(57)【要約】  流体デバイスは、少なくとも１つのシグナル検出セグメントと流体連通し、且つ空間的に分離された少なくとも１つのビーズ保持セグメントを有する、典型的には密集アレイの複数の反応ウェルを含む。それぞれのビーズ保持セグメントは、試薬を付着させることができる単一のビーズを保持するように構成してもよい。
2018531369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応ウェルが少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通した少なくとも１つの空間的に分離されたシグナル検出セグメントとを有することを特徴とする複数の反応ウェルを備えた流体デバイス。
【請求項２】
前記デバイスはマイクロ流体チップであり、前記反応ウェルは反応ウェルのアレイとして提供される請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記反応ウェルは１ａＬから１μＬの容積を有する請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、それぞれが単一のビーズのみを保持するような寸法及び構成であり、前記少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントの少なくとも１つは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントのうちの１つ以上から、標的のビーズの直径の０．３Ｘから約２００Ｘの間、典型的には１μｍから１ｍｍの間、任意で１μｍから１０μｍの間の距離Ｌにある端部を有する請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、直径が１００ｎｍから１ｍｍのマイクロスフェアのビーズを保持するような寸法及び構成であり、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、その中に保持されたそれぞれのビーズの直径の１０１％から１９５％の間の幅を有する請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記別個の少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、隣接するビーズ保持セグメントの幅よりも小さい幅を有する長手のチャネルを備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、単一のビーズ保持セグメントである請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、複数のビーズ保持セグメントである請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントは、複数の別個のシグナル検出セグメントであり、少なくとも１つの隣接する対のビーズ保持セグメントを、前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントの長手のチャネルによって離間しており、前記長手のチャネルは、前記少なくとも１つの隣接する対のビーズ保持セグメントより幅が狭い又は深さが浅い、或いは幅が狭くて深さが浅い、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、複数のビーズ保持セグメントであり、それぞれが共通のサイズを有する請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、複数のビーズ保持セグメントであり、その少なくとも１つは少なくとも１つの別のビーズ保持セグメントとは異なるサイズを有する請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
それぞれのビーズウェルの反応量は、対応するビーズ保持セグメントによって保持されるように寸法決めされ、構成されたビーズの容積よりも２Ｘ〜２００Ｘの大きさである請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ビーズウェルは、約６，０００ウェル／ｃｍ２〜約２，０００，０００ウェル／ｃｍ２の密度で提供される請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記ビーズウェルの前記保持セグメント及び／又は前記シグナル検出セグメントは、テーパー及び／又はストレート壁を備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントのうちの１つ以上は、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントからある距離だけ離間して、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通する環状流体チャネルを備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ビーズウェルは、より幅が狭い直線流体チャネルによって流体的に接続された第１及び第２の離間した端部を有しており、前記第１の端部は、円形の外周を有し、第１のビーズ保持セグメントを画定し、前記第２の端部は、円形の外周を有し、第２のビーズ保持セグメントを画定する請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記第１の端部は、前記第２の端部と比較して、直径及び／又は深さがより大きい、又はより小さい請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記反応ウェルの前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントからシグナルを電子的に検出することによる請求項１〜１７のいずれかに記載の前記デバイスを用いて被分析物を分析する為の方法。
【請求項１９】
電子的なシグナルの検出を行ってそれぞれの反応ウェルの前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントからの陽極アッセイシグナル及び／又は符号化シグナルを検出し、任意で、（ａ）電子的な検出は、反応前及び／又は（ｂ）アッセイが実施される前にベースラインの読み出しを必要とせずに反応後に実施される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記電子的なアッセイシグナルの検出は、一種類以上のビーズを含むアレイに対して実施することができ、各ビーズタイプは固有の特徴（任意に異なる強度レベルの蛍光色素の組み合わせ）で符号化されているとともに、各タイプは、異なる被分析物又は異なる化学反応の検出を可能にする異なる試薬で官能化される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
マイクロウェルを作製する方法であって、
複数の間隔が狭い反応ウェルを少なくとも１枚の基材内又は上に形成することを含み、前記反応ウェルは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通している少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントを含み、隣接する反応ウェルのビーズ保持セグメントの中心線は１μｍ〜１ｍｍ以上の間隔をあけており、前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、標的のビーズの直径の０．３Ｘから２００Ｘの距離Ｌだけ、また任意で１μｍから１ｍｍ、少なくとも１つのビーズ保持セグメントの中心線から延在している前記方法。
【請求項２２】
分析システムであって、
コントローラと、
前記コントローラと連通する検出器と、
反応ウェルを保持するデバイスの前記反応ウェルのシグナル検出セグメントに存在するシグナルを識別するように構成されたモジュールを有する画像処理器を備え、
前記反応ウェルは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントから離れる方向に距離をあけて延在して前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通している少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントを含み、
前記モジュールは、前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントから離れる方向に延在するシグナル検出セグメントに関連付けられた陽極アッセイシグナルを識別するように構成されており、任意で、反応の前に前記検出器からのベースラインの読み出しを必要とせず、前記反応の後に識別を行う前記システム。
【請求項２３】
前記モジュールは、同定された陽極アッセイシグナルに基づいて、又はアッセイが実施される前又は間に、ビーズ復号化を行うように構成された請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記モジュールは、単一の反応ウェルの第１と第２の別個のビーズ保持セグメントに保持された少なくとも２つのビーズを識別するように構成され、前記ウェルは前記ビーズ保持セグメントの一方又は両方と流体連通する少なくとも１つのシグナル検出セグメントを有する請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
隣接する反応ウェルのビーズ保持セグメントの中心線は１μｍ〜１ｍｍの間隔をあけており、前記少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、標的のビーズの直径の０．３Ｘから２００Ｘの距離Ｌだけ、また任意で１〜１００μｍ、それぞれの反応ウェルの前記少なくとも１つのビーズ保持セグメントの中心線から延在する請求項２２〜２４のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１５年７月２２日に出願された米国仮出願番号６２／１９５，３８１の利益及び優先権を主張するものであり、その参照により全文が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府支援の陳述
この発明は、ＤＯＤ国防高等研究計画庁（ＤＡＲＰＡ）によって授与された助成金番号ＨＲ００１１−１２−２−０００１の下で政府の支援によってなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有するものとする。
【０００３】
本発明は、流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のセグメントを増幅する為の非常に感度の高い方法である。ＰＣＲには、多くの適用方法がある。例えば、病気を引き起こす生物の存在を判定する為の微量核酸の検出、遺伝子発現、ジェノタイピング、遺伝子工学や遺伝子組み換え、及び科学捜査への応用などである。ＰＣＲ増幅により、広い被分析物の濃度範囲にわたって卓越した標的の同定及び定量を提供してもよい。しかし、ＰＣＲによって多くの被分析物の同時且つ定量的な分析が非常に困難であることが証明されている。挿入色素蛍光ベースの検出では、トータルのｄｓＤＮＡの濃度を決定することができるだけであり、したがって、単一の反応容器中の複数のテンプレートの並行分析は、この検出方法を用いては不可能である。蛍光プローブ技術（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、分子ビーコン、又は他の化学物質）を使って、各標的は、シグナリングレポーターとして異なる色の蛍光プローブを用いて増幅することができるので、低レベルの反応のマルチプレックス化が可能である。また、プローブは、配列特異的でもあり、プライマーダイマー形成や非特異的増幅からの誤検出を低減する。従来のマイクロタイタープレート又はマイクロ流体リアルタイム−ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）のいずれかでマルチプレックス化する為の典型的な方法では、それぞれが３つの異なる色のプローブを含む少数の反応ウェルの数を使う。しかし、それは、一般的には、互いとの互換性を保証する為には、更なるレベルの慎重な設計と最適化を必要とするので、マルチプレックスプライマー及びプローブセットを設計するのは困難であると考えられている。この方法によるマルチプレックス化は、最終的には、計装と染料との間のスペクトルの重複によって４色検出、しかも、そのうち一色は内部標準色素とするのが限界である。
【０００５】
図１Ａ及びＩＢは、従来の円筒形又は円錐形のビーズウェルを示す。形状及び／又は制限された容積により、その溶液の体積をビーズに近接したエリアに限定できる。ビースの背景の蛍光（ポリスチレンビーズ、特に短波長で顕著）又は蛍光色素符号化（マルチプレックスアッセイに使用）は、アッセイシグナル対ノイズを大幅に減少させる重要な背シグナルを生成する。さらに、検出色素には、ビーズに結合し、高い背景シグナルを提供するものもある（特にカチオン性及び／又は疎水性色素及びカルボキシ官能化ポリスチレンビーズの場合）。さらに、ビーズはアッセイ読み出し中に、ビーズウェル内で望ましくない量が移動してしまい、背景の蛍光の背景の減算が困難になる場合もある。
【発明の概要】
【課題を解決する為の手段】
【０００６】
この発明の実施形態は、ウェル内でアッセイシグナルを検出する為のシグナル対ノイズを増強する為に、ウェル内の隣接する溶液の領域からそれぞれのビーズを分離することができる新規なビーズウェル形状を提供する。
【０００７】
この発明の実施形態は、複数の反応ウェルを含む流体デバイスに対するものであり、反応ウェルは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通した少なくとも１つの空間的に分離されたシグナル検出セグメントとを有することを特徴とするものである。
【０００８】
デバイスはマイクロ流体チップであり、反応ウェルは反応ウェルのアレイとして提供してもよい。
【０００９】
反応ウェルの容積は、１ａＬ〜約１μＬ、任意で約１０ａＬ〜約１μＬ、又は任意で約１ｆＬ〜約１μＬでもよい。
【００１０】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、それぞれが単一のビーズのみを保持するような寸法及び構成としてもよい。
【００１１】
少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントの少なくとも１つは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントのうちの１つ以上から、標的のビーズの直径の０．３Ｘから約１００Ｘの間、典型的には１から１００μｍの間、任意で１から１０μｍの間の距離Ｌにある端部を有していてもよい。
【００１２】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、約１０ｎｍ〜約１ｍｍの間、典型的には約１００ｎｍ〜約１ｍｍの間の直径のマイクロスフェアのビーズを保持するように寸法決めされ、構成され得る。
【００１３】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントの幅は、その中に保持されたそれぞれのビーズの直径の約１０１％〜約１９５％でもよい。
【００１４】
別個の少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、隣接するビーズ保持セグメントの幅よりも小さい幅の長手のチャネルを有していてもよい。
【００１５】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、単一のビーズ保持セグメントとしてもよい。
【００１６】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、複数のビーズ保持セグメントとしてもよい。
【００１７】
少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントは、複数の別個のシグナル検出セグメントとしてもよい。少なくとも１つのビーズ保持セグメントの隣接する対を、少なくとも１つのシグナル検出セグメントの長手のチャネルによって離間させることができる。長手のチャネルは、隣接するビーズ保持セグメントの対の幅及び深さよりも狭く、浅い幅を有していてもよい。
【００１８】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、各々が共通のサイズを有する複数のビーズ保持セグメントとしてもよい。
【００１９】
少なくとも１つのビーズ保持セグメントは、複数のビーズ保持セグメントであってもよく、その少なくとも１つは少なくとも別個のビーズ保持セグメントとは異なるサイズを有する。
【００２０】
それぞれのビーズウェルの反応量は、対応するビーズ保持セグメントによって保持されるように寸法決めされ、構成されたビーズの体積よりも約２Ｘ〜２００Ｘの大きさとしてもよい。
【００２１】
ビーズウェルの密度は、約６，０００ウェル／ｃｍ２〜約２，０００，０００ウェル／ｃｍ２としてもよい。
【００２２】
ビーズウェルの保持セグメント及び／又はシグナル検出セグメントは、テーパー及び／又はストレート壁を有していてもよい。
【００２３】
少なくとも１つのシグナル検出セグメントのうちの１つ以上は、少なくとも１つのビーズ保持セグメントからある距離だけ離間しており、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通する環状流体チャネルを有していてもよい。
【００２４】
ビーズウェルは、より幅が狭い直線流体チャネルによって流体的に接続された第１及び第２の離間した端部を有していてもよい。
【００２５】
第１の端部は、円形の外周を有し、第１のビーズ保持セグメントを画定することができ、第２の端部は、円形の外周を有し、第２のビーズ保持セグメントを画定してもよい。
【００２６】
第１の端部の直径及び／又は深さは、第２の端部と比較してより大きくても小さくてもよい。
【００２７】
他の実施形態は、反応ウェルの少なくとも１つのシグナル検出セグメントから符号化されたビーズシグナル及び／又はアッセイシグナルを電子的に検出することによって、上記の特徴のいずれかを有するデバイスを使用して被分析物を処理、検出、又は分析する方法に関するものである。
【００２８】
電子的なアッセイシグナルの検出は、それぞれの反応ウェルの少なくとも１つのシグナル検出セグメントからの陽極アッセイシグナルを検出するように構成してもよい。
【００２９】
任意で、電子的なシグナルの検出は、反応の前に、ベースラインの読み出しを必要とせずに反応後に実施してもよい。
【００３０】
任意で、電子的なシグナルの検出は、アッセイを実施する前に、それぞれの反応ウェルの少なくとも１つのシグナル検出セグメントから符号化されたシグナルを検出するように構成してもよい。
【００３１】
電子的なシグナルの検出は、ビーズの種類それぞれが固有の特徴（任意に異なる強度レベルの蛍光色素の組み合わせ）で符号化されているとともに、それぞれ異なる被分析物又は異なる化学反応の検出を可能にする異なる試薬で官能化された、一種類超のビーズを含むアレイに対して実施してもよい。
【００３２】
さらに他の実施形態は、マイクロウェルを作製する方法に関するものである。この方法は、少なくとも１枚の基材内又は上に複数の反応ウェルを狭い間隔で形成することを含み、反応ウェルは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通した少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントとを有するものである。隣接する反応ウェルのビーズ保持セグメントの中心線は、１〜２０μｍの間隔をあけていてもよく、少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、標的のビーズの直径の０．３Ｘから１００Ｘの間の距離Ｌ、任意で１μｍ〜２０μｍ若しくはそれ以上、典型的には少なくとも１つのビーズ保持セグメントの中心線から１ｍｍ以下だけ延在している。
【００３３】
他の実施形態は、分析システムに関するものである。このシステムは、コントローラと、コントローラと連通する検出器と、反応ウェルを保持するデバイスの反応ウェルのシグナル検出セグメントに存在するシグナルを識別するよう構成されたモジュールを有する画像処理器を含む。反応ウェルは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと、少なくとも１つのビーズ保持セグメントから離れる方向に距離をあけて延在して、少なくとも１つのビーズ保持セグメントと流体連通している少なくとも１つの別個のシグナル検出セグメントを有する。モジュールは、少なくとも１つのビーズ保持セグメントから離れる方向に延在するシグナル検出セグメントに関連付けられた陽極アッセイシグナルを識別するように構成されており、任意で、反応前に検出器からのベースラインの読み出しを必要とせず、反応後に識別を行う。
【００３４】
モジュールは、同定された陽極アッセイシグナルに基づいて、又はアッセイが実施される前又は間に、ビーズ復号化を行うように構成してもよい。
【００３５】
モジュールは、単一の反応ウェルの第１と第２の別個のビーズ保持セグメントに保持された少なくとも２つのビーズを識別するように構成してもよい。ウェルはビーズ保持セグメントの一方又は両方と流体連通する少なくとも１つのシグナル検出セグメントを有していてもよい。
【００３６】
隣接する反応ウェルのビーズ保持セグメントの中心線は、１〜２０μｍ以上の距離だけ離れていてもよい。
【００３７】
少なくとも１つのシグナル検出セグメントは、それぞれの反応ウェルの少なくとも１つのビーズ保持セグメントの中心線から、標的のビーズの直径の０．３Ｘから２００Ｘの距離Ｌだけ、また任意で１〜２０μｍ以上延在してもよい。
【００３８】
一実施形態に対して説明したこの発明の態様は、特に記載はしないが、別の実施形態に組み込んでもよいことは理解できよう。すなわち、すべての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、任意の方法及び／又は組合せで組み合わせることができる。出願人は、たとえ最初の請求がそうでなくとも、任意の他の請求項又は複数の請求項に従属する及び／又は任意の特徴を組み込む為に、任意の最初に提出された請求項を補正する権利を含み、最初に提出された請求項を修正する及び／又はそれに従った任意の新規の請求項を提出する権利を保有する。本発明のこれら及び他の目的及び／又は態様について、以下に述べる明細書において詳細に説明する。本発明のさらなる特徴、利点及び詳細は、以下の好ましい実施形態の図面及び詳細な説明を読むことにより当業者に理解されよう。また、そのような説明は本発明の単なる例示に過ぎない。
【００３９】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成しており、この発明の実施形態を示し、説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】従来技術のビーズウェルアレイの上面図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示す従来のビーズウェルの側面斜視図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態による例示のビーズウェルアレイの上面図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示すビーズウェルの側面斜視図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態による別の例示のビーズウェルアレイの上面図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示すビーズウェルの側面斜視図である。
【図４Ａ】本発明の実施形態によるさらに別の例示のビーズウェルアレイの上面図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示すビーズウェルの側面斜視図である。
【図５Ａ】本発明の実施形態による別の例示のバリア付きのビーズウェルの上面図である。
【図５Ｂ】本発明の実施形態によるさらに別の例示のバリア付きのビーズウェルの上面図である。
【図６Ａ】本発明の実施形態による例示のマイクロ流体チップの上面図である。
【図６Ｂ】乃至
【図６Ｃ】本発明の実施形態による図６Ａに示すマイクロ流体チップの例示の取り付け可能な基材の上面図である。
【図６Ｄ】本発明の実施形態による光学スペーサを示す、マイクロ流体チップの断面図である。
【図６Ｅ】本発明の実施形態による隣接した反応ウェル間のシーリング剤の使用を示す、例示のマイクロ流体チップの断面図である。
【図７Ａ】ＰＣＲの３０サイクル後のウェルアレイの一部の蛍光顕微鏡画像である。
【図７Ｂ】１２の陽極及び３の陰極反応ウェルからの蛍光シグナルのプロットである。１コピー／５０ｆＬ反応の比較的高い有効濃度により、およそ１１サイクルの早期Ｃｔをもたらす。
【図８Ａ】Ｓｉウェーハ中の連結されたビーズと反応ウェルＤＲＩＥとの明視野顕微鏡画像である。
【図８Ｂ】図８Ａに示したものと同様のアレイの明視野顕微鏡画像を示しており、本発明の実施形態によるビーズを装填した状態を示している。
【図８Ｃ】本発明の実施形態による直径３．３μｍのプロマグ（Ｐｒｏｍａｇ）ビーズを装填したアレイのビーズの背景の蛍光が高いことを示す蛍光顕微鏡画像である。
【図９Ａ】乃至
【図９Ｂ】本発明の実施形態によるサイクル１０（増幅が検出される前、図９Ａ）及びサイクル３０（増幅後、図９Ｂ）からの蛍光画像である。
【図１０Ａ】ビーズウェル領域上で６個の陽極ウェル（実線のトレース）と３個の陰極ウェル（破線のトレース）のみに対するｒｔ−ＰＣＲの３０サイクルの間の平均化した生蛍光シグナルのプロットを表す図である。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態によるこれらの同じビーズに対するシグナル検出セグメント（スリット）ウェル領域のみから平均化された生蛍光シグナルのプロットである。
【図１１Ａ】乃至
【図１１Ｂ】図１１Ａは、シール前の各ウェルのビーズの画像を示し、図１１Ｂは、シール数分後の画像を示す。
【図１２Ａ】乃至
【図１２Ｂ】射出成形によって製造され、ビーズが装填されたビーズウェルアレイを有するポリマーデバイスの例を示す。図１２Ａは、ビーズを有するデバイスのＳＥＭであり、図１２Ｂは、装填されたアレイの蛍光顕微鏡画像を示す。
【図１３Ａ】乃至
【図１３Ｂ】本発明の実施形態によるプラスチック／ポリマー基材にブルズアイ形状のウェル（図１３Ｂ）を製造する為にＤＲＩＥエッチングされたシリコンモールド（図１３Ａ）を使用してホットエンボス加工されたアレイを示すＳＥＭ画像である。
【図１４Ａ】乃至
【図１４Ｄ】本発明の実施形態によるデュアル又はマルチビーズ保持形状を有する反応ウェルの例の上面概略図である。
【図１５Ａ】乃至
【図１５Ｃ】本発明の実施形態による２つより多くのビーズ保持形状を有する反応ウェルの例の上面概略図である。
【図１６】本発明の実施形態による分析システムの概略図である。
【図１７】乃至
【図１９】本発明の実施形態の例示の方法を示すフローチャートである。
【発明を実施する為の形態】
【００４１】
本発明について、本発明の実施形態を示す添付の図面と例を参照しながら以下に説明する。しかしながら、この発明は、様々な異なる形態で具現化することが可能であり、ここで説明する実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的且つ完全となるように提供されるものであり、同業者には、この発明の範囲が完全に伝わるであろう。
【００４２】
全体を通して同様の参照番号は同様の要素を示すものである。図面では、明確に示す為に、一部の線、層、構成部分、要素、又は特徴が強調されている場合もある。本文と図面における、図面Ｆｉｇｕｒｅを表す略語ＦＩＧ．とＦｉｇ．は入れ替えても使用できる。
【００４３】
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用するものであり、この発明を限定することを意図したものではない。本明細書では、文脈がそれを明らかに示さない限り、単数形は複数形もまた含むことを意図している。さらに、本明細書で使用される「含む」及び／又は「含んでいる」という用語は、述べられた特徴、ステップ、動作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、ステップ、動作、要素、構成要素、及び／又はそのグループの存在又は追加を排除するものではないことが理解されるであろう。本明細書で使用される、用語「及び／又は」は、列挙された関連項目の１つ以上の任意及び全ての組み合わせを含むものである。本明細書で使用される「ＸとＹとの間」及び「約ＸとＹとの間」のような語句は、ＸとＹを含むものであることが理解されるであろう。本明細書で使用される「約ＸとＹとの間」のような語句は、「約Ｘと約Ｙの間」を意味する。本明細書で使用される「約ＸからＹまで」のような語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００４４】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術的又は科学的用語を含む）は、一般に本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有するものである。一般に使用される辞書で定義されるような用語は、明細書の文脈及び関連技術における意味と一致する意味を有するものとして理解すべきであり、本明細書に定義されていない限り、理想化された、又は過度に正式な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能又は構造は、簡潔及び／又は明瞭の為に詳しく説明しない場合もある。
【００４５】
ある要素が、他の要素に対し、「上に」「取り付けられて」「接続されて」「連結されて」「接触して」などのように表現されている場合は、直接、当該他の要素上にある、取り付けられている、接続されている、連結されている、又は接触している場合があり、又はその間に介在する要素が存在する場合も含むことは理解されよう。それとは対照的に、ある要素が、例えば、他の要素に対し、「直接〜上に」、〜に「直接取り付けられた」、〜に「直接接続された」、〜と「直接連結された」、又は「直接接触して」などと表現される場合には、間に介在する要素は存在しないものとする。当業者にとって、他の構造に隣接して」配置される構造又は特徴物は、隣接する特徴物と上下に重なる部分を有していてもよいことは理解できよう。
【００４６】
空間的関係を示す用語、例えば、「下に」「下方に」「より低い」「上に」「より上に」などは、図面に示すように、１つの要素又は特徴物の、他の要素（複数も含む）又は特徴物（複数も含む）に対する関係の説明を容易とする為に本明細書で使用することができる。空間的関係を示す用語は、使用中又は操作中のデバイスについて、図面に示した方位に加え、異なる方位も含むことを意図していることは理解されよう。例えば、図面のデバイスを反転させた場合、他の要素又は特徴物の「下」又は「下位」にあると説明した要素は、他の要素又は特徴物の「上位」となる。よって、例示の用語「下」は、「上」と「下」の方位双方を含むことができる。デバイスは、別の方位とする（９０度回転する、又は他の方位）でもよく、本明細書で使用する空間的関係性を示す記述用語はそれに従って解釈するものとする。同様に、本明細書で使用する「上方に」「下方に」「垂直に」「水平に」なども、特に指定がない限りは、説明のみを目的とする。
【００４７】
本明細書で様々な要素に対して「第１」「第２」などを称することがあるが、これらの要素は、これらの用語によって限定されるものではないことは理解できよう。これらの用語は、１つの要素を別の要素から区別する為にのみ使用する。よって、下記に説明する「第１の」要素が本発明の教義から逸脱することなく、「第２の」要素となることも可能である。操作（又はステップ）の配列は、特に指定がない限り、請求項又は図面に示された配列に限定するものではない。
【００４８】
用語「マイクロチップ」及び「マイクロ流体チップ」は入れ替えて使用してもよく、略平坦で薄い装置を意味するものである。マイクロ流体チップは、剛性、半剛性、又は柔軟性を有するものでよい。用語「薄い」は、１０ｍｍ以下、例えば、１０ｍｍと０．１ｍｍの間の厚み寸法をいい、約３ｍｍ、約２．５ｍｍ、約２ｍｍ、約１．５ｍｍ、約１ｍｍ、又は約０．５ｍｍでもよい。マイクロチップは典型的には、約６インチ未満の幅と長さを有し、より典型的には約１インチ〜６インチの間である。しかしながら、いくつかの実施形態では、マイクロチップは、より長い場合もあり、例えば、長さ及び／又は幅が１フィート以上のものもある。マイクロチップは、長さ寸法より小さい幅寸法を有しているものでもよい。マイクロ流体チップは、いくつかの実施形態では、約２．１３インチ（５４ｍｍ）の幅寸法と約３．４インチ（８５．５ｍｍ）の長さ寸法を有していてもよい。マイクロチップは、マイクロサイズ及び／又はナノサイズの流体チャネルも含みうる。
【００４９】
用語「主寸法」は、流体チャネルの幅及び／又は深さ寸法のことをいう。
【００５０】
流体チャネルに対する用語「マイクロサイズの」及び「マイクロ流体の」は、サブミリメートル又はそれより小さい寸法の幅及び／又は深さ（例えば、この用語は、マイクロメートル及びナノメートルサイズのチャネルを含む）を有する流体流路のことをいい、少なくとも数ミリメートル以下の寸法範囲、典型的には９００ミクロン未満且つ１ｎｍより大きいセグメントにおける幅及び／又は深さを有するチャネルを含む。
【００５１】
ビーズウェルアレイのビーズウェルのチャネルは、側壁と、１枚以上の基材に形成された床を有して上面は開放され、底面は閉鎖され、それらの間を側壁が延在する。１つ以上のスペーサ、上基材、膜、又はカバーを使用してもよい。上基材、膜、又はカバーは、流体チャネル（複数も含む）及び／又は反応ウェルのアレイの上面をシール、被覆、又は閉鎖してもよい。
【００５２】
用語「約」は、±２０％以下、例えば±１０％の間で変化しうるパラメータのことをいう。
【００５３】
用語「ビーズ」は、反応ウェルで使用するのに適した、ポリマー、フォトレジスト、プラスチック、ガラス、二酸化シリコン、金属又は半金属酸化物（酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム又は他の酸化物を非限定的に含む）、量子ドット、金属粒子などのような、多孔、表面多孔、無孔材料の粒子、顆粒、又はマイクロスフェア、典型的には磁性マイクロスフェアのような固相部材のことをいう。
【００５４】
用語「回路」は、ハードウェアの実施形態全体又はソフトウェアとハードウェアを結合する実施形態のことをいう。
【００５５】
サンプルの中の被分析物は、例えば、合成及び生物学的高分子、ナノ粒子、小分子、ＤＮＡ、核酸／ポリ核酸、ペプチド、たんぱく質等を含む多様な混合物を含むサンプルからの任意の目的の被分析物でよい。被分析物は、１つ以上の被分析物分子でもよい。サンプル又はサンプルの被分析物は、アミノ酸又は荷電分子、分子、ペプチド、及びタンパク質のような１つ以上の極性代謝産物をさらに含んでいてもよい。サンプル及び／又は被分析物は、生物学的流体、血液、血清、尿、乾燥血液、細胞増殖培地、溶解した細胞、飲料又は食品から抽出された分子を含むことも、代替として含んでいてもよい。サンプルはまた、水、空気又は土壌のような環境サンプルをさらに含んでいても、代替として含んでいてもよい。
【００５６】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも約５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド（例えば、５，６，７，８，９，１０，１２，１５，１８，２０，２１，２２、２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０、又は５００ヌクレオチド）の核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、又は約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドでもよく、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅アッセイにおけるプライマーとして及び／又はハイブリダイゼーションアッセイ若しくはマイクロアレイにおけるプローブとして使用してもよい。この発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知のように、天然又は合成であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、修飾主鎖など、又はそれらの任意の組み合わせでよい。
【００５７】
増幅及び／又は検出の為のものを含むプローブ及びプライマーは、任意の適切な長さのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ及び合成及び／又は修飾オリゴヌクレオチドなどのような自然に存在するオリゴヌクレオチドを含む）であるが、典型的には長さが５，６又は８ヌクレオチドから長さ４０，５０又は６０ヌクレオチドまで、又はそれ以上である。そのようなプローブ及び／又はプライマーは、ビーズ、チップ、ピン、若しくはマイクロタイタープレートウェルのような固体支持体上に固定、若しくは結合してもよく、さらに／又は蛍光化合物、化学発光化合物、放射性元素、若しくは酵素のような検出可能な基に結合しても、標識化されてもよい。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、公知の技術に従って実施してもよい。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、及び第４，９６５，１８８号参照のこと。一般に、ＰＣＲは、まず、ハイブリダイゼーション条件下で検出されるべき特定の配列の各鎖について１つのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸サンプルを（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）処理して、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長産物が特定の配列の各鎖に十分相補的なプライマーで合成されて、各プライマーから合成された伸長産物が、その相補体から分離すると、他のプライマーの伸長産物の合成の為の鋳型として働くようにハイブリダイズし、次に、変性条件下で試料を処理して、検出すべき配列（単数又は複数）が存在する場合、プライマー伸長産物をそれらの鋳型から分離することを含む。これらのステップは、所望の程度の増幅が得られるまでサイクル的に繰り返される。増幅された配列の検出は、反応生成物に、その反応性生物（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）にハイブリダイズできる、検出可能な標識を担持したオリゴヌクレオチドプローブを添加し、次いで既知の技術に従って、又はゲル上で直接的に視覚化することにより標識を検出することによって達成してもよい。増幅された配列は、反応混合物に挿入色素を添加し、二本鎖ＤＮＡの全質量に比例する蛍光シグナル強度を監視することによって検出してもよい。本発明による実施形態はＰＣＲ反応に関して記載されているが、ローリングサークル増幅又はループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）などの等温増幅技術を含む逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のような他の核酸増幅法や、核酸配列決定法をも用いることができることを理解されたい。
【００５９】
上記のようなＤＮＡ増幅技術は、目的の多型又は突然変異を含むＤＮＡに特異的に結合するが同じハイブリダイズ条件下で目的の多型を含まないＤＮＡには結合せず、増幅反応におけるＤＮＡ又はその一部の増幅の為のプライマー又は複数のプライマーとして働くプローブ、プローブの対、又は２対のプローブの使用を含むことができる。このようなプローブは、本明細書では増幅プローブ又はプライマーと呼ぶことがある。
【００６０】
「試薬」という用語は、化学反応を引き起こす為にシステムに添加されるか、又は反応が起こるかどうかを見る為に添加される、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を含む任意の物質又は化合物のことをいう。増幅試薬（単数又は複数）とは、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素以外の増幅に一般に用いられる試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、緩衝液など）のことをいう。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分と共に、反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れて、収容される。
【００６１】
本明細書で使用される用語「磁気」は、強磁性、常磁性、及び超常磁性を含む。
【００６２】
一般に、目的の多型又は突然変異を含むＤＮＡを検出する為に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、その突然変異又は多型を符号化するＤＮＡに結合するが、同じハイブリダイゼーション条件下では、突然変異又は多型を含まないＤＮＡには結合しないものである。オリゴヌクレオチドプローブは、以下に示すような、適切な検出可能な基で標識化される。このようなプローブは、本明細書では、検出プローブ又はプライマーと呼ばれる場合もある。
【００６３】
図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、及び図４Ｂを参照すると、シグナル検出が改善された幾何形状を有するビーズウェル１０の例が示されている。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、従来のビーズウェル１０は、ビーズを保持するように構成された円形の外周（典型的には円筒形又は円錐形のウェル）を有する。対照的に、本発明の実施形態によるビーズウェル１０は、ビーズ保持セグメント１１に隣接するシグナル検出セグメント１５と流体連通するビーズ保持セグメント１１を有する幾何形状を有する。
【００６４】
ビーズウェル１０は、密集したビーズウェル１０の比較的高密度のアレイ１０ａに設けることができる。ビーズウェル１０は、行と列に整列させることができ、又は互いにオフセットさせることもできる。ウェル１０は、定期的な反復パターン、不規則な反復パターン、又は他のパターンで提供される。「密」という用語は、流体分析装置のフットプリントが、１平方ミリメートルあたり約１００〜６０００ウェル１０、及び／又は１平方センチメートルあたり１０，０００〜５，０００，０００ウェル１０、典型的には１平方センチメートルあたり約６，０００〜約２，０００，０００ウェル１０、さらに典型的には１平方センチメートルあたり約５００，０００〜約２，０００，０００ウェル１０を意味する。
【００６５】
隣接するウェル１０のいくつか又は全ては、それぞれの隣接するビーズ保持セグメント１１の中心線間を測定して、約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、若しくはそれ以上、及びそれらの間の任意の数など、１μｍ〜１０ｍｍの間の分離距離を有していてもよい。
【００６６】
ウェル１０のいくつか又はすべては、増幅試薬と協働する反応ウェル１０でもよい。ウェル１０のいくつか又はすべては、サブピコリットルの反応量を処理してもよい。
【００６７】
シグナル検出セグメント１５は、任意で、シグナル検出セグメント１５ｅの端部とビーズ保持セグメント１１とを接続する短い及び／又は長手の流体チャネル１５ｃｈを備えていてもよい。シグナル検出セグメント１５は、ビーズ保持セグメント１１から、典型的には標的ビーズの直径の３０％〜約１０，０００％（０．３Ｘ〜約１００Ｘ）、より典型的には、標的ビーズの直径の約０．３Ｘ〜約２０Ｘ離れた距離「Ｌ」に端部１５ｅを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｌは、標的ビーズの直径の１Ｘ〜５Ｘでもよい。例えば、直径３．２μｍのビーズの場合、長さＬは、約１〜約６４０μｍ、より典型的には１〜３２μｍ、特定の実施形態では、約３．２〜１６μｍとしてもよい。明確にする為に、文字「Ｘ」を有する数字は、乗数、１倍（１Ｘ）、１０倍（１０Ｘ）等を指す。
【００６８】
いくつかの実施形態において、Ｌは、約１μｍ〜１０ｍｍ以上、典型的には約１ｍｍ又は約１００μｍまで、より典型的には１〜２０μｍ、例えば約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、及び約２０μｍである。長さＬは、ビーズ保持セグメント１１の中心線から、又はビーズ保持セグメント１１をシグナル検出セグメント１５ｅの端部と接続するチャネル１５ｃ上に引かれたビーズ保持セグメントの直径を完成する線から測定すればよい。
【００６９】
図２Ａ及び図２Ｂは、シグナル検出セグメント１５を狭いチャネル又は「スリット」として構成することができ、典型的には、ビーズ保持セグメント１１の幅より２５％〜７５％幅を小さくできることを示している。
【００７０】
図３Ａ及び図３Ｂは、シグナル検出セグメント１５の端部は、ビーズ保持セグメント１１の曲率半径より小さい曲率半径を有する弧状部１５ａとしてもよいことを示している。ビーズ保持セグメントの中心線と弧状端部１５ｅとの間の距離「ｄ」は、上述の長さ「Ｌ」と同じでもよい。
【００７１】
図４Ａ及び図４Ｂは、シグナル検出セグメント１５の端部は、内部上方突出部材１９を取り囲む環状チャネル１７としてもよいことを示している。突出部材１９は、シグナル検出セグメント１５の環状チャネル１７内の流体の上に延在するのに十分な高さを有していてもよい。この構成は、環状形状を有する部分を含む光学的に検出可能なシグナルを規定してもよい。
【００７２】
ビーズウェル１０の新しい形状は、マイクロビーズアレイベースの技術での検出を改善すると考えられている。これらのウェル形状は、ウェル１１の１つのエリアが磁気ローディング及びビーズ保持用であり、ウェル１５の別の領域がシグナルの検出に（主に又はそれのみに）使用されるように構成してもよい。いくつかの実施形態では、ウェル１０のビーズ領域１１内のビーズ２５（図２Ａ、図３Ａ、及び図４Ａのそれぞれのウェルのうちの１つに黒丸で例として示す）を装填した後、少量の試薬流体を、当業者には知られているように、不混和性の流体シールなどの方法を使用して、又はガスケット若しくは他の基材のような別の表面に押し付けて、ウェル１０内で単離してもよい。
【００７３】
いくつかの例示的な実施形態を図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、及び図４Ｂに示すが、他の実施形態は、他の形状を含んでもよく、典型的には、ビーズ保持領域１１が、ビーズ２５の直径の約１０１〜１９５％の開口直径を有するポケット又はレセプタクルを有するように構成されており、いくつかの実施形態では約１０５％〜１５０％であってもよい。ビーズ保持領域１１のウェルの深さは、ビーズの直径の約５０％〜１８５％でもよい。
【００７４】
図５Ａ及び図５Ｂは、ウェル１０が、ビーズ保持セグメント１１内のビーズ２５をブロックすることができる物理的バリア１６を含みうることを示している。バリア１６は、流体がビーズ保持セグメントからシグナル検出セグメント１５へ進入できるようにしてもよい。バリア１６は、上面を横切って存在し、ウェル１０の底部に向かってある距離だけ下方に延び、及び／又はビーズ２５が保持領域１１から移動するのを阻害又は防止しながらウェルの液面より下に浸漬してもよい。障壁１６は、全体又は部分的に反応ウェル１０の対向する側壁を横切るように延在してもよい。
【００７５】
シグナル検出領域１５の一部又はすべてにおけるウェル１０の深さは、ビーズ保持セグメント１１のウェルと同じか、それよりも深く、又は浅くてもよい。チャネル１５ｃｈがビーズ保持セグメント１１から遠ざかるにつれて、深さが減少してもよい。チャネル１５ｃｈがビーズ保持セグメント１１からシグナル検出セグメント１５の端部に向かって移動するにつれて、深さが増加してもよい。ウェル１０の壁は、ウェル１０内に向かう方向において、外側又は内側に向かってテーパー状になっていてもよい。
【００７６】
異なるウェル１０は、異なる容積、幾何学的形状パターン及び／又はサイズを有してもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、シグナル検出セグメント又は領域１５は、標的ビーズが物理的に進入することができないポケット又はスリット又は他の幾何学的形状などのチャネル１５ｃｈを有していてもよい。両方の領域１１、１５は流体的に接続され、ビーズ２５から放出された試薬及び／又は検体は、ウェル１０の共通の溶液体積全体にわたって拡散あるいは混合してもよい。ビーズ２５を検出領域１１から空間的に分離することにより、シグナルに対するビーズ蛍光の寄与を低減又は排除し、シグナル対ノイズ比を改善してもよい。
【００７８】
ウェル１０の形状は、それぞれの反応量を増加させ、潜在的に反応効率を改善しながら、反応ウェル１０の高い単一占有装填を可能としてもよい。
【００７９】
図６Ａ〜図６Ｅに示すように、マイクロ流体デバイス５０は、複数のウェル１０を有するウェルアレイ１０ａを含んでいてもよい。ウェル１０は、ビーズ保持セグメント１１にビーズ２５を保持してもよい。ビーズ２５は、任意で、そこに付着したプライマーを含んでもよく、また任意でウェル１０のビーズ保持セグメント１１に予め装填してもよい。デバイス５０は、互いに付着する上側及び下側基材５０ｕ、５０ｂ（図６Ｂ、図６Ｃ）を含んでいてもよい。上側基材５０ｕは、下側基材５０ｂと同じでも、異なっていてもよい。基材５０ｕのいずれか又は両方は、硬質であってよく、例えば、ガラス、石英、シリコン、又は適切な金属を含むことができる。基材５０ｂのいずれか又は両方は、シリコン又は他のポリマー材料（多くの他のものの中でもＰＭＭＡ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＰＤＭＳ、ＰＰ、ＰＥ、ＰＴＦＥ、又はカプトン（ポリアミド）など）のようなポリマーであってもよく、ビーズウェル１０ａの配列を提供してもよい。上側及び下側基材５０ｕは、ウェル１０と流体連通した少なくとも１つのポート５０ｐを有していてもよい。反応ウェル１０は、例えば、任意で、試薬充填及び／又はオイルシールの間に、ウェル１０ａのアレイを有するアレイチャンバを通る流れに対して垂直であってもよいが、他の位置合わせ構成を使用してもよい。
【００８０】
図６Ａは、ビーズウェルのアレイ１０ａが高密度アレイウェルを有するフットプリント「Ｆ」（典型的には１ｍｍ〜１０ｃｍの間）を占めるように、マイクロ流体チップ５０を構成してもよいことを示す。流体マイクロチップ５０は、当業者には周知のように、サンプル用の輸送チャネル（単数又は複数）及び試薬、又はアレイ１０ａと流体連通してもよい他の化学的添加物を含んでいてもよい。
【００８１】
図６Ｄは、上下側基材５０ｕ、５０ｂとの間に存在し得る任意のスペーサ５０ｓを示す。スペーサ５０ｓは、それぞれのウェル１０のいくつか若しくはすべての側壁を画定してもよい。スペーサ５０ｓは、ガスケットとスペーサの両者として用いたフォトレジストを含んでいてもよい。
【００８２】
図６Ｅは、シーリングオイルのようなシーリング剤７５が、当業者には周知のように、隣接するウェル１０とビーズ２５を分離させることができることを示している。疎水性膜（単数又は複数）も、或いは代替として使用してもよい。シーリング剤７５（例えばオイル）を下部基材５０ｂの上面にわたって延ばして塗布してもよい。シーリング剤７５は、スペーサ／ガスケット５０ｓに関連付けられた厚み又は深さを有していてもよい。シーリング剤７５は、ビーズ／反応ウェル１０以外のすべてを覆うことができる。シーリング剤７５は、鉱物、シリコン、炭化水素、又はフルオロカーボン系油及び／又はワックス或いはそれらの任意の組み合わせ又は混合物を含んでいてもよい。反応溶液２３、例えば、水溶液は、典型的には、上側基材５０ｕに接触しない。
【００８３】
この技術は、アナログ又はデジタル検出モードで蛍光シグナルの読み出しを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの増幅方法を含むビーズに基づくアッセイにおいて特に有利であろう。これらのアッセイでは、０個、１個、又は複数の検体分子が磁気ビーズによって捕捉される。次いで、ビーズ２５の装填をウェル１０あたり１個又は０個のビーズに限定する形状を有するマイクロウェルアレイ１０ａに、磁気ビーズを装填してもよい。少量の増幅試薬をビーズ２５が入った各反応ウェル１０に封入して、被分析物分子が存在する場合には、化学反応を行って蛍光シグナルを生成してもよい。次いで、アッセイ蛍光シグナルを測定し、処理し、それを使用して試料中の検体濃度を決定してもよい。
【００８４】
コンパクトアレイにおけるシングルプレックス反応（ＳｉＲＣＡ）は、多くの異なる標的配列に対して、数百、又は数千から数百万の単離されたシングルプレックスｒｔ−ＰＣＲ反応を同時に行う可能性を有するマイクロビーズ−アレイフォーマットを使用する大規模な並列増幅及び検出方法である。例えば、マルチプレックス空間内マイクロ流体デバイス上での並列アッセイの為の試薬のビーズに基づく送達について記載する米国特許出願第１４／４０２，５６５号を参照のこと。この文書の内容は、参照によりここに完全に記載されているように本明細書に援用する。
【００８５】
低い分析標的物濃度での単一コピー、デジタル定量化、及び高い分析標的物濃度での複数コピー、アナログｒｔ−ＰＣＲ定量化を実行する能力により、ａＭ  ＬＯＤで大きなダイナミックレンジとなる。いくつかの実施形態では、アレイ１０ａは、色素符号化され、ストレプトアビジン標識化された、磁性マイクロスフェア又はビーズに結合された個々のビオチン化プライマーのセットで使用してもよい。数十から数百までのビーズタイプを含むビーズセットライブラリを作製することができ、それぞれは異なる標的配列に対して異なるプライマーセットを用い、新しいビーズセットを自由にビーズ混合物に加えることができる。ビーズ混合物が被分析物ＤＮＡ又はＲＮＡと共に培養される場合、ビーズに付着したプライマーは、ハイブリダイゼーションプローブとして作用し、そのビーズに特異的な核酸配列を捕捉して精製する。ビーズを磁気的に分離して洗浄することによって、サンプルのマトリックスインターフェレント（余分なＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞膜成分など）を除去してもよい。クリーンアップ後に、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び挿入色素を添加し、ビーズを個々のウェル１０に装填し、非混和性の油又は疎水性膜を用いて互いにシールする。個々の符号化されたプライマービーズを別個のマイクロ反応ウェルに静的に装填することは、手動でピペットによるものや試薬印刷とは異なり、数秒から数分で達成してもよい。最適化された形状への磁気によるビーズの装填は、液滴への希釈、又はビーズ捕捉用に設計された領域が、ウェル１０用の別個の検出領域を含まない反応ウェルによるランダムな単離より高効率となりうる。ストレプトアビジン／ビオチン相互作用は５０℃未満の温度では非常に安定しているが、ＰＣＲ中の変性の為に使用される高温により、その後、標的ＤＮＡの増幅を開始する第１のｒｔ−ＰＣＲサイクル中に、プライマーを放出する可能性がある。
【００８６】
サブ−ｐＬ反応におけるＳｉＲＣＡの性能を評価する為に、プライマー及びｇＤＮＡを用いたビーズを用いない予備試験を、直径３．７μｍ、深さ５μｍ（容積およそ５０ｆＬの円筒形）、１０μｍの中心間間隔を有する、シリコン中に深い反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を行って製造されたウェルのアレイを有するシリコン流体チップで行った。従って、ｒｔ−ＰＣＲを、ビーズを含まない溶液中でプライマーを用いて及びｇＤＮＡフリーでおよそ５０ｆＬの円筒形反応ウェル中で行った。チップをヘプタン中のオクチルトリクロロシランで前処理して、表面を疎水性にした。チップをエタノール、次いで水で湿らせ、次いでローディング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）でブロックした。マスターミックス（０．０６２５ユニット／μＬの追加のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５％ＢＳＡ、２．７μＭプライマー、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来のｇＤＮＡ、及び３ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含む１ｘプラチナ定量ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ）をチップに添加し、次いでＫｒｙｔｏｘ  ＧＰＬ  １０４ペルフルオロオイルをチップを通して引いて、反応量を互いにシールした。図７Ａは、３０ＰＣＲサイクル後のチップを示す蛍光顕微鏡画像であり、図７Ｂは、１２個の陽極ウェル及び３個の陰極ウェルについての蛍光シグナルのプロットを示す。ウェルあたり１コピー（１コピー／５０ｆＬ又はおよそ３ｐＭ）と関連する鋳型の濃度が比較的高いので、Ｃｔはわずか１１サイクルとなる。
【００８７】
ポリスチレンビーズの背景の蛍光は、反応ウェルの直径が減少するにつれて、より問題になる可能性がある。４〜２５ｐＬのＳｉＲＣＡ反応を用いた以前の研究では、反応ウェル直径は約２５〜５０μｍであり、ビーズの３．３μｍ直径（ビーズ体積およそ２０ｆＬ）よりもはるかに大きかった。ビーズウェルはウェルの中央に位置していた為、ビーズの背景の蛍光は無視するか、バックグラウンドシグナルとして差し引くことができた。高密度のサブ−ｐＬ反応のアレイの場合、円筒状ビーズウェルは、事実上は反応ウェルであり、ビーズ蛍光がシグナルを支配してもよい。ビースの背景の蛍光は、アレイのイメージング中に光退色し、ＰＣＲ増幅によって生成された蛍光シグナルに関係なく、シグナルの正味が減少する。さらに、特定のサイズ未満、例えば、直径がおよそ４．５μｍ、深さがおよそ５μｍの小さな容積のウェルにおける、ビーズのシーリング及びサーモサイクリングの予備調査の間、ビーズは、サイクルの間にウェル内を移動したことが観察され、背景の減算が困難となった。
【００８８】
二本鎖ＤＮＡアンプリコンの存在下において、アッセイシグナルを提供する挿入色素である約４９７ｎｍ／５２０ｎｍのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの最適励起／発光では、ポリスチレンビーズの自己蛍光は高い。さらに、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎはビーズと相互作用して、ビーズの蛍光をかなり増加させることができる。より長い波長の励起／極大発光の他の挿入色素をテストして、ビースの背景の蛍光のアッセイシグナルへの寄与を減少させようと試みたが、１ｘ〜１５ｘの濃度でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで観察されたものよりも強い蛍光シグナルを生じさせることはできなかった。ビーズの明るい背景からアッセイシグナルを空間的に分離してもよいデバイスの使用が望ましい場合がある。
【００８９】
ビースの背景の蛍光を回避し、反応量を増加させる為に、非円筒状の反応ウェル形状のＳｉＲＣＡでの使用について評価した。図８Ａは、Ｓｉウェーハ中の結合ビーズ及び反応ウェルＤＲＩＥの明視野顕微鏡画像である。ウェルの左側のビーズウェルセグメントは直径がおよそ３．５〜３．７μｍであり、右側の検出ウェルセグメントは直径がおよそ２．１μｍである。それらを結ぶチャネルは、幅がおよそ２．０〜２．１μｍ、長さが７．４μｍである。深さは約５μｍであり、約１５０ｆＬの反応量を提供してもよい。図８Ｂは、ビーズを装填して示した同様のアレイを示す。図８Ｃは、直径３．３μｍのプロマグビーズが装填されたアレイにおけるビーズの背景の蛍光が高いことを示す画像である。磁気装填率が高いと占有率が高くなり、二重装填は比較的少ないことが観察された。ビーズの背景の蛍光が高いことは明白である。
【００９０】
新しい反応ウェル１０，１０’は、ビースの背景の蛍光の問題に対処してもよい。効率的なＰＣＲの為に十分な試薬容量を提供し、コンパクトアレイの為の高い反応ウェル密度を維持し、ビーズ及びその蛍光シグナルを検出領域から物理的に分離する設計を評価した。ビーズウェル保持セグメント１１は、狭いスリットであるチャネル１５ｃｈに流体接続してもよい（図８Ａ）。ビーズウェル保持セグメント１１は、ビーズ直径よりも僅かに大きくすることができ、検出スリットは、ビーズ直径より小さくてよく、ウェル構造当たり単一のビーズを装填してもよい。図８Ｂは、参照により本明細書に援用される米国特許出願第１４／４０２，５６５号に記載されている磁気装填技術を用いてウェルに装填された３．３μｍのプロマグビーズの明視野顕微鏡画像を示す。
【００９１】
検出スリットは、任意のフットプリントに適合してもよい隔離された反応ウェルの数を、典型的には２倍減少させるが、高い装填占有率により、任意のフットプリントに対して装填されたウェルを高密度に維持する（この例では、＞６ｋ／ｍｍ２又は６００ｋ／ｃｍ２）。反応をシールする為の最適なウェル間隔を決定する為に最適化を行うことができ、これにより、ウェル密度がより高くなる可能性が最も高い。相対的に二重装填の例はほとんど観察されなかったが、ビーズの異質性により、いくつかのより小さなビーズが検出ウェル又は接続スリットに装填されることがあった。これは容易に検出でき、それらのウェルは分析から除外してもよい。プロトタイプは、反応量がおよそ１００〜１５０ｆＬの範囲のウェルで作製され、ビーズは約２０ｆＬを移動した。
【００９２】
プラスモジウム種間で保存された１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のプライマーで機能化されたストレプトアビジン被覆プロマグビーズを用いて、これらのウェルでＳｉＲＣＡを試験した。簡潔に言うと、およそ３５０ｋプライマー標識ビーズを、培養時におよそ４ｋの寄生虫／μＬ濃度でマラリア血液試料から４０μＬの核酸抽出で３０分間培養した。ビーズを洗浄し、アリコートをチップに装填した。マスターミックス（１ｘの追加のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、０．５％ＢＳＡ、及び０．１２５単位／μＬのプラチナＴａｑポリメラーゼを含むＫａｐａ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ）をチップに添加し、Ｋｒｙｔｏｘ  ＧＰＬ  １０４オイルでシールした。図９Ａ／９Ｂは、サイクル１０（増幅が検出される前）及びサイクル３０（増幅後）からの蛍光画像を示す。図９Ｂに、陽極ウェルを丸で囲んで示す。
【００９３】
ＳｉＲＣＡは、およそ１５０ｆＬの反応量を有する非円筒形ビーズウェルを有する装置で行った。サイクル１０（図９Ａ）とサイクル３０（図９Ｂ）との間の比較が示され、スリット及びより小さいウェルにおける蛍光の増加によって、陽極ウェル（図９Ｂの円で囲まれている「尻尾」が見える部分）を同定してもよい。２つ以上のビーズを装填するウェルは、分析から容易に識別して廃棄してもよい。
【００９４】
ビーズの背景の蛍光から離れた空間でアッセイシグナルを読み取る能力により、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いてサブｐＬのウェルでＳｉＲＣＡが可能になる。これは、ビーズウェル領域からの平均シグナルをスリット及び検出ウェルからの平均シグナルと比較することによって示される。図１０Ａは、図９Ｂに示す６つの陽極ウェル及び３つの陰極ウェル用のビーズウェル領域のみからの平均蛍光シグナルを示す。陰極及び陽極ウェルの間には、ビーズの高い背景シグナルによる、視覚的に容易に識別可能な違いはない。ウェルのスリット（検出）領域のみからのシグナルをプロットすると（図１０Ｂ）、ＰＣＲの約１５サイクル後の蛍光シグナルの顕著な増加によって、ブランクから陽極反応ウェルを容易に区別してもよい。光漂白はすべてのエリアで見られる。チップ表面及び／又は緩衝液又はシグナル処理の修正を変更することにより、より早いサイクルで検出領域の高い背景を低減してもよい。
【００９５】
図１０Ａは、ビーズウェル領域上で６個の陽極ウェル（実線のトレース）と３個の陰極ウェル（破線のトレース）のみに対する３０サイクルのｒｔ−ＰＣＲの間の平均化した生蛍光シグナルのプロットを表す図である。図１０Ｂは、これらの同じビーズに対するスリット及び検出ウェル領域のみから平均化された生蛍光シグナルのプロットである。
【００９６】
タフツ大学（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及びクオンテリックス社（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって一般化された単一分子アレイ（ＳｉＭｏＡ）フォーマットに基づくＥＬＩＳＡアッセイにおいて、スリット形状を有するビーズウェルのアレイ１０ａ（例えば、図２Ａ、図２Ｂ）も試験して、ビースの背景の蛍光（かなりの程度及び可変性でありうる）をアッセイシグナルからデカップリングすることにより、陽極反応の判定を間違えない為にシグナル対ノイズの増強ができるかどうかを判定する。図１１Ａ／１１Ｂは、抗ＴＮＦ−α抗体で標識化したビーズを使用してＴＮＦ−α抗原を捕捉した例を示す。抗原に対するビオチン化二次抗体を使用して、ビーズによって捕捉された抗原にストレプトアビジン結合β−ガラクトシダーゼ酵素分子を結合させた。ビーズをアレイに装填し、酵素標識用の蛍光発生基材で密封した。図１１Ａは、シール前のビーズの画像を示し、図１１Ｂは、数分後の画像を示す。図１１Ａにおいて、ウェル（８）中のビーズは、シール前の背景の蛍光によって見ることができ、図１１Ｂでは、アッセイの読み出しは明白であり、５つの陽極を示している。
【００９７】
ビーズを含む５つのウェル（５）では、ウェルのアッセイ領域では明確なシグナルが見られ、ビーズを含む３つのウェル（３）は背景の蛍光のみを示す。陽極反応を一義的に呼び出すことができる能力により、ビースの背景の蛍光の寄与を除去し、基材の有意な変換（時間ゼロ又はＴ０画像）が起こる前にアレイを画像化する必要性を排除することによって、ＳｉＭｏＡアッセイの精度を改善することができるようになる。反応が非常に迅速に起こるので、１枚又は数枚の画像でアレイ全体をカバーするのに十分な解像度又は視野が撮像システムにない場合には、大型アレイの画像Ｔ０を撮ることは実現できないことがある。別個の領域でアッセイシグナルを読み取ることにより、反応が起こった後にアレイをスキャンし、複数の画像を一緒に結合するか、又は他の方法で調べるか又は組み合わせて、アレイ全体の画像を精度を損なうことなく作成してもよい。さらに、新しいウェル形状の実施形態によって収容されたビーズウェルにおけるより大きな試薬容積は、より多くの基材分子を意味し、したがって、各反応についてより多くの潜在的な蛍光色素分子を得ることができる。
【００９８】
ビーズ保持セグメント１１及びシグナル検出セグメント１５を有する形状のこれらのウェル形状を含んだアレイ１０ａは、任意の適切な材料で製造することができ、シリコン又はガラスに限定されない。例えば、ウェルアレイ１０ａを有するポリマー基材は、熱エンボス加工又は射出成形などの方法で製造してもよい。図１２Ａ及び１２Ｂは、射出成形によって製造され、ビーズが装填されたビーズウェルアレイ１０ａを有するポリマーデバイスの例を示す。図１２Ａは、ビーズを有するデバイスのＳＥＭを示し、図１２Ｂには、装填されたアレイの蛍光顕微鏡画像を示す。
【００９９】
図１３Ａ及び図１３Ｂは、プラスチック／ポリマー基材にブルズアイ形状のウェルを製造する為にＤＲＩＥエッチングされたシリコンモールド（図１３Ａ）を使用してホットエンボス加工で製造されたアレイを示すＳＥＭ画像である。図１３Ａはまた、内径２μｍの環を含む４°テーパーの非円筒型を示し、図１３Ｂは、対応するプラスチック／ポリマー複製を示す。
【０１００】
この発明の実施形態は、２つ以上のビーズを含むように構成された形状を有する反応ウェル１０’を含んでいるので、１つ以上のビーズから放出され、溶液又は１つ以上のビーズの表面又はそれらの任意の組み合わせで反応する試薬間の反応が、図示のように指定された検出領域（単数又は複数）で、又は、その代替として、例えば図１４Ａ〜図１４Ｄ及び図１５Ａ〜図１５Ｃに示されているようにビーズの表面上で研究されてもよい。ビーズウェルアレイ１０ａは、いくつかのウェル１０が１つのビーズ２５を保持し、いくつかのウェル１０’が２つのビーズ２５を保持し、いくつかのウェル１０’が３つ以上のビーズ２５を単一の基材又は流体デバイス、或いは別個の基材又はデバイス上に保持するというバリエーションを有していてもよい。ウェル１０’が２つ以上のビーズ保持セグメント１１を含む場合、複数の（典型的にはそれぞれの）ビーズ保持セグメント１１は、流体チャネル１５ｃｈなどのシグナル検出セグメントを介して互いに流体連通してもよい。
【０１０１】
図１４Ａ〜図１４Ｄ及び図１５Ａ〜図１５Ｃは、研究された各成分について液体試薬を添加することをユーザが必要とする他のコンビナトリアルアプローチと比較して、ユーザの相互作用及び労力を大幅に低減する単純なプロセスで混合物の組合せの複数の反復を迅速に生成する能力を利用することができるいくつかの例示的な構成を示す。これらのウェル１０’は、２つ以上のビーズ保持セグメント１１ａ、１１ｂ、及び場合によっては１１ｃ（図１５Ａ〜図１５Ｃ）を有するように設計され、２つ以上のビーズ２５（図１４Ｄに例示）をチャネル１５ｃによって流体接続された別個の読み出し／検出セグメント又は領域１５（典型的には、幅及び／又は深さ領域がより薄い）で装填してもよい。ビーズウェル保持セグメント１１ａ、１１ｂ（１１ｃ）は、図示のものと同じ又は異なるサイズであってもよく、追加の形状又は数のビーズを有する繰り返しが可能である。２つ及び３つのビーズ保持セグメントが示されているが、ウェル１０’は４つ以上のビーズ保持セグメント１１で構成することができ、異なる形状としてもよい。
【０１０２】
この発明の実施形態で考えられるビーズウェル１０，１０’の使用は、ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡに基づくアッセイに限定されない。アレイ１０ａは、ある体積の試薬、及び対応するシグナルが測定及び／又は検出されるエリア又は領域から試薬又は被分析物を担持するビーズを空間的に分離することが有益となり得る任意のプロセス又は方法に使用できる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、新しいビーズウェル１０は、異なるプライマーセットを試験してマルチプレックスプライマー反応におけるそれらの適合性を評価する為に必要な単調性及び費用を低減する方法において使用してもよい。プライマーの特異性を促進し、プライマーダイマーの形成を回避する為の様々なガイドラインを用いて、ＰＣＲプライマーを分析及び示唆する複雑な予測ソフトウェアが存在するが、現在の最先端のソフトウェアは、パイロットＰＣＲ実験で経験的にテストされるべき配列のみを提案してもよい。この予測、テスト、及び再設計のサイクルは、実験者の間では非常に共通の問題であり、リソースと時間の両方においてコストがかかる。予想外のプライマーダイマー又は的外れな増幅は、非カノニカル塩基相互作用、劣悪な酵素忠実度、ポリメラーゼによって無視されるプライマー配列ミスマッチ、及びＳＮＰ配列又は予想外の実験配列の存在を含む様々なメカニズムから生じる。このプロセスは、マルチプレックスＰＣＲ反応において、特に複数の生物由来の核酸を含有する試料ではさらに複雑である。
【０１０４】
プライマーダイマーの形成は、ＰＣＲ反応の効率を著しく低下させ、誤検出、混乱配列決定労力、及び／又はアンプリコンの他の下流分析を引き起こし兼ねない。伝統的に、プライマーセットは、異なる組み合わせで混合して、２つ以上の対が互いに相互作用して意図しないアンプリコン（ダイマー）を形成するかどうかを決定しなければならない。多数のセット（例えば、１０〜５０セット）を単一の反応に統合する必要がある場合、非特異的な生成物を減少させる為に改変されたセットの初期スクリーニング及び再テストの両方の為に、数千の反応が必要となる。異なるプライマーセットを有する複数の符号化されたビーズセットが作製された場合、それらを一緒に混合し、個々のピペット試薬溶液に代わる単一のアリコートとしてデバイスに装填してもよい。ビーズが、２つ以上のビーズ２５を捕捉する反応ウェル形状１０’（例えば図１４Ａ〜図１４Ｃ、図１５Ａ〜図１５Ｃ）を有するマイクロウェルアレイ１０に装填される場合には、プライマーセットの確率的混合を容易に達成してもよい。その後、ＰＣＲは、アレイを復号化した後のプライマーセットの全ての組み合わせの間の望ましくない相互作用の存在を明らかにして、各反応における各ビーズの同一性を決定してもよい。これらの反応ウェルが１つのデバイスに数百万個存在する可能性がある為、可能なすべての組み合わせの複製が多数あり、分析用の豊富なデータセットが提供される。
【０１０５】
同様の実施形態において、異なる参照ゲノムに対する複数のプライマーセットのスクリーニングは、複数のビーズを装填するアレイを用いて行うことができる。プライマーセットの標的の特異性を確立する為には、目的とする標的だけでなく、関連する試料中に存在し得る複数の生物の核酸に対してもプライマーセットをスクリーニングすることが重要である。多くの可能な相互作用を排除する為に配列データベースを使用できるが、配列がしばしば不完全であり、現在の最先端のアルゴリズムが完全ではない為、経験的試験が依然として必要である。例えば、病原体定量の為に設計された各アッセイについては、宿主ゲノムＤＮＡ及び関連細菌及びウイルス血清型の複数の種をスクリーニングすべきである。マイクロバイオームの研究に適用される場合、数百から数千もの異なる種、時には非常に密接に関連する種を比較する必要がある場合もある。参照ゲノムビーズは、（符号化されたストレプトアビジン官能化ビーズとのその後の培養による断片のビオチン化などの方法を用いて）生物のゲノムを断片化し、その断片を符号化されたビーズに結合させることにより作製してもよい。符号化された参照ゲノムビーズのライブラリーと符号化されたプライマーセットビーズのライブラリーを混合することにより、研究者は、単一のアッセイにおける意図した標的に対し、オフターゲット増幅のスクリーニングと増幅効率の評価の両方が可能となる。プライマービーズは、プライマーにより小さなビーズを使用し、ゲノムにより大きなビーズを使用する（又はその逆）ことにより、ゲノムビーズと効率的に組み合わせることができる。この場合、反応ウェルには大きなビーズウェルと小さなビーズウェルが含まれ、狭いスリットで接続してもよい（図９Ｂ）。最初により大きなゲノムビーズを大きなビーズウェルに装填する場合、より小さいビーズウェルは空となっている。この工程の後、より小さいプライマービーズを、より小さいビーズウェルに効率的に装填してもよい。この方法論は、反応ウェルにおいて、望ましくないプライマー対プライマー及びゲノム対ゲノムの組み合わせを避けることができる。この方法論及び他の方法では、参照ゲノムビーズは、ビーズから放出されたプライマーがそれらと相互作用して測定可能なシグナルを検出領域で生成する間、それらの試薬を、必ずしもそうである必要はないが、保持することができるので、両方の試薬をビーズから放出する必要はない。
【０１０６】
別の例では、この原理は、多くの臨床試料又は実験室試料の核酸プロファイリングに同時に適用してもよい。単一の生物からのｍＲＮＡ又はＩｎｃＲＡなどの核酸の配列は、単一のビーズセットで捕捉してもよい。次いで、多くの異なる個体からの核酸抽出から作製された異なる符号化されたビーズを組み合わせることによって、ライブラリーを作製してもよい。次いで、このライブラリーは、上記のプライマービーズライブラリーに対する標的についてスクリーニングし、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、遺伝子発現、又は他の現象を同定してもよい。
【０１０７】
本発明の方法を実施する為に有用なキットは、一般に、それに結合した試薬及び上記の方法を実施する為の他の試薬が付着した１つ以上のビーズのセット、例えば、任意でこれらの方法を実施する為の適切な指示とともにパッケージ化された制限酵素などを含むことができる。キットはまた、そこに含まれるハウジング要素の為の容器を含んでいてもよい。そのような容器には、バイアル、ビーズウェルアレイを備えたマイクロ流体チップ、及び予め装填されたビーズデバイスを含むカートリッジが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ビーズ２５には、プライマーが付着していてもよい。プライマーは、一対のビオチン化プライマーであってもよく、ビーズ２５は、ビオチン化プライマーがビーズに結合されるようにストレプトアビジン標識化されてもよい。いくつかの実施形態において、ビーズ２５は、各ビーズ２５に固定されたプライマーを同定する為に分析中に使用できる光学マーカーなどのマーカーを含んでいてもよい。例えば、分析中に、付着した異なるプライマーセットを同定できるよう、同じ、又は異なるサイズの符号化された異なるビーズにはマーキングしてもよい。単独で、又は他の符号化方法と組み合わせて使用される、所定のサイズ、形状、磁気特性、及び／又は蛍光ドーピングを含む様々な事前符号化方法を使用して、ビーズ２５上にマーカーを付すことができる。カスタム配列のビオチン化プライマー及びストレプトアビジンで標識化した常磁性磁気ビーズは、共に、市販業者から容易に購入することができ、又は適切に装備された実験室で適切な量で作製してもよい。
【０１０９】
上述したように、本発明による実施形態は、ＰＣＲ反応に関して本明細書に記載されているが、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス、ビーズ、及び反応方法は、様々な他の反応、例えば、試薬がビーズからウェルへ固着して反応に関与するような場合などにも使用することができることは理解できよう。例えば、任意の核酸の転写及び／又は増幅に関連する反応又は配列決定反応は、ＰＣＲ反応、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ｃＤＮＡ（ＲＴ）へのＲＮＡの逆転写、前ＲＴ工程からのｃＤＮＡのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム又はデジタル定量化を使用するＲＴ−ＰＣＲ、免疫ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）及びその変異体、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル複製、及び／又は非酵素的核酸増幅法（例えば、「ＤＮＡ回路」）を非限定的に含み、本発明の範囲に含まれる。本発明の範囲内に非限定的に含まれる他の反応には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、単一分子アレイ測定（ＳｉＭｏＡ）又はデジタルＥＬＩＳＡ、蛍光基材がその後の反応の為にいくつかの点で固着されるように支持面に結合されるＥＬＩＳＡ法、複数のビーズを使ってコンビナトリアルケミストリー用に異なる試薬を送達する反応、ビーズが触媒試薬を送達する反応、及び／又は「クリック」化学試薬が確率的ビーズ装填によって決まる化学量論で送達される反応が含まれる。
【０１１０】
図１６は、分析システム２００の略図である。システム２００は、カメラ又は他の撮像装置又は他のシグナル検出装置を含む光検出器のような電子シグナル検出器２２０と通信する少なくとも１つのコントローラ２１０（通常、少なくとも１つのプロセッサを含む）を含んでいてもよい。シグナル検出器２２０は、それぞれのマイクロ流体チップ５０のビーズウェルアレイ１０ａのシグナルを検出するように構成されている。コントローラ２１０は、アッセイシグナルが反応ウェルのシグナル検出セグメントに存在するかどうかを識別するように構成されたモジュール２２１（例えば、コンピュータプログラム）を有する画像プロセッサ２１１と通信してもよい。画像プロセッサモジュール２２１は、コントローラ及び／又はシグナル検出器２２０の全部又は一部に搭載しても、遠隔でもよい。画像プロセッサモジュール２２１は、ウェルが積極的な読み出しを有するかどうかを評価する為に、複数のウェルのアッセイ後の画像を組み合わせるように構成してもよい。画像プロセッサモジュール２２１は、各ウェルのビーズ保持セグメントからバックグラウンドノイズを除去してもよい。モジュール２２１は、それぞれのウェルの検出セグメント（単数又は複数）からのシグナルの存在を同定して、陽極アッセイ反応が生じたかどうかを同定するように構成してもよい。
【０１１１】
図１７は、本発明の実施形態による分析方法の実行の為に使用できる例示的な動作のフローチャートである。ビーズウェルを有する流体装置が提供される。ビーズウェルは、ビーズ保持セグメントと、ビーズ保持セグメントと流体連通した間隔を空けたシグナル検出セグメントを有する（ブロック２５０）。シグナルは、ビーズがそれぞれのビーズ保持セグメントに保持されている間に、ウェルのシグナル検出セグメントから得られる（ブロック２６０）。
【０１１２】
これら及び／又は他の実施形態では、ビーズを含むセグメントから（すなわち、ビーズから直接的に）符号化されたシグナルを読み取って、ビーズが含有し得る試薬（単数又は複数）及び／又は被分析物を確認してもよい。このようにして、アレイを復号化して、陽極又は陰極アッセイシグナルの意味を判定してもよい。ビーズは、１つ以上の強度レベルの１つ以上の色素による蛍光色素染色、ビーズ直径、ビーズ形状、又は定義された及び／又は観察可能な又は検出可能な特性の任意の組み合わせを含む当業者に知られた手段によって光学的に符号化してもよい。
【０１１３】
ビーズウェルは、反応ウェルを画定するビーズウェルの高密度アレイとして配置してもよい（ブロック２５２）。ビーズ保持セグメントは、ビーズの直径と同じか又はそれより大きい形状及び直径を有していてもよく、シグナル検出セグメントは、ビーズの直径よりも小さい幅の形状を有する（ブロック２５４）。
【０１１４】
シグナル検出セグメントは、ビーズの直径よりも狭い長手のチャネルを含んでいてもよく、ビーズのウェルの形状は、（ａ）スリット、（ｂ）長手のチャネルによって間隔をあけて配置された非対称な円周、（ｃ）ブルズアイパターン（すなわち、環状チャネルに合流する長手のチャネル）、（ｄ）それらの間に延びる少なくとも１本の長手のチャネルによって結合された複数の間隔をあけた円形及び／又は曲線状の円周、のうちの１つ以上を有するように構成されていてもよい（ブロック２５６）。
【０１１５】
ビーズ保持セグメントは、単一の磁気ビーズを保持するだけのサイズと構成にしてもよい（ブロック２５７）。
【０１１６】
ビーズウェルは、１つ以上の増幅試薬を含んでいてもよい（ブロック２５８）。
【０１１７】
検出セグメントは、対応するビーズ保持セグメントから、標的ビーズの直径の０．３Ｘと２００Ｘの間、例えば、１μｍ〜１ｍｍ以上の間、典型的には１〜１００μｍの間の距離Ｌだけ離間させることができる（ブロック２５９）。
【０１１８】
シグナルは、被分析物分子が存在する場合、蛍光シグナル（尾部を伴う）を含むことができる（ブロック２６１）。
【０１１９】
図１８は、本発明の実施形態による例示的なデバイスを製作する方法のフローチャートである。ウェルのアレイは、基材内にパターン化される（例えば、形成される）。すなわち、ウェルは、１ａＬ〜１００μＬの間、より典型的には１ｆＬ〜１μＬの間の容積とすることができ、１ｍｍ〜１０ｃｍの間の線形寸法を有する規定されたフットプリント内に１つ以上の定義された形状を有していてもよく、定義された形状は、ビーズ保持セグメントから空間的に分離されたシグナル検出セグメントと流体連通するビーズ保持セグメントを含む（ブロック３００）。
【０１２０】
ウェルのアレイは、基材にエッチングすることによって形成してもよい（ブロック３０２）。
【０１２１】
ウェルのアレイは、基材に成形してもよい（ブロック３０４）。他の製造方法、例えば、フォトリソグラフィ、ＦＩＢミリング、エンボス加工、スタンピングなどが考えられる。
【０１２２】
ビーズウェルは、いくつかの実施形態では、約３．２〜３．７μｍの範囲の直径で、幅が約２〜３μｍ、長さＬが標的ビーズの直径の０．３Ｘ〜２００Ｘの間、例えば、１μｍ〜１０ｍｍの間、１μｍ〜１ｍｍの間、１〜１００μｍの間、及び／又は１〜１０μｍの間のチャネルに合流するビーズ保持セグメントを有してシグナル検出セグメントを形成してもよい（ブロック３０６）。
【０１２３】
基材を滅菌して、ウェルと協働する磁気ビーズを用いて標的被分析物を流動分析するパッケージ及び／又はキットを提供する（ブロック３０８）。
【０１２４】
ウェルは、１つ以上の増幅試薬との反応ウェルでもよい。
【０１２５】
ウェルのアレイは、６，０００／ｍｍ２から約１０，０００／ｍｍ２、典型的には約６，０００／ｍｍ２の密度で配置してもよい（ブロック３１２）。
【０１２６】
ウェルのアレイは、１０，０００／ｃｍ２〜約２，０００，０００／ｃｍ２の密度で提供してもよい（ブロック３１４）。
【０１２７】
ビーズ保持セグメントは、周囲が、標的（例えば、磁気）ビーズの直径と同じか又は約１９５％以内、すなわち標的ビーズの直径の１０１％〜１９５％又は１５０％の間の幅でもよい（ブロック３１６）。
【０１２８】
ウェルは、１００〜１５０ｆＬの反応量、２０ｆＬのビーズ容積を有していてもよい（ブロック３１８）。
【０１２９】
図１９は、本発明の実施形態によるアッセイを評価する方法のフローチャートである。アッセイシグナルは、反応ウェルの複数のシグナル読み出しセグメントから電子的に検出され、反応ウェルのそれぞれは、それぞれのビーズ保持セグメント内のウェルによって保持されたビーズから分離される（ブロック３５０）。「電子的に」という用語は、カメラ、例えばＣＣＤカメラ、ＳＥＭなどの機械ベースの検出（人の視覚ではない）のすべての形態を指す。シグナルは、光散乱特性（透明度）の変化、透過率又は吸光度の変化、化学発光又は異なるパラメータの組み合わせを含む、強度、蛍光、１つ以上の定義された色、定義されたピクセルパラメータなどの増加であってもよい。
【０１３０】
アッセイシグナルは、反応が起こって陽極を識別した後に、ビーズ保持セグメントから空間的に分離されたシグナル読み出しセグメントをそれぞれ有するビーズウェルのアレイから電子的に検出してもよい（ブロック３５２）。
【０１３１】
シグナル読み出しセグメントは、ビーズ保持セグメント（単数又は複数）の直径よりも小さい幅及び／又は深さを有する長手のチャネルを含む（ブロック３５４）。
【０１３２】
シグナル読み出しセグメントは、ビーズ保持セグメント（単数又は複数）と流体連通する環状流体チャネルを含む（ブロック３５６）。
【０１３３】
アッセイシグナルは、ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡに基づくアッセイの為のものである（ブロック３５８）。
【０１３４】
同じサイズのビーズ又は異なるサイズのビーズを用いて、複数のプライマーセットを互いに又は異なる参照ゲノムに対してスクリーニングすることができ、少なくとも２つのビーズが２つの（場合により異なるサイズの）ビーズ保持セグメント及び少なくとも１つの別個の読み出しセグメント（単数又は複数）を有する１つの反応ウェルによって保持される（ブロック３６０）。
【０１３５】
アッセイシグナルは、規定されたビーズセットを使用して、臨床サンプル又は実験室サンプルの核酸プロファイリングとしてもよい（ブロック３６２）。
【０１３６】
上記は本発明の例示であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。この発明のいくつかの例示的な実施形態について説明したが、当業者であれば、この発明の新規な教示及び利点から実質的に逸脱することなく、例示的な実施形態において多くの変更が可能であることを容易に理解できるであろう。したがって、そのような変更のすべては、特許請求の範囲に定義されるこの発明の範囲内に含まれることが意図される。したがって、前述は本発明の例示であり、開示された特定の実施形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、開示された実施形態に対する変更、ならびに他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとすることは理解できよう。この発明は、下記に示す添付の特許請求の範囲によって定義され、その中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって定義される。
【符号の説明】
【０１３７】
１０  ビーズウェル
１０ａ  アレイ
１１  ビーズ保持セグメント
１５  シグナル検出セグメント
２５  ビーズ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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