(57)【要約】血清の非存在下で浮遊培養することができる適応メイディン・ダービー・イヌ腎細胞株、および適応ＭＤＣＫ細胞株を培養するための合成培地を開示する。さらに、適応ＭＤＣＫ細胞株を生育させる培養方法と、合成培地で生育させた適応ＭＤＣＫ細胞株からワクチンを生産する方法とを開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞および増殖培地を含む組成物であって、前記増殖培地が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない培地を含み、前記適応ＭＤＣＫ細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊培養物中にある、組成物。
【請求項２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍加時間を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ワクチン用のウイルスを生産するのに適している、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）での［寄託番号］である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
マイクロキャリアを含まない浮遊状態で適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を培養する方法であって、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応ＭＤＣＫ細胞を接触させること、および前記細胞を５％ＣＯ２で生育させることを含み、前記適応ＭＤＣＫ細胞はマイクロキャリアを含まない浮遊培養で生育することができる、方法。
【請求項９】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞においてワクチン生産用のウイルスを生産する方法であって、前記適応ＭＤＣＫ細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養することができ、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応ＭＤＣＫ細胞を接触させることと、前記細胞にウイルスを感染させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、方法。
【請求項１５】
前記培地に追加のグルコースを添加しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでの［寄託番号］である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるメイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を産生する方法であって、前記方法が、
ａ）接着ＭＤＣＫ細胞を準備することと、
ｂ）前記ＭＤＣＫ細胞を浮遊培養に適応させるために十分な時間、攪拌されたバイオリアクター中、マイクロキャリアの非存在下で、血清を含む増殖培地中で前記接着ＭＤＣＫ細胞を培養することと、
ｃ）血清を含まない合成培地中の浮遊培養で前記浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるＭＤＣＫ細胞を提供することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記増殖培地が、約１％〜約１０％血清を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖培地が、約５％血清を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）およびｃ）で、前記ＭＤＣＫ細胞を５％ＣＯ２の存在下で培養する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでの［寄託番号］である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により産生された適応ＭＤＣＫ細胞を含む、組成物。
【請求項２８】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ワクチンウイルス生産の分野、特に無血清合成培地でのメイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞株の生育および浮遊培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在ワクチンは、鶏卵、初代培養細胞または細胞株での培養を含む様々な方法を使用して生産されている。これらの方法は、費用、リスク、および大規模な工業生産レベルを維持する能力に関する様々な問題を含んでいる。
【０００３】
メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞は、ワクチン生産、特にインフルエンザのワクチンの生産に使用されている細胞株の１つである。細胞培養は鶏卵の利用能に依存しておらず、より大規模に行うことができるため、ワクチン生産に関する細胞培養は、鶏卵より有利である。しかしながら、ＭＤＣＫ細胞の培養にはいくつかの欠点がある。ＭＤＣＫ細胞は、培養のため血清などの定義されていない補充物質を必要としており、これはヒトで使用するための医薬品を作製する場合には高価であり、望ましくない。またＭＤＣＫ細胞は、頻繁な培地交換を必要としており、これもさらにコストを上げている。さらに、ＭＤＣＫ細胞は、かなりの表面積を必要とする培養容器；またはマイクロキャリアのいずれかにおける接着培養で生育しており、費用効果は不良で、人手がかかり、細胞にダメージを与えるリスクを呈する。
【０００４】
米国特許第６，８２５，０３６号および同８，８４６，９３２号、ならびに米国特許出願公開公報第２０１３／０１８３７４１号は、無血清浮遊培養およびワクチン生産のための方法およびＭＤＣＫ細胞を記載している。しかしながら、これら無血清培地中の細胞の生育は、定義されていない培地成分である加水分解物または他の動物由来成分を必要とし、これらは費用および制御しやすさの点で不利益を呈する。
【０００５】
よって、効率的なワクチン生産のための無血清合成培地での浮遊培養が可能なＭＤＣＫ細胞が、なおも必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書中に記載される技術は、適応ＭＤＣＫ細胞および同細胞を生育させるための培養培地に関する。さらに本技術は、同細胞を培養する方法および同適応細胞を使用してワクチンを生産する方法に関する。本明細書中に記載される適応ＭＤＣＫ細胞は、マイクロキャリアを使用することなく無血清浮遊培養に適応している。さらに適応ＭＤＣＫ細胞は、本明細書中に記載される合成培地の存在下で培養されている。
【０００７】
ＭＤＣＫ細胞株は、健常な雌性成体コッカースパニエルの腎臓に由来する接着性細胞株である。ＭＤＣＫ細胞は、ウイルスの生産、たとえばワクチンの生産に使用されている。現在ＭＤＣＫ細胞は、接着培養として血清含有培地で培養されている。商業生産に適した密度までＭＤＣＫ細胞を生育させるため、ＭＤＣＫ細胞生育の表面積を大きくするために、マイクロキャリア（たとえばマイクロビーズ）またはローラーボトルが使用されている。マイクロキャリアまたはローラーボトルでのＭＤＣＫの培養は、費用の増大および規模拡大の限界を含む多くの欠点を有する。
【０００８】
ＭＤＣＫ細胞を含む細胞株は、通常、細胞の生育および増殖を助けるために血清含有培地で生育させる。しかしながら、血清は、高コスト、コンタミネーションのリスク、定義されていない性質、およびばらつきがあるため、特に大規模な商業生産において有益ではない。このような不利益は、一部の細胞株を培養するための無血清培地の使用に拍車をかけている。しかしながら、無血清培地はなおも、動物性成分、たとえばトランスフェリン、および他の定義されていない生成物、たとえば加水分解物を含んでおり、このことは当該培地を使用する際に、あるレベルのリスクおよび不確実性をもたらす。
【０００９】
合成培地とは、組み換えタンパク質および／またはホルモンのみを含み、正確な培地の構成成分および濃度が既知であり、ワクチン用のウイルスの商業生産で使用される細胞株を生育させるための改善されたシステムを提供する。合成培地は、動物由来の成分を全く含まない。
【００１０】
所定の細胞株が無血清の合成培地中で生育する能力は予測不能である。同様に、特に所定の培地中での細胞株の浮遊培養での生育への適応も予測不能である。たとえば、細胞は、表面に接着する機会がなければ、浮遊培養で生育させると死滅する場合があり；細胞は、血清が培地から除去されている際に死滅する場合があり；合成培地は、細胞の生育を維持するためには十分ではない場合があり；細胞の生育および／または増殖に（たとえば倍化時間が延びることにより）負の影響を与える場合があり；細胞の形態および／または遺伝子発現が変化することにより、当該細胞が意図した目的に適さない場合があり；細胞の特徴が変化することにより、当該細胞により作製されたウイルスが、ワクチンで使用するには抗原性が不十分である場合がある、などのことがあり得る。
【００１１】
本明細書中の開示は、ＭＤＣＫ細胞を、無血清の合成培地中で浮遊培養での生育に適応することができ、適応ＭＤＣＫ細胞が、接着性で血清の存在下で培養される親細胞株よりも高力価のワクチン生産用ウイルスを生産し、当該適応細胞により生産されたウイルスが抗原性を維持しているとの、驚くべき発見に部分的に基づくものである。
【００１２】
一態様では、本開示は、適応ＭＤＣＫ細胞および増殖培地を含む組成物であって、上記増殖培地が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない培地を含み、上記適応ＭＤＣＫ細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊培養で維持されている、組成物に関する。
【００１３】
一態様では、本開示は、マイクロキャリアを含まない浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株を培養する方法であって、上記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と上記適応ＭＤＣＫ細胞株を接触させることを含み、上記適応ＭＤＣＫ細胞株が、マイクロキャリアを含まない浮遊培養で生育できる、方法に関する。一実施形態では、当該細胞は、５％ＣＯ２の存在下で生育する。好ましい実施形態では、培地は、細胞培養段階の間、交換されない。
【００１４】
一態様では、本開示は、適応ＭＤＣＫ細胞株でワクチンを生産する方法であって、上記ＭＤＣＫ細胞株が、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養することができ、上記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地とＭＤＣＫ細胞株を接触させることを含む、方法に関する。一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞を２×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種し、細胞が定常期に近づいて細胞密度が約２×１０６細胞／ｍｌに達すると、ウイルス感染を行う。一実施形態では、ウイルス感染の前に、培地を遠心分離により１００％新鮮なものと交換し、次いでトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシンおよびウイルス菌株を添加する。一実施形態では、ウイルス感染段階の間、細胞を３２〜３４℃でインキュベートする。一実施形態では、細胞を、スピナーフラスコで生育させる。一実施形態では、ＣＰＥが全体的に起こる際に上清を回収する。一実施形態では、追加のグルコースを、培地に添加しない。一実施形態では、培地は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのグルコース、好ましくは約２５ｍＭ〜約３０ｍＭのグルコース、より好ましくは約２６ｍＭ〜約２８ｍＭのグルコースを含む。
【００１５】
一態様では、本開示は、血清を含まない合成培地中でマイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応ＭＤＣＫ細胞株を産生させる方法であって、上記方法が、
ａ）接着性ＭＤＣＫ細胞株を準備することと、
ｂ）ＭＤＣＫ細胞株を浮遊培養に適応させるために十分な時間、マイクロキャリアの非存在下で、攪拌しながら、５％（体積／体積、ｖ／ｖ）血清を含む増殖培地中で、上記接着性ＭＤＣＫ細胞株を培養することと、
ｃ）血清を含まない合成培地中の浮遊培養で浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応ＭＤＣＫ細胞を提供することと
を含む、方法に関する。
【００１６】
一実施形態では、ステップｃ）は、合成培地が培養物中の実質的にすべての培地を表し、かつ実質的にすべての血清が除去されるまで、合成培地の量を増加させ、および血清の量（ｖ／ｖ）を減少させて浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株を浮遊状態で培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応ＭＤＣＫ細胞株を提供することを含む。
【００１７】
一実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞株は、ステップｂ）およびｃ）において、５％ＣＯ２の存在下で培養されている。
【００１８】
特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する。
【００１９】
特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している。特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞により生産されたウイルスは、抗原性である。好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである。
【００２０】
ある特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、２０１６年＿に寄託番号＿として有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ））で寄託された細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】無血清合成培地での浮遊培養にＭＤＣＫ細胞を適応させるために使用するプロトコルの概要である。
【図２Ａ】マイクロキャリアに付着した接着性ＭＤＣＫ（ａＭＤＣＫ）細胞の顕微鏡写真である。細胞は、無血清培地で培養した。
【図２Ｂ】マイクロキャリアを用いずに生育させた適応ＭＤＣＫ（ｓＭＤＣＫ）細胞の顕微鏡写真である。細胞は、動物性成分を含まない合成培地で培養した。
【図３】ａＭＤＣＫ細胞（◆）対ｓＭＤＣＫ細胞（▲）の培養時間に対する生細胞密度を示す。
【図４】１０回の継代におけるｓＭＤＣＫ細胞の生育試験の結果を示す。
【図５】ｓＭＤＣＫ細胞の数回の継代（３回〜１０回）の間で実施したＨ７Ｎ９インフルエンザウイルス生産試験の結果を示す。
【図６】ｓＭＤＣＫ細胞の数回の継代（３回〜１０回）の間で実施したＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス生産試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書を読了した後では、様々な代替的な実施形態および代替的な応用で本発明を実施する方法は当業者にとって明白である。しかしながら、本発明の様々な実施形態のすべてが本明細書中に記載されるものではない。当然のことながら、本明細書中提示される実施形態は、単に例示を目的として提示されており、限定されるものではない。このように、様々な代替的な実施形態の詳細な説明は、以下に記載される本発明の範囲または幅を限定すると解釈すべきではない。
【００２３】
本発明を開示および説明する前に、以下に記載される態様は、特定の組成物、当該組成物を調製する方法、またはそれらの使用が、当然それ自体が変動し得ることから、それらに限定されるものではないと理解されるものである。また、本明細書中使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的のためのものであり、限定するように意図されないと理解すべきである。
【００２４】
本発明の詳細な説明は、読み手の簡便性のためにのみ様々なセクションに分割されており、いずれかのセクションで見いだされた開示を、別のセクションと組み合わされてもよい。特段他の意味で定義されない限り、本明細書中使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書および続く特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語を参照するものとする。
【００２６】
本明細書中使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、本発明を限定するよう意図されていない。本明細書中使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に特段他の意味で明確に示されていない限りは複数形をも含むように意図されている。
【００２７】
「任意の」または「任意に」は、続いて記載される事象または状況が起こり得る、または起こり得ないことを意味し、およびこの記載は、事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。
【００２８】
用語「含む」は、組成物および方法が列挙される要素を含むが、他を排除しないことを意味するように意図されている。組成物および方法を定義するために使用される場合の「〜から本質的になる」は、何らかの本質的に重要な他の要素を組み合わせから排除することを意味するものである。たとえば、本明細書中に定義される要素から本質的になる組成物は、請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない他の要素を排除しない。「〜からなる」は、微量を超える他の成分を排除することを意味し、列挙される実質的な方法ステップを意味するものである。これらの移行句のいずれかにより提示される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００２９】
数字表記、たとえばある範囲を含む温度、時間、量、濃度、および他の数字表記の前で使用される際の用語「約」は、（＋）または（−）１０％、５％、または１％変動し得る近似値を示す。
【００３０】
本明細書中使用されるように、「メイディン・ダービー・イヌ腎細胞」または「ＭＤＣＫ細胞」は、１９５８年に明らかに健常な雌性成体コッカースパニエルの組織由来の細胞株からの細胞を表す。ＭＤＣＫ細胞は、多くの場合、ワクチン生産、特にインフルエンザのために使用される。ＭＤＣＫ細胞は、たとえばＢＣＲＣ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来、カタログ番号６０００４）から、市販されている。市販のＭＤＣＫ細胞は、培養物中で接着性であり、最適な生育のためには血清を必要とする。
【００３１】
本明細書中使用されるように、用語「適応ＭＤＣＫ細胞」は、血清を含まない合成培地中浮遊培養（マイクロキャリアを含まない）で生育するように適応している細胞を指す。
【００３２】
本明細書中使用されるように、用語「合成培地」は、成分のすべてが既知であり、同様にそれらの正確な濃度も既知である細胞培養培地を表す。合成培地は動物由来成分を全く含まない。
【００３３】
本明細書中使用されるように、用語「接着培養」は、ある面、たとえば組織培養プレートまたはマイクロキャリアに細胞が接着する細胞培養を表す。「マイクロキャリア」は、何らかのキャリア、たとえば細胞が培養容器の面以外に接着するための面を提供するビーズである。
【００３４】
本明細書中使用されるように、用語「浮遊培養」は、マイクロキャリアを使用することのない、接着培養とは対照的な、浮遊状態の細胞培養を表す。
【００３５】
本明細書中使用されるように、たとえば培養物中の血清および／または増殖培地の減少を表す場合の用語「実質的にすべて」は、望ましくない成分が、培養培地の約０．１％未満、好ましくは約０．０５％未満、およびより好ましくは約０．０１％未満を構成することを意味する。最も好ましい実施形態では、望ましくない成分のすべてが、培養培地から除去されている。同様に、望ましい成分は、約９９．９０％超、好ましくは約９９．９５％超、およびより好ましくは約９９．９９％超を構成する。最も好ましい実施形態では、望ましい成分（たとえば合成培地）は、培地の１００％を構成する。
【００３６】
組成物
本開示は、適応ＭＤＣＫ細胞および合成増殖培地を含む組成物に関する。本組成物は、血清または他の動物由来成分を含まない。
【００３７】
適応ＭＤＣＫ細胞株
一態様では、本開示は、合成培地を含む浮遊培養で、血清を用いずに生育および／または増殖できる適応ＭＤＣＫ細胞に関する。適応ＭＤＣＫ細胞は、浮遊培養での生育または増殖のために、ある面（たとえばマイクロキャリア）を必要とするものではない。この細胞は、ワクチン生産用のウイルスを生産するために使用できる。
【００３８】
一部の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約２０時間〜約４０時間の平均倍化時間を有する。一部の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約２５時間〜約４０時間の平均倍化時間を有する。一部の実施形態では、適応ＤＣＫ細胞は、約３０時間〜約４０時間の平均倍化時間を有する。一部の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約３５時間〜約４０時間の平均倍化時間を有する。一部の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約２０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する。一部の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約２０時間〜約３０時間の平均倍化時間を有する。好ましい実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する。
【００３９】
一部の好ましい実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している。適応ＭＤＣＫ細胞で生産できるウイルスとして、限定するものではないが、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ウイルス（ＮＩＢＲＧ−１４）およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルス（ＮＩＢＲＧ−２６８）が挙げられており、これらは例示として使用される。特に好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである。特に好ましい実施形態では、ワクチンはヒト用ワクチンである。
【００４０】
一実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞により生産されたウイルスは抗原性を保持している。一実施形態では、ウイルスは、宿主の細胞または生物で免疫応答を引き起こすことができる。好ましい実施形態では、宿主の細胞または生物は、ヒトの細胞またはヒトである。
【００４１】
特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、２０１６年＿に寄託番号＿として有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションで寄託された細胞である。細胞は寄託のために２０１６年１０月１９日に提出された。
【００４２】
浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株の培養のための合成培地
合成培地は、血清、加水分解物、または他の動物由来成分を含まないいずれかの合成培地とすることができる。好ましい実施形態では、合成培地は、ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＩＤ：９１１３６）である。一部の実施形態では、合成培地は、表１に記載されているアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、表１に記載されている範囲内の濃度で培地に存在する。この濃度は、終点を含む所定の範囲内のいずれかの部分範囲または値であってもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸は、表１に提示されている好ましい濃度で培地に存在する。
【表１】
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【００４３】
一部の実施形態では、合成培地はグルコースを含む。一部の実施形態では、グルコースの濃度は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭである。好ましい実施形態では、グルコースは約２５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する。特に好ましい実施形態では、グルコースは、約２７．７５ｍＭの濃度で存在する。濃度は、エンドポイントを含む本明細書中に列挙される範囲内のいずれかの範囲または値であってもよい。
【００４４】
浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞の作製方法および培養方法
本開示は、無血清合成培地でのＭＤＣＫ細胞／細胞株の作製および／または培養の方法に関する。ＭＤＣＫ細胞は浮遊状態で培養され、培養容器またはマイクロキャリアへの接着を必要としない。
【００４５】
浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株の作製
一態様では、本開示は、合成培地での生育および／または増殖を行うことができる浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ細胞）を作製する方法に関する。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示は、血清を含まない合成培地中マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応ＭＤＣＫ細胞（細胞株）を産生させる方法であって、上記方法が、
ａ）接着性ＭＤＣＫ細胞を準備することと、
ｂ）ＭＤＣＫ細胞を浮遊培養に適応させるために十分な時間、マイクロキャリアの非存在下、血清を含む増殖培地中で上記接着ＭＤＣＫ細胞を培養することにより、浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を産生させることと、
ｃ）血清を含まない合成培地中、浮遊培養で浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を培養することにより、合成培地中マイクロキャリアを含まない浮遊培養で培養できるＭＤＣＫ細胞を提供することと
を含む、方法に関する。
【００４７】
一実施形態では、ステップｂ）の増殖培地は合成培地ではない。一実施形態では、合成培地はＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地である。
【００４８】
一実施形態では、細胞は、攪拌されたバイオリアクターで増殖される。
【００４９】
一実施形態では、ステップｃ）は、合成培地が培養物中の実質的にすべての培地を表し、実質的にすべての血清が除去されるまで、合成培地の量を増加させ、血清（ｖ／ｖ）の量が減少させて、浮遊培養で浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応ＭＤＣＫ細胞株を提供することを含む。
【００５０】
一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞を、ステップｂ）において約１％〜約２０％の血清中で培養する。一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞を、ステップｂ）において約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約ｌ８％、約１９％、または約２０％の血清中で培養する。範囲は、本明細書中に列挙される、部分範囲を含むいずれか２つの値の間のいずれかの範囲または値を含む。好ましい実施形態では、ＭＤＣＫ細胞を、ステップｂ）において約２％〜約１０％の血清中で培養する。特に好ましい実施形態では、ＭＤＣＫ細胞を、ステップｂ）において約２％〜約５％の血清中で培養する。
【００５１】
一実施形態では、ステップｃ）は、細胞培養物から培地の一部を除去することと、除去した培地を合成培地と交換することとを伴う。一実施形態では、ステップｃ）は、除去した培地からＭＤＣＫ細胞を分離することと、分離した細胞をＭＤＣＫ培養物に戻すこととを伴う。一実施形態では、ステップｃ）は、継代によって合成培地部分を増大させることを伴う。一実施形態では、ステップｃ）は、細胞を無血清合成培地に直接適応させることを伴う。
【００５２】
好ましい実施形態では、無血清合成培地はＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地である。
【００５３】
浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞株の培養
一態様では、本開示は、マイクロキャリアを含まない浮遊状態でメイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を培養する方法に関する。一実施形態では、本方法は、合成培地と浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を接触させることを含む。好ましい実施形態では、血清または他の動物由来成分は増殖培地に存在しない。一実施形態では、細胞は、５％ＣＯ２で生育する。一実施形態では、細胞を、約３〜５日ごとに継代する。好ましくは細胞を、約４日ごとに継代する。特に好ましい実施形態では、培地は培養の間（たとえば細胞が培養において確立された後）、交換しない。
【００５４】
好ましい実施形態では、浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を、浮遊状態で細胞を維持する条件（たとえば攪拌）下で生育させる。このような条件は、当該分野で知られている。非限定的な例として、使い捨ての攪拌タンク反応器、ウェーブバイオリアクター、スピナーフラスコ、および振盪フラスコが挙げられる。
【００５５】
ワクチンを調製する方法
ＭＤＣＫ細胞からのウイルスの生産性が最適化される場合、当該細胞から生産されたウイルスが、改変されていない細胞またはプロトコルにより生産されたウイルスと類似の抗原性を維持しているかどうかは予測することができない。本開示は、本明細書中記載される組成物および培養方法を使用したワクチン用のウイルスを生産する方法に関する。好ましい実施形態では、ウイルスの抗原性は維持されている。一実施形態では、本開示は、ＭＤＣＫ細胞でワクチンを生産する方法であって、上記ＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いず血清を含まない浮遊状態で培養することができる、方法に関する。好ましい実施形態では、細胞を、合成培地中で培養する。一実施形態では、合成培地はＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地である。
【００５６】
一部の実施形態では、ワクチン生産の間、追加のグルコースを培地に添加しない。
【００５７】
一部の実施形態では、培地は、細胞培養段階の間（たとえば細胞が培養において確立された後）、交換されない。現在、細胞培養段階の間に使用されるＭＤＣＫ細胞の増殖培地の少なくとも一部は、細胞培養段階の間、毎日除去され、交換されている。このステップを排除することは、使用される培地量（およびプロセス全体のコスト）の減少、処理ステップの減少などを含む有意な利点を提供する。
【００５８】
一部の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞により生産されたウイルスの抗原性を評価する。好ましい実施形態では、ウイルスは抗原性を維持している。一部の実施形態では、ウイルスは、接着ＭＤＣＫ細胞により生産されたウイルスと比較して抗原性を維持している。一部の実施形態では、ウイルスは、所望のワクチンの生産に必要とされる抗原性に関して抗原性を維持している。一部の実施形態では、ウイルスは、細胞または生物に関する抗原性を維持している。一部の実施形態では、細胞はヒトの細胞である。一部の実施形態では、生物はヒトである。
【００５９】
「抗原性を維持すること」は、たとえば細胞または生物において、ＭＤＣＫ細胞により生産されたウイルス（またはウイルスの一部）が免疫応答を誘導する能力を表す。抗原性は、任意の方法、例えばＨＩアッセイによって測定することができる。
【００６０】
実施例
追加の実施形態を、以下の実施例でさらに詳細に開示するが、これは特許請求の範囲を限定する意図は全くない。
【００６１】
実施例１：無血清合成培地での浮遊培養へのＭＤＣＫ細胞の適応
接着ＭＤＣＫ細胞を無血清浮遊培養に適応させるための１つの非限定的な例のプロトコルの概略を、図１に提供する。簡単に述べると、接着ＭＤＣＫ細胞（ａＭＤＣＫ）（１）を、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地を使用して浮遊培養に段階的に適応させた（２）。次に、浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞（ｓＭＤＣＫ）を、無血清のＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適応させた（３）。また、ＣＹＴＯＤＥＸ（商標）１ビーズ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で生育させたａＭＤＣＫ細胞を、浮遊培養に適応させることなく、無血清培地に適応させた。各条件でのウイルスの生産性および倍化時間を提供する。
【００６２】
ａＭＤＣＫ細胞を浮遊培養に適応させる前に、ＭＤＣＫ細胞を、５％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で生育させた細胞の凍結ワーキングセルバンク由来の接着性培養物として、（培養を）開始した。細胞をＴフラスコで数回継代し、５％ＦＢＳを含む培地に段階的に適応させた。すなわち、Ｔフラスコ中の増殖培地の実質的にすべてをＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地が構成するまで経時的に、増殖培地中のＤＭＥＭの濃度をゆっくりと減少させ、ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地の濃度をゆっくりと増加させた。
【００６３】
Ｔフラスコ中の細胞を、トリプシン―ＥＤＴＡを使用してトリプシン処理し、次いで細胞を１０００ｒｐｍ（２００ｇ）で遠心分離してトリプシンを除去した。細胞を、５％ＦＢＳを含む新鮮な培地に再度浮遊させ、全量６０ｍｌ、５×１０５細胞／ｍｌで、１２５ｍｌのスピナーフラスコに播種した。スピナーフラスコを、５％ＣＯ２、３７℃の湿潤インキュベーターの攪拌プレート（４５〜５５ｒｐｍ）に配置した。ＭＤＣＫ浮遊培養物に、３〜４日ごとに、５％ＦＢＳを含む３３％のＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地に交換した。１週間以内に細胞密度は、約１×１０５〜約２×１０５細胞／ｍｌに減少し、生存率は５０％超であった。ＭＤＣＫ細胞は第２週または第３週に生育を開始した。ＭＤＣＫ浮遊培養での倍化時間は、接着マイクロキャリア培養物で見られた時間（３０〜４０時間）と同様であり、細胞は、単細胞浮遊状態（すなわち、最少の凝集）で生育した。浮遊培養中のＭＤＣＫ細胞の最大密度は、生存率９０％超で２×１０６細胞／ｍｌであった。これらの浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を、マスターセルバンクとして、１０％のＤＭＳＯを含む無血清培地中で凍結した。
【００６４】
凍結したマスターセルバンク由来の浮遊適応ＭＤＣＫ細胞を融解し、５％ＦＢＳを含むＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地中での浮遊培養として直接（培養を）開始した。融解後の２回目の継代で、細胞を直接、完全に無血清のＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地に適応させた。融解後３回目の継代で、細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む無血清培地中で凍結し、ワーキングセルバンクを作製した。
【００６５】
凍結したワーキングセルバンク由来の、浮遊培養に適応させ、無血清に適応させたＭＤＣＫ細胞（ｓＭＤＣＫ）を融解し、血清を含まないＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ中の浮遊培養として直接（培養を）開始した。浮遊培養でのｓＭＤＣＫ細胞の最大密度は、生存率９０％超で約２×１０６細胞／ｍｌであった。ｓＭＤＣＫの倍化時間は３０〜４０時間であった。細胞は、５％ＣＯ２中、約５０〜７０ｒｐｍｍでの攪拌培養で生育させた。
【００６６】
実施例２：ＭＤＣＫ細胞の凝集
図２Ａは、無血清培養物中のＣｙｔｏｄｅｘｌビーズに付着したａＭＤＣＫ細胞の顕微鏡写真を示す。図２Ｂは、無血清のＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ中の遊離浮遊培養でのｓＭＤＣＫ細胞の顕微鏡写真を示す。
【００６７】
ピペッティングまたは細胞を機械的に分散させる他の方法（細胞の培養に必要とされる５０ｒｐｍの攪拌速度以外）を用いなければ、このレベルの凝集が起こった。理論に拘束されるものではないが、細胞の凝集が減少すると、曝露される細胞の表面積がより大きくなり、細胞をより良好に感染させることができることにより、ウイルス力価がより高くなると考えられる。
【００６８】
実施例３：ＭＤＣＫ細胞の生育の比較
ＭＤＣＫ細胞の生育速度を評価した。ＭＤＣＫ細胞を、０．２×１０６細胞／ｍｌ〜０．２５×１０６細胞／ｍｌの密度で１２５ｍｌのスピナーフラスコに播種し、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター中、５０回転／分（ｒｐｍ）の攪拌速度で生育させた。細胞を４日ごとに継代培養した。ｓＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いることなく、４ｍＭのＬ―グルタミンを補充したＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。ａＭＤＣＫ細胞は、４ｍＭのＬ―グルタミンを補充したＯＰＴＩＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で生育させ、５ｇ／ＬのＣＹＴＯＤＥＸ（登録商標）１ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付着させた。培養の２日目から、ａＭＤＣＫ細胞から培養培地の７０％を除去し、新鮮な培地と交換した。ｓＭＤＣＫ細胞では培地交換を行わなかった。
【００６９】
図３は、１２日間の培養にわたる２つの細胞株の生育速度を示す。生存細胞密度は、マイクロキャリア培養と比較して同様の生育パターンで、４日以内に〜２×１０６細胞／ｍｌに達した。生育速度に有意差は観察されなかった。
【００７０】
浮遊培養では培地交換は必要ではなかった。対照的にマイクロキャリア培養は、高い細胞密度に達するために、培養の２日目から開始する７０％の培地交換を毎日必要とした。
【００７１】
実施例４：ｓＭＤＣＫ細胞でのインフルエンザウイルスの生産
ｓＭＤＣＫ細胞のウイルスを生産する能力を決定した。ＭＤＣＫ細胞を、０．２×１０６細胞／ｍｌ〜０．２５×１０６細胞／ｍｌの密度で１２５ｍｌのスピナーフラスコに播種し、実施例３に記載されるように生育させた。培地に追加のグルコースは添加しなかった。
【００７２】
細胞が２×１０６細胞／ｍｌの密度に達した時点で、培地を、最初に遠心分離により１００％新鮮な培地と交換した。ＴＰＣＫ‐トリプシンを培養培地に添加し、次に細胞に、低い感染多重度（ＭＯＩ）でＨ７Ｎ９インフルエンザウイルスを感染させた。ウイルス培養段階の間、スピナーフラスコを３４℃でインキュベートした。全細胞変性効果（ＣＰＥ）が起こった際に上清を回収した。
【００７３】
浮遊培養でのｓＭＤＣＫ細胞の最大密度は、生存率９０％超で約２×１０６細胞／ｍｌである。ｓＭＤＣＫの倍化時間は３０〜４０時間であり、細胞は、凝集した細胞浮遊状態で生育する（図４）。各試料に関して、２つの１：２の段階希釈物（それぞれ１２×１００μｌ）を、丸底の９６ウェルのマイクロタイタープレートで調製した。段階希釈物を、ウェルからウェルに、１：２０．５の希釈倍率をもたらすよう、１：２０．５の係数で移した。０．２５％シチメンチョウ赤血球（２×１０７ＲＢＣ／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを、室温で少なくとも２時間から最大１日までインキュベートした。その後、プレートを、７００ｎｍで吸光度を測定するプレート用光度計でスキャンした。（無視できるウイルスの存在下での）赤血球のカーペット様沈降物からの移行を、吸光レベルの増加として検出することができた。ボルツマンのシグモイドを各データセットにフィットさせ、感染時点での希釈度（パラメーターのうちの１つ）を、滴定終点として定義した。希釈度の逆数を、単位１ＨＡＵ（１００μｌ）−１のＨＡ比活性として定義した。内部標準を使用して、シチメンチョウ赤血球の様々な品質により引き起こされる変動を補正した。同一の実験に属する試料は、可能な限り常に、同じアッセイ試行で分析した。複数回決定した試料の統計解析は、測定に関して１５％未満の分析誤差（信頼区間、α＝０．０５）を予測した。
【００７４】
感染性ウイルスの力価を、ＭＤＣＫ細胞の５０％を感染させるのに必要とされる組織培養感染用量を決定することにより測定した。ウイルス試料の１０倍の段階希釈物（１０−１〜１０−８）を、ＴＰＣＫ‐トリプシンを含む培地で調製し、ＭＤＣＫ細胞をコンフルエンスとなるまで生育させた９６ウェルプレートに接種した（希釈物あたり６回の反復実験）。プレートを、３４℃で４〜７日間インキュベートした。生存細胞を含むまたはＣＰＥを伴うウェルを、各希釈度で計算した。ＴＣＩＤ５０力価を、さらにリードミュンヒ法により計算した。
【００７５】
この結果を表２にまとめる。ｓＭＤＣＫ細胞は、ａＭＤＣＫ細胞より高い力価を提供した。
【表２】
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【００７６】
ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫ培地で培養したａＭＤＣＫ細胞は、ＯＰＴＩＰＲＯ（商標）ＳＦＭで培養したａＭＤＣＫ細胞よりもわずかに高い力価（５１２．０ＨＡ単位／１００μｌ）を有したが、それでもなおＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ  ＭＤＣＫで培養したｓＭＤＣＫ細胞よりも有意に力価が低かった。同様の結果が、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスで観察された。
【００７７】
Ｈ７Ｎ９生産試験を、３回から１０回の継代の間に行った。ｓＭＤＣＫのウイルスの生産性は、３回から１０回の継代まで、高レベルを維持した（図５）。ＨＡの力価の平均値は９８９．８７ＨＡ単位／１００μｌであり、ＴＣＩＤ５０の力価は８．６ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった（表３）。同様の結果が、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスで観察された（図６）。
【表３】
2018533374.tif 000005
【００７８】
実施例５：抗原性試験
実施例４由来のインフルエンザウイルスの抗原性の分析を、国立生物製品基準規制機構（ＮＩＢＳＣ）から購入した標準抗体を使用した血液凝集（ＨＩ）アッセイにより行った。ＨＩアッセイは、１：４０の血清希釈物で開始した。各試料を３回の反復実験で行った。
【００７９】
インフルエンザウイルスを希釈して、５０μｌあたり８ＨＡＵの調製物を得た。抗体を、Ｖ字型のマイクロタイタープレートで数回希釈し、次に２５μｌのウイルスの試料をマイクロプレートに添加した。ゆっくりと攪拌した後、プレートを室温で１５分間インキュベートした。０．５％シチメンチョウ赤血球の浮遊液５０μｌを各ウェルに添加し、プレートをさらに３０分間放置した後に、読み取りを行った。血液凝集を完全に阻害した抗体の最も高い希釈度の逆数値を、ＨＩ力価であると決定した。結果を表４に提供する。
【表４】
2018533374.tif 000006
【００８０】
多くの様々な修正を本開示の趣旨から逸脱することなく行うことができることは、当業者に理解されている。よって、本明細書中開示される形態は単なる例示であり、本開示の範囲を限定するよう意図していないことが、明確に理解されるものである。
【図１】
2018533374.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018533374.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月30日(2017.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ある特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、２０１６年１０月２１日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３３０９として有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ））で寄託された細胞である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
特定の実施形態では、適応ＭＤＣＫ細胞は、２０１６年１０月２１日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３３０９として有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションで寄託された細胞である。細胞は寄託のために２０１６年１０月１９日に提出された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞および増殖培地を含む組成物であって、前記増殖培地が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない培地を含み、前記適応ＭＤＣＫ細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊培養物中にある、組成物。
【請求項２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍加時間を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ワクチン用のウイルスを生産するのに適している、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）でＤＳＭ  ＡＣＣ３３０９として寄託されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
マイクロキャリアを含まない浮遊状態で適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を培養する方法であって、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応ＭＤＣＫ細胞を接触させること、および前記細胞を５％ＣＯ２で生育させることを含み、前記適応ＭＤＣＫ細胞はマイクロキャリアを含まない浮遊培養で生育することができる、方法。
【請求項９】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
適応メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞においてワクチン生産用のウイルスを生産する方法であって、前記適応ＭＤＣＫ細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養することができ、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応ＭＤＣＫ細胞を接触させることと、前記細胞にウイルスを感染させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、方法。
【請求項１５】
前記培地に追加のグルコースを添加しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでＤＳＭ  ＡＣＣ３３０９として寄託されている、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるメイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を産生する方法であって、前記方法が、
ａ）接着ＭＤＣＫ細胞を準備することと、
ｂ）前記ＭＤＣＫ細胞を浮遊培養に適応させるために十分な時間、攪拌されたバイオリアクター中、マイクロキャリアの非存在下で、血清を含む増殖培地中で前記接着ＭＤＣＫ細胞を培養することと、
ｃ）血清を含まない合成培地中の浮遊培養で前記浮遊培養適応ＭＤＣＫ細胞を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるＭＤＣＫ細胞を提供することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記増殖培地が、約１％〜約１０％血清を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖培地が、約５％血清を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）およびｃ）で、前記ＭＤＣＫ細胞を５％ＣＯ２の存在下で培養する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでＤＳＭ  ＡＣＣ３３０９として寄託されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により産生された適応ＭＤＣＫ細胞を含む、組成物。
【請求項２８】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、約３０時間〜約３５時間の平均倍化時間を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記適応ＭＤＣＫ細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2018533374.tif 000014
2018533374.tif 000015
2018533374.tif 000016