(57)【要約】  １つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法であって、（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置（ｒｓ９５３２１１）、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２９０）、（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２８９）から選択される１つ以上の多型位置について被検者のヌクレオチドを決定することと、及び／又は多型位置に遺伝的に関連する１つ以上のバイオマーカーを検出することと、を含む、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の食事介入を被検者に対し適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法であって、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置（ｒｓ９５３２１１）
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２９０）
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２８９）；から選択される１つ以上の多型位置について前記被検者のヌクレオチドを決定すること、
及び／又は前記多型位置に遺伝的に関連する１つ以上のバイオマーカーを検出すること、を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のバイオマーカーが、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメント内部にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法であって、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、体格指数（ＢＭＩ）、体脂肪量、腰周囲、又は腹囲における変化により表される、方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法であって、配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、ＢＭＩ、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲における変化により表される、方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法であって、配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、ＢＭＩ、体脂肪量、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲における変化により表される、方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法であって、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含む、方法。
【請求項８】
前記減量が、ＢＭＩ、体脂肪量、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲により表される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１の第１０１番目の位置にＧを含み、かつ配列番号２の第１０１番目の位置にＡを含む遺伝子型の存在を決定することを含み、前記遺伝子型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；並びに
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
前記遺伝型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；並びに
（ｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
前記遺伝型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記減量が、ＢＭＩにおける変化により表される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法であって、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、腹囲における変化により表される、方法。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を被検者に適用することにより達成され得る減量について前記被検者の体質を評価する方法であって、配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、ＢＭＩ又は腰周囲における変化により表される、方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を被検者に適用することにより達成され得る減量について前記被検者の体質を評価する方法であって、配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、前記減量が、ＢＭＩ又は腰周囲における変化により表される、方法。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載の１つ以上の食事介入を被検者に適用することにより達成され得る減量について前記被検者の体質を評価する方法であって、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を検出することを含む、方法。
【請求項１７】
前記減量が、ＢＭＩにおける変化、又は腰周囲における変化により表される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１の第１０１番目の位置にＧを含み、配列番号２の第１０１番目の位置にＡを含む遺伝子型の存在を決定することを含み、前記遺伝子型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；並びに
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
前記遺伝型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；並びに
（ｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
前記遺伝型の存在が、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法であって、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメントの配列を決定することを含む、方法。
【請求項２２】
前記食事介入が、低カロリー食である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記低カロリー食が、約６００〜約１２００ｋｃａｌ／日のカロリー摂取量を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記低カロリー食が、少なくとも１種のダイエット食品の投与を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記低カロリー食が、６〜１２週間の継続期間を有する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１箇所以上の多型部分における前記ヌクレオチド、前記バイオマーカー及び／又は前記ＦＡＴ４配列を決定することと、前記被検者の１つ以上の身体測定及び／又は生活習慣特性とを組み合わせることを更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記身体測定が、性別、体重、身長、年齢、及び体格指数からなる群から選択され、前記生活習慣特性が、前記被検者が喫煙者であるか又は非喫煙者であるかである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被検者に対する１つ以上の食事介入を最適化する方法であって、
１つ以上の食事介入により達成され得る減量について被検者の体質を評価することと、及び／又は請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法による１つ以上の食事介入に従った減量維持について被検者の体質を評価することと、
１つ以上の食事介入を前記被検者に適用することと、を含む、方法。
【請求項２９】
被検者の生活習慣の改善を選択するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を実施することと、
（ｂ）達成され得る減量についての予測及び／又は（ａ）による減量維持についての予測をもとに生活習慣の適切な改善を選択することと、を含む、方法が提供される。
【請求項３０】
前記被検者の生活習慣の前記改善に、食事介入が含まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記食事介入が、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
減量用の低カロリー食の一部として使用するためのダイエット食品であって、前記ダイエット食品が、請求項１〜２７のいずれか一向に記載の方法による体重維持及び減量を達成すると予測された被検者に投与される、ダイエット食品。
【請求項３３】
肥満又は肥満関連疾患の治療に使用するためのダイエット食品であって、前記ダイエット食品が、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法による体重維持及び減量を達成すると予測された被検者に投与される、ダイエット食品。
【請求項３４】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置；
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置；又は
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置；から選択された多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３５】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置；
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置；又は
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置；から選択された多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３６】
請求項３４又は３５に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む、診断キット。
【請求項３７】
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置のＧの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、を含む、診断キット。
【請求項３８】
配列番号３の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを更に含む、請求項３７に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の食事介入を被検者に対し適用することによる減量の度合い、及び／又は１つ以上の食事介入による被検者の減量維持、についての予測に使用できるバイオマーカーと、バイオマーカーの組み合わせとを提供する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、世界中の多くの地域で流行の域に達している慢性的な代謝疾患であり、２型糖尿病、循環器疾患、脂質代謝異常、及びある種のがんなどといった深刻な併存症の主要なリスク因子である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  Ｓｅｒ２０００；８９４：ｉ−ｘｉｉ，１−２５３）。
【０００３】
長い間、低カロリーの食事介入は減量に非常に有効であり得るものであり、この減量は概して肥満関連性共存症、特に２型糖尿病のリスクを改善すると認識されてきた。経験的データが示唆するところによれば、初期体重の少なくとも１０％が減量すると、肥満関連の併存症のリスクがかなり減少する（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  Ｓｅｒ．２０００；８９４：ｉ−ｘｉｉ，１−２５３）。しかし、減量能力は、個体間で大きく異なる。
【０００４】
これまでに、低カロリー食では減量がうまくいかない人の割合が示されている（Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ），（２０１１）１９（２）：４５７−４６３）。低カロリー食では減量がうまくいかないと、減量予想が非現実的なものとなり、結果として、食事介入の不順守、脱落、及び全般的な失敗をもたらすことにつながる。
【０００５】
またいくつかの研究が示すところによれば、当該技術分野には、血漿中の特定のバイオマーカーの濃度を監視することを含む、減量を監視するための方法がある（例えば、Ｌｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２０１２Ｊａｎ，１２９（１）：７４−９；Ｃｕｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｊｕｎ，７（３）：２３７−４２；並びにＢｌａｄｂｊｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．２０１０Ｄｅｃ、１０４（１２）：１８２４−３０）。しかし、これらの方法では、特定の被検者が達成可能な減量度合いの予測又は指標は得られない。バイオマーカー強度と減量との相関関係を見る予測値は存在しない。
【０００６】
安定した減量維持は患者に主要な課題も提示する。減量介入後わずか１年程度で、減量した体重のうちのおよそ三分の１程度が再増加してしまう（Ｈｅｎｓｒｕｄ，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．９  Ｓｕｐｐｌ  ４，３４８Ｓ−３５３Ｓ，２００１）。更に、食事により導かれる減量は、体重の再増加を促進するいくつかの身体的変化を誘導する（Ｓｕｍｉｔｈｒａｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｉｅｔｔｏ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．１９７９  １２４，２３１−２４１（２０１３））。かかる変化としては、エネルギー消費量、基質代謝、及び食欲制御に関係するホルモン経路、における変化が挙げられる。これらの生理的及び分子的変化に関しての我々の理解はなおも非常に限られている。
【０００７】
食事介入（例えば低カロリー食）の計画及びデザインを成功させるための解決方法は、減量の変動（weight loss trajectory）を予測する方法が利用できることによる。更に、体重管理の介入の計画及びデザインの成功は、体重維持プログラム中に患者が減量を安定して維持する見込みがあるか（又は失敗するか）について予測する試験が利用可能であることにより補助され得る。
【０００８】
米国特許出願第２０１１／０１２４１２１号には、減量の成功を予測するための方法が開示されている。開示されている方法には、減量療法例えば胃バンディングを受けるか又は受けることを検討している患者を選択すること、カロリー摂取に対する患者の１つ以上のホルモン応答を測定すること、及びホルモン応答に基づいて減量療法の成功を予測することが含まれている。測定されるホルモンは胃腸ホルモン例えば膵臓ホルモンである。
【０００９】
欧州特許出願第２４２０８４３号には、人が計画的な減量の後に減量を維持する可能性を、ダイエット期間の前後で酵素（ＡＣＥ）を転化させるアンギオテンシンの濃度を測定することによって決定するための方法が開示されている。
【００１０】
しかしながら、被検者における減量度及び体重維持を正確に予測する方法がなおも必要とされている。結果として、本発明は、容易に検出することができ、かつ被検者における減量及び体重維持の予測を促進できる、バイオマーカーを提供することを課題とする。このようなバイオマーカーを使用して、減量中及び体重維持中の体重変動（weight trajectory）を予測することができ、並びにこのようなバイオマーカーは、生物学的な減量能及び体重維持能によって患者を適した処置群へと階層化する助けとなり得る。
【００１１】
プロトカドヘリンＦＡＴ  ４は、カドヘリンファミリーメンバー１４（ＣＤＨＦ１４）又はＦＡＴ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４（ＦＡＴ４）としても知られており、ヒトにおいてはＦＡＴ４遺伝子によりコードされているタンパク質である。ＦＡＴ４は、Ｈｉｐｐｏシグナル経路に関係する。Ｈｉｐｐｏ経路は、ショウジョウバエ及び脊椎動物において臓器の発達を適切に制御するのに必須な、保存されているシグナル経路であることが明らかとなっている（Ｈａｌｄｅｒ，２０１１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊａｎ；１３８（１）：９−２２）。
【００１２】
近年、ショウジョウバエＦａｔ（Ｆｔ）カドヘリンが、ミトコンドリアの形態及び代謝の制御に直接関係することが示された（Ｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１５８，１２９３−１３０８）。Ｆｔのタンパク質切断により、可溶性断片（Ｆｔｍｉｔｏ）が放出され、これがミトコンドリアに輸送されることが示されている。かかる切断が、細胞周期及び代謝と協調的なスイッチ機序として機能する。Ｆｔｍｉｔｏレベルを変更することにより、エネルギー要求の変化に応じ、臓器に代謝速度を直接調節させることができることが示唆されている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、被検者に対し１つ以上の直接介入を行うことによる、体重に関係する表現型の変化について、被検者の体質を予測するのに有用なバイオマーカーを同定するものである。本発明は、１つ以上の直接介入を行うことで、体重に関係する表現型を維持させるべく、被検者の体質を予測するのに有用なバイオマーカーも同定するものである。
【００１４】
具体的には、本発明は、体重に関係する表現型における変化に関係するＦＡＴ４遺伝子の特定の多型／対立遺伝子、並びにそれらの易罹患性の変化に基づいた診断ツール及びキットを開示する。したがって、本発明は、体重管理プログラムの結果を予測するのに使用できる（減量プログラム又は体重維持プログラムを含む）。
【００１５】
したがって、本発明は、一態様では、１つ以上の食事介入を被検者に適用することにより達成され得る減量、及び／又は１つ以上の食事介入による減量維持について被検者の体質、について被検者を評価する方法を提供し、本方法は、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメントにおいて、１つ以上の多型マーカーの有無を決定することを含む。
【００１６】
本発明は、一態様において、１つ以上の食事介入を被検者に対し適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法を提供し、方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置（ｒｓ９５３２１１）
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２９０）
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２８９）から選択される１つ以上の多型位置について被検者のヌクレオチドを決定することと、
及び／又は前述の多型位置に遺伝的に関連する１つ以上のバイオマーカーを検出することと、を含む。
【００１７】
一実施形態において、１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＳＮＰ）はＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメントの内部にある。一実施形態において、バイオマーカーは、上記に定義した前述の多型位置から２０、１５、１０、５、４、３、２、１キロベース（ｋｂ）未満のものである。
【００１８】
好ましくは、方法は、被検者のヌクレオチドを、配列番号１の第１０１番目の位置と配列番号２の第１０１番目の位置の両方で決定することを含む。一実施形態において、方法は、配列番号１の第１０１番目の位置、配列番号２の第１０１番目の位置、及び配列場号３の第１０１番目の位置にて被検者のヌクレオチドを決定することを含む。
【００１９】
一実施形態では、方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含む。
【００２０】
一実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、減量は、体格指数（ＢＭＩ）、体脂肪量、腰周囲（hip circumference）、又は腹囲における変化をもとに表される。
【００２１】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法は、配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、減量は、ＢＭＩ、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲における変化をもとに表される。
【００２２】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法は、配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定すること、を含み、減量は、ＢＭＩ、体脂肪量、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲における変化をもとに表される。
【００２３】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することによる減量維持について被検者の体質を評価する方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定すること、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定すること、を含み、減量は、ＢＭＩ、体脂肪量、除脂肪体重、腰周囲、又は腹囲における変化をもとに表される。
【００２４】
特に好ましい実施形態では、配列番号１の第１０１番目の位置のＧと、配列番号２の第１０１番目の位置のＡと、を含む遺伝型を有する被検者は、食事介入後に減量を維持する体質を有するものとして同定される。
【００２５】
上記のものについての「第１０１番目の位置のＧ」なる言及は、被検者が、前述の位置がＧであるコピーを少なくとも１つ有することを意味し、すなわち、被検者は遺伝型Ｇ／Ｇ（ホモ接合）又はＧ／Ａ（ヘテロ接合）を有し得る。
【００２６】
上記のものについての「第１０１番目の位置のＡ」なる言及は、被検者が、前述の位置がＡであるコピーを少なくとも１つ有することを意味し、すなわち、被検者は遺伝型Ａ／Ａ（ホモ接合）又はＧ／Ａ（ヘテロ接合）を有し得る。
【００２７】
好ましくは、減量の維持について被検者の体質を評価する方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；及び
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
かかる遺伝型の存在は、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す。
【００２８】
好ましくは、減量の維持について被検者の体質を評価する方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；並びに
（ｖ）  Ｇ／Ｇ（ホモ接合）  配列番号１の第１０１番目の位置における、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定すること、を含み、
かかる遺伝型の存在は、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す。
【００２９】
好ましくは、減量の維持は、ＢＭＩにおける変化を測定することにより評価される。
【００３０】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、減量は、腰周囲における変化をもとに表される。
【００３１】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、減量は、ＢＭＩ又は腰周囲における変化をもとに表される。
【００３２】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在を決定することを含み、減量は、ＢＭＩ又は腰周囲における変化をもとに表される。
【００３３】
別の実施形態では、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在と、配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在とを検出することを含み、減量は、ＢＭＩにおける変化、又は腰周囲における変化をもとに表される。
【００３４】
特に好ましい実施形態では、配列番号１の第１０１番目の位置にＧを含み、配列番号２の第１０１番目の位置にＡを含む遺伝型を有する被検者は、減量について体質を有するものとして特定される。
【００３５】
上記のものについての「第１０１番目の位置のＧ」なる言及は、被検者が、前述の位置がＧであるコピーを少なくとも１つ有することを意味し、すなわち、被検者は遺伝型Ｇ／Ｇ（ホモ接合）又はＧ／Ａ（ヘテロ接合）を有し得る。
【００３６】
上記のものについての「第１０１番目の位置のＡ」なる言及は、被検者が、前述の位置がＡであるコピーを少なくとも１つ有することを意味し、すなわち、被検者は遺伝型Ａ／Ａ（ホモ接合）又はＧ／Ａ（ヘテロ接合）を有し得る。
【００３７】
好ましくは、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）；並びに
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ａ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定することを含み、
かかる遺伝型の存在は、被検者が、食事介入後に減量を維持する体質を有することを示す。
【００３８】
好ましくは、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質を評価する方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）；
（ｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ／Ｇ（ヘテロ接合）；
（ｉｉｉ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ／Ａ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；
（ｉｖ）配列番号１の第１０１番目の位置における）Ａ／Ｇ（ヘテロ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；並びに
（ｖ）配列番号１の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）、及び配列番号２の第１０１番目の位置におけるＧ／Ｇ（ホモ接合）；から選択される遺伝型の存在を決定することを含み、
かかる遺伝型の存在は、被検者が、食事介入後に減量しない体質を有することを示す。
【００３９】
本発明の別の態様では、１つ以上の食事介入を被検者に適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量維持について被検者の体質を評価する方法が提供され、方法は、図７（配列番号１０〜１０１）に示す１つ以上の多型位置にて被検者のヌクレオチドを決定することを含む。
【００４０】
本発明は、別の態様として、１つ以上の食事介入を適用することにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量維持について被検者の体質を評価する方法を提供し、方法は、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメントの配列を決定することを含む。
【００４１】
本明細書において言及される食事介入は、好ましくは、低カロリー食である。
【００４２】
食事介入には、少なくとも１種のダイエット食品を被験者に投与することが含まれていても良い。
【００４３】
低カロリー食には、脂肪の摂取の低減及び／又は低脂肪食品の摂取の増加が含まれていても良い。単に一例として、低脂肪食品としては、全粒小麦粉及びパン、ポリッジオート麦、高繊維朝食用シリアル、全粒米及びパスタ、野菜及び果実、乾燥豆及びレンズ豆、ベークドポテト、ドライフルーツ、クルミ、白身魚、ニシン、サバ、イワシ、キッパー、ピルチャード、サケ、及び脂肪の少ない白身肉を挙げても良い。
【００４４】
一実施形態では、低カロリー食は、約６００〜約１２００ｋｃａｌ／日のカロリー摂取量を含むことができ、及び／又は少なくとも１つのダイエット製品の摂食を含み得る。
【００４５】
また低カロリー食には、例えば最大で約４００ｇ野菜／日の投与が含まれていても良い。
【００４６】
好ましくは、ダイエット食品はＯｐｔｉｆａｓｔ（登録商標）又はＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）である。
【００４７】
したがって、ダイエット食品は、Ｏｐｔｉｆａｓｔ（登録商標）又はＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）などの製品を含み得る。低カロリー食には、全エネルギー摂取量が約２．５ＭＪ（６００ｋｃａｌ／日）となるよう非でんぷん質野菜が３回に分けて補給されてもよい。低カロリー食には、１日あたり少なくとも２Ｌの水、又はその他のエネルギーを含まない飲料が更に補給されてもよい。
【００４８】
別の実施形態では、ダイエット食は、例えば、４６．４％の炭水化物、３２．５％のタンパク質、及び合わせて２０．１％の脂質、ビタミン、ミネラル、及び微量元素を含み、２．１ＭＪ／日（５１０ｋｃａｌ／日）である組成からなり得る。低カロリー食には、全エネルギー摂取量が約２．５ＭＪ（６００ｋｃａｌ／日）となるよう非でんぷん質野菜が３回に分けて補給されても良い。低カロリー食には、１日あたり少なくとも２Ｌの水、又はその他のエネルギーを含まない飲料が更に補給されてもよい。
【００４９】
一実施形態では、低カロリー食の期間は最大で１２週間、例えば６〜１２週間である。
【００５０】
本明細書において言及される方法は、被検者に関し、１つ以上の人体計測値を測定すること、及び／又は生活習慣特性を評価することを更に含み得る。
【００５１】
人体計測は、例えば、性別、体重、身長、年齢、及び体格指数からなる群から選択でき、生活習慣特性は、例えば、被検者が喫煙者であるか、又は非喫煙者であるかなどといったものである。
【００５２】
本発明の別の態様によると、被検者のために１つ以上の食事介入を最適化するための方法であって、
１つ以上の食事介入により達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は本明細書に定義される方法による１つ以上の食事介入に従った減量維持について被検者の体質を評価することと、
１つ以上の食事介入を被検者に適用することと、を含む、方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様によると、被検者の生活習慣の改善を選択する方法であって、
（ａ）１つ以上の食事介入により達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は本明細書に定義される方法による１つ以上の食事介入に従った減量維持について被検者の体質を評価する方法を実行することと、
（ｂ）達成され得る減量についての予測及び／又は（ａ）による減量維持についての予測をもとに生活習慣の適切な改善を選択することと、を含む、方法が提供される。
【００５４】
一実施形態において、生活習慣の改善は、食事介入、好ましくは本明細書に定義される食事介入を含む。
【００５５】
本発明の別の態様によると、減量用の低カロリー食が提供され、このダイエット食品は、本明細書に定義される方法による減量を達成すると予測された被検者に投与される。
【００５６】
本発明の別の態様によると、減量用の低カロリー食の一部として使用するためのダイエット食品が提供され、このダイエット食品は、本明細書に定義される方法による減量を達成する又は維持すると予測された被検者に投与される。
【００５７】
本発明の別の態様によると、減量用の低カロリー食の一部として使用するためのダイエット食品が提供され、ダイエット食品は、本明細書に定義される方法による体重維持及び減量の両方を達成すると予測された被検者に投与される。
【００５８】
本発明の別の態様によると、肥満又は肥満関連疾患の治療に使用するためのダイエット食品が提供され、ダイエット食品は、本明細書に定義される方法による体重維持及び減量を達成すると予測された被検者に投与される。
【００５９】
一実施形態において、ダイエット食品は、Ｏｐｔｉｆａｓｔ（登録商標）又はＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）などの製品を含み得る。
【００６０】
別の実施形態では、ダイエット食品は、例えば、４６．４％の炭水化物、３２．５％のタンパク質、及び２０．１％の脂質、ビタミン、ミネラル、及び微量元素を含み、２．１ＭＪ／日（５１０ｋｃａｌ／日）である組成からなり得る。低カロリー食には、全エネルギー摂取量が約２．５ＭＪ（６００ｋｃａｌ／日）となるよう非でんぷん質野菜が３回に分けて補給されてもよい。低カロリー食には、１日あたり少なくとも２Ｌの水、又はその他のエネルギーを含まない飲料が更に補給されてもよい。
【００６１】
本発明の別の態様によると、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメント内の多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００６２】
本発明の別の態様によると、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメント内の多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが提供される。
【００６３】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置；
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置；又は
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置；から選択された多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００６４】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置；
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置；又は
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置；から選択された多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが提供される。
【００６５】
本発明の別の態様によると、定義される通り（asdefined in）の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む診断キットが提供される。
【００６６】
本発明の別の態様によると、（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置のＧの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、を含む、診断キットが提供される。
【００６７】
一実施形態では、診断キットは、配列番号３の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを更に含む。
【００６８】
本発明の更なる態様では、プログラム可能なコンピュータに本明細書で説明する方法によって被験者が達成できる減量の程度を予測させるためのコンピュータ実施可能な命令を含むコンピュータプログラム製品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＦＡＴ４遺伝子の近傍に位置するＳＮＰと、体重維持中のＢＭＩの変化との関連性を示す図。Ｘ軸は、４番染色体上のＳＮＰの協調（coordinate）を示し、Ｙ軸は、対立遺伝子試験によるｐ値（−ｌｏｇ１０）を示す。この図は、遺伝子型決定法で評価したＳＮＰから得られた結果を示す。
【図２】ＦＡＴ４遺伝子の近傍に位置するＳＮＰと、体重維持中のＢＭＩにおける変化との関連性を示す図。Ｘ軸は、４番染色体上のＳＮＰの協調を示し、Ｙ軸は、対立遺伝子試験によるｐ値（−ｌｏｇ１０）を示す。この図は、遺伝子型決定法、又はインピュテーションにより得られた遺伝子型のいずれかに対し決定したＳＮＰをもとに作成した。
【図３】ｒｓ９５３２１１（配列番号１）、ｒｓ１５０９２９０（配列番号２）、及びｒｓ１５０９２８９（配列番号３）の配列。多型位置はカギ括弧にくるみ、すなわち、［Ａ／Ｇ］のように示す。
【図４】ＦＡＴ４遺伝子（配列番号４）の遺伝子配列多型位置ｒｓ９５３２１１、ｒｓ１５０９２９０、及びｒｓ１５０９２８９は、下線を引いた配列内の太字の塩基として同定された。
【図５Ａ】３つのＦＡＴ４転写物の配列（配列番号５、６、及び７）
【図５Ｂ】３つのＦＡＴ４転写物の配列（配列番号５、６、及び７）
【図５Ｃ】３つのＦＡＴ４転写物の配列（配列番号５、６、及び７）
【図６Ａ】２つのＦＡＴ４タンパク質配列（配列番号８及び９）の配列
【図６Ｂ】２つのＦＡＴ４タンパク質配列（配列番号８及び９）の配列
【図７】ＦＡＴ４遺伝子近傍（＋／−１０Ｋｂ）に位置するＳＮＰ。９２のＳＮＰでｐ値が５％未満であったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
減量及び体重維持の予測
本発明は、被検者に対し１つ以上の食事介入を行うことにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法が提供される。本発明は、減量介入前、及び／又は体重維持介入前に患者の体重の変動（weight trajectory）を正確に予測することを可能にする。
【００７１】
方法を使用して、被検者の減量能及び／又は減量維持能についての情報に基づいた予測を行い、それに従って１つ以上の食事介入を選択又は調整することができる。
【００７２】
例えば、本発明を使用して、体重管理プログラムの結果を予測すること、体重管理プログラムを適応化（adaptation）させること、並びにかかるプログラムに従って患者を成功確率の高い群又は成功確率の低い群へと階層化させること、ができる。例えば、方法を使用して、食事介入の適用により減量を達成する尤度の「高い」又は「低い」被検者を同定することができる。同様にして、方法を使用して、食事介入後に減量を維持する尤度の「高い」又は「低い」被検者を同定することができる。
【００７３】
食事介入が低カロリー食である場合、この方法を使用して、被検者の適切な食事を補助すること、あるいは１日のカロリー摂取量又は特定食の期間を調整し、被検者にとって現実的な予想を設定する補助とすることができる。
【００７４】
特に、方法は、特定の食事介入、例えば、低カロリー食により効果を得られる尤度が最も高い被検者を評価するのに有用なツールを当業者に提供する。したがって、本方法によって、食事介入例えば低カロリー食及び生活習慣の変更を最適化することができる。
【００７５】
本明細書で定義される減量は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇｍ−２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、腰周囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などといったパラメータにおける減少に言及し得る。
【００７６】
減量の計算を、食事介入の終わりにおける前述のパラメータのうちの１つ以上の値を、食事介入の始まりにおける前記パラメータの値から差し引くことによって行なっても良い。
【００７７】
減量度は、前述の体重の表現型パラメータ（例えば、被検者の体重（例えば、キログラム）又は体格指数（ｋｇｍ−２）における変化率）のうちの１つの変化率として表現され得る。例えば、食事介入後に減量しやすい被検者は、初期体重の少なくとも１０％、初期体重の少なくとも８％、又は初期体重の少なくとも５％を減量する傾向のある被検者であり得る。単なる例として、被検者は、初期体重の５％〜１０％を減量する傾向があり得る。
【００７８】
一実施形態において、減量度が初期体重の少なくとも１０％であることにより、結果として、肥満関連性共存症のリスクが大幅に低下する。
【００７９】
本明細書で定義される通りの体重維持は、例えば、食事介入後の体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇｍ−２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、腰周囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータにおける維持を指し得る。
【００８０】
体重維持度は、食事介入の終了後、一定期間中の前述のパラメータのうちの１つ以上における変化を求めることにより算出できる。この期間は、例えば、食事介入の終了後、少なくとも４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、又は５２週間とすることができる。
【００８１】
体重維持の程度は、食事介入の終了後、一定期間中の体重変化の割合として表すことができる。例えば、体重を維持し易い被検者の再増量は、食事介入中の減量の５０、４０、３０、２０、１０、５％、又は１％未満となる傾向があり得る。
【００８２】
バイオマーカー
用語「多型」は、ヌクレオチド配列が異なる、あるいは様々な数の反復ヌクレオチド単位を有する、遺伝子座集団における２種以上の選択的形態（対立遺伝子）を指す。多型は、遺伝子の翻訳領域（エキソン）、非翻訳領域、又は遺伝子外領域（遺伝子間領域）に生じる。
【００８３】
「対立遺伝子」は、他の形態の遺伝子、遺伝子マーカー、又はその他の遺伝子座とは区別され得る特定の遺伝子型、遺伝的マーカー、又はその他の遺伝子座である。用語「対立遺伝子」としては、例えば、限定するものではないが、一塩基多型（ＳＮＰ）の一形態である。それぞれは、二倍体細胞中の特定の対立遺伝子についてホモ接合であってよく、すなわち、対とするそれぞれの染色体上の対立遺伝子は同一であり、あるいは前述の対立遺伝子についてヘテロ接合であってよく、すなわち、対とするそれぞれの染色体上の対立遺伝子は同一ではない。
【００８４】
用語「遺伝子」は、１つの機能を実行するＤＮＡ単位を指す。通常、この機能は１つのＲＮＡ又は１つのタンパク質の生産に相当する。遺伝子は、翻訳領域、イントロン、非翻訳領域、及び制御領域を含有し得る。
【００８５】
本明細書で使用するとき、フレーズ「遺伝子マーカー」は、ある個体の、対象とする１つ以上の遺伝子座と関連するゲノム（例えば、ある個体のゲノム中に存在するヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列）がもつ特徴を指す。典型的には、遺伝子マーカーは多型であり、遺伝子マーカーの変形形態としては、多くの他の例の中でも、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル（すなわち、挿入／欠失）、単純反復配列（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ法（ＲＡＰＤ）、開裂増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、多様性アレイ法（Diversity Arrays Technology）（ＤＡｒＴ）マーカー、及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、マイクロサテライト、又は単純反復配列（ＳＳＲ）が挙げられる。
【００８６】
「一塩基多型（ＳＮＰ）」は、ある種の個体間（又は個体において対とされる染色体間）でゲノム（又は種の個体間で共有されているその他の配列）中の一塩基−Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、又はＧ（グアニン）−が異なるときに生じるＤＮＡ配列のバリエーションである。
【００８７】
本明細書で使用するとき、「遺伝子型」は、遺伝子マーカーの両方の対立遺伝子の組み合わせを指し、例えば、個体においてペア化される（相同の）単一の遺伝子座上のＳＮＰに限定されない。
【００８８】
用語「ハプロタイプ」は、対となる染色体上の対応する遺伝子座位に位置する識別マーカー（例えば、ＳＮＰ）の変異体又は対立遺伝子を指す。
【００８９】
「連鎖不均衡」（「対立遺伝子の相関」とも呼ばれる）は、所与の集団における個体頻度から予想されるよりも高頻度で親から子孫へと分離するとき、２つ以上の対立遺伝子座にある特定の対立遺伝子が、連鎖群を保つ傾向をもっているという現象を指す。
【００９０】
一態様では、本発明は、被検者に対し１つ以上の食事介入を行うことにより達成され得る減量について被検者の体質、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量の維持について被検者の体質を評価する方法を提供し、方法は、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置（ｒｓ９５３２１１）、
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２９０）、
（ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置（ｒｓ１５０９２８９）、から選択される１つ以上の多型位置について被検者のヌクレオチドを決定すること、
及び／又は前述の多型位置に遺伝的に関連する１つ以上のバイオマーカーを検出すること、を含む。
【００９１】
好ましくは、方法は、配列番号１の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号２の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、及び／又は配列番号３の第１０１番目の位置におけるＡ若しくはＧの存在、を決定することを含む。
【００９２】
本出願において、ＳＮＰは、例えば、配列番号１における位置（例えば、第１０１番目の位置）、配列番号２における位置（例えば、第１０１番目の位置）又は配列番号３における位置（例えば、第１０１番目の位置）についての参照により参照されることは留意されたい。しかしながら、このような参照がなされるとき、本発明は、配列番号に記載の通りの正確な配列に限定されず、それらの変異体及び誘導体が含まれることが理解される。むしろ、類似配列におけるＳＮＰ座（すなわち、各配列番号において同定された位置に相当すると同業者によりみなされる位置におけるＳＮＰ）の同定が検討される。当業者は、類似配列を容易に整列し、同じＳＮＰ座を配置することができる。
【００９３】
配列番号１、２、又は３の第１０１番目の位置のヌクレオチドと塩基対を形成する、配列番号１、２、又は３に対する相補鎖中のヌクレオチドの検出は、言うまでもなく本発明の特許請求の範囲のものである。
【００９４】
本発明の文脈において、ＦＡＴ４遺伝子又はそれらの調節エレメント中のバイオマーカーの存在を検出することは、その個体のＦＡＴ４をコードしている遺伝子又はそれらの調節エレメント中の多型部分の１つ以上のヌクレオチドのアイデンティティ（identity）を決定することを含む。同様にして、配列番号１の多型位置１０１、配列番号２の多型位置１０１、配列番号３の多型位置１０１に遺伝的に関連するバイオマーカーの存在を検出することは、かかる位置に遺伝的に関連する多型部分にて１つ以上のヌクレオチドのアイデンティティを検出することを含む。
【００９５】
多型部分は、被検者集団において、１つ以上の食事介入を行うことにより達成され得る減量、及び／又は１つ以上の食事介入後の減量維持、との関連性を有するであろう。多型部分の特定のヌクレオチド又はヌクレオチド配列がかかる減量及び／又は維持に関連することを意味する。
【００９６】
本発明の１箇所以上の多型部分における変異型ヌクレオチドの存在又は非存在を検出するのに使用できる数多くの分析手法が存在することは、当業者には明白であろう。概して、対立遺伝子変異の検出は、変異を識別する技術、場合により増幅反応、及びシグナル発生系を必要とする。
【００９７】
対立遺伝子の検出
サンプルより得た核酸の遺伝子型を決定して、マーカー遺伝子座に存在する具体的な対立遺伝子を同定することができる。サンプルからマーカーの対立遺伝子を直接検出するのに十分な量のサンプルを得ることができる。
【００９８】
あるいは、より少量のサンプルを被検者から得て、検出前に核酸を増幅する。場合により、核酸サンプルは、マーカー対立遺伝子の検出前に精製（又は部分的に精製）される。
【００９９】
対立遺伝子検出法の例を以下に示す。
【０１００】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ
対立遺伝子特異的ＰＣＲは、変異型又は多型の存在又は非存在（presence of absence）という点で異なる対象領域を区別する。本明細書において開示される配列などの標的配列に対する相補性に基づき、ＰＣＲ増幅プライマーが選択される。プライマーは、標的配列の特定の対立遺伝子に対してのみ結合する。
【０１０１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドスクリーニング方法
このスクリーニング方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）スクリーニング方法（例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６，１９８６）を参照されたい）を利用する。
【０１０２】
任意の特定の対立遺伝子に対し、塩基対のミスマッチを１箇所以上有するオリゴヌクレオチドを作成する。ＡＳＯスクリーニング方法は、第２の対立遺伝子（すなわち、他の対立遺伝子）オリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドの結合の減少を示す、標的ゲノム又はＰＣＲ増幅したＤＮＡ中の対立遺伝子間のミスマッチを検出する。オリゴヌクレオチドプローブは、低ストリンジェンシー下では対立遺伝子の多型形態の両方に結合するものの、高ストリンジェンシー下ではそれらの対応する対立遺伝子に結合するよう設計できる。あるいは、ストリンジェンシーの条件は、本質的にバイナリの応答が得られるよう考案でき、すなわち、標的遺伝子の変異体形態に相当するＡＳＯが、対立遺伝子とハイブリッド形成し、かつ野生型の対立遺伝子とはハイブリッド形成しない、という応答が得られるよう考案できる。
【０１０３】
リガーゼ介在対立遺伝子検出法
リガーゼは、ライゲーション増幅反応においてＳＮＰなどの点変異を検出するのにも使用できる（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９，１９８９に記載）。ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）は、テンプレートに依存したライゲーションのラウンドを連続的に行う、特異的ＤＮＡ配列の増幅を利用する（例えば、上掲のＷｕ、及びＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３，１９９０に記載）。
【０１０４】
変性グラジエントゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して生成された増幅産物は、変性グラジエントゲル電気泳動を使用して分析され得る。異なる対立遺伝子は、配列が異なることによる融解特性、及び溶液におけるＤＮＡの電気泳動度に基づき同定できる。ＤＮＡ分子は、高温条件下又は変性条件下で、融解ドメインと呼ばれるセグメントが融解する。
【０１０５】
それぞれの融解ドメインは、固有の塩基特異的融解温度（Ｔｍ）にて協同的に融解する。融解ドメインの長さは少なくとも２０塩基対であり、この長さは最大で数百塩基対とすることができる。
【０１０６】
配列特異的融解ドメインに基づく対立遺伝子間の識別は、Ｃｈａｐｔｅｒ  ７  ｏｆ  Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して評価できる。
【０１０７】
概して、変性グラジエントゲル電気泳動法により分析される標的領域は、標的領域に隣接するＰＣＲプライマーを使用して増幅される。この増幅されたＰＣＲ産物を、線形変性させたグラジエントを有するポリアクリルアミドゲルにアプライする（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：５０１−５２７，１９８６、及びＭｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｄａｖｉｅｓ  Ｅｄ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９５  １３９，１９８８）。電気泳動システムは、標的配列の融解ドメインのＴｍよりもわずかに低い温度で維持される。
【０１０８】
変性グラジエントゲル電気泳動法の代替法では、標的配列を、上掲Ｅｒｌｉｃｈの第７章に記載の、ＧＣクランプと呼ばれるＧＣヌクレオチド伸長部分に最初に取り付けることができる。一例では、ＧＣクランプ中の少なくとも８０％のヌクレオチドはグアニン又はシトシンのいずれかである。別の例では、ＧＣクランプは、少なくとも３０塩基長である。この方法は、高Ｔｍをもつ標的配列に特に適する。
【０１０９】
概して、標的領域は、上記のポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーのうちの片方は、その５’末端に、増幅中に標的領域の５’末端に組み込まれる、少なくとも３０塩基のＧＣリッチ配列をもつＧＣクランプ領域をもつ。得られた標的領域の増幅産物を、上記の通りの変性グラジエント条件下で電気泳動ゲルで泳動する。１つの塩基が変化していることで異なるＤＮＡ断片は、ゲル中をとおって異なる場所に泳動される。これはエチジウムブロマイドによる染色で可視化できる。
【０１１０】
温度勾配ゲル電気泳動法
温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）は、変性グラジエントゲル電気泳動法と同じ原理に基づくものであるが、ただし、変性勾配は、化学的変性剤の濃度に変化をつけるのではなく、温度に変化をつけることによりもたらされる。標準ＴＧＧＥは、電気泳動経路に沿って温度勾配をもった電気泳動装置を利用する。サンプルは、化学的変性剤の濃度が均一なゲル中を泳動するにつれて、温度の上昇にさらされることになる。ＴＧＧＥの代替法である経時的温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＴＧＥ又はｔＴＧＧＥ）は、電気泳動ゲル全体の温度を経時的に上昇させて同様の結果を達成する。サンプルがゲル中を泳動するにつれてゲル全体の温度が上昇し、これによりサンプルはゲル中を移動するにつれて温度の上昇にさらされることになる。ＧＣクランプを組み込むことによるＰＣＲ増幅、及びＰＣＲ産物の可視化を含むサンプル調製は、変性グラジエントゲル電気泳動法と同様である。
【０１１１】
一本鎖高次構造多型解析
標的配列又は対立遺伝子は、例えば、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２７６６−２７７０，１９８９．に記載の通り、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動に変更を加えて塩基の違いを同定する、一本鎖構造多型解析を用い識別できる。ＰＣＲの増幅産物を上記の通り生成し、加熱又は何らかの方法により変性して一本鎖の増幅産物を形成できる。一本鎖核酸は、塩基配列に一部依存してリフォールディングするか、又は二次構造を形成する。したがって、一本鎖増幅産物を電気泳動することにより、対立遺伝子又は標的配列間の塩基配列の違いを検出できる。
【０１１２】
ミスマッチの化学的又は酵素的切断
標的配列間の違いは、例えば、Ｇｒｏｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４８：２１２−２２２，１９９１に記載の通り、ミスマッチした塩基対の示差的化学的切断により検出することもできる。別の方法では、標的配列間の違いは、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１−１８，１９９３に記載の通り、ミスマッチした塩基対の酵素的切断により検出できる。簡単に、動物及び何らかの影響を受けたファミリーメンバー（affected family member）由来の遺伝子材料を使用して、ミスマッチのないヘテロハイブリッドＤＮＡ二本鎖を作成できる。本明細書で使用するとき、「ヘテロハイブリッド」は、ある動物に由来する１つ目のＤＮＡ鎖と、別の動物に由来する２つ目のＤＮＡ鎖とからなる二本鎖ＤＮＡを意味し、通常、動物は対象とする形質について表現型が異なる。
【０１１３】
非ゲルシステム
他の有用であり得る技術としては、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）などの非ゲルシステムが挙げられる。このシステムでは、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、対象とする変異に隣接させて、かかる領域をＰＣＲ増幅させるよう設計される。次に、３番目のオリゴヌクレオチドプローブは、かかる遺伝子の、異なる対立遺伝子間に変化の生じた塩基を含む領域に結合するよう設計される。このプローブは、５’末端及び３’末端の両方が蛍光色素により標識される。これらの色素は、これらの蛍光色素が互いに近接している間は互いに消光され、検出不能なものとして選択される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートの５’末端に結合したＰＣＲプライマーからプローブに向かって伸長し、アニーリングしたプローブの５’末端に結合している色素を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断する。これにより、消光作用が消失し、プローブの３’末端の色素由来の蛍光が検出可能になる。異なるＤＮＡ配列間の識別は、テンプレート分子に対するプローブのハイブリッド形成が完了していなかった場合、すなわち、何らかの形態でミスマッチが存在していた場合には色素の切断が生じないことによりなされる。したがって、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が、結合したテンプレート分子と完全に相補性であった場合にのみ、消光作用は消失することになる。反応混合物は、それぞれ異なる対立遺伝子に対し設計された２種類の異なるプローブ配列を含んでよく、したがって、１回の反応で両方の対立遺伝子を検出できる。
【０１１４】
対立遺伝子変異体を検出するための現行法の多くは、Ｎｏｌｌａｕ  ｅｔ  ａｈ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，１１１４−１１２０，１９９７；並びに標準参考書、例えば、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」，Ｅｄ．ｂｙ  Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６  ａｎｄ  「ＰＣＲ」，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７においてレビューされている。
【０１１５】
サンプル
核酸の試験サンプルは、好都合なことに、血液サンプル、口腔スワブ、バイオプシー、又は個体から採取されたその他の体液若しくは組織である。試験サンプルは、試験サンプル中の配列と一致する核酸配列と等価であってよく、すなわち、核酸サンプル中の領域の全部又は一部は、最初に、対立遺伝子変異を解析する前に、任意の従来法、例えば、ＰＣＲを使用して増幅され得ることを理解されたい。本発明は、個体から予め取り出された核酸サンプル（上記に定義の通りのものであり得る）から決定された多型を検出することを含む。
【０１１６】
プライマー／プローブ
本発明の一態様によると、ＦＡＴ４遺伝子（又はその相補鎖）又はそれらの制御領域における多型（例えば、ＳＮＰ）を検出することのできる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【０１１７】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置；
（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置；又は
（Ｉｉｉ）配列番号３の第１０１番目の位置；から選択された多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【０１１８】
配列番号１の第１０１番目の位置、配列番号２の第１０１番目の位置、又は配列番号３の第１０１番目の位置から選択された、多型位置を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブについての参照には、それぞれ、配列番号１の第１０１番目の位置、配列番号２の第１０１番目の位置、配列番号３の第１０１番目の位置における多型の相補体（compliment）を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが含まれることは留意されたい。
【０１１９】
本発明の対立遺伝子特異的プライマーは、概して、例えば、ＡＲＭＳ（ＴＭ）アッセイに使用される場合などのように、特定の配列部分における１種の対立遺伝子を選択的に増幅することにより、対立遺伝子同士を識別する、ＰＣＲ反応などの増幅反応において、コンスタントプライマー（constant primer）と一緒に使用される。本発明の対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは、１５〜５０塩基、より好ましくは、約１５〜３５塩基、更により好ましくは、約１７〜３０塩基である。
【０１２０】
配列番号１の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲなどの増幅反応において、配列番号１の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号１の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２１】
配列番号２の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲなどの増幅反応において、配列番号２の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号２の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２２】
配列番号３の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲなどの増幅反応において、配列番号３の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号３の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２３】
プライマーは、任意の従来の合成法を使用して製造され得る。このような方法の例は、標準的な参考書、例えば、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ  ２０；Ｅｄ．Ｓｕｄｈｉｒ  Ａｇｒａｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ  ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３；１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎに見ることができる。必要とされる場合、プライマーを標識して検出を容易にしてもよい。
【０１２４】
プローブの設計法は、分子生物学の領域における当業者には明らかである。かかるプローブは、例えば、最大１００塩基、最大５０塩基、最大４０塩基、並びに最大３０塩基の長さなど、任意の好都合な長さである。例えば、プローブは、１０〜３０塩基、好ましくは、１８〜３０塩基の長さなどであってよい。プローブは、標的配列に完全に相補的な塩基配列を含み得る。しかしながら、必要とされる場合、オリゴヌクレオチドプローブの識別能に極度に影響を及ぼさないものであれば、１つ以上のミスマッチを導入してもよい。本発明のプローブは、検出を容易にする１つ以上の標識を有し得る。
【０１２５】
配列番号１の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プローブは、ハイブリッド形成反応において、配列番号１の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号１の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２６】
配列番号２の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プローブは、ハイブリッド形成反応において、配列番号２の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号２の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２７】
配列番号３の第１０１番目の位置における多型を検出できる対立遺伝子特異的プローブは、ハイブリッド形成反応において、配列番号３の第１０１番目の位置に塩基Ａを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）と、配列番号３の第１０１番目の位置に塩基Ｇを含む配列（又はこのような遺伝子又は断片に相補的な配列）とを識別し得る。
【０１２８】
本発明のプライマー及び／又はプローブは、典型的には、核酸（例えば、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）の形態となろう。あるいは、プライマー及び／又はプローブは、核酸類似体、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、架橋型人工核酸（Locked nucleic acid；ＬＮＡ）、又はＢＮＡ（架橋化核酸）であってよい。プライマー又はプローブは、ＬＮＡ又はＰＮＡにより部分的に置換された核酸であってよい。
【０１２９】
プライマー設計ストラテジー
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用が増加するに伴い、ＰＣＲ用のプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計又は選択の助けとなる多くのプログラムが活発に開発されるようになった。このようなプログラムのうち、インターネットを通じて自由に利用できる４例には、ホワイトヘッド研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＭａｒｋ  Ｄａｌｙ及びＳｔｅｖｅ  ＬｉｎｃｏｌｎによるＰＲＩＭＥＲ（ＵＮＩＸ、ＶＭＳ、ＤＯＳ、及びＭａｃｉｎｔｏｓｈ）、ワシントン大学（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＰｈｉｌ  Ｇｒｅｅｎ及びＬａＤｅａｎａ  ＨｉｌｌｅｒのＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＯＳＰ）（ＵＮＩＸ、ＶＭＳ、ＤＯＳ、及びＭａｃｉｎｔｏｓｈ）、ＹｏｓｈｉのＰＧＥＮ（ＤＯＳのみ）、並びにウィスコンシン大学のＢｉｌｌ  ＥｎｇｅｌｓによるＡｍｐｌｉｆｙ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈのみ）がある。
【０１３０】
概してこれらのプログラムは、既知のある程度の（bitsof）反復配列エレメントを検索した後、推定プライマーの長さ及びＧＣ含量を分析してＴｍを最適化することによりＰＣＲプライマーの設計を助ける。市販のソフトウェアも３５種ほど利用可能であり、プライマー選択法も、一般的な配列分析パッケージに急速に含まれるようになっている。
【０１３１】
プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計する際には、標的を特異的に認識する適切な配列を選択し、この配列を試験して、オリゴヌクレオチドが安定な二次構造を有してしまう可能性を排除する必要がある。配列中の逆方向反復は、反復同定又はＲＮＡフォールディングプログラムを使用して同定できる。
【０１３２】
ステム構造が生じ得ることが観測された場合、プライマーの配列は、予測された二次構造が生じるのを最小限に抑えるべくいずれかの方向に数塩基ずらすことができる。
【０１３３】
ゲノムＤＮＡの増幅に使用されるＰＣＲプライマーについては、プライマー配列は、何らかの意味のあるマッチが生じるか決定するべく、ＧｅｎＢａｎｋデータベース内の配列に対し比較する必要がある。オリゴヌクレオチド配列中に、何らかの既知のＤＮＡ配列が存在する場合、更に重要なことに、任意の既知の反復配列が存在する場合、そのプライマー配列は変更すべきである。
【０１３４】
キット
本発明の別の態様によると、本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含む診断キットが提供される。
【０１３５】
一実施形態では、診断キットは、（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置のＧの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、を含む。
【０１３６】
一実施形態では、診断キットは、（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置のＧの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーと、を含む。
【０１３７】
一実施形態では、診断キットは、（ｉ）配列番号１の第１０１番目の位置のＧの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）配列番号２の第１０１番目の位置のＡの存在を検出できる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【０１３８】
診断キットは、本発明の方法に使用するにあたって適切なパッケージと、使用説明書とを含み得る。このようなキットは、熱安定性ポリメラーゼ、例えば、ｔａｑポリメラーゼなどの適切な緩衝剤及びポリメラーゼを更に含み得る。
【０１３９】
ＦＡＴ４遺伝子
カドヘリンファミリーメンバー１４（ＣＤＨＦ１４）又はＦＡＴ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４（ＦＡＴ４）としても既知のＰｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ  Ｆａｔ  ４は、ヒトにおいてＦＡＴ４  遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＦＡＴ４は、Ｈｉｐｐｏシグナル経路に関係する。Ｈｉｐｐｏ経路は、ショウジョウバエ及び脊椎動物における臓器の発育の適切な制御に必須な、保存されているシグナル経路であることが明らかとなっている（Ｈａｌｄｅｒ，２０１１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊａｎ；１３８（１）：９−２２）。
【０１４０】
本明細書において言及されるＦＡＴ４遺伝子は、翻訳領域、イントロン、非翻訳領域、及び制御領域を含み得る。
【０１４１】
図４は、ＦＡＴ４遺伝子（配列番号４）のゲノム配列を示す。
【０１４２】
図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃは、３通りのＦＡＴ４転写物（配列番号５、６、及び７）の例を示す。
【０１４３】
図６Ａ及び６Ｂは、ＦＡＴ４遺伝子から翻訳された２つのタンパク質配列（配列番号８及び９）の例を示す。
【０１４４】
近年、ショウジョウバエＦａｔ（Ｆｔ）カドヘリンが、ミトコンドリアの形態及び代謝の制御において直接機能していることが示されている（Ｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１５８，１２９３−１３０８）。Ｆｔタンパク質の切断により、ミトコンドリアに輸送される可用性断片（Ｆｔｍｉｔｏ）が放出され、かかる切断が、細胞周期及び代謝に協調するスイッチ機序として機能することが示されている。エネルギー要求量の変化に伴い、Ｆｔｍｉｔｏのレベルを変更することで、臓器の代謝速度が直接調節されることが示唆されている。
【０１４５】
ＦＡＴ４への言及は、上記に開示した正確な配列に限定されず、それらの変異体及び誘導体も含まれるものと理解されたい。類似配列における多型、例えば、ＳＮＰの同定が想到される（すなわち、当業者により、本明細書において同定される位置に相当するとみなされる位置におけるＳＮＰ）。
【０１４６】
被検者
好ましくは被検者は哺乳動物、好ましくはヒトである。被検者は代替的に、非ヒトの哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、又はブタなど）であっても良い。一実施形態では、被検者はコンパニオンアニマル例えばイヌ又はネコであっても良い。
【０１４７】
食事介入
用語「食事介入」が意味するのは、被検者の食生活に変化をもたらす、被検者に適用される外部因子である。一実施形態では、食事介入は低カロリー食である。
【０１４８】
低カロリー食は、動物の初期体重に対し調節された食事である。
【０１４９】
好ましくは、低カロリー食には、約６００〜約１５００ｋｃａｌ／日のカロリー摂取量、より好ましくは約６００〜約１２００ｋｃａｌ／日、最も好ましくは約８００ｋｃａｌ／日が含まれる。一実施形態では、低カロリー食には一日当たり所定の量（グラム）の野菜が含まれていても良い。好ましくは最大で約４００ｇ野菜／日、例えば約２００ｇ野菜／日である。
【０１５０】
低カロリー食には少なくとも１種のダイエット食品の投与が含まれていても良い。ダイエット食品は、食事代替食品又は補助食品（例えば被検者の食欲を抑制しても良い）であっても良い。ダイエット食品には、食品製品、飲料、ペットフード製品、補助食品、栄養補助食品、食品添加物、又は栄養配合物を含めることができる。
【０１５１】
一実施形態では、食事はＯｐｔｉｆａｓｔ（登録商標）又はＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）などの製品が含まれていても良い。低カロリー食には、全エネルギー摂取量が約２．５ＭＪ（６００ｋｃａｌ／日）となるよう非でんぷん質野菜が３回に分けて補給されてもよい。低カロリー食には、１日あたり少なくとも２Ｌの水、又はその他のエネルギーを含まない飲料が更に補給されてもよい。
【０１５２】
別の実施形態では、ダイエット食は、例えば、４６．４％の炭水化物、３２．５％のタンパク質、及び合わせて２０．１％の脂質、ビタミン、ミネラル、及び微量元素を含み、２．１ＭＪ／日（５１０ｋｃａｌ／日）であっても良い。低カロリー食には、全エネルギー摂取量が約２．５ＭＪ（６００ｋｃａｌ／日）となるよう非でんぷん質野菜が３回に分けて補給されてもよい。低カロリー食には、１日あたり少なくとも２Ｌの水、又はその他のエネルギーを含まない飲料が更に補給されてもよい。
【０１５３】
一実施形態では、低カロリー食の期間は最大で１２週間である。好ましくは、低カロリー食の期間は６〜１２週間、好ましくは８〜１０週間、例えば８週間である。
【０１５４】
ジェノタイピングと、人体測定及び／又は生活習慣特性との組み合わせ
【０１５５】
一実施形態において、本発明の方法は、本明細書で言及する通り遺伝子型を決定することと（例えば、多型マーカー、例えば、ＳＮＰの存在を決定すること／ＦＡＴ４遺伝子の配列又はそれらの調節エレメントを決定すること）、１つ以上の被検者の人体測定及び／又は生活習慣特性とを組み合わせることを更に含む。
【０１５６】
当該技術分野で知られるように、身体測定は被検者の測定である。一実施形態では、身体測定は、性別、年齢（年）、体重（キログラム）、身長（センチメートル）、及び体格指数（ｋｇ／ｍ−２）からなる群から選択される。他の身体測定も当業者に知られている。
【０１５７】
用語「生活習慣特性」が意味するのは被験者が行なう任意の生活習慣選択であり、これには、生活習慣、動機づけ、又は好みのアンケートから得られる全ての食事摂取量データ、活動性尺度又はデータが含まれる。一実施形態では、生活習慣特性は被検者が喫煙者であるか又は非喫煙者であるかである。これは本明細書では被検者の喫煙状態とも言う。
【０１５８】
被検者の階層化
本発明の方法により予測された、減量及び／又は体重維持傾向を利用して、被験者を各分類に階層化することもできる。
【０１５９】
被検者は、予測される減量度／維持度の指標となる各分類に階層化され得る。このような階層化は、特定の介入により最大限の効果を得られる被検者を決定するのに有用である。このようにして、食事介入及び生活習慣の変更を最適化することができ、被験者によって達成される減量の現実的な期待を設定することができる。
【０１６０】
一実施形態では、カテゴリには減量しにくい被検者及び減量しやすい被検者が含まれる。
【０１６１】
用語「減量しにくい」は、減量に関係して予測された度合いが規定値に満たないことを意味する。一実施形態において、「減量しにくい」は、被検者の減量度（％）が既定値に満たないこと、例えば、被検者が、予測される減量の１０、１５、２０、又は３０パーセンタイルに満たないと予測されることとして定義される。
【０１６２】
用語「減量しやすい」は、減量に関係して予測された度合いが規定値を超過することを意味する。一実施形態において、「減量しやすい」は、被検者の減量度（％）が既定の閾値を超過すること、として定義される。例えば、被検者は、予測された減量度の８５、８０、又は７５パーセンタイルを超過して減量するものと予測される。
【０１６３】
「期待減量」は、試験されるものとして同じ食事介入を受けた被検者の母集団のデータから得ることができる。
【０１６４】
別の実施形態では、各分類は、体重を維持しにくい被検者（weightmaintenance resistant subjects）、及び体重を維持し易い被検者（weightmaintenance sensitive subjects）を含む。
【０１６５】
用語「体重を維持しにくい」は、体重維持に関係して予測された度合いが規定値に満たないことを意味する。一実施形態において、「体重を維持しにくい」は、被検者の体重維持度合いが規定の閾値に満たないことを意味し、例えば、被検者の食事介入後減量度が、被検者群の１０、１５、２０、又は３０パーセンタイルに満たないことを意味する。
【０１６６】
用語「体重を維持しやすい」は、体重維持に関係して予測された度合いが規定値を超過することを意味する。一実施形態において、「体重を維持しやすい」とは、被検者の体重維持度合いが規定の閾値を超過することを意味し、例えば、被検者の食事介入後減量度が、被検者群の１０、１５、２０、又は３０パーセンタイルを超過することを意味する。
【０１６７】
被検者群は、試験される食事介入と同じ食事介入を経た被検者群のデータから得ることができる。
【０１６８】
被験者の生活習慣の変更を選択するための方法
更なる態様では、本発明によって、被験者の生活習慣を変更するための方法が提供される。被験者における生活習慣の変更は、本明細書で説明する任意の変更であっても良く、例えば、食事の変更、もっと運動すること、異なる作業及び／又は生活環境などである。
【０１６９】
好ましくは、変更は、本明細書で説明するように食事介入である。より好ましくは、食事介入には少なくとも１種のダイエット食品の投与が含まれる。このダイエット食品は好ましくは、以前に摂取されていないか、又は被験者によって異なる量で摂取されていたものである。ダイエット食品は本明細書で説明するようなものであっても良い。また被験者の生活習慣を変更することには、被験者が自分の生活習慣を変える必要性を示すこと（例えば、もっと運動するように又は喫煙をやめるように指示すること）が含まれる。
【０１７０】
例えば、被験者が低カロリー食で体重を減らすとは予測されない場合、変更には被験者の生活習慣において運動を増やすことが含まれていても良い。
【０１７１】
ダイエット食品の利用
一態様では、本発明によって、減量用の低カロリー食の一部として用いるダイエット食品が提供される。ダイエット食品は、本明細書に記載の方法により減量が達成されることが予測される被検者に投与される。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、肥満又は肥満関連疾患の治療に使用するためのダイエット食品を提供し、ダイエット食品は、本明細書に記載の方法により減量することが予測される被検者に投与される。
【０１７３】
肥満関連疾患は、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、脳卒中、高コレステロール、循環器疾患、インスリン抵抗性、冠動脈心疾患、内臓脂肪症候群、高血圧、及び脂肪肝からなる群から選択され得る。更なる態様では、本発明は、減量用の低カロリー食におけるダイエット食品の使用を提供し、ダイエット食品は、本明細書に記載の方法により減量すると予測された被検者に投与される。
【０１７４】
コンピュータプログラム製品
本明細書で説明する方法を、汎用ハードウェア（例えば１つ以上のコンピュータプロセッサ）上で実行されるコンピュータプログラムとして実装しても良い。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する機能を、デバイス例えばスマートフォン、タブレット末端又はパーソナルコンピュータによって実装しても良い。
【０１７５】
一態様では、本発明は、演算可能な（programmable）コンピュータに、本発明のジェノタイピング、並びに任意選択的にユーザーの人体測定及び／又は生活習慣特性に基づき減量／維持度合いを予測させるための、コンピュータに実装可能な指示を含む、コンピュータプログラム製品を提供する。本明細書で説明するように、身体測定には年齢、体重、身長、性別、及び体格指数が含まれ、生活習慣特性には喫煙状態が含まれる。
【０１７６】
特定の好ましい実施形態では、ユーザーは、デバイスに、本発明のジェノタイピングの結果と、任意選択的に年齢、体格指数、性別、及び喫煙状態とを入力する。このデバイスは、次にこの情報を処理して、ユーザーが食事介入により得られ得る減量／維持度についての予測を提供する。
【０１７７】
デバイスは、概してネットワーク上のサーバであっても良い。しかし、バイオマーカーデータ並びに／又は人体計測及び生活習慣データをプロセッサ、中央演算処理装置（ＣＰＵ）などを用いて処理できる限り、任意のデバイスを用いても良い。デバイスは、例えば、スマートフォン、タブレット端末、又はパーソナルコンピュータであっても良く、またユーザーが達成できる減量の程度を示す情報を出力しても良い。
【０１７８】
当業者であれば分かるように、当業者は、本明細書で説明する本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることが、開示した本発明の範囲から逸脱することなく可能である。
【０１７９】
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
【０１８０】
本発明を実施するときには、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用いており、これは当業者の能力の範囲内である。このような技術は文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（１９９５及び定期的追補；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；並びにＥ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，１９９２  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。これらの一般的なテキストはそれぞれ、本明細書において参照により取り入れられている。
【実施例】
【０１８１】
バックグラウンド情報
Ｄｉｏｇｅｎｅｓ（ダイエット遺伝子及び肥満）は、過体重／肥満患者（ＢＭＩが２７〜４５ｋｇ／ｍ２）の介入試験である（Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３，２１０２−２１１３（２０１０））。本発明者らの知るところによると、Ｄｉｏｇｅｎｅｓは、体重管理における、最大級の、最も包括的な試験である。
【０１８２】
患者らには、８週間にわたり低カロリー食（約８００ｋｃａｌ／日）が供される。次に、初期体重の少なくとも８％を減量した参加者らを無作為に５群のうちの１群に割り付け、２×２要因試験（two-by-two factorial design）を行い、２６週間にわたり、体重の再増加を予防するための食事：低タンパク質かつ低グリセミック指数の食事、低タンパク質かつ高グリセミック指数の食事、高タンパク質かつ低グリセミック指数の食事、高タンパク質かつ高グリセミック指数の食事、又は対照食、を自由摂取させた。
【０１８３】
我々の分析は、遺伝子マーカー（ＳＮＰ）が減量及び体重維持の分類子となり得るかを分析することを目的とした。
【０１８４】
実施例１−材料及び方法
試験デザイン
Ｄｉｏｇｅｎｅｓ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００３９０６３７）は、２つの主要な期間から構成される。
低カロリー食（８００ｋｃａｌ／日）を８週間にわたり摂取する減量期間
体重維持食を２６週間にわたり摂取
【０１８５】
異なる時点で数多くの臨床測定及び生体試料を採取した。本発明では、４つの時点を特筆すべき対象とする。
【０１８６】
１．スクリーニング時
２．臨床介入１日目（ＣＩＤ１）：減量期間の開始
３．ＣＩＤ２：減量期間を終了、１種の体重維持食に無作為化、体重維持期間を開始。
４．ＣＩＤ３：体重維持期間の終了
【０１８７】
遺伝子型データ
Ｉｌｕｍｉｎａ  ６６０−ｑｕａｄ  Ｂｅａｄｃｈｉｐを使用して、全ゲノムスキャンを行った（仮説なしアプローチ）。Ｉｌｌｕｍｉｎａの技術は、被検者あたりおよそ６６０’０００個の一塩基多型（ＳＮＰ）のジェノタイピングを可能にするＤＮＡチップに基づくものである。ＳＮＰは染色体全体に分布しており、対応するゲノム領域にタグ付するマーカーとして使用される。プロセス及び実験プロトコルの詳細は製造元の推奨に従った（ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ）。
【０１８８】
ジェノタイピングデータの品質管理
以下の項目の少なくとも１つに該当した場合、そのＳＮＰは除外した。
低コール率（＜９５％）
ハーディー・ワインベルグ平衡からの逸脱（ＦＤＲ＜２０％）
マイナー対立遺伝子頻度＜０．２８％
【０１８９】
以下の項目の少なくとも１つに該当した場合、その被検者は除外した。
低コール率（＜９５％）
ヘテロ接合体型の異常（ＦＤＲ＜１％）
対立遺伝子の共有度（Identity-By-State）が＞０．９５である被検者ペア、コール率の低い被検者が除外される。
遺伝子構造の観点で異常値をもつ個体：Ｄｉｏｇｅｎｅｓ及びＨａｐｍａｐ計画（ＣＥＵ、ＹＲＩ、及びＣＨＢ＋ＪＰＴパネル）をもとに遺伝子型に対し実施した主成分分析に基づき（２成分）クラスタのセントロイドから６標準偏差の距離。
臨床データベースでの記録と、ジェノタイピングデータから推定される性別との間に性別の不一致（gender discrepancy）がある個体
【０１９０】
ＱＣ後の最終的な遺伝子型データセットには、５１６’６３６個のＳＮＰと、８６９名の被検者が含まれた。
【０１９１】
ゲノム座標について
本文書で使用される全てのゲノム座標（ＳＮＰ、遺伝子）は、ヒトゲノムのアセンブリｈｇ１９に対応する。
【０１９２】
ゲノムワイド関連解析
以下の線形モデルを使用してゲノムワイドスキャンを実施した。
ＢＭＩ３〜ＢＭＩ２＋ＳＮＰ＋センター＋性別＋年齢＋ε
【０１９３】
このモデルでは、ＢＭＩ２及びＢＭＩ３は、それぞれ体重維持期間の前後（すなわち、ＣＩＤ２及びＣＩＤ３）に測定された肥満度指数（ＢＭＩ）を指す。センター（center）はＤｉｏｇｅｎｅｓセンターを意味する。年齢（age）は、スクリーニング時点での被検者の年齢を意味する。εはモデルの残差項（residual term）に相当する。
【０１９４】
ＧｅｎＡＢＥＬ  ｑｔｓｃｏｒｅ関数（Ａｕｌｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７７，５７７−５８５（２００７））を使用して、各ＳＮＰに関し関連を独立に解析した。この方法では、最初に共変数（co-variables）について対象とする形質を回帰させた後、最小二乗法を使用して、得られた残差とＳＮＰとの相関を試験した。この関数は、対立遺伝子試験及びジェノタイピング試験の両方を実装している。対立遺伝子試験はジェノタイピング試験よりも強力であることから、データの解釈には対立遺伝子試験のみを用いた。
【０１９５】
被検者の初期人数（ｎ＝８６９）は、ＢＭＩ又は回帰試験の何らかの共変量（モデル化されるＳＮＰを含む）のいずれかの値が満たない被検者を除外したときに、かなり少なくなった。５１６’６３６モデルのそれぞれに使用した、不充足な値のない被検者の平均数は、ｎ＝４６１であった。
【０１９６】
ＴａｇＳＮＰの同定
Ｃａｒｌｓｏｎにより提唱されているＬＤ選別法を使用した（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４，１０６−１２０（２００４））。次の設定でＴａｇ  ＳＮＰ解析を実施した：ＭＡＦ閾値１０％及びＲ二乗閾値５０％。
【０１９７】
ハプロタイプフェージング
ＭＡＣＨソフトウェア（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．３４，８１６−８３４（２０１０））を以下のパラメータ：−−ｒｏｕｎｄｓ  ５０−−ｓｔａｔｅｓ  ２００−−ｐｈａｓｅで使用して、遺伝子型データをフェージングした。
【０１９８】
ハプロタイプ関連解析
ＭＡＣＨによるフェージング後、次のモデルを使用して、体重維持中のＢＭＩの変化と、全てのハプロタイプブロックとの関連を解析した。
ＢＭＩ３〜ＢＭＩ２＋センター＋性別＋年齢＋ＡＡＣ＋ＡＡＴ＋ＡＧＣ＋ＧＡＣ＋ＧＡＴ＋ＧＧＣ＋ε
【０１９９】
センターはＤｉｏｇｅｎｅｓセンターを意味する。年齢は、スクリーニング時点での被検者の年齢を意味する。εはモデルの残差項（residual term）に相当する。
【０２００】
遺伝モデルは、相加的（additive）モデル（ハプロタイプ数：０、１、又は２）及び優勢（有／無）モデルの両方を試験した。次に、当てはめるモデルに対し、変数減少法による選別を行った（ＲのｓｔｅｐＡＩＣ関数（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２０１３）。Ｒ：統計計算向けの言語及び開発実行環境。Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０，ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．））。
【０２０１】
更なる線形モデル
対象とする期間にわたり、所定の形質（体重維持期間又は減量期間）における変化を、線形モデルを使用して試験した。
【０２０２】
これらのモデルを使用して、複数の体重関連性表現型について、単点ＳＮＰ又はエピスタシス（２箇所のＳＮＰ間の相互作用）による影響を試験した。
【０２０３】
これらのモデルは、下記の通りＷｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｒｏｇｅｒ表記法で記載できる：
時点（ｉ）での形質〜時点（ｉ−１）での形質＋遺伝作用（geneticeffect）＋センター＋性別＋年齢＋ε
【０２０４】
形質は、ＢＭＩ；腹囲又は腰周囲；除脂肪量又は体脂肪量などの任意の量的な形質とすることができる。時点（ｉ−１）及び（ｉ）は、所定の期間の前後を指す（例えば、体重維持期間又は減量期間）。このようなモデル化により、時点（ｉ）での形質を予測しながら、時点（ｉ−１）でのベースライン値について調整することが可能になる。
【０２０５】
センターは、Ｄｉｏｇｅｎｅｓセンターを指す。年齢は、スクリーニング時点での被検者の年齢を意味する。εはモデルの残差項に相当する。
【０２０６】
遺伝作用（genetic effect）は、単一ＳＮＰ又は２つのＳＮＰ（ＳＮＰ１及びＳＮＰ２）間の相互作用のいずれかとすることができる。単一ＳＮＰ作用については、遺伝子型モデルを使用した。ＳＮＰ相互作用について解析するとき、所定の対立遺伝子について、ＳＮＰ１及びＳＮＰ２のそれぞれを存在／非存在についてコード化した。用語「ε」は、モデルの残差に相当する。
【０２０７】
このモデルにおいて、各用語の有意性をｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ＡＮＯＶＡを使用して試験した（Ｆｏｘ＆Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ａｎ  Ｒ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．（Ｓａｇｅ，２０１１）．ａｔ  ｈｔｔｐ：／／ｓｏｃｓｅｒｖ．ｓｏｃｓｃｉ．ｍｃｍａｓｔｅｒ．ｃａ／ｊｆｏｘ／Ｂｏｏｋｓ／Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）。
【０２０８】
経時的なＢＭＩ変化における二分化
体重維持試験における回帰性の変化により、患者を体重維持が良好な群及び体重維持が良好ではない群へと階層化可能な閾値を設定した。しばしば、このような階層化は、両極端の患者（例えば、１０パーセンタイル未満又は９０パーセンタイル超の患者）に対してなされる。しかしながら、用いるパーセンタイルの設定は完全に任意である。カットオフの選択によっては（解析を行う前に）異なった結論が導かれてしまうというリスクを排除することはできない。このような任意の設定を行う代わりに、本発明者らは、下記に説明する通り、カットオフを複数用いることにした。
【０２０９】
最初に、本発明者らは、体重維持中のＢＭＩ変化を次の通りに表した：
【数１】
2018502559.tif 000002
式中、ＢＭＩ２及びＢＭＩ３は体重維持期間前後（すなわち、ＣＩＤ２及び及びＣＩＤ３）のＢＭＩを表す。この差（Δ）が、ベースラインＢＭＩ（体重維持前のＢＭＩ）に対する体重維持中ＢＭＩの変化率に相当する。
【０２１０】
Δの解釈は以下の通りである：
Δ＜０は、ＢＭＩ２＜ＢＭＩ３であることを意味し、したがって、患者の体重が再増加していること（すなわち、体重維持プロファイルが不良であること）を意味する。
Δ＞０は、ＢＭＩ２＞ＢＭＩ３であることを意味し、したがって、患者の体重が減量していること（すなわち、体重維持プロファイルが良好であること）を意味する。
【０２１１】
次に、本発明者らは、計算を行い、Δを体重維持プロファイル「良好」群及び「不良」群に二分した。このような二分化は、Δ値が極端な患者を選別することにより行った。この選別では、所定のパーセンタイルを超過する又はそれを下回るΔを選別する。例えば、１０パーセンタイル及び９０パーセンタイルを使用する場合には、本発明者らは以下のように群を設定した：
Δが１０パーセンタイル未満の患者は「体重維持不良者」とする。
Δが９０パーセンタイルを超過する患者は「体重維持良好者」とする。
【０２１２】
この例では、１０パーセンタイル〜９０パーセンタイルの間のΔをもつ被検者は解析には含まれない。これらの被検者は、「中間プロファイル」を有する被験者として参照することができ、いずれの群にも分類されない。
【０２１３】
パーセンタイルの閾値を任意選択することによるバイアスを回避するため、本発明者らは、複数の分類スキーム：
１０パーセンタイル未満又は９０パーセンタイル超のΔをもつ患者
２５パーセンタイル未満又は７５パーセンタイル超のΔをもつ患者
３３パーセンタイル未満又は６６パーセンタイル超のΔをもつ患者
５０パーセンタイル未満又は５０パーセンタイル超のΔをもつ患者、から得られたデータを解析した。
【０２１４】
最初の３つのスキームでは中間プロファイルの患者が除外され（例えば、１０パーセンタイルと９０パーセンタイルとの間のΔ）、したがってデータのサブセットのみが使用されるのに対し、最後のスキームでは全ての患者を２群に階層化すると表記することができる。したがって、最初の３つのスキームを使用する分類は、データの限定されたサブセットのみが使用されるという点が課題となり得る。それに対し、４つ目のスキームは利用可能なデータを全て使用するものの、２群のそれぞれの不均一性（heterogeneity）が高く、また「中間プロファイル」を有する患者は除外されないことから、これらの２群間の区別が明確でない場合がある。したがって、最後の分類スキームが最も複雑であるものと予想される。
【０２１５】
次式を使用して、同様の二分化を減量期間中のＢＭＩに対しても行った。
【数２】
2018502559.tif 000003
式中、ＢＭＩ１及びＢＭＩ２は、それぞれ減量期間前後（すなわち、ＣＩＤ１及びＣＩＤ２）に相当する。
【０２１６】
分類解析
ＢＭＩを「不良」群及び「良好」群に二分化後、本発明者らは、次のような単純な分割表を使用して分類性能を評価した。
【０２１７】
【表１】
2018502559.tif 000004
【０２１８】
表中、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、所定の分類に含まれる患者数に相当する。
【０２１９】
このような表から、分類の正確さを計算することができる：
【数３】
2018502559.tif 000005
【０２２０】
次に、二項検定から分類の正確性についての９５％信頼区間（９５％  ＣＩ）を導出する（Ｒのｂｉｎｏｍ．ｔｅｓｔ関数（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２０１３）。Ｒ：統計計算向けの言語及び開発実行環境。Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０，ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．））。片側二項検定（one-sided binomial test）も実施して、分類の正確性が、データに最も大きな割合で含まれる「情報レートのない場合（no information rate）」よりも良好であるかを試験した（ｃｏｎｆｕｓｉｏｎＭａｔｒｉｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｅｔ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｋｕｈｎ  Ｊ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｆｔｗ．２８，１−２６（２００８）を参照）。
【０２２１】
本発明者らは、非保護的遺伝子型をもとに、Δが低い被検者（体重が再増加する患者）を識別することを目的とした。逆に、本発明者らは、保護的遺伝子型をもとに、Δが高い被検者（体重の再増加が少ない、又は更には減量しさえする患者）を識別することを目的とした。
【０２２２】
保護的及び被保護的遺伝子型は以下の通りに設定した：
【表２】
2018502559.tif 000006
【０２２３】
同じ方法論を減量期間中のＢＭＩ変化に対しても適用した。
【０２２４】
インピュテーションされたＳＮＰの解析
インピュテーションを行い、ＦＡＴ４近傍に位置するその他のＳＮＰの遺伝子型を得た。インピュテーションは、ＭＡＣＨソフトウェア（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．３４，８１６−８３４（２０１０））を使用し、参照データとして１０００人ゲノムプロジェクトのヨーロッパ系被験者（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔ．１０００Ｇ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，５６−６５（２０１２））（フェーズＩＩ）を使用して行った。インピュテーションは、ＭＡＣＨソフトウェアにより推奨されているステップに従って実施した。ＰｒｏｂＡＢＥＬ（Ａｕｌｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１，１３４（２０１０））を使用し、以下のモデル：
【０２２５】
ＢＭＩ３〜ＢＭＩ２＋センター＋性別＋年齢＋ＳＮＰ＋ε、を使用して、対立遺伝子の量的な値（dosage value）の解析を行った。
【０２２６】
ＢＭＩ３及びＢＭＩ２は、それぞれＣＩＤ３及びＣＩＤ２で測定されたＢＭＩを指す。センターは、Ｄｉｏｇｅｎｅｓセンターを指す。年齢は、スクリーニング時点での被検者の年齢を意味する。εはモデルの残差項（residual term）に相当する。用語「ＳＮＰ」は、インピュテーションされた対立遺伝子の量的な値（dosage value）に相当する。
【０２２７】
実施例２−詳細な結果
体重維持についてのＧＷＡスキャン
ゲノムワイドな解析から、４番染色体上に位置するＳＮＰは、体重維持期間中のＢＭＩの変動と有意に相関することが判明した。特に、次の２つのＳＮＰ：ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２８９（表１）は、いずれもゲノムワイドなリストにおいてＳＮＰのランキング上位に現れるＦＡＴ４遺伝子のイントロンの変異型である。これらの２つのＳＮＰの連鎖不平行（ＬＤ）はせいぜいで中程度であり（Ｒ２＝５０．６１％）（図１）、近傍には、相関ｐ値が５％であるその他のＳＮＰが存在することから、本発明者らは、観察された相関がハプロタイプによるものなのかを研究した。
【０２２８】
体重維持についてのハプロタイプ試験
ハプロタイプフェーズで使用するＳＮＰのリストを限定するため、タグＳＮＰ検索を行った。この検索により、次の３つのＳＮＰ：ｒｓ９５３２１１、ｒｓ１５０９２９０、及びｒｓ１３１３６８８９が、体重維持中のＢＭＩとの相関がわずかであることが判明しているその他のＳＮＰ（ｐ値＜５％、図１参照）に最良なタグＳＮＰであるとして同定された。これらの３つのＳＮＰを使用して、６つの異なるハプロタイプ：ＡＡＴ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＡＣ、ＧＡＴ、及びＡＧＣ（各ハプロタイプ中のＳＮＰの順番は、ｒｓ９５３２１１、ｒｓ１５０９２９０、及びｒｓ１３１３６８８９である）を定義できる。
【０２２９】
次に、体重維持中のＢＭＩにおける変化との相関についてこれらのハプロタイプを試験した。相加的遺伝モデル及び優勢遺伝モデルの療法を考慮した。結果を表２〜５に示す。これらの解析により、体重維持介入後のより望ましいＢＭＩと優位に相関するものとして、ＧＡＣ及びＧＡＴハプロタイプが存在することが同定された。特に、いずれかのハプロタイプのうちの少なくとも１コピーをもつ患者は、これらのハプロタイプを全くもたない患者と比較して体重が再増加する傾向が少なかった。これらの結果は、一変量アプローチ（順位和検定）と、Ｐｌｉｎｋソフトウェア（Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬＩＮＫ：ａ  ｔｏｏｌ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８１，５５９−５７５（２００７））により再現された。
【０２３０】
ＧＡＣハプロタイプ及びＧＡＴハプロタイプの両方で望ましい体重維持が観察されたことから、第３のＳＮＰの関与は強くないものと考えられるため、ハプロタイプは、ｒｓ９５３２１１−Ｇ及びｒｓ１５０９２９０−Ａとして単純化できる。反対にこの結果は、同様にして、ｒｓ９５３２１１−Ａハプロタイプ及びｒｓ１５０９２９０−Ｇハプロタイプを有害なハプロタイプとして示唆した。
【０２３１】
体重維持についてのエピスタシス試験
ハプロタイプの結果に照らして、本発明者らは、以下の遺伝子型群を設定した：
ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア
ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ｇ／Ｇ
ｒｓ９５３２１１−Ａ／Ａ及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア
ｒｓ９５３２１１−Ａ／Ａ及びｒｓ１５０９２９０−Ｇ／Ｇ
【０２３２】
上記の群に設定した通り、ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０間の相互作用は体重維持中のＢＭＩにおける変化と優位に相関することが判明した（ｐ＝７．９６Ｅ−０５、方法論についての詳細は、「更なる線形モデル」を参照）。線形モデル及び続くＡＮＯＶＡにより得られた全結果をそれぞれ表６及び表７に示す。これらの結果により、ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリアは、残りの３つの遺伝子型群よりも優位に良好なＢＭＩプロファイルを有することが示される。
【０２３３】
遺伝子診断を容易にするため、４つの遺伝子型群は、「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」と簡略化し、残りの３群の被検者はまとめてプールすることができる。このような遺伝子による二分化も、体重維持期間中のＢＭＩの変動と優位に相関する。線形モデルにより得られた結果を表８に示す。この表も、モデルの各項について、回帰係数をもとにした９５％信頼区間（ＣＩ）を含む。これらの９５％  ＣＩは、ｂｏｏｔｓｔｒａｐを実施することにより得た（Ｄａｖｉｓｏｎ．＆  Ｈｉｎｋｌｅｙ  Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）の線形モデル、ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｗｗｗ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／ｄａｖｉｓｏｎ／ＢＭＡ線形モデル（ｎ＝１’０００を再サンプリングし、ｂｏｏｔパッケージ（Ｃａｎｔｙ，Ａ．＆  Ｒｉｐｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．ｂｏｏｔ：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  Ｒ（Ｓ−Ｐｌｕｓ）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．（２０１４））ｉｎ  Ｒ）を使用）。これらの係数の解釈は次の通りのものである：年齢、性別、参加するセンター及び体重維持前のＢＭＩなどの共変量について調節するとき、体重維持後のＢＭＩに対する「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」の効果は−０．７６ｋｇ／ｍ２である。換言すると、「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」である被検者では、体重維持期間後のＢＭＩに対する効果は、その他の遺伝子型の組み合わせを有する被検者と比較して−０．７６ｋｇ／ｍ２（９５％  ＣＩ＝［−１．１，−０．４３］）である。
【０２３４】
これらの結果を見る更に簡単な方法では、共変量（年齢、性別など）について調整せずに体重維持前後のＢＭＩにおける変化のみを考慮する。遺伝的階層化を行わない場合（すなわち、被検者の遺伝型が不明な場合）、ＢＭＩの中央値における変化は＋０．３８ｋｇ／ｍ２である（表９）。これは、被検者の体重が再増加する傾向があることを意味する。ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０についてのジェノタイピングが利用可能である場合、これらの３つの遺伝子型群の被検者：「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」；「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」及び「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」は、全て体重が再増加する（ＢＭＩの中央値における変化はそれぞれ＋０．５７、＋０．６３、及び＋０．６８ｋｇ／ｍ２である）。対照的に、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」である被検者は、体重が再増加しない傾向があった（ＢＭＩの中央値における変化は０である）。
【０２３５】
したがって、これらの２つの遺伝子マーカーの組み合わせは、
他の３群よりも体重維持は良好である患者群（「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」）を識別する
【０２３６】
これらの２つのマーカーの遺伝子型を知ることで、かかる遺伝子型を知らなかった場合と比較して、追加の情報がもたらされることを実証する。４つの遺伝子型群のそれぞれのＢＭＩ変化は、集団全体の平均的なＢＭＩ変化とは異なる。
【０２３７】
減量についてのエピスタシス試験
同じ組み合わせのＳＮＰが減量期間中のＢＭＩ変化と相関することが判明した（ｐ＝０．０２４３、方法論についての詳細は、「更なる線形モデル」を参照）。線形モデルの結果及び続くＡＮＯＶＡの結果をそれぞれ表１０及び表１１に示す。
【０２３８】
体重維持解析に関し行った通り、これらの２つのＳＮＰの組み合わせを「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」に二分化し、残りの全ての被検者はまとめてプールした。線形モデルにより減量期間中のＢＭＩ変化をモデリングした結果を表１２に示す。この表では、被検者「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」は、その他の遺伝型の組み合わせをもつ被検者と比較して、より強力に減量する（９５％  ＣＩ［−０．３４，−０．０６］におけるＢＭＩ変化＝−０．２０ｋｇ／ｍ２）ことが示される。
【０２３９】
減量期間の前後のＢＭＩの中央値の変化を計算すると、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」は、その他の遺伝子型群と比べて、より減量すること（ＢＭＩの中央値の変化＝−３．６９ｋｇ／ｍ２）が観察できる（表１３を参照）。
【０２４０】
ベースラインＢＭＩについてのエピスタシス試験
ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０（順位和ｐ＝０．９３）により定義される異なる遺伝子型群間で、ベースライン（ＣＩＤ１）のＢＭＩには差がないことが判明した。これにより、これらのマーカーの組み合わせが、介入に応じた体重（例えば、減量又は体重維持）の予測になることが示唆されるものの、予後的なものではない。
【０２４１】
ＦＡＴ４  ＳＮＰ及び体重関連性表現型の相関
ＦＡＴ４  ＳＮＰはＢＭＩにおける変化と相関することから、本発明者らは、同じＳＮＰが、体脂肪量、除脂肪量、腰周囲、及び腹囲における変化などといった、その他の体重関連性の表現型にも相関するかを試験した（方法論についての詳細は、「更なる線形モデル」を参照）。実際のところ、これらのＳＮＰ：ｒｓ１５０９２８９、ｒｓ１５０９２９０、ｒｓ９５３２１１；の単独、又は組み合わせは、体重維持中の、体重関連性表現型における変化と優位に相関する（表１４）。
【０２４２】
減量期間中、複数のＳＮＰ（ｒｓ１５０９２８９、ｒｓ１５０９２９０、並びにｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０の相互作用）がＢＭＩ及び腰周囲における変化と優位に相関することが判明した（表１５）。
【０２４３】
これらの解析は、ＦＡＴ４  ＳＮＰが、体重維持期間及び減量期間の両方で、ＢＭＩ及びいくつかの更なる体重関連性の表現型と相関することを実証する。
【０２４４】
二分化したＢＭＩにおける変化についての分類子としてのＦＡＴ４  ＳＮＰの使用
減量介入又は体重維持介入の結果についての予測性能を評価する目的で、本発明者らは、ＢＭＩの変化率を計算し、この値をもとに「良好」プロファイル及び「不良」プロファイルに二分化した（閾値の詳細については、「経時的なＢＭＩ変化における二分化」の節を参照）。本発明者らは、我々の遺伝子マーカーの遺伝子型を、被検者を「良好」又は「不良」プロファイルのいずれかに同定するものとして予測される組み合わせに二分化した（「分類解析」を参照）。
【０２４５】
二分化した値を解析したところ、統計力が顕著に低下したものの、かかる単純なスキームでは、予測性能に関し非常に保存的な評価が得られる。
【０２４６】
本発明者らは、体重維持期間中及び減量期間中の両方でかかる解析を実施した。同様にして、ＢＭＩを二分化するにあたってのカットオフに起因してバイアスが導入されることを回避するため、本発明者らはカットオフを複数行う解析を繰り返した。
【０２４７】
異なる遺伝マーカーについての予測性能を表１６及び表１７に示す。これらの表は、それぞれ体重維持介入又は減量介入後のＢＭＩ結果を表す。
【０２４８】
これらの表は、９５％信頼区間、及び分割表（分類をもとに作成）をもとに実施したフィッシャーの正確確率検定によるｐ値についてのオッズ比を含む。これらの値が、分類子（遺伝子型）と実際の結果（二分化されたＢＭＩ変化率）との間の相関を評価する。ｐ値が５％未満であると、分類子と結果との間に有意な相関があることが示唆される。
【０２４９】
これらの表は、分類正確度（すなわち、被検者が正確に分類された画分）及び正確性についての９５％信頼区間などの性能メトリクスも含む。無作為分類子（例えば、結果を予測するためのコイントス）では正確性は５０％である。最も低い信頼区間が５０％超であるとき、その分類子が無作為な分類子よりも有意に良好であることを意味する。正確度が無作為分類子よりも有意に良好であるかを評価するための別のメトリクスは、「正確度のｐ値」と呼ばれる。二項検定により得られるこの片側ｐ値は、観察された正確度が情報レートの全くない場合よりも良好であるかを評価する（Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｆｔｗ．２８，１−２６（２００８））。
【０２５０】
ＦＡＴ４遺伝子マーカー（ｒｓ１５０９２８９、ｒｓ１５０９２９、及びｒｓ９５３２１１）を独立に又は組み合わせて使用した解析は、ＢＭＩ結果について予測する無作為分類子よりも優位に正確度が高い（全ての正確なｐ値は＜５％である、表１６を参照）。
【０２５１】
減量期間後のＢＭＩ結果を考慮すると、分類子ｒｓ９５３２１１の正確度は、無作為化分類子よりも良好ではない（正確度ｐ値＞５％、表１７を参照）。ｒｓ９５３２１１では、減量中のＢＭＩ変化との優位な相関が見られないことから、このように予測した。
【０２５２】
２つの他のＳＮＰ（ｒｓ１５０９２８９及びｒｓ１５０９２９）、並びにｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０の組み合わせに関し、分類子の正確度は、主要な二分化スキームに関係する無作為分類子よりも優位に良好である（表１７）。
【０２５３】
したがって、ＦＡＴ４マーカーは、減量期間後、又は体重維持期間後の体重結果の分類子として単独で又は組み合わせて使用できる。
【０２５４】
良好な分類子である可能性があるその他のＳＮＰの発見
いくつかの候補領域が同定されていることから、変数増加させて相関するシグナルを精密化する。相関するシグナルを精密化するプロセスについて記載している多様なレビューがある（ＭｃＣａｒｔｈｙ＆Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７，Ｒ１５６−Ｒ１６５（２００８）；Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０，３１８−３２９（２００９）；ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．９，３５６−３６９（２００８））。いくつかのストラテジーを以下に要約する。
【０２５５】
遺伝子の再配列決定及び更なるジェノタイピング
次世代シーケンサ（ＮＧＳ）の登場により、現在では、大規模コホートのエクソーム又は全ゲノム配列のいずれかを配列決定することができる。販売会社の実験プロトコルに準拠し、コミュニティの最新の解析パイプラインを使用して（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０，１２９７−１３０３（２０１０））、古典的なＳＮＰアレイによるアッセイは行わずに更なるＳＮＰを同定できる。多様な手法により、更にマーカーをジェノタイピングすることができる。このような手法としては、限定するものではないが、配列決定法（エクソーム配列決定法、全ゲノム配列決定法、標的化配列決定、ＲＮＡ配列決定法、パイロシークエンス法）；ジェノタイピング解析（高密度ＳＮＰアレイ、カスタムＳＮＰアレイ、Ｔａｑｍａｎによる標的化ジェノタイピング、Ｆｌｕｉｄｉｇｍのいずれか）、ＰＣＲベースのアッセイ、質量分光法によるジェノタイピング法などが挙げられる。
【０２５６】
更なるマーカーがジェノタイピングされたならば、変数増加させて形質（例えば、ＢＭＩにおける変化）との相関について試験し、病因マーカーを同定する。特に、本発明者らが同定したＳＮＰの近傍（例えば、＋／−１００Ｋｂ）に位置するその他のマーカーをジェノタイピングして上記と同じ分析を繰り返すことにより、減量期間中又は体重維持中の体重関連の表現型の変化を予測するのに有用な更なるマーカー又はマーカーの組み合わせを同定することができる。
【０２５７】
インピュテーションしたＳＮＰの使用
更なるマーカー類の獲得は、インピュテーション法によっても達成できる（Ｍａｒｃｈｉｎｉ＆Ｈｏｗｉｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１，４９９−５１１（２０１０））。公共の参照データセットの可用性から（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔ．Ｉ．Ｈ．３．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６７，５２−５８（２０１０）；Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔ．１０００  Ｇ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，５６−６５（２０１２）；Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２６，７８９−７９６（２００３）；Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，１２９９−１３２０（２００５））  ａｎｄ  ｗｅｌｌ−ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌｓ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．３４，８１６−８３４（２０１０）；Ｍａｒｃｈｉｎｉ＆Ｈｏｗｉｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１，４９９−５１１（２０１０））、このストラテジーはゲノムワイドの相関試験において、試験するマーカーの数を増加させるにあたって一般に使用される。
【０２５８】
このようなストラテジーを本発明者らのデータに適用して、ＦＡＴ４遺伝子（＋／−１０Ｋｂ）近傍に位置する４７５個のＳＮＰについて遺伝子型データを利用可能にした（「インピュテーションされたＳＮＰの解析」の節を参照）。その後、体重維持中のＢＭＩ変化との相関についてこれらのＳＮＰを試験した。結果を図２に示す。９２個のＳＮＰでｐ値が５％未満であったことから、ＦＡＴ４近傍に位置するその他の遺伝子が体重管理に相関することが示唆された（図７中のリストを参照）。しかしながら、これらのＳＮＰの中には、すでに検出されていたＳＮＰよりも強力な相関（低ｐ値）を有するものはなかった（図２）。これにより、インピュテーションされたこれらのＳＮＰはｒｓ９５３２１１、ｒｓ１５０９２９０、又はｒｓ１５０９２８９の代理のＳＮＰとして機能し得るものの、優位に良好な予測値は有しない可能性が高いことが示唆される。
【０２５９】
メタ解析
メタ解析は、複数の試験結果を組み合わせることで、試験間で一貫性のあるパターンを見出すことを目的とする。特に、ＧＷＡ試験のメタ解析は、単一の試験を解析した場合には見逃されてしまう恐れがある、対象とする形質に相関するＳＮＰを同定することを目的とする。遺伝的メタ解析の統計的方法論は十分に確立されており（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０，３１８−３２９（２００９）；Ｅｖａｎｇｅｌｏｕ＆Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４，３７９−３８９（２０１３））、更なるマーカーを同定するにあたって、大規模研究グループにおいてよく使用されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４４，３６９−３７５，Ｓ１−３（２０１２）；ＤＩＡｂｅｔｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＩＡＧＲＡＭ）  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４６，２３４−２４４（２０１４））。
【０２６０】
複数の試験結果を組み合わせて、ＦＡＴ４遺伝子近傍（例えば、＋／−１００Ｋｂ）に位置するＳＮＰに焦点をおくことにより、更なＳＮＰを見出すこともできる。
【０２６１】
多次元削減解析（Multi-dimensionalreduction analyses）
別のアプローチには、すでに検出されている対象とする領域について、多次元削減解析により全ての潜在的な２ＳＮＰ又は更にはより多元でのＳＮＰ相互作用（例えば、３ＳＮＰ相互作用）を選別するというものがある（Ｍｏｏｒｅ  Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．７２，１０１−１１６（２０１０）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＮＪ  １０１９，４６５−４７７（２０１３））。多次元削減アプローチ（ＭＤＲ）を使用して、症例対照研究においてＳＮＰ−ＳＮＰ相互作用を試験できる。ＭＤＲは、バイナリクラスを予測する精度が最良であるＳＮＰの組み合わせを同定することを目的とした、ノンパラメトリックでモデルフリーな方法である。ＭＤＲを用いる場合、訓練データセットと評価データセットの精度を評価するための交差検定が推奨される。これらの精度は、訓練データセット及び評価データセットのそれぞれについて分類精度及び予測精度と呼ばれる（更なる詳細については、次のレビュー：Ｍｏｔｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｔｃｈｉｅ（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２，３１８−３２８（２００６）を参照）。交差検定の一貫性も評価できる。すなわち、データを無作為に複数回訓練セット及び評価セットに分割したときに、同一の最良の分類子（ＳＮＰの組み合わせ）が同定される回数を一貫性として評価できる。
【０２６２】
本発明者らは、このような検定をＦＡＴ４遺伝子（＋／−１０ｋｂ）近傍に位置するＳＮＰに対して行い、最良のＳＮＰ、又は最良の２つのＳＮＰの組み合わせを同定して、体重維持中又は減量中にＢＭＩに生じる二分化変化を予測することを目的とした（「経時的なＢＭＩ変化における二分化」の節を参照。体重維持中又は減量中のＢＭＩ変化についての結果を、それぞれ表１８及び表１９に示す。これらの分析により、ＳＮＰのｒｓ１５０９２８９、ｒｓ９５３２１１、ｒｓ１５０９２９０がＢＭＩ変化についての最良の分類子として本質的に見出された。これは我々の予測解析と一致し、これらのＳＮＰが、減量／維持を予測するにあたり好ましいマーカーであることを示す。
【０２６３】
実施例３−好ましい実施形態の要約
ＦＡＴ４  ＳＮＰ及び体重維持中のＢＭＩにおける変化
本発明者等による様々な解析により、ＦＡＴ４近傍に位置するＳＮＰが体重維持期間中のＢＭＩにおける変化に相関することが実証された。それらの結果は以下の通りに要約できる：
患者は体重維持期間中に再増量する傾向がある。この観察は、任意のＳＮＰの遺伝子型とは無関係に行うことができる。
当業者がＦＡＴ４  ＳＮＰにおける遺伝子型を知っている場合（我々の好ましい実施形態では、ＳＮＰのｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０）、以下の予測を行うことができる：
「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」の患者は、ＢＭＩにおける変化がほとんどない傾向がある（ＢＭＩの中央値における変化は０に近い）
任意の他の遺伝子型群の患者は、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」よりも優位に体重が再増加する傾向があり、かつ集団（すなわち、遺伝子型が無関係にまとめられプールされた全患者）における平均的な（又は中央値の）変化よりも重量が大きい
【０２６４】
したがって、ＦＡＴ４  ＳＮＰの遺伝子型の遺伝子型を知ることにより、以下の予測を行うことができる：
【表３】
2018502559.tif 000007
【０２６５】
ＦＡＴ４  ＳＮＰと、減量中のＢＭＩにおける変化
我々の解析では、体重維持結果を予測するのと同じく、ＦＡＴ４  ＳＮＰを使用して、減量結果を予測することができることも見出された。結果は以下の通りに使用できる：
【表４】
2018502559.tif 000008
【０２６６】
ＦＡＴ４  ＳＮＰ、及び体重維持中のその他の体重関連性表現型における変化
ＦＡＴ４  ＳＮＰは、腰及び腹周囲、体脂肪量、及び除脂肪量などの、更に体重に関連する表現型において、体重維持中の変化に相関することが判明した。これらの遺伝子型についての中央値の変化を遺伝子型群について階層化したものを表２０に示す。これらの結果を以下の通り使用できる：
【０２６７】
【表５】
2018502559.tif 000009
【０２６８】
ＦＡＴ４  ＳＮＰ及び減量中のその他の体重関連性表現型における変化
ＦＡＴ４  ＳＮＰは、体重維持中の腰周囲における変化と顕著に相関することが判明した。ヒップ及びその他の体重に関連する表現型の中央値の変化を遺伝子型群について階層化したものを表２１に示す。腰周囲についての結果は、次の通りに要約できる。
【０２６９】
【表６】
2018502559.tif 000010
【０２７０】
表
【表７】
2018502559.tif 000011
【０２７１】
【表８】
2018502559.tif 000012
【０２７２】
【表９】
2018502559.tif 000013
【０２７３】
【表１０】
2018502559.tif 000014
【０２７４】
【表１１】
2018502559.tif 000015
【０２７５】
【表１２】
2018502559.tif 000016
【０２７６】
このモデルでは、用語「遺伝子型群」は、次のレベルを有する：「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」
【０２７７】
【表１３】
2018502559.tif 000017
【０２７８】
このモデルでは、用語「遺伝子型群」は、以下のレベルを有する：「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」
【０２７９】
【表１４】
2018502559.tif 000018
【０２８０】
異なる用語の推定はブートストラップにより評価される（ｎ＝１０００のリサンプリングによる）。このモデルでは、用語「遺伝子型群」は次のレベル：「その他」、「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」を有する。
【０２８１】
【表１５】
2018502559.tif 000019
【０２８２】
【表１６】
2018502559.tif 000020
【０２８３】
このモデルでは、用語「遺伝子型群」は、以下のレベルを有する：「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」
【０２８４】
【表１７】
2018502559.tif 000021
【０２８５】
このモデルでは、用語「遺伝子型群」は、次のレベルを有する：「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ａ／Ａ；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア」、「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ｇ／Ｇ」
【０２８６】
【表１８】
2018502559.tif 000022
【０２８７】
このモデルでは、用語「遺伝子型群」は次のレベル：「その他」、「ｒｓ９５３２１１−Ｇキャリア及びｒｓ１５０９２９０−Ａキャリア」を有する。
【０２８８】
【表１９】
2018502559.tif 000023
【０２８９】
【表２０】
2018502559.tif 000024
【０２９０】
５％（１０％）に満たないｐ値をボールド体（イタリック体）で示す。これらの解析に遺伝子型モデルを使用した。
【０２９１】
【表２１】
2018502559.tif 000025
【０２９２】
５％（１０％）に満たないｐ値をボールド体（イタリック体）で示す。これらの解析には遺伝子型モデルを使用した。
【０２９３】
【表２２】
2018502559.tif 000026
【０２９４】
遺伝子マーカーのレベルを以下の通りにコード化した：
ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０：「その他」対「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア）」
ｒｓ１５０９２８９：「Ｇ／Ｇ」対「Ａキャリア」
ｒｓ１５０９２９０：「Ｇ／Ｇ」対「Ａキャリア」
ｒｓ９５３２１１：「Ａ／Ａ」対「Ｇキャリア」
【０２９５】
【表２３】
2018502559.tif 000027
【０２９６】
遺伝子マーカーのレベルを以下の通りにコード化した：
ｒｓ９５３２１１及びｒｓ１５０９２９０：「その他」対「ｒｓ９５３２１１  Ｇキャリア；ｒｓ１５０９２９０  Ａキャリア）」
ｒｓ１５０９２８９：「Ｇ／Ｇ」対「Ａキャリア」
ｒｓ１５０９２９０：「Ｇ／Ｇ」対「Ａキャリア」
ｒｓ９５３２１１：「Ａ／Ａ」対「Ｇキャリア」
【０２９７】
【表２４】
2018502559.tif 000028
【０２９８】
【表２５】
2018502559.tif 000029
【０２９９】
【表２６】
2018502559.tif 000030
【０３００】
【表２７】
2018502559.tif 000031
【図１】
2018502559.tif 000032
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図４−２２】
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【図４−２３】
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【図４−２４】
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【図４−２５】
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【図４−２６】
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【図４−２７】
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【図４−２８】
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【図４−２９】
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【図４−３０】
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【図４−３１】
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【図４−３２】
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【図４−３３】
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【図４−３４】
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【図４−３５】
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【図４−３６】
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【図４−３７】
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【図４−３８】
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【図４−３９】
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【図４−４０】
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【図４−４１】
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【図４−４２】
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【図４−４３】
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【図４−４４】
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【図４−４５】
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【図４−４６】
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【図４−４７】
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【図４−４８】
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【図４−４９】
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【図４−５０】
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【図４−５１】
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【図４−５２】
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【図４−５３】
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【図４−５４】
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【図４−５５】
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【図４−５６】
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【図４−５７】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ａ−４】
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【図５Ａ−５】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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