(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、角膜縁の幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）に起因する、角膜薄濁または混濁の防止または軽減に有用な方法および組成物である。本発明は、被験者に十分な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を有する、角膜混濁の防止または治療の方法を備える。加えて、本発明は、角膜混濁を患う被験者に、その被験者の角膜内のケラチンタンパク質の減少をもたらす十分な量のプロテアソームモジュレータを用いて投与する方法を備える。
2018533590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の角膜混濁の治療の方法であって、前記被験者に有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を備える、方法。
【請求項２】
前記被験者は、角膜縁の幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）により引き起こされる角膜混濁を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者は、外傷による角膜外傷、涙の生成の減少または涙の質の低下、眼感染症、角膜炎、眼の炎症または角膜の炎症、コンタクトレンズの使用による角膜損傷、紫外線にさらされることによる角膜損傷、眼への外傷からの眼の瘢痕、火傷による眼の瘢痕および化学刺激による角膜損傷からなる群から選択される状況により引き起こされる角膜混濁を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブまたはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ社のベルケイド（登録商標））である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアソームモジュレータは、ＭＧ‐１３２、ジヒドロエポネマイシン、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、ＭＬＮ２２３８、エポキソミシン、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＯＮＸ‐０９１４（ＰＲ‐９５７）、ＰＳＩ、ＭＧ‐１１５、ＭＧ‐２６２、ＡＭ１１４、ＰＩ‐１８４０、キモトリプシン様（ＣＴ‐Ｌ）モジュレータ、ＭＬＮ９７０８、ＣＥＰ−１８７７０、グリオトキシン、サリノスポラミドＡ（ＮＰＩ‐００５２、マリゾミブ）、Ｃｌａｓｔｏ‐ラクタシスチンβ‐ラクトン、ラクタシスチンおよびそれらの誘導体または類似体からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアソームモジュレータは、オレウロペインである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、前記被験者の角膜混濁の軽減をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記被験者の視力の改善をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、治療より前の前記被験者の２６Ｓ構成のプロテアソーム活性と比較して治療後の前記被験者の２６Ｓ構成のプロテアソーム活性の増加をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、治療より前の前記被験者の２６Ｓ構成のプロテアソーム活性と比較して、治療後７２時間の前記被験者の角膜内の２６Ｓ構成のプロテアソーム活性の増加をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、治療より前の前記被験者の免疫プロテアソーム活性と比較して、治療後の前記被験者の免疫プロテアソーム活性の低下をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記被験者の角膜内のケラチンタンパク質のレベル低下をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、前記被験者の角膜内のケラチン１３のレベル低下をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、前記被験者の角膜内のケラチン４のレベル低下をもたらす、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
被験者の角膜内のケラチンタンパク質のレベルを減らすための方法であって、前記被験者に有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を備える、方法。
【請求項１６】
被験者の角膜内の２６Ｓ構成のプロテアソーム活性を増加させるための方法であって、前記被験者に有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を備える、方法。
【請求項１７】
前記プロテアソームモジュレータは経口で投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアソームモジュレータは、点眼薬として処方される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記点眼薬は、点眼液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記点眼薬は、眼科用懸濁液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記点眼薬は、眼軟膏である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記点眼薬は、眼科用エマルションである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記点眼薬は、眼科用ゲルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロテアソームモジュレータは、局所的に投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテアソームモジュレータは、眼内注射として投与される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であり、かつ、体重１ｋｇあたり０．１２５ｍｇ／ｍＬの用量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であり、かつ、体重１ｋｇあたり０．０１から０．５ｍｇ／ｍＬの用量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロテアソームモジュレータは、７２時間毎に投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロテアソームモジュレータは、４８時間毎に投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロテアソームモジュレータは、２４時間毎と４８時間毎との間で投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテアソームモジュレータは、２４時間未満毎に投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロテアソームモジュレータは、非毒性の用量で投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であって、前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬまでの用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であって、前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬまでの用量で７２時間毎に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であって、前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬまでの用量で４８時間毎に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であって、前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬまでの用量で２４時間毎に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１であって、前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬまでの用量で２４時間未満毎に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３８】
被験者の角膜混濁の防止の方法であって、前記被験者に有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を備える、方法。
【請求項３９】
前記被験者は、外傷による角膜外傷、涙の生成の減少または涙の質の低下、眼感染症、角膜炎、眼の炎症または角膜の炎症、コンタクトレンズの使用による角膜損傷、紫外線にさらされることによる角膜損傷、眼への外傷からの眼の瘢痕、火傷による眼の瘢痕および化学刺激による角膜損傷からなる群から選択される状況により引き起こされる角膜混濁を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロテアソームモジュレータは、ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブまたはベルケイド（登録商標））である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記プロテアソームモジュレータは、ＭＧ‐１３２、ジヒドロエポネマイシン、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、ＭＬＮ２２３８、エポキソミシン、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＯＮＸ‐０９１４（ＰＲ‐９５７）、ＰＳＩ、ＭＧ‐１１５、ＭＧ‐２６２、ＡＭ１１４、ＰＩ‐１８４０、キモトリプシン様（ＣＴ‐Ｌ）モジュレータ、ＭＬＮ９７０８、ＣＥＰ−１８７７０、グリオトキシン、サリノスポラミドＡ（ＮＰＩ‐００５２、マリゾミブ）、Ｃｌａｓｔｏ‐ラクタシスチンβ‐ラクトン、ラクタシスチンおよびそれらの誘導体または類似体からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロテアソームモジュレータは、オレウロペインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＰＳ‐３４１は、点眼薬として処方される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰＳ‐３４１は、点眼液として処方される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬの用量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬの用量で２４から７２時間毎に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＳ‐３４１は、体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬの用量で２４時間未満毎に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
被験者の角膜混濁の治療の方法であって、前記被験者に有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を備え、前記プロテアソームモジュレータはＰＳ‐３４１であり、前記プロテアソームモジュレータは点眼薬として処方され、前記ＰＳ‐３４１は体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．０１２５ｍｇ／ｍＬの用量で２４から７２時間毎に投与され、かつ、前記方法は前記被験者の角膜内のケラチンタンパク質のレベル低下をもたらす、方法。
【請求項４９】
前記被験者はヒトである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験者はウサギである、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照  本願は、２０１５年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２５５，３３８号に基づく利益を主張し、その開示はこれにより参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
角膜縁の幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）に起因する角膜混濁は、角膜内にタンパク質凝集物の異常な蓄積をもたらす。ケラチンは、上皮細胞に中間径フィラメントを形成するタンパク質の群である。それらは、（小さい、酸性の、Ｋ９からＫ２０を含む）Ｉ型ケラチンおよび（大きい、中性から塩基性の、Ｋ１からＫ８を含む）ＩＩ型ケラチンの２つの群に分けられる。それらは、たいていＩ型およびＩＩ型を含むペアで見られ、非常に組織特異的である。角膜上皮細胞は、ケラチンＫ３／Ｋ１２の発現によって特徴づけられ、結膜上皮細胞は、ケラチンＫ１３／Ｋ４の発現によって特徴づけられる（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＬＳＣＤの場合、角膜上皮のケラチン発現は、Ｋ１２／Ｋ３からＫ１３／Ｋ４の陽性細胞に変わり、それは角膜中央の結膜化を示す（Ｂａｒｄａｇ−Ｇｏｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５およびＰｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００３】
関連技術の説明  現在、角膜手術または角膜移植以外に角膜混濁のための治療はほとんどない。ユビキチン２６Ｓ構成のプロテアソーム（２６Ｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）（ＣＰＲ）の機能不全が、ケラチンの凝集および蓄積を引き起こすことが示されており（Ｂａｒｄａｇ−Ｇｏｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、上皮細胞のケラチンのクリアランスの制御におけるＣＰＲの重要な役割を示している。角膜混濁の防止または治療のためのプロテアソーム阻害薬またはプロテアソームモジュレータの使用あるいは、角膜内のケラチンタンパク質を減らすためのプロテアソーム阻害薬またはプロテアソームモジュレータの使用は、当技術分野で説明されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に開示されるのは、角膜薄濁または混濁の防止または軽減に有用な方法および組成物である。特定の実施形態において、角膜混濁は、角膜縁の幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）に起因する。本発明の一実施形態は、被験者に十分な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を有する、角膜混濁の防止または治療の方法を備える。本発明の一実施形態は、角膜混濁を患っている被験者に、その被験者の角膜内のケラチンの減少をもたらす十分な量のプロテアソームモジュレータを用いて投与する方法を備える。本発明の一実施形態は、角膜混濁を患っている被験者に、その被験者の角膜内のケラチン１３の減少をもたらす十分な量のプロテアソームモジュレータを用いて投与する方法を備える。一実施形態において、投与は被験者の角膜内のケラチン４の減少をもたらす。
【０００５】
一実施形態において、方法は被験者の角膜内の結膜のタンパク質の減少をもたらす。さらに別の実施形態において、方法は被験者の角膜内の結膜のタンパク質、Ｍｕｃ５ａｃの減少をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜上のゴブレット細胞の減少をもたらす。一実施形態において、方法は治療後７２時間を越えてＣＰＲの活性の増加をもたらす。一実施形態において、ＣＰＲの活性の増加は、治療より前のＣＰＲの活性と比較して２０％より大きいものである。一実施形態において、ＣＰＲの活性の増加は、治療より前のＣＰＲの活性と比較して３０％より大きいものである。一実施形態において、ＣＰＲの活性の増加は、治療より前のＣＰＲの活性と比較して５０％より大きいものである。一実施形態において、方法はＩＰＲの活性の低下をもたらす。本発明の一実施形態は、被験者の角膜内の炎症の軽減をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜内の壊死因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性の低下をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜内のインターフェロンガンマの減少をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜内の腫瘍壊死因子アルファの減少をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜内のインターロイキンの減少をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の角膜内の混濁の軽減をもたらす。一実施形態において、方法は被験者の視力の改善をもたらす。本発明の特定の実施形態は、角膜混濁による、眼刺激症状、眼組織または眼瞼の発赤、眼組織または眼瞼の腫脹、眼脂、ぼやけた視界および失明の防止および治療のための組成物および方法を備える。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、フックスジストロフィ、円錐角膜、顆粒状ジストロフィ、格子状ジストロフィおよび地図状、点状、指紋状ジストロフィを含む、角膜ジストロフィを防止または軽減する。
【０００６】
一実施形態において、被験者は角膜外傷を有していた。一実施形態において、被験者は眼の外傷による角膜外傷を有していた。一実施形態において、被験者はより少ないまたはより低い質の涙を生成する。一実施形態において、被験者はシェーグレン症候群を有する。一実施形態において、被験者は結膜炎、帯状疱疹または眼ヘルペスを含む眼感染症を有していた。一実施形態において、被験者は角膜炎を有していた、または患っている。特定の実施形態において、被験者は眼の炎症を有していた。特定の実施形態において、被験者は摩耗、角膜組織を損傷する物体、コンタクトレンズの使用、紫外線、火傷または化学刺激からの瘢痕による傷ついた角膜組織を有する。
【０００７】
本発明の一実施形態は、被験者への十分な量のプロテアソーム阻害薬、ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブ／ベルケイド（登録商標））の投与を有する、角膜混濁の治療または防止の方法を備える。本発明の特定の実施形態は、被験者への十分な量のプロテアソームモジュレータの投与を有する、角膜混濁の治療または防止の方法を備え、プロテアソームモジュレータは、ＭＧ‐１３２、ボルテゾミブ（ＰＳ‐３４１）、ジヒドロエポネマイシン、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、ＭＬＮ２２３８、エポキソミシン、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＯＮＸ‐０９１４（ＰＲ‐９５７）、ＰＳＩ、ＭＧ‐１１５、ＭＧ‐２６２、ＡＭ１１４、ＰＩ‐１８４０、キモトリプシン様（ＣＴ‐Ｌ）阻害薬、ＭＬＮ９７０８、ＣＥＰ−１８７７０、グリオトキシン、サリノスポラミドＡ（ＮＰＩ‐００５２、マリゾミブ）、Ｃｌａｓｔｏ‐ラクタシスチンβ‐ラクトン、ラクタシスチン、イキサゾミブ（登録商標）、オレウロペインまたはそれらの誘導体あるいは類似体である。
【０００８】
一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、２４から７２時間投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、４８時間投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、７２時間未満投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、２４時間未満投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、ＰＳ‐３４１の濃度が２．５ｎＭと１０ｎＭの間である製剤で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、ＰＳ‐３４１の濃度が２．５ｎＭである製剤で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、ＰＳ‐３４１の濃度が１０ｎＭである製剤で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、ＰＳ‐３４１の濃度が１０ｎＭと１μＭの間である製剤で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、被験者の体重１ｋｇあたり０．００１２５から０．１２５ｍｇ／ｍＬの用量で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、治療より前と比較して治療の７２時間後の被験者のＣＰＲ活性を２０％より大きく増加させるべく、十分な用量で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、治療より前と比較して治療の７２時間後の被験者のＣＰＲ活性を３０％より大きく増加させるべく、十分な用量で投与される。一実施形態において、ＰＳ‐３４１は、治療より前のＣＰＲ活性と比較して治療の７２時間後の被験者のＣＰＲ活性を６０％より大きく増加させるべく、十分な用量で投与される。
【０００９】
一実施形態において、プロテアソームモジュレータは、経口で投与される。一実施形態において、プロテアソームモジュレータは、局所的に投与される。一実施形態において、プロテアソームモジュレータは、点眼液、眼科用懸濁液、眼軟膏、眼科用エマルションまたは眼科用ゲルとして投与される。一実施形態において、プロテアソームモジュレータは、眼内に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の図面に関して、よりよく理解されるようになるであろう。
【００１１】
【図１】ＬＳＣＤ誘発の混濁のモデルおよび、角膜中央のみがＰＳ‐３４１の局所適用にさらされることを確実にするべく、角膜中央にＰＳ‐３４１を適用することを説明している。
【００１２】
【図２Ａ】正常な角膜上皮（ＮＥ）におけるＫ１３の染色を示している。
【００１３】
【図２Ｂ】角膜外傷後３ヶ月のＬＳＣＤ誘発の混濁のモデル（ＤＥ）において角膜中央がケラチン１３で覆われていることを示している。
【００１４】
【図３Ａ】角膜外傷後３ヶ月でＫ１３のレベルが上昇することを示している。
【００１５】
【図３Ｂ】角膜外傷後３ヶ月でＫ４のレベルが上昇することを示している。
【００１６】
【図３Ｃ】角膜外傷後３ヶ月のＧＡＰＤＨのレベルを示している。
【００１７】
【図４】角膜疾患の上皮においてＣＰＲ活性が著しく低下することを示している。
【００１８】
【図５Ａ】高用量のＰＳ‐３４１によって処置された口腔粘膜上皮細胞においてＣＰＲ活性が著しく低下することを示している。
【００１９】
【図５Ｂ】高用量のＰＳ‐３４１によって処置された口腔粘膜上皮細胞においてＫ４のレベルが上昇することを示している。
【００２０】
【図５Ｃ】高用量のＰＳ‐３４１によって処置された口腔粘膜上皮細胞においてＫ１３のレベルが上昇することを示している。
【００２１】
【図５Ｄ】高用量のＰＳ‐３４１によって処置された口腔粘膜上皮細胞におけるβアクチンのレベルを示している。
【００２２】
【図６】低用量のプロテアソームモジュレータＰＳ‐３４１による細胞の処置が、ＰＳ‐３４１による処置後７２時間のプロテアソーム活性のリバウンドをもたらすことを示している。
【００２３】
【図７Ａ】２．５ｎＭのＰＳ‐３４１による口腔粘膜上皮細胞（ＯＭＥＣＳ）の処置後７２時間の阻害薬カッパＢの発現のレベル低下を示している。
【００２４】
【図７Ｂ】２．５ｎＭのＰＳ‐３４１によるＯＭＥＣＳの処置後７２時間のＫ１３の発現のレベル低下を示している。
【００２５】
【図７Ｃ】２．５ｎＭのＰＳ‐３４１によるＯＭＥＣＳの処置後７２時間のＫ４の発現のレベル低下を示している。
【００２６】
【図７Ｄ】２．５ｎＭのＰＳ‐３４１によるＯＭＥＣＳの処置後７２時間のポリユビキチン化タンパク質のレベルを示している。
【００２７】
【図７Ｅ】２．５ｎＭのＰＳ‐３４１による処置後７２時間のＯＭＥＣＳにおけるリン酸化ＥＲＫのレベル低下を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
手短に言えば、以下により詳細に説明されるように、本明細書に説明されるのは、角膜縁の幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）に起因する角膜混濁の軽減に有用な方法および組成物である。角膜の薄濁または混濁をもたらすＬＳＣの欠損は、世界中で数百万人に失明をもたらす。角膜の問題は、緑内障、白内障、および加齢性黄斑変性症に次いで失明の第４の主因である。
【００２９】
現在のアプローチのいくつかの特徴が留意されるべきである。方法は、角膜損傷を有するおよび／または角膜混濁を患っている被験者における角膜混濁を防止または治療するためのプロテアソームモジュレータの投与を備える。方法は、例えば、ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブまたはベルケイド（登録商標））のようなプロテアソームモジュレータの投与を備える。方法はまた、ＰＳ‐３４１の濃度が非毒性であり、ＣＰＲの活性化をもたらす製剤の点眼液としてＰＳ‐３４１の投与を備える。方法はまた、ＰＳ‐３４１の投与を備え、その投与は、角膜内の炎症の軽減、ケラチンタンパク質、特に、ケラチン１３およびケラチン４の蓄積の減少をもたらす。
【００３０】
このアプローチの利点は多数ある。本発明の１つの重要な利点は、角膜混濁のリスクがあるまたはそれを患っている患者の視力の改善である。別の利点は、本発明が角膜混濁の治療に非侵襲的な代替法を提供することである。
【００３１】
定義  特許請求の範囲および明細書内で使用される用語は、特に指定されない限り、以下に記載されるように定義される。
【００３２】
「プロテアソームモジュレータ」という用語は、被験者におけるプロテアソーム活性またはプロテアソームの存在量の変化を含む、プロテアソームの機能の変化をもたらす、任意の化学または薬物の組成物または物質を指す。
【００３３】
「角膜混濁」という用語は、結膜化、角膜の瘢痕および角膜薄濁、角膜の透明度の低下、角膜内のゴブレット細胞の増加、角膜内の結膜のタンパク質の増加、角膜内のＭｕｃ５ａｃタンパク質の増加または角膜内のケラチンタンパク質の増加をもたらす角膜の状況を含む。
【００３４】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防、重症または進行の緩和、寛解あるいはそれらの治癒を含む、病態の状況を改善させようと試みるための医療の方法を指す。
【００３５】
「インビボ」という用語は、生体内で起こるプロセスを指す。
【００３６】
本明細書で使用されるように「哺乳動物」という用語は、ヒトも非ヒトも含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマおよびブタを含むがそれらに限定されない。
【００３７】
「投与」という用語は、本開示の薬剤をホストに導入することを指す。薬剤の投与の１つの経路は、経口投与である。別の経路は、経静脈投与である。しかしながら、局所、皮下、腹腔、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻、髄液への導入または体のコンパートメントへの滴下注入のような任意の投与の経路が使用され得る。
【００３８】
「溶媒対照群」という用語は、広く、活性成分のための溶媒、キャリアまたはバインダを含むがそれらに限定されない、活性成分が投与される任意の不活性媒体を指す。
【００３９】
「有効な量」という用語は、所望の効果を生むのに十分である量、例えば、状況または疾患の症状を改善するための量である。
【００４０】
「製剤」という用語は、薬剤的に許容される塩類、薬剤的に許容される賦形剤、薬剤的に許容される希釈剤、薬剤的に許容されるキャリアまたは薬剤的に許容されるアジュバントを含む医薬製剤を含む。
【００４１】
本出願において使用される略語は以下を含む。
【００４２】
ＣＰＲ＝２６Ｓ構成のプロテアソーム。
【００４３】
ＩＰＲ＝免疫プロテアソーム。
【００４４】
ＬＳＣＤ＝角膜縁の幹細胞欠損。
【００４５】
Ｋ１３＝ケラチン１３。
【００４６】
Ｋ４＝ケラチン４。
【００４７】
ＣＥＣ＝角膜上皮細胞。
【００４８】
ＣｊＥＣ＝結膜上皮細胞。
【００４９】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈がはっきりと規定しない限り、複数の指示物を含むということが留意されなければならない。
【００５０】
本発明の方法  本明細書に説明されるのは、本発明による角膜混濁の治療のための方法である。本発明の上記方法は、例えば、ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブまたはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ社のベルケイド（登録商標））のような治療上有効な量のプロテアソームモジュレータを投与する段階を含む。
【００５１】
本発明の方法に使用される化合物  本発明の方法に使用される化合物は、市販のプロテアソームモジュレータを備える。本発明の市販のプロテアソームモジュレータは、ＭＧ‐１３２、ボルテゾミブ（ＰＳ‐３４１）、ジヒドロエポネマイシン、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、ＭＬＮ２２３８、エポキソミシン、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＯＮＸ‐０９１４（ＰＲ‐９５７）、ＰＳＩ、ＭＧ‐１１５、ＭＧ‐２６２、ＡＭ１１４、ＰＩ‐１８４０、キモトリプシン様（ＣＴ‐Ｌ）阻害薬、ＭＬＮ９７０８、ＣＥＰ−１８７７０、グリオトキシン、サリノスポラミドＡ（ＮＰＩ‐００５２、マリゾミブ）、Ｃｌａｓｔｏ‐ラクタシスチンβ‐ラクトン、ラクタシスチン、イキサゾミブ（登録商標）、オレウロペインまたはそれらの誘導体あるいは類似体を含むが、それらに限定されない。
【００５２】
本発明の方法に使用される医薬組成物  本発明の方法に使用されるプロテアソームモジュレータは、医薬組成物で処方され得る。これらの組成物は、プロテアソームモジュレータの１または複数に加えて、薬剤的に許容される賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を備え得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、例えば、局所、経口、経静脈、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹腔内の経路のような投与の経路に依存し得る。
【００５３】
局所投与のための医薬組成物は、点眼液、眼科用ゲル形成溶液、眼科用懸濁液、眼軟膏、眼科用エマルションであり得る。
【００５４】
経口投与のための医薬組成物は、タブレット、カプセル、粉末または液体の形態のものであり得る。タブレットは、ゼラチンまたはアジュバントのような固体のキャリアを含み得る。液体の医薬組成物は概して、水、石油、動物油または植物油、鉱物油あるいは合成油のような液体のキャリアを含む。生理食塩水、ブドウ糖または他の糖類の溶液あるいは、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類が含まれ得る。
【００５５】
経静脈、皮膚または皮下の注射あるいは、眼内注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル液、乳酸化リンゲル液のような等張性の溶媒を使用して適切な溶液を調製することが十分に可能である。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
【００５６】
ある個人に与えられる、本発明による薬剤的に有用な化合物、投与は、好ましくは「治療上有効な量」または「予防的に有効な量」であり、これはその個人への有益性を示すのに十分なものである。投与される実際の量ならびに、投与の割合および時間経過は、治療されているタンパク質凝集の疾患の性質および重症度に依存するであろう。例えば、投与量の決定などの治療の処方は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、一般的に、治療される障害、個々の被験者の状況、送達部位、投与の方法および開業医に既知の他の要因を考慮する。上述の技術および手順の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見られ得る。
【００５７】
組成物は、治療される状況に依存して同時にまたは順次にのいずれかで、単独でまたは他の治療と併用して投与され得る。
【００５８】
実施例  以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定する意図は全くない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするべく努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差および偏差は、もちろん、許容されるべきである。
【００５９】
本発明の実施は、特に示されない限り、当技術分野の技術内のタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を採用するであろう。そのような技術が文献内に十分に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【００６０】
方法  ウサギのＬＳＣＤのモデル  体重２．５から３ｋｇのニュージーランドホワイトウサギが使用された。ウサギは、米国科学アカデミーにより説明され、生命科学米国学術研究会議の研究用動物資源協会により発行されたように、アニマルケアのガイドラインに従って管理された。ＬＳＣＤがウサギに外科的に誘発された（実施例１参照）。手短に言えば、ウサギは鎮静させられ、３６０度層状角膜縁切除術（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｍｂｅｃｔｏｍｙ）を受けさせられ、眼科医によりＬＳＣＤが安定していると確認されるまで３ヶ月間経過観察された。
【００６１】
細胞診所見  直径１２ｍｍ、孔径０．４μｍで混合セルロース膜のミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）（登録商標）カルチャーインサート（マサチューセッツ州、ビレリカ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）が、角膜上皮細胞をサンプリングするべく使用された。インサートは、角膜上に数秒間載せられ、次にゆっくり除去された。次にインサートは、室温で１時間乾燥された。次にインサートは、１０％の中性緩衝ホルマリン内で一晩凝固され、免疫組織化学的染色の分析より前に７０％のエタノール内に保存された。膜は、免疫蛍光分析においてＫ１３で染色された。
【００６２】
角膜上皮細胞（ＣＥＣ）および繊維血管性パンヌス組織（ＰＴ）サンプリング  ウサギは、軽く鎮静させられ、角膜上皮をゆるめるべく、角膜を２０％のイソプロピルアルコールに１分間さらすことにより角膜上皮細胞がサンプリングされた。次に角膜は、生理食塩水で３回洗浄され、ＣＥＣが角膜表面から採取され、２ｍｍのアングル型でダブルベベルのクレセントナイフ（ニュージャージー州、デンビル、Ｋａｔｅｎａ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ株式会社）を使用して眼科医によりＰＴが切除および除去された。ＣＥＣは、ＰＢＳに懸濁され、遠心分離され、次に供給業者（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社）により指示されたように、ｐＨ＝７．５の２０ｍＭのトリス塩酸、グリセロール１０％１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼおよび脱リン酸化酵素阻害薬の反応混液を含む溶解緩衝液に再懸濁された。細胞膜は、５秒の音波処理により破壊された。次にサンプルは、全てのサンプル‐健康なおよびＬＳＣＤの上皮細胞‐が生化学分析のために集められるまで、−８０℃で凍結された。
【００６３】
ウェスタンブロット分析  タンパク質濃度は、バイオ・ラッド社のプロテインアッセイを使用して測定された。溶解された角膜上皮細胞のサンプルからおよび採取された口腔粘膜上皮細胞のサンプルからの総タンパク質量の２μｇが、１２４から２０％の勾配ポリアクリルアミドゲルを使用して、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動法により分離された。次にタンパク質は、１時間、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ＝８．３）、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％のメタノール内で、ＰＶＤＦ膜（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移された。膜は、ケラチンＫ４およびＫ１３に対する１次抗体（カリフォルニア州、サンタクルズ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて探索された。ヤギ抗マウスおよびヒツジ抗ヤギの抗体（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）が、２次抗体として使用された。免疫検出が、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ株式会社）を使用して行われた。バンドの濃度測定が、ＧＳ‐８００イメージングデンシトメータ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して実行された。
【００６４】
免疫組織化学  正常なおよびＬＳＣＤ疾患のある角膜上皮細胞ならびに口腔粘膜上皮細胞の標本が１０％の中性緩衝ホルマリン内で凝固された。処理された組織は、薄片にされて、スライドが免疫蛍光染色において染色された。ケラチンＫ４およびＫ１３に対するマウスモノクローナル抗体（カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ユビキチンに対するヤギポリクロナール（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）が、一重染色および二重染色で使用された。Ｋ４およびＫ１３が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に結合された２次抗体で検出された。ユビキチンが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ（登録商標）５６８ロバ抗ヤギに結合された２次抗体で検出された。４'，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が核染色に使用された。タンパク質発現のレベルが、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｘおよびＤＡＰＩを検出するべく、ＦＩＴＣキューブおよびトリプルバンドキューブを備えるＮｉｋｏｎ  ４００蛍光顕微鏡を使用して検査された。画像処理および分析が、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳ５を使用して実行された。
【００６５】
口腔粘膜上皮細胞の単離、細胞培養およびプロテアソーム阻害薬による処置  口腔粘膜の生検が、直径６ｍｍの使い捨てパンチ生検用器具（フロリダ州、ジャクソンビル、Ｂｉｏｐｕｎｃｈ  ＨｅａｌｔｈＬｉｎｋ社）を使用して、鎮静させられた動物に実行された。生検の標本は、無菌食塩水内で洗浄され、ポピドンヨード内で除菌され、無菌食塩水内で再び洗浄され、次にＤＭＥＭ細胞培地内で洗浄された。次に、［２１］に前述のように、標本が口腔粘膜上皮細胞を単離するべく使用された。手短に言えば、標本は刻まれ、ディスパーゼＩ（ドイツ、マンハイム、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）によって１時間、３７℃でインキュベートされ、上皮は粘膜固有層から分離され、上皮細胞を分離するべくトリプシン消化を受けさせられた。次に、単離された１次上皮細胞は、５×１０５の密度でトランズウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ株式会社）にまかれ、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処置のＮＩＨ／３Ｔ３支持細胞（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（ＭＭＣ）‐ｔｒｅａｔｅｄ  ＮＩＨ／３Ｔ３  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ）と共培養された。細胞培養の４日後、培地が変えられ、ＥＧＦが１０ｎｇ／ｍＬの終濃度で加えられた。細胞の培地は２日毎に変えられた。細胞培養の２週間後かつ、細胞が多層組織のようなものを形成するまで育ったときに、プロテアソーム阻害薬（ＰＳ‐３４１、（ボルテゾミブ／Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ製薬会社のベルケイド（登録商標））非常に特異的なプロテアソーム阻害薬）が、それぞれプロテアソーム阻害またはプロテアソーム活性化を達成するべく、２４時間および７２時間、２．５、５、１０、２０および５０ｎＭで細胞培地に加えられた。
【００６６】
プロテアソーム活性  サンプルのホモジネートから総タンパク質量の１μｇが使用された。反応混合物は、ｐＨ＝８の５０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＤＴＴおよび、キモトリプシン様活性のための４０μＭのＳｕｃ‐Ｌｅｕ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｔｙｒ‐ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）基質または、トリプシン様活性のための４０μＭのＢｏｃ‐Ｌｅｕ‐Ｓｅｒ‐Ｔｈｒ‐Ａｒｇ‐ＡＭＣまたは、カスパーゼ様活性のための１００μＭのＡｃ‐Ｇｌｙ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｓｐ‐ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含んだ。５ｍＭのＡＴＰが、２６Ｓプロテアソーム活性を２０Ｓプロテアソーム活性と区別するべく反応混合物に加えられた。次に混合物は３７℃で３０分間インキュベートされ、次に１００μＭのモノクロロ酢酸およびｐＨ＝４．３の３０ｍＭの酢酸ナトリウムを加えることにより止められた。蛍光は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＬＳ３０分光蛍光光度計を使用して、ＡＭＣの放出（λ励起３７０ｎｍ、λ蛍光４１０ｎｍ）を測定することにより決定された。
【００６７】
統計  データは少なくとも３つの別個の実験から得られた。棒は、平均値±ＳＥＭを表す。Ｐ値は、複数の群の比較のための一元配置分散分析およびスチューデント‐ニューマンコイルス法（カリフォルニア州、サンフランシスコ、Ｓｉｇｍａ−Ｓｔａｔ  ｓｏｆｔｄｉｓｈ）により決定される。統計的有意性は、ｐが０．０５に等しいまたはそれより小さいところに設定される。棒グラフは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３‐４として示された。
【００６８】
実施例１：ＬＳＣＤ誘発の混濁のモデル  ＬＳＣＤ誘発の混濁の我々のモデルは、角膜縁の幹細胞の完全な除去を達成し、安定したＬＳＣＤを得た。実験の手順が以下のスケジュールに従って実行された。１）麻酔の投与、２）ＬＳＣＤをもたらすべく層状角膜縁切除術を実行する、３）病状が安定するまで３ヶ月間経過観察する、４）１ヶ月間７２時間毎にＰＳ‐３４１の予め決定された最適な用量の局所投与（図１）によりＰＳ‐３４１治療を行う。我々のインビトロ研究に基づいて、ＰＳ‐３４１の最適な用量の１滴が１ヶ月間７２時間毎に投与された。角膜は、スケジュールされた経過観察においてルーチン的に検査された。５）角膜混濁のグレード付けが、虹彩の細部の可視性に基づいて実行され、グレード０：可視の虹彩の細部を有する透明な角膜、グレード１：明瞭さの少ない虹彩の細部を有する軽度の混濁、グレード２：虹彩があまり見えない場合、中等度の混濁、グレード３：虹彩が見えず、角膜が完全に不透明な場合、重度の混濁、としてスコア化された。６）ウサギが犠牲になり、角膜上皮細胞および繊維血管性パンヌス組織を含む角膜組織が、組織学的分析のため、およびＰＳ‐３４１（Ｋ４／Ｋ１３染色）の効果をスコア化するべく採取された。角膜中央のＰＳ３４１治療が、角膜をＰＳ３４１の局所適用にさらすことにより実行された。改変されたＫ１３および／またはＫ４のみが、内在性のＫ１３および結膜上皮の統合性に全く影響せずに除去されるように、トレフィンがＰＳ３４１の露出を角膜中央のみに限定するべく使用された（図１）。
【００６９】
実施例２：ＬＳＣＤ誘発の混濁のモデルにおいて、角膜中央がケラチン１３およびケラチン４で覆われる。  ＬＳＣＤ誘発の混濁のモデルの病理組織学的検査からの結果は、それぞれ図２Ａおよび図２Ｂの組織の切片の最上部の細胞質の細胞の染色により示されるように、正常な角膜が結膜側のみでＫ１３を陽性に染色したが、Ｋ１３はＬＳＣＤ疾患のある角膜の角膜中央を著しく覆ったことを示した。Ｋ４はまたＬＳＣＤ疾患のある角膜の縁部結膜領域および角膜中央で検出された（データは示されていない）。加えて、ＬＳＣＤ疾患のある角膜から採取されたパンヌス組織は、Ｋ４について陽性であることが発見された（データは示されていない）。その結果は、角膜中央が、ＬＳＣＤを有する動物からの角膜においてＫ１３およびＫ４で覆われており、正常な角膜においては覆われないことを示す。健康な角膜上皮細胞（Ｈ‐ＣＥＣ）と比較して、疾患のある角膜上皮細胞（Ｄ‐ＣＥＣ）内にさらなるより高分子量のバンドを有するＫ１３およびＫ４の蓄積があった。これらはＫ１３およびＫ４の翻訳後修飾を示していて、かつ、Ｋ１３のユビキチン化が疾患のある上皮内のＣＰＲ不全と関連していることを示唆している（図３Ａから図３Ｃ）。ＬＳＣＤ疾患のある角膜から採取されたパンヌス組織（ＰＴ）はまたＫ１３およびＫ４の増加を実証した（図３Ｄから図３Ｆ）。
【００７０】
実施例３：ＬＳＣＤの角膜上皮内でＣＰＲプロテアソーム活性が低下する。  ＬＳＣＤのウサギから採取された角膜上皮細胞になされた実験は、角膜疾患の上皮（ＤＥ）内で全てのＣＰＲ活性が著しく低下したことを示した（図４）。
【００７１】
実施例４：Ｋ４およびＫ１３はＣＰＲにとっての基質である。  Ｋ１３の蓄積におけるＣＰＲの機能不全の役割をさらに実証するべく、結膜上皮細胞と同様にＫ４／Ｋ１３を発現する、ウサギの口腔粘膜上皮細胞（ＯＭＥＣＳ）が、培養され、細胞の採取の前に２４時間、終濃度１０および５０ｎＭを使用して高用量でプロテアソーム阻害薬ＰＳ‐３４１（ボルテゾミブ／ベルケイド（登録商標））で処置された。図５は、ＯＭＥＣＳが高用量のＣＰＲ阻害薬で処置されたときに、キモトリプシン様プロテアソーム活性が低下し、Ｋ４およびＫ１３が改変され、著しく蓄積されたことを示す。さらに、プロテアソームは、Ｋ１３について陽性に染色された部分をプルダウンする（データは示されていない）。これらの結果は、Ｋ４およびＫ１３がＣＰＲにとっての基質であることを実証した。
【００７２】
プロテアソームにより分解される全てのタンパク質がユビキチンとタグ付けされるので、我々はＰＳ‐３４１で処置されたＯＭＥＣＳにおいてケラチンがユビキチン化されたかどうかを分析するべく二重染色の実験を行った（データは示されていない）。Ｋ４もＫ１３もユビキチン化されることを示している、Ｋ４およびＫ１３とユビキチンとの再現可能な共存があった。
【００７３】
実施例５：非毒性の用量のプロテアソーム阻害薬での処置は、プロテアソーム活性のリバウンドおよびＫ１３およびＫ４のレベルの低下をもたらす。  培養されたウサギの経口粘膜上皮細胞において実証されるように、プロテアソーム阻害薬の処置の有益な効果は、薬物の可逆性およびＰＳ‐３４１の処置後７２時間のプロテアソーム活性のリバウンドにある（図６）。口腔粘膜上皮細胞は、２４時間および７２時間、２．５、５、１０、２０および５０ｎＭでＰＳ‐３４１で処置された。２４時間で、全てのＰＳ‐３４１の用量は、（それぞれ、−９％、−４１％、−５９％、−８４％および−８６％の）ＣＰＲキモトリプシン様活性の低下をもたらす。７２時間で、２．５ｎＭ、５ｎＭおよび１０ｎＭが、プロテアソーム活性を増加させる最適の用量である。２．５ｎＭは、未処置の細胞より６１％高い、プロテアソームのキモトリプシン様活性において最も高い増加を示した。ＰＳ‐３４１の２．５ｎＭでの処置はまた最初の２４時間でＩκＢを安定させることにより炎症を減らし、それは次に、ＮＦκＢの活性化を阻害し（図７Ａ）、結果的に、ＰＳ‐３４１処置のＯＭＥＣＳにおいてＫ１３およびＫ４のレベルが低下した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。７２時間、ＰＳ‐３４１の２．５ｎＭで処置された細胞のウェスタンブロット分析は、著しいポリユビキチン化タンパク質の蓄積を示さず（図７Ｄ）、リン酸Ｅｒｋのレベルに著しい変化を示さず（図７Ｅ）、それはアポトーシスシグナルの欠如を示唆し、かつ、処置がこの非常に低用量では毒性の影響を生じないことを示している。したがって、低用量のプロテアソーム阻害薬での細胞の処置は、ケラチンタンパク質の分解をもたらすプロテアソームのリバウンド活性において長期の増加をもたらす。
【００７４】
本発明は、好適な実施形態および様々な代替的な実施形態を参照して具体的に示され、説明されているが、形態および詳細の様々な変更が、本発明の意図および範囲から逸脱することなくそこになされ得ることが、当業者により理解されるであろう。
【００７５】
本明細書の本文内に引用された全ての文献、発行された特許および特許出願は、全ての目的のために、これにより、それら全体が参照により組み込まれる。  引用文献  １．Ｂａｒｄａｇ‐Ｇｏｒｃｅ  Ｆ，Ｒｉｌｅｙ  ＮＥ，Ｎａｎ  Ｌ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＲＯ，Ｌｉ  Ｊ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＢＡ，Ｌｕｅ  ＹＨ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＳＷ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＳ‐３４１，ｃａｕｓｅｓ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ａｇｇｒｅｓｏｍｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４；７６（１）：９‐１６．  ２．Ｂａｒｄａｇ‐Ｇｏｒｃｅ  Ｆ，Ｏｌｉｖａ  Ｊ，Ｗｏｏｄ  Ａ，Ｈｏｆｔ  Ｒ，Ｐａｎ  Ｄ，Ｔｈｒｏｐａｙ  Ｊ，Ｍａｋａｌｉｎａｏ  Ａ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＳＷ，Ｎｉｉｈａｒａ  Ｙ．Ｃａｒｒｉｅｒ‐ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔ（ＣＡＯＭＥＣＳ）ｆｏｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ．２０１５；１３（２）：１５０‐６３  ３．Ｌｉｎ  ＣＴ，Ｈｕ  ＦＲ，Ｋｕｏ  ＫＴ，Ｃｈｅｎ  ＹＭ，Ｃｈｕ  ＨＳ，Ｌｉｎ  ＹＨ，Ｃｈｅｎ  ＷＬ.Ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｌｉｍｂａｌ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１０．  ４．Ｐｏｌｉ  Ｍ，  Ｂｕｒｉｌｌｏｎ  Ｃ，  Ａｕｘｅｎｆａｎｓ  Ｃ，Ｒｏｖｅｒｅ  ＭＲ，  Ｄａｍｏｕｒ  Ｏ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｉｍｂａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｒｎｅａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｏｒｎｅａ．２０１５；３４（７）：８１７‐２３．
【図１】
2018533590.tif 000003
【図２Ａ】
2018533590.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2018533590.tif 000013
【図５Ｂ】
2018533590.tif 000014
【図５Ｃ】
2018533590.tif 000015
【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018533590.tif 000019
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【国際調査報告】
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2018533590.tif 000024