(57)【要約】本発明は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の細胞外ドメイン、特に免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、該受容体へのヒトＧａｓ６の結合を低減又は阻害する抗体、特にヒト又はヒト化抗体に関する。本発明はまた、過剰増殖性疾患又は感染性疾患の診断、予防又は処置におけるこれらの抗体の使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体には結合せず、ヒトＴｙｒｏ３受容体へのヒトＧａｓ６の結合を低減又は阻害する、単離ヒト抗体又は単離ヒト化抗体。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１を含み、及び／又は配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２にさらに結合する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号８８、１０２、１１６、１３０、１４４、又は１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号８９、１０３、１１７、１３１、１４５、又は１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２に結合しない、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１０、３２、４６、６０又は７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１１、３３、４７、６１又は７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖を含む、請求項１、２及び５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号８８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１０３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１３１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１４５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、好ましくは、Ｔｙｒｏ３細胞外ドメインとのＴｙｒｏ３リガンドの結合を低減若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３媒介シグナル伝達を低減若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３リン酸化を低減若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３二量体化を低減若しくは阻止する、Ｔｙｒｏ３受容体の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）  請求項１〜９のいずれかに記載の抗体をコードする核酸配列、及び
（ｂ）  （ａ）の前記配列のいずれかに相補的な核酸、
からなる群から選択される単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体を作製するための方法であって、前記抗体の発現に適した条件下で請求項１２に記載の細胞を培養するステップと、任意的に前記抗体を回収するステップと、を含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載の細胞と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
過剰増殖性疾患又は感染性疾患の診断、予防又は処置に用いるための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体、又は請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関し、特に、Ｔｙｒｏ３受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合する抗体に関する。これらの抗体は、特に治療目的及び診断目的で有利な特性を示す。
【背景技術】
【０００２】
Ｂｙｋ、Ｄｔｋ、Ｒｓｅ、Ｒｅｋ、Ｓｋｙ又はＴｉｆとしても知られるＴｙｒｏ３は、受容体型チロシンキナーゼのＴｙｒｏ３／Ａｘｌ／Ｍｅｒ(TAM)ファミリーの１つである。
【０００３】
チロシンキナーゼ受容体は、特異的リガンドを結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び選択された細胞内基質に結合してリン酸化することができる細胞内触媒ドメインからなる。リガンドが細胞外領域に結合することで、チロシンキナーゼ受容体に一連の構造的再配置が起こり、これが細胞内タンパク質のリン酸化による一連のイベントを誘発するその酵素活性化をもたらし、細胞外シグナルが最終的に核に伝達され、遺伝子発現を変化させる。
【０００４】
ＴＡＭ受容体は、２つの免疫グロブリン(Ig)関連ドメイン及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ型(FNIII)関連ドメインを含むＮ末端細胞外ドメインを含み、単一膜貫通へリックス、及び細胞質チロシンキナーゼドメインが続く。リガンド結合の際に受容体は二量体化し、チロシンキナーゼは活性化される。
【０００５】
これらの受容体は、約４３％のアミノ酸配列同一性を示し、且つプロテインＳには存在するがＧａｓ６には存在しないトロンビン切断部位を除いて同じ複合マルチドメイン構造を共有する、相同リガンドＧａｓ６（成長停止特異性遺伝子−６（growth arrest specific gene-6)）及び／又はプロテインＳによって活性化され得る。
【０００６】
近年の研究では、ＴＡＭ受容体が、免疫、止血、及び炎症に主要な役割を果たすことが明らかにされた(Zheng等、J. Immunol 2015, 194; Rothlin et al.Cell. 2007, 131, 1124-1136)。これらの受容体、特にＴｙｒｏ３は腫瘍発生及び腫瘍細胞生存に関連することも示された（Linger等、Adv Cancer Res, 2008; 100:35-83; Vander Meer et al., Blood. 2014; 213(16):2460-2469）。これらの認識に基づいて、Ｔｙｒｏ３は、膀胱がん、悪性黒色腫、若しくは乳がんなどのＴｙｒｏ３過剰発現がんの治療剤開発のため（国際公開第２０１０／０３１８２８号; Ekyalongo等、Anticancer Res. 2014Jul;34(7):3337-45）、又は免疫応答を向上させるため(Lemke及びRothlin、 Nat Rev Immunol. 2008;8(5):327-336)のターゲットとして特定された。
【０００７】
ＴＡＭ受容体阻害剤は、Ｇａｓ６又はプロテインＳ又は細胞外ドメインに特異的に結合してリガンドと受容体との相互作用を抑制するものなどの受容体活性を低減する分子、Ｇａｓ６又はプロテインＳ濃度を低下させる分子、構成的Ｔｙｒｏ３活性化を阻害する分子、及び細胞内ドメインに結合して受容体のシグナリングを抑制する分子を含む。選択的阻害剤は、小分子、チロシンキナーゼドメイン欠損可溶性受容体、又は抗体の形態であり得る。
【０００８】
Ｔｙｒｏ３受容体は、ＴＡＭ受容体のうちで最も研究が進んでいないものであり、現在まで、この受容体の治療的な選択的阻害のための効果的な方法はない。いくつかの、Ｔｙｒｏ３に対するマウス抗体は市販されており、或いは悪性黒色腫におけるこの受容体の活性を研究するためDemarest等によって記載されている（Biochemistry、2013、52、3102-3118）。しかし、ヒト患者の処置におけるマウスモノクローナル抗体の使用は、抗体に対する宿主の免疫応答をもたらし、処置の有効性を損なう可能性がある。
【０００９】
したがって、Ｔｙｒｏ３に効果的且つ特異的に結合し、その活性を調節するヒト又はヒト化抗体が強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、抗Ｔｙｒｏ３抗体及びその使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様において、本発明は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体に結合せず、ヒトＴｙｒｏ３受容体に対するヒトＧａｓ６の結合を低減又は阻害する、単離されたヒト又はヒト化抗体に関する。
【００１２】
特に、本発明の抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなるか、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１を含み得、及び／又は配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなるか、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１を含み得る。
【００１３】
抗体は、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２にさらに結合し得る。特に、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１及びＩｇ−２に結合する抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号８８、１０２、１１６、１３０、１４４又は１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号８９、１０３、１１７、１３１、１４５又は１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖、を含む。
【００１４】
代替的に抗体は、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し得るが、免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には結合しない。特に、この抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１０、３２、４６、６０、又は７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１１、３３、４７、６１、又は７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖、を含み得る。
【００１５】
特に、本発明の抗体は、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号８８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１０３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１３１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１４５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、又は
配列番号１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖、並びに配列番号１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなるか若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、を含むとよい。
【００１６】
抗体はＴｙｒｏ３受容体の阻害剤であり、好ましくは、Ｔｙｒｏ３細胞外ドメインとのＴｙｒｏ３リガンドの結合を低減若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３媒介シグナル伝達を減少若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３リン酸化を低減若しくは阻止し、及び／又はＴｙｒｏ３二量体化を低減若しくは阻止する阻害剤であるとよい。
【００１７】
抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体であるとよい。
【００１８】
他の態様において、本発明は、
（ａ）  本発明の抗体をコードする核酸配列、及び
（ｂ）  （ａ）の配列のいずれかに相補的な核酸、からなる群から選択される単離核酸分子に関する。
【００１９】
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターにも関する。
【００２０】
本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞にさらに関する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップと、任意的に該抗体を回収するステップとを含む、本発明の抗体を作製するための方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体、核酸、ベクター又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
最後の態様において、本発明はまた、過剰増殖性疾患又は感染性疾患の診断、予防又は処置に用いるための、本発明の抗体又は医薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、作製されたヒトＴｙｒｏ３細胞外ドメイン(ECD)の異なるフラグメントの構成を示す。
【図２】図２は、ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡ設計を示す。
【図３】図３は、ｈＴｙｒｏ３ＥＣＤに対するｓｃＦｖ／ＩｇＧのＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す。図３ＡはｓｃＦｖの結果であり、図３ＢはＩｇＧの結果である。
【図４】図４において、ｈＴｙｒｏ３、ｈＡｘｌ又はｈＭｅｒの精製細胞外ドメインをマイクロタイタープレートにコートし、抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖ(1μg/mL)の存在下でインキュベートした。図４Ａは２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５ｓｃＦｖ、図４Ｂは２７１７及び２７１８ｓｃＦｖ、図４Ｃは２７０９、２７１０、２７１１及び２７１３ｓｃＦｖを示す。結合フラグメントを抗Ｍｙｃ-ＨＲＰ抗体で標識した。
【図５】図５は、抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖとのＧＡＳ６競合アッセイである。図５Ａは、全長Ｔｙｒｏ３へのｓｃＦｖとＭＡＢ８５９との結合を示す。全長Ｔｙｒｏ３をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートにコートした。ｓｃＦｖを１０μｇ／ｍＬで用い、ＭＡＢ８５９を、１μｇ／ｍＬ(MAB859-1)、５μｇ／ｍＬ(MAB859-5)及び１０μｇ／ｍＬ(MAB859-10)の３つの濃度で用いた。全長Ｔｙｒｏ３へのｓｃＦｖ結合を抗ＨＩＳ−ＨＲＰ抗体で検出し、ＭＡＢ８５９を抗マウス−ＨＲＰ抗体で検出した。検出抗体のみの負のコントロールも示された（抗ＨＩＳ、又は抗マウス）。図５Ｂは、Ｔｙｒｏ３／ＧＡＳ６結合におけるｓｃＦｖの効果を示す。ビオチン化ＧＡＳ６(2.5μg/mL)単独又はｓｃＦｖ／ＧＡＳ６混合物を、全長Ｔｙｒｏ３コーティングプレートに室温で１時間適用した。ストレプトアビジン‐ＨＲＰ(400ng/mL)を用いてＧＡＳ６のＴｙｒｏ３への結合を検出した。ストレプトアビジン−ＨＲＰのみの存在下で測定したＯＤを示した。
【図６】図６は、ｓｃＦｖ形式（図６Ａ）とＩｇＧ形式（図６Ｂ）とにおける抗Ｔｙｒｏ３のカニクイザルＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する交差反応性を示す。
【図７】図７は、ｓｃＦｖ形式における抗Ｔｙｒｏ３のマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する交差反応性を示す。
【図８】図８は、Ｔｙｒｏ３ＥＣＤの構造ドメインへの抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖのエピトープ制限を示す。
【図９】図９は、生細胞における抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧの結合を示す。組換えヒトＴｙｒｏ３を発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞と、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞とを、ライブデッドＮＩＲ色素で染色し、ＴＹＲＯ３特異的ＭＡＢ８５９モノクローナル抗体、そのアイソタイプコントロール（上部パネル）又は個々の抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧ（中央と下部のパネル）のいずれかとともにインキュベートした。ＩｇＧアイソタイプコントロールはＩＧＸ２６５６である。ＭＡＢ００２及びＭＡＢ８５９結合は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡｂ（BD Pharmingen）で明らかにされた。抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧ結合は、ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトラムダ軽鎖Ａｂでで明らかにされた。データは、ＡＲＩＡＩＩＩフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて取得され、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（BeckmanCoulter）を用いて解析された。示されるヒストグラムは、ＨＥＫ２９３細胞の特徴的なサイズ及び粒度分布を示す生細胞に限定されている。抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧのＴｙｒｏ３特異的結合は、非トランスフェクト細胞（灰色の線）と比較して、Ｔｙｒｏ３トランスフェクト細胞（黒色の線）の蛍光強度増加によって示される。
【図１０】図１０は、本発明の、捕捉した異なる抗ｈＴＹＲＯ３ＩｇＧとヒトＴｙｒｏ３タンパク質の細胞外ドメインとの間の相互作用のセンサーグラムトレースを示す。
【図１１】図１１は、ｏｃｔｅｔＫ２においてバイオレイヤー干渉法（BLI）によって評価された抗ヒトＴｙｒｏ３ＩｇＧのカイネティックパラメータを示す
【発明を実施するための形態】
【００２５】
［定義］
本明細書で用いられるとき「Ｔｙｒｏ３」、「Ｔｙｒｏ３チロシンキナーゼ」又は「Ｔｙｒｏ３レセプター」という用語は、Ｔｙｒｏ３タンパク質、好ましくはヒトＴｙｒｏ３タンパク質を指す。ヒトＴｙｒｏ３(遺伝子ID:7301)は、Ｂｙｋ、Ｄｔｋ、Ｒｓｅ、Ｒｅｋ、Ｓｋｙ又はＴｉｆとしても知られており、受容体型チロシンキナーゼのＴｙｒｏ３／Ａｘｌ／Ｍｅｒ(TAM)ファミリーの１つである。ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は当該技術分野において周知である。参照配列は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ＿００６２９３．２及びＮＰ＿００６２８４．２である。トランスクリプトームデータベースＵｎｉＧｅｎｅにおけるヒトＴｙｒｏ３の参照エントリーは、Ｈｓ．３８１２８２である。Ｔｙｒｏ３受容体は、２つの免疫グロブリン(Ig)関連ドメインＩｇ−１及びＩｇ−２、並びに２つのフィブロネクチンＩＩＩ型(FNIII)関連ドメインＦＮＩＩＩ−１及びＦＮＩＩＩ−２を含むＮ末端細胞外ドメインからなり、単一の膜貫通ヘリックス及び細胞質チロシンキナーゼドメインが続く。各ドメインの位置は既知であり、公開データベースで容易にアクセス可能である。Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０６４１８（配列番号１）に開示されるように、ヒトＴｙｒｏ３タンパク質の細胞外ドメインは、配列番号１の４１位から１２８位までの第１のＩｇドメイン(Ig-1)、配列番号１の１３９位から２２０位までの第２のＩｇドメイン(Ig-2)、配列番号１の２２７位から３２０位までの第１のＦＮＩＩＩドメイン(FNIII-1)、及び配列番号１の３２５位から４１６位までの第２のＦＮＩＩＩドメイン(FNIII-2)を含む。Ｔｙｒｏ３タンパク質−チロシンキナーゼドメインは、配列番号１の５１８位から７９０位まで及んでいる。
【００２６】
本明細書で定義されるような「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の1つによってコードされる抗体由来定常領域を意味する。本明細書で用いられるとき「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」は、カッパ（Ｃカッパ）又はラムダ（Ｃラムダ）軽鎖によってコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は、通常単一ドメインを含み、本明細書で定義されるように、Ｃカッパ又はＣラムダの１０８〜２１４位を指し、ナンバリングはＥＵインデックスによるものである（Kabat等、1991、Sequencesof Proteins of Immunological Interest、5th Ed., UnitedStates Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。本明細書で用いられるとき「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定するための、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロン遺伝子によってコードされる抗体の領域を意味する。全長ＩｇＧ抗体については、本明細書で定義される定常重鎖とは、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、従って１１８〜４４７位を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによるものである。
【００２７】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」として言及され得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」として言及され得る。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含む。軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」として言及される３つの超可変領域が割って入ったフレームワーク領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、例えば、Ｋａｂａｔ（「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、E.Kabat等、U.S. Department of Health and HumanServices、（1983年）参照）や、Ｃｈｏｔｈｉａのように正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成物である軽鎖及び重鎖の複合フレームワーク領域は、主に抗原への結合に関与するＣＤＲを配置及びアライメントする働きをする。
【００２８】
本明細書で用いられるとき「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域とは、ＣＤＲとして規定される領域を除いた抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された隣接領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)にさらに細分されることができる。
【００２９】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat等、1991年）、並びに/又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）;Chothia及びLesk、J.Mol. Biol 1987;196：901-917）を通常含む。ＡｂＭＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の折衷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触」ＣＤＲは、利用可能な複合体の結晶構造解析に基づいている。ＩＭＧＴの固有のナンバリングは、抗原受容体、鎖型又は種が何であれ、可変ドメインを比較するために定義されている（Lefranc M.-P.、Immunology Today 18,509（1997）; Lefranc M.-P.、The Immunologist 、7,132-136（1999）; Lefranc、M.-P.等、Dev. Comp. Immunol.、27、55-77（2003））。通常、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、上記のＫａｂａｔ等の方法によって実施される。
【００３０】
「Ｋａｂａｔ位置」又は「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリング」及びその変形の用語は、上記のＫａｂａｔ等の抗体の編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又は可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲへの挿入に相当するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列の相同性領域における「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのアライメントにより、所定の抗体について決定され得る。
【００３１】
本明細書で使用される「約」という用語は、特定値の値±１０％の範囲、より好ましくは特定値の値±５％の範囲を指す。例えば、「約１」は、１０％を考慮する場合に０．９〜１．１を意味し、５％を考慮する場合に０．９５〜１．０５を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられるとき「実質的にからなる」という用語は、参照配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を指す。配列は、参照配列に対して置換、好ましくは保存的置換、挿入又は欠失を含み得る。好ましくは、配列は、参照配列に対して１〜１０の置換、挿入又は欠失、より好ましくは参照配列に対して１、２、３、４又は５、さらにより好ましくは１又は２の置換、挿入又は欠失を含むことができる。所定の実施形態において、置換、挿入及び／又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、フレームワーク領域）に生じる。
【００３３】
本明細書で用いられるとき、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列のアライメントからの位置の一致数（％）（同一のアミノ酸残基）に関する。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながらオーバーラップ及び同一性を最大化するようにアライメントした時に配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを用いて、決定されるとよい。同様の長さの配列は、最も有利には長さ全体にわたり配列をアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例として、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム、ニードルマン及びウンシュ、１９７０年）を用いて好ましくはアライメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例として、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（スミス及びウォーターマン、１９８１年）又はアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）アルゴリズム（アルトシュル他、１９９７年、アルトシュル他、２００５年）を用いて好ましくはアライメントされる。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアライメントは、当該技術の範囲内の種々の方法でおこなわれ得、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/、又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/などのインターネット上のウェブサイトにおいて公衆に利用可能なコンピュータソフトウエアが用いられる。当業者は、比較される配列全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のため、アミノ酸配列同一性率値はペアワイズシーケンスアライメントプログラムであるＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを用いて生成された値に関し、該ペアワイズシーケンスアライメントプログラムは、全ての検索パラメータがデフォルト値に設定される、即ち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定される、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを用いて、２つの配列の最適なグローバルアライメントを求める。
【００３４】
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において既知であり、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷型極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐した側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３５】
本明細書で用いられるとき、ポリペプチド又は核酸に関する「精製された」又は「単離された」という用語は、その自然の媒体又は形態ではないポリペプチド又は核酸を指す。従って、「単離された」という用語は、その元の環境、例えば自然に存在する場合であれば自然環境から取り出されたポリペプチド又は核酸を含む。例として、単離されたポリペプチドは、それが通常付随しているか、又は通常混合されているか若しくは溶解されている細胞の少なくともいくつかのタンパク質又は他の成分を典型的には欠いている。単離されたポリペプチドは、細胞溶解物に含まれる自然に産生されたポリペプチド、精製又は部分的に精製された形態のポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞によって発現又は分泌されるポリペプチド、並びに異種宿主細胞又は培養物内のポリペプチドを含む。核酸に関して、単離又は精製されたという用語は、例えば、核酸がその自然のゲノム状況にはないということを示す（例えば、プロモーターに連結され、又は異種宿主細胞に人工的に導入される、発現カセットとしてのベクターにある）。
【００３６】
［本発明の抗体］
本発明は、ヒト対象におけるＴｙｒｏ３受容体活性を有効且つ選択的に調節するために治療的に有用な新規抗体の作製に基づく。
【００３７】
従って、第１の態様において、本発明は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の細胞外ドメインに結合する抗体に関する。
【００３８】
本明細書における「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、及びその誘導体を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体と1つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有会合又は非共有会合によって形成されたより大きな融合分子の一部であり得る。
【００３９】
一部の実施形態では、抗体は全長抗体である。本明細書で用いられるとき「全長抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指し、以下に規定される抗体フラグメントではない。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。好ましい実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される全長ＩｇＧ抗体の抗体であり、好ましくは全長ＩｇＧ１抗体である。
【００４０】
一部の他の実施形態では、抗体は抗体フラグメントである。「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般にその抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的にはＶＨ及びＣＨ１ドメイン）及びｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）フラグメント、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、カッパボディー、線状抗体、一本鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体、並びに抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメント（例えば、Holliger及びHudson、NatBiotechnol. 2005 Sep; 23（9）：1126-36）を含む。抗体フラグメントは、インタクトな抗体や組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）のタンパク質消化を含むが、これに限定されない様々な技術によって作製されることができる。これらの技術は当業者に周知であり、文献に広く記載されている。
【００４１】
抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力をその名前が表す残りの「Ｆｃ」フラグメントとが産生される。ペプシン処理では、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００４２】
本明細書で用いられるとき「Ｆａｂ」、「Ｆａｂフラグメント」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、個別のこの領域又は本明細書に記載のポリペプチドに関するこの領域を指し得る。
【００４３】
Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を付加することにより、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々それらの間にヒンジシステインを有する対のＦａｂ’フラグメントとして産生されたものである。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【００４４】
本明細書で用いられるとき「Ｆｖ」、「Ｆｖ領域」又は「Ｆｖフラグメント」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。このフラグメントは、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。一実施形態では、２本鎖Ｆｖ種は、緊密で非共有の会合である1つの重鎖及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものに類似する「二量体」構造で会合可能であるように、フレキシブルペプチドリンカーによって共有結合されることができる。Ｆｖは、個別のこの領域又は本明細書に記載のポリペプチドに関するこの領域を指し得る。
【００４５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthunによる、The Pharmacology of MonoclonalAntibodies、vol. 113、Rosenburgand Moore eds.、Springer-Verlag、NewYork、pp.269-315（1994）に記載されている。
【００４６】
本明細書で用いられる「Ｆｃ」、「Ｆｃフラグメント」又は「Ｆｃ領域」とは、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２(CH2)及びＣγ３(CH3)並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃ２２６、Ｐ２３０又はＡ２３１位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで及ぶと規定され、ナンバリングはＥＵインデックス指数に従う。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによると残基４４７）は、例えば、抗体の作製若しくは精製時に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去され得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、並びにＫ４４７残基ありなしの抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。Ｆｃは、個別のこの領域又は本明細書に記載のポリペプチドに関するこの領域を指し得る。
【００４７】
「ダイアボディー」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の2つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディーは二価又は二重特異性であってよい。ダイアボディーは、例えば、Hudson等、Nat. Med. 9：129-134（2003）、及びHollinger等、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448（1993）により詳細に記載される。トリアボディー及びテトラボディーも、Hudson等、Nat. Med. 9：129-134（2003）に記載される。
【００４８】
一部の好ましい態様において、抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント及びダイアボディーからなる群から選択される抗体フラグメントである。
【００４９】
本明細書で用いられるとき「抗体誘導体」という用語は、例えば全長抗体又は抗体のフラグメントである本明細書で提供される抗体を指し、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、又はエステル若しくはアミド形成などによって化学的に修飾されているものである。特に、この用語は、当該技術分野において周知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾された、本明細書で提供される抗体を指し得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの例としては、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランおよびポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
誘導体はまた、細胞傷害剤、蛍光部分などの検出可能な部分、診断用放射性同位体若しくはイメージング剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の異種分子；又はアガロースビーズなどのような固体担体、にコンジュゲートされた本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体を含む免疫複合体であってもよい。細胞傷害剤の例には、化学療法剤若しくは薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の、又はそのフラグメントの、タンパク質毒素、酵素活性毒素）又は放射性同位体が含まれるが、これらに限定されない。抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、当業者に周知の種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。リンカーは、細胞内の細胞傷害性薬剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari等、Cancer Res. 52：127-131（1992））を使用することができる。
【００５１】
本発明の抗体は、機能型Ｆｃ領域、天然配列Ｆｃ領域又は変異型Ｆｃ領域を含むことができる。
【００５２】
「機能型Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域のエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」にはＣ１ｑ結合、細胞依存性細胞傷害性（Cell Dependent Cytotoxicity、CDC）、Ｆ受容体結合、抗体依存性細胞傷害性（Antibody Dependent Cell Cytotoxicity、ADCC）、貪食作用、抗体依存性細胞貪食（Antibody Dependent Cell Phagocytosis、ADCP）、細胞表面受容体下方調節などを含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合することを必要とし、様々な周知のアッセイを用いて評価されることができる。
【００５３】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、並びに自然に存在するそれらの変異体が含まれる。
【００５４】
「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも1つのアミノ酸改変、好ましくは1つ以上のアミノ酸置換によって、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、これは例えば天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域における約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換などである。本明細書の変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００５５】
所定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施形態では、結合特異性の１つはＴｙｒｏ３、特にヒトＴｙｒｏ３の細胞外ドメインに対するものであり、もう１つは任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、Ｔｙｒｏ３の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、Ｔｙｒｏ３を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製されることができる。
【００５６】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein及びCuello、Nature305：537（1983）、国際公開第93/08829号、並びにTraunecker等、EMBO J. 10：3655（1991）を参照）、並びに「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」設計（例えば、米国特許第5,731,168号を参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果（electrostatic steering effects）を生じさせること（国際公開第2009/089004A1号）、２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば米国特許第4,676,980号、及びBrennan等、Science 229：81（1985）を参照）、二重特異性抗体を作製するためにロイシンジッパーを使用すること（例えばKostelny等、J. Immunol、148（5）：1547-1553（1992）を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディー」技術を使用すること（例えば、Hollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90：6444-6448（1993）を参照）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えばGruber等、J. Immunol 152：5368（1994）を参照）、及び例えば、Tutt等、J. Immunol. 147：60（1991）に記載のように三重特異性抗体を調製すること、によって作製されるとよい。「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国出願公開第2006/0025576A1号参照）。
【００５７】
好ましい実施形態では、抗体は単離された抗体である。「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。特に抗体は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって測定されるとき純度９５％又は９９％より高く精製されるとよい。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman等、J. Chromatogr. B 848：79-87（2007）が参照される。
【００５８】
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で用いられるとき「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、該集団を構成する個々の抗体が、少量で存在する自然に発生し得る突然変異を除いて同一であるもの、を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を標的とする。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature 256：495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばClackson等、Nature 352：624-628（1991）及びMarks等、J. Mol. Biol. 222：581-597（1991）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５９】
本発明の抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体であってもよい。
【００６０】
「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方で、残余の鎖は、所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は相同である（Morrison等、Proc. Natl. Acad Sci. USA 81：6851-6855（1984））。好ましくは、抗体のフレームワークの少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である。
【００６１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、多くの部分において、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメイン、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分も含み、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む（Jones等、Nature 321：522-525（1986）;Reichmann等、Nature332：323.329 （1988）;及びPresta、Curr. Op. Struct.Biol. 2：593-596（1992））。
【００６２】
キメラ抗体又はヒト化抗体は、当業者に周知であり、且つ文献に広く記載されている様々な技術によって作製されることができる。
【００６３】
「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する、及び／又は本明細書に開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除くものである。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野で既知の様々な技術を用いて作製され得る（Hoogenboom及びWinter、J.Mol. Biol.、227：381（1991）、Marks等、J. Mol.Biol.、222：581（1991））。ヒトモノクローナル抗体の調製のために、Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、AlanR.Liss、p. 77（1985）;Boerner等、J. Immunol.、147（1）：86-95（1991）に記載の方法も利用される。また、van Dijk及びvan de Winkel、Curr. Opin. Pharmacol.、5：368-74（2001）も参照される。ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するように改変されているがその内因性遺伝子座が無効化されて（例えば免疫化ゼノマウス）ヒト遺伝子座に置き換えられているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって、調製することができる（例えば、XENOMOUSE（登録商標）技術に関する米国特許第6,075,181号及び米国特許第6,150,584号参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体に関して、例えば、Li等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、103：3557-3562（2006）も参照される。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒト又はヒト化モノクロ―ナル抗体、さらに好ましくはヒトモノクローナル抗体である。
【００６５】
本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、Ｔｙｒｏ３、特にヒトＴｙｒｏ３に対して高い特異性及び／又は選択性を示す。
【００６６】
「特異的結合」又は「特異性」とは、本明細書で用いられるとき、Ｔｙｒｏ３などの抗原上に存在するエピトープに検出可能に結合する一方、他のタンパク質又は構造（他のＴＡＭ受容体など）に検出可能な反応をあまり示さない抗体の能力を指す。抗体特異性は、実験の項に記載されるようなＥＬＩＳＡ結合アッセイなどの周知の方法を用いた交差反応性の測定によって決定することができる。特異性は、他の無関係の分子への非特異的結合に対する特異的抗原への結合における親和性／結合活性について、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０，０００：１又はそれより大きい比で示されることができる。
【００６７】
「選択的結合」又は「選択性」とは、1つ以上の他の生物学的分子、構造、細胞、組織などとは対照的に、特定の領域、標的、又はペプチドへのタンパク質の優先的結合を指す。Ｔｙｒｏ３結合抗体は、特定の生体において（例えば、マウス生体とは対照的にヒトにおいて）産生されるＴｙｒｏ３受容体、及び／又はＴｙｒｏ３受容体の特定の部分（特定のエピトープ又は抗原決定基領域など）に選択性がある。例えば、選択性は、競合ＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅアッセイによって測定されることができる。選択性を示す親和性／結合活性の違いは、任意の検出可能な優先度であり得る（例えば、検出可能な場合、１：１．１を超える、又は約１：５を超える比が適切であり、１：１０、１：１００、１：１０００以上を含む）。
【００６８】
好ましくは、本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、特異的に／選択的にヒトＴｙｒｏ３に結合する。特に、該抗体は、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体、及び／又はマウスＴｙｒｏ３などの非霊長類哺乳類Ｔｙｒｏ３、並びに特にこれらの受容体の細胞外ドメインに、顕著に結合するものではない。
【００６９】
一部の実施形態において、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体の細胞外ドメインに顕著結合するものではない。ヒトＡｘｌタンパク質の配列はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３０５３０（配列番号６）に開示され、細胞外ドメインは配列番号６の２６位から４５１位に及ぶ。ヒトＭｅｒタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１２８６６（配列番号７）に開示され、細胞外ドメインは、配列番号７の２１位から５０５位に及ぶ。
【００７０】
一部の実施形態において、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、マウスＴｙｒｏ３の細胞外ドメインに顕著に結合するものではない。マウスＴｙｒｏ３タンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ５５１４４（配列番号８）に開示され、細胞外ドメインは、配列番号８の３１位から４１９位に及ぶ。
【００７１】
好ましい実施形態では、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体の細胞外ドメインに顕著に結合するものではなく、マウスＴｙｒｏ３の細胞外ドメインに結合するものでない。
【００７２】
好ましくは、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、カニクイザル（又はMacacafascicularis）Ｔｙｒｏ３受容体の細胞外ドメインにさらに結合する。カニクイザルＴｙｒｏ３タンパク質の細胞外ドメインの配列は配列番号９に開示されている。特定の実施形態では、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体の細胞外ドメインに顕著に結合せず、マウスＴｙｒｏ３の細胞外ドメインに結合せず、カニクイザルＴｙｒｏ３受容体の細胞外ドメインに結合する。
【００７３】
他の実施形態では、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＡｘｌ受容体及びヒトＭｅｒ受容体の細胞外ドメインに顕著に結合しないが、マウスＴｙｒｏ３の細胞外ドメインに結合する。この抗体は、例えば配列番号１の３１０位から３４０位に及ぶＴｙｒｏ３の細胞外ドメインの部分など、ヒトとマウスとのＴｙｒｏ３において相同である受容体のフラグメントに対するものであり得る。
【００７４】
抗Ｔｙｒｏ３抗体は、Ｔｙｒｏ３リガンド結合の競合阻害剤であり得、すなわちＴｙｒｏ３受容体に結合し、Ｔｙｒｏ３リガンドの該受容体、特にヒトＴｙｒｏ３受容体細胞外ドメインへの結合を顕著に低減又は阻害する抗体であり得る。競合阻害剤は、Ｔｙｒｏ３リガンドよりも高い親和性でＴｙｒｏ３に結合することができる。競合アッセイは、当該技術分野における標準的な技術（例えば、競合ＥＬＩＳＡ又は他の結合アッセイ）を用いて行うことができる。
【００７５】
Ｔｙｒｏ３リガンドは、ＧＡＳ６タンパク質又はプロテインＳ、好ましくはＧＡＳ６タンパク質、より好ましくはヒトＧＡＳ６タンパク質であり得る。
【００７６】
ＧＡＳ６（成長停止特異性６）は、構造的に、血漿ビタミンＫ依存性タンパク質のファミリーに属する。ＧＡＳ６は、Ｔｙｒｏ３、ＡＸＬ及びＭＥＲであるＴＡＭファミリーの受容体型チロシンキナーゼとの相互作用を介して成長因子様の特性を有する。ヒトＧＡＳ６は、リン脂質膜への結合を媒介するガンマカルボキシグルタミン酸が豊富なドメイン、４つの上皮成長因子様ドメイン、及び２つのラミニンＧ様ドメイン、からなる６７８アミノ酸のタンパク質である。トランスクリプトームデータベースＵｎｉＧｅｎｅにおけるヒトＧＡＳ６の参照エントリーは、Ｈｓ．６４６３４６である。
【００７７】
プロテインＳは、血液凝固系における抗凝固剤である。これは、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子を分解し、それによって血液凝固を阻害するプロテアーゼである活性化プロテインＣの補助因子として作用する。トランスクリプトームデータベースＵｎｉＧｅｎｅにおけるヒトプロテインＳの参照エントリーは、Ｈｓ.６４０１６である。Ｇａｓ６とプロテインＳとは、全体で４４％のアミノ酸配列同一性を示し、同じ複合マルチドメイン構造を共有し、このドメイン構成を示すマウス及びヒトゲノムにコードされるただ２つのタンパク質である。
【００７８】
本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体へのヒトＧａｓ６の結合を、少なくとも１０％、好ましくは約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５〜約９０％（実験の項に記載される競合ＥＬＩＳＡに基づいた、飽和レベルの抗体で遮断されたリガンドのパーセント）低減又は阻害し得る。特に、本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、約２５％〜約７５％、好ましくは約５０％〜７５％、より好ましくは約６０％〜約７５％の範囲のヒトＴｙｒｏ３受容体へのヒトＧａｓ６の結合を低減又は阻害することができる。
【００７９】
本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、Ｔｙｒｏ３受容体の阻害剤／アンタゴニスト又はアゴニストであり得る。
【００８０】
好ましい実施形態では、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、Ｔｙｒｏ３の阻害剤、すなわちＴｙｒｏ３受容体の少なくとも1つの活性を阻害又は低減する抗体である。
【００８１】
「Ｔｙｒｏ３受容体活性」又は「Ｔｙｒｏ３活性」には、Ｔｙｒｏ３の任意の生物学的活性、例えば、Ｔｙｒｏ３受容体への例えばＧａｓ６又はプロテインＳであるＴｙｒｏ３リガンドの結合によって増強又は誘導される活性が含まれる。特に、Ｔｙｒｏ３受容体は、細胞生存及び増殖、精子形成、免疫調節及び貪食作用の制御に関与することが示されている。この受容体はまた、エボラ及びマールブルグウイルスの細胞侵入因子としても同定されている。
【００８２】
抗体は、例えば、Ｔｙｒｏ３リガンド（例えば、Ｇａｓ６）のＴｙｒｏ３の細胞外ドメインとの結合を低減若しくは阻止すること、Ｔｙｒｏ３媒介シグナル伝達を低減若しくは阻止すること、及び／又はＴｙｒｏ３リン酸化を低減若しくは阻止すること、及び／又はＴｙｒｏ３二量体化を低減若しくは阻止することによって、Ｔｙｒｏ３活性を阻害することができる。阻害活性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって容易にアッセイすることができる。特に、この活性は、結合アッセイ、競合結合アッセイ、又はリン酸化若しくは自己リン酸化アッセイによって測定されることができる。
【００８３】
一部の他の実施形態では、抗Ｔｙｒｏ３抗体は、Ｔｙｒｏ３のアゴニスト、すなわちＴｙｒｏ３受容体の活性を刺激する抗体である。アゴニストは、例えば、Ｔｙｒｏ３リガンドの受容体への結合を促進して、受容体の二量体化を誘導若しくは促進し、及び／又はＴｙｒｏ３リン酸化を誘導若しくは促進し、及び／又はＴｙｒｏ３媒介シグナル伝達を向上させることができる。アゴニスト活性は、上記のような当該技術分野で既知の任意の方法によって容易にアッセイすることができる。
【００８４】
本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の細胞外ドメイン（配列番号１の４１位から４２９位）に結合する。抗体は、２つの免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１及びＩｇ−２のうちの1つ以上、並びに／又は２つのフィブロネクチンＩＩＩ型様ドメインＦＮＩＩＩ−１及びＦＮＩＩＩ−２のうちの1つ以上に結合することができる。
【００８５】
好ましい実施形態において、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合する。特に、そのような抗体は、
AGLKLMGAPVKLTVSQGQPVKLNCSVEGMEEPDIQWVKDGAVVQNLDQLYIPVSEQHWIGFLSLKSVERSDAGRYWCQVEDGGETEISQPVWLT(配列番号２)
のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなるポリペプチドに結合し得る。
【００８６】
一部の他の実施形態では、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２に結合しない。好ましくは、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に特異的又は選択的に結合する。特に、そのような抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなるポリペプチドと、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなるポリペプチドに結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなるポリペプチドに結合しないか、又は顕著に結合しない。
【００８７】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には顕著に結合しない。
【００８８】
特に、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【００８９】
好ましくは、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【００９０】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDEKRASGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSQERNGNYAVFGGGTKLTVL(配列番号１０)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGQIVPRASRTNYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRPYFQTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号１１)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【００９１】
配列番号１０及び１１の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表１に示される。
【００９２】
表１は、配列番号１０及び１１の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表１】
2018512892.tif 000002
【００９３】
別の特定の実施形態では、抗体は、配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には顕著に結合しない。
【００９４】
特に、抗体は、配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【００９５】
好ましくは、抗体は、配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【００９６】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDWKRASGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSQERKGNYFVFGGGTKLTVL(配列番号３２)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGQINRHASNTMYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRSGGATSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号３３)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【００９７】
配列番号３２及び３３の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表２に示される。
【００９８】
表２は、配列番号３２及び３３の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表２】
2018512892.tif 000003
【００９９】
さらなる特定の実施形態では、抗体は、配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には顕著に結合しない。
【０１００】
特に、抗体は、配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１０１】
好ましくは、抗体は、配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１０２】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDKKRVSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSLAVDGNYGVFGGGTKLTVL(配列番号４６)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGAISRNGSTTYYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRSGGLTSGGTIPEYYQHWGPGTLVPVSSVD(配列番号４７)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１０３】
配列番号４６及び４７の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表３に示される。
【０１０４】
表３は、配列番号４６及び４７の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表３】
2018512892.tif 000004
【０１０５】
他の特定の実施形態では、抗体は、配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には顕著に結合しない。
【０１０６】
特に、抗体は、配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１０７】
好ましくは、抗体は、配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１０８】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSQNPQGNYFVFGGGTKLTVL(配列番号６０)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGVINKYASWTRYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRSGGLTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号６１)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１０９】
配列番号６０及び６１の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表４に示される。
【０１１０】
表４は、配列番号６０及び６１の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表４】
2018512892.tif 000005
【０１１１】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２には顕著に結合しない。
【０１１２】
特に、抗体は、配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１１３】
好ましくは、抗体は、配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１１４】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDNKRGSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSKSPEGNYMVFGGGTKLTVL(配列番号７４)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGEIFLPPSTTVYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRQTRLTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号７５)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１１５】
配列番号７４及び７５の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表５に示される。
【０１１６】
表５は、配列番号７４及び７５の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表５】
2018512892.tif 000006
【０１１７】
一部の実施形態において、抗体は、免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合するが、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２に結合せず、又は顕著に結合せず、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１０、３２、４６、６０又は７４、好ましくは配列番号１０、３２、４６、又は６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１１、３３、４７、６１又は７５、好ましくは配列番号１１、３３、４７、又は６１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖、を含む。
【０１１８】
一部の実施形態において、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１に結合し、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２に結合する。特に、そうした抗体は、
‐  配列番号２のアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチド、及び
‐  AGLKLMGAPVKLTVSQGQPVKLNCSVEGMEEPDIQWVKDGAVVQNLDQLYIPVSEQHWIGFLSLKSVERSDAGRYWCQVEDGGETEISQPVWLTVEGVPFFTVEPKDLAVPPNAPFQLSCEAVGPPEPVTIVWWRGTTKIGGPAPSPSVLNVTGVTQSTMFSCEAHNLKGLASSRTATVHLQ(配列番号３)であるアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチド、及び
‐  VPFFTVEPKDLAVPPNAPFQLSCEAVGPPEPVTIVWWRGTTKIGGPAPSPSVLNVTGVTQSTMFSCEAHNLKGLASSRTATVHLQALPAAPFNITVTKLSSSNASVAWMPGADGRALLQSCTVQVTQAPGGWEVLAVVVPVPPFTCLLRDLVPATNYSLRVRCANALGPSPYADWVPFQTKGLA(配列番号４)であるアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチド、に結合し得る。
【０１１９】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号８８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１２０】
特に、抗体は、配列番号８８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１２１】
好ましくは、抗体は、配列番号８８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１２２】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDSKRSSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSANQRGNYMVFGGGTKLTVL(配列番号８８)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGSITRSSSRTHYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRGYTHLRTWGPGTLVTVSS(配列番号８９)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１２３】
配列番号８８及び８９の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表６に示される。
【０１２４】
表６は、配列番号８８及び８９の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表６】
2018512892.tif 000007
【０１２５】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１０３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１２６】
特に、抗体は、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１０３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１２７】
好ましくは、抗体は、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１０３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１２８】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDAKRVSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSASANGNYRVFGGGTKLTVL(配列番号１０２)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGRIRPLLSHTMYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRSWLATSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号１０３)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１２９】
配列番号１０２及び１０３の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表７に示される。
【０１３０】
表７は、配列番号１０２及び１０３の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表７】
2018512892.tif 000008
【０１３１】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１３２】
特に、抗体は、配列番号１１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１３３】
好ましくは、抗体は、配列番号１１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１３４】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDDKRLSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSTEINGNYAVFGGGTKLTVL(配列番号１１６)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGRIHTYQSSTRYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRHHSTTTANPYSSWGPGTLVTVSS(配列番号１１７)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１３５】
配列番号１１６及び１１７の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表８に示される。
【０１３６】
表８は、配列番号１１６及び１１７の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表８】
2018512892.tif 000009
【０１３７】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１３１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１３８】
特に、抗体は、配列番号１３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１３１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１３９】
好ましくは、抗体は、配列番号１３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１３１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１４０】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDKKRISGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSTSTGGNYMVFGGGTKLTVL(配列番号１３０)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGQIRGPASATHYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRHQQQTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号１３１)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１４１】
配列番号１３０及び１３１の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表９に示される。
【０１４２】
表９は、配列番号１３０及び１３１の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表９】
2018512892.tif 000010
【０１４３】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１４５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１４４】
特に、抗体は、配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１４５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１４５】
好ましくは、抗体は、配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１４５の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１４６】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDAKRSSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSLSDSGNYFVFGGGTKLTVL(配列番号１４４)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGQIRGQHSSTLYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRHGASTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号１４５)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１４７】
配列番号１４４及び１４５の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表１０に示される。
【０１４８】
表１０は、配列番号１４４及び１４５の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表１０】
2018512892.tif 000011
【０１４９】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１とヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合する。
【０１５０】
特に、抗体は、配列番号１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１５１】
好ましくは、抗体は、配列番号１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１５２】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDHKRASGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSISPAGNYGVFGGGTKLTVL(配列番号１５８)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGRISRHGSQTYYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRAGGQTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS(配列番号１５９)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１５３】
配列番号１５８及び１５９の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表１１に示される。
【０１５４】
表１１は、配列番号１５８及び１５９の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表１１】
2018512892.tif 000012
【０１５５】
一部の実施形態において、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３の免疫グロブリン様ドメインＩｇ−１と免疫グロブリン様ドメインＩｇ−２とに結合し、
配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号８８、１０２、１１６、１３０、１４４、又は１５８、好ましくは配列番号１０２、１１６、１３０、１４４、又は１５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３とを含む軽鎖、並びに
配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号８９、１０３、１１７、１３１、１４５、又は１５９、好ましくは配列番号１０３、１１７、１３１、１４５、又は１５９の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３からなる、又は実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３とを含む重鎖、を含む。
【０１５６】
他の実施形態において、抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインＦＮＩＩＩ−１に結合する。特に、そうした抗体は、
‐  配列番号４のアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチド、及び
‐  AAPFNITVTKLSSSNASVAWMPGADGRALLQSCTVQVTQAPGGWEVLAVVVPVPPFTCLLRDLVPATNYSLRVRCANALGPSPYADWVPFQTKGLAPASAPQNLHAIRTDSGLILEWEEVIPEAPLEGPLGPYKLSWVQDNGTQDELTVEGTRANLTGWDPQKDLIVRVCVSNAVGCGPWSQPLVVSSHDR(配列番号５)であるアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチド、に結合し得、
配列番号２又は３のアミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチドに結合しない。
【０１５７】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、配列番号１７３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とからなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。好ましくは、該抗体は、ヒトＴｙｒｏ３受容体のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインＦＮＩＩＩ−１に結合する。
【０１５８】
特に、抗体は、配列番号１７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む軽鎖、並びに／又は配列番号１７３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、若しくは３つ、好ましくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。
【０１５９】
好ましくは、抗体は、配列番号１７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、配列番号１７３の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含む。
【０１６０】
さらに特定の実施形態において、抗体は、
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDTKRHSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSAEHRGNYAVFGGGTKLTVL(配列番号１７２)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる軽鎖可変領域と、
EVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGHINPMRSTTTYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWHSLEASDTAMYYCVRNDNHDDYTYTDDWGPGTLVTVSS(配列番号１７３)
のアミノ酸からなる、又は実質的にそれからなる重鎖可変領域と、を含む。
【０１６１】
配列番号１７２及び１７３の可変領域の、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＩＭＧＴ定義システムによるＣＤＲの配列は、表１２に示される。
【０１６２】
表１２は、配列番号１７２及び１７３の可変領域のＣＤＲ配列を示す。
【表１２】
2018512892.tif 000013
【０１６３】
好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１を含み、及び／又は配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１を含む。好ましくは、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１からなるＣＤＲ−Ｌ１を含み、且つ配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１からなるＣＤＲ−Ｈ１を含む。
【０１６４】
さらに特定の好ましい実施形態において、抗体は、Ｋａｂａｔ定義による、
‐  アミノ酸コンセンサス配列SGDALPKKYAY(配列番号１２)からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、
‐  アミノ酸コンセンサスEDX1RX2(配列番号１８６)からなる、若しくは実質的にそれからなり、X1はE、W、K、S、N、A、D、H、若しくはT、好ましくはE、W、K、S、N、A、D、若しくはHであり、X2はA、V、P、G、S、V、L、I、若しくはH、好ましくはA、V、P、G、S、V、L、若しくはIである、ＣＤＲ−Ｌ２、
‐  アミノ酸コンセンサスYSX1X2X3X4GNYX5V(配列番号１８７)からなる、若しくは実質的にそれからなり、X1はQ、L、K、A、T、L、若しくはIであり、X2はE、A、N、若しくはSであり、X3はR、V、P、Q、A、I、T、D、若しくはH、好ましくはR、V、P、Q、A、I、T、若しくはDであり、X4はN、K、D、Q、E、R、G、S、若しくはAであり、X5はA、F、G、M、若しくはRである、ＣＤＲ−Ｌ３、
‐  アミノ酸コンセンサス配列DYWIS(配列番号２１)からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、
‐  アミノ酸コンセンサスX1IX2X3X4X5SX6TX7YGPSFQG(配列番号１８８)からなる、若しくは実質的にそれからなり、X1はQ、A、V、E、S、R、若しくはH、好ましくはQ、A、V、E、S、若しくはRであり、X2はV、N、S、F、T、R、若しくはHであり、X3はP、R、K、L、T、若しくはGであり、X4はR、H、N、Y、P、S、L、Q、若しくはM、好ましくはR、H、N、Y、P、S、L、若しくはQであり、X5はA、G、P、S、L、Q、H、若しくはR、好ましくはA、G、P、S、L、Q、若しくはHであり、X6はR、N、T、W、H、S、A、若しくはQであり、X7はN、M、Y、R、V、H、L、若しくはT、好ましくはN、M、Y、R、V、H、若しくはLである、ＣＤＲ−Ｈ２、及び／又は、
‐  アミノ酸コンセンサスX1X2X3X4TSGGTIPEYYQH(配列番号１８９)からなる、若しくは実質的にそれからなり、X1はP、S、Q、H、若しくはAであり、X2はY、G、T、W、若しくはQであり、X3はF、G、R、L、Q、若しくはAであり、X4はQ、A、L、若しくはSであるＣＤＲ−Ｈ３、又はGYTHLRT(配列番号９９)、HHSTTTANPYSS(配列番号１２７)、若しくはNDNHDDYTYTDD(配列番号183)のアミノ酸配列のうちの１つからなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ３、好ましくは、上記規定のアミノ酸コンセンサスX1X2X3X4TSGGTIPEYYQH(配列番号１８９)からなる、若しくは実質的にそれからなるＣＤＲ−Ｈ３、
のＣＤＲのうちの１、２、３、４、５又は６つ、好ましくは６つを含む。
【０１６５】
本発明の抗体は、Ｔｙｒｏ３に対する結合活性が実質的に保持されるならば、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。特定の実施形態では、抗体の可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲ（ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４）を分離する領域によって配列番号１０及び１１に規定されるとおりである。
【０１６６】
好ましい実施形態では、抗体は全長ＩｇＧ抗体、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１抗体である。抗体は、上記の軽鎖及び重鎖の可変領域の任意のもの、ヒトＩｇＧ定常鎖、好ましくはＩｇＧ１鎖、並びにヒトラムダ鎖又はヒトカッパ鎖、好ましくはラムダ鎖を含み得る。ヒトＩｇＧ１定常鎖の例示的配列を配列番号１９０に示す。ヒトラムダ定常鎖の例示的配列を配列番号１９１に示す。
【０１６７】
好ましい実施形態において、抗体はヒトＴｙｒｏ３受容体に高親和性で結合する。「結合親和性」は、一般に、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用全体の強度を指す。他に示されない限り、本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、結合ペア（例えば抗体と抗原）のメンバー間における１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で既知の一般的な方法によって測定されることができる。低親和性抗体は一般に抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、長期間結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。
【０１６８】
所定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１×１０−６Ｍ以下のＫｄ、より好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、さらにより好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２または１×１０−８Ｍ以下のＫｄを有する。最も好ましい実施形態では、本明細書で提供される抗体は、９、８、７、６、５、４、３、２又は１×１０−９Ｍ以下の解離定数を有する。
【０１６９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、３．１×１０−７Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、好ましくは、表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２４１０、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５、２７１０、２７１１又は２７１３の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体の群から選択される。他の実施形態では、本発明の抗体は、１．４×１０−７Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、好ましくは、表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２４１０、２４１２、２４１３、２４１５、２７１０、又は２７１３の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体の群から選択される。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、７．４×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、好ましくは、表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２４１０、２４１５、２７１０又は２７１３の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体の群から選択される。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、４×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、好ましくは、表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２７１３の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体である。
【０１７０】
Ｋｄは、当業者に既知の任意の技術を用いて測定されることができる。特に、抗Ｔｙｒｏ３抗体とヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤ（配列番号１の４０位から４２９位）との間の結合親和性を測定するために、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（GE Healthcare、Uppsala、Sweden）を用いた表面プラズモン共鳴（surface plasmonresonance、SPR）測定を、アフィボディ（登録商標）（AFFIBODYAB、参照カタログ番号10.0623.02.0005）でコーティングされたシリーズＳのＣＭ５センサーチップ上で行うことができる。１５秒から５５秒の注入時間を用いて、約１００ＲＵの最大応答を得るようにＩｇＧを捕捉することができる。カイネティクス測定のため、０．１５〜１０μＭのヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤの溶液を、３０μｌ／分の流速において２５℃でＰＢＳ−Ｐ緩衝液に注入するとよい。平衡解離定数（ＫＤ）は、異種リガンドモデル及び1：1モデルを用いて算出することができる（BIAcore評価ソフトウェアバージョン3.2）。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される（例えば、Chen等、J. Mol. Biol. 293：865-881（1999）を参照のこと）。Ｋｄ、ｋｏｆｆ（又はＫｄｉｓ）及びｋｏｎ定数は、以下の実験の項（実施例５参照）に記載されるように、バイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry、BLI）によって測定することもできる。
【０１７１】
一部の特定の実施形態では、本発明の抗体は、１×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９×１０４Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ定数を有する。より好ましくは、本発明の抗体は、１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、好ましくは１．２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ定数を有し、好ましくは表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２４１０又は２７１３の軽鎖及び重鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体の群から選択される。
【０１７２】
一部の特定の実施形態では、本発明の抗体は、１×１０−２ｓ−１以下、好ましくは９、８、７、６、５、４×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ定数を有する。より好ましくは、本発明の抗体は、３×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ定数を有し、好ましくは表１３及び表１４に記載のＳｃＦｖ２７１０の軽鎖及び重鎖の可変ドメイン又はＣＤＲ配列を有する抗体である。
【０１７３】
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴｙｒｏ３との結合において、上述のような抗体と、より詳細には表１３に記載の抗体、すなわち抗体２４１０、２４１４、２７０９、２７１０、２７１７、２４１１、２４１２、２４１３、２４１５、２７１１、２７１３及び２７１８からなる群から選択される抗体と競合するヒト又はヒト化抗体を提供する。抗体は、実質的に同じエピトープに結合する場合、他の抗体と競合する。ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、ウェスタンブロット分析、又はＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用に基づくプロトコールは、単純競合試験での使用に適する。単純競合アッセイの表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適合する別の担体）である。コントロール抗体（例えば、表１３に記載の抗体の１つ）を、抗原飽和濃度の表面に接触させ、抗原を保持する表面へのコントロール抗体の結合を測定する。コントロール抗体の該結合を、候補抗体の存在下で抗原を保持する表面へのコントロール抗体の結合と比較する。アッセイ試験において、候補抗体の存在下でのコントロール抗体の結合の有意な減少は、候補抗体が実質的にコントロール抗体と同じエピトープを認識し、したがってこの抗体と競合することを示す。コントロール抗体の結合を、少なくとも約３０、４０又は５０％、好ましくは少なくとも約６０、７０％、又はそれ以上減少させる候補抗体は、コントロール抗体と競合する抗体と考えることができる。コントロール抗体と候補抗体との順序を逆にすることができる、すなわち、競合試験においてコントロール抗体を最初に表面に結合し、候補抗体を続いて表面に接触することができるということが理解されるべきである。
【０１７４】
所定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位を作製又は除去するようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に行われ得る。
【０１７５】
抗体がＦｃ領域を含むところで、それに付加された炭水化物は変更され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然の抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合によって通常付加される分枝状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright等、TIBTECH、1997、15：26-32参照）。オリゴ糖は、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮＡｃに付加されたフコースなどの種々の炭水化物を含み得る。一部の実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、所定の改善特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。
【０１７６】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体のフコース量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％又は２０％〜４０％であり得る。フコース量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定されるようなＡｓｎ２９７に付加されたすべての糖構造の合計に対して（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって測定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）。しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の小規模の配列変異に起因して、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち２９４位〜３００位の間に位置し得る。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例としては、Okazaki等、J. Mol. Biol. 336：1239-1249（2004）及びYamane-OhnukiN、Satoh M、mAbs. 2009; 1：230-236を含むが、これらに限定されない。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化において欠損があるＬｅｄ３ＣＨＯ細胞（Ripka等、Arch. Biochem. Biophys. 249：533-545（1986））、及びα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki等、Biotech. Bioeng. 87：614（2004）；Kanda. Y等、Biotechnol. Bioeng.、94（4）：680-688（2006）を参照）を含む。
【０１７７】
所定の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されたシステイン改変抗体、例えば「チオＭＡｂｓ」を作製することが望ましいことがある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は抗体のアクセス可能な部位に配置され、以下にさらに記載されるように、薬剤部分又はリンカー‐薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするように用いられて、イムノコンジュゲートを作製することができる。所定の実施形態では、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）である残基のいずれか1つ以上がシステインで置換されていてもよい。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製され得る。
【０１７８】
［核酸、ベクター、宿主細胞及び組換体の作製］
別の態様では、本発明は、上述のような本発明の抗体をコードする核酸、又はそのコード配列に相補的な核酸に関する。好ましくは、核酸は単離又は精製された核酸である。
【０１７９】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ若しくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はそれら２つの混合物であり得る。核酸は、一本鎖形態、又は二本鎖形態、又はそれら２つの混合であってもよい。核酸は、例えば修飾された結合、修飾されたプリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾された糖を含む、修飾されたヌクレオチドを含むことができる。核酸は、化学合成、組換え、及び突然変異誘発を含む、当業者に既知の任意の方法によって調製されることができる。本発明による核酸は、本発明による抗体の配列から推定することができ、コドンの使用は、核酸が転写される宿主細胞に従って調節することができる。これらのステップは、当業者に周知の方法に従って実施することができ、そのうちの一部はＳａｍｂｒｏｏｋ等の参考マニュアルに記載されている（Sambrook J、Russell D（2001）Molecular cloning：a laboratory manual、Third Edition ColdSpring Harbor）。
【０１８０】
本発明の核酸は、抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列及び／又は抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードしてもよく、或いはそのようなコード配列に相補的であってもよい。
【０１８１】
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。任意的に、ベクターは、いくつかの本発明の核酸を含んでもよい。特に、ベクターは、調節領域、すなわち1つ以上の制御配列を含む領域に、操作可能に連結された本発明の核酸を含むことができる。任意的に、ベクターは、いくつかの調節領域に操作可能に連結された本発明のいくつかの核酸を含むことができる。
【０１８２】
「制御配列」という用語は、コード領域の発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は内因性又は異種性であってよい。周知であり、現在当業者により使用されている制御配列及び制御配列が好ましい。そのような制御配列には、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
「操作可能に連結された」という用語は、制御配列がコード領域の発現を誘発するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置される構成を意味する。
【０１８４】
本発明はさらに、宿主細胞を形質転換、トランスフェクション又は形質導入するための本発明の核酸又はベクターの使用に関する。
【０１８５】
本発明はまた、本発明の1つ以上の核酸及び／又は本発明の1つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１８６】
「宿主細胞」という用語はまた、複製時に生じる突然変異により親宿主細胞とは同一ではない親宿主細胞の任意の子孫を包含する。
【０１８７】
抗体コードベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。
【０１８８】
例として、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で作製され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号が参照される（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton、Methods in Molecular Biology、Vol. 248 (B.K.C. Lo、 ed.、 Humana Press、 Totowa、 NJ、 2003)、pp.245-254も参照される）。抗体は、発現後、可溶性画分内の細菌細胞溶解物から単離され得、さらに精製され得る。
【０１８９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は抗体コードベクターの適切なクローニング又は発現宿主であり、これは、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を作製する、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌又は酵母株を含む。Gerngross、Nat. Biotech. 22：1409-1414（2004）及びLi等、Nat. Biotech. 24：210-215（2006）が参照される。
【０１９０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と共に使用され得る、多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号を参照されたい。
【０１９１】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例として、懸濁液で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株;ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham等、J. Gen Virol. 36：59（1977）に記載されるような293又は293細胞）;ベビーハムスター腎細胞（BHK）;マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol. Reprod. 23：243-251（1980）に記載されるようなTM4細胞）;サル腎細胞（CV1）;アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）;ヒト子宮頸癌細胞（HELA）;イヌ腎細胞(MDCK);バッファローラット肝細胞(BRL 3A);ヒト胚細胞（W138）;ヒト肝細胞（Hep G2）;マウス乳房腫瘍（MMT 060562）;例えば、Mather等、Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)に記載されるようなＴＲＩ細胞;ＭＲＣ５細胞;並びにＦＳ４細胞が挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR-CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（Urlaub等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216（1980））、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体作製に適した所定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yasaki及びWuの、分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、Vol.248（B.K.C. Lo、 ed.、HumanaPress、Totowa、NJ）、pp. 255-268（2003）を参照されたい。
【０１９２】
本発明はまた、抗体の発現に適した条件下で、上記のように、本発明の核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞を培養することと、任意的に、宿主細胞又は宿主細胞培養培地から抗体を回収することとを含む、本発明の抗体を作製するための方法にも関する。任意的に、回収された抗体をさらに精製又は単離することができる。適切な培地、培養条件及び作製方法は、当業者に周知であり、宿主細胞や作製する抗体に応じて容易に選択されることができる。
【０１９３】
［医薬組成物］
本発明はさらに、本発明の抗体、核酸、ベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物に関する。組成物は、1つ以上の本発明の抗体、1つ以上の本発明の核酸、及び／又は1つ以上の本発明のベクター、及び／又は1つ以上の本発明の宿主細胞を含むことができる。好ましくは、医薬組成物は、1つ以上の本発明の抗体を含む。
【０１９４】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法によって製剤化されることができ、所望の純度を有する抗体が、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態で、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合される（Remington：The Science and Practice ofPharmacy 20th edition（2000））。
【０１９５】
本明細書で使用されるとき、「医薬製剤」又は「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態であり、且つ製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない製剤に関する。好ましくは、そのような製剤は滅菌されており、すなわち、無菌性であるか、又はあらゆる生きた微生物及びそれらの胞子を含まないものである。
【０１９６】
許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤（isotonifier）、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤及びその他の様々な添加剤を含むが、これらに限定されない。
【０１９７】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲のｐＨを維持するために利用される。緩衝剤は、好ましくは、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に適する緩衝剤には、シトラート、スクシナート、タルトラート、フマラート、グルコナート、オキサラート、ラクタート及びアセタート緩衝剤などの有機酸及び無機酸、及びそれらの塩、並びにリン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、並びにトリスなどのトリメチルアミン塩を含むが、これらに限定されない。
【０１９８】
保存剤は、微生物増殖を遅らせるために添加され得、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本発明での使用に適する保存剤は、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メタ−クレゾール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハライド（例えば、クロライド、ブロマイド、ヨーデイド）；ヘキサメトニウム又はベンゼトニウムクロライド；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；及び３−ペンタノールを含むが、これらに限定されない。
【０１９９】
等張剤は、本発明の液体組成物の等張性を確実にするために添加することがされ得、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの３価以上の糖アルコールを含む。
【０２００】
安定化剤は、増量剤から添加剤（治療剤を可溶化する、又は変性若しくは容器壁への付着の防止に利用される）までの機能の範囲であり得る広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、（上記に列挙された）多価糖アルコール；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖又は糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ‐モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類、及びラフィノースなどの三糖類；デキストランなどの多糖類であり得る。安定剤は、治療剤の重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在してもよい。
【０２０１】
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）が、治療薬の可溶化に利用され、また治療用タンパク質を撹拌による凝集から保護するために、添加されることができる。適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロクサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録商標）-20、TWEEN（登録商標）-80など）を含むが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０２０２】
さらなる種々の賦形剤は、増量剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばEDTA）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）、及び共溶媒が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０３】
活性成分は、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセルなどのコアセルベーション技術によって、又はポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどの界面重合法によって、調製されたマイクロカプセルに封入することもできる。そうした技術は、Remington：The Science and Practice ofPharmacy、20th edition（2000）にて公開されている。
【０２０４】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及び投与計画は、処置される症状、疾患の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに応じたものである。
【０２０５】
投与に使用される用量は、様々なパラメーターに応じて、特に使用される投与モード、関連する病状、又は代替的に所望される治療期間に応じて、適合させることができる。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与などのために製剤化することができる。
【０２０７】
好ましくは、医薬製剤は注射可能な製剤である。医薬製剤は、特に、等張性で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はそうした塩の混合物）、或いは乾燥の、特に凍結乾燥された組成物であってもよく、これは、場合によって滅菌水又は生理食塩水の添加により注射液の調製が可能になるものである。
【０２０８】
滅菌注射液は、上記列挙された種々の他の成分とともに、必要量の活性化合物を適切な溶媒に取り込み、必要ならば、その後に濾過滅菌することによって、調製することができる。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から、有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０２０９】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された組成物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固体剤；タイムリリースカプセル剤；及び現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明の抗体を含み得る。
【０２１１】
医薬組成物は、１つ以上の追加の活性化合物をさらに含み得る。追加の活性化合物の例には、化学療法薬剤、抗生剤、抗寄生虫剤、抗真菌剤又は抗ウイルス剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
化学療法薬剤の例は、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、トラスツズマブ、ＧｎＲＨ類似体、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル、マイトマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、エピルビシン、フルオロウラシル、メトトレキセート、ミトザントロン（mitozantrone）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ブレオマイシン、エストラムスチンホスフェート又はエトポシドホスフェートを含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
抗生剤の例としては、アモキシシリン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セファレキシンシプロフロキサシン、ドキシサイクリン、メトロニダゾール、テルビナフィン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、テトラサイクリン及びアジスロマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０２１４】
抗真菌剤の例としては、クロトリマゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、シクロピロクス、クリオキノール、クリオキノール、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、及びトルナフテートを含むが、これらに限定されない。
【０２１５】
抗ウイルス剤の例としては、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル、アンプレナビル及びロピナビルを含むが、これらに限定されない。
【０２１６】
特定の障害又は症状の処置に有効である本発明の抗体の量は、障害又は症状の特性次第であり、標準的な臨床技術によって決定することができる。
【０２１７】
好ましい実施形態では、各用量は、体重キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇの範囲の抗体、又はより好ましくは体重キログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲であり得る。
【０２１８】
投与のための投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度、及び治療剤に対する対象の感受性を含む多くの臨床的因子に応じて、月1回から毎日まで変化し得る。
【０２１９】
［治療及び診断への利用］
本発明は、過剰増殖性疾患又は感染性疾患の予防又は処置に使用するための、本発明の抗体又は本発明の医薬組成物にさらに関する。
【０２２０】
本発明は、疾患の処置のための薬剤としての、本発明の抗体又は本発明の医薬組成物の使用に関する。本発明はまた、薬剤の製造又は調製のための本発明の抗体の使用にも関する。
【０２２１】
特に、本発明は、有効量の本発明の抗体又は組成物を過剰増殖性疾患に罹患している対象に投与することを含む、対象における過剰増殖性疾患を処置する方法に関する。
【０２２２】
本明細書で用いられるとき、「対象」又は「患者」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【０２２３】
有効量は、治療有効量又は予防有効量であり得る。「治療有効量」は、必要な用量及び期間で、所望の治療又は予防結果を得るために、有効な量を指す。本発明の抗体又は組成物の治療有効量は、個体において所望の反応を導くために、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに抗体又は組成物の能力などの因子に応じて変化し得る。治療有効量は、抗体又は組成物の治療上有益な効果がその任意の毒性又は有害な効果を上回る量を包含する。「予防有効量」は、必要な用量及び期間で、所望の予防結果を得るために、有効な量を指す。典型的には、ただし必ずしもそうではないが、予防用量は、疾患に先立って又は疾患の初期において対象に使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少ないものである。
【０２２４】
「過剰増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、過剰増殖性疾患はがんである。
【０２２５】
「がん」という用語は、調節されていない細胞成長・増殖を通常特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、又は表すものである。がんの例としては、がん腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含むが、これらに限定されない。そうしたがんのより具体的な例には、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、骨肉腫、悪性黒色腫、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、白血病及び他のリンパ増殖性障害、並びに種々のタイプの頭頸部がんを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、がんは、膀胱腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、唾液腺の腺様嚢胞がん、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、膵管腺がん、有毛細胞白血病、転移性前立腺がん、悪性黒色腫、大腸がんから選択される。
【０２２６】
本発明はまた、有効量の抗体又は組成物を対象に投与することを含む、感染性疾患に罹患した対象を処置する方法にも関する。
【０２２７】
対象は、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫であり得る病原体によって引き起こされ得る。
【０２２８】
本明細書で提供される方法で処置することができる感染性細菌の例には、任意のタイプのグラム陽性細菌（例えば、レンサ球菌、ブドウ球菌、コリネバクテリウム、リステリア、バチルス及びクロストリジウムなど）又はグラム陰性細菌（サルモネラ、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロホモナス、デロビブリオ、酢酸菌、アルファプロテオバクテリア、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、セラチア・マルセセンスなど）を含むが、これらに限定されない。例の感染性細菌には、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム（例えば結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドナエなど）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群レンサ球菌）、レンサ球菌（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、レンサ球菌（嫌気菌種）、肺炎レンサ球菌、病原性カンピロバクター、エンテロコッカス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリホルム、トレポネーマ・パリダム、トレポネーマ・ペルテニュ、レプトスピラ、アクチノマイセス・イスラエリーを含むが、これらに限定されない。
【０２２９】
本明細書で提供される方法で処置することができる感染性真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストマイセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス及びカンジダ・アルビカンスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
本明細書で提供される方法で処置することができる感染性寄生虫の例には、熱帯熱マラリア原虫及びトキソプラズマ原虫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
本明細書で提供される方法で処置することができるウイルスの例には、レトロウイルス科（例えば、HIV（HIV1及びHIV2など）、ＭＬＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１及び２、ＸＭＲＶ、及びコルチウイルス（CTFV又はバンナウイルスなど））;トガウイルス科（例えばアルファウイルス（ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）又は風疹ウイルス；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス（例えば、西ナイルウイルス又は日本脳炎ウイルス）、黄熱病ウイルス）;コロナウイルス科（例えば、ＳＡＲＳウイルス又はトロウイルスなどのコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、レスピラトリーシンシチアルウイルス、センダイウイルス、及びメタニューモウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス（ラクロスウイルスなど）、フレボウイルス及びナイロウイルス）；ヘパドナウイルス科（B型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（HSV）1及びHSV-2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、HHV-8、HHV-6、HHV-7並びに仮性狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（エボラウイルス及びマールブルグウイルスを含むフィロウイルス）；並びにポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（例えば、天然痘、サル痘、及び伝染性軟属腫ウイルスなど）、ヤタボックスウイルス（タナ痘及びヤナ痘など））であるウイルスファミリーのメンバーなどのエンベロープウイルスが含まれるが、これらに限定されない。カリシウイルス科（胃腸炎を引き起こす株など）；アレナウイルス科（LCMV、ラッサ、フニン、マチュポ及びグアナリトウイルスなどの出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；パルボウイルス科（ヒトボカウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのパルボウイルス）；パピローマウイルス科（パピローマウイルスなど）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（アデノウイルス）;ピコルナウイルス科（エンテロウイルス、腸管系ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、へパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、及びライノウイルス）；並びにイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）であるファミリーのメンバーなどのノンエンベロープウイルスもまた、本明細書で提供される方法で処置することができる。本明細書で提供される方法を使用して処置することができる他のウイルスには、未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原因子（B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトと考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内部感染、クラス２＝非経口感染（例えば、C��肝炎））；カリシウイルス（ノロウイルス、ノーウォーク及び関連ウイルスなど）；ヘペウイルス（例えば、E型肝炎、JC及びBKウイルスなど）並びにアストロウイルスが含まれる。
【０２３２】
本発明の方法において、本発明の抗体は、予防又は処置される疾患に応じて選択され得る他の有効成分と併用して使用することができる。他の有効成分の例には、化学療法薬剤、抗生剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤又は抗真菌剤が含まれるが、これらに限定されない。上記のそうした併用療法には、併用投与（2つ以上の治療剤が同じ又は個別の製剤に含まれる）、及び個別投与が包含され、その場合、本発明の抗体の投与は追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前に、同時に、及び／又は後に、投与することができる。本発明の抗体は、放射線治療と併用して使用することもできる。
【０２３３】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内投与を含み、局所処置が所望されるなら病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与されることができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路、例えば、投与が短期であるか又は長期であるかに部分的に応じて、静脈内又は皮下注射などの注射によって、行われることができる。単回投与又は種々の時点での複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書において考慮される。
【０２３４】
本発明は、さらに、疾患の診断又は検出の方法における使用のための、本発明の抗体又は本発明の医薬組成物に関する。本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＴｙｒｏ３の存在を検出する方法にも関する。
【０２３５】
本発明の抗Ｔｙｒｏ３抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるＴｙｒｏ３の存在を検出するために有用であり得る。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施形態では、生物学的サンプルには、尿路上皮、乳房、膵臓、食道、肺又は脳などの細胞又は組織を含む。
【０２３６】
本方法は、Ｔｙｒｏ３がサンプル内に存在する場合、Ｔｙｒｏ３への抗体の結合を許容する条件下で、生物学的サンプルを本発明の抗体と接触させることと、抗体とＴｙｒｏ３との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含み得る。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法であり得る。
【０２３７】
本発明の抗体を用いて診断され得る例となる障害は、がん（例えば、乳がん、肺がん、膵臓がん、脳がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん、白血病、子宮内膜がん、結腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、骨肉腫及び／又は悪性黒色腫）を含む。
【０２３８】
本発明の抗体はまた、例えば、Ｔｙｒｏ３が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗Ｔｙｒｏ３抗体での治療に適する対象を選択するために用いられる。
【０２３９】
本発明はまた、抗Ｔｙｒｏ３抗体での治療のために、疾患、特にがんに罹患した対象を選択する方法、或いは疾患、特にがんに罹患した対象が、抗Ｔｙｒｏ３抗体での治療から効果を得やすいかを判定する方法にも関する。
【０２４０】
一部の実施形態では、治療又は診断方法に使用される本発明の抗体は、標識されてもよい。標識には、直接的に検出される標識又は部分（蛍光、発色団、電子密度、化学発光及び放射性標識など）、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
以下の実施例は、例示を目的として提供され、限定するものとしてではない。
【実施例】
【０２４２】
＜実施例１  ファージディスプレイによる完全ヒト抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖの作製‐ｓｃＦｖのＩｇＧへの変換＞
抗Ｔｙｒｏ３抗体、すなわち抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖは、対応する抗Ｔｙｒｏ３免疫グロブリン（ＩｇＧ）の変換により、ヒトＴｙｒｏ３タンパク質（配列番号１）に相当するタンパク質の細胞外ドメインを特異的に認識するように選択された。これらの抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖは、それぞれヒトＡＸＬ（配列番号６）及びヒトＭＥＲタンパク質（配列番号７）であるＴＡＭ受容体ファミリーの他のメンバーを認識しないように選択された。
【０２４３】
＜＜抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖのスクリーニング＞＞
ＳｃＦｖクローンは、Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（RLS）を用いて、
‐  非ビオチン化ｈＴｙｒｏ３（組換えヒトDtk-Fcキメラ、R&D Systems、Minneapolis、MN、カタログ番号859-DK）でヒトＦｃ（R＆D Biotechより）と融合したヒトＴｙｒｏ３（ｈＴｙｒｏ３）タンパク質の細胞外ドメイン（ECD）（配列番号１の４１位から４２８位）、
‐  細菌発現全ｈＴｙｒｏ３ＥＣＤ（配列番号１の４１位から４３０位；AxioMx、カタログ番号pAX1635）、又は
‐  ヒトとマウスとのＴｙｒｏ３ＥＣＤの間の１００％相同領域からの、潜在的なグリコシル化部位を含まない、細菌発現ペプチド（アミノ酸配列DWVPFQTKGLAPASAPQNLHAIRTDSGLIL（配列番号１９２）を有する）。このペプチドは、Ｔｙｒｏ３配列のドメインＦＮＩＩＩ１の末端における、配列番号１の３１０位から３４０位の配列に相当する、
に特異的なｓｃＦｖを提示するファージをスクリーニングすることによって、作製と選択とを行った。
【０２４４】
細菌発現タンパク質は、クローニングし、発現させ、精製され、３つのタンパク質全てをビオチン化マルトース結合タンパク質（MBP）融合物として合成した。
【０２４５】
単一コロニーをスクリーニングし、陽性クローンを同定し、抗体クローンを配列決定し、固有の配列を同定した。次いで、陽性固有バインダーを、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓのマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤ−ヒトＦｃ（７５９−ＤＴ−１００）への結合について試験した。
【０２４６】
＜＜ｓｃＦｖ精製及び特異性試験＞＞
タンパク質産生のために、主要なｓｃＦｖをタンパク質産生ベクター（AxioMx;カタログ番号pAPIII6）にクローニングし、正常にクローニングされたｓｃＦｖを導入してNEB Turboコンピテント大腸菌（New England Biolabs [NEB]、Ipswich、MA、カタログ番号C2984H）の形質転換をおこなった。抗体を大腸菌で発現させ、HisPurコバルト樹脂（Thermo Scientific、カタログ番号89965）を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０２４７】
ＥＬＩＳＡを行って、ｈＴｙｒｏ３、ｍＴｙｒｏ３、ｈＡＸＬ（R＆D Systems、カタログ番号154-AL-100）及びｈＭＥＲ（R＆D Systems、カタログ番号891-MR-100）であるＥＣＤ−Ｆｃ融合物に結合する精製タンパク質の能力を評価した。OriGene（OriGene Technologies、Rockville、MD;カタログ番号TP308260）の全長（ＦＬ）ｈＴｙｒｏ３への結合も評価した。
【０２４８】
見込まれる基準を有するｓｃＦｖが同定されると、ｓｃＦｖを全ＩｇＧ１／ラムダＩｇＧとしてＩｇＧ変換し、ＩｇＧ産生が行われた。
【０２４９】
＜＜ｓｃＦｖのＩｇＧ変換＞＞
選択されたＳｃＦｖヌクレオチド配列の翻訳から、それぞれ軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を推定した。選択された抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を以下に示す。これらのアミノ酸配列は、ＩｇＧ変換後の対応するＩｇＧ分子の可変領域を構成する。
【０２５０】
表１３は、選択されたｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【表１３】
2018512892.tif 000014
【０２５１】
ｓｃＦｖの重鎖を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩクローニング部位を用いて、ｐＡＸ１５６６（Invivogen、pFUSE2ss-CHIg-hG1）にクローニングし、ｓｃＦｖの軽鎖を、ＥｃｏＲＩ及びＡｖｒＩＩクローニング部位を用いて、ｐＡＸ１６４２（Invivogen、pFUSE2ss-CLIg-Hl2）にクローニングした。配列確認したクローンをＮＥＢ５アルファ細胞に形質転換し、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Qiagen、12263）を用いてトランスフェクショングレードのＤＮＡを調製した。哺乳動物における発現のために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭａｘ試薬（Life Technologies、16447-100）を製造者の指示に従って使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＣＨＯ細胞（Life Technologies、R800-07）を重鎖及び軽鎖構築物と同時トランスフェクトした。細胞上清を、トランスフェクション後６日目に遠心分離することによって採取し、プロテインＡセファロースカラム（Life Technologies、101042）に負荷した。プロテインＡ樹脂を１０カラム容量のＰＢＳ−Ｔ（PBS/0.1％Tween-20）で２回洗浄し、ｐＨ３．５の３カラム容量のグリシンで溶出した。ｐＨをｐＨ９．０の１Ｍトリスで中和した。ＩｇＧをＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４遠心フィルター（Millipore、UFC801024）でＰＢＳにバッファー交換した。ＩｇＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって解析し、ＩｇＧ濃度をクーマシープラスアッセイ（Thermo Scientific、1856210）によって測定した。内毒素レベルをＬＡＬ発色アッセイ（Thermo Scientific、88282）によって測定した。
【０２５２】
＜実施例２  本発明の抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧの各鎖におけるＣＤＲ領域の規定＞
抗Ｔｙｒｏ３抗体の相補性決定領域は、一方ではＩＭＧＴデータベースのヒトＶｑｕｅｓｔ解析ツール（http://www.imgt.org/）に、他方では抗体エンジニアリングラボマニュアルの抗体可変ドメインのタンパク質配列及び構造解析（Ed.: Duebel、S.及びKontermann、R.、Springer-Verlag、Heidelberg）に記載されているＡＢＹＳＩＳデータベース（http://www.bioinf.org.uk/abs/）の要求ツールに、抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧの軽鎖配列及び重鎖配列を提出することで規定された。本発明の各抗Ｔｙｒｏ３抗体についてのＩＭＧＴ及びＡＢＹＳＩＳによるＣＤＲの境界の結果を、以下に示すように、表１〜表１２に要約しているる。
【０２５３】
表１４は、選択された抗Ｔｙｒｏ３抗体のＣＤＲ配列を示す表の一覧である。
【表１４】
2018512892.tif 000015
【０２５４】
＜実施例３  ｈｉｓ−ｓｔｒｅｐタグのついた組換えＴｙｒｏ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及びそのフラグメントの作製＞
本明細書に記載される異なる結合アッセイ実験のために、ヒト、カニクイザル及びマウス種からの全Ｔｙｒｏ３ＥＣＤに相当するタンパク質配列を、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（UniProtKB）データベースによって提供される情報に基づいて規定した。ヒトＴｙｒｏ３タンパク質の完全な細胞外ドメイン（又はＥＣＤ）の対応するタンパク質配列は、配列番号１のアミノ酸４１〜４２９に相当する。マウスＴｙｒｏ３では、ＥＣＤは、配列番号８のアミノ酸２１〜５０５に対応する。カニクイザルでは、ＥＣＤの配列は配列番号９に記載されている。
【０２５５】
ｈＴｙｒｏ３ＥＣＤの種々のフラグメントも作製された（図1）。これらのフラグメントは、Ｉｇ−１ドメイン、Ｉｇ−１及びＩｇ−２ドメイン、Ｉｇ−１、Ｉｇ−２及びＦＮＩＩＩ−１ドメイン、Ｉｇ−２及びＦＮＩＩＩ−１ドメイン、又はＦＮＩＩＩ−１及びＦＮＩＩＩ−２ドメインを含んだものであった。Ｉｇ−１ドメイン、Ｉｇ−１及びＩｇ−２ドメイン、Ｉｇ−２及びＦＮＩＩＩ−１ドメイン、並びにＦＮＩＩＩ−１及びＦＮＩＩＩ−２ドメインに相当するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、３、４、及び５に記載される。
【０２５６】
これらの種々のタンパク質に対応するＤＮＡ配列を、ヒトでの発現のためにコドン最適化し、遺伝子合成し、構築し、ｐＣＤＮＡ３．３Ｉ−ｎｅｏ（Life Technologies）にクローニングした。すべてのこれらの構築物について、共通のシグナル配列（METDTLLLWVLLLWVPGSTG（配列番号１９３））を組換えタンパク質の分泌に使用した。ニトリロ三酢酸（NTA）／Ｎｉ２＋表面、又はＳｔｒｅｐｍａｂ  ｉｍｍｏｐｌａｔｅ（IBALifesciences）上へのタンパク質の検出（抗ヒスチジン又は抗strepタグ抗体によって）、アフィニティー精製又は選択的な固定化を容易にするために、トロンビン開裂部位と、続くストレプトアビジンタグに結合したオクタ−ヒスチジン（8×His）タグとからなるＣ末端タグ（LVPRGSSAHHHHHHHHSAWSHPQFEK（配列番号１９４）を付加した。
【０２５７】
ヒト及びカニクイザルＴｙｒｏ３タンパク質をＨＥＫ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に一過的にトランスフェクトし、精製した。他の構築物は、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Life technologies）の、自社内で最適化された一過性トランスフェクション方法を用いて、分泌タンパク質として正常に発現された。短時間で、各構築物をコードするｐｃＤＮＡ３．３プラスミドを増幅し、内毒素非含有のミディプレップ（Macherey Nalgene）を調製した。これらのプラスミドを用いて、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Life technologies）のエレクトロポレーションを行った。次いで、３２℃でエレクトロポレーションの２４時間後に添加した酪酸ナトリウム１ｍＭの存在下、８％ＣＯ２の振とうされるインキュベーターにおいて、３４℃で７日間にわたってタンパク質を産生した。発現したタンパク質を、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離によって細胞から分離し、上清を精製前に０．２２μｍで濾過した。哺乳動物細胞で発現された、８×Ｈｉｓタグのついた組換えＴｙｒｏ３タンパク質を、Ni-NTAアガロース（高度に架橋した6％アガロースマトリックス内の、四座キレート配位子であるニトリロ三酢酸（NTA））を用いて、天然条件下で精製した。樹脂に結合したタンパク質は、イミダゾールとの競合によって溶出される。次に、タンパク質をさらに精製し、分取用ＨｉＬｏａｄ２６／５６Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラム（GE healthcare）上のＰＢＳ１Ｘバッファー内でバッファー交換した。タンパク質を、−８０℃で保存する前に０．２２μｍで濾過した。タンパク質の濃度は、紫外可視分光法を用いて測定した。
【０２５８】
すべての精製されたＴｙｒｏ３構築物の純度、質量、及び完全性を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動、続いてクーマシーブルー染色、そしてＨＲＰコンジュゲートストレプトタクチン（IBA life sciences）を用いた免疫ブロット解析によって確認した。解析する構築物のサイズに応じて１５０Å又は３００Åの孔サイズを有するＢｉｏＳＥＣ−３(7.8×300)ＨＰＬＣゲル濾過カラムでタンパク質を解析した。
【０２５９】
＜実施例４  ｈＴｙｒｏ３−ＥＣＤに対するｓｃＦｖ／ＩｇＧのＥＬＩＳＡ結合アッセイ＞
ヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤタンパク質に結合する各抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖ及び各対応する変換ＩｇＧの能力を確認し比較するために、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った（図２）。
【０２６０】
ヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤタンパク質を産生し、実施例３に記載のようにゲル濾過で精製した。このタンパク質は、見かけの分子量約８８Ｋｄａ（グリコシル化追加質量なし）の二量体糖タンパク質として産生された。
【０２６１】
ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。このアッセイは、抗ｓｔｒｅｐｍＡｂ（IBA biotechのStrepMAB-Immoコートしたマイクロプレート）でプレコートしたＥＬＩＳＡプレート上に直接捕捉した、固定化ｓｔｒｅｐタグ付き全ヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤにおいて試験される抗Ｔｙｒｏ３抗体の結合の測定に基づく。短時間で、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏコートしたマイクロプレートの９６ウェルを３００μＬのＰＢＳＴｗｅｅｎ０．２％（ELISA洗浄溶液と言及される）で３回洗浄した。過剰な精製ｓｔｒｅｐタグ付きｈＴｙｒｏ３ＥＣＤタンパク質を、室温で１時間のインキュベーションによって捕捉した。これらの実験では、ＰＢＳ、ＢＳＡ１％（ELISA希釈溶液と言及される）で希釈した３μｇ精製タンパク質をウェル毎に固定化した。ウェルを３００μＬの洗浄溶液で３回洗浄した。ウェル表面上の非特異的結合部位を、２００μＬ／ウェルのブロッキング溶液（PBS、BSA3％）を用いて室温で６０分間ブロッキングした。ウェルを３００μＬの洗浄溶液で５回洗浄した。次に、ＥＬＩＳＡ希釈溶液に希釈した、試験される異なる濃度の抗Ｔｙｒｏ３抗体１００μｌ（デュプリケートで）をウェル毎に加え、室温で１時間インキュベートした。無関係のコントロールＩｇＧ２６５６もこの実験に加えた。ＳｃＦｖ形式の抗Ｔｙｒｏ３抗体については、デュプリケートの６つの濃度で実験を行った（図３Ａ）。ＩｇＧ形式の抗Ｔｙｒｏ３抗体については、デュプリケートの９つの濃度で実験を行った（図３Ｂ）。最初の希釈のＳｃＦｖ開始濃度は１０μｇ／ｍＬ（又は2718については30μg/mL）であり、次いでＥＬＩＳＡ希釈溶液で３倍の希釈を行った。ＩｇＧ実験では、最初の希釈の開始濃度は３μｇ／ｍｌであり、次いでＥＬＩＳＡ希釈溶液で３倍の希釈を行った。ウェルを３００μＬの洗浄溶液で５回洗浄した。次に、評価される抗Ｔｙｒｏ３抗体の特性に応じて（表15の1列目参照）、捕捉されたＴｙｒｏ３構築物へのその結合が、ＥＬＩＳＡ希釈溶液で希釈した提示の希釈（表15の4列目）における表１５（3列目）に記載の対応するＨＲＰコンジュゲート２次抗体１００μｌ／ウェルを添加することによって明らかにされた。この混合物を室温で６０分インキュベートさせた。ウェルを３００μＬの洗浄溶液で５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を、１００μｌ／ウェルの即時使用可能なＴＭＢ溶液で示し、撹拌下且つ光なしで、室温において５〜３０分間インキュベートした。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ  ＭＦ装置を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍでの光学濃度を読み取った。
【０２６２】
表１５は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイ条件を示す。
【表１５】
2018512892.tif 000016
【０２６３】
＜実施例５  バイオレイヤー干渉法（biolayerinterferometry、BLI)を用いた抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧの親和性測定＞
ヒトＴｙｒｏ３の、組換え８ｈｉｓ−ｓｔｒｅｐタグ付き細胞外ドメイン（ECD）（配列番号1の位置40〜429）２０ｍｇをＨｉｌｏａｄＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００  ２６／６０でゲル濾過した。試験される抗ヒトＴｙｒｏ３ＩｇＧもゲル濾過によって精製した。
【０２６４】
親和性の測定は、抗ヒトカイネティクス（anti-HumanKinetics、AHC）使い捨て光ファイバーバイオセンサーチップを備えたＯｃｔｅｔＫ２機器（Pall/ForteBio）でバイオレイヤー干渉法を用いて行った。すべての実験は、推奨されるＦｏｒｔｅｂｉｏランニングバッファー（0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.02％（v/v）Tween_20を含むPBS）内で３０℃にて行われた。このバッファーは、リガンド（ここでは抗体）及び解析物（ここではヒトTyro3タンパク質の細胞外ドメイン）の希釈にも使用した。９６ウェルマイクロプレート（No．黒ポリプロピレン低結合プレート、Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany）内の試料を１０００ｒｐｍで撹拌した。ＡＨＣバイオセンサー（PallCollaboration; ref：18-5060）を用いて、チップを５．６２５μｇ／ｍＬ（37.5nM）の異なる抗ｈＴＹＲＯ３に１０分間浸し、これにより０．３ｎｍの捕捉レベルが典型として得られた。カイネティクス定数は、６つの濃度（37.5又は62.5（実験に応じて）、並びに125、250、500、1000及び2500nM）に希釈したヒトＴｙｒｏ３の細胞外ドメインを添加することによって、精製した抗体のそれぞれについて（分子量150kDa）測定された。測定の間に、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンにおいて５秒の３サイクル、次いでＰＢＳにおいて５秒曝露することによって、抗ヒトＴｙｒｏ３バイオセンサー表面を再生した。会合相を３００秒間測定し、解離相を解離ステップに応じて３００秒間、相互作用に応じて測定した。すべての測定は、二重参照減算を用いて、すなわち、ヒトＴｙｒｏ３タンパク質の細胞外ドメインの各濃度に曝露されたリガンドなしのコントロールセンサーと、ランニングバッファーのみを存在させたリガンドを含む参照ウェルとを減算することで、ベースラインドリフトについて補正された。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウエア９．０上で、各抗体の親和性、会合速度定数（kon）及び解離速度定数（koff）を、1：1相互作用モデル（大域的あてはめ、センサーによってリンクされたRmax）を適用して算出した。通常は異種結合によって生じたものである、ソフトウェアで確実にあてはめができなかった曲線（主にfull R2<0.925）は、その後の解析から除外された。結果を図１０及び図１１に示す。
【０２６５】
＜実施例６  特異性ＥＬＩＳＡ＞
Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのｈＴｙｒｏ３（859-DK-100）、ｈＡｘ１（154-AL-100）又はｈＭｅｒ（891-MR-100）の細胞外ドメインをＰＢＳ内において９６ウェルマイクロタイタープレート（1μg/ウェル）にコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ内において室温で1時間ブロッキングした。プレートを上述のように洗浄し、ｓｃＦｖを１μｇ／ｍＬ（ＰＢＳで希釈）で添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（PBS/0.01％Tween-20）で３回洗浄し、２次抗体抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Abcam、ab49763、ブロッキングバッファーで1/5000希釈）を室温で1時間添加した。プレートを上述のようにＰＢＳＴで洗浄し、シグナルをＵｌｔｒａ−ＴＭＢ試薬（Thermo Scientific、34028）で発色させた。
【０２６６】
図４に提示される結果は、選択された抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖがｈＡｘ１又はｈＭｅｒと交差反応しないことを示す。
【０２６７】
＜実施例７：ＧＡＳ６競合アッセイ＞
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ内で１００μｌ／ウェルの２．５μｇ／ｍＬヒト組換え全長Ｔｙｒｏ３タンパク質（OriGene＃TP308260）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ内において室温で１時間ブロックした。プレートを上述のように洗浄し、抗体（抗Tyro3scFv又はMAB859）、ビオチン化ＧＡＳ６又は抗体／ＧＡＳ６混合物を室温で１時間適用した。プレートをＰＢＳＴ（PBS/0.01％Tween-20）で３回洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した２次抗体を室温で1時間添加した。全長Ｔｙｒｏ３に対するＧＡＳ６結合を０．４μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Abcam、ab7403）で検出し、ＳｃＦｖ結合を抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体（Sigma-Aldrich、A7058、1/5000希釈）で検出し、ＭＡＢ８５９結合を抗マウス−ＨＲＰ（Abcam、ab6728、1/10000希釈）で検出した。プレートをＰＢＳＴでリンスし、シグナルをＵｌｔｒａ−ＴＭＢ試薬（Thermo Scientific、34028）で発色させた。
【０２６８】
ＧＡＳ６の非存在下及び存在下におけるこれらの競合アッセイの結果は、図５Ａ及び図５Ｂにそれぞれ示される。
【０２６９】
＜実施例８：カニクイザル及びマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖ及びＩｇＧの交差反応＞
このアッセイの目的は、マウス及びカニクイザルＴｙｒｏ３タンパク質に対する抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖ及びＩｇＧの交差反応性を評価することであった。このアッセイは、実施例４に記載されて図２に示されるようにダブルサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、実施例３に記載されるように調製されたカニクイザル又はマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤにおける抗Ｔｙｒｏ３抗体の結合を測定することに基づく。
【０２７０】
これらの実験では、５μｇ／ｍＬの最終希釈での（PBS、BSA1％希釈溶液で希釈）カニクイザル及びマウスのＴｙｒｏ３ｓｔｒｅｐタグ付きＥＣＤタンパク質１００μＬを各ウェルに添加した（ウェルあたり約500ngのTyro3タンパク質である）。
【０２７１】
１次抗体及び２次抗体、並びにそれらの使用条件を表１６に記載する。
【０２７２】
表１６は、カニクイザル及びマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖ及びＩｇＧの交差反応性を測定するために用いた抗体を示す。
【表１６】
2018512892.tif 000017
【０２７３】
ｓｃＦｖ形式及びＩｇＧ形式における抗Ｔｙｒｏ３のカニクイザルＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する交差反応性は、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂに示される。
【０２７４】
ｓｃＦｖ形式における抗Ｔｙｒｏ３のマウスＴｙｒｏ３ＥＣＤに対する交差反応性は、図７に示される。
【０２７５】
＜実施例９：抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖのエピトープマッピング＞
このアッセイの目的は、Ｉｇ様（Ig1又はIg2）又はフィブロネクチン（FnIII1又は2）ドメインのなかでヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤのサブドメインに対する本発明の各抗Ｔｙｒｏ３の結合領域を規定することであった。
【０２７６】
このアッセイは、ヒトＴｙｒｏ３ＥＣＤの種々のフラグメントに対する抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖの結合を測定することに基づく。実施例４に記載の二重サンドイッチＥＬＩＳＡを用い、約５００ｎｇ／ウェルの（PBS、BSA1％で希釈した5μg/mL希釈で100μL/ウェル）、実施例３の記載において作製したＴｙｒｏ３フラグメントを固定化した。
【０２７７】
１次抗体及び２次抗体、並びにそれらの使用条件を表１７に記載する。
【０２７８】
表１７は、抗Ｔｙｒｏ３ｓｃＦｖのエピトープマッピングに用いた抗体を示す。
【表１７】
2018512892.tif 000018
【０２７９】
（図８に示されるように）Ｔｙｒｏ３の種々のドメインにおける結合結果において、抗Ｔｙｒｏ３抗体の３つのサブクラス、
Ｉｇ１及びＩｇ２に対するバインダー（2411、2412、2413、2415、2711及び2713）、
Ｉｇ１に結合し、Ｉｇ２に結合しないバインダー（2410、2414、2709、2710及び2717）（2717の場合は特別であり、2717のエピトープはIg1-Ig2フラグメントにアクセスできない（Ig1に結合し、Ig1-Ig2フラグメントについては全く結合しない）が、これは、例えば完全Tyro3ECDにおいて他のドメインが存在する場合には該当しない。）、及び
最後に、ＦＮＩＩＩ１ドメインに対するバインダー（2718ScFv）、が同定された。
【０２８０】
＜実施例１０：生細胞における抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧの結合＞
Ｔｙｒｏ３を過剰発現する細胞に結合する抗Ｔｙｒｏ３ＩｇＧを評価するために、組換えヒトＴｙｒｏ３を発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞と、内因性Ｔｙｒｏ３を発現する非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞とを使用した。
【０２８１】
Ｔｙｒｏ３の過剰発現は、ＰＢＳ内において４℃で３０分間、ライブデッドＮＩＲ色素（Life Technologies、＃L10119）、及び１μｇのＴｙｒｏ３特異的ＭＡＢ８５９モノクローナル抗体（R＆D Systems）又はそのアイソタイプコントロール（MAB002、R＆D systems）に５Ｅ５細胞を暴露してコントロールした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１：１００ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡｂ（BD Pharmingen）とともに、１００μＬのＰＢＳ内において４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、少なくとも１０，０００個の生細胞のＰＥ蛍光をＡＲＩＡＩＩＩフローサイトメーター（Beckton Dickinson）にて直ちに記録した（図９の上部パネル）。
【０２８２】
非トランスフェクト細胞よりもＴｙｒｏ３トランスフェクト細胞にさらに結合するという個々のＩｇＧの能力を測定するために、５Ｅ５非トランスフェクト細胞及びＴｙｒｏ３トランスフェクト細胞を、ＰＢＳ内において４℃で３０分間、ライブデッドＮＩＲ色素（Life Technologies、＃L10119）と１μｇの各ＩｇＸに曝露した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２０μＬのＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトラムダ軽鎖Ａｂ（BD Pharmingen）とともに、１００μＬのＰＢＳ内において４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、少なくとも１０，０００個の生細胞のＰＥ蛍光をＡＲＩＡＩＩＩフローサイトメーター（Beckton Dickinson）にて直ちに記録した（図９の中央と下部のパネル）。過剰発現されたＴｙｒｏ３に結合するＩｇＧの能力を、非トランスフェクト細胞及びＴｙｒｏ３トランスフェクト細胞のＰＥ発現プロファイルを示すオーバーレイヒストグラムを用いて判定した。オーバレイヒストグラムプロットは、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Beckman Coulter）を用いて得られ、ＨＥＫ細胞において特徴的なサイズ及び粒度分布を有する細胞に限定され、そのうち死細胞は除外された（図示せず）。
【図１】
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【図２】
2018512892.tif 000020
【図３】
2018512892.tif 000021
【図４】
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【図５】
2018512892.tif 000023
【図６】
2018512892.tif 000024
【図７】
2018512892.tif 000025
【図８】
2018512892.tif 000026
【図９】
2018512892.tif 000027
【図１０】
2018512892.tif 000028
【図１１】
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【配列表】
2018512892000001.app
【国際調査報告】
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