(57)【要約】  本発明は、（ｉ）アジュバントと、（ｉｉ）担体タンパク質に結合する少なくとも１つの融合ペプチドとを含んでなり、前記担体タンパク質はジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ）であり、前記少なくとも１つの融合ペプチドは、配列番号１〜７および１５〜６０ならびに前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる、ワクチン組成物を提供する。本発明はまた医薬組成物、ならびに必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌の治療または予防のために、本明細書に記載のようにワクチンおよび／または医薬組成物を使用する方法にも及ぶ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アジュバントと、
（ｉｉ）担体タンパク質に結合する少なくとも１つの融合ペプチドと
を含んでなり、
該担体タンパク質はジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号６１）であり、かつ
該少なくとも１つの融合ペプチドは、配列番号１〜７および前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる、
ワクチン組成物。
【請求項２】
前記融合ペプチドが、配列番号８〜１４および前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記融合ペプチドが、配列番号８〜１４のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記融合ペプチドが、配列番号８〜１４のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記融合ペプチドが、配列番号８〜１４のいずれかと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記融合ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９のアミノ酸配列または配列番号８もしくは配列番号９と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記融合ペプチドが、配列番号８または配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記融合ペプチドが、配列番号８または配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記融合ペプチドが、配列番号８または配列番号９と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記融合ペプチドが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記担体タンパク質が２〜３９の融合ペプチドを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記担体タンパク質が６〜１２の融合ペプチドを含んでなる、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化燐灰石、フロイントの完全アジュバント、モンタニド（商標）、フロイントの不完全アジュバント、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバント、マトリックスＭＴＭアジュバント、マトリックスＣＴＭアジュバント、マトリックスＱＴＭアジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭまたはＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ誘導体、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体を含有するアジュバント、およびＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントがモンタニドである、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
チェックポイント阻害剤をさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１８】
必要とする患者において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防する方法であって、該患者に有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物または請求項１７に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項１９】
前記癌が乳癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が胃癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
必要とする患者において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２２】
前記癌が乳癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記癌が胃癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
必要とする患者において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌の治療または予防に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物または請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記癌が乳癌である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
前記癌が胃癌である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、癌関連タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕのフラグメントを含んでなるワクチン組成物、このような組成物を製造する方法、およびＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の発現または過剰発現を特徴とする癌の予防または治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌原遺伝子によりコードされるＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍抗原は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体ファミリーに属する１８５ｋＤａのタンパク質である。この抗原はいくつかのグリコシル化部位を有するシステインに富んだ細胞外ドメイン（ＥＣＤ、アミノ酸２３〜６５２）、疎水性膜貫通ドメイン（アミノ酸６５３〜６７５）および細胞内チロシンキナーゼドメイン（アミノ酸６７６〜１２５５）からなる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体は、様々な上皮細胞種の細胞膜で発現され、特定の増殖因子の結合を介して細胞増殖および分裂の側面を調節する。
【０００３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、多くの正常細胞において低レベルで発現されるが、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌および唾液腺癌を含む様々な癌では過剰発現される。例えば、転移性乳癌のおよそ３０％はＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現することが知られている。この過剰発現は、無再発期間の現象および生存期間の短縮に対応するので、乳癌患者の不良な予後に関連している。現在、乳癌治療の最も一般的な形態は、手術、化学的介入および／または放射線療法を含む。癌が境界領域に限定されていなければ、手術だけでは癌を除去することができない。さらに、放射線処置ならびに化学療法は、重篤な負の副作用を伴い得る。
【０００４】
現行療法に付随する不利益を鑑みて、乳癌などの増殖性障害を処置するための、免疫療法をはじめとするさらなるアプローチを見出す試みがなされてきた。
【０００５】
腫瘍におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現の臨床的意味合いは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを、単独のまたは従来の化学療法との組合せとしての抗体媒介免疫療法の魅力的な標的にした。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｄ５は、アポトーシス、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性(complement-dependent cytotoxicity)（ＣＤＣ）などの直接的および間接的機序により、マウスにおいてＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖を低減することが示されている。これらの結果に基づき、この抗体のヒト化型であるトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））が臨床試験で検討された。細胞傷害性処置＋ハーセプチン（商標）の後に、化学療法またはトラスツズマブ単独に比べてＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現する乳房腫瘍を有する患者の全生存期間の延長が見られた。ハーセプチン（商標）は、現在、単剤療法として使用されているが、細胞傷害性化学療法と組み合わせるとはるかに高い有効性を示す。しかしながら、トラスツズマブは一般に、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体が過剰発現される乳癌においてのみ有効であることに留意されたい。さらに、多回の注入が典型的には必要とされ、高い治療コストとなる。
【０００６】
トラスツズマブなどのモノクローナル抗体による受動免疫療法を用いるＨｅｒ２／ｎｅｕ関連癌に対する別の治療または予防アプローチは、腫瘍特異的な体液性および／または細胞性免疫応答の誘導とヒトＢリンパ球およびＴリンパ球により認識される抗原の同定に基づくものである。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン(extracellular domain)（ＥＣＤ）に対する多くの抗体が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現する細胞でマウスを免疫することにより生成されている。これらの抗体の生物学的効果はエピトープ特異的であると考えられ；すなわち、それはＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤ内の短い部分配列の特異的認識に基づくものである。しかしながら、いくつかの抗体は効果が無いかまたは腫瘍増殖を活発に刺激しさえする。
【０００７】
癌に対するこのようなワクチン免疫療法は、体液性および／または細胞性応答が惹起される抗原に基づくものであった。これらの抗原は、理想的には、もっぱら腫瘍細胞により発現または過剰発現されるべきであり、しばしば腫瘍関連抗原(tumour-associated antigens)（ＴＡＡ）と呼ばれる。乳癌に関して記載された最初のＴＡＡの１つがＨｅｒ２／ｎｅｕであった。一方、異なるエピトープを表す種々のＴＡＡが試験されたが、これまでに首尾良く臨床実施に進んだものはない。
【０００８】
一般に、意図される免疫応答のタイプ（すなわち、Ｂ応答またはＴ細胞応答）によって、異なる戦略が典型的には適用される。例えば、Ｂ細胞（すなわち、抗体）応答を誘導するためには、抗原はＢ細胞エピトープを含んでなるべきである。当技術分野で一般に理解されているように、Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞受容体により認識および結合される抗原の部分である。脂質、多糖およびタンパク質／ペプチドは、選択生物に導入される際に、Ｂ細胞に、導入されたエピトープと特異的に結合する抗体を産生させるＢ細胞エピトープを含有し得る。
【０００９】
Ｂ細胞エピトープを含む、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの個々のフラグメントは当技術分野で公知である。例えば、ＷＯ２００２／０６８４７４は、配列がＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の細胞外部分に見られる、９〜２５アミノ酸のペプチドを含んでなるワクチンを記載している。さらに、ＷＯ２００７／１１８６６０は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の細胞外部分に見られるような種々のアミノ酸配列を呈するペプチドの特定の組合せを含んでなるマルチペプチドワクチンを記載している。これらのペプチドは、個別に、またはそれぞれ好ましくは送達系に個々に結合した複数の離散型ペプチドの形態で組み合わせて投与することができる。さらに別の態様では、ＷＯ２０１１／０２０６０４は、ビロソーム送達系に結合された複数のＨｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープを含んでなる融合ペプチドを記載している。これらのビロソーム(virosome)は、モンタニドＴＭまたはＩＳＣＯＭに基づく送達系とともに処方された同じ融合ペプチドに比べて、単一のＢ細胞エピトープに対してより高い抗体力価を誘導することが示された。
【００１０】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する免疫を誘導するための好適なワクチンを開発するいくつかの試みにもかかわらず、臨床使用に有効なワクチンはまだない。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌などの病態を治療または予防するためのワクチンとして使用するのに好適な改良組成物を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書は、
（ｉ）アジュバントと、
（ｉｉ）担体タンパク質に結合した少なくとも１つの融合ペプチドと
を含んでなり、
前記担体タンパク質はジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ；配列番号６１）であり、
前記少なくとも１つの融合ペプチドは、配列番号１〜７および１５〜６０ならびに前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる、
ワクチン組成物を記載した。
【００１２】
本明細書はまた、本明細書に記載のワクチン組成物と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を記載する。
【００１３】
本明細書はまた、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防する方法であって、前記患者に有効量の本明細書に記載のワクチン組成物または本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法を記載する。
【００１４】
本明細書はまた、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防するための薬剤の製造における本明細書に記載のワクチン組成物の使用を記載する。
【００１５】
本明細書はまた、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌の治療または予防において使用するための本明細書に記載のワクチン組成物または医薬組成物を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの４回の免疫誘導の後に得られた血清サンプルの抗Ｐ４抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図２】図２は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの４回の免疫誘導の後に得られた血清サンプルの抗Ｐ６抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図３】図３は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの４回の免疫誘導の後に得られた血清サンプルの抗Ｐ７抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図４】図４は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの４回の免疫誘導の後に得られた血清サンプルの抗Ｐ４６７抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図５】図５は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの４回の免疫誘導の後に得られた血清サンプルの抗Ｐ６４７抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図６】図６は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの２回目（ＢＡ１；１回目の採血）、３回目（ＢＡ２；２回目の採血）および４回目（ＢＡ３；３回目の採血）の免疫誘導から２週間後に得られた血清サンプルの抗Ｐ４６７抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図７】図７は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの２回目（ＢＡ１；１回目の採血）、３回目（ＢＡ２；２回目の採血）および４回目（ＢＡ３；３回目の採血）の免疫誘導から２週間後に得られた血清サンプルの抗Ｐ６４７抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。
【図８】図８は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチド（１５、３０、５０μｇ）またはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ；３０μｇ）を組み込んだビロソーム処方物での２回目（ＢＡ１；１回目の採血）および３回目（ＢＡ２；２回目の採血）の免疫誘導から２週間後に得られた血清サンプルからの抗体はＨｅｒ２／ｎｅｕの組換えＥＣＤに結合可能であることを示す。データはＯＤ値として表す。
【図９】図９は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチド（１５、３０、５０μｇ）またはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ；３０μｇ）を組み込んだビロソーム処方物での２回目（ＢＡ１；１回目の採血）の免疫誘導から２週間後に得られた血清サンプルからの組換えＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体を示す。データはＯＤ値として表す。
【図１０】図１０は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチド（１５、３０、５０μｇ）またはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ；３０μｇ）を組み込んだビロソーム処方物での４回目（ＢＡ３；３回目の採血）の免疫誘導から２週間後に得られた血清サンプルからの組換えＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体を示す。データはＯＤ値として表す。
【図１１】図１１は、Ｐ４６７またはＰ６４７融合ペプチドを含んでなるＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ；３０μｇ）での２回目、３回目および４回目の免疫誘導後の組換えＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体力価の動態を示す。血清は１：４，０００希釈でアッセイした。データはＯＤ値として表す。
【図１２】図１２は、ビロソームまたはＣＲＭ１９７に３０μｇの濃度で結合したＰ４６７融合ペプチドでの２回目、３回目および４回目の免疫誘導後の抗体力価の直接比較を示す。各群の左から右に：プール前（免疫誘導前に採取した血液）；ＴＩＲＩＶ（エンプティービロソーム）；Ｐ４６７−３０ｍｇ／マウス（ビロソームコンジュゲート）；Ｐ４６７−３０ｍｇ／マウス−ＣＲＭ（ＣＲＭ１９７コンジュゲート）。総ての血清を同じ希釈率でアッセイした。データはＯＤ値として表す。
【図１３】図１３は、ビロソームまたはＣＲＭ１９７に３０μｇの濃度で結合したＰ６４７融合ペプチドでの２回目、３回目および４回目の免疫誘導後の抗体力価の直接比較を示す。各群の左から右に：事前プール（免疫誘導前に採取した血液）；ＴＩＲＩＶ（エンプティービロソーム）；Ｐ６４７−３０ｍｇ／マウス（ビロソームコンジュゲート）；Ｐ６４７−３０ｍｇ／マウス−ＣＲＭ（ＣＲＭ１９７コンジュゲート）。総ての血清を同じ希釈率でアッセイした。データはＯＤ値として表す。
【図１４】図１４は、Ｐ４６７もしくはＰ６４７融合ペプチドまたはＣＲＭ１９７−融合タンパク質コンジュゲート（ＣＲＭ）を組み込んだいずれかのビロソームでの免疫誘導は、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞の表面に発現された天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合し得る抗体を誘導したことを示す。データはＯＤ値として表す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの３種類の用量のＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質の後のマウスにおける抗Ｐ４６７  ＩｇＧ抗体力価を示す。抗体力価を、Ｐ４６７ペプチド単独（Ｐ４６７；２５μｇ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバン（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたレベルと比較した。データはＯＤ値として表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの３種類の用量のＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質の後のマウスにおける抗Ｐ４６７  ＩｇＧ１抗体力価を示す。抗体力価を、Ｐ４６７ペプチド単独を投与した対照動物で見られたレベルと比較した。データはＯＤ値として表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））とともにまたはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの３つの用量のＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質の後のマウスにおける抗Ｐ４６７  ＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。抗体力価を、Ｐ４６７ペプチド単独（Ｐ４６７；２５μｇ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバン（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたレベルと比較した。データはＯＤ値として表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１６Ａ】図１６Ａは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの３つの用量のＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質の後のマウスにおける抗細胞外Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ抗体力価を示す。抗体力価を、Ｐ４６７ペプチド単独（Ｐ４６７；２５μｇ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバン（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたレベルと比較した。データはＯＤ値として表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの３つの用量のＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質の後のマウスにおける抗細胞外Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ１抗体力価を示す。抗体力価を、Ｐ４６７ペプチド単独（Ｐ４６７；２５μｇ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバン（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたレベルと比較した。データはＯＤ値として表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７Ａ】図１７Ａは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞によるＩＬ−２産生を示す。ＩＬ−１２レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物に由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞で見られたＩＬ−２レベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；＊＊ｐ＜０．０１およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞によるＩＬ−２産生を示す。ＩＬ−１２レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した投与対照動物に由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞で見られたＩＬ−２レベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図１８Ａ】図１８Ａは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞によるＩＦＮγ産生を示す。ＩＦＮγレベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物に由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞で見られたＩＦＮγレベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；＊ｐ＜０．０５およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞によるＩＦＮγ産生を示す。ＩＦＮγレベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物に由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞で見られたＩＦＮγレベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図１９Ａ】図１９Ａは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞によるＩＬ−５産生を示す。ＩＬ−５レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物に由来する、ＣＲＭ１９７により活性化された脾細胞で見られたＩＬ−５レベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、単独で（Ｐ４６７−ＣＲＭ）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスに由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞によるＩＬ−５産生を示す。ＩＬ−５レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物に由来する、Ｐ４６７により活性化された脾細胞で見られたＩＬ−５レベルと比較した。データはｐｇ／ｍｌとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３＋ＣＤ４＋脾細胞（Ｔリンパ球）の分布を示す。ＣＤ３＋ＣＤ４＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３＋ＣＤ４＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３＋ＣＤ８＋脾細胞（Ｔリンパ球）の分布を示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３＋ＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３−ＣＤ１９＋脾細胞（Ｂ細胞）の分布を示す。ＣＤ３−ＣＤ１９＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３−ＣＤ１９＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３３５＋脾細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の分布を示す。ＣＤ３３５＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３３５＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして示す；＊ｐ＜０．０５およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニド（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）とともに投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋脾細胞（ＩＦＮγ産生Ｔ細胞）の分布を示す。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして表す；ｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋脾細胞（ＩＦＮγ産生Ｔ細胞）の分布を示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数に対するパーセンテージとして表す；＊ｐ＜０．０５およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、Ｂｒｅｎｎｔａｇからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）、Ｓｅｒｖａからのミョウバンとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン（Ｓｅｒｖａ））またはモンタニドとともに（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）投与した１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのＰ４６７−ＣＲＭ１９７融合タンパク質で免疫誘導したマウスにおける、犠牲時のＣＤ３３５＋ＩＦＮγ＋脾細胞（ＩＦＮγ産生Ｔ細胞）の分布を示す。ＣＤ３３５＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージを、ミョウバン単独（ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ））、モンタニド単独（モンタニド）またはＣＲＭ１９７単独（ＣＲＭ）を投与した対照動物で見られたＣＤ３３５＋ＩＦＮγ＋脾細胞のパーセンテージと比較した。データは全細胞数のパーセンテージとして表す；＊ｐ＜０．０５およびｎｓ＝統計的に有意でない。
【図２２】図２２は、ミョウバン（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）またはモンタニド（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）のいずれかとともに１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇで投与したＰ４６７−ＣＲＭペプチド構築物の最終投与後３週間（ＢＡ２）、８週間（ＢＡ３）、１６週間（ＢＡ４）および６か月（ＢＡ５）の時点でのＰ４６７ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。各クラスターの左から右へ：ＢＡ２、ＢＡ３、ＢＡ４、ＢＡ５および事前採血。
【図２３】図２３は、ミョウバン（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋ミョウバン）またはモンタニド（Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニド）のいずれかとともに１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇで投与したＰ４６７−ＣＲＭペプチド構築物の最終投与後３週間（ＢＡ２）、８週間（ＢＡ３）、１６週間（ＢＡ４）および６か月（ＢＡ５）の時点でのＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的ＩｇＧ抗体力価を示す。データはＯＤ値として表す。各クラスターの左から右へ：ＢＡ２、ＢＡ３、ＢＡ４、ＢＡ５および事前採血。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、限定を意図しない。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価ないずれの材料および方法も本発明を実施するために使用可能である。実務者であれば、当技術の定義および用語ならびに当業者に公知の他の方法について、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y., and Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York, Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87を参照することができる。
【００１８】
本明細書を通じ、文脈がそうではないことを要求しない限り、用語「含んでなる(comprise)」、または「含んでなる(comprises)」もしくは「含んでなる(comprising)」などの変形形態は、述べられた要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を意味するが、他の任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味するものではないと理解される。
【００１９】
「からなる」とは、「からなる」の句に続くものを含み、限定することを意味する。よって、「からなる」の句は、列挙された要素が必要または必須であること、および他の要素が存在してはいけないことを示す。「から本質的になる」とは、この句の後に列挙されるいずれの要素も含み、列挙された要素に関して本開示に明示された活性または作用に干渉しないまたは寄与する他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」の句は、列挙された要素が必要または必須であること、しかしながら、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかによって存在してもよく、または存在してはならないことを示す。
【００２０】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の態様を含む。よって、例えば、「１つの細胞」という場合には、単細胞、ならびに２つ以上の細胞を含み；「１個の生物」という場合には、１個の生物、ならびに２個以上の生物を含むなどである。
【００２１】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別子番号（配列番号）により表される。配列番号：配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２などに数字的に対応する。配列識別子の要約は本明細書に示される。
【００２２】
本開示は、少なくとも１つには、（ｉ）アジュバントと、（ｉｉ）非毒性ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ）に結合したＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に由来する複数のＢ細胞エピトープの融合ペプチドとを含んでなるワクチン組成物が、ビロソームなどの送達系を使用することにより達成可能なものよりはるかに優れた抗原特異的抗体応答を惹起できるという、本発明者らの驚くべき発見に基づく。
【００２３】
よって、１つの側面では、
（ｉ）アジュバントと、
（ｉｉ）担体タンパク質に結合した少なくとも１つの融合ペプチドと
を含んでなり、
前記担体タンパク質はジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ；配列番号６１）であり、
前記少なくとも１つの融合ペプチドは、配列番号１〜７および１５〜６０ならびに前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる、
ワクチン組成物が提供される。
【００２４】
Ｂ細胞エピトープ
本明細書で使用する場合、用語「Ｂ細胞エピトープ」は、Ｂ細胞受容体（抗体）により認識される分子の部分を意味する。よって、「Ｂ細胞エピトープ」は、抗原の小さな部分配列であると理解されるべきであり、前記エピトープ部分配列は抗体により認識され得る。抗原は複数のＢ細胞エピトープを含有してよく、従って、複数の異なる抗体により結合可能であるが、この抗原の所与のエピトープフラグメントは一般に、１つの抗体によってのみ結合される。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、それらの最も広い意味で、２つ以上のアミノ酸残基、またはアミノ酸類似体の分子を意味して使用される。アミノ酸残基はペプチド結合により、あるいはまた例えばエステル、エーテルなどの他の結合により連結され得るが、ほとんどの場合、ペプチド結合により連結される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、自然に存在するおよび自然に存在しないまたは合成アミノ酸（Ｄ型またはＬ型の両方を含む）とアミノ酸類似体の両方を包含する。「アミノ酸類似体」は、その対応する自然に存在するアミノ酸と１以上の原子で異なる自然に存在しないアミノ酸として理解されるべきである。例えば、システインのアミノ酸類似体はホモシステインであり得る。
【００２７】
当業者は、あるペプチドがＨｅｒ２／ｎｅｕのＢ細胞エピトープであるかどうかをどのようにして決定すればよいかを知っている。実例では、ペプチドは、ヒトまたはマウス生殖細胞系によりコードされている抗体により認識されることが知られている既知の配列および／または部分配列のデータベースを用いて対象とするペプチドの配列を比較する、確立されたコンピュータープログラムを使用することにより、Ｂ細胞エピトープである、またはＢ細胞エピトープを含んでなると高精度で同定され得る。あるいは、所与のペプチドまたはポリペプチド内のＢ細胞エピトープは、表面接近性、鎖のフレキシビリティー、ヒドロパシー／親水性(hydropathy/hydrophilicity)特性、予測される二次構造などの抗原性の相関物の種々の組合せを用いてコンピューター支援分析により同定することができる。あるいは、対象とするペプチドは、対象とするペプチドで動物を少なくとも１回免疫して免疫応答を惹起させ、次に、投与されるペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体に関して動物の血清を、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット解析またはスポット−ブロット分析を用いて検定することによって、Ｂ細胞エピトープである、またはＢ細胞エピトープを含んでなると同定され得る。対象とするペプチドがＢ細胞エピトープであるかどうかを決定するための方法のより詳細な説明は、以下の例６および７に記載されている。
【００２８】
以下の表１は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を、その誘導体を含めて示す。
【００２９】
【表１】
2018511659.tif 000002
2018511659.tif 000003
2018511659.tif 000004
【００３０】
本明細書に開示される実施形態では、２つ以上のＢ細胞エピトープは、表１および２に示されるように配列番号１〜７および１５〜６０、ならびに前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有する（すなわち、配列番号１〜７および１５〜６０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する）アミノ酸配列からなる群から選択される。本明細書に開示される別の実施形態では、２つ以上のＢ細胞エピトープは、配列番号１〜７および前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有する；すなわち、配列番号１〜７のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。これらのＢ細胞エピトープはいずれも天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕにおいて連続していないことに留意されたい。
【００３１】
配列番号１〜７および１５〜６０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤの天然（すなわち、自然に存在する）Ｂ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのその位置には存在しない別のアミノ酸で、そのアミノ酸置換が保存性を維持するように置換することにから生じる誘導体を含む。誘導体は、中間体および／もしくは最終産物において融合ペプチドの安定性を高めるために、または中間体および／もしくは最終産物において融合ペプチドの溶解度を高めるために、または融合ペプチドの免疫原性を高めるために作製され得る。好適な誘導体を作製するための方法は当業者に公知である。実例としては、誘導体の合成または変異型核酸分子を用いたその組換え生産を含む。さらに、誘導体は一般に、本明細書の他所に記載されるようにＢ細胞エピトープとしてのその質を保持する。よって、本明細書ではまた、天然配列に対するアミノ酸置換がＢ細胞エピトープとして機能するその誘導体の能力を無効にしない、または完全には無効にしない「機能的」誘導体も開示される。
【００３２】
付加的または最適化免疫刺激融合ペプチドの同定はまた、誘導体による免疫エフェクター細胞の刺激の有効性の決定として、融合ペプチドによるＢ細胞の刺激と誘導体によるＢ細胞の刺激を比較する工程を含み得る。誘導体を既知の融合ペプチドと比較することにより、免疫細胞刺激増強特性を有するペプチドが作製できる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「保存的置換」は、所与の位置で、およそ等価な大きさ、電荷および／または極性のアミノ酸での置換となるようにアミノ酸同一性を変化させることを意味する。アミノ酸の自然の保存的置換の例としては、以下の８つの置換群が含まれる（慣例の文字コードで記載する）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）Ｅ、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓ。
【００３４】
誘導体はまた、機能的に等価なアミノ酸置換からも生じ得る。本明細書で使用する場合、これらは、実施された場合に、１または複数のエピトープフラグメントを含んでなる融合ペプチドが投与された動物由来の血清に基づき、相当する誘導体化が無い融合ペプチドと比べた際に同一または同等（例えば１０％以内）のＥＬＩＳＡ読み取りを示す融合ペプチドをもたらすアミノ酸置換と理解されるべきである。融合ペプチドの抗原性は、例えば、動物の免疫誘導により惹起された抗体の力価を例えば、例６および７に記載されるようにＥＬＩＳＡにより測定することによって決定され得る。類似の方法を用いて、保存的またはそれ以外のアミノ酸置換の機能的等価性をアッセイすることもできる。例えば、非誘導体化「親」フラグメントを含んでなる融合ペプチドにより惹起された免疫応答が、同じアッセイを用いて、誘導体化フラグメントを含んでなる融合ペプチドにより惹起されたものと比較される。誘導体化フラグメントを含んでなる融合ペプチドにより惹起された免疫応答が非誘導体化フラグメントを含む融合ペプチドにより惹起されたものと同等に強ければ、そのアミノ酸置換は、機能的に等価と見なすことができる。その誘導体化免疫応答が非誘導体化のものより優れていれば、そのアミノ酸置換は改良されたものと見なすことができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「天然」および「自然」は、自然界に通常存在するような分子の形態を意味する。従って、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの「天然」配列は、従前に公開されているＨｅｒ２／ｎｅｕアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０４６２６；ＥＲＢＢ２＿ＨＵＭＡＮ）のアミノ酸残基２３〜６５２を意味する。逆に、「非天然リンカー」を含む「非天然」配列は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの天然配列に属さないアミノ酸配列である。よって、本明細書に開示されている実施形態では、ペプチド系「非天然リンカー」は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの隣接する天然配列に接続する、Ｈｅｒ２／ｎｅｕフラグメントいずれの延長物にも相当しない。
【００３６】
融合ペプチド
複数のエピトープ／ペプチドに基づく、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現またはＨｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現癌のための免疫予防および／または免疫治療ワクチン組成物の設計は、離散型（すなわち、分離型）のペプチドとしてのこのようなペプチドの投与を含んでいた。これはある特定の暗黙の欠点を持つ。例えば、同じ組成物内で複数のペプチドを同時に投与することは、これらのペプチドが凝集し、それにより、宿主の免疫系に対して意図されるそれらのアベイラビリティーを低下させるというリスクを侵す。極端な場合、このような凝集物の溶解度が低下する場合があり、その結果、それらの凝集物が沈澱し、宿主の免疫系が利用できなくなる。同時に、このようなペプチドを異なる溶液で、異なる時点で別に投与すると、このようなペプチドの免疫原性効果が有利な形で組み合わせられる見込みが小さくする。
【００３７】
ビロソーム、リポソームまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのある種の送達系で複数の単一のエピトープが使用される場合にはさらなる困難が生じる。再現性のあるワクチン生産を可能とするためには、定義された濃度のエピトープを提供することが有利である。しかしながら、複数のペプチドフラグメントをビロソームまたはリポソームなどの単一の送達系にカップリングする（すなわち、共有結合させる）と、各送達系に同数のエピトープをカップリングさせることを保証するのが困難である。送達系当たりのカップリング数の変動は常に存在する。各実行可能な送達系が例えばエピトープＡおよびＢのそれぞれにカップリングされることは比較的確実であり得るが、いくつかの送達系は意図されるよりもやや多くのエピトープＡと会合し、他のものでは、エピトープＢが意図される量をやや超える。エピトープＡおよびＢのガウス分布はフラグメントＡ：Ｂの意図される比に集中する傾向があり、定義上はいずれのガウス分布もアウトライアーを含み、最大免疫原性有効性から外れている可能性がり、かつ、送達系において意図されるエピトープ比を維持するための要件がよりストリンジェントになるので除外するのにますますコストと労力がかかるにはこれらのアウトライアーである。同様の懸念が、あるＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤフラグメントと別のものの所望の比を実現する試みにおいて、異なるエピトープフラグメントと会合されたビロソームなどの送達系を組み合わせた際にも当てはまる。
【００３８】
本明細書では、上記の欠点を克服する、または少なくとも部分的に緩和するアプローチが開示される。単一の融合ペプチドにおいて、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤに由来する少なくとも２つの不連続Ｂ細胞エピトープ、またはそれらの誘導体を連結することにより、１種類のみの融合ペプチドが存在する均質な処方物が達成できる。融合ペプチドの要素（すなわち、天然ＥＣＤが不連続であるＨｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤのエピトープ）はどのペプチドでも同じであり、所望でないポリペプチド内およびポリペプチド間相互作用が最小となるように選択（または選択および修飾）することができる。
【００３９】
本明細書に記載の実施形態では、ワクチン組成物は単一種の融合ペプチドを含んでなる。よって、存在するＢ細胞エピトープの比は、最終的には、融合ペプチドにおけるこれらのフラグメントの比により記載される。これは、免疫原性応答を惹起するために望まれる比が、融合ペプチドの構築および設計のレベルで簡単かつ確実に固定され得ることを意味する。
【００４０】
最後に、本明細書に記載の融合ペプチドを送達するための担体タンパク質としての非毒性ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７を使用した場合、あるＨｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープと他の任意のその天然に不連続のＢ細胞エピトープの比は、前述のようにこの比は単一の融合ペプチドのレベルで決定されるので、どのくらいの融合ペプチドが担体タンパク質と結合しているかに関わらずに一定を維持することから、ワクチン組成物中の各Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープの相対的分布に関連する変動は最小化または回避され得る。
【００４１】
本明細書に開示される他の実施形態では、ワクチン組成物は、２種類以上の融合ペプチドを含んでなる。
【００４２】
本明細書に開示されるワクチン組成物は、それが投与される宿主において抗原特異的抗体応答を惹起する。驚くべきことに、ワクチン組成物より惹起される抗原特異的応答は、個々にＨｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープを用いて、またはビロソームなどの代替送達系を用いて得ることのできる免疫応答の何桁も大きい。よって、本発明は、ペプチドをビロソームに組み込むための複雑な製造方法、多くの場合に複数の個々のペプチドを送達系に組み込む試みに関連した変動、および得られるワクチン組成物の有効性を損ない得る別個のＢ細胞エピトープフラグメント間の潜在的に有害な相互作用という欠点を回避または少なくとも最小にする。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「融合ペプチド」は、例えばペプチド（アミド）結合により互いに連結された、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープ（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれを超える不連続Ｂ細胞エピトープ）から構成される非天然ペプチドを意味する。本明細書で開示される実施形態では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの２つ以上のＢ細胞エピトープは、それらの天然状態で、すなわち、天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤにおいて不連続である。
【００４４】
本明細書で開示される実施形態では、融合ペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの少なくとも３つの不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる。１つの実施形態では、融合ペプチドは、配列番号８〜１４および前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００４５】
以下の表２は、選択されたＢ細胞エピトープ、ならびに本明細書に開示される実施形態のいくつかに従う融合ペプチドの一覧を示す。
【００４６】
【表２】
2018511659.tif 000005
【００４７】
本明細書で開示される実施形態では、融合ペプチドは、上の表２に示されるように、配列番号８（融合ペプチドＰ４６７と呼称）または配列番号９（融合ペプチドＰ６４７と呼称）のアミノ酸配列または配列番号８もしくは配列番号９と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００４８】
また、本明細書では、タンデムリピートとして２回以上連結した、配列番号１〜７および１５〜６０、または前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの２つ以上のＢ細胞エピトープを含んでなる融合ペプチドが企図される。例えば、本明細書で企図される融合ペプチドは、配列番号１の２つ以上のタンデムリピート、配列番号２の２つ以上のタンデムリピート、配列番号３の２つ以上のタンデムリピート、配列番号４の２つ以上のタンデムリピート、配列番号５の２つ以上のタンデムリピートなどを含んでなり得る。しかしながら、２つ以上の異なるＢ細胞エピトープを融合ペプチドに組み込むと、ＥＣＤの複数のＢ細胞エピトープを特異的に認識する抗体を惹起することにより、より有益な免疫応答を生成する可能性が高くなると理解される。よって、本明細書に開示されている実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１〜７および１５〜６０、または前記のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＨｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤの少なくとも２つの異なるＢ細胞エピトープを含んでなる。
【００４９】
本明細書で開示される実施形態では、融合ペプチドは、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、融合ペプチドは配列番号８（融合ペプチドＰ４６７と呼称）または配列番号９（融合ペプチドＰ６４７と呼称）のアミノ酸配列からなる。
【００５０】
上の表２に示されるように、配列番号３および４の個々のＢ細胞エピトープでは、配列番号４は、配列番号３には見られないＣｙｓ（すなわち、ＧＧＧＧＧＣ）で終わる付加的なＣ末端リンカーを含んでなる。配列番号４のこのＣ末端リンカーはそれ自体Ｃｙｓで終わり、これにより、以下に示す実施例のいくつかで例示されるように、この単一のエピトープを担体タンパク質とカップリングさせることができる。本発明の融合ペプチドの一部として使用する場合、配列番号４のＢ細胞エピトープは、この融合ペプチドに配列番号３の形で存在する。配列番号４のＢ細胞エピトープが採用される試みでは、それは、Ｂ細胞エピトープとして機能する配列番号３に相当する配列番号４の部分である。
【００５１】
本明細書に記載の融合ペプチドを作製する好適な方法は当業者に公知であろう。実例としては、ペプチド合成は、本明細書の他所に記載されるように、各Ｂ細胞エピトープとその個々に隣接するＢ細胞エピトープを連結するペプチド結合を順次形成すること、および前記融合ペプチドを回収することを含む。好適なペプチド合成法は、当技術分野で公知である。実例としては、「アミノ酸およびペプチド合成(Amino Acid and Peptide Synthesis)」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒｓ；Ｊｏｈｎ  Ｊｏｎｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法が含まれる。合成ペプチドはまた、液相合成または種々の固相支持体（例えば、ポリスチレン、ポリアミド、またはＰＥＧ）上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって作製することもできる。ＳＰＰＳは、Ｆ−ｍｏｃ（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）またはｔ−Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）の使用を組み込んでもよい。また、商業的製造者から特注ペプチドを入手することもできる。
【００５２】
あるいは、融合ペプチドは組換え法によっても作製され得る。例えば、融合ペプチドをコードする核酸配列を含んでなる核酸分子は、前記核酸配列を発現し得る好適な宿主細胞にトランスフェクトし、前記宿主細胞を前記核酸配列の発現に好適な条件下でインキュベートし、前記融合ペプチドを回収することができる。対象とする１または複数の融合ペプチドをコードする核酸分子を作製するために好適な方法もまた、１または複数の組換え融合ペプチドを発現および／または分泌のために、使用する宿主細胞（例えば、微生物）の性質に基づきコドンを最適化することをおそらくは含む、遺伝コードの知識に基づけば、当業者には公知であろう。好適な宿主細胞もまた当業者には公知であり、その実例には、原核細胞（例えば、大腸菌(E. coli)）および真核細胞（例えば、Ｐ．パストリス(P. pastoris)）が含まれる。“Short Protocols in Molecular Biology, 第5版, 2 Volume Set: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology” (by Frederick M. Ausubel (著者, 編者), Roger Brent (編者), Robert E. Kingston (編者), David D. Moore (編者), J. G. Seidman (編者), John A. Smith (編者), Kevin Struhl (編者), J Wiley & Sons, London)参照。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「コードする("encode"、"encoding")」などは、ある核酸の、別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を意味する。例えば、核酸配列は、一般に宿主細胞内で転写および／または翻訳されてポリペプチドを生成し得る場合、または転写および／または翻訳されてポリペプチドを生成し得る形にプロセシングされ得る場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸配列は、コード配列またはコード配列と非コード配列の両方を含み得る。よって、用語「コードする」などは、ＤＮＡ分子の転写から生じるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から生じるタンパク質、ＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の形成とその後のそのＲＮＡ産物の翻訳から生じるタンパク質、またはＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の提供、そのＲＮＡ産物のプロセシングによりプロセシングＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）の提供とその後のそのプロセシングＲＮＡ産物の翻訳にから生じるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＢ細胞エピトープまたは融合ペプチドをコードする核酸配列は、好適な宿主細胞での発現のためにコドンが最適化される。例えば、融合ペプチドがヒト対象においてＨｅｒ２／ｎｅｕに対する免疫応答を誘導するために使用される場合、これらの核酸配列はヒト  コドン最適化を受け得る。コドンの最適化の好適な方法は、Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｕｉｌｄ  ａ  Ｇｅｎｏｍｅウェブサイトの「Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｏｏｌｓ」にある「Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ」ツールの「Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」オプションを用いるなど、当業者には公知である。
【００５４】
本明細書に記載のＨｅｒ２／ｎｅｕの２つ以上の不連続Ｂ細胞エピトープは、当業者に公知の手段により融合ペプチド内で互いに連結することができる。用語「連結する」および「連結される」は、ペプチド結合を介した２つの不連続Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープの直接結合を含み、すなわち、１つのＨｅｒ２／ｎｅｕエピトープのＣ末端は、ペプチド結合を介して、別の、本来不連続のエピトープのＮ末端と共有結合されている。用語「連結する」および「連結される」はまた、それらの意味の範囲内に、挿入リンカー要素を介した、本来不連続の２つのＨｅｒ２／ｎｅｕエピトープの連結を含む。
【００５５】
本明細書で開示される実施形態では、少なくとも２つの前記Ｂ細胞エピトープまたはそれらの誘導体は、非天然リンカーペプチド配列を介して互いに連結される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、融合ペプチド内の任意の２つの隣接するＨｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープまたはそれらの誘導体間に挿入された短いポリペプチド配列を意味する。１つの実施形態では、リンカーは、１〜１０個、好ましくは、１、２、３、４または５個の自然に存在するまたは自然に存在しないアミノ酸のポリペプチドリンカーである。１つの実施形態では、リンカーは、炭水化物リンカーである。好適な炭水化物リンカーは当業者に公知である。本明細書に開示される別の実施形態では、融合ペプチドは、１以上のペプチドまたはポリペプチドリンカーを１以上の他の非ペプチドまたは非ポリペプチドリンカーとともに含んでなる。さらに、異なるタイプのペプチドまたは非ペプチドリンカーを、適切と思われる同じ融合ペプチドに組み込むことができる。ペプチドまたはポリペプチドリンカーがＨｅｒ２／ｎｅｕのＥＣＤ由来の２つの個々のＢ細胞エピトープフラグメントを連結するために使用される場合、リンカーは、有利には、そのＮ末端がペプチド結合を介して一方のエピトープフラグメントのＣ末端に結合され、そのＣ末端がペプチド結合を介して他方のフラグメントのＮ末端と結合されるように組み込まれる。融合ペプチド内の個々のＢ細胞エピトープフラグメントはまた、いずれかの末端または両末端に、好ましくは、Ｃ末端に１以上のアミノ酸が付加されていてもよい。よって、例えば、不連続ペプチドを連結し、ペプチド同士の、および／またはアンカーとして働くビロソーム内の脂質分子を介したビロソームなどの送達系との、共有結合を可能とするように、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両末端にリンカーまたはスペーサーアミノ酸が付加されてもよい。好適なペプチドリンカーの実例は、例えば配列番号８に示されるように、ＬＰ（ロイシン−プロリン）である。
【００５７】
当業者には、融合ペプチドと担体タンパク質のカップリングがリンカーを介する場合、Ｎ末端由来のリンカーカップリングは、場合によっては、惹起される所望の免疫応答に負の影響を及ぼすことがあるので、融合ペプチドのＣ末端由来の、このようなリンカー媒介カップリングを達成することが好ましいことが理解されるであろう。
【００５８】
配列同一性および配列類似性
「少なくとも８５％」という言及には、例えば最適アラインメントまたはベストフィット分析の後に８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または類似性を含む。よって、本発明の好ましい形態では、配列は、例えば最適アラインメントまたはベストフィット分析の後に、本明細書で特定される配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％または好ましくは１００％の配列同一性または配列相同性を有する。
【００５９】
用語「同一性」、「類似性」、「配列同一性」、「配列類似性」、「相同性」、「配列相同性」などは、本明細書で使用する場合、アラインされた配列内の任意の特定のアミノ酸残基の位置において、そのアラインされた配列間でアミノ酸残基が同一であることを意味する。用語「類似性」または「配列類似性」は、本明細書で使用する場合、アラインされた配列内の任意の特定の位置において、それらの配列間でアミノ酸残基が類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリン残基に置換可能である。これは保存的置換と呼べる。１つの実施形態では、アミノ酸配列は、本明細書に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換の方式により、修飾が非修飾ポリペプチドと比較して、修飾ポリペプチドの結合特異性または機能活性に影響を及ぼさないように修飾され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドに関する配列同一性は、候補配列における、配列アラインおよび最大パーセンテージの相同性を達成するための必要に応じたギャップの導入の後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、対応するポリペプチドの残基と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージに関する。Ｎ末端もしくはＣ末端延長も挿入も配列同一性または相同性の低下と解釈されるべきではない。２つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実行し、それらの配列同一性または相同性を決定するための方法およびコンピュータープログラムは当業者に周知である。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて容易に計算することができる。本発明は、本明細書に定義される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性または配列相同性を有する配列、および本明細書に記載の方法におけるそれらの使用に及ぶ。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに関する配列同一性は、候補配列における、配列アラインおよび最大パーセンテージの相同性を達成するための必要に応じたギャップの導入の後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、対応するポリヌクレオチドのヌクレオチドと同一であるヌクレオチドのパーセンテージに関する。２つ以上のポリヌクレオチドまたは核酸配列のアラインメントを実行し、それらの配列同一性または相同性を決定するための方法およびコンピュータープログラムは当業者に周知である。
【００６２】
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は当業者に周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／もしくは物理的特性、例えば、電荷または疎水性を有するような、２つ以上のポリペプチドまたは適当な場所における、正確なアミノ酸間比較を意味する。その後、比較されたポリペプチド配列間で、いわゆる「類似性パーセント」を決定することができる。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術も当技術分野で周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し（通常、ｃＤＮＡ中間体を介する）、それによりコードされているアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２の２回目アミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間の正確な一致を意味する。
【００６３】
２つ以上のポリヌクレオチド配列もまた、それらの「同一性パーセント」を決定することにより比較することができる。２つ以上のアミノ酸配列も同様に、それらの「同一性パーセント」を決定することにより比較することができる。核酸配列であれまたはペプチド配列であれ、２配列間の同一性パーセントは、アラインされた２配列間で正確に一致した数を短い方の配列で割り、１００を掛けた解として記載することができる。核酸配列の近似アラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により標準化されたスコアリングマトリックスを用い、ペプチド配列との併用に拡張することができる。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための好適なプログラムは一般に当技術分野で公知である。
【００６４】
核酸配列同一性を決定するための実例では、対象核酸配列を用い、プログラムＢＬＡＳＴＮバージョン２．１（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402に基づく）を使用してＧｅｎＢａｎｋデータベース（http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などの核酸配列データベース検索を行う。このプログラムは、ギャップを含まないモードで使用することができる。低複雑性領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングが使用される。ＢＬＡＳＴＮのデフォルトパラメーターが使用可能である。アミノ酸配列同一性を決定するための実例では、アミノ酸配列を用い、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用してＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などのタンパク質配列データベースを検索する。プログラムはギャップを含まないモードで使用することができる。低複雑性領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングが使用される。ＢＬＳＴＰのデフォルトパラメーターが使用可能される。低複雑性の配列に関するフィルタリングではＳＥＧプログラムを使用することができる。
【００６５】
比較ウインドウをアラインするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピューター実装形態（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査と選択される種々の方法のいずれかにより生成される最適アラインメント（すなわち、比較ウインドウで最高パーセンテージの相同性をもたらす）によって実行することができる。例えばAltschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389により開示されているようなＢＬＡＳＴ系列のプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６６】
担体タンパク質
ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ；配列番号６１）は、アミノ酸残基５２に単一のアミノ酸置換（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）を含むジフテリア毒素の酵素的に不活性で無毒な形態である。Ｇｌｕ５２置換をもたらす単一のＧＣＡ突然変異は、ＣＲＭ−１９７をその野生型種から区別する。ＣＲＭ−１９７に毒性が無いことは、野生型種において感染細胞でタンパク質合成に不可欠な延長因子２（トランスロカーゼ）の化学修飾を触媒する、そのフラグメントＡの酵素活性の欠如によるものと思われる。この非毒性特性はＣＲＭ−１９７をコンジュゲートワクチンの作製のために好適な担体タンパク質とする。
【００６７】
配列番号６１（ＣＲＭ−１９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ）
【化１】
2018511659.tif 000006
融合ペプチドがＣＲＭ−１９７にカップリングされる方法は当業者に公知である。
【００６８】
実例としては、Chang et al. (1998, FEBS Letters, 427:362-366)およびBerti et al. (2004, Biophysical Journal, 86:3-9)により記載されているもの、ならびに以下の例１に示されるものが含まれる。
【００６９】
本明細書に記載の融合ペプチドとＣＲＭ−１９７のコンジュゲーションは一般に、好適な架橋剤を用いたリシル残基の活性化を介して達成される。ＣＲＭ−１９７は４０個のリシン残基を含有し、それらの多くが架橋に利用可能であるので、ＣＲＭ−１９７コンジュゲーションの最終産物は、常にヘテロである。理論または特定の作用機序に縛られるものではないが、一般に、融合ペプチド：担体タンパク質の比は融合ペプチドの大きさまたは分子量に依存すると理解される。例えば、融合ペプチドが比較的小さい場合（例えば、約１０アミノ酸長）、２０〜３９の融合ペプチドと結合した担体タンパク質を作製することが可能となり得る。逆に、より大きな融合ペプチドの場合、担体タンパク質は２０まで、またはそれより少ない融合ペプチドと結合し得る。本明細書に記載の１つの実施形態では、担体タンパク質は、２〜３９の融合ペプチドを含んでなる。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも２０の融合ペプチドを含んでなる。さらに別の実施形態では、担体タンパク質は、６〜１２の融合ペプチドを含んでなる。
【００７０】
融合ペプチドは一般に、共有結合により担体タンパク質とカップリングされる。しかしながら、いくつかの実施形態では、融合ペプチドは、非共有結合により担体タンパク質とカップリングされ得る。融合ペプチドが担体タンパク質と非共有結合される場合、その非共有結合は一般に、融合ペプチドの１以上の原子と担体タンパク質の１以上の原子の間の電磁相互作用を含む。実例としては、イオン結合（すなわち、２つの反対の電荷を有するイオン間でこの反対の電荷により形成される引力）、ファンデルワールス力（すなわち、融合ペプチドおよび担体タンパク質内に存在する共有結合の永久双極子および／または誘起双極子の間の力）および／または疎水性相互作用（すなわち、本明細書に記載の１または複数の融合ペプチド内の疎水性部分／脂肪族部分の、担体タンパク質の疎水性部分と会合する傾向）から生じる力が含まれる。
【００７１】
アジュバント
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は一般に、融合ペプチド−担体タンパク質コンジュゲートにより惹起される免疫応答の規模を、アジュバントの不在下での、本明細書に記載の融合ペプチド単独からまたは融合ペプチド−担体タンパク質コンジュゲートから予想されるものを超えて増大させる物質種を意味する。
【００７２】
好適なアジュバントは当業者に公知である。好適なアジュバントの限定されない例としては、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバンとも呼ばれる））、リポソーム、ビロソーム、油中水型または水中油型エマルション（例えば、フロイントのアジュバント、モンタニド（商標）、ＭＦ５９（商標）およびＡＳ０３）、３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）およびＭＰＬ含有アジュバント（例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０２およびＡＳ０４）およびサポニンに基づくアジュバントが含まれる。サポニンに基づくアジュバントには、例えば、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)、チョウセンニンジン(Panax ginseng)、サンシチニンジン(Panax notoginseng)、アメリカニンジン(Panax quinquefolium)、キキョウ(Platycodon grandiflorum)、ヒメハギセネガ(Polygala senega)、イトヒイメハギ(Polygala tenuifolia)、キラヤ・ブラジリエンスシス(Quillaja brasiliensis)、キバナオウギ(Astragalus membranaceus)およびイノコズチ(Achyranthes bidentate)由来のサポニンまたはサポニン誘導体が含まれる。例示的なサポニンに基づくアジュバントには、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＥＴＲＩＸＴＭアジュバント、マトリックスＭＴＭアジュバント、マトリックスＣＴＭアジュバント、マトリックスＱＴＭアジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭまたはＩＳＣＯＰＲＥＰＴＭ誘導体を含有するアジュバント、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、およびＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントが含まれる。本明細書に記載のワクチン組成物はまた、例えば、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を含む免疫調節薬と会合させることもできる。本明細書では、同じワクチン組成物内の２つ以上のアジュバントの混合物も企図される。
【００７３】
１つの実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントはモンタニドである。
【００７４】
本明細書で開示される実施形態では、ワクチン組成物は、チェックポイント阻害剤をさらに含んでなる。用語「チェックポイント阻害剤」は、１以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に阻害する、低減するまたはそうでなければそれに干渉するもしくは調節する分子を意味するものとして当業者に理解される。好適なチェックポイント阻害剤の実例としては、抗体およびそれらの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）が含まれる。好適なチェックポイントタンパク質は当業者に公知であり、その実例としては、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；ＰＤｌおよびそのリガンドＰＤＬｌおよびＰＤＬ２；ＯＸ４０およびそのリガンドＯＸ４０Ｌ；ＬＡＧ−３およびそのリガンドＭＨＣクラスＩまたはＩＩ；ＴＩＭ−３およびそのリガンドＧＡＬ−９；およびＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）およびそのリガンドであるヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）が含まれる。
【００７５】
医薬組成物
本明細書はまた、本明細書に記載のワクチン組成物と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物に記載する。好適な薬学上許容可能な担体（例えば、賦形剤、希釈剤など）は当業者に公知である。例えば、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、およびヒアルロン酸などの様々な水性（薬学上許容可能な）担体が使用可能である。これらの組成物は従来の周知の滅菌技術により滅菌してもよく、または濾過除菌してもよい。得られた水溶液はそのまま使用するために包装されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥調製物は投与前に無菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、必要に応じて、生理学的条件に近づけるための薬学上許容可能な補助物質、例えば、他の多くのものの中でも、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、および湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、スクロースまたは他の炭水化物をさらに含んでなり得る。非経口的に投与可能な化合物を調製するために好適な方法は当業者には公知であるか自明であり、例えば、A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al.編, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al.編, 第3版Amer. Pharmaceutical Assocにより詳細に記載されている。
【００７６】
医薬組成物は、非経口投与（例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射）に好適な形態または鼻腔内吸入または経口吸入によるなどの吸入による投与に好適なエアゾール形態であり得る。
【００７７】
本明細書に記載の医薬組成物はキットで提供されてもよい。キットは、投与装置、賦形剤、および／または希釈剤など、本明細書に記載の方法の実施を補助するための付加的成分を含んでなり得る。これらのキットは、種々の成分を収容する容器およびこのような方法においてキット成分を使用するための説明書を含んでよい。
【００７８】
本明細書で開示される実施形態では、医薬組成物は、本明細書の他所に記載されるようなチェックポイント阻害剤をさらに含んでなる。
【００７９】
癌を治療または予防するための使用および方法
また、本明細書では、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防する方法が開示され、その方法は、前記患者に有効量の本明細書に記載のワクチン組成物、または本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる。
【００８０】
本開示はまた、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌を治療または予防するための薬剤の製造における本明細書に記載のワクチン組成物の使用にも及ぶ。
【００８１】
本開示はまた、必要とする患者においてＨｅｒ２／ｎｅｕの発現または過剰発現を特徴とする癌の治療または予防において使用するための本明細書に記載のワクチン、または本明細書に記載の医薬組成物にも及ぶ。
【００８２】
当業者ならば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の発現または過剰発現を特徴とする癌のタイプを知っている。実例としては、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌および唾液腺癌が含まれる。１つの実施形態では、癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は胃癌である。
【００８３】
本明細書に記載のワクチンまたは医薬組成物は一般に、「有効な量」、すなわち、とりわけ治療または予防効果いずれか１以上を惹起するのに有用な量で投与される。当業者ならば、慣例の実験により、医薬組成物中に含むまたは所望の転帰のために投与される、有効で非毒性の量を決定することができるであろう。一般に、本明細書に開示されるワクチンおよび／または医薬組成物は、投与経路およびレシピエントの身体的特徴（健康状態を含む）に適合した様式で、所望の効果（すなわち、治療上有効、免疫原性および／または保護的）を惹起するような方法で投与することができる。例えば、組成物の適当な用量は、限定されるものではないが、対象の身体的特徴（例えば、年齢、体重、性別）、組成物が単剤として使用されるか、または補助療法の一部として使用されるか、基礎にある任意の癌の進行（すなわち、病的状態）、および当業者により認識され得る他の因子を含む、様々な因子によって異なり得る。例えば、組成物の適当な用量を決定する際に考慮され得る一般的な考慮事項の他の実例は、Gennaro (2000, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびGilman et al., (編), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press)により考察されている。
【００８４】
この量は、上記で概略を述べた考慮事項のいくつかを考慮して、当業者に公知の方法により決定可能な比較的広範囲にあると思われる。
【００８５】
本明細書に記載されるような有効量の融合ペプチド（担体タンパク質に結合する）は一般に、対象当たり約５μｇ〜約１．０ｍｇの融合ペプチド、対象当たり１０μｇ〜約５００μｇの融合ペプチド、または対象当たり約１５μｇ〜約６０μｇの融合ペプチドの範囲である。有効量は、例えば、抗原特異的抗体力価の測定を含む標準的な方法によって確認することができる。本明細書に記載の組成物により提供される免疫性のレベルを監視して、もしあれば、追加免疫の必要を決定することができる。例えば、血清中の抗原特異的抗体力価の評価の後に、一般に、対象における組成物の最初の投与の数日または数週間後に、任意選択の追加免疫が必要とされる、かつ／または望まれる場合がある。抗原特異的抗体力価は、以下の実施例に示されるように、複数用量の使用により増強される可能性がある。
【００８６】
本明細書に記載されるようにワクチンおよび／または医薬組成物は、それを必要とする対象に単独でまたは１または複数の付加的治療薬と組み合わせて、すなわち、補助療法の一部として投与することができる。補助療法に関して、投与は同時または逐次であってよく、すなわち、まずワクチンおよび／もしくは医薬組成物が投与され、その後、１もしくは複数の付加的治療薬および／もしくは予防薬が投与されるか、または１もしくは複数の付加的治療薬の投与の後にワクチンおよび／または医薬組成物が投与される。よって、２つ以上の実体が対象に「一緒に」投与される場合、それらは単一の組成物で同時に、または別個の組成物で同時に、または別個の組成物で別の時間に投与され得る。
【００８７】
１または複数の治療薬は、本明細書の他所に記載されるようなチェックポイント阻害剤を含んでなり得る。よって、１つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、前記患者に有効量の本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を投与する工程をさらに含んでなる。
【００８８】
所望の免疫応答を誘導するために必要とされる場合には、最適な量および個々の用量の間隔は、例えば、投与の形態、経路および部位、ならびに本発明の他所に記載されるように、処置される特定の対象の性質により決定され得ることが当業者には明らかであろう。最適な条件は当業者に公知の慣例技術を用いて決定され得る。
【００８９】
いくつかの場合では、本明細書に記載のワクチンおよび／または医薬組成物の数回または複数回の投与を含むことが望ましい場合がある。例えば、本組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれを超える回数投与され得る。これらの投与は約１日間隔〜約１２週間隔、特定の実施形態では、約１週間〜約４週間であり得る。腫瘍サイズの減少および／または転移発生の減少などの望ましい治療結果を達成するために間欠的再投与が必要とされる場合がある。また、最適な投与コースは慣例の治療コースまたは有効性もしくは免疫状態決定検査を用いて確認できることも当業者には明らかであろう。
【００９０】
本明細書で企図されるような免疫または抗原特異的抗体応答を「誘導する」とは、腫瘍サイズの減少および／または転移発生の減少などの所望の生理学的効果得るための、免疫応答の惹起もしくは刺激および／または既存の免疫応答の増強を含む。前記効果は、癌の発生を完全にもしくは部分的に予防する、転移発生を完全にもしくは部分的に予防する、および／または前記癌に関連する症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であり得る。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「投与」または「投与すること」は一般に、本明細書に記載のワクチンおよび／または医薬組成物を患者の身体に、患者の免疫系が１または複数の融合ペプチド内の複数のＨｅｒ２／ｎｅｕ  Ｂ細胞エピトープに対する応答を惹起するように導入する工程を意味する。本明細書で使用する場合、「必要とする患者」には、癌細胞がＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現または過剰発現する癌と診断された個体を含む。また、これには、いずれの症状も呈したことはないが、例えば、癌の家族歴、従って、癌を発症する、疑いのある遺伝的素因を持ち得る個体など、まだ癌と診断されていない個体も含む。その最も広い意味において、用語「必要とする患者」は、すでに必要を呈している個体、ならびにＨｅｒ２／ｎｅｕ関連癌を発症するリスクのある個体を包含する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、癌を「予防する」薬剤は、癌を発症するリクスを、理想的にはゼロまで引き下げる。さらに、この用語はまた、例えば原発腫瘍の手術後の癌の再発の予防も意味する。本明細書で使用する場合、癌を「治療する」薬剤は、理想的には、本組成物の投与の中止時に疾患が再発せず寛解に留まるようにその根本原因を除去することによって疾患全体を除去する。本明細書で使用する場合、癌を「改善する」薬剤は、疾患の根本原因を除去しないが、確立された任意のグレード体系により測られるおよび／または患者の福祉の改善、例えば、疼痛および／または不快の軽減の改善により測られる、疾患の重篤度を軽減する。
【００９３】
「有効量」は、確立された投与計画に従って、単独でまたはさらなる用量とともに、本明細書の他所に述べられているような所望の予防、治療または改善を果たす、医薬製剤の量である。
【００９４】
投与経路および計画は、処置される病態の病期または重篤度によって異なり、当業者によって決定されるべきである。例えば、本明細書に記載の本発明によるワクチンまたは医薬組成物は、皮下、皮内、リンパ管内または局所または粘膜（鼻腔）、または筋肉内形態で投与され得る。これらの形態は総て、製薬分野の熟練者に周知である。
【００９５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、当業者に公知の筋肉内、皮下、リンパ管内または鼻腔内経路で投与され得る。
【００９６】
本明細書の他所に述べられているように、本明細書に記載の組成物を使用する投与計画は、例えば、患者の年齢、体重および健康状態処置される病態の病期および重篤度、ならびに投与に意図される特定の融合ペプチドを含む様々な因子に従って選択される。熟練の医師であれば、悪性腫瘍を予防する、治療する、またはその進行もしくは重篤度を改善するために必要とされる例えば、担体タンパク質（それにカップリングされた１または複数の融合ペプチドを含んでなる）の有効量を容易に決定および指示することができる。投与計画はまた、投与するアジュバントの量も考慮し、それは被験体、患者の年齢、体重および健康状態などの、対象に投与される担体タンパク質／融合ペプチドの量を支配する因子の少なくともいくつかによって異なると思われる。担体タンパク質／融合ペプチドおよび／またはアジュバントの、毒性無くまたは許容可能な毒性だけで有効性を生じる範囲の濃度（すなわち、有効量）を達成する上での最適精度は、少なくとも１つには、標的部位に対する担体タンパク質／融合ペプチドおよび／またはアジュバントのアベイラビリティーの動態に基づく計画を必要とする。このプロセスは一般に、担体タンパク質／融合ペプチドおよび／またはアジュバントの分布、平衡、および排出の考慮事項を含み、これらは当業者の能力の範囲内である。
【００９７】
本明細書に述べられる総ての特許、特許出願および刊行物は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の開示の一部とされる。
【００９８】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記載されているもの以外の変形および改変を許容すること認識するであろう。本発明は趣旨および範囲内にあるこのような総ての変形および改変を含むと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に言及または示唆される工程、特徴、組成物および化合物の総てを個々にまたは集合的に、また、２つ以上の任意の前記工程または特徴のいずれか、および総ての組合せを含む。
【００９９】
以下、本発明の特定の実施形態を、下記の例を参照して説明するが、これらの例は例示を目的とするに過ぎず、上記の概論の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
下記の例は、２つの融合ペプチド（Ｈｅｒ２／ｎｅｕに由来する不連続Ｂ細胞エピトープ）と組換え無毒化ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７のコンジュゲーションを対象とする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法による融合ペプチド−担体タンパク質コンジュゲートの初期分析を行った。最後に、融合ペプチド−担体タンパク質コンジュゲートを、動物における最初の免疫原性試験のためにオーストラリアに輸送した。
【０１０１】
例１−Ｈｅｒ２／ｎｅｕペプチド抗原と組換え無毒化ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７のコンジュゲーション
ビロソームに基づく乳癌ワクチンＰＥＶ６Ａ／Ｂは第Ｉ相臨床治験で試験され好結果が得られた(Wiedermann et al., Breast Cancer Res Treat. 2010)。しかしながら、このワクチン処方物には安定性および成分適合性に関する実質的な技術的限界という特徴があり、それは２つの別個の注射が避けられないという事実により最もよく説明される。
【０１０２】
ＰＥＶ６Ｃアプローチは、ＰＥＶ６Ａ／Ｂのこの技術的限界を克服する。ＰＥＶ６Ｃは、３つの抗原（それぞれＰ６、Ｐ７、およびＰ４；配列番号１〜３）を総て単一のペプチド鎖に組合せ（ＷＯ２０１１／０２０６０４Ａ１；Multi-epitope vaccine for her2/neu-associated cancers）、安定で凍結乾燥可能な単一用量適用形態として処方することができる。
【０１０３】
調製および結果
下記の融合タンパク質を担体タンパク質ＣＲＭ−１９７とのコンジュゲーションに使用した：
ペプチド１：Ｐ４６７（コンジュゲーション前）：
【化２】
2018511659.tif 000007
ペプチド２：Ｐ６４７（コンジュゲーション前）：
【化３】
2018511659.tif 000008
【０１０４】
コンジュゲーション反応は、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中、架橋剤スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を用いて行った。この試薬はまずＣＲＭ−１９７担体タンパク質上の第一級アミン（すなわち、リシン残基）と反応し、その後、チオール基（すなわち、システイン残基）と反応可能となる。ＣＲＭ−１９７では、理論的には３９のリシン残基が架橋試薬との反応に利用可能であった。担体タンパク質上でペプチド抗原の良好な分布を達成するために、融合ペプチド：担体タンパク質比を、ＣＲＭ１９７分子当たりに２０個の融合ペプチド分子の平均コンジュゲーションとなるように調整した。反応は次のように室温で４５分間進行させた。
【０１０５】
【表３】
2018511659.tif 000009
【０１０６】
手順
１．融合ペプチドを−２０℃から取り出し、室温で約１０分間置き、その後、バイアルを開封する。
２．３ｍＬのガラスバイアルに融合ペプチドを秤量し：
（ａ）Ｐ４６７、７．８ｍｇ、７８０μＬ注射水（ＷＦＩ）に再懸濁；
（ｂ）Ｐ４６７、７．１ｍｇ、７１０μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁；
（ｃ）Ｐ６４７、６．９ｍｇ、６９０μＬ  ＷＦＩに再懸濁；
（ｄ）Ｐ６４７、９．０ｍｇ、９００μＬ  ＤＭＳＯに再懸濁；
総ての溶液が容易に再懸濁され、凝集塊または濁りは見られなかった。
３．２０倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＭｉｌｌｉ  Ｑ水で１倍ＰＢＳに希釈し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を終濃度１ｍＭまで加える。
４．６本のバイアルのＣＲＭ１９７を０．５ｍＬ  ＷＦＩで再構成して２ｍｇ／ｍＬとする。３本のバイアルをプールして２バッチとし、４℃で保存する（１バッチ当たり１．５ｍＬ、各３ｍｇ）。
５．Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（２ｍｇ）のバイアル１本を取り、それに２００μＬのＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＴＤＡを加え、溶解させる（１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液；溶液は濁ったまま）。
６．３ｍｇ  ＣＲＭ１９７の各バイアルに７５μＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加える。総容量：１．５７５ｍＬ。
７．これらのバイアルを室温で４５分間、ゆっくり混合（回転２５ｒｐｍ）しながらインキュベートする。その間に２本のＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ脱塩カラムをＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーで平衡化する。
８．インキュベーション工程７の後、反応物を平衡化したＺｅｂａ  Ｓｐｉｎカラムに移し（１．５ｍＬ）、２００μＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡを加え、次いで、１０００ｘｇで４分間遠心分離する。
９．１．８ｍＬの各溶液を回収した。
１０．新しい３ｍＬバイアルに次のように加える：
（ａ）バイアル１：６００μＬ  Ｐ４６７（ＷＦＩ中１０ｍｇ／ｍＬ）；および
（ｂ）バイアル２：６００μＬ  Ｐ６４７（ＷＦＩ中１０ｍｇ／ｍＬ）。
１１．各バイアルに、５０μＬの２０倍ＰＢＳを加え、溶液のｐＨをおよそ７に上昇させる。
１２．各バイアルに、１．８ｍＬの脱塩ＣＲＭ１９７−ＳＭＣＣを加える。
１３．これらのバイアルを室温で４５分間、ゆっくり混合（回転）しながらインキュベートし、その後、これらのバイアルを分析まで４℃で保存する。インキュベーション中、バイアル２では沈澱が見られるようになったことに注記しておく。しかしながら、その溶液を温めた後に沈澱は消失した。
【０１０７】
要約
ペプチドＰ４６７−ＣＲＭ１９７、およそ２．４４９ｍｇ／ｍＬ  Ｐ４６７、およそ１．２２ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＭ１９７、およそ２４５０μＬ；１倍ＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、ロット１４０８２９−１＿ａｍ。
ペプチドＰ６４７−ＣＲＭ１９７、およそ２．４４９ｍｇ／ｍＬ  Ｐ６４７、およそ１．２２ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＭ１９７、およそ２４５０μＬ；１倍ＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、ロット１４０８２９−２＿ａｍ。
【０１０８】
Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７ペプチドコンジュゲートは、反応進行中に凝集傾向を示すことが認められた。Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７ペプチドコンジュゲートでは、目に見える凝集は無かった。
【０１０９】
例２−クーマシーブルー染色およびマウス抗血清Ｅを用いたＣＲＭ１９７−抗原コンジュゲートの免疫ブロット
コンジュゲート処方物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ゲルのクーマシーブルー染色により、また従前に作製した、破傷風トキソイドに結合したペプチド抗原Ｐ４、Ｐ６およびＰ７の組合せに対するマウス血清（抗血清Ｅ）を用いた免疫ブロット法により評価した。
【０１１０】
【表４】
2018511659.tif 000010
【０１１１】
手順
２枚のＳＤＳ−ＰＡゲルを次のように調製した：
・ＣＲＭ１９７（２ｍｇ／ｍＬ）保存溶液をＰＢＳ  ｐＨ７．４で１：１０希釈した。
・抗コンジュゲート溶液をＰＢＳ  ｐＨ７．４で１：１０希釈した。
・非コンジュゲート融合ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬの保存溶液として調製し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で１：２０希釈した。
【０１１２】
合計３６μＬの各サンプルを調製し、１レーン当たり１５μＬをロードした。２枚の同じゲルを作製した：ゲル１はクーマシーブルーで染色し、ゲル２はウエスタンブロットに使用した。ゲル１およびゲル２におけるサンプルの分布を以下の表５にまとめる。
【０１１３】
【表５】
2018511659.tif 000011
【０１１４】
結果
ゲル１−クーマシーブルー染色
ゲル１をＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシーブルー染料に振盪下、室温で１時間浸漬した後、室温で１時間、ＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
【０１１５】
ゲル２−ウエスタンブロット
電気泳動後、ゲル２をカセットから取り出し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水で簡単にすすいだ。次に、製造者の説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従い、トランスファーサンドイッチを作製し、Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｌｏｔ機に設置した。転写後、予備染色したマーカータンパク質が完全に存在するようにニトロセルロース膜を調整した。ＳＤＳ  ＰＡゲルで最少量のマーカーだけを見えるように残した。次に、この膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋバッファー中、室温で１時間インキュベートした。マウス血清プールＥをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで１：５００希釈し、膜上、室温で２時間インキュベートした。その後、この膜を１倍ＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。次に、この膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで１：５０００希釈した抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ、０７４−１８０２；Ａｂ２０）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、この膜を１倍ＰＢＳで各５分間３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用い、室温で５分間現像した。
【０１１６】
これらの結果は、各ＣＲＭ１９７コンジュゲートの分子量がより大きい分子量へ明らかにシフトすることを示し、これは融合ペプチドとＣＲＭ１９７の強いコンジュゲーションを示す。両場合に見られた幅広のコンジュゲートバンドはまた、コンジュゲーション反応から予想されたように、担体タンパク質上の融合ペプチドの比較的大きな分布を示した。また、これらの結果は、非コンジュゲートＣＲＭ１９７タンパク質の残留が全くない（または最小である）ことを示唆した。他方、融合ペプチドの微量画分が見られ、使用した総融合ペプチドの＜１０％であると推定された。
【０１１７】
結論
ＣＲＭ１９７コンジュゲートの明らかなシフトが見られ、これはＰ４６７およびＰ６４７融合ペプチドとＣＲＭ１９７担体タンパク質のコンジュゲーションの成功を示す。
【０１１８】
Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７コンジュゲートとＰ６４７−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの間に見られる有意差は無かった。
【０１１９】
両コンジュゲーション反応で限定された量の遊離融合ペプチドが見られた。
【０１２０】
使用した抗血清による免疫ブロットは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素とのいくらかの交差反応性を示したが、それは破傷風トキソイドペプチドコンジュゲートでは上昇した。このことからコンジュゲーション後のＣＲＭ１９７分子が確認されるが、これは２つの融合ペプチドに特異的ではないので、そのタンパク質とのコンジュゲーションは確認できない。抗血清は遊離非コンジュゲート融合ペプチドを染色し、Ｐ４６７の方がＰ６４７よりもやや良好であった。
【０１２１】
例３−マウス抗血清Ｄを用いたＣＲＭ１９７−抗原コンジュゲートの免疫ブロット
これらのコンジュゲート処方物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、従前に作製した、インフルエンザビロソームに結合したペプチド抗原Ｐ４、Ｐ６およびＰ７の組合せに対するマウス血清（抗血清Ｄ）を用いた免疫ブロット法により評価した。ＣＲＭ１９７担体タンパク質上の融合ペプチドＰ４６７およびＰ６４７の存在は、抗血清Ｄを用いた免疫ブロットによりそれぞれ確認した。
【０１２２】
【表６】
2018511659.tif 000012
【０１２３】
手順
１枚のＳＤＳ−ＰＡゲルを次のように作製した：
ＣＲＭ１９７、融合ペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートまたは非コンジュゲート融合ペプチドを含んでなる溶液を総てｐＨ７．４のＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈した。合計３６μＬの各サンプルを調製し、１レーン当たり１５μＬをロードした。ゲル１およびゲル２におけるサンプルの分布を以下の表７にまとめる。
【０１２４】
【表７】
2018511659.tif 000013
【０１２５】
結果
ウエスタンブロット−電気泳動後、ゲルをカセットから取り出し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水で簡単にすすいだ。製造者の説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従い、トランスファーサンドイッチを作製し、Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｌｏｔ機に設置した。転写後、予備染色したマーカータンパク質が完全に存在するようにニトロセルロース膜を調整した。ＳＤＳ  ＰＡゲルで最少量のマーカーだけを見えるように残した。次に、このニトロセルロース膜をＴｗｅｅｎ  ２０（ＭＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中５％ミルクで室温にて１時間インキュベートトした。
【０１２６】
マウス血清プールＤをＭＰＢＳＴで１：５００希釈し、膜上、室温で２時間インキュベートした。その後、この膜を１倍ＭＰＢＳＴで各５分間、３回洗浄した後、ＭＰＢＳＴで１：５０００希釈した抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ、０７４−１８０２；Ａｂ２０）とともに室温で３０分間インキュベートした。その後、この膜を１倍ＭＰＢＳＴで各５分間３回洗浄し、ＴＭＢ溶液を用い、室温で１０分間現像した。
【０１２７】
結論
使用した抗血清Ｄによる免疫ブロットは、ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートのみと反応性を示した。非コンジュゲートＣＲＭ１９７との交差反応性は見られなかった。これらの結果は、有意な量の融合ペプチドが担体タンパク質と結合したことを示し、ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートに関してゲルに見られた移動度のシフトは融合ペプチドと担体タンパク質のコンジュゲーションによるものであって、ＣＲＭ１９７の分子間架橋によるものではないことが確認される。遊離非コンジュゲート融合ペプチドに帰属したシグナルが検出されたが、これは抗血清がそれらと反応しないため、または融合ペプチドがゲルの底部に移動し、ニトロセルロース膜に転写されなかったためである。
【０１２８】
抗血清Ｄは、Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７コンジュゲートよりもＰ６４７−ＣＲＭ１９７コンジュゲートとやや強く反応した。これらの結果は、この抗血清は遊離融合ペプチドよりもコンジュゲート融合ペプチドと強く反応したことを示唆した。
【０１２９】
例４−Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７およびＰ６４７−ＣＲＭ１９７スポットブロット
ＣＲＭ１９７担体タンパク質に対する融合ペプチドＰ４６７およびＰ６４７の存在もまた、抗血清Ｄを用いたスポットブロット試験で確認した。
【０１３０】
サンプル
・ＣＲＭ１９７、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ；
・Ｐ４６７抗原、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ；
Ｐ６４７抗原、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ；
・Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ（計算濃度）；および
・Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ（計算濃度）
【０１３１】
【表８】
2018511659.tif 000014
【０１３２】
手順
プレカットニトロセルロース膜を使用し、鉛筆で線を引いた。エッペンドルフ管にて、１ｍｇ／ｍＬ（１μｇ／μＬ）で始めて各サンプルの２倍希釈をｐＨ７．４のＰＢＳで行った。スポット（１μＬ）当たりの理論濃度は、１μｇ／５００ｎｇ／２５０ｎｇ／１２５ｎｇ／６２．５ｎｇ／３１．２５ｎｇであった。各スポットについて、以下に概略を示すように、およそ１μＬの各サンプルを膜に転写した（二反復）：
・レーンＡ  ＣＲＭ１９７；
・レーンＢ  Ｐ４６７抗原（脂質コンジュゲーション無しの遊離融合ペプチド）；
・レーンＣ  Ｐ６４７抗原（脂質コンジュゲーション無しの遊離融合ペプチド）；
・レーンＤ  Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７（１μｇの融合ペプチドおよび０．５μｇのＣＲＭ１９７で開始）；および
・レーンＥ  Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７（１μｇの融合ペプチドおよび０．５μｇのＣＲＭ１９７で開始）。
【０１３３】
この膜を室温で１０分間風乾した後、ＰＢＳＴ（ＭＰＢＳＴ）中５％ミルクで、室温にて３０分間ブロッキングした。次に、この膜を一次抗体（マウス抗血清プールＤ、ＭＰＢＳＴで１：５００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、この膜をＭＰＢＳＴで各５分間、３回洗浄し、次いで、二次抗体（抗マウスＩｇＧ；ＫＰＬ、０７４−１８０２；Ａｂ２０；ＭＰＢＳＴで１：５０００希釈）とともに室温で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、膜をＭＰＢＳＴで各５分間、３回洗浄し、その後、ＴＭＢ溶液とともに室温でおよそ３分間インキュベートし、次いで、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水で洗浄した後に乾燥させた。
【０１３４】
結論
マウス抗血清Ｄによるスポットブロットは、ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートのみと反応性を示した。非コンジュゲートＣＲＭ１９７タンパク質との交差反応性は最小であった。コンジュゲート中のＣＲＭ１９７の量は融合ペプチドの量の約５０％であったので、このサンプルの最小バックグラウンドはおそらくはジフテリア毒素変異体との交差反応性によるものであった。
【０１３５】
遊離（非コンジュゲート）融合ペプチド（脂質コンジュゲート無しの融合ペプチド）は、Ｐ６４７の場合にのみ、この抗血清でシグナルを生じ、Ｐ４６７の場合には生じなかった。この理由はすぐには明らかにならない。しかしながら、Ｐ６４７の第１サンプル希釈では、シグナルは以降の希釈よりもいくらか弱かった。これは抗体結合部位に対する阻害剤の存在、またはニトロセルロース膜に対する結合の低下を示している可能性がある。この阻害剤の性質は分かっていないが、融合ペプチドの高濃度保存液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製するために、元々使用されていたＤＭＳＯによるものであるかもしれない。
【０１３６】
マウス抗血清ＤはＰ４６７−ＣＲＭ１９７およびＰ６４７−ＣＲＭ１９７コンジュゲートと極めて強く反応し、ほとんどの融合ペプチドと担体タンパク質のコンジュゲーションが確認された。
【０１３７】
融合ペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートに比べての遊離融合ペプチドの不等な抗血清反応性のために、抗原の量を定量することはできなかった。しかしながら、コンジュゲーション反応の後に精製工程を適用しなかったことから、融合ペプチドの理論的開始濃度を用いて計算してもよい。
【０１３８】
要約すると、これらの結果は、この抗血清が遊離融合ペプチドよりもコンジュゲート融合ペプチドと強く反応したことを示唆する。
【０１３９】
例５−マウスにおける用量漸増試験のためのサンプル調製
以下で、マウスにおける用量漸増試験のための融合ペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製を述べる。
【０１４０】
【表９】
2018511659.tif 000015
【０１４１】
手順
動物試験用のサンプル調製については、コンジュゲート反応溶液を定義された目的濃度に希釈した。以下の調製に関して、ペプチドとタンパク質のコンジュゲーション効率は少なくとも９０％であったと仮定された。
【０１４２】
高用量群（群１）のサンプル調製：
これらのサンプルは、試験管当たりおよそ４２０μｇのコンジュゲート融合ペプチド（１．２ｍｇ／ｍＬ）を含有すると予想された。
試験管１：
・１０４５μＬのＰ４６７−ＣＲＭ１９７
・８８０μＬ（１倍）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１４３】
この溶液をよく混合し、３５０μＬを５本のガラスバイアルに移し（各２．５ｍＬ）、次のように表示した：Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７；群１−高用量；推定Ｐ４６７濃度：約１．２ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−１＿ａｍ。
【０１４４】
試験管２：
・１０４５μＬのＰ６４７−ＣＲＭ１９７（強くボルテックス撹拌した後にピペット操作）
・８８０μＬ（１×）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１４５】
この溶液をよく混合し、３５０μＬを５本のガラスバイアルに移し（各２．５ｍＬ）、次のように表示した：Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７；群１−高用量；推定Ｐ６４７濃度：約１．２ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−４＿ａｍ。
【０１４６】
中用量群（群２）のサンプル調製：
これらのサンプルは、試験管当たりおよそ２１０μｇのコンジュゲート融合ペプチド（０．６ｍｇ／ｍＬ）を含有すると予想された。
試験管１：
・５２５μＬのＰ４６７−ＣＲＭ１９７
・１４００μＬ（１倍）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１４７】
この溶液をよく混合し、各３５０μＬを５本の２．５ｍＬガラスバイアルに移し、次のように表示した：Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７；群２−中用量；推定Ｐ４６７濃度：約０．６ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−２＿ａｍ。
【０１４８】
試験管２：
・５２５μＬのＰ６４７−ＣＲＭ１９７（強くボルテックス撹拌した後にピペット操作）
・１４００μＬ（１倍）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１４９】
この溶液をよくボルテックス撹拌し、３５０μＬを５本の２．５ｍＬガラスバイアルに移し、次のように表示した：Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７；群２−中用量；推定Ｐ６４７濃度：約０．６ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−５＿ａｍ。
【０１５０】
低用量群（群３）のサンプル調製：
これらのサンプルは、試験管当たりおよそ１０５μｇのコンジュゲート融合ペプチド（０．３ｍｇ／ｍＬ）を含有すると予想された。
試験管１：
・２６２μＬのＰ４６７−ＣＲＭ１９７
・１６６３μＬ（１倍）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１５１】
この溶液をよく混合し、各３５０μＬを５本の２．５ｍＬガラスバイアルに移し、次のように表示した：Ｐ４６７−ＣＲＭ１９７；群３−低用量；推定Ｐ４６７濃度：約０．３ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−３＿ａｍ。
【０１５２】
試験管２：
・２６２μＬのＰ６４７−ＣＲＭ１９７（強くボルテックス撹拌した後にピペット操作）
・１６６３μＬ（１倍）のＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０１５３】
この溶液をよくボルテックス撹拌し、３５０μＬを５本の２．５ｍＬガラスバイアルに移し、次のように表示した：Ｐ６４７−ＣＲＭ１９７；群３−低用量；推定Ｐ６４７濃度：約０．３ｍｇ／ｍＬ；ロット１４０９０３−６＿ａｍ。
【０１５４】
例６−免疫試験
プチド抗原
２つの融合ペプチドＰ４６７（配列番号８）およびＰ６４７（配列番号９）はＢａｃｈｅｍ（スイス）で合成された。両ハイブリッドを、抗原送達系として好適で付加的アジュバントを必要としないビロソーム（不活化インフルエンザウイルスＡ／ブリスベーン／５９／２００７由来のウイルスエンベロープ）とカップリングした。その融合ペプチドの量に対して計算した３種類の濃度を試験した：注射１回当たり１５μｇ、３０μｇおよび５０μｇ。比較のため、両融合ペプチドをＣＲＭ１９７とカップリングし、注射１回当たり濃度３０μｇで直接比較試験(head-to-head experiment)において使用した。総てのコンジュゲーション手順（ＣＲＭおよびビロソーム）はＭｙｍｅｔｉｃｓ（スイス）で実施された。
【０１５５】
ビロソーム処方物は冷凍由来で、解凍後に濁りを生じた。
【０１５６】
カップリング後、ＣＲＭ−Ｐ６４７コンジュゲートを沈澱処方物として受け取り、一方、ＣＲＭ−Ｐ４６７は水系バッファー中で可溶性を維持していた。
【０１５７】
３つのＨｅｒ−２／ｎｅｕ由来Ｂ細胞エピトープＰ４（配列番号３）、Ｐ６（配列番号１）およびＰ７（配列番号２）がｐｉＣｈｅｍ（オーストリア）で合成され、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）とカップリングされ、これらを単一ペプチドに対する抗体応答をＥＬＩＳＡにより評価するためにコーティング抗原として使用した。
【０１５８】
非コンジュゲート融合ペプチドに対する抗体応答を評価するために、Ｐ４６７およびＰ６４７をＥＬＩＳＡアッセイでコーティング抗原として使用した。
【０１５９】
免疫誘導プロトコール
以下の研究計画に従い、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに２〜３週間隔で皮下免疫した。
【０１６０】
ビロソームコンジュゲート受容群を不活化インフルエンザウイルス（不活化Ａ／ブリスベーン／５９／２００７）で１回プライムした。コンジュゲート構築物による免疫誘導はこのプライミングの１６日後に開始した。総てのビロソーム処方物を使用準備が整った状態で送達し、添加剤を伴わずに注射１回当たり１００μｌを適用した。
【０１６１】
ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートの保存液をＮａＣｌ溶液で希釈し、注射による投与前に水酸化アルミニウムゲル懸濁液と混合した。ＣＲＭ−Ｐ６４７（沈澱）をボルテックス撹拌し、この懸濁液をＣＲＭ−Ｐ４６７と同様に使用した。
【０１６２】
対照群は、エンプティービロソーム（ＴＩＲＩＶ）またはＮａＣｌ溶液＋水酸化アルミニウムを受容した。
【０１６３】
動物
６０個体の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス、配送時（２９．１０．２０１４）に６〜８週齢、起源：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ドイツ。
【０１６４】
１０群：１群当たりマウスｎ＝５−動物施設：Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｅｎｎａ／Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｔ。
【０１６５】
群
・群Ａ−エンプティービロソーム（ＴＩＲＩＶ）−１００μｌ／マウス；
・群Ｂ−Ｐ４６７−ビロソーム−１００μｌ中５０μｇ／マウス；
・群Ｃ−Ｐ４６７−ビロソーム−１００μｌ中３０μｇ／マウス；
・群Ｄ−Ｐ４６７−ビロソーム−１００μｌ中１５μｇ／マウス；
・群Ｅ−Ｐ６４７−ビロソーム−１００μｌ中５０μｇ／マウス；
・群Ｆ−Ｐ６４７−ビロソーム−１００μｌ中３０μｇ／マウス；
・群Ｇ−Ｐ６４７−ビロソーム−１００μｌ中１５μｇ／マウス；
・群Ｈ−ＮａＣｌ＋水酸化アルミニウム（対象）−１００μｌ／マウス；
・群Ｉ−Ｐ４６７−ＣＲＭ＋水酸化アルミニウム−１５０μｌ中３０μｇ／マウス；および
・群Ｊ−Ｐ６４７−ＣＲＭ＋水酸化アルミニウム−１５０μｌ中３０μｇ／マウス。
【０１６６】
免疫誘導前、２回目の免疫誘導から３週間後、３回目の免疫誘導から２週間後および４回目の免疫誘導から２週間後に血液を採取した。次に、これらの血液サンプルを以下に関して分析した：
・ペプチド特異的抗体力価（ＩｇＧ）；
・構築物特異的抗体力価（ＩｇＧ）；
・組換え細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＩｇＧ）に特異的な抗体力価；および
・ＳＫＢＲ−３癌細胞で発現される天然Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する特異性。
【０１６７】
ＥＬＩＳＡプロトコール
１）ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを０．５μｇ／ウェルのＫＬＨ−融合ペプチドコンジュゲートでコーティングした。バックグラウンド評価のため、ウェルをＫＬＨ単独でコーティングした。ブロッキング後、希釈血清を加えた。結合したＩｇＧをＨＲＰ標識抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＸ、Ｆｃフラグメント特異的、Ｎｒ：３１５−０３５−００８；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とその後のＴＭＢ染色を用いて検出した。停止溶液を添加した後、プレートを４５０ｎｍと６３０ｎｍで読み取った。
【０１６８】
（２）融合ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ
非修飾融合ペプチドＰ４６７およびＰ６４７を炭酸バッファー中０．５μｇ／ウェルの濃度でコーティング抗原として使用した。次に、希釈血清を加え、上記のペプチド特異的プロトコールに記載のとおりに分析した。
【０１６９】
（３）細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的ＥＬＩＳＡ
ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕのアミノ酸残基２３〜６５２）の組換え細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質（ＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ、カタログ番号１１２９−ＥＲ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をコーティング抗原として使用した。プレートを０．１μｇ／ウェルのタンパク質およびバックグラウンド評価のためには０．１％ＢＳＡでコーティングした。次に、希釈血清を加え、ＢＳＡ単独ウェルからのバックグラウンドシグナルを減算した後に、上記のように分析した。
【０１７０】
（４）ＳＫＢＲ３細胞を用いたＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的細胞アッセイ
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現するヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３（ＨＴＢ３０、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の供給源として使用した。細胞を継代培養３日後に採取し、−８０℃で保存した。細胞溶解は、いくつかの軽微な点を変更してGodell V and Disis ML J. Immunol. Meth (2005)に従前に記載されているとおりに行った：変異体１：プレートをヒト化抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｅｎｎａにより提供）でコーティングした；変異体２：プレートをヒト化抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体Ｐｅｒｊｅｔａ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｅｎｎａにより提供）でコーティングした。細胞溶解液のタンパク質含量は、使用前にＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット＃２３２２７を用いて直接定量した。溶解液を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００μｇ／ウェルの濃度に希釈した。ブロッキング後、細胞溶解液をウェルに加えた。個々のバックグラウンドのための対照には、ＢＳＡ／ＰＢＳを加えた。ＩｇＧ検出のために、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。ＴＭＢ染色を上記のとおりに行った。各血清サンプルについて、ＯＤ値を、ＳＫＢＲ−３コーティングウェルのＯＤ読み取り値とＢＳＡコーティングウェルのＯＤ読み取り値の間の差として計算した。
【０１７１】
例７−ペプチド特異的抗体
最終採血（すなわち４回の免疫誘導の後）からの血清を使用した。ビロソームおよびＣＲＭ１９７免疫マウスの血清からの種々の希釈液を次のように分析した：
・ビロソーム処方物：１：５，０００希釈で処理した群
・ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲート：１：１００，０００希釈で処理した群。
【０１７２】
データはＯＤ値で示した。ＫＬＨコーティングウェル上でのバックグラウンドを減算した（図１〜３参照）。
【０１７３】
結果
総ての処置群において３種類の単一ペプチドの総てに対する抗体を生じさせた（群Ｂ〜ＧおよびＩ〜Ｊ）。対照群（群ＡおよびＨ）ではペプチド特異的抗体は検出されなかった。抗体力価には顕著な差が見られた。
【０１７４】
ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートによる４回の免疫誘導により、３種類の個々のペプチドの総てに対して、対応するビロソーム処方物による４回の免疫誘導のおよそ１０倍の抗体力価が誘導された。
【０１７５】
両構築物（Ｐ４６７およびＰ６４７）は、カップリング相手にかかわらず、Ｐ７  Ｂ細胞エピトープ（配列番号２）に対して最高の抗体力価を誘導したが、Ｐ４  Ｂ細胞エピトープ（配列番号３）に対して誘導された力価は最低であった。
【０１７６】
図４および５に示されるように、融合ペプチドに結合された抗体もまた作製された。これらの結果は、４回目免疫誘導後の最終採血からの血清を用いた試験から導き出された。ビロソームで免疫誘導した群については、血清は１：５，０００希釈した。ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導した群については、血清は１：１００，０００希釈した。図４および５に示されるデータは、ＯＤ値で示す。図１〜３に示されるペプチド特異的結果と一致して、ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導した群では、対応するビロソーム処方物で免疫誘導したもののおよそ１０倍の抗体力価が見られた。一般に、Ｐ４６７よりもＰ６４７でより高い力価が見られた。
【０１７７】
例８−ＣＲＭコンジュゲートによる免疫誘導過程での抗体動態
血液は２回目、３回目および４回目の免疫誘導の２週間後に採取し、両融合ペプチド（Ｐ４６７およびＰ６４７）に特異的な抗体を測定した（血清は１：１００，０００希釈した）。図６および７に示されるように、融合タンパク質特異的抗体力価は２回目の免疫誘導の後にすでにかなり高く、３回目および４回目の免疫誘導の後にわずかに上昇した。３回目および４回目の免疫誘導の後の融合タンパク質特異的抗体力価における小さな上昇は、有効な免疫応答を生成するためにはＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートによる２回または３回の免疫誘導（すなわち、連続２用量または３用量）で十分であり得ることを示す（ＢＡ１−２回の免疫誘導の後の採血；ＢＡ２−３回の免疫誘導の後の採血；ＢＡ２−４回の免疫誘導の後の採血）。
【０１７８】
例９−細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的抗体
血液を２時点で採取した；ＢＡ１（２回の免疫誘導の後の採血）およびＢＡ２（３回の免疫誘導の後の採血）。種々の血清希釈液を分析した−ビロソーム処方物で免疫誘導した群に由来する血清は１：４００希釈し、ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導した群に由来する血清は１：２，０００希釈した。図８に示されるデータはＯＤ値である。
【０１７９】
図８に示されるように、両融合ペプチド構築物（ビロソームコンジュゲートおよびＣＲＭ１９７コンジュゲート）は、組換え細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に結合する抗体を誘導した。偽処置マウスおよび免疫誘導前血清では有意なＨｅｒ−２／ｎｅｕ反応性は見られなかった。ペプチド特異的および融合ペプチド特異的な結果によれば、ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導した群では、３０μｇ濃度のビロソーム処方物に比べて有意に高いＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的力価が見られた。また、ビロソームでの３回目の免疫誘導の後にも有意な抗体力価が見られた。２回目の免疫誘導の後にＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートですでに免疫化されたマウスでは、抗体力価は高く、３回目の免疫誘導の後に顕著に上昇することはなかった。
【０１８０】
２回目、３回目および４回目の免疫誘導の後の血清抗体力価の分析から、ビロソームコンジュゲートではＣＲＭコンジュゲートとは異なる抗体応答動態が明らかとなった。２回目の免疫誘導の後（免疫誘導開始の６週間後）、ビロソームコンジュゲートに比べてＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導した動物では高い抗体力価が見られた（図９参照）。ビロソームコンジュゲートでの３回目の免疫誘導の後に、有意な抗体力価の上昇が見られた（図８参照）。４回目の免疫誘導の後では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的抗体力価は、ビロソーム免疫マウスとＣＲＭ免疫マウスの間で同等であった（図１０参照）。ＣＲＭ−融合ペプチドコンジュゲートで免疫誘導したマウスでは、３回目と４回目の免疫誘導の間の抗体力価の上昇は小さく、２回目の免疫誘導の後の強い免疫原性、それとともに３回目の免疫誘導の後のさらに強い免疫原性を示す（図１１参照）。
【０１８１】
図１２に示されるように、３０μｇのＰ４６７−ビロソームコンジュゲートまたは３０μｇのＰ４６７−ＣＲＭコンジュゲートによる２回目、３回目および４回目の免疫誘導の後の組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体応答動態の比較から、２回目の免疫誘導の後でさえ、ＣＲＭコンジュゲートによる免疫誘導後の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体力価（各クラスターの４本目の柱）は、対応するビロソームコンジュゲートによる免疫誘導後の抗体力価（各クラスターの３本目の柱）よりも有意に高かったことが明らかである。４回目の免疫誘導の後、両コンジュゲートは同等の組換え抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体力価をもたらす。
【０１８２】
図１３に示されるように、３０μｇのＰ６４７−ビロソームコンジュゲートまたは３０μｇのＰ６４７−ＣＲＭコンジュゲートによる２回目、３回目および４回目の免疫誘導の後の組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体応答動態の比較から、２回目の免疫誘導の後でさえ、ＣＲＭコンジュゲートによる免疫誘導の後の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体力価（各クラスターの４本目の柱）は、対応するビロソームコンジュゲートによる免疫誘導の後の抗体力価（各クラスターの３本目のカラム）よりも有意に高かったことが明らかである。
【０１８３】
これらの結果は、融合ペプチドの送達系としてビロソームまたはＣＲＭ１９７のいずれかを用いる場合にＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的抗体力価の動態に顕著な差を示す。ビロソームコンジュゲートを用いる場合に見られる抗体力価の上昇は、ＣＲＭコンジュゲートを用いる場合よりも有意に遅く、一般に、対応するＣＲＭ免疫誘導で見られるものと同等のレベルに達するためには４回の免疫誘導を必要とする（融合ペプチドＰ４６７に関する）。融合ペプチドＰ６４７に関しては、ビロソームコンジュゲートは、４回目の免疫誘導の後でさえ同等の抗体力価を誘導しなかったことから、ＣＲＭコンジュゲートよりも劣った（図１３）。
【０１８４】
例１０−天然Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する特異性
４回の免疫誘導後に採取した最終血液サンプルに由来する血清を分析した。データはＯＤ値として表し、総ての血清を１：１００希釈した。
【０１８５】
図１４に示されるように、生成された抗体は、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞で過剰発現される天然型のＨｅｒ−２／ｎｅｕを認識した。非精製細胞溶解液を用いるＥＬＩＳＡの範囲内で機能するためには低い血清希釈率が必要であり、本発明者らの従前のデータと一致した。ビロソームコンジュゲートで免疫誘導した群では、ペプチドおよび組換え細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する抗体力価が有意に低いにもかかわらず、ＯＤ値はビロソームコンジュゲートとＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートの間で比較できる。これらの結果は、脂質結合またはビロソームのいくつかの部分に対する抗体とＳＫＢＲ−３細胞溶解液中の成分（例えば、細胞膜）との反応性のより説明され得る。この結合はＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートには存在しない。
【０１８６】
例１１−ミョウバン／Ａｌ（ＯＨ）３またはモンタニドを伴うペプチドＰ４６７−ＣＲＭでの免疫誘導後の免疫応答の評価
試薬の調製
融合タンパク質Ｐ４６７（４９アミノ酸長；Ｂａｃｈｅｍ、スイスで合成）をＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素突然変異体；ＰｉＣｈｅｍ／Ｇｒａｚ／オーストリアとカップリングし、０．４ｍｇ／ｍｌの保存液濃度で配送した。マウスにおいてＰ４６７−ＣＲＭ媒介免疫応答を３種類のアジュバントの存在下または不在下で評価した：
１）ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）「８５」（Ｂｒｅｎｎｔａｇ、デンマークからの水酸化アルミニウム；アルミニウム含量１０ｍｇ／ｍｌ、バッチ番号８５５６３；製造者の説明書に従って１／１０希釈で使用）；
２）Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ−懸濁液（Ｓｅｒｖａ、ドイツからの水酸化アルミニウム；１．３％純度、無菌、アルミニウム含量５．９〜７．１ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号１２２６１、バッチ番号１１１５８９；製造者の説明書に従って１／３希釈で使用）；および
３）モンタニドＩＳＡ  ５１ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ、フランスから、カタログ番号３６３６２ＺＦＬ２Ｒ３；バッチ番号２４２３３９５）。
【０１８７】
免疫誘導プロトコールは以下の「免疫誘導プロトコール」に記載されている。簡単に述べれば、３種類の濃度のペプチド構築物を試験した：注射１回当たり１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇ。上記の例で概略を示した動物試験で使用したＳｅｒｖａからの水酸化アルミニウムを２つのマウス群で試験し（「免疫誘導プロトコール」参照）、Ｂｒｅｎｎｔａｇからの水酸化アルミニウムの使用と比較した。これら２群においてＳｅｒｖａからの水酸化アルミニウムとともに使用したＰ４６７−ＣＲＭの量は１０μｇおよび２５μｇであった。
【０１８８】
モンタニドを用いたペプチド構築物の乳化
モンタニドを用いたＰ４６７−ＣＲＭ、ＰＢＳまたはＮａＣｌの乳化は製造者（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）の説明書に従って行った。Ｐ４６７−ＣＲＭペプチド構築物をＰＢＳ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ水酸化アルミニウムの場合）またはＮａＣｌ（Ｓｅｒｖａ水酸化アルミニウムの場合）のいずれかと混合した。次に、この溶液にアジュバントを加え、室温で十分撹拌した。次に、これらの混合物を投与前、最低４５分間室温で保持した。
【０１８９】
免疫誘導プロトコール
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ、配送時６〜８週齢）（各群マウスｎ＝８；対照群ｎ＝４）。
【０１９０】
マウス群、すなわちＡ〜Ｏを次のように免疫誘導した。
群Ａ（Ｐ４６７−ＣＲＭ、１０μｇ／注射）：１２５０μｌ  ＮａＣｌ（１５００μｌ）とともに２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１５０μｌ／マウス（＝１０μｇ／マウス）
群Ｂ（Ｐ４６７−ＣＲＭ、２５μｇ／注射）：８７５μｌ  ＮａＣｌ（１５００μｌ）とともに６２５μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１５０μｌ／マウス（＝２５μｇ／マウス）
群Ｃ（Ｐ４６７−ＣＲＭ、５０μｇ／注射）：２５０μｌ  ＮａＣｌ（１５００μｌ）とともに１２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１５０μｌ／マウス（＝５０μｇ／マウス）
群Ｄ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−ミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ、１０μｇ／注射）：１７５μｌミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ＋１３２５μｌ  ＰＢＳ（１７５０μｌ）とともに２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１７５μｌ／マウス（＝１０μｇ／マウス）
群Ｅ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−ミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ、２５μｇ／注射）：１７５μｌミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ＋９５０μｌ  ＰＢＳ（１７５０μｌ）とともに６２５μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１７５μｌ／マウス（＝２５μｇ／マウス）
群Ｆ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−ミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ、５０μｇ／注射）：１７５μｌミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ＋３２５μｌ  ＰＢＳ（１７５０μｌ）とともに１２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１７５μｌ／マウス（＝５０μｇ／マウス）
群Ｇ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−ミョウバンＳｅｒｖａ、１０μｇ／注射）：１０００μｌミョウバンＳｅｒｖａ＋２５０μｌ  ＮａＣｌ（１５００μｌ）とともに２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１５０μｌ／マウス（＝１０μｇ／マウス）
群Ｈ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−ミョウバンＳｅｒｖａ、２５μｇ／注射）：１０００μｌミョウバンＳｅｒｖａ（１６２５μｌ）とともに６２５μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１６０μｌ／マウス（＝１０μｇ／マウス）
群Ｉ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−モンタニド、１０μｇ／注射）：３００μｌ  ＮａＣｌ＋６００μｌモンタニドとともに３００μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１００μｌ／マウス
群Ｊ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−モンタニド、２５μｇ／注射）：７００μｌモンタニドとともに７００μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１２６μｌ／マウス
群Ｋ（Ｐ４６７−ＣＲＭ−モンタニド、５０μｇ／注射）：１３００μｌモンタニドとともに１３００μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。２５２μｌ／マウス
群Ｌ（Ｐ４６７−モノマー、２５μｇ／注射）：１２５０μｌ  ＮａＣｌとともに２５０μｌのＰ４６７−ＣＲＭ。１５０μｌ／マウス（＝２５μｇ／マウス）
群Ｍ（モンタニド）：１０００μｌ  ＮａＣｌ＋１０００μｌモンタニド。２５２μｌ／マウス
群Ｎ（ミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ）：１５７５μｌ  ＰＢＳ＋１７５μｌミョウバンＢｒｅｎｎｔａｇ。１７５μｌ／マウス
群Ｏ（ＣＲＭ、５０μｇ／注射）：保存液濃度：２ｍｇ／ｍｌ。ＮａＣｌで１：４希釈（１５０＋４５０  ＮａＣｌ）。１００μｌ／マウス
【０１９１】
対照群はＣＲＭ、水酸化アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）またはモンタニド単独のいずれかを受容した。
【０１９２】
初回投与前（ＢＡ０）、２回目の免疫誘導から２０日後（ＢＡ１）および３回目の免疫誘導から１８日後（ＢＡ２）に動物から血液を採取した。抗体力価動態の評価のために、３回目の免疫誘導から８週間後（ＢＡ３）にも血液を採取した。
【０１９３】
各群の残りの４個体のマウス（総てのマウスを犠牲にした対照群Ｍ、Ｎ、およびＯを除く）で、３回目の免疫誘導から８週間後と１６週間後（それぞれＢＡ４およびＢＡ５）に抗体動態および必要な追加免疫間隔を確認するために抗体力価をさらに評価した。
【０１９４】
脾臓細胞の調製および培養
マウス（ｎ＝４／群）を犠牲にし、それらの脾臓を無菌条件下で摘出し、細断し、無菌フィルターで濾過した。細胞懸濁液を従前に記載されているように(Wiedermann et al, Int. Immunol. 1999; Oct;11(10):1717-24)調製した。脾細胞を９６ウェル丸底プレートにウェル当たり０．５×１０６の密度で播種し、２０μｇ／ｍｌ濃度のＣＲＭまたはＰ４６７で７２時間刺激した。上清を分析まで−２０℃で保存した。対照としてＣｏｎＡによる刺激を行った。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡプロトコール
（ｉ）ペプチド特異的抗体レベルの測定
炭酸バッファーで希釈した非コンジュゲート融合ペプチドＰ４６７（Ｂａｃｈｅｍ、スイス）を、コーティング抗原として０．５μｇ／マイクロタイターウェルの濃度で使用した。血清（ｎ＝８／群）を希釈し、これらのウェルに加え、結合したＩｇＧ抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＸ（Ｆｃフラグメント特異的、カタログ番号３１５−０３５−００８；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えた。停止溶液を加え、これらのプレートを４５０ｎｍと６３０ｎｍで読み取った。
【０１９６】
ＩｇＧサブセットのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの検出のために、希釈血清をマイクロタイタープレートの抗原コーティングウェルに適用した後、ラット抗マウスＩｇＧ１またはラット抗マウスＩｇＧ２ａ抗体のいずれかを適用した。次に、二次抗体ＨＲＰ標識マウス抗ラットＩｇＧ、次いで、ＴＭＢを検出に使用した。停止溶液を加え、これらのプレートを４５０ｎｍと６３０ｎｍで読み取った。
【０１９７】
（ｉｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的抗体レベルの測定
マイクロタイタープレートのウェルを、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合したヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕの組換え細胞外ドメイン（アミノ酸残基２３〜６５２）を含んでなる融合タンパク質でコーティングした。各ウェルを０．１μｇの融合タンパク質でコーティングした。次に、希釈したマウス血清を上記のように分析した。
【０１９８】
ＩｇＧサブセットのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの検出のために、希釈血清を抗原コーティングウェルに適用した後、ラット抗マウスＩｇＧ１またはラット抗マウスＩｇＧ２ａのいずれかを加えた。ＨＲＰ標識マウス抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を検出に使用した。
【０１９９】
（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン産生−ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮγの測定
ＣＲＭ−またはＰ４６７刺激脾細胞からの上清を採取し、製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）の説明書に従ってＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮγの濃度に関して分析した。これらの上清は無希釈で使用するか、分析前に１：１０〜１：２０希釈した。
【０２００】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
ＦＡＣＳは新たに単離した脾臓細胞で行った（２４ウェル平底プレート中２．５×１０６細胞／ｍｌ）。これらの細胞をミリスチン酸酢酸ホルボール（ＰＭＡ；１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１．２５μＭ）の存在下で２時間、およびブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、３７℃でさらに４時間インキュベートした。次に、細胞を４℃で一晩保持し、翌朝、以下の標的に対する抗マウス抗体で染色した。
【０２０１】
【表１０】
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【０２０２】
（ｉ）染色プロトコール：
細胞を採取し、マイクロチューブに分割した（１チューブ当たり１×１０６／細胞）。各マウスサンプルに対して上述の抗体カクテルで単染色を行った。
【０２０３】
次に、細胞を洗浄し、Ｆｃブロック（抗マウスＣＤ１６／３２）でブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ３３５に対する抗体で染色した後、固定／透過処理ならびにＩＦＮγおよびグランザイムＢに関する細胞内染色を行った。
【０２０４】
脾細胞集団−Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｂ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ３３５＋）に関する分析を行った。これらの分析にはまた、細胞内ＩＦＮγタンパク質の検出も含んだ。
【０２０５】
統計分析
ＥＬＩＳＡ結果の分析に関しては、Ｐｒｉｓｍで対応のないｔ検定（両側、信頼区間９５％）を適用した。有意差は１以上のアスタリスクで示される（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊０．０１＜Ｐ値＜０．００１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。有意性無しは「ｎｓ」で示す。３群以上を比較する場合にはＰｒｉｓｍで一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用した。ＦＡＣＳ結果の分析に関しては、Ｐｒｉｓｍでマン・ホイットニー検定（両側、信頼区間９５％）を適用した。
【０２０６】
結果
体液性応答
（ｉ）ペプチド特異的抗体レベル
３回の免疫誘導後の最終採血に由来する血清、ならびに免疫誘導前の血清を、１：１００．０００（ＩｇＧおよびＩｇＧ１の場合）または１：１００（ＩｇＧ２ａの場合）希釈した。全血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体力価をそれぞれ図１５Ａ〜Ｃに示す。
【０２０７】
これらの図では、以下の群（フレーム）を互いに比較し、統計学的に評価した。
・Ｄ、Ｅ、Ｆ：ミョウバン：１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ
・Ｉ、Ｊ、Ｋ：モンタニド：１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ
【０２０８】
データは、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導した総てのマウスで抗Ｐ４６７抗体が惹起されたことを示す。対照動物またはＰ４６７単独で免疫誘導したマウスでは抗体応答は誘導されなかった。ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と比較して、Ｐ４６７−ＣＲＭがモンタニドとともに投与された場合には、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに対する抗体レベルは有意に高かった。ＩｇＧ２ａ力価は一般にＩｇＧ１に関するものより低かったが、Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニドで免疫誘導した動物では、かなり高いＩｇＧ２ａ力価が明らかであった。
【０２０９】
（ｉｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的抗体レベル
３回の免疫誘導の後の最終採血に由来する血清、および免疫誘導前の血清を、１：２５００（〜１０．０００）（ＩｇＧ）、１：１０．０００（ＩｇＧ１）および１：１００（ＩｇＧ２ａ）希釈した。血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体力価をそれぞれ図１６Ａ〜Ｃに示す。
【０２１０】
Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導した総ての動物で、抗細胞外Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩｇＧおよびＩｇＧ１抗体の高い力価が明らかであった。対照群またはＰ４６７単独で免疫誘導したマウスでは抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体応答は明らかでなかった。ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と比較して、ＩｇＧおよびＩｇＧ１抗体力価は、Ｐ４６７−ＣＲＭペプチド構築物がモンタニドとともに投与された場合には有意に高かった。
【０２１１】
サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−５）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生
（ｉ）ＣＲＭまたはＰ４６７で刺激した後のＩＬ−２産生
ミョウバンの存在下、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスに由来するＣＲＭ刺激脾細胞に比べ、モンタニドの存在下、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスに由来するＣＲＭ刺激脾細胞ではＩＬ−２レベルが高かった（図１７Ａおよび１７Ｂ参照）。
【０２１２】
（ｉｉ）ＣＲＭまたはＰ４６７で刺激した後のＩＦＮγ産生
図１８Ａおよび１８Ｂは、ＣＲＭ（図１８Ａ）またはＰ４６７（図１８Ｂ）の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された脾細胞の上清におけるＩＦＮγの濃度を示す。モンタニドとともに２５μｇのＰ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスでは、ＩＦＮγのレベルは範囲外であった。このマウスからのデータは除外し、図１８Ｃ（ＣＲＭによる刺激）および図１８Ｄ（Ｐ４６７による刺激）に示されるように、さらなる分析を行った。
【０２１３】
ミョウバンまたはモンタニドの存在下、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導した総てのマウスに由来する脾細胞において、ＣＲＭ刺激によりＩＦＮγ産生が誘導された。モンタニドを用いた場合（１０μｇ群）のＩＦＮγレベルは、ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）の存在下、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導した対応する群よりも高かった。Ｐ４６７−ＣＲＭで刺激した際、ＩＦＮγレベルは、５０μｇ  Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したモンタニド群で最も高かった。
【０２１４】
（ｉｉｉ）ＣＲＭまたはＰ４６７で刺激した後のＩＬ−５産生
図１９Ａおよび１９Ｂは、ＣＲＭ（図１９Ａ）またはＰ４６７（図１９Ｂ）の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された脾細胞の上清におけるＩＬ−５の濃度を示す。
【０２１５】
ＩＬ−５レベルは、モンタニドの存在下、Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスに由来するＣＲＭ刺激脾細胞で有意に高かった。Ｐ４６７−ＣＲＭペプチド構築物で刺激した後、モンタニドで免疫誘導されたマウスにおいていくらかのＩＬ−５産生が誘導されたが、このＩＬ−５レベルはＣＲＭ刺激後のレベルの約１０分の１であった。
【０２１６】
ＦＡＣＳ分析による脾細胞の特性決定；ＩＦＮγ産生の細胞内染色
異なるアジュバント（すなわち、ミョウバンとモンタニド）の使用がリンパ球分布、特に、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球を変更するかどうかを評価するために、モンタニドまたはミョウバンの存在下、種々の濃度のＰ４６７での免疫誘導後に脾細胞のＦＡＣＳ分析を行った。脾細胞をマウスから単離し、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋、図２０Ａ、およびＣＤ３＋ＣＤ８＋、図２０Ｂ）、Ｂ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋、図２０Ｃ）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ３３５＋、図２０Ｄ）のパーセンテージを分析した。
【０２１７】
データは、ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）に比べ、モンタニドとともにより高用量（すなわち、２５ｍｇおよび５０ｍｇ）のＰ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスに由来する脾細胞において、ＮＫ細胞の有意な減少を示す。
【０２１８】
ＦＡＣＳ分析によるＩＦＮγ産生脾細胞の検出
異なるアジュバントでの免疫誘導がＩＦＮγ産生ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の分布に変化をもたらすかどうかを検討するために、総ての群からのマウスの脾細胞を単離し、Ｔ細胞（ＣＤ４＋、図２１Ａ、およびＣＤ８＋、図２１Ｂ）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ３３５＋、図２１Ｃ）で細胞内ＩＦＮγを測定した。
【０２１９】
データは、Ｄ４＋  Ｔ細胞はＩＦＮγを産生し、これは漸増濃度のＰ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスにおいて顕著であったことを示す。総ての対照群（およびナイーブマウス）が同等のＩＦＮγレベルを示した。対照的に、モンタニドとともに２５μｇ  Ｐ４６７−ＣＲＭで免疫誘導したマウスに由来するＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＦＮγレベルはより高かった。データはまた、Ｐ４６７−ＣＲＭ＋モンタニドで免疫誘導したマウスに由来するＮＫ細胞のよるＩＦＮγ産生も示す。
【０２２０】
抗Ｈｅｒ２およびＰ４６７ペプチド抗体応答の動態
抗体応答の動態を評価するために、最終の免疫誘導から８週間、１６週間および６か月後に血液サンプルを採取した。次に、本明細書に開示されている方法に従い、血液サンプルのＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的およびＰ４６７ペプチド特異的抗体力価を分析した。
【０２２１】
図２２に示されるように、Ｐ４６７ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価は、ミョウバンまたはモンタニドのいずれかとともに最終用量のＰ４６７−ＣＲＭペプチド構築物を投与した後８週間（ＢＡ３）、１６週間（ＢＡ４）および６か月（ＢＡ５）の時点で高いままであった。同様に、図２３に示されるように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的ＩｇＧ抗体力価は、ミョウバンまたはモンタニドのいずれかとともに最終用量のＰ４６７−ＣＲＭペプチド構築物を投与した後８週間（ＢＡ３）、１６週間（ＢＡ４）および６か月（ＢＡ５）の時点で高いままであった。
【０２２２】
要約
ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートとこれらの融合ペプチドを含んでなるビロソーム処方物は両方とも単一のＢ細胞エピトープ（Ｐ４、Ｐ６およびＰ７）、ならびに融合ペプチド（Ｐ４６７およびＰ６４７）に特異的な抗体を生成した。これらの抗体はまたＨｅｒ−２／ｎｅｕの組換え細胞外ドメインにも、またＳＫＢＲ−３乳癌細胞で発現される天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質にも結合することにも留意されたい。
【０２２３】
ＣＲＭ１９７−融合ペプチドコンジュゲートはＢ細胞エピトープ−およびＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体の誘導においてより有効であり、すなわち、対応するビロソーム処方物に比べて有意に高い抗体力価（およそ１０〜２０倍）を生じた。
【０２２４】
組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体力価に基づけば、免疫誘導の過程で抗体応答の動態には明らかな違いがあり、結果は、ＣＲＭコンジュゲートは抗体力価により早期の上昇をもたらし（すでに２回目の２回目の免疫誘導の後、３回目の免疫誘導の後にピークがある）、一方、ビロソームコンジュゲートを用いた場合の抗体力価の上昇はより緩慢で、対応するＣＲＭコンジュゲートで免疫誘導されたマウスで見られたレベルに達するには４回の免疫誘導を必要とした。
【０２２５】
ビロソームは一般に、好適な抗原送達系である。しかしながら、本明細書で明らかに開示される結果は、ビロソームコンジュゲートによる免疫誘導後には抗体力価の上昇の遅延とともに、対応するＣＲＭコンジュゲートで免疫誘導された動物で見られるものと同等の力価を達成するために４回の免疫誘導の必要性を示す。最適な抗体応答のための時間および用量の両方がＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチン組成物の臨床適用に関して考慮されるべき重要な因子である。よって、これらの結果は、ＣＲＭ１９７がワクチン送達に関してＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合ペプチドにより好適な担体タンパク質であることを示す。
【０２２６】
ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）およびモンタニドは、Ｐ４６７−ＣＲＭペプチド構築物に対する上述の抗体応答をさらに増強することが示された。抗Ｐ４６７特異的ＩｇＧならびにＩｇＧ１抗体力価は、モンタニドで免疫誘導された総てのマウスで（総ての用量）、ミョウバンに比べて有意に高かった。抗Ｐ４６７  ＩｇＧ２ａ抗体力価もまた、モンタニドで免疫誘導されたマウスで（総ての用量）、ミョウバンに比べて高かった。抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩｇＧおよびＩｇＧ１抗体力価は、モンタニドで免疫誘導されたマウスにおいて、検討した総ての用量で、ペプチド構築物と併用投与した場合に有意に高かった。Ｐ４６７ペプチド特異的抗体とは対照的に、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩｇＧ２ａ抗体はほとんどまたは全く検出されなかった。
【０２２７】
ＩＦＮγは、脾細胞により、それらの細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＣＲＭの存在下で培養された場合に、Ｐ４６７の存在下で培養された細胞に比べて有意に高い量で産生された。ＣＲＭによる刺激の後、ＩＦＮγレベルは、低用量のペプチド構築物とともに投与された群では、モンタニドとともに適用される場合に、ミョウバン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）とともに適用される場合の同じ量の構築物を受容した群に比べて有意に高かった。このデータは、モンタニドがミョウバンよりも高い抗体力価を誘導するだけでなく、よりサイトカインレベルを誘導することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2018511659.tif 000030
【図１５Ａ】
2018511659.tif 000031
【図１５Ｂ】
2018511659.tif 000032
【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
2018511659.tif 000034
【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
2018511659.tif 000040
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
2018511659.tif 000044
【図２０Ｄ】
2018511659.tif 000045
【図２１Ａ】
2018511659.tif 000046
【図２１Ｂ】
2018511659.tif 000047
【図２１Ｃ】
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【図２２】
2018511659.tif 000049
【図２３】
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【国際調査報告】
2018511659.tif 000051
2018511659.tif 000052
2018511659.tif 000053