(57)【要約】膜貫通型免疫調節タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、および該タンパク質で改変された細胞を提供する。当該膜貫通型免疫調節タンパク質および改変細胞は、様々な免疫学的および腫瘍学的病態に対して治療有用性を提供する。前記タンパク質を製造および使用するための組成物および方法を提供する。2018534245.tif 000049
2018534245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i）野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、少なくとも1つの親和性改変非免疫グロブリンIgSFドメインを含むエクトドメインであって、該少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン；および
(ii）膜貫通ドメイン
を含む、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【請求項２】
前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、哺乳動物細胞上に発現する、請求項1記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞が、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、またはリンパ球であり、任意でT細胞である、請求項2記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、参照用の前記野生型IgSFドメインと比較して、前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項６】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の前記膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を調節する、請求項2〜5のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項７】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の前記膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を増強させる、請求項2〜6のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項８】
前記膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を減弱させる、請求項2〜6のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項９】
前記野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質（SIRP）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（TREML）ファミリー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有（VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（PVR）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン（TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項1〜8のいずれか一項記載の膜貫通型タンパク質。
【請求項１０】
前記野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8α、CD8β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、請求項1〜9のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１１】
前記野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFメンバーである、請求項1〜10のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１２】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、SEQ ID NO：1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１３】
SEQ ID NO：393〜419のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１４】
前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、かつ、該刺激性受容体に対する前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインの結合親和性が、前記野生型IgSFドメインの当該親和性と比較して向上している、請求項1〜13のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１５】
前記刺激性受容体への前記親和性改変IgSFドメインの結合が、前記T細胞の免疫活性を増強させる、請求項14記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１６】
前記刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、請求項14または請求項15記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、B7-1の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、請求項14〜16のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１８】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がICOSである、請求項14〜16のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項１９】
前記親和性改変IgSFドメインが、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、請求項14〜16のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２０】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも一方に対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgSFドメインである、請求項14〜16、18および19のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２１】
前記親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28の両方に対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgV IgSFドメインである、請求項14〜16および18〜20のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２２】
前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、前記野生型IgSFドメインと比較してCTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、請求項17〜21のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２３】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、請求項1〜22のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２４】
1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、請求項1〜23のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２５】
前記少なくとも1つの親和性改変ドメインが、少なくとも2種の細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、請求項1〜22のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２６】
第一の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；かつ
第二の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する阻害性受容体の阻害性リガンドである、
請求項25記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２７】
前記阻害性リガンドへの前記親和性改変ドメインの結合が、前記阻害性受容体への該阻害性リガンドの結合を競合的に阻害する、請求項26記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２８】
前記阻害性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、もしくはTIM-3であるか；または
該阻害性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、もしくはGAL9である、
請求項26または請求項27記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項２９】
前記親和性改変IgSFドメインが、B7-1の親和性改変ドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、請求項26〜28のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３０】
前記阻害性リガンドがPD-L1であり、かつ、前記阻害性受容体がPD-1である、請求項29記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３１】
前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4についての前記野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、請求項29または請求項30記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３２】
前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、請求項29〜31のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３３】
前記親和性改変IgSFドメインが、CD155の親和性改変IgSFドメインまたはCD112の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、刺激性受容体がCD226である、請求項1〜13のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３４】
前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインの親和性と比較して、TIGIT（IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する低下した結合親和性を示す、請求項33記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３５】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、請求項1〜13のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３６】
前記腫瘍特異的抗原がB7-H6である、請求項35記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３７】
前記親和性改変IgSFドメインが、Nkp30の親和性改変IgSFドメインである、請求項35または請求項36記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３８】
前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、第一の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記エクトドメインが、第二の親和性改変IgSFドメインを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項３９】
前記第一および第二の親和性改変IgSFドメインが異なる、請求項38記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４０】
前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインが各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、請求項38または請求項39記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４１】
前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインが各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項38または請求項39記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４２】
細胞内ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４３】
前記細胞内ドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインであるか、またはその機能的に活性な部分である、請求項42記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４４】
前記膜貫通型免疫調節タンパク質がキメラ受容体であり、前記細胞内ドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインではない、請求項42記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４５】
前記細胞内ドメインが、少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含む、請求項42または請求項44記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４６】
前記細胞内ドメインが、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項42、44および45のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４７】
前記細胞内ドメインが、CD28共刺激ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項45または請求項46記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４８】
前記野生型IgSFドメインが、ITIMシグナル伝達ドメインを含む阻害性受容体であるIgSFメンバーに由来する、請求項1〜13のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項４９】
前記阻害性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAであり、かつ、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、それぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAの、親和性改変IgSFドメインである、請求項48記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５０】
前記阻害性受容体がPD-1であり、かつ、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、PD-1の親和性改変IgSFドメインである、請求項48または請求項49記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５１】
前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインと比較して、トランスの表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、該向上した結合親和性が、前記阻害性受容体への該トランスの表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する、請求項48〜50のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５２】
細胞内ドメイン、ITIM、または細胞質シグナル伝達ドメインを含まない、請求項48〜51のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５３】
前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとは10個以下のアミノ酸置換だけ異なる、請求項1〜52のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５４】
前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとは5個以下のアミノ酸置換だけ異なる、請求項1〜53のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５５】
前記親和性改変IgSFドメインが、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインであるか、または親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインを含むか、あるいは1つまたは複数のアミノ酸置換を含むそれらの特異的結合断片である、請求項1〜54のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５６】
前記エクトドメインが、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、請求項1〜55のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５７】
前記1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する、請求項56記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５８】
前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインである、請求項1〜57のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項５９】
前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインではない、請求項1〜57のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項６０】
前記膜貫通型タンパク質が、CD8に由来する膜貫通型タンパク質である、請求項59記載の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【請求項６１】
請求項1〜60のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする、組換え核酸。
【請求項６２】
請求項61記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６３】
請求項62記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項６４】
請求項61記載の核酸を含む、組換え宿主細胞。
【請求項６５】
哺乳動物宿主細胞である、請求項63または請求項64記載の組換え宿主細胞。
【請求項６６】
哺乳動物宿主細胞がヒト宿主細胞である、請求項63〜65いずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
請求項1〜60のいずれか一項記載の膜貫通型免疫調節タンパク質を含む、改変細胞。
【請求項６８】
免疫細胞である、請求項67記載の改変細胞。
【請求項６９】
リンパ球である、請求項67または請求項68記載の改変細胞。
【請求項７０】
前記リンパ球が、T細胞、B細胞またはNK細胞である、請求項69記載の改変細胞。
【請求項７１】
T細胞である、請求項67〜70のいずれか一項記載の改変細胞。
【請求項７２】
前記T細胞が、CD4+またはCD8+である、請求項71記載の改変細胞。
【請求項７３】
抗原提示細胞である、請求項67または請求項68記載の改変細胞。
【請求項７４】
キメラ抗原受容体（CAR）または改変されたT細胞受容体（TCR）をさらに含む、請求項67〜73のいずれか一項記載の改変細胞。
【請求項７５】
請求項67〜74のいずれか一項記載の細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項７６】
無菌である、請求項75記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
請求項67〜74のいずれか一項記載の細胞または請求項75もしくは請求項76記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、哺乳動物対象における免疫応答を調節する方法。
【請求項７８】
前記免疫応答の調節が、前記対象における疾患または障害を治療する、請求項76または請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫応答の調節が、免疫応答の増強である、請求項77〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
前記疾患または障害が腫瘍である、請求項78または請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記疾患または障害ががんである、請求項78〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
前記疾患または障害が、黒色腫、肺癌、膀胱癌、または血液悪性腫瘍である、請求項78〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫応答の調節が、免疫応答の低下である、請求項77〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
前記疾患または障害が、炎症性の疾患または病態である、請求項78または請求項83記載の方法。
【請求項８５】
前記疾患または病態が、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬である、請求項78、83および84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
前記対象がヒトである、請求項77〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞が、前記対象にとって自家である、請求項77〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞が、前記対象にとって同種である、請求項77〜87のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年9月14日に出願された「Tunable Variant Immunoglobulin Superfamily Domains and Engineered Cell Therapy」という表題の米国仮特許出願第62/218,531号から、2016年4月15日に出願された「ICOS Ligand Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof」という表題の米国仮特許出願第62/323,608号、2016年4月15日に出願された「CD80 Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof」という表題の米国仮特許出願第62/323,595号、2016年7月28日に出願された「CD155 Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof」という表題の米国仮特許出願第62/367,822号、および2016年7月28日に出願された「CD112 Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof」という表題の米国仮特許出願第62/367,819号までの優先権を主張するものであり、その各々の内容は、参照によってその全体が組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に出願される。配列表は、2016年9月10日に作成された761612000240SeqList.TXTという表題の750,987バイトサイズのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によってその全体が組み入れられる。
【０００３】
分野
本発明は、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）、ならびに当該免疫調節タンパク質を発現するように改変された、がんおよび免疫学的疾患の治療における免疫応答を調節するための免疫細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
抗原提示細胞（APC）もしくは標的細胞とリンパ球とにより当該細胞間で形成される免疫シナプス（IS）で起こるプロセスへの介入により免疫応答を調節することに関して医学的関心が高まっている。現在のところ、免疫応答を増強または抑制するために使用される生物製剤は、一般に、免疫グロブリン（例えば、抗PD-1 mAb）または可溶性受容体（例えば、Fc-CTLA4）に限定されている。可溶性受容体は、数多くの欠陥を抱えている。可溶性受容体は、タンパク質間相互作用に拮抗するのに有用であるが、このような相互作用を刺激する能力を欠いていることが多い。抗体は、これに関して制限が少ないと証明されており、アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体の両方の例が当技術分野において公知である。それにもかかわらず、可溶性受容体および抗体は共に、ISにおいて機能するのに不可欠である重要な属性を欠いている。機構的には、IS内の細胞表面タンパク質は、複数のタンパク質標的とそれらが結合する単一のタンパク質との間の協調的でしばしば同時の相互作用に関与し得る。ISにおける相互作用は、2つの細胞の接合と密接に関連して起こり、この構造体内の単一のタンパク質は、同じ細胞（シス）上のタンパク質および相互作用している細胞（トランス）上のタンパク質の両方と（おそらく同時に）相互作用することができる。したがって、免疫応答の調節のための改善された分子のニーズがある。このようなニーズを満たす態様が提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において、（1）野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含むエクトドメインであって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン、および（2）膜貫通ドメインを含有する、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）が提供される。
【０００６】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、哺乳動物細胞上に発現する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、またはリンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、T細胞である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
【０００７】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、参照用の野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインを少なくとも1つ含有する膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインを含有する参照用の膜貫通ドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫活性を調節する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインを少なくとも1つ含有する膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインを含有する参照用の膜貫通ドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫活性を増強させる。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインを含有する参照用の膜貫通ドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫活性を減弱させる。
【０００８】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質（SIRP）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（TREML）ファミリー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有（VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（PVR）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン（TIM）ファミリーまたはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8α、CD8β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200RまたはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFメンバーである。
【０００９】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO：1〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通型免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO：393〜419のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。
【００１０】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、かつ、該刺激性受容体に対する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインの結合親和性は、野生型IgSFドメインの当該親和性と比較して向上している。いくつかの態様において、刺激性受容体に対する親和性改変IgSFドメインの結合は、T細胞の免疫活性を増強させる。
【００１１】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを少なくとも1つ含むエクトドメインと；膜貫通ドメインとを含む、第一のT細胞上に発現する膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）であって、親和性改変IgSFドメインが、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つのカウンター構造体に特異的に結合し；哺乳動物細胞が、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、または第二のT細胞であり；かつ親和性改変IgSFドメインのカウンター構造体への特異的結合が、哺乳動物細胞の免疫活性を調節する、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）が提供される。いくつかの態様において、TIPは、第一の親和性改変IgSFドメインを含み、ここで、哺乳動物細胞上に発現するカウンター構造体は、第二のT細胞上に発現する刺激性カウンター構造体であり；第一の親和性改変IgSFドメインは、刺激性カウンター構造体に特異的に結合し、かつ、第二のT細胞の免疫調節活性を増強させる。
【００１２】
いくつかの場合では、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、B7-1の親和性改変IgSFドメインであり、刺激性受容体は、CD28である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、刺激性受容体は、ICOSである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、刺激性受容体は、CD28である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28の少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgSFドメインである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28の両方に対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgV IgSFドメインである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、またはCTLA-4に対する低下した結合親和性を示す。
【００１３】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通型免疫調節タンパク質は、1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変ドメインは、少なくとも2種の細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。
【００１４】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、第一の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；第二の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する阻害性受容体の阻害性リガンドである。
【００１５】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、阻害性リガンドへの親和性改変ドメインの結合は、阻害性受容体への阻害性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、阻害性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、もしくはTIM-3であるか；または、阻害性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、もしくはGAL9である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、B7-1の親和性改変ドメインであり、かつ、刺激性受容体は、CD28である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、阻害性リガンドは、PD-L1であり、かつ阻害性受容体は、PD-1である。
【００１６】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4についての野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、CD155の親和性改変IgSFドメインまたはCD112の親和性改変IgSFドメインであり、かつ刺激性受容体は、CD226である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの親和性と比較して、TIGIT（IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する低下した結合親和性を示す。
【００１７】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、B7-H6である。
【００１８】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、Nkp30の親和性改変IgSFドメインである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、第一の親和性改変IgSFドメインであり、かつエクトドメインは、第二の親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、第一および第二の親和性改変IgSFドメインは、異なる。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含有する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。
【００１９】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞内ドメイン（endodomain）または細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、野生型IgSFドメインを含有する野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインであるか、またはその機能的に活性な部分である。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞内ドメインが野生型IgSFドメインを含有する野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインではないキメラ受容体である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞内ドメインは、少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含有する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含有する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞内ドメインは、CD28共刺激ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含有する。
【００２０】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、ITIMシグナル伝達ドメインを含有する阻害性受容体であるIgSFメンバーに由来する。いくつかの態様において、阻害性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、それぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAの、親和性改変IgSFドメインである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、阻害性受容体はPD-1であり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、PD-1の親和性改変IgSFである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、トランスの表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、当該向上した結合親和性は、阻害性受容体へのトランスの表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する。
【００２１】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞内ドメイン、ITIMまたは細胞質シグナル伝達ドメインを含有しない。
【００２２】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとは10個以下のアミノ酸置換だけ異なる。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとは5個以下のアミノ酸置換だけ異なる。
【００２３】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインであるか、または親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインを含有するか、あるいは1つまたは複数のアミノ酸置換を含有するそれらの特異的結合断片である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、エクトドメインは、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含有する。
【００２４】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインは、野生型IgSFドメインを含有する野生型IgSFメンバーに由来する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通ドメインは、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、膜貫通ドメインは、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインではない。いくつかの態様において、膜貫通型タンパク質は、CD8に由来する膜貫通型タンパク質である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、上に要約された膜貫通型免疫調節タンパク質のいずれかをコードする組換え核酸に関する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、上に要約された核酸のいずれかを含有する組換え発現ベクターに関する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、上に要約された膜貫通型免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸を含有する組換え発現ベクターに関する。
【００２８】
別の局面において、本発明は、上に要約された発現ベクターのいずれかを含有する組換え宿主細胞に関する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、上記の核酸を含有する組換え宿主細胞に関する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、哺乳動物宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、上記の膜貫通型免疫調節タンパク質のいずれかを含有する改変細胞に関する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、該細胞は、免疫細胞である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、該細胞は、リンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、T細胞、B細胞またはNK細胞である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、該細胞は、T細胞である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、T細胞は、CD4+またはCD8+である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、抗原提示細胞である。
【００３１】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、改変細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）または改変されたT細胞受容体（TCR）をさらに含有する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、上記の細胞のいずれかと薬学的に許容し得る担体とを含有する薬学的組成物に関する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、無菌である。
【００３３】
いくつかの態様において、哺乳動物対象における免疫応答を調節する方法であって、上記の態様のいずれか1つに係る細胞または上記の態様のいずれか1つに係る薬学的組成物を対象に投与する工程を包含する方法が本明細書において提供される。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、免疫応答の調節は、対象における疾患または障害を治療する。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、免疫応答の調節は、免疫応答の増強である。いくつかの態様において、疾患または障害は腫瘍である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、疾患または障害はがんである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、疾患または障害は、黒色腫、肺癌、膀胱癌、または血液悪性腫瘍である。
【００３４】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、免疫応答の調節は免疫応答の低下である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、疾患または障害は、炎症性の疾患または病態である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、疾患または病態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬である。
【００３５】
いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、対象はヒトである。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、対象にとって自家である。いずれかのこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、対象にとって同種である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】標識されていない組換えヒトPD-L1-his、ヒトCTLA-4-his、またはヒト-PD-L2-Fc融合タンパク質の存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えCD28 Fc融合タンパク質（rCD28.Fc）の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。
【図１Ｂ】標識されていない組換えヒトrCD28.Fc、ヒトCTLA-4.Fc、またはヒトPD-L2.Fcの存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。
【図２】標的抗原を発現する細胞との共培養後の、抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）単独で改変された細胞、あるいは例示的な膜貫通型免疫調節TIP（CD80-TIPもしくはICOSL-TIP）または対応するCD80もしくはICOSL野生型膜貫通型タンパク質で改変された細胞の細胞傷害性殺傷活性を反映するインピーダンス結果を示す。96ウェルマイクロエレクトロニクスプレート（E-プレート）の培養培地中のインピーダンスの変動を測定するAcea Real-Time Cell Analyzer（RTCA）を使用して、インピーダンスを評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）および当該TIPを発現するように改変された細胞（例えば免疫細胞）が本明細書において提供される。いくつかの態様において、TIPは細胞外リガンド結合ドメインを含有し、該ドメインは、親和性改変IgSFドメインを含有し、かつ1つまたは複数のタンパク質リガンド（概して2以上のタンパク質リガンド）に結合することができる。いくつかの態様において、タンパク質リガンドは、免疫細胞によって発現される細胞表面タンパク質であり、（例えば、リンパ球上の）1つまたは複数の他の免疫受容体と結合して阻害性シグナルまたは活性化シグナルを誘導する。例えば、リンパ球上のある種の受容体とそれらの同族細胞表面リガンドとの相互作用によって抗原提示細胞（APC）または標的細胞とリンパ球との間で免疫シナプス（IS）を形成することにより、免疫系を制御できる共刺激シグナルまたは阻害性シグナルを提供することができる。いくつかの局面において、本明細書において提供されるTIPを発現するTIP改変細胞は、細胞表面タンパク質リガンドとそれらの受容体との相互作用を変化させ、それによって免疫細胞（例えばT細胞）の活性を調節することができる。いくつかの態様において、1つまたは複数のリガンドへのTIPの結合は、それを発現する免疫細胞、または細胞上に発現するTIPが特異的に結合する細胞の、免疫学的免疫応答を調節する、例えば誘導する、増強する、または抑制する。
【００３８】
いくつかの態様において、正常な生理的条件下では、T細胞媒介性免疫応答は、T細胞受容体（TCR）による抗原認識によって開始され、かつ、共刺激シグナルと阻害シグナル（すなわち、免疫チェックポイントタンパク質）とのバランスによって制御される。免疫系は、自己免疫を抑制する（すなわち、自己寛容）、および、免疫応答の間（例えば、病原体感染に対する攻撃の間）の過度の損傷から組織を保護する、免疫チェックポイントに依拠する。しかしながら、いくつかの場合では、これらの免疫調節タンパク質は、腫瘍を含む疾患および状態において、免疫系を回避するための機序として脱制御されている可能性がある。
【００３９】
したがって、いくつかの局面において、T細胞活性のような免疫細胞活性を変化させる免疫療法は、免疫応答が脱制御されているある種の疾患および状態を治療することができる。ISにおける相互作用を調節しようとする治療アプローチは、複数のIS標的に同時にかつ時系列および空間的方向性に感受性である様式で結合する能力から恩恵を受けるだろう。現行の治療アプローチは、この目標に達していない。むしろ、可溶性受容体および抗体は、典型的には、一度にわずか1つの標的タンパク質に結合する。これは、複数の標的種が存在しないことに起因し得る。さらに、野生型受容体およびリガンドが保有する同族結合パートナーに対する親和性は低く、これは、可溶性治療薬としてのそれらの使用を妨げている。
【００４０】
しかしながら、大きな問題ではないが、可溶性受容体および抗体は、一般に、（例えば、一度にわずか1つの標的種に）競合的に結合し、それゆえ、複数の標的に同時に結合する能力を欠いている。そして、一方で、二重特異性抗体、および二つの抗原結合領域を含むモダリティは、複数の標的分子に同時に結合することができるが、これらのモダリティに特有の三次元配置は、しばしば、それらの時間的および空間的要件に合致するやり方でこれらがISにおいて起こる重要なプロセスに介入することを妨げる。
【００４１】
必要とされるものは、抗体または可溶性受容体の特異性および親和性を有するが、加えて、ISにおいて必要とされるサイズ、体積、および空間的方向性の制約を維持する、全く新しいクラスの治療用分子である。さらに、このような治療薬は、それらの標的に非競合的および競合的に結合する能力を有するだろう。それゆえ、これらの特性を備えた分子は、ISにおいて多タンパク質複合体へ一体化する能力において新規機能を有し、かつ、所望の結合配置および結果としてもたらされる生物学的活性を生じさせるだろう。
【００４２】
この目的に向けて、新たに出現した免疫腫瘍学治療法は、腫瘍により誘導されるT細胞寛容を安全に破壊することを必要とする。現在の最先端の免疫治療薬は、T細胞エフェクター機能を制限することが知られているB7/CD28ファミリーの中心的阻害分子である、PD-1またはCTLA4をブロックする。このような単一標的に対するアンタゴニスト抗体は、免疫シナプスチェックポイントシグナル伝達複合体を崩壊させるように機能するが、同時にT細胞を活性化するには不十分である。反対に、二重特異性抗体アプローチは、T細胞を活性化するが、それと同時に、誘導されたシグナルを制御する阻害リガンドをブロックするには、不十分である。
【００４３】
これらの欠点に取り組むために、免疫細胞の活性を調節することができる免疫療法（例えば、細胞療法）を提供する。いくつかの態様において、免疫細胞シグナル伝達（例えば、T細胞活性化シグナル伝達）を増強することができ、かつ/または阻害性制御をブロックすることができ、場合によってはそれらが同時に行われる、免疫療法が提供される。いくつかの態様において、提供される免疫療法は、T細胞活性化および阻害リガンドのブロックの両方における二つの役割を有することが知られている、免疫シナプスの免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）成分に関する。いくつかの局面において、ヒト免疫系リガンドのような免疫系リガンドから改変されたIgSFベースの細胞療法は、それ自体、免疫シナプスの重要な経路に正常に集合するそれらの能力を保持し、かつ、抗体または次世代の二重特異性試薬ができない方法で正常な相互作用および制御機能を維持する可能性がより高い。これは、抗体のその相対的に大きなサイズ、および、これらが免疫シナプスの天然成分ではないという事実に起因する。ヒト免疫系リガンドのこれらの固有の特徴、およびそのようなリガンドの親和性改変バリアントを発現するように改変された細胞は、新たなレベルの免疫療法的有効性および安全性を提供することを約束する。特定の局面において、提供されるTIP改変細胞は、親和性が改変された天然の免疫リガンドを使用した免疫療法プラットフォームであって、様々な腫瘍学的および免疫学的適応症の治療における、調整可能な親和性でそれらの同族免疫受容体の1つまたは複数に結合する免疫療法生物製剤を生成するプラットフォームを提供する。
【００４４】
本明細書において言及される全ての刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）は、それぞれ個々の刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）が参照によって組み入れられると具体的にかつ個別に示されたかのように同程度に、参照によってその全体が全ての目的において本明細書に組み入れられる。本明細書に示される定義が参照によって本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願および他の刊行物に示される定義に反しているかまたは他に矛盾している場合、本明細書に示される定義が参照によって本明細書に組み入れられる定義より優先される。
【００４５】
本明細書において使用される項目の見出しは、単に構成を目的としたものであって、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４６】
I．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての専門用語、注記、ならびに他の技術および科学用語または関連用語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有することを意図する。いくつかの場合では、通常理解されている意味を有する用語は、明確化のためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義され、そして、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも一般に当技術分野において理解されているものと大きな差異をなすと解釈されるべきではない。
【００４７】
本明細書を通して使用される用語は、特定の事例において別段限定されない限り、以下のとおり定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その文脈が他のことを明確に指示しない限り、複数形の指示対象を含む。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語、頭字語、ならびに略称は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。別段の指示のない限り、化学名および生化学名の略称および記号は、IUPAC-IUB命名法による。別段の指示のない限り、全ての数値範囲は、その範囲を規定する値だけでなくその間の全ての整数値も含む。
【００４８】
用語「親和性が改変された（親和性改変）」は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの文脈において使用される場合、親の野生型または未改変の（すなわち、親和性が改変されていない）IgSF対照ドメインと比較してその同族結合パートナー（あるいは「カウンター構造体」）のうちの少なくとも1つに対する結合親和性またはアビディティが（対応する野生型の親または未改変IgSFドメインと比べて）向上または低下するように変化したアミノ酸配列を有する哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを意味する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメイン中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上のアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換）を含有することができる。結合親和性またはアビディティの向上または低下は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005)。また、Linsley et al., Immunity, 1: 7930801 (1994) も参照されたい。その同族結合パートナーに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの向上は、野生型IgSFドメイン対照よりも少なくとも10％大きい値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値よりも少なくとも20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％、または10000％大きい値になる向上である。その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの低下は、対照の90％以下であるが野生型IgSFドメイン対照値の10％以上の値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値の80％、70％、60％、50％、40％、30％、または20％以下であるが10％以上の値になる低下である。親和性が改変されたタンパク質は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。用語「親和性改変IgSFドメイン（親和性が改変されたIgSFドメイン）」は、親和性改変IgSFドメインが作製された任意の特定の出発組成物または方法のあらゆる条件を強要するものと解釈されるべきではない。したがって、本発明の親和性改変IgSFドメインについては、任意の特定の親和性改変プロセスによって野生型IgSFドメインが親和性改変IgSFドメインへと変換されるのに限定されない。親和性改変IgSFドメインポリペプチドは、例えば、野生型哺乳動物IgSFドメイン配列情報から開始して生成され、次いで、その同族結合パートナーに対する結合性についてインシリコでモデル化され、そして、最後に組換えまたは化学合成されて、主題の親和性改変IgSFドメイン組成物を生成することができる。別のほんの一例として、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、親和性改変IgSFドメインは、任意の所与のプロセスによって生産されるが必ずしもその必要はない、生成物を表す。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む様々な技術を用いてもよい。
【００４９】
用語「同種（の）」は、本明細書において使用される場合、ある生物から取り出され、次いで同じ種の遺伝的に異なる生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。
【００５０】
用語「自家（の）」は、本明細書において使用される場合、同じ生物から取り出され、後に前記生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。自家の細胞または組織を、例えば、組換えDNA法によって、生物から取り出される天然の細胞または天然の組織とはもはや遺伝的に同一ではないように改変することができる。例えば、天然の自家T細胞を、膜貫通型免疫調節タンパク質および／またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現する自家の改変細胞となるように組換えDNA技術によって遺伝的に改変することができ、これは、いくつかの場合では、T細胞またはTIL（腫瘍浸潤性リンパ球）を改変することを包含する。次いで、改変細胞を、天然のT細胞が単離された患者へ注入することができる。いくつかの態様において、生物は、ヒトまたはマウスである。
【００５１】
用語「結合親和性」および「結合アビディティ」は、本明細書において使用される場合、特異的結合条件下でのあるタンパク質のその同族結合パートナー（すなわち、そのカウンター構造体）に対する、それぞれ特異的結合親和性および特異的結合アビディティを意味する。生化学速度論では、アビディティは、複数の個々の非共有結合相互作用（例えば、あるIgSFドメインとその同族結合パートナー（すなわち、そのカウンター構造体）との間の非共有結合相互作用）の親和性の強さの総和を指す。このように、アビディティは、単一の相互作用の強さを表す親和性とは異なる。そのカウンター構造体に対する親和性改変IgSFドメインの結合親和性の向上または減弱は、未改変のIgSFドメイン（例えば、天然のまたは野生型のIgSFドメイン）の結合親和性と比較して決定される。結合親和性またはアビディティを決定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005) を参照されたい。
【００５２】
用語「細胞表面カウンター構造体」（あるいは「同族細胞表面結合パートナー」）は、本明細書において使用される場合、哺乳動物細胞上に発現するカウンター構造体（あるいは、同族結合パートナー）である。典型的には、細胞表面カウンター構造体は膜貫通型タンパク質である。いくつかの態様において、細胞表面カウンター構造体は受容体である。
【００５３】
用語「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、本明細書において使用される場合、少なくともエクトドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、哺乳動物細胞上に発現する人工の（すなわち、人造の）膜貫通型タンパク質を指す。場合により、CARタンパク質は、共有結合によりエクトドメインを膜貫通ドメインに連結する「スペーサー」を含む。スペーサーは、多くの場合、ペプチド結合を介してエクトドメインを膜貫通ドメインに連結するポリペプチドである。CARは、典型的には、哺乳動物リンパ球上に発現する。いくつかの態様において、CARは、T細胞または腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）のような哺乳動物細胞上に発現する。T細胞上に発現するCARは、本明細書においてCAR T細胞または「CAR-T」と称される。いくつかの態様において、CAR-Tは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞である。例えば養子細胞移入において臨床的に使用されるとき、患者の腫瘍に対して抗原結合特異性を有するCARは、典型的には、患者から得られる天然リンパ球上に発現するように改変される。CARを発現する改変されたリンパ球は、次いで患者に注入して戻される。したがって、リンパ球は、多くの場合自家T細胞ではあるが、同種のT細胞も本発明の範囲内に含まれる。CARのエクトドメインは、生理的条件下で腫瘍特異的抗原などの抗原と特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片（例えば、scFv）などの抗原結合領域を含む。特異的結合によって、生化学的な一連の事象（すなわち、シグナル伝達）は、CARを発現する細胞の免疫活性の調節をもたらす。したがって、例えば、その抗原へのCAR-Tの抗原結合領域の特異的結合によって、細胞傷害性、増殖またはサイトカイン産生の変化によって反映されるとおり、T細胞活性の免疫活性の変化を導くことができる。CAR活性化によるシグナル伝達は、いくつかの態様において、天然の哺乳動物T細胞におけるシグナル伝達に関与するCD3ζ鎖（「CD3z」）によって達成される。CARは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節するための複数のシグナル伝達ドメイン（例えば、CD28、ICOS、41BB、またはOX40）をさらに含んでもよい。CD3zは、T細胞受容体シグナル伝達に関与する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）として知られている保存されたモチーフを含む。
【００５４】
IgSFドメインまたは親和性改変IgSFドメインなどのタンパク質に関する用語「同族結合パートナー」または「カウンター構造体」は、言及されるタンパク質が特異的結合条件下で特異的に結合する少なくとも1つの分子（典型的には、天然の哺乳動物タンパク質）を指す。いくつかの局面において、親和性改変IgSFドメインは、対応する天然または野生型のIgSFドメインのカウンター構造体に特異的に結合するが、親和性は向上または減弱している。特異的結合条件下で認識されてその同族受容体に特異的に結合するリガンドの一種は、その受容体のカウンター構造体または同族結合パートナーの一例である。特異的結合条件下で天然リガンドが認識して特異的に結合する受容体は、そのリガンドのカウンター構造体の一例である。同様に、天然リガンドは、その受容体のカウンター構造体である。例えば、ICOSLは、CD28およびICOSに特異的に結合し、したがって、これらのタンパク質は、ICOSLのカウンター構造体である。別の例では、腫瘍特異的抗原およびそれが特異的に結合する親和性改変IgSFドメインは各々、他方のカウンター構造体である。本発明において、「細胞表面分子種」は、免疫シナプスを形成する哺乳動物細胞などの細胞（例えば、免疫細胞）上にまた該細胞によって発現される免疫シナプス（IS）のリガンドの同族結合パートナーである。
【００５５】
用語「競合的結合」は、本明細書において使用される場合、あるタンパク質が、少なくとも2種の同族結合パートナーに特異的に結合することができるが、1つの同族結合パートナーの特異的結合が第二の同族結合パートナーの同時結合を阻害する（例えば、妨害するまたは妨げる）ことを意味する。したがって、いくつかの場合では、あるタンパク質が2つの同族結合パートナーに同時に結合することはできない。一般に、競合結合剤は、結合のための同じまたは重複した結合部位を含有するが、これは必須要件ではない。いくつかの態様において、競合的結合は、第二の同族結合パートナーの特異的結合に起因して、その同族結合パートナーの1つへのタンパク質の特異的結合の測定可能な（部分的または完全な）阻害を引き起こす。ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはForte-Bio社のOctet実験システムなどの競合的結合を定量する様々な方法が公知である。
【００５６】
用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書において使用される場合、あるアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備える側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている、アミノ酸置換を意味する。類似の化学特性を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例は、1）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；2）脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；3）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；5）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；6）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに7）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。保存的アミノ酸置換の群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
【００５７】
タンパク質の位置に関する「に対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が（例えば、配列表に示される）開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置「に対応する」という記述は、構造配列アライメントに基づいてまたは標準的なアライメントアルゴリズム（例えば、GAPアルゴリズム）を使用して、開示された配列とのアライメントによって同定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を規準として使用して、対応する残基を同定することができる。
【００５８】
用語「サイトカイン」は、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFN）、ケモカイン、造血成長因子、腫瘍壊死因子（TNF）、およびトランスフォーミング成長因子を含むが、それらに限定されない。一般に、これらは、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖、および分化を制御する、低分子量タンパク質である。
【００５９】
用語「誘導体」または「誘導体化されている」は、その治療的恩恵を保持または増強させながら、半減期、バイオアベイラビリティ、免疫原性、溶解性、毒性、効力、または有効性などの特性を変化させるための、免疫調節タンパク質を直接または間接的に共有結合させることによる免疫調節タンパク質の修飾を指す。誘導体は、グリコシル化、ペグ化、脂質化、またはFc融合によって製造することができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「ドメイン」（典型的には、3以上、一般に5または7またはそれ以上のアミノ酸、例えば10〜200のアミノ酸残基の配列）は、分子の他の部分と構造的および／または機能的に異なりかつ同定可能な分子（例えば、タンパク質またはコーディング核酸）の一部を指す。例えば、ドメインは、1つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立して折り畳まれた構造を形成することができ、かつ／または結合活性などの機能活性によって認識される、ポリペプチド鎖の一部を含む。タンパク質は、1つまたは複数の別個のドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連ファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性、例えばモチーフに対する相同性によって、同定、定義、または識別することができる。別の例では、ドメインは、その機能（例えば、同族結合パートナーなどの生体分子と相互作用する能力）によって識別することができる。ドメインが独立してまたは別の分子に融合して、活動（例えば、結合）を遂行することができるように、ドメインは、独立して、生物学的機能または活性を示すことができる。ドメインは、線形のアミノ酸配列または非線形のアミノ酸配列であることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、公知であり、かつ、当業者が同定することができる。本明細書における例示のため、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは十分に当技術分野の技能の範囲内であると理解される。必要であれば、ドメインを同定するために適切なソフトウェアを採用することができる。IgSFドメインのドメイン構成を説明するために使用されるSEQ ID NOとして示される特定の配列を含めたアミノ酸についての言及は、説明を目的としており、提供される態様の範囲を限定することを意味していないことが理解される。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、類似の分子との相同性分析およびアライメントに基づいて理論的に導出されることが理解される。したがって、正確な遺伝子座は、変化することができ、必ずしもタンパク質毎に同じとは限らない。よって、特定のIgSFドメイン、例えば特定のIgVドメインまたはIgCドメインは、数個のアミノ酸（1、2、3または4個）長めまたは短めになることができる。
【００６１】
用語「エクトドメイン」は、本明細書において使用される場合、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）の、小胞膜の外側（例えば、細胞の外側の空間）にある領域を指す。エクトドメインは、多くの場合、特異的なリガンドまたは特異的な細胞表面受容体と、例えば当該リガンドまたは当該細胞表面受容体に特異的に結合する結合ドメインを介して相互作用する。細胞の膜貫通型タンパク質のエクトドメインは、代替的に細胞外ドメインと称される。
【００６２】
用語「有効量」または「治療有効量」は、単独（すなわち、単剤療法として）または追加の治療剤との組み合わせのいずれかでエクスビボ（患者由来の細胞との接触による）またはインビボ（患者への投与による、例えば養子移入による）で投与されたとき、例えば、疾患の症状および／または病因を改善または排除することによって、疾患進行の統計的に有意な阻害をもたらす、本発明の治療用組成物（例えば、改変細胞を含有する組成物）の量および／または濃度を指す。免疫系の疾患または障害を治療するための有効量は、疾患または障害と関連する少なくとも1つの症状または生物学的応答もしくは影響を緩和する、低下させる、または軽減する、疾患または障害の進行を防止する、あるいは患者の身体機能を改善する量であり得る。細胞療法の場合、有効量は、患者に投与される細胞の有効用量または有効数である。いくつかの態様において、患者は、ヒト患者である。
【００６３】
用語「細胞内ドメイン（endodomain）」は、本明細書において使用される場合、いくつかの膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）において見いだされる、細胞表面膜によって画定される内部空間内に延びる領域を指す。哺乳動物細胞では、細胞内ドメインは、膜タンパク質の細胞質領域である。細胞内において、細胞内ドメインは、細胞内構成成分と相互作用し、かつ、シグナル伝達においてある役割を果たすことができ、したがって、いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインであることができる。細胞の膜貫通型タンパク質の細胞内ドメインは、代替的に細胞質ドメインと称され、これは、いくつかの場合では、細胞質シグナル伝達ドメインであることができる。
【００６４】
用語「増強された」または「増加（向上）した」は、本明細書において哺乳動物リンパ球の免疫活性の増強の文脈で使用される場合、リンパ球の1つまたは複数の活性の増強を意味する。活性の増強は、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性のうちのうちの1つまたは複数の（例えば、統計的に有意な量の）増強であり得る。いくつかの態様において、増強された免疫活性への言及は、インターフェロンγ（IFNγ）産生を（例えば、統計的に有意な量だけ）増加させることを意味する。リンパ球の活性を評価する方法は、本明細書に記載のとおりのいずれかのアッセイを含め、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、増強は、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％大きい増強であり得る。
【００６５】
用語「改変（された）細胞」は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えDNA法またはウイルス形質導入）によって遺伝的に修飾（改変）された哺乳動物細胞を指す。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞であり、例えばリンパ球（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞）または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。細胞は、患者由来の初代細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。本開示の文脈において、改変細胞は、該細胞上に発現している本明細書に記載の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）を含み、該TIPは、改変細胞自体の免疫活性を調節するか、または該TIPの親和性改変IgSFドメインが特異的に結合する哺乳動物細胞の免疫活性を調節するように改変されている。いくつかの場合では、TIPの形式は、異種の細胞質シグナル伝達ドメインまたは細胞内ドメインを含有するキメラ受容体である。提供されるTIP改変細胞の中には、改変されたT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をさらに含有する細胞もある。
【００６６】
用語「改変されたT細胞」は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えDNA法）によって遺伝的に修飾（改変）されたT細胞（例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞（あるいは、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL）、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、またはγδT細胞）を指す。改変されたT細胞は、該T細胞上に発現している本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）を含み、該TIPは、改変されたT細胞自体の免疫活性を調節するか、または該T細胞上に発現する該TIPの親和性改変IgSFドメインが特異的に結合する哺乳動物細胞の免疫活性を調節するように改変されている。
【００６７】
用語「改変（された）T細胞受容体」または「改変（された）TCR」は、選択され、クローニングされ、かつ/またはその後T細胞の集団に導入される（当該T細胞の集団は多くの場合、養子免疫療法に使用される）、主要組織適合複合体（MHC）/ペプチド標的抗原に対して所望の親和性で特異的に結合するように改変されたT細胞受容体（TCR）を指す。改変されたTCRとは対照的に、CARは、MHC依存的に標的抗原に結合するように改変される。
【００６８】
用語「〜上に発現する」は、本明細書において使用される場合、細胞（例えば哺乳動物細胞）の表面に発現するタンパク質に関して使用される。したがって、当該タンパク質は膜タンパク質として発現する。いくつかの態様において、発現する当該タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。いくつかの態様において、当該タンパク質は、低分子部分（例えば、薬物または検出可能標識）にコンジュゲートされる。細胞の表面に発現するタンパク質は、哺乳動物細胞上に発現する細胞表面タンパク質（例えば細胞表面受容体）を含むことができる。
【００６９】
用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターによってコードされるタンパク質を発現させるために使用することができる細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（E. coli）であることができるか、または、宿主細胞は、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであることができる。宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地で成長するVeggie CHOおよび関連細胞株またはDHFR欠損であるCHO系統DX-B11が含まれる。
【００７０】
用語「免疫シナプス」は、本明細書において使用される場合、MHC（主要組織適合複合体）IまたはMHC IIを発現する哺乳動物細胞（例えば、抗原提示細胞または腫瘍細胞）と、哺乳動物リンパ球（例えば、エフェクターT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞）との間の接触面を意味する。
【００７１】
用語「免疫グロブリン」（「Ig」と略記される）は、本明細書において使用される場合、用語「抗体」（「Ab」と略記される）と同義であり、かつ、5種のヒトクラス：IgA（サブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG（サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、およびIgMのいずれかを含む哺乳動物免疫グロブリンタンパク質を指す。該用語はまた、完全または部分的合成（例えば、組換えまたは化学合成）であるか天然に産生されるかにかかわらず全長未満である免疫グロブリン、例えば、抗原結合断片（Fab）、VHおよびVLを含有する可変断片（Fv）、1つの鎖中で一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片（scFv）、ならびに他の抗体V領域断片（Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、dsFvダイアボディ、Fc、およびFdポリペプチド断片）を含む。ホモ二重特異性およびヘテロ二重特異性の二重特異性抗体は、該用語の範囲内に含まれる。
【００７２】
免疫グロブリン分子のFc（結晶性断片）領域またはドメイン（Fcポリペプチドとも呼ばれる）は、主に免疫グロブリン重鎖の定常領域に対応し、かつ、抗体のエフェクター機能を含む種々の機能に関与している。免疫グロブリンFc融合物（「Fc融合物」）は、免疫グロブリンのFc領域に機能的に連結されている1つまたは複数のポリペプチド（または1つまたは複数の低分子）を含む分子である。Fc融合物は、例えば、抗体のFc領域（いくつかの場合には、エフェクター機能および薬物動態を促進する）および野生型もしくは親和性が改変された免疫グロブリンスーパーファミリードメイン（「IgSF」）のIgSFドメイン、または他のタンパク質もしくはその断片のFc領域を含み得る。いくつかの態様において、Fcは、エフェクター機能を促進する低下した（例えば、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上低下した）活性を示すバリアントFcである。IgSFドメインは、同族結合パートナーの認識を媒介する（抗原に対する抗体の抗体可変領域の認識に匹敵する）。免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数のポリペプチドまたは低分子（融合パートナー）に間接的または直接的に連結し得る。種々のリンカーは、当技術分野において公知であり、これを使用して、Fcを融合パートナーに連結させてFc融合物を生成することができる。本発明のFc融合タンパク質は、典型的には、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインに直接または間接的に共有結合された免疫グロブリンFc領域を含む。同一種のFc融合物は、二量体化してFc融合ホモ二量体を形成することができるか、または、非同一種を使用してFc融合ヘテロ二量体形成することができる。
【００７３】
用語「免疫グロブリンスーパーファミリー」または「IgSF」は、本明細書において使用される場合、細胞の、認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の群を意味する。分子は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）と共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして類別され；これらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを保有する。IgSFのメンバーは、免疫系の、細胞表面抗原受容体、共受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある種のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋タンパク質を含む。これらは、通常、免疫系における役割と関連する。免疫シナプス中のタンパク質は、IgSFのメンバーであることが多い。IgSFはまた、機能のような共通の特性に基づいて「サブファミリー」に分類することができる。このようなサブファミリーは、典型的には、4〜30のIgSFメンバーからなる。
【００７４】
用語「IgSFドメイン」または「免疫グロブリンドメイン」または「Igドメイン」は、本明細書において使用される場合、IgSFタンパク質の構造ドメインを指す。Igドメインは、免疫グロブリン分子に因んで命名されている。これらは、約70〜110アミノ酸を含有し、それらのサイズおよび機能に従って類別される。Igドメインは、逆平行β鎖の2つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する、特徴的なIgフォールドを保有する。サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸間の相互作用ならびにBおよびF鎖中のシステイン残基間で形成される高度に保存されているジスフィルド結合は、Igフォールドを安定化させる。Igドメインの一端は、抗体のそれらのリガンドに対する特異性に重要な相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。Ig様ドメインは、IgV、IgC1、IgC2、またはIgIとして（クラスに）分類することができる。ほとんどのIgドメインは、可変（IgV）ドメインまたは定常（IgC）ドメインのいずれかである。9つのβ鎖を有するIgVドメインは、一般に、7つのβ鎖を有するIgCドメインより長い。IgSFのいくつかのメンバーのIgドメインは、アミノ酸配列中のIgVドメインと似ているが、なおIgCドメインとサイズが類似している。これらは、IgC2ドメインと呼ばれ、一方で、標準的なIgCドメインは、IgC1ドメインと呼ばれる。T細胞受容体（TCR）鎖は、細胞外部分における2つのIgドメイン（1つはN末端におけるIgVドメインおよび1つは細胞膜に隣接するIgC1ドメイン）を含有する。
【００７５】
用語「IgSF種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を有するIgSFメンバータンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、そのIgSFメンバーに属する全てのIgSF種にユニークの同一性を規定する。したがって、各IgSFファミリーメンバーは、他のIgSFファミリーメンバーと比べてユニークであり、したがって、特定のIgSFファミリーメンバーの各種は、別のIgSFファミリーメンバー種と比べてユニークである。それにもかかわらず、同じIgSF種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で生じ得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一のIgSF種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因のIgSF種の野生型短縮形態と同様、単一のIgSF種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面IgSF種」は、細胞（一般に哺乳動物細胞）の表面に発現するIgSF種である。
【００７６】
用語「免疫活性」は、本明細書において哺乳動物リンパ球の文脈で使用される場合、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生（例えば、インターフェロンγ）、またはT細胞の細胞傷害活性の1つまたは複数を指す。膜貫通型免疫調節タンパク質の活性を評価することを含む、改変細胞の免疫活性のアッセイ法は、当技術分野において公知であり、抗原刺激後のT細胞増殖能、再刺激の非存在下でのT細胞増殖持続能、および適切な動物モデルにおける抗がん活性を非限定的に含む。アッセイには細胞傷害性を評価するアッセイも含まれ、それには、標準的な51Cr放出アッセイ（例えば、Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464 を参照のこと）もしくはフローベースの細胞傷害性アッセイ、またはインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイ（Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198）が含まれる。改変細胞の免疫活性を評価するアッセイを、対照の未改変細胞と比較するか、または公知の活性を有する1つまたは複数の他の改変された組換え受容体（例えば、抗原受容体）を含有する細胞と比較することができる。
【００７７】
「免疫調節タンパク質」は、免疫活性を調節するタンパク質である。免疫応答の「調節」とは、免疫活性の増強または抑制のいずれかを意味する。免疫調節タンパク質は、単一のポリペプチド鎖であるか、または（例えば、鎖間ジスフィルド結合によって）互いに共有結合された少なくとも2つのポリペプチド鎖の多量体（二量体またはより高次の多量体）であることができる。したがって、単量体、二量体、およびより高次の多量体タンパク質は、その定義された用語の範囲内である。多量体タンパク質は、（同一のポリペプチド鎖の）ホモ多量体または（異なるポリペプチド鎖の）ヘテロ多量体であることができる。膜貫通型免疫調節タンパク質は、免疫調節タンパク質の一種である。
【００７８】
用語「増加（向上）させる」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量だけ増加（向上）させることを意味する。増加（向上）は、非ゼロ対照値より少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、またはより大きい増加（向上）であり得る。
【００７９】
用語「リンパ球」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系の白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する)、T細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する)、およびB細胞（体液性の抗体による獲得免疫に関する）を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球（ILC）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
【００８０】
「阻害性カウンター構造体」は、別個の活性化受容体の近くで近接して結合したとき、活性化受容体によって媒介される活性化シグナル伝達カスケードおよび表現型の頻度、期間、大きさ、または強度の減弱を導く、細胞膜タンパク質、多くの場合受容体である。阻害性受容体の例には、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160およびTIM-3が含まれる。用語「刺激性カウンター構造体」は、活性化されたときおよびシグナル伝達がそれによって誘導されたとき、その受容体によって媒介される表現型の頻度、期間、または強度の増加を導く、細胞膜タンパク質、多くの場合、受容体である。刺激性受容体の例には、CD28、ICOS、およびCD226が含まれる。
【００８１】
用語「リンパ球」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系の白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する)、T細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する)、およびB細胞（体液性の抗体による獲得免疫に関する）を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球（ILC）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
【００８２】
用語「哺乳動物」、「対象」、または「患者」は、具体的には、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも1つへの言及を含む。
【００８３】
用語「膜タンパク質」は、本明細書において使用される場合、生理的条件下で脂質二重層に直接または間接的に付着するタンパク質を意味する。膜を形成する脂質二重層は、生体膜、例えば真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞膜または人工の（すなわち、人造の）膜、例えばリポソーム上に見いだされる膜であることができる。脂質二重層への膜タンパク質の付着は、共有結合による付着であるか、または非共有相互作用、例えば疎水性相互作用もしくは静電相互作用による付着であることができる。膜タンパク質は、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であることができる。表在性膜タンパク質である膜タンパク質は、脂質二重層に非共有相互作用により付着されるか、または内在性膜タンパク質に非共有相互作用により付着される。表在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で表在性膜タンパク質が脂質二重層と相互作用するおよび／または脂質二重層から解離することができるように、脂質二重層への一時的な付着を形成する。表在性膜タンパク質とは対照的に、内在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で内在性膜タンパク質が脂質二重層への付着から解離しないように、膜の脂質二重層への実質的に恒久的な付着を形成する。膜タンパク質は、脂質二重層の一層による膜への付着を形成することができる（モノトピック型）か、または膜の両方の層によって付着することができる（ポリトピック型）。1つの脂質二重層とだけ相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性モノトピック型タンパク質」である。脂質二重層の両方と相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性ポリトピック型タンパク質」である。あるいは、本明細書において「膜貫通型タンパク質」と称される。
【００８４】
用語「調節」または「調節する」は、本明細書において免疫応答（例えば哺乳動物の免疫応答）の文脈で使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質の投与の結果として、または本発明の免疫調節タンパク質（例えば膜貫通型免疫調節タンパク質）を発現する改変細胞の投与の結果として起こる、既存のまたは潜在的な免疫応答の任意の変化、例えば増強または低下を指す。このような調節は、免疫細胞の免疫活性の任意の誘導、または度合いもしくは程度の変化、または抑制を含む。免疫細胞には、B細胞、T細胞、NK（ナチュラルキラー）細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）、および非プロフェッショナル抗原提示細胞、ならびに炎症細胞（好中球、マクロファージ、単球、好酸球、および好塩基球）が含まれる。調節は、既存の免疫応答；発生段階にある免疫応答；潜在的な免疫応答；または免疫応答を誘導する、制御する、それに影響を及ぼす、もしくは応答する能力；に与えられる任意の変化を含む。調節は、免疫応答の一部としての、免疫細胞における遺伝子、タンパク質および／または他の分子の発現および／または機能の任意の変化を含む。免疫応答の調節または免疫活性の調節は、例えば、以下を含む：免疫細胞の排除、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の増殖、誘導、生存または生成；免疫細胞における無応答状態の誘導（すなわち、アネルギー）；免疫細胞の活性または機能の増強または抑制（これらの細胞が発現するタンパク質のパターンを変化させることを非限定に含む）。例には、サイトカイン、ケモカイン、パーフォリン、グランザイム、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、もしくは他の細胞表面受容体のようなある分子クラスの産生および/もしくは分泌の変化、またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが含まれる。調節は、例えば、野生型IgSFタンパク質で改変された細胞と比較して、改変細胞の免疫活性の変化、例えば改変細胞の細胞傷害活性の変化、または改変細胞のサイトカイン分泌の変化によって評価することができる。
【００８５】
用語「分子種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を備えたタンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、同一のまたは実質的に同一の分子種の集合体を規定する。したがって、例えば、ヒトCD80はIgSFメンバーであり、各ヒトCD80分子はCD80の一種である。同じ分子種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化のような翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一の分子種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因の単一の分子種の野生型短縮形態と同様、単一の分子種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面分子種」は、哺乳動物細胞の表面に発現する分子種である。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方のみ又はもう一方のみに存在する（しかし両方ではない）、2つ以上の異なるタンパク質種は、互いに「シス」または「シス配置」にあると言われる。第一のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第一の細胞のみに存在し、第二のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第二の細胞のみに存在する、2つの異なるタンパク質種は、「トランス」または「トランス配置」にあると言われる。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞の両方に存在する、2つの異なるタンパク質種は、これらの細胞上でシス型およびトランス型の両配置にある。
【００８６】
用語「非競合的結合」は、本明細書において使用される場合、少なくとも2つの同族結合パートナーに同時に特異的に結合するタンパク質の能力を意味する。いくつかの態様において、結合は、特異的結合条件下で起こる。したがって、タンパク質は、少なくとも2つの異なる同族結合パートナーに同時に結合することができるが、結合相互作用は、同じ期間である必要はないので、いくつかの場合では、タンパク質は、同族結合パートナーの1つにのみ特異的に結合される。いくつかの態様において、同時結合は、1つの同族結合パートナーの結合が第二の同族結合パートナーへの同時結合を実質的に阻害しないようなものである。いくつかの態様において、非競合的結合は、タンパク質上のその結合部位への第二の同族結合パートナーの結合が、タンパク質上のその結合部位への第一の同族結合パートナーの結合に置き換わらないことを意味する。非競合的結合を評価する方法は、Perez de La Lastra et al.， Immunology， 1999 Apr: 96(4): 663-670 に記載されている方法など、当技術分野において周知である。いくつかの場合では、非競合的相互作用において、第一の同族結合パートナーは、第二の同族結合パートナーの相互作用部位と重複しない相互作用部位で、第二の同族結合パートナーの結合が第一の同族結合パートナーの結合と直接干渉しないように、特異的に結合する。したがって、第二の同族結合パートナーの結合による同族結合パートナーの結合へのあらゆる影響は、第一の同族結合パートナーの結合との直接的な干渉以外の機序を介するものである。例えば、酵素-基質相互作用の状況では、非競合的阻害剤は、酵素の活性部位以外の部位に結合する。非競合的結合は、第二の同族結合パートナーが、第一の同族結合パートナーの結合と重複しない相互作用部位で特異的に結合するが、第一の相互作用部位が第一の同族結合パートナーに占有されているときだけ第二の相互作用部位に結合する、非競合的な結合相互作用を包含する。
【００８７】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の核酸残基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のポリマーを指す。別段の限定されない限り、該用語は、公知の天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸、およびそれと類似の結合特性を有する核酸、および天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で代謝される核酸を包含する。他に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的ヌクレオチド配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成してもよい。核酸またはポリヌクレオチドという用語は、遺伝子によってコードされるcDNAまたはmRNAを包含する。
【００８８】
用語「薬学的組成物」は、哺乳動物対象、しばしばヒトにおける、薬学的用途に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性剤（例えば、本発明の免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞）と担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、それぞれ、典型的には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤である。
【００８９】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、かつ、ペプチド結合を介して連結されている2つ以上のアミノ酸の分子鎖を指す。該用語は、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。該用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。該用語はまた、合成するかまたは公知のタンパク質改変技術を使用して組換え発現することができるような、1つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準なもしくは非天然アミノ酸が含まれる分子も含む。加えて、タンパク質は、周知の有機化学技術によって本明細書に記載されるとおり誘導体化することができる。
【００９０】
用語「初代T細胞アッセイ」は、本明細書において使用される場合、インターフェロン-γ（「IFN-γ」）発現を測定するためのインビトロアッセイを指す。実施例6に記載されるアッセイのような様々なこのような初代T細胞アッセイが当技術分野において公知である。好ましい態様において、使用されるアッセイは、抗CD3同時固定アッセイである。このアッセイでは、初代T細胞が、追加の組換えタンパク質と共にまたはそれなしで固定された抗CD3によって刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。別の態様において、使用されるアッセイは、混合リンパ球反応（MLR）である。このアッセイでは、初代T細胞が、同種異系APCで刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。標準的なELISA技術によって培養上清中のヒトIFN-γレベルを測定する。市販のキットが供給業者から入手可能であり、製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。
【００９１】
用語「精製されている」は、核酸（例えば、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸）またはタンパク質（例えば、免疫調節タンパク質）に適用される場合、一般に、当技術分野において周知の分析技術によって決定したときに他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを表す（例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフ溶出液、および／または密度勾配遠心分離に供された媒体中で、離散バンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中で基本的に1つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。精製された核酸またはタンパク質は、少なくとも約50％純粋、通常、少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％またはそれ以上純粋（例えば、重量パーセントまたはモルベース）である。
【００９２】
用語「組換え」は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入によって人工的に（すなわち、非天然に）変化していることを示す。該変化は、その天然の環境もしくは状態内のまたはそこから取り出された物質に対して実施することができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、親和性改変、DNAシャッフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組換えることによって製造されるものである。「組換えDNA分子」は、このような分子生物学的技術によって一緒に接合されたDNAのセグメントから構成される。用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、組換えDNA分子を使用して発現されるタンパク質分子（例えば、免疫調節タンパク質）を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有するおよび／もしくは発現する細胞であるか、またはそうではなく（例えば、組換えタンパク質（例えば、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質）をコードする核酸分子を細胞に導入することによって）遺伝子工学により改変された細胞である。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列アレイからなる。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルス中の遺伝子を含め様々な真核生物源から単離されている（類似した制御エレメント、すなわち、プロモーターはまた原核生物中にも見いだされる）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどんな細胞タイプが使用されるべきであるかに依存する。用語「機能的な組み合わせにある」、「機能的な順序にある」および「機能的に連結されている」は、本明細書において使用される場合、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子が産生される様式または配向での核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能的タンパク質が産生および／または輸送される様式でのアミノ酸配列の連結も指す。
【００９３】
用語「組換え発現ベクター」は、本明細書において使用される場合、所望のコード配列（例えば、免疫調節核酸、膜貫通型免疫調節核酸）とその機能的に連結されているコード配列の特定の細胞における発現に必要な適切な核酸配列とを含有するDNA分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらく他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、細胞からの融合タンパク質のより簡易な単離のため、発現されたタンパク質が組換え宿主細胞によって分泌されることができるように、分泌シグナルペプチド配列がまた、場合により、コード配列に機能的に連結されている組換え発現ベクターによってコードされることができる。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。このようなベクターには、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターがある。
【００９４】
用語「配列同一性」は、本明細書において使用される場合、遺伝子またはタンパク質間の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列同一性を指す。「配列同一性」は、タンパク質間のアミノ酸レベルでの同一性の尺度および核酸間のヌクレオチドレベルでの同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のための配列のアライメントのための方法は、当技術分野において周知であり、このような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含む。BLASTアルゴリズムは、配列同一性（％）を計算し、かつ、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）ウェブサイトを通して公表されている。
【００９５】
用語「可溶性」は、タンパク質に関して本明細書において使用される場合、タンパク質が膜タンパク質ではないことを意味する。一般に、可溶性タンパク質は、1つまたは複数のIgSFドメインまたはその特異的結合断片を含有するIgSFファミリーメンバー受容体の細胞外ドメイン、またはその一部のみを含有する。
【００９６】
用語「種」は、核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、このような配列の同一の集合体を指す。全長種とアミノ末端またはカルボキシ末端がわずか1、2、または3アミノ酸残基だけ異なる（または差異をコードする）わずかに短縮された配列は、単一種の配列であると見なされる。このような微不均一性は、製造されたタンパク質の共通の特徴である。
【００９７】
用語「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、その親和性またはアビディティが、十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集合体に対する同じタンパク質の平均親和性またはアビディティの少なくとも10倍大きく、しかし場合により50、100、250または500倍大きく、またはさらに少なくとも1000倍大きくなるように、特異的結合条件下で、標的タンパク質に結合するタンパク質の能力を意味する。特異的に結合するタンパク質は、単一の標的分子（例えば、その同族結合パートナー）のみに結合する必要はないが、標的と非標的（例えば、パラログまたはオーソログ）との間の立体配置の類似性に起因して非標的分子に特異的に結合し得る。当業者は、異なる動物種における同じ機能を有する分子（すなわち、オーソログ）への特異的結合または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する非標的分子（例えば、パラログ）への特異的結合が、可能であり、かつ、固有の非標的（例えば、ランダムポリペプチド）の統計的に有効な集合体に対して決定される結合の特異性を損なわないことを認識するだろう。したがって、本発明の親和性改変ポリペプチドは、交差反応性に起因して、複数の別個の標的分子種に特異的に結合し得る。一般に、このようなオフ標的特異的結合は、望ましくない標的に対する親和性またはアビディティを低減することによって緩和される。固相ELISAイムノアッセイまたはビアコア（Biacore）測定を使用して、2つのタンパク質間の特異的結合を決定することができる。一般に、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-5 M未満、しばしば1×10-12 Mまでの低さの解離定数（Kd）を有する。本開示のある種の局面において、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 Mまたは1×10-11 Mの解離定数を有する。
【００９８】
用語「特異的結合断片」または「断片」は、成熟（すなわち、シグナルペプチドを欠いている）野生型IgSFドメインに関して本明細書において使用される場合、全長成熟IgSFドメインより短く、かつ、インビトロおよび／またはインビボで野生型IgSFドメインの天然同族結合パートナーに特異的に結合するポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、特異的結合断片は、全長成熟野生型配列の配列長の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％である。特異的結合断片は、本発明の親和性改変IgSFドメインを形成するために配列を変化させることができる。いくつかの態様において、特異的結合断片は、リンパ球の免疫活性を調節する。用語「抑制する」または「減弱させる」または「低下（減少）させる」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の低下（減少）を意味する。いくつかの態様において、抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の低下（減少）であることができる。
【００９９】
ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞に関して、用語「表面発現する」または「表面発現」は、当該ポリペプチドが膜タンパク質として発現されることを意味する。いくつかの態様において、膜タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「合成（の）」は、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して、組換え法および／または化学合成法によって生産される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、用語「膜貫通型タンパク質」は脂質二重層を実質的にまたは完全に貫通する膜タンパク質を意味し、脂質二重層は、例えば、哺乳動物細胞などの生体膜中に、またはリポソームなどの人工構築物中に見いだされる。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層に統合されかつその統合が生理的条件下で熱力学的に安定である、膜貫通ドメイン（「膜貫通ドメイン」）を含む。膜貫通ドメインは一般に、膜貫通ドメインの疎水性が、タンパク質における水性環境（例えば、細胞質ゾル、細胞外流体）と相互作用する領域と比較して高いことに基づいて、幾つもの市販の生命情報科学ソフトウェアアプリケーションを介して、膜貫通ドメインのアミノ酸配列から予測可能である。膜貫通ドメインは多くの場合、膜を貫通する疎水性αヘリックスである。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層の両層を1回または複数回貫通していてもよい。本明細書に記載される提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通型タンパク質に含まれる。本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインに加えて、エクトドメインをさらに含み、いくつかの態様においては細胞内ドメインをさらに含む。
【０１０２】
疾患または障害の「治療」または「（治）療法」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞を、単独、または本明細書に記載されるとおりの別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することによる臨床または診断症状のいずれかの低減、停止、または排除によって証明される、疾患または障害の進行を遅延、中断、または反転させることを意味する。「治療する」または「治療」は、急性もしくは慢性疾患もしくは障害における症状の重症度の低下、または再発率の低下（例えば、自己免疫疾患経過を再発するまたは寛解する場合のような）、または自己免疫疾患の炎症的側面の場合の炎症の低減も意味する。がんの文脈において本明細書で使用される場合、がんの「治療」またはがんを「阻害する」またはがんの「阻害」という用語は、限定されないが、Response Evaluation Criteria for Solid Tumors（RECIST）のような標準的な基準によって測定した場合の、腫瘍成長率の統計的に有意な低下、腫瘍成長の停止、または腫瘍の、サイズ、質量、代謝活性もしくは体積の低下、または無増悪生存率（PFS）もしくは全生存率（OS）の統計的に有意な向上のうちの少なくとも1つを指す。疾患もしくは障害を「予防する」または疾患もしくは障害の「予防」は、本発明の文脈において使用される場合、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するか、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるための、本発明の免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞を単独または別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することを指す。
【０１０３】
用語「腫瘍特異的抗原」または「TSA」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に主に存在するが一般に哺乳動物対象の正常細胞上には見いだされない抗原を指す。いくつかの場合においては、腫瘍特異的抗原は、IgSFメンバーのカウンター構造体または同族結合パートナーである。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞のみに存在する必要はないが、抗腫瘍治療薬で標的化できかつ腫瘍の影響から哺乳動物を予防または治療することを提供できるように、腫瘍特異的抗原を有する特定の哺乳動物の細胞の割合が十分に高いかまたは腫瘍の表面の腫瘍特異的抗原のレベルが十分に高い。いくつかの態様において、腫瘍を有する哺乳動物由来の細胞のランダム統計試料では、TSAを提示する細胞の少なくとも50％ががん性である。他の態様において、TSAを提示する細胞の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％ががん性である。
【０１０４】
用語「野生型」または「天然」または「親」は、本明細書において使用される場合、核酸分子、タンパク質、IgSFメンバー、宿主細胞などの生物学的材料と併用され、天然に見いだされかつヒトの介入によって改変されていないものを指す。
【０１０５】
II. 膜貫通型免疫調節タンパク質および改変細胞
膜貫通型タンパク質である免疫調節タンパク質（「膜貫通型免疫調節タンパク質」）が本明細書において提供される。膜貫通型免疫調節タンパク質、および当該膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞は、概して、免疫系の応答の調節が有益である疾患または障害を有する哺乳動物における免疫活性を調節することによって、治療有用性を有する。本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメイン、膜貫通ドメイン、およびいくつかの態様においては、細胞内ドメイン、例えば細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０６】
A. エクトドメイン
いくつかの態様において、提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型哺乳動物IgSFメンバーのIgSFドメインと比較して親和性が改変されたIgSFドメインを少なくとも1つ含むエクトドメインを含む。抗体（すなわち、免疫グロブリン）、例えば、哺乳動物の抗体または哺乳動物起源の抗体は、野生型哺乳動物IgSFメンバーに含まれない。したがって、本発明は、非免疫グロブリン（すなわち、非抗体）IgSFドメインであるエクトドメインに関する。免疫グロブリン（すなわち、抗体）ではない野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバーは、それらの核酸配列およびアミノ酸配列と同様に、当技術分野において公知である。全ての非免疫グロブリン哺乳動物IgSFファミリーメンバーの野生型IgSFドメインの親和性が改変されたIgSFドメインが、本発明の範囲内のエクトドメインとして含まれる。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、それらの種々の態様において、少なくとも1つの親和性が改変された哺乳動物IgSFドメイン、例えば少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリン哺乳動物IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバー、およびその中に存在する対応するIgSFドメインは、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒト起源である。いくつかの態様において、IgSFファミリーメンバーは、少なくともまたは厳密に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはより多くのIgSFサブファミリーに由来するメンバーであり、例えばシグナル制御タンパク質（SIRP）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（TREML）ファミリー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有（VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（PVR）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（NCR）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）ファミリーに由来するメンバーである。いくつかの態様において、少なくとも1つのIgSFドメインは、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD274（PD-L1、B7-H1）、PDCD1LG2（PD-L2、CD273）、ICOSLG（B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2）、CD276（B7-H3）、VTCN1（B7-H4）、CD28、CTLA4、PDCD1（PD-1）、ICOS、BTLA（CD272）、CD4、CD8A（CD8α）、CD8B（CD8β）、LAG3、HAVCR2（TIM-3）、CEACAM1、TIGIT、PVR（CD155）、PVRL2（CD112）、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1（CD200R）、およびNC R3（NKp30）のうちのいずれかであるIgSFタンパク質に由来する。
【０１０８】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、哺乳動物IgSFメンバーである非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバーの対応するIgSFドメインと比較して親和性が改変されている。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、表1に示されているIgSFメンバー（およびそれらの任意の哺乳動物オーソログ）のうちの1つであるか、または当該IgSFメンバーのうちの1つに由来するIgSFドメインを含む。オーソログは、種分岐によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オーソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変IgVまたはIgCドメイン（IgC1またはIgC2ドメインを含む）である。
【０１０９】
いくつかの態様において、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、野生型哺乳動物非免疫グロブリン（すなわち、非抗体）IgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインの配列を含むが、その中の少なくとも1つのIgSFドメインは、親和性が改変されている（「I型」膜貫通型免疫調節タンパク質）。IgSFファミリー内に存在する追加のドメイン、例えば少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つのIgSFドメイン、いくつかの態様においては厳密に2つ、3つ、4つ、または5つのIgSFドメインの親和性を改変することができる。本発明のI型膜貫通型免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、表1に示されているIgSFメンバー（およびそれらの任意の哺乳動物オーソログ）のうちの1つであろう。
【０１１０】
表1の第一の列は、その特定のIgSFメンバーについての名称および場合によりいくつかの可能な別名を提供する。第二の列は、uniprot.orgでインターネットを介してアクセス可能な公表されているデータベースである、UniProtKBデータベースのタンパク質識別子を提供する。Universal Protein Resource（UniProt）は、タンパク質配列および注釈データ用の包括的リソースである。UniProtデータベースは、UniProt Knowledgebase（UniProtKB）を含む。UniProtは、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）（EMBL-EBI）、SIBスイスバイオインフォマティクス研究所（SIB Swiss Institute of Bioinformatics）とタンパク質情報リソース（Protein Information Resource）（PIR）の間の共同組織であり、米国国立保健研究所（U.S. National Institutes of Health（NIH））の助成金によって主に支援されている。第三の列は、表示のIgSFドメインが位置している領域を提供する。該領域は、ドメインが範囲を規定している残基を包含する範囲として特定される。列3はまた、特定されたIgSF領域のIgSFドメインクラスを示す。列4は、表示の追加のドメインが位置している領域を提供する（シグナルペプチド、S；細胞外ドメイン、E；膜貫通ドメイン、T；細胞質ドメイン、C）。列5は、列挙されたIgSFメンバーのいくつか、すなわちその同族細胞表面結合パートナーのいくつかを示す。
【０１１１】
典型的には、提供される態様の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの親和性改変IgSFドメインは、ヒトまたはマウスの親和性改変IgSFドメインである。
【０１１２】
（表１）本開示のIgSFメンバー
2018534245.tif 000003
2018534245.tif 000004
2018534245.tif 000005
2018534245.tif 000006
【０１１３】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、少なくとも1つの親和性改変ドメインをさらに含有し、かつ、少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメイン（例えば、未改変のまたは野生型のIgSFドメイン）をさらに含有する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、親和性改変ドメインを少なくとも2つ含有する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含有することができる。
【０１１４】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、野生型IgSFファミリーメンバーには見られない、親和性が改変されたIgSFドメイン配列および／または親和性が改変されていないIgSFドメイン配列の組み合わせ（「非野生型組み合わせ」）および／または配置（「非野生型配置」もしくは「非野生型配列」）を含む（「II型」免疫調節タンパク質）。親和性が改変されていない（例えば、野生型）IgSFドメインまたは親和性が改変されているIgSFドメインの配列は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、カニクイザル、もしくはヒト）起源であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。いくつかの態様において、親和性が改変されていないドメインの配列は、表1に示されている任意のIgSFドメインである。II型免疫調節タンパク質（非野生型組み合わせまたは非野生型配置にかかわらず）のこれらの態様に存在するこのような親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインの数は、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つ、いくつかの態様においては厳密に2つ、3つ、4つ、または5つのIgSFドメインである。
【０１１５】
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも2つは、同一の親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、同一ではない（すなわち、異なる）IgSFドメインである。同一ではない親和性改変IgSFドメインは、特異的結合条件下で異なる同族結合パートナーに特異的に結合し、かつ、これらが設計された野生型IgSFドメインが同じあったか否かに関係なく「同一ではない」。したがって、例えば、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインにおける少なくとも2つの同一ではないIgSFドメインの組み合わせは、起源が1つのIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである少なくとも1つのIgSFドメイン配列と、起源が別のIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである第二のIgSFドメイン配列の少なくとも1つとを含むことができ、ここで、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインのIgSFドメインは、親和性が改変された形態である。しかしながら、代わりの態様において、2つの同一ではないIgSFドメインは、同じIgSFドメイン配列が起源であるが、これらが異なる同族結合パートナーに特異的に結合するように異なって親和性が改変されている。いくつかの態様において、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメイン内に存在する同一ではない親和性改変IgSFドメインの数は、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つ、いくつかの態様においては厳密に2つ、3つ、4つ、または5つの同一ではない親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、同一ではないIgSFドメインは、表1に示されている少なくとも2種のIgSFメンバーに由来する組み合わせであり、いくつかの態様においては、表1の少なくとも3または4つのIgSFメンバーに由来する組み合わせである。
【０１１６】
他の態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、単一のIgSFメンバーに由来するが非野生型配置の少なくとも2つのIgSFドメインを含む。非野生型配置または配列の1つの実例は、野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバー（そのIgSFドメイン配列は親和性改変IgSFドメインの供給源として役立つ）において見られるものと比較して、野生型とは異なる順序で親和性改変IgSFドメイン配列を含む、本発明の免疫調節タンパク質である。先行態様における哺乳動物野生型IgSFメンバーは、具体的に、表1に列挙されているものを含む。したがって、一例では、野生型ファミリーメンバーが、細胞表面タンパク質の膜貫通ドメインの近位にIgC1ドメインを含み、膜貫通ドメインの遠位にIgVドメインを含む場合、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、親和性が改変された形態にもかかわらず、膜貫通ドメインの近位にIgVを含み、膜貫通ドメインの遠位にIgC1を含むことができる。親和性改変IgSFドメインの非野生型組み合わせおよび非野生型配置の両方の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメイン内の存在もまた、本発明の範囲内である。膜貫通型免疫調節タンパク質のポリペプチド鎖のエクトドメイン内の複数の親和性改変IgSFドメインは、互いに直接、共有結合により連結される必要はない。いくつかの態様において、介在する1つまたは複数のアミノ酸残基は、親和性改変IgSFドメインを互いに間接的に共有結合させる。このような「ペプチドリンカー」は、単一のアミノ酸残基であってもより長いものであってもよい。
【０１１７】
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインを、哺乳動物細胞上に発現する単一（例えば、1つ）または複数（例えば、2つ、3つ、4つ、またはより多い）のカウンター構造体（「同族結合パートナー」とも呼ばれる）に特異的に結合するように親和性を改変することができる。典型的には、カウンター構造体は、親和性が改変されているIgSFドメインの対応する野生型IgSFドメインの天然カウンター構造体である。いくつかの態様において、カウンター構造体は、IgSFメンバーである。いくつかの態様において、カウンター構造体は、非IgSFファミリーメンバーである。例えば、いくつかの態様において、BTLA（B- and T-lymphocyte attenuation：B および T リンパ球アテニュエーション）などの親和性改変IgSFドメインのカウンター構造体は、非IgSFメンバーカウンター構造体HVEM（herpes virus entry mediator：ヘルペスウイルス侵入メディエーター）である。BTLA-HVEM複合体は、T細胞免疫応答を負に制御する。膜貫通型免疫調節タンパク質内に存在する各IgSFドメインを、それが結合する単一または複数のカウンター構造体の各々への特異的結合親和性またはアビディティを独立して向上または減弱させるように親和性を改変することができる。この方法によって、複数のカウンター構造体の各々への特異的結合は、独立して、特定の親和性またはアビディティに合わせられる。
【０１１８】
いくつかの態様において、IgSFドメインのカウンター構造体は、表1に列挙されているもののような、野生型IgSFドメインのカウンター構造体（同族結合パートナー）のうちの少なくとも1つであり、時として少なくとも2つまたは3つである。哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインの配列は、少なくとも1つの置換、付加、または欠失でその配列を変化させることによって親和性が改変される。配列の変化は、カウンター構造体の結合部位またはアロステリック部位において起こることができる。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインをコードする核酸は、特定のおよび所定のヌクレオチド部位の置換、付加、欠失、またはその組み合わせによって親和性が改変されて本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインをコードする核酸を生成する。いくつかの対照的な態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインをコードする核酸は、核酸内のランダム部位における置換、付加、欠失、またはその組み合わせによって親和性が改変される。いくつかの態様において、2つのアプローチ（所定のおよびランダムな）の組み合わせが利用される。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの設計がインシリコで実施される。
【０１１９】
いくつかの態様において、エクトドメインの親和性改変IgSFドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含有する野生型もしくは未改変のポリペプチドまたはその一部に対して、1つまたは複数のアミノ酸置換（あるいは、「変異」または「交換」）を含有する。いくつかの態様において、IgSFドメインは、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはIgVドメインもしくはIgCドメインの特異的結合断片である。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、アミノ酸置換のうちの少なくとも1つがIgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片中にある、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片を含有する親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、変化した結合活性または親和性の理由で、IgVドメインまたはIgCドメインは、親和性が改変されたIgSFドメインである。
【０１２０】
いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインは、少なくとも1であるが、合計1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以下のアミノ酸置換、付加、欠失、またはその組み合わせで配列の親和性が改変される。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインなどのIgSFドメインは、少なくとも1であるが、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸置換で配列の親和性が改変される。いくつかの態様において、置換は、保存的置換である。いくつかの態様において、置換は、非保存的である。いくつかの態様において、置換は、保存的置換と非保存的置換との組み合わせである。いくつかの態様において、配列の改変は、そのカウンター構造体に対するIgSFドメインの結合部位において行われる。
【０１２１】
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、哺乳動物のIgSFドメインである。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒト、マウス、カニクイザル、またはラットのものを含むがそれらに限定されないIgSFドメインであることができる。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒトのIgSFドメインである。
【０１２２】
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、IgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン）を含有するIgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインまたはその一部であるか、あるいはそれらを含む。いくつかの場合において、未改変または野生型のIgSFドメインの細胞外ドメインは、複数のIgSFドメイン（例えば、IgVドメインおよびIgCドメイン）を含むことができる。しかしながら、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインおよびIgCドメインの両方を含む必要はない。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片、およびIgCドメインまたはその特異的結合断片を含む。
【０１２３】
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドドメインの任意の1つまたは複数の中に位置することができる。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドの細胞外ドメイン中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはIgVドメインの特異的結合断片中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはIgCドメインの特異的結合断片中に位置する。
【０１２４】
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、SEQ ID NO：1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有されるかまたはSEQ ID NO：1〜27のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列内に含有されるIgSFドメインであるか、あるいはその特異的結合断片である。いくつかの態様において、IgSFドメインは、その中に含有されるIgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片である。表1は、SEQ ID NO：1〜27の各々に含有されるIgSFドメインを特定する。
【０１２５】
いくつかの態様において、未改変のまたは野生型のIgSFドメインは、IgSFメンバー、例えば哺乳動物IgSFメンバーのIgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン）を含む、細胞外ドメイン（ECD）または一部を含む。いくつかの態様において、未改変のまたは野生型のIgSFドメインは、（i）SEQ ID NO：28〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列、(ii）SEQ ID NO：28〜54のいずれかに対して少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または（iii）IgVドメインもしくはIgCドメインを含む（i）もしくは（ii）の特異的結合断片である。
【０１２６】
いくつかの態様において、少なくとも1つのIgSFドメイン、例えば本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質の少なくとも1つの哺乳動物IgSFドメインは、独立して、限定されないがSEQ ID NO:1〜27として表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される対応する野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、または80％の配列同一性を有するように配列の親和性が改変される。
【０１２７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、限定されないがSEQ ID NO:1〜27で表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される野生型または未改変のIgSFドメインの特異的結合断片である。いくつかの態様において、特異的結合断片は、少なくとも50アミノ酸、例えば少なくとも60、70、80、90、100、または110アミノ酸のアミノ酸長を有することができる。いくつかの態様において、IgVドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgVドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様において、IgCドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgCドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、特異的結合断片は、免疫活性を調節する。より具体的な態様において、IgSFドメインの特異的結合断片は、免疫活性を増強させる。代わりの態様において、特異的結合断片は、免疫活性を低下させる。
【０１２８】
いくつかの態様において、2つの核酸配列または2つのアミノ酸の同一性（％）を決定するために、配列を最適な比較のためアライメントさせる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップが導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性（％）は、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％=同一位置の数（#）／位置（例えば、重複位置）の総数（#）×100）。一態様において、2つの配列は、同じ長さである。配列を手動でアライメントさせて、同一の核酸またはアミノ酸の数を計数してもよい。あるいは、同一性（％）の決定のための2つの配列のアライメントを、数学的アルゴリズムを使用して達成してもよい。このようなアルゴリズムは、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12でBLASTヌクレオチド検索を実施してもよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3でBLASTタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためにギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLASTを利用してもよい。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実施してもよい。NBLAST、XBLAST、およびGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター、例えばNCBIウェブサイトで入手可能なものを使用してもよい。あるいは、NCBIデータベースにおいて、例えばBLASTプログラムによって配列をアライメントさせた後に、配列同一性を計算してもよい。一般に、例えば「スコア行列」および「ギャップペナルティ」に関するデフォルト設定をアライメントに使用してもよい。本発明の文脈において、BLASTNおよびPSI BLAST NCBIのデフォルト設定を採用してもよい。
【０１２９】
本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインが設計または作製される手段は、任意の特定の方法に限定されない。しかしながら、いくつかの態様において、野生型IgSFドメインが野生型IgSF遺伝物質から変異誘発され（部位特異的、ランダム、またはその組み合わせ）、実施例に開示される方法に従って結合性の変化についてスクリーニングされる。核酸を変異誘発するための方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、多数の公表されているデータベースで入手可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、その後スクリーニングされる。National Center for Biotechnology Informationは、このような情報を提供し、そして、そのウェブサイトは、先に考察したとおりのUniProtKBデータベースと同様にインターネットを介して公的にアクセス可能である。
【０１３０】
いくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメイン中に存在する少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、免疫シナプス（IS）を形成する哺乳動物細胞の表面に発現する少なくとも1つの細胞表面分子種に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1、2、3、4、5、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含み得る。これらの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの1つまたは複数は、独立して、ISを形成する哺乳動物細胞の一方または両方のいずれかに特異的に結合することができる。
【０１３１】
しばしば、エクトドメインの親和性改変IgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、親和性が改変されている、野生型IgSFファミリーメンバーまたは野生型IgSFドメインの同族結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、哺乳動物IgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、表1に示されるとおりの同族細胞表面結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞の細胞表面のウイルスタンパク質、例えばポリオウイルスタンパク質であろう。
【０１３２】
いくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの少なくとも1つの親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する哺乳動物細胞上に存在する少なくとも2つまたは3つの細胞表面分子種に結合する。エクトドメインの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方もしくは他方の表面のみにある（すなわち、シス配置にある）ことができるか、または、代替的に、細胞表面分子種は、両方上に存在することができる。
【０１３３】
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、少なくとも2種の細胞表面分子種に特異的に結合し、ここで、分子種の一方は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方の細胞に存在し、そして、他方の分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第二の細胞上に存在する。このような態様において、細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方または他方の細胞上に単独で存在する（すなわち、トランス配置にある）必要は必ずしもないが、いくつかの態様において、存在する。したがって、本明細書において提供される態様は、各細胞表面分子種が、ISを形成する哺乳動物細胞のうちの一方または他方のみの表面に存在するもの（シス配置）、ならびに、親和性改変各IgSFが結合する細胞表面分子種がISを形成する哺乳動物細胞の両方の表面に存在するもの（すなわち、シスおよびトランス配置）を含む。
【０１３４】
当業者は、抗原提示細胞（APC）および腫瘍細胞がリンパ球と共に免疫シナプスを形成することを認識するだろう。したがって、いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、がん細胞上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、がん細胞は、リンパ球と連動してISを形成する。他の態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、リンパ球上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、リンパ球は、APCまたは腫瘍細胞と連動してISを形成する。いくつかの態様において、親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する標的細胞（またはAPC）およびリンパ球の両方上に存在する細胞表面分子種に結合する。
【０１３５】
本発明の態様は、特異的結合条件下における、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する、親和性改変IgSFドメインの結合親和性（または多量体もしくは他の関連構造にある場合はアビディティ）が、変化していない野生型または未改変のIgSFドメイン対照と比べて向上するかまたは低下するかのいずれかであるように、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインが、野生型または未改変のIgSFドメイン（例えば、哺乳動物IgSFドメイン）と異なるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む態様を含む。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、例えば、固相ELISAイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたはビアコアアッセイによって決定したところ、野生型または未改変IgSF対照配列のものと異なる、同族結合パートナーに対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が、野生型または未改変のIgSFドメインと比べて向上している。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメインと比べて、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が低下している。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、ヒトタンパク質またはマウスタンパク質のような哺乳動物タンパク質であることができる。
【０１３６】
各同族結合パートナーに対する結合親和性は、独立している；すなわち、いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型または未改変ポリペプチドと比べて、1つ、2つまたは3つの異なる同族結合パートナーに対する結合親和性が向上しており、かつ、異なる同族結合パートナーのうちの1つ、2つまたは3つに対する結合親和性が低下している。
【０１３７】
いくつかの態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、親和性改変IgSFドメインの結合親和性またはアビディティが、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比較して、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、5000％、または10,000％向上している、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインと比較しての結合親和性の向上は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍超の向上である。
【０１３８】
いくつかの態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、親和性改変IgSFドメインの結合親和性またはアビディティが、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比較して、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または最大で90％低下している、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインと比較しての結合親和性の低下は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍超の低下である。
【０１３９】
いくつかの態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、同族結合パートナーへのその特異的結合親和性が少なくとも1×10-5 M、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 Mまたは1×10-11 M、または1×10-12 Mであることができる、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインはIgSFドメインを少なくとも2つ含み、該IgSFドメインのうちの少なくとも1つ（いくつかの態様においては両方）の親和性が改変されており、親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーに対する向上した親和性（またはアビディティ）を有し、かつ、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインがその同族結合パートナーに対する低下した親和性（またはアビディティ）を有する。エクトドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質は、機能的に、その同族結合パートナーへの特異的結合が向上するか低下するかに関係なく、適切なアッセイ制御下で、改変免疫細胞（例えば、リンパ球または抗原提示細胞）の免疫活性を、野生型の親分子を発現する改変免疫細胞と比較して増強または抑制するように作用する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインを少なくとも2つ含むエクトドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質は、親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも1つが活性化受容体を刺激しかつ親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも1つが阻害性受容体と拮抗するように作用するものである。いくつかの態様において、免疫活性の増強は、例えば細胞傷害活性アッセイ、細胞サイトカインを評価するためのアッセイ、または細胞増殖アッセイにおいて、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％大きい増強であり得る。いくつかの態様において、免疫活性の抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の抑制であり得る。
【０１４１】
本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、いくつかの態様において、そのカウンター構造体に競合的に特異的に結合することができる。他の態様において、本発明の親和性改変IgSFドメインは、そのカウンター構造体に非競合的に特異的に結合する。
【０１４２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、別様に複数の細胞表面分子種に結合するがその同族細胞表面分子種の1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されている、IgSFドメインを含有する。したがって、これらの態様において、その同族細胞表面分子種の1つへの特異的結合は、野生型レベルの90％以下、例えば、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、またはより低い特異的結合まで低減されている。いくつかの態様において、その同族細胞表面分子種の1つへの特異的結合は、野生型レベルの10％以下、多くの場合、7％以下、5％以下、3％以下、1％以下、または検出不可もしくは統計的に有意でない特異的結合まで低減されている。
【０１４３】
いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメイン上の特異的結合部位は、細胞表面分子種の少なくとも1つに関して不活性化されているか、または実質的に不活性化されている。したがって、例えば、野生型IgSFドメインが厳密に2つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、該ドメインは厳密に1つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される。また、野生型IgSFドメインが厳密に3つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、該ドメインは厳密に2つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される。その同族細胞表面分子種のうちの1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されているIgSFドメインは、別様にその細胞表面分子種に競合的にまたは非競合的に特異的に結合する、IgSFドメインであることができる。一実例は、カウンター構造体：CD28、PD-L1、およびCTLA4に特異的に結合する天然CD80（B7-1）に関係する。いくつかの態様において、CD80を、CD28および／またはPD-L1へのその特異的結合を増加または減弱させるようにするが、しかしCTLA4にはいかなる生理学的に顕著な程度にも特異的に結合しないように、IgSFの親和性を改変することができる。その細胞表面カウンター構造体のうちの1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されているIgSFドメインは、別様にそのカウンター構造体に競合的にまたは非競合的に特異的に結合するIgSFドメインであることができる。当業者は、2種の同族結合パートナーに競合的に結合する野生型IgSFドメインがそれでもなおそれらのうちの厳密に一方に関して不活性化されることができることを認識するだろう（例えば、それらの結合部位が厳密に同一範囲にないが、一方の特異的結合が他方の同族結合パートナーの結合を阻害し、かつなお両方の競合的結合部位が別個であるように単に重複している場合）。
【０１４４】
提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、いくつかの態様において、その同族細胞表面分子種に競合的に特異的に結合することができる。他の態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、その同族細胞表面分子種に非競合的に特異的に結合する。本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメイン中に存在する任意の数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、競合的にまたは非競合的に特異的に結合することができる。
【０１４５】
いくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、少なくとも2つの親和性が改変されていないIgSFドメイン、または少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメイン、または少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、ここで、1つのIgSFドメインは、その同族細胞表面分子種に、競合的に特異的に結合し、第二のIgSFドメインは、非競合的に結合する。より一般に、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、1、2、3、4、5、もしくは6つの競合的または1、2、3、4、5、もしくは6つの非競合的に結合している親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、またはその任意の組み合わせを含むことができる。したがって、本明細書において提供される免疫調節タンパク質のエクトドメインは、それぞれ：0および1、0 および2、0および3、0および4、1および0、1および1、1および2、1および3、2および0、2および1、2および2、2および3、3および0、3および1、3および2、3および3、4および0、4および1、ならびに、4および2の非競合的および競合的に結合しているIgSFドメインの数を有することができる。
【０１４６】
エクトドメインが複数のIgSFドメインを含有するいくつかの態様において、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインの複数の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、互いに直接共有結合している必要はない。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基の介在範囲は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを互いに間接的に共有結合させる。その連結は、N末端からC末端の残基を介することができる。
【０１４７】
いくつかの態様において、連結は、親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインのN末端またはC末端に位置していないアミノ酸残基の側鎖を介して行うことができる。したがって、連結は、末端もしくは内部アミノ酸残基またはその組み合わせを介して行うことができる。
【０１４８】
親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを連結させる「ペプチドリンカー」は、単一アミノ酸残基またはそれより多い長さであることができる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を有するが、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸残基長である。いくつかの態様において、リンカーは（一文字アミノ酸コードで）：GGGGS（「4GS」）または4GSリンカーの多量体、例えば2つ、3つ、4つ、または5つの4GSリンカーの繰り返しである。
【０１４９】
例示的な親和性改変ドメインおよびエクトドメイン
いくつかの態様において、提供される膜貫通型免疫調節タンパク質のエクトドメインは、上の表1に示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を有する親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはその特異的結合断片中にある。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはその特異的結合断片中にある。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはその特異的結合断片中にあり、そして、1つまたは複数のアミノ酸置換のいくつかは、IgCドメインまたはその特異的結合断片中にある。
【０１５０】
いくつかの態様において、エクトドメインの親和性改変IgSFドメインは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。置換は、IgVドメインまたはIgCドメイン中にあることができる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片中に最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片中に最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメインなどの、野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
【０１５１】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、B7 IgSFファミリーメンバーの野生型または未改変のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインを含有する。いくつかの態様において、B7 IgSFファミリーメンバーは、CD80、CD86またはICOSリガンド（ICOSL）である。いくつかの態様において、エクトドメインの親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:1、2または5のいずれかに示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgVまたはIgC）のような、CD80、CD86またはICOSリガンド（ICOSL）の野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。CD80の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表2に示されている。ICOSLの例示的な親和性改変IgSFドメインは、表3に示されている。CD86の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表4に示されている。
【０１５２】
（表２）例示的なバリアントCD80ポリペプチド
2018534245.tif 000007
2018534245.tif 000008
【０１５３】
（表３）例示的なバリアントICOSLポリペプチド
2018534245.tif 000009
【０１５４】
（表４）例示的なバリアントCD86ポリペプチド
2018534245.tif 000010
【０１５５】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、ポリオウイルス受容体IgSFファミリーメンバーの野生型または未改変のIgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインを含有する。いくつかの態様において、ポリオウイルスIgSFファミリーメンバーは、CD155（PVR）またはCD122（PRR-2）である。いくつかの態様において、エクトドメインの親和性改変IgSFドメインは、CD155またはCD112の野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片、例えばSEQ ID NO：20または21のいずれかに示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgVまたはIgC）に対して少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。CD155の親和性改変IgSFドメインの例が、表5に示されている。CD112の親和性改変IgSFドメインの例が、表6に示されている。
【０１５６】
（表５）例示的なバリアントCD155ポリペプチド
2018534245.tif 000011
【０１５７】
（表６）例示的なバリアントCD112ポリペプチド
2018534245.tif 000012
2018534245.tif 000013
【０１５８】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、NkP30ファミリーメンバーの野生型または未改変のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインを含有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:27に示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgC）のような、NkP30ファミリーメンバーの野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。表7は、例示的な親和性改変NkP30 IgSFドメインを提供する。
【０１５９】
（表７）例示的なバリアントNKp30ポリペプチド
2018534245.tif 000014
【０１６０】
B. 膜貫通ドメイン
本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞上での細胞表面発現のためのコードされたタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、エクトドメインに直接連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、1つまたは複数のリンカーまたはスペーサーを介して間接的にエクトドメインに連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、主として疎水性アミノ酸残基、例えばロイシンおよびバリンを含有する。
【０１６１】
いくつかの態様において、完全長膜貫通アンカードメインを使用して、TIPが確実に改変細胞（例えば、改変されたT細胞）の表面に発現されるようにすることができる。好都合には、これは、親和性が改変されている特定の天然タンパク質（例えば、CD80もしくはICOSLまたは他の天然IgSFタンパク質）に由来することもでき、かつ、天然IgSFタンパク質（例えば、CD80またはICOSL）と同様にして第一の膜近位ドメインの配列に簡単に融合されることもできる。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または未改変のIgSFメンバーの膜貫通ドメイン、例えばSEQ ID NO：1〜27（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される膜貫通ドメインを含む。
【０１６２】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、野生型IgSFメンバーの膜貫通ドメインではない非天然膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質であるかまたは膜貫通型タンパク質である別の非IgSFファミリーメンバーポリペプチドに由来する膜貫通ドメインに由来する。いくつかの態様において、T細胞上の別のタンパク質に由来する膜貫通アンカードメインを使用することができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD8に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、スペーサードメインとして役立つCD8の細胞外部分をさらに含有することができる。例示的なCD8由来膜貫通ドメインは、SEQ ID NO：386に示されるか、またはCD8膜貫通ドメインを含有するその一部である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインである。
【０１６３】
C. 細胞内ドメイン
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインに連結された細胞内ドメイン、例えば細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインは、対応する野生型または未改変のポリペプチドの細胞質ドメイン、例えばSEQ ID NO：1〜27（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される細胞質ドメインを含む。
【０１６４】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインが少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質が提供される。ITAMは、T細胞受容体シグナル伝達に関与するCD3ζ鎖（「CD3z」）を含む、免疫細胞のシグナル伝達に関与する数多くのタンパク質のシグナル伝達ドメインに見いだされる、保存されたモチーフである。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO：387に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：387に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％を示しかつT細胞シグナル伝達活性を保持するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節する共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、ICOS、41BBまたはOX40である。いくつかの態様において、提供されるCAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質は、同族結合パートナーまたはカウンター構造体への親和性改変IgSFドメインの結合によってT細胞シグナル伝達を刺激するCARの特徴を有する。いくつかの態様において、そのカウンター構造体への親和性改変IgSFドメインによる特異的結合によって、細胞傷害性、増殖またはサイトカイン産生の変化によって反映されるとおり、T細胞活性の免疫活性の変化を導くことができる。
【０１６５】
いくつかの態様において、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質は、所望のカウンター構造体に特異的に結合するように改変されている抗原結合領域を含む。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、その天然カウンター構造体に特異的に結合する。いくつかの態様において、カウンター構造体は、IgSFファミリーメンバーである。いくつかの態様において、腫瘍特異的IgSFカウンター構造体に特異的に結合するCAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様において、抗原結合領域（エクトドメイン）は、親和性改変IgSFドメインNKp30である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原NKp30リガンドB7-H6（Levin et al., The Journal of Immunology, 2009, 182, 134.20 を参照のこと）に特異的に結合する。このような態様の例では、細胞内ドメインは、少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、CD28共刺激ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含むことができる。
【０１６６】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞質シグナル伝達を媒介することが可能な細胞内ドメインを含有しない。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型または未改変のポリペプチドのシグナル伝達機序を欠いており、それゆえ、それ自体は細胞シグナル伝達を誘導しない。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または未改変のポリペプチドの細胞内（細胞質）ドメインまたは細胞内ドメインの一部、例えばSEQ ID NO：1〜27（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される細胞質シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、例えばIgSFファミリーの阻害性受容体（例えば、PD-1またはTIGIT）を含むある種の阻害性受容体に含有されるITIM（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）を含有していない。したがって、いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインおよび膜貫通ドメイン（例えば、記載のとおりのいずれか）のみを含有する。
【０１６７】
D. 核酸分子およびベクター
本発明の膜貫通型免疫調節ポリペプチドの種々の提供される態様のいずれかをコードする、「核酸」とまとめて称される単離された核酸または組換え核酸が本明細書において提供される。本明細書に提供される核酸（下記の全てを含む）は、細胞を改変するためということを含め、膜貫通型免疫調節タンパク質の組換え発現において有用である。本明細書に提供される核酸は、RNAの形態またはDNAの形態であることができ、かつ、mRNA、cRNA、組換えもしくは合成RNAおよびDNA、ならびにcDNAを含むことができる。本発明の核酸は、典型的にはDNA分子であり、通常は二本鎖DNA分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のいずれかを含む一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびハイブリッドDNA/RNA核酸、またはそれらの組み合わせも提供される。
【０１６８】
また、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質を発現するように細胞を改変する際に有用である発現ベクターが本明細書において提供される。本明細書において提供される免疫調節ポリペプチドを、組換えDNA技術を使用して細胞内に導入することができる。そのために、膜貫通型免疫調節ポリペプチドをコードする組換えDNA分子が調製される。このようなDNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例として、該ペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してDNAから切除することもできる。あるいは、ホスホロアミダイト法のような化学合成技術を使用してDNA分子を合成することもできる。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。いくつかの例では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通して組換えまたは合成核酸を生成してもよい。
【０１６９】
いくつかの態様において、任意の細胞内ドメイン（すなわち、細胞質ドメイン）、膜貫通アンカードメイン、任意のスペーサードメイン、任意のエピトープタグ、および最後に1つまたは複数の細胞外親和性改変IgSFドメインを含む、完全長DNAインサートを生成することができる。このDNAインサートを、当業者に公知であるとおり、適切なT細胞形質導入/トランスフェクションベクター内にクローニングすることができる。また、該核酸分子を含有するベクターが提供される。
【０１７０】
いくつかの態様において、発現ベクターは、タンパク質の発現に適する条件下にて、適切な細胞内で膜貫通型免疫調節タンパク質を発現させることができる。いくつかの局面において、発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結されている膜貫通型免疫調節タンパク質をコードするDNA分子を含む。DNA分子がベクターに挿入される前後のいずれかにこの機能的連結を行う方法が周知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。いくつかの態様において、本発明の核酸は、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸に機能的に連結されている分泌またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１７１】
いくつかの態様において、DNA分子を有する得られた発現ベクターを使用して、適切な細胞を形質転換、例えば形質導入する。当技術分野において周知の方法を使用して導入を実施することができる。例示的な方法は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、および電気穿孔法を介することを含む、受容体をコードする核酸の移送のための方法を含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入法によって細胞に移送される。
【０１７２】
E. 例示的な膜貫通型免疫調節タンパク質およびそれらをコードする核酸分子
SEQ ID NO：393〜419のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、記載のとおりの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインおよび膜貫通ドメインを含有する、上記に従う膜貫通型免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、記載のとおりの細胞質ドメインをさらに含むことができる。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含有することができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーの天然シグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと）。
【０１７３】
また、SEQ ID NO：393〜419のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、記載のとおりの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメイン、膜貫通ドメインおよび任意で細胞質ドメインを含有する、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドの配列をさらに含むことができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーの天然シグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと）。
【０１７４】
例示的な膜貫通型免疫調節タンパク質は、i）SEQ ID NO：381に示されるアミノ酸配列またはii）SEQ ID NO：381に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、SEQ ID NO：381の親和性改変ドメインを含む、CD80 TIPである。また、i）SEQ ID NO：382に示されるヌクレオチドの配列、ii）SEQ ID NO：381に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を示しかつSEQ ID NO：381の親和性改変ドメインを含むTIPをコードする配列、またはiii）縮重コドンを有するi）もしくはii）の配列が提供される。
【０１７５】
例示的な膜貫通型免疫調節タンパク質は、i）SEQ ID NO：383に示されるアミノ酸配列またはii）SEQ ID NO：381に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、SEQ ID NO：383の親和性改変ドメインを含む、ICOSL TIPである。また、i）SEQ ID NO：384に示されるヌクレオチドの配列、ii）SEQ ID NO：384に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示しかつSEQ ID NO：383の親和性改変ドメインを含むTIPをコードする配列、またはiii）縮重コドンを有するi）もしくはii）の配列が提供される。
【０１７６】
III. 改変細胞
提供される膜貫通型免疫調節ポリペプチドのいずれかを表面に発現する改変細胞が本明細書において提供される。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、リンパ球（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）、T細胞もしくはNK細胞）上または骨髄細胞上に発現する。いくつかの態様において、改変細胞は、抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様において、改変細胞は、改変された哺乳動物T細胞または改変された哺乳動物抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様において、改変されたT細胞またはAPCは、ヒトまたはマウスの細胞である。
【０１７７】
いくつかの態様において、改変されたT細胞には、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞（または、細胞傷害性Tリンパ球もしくはCTL）、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、あるいはγδT細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、CD4+またはCD8+である。MHCのシグナルに加えて、改変されたT細胞はまた、いくつかの態様において先に考察したとおりのTIPによって提供される、共刺激シグナルを必要とする。
【０１７８】
いくつかの態様において、改変されたAPCは、例えば、MHC IIを発現するAPC、例えばマクロファージ、B細胞、および樹状細胞、ならびに、細胞および無細胞（例えば、生分解性高分子ミクロ粒子）の両方のaAPCを含む人工のAPC（aAPC）を含む。人工のAPC（aAPC）は、これらが抗原をT細胞に提示するならびにそれらを活性化するという点でAPCと同様に作用することができる、APCの合成バージョンである。抗原提示は、MHC（クラスIまたはクラスII）によって実施される。いくつかの局面において、改変されたAPC、例えばaAPCにおいて、MHC上に負荷される抗原は、いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。MHC上に負荷された抗原は、T細胞のT細胞受容体（TCR）によって認識され、該T細胞は、いくつかの場合では、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節ポリペプチドの親和性改変ドメインによって認識される1つまたは複数の同族結合パートナーまたは他の分子を発現することができる。aAPCを改変するために使用することができる材料には、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、酸化鉄、リポソーム、脂質二重層、セファロース、およびポリスチレンが含まれる。
【０１７９】
いくつかの態様において、本明細書に提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、抗原結合受容体、例えば組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）を発現する細胞内で共発現されるかまたは改変される。いくつかの態様において、改変細胞、例えば改変されたT細胞は、がん、炎症性および自己免疫性障害、またはウイルス感染と関連する所望の抗原を認識する。具体的な態様において、抗原結合受容体は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含有する。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、抗原、例えば腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、scFv）を含有するCAR（キメラ抗原受容体）T細胞である。別の態様において、改変されたT細胞は、組換えTCRまたは改変TCRを含むTCRを保有する。いくつかの態様において、TCRは、天然TCRであることができる。当業者は、一般に、天然の哺乳動物T細胞受容体が抗原特異的認識および結合に関与するαおよびβ鎖（またはγおよびδ鎖）を含むことを認識するだろう。いくつかの態様において、TCRは、改変されている改変TCRである。いくつかの態様において、改変されたT細胞のTCRは、APCによって提示される腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、TIPタンパク質は、改変T細胞受容体細胞またはおよび改変キメラ抗原受容体細胞内で発現される。このような態様において、改変細胞は、TIPおよびCARまたはTCRを共発現する。
【０１８０】
いくつかの態様において、様々な手法（例えば、組換え宿主細胞用に用いられている手法）によって膜貫通型免疫調節ポリペプチドを改変細胞（例えば、改変されたT細胞または改変されたAPC）内に組み込むことができる。DNA構築物を初代T細胞に導入する様々な方法が当技術分野において公知である。いくつかの態様において、ウイルス形質導入またはプラスミド電気穿孔法が用いられる。典型的な態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子または発現ベクターは、発現した膜貫通型免疫調節タンパク質を細胞膜に局在化させるシグナルペプチドを含む。いくつかの態様において、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸は、宿主哺乳動物細胞内での発現を可能にするウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）内にサブクローニングされる。発現ベクターは哺乳動物宿主細胞内に導入されることができ、宿主細胞培養条件下でTIPが発現される。
【０１８１】
例示的な例では、初代T細胞を、エクスビボで精製して（CD4細胞またはCD8細胞または両方）、種々のTCR/CD28アゴニスト、例えば抗CD3/抗CD28をコートしたビーズからなる活性化プロトコルで刺激することができる。2または3日の活性化プロセス後、本発明のTIPを含有するDNAベクターを、当技術分野で標準的なレンチウイルスもしくはレトロウイルス形質導入プロトコルまたはプラスミド電気穿孔法を通して、初代T細胞内に安定的に導入することができる。細胞を、例えば、抗エピトープタグを、または天然親分子および親和性改変バリアントと交差反応する抗体を使用するフローサイトメトリーによって、TIP発現についてモニタリングすることができる。TIPを発現するT細胞を、抗エピトープタグ抗体を用いたソーティングを通して濃縮することも、または用途に応じて高もしくは低発現のために濃縮することもできる。
【０１８２】
TIPが発現すると、改変されたT細胞を、様々な手段によって、改善された機能についてアッセイすることができる。改変されたCARまたはTCRの共発現を検証して、改変されたT細胞のこの部分がTIP構築物の発現による影響をほとんど受けなかったことを示すことができる。検証されたら、標準的なインビトロ細胞傷害性、増殖、またはサイトカインアッセイを使用して、改変細胞の機能を評価することができる。例示的な標準的な評価項目は、腫瘍株の溶解、改変されたT細胞の増殖、または培養上清中のIFNγタンパク質発現の割合（％）である。対照構築物に対して統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、改変されたT細胞の増殖の増加、またはIFNγ発現の増加をもたらす改変された構築物を選択することができる。追加的に、未改変の細胞、例えば天然の初代または内因性T細胞をまた同じインビトロアッセイに組み込んで、改変細胞（例えば、改変されたT細胞）上に発現するTIP構築物の、活性を調節する（いくつかの場合では、バイスタンダー天然T細胞においてエフェクター機能を活性化および生成することを含む）能力を測定することもできる。内因性T細胞上での活性化マーカー（例えば、CD69、CD44、またはCD62L）発現増加をモニタリングすることもでき、増殖および／またはサイトカイン産生の増加が、改変されたT細胞上に発現するTIPの所望の活性を示し得る。
【０１８３】
いくつかの態様において、同様のアッセイを使用して、CARまたはTCR単独を含有する改変されたT細胞の機能を、CARまたはTCRおよびTIP構築物を含有するものと比較することができる。典型的には、これらのインビトロアッセイは、種々の比率の改変されたT細胞と、同族CARまたはTCR抗原を含有する「腫瘍」細胞株とを共に培養液中に播種することによって実施される。標準的な評価項目は、腫瘍株の溶解、改変されたT細胞の増殖、または培養上清中のIFNγ産生の割合（％）である。同じTCRまたはCAR構築物単独よりも統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、改変されたT細胞の増殖の増加、またはIFNγ産生の増加をもたらした改変されたTIP構築物を選択することができる。改変されたヒトT細胞を、マウスT、NKおよびB細胞を欠いているNSG系統のような免疫不全マウスで分析することができる。CARまたはTCRが異種移植片上の標的カウンター構造体に結合し、かつTIPの親和性改変IgSFドメインと共発現される改変されたヒトT細胞を、異種移植片と比較して異なる細胞数および比率にてインビボで養子移入することができる。例えば、ルシフェラーゼ/GFPベクターを含有するCD19+白血病腫瘍株の生着を、生物発光を通してまたはエクスビボでフローサイトメトリーによってモニタリングすることができる。ある共通の態様において、異種移植片がマウスモデルに導入された後、数日後に改変されたT細胞が導入される。TIPを含有する改変されたT細胞を、CARまたはTCR単独を含有する改変されたT細胞と比較して増加した生存、腫瘍クリアランス、または増殖した改変T細胞の数についてアッセイすることができる。インビトロアッセイと同様に、内因性の天然（すなわち、改変されていない）ヒトT細胞を共養子移入して、より良好な生存または腫瘍クリアランスをもたらす、その集団内に広がる上首尾なエピトープを探すこともできる。
【０１８４】
例示的な機能活性および特徴
いくつかの局面において、TIP改変細胞、例えば改変されたリンパ球（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球、T細胞またはNK細胞）または骨髄細胞（例えば、抗原提示細胞）は、1つまたは複数の望ましい特徴または活性を示す。
【０１８５】
いくつかの態様において、TIPのエクトドメイン上に局在する親和性改変IgSFドメインは、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つのカウンター構造体に特異的に結合する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、自家のまたは同種のマウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。いくつかの局面において、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、またはT細胞としてこのような態様を含むことができる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの腫瘍細胞である。TIPは、1つまたは複数（例えば、2、3、または4つ）の親和性改変IgSFドメインを含むことができる。したがって、いくつかの態様において、TIPは、哺乳動物細胞上の1種のみのカウンター構造体に結合する。いくつかの態様において、TIPの親和性改変IgSFドメインは、哺乳動物細胞上の1種のみのカウンター構造体に特異的に結合する。あるいは、いくつかの態様において、TIPは、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも2つ、3つ、もしくは4つ、または厳密に2つ、3つ、もしくは4つのカウンター構造体に特異的に結合する。いくつかの態様において、TIPは、1種のみの細胞表面カウンター構造体に特異的に結合する。TIPの親和性改変IgSFドメインの哺乳動物細胞上のカウンター構造体への特異的結合は、哺乳動物細胞の免疫活性を調節する。親和性改変IgSFドメインと哺乳動物細胞カウンター構造体とによるそれらの間の特異的結合は、シス配置での特異的結合（すなわち、同じ細胞上での特異的結合）もしくはトランス配置での特異的結合（すなわち、異なる細胞上での特異的結合）、またはシスおよびトランスの両配置での特異的結合であり得る。該細胞の免疫活性は、例えば、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性の増強から明らかなように、増強され得る。代わりの態様において、該細胞の免疫活性は、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性の低下から明らかなように、減弱する。
【０１８６】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質内に存在する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、免疫活性の調節が望まれる哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つの細胞表面カウンター構造体に特異的に結合する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインが特異的に結合するカウンター構造体は、親和性が改変されている野生型IgSFファミリーメンバーまたは野生型IgSFドメインの天然カウンター構造体である。いくつかの態様において、特異的結合は、親和性改変IgSFドメインが改善された結合を示す同族結合パートナーを発現する哺乳動物細胞の活性を増強および／または減弱させる。したがって、提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、特異的結合親和性を向上させることによって、哺乳動物細胞の免疫活性を増強または減弱させることができる。いくつかの態様において、特異的結合は、膜貫通型免疫調節タンパク質を有する改変細胞の免疫活性を調節する、例えば増強する。
【０１８７】
いくつかの態様において、哺乳動物細胞上に発現するカウンター構造体は、哺乳動物IgSFメンバーである。哺乳動物細胞は、いくつかの態様において、抗原提示細胞（APC）、リンパ球、または腫瘍細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）、改変されたもしくは天然のT細胞、または改変されたもしくは天然のNK細胞である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインのカウンター構造体は、天然ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、カウンター構造体は、表1に示されている「細胞表面同族結合パートナー」である。
【０１８８】
いくつかの態様において、親和性改変IgSFを含むTIPは、免疫細胞（例えばリンパ球、例えばT細胞）上に発現するとき、第二の免疫細胞（例えばリンパ球、例えばT細胞）上に発現する少なくとも1つのカウンター構造体に特異的に結合することができる。第二の免疫細胞（例えば第二のT細胞）上のカウンター構造体は、阻害性カウンター構造体または刺激性カウンター構造体であることができる。例示的なカウンター構造体には、細胞表面受容体またはリガンドが含まれる。阻害性受容体/リガンドの例には、PD-1/PD-L1、PD-L2、CTLA-4/B7-1/B7-2、BTLA/HVEM、LAG3/MHCクラスII、TIGIT/PVR、およびTIM-3/CEACAM-1/GAL9が含まれる。刺激性受容体/リガンドの例には、CD28/B7-1/B7-2、ICOS/ICOSL、およびCD226/PVRが含まれる。
【０１８９】
いくつかの態様において、TIPは、それが特異的に結合するカウンター構造体を発現する哺乳動物細胞に対してトランス配置にあるリンパ球またはNK細胞上で発現する。代わりの態様において、それは、シス配置である。いくつかの態様において、TIPは、シスおよびトランス配置にあるカウンター構造体に特異的に結合する。特定の態様において、TIPは、T細胞上に発現し、かつ、T細胞上に発現するカウンター構造体に特異的に結合する親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において 第一および第二のT細胞は、別個のT細胞であり、この態様において、TIPおよびカウンター構造体は、互いにトランスである。いくつかの態様において、TIPおよびカウンター構造体は、同じT細胞上に発現し、互いにシスである。いくつかの態様において、TIPおよびそれが特異的に結合するカウンター構造体は、シスおよびトランスの両方であることができる。いくつかの態様において、T細胞の少なくとも1つは、天然のT細胞または改変されたT細胞である。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞またはT細胞受容体（TCR）改変T細胞である。
【０１９０】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、受容体シグナル伝達の増強を刺激する、細胞表面受容体に対する向上した親和性を有する親和性改変IgSFドメインを含む。受容体シグナル伝達の増強を刺激することは、いくつかの態様において、例えば受容体がその効果を媒介するよう作用する刺激性受容体である場合、その細胞の免疫活性を増強させることができる。いくつかの場合では、受容体シグナル伝達が刺激される細胞の炎症性活性は、増強する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、刺激性受容体の活性を増強する。そのような例では、膜貫通型免疫調節タンパク質のIgSFドメインの親和性を改変して哺乳動物細胞上の天然カウンター構造体（いくつかの場合では、刺激性受容体である）への特異的結合親和性を向上させるようにすることができる。いくつかの態様において、刺激性受容体は、T細胞上に発現する。ある態様において、TIPの親和性改変IgSFドメイン（例えば、TIP改変細胞（例えば、第一のT細胞）によって発現される）は、T細胞（例えば、第二のT細胞）上に発現する刺激性カウンター構造体に、（対照としての親和性が改変されていないIgSFドメインと比較して）向上した親和性で特異的に結合する。ある態様において、TIPの親和性改変IgSFドメインは、T細胞（例えば、第二のT細胞）上に発現する刺激性カウンター構造体に特異的に結合し、かつ、T細胞の免疫調節活性を増強させる。いくつかの態様において、TIPの親和性改変IgSFドメインは、T細胞（例えば、第二のT細胞）上の刺激性カウンター構造体に向上した親和性で結合し、かつT細胞の免疫調節活性を増強させる。
【０１９１】
いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226であり、膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含有する膜貫通型タンパク質と比較して、CD28、ICOS、またはCD226の1つに対する向上した結合親和性を示す親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインを含有するものである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、B7-1（CD80）の親和性改変ドメインである。いくつかの態様において、本発明のTIPの親和性改変CD80（B7-1）IgSFドメインは、第一のT細胞上に発現し、かつ、第二のT細胞上の刺激性カウンター構造体CD28に向上した親和性で結合するように親和性が改変されている。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、ICOSLの親和性改変ドメインである。具体的な態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変ICOSL（誘導性共刺激因子リガンド）ドメインであり、刺激性カウンター構造体は、ICOS（誘導性共刺激因子）またはCD28の少なくとも1つである。いくつかの態様において、ICOSLドメインは、ICOSおよびCD28の両方に特異的に結合するように親和性が改変される。いくつかの態様において、ICOSLは、ICOSまたはCD28の両方ではなくいずれかに特異的に結合するように親和性が改変される。いくつかの態様において、ICOSまたはCD28の一方に対する結合親和性は向上するが、他方に対する結合親和性は減弱する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変CD155である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変CD112である。
【０１９２】
本発明のいくつかの方法において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、阻害性受容体の活性を減弱させる。いくつかの場合では、同族細胞表面分子への膜貫通型免疫調節タンパク質の向上した結合親和性は、哺乳動物細胞上の天然カウンター構造体間の特異的結合の阻害をもたらす。その天然カウンター構造体に対するより大きな親和性（天然IgSFメンバーの競合親和性と比較して）は、そのカウンター構造体への天然分子の特異的結合親和性を減弱させる。当業者は、阻害性受容体シグナル伝達と拮抗することは、いくつかの態様において、例えば受容体がその細胞効果を引き起こすのに役立つ阻害性受容体である場合、その細胞の免疫活性を減弱させることができることを認識するだろう。
【０１９３】
したがって、いくつかの態様において、TIPを使用して、TIPを発現する細胞（シス細胞）の阻害を減弱させながら、TIPを発現しない細胞（すなわち、トランス細胞）を刺激することができる。例えば、いくつかの態様において、TIPは、少なくとも2種の細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性をもたらす、少なくとも1つの親和性改変ドメイン、およびいくつかの場合では、少なくとも2つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、第一の同族結合パートナーは、刺激性受容体であり、第二の細胞表面同族結合パートナーは、阻害性受容体の阻害性リガンドである。いくつかの態様において、阻害性リガンドへの親和性改変ドメインの結合は、阻害性受容体への阻害性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、刺激性受容体および阻害性受容体は、独立して、免疫細胞上、例えばT細胞または抗原提示細胞上に発現することができる。いくつかの態様において、刺激性受容体は、リンパ球（例えばT細胞）上に発現する。いくつかの態様において、阻害性受容体は、TIP改変細胞（例えば、改変T細胞）上に発現する。いくつかの態様において、阻害性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、もしくはTIM-3であり、かつ／または、阻害性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、もしくはGAL9である（例えば、表1を参照のこと）。いくつかの態様において、阻害性カウンター構造体（すなわち、阻害性リガンドおよび阻害性受容体）は、PD-L1またはPD-1である。
【０１９４】
いくつかの態様において、TIPを使用して、TIPを発現する細胞、例えばTIPを発現するT細胞の阻害を減弱させることができる。例えば、T細胞（例えば、第一のT細胞）上に発現するTIPは、第二のT細胞上のカウンター構造体と第一のT細胞上に発現する阻害性カウンター構造体（すなわち、阻害性受容体）との間の特異的結合を阻害する親和性改変IgSFドメインを含むことができる。いくつかの場合では、この態様を独立して使用することも、または、本発明の親和性改変IgSFドメインが第一のT細胞上に発現し、これが第二のT細胞上に発現する少なくとも1つの刺激性カウンター構造体に特異的に結合し、かつ第二のT細胞における免疫活性を増強させる態様と組み合わせて使用することもできる。この機序によって、増強された免疫調節応答が、第一のT細胞上に発現するTIPの第二の細胞上の刺激性カウンター構造体への特異的結合によって、第二のT細胞において生成され；かつ、第二のT細胞は、第二のT細胞上のカウンター構造体と第一のT細胞上に発現する阻害性カウンター構造体とによるそれらの間の特異的結合を阻害する第一のT細胞上に発現する親和性改変IgSFドメインの特異的結合によって、第一のT細胞の免疫調節活性を減弱させることを阻害される。この態様および先行の態様において使用されるT細胞は、概してマウスまたはヒトのT細胞であるが、他の哺乳動物T細胞を採用することができる。多くの場合、細胞傷害性T細胞（CTL）が使用される。
【０１９５】
先に述べたとおり、いくつかの態様において、本発明のTIPは、第一のT細胞上に発現し；かつ、第二のT細胞上の天然カウンター構造体（例えば、阻害性リガンド）と第一のT細胞上のその阻害性天然カウンター構造体（例えば、阻害性受容体）との間の特異的結合を阻害しながらも第二のT細胞上の刺激性カウンター構造体（例えば、刺激性受容体）に特異的に結合する親和性改変IgSFドメインを含む。親和性改変IgSFドメインと2つの天然カウンター構造体のうちの少なくとも1つとの、それらの相互の結合が干渉するような競合的結合によって、第二のT細胞上のカウンター構造体と第一のT細胞上のカウンター構造体との間の特異的結合の阻害を達成することができる。典型的には、IgSFドメインは、そのカウンター構造体に対して、天然カウンター構造体が互いに有するよりも高い結合親和性を有するように親和性が改変される。この設計のいくつかの態様において、TIPは、阻害性カウンター構造体および刺激性カウンター構造体の両方に結合する親和性改変IgSFドメインを含むことができる。したがって、この態様において、親和性改変IgSFは、二重結合能を有する。いくつかの態様において、TIPは、第一のT細胞上のカウンター構造体に結合する第一の親和性改変IgSFドメインと、第一および第二のT細胞上のカウンター構造体によるそれらの間の特異的結合を阻害する第二の親和性改変IgSFドメインとを含む。
【０１９６】
なお別の態様において、第一のT細胞上の刺激性カウンター構造体に結合する親和性改変IgSFドメインは、第一のTIP上にあり、かつ、第一および第二のT細胞上のカウンター構造体によるそれらの間の特異的結合を阻害する親和性改変IgSFドメインは、第二のTIP上にある。この態様において、第一および第二のTIPは、異なるポリペプチド鎖である。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは、同一の親和性改変IgSFドメインである。例えば、ある具体的な態様において、ICOSL（誘導性共刺激因子リガンド）のIgSFドメイン（例えば、親和性改変IgVドメイン）は、ICOSおよびCD28の両方に対して向上した親和性で特異的に結合するように親和性が改変される。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28の両方に対する向上した親和性を有するか、またはICOSおよびCD28の一方もしくは両方への低下した親和性を有する、ICOSLの親和性改変IgSFドメイン（例えば、親和性改変IgVドメイン）である。
【０１９７】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、天然カウンター構造体によるそれらの間の特異的結合の阻害をもたらす。いくつかの態様において、これは、一方または両方の天然カウンター構造体に対してより大きな親和性を有する親和性改変IgSFドメインによって達成することができ、それによりこれらのカウンター構造体によるそれらの間の特異的結合を競合的に阻害する。
【０１９８】
いくつかの態様において、TIPは、CD226に対する向上した親和性およびTIGIT（IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する減弱された親和性を有するCD155の親和性改変IgSFドメインである、親和性改変IgSFドメインを含む。
【０１９９】
いくつかの態様において、（例えば、第一のT細胞上に発現する）TIPは、向上した親和性で（例えば、第二のT細胞上の）刺激性カウンター構造体CD28に結合するように親和性が改変された、親和性改変CD80（B7-1）IgSFドメインを含む。追加的に、この態様において、親和性改変CD80（B7-1）ドメインは、向上した親和性で（例えば、第二のT細胞上に発現する）PD-L1に結合して、（例えば、第一のT細胞上に発現する）そのPD-1カウンター構造体への特異的結合を阻害することができる。先行態様のいずれかのなおさらなる追加において、親和性改変CD80（B7-1）ドメインは、該ドメインがCTLA-4に実質的に特異的に結合しないかまたは減弱された親和性で結合し、それ故、該ドメインの刺激性カウンター構造体CD28への特異的結合がCTLA-4によって有意に阻害されることがないように、親和性が改変されていてもよい。
【０２００】
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）を、天然カウンター構造体（そのうちの少なくとも1つには、IgSFファミリーメンバーが含まれる）によるそれらの間の特異的結合を阻害するデコイカウンター構造体として使用することができる。いくつかの場合では、親和性改変IgSFドメインを含むTIPと天然カウンター構造体の一方との特異的結合は、天然カウンター構造体（例えば、天然の受容体とリガンドとの対）によるそれらの間の相互の特異的結合を阻害する。したがって、いくつかの態様において、TIPは、競合的または非競合的な結合によって特異的結合を減弱させることができる。いくつかの態様において、天然カウンター構造体は、刺激性受容体または阻害性受容体であることができる細胞表面受容体である。TIPの親和性改変IgSFドメインの特異的結合がT細胞の免疫活性を増強または減弱させる態様は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２０１】
いくつかの態様において、天然カウンター構造体は、その天然カウンター構造体と特異的に結合するときに免疫活性を減弱させるように作用する、阻害性カウンター構造体である。例えば、抗原提示細胞（APC）または哺乳動物腫瘍細胞上に発現する天然の細胞表面カウンター構造体は、NK細胞またはリンパ球（例えばT細胞）上の天然の阻害性カウンター構造体に特異的に結合することができる。阻害性カウンター構造体への特異的結合は、阻害性カウンター構造体を発現するNK細胞またはリンパ球の免疫調節活性を減弱させるように作用する。
【０２０２】
いくつかの態様において、阻害性カウンター構造体は、阻害性受容体である。いくつかの態様において、阻害性カウンター構造体は、ITIM（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）を含有する阻害性カウンター構造体である。ITIMモチーフは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞内ドメイン内に見いだされる（Cell Signal, 16 (4）: 435-456, 2004）。いくつかの態様において、親和性改変ドメインは、天然結合パートナーに対する野生型阻害性受容体よりもその天然結合パートナーに対するTIPの親和性改変ドメインの親和性が結果としてより大きくなる、野生型阻害性受容体の親和性が改変された形態である。したがって、これらの態様において、TIPは、その天然IgSFドメインカウンター構造体へのTIPの親和性改変IgSFドメインの特異的結合（例えばITIMを含有する阻害性受容体へのTIPの親和性改変IgSFドメインの特異的結合）によって、ITIMモチーフ受容体の阻害性応答を減弱させることができる。一例として、ITIMを含有するカウンター構造体は、PD-1である。典型的には、PD-1は、阻害性リガンドPD-1に特異的に結合する阻害性受容体である。PD-1へのPD-L1の特異的結合によって、PD-1は、ITIMドメインからのシグナル伝達を介してT細胞活性化を阻害するのに関与する。
【０２０３】
いくつかの態様において、阻害性受容体カウンター構造体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAである。いくつかの態様において、TIPは、野生型阻害性受容体よりも大きな親和性で阻害性受容体の天然阻害性リガンドに結合する、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAの親和性改変IgSFドメインである、親和性改変ドメインを、含有する（例示的な阻害性受容体のリガンド結合パートナーについて表1を参照のこと）。いくつかの態様において、TIPは、野生型PD-1よりも大きな親和性でPD-L1に結合する、PD-1の親和性改変IgSFドメインを含むことができる。競合的または非競合的な結合によって特異的結合を達成することができ、これは本発明の具体的な態様である。親和性改変IgSFドメインとカウンター構造体（すなわち、阻害性受容体、例えばPD-1）とによるそれらの間の競合的な結合は、その天然リガンドカウンター構造体（例えば、PD-L1）へのその結合を阻害する。いくつかの態様において、この態様のTIPは、野生型阻害性受容体のシグナル伝達機序を実質的に欠いており、それゆえ、それ自体が阻害性応答を誘導することはない。
【０２０４】
IV. 組成物、方法および治療用途
哺乳動物細胞の免疫活性の調節における使用のために提供される膜貫通型免疫調節タンパク質およびその改変細胞に関する組成物および方法が本明細書において提供される。組成物を、関連する方法、例えば、免疫療法アプローチ（例えば、哺乳動物のがんの治療、または他の態様においては、自己免疫性障害の治療のための）における免疫活性を調節するための関連する方法において使用することができる。採用される方法は概して、本発明のTIPと哺乳動物細胞とを、親和性改変IgSFドメインの特異的結合および哺乳動物細胞の免疫活性の調節を許容する条件下で接触させる方法を含む。当該方法を、エクスビボまたはインビボで採用することができる。いくつかの態様において、免疫活性を調節する方法は、TIPを発現するよう改変されたリンパ球（例えば、T細胞またはTIL）またはNK細胞上での本発明のTIPの発現によって達成される。TIPを発現する細胞は、哺乳動物細胞（例えば、APC、第二のリンパ球、または腫瘍細胞）における免疫活性を調節できるように、親和性改変IgSFドメインの当該哺乳動物細胞上のカウンター構造体への特異的結合を許容する条件下で、当該哺乳動物細胞と接触させられる。いくつかの態様において、当該方法は、TIPを発現する細胞（例えば、T細胞）が患者に注入して戻される養子細胞移入によって実行される。
【０２０５】
提供される膜貫通型免疫調節タンパク質を含有する治療量の細胞組成物を疾患または障害を有する対象に投与する方法が本明細書において提供される。本明細書に記載される薬学的組成物を、様々な治療用途、例えば疾患の治療において使用することができる。例えば、いくつかの態様において、薬学的組成物は、哺乳動物における炎症性もしくは自己免疫性障害、がん、臓器移植、ウイルス感染、および／または細菌感染を治療するために使用される。薬学的組成物は、免疫応答を調節して疾患を治療することができる。例えば、いくつかの態様において、薬学的組成物は免疫応答を刺激し、これは、例えば、がん、ウイルス感染、または細菌感染の治療において有用であり得る。いくつかの態様において、薬学的組成物は免疫応答を抑制し、これは、炎症性もしくは自己免疫性障害、または臓器移植の治療において有用であり得る。
【０２０６】
提供される方法は、例えば、免疫系および免疫系の応答の調節または制御が有益である哺乳動物における様々な免疫系の疾患または病態を治療するための予防的または治療的方法を非限定的に含む、様々な用途に有用性を有すると考えられる。例えば、免疫応答を抑制することは、ドナー由来の組織、細胞、または臓器移植のレシピエントによる拒絶反応を阻止するための予防的および／または治療的方法において有益であり得る。治療的状況においては、哺乳動物対象は、典型的には、免疫系の疾患または病態を有するものであり、投与は、疾患または病態のさらなる進行を防止するために実行される。
【０２０７】
本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する細胞組成物および関連する方法を、免疫療法用途において使用することができる。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）発現用の改変細胞は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）から単離される細胞である。いくつかの態様において、TIP発現用の宿主細胞として役立つ哺乳動物細胞は、リンパ球、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはT細胞（例えば、CD8+細胞傷害性Tリンパ球もしくはCD4+ヘルパーTリンパ球）である。いくつかの態様において、細胞は、自家の細胞である。提供される方法の局面において、改変細胞は、概して生理的条件下で、免疫活性の調節が望まれる哺乳動物細胞と接触させられる。例えば、哺乳動物細胞は、マウスまたはヒトの細胞、例えば抗原提示細胞または腫瘍細胞であることができる。いくつかの態様において、改変細胞は、自家の細胞である。他の態様において、細胞は、同種である。細胞を、インビボまたはエクスビボで接触させることができる。いくつかの態様において、改変細胞は、例えば注入によって、対象に投与される。したがって、組成物および方法を、養子細胞移入免疫療法において使用することができる。
【０２０８】
いくつかの態様において、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質による免疫活性の調節に感受性であるがんの進行を阻害、停止、または反転させるために、有効量の薬学的組成物が投与される。いくつかの態様において、本発明の方法は、リンパ腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、子宮頚癌、神経芽細胞腫、または多発性骨髄腫などのがんの哺乳動物患者の治療において使用される。本発明の方法によって治療できる他のがんには、黒色腫、膀胱癌、血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、肝臓癌、脳腫瘍、腎臓癌、乳癌、膵臓癌（腺癌）、大腸癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、脾臓癌、胸腺のがんもしくは血液細胞のがん（すなわち、白血病）、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、またはユーイング肉腫が非限定的に含まれる。
【０２０９】
ヒトがん細胞を、インビボ、またはエクスビボで処置することができる。ヒト患者のエクスビボ処置では、がん細胞を含有する組織または流体を体外で処置し、次いで、その組織または流体を患者に再導入して戻す。いくつかの態様において、がんは、治療用組成物の患者への投与によって、ヒト患者においてインビボ処置される。したがって、本発明は、腫瘍の進行を阻害、停止もしくは反転させる、またはそうでなければ、対照での処置と比較して、無増悪生存期間（すなわち、がんが悪化せずに患者が生存している処置中および処置後の時間の長さ）、または全生存期間（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、試験群または処置群における、がんと診断された後またはがんを処置された後に一定期間生存している人の割合）の統計的に有意な増加をもたらす、エクスビボおよびインビボ法を提供する。
【０２１０】
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物をまた、単剤療法として（すなわち、単一の薬剤として）、少なくとも1つの化学療法剤との組み合わせ（すなわち、組み合わせ療法）で、がんワクチンとの組み合わせで、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで、および／または放射線療法との組み合わせで使用して、哺乳動物（特にヒト）のがん細胞の成長を阻害することもできる。本開示のいくつかの局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどである。
【０２１１】
いくつかの態様において、提供される組成物は、例えば、阻害性リガンドの親和性改変IgSFドメインを膜貫通型免疫調節タンパク質が含む場合、免疫応答を減弱させることができる。いくつかの態様において、組成物を使用して、自己免疫性疾患を治療することができる。いくつかの態様において、免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患）を患っている対象に本発明の治療用組成物を投与することにより、当該免疫系の攻撃またはそれと関連する生物学的応答の抑制または阻害をもたらすことができる。健康な体組織に対するこの免疫系の攻撃を抑制することによって、健康な体組織に対するこのような攻撃に起因するかまたはそれに伴う結果として生じる身体的症状（例えば、疼痛、関節の炎症、関節の腫脹または圧痛）を減少させるまたは軽減することができ、免疫系の攻撃から生じるかまたはそれと関連する生物学的および身体的損傷を減少、遅延、または停止させることができる。予防に係る文脈においては、対象は、免疫系の疾患、障害または病態を有するもの、それに罹り易いもの、またはそれを呈すると考えられるものであり得、投与は、典型的には、疾患、障害もしくは病態の進行を防止する、それと関連する症状、徴候、もしくは生物学的応答を阻害もしくは軽減する、そこから潜在的に生じる肉体的損傷を防止する、および／または対象の身体機能を維持もしくは改善するために実行される。
【０２１２】
いくつかの態様において、TIPで改変された細胞を含む薬学的組成物を使用して、対象における1つまたは複数の他の免疫疾患または障害を治療することができる。患者の免疫系の疾患または障害は、例えば、限定されるものではないが、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ANCA）-関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、自己免疫性疾患（例えば、ループス、RA、MS、グレーブス病など）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、ベルガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病/シリアック病、慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経根障害（Chronic Inflammatory Demyelinating, Polyradicalneuropathy）（CIPD）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（CSS）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（CAD）、COPD、CREST症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎（Dermatitis, Herpetiformus）、皮膚筋炎、糖尿病、円板状ループス、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、眼球突出（Exopthalmos）、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、移植関連疾患または障害、グレーブス病、GVHD、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenia Purpura）（ITP）、IgA腎症、免疫増殖性疾患または障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（IBD）、インスリン依存性糖尿病（IDDM）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（JIA）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Lymphoscytic Lypophisitis）、メニエール病、ミラーフィッシャー症候群（Miller Fish Syndrome）/急性散在性脳脊髄神経根障害（acute disseminated encephalomyeloradiculopathy）、混合性結合組織病、多発性硬化症（MS）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ME）、重症筋無力症、眼炎症、落葉性天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ウィテカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植拒絶反応（腎臓、心臓、肝臓、肺など）、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（SLE）、全身性強皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症であっても、それらを含んでもよい。ドナー組織、細胞、移植片、もしくは臓器移植のレシピエント対象による拒絶反応と関連する免疫応答の防止または抑制も挙げられる。移植片関連疾患または障害には、移植片対宿主病（GVDH）（例えば、骨髄移植と関連する）、および、例えば、皮膚、筋肉、神経細胞、膵島、臓器の���植片、肝臓の実質細胞などを含む、臓器、組織、もしくは細胞移植片移植（例えば、組織または細胞の同種移植片または異種移植片）の拒絶反応に起因するかまたはそれに伴う結果として生じる免疫障害が含まれる。レシピエント対象におけるドナー組織、細胞、移植片または固形臓器移植に関して、本明細書に開示される本発明の治療用組成物は、レシピエントにおけるこのような移植の急性拒絶反応を防止する際におよび／またはレシピエントにおけるこのような移植の拒絶反応を防止するための長期維持療法に効果的であり得ると考えられる（例えば、糖尿病を患っている対象レシピエントにおけるドナーからのインスリン産生膵島細胞移植の拒絶反応の阻害）。
【０２１３】
いくつかの態様において、治療量の薬学的組成物が投与される。典型的には、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、および状態の個々の違いを考慮して医師が決定することができる。概して、本明細書に記載の改変細胞（例えばT細胞）を含む薬学的組成物を、104〜109個の細胞/kg（体重）、例えば105〜106個の細胞/kg（体重）の投与量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与可能と規定することができる。また、改変細胞組成物（例えばT細胞組成物）をこれらの投与量で複数回投与してもよい。該細胞を、免疫療法において通常知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 を参照のこと）。特定の患者に対する最適な投与量および処置レジメンは、医学分野の当業者が、患者の疾患の兆候をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって、容易に決定することができる。
【０２１４】
対象の組成物の投与を、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプランテーションまたは移植によることを含む任意の簡便な手法で行ってもよい。本明細書に記載される組成物を、皮下、皮内、腫瘍内、結節内（intranodally）、骨髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射によって、または腹腔内で患者に投与してもよい。一態様において、治療用組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の態様において、治療用組成物は、i.v.注射によって投与される。いくつかの場合では、該細胞組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
【０２１５】
医薬製剤
膜貫通型免疫調節タンパク質を含む薬学的組成物（このような膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞を含む）が提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物および製剤は、1つまたは複数の任意の薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。
【０２１６】
このような組成物は、緩衝液、例えば中性の緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；糖質、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオン；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含んでもよい。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
【０２１７】
本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）される疾患に適した手法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度のような要因によって決定されるが、適切な投与量を臨床試験によって決定してもよい。
【０２１８】
このような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であってもよい。薬学的に許容し得る担体は、1つの組織、臓器、または身体の一部から、別の組織、臓器、または身体の一部への関心対象の細胞の運搬または輸送に関与する薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクルであってもよい。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは封入材料、またはそれらのいくつかの組み合わせであってもよい。担体の各成分は、製剤のその他の有効成分と適合可能でなければならないという点で「薬学的に許容し得る」でなければならない。それはまた、その治療的恩恵を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクを有するべきではないという意味で、直面し得る任意の組織、臓器、または身体の一部との接触に好適でなければならない。
【０２１９】
治療的に採用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景および目的に依存するだろう。したがって、当業者は、治療のための適切な投与量レベルが送達される分子、結合剤分子が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および状態（年齢および総体的な健康）に部分的に依存するだろうことを認識するだろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を設定し、かつ、投与経路を変更してもよい。本発明の薬学的組成物は、非経口、皮下、もしくは静脈内に、または本明細書の他の箇所に記載のとおり投与することができる。本発明の薬学的組成物は、治療有効量で、1ヶ月に1、2、3もしくは4回、1週間に2回、隔週（2週間毎）、または隔月（2ヶ月毎）投与してもよい。投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月またはそれ以上の期間（例えば、1、2、3、4年またはそれ以上、対象の一生にわたる期間を含む）にわたり続けてもよい。
【０２２０】
任意の組成物について、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかで治療有効用量を推定することができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。正確な投与量は、処置（治療）を必要とする対象に関連する要因に照らして決定されるだろう。投与量および投与は、細胞組成物の十分なレベルを提供するようにまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の総体的な健康、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物併用、反応感度、ならびに治療への応答を含む。適切な用量-応答データの使用によって適切な投与量を突き止めてもよい。T細胞活性化もしくは増殖、サイトカイン合成もしくは産生（例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2の産生）、種々の活性化マーカー（例えば、CD25、IL-2受容体）の誘導、炎症、関節の腫脹もしくは圧痛、C-反応性タンパク質の血清中レベル、抗コラーゲン抗体産生、および／またはT細胞依存性抗体応答を含む、治療効果についての多数のバイオマーカーまたは生理学的マーカーをモニタリングすることができる。
【０２２１】
望ましくない免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を排除、隔離、もしくは不活性化すること；防御免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を誘導、生成、もしくは刺激すること；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変化させること；またはこれらの効果の組み合わせによって、本発明の治療用組成物の投与が免疫活性を十分に調節するかどうかを決定するための様々な手段が公知である。免疫活性の調節の測定例は、免疫細胞集団の有無の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する）；シグナルに応答して増殖もしくは分裂する能力または増殖もしくは分裂への抵抗性を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、T細胞増殖アッセイ、および抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA、ペプチドまたはタンパク質抗原を負荷した抗原提示細胞で刺激した後の3H-チミジン取込に基づいたpepscan分析；B細胞増殖アッセイを使用する）；他の細胞を殺傷または溶解する能力の測定（例えば、細胞傷害性T細胞アッセイ）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および細胞の他の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成または解離の、ウェスタンブロットおよび免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用するDNA転写プロファイリング）； アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダリングを測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質、および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、2次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに自己タンパク質または自己ポリペプチドが関与する自己免疫疾患、神経変性性疾患、および他の疾患の臨床症状または改善のような臨床転帰の、例えば、多発性硬化症の場合には再発率または疾患重症度を測定することによる（当業者に公知の臨床スコアを使用する）、I型糖尿病の場合には血糖を、または関節リウマチの場合には関節の炎症を測定することよる、測定（臨床スコア、追加の治療法を使用する必要性、機能的状態、画像研究）を含むが、それらに限定されない。
【０２２２】
V.例示的態様
提供される態様としては、以下の態様が挙げられる。
【０２２３】
1. (i）野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、少なくとも1つの親和性改変非免疫グロブリンIgSFドメインを含むエクトドメインであって、該少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン；および
(ii）膜貫通ドメイン
を含む、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０２２４】
2. 前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、哺乳動物細胞上に発現する、態様1の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２２５】
3. 前記哺乳動物細胞が、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、またはリンパ球であり、任意でT細胞である、態様2の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２２６】
4. 前記哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、態様1〜3のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２２７】
5. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、参照用の前記野生型IgSFドメインと比較して、前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する、態様1〜4のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２２８】
6. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の前記膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を調節する、態様2〜5のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２２９】
7. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の前記膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を増強させる、態様2〜6のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３０】
8. 前記膜貫通型免疫調節タンパク質の特異的結合が、前記野生型IgSFドメインを含む参照用の膜貫通ドメインと比較して、前記哺乳動物細胞の免疫活性を減弱させる、態様2〜6のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３１】
9. 前記野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質（SIRP）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（TREML）ファミリー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有（VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（PVR）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン（TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、態様1〜8のいずれかの膜貫通型タンパク質。
【０２３２】
10. 前記野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8α、CD8β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、態様1〜9のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３３】
11. 前記野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFメンバーである、態様1〜10のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３４】
12. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、SEQ ID NO：1〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様1〜11のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３５】
13. SEQ ID NO：393〜419のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様1〜12のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３６】
14. 前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、かつ、該刺激性受容体に対する前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインの結合親和性が、前記野生型IgSFドメインの当該親和性と比較して向上している、態様1〜13のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３７】
15. 前記刺激性受容体への前記親和性改変IgSFドメインの結合が、前記T細胞の免疫活性を増強させる、態様14の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３８】
16. 前記刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、態様14または態様15の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２３９】
17. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、B7-1の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、態様14〜16のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４０】
18. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がICOSである、態様14〜16のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４１】
19. 前記親和性改変IgSFドメインが、ICOSLの親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、態様14〜16のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４２】
20. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも一方に対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgSFドメインである、態様14〜16、18および19のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４３】
21. 前記親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28の両方に対する向上した結合親和性を有するICOSLの親和性改変IgV IgSFドメインである、態様14〜16および18〜20のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４４】
22. 前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、前記野生型IgSFドメインと比較してCTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、態様17〜21のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４５】
23. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜22のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４６】
24. 1種のみの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜23のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４７】
25. 前記少なくとも1つの親和性改変ドメインが、少なくとも2種の細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜22のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４８】
26. 第一の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；かつ
第二の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する阻害性受容体の阻害性リガンドである、
態様25の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２４９】
27. 前記阻害性リガンドへの前記親和性改変ドメインの結合が、前記阻害性受容体への該阻害性リガンドの結合を競合的に阻害する、態様26の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５０】
28. 前記阻害性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、もしくはTIM-3であるか；または
該阻害性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、もしくはGAL9である、
態様26または態様27の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５１】
29. 前記親和性改変IgSFドメインが、B7-1の親和性改変ドメインであり、かつ、前記刺激性受容体がCD28である、態様26〜28のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５２】
30. 前記阻害性リガンドがPD-L1であり、かつ、前記阻害性受容体がPD-1である、態様29の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５３】
31. 前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4についての前記野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、態様29または態様30の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５４】
32. 前記親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、態様29〜31のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５５】
33. 前記親和性改変IgSFドメインが、CD155の親和性改変IgSFドメインまたはCD112の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、刺激性受容体がCD226である、態様1〜13のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５６】
34. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインの親和性と比較して、TIGIT（IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する低下した結合親和性を示す、態様33の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５７】
35. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜13のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５８】
36. 前記腫瘍特異的抗原がB7-H6である、態様35の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２５９】
37. 前記親和性改変IgSFドメインが、Nkp30の親和性改変IgSFドメインである、態様35または態様36の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６０】
38. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、第一の親和性改変IgSFドメインであり、かつ、前記エクトドメインが、第二の親和性改変IgSFドメインを含む、態様1〜37のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６１】
39. 前記第一および第二の親和性改変IgSFドメインが異なる、態様38の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６２】
40. 前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインが各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、態様38または態様39の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６３】
41. 前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインが各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様38または態様39の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６４】
42. 細胞内ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、態様1〜41のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６５】
43. 前記細胞内ドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインであるか、またはその機能的に活性な部分である、態様42の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６６】
44. 前記膜貫通型免疫調節タンパク質がキメラ受容体であり、前記細胞内ドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインではない、態様42の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６７】
45. 前記細胞内ドメインが、少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含む、態様42または態様44の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６８】
46. 前記細胞内ドメインが、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む、態様42、44および45のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２６９】
47. 前記細胞内ドメインが、CD28共刺激ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含む、態様45または態様46の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７０】
48. 前記野生型IgSFドメインが、ITIMシグナル伝達ドメインを含む阻害性受容体であるIgSFメンバーに由来する、態様1〜13のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７１】
49. 前記阻害性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAであり、かつ、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、それぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAの、親和性改変IgSFドメインである、態様48の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７２】
50. 前記阻害性受容体がPD-1であり、かつ、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、PD-1の親和性改変IgSFドメインである、態様48または態様49の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７３】
51. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインと比較して、トランスの表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、該向上した結合親和性が、前記阻害性受容体への該トランスの表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する、態様48〜50のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７４】
52. 細胞内ドメイン、ITIM、または細胞質シグナル伝達ドメインを含まない、態様48〜51のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７５】
53. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとは10個以下のアミノ酸置換だけ異なる、態様1〜52のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７６】
54. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとは5個以下のアミノ酸置換だけ異なる、態様1〜53のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７７】
55. 前記親和性改変IgSFドメインが、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインであるか、または親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインもしくは親和性改変IgC2ドメインを含むか、あるいは1つまたは複数のアミノ酸置換を含むそれらの特異的結合断片である、態様1〜54のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７８】
56. 前記エクトドメインが、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、態様1〜55のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２７９】
57. 前記1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する、態様56の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２８０】
58. 前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインである、態様1〜57のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２８１】
59. 前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来する天然膜貫通ドメインではない、態様1〜57のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２８２】
60. 前記膜貫通型タンパク質が、CD8に由来する膜貫通型タンパク質である、態様59の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０２８３】
61. 態様1〜60のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする、組換え核酸。
【０２８４】
62. 態様61の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【０２８５】
63. 態様62の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【０２８６】
64. 態様61の核酸を含む、組換え宿主細胞。
【０２８７】
65. 哺乳動物宿主細胞である、態様63または態様64の組換え宿主細胞。
【０２８８】
66. 哺乳動物宿主細胞がヒト宿主細胞である、態様63〜65いずれかの組換え宿主細胞。
【０２８９】
67. 態様1〜60のいずれかの膜貫通型免疫調節タンパク質を含む、改変細胞。
【０２９０】
68. 免疫細胞である、態様67の改変細胞。
【０２９１】
69. リンパ球である、態様67または態様68の改変細胞。
【０２９２】
70. 前記リンパ球が、T細胞、B細胞またはNK細胞である、態様69の改変細胞。
【０２９３】
71. T細胞である、態様67〜70のいずれかの改変細胞。
【０２９４】
72. 前記T細胞が、CD4+またはCD8+である、態様71の改変細胞。
【０２９５】
73. 抗原提示細胞である、態様67または態様68の改変細胞。
【０２９６】
74. キメラ抗原受容体（CAR）または改変されたT細胞受容体（TCR）をさらに含む、態様67〜73のいずれかの改変細胞。
【０２９７】
75. 態様67〜74のいずれかの細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む、薬学的組成物。
【０２９８】
76. 無菌である、態様75の薬学的組成物。
【０２９９】
77. 態様67〜74のいずれかの細胞または態様75もしくは態様76の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、哺乳動物対象における免疫応答を調節する方法。
【０３００】
78. 前記免疫応答の調節が、前記対象における疾患または障害を治療する、態様76または態様77の方法。
【０３０１】
79. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の増強である、態様77〜78のいずれかの方法。
【０３０２】
80. 前記疾患または障害が腫瘍である、態様78または態様79の方法。
【０３０３】
81. 前記疾患または障害ががんである、態様78〜80のいずれかの方法。
【０３０４】
82. 前記疾患または障害が、黒色腫、肺癌、膀胱癌、または血液悪性腫瘍である、態様78〜81のいずれかの方法。
【０３０５】
83. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の低下である、態様77〜78のいずれかの方法。
【０３０６】
84. 前記疾患または障害が、炎症性の疾患または病態である、態様78または態様83の方法。
【０３０７】
85. 前記疾患または病態が、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬である、態様78、83および84のいずれかの方法。
【０３０８】
86. 前記対象がヒトである、態様77〜85のいずれかの方法。
【０３０９】
87. 前記細胞が、前記対象にとって自家である、態様77〜86のいずれかの方法。
【０３１０】
88. 前記細胞が、前記対象にとって同種である、態様77〜87のいずれかの方法。
【０３１１】
89. 膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）であって、
少なくとも1つの親和性改変非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む、エクトドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含み、該TIPが第一のT細胞上に発現し；該親和性改変IgSFドメインが、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つのカウンター構造体に特異的に結合し；該哺乳動物細胞が、抗原提示細胞（APC）、腫瘍細胞、または第二のT細胞であり；かつ、該親和性改変IgSFドメインの該カウンター構造体への特異的結合が該哺乳動物細胞の免疫活性を調節する、前記TIP。
【０３１２】
90. 前記TIPが第一の親和性改変IgSFドメインを含み、前記哺乳動物細胞上に発現するカウンター構造体が第二のT細胞上に発現する刺激性カウンター構造体であり；かつ
該第一の親和性改変IgSFドメインが該刺激性カウンター構造体に特異的に結合し、かつ、該第二のT細胞の免疫調節活性を増強させる、
態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３１３】
91. 前記第二のT細胞上に発現するカウンター構造体と、前記第一のT細胞上に発現するその阻害性カウンター構造体との特異的結合を競合的に阻害する、該第一のT細胞上に発現する第二の親和性改変IgSFドメインをさらに含む、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３１４】
92. 前記第一の親和性改変IgSFドメインがB7-1の親和性改変ドメインであり、かつ、前記刺激性カウンター構造体がCD28である、態様91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３１５】
93. 前記第二のT細胞上に発現するカウンター構造体がPD-L1であり、かつ、前記第一のT細胞上に発現する阻害性カウンター構造体がPD-1である、態様92の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３１６】
94. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、態様92または93の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３１７】
95. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが親和性が改変されたICOSLドメインであり、かつ、前記刺激性カウンター構造体がICOSである、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３１８】
96. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが親和性が改変されたICOSLドメインであり、かつ、前記刺激性カウンター構造体がCD28である、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３１９】
97. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが、前記刺激性カウンター構造体に対する向上した親和性を有する、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２０】
98. 前記TIPのエクトドメインが、前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインの両方を含む、態様91の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３２１】
99. 前記第一の親和性改変IgSFドメインおよび前記第二の親和性改変IgSFドメインが、同一の親和性改変IgSFドメインである、態様98の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２２】
100. 前記第一および第二のT細胞のうちの少なくとも一方が、天然のT細胞または改変されたT細胞である、態様91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２３】
101. 改変されたT細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）で改変されたT細胞である、態様91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２４】
102. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28の少なくとも一方に対する向上した親和性を有するICOSL（誘導性共刺激因子リガンド）IgV IgSFドメインである、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２５】
103. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28の両方に対する向上した親和性を有するICOSLの親和性改変IgV IgSFドメインである、態様90の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２６】
104. 前記第一の親和性改変IgSFドメインが、CD226に対する向上した親和性およびTIGIT（IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する減弱された親和性を有するCD155 IgSFドメインである、態様91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２７】
105. 前記哺乳動物細胞が自家細胞である、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２８】
106. 前記哺乳動物細胞が同種細胞である、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３２９】
107. 前記哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３０】
108. 細胞内ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３１】
109. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記哺乳動物細胞上の前記カウンター構造体に向上した親和性で特異的に結合する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３２】
110. 前記哺乳動物細胞の免疫活性を増強させる、態様109の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３３】
111. 前記哺乳動物細胞の免疫活性を減弱させる、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３４】
112. 前記親和性改変IgSFドメインが、天然IgSFドメインとは10個以下のアミノ酸置換だけ異なる、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３５】
113. 前記親和性改変IgSFドメインが、天然IgSFドメインとは5個以下のアミノ酸置換だけ異なる、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３６】
114. 前記親和性改変IgSFドメインが、1種のみのカウンター構造体に特異的に結合する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３７】
115. 1種のみの細胞表面カウンター構造体に特異的に結合する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３３８】
116. 前記親和性改変IgSFドメインが、少なくとも2種の細胞表面カウンター構造体に特異的に結合する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３３９】
117. 前記親和性改変IgSFドメインが、親和性が改変されたIgV、IgC1、またはIgC2ドメインである、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４０】
118. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記哺乳動物細胞上に発現する第一のカウンター構造体に対する向上した結合親和性を有し、該向上した結合親和性が、第二のカウンター構造体への該第一のカウンター構造体の結合を競合的に阻害する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４１】
119. 前記第二のカウンター構造体が細胞表面受容体である、態様118の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４２】
120. 前記細胞表面受容体が阻害性受容体である、態様119の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４３】
121. 前記阻害性受容体がPD-1であり、かつ、前記親和性改変IgSFドメインがPD-1 IgSFドメインである、態様120の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４４】
122. 前記第二のカウンター構造体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAである、態様118の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４５】
123. 前記T細胞の免疫活性を増強させる、態様118の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３４６】
124. 前記膜貫通型免疫調節タンパク質がキメラ抗原受容体（CAR）であり、かつ、前記親和性改変IgSFドメインが腫瘍特異的IgSFカウンター構造体に特異的に結合する、態様89の膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）。
【０３４７】
125. 前記CARの細胞内ドメインが、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む、態様124の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４８】
126. 前記CARの細胞内ドメインが、少なくとも1つのCD3 ITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）を含む、態様124の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３４９】
127. 前記CARの細胞内ドメインが、CD28共刺激ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含む、態様125の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３５０】
128. 前記親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原B7-H6に特異的に結合する、態様124の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３５１】
129. SEQ ID NO：1〜26から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様89、90、または91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３５２】
130. SEQ ID NO：1〜26から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、態様89、90、または91の膜貫通型免疫調節タンパク質。
【０３５３】
131. 態様89〜130の膜貫通型免疫調節タンパク質のいずれか1つをコードする、組換え核酸。
【０３５４】
132. 態様131の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【０３５５】
133. 態様132の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【０３５６】
134. 哺乳動物宿主細胞である、態様133の組換え宿主細胞。
【０３５７】
135. 前記哺乳動物宿主細胞がヒト宿主細胞である、態様133の組換え宿主細胞。
【０３５８】
136. 治療有効量の態様89〜130のいずれか1つの膜貫通型免疫調節タンパク質を投与することによる、増強されたまたは阻害された免疫学的応答を必要とする哺乳動物患者を治療する方法。
【０３５９】
137. 前記増強された免疫学的応答が、前記患者における黒色腫、肺癌、膀胱癌、または血液悪性腫瘍を治療する、態様136の方法。
【０３６０】
138. 前記阻害された免疫学的応答が、前記患者におけるクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬を治療する、態様136の方法。
【実施例】
【０３６１】
IV. 実施例
以下の実施例は、単に例示を目的に含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３６２】
実施例1〜10は、免疫活性化および阻害の両方における二重の役割を有することが実証された免疫シナプス（IS）の成分である、親和性が改変されたCD80（B7-1）、CD86（B7-2）、ICOSL、およびNKp30免疫調節タンパク質の設計、作製、およびスクリーニングを説明する。これらの実施例は、IgSFドメインの親和性の改変が、免疫活性の増強および低減のいずれにも作用することができるタンパク質を生成することを実証している。この研究はまた、免疫調節活性を達成するII型免疫調節タンパク質を形成するための対で融合された（すなわち、積層された）これらのドメインの種々の組み合わせを記載する。実施例11は、膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）形式のこのようなドメイン、およびTIPをキメラ抗原受容体（CAR）と共に共発現する改変細胞の生成をさらに例示する。
【０３６３】
実施例1
IgSFドメインの変異体DNA構築物の生成
実施例1は、酵母ディスプレイライブラリーとしての酵母の表面上での翻訳および発現のための、ヒトCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 IgSFドメインの変異体DNA構築物の生成を記載する。
【０３６４】
A．縮重ライブラリー
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化のための標的タンパク質の特異的残基を標的化するライブラリーについて、ヒトCD80（SEQ ID NO:28）、ICOSL（SEQ ID NO:32）、およびNKp30（SEQ ID NO:54）の細胞外ドメイン（ECD）のコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。各ECDの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/におけるアルゴリズムを使用して、縮重コドンを生成した。
【０３６５】
概して、変異させる位置および縮重コドンを以下から選択した：関心対象の標的-リガンド対の結晶構造（CD80、NKp30）または相同性モデル（ICOSL）を使用して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。この分析を、URL:spdbv.vital-it.ch）で利用可能な構造ビューア（structure viewer）を使用して実施した。例えば、CTLA4に結合しているCD80についての結晶構造は、URL:www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8L）に公表されており、そして、CTLA4への改善された結合剤の選択のためにCD80::CTLA4界面に基づいて標的化ライブラリーを設計した。しかしながら、リガンドCD28およびPDL1との入手可能なCD80構造はなく、そのためまた同じライブラリーを使用して、CD28（CD80上のCTLA4と同じ領域に結合する）およびPDL1（PDL1がCTLA4と同じ部位に結合するか公知ではない）の結合剤について選択した。ライブラリー設計における次の工程は、保存されている残基を同定するためのヒト、マウス、ラットおよびサルCD80、ICOSLまたはNKp30配列のアライメントであった。この分析に基づいて、保存されている標的残基を縮重コドンで変異させたところ、保存的アミノ酸変化＋野生型残基を特定しただけであった。保存されていない残基を、より積極的に変異させたが、これも野生型残基を含んでいた。野生型残基をまたコードする縮重コドンを配置して、標的タンパク質の過度の変異誘発を回避した。同じ理由で、変異誘発のため最大20の位置までしか一度に標的化できなかった。これらの残基は、接触残基と非接触界面残基との組み合わせであった。
【０３６６】
オリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解させ、等モル比で混合し、95℃に5分間加熱し、そして、アニーリングのためゆっくり室温まで冷ました。次いで、ECDの開始点および終点にアニーリングするECD特異的オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ使用して、PCR産物を生成した。次いで、改変バージョンのpBYDS03クローニングベクター（Life Technologies USA）とBamH1およびKpn1クローニング部位以外および以内で40〜50bpだけ重複するECD特異的オリゴヌクレオチドを使用して、前工程からのPCR産物100ngを増幅させ、合計5μgのDNAを生成した。両方のPCRは、OneTaq 2×PCR master mix（New England Biolabs, USA）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものであった。PCR精製キット（Qiagen, Germany）を使用して第二のPCR産物を精製し、滅菌脱イオン水に再懸濁した。ライブラリー挿入を準備するために、改変された酵母ディスプレイバージョンのベクターpBYDS03をBamH1およびKpn1制限酵素（New England Biolabs, USA）で消化し、そして、大きなベクター断片をゲル精製して、滅菌脱イオン水に溶解させた。ライブラリーDNA 12μgと線状ベクター4μgを総容量50μlの脱イオンおよび滅菌水中で混合することによって、次の工程のためのエレクトロポレーション可能なDNAを生成した。標的化ライブラリーを生成するための代わりの方法は、縮重コドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いて標的ECDの部位特異的変異誘発（Multisite kit, Agilent, USA）を行うことであった。このアプローチを使用して、変異誘発のためのDNAの特異的なストレッチのみを標的化するサブライブラリーを生成した。これらの場合、選択工程に進む前にサブライブラリーを混合した。一般に、ライブラリーサイズは、107〜108個のクローンの範囲であったが、ただし、サブライブラリーは、104〜105個の範囲でしかなかった。大きなライブラリーおよびサブライブラリーをCD80、ICOSL、CD86およびNKp30について生成した。サブライブラリーをCD80、ICOSLおよびNKp30について生成した。
【０３６７】
B．ランダムライブラリー
また、ランダムライブラリーを構築して、CD80（SEQ ID NO:28）、CD86（SEQ ID NO: 29）、ICOSL（SEQ ID NO:32）およびNKp30（SEQ ID NO:54）のECDのバリアントを同定した。野生型ECDをコードするDNAを、改変された酵母ディスプレイベクターpBYDS03のBamH1部位とKpn1部位との間にクローニングし、次いで、同じ制限酵素を使用して切り離した。次いで、ライブラリーバリアント当たり平均3〜5つのアミノ酸変化を生成するために、切り離したDNAをGenemorph II kit（Agilent, USA）で変異誘発させた。次いで、変異誘発させたDNAを2工程PCRによって増幅させ、標的化ライブラリーについて上記のとおりさらに処理した。
【０３６８】
実施例2
酵母へのDNAライブラリーの導入
実施例2は、酵母へのCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 DNAライブラリーの導入を記載する。
【０３６９】
縮重およびランダムライブラリーDNAを酵母に導入するために、酵母BJ5464系統（ATCC.org；ATCC number 208288）のエレクトロポレーションコンピテントセルを調製し、そして、上の工程からのエレクトロポレーション可能なDNAを用いてGene Pulser II（Biorad, USA）で基本的には記載のとおりエレクトロポレーションした（Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358）。唯一の例外は、改変プラスミドpBYDS03によって担持されるLEU2選択マーカーに対応するために形質転換細胞を非誘導最小選択SCD-Leu培地中で成長させたことであった。
【０３７０】
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。エレクトロポレーションした培養物の残りを飽和まで成長させ、そして、この培養物に由来する細胞を同じ培地中でもう一度継代培養して、非形質転換細胞の画分を最小限に抑えた。ライブラリーの多様性を維持するために、計算したライブラリーサイズよりも少なくとも10×以上の細胞を含有した接種源を使用してこの継代培養工程を行った。第二の飽和培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量/体積）グリセロールを含有する新鮮培地に1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
【０３７１】
SCD-Leu培地1リットルは、クエン酸ナトリウム14.7グラム、クエン酸一水和物4.29グラム、デキストロース20グラム、Difcoブランドの酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。0.2μMの真空濾過装置を使用して、使用前に培地を滅菌濾過した。
【０３７２】
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。
【０３７３】
2つ以上の異なるライブラリークローンを含有する細胞からプラスミドを分離するために、ライブラリーサイズの10倍に相当する数の細胞をSCD-Leu一晩培養物から採取し、新鮮SCD-Leu培地中に1/100に継代培養し、そして、一晩成長させた。この一晩培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量／体積）グリセロールに1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
【０３７４】
実施例3
酵母の選択
実施例3は、CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30の親和性が改変されたバリアントを発現する酵母の選択を記載する。
【０３７５】
ライブラリーサイズの少なくとも10倍に等しい数の細胞を、個々のライブラリーストックから解凍し、非誘導SCD-Leu培地中0.1×106個の細胞/mlに懸濁し、そして、一晩成長させた。翌日、ライブラリーサイズの10倍に等しい数の細胞を2000 RPMで2分間遠心分離し、誘導SCDG-Leu培地中0.5×106個の細胞/mlに再懸濁した。SCDG-Leu誘導培地1リットルは、水に溶解させて0.22μmの膜濾過装置に通して滅菌した、Na2HPO4 5.4グラム、NaH2PO4*H20 8.56グラム、ガラクトース20グラム、デキストロース2.0グラム、Difco酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。培養物を20℃で2日間成長させて、酵母細胞表面でライブラリータンパク質の発現を誘導した。
【０３７６】
細胞を磁気ビーズで処理して、非結合剤を還元し、外因性組換えカウンター構造体タンパク質（同族結合パートナー）に結合する能力を有する全てのCD80、CD86、ICOSL、またはNKp30バリアントを富化させた。例えば、酵母にディスプレイされた標的化またはランダムCD80ライブラリーをCD28、CTLA-4、PD-L1に対して選択した。ICOSLライブラリーをICOSに対して選択し、CD28およびNKp30ライブラリーをB7-H6に対して選択した。これに続いて、外因性カウンター構造体タンパク質染色を使用した2〜3ラウンドの蛍光活性化細胞選別（FACS）を行って、改善された結合剤をディスプレイする酵母細胞の画分を富化させた。磁気ビーズ富化およびフローサイトメトリーによる選択は、基本的には、Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 and Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008 に記載のとおりである。
【０３７７】
CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30ライブラリーと共に、標的リガンドタンパク質は、以下のとおりR&D Systems（USA）から供給された：ヒトrCD28.Fc（すなわち、組換えCD28-Fc融合タンパク質）、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc、rICOS.Fc、およびrB7H6.Fc。磁気ストレプトアビジンビーズをNew England Biolabs, USAから得た。カウンター構造体タンパク質のビオチン化のために、ビオチン化キット（cat# 21955, Life Technologies, USA）を使用した。2色フローサイトメトリーソーティングのために、Becton Dickinson FACS Aria II sorterを使用した。CD80、CD86、ICOSL、またはNKp30ディスプレイレベルを、Alexafluor 488（Life Technologies, USA）で標識した抗ヘマグルチニンタグ抗体でモニタリングした。リガンド結合Fc融合タンパク質rCD28.Fc、rCTLA4.Fc、rPDL1.Fc、rICOS.Fc、またはrB7-H6.Fcを、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）／側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲーティングし、そして、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合に基づいており、FL1でより限定されたHAタグ発現結合を保有した。
【０３７８】
フローサイトメトリーソートからの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性についてアッセイした。ソートアウトプット酵母を増殖および再誘導して、これらがコードする特定のIgSF親和性改変ドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親の野生型酵母系統、またはビーズアウトプット酵母集団のような任意の他の選択されたアウトプットと比較することができる。
【０３７９】
ICOSLについて、各集団を、抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、各rICOS.Fc、rCD28.Fc、およびrCTLA4.Fcの結合について第二のソートアウトプット（F2）を親ICOSL酵母と比較した。
【０３８０】
ICOSに対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、5.6nM rICOS.Fcで染色したとき平均蛍光強度（MFI）値997を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrICOS.Fcで染色したとき397と測定された。これは、このF2で選択されたクローンのプールでおおまかに3倍の平均結合の改善を表し、そして、個別に試験したときに、そのプールからの個々のクローンがはるかに良好な改善されたMFI/親和性を有すると予測される。
【０３８１】
CD28に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCD28.Fcで染色したときMFI値640を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCD28.Fcで染色したとき29と測定された（22倍改善）。CTLA4に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCTLA4.Fcで染色したときMFI値949を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCTLA4.Fcで染色したとき29と測定された（32倍改善）。
【０３８２】
B7-H6に対する結合性について選択されたNKp30酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、16.6nM rB7H6.Fcで染色したときMFI値533を与えたが、一方で、親NKp30系統のMFIは、同じ濃度のrB7H6.Fcで染色したとき90と測定された（6倍改善）。
【０３８３】
重要なことに、上記の全てのF2アウトプットのMFIは、FL1にて抗HAタグ抗体を用いて測定したとき、野生型系統と比較して増加することなく、時に低下した場合もあったが、このことは、向上した結合性が選択されたバリアントの酵母の表面での増加した発現の関数ではなかったことを示しており、そして、高いリガンド結合を有する中から低エクスプレッサーのみを選択するゲーティング戦略を検証した。
【０３８４】
実施例4
Fc融合物としてのおよび種々の免疫調節タンパク質タイプにおける選択アウトプットの再編成
実施例4は、Fc分子に融合されたCD80またはICOSLの親和性が改変された（バリアント）細胞外ドメイン（ECD）（バリアントECD-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質としての選択アウトプットの再編成を記載する。
【０３８５】
最終フローサイトメトリーCD80およびICOSLソートからのアウトプット細胞をSCD-Leu培地中末端密度まで成長させた。各アウトプットからのプラスミドDNAを、酵母プラスミドDNA単離キット（Zymoresearch, USA）を使用して単離した。Fc融合物について、選択したFc融合ベクターへのクローニングに好適な制限部位を付加したPCRプライマーを使用して、プラスミドDNAプレップから変異体標的ECDのコーディングDNAをバッチ増幅させた。制限消化後、PCR産物を、適切なFc融合ベクターにライゲーションし、続いて、XL1 Blue系統大腸菌（Agilent, USA）またはNEB5α（New England Biolabs）に供給者の指示どおり化学形質転換した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
【０３８６】
形質転換反応の希釈物を、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有するLB-寒天上にプレーティングして、単一コロニーを生成した。次いで、各形質転換からの最大96個のコロニーを、96ウェルプレート内、LB-ブロス（Teknova cat # L8112）中37℃で一晩飽和まで成長させ、そして、全てのクローン中の変異を同定するために各ウェルからの小アリコートをECDインサートのDNAシークエンシングに送った。サービス提供会社（Genewiz；South Plainfield, NJ）によって提供されるプロトコールを使用して、DNAシークエンシング用の試料調製を行った。DNAシークエンシング用の試料を取り出した後、次いで残りの培養物にグリセロールを最終グリセロール含量25％まで加え、そして、後で使用するためプレートをマスタープレート（以下参照）として-20℃で貯蔵した。あるいは、DNAシークエンシング用の試料を、成長させた液体培養物から固体寒天プレートへのディスポーザブル96ウェルレプリケーター（VWR, USA）を使用したレプリカプレーティングによって生成した。これらのプレートを一晩インキュベートして成長パッチを生成し、そして、プレートをGenewizに規定されているとおりGenewizに送った。
【０３８７】
Genewizで生成されたDNAシークエンシングデータの分析からの関心対象のクローンの同定後、関心対象のクローンをマスタープレートから回収し、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有する液体LB-ブロス5ml中で密度まで個々に成長させ、次いで、各培養物2mlを、Pureyield kit（Promega）のような標準キットを使用する各クローンの約10μgのミニプレッププラスミドDNAの調製に使用した。関心対象のクローンの同定は、一般に、以下の工程を包含した。最初に、DNA配列データファイルをGenewizウェブサイトからダウンロードした。次いで、ECDコード領域の開始点で始まるように全ての配列を手動で処理した。次いで、URL:www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/.で利用可能な好適なプログラムを使用して、処理した配列をバッチ翻訳した。次いで、翻訳した配列を、URL:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlで利用可能な好適なプログラムを使用してアライメントさせた。
【０３８８】
次いで、関心対象のクローンを以下の基準を使用して同定した：1.）同一のクローンがアライメント中に少なくとも2回生じる、および2.）変異がアライメント中に少なくとも2回、好ましくは別個のクローンで生じる。これらの基準のうちの少なくとも1つを満たしたクローンは、改善された結合に起因して本発明者らのソーティングプロセスによって富化されたクローンであった。
【０３８９】
方法は、以下のとおり設計されたタンパク質をコードするコーディングDNAを生成し、少なくとも1つの親和性改変ドメインを有するCD80またはICOSLのECDを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続いてバリアント（変異型）ECD、続いて3つのアラニン（AAA）のリンカー、続いて変異N297G（SEQ ID NO:226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）を含有するヒトIgG1 Fc。当該ヒトIgG1 Fcは、変異R292CおよびV302C（SEQ ID NO:226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）も含有した。その構築物は、システインと共有結合を形成することができる抗体軽鎖を含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、SEQ ID NO:226に示される野生型または未改変のFcと比較して、5位（C5S）にシステイン残基のセリン残基への置換を含有した。
【０３９０】
加えて、以下の実施例8は、一緒に連結されFcに縮合された同定バリアントCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30分子に由来する少なくとも2つの異なる親和性改変ドメインを含有するスタック構築物として生成されたさらなる免疫調節タンパク質を記載する。
【０３９１】
実施例5
Fc融合物の発現および精製
実施例5は、バリアントECD CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30を含有するFc融合タンパク質のハイスループット発現および精製を記載する。
【０３９２】
組換えバリアントFc融合タンパク質をExpi293発現系（Invitrogen, USA）で生産した。先の工程からの各プラスミドDNA 4μgをOpti-MEM（Invitrogen, USA）200μlに加え、同時に、ExpiFectamine 10.8μlを別のOpti-MEM 200μlに別々に加えた。5分後、プラスミドDNA 200μlをExpiFectamine 200μlと混合し、この混合物を細胞に加える前に追加で20分間さらにインキュベートした。1000万個のExpi293細胞を、10mlの滅菌円錐底ディープ24ウェル成長プレート（Thomson Instrument Company, USA）の別々のウェルのExpi293培地（Invitrogen, USA）容量3.4ml中に分注した。プレートを、湿度95％および8％CO2に設定された哺乳動物細胞培養インキュベーター内、120RPMで5日間振盪した。5日間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、培養上清を取り出した。
【０３９３】
ハイスループット96ウェルタンパク質A精製キット（Catalog number 45202, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、上清からタンパク質を精製した。得られた溶出分画を、Zeba 96 well spin desalting plate（Catalog number 89807, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、PBSに緩衝液交換した。Nanodrop instrument（Thermo Fisher Scientific, USA）によって測定した280nmの吸光度を使用して、精製したタンパク質を定量し、そして、タンパク質5μgを変性および還元条件下のNUPAGEプレキャストポリアクリルアミドゲル（Life Technologies, USA）上にロードし、その後ゲル電気泳動することによってタンパク質純度を評価した。標準的なクマシー染色を使用してゲル中でタンパク質を可視化した。
【０３９４】
実施例6
親和性成熟されたIgSFドメイン含有分子の結合および活性の評価
A．細胞表面に発現しているカウンター構造体に対する結合性
この実施例は、同族結合パートナーに対するCD80およびICOSLドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性および親和性を示すFc融合物結合研究を記載する。
【０３９５】
同族結合パートナーを発現する細胞を生産するため、ヒトCD28、CTLA4、PD-L1、ICOS、およびB7-H6の各々についての全長哺乳動物表面発現構築物は、pcDNA3.1発現ベクター（Life Technologies）中で設計されており、これはGenscript, USAから供給された。上記のExpi293F一過性トランスフェクション系（Life Technologies, USA）を使用して結合研究を行った。実験に必要な細胞数を決定し、そして、製造業者の推奨プロトコールを使用して、適切な30mlスケールのトランスフェクションを実施した。CD28、CTLA-4、PD-L1、ICOS、B7-H6または偽の30mlトランスフェクション毎に、7500万個のExpi293F細胞を発現構築物DNA 30μgおよび希釈したExpiFectamine 293試薬1.5mlと48時間インキュベートし、その時点で染色用に細胞を収集した。
【０３９６】
フローサイトメトリーによる染色のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照の200,000個の細胞を96ウェル丸底プレート中にプレーティングした。細胞をスピンダウンし、染色緩衝液（PBS（リン酸緩衝食塩水）、1％BSA（ウシ血清アルブミン）、および0.1％アジ化ナトリウム）中に20分間再懸濁して、非特異的結合をブロッキングした。その後、細胞を再度遠心分離し、これを、50μlの各候補CD80バリアントFc、ICOSLバリアントFc、またはスタックされたIgSFバリアントFc融合タンパク質の実験に応じて、100nM〜1nMのバリアント免疫調節タンパク質を含有する染色緩衝液に再懸濁した。一次染色を氷上で45分間実施した後、染色緩衝液中で細胞を2回洗浄した。PEコンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を染色緩衝液50μl中1:150に希釈し、細胞に加えて氷上でさらに30分間インキュベートした。二次抗体を2回洗い流し、細胞を4％ホルムアルデヒド／PBS中で固定し、そして、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson, USA）で試料を分析した。
【０３９７】
トランスフェクタントおよび陰性親系統毎に、Cell Quest Pro software（Becton Dickinson, USA）で平均蛍光強度（MFI）を計算した。
【０３９８】
B．生物活性の特性決定
この実施例は、ヒト初代T細胞インビトロアッセイにおけるFc融合バリアントタンパク質の生物活性の特性決定をさらに記載する。
【０３９９】
1．混合リンパ球反応（MLR）
可溶性rICOSL.FcまたはrCD80.Fcの生物活性をヒト混合リンパ球反応（MLR）で試験した。PBMC（BenTech Bio, USA）から単離された単球をEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）中500U/ml rIL-4（R&D Systems, USA）および250U/ml rGM-CSF（R&D Systems, USA）とインビトロで7日間培養することによって、ヒト初代樹状細胞（DC）を生成した。10,000個の成熟DCおよび100,000個の精製同種CD4+T細胞（BenTech Bio, USA）を、96ウェル丸底プレート内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地中でICOSLバリアント融合タンパク質、CD80バリアントFc融合タンパク質、または対照と共培養した。5日目に、Human IFN-gamma Duoset ELISA kit（R&D Systems, USA）を使用して培養上清中のIFN-γ分泌を分析した。VMax ELISA Microplate Reader（Molecular Devices, USA）によって光学密度を測定し、IFN-gamma Duo-set kit（R&D Systems, USA）に含まれる用量設定したrIFN-γ標準に対して定量した。
【０４００】
2．抗CD3同時固定アッセイ
ICOSL融合タンパク質およびCD80 Fc融合バリアントの共刺激生物活性を抗CD3同時固定アッセイで決定した。1nMまたは4nMのマウス抗ヒトCD3（OKT3, Biolegends, USA）を、PBS中1nM〜80nM rICOSL.FcまたはrCD80.Fcバリアントタンパク質で希釈した。この混合物を、組織培養処理平底96ウェルプレート（Corning, USA）に一晩加え、プレートのウェルへの刺激タンパク質の結合を促進した。翌日、未結合のタンパク質をプレートから洗い出し、100,000個の精製ヒトpan T細胞（BenTech Bio, US）またはヒトT細胞クローンBC3（Astarte Biologics, USA）を、各ウェル内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）に加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
【０４０１】
C．結果
例示的な試験バリアントについての結合および活性研究の結果を表8〜10に示す。特に、表8は、それぞれの同族構造CD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表9は、それぞれの同族構造PD-L1に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表10は、それぞれの同族構造ICOSおよびCD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたICOSLのECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表毎に、例示的なアミノ酸置換は、以下のとおり、それぞれの参照未改変ECD配列に対応するアミノ酸位置番号によって示される。例えば、表8および9中の参照未改変ECD配列は、SEQ ID NO:28に示される未改変のCD80 ECD配列であり、そして、表10中の参照未改変ECD配列は、未改変ICOSL ECD配列（SEQ ID NO:32）である。アミノ酸位置は中央に示され、ここで、対応する未改変（例えば、野生型）のアミノ酸は番号の前に列挙され、そして、同定されたバリアントアミノ酸置換は、番号の後に列挙される。列2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントECDについてのSEQ ID NO識別子を示す。
【０４０２】
また、同族カウンター構造体リガンドを発現するように改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現するカウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、i）抗CD3と同時固定された表示のバリアントECD-Fc融合分子またはii）MLRアッセイ中の表示のバリアントECD-Fc融合分子のいずれかで生成された、培養上清中のIFN-γの計算値（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントFc融合分子の機能活性も示される。また、表は、両方の機能性アッセイにおいて対応する未改変のECD-Fcと比較した、各バリアントECD-Fcによって生産されたIFN-γの比も示す。
【０４０３】
示されるとおり、選択は、少なくとも1つ、いくつかの場合では複数の同族カウンター構造体リガンドに対する向上した結合性を示すように親和性が改変された多数のCD80またはICOSL IgSFドメインバリアントの同定をもたらした。加えて、その結果は、バリアント分子の親和性改変がまた、当該分子のフォーマットに応じて免疫活性を増強および低下させる改善された活性を示したことを示した。例えば、リガンドの同時固定は、おそらく、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fc分子と比較して、細胞との多価相互作用を提供してクラスター化するか、またはアゴニスト活性を有利にするアビディティを向上させて、T細胞活性化を向上させる。しかしながら、分子が溶液で二価Fc分子として提供されるとき、同じIgSFドメインバリアントは、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fv分子と比較して、T細胞活性化を低下させるアンタゴニスト活性を示した。
【０４０４】
（表８）CD28に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2018534245.tif 000015
2018534245.tif 000016
2018534245.tif 000017
【０４０５】
（表９）PD-L1に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2018534245.tif 000018
2018534245.tif 000019
【０４０６】
（表１０）CD28またはICOSに対して選択されたICOSLバリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2018534245.tif 000020
2018534245.tif 000021
*:親に対する比率は、WT ICOSLについての346pg/ml IFN-γを使用して計算された
【０４０７】
実施例7
リガンド結合競合アッセイ
実施例6に示されるとおり、いくつかのCD80バリアント分子は、CD28およびPD-L1の一方または両方に対する改善された結合性を示した。リガンドCD28およびPD-L1へのCD80の結合活性をさらに評価するため、この実施例は、CD28およびPD-L1の両方に結合する例示的なCD80バリアントの非競合性を評価するリガンド競合アッセイを記載する。
【０４０８】
CD28およびPD-L1に同時に結合するCD80の能力を評価するために、プレートに結合したCD80バリアントA91G ECD-Fcを組み込んだELISAベースの結合アッセイを設定した。PBS中の100nMヒト組換えCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質でMaxisorp 96ウェルELISAプレート（Nunc, USA）を一晩コートした。翌日、未結合タンパク質を洗い流し、そして、1％ウシ血清アルブミン（Millipore, USA）/PBSを用いて室温で1時間プレートをブロッキングした。このブロッキング試薬をPBS/0.05％Tweenで3回洗い流した。洗浄毎にプラットフォーム振盪器上での2分間のインキュベーションを含めた。
【０４０９】
競合アッセイの一方のアームでは、CD80をCD28とインキュベートした後、次いで、他の公知のCD80リガンドカウンター構造体PD-L1もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下でCD28結合CD80を競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトCD28 Fc融合タンパク質（rCD28.Fc；R&D Systems）を、ウェル内、25μl容量中10nMで開始して、1:2希釈で8点希釈することで用量漸増した。ビオチン化rCD28.Fcを加えた直後に、未標識競合結合剤の組換えヒトPD-L1単量体hisタグ化タンパク質、組換えヒトCTLA-4単量体hisタグ化タンパク質、または陰性対照ヒト組換えPD-L2 Fc融合タンパク質（R&D Systems）を、それぞれ25μl容量中2000/1000/500nMで、最終容量50μlでウェルに加えた。これらのタンパク質を一緒に1時間インキュベートした後、上記のとおりの3回の洗浄工程を繰り返した。
【０４１０】
洗浄後、1ウェル当たり2.5ngのHRPコンジュゲートストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch, USA）を1％BSA/PBS中で希釈してウェルに加え、結合したビオチン化rCD28.Fcを検出した。1時間のインキュベーション後、ウェルを再度上記のとおり3回洗浄した。シグナルを検出するために、洗浄に続いてTMB基質（Pierce, USA）50μlをウェルに加え、7分間インキュベートした後に2M硫酸停止溶液50ulを加えた。光学密度をEmax Plus microplate reader（Molecular Devices, USA）で決定した。光学密度値をPrism（Graphpad, USA）でグラフ化した。
【０４１１】
結果を図1Aに示す。結果は、rCD28.Fcの用量漸増に伴うCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質へのビオチン化rCD28.Fcの低下した結合性を示した。rCD28.Fc結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するCD28結合の減少はなかった（黒三角）。対照的に、競合対照タンパク質rCTLA-4は、CD28.Fcとインキュベートしたとき、予想のとおりCD80に対して減少したCD28結合をもたらした（x線）。組換えPD-L1をCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのCD28結合の減少は観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。CD80へのCD28競合アッセイにおいて使用された組換えPD-L1タンパク質の結合は、ビオチン化PD-L1を非ビオチン化rCD28.Fcの存在下でインキュベートすることによって確認された（四角）。
【０４１２】
また、CD80をPD-L1とインキュベートした逆競合を設定した後、次いで、PD-L1結合CD80を、他の公知のCD80リガンドカウンター構造体CD28もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下での競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質を組換えCD80バリアントを含有するウェルに用量漸増することによってアッセイを実施した。このリガンドとは結合が弱いので、用量漸増を、25μL中5000nMで開始して同様の8点の1:2希釈を行った。結合を検出するためにrPD-L1-hisを使用したとき、競合リガンドヒトrCD28.Fc、ヒトrCTLA-4.Fc、またはヒトrPD-L2.Fc対照を、総容量50μlで25μl中2.5nMの最終濃度で加えた。その後の洗浄、検出、およびOD測定は、上記と同じであった。
【０４１３】
結果を図1Bに示す。用量漸増したPD-L1-his結合単独は、プレート上に固定されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子にPD-L1が結合したことを確認した（四角）。PD-L1-his結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するPD-L1結合の減少はなかった（三角）。CD28競合対照タンパク質rCTLA-4は、PD-L1-hisとインキュベートしたとき、CTLA-4はCD28に対して競合的であるにもかかわらず、CD80に対して減少したPD-L1結合をもたらさなかった（x線）。この結果は、CD80結合に対してのCD28とPD-L1との間の競合の欠如をさらに実証した。最後に、PD-L1-hisをCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのPD-L1結合の減少が観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。
【０４１４】
したがって、結果は、CTLA-4はCD80へのCD28の結合に対して競合したが、PD-L1または陰性対照PD-L2は競合しなかったこと（図1A）、およびCD28、CTLA-4、およびPD-L2は、CD80へのPD-L1の結合に対して競合しなかったこと（図1B）を示した。したがって、これらの結果は、CD28およびPD-L1がCD80の非競合結合剤であること、および、リガンドがELISAで検出されるかに関係なくこの非競合的結合を実証できることを実証した。
【０４１５】
実施例8
異なる親和性改変ドメインを含有するスタックされた分子の生成および評価
1つまたは複数のカウンター構造体リガンドについて親和性が改変された上記の選択されたバリアント分子を使用して、2つ以上の親和性が改変されたIgSFドメインを含有する「スタック」分子（すなわち、II型免疫調節タンパク質）を生成した。Gibson assembly kit（New England Biolabs）を使用した標準的なGibsonアセンブリによってFcへのその融合を可能にするフォーマットで該スタックをコードする遺伝子ブロック（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）としてスタック構築物を得た。
【０４１６】
以下のとおり設計されたタンパク質をコードする全てのスタックのコーディング核酸分子を生成した：シグナルペプチド、続いて関心対象の第一のバリアントIgV、続いて3つのGGGGS（G4S）モチーフから構成される15アミノ酸リンカー（SEQ ID NO:228）、続いて関心対象の第二のIgV、続いて2つのGGGGSリンカー（SEQ ID NO: 229）、続いて3つのアラニン（AAA）、続いて上記のとおりのヒトIgG1 Fc。各スタックにおけるIgVドメインの正確なホールディングの可能性を最大限にするため、第一のIgVの前に、通常野生型タンパク質で生じる全ての残基をこのIgVとシグナルペプチド（リーディング配列）との間に置く。同様に、第一のIgVの後に、通常該IgVを野生型タンパク質中で次のIgドメイン（典型的には、IgCドメイン）またはこのような第二のIgVドメインが存在しない場合は該IgVを膜貫通ドメイン（トレーリング配列）に接続する残基のいずれかに接続する全ての残基が続く。両方のIgVドメインが同じ親タンパク質由来であった（例えば、別のCD80 IgVでスタックされたCD80 IgV）場合は両方の間のリンカーが繰り返し存在しなかったこと以外は、同じ設計原理を第二のIgVドメインに適用した。
【０４１７】
表11は、例示的なスタックされた構築物の設計を示す。表11に示される例示的なスタック分子は、表示のとおりのIgVドメインおよびさらに上記のとおりのリーディングまたはトレーリング配列を含有する。表には、以下の成分が次の順序で存在する：シグナルペプチド（SP; SEQ ID NO:225）、IgVドメイン1（IgV1）、トレーリング配列1（TS1）、リンカー1（LR1; SEQ ID NO:228）、IgVドメイン2（IgV2）、トレーリング配列2（TS2）、リンカー2（LR2; SEQ ID NO:230）およびFcドメイン（C5S/N82Gアミノ酸置換を含有するSEQ ID NO:226）。いくつかの場合では、リーディング配列1（LS1）は、シグナルペプチドとIgV1の間に存在し、いくつかの場合では、リーディング配列2（LS2）は、リンカーとIgV2の間に存在する。
【０４１８】
（表１１）例示的なスタックされた構築物の成分のアミノ酸配列（SEQ ID NO）
2018534245.tif 000022
2018534245.tif 000023
2018534245.tif 000024
2018534245.tif 000025
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2018534245.tif 000030
2018534245.tif 000031
2018534245.tif 000032
【０４１９】
少なくとも1つの親和性改変IgVドメインを含有するCD80、CD86、ICOSLまたはNkp30由来のバリアントIgVドメインの種々の組み合わせを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のハイスループット発現および精製を、実施例5に記載のとおり行った。また、バリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のそれぞれのカウンター構造体に対する結合性および抗CD3同時固定アッセイによる機能活性を実施例6に記載されるとおり評価した。例えば、スタックされたIgSF Fc融合タンパク質の共刺激生物活性を上記と同様の固定化抗CD3アッセイで決定した。この場合、4nMの抗CD3（OKT3, Biolegend, USA）を、組織培養処理96ウェルプレート（Corning, USA）上で4nM〜120nMのヒトrB7-H6.Fc（R&D Systems, USA）またはヒトrPD-L1.Fc（R&D Systems, USA）と一晩同時固定した。翌日、未結合タンパク質をPBSで洗い出し、そして、100,000個の精製したpan T細胞を各ウェルのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）100ulに加えた。その後、スタックされたIgSFドメインを100ulの容量中8nM〜40nMの濃度で合計200ulの容量で加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
【０４２０】
結果を表12〜16に示す。具体的には、表12は、NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表13は、NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFv融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表14は、バリアントCD80 IgVドメインおよびCD80、CD86またはICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表15は、2つのバリアントCD80 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表16は、バリアントCD80またはCD86 IgVドメインおよびバリアントICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結果を示す。
【０４２１】
表12〜16の各々について、列1は、アミノ末端（N末端）ドメインから始まり、続いてC末端ヒトIgG1 Fcドメインの前に中央のWTまたは親和性が改変されたドメインが位置する、スタックされた、親和性が改変されたまたは野生型（WT）ドメインの構造的構成および配向を示す。列2は、それぞれの「スタック」分子中に含有される各IgVドメインの配列についてのSEQ ID NO識別子を示す。列3は結合パートナーを示しており、当該結合パートナーに対して、列1に表示されている親和性が改変されたスタックされたドメインが選択された。
【０４２２】
また、種々のカウンター構造体リガンドを発現するように改変された細胞への各スタック分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現するカウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換を含有しない未改変IgVドメインを含有する対応するスタック分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、溶液の表示のバリアントスタック分子および実施例6に記載されるとおりの抗CD3と同時固定された適切なリガンドで生成された培養上清中のIFN-γの計算レベル（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントスタック分子の機能活性も示される。また、表は、同時固定アッセイにおいて対応する未改変のスタック分子と比較した、各バリアントスタック分子によって生産されたIFN-γの比も示す。
【０４２３】
示されるとおり、結果は、それぞれの未改変（例えば、野生型）のIgVドメインを含有する対応するスタック分子と比較して、少なくとも1つの同族カウンター構造体リガンドに対して親和性が改変された向上した結合活性を示した少なくとも1つのバリアントIgSFドメインを含有するスタック分子を生成することが可能であったことを示した。いくつかの場合では、分子中の両方のバリアントIgSFドメインの一方または組み合わせのいずれかに由来するスタック分子は、複数の同族カウンター構造体リガンドに対する向上した結合性を示した。結果はまた、スタックされた分子中のIgVドメインの順序が、いくつかの場合では、改善された結合活性の程度も変化させうることを示した。いくつかの場合では、標的化同時固定アッセイで評価したときに機能的T細胞活性もまた変化した。
【０４２４】
（表１２）NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
2018534245.tif 000033
【０４２５】
（表１３）NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
2018534245.tif 000034
【０４２６】
（表１４）CD80 IgVドメインおよびCD80、CD86、またはICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
2018534245.tif 000035
2018534245.tif 000036
2018534245.tif 000037
2018534245.tif 000038
【０４２７】
（表１５）2つのCD80 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
2018534245.tif 000039
2018534245.tif 000040
【０４２８】
（表１６）CD80またはCD86 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質 
2018534245.tif 000041
2018534245.tif 000042
2018534245.tif 000043
【０４２９】
実施例9：CD155の親和性改変IgSFドメインバリアントの生成、選択およびスクリーニング
CD155の親和性改変IgSFドメインバリアントを、上記実施例1〜6に実質的に記載のとおり、幾らかのわずかな修正を加えて生成した。例えば、CD155バリアントの生成について、ECDのその他の2つのドメインではなくIgVドメインのみを生成されたタンパク質中に含めた。
【０４３０】
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化によってCD155の特異的残基を標的化するライブラリーを生成するために、ヒトCD155の免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（SEQ ID NO：241）についてのコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。一般に、IgVドメインの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。縮重コドンを、URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/でのアルゴリズムを使用して生成した。一般に、突然変異させる位置および縮重コドンを、関心対象の標的-リガンド対を含有するこの構造から作られた結晶構造情報（PDB：3UDW）または相同性モデルから選択して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。例えば、TIGITに結合したCD155の結晶構造は、タンパク質データベースコード3UDWについてURL：www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3UDWで公的に利用可能である。この分析を、URL: spdbv.vital-it.ch）で利用可能な構造ビューア（structure viewer）を使用して実施した。
【０４３１】
実施例1に記載のとおり、オリゴヌクレオチドをPCR増幅に使用して、修飾された酵母提示バージョンのベクターpBYDS03への挿入のためのライブラリーDNAインサートを実質的に生成した。あるいは、最大200bp長のUltramer（Integrated DNA Technologies）をメガプライマーPCR（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）と共に使用して、複数の小さい重複プライマーを使用して容易に組み込むことのできないより大きなストレッチの縮重コドンを生成した。メガプライマーPCRを使用した完全長産物の生成に続いて、突然変異体IgVドメインライブラリーを、酵母への相同組換えのための修飾されたpBYDS03クローニングバリアントと40bpの重複領域を含有するDNAプライマーを使用して再度PCR増幅した。DNAインサートのライブラリーを、実施例1に実質的に記載のとおりライブラリー挿入用に調製し、電気穿孔法に使用できるDNAを調製した。
【０４３２】
代わりのアプローチとして、CD155のIgVドメインの特異的残基を標的とする部位特異的突然変異誘発によって生成されるサブライブラリーまたはCD155のIgVドメインのランダムライブラリーのいずれかを生成して、実施例1に実質的に記載のとおりCD155のIgVドメインのバリアントをさらに同定した。
【０４３３】
縮重またはランダムライブラリーDNAを、実施例2に記載のとおり実質的に酵母に挿入した。CD155の親和性改変バリアントを発現する酵母を、実施例3に記載される方法を使用して実質的に選択した。選択のために、以下の標的リガンドタンパク質を採用した：ヒトrTIGIT.Fc（すなわち、組換えTIGIT-Fc融合タンパク質）およびrCD226.Fc。磁気プロテインAビーズをNew England Biolabs（USA）から得た。2カラーフローサイトメトリーソーティングのために、Bio-Rad S3eソーターを使用した。CD155提示レベルを、Alexafluor 488で標識された抗ヘマグルチニン抗体（Life Technologies, USA）でモニタリングした。Fc融合タンパク質rTIGIT.FcまたはrCD226.Fcのリガンド結合を、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）/側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲートアウトし、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合（これは、FL1でより限定されたタグ発現結合を有した）に基づいた。
【０４３４】
第二のソートアウトプット（F2）を、実施例3に記載のとおり、より高い特異的結合親和性についてアッセイされたソートアウトプットを拡大してその発現を再誘導することによって実質的に得て、これを使用して、親の野生型酵母系統と比較した結合を評価した。CD155について、各集団を抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、第二のFACSアウトプット（F2）を親CD155酵母とrTIGIT.FcまたはrCD226.Fcの結合について比較した。
【０４３５】
選択されたアウトプットを、完全ECDドメインではなくIgVドメインのみを含むこと以外は実施例4に記載のとおり、Fc分子に融合されたCD155の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（バリアントIgVドメイン-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として実質的に再編成した。CD155アウトプットについてのいくつかの代わりの方法では、そのアウトプット由来のDNAを、Fc融合ベクターといずれかの端部上に40bpの重複領域を含有するプライマーでPCR増幅し、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs）を使用したインビトロ組換えを行って、これをその後、大腸菌（E. Coli）系統NEB5αへの熱ショック形質転換に使用した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
【０４３６】
形質転換後、実施例4に実質的に記載のとおり試料をDNAシーケンス用に調製した。次いで、IgVコード領域の最初で開始するように配列を手動でキュレートした以外は実施例4に記載のとおり、配列を手動でキュレートした。キュレートされた配列を、実施例4に記載のとおりバッチ翻訳および整列させた。関心対象のクローンを、実施例4に記載のとおりの基準を使用して同定した。表17は、同定されたバリアントCD155親和性改変分子（各バリアントに含有されるアミノ酸置換を含む）を示す。
【０４３７】
該方法は、以下のとおりのタンパク質をコードするコーディングDNAが生成された、CD155の親和性改変IgVドメインを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続く、バリアント（突然変異体）IgVドメイン、続く、3つのアラニン（AAA）のリンカー、続く、突然変異N297Gを含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）。ヒトIgG1 Fcはまた、突然変異R292CおよびV302Cを含有した（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）。構築物は、システインと共有結合を形成できる任意の抗体軽鎖も含まないので、SEQ ID NO：226に示される野生型または未改変のFcと比較して、ヒトIgG1 Fcはまた、5位におけるシステイン残基のセリン残基への置き換え（C5S）を含有した。
【０４３８】
組換えバリアントCD155 Fc融合タンパク質を、実施例5に記載のとおり実質的に発現および精製した。親和性改変バリアントCD155 Fc融合タンパク質の結合および活性を、完全長ヒトCD226およびTIGIT同族結合パートナーを発現する細胞を生成した以外は実施例6に記載のとおり実質的に評価した。細胞をフローサイトメトリーによってCD155 Fcバリアントで染色し、平均蛍光強度（MFI）を実施例5に記載のとおり決定した。生物活性の特徴付けのために、組換えCD155 Fcバリアントを、実施例5に記載のとおり抗CD3同時固定化アッセイで実質的に評価した。
【０４３９】
結合および活性の研究についての結果は、表17に示される。表は、それぞれの同族構造TIGITおよびCD226に対する親和性成熟についてのスクリーニングにおいて選択されたCD155のIgVドメイン内の例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（置き換え）を示す。例示的なアミノ酸置換は、SEQ ID NO：241に示される未改変の配列（IgV）の位置に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。アミノ酸位置は中央に示され、対応する未改変の（例えば、野生型）アミノ酸は番号の前に列挙され、同定されたバリアントアミノ酸置換は番号の後に列挙される。カラム2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントについてのSEQ ID NO識別子を示す。
【０４４０】
また、同族カウンター構造体リガンドを発現するよう改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された場合の結合活性が、同じ細胞が発現しているカウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換（1つまたは複数）を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比として示される。また、T細胞の活性を調節するためのバリアントFc融合分子の機能活性も、抗CD3と同時固定された表示のバリアントFc融合分子で生成された培養上清中のIFNγの算出されたレベル（pg/ml）に基づいて、両方の機能的アッセイにおいて対応する未改変のCD155 IgV-Fcと比較した各バリアントCD155 IgV-Fcによって産生されたIFNγの比として示される。
【０４４１】
（表１７）同族結合パートナーに対して選択されたCD155バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2018534245.tif 000044
【０４４２】
実施例10：CD112の親和性改変IgSFドメインバリアントの生成、選択およびスクリーニング
CD112の親和性改変IgSFドメインバリアントを、上記実施例1〜6に記載のとおり、いくらかのわずかな修正を加えて実質的に生成した。例えば、CD112バリアントの生成について、ECDのその他の2つのドメインではなくIgVドメインのみを生成されたタンパク質中に含めた。
【０４４３】
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化によってCD155の特異的残基を標的化するライブラリーを生成するために、ヒトCD112の免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（SEQ ID NO：286）についてのコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。一般に、IgVドメインの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。縮重コドンを、URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/でのアルゴリズムを使用して生成した。一般に、突然変異させる位置および縮重コドンを、関心対象の標的-リガンド対を含有するこの構造から作られた結晶構造情報（PDB：3UDW）または相同性モデルから選択して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。
【０４４４】
実施例1に記載のとおり、オリゴヌクレオチドをPCR増幅に使用して、修飾された酵母提示バージョンのベクターpBYDS03への挿入のためのライブラリーDNAインサートを実質的に生成した。あるいは、最大200bp長のUltramer（Integrated DNA Technologies）をメガプライマーPCR（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）と共に使用して、複数の小さい重複プライマーを使用して容易に組み込むことのできないより大きなストレッチの縮重コドンを生成した。メガプライマーPCRを使用した完全長産物の生成に続いて、突然変異体IgVドメインライブラリーを、酵母への相同組換えのための修飾されたpBYDS03クローニングバリアントと40bpの重複領域を含有するDNAプライマーを使用して再度PCR増幅した。DNAインサートのライブラリーを、実施例1に記載のとおりライブラリー挿入用に実質的に調製し、電気穿孔法に使用できるDNAを調製した。
【０４４５】
代わりのアプローチとして、CD112のIgVドメインの特異的残基を標的とする部位特異的突然変異誘発によって生成されるサブライブラリーまたはCD112のIgVドメインのランダムライブラリーのいずれかを生成して、実施例1に記載のとおりCD112のIgVドメインのバリアントをさらに実質的に同定した。
【０４４６】
縮重またはランダムライブラリーDNAを、実施例2に記載のとおり酵母に実質的に挿入した。CD112の親和性改変バリアントを発現する酵母を、実施例3に記載される方法を使用して実質的に選択した。選択のために、以下の標的リガンドタンパク質を採用した：ヒトrTIGIT.Fc（すなわち、組換えTIGIT-Fc融合タンパク質）、rCD226.FcおよびrCD112R.Fc。磁気プロテインAビーズをNew England Biolabs（USA）から得た。2カラーフローサイトメトリーソーティングのために、Bio-Rad S3eソーターを使用した。CD112提示レベルを、Alexafluor 488で標識された抗ヘマグルチニン抗体（Life Technologies, USA）でモニタリングした。Fc融合タンパク質rTIGIT.Fc、rCD226.Fc、またはrCD112R.Fcのリガンド結合を、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）/側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲートアウトし、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合（これは、FL1でより限定されたタグ発現結合を有した）に基づいた。
【０４４７】
第二のソートアウトプット（F2）を、実施例3に記載のとおり、より高い特異的結合親和性についてアッセイされたソートアウトプットを拡大してその発現を再誘導することによって実質的に得て、これを使用して、親の野生型酵母系統と比較した結合を評価した。CD112について、各集団を抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、第二のFACSアウトプット（F2）を親CD112酵母と各rTIGIT.Fc、rCD226.Fc、およびrCD112Rの結合について比較した。
【０４４８】
選択されたアウトプットを、完全ECDドメインではなくIgVドメインのみを含むこと以外は実施例4に記載のとおり、Fc分子に融合されたCD112の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（バリアントIgVドメイン-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として実質的に再編成した。CD112アウトプットについてのいくつかの代わりの方法では、そのアウトプット由来のDNAを、Fc融合ベクターといずれかの端部上に40bpの重複領域を含有するプライマーでPCR増幅し、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs）を使用したインビトロ組換えを行って、これをその後、大腸菌系統NEB5αへの熱ショック形質転換に使用した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
【０４４９】
形質転換後、実施例4に記載のとおり試料をDNAシーケンス用に実質的に調製した。次いで、IgVコード領域の最初で開始するように配列を手動でキュレートした以外は実施例4に記載のとおり、配列を手動でキュレートした。キュレートされた配列を、実施例4に記載のとおりバッチ翻訳および整列させた。関心対象のクローンを、実施例4に記載のとおりの基準を使用して同定した。表18は、同定されたバリアントCD112親和性改変分子（各バリアントに含有されるアミノ酸置換を含む）を示す。
【０４５０】
該方法は、以下のとおりのタンパク質をコードするコーディングDNAが生成された、CD112の親和性改変IgVドメインを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続く、バリアント（突然変異体）IgVドメイン、続く、3つのアラニン（AAA）のリンカー、続く、突然変異N297Gを含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）。ヒトIgG1 Fcはまた、突然変異R292CおよびV302Cを含有した（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）。構築物は、システインと共有結合を形成できる任意の抗体軽鎖も含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、SEQ ID NO：226に示される野生型または未改変のFcと比較して、5位におけるシステイン残基のセリン残基への置き換え（C5S）を含有した。
【０４５１】
組換えバリアントCD112 Fc融合タンパク質を、実施例5に記載のとおり実質的に発現および精製した。親和性改変バリアントCD112 Fc融合タンパク質の結合および活性を、完全長ヒトCD226、TIGITおよびCD112R同族結合パートナーを発現する細胞を生成した以外は実施例6に記載のとおり実質的に評価した。細胞をフローサイトメトリーによってCD112 Fcバリアントで染色し、平均蛍光強度（MFI）を実施例5に記載のとおり決定した。生物活性の特徴付けのために、組換えCD112 Fcバリアントを、実施例5に記載のとおり抗CD3同時固定化アッセイで実質的に評価した。
【０４５２】
結合および活性の研究についての結果は、表18に示される。表は、それぞれの同族構造TIGIT、CD226およびCD112Rに対する親和性成熟についてのスクリーニングにおいて選択されたCD112のIgVドメイン内の例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（置き換え）を示す。例示的なアミノ酸置換は、SEQ ID NO：286に示される未改変の配列の位置に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。アミノ酸位置は中央に示され、対応する未改変の（例えば、野生型）アミノ酸は番号の前に列挙され、同定されたバリアントアミノ酸置換は番号の後に列挙される。カラム2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントECDについてのSEQ ID NO識別子を示す。
【０４５３】
また、同族カウンター構造体リガンドを発現するよう改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された場合の結合活性が、同じ細胞が発現しているカウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換（1つまたは複数）を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比として示される。また、T細胞の活性を調節するバリアントFc融合分子の機能活性も、抗CD3と同時固定された表示のバリアントFc融合分子で生成された培養上清中のIFNγの算出されたレベル（pg/ml）に基づいて、両方の機能的アッセイにおいて対応する未改変のCD112 IgV-Fcと比較した各バリアントCD112 IgV-Fcによって産生されたIFNγの比として示される。
【０４５４】
（表１８）同族結合パートナーに対して選択されたCD112バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
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【０４５５】
実施例11：膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞の生成および評価
上記のとおりのバリアントCD80またはICOSL親和性改変IgSFドメインのいずれかを含有する細胞外ドメイン（ECD）を含有する膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）がキメラ抗原受容体（CAR）と共発現された、改変されたT細胞を生成した。TIPはまた、対応する野生型CD80またはICOSL膜貫通型タンパク質配列の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有した。改変細胞の免疫調節活性を、CARだけを発現している細胞または対応する野生型CD80もしくはICOSL膜貫通型タンパク質をCARと共発現している細胞と比較した。
【０４５６】
例示的なCD80-TIPは、SEQ ID NO：28に示されるCD80細胞外ドメインならびにSEQ ID NO：1の残基243〜288に対応する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの位置に関してI67T/L70Q/A91G/T120Sに対応するIgVおよびIgCドメインにアミノ酸突然変異を含有する親和性改変IgSFドメインを有するバリアントCD80であった。例示的なCD80-TIPのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：381に示され、かつ、SEQ ID NO：382に示されるヌクレオチドの配列によってコードされる。対応する野生型CD80膜貫通型タンパク質は、SEQ ID NO：1のアミノ酸残基35〜288として示されるアミノ酸配列を有しており、かつ、SEQ ID NO：391に示されるアミノ酸配列によってコードされる。
【０４５７】
例示的なICOSL-TIPは、SEQ ID NO：32に示されるICOSL細胞外ドメインならびにSEQ ID NO：5の残基257〜302に対応する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインにおける位置に関してN52H/I143Tに対応するIgVドメインにアミノ酸突然変異を含有する親和性改変IgSFドメインを有するバリアントICOSLであった。例示的なICOSL-TIPのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：383に示され、かつ、SEQ ID NO：384に示されるヌクレオチドの配列によってコードされる。対応する野生型ICOSL膜貫通型タンパク質は、SEQ ID NO：5のアミノ酸残基19〜302として示されるアミノ酸配列を有しており、かつ、SEQ ID NO：392に示されるアミノ酸配列によってコードされる。
【０４５８】
親和性改変ドメインを含有するTIPまたは対応する親和性が改変されていないIgSFドメインを含有する野生型膜貫通型タンパク質を、T細胞においてCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する第1世代キメラ抗原受容体（CAR）と共発現させた。第1世代CARは、CD19に特異的なScFv（SEQ ID NO：385）、CD8に由来するヒンジおよび膜貫通ドメイン（SEQ ID NO：386）ならびにCD3ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン（SEQ ID NO：387に示される）を含んだ。CD19 scFv-CD3ζCARをコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：388に示される。
【０４５９】
CAR単独をコードする核酸分子、または自己切断性T2A配列によってCARから分離された例示的なTIPもしくは野生型膜貫通型タンパク質の1つもコードする核酸分子（SEQ ID NO：390およびSEQ ID NO：389に示されるヌクレオチドの配列によってコードされる）を生成した。例示的な構築物は、表19に示される核酸配列を含有した。対照として、CD28共刺激ドメインを追加で含有する第2世代CARをコードする核酸構築物も生成した（CD19 scFv-CD28-CD3ζ）。
【０４６０】
（表１９）核酸構築物
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【０４６１】
核酸分子をレンチウイルスベクターに個別にクローニングし、これを使用して3人の異なる健康なドナーから得られたヒトPBMC試料から単離されたT細胞を形質導入した。ベクターおよびレンチウイルスパッケージング構築物でのHEK293細胞の同時トランスフェクション後に、核酸配列を含有するレンチウイルス粒子を生産した。レンチウイルス粒子を超遠心分離によって培養培地から収集し、qRT-PCRによって滴定した。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、3人の正常な血液ドナーから密度沈降法を使用して単離した。PBMCを抗CD3および抗CD28抗体ならびにIL-2と一晩培養し、次いで、レンチウイルス調製物を感染多重度5：1で形質導入した。対照の第2世代CARをコードするレンチウイルスベクターを、1人のドナー由来の細胞を形質導入するためだけに使用した。
【０４６２】
培養の2週間（14日）後、細胞を、96ウェルマイクロエレクトロニクスプレート（E-プレート）の培養培地中のインピーダンス変動を測定し、かつリアルタイムプロットで細胞の数および形態学の変化を示すAcea Real-Time Cell Analyzer（RTCA）を使用して、標的抗原を発現する細胞との共培養後の細胞傷害性について分析した。CD19発現HeLa標的細胞（HeLa-CD19）を96ウェルE-プレートに播種し、RTCAシステムを使用して各単層のインピーダンスを24時間モニタリングした。改変されたT細胞をウェルにエフェクター：標的比10：1で加え、ウェルをさらに48時間モニタリングした。その結果を、測定された電気インピーダンスの変化から生じる細胞指数（Cell Index）（CI）値として表示および記録し、次いで、全ての時点の全てのウェルのCI読み取り値を同じ時間（基準時間）の個々のウェルのCI値で割って比率変換し、基準時間での値の割合を表すノーマライズされた細胞指数値を得た（Zhang et al. “Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigence（登録商標）System with RTCA Package. ” Bioconductor. May, 3, 2016, bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/RTCA/inst/doc/aboutRTCA.pdf. Accessed September 9, 2016を参照のこと）。このアッセイでは、単層のインピーダンスの減少は、形質導入細胞による標的細胞の殺傷を反映する。
【０４６３】
結果は、形質導入されていないT細胞と比較して第1世代CARを発現する細胞で減少したインピーダンスが得られたが、第1世代CARを発現する細胞についての減少したインピーダンスの程度は、第2世代CARを発現する細胞よりも小さかったことを示した。第1世代CARを発現する細胞における減少したインピーダンスは、一般に、アッセイの最初の8時間まで続いたが、一方で、第2世代CARを発現する細胞のみその後もインピーダンスの減少が続いた。
【０４６４】
図2に示されるとおり、1人のドナーでは、TIPまたは対応する野生型膜貫通型タンパク質を第1世代CARと共発現する細胞の各々は、インピーダンスのより大きな減少を示し、このことは、第1世代CARのみを発現する細胞と比較してより大きい細胞傷害活性を示した。さらに、結果は、親和性が改変されていないIgSFドメインを含有する対応する野生型CD80またはICOSL膜貫通型タンパク質を共発現しているCAR発現細胞と比較して、CD80-TIPまたはICOSL-TIPを共発現しているCAR発現細胞において細胞傷害活性がより大きかったことを示した。これらのTIP改変細胞の観察された結果は、CD80-TIPまたはICOSL-TIPをCARと共発現する細胞における細胞傷害活性が、抗原特異的T細胞、例えばCAR発現T細胞の細胞傷害性免疫応答を調節する活性の増強を発揮したこと示した。
【０４６５】
その他の2人のドナーでは、CD80-TIPを発現する細胞は、対応する野生型CD80膜貫通型タンパク質を発現する細胞と比較してより大きなインピーダンスの減少をもたらさなかった。1人のドナーでは、野生型膜貫通型タンパク質構築物を細胞に形質導入するのに十分ではなかったが、このドナーでは、ICOS-L TIPは、試験したその他の構築物と比較して最良の細胞傷害性を与えた。他のドナーでは、ICOS-L-TIPを発現する細胞は、対応する野生型ICOS-L膜貫通型タンパク質を発現する細胞と比較してより大きなインピーダンスの減少をもたらさなかった。試験した細胞において、CD80-TIP、ICOSL-TIPまたは対応する野生型膜貫通型タンパク質のいずれかをCARと共発現する全ての細胞は、第1世代CARのみを発現する細胞よりも大きな細胞傷害活性を示した。ドナーの中で観察された結果の違いは、ドナーの中のT細胞の違い、細胞の表面の種々の改変されたタンパク質の発現レベルの違い、細胞における殺傷の評価（例えば、14日目の形質導入細胞の評価、単一のエフェクター：標的細胞比の評価）のためのこの例示的アッセイにおいて使用された特定の条件、または他の要因に関連し得る。
【０４６６】
本明細書において本発明の好ましい態様が示されかつ記載されているが、このような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載される本発明の態様の種々の代替物を、本発明を実施する際に用いてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、ならびに、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構成物がそれによって網羅されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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