(57)【要約】本発明は、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカンの混合物を０．１〜１０．０重量％含む組成物であって、グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下である組成物を対象とする。さらに、本発明はまた、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカン組成物であって、グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下である組成物の、抗老化組成物としての使用も対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカンの混合物を０．１〜１０．０重量％含む組成物であって、グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下である組成物。
【請求項２】
グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも１０％かつ９０％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも１０％かつ９５重量％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１〜２の組成物を含む美容組成物。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカンの混合物が、組成物全体に基づいて０．５〜５重量％の量で存在する、請求項３に記載の美容組成物。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカンの混合物が、少なくとももう１種のグリコサミノグリカンを含む、請求項３〜４に記載の美容組成物。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンの混合物が、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸との混合物からなる、請求項３〜４に記載の美容組成物。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の美容組成物であって、
前記組成物が、水溶液、液体の形態であるか、またはゲルのような粘性の形態であり、
前記組成物が、水と、必要に応じて、保湿剤、抗酸化剤、防腐剤、安定剤および美容ゲルにおいて一般的に使用される他の化合物から選択される他の添加物と、をさらに含む、
美容組成物。
【請求項８】
請求項１〜６に記載の美容組成物であって、
前記組成物が、クリームの形態であり、
前記組成物が、天然および合成の油／脂肪またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の油およびまたはシリコンまたは脂肪と、イオン性乳化剤および非イオン性乳化剤から選択される１種以上の乳化剤と、必要に応じて、水、ならびに保湿剤、抗酸化剤、防腐剤、安定剤および美容クリームにおいて一般的に使用される他の化合物から選択される他の添加物と、をさらに含む、
美容組成物。
【請求項９】
デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカン組成物であって、グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下である組成物の、抗老化組成物としての使用。
【請求項１０】
デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカン組成物であって、グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも５重量％かつ９５重量％以下である組成物の、抗皺組成物としての使用。
【請求項１１】
デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカンの組成物であって、
グリコサミノグリカンの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも２０重量％かつ９０重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも１０重量％かつ８０重量％以下であり、
デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸が合計でＧＡＧの総量の少なくとも６０重量％という量で存在し、ヘパリンの量が５重量％未満であり、ヒアルロン酸の量が２０重量％未満である、
組成物。
【請求項１２】
デルマタン硫酸対コンドロイチン硫酸の重量比が５０／５０〜９０／１０に含まれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ヘパラン硫酸をさらに含む、請求項１２〜１３に記載の組成物。
【請求項１４】
デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸が合計でＧＡＧの総量の少なくとも８０重量％という量で存在する、請求項１１〜１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１１〜１４に記載のグリコサミノグリカン組成物を含む経口投与可能な組成物であって、コラーゲンおよびエラスチンを実質的に含まない経口投与可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の組成物であって、ＧＡＧの総量に基づいてデルマタン硫酸の量が少なくとも１重量％かつ９９重量％以下であり、コンドロイチン硫酸の量が少なくとも１重量％かつ９９重量％以下である組成物を対象とする。
【０００２】
より具体的には、本発明は、ＧＡＧの混合物を０．１〜１５．０重量％（好ましくは０．２〜１０．０重量％）含む組成物であって、当該混合物がデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含み、デルマタン硫酸の量がＧＡＧの総量に基づいて少なくとも１重量％であり、コンドロイチン硫酸の量がＧＡＧの総量に基づいて少なくとも１重量％である、組成物を対象とする。本発明による組成物は、美容分野において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
医薬分野におけるＧＡＧの使用は当技術分野で周知である。血餅を防止するための低分子量ヘパリンの周知の使用とは別に、ＧＡＧの他の医薬用途が提唱されている。例えば、ＵＳ２０１４／０３４３０１２は、変形性関節症の処置におけるヒアルロン酸と別のＧＡＧ（例えばコンドロイチン硫酸）との組み合わせの使用を開示する。
【０００４】
ＷＯ２００６／０１５１７１は、敗血症の処置のためのデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸およびＬＭＷヘパリンなどの様々なＧＡＧの使用を開示する。
【発明の概要】
【０００５】
驚くべきことに、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含む混合物を含む皮膚用製品が抗老化組成物として非常に有効であり、皺を減少させ、皮膚の水和を維持するということが見出された。
【０００６】
より具体的には、本発明は、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むＧＡＧの混合物を含む美容組成物を対象とする。デルマタン硫酸の量は、ＧＡＧの総量に基づいて少なくとも１重量％または少なくとも２重量％または少なくとも５重量％または少なくとも１０重量％または少なくとも２０重量％または少なくとも４０重量％または少なくとも５０重量％または少なくとも６０重量％である。
【０００７】
コンドロイチン硫酸の量は、ＧＡＧの総量に基づいて少なくとも１重量％または少なくとも２重量％または少なくとも５重量％または少なくとも１０重量％または少なくとも２０重量％である。
【０００８】
デルマタン硫酸／コンドロイチン硫酸の重量比に関しては、それは５／９５または１０／９０または２０／８０または２５／７５または４０／６０または５０／５０〜９５／５または９０／１０または８５／１５または８０／２０または７５／２５に含まれる。上記で定義される比の限界の組み合わせから導き出される任意の範囲が本明細書で開示される。例えば、その範囲は、５／９５〜９５／５または２５／７５〜９０／１０または５０／５０〜８５／１５であってよい。
【０００９】
デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸の両方の存在が必須であるが、他のＧＡＧが存在する可能性があることは排除されない。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＧＡＧ（またはムコ多糖（mucoplysaccharide））は、二糖単位の繰り返しからなる長く枝分かれしていない多糖である。繰り返し単位（ケラタンを除く）は、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）とウロン糖（グルクロン酸またはイズロン酸）またはガラクトースとからなる。
【００１１】
ＧＡＧの非限定的な例は、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、脱重合されたヘパリン（例えば、低分子量ヘパリンおよび非常に低分子量のヘパリン）、化学修飾されたヘパリン（例えば、超硫酸化ヘパリン）、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸である。
【００１２】
デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸が合計でＧＡＧの総量の少なくとも４０重量％（好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、さらにより好ましくは少なくとも７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％）という量で存在することが好ましい。
【００１３】
ＧＡＧ組成物は、好ましくは２０重量％未満または１０重量％未満または５重量％未満の量のヒアルロン酸を含む。より好ましくは、ＧＡＧ組成物は、ヒアルロン酸を実質的に含まない。また、ヘパリンの量も、好ましくは２０重量％未満または１０重量％未満または５重量％未満である。特に好ましい実施形態では、組成物は、ヘパリンを実質的に含まない。好ましくは、ケラタン硫酸の量も制限され、好ましくは２０重量％未満または１０重量％未満または５重量％未満である。より好ましくは、ＧＡＧ組成物は、ケラタン硫酸を実質的に含まない。
【００１４】
本発明の組成物は、老化した皮膚または皮膚の症状（例えば、アトピー性肌、乾燥肌／超乾燥肌、かゆみ肌等）の処置における使用のための任意の好適な組成物であってよい。例えば、組成物は、水溶液またはクリームの形態であってよい。
【００１５】
従って、本発明の実施形態は、皮膚を処置する方法であって、上記で定義されるＧＡＧ組成物を好ましくは１〜１５重量％に含まれる量で含むクリームまたはゲルを皮膚に適用することを含む方法に関する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、皮膚上の皺の深さを減少させるための方法を対象とし、この方法は、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含む美容組成物を皮膚に適用することを含み、ここで美容組成物中のデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸の合計量は、好ましくは０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは０．２重量％〜５重量％、さらにより好ましくは０．４重量％〜３重量％に含まれる。
【００１７】
本発明によるＧＡＧ組成物はまた、経口投与されてもよい。経口投与に有用な組成物は、ＧＡＧ組成物の総量に基づいて、デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸を好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくはこれら２種の成分を少なくとも８０重量％、含む。経口投与のための組成物は、経口投与可能な丸剤、錠剤等の調製において通常使用される他の賦形剤をさらに含んでよい。別の態様では、経口投与可能な組成物は、コラーゲンを実質的に含まない。別の態様では、経口投与可能な組成物は、エラスチンを実質的に含まない。本明細書全体にわたって、「実質的に含まない」なる表現により、その量が１．０重量％未満（好ましくは０．５重量％、より好ましくは０．１重量％未満、あるいは検出限界未満）であることが意図される。
【００１８】
典型的には、美容組成物は、溶液またはクリームとして製剤化される。溶液は水性単相系であり、これは、好ましくは、３０〜９８重量％（より好ましくは８５〜９７重量％）の水を含む。水溶液はまた、ゲルの形態であってもよく、ここで、その構造は一般に、好ましくは０．１〜１０重量％（より好ましくは０．２〜５重量％）に含まれる量の特定のレオロジー成分（すなわち、ゲル形成剤）に起因する安定化によって達成される。組成物は、他の添加物（保湿剤、抗酸化剤、防腐剤、安定剤、および美容ゲルにおいて一般的に使用される他の化合物など）をさらに含んでよい。
【００１９】
組成物がクリーム（水中［油および／またはシリコン］型エマルジョンまたは［油および／またはシリコン］中水型エマルジョンのいずれか）の形態である場合、水は通常、好ましくは０〜７５重量％、より好ましくは３０〜７０重量％、より好ましくは６０〜７０重量％に含まれる、より少ない量で存在する。この場合、組成物はまた、好ましくは５〜５０重量％、より好ましくは８〜３０重量％、最も好ましくは１０〜２０重量％に含まれる量の、天然および合成の油／脂肪またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の油および／またはシリコンまたは脂肪と；好ましくは１〜２０重量％、より好ましくは２〜１５重量％、最も好ましくは４〜１４重量％に含まれる量の、イオン性乳化剤および非イオン性乳化剤から選択される１種以上の乳化剤と、を含む。従って、クリームの形態の本発明による好ましい組成物は、少なくとも１種の合成または天然の油または脂肪と、必要に応じて水、乳化剤、防腐剤、抗酸化剤、保湿剤、および美容クリームにおいて通常使用される他の化合物と、を含むであろう。
【００２０】
本発明による美容組成物中のＧＡＧ組成物の含有量は、少なくとも０．１重量％または少なくとも０．２重量％または少なくとも０．３重量％または少なくとも０．５重量％または少なくとも０．８重量％である。また、グリコサミノグリカン組成物が１５．０重量％以下または１０．０重量％以下または５．０重量％以下または３．０重量％以下または２．０重量％以下または１．５重量％以下または１．３重量％以下の量で存在することも好ましい。最も好ましい実施形態では、組成物は、約１重量％（例えば、０．９重量％〜１．１重量％）の量で存在する。本発明による美容組成物中に存在する他のＧＡＧ成分またはＧＡＧ以外の成分とは別個に、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸を合わせた量が、美容組成物全体の少なくとも０．１重量％（好ましくは少なくとも０．２重量％、より好ましくは少なくとも０．４重量％、さらにより好ましくは少なくとも０．５重量％）となることが好ましい。
【００２１】
一方で、デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸を合わせた量は、美容組成物の総重量に基づいて、好ましくは１０重量％未満、より好ましくは５重量％未満、さらにより好ましくは３重量％未満である。
【００２２】
ゲル組成物およびクリームの例は以下の通りである。
【００２３】
ゲル：
水                                    ９６．４５％
Ｓｅｐｉｐｌｕｓ  Ｓ（安定剤）        ３．０％
ＧＡＧ組成物                          ０．５％
Ｋａｔｈｏｎ（防腐剤）                ０．０５％
【００２４】
クリーム
水相：
水                                                                  ６６．６５％
グリセリン（保湿剤）                                                ４．０％
キサンタンガム（安定剤）                                            ０．２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（スカベンジャー）                            ０．１％
安息香酸ナトリウム（防腐剤）                                        ０．５％
クエン酸（ｐＨ補正剤）                                              ０．２５％
ＧＡＧ組成物                                                        ０．５％
乳化剤（オリボイル（Olivoyl）グルタミン酸ナトリウム、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル）                                                  ５．０％
安定剤（ポリアクリルアミド水溶液、Ｃ１３〜１４イソパラフィン、ラウレス−７、Ｓｅｐｉｇｅｌ  ３０５）                                                ３．０％
油相：
水素化オリーブ油、オリーブ油、オリーブ油不鹸化物                    １．０％
ジメチコン                                                          １．０％
安息香酸Ｃ１２〜１５アルキル                                        １０．０％
ステアリン酸グリセリル                                              ４．０％
セテアリルアルコール                                                ２．５％
パルファム                                                          ０．５％
フェノキシエタノール                                                ０．８％
【００２５】
皮膚用製品における本発明によるＧＡＧ組成物の使用は皮膚マトリックスの改善をもたらし、この改善が抗老化、抗皺および保湿効果をもたらすということが見出された。
【００２６】
皮膚マトリックスは、皮膚の構造的完全性、機械的弾力性、安定性および多くの他の特性に寄与する。皮膚マトリックスの分解は、皺および皮膚の老化の他の徴候の出現において重要な役割を果たす。皮膚マトリックスの最も良く知られている成分は、構造タンパク質（コラーゲンおよびエラスチン）であり、これらは、皮膚の健康および若々しさに不可欠である。構造タンパク質は、健康な皮膚マトリックスに必要であるが十分ではない。主要な皮膚マトリックス充填物質であるヒアルロン酸は、機械的クッション性をもたらし、水分を保持し、長続きする保湿特性に寄与する。
【００２７】
デコリンは、皮膚に存在する主要なプロテオグリカンである。デコリンは、コアタンパク質を有する小さなプロテオグリカンであり、これは馬蹄形であり、その内側の凹部は、Ｉ型コラーゲンを収容し、Ｉ型コラーゲンの結合部位を提供する可能性がある。皮膚マトリックス中のデコリンの量は、皮膚の弾力性に大きな影響を及ぼす。実際、最適な繊維形成には、特定のデコリン対コラーゲン比が必要である。
【００２８】
本発明による組成物は、長期的な皮膚の水和を増加させるのに、および皺の深さを減少させるのに有効である。
【００２９】
いかなる理論にも束縛されることはないが、本発明による組成物の保湿、抗老化および抗皺効果は、デコリン、コラーゲンＩおよびヒアルロン酸シンセターゼの遺伝子発現の増加におけるその効果に関連する可能性がある。
【００３０】
実験パート
ＧＡＧ組成物中のデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸の濃度は、以下の方法に従って電気泳動により測定した。
【００３１】
精製水中で約０．７％の濃度のＧＡＧ組成物の溶液を調製した。クリオスタットのスイッチを入れ、電気泳動槽を冷却した。泳動槽の側方タンクは１Ｍの酢酸バリウム緩衝液で満たし、中央のタンクはｎ−デカンで満たした。これら２種の液体は混和しない。より軽いデカンは、表面にとどまり、緩衝液の温度を一定に保つために使用された。
【００３２】
１つのプレキシガラスのタンクを精製水で満たし、もう１つを０．１Ｍの酢酸バリウム溶液で満たした。プレートの片側を精製水中に約１ｃｍの深さまで浸し、紙タオルで乾燥させ、残りの部分に０．１Ｍの酢酸バリウム溶液を染み込ませ、水と酢酸バリウムとの間に数ｍｍの乾燥したプレートを残した。これを紙タオルで乾燥させ、アプリケーターを使用して、プレートの水に浸された部分に試料および任意のスタンダードを配置した。
【００３３】
電気泳動セル中でブリッジの上にプレートを配置し、その多孔質部分を下向きにし、試料を配置した側をカソード（陰極）に向けた。１回目の電気泳動は、２００ボルトで２分間行った。試料は、２種の溶液（水および酢酸バリウム）の間のライン上を移動した。プレートを取り出し、乾燥させ、３％のエタノール溶液に正確に２分間浸した。このようにして、ゆっくり移動するバンドの移動を停止させた。プレートを乾燥させ、セル内に戻し、２００ボルトで１５分間、２回目の泳動を行った。泳動の終了時にプレートを取り出し、乾燥させ、２０％のエタノール溶液中に正確に２分間配置した。このようにして、速く移動する（デルマタン硫酸の）バンドを停止させた。
【００３４】
プレートを乾燥させ、２００ボルトでの２５分間の３回目の電気泳動のためにセル内に配置した。このようにして、コンドロイチン硫酸のバンドが移動する。最後に、プレートを乾燥させ、染色溶液中に１０分間移した後、完全な変色が得られるまで脱色溶液中に移した（この溶液は時折交換した）。
【００３５】
デンシトメーターへのプレートの読み取りは、以下の条件で行った。
波長：６００ｍｍ
フォトモード：反射
この装置は、移動バンドがクロマトグラムとして示されるレポートを作成した。ピークごとに、電気泳動移動度（Ｒｆ）、面積および面積％（［各ピークの面積×１００］／［全てのピークの面積の合計］）の値が表示される。
【００３６】
ヒアルロン酸の検出は、従来の技術に従ってＨＰＬＣにより行うことができる。また、ヘパリンおよびヘパラン硫酸も、電気泳動技術によって検出される。
【００３７】
インビトロ実験
本発明によるＧＡＧ組成物を１％含む溶液に対してインビトロ実験を行った。ＧＡＧ組成物は、７５重量％のデルマタン硫酸と２５重量％のコンドロイチン硫酸とからなるものであった。実験は、３Ｄ組織に対して行った。
【００３８】
インビトロの選択肢の間では、３Ｄ組織は、ヒトに最も近い生物学的モデルを表すという強い利点を有する。それらは、インビボの組織のように多層構造および組織機能を有する。さらに、試験される製品を、インビボと同じ濃度および態様で組織表面上に適用できる。
【００３９】
局所適用される製品によるヒトの皮膚の処置はゲノム応答をもたらし、このゲノム応答は動的経路を有し、事象のカスケードに寄与する転写レベルでの最初の細胞シグナルを表す。３Ｄの生きているヒト組織は、直接的なゲノム応答、さらには、可溶性のメディエーターを介した細胞間の伝達およびクロストークならびに特異的なバイオマーカーの発現の結果を考慮に入れて有効性を評価するのに妥当な試験系である。
【００４０】
「美容ゲノミクス（cosmetogenomics）」の概念を、成分および最終製品の有効性を予測するための定まった実験モデルに適用した。真皮および表皮のコンパートメントを再現する「全層皮膚モデル」（ＦＴ皮膚）に対する美容製品試験のために、ホメオスタシスモデルを特別に開発した。このモデルは、製品の適用後の短期間（２４時間／４８時間）および長期間（最大２週間）の後の真皮の細胞外マトリックスの改変の調査を可能にするという特殊性を有する。対照である無処置の組織と比較して、製品の相対的効力が定量化される。
【００４１】
活性のある１重量％の溶液の有効性を、２４時間および４８時間の処置の後に、皮膚ホメオスタシス条件におけるＦＴ皮膚モデルにおいてインビトロで評価した。
【００４２】
Ｐｈｅｎｉｏｎ（登録商標）  Ｆｕｌｌ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  Ｓｋｉｎ  Ｍｏｄｅｌは、Ｈｅｎｋｅｌ（デュッセルドルフ、ドイツ、直径１．３ｃｍ）により作製される。このモデルでは、表皮角化細胞および皮膚線維芽細胞（健康なドナーからの生検材料に由来）が、培養条件下でヒトの皮膚に似た多層の皮膚等価物を形成する。線維芽細胞は、線維芽細胞の牽引力の下で収縮しない特殊な安定したマトリックス中で増殖させる。この真皮等価物の発達の後、角化細胞が覆い、数日以内に、それらは、はっきりと認識できる層を有する表皮を発達させる。表皮および真皮の両方が、生理学的に機能するユニットを形成し、ヒトの皮膚のように、表皮は、様々な分化マーカー（サイトケラチン１０、フィラグリン、トランスグルタミナーゼ、およびインボルクリン）を産生する。表皮真皮境界部は、基底膜タンパク質（ラミニンおよびコラーゲンＩＶ）を特徴とする。真皮のコンパートメントにおいて、エラスチンおよびフィブロネクチンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成が実証されている。基底層の増殖細胞は、Ｋｉ−６７染色によって識別される。このモデルは、５週間の培養期間の後には、十分に発達する。
【００４３】
処置：１００μＬの１％溶液および陰性対照としての生理食塩水溶液を、ホメオスタシス条件（ストレス不適用）の二連の培養物に対して表皮表面上に２４時間および４８時間、適用した。２４時間後に製品を再び適用した。以下のバイオマーカーをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した：デコリン、コラーゲンＩおよびヒアルロン酸シンセターゼ１（Hyluronate Synthetase 1）。タンパク質のレベルは、相補的免疫蛍光定性分析（complementary immunofluorescence qualitative analysis）によって解析した。デコリンおよびコラーゲンＩのタンパク質発現は、ウエスタンブロット解析によって定量化した。
【００４４】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
３つのステップについては、既製の試薬を使用した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ法は、細胞の試料から全ＲＮＡを抽出するために使用される、迅速でフェノールを含まない、フィルターを利用したＲＮＡ単離システムである。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。蛍光に基づくＰＣＲケミストリー（ＴａｑＭａｎアッセイ）と共に装置Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを使用して、重要なバイオマーカーの遺伝子発現を調査した。遺伝子発現は、ＤＮＡ配列などの遺伝子中の遺伝情報をタンパク質またはＲＮＡなどの機能的遺伝子産物にするプロセスである。相対的定量化は、試験試料中の核酸配列の発現の、較正用試料中の同じ配列に対しての変化を決定する。投入量を標準化するための内因性対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。各複製物を三連で評価した。２×ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘにＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイおよびｃＤＮＡ（２５ｎｇ）を添加して２５μＬの総体積にした。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００  Ｆａｓｔの温熱条件ステップは、９５℃２０秒；４０サイクル（９５℃３秒＋６０℃３０秒）である。
【００４５】
ウエスタンブロット解析
方法の原理
ウエスタンブロッティングは、タンパク質の検出および解析のための、十分に確立され、広く使用されている技術である。この方法は、メンブレン上に固定されたタンパク質に対する抗体の特異的結合を介した抗体：タンパク質複合体の構築と、いくつかの検出方法のうちの１つによる結合した抗体の検出と、に基づく。タンパク質試料は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供される。次いで、このゲルがニトロセルロースのシートの上に配置され、電気泳動によりゲル中のタンパク質がニトロセルロースに転写される。次いで、タンパク質の非特異的結合を「ブロック」するためにニトロセルロースがブロッキングバッファーに浸される。次いで、ニトロセルロースは、目的のタンパク質に対する特異的抗体と共にインキュベートされる。次いで、ニトロセルロースは、一次抗体に対して特異的である二次抗体と共にインキュベートされる。二次抗体は通常、発色基質を供されると呈色反応を引き起こすことになる、共有結合された酵素を有するであろう。
【００４６】
手順
プロテアーゼ阻害剤混合物を新たに添加したＢＩＯ−ＰＬＥＸ  ＣＥＬＬ  ＬＹＳＩＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）中にＦＴ皮膚を入れ、ホモジナイズし、氷上に３０分間置いた後、４℃にて１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。ＲＣ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いてタンパク質の定量を行った。ライセートに等体積の２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを添加した後、各試料をサンプルバッファー中で１００℃にて５分間ボイルすると、そのままＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ（ＴＧＸ）  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅプレキャストゲル  ７．５％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ＰＶＤＦメンブレン（ＢＩＯＲＡＤ）に転写することができる（総タンパク質５０μｇ）。ＴＢＳＴ ０．０５％中の５％のブロッキング溶液（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間、メンブレンをブロッキングする。メンブレンを室温で１時間、ウサギポリクローナル抗体である抗ＤＣＮ（ＮＢＰ−８４９７０、ＮｏｖｕｓＢｉｏ）および抗ＣＯＬ１（ＰＡ５−２９５６９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。ＴＢＳＴでの３回の洗浄（それぞれ５分）によりメンブレンをリンスした。
室温で１時間、ＴＢＳＴ中の標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（６５６１２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨希釈物を用いて、結合した抗体を検出した。ＴＢＳＴでの３回の洗浄の後、メンブレンに対して、ＣＬＡＲＩＴＹ  ＷＥＳＴＥＲＮ  ＥＣＬ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ（ＢＩＯＲＡＤ）によるシグナル展開を行うことができる。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳシステム（ＢＩＯＲＡＤ）を用いてＤＣＮおよびＣＯＬ１の化学発光バンドを可視化し、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを用いて定量化した（それぞれ１００／５０ＫＤａおよび２５０ｋＤａ）。
【００４７】
図１〜３に、実験で得られた結果を提示する。処置から４８時間後、デコリンの遺伝子発現（図１）の増加は４６％であり、コラーゲンＩの遺伝子発現（図２）の増加は６１％であり、ヒアルロン酸シンセターゼの遺伝子発現（図３）の増加は５５９％である。
【００４８】
インビボ実験
試験は、４週間の処置を２５人の志願者に対して行った。上記で定義されるような水中油型エマルジョンのクリームで志願者を処置した。
【００４９】
ＧＡＧ組成物は、７５重量％のデルマタン硫酸と２５重量％のコンドロイチン硫酸とからなるものであった。参照用として、ＧＡＧを含まない同一のクリームを使用した（ベースのエマルジョン）。
【００５０】
２５人の志願者に対して２種類の測定を行った：皺の深さおよび水和レベル。皺の深さは、Ｄｅｒｍａｔｏｐ  Ｂｌｕｅ（商標）により評価した。水和レベルは、最初の適用から３時間後および８日間の１日２回の適用の後に角質水分測定（corneometry）によって測定した。
【００５１】
抗皺効果
本発明によるクリームを使用した志願者は、４週間後の皺の深さが平均で２３．１％減少したのに対し、ベースのエマルジョンを使用した志願者では１６．４％の減少であった。
【００５２】
保湿効果
最初の適用から３時間後、ベースのエマルジョンは、本発明によるクリームよりも有効であるように見えた（ベースのエマルジョンでは＋３９．９％であるのに対し本発明のクリームでは＋２８．７％）。しかし、８日後、その実態は完全に変化した（ベースのエマルジョンでは＋３３．５％であるのに対し本発明のクリームでは＋５２．３％）。
【００５３】
これらのデータは、インビトロのデータがインビボの試験によって確認されるということを実証する。デルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むＧＡＧ組成物の使用は、保湿効果と、統計的に意味のある皺の深さの減少と、をもたらす。
【国際調査報告】
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