることとした。種交差反応性を特定するために、ＨＥＫ−２９３Ｆマウス（クローン５）及びラット（クローン１）細胞株も使用した。
【０２９２】
結合実験の結果を図１３に示す。ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９、並びにＩＬ１ＲＡＰ  ｎｕｌｌアームコントロールＩＡＰＢ１００（ＩＡＰＢ６３×Ｂ２３Ｂ４９）及び（ＩＡＰＢ１０１（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９）は、ＨＥＫ−２９３ＦヒトクローンＨＥ２及びＣｙｎｏクローンＣＢ８  ＩＬ１ＲＡＰ  ＦＬ−ＥＣＤ細胞株に特異的に結合した。抗ＭＹＣ陽性コントロール抗体は、各細胞株上で構築物の発現を検出した。ＣＤ３  ｎｕｌｌアームＣＮＴＯ  ７００８（Ｂ２３Ｂ３９×ＣＤ３Ｂ２１９）及びＩ３ＣＢ１５（ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ  ｎｕｌｌアームアイソタイプコントロール）は、低い結合発現を有した。ＨＥＫ−２９３Ｆ親、マウスクローン５、及びラットクローン１へのＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９のバックグラウンド結合は、アッセイした最高濃度においてのみ観察された。
【０２９３】
実施例１８：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果。
この実験は、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。マウスには、それぞれ２００μＬのＰＢＳ容積中の１×１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内に注射した。７日目に、マウスには、背側の脇腹においてＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ細胞（２００μＬのＰＢＳ中の１０×１０６個の細胞）を皮下に移植し、続いて、ＰＢＳ又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。１８日目及び２１日目（ｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において０．５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した（図１４）。
【０２９４】
実施例１９：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果
この実験は、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。マウスには、それぞれ２００μＬのＰＢＳ中の１×１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内に注射した。７日目に、マウスには、ＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ細胞（背側の脇腹において２００μＬのＰＢＳ中の１×１０６個の細胞）を皮下に移植し、続いて、ＰＢＳ又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。８日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、及びｐ＜０．０００１）及び１２日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、及びｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において０．０５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した（図１５）。
【０２９５】
実施例２０：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果
この実験は、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片の腫瘍化抑制におけるＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。マウスには、それぞれ２００μＬのＰＢＳ中の１×１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内に注射した。７日目に、マウスには、ＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ細胞（背側の脇腹において２００μＬのＰＢＳ中の１×１０６個の細胞）を皮下に移植し、続いて、ＰＢＳ、ＩＣ３Ｂ１８、又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。１８日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１）及び２１日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において０．０５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した。加えて、１４日目（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０５）、１８日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１）及び２１日目（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１８の活性が存在した（図１６）。
【０２９６】
実施例２１：２８日目と３１日目に開始された処置を比較した、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧ内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果
この実験は、雌性ＮＳＧマウス内の確立されたＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。マウスにはそれぞれ、背側の脇腹においてＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ細胞（２００μＬのＰＢＳ中の１０×１０６個の細胞）を皮下に移植した。動物には、２８日目に平均容積９３．７ｍｍ３で腫瘍容積により無作為化を行い、ＰＢＭＣを静脈内に注射した。２８日目には、５つの群に対して、ＰＢＳ又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。加えて、３５日目には、２つの群に対して、ＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。ＰＢＭＣ注射と同じ日（２８日目）に、ＩＣ３Ｂ１９を０．５ｍｇ／ｋｇで投与された動物は、ＰＢＳ処置と比較して有意な腫瘍増殖抑制を４５日目（ｐ＜０．０００１）において有した。加えて、ＰＢＭＣ注射の３日後（３１日目）に、ＩＣ３Ｂ１９を０．５ｍｇ／ｋｇで投与された動物は、ＰＢＳ処置と比較して有意な腫瘍増殖抑制を４１日目（ｐ＜０．０００１）及び４５日目（ｐ＜０．０００１）において有した（図１７）。
【０２９７】
実施例２２：３１日目と３５日目に開始された処置を比較した、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果
この実験は、雌性ＮＳＧマウス内の確立されたＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。マウスにはそれぞれ、背側の脇腹においてＯＣＩ−ＡＭＬ５ヒトＡＭＬ細胞（２００μＬのＰＢＳ中の１０×１０６個の細胞）を皮下に移植した。動物には、２８日目に平均容積１１１．５ｍｍ３で腫瘍容積により無作為化を行い、ＰＢＭＣを静脈内に注射した。３１日目には、７つの群に対して、ＰＢＳ、ＩＣ３Ｂ１８、又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。加えて、３５日目には、４つの群に対して、ＩＣ３Ｂ１８又はＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。投与の開始日が３１日目であるか３５日目であるかに関係なく、ＰＢＳ処置と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下におけるＩＣ３Ｂ１８の活性は存在しなかった。４６日目（ｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳと比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において、３５日目に投与を開始した、０．５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した。また、４２日目（ｐ＜０．０５）及び４６日目（ｐ＜０．０００１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示されるように、ヒトエフェクター細胞の存在下において、３５日目に投与を開始した、１ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した。加えて、４６日目（ｐ＜０．０１）におけるＰＢＳ処置と比較した統計的に有意な腫瘍増殖抑制によって示す、ヒトエフェクター細胞の存在下において、３１日目に投与を開始した、１ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９の活性が存在した（図１８）。
【０２９８】
実施例２３：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の抗腫瘍効果
この実験は、雌性ＮＳＧマウス内の確立されたＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。０日目に、マウスにはそれぞれ、トロカール移植により、背側の脇腹において左右両側にＳＫＮＯ−１腫瘍フラグメントを皮下に移植した。動物には、５０日目に平均容積１３５．０ｍｍ３で腫瘍容積により無作為化を行い、ＰＢＭＣを静脈内に注射した。ＰＢＭＣ注射の７日後である５７日目に、動物には、ＩＣ３Ｂ１９をおよそ１日おきに５回にわたって静脈内に投与した。０．５ｍｇ／ｋｇでのＩＣ３Ｂ１９は、６７日目（ｐ＜０．０５）及び７１日目（Ｐ＜０．００１）に、ヒトエフェクター細胞の存在下において、ＰＢＳ処置と比較して統計的に有意な腫瘍増殖抑制をもたらした（図１９）。
【０２９９】
実施例２３：Ｆｃリガンド結合アッセイ
ヒトＦｃリガンドＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃＲｎへの結合競合を、野生型ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ、並びに関連するＩｇＧ４  ＰＡＡ親（二価）及びｎｕｌｌアーム（一価）コントロール抗体の集合体に対してＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９について測定した。ビーズベースのルミネッセンス近接アッセイである、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（ＡＬＰＨＡ），ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）を使用して測定を行った。ドナービーズのレーザー励起により酸素が励起され、この酸素は、アクセプタービーズに十分に近接していれば、化学発光イベントのカスケードを生成し、最終的に５２０〜６２０ｎｍの蛍光発光をもたらす。ストレプトアビジンドナービーズに取り付けるための標準的な方法でコントロール抗体をビオチン化し、ＧＳＴタグを付けたＦｃγＲｓ及びＦｃＲｎをグルタチオンキレートアクセプタービーズに結合した。競合の不在下において、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体、コントロール又は野生型抗体、及びヒトＦｃリガンドは、５２０〜６２０ｎｍのシグナルと相互作用し、同シグナルを生成する。
【０３００】
ＦｃγＲＩでは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の競合性はｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプコントロール以下である（図２０Ａ）。ＦｃγＲＩＩａでは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の競合性はｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプコントロール以下である（図２０Ｂ）。ＦｃγＲＩＩｂでは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の競合性はｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプコントロール以下である（図２０Ｃ）。ＦｃγＲＩＩＩａでは、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の競合性はｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプコントロール以下である（図２０Ｄ）。ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９は、ｈＩｇＧ１  ＷＴ及びｈＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプと同じ効率でＦｃＲｎに結合する（図２０Ｅ）。要約すると、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９は、対応するＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプと本質的に同程度に、試験した全てのＦｃ受容体に結合する。ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂにおいて、ＩＣ３Ｂ１８及びＩＣ３Ｂ１９の競合性は、ＣＤ３Ｂ２１９親及びＣＤ３Ｂ２１９×Ｂ２１Ｍ（ｎｕｌｌアーム）Ａｂより有意に小さいことに注意されたい（図２０Ｂ及び図２０Ｃ）。ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂでは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の競合性もまた、２つのＩＬ１ＲＡＰ×Ｂ２１Ｍ（ｎｕｌｌアーム）抗体より有意に小さい（図２０Ｂ及び図２０Ｃ）。
【０３０１】
実施例２４：Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の効果
インビトロで増殖され、ｉｐで活性化された２０×１０６個のヒトＴ細胞でヒト化された雌性ＮＳＧマウス内の確立されたＳＫＮＯ−１ヒトＡＭＬ異種移植片においてＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。０．５若しくは１ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９又はＰＢＳコントロールを３５、３７、３９、４１、４３、４６、４８、５０、５３、及び５５日目に計１０回にわたり、ｑ２ｄ〜ｑ３ｄで投与した。全ての処置群において８匹の動物のうちの少なくとも６匹が生き残っていた最後の日である、腫瘍移植後の６０日目に、腫瘍増殖抑制（％ＴＧＩ）を計算した。６３日目（ｐ＜０．００１、図２１）までに、１匹を除いた全ての動物において完全又は部分的な退行が観察された、ＰＢＳ処置されたコントロールと比較して、０．５又は１ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９では、両方の処置群において１００％ＴＧＩを有する、統計的に有意な腫瘍増殖抑制が観察された。８１日目までに、０．５ｍｇ／ｋｇ処置群において６／８の腫瘍が完全に退行し、１ｍｇ／ｋｇ処置群において７／８の腫瘍が完全に退行した。
【０３０２】
実施例２５：Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のびまん性ＭＯＬＭ−１３ルシフェラーゼヒトＡＭＬモデルにおけるＩＣ３Ｂ１９の効果
インビトロで活性化され、ｉｐで増殖された２０×１０６個のヒトＴ細胞でヒト化された雌性ＮＳＧマウス内のルシフェラーゼトランスフェクトされたびまん性ＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬモデルにおいてＩＣ３Ｂ１９の効果を評価し、生きた動物の生体発光撮像によって無作為化した。０．０５、０．５、若しくは１ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９又は１ｍｇ／ｋｇのＣＤ３×ｎｕｌｌコントロールＣＮＴＯ７００８による処置を、ｑ３ｄ〜ｑ４ｄで４、８、１１、１４、１７、２１、２４、２８、３１、３５、及び３８日目に計１１回にわたってｉｐで行った。ＧｖＨＤ関連の病的状態が原因で動物を安楽死させた日の前日である、腫瘍移植後の４６日目に、延命率（％ＩＬＳ）を計算した。０．０５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９は、ＣＤ３×ｎｕｌｌコントロール抗体と比較して、統計的に有意な延命率１９９％、１３８％及び＞１３８％をそれぞれに有した（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．０００３、ｐ＜０．０００１、図２２）。１６日目までに、ＣＮＴＯ７００８コントロールで処置されたマウス内のＭＯＬＭ−１３ルシフェラーゼ細胞が後肢及び脊髄にホーンして（honed）、後肢麻痺又は病的状態の最終段階に達した。加えて、１６日目に、０．５ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９で処置された群内の２匹の動物を後肢麻痺又は病的状態が原因で、安楽死させるか、その死亡を確認した。ＩＣ３Ｂ１９で処置されたマウスは、１２日目及び１４日目において脊髄及び後肢における腫瘍量の減少を生体発光により示した。４６日目において、ＩＣ３Ｂ１９処置群（０．０５、０．５、１ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれにおける３匹の動物は、生体発光により評価すると腫瘍がなくなっていた。
【０３０３】
実施例２６：固体腫瘍中のＩＬ１ＲＡＰのＲＮＡ発現
この実験では、ＩＬ１ＲＡＰのＲＮＡ発現の分布を多様な腫瘍タイプ（ｎ＝１４）において評価し、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ（ＴＣＧＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能なデータからの対応する正常サンプルに対する各腫瘍のＲＮＡ発現と比較した。どの患者にＩＬ１ＲＡＰ阻害が有効であり得るのかの特定に役立てるために、この実験を行って、どの固体腫瘍タイプがＩＬ１ＲＡＰの高度発現を有するか評価した。
【０３０４】
ＴＣＧＡ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ
ｏｍｉｃｓｏｆｔ（ｗｗｗ．ｏｍｉｃｓｏｆｔ．ｃｏｍ）が提供する内部知識ベース（Ｏｎｃｏｌａｎｄ、ＴＣＧＡ＿Ｂ３７）を使用して、ＴＣＧＡプロジェクトのＲＮＡＳｅｑ調査のデータを照会した。誘導体データは、ＯＳＡアライナー１、並びにゲノムリファレンスライブラリＨｕｍａｎ．Ｂ３７．３及び遺伝子モデル「ＯｍｉｃｓｏｆｔＧｅｎｅ２０１３０７２３」）を使用したＲＰＫＭ正規化によるＲＮＡ定量化の決定を使用して、Ｏｍｉｃｓｏｆｔによりプリコンパイルされている。ＲＮＡ−Ｓｅｑ出力は、同一患者のサブセットに由来した腫瘍とそれに隣接した正常組織を比較することによってＴＣＧＡにおいて評価されている。
【０３０５】
分析手順
固体腫瘍中の腫瘍及び正常の両方に使用可能なデータを有する１４の適応症を評価した。
ＩＤ      タイプ
ＥＳＣＡ  食道
ＢＬＣＡ  膀胱
ＫＩＲＰ  腎乳頭
ＵＣＥＣ  子宮
ＳＴＡＤ  胃
ＣＯＡＤ  結腸
ＨＮＳＣ  頭及び頚
ＬＵＳＣ  肺扁平上皮
ＰＲＡＤ  前立腺
ＴＨＣＡ  甲状腺未分化
ＬＵＡＤ  肺腺がん
ＫＩＲＣ  腎明細胞
ＢＲＣＡ  乳房
ＰＡＡＤ  膵
【０３０６】
ＯｎｃｏｌａｎｄでＩＬ１ＲＡＰを照会し、隣接した正常に対してより高い発現を有する腫瘍の数を表にまとめ、頻度推定を計算した。高度発現を有するサンプルを、その発現値が対応の正常サンプルにおける最高発現値よりも大きかったときにカウントした。正規化（ＦＰＫＭ）ＲＮＡ分布を視覚的に評価するための箱ひげ図も腫瘍タイプごとに生成した。
【０３０７】
顕著な高度発現で特定され、更に比較のために使用可能な十分な数の対応する正常サンプル（＞１０）を有した、５つの腫瘍タイプが存在した（表１８及び図２３）。正常に対して高度発現を有する腫瘍タイプには、食道（２８％）、膀胱（２６％）、結腸（７２％）、肺扁平上皮（２９％）及び未分化甲状腺（７０％）が挙げられる。
【０３０８】
【表１８】
2018534933.tif 000032
【０３０９】
実施例２６：固体腫瘍細胞株の表面上のＩＬ１ＲＡＰ受容体の定量化
実施例２６のＲＮＡ  Ｓｅｑデータは、固体腫瘍中のＩＬ１ＲＡＰ  ＲＮＡの存在を示す。固体腫瘍治療としてのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３の可能性を探るために、アトポーシス細胞ベースのアッセイにおいて様々ながん腫瘍細胞タイプをＩＬ１ＲＡＰ表面発現及びそれらの被殺傷能力について定量した。
【０３１０】
肺、前立腺、膵、及び結腸細胞株をＡＴＣＣ条件に従って培養し、７０〜８５％コンフルエントまで増殖させた。がん細胞株を必要に応じて非酵素的解離バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃  １３１５１−００４）で解離させ、ＤＰＢＳ−／−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１４１９０２−２５０）中で洗浄した。細胞をカウントし、ＤＰＢＳ−／−中で濃度３＊１０＾６個／ｍＬまで再懸濁させ、１００μＬを各ウェル内に播種した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１００８２−１４７）をＲＴで２５分間にわたってサンプルに加えた。サンプルを２００μＬのフローサイトメトリーステインバッファ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｃａｔ＃＃５５４６５７）中で洗浄し、ＦＣブロック（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＮＢ３０９）で室温において１５分間ブロッキングし、フローサイトメトリーステインバッファ中で５μｇ／ｍＬのアイソタイプコントロール（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  ＩＣ００２Ｐ）又はＩＬ１ＲＡＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＦＡＢ６７６Ｐ）により、４℃において４５分間染色した。染色した細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（商標）上で評価した。Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  Ｖ＿１０でＳｉｎｇｌｅｔｓ／Ｌｉｖｅ／Ｃｅｌｌｓ集団を使用して幾何平均比を計算した。Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｎｇ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃８１５）及びＢＤ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｃａｌｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐｌｏｔマクロを使用して受容体密度を計算した。表１９には、各細胞株のＩＬ１ＲＡＰ受容体密度がまとめてあり、固体腫瘍中の様々な表面発現が示されている。
【０３１１】
【表１９】
2018534933.tif 000033
ａ値は６つの測定値の平均である
ｂ値は４つの測定値の平均である
ｃ値は７つの測定値の平均である
【０３１２】
実施例２７：アポトーシスアッセイにおけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の評価
肺、前立腺、膵、及び結腸細胞株をＡＴＣＣ条件に従って培養し、７０〜８５％コンフルエントまで増殖させた。標的細胞を必要に応じて非酵素的解離バッファ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１３１５１−０１４）で解離させ、ＰＢＳ中で洗浄した。細胞をカウントし、指定された完全フェノールレッド不含培地中で０．４＊１０＾６個／ｍＬまで再懸濁させた。標的細胞を無菌の９６ウェルプレートに分注し（５０μＬ／ウェル）、３７℃及び５％  ＣＯ２で一晩インキュベートさせた。その次の日に、健康なドナーからの汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｄｏｎｏｒｓ  ＃Ｍ７４１２、ＬＳ−１１−５３１０８、＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａ、又はＭ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂ）をカウントし、１．０＊１０＾６個／ｍＬで、５００ＸのＥｓｓｅｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ＃４４４０）を含有する完全フェノールレッド不含培地に播種した（１００μＬ／ウェル）。様々な濃度のＩＣ３Ｂ１９（ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３２１９）及びコントロール抗体［ＣＮＴＯ  ７００８（Ｂ２３Ｂ３９×ＣＤ３Ｂ２１９）及びＩＡＰＢ１０１（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９］）を適当なウェルに加えた。プレートを室温で２０分間平衡化させ、３７℃及び５％ＣＯ２に維持されたＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置内に最大１２０時間入れた。アポトーシスを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）撮像装置の処理定義内のサイズによりＴ細胞が除外されている緑色対象物合計面積（μｍ２／ウェル）測定基準を使用して７２時間の時点で定量した。曲線下面積を、各濃度における７２時間の時点での未加工値からＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２で計算した。濃度応答曲線をグラフ化し、非線形回帰計算を可変勾配関数と共に使用してＩＣ３Ｂ１９のＥＣ５０値を計算した。ＥＣ５０値は、９５％信頼区間が＜ｌｏｇ１．５の場合に有効であった。ＩＣ３Ｂ１９は、試験した固体腫瘍細胞株の大半でカスパーゼ活性の上昇を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激する。コントロール抗体（ＣＮＴＯ７００８及びＩＡＰＢ１０１）は測定可能なアポトーシス応答を生成しなかった。ＩＣ３Ｂ１９を加えた場合、Ｈ５２０は、「Ｎｏ  Ｆｉｔ」（ＮＦ）と表示され、測定可能なアポトーシス応答を生成しなかった。アポトーシスアッセイの結果を表２０に要約する。代表的なグラフを図２４に示す。
【０３１３】
【表２０】
2018534933.tif 000034
ａ値は７つの測定値の平均である
ｂ値は３つの測定値の平均である
３人の健康なＴ細胞ドナーを使用した；Ｄｏｎｏｒｓ  ＃Ｍ７４１２、ＬＳ−１１−５３１０８及び＃Ｍ６８０７、ＬＳ−１１−５３８４７Ａ、並びにＭ７２６７、Ｌｏｔ＃ＬＳ−１１−５３０７２Ｂ
ＮＦ＝Ｐｒｉｓｍが値を返さない（例えば「あいまい」）又はフィットが不良であると判定される（ｌｏｇ  ＥＣ５０の９５％  ＣＩ範囲＞ｌｏｇ１．５）のいずれかの場合にＮｏ  ｆｉｔが使用される
ＮＤ＝決定されず
【０３１４】
要約すると、ＩＬ１ＲＡＰは、肺、結腸、膵、及び前立腺の細胞株を含めて、様々な固体腫瘍細胞株の表面で発現される。ＩＣ３Ｂ１９は、これらのＩＬ１ＲＡＰ陽性固体腫瘍細胞株においてカスパーゼ活性の上昇を特徴とするＴ細胞指向性アポトーシス応答を刺激するが、ＩＬ１ＲＡＰ陰性細胞株であるＨ５２０では刺激しない。
【０３１５】
実施例２８．血液悪性細胞株でのＩＬ１ＲＡＰ受容体密度レベル：
ＩＬ１ＲＡＰ細胞表面発現の発現を理解するために、２２６個の血液細胞株をＩＬ１ＲＡＰ細胞表面受容体密度レベルについて分析した。市販のフィコエリトリン（ＰＥ）標識化抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃  ＦＡＢ６７６Ｐ）を利用して、２つの異なる方法で受容体密度レベルを決定した。標準曲線を生成するために、ＰＥ標識化ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ、ｃａｔ＃  ３４０７６８）又は抗マウス捕捉ビーズ（Ｂａｎｇ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ、ｃａｔ＃  ８１５）のいずれかを使用して市販のＰＥ標識化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を捕捉した。試験した全ての細胞株のＩＬ１ＲＡＰ幾何平均発現を計算し、アイソタイプ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃  ＩＣ００２Ｐ）の値を差し引いた。両方の方法に対して受容体密度レベルを標準曲線から生成した。外挿できなかった又は検出限界未満であった値は、決定されず（ＮＤ）と表した。これらのデータは、ほとんどの血液細胞株が細胞表面上において様々なレベルでＩＬ１ＲＡＰを発現することを示している（表２１）。列記した適応疾患の中で、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、並びにＴ細胞急性リンパ性白血病及びＴ細胞白血病の疾患適応症は、比較的高いＩＬ１ＲＡＰ受容体密度レベルを有した適応疾患の間にあるものであった。
【０３１６】
【表２１−１】
2018534933.tif 000035
【０３１７】
【表２１−２】
2018534933.tif 000036
【０３１８】
【表２１−３】
2018534933.tif 000037
【０３１９】
【表２１−４】
2018534933.tif 000038
注：一部の細胞株が繰り返されているのは、それらが異なるソースから得られたものであるからである。ＣＢＳ＝Ｊａｎｓｓｅｎの内部細胞バンクサービス、ＡＴＣＣ＝Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＤＳＭＺ＝Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、ＮＤ＝決定されず、レベルが検出レベル未満であった
【０３２０】
実施例２９．ＣＭＬ、ＤＬＢＣＬ、Ｔ−ＡＬＬ及びＴ細胞白血病細胞株での機能性細胞毒性アッセイにおけるＩＣ３Ｂ１９の評価
ＩＣ３Ｂ１９及びコントロール抗体（ＣＮＴＯ  ７００８及びＩＡＰＢ１０１）を追加の血液適応症において試験した。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）標的細胞（ＬＡＭＡ−８４、ＭＥＧ−０１、及びＫＹＯ−１）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）標的細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−１６、Ｕ−２９４０、ＳＵ−ＤＨＬ−６）、並びにＴ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及びＴ細胞白血病／リンパ腫標的細胞（ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＣＥＭ／Ｃ１、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＳＵＰ−Ｔ１）を３人の健康なコントロール汎ＣＤ３＋  Ｔ細胞ドナーで試験した。実施例１２に前述したプロトコルに従った。
【０３２１】
３つの健康なコントロール汎ＣＤ３＋  Ｔ細胞の平均が表されている（図２６〜図２８）。ＩＣ３Ｂ１９は、ＣＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ／Ｔ細胞白血病／リンパ腫、及びＤＬＢＣＬ細胞株における細胞毒性、並びにＴ細胞媒介性の活性化（ＣＤ２５）を誘引した。観察された最大細胞毒性及び対応するＥＣ５０（ｎＭ）を表２２に示す。これらのデータは、コントロール抗体（ＣＮＴＯ  ７００８及びＩＡＰＢ１０１）が全体的なＴ細胞媒介性腫瘍細胞毒性を有しなかったが、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３はＣＭＬ、Ｔ−ＡＬＬ／Ｔ細胞白血病／リンパ腫及びＤＬＢＣＬ適応症において活性を有することを示している。
【０３２２】
【表２２】
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注：＊ＮＤ＝決定されず、ＥＣ５０曲線があいまいであった
【０３２３】
実施例３０．Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウス内のＨ１９７５ヒト非小細胞肺がん異種移植片におけるＩＣ３Ｂ１９の効果
インビトロで増殖され、ｉｐで活性化された２０×１０６個のヒトＴ細胞でヒト化された雌性ＮＳＧマウス内の確立されたＨ１９７５ヒト非小細胞肺がん異種移植片においてＩＣ３Ｂ１９の効果を評価した。腫瘍移植後１３日目に、マウスを腫瘍容積によりそれぞれ１０匹の動物からなる群に平均腫瘍容積７４ｍｍ３で無作為化した。０．５、１若しくは２．５ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９又は１ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ７００８（ＣＤ３×Ｎｕｌｌコントロール）を、週に２度、１４、１７、２０、２３、２７、３０、３５、及び３８日目に計８回にわたってｉｐ投与した。全ての処置群において１０匹の動物のうちの少なくとも９匹が生き残っていた最後の日である、腫瘍移植後の３０日目に、腫瘍増殖抑制（％ＴＧＩ）を計算した。ＣＮＴＯ７００８で処置されたコントロールと比較して、１ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９では、８０％及び９０％  ＴＧＩをそれぞれに有する、統計的に有意な腫瘍増殖抑制が観察された（ｐ＜０．０００１、図２９）。２．５ｍｇ／ｋｇのＩＣ３Ｂ１９処置は、３０日目に４／１０のマウスにおいて腫瘍の停滞又は退行をもたらした。
【０３２４】
実施例３１．ＩＣ３Ｂ１９によるＩＬ１ＲＡＰ＋骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の標的化
肺及び前立腺の腫瘍微小環境内でのＴｒｅｇ及びＭＤＳＣの増殖は、がん細胞が宿主免疫監視から逃れるためのメカニズムの一部であり、チェックポイント阻害剤に対する応答を制限し得る（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ２００６；Ｄａｓａｎｕ  ２０１２；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ２０１２，Ｉｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ−１サイトカインファミリーのメンバー（ＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３３／ＳＴ２及びＩＬ−３６／ＩＬ−１ＲＬ２）のための補助タンパク質であり、炎症誘発応答及び自然免疫応答に関係するサイトカインシグナル伝達を可能にする。ＩＬ１ＲＡＰは正常組織及び正常細胞内では発現しにくいが、本発明者らは、肺及び前立腺のがんドナーの全血から得た骨髄由来免疫抑制細胞において高レベルのＩＬ１ＲＡＰ表面発現を検出した。その生物学は十分に理解されていないが、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ−１、及びＩＬ−３３は、免疫攻撃を抑制し、血管新生を促進することによって、腫瘍の生存／増殖能力を高め得る。液状腫瘍タイプと固体腫瘍タイプの両方を有する患者において永続性のある成果が欠如しているため、ＩＣ３Ｂ１９を開発した。ＩＣ３Ｂ１９は、ＩＬ１ＲＡＰ陽性腫瘍細胞及び腫瘍由来のＭＤＳＣを殺傷するように免疫系をリダイレクトする。したがって、ＩＣ３Ｂ１９によるこの免疫抑制集団の枯渇は、固体腫瘍における臨床応答の改善につながると仮定される。
【０３２５】
この仮定を検証するために、ＭＤＳＣドナー血液枯渇エクスビボアッセイに従った。簡潔に、血液サンプルをＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で１：１に希釈した。これは、ＭＤＳＣ上の標的発現の基準パーセンテージ（受容体密度／細胞）として機能した。ＭＤＳＣパネルは、Ｌ／Ｄ、ＬＩＮ−（ＣＤ３／ＣＤ５６／ＣＤ１９／）、ＨＬＡ−ＤＲ低、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４、ＣＤ１５：ＭＤＳＣ上の標的発現：ＰＥ  ＩＬ１−ＲＡＰで構成された。サンプルを上記パネルで染色し、４℃で３０分間インキュベートした。ＲＢＣ溶解バッファ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃００−４３００−５４）を使用してＲＢＣを溶解し、室温で５分間カバーし、１５００ｒｐｍで４分間スピンさせてバッファを除去した。バッファによる溶解を少なくとも４回行った。サンプルをＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１４１９０２−２５０）で洗浄し、Ｎｅａｒ  ＩＲ  Ｌ／Ｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１００８２−１４７）で染色し、室温で１０〜１５分間カバーした。最後の洗浄をＰＢＳ／ＦＡＣＳで行い、Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析するためにサンプルをＦＡＣＳバッファ中で再懸濁させた。Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  Ｖ＿１０でＳｉｎｇｌｅｔｓ／Ｌｉｖｅ／Ｃｅｌｌｓ集団を使用して幾何平均比を計算し、続いて、ＭＤＳＣパネルマーカーを行った。そして、ＭＤＳＣ集団の枯渇（％）が測定されている（図３０）。
【０３２６】
ＮＳＣＬＣドナー及び前立腺がんドナーの商業的に供給されている末梢血サンプルの臨床前分析は、健康な対象からの末梢血と比較して、試験した全てのドナーにおいてＩＬ１ＲＡＰ＋  ＭＤＳＣの有意な増加を示した。詳細分析は、エクスビボアッセイにおける前立腺がんドナー及び肺がんドナーの血液中での単球性ＭＤＳＣ集団におけるＩＬ１ＲＡＰの高度発現（図３１）及びＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３による枯渇へのこれらのＭＤＳＣの感度を示した。ｑｕａｎｔ−ｂｒｉｔｅビーズ定量化法を使用すると、固体腫瘍ドナーの全血中でのＩＬ１ＲＡＰ受容体密度は、ＮＳＣＬＣの場合は〜２５００個の受容体／細胞、前立腺がんの場合は〜６００〜８００個の受容体／細胞の範囲で変動している（図３２）。これらの血液サンプル中のＩＬ１ＲＡＰ＋免疫抑制細胞の枯渇は、Ｔ細胞活性化及び増殖の増大につながる。
【０３２７】
要約すると、ドナー血液サンプル中のＭＤＳＣレベルは、腫瘍によって変化し、前立腺がんでは〜２５％、ＮＳＣＬＣでは腫瘍〜１０％である。ＩＬ１ＲＡＰは、患者ドナーサンプルからのＭＤＳＣにおいて見られる可変の受容体密度で発現する：前立腺がんの場合は〜６００〜８００個の受容体／細胞及びＮＳＣＬＣの場合は〜２５００個の受容体／細胞。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３は、ドナー血液サンプルからＩＬ１ＲＡＰ＋  ＭＤＳＣを枯渇させる能力を有する。
【０３２８】
実施例３２．発生期の腫瘍血管構造の破壊におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の役割の評価
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３に依存したＴ細胞リダイレクトが、腫瘍微小環境内に新たに確立された血管構造を破壊し、除去することができるかどうかを調査するために、血管新生アッセイを開発した。このアッセイは、２次元ガラス表面上での管状網状組織の相対的な増殖を測定する。このために、蛍光標識化した正常ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を取得し、ＶＥＧＦ刺激（４ｎｇ／ｍＬ）の存在下でそれらを正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）と共培養した。一般的なチロシンキナーゼ阻害剤である、スラミン（１００μＭ）を添加して、ＶＥＧＦシグナル伝達をブロッキングした。ついで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｚｏｏｍを使用して、培養された細胞を含有するプレートを３時間ごとに撮像した。図３３に示すように、ＶＥＧＦ刺激は処置後すぐに管状網状組織の急速な増殖を誘引するが、スラミンの追加はその効果を完全に打ち消す。確立された網状組織は、インキュベータ内で少なくとも５日間存続し得る。これらの結果は、アッセイのダイナミックレンジを示している。
【０３２９】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３に依存したＴ細胞リダイレクトの効果を決定するための次の工程として、単離された健常ドナー汎Ｔ細胞及び腫瘍細胞の存在下で網状組織の成長を評価した。Ｈ１９７５肺がん細胞株を使用して固体腫瘍（ＮＳＣＬＣ）を模擬し、ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞を使用して液状腫瘍（ＡＭＬ）を模擬した。図３４は、ＨＵＶＥＣをＴ細胞又はＨ１９７５細胞と共培養することが、アッセイの期間中に管状網状組織の形成をかき乱さないことを示している。興味深いことには、ＨＵＶＥＣ培地へのＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞の追加は、網状組織の成長を少し減速させたが、アッセイの６日目（１４４時間）までに、全ての網状組織が同等によく成長していたので、最大網状組織密度を抑制することはなかった。
【０３３０】
ついで、Ｔ細胞上及びがん細胞上におけるＩＬ１ＲＡＰ発現のレベルを評価した。複数の前の観察と一致して、Ｔ細胞はＩＬ１ＲＡＰについて完全に陰性であったが、Ｈ１９７５及びＯＣＩ−ＡＭＬ５は表面上で高レベルの分子を発現した（図３５）。これにより、血管新生アッセイでこれらの細胞を使用してＩＬ１ＲＡＰ陽性腫瘍及びその微小環境をモデル化する意図が確認された。Ｔ細胞上及びがん細胞上でのＩＬ１ＲＡＰ発現レベルの評価が完了すると、ＨＵＶＥＣ細胞はＩＬ１ＲＡＰを発現するかどうかの疑問が生じた。解凍直後のフローサイトメトリー分析は、ＩＬ１ＲＡＰが細胞表面上に存在しないことを示した（データは図示せず）。しかしながら、ガラス上で７日間培養すると、ＨＵＶＥＣは、いくらかのＩＬ１ＲＡＰ発現を示し、およそ６０％の細胞が、上記アイソタイプを染色しているタンパク質を有した（図３６）。誘引された発現は、培養条件に左右されなかったが、スラミンの存在下で、あるいはストレスに対処するメカニズムとして、強化されるようであった。
【０３３１】
最後に、ＨＵＶＥＣをＴ細胞及びがん細胞と共に、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で共培養した。図３７は、処置後２４時間内で、１０ｎＭのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３が、管状網状組織を完全に破壊するのに十分であったことを示している。一方、コントロール化合物（Ｎｕｌｌ×ＣＤ３）又はビヒクル（ＰＢＳ）による処置は、確立された網状組織の動態を改変しなかった。この観察は、Ｈ１９７５細胞（図３７Ａ）及びＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（図３７Ｂ）で繰り返されており、腫瘍血管新生におけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３に依存したＴ細胞リダイレクトの役割が、固体腫瘍及び液状腫瘍に関連することが示されている。また、１００ｎＭ及び１ｎＭのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の投与も試験し、同様の結果がもたらされた。薬理学的操作に応答した代表的な網状組織構造の例を図３８に示す。パネルＡ、Ｂ及びＣは、ＨＵＶＥＣ管状網状組織からの緑色蛍光を示し、Ｄ、Ｅ及びＦは分析に使用したコンピュータ生成の網状組織マスクを示している。
【０３３２】
撮像アッセイの完了後、技術的複製をプールし、フローサイトメトリーによってＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５）及びＴ細胞上のＩＬ１ＲＡＰ発現について分析した。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体で処置が行われたときのＨＵＶＥＣにおけるＩＬ１ＲＡＰの発現及びそれらの破壊と整合して、Ｔ細胞上のＣＤ２５が抗体依存の態様で著しく増加するのが見られた。Ｎｕｌｌ×ＣＤ３  ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）Ａｂ（ＣＮＴＯ  ９２５３）に暴露されたＴ細胞は、ＣＤ２５を上方調節しなかった。これは、Ｈ１９７５細胞（図３９Ａ）とＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞（図３９Ｃ）との間で同様であった。興味深いことには、Ｈ１９７５の存在下で活性化されたＴ細胞においてＩＬ１ＲＡＰは誘引されなかったが（３９Ｂ）、ＯＣＩ−ＡＭＬ５で活性化されたＴ細胞においてはＩＬ１ＲＡＰの実質的な増加が見られ（図３９Ｄ）、ＡＭＬ細胞株によって生成された可溶性因子が、Ｔ細胞において活性化時にＩＬ１ＲＡＰの発現をトリガーし得ることが示唆された。
【０３３３】
最後に、Ｔ細胞上でのＣＤ２５発現とＩＬ１ＲＡＰ発現との間の関係を調査するために、等高線プロットを生成し、１／４区ゲートをアイソタイプコントロール染色に基づいて設定した。結果として生じた図は、Ｈ１９７５細胞の存在下で、１０ｎＭのＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３により、ＣＤ２５が誘引されるが、ＩＬ１ＲＡＰは誘引されないことを示している（図４０Ａ）。Ｎｕｌｌ×ＣＤ３ではＣＤ２５の類似の増加がもたらされないので、活性化は特異的である（図４０Ｂ）。一方、ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞と共培養され、かつ、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３で処置されたＴ細胞では、ＣＤ２５及びＩＬ１ＲＡＰが増加する（図４０Ｃ）。重要なことには、活性化されたＴ細胞のサブセットのみがＩＬ１ＲＡＰを発現させた。更に、Ｎｕｌｌ×ＣＤ３は、Ｔ細胞においてＣＤ２５発現もＩＬ１ＲＡＰ発現も誘引しない（図４０Ｄ）。
【０３３４】
実施例３３．初代のＡＭＬ及びＭＤＳの白血病性芽球及び骨髄由来免疫抑制細胞に対するＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体効果のエクスビボ評価
この実験の目的は、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有するドナーからのＴ細胞を白血病性芽球に対して活性化できるかどうかを調査することとした。このため、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を模擬した培養条件を確立して、初代のドナー白血病性細胞の増殖を支援した。この実験は、ＩＬ１ＲＡＰ結合アームを有するツール化合物（ＩＡＰＢ５７）、及びＣＤ３結合アーム（Ｂ２２０）で行った。簡潔に、２つのＡＭＬドナーサンプルからの末梢血から単離された新鮮な単核球（ＰＢＭＣ）及び２つのＭＤＳドナーサンプルからの凍結保存された骨髄単核球（ＢＭＭＣ）（それぞれ、表２３及び表２４）をヒト間質細胞株ＨＳ−５の層の上に播種し、１０〜１４日間増殖させた。ついで、細胞培養を３つの群に分類した：未処置、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂで処置及びＮｕｌｌ×ＣＤ３  Ａｂで処置（両Ａｂは１μｇ／ｍＬ）。処置の０日目及び１４日目には、ＩＬ１ＲＡＰ＋芽球及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、並びにＴ細胞の増殖／活性化の評価のために、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。
【０３３５】
【表２３】
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ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；Ｍ７、巨核芽球；ＦＤ、最初の診断；ＰＢ、末梢血。
１化学療法中であり、２０１６年６月現在でＤａｃｏｇｅｎ（登録商標）による継続治療下にあるドナー。急性骨髄性白血病への形質転換を含む骨髄線維症−等級２の病歴。２処置の０日目にフローサイトメトリーによって測定された芽球及びＴ細胞のパーセント。
【０３３６】
【表２４】
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ＭＤＳ、骨髄異形成症候群；ＲＡＥＢ−２、芽球増加を伴う不応性貧血−２。
１凍結骨髄ＭＮＣの提供元；２処置の０日目にフローサイトメトリーによって測定された芽球及びＴ細胞のパーセント。
【０３３７】
間質細胞株との初代のＡＭＬ  ＰＢＭＣ及びＭＤＳ  ＢＭＭＣ細胞の共培養は、白血病性芽球及びＴ細胞の生存を２８日まで支援した。試験した全てのサンプルにおいて、白血病性芽球はＩＬ１ＲＡＰ陽性であった（図４１）。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３  Ａｂによる処置は、コントロール又はＮｕｌｌ×ＣＤ３  Ａｂで処置された細胞と比較すると、試験したＭＤＳ患者サンプルと２つのＡＭＬ試験サンプルのうちの１つとの両方において、ＩＬ１ＲＡＰ＋白血病性芽球の有意な（４０〜６０％）減少をもたらした。ＩＬ１ＲＡＰ＋細胞の減少は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の増加並びにそれらの活性化と強い相関があった。未処置の細胞又はＮｕｌｌ×ＣＤ３  Ａｂで処置された細胞では、Ｔ細胞の増殖は観察されなかった（図４２及び図４３）。同様に、非応答性のＡＭＬサンプルでは、１４日目の時点で、わずかなＣＤ８＋細胞が存在し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は検出不可能であった（図４４）。
【０３３８】
更に、試験した全てのサンプルにおいて、培養の最初の数日内での間質細胞との接触に起因して、Ｔ細胞の活性化時にＭＤＳＣが生成された。ＡＭＬサンプルとＭＤＳサンプルの両方において、ＭＤＳＣはＩＬ１ＲＡＰ＋であった（図４５Ａ）。応答性サンプルでは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３による処置後のＭＤＳＣのパーセントは、未処置コントロール又はＮｕｌｌ×ＣＤ３  Ａｂで処置された細胞と比較して有意に低く、これは、標的特異的なＭＤＳＣの殺傷を示唆している。非応答性ＡＭＬサンプルでは、３つ全ての処置群においてＭＤＳＣのパーセントは同じであった。これは、Ｔ細胞の欠如と相関がある（図４５Ｂ）。応答性サンプルでは、ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３による処置後のＭＤＳＣのパーセントは、未処置コントロール又はＮｕｌｌ×ＣＤ３  Ａｂで処置された細胞と比較して有意に低く、これは、標的特異的なＭＤＳＣの殺傷を示唆している。非応答性ＡＭＬサンプルでは、３つ全ての処置群においてＭＤＳＣのパーセントは同じであった。これは、Ｔ細胞の欠如と相関がある（図４５Ｂ）。
【０３３９】
【表２５−１】
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【０３４０】
【表２５−２】
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【０３４１】
【表２５−３】
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【０３４２】
【表２５−４】
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【０３４３】
【表２５−５】
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【０３４４】
【表２５−６】
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【０３４５】
【表２５−７】
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【０３４６】
【表２５−８】
2018534933.tif 000049
【０３４７】
【表２５−９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４３Ｇ】
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【図４３Ｈ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018534933.tif 000157
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