(57)【要約】  Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化するための方法及び製剤を記載する。前記方法及び製剤は、胸膜腔のＢ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化するために気道へ投与できる。炎症性または自己免疫性要素を伴う病態を治療できる。Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージは、線維または線維形成ペプチドを使用して、標的化かつ活性化させることができる。
2018534330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象の多発性硬化症を治療する方法であって、前記方法が、
前記対象の気道に配列番号１０５３の原線維形成ペプチドを含む製剤の治療上有効な量を投与すること、
それによって治療を必要とする前記対象の多発性硬化症を治療すること、を含む、前記方法。
【請求項２】
治療を必要とする対象の炎症性または自己免疫状態を治療するために、Ｂ−１ａリンパ球を活性化する方法であって、前記方法が、
治療を必要とする前記対象に原線維または原線維形成ペプチドを含む製剤の治療上有効な量を投与すること、
それによってＢ−１ａリンパ球を活性化すること、及び治療を必要とする前記対象の前記炎症性または自己免疫状態を治療すること、を含む、前記方法。
【請求項３】
前記炎症性または自己免疫状態が、多発性硬化症、関節リウマチ、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、癌、虚血性再灌流傷害、関節炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与することが気道へのものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記気道への前記投与することが肺の肺胞領域へのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記原線維または原線維形成ペプチドが配列番号１０５３である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記原線維形成ペプチドが、−２３ｋｃａｌ／モル以下のＲｏｓｅｔｔａエネルギーでオリゴマー形成するヘキサペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号１〜１０６２のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号５、配列番号１０４８、配列番号１０４９、配列番号１２３、配列番号１０５０、配列番号１０５１、配列番号７９１、配列番号１０５２、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号２２０、及び配列番号１０５８のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記製剤が導電性製剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記製剤が粘膜作用剤または粘液溶解剤を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が乾燥粉末製剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記製剤が導電剤を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ−１ａリンパ球を活性化することが胸膜腔で生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
原線維または原線維形成ペプチド、及び導電剤を含む、導電性製剤。
【請求項１６】
前記導電剤が高張性食塩水である、請求項１５に記載の導電性製剤。
【請求項１７】
粘膜作用剤または粘液溶解剤を更に含む、請求項１５に記載の導電性製剤。
【請求項１８】
前記原線維形成ペプチドが、−２３ｋｃａｌ／モル以下のＲｏｓｅｔｔａエネルギーでオリゴマー形成するヘキサペプチドである、請求項１５に記載の導電性製剤。
【請求項１９】
前記原線維または原線維形成ペプチドが配列番号１０５３を含む、請求項１５に記載の導電性製剤。
【請求項２０】
前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号１〜１０６２から選択される１つ以上のペプチドを含む、請求項１５に記載の導電性製剤。
【請求項２１】
前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号５、配列番号１０４８、配列番号１０４９、配列番号１２３、配列番号１０５０、配列番号１０５１、配列番号７９１、配列番号１０５２、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号２２０、及び配列番号１０５８から選択される１つ以上のペプチドを含む、請求項１５に記載の導電性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１８日出願の米国特許仮出願第６２／２５６，８１４号の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化するための方法及び製剤を記載する。前記方法及び製剤は、胸膜腔のＢ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化するために気道へ投与することができる。炎症性または自己免疫性要素を伴う病態を治療できる。Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージは、線維または線維形成ペプチドを使用して、標的化かつ活性化させることができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫系のＢ細胞は抗体を産生する。歴史的にすべてのＢ細胞は、病原体への曝露後、抗体を産生すると考えられた。しかしＢ２細胞は病原体への曝露後、抗体を産生するが、一方でＢ１細胞は病原体への曝露がない状態で抗体を産生することが今では知られている。Ｂ１細胞は、抗原をＴ細胞に効率的に提示する際、及び特異的刺激のない状態で持続性シグナル伝達の証拠を示す際、Ｂ２細胞とは機能的にも異なる。
【０００４】
更に広い意味でそれらが反応性かつレパートリー選択されるという点で、Ｂ１細胞によって産生する抗体（「天然」また「静止期」免疫グロブリン（例えば、静止期ＩｇＭまたはＩｇＡ）と呼ばれる）は、他の抗体と異なる。静止期免疫グロブリンが細菌及びウイルス感染に対する初期防御で重要な役割を果たし、更に自己抗原の認識及び細胞デブリの結合によって多種多様な疾患で役割を果たすことが、今では知られている。
【０００５】
Ｂ１細胞は、Ｂ−１ａリンパ球及びＢ−１ｂリンパ球に更に細分類されることができる。両方の種類は、マーカープロファイルＣＤ２０＋ＣＤ２７＋ＣＤ４３＋ＣＤ７０−を有する。Ｂ−１ａリンパ球はＣＤ５＋であり、Ｂ−１ｂリンパ球はＣＤ５−である。Ｂ−１ａ及びＢ−１ｂ前駆細胞は、ＣＤ１３８発現レベルも異なる。
【０００６】
マクロファージは、単球の分化によって産生される白血球である。単球及びマクロファージは食細胞であり、獲得免疫（特異的防衛機構）を開始させるのを助けるだけでなく、先天免疫（非特異的免疫防御）で役割を果たす。これらの細胞は、静止細胞としてまたは移動細胞として細胞デブリ及び病原体を貪食する（取り込んで、それから消化する）。病原体によってまたは他の機構によって活性化するとき、マクロファージは、リンパ球及び他の免疫細胞を刺激かつ補充して、侵襲に反応する。
【０００７】
マクロファージは宿主免疫防御で重要な役割を果たすが、活性化マクロファージは多くの疾患及び障害の進行にも関与している。活性化マクロファージは、広範囲に及ぶ白血球浸潤を誘発し、炎症性メディエータ、アポトーシス促進性因子及びマトリクス分解性プロテアーゼで周囲組織をあふれさせる。これらの作用は、重大な障害を負う位置に組織を破壊する炎症をもたらしうる。マクロファージ誘発性炎症によって行われる組織破壊は、腫瘍、自己免疫不全及び他の状態の進行と関連していた。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、気道周囲の標的化及び活性化Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージが、炎症または自己免疫要素を有する病態を治療できることを提供する。Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージは、線維または線維形成ペプチドを使用して、効果的に標的化かつ活性化させることができる。
【０００９】
本明細書で提出する図面の多くは、色で理解がすすむが、それは出願時の特許出願公報では利用できない。出願人は、元の提出試料の一部として図面のカラーバージョンを検討し、後の審理で図面のカラー画像を提出する権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】アミロイド線維はタウ６２３−６２８結合からなり、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９  ＣＤ５）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉ腹腔Ｍφ）によって貪食される。１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、ラット抗マウスＣＤ１９（ＰＥ）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）及びＤＡＰＩで染色した野生型マウスからの腹腔細胞の共焦点画像のセットから作成した動画からの（図１Ａ）複合共焦点画像（倍率４０倍）及び（図１Ｂ）単Ｚ−ｃｕｔ（６３倍）である。細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８白色光レーザー共焦点顕微鏡を使用して可視化された。（図１Ｃ）野生型マウスは、１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、腹膜細胞は１０分後に単離されて、非注入動物からの腹膜細胞と比較した。細胞は洗浄され、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及び生存率のためにヨウ化プロピジウムで染色した。異なる細胞型の境界を画定するゲートは、２つの上図（注入の１０分後）に示され、各細胞型のＦＩＴＣ−タウによる染色の量は５つの下図に示される。
【図１Ｂ】アミロイド線維はタウ６２３−６２８結合からなり、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９  ＣＤ５）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉ腹腔Ｍφ）によって貪食される。１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、ラット抗マウスＣＤ１９（ＰＥ）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）及びＤＡＰＩで染色した野生型マウスからの腹腔細胞の共焦点画像のセットから作成した動画からの（図１Ａ）複合共焦点画像（倍率４０倍）及び（図１Ｂ）単Ｚ−ｃｕｔ（６３倍）である。細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８白色光レーザー共焦点顕微鏡を使用して可視化された。（図１Ｃ）野生型マウスは、１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、腹膜細胞は１０分後に単離されて、非注入動物からの腹膜細胞と比較した。細胞は洗浄され、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及び生存率のためにヨウ化プロピジウムで染色した。異なる細胞型の境界を画定するゲートは、２つの上図（注入の１０分後）に示され、各細胞型のＦＩＴＣ−タウによる染色の量は５つの下図に示される。
【図１Ｃ】アミロイド線維はタウ６２３−６２８結合からなり、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９  ＣＤ５）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉ腹腔Ｍφ）によって貪食される。１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、ラット抗マウスＣＤ１９（ＰＥ）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）及びＤＡＰＩで染色した野生型マウスからの腹腔細胞の共焦点画像のセットから作成した動画からの（図１Ａ）複合共焦点画像（倍率４０倍）及び（図１Ｂ）単Ｚ−ｃｕｔ（６３倍）である。細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８白色光レーザー共焦点顕微鏡を使用して可視化された。（図１Ｃ）野生型マウスは、１０μｇのＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、腹膜細胞は１０分後に単離されて、非注入動物からの腹膜細胞と比較した。細胞は洗浄され、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及び生存率のためにヨウ化プロピジウムで染色した。異なる細胞型の境界を画定するゲートは、２つの上図（注入の１０分後）に示され、各細胞型のＦＩＴＣ−タウによる染色の量は５つの下図に示される。
【図２Ａ】ゲーティング方法を、種々のマウス腹膜細胞集団を識別するために使用した。腹膜洗浄からの全細胞を、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及びヨウ化プロピジウム（生存率マーカー）で染色した。（図２Ａ）ワクチン接種を受けていないマウスからの腹膜細胞は、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、好酸球（ＣＤ１１ｂｌｏＳＳＣｈｉ）、マスト細胞（ＣＤ１１ｂ−ＳＳＣｈｉ）、Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ５ｈｉＣＤ１９−）、Ｂ−１ａ（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）及びＢ−２（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）細胞を識別するために、順次ゲート開閉した。（図２Ｂ）ワクチン接種を受けていないマウスからの種々の腹膜細胞サブセットは、ＦＩＴＣチャネルに発される自家蛍光のレベルを分析し、負の閾値（すなわちＦＩＴＣ−タウｎｅｇａｔｉｖｅ）を確定した。それを、図１に示すＦＩＴＣ−タウの結合を決定するために使用した。（図２Ｃ）１０μｇのＦＩＴＣ−タウの腹腔内注射の１０分後及び５時間後の腹膜細胞を処理して、上述のとおり染色し、マクロファージ、好酸球及びマスト細胞を識別するためにゲート開閉した。ＣＤ１１ｂｈｉマクロファージは、注入５時間後に劇的に、すなわち４０％超（左図）から３％未満（右図）まで減少した。（図２Ｄ）図は、ＦＩＴＣ−タウ注入の１０分後及び５時間後の、腹腔Ｂ細胞（Ｂ−１及びＢ−２）を示す。腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の注入の過半数（＞７０％）の１０分後に、ＦＩＴＣ−タオ（中央図）を貪食する。これに対して、注入の５時間後、腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の割合は劇的に減少し、残存するレジデントＢ−１ａ及びＢ−２細胞は、ＦＩＴＣ−タオ（右パネル）が陰性だった（右図）。
【図２Ｂ】ゲーティング方法を、種々のマウス腹膜細胞集団を識別するために使用した。腹膜洗浄からの全細胞を、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及びヨウ化プロピジウム（生存率マーカー）で染色した。（図２Ａ）ワクチン接種を受けていないマウスからの腹膜細胞は、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、好酸球（ＣＤ１１ｂｌｏＳＳＣｈｉ）、マスト細胞（ＣＤ１１ｂ−ＳＳＣｈｉ）、Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ５ｈｉＣＤ１９−）、Ｂ−１ａ（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）及びＢ−２（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）細胞を識別するために、順次ゲート開閉した。（図２Ｂ）ワクチン接種を受けていないマウスからの種々の腹膜細胞サブセットは、ＦＩＴＣチャネルに発される自家蛍光のレベルを分析し、負の閾値（すなわちＦＩＴＣ−タウｎｅｇａｔｉｖｅ）を確定した。それを、図１に示すＦＩＴＣ−タウの結合を決定するために使用した。（図２Ｃ）１０μｇのＦＩＴＣ−タウの腹腔内注射の１０分後及び５時間後の腹膜細胞を処理して、上述のとおり染色し、マクロファージ、好酸球及びマスト細胞を識別するためにゲート開閉した。ＣＤ１１ｂｈｉマクロファージは、注入５時間後に劇的に、すなわち４０％超（左図）から３％未満（右図）まで減少した。（図２Ｄ）図は、ＦＩＴＣ−タウ注入の１０分後及び５時間後の、腹腔Ｂ細胞（Ｂ−１及びＢ−２）を示す。腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の注入の過半数（＞７０％）の１０分後に、ＦＩＴＣ−タオ（中央図）を貪食する。これに対して、注入の５時間後、腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の割合は劇的に減少し、残存するレジデントＢ−１ａ及びＢ−２細胞は、ＦＩＴＣ−タオ（右パネル）が陰性だった（右図）。
【図２Ｃ】ゲーティング方法を、種々のマウス腹膜細胞集団を識別するために使用した。腹膜洗浄からの全細胞を、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及びヨウ化プロピジウム（生存率マーカー）で染色した。（図２Ａ）ワクチン接種を受けていないマウスからの腹膜細胞は、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、好酸球（ＣＤ１１ｂｌｏＳＳＣｈｉ）、マスト細胞（ＣＤ１１ｂ−ＳＳＣｈｉ）、Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ５ｈｉＣＤ１９−）、Ｂ−１ａ（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）及びＢ−２（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）細胞を識別するために、順次ゲート開閉した。（図２Ｂ）ワクチン接種を受けていないマウスからの種々の腹膜細胞サブセットは、ＦＩＴＣチャネルに発される自家蛍光のレベルを分析し、負の閾値（すなわちＦＩＴＣ−タウｎｅｇａｔｉｖｅ）を確定した。それを、図１に示すＦＩＴＣ−タウの結合を決定するために使用した。（図２Ｃ）１０μｇのＦＩＴＣ−タウの腹腔内注射の１０分後及び５時間後の腹膜細胞を処理して、上述のとおり染色し、マクロファージ、好酸球及びマスト細胞を識別するためにゲート開閉した。ＣＤ１１ｂｈｉマクロファージは、注入５時間後に劇的に、すなわち４０％超（左図）から３％未満（右図）まで減少した。（図２Ｄ）図は、ＦＩＴＣ−タウ注入の１０分後及び５時間後の、腹腔Ｂ細胞（Ｂ−１及びＢ−２）を示す。腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の注入の過半数（＞７０％）の１０分後に、ＦＩＴＣ−タオ（中央図）を貪食する。これに対して、注入の５時間後、腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の割合は劇的に減少し、残存するレジデントＢ−１ａ及びＢ−２細胞は、ＦＩＴＣ−タオ（右パネル）が陰性だった（右図）。
【図２Ｄ】ゲーティング方法を、種々のマウス腹膜細胞集団を識別するために使用した。腹膜洗浄からの全細胞を、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＡＰＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及びヨウ化プロピジウム（生存率マーカー）で染色した。（図２Ａ）ワクチン接種を受けていないマウスからの腹膜細胞は、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、好酸球（ＣＤ１１ｂｌｏＳＳＣｈｉ）、マスト細胞（ＣＤ１１ｂ−ＳＳＣｈｉ）、Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ５ｈｉＣＤ１９−）、Ｂ−１ａ（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）及びＢ−２（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）細胞を識別するために、順次ゲート開閉した。（図２Ｂ）ワクチン接種を受けていないマウスからの種々の腹膜細胞サブセットは、ＦＩＴＣチャネルに発される自家蛍光のレベルを分析し、負の閾値（すなわちＦＩＴＣ−タウｎｅｇａｔｉｖｅ）を確定した。それを、図１に示すＦＩＴＣ−タウの結合を決定するために使用した。（図２Ｃ）１０μｇのＦＩＴＣ−タウの腹腔内注射の１０分後及び５時間後の腹膜細胞を処理して、上述のとおり染色し、マクロファージ、好酸球及びマスト細胞を識別するためにゲート開閉した。ＣＤ１１ｂｈｉマクロファージは、注入５時間後に劇的に、すなわち４０％超（左図）から３％未満（右図）まで減少した。（図２Ｄ）図は、ＦＩＴＣ−タウ注入の１０分後及び５時間後の、腹腔Ｂ細胞（Ｂ−１及びＢ−２）を示す。腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の注入の過半数（＞７０％）の１０分後に、ＦＩＴＣ−タオ（中央図）を貪食する。これに対して、注入の５時間後、腹腔Ｂ−１ａ及びＢ−２細胞の割合は劇的に減少し、残存するレジデントＢ−１ａ及びＢ−２細胞は、ＦＩＴＣ−タオ（右パネル）が陰性だった（右図）。
【図３】アミリン２８−３３と腹膜細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、細胞生存度に影響を及ぼさない。腹膜細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６のマウスの洗浄により単離され、９６ウェル丸底プレート１ウェル当たり５００，０００細胞分取され、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中でアミリン２８−３３の１．０、０．５、０．２５、０．１２５μｇ／ウェルで３０分間または１２０分間処理した。培養終了後、細胞を回転させ、上澄みを吸引し、細胞はラット抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５（ＰＥ）、ＣＤ１９（ＡＰＣ）で染色して、氷上で３０分間インキュベートした。細胞は１度洗浄され、吸引液をＦＡＣＳ管に移し、ＰＩを加え、フローサイトメトリーで分析した。
【図４Ａ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｂ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｄ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｅ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｆ】Ｂ−１ａリンパ球及びＩＬ−１０は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性に必要である。μＭＴマウスは、症状発症時に、毎日１０μｇの（図４Ａ）アミリン２８−３３（ｎ＝１０）または（図４Ｂ）タウ６２３−６２８（ｎ＝１０）の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入で処理した。（図４Ｃ）野生型ＥＡＥマウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３を腹腔内注入して処理した（ｎ＝１０）。（図４Ｄ）ＩＬ−１０欠損型（ｎ＝７）及び（図４Ｅ）野生型（ｎ＝１０）マウスは、毎日１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。すべての実験は、少なくとも２回繰り返した。（図４Ｆ）ＥＡＥの徴候前、３．５×１０５のＢ−１ａ細胞のμＭＴマウスへの養子移入は、１０μｇのアミリン２８−３３または対照緩衝液を毎日腹腔内注入して処理した（ｎ＝６）。細胞の移動のないマウスは、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。グラフの値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図５】アミロイド形成ペプチドによって誘発される、生物発光を使用した養子移入したＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの輸送の実時間測定である。（図５左上）１×１０５及び２×１０５のＢ−１ａ選別細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスの腹腔内及び基質ルシフェリンに注入した。５分後、生物発光画像を連続して５分毎にＣＣＤカメラを使用して得た。生物発光信号は腹膜領域から検出可能で、時間の経過とともに減少して、鼠径部リンパ節領域に再局在化した。（図５右上）タウ６２３−６２８の注入後、長期にわたってＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスから光放出を測定することによる、Ｂ−１ａＬｕｃ＋細胞分布の定量化である。（図５左下）１×１０６のｌｕｃ＋ＬＰＭをＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスに腹腔内注入し、画像取得前、ルシフェラーゼを３０分毎に再注入した。Ｍφは腹膜から放出され（大きな円）、鼠径リンパ節を含む異なる組織に移動した（小さな円）。（図５右下）光放出を測定することによる、腹膜からリンパ節に移動するＭφ細胞の定量化である。リンパ節から測定したＢＬＩは、５分での最初の測定と比較して６０分で１０倍増加した。
【図６Ａ】タウ６２３−６２８またはアミリン２８−３３からなるアミロイド線維は、Ｂ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφ（ＳＰＭ及びＬＰＭ）のＬＰＳより遺伝子発現の異なるパターンを誘発する。（図６Ａ）ＬＰＳ及び２つの種類のアミロイド線維により誘発される、ヒートマップとして表される差次的遺伝子発現（７２０注釈付遺伝子）である。ＲＮＡは、１０μｇのＬＰＳ、アミリン２８−３３、タウ６２３−６２８または緩衝液のいずれかを注入した３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループから単離した、精製Ｂ−１ａリンパ球及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＭφから単離した。ＲＮＡ試料のそれぞれは、マイクロアレイプレート（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウス、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して定量化かつ分析した。（図６Ｂ）炎症性サイトカイン、（図６Ｃ）免疫抑圧系遺伝子または（図６Ｄ）活性化遺伝子を表す遺伝子のセットの未注入動物からの細胞と比較した、遺伝子誘導のｑＰＣＲによる測定。グラフは、３つの別々の測定値の結果を表す。完全なデータ一式はＧｅｏデータバンクに保管されている。
【図６Ｂ】タウ６２３−６２８またはアミリン２８−３３からなるアミロイド線維は、Ｂ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφ（ＳＰＭ及びＬＰＭ）のＬＰＳより遺伝子発現の異なるパターンを誘発する。（図６Ａ）ＬＰＳ及び２つの種類のアミロイド線維により誘発される、ヒートマップとして表される差次的遺伝子発現（７２０注釈付遺伝子）である。ＲＮＡは、１０μｇのＬＰＳ、アミリン２８−３３、タウ６２３−６２８または緩衝液のいずれかを注入した３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループから単離した、精製Ｂ−１ａリンパ球及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＭφから単離した。ＲＮＡ試料のそれぞれは、マイクロアレイプレート（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウス、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して定量化かつ分析した。（図６Ｂ）炎症性サイトカイン、（図６Ｃ）免疫抑圧系遺伝子または（図６Ｄ）活性化遺伝子を表す遺伝子のセットの未注入動物からの細胞と比較した、遺伝子誘導のｑＰＣＲによる測定。グラフは、３つの別々の測定値の結果を表す。完全なデータ一式はＧｅｏデータバンクに保管されている。
【図６Ｃ】タウ６２３−６２８またはアミリン２８−３３からなるアミロイド線維は、Ｂ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφ（ＳＰＭ及びＬＰＭ）のＬＰＳより遺伝子発現の異なるパターンを誘発する。（図６Ａ）ＬＰＳ及び２つの種類のアミロイド線維により誘発される、ヒートマップとして表される差次的遺伝子発現（７２０注釈付遺伝子）である。ＲＮＡは、１０μｇのＬＰＳ、アミリン２８−３３、タウ６２３−６２８または緩衝液のいずれかを注入した３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループから単離した、精製Ｂ−１ａリンパ球及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＭφから単離した。ＲＮＡ試料のそれぞれは、マイクロアレイプレート（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウス、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して定量化かつ分析した。（図６Ｂ）炎症性サイトカイン、（図６Ｃ）免疫抑圧系遺伝子または（図６Ｄ）活性化遺伝子を表す遺伝子のセットの未注入動物からの細胞と比較した、遺伝子誘導のｑＰＣＲによる測定。グラフは、３つの別々の測定値の結果を表す。完全なデータ一式はＧｅｏデータバンクに保管されている。
【図６Ｄ】タウ６２３−６２８またはアミリン２８−３３からなるアミロイド線維は、Ｂ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφ（ＳＰＭ及びＬＰＭ）のＬＰＳより遺伝子発現の異なるパターンを誘発する。（図６Ａ）ＬＰＳ及び２つの種類のアミロイド線維により誘発される、ヒートマップとして表される差次的遺伝子発現（７２０注釈付遺伝子）である。ＲＮＡは、１０μｇのＬＰＳ、アミリン２８−３３、タウ６２３−６２８または緩衝液のいずれかを注入した３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループから単離した、精製Ｂ−１ａリンパ球及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＭφから単離した。ＲＮＡ試料のそれぞれは、マイクロアレイプレート（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウス、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して定量化かつ分析した。（図６Ｂ）炎症性サイトカイン、（図６Ｃ）免疫抑圧系遺伝子または（図６Ｄ）活性化遺伝子を表す遺伝子のセットの未注入動物からの細胞と比較した、遺伝子誘導のｑＰＣＲによる測定。グラフは、３つの別々の測定値の結果を表す。完全なデータ一式はＧｅｏデータバンクに保管されている。
【図７Ａ】アミリン２８−３３の鼻腔内送達は、ＥＡＥの臨床徴候を低減する。（図７Ａ）ＥＡＥマウスは、症状発症時１０日間毎日鼻腔内に１０μｇのアミリン２８−３３で処理した（ｎ＝１６）。グラフの値は平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。実験は、２回繰り返した。（図７Ｂ）１０μｇのアミリン２８−３３で処理したＥＡＥマウスからの脾細胞は、０、５、１０及び２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５によって刺激され、サイトカインＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＩＬ−１７のレベルを測定した（ｎ＝３）。グラフの値は平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｂ】アミリン２８−３３の鼻腔内送達は、ＥＡＥの臨床徴候を低減する。（図７Ａ）ＥＡＥマウスは、症状発症時１０日間毎日鼻腔内に１０μｇのアミリン２８−３３で処理した（ｎ＝１６）。グラフの値は平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。マン・ホイットニーＵ検定により＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５。実験は、２回繰り返した。（図７Ｂ）１０μｇのアミリン２８−３３で処理したＥＡＥマウスからの脾細胞は、０、５、１０及び２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５によって刺激され、サイトカインＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＩＬ−１７のレベルを測定した（ｎ＝３）。グラフの値は平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図８】Ａβ４２及びＡβ４０の代表的な配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
免疫系のＢ細胞は抗体を産生する。歴史的にすべてのＢ細胞は、病原体への曝露後、抗体を産生すると考えられた。しかしＢ２細胞は病原体への曝露後、抗体を産生するが、一方でＢ１細胞は病原体への曝露がない状態で抗体を産生することが今では知られている。Ｂ１細胞は、抗原をＴ細胞に効率的に提示する際、及び特異的刺激のない状態で持続性シグナル伝達の証拠を示す際、Ｂ２細胞とは機能的にも異なる。
【００１２】
更に広い意味でそれらが反応性でかつレパートリー選択されるという点で、Ｂ１細胞によって産生する抗体（「天然」また「静止期」免疫グロブリン（例えば、静止期ＩｇＭまたはＩｇＡ）と呼ばれる）は、他の抗体と異なる。静止期免疫グロブリンが細菌及びウイルス感染に対する初期防御で重要な役割を果たし、更に自己抗原の認識及び細胞デブリの結合によって多種多様な疾患で役割を果たすことが、今では知られている。
【００１３】
Ｂ１細胞は、Ｂ−１ａリンパ球及びＢ−１ｂリンパ球に更に細分類されることができる。両方の種類は、マーカープロファイルＣＤ２０＋ＣＤ２７＋ＣＤ４３＋ＣＤ７０−を有する。Ｂ−１ａリンパ球はＣＤ５＋であり、Ｂ−１ｂリンパ球はＣＤ５−である。Ｂ−１ａ及びＢ−１ｂ前駆細胞は、ＣＤ１３８発現レベルも異なる。
【００１４】
マクロファージは、単球の分化によって産生される白血球である。単球及びマクロファージは食細胞であり、獲得免疫（特異的防衛機構）を開始させるのを助けるだけでなく、先天免疫（非特異的免疫防御）で役割を果たす。これらの細胞は、静止細胞としてまたは移動細胞として細胞デブリ及び病原体を貪食する（取り込んで、それから消化する）。病原体によってまたは他の機構によって活性化するとき、マクロファージは、リンパ球及び他の免疫細胞を刺激かつ補充して、侵襲に反応する。
【００１５】
マクロファージは宿主免疫防御で重要な役割を果たすが、活性化マクロファージは多くの疾患及び障害の進行にも関与している。活性化マクロファージは、広範囲に及ぶ白血球浸潤を誘発し、プロテアーゼを分解する炎症性メディエータ、アポトーシス促進性因子及び基質で周囲組織をあふれさせる。これらの作用は、重大な障害を負う位置に組織を破壊する炎症をもたらすことができる。マクロファージ誘発性炎症によって行われる組織破壊は、腫瘍、自己免疫不全及び他の状態の進行と関連していた。
【００１６】
本開示は、気道周囲の標的化及び活性化Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージが、炎症または自己免疫要素を有する病態を治療できることを提供する。Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージは、線維または線維形成ペプチドを使用して、効果的に標的化かつ活性化させることができる。
【００１７】
気道は、大気と血流の間の気体の交換に関与する構造である。気道は、中咽頭及び喉頭を含む上気道を包含し、気管支及び細気管支に分岐する気管を含む下気道が続く。上下気道は、誘導気道と呼ばれる。それから終末細気管支は、最終的な呼吸領域、気体の交換が生じる肺胞または肺深部に至る呼吸細気管支に分かれる。肺胞表面積は、活性剤（例えば、薬）吸収が生じる呼吸器系で最も大きい。
【００１８】
胸膜は肺を囲む膜であり、通常胸壁に付着する外側または壁側胸膜、ならびに肺及び隣接構造をカバーする内側または臓側胸膜を含む、２層構造を有する。内側及び外側胸膜の間の隙間は、胸腔、胸膜腔または胸膜内腔と呼ばれる。
【００１９】
本明細書で開示する特定の実施形態は、活性剤を含む製剤を気道の種々の部分に投与することを含む。特定の実施形態は、胸膜腔のＢ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化するための気道への投与を含む。
【００２０】
「経肺投与」とは、それらが肺、及び特定の実施形態では肺の肺胞領域に達するための、製剤の投与を意味する。特定の実施形態において、経肺投与は、鼻または口による吸入または投与によって生じる。
【００２１】
気道の配置は、肺内への活性剤分散のための重要なバリアである。そこには沈着の３つの基本機序、衝突、沈降及びブラウン運動がある（Ｐａｄｆｉｅｌｄ．１９８７．Ｉｎ：Ｄ．Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ＆Ｔ．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｄｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｔｒａｃｔ，Ｅｌｌｉｓ  Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃｈｉｃｈｅｒｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）。粒子が、特に気道分岐で、気流内にとどまることができないとき、衝突が生じる。気管支壁を覆う粘液層上に沈降し、粘膜毛様体作用によって排出される。衝突は、多くの場合、直径５μｍ以上の粒子によって生じる。より小さな粒子（＜５μｍ）はより容易に気流内にとどまり、肺内に深く運ばれることができる。沈殿は、気流がより遅い下の呼吸器系でしばしば起きる。非常に小さい粒子（＜０．６μｍ）は、ブラウン運動によって沈着できる。特定の実施形態において、この沈着は、それが肺胞を標的にしないので望ましくない（Ｗｏｒａｋｕｌ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ．２００２．Ｉｎ：Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓ．Ｄｕｍｉｔｒｉｕ  ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００２２】
製剤は、例えば液滴、乾燥粉末形態、フォーム、ゲル、ミスト、粒子、溶液、スプレー、懸濁液及び／または蒸気で気道の様々な部分に送られることができる。特定の実施形態において、製剤はエアロゾル化されることができる。
【００２３】
エアロゾルとは、通常、直径１０μｍ未満の粒子の微細な霧の任意の製剤を指す。特定の実施形態において、エアロゾル粒子の水溶性製剤の平均直径は、例えば０．１と３０μｍの間、０．５と２０μｍの間、０．５と１０μｍの間、または５μｍである。
【００２４】
気道へ活性剤の送達するためのエアロゾルは、例えば、Ａｄｊｅｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，７：５６５−５６９（１９９０）、Ｚａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｍ，Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１１４：１１１−１１５（１９９５）、Ｇｏｎｄａ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６：２７３−３１３（１９９０）、及びＭｏｒｅｎ，”Ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”ｉｎ：Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｅｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。
【００２５】
エアロゾルは一般的に、噴霧器、加圧缶、連続噴霧器による加圧下で、もしくは定量噴霧式吸入器（「ＭＤＩ」）もしくは加圧定量噴霧式吸入器（ｐＭＤＩ）の使用により、溶液または懸濁液を微粒化することによって形成される。
【００２６】
噴霧器は溶液または懸濁液の状態から微細な霧を生成し、それは対象によって吸入される。霧状化した食塩水は以前から、少量の活性剤（例えばβアゴニスト、副腎皮質ステロイドまたは抗生物質）と共に長期にわたって肺に投与されてきた。しばしば、これらの食塩水は高張性（０．９重量％超の塩化ナトリウム濃度、多くの場合５重量％と同程度）であり、一般的にそれは最大２０分間投与される。ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）吸入液（ＧＳＫ）は、肺への投与のために霧状化されることができる硫酸アルブテロール溶液である。吸入投与用のＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）溶液は、総体積３ｍＬを得るために、例えば水溶液０．２５〜０．５ｍＬ中の１．２５〜２．５ｍｇのアルブテロール硫酸塩を滅菌の生理食塩水に混合することによって調製できる。ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）吸入投与による肺への送達と関連する副作用は、見いだせなかった。霧状化装置は、例えば米国特許第５，７０９，２０２号に記載されている。
【００２７】
ｐＭＤＩは通常、計量弁を有する加圧キャニスターを含み、キャニスターは、溶液または懸濁液、噴射剤を満たされる。特定の実施形態において、溶液また懸濁液は噴射剤として作用する。他の実施形態において、噴射剤は、ヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）噴射剤（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標）ＨＦＡ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＦＲＥＯＮ（登録商標）（Ｅ．Ｉ．Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  Ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｃｏｒｐ．）を含むことができる。キャニスターから放出されるとき、製剤は微細の霧であり、噴射剤及び溶媒は、圧力の低下により完全にまたは部分的に蒸発してもよい。
【００２８】
乾燥粉末製剤も使用できる。大粒子サイズの乾燥粉末製剤（ＤＰＦ）は、改善した流動性（例えばより少ない凝集）、より簡単なエアロゾル化、及び潜在的により少ない貪食作用を有する。吸入用の乾燥粉末エアロゾルは一般的に、主に５μｍ未満の範囲の平均直径を有する粒子を使用して作成されるが、特定の実施形態において、その範囲は空気力学的粒径の１と１０μｍの間である。大きな「担体」粒子（活性剤を含有しない）は、他の予想される利点の中の効率的なエアロゾル化を達成するのを補助するために、乾燥粉末エアロゾルによって共送達されてきた。分解及び数秒〜数か月の範囲の放出時間を有する粒子は、当該技術分野において周知の方法によりデザインかつ作成されることができる。
【００２９】
特定の実施形態において、「空気力学的軽粒子」は、乾燥粉末製剤で使用できる。「空気力学的軽粒子」は、０．４ｇ／ｃｍ３未満の平均またはタップ密度を有する粒子である。タップ密度は、エンベロープ質量密度の標準的な指標である。等方性粒子のエンベロープ質量密度は、粒子の質量を、それが封入されることができる最小球の外膜容積で割ったものとして定義される。低タップ密度の原因となる特徴としては、不規則な表面テクスチャー及び多孔質構造が挙げられる。乾燥粉末粒子のタップ密度は、標準ＵＳＰタップ密度測定によって得てもよい。
【００３０】
吸入用の空気力学的軽粒子において、現在好適な平均直径は、直径３と３０μｍの間、または５と７μｍの間である。空気力学的軽粒子は、気道の選択された領域（例えば肺深部または上気道）への局所送達のための適切な材料、表層粗さ、直径及びタップ密度によって製造されてもよい。例えば高密度またはより大きな粒子を、上気道への送達のために使用してもよい。同様に、同じまたは異なる活性剤を備える異なる大きさの粒子の混合物は、１つの投与で肺の異なる部位を標的とするために投与されてもよい。
【００３１】
特定の実施形態において、導電性製剤を、気道への投与のために使用することができる。導電性製剤は、粒子放出を抑制するために特に有用である。溶液導電率は、イオン強度、濃度及び移動度の結果である（後者の２つは全体として製剤の導電率の一因となる）。イオン性成分の任意の形状（アニオン、カチオンまたは双性イオン）を使用できる。これらの導電性材料は、例えば粘液内の架橋剤として作用することによって、気道の粘膜内層の特性を変えてもよい。導電性製剤のイオン成分は、通常の気管気管支粘液内で強く結びつくアニオン性グリコプロテインと相互作用できる。この相互作用は、気道内層流体の空気／液面の状態、ならびに一時的には、水素結合、疎水性及び静電相互作用を含む共有結合性及び非共有結合性相互作用が原因の物理的もつれの性質に影響を与える。
【００３２】
導電性製剤を形成するのに有用な物質は、水性または有機溶媒環境で容易にイオン化されるものである（本明細書において「導電剤」とも称される）。このような物質の例は、塩、イオン性界面活性剤、荷電アミノ酸、荷電タンパク質または他の荷電物質を含む。
【００３３】
好適な塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、ケイ素、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、コバルト、ニッケル、銅、マンガン、亜鉛、スズ及び同様の元素の任意の塩形態を含む。例としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、リン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、重炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ホウ酸カリウム、重亜硫酸カリウム、重リン酸カリウム、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸第二銅、塩化第二クロム、塩化第一スズ及びメタケイ酸ナトリウムを含む。
【００３４】
好適なイオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）としても既知）、ラウリル硫酸マグネシウム、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及び類似の界面活性剤を含む。
【００３５】
好適な荷電アミノ酸は、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、グリシン、システイン及びチロシンを含む。
【００３６】
適切な帯電タンパク質は、カルモジュリン（ＣａＭ）、トロポニンＣ及び帯電リン脂質を含む。負に帯電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルカノイルホスファチジルグリセロール（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシトール）、ホスファチジルイノシトール４−ホスフェート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）及びホスファチジルエタノールアミンを含む。正に帯電したリン脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン、ホスファチジン酸のエステル、ジパルミトイルホスファチジン酸及びアミノアルコール（例えばヒドロキシエチレンジアミン）を有するジステアロイル−ホスファチジン酸を含む。
【００３７】
特定の実施形態において、導電性製剤は、５，０００μＳ／ｃｍ超、１０，０００μＳ／ｃｍ超、または２０，０００μＳ／ｃｍ超の導電率値を有することができる。特定の実施形態において、導電性製剤は、４，０００〜５０，０００μＳ／ｃｍ、１０，０００〜４０，０００μＳ／ｃｍ、３０，０００〜６０，０００μＳ／ｃｍ範囲の導電率値を有することができる。特定の実施形態において、導電性製剤は、等張食塩水の比導電率より大きな比導電率を有する。
【００３８】
導電性製剤の特定の実施形態は、塩（例えば、食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌまたは０．９％）、ＣａＣｌ２溶液、食塩水中のＣａＣｌ２）、またはイオン性界面活性剤（例えばＳＤＳまたはＳＬＳ）を含有する食塩水を含む。特定の実施形態において、製剤は食塩水及びＣａＣｌ２を含む。塩または他の導電性／帯電化合物の好適な濃度範囲は、０．０１％〜２０％、０．１％〜１０％または０．１〜７％（導電性または帯電化合物の重量／製剤の全重量）まで変化できる。特定の実施形態において、製剤は、高張性食塩水（すなわち０．９重量％超の塩化ナトリウム濃度）を含有する。
【００３９】
特定の実施形態において、製剤は粘膜作用剤または粘液溶解剤を含み、それは粘液産生、分泌、組成及び／または上皮との相互作用を改変できる物質である。粘膜作用剤または粘液溶解剤の例は、ＭＵＣＳＡＣ及びＭＵＣ５Ｂムチン、ＤＮＡ、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、システイン、ｎａｃｙｓｔｅｌｙｎ、ドルナーゼアルファ、ゲルゾリン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、Ｐ２Ｙ２アゴニスト（例えばＵＴＰ、ＩＮＳ３６５）ならびにネドクロミルナトリウムを含む。
【００４０】
気道への製剤の投与によりＢ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージ（例えば、胸膜腔Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージ）を標的化かつ活性化させることは、炎症性または自己免疫性要素を伴う多数の病態を治療できる。
【００４１】
炎症性または自己免疫性要素を有する状態は、アレルギー性気道疾患、アルパース病、アルツハイマー病（ＡＤ）、アミロイド腎症、アミロイド神経障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、喘息、バッテン病、癌、心虚血性再灌流傷害、セリアック病、脳・眼・顔・骨格症候群、化学療法関連認知障害及び認知症、慢性肝炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、コラーゲン誘発関節炎、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クローン病、うつ病誘発認知症、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、緑内障、バセドウ病、ＨＩＶ関連認知障害、ハンチントン病（ＨＤ）、免疫性血小板減少紫斑病、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血／再灌流傷害、若年性関節炎、ラクナ症候群、レビー小体病、ループス、黄斑変性症、軽度の認知障害、単肢筋萎縮症、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧（シャイ‐ドレーガー症候群）を伴う多系統萎縮症、重症筋無力症、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、眼球クローヌス・ミオクローヌス、パーキンソン病（ＰＤ）、脳炎後認知症、外傷後ストレス障害、後部皮質萎縮症、プリオン病、原発性抗リン脂質抗体症候群、原発性進行性失語、原発性シェーグレン症候群、進行性多巣性白質脳症、進行性核上性麻痺、仮性認知症、網膜虚血再灌流傷害、網膜色素変性症、関節リウマチ、脊髄損傷、脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脳卒中、全身エリテマトーデス、外傷性脳損傷、１型糖尿病、２型糖尿病、血管性認知症、及びウェルニッケ・コルサコフ症候群を含む。
【００４２】
例えば虚血は、細胞代謝を維持するための酸素及びグルコースの不十分な供給が原因で、患部の組織破壊を引き起こす血液供給の制限である。不十分な血流は、血管収縮、動脈閉塞、低血圧、敗血性ショック、貧血、心不全または臓器移植によって生じる可能性がある。影響を受ける組織の種類に応じて、不可逆的損傷は、３〜５分以内に（例えば、脳または心臓で）、または好気的に強度でない器官（例えば、皮膚）で１０〜２０分以内に生じ得る。虚血は代謝廃棄物及び細胞の漏出の蓄積を引き起こし、症状は皮膚のアンギナ、炎症、まだらまたは変色を含んでもよい。
【００４３】
虚血の後、血流が再導入されるとき、再灌流傷害は生じることができ、酸素の回復は、遊離基及び活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生、ならびに例えばＮｏｘ２活性によって生じる組織への酸化的損傷を引き起こすことにつながる可能性がある。再灌流は、白血球が組織破壊に過剰反応する場合、心臓不整脈、加速した細胞の自己破壊、虚血によりすでに炎症を起こした組織の炎症悪化を引き起こす可能性がある。
【００４４】
喘息は、アレルギー反応により、または細菌もしくはウイルスへの感染により誘発される気管支炎症が慢性になり、このことから増大する気道過敏及び可逆性の気道狭窄を引き起こして、喘鳴の発作、咳、無呼吸及び胸部絞扼感などの症状に至る、呼吸器疾患である。これらの症状は、夜または早朝に多く見られる。気道の反応性が増大すると、症状はより重篤かつ連続的になって、肺機能の日間変化が増加する。
【００４５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、呼吸困難を引き起こす慢性肺疾患である。それは、慢性気管支炎（長期間の湿性咳）もしくは気腫（肺破壊）、または両方の組み合わせの可能性がある。気体または蒸気の吸入、間接喫煙への曝露または高レベルの汚染を含む他の危険因子と併せて、それは喫煙によって最も一般的に生じる。症状は、咳、倦怠、呼吸器感染症、息切れ及び喘鳴を含む。
【００４６】
癌（腫瘍形成）は、無秩序な細胞増殖及び細胞分裂によって特徴づけられる。炎症性要素を有する癌の例としては、聴神経腫瘍、腺癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、気管支癌、中枢神経系癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ性白血病、大腸癌、頭蓋咽頭腫、上衣腫、ユーイング腫、線維肉腫、腺癌、神経膠腫、毛様細胞性白血病、血管芽腫、肝細胞癌、肝癌、腎臓癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、脂肪肉腫、肺癌、黒色腫、髄芽腫、髄様癌、髄質甲状腺癌、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、乏突起神経膠腫、骨肉種、卵巣癌、乳頭状腺癌、乳頭様甲状腺癌、膵臓癌、褐色細胞腫、乳頭癌、松果体部腫瘍、前リンパ球性白血病、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮脂腺癌、精上皮腫、皮膚癌、扁平上皮細胞癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌及び／またはウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００４７】
癌に対する有効な治療は、癌細胞数を減少させ、腫瘍転移数を減少させ、腫瘍体積を減少させ、癌細胞のアポトーシスを誘発し、癌細胞死を誘発し、癌細胞の化学感受性または放射線感受性を誘発し、癌細胞近くでの血管新生を阻害し、癌細胞増殖を阻害し及び／または腫瘍増殖を阻害できる。癌に対する有効な治療は、期待寿命を延ばし、対象の生命を延長し、癌関連の痛みを和らげ及び／または治療の後の癌の再発または再発生を低減することもできる。特定の実施形態において、癌に対する有効な治療は、転移性腫瘍の数または重篤度を予防する、低減する、または遅延させる。
【００４８】
関節リウマチは、全身徴候を伴ってまたはそれを伴わず、潜在的に関節及び関節周辺の構造の進行性破壊をもたらす、通常は末梢関節の対称性炎症によって特徴づけられる、慢性症候群である。関節リウマチの発症は、進行性関節症状を伴う場合、通常進行性であるが、複数の関節の同時の炎症を伴う場合、突発性であり得る。ほとんどすべての炎症を起こした関節の圧痛は、最も感受性の高い身体所見である。最も特異的な身体所見である滑膜肥厚は、大部分の関連関節で最終的に生じる。小さな手の関節（特に近位指節間及び中手指節関節）、足の関節（中足指節）、手首、肘及び足首の対称性病変が一般的であるが、初期の徴候はいかなる関節でも生じ得る。
【００４９】
多発性硬化症（ＭＳ）は、緩解及び繰り返し起きる憎悪を伴う、ＣＮＳ機能不全の種々の症状及び徴候によって特徴づけられる、炎症性神経疾患である。最も一般的にある症状は、１つ以上の四肢、躯幹もしくは顔の片面の知覚異常；脚もしくは手の脱力もしくは不器用さ；または、視覚障害（例えば、１つの眼の部分的な失明及び痛み（球後視神経炎）、視野の薄暗さもしくは暗点）である。他の一般的な初期症状は、複視（二重視）をもたらす眼筋麻痺、１つ以上の四肢の一過性脱力、肢の軽微なこわばりまたは異常な易疲労感、軽微な歩行障害、排尿コントロールの支障、めまい、及び軽度の情緒障害である。すべては散在するＣＮＳ障害を示し、疾患が認識される前に、多くの場合、数か月または数年も発生する。過剰な熱は、症状及び徴候を強調し得る。
【００５０】
再発寛解型ＭＳ（ＲＲ  ＭＳ）は、発作の間の神経障害の部分的または完全な回復と共に、数か月から数年にわたって発生する再発及び緩解によって臨床的に特徴づけられる。このような患者は、１年当たり１つの発作または再発を発現する。１０〜２０年間に、ＲＲ  ＭＳ患者の５０％は、障害の憎悪をもたらす神経障害の発作と蓄積の間の不完全な回復によって特徴づけられる、二次性進行型ＭＳ（ＳＰ  ＭＳ）を示す。
【００５１】
ＭＳの診断は、臨床のＸ線撮影（磁気共鳴（ＭＲ）走査上の脳の斑点）からより小規模の研究室（ＣＳＦ分析のオリゴクローナルバンド）機能の診断は間接的である。
【００５２】
ハンチントン病（ＨＤ）は、筋の協応性に影響を及ぼして、認知低下及び精神障害を引き起こす、神経変性ならびに炎症性遺伝性疾患である。ＨＤの臨床症状は、異常な及び／または普通でない運動、不安、行動障害、舞踏病、認知障害、混乱、嚥下障害、見当識障害、そわそわすること、幻覚、眼位を変えるための振り返り、不随意のしかめ面、腕、足、顔及び他の身体部位の痙動、易刺激性、協調性の欠如、人格変化、もの忘れ、不機嫌、妄想性障害、精神病、不穏状態、剛直、小さな無意識の開始動作または未完成の動作、動作緩慢、発語変化、発語障害、自殺念慮及び自殺企図、振戦、ならびに体重減少を含む。
【００５３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、中枢神経系の変性及び炎症性疾患である。４つの運動症状、振戦、剛直、動作緩慢及び姿勢の不安定が、ＰＤの特徴であると考えられている。疾患進行の後期に思考及び行動障害が生じ得て、疾患の進行期に発生する認知症を伴い、軽度から重度の範囲にある可能性がある。うつ病は、最も一般的の精神症状である。他の一般的な症状は、発語、認知、機嫌、挙動及び思考障害を含む。認知障害は実行機能不全を更に含み、それは、計画性、認識の柔軟性、抽象思考、ルール習得、適切な行動の開始及び不適切な行動の抑制、関連する感覚情報の選択、注意の変動、認知速度及びもの忘れを伴う障害を含むことができる。他の症状は、睡眠障害を含む。
【００５４】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、１次及び２次運動ニューロンの両方に影響を及ぼす、致死性運動ニューロン疾患である。ＡＬＳの初期の臨床症状は、一般的に脱力及び／または筋萎縮である。他の初期症状は、影響を受けた筋肉の嚥下困難（嚥下障害）、痙攣もしくはこわばり；腕もしくは脚に影響を及ぼす筋力低下；及び／または鼻声もしくは構音困難（構音障害）、ならびに場合によっては認知症を含む。皮膚下で見ることができる筋肉の単収縮（線維束性収縮）が観察され、一般的にバビンスキー反射と呼ばれる異常な反射が、上位運動ニューロンの損傷を示す。
【００５５】
ＡＬＳの進行度を、「ＡＬＳ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ  Ｒｅｖｉｓｅｄ（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）」と呼ばれる評価基準を使用して測定できる。それは、４８（正常機能）と０（重度障害）の間のスコアを生じる臨床面接または患者報告アンケートとして行われる１２項目調査である。臨床医の間の調査を基にした研究は、それらがＡＬＳＦＲＳ−Ｒの臨床的に有意性のある傾きで２０％の変化だったことを示した（Ｃａｓｔｒｉｌｌｏ−Ｖｉｇｕｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ，１１（１−２）：１７８−８０（２０１０））。
【００５６】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、外部の機械的力、通常は頭部外傷が脳の機能障害を引き起こすときに生じる。ＴＢＩは、広範囲の身体的及び心理的影響を有することができる。いくつかの症状は直ちに現れるが、外傷性事象後、数日または数週間後まで他のものは現れない可能性がある。ＴＢＩの症状は、意識喪失；呆然とした、困惑したもしくは見当識を失った状態；記憶もしくは集中力の障害；頭痛、めまいもしくは平衡の喪失；悪心もしくは嘔吐；知覚障害（例えばかすみ目、耳鳴りまたは口内に感じる不快な味）；光または音に対する感受性；気分変化もしくは気分変動；抑うつもしくは不安な気分；疲労もしくは眠気；睡眠困難；いつもより眠ること、興奮、好戦性もしくは他の異常な挙動；不正確な発語；睡眠から起床することができない；指及び足指の脱力もしくは麻痺；協調性の喪失；痙攣または発作、眼の片方もしくは両方の瞳孔の拡大、及び／または鼻もしくは耳からの透明流体の流出を含む。小児の更なる症状は、食習慣または授乳習慣の変化；持続する泣き及び慰めることができない；異常なもしくは易刺激性；注意能力の変化；睡眠習慣の変化；悲しい気分もしくは抑うつ気分、及び／または好きな玩具もしくは遊びに対する関心の喪失を含む。
【００５７】
本明細書に記載の炎症性または自己免疫要素を伴う状態に対する有効な治療処置は、臨床及び／または研究の場での状態と関連する症状の統計的に有意な改善を観察することによって確認できる。特定の症状が本明細書に記載されていない状態について、関連分野の臨床医及び研究者に周知で認識されている状態の任意の臨床的に関連したモデルを、治療効果を評価するために用いることができる。
【００５８】
特定の実施形態において、中枢神経系要素を伴う炎症性または自己免疫状態は、認知障害及び／または精神神経症状（例えば認知機能の障害、記憶、気分、挙動、思考、レム睡眠行動障害、無感情、倦怠、社会的関与の無関心及び欠如、ならびに鈍麻）に対する検査を使用して評価されることができる。これらの態様を測定し、モニタリングする方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ヒトの記憶過程に注目する系列位置試験（Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃｓ，６３（４）：７３７−７４５（２００１））、ヒトの発語及び言語に注目する単語優位試験（Ｋｒｕｅｇｅｒ、Ｍｅｍｏｒｙ＆Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２０（６）：６８５−６９４（１９９２））、ヒト短期記憶に注目するブラウン−ピーターソン試験（Ｎａｉｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ  Ａ：Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ，５２：２４１−２５１（１９９９））、記憶範囲試験（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｏｒｙ＆Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２７（５）：７５９−７６７（１９９９））、視覚探索試験（Ｗｏｌｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ：Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，１５（３）：４１９−４３３（１９８９））、ならびに  知識表現（例えば、意味ネットワーク）試験を含む。追加の試験は、処理速度；反応時間（すなわちクロック速度）；課題ルールの変化に順応する柔軟性及び能力；注意、注目及び集中；問題解決；記憶：ならびに発話の流暢さを調べる。代表的な試験及び調査は、ＷＡＩＳ及びＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｒａｖｅｎｓ  Ｍａｔｒｉｃｅｓなどの従来のＩＱテスト、ならびにＬｕｍｉｎｏｓｉｔｙ（Ｌｕｍｏｓ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で利用可能な一連の試験を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、炎症性または自己免疫性要素を伴う病態は、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化しかつ活性化させることによって治療できる。特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの標的化及び活性化は、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージによるＩＬ−１０発現の増加によって明示される。ＩＬ−１０は、炎症性サイトカインの産生を阻害できる抗炎症性サイトカインである。
【００６０】
特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化しかつ活性化させることは、炎症性サイトカインの抑制を引き起こす。炎症誘発性サイトカインの例は、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを含む。炎症性サイトカインの抑制は、１つ以上の炎症性サイトカインの発現の統計学的に有意な減少を意味することができる。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの標的化及び活性化は、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージのリンパ節への移動によって明示される。特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの標的化及び活性化は、ＩＬ−１０発現の増加ならびにＢ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージのリンパ節への移動によって明示される。特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの標的化及び活性化は、炎症性サイトカインの減少した産生によって明示されることができる。特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの標的化及び活性化は、病態と関連する症状の統計学的に有意な減少によって明示される。
【００６２】
特定の実施形態において、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージは、線維または線維形成ペプチドを使用して、標的化かつ活性化させる。特定の実施形態において、原線維とは、タンパク質またはペプチドの線維状構造への凝集を意味し、それによって、タンパク質またはペプチドの多くの複製物は互いに付着して、不溶性線維を形成する。特定の実施形態において、原線維形成ペプチドはアミロイド形成的と称されることができる。原線維を自然に形成するタンパク質及び／またはペプチドの例は、アミロイドβ、タウ及びアミリンを含む。
【００６３】
特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドを含むことができる。Ａβペプチドは、配列番号１０６３及び配列番号１０６４（図８）に記載される配列、ならびにその断片及び誘導体を含む。Ａβは、アミロイド斑の主成分である。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（未確定機能の膜貫通グリコプロテイン）の連続的切断から形成される。ＡＰＰは、α、β及びγセクレターゼによって処理されることができる。Ａβタンパク質は、β及びγセクレターゼの連続的作用によって生成される。γセクレターゼ（ＡβペプチドのＣ末端を産生する）は、ＡＰＰの膜貫通領域内で開裂し、３６〜４３のアミノ酸残基長の多くのアイソフォームを生成できる。最も一般的なアイソフォームは、Ａβ１〜４０及びＡβ１〜４２（「Ａβ４０」及び「Ａβ４２」）である。短い形態は通常、小胞体で生じる裂開によって生成されることができ、長い形態はトランスゴルジ網での裂開によってできる。Ａβ４０は２つのうちでより一般的であるが、Ａβ４２はより凝集性が高い。
【００６４】
特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、Ａβの活性断片であり得る。Ａβペプチドの活性断片は、完全長Ａβペプチドと機能または結合特性を共有する。特定の実施形態において、Ａβの活性断片は、原線維または凝集体を形成するために自己重合できる、完全長Ａβの任意の断片であり得る。特定の実施形態において、Ａβの活性断片は、５〜４３のアミノ酸長の任意の長さであり得る。Ａβペプチドのエピトープ断片は、１つ以上の抗Ａβモノクローナル抗体と結合する能力を保持する断片である。Ａβは本質的に非構造化であり、それは溶液中でコンパクトな三次フォールドを得ず、むしろ一組の構造を形成することを意味する。ＮＭＲ誘導シミュレーションによって、Ａβ４０及びＡβ４２は、Ａβ４０よりも構造化されているＡβ４２のＣ末端のため、非常に異なる立体構造も特徴とするようである。
【００６５】
特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、アミリンの活性断片であり得る。アミリンは、膵臓からインスリンと共に分泌されるペプチドホルモンである。特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、アミリン２８〜３３として知られているアミリンタンパク質の残基２８〜３３であり得る（配列番号１０５３）。特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、アミリン２８〜３３のアミロイド形成類似体であり得る。アミリン２８〜３３のアミロイド形成類似体は、配列番号１０６２及び配列番号４４９を含むことができる（Ｋｕｒｎｅｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＪＥＭ２１１（９）：１８４７）。
【００６６】
特定の実施形態において、ペプチドまたはタンパク質の原線維構造または凝集は、チオフラビンＴアッセイ、動的光散乱法及びサイズ除外クロマトグラフィーを含む技術を使用して測定されることができる。チオフラビンＴアッセイは、タンパク質／ペプチド試料をチオフラビンＴで処理して、それから蛍光を顕微鏡または分光法で測定することによって、原線維構造を測定するために使用することができる。
【００６７】
特定の実施形態において、原線維とは、非共有結合で結合される４つ以上のペプチド分子の原線維の凝集体を意味する。特定の実施形態において、凝集体は、１００以上、１，０００以上、５，０００以上または１０，０００以上のペプチド分子を含む。特定の実施形態において、原線維形成またはアミロイド形成ペプチドは、自然にまたは一定の条件（例えば温度または塩分）への曝露で、非共有結合相互作用によってオリゴマー形成して、原線維を形成する。
【００６８】
特定の実施形態において、原線維形成ペプチドは、Ｌ配置、Ｄ配置または配置の混合物のアミノ酸を有するヘキサペプチドを含む。特定の実施形態において、原線維形成ペプチドは、−２３ｋｃａｌ／モル以下（すなわち、より負の）の結合のＲｏｓｅｔｔａエネルギーを発生させるペプチドである。Ｒｏｓｅｔｔａは、タンパク質及びペプチドの計算モデリングで使用するソフトウェアセットである。原線維形成性における−２３ｋｃａｌ／モルのカットオフ値は、実験的に検証済みモデルに基づく（ヘキサペプチドのＲｏｓｅｔｔａエネルギー算出方法については、Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔら（２０１０）ＰＮＡＳ１０７（５）：３４８７−３４９２を参照のこと）。
【００６９】
特定の実施形態において、ペプチドは、極性塩基性側鎖を有する１、２または３のアミノ酸を含む。極性塩基性側鎖は、末端アミノまたは末端イミダゾール基を有してもよい。他の場合では、ペプチドは１つの極性酸性側鎖を含む。他の場合では、ペプチドは、疎水性側鎖を有する０、１、２、３、４または５のアミノ酸を含む。更に他の場合には、ペプチドは極性非荷電側鎖を有する０、１、２、３、４または５のアミノ酸を含み、そこでペプチドは正電荷を有する。特定の実施形態において、原線維または原線維形成ペプチドは、プロリンを含まない。
【００７０】
ペプチドのカルボキシ末端は一般的に、カルボン酸（すなわち−ＣＯＯＨ）またはアミド（すなわち−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、ここでＲはアルキルもしくは水素などの置換基）である。アミノ末端は一般的に、アミン（すなわち、Ｎ（Ｒ’）２、ここでＲ’はアルキルもしくは水素などの置換基）、または酢酸基（すなわち−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、ここでＲ”はメチル、エチルまたは長いアルキルなどの置換基）である。
【００７１】
特定の実施形態において、原線維形成ペプチドは、以下のヘキサペプチド、ＳＶＮＶＤＬ（配列番号１）、ＳＬＮＶＤＶ（配列番号２）、ＳＶＤＶＮＬ（配列番号３）、ＤＬＳＶＶＬ（配列番号４）、ＳＶＮＬＤＶ（配列番号５）、ＳＶＶＮＤＶ（配列番号６）、ＤＶＳＬＶＮ（配列番号７）、ＤＶＳＶＬＮ（配列番号８）、ＳＤＬＶＮＶ（配列番号９）、ＳＬＮＶＶＳ（配列番号１０）、ＬＮＶＤＳＶ（配列番号１１）、ＮＤＬＳＶＶ（配列番号１２）、ＶＤＮＬＶＳ（配列番号１３）、ＶＮＤＶＳＬ（配列番号１４）、ＶＳＤＮＶＬ（配列番号１５）、ＬＮＤＶＶＳ（配列番号１６）、ＬＳＶＤＶＮ（配列番号１７）、ＮＳＶＤＬＶ（配列番号１８）、ＶＤＶＬＮＳ（配列番号１９）、ＶＮＤＳＶＬ（配列番号２０）、ＶＮＶＳＬＤ（配列番号２１）、ＬＤＶＮＳＶ（配列番号２２）、ＬＮＶＶＤＳ（配列番号２３）、ＬＳＤＶＶＮ（配列番号２４）、ＬＶＶＮＤＳ（配列番号２５）、ＮＳＬＤＶＶ（配列番号２６）、ＶＬＶＤＮＳ（配列番号２７）、ＶＮＬＳＤＶ（配列番号２８）、ＶＮＶＤＬＳ（配列番号２９）、ＤＮＶＳＶＤ（配列番号３０）、ＬＳＤＮＶＶ（配列番号３１）、ＬＳＶＶＤＮ（配列番号３２）、ＶＬＤＶＳＮ（配列番号３３）、ＶＮＤＬＶＳ（配列番号３４）、ＶＮＶＳＤＬ（配列番号３５）、ＶＶＬＳＤＮ（配列番号３６）、ＬＶＳＶＮＬ（配列番号３７）、ＬＶＮＶＳＶ（配列番号３８）、ＳＬＮＶＳＶ（配列番号３９）、ＬＶＳＶＮＳ（配列番号４０）、ＳＶＤＶＮＶ（配列番号４１）、ＬＶＶＳＶＬ（配列番号４２）、ＶＮＬＶＶＳ（配列番号４３）、ＳＮＬＶＳＶ（配列番号４４）、ＳＶＮＶＬＳ（配列番号４５）、ＶＬＶＳＶＬ（配列番号４６）、ＬＶＮＶＳＬ（配列番号４７）、ＳＶＮＶＤＳ（配列番号４８）、ＶＬＳＶＮＶ（配列番号４９）、ＮＬＶＶＳＶ（配列番号５０）、ＳＶＶＬＮＶ（配列番号５１）、ＬＳＶＶＮＬ（配列番号５２）、ＳＮＬＶＶＳ（配列番号５３）、ＳＶＶＬＤＶ（配列番号５４）、ＬＶＳＬＮＶ（配列番号５５）、ＶＳＬＮＶＶ（配列番号５６）、ＶＫＶＱＩＹ（配列番号５７）、ＱＶＶＩＹＫ（配列番号５８）、ＫＶＩＱＶＹ（配列番号５９）、ＶＹＶＫＩＹ（配列番号６０）、ＱＩＶＶＹＫ（配列番号６１）、ＱＶＩＫＶＹ（配列番号６２）、ＶＱＶＫＩＹ（配列番号６３）、ＱＶＶＫＩＹ（配列番号６４）、ＱＶＩＶＹＫ（配列番号６５）、ＱＩＶＫＶＹ（配列番号６６）、ＱＫＩＶＶＹ（配列番号６７）、ＱＫＶＶＹＩ（配列番号６８）、ＫＶＱＶＹＩ（配列番号６９）、ＱＶＶＫＹＩ（配列番号７０）、ＫＶＱＩＹＶ（配列番号７１）、ＶＫＩＱＶＹ（配列番号７２）、ＶＩＱＫＶＹ（配列番号７３）、ＫＶＶＩＹＫ（配列番号７４）、ＱＩＶＫＹＶ（配列番号７５）、ＱＫＶＩＹＶ（配列番号７６）、ＫＱＶＶＩＹ（配列番号７７）、ＫＩＱＶＹＶ（配列番号７８）、ＫＶＹＶＱＩ（配列番号７９）、ＶＶＱＩＹＫ（配列番号８０）、ＫＱＶＩＶＹ（配列番号８１）、ＶＱＩＫＶＹ（配列番号８２）、ＱＫＩＶＹＶ（配列番号８３）、ＶＩＱＶＹＫ（配列番号８４）、ＫＶＶＩＱＹ（配列番号８５）、ＫＶＱＶＩＹ（配列番号８６）、ＱＹＶＶＩＫ（配列番号８７）、ＹＶＶＩＱＫ（配列番号８８）、ＫＩＶＶＱＹ（配列番号８９）、ＹＱＶＩＶＫ（配列番号９０）、ＫＩＹＶＱＶ（配列番号９１）、ＫＶＶＩＹＱ（配列番号９２）、ＫＹＶＶＱＩ（配列番号９３）、ＹＱＩＶＶＫ（配列番号９４）、ＹＶＶＩＱＹ（配列番号９５）、ＫＱＶＩＹＶ（配列番号９６）、ＫＹＶＱＶＩ（配列番号９７）、ＫＹＶＶＩＱ（配列番号９８）、ＱＫＶＶＩＹ（配列番号９９）、ＱＹＶＩＶＫ（配列番号１００）、ＩＶＱＫＶＹ（配列番号１０１）、ＫＹＩＶＶＱ（配列番号１０２）、ＱＶＩＫＹＶ（配列番号１０３）、ＹＩＶＶＱＫ（配列番号１０４）、ＹＱＶＶＩＫ（配列番号１０５）、ＩＫＶＱＶＹ（配列番号１０６）、ＫＶＶＱＹＩ（配列番号１０７）、ＫＹＶＱＩＶ（配列番号１０８）、ＶＫＱＶＹＩ（配列番号１０９）、ＶＱＶＩＹＫ（配列番号１１０）、ＶＶＩＱＫＹ（配列番号１１１）、ＩＱＶＶＹＫ（配列番号１１２）、ＫＩＶＶＹＱ（配列番号１１３）、ＫＹＱＶＩＶ（配列番号１１４）、ＫＹＶＩＶＱ（配列番号１１５）、ＶＶＹＩＱＫ（配列番号１１６）、ＩＶＱＶＹＫ（配列番号１１７）、ＫＱＩＶＹＶ（配列番号１１８）、ＫＹＶＩＱＶ（配列番号１１９）、ＱＫＶＩＶＹ（配列番号１２０）、ＱＹＩＫＶＶ（配列番号１２１）、ＱＹＩＶＫＶ（配列番号１２２）、ＶＱＩＶＹＫ（配列番号１２３）、ＶＶＱＫＹＩ（配列番号１２４）、ＶＹＱＩＶＫ（配列番号１２５）、ＹＶＱＶＩＫ（配列番号１２６）、ＱＩＶＹＶＫ（配列番号１２７）、ＩＫＶＹＱＶ（配列番号１２８）、ＫＶＶＹＩＱ（配列番号１２９）、ＶＱＫＹＩＶ（配列番号１３０）、ＶＱＫＹＶＩ（配列番号１３１）、ＫＶＶＱＩＹ（配列番号１３２）、ＹＶＩＫＩＹ（配列番号１３３）、ＱＶＩＶＹＶ（配列番号１３４）、ＶＶＩＫＶＹ（配列番号１３５）、ＫＶＶＩＹＩ（配列番号１３６）、ＶＹＶＶＩＫ（配列番号１３７）、ＹＩＶＱＶＹ（配列番号１３８）、ＹＶＩＱＶＹ（配列番号１３９）、ＹＶＩＶＶＹ（配列番号１４０）、ＫＶＩＶＹＩ（配列番号１４１）、ＹＶＩＫＶＹ（配列番号１４２）、ＶＱＶＩＶＫ（配列番号１４３）、ＹＶＶＫＩＹ（配列番号１４４）、ＹＶＶＱＶＩ（配列番号１４５）、ＱＩＶＶＹＱ（配列番号１４６）、ＶＶＱＩＶＫ（配列番号１４７）、ＶＱＩＶＶＫ（配列番号１４８）、ＶＩＶＶＹＫ（配列番号１４９）、ＩＶＱＶＹＩ（配列番号１５０）、ＹＶＶＩＱＶ（配列番号１５１）、ＶＹＱＶＶＩ（配列番号１５２）、ＫＹＩＱＶＹ（配列番号１５３）、ＫＹＶＶＩＹ（配列番号１５４）、ＫＹＶＱＩＹ（配列番号１５５）、ＶＶＱＶＩＫ（配列番号１５６）、ＱＫＩＶＶＫ（配列番号１５７）、ＫＹＶＩＶＹ（配列番号１５８）、ＫＱＶＶＩＫ（配列番号１５９）、ＹＶＱＩＹＶ（配列番号１６０）、ＹＫＶＱＶＹ（配列番号１６１）、ＩＫＶＱＩＹ（配列番号１６２）、ＫＩＶＶＱＫ（配列番号１６３）、ＶＩＫＶＶＩ（配列番号１６４）、ＶＹＩＫＶＶ（配列番号１６５）、ＶＹＩＶＱＶ（配列番号１６６）、ＩＶＹＶＱＩ（配列番号１６７）、ＫＶＱＩＹＫ（配列番号１６８）、ＩＹＶＩＶＹ（配列番号１６９）、ＶＩＹＶＩＶ（配列番号１７０）、ＫＹＱＶＹＩ（配列番号１７１）、ＶＩＱＫＶＶ（配列番号１７２）、ＶＫＩＶＹＶ（配列番号１７３）、ＶＫＱＩＶＶ（配列番号１７４）、ＹＩＶＫＱＹ（配列番号１７５）、ＹＩＶＶＱＹ（配列番号１７６）、ＹＫＩＱＶＹ（配列番号１７７）、ＹＱＶＶＩＹ（配列番号１７８）、ＹＶＶＫＱＹ（配列番号１７９）、ＶＩＶＫＶＱ（配列番号１８０）、ＱＫＶＶＩＫ（配列番号１８１）、ＧＭＶＶＶＧ（配列番号１８２）、ＧＶＶＶＭＧ（配列番号１８３）、ＧＶＶＭＶＧ（配列番号１８４）、ＧＧＶＶＶＭ（配列番号１８５）、ＧＶＶＧＶＭ（配列番号１８６）、ＧＶＶＶＧＭ（配列番号１８７）、ＧＶＭＶＶＧ（配列番号１８８）、ＧＧＶＶＭＶ（配列番号１８９）、ＧＧＶＭＶＶ（配列番号１９０）、ＧＭＶＶＧＶ（配列番号１９１）、ＧＶＶＭＧＶ（配列番号１９２）、ＧＭＶＧＶＶ（配列番号１９３）、ＧＶＭＶＧＶ（配列番号１９４）、ＧＶＶＧＭＶ（配列番号１９５）、ＧＧＭＶＶＶ（配列番号１９６）、ＧＶＧＶＭＶ（配列番号１９７）、
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ＴＮＶＳＳ（配列番号８３８）、ＳＴＮＶＴＧ（配列番号８３９）、ＳＴＮＶＴＳ（配列番号８４０）、ＳＴＱＱＳＧ（配列番号８４１）、ＳＴＱＱＳＱ（配列番号８４２）、ＳＴＱＱＳＶ（配列番号８４３）、ＳＴＱＱＴＱ（配列番号８４４）、ＳＴＱＱＴＳ（配列番号８４５）、ＳＴＱＱＴＶ（配列番号８４６）、ＳＴＱＳＮＶ（配列番号８４７）、ＳＴＱＳＴＶ（配列番号８４８）、ＳＴＱＴＳＳ（配列番号８４９）、ＳＴＱＴＳＶ（配列番号８５０）、ＳＴＱＶＮＳ（配列番号８５１）、ＳＴＱＶＳＧ（配列番号８５２）、ＳＴＱＶＳＮ（配列番号８５３）、ＳＴＱＶＳＴ（配列番号８５４）、ＳＴＱＶＴＧ（配列番号８５５）、ＳＴＱＶＴＮ（配列番号８５６）、ＳＴＱＶＴＱ（配列番号８５７）、ＳＴＱＶＴＳ（配列番号８５８）、ＳＴＱＶＴＴ（配列番号８５９）、ＳＴＳＧＮＶ（配列番号８６０）、ＳＴＳＮＡＳ（配列番号８６１）、ＳＴＳＮＧＶ（配列番号８６２）、ＳＴＳＮＱＶ（配列番号８６３）、ＳＴＳＮＳＶ（配列番号８６４）、ＳＴＳＱＡＱ（配列番号８６５）、ＳＴＳＱＧＶ（配列番号８６６）、ＳＴＳＱＮＱ（配列番号８６７）、ＳＴＳＱＱＱ（配列番号８６８）、ＳＴＳＱＱＶ（配列番号８６９）、ＳＴＳＱＳＱ（配列番号８７０）、ＳＴＳＳＡＶ（配列番号８７１）、ＳＴＳＳＧＶ（配列番号８７２）、ＳＴＳＳＱＱ（配列番号８７３）、ＳＴＳＳＱＳ（配列番号８７４）、ＳＴＳＳＱＶ（配列番号８７５）、ＳＴＳＳＳＱ（配列番号８７６）、ＳＴＳＴＡＶ（配列番号８７７）、ＳＴＳＴＧＶ（配列番号８７８）、ＳＴＳＴＱＡ（配列番号８７９）、ＳＴＳＴＱＧ（配列番号８８０）、ＳＴＳＴＱＴ（配列番号８８１）、ＳＴＳＴＱＶ（配列番号８８２）、ＳＴＳＴＳＱ（配列番号８８３）、ＳＴＳＴＳＶ（配列番号８８４）、ＳＴＳＶＡＧ（配列番号８８５）、ＳＴＳＶＡＮ（配列番号８８６）、ＳＴＳＶＡＱ（配列番号８８７）、ＳＴＳＶＡＳ（配列番号８８８）、ＳＴＳＶＡＴ（配列番号８８９）、ＳＴＳＶＧＧ（配列番号８９０）、ＳＴＳＶＧＮ（配列番号８９１）、ＳＴＳＶＧＱ（配列番号８９２）、ＳＴＳＶＧＳ（配列番号８９３）、ＳＴＳＶＮＧ（配列番号８９４）、ＳＴＳＶＮＮ（配列番号８９５）、ＳＴＳＶＮＳ（配列番号８９６）、ＳＴＳＶＱＧ（配列番号８９７）、ＳＴＳＶＱＮ（配列番号８９８）、ＳＴＳＶＱＱ（配列番号８９９）、ＳＴＳＶＱＳ（配列番号９００）、ＳＴＳＶＱＴ（配列番号９０１）、ＳＴＳＶＳＧ（配列番号９０２）、ＳＴＳＶＳＮ（配列番号９０３）、ＳＴＳＶＳＱ（配列番号９０４）、ＳＴＳＶＳＳ（配列番号９０５）、ＳＴＳＶＳＴ（配列番号９０６）、ＳＶＮＧＳＴ（配列番号９０７）、ＳＶＮＧＴＳ（配列番号９０８）、ＳＶＮＱＡＱ（配列番号９０９）、ＳＶＮＱＱＱ（配列番号９１０）、ＳＶＮＳＧＴ（配列番号９１１）、ＳＶＮＳＮＱ（配列番号９１２）、ＳＶＮＳＮＳ（配列番号９１３）、ＳＶＮＳＴＧ（配列番号９１４）、ＳＶＮＳＴＳ（配列番号９１５）、ＳＶＮＴＧＳ（配列番号９１６）、ＳＶＮＴＳＧ（配列番号９１７）、ＳＶＱＱＳＱ（配列番号９１８）、ＳＶＱＱＳＴ（配列番号９１９）、ＳＶＱＱＴＱ（配列番号９２０）、ＳＶＱＱＴＳ（配列番号９２１）、ＳＶＱＱＴＴ（配列番号９２２）、ＳＶＱＳＮＱ（配列番号９２３）、ＳＶＱＳＮＳ（配列番号９２４）、ＳＶＱＳＳＧ（配列番号９２５）、ＳＶＱＳＳＱ（配列番号９２６）、ＳＶＱＳＳＳ（配列番号９２７）、ＳＶＱＳＴＧ（配列番号９２８）、ＳＶＱＳＴＱ（配列番号９２９）、ＳＶＱＳＴＳ（配列番号９３０）、ＳＶＱＴＳＧ（配列番号９３１）、ＳＶＱＴＳＮ（配列番号９３２）、ＳＶＱＴＳＳ（配列番号９３３）、ＳＶＱＶＳＮ（配列番号９３４）、ＳＶＳＧＮＴ（配列番号９３５）、ＳＶＳＧＱＳ（配列番号９３６）、ＳＶＳＮＡＱ（配列番号９３７）、ＳＶＳＮＡＳ（配列番号９３８）、ＳＶＳＮＧＳ（配列番号９３９）、ＳＶＳＮＧＴ（配列番号９４０）、ＳＶＳＮＱＧ（配列番号９４１）、ＳＶＳＮＱＳ（配列番号９４２）、ＳＶＳＮＱＴ（配列番号９４３）、ＳＶＳＮＳＴ（配列番号９４４）、ＳＶＳＮＴＧ（配列番号９４５）、ＳＶＳＱＡＱ（配列番号９４６）、ＳＶＳＱＡＳ（配列番号９４７）、ＳＶＳＱＧＱ（配列番号９４８）、ＳＶＳＱＮＱ（配列番号９４９）、ＳＶＳＱＱＧ（配列番号９５０）、ＳＶＳＱＱＱ（配列番号９５１）、ＳＶＳＱＱＳ（配列番号９５２）、ＳＶＳＱＳＧ（配列番号９５３）、ＳＶＳＱＳＳ（配列番号９５４）、ＳＶＳＱＴＱ（配列番号９５５）、ＳＶＳＳＡＱ（配列番号９５６）、ＳＶＳＳＡＳ（配列番号９５７）、ＳＶＳＳＧＧ（配列番号９５８）、ＳＶＳＳＧＳ（配列番号９５９）、ＳＶＳＳＧＴ（配列番号９６０）、ＳＶＳＳＮＧ（配列番号９６１）、ＳＶＳＳＮＱ（配列番号９６２）、ＳＶＳＳＮＳ（配列番号９６３）、ＳＶＳＳＮＴ（配列番号９６４）、ＳＶＳＳＱＧ（配列番号９６５）、ＳＶＳＳＱＱ（配列番号９６６）、ＳＶＳＳＱＳ（配列番号９６７）、ＳＶＳＳＱＴ（配列番号９６８）、ＳＶＳＳＱＶ（配列番号９６９）、ＳＶＳＳＳＧ（配列番号９７０）、ＳＶＳＳＳＱ（配列番号９７１）、ＳＶＳＳＳＳ（配列番号９７２）、ＳＶＳＴＡＧ（配列番号９７３）、ＳＶＳＴＡＳ（配列番号９７４）、ＳＶＳＴＡＴ（配列番号９７５）、ＳＶＳＴＧＳ（配列番号９７６）、ＳＶＳＴＮＳ（配列番号９７７）、ＳＶＳＴＮＴ（配列番号９７８）、ＳＶＳＴＱＱ（配列番号９７９）、ＳＶＳＴＱＳ（配列番号９８０）、ＳＶＳＴＱＴ（配列番号９８１）、ＳＶＳＴＳＧ（配列番号９８２）、ＳＶＳＴＳＮ（配列番号９８３）、ＳＶＳＴＳＳ（配列番号９８４）、ＳＶＳＴＳＴ（配列番号９８５）、ＴＡＳＱＳＱ（配列番号９８６）、ＴＡＳＱＶＱ（配列番号９８７）、ＴＧＳＮＳＶ（配列番号９８８）、ＴＧＳＮＶＳ（配列番号９８９）、ＴＧＳＳＮＶ（配列番号９９０）、ＴＧＳＶＮＳ（配列番号９９１）、ＴＧＳＶＳＮ（配列番号９９２）、ＴＮＳＧＳＶ（配列番号９９３）、ＴＮＳＧＶＳ（配列番号９９４）、ＴＮＳＱＶＱ（配列番号９９５）、ＴＮＳＳＧＶ（配列番号９９６）、ＴＮＳＶＧＳ（配列番号９９７）、ＴＮＳＶＳＧ（配列番号９９８）、ＴＱＳＱＳＱ（配列番号９９９）、ＴＱＳＱＶＱ（配列番号１０００）、ＴＱＳＴＶＳ（配列番号１００１）、ＴＱＳＶＳＮ（配列番号１００２）、ＴＱＳＶＳＳ（配列番号１００３）、ＴＳＮＧＶＳ（配列番号１００４）、ＴＳＮＶＧＳ（配列番号１００５）、ＴＳＮＶＳＧ（配列番号１００６）、ＴＳＳＧＮＶ（配列番号１００７）、ＴＳＳＧＶＮ（配列番号１００８）、ＴＳＳＮＧＶ（配列番号１００９）、ＴＳＳＮＳＶ（配列番号１０１０）、ＴＳＳＮＶＧ（配列番号１０１１）、ＴＳＳＱＳＱ（配列番号１０１２）、ＴＳＳＳＶＱ（配列番号１０１３）、ＴＳＳＶＧＮ（配列番号１０１４）、ＴＳＳＶＮＧ（配列番号１０１５）、ＴＳＳＶＳＧ（配列番号１０１６）、ＴＳＳＶＳＳ（配列番号１０１７）、ＴＳＳＶＴＳ（配列番号１０１８）、ＴＶＮＳＧＳ（配列番号１０１９）、ＴＶＮＳＳＧ（配列番号１０２０）、ＴＶＳＧＮＳ（配列番号１０２１）、ＴＶＳＧＳＮ（配列番号１０２２）、ＴＶＳＮＧＳ（配列番号１０２３）、ＴＶＳＮＳＧ（配列番号１０２４）、ＴＶＳＮＳＴ（配列番号１０２５）、ＴＶＳＮＶＧ（配列番号１０２６）、ＴＶＳＱＮＱ（配列番号１０２７）、ＴＶＳＱＱＶ（配列番号１０２８）、ＴＶＳＱＳＧ（配列番号１０２９）、ＴＶＳＱＳＱ（配列番号１０３０）、ＴＶＳＳＧＮ（配列番号１０３１）、ＴＶＳＳＮＧ（配列番号１０３２）、ＴＶＳＳＮＱ（配列番号１０３３）、ＴＶＳＳＮＳ（配列番号１０３４）、ＴＶＳＳＳＱ（配列番号１０３５）、ＴＶＳＴＳＧ（配列番号１０３６）、ＴＶＳＴＳＮ（配列番号１０３７）、ＴＶＳＴＳＳ（配列番号１０３８）、ＴＶＳＴＳＴ（配列番号１０３９）、ＶＧＳＴＮＳ（配列番号１０４０）、ＶＮＳＴＳＧ（配列番号１０４１）、ＶＮＳＴＳＮ（配列番号１０４２）、ＶＳＳＱＳＱ（配列番号１０４３）、ＶＳＳＱＶＱ（配列番号１０４４）、ＶＳＳＴＮＧ（配列番号１０４５）、ＶＴＳＮＳＧ（配列番号１０４６）、ＶＴＳＱＳＱ（配列番号１０４７），ＳＶＮＤＬＶ（配列番号１０５９）、ＬＫＶＫＶＬ（配列番号１０６０）、ＮＫＧＡＩＩ（配列番号１０６１）、及びＮＶＳＴＳＧ（配列番号１０６２）のうちの１つ以上を含むことができ、示された各アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸である（六量体の後に、括弧内にその配列番号識別子としてヘキサペプチドの記号を示す）。
【００７２】
特定の実施形態において、原線維形成ペプチドは、以下のヘキサペプチド、ＳＶＮＬＤＶ（配列番号５）、ＶＥＡＬＹＬ（配列番号１０４８）、ＬＹＱＬＥＮ（配列番号１０４９）、ＶＱＩＶＹＫ（配列番号１２３）、ＧＹＶＩＩＫ（配列番号１０５０）、ＳＮＱＮＮＦ（配列番号１０５１）、ＳＳＱＶＴＱ（配列番号７９１）、ＳＶＬＴＳＬ（配列番号１０５２）、ＳＳＴＮＶＧ（配列番号１０５３）、ＳＶＳＳＳＹ（配列番号１０５４）、ＧＡＩＬＳＳ（配列番号１０５５）、ＧＡＩＩＧＬ（配列番号１０５６）、ＡＩＩＧＬＭ（配列番号１０５７）、ＭＶＧＧＶＶ（配列番号２２０）、ＧＧＶＶＩＡ（配列番号１０５８）のうちの１つ以上を含むことができ、示された各アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸である。
【００７３】
本明細書に開示されるペプチドの変異体も、変異体が原線維構造の一因となり続ける限り、使用することができる。「変異体」は、本明細書の他で開示されるタンパク質配列と比較すると、１つ以上のアミノ酸付加、削除、停止位置または置換を有するタンパク質配列を含む。
【００７４】
アミノ酸置換は、保存的または非保存的置換であり得る。本明細書において開示するタンパク質配列の変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含むことができる。「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」は、以下の保存的置換基、グループ１：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、グループ２：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グループ３：アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グループ４：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、グループ５：イソロイシン（ｌｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、及びグループ６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）の１つに記載されている置換を含有する。
【００７５】
そのうえアミノ酸は、類似する機能、化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）によって保存的置換グループにグループ分けすることができる。例えば脂肪族グループは、置換のために、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩを含むことができる。互いに保存的置換と考えられているアミノ酸を含む他のグループは、硫黄含有：Ｍ及びＣ、酸性：Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱ、小脂肪族、非極性または弱極性残基：Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ及びＧ、極性、負に帯電した残基及びそのアミド：Ｄ、Ｎ、Ｅ及びＱ、極性で、正に帯電残基：Ｈ、Ｒ及びＫ、大脂肪族の非極性残基：Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ及びＣ、ならびに大芳香族残基：Ｆ、Ｙ及びＷが含まれる。
【００７６】
非保存的置換は、著しく影響を及ぼすもの（変更領域のペプチド主鎖の構造（例えば、αヘリカルまたはβシート構造）、標的部位の分子の帯電もしくは疎水性、または大きな側鎖）を含む。タンパク質の特性の最も大きな変化を作成すると一般的に予想される、非伝統的な置換は、（ｉ）親水性残基（例えばＳまたはＴ）は、疎水性残基（例えばＬ、Ｉ、Ｆ、ＶまたはＡ）と（またはそれによって）置換されることができる、（ｉｉ）ＣまたはＰは、他の任意の残基と（またはそれによって）置換されることができる、（ｉｉｉ）陽電性側鎖（例えばＫ、ＲまたはＨ）を有する残基は、陰電性残基（例えばＱまたはＤ）と（またはそれによって）置換されることができる、または、（ｉｖ）嵩高い側鎖（例えばＦ）を有する残基は、嵩高い側鎖を有しないもの（例えばＧ）で（またはそれによって）置換できる、ものである。追加情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ）に記載されている。
【００７７】
本明細書で開示される原線維形成ペプチドの変異体は、配列番号１〜１０６４のいずれかとの７０％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの７５％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８０％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８１％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８２％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８３％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８４％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８５％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８６％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８７％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８８％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの８９％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９０％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９１％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９２％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９３％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９４％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９５％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９６％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９７％の配列同一性、配列番号１〜１０６４のいずれかとの９８％の配列同一性、または配列番号１〜１０６４のいずれかとの９９％の配列同一性を共有するタンパク質を含む。
【００７８】
本明細書で定義される配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るために、必要に応じて配列の配列比較及び間隙の導入後に、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための配列比較は、当該技術分野の技術内の種々の方法で、例えば一般公開されているコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して達成されることができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大の配列比較を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列比較を測定するための適切なパラメータを測定することができる。例えば、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６））を使用して作成したアミノ酸配列同一性％値は、複数の探索パラメータを使用し、そのほとんどはデフォルト値に設定される。デフォルト値（すなわち、可調節パラメータ）に設定されないものは、以下の値（オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコア行列ＢＬＯＳＵＭ６２）で設定される。
【００７９】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるペプチドから形成される原線維は、１つ以上の血漿タンパク質により複合体を形成できる。「複合体」とは、２つ以上の構成成分分子実体（イオン性または無荷電）を含む、非共有結合関連によって形成される分子実体を指す。成分間の結合は通常、共有結合より弱い。一般的に複合体（「Ｋｄ」）の解離定数は、１μＭに等しい、またはそれより大きい。
【００８０】
このような血漿タンパク質の非限定例は、アポリポタンパク質Ｂ−１００（Ａ）、補体Ｃ３（Ｂ）、補体Ｃ１ｓ（Ｃ）、β−２−グリコプロテイン１（Ｄ）、クラステリン（Ｅ）、凝固因子Ｖ（Ｆ）、補体Ｃ１ｒ（Ｇ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｈ）、ＩＴＩＨ２（Ｉ）、補体１ｑＢ（Ｊ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（Ｋ）、補体因子Ｈ（Ｌ）、フィブリノゲンβ鎖（Ｍ）、補体Ｃ４−Ａ（Ｎ）、トランスチレチン（０）、セルピンＧ１血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｐ）、フィブリノゲンα鎖（Ｑ）、補体Ｃ１ｑＡ（Ｒ）、ビトロネクチン（Ｓ）、セルピナ−１  α−１−アンチトリプシン（Ｔ）、ビタミンＤ−結合タンパク質（Ｕ）、ハプトグロビン関連タンパク質（Ｖ）、ＩＴＩＨ４（Ｗ）、フィブリノゲンγ鎖（Ｘ）、セルピンＣ１アンチトロンビン−ＩＩＩ（Ｙ）、アポリポタンパク質Ａ−２（Ｚ）、補体因子Ｈ関連タンパク質（ＡＡ）、ゲルソリン（ＢＢ）、補体因子Ｂ（ＣＣ）、α−２−ＨＳ−糖タンパク質（ＤＤ）、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＥＥ）、補体Ｃ５（ＦＦ）、アポリポタンパク質Ｃ５（ＧＧ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ＨＨ）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（ＩＩ）、ＩＴＩＨ１（ＪＪ）、フォンビルブランド因子（ＫＫ）、セルロプラスミン（ＬＬ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＭＭ）、フィラミン−Ａ（ＮＮ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＯＯ）、セルピンＦ２  α−２−抗プラスミン（ＰＰ）、凝固因子ＩＩプロトロンビン（ＱＱ）、凝固因子Ｘ（ＲＲ）、ビタミンＫ依存性タンパク質（ＳＳ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＴＴ）、α−１酸性糖タンパク質２（ＵＵ）、凝固第ＩＸ因子（ＶＶ）、アポリポタンパク質Ｍ（ＷＷ）、血清アルブミン（ＸＸ）を含む（血漿タンパク質の後の括弧内に、血漿タンパク質の記号を示す）。
【００８１】
形成されることが可能なペプチド原線維／血漿タンパク質複合体の例は、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂ、１６Ｂ、１７Ｂ、１８Ｂ、１９Ｂ、２０Ｂ、２１Ｂ、２２Ｂ、２３Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂ、２７Ｂ、２８Ｂ、２９Ｂ、３０Ｂ、３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ、３７Ｂ、３８Ｂ、３９Ｂ、４０Ｂ、４１Ｂ、４２Ｂ、４３Ｂ、４４Ｂ、４５Ｂ、４６Ｂ、４７Ｂ、４８Ｂ、４９Ｂ、５０Ｂ、５１Ｂ、５２Ｂ、５３Ｂ、５４Ｂ、５５Ｂ、５６Ｂ、５７Ｂ、５８Ｂ、５９Ｂ、６０Ｂ、６１Ｂ、６２Ｂ、６３Ｂ、６４Ｂ、６５Ｂ、６６Ｂ、６７Ｂ、６８Ｂ、６９Ｂ、７０Ｂ、７１Ｂ、７２Ｂ、７３Ｂ、７４Ｂ、７５Ｂ、７６Ｂ、７７Ｂ、７８Ｂ、７９Ｂ、８０Ｂ、８１Ｂ、８２Ｂ、８３Ｂ、８４Ｂ、８５Ｂ、８６Ｂ、８７Ｂ、８８Ｂ、８９Ｂ、９０Ｂ、９１Ｂ、９２Ｂ、９３Ｂ、９４Ｂ、９５Ｂ、９６Ｂ、９７Ｂ、９８Ｂ、９９Ｂ、１００Ｂ、１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂ、１１１Ｂ、１１２Ｂ、１１３Ｂ、１１４Ｂ、１１５Ｂ、１１６Ｂ、１１７Ｂ、１１８Ｂ、１１９Ｂ、１２０Ｂ、１２１Ｂ、１２２Ｂ、１２３Ｂ、１２４Ｂ、１２５Ｂ、１２６Ｂ、１２７Ｂ、１２８Ｂ、１２９Ｂ、１３０Ｂ、１３１Ｂ、１３２Ｂ、１３３Ｂ、１３４Ｂ、１３５Ｂ、１３６Ｂ、１３７Ｂ、１３８Ｂ、１３９Ｂ、１４０Ｂ、１４１Ｂ、１４２Ｂ、１４３Ｂ、１４４Ｂ、１４５Ｂ、１４６Ｂ、１４７Ｂ、１４８Ｂ、１４９Ｂ、１５０Ｂ、１５１Ｂ、１５２Ｂ、１５３Ｂ、１５４Ｂ、１５５Ｂ、１５６Ｂ、１５７Ｂ、１５８Ｂ、１５９Ｂ、１６０Ｂ、１６１Ｂ、１６２Ｂ、１６３Ｂ、１６４Ｂ、１６５Ｂ、１６６Ｂ、１６７Ｂ、１６８Ｂ、１６９Ｂ、１７０Ｂ、１７１Ｂ、１７２Ｂ、１７３Ｂ、１７４Ｂ、１７５Ｂ、１７６Ｂ、１７７Ｂ、１７８Ｂ、１７９Ｂ、１８０Ｂ、１８１Ｂ、１８２Ｂ、１８３Ｂ、１８４Ｂ、１８５Ｂ、１８６Ｂ、１８７Ｂ、１８８Ｂ、１８９Ｂ、１９０Ｂ、１９１Ｂ、１９２Ｂ、１９３Ｂ、１９４Ｂ、１９５Ｂ、１９６Ｂ、１９７Ｂ、１９８Ｂ、１９９Ｂ、２００Ｂ、２０１Ｂ、２０２Ｂ、２０３Ｂ、２０４Ｂ、２０５Ｂ、２０６Ｂ、２０７Ｂ、２０８Ｂ、２０９Ｂ、２１０Ｂ、２１１Ｂ、２１２Ｂ、２１３Ｂ、２１４Ｂ、２１５Ｂ、２１６Ｂ、２１７Ｂ、２１８Ｂ、２１９Ｂ、２２０Ｂ、２２１Ｂ、２２２Ｂ、２２３Ｂ、２２４Ｂ、２２５Ｂ、２２６Ｂ、２２７Ｂ、２２８Ｂ、２２９Ｂ、２３０Ｂ、２３１Ｂ、２３２Ｂ、２３３Ｂ、２３４Ｂ、２３５Ｂ、２３６Ｂ、２３７Ｂ、２３８Ｂ、２３９Ｂ、２４０Ｂ、２４１Ｂ、２４２Ｂ、２４３Ｂ、２４４Ｂ、２４５Ｂ、２４６Ｂ、及び２４７Ｂ−１０４７Ｂ、１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、１２Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｃ、１６Ｃ、１７Ｃ、１８Ｃ、１９Ｃ、２０Ｃ、２１Ｃ、２２Ｃ、２３Ｃ、２４Ｃ、２５Ｃ、２６Ｃ、２７Ｃ、２８Ｃ、２９Ｃ、３０Ｃ、３１Ｃ、３２Ｃ、３３Ｃ、３４Ｃ、３５Ｃ、３６Ｃ、３７Ｃ、３８Ｃ、３９Ｃ、４０Ｃ、４１Ｃ、４２Ｃ、４３Ｃ、４４Ｃ、４５Ｃ、４６Ｃ、４７Ｃ、４８Ｃ、４９Ｃ、５０Ｃ、５１Ｃ、５２Ｃ、５３Ｃ、５４Ｃ、５５Ｃ、５６Ｃ、５７Ｃ、５８Ｃ、５９Ｃ、６０Ｃ、６１Ｃ、６２Ｃ、６３Ｃ、６４Ｃ、６５Ｃ、６６Ｃ、６７Ｃ、６８Ｃ、６９Ｃ、７０Ｃ、７１Ｃ、７２Ｃ、７３Ｃ、７４Ｃ、７５Ｃ、７６Ｃ、７７Ｃ、７８Ｃ、７９Ｃ、８０Ｃ、８１Ｃ、８２Ｃ、８３Ｃ、８４Ｃ、８５Ｃ、８６Ｃ、８７Ｃ、８８Ｃ、８９Ｃ、９０Ｃ、９１Ｃ、９２Ｃ、９３Ｃ、９４Ｃ、９５Ｃ、９６Ｃ、９７Ｃ、９８Ｃ、９９Ｃ、１００Ｃ、１０１Ｃ、１０２Ｃ、１０３Ｃ、１０４Ｃ、１０５Ｃ、１０６Ｃ、１０７Ｃ、１０８Ｃ、１０９Ｃ、１１０Ｃ、１１１Ｃ、１１２Ｃ、１１３Ｃ、１１４Ｃ、１１５Ｃ、１１６Ｃ、１１７Ｃ、１１８Ｃ、１１９Ｃ、１２０Ｃ、１２１Ｃ、１２２Ｃ、１２３Ｃ、１２４Ｃ、１２５Ｃ、１２６Ｃ、１２７Ｃ、１２８Ｃ、１２９Ｃ、１３０Ｃ、１３１Ｃ、１３２Ｃ、１３３Ｃ、１３４Ｃ、１３５Ｃ、１３６Ｃ、１３７Ｃ、１３８Ｃ、１３９Ｃ、１４０Ｃ、１４１Ｃ、１４２Ｃ、１４３Ｃ、１４４Ｃ、１４５Ｃ、１４６Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｃ、１４９Ｃ、１５０Ｃ、１５１Ｃ、１５２Ｃ、１５３Ｃ、１５４Ｃ、１５５Ｃ、１５６Ｃ、１５７Ｃ、１５８Ｃ、１５９Ｃ、１６０Ｃ、１６１Ｃ、１６２Ｃ、１６３Ｃ、１６４Ｃ、１６５Ｃ、１６６Ｃ、１６７Ｃ、１６８Ｃ、１６９Ｃ、１７０Ｃ、１７１Ｃ、１７２Ｃ、１７３Ｃ、１７４Ｃ、１７５Ｃ、１７６Ｃ、１７７Ｃ、１７８Ｃ、１７９Ｃ、１８０Ｃ、１８１Ｃ、１８２Ｃ、１８３Ｃ、１８４Ｃ、１８５Ｃ、１８６Ｃ、１８７Ｃ、１８８Ｃ、１８９Ｃ、１９０Ｃ、１９１Ｃ、１９２Ｃ、１９３Ｃ、１９４Ｃ、１９５Ｃ、１９６Ｃ、１９７Ｃ、１９８Ｃ、１９９Ｃ、２００Ｃ、２０１Ｃ、２０２Ｃ、２０３Ｃ、２０４Ｃ、２０５Ｃ、２０６Ｃ、２０７Ｃ、２０８Ｃ、２０９Ｃ、２１０Ｃ、２１１Ｃ、２１２Ｃ、２１３Ｃ、２１４Ｃ、２１５Ｃ、２１６Ｃ、２１７Ｃ、２１８Ｃ、２１９Ｃ、２２０Ｃ、２２１Ｃ、２２２Ｃ、２２３Ｃ、２２４Ｃ、２２５Ｃ、２２６Ｃ、２２７Ｃ、２２８Ｃ、２２９Ｃ、２３０Ｃ、２３１Ｃ、２３２Ｃ、２３３Ｃ、２３４Ｃ、２３５Ｃ、２３６Ｃ、２３７Ｃ、２３８Ｃ、２３９Ｃ、２４０Ｃ、２４１Ｃ、２４２Ｃ、２４３Ｃ、２４４Ｃ、２４５Ｃ、２４６Ｃ、及び２４７Ｃ−１０４７Ｃ、１Ｆ、２Ｆ、３Ｆ、４Ｆ、５Ｆ、６Ｆ、７Ｆ、８Ｆ、９Ｆ、１０Ｆ、１１Ｆ、１２Ｆ、１３Ｆ、１４Ｆ、１５Ｆ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｆ、１９Ｆ、２０Ｆ、２１Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、２５Ｆ、２６Ｆ、２７Ｆ、２８Ｆ、２９Ｆ、３０Ｆ、３１Ｆ、３２Ｆ、３３Ｆ、３４Ｆ、３５Ｆ、３６Ｆ、３７Ｆ、３８Ｆ、３９Ｆ、４０Ｆ、４１Ｆ、４２Ｆ、４３Ｆ、４４Ｆ、４５Ｆ、４６Ｆ、４７Ｆ、４８Ｆ、４９Ｆ、５０Ｆ、５１Ｆ、５２Ｆ、５３Ｆ、５４Ｆ、５５Ｆ、５６Ｆ、５７Ｆ、５８Ｆ、５９Ｆ、６０Ｆ、６１Ｆ、６２Ｆ、６３Ｆ、６４Ｆ、６５Ｆ、６６Ｆ、６７Ｆ、６８Ｆ、６９Ｆ、７０Ｆ、７１Ｆ、７２Ｆ、７３Ｆ、７４Ｆ、７５Ｆ、７６Ｆ、７７Ｆ、７８Ｆ、７９Ｆ、８０Ｆ、８１Ｆ、８２Ｆ、８３Ｆ、８４Ｆ、８５Ｆ、８６Ｆ、８７Ｆ、８８Ｆ、８９Ｆ、９０Ｆ、９１Ｆ、９２Ｆ、９３Ｆ、９４Ｆ、９５Ｆ、９６Ｆ、９７Ｆ、９８Ｆ、９９Ｆ、１００Ｆ、１０１Ｆ、１０２Ｆ、１０３Ｆ、１０４Ｆ、１０５Ｆ、１０６Ｆ、１０７Ｆ、１０８Ｆ、１０９Ｆ、１１０Ｆ、１１１Ｆ、１１２Ｆ、１１３Ｆ、１１４Ｆ、１１５Ｆ、１１６Ｆ、１１７Ｆ、１１８Ｆ、１１９Ｆ、１２０Ｆ、１２１Ｆ、１２２Ｆ、１２３Ｆ、１２４Ｆ、１２５Ｆ、１２６Ｆ、１２７Ｆ、１２８Ｆ、１２９Ｆ、１３０Ｆ、１３１Ｆ、１３２Ｆ、１３３Ｆ、１３４Ｆ、１３５Ｆ、１３６Ｆ、１３７Ｆ、１３８Ｆ、１３９Ｆ、１４０Ｆ、１４１Ｆ、１４２Ｆ、１４３Ｆ、１４４Ｆ、１４５Ｆ、１４６Ｆ、１４７Ｆ、１４８Ｆ、１４９Ｆ、１５０Ｆ、１５１Ｆ、１５２Ｆ、１５３Ｆ、１５４Ｆ、１５５Ｆ、１５６Ｆ、１５７Ｆ、１５８Ｆ、１５９Ｆ、１６０Ｆ、１６１Ｆ、１６２Ｆ、１６３Ｆ、１６４Ｆ、１６５Ｆ、１６６Ｆ、１６７Ｆ、１６８Ｆ、１６９Ｆ、１７０Ｆ、１７１Ｆ、１７２Ｆ、１７３Ｆ、１７４Ｆ、１７５Ｆ、１７６Ｆ、１７７Ｆ、１７８Ｆ、１７９Ｆ、１８０Ｆ、１８１Ｆ、１８２Ｆ、１８３Ｆ、１８４Ｆ、１８５Ｆ、１８６Ｆ、１８７Ｆ、１８８Ｆ、１８９Ｆ、１９０Ｆ、１９１Ｆ、１９２Ｆ、１９３Ｆ、１９４Ｆ、１９５Ｆ、１９６Ｆ、１９７Ｆ、１９８Ｆ、１９９Ｆ、２００Ｆ、２０１Ｆ、２０２Ｆ、２０３Ｆ、２０４Ｆ、２０５Ｆ、２０６Ｆ、２０７Ｆ、２０８Ｆ、２０９Ｆ、２１０Ｆ、２１１Ｆ、２１２Ｆ、２１３Ｆ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１６Ｆ、２１７Ｆ、２１８Ｆ、２１９Ｆ、２２０Ｆ、２２１Ｆ、２２２Ｆ、２２３Ｆ、２２４Ｆ、２２５Ｆ、２２６Ｆ、２２７Ｆ、２２８Ｆ、２２９Ｆ、２３０Ｆ、２３１Ｆ、２３２Ｆ、２３３Ｆ、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３６Ｆ、２３７Ｆ、２３８Ｆ、２３９Ｆ、２４０Ｆ、２４１Ｆ、２４２Ｆ、２４３Ｆ、２４４Ｆ、２４５Ｆ、２４６Ｆ、及び２４７Ｆ−１０４７Ｆ、１Ｇ、２Ｇ、３Ｇ、４Ｇ、５Ｇ、６Ｇ、７Ｇ、８Ｇ、９Ｇ、１０Ｇ、１１Ｇ、１２Ｇ、１３Ｇ、１４Ｇ、１５Ｇ、１６Ｇ、１７Ｇ、１８Ｇ、１９Ｇ、２０Ｇ、２１Ｇ、２２Ｇ、２３Ｇ、２４Ｇ、２５Ｇ、２６Ｇ、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ、３２Ｇ、３３Ｇ、３４Ｇ、３５Ｇ、３６Ｇ、３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｇ、４０Ｇ、４１Ｇ、４２Ｇ、４３Ｇ、４４Ｇ、４５Ｇ、４６Ｇ、４７Ｇ、４８Ｇ、４９Ｇ、５０Ｇ、５１Ｇ、５２Ｇ、５３Ｇ、５４Ｇ、５５Ｇ、５６Ｇ、５７Ｇ、５８Ｇ、５９Ｇ、６０Ｇ、６１Ｇ、６２Ｇ、６３Ｇ、６４Ｇ、６５Ｇ、６６Ｇ、６７Ｇ、６８Ｇ、６９Ｇ、７０Ｇ、７１Ｇ、７２Ｇ、７３Ｇ、７４Ｇ、７５Ｇ、７６Ｇ、７７Ｇ、７８Ｇ、７９Ｇ、８０Ｇ、８１Ｇ、８２Ｇ、８３Ｇ、８４Ｇ、８５Ｇ、８６Ｇ、８７Ｇ、８８Ｇ、８９Ｇ、９０Ｇ、９１Ｇ、９２Ｇ、９３Ｇ、９４Ｇ、９５Ｇ、９６Ｇ、９７Ｇ、９８Ｇ、９９Ｇ、１００Ｇ、１０１Ｇ、１０２Ｇ、１０３Ｇ、１０４Ｇ、１０５Ｇ、１０６Ｇ、１０７Ｇ、１０８Ｇ、１０９０、１１０Ｇ、１１１Ｇ、１１２Ｇ、１１３Ｇ、１１４Ｇ、１１５Ｇ、１１６Ｇ、１１７Ｇ、１１８Ｇ、１１９Ｇ、１２０Ｇ、１２１Ｇ、１２２Ｇ、１２３Ｇ、１２４Ｇ、１２５Ｇ、１２６Ｇ、１２７Ｇ、１２８Ｇ、１２９Ｇ、１３０Ｇ、１３１Ｇ、１３２０、１３３Ｇ、１３４Ｇ、１３５Ｇ、１３６Ｇ、１３７Ｇ、１３８Ｇ、１３９Ｇ、ＨＯＧ、１４１Ｇ、１４２Ｇ、１４３Ｇ、１４４Ｇ、１４５Ｇ、１４６Ｇ、１４７Ｇ、１４８Ｇ、１４９Ｇ、１５０Ｇ、１５１Ｇ、１５２Ｇ、１５３Ｇ、１５４Ｇ、１５５Ｇ、１５６Ｇ、１５７Ｇ、１５８Ｇ、１５９Ｇ、１６０Ｇ、１６１Ｇ、１６２Ｇ、１６３Ｇ、１６４Ｇ、１６５Ｇ、１６６Ｇ、１６７Ｇ、１６８Ｇ、１６９Ｇ、１７０Ｇ、１７１Ｇ、１７２Ｇ、１７３Ｇ、１７４０、１７５Ｇ、１７６Ｇ、１７７Ｇ、１７８Ｇ、１７９Ｇ、１８０Ｇ、１８１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ、１８４Ｇ、１８５Ｇ、１８６Ｇ、１８７Ｇ、１８８Ｇ、１８９Ｇ、１９０Ｇ、１９１Ｇ、１９２Ｇ、１９３Ｇ、１９４Ｇ、１９５Ｇ、１９６Ｇ、１９７Ｇ、１９８Ｇ、１９９Ｇ、２００Ｇ、２０１Ｇ、２０２Ｇ、２０３Ｇ、２０４Ｇ、２０５Ｇ、２０６Ｇ、２０７Ｇ、２０８Ｇ、２０９Ｇ、２１０Ｇ、２１１Ｇ、２１２Ｇ、２１３Ｇ、２１４Ｇ、２１５Ｇ、２１６Ｇ、２１７Ｇ、２１８Ｇ、２１９Ｇ、２２０Ｇ、２２１Ｇ、２２２Ｇ、２２３Ｇ、２２４Ｇ、２２５Ｇ、２２６Ｇ、２２７Ｇ、２２８Ｇ、２２９Ｇ、２３０Ｇ、２３１Ｇ、２３２Ｇ、２３３Ｇ、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｇ、２３７Ｇ、２３８Ｇ、２３９Ｇ、２４０Ｇ、２４１Ｇ、２４２Ｇ、２４３Ｇ、２４４Ｇ、２４５Ｇ、２４６Ｇ、及び２４７Ｇ−１０４７Ｇ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、１０Ｍ、１１Ｍ、１２Ｍ、１３Ｍ、１４Ｍ、１５Ｍ、１６Ｍ、１７Ｍ、１８Ｍ、１９Ｍ、２０Ｍ、２１Ｍ、２２Ｍ、２３Ｍ、２４Ｍ、２５Ｍ、２６Ｍ、２７Ｍ、２８Ｍ、２９Ｍ、３０Ｍ、３１Ｍ、３２Ｍ、３３Ｍ、３４Ｍ、３５Ｍ、３６Ｍ、３７Ｍ、３８Ｍ、３９Ｍ、４０Ｍ、４１Ｍ、４２Ｍ、４３Ｍ、４４Ｍ、４５Ｍ、４６Ｍ、４７Ｍ、４８Ｍ、４９Ｍ、５０Ｍ、５１Ｍ、５２Ｍ、５３Ｍ、５４Ｍ、５５Ｍ、５６Ｍ、５７Ｍ、５８Ｍ、５９Ｍ、６０Ｍ、６１Ｍ、６２Ｍ、６３Ｍ、６４Ｍ、６５Ｍ、６６Ｍ、６７Ｍ、６８Ｍ、６９Ｍ、７０Ｍ、７１Ｍ、７２Ｍ、７３Ｍ、７４Ｍ、７５Ｍ、７６Ｍ、７７Ｍ、７８Ｍ、７９Ｍ、８０Ｍ、８１Ｍ、８２Ｍ、８３Ｍ、８４Ｍ、８５Ｍ、８６Ｍ、８７Ｍ、８８Ｍ、８９Ｍ、９０Ｍ、９１Ｍ、９２Ｍ、９３Ｍ、９４Ｍ、９５Ｍ、９６Ｍ、９７Ｍ、９８Ｍ、９９Ｍ、１００Ｍ、１０１Ｍ、１０２Ｍ、１０３Ｍ、１０４Ｍ、１０５Ｍ、１０６Ｍ、１０７Ｍ、１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Ｋ、２０８ＫＫ、２０９ＫＫ、２１０ＫＫ、２１１ＫＫ、２１２ＫＫ、２１３ＫＫ、２１４ＫＫ、２１５ＫＫ、２１６ＫＫ、２１７ＫＫ、２１８ＫＫ、２１９ＫＫ、２２０ＫＫ、２２１ＫＫ、２２２ＫＫ、２２３ＫＫ、２２４ＫＫ、２２５ＫＫ、２２６ＫＫ、２２７ＫＫ、２２８ＫＫ、２２９ＫＫ、２３０ＫＫ、２３１ＫＫ、２３２ＫＫ、２３３ＫＫ、２３４ＫＫ、２３５ＫＫ、２３６ＫＫ、２３７ＫＫ、２３８ＫＫ、２３９ＫＫ、２４０ＫＫ、２４１ＫＫ、２４２ＫＫ、２４３ＫＫ、２４４ＫＫ、２４５ＫＫ、２４６ＫＫ、及び２４７ＫＫ−１０４７ＫＫ、１ＬＬ、２ＬＬ、３ＬＬ、４ＬＬ、５ＬＬ、６ＬＬ、７ＬＬ、８ＬＬ、９ＬＬ、１０ＬＬ、１１ＬＬ、１２ＬＬ、１３ＬＬ、１４ＬＬ、１５ＬＬ、１６ＬＬ、１７ＬＬ、１８ＬＬ、１９ＬＬ、２０ＬＬ、２１ＬＬ、２２ＬＬ、２３ＬＬ、２４ＬＬ、２５ＬＬ、２６ＬＬ、２７ＬＬ、２８ＬＬ、２９ＬＬ、３０ＬＬ、３１ＬＬ、３２ＬＬ、３３ＬＬ、３４ＬＬ、３５ＬＬ、３６ＬＬ、３７ＬＬ、３８ＬＬ、３９ＬＬ、４０ＬＬ、４１ＬＬ、４２ＬＬ、４３ＬＬ、４４ＬＬ、４５ＬＬ、４６ＬＬ、４７ＬＬ、４８ＬＬ、４９ＬＬ、５０ＬＬ、５１ＬＬ、５２ＬＬ、５３ＬＬ、５４ＬＬ、５５ＬＬ、５６ＬＬ、５７ＬＬ、５８ＬＬ、５９ＬＬ、６０ＬＬ、６１ＬＬ、６２ＬＬ、６３ＬＬ、６４ＬＬ、６５ＬＬ、６６ＬＬ、６７ＬＬ、６８ＬＬ、６９ＬＬ、７０ＬＬ、７１ＬＬ、７２ＬＬ、７３ＬＬ、７４ＬＬ、７５ＬＬ、７６ＬＬ、７７ＬＬ、７８ＬＬ、７９ＬＬ、８０ＬＬ、８１ＬＬ、８２ＬＬ、８３ＬＬ、８４ＬＬ、８５ＬＬ、８６ＬＬ、８７ＬＬ、８８ＬＬ、８９ＬＬ、９０ＬＬ、９１ＬＬ、９２ＬＬ、９３ＬＬ、９４ＬＬ、９５ＬＬ、９６ＬＬ、９７ＬＬ、９８ＬＬ、９９ＬＬ、１００ＬＬ、１０１ＬＬ、１０２ＬＬ、１０３ＬＬ、１０４ＬＬ、１０５ＬＬ、１０６ＬＬ、１０７ＬＬ、１０８ＬＬ、１０９ＬＬ、１１０ＬＬ、１１１ＬＬ、１１２ＬＬ、１１３ＬＬ、１１４ＬＬ、１１５ＬＬ、１１６ＬＬ、１１７ＬＬ、１１８ＬＬ、１１９ＬＬ、１２０ＬＬ、１２１ＬＬ、１２２ＬＬ、１２３ＬＬ、１２４ＬＬ、１２５ＬＬ、１２６ＬＬ、１２７ＬＬ、１２８ＬＬ、１２９ＬＬ、１３０ＬＬ、１３１ＬＬ、１３２ＬＬ、１３３ＬＬ、１３４ＬＬ、１３５ＬＬ、１３６ＬＬ、１３７ＬＬ、１３８ＬＬ、１３９ＬＬ、１４０ＬＬ、１４１ＬＬ、１４２ＬＬ、１４３ＬＬ、１４４ＬＬ、１４５ＬＬ、１４６ＬＬ、１４７ＬＬ、１４８ＬＬ、１４９ＬＬ、１５０ＬＬ、１５１ＬＬ、１５２ＬＬ、１５３ＬＬ、１５４ＬＬ、１５５ＬＬ、１５６ＬＬ、１５７ＬＬ、１５８ＬＬ、１５９ＬＬ、１６０ＬＬ、１６１ＬＬ、１６２ＬＬ、１６３ＬＬ、１６４ＬＬ、１６５ＬＬ、１６６ＬＬ、１６７ＬＬ、１６８ＬＬ、１６９ＬＬ、１７０ＬＬ、１７１ＬＬ、１７２ＬＬ、１７３ＬＬ、１７４ＬＬ、１７５ＬＬ、１７６ＬＬ、１７７ＬＬ、１７８ＬＬ、１７９ＬＬ、１８０ＬＬ、１８１ＬＬ、１８２ＬＬ、１８３ＬＬ、１８４ＬＬ、１８５ＬＬ、１８６ＬＬ、１８７ＬＬ、１８８ＬＬ、１８９ＬＬ、１９０ＬＬ、１９１ＬＬ、１９２ＬＬ、１９３ＬＬ、１９４ＬＬ、１９５ＬＬ、１９６ＬＬ、１９７ＬＬ、１９８ＬＬ、１９９ＬＬ、２００ＬＬ、２０１ＬＬ、２０２ＬＬ、２０３ＬＬ、２０４ＬＬ、２０５ＬＬ、２０６ＬＬ、２０７ＬＬ、２０８ＬＬ、２０９ＬＬ、２１０ＬＬ、２１１ＬＬ、２１２ＬＬ、２１３ＬＬ、２１４ＬＬ、２１５ＬＬ、２１６ＬＬ、２１７ＬＬ、２１８ＬＬ、２１９ＬＬ、２２０ＬＬ、２２１ＬＬ、２２２ＬＬ、２２３ＬＬ、２２４ＬＬ、２２５ＬＬ、２２６ＬＬ、２２７ＬＬ、２２８ＬＬ、２２９ＬＬ、２３０ＬＬ、２３１ＬＬ、２３２ＬＬ、２３３ＬＬ、２３４ＬＬ、２３５ＬＬ、２３６ＬＬ、２３７ＬＬ、２３８ＬＬ、２３９ＬＬ、２４０ＬＬ、２４１ＬＬ、２４２ＬＬ、２４３ＬＬ、２４４ＬＬ、２４５ＬＬ、２４６ＬＬ、及び２４７ＬＬ−１０４７ＬＬ、１ＸＸ、２ＸＸ、３ＸＸ、４ＸＸ、５ＸＸ、６ＸＸ、７ＸＸ、８ＸＸ、９ＸＸ、１０ＸＸ、１１ＸＸ、１２ＸＸ、１３ＸＸ、１４ＸＸ、１５ＸＸ、１６ＸＸ、１７ＸＸ、１８ＸＸ、１９ＸＸ、２０ＸＸ、２１ＸＸ、２２ＸＸ、２３ＸＸ、２４ＸＸ、２５ＸＸ、２６ＸＸ、２７ＸＸ、２８ＸＸ、２９ＸＸ、３０ＸＸ、３１ＸＸ、３２ＸＸ、３３ＸＸ、３４ＸＸ、３５ＸＸ、３６ＸＸ、３７ＸＸ、３８ＸＸ、３９ＸＸ、４０ＸＸ、４１ＸＸ、４２ＸＸ、４３ＸＸ、４４ＸＸ、４５ＸＸ、４６ＸＸ、４７ＸＸ、４８ＸＸ、４９ＸＸ、５０ＸＸ、５１ＸＸ、５２ＸＸ、５３ＸＸ、５４ＸＸ、５５ＸＸ、５６ＸＸ、５７ＸＸ、５８ＸＸ、５９ＸＸ、６０ＸＸ、６１ＸＸ、６２ＸＸ、６３ＸＸ、６４ＸＸ、６５ＸＸ、６６ＸＸ、６７ＸＸ、６８ＸＸ、６９ＸＸ、７０ＸＸ、７１ＸＸ、７２ＸＸ、７３ＸＸ、７４ＸＸ、７５ＸＸ、７６ＸＸ、７７ＸＸ、７８ＸＸ、７９ＸＸ、８０ＸＸ、８１ＸＸ、８２ＸＸ、８３ＸＸ、８４ＸＸ、８５ＸＸ、８６ＸＸ、８７ＸＸ、８８ＸＸ、８９ＸＸ、９０ＸＸ、９１ＸＸ、９２ＸＸ、９３ＸＸ、９４ＸＸ、９５ＸＸ、９６ＸＸ、９７ＸＸ、９８ＸＸ、９９ＸＸ、１００ＸＸ、１０１ＸＸ、１０２ＸＸ、１０３ＸＸ、１０４ＸＸ、１０５ＸＸ、１０６ＸＸ、１０７ＸＸ、１０８ＸＸ、１０９ＸＸ、１１０ＸＸ、１１１ＸＸ、１１２ＸＸ、１１３ＸＸ、１１４ＸＸ、１１５ＸＸ、１１６ＸＸ、１１７ＸＸ、１１８ＸＸ、１１９ＸＸ、１２０ＸＸ、１２１ＸＸ、１２２ＸＸ、１２３ＸＸ、１２４ＸＸ、１２５ＸＸ、１２６ＸＸ、１２７ＸＸ、１２８ＸＸ、１２９ＸＸ、１３０ＸＸ、１３１ＸＸ、１３２ＸＸ、１３３ＸＸ、１３４ＸＸ、１３５ＸＸ、１３６ＸＸ、１３７ＸＸ、１３８ＸＸ、１３９ＸＸ、１４０ＸＸ、１４１ＸＸ、１４２ＸＸ、１４３ＸＸ、１４４ＸＸ、１４５ＸＸ、１４６ＸＸ、１４７ＸＸ、１４８ＸＸ、１４９ＸＸ、１５０ＸＸ、１５１ＸＸ、１５２ＸＸ、１５３ＸＸ、１５４ＸＸ、１５５ＸＸ、１５６ＸＸ、１５７ＸＸ、１５８ＸＸ、１５９ＸＸ、１６０ＸＸ、１６１ＸＸ、１６２ＸＸ、１６３ＸＸ、１６４ＸＸ、１６５ＸＸ、１６６ＸＸ、１６７ＸＸ、１６８ＸＸ、１６９ＸＸ、１７０ＸＸ、１７１ＸＸ、１７２ＸＸ、１７３ＸＸ、１７４ＸＸ、１７５ＸＸ、１７６ＸＸ、１７７ＸＸ、１７８ＸＸ、１７９ＸＸ、１８０ＸＸ、１８１ＸＸ、１８２ＸＸ、１８３ＸＸ、１８４ＸＸ、１８５ＸＸ、１８６ＸＸ、１８７ＸＸ、１８８ＸＸ、１８９ＸＸ、１９０ＸＸ、１９１ＸＸ、１９２ＸＸ、１９３ＸＸ、１９４ＸＸ、１９５ＸＸ、１９６ＸＸ、１９７ＸＸ、１９８ＸＸ、１９９ＸＸ、２００ＸＸ、２０１ＸＸ、２０２ＸＸ、２０３ＸＸ、２０４ＸＸ、２０５ＸＸ、２０６ＸＸ、２０７ＸＸ、２０８ＸＸ、２０９ＸＸ、２１０ＸＸ、２１１ＸＸ、２１２ＸＸ、２１３ＸＸ、２１４ＸＸ、２１５ＸＸ、２１６ＸＸ、２１７ＸＸ、２１８ＸＸ、２１９ＸＸ、２２０ＸＸ、２２１ＸＸ、２２２ＸＸ、２２３ＸＸ、２２４ＸＸ、２２５ＸＸ、２２６ＸＸ、２２７ＸＸ、２２８ＸＸ、２２９ＸＸ、２３０ＸＸ、２３１ＸＸ、２３２ＸＸ、２３３ＸＸ、２３４ＸＸ、２３５ＸＸ、２３６ＸＸ、２３７ＸＸ、２３８ＸＸ、２３９ＸＸ、２４０ＸＸ、２４１ＸＸ、２４２ＸＸ、２４３ＸＸ、２４４ＸＸ、２４５ＸＸ、２４６ＸＸ、及び２４７ＸＸ−１０４７ＸＸを含む（六量体の記号のあとに血漿タンパク質の記号が続く）。
【００８２】
示されるように、これらのペプチドは、気道への投与のために調製されることができる。効果的な治療をもたらす治療上有効な量（本明細書で用量とも称される）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及び／または動物モデルからの結果に基づいて最初に推定される。このような情報は、目的の対象に有用な与量をより正確に決定するために使用することができる。
【００８３】
特定の対象に投与される実際の投与量は、パラメータ（例えば標的、体重、状態の種類、状態の段階または重篤度、前のまたは同時の治療介入、対象の突発性などを含む、身体的、生理学的及び心理的因子）を考慮に入れる医師、獣医師または研究者で、測定されることができる。代表的な用量は、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを含むことができる。
【００８４】
例示的実施形態
１．治療を必要とする対象の気道に、配列番号１０５３の原線維または原線維形成ペプチドを含む製剤の治療上有効な量を投与すること、
それによって前記対象の胸膜腔のＢ−１ａリンパ球を標的化かつ活性化すること、及び病態を治療することを含む、治療を必要とする前記対象の炎症性または自己免疫要素を含む病態を治療するために胸膜腔のＢ−１ａリンパ球を標的化かつ活性化させる方法。
２．前記炎症性または自己免疫性要素を含む前記病態が、多発性硬化症、関節リウマチ、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、癌、虚血性再灌流傷害、関節炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、実施形態１の方法。
３．治療を必要とする対象に原線維または原線維形成ペプチドを含む製剤の治療上有効な量を投与すること、
それによって免疫系を抑制すること、及び前記対象の病態を治療することを含む、治療を必要とする前記対象の免疫系を抑制して、炎症性または自己免疫要素を伴う病態を治療するために、Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージを標的化かつ活性化する方法。
４．前記病態が、多発性硬化症、関節リウマチ、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、癌、虚血性再灌流傷害、関節炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、実施形態３の方法。
５．前記投与が気道へのものである、実施形態３または４の方法。
６．前記気道への投与が肺の肺胞領域へのものである、実施形態１または５の方法。
７．前記原線維または原線維形成ペプチドが配列番号１０５３である、実施形態３〜６のいずれかの方法。
８．前記原線維または原線維形成ペプチドが、−２３ｋｃａｌ／モル以下のＲｏｓｅｔｔａエネルギーでオリゴマー形成するヘキサペプチドである、実施形態３〜６のいずれかの方法。
９．前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号１〜１０６２のうちの１つ以上を含む、実施形態３〜８のいずれかの方法。
１０．前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号５、配列番号１０４８、配列番号１０４９、配列番号１２３、配列番号１０５０、配列番号１０５１、配列番号７９１、配列番号１０５２、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号２２０、及び配列番号１０５８のうちの１つ以上を含む、実施形態３〜８のいずれかの方法。
１１．前記製剤が導電性製剤である、前述の実施形態のいずれかの方法。
１２．前記製剤が粘膜作用剤または粘液溶解剤を更に含む、前述の実施形態のいずれかの方法。
１３．前記製剤が乾燥粉末製剤である、前述の実施形態のいずれかの方法。
１４．前記製剤が導電剤を更に含む、前述の実施形態のいずれかの方法。
１５．Ｂ−１ａリンパ球及び／またはマクロファージの前記標的化かつ活性化することが胸膜腔で生じる、前述の実施形態のいずれかの方法。
１６．前記方法が免疫系を抑制する、前述の実施形態のいずれかの方法。
１７．免疫系を抑制することが１つ以上の炎症誘発性サイトカインの抑制を含む、実施形態１６の方法。
１８．前記１つ以上の炎症誘発性サイトカインがＴＮＦα、ＩＬ−６及び／またはＩＦＮγである、実施形態１７の方法。
１９．原線維または原線維形成ペプチド、及び導電剤を含む、導電性製剤。
２０．前記導電剤が高張性食塩水である、実施形態１９の導電性製剤。
２１．粘膜作用剤もしくは粘液溶解剤を更に含む、実施形態１９または２０の導電性製剤。
２２．前記原線維または原線維形成ペプチドが、−２３ｋｃａｌ／モル以下のＲｏｓｅｔｔａエネルギーでオリゴマー形成するヘキサペプチドである、実施形態１９、２０または２１のいずれかの方法。
２３．前記原線維または原線維形成ペプチドが配列番号１０５３である、実施形態１９、２０または２１の導電性製剤。
２４．前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号１〜１０６２のうちの１つ以上のペプチドを含む、実施形態１９、２０または２１の導電性製剤。
２５．前記原線維または原線維形成ペプチドが、配列番号５、配列番号１０４８、配列番号１０４９、配列番号１２３、配列番号１０５０、配列番号１０５１、配列番号７９１、配列番号１０５２、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号２２０及び配列番号１０５８のうちの１つ以上のペプチドを含む、実施形態１９、２０または２１の導電性製剤。
【実施例】
【００８５】
実施例１。ヘキサペプチドからなるアミロイド線維は、マウスの腹膜内に注入されるとき、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の麻痺徴候を軽減するのに十分な程度の免疫抑圧反応を刺激する。ＰＢＭＣの差次的遺伝子発現パターンの分析は、アミロイド形成ペプチド（例えば、１型インターフェロン（ＩＦＮ）反応を誘発するタウ６２３−６２８（配列番号１２３））を明らかにした。形質細胞様樹状細胞は１型ＩＦＮの発生源であり、それは、アミロイド線維の好中球エンドサイトーシスから生じるネトーシスによって誘発された。１型ＩＦＮの産生は、Ｔｈ１誘発ＥＡＥで治療効果があったが、Ｔｈ１７誘発性疾患の麻痺徴候を悪化させた。しかし、すべてのアミロイド形成ペプチドが、等価量の１型ＩＦＮを誘発するとは限らなかった。１型ＩＦＮの誘発は、チオフラビンＴで測定した原線維構造の量と相関するように見えた。極性原線維インタフェースを有するペプチドのセット（例えばアミリン２８〜３３（配列番号１０５３））は、１型ＩＦＮの最小量を誘発する、生理的緩衝液中の測定できる程度の原線維を形成しなかったが、それにもかかわらず治療効果があり、ＰＢＭＣによるＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−６産生を低減し、そうして第２の免疫抑圧経路の証拠を示した。この第２の免疫抑圧経路の重要性の更なる証明は、ＥＡＥのＩＦＮα／βＲ−／−動物で治療効果のあるアミロイド形成ペプチドの能力であった。
【００８６】
この第２の免疫抑圧経路をより良好に画定するために、腹膜の注入部位でアミロイド線維の誘発効果を調べた。腹腔は、２種類の常在マクロファージ（Ｍφ）（大きい腹腔Ｍφ（ＬＰＭ）（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉＭＨＣ−ＩＩ−）及び小さい腹腔Ｍφ（ＳＰＭ）（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０ｌｏＭＨＣ−ＩＩｈｉ））、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋ＣＤ２３）、ならびにＢ−２リンパ球（ＣＤ１９＋ＣＤ５−ＣＤ２３＋）、Ｔリンパ球、マスト細胞、好中球、好酸球及びＮＫ細胞を含む血液の比較的多く見られる成分を含む、様々な特異性細胞を含有する。ＬＰＭ（Ｆ４／８０ｈｉ）は、ＳＰＭ（ＭＨＣ−ＩＩ）より一般的であり、腹腔Ｍφの９０％を示す。Ｂ−１ａ及びＭφ（ＬＰＭ＋ＳＰＭ）はそれぞれ、全腹腔細胞の３０％を含む。いくつかのグループは，Ｂ−１ａリンパ球がより豊富なＢ−２リンパ球と識別可能で、体腔で豊富であることを確認した。活性化されるとき、Ｂ−１ａの腹腔への局在及びその流出の原因である、ケモカイン及びインテグリンも画定された。Ｂ−１ａ細胞集団は、ＩＬ−１０、十分に確立した免疫抑圧サイトカインの構成的発現に特徴がある。ＩＬ−１０を産生すＢ細胞（Ｂ１０細胞）は、ＥＡＥの徴候からの回復に必要であることがＪａｎｅｗａｙらによって最初に示され、その後、免疫多発性硬化症（炎症性腸疾患）において、多発性硬化症、炎症性腸疾患、コラーゲン誘発関節炎、ループス、脳卒中、インスリン抵抗性及びアレルギー性気道疾患の動物モデルで免疫抑圧性であることが証明された。これらの研究の多数のＢ１０細胞は、腹腔からではなく、脾臓から単離された。
【００８７】
Ｂ１０細胞による最大限の免疫抑制は、細胞がＴＬＲ、ＣＤ４０またはＩＬ−２１連結によって活性化された後に観察され、そのすべては、ＩＬ−１０産生の増加、及び腹膜から二次リンパ器官への細胞放出の両方を誘発する。炎症性、自己免疫疾患の症状の減少はＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＦＮγの減少と相関し、それと類似のパターンはアミロイド形成ペプチドの投与でも見られた。
【００８８】
方法。ＭＯＧ及び補助剤で免疫化したマウスの活性ＥＡＥの誘発。ＥＡＥは、雌の野生型Ｃ５７ＢＩ／６マウス、またはＣ５７ＢＩ／６背景のμＭＴ及びＩＬ−１０欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で上述の手順によって誘発された。簡単に説明すると、ＥＡＥは、生理食塩水中の２００μｇのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５（ＭＯＧ３５−５５、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１０６５））を含有するエマルション、及び４μｇ／ｍｌの結核菌Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｓｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の皮下免疫化フロイント完全アジュバントによる、側腹部の皮下ワクチン接種によって生後９週間目で誘発された。すべてのマウスは、ワクチン接種後０時及び４８時に、腹膜内（ｉ．ｐ．）に４００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を投与された。神経学的障害の徴候は、以下のとおり、０：臨床的疾患なし、１：尾の脱力、２：後肢の脱力、３：完全な後肢麻痺、４：後肢麻痺及び若干の前肢の脱力、５：瀕死または死、と記録された。動物が、臨床徴候のレベル１〜２の平均を示すとき、それらは、１０μｇのタウ６２３−６２８、アミリン２８−３３ペプチド（配列番号：１０５３）またはＰＢＳを、毎日腹膜に注入された。鼻腔内接種において、１０μｌのＰＢＳ中の１０μｇのアミリン２８−３３を、麻酔下のマウスの鼻孔内にゆっくりと放出した。すべての動物のプロトコルは、ＩＡＣＵＣ委員会に承認された。
【００８９】
Ｂ−１ａリンパ球の養子移入。Ｂ−１ａリンパ球は、野生型Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの腹膜細胞の細胞選別で精製された。μＭＴマウスの活性ＥＡＥの誘発後１０日目に、３．５×１０５Ｂ−１ａリンパ球を腹腔に移した。マウスは、１４日間、毎日１０μｇのアミリン２８−３３またはＰＢＳで処理した。対照μＭＴＥＡＥマウスは、Ｂ−１ａリンパ球を移動せずに、１０μｇのアミリン２８−３３で処理した。マウスは、毎日ＥＡＥの臨床徴候がないか調べられて、上述の５段階スケールで記録された。
【００９０】
顕微鏡観察。Ｃ５７ＢＩ／６雌マウスはＦＩＴＣ−タウ６２３−６２８を注射され、１０分後、腹膜細胞は単離されて、洗浄され、ラット抗マウスＣＤ１９（ＰＥ）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）及びＤＡＰＩで染色され、洗浄されて、ポリリシン被覆顕微鏡スライドに蒔いた。細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８白色光レーザー共焦点顕微鏡を使用して可視化された。
【００９１】
生物発光実験。Ｂ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφは、ルシフェラーゼトランスジェニックマウス（Ｂ６．ＦＶＢ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｔｇ（ＣＡＧ−ｌｕｃ−ＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ  Ｔｈｙ１ａ／Ｊ）、それはＣＡＴ−ｌｕｃ−ｅＧＦＰ（Ｌ２Ｇ８５導入遺伝子）を発現）から単離した腹膜細胞の細胞選別によって精製された。最初の実験で、２×１０５及び１×１０５Ｂ−１ａリンパ球をＣ５７ＢＬ／６雌アルビノマウス（Ｂ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ）の腹膜に注入し、それからリンパ球の活性化のための１０μｇのタウ６２３−６２８の注入、及び生物発光画像診断を開始するためのルシフェリン基質（ＤルシフェリンホタルＬ−８２２０Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）の０．３ｍｇ／体重ｇの注入が続く。ルシフェラーゼ発現細胞の位置は、７５分間、５分毎に撮像することによって測定した。
【００９２】
発光の減少がｌｕｃ＋細胞の分解ではなく、ｌｕｃ＋細胞の輸送が原因であることを確認するために、２匹のＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスは１０６のｌｕｃ＋腹腔Ｍφ、３匹目は２×１０５のＢ−１ａリンパ球を注入し、ＢＬＩ対照として使用する４匹目のマウスはルシフェリンだけを注入された。マウスはその後、１０μｇのタウ６２３−６２８及び０．３ｍｇ／ｇのルシフェリンを注入した。生物発光は、ルシフェリン注入直後及び５分後に測定された。３０分後、マウスはルシフェリンを再注入されて、生じる発光を測定した。類似の注入及び測定を、６０分後に行った。ルシフェリンの複数の注入は、すべての測定中、ほぼ飽和の薬物濃度を保ち、その結果、いかなる変化も細胞運動に起因した。マウスは、ＩＶＩＳ１００電荷結合素子（ＣＣＤ）画像処理システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して撮像した。画像データは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア４．４（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で分析して、定量化された。
【００９３】
ペプチド合成及びＦＩＴＣ−タウの調製。ペプチドは、前述したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置で、固相技術ならび市販のＦｍｏｃアミノ酸、樹脂及び試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ，ａｎｄ  Ｂａｃｈｅ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用して合成した。Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７（２４）：１３００３−１３００８。ペプチドの純度は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７００Ｅ  ＨＰＬＣ及び逆相カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｌｔｉｍａ）を使用して９０％超であることがわかった。ペプチドの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離質量分析を使用して確認した。原線維中の過剰量のフルオロフォアを防ぐために、タウ６２３−６２８は、アミノカプロン酸リンカーを有するタウ６２３−６２８のアミノ末端に付着したＦＩＴＣを有する類似体と、１０：１の比率で混合した。得られた原線維混合物は、ＦＩＴＣ−タウと本テキストで呼ばれる。
【００９４】
ＲＮＡ単離、チップハイブリダイゼーション及びｑＰＣＲ。トータルＲＮＡは、トリゾール試薬及びＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔを使用して、１０μｇのＬＰＳ、タウ６２３−６２８、アミリン２８−３３またはＰＢＳを注入した３−６Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスから得られた、ＦＡＣＳ精製したＢ−１ａ球及び腹腔Ｍφから抽出した。１本鎖ｃＤＮＡは、ｑＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して、３０〜５０ｎｇのトータルＲＮＡで合成した。ＱＰＣＲアッセイは、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施され、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、市販のプライマー（ＡＢＩ）を使用した。すべてのアッセイは、製造業者の指示書に従って実施した。相対定量化のための比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ）は、遺伝子発現を比較するために使用した。ハウスキーピング遺伝子発現は、次式：正規化発現＝２［Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）−Ｃｔ（遺伝子）］を使用して発現を正規化するために使用した。
【００９５】
ＬＰＳ、アミリン２８−３３及びタウ６２３−６２８による処理に関連する遺伝子発現の変化を、マイクロアレイを用いて定量化した（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｍｏｕｓｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＲＮＡ品質は、マイクロアレイ実験に好適であることを示した（２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。データの分析及び定量化は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェアを使用して行った。
【００９６】
フローサイトメトリー。腹腔細胞は、０．１％のウシ血清アルブミン及び５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍｌの冷ＰＢＳで腹腔を洗浄することによって得た。単細胞懸濁液は、以下の蛍光色素抱合体：ＣＤ５（ＰＥ  Ｃｙ５、ＰＥまたはＡＰＣ）、ＣＤ１９（ＰＥ  Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｌｕｅまたはＡＰＣ）、ＣＤ１１ｂ（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｌｕｅまたはＰＥ）、Ｆ４／８０（ＡＰＣ）、ＣＤ２１（ＡＰＣ）、ＣＤ２３（ＰＥ）、Ｇｒ−１（ＰＥＣｙ７）、Ｂ２２０（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ８０／８６（ｂｉｏｔｉｎ−Ｑｄｏｔ６０５−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）及びＩｇＭ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００）で染色した。細胞選別は、２２パラメータ解析のための４つのレーザー及び光学を備えるＦＡＣＳ−ＡｒｉａまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）を使用した。解析は、ＦｌｏｗＪｏを使用して行われた。
【００９７】
ＴＬＲ結合アッセイ。マウスＴＬＲ４、ＭＤ−２、ＣＤ１４またはＴＬＲ２でトランスフェクトした市販のＨＥＫ２９３細胞、及び誘発性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を９６ウェルプレートに蒔いた。細胞のＳＥＡＰレポーター遺伝子は、ＩＬ−１２  ｐ４０最小プロモーターの制御下で、５つのＮＦ−κＢ及びＡＰ−１−結合部位に融合した。ＴＬＲ４またはＴＬＲ２リガンドによる刺激は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１を活性化させ、それはＳＥＡＰの産生を誘発する。細胞培養培地で測定した分泌型アルカリホスファターゼの濃度は、ＴＬＲ経路の刺激に比例している。バックグラウンドレベルはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  Ｎｕｌｌ細胞を使用して測定し、それはＴＬＲ受容体でなく、アルカリホスファターゼでトランスフェクトする。ＴＬＲ４トランスフェクト細胞はコンフルエンスまで増殖し、ＬＰＳの２、１、０．２μｇ、または１セットのアミロイド形成的ペプチドの１０μｌを、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ検出媒質（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）の各ウェルに２連で加えた。ＴＬＲ２トランスフェクト細胞の場合、ＰＡＭ２ＣＳＫ４は陽性対照であり、ＬＰＳの２μｇだけを分析した。プレートを３７℃で１２時間インキュベートし、得られた青色は６５０ｎｍの吸収を読み取ることで測定した。
【００９８】
結果。アミロイド線維は、腹腔Ｂ細胞及びＭφによって貪食される。アミロイド線維は、Ｍφ、樹枝細胞、小膠細胞及び好中球によって貪食される。腹膜細胞がアミロイド線維を結合するか判定するために、蛍光標識したタウ６２３−６２８は１：１０の比率で非標識ペプチドと混合し、得られた原線維は、健康な野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹膜に注入される。２０分後、腹膜細胞は洗浄によって収集され、抗ＣＤ１９及び抗Ｆ４／８０で染色され、ポリリジン被覆スライドに重ねた。共焦点顕微鏡観察を実施して、細胞内の蛍光原線維の存在を明らかにし、それは、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）及びＭφ（Ｆ４／８０＋）の両方によって、原線維が囲まれて、貪食されたことを示唆する（図１Ａ及び図１Ｂ）。大部分の蛍光原線維が、より低い割合でＣＤ１９＋Ｂ細胞と結合するＦ４／８０＋細胞に囲まれていることは、複数の領域を見ることで明らかになった。
【００９９】
フローサイトメトリーによる、蛍光アミロイド線維を注入しるマウスから単離した腹膜細胞の分析は、顕微鏡観察研究を確認し、拡大した。腹膜の種々の細胞型の構成は、１０色、１２パラメータ高次元解析を使用して詳細に描写できる（図２Ａ及び図２Ｂ）。腹腔Ｍφ（ＳＰＭ及びＬＰＭの両方）、マスト細胞、Ｔ、Ｂ−２及びＢ−１リンパ球は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５及びＣＤ１９に対する抗体で詳細に描写され、取り込み及び輸送のより複雑なパターンは明らかである（図１Ｃ）。ＦＩＴＣ−タウ注入の１０分以内に、Ｂ−１及びＢ−２リンパ球ならびにＬＰＭの７０％超は、ＦＩＴＣ陽性である。Ｔリンパ球及びマスト細胞は最小限に染色され、Ｂ細胞及びＭφによる特異的結合または取り込みを示す。アミロイド線維の注入の５時間後に、興味深いパターンが現れる。大部分のＣＤ１１ｂ高集団は、全腹膜細胞の４５％から３％まで著しく低下する（図２Ｃ）。残留する細胞がＦＩＴＣ−タウ陰性の場合、Ｂ−１ａ集団の大部分は消えた（図２Ｄ）。大多数のＴリンパ球及びマスト細胞は、原線維と共に染色されないままだった。全体的に、Ｂ細胞及びＭφが原線維を結合し、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉ）の相対的数が、アミロイドの注入の５時間後に激減したことが、フローサイトメトリー研究でわかった。
【０１００】
原線維が、Ｂ−１ａ及びＬＰＭへ選択的に毒性であるかが評価された。腹膜細胞が蛍光アミロイドでｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養される場合、細胞死が観察されないとき、これが優勢である可能性は低い（図３）。細胞を死滅させる代わりに、検証できる仮説は、原線維が腹膜から２つの細胞集団の流出を誘発したということであった。
【０１０１】
μＭＴ及びＩＬ−１０ノックアウトマウスは、治療に反応しない。アミロイド線維の作用機序でのＢリンパ球の重要性を決定するために、ＥＡＥはμＭＴマウスで誘発され、それはＢ細胞のすべてのサブタイプのＩｇＭ欠如発現の膜貫通領域での突然変異による。疾患の麻痺徴候はこれらの動物で誘発され、Ｔリンパ球による疾患の誘発と一致するが、野生型マウスで見られる効果と比較すると、タウ６２３−６２８もアミリン２８−３３も治療の治療効果はなかった（図４Ａ〜図４Ｃ）。アミロイド形成的ペプチドの治療効果は、Ｂ細胞（腹膜の組成及び顕微鏡検査に基づく最も可能性が高いＢ−１ａリンパ球）の存在を必要とするように見えた。
【０１０２】
Ｂ−１ａリンパ球は、比較的大量のＩＬ−１０の構成的発現によって特徴づけられる。このサイトカインがペプチドの治療的有効性の中心であるか立証して、このＢ細胞サブタイプに活性を関連づけるために、１０μｇのアミリン２８−３３は、ＩＬ−１０ノックアウト動物で誘発されるＥＡＥを処理するために使用した（図４Ｄ及び図４Ｅ）。ペプチドはこの動物モデルでも効果がなく、ＩＬ−１０及びＢリンパ球の両方はアミロイド形成ペプチドの治療効果の中心であると確認した。
【０１０３】
Ｂ−１ａリンパ球の養子移入は、μＭＴ動物のアミロイド形成ペプチドの治療有効性を回復させた。腹腔Ｂ−１ａリンパ球の特性は、治療機能の明らかな要件と相互に関連している。したがってμＭＴマウスのこの集団の置換は、アミロイド線維の免疫抑制活性を回復させることとなる。腹膜細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスから単離され、Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋）は細胞選別によって精製された。ＥＡＥはμＭＴマウスで誘発され、誘発後１０日目、臨床徴候の発現前に、マウスは、精製されたＢ−１ａリンパ球（３．５×１０５細胞）を腹腔に注入された。マウスは２つのグループに分けられて、毎日アミリン２８−３３（１０μｇ）または緩衝液のみで処理した（図４Ｆ）。Ｂ−１ａリンパ球を受けていないがアミリン２８−３３で処理したＥＡＥ誘発μＭＴマウスを、比較のために使用した。興味深いことに、毎日アミロイド形成ペプチドで処理したＢ−１ａリンパ球の移行を受けたマウスだけが、ＥＡＥの減少した麻痺徴候を示した。未処理Ｂ−１ａリンパ球の養子移入は、緩衝液対照と同じように効果がなく、Ｂ−１ａリンパ球の重要性だけでなく、細胞集団が効果的な原線維によって活性化される必要があることを確認した。これは、制御性Ｂ細胞がその非活性化物より強力な自己免疫抑制因子である研究を裏づける。
【０１０４】
アミロイド形成ペプチドは、腹腔からのＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの流出を誘発する。生物発光の実時間測定は、アミロイド形成ペプチドが腹膜からのＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの流出を誘発することを証明した。Ｂ−１ａリンパ球（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋ＣＤ２３−）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉ）は、ＣＡＴ−ｌｕｃ−ｅＧＦＰ，Ｌ２Ｇ８５導入遺伝子を発現するルシフェラーゼトランスジェニックマウス、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｌ２Ｇ８５（Ｈ−２ｄ）（Ｂ６．ＦＶＢ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｔｇ（ＣＡＧ−ｌｕｃ，−ＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ  Ｔｈｙ１ａ／Ｊ）から単離した腹膜細胞から選別した。最初の実験で、１×１０５及び２×１０５のＢ−１ａリンパ球をＣ５７ＢＬ／６雌アルビノマウスの腹膜内に注入し、それからリンパ球の活性化のための１０μｇのタウ６２３−６２８の注入、及び生物発光画像診断のために酵素基質反応を開始するためのルシフェリン基質の３００μｇ／体重ｇの注入が続く。ルシフェラーゼ発現細胞の位置は、７５分間５分毎にマウスを撮像することによって監視した（図５左上）。初期に見られる腹腔に対応する発光の拡散配布は、徐々に強度が減少し、併せて鼠径リンパ節に局在化するように見える強度の焦点領域は、３５分に始まる（図５左上）。腹部の１秒当たり光子の総数を測定することは、実験の７５分間で発された光子の急速な用量依存性減少を明らかにした（図５右上）。信号のサイズが注入した細胞数に比例する場合でも、減少率または曲線の傾斜は２匹の動物で同じだった。このような結果は、腹膜からのＢ−１ａリンパ球の放出を引き起こすアミロイド線維と一致する。
【０１０５】
ルシフェリンの濃度も実験の７５分間で減少するので、最初の実験の実験計画では、明確に信号の減少がリンパ球の移動によるとすることができなかった。発光の減少の理由をｌｕｃ＋細胞の移動に十分に帰させるために、２回目の実験は４匹のレシピエントマウスで実施した。２匹は１×１０６のｌｕｃ＋Ｍφ（ＬＰＭ）、３匹目は２×１０５のＢ−１ａリンパ球、及び対照として使用する４匹目のマウスはルシフェリンだけを注入した。この実験で、マウスはその後、１０μｇのタウ６２３−６２８及びルシフェリンを注入した。生物発光は、ルシフェリン注入直後及び５分後に測定された。３０分後、マウスはルシフェリンを再注入されて、生じる発光を測定した。類似の注入及び測定を、６０分後に行った。ルシフェリンの複数の注入は、すべての測定中、ほぼ飽和の薬物濃度を保ち、その結果、いかなる変化も遊走及び輸送に起因した。１×１０６ＬＰＭを使用すると、すべての時点で鮮明な信号（鼠径リンパ節にわたる領域での集中と共に経時的に増大した光の分布）を生成し、その詳細は最初の実験で観察されるものと類似していた（図５左下）。Ｂ−１ａリンパ球を受けたマウスで、より弱い信号が観察されたが、にもかかわらず、腹膜からのｌｕｃ＋細胞の流出の証拠は明らかだった。各マウス全身の１秒当たりの光子を測定して、時間に対してプロットするとき、時間関数として信号が比例して増加した。鼠径リンパ節に対応する領域の場合、５〜６０分の測定から発光は約１０倍の増加があった（図５、右下）。総じて画像撮影実験は、アミロイド形成ペプチドが腹膜から鼠径リンパ節へのＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの両方の移動を誘発することを確認する。
【０１０６】
アミロイド線維がどのようにＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの流出を誘発するかについて更に試験するために、一連の実験がＩＬ−１０レポーターマウスを使用して実施され、そこでＩＬ−１０及びＧＦＰは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介して接続されて、蛍光によりＩＬ−１０分泌細胞を標識するバイシストロン性メッセージを作成する（Ｂｏｕａｂｅ（２０１２）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５（６）：５５３−５６７）。ＬＰＳが腹膜から脾臓までＢ−１ａ細胞遊走を誘発するので、アミロイド線維の効果を、ＴＬＲ４リガンドで観察した効果と比較した（Ｂａｌａｂａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（６）：３３９２−３４００、Ｇｈｏｓｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０８（７）：２８７９−２８８４）。ＩＬ−１０転写の最大限の変化を考慮するために、及び得られたＧＦＰが比較的長寿命なので、実験は、流出を確認して、遊走可能部位を特定するように設計された。以前の実験がＢ−１ａ及びＬＰＭの８０％が５時間で腹膜を出ることを確認したので、分析時点は３０分毎に、原線維の注入後は２４時間毎に選択された。３匹のＩＬ−１０レポーターＣ５７ＢＬ／６雌マウスの３つのグループは、１０μｇのＬＰＳ、１０μｇのアミリン２８−３３または緩衝液のみを注入され、５または２４時間後に腹膜細胞を洗浄した。脾臓ならびに鼠径及び腋窩リンパ節は、プールされたリンパ節と切開され、単細胞懸濁液が調製され、１０色、１２パラメータ高次元解析を使用して詳細に描写された。類似の細胞及び組織も、追加の対照として３匹の野生型マウスからとられた。ＬＰＳの注入は、ＩＬ−１０分泌性Ｂ−１ａリンパ球の相対数を増加させる（２４時間で２５％から４０％へ）だけでなく、それは、ＧＦＰ中位蛍光強度（ＭＦＩ）のより高いレベルによって明示されるように、ＩＬ−１０のより高濃度を誘発した。対照的に、アミリン２８−３３の注入はＩＬ−１０分泌を増加させなかったが、ＬＰＳで観察されなかった、２４時間後の腹膜のＩＬ−１０＋Ｂ−１ａリンパ球及びＬＰＭの数に減少があった。
【０１０７】
脾臓で、ＬＰＳは、注入の２４時間後に細胞当たり発現するＢ−１ａリンパ球の数及びＩＬ−１０の量の増加を誘発した。アミリン線維は脾臓のＢ−１ａリンパ球の増加を誘発せず、むしろその数及びＩＬ−１０発現の明らかな減少を誘発した。逆のパターンは、プールしたリンパ節で観察された。ＬＰＳは、プールしたリンパ節中のＢ−１ａリンパ球の軽微な増加をもたらした。アミリン２８−３３の注入は、リンパ節のＢ−１ａの割合上昇させ、併せてＩＬ−１０発現の量を増加させた。ＩＬ−１０ＥＡＥレポーターマウスで、追加のパターンを観察した。脳または脊髄で、Ｂ−１ａリンパ球の有意な増加は検出されず、Ｂ−１ａ及びＭφ集団が炎症の原発部位ではなく、二次リンパ器官に移動するという仮説と一致した。
【０１０８】
ＩＬ−１０レポーターマウスを使用した実験で、ＬＰＳ及び原線維の両方が、Ｂ−１ａリンパ球、ＳＰＭ及びＬＰＭを活性化し、ＩＬ−１０遺伝子発現及びその後の腹膜から流出を誘発することがわかった。しかし、増加の大きさ及び遊走の方向の詳細は異なる。以前報告したように、ＬＰＳは、ＩＬ−１０の増大した産生及び脾臓への遊走をもたらすＢ−１ａリンパ球を活性化させて、一方で原線維はリンパ節への遊走を主に誘発した。興味深いことにＣＤ８０／８６発現Ｂ−１ａリンパ球だけがＩＬ−１０を分泌し、ＩＬ−１０分泌性Ｂ−１ａリンパ球は、アミリン線維の注入によって増加する相対数で正常動物のリンパ節中に見いだされた。フローサイトメトリー実験は、アミロイド形成ペプチドがＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの両方を活性化して、流入領域リンパ節に両方の細胞型の輸送をもたらすことを確認する。
【０１０９】
アミロイド線維によって誘発されたＢ−１ａリンパ球及びＭφの差次的遺伝子発現。アミロイド線維の注入後のＢ−１ａリンパ球及びＬＰＭの遊走は、両方の細胞型の活性化と位置する。しかし、原線維の受容体（複数可）は、Ｂ−１ａリンパ球または腹膜Ｍφのいずれかにおいて画定されていない。ＬＰＳ刺激によって誘発される遊走とは異なり、ペプチドからなる原線維はＴＬＲ２  ＭＤ２／ＴＬＲ４と結合しない１セットの１５以上の異なるアミロイド形成ペプチドは、マウスＴＬＲ２またはＭＤ２／ＣＤ１４／ＴＬＲ４によってトランスフェクトする市販のＨＥＫ細胞と結合するために、スクリーニングされた。トランスフェクト細胞は、ＮＦｋＢプロモーターの制御下のアルカリホスファターゼの分泌型を含んだ。様々なペプチドからなるアミロイド線維のいずれも、このアッセイで陽性ではなかった。
【０１１０】
原線維が腹膜細胞を活性化する方法の理解を確認し、それを拡大するために、精製Ｂ−１ａ及びＬＰＭの差動の遺伝子誘導を解析した。このような測定を行うことは、ＬＰＳ及び原線維が腹腔から関連細胞の急速な移動を誘発する、ならびにしたがって高い割合は、注入の１時間後に洗浄により単離されないという事実によって難しくなった。集団バイアスを最小化して、更に原線維が遺伝子発現を誘発する十分な時間を可能にするために、細胞は、ＬＰＳまたはアミロイド形成ペプチドの注入後の３０〜４０分の間に単離された。したがって解析は、刺激の３０〜４０分後の遺伝子発現に限る。３匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスのグループからの腹膜細胞は、ＬＰＳ、アミリン２８−３３またはタウ６２３−６２８からなる原線維または緩衝液対照による注入の後、単離された。３匹のマウスの４つのグループからのＢ−１ａリンパ球（ＣＤ１９ｈｉＣＤ５＋ＣＤ２３−）及びＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＭφ）は、トリゾール（抽出したＲＮＡ）に選別され、遺伝子発現はマウスＡｇｉｌｅｎｔ全ゲノム発現マイクロチップを使用して測定した。Ｂ−１ａ及びＬＰＭの差次的遺伝子発現は、ＬＰＳまたはアミロイド線維を注入したマウスからの発現データから、緩衝液を注入したマウスから単離した細胞からの遺伝子発現データを減ずることによって計算した（図６Ａ）。全マイクロアレイデータは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベースで利用できる（ＧＥＯシリーズ受入番号：ＧＳＥ７３０２６）。
【０１１１】
ＬＰＳによって誘発される遺伝子発現のパターンは、ＣＤ１４／ＴＬＲ４と結合する両方の細胞型で十分に特徴づけられる（Ｋａｗａｉ＆Ａｋｉｒａ（２０１０）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：  ３７３−３８４、Ｒｏｓｓｏｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（５）：３７９−４４６）、広範囲の炎症誘発性メディエータ（例えばＩＬ−６、ＴＮＦα、１型ＩＦＮ、セルピン、ＩＬ−１α及びβ、ケモカインＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ３、ＭＹＤ８８、及びＲｅｌＡ／ｐ６５  ＮＦｋＢによって誘導されることが周知の５０以上遺伝子）の誘発をもたらす（Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ２４（６）：１１８５−１１９４）。腹腔Ｍφで、アミロイド形成ペプチドは、ＬＰＳにより誘発されるものと明らかに異なる遺伝子のセットを刺激した。バリエーションを描写するために、ＭφのＬＰＳによって誘発される１セットの７３０注釈付遺伝子の相関のヒートマップは、２つのアミロイド形成ペプチドにより誘発される遺伝子発現の徴候が類似し、ＬＰＳの注入によって生成するパターンとは異なることを実証する（図６Ａ）。原線維によって優先して誘導される遺伝子の大部分は、Ｍφ刺激、サイトカインの産生、酸化的リン酸化及びミトコンドリア機能不全経路に対応した。酸化的リン酸化経路が誘発され、ミトコンドリア電子伝達及びＡＴＰ産生を伴う５つの複合体を含む、多数のミトコンドリア遺伝子の発現によって証明され、アミロイド線維とミトコンドリアの相互作用の特徴を示した（ＤｕＢｏｆｆ  Ｂ，Ｆｅａｎｙ  Ｍ，＆Ｇｏｔｚ  Ｊ（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ３６（６）：３２５−３３５）。
【０１１２】
Ｂ−１ａリンパ球の場合、ＬＰＳとペプチドの間のさほど鮮明でない違いが見られるが、原線維の２つのタイプにより誘発されるパターンはＬＰＳのものと識別可能である。これに対してＭφで、ＬＰＳ及びアミロイド形成ペプチドは、Ｂ細胞活性化の特徴を示す発現パターンを両方とも誘発した。アミロイド形成ペプチドは、ＣＤＣ４２小型エフェクタータンパク質、カルシウム放出（ｓｔｉｍ１、ｏｒａｉ１及び３）、ＢｃＲ（ＣＤ７９、Ｓｙｋ、Ｌｙｎ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍ−Ｔｏｒ、Ｂｃｌ２Ａ１ｄ、ｃ−ｓｒｃ、ＰＴＥＮ及びＶａｖ−１）ならびにＣＤ４０シグナリング（Ｔｒａｆ２、４及び５）を刺激し、これらのすべてはＮＦＫＢ活性化を誘発する。ＬＰＳ及びアミロイド形成ペプチドが、リンパ球活性化に伴う多数の類似遺伝子を誘発する場合でも、１セットの免疫抑制タンパク質（例えばＢＴＬＡ、ＩＲＦ４及びＳｉｇｌｅｃ  Ｇ）を誘発するアミロイド形成ペプチドについて明らかな差異を観察できる。
【０１１３】
チップから遺伝子発現データを確認するために、１セットの遺伝子をｑＰＣＲで分析した（図６Ｂ〜図６Ｄ）。これらの実験で、ＲＮＡは、マイクロアレイで行ったように、刺激剤の注入後、同一の方法及び類似の時間を使用して、Ｂ−１ａ、大及び小Ｍφから単離した。チップデータの経路解析と一致して、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１β及びＩＦＮβ１は、腹腔ＭφのＬＰＳによって及び最小限にペプチド線維によって、著しく誘発された。興味深いことに、ＳＰＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０ｌｏ／−Ｍφ）は、ＬＰＭ（ＣＤ１１ｂｈｉＦ４／８０ｈｉＭφ）より多くの炎症性遺伝子（特にＩＬ−１β）を均一に発現した。腹膜で、ＳＰＭはＭφ集団の１０％未満を構成し、原線維を貪食する優性細胞型ではなく、それらは、ＬＰＳまたは原線維の注入後、細胞の主に激減する集団を発現しない。対照的に、原線維は、免疫制御規則と関連する遺伝子のセット（Ｂ−１ａリンパ球のＢＴＬＡ、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ及びＩＲＦ４、ならびにＬＰＭのＣＤ２７４）を誘発した。ＬＰＳはいくつかを誘発し、それは遺伝子とは限らなかった。解析した遺伝子の第３のセットは、細胞活性化と関連することが周知のものだった。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びセマフォリン４Ｄは、Ｂ−１ａリンパ球のＬＰＳ及び原線維の両方、ならびにＭφの両方の種類によって誘発された。ＣＤ８３は主にＭφの両方の刺激により誘発され、一方でＣＤ７９ａ及びＲａｆｔｌｉｎはＢ−１ａリンパ球で誘発された。
【０１１４】
遺伝子発現のパターンは、アミロイド線維がＢ−１ａリンパ球及び腹腔Ｍφの両方の集団（ＳＰＭ及びＬＰＭ）を活性化することを示した。ＩＬ−１０遺伝子発現はＢ−１ａ及びＬＰＭで増加し、２つの細胞型がリンパ節へ輸送されるのが示された。Ｂ−１ａリンパ球のＢＴＬＡ及びＳｉｇｌｅｃ  Ｇの誘発は、それらの免疫制御表現型を増加させる。ＬＰＭのＩＬ−１０発現は、Ｍ２表現型へのこれらの細胞の転換と一致しており、炎症性反応を抑制するとも考えられている。
【０１１５】
気道への送達は、アミロイド形成ペプチドの治療有効性を保持する。腹腔注入は、ヒトのＢ−１ａリンパ球の活性化のための薬物投与の実用的な経路ではない。しかしＢ−１ａリンパ球は、マウス及びヒトの胸膜腔に豊富にある（Ｙｅｎｓｏｎ  Ｖ＆Ｂａｕｍｇａｒｔｈ  Ｎ（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１９０：１７−３４）。この代わりの投与経路が処理に実用的かつ十分であるかを試験するために、１０μｇのアミリン２８−３３を、１０匹のＣ５７ＢＬ／６ＥＡＥマウスのグループに毎日鼻腔内に投与した。疾患の麻痺徴候は、アミロイド形成ペプチドを腹腔内に注入したとき見られたものと同じように減少した（図７Ａ）。更にペプチド処理したマウスからの脾細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＭＯＧ３５−５５チャレンジに反応して、対照と比較して、炎症性サイトカイン、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＩＬ−１７の分泌の減少を示し（図７Ｂ）、パターンはアミリン２８−３３を注入したときと同一だった（Ｋｕｒｎｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５（１７９）：１７９ｒａ１４２）。
【０１１６】
気道への送達の成功は作用機序と一致し、そこでＢ−１ａリンパ球は中心的役割を果たし、ヒト患者の臨床試験で使用できる可能性がある投与経路も確認する。
【０１１７】
考察。アミロイド形成ペプチドからなるアミロイド線維は、広範囲の生物活性を示し、その全体は、多発性硬化症の強力なモデルにおいて、治療的な十分な大きさの免疫抑圧する反応を引き起こす。分子シャペロンとして、それらは、血漿中の一連の炎症誘発性メディエータを結合する。血液中、それらは好中球によって貪食され、それはｎｅｔの産生を誘発し、それにより形質細胞様樹状細胞を誘発して、１型ＩＦＮを分泌させる。ここで、原線維がＢ−１ａリンパ球及び大型腹腔ΜΦ（ＬＰＭ）として周知の腹腔ΜΦのサブセットの両方を結合し、活性化させることが示され（Ｇｈｏｓｎ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０７（６）：２５６８−２５７３）、それはＩＬ−１０転写を増加させ、腹膜から二次リンパ器官へ移動するように誘発される。流出は、炎症性Ｔリンパ球及びその相補抗原提示細胞と共通の免疫部位へのＩＬ−１０の選択的送達を引き起こす。ＩＬ−１０は、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα及びＩＦＮγ）の産生の減少によって、両方の炎症性細胞集団を効果的に阻害する。サイトカインのこの減少は、アミロイド形成ペプチドによってＥＡＥで誘発される免疫抑制の特徴であった。腹膜細胞は、ＣＮＳの炎症部位に移動しないと思われ、したがって血液脳関門を通過する必要はない。ノックアウトマウスは、その機構を確立するのが重要であった。ペプチドアミロイドがＢ細胞欠損μＭＴＥＡＥマウスの炎症を低減できないことは、Ｂ細胞の重要性を強調した。フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査は、腹膜で、Ｂ細胞集団の関連標的がＢ−１ａリンパ球（ＩＬ−１０の分泌型）だったことを確認するために使用した。ＩＬ−１０分泌性Ｂ−１ａリンパ球の役割への追加の証拠は、ＩＬ−１０−／−ＥＡＥマウスがアミロイド治療に反応しないことだった。作用機序におけるＩＬ−１０分泌性Ｂ−１ａリンパ球の役割の更なる証拠は、従来の養子移入実験から生じた。μＭＴマウスへの精製Ｂ−１ａリンパ球の養子移入は、Ｂ細胞欠損マウスをノンレスポンダーからアミロイド形成ペプチドへのレスポンダーに変化させた。重要な点は、Ｂ−１ａリンパ球だけの移動はＥＡＥの麻痺徴候を低減しないということだった。徴候は、原線維の注入後のみ低減し、それは移動した集団を活性化することを示した。
【０１１８】
活性化すると、Ｂ−１ａリンパ球及びＬＰＭは腹膜を離れるが、その輸送パターンはさほどはっきりしていない。これまでの実験は、Ｂ−１ａリンパ球のＬＰＳ活性が腹膜から脾臓への輸送を引き起こすことを確認した。Ｔｅｄｄｅｒらは、流入領域リンパ節に移動する制御性Ｂ細胞の脾臓集団の活性化を示した。養子移入した発光Ｂ−１ａリンパ球及びＬＰＭの実時間測定値を使用して、アミロイド線維の活性化が鼠径リンパ節への移入を引き起こすことが明らかになった。ＩＬ−１０レポーターマウスを使用するフローサイトメトリー実験は、輸送のタイミング及び位置の両方を裏づけた。
【０１１９】
腹腔内注入の場合、腹膜細胞の活性化は、血清の原線維により刺激されるいかなる生物活性にも先行すると予想され、したがって反応のより大きな割合に寄与するはずである。提示された作用機序は、アミロイド形成ペプチドの比較的長い薬物動態及び薬効と一致する。原線維自体は、数分で測定される予想される半減期がある。しかし、原線維は１セットの腹膜細胞を活性化し、それは治療薬であり、二次リンパ器官に移動し、免疫抑圧性ＩＬ−１０を分泌する。細胞は、ＥＡＥマウスの脊椎及び脳の炎症部位に移動しないと思われ、血液脳関門を通過せず、それはＥＡＥ病変のＢリンパ球の実証された欠乏と一致する。Ｂ−１ａリンパ球及びＬＰＭの結果は治療の薬効を示し、アミロイド形成ペプチドはそれを示さなかった。同様に反応の薬物動態で、原線維の注入後、麻痺徴候の減少の１、２日の遅延は、十分大きな割合の炎症Ｔリンパ球の免疫抑制と共に、活性化に必要な時間及び腹膜細胞の移動を反映する。相反的に治療の停止は、麻痺徴候の再発に２４〜７２時間の遅延を引き起こし、それは、原線維の半減期ではなく、ＩＬ−１０生産細胞によって誘発される免疫抑制の半減期と一致する。多くの点で、原線維の治療有効性は、従来の小分子薬物よりも養子性細胞療法の薬物動態に似ている。それらが循環炎症性抗原提示細胞及びＴリンパ球を抑制する、二次リンパ器官への免疫抑圧細胞の移動の提示した機序は、Ｂ制御細胞に関する公表された研究と一致する（Ｂａｕｍｇａｒｔｈ  Ｎ，Ｗａｆｆａｒｎ  ＥＥ，＆Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＴ（２０１５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕａｚｉｚ  ＪＤ，Ｙａｎａｂａ  Ｋ，＆Ｔｅｄｄｅｒ  ＴＦ（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２２４：２０１−２１４）。前記機序は、この治療法が多くの全身炎症徴候で有益な可能性があることも示す。
【０１２０】
原線維は、ＳＰＭで最も明らかに、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＩＬ−６の誘発と共に、付随する炎症反応を誘発する。この反応がなぜ免疫抑圧効果で優位を占めないのかは、大過剰なＬＰＭ及びＢ−１ａリンパ球、ならびに腹膜から二次リンパ組織へ急速に移動するより大きな傾向によって最も説明されることができる。
【０１２１】
原線維の気道投与による有効な治療は、ヒトの治療への翻訳にとって、特に胸膜腔でのＢ−１ａリンパ球の優位の点から良い前兆である。
【０１２２】
本明細書で開示したアミロイド形成ペプチドは、制御性Ｂ細胞を標的とする最初の治療とする。この細胞集団が炎症を制限している徴候の広範囲なリストは、炎症性または自己免疫要素を有する一連の状態でアミロイド線維を使用する方法の可能性を裏づける。
【０１２３】
当業者に理解されるように、本明細書に記載する各実施形態は、その特定の記載した要素、工程、成分またはコンポーネントを含むことができる、本質的にそれらからなることができる、またはそれらからなることができる。したがって「ｉｎｃｌｕｄｅ(含む)」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ(含んでいる)」という用語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ(を含む)、ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ(からなる)、またはｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ(本質的にからなる)」を列挙していると解釈されなければならない。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ(含む)またはｃｏｍｐｒｉｓｅｓ(含む)」という移行語は、これらに限定されないが、主要な量でも不特定の要素、工程、成分またはコンポーネントを含む、及びその含有を許容することを意味する。「からなる」という移行句は、特定しない任意の要素、工程、成分またはコンポーネントを排除する。「から本質的になる」という移行句は、実施形態の範囲を、特定する要素、工程、成分またはコンポーネントならびに実施形態に実体上影響しないものに制限する。実質的な効果は、ＭＳのＥＡＥ動物モデルの有効性で大幅な低減を引き起こす。
【０１２４】
特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されている材料の量、分子量などの特性、反応条件などを表現する数字はすべて、すべての場合に用語「約」で修飾されていると理解するべきである。したがって、特に異議を唱えない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて変更可能な近似値である。最低限でも、及び特許請求の範囲へ同等物の理論の適用を制限するための試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数の数を考慮して、及び通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるべきである。更なる明確さが求められる場合、「約」という用語は、明記した数値または範囲と関連して使用する場合、当業者によって合理的だとされる意味を有する。すなわち、記載した値の±２０％、記載した値の±１９％、記載した値の±１８％、記載した値の±１７％、記載した値の±１６％、記載した値の±１５％、記載した値の±１４％、記載した値の±１３％、記載した値の±１２％、記載した値の±１１％、記載した値の±１０％、記載した値の±９％、記載した値の±８％、記載した値の±７％、記載した値の±６％、記載した値の±５％、記載した値の±４％、記載した値の±３％、記載した値の±２％、または記載した値の±１％の範囲内で、記載した値または範囲の多少多いまたは多少少ないものを示す。
【０１２５】
本発明の広範囲で示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、具体例に記載の数値は可能な限り正確に報告する。しかし、いずれの数値も、本質的にそれらそれぞれの試験測定で見いだされる標準偏差から必然的に生じる、一定の誤差を含む。
【０１２６】
本発明で示されるもの関連して使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び類似の指示物の使用は、本明細書で示されるまたは文脈により明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を対象とすると解釈される。本明細書で範囲の記載は、その範囲内に入るそれぞれ別個の値を個別に指す簡単な方法として機能することを、単に意図している。本明細書で特に指示がない限り、各個別の値は、それが本明細書中で個別に引用されるように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特に指示がない限り、または文脈により明確に否定されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供するあらゆる例または例示的な語句（例えば「など」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図するにすぎず、特に主張がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の用語は、任意の非請求の要素を、本発明の実施に必須のものと示していると解釈されるべきではない。
【０１２７】
本明細書に記載する発明の別の要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈してはならない。各グループのメンバーは、個別にまたは本明細書に見いだされるグループの他のメンバーまたは他の要素と組み合わせて言及及び特許請求される場合がある。グループの１つ以上のメンバーが、便宜上及び／または特許性の理由により、グループに含有される、またはそこから削除される場合があることは予想される。任意のこのような包含または削除が起きる場合、明細書は、添付する特許請求の範囲で使用するすべてのマーカッシュ形式グループの明細書で実施されるように、このような改変したグループを含むとみなされる。
【０１２８】
本発明の特定の実施形態は本開示に記載され、本発明を実施するために本発明者らに周知の最良の態様を含む。当然のことながら、これらの記載した実施形態の変形は、前述の説明を読んだ当業者には明らかであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を必要に応じて用いることを予期し、本発明者らは、本発明が具体的に本開示に記載されたものと異なって実行されることを意図する。したがって本発明は、準拠法により許容された添付の特許請求の範囲に記載の内容のすべての改変及び等価物を含む。更にそれらのすべての可能な変形での上述した要素の任意の組み合わせも、本明細書中に特に記載されない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【０１２９】
更に多数の参照が、本明細書全体を通して特許、出版物、論文及び他の文章に行われた（本明細書で「参照文献」という）。それぞれの参照文献は、個別にその特定の引用した教示について、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
最後に、本明細書に記載する本発明の実施形態が、本発明の原理の例示であることは理解されるべきである。使用できる他の改変も本発明の範囲内である。したがって、例えばこれに限定されないが、本明細書の教示に従って本発明の別の構成を利用することができる。したがって、本発明は以前に示した及び記載したものに限定されない。
【０１３１】
本明細書に示す事項は例示的なものであり、本発明の好ましい実施形態を説明する目的のためであって、本発明の種々の実施形態の原則及び概念的態様の説明で最も有効かつ容易に理解されるものを提供するために示される。この点において、本発明の基本的な理解に必要であるものより詳細に本発明の構造を示す試みはしておらず、当業者であれば、図面及び／または実施例と併せて本明細書を読めば本発明のいくつかの形態を実施する際どのように具体化するかが明らかである。
【０１３２】
本開示で使用する定義及び説明は、次の実施例で明らかかつ明確に改変されていない限り、またはその意味を適用した場合いずれかの解釈が無意味もしくは本質的に無意味にならない限り、いずれかの未来の解釈で制御されることを意味ならびに意図する。用語の解釈が無意味または本質的に無意味になる場合、定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版またはＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）などの当業者に周知の辞書から引用すべきである。
【図１Ａ】
2018534330.tif 000003
【図１Ｂ】
2018534330.tif 000004
【図１Ｃ】
2018534330.tif 000005
【図２Ａ】
2018534330.tif 000006
【図２Ｂ】
2018534330.tif 000007
【図２Ｃ】
2018534330.tif 000008
【図２Ｄ】
2018534330.tif 000009
【図３】
2018534330.tif 000010
【図４Ａ】
2018534330.tif 000011
【図４Ｂ】
2018534330.tif 000012
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2018534330.tif 000014
【図４Ｅ】
2018534330.tif 000015
【図４Ｆ】
2018534330.tif 000016
【図５】
2018534330.tif 000017
【図６Ａ】
2018534330.tif 000018
【図６Ｂ】
2018534330.tif 000019
【図６Ｃ】
2018534330.tif 000020
【図６Ｄ】
2018534330.tif 000021
【図７Ａ】
2018534330.tif 000022
【図７Ｂ】
2018534330.tif 000023
【図８】
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【配列表】
2018534330000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月7日(2018.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2018534330.tif 000025
2018534330.tif 000026
2018534330.tif 000027
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