(57)【要約】  ＣＨ１及びＣＫドメイン間の二量体化から形成され、且つ２つの標的抗原に結合する多量体多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質は、産生及び疾患、特に癌又は感染性疾患の処置で利点を有する。
2018519296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）であって、前記ＣＨ１又はＣκドメインがそのＣ末端でヒトＦｃドメインに融合されている、可変ドメインをそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含む多重特異的タンパク質であって、前記第１の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位がＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第２の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメイン及び二量体Ｆｃドメインを形成し、前記ポリペプチド鎖の１つが、第２の抗原結合ドメインを形成する抗原結合ドメインをさらに含み、前記Ｆｃドメインが残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含み、且つヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する、多重特異的タンパク質。
【請求項２】
ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含む多重特異的タンパク質であって、第１の（中心）鎖が、２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位と、前記単位間に介在するヒトＦｃドメインとを含み、第２の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とヒトＦｃドメインとを含み、且つ第３の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、前記中心鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第２の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメイン及び二量体Ｆｃドメインを形成し、前記中心鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第３の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第２の抗原結合ドメインを形成し、前記Ｆｃドメインが残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含み、且つヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する、多重特異的タンパク質。
【請求項３】
３つの目的の抗原に結合する多重特異的タンパク質であって、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含み、第１の（中心）鎖が２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、且つ第２及び第３の鎖のそれぞれが１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、前記中心鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第２の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメインを形成し、前記中心鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第３の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第２の抗原結合ドメインを形成し、前記ポリペプチド鎖の１つが、第３の抗原結合ドメインを形成する抗原結合ドメインをさらに含む、多重特異的タンパク質。
【請求項４】
第１の（中心）鎖が、２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位と、前記単位間に介在するヒトＦｃドメインとを含み、且つ前記第２の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とヒトＦｃドメインとを含み、前記中心鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の１つが、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第２の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメイン及び二量体Ｆｃドメインを形成する、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
３つの目的の抗原とヒトＣＤ１６ポリペプチドとに結合する多重特異的タンパク質であって、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含み、第１の（中心）鎖が、Ｎ末端からＣ末端へと、第１のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位、ヒトＦｃドメイン及び第２のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、且つ第２の鎖が、Ｎ末端からＣ末端へと、第１のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位及びヒトＦｃドメインを含み、且つ第３の鎖がＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、前記中心鎖の前記第１のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第２の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメイン及び二量体Ｆｃドメインを形成し、前記中心鎖の前記第２のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって前記第３の鎖の前記Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第２の抗原結合ドメインを形成し、前記第３のポリペプチド鎖が、第３の抗原結合ドメインを形成する抗原結合ドメインをさらに含む、多重特異的タンパク質。
【請求項６】
前記Ｆｃドメインが残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含み、且つヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する、請求項３〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインと前記第２のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインとが、第１の抗原に特異的に結合する同一の第１の親抗体に由来し、且つ前記第１のポリペプチドの前記第２の可変ドメインが、第２の抗原に特異的に結合する第２の親抗体由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
二量体Ｆｃドメインを有する二量体であり、ドメイン配置：
【化１】
2018519296.tif 000081
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、且つＶ２の対が第２のＡＢＤを形成する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
二量体Ｆｃドメインを有する三量体であり、ドメイン配置：
【化２】
2018519296.tif 000082
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、且つＶ２の対が第２のＡＢＤを形成する、請求項２又は６若しくは７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ドメイン配置：
【化３】
2018519296.tif 000083
を有する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ドメイン配置：
【化４】
2018519296.tif 000084
を有する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ドメイン配置：
【化５】
2018519296.tif 000085
を有する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ドメイン配置：
【化６】
2018519296.tif 000086
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対が第２のＡＢＤを形成し、且つ前記Ｖ３が対形成して第３のＡＢＤを形成する、請求項３〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ドメイン配置：
【化７】
2018519296.tif 000087
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対が第２のＡＢＤを形成し、且つ前記Ｖ３が対形成して第３のＡＢＤを形成する、請求項３若しくは４又は６若しくは７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ドメイン配置：
【化８】
2018519296.tif 000088
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対が第２のＡＢＤを形成し、且つ前記Ｖ３が対形成して第３のＡＢＤを形成する、請求項３若しくは４又は６若しくは７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
第１の目的の抗原に結合する第１のＡＢＤと、第２の目的の抗原に結合する第２のＡＢＤと、第３の目的の抗原に結合する第３のＡＢＤとを含む多量体タンパク質であって、ドメイン配置：
【化９】
2018519296.tif 000089
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対が第２のＡＢＤを形成し、且つ前記Ｖ３が対形成して第３のＡＢＤを形成する、多量体タンパク質。
【請求項１７】
第１の目的の抗原に結合する第１のＡＢＤと、第２の目的の抗原に結合する第２のＡＢＤと、Ｎ連結グリコシル化を有し且つヒトＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインとを含む多量体タンパク質であって、ドメイン配置：
【化１０】
2018519296.tif 000090
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、且つＶ２の対が第２のＡＢＤを形成する、多量体タンパク質。
【請求項１８】
ドメイン配置：
【化１１】
2018519296.tif 000091
を有する、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
ドメイン配置：
【化１２】
2018519296.tif 000092
を有する、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ドメイン配置：
【化１３】
2018519296.tif 000093
を有する、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２１】
Ｆｃドメインがヒンジ領域を介して抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン及び／又はＣＫドメインに融合されており、前記ヒンジ領域が、前記ヒンジ領域中のシステイン残基を非システイン残基で置換するためのアミノ酸改変を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
第１の目的の抗原に結合する第１のＡＢＤと、第２の目的の抗原に結合する第２のＡＢＤと、第３の目的の抗原に結合する第３のＡＢＤと、Ｎ連結グリコシル化を有し且つヒトＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインとを含む多量体タンパク質であって、ドメイン配置：
【化１４】
2018519296.tif 000094
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、且つＶ２の対が第２のＡＢＤを形成する、多量体タンパク質。
【請求項２３】
第１の目的の抗原に結合する第１のＡＢＤと、第２の目的の抗原に結合する第２のＡＢＤと、第３の目的の抗原に結合する第３のＡＢＤと、Ｎ連結グリコシル化を有し且つヒトＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインとを含む多量体タンパク質であって、ドメイン配置：
【化１５】
2018519296.tif 000095
を有し、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインであり、Ｖ１の対が第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対が第２のＡＢＤを形成し、且つ前記Ｖ３が対形成して第３のＡＢＤを形成する、多量体タンパク質。
【請求項２４】
前記可変ドメインのそれぞれが単一免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
Ｆｃドメインがヒンジ領域又はリンカーペプチドを介して抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン及び／又はＣＫドメインに融合されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記多重特異的ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体の一価結合に対する親和性と実質的に均等な一価結合に対する親和性でヒトＦｃγ受容体に結合する、請求項１〜１３又は１７〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２７】
表面上に固定されて、Ｂｉａｃｏｒｅによる表面プラズモン共鳴を使用して決定された場合に、２０００ｎＭ以下、任意選択により１３００ｎＭ以下、任意選択により１１００ｎＭ以下である一価結合に対するＫＤで可溶性ヒトＣＤ１６に結合する、請求項１〜１３又は１７〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃγ受容体への結合を増加させるためのアミノ酸置換を含むヒトＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記Ｆｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能なＣＨ３ドメインを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
ヒトＦｃγ受容体への結合を実質的に欠いている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
１つのＡＢＤが、エフェクター細胞の表面で発現される活性化受容体に結合し、且つ１つのＡＢＤが癌、ウイルス又は細菌抗原に結合する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３２】
１つのＡＢＤが、エフェクター細胞の表面で発現される活性化受容体に結合し、且つ２つのＡＢＤがそれぞれ癌、ウイルス又は細菌抗原に結合する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
（ｉ）免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインによって結合される前記活性化受容体以外の目的の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインとを含むタンパク質。
【請求項３４】
前記抗原結合部位の少なくとも１つが、従来のヒトＩｇＧ１抗体中の抗原結合部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を有するように構成されている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
少なくとも１つのポリペプチド鎖を含み、前記少なくとも１つのポリペプチド鎖が、可撓性リンカー、任意選択により可撓性ポリペプチドリンカーによって定常ドメイン又はＦｃドメインに結合された抗原結合ドメインを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３６】
前記活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞を誘導して、癌、ウイルス又は細菌抗原を発現する標的細胞を溶解させることができ、前記標的細胞の前記溶解が、前記活性化受容体によるシグナル伝達によって少なくとも部分的に媒介される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記癌、ウイルス又は細菌抗原を発現する標的細胞の非存在下において、前記活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞中で前記活性化受容体によるシグナル伝達を誘導しないか又は増加させない、請求項３６に記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記第３の抗原結合ドメインが、標的細胞によって発現される目的の抗原に結合し、前記目的の抗原が、前記第２の抗原結合ドメインによって結合される前記目的の抗原と同一であるか又は異なる、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記第３の抗原結合ドメインが、前記第１の抗原結合ドメインによって結合される前記活性化受容体以外の免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記第１の抗原結合ドメインがヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、前記第２の抗原結合ドメインが癌抗原に結合し、且つ前記第３の抗原結合ドメインがヒトＣＤ１３７に結合する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４１】
ヒトＣＤ１６に結合するＦｃドメインを含み、任意選択によりさらに、前記抗原結合ドメインがいずれもＣＤ１６Ａに結合しない、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載のタンパク質。一態様では、前記タンパク質が、本明細書で開示される任意の実施形態の特徴又はドメイン配置を有する。
【請求項４２】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の多量体タンパク質である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４３】
少なくとも１つのＡＢＤが、完全長ヒトＩｇＧ１抗体の結合時に細胞内インターナリゼーションの誘導又は増加を受け得ることが分かっている癌、ウイルス又は細菌抗原に結合する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４４】
標的細胞上の、前記タンパク質が結合する抗原の細胞内インターナリゼーションを実質的に増加させない、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項４６】
疾患の処置のための薬剤としての、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のタンパク質又は組成物の使用。
【請求項４７】
対象における疾患を処置する方法であって、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４８】
前記疾患が癌又は感染性疾患である、請求項４６又は４７に記載の方法又は使用。
【請求項４９】
ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３２のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか一項に記載の第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意するステップ、
（ｃ）任意選択により、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の第３のポリペプチド鎖を含む第３の核酸を用意するステップ、及び
（ｄ）前記第１及び第２（並びに任意選択により第３）の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２（並びに任意選択により第３）のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、前記産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択によりプロテインＡ支持体上にローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法。
【請求項５０】
多量体ポリペプチドを同定又は評価する方法であって、
（ａ）請求項１〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖をコードする核酸を用意するステップ、
（ｂ）前記核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記ポリペプチド鎖を産生させ、且つ前記ポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質を回収するステップ、及び
（ｃ）前記産生されたポリペプチドを目的の生物学的活性に関して評価するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
エフェクター細胞に結合し、且つこのエフェクター細胞を特異的に再誘導して目的の標的細胞を溶解させるために使用され得る多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質形態は、疾患の処置において有用性を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，４９１号明細書及び２０１５年６月２３日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１５／０６４０７０号明細書の利益を主張し、これらは両方とも、全ての図面及び配列表を含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１６年６月２１日に作成された３０１ＫＢサイズの「ＢＩＳＰ３ＰＣＴ＿ＳＴ２５  ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
２つの異なるエピトープに結合する二重特異的抗体は、特異性を高める機会、効力を拡張する機会、及び従来のモノクローナル抗体では達成できない作用の新規な機序を利用する機会を提供する。同時に２つの標的に結合する二重特異的抗体の様々な形態が報告されている。また、二重特異的抗体を用いて２つの異なる受容体を架橋してシグナル伝達経路を阻害することは、様々な適用例で有用性を示している（例えば、（非特許文献１）を参照されたい）。二重特異的抗体は、２つの異なる受容体を中和するために使用されてきた。他のアプローチでは、二重特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を動員するために使用され、ここで、Ｔ細胞の活性化が、２つの異なる細胞型における受容体に同時に結合する二重特異的抗体によって腫瘍細胞の近傍で達成される（（非特許文献２）を参照されたい）。そのようなアプローチの殆どは、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に連結する二重特異的抗体を含む。最もよく研究されている二重特異的抗体形態は、Ｆｃドメインを含まない「ＢｉＴｅ」抗体及び「ＤＡＲＴ」抗体である。しかしながら、これらの抗体は、作製が困難であること、長期にわたる細胞の成長を必要とすること、作製収率が低いこと、及び／又は均質なタンパク質組成物として（公開されている文献に基づいて）作製され得ないことが知られている。特に、Ｔ細胞を完全に活性化させるには、Ｔ細胞とＢｉＴＥのクラスターとが標的細胞の表面上で相互作用しなければならない。ＢｉＴＥ形態で機能する抗体可変領域を見出すことの困難さに起因して、今日まで、ＣＤ１９×ＣＤ３特異的抗体ブリナツママブ（ｂｌｉｎａｔｕｍａｍａｂ）では単一の免疫細胞受容体（ＣＤ３）のみが標的とされている。今日までに開発された二重特異的抗体として、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に連結するものも挙げられる。別の例では、ＦｃγＲＩＩＩに結合する１つのアームとＨＥＲ２受容体に結合するもう１つとを有する二重特異的抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣及び乳房腫瘍の治療のために開発された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊａｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２０８５０−２０８５９
【非特許文献２】Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（１２）：４９４１−４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、二重特異的抗体の様々な形態の存在にもかかわらず、その結果として、当技術分野では、２つ以上の生物学的標的に結合し得、及び工業的発展のために魅力的な特性を有する新規で十分に定義された作用機序を有するタンパク質が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、標準的な組換え作製技術に適合することによる製造上の利点を有し、さらに生成物に特異的な折り畳み又は精製技術の開発を必要としない、広範囲にわたる抗体可変領域の容易な使用を可能する機能的タンパク質形態の発見に由来する。新規のタンパク質形態を使用して、所望の可変領域の組込みにより任意の所望の抗原に結合することができるが、多重特異的タンパク質が、標的細胞（例えば、除去するか又は枯渇させる細胞）上の１つ（又は任意選択により２つ若しくは３つ）の目的の抗原と、免疫細胞（例えば、リンパ球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞等）上の１つ、２つ又は３つの免疫エフェクター細胞活性化受容体（任意選択により、この活性化受容体の１つはヒトＣＤ１６Ａである）とに結合することができる有利な例が提供される。一部の例では、このタンパク質は、免疫グロブリン可変領域によって形成され、それにより標的抗原に結合する１つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｎ連結グリコシル化を含み且つ活性化受容体ＣＤ１６Ａに結合する二量体Ｆｃドメインとを有する。一部の例では、このタンパク質は、免疫グロブリン可変領域によりそれぞれ形成され、それにより２つ抗原（例えば、異なる抗原）に結合する２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｎ連結グリコシル化を含み且つ活性化受容体ＣＤ１６Ａに結合する二量体Ｆｃドメインとを有し、そのようなタンパク質が、ＣＤ１６Ａ以外のエフェクター細胞活性化受容体に結合するＡＢＤを含む場合、このタンパク質は、２つのエフェクター細胞活性化受容体（即ち、ＣＤ１６Ａ、及びＣＤ１６Ａ以外のエフェクター細胞活性化受容体）に結合し、それにより有利な免疫増強活性が生じる。他の例示的な多重特異的タンパク質は、免疫グロブリン可変領域によって形成された３つの抗原結合ドメインを有することができ、例えば、そのようなタンパク質は、異なるエフェクター細胞活性化受容体（例えば、ＣＤ１６Ａを含んでもよく又は含まなくてもよい）に結合する１つ又は２つのＡＢＤと、癌抗原に結合する１つ又は２つのＡＢＤとを有することができる。そのような３つのＡＢＤを有するタンパク質が、Ｎ連結グリコシル化を含み且つ活性化受容体ＣＤ１６Ａに結合する二量体Ｆｃドメインをさらに含む場合、例えば、このタンパク質は、癌抗原に結合する最大３つのＡＢＤを有することができるか、又は癌抗原に結合する１つ若しくは２つのＡＢＤと、ＣＤ１６Ａ以外のエフェクター細胞活性化受容体に結合する１つのＡＢＤとを有することができる。そのため、例示的な多重特異的タンパク質は３つの抗原に結合することができ、これらの抗原は同一であってもよく又は異なっていてもよい。
【０００８】
一実施形態では、（ｉ）免疫細胞（例えば、エフェクター細胞）上の活性化受容体（任意選択により活性化ＮＫ受容体）に結合する第１の抗原結合ドメインであって、任意選択により、この受容体が、ＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリメンバー又は免疫グロブリンスーパーファミリメンバーであり、任意選択により、この受容体が、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ８及びＮＫＧ２Ｄポリペプチドから選択される、第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、Ｎ連結グリコシル化を含み且つヒトＣＤ１６Ａに結合する二量体Ｆｃドメインとを含む多重特異的タンパク質が提供される。
【０００９】
別の実施形態では、（ｉ）免疫細胞（例えば、エフェクター細胞）上の活性化受容体（任意選択により活性化ＮＫ受容体）に結合する第１の抗原結合ドメインであって、任意選択により、この受容体が、ＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリメンバー又は免疫グロブリンスーパーファミリメンバーであり、任意選択により、この受容体が、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ８及びＮＫＧ２Ｄポリペプチドから選択される、第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）第１の抗原結合ドメインによって結合される活性化受容体以外の免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する第３の抗原結合ドメインとを含む多重特異的タンパク質が提供される。任意選択により、このタンパク質は、Ｎ連結グリコシル化を含み且つヒトＣＤ１６Ａに結合する二量体Ｆｃドメインをさらに含む。
【００１０】
一実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、癌細胞上で、感染細胞上で又は炎症誘発性細胞上で発現される抗原に結合し、例えば癌抗原に結合する。
【００１１】
一実施形態では、第１及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれ異なる活性化ＮＫ受容体に結合する。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＮＫ細胞上の活性化受容体（任意選択により天然細胞傷害受容体（例えば、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４））に結合し、第３の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）上の活性化受容体に結合する。任意選択により、第３の抗原結合ドメインはヒトＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ８又はＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００１２】
一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、例えば従来の完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して実質的なＦｃγＲ（例えば、ＣＤ１６）結合性を保持するように設計されている。任意選択により、この多重特異的タンパク質は、（例えば、そのＦｃドメインを介して）ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、この多重特異的抗体は、例えば従来の完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較してヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合が増加するように設計されており、任意選択により、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃドメインと比較して１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１３】
このタンパク質は、ヒトＣＨ１又はＣκ定常ドメインに融合された少なくとも１つの重鎖又は軽鎖可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む異なるポリペプチド鎖で作製されており、これらのタンパク質鎖は、ＣＨ１−Ｃκ二量体を受けて、非共有結合によって且つ任意選択によりさらにはそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間に形成されたジスルフィド結合によって互いに結合している。一般に、これらの鎖の２つはＦｃドメインを含み、それにより、二量体Ｆｃドメインが形成されている。
【００１４】
一実施形態では、第１、第２及び任意選択により第３の抗原に結合する、単離又は精製されたヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質であって、異なるＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位をそれぞれ含む２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、任意選択により、これらの鎖の２つが、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位のＣ末端に融合されたＦｃドメインをさらに含み、それにより、これらの鎖が、非共有結合によって且つ任意選択によりさらにはＣＨ１及びＣκドメイン間のジスルフィド結合によって互いに結合しており、任意選択により、それにより、これらの鎖が、それぞれの可変領域間、ＣＨ１及びＣκドメイン間の非共有結合によりさらに結合しており、任意選択によりさらに、これらの鎖の２つがＦｃドメインを含み、且つこのＦｃ部分のＣＨ３ドメイン間の非共有結合によりさらに結合している、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質が提供される。
【００１５】
これらの可変及び定常領域は、各鎖がその所望の相補的パートナー鎖と優先的に結合するように選択及び構成されている。従って、得られる多量体タンパク質は、組換え宿主細胞を使用する従来の作製方法を使用して作製することが簡単であろう。いずれのＶＨ、ＶＬが単位中のＣＨ１及びＣκと結合するかの選択は、所望の多量体の形成を駆動するように対形成する単位間の親和性に基づく。得られる多量体は、相補的なＶＨ及びＶＬドメイン間の非共有結合により、相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間の非共有結合により、並びに任意選択により相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間のジスルフィド結合（及び／又は任意選択によりさらには相補的なヒンジドメイン間のジスルフィド結合）により結合する。ＶＨ−ＶＬ結合はＶＨ−ＶＨ又はＶＬ−ＶＬと比べて強力であり、その結果として、本明細書で示すように、ＶＨ又はＶＬをＣＨ１又はＣκのいずれかに隣接して配置することができ、得られるＶ−Ｃ単位は、好ましくは、そのＶ−Ｃカウンターパートとパートナーになる。例えば、ＶＨ−Ｃκは、ＶＨ−ＣＨ１よりも優先的にＶＬ−ＣＨ１と対形成する。加えて、Ｆｃドメインを含むことにより、２つのＦｃ含有鎖がＦｃドメインのＣＨ３ドメイン間の非共有結合により結合することから、好ましい鎖対形成がさらに改善される。従って、任意選択によりＦｃ対形成とさらに組み合わされる様々なＶ−Ｃの組み合わせは、ヘテロ多量体タンパク質を作製するためのツールを提供する。
【００１６】
一例では、３つの抗原に結合する多重特異的タンパク質であって、これらの抗原の１つがヒトＣＤ１６である、多重特異的タンパク質が提供される。一実施形態では、このタンパク質は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）であり、ＣＨ１又はＣκドメインがそのＣ末端でヒトＦｃドメインに融合されている、可変ドメインをそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体を受けており、それにより第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）及び二量体Ｆｃドメインを形成し、これらのポリペプチド鎖の１つは、第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）を形成する抗原結合ドメインをさらに含み、ＦｃドメインはヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。一実施形態では、このＦｃドメインは、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む。一例では、このタンパク質は、ドメイン配置：
【化１】
2018519296.tif 000003
を有する。
【００１７】
一例では、３つの抗原に結合する多重特異的タンパク質であって、これらの抗原の１つがヒトＣＤ１６である、多重特異的タンパク質が提供される。一実施形態では、このタンパク質は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含み、第１の（中心）鎖が、２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位と、これらの単位間に介在するヒトＦｃドメインとを含み、第２の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とヒトＦｃドメインとを含み、且つ第３の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を受けており、それにより第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）及び二量体Ｆｃドメインを形成し、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を受けており、それにより第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）を形成し、ＦｃドメインがヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。一実施形態では、このＦｃドメインは、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む。一例では、このタンパク質は、ドメイン配置：
【化２】
2018519296.tif 000004
を有する。
【００１８】
一実施形態では、３つの抗原結合ドメインを有し、且つＦｃドメインによるＣＤ１６への結合性を欠いているか、又はＣＤ１６に結合するＦｃドメインをさらに含むヘテロ三量体タンパク質が提供される。そのようなタンパク質の一例は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含む三量体であって、第１の（中心）鎖が２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、且つ第２及び第３の鎖のそれぞれが１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、ＣＨ１−Ｄκ二量体化によって第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）を形成し、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位に結合され、それにより第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）を形成し、これらのポリペプチド鎖の１つが、第３の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ３）を形成する抗原結合ドメイン（例えば、直列型可変ドメイン、ｓｃＦｖ）をさらに含む、三量体である。一例では、このタンパク質は、ドメイン配置：
【化３】
2018519296.tif 000005
を有する。
【００１９】
３つの抗原結合ドメインを有するタンパク質がヒトＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインも含む場合、得られるタンパク質は、第１、第２及び第３の抗原に加えてＣＤ１６に結合することができる。
【００２０】
一実施形態では、中心鎖は、２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位間に介在するＦｃドメイン（又は一部）を含む。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドはＦｃドメイン（又はその一部）を含み、例えば、このＦｃドメインは第２又は第３の鎖中のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位のＣ末端に配置されており、中心鎖のＦｃドメイン（又は一部）と第２又は第３の鎖のＦｃドメインとがヘテロ多量体タンパク質内で結合して二量体Ｆｃドメインを形成する。一実施形態では、この二量体ＦｃドメインはヒトＦｃＲｎ及びヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。一実施形態では、このＦｃドメインは残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む。
【００２１】
ある鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が別の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位との二量体化を受けている場合、これらの単位は、非共有結合によって且つ任意選択によりさらにはそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間のジスルフィド結合（並びに、上記で論じたようにさらなる非共有結合）によって結合する。選択される可変（Ｖ）ドメイン及びＣＨ１／Ｃκは、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の各相補対が合わせて１つのＶＨ、１つのＶＬ、１つのＣＨ１及び１つのＣκドメインを含むように構成されている。
【００２２】
一実施形態では、第１の目的の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）と、第２の目的の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）であって、第１及び第２の抗原が同一である、第２の抗原結合ドメインと、第３の目的の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ３）と、ヒトＦｃドメインの少なくとも一部であって、ＦｃドメインがＡＢＤ１とＡＢＤ２との間に介在している、ヒトＦｃドメインの少なくとも一部とを含むヘテロ多量体多重特異的タンパク質が提供される。一例では、第１の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原であり、第２の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原（第１の抗原と同一若しくは異なるか、又は第１の抗原と同一のタンパク質上の異なるエピトープ）であり、且つ第３の抗原は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）によって発現される抗原である。一例では、これらの第１及び第２の抗原は同一の抗原（任意選択により、同一の抗原上の同一の又は異なるエピトープ）であり、それにより、この多重特異的タンパク質は、除去される標的細胞によって発現される抗原に二価の様式で結合し、且つ免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に一価の様式で結合する。そのような多重特異的タンパク質は、一価の様式でエフェクター細胞上の活性化受容体を誘発することによって標的細胞によって発現される抗原の有利な標的化を可能にし、それにより、標的細胞の非存在下でエフェクター細胞上の受容体でのアゴニスト活性を予防するか又は減少させる。一例では、第１の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原であり、第２及び第３の抗原は、それぞれ免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）により表面で発現される異なる活性化受容体であり、任意選択により、これらの抗原の一方はヒトＣＤ１３７であり、且つこれらの抗原の他方は異なる活性化免疫エフェクター細胞受容体であり、例えばヒトＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３又はＣＤ８である。一実施形態では、第２及び第３の抗原がそれぞれ異なる活性化受容体である場合、多重特異的タンパク質は一価の様式で各活性化受容体に結合する。
【００２３】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本多重特異的タンパク質は、一価の様式で免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、標的細胞（例えば、この多重特異的タンパク質が結合する抗原を発現する、除去される細胞）の存在下において、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞中で多重特異的タンパク質（又はそのＡＢＤ）が結合する活性化受容体のアゴニスト活性を媒介する（例えば、シグナル伝達を誘発する）ことができる。任意選択により、この多重特異的タンパク質は、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞及び標的細胞中で活性化受容体のアゴニスト活性を媒介することができるが、標的細胞の非存在下において、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞中で活性化受容体のアゴニスト活性を実質的に誘導も媒介もしない。アゴニスト活性を任意の適切な方法で評価することができ、例えば、免疫エフェクター細胞による活性化受容体依存性の標的細胞溶解の刺激、免疫細胞上の活性化及び／又は細胞傷害性マーカー、活性化受容体によるシグナル伝達又はシグナル伝達経路の評価等で評価することができる。
【００２４】
本多量体ポリペプチドは、１つ又は２つの鎖がＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化に基づいて中心鎖と二量体化する２つ又は３つの異なるポリペプチド鎖で構成されている。この多量体を中心（第１の）ポリペプチド鎖で構成することができ、この中心（第１の）ポリペプチド鎖は、このポリペプチド鎖上の２つの免疫グロブリン可変ドメイン間に介在するＦｃドメインを有する、別個の抗原結合ドメイン（例えば、抗原特異性が異なる）の一部である２つの免疫グロブリン可変ドメインと、これらの可変ドメインの１つ又はそれぞれに隣接するポリペプチド鎖上に配置されているＣＨ１又はＣＫ定常ドメインとを含む。次いで、第２の追加のポリペプチド鎖は、第１の免疫グロブリン可変ドメインと、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化を可能にするように選択されているＣＨ１又はＣＫ定常領域とを含むように構成され、免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接する中心鎖の可変ドメインを補完し、それによりこれらの相補的可変ドメインが第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される。次いで、第２及び第３の目的の抗原用の抗原結合ドメインをいくつかの構成に従って形成することができる。一構成では、中心ポリペプチド鎖は５つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、１つの可変ドメインは、（第２のポリペプチド中の可変ドメインと一緒に）第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインの一部であり、第２及び第３の可変ドメインは、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（カッパ）可変ドメイン（ＶＫ）、例えばｓｃＦｖ単位を形成する）として構成されており、第４及び第５の可変ドメインは、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメインとして構成されている。
【００２５】
第２の構成では、第２のポリペプチド鎖は、第３の抗原用の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメインとして構成された第２及び第３の可変ドメインを（第１の免疫グロブリン可変ドメイン及びＣＨ１又はＣＫ定常領域に加えて）含み、中心ポリペプチド鎖は３つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、１つの可変ドメインは、（第２のポリペプチド中の可変ドメインと一緒に）第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインの一部であり、第２及び第３の可変ドメインは、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメインとして構成されている。
【００２６】
第３の構成では、中心ポリペプチド鎖は、ＣＨ１又はＣＫ定常ドメインにそれぞれ隣接して配置された２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、これらの可変ドメインの一方は、（第２のポリペプチド中の可変ドメインと一緒に）第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインの一部である。次いで、第３のポリペプチド鎖は、（ａ）中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化を可能にし、それにより中心鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの第１の可変領域とが第２の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に隣接した第１の免疫グロブリン可変ドメインと、（ｂ）第３の抗原用の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメインとして構成された第２及び第３の可変ドメインとを含む。この構成では、中心鎖は、Ｆｃドメインが介在する２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、これら２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方は、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成し、且つこれら２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方は、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とヘテロ二量体を形成する。第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の免疫グロブリン可変ドメインは、中心鎖の不対可変ドメインを補完し、それによりこれらの相補的な可変ドメインが第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
【００２７】
一態様では、３つの目的の抗原（これらの抗原は同一であってもよく又は異なっていてもよい）に特異的に結合する多重特異的タンパク質であって、異なる抗原結合ドメインの一部である少なくとも２つの可変ドメイン、これらの可変ドメインの１つのＣ末端に融合されたＣＨ１又はＣκ定常領域（それにより、Ｃ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が形成される）、及びこれらの２つの可変ドメイン間に介在するＦｃドメインを含む中心（第１の）ポリペプチド鎖と、少なくとも１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位をそれぞれ含む第２及び／又は第３のポリペプチド鎖とを含み、第２のポリペプチド鎖（及び存在する場合には第３のポリペプチド）のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の可変ドメイン及びＣＨ１又はＣκ定常領域は、第１のポリペプチド鎖のＶ及びＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であり（しかしながら、第２又は第３の鎖の他方のＶ及びＣＨ１又はＣκに相補的ではない）、それにより、第２（及び存在する場合には第３のポリペプチド）鎖は中心鎖とＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体を優先的に形成し、それによりヘテロ二量体（又はヘテロ三量体）を形成する、多重特異的タンパク質が提供される。このＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体（又はヘテロ三量体）は非共有結合によって特徴付けられ、それぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間に形成されたジスルフィド結合によって任意選択によりさらに特徴付けられ得る。第２のポリペプチドがＦｃドメインを含む（及びＣＨ１／Ｃκ−Ｆｃドメインがヒンジドメインを含む）場合、このタンパク質は、ヒンジドメイン間に形成されたジスルフィド結合によって任意選択によりさらに特徴付けられ得る。
【００２８】
１つの有利な形態では、３つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を介して３つの目的の抗原（これらの抗原は同一であってもよく又は異なっていてもよい）に特異的に結合する三量体タンパク質であって、
（ｉ）第１のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位であって、Ｖドメインが第１のＡＢＤの一部を形成する、第１のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位、Ｆｃドメイン又はその一部、及び第２のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位であって、Ｖドメインが第２のＡＢＤの一部を形成する、第２のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を（例えば、Ｎ末端からＣ末端へと）含む中心（第１の）ポリペプチド鎖と、
（ｉｉ）Ｖ−ＣＨ１／Ｃκ単位（及び任意選択によりＦｃドメイン又はその一部）を（例えば、Ｎ末端からＣ末端へと）含む第２のポリペプチド鎖であって、可変ドメイン及びＣＨ１又はＣκ定常領域が中心ポリペプチド鎖の第１の（第２ではない）Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位のＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的である（例えば、それにより、第２の鎖は中心鎖とのＣＨ１／Ｃκ二量体化を受け、第２の鎖のＶドメインが中心鎖のＶドメインと一緒に第１のＡＢＤを形成する）、第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位、及び直列型可変領域（この直列型可変領域は第３のＡＢＤを形成する）を（例えば、Ｎ末端からＣ末端へと）含む第３のポリペプチド鎖であって、可変ドメイン及びＣＨ１又はＣκ定常領域が中心ポリペプチド鎖の第２の（第１ではない）Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の可変ドメイン及びＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的である（例えば、それにより、第３の鎖は中心鎖とのＣＨ１／Ｃκ二量体化を受け、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位のＶドメインが中心鎖のＶドメインと一緒に第２のＡＢＤを形成する）、第３のポリペプチド鎖と
を含む三量体タンパク質が提供される。一実施形態では、この直列型可変領域はｓｃＦｖ（ペプチドリンカーを介してＶＬに融合されたＶＨ）である。そのため、そのような三量体タンパク質は、２つのＦ（ａｂ）様構造と１つの直列型可変ドメインとを含むことができ、有利な結合特性がもたらされる。
【００２９】
一実施形態では、本多量体多重特異的タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合する二量体Ｆｃドメインを含む。
【００３０】
一例では、本多重特異的タンパク質は、第１、第２及び第３の抗原に特異的に結合することができ、第１の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原であり、第２の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原であり、且つ第３の抗原は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）によって発現される抗原であり、このエフェクター細胞を誘導して標的細胞（例えば、癌細胞）が溶解される。一実施形態では、第１及び第２の抗原は同一の抗原であり、それにより、この多重特異的タンパク質は、除去される標的細胞によって発現される抗原に二価の様式で結合し、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に一価の様式で結合する。そのような多重特異的タンパク質は、一価の様式でエフェクター細胞上の選択された活性化受容体を誘発することにより、標的細胞によって発現される抗原の有利な標的化を可能にすることができ、それにより（標的細胞の存在下で及び／又は非存在下で）エフェクター細胞上の他の受容体でのアゴニスト活性が予防されるか又は減少する。
【００３１】
別の例では、本多重特異的タンパク質は、第１、第２及び第３の抗原に特異的に結合することができ、第１の抗原は、除去される標的細胞によって発現される抗原であり、第２の抗原は、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原であり、且つ第３の抗原は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）によって発現される抗原であり、これらのエフェクター細胞は標的細胞（例えば、癌細胞）に誘導される。このエフェクター細胞上の抗原は有利には活性化受容体であり得る。一実施形態では、第２及び第３の抗原は異なる抗原であり、それにより、この多重特異的タンパク質は、除去される標的細胞によって発現される抗原に一価の様式で結合し、免疫エフェクター細胞によって発現される２つの異なる抗原（例えば、活性化受容体）に一価の様式で結合する。そのような多重特異的タンパク質は、エフェクター細胞上の複数の経路を誘発することにより、及び／又はエフェクター細胞の複数の集団の（標的細胞への）再誘導を引き起こすことにより、標的細胞によって発現される抗原の有利な標的化を可能にすることができる
【００３２】
さらに、主題の多重特異的タンパク質にＣＤ１６が結合するにもかかわらず、予想外にも、目的の抗原の標的化が、従来の抗体（例えば、完全長ヒトＩｇＧ１）が結合する場合に下方調節又はインターナリゼーションに対して敏感であることが知られている場合であっても、この多重特異的タンパク質は、目的の抗原の下方調節又はインターナリゼーションを誘導又は増加しない。これに基づき、主題の多重特異的タンパク質は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞又は感染細胞）によって発現される目的の抗原の標的化に十分適しているはずであり、例えば、従来の抗体（例えば、ＣＤ１６結合性を保持するヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する抗体）が結合する場合に下方調節又はインターナリゼーションを受け得ることが知られている抗原の標的化に十分適しているはずである。これは治療上の巨大な利益であり、なぜなら、当技術分野では、抗原インターナリゼーションは、従来のヒトＩｇＧ１抗体の標的細胞に対してＡＤＣＣを媒介する能力を実質的に妨げる可能性があることが知られているからである。そのため、一実施形態では、多重特異的タンパク質（又はそのＡＢＤ）は、従来の抗体（例えば、モノクローナル単一特異的ヒトＩｇＧ１）への結合時にインターナライズすることが知られている、標的細胞によって発現される抗原に結合し、この多重特異的タンパク質は、従来の抗体と比較して抗原のインターナリゼーションの誘導又は増加が少ない（又は生じない）。
【００３３】
一部の実施形態では、この多重特異的抗体はヒトＣＤ１６に結合するように設計され得、従って、任意選択によりエフェクター細胞上の他の活性化受容体に加えて、ＣＤ１６を介して標的細胞溶解を媒介することができる。
【００３４】
一部の実施形態（３つの免疫グロブリンＡＢＤを含むタンパク質）では、この多重特異的抗体は、ヒトＣＤ１６及び／又は他のＦｃγＲへの結合性を欠くように設計され得、ＣＤ１６を介してエフェクター細胞を実質的に活性化させず、この多重特異的抗体は、この多重特異的抗体の超可変領域が結合する抗原の機能として、特定の目的のエフェクター細胞に対して選択的であり、任意選択により、あらゆる望まれていないＦｃγＲ媒介架橋効果若しくは毒性（例えば、サイトカイン媒介毒性）及び／又は標的とされるエフェクター細胞の抑制性ＦｃγＲ媒介抑制を回避する。この多重特異的ポリペプチドは、例えば、標的抗原発現エフェクター細胞を誘導して標的抗原（例えば、癌抗原、ウイルス抗原等）を発現する標的細胞を溶解させることができる。ＣＤ１６結合が望まれていない場合、この多量体ポリペプチドは、ＣＤ１６に結合しない単量体Ｆｃドメイン又は二量体Ｆｃドメインを有するように設計され得る。単量体Ｆｃドメインの場合、このＦｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためにＣＨ３二量体界面で１つ以上アミノ酸変異（例えば、置換）を有するＣＨ３ドメインを含むことができる。単量体Ｆｃドメインの別の例では、このＦｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するために直列型ＣＨ３ドメインを含むことができる。
【００３５】
一例では、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖ１−Ｖ１−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）
を有し、それにより、ドメイン配置：
【化４】
2018519296.tif 000006
を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成され、一方のＶ１は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１は重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２は重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３は重鎖可変ドメインである。Ｖ１の対は第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対は第２のＡＢＤを形成し、且つ第Ｖ３は対形成して第３のＡＢＤを形成する。例えば、直列型ＣＨ３ドメインを含むことにより、又はＣＨ３−ＣＨ３二量体化を減少させるアミノ酸改変を行なうことにより、中心ポリペプチド鎖間でのＣＨ３ヘテロ二量体化を回避するようにＦｃドメインを構成することができる。
【００３６】
別の例では、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−Ｖ１−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｖ３−Ｖ３を有し、それにより、ドメイン配置：
【化５】
2018519296.tif 000007
を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成される。
【００３７】
別の例では、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂを有し、それにより、ドメイン配置：
【化６】
2018519296.tif 000008
を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成され、一方のＶ１は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１は重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２は重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３は重鎖可変ドメインである。Ｖ１の対は第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対は第２のＡＢＤを形成し、且つ第Ｖ３は対形成して第３のＡＢＤを形成する。
【００３８】
別の例では、形成されるヘテロ多量体ポリペプチドは、ドメイン配置：
【化７】
2018519296.tif 000009
を有する。
【００３９】
別の例では、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｖ３−Ｖ３を有する。形成されるヘテロ多量体ポリペプチドは、ドメイン配置：
【化８】
2018519296.tif 000010
を有することができる。
【００４０】
任意選択により、任意の実施形態では、本多量体タンパク質の第２及び存在する場合には第３のポリペプチド鎖は、相補的なＶＨ及びＶＬドメイン間の非共有結合により、相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間の非共有結合によって且つ任意選択により相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間のジスルフィド結合（及び／又は、両方の鎖に存在する場合には任意選択によりさらに相補的なヒンジドメイン間のジスルフィド結合）によって中心／第１の鎖に結合していることにより特徴付けられ得る。第２又は第３の鎖がＦｃドメイン含有鎖である場合、第２又は第３の鎖は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン間の非共有結合により中心／第１の鎖に結合していることによって特徴付けられ得る。
【００４１】
また、精製された又は均質な組成物であって、この組成物中のタンパク質の少なくとも９０％、９５％又は９９％が本開示の多量体ポリペプチドであり、例えば、２つ又は３つのポリペプチド鎖で構成され且つ本明細書で示すドメイン構造を有するタンパク質である、組成物も提供される。
【００４２】
任意選択により、任意の実施形態では、可変ドメインのそれぞれは単一免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインである。任意選択により、任意の実施形態では、１つ以上のＡＢＤ（ＡＢＤのそれぞれの１つ以上）は、抗原に結合する単一非免疫グロブリン結合ドメインであり、例えば非免疫グロブリン足場を含む。
【００４３】
任意選択により、任意の実施形態では、異なるドメイン間（例えば、直列に配置された２つのＶドメイン間、ＶドメインとＣＨ１又はＣκドメインとの間、ＣＨ１又はＣκドメインとＦｃドメインとの間、ＦｃドメインとＶドメインとの間）の同一のポリペプチド鎖上の融合又は連結は介在アミノ酸配列を介して起こり得、例えばヒンジ領域又はリンカーペプチドを介して起こり得る。
【００４４】
別の実施形態では、具体的には、細胞表面活性化受容体でアゴニスト活性が望まれている場合、多重特異的タンパク質は、例えば従来のヒトＩｇＧ抗体のＡＢＤと比較して１つ以上の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）の運動（鎖内ドメイン運動）の自由度又は柔軟性が増加している構造を有する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、第１の抗原結合ドメインの抗原結合部位と第２の抗原結合ドメインの抗原結合部位とが、機能（例えば、この多重特異的タンパク質が、細胞表面受容体を介したシグナル伝達及び／又は標的細胞の溶解を誘導する能力）を向上させる距離（例えば、任意選択により８０オングストローム（Å）未満の距離）で分離されることを可能にする構造を有する。ＡＢＤがより大きい柔軟性を有し、及び／又は最適化された距離で分離されている多重特異的タンパク質は、溶解性エフェクター細胞標的シナプスの形成を増強することができ、それにより活性化受容体に媒介されるシグナル伝達が増強される。
【００４５】
一実施形態では、（例えば、従来のヒトＩｇＧ抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）のＡＢＤと比較して）抗原結合ドメインの運動の自由が増加している多重特異的タンパク質である。そのようなタンパク質の一例は、抗原結合ドメイン（例えば、免疫細胞上の活性化受容体に結合するＡＢＤ又は目的の抗原に結合するＡＢＤ）が可撓性リンカーを介してＦｃドメインに連結又は融合された単量体又は多量体Ｆｃドメイン含有タンパク質（例えば、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体）である。このリンカーは、このリンカーで曲げてＡＢＤとＦｃドメインとの間（又は２つのＡＢＤ間）の角度を潜在的に減少させる能力を付与することにより、１つ以上のＡＢＤの柔軟性又は運動の自由度を提供することができる。任意選択により、両方の抗原結合ドメイン（及び任意選択により、さらなるＡＢＤが多重特異的タンパク質中に存在する場合にはより多く）が、リンカー（概して可撓性ペプチドリンカー）を介してＦｃドメインに連結又は融合されている。任意選択により、１つ以上のエフェクター機能を変更（増強又は阻害）するために任意選択により改変され得る定常ドメイン等の他の配列又はドメインがＦｃドメインとＡＢＤとの間に配置されており、例えば、それにより、ＡＢＤは可撓性リンカー及び定常領域を介してＦｃドメインに融合されている。任意選択により、運動の自由度が増加しているタンパク質は、このタンパク質が、抗活性化受容体結合部位と目的の標的細胞抗原結合部位との間の距離が両方の結合ドメインがＦａｂであったタンパク質で観測した場合と比べて小さいか、又は完全長抗体で観測した場合と比べて小さい高次構造を採用することを可能にする。
【００４６】
ＡＢＤを、可撓性リンカーを介して（任意選択により、定常領域ドメイン又はその一部等の介在配列、例えばＣＨ１又はＣＫを介して）Ｆｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に接続することができる。このリンカーはポリペプチドリンカーであり得、例えば、少なくとも５個の残基、少なくとも１０個の残基、少なくとも１５個の残基、少なくとも２０個の残基、少なくとも２５個の残基、少なくとも３０個の残基又はより多くの長さを含むペプチドリンカーであり得る。他の実施形態では、このリンカーは、２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜３０個の残基、１０〜２４個の残基、１０〜２６個の残基、１０〜３０個の残基又は１０〜５０個の残基の長さを含む。任意選択により、リンカーは抗体定常領域に由来するアミノ酸配列を含み、例えばＮ末端のＣＨ１又はヒンジ配列を含む。任意選択により、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含む。任意選択により、リンカーは、グリシン及び／又はセリン残基で主に又はそれのみで構成されている可撓性リンカーであり、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ２Ｓ）２ＧＧＡＤ又はアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３である。
【００４７】
任意選択により、任意の実施形態では、各抗原結合ドメインは抗体の超可変領域を含み、任意選択により重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。任意選択により、任意の実施形態では、可変ドメインはヒトフレームワーク領域由来のフレームワーク残基を含み、例えば、可変ドメインは、ヒト又は非ヒト起源の１つ、２つ又は３つのＣＤＲとヒト起源のフレームワーク残基とを含む。
【００４８】
任意選択により、任意の実施形態では、目的の抗原の１つ又は２つは、癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原であり、且つ目的の抗原の１つ又は２つは、免疫エフェクター細胞の表面上で発現されるポリペプチドである。任意選択により、任意の実施形態では、目的の抗原の２つは癌抗原（例えば、同一の抗原又は異なる抗原）であり、且つ目的の抗原の１つは、免疫エフェクター細胞の表面上で発現されるポリペプチドである。任意選択により、任意の実施形態では、目的の抗原の１つは癌抗原であり、且つ目的の抗原の２つは、免疫エフェクター細胞の表面上で発現される異なる活性化受容体ポリペプチドである。
【００４９】
任意選択により、任意の実施形態では、目的の抗原の３つ全ては、癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原であり、且つ多量体タンパク質は、ヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含む。任意選択により、目的の抗原の３つ全ては異なる癌抗原である。
【００５０】
一実施形態では、（ｉ）免疫エフェクター細胞上の活性化受容体（例えば、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ｄ又は本明細書で開示されている他のポリペプチド）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）第１の抗原結合ドメインによって結合される活性化受容体以外の目的の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインとを含むタンパク質が提供される。例えば、第３の抗原結合ドメインは、標的細胞によって発現される目的の抗原に結合することができ、この目的の抗原は、第２の抗原結合ドメインによって結合される目的の抗原と同一であるか又は異なる。一実施形態では、第３の抗原結合ドメインは第２の抗原結合ドメインと同一の目的の抗原に結合し、任意選択によりさらに、第３の抗原結合ドメインは、目的の抗原上において第２の抗原結合ドメインと同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合ドメインは癌抗原に結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合ドメインは、悪性免疫細胞（例えば、血液系腫瘍に関与する細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞）の表面で発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質、ＣＤ１９タンパク質、ＣＤ２０タンパク質等に結合する。一実施形態では、このタンパク質を使用して血液系腫瘍を処置し、例えば白血病又はリンパ腫細胞を処置する。別の実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合ドメインは、感染細胞の表面上で又はウイルス感染細胞、細菌感染細胞若しくは寄生虫感染細胞等の感染因子によって発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質に結合する。任意選択により、このタンパク質は一価の様式で活性化受容体に結合する（このタンパク質は、活性化受容体に結合する単一の抗原結合ドメインを含む）。任意選択により、このタンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメインを含み、任意選択によりさらに、いずれの抗原結合ドメインもＣＤ１６Ａに結合しない。一態様では、このタンパク質は、本明細書で開示されている任意の実施形態の特徴又はドメイン配置を有する。
【００５１】
一実施形態では、（ｉ）免疫エフェクター細胞上の活性化受容体（例えば、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ｄ又は本明細書で開示されている他のポリペプチド）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）第１の抗原結合ドメインによって結合される活性化受容体以外の免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する第３の抗原結合ドメインとを含むタンパク質が提供される。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインはヒトＮＫｐ４６に結合し、第２の抗原結合ドメインは癌抗原に結合し、且つ第３の抗原結合ドメインはヒトＣＤ１３７に結合する。一実施形態では、第２の抗原結合ドメインは癌抗原に結合し、任意選択により、悪性免疫細胞（例えば、血液系腫瘍に関与する細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞）の表面で発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質、ＣＤ１９タンパク質、ＣＤ２０タンパク質等に結合する。一実施形態では、このタンパク質を使用して血液系腫瘍を処置し、例えば白血病又はリンパ腫細胞を処置する。別の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、感染細胞の表面上で又はウイルス感染細胞、細菌感染細胞若しくは寄生虫感染細胞等の感染因子によって発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質に結合する。任意選択により、このタンパク質は一価の様式で活性化受容体のそれぞれに結合する（このタンパク質は、活性化受容体に結合する単一の抗原結合ドメインを含む）。任意選択により、このタンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメインを含み、任意選択によりさらに、いずれの抗原結合ドメインもＣＤ１６Ａに結合しない。一態様では、このタンパク質は、本明細書で開示されている任意の実施形態の特徴又はドメイン配置を有する。
【００５２】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、本多量体タンパク質は、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対する場合と比べて、癌抗原（又はウイルス若しくは細菌抗原）に対する大きい結合親和性（一価）を有する。そのような抗体は有利な薬理学的特性をもたらす。本発明の実施形態のいずれかの一態様では、このポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現されるポリペプチドへの結合に対して、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満又は好ましくは１０−９Ｍ未満の、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原への結合（一価）に対するＫｄを有し、任意選択により、このポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原への結合（一価）に対するＫｄと比べて低い、癌、ウイルス又は細菌抗原への結合（一価）に対するＫｄを有する（即ち、より良好な結合親和性を有する）。
【００５３】
本明細書のポリペプチドのいずれかの一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、目的の抗原の１つを発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を誘導して、他の目的の抗原を発現する標的細胞（例えば、癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌細胞、炎症誘発性細胞等）を溶解させることができる。
【００５４】
本明細書のポリペプチドのいずれかの一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含み、且つこのタンパク質は、ヒトＣＤ１６を発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を誘導して、目的の抗原の１つ以上を発現する標的細胞（例えば、癌細胞）を溶解させることができる。一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ＣＤ１６に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）に少なくとも部分的に起因して、標的細胞の溶解を引き起こす。一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、（ａ）この多重特異的タンパク質のＡＢＤが結合する免疫細胞上の活性化受容体のシグナル伝達の増強又は誘導と、（ｂ）ＣＤ１６に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）との組み合わせにより標的細胞の溶解を引き起こす。
【００５５】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、本開示のタンパク質のいずれかの第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸が提供される。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、本開示のタンパク質のいずれかの第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供され、任意選択により、この宿主細胞は、本開示のタンパク質を少なくとも１、２、３又は４ｍｇ／Ｌの収量（最終生産性、精製後）で産生する。また、本開示の第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸と、本開示の第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸と、任意選択により、本開示の第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸とを含むキット又は核酸のセットも提供される。また、本開示の単量体、ヘテロ二量体及びヘテロ三量体タンパク質を作製する方法も提供される。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質（例えば、本明細書で開示されている任意のヘテロ二量体タンパク質）を作製する方法であって、
ａ）本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
ｂ）本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意するステップ、
ｃ）任意選択により、本明細書で説明されている第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を用意するステップ、及び
ｄ）前記第１及び第２（並びに任意選択により第３の）核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２（並びに任意選択により第３の）ポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヘテロ二量体（又は任意選択によりヘテロ三量体）タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されるヘテロ二量体（又はヘテロ三量体）タンパク質は、精製前に得られる総多重特異的タンパク質の少なくとも２０％、２５％又は３０％を示す。任意選択により、ステップ（ｄ）は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換又はプロテインＡカラム上へのローディング後に回収したタンパク質）をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。
【００５７】
本開示のタンパク質はまた、ＢＩＴＥ、ＤＡＲＴ及び他の多重特異的形態と異なり標準的な細胞株及び標準化された高収率の方法で産生される能力により、多重特異的タンパク質に組み込むべき最も有効な可変領域に関するスクリーニング用の好都合なツールも提供する。一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質で使用する候補可変領域を同定又は評価する方法であって、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する様々な抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸とを含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれに関して、
（ｉ）コードする第１の核酸を産生し、本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意することと、
（ｉｉ）本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意することと、
（ｉｉｉ）任意選択により、本明細書で説明されている第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を用意することと
により、ヘテロ二量体又は三量体タンパク質を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸は、第１、第２又は第３の核酸上に独立して配置されており、それにより、これらの可変領域が目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
ｃ）第１及び第２（並びに任意選択により第３）のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２（並びに任意選択により第３）のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヘテロ二量体（又はヘテロ三量体）タンパク質を回収するステップ、及び
ｄ）産生された複数のヘテロ二量体（又はヘテロ三量体）タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。
【００５８】
一態様では、本開示は、少なくとも５つ、１０、２０、３０、５０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリであって、これらのタンパク質はドメイン配置を共有するが、それらの抗原結合ドメインの１つ、２つ又は３つの可変ドメインのアミノ酸配列が異なる、ライブラリを提供する。
【００５９】
一態様では、本開示は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は１０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリであって、これらのタンパク質は、それらの抗原結合ドメインの１つ、２つ又は３つの可変ドメインのアミノ酸配列を共有するがドメイン配置が異なる、ライブラリを提供する。
【００６０】
一態様では、本明細書で説明されている化合物又は組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００６１】
一態様では、疾患の処置のための薬剤としての、上記の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物の使用が提供される。
【００６２】
一態様では、対象における疾患を処置する方法であって、本明細書で説明されている化合物又は組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６３】
一実施形態では、この疾患は癌又は感染性疾患である。
【００６４】
いずれの方法も、特に「発明を実施するための形態」を含め、本出願に開示されるあらゆるステップを含むとしてさらに特徴付けることができる。本発明はさらに、任意の本方法によって得ることができるタンパク質に関する。本開示はさらに、本発明の抗体の医薬剤又は診断剤に関する。本開示はさらに、治療又は診断の方法における抗体の使用方法に関する。
【００６５】
本発明のこれらの及び追加の有利な態様及び特徴が本明細書の他の箇所でさらに説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、分離された場合にはＢ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下でＴ／Ｂ細胞の凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方を共にインキュベートされた場合に細胞の凝集を引き起こすことを示す。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ〜２Ｅは、産生された二重特異的タンパク質の様々なドメイン配置を示す。図２Ｆは、３つの免疫グロブリンＡＢＤを有する様々なドメイン配置タンパク質を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】それぞれＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的Ｆ１及びＦ２形態タンパク質は、静止ＮＫ細胞をそれらのＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に誘導することができ、アイソタイプ対照抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞の除去をもたらさなかったことを示す。リツキシマブ（ＲＴＸ）はＡＤＣＣの陽性対照としての役割を果たし、ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌ）で得られた最大応答は２１．６％の特異的溶解であった。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａは、Ｆ２形態のタンパク質におけるＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する二重特異的抗体が標的細胞の非存在下で静止ＮＫ細胞を活性化せず、対照的に、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及び陽性対照アレムツズマブがＮＫ細胞を活性化したことを示す。図４Ｂは、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の結合ドメインのそれぞれを含む）がＤａｕｄｉ標的細胞の存在下で静止ＮＫ細胞を活性化したが、完全長抗ＣＤ１９が最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化を示し、完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツズマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を実質的に超える活性化の実質的な増大を誘発しなかったことを示す。図４Ｃは、ＣＤ１９陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の可変領域のそれぞれを含む）のいずれもＮＫ細胞を活性化しなかったことを示す。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツズマブは、即ちＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルで、ＮＫ細胞の検出可能な活性化をもたらした。アイソタイプ対照抗体は活性化を誘導しなかった。
【図５Ａ−５Ｂ】１：１の低いエフェクター：標的比では、試験した二重特異的抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体のそれぞれがＤａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させたこと、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体が対照抗ＣＤ１９抗体及び完全長ヒトＩｇＧ１  ＡＤＣＣ誘導抗体と比べてはるかに強力であった（標的細胞の溶解をより良好に誘発した）ことを示す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ及び図６Ｂは、各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）が、ヒトＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６陰性ｈＮＫｐ４６陽性ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞（図６Ａ）又はＢ２２１細胞（図６Ｂ）の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１  アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体を誘導しなかったことを示す。図６Ｃは、ＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質（形態Ｆ６）が、同一の抗ＫＩＲ３ＤＬ２可変領域を有する従来のＩｇＧ１抗体と同程度にＮＫｐ４６結合（ＣＤ１６結合なし）によりＨＵＴ７８腫瘍細胞の特異的溶解を誘導したことを示す。
【図７】ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＦ５形態でのＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質が、Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態の二重特異的タンパク質と比べてはるかに強力であることを示す。この図はまた、ＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＦ６形態での二重特異的抗ＣＤ１９が、Ｄａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度に強力であったことも示し、これは、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体が二価でＣＤ１９に結合することを考慮すると予想外である。同等レベルの標的細胞溶解では、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３は、完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１と比べて少なくとも１０００倍強力であった。
【図８】新鮮なＮＫ細胞を使用する細胞傷害アッセイの結果を示し（右側パネルにおけるＤａｕｄｉ細胞及び左側パネルにおけるＨＵＴ７８細胞）、Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、ＮＫ細胞が標的細胞と遭遇した場合にＮＫｐ４６誘発の作用様式を有するが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３二重特異的タンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力を示した。Ｆ５タンパク質もＦ６タンパク質も、ＨＵＴ７８細胞へのいかなるＮＫ細胞の細胞傷害性も媒介しなかった。
【図９】Ｆ５タンパク質によるＮＫ細胞の表面上のＣＤ１３７の強力な上方制御を示したＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色の結果を示す（最も左側のパネル：ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ、中央のパネル：ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８、最も右側のパネル：ＮＫ細胞のみ）。ＣＤ１６に結合する完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１抗体もＣＤ１３７上方制御を示したが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３タンパク質と比べてはるかに低かった。ＮＫｐ４６を介して機能するがＣＤ１６を介しては機能しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、いかなるＣＤ１３７上方制御も示さなかった。
【図１０】ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質のＤａｕｄｉ細胞を溶解させる能力を同一の可変領域を含む比較抗体（ＧＡ１０１）と比較した細胞傷害アッセイの結果を示す。図１０の結果は、ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質がＧＡ１０１と比べてＤａｕｄｉ細胞への細胞傷害の媒介ではるかに高い効力（ＥＣ５０で約１０倍の増加）を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００６８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により「本質的に〜からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」で置き換えることができ、さらに任意選択により「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」に置き換えることができる。
【００６９】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」又は「ＡＢＤ」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。
【００７０】
本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。
【００７１】
本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。
【００７２】
「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。
【００７３】
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。
【００７４】
本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（ＣＫ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、ＣＫの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説されたその他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。
【００７６】
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００７７】
本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。Ｆｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。また、本発明に係るＦｃ領域として、Ｆｃ関連エフェクター機能を変更（増強又は低減）する少なくとも１つの改変を含む変異体も挙げられる。また、本発明に係るＦｃ領域として、例えば異なるアイソタイプ又は種の抗体に由来する異なるＦｃ領域の異なる部分又はドメインを含むキメラＦｃ領域も挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（Ｋ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（ＶＫ及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。
【００８０】
「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナーに結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。
【００８１】
本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数ＫＡは１／ＫＤによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。
【００８２】
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。
【００８３】
「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００８４】
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
【００８５】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００８６】
「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。
【００８７】
本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。
【００８８】
「細胞内インターナリゼーション」と互換的に使用される「インターナリゼーション」という語は、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面へと分子を移行させるプロセスと関連する分子事象、生化学的事象及び細胞事象を指す。分子の細胞内インターナリゼーションに関与するプロセスは公知であり、特に、細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体及び有機小分子）、膜関連分子（例えば、細胞表面受容体）並びに細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜関連分子に結合した抗体）のインターナリゼーションを挙げることができる。そのため、「インターナリゼーションを誘導し及び／又は増加させる」は、細胞内インターナリゼーションが開始され、且つ／又は細胞内インターナリゼーションの割合及び／若しくは程度が増加する事象を指す。
【００８９】
本明細書で使用される「ＮＫ細胞」という句は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解するか又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＫＳ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｎｎａ  Ｍ）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞」は、胸腺中で成熟し、且つ他の分子の中でもＴ細胞受容体を表面上で提示するリンパ球の亜集団を指す。Ｔ細胞を特定の特徴及び生物学的特性により同定することができ、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ４又はＣＤ８等の特定の表面抗原の発現、特定のＴ細胞の腫瘍又は感染細胞を死滅させる能力、特定のＴ細胞の免疫系の他の細胞を活性化させる能力、及び免疫反応を刺激又は抑制する、サイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力により同定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを使用し、当技術分野で公知の方法を使用してＴ細胞を同定することができる。本明細書に関連して、「活性な」又は「活性化された」Ｔ細胞は生物学的に活性なＴ細胞を指し、より具体的には、例えばサイトカインを分泌することにより細胞溶解の能力又は免疫応答を刺激する能力を有するＴ細胞を指す。活性細胞を多くの公知の方法（例えば、機能的アッセイ、及びＴＮＦ−アルファ等のサイトカインの発現等の発現ベースのアッセイ）のいずれかで検出することができる。
【００９１】
本明細書で使用される、細胞表面受容体（例えば、活性化受容体）で「アゴニスト」活性を有する作用物質は、例えば、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるか又は伝達する受容体の能力など、受容体によるシグナル伝達を引き起こす又は増加させることができる作用物質である。シグナル伝達活性の変化は、例えば、シグナル伝達要素のリン酸化の監視などによる受容体シグナル伝達経路の変化を測定するように設計されたアッセイ、特定のシグナル伝達要素と他のタンパク質若しくは細胞内構造の結合を測定するアッセイ、又はキナーゼなどの成分の生化学活性において、又は受容体感受性プロモーター又はエンハンサーの制御下でのレポーター遺伝子の発現を測定するように設計されたアッセイにより、又は受容体によって媒介される下流の効果（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞における特定の細胞溶解装置の活性化）により間接的に測定することができる。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子であり得る（例えば、サイトカインの産生を監視する）、又は細胞に人工的に導入される遺伝子であり得る。他の遺伝子は、このような調節要素の制御下に置くことができ、従って、受容体シグナル伝達のレベルを報告する役割を果たす。
【００９２】
ポリペプチドの産生
本明細書に記載の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復ドメイン、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー、又はシステインリッチｋｎｏｔｔｉｎペプチド）の任意のものから容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５を参照されたい。
【００９３】
免疫グロブリンＡＢＤは、（免疫グロブリン鎖からの）抗体に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖に存在する結合したＶＬ及びＶＨドメイン、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶＨＨドメインの形態である可変ドメインから得ることができる。対形成及び／又は折り畳みを実質的にさらに必要とすることなくＦａｂ又はｓｃＦｖ由来の広範囲の可変領域の使用を直接可能にする本明細書で開示されている特定の有利なタンパク質形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ＡＢＤ１及びＡＢＤ２）はまた、Ｆａｂ又はｓｃＦｖとして抗体にも容易に由来し得る。
【００９４】
典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。ヒト抗体は、ヒト抗体レパートリーを発現するようにエンジニアリングされたトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ  ｅｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５）を免疫に用いることにより、又はファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択により産生することもできる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫に使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられたマウス宿主である。従って、このマウスにより、又はこのマウスのＢ細胞から産生されたハイブリドーマで産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。抗体はまた、例えば、（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されているように、免疫グロブリンの組み合わせライブラリの選択によって産生することもできる。ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５７３，９０５号明細書；同第５，５６７，６１０号明細書；及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい。組み合わせライブラリが、ヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、組み合わせライブラリからの選択により、ヒト抗体が得られる。
【００９５】
加えて、広範囲の抗体が、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列を含む化学文献及び特許文献で、又は民間供給業者から入手可能である。抗体は、典型的には、所定の抗原に対するものである。抗体の例としては、除去されるべき標的細胞、例えば、増殖細胞又は病理の原因となる細胞によって発現される抗原を認識する抗体が挙げられる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌又は寄生虫）抗原、又はウイルス抗原を認識する抗体が挙げられる。
【００９６】
可変ドメイン及び／又は抗原結合ドメインは所望の細胞標的に基づいて選択され得、例えば、癌抗原、細菌又はウイルス抗原等が挙げられ得る。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎａｅ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ���ａ  １Ｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
【００９７】
本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。
【００９８】
本明細書で使用される「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という語は互換的に使用され、癌細胞により差次的に発現され、又は腫瘍誘発効果（例えば、免疫抑制効果）を有する非腫瘍細胞（例えば、免疫細胞）によって発現され、それにより癌細胞を標的とするために利用され得る抗原を指す。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。この抗原の一部は、正常細胞により、必ずしも発現されるものではないがコードされているか、又はより低いレベル若しくはより少ない頻度で発現される。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現されない）抗原、分化の特定の段階のみで発現される抗原、及び胚抗原及び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持されたウイルス遺伝子によってコードすることができる。さらに他の癌抗原は、腫瘍誘発効果に寄与し得るか又はそれを媒介し得る免疫細胞（例えば、免疫回避に寄与する細胞、単球若しくはマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞若しくは骨髄由来のサプレッサー細胞）上で発現され得る。
【００９９】
癌抗原は、通常、過剰発現されるか若しくは異常な回数で発現される正常細胞の表面抗原であるか、又は標的とされる細胞の集団によって発現される。理想的には、標的抗原は増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）上又は腫瘍誘発細胞（例えば、免疫抑制効果を有する免疫細胞）上でのみ発現されるが、実際にはこのようなことが観測されるのは稀である。結果として、標的抗原は、多くの場合、増殖／疾患組織と健康組織との間の差次的な発現に基づいて選択される。癌抗原の例として以下が挙げられる：受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｙｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、Ｓｉｇｌｅｃファミリメンバー、例えばＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）又はＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６及びＴＭＥＦＦ２。癌抗原の例として以下も挙げられる：免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）、例えばサイトカイン受容体、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリタンパク質、例えばキラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ−６受容体。例として以下も挙げられるが、これは包括的であることを意図されていない：ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えば、ネクチン−４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリのタンパク質、レチノイン酸初期転写産物−１（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅａｒｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１）（ＲＡＥＴ１）ファミリのタンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリ、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリ、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ２．７．１０．１）としても知られている、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポイエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットで構成されたヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリン、ＰＤＧＦベータ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８受容体、ｈＣＧ、ＩＬ−６受容体、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連の単球及びマクロファージ）、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、並びにｃ−ｅｒｂＢ−２。一態様では、目的の抗原は、例えばＦｃγ受容体細胞の存在下で又は非存在下で従来のヒトＩｇＧ１抗体が結合した場合、細胞内インターナリゼーションを受けることができる抗原（例えば、上記で列挙した抗原の任意の１つ）である。一態様では、目的の抗原はＣＤ１９又はＣＤ２０ポリペプチドであり、一態様では、本多重特異的タンパク質はＶＨ及び／若しくはＶＬ又はｓｃＦｖ又は別のＡＢＤを含み、これらは、本明細書の実施例で説明されている抗ＣＤ１９若しくは抗ＣＤ２０それぞれのＶＨ、ＶＬ若しくはｓｃＦｖの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９若しくはＣＤ２０に結合するか、又は本明細書で開示されている抗ＣＤ１９若しくは抗ＣＤ２０の重鎖及び軽鎖の可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。一態様では、本多重特異的タンパク質は、本明細書の実施例で開示されている各抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２０のＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖを含む抗体（即ちＦ５若しくはＴ６タンパク質）と、ヒトＣＤ１９又はＣＤ２０ポリペプチドへの結合に関して競合する。
【０１００】
一実施形態では、目的の抗原に結合するＡＢＤは、抗原性標的（細胞上の目的の抗原）に結合した場合に目的の抗原の下方調節又は細胞内インターナリゼーションを増加させるか又は誘導する、目的の抗原に結合する親抗体（例えば、ネズミ抗体、ヒト抗体）に由来する（例えば、この親抗体の超可変領域を含むか、又はこの親抗体のＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つを含む）。一実施形態では、目的の抗原は癌抗原であり、例えば、インターナライズすることが分かっている上記で列挙した癌抗原の１つ（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）メンバー、例えばサイトカイン受容体α又はβ鎖、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリタンパク質、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｓｉｇｌｅｃファミリメンバー、ＥＧＦ受容体及びＥＧＦ様受容体ファミリメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、インテグリン、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、ＣＳＦ−１Ｒ等）である。一実施形態では、抗原標的は、腫瘍誘発効果を媒介することができる免疫細胞（例えば、単球又はマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞又は骨髄由来のサプレッサー細胞）上に存在するポリペプチドである。
【０１０１】
例示的な実施形態では、ＡＢＤ、可変ドメイン又は相補可変ドメインの対は、除去される標的細胞によって発現される抗原（例えば、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌若しくは寄生虫）抗原、ウイルス抗原、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の一因である免疫細胞上で発現される抗原）に結合し、別のＡＢＤ、可変ドメイン又は相補可変ドメインの対は、免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）上で発現される抗原（例えば、Ｔ若しくはＮＫ細胞等のエフェクター細胞の細胞表面受容体）に結合する。免疫細胞（任意選択により免疫エフェクター細胞）上で発現される抗原の例として、ヒトリンパ球系細胞系統のメンバー上で発現される抗原が挙げられ、例えば、ヒトＴ細胞、ヒトＢ細胞若しくはヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト単球、ヒト好中性顆粒球又はヒト樹状細胞が挙げられる。有利には、そのような細胞は、除去される標的細胞（例えば、腫瘍抗原、微生物抗原、ウイルス抗原、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の一因である免疫細胞上に発現される抗原を発現する）への細胞傷害性又はアポトーシス効果を有する。特に有利には、ヒトリンパ球細胞は、活性化された場合に標的細胞への細胞傷害効果を発揮する細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。次いで、この実施形態によれば、ヒトエフェクター細胞の細胞傷害活性が補充される。別の実施形態によれば、ヒトエフェクター細胞はヒト骨髄系統のメンバーである。
【０１０２】
断片が多重特異的タンパク質を構成する抗体が結合し得る免疫細胞上で発現される抗原として、ＮＫ及び／又はＴ細胞受容体も挙げられ、例えば、それぞれがＮＫ又はＴ細胞を除去する対象の標的細胞に誘導し、及び好ましくはＮＫ及び／又はＴ細胞が標的細胞の除去又は溶解を媒介するのを可能にするのに役立つことができるＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上のいずれかの分子も挙げられる。例として、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリのメンバー、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリのメンバー、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）ファミリ又はレクチンファミリー若しくはＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリが挙げられる。活性を、例えば多重特異的ポリペプチドの存在下で標的細胞とエフェクター細胞とを接触させることにより測定することができる。任意選択により、免疫細胞受容体は免疫エフェクター細胞活性化受容体であり、例えば活性化ＮＫ細胞又はＴ細胞受容体である。本明細書で使用する場合、「活性化ＮＫ細胞受容体」及び「活性化Ｔ細胞受容体」という語は、ＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上の任意の分子をそれぞれ指し、この分子は、刺激された場合、ＮＫ細胞又はＴ細胞の活性に関連した当技術分野で既知の任意の特性又は活性の測定可能な上昇をそれぞれ引き起こし、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ若しくはＴＮＦ−α）の産生、細胞内遊離カルシウムレベルの上昇、例えば本明細書の別の場所で説明されている再誘導死滅アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）での標的細胞を溶解する能力、又はＮＫ細胞若しくはＴ細胞の増殖を刺激する能力の測定可能な上昇をそれぞれ引き起こす。「活性化ＮＫ受容体」という語は、限定されるものではないがＤＮＡＸアクセサリー分子−１（ＤＮＡＭ−１）、２Ｂ４、活性化型のＫＩＲタンパク質（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ及びＩＬ−２１Ｒを含む。一実施形態では、活性化ＮＫ細胞受容体はＦｃγ受容体以外の受容体である。一実施形態では、活性化ＮＫ細胞受容体はＮＫｐ４６以外の受容体である。
【０１０３】
細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、この実施形態の多重特異的（例えば、二重特異的）ポリペプチドによる細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のエフェクター抗原としてのＣＤ３抗原の結合により起こり得る。ヒトＣＤ３抗原は、ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の両方上に存在する。ヒトＣＤ３は、多分子Ｔ細胞複合体の一部としてＴ細胞上で発現され且つ３つの異なる鎖：ＣＤ３−イプシロン、ＣＤ３−デルタ及びＣＤ３−ガンマを含む抗原を指す。ＡＢＤが結合し得る他のエフェクター細胞抗原は、ヒトＣＤ８抗原、ヒトＣＤ２抗原、ヒトＣＤ２８抗原又はヒトＣＤ２５抗原である。
【０１０４】
一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ＣＤ８に特異的に結合する１つのＡＢＤと、ＣＤ３に結合する１つのＡＢＤとを含む。一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、エフェクターＮＫ細胞上に存在する活性化受容体に特異的に結合する１つのＡＢＤと、エフェクターＴ細胞上に存在する活性化受容体に結合する１つのＡＢＤとを含む。一実施形態では、本多重特異的は、癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原に結合する１つのＡＢＤを含む。
【０１０５】
本ポリペプチドに組み込まれるＡＢＤ又は可変ドメインを、ポリペプチドへの包含前に任意の所望の活性に関して試験することができる。所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインを同定すると、各可変ドメインをコードするＤＮＡを、酵素認識タグ又はＣＨ２及びＣＨ３ドメイン等の任意の要素をコードするＤＮＡ並びに適切な宿主への遺伝子導入のための任意の他の任意選択的要素をコードするＤＮＡ（例えば、リンカー又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ）と一緒に、適切な発現ベクター中に適切な配置で配置し得る。次いで、宿主を使用して、本多重特異的タンパク質を構成するポリペプチド鎖を組み換え産生する。
【０１０６】
抗体に由来するＡＢＤ又は可変領域は、概して、多量体ポリペプチド中に存在する場合に結合活性を付与するのに十分な超可変領域を少なくとも含む。ＡＢＤ又は可変領域は、所望され得る他のアミノ酸又は機能的ドメインを含み得、このアミノ酸又は機能的ドメインとして、限定されるものではないがリンカー要素（例えば、リンカーペプチド、定常ドメイン由来の配列、ヒンジ、又はそれらの断片、これらのそれぞれを必要に応じて可変ドメインとＣＨ１、Ｃκ、ＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインとの間又は他のドメイン間に配置することができる）が挙げられることが認識されるであろう。
【０１０７】
任意の実施形態では、ＡＢＤ又は可変領域は、ヒト化抗体から得ることができ、このヒト化抗体では、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（親又はドナー抗体、例えば、マウス又はラット抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているが、所望の特異性、親和性、及び元の抗体の能力を維持している。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部又は全てがコードされた親抗体のＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに全て又は一部を移植して、その特異性が移植されるＣＤＲによって決まる抗体を作製する。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。従って、抗原結合ドメインは、非ヒト超可変領域又はＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域の配列（任意選択により逆突然変異を含む）を有し得る。
【０１０８】
互いに作動可能に連結された所望のドメインを有するポリペプチドを作製するために、１つ以上の発現ベクター中にポリペプチド鎖を配置する。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞又はそれらの任意の派生細胞、不死化細胞若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。
【０１０９】
次いで、このポリペプチドを適切な宿主細胞中で産生させて、又は任意の適切な合成プロセスにより作製して、多量体（例えば、二量体又は三量体）ポリペプチドの形成に適した条件下で接触させることができる。
【０１１０】
ポリペプチドの立体配置
第１、第２及び第３の目的の抗原に結合する単離されたヘテロ多量体タンパク質を様々な立体配置に従って調製することができ、いずれの場合でも、このヘテロ多量体タンパク質は、中心（第１の）ポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖と任意選択により第３のポリペプチド鎖とを少なくとも含む。
【０１１１】
第１（中心）のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと共に、目的の１つの（例えば、第１の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する１つの可変ドメインを提供する。第１（中心）のポリペプチド鎖はまた、相補的な可変ドメインと対を形成して目的の別の（例えば、第２の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する第２の可変ドメインを提供し、第２の可変ドメインに相補的な可変ドメインは、（例えば、直列型可変ドメイン構築物、例えば、ｓｃＦｖの第２の可変ドメインに隣接した）中心ポリペプチド上に配置することができるか、又は第２のポリペプチド鎖上に配置することができ、又は第３のポリペプチド鎖上に配置することができる。第２（及び存在する場合には第３）のポリペプチド鎖は、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化によって中心ポリペプチド鎖と結合し、非共有相互作用並びに任意選択によりそれぞれのヒンジドメイン間と相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン間とのさらなる鎖間ジスルフィド結合を形成し、ＣＨ／ＣＫ及びＶＨ／ＶＫドメインが唯一の二量体化構造を生じさせるように選択される限り、単一の多量体ポリペプチドが形成される。三量体では、又はポリペプチドが三量体の調製のために構築される場合、一般に、天然に存在しないＶＨ−ＣＫ又はＶＫ−ＣＨ１ドメイン配置を含む１つのポリペプチド鎖が存在するであろう。
【０１１２】
ＣＬ定常領域のＣＨ１に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）（例えば、このＶドメインは、そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域のＮ末端に融合されている）と、第２の可変ドメインと、第１及び第２の可変ドメイン間に介在しているＦｃドメイン（例えば、完全Ｆｃドメイン又はその一部）とを含む第１の（中心）ポリペプチド鎖は、限定されるものではないが以下が挙げられる第１のポリペプチドのドメイン配置の例を有することができる。
【０１１３】
【表１】
2018519296.tif 000011
【０１１４】
第２のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＬ定常領域に相補的であるように選択されているＣＨ１又はＣＬ（例えば、ＣＫ）定常領域に（例えば、Ｃ末端で）融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含み、それにより、第１及び第２のポリペプチドはＣＨ１−ＣＬ（例えば、ＣＨ１−ＣＫ）ヘテロ二量体を形成する。第２のポリペプチド鎖は、例えばＣＨ１若しくはＣＬドメインのＣ末端に融合された又は可変ドメインのＮ末端に融合されたＦｃドメイン（例えば、完全Ｆｃドメイン又はその一部）をさらに含むことができる。第２のポリペプチドのドメイン配置の例として、限定されるものではないが以下が挙げられる。
【０１１５】
【表２】
2018519296.tif 000012
【０１１６】
第３のポリペプチド鎖は、存在する場合に以下のドメイン配置を有することができる。
【０１１７】
【表３】
2018519296.tif 000013
【０１１８】
２つのＡＢＤと二量体Ｆｃとを有するヘテロ二量体
そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）の例として、以下：
Ｖａ１−（ＣＨ１若しくはＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ２−Ｖｂ２、又は
Ｖａ２−Ｖｂ２−Ｆｃドメイン−Ｖａ１−（ＣＨ１若しくは−ＣＫ）ａ
が挙げられ、Ｖａ１は軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
【０１１９】
中心鎖のＦｃドメインは、所望の機能性（例えば、ＣＤ１６及びＦｃＲｎ結合性）を付与するのに十分な完全Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＦ３）又はその一部であり得る。次いで、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化を可能にするように選択されている、免疫グロブリン可変ドメイン及びＣＨ１又はＣＫ定常領域（例えば、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位）を含む第２のポリペプチド鎖を構成し、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接している中心鎖の可変ドメインを補完し、それにより相補的な可変ドメインが第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
【０１２０】
例えば、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、Ｖｂ１は中心鎖のＶａ１と一緒に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のＶａ１が軽鎖可変ドメインである場合にはＶｂ１は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のＶａ１が重鎖可変ドメインである場合にはＶｂ１は軽鎖可変ドメインである。
【０１２１】
次いで、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを、中心又は第２の鎖上の直列型可変ドメインとして構成されているＶａ２及びＶｂ２から形成することができ、それにより、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメイン（例えば、例えばｓｃＦｖ単位を形成する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（カッパ）可変ドメイン（ＶＫ））が形成される。或いは、第２の目的の抗原用の抗原結合ドメインを、中心鎖上に存在する単一可変ドメインＶ２から形成することもできる。
【０１２２】
得られるヘテロ二量体は、別の例では以下のような構成（図２Ｄで示す形態１３として示されるそのようなタンパク質の例も参照されたい）：
【化９】
2018519296.tif 000014
を有することができ、第１のポリペプチド鎖のＶａ１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
【０１２３】
一実施形態では、本ヘテロ二量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、以下：
【化１０】
2018519296.tif 000015
の１つのドメイン配置を含み、任意選択により、一方又は両方のヒンジドメインがペプチドリンカーで置換されており、任意選択により、Ｆｃドメインは、ペプチドリンカーを介して、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）によって発現されるポリペプチドに結合するｓｃＦｖに融合されている。
【０１２４】
抗活性化受容体用ＡＢＤは、例えば、免疫細胞上の活性化受容体（例えば、活性化ＮＫ細胞受容体）に結合する任意のＡＢＤであり得る。このＡＢＤはｓｃＦｖを例えば含むことができる。
【０１２５】
形成される二量体ポリペプチドのドメイン配置の例として、限定されるものではないが以下の表中のものが挙げられる。
【０１２６】
【表４】
2018519296.tif 000016
【０１２７】
２つのＡＢＤと二量体Ｆｃとを有するヘテロ三量体
ヘテロ三量体タンパク質を、例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）と、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）と、第１及び第２の可変ドメイン間に介在するＦｃドメイン又はその一部（即ち、このＦｃドメインは第１及び第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ））単位間に介在する）とを含む中心（第１の）ポリペプチド鎖を使用することによって形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖａ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ
を有することができる。
【０１２８】
第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｃは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、Ｖａ１及びＶｂ１は抗原結合ドメインを形成する。
【０１２９】
第３のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖｂ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｄは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、Ｖａ２及びＶｂ２は抗原結合ドメインを形成する。
【０１３０】
二量体Ｆｃドメインを有する、得られるヘテロ三量体の構成（図２Ｄにおいて形態５としても示されている）の例は、ドメイン配置：
【化１１】
2018519296.tif 000017
を有する。
【０１３１】
そのため、三量体ポリペプチドの構成では、第１のポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖上の可変ドメイン（即ち、第２及び第３の鎖の可変ドメイン）と抗原結合ドメインをそれぞれ形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は１つの可変ドメインを有し、且つ第３のポリペプチドは１つの可変ドメインを有し、この三量体は、ＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインを有する。
【０１３２】
形成される三量体二重特異的ポリペプチドのドメイン配置の例として、限定されるものではないが以下が挙げられる。
【０１３３】
【表５】
2018519296.tif 000018
【０１３４】
３つのＡＢＤ（及び任意選択によりさらに二量体Ｆｃ）を有するヘテロ二量体
そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）の例として、以下：
Ｖ１−Ｖ１−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１若しくはＣＫ）ａ
（ここで、一方のＶ１は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１は重鎖可変ドメインであり、１つのＶ２は軽鎖又は重鎖可変ドメインである）、又は
Ｖ１−Ｖ１−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１若しくはＣＫ）ａ−Ｖ３−Ｖ３
（ここで、一方のＶ１は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１は重鎖可変ドメインであり、１つのＶ２は軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３は重鎖可変ドメインである）
が挙げられる。Ｖ１の対は第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと一緒に第２のＡＢＤを形成し、且つ２つのＶ３ドメインは対形成して第３のＡＢＤを形成する。中心鎖のＦｃドメインは、所望の機能性（例えば、ＦｃＲｎ結合性及び／又はＣＤ１６結合性）を付与するのに十分な完全Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）又はその一部であり得る。次に、免疫グロブリン可変ドメインと、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化を可能にするように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域（例えば、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位）とを含む第２のポリペプチド鎖が構成され、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接する中心鎖の可変ドメインを補完し、それによりこれらの相補的な可変ドメインが第１の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
【０１３５】
例えば、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
（ＶＨ若しくはＶＫ）−（ＣＨ１若しくは（ＣＫ）ｂ−ｓｃＦｖ、又は
（ＶＨ若しくはＶＫ）−（ＣＨ１若しくは（ＣＫ）ｂ。
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、第２の鎖のＶドメインは中心鎖のＶ２と一緒に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のＶ２が軽鎖可変ドメインである場合には第２の鎖のＶは重鎖可変ドメインであり、中心鎖のＶ２が重鎖可変ドメインである場合には第２の鎖のＶは軽鎖可変ドメインである。中心鎖がＣ末端ｓｃＦｖを欠く場合、第２のポリペプチドはＣ末端ｓｃＦｖを含むように選択される。
【０１３６】
Ｃ末端ｓｃＦｖを欠いている中心鎖を採用する場合、結果として、ドメイン配置：
【化１２】
2018519296.tif 000019
を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成され、一方のＶ１が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ１が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ２が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ２が重鎖可変ドメインであり、一方のＶ３が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のＶ３が重鎖可変ドメインである。Ｖ１の対は第１のＡＢＤを形成し、Ｖ２の対は第２のＡＢＤを形成し、且つ第Ｖ３は対形成して第３のＡＢＤを形成する。このタンパク質を図２Ｆにおいて形態Ｔ１１としても示す。
【０１３７】
別の例では、Ｃ末端ｓｃＦｖを欠いている中心鎖を採用する場合、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−Ｖ１−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｖ３−Ｖ３を有し、それにより、ドメイン配置：
【化１３】
2018519296.tif 000020
を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成される。
【０１３８】
このＦｃドメインは、例えば、直列型ＣＨ３ドメインを含むことにより、又はＣＨ３−ＣＨ３二量体化を減少させるアミノ酸改変を行なうことにより、中心ポリペプチド鎖間のＣＨ３ヘテロ二量体化を回避するように構成され得る。
【０１３９】
３つのＡＢＤ（及び任意選択によりさらに二量体Ｆｃ）を有するヘテロ三量体
例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）と、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）と、第１及び第２の可変ドメイン間に介在するＦｃドメイン又はその一部（即ち、このＦｃドメインは第１及び第２の（Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ））単位間に介在している）とを含む中心（第１の）ポリペプチド鎖を使用することにより、ヘテロ三量体タンパク質を形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ
を有することができる。
【０１４０】
次いで、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ１−（ＣＨ１若しくはＣＫ）ｃ、又は
Ｖ１−（ＣＨ１若しくはＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１若しくはＣＫ）ｃは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、Ｖａ１及びＶｂ１は抗原結合ドメインを形成する。
【０１４１】
次いで、第３のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ−ｓｃＦｖ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｄは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、Ｖａ２及びＶｂ２は抗原結合ドメインを形成する。
【０１４２】
二量体Ｆｃドメインを有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例（図２Ｆ中で形態Ｔ５としても示される）は、ドメイン配置：
【化１４】
2018519296.tif 000021
を有する。
【０１４３】
単量体Ｆｃドメインを有する、得られるヘテロ三量体の構成（図２Ｆにおいて形態Ｔ６及びＴ９ｂとしても示される）の一例は、ドメイン配置：
【化１５】
2018519296.tif 000022
を有する。
【０１４４】
別の例では、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｖ３−Ｖ３を有する。形成されるヘテロ多量体ポリペプチドは、ドメイン配置：
【化１６】
2018519296.tif 000023
を有することができる。
【０１４５】
本明細書のポリペプチド鎖のいずれかでは、ヒンジ領域は、概して、ＣＨ１ドメインとＦｃドメインのＣＨ２ドメインとの間のポリペプチ上に存在し、及び／又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在することができる。任意選択により、ヒンジ領域を例えば適切なリンカーペプチドで置き換えることができる。
【０１４６】
本開示で記載されるタンパク質ドメインは、任意選択により、Ｎ末端からＣ末端であると指定することができる。例示のための開示のタンパク質の配置は、Ｎ末端（左側）からＣ末端へと示されている。ドメインは、互いに融合されていると言える（例えば、ドメインは、その左側のドメインのＣ末端に融合されていると言え、且つ／又はドメインは、その右側のドメインのＮ末端に融合されていると言える）。
【０１４７】
本開示に記載されるタンパク質ドメインは、直接又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。例えば、ＣＨ１又はＣＫドメインは、リンカーペプチド、任意選択によりヒンジ領域又はその断片を介してＦｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に融合される。別の例では、ＶＨ又はＶＫドメインは、リンカーペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合される。直列型に互いに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、リンカーペプチド（例えば、ｓｃＦｖとして）を介して融合される。Ｆｃドメインに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、リンカーペプチドを介して融合される。２つのポリペプチド鎖は、非共有結合によって互いに結合され（「｜」によって示される）、且つ任意選択により、相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン内のシステイン残基間に形成される鎖間ジスルフィド結合によってさらに結合され得る。
【０１４８】
本明細書の任意の実施形態ではＶΚドメインをＶラムダ可変ドメインで置換し得ることが認識されるであろう。
【０１４９】
ドメイン配置のいずれかでは、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３単位（完全長ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はこれらの断片）を含むことができる。Ｆｃドメイン（二量体Ｆｃドメイン）を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、ＣＨ３ドメインはＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能である（例えば、野生型ＣＨ３ドメイン）。Ｆｃドメイン（単量体Ｆｃドメイン）を有する１つの鎖のみを含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、このＦｃドメインはＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能であり、例えば、ＣＨ３ドメインがＣＨ３二量体界面でアミノ酸改変を有するか、又はＦｃドメインがＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能な直列型ＣＨ３ドメインを含む。本明細書の任意の態様の一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、リンカーにより第２のＣＨ３ドメインに接続されている。直列型ＣＨ３ドメインは、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−
を有することができる。
【０１５０】
直列型ＣＨ３ドメイン中のリンカーは可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）である。一実施形態では、このリンカーは、ＣＨ３ドメインが非共有結合的相互作用により互いに結合することを可能にする。一実施形態では、このリンカーは、１０〜５０個のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。一実施形態では、このリンカーは式（Ｇ４Ｓ）ｘを有する。任意選択により、ｘは、２、３、４、５又は６である。実施形態のいずれかでは、各ＣＨ３ドメインは、独立して、完全長及び／若しくは天然ＣＨ３ドメイン、又は機能するＣＨ３二量体化界面を保持する断片若しくは改変ＣＨ３ドメインである。
【０１５１】
可撓性ペプチドリンカー（下線で示す）を有する例示的な直列型ＣＨ３を以下に示す。そのため、例示的な直列型ＣＨ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％同一の配列を含むことができる。
【化１７】
2018519296.tif 000024
【０１５２】
本明細書で開示されている直列型ＣＨ３ドメインと、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸改変を有するＣＨ３ドメインとは、（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して）部分的なＦｃＲｎ結合性を保持する。本明細書で提供される単量体ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの例は、部分的なＦｃＲｎ結合性を保持するが、ヒトＦｃγ受容体結合性が減少している。任意選択により、本多量体ポリペプチドは、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎへの結合性を保持するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較してヒトＦｃＲｎ受容体への結合が減少している。このＦｃ部分は、例えばＣＨ２ドメイン中に、１つ以上のＦｃγ受容体への結合をさらに減少させる（例えば、消失させる）１つ以上のアミノ酸改変をさらに含むことができる。
【０１５３】
単量体Ｆｃドメインを有する多量体ポリペプチドはＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有利に含むことができ、前記ＣＨ３ドメインは改変ＣＨ３二量体界面（例えば、ＣＨ３二量体界面中の変異）を含み、別のＦｃ由来ポリペプチドとの二量体化を防止する。一実施形態では、ホモ二量体の形成を防止するように改変されたＣＨ３ドメインを含むＣＨ２−ＣＨ３部分は、以下：
【化１８】
2018519296.tif 000025
に示すアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と少なくとも９０、９５％又は９８％同一の配列を含み、任意選択により、配列の残基１２１、１３６、１６５、１７５、１７７又は１７９の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つで置換をさらに含む。
【０１５４】
本明細書のポリペプチド又は方法のいずれかの一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位（若しくはＹ４０７位）及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同じようにＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つでアミノ酸置換を含む。
【０１５５】
抗原結合ドメインを形成する２つの可変領域が同一のポリペプチド鎖上に配置されている場合、これらの可変領域は、概して、ＡＢＤが結合しようとする抗原への結合を可能にするようにＡＢＤが折り畳むのを可能にするのに十分な長さのリンカーにより互いに連結されており、例えば、これらの可変領域はｓｃＦｖを形成することができる。リンカーの例として、例えばグリシン及びセリン残基を含むリンカーが挙げられ、例えばアミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ２Ｓ）２ＧＧＡＤを含むリンカーが挙げられる。別の特定の実施形態では、ｓｖＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３により互いに連結されている。
【０１５６】
ＡＢＤがその標的抗原に結合して所望の機能性を示すようにＡＢＤが配置されるのを可能にするリンカー（例えば、可撓性ポリペプチドリンカー）を介して、ＡＢＤを定常ドメイン又はＦｃドメインに連結させることができ、例えば、このリンカーは、多重特異的タンパク質の残り（Ｆｃドメイン及び／又は他のＡＢＤ）と比べて十分な運動の範囲を有し、それにより細胞表面活性化受容体でのシグナル伝達が媒介する。リンカーの例として、例えば、抗体ヒンジ領域に由来するリンカー、アミノ配列ＲＴＶＡ、又はグリシン及びセリン残基を含むリンカー、例えばアミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ２Ｓ）２ＧＧＡＤが挙げられる。別の特定の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３により互いに連結されている。ＡＢＤが、同一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）上に配置されている２つの可変領域を含む場合、そのようなリンカーを特に有利に使用して、ＡＢＤを定常領域又はＦｃドメインに連結させることができる。
【０１５７】
主題の多重特異的タンパク質に含まれるペプチドリンカーのいずれかは、少なくとも４個の残基、少なくとも５個の残基、少なくとも１０個の残基、少なくとも１５個の残基、少なくとも２０個の残基、少なくとも２５個の残基、少なくとも３０個の残基又はより多くの長さを含むことができる。他の実施形態では、このリンカーは、２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜２２個の残基、２〜２４個の残基、２〜２６個の残基、２〜２８個の残基、２〜３０個の残基、２〜５０個の残基又は１０〜５０個の残基の長さを含む。
【０１５８】
ＡＢＤ（例えば、免疫グロブリン可変領域）は、従来の（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ）抗体と比較して（例えば、ＡＢＤとＦｃドメインとの間の又は中の）構造の剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）又は剛性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を小さくする可撓性リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介して定常ドメイン又はＦｃドメインに任意選択により連結され得る。例えば、多重特異的タンパク質は、従来の（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ）抗体中のＡＢＤと比較してドメインの運動範囲の増加を可能にする、ＡＢＤと定常ドメイン又はＦｃドメインとの間の構造又は可撓性リンカーを有することができる。具体的には、この構造又は可撓性リンカーを、従来のヒトＩｇＧ１抗体中の抗原結合部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を抗原結合部位に付与するように構成することができる。例えば、リンカー又はヒンジを含むタンパク質の旋回半径を測定するための又は比較するためのコンピュータモデリング、電子顕微鏡、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の分光法、Ｘ線結晶構造解析（Ｂファクター）又は沈降速度分析超遠心分離（ＡＵＣ）により、剛性又はドメイン運動／鎖間ドメイン運動を決定することができる。試験タンパク質又はリンカーは、この試験タンパク質が比較器（例えば、ＩｇＧ１抗体又はヒンジ）の値と少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％異なる、先の文章で記載されている試験のいずれかから得られる値を有する場合、比較器タンパク質（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比べて低い剛性を有することができる。当業者は、これらの試験の結果を解釈することにより、これらの試験から、試験タンパク質がそれぞれ別のタンパク質よりも低い剛性を有するどうかを決定することができるであろう。
【０１５９】
一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、２つのＡＢＤが、約８０オングストローム未満、約６０オングストローム未満又は約４０〜６０オングストロームの範囲を含む前記２つのＡＢＤ間の間隔を有することを可能にする、ＡＢＤと定常ドメイン又はＦｃドメインとの間の構造又は可撓性リンカーを有することができる。
【０１６０】
一実施形態では、ＣＨ１又はＣＫドメインは、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域の断片を含むリンカーを介して、Ｆｃドメイン（例えば、ＦｃドメインのＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）に連結又は融合されている。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列を可変ドメインに融合させて、野生型抗体の天然構造を可能な限り密接に模倣することができる。一実施形態では、このリンカーは、ヒンジドメイン又はＮ末端ＣＨ１アミノ酸由来のアミノ酸配列を含む。この配列は、例えば２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜２２個の残基、２〜２４個の残基、２〜２６個の残基、２〜２８個の残基又は２〜３０個の残基であり得る。一実施形態では、このリンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含むか、又はアミノ酸配列ＲＴＶＡからなる。
【０１６１】
一実施形態では、ＣＨ１又はＣＫドメインは、ヒトＩgＧ１抗体のヒンジドメインに由来するヒンジ領域（又はその断片）を介して、Ｆｃドメインに連結又は融合されている。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、任意選択により、一方又は両方のシステインが欠失しているか、又は別のアミノ酸残基で置換されている。
【０１６２】
一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、ヒトＩｇＭ抗体のＣμ２−ＣＣμ３ヒンジドメインに由来する。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｍ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、任意選択により、一方又は両方のシステインが欠失しているか、又は別のアミノ酸残基で置換されている。
【０１６３】
非共有結合を介して互いに二量体化して結合するポリペプチド鎖は、これらの鎖上のそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間並びに／又はそれぞれのヒンジドメイン間に形成された鎖間ジスルフィド結合によりさらに結合してもよく又は結合しなくてもよい。ＣＨ１、Ｃκ及び／若しくはヒンジドメイン（又は他の適切な連結アミノ酸配列）を、鎖の所望の対形成が好まれ且つ望ましくない又は不正確なジスルフィド結合形成が回避されるように鎖間ジスルフィド結合が鎖間で形成されるように、任意選択により構成することができる。例えば、対形成する２つのポリペプチド鎖がそれぞれヒンジドメインに隣接するＣＨ１又はＣκを有する場合、これらのポリペプチド鎖を、それぞれのＣＨ１／Ｃκ−ヒンジ断片間での鎖間ジスルフィド結合形成に利用可能なシステインの数が減少する（又は完全になくなる）ように構成することができる。例えば、それぞれのＣＨ１、Ｃκ及び／又はヒンジドメインのアミノ酸配列を改変して、ポリペプチドのＣＨ１／Ｃκ及びヒンジドメイン両方中のシステイン残基を除去することができ、それにより、二量体化する２つの鎖のＣＨ１及びＣκドメインは非共有的相互作用によって結合する。
【０１６４】
別の例では、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステインを含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステイン（例えば、Ｋａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジに関して付番した場合にはＣｙｓ２３９及びＣｙｓ２４２）の欠失又は置換を含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
別の例では、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステイン残基で欠失又は置換を含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステイン（例えば、Ｋａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジに関して付番した場合にはＣｙｓ２３９及びＣｙｓ２４２）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
別の例では、ヒンジ領域はＩｇＭ抗体に由来する。そのような実施形態では、ＣＨ１／ＣＫの対形成は、ＩｇＭ抗体でのＣμ２ドメインホモ二量体化を模倣する。例えば、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステインで欠失又は置換を含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているＩｇＭヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステインを含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
定常領域ドメインは任意の適切なヒト抗体に由来することができ、定常重（ＣＨ１）及び軽（Ｃκ）ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが挙げられる。「ＣＨ１」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと３４１〜４４７位を指す。
【０１６８】
「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は本明細書において、抗体の第１及び第２の定常ドメイン間の可撓性ポリペプチド又はリンカーを指す。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０位で終端し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインはＥＵ２３７位の残基で始まる。そのため、ＩｇＧの場合、ヒンジは、概して、２２１位（ＩｇＧ１中のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含み、これらの付番は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う。ポリペプチド内で見られる定常領域ドメイン内の特定のアミノ酸残基への言及は、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、ＩｇＧ抗体との関連で、Ｋａｂａｔに従って定義されるものとする。
【０１６９】
主題の抗体又は多重特異的タンパク質中に存在し得るＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、任意の適切な抗体に由来することができる。そのようなＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、野生型ドメインとして使用され得るか、又は改変されたＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインの基礎として機能する場合もある。任意選択により、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインはヒト由来であるか、又は別の種（例えば、齧歯動物、ウサギ、非ヒト霊長類）のものを含むことができるか、又は改変された若しくはキメラのＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（例えば、異なるＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン由来（例えば、異なる抗体アイソタイプ又は種抗体由来）の部分若しくは残基を含むもの）を含むことができる。
【０１７０】
多重特異的がヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合することが意図されていない実施形態では、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（又はそれらを含むＦｃドメイン）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）への結合を減少又は消失させる改変を含むことができる。例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ付番）での二量体Ｆｃドメインタンパク質中におけるＣＨ２変異は、ＣＤ１６Ａ結合を除去することができる。しかしながら、他の構成が実行され得ることを当業者は認識するであろう。例えば、２３３〜２３６位でのＩｇＧ２残基のヒトＩｇＧ１への並びに３２７位、３３０位及び３３１位でのＩｇＧ４残基への置換は、Ｆｃγ受容体への結合の大きい減少を示し、その結果としてＡＤＣＣ及びＣＤＣの大きい減少を示した。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４は、Ｋ３２２等の様々な位置でのアラニン置換が補体活性化を著しく減少させることを実証した。
【０１７１】
ＣＤ１６Ａへの結合が所望されている本明細書の特定の実施形態では、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（又はそれらを含むＦｃドメイン）は、野生型ドメインであってもよく、又はヒトＣＤ１６及び任意選択によりＦｃＲｎ等の別の受容体への結合を増加させる１つ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含んでもよい。任意選択により、この改変は、Ｆｃ由来ポリペプチドの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（例えば、ヒトＦｃＲｎ）に結合する能力を実質的に低下も消失もさせない。典型的な改変として、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）を含む改変ヒトＩｇＧ１由来定常領域及び／又は変更されたタイプのグリコシル化（例えば、低フコシル化）が挙げられる。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響を及ぼすことができる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち、免疫系増強）受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は抑制（即ち、免疫系抑制）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上のＦｃγＩＩＩａへのＦｃドメインの結合を増加させることができ、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合を減少させることができる。改変の例は、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公報国際公開第２０１４／０４４６８６号パンフレットに記載されている。ＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼす（増強する）特定の変異ＩｇＧ１も以下に記載する。
【０１７２】
【表６】
2018519296.tif 000026
【０１７３】
一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は変異型Ｆｃ領域を含み、このＦｃ領域は、そのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変を有し）、この改変はヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合を増強する。他の実施形態では、多重特異的タンパク質は、アミノ酸２３７〜３４１からのＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中に又は残基２３１〜３４１を含む下位のヒンジ−ＣＨ２領域内で少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含む。一部の実施形態では、多重特異的タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２つ、３、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含み、そのよう改変の少なくとも１つはＣＨ３領域内であり、且つ少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域内である。また、ヒンジ領域中のアミノ酸改変も包含される。一実施形態では、ＣＨ１ドメイン中の、任意選択により残基２１６〜２３０（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）を含む上位のヒンジ領域中のアミノ酸改変も包含される。Ｆｃ改変の適切に機能するあらゆる組み合わせを行うことができ、例えば、様々なＦｃ改変の任意の組み合わせが以下のいずれかで開示されている：米国特許第７，６３２，４９７号明細書；同第７，５２１，５４２号明細書；同第７，４２５，６１９号明細書；同第７，４１６，７２７号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書及び同第６，７３７，０５６号明細書；並びに／又はＰＣＴ公報国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；同第２００８／１０５８８６号パンフレット；同第２００８／００２９３３号パンフレット；同第２００７／０２１８４１号パンフレット；同第２００７／１０６７０７号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０５／１１５４５２号パンフレット；同第０５／１１０４７４号パンフレット；同第０４／１０３２２６９号パンフレット；同第００／４２０７２号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０７／０２４２４９号パンフレット；同第０５／０４７３２７号パンフレット；同第０４／０９９２４９号パンフレット及び同第０４／０６３３５１号パンフレット；並びに／又はＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（１１）：４０５−４１０；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）。
【０１７４】
一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む同一分子と比較してヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増強されており、任意選択により、この変異型Ｆｃ領域は、２２１位、２３９位、２４３位、２４７位、２５５位、２５６位、２５８位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１６位、３２０位、３２２位、３２６位、３２９位、３３０位、３３２位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３５９位、３６０位、３７０位、３７３位、３７６位、３７８位、３９２位、３９６位、３９９位、４０２位、４０４位、４１６位、４１９位、４２１位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位及び／又は４３９位（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）の任意の１つ以上において置換を含む。
【０１７５】
一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比較してヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増強されており、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は、２３９位、２９８位、３３０位、３３２位、３３３位及び／又は３３４位の任意の１つ以上で置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ及び／又はＫ３３４Ａ置換）を含み、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は残基Ｓ２３９及びＩ３３２で置換を含み、例えばＳ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ置換（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増加している変更されたグリコシル化パターンを含むＦｃドメインを含む。そのような炭水化物改変を、例えば、変更されたグリコシル化装置を有する宿主細胞中において多重特異的タンパク質をコードする核酸を発現させることにより達成することができる。変更されたグリコシル化装置を有する細胞は当技術分野で既知であり、組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、それぞれ参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられるＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、並びに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ公報国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；同第０３／０３５８３５号パンフレット；同第９９／５４３４２号パンフレットを参照されたい。一態様では、多重特異的タンパク質は１つ以上の低フコシル化定常領域を含む。そのような多重特異的タンパク質は、アミノ酸変更を含んでもよく若しくはアミノ酸変更を含まなくてもよく、又は低フコシル化が得られる条件下で発現、合成若しくは処理されてよい。一態様では、多重特異的タンパク質組成物は本明細書で説明されている多重特異的タンパク質を含み、この組成物中の抗体種の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％又は実質的に全てが、フコースを欠いているコア炭水化物構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）を含む定常領域を有する。一実施形態では、フコースを有するコア炭水化物構造を含む抗体を含まない多重特異的タンパク質組成物が提供される。このコア炭水化物は、好ましくはＡｓｎ２９７での糖鎖である。
【０１７７】
任意選択により、二量体Ｆｃドメインを含む多重特異的タンパク質は、例えば表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、従来のヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性の１−ｌｏｇ内であるヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性を有することによって特徴付けられ得る。
【０１７８】
一実施形態では、Ｆｃ受容体結合を増強するように操作された二量体Ｆｃドメインを含む多重特異的タンパク質は、例えば表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、従来又は野生型のヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性と比べて少なくとも１−ｌｏｇ大きいＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性を有することによって特徴付けられ得る。
【０１７９】
任意選択により、二量体Ｆｃドメインを含む二重特異的タンパク質は、（例えば、実施例１３、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上に固定された二重特異的抗体、及びこの固定された二重特異的抗体全体に注入された可溶性ＣＤ１６ポリペプチドの連続希釈物によりＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施したＳＰＲ測定のように）表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、ヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合（一価）に関するＫｄが１０−５Ｍ（１０μモル濃度）未満、任意選択により１０−６Ｍ（１μモル濃度）未満であることによって特徴付けられ得る。
【０１８０】
一実施形態では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質（例えば、本明細書で説明されている任意のヘテロ二量体タンパク質）を作製する方法であって、
ａ）本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖（例えば、ＣＫ定常領域のＣＨ１に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）と、第２の可変ドメイン（及び任意選択により第３の可変ドメイン、第２及び第３の可変ドメインは第１の抗原結合ドメインを形成する）と、第１及び第２の可変ドメイン間に介在するＦｃドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
ｂ）本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖（例えば、ＣＨ１又はＣＫ定常領域にＣ末端で融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）であって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチドの第１の可変ドメインが第２の抗原結合を形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、第１の可変ドメイン（Ｖ）と、Ｆｃドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップ、及び
ｃ）前記第１及び第２の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に総タンパク質（例えば、二重特異的タンパク質）の少なくとも２０％、２５％又は３０％を示す。任意選択により、ステップ（ｃ）は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（又は親和性交換若しくはプロテインＡカラム上へのローディング後に回収したタンパク質）をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと一緒に）ＮＫｐ４６に結合する。
【０１８１】
ＢｉＴＥ（商標）、ＤＡＲＴ（商標）及び他の二重特異的形態と異なり、標準的な細胞株及び標準化された高収率の方法で産生される能力により、本開示のタンパク質はまた、多重特異的タンパク質に組み込むべき最も有効な可変領域に関するスクリーニング用の好都合なツールも提供する。一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質で使用する候補可変領域を同定又は評価する方法であって、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する様々な抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸とを含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれに関して、
（ｉ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方と、第２の可変ドメイン（及び任意選択により第３の可変ドメイン、第２及び第３の可変ドメインは第１の抗原結合ドメインを形成する）と、候補及び第２の可変ドメイン間に介在するＦｃドメイン又はその一部とを含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製することと、
（ｉｉ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域にＣ末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方であり、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第２の抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方と、Ｆｃドメイン又はその一部とを含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製することと、
（ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収することと
により、ヘテロ二量体タンパク質を作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。この方法では、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと一緒に）ＮＫｐ４６に結合する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも２０％、２５％又は３０％を示す。任意選択により、（ｉｉｉ）での回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（又は親和性交換若しくはプロテインＡカラム上へのローディング後に回収したタンパク質）をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体タンパク質（例えば、本明細書で説明されている任意のヘテロ三量体タンパク質）を作製する方法であって、
（ａ）本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖（例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）と、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメインと、第１及び第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位間に介在するＦｃドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
（ｂ）本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖（例えば、Ｃ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメイン（Ｖ）であって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、可変ドメインと、Ｆｃドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップ、
（ｃ）本明細書で説明されている第３のポリペプチド鎖（例えば、Ｃ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含むポリペプチド鎖を含む第３の核酸を用意するステップであって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドの第２の可変ドメイン及び第３のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、ステップ、及び
（ｄ）前記第１、第２及び第３の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含むヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも２０％、２５％又は３０％を示す。任意選択により、ステップ（ｄ）は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（又は親和性交換若しくはプロテインＡカラム上へのローディング後に回収したタンパク質）をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ三量体画分を回収するステップを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン又はその断片をさらに含む。
【０１８３】
一態様では、本開示は、ヘテロ三量体タンパク質で使用する候補可変領域を同定又は評価する方法であって、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸とを含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれに関して、
（ｉ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方と、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメインと、第１及び第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位間に介在するＦｃドメイン又はその一部とを含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製することと、
（ｉｉ）Ｃ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方であり、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方と、Ｆｃドメイン又はその一部とを含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製することと、
（ｉｉｉ）Ｃ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を作製することであって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドが、第１のポリペプチドの第２の可変ドメイン及び第３のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、作製することと、
（ｉｖ）前記第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第１及び第２のポリペプチド鎖を産生させ、且つヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収することと
により、ヘテロ三量体タンパク質を作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン又はその断片をさらに含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも２０％、２５％又は３０％を示す。任意選択により、（ｉｉｉ）での回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換若しくはプロテインＡカラム上へのローディング後に回収したタンパク質）をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ三量体画分を回収するステップを含む。
【０１８４】
この候補可変領域を同定又は評価する方法では、候補可変領域が例えば抗活性化受容体抗体又は目的の抗原に結合する抗原に由来し得ることが認識されるであろう。候補可変領域対及び他の可変領域対用のそれぞれのＡＢＤの位置を逆転させ得ることも認識されるであろう。例えば、三量体タンパク質では、この方法を、第１のポリペプチドの第２のＶ領域及び第２のポリペプチドのＶ領域により重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが形成され且つ第１のポリペプチドの第１のＶ領域及び第３のポリペプチドのＶ領域により他の可変領域対が形成されるように改変することができる。
【０１８５】
一実施形態では、第１のポリペプチドの第２の可変ドメイン及び第３のポリペプチドの可変ドメインは、免疫細胞上の活性化受容体に結合する抗原結合ドメインを形成する。
【０１８６】
さらに、全てが標準的な細胞株及び標準化された高収率の方法で産生され得るが、タンパク質の機能的活性に影響を及ぼし得る様々な特性（例えば、高次構造の柔軟性、２つの抗原結合ドメイン間の間隔等）を有する様々な多重特異的タンパク質形態のパネルを提供することにより、本開示のタンパク質形態（例えば、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１１及び誘導体の任意の２つ以上）をパネルで使用して、所与の目的の抗原又は第１及び第２の目的の抗原の組合せに最も有効な構成又は形態を同定するためにタンパク質の構成又は形態をスクリーニングすることができる。様々なタンパク質形態がそれらの抗原標的に別々に接近又は結合することができる。
【０１８７】
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質で使用する候補タンパク質構成を同定又は評価する方法であって、本開示の複数の多重特異的タンパク質を別々に（例えば、別々の容器中で）作製するステップであって、これらのタンパク質はそれらのドメイン配置が異なる、ステップ、及び作製された複数の多重特異的タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、ドメイン配置が異なるタンパク質は、目的の抗原用の抗原結合ドメイン（例えば、同一のＣＤＲ又は可変ドメイン）を共有する。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はより多くの異なるタンパク質を作製して評価する。一実施形態では、これらのタンパク質の１つ以上（又は全て）は、本明細書で開示されているドメイン配置を有するタンパク質の群から選択され、例えば形態Ｆ５又はＴ５のタンパク質である。一実施形態では、これらのタンパク質を本明細書で開示されている方法に従って作製する。
【０１８８】
一態様では、本開示は、少なくとも５つ、１０、２０、３０、５０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリであって、これらのタンパク質はドメイン配置を共有するが、これらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列が異なる、ライブラリを提供する。
【０１８９】
一態様では、本開示は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は１０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリであって、これらのタンパク質は、それらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列を共有するがドメイン配置が異なる、ライブラリを提供する。
【０１９０】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質を回収するステップは、このタンパク質を固相に導入して固定させるステップを含むことができる。続いて、固定されたタンパク質を溶出させることができる。一般に、固体支持体は、タンパク質を可逆的に且つ直接的に又は間接的に付着させることができる任意の適切な不溶性の機能化物質であり得、このタンパク質を、望まれていない物質（例えば、過剰な試薬、汚染物質及び溶媒）から分離することができる。固体支持体の例として、例えば、機能化ポリマー物質（例えば、アガロース）又はそのビーズ形態Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、デキストラン、ポリスチレン及びポリプピレン、又はそれらの混合物；微小流体チャネル構造を含むコンパクトディスク；タンパク質アレイチップ；ピペットチップ；膜（例えば、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜）；並びに微粒子（例えば、常磁性又は非常磁性ビーズ）が挙げられる。一部の実施形態では、この固体支持体には親和性媒体が結合し、タンパク質は、この親和性媒体を介して固体支持体に間接的に付着する。一態様では、この固体支持体は、プロテインＡ親和性媒体又はプロテインＧ親和性媒体を含む。「プロテインＡ親和性媒体」及び「プロテインＧ親和性媒体」は、それぞれプロテインＡ若しくはプロテインＧのＦｃ結合ドメインを含む天然若しくは合成のタンパク質がそれぞれ結合している固相を指し、又はプロテインＡ若しくはプロテインＧのＦｃ結合ドメインの変異した変異体若しくは断片がそれぞれ結合している固相を指し、この変異体又は断片は、抗体のＦｃ部分に対する親和性を保持する。プロテインＡ及びプロテインＧは、哺乳動物ＩｇＧのＦｃ部分用の結合部位を有する細菌の細胞壁タンパク質である。これらのタンパク質のＩｇＧに対する能力は種によって異なる。一般に、ＩｇＧはプロテインＡと比べてプロテインＧに対して高い親和性を有し、プロテインＧは、広範囲の種由来のＩｇＧに結合することができる。特にマウス及びヒト由来の様々なＩｇＧサブクラスの親和性は、プロテインＧの場合と比べてプロテインＡの場合で異なる。従って、プロテインＡを使用して、いくつかの種からアイソタイプ的に純粋なＩｇＧを調製することができる。固体マトリックス（例えば、架橋アガロース）に共有結合的に付着した場合、このタンパク質を使用して、生化学溶液から抗体−タンパク質複合体を捕捉して精製することができる。市販の製品として、例えば、アガロース若しくはセファロースビーズに結合したプロテインＧ、Ａ又はＬ（例えば、ＥＺｖｉｅｗ（商標）Ｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌは、４％Ａｇａｒｏｓｅビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）に共有結合したプロテインＧである）；又はＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ、Ｇ及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＨＰＬＣカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。また、親和性捕捉試薬も例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＣで説明されており、参照によりその開示内容が本明細書に組み��まれる）。
【０１９１】
多重特異的タンパク質を作製すると、このタンパク質を生物学的活性に関して評価することができる。除去される標的細胞上の抗原及びエフェクター細胞上の活性化受容体にタンパク質が結合する本明細書の任意の実施形態の一態様では、エフェクター細胞及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下で多重特異的タンパク質をインキュベートされた場合に、このタンパク質は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）の活性化を誘導することができる）。本明細書の任意の実施形態の一態様では、エフェクター細胞及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下で多重特異的タンパク質をインキュベートされた場合に、このタンパク質は免疫エフェクター細胞活性化受容体でのシグナル伝達を誘導することができる）。任意選択により、エフェクター細胞の活性化又はシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ１０７、ＣＤ６９などの発現の増加によって特徴付けられる。活性は、例えば、多重特異的ポリペプチドの存在下で、標的細胞とエフェクター細胞とを互いに接触させることによって測定することができる。一例では、標的細胞とエフェクター細胞との凝集が測定される。別の例では、多重特異的タンパク質は、例えば、ＮＫ細胞の活性に関連した当技術分野で公知の任意の特性又は活性、例えば、細胞毒性のマーカー（ＣＤ１０７）又はサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮ−γ若しくはＴＮＦ−α）の測定可能な増加をもたらす能力、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、リダイレクト殺傷アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において標的細胞を溶解する能力などについて評価することができる。タンパク質を同定、評価又は作製する方法のいずれかの一実施形態では、この方法は、多重特異的タンパク質を、免疫細胞及び多重特異的タンパク質のＡＢＤが結合する目的の抗原（例えば、癌抗原）を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＡＢＤ多重特異的タンパク質が結合する活性化受容体を発現する活性な免疫細胞を誘導するか又は増加させる能力（例えば、活性化又は細胞傷害性、サイトカイン産生、標的細胞を溶解させる能力等のマーカー）に関して評価するステップを含む。一実施形態では、この免疫細胞はＮＫｐ４６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１３７を発現する。一実施形態では、この細胞はＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞である。一実施形態では、この免疫細胞はＣＤ１６＋細胞である。一実施形態では、この免疫細胞はＣＤ１３７＋細胞である。
【０１９２】
標的細胞（目的の抗原を発現する標的細胞）及びタンパク質によって結合された活性化受容体を発現するエフェクター細胞の存在下で、多重特異的タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、エフェクター（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）細胞の活性に関連した特性又は活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化、ＣＤ１０７の発現、ＩＦＮγの産生）の増加を引き起こすことができる。例えば、本開示の多重特異的タンパク質は、多重特異的タンパク質に接触されない同じＮＫ細胞又はＴ細胞と標的細胞を用いて同じエフェクター：標的細胞比で達成されるＮＫ細胞又はＴ細胞の活性と比較して、約２０％超、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれを超えるＮＫ細胞又はＴ細胞の活性を増加させることができるように選択することができ、このＮＫ細胞の活性は、ＮＫ細胞又はＴ細胞のアッセイ、例えば、ＮＫ細胞傷害性の活性化のマーカー、ＣＤ１０７又はＣＤ６９の発現、ＩＦＮγの産生、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性のクロム放出試験によって測定される。活性化及び細胞毒性アッセイのプロトコル例は、本明細書の実施例のセクション、及び例えばＰｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０；Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６；Ｂｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７８：３５９−３７１；Ｅｌ−Ｓｈｅｒｂｉｎｙ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（１８）：８４４４−９；ａｎｄ  Ｎｏｌｔｅ−’ｔ  Ｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：６７０−６７３）に記載されている。
【０１９３】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質を目的の特性に関して評価するステップは、このタンパク質を、以下からなる群から選択される１つ以上の性質に関して評価するステップを含む：目的の抗原への結合性、免疫エフェクター細胞上の抗原への結合性、腫瘍、ウイルス又は細菌抗原への結合性、ＦｃＲｎ受容体への結合性、ヒトＣＤ１６への結合性及び／又は他のＦｃドメインに媒介されるエフェクター機能、多量体タンパク質が結合するポリペプチドでのアゴニスト又はアンタゴニスト活性、目的の抗原を発現する細胞の活動を調節する（例えば、細胞死を引き起こす）能力、目的の抗原を発現する細胞にリンパ球を誘導する能力、目的の抗原を発現する細胞の存在下及び／又は非存在下でリンパ球を活性化する能力、ＮＫ細胞活性化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性又は半減期、産生収率、組成物内での純度、及び溶液中での凝集に対する感受性。
【０１９４】
一態様では、本開示は、タンパク質を同定又は評価する方法であって、
（ａ）本明細書で説明されているタンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
（ｂ）前記核酸をそれぞれ宿主細胞中で発現させて前記タンパク質を産生させ、前記タンパク質を回収するステップ、及び
（ｃ）産生されたタンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性、標的細胞（目的の抗原を発現する）の溶解を媒介する能力を評価するステップ
を含む方法を提供する。一実施形態では、複数の異なる多重特異的タンパク質を産生させて評価する。
【０１９５】
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）タンパク質の、このタンパク質が結合する活性化受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）に、標的細胞（目的の抗原を発現する）の存在下でそのようなエフェクター細胞と共にインキュベートされた場合に、標的細胞の溶解を媒介させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）後、標的細胞の溶解を媒介するタンパク質を（例えば、さらなる開発のために、薬剤として使用するために）選択することを含むステップが続く。
【０１９６】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、免疫エフェクター細胞上の活性化受容体に結合するＡＢＤを含む本明細書で説明されている多重特異的タンパク質は、例えば以下によって特徴付けられ得る：
（ａ）エフェクター細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、多重特異的タンパク質のＡＢＤが結合する活性化受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を誘導して標的細胞を溶解させることができ、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされた場合の、ＡＢＤが結合する活性化受容体でのアゴニスト活性の欠如であって、多重特異的タンパク質がＣＤ１６に結合することができ、エフェクター細胞がＣＤ１６陰性細胞（例えば、ＣＤ１６−ＮＫ細胞）である、欠如。任意選択により、このエフェクター細胞は精製されたエフェクター細胞である。
【０１９７】
化合物の使用
一態様では、疾患の処置、予防又は診断を、それを必要とする哺乳動物において行うための医薬製剤の製造のための、本明細書で定義されている化合物（具体的には、本発明の多重特異的タンパク質若しくは抗体及び／又はそれらを発現する細胞）のいずれかの使用が提供される。また、薬剤としての又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質としての、上記で定義されている化合物のいずれかの使用も提供される。さらなる態様では、本発明は、経口投与、局所投与、又は注射による投与のための固体又は液体製剤を生成するために本明細書で定義されている化合物を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法又はプロセスは、この化合物と薬学的に許容され得る担体とを混合するステップを少なくとも含む。
【０１９８】
一態様では、本明細書で説明されている多重特異的タンパク質又はそれを含む（医薬）組成物を使用することにより、又は投与することにより、個体における所定の状態を処置する方法、予防する方法若しくはより一般的にはこの状態に影響を及ぼす方法、又は特定の状態を検出する方法が提供される。
【０１９９】
本明細書に記載のポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス又は微生物／細菌感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。
【０２００】
一実施形態では、目的の抗原は、以下からなる群から選択されるタイプの癌の悪性細胞の表面で発現される：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ  １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）。
【０２０１】
一実施形態では、本明細書に記載の本発明の多重特異的ポリペプチドを使用して、以下からなる群から選択される癌を予防又は処置することができる：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。本発明によって処置することができる他の例示的な障害としては、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ  １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞若しくはＴ細胞）の活性の回復又は増強を、それを必要とする患者（例えば、癌又はウイルス、寄生虫若しくは細菌の感染を有する患者）において行う方法であって、この患者に本多重特異的タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本多重特異的タンパク質が結合する活性化受容体を発現するリンパ球の活性を増加させることに向けられる。
【０２０３】
別の実施形態では、主題の多重特異的タンパク質を、処置する患者に由来するか又は別のドナーに由来する免疫細胞（特にＮＫ細胞）及びそれを必要とする患者（例えば、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）活性の増加が有益である疾患又は不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるか、若しくはこの活性によって特徴付けられ得る疾患を有する患者、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物（例えば、細菌）若しくは寄生虫の感染を有する患者）に投与されるこのＮＫ細胞と組み合わせて使用又は投与してよい。ＮＫ細胞は（ＣＡＲ−Ｔ細胞と異なり）ＴＣＲを発現しないことから、このＮＫ細胞は、たとえ別のドナー由来のものであってもＧＶＨＤ反応を誘導しない（例えば、Ｇｌｉｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＡＲ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６，Ａｒｔ．２１：１−６（２０１５）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，Ａｒｔ．１９５：１−６（２０１５）を参照されたい）。
【０２０４】
一態様では、処置の方法は、治療有効量で本開示の多重特異的タンパク質を個体に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者において治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者の少なくとも相当な割合及びこの患者と実質的に類似の特徴でそのような効果を促進、増強及び／若しくは誘導する）任意の量であり得る。
【０２０５】
本開示の多重特異的タンパク質をキットに含めることもできる。このキットは、任意選択により、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含むことができ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はあらゆる他の数の多重特異的タンパク質及び／又は他の化合物をさらに含むことができる。キットの内容物に関するこの説明は決して限定するものではないことが認識されるであろう。例えば、このキットは、他のタイプの治療化合物を含むことができる。任意選択により、このキットはまた、ポリペプチドの使用に関する取扱説明書も含み、例えば、本明細書で説明されている方法を詳述する取扱説明書も含む。
【０２０６】
本発明はまた、主題の多重特異的タンパク質と、任意選択により、上記定義された他の化合物とを含む医薬組成物も提供する。多重特異的タンパク質及び任意選択により別の化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させるか又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。そのようなアジュバントの非限定的な例として、無機及び有機アジュバント、例えばミョウバン、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム、スクアレン、リポソーム、リポ多糖、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓ−ｓ）ＤＮＡ、並びに非メチル化ＣｐＧ等のＴＬＲアゴニストが挙げられる。
【０２０７】
本発明による多重特異的タンパク質は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択により凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択により２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。
【実施例】
【０２０８】
実施例１
抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質で免疫化した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
【０２０９】
一次スクリーニング：増殖しているクローンの上清（Ｓ／Ｎ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いるフローサイトメトリーによって一次スクリーニングで試験した。簡単に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングでは、上清中の反応性抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。
【０２１０】
ＮＫｐ４６に結合する抗体のパネルを選択し、産生し、及びそれらの可変領域を配列決定し、且つこれらの抗体及びその誘導体を二重特異的分子との関連でのそれらの活性についてさらに評価した。
【０２１１】
実施例２  エフェクター細胞受容体を標的とする、ＦｃＲｎには結合するがＦｃγＲには結合しない二重特異的抗体形態の同定
実験は、Ｆｃドメインを、抗ＮＫｐ４６結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することを目的として行われた。そのような二重特異的タンパク質は、その抗ＮＫｐ４６結合ドメインを介してＮＫｐ４６に一価で結合するはずである。単量体Ｆｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しないはずである。結果として、そのような二重特異的タンパク質は、Ｆｃγ媒介（例えば、ＣＤ１６媒介）標的細胞溶解を誘導しないはずである。
【０２１２】
実施例２−１  抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ抗ＣＤ３の作製及び結合分析
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗ＮＫｐ４６二重特異的抗体が作製されていないため、ＮＫｐ４６を介したＮＫ細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の可能な機能を調べるために、ＮＫｐ４６の代わりにＣＤ３をモデル抗原として使用した。
【０２１３】
腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）をベースとした二重特異的Ｆｃを使用して、新規な単量体二重特異的ポリペプチド形態のＦｃＲｎ結合及びＣＤ１９結合機能を評価した。最終ポリペプチドのドメイン配置は、「Ｆ１」形態と呼ばれる（ＣＨ２ドメインの星は、本明細書で試験されたポリペプチドには含まれていない任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）（図２を参照されたい）。
【０２１４】
二重特異的単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）をベースに構築した。ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙを含んでいた。このポリペプチドは、以下のように配置されたドメインを有する：抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＤ３。ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列も設計した。
【０２１５】
このＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙを含んでいた。選択したＣＨ２ドメインは野生型ＣＨ２であった。単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分及び抗ＣＤ１９のＤＮＡ及びアミノ酸配列を以下に示す。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下の通りであった。
抗ＣＤ１９−ＶＫ
【化１９】
2018519296.tif 000027
抗ＣＤ１９−ＶＫ
【化２０】
2018519296.tif 000028
抗ＣＤ１９−ＶＨ
【化２１】
2018519296.tif 000029
抗ＣＤ１９−ＶＨ
【化２２】
2018519296.tif 000030
【０２１６】
単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分及び最終の二重特異的ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ（最後のＫは、この構築物中で除去された）
【化２３】
2018519296.tif 000031
ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ＊（＊最後のＫ残基は、この構築物中で除去された）
【化２４】
2018519296.tif 000032
抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３完全配列（成熟タンパク質）
【化２５】
2018519296.tif 000033
【０２１７】
組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
【０２１８】
ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）をＡＭＡＸＡ  ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種した。２４時間後、ハイグロマイシンＢを培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を１週間後に培地で監視した。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得た。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。
【０２１９】
ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ  ｐＨ３）で溶出し、及びＴＲＩＳ−ＨＣＬ  ｐＨ８．５を用いて溶出物を即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ  ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【０２２０】
実施例２−２：抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＣＤ３〜Ｂ２２１、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、及びＣＨＯ細胞株の結合分析
細胞を回収して、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３産生細胞の細胞上清で、４℃で１時間染色した。染色緩衝液（ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ）で２回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒト（Ｆｃ）−ＰＥ抗体（ＩＭ０５５０  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ−１／２００）で４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２２１】
ＣＤ３及びＣＤ１９の発現もフローサイトメトリーによって制御した。細胞を回収して、５μｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び５μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体を用いて、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２２２】
これらの実験の結果は、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３タンパク質が、ＣＤ３細胞株（ＨＵＴ７８及びＪＵＲＫＡＴ細胞株）及びＣＤ１９細胞株（Ｂ２２１細胞株）に結合するが、陰性対照として使用されたＣＨＯ細胞株には結合しないことを明らかにした。
【０２２３】
実施例２−３：
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３によるＴ細胞及びＢ細胞の凝集
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３をＴ／Ｂ細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、ＣＤ１９及びＣＤ３発現細胞の凝集を促進するか否かを評価した。
【０２２４】
このアッセイの結果が図１に示されている。上のパネルは、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下で凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が同時にインキュベートされるときに細胞を凝集させることを示し、二重特異的抗体が機能的であることを例示する。下のパネルは、抗体なしで実施された対照実験の結果を示す。
【０２２５】
実施例２−４：
二重特異的単量体ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃において行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸  ｐＨ５．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液として使用された。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０２２６】
ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２２７】
親和性試験
一価親和性試験をＳｉｎｇｌｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の４１．５〜６６０ｎＭの可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）を（再生なしで）ＦｃＲｎに添加し、再生の１０分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、１：１ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
【０２２８】
結果
ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが２つの抗原結合ドメイン（具体的には２つのｓｃＦｖ）間に配置された抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３を評価して、そのような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、ＦｃＲｎへの結合を維持することができ、且つ従来の二重特異的抗体と比較して改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するか否かを決定した。これらの実験の結果はＦｃＲｎ結合性が維持されることを示しており、このモデルは、正常なＩｇＧ又は野生型ＩｇＧに対して、２：１の比（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）ではなく１：１の比（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）を示唆している。
【０２２９】
この多重特異的タンパク質の結合親和性を、ＳＰＲを使用して評価し、完全なヒトＩｇＧ１定常領域を含むキメラ完全長抗体と比較した。単量体Ｆｃは、ＦｃＲｎに対して著しい単量体結合性を維持した（単量体Ｆｃ：ＫＤ＝１９４ｎＭの親和性；二価結合を有する完全長抗体：ＫＤ＝１５．４ｎＭの親和性）。
【０２３０】
実施例３：
単量体Ｆｃを有する多量体二重特異的タンパク質の構築
ＮＫ細胞等のエフェクター細胞上の活性化受容体はエフェクター細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解に寄与し得るが、従来の抗体は活性化受容体をブロックすることができ、完全長ＩｇＧ１としてＮＫｐ４６シグナル伝達をブロックする抗ＮＫｐ４６抗体により例証される。本発明者らは、標的から離れた不適切なＮＫ活性化及び／又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらし得る、標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６アゴニズムを誘導することなく、二重特異的タンパク質形態がＮＫｐ４６のトリガーを引き起こすことができたか否かを調べた。
【０２３１】
新規な二重特異的タンパク質形態を、ＦｃＲｎには結合するがＦＣγＲには結合しない一本鎖タンパク質として開発した。加えて、２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、Ｆｃドメインが単量体を維持している多量体タンパク質を開発し、この多量体タンパク質は、ｓｃＦｖ形態に変換されたときにそれらの標的に対する結合性を維持しない抗体可変領域での使用に適合している。ｓｃＦｖ形態は、抗体のスクリーニングに便利に使用することができ、少なくとも１つの結合領域をＦ（ａｂ）構造として含めることにより、任意の抗標的（例えば、抗腫瘍）抗体可変領域を、抗体がｓｃＦｖとして結合性を維持するか否かにかかわらず、二重特異的タンパク質内のＦ（ａｂ）形態として二重特異的構築物で直接発現させて試験することができ、それにより、利用可能な抗体を単純にスクリーニングしてその数を増加させることができる。Ｆｃドメインが単量体を維持するこれらの形態は、最大の配座柔軟性を維持するという利点を有し、且つ以下に示すように、活性化受容体（例えば、ＮＫｐ４６）又は標的抗原に対する最適な結合性を可能にし得る。
【０２３２】
異なる構築物を、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖからの可変ドメイン、及び実施例１に示されたＮＫｐ４６受容体に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて、二重特異的抗体の調製に使用するために作製した。
【０２３３】
Ｆｃドメインが、一本鎖ポリペプチドで、又は１つの鎖のみがＦｃドメインを有する多量体で単量体を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が、２つの異なる戦略：（１）特定の変異（ＥＵ付番）、即ちＬ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含むＣＨ３ドメインの使用により、又は（２）直列型ＣＨ３ドメインが互いに結合された可撓性リンカーにより分離され、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する直列型ＣＨ３ドメインの使用によって防止された。上記で特定された点変異を含む単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同じであった。直列型ＣＨ３ドメインを有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３−リンカーＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、図２Ａ〜図２Ｄに示されている。
【０２３４】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列も実施例２−１と同じであった。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。以下に、ＮＫｐ４６−３と呼ばれる抗ＮＫｐ４６  ｓｃＦｖの例示的な軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列が示される。
【０２３５】
【表７】
2018519296.tif 000034
【０２３６】
形態１（Ｆ１）（抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＮＫｐ４６（ｓｃＦｖ））
形態１（Ｆ１）のドメイン構造が図２Ａに示されている。二重特異的Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）に特異的なｓｃＦｖ及びＮＫｐ４６受容体に特異的なｓｃＦｖをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６
【０２３７】
アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。最終ポリペプチドのドメイン配置（ＣＨ２ドメインの星は、任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）が図２に示されている。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメインとＶＫドメインとの間にリンカーを含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。アミノ酸配列（完全な配列（成熟タンパク質））が以下に示されている。
【化２６】
2018519296.tif 000035
【０２３８】
形態２（Ｆ２）：ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３
Ｆ２ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であり、それは、同様にＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ）を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ。
【０２３９】
（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（即ち、ｓｃＦｖ）から構成されていた。二重特異的ポリペプチドの他の形態と同様に、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【化２７】
2018519296.tif 000036
【０２４０】
形態８（Ｆ８）
Ｆ８ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｂに示す。単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は形態Ｆ２と同様であり、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙ、並びにＮ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性をさらに消失させるＮ２９７Ｓ変異）を同様に含む。Ｆ８タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである１（野生型、Ｆ８Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ８Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ８Ｃ）。変異型Ｆ８Ｂ及びＦ８Ｃは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製上の利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
【０２４１】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は３．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ８Ｃ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ８「Ｃ」変異体の３つのＦ８タンパク質鎖のアミノ酸配列を配列番号１３、１４及び１５に示す。
【化２８】
2018519296.tif 000037
【０２４２】
形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びそれぞれＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合している２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。この三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造を図２Ｂに示し、ＣＨ１及びＣＫドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を維持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ９タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を回避することにより作製で利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
【０２４３】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールで８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）という高い産生収率を示した。変異体Ｆ９Ａ、Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃのそれぞれに関する３つＦ９タンパク質鎖のアミノ酸配列を、以下の表で列挙する配列番号に示す。
【０２４４】
【表８】
2018519296.tif 000038
【０２４５】
【化２９】
2018519296.tif 000039
【化３０】
2018519296.tif 000040
【０２４６】
形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びＣＨ１−ＣＫ二量体化によって中心鎖に結合している第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。この二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造を図２Ｂに示し、ＣＨ１及びＣＫドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４で示すような直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ１０タンパク質の以下の３つの変異体も作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基により置換された第２（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製で利点を提供した。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
【０２４７】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールで２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）という良好な産生収率を示した。変異体Ｆ１０Ａ、Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃのそれぞれに関する３つＦ９タンパク質鎖のアミノ酸配列を、以下の表で列挙する配列番号に示す。
【０２４８】
【表９】
2018519296.tif 000041
【０２４９】
【化３１】
2018519296.tif 000042
【化３２】
2018519296.tif 000043
【化３３】
2018519296.tif 000044
【０２５０】
形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示す。このヘテロ二量体タンパク質はＦ１０に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ様構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１。
【０２５１】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号３１及び３２に示す。
【化３４】
2018519296.tif 000045
【０２５２】
形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示し、ＣＨ１及びＣＫドメイン間の結合はジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質はＦ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣＫドメインが逆である。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ。
【０２５３】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号３３及び３４に示す。
【化３５】
2018519296.tif 000046
【０２５４】
形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示し、ＣＨ１及びＣＫドメイン間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質はＦ９と同様であるが、ＶＨ及びＶＫドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣＫドメインは、それぞれそれらのパートナーと逆である。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
【０２５５】
加えて、Ｆ１７タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生して精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質鎖の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号３５、３６、及び３７に示す。
【化３６】
2018519296.tif 000047
【０２５６】
実施例４：
二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的ＮＫｐ４６抗体形態
二量体Ｆｃドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発しており、このタンパク質構築物は、実施例３の単量体Ｆｃドメインタンパク質の利点の多くを共有するが、より高い親和性でＦｃＲｎに結合する。ＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）への結合が低かった若しくは実質的に欠如していた又はＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）への結合を有していた様々なタンパク質形態を作製し、例えば、ヒトＣＤ１６への結合親和性は、ＳＰＲ（例えば、実施例１５の方法を参照されたい）によって評価された場合に、野生型ヒトＩｇＧ１抗体の結合親和性の１−ｌｏｇ内であった。この異なるポリペプチド形態を、（ＶＨ−（ＣＨ１／ＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位又は（ＶＫ−（ＣＨ１又はＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験及び比較した。次いで、ＣＨ３ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン（分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン）、直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。２つの鎖が、ＣＨ１−ＣＫ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第３鎖と結合して三量体を形成する。
【０２５７】
様々な構築物を、二重特異的抗体の調製に使用するために、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列及び実施例１で明らかにされたＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて作製した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ドメイン構造は、図２Ａ〜図６Ｄに示されている。
【０２５８】
形態５（Ｆ５）：ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣＫとＣＨ２ドメイン間に図形で示されている）及びＣＨ１とＣＫドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１
【０２５９】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３７ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８、３９、及び４０に示されている。
【化３７】
2018519296.tif 000048
【０２６０】
形態６（Ｆ６）：ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ連結グリコシル化を防止するためのＮ２９７Ｓ置換を含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１２ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４１、４２、及び４３に示されている。
【化３８】
2018519296.tif 000049
【０２６１】
形態７（Ｆ７）：ＣＤ１９−Ｆ７−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ７タンパク質は、Ｆ６と同じであるが、但し、中心鎖とＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのＣ末端でＦｃドメインに連結されたＣＨ１及びＣＫドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１１ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。７６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、及び４６に示されている。
【化３９】
2018519296.tif 000050
【０２６２】
形態１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９−Ｆ１３−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣＫとＣＨ２ドメイン間に示されている）及びＣＨ１とＣＫドメイン間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３。
【０２６３】
（ＶＨ−ＶＫ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。
【０２６４】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、６．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ１３タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４７及び４８に示されている。
【化４０】
2018519296.tif 000051
【０２６５】
形態１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９−Ｆ１４−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４二重特異的形態は、Ｎ連結グリコシル化をなくすためにＣＨ２ドメイン変異Ｎ２９７Ｓを有する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ１４タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４９及び５０に示されている。
【化４１】
2018519296.tif 000052
【０２６６】
形態１５（Ｆ１５）：ＣＤ１９−Ｆ１５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１５ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＮ末端ＶＨ−ＣＨ１とＶＫ−ＣＫ単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、０．９ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１５タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号５１、５２、及び５３に示されている。
【化４２】
2018519296.tif 000053
【０２６７】
形態１６（Ｆ１６）：ＣＤ１９−Ｆ１６−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＣ末端ＶＨ−ＣＫとＶＫ−ＣＨ１単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号５４、５５、及び５６に示されている。
【化４３】
2018519296.tif 000054
【０２６８】
形態Ｔ５（Ｔ５）
三量体Ｔ５ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ５ポリペプチドはＦ５形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３の鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。従って、このタンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを有し、このタンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。以下のように、２つの異なるＴ５タンパク質を作製した。
【０２６９】
第１のＴ５タンパク質は、ヒトＣＤ１３７に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトＮＫｐ４６に結合する１つの抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する１つの抗原結合ドメインとを有した。Ｔ５  ＣＤ１３７−Ｔ５−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す（抗ＣＤ１３７を太字及び下線で示し、抗ＣＤ１９を下線で示し、抗ＮＫｐ４６をイタリック体で示す）。
ＣＤ１３７−Ｔ５−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９
ポリペプチド１：
残基１〜１２１は抗ＣＤ１３７結合ドメインであり、１２２〜４５４及び５７１〜６７７はＴ５配列であり、４５５〜５７０は抗ＮＫｐ４６結合ドメインである
【化４４】
2018519296.tif 000055
ポリペプチド２：
残基１〜１０９（抗ＣＤ１３７）、１１０〜４４３はＴ５配列である
【化４５】
2018519296.tif 000056
ポリペプチド３：
残基１〜１０７は抗ＮＫｐ４６結合ドメインであり、１０８〜２１９はＴ５配列であり、２２０〜４６９は抗ＣＤ１９結合ドメインである
【化４６】
2018519296.tif 000057
【０２７０】
第２のＴ５タンパク質は、異なる抗体に由来する（及びＣＤ２０上の異なるエピトープに結合する）、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇａｚｙｖａｒｏ（登録商標）、オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶＨ及びＶＬを含んだ。第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶＨ及びＶＬを含んだ。第３の抗原結合ドメインはヒトＮＫｐ４６に結合する。このＴ５タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す（リツキシマブ配列を太字及び下線で示し、抗ＧＡ１０１配列を下線で示し、抗ＮＫｐ４６をイタリック体で示す）。
ポリペプチド１：
【化４７】
2018519296.tif 000058
ポリペプチド２：
【化４８】
2018519296.tif 000059
ポリペプチド３：
【化４９】
2018519296.tif 000060
【０２７１】
形態Ｔ６（Ｔ６）
三量体Ｔ６ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ６ポリペプチドはＦ６形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３の鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。このタンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを有するが、Ｎ２９７置換に起因して、この三量体タンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。２つの異なるＴ６タンパク質を作製した。第１のＴ６タンパク質は、ヒトＣＤ１３７に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトＮＫｐ４６に結合する１つの抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する１つの抗原結合ドメインとを有した。第２のＴ６タンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した（ＣＤ１３７−Ｔ６−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９）。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含んだ。これらのＴ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
ＣＤ１３７−Ｔ６−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９
ポリペプチド２：
【化５０】
2018519296.tif 000061
ポリペプチド１：
【化５１】
2018519296.tif 000062
ポリペプチド３：
【化５２】
2018519296.tif 000063
ＧＡ１０１−Ｔ６−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド２：
【化５３】
2018519296.tif 000064
ポリペプチド１：
【化５４】
2018519296.tif 000065
ポリペプチド３：
【化５５】
2018519296.tif 000066
【０２７２】
形態Ｔ９Ｂ（Ｔ９Ｂ）
三量体Ｔ９Ｂポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ９ＢポリペプチドはＦ９形態（Ｆ９Ｂ変異体）の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、（第３の鎖上の）遊離ＣＨ１ドメインのＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。このタンパク質は、従って、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを有するが、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換に起因して、このタンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。２つの異なるＴ９Ｂタンパク質を作製した。第１のＴ９Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ１３７に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトＮＫｐ４６に結合する１つの抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する１つの抗原結合ドメインとを有した（ＣＤ１３７−Ｔ９Ｂ−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９）。第２のＴ９Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含んだ。これらのＴ９Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
ＣＤ１３７−Ｔ９Ｂ−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９
ポリペプチド２：
【化５６】
2018519296.tif 000067
ポリペプチド１：
【化５７】
2018519296.tif 000068
ポリペプチド３：
【化５８】
2018519296.tif 000069
ＧＡ１０１−Ｔ９Ｂ−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド２：
【化５９】
2018519296.tif 000070
ポリペプチド１：
【化６０】
2018519296.tif 000071
ポリペプチド３：
【化６１】
2018519296.tif 000072
【０２７３】
形態Ｔ１１（Ｔ１）：ＣＤ１９−Ｔ１１−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｔ１１ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ１１ポリペプチドはＦ１１形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離ＣＨ１ドメインのＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。このタンパク質は、従って、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを有するが、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換に起因して、この二量体タンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。２つの異なるＴ１１Ｂタンパク質を作製した。第１のＴ１１Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ１３７に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトＮＫｐ４６に結合する１つの抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する１つの抗原結合ドメインとを有した（ＣＤ１３７−Ｔ９Ｂ−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９）。第２のＴ９Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは親抗体リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含んだ。これらのＴ１１タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
ＣＤ１３７−Ｔ１１−ＮＫｐ４６−ＣＤ１９
ポリペプチド１：
【化６２】
2018519296.tif 000073
ポリペプチド２：
【化６３】
2018519296.tif 000074
ＧＡ１０１−Ｔ１１−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド１：
【化６４】
2018519296.tif 000075
ポリペプチド２：
【化６５】
2018519296.tif 000076
【０２７４】
実施例５：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ  Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ  １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａで精製した。
【０２７５】
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２７６】
結合試験
抗体を、異なる形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４として試験し、単鎖形態（Ｆ１）及び完全長ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６抗体と比較した。
【０２７７】
二重特異的タンパク質を１μｇ／ｍＬで、プロテインＡチップ上で捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬで、捕捉した二重特異的抗体に注入した。ブランク差し引きのために、サイクルを再び行って、ＮＫｐ４６タンパク質を泳動用緩衝液に替えた。
【０２７８】
親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６２．５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。
【０２７９】
結果
ＳＰＲは、形態Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４の二重特異的ポリペプチドが、ＮＫｐ４６への結合性を維持したことを示した。一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表３に示されている。
【０２８０】
【表１０】
2018519296.tif 000077
【０２８１】
実施例６：
Ｄａｕｄｉ腫瘍標的に対するＮＫ細胞とＦｃ含有ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質との結合
単量体Ｆｃドメイン及び実施例３に記載の一本鎖Ｆ１又は二量体Ｆ２形態に従って配置されたドメイン、及び異なる抗ＮＫｐ４６可変ドメイン（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４）をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、ＮＫ細胞にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｂリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるＤａｕｄｉ）を溶解させる機能的能力について試験した。Ｆ２タンパク質は、ｓｃＦｖ形態ではＮＫｐ４６への結合性を失うが、Ｆ２のＦ（ａｂ）様形態では結合性を維持するさらなる抗体の可変領域（ＮＫｐ４６−９）をさらに含んでいた。
【０２８２】
簡単に述べると、（ａ）静止ヒトＮＫ細胞、及び（ｂ）ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクトされたヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のそれぞれの細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレートにおいて典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで、異なる濃度の単量体二重特異的抗体の存在下で、ＫＨＹＧ−１では５０、静止ＮＫ細胞では（Ｆ１タンパク質に対して）１０又は（Ｆ２タンパク質に対して）８．８に等しいエフェクター／標的比で、ｈＮＫ４６でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１と混合した。短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、上清のサンプルを取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  ベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０２８３】
結果
ＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ実験モデルでは、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）及びＣＤ１９／ＣＤ３二重特異的抗体）と比較して、ヒトＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。
【０２８４】
静止ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したときに、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が同様に、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体）と比較して、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラＩｇＧ１）を、静止ヒトＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の陽性対照として使用した。ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌで）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であり、二重特異的抗体が高い標的細胞溶解活性を有することを例証した。静止ＮＫ細胞での実験の結果は、一本鎖Ｆ１タンパク質については図３Ａに示され、二量体Ｆｃタンパク質については図３Ｂに示されている。
【０２８５】
実施例７：
完全長抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂと枯渇抗腫瘍ｍＡｂとの比較：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質が非特異的ＮＫ活性化を防止する
これらの実験では、特有の二重特異的形態を有する二重特異的抗体が、非特異的ＮＫ細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ活性化を媒介することができるか否かを評価することを目的として、そのような二重特異的抗体を作製した。
【０２８６】
具体的には、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較（ＡＤＣＣ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
【０２８７】
実験は、対照として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ、高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体対照；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ、ヒトＩｇＧ１は、標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合する；並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。
【０２８８】
様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８  Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＮＫ細胞の活性化に対するその相対的な機能的影響について評価するために試験した。
【０２８９】
簡単に述べると、ＮＫ活性化を、フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ１０７の発現を評価することによって試験した。アッセイは、完全ＲＰＭＩ、１５０μＬ最終／ウェルで、９６Ｕウェルプレートで行った。エフェクター細胞は、ドナーから精製した新鮮なＮＫ細胞とした。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９−陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−陰性）、又はＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）とした。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下の３つの条件を試験した。
＞ＮＫ細胞のみ
＞ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（Ｃ１９＋）
＞ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
【０２９０】
エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、２．５：１（５０，０００Ｅ：２０，０００Ｔ）とし、抗体の希釈範囲は、１／４希釈で１０μｇ／ｍＬから始めた（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、３００ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートし、５００ｇで３分間回転させ、染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄し、５０μＬの染色Ａｂミックスを加え、３００ｇで３０分間インキュベートし、ＣｅｌｌＦｉｘを含むＳＢ再懸濁ペレットで２回洗浄し、４℃で一晩保存し、Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を検出した。
【０２９１】
結果
１．ＮＫ細胞のみ
これらの実験の結果は図４Ａに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）はいずれも、ＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現による評価によるとＮＫ細胞を活性化しなかった。完全長抗ＣＤ１９もＮＫ細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでＮＫ細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２９２】
２．ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
これらの実験の結果は図４Ｂに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の結合ドメインのそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。完全長抗ＣＤ１９抗体は、最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化のみを示した。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図４のデータは、完全長抗ＮＫｐ４６抗体が、ＮＫ細胞のみの存在下で観察されたものと同様のレベルのベースライン活性化を誘発することを示す。アレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのＮＫ細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度（ＥＴ  ２．５：１）では、活性化は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２９３】
３．ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
これらの実験の結果は図４Ｃに示されている。標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２９４】
上述の結果は、本発明の二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質が、完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体と異なり、さらには標的細胞の非存在下で同様にＮＫ細胞を活性化する枯渇ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体とも異なり、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化し得ることを示す。抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質により達成されるＮＫ細胞の活性化は、完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１抗体で観察される活性化と比べて顕著に高かった。従って、この二重特異的抗体は、誘発する非特異的細胞傷害性がより低いはずであり、治療で使用される場合により強力であり得る。
【０２９５】
実施例８：
低いＥＴ比での枯渇抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター：標的比で、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるＥＴ比は、実施例７で使用された２．５：１のＥＴ比又は実施例６の１０：１のＥＴ比よりもｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇するであろう設定に近いと考えられる１：１とした。
【０２９６】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
【０２９７】
実験は、対象として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ（標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１）、並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８  Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現により評価される、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な影響について試験した。これらの実験は、ＥＴ比を１：１としたことを除いて実施例７と同様に行った。
【０２９８】
結果
結果
上記の実験の結果は図５に示されている（図５Ａ：ＣＤ１０７及び図５Ｂ：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９の可変領域をそれぞれ含む）は全て、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化した。
【０２９９】
Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、完全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体によって誘発されるものよりも遥かに強力であった。このＡＤＣＣ誘導抗体は、この設定で低い活性を有していた。さらに、この低いＥ：Ｔ比の設定では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同程度に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比で観察された濃度よりも１０倍高い最高濃度でのみ観察された。
【０３００】
標的細胞の非存在下又は標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下では、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたものと同様のレベルのベースライン活性化を示した。抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体は、ＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化しなかった。
【０３０１】
上記の結果は、本発明の二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質が、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができ、より低いエフェクター：標的比が、ＮＫ細胞の活性化の媒介において従来のヒトＩｇＧ１抗体よりも有効であることを示す。
【０３０２】
実施例９：
動作機序の研究
ＮＫｐ４６−３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ２、Ｆ３、Ｆ５、又はＦ６形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９二重特異的抗体を、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解させるその機能的能力について、リツキシマブ（抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
【０３０３】
簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中において典型的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６個の細胞）で標識し、次いで１／５希釈で１０−７ｍｏｌ／Ｌから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した（ｎ＝８濃度）。
【０３０４】
短時間の遠心分離及び３７℃での４時間にわたるインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）による標的細胞の溶解により得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０３０５】
結果
上記実験の結果を図６Ａ（ＫＨＹＧ−１対Ｄａｕｄｉ）及び図６Ｂ（ＫＨＹＧ−１対Ｂ２２１）に示す。ＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ実験モデルでは、各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導するが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体を誘導しなかった。
【０３０６】
実施例１０
抗ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質
ヒトＫＩＲ３ＤＬ２を標的とする二重特異的タンパク質（ＫＩＲ３ＤＬ２×ＮＫｐ４６二重特異的）をＦ６形態として構築し、活性に関して試験した。ＫＩＲ３ＤＬ２（ＣＤ１５８ｋ；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部２）は、Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５０５−５１８（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）で説明されている約１４０ｋＤの３つのＩｇドメイン分子のジスルフィド連結ホモ二量体である。ＫＩＲ３ＤＬ２ポリペプチドに関していくつかの対立遺伝子変異体が報告されており、これらはそれぞれ用語ＫＩＲ３ＤＬ２に包含される。成熟ヒトＫＩＲ３ＤＬ２（対立遺伝子＊００２）のアミノ酸配列をＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ５２５２０に示す。簡潔に述べると、ドナーからのＢｕｆｆｙコート由来のＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中での典型的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。ＫＩＲ３ＤＬ２を発現するＨＵＴ７８腫瘍細胞（ＣＴＣＬ）を５１Ｃｒで標識し、次いで、１／１０希釈で１０μｇ／ｍＬ（又は１００μｇ／ｍＬ）から始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、１０：１（２５０００：２５００）に等しいエフェクター／標的比でＮＫ細胞と混合した（ｎ＝８）。アッセイは、３連においてｃＲＰＭＩ（１５０μＬ最終／ウェル）中であった。
【０３０７】
結果を図６Ｃに示す。この形態中のＣＤ１６に結合しないＦｃドメインにもかかわらず、ＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質として作製したＦ６タンパク質構造は、驚くべきことに、同一の可変領域を含んでおり且つ二価でＫＩＲ３ＤＬ２に結合する既知の抗ＫＩＲ３ＤＬ２ヒトＩｇＧ１抗体と同等の標的細胞溶解能力を示した。
【０３０８】
実施例１１
多量体タンパク質内の鎖内ドメイン運動の効果
本発明者らは、ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質の、標的細胞のＮＫｐ４６媒介溶解を促進する能力が、ＮＫｐ４６抗原結合ドメイン及び目的の抗原と相互作用する抗原結合ドメインの一方又は両方の能力に影響を及ぼしてそれぞれの標的と相互作用することができる二重特異性タンパク質中の２つの抗原結合ドメイン間の距離に影響され得ることを理論化した。また、標的細胞のＮｋｐ４６媒介溶解が、２つの抗原結合ドメインの構造及び／又はそれぞれの高次構造、２つの抗原結合ドメインの構造の影響を受け得る運動の自由度又は柔軟性、並びに２つの抗原結合ドメインが互いに結合する方法、例えばリンカーペプチド及びこのリンカーペプチドの特定の長さ及び化学組成の影響を受け得ることもさらに理論化した。具体的には、溶解性ＮＫｐ４６標的細胞シナプスが二重特異的タンパク質のサイズ及び構造の関数として変化し得ることを理論化した。従って、本発明者らは、抗原結合ドメインが、この抗原結合ドメインがその高次構造、間隔及び柔軟性をより密接に模倣又は近似する形態である二重特異的タンパク質を仮定した。
【０３０９】
これは理論化されており、なぜなら、高次構造の柔軟性、特に鎖内ドメインの運動又は移動が、例えばＮＫｐ４６と目的の抗原結合部位との間の有効距離に影響を及ぼす場合があり、この有効距離は、ＮＫｐ４６標的細胞シナプス並びに多量体二重特異的タンパク質のＮＫｐ４６媒介シグナル伝達及び溶解を媒介する能力への影響を有する可能性があるからである。これらの仮定に基づいて、本発明者らは、抗原結合部位及びこれらの抗原結合部位を分離する具体的なリンカーの構造に基づいて、抗原結合ドメインのより大きい又はより小さい運動の自由度を含む様々な二重特異的タンパク質形態の多量体タンパク質の溶解機能を評価した。
【０３１０】
具体的には、様々な腫瘍抗原に結合する様々な形態（例えば、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１形態）の様々なＮＫｐ４６×腫瘍抗原二重特異的タンパク質を、それぞれのＫＨＹＧ−１ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６−）による腫瘍標的細胞のＮＫｐ４６媒介溶解を誘導する能力に関して評価した。Ｆ５及びＦ６二重特異的タンパク質形態は、ＮＫｐ４６結合部位と目的の抗原結合部位との間の距離が完全長抗体の場合と比べて小さい。これに対して、Ｆ９形態でヒトＣＤ１９を標的とする二重特異的タンパク質（ＣＤ１９×ＮＫｐ４６二重特異的）は、従来の完全長抗体における２つの結合部位の距離と同様に、さらに離れている結合部位を有する。従って、二重特異的タンパク質をＦ９形態として構築し、Ｆ１０及びＦ１１形態と比較した。構造的には形態Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１は互いに非常に近いが、形態Ｆ１０及びＦ１１は、Ｆａｂ構造を有する１つの抗原結合ドメインと、直列型可変ドメイン構造（可撓性リンカーによって分離されている２つの可変ドメイン）を有する他の抗原結合ドメインとによって特徴付けられる。従って、Ｆ１０及びＦ１１は、Ｆ９タンパク質におけるよりも結合部位間の距離が場合により小さいだけなく、より大きい鎖内ドメインの運動及び／又はより小さい局所的立体障害を有する。
【０３１１】
ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中における典型的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６個の細胞）で標識し、次いで、１／５希釈で１０−７ｍｏｌ／Ｌから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した（ｎ＝８濃度）。結果は、ＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞溶解の誘導において、形態Ｆ１０及びＦ１１が両方とも形態Ｆ９と比べて強力であることを示した。上述したように、Ｆ９形態タンパク質は、ＮＫｐ４６結合部位と目的の抗原結合部位との間の距離が完全長抗体と類似し、又は約８０Åであり、Ｆ１０及びＦ１１タンパク質は、可撓性リンカーによりＦｃに連結された単鎖ドメインを含み、抗原結合部位間が実質的に８０Å未満である（Ｆ１０の場合には約５５Å）。
【０３１２】
これに基づき、他のＣＤ１９×ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質を使用して、ＮＫｐ４６結合ドメインと目的の抗原結合ドメインとの間のさらに短い距離の効果を試験した。この実験では、タンパク質形態Ｆ１０及びＦ１１との比較のためにＦ３、Ｆ４タンパク質形態を選択した。これらのタンパク質のそれぞれは抗原結合部位間の距離が８０Å未満であるが、Ｆ３及びＦ４はＦ１０及びＦ１１と比べて短く、Ｆ３及びＦ４は抗原結合部位間の距離がＦ１１と等しいがＦ１０の場合と比べて２５Å小さい。この実験の結果は、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ１０及びＦ１１形態がそれらのＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞溶解を誘導する能力において有意に異ならないことを示した。この結果は、効力を改善する抗原結合ドメイン間の最適な最小間隔が存在し得ること、並びに／又は効力が、抗原結合ドメイン間の間隔と抗原結合ドメインの柔軟性及び／若しくは高次構造との組み合わせの影響を受けることを示唆するであろう。
【０３１３】
実施例１２：
ＮＫｐ４６誘発及びＣＤ１６誘発の組み合わせ
ＮＫｐ４６−３由来の抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＦ５形態に係る配置を有する、ヒトＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質を、精製されたＮＫ細胞を誘導してＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力に関して、Ｆ６形態（ＣＤ１６結合を欠く）での同一の二重特異的抗体及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ１９抗体並びにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
【０３１４】
簡単に述べると、ＥＦＳ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔからの新鮮なヒト精製済ＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中における典型的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＨＵＴ７８細胞（ＣＤ１９を発現しない陰性対照細胞）を５１Ｃｒで標識し、次いで、１／１０希釈で１０μｇ／ｍＬから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、１０：１に等しいエフェクター／標的比でＮＫ細胞と混合した（ｎ＝８濃度）。
【０３１５】
短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０３１６】
この実験の結果を図７に示す。Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６（Ｆ６形態での二重特異的タンパク質）は、完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同様にＤａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において強力であった。この結果は、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体が二価でＣＤ１９に結合することを考慮すると、さらにＣＤ１６が抗ＣＤ１９抗体に結合することから、特に注目すべきである。Ｆ６タンパク質を、Ｋａｂａｔ残基２９７でのアスパラギンを除いてＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６タンパク質と同一であるタンパク質ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６とも比較した。驚くべきことに、ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６（Ｆ５形態タンパク質）によるＣＤ１６誘発によって媒介される強力なＮＫ活性化にもかかわらず、Ｆ５形態は、Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介において、完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態二重特異的タンパク質と比べてはるかに強力であった。これは、ＣＤ１６が誘発される場合であってもＮＫｐ４６が標的細胞溶解を増強し得ることを示唆するであろう。実際に、同程度の標的細胞溶解では、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６は、完全長抗ＣＤ１９  ＩＧｇ１と比べて少なくとも１０００倍強力であった。これらの効力の結果は、本発明の多重特異的ＮＫｐ４６抗体が、例えば癌又は感染性疾患の処置において、ヒト治療での使用に十分に適しているはずであることを示唆するであろう。
【０３１７】
実施例１３：
ＣＤ１６結合ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的の作用機序
ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的Ｆ５及びＦ６によるＤａｕｄｉ細胞の溶解を従来のヒトＩｇＧ１抗体と比較した。対照として、ＣＤ１９を欠くＨＵＴ７８細胞についても溶解を試験し、ＨＵＴ７８細胞溶解の陽性対照は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＫＩＲ３ＤＬ２であった（ＨＵＴ７８はＫＩＲ３ＤＬ２陽性である）。細胞傷害アッセイを実施例１０と同様に行った。ＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色を実施例７と同様に行った。
【０３１８】
細胞傷害アッセイに関する結果を図８に示す（右側パネルにおけるＤａｕｄｉ細胞及び左側パネルにおけるＨＵＴ７８細胞）。Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、ＮＫ細胞が標的細胞と遭遇した場合にＮＫｐ４６が誘発する作用様式を有するが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３二重特異的タンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力を示した。Ｆ５タンパク質もＦ６タンパク質も、ＨＵＴ７８細胞へのいかなるＮＫ細胞の細胞傷害性も媒介しなかった。
【０３１９】
ＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色の結果は、Ｆ５タンパク質によるＮＫ細胞の表面上のＣＤ１３７の強力な上方制御を示した。この結果を図９に示す（最も左側のパネル：ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ、中央のパネル：ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８、最も右側のパネル：ＮＫ細胞のみ）。ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３が最高のＣＤ１３７上方制御を示した。ＣＤ１６に結合する完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１抗体はＣＤ１３７上方制御も誘発したが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３と比べてはるかに低かった。ＮＫｐ４６を介して機能するがＣＤ１６を介しては機能しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、いかなる検出可能なＣＤ１３７上方制御も誘発しなかった。Ｆ５形態の顕著な効力は、ＮＫｐ４６及びＣＤ１６の二重標的化によって媒介され得るＮＫ細胞上の特に強力なＣＤ１３７上方制御から生じ得ると仮定する。
【０３２０】
実施例１４：
Ｆｃが操作されたＣＤ１６結合ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的
最も強力な新世代のＦｃ増強抗体を改善することができる薬剤を生成するために、新規の二重特異的タンパク質をさらに構築した。この実験では、比較抗体として市販の抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇａｚｙｖａｒｏ（登録商標）、オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を選択し、これらは、低フコシル化されたＮ連結グリコシル化の結果としてＣＤ１６Ａ結合性が増強されているＦｃ改変ヒトＩｇＧ１抗体である。
【０３２１】
ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的タンパク質を、ＣＤ１６結合なしのタンパク質（Ｆ６形態）として、ＣＤ１６結合ありのタンパク質（Ｆ５形態）として、又はＦ５をベースとするが重鎖のＣＨ２ドメイン中にヒトＣＤ１６Ａに対する結合親和性を増加させる２つのアミノ酸置換を含むＦｃ操作形態（「Ｆ５＋」と称する）として作製した。これらの構築物では、抗ＣＤ２０  ＡＢＤはＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含む。
【０３２２】
ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的Ｆ５、Ｆ５＋及びＦ６抗体によるＤａｕｄｉ細胞の溶解を市販の抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標））と比較した。細胞傷害アッセイを実施例１０と同様に行った。
【０３２３】
この細胞傷害アッセイの結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質は、ＧＡ１０１と比べてＤａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力（ＥＣ５０で約１０倍の増加）を示した。
【０３２４】
さらに、ＡＤＣＣ最適化Ｆｃを二重特異的形態（Ｆ５＋）に使用する場合、ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１活性におけるＮＫｐ４６の寄与を確認する、ＮＫｐ４６アームを欠くＦ５＋−ＢＳ（ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＩＣ；黒色の菱形）とＣＤ１６＋ＮＫｐ４６に同時に結合するＦ５＋−ＢＳ（ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１；黒色の四角）との間での有意な差異を観測した。驚くべきことに、ＣＤ１６に対するＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１の高い親和性及び推定される最大ＮＫ細胞媒介溶解にもかかわらず、ＮＫｐ４６はそれでも細胞傷害活性の実質的なさらなる増加を誘発した。この結果は、ＣＤ１６を介してＡＤＣＣを誘導することができる薬剤を、ＮＫｐ４６に媒介される溶解を誘導する能力をこの薬剤にさらに付与することにより改善し得ること、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６薬剤の効力を、Ｆｃ操作によりＣＤ１６への親和性を増強させることによって改善することもできることを示唆するであろう。
【０３２５】
様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲＮに対する親和性を、実施例２〜６に記載されているように、組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。
【０３２６】
完全なヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及びＮＫｐ４６−３（Ｆ２ではＮＫｐ４６−２）からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、又はＦ１４形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質をそれぞれの分析物について試験し、全てのセンサーグラムを、定常状態又は１：１のＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
【０３２７】
これらの実験の結果は以下の表４に示されている。二量体Ｆｃドメイン（形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）を有する二重特異的タンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体の親和性と同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメイン（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）を有する二重特異的タンパク質もＦｃＲｎに対する結合親和性を示したが、二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的タンパク質よりも低い結合性であった。
【０３２８】
【表１１】
2018519296.tif 000078
【０３２９】
実施例１６
Ｆｃγに対する結合性
そのような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質がＦｃγ受容体への結合を保持し得るかどうかを評価するために、様々な二重特異的Ｆｃタンパク質を評価した。
【０３３０】
ＳＰＲ測定を２５℃においてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えヒトＦｃＲ（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂ）をクローニングし、産生させて精製した。
【０３３１】
Ｆ５及びＦ６二重特異的抗体ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３又はＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。二重特異的抗体を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、８００〜９００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。
【０３３２】
一価親和性試験を古典的なｋｉｎｅｔｉｃ  ｗｉｚａｒｄ（製造業者により推奨されている）に従って評価した。ＣＤ６４の場合には０．７〜６０ｎＭの及び他の全てのＦｃＲの場合には６０〜５０００ｎＭの範囲の可溶性分析物（ＦｃＲ）の連続希釈物を固定した二重特異的抗体全体にわたり注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、ＣＤ６４の場合には１：１動態結合モデルを使用してフィッティングし、他の全てのＦｃＲの場合にはＳｔｅａｄｙ  Ｓｔａｔｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙモデルでフィッティングした。
【０３３３】
この結果は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１が全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合するが、ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３二重特異的抗体はいずれの受容体にも結合しないことを示した。一方、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３は、ヒト受容体ＣＤ６４（ＫＤ＝０．７ｎＭ）、ＣＤ３２ａ（ＫＤ＝８４６ｎＭ）、ＣＤ３２ｂ（ＫＤ＝１８５０ｎＭ）、ＣＤ１６ａ（ＫＤ＝１０９８ｎＭ）及びＣＤ１６ｂ（ＫＤ＝２４２６ｎＭ）のそれぞれに結合した。従来のヒト抗ＩｇＧ１抗体は、これらのＦｃ受容体への同等の結合性を有する（ＫＤを以下の表に示す）。
【０３３４】
【表１２】
2018519296.tif 000079
【０３３５】
実施例１８：
様々な二重特異的形態の、既存の形態と比較して改善された産生プロフィール及び収率
ブリナツモマブ、並びにＦ１〜Ｆ１７形態及びＮＫｐ４６−３をベースとするＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する２つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って且つ同じ発現系を使用して、形態６（Ｆ６）、ＤＡＲＴ形態及びＢＩＴＥ形態の下でクローニングして産生させた。Ｆ６、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥ二重特異的タンパク質を、Ｆ６の場合にはｐｒｏｔ−Ａビーズを使用し、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥの場合にはＮｉ−ＮＴＡビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。精製したタンパク質をさらに分析し、ＳＥＣにより精製した。ＢＩＴＥ及びＤＡＲＴは、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示しており、精製したタンパク質は非常に複雑なＳＥＣプロフィールを有する。ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥは、予想されるＳＥＣ画分（ＢＩＴＥの場合には３及び４、並びにＤＡＲＴの場合には４及び５）でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってわずかに検出可能であり、Ｆ６形態は、多量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク（画分３）を有する、明確で単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。Ｆ６形態の主ピークは全タンパク質の約３０％に一致する。これらの結果は、Ｆ１〜Ｆ１７タンパク質で見られるものと一致し（データは示さない）、これは、これらの形態中に存在するＦｃドメイン（又はＦｃ由来ドメイン）が産生を促進し、二重特異的タンパク質の品質及び溶解性を改善することを示す。
【０３３６】
さらに、タンパク質Ｆ１〜Ｆ１７中に存在するＦｃドメインは、ペプチドタグの取込みを必要とすることなくアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適しているという利点を有する。これは、そのようなタグは望ましくない免疫原性を潜在的に誘発し得ることから治療用製品では望ましくないことから望ましい。対照的に、ＢｉＴｅ及びＤＡＲＴ抗体を、プロテインＡを使用して精製することができないが、Ｆ１〜Ｆ１７抗体全てにプロテインＡが結合する。以下の表６は、様々な形態の生産性を示す。
【０３３７】
【表１３】
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【０３３８】
表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合に「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。
【０３３９】
本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。
【０３４０】
語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。
【０３４１】
本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。
【０３４２】
本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
【０３４３】
前述の本発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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