(57)【要約】  好ましくはインターロイキン２３（ＩＬ−２３）関連疾患の予防または処置に使用されるワクチンであって、薬学的に許容されるキャリアに結合したペプチドを含み、前記ペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）の群から選択され、前記ＩＬ−２３関連疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、好ましくはＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病もしくは多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病、がん、好ましくは、食道がん、大腸がん、肺腺がん、小細胞がん、および口腔の扁平上皮がん、特に、乾癬、神経変性疾患またはＩＢＤの群から選択される、ワクチンを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２３（ＩＬ−２３）関連疾患の予防または処置に使用するワクチンであって、薬学的に許容されるキャリアに結合したペプチドを含み、前記ペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）の群、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）から選択され、前記ＩＬ−２３関連疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病または多発性硬化症）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病およびがん（特に、食道がん、大腸がん、肺腺がん、小細胞がん、および口腔の扁平上皮がん）；好ましくは、乾癬、乾癬性関節炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病）、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、またはＩＢＤ；特に、乾癬、乾癬性関節炎またはＩＢＤの群から選択される、ワクチン。
【請求項２】
少なくとも１つのシステイン残基が、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
少なくとも１つのシステイン残基が、ペプチドのＮ末端に結合している、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
キャリアがタンパク質キャリアである、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
タンパク質キャリアが、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）からなる群から選択される、請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
ワクチンが、アジュバントと共に処方され、好ましくは、キャリアに結合したペプチドがミョウバンに吸着している、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与で処方される、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
ペプチドが、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量で、ワクチンに含まれる、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ペプチドが、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、特に２〜５アミノ酸残基を有するペプチドリンカーによって、キャリアに結合している、請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−ＧｌｙおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの群から選択される、請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
ワクチンが、ビエピトープワクチン、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）の群のペプチドを含むワクチンである、請求項１〜１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
ワクチンが、２成分ワクチン、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群からのペプチド、およびＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群からのペプチド、好ましくはペプチドＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）およびペプチドＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、を含み、それぞれが別個のキャリアと結合する、請求項１〜１１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のワクチン、および、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病または多発性硬化症）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病、がん（特に、食道がん、大腸がん、肺腺がん、小細胞がん、および口腔の扁平上皮がん）；好ましくは、乾癬、乾癬性関節炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病）、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、またはＩＢＤ；特に、乾癬、乾癬性関節炎またはＩＢＤの群から選択される疾患に対する、さらなるワクチン、好ましくは抗ＩＬ−２３ワクチン、特に抗ｐ１９−ＩＬ−２３ワクチンを含む、ワクチンのキット。
【請求項１４】
ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、およびＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群から選択される、ペプチド。
【請求項１５】
１つのペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群から選択され、第２のペプチドが、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群から選択され、好ましくはペプチドＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）とペプチドＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）である、ペプチド対。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）関連疾患の予防または処置に関する。
ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ファミリーに属し、これはヘテロ２量体のサイトカインである。ＩＬ−２３は、ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２と共通で、ｐ３５要素と結合する）、およびジスルフィド結合で連結したｐ１９サブユニットで構成される(Oppmann et al., 2000)。最初に発見された際、ｐ１９サブユニットはＩＬ−Ｂ３０と命名された。間もなく、このサブユニットは、ｐ４０サブユニットと対をなす場合にのみ、生物学的機能を示すことが発見された(Oppmann et al., 2000)。
【０００２】
数種の機能性ドメインが、サブユニットにおいて記述されてきた：ｐ１９の表面で、その受容体であるＩＬ−２３Ｒとの相互作用を形成するドメイン、ｐ４０の表面で、ＩＬ−１２受容体の一部であるＩＬ−１２β１と相互作用を形成するドメイン、ｐ４０の、ＩＬ−２３Ｒとの相互作用におけるドメイン、ならびにｐ１９およびｐ４０の両方における、この２つのサブユニットの相互作用を促進するドメイン。
【０００３】
ＩＬ−２３に対する特異性を与える受容体は、ヘモポイエチン受容体ファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１２Ｒβ１と対をなし、この受容体はＩＬ−１２ｐ４０と結合する。そのリガンドと結合すると、この受容体はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達し、ＳＴＡＴ３に支配的に関与し、またＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ５にも関与する。
【０００４】
機能的に、ＩＬ−２３は、メモリーＴ細胞の増殖の誘導に関与し(Oppmann et al., 2000)、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞を産生し、安定化し、かつ維持するという点で独特である。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞とは異なる、最近記述されたＴ細胞分化の系であり、大量のサイトカインおよび炎症性エフェクターを発現する。さらに、ＩＬ−２３は、様々な１７型免疫細胞の生物学において役割を担っており、これらの細胞は、性質および役割が未だほとんど不明な細胞集団の多形性群である (Gaffen et al., 2014)。
【０００５】
ＩＬ−２３の機能についての検定は、わずかしかない。現在の標準的なアッセイは、細胞のアッセイであり、これは単離したマウスの脾細胞が、ヒトＩＬ−２３での刺激後に、ＩＬ−１７Ａを産生する能力を定量化する(Aggarwal et al., 2003)。このアッセイは、ｒＩＬ−２３の製造者によって通常用いられ、その製品の質を評価する。「ＳＴＡＴ３−アッセイ」と呼ばれる分子アッセイは、ＩＬ−２３がその受容体に結合し、ＪＡＫ２およびＴＹＫ２を介してシグナル伝達した後、ＳＴＡＴ３がＹ７０５においてリン酸化される、という事実を利用する。ＳＴＡＴ３のリン酸化を、フローサイトメトリーにおいて、ＳＴＡＴ３ｐ特異的モノクローナル抗体でモニターできる。種々の細胞系において、ＩＬ−２３誘導性の細胞増殖後の比色反応に基づく、他のアッセイが文献に報告されてきたが、我々には再現性がとれなかった。
【０００６】
ＩＬ−２３は、数種の悪性腫瘍に大きく関与することが示されてきた。これらの中で最も有名であり、これに関連して最も研究されているものが、乾癬である。
【０００７】
乾癬は、外因性および内因性ｎｏｘ（(Wippel-SlupetzkyおよびStingl, 2009)に概説）が起因となり得る、慢性および再発性の炎症性皮膚疾患である。この疾患は、人口の約２％に発症し、生活の質を低下させる（不快感、身体障害、社会的交流の抑制、併存疾患）。この疾患は未だ不治で、集中治療的で、患者にとって身体的、精神的、社会的および物質的な側面において大きな負担となり、自殺傾向に達し得るため、新規で有効な治療法の十分な必要性がある。乾癬に関連する治療の年間の総売上高は、３３億米ドル／年と見積もられる。
【０００８】
この疾患の病因は未だ解明されておらず、可能性のある多数の内因性および外因性トリガーが遺伝的な素因と共に、乾癬に対する感受性の遺伝様式を複雑にしている。最近のデータは、ＩＬ−２３が、この疾患の進行および永続化において、中心的な役割を果たしていることを示す。サイトカインおよびその受容体の両方が、この病気に遺伝的に関連しており、サイトカインの発現は、通常の皮膚と比較して、乾癬病巣において明らかに増加する(Lee et al., 2004)。
【０００９】
ＩＬ−２３は、大部分が単球および樹状細胞によって産生（おそらく、損傷したケラチノサイトの生成物がトリガーとなる）し、Ｔｈ１７細胞を刺激および維持することによって炎症に寄与し、Ｔｈ１７細胞は続いて数種のサイトカインを発現する。これらの中で、ＩＬ−１７Ａは、様々な炎症性エフェクターおよびサイトカインの産生を活性化し、したがって、炎症性の環境を作り出すのに寄与し、ＩＬ−２２は、ケラチノサイトの過剰増殖のトリガーとなる。損傷したケラチノサイトは、走化性のより多くの免疫系細胞を次々に誘引し、炎症の悪化を起こす(Nestle et al., 2009)。
【００１０】
乾癬に加えて、数種の他の疾患が、Ｔｈ１７／ＩＬ−２３経路の脱制御に関連している（例えば、(Gaffen et al., 2014)に概説）：例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎(hidratenitis suppurtiva)、ＡＮＣＡ関連血管炎、およびアルツハイマー病、ならびに様々な形式のがん。このリストは速いペースで増えている。
【００１１】
新規の抗体に基づく治療法は、乾癬を患う患者のＩＬ−２３の減少を目的とする。臨床研究は、ＩＬ−２３とその受容体との結合に干渉する抗体の反復適用が、この疾患の症状の顕著で永続的な改善を導くことを示す(Cingoz, 2009)。これらの研究の結果として、ある抗体（ウステキヌマブ／ステラーラ（登録商標））が乾癬の処置において承認されたが、他の数種は開発中である。マウスＩＬ−２３サブユニット配列に由来する、特定のＫＬＨに連結したペプチドでの、マウスのワクチン接種は、関節炎およびＩＢＤに対して有効であることが示されてきた。
【００１２】
WO 2005/108425 A1は、アレイ形式でのＩＬ−２３ｐ１９抗原に関する。Ratsimandresy et al. (Vaccine 29 (2011): 9329-9336)の論文は、特異的なペプチドを用いた、ＩＬ−２３ｐ１９に対する能動免疫化を報告する。Guan et al. (Immunotherapy 5 (2013): 1313-1322)の論文は、ＩＬ−２３をブロックし、慢性マウス大腸炎を改善する、ＩＬ−２３ｐ１９ワクチンを開示する。WO 2007/027714 A2は、抗ＩＬ−２３抗体の設計を開示する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、ＩＬ−２３関連疾患、特に乾癬に有効な代替手段および／または改善した手段を提供することである。これらの手段は、好ましくは、処置した患者への重大な副作用を伴わず、効率的で費用対効果の高い、これらの疾患の予防方法および処置方法を可能にするはずである。さらに、このような手段は、好ましくは、多くの患者の予防および処置を、確実な方法で可能にし、公的および民間の医療システムにおいて、容易に利用可能および適応可能なものである。
【００１４】
したがって、本発明は、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）関連疾患の予防および処置に使用するワクチンを開示し、これは薬学的に許容されるキャリアに結合したペプチドを含み、前記ペプチドはＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）からなる群から選択される。前記ＩＬ−２３関連疾患は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病（好ましくはＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、神経変性疾患（好ましくはアルツハイマー病または多発性硬化症）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病またはがん（好ましくは、食道がん(oesophagal carcinoma)、大腸がん、肺腺がん、小細胞がん、または口腔の扁平上皮がん）；好ましくは、乾癬、乾癬性関節炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病）、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、またはＩＢＤ；特に、乾癬、乾癬性関節炎、ＩＢＤの群から選択される。
【００１５】
本発明において、AFFITOPE（登録商標）と呼ばれる、明確に定義されたペプチドを提供し、これは、乾癬および／または、Ｔｈ１７／ＩＬ−２３経路の異常調節によって起こり、もしくは悪化する他のヒト疾患の、発症、軽減または治癒において、ワクチン接種する試薬として使用できる。そのような疾患は、当分野でよく記述されており、例えば、Leng et al.（全身性エリテマトーデス）、Monteleone et al.（ＩＢＤ／クローン病）、Brennan et al.（関節リウマチ）、Chi et al. 2008（ベーチェット病）、Zeng et al.（強直性脊椎炎（ベクテレフ病(M. Bechterev)））、Chi et al. 2007（フォークト・小柳・原田病）、Schlapbach et al.（化膿性汗腺炎）、Fukuda et al.（扁平上皮がん、非小細胞肺がんなどのがん）またはvom Berg et al.（アルツハイマー病）である。
【００１６】
さらに、最近のデータは、ＩＬ−２３がトリガーとなった炎症が、他の疾患（アルツハイマー病またはおそらく糖尿病など）を悪化させ得ることを示唆するため、ＩＬ−２３に対するワクチンを、他の標的に対するワクチンと共に使用してもよい。本発明におけるAFFITOPE（登録商標）によって誘発される抗体は、ＩＬ−２３に対して特異的であり、このサイトカインは、この経路の初期段階で重要な役割を担う。モノクローナル抗体での受動ワクチン化に対する、能動免疫化の利点は、個人および／または医療システムにおけるより低いコスト、レジメン完了後の免疫応答の推定上のより長い持続、および応答のポリクローナルな性質による、抗薬剤抗体の誘発のより低い可能性である。
【００１７】
本発明におけるワクチンは、薬学的に許容されるキャリアに結合したＩＬ−２３特異的AFFITOPE（登録商標）（「本発明におけるペプチド」）から構成される。このキャリアは、本発明におけるペプチドに直接連結してもよい。また、ペプチドとキャリアとの間に特定のリンカー分子を与えてもよい。そのようなリンカーの提供は、ワクチンに有益な性質をもたらし得る（例えば、免疫原性の改善、特異性の改善、または取り扱いの改善（例えば、溶解性または製剤能力の改善による））。好ましい実施態様において、本発明におけるペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する、少なくとも１つのシステイン残基を含む。特に好ましい例は、配列番号１６（ＣＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱＲＬ；ｐ６０６３）、２８（ＣＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ；ｐ８４６１）、３３（ＣＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ；ｐ８４００）、４３（ＣＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ；ｐ９２６９）、４６（ＣＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ；ｐ９４４０）、４７（ＣＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ；ｐ９４４１）および２４（ＣＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ；ｐ８３２２）におけるペプチドである。そして、このシステイン残基を用いて、ペプチドをキャリアと共有結合的に連結してもよい。システイン残基を、ペプチドの任意の適切な位置に供給できるが、システイン残基をペプチドのＮ末端に連結することが特に好ましい。
【００１８】
したがって、本発明の好ましいワクチンにおいて、ペプチドは、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、特に２〜５アミノ酸残基を有するペプチドリンカーによって、キャリアと結合する。好ましいリンカーは、ワクチン技術において、適用および／または承認されたリンカーであり；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−ＧｌｙおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどの、システイン残基を含む、またはからなるペプチドリンカーが特に好ましい。
【００１９】
好ましい実施態様において、本発明のワクチンは、ビエピトープ(biepitopic)のワクチン、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）の群のペプチドを含む、ワクチンである。ビエピトープワクチンは、２つのエピトープを組み合わせた、より長いペプチドを含む。考え得る状況は、それらの本来の配列もしくは変更された配列のいずれかにおける、天然に存在する一続きのエピトープ、または、一つのペプチドに連結され、おそらくはスペーサーによって分離されている、複合体の同一または異なるサブユニットにおける、離れた位置にあるエピトープの組合せ、を含む。好ましい実施態様において、これらのビエピトープペプチドを、他の標的ペプチド、好ましくは、配列番号１１６〜１３４（下記参照）における１以上のペプチドなどの、さらなるＩＬ２３ｐ４０ペプチドおよび／またはＩＬ２３ｐ１９ペプチド、特にペプチドｐ６４４９（ｐ４０３５−４９）および／またはペプチドｐ６０６１（ｐ１９１００−１１９）と組み合わせる。
【００２０】
さらなる好ましい実施態様において、本発明のワクチンは２成分ワクチン(binary vaccine)であり、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４５９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群からのペプチド、およびＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群からのペプチド、好ましくはＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）ペプチドとＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）ペプチド、を含むワクチンであり、それぞれは別個のキャリアと結合する。２成分ワクチンでは、２つのモノエピトープ(monoepitopic)ペプチドが、対象に同時に適用される。考え得る状況は、同一のドメイン由来のペプチド、分子／複合体の異なるサブユニット由来の空間的に区別されるドメイン由来のペプチド、または異なる標的由来のペプチド、に関する。ペプチドを、同一または異なるキャリアに連結してもよく、後者はキャリア依存的なエピトープ阻害を回避する。このような２成分ワクチンを、（複数の特異性を有するワクチンとして）一つのワクチンに含んでもよく、または１以上のワクチンを含むキットにおいて提供してもよい。最近のワクチン戦略は、複数の特異性を有するワクチンの使用を好む（本発明においても好ましい）が、特に、Ｔｈ１７／ＩＬ−２３経路などの複雑な経路の対処を扱う際の戦略があり得、各々が異なる特異性を有する複数のワクチンを、複数の特異性を有するワクチンの代わりに適用する。したがって、本発明はまた、本発明におけるワクチン、および、疾患関連タンパク質に対するさらなるワクチン、好ましくは特にＴｈ１７／ＩＬ−２３経路における標的に対処するワクチン、好ましくはＩＬ１２／２３ｐ４０由来のペプチドｐ６４４９（ｐ４０３５−４９）などの抗ＩＬ−２３ワクチン、特にペプチドｐ６０６１（ｐ１９１００−１１９）などの抗ＩＬ−２３ｐ１９ワクチンを含む、ワクチンのキットを提供する。
【００２１】
WO 2005/108425 A1 [Bachman/Cytos]において、ＩＬ−２３ｐ１９由来のＦＹＥＫＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥ、ＦＹＥＫＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰ、ＶＡＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱＰ、ＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰＶＡＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱＰ、ＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（＝ｐ８７５９）、ＰＳＬＬＰＤＳＰ、ＬＰＤＳＰＶＡ、ＦＹＥＫＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰＶＡＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱＰ、ＬＬＰＤＳＰ、ＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰＶＡＱＬＨＡＳＬＬＧ、ＦＹＥＫＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰＶＡＱＬＨＡＳＬＬＧ、ＱＰＥＧＨＨＷ、ＬＰＤＳＰＶＧＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱおよびＱＣＱＱＬＳＱＫＬＣＴＬＡＷＳＡＨＰＬＶが、ＩＬ−２３のワクチンペプチドとして提案された。WO 03/084979 A2 [Zagury]において、ＩＬ−２３ｐ１９由来のＧＨＭＤＬＲＥＥＧＤＥＥＴＴ、ＬＬＰＤＳＰＶＧＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱおよびＬＬＲＦＫＩＬＲＳＬＱＡＦＶＡＶＡＡＲＶ（＝ｐ７９７７）ならびにＩＬ−１２／２３ｐ４０サブユニット由来のＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥおよびＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧが、抗サイトカインワクチンの可能性があるとして、言及された。Ｔｈ１７／ＩＬ−２３系の構成要素に対するワクチン接種は、Ｔｈ１７／ＩＬ−２３依存性疾患の様々な動物モデルにおいて、試みられてきた。検査された処方は、キャリアに連結した、全マウスＩＬ−１２(Uyttenhove)およびマウスＩＬ−１７（ａａ２６〜１５８）、ならびにＨＢｃＡｇと遺伝子組換えによって連結した、マウスＩＬ−１２／２３Ｐ４０由来のペプチドである、ＰＥＥＤＤＩＴＷＴＳＤＱＲＨＧＶＩＧＳ、ＰＤＳＲＡＶＴＣＧＭＡＳＬＳＡＥＫＶおよびＴＰＤＡＰＧＥＴＶであった(Guan 2009, 2012)。さらに、マウスＩＬ−２３ｐ１９由来の配列ＤＳＤＩＦＫＧＥＰＡＬＬＰＤＳＰＭＥＱＬおよびＴＱＱＭＰＳＬＳＳＳＱＱＷＱＲＰＬＬＲＳが調査された(Ratsimandresy)（配列番号１１６〜１３９）。したがって、本発明のワクチンの好ましい実施態様において、本発明のペプチドを、そのような先行技術の１以上のペプチド、特に配列番号１１６〜１３４の群の１以上と組み合わせてもよい。
【００２２】
さらなる実施態様において、本発明はまた、そのような本発明のペプチド、または医薬品において提供される本発明のペプチド、すなわち、ＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱＲＬ（配列番号９７；ｐ６０６３）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群から選択されるペプチド、ならびにＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、およびＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群由来のペプチド、に関する。本発明の別の態様は、ペプチド対に関し、１つのペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群から選択され、第２のペプチドが、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群から選択され、好ましくはペプチドＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）とペプチドＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）である。ワクチン接種の目的における本発明のペプチドの（キャリアを伴う）使用に加えて、本発明のペプチドまたはペプチド対を、他の目的、好ましくは医療上の目的、特に診断上の目的で、使用してもよい。例えば、本発明のペプチドを、本発明のワクチンでのワクチン接種の性能を観察するため、かつ／または、本発明のワクチンに対して誘発される抗体を捕捉、同定し、もしくは抗体に結合するために、用いてもよい。そのような目的において、本発明のペプチドを、表面（または薬学的に許容されないキャリア）に結合させてもよく、またはマーカー物質（磁気マーカー、色もしくは色素(colourigenic)マーカー、放射性マーカーまたは蛍光マーカーなど）と結合させてもよい。
【００２３】
本発明において、本発明のペプチドを輸送する任意の適切なキャリア分子を、このキャリアが薬学的に許容される限り（すなわち、そのようなキャリアを、そのようなワクチンのヒトレシピエントに投与される医薬品に、提供できる限り）、本発明のワクチンに用いてもよい。本発明における好ましいキャリアは、タンパク質キャリア、特にキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（プロテインＤ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）である。好ましいキャリアはまた、非毒性ジフテリア毒素変異体、特にＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７であり（例えば、Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973参照）、ＣＲＭ１９７が特に好ましい。
【００２４】
本発明におけるワクチンは、ヒト個体に適用するのに適切なワクチン製剤またはワクチン組成物である（この点において、用語「ワクチン」、「ワクチン組成物」および「ワクチン製剤」は、本明細書において互換的に用いられ、これらは、薬学的に許容されるキャリアに結合する、本発明のペプチドを含む医薬品を特定する）。
【００２５】
好ましい実施態様において、本発明におけるワクチンは、アジュバントと共に処方され、好ましくは、キャリアに結合するペプチドはミョウバンに吸着している。
【００２６】
本発明におけるワクチンは、好ましくは、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与、特に皮下または皮内投与で、処方される。
【００２７】
本発明におけるワクチン組成物は、好ましくは、本発明におけるペプチドを、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量で、含む。本発明のワクチンを、任意の適切な適用方法（例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口的、皮下、経皮的、皮内など）で、任意の適切な送達デバイスで、投与してもよい(O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735)。したがって、本発明のワクチンは、好ましくは、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与において処方される（例えば、"Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004参照）。
【００２８】
本発明におけるワクチンは、医薬組成物において、本発明におけるペプチドを、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量、あるいは、例えば１００ｆｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、好ましくは１０ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ、特に１００ｐｍｏｌ〜１００ｎｍｏｌの量で、含む。典型的に、ワクチンはまた、緩衝液、安定剤などの、補助物質を含み得る。
【００２９】
典型的に、本発明のワクチン組成物はまた、例えば緩衝液、安定剤などの、補助物質を含み得る。好ましくは、そのような補助物質（例えば、水、緩衝液および／または安定剤などの、薬学的に許容された賦形剤）を、０．１〜９９％（重量）、より好ましくは５〜８０％（重量）、特に１０〜７０％（重量）で含む。考え得る投与レジメンは、約１〜１２月間の、毎週、隔週、４週毎（毎月）または隔月の処置を含む；しかしながら、他のワクチンにおいて既に示唆されている他の方法に加えて、２〜５回、特に３〜４回の、初期の（１月または２月での）ワクチン投与後の、６〜１２月または数年間もの追加のワクチン接種が好ましい。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチンにおけるペプチドを、免疫化毎に０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．５〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇの量で、個体に投与する。好ましい実施態様において、これらの量は、本発明のワクチン組成物中に存在する全てのペプチドの量を指す。別の好ましい実施態様において、これらの量は、組成物中に存在する単一のペプチド毎の量を指す。言うまでもなく、様々な異なるペプチドが異なる量または等量で存在する、ワクチンを提供できる。しかしながら、本発明のペプチドを、代替の方法として、体重１ｋｇ当たり０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜３００μｇの量（１回の投与量）で、個体に投与してもよい。
【００３１】
キャリア物質と組み合わせ、１つの剤形を生成し得るペプチドの量は、処置されるホストおよび投与の特定の方法に依存して、様々である。組成物の投与量は、個体の病態、年齢、性別および体重などの要素、ならびに個体に所望の応答を誘発させる抗体の能力に従って、様々であり得る。投与計画を調整し、最適な治療応答を提供できる。例えば、分割量を、毎日数回投与してもよく、または投与量を、治療状態の緊急性に応じて減少させてもよい。ワクチンの投与量はまた、状況に依存して、最適な予防投与の応答を与えるように、様々であってよい。例えば、本発明のワクチンを、本発明の組成物の投与によって誘導される抗体のレベルに常に依存して、数日間、１もしくは２週間、または数月もしくは数年の間隔で、個体に投与してもよい。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチン組成物を、２ないし１０回、好ましくは２ないし７回、さらにより好ましくは５回以下、最も好ましくは４回以下で、適用する。
この免疫化の回数は、基本免疫化(basic immunization)をもたらし得る。特に好ましい実施態様において、次のワクチン接種との間の時間間隔を、２週間〜５年、好ましくは１月〜３年以内、より好ましくは２月〜１．５年の間で選択する。代表的なワクチン接種の計画は、６〜８週間に渡る３〜４回の初期のワクチン接種、および６月以内であることを含んでもよい。その後、ワクチン接種を２〜１０年毎に繰り返してもよい。本発明のワクチンの反復投与は、治療用ワクチンの最終的な効果を最大化し得る。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチンは少なくとも１つのアジュバントと共に処方される。
「アジュバント」は、抗原の免疫応答を増強する化合物または混合物である（すなわち、本発明におけるAFFITOPE（登録商標））。アジュバントは、主に送達システム、もしくは主に免疫調節剤として働き、またはその両方の強力な特徴を有する。適切なアジュバントは、ヒトを含む哺乳類における使用に適したアジュバントを含む。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施態様において、本明細書で定義されるワクチン組成物に使用する少なくとも１つのアジュバントは、自然免疫系を刺激できる。
【００３５】
自然免疫応答は、細胞表面のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および細胞内のＮｏｄ−ＬＲＲタンパク質（ＮＬＲ）を介して起こり、それぞれＤ１領域およびＤ０領域を介して起こる。自然免疫応答は、ＴＬＲ活性化に対するサイトカイン産生ならびに特定のＮＬＲ（Ｉｐａｆを含む）に対するカスパーゼ１の活性化およびＩＬ−１βの分泌を含む。この応答は、特定の抗原に依存しないが、抗原特異的な適応免疫応答のためのアジュバントとして働き得る。
【００３６】
多数の異なるＴＬＲが特徴付けられてきた。これらのＴＬＲは、異なるリガンドに結合し、活性型となり、これらは同様に、異なる生物または構造体に位置している。特定のＴＬＲにおいて応答を誘発できる、免疫賦活化合物の開発が、当分野で興味の対象となっている。例えば、US 4,666,886は、ＴＬＲ２アゴニストである、特定のリポペプチド分子を記述する。WO 2009/118296、WO 2008/005555、WO 2009/111337およびWO 2009/067081はそれぞれ、ＴＬＲ７の小分子アゴニストの種類を記述する。WO 2007/040840およびWO 2010/014913は、疾患の処置のためのＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストを記述する。これらの様々な化合物は、小分子免疫賦活化合物（ＳＭＩＰ）を含む。
【００３７】
自然免疫系を刺激できる少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、好ましくは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９アゴニスト、特に好ましくはＴＬＲ４アゴニストを含み、または、からなる。
【００３８】
Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストは、当分野でよく知られている。例えば、ＴＬＲ２アゴニストは、Ｐａｍ３ＣｙｓＳｅｒＬｙｓ４、ペプチドグリカン（Ｐｐｇ）、ＰａｍＣｙｓであり、ＴＬＲ３アゴニストはＩＰＨ ３１ＸＸであり、ＴＬＲ４アゴニストは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、Ｅ６０２０、ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−６０１、ＣＲＸ−６７５、５Ｄ２４．Ｄ４、ＲＣ−５２７であり、ＴＬＲ７アゴニストは、イミキモド、３Ｍ−００３、アルダラ、８５２Ａ、Ｒ８５０、Ｒ８４８、ＣＬ０９７であり、ＴＬＲ８アゴニストは３Ｍ−００２であり、ＴＬＲ９アゴニストは、フラジェリン、Vaxlmmune、ＣｐＧ ＯＤＮ（ＡＶＥ０６７５、ＨＹＢ２０９３）、ＣＹＴ００５−１５ ＡｌｌＱｂＧ１０、ｄＳＬＩＭである。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様において、ＴＬＲアゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、ポリＩ：Ｃ、ＧＬＡ、フラジェリン、Ｒ８４８、イミキモド、およびＣｐＧからなる群から選択される。
【００４０】
本発明の組成物はＭＰＬを含んでもよい。ＭＰＬは、合成的に生成するＭＰＬまたは天然資源から得られるＭＰＬであってよい。言うまでもなく、本発明の組成物に、化学的に修飾したＭＰＬを添加することもできる。そのようなＭＰＬの例は、当分野で公知である。
【００４１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、少なくとも１つのアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１、油中水エマルジョンおよびリポソームを含む、または、からなる。
【００４２】
少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、ＭＦ５９、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群から選択される。
【００４３】
ヒトに使用できる公知の適切な送達システム型アジュバントの例は、限定されないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタナイド(Montanide)などの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子またはナノ粒子、を含む。
【００４４】
ヒトに使用できる公知の適切な免疫調節型アジュバントの例は、限定されないが、アクイラの樹木(Aquilla tree)の樹皮由来のサポニン抽出物（ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ）、ＴＬＲ４アゴニスト（ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ−ＡＱなど）、ＬＴ／ＣＴ変異体、およびサイトカイン（種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）またはＧＭ−ＣＳＦなど）など、を含む。
【００４５】
ヒトに使用できる、送達の特徴および免疫調節の特徴の両方を有する、公知の適切な免疫調節型アジュバントの例は、限定されないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Sjoelander et al.(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO06/134423およびWO07/026,190参照）または、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲ４アゴニストなど）と水中油エマルジョンの組合せである、ＧＬＡ−ＥＭを含む。
【００４６】
本発明のワクチン組成物の有効性を増強するさらなる代表的なアジュバントは、限定されないが：（１）水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁の構成要素などの、他の特異的な免疫刺激剤を含む、または含まない）、例えば（ａ）ＳＡＦ（１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック(pluronic-blocked)ポリマーＬ１２１、およびサブミクロンのエマルジョンにマイクロ流動化(microfluidize)したｔｈｒ−ＭＤＰまたはボルテックスし、より大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるｔｈｒ−ＭＤＰのいずれか、を含む）、および（ｂ）ＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ribi Immunochem、Hamilton、Mont.）（２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１以上の細菌細胞壁の構成要素（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））など）を含む）など；（２）サポニンアジュバント（ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）(Cambridge Bioscience、Worcester、Mass.)、Abisco（登録商標）(Isconova、Sweden)、またはIscomatrix（登録商標）(Commonwealth Serum Laboratories、Australia)など）、これらを用いてもよく、またはＩＳＣＯＭ（免役刺激複合体）などから生成した粒子でもよく、ここでＩＳＣＯＭＳはさらなる界面活性剤を含まなくてもよい（例えばWO00/07621）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（WO99/44636）など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの、サイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、GB-2220221、EP-A-0689454参照）、ここで肺炎球菌サッカライドと共に用いる際は、場合により、実質的にミョウバンを含まず（例えばWO00/56358参照）；（６）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231参照）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えばWO99/52549参照）；（８）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノール(WO01/21207)との組合せ、またはポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤と、オクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤との組合せ(WO01/21152)；（９）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）(WO00/62800)；（１０）免疫賦活剤および金属塩の粒子（例えばWO00/23105参照）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えばWO99/11241）；（１２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えばWO98/57659）；（１３）これらの組成物の効果を増強する免疫賦活剤として作用する他の物質、を含む。ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈ���−ＭＤＰ）、Ｎ−２５ アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン(N-25 acetyl-normnuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine)（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）など、を含む。
【００４７】
本発明の特に好ましい組成物は、アジュバントとして、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、水中油エマルジョン、ならびにＴｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、リポソームおよび／またはサポニン含有アジュバントを含む。本発明の組成物はまた、アジュバントとして、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、または含まない、水酸化アルミニウムを含んでもよい。
【００４８】
本発明を、以下の実施例および図によってさらに説明するが、本発明がそれらによって限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＳＴＡＴ３アッセイ（Ａ）および脾細胞アッセイ（Ｂ）で測定した、ｐ１９由来のペプチドで誘導した血清による、ＩＬ−２３機能の阻害、ならびにＳＴＡＴ３アッセイ（Ｃ）で測定した、ｐ４０由来のペプチドで誘導した血清による、ＩＬ−２３機能の阻害：ｐ１９およびｐ４０由来のペプチド（灰色のカラム）は、ＩＬ−２３機能を阻害するマウス血清を誘発する。無関係のペプチド（ｐ４９９４、黒色のカラム）で誘導した血清を負の対照として用いた。免疫血清の誘発に用いたペプチドを横軸に示し、その下部に、それぞれのペプチドが位置するドメインを示す。それぞれ５匹の動物の血清をプールしたものを用いた。同一の血清を両方のアッセイに用いた。（Ｄ）：ＳＴＡＴ３アッセイで測定した、他のｐ１９由来のペプチドで誘導した血清による、ＩＬ−２３機能阻害の欠如。ｐ１９ペプチドで誘導した、効果のない血清（灰色のカラム）を、ｐ６０６３血清（白色のカラム）と比較する。それぞれ５匹の動物の血清をプールしたものを用いた。
【００５０】
【図２】ｐ６０６３領域は、２つの別個のエピトープを含む。ｐ６０６３特異的な血清の抗体と、１２アミノ酸長のペプチドであって、１アミノ酸ずつスライドさせた一連の重複するペプチドをマイクロアレイ上のガラスに接着したものとの結合を、蛍光リーダーでの蛍光標識された２次抗体の検出後に、測定した。Ａ：ｐ１９配列（上縁および下縁、ｐ６０６３の配列を太字で示す）に対するペプチドの位置。データはｏＤ６８０であり、所定のペプチドに結合した抗体の量に対応し、より黒い部分がより高い値を示す。Ｂ：連続的なペプチドはそれぞれ、ｐ６０６３と少なくとも部分的に重複しており、カラムによって示される。データを、最も強く結合したペプチドに対する割合として表す。あるエピトープに対するペプチドの所属をカラムの色で示し、血清によって検出された個々のペプチド配列を、横軸に示す。
【００５１】
【図３】脾細胞アッセイで測定した、ｐ６０６３特異的な血清のＩＬ−２３阻害能の競合。ペプチドを脾細胞アッセイに加え、血清抗体の結合において、ＩＬ−２３と競合させた。白色のカラム：機能的対照：ＩＬ−２３によるＩＬ−１７産生の刺激および抗ｐ６０６３血清で生じた、その阻害。黒色のカラム：無関係の血清での負の対照。明るい灰色のカラム：抗ｐ６０６３血清と、表示された濃度の単一のペプチドとの競合。暗い灰色のカラム：抗ｐ６０６３血清と、表示された濃度で組み合わせたペプチドとの競合。Ｎ末端の競合ペプチドはｐ８４６４（ｐ１９１４０−１４７）であり、Ｃ末端の競合ペプチドはｐ７４３４（ｐ１９１４４−１５８）であった。データを、無関係の血清（ｐ４９９４、ヒトＣ５ａ由来）存在下で刺激した脾細胞と比較した、ＩＬ−１７の発現量の割合として得た。無関係の血清をこの同一のペプチドで生成した。ｐ６０６３血清を、強力な免疫応答を有する単一の動物から取り出した。対照の血清は、５匹の動物由来のプールであった。血清濃度は２．５％であった。
【００５２】
【図４】免疫学的な関連性が最も小さい配列の探索。ドメイン３のＮ末端エピトープ（Ａ）およびＣ末端エピトープ（Ｂ）において、切除(truncation)を行った。左のパネルは、ドメイン３の配列（太字：ｐ６０６３）に対するペプチドの位置を示し；右のパネルは、それぞれの血清によるＩＬ−１７発現の機能的阻害を示す。脾細胞アッセイで測定した、ＩＬ−１７Ａの発現量：表示したペプチドに対して産生した血清の存在下で、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３で刺激した細胞。データを、無関係の血清（ｐ４９９４、黒色のカラム）存在下で刺激した脾細胞と比較した、ＩＬ−１７発現量の割合として得た。５匹の動物由来の血清プールを用いた。
【００５３】
【図５】ビエピトープおよび２価のワクチン。Ａ：ビエピトープペプチドｐ９２６９に対して誘発した血清と、モノエピトープペプチドｐ８４６１およびｐ８４００に対する血清との比較。脾細胞アッセイで測定した、ＩＬ−１７Ａの発現量：表示したペプチドに対して産生した血清の存在下で、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３で刺激した細胞。データを、無関係の血清（ｐ４９９４、黒色のカラム）存在下で刺激した脾細胞と比較した、ＩＬ−１７発現量の割合として得た。Ｂ：ｐ９２６９における、潜在的なプロテアソームの切断部位。文字間の黒色の縦線のサイズは、切断の可能性を示す。灰色で表示された領域は、強くＭＨＣ Ｉと結合すると予測された配列を強調している（表２参照）。Ｃ：ｐ９２６９由来のヘキサペプチドと、無関係のタンパク質との相同性。縦棒の長さは、所定のヘキサペプチド（ｘ軸に示される）と相同性を有するタンパク質の数（ｙ軸に示される）に相関する。Ｄ：ｐ９２６９（左のカラム対）、ｐ８３２２（中央のカラム対）およびｐ８４００と同時に注入したｐ８４６１（右のカラム対）にて誘導した血清のＩＬ−２３阻害能の比較。結果を、複数の独立した実験から収集し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。詳細は（Ａ）と同様である。Ｅ：ｐ８３２２における、潜在的なプロテアソームの切断部位。詳細は（Ｂ）と同様である。Ｆ：ｐ８３２２由来のヘキサペプチドと、無関係のタンパク質との相同性。詳細は（Ｃ）と同様である。
【００５４】
【図６】２価のワクチン。Ａ−Ｄ：ペプチドｐ９２６９（ｐ１９１３６−１５４）（Ａ）、ｐ８３２２（ｐ１９１３６−１５１）（Ｂ）、ｐ８４６１（ｐ１９１３６−１４５）（Ｃ）およびｐ８４００（ｐ１９１４４−１５４）（Ｄ）中の、０を超えるSYFPEITHIスコアを有する、潜在的なエピトープ。横軸の数字は、所定のペプチドのSYFPEITHIスコアを示し、縦軸の数字は、ペプチドの数を示す。カラムのサイズは、各々のSYFPEITHIスコアを有するペプチドの数を表す。Ｅ、Ｆ：同一のサブユニット（Ｅ）または異なるサブユニット（Ｆ）の異なる領域由来のペプチドでの、２価のワクチンの接種。それぞれ３０μｇの単一ペプチドを、個別に注入した（白色のカラム）。ペプチドを同時に注入する際には（灰色のカラム）、それぞれ１５μｇのペプチドを用いた。データを、無関係の血清（抗ｐ４９９４血清、黒色のカラム）存在下で刺激されたＴ細胞のＳＴＡＴ３リン酸化と比較した、相対的なＳＴＡＴ３リン酸化として得た。データは、２回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。血清は、それぞれ５匹の動物のプールであった。両方のペプチドをＫＬＨに連結した。
【００５５】
【図７】ｐ６０６３、または最小のエピトープであるｐ８４００およびｐ８４６１を含むペプチド、で誘発されたＩＬ−２３に対する免疫応答（灰色のカラム）と、他の特許で言及された配列由来ペプチドで誘発された応答（白色のカラム）との比較（Ａ）。データを、ｐ６０６３血清の存在下で刺激された脾細胞によるＩＬ−１７の発現量と比較した、相対的なＩＬ−１７の発現量として得た。無関係な血清（抗ｐ４９９４血清、黒色のカラム）を、対照の目的で含んだ。データは、２回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。血清は、それぞれ５匹の動物のプールであった。Ｂは、ＩＬ−２３ｐ１９の配列に対するペプチドの位置を示す。ｐ６０６３に包含される配列を太字で示す。灰色の横棒：ｐ６０６３、および最小のエピトープを包含するペプチド、白色の横棒：外国特許に記述される配列由来のペプチド。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５６】
試料と方法
マウス
ＢＡＬＢ／ｃｊマウスおよびＣ５７ＢＬ／６ｊマウスを、チャールスリバー（Sulzfeld, Germany）またはJanvier（St. Berthevin, France）から購入した。
全ての動物の検定を、オーストリアの現在の国内法(Tierversuchsgesetz 2012-TVG 2012)に従って、関係官庁の承諾を得て、行った。
【００５７】
ペプチド
ペプチドをEMC Microcollections GmbH (Tubingen, Germany)から購入した。全てのペプチドは、無関係のペプチドｐ４９９４を除いて、ＩＬ−２３配列由来である。このペプチドｐ４９９４は、ヒトＣ５ａ由来であり、ＩＬ−２３のいずれのサブユニットにも関連する類似性を有さない。
【００５８】
配列
GenBankの配列AAH66268.1（ｐ１９について）およびAAD56386.1（ｐ４０について）を、ワクチン投与のペプチドの配列および計算の鋳型として選択した。それらは、推定上のリーダー配列を含む、サイトカインサブユニットの完全な配列を表す。これらの配列は、GeneBankおよびSwissProtで検索できる、完全なＩＬ−２３サブユニットタンパク質の配列の大部分と、１００％の配列相同性を有するため、代表的な配列である。ペプチド配列を、ＩＬ−２３特異性について、blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）で検定した。
【００５９】
ペプチドの連結
ＫＬＨ（シグマ アルドリッチ，St. Louis, MO、またはbiosyn Arzneimittel GmbH, Fellbach, Germany）を、Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ; AppliChem, Darmstadt, Germany）と共に、１：２の重量比で、室温で３０分間インキュベートすることによって活性化し、次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）に対して透析する。１０％ＤＭＳＯ／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の、Ｎ末端またはＣ末端にシステインを付加した１ｍｇ／ｍｌのペプチドを、等体積の活性化ＫＬＨに添加し、室温で２時間インキュベートする。結合効率を、エルマン(Ellmann)アッセイまたはＨＰＬＣで検定する。
【００６０】
ＣＲＭ１９７（Pfenex Inc., San Diego, CA）を、Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ; AppliChem, Darmstadt, Germany）と共に、室温で３０分間インキュベートすることによって活性化し、次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）に対して透析する。１０％ＤＭＳＯ／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の、Ｎ末端またはＣ末端にシステインを付加した１ｍｇ／ｍｌのペプチドを、等体積の活性化ＣＲＭに添加し、室温で２時間インキュベートする。結合効率を、ＨＰＬＣで検定する。
【００６１】
ワクチンの調製
キャリアに連結したペプチドを、正味の終濃度が１５０μｇ／ｍｌとなるように、１ｘＰＢＳおよび水に希釈し、０．２２μｍの網目に通して、無菌濾過する。次いで、１０分の１の体積の１０ｍｇ／ｍｌのミョウバン（Brenntag Biosector A/S, Frederiksund, DK）を添加する。ワクチンを分取し、室温で１時間インキュベートし、使用するまで４℃で保存する。
【００６２】
マウスの免疫化
ワクチン（２００μｌ中の正味３０μｇのAFFITOPE（登録商標））をボルテックスし、マウスの側腹部に、Ｇ３０ゲージ（Omnican（登録商標）50, B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany）のインスリン用注射器で、皮下投与する。ワクチン投与を、４回（０日目、１４日目、２８日目および４２回目）反復する。マウスを、苦痛の症状について、注入の１時間後にモニターする。典型的に、一つのペプチドを、５体のマウスの群において検定した。２成分ワクチンを検定する際、各１５μｇのAFFITOPE（登録商標）を、同一の動物の両方の側腹部に、別々の注射で、連続的に投与した。
【００６３】
血清の収集
２回目および３回目のプレ血漿(pre-plasma)および対照血漿を、断尾(tail-cripping)によって取り出した。２０μｌの血液を尾静脈から、ＥＤＴＡで被覆したキャピラリー(Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Germany)で取り出し、キャピラリーから、１８０μｌのＰＢＳを含むエッペンドルフチューブに、排出する。このチューブを１３０００ ｘ ｇで、１０分間、４℃で遠心し、次いで上清を、新たなチューブに移し、さらなる分析まで−８０℃で凍結する。
【００６４】
最終的な血清の収集において、マウスに深麻酔を行う。血液を、定量的に（典型的に６００μｌ）、動物から血清のチューブ(ＢＤマイクロティナ, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)に収集する。チューブを３０分間室温で放置し、次いで、室温で３分間、２０００ ｘ ｇで遠心する。上清を収集し、エッペンドルフチューブに移し、さらなる分析まで−８０℃で凍結する。
血液収集後、マウスを、頸椎脱臼で屠殺する。
【００６５】
血清の検定
注入したペプチドに対する応答
ＢＳＡに連結するペプチド（１μＭ、５０μｌ）を、９６ウェルプレートに結合する。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、次いで、非結合のペプチドの除去後、３７℃で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）でブロックする。ブロッキング緩衝液の除去後、５０μｌの血清を、希釈緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）との、１：１００の希釈から始まる１：２の段階希釈系列で、各ウェルに添加する。３７℃で１時間経過後、上清を除去し、プレートを３回洗浄（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）する。５０μｌのビオチン化抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）を、０．２５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートする。非結合の抗体を、続く３回の洗浄の工程で除去する。５０μｌ／ウェル（０．２５Ｕ／ｍｌ）のストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Roche, Mannheim, Germany）を添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。３回の洗浄後、５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液（０．０６８μＭ ＡＢＴＳ(AppliChem)、０．１Ｍクエン酸中、ｐＨ４．３）をＨ２Ｏ２と共に（１：１０００）、各ウェルに添加し、室温で４０分間インキュベートする。反応を、５０μｌの停止液（１％のＳＤＳ、水中）の添加によって停止させる。その後、血清抗体濃度を、マイクロウェルリーダー（BioTek Power Wave 340 （BioTek, Winooski, VT, USA）またはTecan Sunrise （Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland））で、４０５ｎｍにおいて測定する。
【００６６】
ＩＬ−２３の交差反応性
ｒｈｕ ＩＬ−２３（HumanZyme, Chicago, IL, USA）を、０．５μｇ／ｍｌの濃度、５０μｌの一定分量で、９６ウェルプレートのウェルに配置する。プレートを、４℃で一晩インキュベートする。非結合のコーティング試薬の除去後、事前に希釈した血清を各ウェルに、希釈倍列が昇順となるように、添加する。３７℃で１時間経過後、上清を除去し、プレートを３回洗浄（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）する。５０μｌのビオチン化抗マウスＩｇＧを、０．２５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートする。非結合の抗体を、続く３回の洗浄の工程で除去する。５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（０．２５Ｕ／ｍｌ）を添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。３回の洗浄後、５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液（０．０６８μＭ ＡＢＴＳ、０．１Ｍクエン酸中、ｐＨ４．３）をＨ２Ｏ２と共に（１：１０００）、各ウェルに添加し、室温で４０分間インキュベートする。反応を、５０μｌの停止液（１％のＳＤＳ、水中）の添加によって停止させる。その後、血清抗体濃度を、マイクロウェルリーダーで、４０５ｎｍにおいて測定する。
【００６７】
脾細胞アッセイ
ＩＬ−２３で誘導した、脾細胞によるＩＬ−１７Ａの産生および、血清抗体によるその抑制を、公表された(Aggarwal et al., 2003)ように、測定する。簡潔に述べると、脾臓を、屠殺したC57BL/6jマウスから切り取り、脾細胞を、ＤＮＡｓｅ Ｉ（２０μｇ／ｍｌ）消化物およびコラゲナーゼＤ（１００マンドルユニット(Mandl Unit)／ｍｌ）消化物（共にRocheによって提供された）を伴う機械的な破砕によって、単数化(singularize)する。赤血球の除去後、細胞を、１０％ＦＣＳおよび４ｎｇ／ｍｌ ｒｍｕＩＬ−２（e-Bioscience, San Diego CA, USA）を添加したＲＰＭＩに、２．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で、再懸濁する。細胞を、０．１ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２３（R&D systems, Minneapolis, MN, USA）で刺激し、プレート上に、２００μｌの一定分量で配置する。検定する５μｌの血清を各ウェルに添加する。プレートを３日間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、その後、上清を収集し、さらなる分析まで−８０℃で凍結する。
【００６８】
ＩＬ−１７Ａの分析を、ＩＬ−１７Ａ（ホモ２量体）ELISA Ready-SET-Go!（登録商標）キット（eBioscience）で、製造者の説明書に厳格に従って行う。
血清で阻害した、ＩＬ−１７Ａの発現量の結果を：
【数１】
2018521016.tif 000002
として計算する。
【００６９】
ＳＴＡＴ３アッセイ
初代のヒトリンパ球におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を、フローサイトメトリーで測定する（（KrutzikおよびNolan, 2003）、改変）。簡潔に述べると、ＰＢＭＣ（オーストリア赤十字からのバフィーコートまたは新鮮な収集した血液のいずれかから単離）を、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（共にMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach,Germanyから）およびｒｈｕＩＬ−２（eBioscienceまたはR&D systems）で３日間、刺激する。氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、Ｔ細胞芽球をＰＢＳに再懸濁し、２ｘ１０５細胞／２００μｌに分取し、ＩＬ−２３阻害剤を伴い、または伴わずに、５ｎｇ／ｍｌのｒｈｕ ＩＬ−２３（eBioscience）で刺激する。４℃で２０分間のインキュベーション後、細胞を固定し、BD Phosflow（商標）キット（ベクトン・ディッキンソン）を用いて、製造者の説明書に従って、透過処理する。リン酸化ＳＴＡＴ３の細胞内染色に用いる抗体は、マウス抗ヒトＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５）−Alexa Fluor（登録商標）４８８である。マウス抗ヒトＣＤ４−ＡＰＣを、対比染色に用いる（両方の抗体はベクトン・ディッキンソンから提供された）。ＣＤ４＋Ｔ細胞芽球のAlexa Fluor（登録商標）４８８の蛍光を、FACSCanto IIフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）で測定する。
血清で生じる、ＳＴＡＴ３リン酸化の減少を：
【数２】
2018521016.tif 000003
として計算する。
【００７０】
エピトープの微細マッピング
マイクロアレイに基づくエピトープの微細マッピングを、PEPperPRINT GmbH (Heidelberg, GE)で、PEPperMAP（登録商標）技術を用いて、行った。簡潔に述べると、ドメイン３の配列およびその周囲の配列を、１アミノ酸ずつスライドさせ、重複する１２アミノ酸長のペプチドに分割した。得られたペプチドを、ガラススライド上の３カ所で見出した。これらの処理されたスライドを、希釈したマウス抗ｐ６０６３血清と共にインキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）DyLight680二次抗体を用いて、血清抗体を検出した。蛍光強度を、LI-COR Odysseyイメージングシステム（LI-COR Biosciences, NE, US）で測定し、定量化した。
【００７１】
コンピュータでの解析
SYFPEITHI（http://syfpeithi.de/）を用いて、種々の長さのワクチン投与のペプチドに含まれるフラグメントの、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの親和性を予測した。PAProC（http://www.paproc.de/）を用いて、プロテアソームの切断部位を予測した。
【００７２】
配列
【表１】
2018521016.tif 000004
本研究で用いる配列の表。配列前の「Ｃ−」または配列後の「−Ｃ」は、ペプチドがキャリアに結合するのに必要な、このシステインが、元のタンパク質配列の一部ではないことを示し、配列前後の「Ｃ」は、天然に存在するシステインを示す；Ｃ結合ペプチドと追加のＣを含まないペプチドにおけるペプチド名（「ｐＸＸＸＸ」）は、コア配列が同一であるため、同一である。
【表２】
2018521016.tif 000005
特許請求の範囲の配列の表。配列前の「Ｃ−」または配列後の「−Ｃ」は、ペプチドがキャリアに結合するのに必要な、このシステインが、元のタンパク質配列の一部ではないことを示し、配列前後の「Ｃ」は、天然に存在するシステインを示す。
【００７３】
結果
対象の領域の定義（ドメイン３／ｐ６０６３）
潜在的なワクチンとして認定されるために、ペプチドは、３つの条件を達成する血清を誘発する必要がある：血清は、ａ）免疫化ペプチドと反応し、ｂ）本来の標的（すなわち、ＩＬ−２３）と交差反応し、かつｃ）ＩＬ−２３の機能に干渉しなければならない。本研究において、免疫化に用いる全てのペプチドを、これらの条件でアッセイした。
【００７４】
ＩＬ−２３結合血清を誘導するエピトープについてのスクリーニング
１６個の重複したペプチドを用いて、免疫原性領域について、ｐ１９サブユニットをスクリーニングした。ペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端がキャリアに連結しており、配列の約９０％を包含する。誘発した全ての血清は、免疫化ペプチドに結合できたが（データは示していない）、１６個中１４個の血清が、ｒｈｕＩＬ−２３と交差反応する抗体を含んでいたことがわかった（表１）。同様に、ウステキヌマブの標的領域が、免疫原性領域を含むことを示し、ペプチドと公知の免疫原性領域との比較を可能にするデータを得た（表１）。
【００７５】
機能的に関連するエピトープについてのスクリーニング
ペプチド特異的な血清が、ＩＬ−２３の機能に干渉できるか否かを決定するため、２つのアッセイを用いた：第一に、ｒｈｕ−ＩＬ−２３を用いて、マウス細胞におけるＩＬ−１７Ａの産生を刺激する、脾細胞アッセイ、および第二に、初代ヒト細胞を、ヒトＩＬ−２３受容体の結合によるＳＴＡＴ３リン酸化を介する、ｒｈｕＩＬ−２３の機能の読み出しとして用いる、ＳＴＡＴ３アッセイ。
【００７６】
機能的に関連する抗体を繰り返し誘導する、免疫原性のエピトープを含む、ＩＬ−２３ｐ１９内の３つの領域を見出した（図１ＡおよびＢ）。これらの領域をそれぞれ、ドメイン１、２および３と呼ぶ。ｐ６０５９（ｐ１９４２−５７）はドメイン１に位置する。サイトカインの結晶構造モデル（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=66205、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=66470）において、このドメインは、２つのサブユニット間の界面に位置することがわかった。ｐ６０６１（ｐ１９１００−１１９）およびｐ６０６３（ｐ１９１３９−１５９）はそれぞれ、ドメイン２および３に位置する。これらのドメインは、このモデルにおいて、複合体の外側に面して位置しており、そのため、抗体がアクセスしやすい可能性がある。したがって、これらは、ＩＬ−２３に対する免疫的な介入のための有望な標的である。ウステキヌマブの標的領域由来のペプチドである、ｐ６４４９（ｐ４０３５−４９）もまた、ＩＬ−２３の機能を阻害する（図１Ｃ）。これは、外側に面する大きなサブユニットの遠端のループ上に位置する。
【００７７】
ＩＬ−２３の機能を阻害しない、ｐ１９ペプチドで誘導した血清からのデータを、図１Ｄに示す。
検定したペプチドにおいて、ｐ６０６３（ｐ１９１３９−１５９）は、最も強力なＩＬ−２３阻害血清を、繰り返し誘発した。したがって、抗ＩＬ−２３ワクチン投与薬の開発において、ドメイン３に重点を置くことを選択した。ドメイン３の位置は、ドメイン特異的な血清によるＩＬ−２３の機能的阻害が、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用の阻害を介して起こることを示唆する。
【００７８】
ドメイン３の微細なエピトープ分析
正確なエピトープマッピングは、驚くべきことに、ｐ６０６３領域において、近接しているが別個の、２つのエピトープの存在を明らかにした。興味深いことに、抗ｐ６０６３血清由来の抗体は、マイクロアレイに基づく結合の研究によって示されるように、２つの異なる領域を認識する（図２）。
【００７９】
ｐ６０６３血清中に含まれる、機能的に関連する抗体のエピトープ特異性を確かめるため、ｐ６０６３ペプチドを脾細胞アッセイに添加し、血清抗体における、ＩＬ−２３に対する特異的な競合相手を供給した。実際に、このペプチドの添加は、ＩＬ−２３阻害を完全に消失させたが、無関係のペプチド（ｐ４９９４）の添加は阻害に干渉せず、これは、特異的な抗体によって生じ、非特異的な干渉では生じない効果を実証した（図３）。
【００８０】
これらの発見を確かめ、２つの別個のエピトープの正確な位置についての補足情報を得るため、切断型のｐ６０６３ペプチド、すなわち、Ｎ末端からのｐ８４６４（ｐ１９１４０−１４７）およびＣ末端からのｐ７４３４（ｐ１９１４４−１５８）を、競合相手として用いた。両方のペプチドは、部分的にＩＬ−２３阻害を消失でき、これは、ａ）ｐ６０６３領域は２以上の関連するエピトープを含むこと、およびｂ）これらのペプチドは、実際には、血清抗体において、異なるエピトープと競合することを実証した（図３）。したがって、アッセイにｐ８４６４およびｐ７４３４の組合せを添加することは、ｐ６０６３で得られる阻害のブロッキングと同等のブロッキングをもたらす。いずれの切断型ペプチドを無関係のペプチドと組み合わせても、相乗的な効果をもたらさなかった（図３）。
【００８１】
最小のエピトープの定義
最小のコア配列の定義を目的とし、マウスに、ドメイン３中に含まれるペプチドの切断型を、連続的にワクチン投与した。
Ｎ末端のエピトープを定義するため、コアとしてｐ８４６４ペプチドを含み、Ｎ末端およびＣ末端の両方を伸長した、１４アミノ酸長のｐ８４５９（ｐ１９１３６−１４９）から始めた。Ｃ末端の切断を２アミノ酸ずつ行い、Ｃ末端エピトープに対する限界を定義した。最良の結果は、１０アミノ酸長ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱのｐ８４６１（ｐ１９１３６−１４５）において得られた（図４Ａ）。
【００８２】
Ｃ末端のエピトープの最小配列を定義するため、１４アミノ酸長のｐ８３９７（ｐ１９１４４−１５７）から始めた。このペプチドは、ｐ７４３４の切断型であり、これはドメイン３の第２のエピトープを模倣する。次いで、Ｃ末端を１アミノ酸ずつ切断した。全ての切断型ペプチドは、機能的に活性な血清を生じたが、最良の結果は、１１アミノ酸長ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱのｐ８４００（ｐ１９１４４−１５４）において得られた（図４Ｂ）。
【００８３】
組合せの戦略：ビエピトープペプチドおよび２成分ワクチン
ＩＬ−２３の機能的阻害をさらに増大させる試みにおいて、マウスに、２つの免疫原性のエピトープを含むワクチンを、一度に注入した。この背景にある考えは、同一の分子／複合体の異なる部位への免役的攻撃が、受容体の結合に、より効果的に干渉し得、かつ、標的のよりポリクローナルなオプソニン化(polyclonal opsonisation)および続く食細胞の交差活性化(crossactivation)によって、生体のクリアランスを増加させることが期待される、ということである。
この目的のために２つの異なる戦略を用いた：一方では、ビエピトープワクチンを用い、他方では、２成分ワクチンを用いた。
【００８４】
ビエピトープワクチン
ビエピトープワクチンは、２つのエピトープを含む、より長いペプチドを含む。考え得る状況は、それらの本来の配列もしくは変更した配列のいずれかにおける、天然に存在する一続きのエピトープ、または、一つのペプチドに連結され、おそらくはスペーサーによって分離されている、複合体の同一または異なるサブユニットにおける、離れた位置にあるエピトープの組合せ、を含む。我々の考えを確かめるため、ｐ８４６１およびｐ８４００を包含する元のＩＬ−２３ｐ１９配列に対応する、ペプチドｐ９２６９（ｐ１９１３６−１５４）を用いた。実際に、ｐ９２６９によって誘発された血清は、ｐ８４６１およびｐ８４００単独に対するそれぞれの血清よりも、効果的にＩＬ−２３の機能を阻害した（図５Ａ）。
【００８５】
免役原としてのペプチドの使用は、２つの潜在的な安全上の問題を持つ：第一に、ペプチド配列内のＭＨＣクラスＩエピトープの存在、および第二に、血清の、他の無関係のタンパク質との交差反応性である。第一の場合において、ワクチン投与のペプチドがＭＨＣクラスＩ経路に入る状況が考えられ、これは、ペプチドフラグメントに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答の発生を導き得、この細胞応答は、ＩＬ−２３産生細胞を次々に標的とし、したがって、細胞／組織に深刻な損傷を生じ得る。この状況は、明らかに望ましくない。この問題に対処するため、ｐ９２６９について、所定の配列におけるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを計算するために設計されたアルゴリズムである、SYFPEITHIを行った。このアルゴリズムは、７個の潜在的にＭＨＣクラスＩに強く結合する配列を予測し、これらは、５個の異なるＭＨＣＩ対立遺伝子に親和性を有する４個の異なる配列からなる（表２）。第二のアルゴリズムであるPAProCは、これらの配列の１つが、プロテアソーム分解によって生成し得ることを明らかにした（図５Ｂ）。
【００８６】
ｐ９２６９の配列を、重複するヘキサペプチドに断片化し、SWISS-Protデータベースに対してBLAST検索を行うことによって、第二の問題に対処した。無関係のペプチドとの２７個の相同性が見出された（図５Ｃ）。興味深いことに、相同性の大多数は、ｐ９２６９のＣ末端の３つのアミノ酸に関連する。直線的な相同性におけるBLAST検索を、（ｐ８７５９のように）Ｃ末端に１つのアミノ酸を伸長した配列に拡張すると、ヘプタペプチドとの相同性を有する１つのタンパク質およびヘキサペプチドとの相同性を有する５つのさらなるタンパク質を発見でき、これらはこれらの様々なスプライスバリアントを含まない。
【００８７】
ｐ９２６９における、Ｃ末端の１つ、好ましくは２つまたは３つのアミノ酸の切除は、潜在的な安全上の欠点を共に改善し、かつドメイン３のエピトープの両方を維持すると考えられる。ｐ９２６９のＣ末端の３つのアミノ酸の除去は、１６アミノ酸長のｐ８３２２（ｐ１９１３６−１５１）をもたらす。このペプチドは、実際に、ｐ９２６９と同様のＩＬ−２３阻害能を持つ血清を誘発する（図５Ｄ）。SYFPEITHIは、より長いペプチドにおける７個のＭＨＣクラスＩに強く結合する配列のうち６個を予測し、これらのフラグメントは、PAProCによると、プロテアソーム分解によって生成できない（図５Ｅ）。一方、ｐ９２６９において同定された、無関係のタンパク質との２７個のヘキサペプチドの相同性のうち、１つの相同性のみが、ｐ８３２２において残っている（図５Ｆ）。
【００８８】
まとめると、これらの結果は、ビエピトープペプチドが、抗ＩＬ−２３免役の誘発について、単一のモノエピトープペプチドよりも強力であり得、十分安全であるように設計できることを示す。
【００８９】
２成分ワクチン
２成分ワクチンでは、２つのモノエピトープペプチドを、対象に同時に投与する。考え得る状況は、同一のドメイン由来のペプチド、分子／複合体の異なるサブユニット由来の空間的に区別されるドメイン由来のペプチド、または異なる標的由来のペプチド、に関する。ペプチドは、同一または異なるキャリアに連結でき、後者はキャリア依存的なエピトープ阻害を回避する。
【００９０】
この考えを確かめるため、マウスに、ＫＬＨに連結するｐ８４６１およびＣＲＭ１９７に連結するｐ８４００を含む別個のワクチンを、別個の位置（すなわち、一方の側腹部と反対側の側腹部）に投与した。２価のワクチンは実際に、上述のビエピトープペプチドと同様の強力な抗ＩＬ−２３応答を、繰り返し達成した（図５Ｄ）。
【００９１】
安全上の問題に対処するため、SYPPEITHIアルゴリズムを用いて、１９アミノ酸長のｐ９２６９（ｐ１９１３６−１５４）（図６Ａ）、１６アミノ酸長のｐ８３２２（ｐ１９１３６−１５１）（図６Ｂ）、ならびに、最小のエピトープを含むペプチドである、Ｎ末端の１０アミノ酸長のｐ８４６１（ｐ１９１３６−１４５）（図６Ｃ）およびＣ末端の１１アミノ酸長のｐ８４００（ｐ１９１４４−１５４）（図６Ｄ）に含まれる、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性のあるペプチドを探索した。３つ全てのペプチドについて、SYPPEITHIで利用できる、全体で１２４ｎアミノ酸長／ＭＨＣ Ｉ／ＩＩの組合せにおける、８アミノ酸長〜１５アミノ酸長でのエピトープ探索を行った。実際に、分析したペプチドの長さと潜在的なエピトープの量の間には明らかな相関がある：ｐ９２６９は、SYPPEITHIスコア＞０である、６０３個の可能性のあるペプチドを含み、このうち７個のＭＨＣクラスＩに結合するペプチドは、≧２０のスコアを示し（表２参照）、それらを潜在的にＭＨＣに強く結合する配列とする。ｐ８３２２は、SYPPEITHIスコア＞０である、３６８個の可能性のあるペプチドを含み、それらのうち６個は、上述のように、ｐ９２６９と同様の、推定上強く結合するペプチドである。ｐ８４００は、SYPPEITHIスコア＞０である、１４２個の可能性のあるペプチドを含み、ｐ８４６１は、SYPPEITHIスコア＞０である、わずか７５個の可能性のあるペプチドを含む。短いペプチドはいずれも、潜在的に強く結合するペプチドを含まない。PAProCによると、ＭＨＣ Ｉに結合するのに十分な長さのフラグメントは、ｐ８４６１またはｐ８４００から、プロテアソーム切断によって生成し得ない（データは示していない）。
【００９２】
さらなる実験は、１価のワクチンが、同一のサブユニットの異なるドメイン由来（すなわち：ｐ１９サブユニットのドメイン２由来のｐ６０６１（ｐ１９１００−１１９）とドメイン３由来のｐ６０６３（ｐ１９１３９−１５９））（図６Ｅ）または、異なるサブユニット由来（すなわち：小さなサブユニット由来のｐ６０６３と大きなサブユニット由来のｐ６４４９（ｐ４０３５−４９））（図７Ｆ）である場合、２価のワクチンの考えが、有益な結果を生じることを示す。
【００９３】
まとめると、これらの結果は、２価のワクチンによって誘発される強力な抗ＩＬ−２３応答を示し、より短いペプチドの使用が、標的を介する細胞傷害性の応答における、安全上の問題を排除することを示す。
【００９４】
以前に公表されたペプチドに対する限界の決定
他の特許に記述された、ドメイン３内の配列またはその近傍の配列由来のペプチドを、Ｎ末端にシステインを伴って合成し、ＫＬＨと連結させ、マウスに注入した。得られた血清を、抗ＩＬ−２３活性について検定した（図７）。
【００９５】
２つの独立した実験における検定において、ｐ８４６１（ｐ１９１３６−１４５）は、ＩＬ−１７発現量を、脾細胞によって２６．２±４．５％に減少させ、ｐ８４００（ｐ１９１４４−１５４）は３４．６±３．０％に減少させた。ｐ６０６３（ｐ１９１３９−１５９）は、無関係の血清と比較して、ＩＬ−１７発現量を、脾細胞によって２３．６±２．５％に減少させた。
【００９６】
ｐ８３３２（ｐ１９１３７−１４６）（すなわち：ＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ）およびｐ８３３３（ｐ１９１５５−１６４）（すなわち：ＰＷＱＲＬＬＬＲＦＫ）は、EP 2 392 597 A2 [Lewis]由来であり、これらは、ＩＬ−２３およびＩＬ−１７Ａに対する二重特異性抗体における標的配列として言及される。ｐ８３３２に誘発される血清は、ｐ６０６３に対する血清よりも４８％低い効果で、ＩＬ−２３機能を阻害し、重要なことに、非常に重複したｐ８４６１に対して誘発される血清よりも３３％低い効果で、ＩＬ−２３機能を阻害する。ｐ８３３３血清は、ｐ６０６３血清よりも３００％低い効率でＩＬ−２３を阻害し、これは無関係の血清と同程度である。
【００９７】
ｐ８３３７（ｐ１９１２７−１３７）（すなわち：ＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱＰ）は、WO 2007/005955 A2 [Benson]に記述され、設計された抗ＩＬ−２３抗体の標的部位を表す。得られる血清はまた、無関係の対照血清と同程度で、ＩＬ−１７Ａの発現量を減少させた。
【００９８】
ｐ８７５９（ｐ１９１３７−１５５）（すなわち：ＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ）は、WO 2005/108425 A1 [Bachman/Cytos]において、ウイルス様粒子と連結後の抗ＩＬ−２３免疫化に使用できる可能性のあるペプチド配列として言及されたが、この配列または他のいかなるＩＬ−２３ｐ１９由来のペプチドを用いた免疫化の研究は示されなかった。得られた血清は、ｐ６０６３由来の血清よりも９２％低い効果、ｐ８４００由来の血清よりも３１％低い効果、およびｐ８４６１由来の血清よりも７３％低い効果で、ＩＬ−１７Ａの発現量を減少させた。
【００９９】
ｐ７９７７（ｐ１９１６０−１７９）（すなわち：ＬＬＲＦＫＩＬＲＳＬＱＡＦＶＡＶＡＡＲＶ）は、WO 03/084979 A2 [Zagury]において、抗サイトカイン免疫化の可能性のある試薬として記述され、ｐ６０６３領域のＣ末端に位置する。このペプチドで誘発された血清は、ｐ６０６３に由来する血清よりも２７５％低い効果で、ＩＬ−１７Ａの発現量を減少させた。
【０１００】
ｐ９１６５（ｐ１９１５２−１５９）（すなわち：ＰＳＱＰＷＱＲＬ）はWO 2007/027714 A2 [Presta]に言及され、設計された抗ＩＬ−２３抗体の標的部位を表し、ｐ６０６３のＣ末端に位置する。このペプチドで誘発された血清はまた、無関係の血清と同程度でのみ、ＩＬ−１７Ａの発現量を減少させた。
【０１０１】
これらのデータは、定義されたペプチドが、Ｎ末端エピトープ（すなわち：ｐ８４６１（ｐ１９１３６−１４５））およびＣ末端エピトープ（すなわち：ｐ８４００（ｐ１９１４４−１５４））において、最小のエピトープを含み、かつ、血清を誘発するより長いｐ６０６３が、ＩＬ−２３活性の抑制において、以前に記述された重複する配列よりも優れていることを示す。
【０１０２】
図と表
【表３】
2018521016.tif 000006
１：ｎは、α−ＩＬ２３ ＥＬＩＳＡにおいて、ｏＤｍａｘ／２に達する希釈係数である。
２：機能的関連性は、脾細胞アッセイまたはＳＴＡＴ３アッセイで検定される、所定の血清がｒｈｕＩＬ−２３の機能的活性を阻害する能力を意味する。−：応答なし、＋：応答あり、＋＋：強い応答。
表１：免疫原性領域について、ＩＬ−２３ｐ１９およびウステキヌマブ領域をスキャンするのに用いたペプチド。配列前の「Ｃ−」または配列後の「−Ｃ」は、ペプチドがキャリアに結合するのに必要な、このシステインが、元のタンパク質配列の一部ではないことを示し、配列後の「Ｃ」は、天然に存在するシステインを示す。ｏＤｍａｘ／２を達成する最小の希釈係数が少なくとも１：１００であった場合、血清は結合すると考えられる。
【０１０３】
【表４】
2018521016.tif 000007
表２：SYFPEITHIによって明らかにされた、ｐ９２６９およびｐ８３２２の配列内の、ＭＨＣクラスＩに強く結合する配列。「対立遺伝子」は、それぞれの配列が結合する、ＭＨＣＩ対立遺伝子を記述する。このカラムの空欄は、対立遺伝子が上の行と同一であることを示す。「配列」は、結合すると予測される配列のアミノ酸配列を示す。太字は、主要なアンカー位置を示し、下線が引かれた文字は、第二のアンカーを示す。「スコア」は、SYFPEITHIで計算されたスコアを表す。より高いスコアは、ＭＨＣクラスＩに強く結合する配列である可能性がより高いことを示す。「頻度」は、ヒトの種々の地理的集団および／または民族的集団における、所定の対立遺伝子の頻度を表す。「集団」は、所定の対立遺伝子が最も高い頻度で発生する、地理的領域および／または民族を示す。「頻度」および「集団」は、http://www.allelefrequencies.net/から検索される。
【０１０４】
本開示から、以下の好ましい実施態様を明示する：
１．インターロイキン２３（ＩＬ−２３）関連疾患の予防または処置に使用するワクチンであって、薬学的に許容されるキャリアに結合したペプチドを含み、前記ペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱＲＬ（配列番号９７；ｐ６０６３）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）の群から選択され、前記ＩＬ−２３関連疾患が好ましくは、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／クローン病、多発性硬化症、ベーチェット病、強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、慢性肉芽腫症、化膿性汗腺炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、神経変性疾患（特にアルツハイマー病または多発性硬化症）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病およびがん（特に、食道がん、大腸がん、肺腺がん、小細胞がん、および口腔の扁平上皮がん）；特に、乾癬、神経変性疾患またはＩＢＤの群から選択される、ワクチン。
２．少なくとも１つのシステイン残基が、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している、実施態様１記載のワクチン。
３．少なくとも１つのシステイン残基が、ペプチドのＮ末端に結合している、実施態様１または２に記載のワクチン。
４．キャリアがタンパク質キャリアである、実施態様１〜３のいずれかに記載のワクチン。
５．タンパク質キャリアが、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）からなる群から選択される、実施態様４記載のワクチン。
６．ワクチンが、アジュバントと共に処方され、好ましくは、キャリアに結合したペプチドがミョウバンに吸着している、実施態様１〜５のいずれかに記載のワクチン。
７．静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与で処方される、実施態様１〜６のいずれかに記載のワクチン。
８．ペプチドが、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１ｍｇ、特に１００ｎｇ〜１００μｇの量で、ワクチンに含まれる、実施態様１〜７のいずれかに記載のワクチン。
９．ペプチドが、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、特に２〜５アミノ酸残基を有するペプチドリンカーによって、キャリアに結合している、実施態様１〜８のいずれかに記載のワクチン。
１０．ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−ＧｌｙおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの群から選択される、実施態様９記載のワクチン。
【０１０５】
１１．ワクチンが、ビエピトープワクチン、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、およびＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）の群のペプチドを含む、ワクチンである、実施態様１〜１０のいずれかに記載のワクチン。
１２．ワクチンが、２成分ワクチン、特にＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群からのペプチド、およびＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群からのペプチド、好ましくはＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）ペプチドおよびＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）ペプチド、を含み、それぞれが別個のキャリアと結合する、実施態様１〜１１のいずれかに記載のワクチン。
１３．実施態様１〜１２のいずれかに記載のワクチンおよび、Ｔｈ１７／ＩＬ−２３経路に対処するさらなるワクチン、好ましくは抗ＩＬ−２３ワクチン、特に抗ｐ１９−ＩＬ−２３ワクチンを含む、ワクチンのキット。
１４．ＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱＲＬ（配列番号９７；ｐ６０６３）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号１００；ｐ９２６９）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１０１；ｐ９４４０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１０２；ｐ９４４１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１０３；ｐ８３２２）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、およびＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群から選択される、ペプチド。
１５．１つのペプチドが、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳ（配列番号１０４；ｐ８４９５）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰ（配列番号１０５；ｐ８４５９−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩ（配列番号１０６；ｐ８４６０）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱ（配列番号１０７；ｐ８４６０−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱ（配列番号９８；ｐ８４６１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥＴ（配列番号１０８、ｐ８４６１−１）、ＱＰＥＧＨＨＷＥ（配列番号１０９；ｐ８４６２）の群から選択され、第２のペプチドが、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱ（配列番号１１０、ｐ８３９７）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷ（配列番号１１１、ｐ８３９８）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰ（配列番号１１２、ｐ８３９９）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳ（配列番号１１３；ｐ８７６１）、ＴＱＱＩＰＳＬＳＰ（配列番号１１４；ｐ８７６２）、ＴＱＱＩＰＳＬＳ（配列番号１１５；ｐ８７６３）の群から選択され、好ましくはＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱペプチド（配列番号９８；ｐ８４６１）とＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱ（配列番号９９；ｐ８４００）ペプチドである、ペプチド対。
【０１０６】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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