(57)【要約】本開示は、プロピオネート異化酵素をコードする異種遺伝子を含む、操作された細菌細胞を提供する。他の態様では、操作された細菌細胞は、プロピオネートの輸送体またはキルスイッチをコードする少なくとも１つの異種遺伝子をさらに含む。本開示は、操作された細菌を含む医薬組成物、ならびに該医薬組成物を用いて、プロピオネートの異化を伴う障害、例えば、プロピオン酸血症およびメチルマロン酸血症を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む細菌であって、前記遺伝子配列が、プロピオネート異化酵素遺伝子と天然では会合していない直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している、細菌。
【請求項２】
プロピオネートの１つまたは複数の輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含み、前記遺伝子配列が、輸送体遺伝子と天然では会合していないプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
スクシネートの１つまたは複数の輸出体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含み、前記遺伝子配列が、輸送体遺伝子と天然では会合していないプロモーターに作動可能に連結している、請求項１または請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
スクシネートの前記細菌への移入を低減する遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
前記プロモーターが、直接的または間接的誘導性プロモーターである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌におけるプロピオネートの内因性生合成を低減する遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーター、およびプロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項８】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーター、およびプロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、同じプロモーターの同じコピーである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項９】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーター、およびプロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、異なるプロモーターである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１０】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、哺乳動物の消化管に見いだされる外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１１】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、低酸素または嫌気的条件下で直接的または間接的に誘導される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１２】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１３】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、ＦＮＲＳプロモーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１４】
プロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、哺乳動物の消化管に見いだされる外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１５】
プロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、低酸素または嫌気的条件下で直接的または間接的に誘導される、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１６】
プロピオネートの輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結した前記プロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１７】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、該細菌における染色体上に位置する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１８】
プロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、該細菌におけるプラスミド上に位置する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１９】
プロピオネートをスクシネートに変換する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項２０】
ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢから選択される１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項２１】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、単一の遺伝子カセット内に存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項２２】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列が２つまたはそれ以上の別個の遺伝子カセット内に存在する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項２３】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、第１のプロモーターに作動可能に連結した第１のカセット内に存在し、第２のプロモーターに作動可能に連結した第２の遺伝子カセット内に存在する、請求項２２に記載の細菌。
【請求項２４】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２５】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、異なるプロモーターである、請求項２３または請求項２４に記載の細菌。
【請求項２６】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項２３または２４に記載の細菌。
【請求項２７】
前記第１の遺伝子カセットが、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢおよびａｃｃＡ１を含み、前記第２の遺伝子カセットが、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項２８】
ｐｒｐＥをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２５と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項２９】
ｐｃｃＢをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３０】
ａｃｃＡ１をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号３８と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３１】
ｍｍｃＥをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号３２と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３２】
ｍｕｔＡをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号３３と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３３】
ｍｕｔＢをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号３４と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３４】
プロピオネートをポリヒドロキシアルカノエートに変換する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項３５】
ｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む、請求項３４に記載の細菌。
【請求項３６】
ｐｒｐＥをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２５と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３５に記載の細菌。
【請求項３７】
ｐｈａＢをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２６をコードすると少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３５に記載の細菌。
【請求項３８】
ｐｈａＣをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２７をコードすると少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３５に記載の細菌。
【請求項３９】
ｐｈａＡをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２８をコードすると少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３５に記載の細菌。
【請求項４０】
プロピオネートをピルベートおよびスクシネートに変換する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項４１】
１つまたは複数の遺伝子配列が、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＣおよびｐｒｐＤをコードする、請求項４０に記載の細菌。
【請求項４２】
前記１つまたは複数の遺伝子配列が、ｐｒｐＥをコードする、請求項４０または請求項４１に記載の細菌。
【請求項４３】
ｐｒｐＥをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号２５と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４０または請求項４１に記載の細菌。
【請求項４４】
ｐｒｐＣをコードする前記１つまたは複数の遺伝子配列が、配列番号５７と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４０または請求項４１に記載の細菌。
【請求項４５】
ｐｒｐＤをコードする前記１つまたは複数の遺伝子配列が、配列番号５８と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４０または請求項４１に記載の細菌。
【請求項４６】
ｐｒｐＢをコードする前記１つまたは複数の遺伝子配列が、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４０または請求項４１に記載の細菌。
【請求項４７】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする前記１つまたは複数の遺伝子配列が、細菌細胞におけるプラスミド上に位置する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項４８】
１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする前記１つまたは複数の遺伝子配列が、前記細菌細胞における染色体上に位置する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項１〜４７に記載の細菌。
【請求項４９】
前記スクシネート輸出体をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、ｄｃｕＣをコードする、請求項３〜４８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５０】
ｄｃｕＣをコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号４９の配列と少なくとも約９０％の同一性である、請求項４９に記載の細菌。
【請求項５１】
前記スクシネート輸出体をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、ｓｕｃＥ１をコードする、請求項３〜４８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５２】
ｓｕｃＥ１をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、配列番号４６の配列と少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項５１に記載の細菌。
【請求項５３】
操作された細菌細胞が、前記少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５４】
前記操作された細菌細胞が、ｐｒｐＥの活性を増加させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５５】
前記操作された細菌細胞が、ｐｋａにおける遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５６】
プロバイオティック細菌細胞である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５７】
バクテロイデス属、バフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、大腸菌属、乳酸桿菌属および乳酸球菌属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５８】
大腸菌属のものである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５９】
前記操作された細菌細胞が、大腸菌種ニッスル株のものである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６０】
前記操作された細菌細胞が哺乳動物消化管内に存在する場合、前記操作された細菌細胞が、補足される遺伝子における栄養要求体である、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６１】
前記哺乳動物消化管が、ヒト消化管である、請求項６０に記載の細菌。
【請求項６２】
前記操作された細菌細胞が、ジアミノピメリン酸における栄養要求体、またはチミン生合成経路における酵素における栄養要求体である、請求項６０または請求項６１に記載の細菌。
【請求項６３】
前記操作された細菌細胞が、該細菌に対して有毒である物質をコードする遺伝子を有するようにさらに操作され、前記遺伝子が、前記哺乳動物消化管に天然で存在しない環境条件により直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の細菌と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
経口投与用に製剤化された、請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
対象におけるプロピオネート、メチルマロネートおよびそれらの副産物分子のレベルを低下させるための、および／または対象におけるプロピオネートの異化を伴う疾患もしくは障害を治療するための方法であって、請求項６４または請求項６５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項６７】
プロピオネートの異化を伴う前記障害が、有機酸血症である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記有機酸血症が、プロピオン酸血症（ＰＡ）である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記有機酸血症が、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
プロピオネートの異化を伴う前記障害が、ビタミンＢ１２欠乏症である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、それぞれの全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、２０１５年７月３１日に出願した米国特許仮出願第６２／１９９，４４５号および２０１６年５月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／３４１，３２０号の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
健常な対象では、人体は、特定のアミノ酸、例えばイソロイシン、バリン、トレオニンおよびメチオニン、ならびに奇数鎖脂肪酸をプロピオニルＣｏＡに変換してエネルギーを作り出す（図４）。次いで酵素プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）がプロピオニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡに変換し、次いでメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）酵素がメチルマロニルＣｏＡをスクシニルＣｏＡに変換し、そのスクシニルＣｏＡがクエン酸サイクルおよび糖新生に入る。
【０００３】
プロピオニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡの毒性蓄積につながる酵素欠損または突然変異は、プロピオネート異化に関連する障害、例えば、プロピオン酸血症（ＰＡ）およびメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の発生をもたらす。ビタミンＢ１２の重度栄養障害もまたＭＭＡにつながり得る（Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍら、Ｍ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９９巻（７号）：３１７〜３２３頁、１９７８年）。これらの疾患では、プロピオン酸またはメチルマロン酸が血流内に蓄積して、脳、心臓および肝臓の損傷をもたらし得る（図３および４）。疾患の臨床症状は、酵素欠損度に依存して様々であり、発作、嘔吐、嗜眠、筋緊張低下、脳症、発育遅延、成長障害、および続発性高アンモニア血症を含む（Ｄｅｏｄａｔｏら、Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ、１４２巻（２号）：１０４〜１１２頁、２００６年）。
【０００４】
プロピオネート異化を伴う障害の現在利用可能な治療は、該障害の長期管理には不十分であり、厳しい制限を有する。微量栄養素およびビタミンの補給を必要に応じて用いる低タンパク質食は、多くのそのような障害のための広く受け入れられている長期疾患管理戦略である（Ｓａｕｄｕｂｒａｙら、Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、２０１２年）。Ｌ−カルニチンの補給、ならびに腸内プロピオン酸生成細菌叢を除去するための抗生物質療法も、利用されることが多い。しかし、タンパク質は代謝活性に必要であるので、食事摂取制限には大いに問題があり得る（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、９巻（１３０号）：１〜３６頁、２０１４年）。それ故、適正なモニタリングおよび患者コンプライアンスがあったとしても、食事制限に起因する知能障害の発生率は高い（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、２０１４年）。最近、ＰＡおよびＭＭＡ対象に対して肝臓移植が考慮されている（Ｌｉら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、２０１５年）。しかし、ドナー臓器の限られた入手可能性、移植自体に付随する費用、および継続的な免疫抑制療法に随伴する望ましくない作用により、プロピオネートの異化を伴う障害の治療のための肝臓移植の実際の使用は制限される。したがって、プロピオネートの異化を伴う障害の有効で、信頼でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍら、Ｍ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９９巻（７号）：３１７〜３２３頁、１９７８年
【非特許文献２】Ｄｅｏｄａｔｏら、Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ、１４２巻（２号）：１０４〜１１２頁、２００６年
【非特許文献３】Ｓａｕｄｕｂｒａｙら、Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、２０１２年
【非特許文献４】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、９巻（１３０号）：１〜３６頁、２０１４年
【非特許文献５】Ｌｉら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、２０１５年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、操作された細菌細胞、それらの医薬組成物、ならびにプロピオネートの異化を伴う障害をモジュレートおよび治療する方法を提供する。具体的には、本明細書で開示する操作された細菌は、遺伝子回路、例えば、疾患を治療するための１つまたは複数のプロピオネート異化遺伝子と、操作された細菌が投与される対象の安全性および非コロニー形成を保証するように設計された他の任意選択の回路構成要素、例えば栄養要求体、キルスイッチおよびこれらの組合せなどとで構成されている遺伝子回路、を含むように構築したものである。これらの操作された細菌は、安全であり、耐容性良好であり、対象のマイクロバイオームの生得的活性を増強して治療効果を実現する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロピオネート異化酵素またはプロピオネート異化経路をコードする１つまたは複数の遺伝子、遺伝子カセットおよび／または合成回路を含むように遺伝子操作された細菌細胞であって、プロピオネートおよび／または他の代謝産物、例えば、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロネート、および／もしくはメチルマロニルＣｏＡを代謝することができる細菌細胞を提供する。したがって、遺伝子操作細菌細胞、および該細菌細胞を含む医薬組成物は、プロピオネート異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症（ＰＡ）およびメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）を治療および／または予防するために用いることができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞であって、プロピオネートならびに／または他の代謝物、例えば、メチルマロネート、プロピオニルＣｏＡおよび／もしくはメチルマロニルＣｏＡのレベルを低下させることができる細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば哺乳動物の消化管に見いだされる条件などの低酸素および／または嫌気的条件下で誘導される誘導性プロモーターに作動可能に連結している１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、環境シグナルおよび／または哺乳動物の消化管に見いだされる条件により誘導される（例えば、哺乳動物の消化管に見られる代謝産物もしくは生体分子により誘導される）誘導性プロモーターに作動可能に連結されている１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように操作された細菌細胞であって、低酸素環境における、例えば消化管内の、プロピオネートならびに／または他の代謝物、例えば、メチルマロネート、プロピオニルＣｏＡおよび／もしくはメチルマロニルＣｏＡのレベルを低下させることができる細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の回路を含むように遺伝子操作されたものであり、例えば、低酸素環境において、例えば消化管内で、プロピオネート、メチルマロネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡをプロセッシングすることおよびそれらのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞はまた、プロピオネートの１つまたは複数の輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子操作されたものである。したがって、本開示の遺伝子操作細菌細胞および本開示の細菌細胞を含む医薬組成物は、プロピオネートの異化を伴う障害に関連する状態、例えば、プロピオン酸血症またはメチルマロン酸血症を治療および／または予防するために、過剰なプロピオン酸、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡを非毒性分子に変換するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プロピオン酸血症、ならびに／またはメチルマロン酸血症、ならびに／またはプロピオン酸血症および／もしくはメチルマロン酸血症を特徴とする障害の治療のための、本開示の例示的合成生物の概略図である。図１Ａは、誘導性プロモーターの制御下でｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡ遺伝子を発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。ＰｒｐＥ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣおよびＰｈａＡは、プロピオネートもしくはプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡをＰ（ＨＶ−ｃｏ−ＨＢ）に異化することができる。タンパク質リシンアシルトランスフェラーゼは、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために欠失される。図１Ｂは、２つの誘導性プロモーターからの２つのポリシストロン性メッセージとしてｐｒｐＥ、ａｃｃＡ、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。ｐｒｐＥ、ａｃｃＡ、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢは、プロピオネートもしくはプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡをスクシネートに異化することができ、このスクシネートは、ＴＣＡサイクルによって利用されることもあり、または細胞から輸出されることもある。タンパク質リシンアシルトランスフェラーゼ（ｐｋａ）は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために欠失される。
【図２】様々な分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）分解経路、ならびにＢＣＡＡ代謝に関係する代謝物および関連疾患を示す図である。
【図３】プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはメチルマロニルＣｏＡムターゼにおける遺伝子欠陥に起因する、プロピオン酸血症（ＰＡ）およびメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）などのプロピオネート異化に関連する疾患の原因および症状を示す図である。
【図４】健常（正常）ヒト対象と、プロピオネート異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症（ＰＡ）を有する対象との差を示す図である。
【図５】健常ヒト対象におけるプロピオネート異化の主経路（図５Ａ）および副経路（図５Ｂ）の概略図である。手短に述べると、プロピオニルＣｏＡは、酵素プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）によりＤ−メチルマロニルＣｏＡにカルボキシル化され、そのＤ−メチルマロニルＣｏＡがＬ−メチルマロニルＣｏＡに異性化される。次いで、ビタミンＢ１２依存性酵素であるメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）がＬ−メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの再構成を触媒し、次いで、そのスクシニルＣｏＡがクエン酸サイクルに組み込まれる。副次的なプロピオネート異化経路も存在し、プロピオネート異化に関連する疾患、例えば、ＰＡを有する対象に存在するが、これらの経路は、主経路の欠如を相殺するには不十分である。図５Ｃは、ＰＡとＭＭＡ間の代謝の関連性を示す概略図を示す図である。図５Ｄは、ＰＡおよびＭＭＡにおける酵素および他の欠損を示す図である。
【図６】ＷＴ  ＦＶＢマウスと比較してＰＣＣＡＡ１３８Ｔハイポモルフマウスモデルにおけるプロピオン酸血症バイオマーカーを示すグラフである。図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、以下の血液バイオマーカーの検出を示すグラフを示す；プロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン比（図６Ａ）、プロピオネート濃度（図６Ｂ）および２−メチルシトレート（図６Ｃ）。図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、以下の尿バイオマーカーの検出を示すグラフを示す；プロピオニル−グリシン（図６Ｄ）、チグリルグリシン（図６Ｅ）、および２−メチルシトレート（図６Ｆ）。
【図７】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（図７Ａおよび図７Ｃ）およびＰＣＣＡＡ１３８Ｔマウス（図７Ｂおよび図７Ｄ）における同位体プロピオン酸の皮下投与後の様々な時点での血液、小腸および大腸中の内因性プロピオン酸（図７Ａおよび図７Ｂ）および放射標識プロピオン酸（図７Ｃおよび図７Ｄ）のレベルを示す棒グラフである。３０分以内に血液、小腸および盲腸において非常に低いレベルの同位体プロピオン酸が見られ、これは、プロピオン酸の腸再循環が起こっていることを示す。
【図８】プロピオン酸および／またはメチルマロン酸を消費して不活性最終産物にするような細菌にする操作を行うことができる可能性のある経路を示す図である。図８Ａは、不活性産物をもたらす、プロピオネート異化の概略図を示す図である。図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、プロピオネートまたはメチルマロン酸触媒作用に利用することができる３つの例示的経路の概略図を示す図である。メチルマロニル−ＣｏＡ（ヒト）経路および２−メチルシトレート経路は、スクシネートを産生する。いくつかの実施形態では、スクシネート輸出体も、操作された細菌において発現し得る。他の実施形態では、操作された細菌においてポリヒドロキシアルカノエートの産生をもたらす、ポリヒドロキシアルカノエート経路を設計し、利用することができる。これらの経路は、本明細書で開示する、設計プロピオネート異化経路回路のフレームワークとして役立つ。図８Ｄは、プロピオン酸からの炭素の運命の予測を示す、図８Ｃの再編成版を示す概略図を示す図である。ＰＨＡ経路については、炭素はＰＨＡポリマーとして細胞内に貯蔵される。ＭＭＣＡ経路では、プロピオネートがＴＣＡサイクルにより消費され（炭素をＣＯ２として放出する）か、またはスクシネートが輸出される。
【図９】プロピオネートのプロピオニルＣｏＡへの活性化を示す概略図である。図９Ａは、ＰｒｐＥによるプロピオネート活性化の概略図を示す。ＰｒｐＥは、プロピオネートおよび遊離ＣｏＡを不可逆的なＡＴＰ依存性の形でプロピオニルＣｏＡに変換し、その結果、ＡＭＰおよびＰＰｉ（ピロホスフェート）が放出される。ＰｒｐＥは、活性部位リシンの翻訳後改変により不活性化され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではタンパク質リシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｐｋａ）がＰｒｐＥのプロピオニル化を行う。酵素ＣｏｂＢは、ＰｒｐＥ−Ｐｒを脱プロピオニル化し、その結果、不活性化が可逆的になる。ｐｋａ遺伝子を単に欠失させることにより、ＰｒｐＥ不活性化は完全に消失される。本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために、および下流の異化経路による活性を増加させるために、Δｐｋａを含む。図９Ｂは、ｐｃｔによるプロピオネート活性化の概略図を示す。ｐｃｔは、可逆的反応でプロピオネートおよびアセチル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡおよびアセテートに変換する。
【図１０】ポリヒドロキシアルカノエート経路（図１０Ａ）、およびＰＨＡ経路によりプロピオネートから産生されるポリマーの化学構造（図１０Ｂ）、および本開示の操作された細菌についての例示的回路設計（図１０Ｃ）の概略図である。ＰＨＡ経路は、ポリマーとしての炭素貯蔵に用いられる異種細菌経路である。この回路では、ｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下で発現する。ＰｒｐＥ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣおよびＰｈａＡは、プロピオネートまたはプロピオニルＣｏＡをポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、またはＰ（ＨＶ−ｃｏ−ＨＢ）に異化することができる。具体的には、プロピオン酸−ＣｏＡリガーゼであるＰｒｐＥがプロピオネートをプロピオニルＣｏＡに変換する。次いで、ベータ−ケトチオラーゼであるＰｈａＡがプロピオニルＣｏＡを３−ケト−バレリル−ＣｏＡに変換するか、またはアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する。次いで、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼであるＰｈａＢがアセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−ブチリル−ＣｏＡに変換するか、または３−ケト−バレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡに変換する。ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼであるＰｈａＣは、３−ヒドロキシ−ブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換するか、または３−ヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡをポリヒドロキシバレレートに変換するか、またはポリヒドロキシブチレートおよびポリヒドロキシバレレートをＰ（ＨＶ−ｃｏ−ＨＢ）に変換する。いくつかの実施形態では、ＰｈａＢＣＡ遺伝子は、アシネトバクター属菌種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ）ＲＡ３８４９に由来し、大腸菌用にコドン最適化される。いくつかの実施形態では、大腸菌ニッスル（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）ｐｒｐＥ遺伝子およびコドン最適化ｐｈａＢＣＡ遺伝子は、単一オペロン内でａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にある。
【図１１】コピー数約１０のカナマイシン耐性プラスミド上の、テトラサイクリン誘導性プロモーター配列の制御下のｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ遺伝子カセットを含む、例示的構築物の遺伝子構成の概略図である。
【図１２】誘導物質分子の存在および非存在下で、野生型ニッスル対照と比較して、コピー数約１０のプラスミド上のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）経路を発現する遺伝子操作細菌を含む試料中のプロピオネート濃度を経時的に示すグラフである。細菌をＡＴＣで誘導し（または誘導せずに放置し）、その後、栄養補給した培養培地で２．０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心分離により試料を採取し、Ｍ９最小培地に再懸濁した。グルコースおよびプロピオン酸ナトリウム（３ｍＭ）を補給したＭ９最小培地に試料を１．０のＯＤ６００まで接種することにより、再懸濁試料の活性を測定した。接種後０時間、１．５時間、３時間および４．５時間の時点で試料を除去し、プロピオネート濃度を質量分析により決定した。グラフは、野生型ニッスルと比較して、誘導された状態の操作された細菌（ＳＹＮ−ＰＨＡ）についてのポリヒドロキシアルカノエート回路設計によるプロピオン酸消費を示す。プロピオネートアッセイを約１０９ｃｆｕ／ｍｌの誘導済み細菌で開始し、プロピオネート消費速度は、１０９細胞当り約１．４ｕｍｏｌ／時であった。
【図１３】コピー数約１０のプラスミド上でポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）経路を発現する遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＰＨＡ）を含む試料におけるプロピオネート（図１３Ａ）、アセテート（図１３Ｂ）およびブチレート（図１３Ｃ）濃度を、野生型ニッスル対照と比較して、両方とも誘導物質分子の存在下で、経時的に示すグラフである。ＰＨＡアッセイは、結腸の比（プロピオネート：アセテート：ブチレート、約６：１０：４）を模倣すべく短鎖脂肪酸の混合物中で実施した。細菌をＡＴＣで誘導し（または誘導せずに放置し）、その後、栄養補給した培養培地で２．０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心分離により試料を採取し、Ｍ９最小培地に再懸濁した。グルコースならびにプロピオン酸ナトリウム（６ｍＭ）、アセテート（１０ｍＭ）およびブチレート（４ｍＭ）を補給したＭ９最小培地に試料を１．０のＯＤ６００まで接種することにより、再懸濁試料の活性を測定した。接種後０時間、１．５時間、３時間および４．５時間の時点で試料を除去し、プロピオネート濃度を質量分析により決定した。データは、プロピオネート消費速度が、アセテートおよびブチレートの存在または非存在下で一致していること、ならびにＰＨＡ経路がアセテートおよびブチレート濃度に有意な影響を及ぼさないことを示す。
【図１４】誘導物質分子の存在下で、コピー数約１０のプラスミド上の誘導性ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）カセット（ｐｔｅｔ−ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ）を発現する遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＰＨＡ）を含む試料中のプロピオネート濃度を経時的に示すグラフである。これらの菌株に、誘導性プロモーター、すなわちアラビノース誘導性プロモーター、の制御下で遺伝子、すなわちｐｒｐＥ（図１４Ａ）、ｐｈａＢ（図１４Ｂ）、ｐｈａＣ（図１４Ｃ）およびｐｈａＢ（図１４Ｄ）、のうちの１つを発現する第２のプラスミド（約１５コピー）をさらに補給した。このアッセイでは、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンを単独で誘導するか、またはｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡプラスミドと、前記オペロン遺伝子のうちの１つについての第２のコピーを有するアラビノース誘導性プラスミドの両方を誘導した。野生型ニッスルを参照のために含めた。細菌をＡＴＣまたはＡＴＣとアラビノースで誘導し（または誘導せずに放置し）、その後、栄養補給した培養培地で２．０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心分離により試料を採取し、Ｍ９最小培地に再懸濁した。グルコースおよびプロピオン酸ナトリウム（３ｍＭ）を補給したＭ９最小培地に試料を１．０のＯＤ６００まで接種することにより、再懸濁試料の活性を測定した。接種後０時間、１．５時間、３時間および４．５時間の時点で試料を除去し、プロピオネート濃度を質量分析により決定した。グラフは、より多くのｐｈａＣが発現するときプロピオネート消費速度が最も有意に上昇することを示し、これは、この経路が、最初のｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡプラスミドからのＰｈａＣレベルを上昇させることにより改善されることを示唆している。これは、例えば、ｐｈａＣ遺伝子の前により強いリボソーム結合部位を利用することにより翻訳速度を上昇させることによって達成することができる。あるいは、遺伝子の追加のコピーを同じ回路または追加の回路に加えてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、強いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の利用によりＰｈａＣレベルが増加される、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンを含む。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンを含む遺伝子操作細菌は、ｐｈａＣの追加のコピーをさらに含む。
【図１５】メチルマロニル−ＣｏＡ経路および例示的メチルマロニルＣｏＡ回路設計の概略図である。図１５Ａは、ＰｒｐＥ反応を、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ遺伝子の産物がプロピオネートをスクシネートに変換するメチルマロニルＣｏＡ経路であって、回路設計に用いることができる経路により示す概略図を示す図である。メチルマロニル−ＣｏＡ経路は、哺乳動物の経路におけるものと同種の反応を行うが、この経路は、異種細菌酵素から構成される。一実施形態では、遺伝子ａｃｃＡ（ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来する）、ｐｃｃＢ（ストレプトマイセス・セリカラーに由来する）、ｍｍｃＥ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に由来する）、およびｍｕｔＡＢ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する）を用い、大腸菌ニッスルにおける発現のためにコドン最適化した。図１５Ｂは、遺伝子操作細菌が、誘導性プロモーター、例えばａＴｃ誘導性プロモーター、の制御下のｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ遺伝子を含む遺伝子カセットを含む、本開示の例示的回路設計を示す概略図を示す図である。図１５Ｃは、遺伝子操作細菌が、第１の誘導性プロモーター、例えばＰｔｅｔ（ａＴｃ誘導性）、の制御下のｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１を含むカセットと、第２の誘導性プロモーター、例えばＰａｒａ（アラビノース誘導性）、の制御下のｍｍｃＥおよびｍｕｔＡＢを含む第２のカセットとを含む、本開示の例示的回路設計を示す概略図を示す図である。経路の誘導は、ａＴｃおよびアラビノースの付加を必要とする。どちらの回路（図１５Ｂまたは図１５Ｃ）でも、操作細菌においてスクシネート輸出体も発現し得る。
【図１６】例示的構築物の遺伝子構成の概略図である。図１６Ａは、コピー数約１５のアンピリシン耐性プラスミド上の、アラビノース誘導性プロモーター配列の制御下のｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ遺伝子カセットを含む、例示的構築物の遺伝子構成の概略図を示す図である。図１６Ｂは、コピー数約１０のカナマイシン耐性プラスミド上の、テトラサイクリン誘導性プロモーター配列の制御下のｐｒｐＥ−ａｃｃＡ−ｐｃｃＢ遺伝子カセットを含む、例示的構築物の遺伝子構成の概略図を示す図である。
【図１７】スクシネート輸出体および関連する例示的遺伝子回路および合成生物と組み合わせたＭＭＣＡ経路の概略図である。図１７Ａは、ＭＭＣＡ経路によるプロピオネートおよび／またはメチルマロン酸異化の概略図を示す図である。得られたスクシネートは、ＴＣＡサイクルにより代謝されることもあり、または輸出体によって細菌細胞から除去されることもある。例示的輸出体は、ｓｕｃＥ１スクシネート輸出体（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来する）および／または天然ニッスルスクシネート輸出体ｄｃｕＣを含む。図１７Ｂは、誘導性プロモーター、例えばアラビノース誘導性プロモーター、の制御下のｓｕｃＥ１スクシネート輸出体（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する）の発現のための例示的回路または遺伝子カセットを示す図である。この構築物を合成生物においてプラスミド上で発現させることができ、またはそのゲノムに組み込むことができる。例えば、ａｒａＢＡ遺伝子とａｒａＤ遺伝子の一部とを欠失させる、構築物のノックインを実施することができ、これにより大腸菌によるアラビノースの代謝が排除される。図１７Ｃは、誘導性プロモーターの制御下でｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡ遺伝子を発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。この合成生物は、誘導性プロモーターの制御下のｓｕｃＥ１遺伝子を発現する遺伝子カセットをさらに含む。図１７Ｄは、ｓｕｃＥ１スクシネート輸出体（コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する）を含む構築物の概略図を示す図である。図１７Ｅは、大腸菌ｄｃｕＣスクシネート輸送体を含む構築物の概略図を示す図である。図１７Ｆは、ｓｕｃＥ１輸送体とｄｃｕＣ輸送体の両方を含むまたは含む構築物の概略図を示す図である。
【図１８】誘導物質分子の存在下で、野生型ニッスル対照と比較して、コピー数約１０およびコピー数約１５のプラスミド上のメチルマロニル−ＣｏＡ経路回路を発現する遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＭＭＣＡ）またはポリヒドロキシアルカノエート経路回路を発現する遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＰＨＡ）を含む試料中のプロピオネート濃度を経時的に示すグラフである。細菌をＡＴＣまたはＡＴＣおよびアラビノースで誘導し（または誘導せずに放置し）、その後、栄養補給した培養培地で２．０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心分離により試料を採取し、Ｍ９最小培地に再懸濁した。グルコースおよびプロピオン酸ナトリウム（３ｍＭ）を補給したＭ９最小培地に試料を１．０のＯＤ６００まで接種することにより、再懸濁試料の活性を測定した。接種後０時間、１．５時間、３時間、４．５時間および１８時間の時点で試料を除去し、細胞を除去し、プロピオネート濃度を質量分析により決定した。グラフは、野生型ニッスルと比較して、誘導された状態の操作された細菌についてのメチルマロニル−ＣｏＡ経路またはポリヒドロキシアルカノエート回路設計によるプロピオン酸消費を示す。プロピオネートアッセイを約１０９ｃｆｕ／ｍｌの誘導済み細菌で開始し、プロピオネート消費速度は、メチルマロニル−ＣｏＡ経路回路を発現する菌株において約３．８μｍｏｌ／時／１０９細菌であった。
【図１９】細菌、例えば大腸菌、におけるメチルシトレートサイクルによるプロピオネートの異化についての通常の経路の一例を示す図である。手短に述べると、プロピオン酸−ＣｏＡリガーゼであるＰｒｐＥがプロピオネートをプロピオニルＣｏＡに変換する。次いで、２−メチルクエン酸シンテターゼであるＰｒｐＣがプロピオニルＣｏＡを２−メチルシトレートに変換する。次いで、２−メチルクエン酸デヒドロゲナーゼであるＰｒｐＤが２−メチルシトレートを２−メチルイソシトレートに変換し、２−メチルイソクエン酸リアーゼであるＰｒｐＢが２−メチルイソシトレートをスクシネートおよびピルベートに変換する。
【図２０】細菌、例えば大腸菌、における２−メチルシトレートサイクルの概略図（図２０Ａ）、および操作された細菌のための例示的回路設計の概略図（図２０Ｂ）である。この回路において、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤおよびｐｒｐＥ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現して、スクシネートおよびピルベートを産生する。いくつかの実施形態では、スクシネート輸出体も、操作された細菌において発現し得る。図２０Ｃは、コピー数約１０のカナマイシン耐性プラスミド上の、テトラサイクリン誘導性プロモーター配列の制御下のｐｒｐＢＣＤＥ遺伝子カセットを含む、例示的構築物の遺伝子構成の概略図を示す。
【図２１】プロピオン酸血症、ならびに／またはメチルマロン酸血症、ならびに／またはプロピオン酸血症および／もしくはメチルマロン酸血症を特徴とする障害の治療のための、本開示の例示的合成生物の概略図である。図２１Ａは、誘導性プロモーターの制御下のｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡ遺伝子を発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。ＰｒｐＥ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣおよびＰｈａＡは、プロピオネートもしくはプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡをＰ（ＨＶ−ｃｏ−ＨＢ）に異化することができる。タンパク質リシンアシルトランスフェラーゼ（ｐｋａ）は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために欠失される。特定の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路は、ｐｈａＣ翻訳開始部位の上流に強いＲＢＳを加えることにより、さらに改変される。他の実施形態では、合成生物は、ＰｈａＣ遺伝子の複数のコピーを含んだ。いくつかの実施形態では、ＰｈａＣ遺伝子は、最高数の転写物を確保するために、カセット内のｒｓｔ遺伝子として、プロモーターの直ぐ末端側に位置する。Ｔ７ポリメラーゼは、不完全なポリシストロン性転写物（途中で終結されたもの）を産生し得る。図２１Ｂは、ＴｈｙＡ栄養要求性を加えた、図１Ａまたは図２１Ａの合成生物の概略図を示す図である。図２１Ｃは、ＴｈｙＡ栄養要求性を加えた、図１Ｂの合成生物を示す図である。図２１Ｄは、ｐｒｐＥ、ａｃｃＡ、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを２つの誘導性プロモーターからの２つのポリシストロン性メッセージとして発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。ｐｒｐＥ、ａｃｃＡ、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢは、プロピオネートもしくはプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡをスクシネートに異化することができ、そのスクシネートは、ＴＣＡサイクルによって利用されることもあり、または細胞から輸出されることもある。タンパク質リシンアシルトランスフェラーゼ（ｐｋａ）は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために欠失される。いくつかの実施形態では、合成生物は、本明細書に記載の通りのＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ輸出体カセットを含む。図２１Ｅは、プロピオネート異化のための２つの異なる遺伝子カセット（ＰＨＡおよびＭＭＣＡ経路カセット）のうちの１つまたは複数を含む合成生物の概略図を示す図である。図２１Ｆは、ＭａｔＢと組み合わせて２つの誘導性プロモーターからの２つのポリシストロン性メッセージとしてｐｒｐＥ、ａｃｃＡ、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを発現する遺伝子カセットを含む本開示の例示的合成生物の概略図を示す図である。タンパク質リシンアシルトランスフェラーゼ（ｐｋａ）は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するために欠失される。いくつかの実施形態では、合成生物は、本明細書に記載の通りのＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ輸出体カセットを含む。図２１Ｇは、ＭａｔＢと組み合わせてプロピオネート異化のための２つの異なる遺伝子カセット（ＰＨＡおよびＭＭＣＡ経路カセット）のうちの１つまたは複数を含む合成生物の概略図を示す図である。
【図２２】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。図２２に組換え細菌に見いだされない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の必須遺伝子の転写を抑制する立体配座をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これが必須遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能力を維持する。
【図２３】抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔＲの発現を誘導し、ひいては毒素の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場会、ＴｅｔＲは、発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素に打ち勝ち、細胞を殺滅する。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターより弱いプロモーターであるべきである。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターの制御下にある。
【図２４】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。
【図２５】外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、１つまたは複数の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは毒素遺伝子をフリップして活性化された立体配座にし、リコンビナーゼの天然の速度論により毒素発現の時間遅延が生じ、その結果、異種遺伝子を完全に発現することが可能となる。毒素は発現すると、細胞を殺滅する。
【図２６】外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、１つまたは複数の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは毒素遺伝子をフリップして活性化された立体配座にし、リコンビナーゼの天然の速度論により毒素発現の時間遅延が生じ、その結果、異種遺伝子を完全に発現することが可能となる。毒素は発現し、細胞を殺滅する。
【図２７】外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、１つまたは複数の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは、少なくとも１つの切除酵素をフリップして、活性化された立体配座にする。次いで、少なくとも１つの切除酵素は、１つまたは複数の必須遺伝子を切除し、その結果、老化、そして最終的には細胞死に至る。リコンビナーゼおよび切除遺伝子の天然の速度論は、時間遅延を引き起こし、その速度論を切除すべき必須遺伝子の数および選択に依存して変更および最適化することができ、それにより数時間または数日のうちに細胞死が起こることが可能となる。入れ子状態の複数のリコンビナーゼの存在を用いて、細胞死のタイミングをさらに制御することができる。
【図２８】遺伝子操作細菌が等量のＨｏｋ毒素および短寿命Ｓｏｋ抗毒素を産生する、本開示の１つの非限定的実施形態の概略図である。細胞がプラスミドを失うと、抗毒素は崩壊し、細胞は死ぬ。上のパネルにおいて、細胞は、等量の毒素および抗毒素を産生し、安定である。中間のパネルにおいて、細胞は、プラスミドを失い、抗毒素が崩壊し始める。下のパネルにおいて、抗毒素が完全に崩壊し、細胞が死ぬ。
【図２９】外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、１つまたは複数の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および第１のリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは、第２のリコンビナーゼを逆方向から活性立体配座にフリップする。次いで、活性化された第２のリコンビナーゼが毒素遺伝子をフリップして活性化された立体配座にし、リコンビナーゼの天然の速度論により毒素発現の時間遅延が生じ、それにより、異種遺伝子を完全に発現することが可能となる。毒素は発現すると、細胞を殺滅する。
【図３０】本明細書中でより詳細に説明するＧｅｎｅＧｕａｒｄシステムなどの、宿主−プラスミド相互依存性を生じさせるように改変されたプラスミドを含む遺伝子操作細菌の例を示す図である。
【図３１】複数の作用機構（ＭｏＡｓ）を含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。単一の合成生物は、細菌染色体の異なる部位への同じ合成回路の複数のコピーの挿入または異なる合成回路の挿入に基づく複数の作用機構（ＭＯＡｓ）を有し得る。
【図３２】大腸菌ニッスル染色体内の組込み部位のマップを示す図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨げることなく、回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を用いて、挿入が発散的または収束的に発現する遺伝子間に起こることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内への挿入は、栄養要求性を生じさせるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、個々の回路成分を複数の示された部位に挿入する。
【図３３】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現する３つの細菌菌株を示す図である。菌株１〜３では、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入され、蛍光灯下で様々な程度の輝度をもたらした。非改変大腸菌ニッスル（菌株４）は、非蛍光性である。
【図３４】ニッスルのｉｎ  ｖｉｖｏでの滞在を示すグラフである。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。
【図３５】強制経口投与後１、４、８、１２、２４および３０時間の時点の腸管の様々なコンパートメントにおけるストレプトマイシン耐性ニッスルの滞在の経時的な棒グラフである。マウスに約１０９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。
【図３６】細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境に移動させることができるようにペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることによって、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチド（星）を分泌する鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌システムの概略図である。
【図３７】治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌システムの概略図である。このシステムにおいて、Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体に動員され、そこでベータ−ドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。次いで治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。治療用ペプチドは、自触媒切断によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（ハサミ）の標的化によってリンカーシステムから解放される。
【図３８】内および外膜の両方を通るチャンネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を用いてパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接転位させる、Ｉ型分泌システムの概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【図３９】漏出性または不安定化外膜を作製し、それにより、細胞外腔への治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含む真核生物由来の治療用ポリペプチドの転位を促進するためのグラム陰性細菌の外および内膜、ならびにいくつかの欠失標的の概略図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ留めるタンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を発生させる。突然変異の組合せは、漏出性表現型を相乗的に増強させ得る。
【図４０】細菌が消化管内腔に分泌治療用タンパク質を注入することを可能にする改変された３型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を示す図である。誘導性プロモーター（小矢印、上）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、タグ付きペプチドを細胞外に分泌する装置を作るＴ３分泌システム遺伝子カセット（３つの大矢印、上）の発現を誘導する。誘導性プロモーター（小矢印、下）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、次にタグ付き治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する、調節因子、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの発現を駆動する。
【図４１】例示的ＦＮＲプロモーターから選択されたＦＮＲ応答性プロモーターからｌａｃＺを発現する低コピープラスミドを有する細菌を含む試料におけるβ−ガラクトシダーゼレベルを示す図である。異なるＦＮＲ応答性プロモーターを用いて、様々な発現レベルおよびダイナミックレンジを有する嫌気誘導性レポーターのライブラリーを作出した。これらのプロモーターは、強いリボソーム結合部位を含んだ。細菌培養物を好気的条件（＋Ｏ２）または嫌気的条件（−Ｏ２）のどちらかで増殖させた。４時間の時点で試料を除去し、標準的β−ガラクトシダーゼ比色アッセイを実施することによりβ−ガラクトシダーゼレベルに基づいてプロモーター活性を分析した。
【図４２】例示的ＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）の制御下のｌａｃＺ遺伝子の概略図である。ｌａｃＺは、β−ガラクトシダーゼ酵素をコードし、細菌によく見られるレポーター遺伝子である。図４２Ｂは、ＳＹＮ３４０におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の関数としてＦＮＲプロモーター活性を示す図である。低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を有する操作された細菌菌株であるＳＹＮ３４０を、酸素の存在または非存在下で増殖させた。標準的β−ガラクトシダーゼ比色アッセイについての値は、ミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２年）で表される。これらのデータは、ｆｎｒＳプロモーターが嫌気的条件下で１時間以内に高レベル遺伝子発現を駆動し始めることを示唆している。図４２Ｃは、ｌａｃＺを発現する細菌細胞培養物の酸素存在下および非存在下両方における増殖を経時的に示す図である。
【図４３】ＡＴＣ（図４３Ａ）または酸化窒素誘導性（図４３Ｂ）リポーター構築物を示す図である。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。対照、ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰリポーター構築物または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰリポーター構築物を含むプラスミドを含むニッスル細胞は、一連の濃度にわたり誘導した。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。図４３Ｃは、構築物の概略図を示す図である。図４３Ｄは、構成的プロモーターの制御下のＮｓｒＲを発現するプラスミドおよびＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下のリポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を含む細菌のドットブロットを示す図である。ＤＳＳ投与マウスをＨＥの例示的モデルとする。ＨＥ対象と同様に、マウスの消化管は、飲料水に２〜３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加することによって損傷する。化学発光は、ＤＳＳ投与マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターで示されている。
【図４４】ｐｒｐＲプロピオネート応答性誘導性プロモーターを示す図である。１つのプロピオネート応答性プロモーターの配列を（配列番号７０）として本明細書においても開示する。
【図４５】野生型ｃｌｂＡ構築物およびｃｌｂＡノックアウト構築物の概略図である。
【図４６】本開示の遺伝子操作細菌を設計し、作製する非限定的な方法の概略を示す図である。「定義する」ステップは、１．微生物生理学および疾患生物学に基づく多様な候補アプローチの特定、２．候補代謝経路を決定するためのバイオインフォマティクスの使用、最適化操作された合成生物の要求される性能目標を決定するための予測ツールの使用を含む。「設計する」ステップは、１．経路構成のコンビナトリアル試験を可能にするための最先端のＤＮＡアセンブリ、２．経路の効率を予測するための数学モデル、３．操作された回路の制御および調節を可能にする専用のスイッチおよび部品の内部安定の使用を含む。「構築する」ステップは、１．コア構造「シャーシー」を構築すること、２．操作された回路を、効率的発現のための最適な染色体位置に安定に組み込むこと、３．固有の機能アッセイを用いて、遺伝子回路の忠実性および活性を評価することを含む。「組み込む」ステップは、１．動物モデルにおける合成生物の局在および通過時間のモニタリングを可能にする、染色体マーカーの使用、２．特定の疾患状態がＧＩ微生物叢および当環境における合成生物の挙動にどのように影響を及ぼすかの理解を拡大するための専門のマイクロバイオームネットワークおよびバイオインフォマティクスを利用すること、３．開発候補の前臨床への速やかで、途切れのない移行を可能にする、発見段階における組織内での方法の開発研究および最適化を活発にすること、候補合成生物の用意周到で、高品質の試験を支援する、特殊疾患動物モデルの改良の広範な経験を利用することを含む。
【図４７】本開示の遺伝子操作細菌の上流および下流産生のための非限定的な製造方法の概略図である。図４７Ａは、種培養１（ＳＣ１）のパラメーター：白金耳量−グリセロール保存液、継続時間一夜、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図４７Ｂは、種培養２（ＳＣ２）のパラメーター：ＳＣ１からの１／１００希釈、継続時間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図４７Ｃは、生産バイオリアクターのパラメーター：接種物−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、継続時間２４時間を示す。図４７Ｄは、収集のパラメーター：４０００ｒｐｍの速度および３０分の継続時間での遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、再懸濁１０％グリセロール／ＰＢＳを示す。図４７Ｅは、バイアル充填／貯蔵のパラメーター：１〜２ｍＬの小分け、−８０℃を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、操作された細菌細胞、それらの医薬組成物、ならびにプロピオン酸異化に関連する障害、例えば、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症またはビタミンＢ１２欠乏症をモジュレートおよび治療する方法を提供する。具体的には、本明細書で開示する操作された細菌は、遺伝子回路、例えば、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素で構成されている遺伝子回路を含むように構築したものである。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、該操作された細菌が投与される対象の安全性および非コロニー形成を保証するように設計された任意選択の回路構成要素、例えば、栄養要求体、キルスイッチ等をさらに含む。これらの操作された細菌は、安全であり、耐容性良好であり、対象のマイクロバイオームの生得的活性を増強して治療効果を実現する。
【００１１】
本開示をより容易に理解することができるために、特定の用語を最初に定義する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして、また当業者により理解されているように読むべきである。別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、この詳細な説明を通して示す。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「操作（された）細菌細胞」または「操作（された）細菌」という用語は、それらの天然の状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を意味する。例えば、操作された細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入されたヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成、および／またはヌクレオチド改変を有し得る。これらの遺伝子改変は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示する操作された細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、操作された細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「組換え微生物」という用語は、その天然の状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌もしくはウイルス細胞、または細菌もしくはウイルスを意味する。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、それらの天然の状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を意味する。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入されたヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成およびヌクレオチド改変を有し得る。これらの遺伝子改変は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示する組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【００１４】
「プログラムされた微生物」または「操作（された）微生物」は、その天然の状態から、特定の機能を果すように、例えば、プロピオネートを、および／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数を、代謝するように、遺伝子改変された微生物、例えば、細菌もしくはウイルス細胞、または細菌もしくはウイルスを意味する。特定の実施形態では、プログラムされたまたは操作された微生物は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するまたは治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変されたものである。プログラムされたまたは操作された微生物は、目的のタンパク質（複数可）が発現すると増殖を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力を、さらに有し得る。
【００１５】
「プログラムされた細菌細胞」または「操作（された）細菌細胞」は、その天然の状態から遺伝子改変された細菌細胞である。特定の実施形態では、プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、その天然の状態から、特定の機能を果すように、例えば、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するまたは治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変された、例えば、プロピオネートおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数を代謝するように改変されたものである。プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、目的のタンパク質（複数可）が発現すると増殖を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力を、さらに有し得る。例えば、操作された細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入されたヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成、およびヌクレオチド改変を有し得る。これらの遺伝子改変は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示する操作された細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、操作された細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、タンパク質またはその断片をコードする任意の核酸配列であって、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）、およびコード配列の後に続く調節配列（３’非コード配列）を任意選択で含む核酸配列を意味する。一実施形態では、「遺伝子」は、コード配列に先行するおよびコード配列の後に続く調節配列を含まない。「天然遺伝子」は、天然で見いだされるような遺伝子であって、コード配列に先行するまたはコード配列の後に続くそれ固有の調節配列を任意選択で有する遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子であって、コード配列に先行するまたはコード配列の後に続く調節配列を任意選択で含み、前記コード配列および／または調節配列の全部または一部が天然では一緒に見いだされないものである、任意の遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが天然で見いだされるものとは構成が異なる調節配列およびコード配列を含み得る。「遺伝子」という用語は、完全長遺伝子配列（例えば、天然で見いだされるようなもの、および／または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子配列）を含むことを意味し、部分遺伝子配列（例えば、天然で見いだされる遺伝子配列の断片、および／またはポリペプチドもしくはタンパク質の一部分もしくは断片をコードする遺伝子配列）を含むことも意味する。「遺伝子」という用語は、改変された遺伝子配列（例えば、天然で見いだされる配列と比較して改変されているもの）を含むことを意味する。したがって、「遺伝子」という用語は、天然で見いだされる天然または完全長遺伝子配列に限定されない。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば、核酸配列を意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列または他の非タンパク質コード配列を含むことも意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「異種」遺伝子または「異種配列」は、所定の細胞において通常は天然で見いだされないヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用する場合、「異種配列」は、所定の細胞に外から導入される核酸配列であって、（細胞において天然に見いだされるまたは発現する）天然配列であってもよく、または（細胞において天然に見いだされも、発現しもしない）非天然配列であってもよく、および天然もしくは野生型配列であってもよく、または変異体、非天然もしくは合成配列であってもよい、核酸配列を含む。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞に導入された、天然遺伝子またはその断片を含む。例えば、異種遺伝子は、宿主細胞に再導入される非天然調節領域を含むためのキメラ遺伝子の一部分である天然コード配列を含み得る。異種遺伝子は、非天然宿主細胞に導入される天然遺伝子またはその断片も含み得る。したがって、異種遺伝子は、受容細胞にとって異質なものであってもよく、もしくは生得のものであってもよく；所定の細胞において天然に見いだされるが、核酸および／もしくはそれをコードするポリペプチドを不自然な量を発現する、核酸配列であってもよく；ならびに／または天然の場合と同じ互いとの関連性では見いだされない２つもしくはそれ以上の核酸配列であってもよい。本明細書で使用する場合、「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノム内のその天然の位置にある天然遺伝子を意味する。本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主生物、例えば宿主細菌細胞、ゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「非天然」核酸配列は、微生物に通常は存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余剰のコピー、あるいは異種配列、例えば、細菌もしくはウイルスの異なる種、株もしくは亜株に由来する配列、または同じ亜型の細菌もしくはウイルスに由来する非改変配列と比較して改変されているおよび／もしくは突然変異している配列を意味する。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成非天然型配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年参照）。非天然核酸配列は、遺伝子カセットにおける調節領域、プロモーター、遺伝子および／または１つもしくは複数の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」は、天然で互いに同じ関係性が見いだされない２つまたはそれ以上の核酸配列を意味する。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、遺伝子であって、該遺伝子と天然では会合していないプロモーターに作動可能に連結している前記遺伝子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示する遺伝子操作細菌は、遺伝子であって、該遺伝子と天然では会合していない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているＦＮＲ応答性プロモーター（または本明細書で開示する他のプロモーター）に、作動可能に連結している前記遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作ウイルスは、遺伝子であって、該遺伝子と天然では会合しない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターに、作動可能に連結している前記遺伝子を含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。「調節配列」という用語は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、またはコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード領域）であって、転写、ＲＮＡプロセッシング、ＲＮＡ安定性、または付随するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、エフェクター結合部位、シグナル配列、およびステム−ループ構造を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、調節配列は、プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーターまたは本明細書で開示する他のプロモーターを含む。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝物質が保持され、発現し、伝播されるように、宿主ゲノムに組み込まれるまたは自己複製染色体外プラスミド上に伝播される非天然遺伝物質、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を有する細菌宿主細胞を指すために用いられる。安定な細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、生存および／または増殖することができる。例えば、安定な細菌は、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子操作細菌であって、前記遺伝子を有するプラスミドまたは染色体が、プロピオネート異化酵素を該細菌において発現させることができるように、かつ該細菌がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存および／または増殖することができるように、細菌内で安定に維持されている、遺伝子操作細菌であり得る。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現レベルに影響を及ぼす。
【００２２】
本明細書で使用する場合、プロピオネート異化経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロン」は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸、またはメチルマロニルＣｏＡを不活性最終産物、例えば、スクシネートまたはポリヒドロキシアルカノエートに異化するために必要な２つまたはそれ以上の遺伝子を意味する。前記分子を産生することができる一組の遺伝子をコードすることに加えて、遺伝子カセットまたはオペロンは、さらなる転写および翻訳エレメント、例えば、リボソーム結合部位も含み得る。各遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。加えて、任意の遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の複数のコピーが細菌に存在してもよく、前記遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の１つまたは複数のコピーを、本明細書に記載の通り突然変異させる、あるいは変更することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、コピー数を増加させるために同じ遺伝子、遺伝子カセットもしくは調節領域の複数のコピーを含むように操作されるか、または複数の異なる機能を果す遺伝子カセットの複数の異なる構成要素を含むように操作される。
【００２３】
「作動可能に連結した」は、単一核酸断片上の核酸配列が、ある配列の機能が他の配列による影響を受けるように、会合することを意味する。調節エレメントとコード配列は、調節エレメントとコード配列間の距離に関係なく、調節エレメントが遺伝子コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、作動可能に連結している。より具体的には、作動可能に連結したは、核酸配列の発現、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に連結している核酸配列、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に当てはまる。換言すると、調節配列は、シスで作動する。一実施形態では、遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に「直接的に連結した」ものであってもよい。他の実施形態では、遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に「間接的に連結した」ものであってもよい。一実施形態では、２つまたはそれ以上の遺伝子は、該２つまたはそれ以上の遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に直接的または間接的に連結したものであってもよい。調節領域または配列は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含むことができる。
【００２４】
「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、コード配列または遺伝子の発現を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、一般に、それらが調節する配列の５’側に位置する。プロモーターは、それらの全部が天然遺伝子に由来することもあり、または天然で見いだされるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていることもあり、および／または合成ヌクレオチドセグメントを含むこともある。異なるプロモーターが、特定の刺激に例えば細胞もしくは組織特異的な形で応答して、異なる環境もしくは生理的条件に応答して、または特定の化合物に応答して、コード配列または遺伝子の発現を調節し得ることは、当業者には容易に確められるであろう。原核生物プロモーターは、一般的に２つのクラスに分類される：誘導性および構成的。「構成的プロモーター」は、その制御下のコード配列または遺伝子の連続転写を可能にするプロモーターを意味する。
【００２５】
「構成的プロモーター」は、その制御下の、かつ／またはそれが作動可能に連結したコード配列もしくは遺伝子の連続的転写を駆動することができるプロモーターを意味する。構成的プロモーターおよび変異体は、当技術分野で周知であり、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｎａｍｅ  ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；  ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；  ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０）、構成的枯草菌σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３）、構成的枯草菌σＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、およびバクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結している調節領域であって、前記遺伝子（複数可）の発現が前記調節領域の誘導物質の存在下で増加する、前記調節領域を意味する。「誘導性プロモーター」は、その制御下のコード配列または遺伝子の転写レベル上昇を刺激または外因性環境条件に応答して開始するプロモーターを意味する。「直接的誘導性プロモーター」は、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結している調節領域であって、該調節領域の誘導物質の存在下で前記タンパク質またはポリペプチドが発現する、前記調節領域を意味する。「間接的誘導性プロモーター」は、２つまたはそれ以上の調節領域を含む調節システムであって、例えば、第２の遺伝子に作動可能に連結している第２の調節領域を調節することができる、第１のタンパク質、ポリペプチドまたは因子、例えば、転写調節因子をコードする第１の遺伝子に作動可能に連結している第１の調節領域を含み、前記第２の調節領域が活性化または抑制されることにより、第２の遺伝子の発現が活性化または抑制される、調節システムを意味する。直接的誘導性プロモーターと間接的誘導性プロモーターの両方が「誘導性プロモーター」に含まれる。本明細書に記載の例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、本明細書中でより詳細に説明する、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーターおよびＰＴｅｔＲプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の誘導性プロモーターの例は、本明細書中の後段にて提供する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、核酸に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積、ならびに／またはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」または「ベクター」という用語は、細菌細胞のゲノムに組み込まれない、染色体外核酸、例えばＤＮＡ、構築物を意味する。プラスミドは、通常は環状であり、自律増殖することができる。プラスミドは、当技術分野で周知であるように、低コピー、中コピー、または高コピーであり得る。プラスミドは、該プラスミドを含有する細菌細胞についての選択を助け、かつ該プラスミドが前記細菌細胞内に確実に保持されるようにする、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子を任意選択で含み得る。プラスミドは、１つまたは複数の異種遺伝子または遺伝子カセットをコードする核酸配列を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「形質転換する」または「形質転換」という用語は、遺伝子的に安定した遺伝をもたらす、核酸断片の宿主細胞への移入を意味する。形質転換された核酸断片を含む宿主細菌細胞は、「組換え」または「トランスジェニック」または「形質転換（された）」生物と呼ばれる。
【００３０】
「遺伝子改変」という用語は、本明細書で使用する場合、任意の遺伝子変化を意味する。例示的遺伝子改変は、例えば、天然染色体または染色体外遺伝物質の改変を含む、遺伝子の発現を増加、減少または消失させるものを含む。例示的遺伝子改変は、少なくとも１つのプラスミドの導入、染色体または染色体外遺伝物質（複数可）の改変、突然変異、塩基欠失、塩基付加、塩基置換および／もしくはコドン改変、遺伝子過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子抑制、プロモーター改変もしくは置換、遺伝子付加（単コピーもしくは多コピーのどちらか）、アンチセンス発現もしくは抑制、または宿主細胞の遺伝要素に対する任意の他の変化（その変化が表現型の変化を生じさせるか否かを問わない）も含む。遺伝子改変は、プラスミド、例えば、プロモーターに作動可能に連結したプロピオネート異化酵素を含むプラスミドの、細菌細胞への導入を含み得る。遺伝子改変は、染色体内での、例えば、天然遺伝子プロモーターを誘導性プロモーター、調節プロモーター、強いプロモーターまたは構成的プロモーターで置換するための、標的化置換も含み得る。遺伝子改変は、遺伝子増幅、例えば、細胞の染色体への天然遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーの導入も含み得る。あるいは、染色体遺伝子改変は、遺伝子突然変異を含み得る。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子突然変異」という用語は、遺伝子または関連調節領域のヌクレオチド配列の、該ヌクレオチド配列をその天然または野生型配列と比較して変更する、１つまたは複数の変化を意味する。突然変異は、例えば、野生型配列内での、全体的または部分的、置換、付加および欠失を含む。そのような置換、付加または欠失は、配列への実質的変化をもたらし得る、単一ヌクレオチド変化（例えば、１つもしくは複数の点突然変異）であってもよく、または２つもしくはそれ以上の変化であってもよい。突然変異は、遺伝子のコード領域内ならびに遺伝子の非コードおよび調節配列内で起こり得る。「遺伝子突然変異」という用語は、コード領域内でのサイレントおよび保存的突然変異、ならびに遺伝子によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更する変化を含むことを意図するものである。遺伝子コード配列における遺伝子突然変異は、例えば、その遺伝子のポリペプチド産物の活性（例えば、酵素的活性）を増加させることもあり、減少させることもあり、または別様に変更することもある。調節配列の遺伝子突然変異は、変更された調節配列に作動可能に連結した配列の発現を増加させるか、減少させるか、または別様に変更する。
【００３２】
具体的には、「プロピオネートの細菌細胞への移入を増加させる遺伝子改変」という用語は、遺伝子改変であって、該改変を有さない細菌細胞、例えば野生型細菌細胞、の細胞質ゾルへのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸またはメチルマロニルＣｏＡの取込み速度または取込み量と比較して、細菌細胞の細胞質ゾルへのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡまたはその代謝物の取込み速度を上昇させる、または取込み量を増加させる遺伝子改変を意味する。一実施形態では、操作された細菌細胞であって、該細菌細胞へのプロピオネートの移入を増加させる遺伝子改変を有する細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする異種遺伝子を含む細菌細胞を意味する。一実施形態では、組換え細菌細胞であって、該細菌細胞からのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはそれらの代謝物の移入を増加させる遺伝子改変を有する細菌細胞は、天然遺伝子の遺伝子突然変異を含む。他の実施形態では、組換え細菌細胞であって、該細菌細胞からのプロピオネートおよび／またはその代謝物の移入を増加させる遺伝子改変を有する細菌細胞は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはそれらの代謝物の移入を増加させる遺伝子の転写を増加させるまたは活性化する、天然プロモーターにおける遺伝子突然変異を含む。他の実施形態では、組換え細菌細胞であって、該細菌細胞からのｐプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはそれらの代謝物の移入を増加させる遺伝子改変を有する該細菌細胞は、プロピオネートおよび／またはその代謝物の取込み輸送体（輸送体）の活性化因子の過剰発現につながる遺伝子突然変異を含む。他の実施形態では、組換え細菌細胞であって、該細菌細胞からのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはそれらの代謝物の移入を増加させる遺伝子改変を有する該細菌細胞は、輸送体（取込み輸送体）をコードする遺伝子の翻訳を増加させるまたは活性化する遺伝子突然変異を含む。
【００３３】
さらに、「プロピオネートおよび／またはその代謝物の細菌細胞への移入を増加させる遺伝子改変」という用語は、該改変を有さない細菌細胞、例えば野生型細菌細胞、の細胞質ゾルへのプロピオネートおよび／またはその代謝物の取込み速度または取込み量と比較して、細菌細胞の細胞質ゾルへのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはその代謝物の取込み速度を上昇させる、または取込み量を増加させる遺伝子改変を意味する。いくつかの実施形態では、操作された細菌細胞であって、該細菌細胞へのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはその代謝物の移入を増加させる遺伝子改変を有する細菌細胞は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡおよび／またはその代謝物の１つまたは複数の取込み輸送体（輸送体）をコードする異種遺伝子配列（天然または非天然のもの）を含む細菌細胞を意味する。いくつかの実施形態では、該細菌細胞へのプロピオネートの移入およびその代謝物のうちの１つまたは複数の移入を増加させる遺伝子改変を含む遺伝子操作細菌は、プロピオネート輸送体、または該細菌細胞内に１つもしくは複数のプロピオネート代謝物を輸送する他のアミノ酸輸送体、例えば、メチルマロン酸を細菌細胞に輸送することができる輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。輸送体は、プロピオネートおよび／またはその代謝物の細胞への移入を支援するまたは可能にするいずれの輸送体であってもよい。特定の実施形態では、プロピオネート輸送体は、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体のうちの１つである。特定の実施形態では、操作された細菌細胞は、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列を含有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、複数のプロピオネート輸送体、例えば、２つまたはそれ以上の異なるプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
【００３４】
「プロピオネート」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｃ２Ｈ５ＣＯＯ−を意味する。プロピオネートは、プロピオン酸の共役塩基である。「プロピオン酸」という用語は、本明細書で使用する場合、化学式ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＨを有するカルボン酸を意味する。プロピオネートは、カルボン酸の異化における第１ステップとしてプロピオニル補酵素Ａ（「プロピオニルＣｏＡ」）に変換される。プロピオネートおよびプロピオニルＣｏＡは、平衡状態で存在する。ヒトおよび他の脊椎動物では、プロピオニルＣｏＡは、ビオチン（ビタミンＢ７）を活用して酵素プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）によりＤ−メチルマロニルＣｏＡにカルボキシル化され、そのＤ−メチルマロニルＣｏＡがＬ−メチルマロニルＣｏＡに異性化される（図５参照）。本明細書で使用する場合、「メチルマロニルＣｏＡ」という用語は、メチルマロン酸に連結した補酵素Ａからなるチオエステルを意味する。次いで、ビタミンＢ１２依存性酵素であるメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）がＬ−メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの再構成を触媒し、次いで、そのスクシニルＣｏＡがクエン酸サイクルに組み込まれる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「プロピオネート結合タンパク質」という用語は、プロピオネート、および／または１つもしくは複数のプロピオネート代謝物（メチルマロネートおよび／またはメチルマロン酸を含むがこれらに限定されない）に結合することができるタンパク質を意味する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「輸送体」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド等）、毒素、代謝物、基質、ならびに他の生体分子を細胞外環境から微生物に移入するための機構、例えば、１つのタンパク質、複数のタンパク質、またはタンパク質複合体を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「プロピオネート輸送体」という用語は、プロピオネート、および／またはその代謝物（メチルマロネートおよび／またはメチルマロン酸を含むがこれらに限定されない）のうちの１つもしくは複数を細菌細胞に輸送するように機能するポリペプチドを意味する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「メチルマロン酸」および「メチルマロネート」という用語は、同義で用いる。本明細書で使用する場合、「プロピオネート」および「プロピオン酸」という用語は、同義で用いる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「プロピオネートおよび／またはその代謝物」または「プロピオネート、および／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数」という語句は、プロピオネートの任意の代謝物、例えば、本明細書に記載の代謝物のいずれかを含み、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸、またはメチルマロニルＣｏＡも含む。
【００４０】
「消化管」は、食物の輸送および消化、栄養素の吸収、ならびに廃物の排泄に関与する器官、腺、路および系を意味する。ヒトにおいては、消化管は、口から始まり、肛門で終わり、食道、胃、小腸および大腸をさらに含む、胃腸（ＧＩ）管を含む。消化管は、脾臓、肝臓、胆嚢および膵臓などの、付属器官および腺も含む。上部胃腸管は、食道、胃および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、ならびに大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸および肛門管を含む。細菌は、消化管を通して、例えば、胃腸管、とりわけ腸に見いだすことができる。
【００４１】
「非病原性細菌」は、宿主における疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌を意味する。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌の例は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ズブチリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびサッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）を含むが、これらに限定されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然で病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性の低下または消失をもたらすことができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「治療する」という用語およびその同語源語は、疾患、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を意味する。他の実施形態では、「治療する」は、患者によって必ずしも認識できない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。他の実施形態では、「治療する」は、疾患の進行を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、抑制することを意味する。他の実施形態では、「治療する」は、疾患の進行を遅くすることまたは進行を逆転することを意味する。本明細書で使用する場合、「妨げる」およびその同語源語は、所定の疾患の発生を遅延させることまたはかかるリスクを低下させることを意味する。
【００４３】
治療を必要とする人は、特定の医学的疾患を既に有する人、疾患を有するリスクがある、または最終的に疾患にかかる可能性がある人を含み得る。治療の必要性は、例えば、疾患の発生に関連する１つもしくは複数のリスクファクターの存在、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の治療に対する生じ得る受容によって評価される。プロピオネートの異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症（ＰＡ）またはメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）は、公知の治療法が存在しない先天性遺伝子突然変異によって引き起こされ得る。疾患はまた、他の状態、例えば肝疾患、の二次的なものであり得る。ＰＡまたはＭＭＡなどの、プロピオネートの異化を伴う疾患の治療は、プロピオネート、プロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／もしくはメチルマロニルＣｏＡの正常レベルを低下させること、プロピオネート、プロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／もしくはメチルマロニルＣｏＡの過剰レベルを低下させること、またはプロピオネート、プロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／もしくはメチルマロニルＣｏＡを消失させることを含み得るものであり、基礎疾患の消失を必ずしも含まない。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「異化」という用語は、奇数鎖脂肪酸、コレステロール、または分枝鎖アミノ酸、例えば、メチオニン、トレオニン、イソロイシンもしくはバリンの、その対応するプロピオニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、またはスクシニルＣｏＡへの変換を意味する。一実施形態では、「異常な異化」は、対象の血液中または脳内へのプロピオニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡの蓄積につながる、奇数鎖脂肪酸、コレステロールまたは分枝鎖アミノ酸のその対応するプロピオニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡまたはスクシニルＣｏＡへの変換速度または変換レベルの低下を意味する。一実施形態では、対象の血液中または脳内へのプロピオニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡの蓄積は、毒性になり、対象におけるプロピオネートの異常な異化に関連する疾患または障害の発生につながる。「異化」、例えば、「プロピオネート異化」は、プロピオネートおよび／またはメチルマロン酸の、本明細書に記載のその分解産物のうちの１つまたは複数への分解も意味する。
【００４５】
一実施形態では、「プロピオネートの異化を伴う障害」は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸またはメチルマロニルＣｏＡの異常な異化を伴う疾患または障害である。本明細書で使用する場合、「プロピオネートの異常な異化を伴う障害」という用語は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／またはメチルマロニルＣｏＡの異化が異常である疾患または障害を意味する。一実施形態では、「異常な異化」は、対象の血液中または脳内へのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／またはメチルマロニルＣｏＡの蓄積につながる、プロピオニルＣｏＡのメチルマロニルＣｏＡへの変換速度もしくは変換レベルの低下、またはメチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの変換速度もしくは変換レベルの低下を意味する。一実施形態では、対象の血液中または脳内へのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸および／またはメチルマロニルＣｏＡの蓄積は、毒性になり、対象におけるプロピオネートの異常な異化に関連する疾患または障害の発生につながる。一実施形態では、プロピオネートの異常な異化を伴う障害は、プロピオン酸血症またはメチルマロン酸血症である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「外因性環境条件」または「外因性環境シグナル」という語句は、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される、状況、環境、刺激、または生体分子を意味する。「外因性環境条件」という語句は、操作された微生物にとっては外部であるが、宿主対象の環境にとっては内因性または天然の環境条件を意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、同義で用いて、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、完全な微生物細胞に対しては外部または外因性である環境条件を意味することができる。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の上部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の下部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の小腸に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境のような、低酸素、微好気的または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝物、例えば、プロピオネートである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織に固有または疾患に固有の代謝物もしくは分子（複数可）である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、プロピオネート異化酵素疾患、例えば、プロピオン酸血症および／またはメチルマロン酸血症に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルにより誘発され、異なる速度論で発生し得る。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子発現を活性化する。
【００４７】
酸素レベル依存性転写因子の例は、ＦＮＲ（フマル酸・硝酸レダクターゼ）、ＡＮＲおよびＤＮＲを含むが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気硝酸呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターは、当技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年参照）、非限定的な例を表１に示す。
【００４８】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素の条件下で高度に発現することが公知である大腸菌ニッスルフマル酸・硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来していた（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、ニッスルに天然で見いだされるグローバルな転写調節因子ＦＮＲにより嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下の特定の遺伝子のプロモーターにおける特定の配列に結合し、それにより、それらの発現を活性化する。しかし、好気的条件下では、酸素がＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形に変換する。このようにして、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本願書においてＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびＰｆｎｒＳプロモーターを示すための他のそのような関連する記号表示と同義で用いる。
【００４９】
【表１】
2018521674.tif 000002
【００５０】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、活性酸素種（ＲＯＳ）の存在または非存在である。他の実施形態では、外因性環境条件は、活性窒素種（ＲＮＳ）の存在または非存在である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、炎症反応に関与する生体分子、例えば、消化管の炎症性障害の際に存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、組換え細菌細胞が滞留する環境に、天然に存在する、または天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、例えば、生物学的条件の作出もしくは除去、および／または生体分子の投与もしくは除去により、人工的に作出される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、哺乳動物の消化管内に天然に存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、本開示の医薬組成物と併用して投与される分子または代謝物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生体分子によって刺激される。いくつかの実施形態では、外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、本開示の組換え細菌細胞を含む培養培地に加えられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件は、哺乳動物の消化管内に天然に存在する（例えば、低酸素もしくは嫌気的条件、または炎症反応に関与する生体分子）。いくつかの実施形態では、外因性環境条件への（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの）曝露の喪失は、プロモーターを誘導するための外因性環境条件が存在しない（例えば、消化管外の好気的環境）故、誘導性プロモーターの活性を阻害する。「消化管」は、食物の輸送および消化、栄養素の吸収、ならびに廃物の排泄に関与する器官、腺、路および系を意味する。ヒトの場合、消化管は、口で始まり肛門で終わり、食道、胃、小腸および大腸をさらに含む、胃腸管（ＧＩ）を含む。消化管は、脾臓、肝臓、胆嚢および膵臓などの、付属器官および腺も含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、ならびに大腸の全て、すなわち、盲腸、結腸、直腸および肛門管を含む。細菌は、消化管の至る所で、例えば、胃腸管内、とりわけ腸内で見いだすことができる。
【００５２】
「微生物」は、一般的に単細胞からなる顕微鏡的、超顕微鏡的または極超微鏡的サイズの生物または微小生物を意味する。微生物の例は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類および原虫を含む。いくつかの態様では、微生物は、１つまたは複数の治療用分子、例えば、リソソーム酵素（複数可）を産生するように操作されている（「操作（された）微生物」である）。特定の態様では、操作微生物は、操作細菌である。特定の実施形態では、操作微生物は、操作ウイルスである。
【００５３】
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌を意味する。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、リポ多糖（ＬＰＳ）を含有しない。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌の例は、バシラス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、クロストリジウム属、腸球菌属、大腸菌、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、サッカロミセス属およびスタフィロコッカス属、に属する特定の菌株、例えば、バシラス・コアグランス、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・ファシウム、大腸菌、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティスおよびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌も含む。一実施形態では、本開示は、非病原性サッカロミセス属、例えば、サッカロミセス・ブラウディをさらに含む。天然で病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性を低下または消失させることができる。
【００５４】
「プロバイオティク」は、適切な量の微生物を含有する宿主生物に健康上の恩恵をもたらすことができる、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために用いられる。いくつかの実施形態では、宿主生物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、プロバイオティク細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、プロバイオティク細菌は、グラム陽性細菌である。非病原性細菌のいくつかの種、菌株および／または亜型は、現在プロバイオティク細菌と認識されている。プロバイオティク細菌の例は、ビフィドバクテリウム属、大腸菌、乳酸桿菌属およびサッカロミセス属に属する特定の菌株、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エンテロコッカス・ファシウム、大腸菌ニッスル株、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・パラカゼイ、およびラクトバシラス・プランタルム、ならびにサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクは、細菌の変異または突然変異菌株であり得る（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌を遺伝子操作して、所望の生物学的特性、例えば、生存性を増強または改善することができる。非病原性細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を与えることができる。プロバイオティク細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を増強または改善することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「栄養要求体」または「栄養要求性の」という用語は、その成長を支持するために特定の因子（例えば、アミノ酸、糖または他の栄養素）を必要とする生物を意味する。「栄養要求性の改変」は、外から加えられる生存または成長に必須の栄養素の非存在下で生物が前記栄養素を産生できないため死滅する原因となる、遺伝子改変である。本明細書で使用する場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞の増殖および／または生存に欠くことのできない遺伝子を意味する。必須遺伝子は、より詳細に下で説明するものであり、ＤＮＡ合成遺伝子（例えば、ｔｈｙＡ）、細胞壁合成遺伝子（例えば、ｄａｐＡ）、およびアミノ酸遺伝子（例えば、ｓｅｒＡおよびｍｅｔＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害および／もしくは状態、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、患者によって必ずしも認識できない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、疾患、障害および／または状態の進行を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、抑制することを意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、疾患、障害および／または状態の進行を遅くすることまたは進行を逆転することを意味する。本明細書で使用する場合、「妨げる」およびその同語源語は、所定の疾患、障害および／または状態あるいはそのような疾患、障害および／または状態に関連する症状の発生を遅延させることまたはかかるリスクを低下させることを意味する。
【００５７】
治療を必要とする人は、特定の医学的疾患を既に有する人、疾患を有するリスクがある、または最終的に疾患にかかる可能性がある人を含み得る。治療の必要性は、例えば、疾患の発生に関連する１つもしくは複数のリスクファクターの存在、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の治療に対する生じ得る受容によって評価される。プロピオネートの異化および／またはその代謝産物のうちの１つもしくは複数の異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症および／またはメチルマロン酸血症は、公知の治療法が存在しない先天性遺伝子突然変異によって引き起こされ得る。疾患はまた、他の状態の二次的なものであり得る。プロピオネートおよびメチルマロネートの異化を伴う疾患、例えば、プロピオン酸血症および／またはメチルマロン酸血症の治療は、プロピオネートの正常レベルおよび／もしくはその代謝物のうちの１つもしくは複数の正常レベルを低下させること、プロピオネートの過剰レベルおよび／もしくはその代謝物のうちの１つもしくは複数の過剰レベルを低下させること、またはプロピオネートを、および／もしくはその代謝物のうちの１つもしくは複数を消失させることを含み得るものであり、基礎疾患の消失を必ずしも含まない。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、細菌またはウイルスなどの遺伝子操作微生物により産生される、目的の１つもしくは複数の分子を意味する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロード、例えば、プロピオネート異化酵素またはプロピオネート輸送体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えば、ＦＮＲのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーのような、調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ペイロードは、ＦＮＲＳのような、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、キルスイッチのような、リプレッサーエレメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つの遺伝子、複数の遺伝子、遺伝子カセット、またはオペロンによりコードされる。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により生成されるものであって、前記生合成または生化学的経路は、任意選択で微生物に対して内因性であってもよい。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により生成されるものであって、前記生合成または生化学的経路は、微生物に対して内因性でない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作微生物は、２つまたはそれ以上のペイロードを含む。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」ならびに「（複数の）ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直線状に連結したアミノ酸単量体から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つもしくはそれ以上のアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはそれらと同義で用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断または非天然アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得ることができ、または組換え技術により生成することができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作細菌またはウイルスにより産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５もしくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、２００もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、１０００もしくはそれ以上、または２０００もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有さないが、定義された３次元構造を有し得る。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、折りたたみと呼ばれ、定義された３次元構造を有さずに、多数の異なる立体配座をとり得るポリペプチドは、変性と呼ばれる。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を意味し、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列および他のペプチド配列から選択される配列と一致するアミノ酸配列を意味し得る。
【００６０】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は、要求されない。細菌または哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない宿主細胞において発現した組換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換した、細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。大部分の細菌培養において発現するタンパク質またはペプチドは、一般的にグリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変異体、およびそれらのいずれかの組合せもポリペプチドとして含まれる。「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語は、最初のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する最初のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持している、任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解性断片ならびに欠失断片を含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異抗体または生物活性断片もしくは免疫学的に活性な断片も含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発法を用いて生成することができる。変異型ポリペプチドは、同類もしくは非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６１】
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、最初のペプチドのまたは最初のペプチドと十分に類似した配列を含む、融合タンパク質を含む。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。一般的に、融合タンパク質は、周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術により得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個別の最初のタンパク質と類似の構造的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の調節機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の生化学的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または免疫学的活性（ただし必ずしも同じ程度でない）を有し得る。「誘導体」は、２０種の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含む、ペプチドを含むが、これに限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。それが同一または同類アミノ酸置換である場合、１つのペプチドのアミノ酸は、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。同類置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ  Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９７８年）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保守的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように第２のアミノ酸配列と比べて十分なまたは最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書で十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。そのような変異体は、一般的に本発明のペプチドの機能活性を保持している。変異体は、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、付加および／または置換により、それぞれ天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体ならびに人工的に設計されたものであり得る。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を結合または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは非天然型アミノ酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を意味する。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる例示的リンカーは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に記載されている。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化」という用語は、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変であって、前記核酸分子によりコードされたポリペプチドを変更することなく、宿主生物の一般的なコドン使用を反映するような改変を意味する。そのような最適化は、コドンの少なくとも１つ、または複数、または有意な数を、宿主生物の遺伝子においてより高頻度に使用されている１つまたは複数のコドンで置換することを含む。「コドン最適化配列」は、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するために、またはコード配列の転写を改善するために、既存のコード配列から改変された、または設計された配列を意味する。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選択に適合するコード配列のコドンを選択することを含む過程を含むが、これに限定されない。多くの生物は、成長しつつあるポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用についてバイアスまたは選択を示す。コドン選択またはコドンバイアスは、生物間のコドン使用の差であり、遺伝コードの縮重によって可能になるものであり、多くの生物で十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率としばしば相関しており、これがひいては、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選択されるｔＲＮＡｓが優位であることは、一般的にペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映するものである。したがって、コドン最適化に基づいて所定の生物における最適の遺伝子発現を得るために遺伝子を調整することができる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「分泌システム」または「分泌タンパク質」という用語は、微生物の細胞質、例えば、細菌の細胞質から、生体分子、例えば、ポリペプチドを分泌または輸出することができる天然または非天然分泌機構を意味する。分泌システムは、単一タンパク質を含み、または複合体、例えば、ＨｌｙＢＤに集合する２つまたはそれ以上のタンパク質を含み得る。グラム陰性細菌の分泌システムの非限定的な例は、改変ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌システムを含む。グラム陽性細菌の分泌システムの非限定的な例は、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、分泌されるポリペプチドは、特定の分泌システムにそのポリペプチドを導くための、ＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、操作された細菌からポリペプチドを分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシステムにより「パッセンジャー」ペプチドの細胞質からペリプラズムコンパートメント内への転位時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を越えて転位すると、Ｃ末端分泌タグが自己触媒性切断またはプロテアーゼ触媒型切断、例えばＯｍｐＴ切断、によって除去され、それによりリソソーム酵素（複数可）を細胞外環境中に放出することができる。いくつかの実施形態では、分泌システムは、「漏出性」または不安定な外膜の生成を伴い、これは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子を欠失または突然変異させることによって達成することができる。Ｌｐｐは、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を得るための他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐｌなどの、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化した場合に認められた。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される、１つもしくは複数の欠失または突然変異膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、例えばｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される、１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の成分を伴う細菌細胞の製剤を意味する。
【００６７】
同義で用いることができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対する著しい刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を意味する。アジュバントは、これらの語句のもとに含まれる。
【００６８】
「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を意味する。例は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発症の予防、遅延、または疾患の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために用いられる。治療有効量は、例えば、疾患の１つもしくは複数の症状を治療する、防止する、重症度を低下させる、発症を遅延させる、かつ／または発生のリスクを低下させるのに十分であり得る。治療有効量、ならびに治療有効投与頻度は、当技術分野で公知であり、下文で述べる方法により決定することができる。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「静菌性の」または「細胞増殖抑制性の」という用語は、本開示の操作された細菌細胞の成長、分裂、増殖または複製を停止、遅延または阻害することができる、分子またはタンパク質を意味する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「殺菌性の」という用語は、本開示の操作された細菌を殺滅することができる、分子またはタンパク質を意味する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「毒素」という用語は、本開示の操作された細菌の成長、分裂、増殖または複製を停止、遅延もしくは阻害することができる、または本開示の操作された細菌細胞を殺滅することができる、タンパク質、酵素、もしくはそのポリペプチド断片、または他の分子を指す。「毒素」という用語は、静菌性タンパク質および殺菌性タンパク質を含むことを意図するものである。「毒素」という用語は、これらに限定されないが、溶解性タンパク質、バクテリオシン（例えば、ミクロシンおよびコリシン）、ジャイレース阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、転写阻害剤、翻訳阻害剤、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼを含むことを意図するものである。「抗毒素（ａｎｔｉ−ｔｏｘｉｎ）」または「抗毒素（ａｎｔｉｔｏｘｉｎ）」という用語は、本明細書で使用する場合、毒素の活性を阻害することができる、タンパク質または酵素を意味する。抗毒素という用語は、これらに限定されないが、免疫モジュレーター、および毒素発現の阻害剤を含むことを意図するものである。毒素および抗毒素の例は当技術分野で公知であり、より詳細に下で説明する。
【００７３】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、それに反することが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解すべきである。
【００７４】
「および／または」という語句は、リストにおける要素の間に用いられる場合、（１）１つの列挙された要素のみが存在すること、または（２）リストの複数の要素が存在することを意味するものとする。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、選択がＡのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、ＢおよびＣであり得ることを示している。「および／または」という語句は、リストにおける要素「のうちの少なくとも１つ」または「のうちの１つもしくは複数」と同義で用いることができる。
【００７５】
本明細書において提供する範囲は、範囲内の値の全てについての省略表現であると解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと解される。
【００７６】
細菌菌株
本開示は、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、非病原性細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、共生細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロバイオティク細菌細胞である。
【００７７】
特定の実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ズブチリス、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、大腸菌、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトコッカス・ラクティス、およびオキサロバクター・ホルミゲネス（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ）細菌細胞からなる群から選択される。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・フラジリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・シータイオタオミクロン細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・ズブチリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・アニマリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・インファンティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ラクティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、クロストリジウム・ブチリカム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、クロストリジウム・シンデンス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・アシドフィラス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・プランタルム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・ロイテリ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトコッカス・ラクティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、オキサロバクター・ホルミゲネス細菌細胞である。他の実施形態では、細菌細胞は、オキサロバクター・ホルミゲネスを含まない。
【００７８】
一実施形態では、細菌細胞は、グラム陽性細菌細胞である。他の実施形態では、細菌細胞は、グラム陰性細菌細胞である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、最もよく特徴付けられているプロバイオティクの１つに進化した腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性細菌である、大腸菌ニッスル１９１７株（大腸菌ニッスル）である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。この菌株は、その完全な無害性（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ：一般的に安全と認められる）状態（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、強調は著者による）を有する。ゲノム配列決定により、大腸菌ニッスルには顕著な病原性因子（例えば、大腸菌α−ヘモリシン、Ｐ線毛アドヘシン）がないことが確認されており（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）、大腸菌ニッスルは、病原性接着因子を有さず、いかなる腸毒素も細胞毒素も産生せず、侵襲性でなく、尿路病原性でない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。早くも１９１７年には、大腸菌ニッスルは、治療用のＭｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬カプセルに包装された。大腸菌ニッスルの治療有効性および安全性が説得力をもって立証された（Ｕｋｅｎａら、２００７年）ことは、一般的に受け入れられている。
【００８０】
一実施形態では、操作された細菌細胞は、対象にコロニーを形成しない。
【００８１】
当業者は、本明細書で開示した遺伝子改変は、細菌の他の種、菌株および亜型に適応することができることを十分に理解するであろう。さらに、１つまたは複数の異なる種に由来する遺伝子を互いに導入することができ、例えば、ラクトバシラス・プランタルムまたはメタノブレビバクター・スミシー（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ）３１４２に由来する遺伝子を大腸菌において発現させることができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、遺伝子操作細菌細胞である。他の実施形態では、細菌細胞は、操作された細菌細胞である。いくつかの実施形態では、本開示は、細菌細胞のコロニーを含む。
【００８３】
他の態様では、本開示は、操作された細菌細胞を含む、操作された細菌培養物を提供する。
【００８４】
上記遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセット（複数可）は、細菌におけるプラスミド上に存在し、前記プラスミド上の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、遺伝子または遺伝子カセット（複数可）は、細菌の染色体内に存在し、前記染色体内の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【００８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、栄養要求体または条件付き栄養要求体である。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉｌ栄養要求体から選択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、複数の栄養要求性を有し、例えば、それらは、ΔＴｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書で示したキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および逆方向毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の逆方向切除遺伝子をさらに含み、切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰａｒａＢＡＤのような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む。
【００８８】
上記遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセット（複数可）は、細菌のプラスミド上に存在し、前記プラスミド上の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、遺伝子または遺伝子カセット（複数可）は、細菌の染色体内に存在し、前記染色体内の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【００８９】
一態様では、本開示は、培養物の培地中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを低下させる、操作された細菌培養物を提供する。一実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルは、約５０％、約７５％、または約１００％低下される。他の実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルは、約２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下される。一実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルは、検出限界未満に低下される。
【００９０】
遺伝子操作微生物またはプログラムされた微生物、例えば、本開示の遺伝子操作細菌は、プロピオネートの代謝および／または１つもしくは複数のプロピオネート代謝物の代謝のための１つまたは複数の酵素を産生することができる。そのような酵素およびプロピオネート代謝経路の非限定的な例は、本明細書に記載されている。例えば、プロピオネート代謝経路は、例えば本明細書に記載の、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、メチルマロニル−ＣｏＡ（ＭＭＣＡ）および２−メチルシトレート（２ＭＣ）経路のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本開示は、プロピオネートおよび／または特定のプロピオネート代謝物、例えばメチルマロネート、のレベルの減少をもたらす１つまたは複数のプロピオネート異化酵素または他のタンパク質をコードする１つまたは複数の異種遺伝子配列および／または遺伝子カセットを含む、細菌細胞を提供する。
【００９１】
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、偏性嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、通性嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、好気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、グラム陽性細菌であり、ＬＰＳを欠く。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、グラム陽性かつ偏性嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、グラム陽性かつ通性嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロバイオティク細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、病原性を低下または消失させるように改変または突然変異されている、天然では病原性の細菌である。例示的な細菌は、バシラス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属、腸球菌属、大腸菌、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サッカロミセス属、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、バシラス・コアグランス、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＵＣ２００３、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・ブチリカムＭ−５５、クロストリジウム・コクレアリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ）、クロストリジウム・フェルシネウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ）、クロストリジウム・ヒストリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）、多発酵性クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）−ＮＴ、クロストリジウム・パラピュトリフィカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ）、クロストリジウム・ペクチノボルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ロゼウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、クロス���リジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・テルチウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｒｔｉｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌ニッスル１９１７、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、エンテロコッカス・ファシウム、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ズブチリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティス細菌細胞から選択される。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・フラジリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・シータイオタオミクロン細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・ズブチリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・インファンティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ラクティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、クロストリジウム・ブチリカム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・アシドフィラス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・プランタルム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・ロイテリ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトコッカス・ラクティス細菌細胞である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、最もよく特徴付けられているプロバイオティクの１つに進化した腸内細菌科のグラム陰性細菌である、大腸菌ニッスル１９１７株（大腸菌ニッスル）である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。該菌株は、その完全な無害（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認識された（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ））状態（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、強調は著者による）を有する。ゲノム配列決定により、大腸菌ニッスルには顕著な病原性因子（例えば、大腸菌α−ヘモリシン、Ｐ線毛アドヘシン）がないことが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）。さらに、大腸菌ニッスルは、病原性接着因子を有さず、いかなる腸毒素も細胞毒素も産生せず、侵襲性でなく、尿路病原性でないことが示された（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。早くも１９１７年には、大腸菌ニッスルは、治療用のＭｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬カプセルに包装された。大腸菌ニッスルは、それ以来、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトにおける潰瘍性大腸炎を治療するために（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎら、１９９９年）、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトにおける炎症性腸疾患、クローン病および回腸嚢炎を治療するために（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで腸管侵襲性サルモネラ属、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）を抑制するために（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒら、２００４年）用いられている。大腸菌ニッスルの治療有効性および安全性が説得力をもって立証された（Ｕｋｅｎａら、２００７年）ことは、一般的に受け入れられている。
【００９３】
当業者は、本明細書で開示した遺伝子改変は、細菌の他の種、菌株および亜型に適応することができることを十分に理解するであろう。さらに、１つまたは複数の異なる種に由来する遺伝子を互いに導入することができ、例えば、アシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９に由来するｐｈａＢＣＡ遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラーに由来するａｃｃＡ遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラーに由来するｐｃｃＢ遺伝子、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来するｍｍｃＥ遺伝子またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来するｍｕｔＡＢ遺伝子、またはロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）に由来するｍａｔＢを、大腸菌において発現させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば大腸菌における発現のために、コドン最適化される。一実施形態では、組換え細菌細胞は、障害を有する対象にコロニーを形成しない。非改変大腸菌ニッスルおよび本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、消化管または血清中の防御因子により、破壊され得る（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。いくつかの実施形態では、滞留時間をヒト対象について計算する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間を本発明の遺伝子操作細菌について計算する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、遺伝子操作細菌細胞である。他の実施形態では、細菌細胞は、組換え細菌細胞である。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示する細菌細胞のコロニーを含む。
【００９５】
他の態様では、本開示は、本明細書で開示する細菌細胞を含む、組換え細菌培養物を提供する。一態様では、本開示は、培養物の培地中のプロピオネートレベルを低下させる組換え細菌培養物を提供する。一実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネートのレベルおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数のレベルは、約５０％、約７５％、または約１００％低下される。他の実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネートのレベルおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数のレベル、約２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下される。一実施形態では、細胞培養物の培地中のプロピオネートのレベルおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数のレベルは、検出限界未満に低下される。
【００９６】
上記遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し、前記プラスミド上の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーター、例えば、本明細書で開示するプロモーターのいずれかに作動可能に連結している。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌の染色体内に存在し、前記染色体内の低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーター、例えば、本明細書で開示するプロモーターのいずれかに作動可能に連結している。上記遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し、前記プラスミド上の炎症性条件下で誘導されるプロモーター、例えば、本明細書で開示するプロモーターのいずれかに作動可能に連結している。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌の染色体内に存在し、前記染色体内の炎症性条件下で誘導されるプロモーター、例えば、本明細書で開示するプロモーターのいずれかに作動可能に連結している。
【００９７】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作細菌は、栄養要求体である。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉｌ栄養要求体から選択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、複数の栄養要求性を有し、例えば、それらは、ΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作細菌は、機能性ｉｌｖＣ遺伝子配列を欠き、例えば、ｉｌｖＣ栄養要求体である。ｉｌｖＣは、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードし、この酵素は、プロピオネート合成に必要である。ｉｌｖＣのノックアウトは、栄養要求体を作出するものであり、生存するためにイソロイシンおよびバリンを移入するための細菌細胞を必要とする。
【００９８】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作細菌は、細菌細胞へのプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。特定の実施形態では、プロピオネート輸送体は、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６、または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体である。特定の実施形態では、細菌細胞は、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列を含有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作細菌は、生体分子を分泌するための分泌タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、本明細書で開示する分泌システムのいずれかをコードする、遺伝子配列（複数可）をさらに含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の抗生物質遺伝子、例えば、本明細書で開示する抗生物質遺伝子のいずれかをコードする、遺伝子配列（複数可）をさらに含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素を含む遺伝子操作細菌は、キルスイッチ回路、例えば、本明細書で示すキルスイッチ回路のいずれかをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子と、逆方向毒素配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子と、１つまたは複数の逆方向切除遺伝子とをさらに含み、前記切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤのような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子とをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子配列を含む栄養要求体であり、キルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかをさらに含む。
【０１０３】
上記遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、プロピオネート輸送体、例えば、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６、または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌におけるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、プロピオネート輸送体、例えば、ＭｃｔＣ、ＰｕｔＰ＿６、または本明細書に記載の任意の他のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、生体分子を分泌するための分泌タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、本明細書で開示する分泌システムのいずれかをコードする遺伝子配列は、細菌におけるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、生体分子を分泌するための分泌タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、本明細書で開示する分泌システムのいずれかをコードする遺伝子配列は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌におけるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌染色体内に存在する。
【０１０４】
誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、プロピオネート異化酵素を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つまたはそれ以上の異なるプロピオネート異化酵素を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じプロピオネート異化酵素遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、異なるプロピオネート異化酵素遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、染色体上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、染色体内に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートおよび／またはその１つもしくは複数の代謝物の輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、前記輸送体を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の２つまたはそれ以上の異なるコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの同じ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、染色体上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、染色体内に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネートおよび／またはメチルマロネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーター、およびプロピオネート輸送体をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件により直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーター、およびプロピオネート輸送体をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件により間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に固有の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に固有の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境のような低酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特有である分子または代謝物、例えば、プロピオネートにより直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により直接的または間接的に誘導される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、プロピオネート結合タンパク質を宿主細胞において発現させることができ、該宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の２つまたはそれ以上の異なるコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの同じ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、染色体上に存在し、直接的または間接的誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、染色体内に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーター、およびプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件により直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーター、およびプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件により間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特有である外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特有である外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特有である分子または代謝物、例えば、プロピオネートにより直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により直接的または間接的に誘導される。
【０１０９】
ＦＮＲ依存性調節
特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現する、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現する、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現する、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気的状態では、ＦＮＲは、嫌気性増殖への適応に関与する数百もの遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気的状態では、ＦＮＲは、酸素によって二量体化を妨げられ、不活性である。
【０１１０】
ＦＮＲ応答性プロモーターは、下の図表に収載するＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、それらに限定されない。下線付き配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに用いられる制限部位である。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３−１】
2018521674.tif 000004
【表３−２】
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【表３−３】
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【０１１３】
一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号３を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号４を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号６を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号７を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号８を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号９を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１０を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１１を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１２を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１３を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１５を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１６を含む。さらに他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１７を含む。
【０１１４】
他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜１７のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜１７のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜１７のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜１７のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜１７のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、いくつかの実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１〜４３のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝子操作細菌に挿入される。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御下で発現する、本明細書で開示するプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を含む。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御下で発現する、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御下で発現する、プロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。これらの実施形態では、プロピオネートおよび／またはその代謝物の異化は、低酸素または嫌気的環境において、例えば消化管内で、大いに活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野で公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化することおよび／またはｍＲＮＡの安定性を増大させることにより、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物消化管は、ヒト哺乳動物消化管である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および異なる細菌種に由来する対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、低酸素または嫌気的環境において、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の転写を、同じ条件下の細菌における天然遺伝子（複数可）およびプロモーターと比較して、増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌（Ｎ．Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型活性を保持する。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、野生型活性を低減または消失させる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および同じ亜型の細菌に由来する野生型プロモーターと比べて突然変異している対応するプロモーターを含む。突然変異プロモーターは、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境において、野生型転写調節因子への結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーター、および同じ亜型の細菌に由来する野生型転写調節因子と比べて突然変異している対応する転写調節因子を含む。突然変異転写調節因子は、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気的環境において、野生型プロモーターへの結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増加させるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年参照）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子、の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、同じプラスミド上に存在する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子、および／またはプロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、同じ染色体上に存在する。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、プロピオネート異化酵素および／またはプロピオネート輸送体および／またはその代謝物および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、プロピオネート異化酵素および／またはプロピオネート輸送体および／またはその代謝物および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびプロピオネート異化酵素は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０１２０】
ＲＮＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現するプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素および／またはプロピオネート輸送体および／またはその代謝物および／またはプロピオネート結合タンパク質を発現する遺伝子操作細菌は、炎症状態により活性化されるプロモーターの制御下にある。一実施形態では、プロピオネート異化酵素および／またはプロピオネート輸送体および／またはその代謝物および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生するための遺伝子は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、活性窒素種またはＲＮＳプロモーターの制御下で発現する。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「活性窒素種」および「ＲＮＳ」は、同義で用い、分子状窒素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＮＳは、ニトロソ化ストレスのような有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＮＳは、酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（・ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロペルオキシカーボネート（ＯＮＯＯＣＯ２−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルにより誘発され、異なる速度論で発生する。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素遺伝子配列（複数可）、例えば本明細書に記載のアミノ酸異化酵素のいずれか、に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素遺伝子配列（複数可）、プロピオネート輸送体配列（複数可）、プロピオネート結合タンパク質（複数可）に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、調節領域にもはや結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、ＲＮＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を活性化する。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」は、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮＳ抑制性調節領域および／またはＲＮＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表４に示すものを含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性窒素種を感知することができる転写因子により直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を直接的または間接的に駆動することができる１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結しており、その結果として、ＲＮＳレベルに対してプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を制御する。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質、例えば、本明細書で示すアミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質のいずれかである。ＲＮＳが、例えば炎症組織に、存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、および／または調節領域を活性化し、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子の発現を駆動する。その後、炎症が改善し、ＲＮＳレベルが低下すると、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の産生は、減少または消失する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＮＳを感知するとき、それは、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ＮＯを亜酸化窒素に還元する、フラボルブレドキシンおよび関連フラビタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ応答性転写活性化因子である」（Ｓｐｉｒｏ、２００６年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＮｏｒＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子配列に作動可能に連結しているｎｏｒＶＷに由来するＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｏｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子（複数可）の発現を駆動し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＤＮＲである。ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）は、酸化窒素の存在下で「ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する」（Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺伝子の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｇｉａｒｄｉｎａら、２００８年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、酪酸生成遺伝子カセットに作動可能に連結したｎｏｒＣＢのＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＤＮＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した１つまたは複数の遺伝子の発現を駆動し、１つまたは複数のアミノ酸異化酵素を産生する。いくつかの実施形態では、ＤＮＲは、緑膿菌ＤＮＲである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットを活性化する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ＮＯを感知し、ＮＯの代謝に関与する遺伝子の発現を制御することができるＲｒｆ２型の転写リプレッサー」である（Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＮｓｒＲによって抑制される遺伝子の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＮｓｒＲは、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年；Ｄｕｎｎら、２０１０年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素に作動可能に連結しているｎｏｒＢに由来するＲＮＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｓｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＢ調節領域にもはや結合せず、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結したプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子を抑制解除し、アミノ酸異化酵素（複数可）をコードするものを産生する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子を発現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＮＳ感知転写因子は、例えば、淋菌に由来するＮｓｒＲであり、ここで、大腸菌は、前記ＮｓｒＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限にまたは排除する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制性調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０１３５】
これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アミノ酸異化酵素を発現させるために用いられる、２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＮＳ感知リプレッサーと、例えばアミノ酸異化酵素をコードする、遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結している第２のリプレッサーとを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＮＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施形態において有用な第２のリプレッサーの例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが、これらに限定されない。第１のリプレッサーによる結合の非存在（ＲＮＳの非存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーが転写され、これが１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。第１のリプレッサーによる結合の存在（ＲＮＳの存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーの発現が抑制され、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子が発現する。
【０１３６】
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域の配列によって遺伝子発現を誘導、活性化、または抑制し得る。１つまたは複数の種類のＲＮＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作細菌に存在し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、および例えば、ｎｏｒＢに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、ならびに例えば、ｎｏｒＢおよびａｎｉＡに由来する、２つまたはそれ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲ、ならびに例えば、それぞれｎｏｒＢおよびｎｏｒＲに由来する、２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＮＳ応答性調節領域が複数の転写因子に結合できることがあり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感知転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳにより調節される調節領域の核酸配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年；Ｄｕｎｎら、２０１０年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２年）。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｎｓｒＲ遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＮＳ感知転写因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知転写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させ得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子ＮｓｒＲおよび淋菌に由来する対応する調節領域ｎｓｒＲを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異させる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ＮｓｒＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異している、対応する調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下でプロピオネート異化酵素の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、対応する転写因子、例えば、ＮｓｒＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型転写因子と比較して、ＲＮＳの存在下でプロピオネート異化酵素の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＳの存在下でのプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を増加させるために、ＲＮＳ感知転写因子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌の野生型配列と比べて突然変異させる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＮＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を増大させることによって、発現がさらに最適化される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）のいずれかを１つまたは複数の組込み部位において細菌染色体に組み込むことができる。例えば、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）の１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれた１つまたは複数の遺伝子の複数のコピーを有することにより、アミノ酸異化酵素（複数可）のより多くの産生が可能となり、発現のレベルの微調整も可能となる。あるいは、複数の異なる機能を果たすために治療用遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）に加えて、分泌または輸出回路のいずれかのような、本明細書に記載の異なる回路を細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことが可能である。
【０１４４】
ＲＯＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現するプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞損傷の状態により活性化されるプロモーターの制御下でプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を発現する、遺伝子操作細菌。一実施形態では、プロピオネート異化酵素を産生するための遺伝子は、細胞または組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷依存性プロモーター、例えば、活性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現する。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、「活性酸素種」および「ＲＯＳ」は、同義で用いられ、分子状酸素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＯＳは、好気的呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生され、酸化的損傷などの有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、炭酸ラジカル、過酸化物またはペルオキシルラジカル（・Ｏ２−２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、酸化窒素（ＮＯ・）およびペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なるＲＯＳレベルによって誘発され、異なる速度論で発生する（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＯＳ誘導性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子配列、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸異化酵素をコードする１つまたは複数の配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を誘導する。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に、作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、もはや調節領域に結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を活性化する。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制性調節領域は、１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。
【０１４９】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」は、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯＳ抑制性調節領域および／またはＲＯＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表５に示すものを含むが、それらに限定されない。
【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知することができる転写因子に直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、アミノ酸異化酵素の発現を直接的または間接的に駆動することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結しており、その結果として、ＲＯＳレベルに対してプロピオネート異化酵素の発現を制御する。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、分子は、アミノ酸異化酵素である。ＲＯＳが、例えば炎症組織に存在する場合、ＲＯＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、および／または調節領域を活性化し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の遺伝子配列の発現を駆動し、それによってアミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。その後、炎症が改善し、ＲＯＳレベルが低下すると、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の産生は、減少または消失する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＯＳを感知するとき、それは、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「過酸化物ストレス反応のグローバルな調節因子として主として機能し」、多くの遺伝子、例えば、「Ｈ２Ｏ２の解毒（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元剤供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ−Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄移入システムの抑制（ｆｕｒ）に関与する遺伝子」および「小調節ＲＮＡであるＯｘｙＳ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）を調節することができる。遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎｇら、２００１年；Ｄｕｂｂｓら、２０１２年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子に作動可能に連結している、ｏｘｙＳに由来するＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＨ２Ｏ２、の存在下で、ＯｘｙＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｘｙＳ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結したプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子の発現を駆動し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、大腸菌ｏｘｙＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｏｘｙＳ調節領域は、大腸菌ｏｘｙＳ調節領域である。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓおよびａｈｐＣの調節領域から選択される。
【０１５４】
代替実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの酸化によって活性化される場合、それがＳｏｘＳの合成を増加させ、これがその標的遺伝子発現を活性化する」（Ｋｏｏら、２００３年）。「ＳｏｘＲは、スーパーオキシドおよび酸化窒素に主として応答することが公知であり」（Ｋｏｏら、２００３年）、Ｈ２Ｏ２に応答することもできる。本発明の遺伝子操作細菌は、ＳｏｘＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｋｏｏら、２００３年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、アミノ酸異化酵素に作動可能に連結しているｓｏｘＳに由来するＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳの存在下で、ＳｏｘＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結したプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子の発現を駆動し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットを活性化する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｏｈｒＡプロモーター部位と重複する逆方向反復ＤＮＡ配列の対に結合し、それにより、転写イベントを抑制する」が、酸化ＯｈｒＲは、「そのＤＮＡ標的に結合することが不可能である」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０年）。ＯｈｒＲは、「有機過酸化物およびＮａＯＣｌの両方を感知する転写リプレッサーであり」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、「Ｈ２Ｏ２により弱く活性化されるが、有機ヒドロペルオキシドに対するはるかにより高い反応性を示す」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｈｒＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子に作動可能に連結している、ｏｈｒＡに由来するＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＮａＯＣｌ、の存在下で、ＯｈｒＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｈｒＡ調節領域にはもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子を抑制解除し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。
【０１５７】
ＯｈｒＲは、ＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「ＭａｒＲファミリーの大部分のメンバーは、転写リプレッサーであり、プロモーターにおける−１０または−３５領域にしばしば結合し、ＲＮＡポリメラーゼの結合の立体阻害をもたらす」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。このファンリーの他のメンバーは、当技術分野で公知であり、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲおよびＳａｒＺを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺであり、本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺにより抑制される遺伝子の１つまたは複数の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「共通配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡを有する１８ｂｐ逆方向反復配列」に結合する「ＭａｒＲ型転写調節因子」であり、「酸化剤Ｈ２Ｏ２により可逆的に阻害される」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。ＲｏｓＲは、「推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲの上流で、異なる遺伝子）、感覚ヒスチジンキナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子（ｃｇ３２９１）、グルタチオンＳ−トランフェラーゼファミリーのタンパク質（ｃｇ１４２６）、２つの推定ＦＭＮレダクターゼ（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）ならびに４つの推定モノオキシゲナーゼ（ｃｇ０８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９およびｃｇ３０８４）」を含むが、これらに限定されない、多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質に作動可能に連結している、ｃｇｔＳ９に由来するＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＨ２Ｏ２、の存在下で、ＲｏｓＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｃｇｔＳ９調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子を抑制解除し、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子を発現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＯＳ感知転写因子は、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来するＲｏｓＲであり、大腸菌は、前記ＲｏｓＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限にまたは排除する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制性調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＰｅｒＲである。枯草菌では、ＰｅｒＲは、「ＤＮＡに結合した場合、酸化ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣおよびｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒおよびｚｏａＡ）ならびにそれ自体の合成（ｐｅｒＲ）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「主としてＨ２Ｏ２に応答するグローバルな調節因子であり」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、「ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内および近くに存在する特定の回文構造共通配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）である、ｐｅｒボックスにおけるＤＮＡと相互作用する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「プロモーターの一部と重複するかまたはそのすぐ下流にある」調節領域に結合することができる（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年；表１参照）。
【０１６２】
これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アミノ酸異化酵素を発現させるために用いられる、２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えばＰｅｒＲと、遺伝子または遺伝子カセット、例えばアミノ酸異化酵素に作動可能に連結している第２のリプレッサー、例えばＴｅｔＲとを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施形態において有用な第２のリプレッサーの例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、ＰｅｒＲである。いくつかの実施形態では、第２のリプレッサーは、ＴｅｔＲである。この実施形態では、ＰｅｒＲ抑制性調節領域は、ＴｅｔＲの発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、アミノ酸異化酵素の発現を駆動する。ＰｅｒＲ結合の非存在（ＲＯＳの非存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲが転写され、ＴｅｔＲが遺伝子または遺伝子カセット、例えば、アミノ酸異化酵素の発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合の存在（ＲＯＳの存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲの発現が抑制され、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質が発現する。
【０１６３】
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域配列によって遺伝子発現を誘導、活性化または抑制し得る。例えば、「ＯｘｙＲは、酸化条件下では主として転写活性化因子として考えられているが、ＯｘｙＲは、酸化および還元の両条件下でリプレッサーまたは活性化因子として機能することができ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、ＯｘｙＲは、「それ自体のリプレッサーならびにｆｈｕＦ（第二鉄イオンレダクターゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のそれであることが示された」（Ｚｈｅｎｇら、２００１年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、上述のように、２つのリプレッサー活性化調節回路に用いられる。ＯｘｙＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎｇら、２００１年；表１参照）。または、例えば、ＲｏｓＲは、多くの遺伝子を抑制することができるが、それは、特定の遺伝子、例えば、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性化することもできる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。さらに、「ＰｅｒＲ媒介性の正の調節も認められ、遠隔上流部位へのＰｅｒＲの結合に関係すると思われる」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
【０１６４】
１つまたは複数の種類のＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作細菌に存在し得る。例えば、「ＯｈｒＲは、グラム陽性およびグラム陰性細菌に認められ、ＯｘｙＲもしくはＰｅｒＲまたは両方と共存し得る」Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲ、および例えば、ｏｘｙＳに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲ、ならびに例えば、ｏｘｙＳおよびｋａｔＧに由来する２つまたはそれ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲおよびＰｅｒＲ、ならびに例えば、ｏｘｙＳおよびｋａｔＡに由来する２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、複数の転写因子に結合し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＯＳ感知転写因子、および１つの対応する調節領域配列を含む。
【０１６５】
いくつかの例示的なＯｘｙＲにより調節される調節領域の核酸配列を表６に示す。ＯｘｙＲ結合部位は、下線付きの太字である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１８、１９、２０もしくは２１のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｏｘｙＲ遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＯＳ感知転写因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写調節因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知転写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調節領域と比較して、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させ得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子ＯｘｙＲ、および大腸菌に由来する対応する調節領域ｏｘｙＳを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異させる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ｓｏｘＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異している、対応する調節領域、例えば、ｓｏｘＳ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＯＳの存在下でプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、対応する転写因子、例えば、ＯｘｙＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型転写因子と比較して、ＲＯＳの存在下でプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＳの存在下でのプロピオネート異化酵素の発現を増加させるために、ＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌に由来する野生型配列と比べて突然変異させる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体内に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を増大させることにより、発現をさらに最適化する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アミノ酸異化酵素（複数可）、プロピオネート輸送体（複数可）および／またはプロピオネート結合タンパク質（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸異化酵素（複数可）、プロピオネート輸送体（複数可）および／またはプロピオネート結合タンパク質（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）はプラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生することができる遺伝子（複数可）は染色体内に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に作動可能に連結している。
【０１７４】
このように、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターまたは活性窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーター、および対応する転写因子の制御下で１つまたは複数のアミノ酸異化酵素を産生する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を産生するための遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では、細菌は、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子を低コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増大させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導性条件下で漏出性発現を減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子を高コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質の発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子を染色体上で発現させる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増加させるため）または複数の異なる機能を果たす回路を含むように遺伝子操作を施す。例えば、遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位に挿入された特定のプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子の４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入された特定のプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子の３つのコピーと、３つの異なる挿入部位に挿入された異なるプロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質をコードする遺伝子の３つのコピーとを含み得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質が発現する条件下で、本開示の遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍多い、アミノ酸異化酵素、プロピオネート輸送体および／もしくはプロピオネート結合タンパク質、ならびに／またはオペロン内のその（それらの）遺伝子の転写物を産生する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出および／または定量する。プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）に固有のプライマーを当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素ｍＲＮＡを含有する可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１ＣＴの結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出および／または定量する。プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）に固有のプライマーを当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質ｍＲＮＡを含有する可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１ＣＴの結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体および／またはプロピオネート結合タンパク質遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０１８０】
他の実施形態では、誘導性プロモーターは、プロピオネート応答性プロモーターである。例えば、ｐｒｐＲプロモーターは、プロピオネート応答性プロモーターである。一実施形態では、プロピオネート応答性プロモーターは、配列番号７０を含む。
【０１８１】
プロピオネート異化酵素ならびにプロピオネート異化遺伝子および遺伝子カセット
本明細書で使用する場合、「プロピオネート異化遺伝子」、「プロピオネート異化遺伝子カセット」、「プロピオネート異化カセット」、または「プロピオネート異化オペロン」という用語は、生合成経路においてプロピオネートおよび／もしくはその代謝物ならびに／またはメチルマロン酸および／もしくはその代謝物を異化することができる遺伝子または一組の遺伝子を意味する。
【０１８２】
本明細書で使用する場合、「プロピオネート異化酵素」または「プロピオネート異化作用もしくは異化酵素」または「プロピオネート代謝酵素」という用語は、プロピオネートおよび／またはその代謝物を代謝することができる任意の酵素を意味する。「プロピオネート異化酵素」または「プロピオネート異化作用もしくは異化酵素」または「プロピオネート代謝酵素」という用語は、メチルマロン酸および／またはその代謝物を代謝することができる任意の酵素を意味する。例えば、「プロピオネート異化酵素」または「プロピオネート異化作用もしくは異化酵素」または「プロピオネート代謝酵素」という用語は、プロピオネート、プロピオニル−ＣｏＡ、メチルマロン酸、および／またはメチルマロニルＣｏＡを代謝することができる任意の酵素を意味する。例えば、「プロピオネート異化酵素」または「プロピオネート異化作用もしくは異化酵素」または「プロピオネート代謝酵素」という用語は、蓄積したプロピオネートおよび／もしくはメチルマロン酸および／もしくはプロピオニルＣｏＡおよび／もしくはメチルマロニルＣｏＡを低減することができる、または１つもしくは複数のプロピオネートおよび／もしくはメチルマロン酸疾患もしくは疾患症状を緩和、改善もしくは予防することができる、任意の酵素を意味する。プロピオネートおよび／またはメチルマロン酸代謝酵素の例は、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＰｒｐＥ）、２−メチルイソクエン酸リアーゼ（ＰｒｐＢ）、２−メチルクエン酸シンターゼ（ｐｒｐＣ）、２−メチルクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｒｐＤ）、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ｐｃｃＢ）、アセチル−／プロピオニル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ａｃｃＡ１）、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ｍｍｃＥ）、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｍｕｔＡ、およびｍｕｔＢ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈａＢ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）シンターゼ、例えばｐｈａＣによりコードされるもの、および３−ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）、ｐｃｔ、ならびにマロニル−補酵素Ａ（マロニル−ＣｏＡ）シンテターゼ（ｍａｔＢ）を含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
これらのタンパク質の機能的欠損は、細胞および組織内へのプロピオネートおよび／もしくはメチルマロン酸、またはそれらの代謝物のうちの１つもしくは複数についての蓄積をもたらす。本開示のプロピオネート異化酵素は、野生型または改変プロピオネート異化酵素の両方を含み、組換えおよび合成方法を用いて産生することができ、または天然源から精製することができる。プロピオネート異化酵素は、完全長ポリペプチドおよびその機能性断片、ならびにそれらの相同体および変異体を含む。プロピオネート異化酵素は、例えば１つまたは複数のアミノ酸欠失、挿入および／または置換を有するポリペプチドを含む、野生型配列から改変されたポリペプチドを含み、例えば、融合ポリペプチド、ならびに追加の配列、例えば、調節ペプチド配列、リンカーペプチド配列および他のペプチド配列を有するポリペプチドを含み得る。
【０１８４】
本明細書で使用する場合、「プロピオネート異化酵素」という用語は、プロピオネートもしくはプロピオニルＣｏＡおよびまたはメチルマロン酸もしくはメチルマロニルＣｏＡの、非毒性分子、例えば、その対応するメチルマロニルＣｏＡ分子、対応するスクシニルＣｏＡ分子、スクシネート、またはポリヒドロキシアルカノエートへの異化、あるいはメチルマロニルＣｏＡの、非毒性分子、例えば、その対応するスクシニルＣｏＡ分子への異化に関与する酵素を意味する。プロピオネートの異化に関与する酵素は、当業者に周知である。
【０１８５】
ヒトの場合、ピロピオニル−ＣｏＡを代謝するための主経路は、酵素プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）を含み、この酵素がプロピオニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡに変換し、次いでメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）酵素が、メチルマロニルＣｏＡをスクシニルＣｏＡに変換する（例えば、図５参照）。プロピオニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡの毒性蓄積につながる酵素欠損または突然変異は、プロピオネート異化に関連する障害、例えば、ＰＡおよびＭＭＡの発生をもたらし、ビタミンＢ１２の重度栄養障害もまたＭＭＡをもたらし得る（Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍら、Ｍ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９９巻（７号）：３１７〜３２３頁、１９７８年）。他の副経路がヒトには存在するが、これらの経路は、プロピオニルＣｏＡ代謝についての主経路の非存在または突然変異を補償するには不十分である（例えば図５参照）。それ故、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーとメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）の１つまたは複数のコピーとをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。
【０１８６】
本開示の経路または回路のいずれかにより消費されることになるプロピオン酸については、該プロピオン酸は、まず、プロピオニルＣｏＡに活性化されなければならない。この活性化は、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＰｒｐＥ）またはプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）のどちらかにより触媒され得る。それ故、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＰｒｐＥ）の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）の１つまたは複数のコピーをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＰｒｐＥ）の１つまたは複数のコピーとプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーとをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオニル−Ｃｏトランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）の１つまたは複数のコピーと、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーと、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）の１つまたは複数のコピーとをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）の１つまたは複数のコピーとプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーとをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）の１つまたは複数のコピーと、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の１つまたは複数のコピーと、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）の１つまたは複数のコピーとをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。
【０１８７】
ＰｒｐＥは、プロピオネートおよび遊離ＣｏＡを不可逆的なＡＴＰ依存性の形でプロピオニルＣｏＡに変換し、その結果、ＡＭＰおよびＰＰｉ（ピロホスフェート）が放出される。ＰｒｐＥは、例えば図９Ａに示す通り、活性部位リシンの翻訳後改変により不活性化され得る。大腸菌ではタンパク質リシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｐｋａ）がＰｒｐＥのプロピオニル化を行う。酵素ＣｏｂＢは、ＰｒｐＥＰｒを脱プロピオニル化し、その結果、不活性化が可逆的になる。しかし、この不活性化経路を、ｐｋａ遺伝子の欠失により完全に消失させることができる。本明細書のここおよび他の箇所に記載のいずれの実施形態においても、遺伝子操作細菌は、ＰｒｐＥの不活性化を防止するためにｐｋａの欠失（Δｐｋａ）を含む。いくつかの実施形態では、ｐｋａの欠失は、ＰｒｐＥおよび下流の異化作用酵素のより大きい活性をもたらす。
【０１８８】
Ｐｃｔは、可逆的反応でプロピオネートおよびアセチル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡおよびアセテートに変換する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば図９Ｂに示す通り、プロピオネートからのプロピオニルＣｏＡの生成のためのＰｃｔをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰＨＡおよび／またはＭＭＣＡおよび／または２ＭＣ経路カセット（複数可）のうちの１つまたは複数の構成要素との組合せで、またはそのような構成要素として、Ｐｃｔを含む。
【０１８９】
細菌の場合、ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣおよびＰｒｐＤは、プロピオニルＣｏＡをスクシネートおよびピルベートに変換することができ、ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣ、ＰｒｐＤおよびＰｒｐＥは、プロピオネートをスクシネートおよびピルベートに変換することができる。具体的には、プロピオン酸−ＣｏＡリガーゼであるＰｒｐＥが、プロピオネートをプロピオニルＣｏＡに変換する。次いで、２−メチルクエン酸シンターゼであるＰｒｐＣが、プロピオニルＣｏＡを２−メチルシトレートに変換する。次いで、２−メチルクエン酸デヒドロゲナーゼであるＰｒｐＤが、２−メチルシトレートを２−メチルイソシトレートに変換し、２−メチルイソクエン酸リアーゼであるＰｒｐＢが、２−メチルイソシトレートをスクシネートおよびピルベートに変換する（図１９参照）。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子配列（複数可）を含む：ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣおよびＰｒｐＤ。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子配列（複数可）を含む：ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣ、ＰｒｐＤおよびＰｒｐＥ。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のいずれかをコードする遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを含む：ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣおよびＰｒｐＤならびにこれらの組合せ。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のいずれかをコードする遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを含む：ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣ、ＰｒｐＤおよびＰｒｐＥならびにこれらの組合せ。
【０１９０】
他の細菌経路、ポリヒドロキシアルカノエート経路では、プロピオネートは、ＰｒｐＥによりプロピオニル−ＣｏＡに変換される。次いで、プロピオニル−ＣｏＡは、ＰｈａＡにより３−ケト−バレリル−ＣｏＡに変換され、次いでこの３−ケト−バレリル−ＣｏＡがＰｈａＢにより３−ヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡに変換される。最後に、ＰｈａＣが３−ヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡをＰＨＶに変換する（図１０参照）。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子配列（複数可）を含む：ＰｒｐＥ、ＰｈａＡおよびＰｈａＢ。
【０１９１】
本開示は、プロピオネート異化に関連する疾患を治療するためにプロピオネートを異化するための、ヒトメチルマロニル−ＣｏＡ経路の機能活性を模倣する遺伝子回路の設計を含む。例えば、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを発現させるように回路を設計することができる（図１５）。この回路では、ＰｒｐＥがプロピオネートをプロピオニル−ＣｏＡに変換し、次いでこのプロピオニル−ＣｏＡがＰｃｃＢおよびＡｃｃＡ１によりＤ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。次いで、Ｄ−メチルマロニル−ＣｏＡがＭｍｃＥによりＬ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換され、ＭｕｔＡおよびＭｕｔＢがＬ−メチルマロニルＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡに変換する。あるいは、これらの遺伝子を、図１５に示す通り、２つの回路、すなわち、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢに分割することができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡ、およびｍｕｔＢから選択される遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、次のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子配列（複数可）を含む：ＰｒｐＥ、ＰｃｃＢ、ＡｃｃＡ１、ＭｍｃＥ、ＭｕｔＡ、およびＭｕｔＢ。他の実施形態では、本開示は、プロピオネート異化に関連する疾患を治療するためにプロピオネートを異化するための、細菌における２−メチルシトレートサイクル経路を構成する遺伝子回路、例えば、ｐｒｐＢＣＤＥ回路（図２０）またはポリヒドロキシアルカノエート経路、例えばｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＡ遺伝子（図１０Ｃ）の設計を含む。
【０１９２】
本開示は、ＭａｔＢを含む遺伝子回路の設計を含む。マロニル−補酵素Ａ（マロニル−ＣｏＡ）シンテターゼ（ＭａｔＢ）は、ＡＭＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質ファミリーに属する。これらの酵素は、ＡＴＰおよび有機酸がピロホスフェートの放出に伴ってまずアシル−ＡＭＰに変換され、それに補酵素Ａの結合、ＡＭＰの置換、そしてアシル−ＣｏＡ産物の放出が続く、ピンポン機構による有機酸のアセチル−ＣｏＡチオエステルへの変換を触媒する（例えば、Ｃｒｏｓｂｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＭａｔＢ）ｏｆ  Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年９月、７８巻、１８号、６６１９〜６６２９頁、およびその中の参考文献参照）。ＭａｔＢは、マロネートを、この機構に従って２ステップで、マロニル−ＡＭＰ中間体経由でマロニル−ＣｏＡに変換し、同様にメチルマロネートをメチルマロニル−ＣｏＡにも変換する。
【０１９３】
ＭａｔＢを含む遺伝子回路は、メチルマロン酸血症の治療に有用であり、蓄積したメチルマロン酸のメチルマロニルＣｏＡへの変換を可能にする。メチルマロニルＣｏＡに変換されると、異化がＭＭＣＡ経路に沿って（例えば、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢにより）進行し得る。あるいは、メチルマロニルＣｏＡをプロピオニルＣｏＡに変換することができる。この反応は、本開示の遺伝子回路によってコードされているＡｃｃＡ１／ＰｃｃＢ複合体により触媒され得る。ＡｃｃＡ１／ＰｃｃＢ複合体は、本明細書に記載の通り、プロピオニルＣｏＡのメチルマロニルＣｏＡへの可逆的変換を触媒する。メチルマロニルＣｏＡがプロピオニルＣｏＡに変換されると、本明細書に記載の遺伝子回路、例えば、ＰＨＡ、ＭＭＣＡおよび／または２ＭＣ回路によりコードされているいずれのプロピオネート異化酵素も、不活性産物をもたらす触媒反応に適している。したがって、本明細書のここおよび他の箇所に記載のいずれの実施形態においても、操作された細菌は、ＭａｔＢをコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含み得る。
【０１９４】
本開示のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットは、ＭａｔＢ、例えば、ロドシュードモナス・パルストリスに由来するＭａｔＢを含む。本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、例えば、ロドシュードモナス・パルストリスに由来するＭａｔＢを含む、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。非限定的な例では、ＭａｔＢを含む１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作細菌は、メチルマロン酸血症、またはメチルマロン酸血症およびプロピオン酸血症の治療に適している。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢをコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、本明細書に記載の１つまたは複数のＭＭＣＡ遺伝子カセットとを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢをコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、本明細書に記載の１つまたは複数のＭＭＣＡ遺伝子またはＭＭＣＡ遺伝子カセットとを含む。いくつかの実施形態では、ＭａｔＢは、別個のプロモーターにより駆動され、別個のプラスミドまたは染色体組込み部位上にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含むオペロンのＭａｔＢ部分。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢのうちの１つまたは複数をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌によりコードされている遺伝子回路は、ＭａｔＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢのうちの１つまたは複数をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌によりコードされている遺伝子回路は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢ、ならびにｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢ、ならびにｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ、ならびにさらにｐｒｐＥをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＭａｔＢ、Ａｃｃ１ＡおよびＰｃｃＢ、ならびにｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢをコードし、さらにＰＨＡおよび／または２ＭＣ経路回路をコードし、さらにｐｒｐＥを含んでもよく、または含まなくてもよい。これらの遺伝子を本明細書に記載の通り１つまたは複数の遺伝子カセットに構成することができる。１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含みかつ例示的オペロンまたは遺伝子カセット（複数可）を含む遺伝子操作細菌の非限定的な例を図２１Ｇおよび図２１Ｆに示す。他の非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子カセットを次のように構成することができる：ＭａｔＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ；単独での、またはＰＰＨＡおよび／もしくは２ＭＣ経路カセットとの組合せでの、ＭａｔＢ−Ａｃｃ１Ａ−ＰｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ；単独での、またはＰＰＨＡおよび／もしくは２ＭＣ経路カセットとの組合せでの、ＰｒｐＥ−ＭａｔＢ−Ａｃｃ１Ａ−ＰｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ。
【０１９８】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡ異化速度を上昇させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるプロピオネートのレベルを低下させる。他の実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるプロピオン酸のレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるプロピオニルＣｏＡのレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるメチルマロニルＣｏＡのレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるメチルマロン酸のレベルを低下させる。
【０１９９】
他の実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるメチルマロニルＣｏＡのレベルを、細胞におけるその対応するプロピオニルＣｏＡのレベルと比較して上昇させる。他の実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるスクシネートのレベルを、細胞におけるその対応するメチルマロニルＣｏＡのレベルと比較して上昇させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを、細胞におけるスクシネートまたはスクシニルＣｏＡのレベルと比較して低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、細胞におけるスクシネートまたはスクシニルＣｏＡのレベルを、細胞におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルと比較して上昇させる。
【０２００】
プロピオネートの異化に関与する酵素を、プロピオネートの異化を増進するように細胞において発現させるまたは改変することができる。具体的には、異種プロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセットが、操作された細菌細胞において発現した場合、前記細菌細胞は、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より、多くのプロピオネートおよび／もしくはプロピオニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡに変換し、または前記遺伝子または遺伝子カセットが発現した場合、多くのメチルマロニルＣｏＡをスクシネートもしくはスクシニルＣｏＡに変換する。したがって、異種プロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセットを発現する遺伝子操作細菌は、プロピオネートの異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症（ＰＡ）およびメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）を治療するために、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡを異化することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、１つまたは複数のプロピオン酸血症および／またはメチルマロン酸血症バイオマーカーのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌により発現されるプロピオネート異化遺伝子カセットは、１つまたは複数のプロピオン酸血症および／またはメチルマロン酸血症バイオマーカーのレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、例えばプロピオネートおよび／またはメチルマロネートのレベルが上昇している哺乳動物対象において、血液および／または尿中のプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比を低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、例えばプロピオネートおよび／またはメチルマロネートのレベルが上昇している哺乳動物対象において、血液および／または尿中の２−メチルシトレートのレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、例えばプロピオネートおよび／またはメチルマロネートのレベルが上昇している哺乳動物対象において、血液および／または尿中のプロピオニルグリシンのレベルを低下させる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットの発現は、例えばプロピオネートおよび／またはメチルマロネートのレベルが上昇している哺乳動物対象において、血液および／または尿中のチグリルグリシンのレベルを低下させる。
【０２０２】
一実施形態では、細菌細胞は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む。
【０２０３】
一実施形態では、操作された細菌細胞は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットを含む細菌細胞を提供する。一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる細菌種に由来する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットを含む。他の実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする天然遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含む。さらに他の実施形態では、細菌細胞は、少なくとも１つの天然のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの天然遺伝子または遺伝子カセットと、異なる生物、例えば異なる細菌種に由来する１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットの少なくとも１つのコピーとを含む。一実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子または遺伝子カセットの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子カセットは、１つまたは複数の天然および１つまたは複数の非天然または異種遺伝子を含み得る。
【０２０４】
複数の異なるプロピオネート異化酵素が当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素は、細菌種に由来する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素は、非細菌種に由来するプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットによりコードされる。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素は、真核生物種、例えば、酵母種または植物種に由来する遺伝子によりコードされる。一実施形態では、プロピオネート異化酵素は、ヒトに由来する遺伝子によりコードされる。一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、以下のものを含むがこれらに限定されない属または種の生物に由来する：アシネトバクター属（Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バシラス属、バクテロイデス属、バフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バークホリデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、クロノバクター属（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌属、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、リステリア属、マクロコッカス属（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナカムレラ属（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ナソニア属（Ｎａｓｏｎｉａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、ペクトバクテリウム属（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、サッカロミセス属、サルモネラ属、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、スタフィロコッカス属およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、例えば、アシネトバクター・レイディオレジステンス（Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・コアグランス、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、��フィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、バークホリデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、シトロバクター・ヤンガエ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ）、シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ブチリカム、コリネバクテリウム・アウリムコスム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ）、コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ）、クロノバクター・サカザキ（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、クロノバクター・ツリセンシス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・カンセロゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、火傷病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖａｒａ）、エルウィニア・ピリフォリアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａｅ）、エルウィニア・タスマニエンシス（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティス、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）、大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｅｎｓｉｓ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、マクロコッカス・カセオリティカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ナカムレラ・マルチパーティタ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔ���）、キョウソヤドリコバチ（Ｎａｓｏｎｉａ  ｖｉｔｉｐｅｎｎｉｓ）、ノストック・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、軟腐病菌（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サイクロバクター・アルクティカス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｒｔｉｃｕｓ）、サイクロバクター・クリオハロンティス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｏｈａｌｏｌｅｎｔｉｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、サッカロミセス・ブラウディ、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルシナ・ベントリクリ（Ｓａｒｃｉｎａ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｒｕｓ）、スタフィロコッカス・カピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、エルシニア・エンテロコチリカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・モラレティイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）、エルシニア・ローデイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｏｈｄｅｉ）、およびエルシニア・アルドバーエ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ａｌｄｏｖａｅ）。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ｐｒｐＥをコードする遺伝子は、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ａｃｃＡ１をコードする遺伝子は、ストレプトマイセス・セリカラーに由来する。いくつかの実施形態では、ｐｃｃＢをコードする遺伝子は、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ｍｍｃＥをコードする遺伝子は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する。いくつかの実施形態では、ｍｕｔＡをコードする遺伝子は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する。いくつかの実施形態では、ｍｕｔＢをコードする遺伝子は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＢをコードする遺伝子は、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＣをコードする遺伝子は、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＤをコードする遺伝子は、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｈａＢをコードする遺伝子は、アシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｈａＣをコードする遺伝子は、アシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｈａＡをコードする遺伝子は、アシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９に由来する。
【０２０６】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、操作された細菌細胞における使用のためにコドン最適化されたものである。一実施形態では、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットは、大腸菌における使用のためにコドン最適化されたものである。少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が、操作された細菌細胞において発現した場合、細菌細胞は、同じ条件（例えば、培養または環境条件）下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのプロピオネートまたはプロピオニルＣｏＡを異化する。したがって、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作細菌を用いて、プロピオネートの異化に関連する疾患、例えば、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、またはビタミンＢ１２欠乏症を治療するために過剰なプロピオネート、プロピオン酸および／またはプロピオニルＣｏＡを異化することができる。
【０２０７】
本開示は、プロピオネート異化酵素の機能性断片またはプロピオネート異化酵素（複数可）の機能性変異体をコードする遺伝子および遺伝子カセットをさらに含む。本明細書で使用する場合、プロピオネート異化酵素の「その機能性断片」または「その機能性変異体」という用語は、該断片または変異体が由来した野生型プロピオネート異化酵素と同様の質の生物学的活性を有するエレメントに関する。例えば、突然変異プロピオネート異化酵素の機能性断片または機能性変異体は、該機能性断片または機能性変異体が由来したプロピオネート異化酵素と本質的に同じプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡ異化能力を保持するものである。例えば、プロピオネート異化酵素活性を有するポリペプチドをＮ末端またはＣ末端で切断し、本明細書で示す例示的アッセイを含む当業者に公知のアッセイを用いてプロピオネート異化酵素活性の滞留を評価することができる。一実施形態では、操作された細菌細胞は、プロピオネート異化酵素機能性変異体をコードする異種遺伝子を含む。他の実施形態では、操作された細菌細胞は、プロピオネート異化酵素機能性断片をコードする異種遺伝子または遺伝子カセットを含む。
【０２０８】
プロピオネート異化酵素、プロピオネート異化酵素機能性変異体、またはプロピオネート異化酵素機能性断片の活性を試験するためのアッセイは、当業者に周知である。例えば、プロピオネート異化は、内因性プロピオネート異化酵素活性を欠く操作された細菌細胞において、タンパク質、その機能性変異体または断片を発現させることにより評価することができる。他の例では、本明細書に記載の通り、プロピオネートを培地に添加し、操作された細菌菌株と対応する野生型株とを培地からのプロピオネート枯渇に関して比較することができる。質量分析またはガスクロマトグラフィーを用いてプロピオネートレベルを評価することができる。例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ充填カラムを備えているＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＸＬガスクロマトグラフに試料を注入し、製造業者の指示に従って分析を行うことができる（例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉ（１９９８）Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ８５６Ｂ：２０１４年参照）。あるいは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてプロピオネートレベルを決定することができる。例えば、コンピュータ制御Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムは、モデル６００クウォータナリーソルベント送液システム、およびモデル９９６フォトダイオードアレイ検出器を装備しており、試料の成分をＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｘ７．８ｍｍ）有機酸分析カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分解することができる（例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら、２００３年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻（９号）：２８０２〜２８１０頁参照）。
【０２０９】
哺乳動物の場合、特定のプロピオネート副産物または代謝物、例えば、プロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン比、２−メチル−シトレート、プロピオニルグリシン、および／またはチグリルグリシンのレベルを、プロピオネートレベルに加えて、本明細書に記載の通り質量スペクトルにより測定することができる。
【０２１０】
本明細書で使用する場合、「相同性」も含めて、「パーセント（％）配列同一性」または「パーセント（％）同一性」という用語は、配列をアラインし、最大配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義する。比較のための最適な配列アランメントは、手作業でのほかに、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年、Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２巻、４８２頁の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻、４４３頁の局所相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻、２４４４頁の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、生成することができる。
【０２１１】
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸をその配列中に含むプロピオネート異化酵素をコードする遺伝子を含む。本明細書に記載の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列を含む。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸のものと類似している化学的および／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸による第１のアミノ酸の置換を意味する。保存的置換は、以下の群内のあるアミノ酸の別のものによる置換を含む：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、ＳおよびＴ。同様に、ある塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸での置換（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間の置換）、ある酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸での置換（例えば、ＡｓｐとＧｌｕ間の置換）、ある中性アミノ酸の別の中性アミノ酸での置換（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌの間の置換）が企図される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素（複数可）をコードする遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）に突然変異を起こさせ、活性増加を示す突然変異体を選択し、プロピオネート異化酵素（複数可）をコードする突然変異を起こした遺伝子（複数可）または突然変異を起こした遺伝子カセット（複数可）を単離し、細菌細胞に挿入する。一実施形態では、生じる自然突然変異体であって、唯一の炭素源としてプロピオネートを用いて細菌を増殖させる自然突然変異についてスクリーニングすることができ、そのような自然突然変異体を選択することができる。本明細書に記載の改変を含む遺伝子（複数可）は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０２１３】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＥである。ｐｒｐＥは、プロピオン酸−ＣｏＡリガーゼであるＰｒｐＥをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号２５の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子は、配列番号７３の配列からなる。
【０２１４】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＣである。ｐｒｐＣは、２−メチルクエン酸シンテターゼであるＰｒｐＣをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号５７の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＣ遺伝子は、配列番号７６の配列からなる。
【０２１５】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＤである。ｐｒｐＤは、２−メチルクエン酸デヒドロゲナーゼであるＰｒｐＤをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号５８の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＤ遺伝子は、配列番号７９の配列からなる。
【０２１６】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＢである。ｐｒｐＢは、２−メチルイソクエン酸リアーゼであるＰｒｐＢをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号５６の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＢ遺伝子は、配列番号８２の配列からなる。
【０２１７】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｈａＢである。ｐｈａＢは、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼであるＰｈａＢをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＢ遺伝子は、配列番号２６からなる。
【０２１８】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｈａＣである。ｐｈａＣは、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼであるＰｈａＣをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号２７からなる。
【０２１９】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｈａＡである。ｐｈａＡは、ベータ−ケトチオラーゼであるＰｈａＡをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＡ遺伝子は、配列番号２８をコードする配列からなる。
【０２２０】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｃｃＢである。ｐｃｃＢは、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼであるＰｃｃＢをコードする。したがって、一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号３９の配列からなる。
【０２２１】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｃｃＢである。したがって、一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｃｃＢ遺伝子は、配列番号９６の配列からなる。
【０２２２】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ａｃｃＡ１である。ａｃｃＡ１は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼであるＡｃｃＡ１をコードする。したがって、一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８の配列を含む。さらに他の実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号３８の配列からなる。
【０２２３】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ａｃｃＡ１である。ａｃｃＡ１は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼであるＡｃｃＡ１をコードする。したがって、一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４の配列を含む。さらに他の実施形態では、ａｃｃＡ１遺伝子は、配列番号１０４の配列からなる。
【０２２４】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｍｃＥである。ｍｍｃＥは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼであるＭｍｃＥをコードする。したがって、一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号３２の配列からなる。
【０２２５】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｍｃＥである。したがって、一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｍｃＥ遺伝子は、配列番号１０６の配列からなる。
【０２２６】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｕｔＡである。ｍｕｔＡは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ小サブユニットであるＭｕｔＡをコードする。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号３３の配列からなる。
【０２２７】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｕｔＡである。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号１１０の配列からなる。
【０２２８】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｕｔＢである。ｍｕｔＢは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ大サブユニットであるＭｕｔＢをコードする。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号３４の配列からなる。
【０２２９】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｕｔＢである。ｍｕｔＢは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ大サブユニットであるＭｕｔＢをコードする。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号１１２の配列からなる。
【０２３０】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＥである。一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｒｐＥである。一実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＥは、配列番号７１をコードする配列からなる。
【０２３１】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｈａＡである。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＡは、配列番号１７５と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＡは、配列番号１３７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＡは、配列番号１３７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＡは、配列番号１３７をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＡは、配列番号１３７をコードする配列からなる。
【０２３２】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｈａＢである。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＢは、配列番号１３５をコードする配列からなる。
【０２３３】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｈａＣである。したがって、一実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｈａＣは、配列番号１３６をコードする配列からなる。
【０２３４】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｍｍｃＥである。したがって、一実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｍｃＥは、配列番号１３２をコードする配列からなる。
【０２３５】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｍｕｔＡである。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＡは、配列番号１３３をコードする配列からなる。
【０２３６】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｍｕｔＢである。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｕｔＢは、配列番号１３４をコードする配列からなる。
【０２３７】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ａｃｃＡである。したがって、一実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ａｃｃＡは、配列番号１３０をコードする配列からなる。
【０２３８】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｃｃＢである。したがって、一実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｃｃＢは、配列番号１３１をコードする配列からなる。
【０２３９】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｒｐＣである。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＣは、配列番号７４をコードする配列からなる。
【０２４０】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｒｐＤである。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＤは、配列番号７７をコードする配列からなる。
【０２４１】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ＭａｔＢである。ＭａｔＢは、マロニル−補酵素Ａ（マロニル−ＣｏＡ）シンテターゼ（ＭａｔＢ）をコードする。したがって、一実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１の配列を含む。さらに他の実施形態では、ＭａｔＢ遺伝子は、配列番号１４１の配列からなる。
【０２４２】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｍａｔＢである。したがって、一実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍａｔＢは、配列番号１４０をコードするの配列からなる。
【０２４３】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ｐｒｐＢである。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＢは、配列番号８０をコードする配列からなる。
【０２４４】
一実施形態では、プロピオネートおよび／またはその代謝物のレベルを有効に低下させるプロピオネート異化酵素の任意の組合せを用いることができる。一実施形態では、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを有効に低下させるプロピオネート異化酵素の任意の組合せを用いることができる。一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＢＣＤである。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＢＣＤＥである。４つすべての異種遺伝子、例えば、ｐｒｐＢＣＤＥの使用は必須ではないが、その使用により、過剰なプロピオネートをスクシネートおよびピルベートに変換して、クレブスサイクルに供給すること、および細菌にそれらの増殖を増加させることにより恩恵をもたらすことが可能となる。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢである。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第１の誘導性プロモーターの制御下のｐｒｐＥ、ｐｃｃＢおよびａｃｃＡ１、ならびに第２の誘導性プロモーターの制御下のｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢである。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡである。
【０２４５】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＢＣＤを含む。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号１３８の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤオペロンは、配列番号８３または配列番号８４の配列からなる。
【０２４６】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＢＣＤＥを含む。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５と少なくとも約８０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５と少なくとも約９５％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号５５の配列からなる。他の実施形態では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンは、配列番号９３または配列番号９４の配列からなる。
【０２４７】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｈａＢＣＡを含む。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９の配列を含む。他の実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１３９の配列からなる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＥおよびｐｈａＢＣＡを含む。
【０２４８】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｈａＢＣＡを含む。したがって、一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２の配列を含む。他の実施形態では、ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号１０２の配列からなる。一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＥおよびｐｈａＢＣＡを含む。
【０２４９】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡを含む。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンは、配列番号２４の配列からなる。
【０２５０】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを含む。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せと少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せと少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せと少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せの配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３７および３１の組合せの配列からなる。
【０２５１】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｐｒｐＥ、ｐｃｃＢおよびａｃｃＡ１を含む。したがって、一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７の配列を含む。他の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１オペロンは、配列番号３７の配列からなる。
【０２５２】
一実施形態では、プロピオネート異化遺伝子カセットは、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢを含む。したがって、一実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せと少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せと少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せと少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せの配列を含む。他の実施形態では、ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢオペロンは、配列番号３１の組合せの配列からなる。
【０２５３】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第１のプロモーターに直接的に作動可能に連結している。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第１のプロモーターに間接的に作動可能に連結している。一実施形態では、プロモーターは、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子と天然では作動可能に連結していない。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で発現する。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、外因性環境条件により直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現する。一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、低酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現し、前記少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現は、哺乳動物消化管の環境などの、低酸素または嫌気的環境下で活性化される。誘導性プロモーターは、より詳細に下で述べる。
【０２５５】
少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞におけるプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置し、異なる細菌種に由来する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が細菌細胞の染色体内に位置する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素の発現を増加させ、それによりプロピオネート、プロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロン酸、および／またはメチルマロニルＣｏＡの異化を増加させるのに有用であり得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現する少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む操作された細菌細胞は、プロピオネートの異種取込み輸送体の非存在下、かつプロピオネートの天然取込み輸送体の追加のコピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現する同じ遺伝子を含む操作された細菌細胞と比較して、プロピオネート異化を増加させもせず、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させもしない。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化の律速ステップがプロピオネート異化酵素の発現ではなく、むしろプロピオネートまたはプロピオニルＣｏＡの利用可能性であるということを、驚くべきことに発見した。したがって、いくつかの実施形態では、細胞へのプロピオネート輸送を増加させ、それによりプロピオネート異化を増進することが有利であり得る。さらに、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む低コピープラスミドを組み合わせて用いることは、操作された細菌細胞にプロピオネートの輸送体を組み込むいくつかの実施形態では、高度なプロピオネート異化を維持しながらプロピオネート異化酵素の発現の安定性を向上させるために、および形質転換細菌に対する負の選択圧を低下させるために、さらに有利であり得る。代替実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体を高コピープラスミドと組み合わせて用いる。
【０２５８】
ＮＡＤ依存性デアシラーゼであるＣｏｂＢによるプロピオニル化ＰｒｐＥ（ＰｒｐＥＰｒ）の脱アシル化により、細菌細胞がプロピオネートを異化することが可能となる。したがって、一実施形態では、操作された細菌細胞が異種ＰｒｐＥ酵素を発現する場合、操作された細菌細胞は、異種ｃｏｂＢ遺伝子（配列番号１１４）をさらに含み得る。一実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｃｏｂＢ遺伝子は、配列番号１１４の配列からなる。
【０２５９】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ＣｏｂＢである。したがって、一実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３と少なくとも約１１３％の同一性を有する。一実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ＣｏｂＢは、配列番号１１３をコードする配列からなる。
【０２６０】
他の実施形態では、異種ｃｏｂＢ遺伝子を含む操作された細菌細胞は、ｐｋａ遺伝子における遺伝子改変をさらに含む。タンパク質リシンアセチルトランスフェラーゼであるＰｋａは、プロピオニル化形態のＰｒｐＥ（ｐｒｐＥＰｒ）にプロピオネートを代謝できなくさせる。したがって、ｐｋａ遺伝子（配列番号１１６）を機能的に不活性にするｐｋａ遺伝子の遺伝子改変は、プロピオネートを異化する細菌細胞の能力を増強する。
【０２６１】
プロピオネートの輸送体（取込み輸送体）
細菌細胞へのプロピオネートの取込みは、一般的には受動拡散により起こる（例えば、Ｋｅｌｌら、１９８１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、９９８１〜９９８８頁参照）。しかし、プロピオネートの能動移入は、当業者に周知のタンパク質によっても媒介される。例えば、ＭｃｔＣ（モノカルボン酸輸送体）という名のコリネバクテリウム・グルタミクムにおけるプロピオネートのアップデートのための細菌輸送システムは公知である（例えば、Ｊｏｌｋｖｅｒら、２００９年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９１巻（３号）：９４０〜９４８頁参照）。ビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種に由来するｐｕｔＰ＿６プロピオネート輸送体（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａ０Ａ０２４ＱＧＵ１）も同定されている。
【０２６２】
プロピオネート輸送体、例えば、プロピオネート取込み輸送体を、細菌においてその細胞へのプロピオネート輸送を増進させるために発現させるまたは改変することができる。具体的には、プロピオネートの輸送体（取込み輸送体）が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸送体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのプロピオネートを細胞に移入する。したがって、プロピオネートの輸送体をコードする異種遺伝子を含む遺伝子操作細菌を用いてプロピオネートを細菌に移入することができ、その結果、生物において発現するプロピオネート異化酵素をコードする任意の遺伝子を用いて、有機酸尿症（ＰＡおよびＭＭＡを含む）およびビタミンＢ１２欠乏症などの、プロピオネートの異化に関連する疾患を治療することができる。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする異種遺伝子を含む。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体とコードする異種遺伝子と、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む。
【０２６３】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結したプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、プロピオネート輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む、細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結したプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む細菌細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、第２のプロモーターに作動可能に連結したプロピオネートの      をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む、細菌細胞を提供する。一実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターの別個のコピーである。他の実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、異なるプロモーターである。
【０２６４】
一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる細菌種に由来するプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は、改変されない。他の実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子の複数のコピーを含む。さらに他の実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの天然取込み輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー、ならびに異なる細菌種に由来するプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の複数のコピーを含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体は、バシラス属、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌属、シュードモナス属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、枯草菌、ジェジュニ菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス、大腸菌、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、緑膿菌、ネズミチフス菌、ビルジバチルス属、または黄色ブドウ球菌を含むがこれらに限定されない、細菌属または菌種に由来するプロピオネート遺伝子の輸送体によりコードされる。いくつかの実施形態において、細菌は、ビルジバチルス属である。いくつかの実施形態において、細菌は、コリネバクテリウム属である。一実施形態では、細菌は、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。他の実施形態において、細菌は、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）である。他の実施形態において、細菌は、Ｃ．エフィシエンスである。他の実施形態では、細菌は、Ｓ．セリカラー（Ｓ．ｃｅｏｌｉｃｏｌｏｒ）である。他の実施形態において、細菌は、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）である。他の実施形態において、細菌は、Ｎ．ファルシニカ（Ｎ．ｆａｒｃｉｎｉｃａ）である。他の実施形態では、細菌は、大腸菌である。他の実施形態において、細菌は、枯草菌である。
【０２６６】
本開示は、プロピオネートの輸送体の機能性断片またはプロピオネートの輸送体の機能性変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用する場合、プロピオネートの輸送体の「その機能性断片」または「その機能性変異体」という用語は、該断片または変異体が由来したプロピオネートの野生型取込み輸送体と同様の質の生物学的活性を有するエレメントに関する。例えば、プロピオネートタンパク質の突然変異取込み輸送体の機能性断片または機能性変異体は、該機能性断片または機能性変異体が由来した取込み輸送体タンパク質が細菌細胞にプロピオネートを移入するのと本質的に同じ移入能力を保持するものである。一実施形態では、操作された細菌細胞は、プロピオネートの輸送体の機能性断片をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。他の実施形態では、操作された細菌細胞は、プロピオネートの輸送体の機能性変異体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。
【０２６７】
プロピオネートの輸送体、プロピオネート機能性変異体の輸送体、またはプロピオネート機能性断片の輸送体の活性を試験するためのアッセイは、当業者に周知である。例えば、プロピオネート移入は、内因性プロピオネート取込み輸送体を欠く操作された細菌細胞において、タンパク質、その機能性変異体または断片を発現させることにより評価することができる。プロピオネート移入は、質量分析を用いて評価することもできる。プロピオネート移入は、ガスクロマトグラフィーを用いて表すこともできる。例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ充填カラムを備えているＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＸＬガスクロマトグラフに試料を注入することができ、製造業者の指示に従って分析を行うことができる（例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉ（１９９８）Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ８５６Ｂ：２０１４年参照）。あるいは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて試料をプロピオネート移入について分析することができる。例えば、コンピュータ制御Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムは、モデル６００クウォータナリーソルベント送液システム、およびモデル９９６フォトダイオードアレイ検出器を装備しており、試料の成分をＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｘ７．８ｍｍ）有機酸分析カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分解することができる（例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら、２００３年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻（９号）：２８０２〜２８１０頁参照）。
【０２６８】
一実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする遺伝子は、宿主生物における使用のためにコドン最適化されたものである。一実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする遺伝子は、大腸菌における使用のためにコドン最適化されたものである。
【０２６９】
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸をその配列中に含むプロピオネートの輸送体をコードする遺伝子も含む。本明細書に記載の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列を含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子に突然変異を起こさせ、プロピオネート輸送体増加を示す突然変異体を選択し、プロピオネートの輸送体をコードする、突然変異を起こした少なくとも１つの遺伝子を単離し、細菌細胞に挿入する。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子に突然変異を起こさせ、プロピオネート輸送体減少を示す突然変異体を選択し、プロピオネートの輸送体をコードする、突然変異を起こした少なくとも１つの遺伝子を単離し、細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の取込み輸送体改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０２７１】
一実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、ＭｃｔＣである。一実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｍｃｔＣ遺伝子は、配列番号８８の配列からなる。
【０２７２】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ＭｃｔＣである。したがって、一実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７と少なくとも約８７％の同一性を有する。一実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ＭｃｔＣは、配列番号８７をコードする配列からなる。
【０２７３】
他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、ＰｕｔＰ＿６である。一実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｐｕｔＰ＿６遺伝子は、配列番号９０の配列からなる。
【０２７４】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ＰｕｔＰ＿６である。したがって、一実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ＰｕｔＰ＿６は、配列番号８９をコードする配列からなる。
【０２７５】
他のプロピオネート取込み輸送体遺伝子は、当業者に公知である。例えば、Ｊｏｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００９年、１９１巻（３号）：９４０〜９４８頁参照。一実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｃ．グルタミクムに由来するｍｃｔＢＣ遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、ジフテリア菌に由来するｄｉｐ０７８０およびｄｉｐ０７９１遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｃ．エフィシエンスに由来するｃｅ０９０９およびｃｅ０９１０遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｃ．エフィシエンスに由来するｃｅ１０９１およびｃｅ１０９２遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｓ．セリカラーに由来するｓｃｏ１８２２およびｓｃｏ１８２３遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｓ．セリカラーに由来するｓｃｏ１２１８およびｓｃｏ１２１９遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｓ．セリカラーに由来するｃｅ１０９１およびｓｃｏ５８２７遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、スメグマ菌に由来するｍ＿５１６０、ｍ＿５１６１、ｍ＿５１６５およびｍ＿５１６６遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、Ｎ．ファルシニカに由来するｎｆａ  １７９３０、ｎｆａ  １７９４０、ｎｆａ  １７９５０およびｎｆａ  １７９６０遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、大腸菌に由来するａｃｔＰおよびｙｊｃＨ遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体は、枯草菌に由来するｙｗｃＢおよびｙｗｃＡ遺伝子を含む。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、第１のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第２のプロモーターに直接的に作動可能に連結している。他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第２のプロモーターに間接的に作動可能に連結している。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体およびプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子と、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子とをコードする、各々の遺伝子の発現は、異なるプロモーターにより制御される。
【０２７８】
一実施形態では、プロモーターは、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子と天然では作動可能に連結していない。いくつかの実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、その天然プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、誘導性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、その天然プロモーターより強いプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、構成的プロモーターにより制御される。
【０２７９】
他の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、より詳細に下で述べる。
【０２８０】
一実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来するプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置し、異なる細菌種に由来するプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、プロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来するプロピオネートの輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞の染色体内に位置する。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、細菌細胞における取込み輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は改変されず、天然取込み輸送体の１つまたは複数の追加のコピーがゲノムに挿入される。一実施形態では、ゲノムに挿入される天然取込み輸送体の１つまたは複数の追加のコピーは、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのプロピオネート異化酵素の発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代替実施形態では、取込み輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は改変されず、異なる細菌菌種に由来する取込み輸送体の１つまたは複数の追加のコピーが細菌細胞のゲノムに挿入される。一実施形態では、細菌細胞のゲノムに挿入される取込み輸送体の１つまたは複数の追加のコピーは、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０２８２】
一実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、取込み輸送体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より１０％多いプロピオネートを細菌細胞に移入する。他の実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、取込み輸送体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多いプロピオネートを細菌細胞に移入する。さらに他の実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、取込み輸送体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より２倍多いプロピオネートを細胞に移入する。さらに他の実施形態では、プロピオネートの取込み輸送体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、取込み輸送体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍多いプロピオネートを細胞に移入する。
【０２８３】
スクシネートの輸出体
細菌におけるスクシネート輸出は、通常は嫌気的条件下で能動的である。スクシネートの輸出は、当業者に周知のタンパク質により媒介される。例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムにおけるスクシネート輸出体は、ＳｕｃＥ１として公知である。ＳｕｃＥ１は、アスパラギン酸：アラニン交換輸送体（ＡＡＥ）ファミリーに属する膜タンパク質である（例えば、Ｆｕｋｕｉら、２０１１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４巻（１号）：２５〜３４頁参照）。大腸菌に由来するＤｃｕＣスクシネート輸出体も同定されている（例えば、Ｃｈｅｎｇら、２０１３年、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．、２０１３年：ＩＤ  ５３８７９０参照）。
【０２８４】
スクシネート輸送体、例えば、スクシネート輸出体を、細菌においてその細胞へのスクシネート輸送を増進させるために発現させるまたは改変することができる。具体的には、スクシネートの輸出体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸出体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのスクシネートを細胞から輸出する。一実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする異種遺伝子を含む。一実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする異種遺伝子と、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットとを含む。
【０２８５】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットと、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む、細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第１のプロモーターに作動可能に連結しており、スクシネートの輸出体をコードする異種遺伝子は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターの別個のコピーである。他の実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、異なるプロモーターである。
【０２８６】
一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる細菌種に由来するスクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。一実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は、改変されない。他の実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子の複数のコピーを含む。さらに他の実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの天然輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー、ならびに異なる細菌種に由来するスクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の複数のコピーを含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体は、アクチノバシラス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アナエロビオスピリルム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、およびマンヘイミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、ネズミチフス菌、クレブシエラ・ニューモニエ、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、枯草菌、炭疽菌、バシラス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ）、およびサッカロミセス・セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むがこれらに限定されない、細菌属または菌種に由来するスクシネート遺伝子の輸出体によりコードされる。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体は、コリネバクテリウム属に由来する。一実施形態では、スクシネートの輸出体は、Ｃ．グルタミクムに由来する。他の実施形態では、スクシネートの輸出体は、コレラ菌に由来する。他の実施形態では、スクシネートの輸出体は、大腸菌に由来する。他の実施形態では、スクシネートの輸出体は、枯草菌に由来する。
【０２８８】
本開示は、スクシネートの輸出体の機能性断片またはスクシネートの輸出体の機能性変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用する場合、スクシネートの輸出体の「その機能性断片」または「その機能性変異体」という用語は、該断片または変異体が由来したスクシネートの野生型輸出体と同様の質の生物学的活性を有するエレメントに関する。例えば、スクシネートタンパク質の突然変異輸出体の機能性断片または機能性変異体は、該機能性断片または機能性変異体が由来した輸出体タンパク質が細菌細胞にスクシネートを移入するのと本質的に同じ移入能力を保持するものである。一実施形態では、操作された細菌細胞は、スクシネートの輸出体の機能性断片をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。他の実施形態では、操作された細菌細胞は、スクシネートの輸出体の機能性変異体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のスクシネート取込み輸送体、例えば、Ｄｃｔ、ＤｃｔＣ、ｙｂｈＩまたはｙｄｊＮにおける突然変異または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＵＣＤＨ）は、突然変異または欠失され得る。理論により拘束されることを望むものではないが、そのような突然変異は、細胞内スクシネート濃度を低下させることができ、プロピオネート異化経路を経るフラックスを増加させることができる。
【０２９０】
スクシネートの輸出体、スクシネート機能性変異体の輸出体またはスクシネート機能性断片の輸出体の活性を試験するためのアッセイは、当業者に周知である。例えば、スクシネート輸送は、内因性スクシネート輸出体を欠く操作された細菌細胞においてタンパク質、その機能性変異体または断片を発現させ、タンパク質の発現後の培地中のスクシネートレベルを評価することにより、評価することができる。スクシネート輸出体を測定するための方法は、当業者に周知である。例えば、Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５４巻（１号）：２５〜３４頁、２０１１年参照。
【０２９１】
一実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする遺伝子は、宿主生物における使用のためにコドン最適化されたものである。一実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする遺伝子は、大腸菌における使用のためにコドン最適化されたものである。
【０２９２】
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸をその配列中に含むスクシネートの輸出体をコードする遺伝子も含む。本明細書に記載の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列を含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子に突然変異を起こさせ、スクシネート輸送増加を示す突然変異体を選択し、スクシネートの輸出体をコードする、突然変異を起こした少なくとも１つの遺伝子を単離し、細菌細胞に挿入する。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子に突然変異を起こさせ、スクシネート輸送減少を示す突然変異体を選択し、スクシネートの輸出体をコードする、突然変異を起こした少なくとも１つの遺伝子を単離し、細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の輸出体改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０２９４】
一実施形態では、スクシネート輸出体は、ＤｃｕＣである。一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号４９と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号４９と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号４９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号４９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号４９の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号７０の配列からなる。
【０２９５】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ＤｃｕＣである。したがって、一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１２９をコードする配列からなる。
【０２９６】
一実施形態では、スクシネート輸出体は、ＤｃｕＣである。一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｄｃｕＣ遺伝子は、配列番号１１８の配列からなる。
【０２９７】
一実施形態では、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素は、ＤｃｕＣである。したがって、一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ＤｃｕＣは、配列番号１１７をコードする配列からなる。
【０２９８】
他の実施形態では、スクシネート輸出体は、ＳｕｃＥ１である。一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号４６の配列からなる。
【０２９９】
他の実施形態では、スクシネート輸出体は、ＳｕｃＥ１である。一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０の配列を含む。さらに他の実施形態では、ｓｕｃＥ１遺伝子は、配列番号１２０の配列からなる。
【０３００】
一実施形態では、少なくとも１つのスクシネート輸出体は、ｓｕｃＥ１である。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１２８をコードする配列からなる。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９と少なくとも約８９％の同一性を有する。一実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９と少なくとも約９０％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９と少なくとも約８５％、８６％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９をコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、ｓｕｃＥ１は、配列番号１１９をコードする配列からなる。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、第１のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第２のプロモーターに直接的に作動可能に連結している。他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、第２のプロモーターに間接的に作動可能に連結している。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体およびプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子と、少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子とをコードする、各々の遺伝子の発現は、異なるプロモーターにより制御される。
【０３０３】
一実施形態では、プロモーターは、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子と天然では作動可能に連結していない。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、その天然プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、誘導性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、その天然プロモーターより強いプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、構成的プロモーターにより制御される。
【０３０４】
他の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、より詳細に下で述べる。
【０３０５】
一実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来するスクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置し、異なる細菌種に由来するスクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。さらに他の実施形態では、スクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、異なる細菌種に由来するスクシネートの輸出体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーが細菌細胞の染色体内に位置する。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞における輸出体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は改変されず、天然輸出体の１つまたは複数の追加のコピーがゲノムに挿入される。一実施形態では、ゲノムに挿入される天然輸出体の１つまたは複数の追加のコピーは、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのプロピオネート異化酵素の発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代替実施形態では、輸出体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は改変されず、異なる細菌種に由来する輸出体の１つまたは複数の追加のコピーが細菌細胞のゲノムに挿入される。一実施形態では、細菌細胞のゲノムに挿入される輸出体の１つまたは複数の追加のコピーは、プロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０３０７】
一実施形態では、スクシネートの輸出体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸出体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より１０％多いスクシネートを細菌細胞から輸出する。他の実施形態では、スクシネートの輸出体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸出体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多いスクシネートを細菌細胞から輸出する。さらに他の実施形態では、スクシネートの輸出体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸出体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より２倍多いスクシネートを細胞から輸出する。さらに他の実施形態では、スクシネートの輸出体が、操作された細菌細胞において発現する場合、細菌細胞は、輸出体が発現すると、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍多いスクシネートを細胞から輸出する。
【０３０８】
必須遺伝子および栄養要求体
本明細書で使用する場合、「必須遺伝子」という語は、細胞の増殖および／または生存に必要な遺伝子を意味する。細菌必須遺伝子は、当業者に周知であり、遺伝子の特異的欠失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することができる（例えば、それぞれの全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｚｈａｎｇおよび  Ｌｉｎ、２００９年、ＤＥＧ  ５．０、ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３７巻：Ｄ４５５〜Ｄ４５８頁ならびにＧｅｒｄｅｓら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻（５号）：４４８〜４５６頁参照）。
【０３０９】
「必須遺伝子」は、生物が生存する状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、改変または切除は、栄養要求体になる本開示の操作された細菌をもたらすことがあり、例えば、前記細菌は、環境条件に依存する栄養要求体（条件付き栄養要求体）であり得る。栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させることを意図するものである。
【０３１０】
栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させることを意図するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含むが、これらに限定されない、細胞の生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子を標的にすることができる。
【０３１１】
表７に栄養要求性菌株を作製するために破壊または除去することができる例示的な細菌遺伝子を示す。これらは、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０３１２】
【表７】
2018521674.tif 000010
【０３１３】
表８に強制経口投与後２４時間および４８時間目に検出されたマウス消化管内の種々のアミノ酸栄養要求体の生存を示す。これらの栄養要求体は、大腸菌の非ニッスル株であるＢＷ２５１１３を用いて作製した。
【０３１４】
【表８】
2018521674.tif 000011
【０３１５】
例えば、チミンは、細菌細胞の増殖に必要な核酸であり、その非存在下では、細菌は、細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによるチミン合成における第１のステップを触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼをコードする（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失しており、かつ／または無関係の遺伝子で置換されている、ｔｈｙＡ栄養要求体である。ｔｈｙＡ栄養要求体は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを加えることにより、十分な量のチミンが存在する場合にのみ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒト消化管において天然に見いだされる高いチミンレベルの存在下でのみ、増殖することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物消化管内に存在する場合、補足される遺伝子における栄養要求体である。十分な量のチミンが存在しない場合、ｔｈｙＡ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１６】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁の増殖に必要である（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｄａｐＤ栄養要求体である。ｄａｐＤ栄養要求体は、例えば、ＤＡＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることにより、十分の量のＤＡＰが存在する場合にのみ増殖することができる。十分の量のＤＡＰが存在しない場合、ｄａｐＤ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１７】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ｕｒａＡが欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｕｒａＡ栄養要求体である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取込みおよびその後の代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求体は、例えば、ウラシルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることによって十分の量のウラシルが存在する場合にのみ増殖することができる。十分の量のウラシルが存在しない場合、ｕｒａＡ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１８】
複雑なコミュニティーにおいて、細菌がＤＮＡを共有することは可能である。非常にまれな状況では、栄養要求性細菌菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求体を永久的に救出する非栄養要求性菌株からＤＮＡを受け取り得る。したがって、複数の栄養要求体を含む細菌菌株を操作することにより、ＤＮＡ転移が栄養要求体を救出するのに十分な時間起こる可能性が著しく低くなり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な２つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含む。
【０３１９】
必須遺伝子の他の例は、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡを含むが、これらに限定されない。他の必須遺伝子は、当業者に公知である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求体である（その全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｌｏｐｅｚおよび  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５参照）。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧおよびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃのうちの１つまたは複数を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌのうちの１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇのうちの１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃのうちの１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇのうちの１つまたは複数を含むａｄｋである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドにより補足されている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸またはＬ−ヒスチジンメチルエステルにより補足される。ｄｎａＮ（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ａｄｋ（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールにより補足される。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドに対して栄養要求性にする複数の突然変異遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）ならびにｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）における突然変異を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）ならびにｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）における突然変異を含む。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、その必須遺伝子（複数可）が本明細書に記載のアラビノース系を用いて置換されている、条件付き栄養要求体である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ成分およびシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路も含む。例えば、操作された細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な必須遺伝子における、例えば、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡもしくはＭｅｔＡにおける欠失もしくは突然変異を含み得、ならびに毒素遺伝子であって、環境条件（複数可）および／もしくはシグナル（複数可）（例えば、記載のアラビノース系）に応答して発現する１つもしくは複数の転写活性化因子により調節される、または外因性環境条件（複数可）および／もしくはシグナル（複数可）を感知することにより発現する１つもしくは複数のリコンビナーゼ（例えば、本明細書に記載のリコンビナーゼ系）により調節される、毒素遺伝子も含み得る。他の実施形態は、その全内容が参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５年）４巻：３０７〜３１６頁に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ構成要素およびシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路構成要素、ならびに条件複製起点のような、他のバイオセキュリティシステム（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年、上掲参照）も含む。
【０３２６】
遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための重層的遺伝子調節回路を含む（例えば、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号参照）。遺伝子調節回路は、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体、および／もしくはプロピオネート結合タンパク質を産生する、または栄養要求体を救出する、突然変異細菌についてのスクリーニングに有用である。特定の実施形態では、本発明は、目的の１つまたは複数の遺伝子を産生する遺伝子操作細菌を選択するための方法を提供する。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとＴ７ポリメラーゼ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第１の遺伝子であって、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、ペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットであって、前記Ｔ７ポリメラーゼにより誘導されるＴ７プロモーターに作動可能に連結している第２の遺伝子または遺伝子カセットと、前記Ｔ７ポリメラーゼを阻害することができる阻害因子であるＬｙｓＹをコードする第３の遺伝子とを含む。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ペイロードは発現しない。ＬｙｓＹは、構成的に発現し（Ｐ−ｌａｃ構成的であり）、さらにＴ７ポリメラーゼを阻害する。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、Ｔ７ポリメラーゼは、ｌｙｓＹ阻害を克服するのに十分なレベルで発現し、ペイロードが発現する。いくつかの実施形態では、ｌｙｓＹ遺伝子は、さらなるＦＮＲ結合部位に作動可能に連結している。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、上記の通り二量体化してＴ７ポリメラーゼ発現を活性化し、そしてまたｌｙｓＹ発現を阻害する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとプロテアーゼ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、ｔｅｔ調節領域（ｔｅｔＯ）に作動可能に連結しているペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットと、ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）に連結しているｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルをコードする第３の遺伝子であって、前記ｔｅｔＲが、前記ｔｅｔ調節領域に結合し、前記第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものである、第３の遺伝子とを含む。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識することができ、ｔｅｔＲを分解することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リプレッサーは分解せず、ペイロードは発現しない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、それによりｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼの発現を誘導する。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、ｔｅｔＲを分解し、ペイロードが発現する。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとリプレッサー調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、第１のリプレッサーをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、構成的プロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結したペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットと、第２のリプレッサーをコードする第３の遺伝子であって、前記第２のリプレッサーが、前記第１の調節領域に結合し、前記第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものである、第３の遺伝子とを含む。第３の遺伝子は、構成的プロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結しており、第１のリプレッサーは、その第２の調節領域に結合することができ、第２のリプレッサーの発現を阻害することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、第１のリプレッサーは発現せず、第２のリプレッサーは発現し、ペイロードは発現しない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、第１のリプレッサーが発現し、第２のリプレッサーは発現せず、ペイロードが発現する。
【０３３０】
これらの実施形態に有用なリプレッサーの例は、ＡｒｇＲ、ＴｅｔＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲおよびＰｔｘＳ（米国特許出願公開第２００３０１６６１９１号）を含むが、これらに限定されない。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットと調節ＲＮＡ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、調節ＲＮＡをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、ペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットとを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに作動可能に連結しており、さらにヌクレオチド配列に連結しており、該ヌクレオチド配列は、ペイロードの翻訳を阻害するｍＲＮＡヘアピンを産生することができるものである。調節ＲＮＡは、ｍＲＮＡヘアピンを消失させることができ、リボソーム結合部位経由でペイロード翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、調節ＲＮＡは発現せず、ｍＲＮＡヘアピンは、ペイロードが翻訳されるのを防止する。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、調節ＲＮＡが発現し、ｍＲＮＡヘアピンは消失し、ペイロードが発現する。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとＣＲＩＳＰＲ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、Ｃａｓ９タンパク質と、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、ペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットであって、構成的プロモーターを含む調節領域に作動可能に連結している第２の遺伝子または遺伝子カセットと、構成的プロモーターに作動可能に連結しているリプレッサーをコードする第３の遺伝子であって、前記リプレッサーが、前記調節領域に結合し、前記第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものである、第３の遺伝子とを含む。第３の遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに結合することができるＣＲＩＳＰＲ標的配列にさらに連結しており、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡへの前記結合は、Ｃａｓ９タンパク質による切断を誘導し、リプレッサーの発現を阻害する。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ガイドＲＮＡは発現せず、リプレッサーが発現し、ペイロードは発現しない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、ガイドＲＮＡが発現し、リプレッサーは発現せず、ペイロードが発現する。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとリコンビナーゼ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、構成的プロモーターに作動可能に連結したペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットとを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、方向が逆（３’から５’）になっており、第２の遺伝子または遺伝子カセットにはリコンビナーゼ結合部位が隣接しており、リコンビナーゼは、前記リコンビナーゼ結合部位に結合して、その方向を（５’から３’に）戻すことにより第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現せず、ペイロードは３’から５’の方向のままであり、機能性ペイロードは一切産生されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現し、ペイロードは５’から３’の方向に戻り、機能性ペイロードが産生される。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットとポリメラーゼ・リコンビナーゼ調節型遺伝子調節回路とを含む遺伝子操作細菌を提供する。例えば、遺伝子操作細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子と、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結しているペイロードを産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットと、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子であって、前記Ｔ７ポリメラーゼが、前記Ｔ７プロモーターに結合し、前記ペイロードの発現を誘導することができるものである、第３の遺伝子とを含む。Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子は、方向が逆（３’から５’）になっており、第３の遺伝子にリコンビナーゼ結合部位が隣接しており、リコンビナーゼは、前記リコンビナーゼ結合部位に結合して、その方向を（５’から３’に）戻すことによりＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現せず、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は３’から５’の方向のままであり、ペイロードは発現しない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現し、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は５’から３’の方向に戻り、ペイロードが発現する。
【０３３５】
キルスイッチ
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、キルスイッチも含む（例えば、それぞれが参照によりそれらの全体として本明細書に明確に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／１８３，９３５号および第６２／２６３，３２９号参照）。キルスイッチは、外部刺激に反応して操作された微小生物を能動的に殺滅することを意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために死ぬという栄養要求性突然変異と対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微小生物内の有毒分子の産生を誘導する環境中の特定の因子によって誘発される。
【０３３６】
キルスイッチにより操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究目的のために、例えば、実験室環境の外部へのバイオ燃料産生微生物の広がりを制限するために操作されたものである。疾患または障害を治療するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために操作された細菌は、１つもしくは複数の異種遺伝子もしくは遺伝子カセット、例えば治療用遺伝子（複数可）、の発現および送達の後または対象が治療効果を経験した後、特定に時点に死ぬようにプログラムすることもできる。例えば、いくつかの実施形態では、操作された細菌中に存在するプロピオネート異化酵素カセット（複数可）および／または遺伝子（複数可）の発現後の一定の期間の後にキルスイッチを作動させて細菌を殺滅する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）の発現後に、例えば、対応するタンパク質（複数可）または分子（複数可）の産生後にキルスイッチを遅れて作動させる。あるいは、細菌は、細菌が疾患部位の外側に広がった後に死ぬように操作することができる。とりわけ、微生物による対象への長期住みつき、対象内の目的の範囲外への微生物の広がり（例えば、消化管の外側）、または対象の外側の微生物の環境中への広がり（例えば、対象の大便を介する環境への広がり）を防ぐことは、有用であり得る。
【０３３７】
キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例は、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、または他の機構により細胞死を引き起こす他の分子を含むが、これらに限定されない。そのような毒素は、個別にまたは組み合わせて用いることができる。それらの産生を制御するスイッチは、例えば、転写活性化（トグルスイッチ；例えば、Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００年参照）、翻訳（リボレギュレーター）またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼベースのスイッチ）に基づくものであってよく、嫌気状態または活性酸素種のような環境刺激を検知することができる。これらのスイッチは、単一環境因子により作動させることができるか、または細胞死をもたらすためにＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理構成のいくつかの活性化因子を必要とし得る。例えば、ＡＮＤリボレギュレータースイッチは、細胞膜を透過性にし、細胞を殺滅するリシンの発現を誘導するためのテトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびアラビノースにより活性化される。ＩＰＴＧは、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、これらが次に、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって活性化される。細胞死をもたらすために３つの誘導物質のすべてが存在しなければならない。キルスイッチの例は、当技術分野で公知である（Ｃａｌｌｕｒａら、２０１０年）。いくつかの実施形態では、異種遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）の酸素レベル依存性発現後の一定の期間の後にキルスイッチを作動させて細菌を殺滅する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）の酸素レベル依存性発現後にキルスイッチを遅れて作動させる。
【０３３８】
キルスイッチは、毒素が環境条件もしくは外部シグナルに反応して産生される（例えば、細菌が外部キューに反応して殺滅される）ように設計することができ（すなわち、活性化ベースのキルスイッチ）、または代わるべきものとして、環境条件がもはや存在しなくなると、もしくは外部シグナルが停止すると、毒素が産生されるように設計することができる（すなわち、抑制ベースのキルスイッチ）。
【０３３９】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、例えば、低酸素環境において外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、その発現は、環境条件またはシグナルに反応した誘導され、細胞を殺滅する毒素の発現を最終的にもたらす１つまたは複数の組換え事象を引き起こす。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のレコンビナーゼによってフリップされた後に構成的に発現する細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現は、遺伝子操作細菌を殺滅する。これらの種類のキルスイッチシステムでは、操作された細菌細胞が外因性環境条件を感知し、目的の異種遺伝子を発現すると、操作細菌細胞は、もはや生存できない。
【０３４０】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌が少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに反応して１つまたは複数のリコンビナーゼを発現し、遺伝子操作細菌は、外因性環境条件またはシグナルに反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、抗毒素は、毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作細菌の死を遅らせる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。
【０３４１】
他の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップした後に構成的に発現する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第２のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、外因性環境条件に反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、抗毒素は、外因性環境条件が存在する場合に毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作細菌の死を遅らせる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。
【０３４２】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコンビナーゼによる第３のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第３のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。したがって、一実施形態では、本開示は、逐次的に用いることができる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のリコンビナーゼを提供する。
【０３４３】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第１の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、第１の切除酵素は、第１の必須遺伝子を切除する。一実施形態では、プログラムされた操作細菌細胞は、第１の必須遺伝子が切除された後、生存できない。
【０３４４】
一実施形態では、第１のリコンビナーゼは、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子をさらにフリップする。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、第１の必須遺伝子および第２必須遺伝子の両方が切除される場合、遺伝子操作細菌は、死ぬかまたはもはや生存できない。一実施形態では、第１のリコンビナーゼにより第１の必須遺伝子が切除されるかまたは第２の必須遺伝子が切除される場合、遺伝子操作細菌は、死ぬかまたはもはや生存できない。
【０３４５】
一実施形態では、第１の切除酵素は、Ｘｉｓ１である。一実施形態では、第１の切除酵素は、Ｘｉｓ２である。一実施形態では、第１の切除酵素はＸｉｓ１であり、第２の切除酵素はＸｉｓ２である。
【０３４６】
一実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後に死ぬ。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後にもはや生存できない。
【０３４７】
これらの実施形態のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４からなる群またはその生物学的活性な断片から選択されるリコンビナーゼであり得る。
【０３４８】
上述のキルスイッチ回路において、毒素は、環境因子またはシグナルの存在下で産生される。キルスイッチ回路の他の態様では、毒素は、環境因子の存在下で抑制され（産生されず）、環境条件または外部シグナルがもはや存在しなくなれば、産生され得る。そのようなキルスイッチは、抑制ベースのキルスイッチと呼ばれ、細菌細胞が外部因子またはシグナル、例えば、アラビノースまたは他の糖の存在下でしか生存できないシステムを表す。毒素が外部因子またはシグナルの存在下で抑制される（そして外部シグナルが除去されると活性化される）例示的キルスイッチ設計を本明細書に記載する。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知することにより１つまたは複数の異種遺伝子を発現する、操作された細菌細胞を提供する。この態様では、操作された細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の１つまたは複数の遺伝子を含む。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の遺伝子の転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、所望の遺伝子、例えば、毒素遺伝子の発現を抑制するｔｅｔＲの発現を誘導する、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、活性化することを可能にする立体配座の変化を受ける。この実施形態では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境においては、ｔｅｔＲ遺伝子が活性化されず、毒素が発現し、それにより細菌を殺滅する。必須遺伝子がアラビノースまたは他の糖の存在下でのみ発現し、アラビノースまたは他の糖が環境に存在しない場合には発現しないという、アラビノース系を用いて、必須遺伝子を発現させることもできる。
【０３４９】
したがって、外因性環境中のアラビノースを感知することにより１つまたは複数の異種遺伝子が発現するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種遺伝子は、直接的または間接的にａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、発現異種遺伝子は、異種治療用遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、リプレッサータンパク質もしくはポリペプチド、例えば、ＴｅｔＲリプレッサーをコードする異種遺伝子、細菌細胞に見いだされない必須タンパク質をコードする異種遺伝子および／または調節タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子のうちの１つまたは複数から選択される。
【０３５０】
アラビノース誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣおよびＰａｒａＢＡＤを含む。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ＰａｒａＣプロモーターおよびＰａｒａＢＡＤプロモーターは、二方向性プロモーターとして作動し、ＰａｒａＢＡＤプロモーターは、１つの方向の異種遺伝子（複数可）の発現を制御し、ＰａｒａＣ（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに近接し、それと反対側の鎖上の）は、他の方向の異種遺伝子（複数可）の発現を制御する。アラビノースの存在下では、両プロモーターからの両異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの非存在下では、両プロモーターからの両異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０３５１】
本開示の１つの例示的実施形態では、本開示の操作された細菌は、少なくとも以下の配列を有するキルスイッチを含有する：テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＣプロモーター、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質により抑制されるプロモーター（ＰＴｅｔＲ）に作動可能に連結した細菌毒素をコードする異種遺伝子。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、これがＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、これが次に毒素の転写を抑制する。しかし、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣがＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、毒素が発現する。毒素は、操作された細菌細胞内に蓄積し、操作された細菌細胞を殺滅する。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、したがって、構成的に発現する。
【０３５２】
本開示の一実施形態では、操作された細菌細胞は、構成的プロモーターの制御下の抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質による抑制のため、毒素が発現せず、抗毒素タンパク質が細胞中に蓄積する。しかし、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は、操作された細菌細胞内に蓄積し始める。操作された細菌細胞は、毒素タンパク質が細胞内の抗毒素タンパク質の量と等しいかまたはそれより多い量で存在するともはや生存できず、操作された細菌細胞は、毒素により殺滅されることになる。
【０３５３】
本開示の他の実施形態では、操作された細菌細胞は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現し、抗毒素が細胞中に蓄積し、ＴｅｔＲタンパク質による抑制により、毒素は、発現しない。しかし、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒素の両方が発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は、操作された細菌細胞内に蓄積し始める。操作された細菌細胞は、毒素タンパク質が発現するともはや生存できず、操作された細菌細胞は、毒素により殺滅されることになる。
【０３５４】
本開示の他の例示的実施形態では、本開示の操作された細菌は、少なくとも以下の配列を有するキルスイッチを含有する：操作された細菌細胞において見いだされない（かつ生存に必要な）必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＣプロモーター。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それにより必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写が活性化され、その結果、操作された細菌細胞は生存することが可能となる。しかし、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣがＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質が発現しない。この場合、操作された細菌細胞は、アラビノースの非存在下で死ぬ。いくつかの実施形態では、操作された細菌細胞において見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素キルスイッチシステムとともに細菌細胞内に存在し得る。いくつかの実施形態では、操作された細菌細胞において見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシステムとともに細菌細胞内に存在し得る。
【０３５５】
他の実施形態では、細菌は、短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定システムを含み得る。このシステムでは、細菌細胞は、毒素を中和するために等量の毒素および抗毒素を産生する。しかし、細胞がプラスミドを失うならば／場合、短寿命抗毒素は、減衰し始める。抗毒素が完全に減衰した場合、長寿命毒素が細胞を殺滅した結果として、細胞は死ぬ。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、本開示の操作された細菌、例えば、本明細書に記載の細菌は、上述のキルスイッチ回路のいずれかの構成要素をコードする遺伝子（複数可）をさらに含み得る。
【０３５７】
上述の実施形態のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ、ミクロシンＣ７−Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６；コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭおよびクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０３５８】
上述の実施形態のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リシン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤおよびＣｍｉ、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０３５９】
一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して殺菌性である。一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して静菌性である。
【０３６０】
一実施形態では、方法は、対象に第２の操作された細菌細胞を投与することをさらに含み、前記第２の操作された細菌細胞は、外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される誘導性プロモーターに作動可能に連結した異種レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、異種レポーター遺伝子は、蛍光遺伝子である。一実施形態では、蛍光遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。他の実施形態では、方法は、対象に第２の操作された細菌細胞を投与することをさらに含み、前記第２の操作された細菌細胞は、ｌａｃＺレポーター構築物を発現し、該ｌａｃＺレポーター構築物が基質を切断して、尿において検出することができる小分子を産生する（例えば、その全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｄａｎｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７巻（２８９号）：１〜１２頁、２０１５年参照）。
【０３６１】
単離されたプラスミド
他の実施形態では、本開示は、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結した第１のペイロードをコードする第１の核酸と、第２の誘導性プロモーターに作動可能に連結した第２のペイロードをコードする第２の核酸とを含む、単離されたプラスミドを提供する。他の実施形態では、本開示は、第３の誘導性プロモーターに作動可能に連結した第３のペイロードをコードする第３の核酸をさらに含む、単離されたプラスミドを提供する。他の実施形態では、本開示は、誘導性プロモーターに作動可能に連結した４つ、５つ、６つまたはそれ以上のペイロードをコードする４つ、５つ、６つまたはそれ以上の核酸を含むプラスミドを提供する。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、第１、第２、第３、第４，第５、第６等の「ペイロード（複数可）」は、プロピオネート異化酵素、プロピオネート輸送体、プロピオネート結合タンパク質、または本明細書に記載の他の配列であり得る。一実施形態では、第１のペイロードをコードする核酸、および第２のペイロードをコードする核酸は、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、第１のペイロードをコードする核酸は、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結しており、第２のペイロードをコードする核酸は、第２の誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、第１の誘導性プロモーターおよび第２の誘導性プロモーターは、同じ誘導性プロモーターの別個のコピーである。他の実施形態では、第１の誘導性プロモーターおよび第２の誘導性プロモーターは、異なる誘導性プロモーターである。第３の核酸を含む他の実施形態では、第３のペイロードをコードする核酸、ならびに第１および第２のペイロードをコードする核酸は、すべてが同じ誘導性プロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、第１のペイロードをコードする核酸は、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結しており、第２のペイロードをコードする核酸は、第２の誘導性プロモーターに作動可能に連結しており、第３のペイロードをコードする核酸は、第３の誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の誘導性プロモーターは、同じ誘導性プロモーターの別個のコピーである。他の実施形態では、第１の誘導性プロモーター、第２の誘導性プロモーター、および第３の誘導性プロモーターは、異なる誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、および任意選択の第３のプロモーター、または第１のプロモーターおよび第２のプロモーターおよび任意選択の第３のプロモーターは、それぞれが低酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、および任意選択の第３のプロモーター、または第１のプロモーターおよび第２のプロモーターおよび任意選択の第３のプロモーターは、それぞれがフマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターである。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、および任意選択の第３のプロモーター、または第１のプロモーターおよび第２のプロモーターおよび任意選択の第３のプロモーターは、それぞれがＲＯＳ誘導性調節領域である。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、および任意選択の第３のプロモーター、または第１のプロモーターおよび第２のプロモーターおよび任意選択の第３のプロモーターは、それぞれがＲＮＳ誘導性調節領域である。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする異種遺伝子は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態において、構成的プロモーターは、ｌａｃプロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、ｔｅｔプロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、構成的大腸菌σ３２プロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、構成的大腸菌σ７０プロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、構成的枯草菌σＡプロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、構成的枯草菌σＢプロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、サルモネラ属プロモーターである。他の実施形態において、構成的プロモーターは、バクテリオファージＴ７プロモーターである。他の実施形態では、構成的プロモーターは、バクテリオファージＳＰ６プロモーターである。上記実施形態のいずれかにおいて、プラスミドは、構成的プロモーターに作動可能に連結していてもよく、または誘導性プロモーターに作動可能に連結していてもよい、プロピオネート輸送体、プロピオネート結合タンパク質および／またはキルスイッチ構築物をコードする異種遺伝子をさらに含む。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、単離されたプラスミドは、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つの異種プロピオネート異化酵素遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに作動可能に連結したＴｅｔＲタンパク質をコードする異種遺伝子と、ＰａｒａＣプロモーターに作動可能に連結したＡｒａＣをコードする異種遺伝子と、構成的プロモーターに作動可能に連結した抗毒素をコードする異種遺伝子と、ＰＴｅｔＲプロモーターに作動可能に連結した毒素をコードする異種遺伝子とを含む。他の実施形態では、単離されたプラスミドは、第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結したプロピオネート異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに作動可能に連結したＴｅｔＲタンパク質および抗毒素をコードする異種遺伝子と、ＰａｒａＣプロモーターに作動可能に連結したＡｒａＣをコードする異種遺伝子と、ＰＴｅｔＲプロモーターに作動可能に連結した毒素をコードする異種遺伝子とを含む。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、ｐｒｐＥおよび／またはＰｈａ遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、Ｐｈａ遺伝子またはＰｈａオペロン、例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡである。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子またはＰｈａ遺伝子またはＰｈａオペロンは、追加のプロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセット、例えば、本明細書に記載のＭＭＣＡカセットおよび／または２ＭＣカセットと共発現する。他の実施形態では、スクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはＤｃｕＣ、をコードする遺伝子がさらに発現する。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体がさらに発現する。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、ｐｒｐＥおよび／またはＭＭＣＡ経路遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、ｐｒｐＥおよび／もしくはＭＭＣＡ経路遺伝子またはＭＭＣＡ経路オペロン、例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢもしくはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢもしくはｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢである。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子および／もしくはＭＭＣＡ経路遺伝子またはＭＭＣＡ経路オペロンは、追加のプロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセット、例えば、本明細書に記載のＰｈａカセットおよび／または２ＭＣカセットと共発現する。他の実施形態では、スクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはＤｃｕＣ、をコードする遺伝子がさらに発現する。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体がさらに発現する。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、ｐｒｐＥおよび／または２ＭＣ経路遺伝子を含む。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素をコードする第１の核酸は、ｐｒｐＥおよび／もしくは２ＭＣ経路遺伝子または２ＭＣ経路オペロン、例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥもしくはｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤである。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＥ遺伝子および／もしくは２ＭＣ経路遺伝子または２ＭＣ経路オペロンは、追加のプロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセット、例えば、本明細書に記載のＰｈａカセットおよび／またはＭＭＣＡカセットと共発現する。他の実施形態では、スクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはＤｃｕＣ、をコードする遺伝子がさらに発現する。他の実施形態では、プロピオネート取込み輸送体がさらに発現する。
【０３６７】
一実施形態では、プラスミドは、高コピープラスミドである。他の実施形態では、プラスミドは、低コピープラスミドである。
【０３６８】
他の態様では、本開示は、本明細書に記載の単離されたプラスミドを含む、組換え細菌細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、組換え細菌細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０３６９】
一実施形態では、細菌細胞は、ｐｒｐＥをピロピオニル化して不活性化するリシンアセチルトランスフェラーゼ、例えばｐｋａ、をコードする内因性遺伝子における遺伝子突然変異をさらに含む。他の実施形態では、細菌細胞は、細菌細胞からのプロピオネートおよび／またはその代謝物の輸出を低減する遺伝子突然変異をさらに含む。
【０３７０】
一実施形態では、細菌細胞は、プロピオネート生合成遺伝子をコードする内因性遺伝子における遺伝子突然変異であって、該細菌細胞におけるプロピオネートの生合成およびその代謝物のうちの１つまたは複数の生合成を低減する遺伝子突然変異をさらに含む。
【０３７１】
複数の作用機構
いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増加させるため）または複数の異なる機能を果たす回路を含むように遺伝子操作を施す。挿入部位の例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａ、および図３２に示すその他のものを含むが、これらに限定されない。例えば、遺伝子操作細菌は、プロピオネート異化遺伝子もしくはプロピオネート異化遺伝子カセットの４つのコピー、または４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤおよびｌａｃＺに挿入されたプロピオネート異化遺伝子の４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺに挿入されたプロピオネート異化遺伝子もしくは遺伝子カセットの１つもしくは複数のコピー、１つもしくは複数の異なる挿入部位、例えば、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入されたプロピオネート異化遺伝子もしくは遺伝子カセットの１つもしくは複数のコピー、ならびに／または１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたプロピオネート異化遺伝子もしくは遺伝子カセットの１つもしくは複数のコピーを含み得る。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、次のうちの１つまたは複数を含む：（１）野生型または（安定性もしくは代謝活性増大のために）突然変異形態の、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子および／または遺伝子カセット；（２）野生型または（安定性もしくは代謝活性増大のために）突然変異形態の、プロピオネートおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数（メチルマロン酸を含む）の取込みのための１つまたは複数の輸送体をコードする１つまたは複数の遺伝子および／または遺伝子カセット；（３）プロピオネートおよび／またはその代謝物のうちの１つもしくは複数の分泌および細胞外分解のための１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット；（４）本明細書に記載の通りの、分泌マシナリーの１つまたは複数の構成要素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット；（５）１つまたは複数の栄養要求性、例えば、デルタＴｈｙＡ；（６）カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の抗生物質耐性をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット；（７）細菌細胞からのスクシネート輸出を増加させる１つまたは複数の改変；（８）細菌細胞へのスクシネート移入を低減する１つまたは複数の改変；（９）本明細書に記載の通りの遺伝子、例えば、ｐｋａ、スクシネート取込み輸送体またはプロピオネート輸出体における突然変異／欠失；（１０）内因性プロピオネート合成経路の遺伝子における突然変異／欠失。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオネート異化酵素を含む、２つまたはそれ以上の異なる経路カセットまたはオペロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｒｐＥ、ＡｃｃＡ１、ＰｃｃＢ、ＭｍｃＥ、ＭｕｔＡおよびＭｕｔＢから選択される１つまたは複数のプロピオネート異化酵素ならびにそれらの組合せをコードする、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥ、ａｃｃＡ１、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢから選択される任意の遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを含む、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｒｐＥ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣおよびＰｈａＡから選択される１つまたは複数のプロピオネート異化酵素ならびにそれらの組合せをコードする、遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣおよびｐｈａＡから選択される任意の遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを含む、遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｒｐＢ、ＰｒｐＣ、ＰｒｐＤおよびＰｒｐＥから選択される１つまたは複数のプロピオネート異化酵素ならびにそれらの組合せをコードする、遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤおよびｐｒｐＥから選択される任意の遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを含む、遺伝子配列（複数可）を含む。組合せの非限定的な例は、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と組み合わせて１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む、遺伝子操作細菌を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と組み合わせて１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）と、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）とを含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）とを含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）とを含む。
【０３７４】
組合せの非限定的な例は、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と組み合わせて、およびｍａｔＢを含む１つまたは複数のカセットと組み合わせて、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む、遺伝子操作細菌を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と組み合わせて、およびｍａｔＢを含む１つまたは複数のカセットと組み合わせて、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）、および１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）を、ｍａｔＢを含む１つまたは複数のカセットと組み合わせて含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）、および１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）を、ＭａｔＢを含む１つまたは複数のカセットと組み合わせて含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）、および１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を、ｍａｔＢを含む１つまたは複数のカセットと組み合わせて含む。ｍａｔＢを含む上記の組合せのいずれも、ｐｒｐＥを含んでもまたは含まなくてもよく、例えば、ｐｒｐＥの代わりにｍａｔＢを含んでもよい。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、１つまたは複数のプロピオネート輸送体（取込み輸送体）、例えば、本明細書に記載のあるいは当技術分野で公知のプロピオネート輸送体のいずれかをコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットとを含む。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットとを含む。組合せの非限定的な例は、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）、および１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと組み合わせて、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む、遺伝子操作細菌を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）、および１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと組み合わせて、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）を含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）と、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と、１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と、１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットとを含む。組合せの他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）と、１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと含む。他の非限定的な例では、例えば上記の通りの、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、１つまたは複数のスクシネート輸出体、例えばＳｕｃＥ１および／またはｄｃｕＣ、をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットとを含む遺伝子操作細菌は、ｍａｔＢを含む１つもしくは複数の遺伝子もしくは遺伝子カセットを含むことがあり、またはｍａｔＢが、ｐｒｐＥの代わりに置換されていることもある。いずれの実施形態においても、操作された細菌は、１つまたは複数のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）も含み得る。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、細菌細胞へのスクシネート移入を低減または減少させる１つまたは複数の遺伝子改変、例えば、本明細書に記載のあるいは当技術分野で公知の遺伝子改変のいずれか、とを含む。操作された細菌は、１つまたは複数のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含み得る。操作された細菌は、１つまたは複数のスクシネート輸出体をコードする遺伝子配列をさらに含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、細菌細胞へのスクシネート移入を低減または減少させる１つまたは複数の遺伝子改変と、１つまたは複数のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）とを含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、細菌細胞へのスクシネート移入を低減または減少させる１つまたは複数の遺伝子改変と、１つまたは複数のスクシネート輸出体をコードする遺伝子配列（複数可）とを含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数のプロピオネート異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットと、細菌細胞へのスクシネート移入を低減または減少させる１つまたは複数の遺伝子改変と、１つまたは複数のプロピオネート輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）と、１つまたは複数のスクシネート輸出体をコードする遺伝子配列（複数可）とを含む。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、特定の触媒ステップは律速的であり、そのような場合、１つまたは複数の律速酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子の追加のコピーを加えるのが有益であり得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と、１つまたは複数のｐｈａＡをコードする１つまたは複数の追加の遺伝子または遺伝子カセットとをコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）と、ｐｒｐＥおよび／またはｐｈａＢおよび／またはｐｈａＣおよび／またはｐｈａＡのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の追加の遺伝子または遺伝子カセットとを含み得る。
【０３７９】
非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＭＭＣＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）と、ｐｒｐＥおよび／またはａｃｃＡ１および／またはｏｐｃｃＢおよび／またはｍｍｃＥおよび／またはｍｕｔＡおよび／またはｍｕｔＢのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の追加の遺伝子または遺伝子カセットとをコードし得る。他の非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）と、ｐｒｐＢおよび／またはｐｒｐＣおよび／またはｐｒｐＤおよび／またはｐｒｐＥをコードする１つまたは複数の追加の遺伝子または遺伝子カセットとを含み得る。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロピオネート異化経路、例えば、ＰＨＡ、ＭＭＣＡおよび／または２ＭＣからの各遺伝子を、それぞれ別個の（同じまたは異なる）プロモーターの制御下で、個別に発現させることができる。例えば、ｐｒｐＥおよび／またはｐｈａＢおよび／またはｐｈａＣおよび／またはｐｈａＡのうちの１つまたは複数を、それぞれ別個の（同じまたは異なる）プロモーターの制御下で、個別に発現させることができる。例えば、ｐｒｐＥおよび／またはａｃｃＡ１および／またはｏｐｃｃＢおよび／またはｍｍｃＢおよび／またはｍｍｃＥおよび／またはｍｕｔＡおよび／またはｍｕｔＢのうちの１つまたは複数を、それぞれ別個の（同じまたは異なる）プロモーターの制御下で、個別に発現させることができる。例えば、ｐｒｐＢおよび／またはｐｈａＣおよび／またはｐｒｐＤおよび／またはｐｒｐＥのうちの１つまたは複数を、それぞれ別個の（同じまたは異なる）プロモーターの制御下で、個別に発現させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロピオネート異化経路、例えば、ｍａｔＢ含有経路からの各遺伝子（例えば、ｍａｔＡ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ、および／またはＭａｔＢ、Ａｃｃ１Ａ、およびＰｃｃＢ、（例えば、ＰｒｐＥを伴う））を、それぞれ別個の（同じまたは異なる）プロモーターの制御下で、個別に発現させることができる。
【０３８１】
特定の実施形態では、遺伝子カセット内の遺伝子の順序を変更して、例えば、カセット内の特定の遺伝子のレベルを上昇または低下させることができる。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｈａＣが１番目になる、またはｐｈａＢが１番目になる、またはｐｒｐＥが１番目になる、またはｐｈａＡが１番目になる、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、そのｐｈａＣが２番目になる、またはｐｈａＢが２番目になる、またはｐｒｐＥが２番目になる、またはｐｈａＡが２番目になる、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｈａＣが３番目になる、またはｐｈａＢが３番目になる、またはｐｒｐＥが３番目になる、またはｐｈａＡが３番目になる、１つまたは複数のＰＨＡ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢ−ｐｈａＣ−ｐｈａＡ）をコードし得る。
【０３８２】
非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＢが１番目になる、またはｐｒｐＣが１番目になる、またはｐｒｐＤが１番目になる、またはｐｒｐＥが１番目になる、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＢが２番目になる、またはｐｒｐＣが２番目になる、またはｐｒｐＤが２番目になる、またはｐｒｐＥが２番目になる、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＢが３番目になる、またはｐｒｐＣが３番目になる、またはｐｒｐＤが３番目になる、またはｐｒｐＥが３番目になる、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＢが４番目になる、またはｐｒｐＣが４番目になる、またはｐｒｐＤが４番目になる、またはｐｒｐＥが４番目になる、１つまたは複数の２ＭＣ経路オペロン（例えば、ｐｒｐＢ−ｐｒｐＣ−ｐｒｐＤ−ｐｒｐＥ）をコードし得る。
【０３８３】
非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥが１番目になる、またはａｃｃＡ１が１番目になる、またはｐｃｃＢが１番目になる、またはｍｍｃＥが１番目になる、またはｍｕｔＡが１番目になる、またはｍｕｔＢが１番目になる、１つまたは複数のＭＭＣＡオペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥが２番目になる、またはａｃｃＡ１が２番目になる、またはｐｃｃＢが２番目になる、またはｍｍｃＥが２番目になる、またはｍｕｔＡが２番目になる、またはｍｕｔＢが２番目になる、１つまたは複数のＭＭＣＡオペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥが３番目になる、またはａｃｃＡ１が３番目になる、またはｐｃｃＢが３番目になる、またはｍｍｃＥが３番目になる、またはｍｕｔＡが３番目になる、またはｍｕｔＢが３番目になる、１つまたは複数のＭＭＣＡオペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）をコードし得る。非限定的な例では、遺伝子操作細菌は、ｐｒｐＥが４番目、５番目もしくは６番目になる、またはａｃｃＡ１が４番目、５番目もしくは６番目になる、またはｐｃｃＢが４番目、５番目もしくは６番目になる、またはｍｍｃＥが４番目、５番目もしくは６番目になる、またはｍｕｔＡが４番目、５番目もしくは６番目になる、またはｍｕｔＢが４番目、５番目もしくは６番目になる、１つまたは複数のＭＭＣＡオペロン（例えば、ｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ、またはｐｒｐＥ−ａｃｃＡ１−ｐｃｃＢおよびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡ−ｍｕｔＢ）をコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍａｔＢは、ｍａｔＢを含む遺伝子カセット内で１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目になる。
【０３８４】
本明細書のこの節にまたは他の箇所に記載の実施形態のいずれかにおいて、任意の１つまたは複数の遺伝子を、例えば、哺乳動物消化管に見いだされるもののような低酸素または嫌気的条件により誘導される直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかに、作動可能に連結することができる。
【０３８５】
特定の実施形態では、リボソーム結合部位、例えば、より強いまたはより弱いリボソーム結合部位を用いて、カセット内のプロピオネート異化酵素の発現レベルをモジュレートする（上昇または低下させる）ことができる。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ｐｋａ、スクシネート取込み輸送体またはプロピオネート輸出体における突然変異または欠失、および栄養要求性をさらに含む。
【０３８７】
宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、宿主−プラスミド相互依存性をもたらすように改変されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、ＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必須の複製イニシエータータンパク質がトランスで配置されている、条件複製起点、（ｉｉ）ゲノム転位により宿主によって救出され、リッチ培地中の使用にも適合する栄養要求性の改変、および／または（ｉｉｉ）広域スペクトルの毒素をコードする核酸配列を含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現しない菌株（例えば、野生型細菌）に対してそれ自体不利であるプラスミドＤＮＡを作製することによりプラスミドが伝播しないように選択するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質選択を用いずに少なくとも１００世代にわたり安定している。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本明細書に記載の遺伝子操作細菌における意図的でないプラスミドの増殖を著しく減少させるために用いられる。
【０３８８】
相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載のもの（例えば、キルスイッチ、栄養要求体）などの、他のバイオセーフティー機能と組み合わせて用いることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数のキルスイッチを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の栄養要求体を含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つもしくは複数のキルスイッチおよび／または１つもしくは複数の栄養要求体を含む。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、条件複製起点を含む。いくつかの実施形態では、条件複製起点は、Ｒ６ＫまたはＣｏｌＥ２−Ｐ９である。プラスミドが条件複製起点Ｒ６Ｋを含む実施形態では、宿主細胞は、複製イニシエータータンパク質πを発現する。プラスミドが条件複製起点ＣｏｌＥ２を含む実施形態では、宿主細胞は、複製イニシエータータンパク質ＲｅｐＡを発現する。複製イニシエータータンパク質の発現を、該タンパク質の所望の発現レベルが宿主細胞において達成されてそれによりプラスミドの複製が制御されるように、調節することができることは、当業者には理解される。例えば、いくつかの実施形態では、複製イニシエータータンパク質をコードする遺伝子を、強い、中程度の、または弱いプロモーターの制御下において発現させ、該タンパク質の発現を調節することができる。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞の栄養要求性、好ましくは富栄養培地適合性の栄養要求性、の補足に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チミジン栄養要求性（ΔｔｈｙＡ）であり、ベクターは、チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ジアミノピメリン酸栄養要求性（ΔｄａｐＡ）であり、ベクターは、４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）遺伝子を含む。宿主細胞の栄養要求性の補足に必要なタンパク質をコードする遺伝子の発現を、該タンパク質の所望の発現レベルが該宿主細胞において達成されるように調節することができることは、当業者には理解される。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、毒素遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、抗毒素をコードする、および／または抗毒素の発現に必要な、抗毒素遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、毒素は、Ｚｅｔａであり、抗毒素は、Ｅｐｓｉｌｏｎである。いくつかの実施形態では、毒素は、Ｋｉｄであり、抗毒素は、Ｋｉｓである。好ましい実施形態では、毒素は、静菌性である。本明細書に記載の毒素／抗毒素対のいずれを本開示のベクター系において用いてもよい。毒素の発現レベルが抗毒素を発現する宿主細胞にとって有害になることを防止するための当技術分野で公知の方法を用いて、毒素をコードする遺伝子の発現を調節することができることは、当業者には理解される。例えば、いくつかの実施形態では、毒素をコードする遺伝子を中程度のプロモーターにより調節することができる。他の実施形態では、毒素をコードする遺伝子を目的のリボソーム結合部位に隣接してクローニングして、該遺伝子の発現レベルを所望のレベルに調節することができる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら（２０１５年）参照）。
【０３９２】
組込み
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）のいずれかを細菌染色体の１つまたは複数の組込み部位に組み込むことができる。異種遺伝子または異種遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれた遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを有することにより、対応するタンパク質（複数可）のより多くの産生が可能となり、発現のレベルの微調整も可能となる。あるいは、治療用遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）に加えて、本明細書に記載の異なる回路、例えば、キルスイッチ回路のいずれかを、複数の異なる機能を果すように細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことが可能である。
【０３９３】
例えば、図３２は、大腸菌ニッスル染色体内の組込み部位のマップを示す。図３３は、ＲＦＰ遺伝子を細菌染色体の組込み部位に組み込むことに成功した３つの細菌菌株を示す。
【０３９４】
分泌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌細胞質からプロピオネート異化酵素を分泌することができる天然分泌機構（例えば、グラム陽性細菌）または非天然分泌機構（例えば、グラム陰性細菌）をさらに含む。多くの細菌が細菌細胞外被を越えて基質を輸送する高機能の分泌システムを発達させた。小分子、タンパク質およびＤＮＡのような、基質は、細胞外腔もしくはペリプラズム（消化管内腔もしくは他の腔など）中に放出し、標的細胞中に注入し、または細菌膜に結合させることができる。
【０３９５】
グラム陰性細菌では、分泌機構は、内および外膜の１つまたは両方にわたり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然二重膜スパンニング分泌システムをさらに含む。二重膜スパンニング分泌システムは、Ｉ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌システム（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）およびレジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ＲＮＤ）多剤排出ポンプのファミリーを含むが、これらに限定されない（Ｐｕｇｓｌｅｙ、１９９３年；Ｇｅｒｌａｃｈら、２００７年；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎら、２０１５年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年；Ｒｅｅｖｅｓら、２０１５年；国際公開第２０１４１３８３２４号Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図３〜６に示す。グラム陰性様細胞外被を有する、マイコバクテリアもＶＩＩ型分泌システム（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙら、２００３年）。Ｔ２ＳＳを除いて二重膜スパンニング分泌は、一般的に基質を細菌細胞質から細胞外腔または標的細胞内に直接的に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび外膜のみに及ぶ分泌システムは、２ステップ機構を使用し得るものであり、基質は、最初に内膜スパンニング輸送体によってペリプラズムに転位させられ、次に外膜に運ばれるかまたは細胞外腔に分泌される。外膜スパンニング分泌システムは、Ｖ型分泌または自己輸送システム（Ｔ５ＳＳ）、カーリー（ｃｕｒｌｉ）分泌システムおよび線毛アセンブリのシャペロン−アッシャー経路を含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年）。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、赤痢菌属、サルモネラ属、大腸菌属、ビブリオ属、バークホルデリア属、エルシニア属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）またはシュードモナス属に由来するＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌システム（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、ニードル複合体を介して細菌細胞質から宿主細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞質から分子を分泌するが、宿主細胞質に分子を注入しないように、改変することができる。したがって、分子は、消化管内腔または他の細胞外腔に分泌される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、前記改変Ｔ３ＳＳを含み、細菌細胞質からプロピオネート異化酵素を分泌することができる。いくつかの実施形態では、分泌分子、例えば、異種タンパク質もしくはペプチド、例えばプロピオネート異化酵素は、プロピオネート異化酵素が細菌から分泌されることを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路を用いて、目的の分子、例えば、プロピオネート異化酵素を分泌する。いくつかの実施形態では、ペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることにより、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチドを分泌する。この方法で、細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境中に移動させることができる。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、Ｖ型自己輸送体分泌システムを用いて、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌する。このマシナリーの単純さおよび比較的に大きなタンパク質フラックスを扱う能力のため、Ｖ型分泌システムは、組換えタンパク質の細胞外産生に魅力的である。図１０に示すように、治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインに融合させることができる。Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータドメインは、Ｂａｍ複合体（「ベータ−バレルアセンブリマシナリー」）に動員され、そこでベータドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。細胞外環境に曝露したならば、治療用ペプチドは、自触媒切断（Ｂａｍ複合体の左側）によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（黒いハサミ；Ｂａｍ複合体の右側）の標的化によってリンカーシステムから解放される。このように、いくつかの実施形態では、分泌分子、例えば、異種タンパク質またはペプチド、例えばプロピオネート異化酵素は、該分子が細菌から分泌されることを可能にするための、Ｎ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインを含む。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、ヘモリシンに基づく分泌システムを用いて、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌する。Ｉ型分泌システムは、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接に移動させ、他の分泌の種類の２ステップ工程が不要となるという利点がある。図１１は、尿路病原性大腸菌のアルファ−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＡＴＰ結合カセット輸送体である、ＨｌｙＢ；膜融合タンパク質である、ＨｌｙＤ；および外膜タンパク質である、ＴｏｌＣを用いる。これらの３つのタンパク質の集合により、内および外膜の両方を通るチャンネルが形成される。天然では、このチャンネルは、ＨｌｙＡを分泌するために用いられるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【０４００】
代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然単一膜スパンニング分泌システムをさらに含む。単一膜スパンニング輸送体は、分泌システムの構成要素としての役割を果たすか、または基質を独立して輸出し得る。そのような輸送体は、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／ビルレンス関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、一般的分泌システム（例えば、大腸菌におけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよびいくつかの種類のグラム陽性細菌（例えば、炭疽菌、ラクトバシラス・ジョンソニイ、コリネバクテリウム・グルタミクム、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、黄色ブドウ球菌）における付属分泌システム、およびツイン−アルギニン転位（ＴＡＴ）システム（Ｓａｉｅｒ、２００６年；ＲｉｇｅｌおよびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ、２００８年；Ａｌｂｉｎｉａｋら、２０１３年）を含むが、これらに限定されない。一般的分泌およびＴＡＴシステムは、両方が切断可能なＮ末端シグナルペプチドを用いて基質をペリプラズム内に輸出し得ることが公知であり、生物医薬の製造に関連して探究された。しかし、ＴＡＴシステムは、とりわけ折りたたまれた基質を輸送することができ、それにより早発または不正折りたたみの可能性が解消される点で優位である。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様システムを含み、細菌細胞質からプロピオネート異化酵素を分泌することができる。当業者は、本明細書で開示した分泌システムは、細菌の種々の種、菌株および亜型において機能を発揮するように改変し、かつ／または種々のペイロードを送出するように構成することができることを理解するであろう。
【０４０１】
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外腔に移動させるために、ポリペプチドは、最初に細胞内で移動させ、内膜を越えて移動させ、最後に外膜を越えて移動させなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−とりわけ真核生物由来のもの−は、３次および４次構造を安定化するためにジスルフィド結合を含む。これらの結合は、酸化ペリプラズムコンパートメント内でペリプラズムシャペロンの助けにより正しく形成することができるが、ポリペプチドを外膜を越えて移動させるために、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を再び広げなければならない。
【０４０２】
グラム陰性細菌−とりわけジスルフィド結合を必要とするもの−における適切に折りたたまれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定な外膜を有する細菌におけるペリプラズムを標的にすることである。この方法により、タンパク質を酸化環境中に移動させ、適切に折りたたませる。調和のとれた細胞外分泌システムと対照的に、タンパク質は、膜の漏れによって正しく折りたたまれた形態でペリプラズム腔を脱出することができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は、生物活性の、適切にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、「漏出性」または不安定な外膜を有する。漏れをもたらすために細菌の外膜を不安定にすることは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子を欠失または突然変異を起こさせることによって達成することができる。Ｌｐｐは、細胞当たり約５００，０００コピーで存在する細菌細胞中の最も豊富なポリペプチドであり、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する（Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．  Ｊ．、Ｋａｈｎｅ  Ｄ．およびＷａｌｋｅｒ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２、  ａ０００４１４  （２０１０年））。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を得るための他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化した場合に認められた。ペリプラズムは、タンパク質とともに非常に密に充填されており、したがって、いくつかのペリプラズムタンパク質をコードして、タンパク質のターンオーバーを促進する。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩのようなペリプラズムプロテアーゼを除去することにより、ペリプラズムタンパク質の過剰な蓄積が促進されて、漏出性表現型がもたらされ得る。プロテアーゼの突然変異によっても、これらのプロテアーゼによる標的化分解が妨げられることによりエフェクターポリペプチドを保存することができる。さらに、これらの突然変異の組合せにより、細胞の生存の重大な犠牲を伴わずに細胞の漏出性表現型が相乗的に高められる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、欠失または突然変異ｌｐｐ膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。
【０４０３】
細胞の生存への擾乱を最小限にするために、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つもしくは複数の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことによって漏出性表現型を誘導性にすることができる。例えば、治療用ポリペプチドを送出（分泌）させる必要がある状態においてｌｐｐまたは他の細胞壁安定タンパク質またはペリプラズムプロテアーゼの発現を抑制することができる。例えば、誘導性条件下で、標的膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減する転写リプレッサータンパク質または設計アンチセンスＲＮＡを発現させることができる。逆に、特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシンまたはＴｏｌＡの第３のトポロジードメインの過剰発現は、表現型の不安定化をもたらし得るものであり、治療用ポリペプチドを送出（分泌）させる必要がある状態においてペプチドの過剰発現を誘導することができる。これらの戦略の選別は、脆弱、漏出性表現型をバイオマス産生から切り離すものである。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つもしくは複数の膜および／またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。
【０４０４】
表９：下の表は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌システムを収載するものである。
【０４０５】
【表９】
2018521674.tif 000012
【０４０６】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０４０７】
グラム陽性およびグラム陰性細菌についての上記表は、操作された細菌からポリペプチドおよび他のプロピオネート異化酵素を分泌するために用いることができる分泌システムを収載するものであり、これらは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．Ｓａｉｅｒ、Ｊｒ．Ｍｉｃｒｏｂｅ／１巻、９号、２００６年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｍａｎｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ」に総説されている。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のプロピオネート異化酵素が分泌される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のプロピオネート異化酵素は、分泌効率、プロテアーゼに対する感受性低下、安定性および／または半減期を改善するようにさらに改変される。いくつかの実施形態では、ＰｒｐＥは、単独で、または他のプロピオネート異化酵素と組み合わせて、例えば、ａｃｃＡ１、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡ、およびｍｕｔＢのうちの１つもしくは複数、、ならびに／またはｐｒｐＢ、ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤのうちの１つもしくは複数、ならびに／またはｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＡのちの１つもしくは複数とともに分泌される。いくつかの実施形態では、ａｃｃＡ１、ｐｃｃＢ、ｍｍｃＥ、ｍｕｔＡ、ｍｕｔＢのうちの１つまたは複数が分泌される。いくつかの実施形態では、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤのうちの１つまたは複数が分泌される。いくつかの実施形態では、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＡのうちの１つまたは複数が分泌される。
【０４０９】
あるいは、本明細書に記載の、例えば、図９、図１０、図１５および図２０に記載の遺伝子により発現される酵素のいずれかを組み合わせることができる。
【０４１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏモデル
操作された細菌をｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。プロピオネートの異化に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデルを用いることができる。例えば、Ｇｕｅｎｚｅｌらにより記載されたようなプロピオン酸血症のハイポモルフマウスモデルを用いることができる（例えば、Ｇｕｅｎｚｅｌら、２０１３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｔｈｅｒ．、２１巻（７号）：１３１６〜１３２３頁参照）。このＰＣＣＡ−／−ノックアウトマウスは、Ｐｃｃａプロテインを欠き、高レベルのプロピオニルカルニチンおよびメチルシトレートを蓄積し、生後３６時間以内に死亡する。しかし、ＰＣＣＡ−／−（Ａ１３８Ｔ）のハイポモルフマウスは、プロピオン酸血症のレベルが上昇しても生き残り、それ故、このマウスは卓越した使用モデルである。これらのハイポモルフマウスへのアデノ随伴ウイルス２／８（ＡＡＶ８）ベクターの静脈内注射は、プロピオニルカルニチンおよびメチルシトレートを低減し、持続性効果を媒介した。ＰＣＣＡ−／−ノックアウトマウスモデルも用いることができる（例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻：３５９９５〜３５９９９頁参照）。メチルマロン酸血症のマウスモデルもＰｅｔｅｒｓらにより記載されている（例えば、Ｐｅｔｅｒｓら、２０１２年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７（７）：ｅ４０６０９参照）。
【０４１１】
あるいは、メチルマロン酸血症のマウスモデルが、マウスメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（Ｍｕｔ）遺伝子における重要なエクソンの標的欠失により作製された（ＶＥＮＤＩＴＴＩ  ＣＰら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｅｍｉａ（ＭＭＡ）Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．、２００５年；８４巻：２０７〜２０８頁）。Ｍｕｔ−／−マウスは、早期新生児致死を示し、罹患したヒトの重症表現型を忠実に複製し、早期新生児致死を示す。Ｍｕｔ−／−マウスにおける研究により、進行性の肝臓病態、および死亡時間近の肝臓におけるメチルマロン酸の大量の蓄積が実証された。このモデルは、ＭＭＡの治療におけるｒＡＡＶの有効性を調査するために広範に用いられている。例えば、Ｍｕｔ  ｃＤＮＡを発現する血清型９  ｒＡＡＶは、Ｍｕｔ−／−マウスを致死から有効に救出し、長期生存をもたらし、代謝を著しく改善し、腎機能および組織構造を顕著に保存する結果となった（Ｓｅｎａｃら、Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  Ａｃｉｄｅｍｉａ（ＭＭＡ）ｕｓｉｎｇ  ｒＡＡＶ９  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２年４月、１９巻（４号）：３８５〜３９１頁）。他のＭｕｔ（−／−）マウスは、Ｐｅｔｅｒｓらにより記載されている（Ｐｅｔｅｒｓら、Ａ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３年１２月２６日、２７８巻（５２号）：５２９０９〜１３頁、およびまたＰｅｔｅｒｓら、２０１２年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７（７）：ｅ４０６０９）。
【０４１２】
操作された細菌細胞を動物に例えば強制経口投与により投与することができ、例えば、治療前および後のプロピオニルカルニチン、アセチルカルニチンおよび／またはメチルシトレートの血中レベルを測定することにより、治療有効性を決定する（例えば、Ｇｕｅｎｚｅｌら、２０１３年参照）。動物を屠殺し、組織試料を採取し、分析することができる。治療後のプロピオニルカルニチン、アセチルカルニチン、および／またはメチルシトレートの血中レベルの低下は、操作された細菌が疾患の治療に有効であることを示す。
【０４１３】
スクリーニング方法
代謝物または生体分子を輸送する能力が増強された細菌菌株の作製
微小生物は、それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さいゲノムのため、簡易タイムスケールで固有の表現型に進化され得る。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型を有する菌株に進化させるために選択圧下で微小生物を継代させる方法である。最も一般的には、これは、炭素／エネルギー源の利用または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）への菌株の適応を増すために適用され、それにより、炭素基質を用いてまたはストレス下で増殖する能力がより高い突然変異菌株は、集団内の適応性がより低い菌株を打ち負かすことになり、最終的には集団を支配するようになる。
【０４１４】
この同じ方法を、栄養要求体を作製することにより任意の必須代謝物に拡大することができる。栄養要求体は、必須代謝物を合成することができない菌株であり、したがって、増殖のために培地に供給された代謝物を有さなければならない。栄養要求体を作製し、代謝物の量を減少させながらそれを継代させことによるこのシナリオで得られる優性菌株は、この必須代謝物または生体分子を獲得する能力および組み込む能力がより高いはずである。
【０４１５】
例えば、特定の代謝物または生体分子を産生するための生合成経路が破壊された場合、ＡＬＥによって前記代謝物または生体分子の高親和性捕捉が可能な菌株に進化させることができる。まず、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで様々な濃度の栄養要求性アミノ酸または代謝物中で菌株を増殖させる。次いで、菌株をその濃度で継代させ、定期的な間隔で希釈して漸減代謝物または生体分子濃度にする。時が経つにつれて、代謝物または生体分子について−増殖制限濃度で−最も競争力の高い細胞が集団を支配するようになる。これらの菌株は、必須の制限代謝物または生体分子を移入する能力が増大する結果となる、それらの代謝物−輸送体における突然変異を有する可能性が高いであろう。
【０４１６】
同様に、特定の代謝物または生体分子を形成するために上流に代謝物を用いることができない栄養要求体を用いることにより、菌株を、上流の代謝物をより効率的に移入することができるばかりでなく、代謝物を必須の下流代謝物に変換することもできるものに進化させることができる。これらの菌株は、上流の代謝物の移入を増加させるために突然変異を進化させることにもなるが、下流の酵素の発現または反応速度を上昇させる突然変異、または競合的基質利用経路を低減する突然変異も含有し得る。
【０４１７】
微小生物に固有の代謝物は、その内因性代謝物の増殖制限性補給で作動される突然変異的栄養要求性および選択により必須のものにされ得る。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型を、それらの消費を必須化合物の産生に結びつけることにより、進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生することができる異なる生物からの遺伝子を単離した場合、この遺伝子を異種宿主に組換え導入し、その異種宿主において発現させることができる。この新たな宿主菌株には以前は代謝できなかった基質から必須栄養素を合成する能力が今ではあることになる。
【０４１８】
これにより、直ぐ下流の代謝物を変換することができない栄養要求体を作出し、組換え酵素の同時発現を用いて増殖制限量の非天然化合物中で選択することにより、同様のＡＬＥ方法を適用することができる。この結果、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性における突然変異が生じることになる。強調すべきは、この方法における肝要な要件が、非天然代謝物の消費を増殖に必須の代謝物の産生に結びつけることができることであるということである。
【０４１９】
選択機構の基礎を確立し、最小補給レベルを確定したら、実際のＡＬＥ実験に取りかかることができる。この方法を通して、いくつかのパラメーターを注意深くモニターしなければならない。重要なのは、培養物を指数増殖期で維持し、飽和／定常期に到達させないことである。これは、各継代中に増殖速度をチェックし、そしてそれに合うようにその後の希釈度を調整しなければならないことを意味する。希釈度が大きくなるような程まで増殖速度が向上した場合には、増殖速度が緩徐化され、選択圧が増大され、希釈度が継代中の亜集団を重度に偏らせるほど過酷なものにならないように、栄養要求体補給の濃度を低下させるべきである。加えて、定期的な間隔で、細胞を希釈し、固形培地で増殖させ、個々のクローンを試験してＡＬＥ培養物で観察された増殖速度表現型を確認すべきである。
【０４２０】
中断するタイミングを予測して、ＡＬＥ実験の停止にも警戒する必要がある。進化を方向づけることの成功は、実験を通して「スクリーニングされる」突然変異の数に直接関係しており、突然変異は、一般に、ＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂数（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異体数の代わりとして動作する。以前の研究により、異なる炭素源を用いる増殖に有益な表現型を約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが示された。この速度は、ＤＮＡ複製エラー増加を引き起こす−Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの−化学的突然変異誘発要因の培地への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果、増殖速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、最大適応度に収束し、ＡＬＥ実験は中断され得る。
【０４２１】
ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固形培地上で単離し、培養フラスコのものにマッチする増殖表現型についてアッセイするべきである。次いで、選択されたものから最も性能のよいものがゲノムＤＮＡ用に調製され、全ゲノム配列決定に送られる。配列決定は、向上した表現型をもたらすことができるゲノムの周囲に存在する突然変異を明らかにすることになるが、サイレント突然変異（恩恵をもたらさないが、所望の表現型を損なわないもの）も含有することになる。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発要因の存在下で進化させた培養物には、それよりサイレント性が有意に高いバックグラウンド突然変異が存在することになる。その現状で最も性能の良い菌株に納得がいけば、使用者は、その菌株での応用に進むことができる。そうでなければ、ゲノム操作技術により親菌株に突然変異を再導入することにより、進化菌株から寄与突然変異をデコンボリュートすることができる。例えば、Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．およびＰａｌｓｓｏｎ，Ｂ．ＯＥ．、Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２（２０１１年）を参照されたい。
【０４２２】
同様の方法を用いて、プロピオネートおよびまたはその代謝物のうちの１つもしくは複数を消費または移入する、大腸菌ニッスル突然変異体を作製することができる。
【０４２３】
医薬組成物および製剤
本明細書に記載の遺伝子操作細菌を含む医薬組成物は、プロピオネート異化に関連する障害を治療、管理、改善および／または予防するために用いることができる。１つまたは複数の遺伝子操作細菌を、単独でまたは予防薬、治療薬および／または薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【０４２４】
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように、例えば、少なくとも１つのプロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセットを発現するように、操作されている細菌の１つの種、菌株または亜型を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように、例えば、少なくとも１つのプロピオネート異化遺伝子または遺伝子カセットを発現するように、各々が操作されている細菌の２つまたはそれ以上の種、菌株および／または亜型を含む。
【０４２５】
本明細書に記載の医薬組成物は、有効成分を医薬用組成物に加工することを促進する、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて通常の方法で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ参照）。いくつかの実施形態では、医薬組成物を打錠、凍結乾燥、直接圧縮、常法による混合、溶解、造粒、研和、乳化、カプセル封入、封入または噴霧乾燥にかけて、腸溶コーティングを施しても非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット剤または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に依存する。
【０４２６】
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液剤、カプセル剤、サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶性錠剤、懸濁散剤、顆粒剤または経口投与用のマトリックス持続放出製剤）の、および任意の適切な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即時放出、拍動性放出、遅延放出または持続放出）用の医薬組成物に製剤化することができる。遺伝子操作細菌の適切な投与量は、約１０５〜１０１２細菌、例えば、約１０５細菌、約１０６細菌、約１０７細菌、約１０８細菌、約１０９細菌、約１０１０細菌、約１０１１細菌または約１０１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日、週または月１回もしくは複数回投与することができる。
【０４２７】
組成物は、食事の前、食事中または後に投与することができる。一実施形態では、対象が食事をとる前に医薬組成物を投与する。一実施形態では、医薬組成物を食事と同時に投与する。一実施形態では、対象が食事をとった後に医薬組成物を投与する。
【０４２８】
遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、界面活性剤、中性もしくは陽イオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または物質を含む医薬組成物に製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコールならびに例えば、ポリソルベート２０を含む表面活性剤の添加を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例えば、重炭酸ナトリウムの１モル溶液（例えば、胃などの、酸性細胞環境を緩衝するために）に製剤化することができる。遺伝子操作細菌は、中性または塩の形態として投与すること、かつ製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンとで形成されるものならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの陽イオンとで形成されるものを含む。本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、軟膏剤、クリーム剤、経皮貼付剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、液剤、乳剤の形態でまたは当業者に周知の他の形態で局所投与すること、かつ製剤化することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照されたい。一実施形態では、非噴霧用局所剤形については、局所適用に適合性であり、水より大きい動粘度を有する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含む粘稠から半固体または固体剤形が用いられる。適切な製剤は、滅菌することができるまたは様々な特性、例えば、浸透圧に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合することができる、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、塗布剤、軟膏剤等を含むが、これらに限定されない。他の適切な局所剤形は、有効成分が固体または液体不活性担体と一緒に加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴射剤）との混合物でまたはスクィーズボトルに包装されている噴霧用エアゾール製剤を含む。保湿剤または湿潤剤も医薬組成物および製剤に加えることができる。そのような付加的な成分の例は、当技術分野で周知である。一実施形態では、操作された細菌を含む医薬組成物は、衛生用品として製剤化することができる。例えば、衛生用品は、抗菌製剤または発酵ブロスなどの発酵製品であり得る。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、パスタ、ローションおよびリップクリームであり得る。
【０４２９】
本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、経口投与することができ、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として製剤化することができる。経口用医薬組成物は、固体賦形剤を用い、得られた混合物を場合によって粉砕し、所望の場合、適切な補助剤を加えた後に、顆粒剤の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを製造することができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖などの増量剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーを含むが、これらに限定されない。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤も加えることもできる。
【０４３０】
錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ゴム、カオリンおよびトラガント）；増量剤（例えば、ラクトース、結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて通常の手段により調製することができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法により被覆することができる。コーティングシェルが存在していてもよく、一般的な膜は、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギネート−ポリリシン−アルギネート（ＡＰＡ）、アルギネート−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギネート（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルアクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メチルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、珪質カプセル化物、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸ナトリウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ゲラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−−ｃｏグリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸および腸溶コーティングポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例えば、大腸内への放出のために腸溶コーティングを施す。胃から結腸までの一般的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルを修正することができる。いくつかの実施形態では、コーティングは、放出部位を規定するために特定のｐＨ環境において分解する。いくつかの実施形態では、少なくとも２種のコーティングを用いる。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングが異なるｐＨレベルで分解する。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、腸溶コーティング材料を、１つまたは複数のコーティング層（例えば、外、内および／または中間コーティング層）において用いることができる。腸溶コーティング用ポリマーは、低ｐＨでは非イオン化状態のままであり、したがって不溶性のままである。しかし、胃腸管内でｐＨが上昇すると、酸性官能基はイオン化することができ、ポリマーは腸液に膨潤するか、または可溶性になる。
【０４３３】
腸溶コーティングに用いられる材料は、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メタクリル酸メチル）、酢酸トリメリット酸セルロース（ＡＣＴ）、ポリ（酢酸フタル酸ビニル）（ＰＶＡＰ）およびフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、脂肪酸、ろう、セラック（アロイリチン酸のエステル）、プラスチックおよび植物繊維を含む。加えて、ゼイン、アクア・ゼイン（アルコールを含有しない水性ゼイン製剤）、アミロースデンプンおよびデンプン誘導体、ならびにデキストラン（例えば、マルトデキストラン）も用いられる。他の公知の腸溶コーティングは、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸アミロース、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アクリル酸エチル、およびメタクリル酸メチルを含む。
【０４３４】
コーティングポリマーは、フタレート誘導体、ＣＡＴ、ＨＰＭＣＡＳ、ポリアクリル酸誘導体、アクリル酸と少なくとも１つのアクリル酸エステルとを含むコポリマー、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：２）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：１）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ（商標）、（ポリ（メタクリル酸、アクリル酸エチル）１：１）；および（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００−５５）（ポリ（メタクリル酸、アクリル酸エチル）１：１）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌは、メタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルから合成されたアニオン性ポリマーである）、アクリル酸およびアクリル酸エステルコポリマーとブレンドされたポリメタクリル酸メチル、アルギン酸、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ナトリウム、カリウム、マグネシウムもしくはカルシウム、酢酸ビニルコポリマー、ポリ酢酸ビニル３０Ｄ（水中の３０％分散体）、ポリ（アクリル酸ジメチルアミノエチル）を含む中性メタクリル酸エステル（「Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｅ（商標）」）、メタクリル酸メチルおよびアクリル酸エチルとメタクリル酸トリメチルアンモニオエチルクロリドとのコポリマー、メタクリル酸メチルとアクリル酸エチルのコポリマー、ゼイン、セラック、ゴムまたは多糖類のうちの１つまたは複数、あるいはそれらの組合せも含み得る。
【０４３５】
コーティング層は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＭＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）（エツロース）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシメチルエチルセルロース（ＨＭＥＣ）、プロピルヒドロキシエチルセルロース（ＰＨＥＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、疎水変性ヒドロキシエチルセルロース（ＮＥＸＴＯＮ）、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、水溶性酢酸ビニルコポリマー、ゴム、多糖類、例えば、アルギン酸およびアルギン酸塩、例えば、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、炭水化物の酸フタレート、酢酸フタル酸アミロース、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、フタル酸セルロースエステル、フタル酸セルロースエーテル、フタル酸ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣＰ）、フタル酸ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣＰ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、を含有するポリマーも含み得る。
【０４３６】
経口投与用の液体製剤は、液剤、シロップ剤、懸濁剤または使用前に水もしくは他の適切な媒体で構成するための乾燥製剤の形態をとり得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される物質を用いて通常の手段により調製することができる。製剤は、適宜、緩衝塩類、着香料、着色剤および甘味料も含み得る。経口投与用の製剤は、本明細書に記載の遺伝子操作細菌の徐放、制御放出または持続放出用に適切に製剤化することができる。
【０４３７】
一実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、小児対象への投与に適する組成物に製剤化することができる。当技術分野において周知であるように、小児は、異なる胃排出速度、ｐＨ、消化管透過性等を含む多くの面で、成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３４巻（２号）：３６１〜３７２頁、２０１４年）。さらに、投与経路および味覚特性などの、小児用製剤の受容性および好みは、容認できる小児のコンプライアンスを達成するために重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、飲み込み易い若しくは溶ける剤形、または添加着香料、甘味料もしくは味覚ブロッカーを含む組成物などの、より味の良い組成物を含み得る。一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、成人への投与に適するものでもあり得る。
【０４３８】
一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤もしくは液剤として再構成するための散剤、分散／発泡錠、咀嚼錠剤、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ剤、チューインガム、経口薄型ストリップ、口内崩壊錠剤、サシェ剤、軟ゼラチンカプセル剤、振りかけ経口散剤、または顆粒剤を含み得る。一実施形態では、組成物は、キャンディーに弾性、所望の噛みごたえのある堅さおよびより長い貯蔵寿命を与える、ゼラチン基剤から製造されるグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーは、甘味料または着香料も含み得る。
【０４３９】
一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、着香料を含み得る。本明細書で使用する場合、「着香料」は、製剤に明白な風味および芳香をもたらす物質（液体または固体）である。着香料は、製剤の食味を改善する助けともなる。着香料は、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、風船ガムおよびチェリーを含むが、これらに限定されない。
【０４４０】
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、不活性希釈剤または同化可食性担体とともに経口投与することができる。この化合物は、硬もしくは軟シェルゼラチンカプセルに封入、錠剤に圧縮、または対象の食事に直接混入することもできる。経口治療投与のために、化合物は、賦形剤とともに組込み、摂食できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハースなどの形態で用いることができる。非経口投与以外により化合物を投与するためには、その不活性化を防ぐための材料で化合物を被覆すること、またはそれ共に化合物を同時投与することが必要であり得る。
【０４４１】
他の実施形態では、操作された細菌を含む医薬組成物は、摂食可能な製品、例えば、食品であり得る。一実施形態では、食品は、乳、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酸乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉乳、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜果実ジュース、果実ジュース、スポーツ飲料、菓子類、砂糖菓子、乳児食（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの、発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルトである。他の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、乳、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキまたはケフィアである。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロバイオティクスとして機能することを意図する他の生菌細胞を含む製剤に組み込む。他の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、果実ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブエキスを含む飲料である。他の実施形態では、食品は、ゼリーまたはプリンである。操作された細菌の投与に適する他の食品は、当技術分野において周知である。例えば、それぞれの内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第２０１５／０２３８５４５号を参照されたい。他の実施形態では、医薬組成物は、パン、ヨーグルトまたはチーズなどの、食品に注入、噴霧、または振りかける。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングを施したまたは非被覆の、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセルまたは微小錠剤による、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与または結腸内投与用に製剤化する。医薬組成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を用いた、坐剤または停留かん腸剤などの直腸組成物に製剤化することもできる。組成物は、油性または水性媒体中懸濁剤、液剤または乳剤であってよく、懸濁化、安定化および／または分散剤を含み得る。
【０４４３】
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、エアゾールの形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態に製剤化して鼻腔内に投与し、また適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を用いることにより、加圧パックまたはネブライザーからエアゾール噴霧剤の形態で好都合に送達することができる。加圧エアゾールの投与単位は、定量を送出するために弁を備えることによって決定することができる。吸入器または吹送器に用いるカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンの）は、ラクトースまたはデンプンなどの化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤を含むものを製剤化することができる。
【０４４４】
遺伝子操作細菌は、デポ製剤として投与し、製剤化することができる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みにより、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射を含む注射、もしくは注入により投与することができる。組成物は、例えば、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはわずかに溶ける誘導体として（例えば、わずかに溶ける塩として）製剤化することができる。
【０４４５】
いくつかの実施形態では、単一剤形の、薬学的に許容される組成物を本明細書で開示する。単一剤形は、液体または固形であり得る。単一剤形は、変更なしに患者に直接投与することができ、または投与前に希釈もしくは再構成することができる。特定の実施形態では、単一剤形は、ボーラス型で、例えば、単回注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤等を含む経口投与を含む、単回経口投与で投与することができる。代替実施形態では、単一剤形は、例えば、注入により、一定の時間にわたって投与することができる。
【０４４６】
医薬組成物の単一剤形は、医薬組成物を、より小さい分割量、一回量容器、一回量液体製剤、または腸溶コーティングを施しても非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット剤もしくは散剤などの、一回量固形製剤に分割することによって用意することができる。固形製剤の一回量は、患者への投与前に液体、一般的に滅菌水または生理食塩水を加えることにより再構成することができる。
【０４４７】
他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いて、本開示の治療薬の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリメタクルリル酸、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。持続放出製剤に用いられるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、保存で安定で、滅菌で、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出システムは、予防および治療標的の近くに配置することができ、したがって、全身投与量の一部を必要とするにすぎない。当業者に公知の任意の適切な技術を用いることができる。
【０４４８】
投与計画は、治療反応をもたらすように調節することができる。投与は、疾患の重症度および反応性、投与経路、治療の時間経過（数日から数カ月、さらには数年）ならびに疾患の改善までの時間などのいくつかの因子に依存し得る。例えば、単回ボーラスは、１回で投与することができ、いくつかの分割量を所定の期間にわたって投与することができ、あるいは治療状況によって示される通りに減量または増量することができる。用量の明細は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果によって決定づけられる。投与量は、緩和されるべき状態の種類および重症度によって異なり得る。個別の対象について、個々の必要および担当臨床医の専門的判断に従って具体的な投与計画を長期にわたって調節することができる。本明細書で示す化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的方法により判断することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０およびＩＣ５０を決定することができ、毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、副作用を低減するために起こり得る被害を最小限にする注意深い修正を加えて用いることができる。投与は、最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイならびに動物試験から得られるデータは、ヒトに用いる一連の用量を策定するのに用いることができる。成分は、例えば、活性薬剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器に入れた乾燥凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として、単位剤形で別個にまたは一緒に混合して供給される。投与方法が注射による場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意することができる。
【０４４９】
医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器に包装することができる。一実施形態では、医薬組成物のうちの１つまたは複数を密閉容器に入れた乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として供給し、対象への投与に適切な濃度に再構成することができる（例えば、水または生理食塩水で）。一実施形態では、予防もしくは治療薬または医薬組成物のうちの１つまたは複数を２℃〜８℃で保存された密閉容器に入れた乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給し、再構成した後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内または１週間以内に投与する。凍結乾燥剤形について主として０〜１０％スクロース（最適には０．５〜１．０％）などの凍結防止剤を含めることができる。他の適切な凍結防止剤は、トレハロースおよびラクトースを含む。他の適切な充填剤は、いずれかを０〜０．０５％の濃度で含めることができる、グリシンおよびアルギニン、ならびにポリソルベート８０（０．００５〜０．０１％の濃度で任意選択で含める）を含む。さらなる界面活性剤は、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、注射用容器として調製することができ、吸収または分散を高めるために用いられるもの、例えば、ヒアルロニダーゼなどの佐剤として有用な物質をさらに含み得る。
【０４５０】
治療の方法
本開示の他の態様は、対象におけるプロピオネートの異化に関連する疾患、または対象におけるプロピオネートの異化に関連する前記疾患に関連する症状（複数可）を治療する方法を提供する。一実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害は、プロピオネートの異常な異化を伴う代謝性障害である。プロピオネートの異常な異化に関連する代謝性疾患は、プロピオン酸血症（ＰＡ）およびメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）はもちろん、重度ビタミンＢ１２栄養障害も含む。一実施形態では、プロピオネートの異常な異化に関連する疾患は、プロピオン酸血症である。一実施形態では、プロピオネートの異常な異化に関連する疾患は、メチルマロン酸血症である。他の実施形態では、プロピオネートの異常な異化に関連する疾患は、ビタミンＢ１２欠損症である。
【０４５１】
一実施形態では、疾患は、プロピオン酸血症である。プロピオン酸血症は、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、ＰＲＯＰ、ＰＣＣ欠損症、ケトーシス型高グリシン血症、ケトーシス型グリシン血症、ならびにケトアシドーシスおよび白血球減少症を伴う高グリシン血症としても公知であり、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ；ＥＣ  ６．４．１．３）の活性低下により引き起こされる常染色体劣性障害である。ＰＣＣは、プロピオニルＣｏＡのメチルマロニルＣｏＡへの変換に関与する。ＰＡを有する患者は、プロピオニルＣｏＡを適切にプロセッシングすることができず、これは、血液、脳脊髄液および組織中へのプロピオニルＣｏＡおよびプロピオン酸の毒性蓄積につながり得る。疾患の臨床症状は、酵素欠損度に依存して様々であり、発作、嘔吐、嗜眠、筋緊張低下、脳症、発育遅延、成長障害、および続発性高アンモニア血症を含む（Ｄｅｏｄａｔｏら、Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ、１４２巻（２号）：１０４〜１１２頁、２００６年）。
【０４５２】
プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）は、アルファおよびベータサブユニットからなる十二量体酵素である。ＰＣＣのアルファサブユニット（ＰＣＣＡとも呼ばれる；ＮＭ＿０００２８２）は、ビオチンカルボキシラーゼおよびビオチンカルボキシルキャリアータンパク質ドメインを含み、その一方でベータサブユニット（ＰＣＣＢとも呼ばれる；ＮＭ＿０００５３２）は、カルボキシルトランスフェラーゼ活性を有する（Ｄｉａｃｏｖｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻（４４号）：１４０２７〜１４０３６頁、２００４年）。ＰＰＣＡまたはＰＣＣＢ遺伝子のいずれかにおける突然変異は、プロピオン酸血症の発生につながることがあり、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢをコードする遺伝子における２４より多くの突然変異が同定されており（Ｐｅｒｅｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂｏｌ．、７８巻（１号）：５９〜６７頁、２００３年）、そのような突然変異には、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、スプライシングに影響するエクソンの点突然変異、スプライシング突然変異、挿入および欠失が含まれる。
【０４５３】
一実施形態では、疾患は、メチルマロン酸血症である。メチルマロン酸血症は、メチルマロン酸尿症またはメチルマロン酸血症単独型としても公知であり、いくつかの遺伝子：ＭＵＴ（ＯＭＩＭ  ２５１０００）、ＭＭＡＡ（ＯＭＩＭ  ２５１１００）、ＭＭＡＢ（ＯＭＩＭ  ２５１１１０）、ＭＭＡＣＨＣ（ＯＭＩＭ  ２７７４０）、ＭＭＡＤＨＣ（ＯＭＩＭ  ２７７４１０）、またはＬＭＢＲＤ１（ＯＭＩＭ  ２７７３８０）のうちの１つの活性低下により引き起こされる常染色体劣性障害である。しかし、メチルマロン酸血症を有する対象の６０パーセントより多くが、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ）遺伝子における突然変異を有する。ＭＵＴは、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの変換に関与するものであり、機能するためにビタミンＢ１２由来補欠分子族であるアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂ１としても公知）を必要とする。ミトコンドリアに侵入すると、ＭＵＴのＮ末端におけるミトコンドリアリーダー配列が切断され、次いでＭＵＴ単量体が会合してホモ二量体になる。メチルマロン酸尿症Ａ型タンパク質、ミトコンドリア性（ＭＭＡＡとしても公知）は、ＭＵＴへのＡｄｏＣｂ１の担持を助ける。同様に、コビリン酸（Ｉ）ａ，ｃ−ジアミドアデノシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア性（ＭＭＡＢ）は、ビタミンＢ１２のアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂ１）への変換の最終ステップを触媒する酵素である。メチルマロン酸尿症およびホモシスチン尿症Ｃ型タンパク質、ミトコンドリア性（ＭＭＡＣＨＣとしても公知）、ならびにメチルマロン酸尿症およびホモシスチン尿症Ｄ型タンパク質、ミトコンドリア性（ＭＭＡＤＨＣとしても公知）は、ビタミンＢ１２（コバラミン）合成にも関与するミトコンドリアタンパク質をコードする。
【０４５４】
ＭＭＡを有する患者は、メチルマロニルＣｏＡを適切にプロセッシングすることができず、これは、血液、脳脊髄液および組織中へのメチルマロニルＣｏＡおよびメチルマロン酸の毒性蓄積につながり得る。疾患の臨床症状は、酵素欠損度に依存して様々であり、発作、嘔吐、嗜眠、筋緊張低下、脳症、発育遅延、成長障害、続発性高アンモニア血症を含む（Ｄｅｏｄａｔｏら、Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ、１４２巻（２号）：１０４〜１１２頁、２００６年）。
【０４５５】
アミノ酸を適切に完全に破壊することができないため、プロピオネートの異化に関連する疾患を有する患者は、様々な副産物分子を彼らの血液および尿中に蓄積する（Ｃａｒｒｉｌｌｏ−ＣａｒｒａｓｃｏおよびＶｅｎｄｉｔｔｉ、Ｇｅｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ；  １９９３〜２０１５年）。これらの副産物分子の異常なレベルは、障害を診断するための主要診断基準として用いられる（例えば、表１１参照）。
【０４５６】
【表１１】
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【０４５７】
診断およびマーカーに有用な検出可能な尿中有機酸は、Ｎ−プロピオニルグリシン、Ｎ−チグリルグリシン、２−メチル−３−オキソ吉草酸、３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、２−メチル−３−オキソ酪酸、３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸、３−オキソ−ｎ−吉草酸を含むが、これらに限定されない。
【０４５８】
プロピオン酸血症およびメチルマロン酸血症の現在利用可能な治療は、疾患の長期管理には不十分であり、厳しい制限を有する（Ｌｉら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１５年）。微量栄養素およびビタミンの補給を必要に応じて用いる低タンパク質食は、ＰＡおよびＭＭＡの広く受け入れられてる長期疾患管理戦略である（Ｌｉら、２０１５年）。しかし、タンパク質摂取制限は、大いに問題があり、有意な罹患率をもたらし得る。適正なモニタリングおよび患者コンプライアンスがあったとしても、タンパク質食制限に起因する知能障害発生率および死亡率は高い（Ｌｉら、２０１５年）。さらなる非外科的慢性管理計画は、Ｌカルニチン投与、抗生物質（メトロニダゾール）、選ばれたＭＭＡ応答性患者（ｃｂｌＡ＞ｃｂｌＢ＞ｍｕｔ（−））に対するビタミンＢ１２、およびアミノ酸食事献立（イソロイシン／バリン、グルタミン、アラニン補給）、および透析を含む。さらに、ＰＡおよびＭＭＡの少数の症例は、肝臓移植（Ｌｉら、２０１５年）、腎臓移植、または肝腎複合移植により治療されている。しかし、ドナー臓器の限られた入手可能性、移植自体に付随する費用、および継続的な免疫抑制療法に随伴する望ましくない作用により、疾患の治療のための肝臓移植の実際の使用は制限される。したがって、ＰＡおよびＭＭＡの有効で、信頼でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない必要性がある。
【０４５９】
本開示は、驚くべきことに、操作された細菌細胞を含む医薬組成物を用いてプロピオネートの異常な異化を伴う代謝性疾患、例えば、ＰＡおよびＭＭＡを治療することができるということを実証する。
【０４６０】
一実施形態では、ＰＡを有する対象は、ＰＣＣＡ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＰＡを有する対象は、ＰＣＣＢ遺伝子の突然変異を有する。
【０４６１】
一実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＭＵＴ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＭＭＡＡ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＭＭＡＢ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＭＭＡＣＨＣ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＭＭＡＤＨＣ遺伝子の突然変異を有する。他の実施形態では、ＭＭＡを有する対象は、ＬＭＢＲＤ１遺伝子の突然変異を有する。
【０４６２】
他の態様では、本開示は、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロン酸ＣｏＡの血漿中レベルを低下させる方法であって、細菌細胞を含む医薬組成物を前記対象に投与することによって前記対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロン酸ＣｏＡの血漿中レベルを低下させることによる方法を提供する。一実施形態では、対象は、プロピオネートの異化を伴う疾患または障害を有する。一実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害は、プロピオネートの異常な異化を伴う代謝性障害である。他の実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害は、プロピオン酸血症である。他の実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害は、メチルマロン酸血症である。他の実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害は、ビタミンＢ１２欠損症である。
【０４６３】
いくつかの実施形態では、本開示は、これらの疾患に関連する１つまたは複数の症状を低減、改善または消失させる方法を提供し、前記症状は、発作、嘔吐、嗜眠、筋緊張低下、脳症、発育遅延、成長障害、肝不全、および／または続発性高アンモニア血症を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾患は、他の状態、例えば肝疾患、の二次的なものでもある。
【０４６４】
特定の実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの異化に関連する疾患を治療するために、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡを異化することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、食事性タンパク質と同時に送達される。他の実施形態では、細菌細胞は、Ｌ−カルニチンと同時に送達される。いくつかの実施形態では、細菌細胞および食事性タンパク質は、絶食またはタンパク質制限ダイエットの期間後に送達される。これらの実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害、例えば、ＰＡまたはＭＭＡに罹患している患者は、実質的に普通の食事、または無タンパク質もしくは超低タンパク質食より制限の緩い食事を再開することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、プロピオネートの異化に関連する疾患を治療するために、さらなる源、例えば血液、からのプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡを異化することができる。これらの実施形態では、細菌細胞を食事性タンパク質と同時に送達する必要がなく、勾配、例えば、血液から消化管への勾配が発生し、操作された細菌は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡを異化し、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡの血漿中レベルを低下させる。
【０４６５】
方法は、本明細書に記載の細菌の少なくとも１つの遺伝子操作種、菌株または亜型を含む医薬組成物を調製し、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、経口投与、例えば、液体懸濁剤で経口投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ゲルキャップ中で凍結乾燥し、経口投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、胃管または胃シャントにより投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、直腸に、例えば、かん腸剤により投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、局所、腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内投与する。
【０４６６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を投与して、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低下させる。他の実施形態では、本開示の方法は、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下させる。いくつかの実施形態では、低下は、医薬組成物の投与前および後の対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを比較することにより測定する。一実施形態では、対象の消化管内のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させる。他の実施形態では、対象の血液中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させる。他の実施形態では、対象の血漿中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させる。他の実施形態では、対象の脳内のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを低下させる。
【０４６７】
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を投与して、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを正常レベルに低下させる。他の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を投与して、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを正常レベル未満に低下させる。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害、例えば、ＰＡまたはＭＭＡを治療する方法は、状態または障害の１つまたは複数の症状が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上改善することを可能にする。いくつかの実施形態では、プロピオネートの異化を伴う障害、例えば、ＰＡまたはＭＭＡを治療する方法は、状態または障害の１つまたは複数の症状が少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍改善することを可能にする。
【０４６９】
医薬組成物の投与前、投与中および投与後に、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルを、血液、血清、血漿、尿、腹水、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜剥離物などの生物学的試料、組織から採取した試料、ならびに／または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸および肛門管のうちの１つもしくは複数の内容物から採取した試料において測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを低下させるための、本開示の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡを検出できないレベルに低下させるための、本開示の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象におけるプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／もしくはメチルマロニルＣｏＡ濃度を、検出できないレベルに、または治療前の対象のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／もしくはメチルマロニルＣｏＡレベルの約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％未満に低下させるための、本開示の組成物の投与を含み得る。
【０４７０】
いくつかの実施形態では、操作された細菌細胞は、哺乳動物消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でプロピオネート異化酵素を産生して、血液または血漿中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約６分の１、少なくとも約７分の１、少なくとも約８分の１、少なくとも約９分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、または少なくとも約５０分の１に低下させる。
【０４７１】
特定の非改変細菌は、認識できるプロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡプロセッシングレベルを有さないことになる。これらの細菌の遺伝子改変形態を用いる実施形態では、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのプロセッシングが外因性環境条件下で認識できることになる。
【０４７２】
プロピオネート、プロピオニルＣｏＡ、および／またはメチルマロニルＣｏＡレベルは、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｇｕｅｎｚｅｌら、２０１３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒ．、２１巻（７号）：１３１６〜１３２３頁に記載されているような採血および質量分析により測定することができる。いくつかの実施形態では、プロピオネート異化酵素、例えば、ＰｒｐＢＣＤＥの発現を当技術分野で公知の方法により測定する。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素活性を当技術分野で公知の方法により測定して、ＰｒｐＢＣＤＥ活性を評価する（上記プロピオネート異化酵素の節参照）。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素活性を当技術分野で公知の方法により測定して、本明細書に記載のＰＨＡ経路回路の活性を評価する。他の実施形態では、プロピオネート異化酵素活性を当技術分野で公知の方法により測定して、本明細書に記載のＭＭＣＡ回路の活性を評価する。
【０４７３】
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルである。遺伝子操作細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子により（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）、または投与の数時間もしくは数日後にキルスイッチの活性化により、破壊され得る。それ故、操作された細菌を含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与され得る。マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでニッスルの滞留期間を決定することができる。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、投与後数時間または数日以内に殺滅されず、増殖し、消化管にコロニー形成し得る。
【０４７４】
一実施形態では、細菌細胞を対象に１日１回投与する。他の実施形態では、細菌細胞を対象に１日２回投与する。他の実施形態では、細菌細胞を対象に１日３回投与する。他の実施形態では、細菌細胞を食事と併用で対象に投与する。他の実施形態では、細菌細胞を食事前に対象に投与する。他の実施形態では、細菌細胞を食事後に対象に投与する。医薬組成物の用量および投与頻度は、症状の重症度および障害の進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効用量および／または投与頻度は、担当臨床医が選択することができる。
【０４７５】
本明細書で開示する方法は、単独での、または１つもしくは複数の追加の治療、例えば、フェニルブチレート、チアミン補給、Ｌ−カルニチン、および／または低タンパク質食と併用での、組成物の投与を含み得る。医薬組成物は、単独で、または１つもしくは複数の追加の治療薬と併用で投与することができる。
【０４７６】
１つもしくは複数の追加の治療薬の選択に際して考慮すべき重要な事柄は、薬剤（複数可）が細菌に適合すべきであること、例えば、薬剤（複数可）が細菌に干渉も殺滅もしてはならないことである。いくつかの実施形態では、医薬組成物を食物とともに投与する。代替実施形態では、食物を摂食する前または後に医薬組成物を投与する。医薬組成物を、１つまたは複数の食事改善、例えば、低タンパク質食およびアミノ酸補給と併用して投与することができる。医薬組成物の用量および投与頻度は、症状の重症度および障害の進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効量および／または投与頻度は、担当臨床医が選択することができる。
【０４７７】
方法は、組成物の投与前に対象から血漿試料を単離すること、および試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを決定することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、組成物の投与後に対象から血漿試料を単離すること、および試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを決定することをさらに含み得る。
【０４７８】
一実施形態では、方法は、対象への組成物の投与後の対象からの血漿試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを、対象への組成物の投与前の対象からの血漿試料と比較することをさらに含む。一実施形態では、組成物の投与後の対象からの血漿試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベル低下は、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡの血漿中レベルが低下され、それにより対象におけるプロピオネートの異化を伴う障害が治療されることを示す。一実施形態では、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡの血漿中レベルは、医薬組成物の投与後の試料において、医薬組成物の投与前の試料における血漿中レベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０＄、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下される。他の実施形態では、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡの血漿中レベルは、医薬組成物の投与後の試料において、医薬組成物の投与前の試料における血漿中レベルと比較して少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１に低下される。
【０４７９】
一実施形態では、方法は、組成物の投与後の対象からの血漿試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを、プロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡの対照レベルと比較することをさらに含む。
【０４８０】
方法は、組成物の投与前に対象から血漿試料を単離すること、および試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを決定することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、組成物の投与後に対象から血漿試料を単離すること、および試料中のプロピオネート、プロピオニルＣｏＡおよび／またはメチルマロニルＣｏＡのレベルを決定することをさらに含み得る。
【０４８１】
他の実施形態では、方法は、対象への組成物の投与後の対象からの血漿試料中のメチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／もしくはアセチルカルニチンのレベル、ならびに／またはプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比を、対象への組成物の投与前の対象からの血漿試料と比較することをさらに含む。一実施形態では、組成物の投与後の対象からの血漿試料中のメチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／もしくはアセチルカルニチンのレベル低下、ならび／またはプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比の低下は、メチルシトレート、プロピオニルカルニチン、および／またはアセチルカルニチンの血漿中レベルが低下されることににより対象におけるプロピオネートの異化を伴う障害が治療されることを示す。一実施形態では、メチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／もしくはアセチルカルニチンの血漿中レベル、ならび／またはプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比は、医薬組成物の投与後の試料において、医薬組成物の投与前の試料における血漿中レベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０＄、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下される。他の実施形態では、メチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／もしくはアセチルカルニチンの血漿中レベル、ならび／またはプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比は、医薬組成物の投与後の試料において、医薬組成物の投与前の試料における血漿中レベルと比較して少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１に低下される。
【０４８２】
一実施形態では、方法は、組成物の投与後の対象からの血漿試料中のメチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／もしくはアセチルカルニチンのレベル、ならび／またはプロピオニルカルニチンのアセチルカルニチンに対する比を、メチルシトレート、プロピオニルカルニチンおよび／またはアセチルカルニチンの対照レベルと比較することをさらに含む。
【実施例】
【０４８３】
以下の実施例により本開示をさらに例証するが、以下の実施例をいかなる点においても限定とみなすべきではない。本出願の至る所で引用する、参照文献、発行特許および公開特許出願を含む、すべての引用参考文献の内容は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。本明細書に付属するすべての図および表の内容もまた参照によって本明細書に明確に組み込まれることをさらに理解されたい。
操作された細菌細胞の開発
【実施例１】
【０４８４】
プロピオネート異化酵素およびプロピオネート輸送体（ｐｒｐＢＣＤＥオペロンおよびｍｔＣ遺伝子）をコードするプラスミドの構築
大腸菌ニッスル株からのｐｒｐＢＣＤＥオペロン（配列番号４５）またはサルモネラ属からのｐｒｐＢＣＤＥオペロン（配列番号９４）のいずれかを合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、Ｔｅｔプロモーターに融合させ、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリにより高コピープラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎにクローニングし、本明細書に記載の通りの大腸菌ＤＨ５αに形質転換させて、プラスミドｐＴｅｔ−ｐｒｐＢＣＤＥを作製する。Ｔｅｔプロモーターに融合したコリネバクテリウム属のｍｃｔＣ遺伝子（配列番号８８）を合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、高コピープラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎにクローニングして、プラスミドｐＴｅｔ−ｍｃｔＣを作製する。
【０４８５】
特定の構築物では、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンをＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結し、それを強いリボソーム結合部位配列にさらに融合させてもよい。効率的な翻訳のために、オペロンにおける各合成遺伝子をＴ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対リボソーム結合部位により離隔した。各遺伝子カセットおよび調節領域構築物を高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上で発現させる。
【０４８６】
特定の実施形態では、構築物を大腸菌ニッスルにおける細菌ゲノムの以下の挿入部位のうちの１つまたは複数に挿入する：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を用いることができる（例えば、図３２を参照されたい）。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間であってもよい。挿入の部位における、その挿入部位と相同であり、かつプロピオネート構築物と相同である、ＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含有する線状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを下で述べるように実施する。得られた大腸菌ニッスル細菌を、プロピオネート生合成カセットを発現してプロピオネートを産生するように遺伝子操作する。
【実施例２】
【０４８７】
プロピオネート異化酵素をコードするプラスミドの構築（ＰＨＡ経路）
最初に、大腸菌ニッスルｐｒｐＥ遺伝子およびアシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９からのｐｈａＢＣＡ遺伝子を大腸菌ニッスルにおける発現のためにコドン最適化し、合成し、図１０Ｃおよび図１１に示すように、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリによりコピー数約１０のプラスミドｐ１５Ａ−Ｋａｎである高コピープラスミドの単一オペロンにおけるａＴｃ誘導性プロモーターの制御下においた。対応する構築物配列を表１２に収載する。
【０４８８】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１１】
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【表１２−１２】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−１５】
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【０４８９】
プラスミドを本明細書に記載の通りの大腸菌ＤＨ５αに形質転換させてプラスミドｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡを作製した。
【０４９０】
特定の構築物では、ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡオペロンをＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結し、それを強いリボソーム結合部位配列にさらに融合させてもよい。効率的な翻訳のために、２０〜３０ｂｐリボソーム結合部位をオペロンにおける各合成遺伝子のために含めた。各遺伝子カセットおよび調節領域構築物を高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上で発現させる。
【０４９１】
特定の実施形態では、構築物を大腸菌ニッスルにおける細菌ゲノムの以下の挿入部位のうちの１つまたは複数に挿入する：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を用いることができる（例えば、図３２を参照されたい）。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間であってもよい。挿入の部位における、挿入部位と相同であり、かつプロピオネート構築物と相同である、ＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含有する線状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを下で述べるように実施する。得られた大腸菌ニッスル細菌を、プロピオネート生合成カセットを発現してプロピオネートを産生するように遺伝子操作する。
【実施例３】
【０４９２】
プロピオネート異化酵素をコードするプラスミドの構築（ＭＭＣＡ経路）
メチルマロニル−ＣｏＡ経路（ＭＭＣＡ）は、哺乳動物経路におけるものと同種の反応を行う。遺伝子ａｃｃＡ（ストレプトマイセス・セリカラーに由来する）、ｐｃｃＢ（ストレプトマイセス・セリカラーに由来する）、ｍｍｃＥ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する）、およびｍｕｔＡＢ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する）を、大腸菌ニッスルにおける発現のためにコドン最適化した。２つの構築物を合成し、第１の構築物は、誘導性Ｐｔｅｔプロモーターの制御下のｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１を含むカセットを有し、第２の構築物は、第２の誘導性プロモーターであるＰａｒａの制御下のｍｍｃＥおよびｍｕｔＡＢを含むカセットを有した（図１５Ｃおよび図１６Ａおよび図１６Ｂに示す通り）。
【０４９３】
構築物をＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリによりプラスミドｐ１５ａ−Ｋａｎ（ｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ｐｃｃＢ−ａｃｃＡ１）およびＣｏｌＥ１−Ａｍｐ（ｐＡｒａ−ｍｍｃＥ−ｍｕｔＡＢ）にクローニングし、本明細書に記載の通りの大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。ＭＭＣＡ経路回路の配列を図１３に収載する。
【０４９４】
【表１３−１】
2018521674.tif 000032
【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
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【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【表１３−１９】
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【表１３−２０】
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【表１３−２１】
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【表１３−２２】
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【表１３−２３】
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【表１３−２４】
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【表１３−２５】
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【表１３−２６】
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【表１３−２７】
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【表１３−２８】
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【表１３−２９】
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【０４９５】
特定の構築物では、ｐｒｐＥ  ｐｃｃＢ，−ａｃｃＡ１およびｍｍｃＥ−ｍｕｔＡＢカセットをＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結し、それを強いリボソーム結合部位配列にさらに融合させてもよい。効率的な翻訳のために、１５塩基対リボソーム結合部位をオペロンにおける各合成遺伝子のために設計した。各遺伝子カセットおよび調節領域構築物を高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上で発現させる。
【０４９６】
特定の実施形態では、構築物を大腸菌ニッスルにおける細菌ゲノムの以下の挿入部位のうちの１つまたは複数に挿入する：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を用いることができる（例えば、図３２参照）。挿入部位は、ゲノム内のどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を作製するために）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製部位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間であってもよい。挿入の部位における、挿入部位と相同であり、かつプロピオネート構築物と相同である、ＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含有する線状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを下で述べるように実施する。得られた大腸菌ニッスル細菌を、プロピオネート生合成カセットを発現してプロピオネートを産生するように遺伝子操作する。
【実施例４】
【０４９７】
プロピオネートの輸送体および／またはプロピオネート異化酵素を含む、操作された細菌の作製
ｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡプラスミド（および本明細書に記載の他のプラスミド）を大腸菌ニッスル、ＤＨ５α、またはＰＩＲ１に形質転換させた。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌（ニッスル、ＤＨ５αまたはＰＩＲ１）の一夜培養物を４ｍＬのＬＢで１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。次いで、１ｍＬの培養物を１．５ｍＬ小遠心管で１分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去する。次いで、細胞を予冷１０％グリセロールで３回洗浄し、４０ｕＬの予冷１０％グリセロールに再懸濁する。エレクトロポレーターを１．８ｋＶに設定する。１ｕＬのｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡミニプレップを細胞に加え、ピペッティングすることによって混合し、滅菌し冷却した１ｍｍキュベットにピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。５００ｕＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３７℃で１時間インキュベートする。ｐＴｅｔ−ｐｒｐＢＣＤＥおよびｐＴｅｔ−ｍｃｔＣのための５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢプレート上に細胞を広げる。
【０４９８】
代替実施形態では、ｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセットまたはｐＦＮＲ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセットを相同的組換えによりニッスルゲノムに挿入することができる（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。
【０４９９】
合成したｐＴｅｔ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡまたはｐＦＮＲ−ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセットを染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、まず、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ニッスル遺伝子座、例えば、ｌａｃＺ遺伝子座に相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ起源プラスミドｐＫＤ３に加えた。これは、ニッスルゲノムにおける遺伝子座、例えば、ｌａｃＺ遺伝子座に組み込まれるこれらの相同性アーム間にクローニングされるＤＮＡを標的とする。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、これらのアーム間の断片をクローニングする。ＰＣＲを用いて、このプラスミドから、相同性アームの全配列はもちろんそれらの間のｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセットも含む領域を増幅した。このＰＣＲ断片を用いて、ラムダレッドレコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含有する菌株であるエレクトロコンピテントニッスル−ｐＫＤ４６を、形質転換させる。形質転換後、細胞を２時間増殖させた後、２０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを用いて３７℃で平板培養する。３７℃での増殖もｐＫＤ４６プラスミドを治癒させる。カセットを含有する形質転換細胞は、クロラムフェニコール耐性であり、ｌａｃマイナスであった。
【実施例５】
【０５００】
ラムダレッド組換え
ラムダレッド組換えを用いて、例えば、大腸菌ニッスルにおいて１つまたは複数のｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセット（または本明細書に記載の他のカセット）を発現させるように、染色体改変を施す。ラムダレッドは、バクテリオファージラムダに由来する組換え酵素を用いて、カスタムＤＮＡの断片を大腸菌の染色体に挿入する手法である。ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ニッスル宿主株に導入する。大腸菌ニッスル細胞をＬＢ培地中で一夜増殖させる。一夜培養を５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペッティングし、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングすることによって混合する。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一夜インキュベートする。
【０５０１】
上に示した所望のｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセット（複数可）を含むＤＮＡ配列を遺伝子合成会社に発注する。ラムダ酵素を用いて、この構築物を相同的組換えにより大腸菌ニッスルのゲノムに挿入する。構築物は、そのＤＮＡ配列に基づいて大腸菌ニッスルのゲノムにおける特定の部位に挿入される。構築物を特定の部位に挿入するために、構築物に隣接する相同ＤＮＡ配列を同定し、該相同ＤＮＡ配列は、配列の両側に約５０塩基を含む。相同配列は、合成遺伝子の一部として注文する。あるいは、相同配列は、ＰＣＲにより加えることができる。構築物は、組換えによって除去することができる抗生物質耐性マーカーを含む。得られる構築物は、上流に相同性の約５０塩基、組換えによって除去することができるカナマイシン耐性マーカー、ｐｒｐＥ−ＰｈａＢＣＡカセット（複数可）、および下流に相同性の約５０塩基を含む。
【実施例６】
【０５０２】
ＰＣＣＡＡ１３８Ｔハイポモルフマウスモデルにおけるプロピオン酸血症バイオマーカーの確立
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、プロピオン酸血症のモデルとして用いるためのＰＣＣＡＡ１３８Ｔハイポモルフマウスを入手した。最初に、プロピオン酸血症のバイオマーカーを確立した。
【０５０３】
ＰＣＣＡＡ１３８ＴマウスおよびＦＶＢ（親）対象（１０〜１２週齢）を通常食で飼育した。血液および尿を採取し、プロピオン酸血症の公知のバイオマーカーについてアッセイした。血液中のプロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン比、プロピオネート濃度、および２−メチルシトレート濃度を、本明細書に記載の通り質量分析により決定した。結果を図６Ａ〜図６Ｃに示す。尿については、プロピオニル−グリシン、チグリルグリシン、および２−メチルシトレートを本明細書に記載の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。結果を図６Ｄ〜図６Ｆに示す。
【実施例７】
【０５０４】
ＰＣＣＡＡ１３８Ｔハイポモルフマウスモデルにおけるプロピオン酸の腸再循環
プロピオネートが腸再循環されるかどうかを判断するために、アミノ酸について仮説が立てられ、示されている方法（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｅｎｚｙｍｅ−ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ａｓ  ｉｎ  ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ；Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５年；２３号（１巻）：１〜２１頁参照）と同様の方法で、ＰＣＣＡＡ１３８Ｔマウスモデルを用いて消化管の様々なコンパートメントにおいて標識プロピオネートの血流からの腸内変換レベルを測定した。
【０５０５】
すべてのＰＣＣＡＡ１３８Ｔマウス（１０〜１２週齢）は、Ｔ０に０．１ｍｇ／ｇの同位体プロピオン酸を皮下注射により投与するまで、通常の飼料で飼育した。
【０５０６】
各時点（ＳＣ注射の０、３０分、１時間および２時間後）に動物［［（ｎ＝Ｘ）］］を安楽死させ、血液、小腸、大腸および盲腸を除去し、収集した。各腸部分の切片を０．５ｍｌの冷ＰＢＳでフラッシュし、別個の１．５ｍｌ管に収集した。盲腸を採取し、内容物をしぼり出し、０．５ｍｌの冷ＰＢＳでフラッシュし、１．５ｍｌ管に収集した。血液を下顎採血により採取した。血液、腸コンパートメントおよび盲腸における内因性の放射標識プロピオネートの濃度を本明細書に記載の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。図７Ａ〜図７Ｄに示す通り、ＳＣ注射した同位体プロピオン酸は、３０分以内に血液、小腸および盲腸において非常に低レベルで認められた。これは、プロピオネートがＰＡ／ＭＭＡ動物モデルにおいて血液から腸コンパートメントに循環したことを示す。
【実施例８】
【０５０７】
ＰＡバイオマーカーへの細菌の寄与
抗生物質治療ＰＡ患者での実験は、消化管における細菌の代謝がプロピオネートの約３０％に寄与することを示唆する。ＰＡバイオマーカーレベルへの細菌の寄与は、ＰＣＣＡＡ１３８Ｔモデルにおいて微生物叢集団を有意に（＞９９．９％）低減させる抗生物質治療の効果を測定することにより評価する。
【０５０８】
ＰＣＣＡＡ１３８Ｔマウスを研究１日目まで普通の飼料で飼育する。１日目に、血漿、尿、糞便飼料を採取し、半数のマウスの水に抗生物質（アンピリシン（１ｇ／Ｌ）、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ））を添加する。８日目に、血漿、尿，糞便飼料（ｎ＝４）を採取し、代謝物レベルを本明細書に記載の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量する。細菌レベルは、ニッスルおよび全細菌からのＤＮＡを増幅するプライマーを用いてｑＰＣＲにより定量する。代謝物（プロピオネート、プロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン比；プロピオニルカルニチン、２−メチルシトレート、アセチルカルニチン）を本明細書に記載の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量する。
【実施例９】
【０５０９】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）経路プロピオネート消費アッセイ
ＰＨＡ経路は、ポリマーとして炭素を貯蔵するために用いられる異種細菌経路であり、プロピオネートを消費するその能力について評価した。
【０５１０】
本明細書に記載の通り、大腸菌ニッスルｐｒｐＥ遺伝子、およびアシネトバクター属菌種ＲＡ３８４９からのｐｈａＢＣＡ遺伝子（大腸菌ニッスルにおける発現のためにコドン最適化した）を、図１０Ｃおよび図１１に示すように、高コピープラスミドの単一オペロンにおけるａＴｃ誘導性プロモーターの制御下においた。対応する構築物配列を実施例２の表１２に収載してある。次に、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を含む遺伝子操作細菌のプロピオネート消費速度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
【０５１１】
ｔｅｔプロモーターにより駆動されるｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を含むプラスミドで形質転換させた大腸菌ニッスルの培養物、および野生型対照ニッスルの培養物を一夜増殖させ、次いでＬＢで１：２００に希釈した。ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ構築物プラスミドを含有する菌株の培養物にＡＴＣを１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えて、ｐｒｐＥおよびｐｈａＢＣＡ遺伝子の発現を誘導した。次いで、細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。２時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、洗浄し、グルコース（０．２％）およびプロピオネート（２〜８ｍＭ）を添加した１ｍＬのＭ９培地に約１０９ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度で再懸濁した。本明細書に記載の通りのプロピオネート定量のために０時間、１．５時間、３時間および４．５時間の時点でアリコートを採取した。図１２に示す通り、ｔｅｔプロモーターにより駆動されるｐｒｐＥおよびｐｈａＢＣＡ遺伝子を発現する遺伝子操作細菌は、プロピオネートを除去する効率が野生型ニッスルまたは未誘導の操作菌株より高かった。異化速度は、１０９細胞当り０．３９６〜１．４ｕｍｏｌ／時であると算定した。
【実施例１０】
【０５１２】
混合有機酸でのＰＨＡ経路の性能
アセテートまたはブチレート（これらは結腸内に大量に存在する）がＰＨＡ経路によるプロピオネート消費に影響を及ぼすかどうかを判断するために、結腸比（プロピオネート：アセテート：ブチレート、約６：１０：４）を模倣すべく短鎖脂肪酸の混合物でＰＨＡアッセイを行った。
【０５１３】
ｔｅｔプロモーターにより駆動されるｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を含むプラスミドで形質転換させた大腸菌ニッスルの培養物（実施例９に記載の通り）および野生型対照ニッスルの培養物を一夜増殖させ、次いでＬＢで１：２００に希釈した。ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ構築物プラスミドを含有する菌株の培養物および野生型ニッスル培養物にＡＴＣを加え、細胞を２時間インキュベートした。細胞を遠沈し、グルコース（０．２％）およびプロピオネート（６ｍＭ）、ブチレート（４ＭＭ）、およびアセテート（１０ｍＭ）を添加した１ｍＬのＭ９培地に約１０９ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度で実施例９に記載の通りに再懸濁した。本明細書に記載の通りのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるプロピオネート定量のために０時間、１．５時間、３時間および４．５時間の時点でアリコートを採取した。図１３Ａに示す通り、ｔｅｔ−ｐｒｐＥおよびｐｈａＢＣＡ遺伝子カセットを発現する遺伝子操作細菌は、野生型ニッスルと比較してプロピオネートの濃度を、実施例９においてアセテートおよびブチレートの非存在下で観察された速度と同様の速度で低下させた。異化速度は、１０９細胞当り０．３９６〜１．４ｕｍｏｌ／時であると算定した。
【０５１４】
また、遺伝子操作細菌は、野生型ニッスルと比較してアセテートレベルにもブチレートレベルにも影響を及ぼさなかった（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。これは、ＰＨＡ経路がアセテートおよびブチレート濃度に有意な影響を与えないことを示す。
【実施例１１】
【０５１５】
ＰＨＡ経路の最適化
ＰＨＡ経路を最適化するために、かつこの経路における律速ステップを決定するために、ａＴｃ誘導性ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンを発現する基礎菌株に、図１４Ａ〜図１４Ｄに示す通り、アラビノース誘導性プロモーターの制御下のオペロン遺伝子のうちの１つを含有する構築物を発現する第２のプラスミドを補給した。表１４は、追加のプラスミドからの構築物配列を収載するものである。
【０５１６】
このアッセイでは、単独のｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡオペロンを誘導して、またはｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡプラスミドと、この経路における遺伝子のうちの１つについての追加のコピーを有するアラビノース誘導性プラスミドとの両方を誘導して、これらの遺伝子のいずれかについての追加の発現が、プロピオネート消費を増加させることができるかどうかを評価した。野生型ニッスルを参照のために含めた。
【０５１７】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【０５１８】
ｔｅｔ−ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を含むプラスミドと第２のプラスミド（ｐＡｒａ−ｐｒｐＥまたはｐＡｒａ−ｐｈａＢまたはｐＡｒａ−ｐｈａＣまたはｐＡｒａ−ｐｈａＡのうちの１つを含有する）とで形質転換させた大腸菌ニッスルの培養物を一夜増殖させ、次いでＬＢで１：２００に希釈した。野生型対照ニッスル培養物も参照として増殖させた。ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加えて、ｔｅｔ−ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ構築物遺伝子カセットを誘導した。ｔｅｔ−ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を含有する４つの菌株の培養物の半分にアラビノースを１０ｍＭの濃度で加えて、第２のプラスミドを誘導した。細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。２時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、洗浄し、０．５％グルコースおよび８ｍＭプロピオネートを加えた１ｍＬのＭ９培地に約１０９ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度で再懸濁した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるプロピオネート定量のために０時間、１時間、２時間、３時間、４時間および５時間の時点でアリコートを採取した。図１４Ａ〜図１４Ｄに示す通り、プロピオネート消費速度は、より多くのｐｈａＣが発現する場合に最も有意に上昇し、これは、この経路が、最初のｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡプラスミドからのＰｈａＣレベルを上昇させることにより改善されることを示唆している。
【０５１９】
特定の実施形態では、ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ回路を、ｐｈａＣ翻訳開始部位の上流に強いＲＢＳを加えることにより、さらに改変する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ遺伝子カセットと、ｐｈａＡ遺伝子を含む１つまたは複数の追加のカセットとを含む。
【実施例１２】
【０５２０】
ＭＭＣＡ経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
メチルマロニル−ＣｏＡ経路を、プロピオネートを異化するその能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。実施例３に記載の通り、遺伝子ａｃｃＡ（ストレプトマイセス・セリカラーに由来する）、ｐｃｃＢ（ストレプトマイセス・セリカラーに由来する）、ｍｍｃＥ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する）、およびｍｕｔＡＢ（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒに由来する）を、大腸菌ニッスルにおける発現のためにコドン最適化した。誘導性Ｐｔｅｔプロモーターの制御下のｐｒｐＥ、ｐｃｃＢ、ａｃｃＡ１を含むカセットを有する第１のプラスミド、ならびに第２の誘導性プロモーターであるＰａｒａの制御下のｍｍｃＥおよびｍｕｔＡＢを含むカセットを有する第２のプラスミドである、２つのプラスミドを作製した（図１５Ｃおよび図１６Ａおよび図１６Ｂに示す通り）。したがって、経路の誘導には、ａＴｃおよびアラビノースを加えることが必要である。ＭＭＣＡ経路回路の配列は、実施例３の表１３に収載してある。
【０５２１】
ＭＭＣＡ回路を有する第１および第２のプラスミドを含む大腸菌ニッスル培養物と野生型対照ニッスルの培養物をＬＢおよび５０ｕｇ／ｍＬのアンピリシン中で一夜増殖させ、次いでＬＢで１：１００に希釈した。適切な抗生物質を用いて細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら初期対数期まで増殖させた。無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）およびアラビノース（１０ｍＭ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えて構築物の発現を誘導し、細菌をさらに２時間増殖させた。次いで、細菌をペレット化し、洗浄し、最小培地に約１０９ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁し、０．５％グルコースおよびプロピオネート（６ｍＭ）を添加した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるプロピオネート定量のために０時間、２時間、４時間、１７時間および１８時間の時点でアリコートを取り出した。
【０５２２】
ＰＨＡ経路の誘導のために、培養物を増殖させ、誘導し、実施例９に記載の通りアッセイした。
【０５２３】
図１８に示す通り、ＭＭＣＡ回路の発現は、培地中のプロピオネート濃度を低下させ、これは、これらの回路がプロピオネート触媒作用を促進することを示す。プロピオネートアッセイを約１０９ｃｆｕ／ｍｌの誘導済み細菌で開始し、プロピオネート消費速度は、メチルマロニル−ＣｏＡ経路回路を発現する菌株において約３．８μＭ／時／１０９細菌であった。全体的に見て、ＭＭＣＡ経路は、プロピオネート破壊の点でＰＨＡ経路より有効であるように思われる。
【実施例１３】
【０５２４】
スクシネート輸出体回路と組み合わせたＭＭＣＡ経路回路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
スクシネート輸出体が、ＭＭＣＡ経路によって異化されるプロピオネートの量を増加させることができるかどうかを判断するために、ｓｕｃＥ１スクシネート輸出体（コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する）を含む構築物（図１７Ｂおよび図１７Ｄに示す通り）、または大腸菌ｄｃｕＣスクシネート輸送体を含む構築物（図１７Ｅ）、または両方の輸送体を含む構築物（図１７Ｆ）を作製した。ｓｕｃＥ１構築物をニッスル染色体内のＰａｒａ（アラビノース誘導性）の制御下においた。このノックインはまた、ａｒａＢＡ遺伝子とａｒａＤ遺伝子の一部とを欠失させ、その結果、大腸菌によるアラビノースの代謝が有効に消失された。
【０５２５】
輸出体構築物の配列を表１５に示す。単独での、または組み込まれたｓｕｃＥ１回路と組み合わせた、ＭＭＣＡ経路回路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１２および本明細書の他の箇所に記載の通りに比較した。
【０５２６】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【表１５−１４】
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【０５２７】
【実施例１４】
【０５２８】
２−メチルシトレート経路の活性
遺伝子操作細菌によるプロピオネート消費に対する２−メチルシトレート経路の適合性を判断するために、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤおよびｐｒｐＥ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下で発現される回路を作製する。２−メチルシトレート経路配列を表１６に示す。
【０５２９】
【表１６−１】
2018521674.tif 000081
【表１６−２】
2018521674.tif 000082
【表１６−３】
2018521674.tif 000083
【表１６−４】
2018521674.tif 000084
【表１６−５】
2018521674.tif 000085
【表１６−６】
2018521674.tif 000086
【表１６−７】
2018521674.tif 000087
【表１６−８】
2018521674.tif 000088
【表１６−９】
2018521674.tif 000089
【表１６−１０】
2018521674.tif 000090
【表１６−１１】
2018521674.tif 000091
【表１６−１２】
2018521674.tif 000092
【表１６−１３】
2018521674.tif 000093
【表１６−１４】
2018521674.tif 000094
【表１６−１５】
2018521674.tif 000095
【表１６−１６】
2018521674.tif 000096
【表１６−１７】
2018521674.tif 000097
【０５３０】
次に、２−メチルシトレートサイクル回路を含む遺伝子操作細菌のプロピオネート消費速度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価する。
【０５３１】
ｔｅｔプロモーターにより駆動されるｐｒｐＢＣＤＥ回路を含むプラスミドで形質転換させた大腸菌ニッスルの培養物、および野生型対照ニッスルの培養物を一夜増殖させ、次いでＬＢで１：２００に希釈する。ｐｒｐＥ−ｐｈａＢＣＡ構築物プラスミドを含有する菌株の培養物にＡＴＣを１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えて、ｐｒｐＢＣＤＥ遺伝子の発現を誘導し、細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させる。２時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、洗浄し、グルコース（０．５％）およびプロピオネート（８ｍＭ）を添加した１ｍＬのＭ９培地に約１０９ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度で再懸濁する。プロピオネート定量のために０時間、２時間および４時間の時点でアリコートを採取し、異化速度を計算する。
【実施例１５】
【０５３２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細菌上清中のプロピオネートの定量
試料調製
プロピオン酸ナトリウム保存液（１０ｍｇ／ｍＬ）を水を用いて調製し、１．５ｍＬ小遠心管に小分けし（１００μＬ）、−２０℃で保存した。保存溶液から、水中のプロピオン酸ナトリウム標準（１０００、５００、２５０、１００、２０、４、０．８μｇ／ｍＬ）を調製した。次に、２５μＬの試料（細菌上清および標準）を、丸底９６ウエルプレートにおいて、１０μｇ／ｍＬのプロピオン酸ナトリウム−ｄ５を含有する７５μＬのＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（４５：３０、ｖ／ｖ）と混合した。プレートをＰｉｅｒｃｅＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合した。
【０５３３】
Ｖ型底９６ウエルポリプロピレンプレートにおいて、５μＬの希釈試料を９５μＬの誘導体化ミックス（１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．０）中の２０ｍＭ  ＥＤＣ［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩］および２０ｍＭ  ＴＦＥＡ［２，２，２−トリフルオロエチルアミン塩酸塩］）に加えた。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合した。試料を誘導体化のために室温で１時間インキュベートし、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０５３４】
次に、２０μＬのその溶液を丸底９６ウエルプレートに移し、１８０ｕＬの０．１％ギ酸水溶液を試料に加えた。プレートを上述のように熱融着させ、混合した。
【０５３５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
誘導体化プロピオネートを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣ法の詳細を表１７および表１８に記載する。タンデム質量分析の詳細を表１９に記載する。
【０５３６】
【表１７】
2018521674.tif 000098
【０５３７】
【表１８】
2018521674.tif 000099
【０５３８】
【表１９】
2018521674.tif 000100
【実施例１６】
【０５３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿および尿中のアセチルカルニチンおよびプロピオニルカルニチンの定量
試料調製
アセチルカルニチンおよびプロピオニルカルニチン保存液（１０ｍｇ／ｍＬ）を水を用いて調製し、１．５ｍＬ小遠心管に小分けし（１００μＬ）、−２０℃で保存した。水中の２５０、１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍＬの標準を調製した。試料（１０μＬ）および標準を、Ｖ型底９６ウエルプレートにおいて、９０μＬのＡＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６０：２０：１０、ｖ／ｖ）と混合した（最終溶液中に１μｇ／ｍＬのアセチルカルニチン−ｄ３およびプロピオニルカルニチン−ｄ３を含有する）。プレートをＡｌｕｍＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、よく混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、２０μＬのその溶液を丸底９６ウエルプレートに移し、１８０ｕＬの０．１％ギ酸水溶液を試料に加えた。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートを用いて熱融着させ、十分に混合した。
【０５４０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
プロピオニルカルニチンおよびアセチルカルニチンを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣ法の詳細を表２０および表２１に記載する。タンデム質量分析の詳細を表２２に記載する。
【０５４１】
【表２０】
2018521674.tif 000101
【０５４２】
【表２１】
2018521674.tif 000102
【０５４３】
【表２２】
2018521674.tif 000103
【実施例１７】
【０５４４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿および尿中のプロピオネート、２−メチルシトレート、プロピオニルグリセリンおよびチグロイルグリシンの定量
試料調製
１０ｍｇ／ｍＬのプロピオン酸ナトリウム、２−メチルシトレート、プロピオニルグリシンおよびチグロイルグリシンの保存液を水を用いて調製し、１．５ｍＬ小遠心管に小分けし（１００μＬ）、−２０℃で保存した。５００、２５０、１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍＬの各保存液の標準を水を用いて調製した。氷上で、１０μＬの試料（および標準）をＶ型底９６ウエルポリプロピレンプレートにピペッティングし、５ｕｇ／ｍＬのプロピオン酸ナトリウム−１３Ｃ３および２−メチルシトレート−ｄ３を有するアセトニトリル中の５０ｍＭの２−ヒドラジノキノリン（２−ＨＱ）とジピリジルジスルフィドとトリフェニルホスフィンとを含有する９０μＬの誘導体化溶液を、最終溶液に加えた。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合した。試料を誘導体化のために６０℃で１時間インキュベートし、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、２０μＬの誘導体化試料を丸底９６ウエルプレートにおいて水／ＡＣＮ（１４０：４０）中の０．１％ギ酸  １８０μＬに加えた。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートを用いて熱融着させ、十分に混合した。
【０５４５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
誘導体化代謝物を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣ法の詳細を表２３および表２４に記載する。タンデム質量分析の詳細を表２５に記載する。
【０５４６】
【表２３】
2018521674.tif 000104
【０５４７】
【表２４】
2018521674.tif 000105
【０５４８】
【表２５】
2018521674.tif 000106
【実施例１８】
【０５４９】
操作された細菌細胞がプロピオネート濃度を低下させることを実証するｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究にはプロピオン酸血症のハイポモルフマウスモデルを用いる（例えば、Ｇｕｅｎｚｅｌら、２０１３年参照）。あるいは、ＰＣＣＡ−／−ノックアウトマウス、またはメチルマロン酸血症のマウスモデルを用いることができる（例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉら、２００１年またはＰｅｔｅｒｓら、２０１２年参照）。手短に述べると、０日目に、操作された細菌の投与前のマウスにおけるメチルシトレート、アセチルカルニチンおよび／またはプロピオニルカルニチンの血中レベルを測定する。１日目に、ｐＴｅｔ−ｐｒｐＢＣＤＥおよび／またはｐＴｅｔ−ｍｃｔＣを含有する大腸菌ニッスルの培養物を３匹の野生型マウスおよび３匹のハイポモルフマウスに１日１回、１週間投与する。加えて、３匹のハイポモルフマウスにＰＢＳを対照として１日１回、１週間投与する。治療有効性は、例えば、メチルシトレート、アセチルカルニチンおよび／またはプロピオニルカルニチンの血中レベルを測定することにより判断する。操作された細菌細胞での治療後のメチルシトレート、アセチルカルニチンおよび／またはプロピオニルカルニチンの血中レベルの低下は、操作された細菌細胞がプロピオン酸血症およびメチルマロン酸血症の治療に有効であることを示す。さらに、この研究を通して、マウスの表現型も分析することができる。ＰＡまたはＭＭＡに関連する症状、例えば発作、の数の減少は、ＰＡおよびＭＭＡの治療に対する操作された細菌細胞の有効性をさらに示す。
【実施例１９】
【０５５０】
ΔＴｈｙＡの発生
栄養要求性突然変異は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させる。栄養要求性の改変を有する遺伝子操作細菌を作製するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ニッスルにおけるｔｈｙＡの欠失は、チミジンが補給されない限り、ＬＢプレート上でコロニーを形成することができない菌株を生じさせる。
【０５５１】
ｔｈｙＡ：：ｃａｍ  ＰＣＲ断片を以下のように３ラウンドのＰＣＲを用いて増幅した。１００μｍの濃度で用いたプライマーの配列は、表２６に見いだされる。
【０５５２】
【表２６】
2018521674.tif 000107
【０５５３】
第１のＰＣＲラウンドについては、鋳型としての１ｎｇ  ｐＫＤ３、２５μｌ２ｘｐｈｕｓｉｏｎ、０．２μｌプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８、ならびに０、０．２、０．４または６μｌ  ＤＭＳＯを含む４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応物をヌクレアーゼ不含有水を用いて５０μｌとし、以下のサイクル条件下で増幅した。
ステップ１：３０秒間９８ｃ
ステップ２：１０秒間９８ｃ
ステップ３：１５秒間５５ｃ
ステップ４：２０秒間７２ｃ
反復ステップ２〜４：３０サイクル
ステップ５：５分間７２ｃ
【０５５４】
その後、５μｌのＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行って、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認した。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを用いて製造業者の指示に従って、残りのＰＣＲ反応からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ不含有水で溶出した。
【０５５５】
第２のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除き、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上述したのと同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけて、増幅を確認し、精製し、上述のように３０μｌで溶出した。
【０５５６】
第３のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、ラウンド１および２について述べたのと同じであった。上述のように増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出した。濃度および純度は、分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に相同の９２ｂｐ、ｆｒｔ部位により隣接されたクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同の９８ｂｐを含む、得られた線状ＤＮＡ断片を組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッスル１９１７株に形質転換させた。エレクトロポレーションの後、３ｍＭチミジンを含む１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を振盪しながら３７℃で２時間回復させた。次いで細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一夜インキュベートした。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再び画線した。＋ｃａｍ  ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ  ３ｍＭ（ｔｈｙＡ栄養要求体のみがｔｈｙ  ３ｍＭを添加した培地中で増殖する）
【０５５７】
次に、ｐＣＰ２０形質転換によって抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐ組換え遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子および温度感受性複製を有する。細胞を選択抗生物質を含むＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．４〜０．６となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＬの細胞を次のように洗浄した。細胞を１６，０００ｘｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬ氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。この洗浄ステップを３回反復した。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡとともにエレクトロポレートし、３ｍＭチミジンを添加した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。次に、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転換細胞を４２℃で非選択的（無抗生物質）にコロニー精製した。
【０５５８】
コロニー精製形質転換細胞を試験するために、コロニーを４２℃プレートからピペットチップで採取し、１０μｌのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を次の一組の３つのプレート上にピペッティングした：Ｃａｍ（３７℃；宿主菌株のゲノムにおけるＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ（３０℃；ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）および３７℃のＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）。ＣａｍまたはＡｍｐプレートのいずれにおいても増殖が存在しない場合、コロニーは治癒したとみなし、採取し、ＬＢプレート上に再画線して、単一コロニーを得て、３７℃で一夜増殖させた。
【０５５９】
その後、５μｌのＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行って、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認した。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを用いて製造業者の指示に従って、残りのＰＣＲ反応からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ不含有水で溶出した。
【０５６０】
第２のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除き、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上述したのと同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけて、増幅を確認し、精製し、上述のように３０μｌで溶出した。
【０５６１】
第３のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、ラウンド１および２について述べたのと同じであった。上述のように増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出した。濃度および純度は、分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に相同の９２ｂｐ、ｆｒｔ部位により隣接されたクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同の９８ｂｐを含む、得られた線状ＤＮＡ断片を組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッスル１９１７株に形質転換させた。エレクトロポレーションの後、３ｍＭチミジンを含む１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を振盪しながら３７℃で２時間回復させた。次いで細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一夜インキュベートした。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再び画線した。＋ｃａｍ  ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ  ３ｍＭ（ｔｈｙＡ栄養要求体のみがｔｈｙ  ３ｍＭを添加した培地中で増殖する）
【０５６２】
次に、ｐＣＰ２０形質転換によって抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐ組換え遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子および温度感受性複製を有する。細胞を選択抗生物質を含むＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．４〜０．６となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＬの細胞を次のように洗浄した。細胞を１６，０００ｘｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬ氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。この洗浄ステップを３回反復した。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡとともにエレクトロポレートし、３ｍＭチミジンを添加した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。次に、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転換細胞を４２℃で非選択的（無抗生物質）にコロニー精製した。
【０５６３】
コロニー精製形質転換細胞を試験するために、コロニーを４２℃プレートからピペットチップで採取し、１０μｌのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を次の一組の３つのプレート上にピペッティングした：Ｃａｍ（３７℃；宿主菌株のゲノムにおけるＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ（３０℃；ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）および３７℃のＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）。ＣａｍまたはＡｍｐプレートのいずれにおいても増殖が存在しない場合、コロニーは治癒したとみなし、採取し、ＬＢプレート上に再画線して、単一コロニーを得て、３７℃で一夜増殖させた。
【実施例２０】
【０５６４】
酸化窒素誘導性レポーター構築物
ＡＴＣおよび酸化窒素誘導性レポーター構築物を合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導されるとＧＦＰを発現し、それを、プレートリーダーにおいてそれぞれ３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニタリングすることにより検出する。対照、ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物、または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを含有するプラスミドを有するニッスル細胞をまず早期対数期（約０．４〜０．６のＯＤ６００）まで増殖させ、増殖した時点で、ＬＢを含有する９６ウエルマイクロタイタープレートにそれらの細胞を移し、それらの細胞は、誘導物質（ＡＴＣ、または長い半減期のＮＯドナーであるＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））を半減させた。ＡＴＣおよびＮＯは両方とも、ある範囲の濃度にわってそれらのそれぞれの構築物においてＧＦＰの発現を誘導することができた（図４３）。プロモーター活性を相対蛍光単位として表す。酸化窒素誘導性レポーター構築物の例示的配列を示す。ｂｓｒＲ配列は、太字である。ｆｇｐ配列は、下線付きである。ＰｎｓｒＲ（ＮＯ調節プロモーターおよびＲＢＳ）は斜体である。構成的プロモーターおよびＲＢＳは囲み線付きである。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導されるとＧＦＰの高レベル発現をもたらし、それを、プレートリーダーにおいてそれぞれ３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニタリングすることにより検出する。ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを含有するプラスミドを有するニッスル細胞をまず早期対数期（ＯＤ６００＝約０．４〜０．６）まで増殖させ、増殖した時点で、ＬＢを含有する９６ウエルマイクロタイタープレートにそれらの細胞を移し、それらの細胞は、誘導物質（ＡＴＣ、または長い半減期のＮＯドナーであるＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））を半減させた。ＡＴＣおよびＮＯは両方とも、広範な濃度にわたってそれらのそれぞれの構築物においてＧＦＰの発現を誘導することができることが認められた。プロモーター活性を相対蛍光単位として表す。
【０５６５】
図４３Ｄは、ＮＯ−ＧＦＰ構築物のドットブロットを示す。酸化窒素誘導性ＮｓｒＲ−ＧＦＰレポーター融合体を有する大腸菌ニッスルを、カナマイシンを添加したＬＢ中で一夜増殖させた。次いで、細菌を、カナマイシンを含有するＬＢで１：１００希釈し、０．４〜０．５の光学密度まで増殖させ、次いで、遠心分離によりペレット化した。細菌をリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、１００マイクロリットルを強制経口投与によりマウスに投与した。細菌強制経口投与前に７日間、飲料水に２〜３％デキストラン硫酸ナトリウムを添加することによりマウスにおいてＩＢＤを誘導する。強制経口投与後４時間の時点でマウスを屠殺し、結腸試料から細菌を回収した。結腸の内容物をＳＤＳ中で煮沸し、可溶性画分を用いて、ＧＦＰ検出（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）のためにドットブロットを行った。ＧＦＰの検出は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）に結合した抗ＧＦＰ抗体の結合により行った。Ｐｉｅｒｃｅ化学発光検出キットを用いて検出を可視化した。この図には、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ治療マウスにおいて誘導されることが示されているが、未治療マウスでは誘導されることが示されていない。これは、ＮＯに応答してのＮｓｒＲの役割、したがって炎症と一致する。
【０５６６】
構成的プロモーターの制御下のＮｓｒＲとＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）とを発現するプラスミドを有する細菌を、カナマイシンを添加したＬＢ中で一夜増殖させた。次いで、細菌を、カナマイシンを含有するＬＢで１：１００に希釈し、約０．４〜０．５の光学密度まで増殖させ、次いで、遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、１００マイクロリットルを強制経口投与によりマウスに投与する。細菌強制経口投与前に７日間、飲料水に２〜３％デキストラン硫酸ナトリウムを添加することによりマウスにおいてＩＢＤを誘導する。強制経口投与後４時間の時点でマウスを屠殺し、結腸試料から細菌を回収した。結腸の内容物をＳＤＳ中で煮沸し、可溶性画分を用いて、ＧＦＰ検出（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）のためにドットブロットを行った。ＧＦＰの検出は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）に結合した抗ＧＦＰ抗体の結合により行った。Ｐｉｅｒｃｅ化学発光検出キットを用いて検出を可視化した。図４３は、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ治療マウスでは誘導されるが、未治療マウスでは誘導されないことを示す。
【実施例２１】
【０５６７】
ＦＮＲプロモーター活性
異なるＦＮＲプロモーターのプロモーター活性を測定するために、ｌａｃＺ遺伝子、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ｌａｃＺ遺伝子を、表３において開示した例示的ＦＮＲプロモーター配列のいずれかの制御下においた。これらの構築物のヌクレオチド配列を表２７〜３１（配列番号６５〜６９）に示す。しかし、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子を他の誘導性プロモーターにより駆動して、それらのプロモーターの活性を分析してもよく、他の遺伝子をｌａｃＺ遺伝子の代わりにプロモーター活性についての読み出し情報として使用してもよい。例示的結果を図４１に示す。
【０５６８】
表２７は、ｌａｃＺをコードする遺伝子と例示的ＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ１とを含む例示的構築物のヌクレオチド配列（配列番号６５）を示す。この構築物は、ニッスルｎｉｒＢ１遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体であって、ｌａｃＺコード領域の８番目のコドンにインフレームで融合している翻訳融合体を含む。Ｐｆｎｒ１配列は、太字の小文字であり、プロモーター中の予測リボソーム結合部位は、下線付きである。ｌａｃＺ配列は、下線付き大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いたクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０５６９】
表２８は、ｌａｃＺをコードする遺伝子と例示的ＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ２とを含む例示的構築物のヌクレオチド配列（配列番号６６）を示す。この構築物は、ニッスルｙｄｆＺ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体であって、ｌａｃＺコード領域の８番目のコドンにインフレームで融合している翻訳融合体を含む。Ｐｆｎｒ２配列は、太字の小文字であり、プロモーター中の予測リボソーム結合部位は、下線付きである。ｌａｃＺ配列は、下線付き大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いたクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０５７０】
表２９は、ｌａｃＺをコードする遺伝子と例示的ＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ３とを含む例示的構築物のヌクレオチド配列（配列番号６７）を示す。この構築物は、ニッスルｎｉｒＢ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体であって、強いリボソーム結合部位に融合しているプロモーター領域のみを用いる翻訳融合体を含む。Ｐｆｎｒ３配列は、太字の小文字であり、プロモーター中の予測リボソーム結合部位は、下線付きである。ｌａｃＺ配列は、下線付き大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いたクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０５７１】
表３０は、ｌａｃＺをコードする遺伝子と例示的ＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ４とを含む例示的構築物のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示す。この構築物は、ニッスルｙｄｆＺ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体を含む。Ｐｆｎｒ４配列は、太字の小文字であり、プロモーター中の予測リボソーム結合部位は、下線付きである。ｌａｃＺ配列は、下線付き大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いたクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０５７２】
表３１は、ｌａｃＺをコードする遺伝子と例示的ＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒＳとを含む例示的構築物のヌクレオチド配列（配列番号６９）を示す。この構築物は、ｌａｃＺに融合している、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ１の翻訳融合体を含む。Ｐｆｎｒｓ配列は、太字の小文字であり、プロモーター中の予測リボソーム結合部位は、下線付きである。ｌａｃＺ配列は、下線付き大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いたクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０５７３】
【表２７−１】
2018521674.tif 000108
【表２７−２】
2018521674.tif 000109
【０５７４】
【表２８−１】
2018521674.tif 000110
【表２８−２】
2018521674.tif 000111
【０５７５】
【表２９−１】
2018521674.tif 000112
【表２９−２】
2018521674.tif 000113
【０５７６】
【表３０−１】
2018521674.tif 000114
【表３０−２】
2018521674.tif 000115
【０５７７】
【表３１−１】
2018521674.tif 000116
【表３１−２】
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【表３１−３】
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【実施例２２】
【０５７８】
配列
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオネート応答性プロモーターにより駆動される遺伝子カセットを含む。非限定的な例では、遺伝子カセットは、ｐｒｐＲプロピオネート応答性プロモーターにより駆動される。非限定的な例では、ｐｒｐＲプロピオネート応答性プロモーターは、表３２に示す配列を有する。
【０５７９】
【表３２−１】
2018521674.tif 000119
【表３２−２】
2018521674.tif 000120
【０５８０】
【表３３−１】
2018521674.tif 000121
【表３３−２】
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【表３３−３】
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【表３３−４】
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【表３３−５】
2018521674.tif 000125
【表３３−６】
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【表３３−７】
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【表３３−８】
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【表３３−９】
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【表３３−１０】
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【表３３−１１】
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【表３３−１２】
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【表３３−１３】
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【表３３−１４】
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【表３３−１５】
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【表３３−１６】
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【表３３−１７】
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【表３３−１８】
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【表３３−１９】
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【表３３−２０】
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【表３３−２１】
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【表３３−２２】
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【表３３−２３】
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【表３３−２４】
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【表３３−２５】
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【表３３−２６】
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【表３３−２７】
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【表３３−２８】
2018521674.tif 000148
【表３３−２９】
2018521674.tif 000149
【表３３−３０】
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【表３３−３１】
2018521674.tif 000151
【表３３−３２】
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【表３３−３３】
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【表３３−３４】
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【０５８１】
【表３４−１】
2018521674.tif 000155
【表３４−２】
2018521674.tif 000156
【表３４−３】
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【表３４−４】
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【表３４−５】
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【表３４−６】
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【表３４−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
2018521674.tif 000182
【図１３−１】
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【図１３−２】
2018521674.tif 000184
【図１４−１】
2018521674.tif 000185
【図１４−２】
2018521674.tif 000186
【図１４−３】
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【図１４−４】
2018521674.tif 000188
【図１５Ａ】
2018521674.tif 000189
【図１５Ｂ】
2018521674.tif 000190
【図１５Ｃ】
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【図１６−１】
2018521674.tif 000192
【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
2018521674.tif 000198
【図１９】
2018521674.tif 000199
【図２０−１】
2018521674.tif 000200
【図２０−２】
2018521674.tif 000201
【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2018521674.tif 000209
【図２７】
2018521674.tif 000210
【図２８】
2018521674.tif 000211
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2018521674.tif 000215
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2018521674.tif 000218
【図３６】
2018521674.tif 000219
【図３７】
2018521674.tif 000220
【図３８】
2018521674.tif 000221
【図３９】
2018521674.tif 000222
【図４０】
2018521674.tif 000223
【図４１】
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【図４２−１】
2018521674.tif 000225
【図４２−２】
2018521674.tif 000226
【図４２−３】
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【図４３−１】
2018521674.tif 000228
【図４３−２】
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【図４３−３】
2018521674.tif 000230
【図４３−４】
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【図４４】
2018521674.tif 000232
【図４５】
2018521674.tif 000233
【図４６】
2018521674.tif 000234
【図４７】
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【配列表】
2018521674000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月31日(2017.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９５】
グラム陰性細菌では、分泌機構は、内および外膜の１つまたは両方にわたり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然二重膜スパンニング分泌システムをさらに含む。二重膜スパンニング分泌システムは、Ｉ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌システム（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）およびレジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ＲＮＤ）多剤排出ポンプのファミリーを含むが、これらに限定されない（Ｐｕｇｓｌｅｙ、１９９３年；Ｇｅｒｌａｃｈら、２００７年；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎら、２０１５年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年；Ｒｅｅｖｅｓら、２０１５年；国際公開第２０１４１３８３２４号Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図３６〜３８に示す。グラム陰性様細胞外被を有する、マイコバクテリアもＶＩＩ型分泌システム（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙら、２００３年）。Ｔ２ＳＳを除いて二重膜スパンニング分泌は、一般的に基質を細菌細胞質から細胞外腔または標的細胞内に直接的に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび外膜のみに及ぶ分泌システムは、２ステップ機構を使用し得るものであり、基質は、最初に内膜スパンニング輸送体によってペリプラズムに転位させられ、次に外膜に運ばれるかまたは細胞外腔に分泌される。外膜スパンニング分泌システムは、Ｖ型分泌または自己輸送システム（Ｔ５ＳＳ）、カーリー（ｃｕｒｌｉ）分泌システムおよび線毛アセンブリのシャペロン−アッシャー経路を含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９８】
いくつかの実施形態では、Ｖ型自己輸送体分泌システムを用いて、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌する。このマシナリーの単純さおよび比較的に大きなタンパク質フラックスを扱う能力のため、Ｖ型分泌システムは、組換えタンパク質の細胞外産生に魅力的である。図３７に示すように、治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインに融合させることができる。Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータドメインは、Ｂａｍ複合体（「ベータ−バレルアセンブリマシナリー」）に動員され、そこでベータドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。細胞外環境に曝露したならば、治療用ペプチドは、自触媒切断（Ｂａｍ複合体の左側）によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（黒いハサミ；Ｂａｍ複合体の右側）の標的化によってリンカーシステムから解放される。このように、いくつかの実施形態では、分泌分子、例えば、異種タンパク質またはペプチド、例えばプロピオネート異化酵素は、該分子が細菌から分泌されることを可能にするための、Ｎ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９９】
いくつかの実施形態では、ヘモリシンに基づく分泌システムを用いて、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌する。Ｉ型分泌システムは、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接に移動させ、他の分泌の種類の２ステップ工程が不要となるという利点がある。図３８は、尿路病原性大腸菌のアルファ−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＡＴＰ結合カセット輸送体である、ＨｌｙＢ；膜融合タンパク質である、ＨｌｙＤ；および外膜タンパク質である、ＴｏｌＣを用いる。これらの３つのタンパク質の集合により、内および外膜の両方を通るチャンネルが形成される。天然では、このチャンネルは、ＨｌｙＡを分泌するために用いられるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０４】
表９および１０：下の表は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌システムを収載するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2018521674.tif 000236
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５−１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図５Ａ】
2018521674.tif 000237
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図５Ｂ】
2018521674.tif 000238
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０−１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１０Ａ】
2018521674.tif 000239
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１０Ｂ】
2018521674.tif 000240
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５Ａ】
2018521674.tif 000241
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2018521674.tif 000242
【国際調査報告】
2018521674.tif 000243
2018521674.tif 000244
2018521674.tif 000245
2018521674.tif 000246
2018521674.tif 000247
2018521674.tif 000248