(57)【要約】  ペプチド両親媒性物質と生体適合性粒子との複合体を含む組成物、ならびに骨及び／または組織の欠損の治療のための当該組成物の使用が、本明細書で提供される。詳細には、組成物は、ペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液を固体の生体適合性粒子と混合したもののスラリーペーストを含み、組織／骨再生、成長因子送達、及び／または細胞送達に使用される。
2018534043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ペプチド両親媒性物質ナノファイバー及び（２）生体適合性ポリマー粒子を含む、複合材料。
【請求項２】
前記組成物がペースト様粘性を有する、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
１種以上の成長因子をさらに含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項４】
前記生体適合性ポリマーがコラーゲンを含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項５】
前記コラーゲンが吸収性コラーゲンスポンジに由来する、請求項４に記載の複合材料。
【請求項６】
前記ペプチド両親媒性物質ナノファイバーがペプチド両親媒性物質溶液に由来する、請求項１に記載の複合材料。
【請求項７】
骨または軟骨の欠損の修復を促進する方法であって、請求項１に記載の複合材料を前記骨または軟骨の欠損に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の複合材料を調製する方法であって、水溶液中でペプチド両親媒性物質の溶液を生体適合性ポリマー粒子と混合することを含む、前記方法。
【請求項９】
生体適合性ポリマーを粉砕及び／または凍結乾燥して生体適合性ポリマーの粒子を生成するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項１に記載の複合材料、及び
（ｂ）前記組成物を対象における骨または軟骨の欠損に適用するための医療デバイスを含む、システム。
【請求項１１】
前記医療デバイスが、シリンジ、カテーテル、またはペーストアプリケーターである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
骨または組織の欠損の治療のための、請求項１に記載の複合材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
関連出願の相互参照
本発明は、２０１５年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２４１，４１０号による優先権の利益を主張する。当該仮出願は、その全体が参照により本書に組み込まれる。
【０００２】
分野
ペプチド両親媒性物質と生体適合性粒子との複合体を含む組成物、ならびに骨及び／または組織の欠損の治療のための当該組成物の使用が、本明細書で提供される。詳細には、組成物は、ペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液を固体の生体適合性粒子と混合したもののスラリーペーストを含み、組織／骨再生、成長因子送達、及び／または細胞送達に使用される。
［背景技術］
【０００３】
骨吸収及び骨欠損（例えば、頭蓋欠損、脊椎欠損など）の癒着不良は、重大な懸案である（例えば、Ｄｕｎｉｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１１８，１１４１−１１４７（２０１３）；Ｂｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １１，５２６−５３２（２０１３）を参照；これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。骨再生及び成長因子の送達を容易にする組成物が必要とされている。
［発明の概要］
【０００４】
ペプチド両親媒性物質と生体適合性粒子との複合体を含む組成物、ならびに骨及び／または組織の欠損の治療のための当該組成物の使用が、本明細書で提供される。詳細には、組成物は、ペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液を固体の生体適合性粒子と混合したもののスラリーペーストを含み、組織／骨再生、成長因子送達、及び／または細胞送達に使用される。
【０００５】
一部の実施形態では、骨／組織の欠損の修復に有用な材料が本明細書で提供される。本明細書における諸実施形態は、成長因子の送達（例えば、局在的送達、タンパク質の送達など）、骨空隙充填剤として、及び／または骨再生（例えば、脊椎内注入用の骨成長注入誘発など）で使用される。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、ペプチドナノファイバー溶液を固体の生体適合性粒子（例えば、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸、ポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ、及び／または他のバイオポリマー））と混合したものから作製されるスラリーペーストを含む。一部の実施形態では、この混合物のペースト様粘性により、当該材料を任意のサイズの骨欠損に（例えば、手術により）適合させることが可能になる。移植後、ナノファイバーは、ペーストを骨欠損の形状でゲル化させる。一部の実施形態では、本明細書における材料は、骨伝導性かつ骨誘導性であり、かつ／または成長因子を欠損部位に送達させるために使用される。一部の実施形態では、成長因子は、経時的に（例えば、時間、日、週で）ナノファイバーゲルから放出される。
［図面の簡単な説明］
【０００６】
［図１Ａ］ラット脊椎癒合モデルを示す。
［図１Ｂ］以下の３つの実験群で測定した癒合スコアを示す。第１群：コラーゲンスポンジ及び１００ｎｇのＢＭＰ２、第２群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びコラーゲン粒子、第３群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ。
［図２］ウサギ後外側脊椎癒合モデルにおける実験手順及び治療群を示す。浸漬及びロール（ｓｏａｋ−ａｎｄ−ｒｏｌｌ）の技法を用いて第１〜４群からの移植物を調製した。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ群（第５〜７群）には、５ｍＬのシリンジから直接癒合ベッド（ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｄ）に適用した。
［図３］ウサギの後外側脊椎癒合モデルに対する、盲検的な手触診に基づく癒合率及びスコアを示す。
［図４］ウサギの後外側脊椎癒合モデルに対する移植後８週間の最終時点における全てのＸ線写真である。
［図５］ウサギの後外側脊椎癒合モデル；手術後８週間時の選択群のｕＣＴ画像である。
［図６］ウサギの後外側脊椎癒合モデル；選択群の各々において最も多くの量の骨成長を伴った個体を示すｕＣＴ画像である。「偽手術後対照」の代表個体は、ＰＬＦ皮質除去手順の直後に安楽死させた。
【０００７】
定義
本明細書に記載の実施形態を実施または試験する際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似または同等の任意の方法及び材料を使用してもよいが、本明細書でいくつかの好ましい方法、組成物、デバイス、及び材料について説明する。ただし、本発明の材料及び方法の説明に入る前に、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルは、通例の実験及び最適化に応じて変動し得るため、本発明がこれらの記載事項に限定されないということを理解されたい。また、発明を実施するための形態で使用する用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明するためのものに過ぎず、こうした用語が本明細書に記載の実施形態の範囲を限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【０００８】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。ただし、矛盾が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。
【０００９】
本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「ａ（１つの、１種の）」、「ａｎ（１つの、１種の）」、及び「ｔｈｅ（その、当該）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ペプチド両親媒性物質」への言及は、当業者に知られている１種以上のペプチド両親媒性物質及びその相当物などへの言及である。
【００１０】
本明細書で使用する「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という用語及びその言語的変形形態は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、追加的な特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在は除外されない。これに対し、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」という用語及びその言語的変形形態は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、列挙されていない任意の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などは、通常付随する不純物を除いて除外される。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）」という表現は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などに加えて、組成物、システム、または方法の基本的性質に実質的に影響を及ぼさない任意の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを示す。本明細書における多くの実施形態は、オープンな「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語を用いて記載されている。このような実施形態は、このような語を用いて代替的に特許請求または説明され得る、実施形態の複数のクローズドな「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）」を含む。
【００１１】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体、そして別段の指示がない限り、これらのＤ及びＬ立体異性体の全て（これらの構造がかかる立体異性体形態をとることが可能な場合）を指す。
【００１２】
天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。
【００１３】
非天然アミノ酸としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第３級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ホモＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４−ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ−アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）（Ｎ−メチルグリシンを含む）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）（Ｎ−メチルペンチルグリシンを含む）、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）。
【００１４】
「アミノ酸類似体」という用語は、Ｃ末端のカルボキシ基、Ｎ末端のアミノ基、及び側鎖の生体活性基のうちの１つ以上が、化学的にブロックされた（可逆的または不可逆的に）、または別の生体活性基に修飾された、天然または非天然のアミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸（ベータ−メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸類似体であり、Ｎ−エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸類似体であり、アラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、及びＳ−（カルボキシメチル）−システインスルホンが挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により共に連結したアミノ酸のオリゴマー〜短いポリマーを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドの長さは約５０アミノ酸以下である。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／または修飾アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、天然存在のタンパク質の部分配列であっても、非天然（人工）の配列であってもよい。
【００１６】
本明細書で使用する「人工」という用語は、人間により設計または調製され、天然に存在しない組成物及びシステムを指す。例えば、人工のペプチド、ペプトイド、または核酸は、非天然の配列を含むペプチド、ペプトイド、または核酸（例えば、天然存在のタンパク質またはその断片に対し１００％同一性を有しないペプチド）である。
【００１７】
本明細書で使用する「保存的」アミノ酸置換とは、ペプチドまたはポリペプチド内のアミノ酸が、類似の化学的性質（例えば、サイズ及び電荷）を有する別のアミノ酸で置換されることを指す。本開示の目的のため、以下の８つの群のそれぞれには、互いの保存的置換であるアミノ酸が含まれている：
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。
【００１８】
天然存在の残基は、共通する側鎖の性質に基づいて、例えば以下のクラスに分類することができる：正極性（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ））；負極性（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；中性極性（セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリン及びグリシン；ならびにシステイン。本明細書で使用する「半保存的」アミノ酸置換とは、ペプチドまたはポリペプチド内のアミノ酸が、同じクラス内の別のアミノ酸で置換されることを指す。
【００１９】
一部の実施形態では、別段の明記がない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換は、天然の残基に類似する化学的性質を有する非天然存在のアミノ酸残基も含み得る。このような非天然残基は、典型的には、生体系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって取り込まれる。非天然残基としては、ペプチド模倣体及び他の逆転または反転形態のアミノ酸部分が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における実施形態は、一部の実施形態において、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び／またはアミノ酸類似体に限定される場合がある。非保存的置換は、あるクラスのメンバーが別のクラスからのメンバーに交換されることを伴い得る。
【００２０】
本明細書で使用する「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同じモノマーサブユニットの逐次合成（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が保存的及び／または半保存的アミノ酸置換にのみより異なる程度を指す。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）は、以下のようにして算出される：（１）２つの最適アラインメント配列を比較ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）（例えば、比較的長い配列の長さ、比較的短い配列の長さ、指定ウインドウなど）を介して比較する、（２）同一の（または類似の）モノマー（例えば、同じアミノ酸が両方の配列で生じる、類似のアミノ酸が両方の配列で生じる）を含有する位置数を決定してマッチした位置数を得る、（３）マッチした位置の数を比較ウインドウ（例えば、比較的長い配列の長さ、比較的短い配列の長さ、指定ウインドウ）内の位置の総数で割る、及び（４）結果に１００を掛けてパーセント配列同一性またはパーセント配列類似性を得る。例えば、ペプチドＡ及びＢが共に２０アミノ酸長であり、１つ以外の全ての位置で同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは、９５％配列同一性を有する。同一でない位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特性（例えば、いずれも酸性）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは１００％配列類似性を有することになる。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤの１５アミノ酸のうち１４アミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸に対し同一である場合、ペプチドＣ及びＤは７０％配列同一性を有し、ただしペプチドＤはペプチドＣの最適比較ウィンドウに対しては９３．３％配列同一性を有する。本明細書における「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）を算出する上で、アラインメント配列内の任意のギャップはその位置におけるミスマッチとして処理される。
【００２１】
本明細書に記載される、参照配列ＩＤ番号との特定のパーセント配列同一性または類似性（例えば、少なくとも７０％）を有する任意のポリペプチドは、その参照配列に対する最大数の置換（または末端部欠失）を有するものとして表現することもできる。例えば、配列番号Ｚ（例えば、１００アミノ酸）との少なくともＹ％配列同一性（例えば、９０％）を有する配列は、配列番号Ｚに対しＸ個（例えば、１０個）までの置換を有することができ、そのため「配列番号Ｚに対しＸ個（例えば、１０個）以下の置換を有する」ものとして表現することもできる。
【００２２】
本明細書で使用する「ナノファイバー」という用語は、典型的には１００ナノメートル未満の直径を有する、細長いまたは糸状の（例えば、幅または直径よりも顕著に大きな長さ寸法を有する）フィラメントを指す。
【００２３】
本明細書で使用する「超分子」という用語（例えば、「超分子複合体」、「超分子相互作用」、「超分子繊維」、「超分子ポリマー」など）は、分子間における非共有結合的な相互作用（例えば、ポリマー、巨大分子など）、ならびに結果として形成される多成分集合体、複合体、システム、及び／または繊維を指す。
【００２４】
本明細書で使用する「自己集合する」及び「自己集合」という用語は、構成要素の諸部分から離散性、非ランダムの凝集構造が形成されることを指し、この集合は、諸構成要素（例えば、分子）のランダムな運動を介し、これらの構成要素における固有の化学的または構造的性質及び引力のみに起因して、自然に発生する。
【００２５】
本明細書で使用する「ペプチド両親媒性物質」という用語は、少なくとも非ペプチドの親油性（疎水性）セグメント、構造ペプチドセグメント及び／または荷電ペプチドセグメント（両方の場合が多い）、ならびに任意選択により生体活性セグメント（例えば、リンカーセグメント、生体活性セグメントなど）を含む分子を指す。ペプチド両親媒性物質は、生理的ｐＨにおける実効電荷、すなわち実効正電荷もしくは実効負電荷、または双性イオン（すなわち、正電荷及び負電荷の両方を保有する）であってもよい実効電荷を発現することができる。あるいくつかのペプチド両親媒性物質は、（１）疎水性非ペプチドセグメント（例えば、６個以上の炭素を有するアシル基を含む）、（２）構造ペプチドセグメント（例えば、βシート形成）、（３）荷電ペプチドセグメント、及び（４）生体活性セグメント（例えば、リンカーセグメント）からなる、またはこれらを含む。
【００２６】
本明細書及び付属の請求項で使用する「親油性部分」または「疎水性部分」という用語は、ペプチド両親媒性物質の一方の末端（例えば、Ｃ末端、Ｎ末端）に配置される部分（例えば、アシル、エーテル、スルホンアミド、またはホスホジエステル部分）を指し、本明細書その他において親油性または疎水性のセグメントまたは構成要素と称され得る。疎水性セグメントは、水中または別の極性溶媒系中で、両親媒性的挙動及び凝集体（またはナノ球体もしくはナノファイバー）形成をもたらすのに十分な長さを有するはずである。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈において、疎水性構成要素は、式：Ｃｎ−１Ｈ２ｎ−１Ｃ（Ｏ）−−（式中、ｎ＝２〜２５）の単一の直線状アシル鎖を含むことが好ましい。一部の実施形態では、直線状アシル鎖は、親油性基（飽和または不飽和の炭素）のパルミチン酸である。ただし、他の親油性基（例えば、ステロイド、リン脂質、及びフルオロカーボン）をアシル鎖の代わりに使用してもよい。
【００２７】
本明細書で使用する「構造ペプチド」という用語は、典型的には疎水性セグメントと荷電ペプチドセグメントとの間に配置されたペプチド両親媒性物質の一部を指す。構造ペプチドは、概して、非極性の非荷電側鎖を有する３〜１０個のアミノ酸残基（例えば、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｈｅ（Ｆ））から構成され、これらは、隣接する構造セグメントの構造セグメントとの結合または他の安定化相互作用（例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用など）を形成する自らの傾向により選択される。一部の実施形態では、構造ペプチドセグメントを有するペプチド両親媒性物質のナノファイバーは、顕微鏡により調べると直線状構造または２Ｄ構造を示し、及び／または円２色性（ＣＤ）により調べるとαヘリックス及び／またはβシートの特徴を示す。
【００２８】
本明細書で使用する「ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント」という用語は、（例えば、ＣＤにより解析した場合に）βシート様特徴を示す傾向を有する、構造ペプチドセグメントを指す。一部の実施形態では、ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント内のアミノ酸は、ベータシート２次構造を形成する自らの傾向により選択される。２０種の天然存在のアミノ酸から選択される好適なアミノ酸残基の例としては、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、及びＧｌｙ（Ｇ）（ベータシートを形成する傾向の順に収載）が挙げられる。ただし、類似のベータシート形成傾向を有する非天然存在のアミノ酸も使用することができる。相互作用してベータシートを形成することができる、及び／またはベータシートを形成する傾向を有するペプチドセグメントについては理解がなされている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６），５：１３０１−１３１５を参照。）。
【００２９】
本明細書で使用する「荷電ペプチドセグメント」という用語は、荷電アミノ酸残基、または生理的条件下で実効正電荷もしくは実効負電荷を有するアミノ酸残基に富んだ（例えば、＞５０％、＞７５％など）ペプチド両親媒性物質の一部を指す。荷電ペプチドセグメントは、酸性（例えば、負に荷電）であっても、塩基性（例えば、正に荷電）であっても、双性イオン性（例えば、酸性及び塩基性両方の残基を有する）であってもよい。
【００３０】
本明細書で使用する「カルボキシリッチペプチドセグメント」、「酸性ペプチドセグメント」、及び「負荷電ペプチドセグメント」という用語は、カルボン酸側鎖を示す側鎖を有する１個以上のアミノ酸残基（例えば、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｐ（Ｄ）、または非天然アミノ酸）を含むペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。カルボキシリッチペプチドセグメントは、任意選択により、１個以上の追加的な（例えば、酸性ではない）アミノ酸残基を含有してもよい。当業者には明らかであろうことだが、酸性側鎖を有する非天然アミノ酸残基またはペプチド模倣体も使用できると考えられる。このセグメントには、約２〜約７アミノ酸、及びまたは約３もしくは４アミノ酸が存在し得る。
【００３１】
本明細書で使用する「アミノリッチペプチドセグメント」、「塩基性ペプチドセグメント」、及び「正荷電ペプチドセグメント」という用語は、正に荷電した酸側鎖を示す側鎖を有する１個以上のアミノ酸残基（例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、または非天然アミノ酸、またはペプチド模倣体）を含むペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。塩基性ペプチドセグメントは、任意選択により、１個以上の追加的な（例えば、非塩基性の）アミノ酸残基を含有してもよい。当業者には明らかであろうことだが、塩基性側鎖を有する非天然アミノ酸残基も使用できると考えられる。このセグメントには、約２〜約７アミノ酸、及びまたは約３もしくは４アミノ酸が存在し得る。
【００３２】
本明細書で使用する「生体活性ペプチド」という用語は、関連する配列、分子、または超分子複合体の作用を媒介するアミノ酸配列を指す。生体活性ペプチド（例えば、ＴＦ標的化配列など）を有するペプチド両親媒性物質及び構造（例えば、ナノファイバー）は、生体活性ペプチドの機能を示す。
【００３３】
本明細書で使用する「生体適合性」という用語は、細胞または生物に対し毒性を有しない材料及び作用物質を指す。一部の実施形態では、ある物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に添加したときに、およそ１０％以下、通常は５％未満、より通常は１％未満の細胞死がもたらされる場合、この物質は「生体適合性」とみなされる。
【００３４】
本明細書において、ポリマー、ヒドロゲル、及び／または創傷被覆材の説明に使用される「生分解性」とは、生理的条件への露出下で分解する、または「崩壊する（ｂｒｏｋｅｎ  ｄｏｗｎ）」組成物を指す。一部の実施形態では、生分解性物質は、細胞機構、酵素分解、化学的プロセス、加水分解などによって崩壊する。一部の実施形態では、創傷被覆材または創傷コーティングは、生分解性をもたらす加水分解性エステル結合を含む。
【００３５】
本明細書で使用する「生理的条件」という表現は、組織の細胞内液内及び細胞外液内で遭遇する可能性がある化学的条件（例えば、ｐＨ、イオン強度）及び生化学的条件（例えば、酵素濃度）の範囲に関連する。ほとんどの組織に関して、生理的ｐＨは約７．０〜７．４の範囲である。
［発明を実施するための形態］
【００３６】
ペプチド両親媒性物質と生体適合性粒子との複合体を含む組成物、ならびに骨及び／または組織の欠損の治療のための当該組成物の使用が、本明細書で提供される。詳細には、組成物は、ペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液を固体の生体適合性粒子と混合したもののスラリーペーストを含み、組織／骨再生、成長因子送達、及び／または細胞送達に使用される。
【００３７】
既存の骨空隙充填剤に対する本発明の組成物及び方法の利点としては、以下が挙げられる：（１）生理的条件下における（例えば、周囲の天然存在イオンにより誘発される）「ゲル」が任意の形状に適応できること；（２）高荷電ナノファイバーゲルに結合する、混合物に添加する成長因子または他の作用物質の任意のカクテルの送達；及び／または（３）任意の生体適合性粒子を多種多様な再生ペプチド両親媒性分子と組み合わせて柔軟に使用できること。
【００３８】
本明細書における組成物は、次の２つの主要構成要素を含む；（１）生体適合性粒子（例えば、コラーゲン粒子、ヒアルロン酸ゲル粒子、及び／またはバイオポリマー粒子）、及び（２）ペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液（例えば、成長因子のありまたはなしで）。一部の実施形態では、成長因子（ＧＦ）及び／またはＧＦ結合ペプチドは、ペプチド両親媒性物質ナノファイバー上に提示され、及び／または組成物内もしくはペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液内に埋め込まれている。一部の実施形態では、細胞（例えば、骨芽細胞、幹細胞または他の前駆細胞、軟骨細胞など）は、組成物またはペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液内に埋め込まれている。
【００３９】
本明細書に記載の例示的な組成物はコラーゲン粒子を使用しているが、他の好適なバイオポリマーも本明細書の範囲内である。一部の実施形態では、例示的なコラーゲン粒子は、他の場で説明されている架橋フリーズドライ法の方法により調製された、多孔性コラーゲンスポンジから調製される。これらのスポンジは小片（１ｃｍｘ１ｃｍ）にカットし、５０ｕＬの水で湿らせ、次に液体Ｎ２で瞬間凍結し、次に冷凍状態の間に乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し微粉にする。この粉末化コラーゲンを凍結乾燥し乾燥粉末にして、ナノファイバー溶液と混合する。類似の方法は、他の生体適合性の出発材料を用いた他のポリマー粒子の調製に使用される。
【００４０】
ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）ナノファイバー溶液は、任意の好適な組合せのＰＡを含むことができる。一部の実施形態では、溶液のうちの少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３０ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、０．６０ｍｇ／ｍｌ、０．７０ｍｇ／ｍｌ、０．８０ｍｇ／ｍｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、またはこれ以上、またはこれらの間の範囲）が充填剤ＰＡである（例えば、ペプチドエピトープまたは他のナノファイバー表面提示部分を伴わない場合）。一部の実施形態では、溶液のうちの少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬが充填剤ＰＡである。一部の実施形態では、充填剤ＰＡは、分子末端部（例えば、表面提示端部）に高荷電グルタミン酸残基を有する非生体活性ＰＡ分子である。これらの負荷電ＰＡにより、ナノファイバー間でイオン架橋を介してのゲル化が起こる。充填剤ＰＡにより、ナノファイバー溶液のゲル化能力を従来通り保証しながら、他の生体活性ＰＡ分子をナノファイバーマトリックスに取り込むことが可能になる。一部の実施形態では、溶液は、粘度増加及びゲル機構強化のためアニールされる。このような充填剤ＰＡは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７２，２２８号（例えば、Ｖ３Ａ３Ｅ３、ラウリン酸−Ｖ３Ａ３Ｅ３）に記載されている。
【００４１】
例示的な一実施形態では、生体適合性粒子及びペプチド両親媒性物質ナノファイバー溶液は、５重量％の生体適合性粒子（例えば、コラーゲン粒子、ヒアルロン酸ゲル粒子など）及び１重量％のＰＡにおいて中性ｐＨの水中で混合される。他の範囲（例えば、１重量％〜２０重量％（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９  １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれらの間の任意の範囲）の生体適合性粒子；０．１重量％〜１０重量％（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれらの間の任意の範囲）のＰＡ）を用いてもよい。特定の実施形態では、コラーゲン（または別のポリマー）は０重量％〜２０重量％で使用され、ＰＡは０．０５重量％〜３重量％で使用される。一部の実施形態では、ＢＭＰ−２などの成長因子は、コラーゲン粒子と合わせる前かつＰＡ溶液のアニール後に、ＰＡ溶液に混ぜ入れる。一部の実施形態では、細胞（例えば、骨芽細胞、幹細胞または他の前駆細胞、軟骨細胞など）は、コラーゲン粒子と合わせる前かつＰＡ溶液のアニール後に、ＰＡ溶液に混ぜ入れる。一部の実施形態では、細胞及び／または成長因子は、粒子の後に添加する。
【００４２】
本明細書の材料における粒子としての使用に好適な生体適合性ポリマーは、以下からなる群から選択される：ＰＬＡ、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ＰＧＬＡ、ＰＣＬ、キトサン、ポリラクチド、ポリグリコリド、エプシロン−カプロラクトン、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリヒドロキシ酪酸、他のポリヒドロキシ酸、ポリトリメチレンカーボネート、ポリアミン、ビニルポリマー、ポリアクリル酸及びエステルを含有するその誘導体、ポリエチレングリコール、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリアミノ酸、ポリリン酸エステル、ポリエステルアミド、ポリフマレート、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアキレンオキサレート（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ  ｏｘａｌａｔｅ）、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリアセタール、ポリアルカノエート、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、多糖、アルギネート、キチン、ヒアルロン酸、ならびにこれらの組合せ。本明細書に記載の及び／または当分野で理解されている方法は、上記生体適合性ポリマーの粒子の調製に使用される。
【００４３】
一部の実施形態では、粒子は、任意の好適なサイズ及び形状をとることができる。一部の実施形態では、粒子は微粒子であり、平均直径が１μｍから１ｍｍの間（例えば、１μｍ、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１ｍｍ、またはこれらの間の範囲）である。一部の実施形態では、粒子はナノ粒子であり、１ｎｍから１μｍの間の平均直径（例えば、１ｎｍ、２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１ｎｍ、またはこれらの間の範囲）を有する。一部の実施形態では、粒子は、任意の好適な技法（例えば、凍結（例えば、液体Ｎ２下で）、乾燥、フリーズドライ、凍結乾燥、粉砕、摩砕、溶媒（例えば、エタノール）への露出、シーブ、及びこれらの組合せ）を用いて生成される。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態におけるペプチド両親媒性物質分子及び組成物の合成は、当業者によく知られている調製技法を用いて、好ましくは標準的なペプチド固相合成により、親油性セグメントを創生するためにペプチドのＮ末端（またはＣ末端）に標準的アミノ酸の代わりに脂肪酸を添加して、行われる（ただし、一部の実施形態では、ナノファイバーのアラインメントは、当技術分野で過去に開示も使用もされていない技法（例えば、メッシュスクリーンを通じての押出）を介して実施される）。合成は、典型的にはＣ末端から開始し、リンクアミド樹脂（樹脂からの切断後、ペプチドのＣ末端に−−ＮＨ２基がもたらされる）またはワング樹脂（Ｃ末端に−−ＯＨ基がもたらされる）のいずれかを用いて、アミノ酸が順次Ｃ末端に付加される。したがって、本明細書に記載の実施形態は、−−Ｈ、−−ＯＨ、−−ＣＯＯＨ、−−ＣＯＮＨ２、及び−−ＮＨ２からなる群から選択され得るＣ末端部分を有するペプチド両親媒性物質を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、ペプチドに連結した疎水性（非ペプチド）セグメントを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、構造セグメント（例えば、水素結合形成セグメント、ベータシート形成セグメントなど）、及び荷電セグメント（例えば、酸性セグメント、塩基性セグメント、双性イオン性セグメントなど）を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、可溶性、柔軟性、セグメント間の距離などを付加するため、リンカーセグメントまたはスペーサーセグメントをさらに含む。一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、疎水性セグメントの反対側のペプチド末端に、スペーサーセグメント（例えば、ペプチド及び／または非ペプチドスペーサー）を含む。一部の実施形態では、スペーサーセグメントは、ペプチド及び／または非ペプチドの要素を含む。一部の実施形態では、スペーサーセグメントは、１つ以上の生体活性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオールなど）を含む。一部の実施形態では、様々なセグメントがリンカーセグメント（例えば、ペプチド（例えば、ＧＧ）または非ペプチド（例えば、アルキル、ＯＥＧ、ＰＥＧなど）リンカー）により接続され得る。
【００４６】
親油性または疎水性セグメントは、典型的には、最後のアミノ酸カップリング後にペプチドのＮ末端またはＣ末端で取り込まれ、脂肪酸、またはアシル結合を介してＮ末端もしくはＣ末端に連結した他の酸から構成される。水溶液中で、ＰＡ分子は自己集合し（例えば、円柱状のミセル（別名ナノファイバー）になり）、自らのコアに親油性セグメントを埋め込み、表面に生体活性ペプチドを提示する。構造ペプチドは、分子内の水素結合を経て、ミセルの長軸に対し平行に配向したベータシートを形成する。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物はＰＡ構成単位を含み、ＰＡ構成単位自身は疎水性セグメント及びペプチドセグメントを含む。あるいくつかの実施形態では、十分な長さ（例えば、２個の炭素、３個の炭素、４個の炭素、５個の炭素、６個の炭素、７個の炭素、８個の炭素、９個の炭素、１０個の炭素、１１個の炭素、１２個の炭素、１３個の炭素、１４個の炭素、１５個の炭素、１６個の炭素、１７個の炭素、１８個の炭素、１９個の炭素、２０個の炭素、２１個の炭素、２２個の炭素、２３個の炭素、２４個の炭素、２５個の炭素、２６個の炭素、２７個の炭素、２８個の炭素、２９個の炭素、３０個の炭素、またはそれ以上、またはこれらの間の任意の範囲）を有する疎水性（例えば、炭化水素及び／もしくはアルキル／アルケニル／アルキニルの尾部、またはコレステロールなどのステロイド）セグメントは、ペプチドセグメント（例えば、ベータストランド立体構造または他の超分子相互作用に対し選好性を有するセグメントを含むペプチド）に共有結合的にカップリングして、ペプチド両親媒性物質分子を産生する。一部の実施形態では、複数のこのようなＰＡは、水（または水溶液）中で自己集合してナノ構造（例えば、ナノファイバー）となる。様々な実施形態では、ペプチドセグメント及び疎水性セグメントの相対的長さが、ＰＡ分子の形状及びナノ構造アーキテクチャーの相違をもたらす。例えば、幅の広いペプチドセグメント及び幅の狭い疎水性セグメントは円錐状の分子形状をもたらし、ＰＡの集合体に影響を及ぼす（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｎ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ  Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒｃｅｓ；２ｎｄ  ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９２を参照）。他の分子形状は、集合体及びナノ構造アーキテクチャーに類似の影響を及ぼす。
【００４８】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質の水溶液の自己集合を誘発するため、溶液のｐＨは変化（上昇または低下）してもよく、あるいはカルシウムなどの多価イオン、または荷電したポリマーもしくは他の巨大分子が溶液に添加されてもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、疎水性セグメントは非ペプチドセグメント（例えば、アルキル／アルケニル／アルキニル基）である。一部の実施形態では、疎水性セグメントは、４〜２５（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の炭素を有する（例えば、飽和した）アルキル鎖、フッ素化セグメント、フッ素化アルキル尾部、複素環式環、芳香族セグメント、パイ共役セグメント、シクロアルキル、オリゴチオフェンなどを含む。一部の実施形態では、疎水性セグメントは、２〜３０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）個の炭素を有する（例えば、飽和した）アシル／エーテル鎖を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ＰＡは１つ以上のペプチドセグメントを含む。ペプチドセグメントは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣体、またはこれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ペプチドセグメントは、本明細書に記載のペプチド配列のうちの１つ以上に対し、少なくとも５０％の配列同一性または類似性（例えば、保存的または半保存的）を備える。
【００５１】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は荷電ペプチドセグメントを含む。荷電セグメントは、酸性であっても、塩基性であっても、双性イオン性であってもよい。
【００５２】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は酸性ペプチドセグメントを含む。例えば、一部の実施形態では、酸性ペプチドは、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７個、またはそれ以上）の酸性残基（Ｄ及び／またはＥ）を配列に含む。一部の実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、長さが７個までの残基を含み、少なくとも５０％の酸性残基を含む。一部の実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘａ）１〜７（式中、各Ｘａは独立してＤまたはＥである）を含む。一部の実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、ＥＥを含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は塩基性ペプチドセグメントを含む。例えば、一部の実施形態では、酸性ペプチドは、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７個、またはそれ以上）の塩基性残基（Ｒ、Ｈ、及び／またはＫ）を配列に含む。一部の実施形態では、塩基性ペプチドセグメントは、長さが７個までの残基を含み、少なくとも５０％の塩基性残基を含む。一部の実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘｂ）１〜７（式中、各Ｘｂは独立してＲ、Ｈ、及び／またはＫである）を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、構造セグメント及び／またはベータシート形成セグメントを含む。一部の実施形態では、構造セグメントは、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、及びＡ残基に富んでいる。一部の実施形態では、構造セグメント及び／またはベータシート形成セグメントは、アラニンリッチペプチドセグメント及びバリンリッチペプチドセグメント（例えば、ＡＡＶＶ（配列番号１）、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号２）、またはＶ及びＡ残基の他の組合せ、など）を含む。一部の実施形態では、構造ペプチド及び／またはベータシートペプチドは、４個以上の連続したＡ及び／もしくはＶ残基、またはこれらに対する保存的もしくは半保存的置換を含む。一部の実施形態では、構造ペプチドセグメント及び／またはベータシート形成セグメントは、４個以上の連続した非極性脂肪族残基（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））を含む。一部の実施形態では、構造ペプチドセグメント及び／またはベータシート形成セグメントは２〜１６アミノ酸長を含み、かつ４個以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれらの間の範囲）の非極性脂肪族残基を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントを含む。一部の実施形態では、非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントは、疎水性セグメントの反対側のペプチド末端に位置する。一部の実施形態では、スペーサーまたはリンカーセグメントは、生体活性基のための付着部位を提供する。一部の実施形態では、スペーサーまたはリンカーセグメントは、ＰＡの官能化のための反応性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオール、マレイミドなど）を提供する。一部の実施形態では、スペーサーまたはリンカーは、ＣＨ２、Ｏ、（ＣＨ２）２Ｏ、Ｏ（ＣＨ２）２、ＮＨ、及びＣ＝Ｏ基の実質的に直線状の鎖である（例えば、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨ、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＣＨなど）。一部の実施形態では、スペーサーまたはリンカーは、追加的な生体活性基、置換基、分岐などを含む。
【００５６】
本明細書における材料での使用、ならびにＰＡ及び関連材料、ＰＡで使用するアミノ酸配列、及びＰＡで使用される材料の調製方法における使用に好適なペプチド両親媒性物質は、以下の特許に記載されている：米国特許第９，０４４，５１４号；米国特許第９，０４０，６２６号；米国特許第９，０１１，９１４号；米国特許第８，７７２，２２８号；米国特許第８，７４８，５６９号；米国特許第８，５８０，９２３号；米国特許第８，５４６，３３８号；米国特許第８，５１２，６９３号；米国特許第８，４５０，２７１号；米国特許第８，２３６，８００号；米国特許第８，１３８，１４０号；米国特許第８，１２４，５８３号；米国特許第８，１１４，８３５号；米国特許第８，１１４，８３４号；米国特許第８，０８０，２６２号；米国特許第８，０７６，２９５号；米国特許第８，０６３，０１４号；米国特許第７，８５１，４４５号；米国特許第７，８３８，４９１号；米国特許第７，７４５，７０８号；米国特許第７，６８３，０２５号；米国特許第７，５５４，０２１；米国特許第７，５４４，６６１号；米国特許第７，５３４，７６１号；米国特許第７，４９１，６９０号；米国特許第７，４５２，６７９号；米国特許第７，３７１，７１９号；米国特許第７，０３０，１６７号；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
ＰＡ超分子構造の特性（例えば、形状、剛性、親水性など）は、ペプチド両親媒性物質の構成要素（例えば、親油性セグメント、酸性セグメント、構造セグメント、生体活性セグメントなど）の同一性に依存する。例えば、ナノファイバー、ナノ球体、中間形状、及び他の超分子構造は、ＰＡ構成要素部分の同一性を調整することにより達成される。一部の実施形態では、ＰＡの超分子ナノ構造の特性は、集合後の操作（例えば、加熱／冷却、伸展など）により変更される。
【００５８】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（ａ）８〜２４個の炭素を有するアルキル鎖を含む疎水性尾部；（ｂ）（例えば、ＶＶＡＡを含む）構造セグメント；及び（ｃ）（例えば、ＫＫ、ＥＥなどを含む）荷電セグメント、を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の範囲内の、本明細書に記載の構成要素を含む、または当業者の技量範囲内の任意のＰＡは、本明細書で使用することができる。
【００５９】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は生体活性部分を含む。特定の実施形態では、生体活性部分は、ＰＡの最もＣ末端側またはＮ末端側のセグメントである。一部の実施形態では、生体活性部分は、荷電セグメントの端部に付着している。一部の実施形態では、生体活性部分は、集合したＰＡ構造（例えば、ナノファイバー）の表面で露出される。生体活性部分は、典型的にはペプチド（例えば、成長因子など）であるが、これに限定されない。一部の実施形態では、生体活性部分は、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合するペプチド配列（例えば、成長因子）である。官能性を達成するための生体活性ペプチド及び他の部分については、理解されるところとなる。一部の実施形態では、生体活性部分は、標的タンパク質（例えば、成長因子）に対する結合親和性を有して提供される。結合親和性（Ｋｄ）は、以下のうちの１つから選ばれ得る：１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００μＭ未満。一部の実施形態では、生体活性部分は、成長因子の全てまたは活性部分に対し、少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有して提供される。
【００６０】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（ａ）８〜２４個の炭素を有するアルキル鎖を含む疎水性尾部；（ｂ）（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号３）、ＡＡＶＶ（配列番号１）、ＶＡ、ＡＶなどを含む）構造セグメント；（ｃ）（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥなどを含む）荷電セグメント、及び生体活性ペプチド（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド）、を含む。一部の実施形態では、ＰＡは、疎水性尾部がＰＡのペプチド部分に付着するための付着セグメントまたは付着残基（例えば、Ｋ）をさらに含む。一部の実施形態では、疎水性尾部はリジン側鎖に付着している。
【００６１】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は（例えば、Ｃ末端からＮ末端にかけて、またはＮ末端からＣ末端にかけて）以下のものを含む：生体活性ペプチド（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド）−（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥなどを含む）荷電セグメント−（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号３）、ＡＡＶＶ（配列番号１）、ＶＡ、ＡＶなどを含む）構造セグメント−（例えば、８〜２４個の炭素を有するアルキル鎖を含む）疎水性尾部。
【００６２】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は（例えば、Ｃ末端からＮ末端にかけて、またはＮ末端からＣ末端にかけて）以下のものを含む：生体活性ペプチド（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド）−（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥなどを含む）荷電セグメント−（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号３）、ＡＡＶＶ（配列番号１）、ＶＡ、ＡＶなどを含む）構造セグメント−付着セグメントまたは付着ペプチド（例えば、Ｋ）−（例えば、８〜２４個の炭素を有するアルキル鎖を含む）疎水性尾部。
【００６３】
一部の実施形態では、ペプチド両親媒性物質は（例えば、Ｃ末端からＮ末端にかけて、またはＮ末端からＣ末端にかけて）以下のものを含む：生体活性ペプチド（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド）−ＫＫＡＡＶＶ（Ｋ）（配列番号４）−（例えば、８〜２４個の炭素を有するアルキル鎖を含む）疎水性尾部。一部の実施形態では、疎水性尾部は（Ｋ）側鎖に付着している。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチド両親媒性物質から集合したナノファイバー及びナノ構造が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ナノファイバーは、本明細書に記載のＰＡの自己集合により調製される。一部の実施形態では、ナノファイバーは、成長因子またはＧＦ標的化ペプチドを提示するＰＡを含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、成長因子またはＧＦ標的化ペプチドは、ナノファイバーの表面に提示される。一部の実施形態では、ＴＦ標的化ペプチドを提示するＰＡに加えて、充填剤ＰＡがナノファイバーに含まれる。一部の実施形態では、充填剤ＰＡは、本明細書に記載のペプチド両親媒性物質（例えば、構造セグメント、荷電セグメント、疎水性セグメントなど）であるが、生体活性部分が欠如している。一部の実施形態では、充填剤ＰＡ及び成長因子ＰＡまたはＧＦ標的化ＰＡは、自己集合して両タイプのＰＡを含むナノファイバーになる。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチド両親媒性物質から集合したナノ構造（例えば、ナノファイバー）が提供される。
【００６５】
一部の実施形態では、ＰＡナノファイバー及び／またはＰＡナノファイバーを含む溶液は、成長因子（または他の生体活性作用物質）を支持するための骨格及び／または環境を提供するが、このような成長因子（または他の生体活性作用物質）に対し共有結合的には連結していない。
【００６６】
一部の実施形態では、ナノ構造は、（１）生体活性部分（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド）を有するＰＡ、及び（２）充填剤ＰＡ（例えば、標識されておらず生体活性部分も提示しないＰＡなど）から集合する。一部の実施形態では、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）は、（ｉ）生体活性部分（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド部分）を有する５０％未満（例えば、４９％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれらの間の範囲）のＰＡを含む。一部の実施形態では、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）は、（ｉ）生体活性部分（例えば、成長因子またはＧＦ標的化ペプチド部分）を有する少なくとも２％（例えば、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはこれらの間の範囲）のＰＡを含む。一部の実施形態では、ナノファイバーは、少なくとも５０％（５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはこれらの間の範囲）の充填剤ペプチド両親媒性物質を含む。一部の実施形態では、生体活性部分を有するＰＡの充填剤ＰＡに対する比率は、ナノ構造表面に提示される生体活性部分（例えば、成長因子またはＧＦ標的化部分）の密度を決定する。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の材料は、組織／骨の欠損及び／または組織／骨の再生のための、成長因子または他の生体活性作用物質の送達に使用される。本明細書における実施形態での使用に好適な作用物質としては、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、及びＢＭＰ−７）；形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３を含むがこれらに限定されない）；成長分化因子（ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ミオスタチン／ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、及びＧＤＦ１５）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；などが挙げられる。これらの作用物質または他のものは、ＰＡに対し共有結合的に連結する場合、ＰＡナノファイバーに提示されるペプチドと非共有結合的に会合する場合、ＰＡナノファイバーマトリックス内に埋め込まれる場合、本明細書に記載の複合体組成物内に埋め込まれる場合などがある。
【００６８】
本明細書における組成物及び方法は、様々な用途で使用される。骨空隙充填剤としては、ＰＡ／ポリマー混合物のペースト様粘性により、手術で材料を任意のサイズの骨欠損に容易に適合させることが可能になり、そして移植後は、ナノファイバーによりペーストが骨欠損の形状でゲル化する。この材料は骨成長を誘発し、また成長因子を欠損部位に送達させるために使用することができ、送達された成長因子はナノファイバーゲルから経時的に放出されることになる。脳及び脊椎の骨再生及び修復は、特別な用途である。骨修復は、頭蓋から骨の一部を除去して脳を露出する手術手順（開頭術）及び頭蓋外傷にとって、重大な懸案である。骨吸収（骨細胞が骨を崩壊させ骨からミネラルを放出するプロセス）及び頭蓋欠損の癒着不良は、本明細書における組成物及び方法により対処される。
【００６９】
本明細書における実施形態は、軟骨再生にも使用される。軟骨は、様々な疾患（先天性の形態学的異常（例えば、口唇裂及び口蓋裂）、関節の外傷、腫瘍またはがんの手術後の大きな欠損、変形性関節症などの加齢関連疾患、及びリウマチ関節炎などの炎症性疾患を含む）により影響を受ける。軟骨組織がこれらの障害により損傷を受けると、顔または身体の形態を維持することが困難になり、さらに日常の活動の低下がもたらされる。軟骨組織の自己修復能力は限定されている。軟骨疾患は、従来から自己由来軟骨の移植または人工関節の置き換えにより治療されてきたが、このようなタイプの治療には、持続性、感染、及びドナー部位の侵襲性などの問題が存在する。軟骨再生のために、当該組成物は、細胞及び成長因子を欠損部位内に局在化させ、かつ維持する。一部の実施形態では、本明細書における組成物は、侵襲性が最小限の手段を介して移植され、かつ身体により安全に除去されるアミノ酸及び脂質に生分解される。
【００７０】
実験的
実施例１
ラットモデル
本明細書における実施形態の開発中に、本明細書に記載の組成物の有効性をｉｎ  ｖｉｖｏでラットモデルにおいて評価するため、実験を行った（図１Ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、ラットに実施した脊椎癒合モデルにおけるＢＭＰ２成長因子からの送達ビヒクルとしてＮａｎｏＳｌｕｒｒｙを使用して実施した。
【００７１】
材料及び方法
合成及び精製
本研究で使用したＰＡ分子、ＴＳＰＨＶＰＹＧＧＧＳ−Ｅ３Ａ３Ｖ３−Ｃ１６（ＢＭＰ２−ＰＡ）（配列番号５）及びＥ３Ａ３Ｖ３−Ｃ１６（希釈剤ＰＡ）（配列番号６）を、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学作用により、ＣＳ  Ｂｉｏ自動ペプチド合成装置において過去に報告された方法（Ｌｅｅ  ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ４（１），（２０１５）１３１−１４１．；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて合成した。得られた生成物を、標準的な逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製した。各ＰＡの純度及び正確な質量を、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析計における液体クロマトグラフィー／質量分析を用いて検証した。次にＰＡ分子を滅菌フィルター処理し、分取し、凍結乾燥し、使用まで−８０℃で保管した。
【００７２】
移植材料の調製
全てのＰＡ溶液を滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。手術当日、ＰＡ溶液をストックｒｈＢＭＰ−２溶液（１，５００μｇ／ｍＬ）及び水と混合して、ＰＡナノファイバー溶液に分散した所望最終濃度のｒｈＢＭＰ−２を達成した。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙの調製用に、上記で調製したナノファイバー溶液を乾燥コラーゲン粒子と混合してペーストを形成した。指定のｒｈＢＭＰ−２濃度で混合した後、１３０ｕＬのＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ混合物を滅菌１ｍＬシリンジに装填した。
【００７３】
第１群、ｎ＝８
製剤：
吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）及び０．１ｕｇのｒ−ＢＭＰ−２
１）１３０ｕＬの０．３８ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／ｍＬを４ｍｍ  ｘ  １０ｍｍのＡＣＳシートに装填する。
【００７４】
第２群、ｎ＝１２
製剤：
５重量％の吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）粒子、（０．１ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／動物）０．３８ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／ｍＬ
１）１．５ｍＬの水及び１６７ｕＬの４．０４ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／ｍＬを混合、
２）８７．７ｍｇの粉砕ＡＣＳと混合。（全体積１．７５４７ｍＬと想定）
３）１つの欠損Ｘ１０への移植用に１３０ｕＬを１ｃｃシリンジに装填
【００７５】
第３群、ｎ＝１２
製剤：
５重量％の吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）、１重量％のＰＡ、（０．１ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／個体）０．３８ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／ｍＬ
１）１．５ｍＬの１．１１重量％  Ｅ３及び１６７ｕＬの４．０４ｕｇ  ｒＢＭＰ−２／ｍＬを混合、
２）８７．７ｍｇの粉砕ＡＣＳと混合。（全体積１．７５４７ｍＬと想定）
３）１つの欠損Ｘ１０への移植用に１３０ｕＬを１ｃｃシリンジに装填
【００７６】
ラットの後外側腰椎横突間脊椎癒合
本明細書における実施形態の開発中に行った実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を受け、ＩＡＣＵＣの方針及び手順に従って行った。最初に、動物を以下の３つの治療群のうちの１群に割り当てた：第１群：１００ｎｇのＢＭＰ２及び吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）、第２群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びコラーゲン粒子、第３群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ。手術手順：ラットを、イソフルラン吸入麻酔送達システムによる継続的な麻酔下で暖房パッド上に維持し、心臓または呼吸の困難に備えたアシスタントが手順の全体にわたりラットを監視した。過去に説明された手術技法を利用して、腰椎棘突起に対し後部正中線切開を行い、この後に正中線から４ｍｍのところで２つの別々の筋膜切開を行った。筋裂アプローチを用いて、骨膜までの鈍的な剥離により、Ｌ４及びＬ５横突起を露出させた。十分な露出の後、癒合ベッド（ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｄ）を滅菌ゲンタマイシン／食塩水溶液で洗浄し、高速バールを使用して横突起の表面皮層を取り除いた。次にグラフト材料を、横突起間にある傍脊椎筋系の両側に移植した。筋膜及び皮膚の切開を、３−０  Ｍｏｎｏｃｒｙｌ吸収性縫合糸によるシンプルな断続パターンを用いて閉鎖した。縫合糸は術後７〜１０日で皮膚から除去された。手術後、ラットを別々のケージに収容し、自由に飲食させ、体重を支持させた。
【００７７】
手触診
術後８週間時に安楽死させた後、手触診により癒合を評価した。内容を知らされていない３人の観察者が、過去に確立した以下のスコア付け体系を用いて脊椎をスコア化した：
０＝ブリッジングなし；１＝片側のブリッジング；２＝両側のブリッジング；３＝十分量の骨による両側のブリッジング。平均スコアが１．０以上の脊椎を癒合が成功したものとみなした。
【００７８】
結果
ラット研究の結果を図１Ｂに示す。第３群は、全ての動物について１００％癒合という結果だった。これらの結果は、成長因子送達ビヒクルとしてのＮａｎｏＳｌｕｒｒｙの有効性を実証するものである。２つの対照群である第１群及び第２群は、コラーゲン及び水しか含有しておらず、これらの群は手触診による有意な脊椎癒合の尺度をもたらさなかった。これらの結果は、ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ製剤内に含まれるナノファイバーがｒｈＢＭＰ−２を有効に送達し、結果として脊椎癒合をもたらす役目を果たしていることを示すものである。
【００７９】
実施例２
ウサギの後外側脊椎癒合
本明細書における実施形態の開発中に、本明細書に記載の組成物の有効性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するため、ウサギの後外側脊椎癒合モデルにおいて実験を行った（図２）。
【００８０】
材料及び方法
合成及び精製
本研究で使用したＰＡ分子、ＴＳＰＨＶＰＹＧＧＧＳ−Ｅ３Ａ３Ｖ３−Ｃ１６（ＢＭＰ２−ＰＡ）（配列番号５）及びＥ３Ａ３Ｖ３−Ｃ１６（希釈剤ＰＡ）（配列番号６）を、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学作用により、ＣＳ  Ｂｉｏ自動ペプチド合成装置において過去に報告された方法（Ｌｅｅ他）を用いて合成した。得られた生成物を、標準的な逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製した。各ＰＡの純度及び正確な質量を、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析計における液体クロマトグラフィー／質量分析を用いて検証した。次にＰＡ分子を滅菌フィルター処理し、分取し、凍結乾燥し、使用まで−８０℃で保管した。
【００８１】
移植材料の調製
全てのＰＡ溶液を滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。手術当日、ＰＡ溶液をストックｒｈＢＭＰ−２溶液（１，５００μｇ／ｍＬ）及び水と混合して、ＰＡナノファイバー溶液に分散した所望最終濃度のｒｈＢＭＰ−２を達成した。次にＰＡ／ｒｈＢＭＰ−２溶液をＡＣＳ骨格に浸し、２枚一組で重ねて巻いて最終移植物にした（図２）。
【００８２】
ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙの調製用に、上記で調製したナノファイバー溶液をコラーゲンスポンジに添加するのではなく、乾燥コラーゲン粒子と混合してペーストを形成した。指定のｒｈＢＭＰ−２濃度で混合した後、２ｍＬのＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ混合物を滅菌５ｍＬシリンジに装填した。
【００８３】
手術前の動物飼育
手術の２４時間前に、動物に首輪をはめ、右耳介の内側でフェンタニルパッチ（１２μｇ／時間）を投与した。
【００８４】
手術部位の準備
手術部位を剪毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（ポビドンヨード）擦り付け及びアルコール拭き取りのプロトコルを用いて滅菌様式で準備した。
【００８５】
手術手順
ケタミン／キシラジンカクテル注射を用いてウサギに麻酔をかけ、ノーズコーンを介した２．５％イソフルラン吸入を用いて鎮静状態を維持した。手術部位を滅菌ドレープで覆った。手触診を用いて腸骨稜を識別し、Ｌ３〜Ｌ６椎体の位置に近接し、切開部位に局所麻酔を皮下投与した。対応棘突起のすぐ上方にある背側腰椎領域に沿って１０ｃｍの正中線切開を行った。Ｌ４〜Ｌ５横突起を露出するため、Ｌ４及びＬ５の棘突起の側面に（椎間関節の側面に）両側縦方向の筋膜及び筋肉の切開を行った。鈍的及び鋭的な剥離の組合せを用いて、傍脊椎筋群を椎体及び横突起から分離した。
【００８６】
Ｌ４〜Ｌ５に及ぶ横突間溝を創生した。横突起を十分に露出したら、０．５ｍｌのゲンタマイシン溶液を各溝に塗布した。塗布直後、滅菌ガーゼで余分なゲンタマイシン溶液を除去した。次に、電気バールを使用してＬ４及びＬ５の横突起の皮層を取り除いた。皮層除去の完了後、Ｌ４〜Ｌ５の横突起に及ぶ移植物を手術ベッドの両側に入れた。次に、３−０吸収性縫合糸による８の字縫合を用いて、筋膜層を閉鎖した。皮下に断続的様式で埋め込んだ３−０吸収性縫合糸を用いて、皮下組織を再び並べた。皮膚を創クリップで縫合した。
【００８７】
獣医学スタッフにより、術後の鎮痛及び補液を含めて動物を回復させた。全ての動物に、予防的な術後抗生物質治療及び不快感のための非ステロイド抗炎症剤を３日間受けさせた。
【００８８】
Ｘ線
Ｘ線撮影を２週間間隔で、ＣＣＭ施設で術後８週時に屠殺するまで行った。Ｘ線撮影については、Ｌｏｍｉｒのウサギ用包帯（ｓｗａｄｄｌｅ）を用いてウサギを物理的に固定した。この包帯は横たわらせるためのデバイス（ｓｎｕｇｇｌｅ  ｄｅｖｉｃｅ）であり、動物の胸骨位置を保持して、麻酔の必要なしに腰椎の撮影を容易にする。
【００８９】
触診及び癒合評価
動物を術後８週間時に安楽死させ、手触診による癒合の評価用に脊椎を採取した。評価は、前述のようにグレード分けされたスコア付け体系（０はブリッジングしていない骨、１はＬ４〜Ｌ５ブリッジング骨による片側癒合、２は両側がブリッジングした骨）を用いて、３人の独立した内容を知らされていない観察者により実施された。次に、各試験片に対する個々のスコアを平均化した。平均スコア≧１．０を安定した癒合とみなした。
【００９０】
結果
２つの対照群（第１群はＡＣＳ＋３０μｇのｒｈＢＭＰ−２、第２群はＡＣＳ＋６０μｇのｒｈＢＭＰ−２）は、それぞれの癒合率が０％、５０％であり、予想される通りであった（図３）。発明者らは、ｒｈＢＭＰ−２の送達がＰＡナノファイバーの添加（第３群及び第４群）により強化されたことを見いだした。移植物にＰＡを添加することにより、３０ｕｇまたは６０ｕｇのｒｈＢＭＰ−２を送達させた場合において、全ての動物に対し、１００％の癒合率及び可能な範囲での最高の癒合スコア（全ての動物における両側の癒合）がもたらされた。これらの目覚ましい結果は、ＰＡナノゲルによるｒｈＢＭＰ−２の保持、ｒｈＢＭＰ−２のバースト放出の回避、及びバースト放出ではなくゆっくりとした成長因子放出の動態が可能になったことによるものであると、発明者らは考えている。ＰＡナノファイバーは、ｒｈＢＭＰ−２に強力に結合し、バースト放出を防止するが、場合によってはｒｈＢＭＰ−２を非活性化する可能性が考えられる酵素及び他の生物学的因子に対するバリアも提供する。発明者らは、ＰＡナノゲルは、侵入細胞がナノファイバーマトリックスを分解し保持されている成長因子へのアクセスを得るまで、ナノファイバーマトリックス内のほとんどのｒｈＢＭＰ−２を保護及び保持するものと仮定している。
【００９１】
本研究中に、発明者らは、脊椎癒合用のＰＡナノファイバーに適用する新たな方法の開発及び試験を行い、ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙと称した。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ設計の背後にある理論的根拠は、任意の空間に成形及び形成され得るＰＡナノファイバーを癒合部位に適用するためのより容易な方法を、外科医にもたらすことであった。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙは、以前の群（１〜４）に匹敵する量のコラーゲン材料を含有し、新たな材料は含有しなかった。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ群も、３０ｕｇまたは６０ｕｇのｒｈＢＭＰ−２を送達させた場合に１００％の癒合率がもたらされた。
【００９２】
興味深いことに、手触診に基づけば、ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙは６匹中２匹の動物において、ｒｈＢＭＰ−２の添加なしで測定可能な量の癒合を誘発した。この結果は、ラットＰＬＦ脊椎癒合モデル１における発明者らの過去の発見を反映するものである。発明者らは、これらの横突起をブリッジングする石灰化組織を視覚化するため、これらの２つの試験片を非脱灰組織診断に送ることを計画している。それでもなお、発明者らは、この群における骨形成の性質は、内在性成長因子を結合しかつ保持する一方で、侵入細胞に伝導性骨格を提供する、当該材料の能力によるものと考えている。
【００９３】
ウサギの後外側脊椎癒合モデルを用いて行った実験は、ＰＡナノファイバーゲルが、「ＡＣＳのみ」の送達方法よりも優れた、強力なｒｈＢＭＰ−２送達ビヒクルをもたらすことを実証するものである（ナノファイバーゲルによる１００％の癒合率ｖｓＡＣＳによる５０％の癒合率）。ＰＡナノゲルによる６０μｇ／動物及び３０μｇ／動物におけるｒｈＢＭＰ−２送達は、１００％の癒合率をもたらした。これより低い用量も、同様にロバストな癒合を達成することが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１Ａは、ラット脊椎癒合モデルを示し、図１Ｂは、以下の３つの実験群で測定した癒合スコアを示す。第１群：コラーゲンスポンジ及び１００ｎｇのＢＭＰ２、第２群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びコラーゲン粒子、第３群：１００ｎｇのＢＭＰ２及びＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ。
【図２】ウサギ後外側脊椎癒合モデルにおける実験手順及び治療群を示す。浸漬及びロール（ｓｏａｋ−ａｎｄ−ｒｏｌｌ）の技法を用いて第１〜４群からの移植物を調製した。ＮａｎｏＳｌｕｒｒｙ群（第５〜７群）には、５ｍＬのシリンジから直接癒合ベッド（ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｄ）に適用した。
【図３】ウサギの後外側脊椎癒合モデルに対する、盲検的な手触診に基づく癒合率及びスコアを示す。
【図４−１】ウサギの後外側脊椎癒合モデルに対する移植後８週間の最終時点における全てのＸ線写真である。
【図４−２】ウサギの後外側脊椎癒合モデルに対する移植後８週間の最終時点における全てのＸ線写真である。
【図５】ウサギの後外側脊椎癒合モデル；手術後８週間時の選択群のｕＣＴ画像である。
【図６】ウサギの後外側脊椎癒合モデル；選択群の各々において最も多くの量の骨成長を伴った個体を示すｕＣＴ画像である。「偽手術後対照」の代表個体は、ＰＬＦ皮質除去手順の直後に安楽死させた。
【図１】
2018534043.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2018534043.tif 000010