(57)【要約】  少なくとも１つのアップレギュレートされた長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ）を含む、工学的ＬＣＤＡ生成経路を含む組換え微生物細胞が開示される。これらの組換え微生物細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる。ＬＣＤＡを生成するための組換え微生物細胞を使用する方法もまた開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを含む工学的ＬＣＤＡ生成経路を含む組換え微生物細胞であって、前記微生物細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる組換え微生物細胞。
【請求項２】
前記ＡＣｏＳ酵素は、配列番号４４、４９、３６、３３もしくは３４と少なくとも９０％同一である１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項３】
前記ＡＣｏＳ酵素は、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性およびクマロイル−ＣｏＡシンテターゼ活性の両方を有する、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項４】
前記ＡＣｏＳ酵素は、配列番号４４もしくは４９と少なくとも９０％同一である１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の組換え微生物細胞。
【請求項５】
前記工学的ＬＣＤＡ生成経路は、さらに下記の特徴：
（ｉ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉｉ）脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｖ）脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｖ）脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項６】
前記ＣＹＰ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列および前記ＣＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列の一方または両方がアップレギュレートされる、請求項５に記載の組換え微生物細胞。
【請求項７】
前記微生物細胞は、ペルオキシソーム生物発生因子をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションをさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項８】
前記ペルオキシソーム生物発生因子は、ペルオキシソーム生物発生因子３である、請求項７に記載の組換え微生物細胞。
【請求項９】
前記微生物細胞は、ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションをさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１０】
前記ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ−２、−３および／または−４である、請求項９に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１１】
前記微生物細胞は、減少した脂質合成および／または貯蔵能力を有する、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１２】
前記減少した脂質合成および／または貯蔵能力は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ酵素）をコードする少なくとも１つの内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションに起因する、請求項１１の組換え微生物細胞。
【請求項１３】
前記微生物細胞は、酵母細胞である、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１４】
前記酵母細胞は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞である、請求項１３に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１５】
前記ＬＣＤＡ生成物は、炭素原子１０〜２４個の鎖長を有する、および／または前記長鎖脂肪酸含有基質は、遊離長鎖脂肪酸またはエステル化長鎖脂肪酸を含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１６】
長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）を生成する方法であって：
ａ）請求項１に記載の前記組換え微生物細胞を長鎖脂肪酸含有基質と接触させる工程であって、前記微生物細胞が前記基質からＬＣＤＡを合成する工程；および
ｂ）任意選択的に工程（ａ）の前記ＬＣＤＡを回収する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記微生物細胞は酵母細胞である、および任意選択的に、前記酵母細胞はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／１９５，３４０号明細書（２０１６年７月２２日出願）および同第６２／１９５，３３８号明細書（２０１６年７月２２日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、分子生物学の分野に含まれる。例えば、本開示は、脂肪酸含有基質から長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）を生成するために遺伝子操作された酵母などの微生物に関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、４８０キロバイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、２０１６年７月１８日に作成されたＣＬ６４６７ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５のファイル名を備えるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含有された配列表は、本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
１０個以上の炭素原子を含むジカルボン酸は、長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）と呼ぶことができる。ＬＣＤＡは、ポリアミド（ナイロン）、ポリウレタンおよびポリエステルなどの様々な合成物質のための構成的モノマーとして有用である。ＬＣＤＡのその他の使用には、例えば、所定のポリカーボネート、粉体コーティング、フレグランス、パーソナルケア品目、食品添加物、溶媒、クリーニング添加物、ホットメルト接着剤、潤滑剤、殺虫剤および殺菌剤の製造が含まれる。ＬＣＤＡは、さらにまた、例えば、プラスチックを工学的に設計するための可塑剤および金属加工技術における腐食阻害剤として使用することもできる。
【０００５】
例えば上述したような商業的用途を実施するための好適な量のＬＣＤＡは、一般に自然界では見いだされない。所定のＬＣＤＡ、例えばドデカン二酸（ＤＤＤＡ）は、様々な合成プロセスによって調製することができる。しかし、例えば微生物発酵法などの生物学的プロセスもまた、ＬＣＤＡを生成するために有用な可能性があろう。油もしくは遊離脂肪酸を含有する供給原料は、例えば、ＬＣＤＡ生成物を発酵させるための基質として好適な可能性がある。酵母生体触媒を用いてＬＣＤＡを発酵させる努力が企てられてきた（特許文献１、２、３、４）。
【０００６】
脂肪酸は、β酸化および他の下流経路において使用するために酵母内で活性化することができ、それにより脂肪酸はω酸化の経路から切り離される。したがって、一部の酵母生体触媒は、ω酸化によるＬＣＤＡ生成物の発酵を増強するために、長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現をダウンレギュレートすることなどによって、減少した脂肪酸活性化を示すように改変されている（例えば、特許文献４および５を参照されたい）。
【０００７】
上記の開示があるにもかかわらず、現在では、驚くべきことに長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼをアップレギュレートすることによって酵母内での脂肪酸活性化の増加がＬＣＤＡの高生成を可能にすることが見いだされている。したがって、本明細書では、高レベルのＬＣＤＡ生成のために工学的に操作された微生物生体触媒が開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１４６９９９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／００４１１１５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／０２６７０１２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１４／０２２８５８６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０２６７０１２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの実施形態では、本開示は、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを含む工学的ＬＣＤＡ生成経路を含む組換え微生物細胞であって、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる組換え微生物細胞に関する。
【００１０】
また別の実施形態は、組換え微生物細胞であって：
（ｉ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉ）長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、および
（ｉｉｉ）ペルオキシソーム生物発生因子３をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションを含み、
ここで微生物細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる組換え微生物細胞に関する。
【００１１】
また別の実施形態は、長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）を生成する方法に関する。本方法は、ａ）本明細書に開示した組換え微生物細胞を長鎖脂肪酸含有基質と接触させる工程であって、ここで微生物細胞がその基質からＬＣＤＡを合成する工程；およびｂ）任意選択的に工程（ａ）のＬＣＤＡを回収する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】脂質代謝の脂肪酸β酸化態様およびω酸化態様を含む、脂質代謝経路を示す図である。破線／破線矢印は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における低活性もしくは弱活性を示している。
【図２】油、油由来脂肪酸および／または脂肪酸エステルからＬＣＤＡを生成するためにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を工学的に操作するための戦略が示されている。
【図３】Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来の候補アシル−ＣｏＡシンテターゼの系統樹を示す図である。この図において使用した所定の略語：ＦＡＡ１およびＦＡＡ２は、それぞれＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｆａａ１ｐおよびＦａａ２ｐを意味する。ＹＡ−１は、ＹｌＦａａ１ｐを意味する。「ＹＡ−」は、「ＹｌＡＣｏＳ−」を意味する。実施例１を参照されたい。
【図４】フラスコアッセイにおける菌株Ｄ０１４５によるＬＣＤＡの生成を示す図である。ＤＣＡ、ジカルボン酸。実施例２を参照されたい。
【図５Ａ】プラスミド構築物ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号６３）を示す図である。
【図５Ｂ】プラスミド構築物ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号６４）を示す図である。
【図５Ｃ】プラスミド構築物ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）を示す図である。
【図５Ｄ】プラスミド構築物ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号６６）を示す図である。
【図５Ｅ】プラスミド構築物ｐＺＫＬ７Ａ−ＦＹｌＦＡＡ（配列番号６７）を示す図である。
【図５Ｆ】プラスミド構築物ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号６８）を示す図である。
【図６】図６Ａは、推定脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼを過剰発現させるために形質転換させたＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞の可溶性および不溶性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、２、３、４、５、６：ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）、ＹｌＦＡＡ（配列番号３６）またはＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５６）をそれぞれ過剰発現するＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞由来のサンプル。レーンＣ：ｐＥＴ２３ｄベクター単独（陰性コントロール）を用いて形質転換させたＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞由来のサンプル。レーンＭ：タンパク質マーカー。実施例５を参照されたい。図６Ｂは、推定脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼのＩＰＴＧ誘導性過剰発現の前後のＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、２、３、４：ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）またはＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）をそれぞれ過剰発現するＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞由来のサンプル。レーンＣ：ｐＥＴ２３ｄベクター単独（陰性コントロール）を用いて形質転換させたＥ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞由来のサンプル。レーンＭ：タンパク質マーカー。実施例５を参照されたい。
【図７Ａ】表７に列挙した所定の菌株の系統を示す図である。実施例６を参照されたい。
【図７Ｂ】本明細書に開示した所定の菌株の系統を示す図である。
【図８Ａ】プラスミド構築物ｐ１２＿３−Ｂ−Ｐｅｘ３ｄｅｌ１（配列番号７６）を示す図である。
【図８Ｂ】プラスミド構築物ｐ７０＿Ｐｏｘ２：：Ｌｅｕ２（配列番号７７）を示す図である。
【図９Ａ】プラスミド構築物ｐＺＫＬＹ−ＦＣｔＲ１７Ｕ（配列番号８２）を示す図である。
【図９Ｂ】プラスミド構築物ｐＺＫＡＤｎ−Ｃ２Ｆ１Ｕ（配列番号８７）を示す図である。
【図１０】２Ｌ発酵実験におけるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ１３０８によるＬＣＤＡ生成の時間経過を示す図である。ＬＣＤＡ生成のための基質としてパルミチン酸エチルを使用した。ダイヤモンドは全ＬＣＤＡ量を示し、四角は時間経過中に測定されたＣ１６：０のＬＣＤＡの量を示す。実施例８を参照されたい。
【図１１Ａ】プラスミド構築物ｐＹＲＨ２１３（配列番号９２）を示す図である。
【図１１Ｂ】プラスミド構築物ｐＺＳＣＰｎー３ＦＡＯＢＵ（配列番号９８）を示す図である。
【図１２】２Ｌ発酵実験におけるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ２３００によるＬＣＤＡ生成の時間経過を示す図である。ＬＣＤＡ生成のための基質としてパルミチン酸エチルを使用した。四角は全ＬＣＤＡ量を示し、丸は時間経過中に測定されたＣ１６：０のＬＣＤＡの量を示す。実施例９を参照されたい。
【図１３】５Ｌフェドバッチ式発酵実験におけるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ３９２８によるＬＣＤＡ生成の時間経過を示す図である。ＬＣＤＡ生成のための基質としてパルミチン酸エチルを使用した。四角は全ＬＣＤＡ量を示し、ダイヤモンドは時間経過中に測定されたＣ１６：０のＬＣＤＡの量を示す。実施例１２を参照されたい。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
【表２】
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【００１５】
【表３】
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【００１６】
【表４】
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【００１７】
【表５】
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【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に引用した全ての特許文献および非特文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
他に特に開示しない限り、本明細書で使用する用語「１つの」は、参照した特徴の１つ以上（つまり、少なくとも１つ）を含むことが意図されている。
【００２０】
存在する場合、他に特に記載されていない限り、全ての範囲は、包括的および結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が記載された場合、記載された範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈すべきである。
【００２１】
用語「長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ」、「長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ」、「長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ」などは、本明細書では互換的に使用され、「ＡＣｏＳ」と略記することができる。ＥＣ登録番号６．２．１．３を有する本明細書のＡＣｏＳ酵素は、ＡＴＰによって提供されるエネルギーを使用して長い脂肪酸鎖から脂肪酸アシル−ＣｏＡへの活性化を触媒することができる。詳細には、ＡＣｏＳ酵素によって触媒される反応は次の通りである（「ＡＣｏＳ活性」）：ＡＴＰ＋長鎖カルボキシレート＋ＣｏＡ（補酵素Ａ）→ＡＭＰ＋二リン酸塩（ＰＰｉ）＋アシル−ＣｏＡ。一般に、ＡＣｏＳ酵素は、真核細胞内のペルオキシソームタンパク質である。本明細書のＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションは、ＡＣｏＳ酵素の増加した量の発現をもたらし、これは順に増加した量の長鎖脂肪酸から長鎖アシル−ＣｏＡへ活性化するために利用することができる。本明細書のＡＣｏＳ酵素は、ＥＣ登録番号２．３．１．８６を有する「脂肪酸アシル−ＣｏＡシンターゼ」酵素ではない。
【００２２】
用語「シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」、「ＣＹＰ酵素」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書のＣＹＰ酵素は、二原子酸素（Ｏ２）の１個の原子の有機基質への移動（典型的にはアルコール基を産生する）を触媒することができ、その間に他方の酸素原子は水に還元される。ＣＹＰ酵素は、酵素委員会（ＥＣ）登録番号１．１４．１４．１を有する。ＣＹＰ酵素は、ω−ヒドロキシラーゼ錯体（下記）内に含まれる可能性がある。本明細書のＣＹＰ酵素は、一般に、電子移動のためにＣＰＲ酵素を利用するクラスＩＩのＰ４５０酵素として分類されている。一般に、ＣＹＰ酵素は、膜結合型である。ＣＹＰ酵素は、一般に、参照により本明細書に組み込まれるＵｒｌａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｉｒｈａｒｄ（Ｃｅｌｌ  ３０：２６−３６）およびｖａｎ  Ｂｏｇａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７８：２０６−２２１）に記載されている。本明細書のＣＹＰ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションは、増加した量のＣＹＰ酵素の発現をもたらし、これは順に増加した量のω−ヒドロキシラーゼ錯体を形成するために利用することができる。
【００２３】
用語「シトクロムＰ４５０レダクターゼ」、「ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ」、「ＣＰＲ酵素」、「ＮＡＤＰＨ−フェリヘムタンパク質レダクターゼ」などは、本明細書では互換的に使用される。ＣＰＲ酵素は、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）およびＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）レドックス補因子を介して、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ内でのヘムチオレート部分の還元をそれに電子を移動させることによって触媒することができる。ＣＰＲ酵素は、ＥＣ登録番号１．６．２．４を有する。ＣＰＲ酵素は、ω−ヒドロキシラーゼ錯体（下記）内に含まれる可能性がある。一般に、ＣＰＲ酵素は、膜結合型である。ＣＰＲ酵素機能は、一般に、参照により本明細書に組み込まれるＰｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｓｐｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：１６８２−１６８７）およびＥｌｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４８９６０−４８９６４）に記載されている。本明細書のＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションは、増加した量のＣＰＲ酵素の発現をもたらし、これは順に増加した量のω−ヒドロキシラーゼ錯体を形成するために利用することができる。
【００２４】
用語「ω−ヒドロキシラーゼ錯体」、「ヒドロキシラーゼ錯体」、「ヒドロキシラーゼ酵素錯体」、「ＣＰＲ−Ｐ４５０系」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書のω−ヒドロキシラーゼ錯体は、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素を含み、例えばアルカン、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒドおよび脂肪酸などの所定の有機基質のω水酸化を実施することができる。一般に、ω−ヒドロキシラーゼ錯体は膜結合型である。酵母の小胞体（ＥＲ）膜内で発生するω水酸化は、典型的にはω酸化の第１工程である。
【００２５】
用語「脂肪族アルコールオキシダーゼ」（ＦＡＯ）、「長鎖脂肪酸オキシダーゼ」、「長鎖アルコールオキシダーゼ」、「ＦＡＯ酵素」などは、本明細書では互換的に使用される。ＦＡＯ酵素は、ＥＣ登録番号１．１．３．２０を有する。本明細書のＦＡＯ酵素は、次の反応：脂肪族アルコール＋Ｏ２→脂肪族アルデヒド＋Ｈ２Ｏ２（式中、脂肪族アルコールは好ましくはω−ヒドロキシ長鎖脂肪酸であり、および脂肪族アルデヒドは好ましくはω−アルド長鎖脂肪酸であり、それぞれは少なくとも炭素１０個（例えば、１０〜２４個）の炭素鎖長を有する）を触媒することができる。一般に、ＦＡＯ酵素は、酵母細胞内のペルオキシソームタンパク質である。
【００２６】
用語「脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ」（ＦＡＤＨ）、「長鎖脂肪酸デヒドロゲナーゼ」、「ＡＤＨ酵素」、「ＦＡＤＨ酵素」などは、本明細書では互換的に使用される。ＦＡＤＨ酵素は、ＥＣ登録番号１．１．１．１を有する。本明細書のＦＡＤＨ酵素は、次の反応：脂肪族アルコール＋ＮＡＤ＋→脂肪族アルデヒド＋ＮＡＤＨ（式中、脂肪族アルコールは好ましくはω−ヒドロキシ長鎖脂肪酸であり、および脂肪族アルデヒドは好ましくはω−アルド長鎖脂肪酸であり、それぞれは少なくとも炭素１０個（例えば、１０〜２４個）の炭素鎖長を有する）を触媒することができる。一般に、ＦＡＤＨ酵素は、酵母細胞内の小胞体膜タンパク質である。ＦＡＤＨ酵素は、典型的には補因子としてのＺｎ２＋もしくはＦｅカチオンを使用する。
【００２７】
用語「脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ」（ＦＡＬＤＨ）、「長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ」、「ＦＡＬＤＨ酵素」などは、本明細書では互換的に使用される。ＦＡＬＤＨ酵素は、ＥＣ登録番号１．２．１．４８を有する。本明細書のＦＡＬＤＨ酵素は、次の反応：脂肪族アルデヒド＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ→ＬＣＤＡ＋ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋（式中、脂肪族アルデヒドは、好ましくは少なくとも炭素１０個（例えば、１０〜２４個）の炭素鎖長を有するω−アルド長鎖脂肪酸である）（好ましいＬＣＤＡについては、本明細書で詳細に開示する）を触媒することができる。一般に、ＦＡＬＤＨ酵素は、酵母細胞内のペルオキシソームタンパク質および／または小胞体膜タンパク質である。
【００２８】
本明細書の「工学的ＬＣＤＡ生成経路」は、例えば：
（ｉ）ＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、および
（ｉｉ）ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション（すなわち、ω−ヒドロキシラーゼのアップレギュレーション）を含むことができる。
そのような経路は、例えば、長鎖脂肪酸含有基質からＬＣＤＡ生成物を生成することができる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「ω酸化」は、ω炭素（脂肪酸のカルボキシル基から最も離れている炭素）がカルボン酸基に酸化される脂肪酸代謝経路を意味する（図１を参照されたい）。ω酸化の第１工程は、ω炭素へのヒドロキシル（ＯＨ）基の添加を触媒するω−ヒドロキシラーゼ錯体によって実施され、結果としてω−ヒドロキシ脂肪酸が生じる。ω酸化の次の工程は、脂肪族アルコールオキシダーゼ（例えば、ＥＣ登録番号１．１．３．２０）または脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ登録番号１．１．１．６６、１．１．１．１９２）によるω−ヒドロキシル基からアルデヒド（Ｃ＝Ｏ）基への酸化を含み、結果としてω−アルド脂肪酸が生じる。ω酸化の最終工程は、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ登録番号１．２．１．３、１．２．１．４８）によるアルデヒド基からカルボキシル（ＣＯＯＨ）基（カルボン酸基）への酸化を含み、結果としてジカルボン酸が生じる。長鎖脂肪酸のω酸化の生成物は、長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）である。
【００３０】
本明細書の用語「β酸化」は、脂肪酸がその脂肪酸のカルボキシル末端からある時点に２個の炭素の除去によって異化されるプロセスを意味する。β酸化は、典型的には酵母内のペルオキシソーム内でのみ発生する。ペルオキシソームは、膜に包まれた、様々なオキシドレダクターゼを含有する細胞質小器官である。本明細書の脂肪酸のβ酸化の遮断は、例えば、ペルオキシソーム発生を破壊する工程、および／または１つ以上のβ酸化経路酵素の発現をダウンレギュレートする工程によって実施できる。
【００３１】
用語「ペルオキシソームタンパク質」、「ペルオキシソーム関連性タンパク質」などは、本明細書では互換的に使用される。ペルオキシソームタンパク質は、ペルオキシソーム発生に関係する、および／またはタンパク質がペルオキシソーム構造および／または代謝機能（例えば、β酸化経路）を維持することに関係するペルオキシソーム内に所在するタンパク質である。本明細書のペルオキシソームタンパク質の例としては、Ｐｅｘタンパク質およびＰｏｘタンパク質が挙げられる。
【００３２】
用語「ペルオキシソーム生物発生因子」、「ペルオキシソーム生物発生因子タンパク質」、「ペルオキシン」、「Ｐｅｘタンパク質」などは、本明細書では互換的に使用され、ペルオキシソーム生物発生に関係する、および／または細胞タンパク質をペルオキシソーム内に持ち込むプロセスに関係しているタンパク質を意味する。例えば、Ｐｅｘタンパク質をコードする遺伝子もしくはオープンリーディングフレームなどのポリヌクレオチド配列の略語は、例えば、「ＰＥＸ」または「ＰＥＸポリヌクレオチド」またはＰＥＸ遺伝子」と呼ぶことができる。Ｐｅｘ配列の命名方式は、Ｄｉｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３５：１−３）によって記載されている。これまでに、少なくとも３２の異なるＰＥＸ配列が様々な真核生物において同定されている。次の真菌Ｐｅｘタンパク質：Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様およびＰｅｘ２６ｐは、Ｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｆｆｉｃ  ７：１２９１−１３０３）によって同定された。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００９／０１１７２５３号明細書）は、酵母における所定のＰＥＸ配列のダウンレギュレーションが脂質および脂肪酸蓄積を増強することを開示した。
【００３３】
本明細書の用語「ＰＥＸ３」は、ペルオキシソーム生物発生因子３（Ｐｅｘ３タンパク質［「Ｐｅｘ３ｐ」］）をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。Ｐｅｘ３タンパク質は、ペルオキシソーム生物発生中のペルオキシソーム膜形成において重要な役割を果たすと考えられるペルオキシソーム内在性膜タンパク質である（例えば、Ｂａｅｒｅｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：８８８７−８８９４；Ｂａｓｃｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４：９３９−９５７を参照されたい）。
【００３４】
用語「ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ」、「Ｐｏｘタンパク質」、「Ａｏｘタンパク質」などは、本明細書では互換的に使用され、ペルオキシソーム内で発生するβ酸化経路に含まれるタンパク質を意味する。ＥＣ登録番号が１．３．３．６である本明細書のＰｏｘタンパク質は、典型的には次の反応：脂肪酸アシル−ＣｏＡ＋Ｏ２→トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ２を触媒する。例えば、Ｐｏｘタンパク質をコードする遺伝子もしくはオープンリーディングフレームなどのポリヌクレオチド配列の略語は、例えば、「ＰＯＸ」、「ＰＯＸポリヌクレオチド」または「ＰＯＸ遺伝子」（例えば、ＰＯＸ４）と呼ぶことができる。Ｐｏｘタンパク質の例は、Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５および−６である。
【００３５】
用語「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」、「アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」、「ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ」、「ＤＧＡＴ」、「ＤＡＧＡＴ」などは、本明細書では互換的に使用される。ＤＧＡＴ酵素は、ＥＣ登録番号２．３．１．２０を有し、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびＣｏＡに変換させる（これによりＴＡＧ生合成の最終工程に含まれる）。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２は、本明細書のＤＧＡＴＳの例である。ＤＧＡＴ１酵素は、アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ酵素と相同性を共有する（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３８８６２−３８８６９）。
【００３６】
用語「クマロイル−ＣｏＡシンテターゼ」、「４−クマロイル−ＣｏＡシンテターゼ」、「４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ」などは、本明細書では互換的に使用される。ＥＣ登録番号６．２．１．１２を有する本明細書のクマロイル−ＣｏＡシンテターゼ酵素は、次の反応（「クマロイル−ＣｏＡシンテターゼ活性」）：ＡＴＰ＋４−クマル酸＋ＣｏＡ→ＡＭＰ＋二リン酸＋４−クマル酸＋ＣｏＡを触媒することができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「長鎖」は、少なくとも１０個の炭素原子、および典型的には２４個までの炭素原子の直鎖を意味する。「長鎖脂肪酸」は、例えば、長さが１０〜２４個の炭素原子の鎖を有することができる。長鎖脂肪酸の炭素鎖内の炭素原子の数は、その脂肪族炭素（存在する場合は、ＣＨ３−、−ＣＨ２−および＝ＣＨ−）およびカルボン酸基炭素（ＣＯＯＨ）からなる。
【００３８】
用語「長鎖ジカルボン酸」（ＬＣＤＡ）、「長鎖二酸」、「長鎖二塩基酸」、「長鎖α，ω−ジカルボン酸」、「長鎖脂肪ジカルボン酸」などは、本明細書では互換的に使用される。ＬＣＤＡは、長鎖脂肪酸の完全ω酸化の結果として生じるので、αおよびωカルボン酸基（すなわち、炭素鎖の各末端にあるＣＯＯＨ）を有する。本明細書のＬＣＤＡは、例えば、長さが炭素原子１０〜２４個の鎖を有することができる。ＬＣＤＡの炭素鎖内の炭素原子の数は、その脂肪族炭素（存在する場合は、−ＣＨ２−および＝ＣＨ−）および両方のカルボン酸基の炭素からなる。例示するために、Ｃ１８：０のＬＣＤＡ（１８炭素鎖長、二重結合なし）は、１６のＣＨ２基および２つのカルボキシル基を有する；およびＣ１８：１のＬＣＤＡ（１８炭素鎖長、１つの二重結合）は、１４のＣＨ２基、２つのＣＨ基および２つのカルボキシル基を有する。本明細書のＬＣＤＡは、好ましくは脂肪族炭素のいずれにも有機側鎖を有していない直鎖状である。
【００３９】
本明細書の「長鎖アシル−ＣｏＡ」もしくは「長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ」は、長鎖脂肪酸が補酵素Ａ（ＣｏＡ）とチオエステル結合している化合物を意味する。長鎖アシル−ＣｏＡは、長鎖脂肪酸基質上の長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性の生成物である。本明細書の「長鎖脂肪酸活性化」は、それにより長鎖脂肪酸が長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性によって細胞内で長鎖アシル−ＣｏＡに変換させられるプロセスを意味する。
【００４０】
用語「長鎖脂肪酸含有基質」、「長鎖脂肪酸を含む基質」、「長鎖脂肪酸含有供給原料」などは、本明細書では互換的に使用される。生物学的もしくは生物学的由来起源から得られる本明細書の任意の長鎖脂肪酸含有基質は、所望であれば「再生可能」または「生体再生可能」であると特徴付けることができる。長鎖脂肪酸含有基質は、例えば、「遊離長鎖脂肪酸」（例えば、非エステル化もしくは非アミド結合長鎖脂肪酸）または「結合長鎖脂肪酸」（例えば、エステル化もしくはアミド結合長鎖脂肪酸）を含むことができる。
【００４１】
本明細書の遊離長鎖脂肪酸のＣＯＯＨ基は、例えばエステル結合（すなわち、遊離長鎖脂肪酸はエステル化されていない）またはアミド結合（すなわち、遊離長鎖脂肪酸はアミド結合していない）などの結合中には含まれていない。
【００４２】
結合長鎖脂肪酸は、例えば、「エステル化長鎖脂肪酸」または「アミド結合長鎖脂肪酸」であってよい。
【００４３】
長鎖脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは脂肪酸内の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙ（もしあれば）は二重結合の数である）の単純な表記法によって表示できる。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）および「ω−６脂肪酸」対「ω−３脂肪酸」の区別に関する追加の情報は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７２３８４８２号明細書に提供されている。
【００４４】
本明細書の「グリセリド分子」もしくは「グリセリド」は、グリセロールにエステル化されたそれぞれ１個、２個または３個の脂肪酸を含有するモノ−、ジ−および／またはトリグリセリド（または、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよび／またはトリアシルグリセロールと呼ぶことができる）を意味する。グリセリド分子は、中性脂質の例である。
【００４５】
本明細書の「脂肪酸アルキルエステル」は、脂肪酸のカルボン酸基とアルキルアルコールのヒドロキシル基との間のエステル結合によって形成されたエステルを意味する。例示するために、本明細書の脂肪酸アルキルエステルは、例えば、脂肪酸からメタノールへのエステル化によって生成される脂肪酸メチルエステルであってよい。脂肪酸アルキルエステルは、脂肪酸エステルの１つの例である。
【００４６】
本明細書で使用する「エステル基」は、エーテル結合に隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を有する有機部分を意味する。エエステル基の一般式は：
【化１】
2018519843.tif 000008
である。
【００４７】
エステル化長鎖脂肪酸に関して、上記のエステル式内のＲは、エステル化脂肪酸の脂肪族炭素原子の直鎖を含む。Ｒ’基は、例えば、アルキル基、アリール基または他の有機基を意味する。エステル基の例は、グリセロールにエステル化された、それぞれ１個、２個または３個の脂肪酸を含有するモノ−、ジ−およびトリグリセリド内で見いだされる。上記の式を参照すると、モノグリセリドのＲ’基は、その分子のグリセロール部分を意味するであろう；ジグリセリドもしくはトリグリセリドのＲ’基は、それぞれ１個もしくは２個の他の脂肪酸にエステル結合したグリセロール部分を意味するであろう。
【００４８】
本明細書で使用する用語「脂質」は、脂肪可溶性（すなわち、親油性）分子を意味する。脂質の一般的概説は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書に提供されている（その中の表２を参照されたい）。長鎖脂肪酸含有基質として本明細書で有用な脂質の例としては、グリセロ脂質（例えば、モノ−、ジ−およびトリアシルグリセロール）、脂肪酸アシル（例えば、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸）、スフィンゴ脂質（例えば、セラミド、ホスホ−スフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、例えばガングリオシドおよびセレブロシド）およびサッカロ脂質（その中で脂肪酸が糖骨格に直接結合している化合物）（例えば、アシルアミノ糖、アシルアミノ−グリカン、アシルトレハロース）が挙げられる。本明細書の脂肪酸含有基質は、所望であれば、脂肪酸含有脂質であると特徴付けることができる。
【００４９】
本明細書で使用する用語「油」は、２５℃で液体である脂質を意味する；油は、有機溶媒中では疎水性および可溶性である。油は、典型的には主としてトリアシルグリセロールから構成されるが、さらに他の中性脂質の例である、ならびにリン脂質および遊離脂肪酸を含有することができる。
【００５０】
本明細書で使用する用語「脂肪酸留出物」、「油の脂肪酸留出物」などは、特定タイプの油の脂肪酸を含む組成物を意味する。例えば、パーム脂肪酸留出物は、パーム油中に存在する脂肪酸を含む。脂肪酸留出物は、一般に植物油精製プロセスの副生成物である。
【００５１】
本明細書の用語「細胞」は、原核細胞または真核細胞などの任意のタイプの細胞を意味する。真核細胞は、核および他の膜で包まれた構造（細胞小器官）を有するが、他方、原核細胞は核を持たない。本明細書の「微生物細胞」（微生物）は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原核細胞、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞または卵菌細胞を意味することができる。本明細書の原核細胞は、典型的には、細菌細胞を意味する。
【００５２】
本明細書の用語「酵母」は、主として単細胞の形態で存在する真菌種を意味する。または、酵母は、「酵母細胞」と呼ぶこともできる。本明細書の酵母は、例えば、従来型酵母または非従来型酵母のいずれかであると特徴付けることができる。
【００５３】
本明細書の用語「従来型酵母」（「モデル酵母」は、一般に、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種を意味する。所定の実施形態における従来型酵母は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される修復プロセスよりも相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である。
本明細書の用語「非従来型酵母」は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもない任意の酵母を意味する。非従来型酵母は、参照により本明細書に組み込まれるＮｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）およびＳｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：１４７−１５６）において記載されている。非従来型酵母の一部の菌株は、追加して（またはその代りに）ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である可能性がある。この考えに沿った非従来型酵母の定義−ＨＲよりもＮＨＥＪを優先する傾向−は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ５７９５２）によってさらに開示されている。本明細書の好ましい非従来型酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の酵母（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））である。
【００５４】
遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列の発現を説明するために使用する場合、用語「ダウンレギュレートされた」、「ダウンレギュレーション」、「破壊」、「阻害」、「不活性化」および「サイレンシング」などは、ポリヌクレオチド配列の転写が減少または排除される例を言及するために、本明細書では互換的に用いられる。これは、ポリヌクレオチド配列からのＲＮＡ転写産物の減少または排除を生じさせ、結果として（遺伝子がＯＲＦを含む場合は）ポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質発現の減少もしくは排除をもたらす。または、ダウンレギュレーションは、ポリヌクレオチド配列によって生成される転写産物からのタンパク質翻訳が減少させられる、または排除される場合を意味することができる。さらにまたは、ダウンレギュレーションは、ポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質の活性が低下する場合を意味することができる。細胞内での上記のプロセス（転写、翻訳、タンパク質活性）のいずれかにおける減少は、好適なコントロール細胞内での対応するプロセスと比較して少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％である可能性がある。ダウンレギュレーションは、例えば、ターゲティング事象（例えば、インデル、ノックアウト、ノックイン）から、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉテクノロジーを使用した結果として生じる可能性がある。
【００５５】
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」、「ＤＮＡターゲティング」、「編集」、「遺伝子編集」、および「ＤＮＡ編集」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書のＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体中などの、特定のＤＮＡ配列でのインデル、ノックアウトもしくはノックインの導入であってよい。例えば相同組換え（ＨＲ）などの微生物細胞内でのターゲティングのための手段は、当分野において公知であり、適宜に適用することができる。例えば、酵母細胞内で実施できる様々なＨＲ手法は、参照により本明細書に組み込まれるＤＮＡ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１１）に開示されている。ＨＲプロセスは、例えば、ＤＮＡターゲット部位でインデル、ノックアウトまたはノックインを導入するために使用できる。
【００５６】
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」、「遺伝的ノックアウト」、「破壊された」などは、本明細書では互換的に使用される。ノックアウトは、本明細書中で、ＤＮＡターゲティングによって部分的または完全に無効にされている、本明細書の細胞のＤＮＡ配列を表す；そのノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードしていてもよい、または調節機能（例えば、プロモーター）を有していてもよい。ノックアウトは、例えば、ＤＮＡ配列欠失を提供するための特定の方法を表す。ノックアウトは、例えば、突然変異誘発プロセス（例えば、インデル形成をもたらす）もしくは（例えば、ＨＲによる）配列の特異的除去によって生成することができ、例えばタンパク質および／またはその調節配列をコードするポリヌクレオチドなどのＤＮＡ配列の機能を減少させる、または完全に破壊する。本明細書のノックアウトされたＤＮＡ配列ポリヌクレオチドは、さらにまた部分的もしくは完全に破壊されている、または部分的もしくは完全にダウンレギュレートされていると特徴付けることができる。
【００５７】
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」および「遺伝的ノックイン」などは、本明細書では互換的に使用される。ノックインは、ＤＮＡターゲティングによる細胞内での特異的ＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換もしくは挿入を表す。ノックインの例としては、異種アミノ酸コーディング配列のポリヌクレオチド配列および／またはその調節配列のタンパク質コーディング領域内への特異的挿入が挙げられる。そのような挿入は、例えば、標的配列のダウンレギュレーションを生じさせることができる。ノックインは、例えば、（例えば、ＨＲによる）配列の特異的挿入によって生成することができる。
【００５８】
本明細書の用語「インデル」は、標的ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入もしくは欠失を意味する。そのような挿入もしくは欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の塩基の挿入もしくは欠失であってよい。所定の実施形態におけるインデルは、いっそう大きく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基であってよい。インデルが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入される場合は、インデルは多くの場合、フレームシフト突然変異を生じさせることによって、ＯＲＦによってコードされたタンパク質の野生型発現を破壊する。インデルは、例えば、突然変異誘発プロセスを使用して作成することができる。
【００５９】
用語「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「体積％」、「ｖ／ｖ％」などは、本明細書では互換的に使用される。溶液中の溶質の体積によるパーセントは、式：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％を使用して決定できる。
【００６０】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では互換的に使用される。重量によるパーセントは、それが組成物中、混合物中もしくは溶液中に含まれるかのように質量ベースでの物質のパーセンテージを意味する。
【００６１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」などは、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり、任意選択的に合成、非天然もしくは改変ヌクレオチド塩基を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物のうちの１つ以上のセグメントから構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）は、次の一文字略称によって呼ぶことができる：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）に対して「Ａ」、シチジル酸またはデオキシチジル酸（ＲＮＡまたはＤＮＡそれぞれに対して）に対して「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸（ＲＮＡまたはＤＮＡそれぞれに対して）に対して「Ｇ」、ウリジル酸（ＲＮＡに対して）に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸（ＤＮＡに対して）に対して「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して「Ｙ」、ＧまたはＴに対して「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」、ＡまたはＴに対して「Ｗ」、そして任意のヌクレオチドに対して「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＴまたはＧであってよく；ＲＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＵまたはＧであってよい）。
【００６２】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、コーディング領域からＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し、そのＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）または非タンパク質コーディングＲＮＡであってよい。遺伝子は、コーディング領域単独を意味する場合がある、またはコーディング領域への上流および／または下流の調節配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’転写ターミネーター領域）を含む場合がある。またはタンパク質をコードするコーディング領域は、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ぶことができる。「天然」もしくは「内因性」である遺伝子は、固有の調節配列を備える自然界で見いだされる遺伝子を意味する；そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノム内の自然な場所に所在する。「キメラ」遺伝子は、天然遺伝子ではない、自然には一緒に見いだされることのない調節配列およびコーディング配列を含む（すなわち、調節配列およびコーディング配列は相互に異種である）あらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一起源に由来するが自然に見いだされるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含む可能性がある。「外来」もしくは「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生体内に導入される遺伝子を意味する。外来／異種遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主の新規な場所に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含む可能性がある。本明細書に開示した所定の実施形態内のポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手法（例えば、形質転換法）によりゲノム内に導入されている遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００６３】
本明細書の細胞もしくは生物に含まれる「非天然」アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞もしくは生物の天然（自然）対応物中では発生しない。
【００６４】
本明細書で使用する「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロンおよび３’非コーディング領域を指し、遺伝子から転写されたＲＮＡの翻訳、プロセシングもしくは安定性および／または翻訳に影響を及ぼす可能性がある。本明細書の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造および遺伝子発現の調節に関連する他の要素を含む可能性がある。本明細書の１つ以上の調節要素は、本明細書のコーディング領域に対して異種であってよい。
【００６５】
本明細書中で使用する「プロモーター」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してよい、自然界で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成されてよい、またはいっそう合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。あらゆる状況下のほとんどの時点で遺伝子が細胞内で発現することを誘発するプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。本明細書の１つ以上のプロモーターは、本明細書のコーディング領域にとって異種であってよい。
【００６６】
本明細書で使用する「誘導性プロモーター」は、所定の特定条件下で（すなわち、生物因子もしくは非生物因子の存在または非存在によって）遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することのできるプロモーターを意味する。これらのタイプのプロモーターは、典型的には、誘導条件が存在しない条件下では活性を有していない、または極めて低い活性しか有していない。
【００６７】
本明細書で使用する「強力プロモーター」は、単位時間当たり相当に多数の生成開始を指示できるプロモーター、および／または細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターである。
【００６８】
本明細書で使用する用語「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」および「ターミネーター」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味する。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。
【００６９】
用語「カセット」、「発現カセット」、「遺伝子カセット」などは、本明細書では互換的に使用される。カセットは、タンパク質コーディングＲＮＡもしくは非タンパク質コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターを意味することができる。カセットは、任意選択的に３’非コーディング配列に機能的に連結していてよい。本明細書のカセットの構造は、任意選択的に、「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記方式によって表すことができる。詳細には、Ｘはプロモーターを表し、Ｙはコーディング配列を表し、およびＺはターミネーター（任意選択的）を表す；ＸはＹに機能的に連結しており、およびＹはＺに機能的に連結している。
【００７０】
本明細書で使用する用語「発現」は、（ｉ）コーディング領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは非タンパク質コーディングＲＮＡ）の転写、および／または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を意味する。ポリヌクレオチド配列のコーディング領域の発現は、所定の実施形態では、アップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。
【００７１】
本明細書で使用する用語「機能的に連結した」は、一方の機能が他方の機能によって影響されるような２つ以上の核酸配列の会合を意味する。例えば、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と機能的に連結している。すなわち、コーディング配列は、プロモーターの転写調節下にある。コーディング配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）または２つ以上（例えば、プロモーターおよびターミネーター）の調節配列と機能的に連結させることができる。
【００７２】
本明細書で例えばプラスミド、ベクターまたは構築物などのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用する場合の用語「組換え」は、例えば化学合成によって、および／または遺伝子工学技術による核酸の分離セグメントの操作によって、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人工的組み合せを意味する。本明細書の組換え構築物／ベクターを調製するための方法は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）によって記載された標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術にしたがうことができる。
【００７３】
本明細書で使用する用語「形質転換」は、任意の方法によって核酸分子を宿主生物または宿主細胞に移動させることを意味する。生物／細胞に形質転換されている核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製する分子、生物／細胞のゲノムに組み込まれる分子または複製もしくは組み込みされずに細胞内に一時的に存在する分子であってよい。例えばプラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子などの、形質転換のために好適な核酸分子の非限定的な例は、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する本明細書に記載の宿主生物／細胞は、例えば、「トランスジェニック」、「組換え」、「形質転換（された）」、「工学的（に操作された）」、「形質転換体」、および／または「外因性遺伝子発現のために改変（された）」と称することができる。
【００７４】
本明細書に記載したポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、任意の標準技術によって細胞内に導入することができる。これらの技術には、例えば、形質転換法（例えば、酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］）、バイオリスティックインパクト法、エレクトロポーレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。１つの例として、米国特許第４８８０７４１号明細書および同第５０７１７６４号明細書ならびにＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２３２−２３５）は、ＤＮＡの線状化断片に基づくＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についての統合技術を開示している。
【００７５】
用語「コントロール細胞」および「好適なコントロール細胞」は、本明細書では互換的に使用され、特定の改変（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドのダウンレギュレーション）が加えられた細胞（すなわち、「実験細胞」）の基準として参照することができる。コントロール細胞は、実験細胞の特定の改変を有していない、または発現もしない任意の細胞であってよい。したがって、コントロール細胞は、非形質転換野生型細胞であってよい、または遺伝的に形質転換されているが、特定の改変を発現しない細胞であってよい。例えば、コントロール細胞は、実験細胞の直接の親であってよく、その直接の親細胞は、実験細胞中に存在する特定の改変を有していない。または、コントロール細胞は、一世代または複数世代によって除去される、実験細胞の親であってよい。さらにまたは、コントロール細胞は、実験細胞の同胞であってよく、この同胞は、実験細胞中に存在する特定の改変を含まない。コントロール細胞は、任意選択的に、実験細胞になるように改変させられる前に存在していた細胞であると特徴付けることができる。
【００７６】
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する用語「配列同一性」もしくは「同一性」は、特定の比較窓にわたって最高一致について整列させた場合に同一である２つの配列内の核酸塩基もしくはアミノ酸残基を意味する。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」もしくは「同一性率（％）」は、比較窓にわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定される数値を意味するが、このとき比較窓内のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較して付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含む可能性がある。パーセンテージは、配列同一性のパーセンテージを得るために、マッチした位置数を生じさせるために両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、マッチした位置数を比較窓内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列同一性を計算した場合に、ＤＮＡ配列のＴ残基がＲＮＡ配列のＵ残基と一致すれば「同一」と見なせることは理解されるであろう。第１および第２ポリヌクレオチドの「相補率」を決定するためには、例えば、（ｉ）第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドの相補配列（またはその逆）との同一性率、および／または（ｉｉ）正準ワトソン＆クリック塩基対を作り出すであろう第１および第２ポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを決定することによってこれを得ることができる。
【００７７】
オンラインにより全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用できるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズムを使用すると、例えば、本明細書で開示する、２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間の同一性率を測定することができる。または、配列間の同一性率は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶもしくはＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ）を使用して実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法を使用するマルチプルアラインメントについては、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する可能性がある。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性率の計算のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸については、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。またはさらに、配列間の同一性率は、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して、例えば、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝フォールス、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５などのパラメーターを用いるＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えば、ニードル）を使用して実施することができる。
【００７８】
本明細書で、第２配列と「相補的な」第１配列は、または第２配列と「アンチセンス」方向にあると呼ぶことができる。
【００７９】
本明細書では、様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列は、所定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示した配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％もしくは９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変異体は、使用または参照することができる。または、変異アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有することができる。変異アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性または開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端で少なくとも１つの開始メチオニンをさらに含むことができる。
【００８０】
本明細書に開示したタンパク質の各アミノ酸位置の全てのアミノ酸残基は、例である。所定のアミノ酸が相互に類似の構造的特徴および／または荷電特徴を共有する（すなわち、保存されている）ことを前提にすると、本明細書のタンパク質の各位置でのアミノ酸は、本明細書に開示した配列で提供されるようなアミノ酸であってよい、または以下のように、保存アミノ酸残基で置換されていてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．次の小さな脂肪族の非極性もしくは弱極性の残基は、相互に置換することができる：
Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．次の極性の負荷電残基およびそれらのアミドは、相互に置換することができる：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．次の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．次の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；および
５．次の大きな芳香族残基は、相互に置換することができる：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００８１】
本明細書で使用する用語「単離（された）」は、その天然源から完全に、または部分的に精製されているポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子を意味する。一部の例では、単離ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子は、より大きな組成物、バッファー系または試薬ミックスの一部である。例えば、単離ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子は、細胞もしくは生物の内部に異種的方法で含まれる可能性がある。異種構成要素および／または１つ以上の遺伝子欠失を含むそのような細胞もしくは生物は、自然には発生しない。本明細書の「単離（された）」は、さらに合成／人工である実施形態、および／または天然型ではない特性を有する実施形態を特徴付けることができる。
【００８２】
本明細書で使用する用語「増加（した）」は、それに対して増加した量または活性が比較される量もしくは活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％もしくは２００％以上である量もしくは活性を意味することができる。用語「増加（した）」、「上昇（した）」、「増強（された）」、「より多い」、「改善（された）」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの「過剰発現」または「アップレギュレーション」を特徴付けるために使用できる。
【００８３】
増強されたＬＣＤＡ発酵能力を備える新規な微生物生体触媒が望ましい。したがって、本明細書に開示した一部の実施形態は、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを含む工学的ＬＣＤＡ生成経路を含む組換え微生物細胞に関する。重要なことに、そのような微生物細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる。
【００８４】
本明細書に開示した一部の実施形態は、例えば酵母細胞などの組換え微生物細胞であって：
（ｉ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉ）長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、および
（ｉｉｉ）ペルオキシソーム生物発生因子３をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションを含む組換え微生物細胞に関する。
【００８５】
重要なことに、そのような微生物細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる。
【００８６】
本明細書の組換え細胞内のＡＣｏＳ酵素のこの酵素をコードするポリヌクレオチド配列をアップレギュレートすることによるアップレギュレーションは、この細胞内での増加したレベルの長鎖アシル−ＣｏＡを生じさせると考えられる。この代謝産物のそのような増加は、細胞内の増加したレベルの長鎖脂肪酸の活性化を反映する。
【００８７】
本明細書の所定の態様におけるＡＣｏＳ酵素のアップレギュレーションは、ＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを通してであってよい。ＡＣｏＳ酵素の過剰発現をもたらすそのようなアップレギュレーションは、１つ以上の様々な方法によって実施することができる。例えば、ＡＣｏＳコーディングポリヌクレオチドは、一過性または安定性のいずれかで、細胞に多コピーで提供することができる（そのようなポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列［例えば、異種プロモーター］に機能的に連結している。ポリヌクレオチド配列を多コピーで提供する工程は、ポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは５０コピー）を細胞に提供する工程によって実施できる。安定性方法で提供されるポリヌクレオチド配列は、典型的には一過性方法で提供されるポリヌクレオチド配列のコピー数と比較して少ないコピー数を有することは理解されるであろう。また別の例として、ＡＣｏＳコーディングポリヌクレオチド配列は、それらのいずれも異種である可能性がある構成的プロモーター、強力プロモーターもしくは誘導性プロモーターへの機能的連結によってアップレギュレートすることができる。
【００８８】
本明細書の細胞内のＡＣｏＳ酵素のアップレギュレーション（例えば、過剰発現）は、任意選択的に好適なコントロール細胞と比較して考察することができる。例えば、本明細書の細胞内のＡＣｏＳ酵素の増加したレベルは、好適なコントロール細胞内のＡＣｏＳ酵素の発現より少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％もしくは１０００％高いと特徴付けることができる。好適なコントロール細胞の１つの例は、アップレギュレートされたＡＣｏＳ酵素発現を有するように改変される前に存在した細胞（例えば、親細胞）である。
【００８９】
本明細書のＡＣｏＳ酵素は、例えば、細胞にとって異種であってよい。異種ＡＣｏＳ酵素の１つの例は、その中でＡＣｏＳ酵素がアップレギュレートされている細胞の種もしくは菌株とは異なる種もしくは菌株に由来する異種ＡＣｏＳ酵素であってよい。
【００９０】
または、細胞内でアップレギュレートされるＡＣｏＳ酵素は、その細胞にとって天然であってよい。天然ＡＣｏＳ酵素は、例えば、ポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションに関して上記に開示した手段のいずれかを使用して、アップレギュレートすることができる。例えば、細胞にとって天然であるこの酵素をコードする（プロモーター［例えば、異種プロモーター］に機能的に連結している）ポリヌクレオチド配列は、安定性もしくは一過性方法で細胞に提供することができる（しかしポリヌクレオチド配列の場所は、非天然部位［すなわち、異種部位］に位置するであろう）。また別の例として、細胞のゲノム内に自然に存在するＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、天然ポリヌクレオチド配列が過剰発現するように改変することができる。これは、例えば、ＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子の１つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター）を改変する工程によって実施することができる。
【００９１】
１種、２種、３種、４種以上のＡＣｏＳ酵素は、任意選択的に、ＡＣｏＳ酵素をコードする２つ、３つ、４つ以上のセット（コピー）のポリヌクレオチド配列を提供することによって本明細書の細胞内でアップレギュレートすることができる。ＡＣｏＳ酵素は、例えば、（ｉ）同一ＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のコピーおよび／または（ｉｉ）異なるＡＣｏＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を導入する工程（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属ＡＣｏＳおよびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＡＣｏＳ両方の過剰発現）によって細胞に提供することができる。
【００９２】
本明細書のＡＣｏＳ酵素は、真核生物、例えば、次に開示した任意の真核生物に由来してよい：本明細書の真核生物は、動物、植物、真菌または原生生物であってよい。本明細書の動物は、例えば、哺乳動物、鳥類、両生類、爬虫類、魚類もしくは無脊椎動物（例えば、昆虫、甲殻類、軟体動物、線虫）であってよい。本明細書の哺乳動物は、例えば、ヒトまたは齧歯類（例えば、マウス、ラット）であってよい。本明細書の植物は、例えば、単子葉植物または双子葉植物であってよい。本明細書の単子葉植物の例としては、コーン、コメ、ライムギ、ソルガム、キビ、コムギ、サトウキビ、オートムギ、オオムギおよびスイッチグラスが挙げられる。本明細書の双子葉植物の例としては、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（例えば、Ａ．タリアナ（ｔｈａｌｉａｎａ）、Ａ．リラータ（ｌｙｒａｔａ））、ヒマワリ、綿、落花生、トマト、ジャガイモおよびオオカラスノエンドウ（例えば、ビシア・サティバ（Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ））が挙げられる。本明細書の真菌は、例えば、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）もしくは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌であってよい。真菌は、所定の実施形態では酵母または糸状菌であってよい。酵母の例としては、下記に開示した種（例えば、本明細書の所定の態様における組換え酵母細胞を調製するために使用できるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種、例えばＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種、例えばＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、例えばＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のいずれかが挙げられる。本明細書の糸状菌の例としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、クリホネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属が挙げられる。本明細書の原生生物の例としては、藻細胞（例えば、緑藻類、褐藻類、紅藻類）および繊毛虫（Ｃｉｌｉａｔａ）綱の原生生物、鞭毛虫亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）（鞭毛虫）、植物性鞭毛虫（Ｐｈｙｔｏ��ａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱、動物性鞭毛虫（Ｚｏｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱、根足虫（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）上綱、葉状仮足（Ｌｏｂｏｓｅａ）綱および真正動菌（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）綱が挙げられる。
【００９３】
所定の実施形態におけるＡＣｏＳ酵素は、原核生物、例えば、次に開示する任意の原核生物などに由来してよい：本明細書の原核生物は、例えば、細菌もしくは古細菌であってよい。細菌の例としては、グラム陰性およびグラム陽性である細菌が挙げられる。細菌のさらに他の例としては、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシドアミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アフィピア（Ａｆｉｐｉａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カルジオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エリシペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ））、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ユーインゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、Ｈ．ピロリ（ｐｙｌｏｒｉ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ノルカルジア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、ノルカルジオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、ロカリマエア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルシニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、テルモアクチノミセテス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ウィークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌が挙げられる。
【００９４】
一部の実施形態では、ＡＣｏＳ酵素は、微生物性（すなわち、細菌細胞；藻類細胞などの原生生物細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ユーグレナ類細胞；ストラメノパイル類細胞；または卵菌類細胞に由来する）であると特徴付けることができる。
【００９５】
本明細書のＡＣｏＳ酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５０３８６２．１、ＸＰ＿５０３６０８．１、ＸＰ＿５０２９５９．１、ＡＪＴ７１７３４．１、ＮＰ＿０１４９６２．３、ＡＪＵ１３２５５．１、ＮＰ＿０１０９３１．３、ＥＷＧ９１４０２．１、ＥＪＴ４２０９２．１、ＮＰ＿００１１５３１０１．１、ＮＰ＿００１２７３６３７．１、ＸＰ＿００１１４６３６１．１、ＸＰ＿００３８２９３６５．１、ＸＰ＿００４０３３３２４．１、ＮＰ＿００１１２５６２５．１、ＸＰ＿００３２６６９５４．１、ＸＰ＿００１３６３５４７．２、ＸＰ＿００７４２２７５８．１、ＸＰ＿００２８８０２９０．１、ＮＰ＿６３１０３４．１、Ｏ１４９７５．２、ＣＡＨ２１２９５．１、ＣＡＬ２０７０９．１、ＡＥＶ１８８２７．１、ＣＥＭ５８４６６．１、ＣＢＡ２０９５４．１、ＢＡＫ２５２２４．１、ＡＩＵ３３１７５．１、ＣＢＪ５１９２８．１、ＣＡＬ９３６５０．１、ＣＡＬ０９５４４．１、ＣＥＥ０１５４８．１、ＧＡＥ３３９８８．１、ＡＡＹ８１４４１．１、ＢＡＨ８１０６４．１、ＣＣＡ８９１６６．１、ＫＪＸ８９５６９．１、ＷＰ＿０２３３０６４６９．１、ＥＡＺ５９４２８．１、ＥＦＨ７５９１６．１、ＥＦＧ６４８０３．１、ＥＦＦ１３０６６．１、ＡＩＥ６０９６８．１、ＫＪＦ３１１４８．１、ＷＰ＿０２３２９０２１１．１、ＡＧＣ４３０８３．１、ＧＡＬ０５４０８．１、ＫＧＭ６５０７９．１、ＣＥＥ０１５４９．１、ＫＤＬ７７５４９．１、ＢＡＯ７０６７８．１、ＥＰＹ５３８１０．１、ＥＥＢ０８７４０．１、ＧＡＦ１０６７７．１、ＣＣＧ４３９０４．１、ＷＰ＿０４２２６８５７８．１、ＫＧＧ８５７６９．１、ＣＮＯ８８２４１．１、ＫＫＥ７３３５７．１、ＷＰ＿００１０５５１６０．１、ＷＰ＿００３２３９４６６．１、ＷＰ＿０２８７４２３７１．１、ＷＰ＿０２７３２５３４６．１およびＫＢＡ４２６４２．１において開示されたアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＡＣｏＳアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＡＣｏＳ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＡＣｏＳ酵素は、対応する非変異ＡＣｏＳ酵素参照物質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含む可能性がある。
【００９６】
本明細書の所定の態様では、ＡＣｏＳ酵素は、配列番号４４（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＣｏＳ）、配列番号４９（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＣｏＳ）、配列番号３６（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＣｏＳ）、配列番号３３（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣｏＳ）または配列番号３４（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣｏＳ）のアミノ酸配列を含むことができる。表２および３（下記）において列挙したアミノ酸配列のいずれかを含むタンパク質は、一部の他の態様においてＡＣｏＳ酵素として有用な可能性があると考えられる。または、本明細書のＡＣｏＳ酵素は、例えば、上記のＡＣｏＳ酵素アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むことができる。そのような変異ＡＣｏＳ酵素は、対応する非変異ＡＣｏＳ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。当分野において（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＧａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：５９−６４）または下記の実施例５に開示した利用できるＡＣｏＳ酵素活性を測定する方法は、本明細書において適宜に適用することができる。
【００９７】
所定の実施形態では、本明細書のＡＣｏＳ酵素は、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性およびクマロイル−ＣｏＡシンテターゼ活性の両方を有する。本明細書に開示したそのようなＡＣｏＳ酵素の例は、配列番号４４もしくは４９と少なくとも９０％同一である１つのアミノ酸配列を含む。
【００９８】
本明細書の組換え細胞は、任意選択的に、少なくとも１つのアップレギュレートされたＡＣｏＳ酵素を含む工学的ＬＣＤＡ生成経路を含むと特徴付けることができる。一部の態様における工学的ＬＣＤＡ生成経路は：（ｉ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションおよび／または（ｉｉ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションをさらに含む。これらのアップレギュレーション（［ｉ］および／または［ｉｉ］）のいずれかまたは両方はω−ヒドロキシラーゼのアップレギュレーションをもたらすと期待されている。一部の他の実施形態では、工学的ＬＣＤＡ生成経路は、（任意選択的にアップレギュレーション（［ｉ］および／または［ｉｉ］に加えて）：（ｉｉｉ）脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、（ｉｖ）脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションおよび／または（ｖ）脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００９９】
所定の実施形態における組換え細胞は、例えば、アップレギュレートされたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の両方を有することができる。または、ＣＹＰ酵素をアップレギュレートすることができる、またはＣＰＲ酵素をアップレギュレートすることができる。ＣＹＰ酵素がアップレギュレートされるが、ＣＰＲ酵素は野生型レベルで発現する実施形態では、アップレギュレートされたω−ヒドロキシラーゼ錯体は、ＣＹＰ酵素のアップレギュレーションによって生じる可能性がある。ＣＰＲ酵素がアップレギュレートされるが、ＣＹＰ酵素は野生型レベルで発現する実施形態では、アップレギュレートされたω−ヒドロキシラーゼ錯体は、ＣＰＲ酵素のアップレギュレーションによって生じる可能性がある。
【０１００】
本明細書の所定の態様におけるＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素のアップレギュレーションは、ＣＹＰ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションおよび／またはＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを通してであってよい。ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素の過剰発現をもたらすそのようなアップレギュレーションは、様々な方法の１つ以上によって実施することができる。例えば、ＣＹＰコーディングポリヌクレオチドおよび／またはＣＹＰ酵素コーディングポリヌクレオチドは、一過性または安定性のいずれかで、細胞に多コピーで提供することができる（そのようなポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列［例えば、異種プロモーター］に機能的に連結している。ポリヌクレオチド配列を多コピーで提供する工程は、ポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは５０コピー）を細胞に提供する工程によって実施できる。安定性方法で提供されるポリヌクレオチド配列は、典型的には一過性方法で提供されるポリヌクレオチド配列のコピー数と比較して少ないコピー数を有することは理解されるであろう。また別の例として、ＣＹＰ酵素コーディングポリヌクレオチド配列および／またはＣＰＲ酵素コーディングポリヌクレオチドは、それらのいずれも異種である可能性がある構成的プロモーター、強力プロモーターもしくは誘導性プロモーターへの機能的連結によってアップレギュレートすることができる。
【０１０１】
ＣＹＰ酵素コーディングポリヌクレオチド配列およびＣＰＲ酵素コーディングポリヌクレオチド配列は、所定の実施形態ではどちらもアップレギュレートされる；このアップレギュレーションは、例えば、本明細書に開示した過剰発現戦略の１つまたは組み合わせにしたがって実施することができる。例えば、個々のポリヌクレオチド（例えば、プラスミドなどのベクター）−ＣＹＰ酵素をコードするポリヌクレオチドおよびＣＰＲ酵素をコードする他のポリヌクレオチド−を使用することができる。また別の例として、各ＣＹＰおよびＣＰＲコーディング配列を含む単一ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドなどのベクター）を使用することができる；各コーディング配列は、例えば、その固有の発現カセット（例えば、プロモーター−−コーディング配列−−ターミネーター）内またはバイシストロニック発現カセット内に含まれてよい。
【０１０２】
細胞内のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素のアップレギュレーション（例えば、過剰発現）は、任意選択的に好適なコントロール細胞と比較して考察することができる。例えば、本明細書の細胞内のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素の増加したレベルは、好適なコントロール細胞内のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素の発現より少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％もしくは１０００％高いと特徴付けることができる。好適なコントロール細胞の１つの例は、アップレギュレートされたＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素発現を有するように改変される前に存在した細胞（例えば、親細胞）である。
【０１０３】
本明細書のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、例えば、細胞にとって異種である可能性がある。異種ＣＹＰ酵素（および／またはＣＰＲ酵素）の１つの例は、その中でＣＹＰ酵素（および／またはＣＰＲ酵素）がアップレギュレートされている細胞の種もしくは菌株とは異なる種もしくは菌株に由来するＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素であってよい。ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、所定の態様では、細胞にとって異種である。細胞内のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素の異種発現は、任意選択的に細胞へ異種ω−ヒドロキシラーゼ錯体を提供すると特徴付けることができる。異種ω−ヒドロキシラーゼ錯体は、異種ＣＹＰ酵素またはＣＰＲ酵素の一方または両方を含む。
【０１０４】
または、細胞内でアップレギュレートされるＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、その細胞にとって天然であってよい。天然ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、例えば、ポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションに関して上記に開示した手段のいずれかを使用して、アップレギュレートすることができる。例えば、細胞にとって天然である（プロモーター配列に機能的に連結している）この酵素をコードする各ポリヌクレオチド配列は、安定性もしくは一過性方法で細胞に提供することができる（しかしポリヌクレオチド配列の場所は、非天然部位［すなわち、異種部位］に位置するであろう）。また別の例として、ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素をコードする各ポリヌクレオチド配列は、それらが細胞のゲノム内に自然に存在するので、天然ポリヌクレオチド配列が過剰発現するように改変することができる。これは、例えば、ＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子の１つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター）を改変する工程によって実施することができる。
【０１０５】
２種、３種、４種以上のω−ヒドロキシラーゼ錯体は、任意選択的に、それぞれＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素をコードする２つ、３つ、４つ以上のセット（例えば、コピー）のポリヌクレオチド配列を提供することによって本明細書の細胞内でアップレギュレートすることができる。複数のω−ヒドロキシラーゼは、細胞に、例えば、（ｉ）同一ω−ヒドロキシラーゼを過剰発現させるためにＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＹＰ／ＣＰＲコーディング配列の２つのコピーを用いて形質転換された酵母細胞）のコピーおよび／または（ｉｉ）異なるω−ヒドロキシラーゼのＣＹＰおよび／またはＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、マウスおよび植物ω−ヒドロキシラーゼ両方の過剰発現）のセットを導入する工程によって提供することができる。一部の実施形態では、本明細書の細胞は、２つ、または少なくとも２つのアップレギュレートされたＣＹＰ−およびＣＰＲコーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＶｓＣＹＰおよびＶｓＣＰＲ）を含む。
【０１０６】
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素のどちらも本明細書の細胞内でアップレギュレートされる実施形態では、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、同一の種／起源由来であってよい。または、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、異なる種／起源由来であってよい。１つの例は、ＣＹＰ酵素が哺乳動物配列によってコードされ、ＣＰＲ酵素が植物配列によってコードされる実施形態である。また別の例は、これらの酵素の１つ（例えば、ＣＹＰ）が細胞にとって異種であり、他方の酵素（例えば、ＣＰＲ）がその細胞にとって天然である実施形態である。ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が異なる種／起源由来であるこれらの後者の実施形態のタイプでは、結果として生じるω−ヒドロキシラーゼ（起源の異なるＣＹＰおよびＣＰＲ酵素成分を含有する）は、任意選択的にキメラω−ヒドロキシラーゼ錯体であると特徴付けることができる。
【０１０７】
本明細書のＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、例えば、真核生物もしくは原核生物に由来してよい。そのような真核生物および原核生物の例は、ＡＣｏＳ酵素の誘導に関して上記に開示されている。本明細書において有用なＣＹＰ活性およびＣＰＲ活性両方を有するＣＹＰ酵素は、一部の態様では原核生物に由来することができる。一部の実施形態におけるＣＹＰ酵素および／またはＣＰＲ酵素は、微生物性であると特徴付けることができる（すなわち、細菌細胞；藻類細胞などの原生生物細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ユーグレナ類細胞；ストラメノパイル類細胞；または卵菌類細胞に由来する）。
【０１０８】
ω−ヒドロキシラーゼ錯体が同一の種もしくは菌株（例えば、マウス、ラット、ヒト、植物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、オオカラスノエンドウ、酵母、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの本明細書に開示した種／菌株のいずれか）由来のＣＹＰおよびＣＰＲ酵素成分を有する実施形態では、そのようなω−ヒドロキシラーゼ錯体は、任意選択的にその種もしくは菌株由来であると特徴付けることができる。例えば、マウスＣＹＰおよびＣＰＲ酵素成分を含むω−ヒドロキシラーゼ錯体は、任意選択的に、マウスω−ヒドロキシラーゼ錯体であると特徴付けることができる。同様に、本明細書の所定のω−ヒドロキシラーゼ錯体は、それぞれ、ラット、ヒト、植物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、オオカラスノエンドウ、酵母またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ω−ヒドロキシラーゼ錯体であると特徴付けることができる。
【０１０９】
所定の実施形態におけるＣＹＰ酵素は、特定のＣＹＰ酵素サブファミリー由来であってよい。例えば、ＣＹＰ酵素は、サブファミリーＣＹＰ４（例えば、ＣＹＰ４Ａ１およびＣＹＰ４Ａ１０などの哺乳動物ＣＹＰ４）、ＣＹＰ８６（例えば、植物ＣＹＰ８６）、ＣＹＰ９４（例えば、ＣＹＰ９４Ａ１などの植物ＣＹＰ９４）、ＣＹＰ９６（例えば、ＣＹＰ９６Ａ４などの植物ＣＹＰ９６）、ＣＹＰ５２（例えば、ＣＹＰ５２Ａ４およびＣＹＰ５２Ａ１などの酵母ＣＹＰ５２）またはＣＹＰ１０２（例えば、細菌ＣＹＰ１０２）由来であってよい。
【０１１０】
本明細書のＣＹＰ酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ３１４３５、ＢＡＡ３１４３７、ＢＡＡ３１４３９、Ｐ１６４９６、Ｐ１６１４１、Ｑ１２５８６、ＥＥＱ４３７６３、Ｐ１０６１５、Ｐ３０６０９、Ｐ３０６１０、ＡＡＯ７３９５２、ＡＡＯ７３９５３、ＡＡＯ７３９５４、ＡＡＯ７３９５５、ＡＡＯ７３９５８、ＡＡＯ７３９５９、ＮＰ＿２００６９４、ＮＭ＿１０００４２、ＮＰ＿１８２１２１、ＤＱ０９９５３８、ＡＡＤ１０２０４、Ｐ９８１８８、Ｑ９ＦＭＶ７、Ｑ９ＳＭＰ５、Ｑ９ＺＵＸ１、ＮＰ＿２０００４５、ＸＰ＿００２８６５９０７、ＮＭ＿１７５８３７、Ｐ２０８１６、ＮＰ＿７８６９３６、ＡＡＨ８１７７１、ＮＰ＿０３４１４１およびＱ０２９２８に開示されたＣＹＰアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＣＹＰアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＣＹＰ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＣＹＰ酵素は、対応する非変異ＣＹＰ酵素参照物質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいる可能性がある。
【０１１１】
本明細書の所定の態様では、ＣＹＰ酵素は、配列番号８４（Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＣＹＰ）または配列番号９４（Ｖ．サティバ（ｓａｔｉｖａ）ＣＹＰ）のアミノ酸配列を含む可能性がある。または、本明細書のＣＹＰ酵素は、例えば、上記のＣＹＰ酵素アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むことができる。そのような変異ＣＹＰ酵素は、対応する非変異ＣＹＰ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。
【０１１２】
本明細書のＣＰＲ酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７６２２６、Ｐ３７２０１、Ｘ６６０１６、Ｘ６６０１７、ＮＭ＿００８８９８、Ｍ１２５１６およびＺ２６２５２に開示されたＣＰＲアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＣＰＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＣＰＲ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＣＰＲ酵素は、対応する非変異ＣＰＲ酵素参照物質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいる可能性がある。
【０１１３】
本明細書の所定の態様では、ＣＰＲ酵素は、配列番号８６（Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＣＰＲ）または配列番号９６（Ｖ．サティバ（ｓａｔｉｖａ）ＣＰＲ）のアミノ酸配列を含む可能性がある。または、本明細書のＣＰＲ酵素は、例えば、上記のＣＰＲ酵素アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むことができる。そのような変異ＣＰＲ酵素は、対応する非変異ＣＰＲ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。
【０１１４】
本明細書の一部の態様における組換え細胞は、（１）脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ酵素）のアップレギュレーションおよび／または（２）脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＨ酵素）のアップレギュレーションおよび／または（３）脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ酵素）のアップレギュレーションを含むことができる。ＦＡＯおよび／またはＦＡＤＨのアップレギュレーションは、長鎖脂肪酸ω酸化の経路におけるω−ヒドロキシ脂肪酸からω−アルド脂肪酸へのアップレギュレートされた転換を提供する（図１および２）。ＦＡＬＤＨのアップレギュレーションは、長鎖脂肪酸ω酸化の経路におけるω−アルド脂肪酸からＬＣＤＡへのアップレギュレートされた転換を提供する（図１および２）。
【０１１５】
本明細書の組換え細胞内でのＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素のアップレギュレーションは、例えば下記の通りであってよい：
（ｉ）少なくとも１つのＦＡＯ酵素がアップレギュレートされる、
（ｉｉ）少なくとも１つのＦＡＤＨ酵素がアップレギュレートされる、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＦＡＬＤＨ酵素がアップレギュレートされる、
（ｉｖ）少なくとも１つのＦＡＯおよび少なくとも１つのＦＡＤＨ酵素がアップレギュレートされる、
（ｖ）少なくとも１つのＦＡＯおよび少なくとも１つのＦＡＬＤＨ酵素がアップレギュレートされる、
（ｖｉ）少なくとも１つのＦＡＤＨおよび少なくとも１つのＦＡＬＤＨ酵素がアップレギュレートされる、または
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＦＡＯ、少なくとも１つのＦＡＤＨおよび少なくとも１つのＦＡＬＤＨ酵素がアップレギュレートされる。
【０１１６】
本明細書の所定の態様におけるＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素のアップレギュレーションは、（１）ＦＡＯ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、（２）ＦＡＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、および／または（３）ＦＡＬＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを通してでよい。ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素の過剰発現をもたらすそのようなアップレギュレーションは、１つ以上の様々な方法によって実施することができる。例えば、ＦＡＯ−、ＦＡＤＨ−および／またはＦＡＬＤＨ−コーディングポリヌクレオチドは、一過性または安定性のいずれかで、細胞に多コピーで提供することができる（そのようなポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列［例えば、異種プロモーター］に機能的に連結している。ポリヌクレオチド配列を多コピーで提供する工程は、ポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは５０コピー）を細胞に提供する工程によって実施できる。また別の例として、ＦＡＯ−、ＦＡＤＨ−および／またはＦＡＬＤＨ−コーディングポリヌクレオチド配列は、それらのいずれも異種である可能性がある構成的プロモーターもしくは強力プロモーターへの機能的連結によってアップレギュレートすることができる。上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）に列挙したＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素のアップレギュレーションのいずれもポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションによってでよい。
【０１１７】
ポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションは、例えば、本明細書に開示した過剰発現戦略の１つまたは組み合わせにしたがって実施することができる。例えば、ＦＡＯ、ＦＡＤＨまたはＦＡＬＤＨ酵素をコードする個別ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドなどのベクター）が使用されてよい。また別の例として、２つ以上のＦＡＯ、ＦＡＤＨまたはＦＡＬＤＨコーディング配列を含む単一ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドなどのベクター）が使用されてよい；各コーディング配列は、例えば、その固有の発現カセット（例えば、プロモーター−−コーディング配列−−ターミネーター）内またはバイシストロニック発現カセット内に含まれてよい。
【０１１８】
本明細書の細胞内のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素のアップレギュレーション（例えば、過剰発現）は、任意選択的に好適なコントロール細胞と比較して考察することができる。例えば、本明細書の細胞内のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素の増加したレベルは、好適なコントロール細胞内のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素の発現より少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％もしくは１０００％高いと特徴付けることができる。好適なコントロール細胞の１つの例は、アップレギュレートされたＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素発現を有するように改変される前に存在した細胞（例えば、親細胞）である。
【０１１９】
ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、例えば、細胞にとって異種であってよい。異種ＦＡＯ、ＦＡＤＨまたはＦＡＬＤＨ酵素の１つの例は、その中でＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素がアップレギュレートされている細胞の種もしくは菌株とは異なる種もしくは菌株に由来する異種ＦＡＯ、ＦＡＤＨまたはＦＡＬＤＨ酵素であってよい。ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよびＦＡＬＤＨ酵素のうちの少なくとも１つ、２つまたは全部は、所定の態様（例えば、上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）に列挙したアップレギュレーションのいずれか）における細胞にとって異種である。
【０１２０】
または、細胞内でアップレギュレートされるＦＡＯ、ＦＡＤＨおよびＦＡＬＤＨ酵素は、その細胞にとって天然であってよい。天然ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよびＦＡＬＤＨ酵素は、例えば、ポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションに関して上記で開示した任意の手段を使用してアップレギュレートすることができる。例えば、細胞にとって天然である（プロモーター配列［例えば、異種プロモーター］に機能的に連結している）これらの酵素をコードする各ポリヌクレオチド配列は、安定性もしくは一過性方法で細胞に提供することができる（しかしポリヌクレオチド配列の場所は、非天然部位［すなわち、異種部位］に位置するであろう）。また別の例として、ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素をコードする各ポリヌクレオチド配列は、それらが細胞のゲノム内に自然に存在するので、天然ポリヌクレオチド配列が過剰発現するように改変することができる。これは、例えば、ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子の１つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター）を改変する工程によって実施することができる。
【０１２１】
１種、２種、３種、４種以上のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、任意選択的に、それぞれＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素をコードする１つ、２つ、３つ、４つ以上のセット（例えば、コピー）のポリヌクレオチド配列を提供することによって本明細書の細胞内でアップレギュレートすることができる。複数のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、細胞に、例えば、（ｉ）同の一ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素を過剰発現させるためにＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素の２つのコピーを用いて形質転換された細胞）のコピーおよび／または（ｉｉ）異なるＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、マウスＦＡＯおよび植物ＦＡＯ両方の過剰発現）のセットを導入する工程によって提供することができる。一部の実施形態では、本明細書の細胞は、３つ、または少なくとも３つの異なるアップレギュレートされたＦＡＯコーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｔＦＡＯ１Ｍ、ＣｃＦＡＯ１およびＣｃＦＡＯ２）を含む。
【０１２２】
本明細書のＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、例えば、真核生物もしくは原核生物に由来してよい。そのような真核生物および原核生物の例は、ＡＣｏＳ酵素の誘導に関して上記に開示されている。一部の実施形態におけるＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、微生物性であると特徴付けることができる（すなわち、細菌細胞；藻類細胞などの原生生物細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ユーグレナ類細胞；ストラメノパイル類細胞；または卵菌類細胞に由来する）。
【０１２３】
ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素は、特定の酵素ファミリーもしくはサブファミリー由来であってよい。例えば、ＦＡＯ酵素は、ＦＡＯ１、ＦＡＯ２、ＦＡＯ３もしくはＦＡＯ４酵素であってよい。ＦＡＤＨ酵素は、例えば、ＡＤＨ、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＦＡＤＨ１、ＦＡＤＨ２もしくはＦＡＤＨ３酵素であってよい。ＦＡＬＤＨ酵素は、例えば、ＦＡＬＤＨ１、ＦＡＬＤＨ２、ＦＡＬＤＨ３もしくはＦＡＬＤＨ４酵素であってよい。
【０１２４】
本明細書のＦＡＯ酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１３８９３８２、ＸＰ＿００２８６７９４３、Ｑ９ＺＷＢ９、ＣＡＡ１８６２５、ＡＥＥ７６７６２．１、ＡＥＥ８４１７４、ＡＥＥ８５５０８、ＸＰ＿００７１５８０８３、ＸＰ＿００７１３２９２６、ＸＰ＿００３５４００２１、ＸＰ＿００３５５４２９５、ＸＰ＿００３５３４３３８、ＸＰ＿００９１０２６２１、ＥＡＫ９３１９９、ＣＡＢ７５３５１、ＣＡＢ７５３５２、ＸＰ＿００２４２２２３６、ＣＣＧ２３２９１、ＣＣＧ２３２９３、ＣＣＥ４２７９９、ＣＣＥ４２８００、ＡＡＳ４６８７８、ＡＡＳ４６８７９、ＡＡＳ４６８８０、ＣＡＢ７５３５３、ＥＧＶ６１３５７、ＸＰ＿４５９５０６、ＥＦＸ０４１８５、ＪＸ８７９７７６、ＸＰ＿００１５２５３６１、ＣＡＰ１５７６２．１、ＫＥＨ２３９５０、ＥＧＷ３３９４１およびＸＰ＿００１３８６０８７に開示されたアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＦＡＯアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＦＡＯ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＦＡＯ酵素は、対応する非変異ＦＡＯ酵素参照物質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいてよい。
【０１２５】
本明細書の所定の態様では、ＦＡＯ酵素は、配列番号１００（Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＦＡＯ）、配列番号１０２（Ｃ．クロアカエ（ｃｌｏａｃａｅ）ＦＡＯ）または配列番号１０４（Ｃ．クロアカエ（ｃｌｏａｃａｅ）ＦＡＯ）のアミノ酸配列を含む可能性がある。または、本明細書のＦＡＯ酵素は、例えば、上記のＦＡＯ酵素アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むことができる。そのような変異ＦＡＯ酵素は、対応する非変異ＦＡＯ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。
【０１２６】
本明細書のＦＡＤＨ（ＡＤＨ）酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８２６２５、ＥＥＱ４６５１６、ＥＥＱ４２３８３、ＸＭ＿７１２５５６、ＢＡＤ１２４８２、ＣＤ３６＿０７８５０、ＡＢＤ６００８４、ＡＢＤ６００８４、ＸＰ＿００２６１９０１２、ＡＤＭ０８００５、ＡＤＭ０８００８、ＸＰ＿００３８７０５２３、ＡＦＤ２９１８５、ＸＰ＿００６６８３７４５、ＸＰ＿００２５４６６３５、ＸＰ−００２５５０８２９、ＧＵ０５６２８２、ＧＵ０５６２８３、ＧＵ０５６２８６、ＧＵ０５６２８７、ＸＰ＿４６０５３７、ＷＰ＿０２４１７３６０７、ＡＨＣ５３９８７、ＡＡＰ５１０４０、ＸＰ＿００１５２４９７４、ＡＡＰ５１０４７、ＡＡＰ５１０４８、ＡＡＰ５１０４９、ＸＰ＿００１４８５６１０、ＥＳＷ９５８８１、ＡＦＨ３５１３６、ＫＧＫ４０２７７、ＥＪＳ４４１２１、ＡＡＰ５１０４３、ＥＨＮ００６９３、ＥＪＴ４３５８８、ＸＰ＿００７３７７１６３、ＡＧＯ１００７４、ＣＡＡ７３６９０、ＸＰ＿００１３８２９２２、ＸＰ＿００３６８６５９５、ＸＰ＿００１６４２９３９、ＣＣＨ４１２２７、ＸＰ＿５０３２８２、Ｆ２Ｚ６７８、ＸＰ＿５００１２７、ＸＰ＿５０００８７およびＸＰ＿５０３６７２に開示されたアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＦＡＤＨ（ＡＤＨ）酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＦＡＤＨ（ＡＤＨ）酵素は、対応する非変異ＦＡＤＨ（ＡＤＨ）酵素参照物質と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいてよい。
【０１２７】
本明細書のＦＡＬＤＨ酵素のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿７１９０２８、ＫＧＱ８４５０８、ＫＧＱ９８４４４、ＸＰ＿００２４２１４０１、ＥＭＧ４６５９４、ＥＭＧ４７６７５、ＸＰ＿００３８６８１９３、ＸＰ＿００２５５０１７３、ＸＰ＿００２５５０７１２、ＸＰ＿５０５８０２、ＸＰ＿５００３８０、ＸＰ＿５０３９８１、ＢＡＰ８２４５７、ＸＰ＿５００１７９およびＣＣＨ４１１３６に開示されたアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＦＡＬＤＨアミノ酸配列のいずれかの変異体を使用することができるが、対応する非変異ＦＡＬＤＨ酵素参照物質の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。そのような変異ＦＡＬＤＨ酵素は、対応する非変異ＦＡＬＤＨ酵素参照物質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいてよい。
【０１２８】
本明細書の所定の態様では、ＦＡＬＤＨ酵素は、配列番号９１（Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＦＡＬＤＨ）のアミノ酸配列、または配列番号９１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含んでいてよい。そのような変異ＦＡＬＤＨ酵素は、配列番号９１のＦＡＬＤＨ酵素の酵素活性の一部（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部の酵素活性（上記の定義を参照されたい）を有しているはずである。
【０１２９】
一部の実施形態では、組換え細胞は、ペルオキシソーム生物発生因子（Ｐｅｘタンパク質）のダウンレギュレーションを含む可能性がある。例えば、組換え細胞は、ペルオキシソーム生物発生因子３（Ｐｅｘ３タンパク質）をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションを含む可能性がある。任意の特定の理論もしくは機序に固執することは意図していないが、Ｐｅｘタンパク質のダウンレギュレーションが正常ペルオキシソーム機能（例えば、ペルオキシソーム膜機能）を損傷させることによって組換え細胞内の遮断もしくは減少したレベルのβ酸化を生じさせることは企図されている。遮断もしくは減少したレベルのβ酸化は、脂肪酸がＬＣＤＡ合成のための基質として機能するω酸化経路へ脂肪酸を向け直すことを生じさせることは企図されている（図１および２を参照されたい）。所定の実施形態では、次のＰｅｘタンパク質：Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様およびＰｅｘ２６ｐの１つ以上の発現は、ダウンレギュレートすることができる。
【０１３０】
例えばＰｅｘ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることなどによってダウンレギュレートすることができるＰｅｘ３タンパク質の例は、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ７８５６５（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、本明細書では配列番号１０７としても開示されている）、ＮＰ＿０１０６１６．３（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８）、ＡＨＹ７５３０３．１（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＭ９９３）、ＥＷＨ１９０３３．１（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｐ２８３）、ＥＷＧ９６６２４．１（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ１０３）、ＥＷＧ８７３４４．１（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ００８）、ＥＧＡ７５５４６．１（Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＷＲＩ７９６）、ＣＡＢ１０１４１（Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ））、ＥＫＤ００３７７．１（トリコスポロン・アサヒイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ））、ＡＡＣ４９４７１（ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ＸＰ＿５６９７５１．１（クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、ＸＰ＿００３１９３１３３．１（クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ））、ＸＰ＿７１３８７１．１（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、ＣＣＧ２１１６８．１（カンジダ・オルトプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ））、ＣＡＸ４４９９８．１（カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ））、ＣＣＡ３９０６６．１（コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、Ｑ６ＢＫ００．１（デバリョミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ））、Ｏ９４２２７．１（クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））、Ｑ０１４９７．１（オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ））、ＡＢＮ６７６９９．２（シェフェルソミセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ））、ＡＡＳ５２２１７．１（アシュビヤ・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ））およびＣＣＨ４４０６１．１（ウィッカーハモミセス・シフェリイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ））に開示されている。これらのＰｅｘ３タンパク質がＰｅｘ３タンパク質を発現する各細胞内でのダウンレギュレーションの標的とされることは理解されるであろう（例えば、Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｐｅｘ３タンパク質はＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内でダウンレギュレートされるであろう）。
【０１３１】
例えば、上記のＰｅｘ３タンパク質のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＰｅｘ３タンパク質は、他の実施形態において細胞内でダウンレギュレートすることができる。例えば、配列番号１０７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＰｅｘ３タンパク質を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは任意の他のタイプの本明細書の酵母細胞は、そのようなＰｅｘ３タンパク質のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。
【０１３２】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞を用いるなどの一部の実施形態では、ダウンレギュレートされた内因性ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０７と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＰｅｘ３タンパク質をコードする可能性がある。所定の他の実施形態では、Ｐｅｘ３タンパク質をコードするダウンレギュレートされた内因性ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
Ｐｅｘ３などのＰｅｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、本明細書の所定の態様におけるポリヌクレオチド配列の突然変異に起因する可能性がある。そのような突然変異は、例えば、置換、欠失または挿入であってよい。
【０１３４】
欠失は、（ｉ）Ｐｅｘタンパク質（すなわち、ＰＥＸオープンリーディングフレーム）をコードするオープンリーディングフレーム由来の１つ以上のヌクレオチドおよび／または（ｉｉ）例えば、Ｐｅｘタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’末端の５００もしくは１０００塩基対内に位置する非タンパク質コーディング配列の１つ以上のヌクレオチドを除去することができる。所定の実施形態における挿入は、（ｉ）Ｐｅｘタンパク質をコードするオープンリーディングフレームまたは（ｉｉ）Ｐｅｘタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’末端の５００もしくは１０００塩基対内に位置する非タンパク質コーディング配列内で発生する可能性がある。他のタイプの突然変異もまた、さらに、所望であればＰｅｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートするために使用できる。例えば、単一ヌクレオチドを他のヌクレオチドと交換する（すなわち、ヌクレオチド置換）１つ以上の点突然変異は、適宜に使用することができる。
【０１３５】
実施例６では、Ｐｅｘ３タンパク質をコードするＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の内因性ポリヌクレオチド配列を欠失させることを開示する。この研究の１つの態様では、ＰＥＸ３オープンリーディングフレームは、相同性組換えに基づくターゲティングによって除去され、適切なドナーＤＮＡを使用してＵＲＡ３カセットと置換された。この置換は、ＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３カセットに隣接する５’−および３’−非コーディングＰＥＸ３相同性アーム配列（それぞれ１００ｂｐ）の部分を含む配列番号７１を含むダウンレギュレート（破壊またはノックアウト）された配列を提供した。この研究のまた別の態様は、配列番号７２を含む配列をダウンレギュレート（破壊またはノックアウト）させるためにＣｒｅリコンビナーゼ（１つのＬｏｘＰ配列を残して、ＬｏｘＰ配列間の組換えを刺激した）を発現させることによってＵＲＡ３カセットを除去することを含んでいた。配列番号７２は、１つのＬｏｘＰ配列を隣接する５’−および３’−非コーディングＰＥＸ３相同性アーム配列（それぞれ１００ｂｐ）の部分を含む。したがって、本明細書の所定の実施形態は、Ｐｅｘ３タンパク質をコードするダウンレギュレートされた内因性ポリヌクレオチド配列を含む組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母細胞に関するが、ここでこのダウンレギュレーションは、Ｐｅｘ３タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列の破壊（ノックアウト）に起因する；この破壊（ノックアウト）は、配列番号７１もしくは７２、または配列番号７１もしくは７２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１３６】
コドンによってコードされたアミノ酸を変化させないＰＥＸオープンリーディングフレームのコドンにおける突然変異（すなわち、サイレント突然変異）は、典型的には、本明細書に記載したＰＥＸポリヌクレオチドをダウンレギュレートする突然変異ではない。さらに典型的には、Ｐｅｘタンパク質の野生型機能を変化させない関連アミノ酸へのコドンによってコードされるアミノ酸を変化させる突然変異（例えば、保存的突然変異）でもない。所定の実施形態における関連アミノ酸は、構造および／または電荷を共有する側基を有する、および次の：脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、ヒドロキシル基含有（セリン、トレオニン）、硫黄基含有（システイン、メチオニン）、カルボン酸基含有（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、アミド基含有（アスパラギン、グルタミン）およびアミノ基含有（ヒスチジン、リシン、アルギニン）のように分類することができる。しかし、ＰＥＸポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を（例えば、トランス活性化転写および／または翻訳因子を阻害することによって）ダウンレギュレートするそのような突然変異（サイレント突然変異または保存的突然変異）のいずれも、典型的には本明細書ではＰＥＸポリヌクレオチドをダウンレギュレートする突然変異であると見なされる。
【０１３７】
当業者であれば、Ｐｅｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列への本明細書に開示した突然変異のいずれかは、好適なコントロール細胞中の対応する内因性Ｐｅｘタンパク質をコードする配列を参照することによってダウンレギュレーション突然変異を構成すると決定できることは理解されるであろう。例えば、改変細胞内のＰＥＸポリヌクレオチド配列は、それに改変細胞が由来した対応細胞（例えば、親細胞）の内因性の対応するＰＥＸポリヌクレオチド配列と比較することができる。
【０１３８】
所定の実施形態におけるＰｅｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内での対応するＰｅｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と比較して、内因性ポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳における少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少である。他の実施形態では、Ｐｅｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内の対応するＰｅｘタンパク質の機能と比較して、コードされたＰｅｘタンパク質の機能（例えば、タンパク質局在化および／または活性）の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少によって反映される。
【０１３９】
任意の特定の理論もしくは機序に固執することは意図していないが、本明細書の組換え細胞内のＰｅｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションが、正常ペルオキシソーム機能（例えば、ペルオキシソーム膜機能）を損傷させることによって組換え細胞内の遮断もしくは減少したレベルのβ酸化を生じさせることは企図されている。β酸化は、ダウンレギュレートされたＰｅｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列含む細胞内で、例えば、（主題ダウンレギュレーションを有していない親細胞などの好適なコントロール細胞と比較して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％減少させることができる。
【０１４０】
本明細書の所定の態様では、Ｐｅｘタンパク質（例えば、配列番号１０７）をコードするが、Ｐｅｘ１０タンパク質（例えば、配列番号１０８）もＰｅｘ１６タンパク質（例えば、配列番号１０９）もコードしないポリヌクレオチドをダウンレギュレートする工程は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上のＬＣＤＡ生成物を生成できる組換え酵母細胞（例えば、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、実施例１４を参照されたい）を調製するために好適である。したがって、一部の実施形態における酵母細胞は、ダウンレギュレートされたＰｅｘ１０タンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｐｅｘ１６タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはダウンレギュレートされた、Ｐｅｘ−１、−２、−４、−５、−６、−７、−８、−１２、−１３、−１４、−１５、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２または−２６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない。本明細書のＰｅｘ１０タンパク質もしくはＰｅｘ１６タンパク質の例は、それぞれ配列番号１０８もしくは配列番号１０９、または配列番号１０８もしくは配列番号１０９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
Ｐｅｘ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、一部の実施形態では、ＬＣＤＡ生成物を生成するために組換え酵母細胞にとって必要である、ペルオキシソームタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にとっての唯一の改変である可能性がある。実際に、下記の実施例１４は、ダウンレギュレートされたＰＥＸ３ポリヌクレオチドだけを含み、ペルオキシソーム機能（例えば、ペルオキシソーム発生および／または維持；ペルオキシソーム内で発生するβ酸化などの代謝経路）に直接含まれる任意の他のタンパク質のダウンレギュレーションを含まない組換え酵母が脂肪酸含有基質からＬＣＤＡを生成できることを証明している。したがって、本明細書に開示した所定の実施形態は、ダウンレギュレートされたＰＥＸ３ポリヌクレオチドがペルオキシソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドにとっての唯一の改変である組換え酵母細胞に関する。
【０１４２】
所定の態様におけるペルオキシソームタンパク質は、Ｐｅｘタンパク質（例えば、Ｐｅｘ−１、−２、−４、−５、−６、−７、−８、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２および／または−２６タンパク質）などのペルオキシソーム構造／機能を発生および／または維持する際に重要な役割を果たすペルオキシソームタンパク質であってよい。本明細書のペルオキシソームタンパク質のまた別の例は、例えばβ酸化などのペルオキシソーム内で実施される代謝活性において重要な役割を果たすペルオキシソームタンパク質である。β酸化に含まれるペルオキシソームタンパク質の例としては、Ｐｏｘタンパク質（例えば、Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５、−６）が挙げられる。本明細書の一部の態様における酵母細胞は、Ｐｅｘ３以外のＰｅｘタンパク質のダウンレギュレートされた発現および／またはＰｏｘタンパク質のダウンレギュレートされた発現を有していない。一部の他の態様では、酵母細胞は、（ｉ）Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５および−６タンパク質；（ｉｉ）Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４および−５タンパク質；（ｉｉｉ）Ｐｏｘ−２、−３、−４および−５タンパク質；（ｉｖ）Ｐｏｘ−２、−３および−５タンパク質；または（ｖ）Ｐｏｘ−４および−５タンパク質のダウンレギュレートされた発現を有していない。
【０１４３】
Ｐｅｘ３タンパク質は、本明細書の組換え酵母細胞内でのダウンレギュレーションのための唯一のＰｅｘタンパク質であることは企図されているが、１つ以上の追加のＰｅｘタンパク質が任意選択的にダウンレギュレートされてもよい。本明細書に列挙したＰｅｘタンパク質のいずれかをダウンレギュレートすることができる；そのような他のＰｅｘタンパク質の特定の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１１７２５３号明細書の表４に列挙されている。例えば、Ｐｅｘ１０および／またはＰｅｘ１６タンパク質は、Ｐｅｘ３タンパク質をダウンレギュレートすることに加えてダウンレギュレートすることができる。
【０１４４】
本明細書に開示した組換え細胞は、一部の実施形態では、ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（Ｐｏｘタンパク質）をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションを含む可能性がある。例えば、Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５または−６は、ダウンレギュレーションのために好適な可能性がある。これらのＰｏｘタンパク質のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つまたはそれらの任意の組み合わせをダウンレギュレートする工程は、所望に応じて使用することができる。本明細書のダウンレギュレーションのためのＰｏｘタンパク質の組み合わせの例としては：（ｉ）Ｐｏｘ−２、−３、−４；（ｉｉ）Ｐｏｘ−２、−３、−４、−５；（ｉｉｉ）Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５；（ｉｖ）Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４、−５、−６；（ｖ）Ｐｏｘ−１、−２、−３、−４；および（ｖｉ）Ｐｏｘ−２、−３、−４、−５、−６が挙げられる。追加の例として、組換え細胞は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ−２、−３および／または−４酵素のダウンレギュレーションを含むことができる。本明細書の１つ以上のＰｏｘタンパク質のダウンレギュレーションは、例えば、Ｐｅｘ３タンパク質の発現をダウンレギュレートするために有用である本明細書に開示した戦略（例えば、欠失、挿入、他のタイプの突然変異）のいずれかを使用して実施できる。さらに、そのようなダウンレギュレーションのレベルおよびダウンレギュレーションが決定される方法は、Ｐｅｘ３タンパク質の発現のダウンレギュレーションに関して上記に開示した関連する実施形態にしたがうことができる。組換え細胞は、任意選択的に、一部の態様ではＰｏｘタンパク質のダウンレギュレーションを含まない。
【０１４５】
上述したＰｏｘタンパク質のいずれかは、例えば、本明細書では１つ以上のＰｏｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることによってでよい。所定の実施形態におけるＰｏｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内での対応するＰｏｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と比較して、内因性ポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少である。他の実施形態では、Ｐｏｘタンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内の対応するＰｏｘタンパク質の機能と比較して、コードされたＰｏｘタンパク質の機能（例えば、タンパク質局在化および／または活性）の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少によって反映される。
【０１４６】
Ｐｏｘ４タンパク質などのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることなどによって本明細書でダウンレギュレートできるＰｏｘ４タンパク質の例は、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ８００７８（本明細書では配列番号１１１としても開示されているＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ０６５９８（カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、Ｐ０５３３５（カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ））、ＫＨＣ５２０４０（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、ＥＩＦ４６６１３（ブレッタノミセス・ブルクセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ））、ＸＰ＿００７３７６２２５（スパサスポラ・パッサリダルム（Ｓｐａｔｈａｓｐｏｒａ  ｐａｓｓａｌｉｄａｒｕｍ））、ＸＰ＿００１５２６３７３（ロッデロミセス・エロンジスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ））、ＸＰ＿００１３８７０４２（シェフェルソミセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ））、ＸＰ＿０１１２７６９７２（ウィッカーハモミセス・シフェリイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ））およびＥＮＨ６６７０３（フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））が含まれる。これらのＰｏｘ４タンパク質がＰｏｘ４タンパク質を発現する各細胞内でのダウンレギュレーションの標的とされることは理解されるであろう（例えば、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｐｏｘ４タンパク質はＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）内でダウンレギュレートされるであろう）。
【０１４７】
上記のＰｏｘ４タンパク質のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含み、Ｐｏｘ４活性を有する、Ｐｏｘ４タンパク質は、所定の実施形態において細胞内でダウンレギュレートすることができる。例えば、配列番号１１１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＰｏｘ４タンパク質を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＰｏｘ４タンパク質のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。
【０１４８】
実施例６では、Ｐｏｘ４タンパク質をコードするＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の内因性ポリヌクレオチド配列を欠失させることを開示する。本研究の１つの態様では、ＰＯＸ４オープンリーディングフレームは、相同性組換えに基づくターゲティングによって除去した。このターゲティングは、５’および３’ＰＯＸ４相同性アーム配列の所定の部分を含む配列番号７４を含むダウンレギュレート（破壊またはノックアウト）された配列を提供した。詳細には、配列番号７４の塩基位置１〜４５５位および４６４〜９５７位は、それぞれ所定の５’および３’ＰＯＸ４遺伝子配列と対応する。したがって、本明細書の所定の実施形態は、Ｐｏｘ４タンパク質をコードするダウンレギュレートされた内因性ポリヌクレオチド配列を含む組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母細胞に関するが、ここでこのダウンレギュレーションは、Ｐｏｘ４タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列の破壊（ノックアウト）に起因する；この破壊（ノックアウト）は、配列番号７４、または配列番号７４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
Ｐｏｘ２タンパク質などのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることなどによって本明細書でダウンレギュレートすることができるＰｏｘ２タンパク質の例としては、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ００４６８．１（カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ））、Ｐ１１３５６．３（カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、Ｏ７４９３５．１（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、本明細書では配列番号７９としても開示されている）、ＣＣＡ３７４５９．１（コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ＣＡＸ４２７０７．１（カンジタ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ））およびＸＰ＿７２１６１３．１（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））が挙げられる。これらのＰｏｘ２タンパク質がＰｏｘ２タンパク質を発現する各細胞内でのダウンレギュレーションの標的とされることは理解されるであろう。
【０１５０】
上記のＰｏｘ２タンパク質のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、およびＰｏｘ２活性を有するアミノ酸配列を含むＰｏｘ２タンパク質は、所定の実施形態において細胞内でダウンレギュレートすることができる。例えば、配列番号７９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＰｏｘ２タンパク質を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＰｏｘ２タンパク質のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。
【０１５１】
本明細書のＰｏｘ３タンパク質などをコードするポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることなどによって本明細書でダウンレギュレートすることができるＰｏｘ３タンパク質の例は、配列番号８１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
組換え細胞は、本開示の所定の態様において減少した脂質（油）合成および／または貯蔵能力を有する可能性がある。脂質合成および／または貯蔵能力は、例えば、（親細胞などの好適なコントロール細胞と比較して）少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％減少させることができる。細胞内の減少した脂質合成および／または貯蔵能力は、例えば細胞脂質含量のクロマトグラフィー分析（例えば、ガスクロマトグラフィー）および／または所定の視覚的分析（例えば、脂肪体の顕微鏡評価）などの当分野において公知の任意の多数の手段を使用して決定することができる。
【０１５３】
減少した脂質合成および／または貯蔵能力を備える組換え細胞は、例えば、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとして測定した全脂質の約５０％、２５％、１０％、５％、４％、３％、２．５％、２．０％、１．５％もしくは１．０％未満を有する可能性がある。
【０１５４】
ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に変換させる内因性活性は、一部の実施形態では、脂質合成および／または貯蔵能力を減少させるために減少させることができる。これは、ＴＡＧが一般に細胞内の主要脂質貯蔵分子を表すことを反映している。ＴＡＧ合成を減少させる例は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする少なくとも１つの内因性ポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることによってでよい。ダウンレギュレーションのための本明細書のＤＧＡＴの例としては、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２が挙げられる。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の一方または両方は、本明細書の一部の態様においてダウンレギュレートすることができる。ＤＧＡＴ１および／またはＤＧＡＴ２のダウンレギュレーションは、例えば、Ｐｅｘ３タンパク質の発現をダウンレギュレートするために有用である本明細書に開示した戦略（例えば、欠失、挿入、他のタイプの突然変異）のいずれかを使用して実施できる。さらに、そのようなダウンレギュレーションのレベルおよびダウンレギュレーションが決定される方法は、Ｐｅｘ３タンパク質の発現のダウンレギュレーションに関して上記に開示した関連する実施形態にしたがうことができる。
【０１５５】
本明細書でダウンレギュレートすることのできるＤＧＡＴ１酵素の例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１酵素を表す配列番号１１３である。配列番号１１３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である１つのアミノ酸配列を含むＤＧＡＴ１酵素を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＤＧＡＴ１酵素のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。また別の例として、配列番号１１３のＤＧＡＴ１の少なくとも約８０％、９０％、９５％もしくは１００％の活性を有する酵素を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＤＧＡＴ１酵素のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。
【０１５６】
本明細書でダウンレギュレートすることのできるＤＧＡＴ２酵素の例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２酵素を表す配列番号１１５である。配列番号１１５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＤＧＡＴ２酵素を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＤＧＡＴ２酵素のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。また別の例として、配列番号１１５のＤＧＡＴ２の少なくとも約８０％、９０％、９５％もしくは１００％の活性を有する酵素を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞もしくは本明細書の任意の他のタイプの細胞は、そのようなＤＧＡＴ２酵素のダウンレギュレートされた発現を有するように改変することができる。
【０１５７】
本明細書のＤＧＡＴ酵素は、例えば、１つ以上のＤＧＡＴコーディングポリヌクレオチド配列をダウンレギュレートすることによってダウンレギュレートすることができる。所定の実施形態におけるＤＧＡＴをコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内での対応するＤＧＡＴをコードするポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と比較して、内因性ポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少である。他の実施形態では、ＤＧＡＴをコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションは、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）内の対応するＤＧＡＴタンパク質の機能と比較して、コードされたＤＧＡＴの機能（例えば、タンパク質局在化および／または活性）の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の減少によって反映される。
【０１５８】
他のタイプのアシルトランスフェラーゼは、所望であれば、脂質合成および／または貯蔵能力における減少をもたらすために、本明細書の組換え細胞内でダウンレギュレートすることができる。そのようなダウンレギュレーションは、ＤＧＡＴ１および／またはＤＧＡＴ２酵素をダウンレギュレートすることとは無関係であってよい、またはそれに追加してでもよい。任意選択的にダウンレギュレーションの標的にすることのできる他のアシルトランスフェラーゼには、どちらも、一般に、リン脂質およびＤＡＧからリソリン脂質およびＴＡＧへの変換を触媒することができるレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４３；ホスファチジルコリン−ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼとも呼ばれる）およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ、ＥＣ２．３．１．１５８）が含まれる。
【０１５９】
本明細書の組換え微生物細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原核細胞、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞または卵菌細胞を意味することができる。本明細書の原核細胞は、例えば、細菌細胞または古細菌細胞を意味することができる。酵母細胞は、本明細書に開示した任意の酵母であってよい。例えば、酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属（例えば、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えば、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｄ．ハンセニイ（ｈａｎｓｅｎｉｉ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ））またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えば、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ））酵母種であってよい。
【０１６０】
本明細書中の真菌細胞は、酵母（例えば、下記）または糸状菌などの任意の他の真菌型であってよい。例えば、本明細書の真菌は、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）もしくは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌であってよい。本明細書中の糸状菌の例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属（例えば、Ｔ．リーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ））、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、Ｎ．クラッサ（ｃｒａｓｓａ）、Ｎ．シトフィラ（ｓｉｔｏｐｈｉｌａ））、クリホネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えば、Ｃ．パラシチカ（ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（例えば、Ａ．プルランス（ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、Ｐ．ビライアエ（ｂｉｌａｉａｅ）、Ｐ．カメムベルチ（ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、Ｐ．カンディヅム（ｃａｎｄｉｄｕｍ）、Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｐ．エクスパンスム（ｅｘｐａｎｓｕｍ）、Ｐ．フニクロスム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、Ｐ．グラウクム（ｇｌａｕｃｕｍ）、Ｐ．マルネフェイ（ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、Ｐ．ロケフォルチ（ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、Ｐ．ベルコスム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｐ．ビリジカツム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、Ｇ．アクミナタ（ａｃｕｍｉｎａｔａ）、Ｇ．アベナセア（ａｖｅｎａｃｅａ）、Ｇ．バッカータ（ｂａｃｃａｔａ）、Ｇ．シルシナタ（ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、Ｇ．シアノゲナ（ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、Ｇ．フジクロイ（ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、Ｇ．イントリカンス（ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、Ｇ．プリカリス（ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、Ｇ．スティルボイデス（ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、Ｇ．トリシンクタ（ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、Ｇ．ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、Ｍ．ロウキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）、Ｍ．シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．フラブス（ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．レンツルス（ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、Ａ．テレウス（ｔｅｒｒｅｕｓ）、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ａ．フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、Ｆ．グラミネアルム（ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｆ．オキシスポルム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ブビゲヌム（ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、Ｆ．ソラニ（ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．オキシスポルム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ベルチシリオイデス（ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、Ｆ．プロリフェラツム（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、Ｆ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属の糸状菌ならびにそれらのアナモルフおよびテレモルフが挙げられる。本明細書の真菌の属および種は、所望であれば、Ｂａｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示された形態学によって定義することができる。
【０１６１】
本明細書の所定の実施形態における酵母は、無性生殖（アナモルフィック）または有性生殖（テレオモルフィック）で繁殖する酵母であってよい。本明細書の酵母は、典型的には、単細胞の形態で存在するが、これらの酵母の所定のタイプは、任意選択的に、仮性菌糸（出芽細胞が連結した糸）を形成することができる。さらに他の態様では、酵母は一倍体もしくは二倍体であってよい、および／またはこれらの倍数体形のいずれでも存在する能力を有していてよい。
【０１６２】
本明細書の酵母の例としては、従来型酵母および非従来型酵母が挙げられる。本明細書の従来型酵母の例としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、出芽酵母、パン酵母、および／または醸造酵母としても知られるＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ｓ．バヤヌス（ｂａｙａｎｕｓ）；Ｓ．ボウラルディ（ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）；Ｓ．ブルデリ（ｂｕｌｄｅｒｉ）；Ｓ．カリオカヌス（ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）；Ｓ．カリオクス（ｃａｒｉｏｃｕｓ）；Ｓ．ケバリエリ（ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）；Ｓ．ダイレネンシス（ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）；Ｓ．エリプソイデウス（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）；Ｓ．オイバヤヌス（ｅｕｂａｙａｎｕｓ）；Ｓ．エクシグウス（ｅｘｉｇｕｕｓ）；Ｓ．フロレンティヌス）；Ｓ．クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）；Ｓ．マルチニアエ（ｍａｒｔｉｎｉａｅ）；Ｓ．モナセンシス（ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）；Ｓ．ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）；Ｓ．パラドクスス（Ｐａｒａｄｏｘｕｓ）；Ｓ．パストリアヌス（ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）；Ｓ．スペンセロルム（ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）；Ｓ．ツリセンシス（ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）；Ｓ．ユニスポルス（ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）；Ｓ．ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）；Ｓ．ゾナツス（ｚｏｎａｔｕｓ）およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、分裂酵母としても知られるＳ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）；Ｓ．クリオフィルス（ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）；Ｓ．ヤポニクス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；Ｓ．オクトスポルス（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））の種が挙げられる。
【０１６３】
本明細書中の非従来型酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ））の種などの従来型酵母ではない。本明細書の非従来型酵母は、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれるＮｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）、Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｈａｂｉｔａｔｓ（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）および／またはＹｅａｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｋｕｎｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）などに開示されている当分野において公知の任意の手段にしたがって培養することができる。
【０１６４】
本明細書の非従来型酵母の非限定的例には、下記の：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属の酵母が含まれる。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種の好適な例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の好適な例としては、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）（コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）としても公知である）、Ｐ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｐ．スティピティス（ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ）（ハンヌセラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）としても公知である）が挙げられる。シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｓ．カステリイ（ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、Ｓ．アルビウス（ａｌｌｕｖｉｕｓ）、Ｓ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｓ．オキシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｓ．カプリオッティ（ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、Ｓ．エチェルシィ（ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、Ｓ．ポリモルファス（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．シュードポリモルファス（ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．バンリジアエ（ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、およびＳ．ヤマダエ（ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｋ．ファゼオロスポラス（ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｋ．バヌデニイ（ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、Ｋ．ワルティ（ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．アフリカヌス（ａｆｒｉｃａｎｕｓ）およびＫ．ポリスポラス（ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の好適な例としては、Ａ．アデニニボランス（ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびＡ．テレストレ（ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の好適な例としては、Ｔ．クタネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、Ｔ．カピタツム（ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、Ｔ．インキン（ｉｎｋｉｎ）およびＴ．ビーメリ（ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種の好適な例としては、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．アスカラフィダルム（ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．アンフィクシアエ（ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、Ｃ．アンタークティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｃ．アピコーラ（ａｐｉｃｏｌａ）、Ｃ．アルゲンティア（ａｒｇｅｎｔｅａ）、Ｃ．アトランティカ（ａｔｌａｎｔｉｃａ）、Ｃ．アトモスファェリカ（ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、Ｃ．ブラッテ（ｂｌａｔｔａｅ）、Ｃ．ブロメリアセアルム（ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、Ｃ．カルポフィラ（ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．カルバジャリス（ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、Ｃ．セラムビシダルム（ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．チャウリオデス（ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、Ｃ．コリダリ（ｃｏｒｙｄａｌｉ）、Ｃ．ドッセイ（ｄｏｓｓｅｙｉ）、Ｃ．デュブリニエンシス（ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．エルガテンシス（ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、Ｃ．フルクツス（ｆｒｕｃｔｕｓ）、Ｃ．グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．フェルメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｃ．ギリエルモンディ（ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ハエムロニィ（ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、Ｃ．インセクタメンス（ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、Ｃ．インセクトルム（ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、Ｃ．インテルメディア（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｃ．イェフレシィ（ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、Ｃ．ケフィア（ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ケロセニエ（ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、Ｃ．クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ルシタニエ（ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｃ．リキソソフィラ（ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．マルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）、Ｃ．マリーナ（ｍａｒｉｎａ）、Ｃ．メンブラニファシエンス（ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｃ．ミレリ（ｍｉｌｌｅｒｉ）、Ｃ．モギイ（ｍｏｇｉｉ）、Ｃ．オレオフィラ（ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．オレゴネンシス（ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．パラプシローシス（ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．クエルシトルーサ（ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、Ｃ．ルゴサ（ｒｕｇｏｓａ）、Ｃ．サケ（ｓａｋｅ）、Ｃ．シャハテア（ｓｈｅｈａｔｅａ）、Ｃ．テムノキラエ（ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、Ｃ．テヌイス（ｔｅｎｕｉｓ）、Ｃ．テアエ（ｔｈｅａｅ）、Ｃ．トレランス（ｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ツチヤエ（ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、Ｃ．シノラボランティウム（ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、Ｃ．ソーヤ（ｓｏｊａｅ）、Ｃ．サブハシィ（ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、Ｃ．ビスワナチイ（ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、Ｃ．ユティリス（ｕｔｉｌｉｓ）、Ｃ．ウバツベンシス（ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）およびＣ．ゼンプリニナ（ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の好適な例としては、Ｕ．アベナエ（ａｖｅｎａｅ）、Ｕ．エスクレンタ（ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、Ｕ．ホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ）、Ｕ．マイジス（ｍａｙｄｉｓ）、Ｕ．ヌーダ（ｎｕｄａ）およびＵ．トリチシ（ｔｒｉｔｉｃ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の好適な例としては、Ｔ．ゲオチャレス（ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、Ｔ．アジマ（ａｚｙｍａ）、Ｔ．グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）およびＴ．カンジダ（ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｚ．バイリイ（ｂａｉｌｉｉ）、Ｚ．ビスポラス（ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｚ．シドリ（ｃｉｄｒｉ）、Ｚ．フェルメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｚ．フロレンティヌス（ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、Ｚ．コンブチャエンシス（ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、Ｚ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｚ．メリス（ｍｅｌｌｉｓ）、Ｚ．ミクロエリプソイデス（ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、Ｚ．ムラキイ（ｍｒａｋｉｉ）、Ｚ．シュードロウキシイ（ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、およびＺ．ロウキシィ（ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の好適な例としては、Ｔ．バリアビリス（ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の好適な例としては、Ｃ．ローレンティ（ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、Ｃ．アルビダス（ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｃ．ガッティ（ｇａｔｔｉｉ）、Ｃ．ユニグトゥラツス（ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、Ｃ．アデリエンシス（ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．アエリウス（ａｅｒｉｕｓ）、Ｃ．アルビドシミリス（ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｃ．アンタルクティカス（ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アクアティカス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アーテル（ａｔｅｒ）、Ｃ．ブータネンシス（ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．コンソルティオニス（ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、Ｃ．カルバツス（ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｃ．フェノリカス（ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、Ｃ．スキンネリ（ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、Ｃ．テレウス（ｔｅｒｒｅｕｓ）およびＣ．ビシュニアッシ（ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の好適な例としては、Ｒ．アケニオルム（ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、Ｒ．トゥラ（ｔｕｌａ）、Ｒ．アクタ（ａｃｕｔａ）、Ｒ．アメリカーナ（ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ｒ．アラウカリアエ（ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、Ｒ．アークティカ（ａｒｃｔｉｃａ）、Ｒ．アルメニアカ（ａｒｍｅｎｉａｃａ）、Ｒ．アウランティアカ（ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｒ．アウリクラリエ（ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、Ｒ．バカルム（ｂａｃａｒｕｍ）、Ｒ．ベンチカ（ｂｅｎｔｈｉｃａ）、Ｒ．ビオウルゲイ（ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、Ｒ．ボゴリエンシス（ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ブロンキアリス（ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、Ｒ．ブフォニィ（ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、Ｒ．カリプトゲナエ（ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、Ｒ．チュングナメンシス（ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、Ｒ．クラディエンシス（ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．コラリナ（ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、Ｒ．クレゾリカ（ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、Ｒ．クロセア（ｃｒｏｃｅａ）、Ｒ．シクロクラスティカ（ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、Ｒ．ダイレネンシス（ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ディフルエンス（ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｒ．エバーグラディエンシス（ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フェルリカ（ｆｅｒｕｌｉｃａ）、Ｒ．フォリオルム（ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、Ｒ．フラガリア（ｆｒａｇａｒｉａ）、Ｒ．フジサネンシス（ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フトロネンシス（ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ゲラティノーサ（ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｒ．グラシアリス（ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、Ｒ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．グリンベルグシィ（ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、Ｒ．ヒマライエンシス（ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ヒヌレア（ｈｉｎｎｕｌｅａ）、Ｒ．ヒストリティカ（ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｒ．ヒロフィラ（ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．インカルナタ（ｉｎｃａｒｎａｔａ）、Ｒ．インゲニオサ（ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、Ｒ．ジャバニカ（ｊａｖａｎｉｃａ）、Ｒ．コイシカウェンシス（ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ラクトーサ（ｌａｃｔｏｓａ）、Ｒ．ラメリブラキエ（ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、Ｒ．ラリンギス（ｌａｒｙｎｇｉｓ）、Ｒ．リグノフィラ（ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．リニ（ｌｉｎｉ）、Ｒ．ロンギッシマ（ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、Ｒ．ルドウィギィ（ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、Ｒ．リシノフィラ（ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．マリーナ（ｍａｒｉｎａ）、Ｒ．マルチニエ−フラガンティス（ｍａｒｔｙｎｉａｅ−ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、Ｒ．マトリテンシス（ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｒ．メリ（ｍｅｌｉ）、Ｒ．ミヌータ（ｍｉｎｕｔａ）、Ｒ．ムシラギノーサ（ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ニテンス（ｎｉｔｅｎｓ）、Ｒ．ノトファギ（ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、Ｒ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）、Ｒ．パシフィカ（ｐａｃｉｆｉｃａ）、Ｒ．パリダ（ｐａｌｌｉｄａ）、Ｒ．ペネアウス（ｐｅｎｅａｕｓ）、Ｒ．フィリラ（ｐｈｉｌｙｌａ）、Ｒ．フィロプラナ（ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、Ｒ．ピラティ（ｐｉｌａｔｉｉ）、Ｒ．ピリマナエ（ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、Ｒ．ピニコラ（ｐｉｎｉｃｏｌａ）、Ｒ．ピリカータ（ｐｌｉｃａｔａ）、Ｒ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｒ．サイクロフェノリカ（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、Ｒ．サイクロフィラ（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．パストゥラ（ｐｕｓｔｕｌａ）、Ｒ．レティノフィラ（ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．ロザケア（ｒｏｓａｃｅａ）、Ｒ．ロスラータ（ｒｏｓｕｌａｔａ）、Ｒ．ルベファシエンス（ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．ルベラ（ｒｕｂｅｌｌａ）、Ｒ．ルベスセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｒ．ルブラ（ｒｕｂｒａ）、Ｒ．ルブロルゴサ（ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、Ｒ．ルフラ（ｒｕｆｕｌａ）、Ｒ．ルティラ（ｒｕｔｉｌａ）、Ｒ．サングイネア（ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、Ｒ．サニエイ（ｓａｎｎｉｅｉ）、Ｒ．サルトリィ（ｓａｒｔｏｒｙｉ）、Ｒ．シルベストリス（ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、Ｒ．シンプレックス（ｓｉｍｐｌｅｘ）、Ｒ．シネンシス（ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．スルーフィアエ（ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、Ｒ．ソンクキィ（ｓｏｎｃｋｉｉ）、Ｒ．ストラミネア（ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、Ｒ．スベリコラ（ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、Ｒ．スガニィ（ｓｕｇａｎｉｉ）、Ｒ．タイワネンシス（ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．タイワニアナ（ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、Ｒ．テルペノイダリス（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、Ｒ．テッレア（ｔｅｒｒｅａ）、Ｒ．テキセンシス（ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、Ｒ．トキョエンシス（ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ウルザマエ（ｕｌｚａｍａｅ）、Ｒ．バニリカ（ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、Ｒ．ブイレミニィ（ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、Ｒ．ヤロウィ（ｙａｒｒｏｗｉｉ）、Ｒ．ユナネンシス（ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）およびＲ．ゾルティ（ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の好適な例としては、Ｐ．ロドジマ（ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。
スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｓ．アルボルベスセンス（ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．バナエンシス（ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ベイジンゲンシス（ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ビスコフィエ（ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、Ｓ．クラバツス（ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｓ．コプロスマエ（ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、Ｓ．コプロスミコーラ（ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、Ｓ．コラリヌス（ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、Ｓ．ディメナエ（ｄｉｍｍｅｎａｅ）、Ｓ．ドラコフィリィ（ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、Ｓ．エロンガツス（ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、Ｓ．グラシリス（ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｓ．イノシトフィルス（ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ジョンソニィ（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｓ．コアラエ（ｋｏａｌａｅ）、Ｓ．マグニスポラス（ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｓ．ノボゼアランディカス（ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、Ｓ．オドラス（ｏｄｏｒｕｓ）、Ｓ．パタゴニカス（ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、Ｓ．プロダクツス（ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、Ｓ．ロセウス（ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ．サシコーラ（ｓａｓｉｃｏｌａ）、Ｓ．シバタヌス（ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、Ｓ．シンギュラリス（ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．スブルンネウス（ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、Ｓ．シンメトリカス（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、Ｓ．シジギィ（ｓｙｚｙｇｉｉ）、Ｓ．タウポエンシス（ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ツガエ（ｔｓｕｇａｅ）、Ｓ．キサンツス（ｘａｎｔｈｕｓ）、およびＳ．ユナネンシス（ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属種の好適な例としてはそれぞれ、Ｐ．タノフィルス（ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）およびＭ．ポリニス（ｐｏｌｌｉｎｉｓ）が挙げられる。本明細書の非従来型酵母のさらになお他の例としては、シュードジマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属種（例えば、Ｓ．アンタルクチカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ））、トドトルタ（Ｔｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種（例えば、Ｔ．ボゴリエンシス（ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ））、ウィッカーハミエラ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ）属種（例えば、Ｗ．ドメルキアエ（ｄｏｍｅｒｃｑｉａｅ））、スタルメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）属種（例えば、Ｓ．ボンビコーラ（ｂｏｍｂｉｃｏｌａ））、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属種（例えば、Ｄ．ハンセニイ（ｈａｎｓｅｎｉｉ））、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属種（例えば、Ｏ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ））およびアシュビヤ（Ａｓｈｂｙａ）属種（例えば、Ａ．ゴシッピイ（ｇｏｓｓｙｐｉｉ））が挙げられる。
【０１６５】
所定の実施形態における酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。好適なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の例としては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる次の単離菌：菌株名称ＡＴＣＣ番号＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９および／または＃２０１８４７が挙げられる。
【０１６６】
所定の実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、下記：緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、紅色植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、褐色植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）（褐藻類）、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）（珪藻類）および双鞭毛虫類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）（渦鞭毛藻（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））のいずれか由来の藻類細胞であってよい。藻類細胞は、他の態様において、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物もしくはプランクトン藻類）または大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってよい。また別の例として、本明細書の藻類細胞は、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｃ．レインハルティ（ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））、ポルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（紫色の海苔）、パルマリア（Ｐａｌｍａｒｉａ）属（例えば、Ｐ．パルマータ（ｐａｌｍａｔａ）［ダルス］））、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属（例えば、Ａ．プラテンシス（ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）［スピルリナ］）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（例えば、Ｃ．プロトテコイデス（ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、Ｃ．ブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ））、コンドラス（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属（例えば、Ｃ．クリスプス（ｃｒｉｓｐｕｓ）［アイリッシュ・モス］））、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、サルガスム（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、Ｂ．ブラウニイ（ｂｒａｕｎｉｉ））、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（例えば、Ｄ．テルティオレクタ（ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、Ｄ．サリナ（ｓａｌｉｎａ））、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プロイロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属（例えば、Ｐ．カルテラエ（ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッスチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、ファエオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えば、Ｐ．トリコルヌツム（ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属（例えば、Ｓ．オブリクウス（ｏｂｌｉｑｕｕｓ））、スティコノコッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えば、Ｔ．スエシカ（ｓｕｅｃｉｃａ））、タラシオシリア（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えば、Ｔ．シュードナナ（ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えば、Ｃ．コーニイ（ｃｏｈｎｉｉ））、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えば、Ｎ．オレオアバンダンス（ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））またはシオキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であってよい。本明細書の藻類種は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌ��ｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １、ｅｏｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ−ｃｈａｐｔｅｒｓのインターネットサイトから入手可能）に記載されたように培養および／または操作することができる。
【０１６７】
所定の実施形態における細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ菌、スフェロプラスト菌、プロトプラスト菌などの形態の細菌細胞であってよい。細菌のさらに他の非限定的例としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えばＳ．チフス（ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．エンテリティディス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属（例えばＳ．ディセンテリアエ（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えばＥ．コリ（ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ユーインゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＳ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えばＶ．コレラエ（ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エーロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロカリマエア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＳ．ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）属、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ニューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＥ．フェーカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ））、エーロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＬ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属（例えばＬ．メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばＢ．セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばＣ．ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えばＬ．モノシトゲネス（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、ガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばＡ．ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えばＰ．アエルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シェバネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウィークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、アフィピア（Ａｆｉｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルジオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルシニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モビルンクス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オイバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばＬ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えばＣ．ボツリナム（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．パーフィリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）属、レプトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルディオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、サーモアクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属の細菌が挙げられる。
【０１６８】
本明細書の組換え細胞は、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上のＬＣＤＡ生成物を生成することができる。本明細書に開示した細胞によって培養培地の体積中で生成できるＬＣＤＡの総量は、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０もしくは１２０ｇ／Ｌ（または５〜１２０ｇ／Ｌの間の整数）であってよい。本開示の組換え細胞の例は、同一発酵条件下で増殖させた場合に、好適なコントロール細胞（例えば、親細胞）と比較して、ＬＣＤＡ生成における１０倍〜１０００倍の増加を示すことができる。そのような増加は、例えば、約、または少なくとも約１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、７５０倍または１０００倍であってよい。
【０１６９】
本明細書の細胞によって生成されたＬＣＤＡの均質性もしくは不均質性の程度は、典型的には細胞に供給された長鎖脂肪酸含有基質の性質に左右される。例えば、１つのタイプの長鎖脂肪酸（均質脂肪酸含有基質）を含む基質を用いて増殖した細胞は、典型的には、基質内の脂肪酸と同一の炭素鎖長を備える大部分の（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０もしくは７５重量％）のＬＣＤＡを含むＬＣＤＡ生成物を生成することができる。例示するために、パルミチン酸（Ｃ１６：０）もしくはオレイン酸（Ｃ１８：１）だけを含む基質を用いた培養培地中で増殖させた一部の態様における細胞は、典型的には、それぞれ１６または１８の炭素鎖長を備える少なくとも５０重量％のＬＣＤＡ生成物を含むＬＣＤＡを生成することができる。
【０１７０】
２つ以上のタイプの長鎖脂肪酸（不均質脂肪酸含有基質）を含む基質を用いた培養培地中で増殖させた一部の態様における細胞は、典型的には、基質内の脂肪酸の対応する炭素鎖長に概して比例する炭素鎖長を備えるＬＣＤＡ生成物のプロファイルを生成することができる。例えば、典型的には脂肪酸の約７％のαリノレン酸（Ｃ１８：３）、約５５％のリノール酸（Ｃ１８：２）、約２３％のオレイン酸（Ｃ１８：１）、約４％のステアリン酸（Ｃ１８：０）および約１１％のパルミチン酸（Ｃ１６：０）（したがって、脂肪酸の約８９％はＣ１８であり、約１１％はＣ１６である）を含む大豆油を用いて増殖させた細胞は、１８の炭素鎖長を備える大部分が（例えば少なくとも５０、５５、６０、６５、７０もしくは７５重量％）のＬＣＤＡ生成物を含むＬＣＤＡを生成することができる。
【０１７１】
本明細書のＬＣＤＡは、例えば、１０〜２４個の炭素鎖長を有することができる。ＬＣＤＡは、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３もしくはＣ２４のＬＣＤＡであってよい。ＬＣＤＡは、一部の実施形態では、１０〜２２個、１２〜２２個、１４〜２２個、１６〜２２個、１８〜２２個、２０〜２２個、１６〜１８個、１６〜２０個もしくは１６〜２２個の炭素原子の鎖長を有することができる。所定の態様におけるＬＣＤＡ生成物の例は、飽和であり（それらの炭素鎖は二重結合を含んでいない）、表Ａに列挙されている。
【０１７２】
【表６】
2018519843.tif 000009
【０１７３】
本明細書のＬＣＤＡ生成物のさらに他の例は、不飽和である。不飽和ＬＣＤＡは、例えば、１、２、３、４、５もしくは６個の二重結合を有する脂肪族炭素鎖を含むことができる。本明細書の不飽和ＬＣＤＡの例としては、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４、Ｃ２０：１、Ｃ２０：２、Ｃ２０：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５、Ｃ２２：１、Ｃ２２：２、Ｃ２２：３、Ｃ２２：４、Ｃ２２：５およびＣ２２：６が挙げられる。上記のＬＣＤＡのいずれも、例えば、対応する鎖長および飽和／不飽和プロファイルを有する脂肪酸を含む基質を用いて、本明細書に開示した組換え細胞を増殖させることによって生成することができる。ＬＣＤＡ生成物の炭素鎖内の不飽和の位置は、例えば、ＬＣＤＡを調製するために使用される脂肪酸含有基質内の不飽和の位置と対応する可能性がある。
【０１７４】
本明細書の長鎖脂肪酸含有基質内で提供される長鎖脂肪酸は、例えば、少なくとも１０個の炭素鎖長または１０〜２４個の炭素原子の長さを有することができる。長鎖脂肪酸は、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３もしくはＣ２４長鎖脂肪酸であってよい。長鎖脂肪酸は、一部の実施形態では、１０〜２４個、１２〜２４個、１４〜２４個、１６〜２４個、１８〜２４個、２０〜２４個、１０〜２２個、１２〜２２個、１４〜２２個、１６〜２２個、１８〜２２個、２０〜２２個、１６〜１８個、１６〜２０個もしくは１６〜２２個の炭素原子の鎖長を有することができる。本明細書に開示した基質は、少なくとも１０個の炭素鎖長または１０〜２４個の範囲内の炭素原子を備える脂肪酸を含むが、所望であれば、追加のタイプの脂肪酸もまた本基質中に存在することができる。例えば、基質は、さらに１０個未満の炭素鎖長を備える１つ以上のタイプの脂肪酸を含むことができる。
【０１７５】
本明細書の長鎖脂肪酸は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和長鎖脂肪酸の例は、脂肪酸炭素鎖内に唯一の二重結合が存在する場合は一不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、脂肪酸炭素鎖が２つ以上の二重結合を有する場合は多不飽和脂肪酸（ＰＵＣＡ）である。本明細書の長鎖脂肪酸の例は、表Ｂに提供した。
【０１７６】
【表７】
2018519843.tif 000010
【０１７７】
長鎖脂肪酸は、それが細胞にとって非毒性または低毒性しか示さない限り、一部の場合には置換脂肪酸であってよい。脂肪酸の脂肪族鎖内の１つ以上の水素は、任意選択的に、ハロゲン、アセチル、ＯＲ、ＮＲ２もしくはＳＲ基（式中、Ｒは、例えば、独立してＨまたはＣ１−Ｃ８アルキル基である）で置換することができる。本明細書の置換脂肪酸の所定の例としては、ω−アルコールもしくはω−アルデヒド基を備える脂肪酸が挙げられる。
【０１７８】
本明細書に開示した長鎖脂肪酸含有基質は、本明細書の一部の態様では、遊離長鎖脂肪酸を含むことができる。そのような脂肪酸は、任意選択的に、非エステル化長鎖脂肪酸もしくは非結合長鎖脂肪酸であると特徴付けることができる。本明細書に開示した（例えば、表Ｂに列挙した）任意の長鎖脂肪酸は、例えば、そのような基質中に含まれる可能性がある。遊離長鎖脂肪酸を含む基質のその他の例としては、油の脂肪酸留出物が挙げられる。脂肪酸留出物は、例えば植物油（例えば、パーム油脂肪酸留出物［ＰＦＡＤ］）などの本明細書に開示した任意の油の脂肪酸留出物であってよい。
【０１７９】
本明細書に開示した長鎖脂肪酸含有基質は、一部の態様では、エステル化長鎖脂肪酸を含むことができる。本明細書に開示した（例えば、表Ｂに列挙した）任意の長鎖脂肪酸は、例えば、そのような基質中に含まれる可能性がある。本明細書のエステル化長鎖脂肪酸の一部の例としては、グリセリド分子または脂肪酸アルキルエステル内に含まれる長鎖脂肪酸が挙げられる。
【０１８０】
本明細書のグリセリド分子は、モノ−、ジ−もしくはトリグリセリドまたはそれらの混合物であってよい。長鎖脂肪酸含有基質がジ−および／またはトリグリセリドを含む実施形態では、それらのエステル化脂肪酸の全部が長鎖脂肪酸である必要はない。本明細書のグリセリド分子は、典型的には油として提供されるが、一部の実施形態では、グリセリド分子は脂肪として提供することもできる。したがって、長鎖脂肪酸含有基質は、任意選択的に１つ以上のタイプの油および／または脂肪を含むと特徴付けることができる。
【０１８１】
本明細書で使用するために好適な油（もしくは脂肪）の例は、植物、微生物、酵母、真菌、細菌、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル類、動物、家禽類および魚類由来であってよい。植物油（植物性油脂）の例としては、カノーラ油、コーン油、パーム核油、ケル（ｃｈｅｒｕ）種油、野生アンズ種油、ゴマ油、ソルガム油、大豆油（ｓｏｙ  ｏｉｌ）、菜種油、大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ  ｏｉｌ）、セイヨウアブラナ油、トール油、ヒマワリ油、麻実油、オリーブ油、亜麻仁油、ココナッツ油、ヒマシ油、落花生油、パーム油、マスタード油、綿実油、カメリナ油、ジャトロファ油およびハマナ油が挙げられる。本明細書の油および脂肪のその他の例としては、精製脂肪および油；飲食店用油脂；黄色および褐色油脂；廃産業用揚油；獣脂；ラード；鯨油；乳脂肪；魚油；藻類油；酵母油；微生物油；酵母バイオマス、微生物バイオマス、下水汚泥由来の油／脂肪；ならびにリン脂質（例えば、石鹸原料で提供される）が挙げられる。本明細書において有用な油のさらに他の例としては、（ｉ）化石燃料由来油、例えば石油関連製品由来の油、使用済み潤滑油および工業用潤滑油、石炭液化油；（ｉｉ）石油化学プロセスおよび化学プロセスからの副生成物として生成される合成油；および（ｉｉｉ）産業廃棄物および／または農業廃棄物由来の油が挙げられる。
【０１８２】
本明細書の脂肪酸アルキルエステルは、例えば、それぞれメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルもしくはデシル基などのＣ１〜Ｃ１０アルキル基を含むことができる。例としては、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪酸エチルエステルが挙げられる。本明細書に開示した長鎖脂肪酸は、脂肪酸アルキルエステル内に含まれてよいが、一部の例には、Ｃ１６（例えば、パルミチン酸）およびＣ１８（例えば、オレイン酸）脂肪酸が含まれる。脂肪酸アルキルエステルのうちの１つまたは混合物は、ＬＣＤＡ生成のために本明細書の細胞とともに使用することができる。脂肪酸アルキルエステルの混合物は、一部の態様では、当分野において公知の任意の適切な方法を使用して、脂肪酸エステルを生成するために、本明細書に開示したいずれかの油もしくは脂肪（すなわち、脂質）をアルコール（例えば、メタノールもしくはエタノール）と化学的に反応させることによって提供することができる。そのような混合物の１つの例は、典型的には植物性油脂もしくは動物性脂肪（例えば、獣脂）由来であるバイオディーゼルである。
【０１８３】
本明細書に開示した長鎖脂肪酸含有基質は、一部の態様では、アミド結合長鎖脂肪酸を含むことができる。本明細書のアミド結合長鎖脂肪酸の例としては、脂肪族アミド、アシルアミノ糖およびアシルアミノ−グリカンが挙げられる。本明細書に開示した（例えば、表Ｂに列挙した）任意の長鎖脂肪酸は、例えば、アミド結合長鎖脂肪酸として提供することができる。
【０１８４】
本明細書の細胞は、長鎖脂肪酸を含む基質からＬＣＤＡを生成すると記載されてはいるが、さらに、例えばアルカン、脂肪族アルコールおよび／または脂肪族アルデヒドなどの他の有機基質からＬＣＤＡを生成することもできると考えられている。そのような他の基質は、長鎖脂肪酸を含む基質について本明細書に開示した基質と同一の炭素鎖長の基質であってよい。
【０１８５】
本開示は、さらに１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）を生成する方法に関する。本方法は、本明細書に開示した組換え細胞（例えば、酵母細胞などの微生物細胞）を長鎖脂肪酸含有基質と接触させる工程であって、ここで細胞がその基質からＬＣＤＡを合成する工程を含む。本方法は、細胞によって合成されたＬＣＤＡを回収する任意選択的工程をさらに含む。
【０１８６】
本方法は、例えば、上記に開示した実施形態または下記の実施例の任意の特徴（例えば、細胞タイプ；ＡＣｏＳ酵素の配列；ＣＹＰおよび／またはＣＰＲ酵素の配列；ＦＡＯ、ＦＡＤＨおよび／またはＦＡＬＤＨ酵素の配列；Ｐｅｘ３タンパク質の配列などに関連する特徴）を使用して実施することができる。したがって、上記に開示した特徴もしくは実施例中の特徴のいずれか、またはこれらの特徴の任意の組み合わせを適切に使用すると、本明細書のＬＣＤＡ生成法の実施形態を特徴付けることができる。下記の方法の特徴は、また別の実施例である。
【０１８７】
本明細書に開示したＬＣＤＡ生成法は、組換え細胞を長鎖脂肪酸含有基質と接触させる工程であって、ここで細胞がその基質からＬＣＤＡを合成する工程を含む。そのような接触させる工程は、任意選択的に、脂肪酸含有基質を含む培地中で組換え細胞をインキュベートする、培養する、および／または増殖させる工程であると特徴付けることができる。この接触させる工程は、所望であれば、発酵工程（例えば、長鎖脂肪酸含有基質からのＬＣＤＡ生成の発酵）（例えば、ＬＣＤＡ発酵法）であると特徴付けることもできる。
【０１８８】
本明細書のＬＣＤＡを発酵させるために好適なｐＨ（例えば、その中で細胞が長鎖脂肪酸含有基質と接触させられる培地のｐＨ）は、例えば、約ｐＨ４．０〜９．０である。この範囲内の好適なｐＨは、例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０であってよい。一部の他の態様では、約ｐＨ７．５〜８．５の範囲内のｐＨを使用することができる。約５．５〜７．５のｐＨは、場合により初期増殖条件のために有用な場合がある。
【０１８９】
本明細書のＬＣＤＡを発酵させるために好適な温度（例えば、その中で細胞が長鎖脂肪酸含有基質と接触させられる培地の温度）は、本明細書の組換え細胞が最高増殖を示す温度であってよい。好適な温度の例としては、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５℃が挙げられる。一部の場合に使用できる好適な温度範囲には、２５〜３２℃、２８〜３２℃および２８〜３０℃が含まれる。
【０１９０】
１つ以上のＬＣＤＡを発酵させるために組換え細胞を長鎖脂肪酸含有基質とともに増殖させるための時間量は、約、または少なくとも約３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８または２４０時間であってよい。発酵期間は、所定の他の実施形態では、約３〜７日間、４〜６日間または５日間であってよい。細胞は、任意選択的に、長鎖脂肪酸含有基質と接触させる前に約１２〜２４時間増殖させることができる。
【０１９１】
その中で組換え微生物細胞が長鎖脂肪酸含有基質と接触させられる培地中のそのような基質の濃度は、例えば、約、または少なくとも約１、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｇ／Ｌ（または１〜１００ｇ／Ｌの間の任意の整数）であってよい。そのような濃度は、所定の他の実施形態では、約３〜３０もしくは５〜２０ｇ／Ｌであってよい。これらの濃度のいずれも、微生物細胞を含むＬＣＤＡを発酵させるための培地に加えられた直後に存在する基質の濃度である、開始濃度（出発濃度）であってよい。初期長鎖脂肪酸含有基質の濃度は、任意選択的に、例えば、パルス式供給または連続的供給の開始時の濃度を特徴付けることができる。
【０１９２】
一部の実施形態におけるＬＣＤＡ発酵法は、バッチ式、フェドバッチ式または連続式発酵プロセスを使用して実施することができる。バッチ式発酵法は、典型的には、その中で培地（長鎖脂肪酸含有基質を含む）がプロセスの開始時に固定され、発酵中のｐＨおよび／または酸素レベルを維持するために必要とされる可能性がある添加／修飾を超えるそれ以上の添加／修飾を受けない閉鎖型システムを含む。本明細書のフェドバッチ式システムは、このプロセスが発酵中のｐＨおよび／または酸素レベルを維持するために必要とされる可能性がある添加／修飾を超えるそれ以上の添加／修飾を受けることを除けば、バッチ式プロセスと類似である。例えば、長鎖脂肪酸含有基質がこのプロセス中にこのシステムに加えられる場合がある；そのような添加は、交互／断続的または連続的であってよい。バッチ式およびフェドバッチ式培養法は、当分野において公知である（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，１９８９；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７−２３４を参照されたい）。本明細書の連続式発酵プロセスは、典型的には、ＬＣＤＡ生成物回収のための培養体積の等量を同時に除去しながら、発酵容器に規定培地を連続的に添加することによって実施することができる。Ｂｒｏｃｋは、連続的発酵方法論を開示している。
【０１９３】
さらに他の培養条件は、任意選択的に、本明細書のＬＣＤＡ生成法を実施するために適用することができる。例えば、組換え細胞は、好気的（例えば、微好気的）または嫌気的条件下で培養することができるが、一部の例では前者が好ましい。振とうまたは回転の形態での撹拌は、任意選択的に、例えば約１００、１５０、２００、３００、５００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００もしくは２０００ｒｐｍなどの速度で培養に適用することができる。また別の例では、第１段階が細胞増殖を促進し、第２段階がＬＣＤＡ生成を促進する２段階プロセスを使用することができる。本明細書に開示した２つ、３つ、４つ以上の異なるタイプの（好ましくは同一の種、属もしくは科の）組換え細胞は、さらに他の実施例において使用できる。
【０１９４】
本明細書に開示したＬＣＤＡ生成法において生成されるＬＣＤＡの総量は、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０もしくは１２０ｇ／Ｌ（または５〜１２０ｇ／Ｌの間の整数）であってよい。これらの濃度は、その中で本明細書の微生物細胞が長鎖脂肪酸含有基質と接触させられる培地中で、および上記に開示した増殖期間のいずれかで測定される濃度であってよい。所定のＬＣＤＡ生成法におけるＬＣＤＡ生成率は、約、または少なくとも約０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５もしくは１．２０ｇ／Ｌ／時であってよい。ＬＣＤＡ産出量のこれらの尺度のいずれかをもたらす微生物細胞の出発量は、所定の態様では、下記の実施例において試験したそれらの量のいずれかであってよい。
【０１９５】
本明細書のＬＣＤＡ生成法において細胞によって合成されるＬＣＤＡ生成物は、任意選択的に単離することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２２８５８７号明細書および／または同第２０１２／０２５３０６９号明細書に開示されているなどの発酵ブロスからＬＣＤＡを単離するための当分野において公知の任意の方法を適用することができる。さらに、例えば、下記の実施例において開示した任意のＬＣＤＡ単離法を使用することができる。
【０１９６】
１つ以上のω−ヒドロキシ長鎖脂肪酸および／またはω−アルド長鎖脂肪酸は、本明細書のＬＣＤＡ合成法中の中間物として生成される（図１および２を参照されたい）。したがって、本開示の所定のまた別の実施形態では、ＬＣＤＡを合成する方法は、任意選択的に、ω−ヒドロキシ長鎖脂肪酸および／またはω−アルド長鎖脂肪酸を生成する方法であると特徴付けることもできる。そのようなＬＣＤＡ代謝産物は、例えば、本明細書に開示したＬＣＤＡおよび長鎖脂肪酸のいずれかに対応する炭素数を有することができる。
【０１９７】
本明細書に開示した組成物および方法の非限定的例としては、以下が挙げられる：
１．長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＳ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションを含む工学的ＬＣＤＡ生成経路を含む組換え微生物細胞であって、長鎖脂肪酸含有基質から１つ以上の長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成物を生成することができる組換え微生物細胞。
【０１９８】
２．ＡＣｏＳ酵素が配列番号４４、４９、３６、３３もしくは３４と少なくとも９０％同一である１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１の組換え微生物細胞。
【０１９９】
３．ＡＣｏＳ酵素が長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性およびクマロイル−ＣｏＡシンテターゼ活性の両方を有する、実施形態１または２の組換え微生物細胞。
【０２００】
４．ＡＣｏＳ酵素が配列番号４４もしくは４９と少なくとも９０％同一である１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３の組換え微生物細胞。
【０２０１】
５．工学的ＬＣＤＡ生成経路がさらに下記の特徴：
（ｉ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｉｉ）脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｉｖ）脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーション、
（ｖ）脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ酵素）をコードするポリヌクレオチド配列のアップレギュレーションのうちの１つ以上を含む、実施形態１、２、３または４の組換え微生物細胞。
【０２０２】
６．ＣＹＰ酵素をコードするポリヌクレオチド配列およびＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列の一方または両方がアップレギュレートされる、実施形態５の組換え微生物細胞。
【０２０３】
７．微生物細胞がペルオキシソーム生物発生因子をコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションをさらに含む、実施形態１、２、３、４、５または６の組換え微生物細胞。
【０２０４】
８．ペルオキシソーム生物発生因子はペルオキシソーム生物発生因子３である、実施形態７の組換え微生物細胞。
【０２０５】
９．微生物細胞がペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションをさらに含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７または８の組換え微生物細胞。
【０２０６】
１０．ペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼはペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ−２、−３および／または−４である、実施形態９の組換え微生物細胞。
【０２０７】
１１．微生物細胞は、減少した脂質合成および／または貯蔵能力を有する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の組換え微生物細胞。
【０２０８】
１２．減少した脂質合成および／または貯蔵能力は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ酵素）をコードする少なくとも１つの内因性ポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションに起因する、実施形態１１の組換え微生物細胞。
【０２０９】
１３．微生物細胞は酵母細胞である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の組換え微生物細胞。
【０２１０】
１４．酵母細胞はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞である、実施形態１３の組換え微生物細胞。
【０２１１】
１５．ＬＣＤＡ生成物は炭素原子１０〜２４個の鎖長を有する、および／または長鎖脂肪酸含有基質は遊離長鎖脂肪酸またはエステル化長鎖脂肪酸を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の組換え微生物細胞。
【０２１２】
１６．長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）を生成する方法であって：ａ）実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の組換え微生物細胞を長鎖脂肪酸含有基質と接触させる工程であって、微生物細胞がその基質からＬＣＤＡを合成する工程；およびｂ）任意選択的に工程（ａ）のＬＣＤＡを回収する工程を含む方法。
【０２１３】
１７．微生物細胞は酵母細胞である、および任意選択的に、酵母細胞はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞である、実施形態１６の方法。
【実施例】
【０２１４】
本開示を以下の実施例において詳細に説明する。これらの実施例は、本明細書の所定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ記されていると理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、本明細書に開示した実施形態を様々な使用および条件に適合させるために様々な変更および修飾を加えることができる。
【０２１５】
一般的方法
実施例において使用した標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野において周知であり、例えば：１）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；および３）Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）によって記載されている。
【０２１６】
微生物培養の維持および増殖に好適な材料および方法は、当分野において周知である。下記の実施例において使用するために好適な技術は、例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒ．Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）；および／またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９）の中に見いだすことができる。全ての試薬、制限酵素および細胞増殖材料は、他に特に明記しない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）菌株は、典型的には３７℃のルリア・ベルターニ（ＬＢ）プレート上で増殖させた。
【０２１７】
一般的分子クローニングは、標準方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）にしたがって実施された。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ）によって合成された。個々のＰＣＲ増幅反応は、他に特に明記しない限り、次の：ＰＣＲバッファー（１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーおよび１μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を含む総量５０μＬ中で実施された。部位特異的突然変異誘発法は、Ａｇｉｌｅｎｔの部位特異的突然変異誘発キットを製造業者の取扱説明書にしたがって使用して実施された。ＰＣＲもしくは部位特異的突然変異誘発法がサブクローニングに含まれた場合、構築物は、配列に誤差が持ち込まれなかったことを確証するためにシークエンシングされた。ＰＣＲ生成物は、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および／またはｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングされた。全てのコドン最適化遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。
【０２１８】
ＤＮＡ配列は、ベクター特異的およびインサート特異的プライマーの組み合わせを用いて色素ターミネーターテクノロジーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で生成された。配列の編集および分析は、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して実施された。遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して実施された。または、遺伝子配列の操作は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手できるＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）１０プログラムを使用して達成された。
【０２１９】
それにクエリー配列が最大の類似性を有した配列を要約するアラインメント比較の結果は、同一性率、類似性率および期待（Ｅ）値にしたがって報告されている。「期待値」は、完全に偶然によってこのサイズのデータベースの検索において期待される、マッチ数を特定するマッチの統計的有意性を所定のスコアを用いて推定する。
【０２２０】
本明細書で使用する所定の略語の意味は、次の通りである：「ｓｅｃ」は秒（間）を意味し、「ｍｉｎ」は分（間）を意味し、「ｈ」は時（間）を意味し、「ｄ」は日（間）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」は「マイクロモルの」を意味し、「ｍＭ」は「ミリモルの」を意味し、「Ｍ」は「モルの」を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ＤＣＷ」は乾燥細胞重量を意味し、および「ＴＦＡ」は全脂肪酸を意味する。
【０２２１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養および形質転換
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株ＡＴＣＣ番号２０３６２およびＡＴＣＣ番号＃９０８１２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株は、下記に示した配合にしたがって、２８〜３０℃の数種の培地中で規定通りに増殖させた。寒天プレートは、各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加することによって調製した。
【０２２２】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌ当たり）：１０ｇの酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、２０ｇのＢａｃｔｏ（商標）ペプトン（ＤＩＦＣＯ）、２０ｇのグルコース。
【０２２３】
基本の最少培地（ＭＭ）（１Ｌ当たり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇの酵母用ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１．０ｇのプロリン（ｐＨ６．１）（無調整）。
【０２２４】
最少培地＋ウラシル（ＭＭ＋ウラシルもしくはＭＭＵ）（１Ｌ当たり）：ＭＭ培地を上述のように調製し、０．１ｇのウラシルおよび０．１ｇのウリジンを加える。
【０２２５】
最少培地＋ウラシル＋スルホニル尿素（ＭＭＵ＋ＳＵ）（１Ｌ当たり）：ＭＭ培地を上述のように調製し、２８０ｍｇのスルホニル尿素を加える。
【０２２６】
最少培地＋ロイシン＋リシン（ＭＭＬｅｕＬｙｓ）（１Ｌ当たり）：ＭＭ培地を上述のように調製し、０．１ｇのロイシンおよび０．１ｇのリシンを加える。
【０２２７】
最少培地＋５−フルオロオロチン酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１Ｌ当たり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母用ニトロゲンベース、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジンおよび（供給業者から受領した各バッチ内では変動が発生するので１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対して試験したＦＯＡ活性）に基づく適切な量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）。
【０２２８】
ＭＦ培地（１Ｌ当たり）：１４．３ｇの酵母抽出物、７．１５ｇのペプトン、０．８２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１６．３７ｇのＫ２ＨＰＯ４、２０ｇのグルコース、１．２ｍＬの微量金属（１００×）。３ｍＬのＭｇＳＯ４（１Ｍ）、０．６ｍＬのチアミンＨＣｌ（１．５ｇ／Ｌ）。
【０２２９】
ＭＦバッファー１培地（１Ｌ当たり）：１５０ｇのグルコース、１００．１２ｇのＫＨＣＯ３、４．２９ｇの尿素。
【０２３０】
ＹＭ培地：０．５％のペプトン、０．３％の酵母抽出物、０．３％のマルトース抽出物。
【０２３１】
ＹＮＢ培地（１Ｌ当たり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇの酵母用ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、２０ｇの寒天（ｐＨ６．１）（無調整）。
【０２３２】
ＹＰＤ２−Ｂ培地：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、９４ｍＬのＫ２ＨＰＯ４（１Ｍ）、６ｍＬのＫＨ２ＰＯ４（１Ｍ）、２００μＬの微量金属（１００×）、１ｍＬのチアミンＨＣｌ（７５ｍｇ／ｍＬ）、１ｍＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１２．５ｇ／１００ｍＬ）。
【０２３３】
ＹＰＤ４−Ｂ培地：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのペプトン、４０ｇのグルコース、９４ｍＬのＫ２ＨＰＯ４（１Ｍ）、６ｍＬのＫＨ２ＰＯ４（１Ｍ）、２００μＬの微量金属（１００×）、１ｍＬのチアミンＨＣｌ（７５ｍｇ／ｍＬ）、１ｍＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１２．５ｇ／１００ｍＬ）。
【０２３４】
Ｙ２Ｐ１Ｄ２−Ｂ培地：２０ｇの酵母抽出物、１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、９４ｍＬのＫ２ＨＰＯ４（１Ｍ）、６ｍＬのＫＨ２ＰＯ４（１Ｍ）、２００μＬの微量金属（１００×）、１ｍＬのチアミンＨＣｌ（７５ｍｇ／ｍＬ）、１ｍＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１２．５ｇ／１００ｍＬ）。
【０２３５】
微量金属の配合（１００×）：１０．０ｇ／Ｌのクエン酸、１．５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０．０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２０ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３０ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ。
【０２３６】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の形質転換：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、他に特に明記しない限り、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２３２−２３５）にしたがって実施した。手短には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属をＹＰＤプレート上に画線し、３０℃でおよそ１８時間増殖させた。プレートから多めの数ループ分の細胞を擦り取り、２．２５ｍＬの５０％のＰＥＧ（平均ＭＷ３３５０）、０．１２５ｍＬの２Ｍの酢酸リチウム（ｐＨ６．０）および０．１２５ｍＬの２ＭのＤＴＴを含有する１ｍＬの形質転換バッファー中に再懸濁させた。次に、およそ５００ｎｇの線状化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞中でインキュベートし、ボルテックスミキサーを用いて１５分間隔で撹拌しながら３９℃で１時間維持した。細胞は選択培地プレート上でプレーティングし、３０℃で２〜３日間にわたり維持した。
【０２３７】
長鎖ジカルボン酸（ＬＣＤＡ）生成のためのフラスコ培養：１ループの新鮮画線ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）細菌培養管中の３ｍＬのＭＭ培地に接種し、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で一晩（約２０時間）増殖させた。一晩培養した細胞を使用して２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内で５０ｍＬのＹ２Ｐ１Ｄ２−Ｂ液体培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで振とうした。２４時間後、培養は、２．０ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３および１．０ｍＬのグルコース溶液（２００ｇ／Ｌ）を添加することによってｐＨ８．０へ調整した。次に、１．５ｍＬのパルミチン酸エチル（基質）を最終濃度が２３ｍｇ／ｍＬとなるように培養培地に直接加え、この培養物を２５０ｒｐｍ、３０℃で４日間にわたり振とうした。各フラスコ培養からの全ブロスサンプルをＬＣＤＡ分析にかけた。
【０２３８】
ＬＣＤＡ生成のための微量発酵：
微量発酵槽分析のための菌株は、冷凍ストックからＹＰＤ寒天プレート上の単一コロニーに増殖させた。単一コロニーは１５ｍＬのＦＡＬＣＯＮ培養管中の３ｍＬの最少培地中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。これらの培養から、１ｍＬの種培養および１ｍＬの５０％のグリセロールストックを用いて発酵バイアルを作成し、−８０℃で保管した。発酵バイアルを解凍し、２００μＬの培養を使用して２４ウエルカセット内の１ウエル当たり４ｍＬのＭＦ培地に接種した。微量発酵槽は３０℃、７００ｒｐｍ、最初の２４時間については２０のＤＯおよびラン中の残り７２時間については７５のＤＯを用いてで作動させた。ＭＦバッファー１培地は、各ウエルに２４時間後（２００μＬ）、３２時間後（１５０μＬ）、４８時間後（１５０μＬ）、５６時間後（１５０μＬ）および７２時間後（５０μＬ）に添加した。パルミチン酸エチル基質は、各ウエルに２４時間後（２０μＬ）、３２時間後（３０μＬ）、４８時間後（２０μＬ）、５６時間後（３０μＬ）、７２時間後（２０μＬ）および８０時間後（３０μＬ）に添加した。微量発酵槽培養を９６時間後に収穫し、ＬＣＤＡ分析のためにアリコートを採取した。
【０２３９】
２５０ｍＬのフラスコ培養からのＬＣＤＡ抽出および分析：
全ブロスサンプル（１．０ｍＬ）は、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）製セプタムを備えるネジ蓋付きガラスバイヤル内に収穫した。サンプルは、１ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨ３．０に酸性化し、次に５．０ｍｇ／ｍＬのミリスチン酸内部標準物質を含有する１．０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１回抽出した。サンプルをボルテックスミキサーにかけ、その後に水相および有機相は４５００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって分離させた。有機ＭＴＢＥ相（ＬＣＤＡを含有する）アリコート（０．５ｍＬ）を新規なバイアルに移し、メチル基を備えるＬＣＤＡ生成物の誘導体化は０．５ｍＬのメタノール性Ｈ２ＳＯ４（５％ｖ／ｖ）の添加により実施し、８０℃で１時間加熱した。誘導体化後、１ＭのＮａＣｌ水溶液（０．５ｍＬ）を加え、サンプルをボルテックスミキサーにかけると、静止後に相分離した。メチル誘導体化ＬＣＤＡ生成物を含有する上方のＭＴＢＥ有機相は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析のために収集した。化合物保持時間および質量スペクトルデータは、商業規格からのメチルエステルについて測定された化合物保持時間および質量スペクトルデータと比較した（Ｕｌｔｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏｒｔｈ  Ｋｉｎｇｓｔｏｗｎ，ＲＩ）。ＧＣ分析は、Ｏｍｅｇａｗａｘ（登録商標）３２０溶融シリカ毛細管カラム、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を装備した７８９０  ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて実施された。水素は、分割比１０：１および入口圧力１８．０ｐｓｉを用いて５．５ｍＬ／分でキャリアーガスとして使用した。オーブン温度は、最初は２００℃にプログラミングし、次に直ちに２５℃／分で２４０℃へ上昇させた；検出器は２６０℃であった。
【０２４０】
２Ｌの発酵サンプルからのＬＣＤＡの抽出および分析：
本方法は、１００μＬの全ブロスサンプルを反応バイアルへ移す工程を含んでいた。サンプル重量を測定し、化学天秤を使用して±０．１ｍｇまで記録した。移した直後、メチル基を備えるＬＣＤＡ生成物の誘導体化は、１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬのミリスチン酸内部標準物質（トルエン中で提供された）および２．０ｍＬのメタノール性Ｈ２ＳＯ４（５％ｖ／ｖ）を添加し、この反応バイアルを８０℃で１時間加熱することによって実施した。誘導体化後、溶媒抽出は、２．０ｍＬの１ＭのＮａＣｌ水溶液および２．０ｍＬのヘキサンを反応混合液に添加することによって実施した。ＦＩＤを備えるＧＣによる分析のために、誘導体化生成物を含有する上方のヘキサン有機相を収集した。化合物保持時間および質量スペクトルデータは、商業規格からのメチルエステルについての化合物保持時間および質量スペクトルデータと比較された（Ｕｌｔｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏｒｔｈ  Ｋｉｎｇｓｔｏｗｎ，ＲＩ）。サンプル中のＬＣＤＡ生成物の濃度は、ミリスチン酸内部標準物質に関連付けて計算した。ＧＣ分析は、Ｏｍｅｇａｗａｘ（登録商標）３２０溶融シリカ毛細管カラム、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．）を装備した６８９０  ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施された。ヘリウムは、分割比２０：１および入口圧力１８．０ｐｓｉを用いて２．８ｍＬ／分でキャリアーガスとして使用した。オーブン温度は、最初は１６０℃にプログラミングし、次に直ちに５℃／分で２００℃へ上昇させ、１０℃／分で２４０℃へ上昇させ４分間保持した。検出器は２６０℃であった。
【０２４１】
植物油系基質からＬＣＤＡを生成するためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母を工学的に操作するための戦略
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、炭素源としてのグルコースを用いて窒素制限条件下で増殖させた場合に２５％超の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）で脂質を生成する非従来型油脂性酵母である。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は強力なβ酸化能力を有するので、この酵母は例えばｎ−アルカン、油、脂肪および脂肪酸などの疎水性基質を単独炭素源として容易に使用することができる。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に脂肪酸または脂肪酸エステルが供給されると、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は４０％を超えるＤＣＷで脂質を生成することができる。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に供給される脂肪酸および／または脂肪酸エステルの大多数は、トリアシルグリセロールの形態で貯蔵される。
【０２４２】
図１は、脂肪酸β酸化およびω酸化態様を含む、脂質代謝経路を示している。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、極めて弱いω酸化能力（図１において破線で表示されている）を有する。この低活性のために、酵母（野生型）に植物油、植物油由来脂肪酸または脂肪酸エステルが供給された場合には、検出可能なＬＣＤＡは生成されない。植物油、植物油由来脂肪酸または脂肪酸エステルをＬＣＤＡに転換させるためにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を工学的に操作するための戦略は、図２に例示されており、下記の：（１）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）およびリン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）をコードする遺伝子をノックアウトすることにより貯蔵脂質を減少させる工程；（２）ペルオキシソーム生物発生因子（ＰＥＸ）をコードする遺伝子をノックアウトすることによってペルオキシソーム内のβ酸化を減少もしくは除外する工程；（３）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ）およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）遺伝子を過剰発現させることによってω酸化を強化する工程が含まれる。
【０２４３】
したがって、図１および２に示したように、細胞膜を越える細胞質内への脂肪酸輸送の速度および程度は、脂肪酸トランスポーターおよび長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性によって、工学的Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞内でのＬＣＤＡの生成に影響を及ぼすと考えられる。実際に、下記に開示するように、長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼのアップレギュレーションは、工学的ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞内でのＬＣＤＡの生成を増加させることが見いだされた。
【０２４４】
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの推定長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子
本実施例では、微生物中で長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝産物を生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼの候補配列の同定について記載する。
【０２４５】
細胞内に輸送される脂肪酸は、エステル化によって活性化されなければならない。長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ酵素は、脂肪酸を補酵素Ａにコンジュゲートさせることによるこの活性化工程を触媒して、脂肪酸アシル−ＣｏＡを形成する。Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内には中鎖および長鎖脂肪酸に対する特異性を有するアシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする４種の遺伝子（ＦＡＡ−１、−２、−３、−４）が存在する。例えば、ＦＡＡ１はＣ１２〜Ｃ１６の鎖長を備える脂肪酸を好むアシル−ＣｏＡシンテターゼＳｃＦａａ１ｐ（配列番号３３）をコードし、およびＦＡＡ２はＣ９〜Ｃ１３の鎖長を備える脂肪酸を好む酵素ＳｃＦａａ２ｐ（配列番号３４）をコードする（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２７：７５１−７６２；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８６：１８−２７）。
【０２４６】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内のＦＡＡホモログを同定するために、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムデータベース（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ．ｏｒｇ／ｙａｌｉ．ｈｔｍｌ）内の予測オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列によってコードされるアミノ酸配列をＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｆａａ１ｐ（配列番号３３）およびＦａａ２ｐ（配列番号３４）の予測アミノ酸配列に対して整列させた。これらのＢＬＡＳＴ分析によって１５個のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦが同定された（表２）。これらのＯＲＦによってコードされた１５個のＦａａ１ｐおよびＦａａ２ｐホモログ中、１２個はペルオキシソーム性（ペルオキシソーム局在化シグナルを含有する）であると予測されたが、３個は未知の細胞局在化情報を有していた。
【０２４７】
【表８】
2018519843.tif 000011
【０２４８】
別々に、Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｆａａ１ｐ（配列番号３３）およびＦａａ２ｐ（配列番号３４）アミノ酸配列をカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のゲノム（ｗｗｗ．ｃａｎｄｉｄａｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｍｐｕｔｅ／ｂｌａｓｔ＿ｃｌａｄｅ．ｐｌ＃Ｓｅｌｅｃｔ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）によってコードされたアミノ酸配列に対して整列させた。全６個の候補ＯＲＦが同定された。これらのＯＲＦ中３個は推定ペルオキシソーム局在化シグナルを含有するアミノ酸配列をコードしたので、したがってペルオキシソームタンパク質をコードすると予測された。表３は、これらの候補配列の各々を列挙している。
【０２４９】
【表９】
2018519843.tif 000012
【０２５０】
Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｆａａ１ｐ（配列番号３３）およびＦａａ２ｐ（配列番号３４）のアミノ酸配列、１５種のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補および６種のＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補をＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩソフトウェアを使用して整列させた。このアラインメントから生じた系統樹は、図３に示した。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属候補ＹｌＡｃｏＳ−２Ｐ（配列番号３７）、−３Ｐ（配列番号３９）、−４Ｐ（配列番号４０）、−５Ｐ（配列番号４２）、−６Ｐ（配列番号４４）、−７Ｐ（配列番号４５）、−９Ｐ（配列番号４７）、−１０Ｐ（配列番号４９）、−１１Ｐ（配列番号５０）および−１２Ｐ（配列番号５１）は、一緒にクラスター化して１つの群を形成した。これらの配列は全部がペルオキシソームタンパク質であると予測される。６種のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補ＹｌＦａａ１（配列番号３６）、ＹｌＡｃｏＳ−８（配列番号４６）、−１３Ｐ（配列番号５２）、−１４（配列番号５３）、−１５Ｐ（配列番号５４）は２種のＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アシル−ＣｏＡシンテターゼと一緒にクラスター化した。ＳｃＦａａ１（配列番号３３）は、ＣＡ−１（配列番号５７）およびＹｌＦａａ１（配列番号３６、図３における「ＹＡ−１」）と密接に関連している。ＳｃＦａａ２（配列番号３４）およびＣＡ−２〜−６は１つの群を形成し、ＹｌＡｃｏＳ−８（配列番号４６、−１３Ｐ（配列番号５２）、−１４（配列番号５３）および−１５Ｐ（配列番号５４）は第３グループを形成した。
【０２５１】
したがって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の候補長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの配列が同定された。
【０２５２】
実施例２
工学的Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞内での候補長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現パターン
本実施例では、培地への基質添加の条件下で誘導される配列を同定するためのｑＲＴ−ＰＣＲによる、実施例１において同定されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補のスクリーニングについて説明する。その発現が脂肪酸含有基質によって誘導される任意の長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの配列は、基質移入を促進するための候補酵素であろう。
【０２５３】
ＬＣＤＡを生成するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株であるＤ０１４５（下記の実施例１３はこの菌株の構築について記載する）は、３０℃、振とう速度２５０ｒｐｍで０．１５の出発ＯＤ６００を用いて、Ｙ２Ｐ２Ｄ２増殖培地（２０ｇ／Ｌの酵母抽出物；２０ｇ／ＬのＢＡＣＴＯ−ＰＥＰＴＯＮＥ；２０ｇ／Ｌのグルコース）を含む２５０ｍＬのフラスコ内の５０ｍＬ培養中で３回ずつ増殖させた。２４時間後、ＲＮＡ抽出およびＬＣＤＡ定量それぞれのために０．５ｍＬおよび１ｍＬの「第０日」培養サンプルを収集した。残りの培養については、ｐＨを８．０に調整するために１ＭのＮａＨＣＯ３を加え、その後にパルミチン酸エチル基質を最終濃度が３％になるまで加えた。基質添加の２４時間後、ＲＮＡ抽出およびＬＣＤＡ定量それぞれのために０．５ｍＬおよび１ｍＬの「第１日」培養サンプルを収集した。図４は、様々な時点での菌株Ｄ０１４５によるＬＣＤＡの生成を示している。培地へのパルミチン酸エチル添加前にＬＣＤＡの生成は見られなかったが、基質添加後にはそのような生成が生じ、これは定常速度で約第２日まで増加した（図４）。
【０２５４】
ＲＮＡサンプルを調製するために、第０日および第１日の各培養からの０．５ｍＬのアリコートを１３，０００×ｇでの１分間の遠心分離によって採取した。細胞ペレットを直ちに凍結し、−８０℃で貯蔵した。全ＲＮＡは各細胞ペレットからＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して調製した。細胞破砕は、ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ−８（ＢＳＰ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を使用して実施した。各サンプルから抽出した全ＲＮＡを次にＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（商標）キットを使用して精製した。任意の残留ゲノムＤＮＡを除去するために、３μｇの全ＲＮＡはＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理した。ＤＮａｓｅは次に、１ｍＭのＥＤＴＡを添加し、７５℃で５分間加熱することによって不活性化した。１μｇのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡは、次に高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して相補的（ｃＤＮＡ）に転換させた。ｃＤＮＡは次に、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のためにＲＮａｓｅフリー水中に１：１０で希釈した。
【０２５５】
ｑＰＣＲは、表４に列挙した標的遺伝子の発現を検出するために実施した。表４に列挙した全プライマーは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳのバージョン３．０．１のソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して設計した。プライマーは、ＢＬＡＳＴ分析によってＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓデータベース（ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ．ｏｒｇ／ｙａｌｉ．ｈｔｍｌ）に対して特異性について評価し、ゲノムＤＮＡを使用する定量について妥当性を確認した（データは示していない）。０．８５〜１．１５の間のＰＣＲ効率を備えるプライマーを定量のために妥当性を確認した。全ｑＰＣＲ反応は、ＡＢＩ７９００  ＳＤＳ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上での検出のためにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを使用して３回ずつ実施した。相対発現（ＲＱ）は、Ｄａｔａ  Ａｓｓｉｓｔソフトウェアのバージョン３．０１およびΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して計算した。１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子は、このソフトウェアによって最適内因性コントロール遺伝子であると同定されたので、データ正規化のために利用した。第１日の各遺伝子の相対発現は、次に、その発現を１．０に設定されたその第０日の発現と比較することによって計算した。
【０２５６】
【表１０】
2018519843.tif 000013
【０２５７】
表５（下記）は、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。第０日（Ｄ０）および第１日（Ｄ１）サンプルそれぞれの発現測定値（ＳＹＢＲ）は、１．００に設定されたサンプル第０〜１日（「Ｄ０〜１」）に比例している。各データポイントは、３回の独立ＰＣＲ反応によってランし、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現に正規化した。「ＳＹＢＲ  ＳＤ」値は、ＰＣＲ反応の各３例についての標準偏差である。ＹｌＡｃｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）、ＹｌＡｃｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）およびＹｌＡｃｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする転写産物は、第０日の発現に比較して第１日に相対発現における４倍を超える増加を示した（表５のグレーのセルを用いて示した。
【０２５８】
【表１１】
2018519843.tif 000014
【０２５９】
表５に記載のデータに基づくと、ＹｌＡｃｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）、ＹｌＡｃｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）およびＹｌＡｃｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）の推定長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現は、長鎖脂肪酸含有基質を用いた処理後にはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で誘導される。このためこれらの長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼは、長鎖脂肪酸含有基質の移入を促進するために有用な可能性がある。
【０２６０】
実施例３
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のための推定長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードするポリヌクレオチド配列のコドン最適化
長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）およびＹｌＦＡＡ（配列番号３６）をコードするＤＮＡオープンリーディングフレームは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７１２５６７２号明細書に開示された方法にしたがってＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における高度の発現のためにコドン最適化した。したがって、ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）およびＹｌＦａａ１（配列番号３６）をそれぞれコードするポリヌクレオチド配列ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３８）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４１）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４３）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４８）およびＹｌＦＡＡ１（配列番号３５）を調製した。コドン最適化ＤＮＡ配列のそれぞれは、個別に合成し、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号６３）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号６４）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号６６）およびｐＺＫＬ７Ａ−ＦＹｌＦＡＡ（配列番号６７）（それぞれ図５Ａ〜Ｅ）を生成するためにＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって発現ベクター内にクローニングした。ＹｌＡｃｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）の短縮バージョン（アミノ酸６個のＣ末端切断）であるＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５６）の発現を可能にするまた別のベクターであるｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号６８、図５Ｆ）もまた調製した。
【０２６１】
上記の構築物は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属内で長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補を過剰発現させるために使用することができる。
【０２６２】
実施例４
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内での長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補の発現
本実施例は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内のＴ７誘導性プロモーター下でのアシル−ＣｏＡシンテターゼ候補ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）、ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５６、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐのアミノ酸６個のＣ末端切断バージョン）およびＹｌＦＡＡ（配列番号３６）を過剰発現させる工程を開示する。
【０２６３】
最初に、ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３８）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４１）、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４３）、ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４８）、ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５５）およびＹｌＦＡＡ（配列番号３５）（それぞれヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における発現のためにコドン最適化されている）のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号６３）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号６４）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号６６）、ｐＺＰ２−ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号６８）およびｐＺＫＬ７Ａ−ＦＹｌＦＡＡ（配列番号６７）（図５Ａ〜Ｆ）からＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ使用して切断し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位で個別ｐＥＴ２３ｄベクター（配列番号６９）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にライゲートした。制限分析を使用して、各ライゲーションを検証した（データは示していない）。
【０２６４】
各推定長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現させるために、適切なｐＥＴ２３ｄをベースとするプラスミドを用いて形質転換させ、ＬＢＡＭＰ培地（ＡＭＰ：アンピシリン、最終濃度１００μｇ／ｍＬ）中で増殖させたＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＢＬ（ＤＥ３）の８時間培養を５００ｍＬフラスコ内の１００ｍＬの同一培地中に１：５０で希釈した。各培養は６００ｎｍでの光学密度が０．８〜０．９に達するまで３７℃で振とうし、その後にフラスコを１８℃のインキュベーター内に約２０分間配置し、その後にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１００μＭとなるまで添加した。各培養は、次に１８℃でさらに１０〜１２時間振とうした。細胞（１５ｍＬの培養からの約１００ｍｇの湿塊）を遠心分離によって収集し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、次に４００μＬの溶解バッファー（２５％のグリセロール、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰｉｅｒｃｅ製のＢＵＧＢＵＳＴＥＲ  ＨＴ）中に再懸濁させ、２０分間にわたり室温の振とうプラットフォーム上でインキュベートした。細胞断片は、４℃で３０分間にわたり１２，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。後に続く酵素アッセイを妨害する可能性がある上清から小分子を除去するために、上清を１０ＫＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心分離装置内に配置し、４℃、１２，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。保持されたタンパク質溶液（約５０〜１００μＬ）を４００μＬ（最終体積）のバッファー（０．１ＭのＫＰｉ、２０％のグリセロール（ｐＨ７．５））中に再懸濁させ、再び４℃、１２，０００×ｇで３０分間にわたり１回遠心分離した。濃縮タンパク質溶液を約２００μＬの最終体積の０．１ＭのＫＰｉ、２０％のグリセロール（ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、新規な遠心分離管に移し、いずれかの沈降タンパク質を除去するために最高速度で短時間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、タンパク質濃度の決定および酵素アッセイのために使用した浄化上清を−８０℃で貯蔵した。図６ＡおよびＢに示したように、全６種のアシル−ＣｏＡシンテターゼ候補は、ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）を除いてＥ．コリ（ｃｏｌｉ）内で上首尾で過剰発現させ、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）細胞溶解物の可溶性分画で見いだされた。
【０２６５】
実施例５
長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補の比活性の決定
本実施例では、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補の比活性の分析について開示する。詳細には、可溶性Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）分画（実施例４で生成）中に存在するアシル−ＣｏＡシンテターゼ候補を基質としてパルミチン酸もしくはｐ−クマル酸のいずれかを使用して活性について試験した。
【０２６６】
パルミチン酸基質上の各長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補の比活性は、下記のように決定した。推定アシル−ＣｏＡシンテターゼによる浄化上清（実施例４）中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の形成は、下記のスキーム（１→４）に描出したように、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＮＡＤＨ、ミオキナーゼおよびピルビン酸キナーゼの存在下で、乳酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの酸化（３４０ｎｍの吸光度によって監視）と結合した：
１．ＲＣＯＯＨ（脂肪酸基質）＋ＣｏＡＳＨ＋ＡＴＰ←→ＲＣＯＳＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ（アシル−ＣｏＡシンテターゼが触媒した）。
２．ＡＭＰ＋ＡＴＰ←→２ＡＤＰ（ミオキナーゼが触媒した）。
３．２  ＡＤＰ＋２  ＰＥＰ→２ＡＴＰ＋２ピルビン酸（ピルビン酸キナーゼが触媒した）。
４．２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ→２乳酸＋２ＮＡＤ＋（乳酸デヒドロゲナーゼが触媒した）。
【０２６７】
詳細には、各アッセイ（３００μＬの最終体積）は３０℃で実施し、下記を含有していた：１ｍＭのパルミチン酸（ＤＭＳＯ中で作成した１０ｍＭのストック液から希釈した）、４ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのＣｏＡＳＨ、１ｍＭのＰＥＰ、５単位のピルビン酸キナーゼ、５単位の乳酸デヒドロゲナーゼ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中の６単位のミオキナーゼ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）。この反応プロセスは、候補長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼを含有する適切な量の細胞溶解物（実施例４）を添加することによって開始した。３４０ｎｍでのＮＡＤＨの（ＮＡＤ＋への）酸化は、Ｃａｒｙ−１００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞抽出物の添加後５分間にわたり監視した。初期勾配は、パルミチン酸基質がＤＭＳＯと交換された酵素アッセイにおいて観察された背景活性を減じることによって計算した。
【０２６８】
パルミチン酸基質に対して上記で測定した推定長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの比活性は、下記の表６に要約した。比活性測定値はｍＵ／ｍｇで提供されるが、このとき１単位は、３０℃およびｐＨ７．２；ＮＡＤＨの吸光度係数＝６，２２０Ｍ−１／ｃｍで、１ｍＭのパルミチン酸、４ｍＭのＡＴＰおよび１．５ｍＭのＣｏＡの存在下で１分間当たり１．０μモルのパルミトイル−ＣｏＡを生成する酵素の量に対応する。コントロール細胞（空ｐＥＴ２３ｄベクターを用いて形質転換された）から調製された上清ならびにＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）およびＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５６）を発現する細胞から調製された上清内では、背景レベルを超える活性は検出されなかった（表６では「ｎ．ｄ．」と記載した）。
【０２６９】
アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）およびＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）に関連する配列はＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおいて推定４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼであると注記されているが、他方ＹｌＦＡＡ（配列番号３６）はＦａａ１ｐ（配列番号３３）（明確に特徴付けられたＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＣ１２：０〜Ｃ１６：０の脂肪酸への優先性を備える長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼ）との５０％の同一性を示し、上述の酵素の比活性についても基質としてのｐ−クマル酸（ｐＣＡ）を使用して試験した。ｐＣＡ基質上の各長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ候補の比活性は、下記のように決定した。各アッセイ（２５０μＬの最終体積）は３０℃で実施し、下記を含有していた：１ｍＭのｐ−クマル酸（ＤＭＳＯ中で作成された１０ｍＭのストック液から希釈した）、４ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中の１．５ｍＭのＣｏＡＳＨ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）。この反応は、候補長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼを含有する適切な量の細胞溶解物（実施例４）を添加することによって開始させた。３４０ｎｍでの吸光度の増加（ｐ−クマロイル−ＣｏＡの形成に起因する）は、Ｃａｒｙ−１００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した細胞抽出物の添加後１０分間にわたり監視した。初期勾配は、ｐＣＡがＤＭＳＯと交換された酵素アッセイにおいて観察された背景活性を減じることによって計算した。
【０２７０】
ｐＣＡ基質に対して上記で測定した推定長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの比活性は、下記の表６に要約した。比活性測定値はｍＵ／ｍｇで提供されるが、このとき１単位は１ｍＭのｐ−クマル酸、４ｍＭのＡＴＰおよび１．５ｍＭのＣｏＡの存在下で３０℃およびｐＨ７．２；クマロイル−ＣｏＡの吸光度係数＝２１，０００Ｍ−１／ｃｍで１分間当たり１．０μモルのｐ−クマロイル−ＣｏＡを生成する酵素の量に対応する。コントロール細胞（空ｐＥＴ２３ｄベクターを用いて形質転換された）から調製された上清およびＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）、ＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）、ＹｌＡＣｏＳ−５ＰＳ３（配列番号５６）およびＹｌＦＡＡ（配列番号３６）を発現する細胞から調製された上清内では、背景レベルを超える活性は検出されなかった（表６では「ｎ．ｄ．」と記載した）。
【０２７１】
【表１２】
2018519843.tif 000015
【０２７２】
これらの結果は、ＹｌＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）およびＹｌＡＣｏＳ−１０Ｐ（配列番号４９）が、基質として芳香族カルボン酸および長鎖脂肪酸の両方を受容できるという意見を支持している。これとは対照的に、ＹＩＦＡＡ１（配列番号３６）は、パルミチン酸にとって特異的であると思われる。ＹｌＡＣｏＳ−３Ｐ（配列番号３９）およびＹｌＡＣｏＳ−５Ｐ（配列番号４２）は、どちらも既定の反応条件下では２種の基質に対する活性を示さなかった。
【０２７３】
実施例６
植物油系基質からＬＣＤＡを生成するための新型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）親菌株の生成
本実施例は、多量のＬＣＤＡを生成できる菌株を生じさせる、追加の遺伝子組換えに適していたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株について開示する。
【０２７４】
上述したように、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、植物油、植物油由来脂肪酸または脂肪酸エステルからＬＣＤＡを効率的に生成するための脂質貯蔵およびβ酸化を減少もしくは排除するために工学的に操作される必要がある可能性が高い。さらに、ＬＣＤＡの生成のためには多様な遺伝的背景が有益である可能性も高い。表７に示したように、一連のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株は野生型菌株ＡＴＣＣ番号２０３６２および９０８１２から生成した。これらの菌株の一部は、脂質貯蔵能力を減少させ、β酸化機能を減少させた。図７Ａは、相互に対してこれらの菌株の一部の系統を図で示している。
【０２７５】
【表１３】
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【０２７６】
詳細には、菌株Ｄ０００４は、菌株Ｌ１８３内のＰＥＸ３遺伝子（ペルオキシソーム生物発生因子３タンパク質［Ｐｅｘ３ｐ］をコードする）をノックアウトすることによって生成した。Ｄ０００３と指名された菌株Ｌ１８３は、相同組換えによってＰＥＸ３遺伝子をノックアウトするためにプラスミドｐＹ１５７（配列番号７０、米国特許出願公開第６２／１４０，６８１号明細書における図４Ａを参照されたい）のＵＲＡ３含有ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片を用いて形質転換させた。菌株Ｔ１８７６と指名された形質転換体の１つは、リアルタイムＰＣＲによってｐｅｘ３−（すなわち、Δｐｅｘ３）であると同定された。菌株Ｔ１８７６のＰＥＸ３ノックアウト部位は、配列番号７１（野生型ＰＥＸ３遺伝子座配列に代えて）（配列番号７１の説明については表１を参照されたい）を含むと予測された。菌株Ｔ１８７６は、ＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子（ＰＥＸ３をノックアウトしたｐＹ１５７の断片によって導入された）を切断するためにＣｒｅリコンビナーゼを発現させるためにプラスミドｐＹ１１７（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１４２０８２号明細書の表２０に開示されている）を用いて形質転換させた。ｐＹ１１７形質転換体は、ＭＭ上では増殖できなかったがＭＭＵ上では増殖することができ、これはこの形質転換体にＵＲＡ３遺伝子が欠如することを示していた；この形質転換体は菌株Ｄ０００４（ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、ｕｒａ３−）と指名された。菌株Ｄ０００４のＰＥＸ３ノックアウト部位は、配列番号７２（野生型ＰＥＸ３遺伝子座配列に代えて）（配列番号７２の説明については表１を参照されたい）を含むと予測された。
【０２７７】
菌株Ｄ００１５は、菌株Ｄ０００４からＰＯＸ４遺伝子（ペルオキシソームアシル−ＣｏＡシンテターゼ−４［Ｐｏｘ４酵素、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ８００７８］）を「ポップイン／ポップアウト」法によってノックアウトすることによって生成した（このタイプのノックアウト戦略に関するこれ以上の詳細については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２２０６４５号明細書を参照されたい）。手短には、菌株Ｄ０００４は、Ｘｂａｌ消化プラスミドｐＹＲＨ１４６−Ｐｏｘ４ＫＯ（配列番号７３、米国特許出願公開第６２／１４０，６８１号明細書における図４Ｃを参照されたい）。計２８種の形質転換体をＭＭプレート上で増殖させた。ＰＣＲ分析は、その中で第一交雑（ポップイン）が天然ＰＯＸ４遺伝子の相同性３’−アーム配列と構築体ｐＹＲＨ１４６−Ｐｏｘ４ＫＯとの間であった２つの形質転換体＃７および＃１７を検出した。＃７形質転換体を取り上げ、ＹＰＤ液体培地中で増殖させ、ＹＰＤ液体培地中で増殖させ、次にＦＯＡ６００プレート上でプレーティングした（ｕｒａ３−を生じさせるポップアウトイベントのために選択するため）。ＰＣＲ分析は、ＦＯＡ６００プレート上で増殖させた菌株２８個中１３において第二交雑（各５’−アーム相同配列間）を検出した。これらの１３個の菌株中１個は、ＰＯＸ４遺伝子のノックアウトを有すると決定されたＤ００１５と指名された。Ｄ００１５は、次の遺伝子型：ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ４−、ｕｒａ３−を有している。ＰＯＸ４ノックアウト部位は、配列番号７４（野生型ＰＯＸ４遺伝子座配列に代えて）（配列番号７４の説明については表１を参照されたい）を含むと予測された。
【０２７８】
菌株Ｗ１０１は、菌株ＡＴＣＣ番号９０８１２をプラスミドｐＹＲＨ７２（配列番号７５）のＵＲＡ３含有ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ断片で形質転換させることによって生成した。
【０２７９】
二倍体菌株である１Ｄ２３７３は、Ｗ１０１をＤ０００４へ交雑させることによって生成した。
【０２８０】
菌株１Ｄ２３７３を胞子形成させると、その子孫の１つである菌株２３７３Ｉ−６は、リアルタイムＰＣＲによって交配型Ｂ遺伝子型を備える半数体であると決定された。菌株２３７３Ｉ−６は、ＳＣ−ｌｅｕ培地上では増殖することができず、菌株１Ｂ２４７９Ｉと改名された。
【０２８１】
二倍体菌株である２Ｄ２５１９は、１Ｂ２４７９ＩをＤ０００４へ交雑させることによって生成した。
【０２８２】
菌株２Ｄ２５１９を胞子形成させると、その子孫の１つである菌株２５１９Ｉ−１は、リアルタイムＰＣＲによって交配型Ｂ遺伝子型を備える半数体であると決定された。菌株２５１９Ｉ−１は、ＳＣ−ｌｅｕ培地上では増殖することができず、菌株２Ｂ２５８３Ｉであると改名された。
【０２８３】
二倍体菌株である３Ｄ２６５３は、２Ｂ２５８３ＩをＤ０００４へ交雑させることによって生成した。
【０２８４】
菌株３Ｄ２６５３を胞子形成させると、その子孫の１つである菌株２６５３Ｉ−１９は、リアルタイムＰＣＲによってｄｇａｔ２−、ＭＡＴＢの遺伝子型を備える半数体であると決定された。菌株２６５３Ｉ−１９は、ＳＣ−ｌｅｕ培地上では増殖することができず、菌株３Ｂ２７０２Ｉであると改名された。
【０２８５】
菌株Ｄ００１５は、二倍体菌株である４Ｄ２７３８を生成するために菌株３Ｂ２７０２Ｉへ交雑させた。
【０２８６】
菌株４Ｄ２７３８を胞子形成させると、その子孫の１つである菌株２７３８Ｙ−１４は、リアルタイムＰＣＲによってｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｏｘ４−、ｐｅｘ３−およびＭＡＴＡの遺伝子型を備える半数体であると決定された。菌株２７３８Ｙ−１４は、ＭＭ培地上では増殖することができず、Ｄ００１７であると指名された。
【０２８７】
菌株４Ｄ２７３８を胞子形成させると、その子孫の１つである菌株２７３８Ｙ−４５は、リアルタイムＰＣＲによってｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｏｘ４−およびｐｅｘ３−の遺伝子型を備える半数体であると決定された。菌株２７３８Ｙ−４５は、ＳＣ−ｕｒａもしくはＳＣ−ｌｅｕプレート上では増殖することができなかった。このため、菌株２７３８Ｙ−４５は、ＭＡＴＡ、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ４−、ｕｒａ３−およびｌｅｕ２−の遺伝子型を有する。
【０２８８】
菌株７７Ｔ５−５は、一段階アプローチによって２７３８Ｙ−４５からＰＯＸ３遺伝子を欠失させることによって生成した。菌株２７３８Ｙ−４５は、プラスミドｐ１２＿３−Ｂ−Ｐｅｘ３ｄｅｌ１（図８Ａ、配列番号７６）のＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片を用いて形質転換させた。形質転換体の１つは、リアルタイムＰＣＲによってｐｏｘ３−であると同定された。この形質転換体は、７７Ｔ５−５（ＭＡＴＡ、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｌｅｕ２−、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋）であると指名された。
【０２８９】
菌株Ｄ００３１は、一段階アプローチによって７７Ｔ５−５からＰＯＸ２遺伝子を最初に欠失させることによって生成した。菌株７７Ｔ５−５は、プラスミドｐ７０  Ｐｏｘ２：：Ｌｅｕ２（図８Ｂ、配列番号７７）のＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片を用いて形質転換させた。形質転換体１１８Ｔ１−１４の１つは、リアルタイムＰＣＲによってｐｏｘ２−であると同定された。菌株１１８Ｔ１−１４（ＭＡＴＡ、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋）は順に、プラスミドｐＹ１１７（ＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子（前の段階でｐ１２＿３−Ｂ−Ｐｅｘ３ｄｅｌ１によって導入された）を切断するためにＣｒｅリコンビナーゼを発現させるために（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１４２０８２号明細書の表２０に開示されている）を用いて形質転換された。形質転換体の１つである１１８Ｔ１−１４−７−１Ｕは、ＭＭ上では増殖できなかったがＭＭＵ上では増殖することができ、これはこの形質転換体にＵＲＡ３遺伝子が欠如することを示していた；この形質転換体は菌株Ｄ００３１（ＭＡＴＡ、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、ｕｒａ３−）と指名された。
【０２９０】
したがって、一部の欠如する機能的ＰＥＸ３（ｐｅｘ３−）、ＰＯＸ２（ｐｏｘ２−）、ＰＯＸ３（ｐｏｘ３−）およびＰＯＸ４（ｐｏｘ４−）遺伝子を含む所定のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株が生成された。これらの菌株は、有意な量のＬＣＤＡを生成できた菌株を生じさせる、追加の遺伝子組換えに適していた（下記の実施例）。
【０２９１】
実施例７
ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素を過剰発現させることによるＬＣＤＡの生成のためのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ１０１７の生成
本実施例は、菌株Ｄ００３１におけるＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素をコードするコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ１０１７の構築について開示する。菌株Ｄ１０１７は、菌株Ｄ３９２８を発生させるために使用した中間菌株であった（図７Ｂ）。
【０２９２】
構築体ｐＺＫＬＹ−ＦＣｔＲ１７Ｕ（図９Ａ、配列番号８２）は、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のコドン最適化ＣＹＰ５２Ａ１７（ＣｔＣＹＰＡ１７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ７３９５８、配列番号８４をコードする配列番号８３）およびＣＰＲ（ＣｔＣＰＲ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３７２０１、配列番号８６をコードする配列番号８５）コーディング配列のそれぞれ１コピーを含有する。各コーディング配列は、異種プロモーターおよび３’−ターミネーター配列の制御下にあった。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位は、それぞれＣｔＣＹＰＡ１７もしくはＣｔＣＰＲをコードするコドン最適化配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＺＫＬＹ−ＦＣｔＲ１７Ｕプラスミド（配列番号８２）の構成成分については、表８で詳細に記載する。
【０２９３】
【表１４】
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【０２９４】
プラスミドｐＺＫＬＹ−ＦＣｔＲ１７Ｕ（配列番号８２）はＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ００３１を形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に３０℃で液体ＭＭ中に接種し、２５０ｍＬで１日間振とうした。一晩培養した細胞を使用して２５０ｍＬのフラスコ内で２５ｍＬのＹＰＤ４−Ｂ液体培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで振とうした。４０時間後、培養は２．０ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチル（Ｗ２４５１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度が８ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、１８０ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０２９５】
ＧＣ分析は、親菌株Ｄ００３１においてヘキサデカン二酸（Ｃ１６：０のＬＣＤＡ）が検出されないことを示した。しかし、親菌株Ｄ００３１の大多数の形質転換体は、８ｇ／Ｌを超えるＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。形質転換体＃６、＃８、＃１０および＃１１は、それぞれ９．５、９．５、１２．１および９．１ｇ／ＬのＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。これらの４種の菌株は、それぞれＤ１０１５、Ｄ１０１６、Ｄ１０１７およびＤ１０１８と指名された。
【０２９６】
その後に、菌株１０１５、Ｄ１０１６およびＤ１０１７のフラスコ分析を実施した。詳細には、Ｄ１０１５、Ｄ１０１６およびＤ１０１７菌株は、最終濃度が１６ｍｇ／ｍＬとなるまで添加したパルミチン酸エチルとともに、それぞれ２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内の５０ｍＬの培養中に配置した。培養は、４日間にわたり１８０ｒｐｍ、３０℃で振とうした。菌株Ｄ１０１５、Ｄ１０１６およびＤ１０１７は、それぞれ約７．４、７．６および９．３ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０２９７】
菌株Ｄ１０１７はさらに、微量発酵分析によっても分析した。コントロール菌株（Ｄ０２８５、データは示していない）は６．４ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成したが、菌株Ｄ１０１７は約７．４ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０２９８】
菌株Ｄ１０１７およびその子孫を産生するためにＤ００３１を形質転換させるために使用したｐＺＫＬＹ−ＦＣｔＲ１７Ｕ（配列番号８２）ＤＮＡは、リパーゼＹ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５４９５１９）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２と比較してＤ１０１７およびその子孫の遺伝子型は、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋、不明１−、ＦＢＡ：：ＣｔＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ１：：ＣｔＣＹＰＡ１７ｓ：：Ｐｅｘ２０であった。
【０２９９】
したがって、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ１０１７が生成され、これはフラスコアッセイにおいて長鎖脂肪酸含有基質が供給されると５ｇ／Ｌを超えるＬＣＤＡ生成物を生成することができた。
【０３００】
実施例８
脂肪族アルコールオキシダーゼおよび脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼを過剰発現させることによるＬＣＤＡの生成のためのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ１３０８の生成
本実施例は、カンジダ・クロアカエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｌｏａｃａｅ）脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）およびＣ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ）酵素をコードするコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ１３０８の構築を開示する。菌株Ｄ１３０８は、菌株Ｄ３９２８を発生させるために使用された中間菌株であった（図７Ｂ）。
【０３０１】
最初に、菌株Ｄ１０１７Ｕは、菌株Ｄ１０１７から発生した。プラスミドｐＹ１１７は、菌株Ｄ１０１７内のＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子を切断するためのＣｒｅリコンビナーゼの一時的発現のために使用した。ｐＹ１１７形質転換体は、ＭＭ上では増殖できなかったがＭＭＵ上では増殖することができ、これはこの形質転換体にＵＲＡ３遺伝子が欠如することを示していた；この形質転換体は菌株Ｄ１０１７Ｕと指名された。
【０３０２】
次に、Ｄ１０１７Ｕは、線状化プラスミド構築体ｐＺＫＡＤｎーＣ２Ｆ１Ｕ（図９Ｂ、配列番号８７）を用いて形質転換された。この断片は、１つはＦＡＯ酵素（ＣｃＦＡＯ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ７５３５１、配列番号８９をコードする配列番号８８）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるため、およびもう１つはＦＡＬＤＨ酵素（ＣｔＦＡＬＤＨ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２５５０７１２、配列番号９１をコードする配列番号９０）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるための２つの発現カセットを含有していた。ｐＺＫＡＤｎ−Ｃ２Ｆ１Ｕプラスミド（配列番号８７）の構成成分については、表９で詳細に記載する。
【０３０３】
【表１５】
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【０３０４】
プラスミドｐＺＫＡＤｎ−Ｃ２Ｆ１Ｕ（配列番号８７）はＡｓｃＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ１０１７Ｕを形質転換させるために使用した。形質転換体細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に２４ウエルブロック内のＹＰＤ２−Ｂ液体培地中に接種し、これを次に３０℃、３７５ｒｐｍで２０時間にわたり振とうした。培養は０．１２ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチルを最終濃度が２３ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、３７５ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３０５】
ＧＣ分析は、菌株Ｄ１０１７Ｕの３つの形質転換体が１０ｇ／Ｌを超えるＣ１６：０のＬＣＤＡを生成することを証明した。詳細には、形質転換体＃２、＃５および＃１０は、それぞれ１０．２、１４．５および１０．８ｇ／ＬのＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。これら３種の菌株は、それぞれＤ１３０７、Ｄ１３０８およびＤ１３０９と指名された。
【０３０６】
菌株Ｄ１３０７およびＤ１３０８はさらに、微量発酵分析によっても分析した。コントロール菌株（Ｄ０２８５、データは示していない）は約６．０ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成したが、菌株Ｄ１３０７およびＤ１３０８はそれぞれ約９．７および１０．８ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０３０７】
菌株Ｄ１３０８は、さらに２Ｌ発酵実験を使用して試験した。表１０および図１０に示したように、菌株Ｄ１３０８は、１６２時間の発酵後に、総量が約５０．９ｇ／ＬのＬＣＤＡを生成し、それらのうち約４２．６ｇ／ＬはＣ１６：０のＬＣＤＡであった。
【０３０８】
【表１６】
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【０３０９】
菌株Ｄ１３０８およびその子孫を産生するためにＤ１０１７Ｕを形質転換させるために使用したｐＺＫＡＤｎ−Ｃ２Ｆ１Ｕ（配列番号８７）ＤＮＡは、アルコールデヒドロゲナーゼ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７５２７３）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２と比較したＤ１３０８およびその子孫の遺伝子型は、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋、不明１−、不明２−、ＦＢＡ：：ＣｔＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ１：：ＣｔＣＹＰＡ１７ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＤＧ２Ｐｒｏ−７１５：：ＣｔＡＬＤＨ２ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ１Ｌ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ａｃｏであった。
【０３１０】
したがって、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ１３０８が生成され、長鎖脂肪酸含有基質が供給されると、５０ｇ／Ｌを超えるＬＣＤＡ生成物を生成できた。
【０３１１】
実施例９
７０ｇ／Ｌを超えるＬＣＤＡ生成のためのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ２３００の生成
本実施例は、菌株Ｄ１３０８におけるＶ．サティバ（ｓａｔｉｖａ）ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素をコードするコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ２３００の構築について開示する。菌株Ｄ２３００は、菌株Ｄ３９２８を発生させるために使用した中間菌株であった（図７Ｂ）。
【０３１２】
最初に、菌株Ｄ１３０８Ｕは、菌株Ｄ１３０８から発生した。プラスミドｐＹ１１７は、菌株Ｄ１３０８内のＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子を切断するためのＣｒｅリコンビナーゼの一時的発現のために使用した。ｐＹ１１７形質転換体は、ＭＭ上では増殖できなかったがＭＭＵ上では増殖することができ、これはこの形質転換体にＵＲＡ３遺伝子が欠如することを示していた；この形質転換体は菌株Ｄ１３０８Ｕと指名された。
【０３１３】
次に、菌株Ｄ１３０８Ｕは、線状化プラスミド構築体ｐＹＲＨ２１３（図１１Ａ、配列番号９２）由来のＤＮＡ断片を用いて形質転換された。この断片は、１つはＣＹＰ酵素（ＶｓＣＹＰ９４Ａ１ｓ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１０２０４、配列番号９４をコードする配列番号９３）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるため、およびもう１つはＣＰＲ酵素（ＶｓＣＰＲｓ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２６２５２、配列番号９６をコードする配列番号９５）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるための２つの発現カセットを含有していた。各コーディング配列は、異種プロモーターおよび３’−ターミネーター配列の制御下にあった。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位は、それぞれＶｓＣＹＰもしくはＶｓＣＰＲをコードするコドン最適化配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＹＲＨ２１３プラスミド（配列番号９２）の構成成分については、表１１で詳細に記載する。
【０３１４】
【表１７】
2018519843.tif 000020
【０３１５】
プラスミドｐＹＲＨ２１３（配列番号９２）はＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ１３０８Ｕを形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換からの個別コロニーをＭＭプレート上に再画線した。２種の菌株は、フラスコアッセイを使用してＬＣＤＡの生成について直接的に分析した。詳細には、個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に２４ウエルブロック内のＹＰＤ２−Ｂ液体培地中に接種し、これを次に３０℃、３７５ｒｐｍで２０時間にわたり振とうした。培養は０．１２ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチルを最終濃度が２３ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、３７５ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３１６】
ＧＣ分析は、菌株Ｄ１３０８Ｕの２つの形質転換体が８．２および１２．６ｇ／ＬのＣ１６：０のＬＣＤＡを生成することを証明した。１２．６ｇ／ＬのＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した菌株は、菌株Ｄ２３００と指名された。
【０３１７】
菌株Ｄ２３００は、さらに２Ｌ発酵実験を使用して試験した。表１２および図１２に示したように、菌株Ｄ２３００は、１６３時間の発酵後に、総量が約７２．７ｇ／ＬのＬＣＤＡを生成し、そのうち約６４．６ｇ／ＬはＣ１６：０のＬＣＤＡであった。
【０３１８】
【表１８】
2018519843.tif 000021
【０３１９】
菌株Ｄ２３００およびその子孫を産生するためにＤ１３０８Ｕを形質転換させるために使用したｐＹＲＨ２１３（配列番号９２）ＤＮＡは、リパーゼＹ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５４９５１９）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２と比較したＤ２３００およびその子孫の遺伝子型は、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋、不明１−、不明２−、不明３−、ＦＢＡ：：ＶｓＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ１：：ＣｔＣＹＰＡ１７ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＣＰＲ１：：ＶｓＣＹＰ９４Ａ１ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＤＧ２Ｐｒｏ−７１５：：ＣｔＡＬＤＨ２ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ１Ｌ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ａｃｏであった。
【０３２０】
したがって、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ２３００が生成され、長鎖脂肪酸含有基質が供給されると、７０ｇ／Ｌを超えるＬＣＤＡ生成物を生成できた。
【０３２１】
実施例１０
ＬＣＤＡ生成のためのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ２８８２の生成
本実施例は、菌株Ｄ２３００における脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）酵素をコードする３種のコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ２８８２の構築について開示する。菌株Ｄ２３００は、菌株Ｄ３９２８を発生させるために使用した中間菌株であった（図７Ｂ）。
【０３２２】
最初に、ｐＹＲ２１３（配列番号９２）ＤＮＡ（実施例９を参照されたい）を用いて形質転換されることによってＵｒａ３＋であった菌株Ｄ２３００は、ｕｒａ３−にさせられた。詳細には、Ｄ２３００は、無傷ＵＲＡ３配列にｕｒａ３−突然変異配列を統合するためにプラスミドｐＺＫＵＭを用いて形質転換させた。ｕｒａ−Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を得るためのプラスミドｐＺＫＵＭの構築および使用は、記載されている（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書、その中の表１５を参照されたい）。手短には、プラスミドｐＺＫＵＭはＳａｌＩ／ＰａｃＩを用いて消化され、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ２３００内に形質転換された。形質転換後、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上でプレーティングし、３０℃で２〜３日間にわたり維持した。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖した計８個の形質転換体を取り上げ、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡ上に個別に再画線した。これらの全８個の形質転換体は、ｕｒａ−表現型を有していた（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖できたが、ＭＭプレート上では増殖できなかった）。形質転換体＃１、＃２および＃３は、Ｄ２３００Ｕ１、Ｄ２３００Ｕ２およびＤ２３００Ｕ３と指名され、これらはまとめてＤ２３００Ｕであると指名された。
【０３２３】
菌株Ｄ２８８２を生成するために、菌株Ｄ２３００Ｕ１は、ＦＡＯ酵素（ＣｔＦＡＯ１、ＣｃＦＡＯ１、ＣｃＦＡＯ２）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるために３つの発現カセットを含有していた構築体ｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵ（図１１Ｂ、配列番号９８）由来のＤＮＡ断片を用いて形質転換された。詳細には、発現カセットは、下記の配列：（ｉ）ＣｔＦＡＯ１Ｍ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ４６８７８のＣｔＦＡＯ１の突然変異形である配列番号１００をコードする配列番号９９）（野生型ＣｔＦＡＯ１と比較して、ＣｔＦＡＯ１Ｍはチロシン残基の代わりにアミノ酸３５９位でヒスチジン残基を含む）、（ｉｉ）ＣｃＦＡＯ１（配列番号１０２をコードする配列番号１０１）および（ｉｉｉ）ＣｃＦＡＯ２（配列番号１０４をコードする配列番号１０３）を含んでいた。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位は、それぞれ上記のＦＡＯ酵素をコードするコドン最適化配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵプラスミド（配列番号９８）の構成成分については、表１３で詳細に記載する。
【０３２４】
【表１９】
2018519843.tif 000022
【０３２５】
プラスミドｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵ（配列番号９８）はＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ２３００Ｕ１を形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に２４ウエルブロック内のＹＰＤ２−Ｂ液体培地中に接種し、これを次に３０℃、３７５ｒｐｍで２０時間にわたり振とうした。培養は０．１２ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチルを最終濃度が２３ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、３７５ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３２６】
それぞれがｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵ（配列番号９８）を用いた菌株Ｄ２３００Ｕ１の形質転換の結果として生じた２４種の菌株を培養し、ＧＣによって分析した。２４個の形質転換体中５つは１０．６ｇ／Ｌ超でＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。詳細には、形質転換体＃１１、＃１４、＃１８および＃２１は、それぞれ１２．１、１２．０、１２．４および１０．６ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。これらの４種の菌株は、それぞれＤ２８８２、Ｄ２８８３、Ｄ２８８４およびＤ２８８５と指名された。
【０３２７】
菌株Ｄ２８８２、Ｄ２８８３、Ｄ２８８４およびＤ２８８５はさらに、一般的方法にしたがってフラスコアッセイによってＬＣＤＡの生成について分析された。表１４に示したように、菌株Ｄ２８８２、Ｄ２８８３、Ｄ２８８４およびＤ２８８５は、それぞれ約１５．１、１３．２、１５．０および１５．５ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０３２８】
【表２０】
2018519843.tif 000023
【０３２９】
菌株Ｄ２８８２およびＤ２８８５はさらに、一般的方法にしたがって微量発酵分析によってＬＣＤＡの生成について分析された。表１５に示したように、菌株Ｄ２８８２およびＤ２８８５は、それぞれ約２３．４および２１．０ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０３３０】
【表２１】
2018519843.tif 000024
【０３３１】
菌株Ｄ２８８２およびその子孫を産生するためにＤ２３００Ｕ１を形質転換させるために使用したｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵ（配列番号９８）ＤＮＡは、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＣＰ２（ステロール担体タンパク質）遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ４３１３６２、ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２に比較したＤ２８８２およびその子孫の遺伝子型は、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、ＦＢＡ：：ＣｔＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＶｓＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ１：：ＣｔＣＹＰＡ１７ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＣＰＲ１：：ＶｓＣＹＰ９４Ａ１ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＤＧ２Ｐｒｏ−７１５：：ＣｔＡＬＤＨ２ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ１Ｌ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ａｃｏ；ＹＡＴ：：ＣｔＦＡＯ１ｓＭ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ｌｉｐ１、ＡＬＫ２ＬＭ−Ｃ：：ＣｃＦＡＯ２ｓ：：Ａｃｏ３であった。
【０３３２】
実施例１１
長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現させることによるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ３９２８の生成
本実施例では、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＹＬＡＣｏＳ−６Ｐ、配列番号４４、実施例５を参照されたい）をコードするコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ３９８２の構築について開示する。この菌株は、実施例１２に示したように、１００ｇ／Ｌ超でＬＣＤＡを生成することができた。
【０３３３】
菌株Ｄ３９２８は、下記のように菌株Ｄ２８８２（図７Ｂ）から生成された。
【０３３４】
最初に、ｐＺＳＣＰｎ−３ＦＡＯＢＵ（配列番号９８）ＤＮＡ（実施例１０を参照されたい）を用いて形質転換されることによってＵｒａ３＋であった菌株Ｄ２８８２は、ｕｒａ３−にさせられた。詳細には、プラスミドＤ２８８２は、菌株Ｄ２８８２内のＬｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子を切断するためのＣｒｅリコンビナーゼの一時的発現のためにプラスミドｐＹ１１７を用いて形質転換された。ｐＹ１１７形質転換体は、ＭＭ上では増殖できなかったがＭＭＵ上では増殖することができ、これはこの形質転換体にＵＲＡ３遺伝子が欠如することを示していた；この形質転換体は菌株Ｄ２８８２Ｕと指名された。
【０３３５】
菌株Ｄ３９２８を生成するために、菌株Ｄ２８８２Ｕは、ＹＩＡＣｏｓ−６Ｐ酵素（配列番号４４）をコードするコドン最適化配列を過剰発現させるために１つの発現カセットを含有していた構築体ｐＺＰ２−ＹＩＡＣｏＳ−６Ｐ（図５Ｃ、配列番号６５）由来のＤＮＡ断片を用いて形質転換された。詳細には、発現カセットは、配列番号４４をコードする長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ配列ＹＬＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４３）を含んでいた。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位は、それぞれ上記のＹＬＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号４４）をコードする合成配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＺＰ２−ＹＬＡＣｏＳ−６Ｐプラスミド（配列番号６５）の構成成分については、表１６で詳細に記載する。
【０３３６】
【表２２】
2018519843.tif 000025
【０３３７】
プラスミドｐＺＰ２−ＹＩＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）はＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ２８８２Ｕを形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に２４ウエル内のＹＰＤ２−Ｂ液体培地中に接種し、これを次に３０℃、３７５ｒｐｍで２０時間にわたり振とうした。培養は０．１２ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチルを最終濃度が２３ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、３７５ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３３８】
それぞれがｐＺＰ２−ＹＩＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）を用いた菌株Ｄ２８８２Ｕの形質転換の結果として生じた２４種の菌株を培養し、ＧＣによって分析した。２４個の形質転換体中９個は１４．５ｇ／Ｌ超でＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。詳細には、形質転換体＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１、＃１２、＃１３および＃２０は、それぞれ１４．８、１７．７、１８．７、１８．３、２０．６、１７．８、１５．４、１７．１および１４．５ｇ／Ｌ超でＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。これらの形質転換体は、それぞれ菌株Ｄ３９２４、Ｄ３９２５、Ｄ３９２６、Ｄ３９２７、Ｄ３９２８、Ｄ３９２９、Ｄ３９３０、Ｄ３９３１およびＤ３９３２と指名された。
【０３３９】
菌株Ｄ３９２８、Ｄ３９３１およびＤ３９３２はさらに、一般的方法にしたがって微量発酵分析によってＬＣＤＡの生成について分析された。表１７に示したように、菌株Ｄ３９２８、Ｄ３９３１およびＤ３９３２は、それぞれ約２３．０、２１．２および２２．７ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０３４０】
【表２３】
2018519843.tif 000026
【０３４１】
菌株Ｄ３９２８およびその子孫を産生するためにＤ２８８２Ｕを形質転換させるために使用したｐＺＰ２−ＹＩＡＣｏＳ−６Ｐ（配列番号６５）は、Ｐｏｘ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００１３００）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２に比較したＤ３９２８およびその子孫の遺伝子型は、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、Ｌｅｕ２＋、ｐｅｘ３−、ｐｏｘ２−、ｐｏｘ３−、ｐｏｘ４−、Ｕｒａ３＋、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、不明５−、ＦＢＡ：：ＣｔＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＶｓＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ１：：ＣｔＣＹＰＡ１７ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＣＰＲ１：：ＶｓＣＹＰ９４Ａ１ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＤＧ２Ｐｒｏ−７１５：：ＣｔＡＬＤＨ２ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ１Ｌ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ａｃｏ；ＹＡＴ：：ＣｔＦＡＯ１ｓＭ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡ：：ＣｃＦＡＯ１ｓ：：Ｌｉｐ１、ＡＬＫ２ＬＭ−Ｃ：：ＣｃＦＡＯ２ｓ：：Ａｃｏ３、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＡｃｏＳ−６Ｐｓ：：Ｐｅｘ２０であった。
【０３４２】
したがって、長鎖脂肪酸含有基質が供給された場合に有意な量のＬＣＤＡ生成物を合成することができる長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株が生成された。
【０３４３】
実施例１２
フェドバッチ式発酵条件下で長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属によるＬＣＤＡの生成
本実施例では、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属がフェドバッチ式発酵で増殖させた場合に１００ｇ／Ｌ長のＬＣＤＡ生成物を生成できることについて開示する。特別には、菌株Ｄ３９２８は、約１４３時間の発酵後に１０９ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡおよび１１９ｇ／Ｌで全ＬＣＤＡＳを生成することができた（表１８、図１３）。
【０３４４】
種培養プロトコール：−８０℃で貯蔵された工学的ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ３９２８をＹＰＤプレート上に画線し、３０℃で約２４時間インキュベートした。単一コロニーは、５ｍＬの天然培地（６．７ｇ／Ｌの酵母用ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ＬのＤ−グルコース、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、３．３ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）を含有する１４ｍＬのＦＡＬＣＯＮ試験管（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内に接種した。試験管培養は、約２５０〜３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で約２４時間増殖させた。この培養の一部分（０．２〜５．０ｍＬ）は、５０ｍＬの天然培地（上記）を含有する２５０ｍＬの振とうフラスコに移し、さらに３０℃で追加して約２０時間にわたりおよそ５．０〜１０．０のＯＤ６００へインキュベ
ートした。この培養は、体積で約３％で５Ｌの発酵槽に接種するための種培養として使用した。
【０３４５】
５Ｌの発酵プロトコール：上記で調製した振とうフラスコ種培養は、発酵を開始させる（ｔ＝０時間）ために５Ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ，ＢｉｏＳｔａｔ  Ｂ  ｐｌｕｓ）に移した。発酵培地は、５０ｇ／ＬのＤ−グルコース、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、３．３ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、８ｍＬ／Ｌの微量金属（１００×）、４０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ（商標）酵母抽出物、２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ（商標）ペプトン、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、６ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌおよび１５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有していた。微量金属（１００×）は、１０ｇ／Ｌのクエン酸、１．５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ／Ｌ  １０ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２ＯおよびＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏから構成された。初期作業体積は、３．０Ｌであった。最初の２６時間にわたり、溶存酸素レベル（ｐＯ２）は、撹拌速度を３００〜１２００ｒｐｍの間でカスケードすることによって約２０％の空気飽和度で制御した。ｔ＝２６時間になった後、撹拌速度を１２００ｒｐｍで固定し、次にｐＯ２は、純粋酸素供給だけを用いたカスケードによって６０％の空気飽和度で制御した。７００ｇ／Ｌのグルコースおよび１５〜２５ｇ／Ｌの尿素を含むグルコース供給原料を調製した；グルコース供給は、最初に装填したグルコースが消費された約１８時間後に開始した。グルコース供給速度は２０ｍＬ／時という高さで開始し、次に発酵終了時（約１４４時間後）には１０ｍＬ／時に徐々に減少した。通気速度は１．５〜２．５Ｌ／分で制御し、温度は全ランを通して３０℃で維持した。ｐＨ値は最初の２６時間は６．０で制御し、その後にＫＯＨを供給することによってランの残りにおいては７．５に上昇した。ｔ＝２８時間から出発して、パルミチン酸エチルの残留濃度を１〜２０ｇ／Ｌの範囲内に制御するために発酵槽に供給した。発酵サンプル（各時点に約２５ｍＬ）は、発酵培地中のＯＤ６００、残留グルコース、残留パルミチン酸エチルおよびＬＣＤＡを分析するために１日２回採取した。
【０３４６】
５Ｌの発酵試験結果：１４３．４時間の発酵後、約１１９ｇ／ＬのＬＣＤＡが生成された。ＬＣＤＡ生成物の大多数は、ヘキサデカン二酸（Ｃ１６：０の二酸）（表１８および図１３）であった。
【０３４７】
【表２４】
2018519843.tif 000027
【０３４８】
したがって、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを過剰発現する（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属は、長鎖脂肪酸含有基質が供給された場合に有意な量のＬＣＤＡ生成物を合成することができる。
【０３４９】
実施例１３
ＬＣＤＡ生成のための陽性コントロールとしてのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）菌株Ｄ０１４５の生成
本実施例では、所定のビシア・サティバ（Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ）（オオカラスノエンドウ）ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素をコードするコドン最適化配列を発現させることによる様々なヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株の構築について開示する。菌株Ｄ０１４５を含むこれらの菌株の大多数は、ＬＣＤＡを生成することができた。
【０３５０】
構築体ｐＺＫＬＹ−ＶｓＣＰＲ＆ＣＹＰ（配列番号１０５）は、コドン最適化オオカラスノエンドウＣＹＰ（ＶｓＣＹＰ９４Ａ１、Ｖ．サティバ（ｓａｔｉｖａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１０２０４、配列番号９４をコードする配列番号９３に由来する）およびＣＰＲ（ＶｓＣＰＲ、Ｖ．サティバ（ｓａｔｉｖａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２６２５２、配列番号９６をコードする配列番号９５）コーディング配列それぞれの１コピーを統合するために生成された。各コーディング配列は、異種プロモーターおよび３’−ターミネーター配列の制御下にあった。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位は、それぞれＶｓＣＹＰもしくはＶｓＣＰＲをコードするコドン最適化配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＺＫＬＹ−ＶｓＣＰＲ＆ＣＹＰ（配列番号１０５）プラスミドの構成成分については、表１９で詳細に記載する。
【０３５１】
【表２５】
2018519843.tif 000028
【０３５２】
プラスミドｐＺＫＬＹ−ＶｓＣＰＲ＆ＣＹＰ（配列番号１０５）はＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｄ０００４（ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、ｕｒａ３−）（表７を参照されたい）を形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に３０℃で液体ＭＭ中に接種し、２５０ｍＬで１日間振とうした。一晩培養した細胞を使用して２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内で５０ｍＬのＹＰＤ２−Ｂ液体培地に接種し、これを次に３０℃、２５０ｒｐｍで振とうした。２４時間後、培養は２．０ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチルを最終濃度が１６ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、２５０ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３５３】
それぞれがｐＺＫＬＹ−ＶｓＣＰＲ＆ＣＹＰ（配列番号１０５）を用いた親菌株Ｄ０００４の形質転換の結果として生じた４８種の菌株を培養し、ＧＣによって分析した。４８種の菌株中のほぼ全部が３ｇ／Ｌ超でＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。例えば、形質転換体＃１２、＃１５、＃２０、＃２３、＃２８、＃２９、＃３１、＃３７、＃３９、＃４４および＃４８は、それぞれ５．０、５．１、５．１、５．０、５．２、４．９、５．５、４．８、５．５、５．０および４．８ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。これらの１１個の形質転換体は、それぞれＤ０１３８、Ｄ０１３９、Ｄ０１４０、Ｄ０１４１、Ｄ０１４２、Ｄ０１４３、Ｄ０１４４、Ｄ０１４５、Ｄ０１４６、Ｄ０１４７およびＤ
０１４８と指名された。
【０３５４】
菌株Ｄ０１４５およびその子孫を産生するためにＤ０００４を形質転換させるために使用したｐＺＫＬＹ−ＶｓＣＰＲ＆ＣＹＰ（配列番号１０５）は、リパーゼＹ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５４９５１９）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、これらの菌株中ではそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２に比した菌株Ｄ０１４５およびその子孫の遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、不明１−、ＦＢＡ：：ＶｓＣＰＲｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＶｓＣＹＰ９４Ａ１ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０３５５】
したがって、アップレギュレートされたヒドロキシラーゼ複合発現およびダウンレギュレートされたＰＥＸ３発現を備える酵母（例えば、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属）は、脂肪酸含有基質からＬＣＤＡを生成することができる。
【０３５６】
実施例１４
ｐｅｘ３−ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属はＬＣＤＡを生成できる
本実施例は、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＣＹＰおよびＣＰＲ酵素をコードするコドン最適化配列を発現させることによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌株Ｄ０１０１の構築について開示する。さらに、本実施例では、ｐｅｘ３−菌株はＬＣＤＡを生成できるが、他方ＰＥＸ３＋菌株（例えば、ＰＥＸ遺伝子破壊を有していない、またはｐｅｘ１０−もしくはｐｅｘ１６−である菌株）はこの活性を有していないことを開示する。
【０３５７】
構築体ｐＺＰ２Ｎ−ＦＣｔＡ１Ｒは、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のコドン最適化ＣＹＰ（ＣｔＡＬＫ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１０６１５）およびＣＰＲ（ＣｔＣＰＲ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３７２０１）コーディング配列それぞれの１コピーを統合するために生成した。各コーディング配列は、異種プロモーターおよび３’−ターミネーター配列の制御下にあった。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位は、それぞれＣｔＡＬＫ１もしくはＣｔＣＰＲをコードするコドン最適化配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の周囲および停止コドンの後に加えられた。ｐＺＰ２Ｎ−ＦＣｔＡ１Ｒプラスミドの構成成分については、表１２で詳細に記載する。
【０３５８】
【表２６】
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【０３５９】
プラスミドｐＺＰ２Ｎ−ＦＣｔＡ１ＲはＡｓｃＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、次に一般的方法にしたがって菌株Ｙ２２２４、Ｄ０００３、Ｄ０００４およびＤ０００９を形質転換させるために使用した。形質転換細胞はＭＭプレート上でプレーティングし、３０℃で２日間にわたり維持した。各形質転換由来の個別コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次に３０℃で液体ＭＭ中に接種し、２５０ｒｐｍで１日間振とうした。一晩培養した細胞を使用して２５０ｍＬのフラスコ内で２５ｍＬのＹＰＤ４−Ｂ液体培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで振とうした。４０時間後、培養は２．０ｍＬの１ＭのＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ８．０に調整し、その後にパルミチン酸エチル（Ｗ２４５１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度が８ｍｇ／ｍＬとなるまで培養培地に直接的に添加した。培養を次にさらに４日間にわたり、１８０ｒｐｍ、３０℃で振とうし、その後に各フラスコ培養からの全ブロスサンプルを一般的方法にしたがってＬＣＤＡ分析にかけた。
【０３６０】
各親菌株（Ｙ２２２４、Ｄ０００３、Ｄ０００４、Ｄ０００９）のｐＺＰ２Ｎ−ＦＣｔＡ１Ｒを用いた形質転換の結果として生じた菌株はＧＣによって分析した。親菌株Ｙ２２２４、Ｄ０００３もしくはＤ０００９の形質転換体ではヘキサデカン二酸（Ｃ１６：０のＬＣＤＡ）は検出されなかった。しかし、親菌株Ｄ０００４の形質転換体は、１ｇ／Ｌを超えるＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。１２．４ｇ／ＬのＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した１種のＤ０００４形質転換体は、菌株Ｄ０１０１と指名された。
【０３６１】
菌株Ｄ０１０１のその後のフラスコ分析を実施した。詳細には、Ｄ０１０１は、最終濃度が１６ｍｇ／ｍＬとなるまで添加したパルミチン酸エチルとともに、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内の２５ｍＬの培養中に配置した。培養は、４日間にわたり１８０ｒｐｍ、３０℃で振とうした。この培養は、約５ｇ／ＬでＣ１６：０のＬＣＤＡを生成した。
【０３６２】
菌株Ｄ０１０１を産生するためにＤ０００４を形質転換させるために使用したｐＺＰ２Ｎ−ＦＣｔＡ１Ｒ  ＤＮＡは、Ｐｏｘ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００１３００）を強力にノックアウトできたと認められる。しかし、Ｄ０１０１中のそのようなノックアウトは確認されなかった。野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号＃２０３６２と比較した菌株Ｄ０１０１の遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、不明１−、ＦＢＡ１：：ＣｔＡＬＫ１ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＣｔＣＰＲｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０３６３】
親菌株Ｄ０００４（ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ３−、ｕｒａ３−）の形質転換体（例えば、菌株Ｄ０１０１）はＬＣＤＡを生成したが、他方親菌株Ｄ０００９（ｄｇａｔ１−、ｄｇａｔ２−、ｐｅｘ１０−、ｕｒａ３−）の形質転換体はこの能力を有していなかった。両方のタイプの形質転換体は、（ｉ）ダウンレギュレートされたＰＥＸ遺伝子（損傷したペルオキシソーム機能および遮断されたβ酸化を生じさせる）および（ｉｉ）他の点では同一の遺伝子型（減少した油貯蔵をもたらすダウンレギュレートされたＤＧＡＴ遺伝子）を有していたが、ダウンレギュレートされたＰＥＸ３を有する酵母だけがＬＣＤＡを生成することができた。ｐｅｘ１０−菌株に類似して、ｐｅｘ１６−菌株にもＬＣＤＡを生成する能力が欠如していた（データは示していない）。そこで、ペルオキシソーム機能およびβ酸化が遮断される方法は、脂肪酸含有基質からのＬＣＤＡの生成に有意な影響を及ぼす。
【０３６４】
したがって、ダウンレギュレートされたＰＥＸ３発現を有する酵母（例えば、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属）は、脂肪酸含有基質からＬＣＤＡを生成することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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