(57)【要約】  液体試料中の被分析物濃度を定量的に測定するための、ラテラルフローデバイスなどの分析装置用の改良された光検出ユニット、およびそれを含む分析装置。検出ユニットは、λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有する有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）発光体と、λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有する有機フォトダイオード検出器（ＯＰＤ）とを含む。検出ユニットは、λ１〜λ２の波長範囲内の吸収スペクトルＡを有する光吸収成分を含む試験領域を有する。試験領域は、発光ダイオードから試験領域の少なくとも一部を通ってフォトダイオードまで光路を形成するために、発光体と検出器とに隣接して位置付けられる。式Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定し、Ｍは、約０．４未満である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中における被分析物の濃度を定量的に測定するための分析装置用の光検出ユニットであって、
λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有する有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）発光体と、
λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有する有機フォトダイオード検出器（ＯＰＤ）と、
λ１〜λ２の波長範囲内の吸収スペクトルＡを有する光吸収成分を含む試験領域とを含み、
前記試験領域は、前記発光体と前記検出器とに隣接して配設され、前記発光ダイオードから前記試験領域の少なくとも一部を通って前記フォトダイオードまでの光路を形成し、
式Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定し、Ｍは、約０．４未満であることを特徴とする光検出ユニット。
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【請求項２】
前記光路は、光学フィルタを含まないことを特徴とする請求項１に記載の光検出ユニット。
【請求項３】
前記試験領域は、光透過性ラテラルフローメンブレンを含むことを特徴とする請求項１に記載の光検出ユニット。
【請求項４】
Ｍは、約０．３未満であることを特徴とする請求項１〜３に記載の光検出ユニット。
【請求項５】
Ｍは、約０．２未満であることを特徴とする請求項４に記載の光検出ユニット。
【請求項６】
Ｍは、約０．１未満であることを特徴とする請求項５に記載の光検出ユニット。
【請求項７】
前記光吸収成分は、金属粒子、またはラテックス粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載された光検出ユニット。
【請求項８】
前記光吸収成分は、金粒子であることを特徴とする請求項７に記載の光検出ユニット。
【請求項９】
前記ＯＬＥＤは、燐光性イリジウム錯体を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の光検出ユニット。
【請求項１０】
前記ＯＰＤは、光吸収ポリマードナーと、フラーレンアクセプターとを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の光検出ユニット。
【請求項１１】
前記ポリマードナーは、レジオレギュラーポリチオフェンを含むことを特徴とする請求項１０に記載の光検出ユニット。
【請求項１２】
液体試料中における少なくとも１つの被分析物の濃度を定量的に測定するための分析装置であって、
λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有するプレーナ型発光体と、
λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有するプレーナ型検出器と、
前記発光体と前記検出器との間に配設されたラテラルフローメンブレンと、
前記ラテラルフローメンブレンの近位末端と流体連絡しているコンジュゲートパッドであって、第１アッセイ成分に結合した光学的に検出可能なタグ粒子を含み、λ１〜λ２の波長範囲内の吸収スペクトルＡを有するコンジュゲートパッドと、
前記ラテラルフローメンブレンの遠位末端に流体連絡している吸収パッドであって、前記ラテラルフローメンブレンは、光透過性材料から形成され、前記コンジュゲートパッドから前記吸収パッドへ毛細管作用によって流体を移動可能であり、前記ラテラルフローメンブレンは、前記液体試料中の前記被分析物の濃度を示す、試験領域内のタグ粒子の濃度を求めるために、少なくとも１つの試験領域であって、当該試験領域内にタグ粒子を、前記被分析物と前記第１アッセイ成分と第２アッセイ成分との間の結合によって保持するための固定化された第２アッセイ成分を含む試験領域を含む、吸収パッドとを備え、
前記発光体は、有機エレクトロルミネッセンス材料の発光層を含み、当該発光層は、前記ラテラルフローメンブレンの前記試験領域と一直線に並び、それによって前記発光体は前記試験領域を照らすことが可能であり、
前記検出器は、有機太陽電池材料の吸収層を含み、当該吸収層は、前記ラテラルフローメンブレンの前記試験領域と一直線に並び、それによって前記検出器は、前記試験領域からの光を検出することが可能であり、
式Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定しており、Ｍは約０．４未満であることを特徴とする分析装置。
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【請求項１３】
前記光路は、光学フィルタを含まないことを特徴とする請求項１２に記載の分析装置。
【請求項１４】
Ｍは、約０．３未満であることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載の分析装置。
【請求項１５】
Ｍは、約０．２未満であることを特徴とする請求項１４に記載の分析装置。
【請求項１６】
Ｍは、約０．１未満であることを特徴とする請求項１５に記載の分析装置。
【請求項１７】
前記光吸収成分は、金属粒子、またはラテックス粒子であることを特徴とする請求項１２、または請求項１３に記載の分析装置。
【請求項１８】
前記光吸収成分は、金粒子であることを特徴とする請求項１７に記載の分析装置。
【請求項１９】
前記ＯＬＥＤは、燐光性イリジウム錯体を含むことを特徴とする請求項１２、または請求項１３に記載の分析装置。
【請求項２０】
前記ＯＰＤは、光吸収ポリマードナーと、フラーレンアクセプターとを含むことを特徴とする請求項１２、または請求項１３に記載の分析装置。
【請求項２１】
前記ポリマードナーは、レジオレギュラーポリチオフェンを含むことを特徴とする請求項２０に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料における被分析物濃度を定量的に測定するための分析装置用の改良された光検出ユニット、および当該検出ユニットを含む分析装置に関する。ユニットの発光体は、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）であってもよく、光検出器は、有機光検出器（ＯＰＤ）であってもよく、試料は、液体の生物学的試料、たとえば、血漿、血清、唾液、もしくは尿、または液体に変えられた生物学的試料であってもよい。
【背景技術】
【０００２】
ラテラルフローデバイス（ＬＦＤ）は、液体試料における被分析物を検出するための光学手段を使用可能である分析装置の一例であり、重要な用途を見出した。用途の１つは、液体試料を分析して、液体試料中に存在し得る１以上の標的被分析物の存在の有無を測定する装置におけるものである。これらの装置においては、越えたときには、標的被分析物が存在する定性的指標が得られる閾値濃度が存在するのが通常である。
【０００３】
いくつかの技術は、たとえば、光源と組み合わせられた光受容器を用いて標的被分析物の濃度の定量的測定値を得るために開発された。この分野において、２つの広い下位分類が存在する。一つは、光源からの反射光の検出を使用する。このクラスでは、光源と光検出器との両方が、たとえばラテラルフローメンブレンの同じ側に設けられる。他方のクラスは、光源とラテラルフローメンブレンの反対側の光検出器とを、光（または他の電磁放射）が膜を通って検出器に伝えられるように位置付ける。
【０００４】
ＷＯ２００５／１１１５７９号公報は、透過系発光検出システムである。
【０００５】
光源と光検出器とは、無機光電子成分を含んでもよい。たとえば、無機ＬＥＤは、散光器、レンズ、または他の光成形成分と組み合わされてもよい輝点源を提供し、吸光度測定に必要な試料の均一な照射をもたらす。これらの用途において、検出器としての使用に適した無機光検出器は、シリコンフォトダイオード、フォトトランジスタ、またはフォトレジスタを含んでもよい。散光器、レンズ、または光学フィルタなどの他の構成要素も、試料中における必要な吸光度変化を正確に測定するために必要とされてもよい。
【０００６】
有機光源および検出器は、それらの無機代替物から容易に得ることができない特定の利点を備えており、益々使用されている。たとえば、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）は、追加の構成要素の必要なしに、試料の拡散した領域の照射が可能であり、それらの典型的なプレーナ型構造は、フローセル、キュベット、またはラテラルフローデバイスにおける液体試料の照射に良好に適用される。なぜなら、それは、試料と光源とを密接に近づけることを可能とするからである。同様に、光検出器は、有機フォトダイオード（ＯＰＤ）であってもよく、追加の構成要素の必要なしに、拡散領域を検出することができる。同様に、有利なことに、試料に近接して位置付けることができる。
【０００７】
有機光源および光検出器の、それらの無機等価物と比較した顕著なさらなる利点は、それらの吸収または発光スペクトルを特定の用途に適合させることができる程度にある。ＯＬＥＤおよびＯＰＤの両方について、様々な吸収または発光スペクトルを有する多くの種類の有機光活性材料が知られている。さらに、装置構造の特徴は、吸収および発光スペクトルを調整するために変更することができる。たとえば、ＯＬＥＤおよびＯＰＤの活性層の厚さの変更、電荷輸送層などの隣接した非発光もしくは非吸収プレイヤーの組成、またはブラッグフィルタもしくはマイクロキャビティ（微小共振器）などのアウトカップリング構造は全て、有機的装置の吸収または発光スペクトルに影響を与える。
【０００８】
装置がラテラルフローデバイスである場合、様々な消光剤検出標識を利用することができる。典型的には、これらの標識は、アッセイの進行中に、発光体および検出器の光路内に固定化された抗体に付加される。標識は、高い吸光係数を有する小さな有機分子であってもよく、その場合、標識の量を測定するために吸光度測定を使用することができ、または標識はラテックス粒子などの光散乱粒子であってもよく、または標識は複合的な光学特性を有する金ナノ粒子などの金属粒子であってもよい。これらの光学変化はすべて、本明細書においては、用語「吸収」に分類されている。
【０００９】
被分析物の定量的測定のための分析装置の設計者には、したがって、特定用途のための、利用可能な最適の発光体、検出器、および吸収標識を選択する場合の、ならびに発光体または検出器における、複雑な構造的変化の利点または欠点を定量化する場合の判断についての複雑な組み合わせが示される。これらの選択を最適化することが、そのような分析装置から最高の性能を達成するためには必要である。
【００１０】
したがって、液体試料中における被分析物の濃度を定量的に測定するための分析装置用の、改良され、好ましくは最適化された光検出ユニットを含む分析装置が必要とされている。
【００１１】
本発明は、少なくともその好ましい実施形態においては、そのように改良された、または最適化された分析装置を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００１２】
本開示によれば、液体試料における被分析物の濃度を定量的に測定するための分析装置用の光検出ユニットが提供される。検出ユニットは、λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有する有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）発光体と、λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有する有機フォトダイオード検出器（ＯＰＤ）とを含む。検出ユニットは、λ１〜λ２までの波長範囲内の吸収スペクトルＡを有する光吸収成分を含む試験領域を有する。試験領域は、発光体と検出器とに隣接して位置し、発光ダイオードから試験領域の少なくとも一部を通ってフォトダイオードまで光路を形成する。式Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定し、Ｍは、約０．４未満である。
【数１】
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【００１３】
したがって、前記開示によれば、光検出ユニットは、吸収成分の改良された検出を提供するように互いに一致するスペクトルを有する、有機発光体、有機検出器、および光吸収成分を含む、比較的簡単な構成を備える。本発明者らは、有機発光体、有機検出器、および光吸収成分のスペクトルが上述の式に従って一致し、前記ユニットが約０．４未満のＭ値を有するように構成されると、光検出が、有機吸光度検出ユニットにおいて驚くほど改良されることを見出した。好ましくは、Ｍの値は、約０．３未満であり、より好ましくはＭの値は、約０．２未満であり、最も好ましくは、Ｍの値は、約０．１未満である。Ｍのこれらの値は、低いバックグラウンドシグナル、低減されたノイズを有するユニットを用いて吸光度測定を行うことを可能にし、それによってより高感度で高精度な吸光度測定を可能にする。
【００１４】
有機的装置において、有機発光体と有機検出器とのスペクトルの程度は、活性材料の選択によって調整されてもよく、装置構成は重要である。したがって、特定の実施形態において、必要とされるＭ値は、たとえば、無機発光体または検出器を用いる場合などにそうでなければ必要とされ得る狭いバンドパスフィルタなどの光学フィルタに必要とされることなく満たされてもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、試験領域は、たとえばラテラルフローデバイス（ＬＦＤ）において使用され得るようなニトロセルロース膜などの光透過性ラテラルフローメンブレンであってもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、光吸収材料は、たとえば、ラテックス粒子、または金粒子などの金属粒子などの粒子であってもよい。ＬＦＤ実施形態において、そのような粒子は、抗体に結合してもよく、光散乱をもたらす被分析物の存在に応じて、または本明細書において「吸収」と称される他の消光効果に応じて試験領域内に集まり始めてもよい。
【００１７】
特定の実施形態において、光検出ユニットのＯＬＥＤは、たとえばｌｒ（ｐｐｙ）３などの燐光性イリジウム錯体を発光成分として含み得る。他の実施形態において、ＯＬＥＤは、発光ポリマーを含んでもよく、これによって発光は、蛍光特性である。
【００１８】
特定の実施形態において、光検出ユニットは、光吸収ポリマードナーと、フラーレンアクセプターとを含んでもよい。好ましくは、ポリマードナーは、レジオレギュラーポリチオフェンを含む。光検出ユニットにおいて、ポリマードナーによる光の吸収と、それに続くアクセプターへの電子輸送は、電極において光電流として検出される。
【００１９】
本開示は、液体試料における少なくとも１つの被分析物の濃度を定量的に測定するための分析装置をさらに提供する。本装置は、λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有するプレーナ型発光体と、λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有するプレーナ型検出器と、発光体と検出器との間のラテラルフローメンブレンとを含む。本装置は、ラテラルフローメンブレンの近位末端と流体連絡するコンジュゲートパッドをさらに含む。前記コンジュゲートパッドは、第１アッセイ成分に結合した光学的に検出可能なタグ付粒子を含み、λ１〜λ２の波長範囲内の吸収スペクトルＡを有する。吸収パッドは、ラテラルフローメンブレンの遠位末端と流体連絡している。ラテラルフローメンブレンは、光透過性材料から形成され、コンジュゲートパッドから吸収パッドに毛細管作用によって流体を移動させることができる。ラテラルフローメンブレンは、液体試料中における被分析物の濃度の指標である、試験領域内のタグ付粒子の濃縮をもたらすために、被分析物と第１アッセイ成分と第２アッセイ成分との間の結合によって試験領域内にタグ付粒子を保持するための、固定化された第２アッセイ成分を含む少なくとも１つの試験領域を含む。発光体は、有機エレクトロルミネッセンス材料の発光層を含み、当該発光層は、発光体が試験領域を照らすようにラテラルフローメンブレンの試験領域に一直線に並べられる。検出器は、有機太陽電池材料の吸収層を含み、当該吸収層は、検出器が試験領域から光を検出することができるようにラテラルフローメンブレンの試験領域に一直線に並べられる。Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定し、Ｍは、約０．４未満である。
【数２】
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【００２０】
この実施形態は、したがって、有機発光体と有機検出器と任意に検出可能なタグ粒子とのスペクトルが、向上したタグ粒子の検出をもたらすような方法で互いに一致するラテラルフローデバイスであり得る装置を提供する。Ｍの値は、約０．４未満である。好ましくは、Ｍの値は、約０．３未満であり、より好ましくは、Ｍの値は、約０．２未満であり、最も好ましくは、Ｍの値は、約０．１未満である。Ｍのこれらの値は、低いバックグラウンドシグナル、低減したノイズを有するユニットを用いてなされる吸光度測定を可能にし、それによって、さらに高感度で高精度な吸光度測定を可能にする。
【００２１】
本装置の特定の実施形態において、必要なＭ値は、たとえば、無機発光体または検出器を用いる場合でなければ必要とされない狭いバンドパスフィルタなどの光学フィルタを必要とすることなく満たすことが可能である。
【００２２】
本装置のいくつかの実施形態において、光吸収材料は、たとえば、ラテックス粒子、または金粒子などの金属粒子などの粒子であってもよい。
【００２３】
本装置の特定の実施形態において、光検出ユニットのＯＬＥＤは、発光成分として、たとえばｌｒ（ｐｐｙ）３などの燐光性イリジウム錯体を含んでもよい。他の実施形態において、ＯＬＥＤは、発光ポリマーを含んでもよく、これによって発光は、蛍光特性である。
【００２４】
本装置の特定の実施形態において、光検出ユニットは、光吸収ポリマードナーとフラーレンアクセプターとを含んでもよい。好ましくは、ポリマードナーは、レジオレギュラーポリチオフェンを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して以下にさらに説明される。
【図１】図１Ａは、本発明の一実施形態に係る光検出ユニットを含む分析装置の図である。図１Ｂは、図１Ａの実施形態に係る光検出ユニットを含む分析装置のさらなる視野の図である。
【図２】本発明のさらなる実施形態に係る光検出ユニットの図である。
【図３】図３は、本発明に係る分析装置の一実施形態の構成要素の図である。
【図４】本発明に係る分析装置の一実施形態の１行ピクセルパターンの図である。
【図５】本発明に係る分析装置の一実施形態の２行ピクセルパターンの図である。
【図６】本発明に係る分析装置の一実施形態の３行ピクセルパターンの図である。
【図７】本発明に係る分析装置の一実施形態の４行ピクセルパターンの図である。
【図８】図８ａおよび８ｂは、実施例１に係る、カッパおよびラムダＦＬＣアッセイの用量作用曲線を示す。
【図９】実施例２に係るオピエート分析の用量作用曲線を示す。
【図１０】本発明の実施形態に係り、実施例３に記載されたような光検出ユニットの装置の、発光、吸収、および検出スペクトルを示す。
【図１１】本発明の一実施形態に係るユニットにおける使用のための様々な活性層の厚さを有する一連の有機フォトダイオードの検出スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、本発明の一実施形態によれば、薄く、実質的に立方形のハウジング５０に含まれる分析装置１が提供される。図１Ｂは、図１Ａに示された装置と同じ装置の模式図の側面図を提供する。ハウジングの片方の端部は、ハウジング５０の長さおよび幅の平面に提供される試験モジュール２０を含む。ハウジング５０の反対側の端部は、ハウジング５０の壁に接して円柱状のバッテリー２３を収容する。試験モジュール２０とバッテリー２３との間は、バッテリーから試験モジュール２０と同じ平面におけるハウジングの長さまで延びるプリント回路基板２２である。試験モジュール２０における電極は、電気的インターフェース２４を介してプリント回路基板２２に接続される。試験モジュール２０は、コンジュゲートパッド５に流体連絡した試料パッド６を含む。本コンジュゲートパッド５は、アッセイ成分に結合することができる粒子タグを含む。ラテラルフローメンブレン４は、コンジュゲートパッド５と吸収パッド７との間を接続する。支持構造体２１は、ハウジング５０における試験モジュール２０を固定する。
【００２７】
図２は、本発明の一実施形態に係る光検出ユニット２０を示す。試料が試料パッド６に置かれると、過剰の試料の貯留層が形成される。過剰の試料は、コンジュゲートパッド５に移動する。この移動は、第１にコンジュケートパッド５によって、続いてラテラルフローメンブレン４の吸い上げ作用によって、続いてさらに吸収パッド７によってもたらされる。ラテラルフローメンブレン４は、ニトロセルロース膜から形成される。コンジュゲートパッド５は、被分析物タグを含む。被分析物タグは、対応する利用可能な被分析物に結合する。毛細管運動は、任意のタグ付き被分析物を含む液体試料を、吸収パッド７に向かってコンジュゲートパッド５から試験領域１９にラテラルフローメンブレン４を流す。試料は、吸収パッド７に到達する前に、被分析物に対する固定された受容体を含む反応ライン８に遭遇する。タグ付き被分析物がこの点に到達すると、受容体は、被分析物に結合し、被分析物およびタグを適切な位置に保持する。着色された被分析物タグの存在は、反応ライン８の色を変える。なぜなら、タグ濃度が増加するからである。上述の例において、色付きタグの濃度は、液体試料中における被分析物の濃度の指標をもたらす反応ラインにおける被分析物の濃度の直接的指標である。
【００２８】
上述の記載は、サンドイッチアッセイ法の例である。反応ライン１２からの反応（通常、着色）の強度が試料中に存在する被分析物の量に反比例する競合アッセイも可能である。この方法の一例において、コンジュゲートパッド５は、予めタグを付された第２被分析物、または被分析物類似体をさらに含む。試料に由来する被分析物は、コンジュゲートパッド５を変化せずに通り、さらなる反応ライン１２において受容体に結合し、予めタグを付された被分析物、または被分析物類似体が、そうでなければ結合したであろう受容体部位を占める。試料中の被分析物が少ないほど、多くの、予めタグを付された被分析物、または被分析物類似体が受容体に結合可能であり、より強いラインの着色をもたらす。この方法のさらなる例において、コンジュゲートパッド５は、さらにタグ付き受容体も含むか、またはその代わりにタグ付き受容体を含むことができる。この場合、固定された被分析物または被分析物類似体は、反応ライン上に固定化される。被分析物が試料中に多く存在すればするほど、試料に由来する被分析物に結合するタグ付き受容体が多くなるので、固定された被分析物、または被分析物類似体の結合に利用することができない。競合アッセイ法は、特定の被分析物の欠如についての定量的試験に使用されてもよいが、純粋な２値化試験ではない。試料中の非常に少量の被分析物は、ラインの位置において予めタグを付された分子（被分析物、被分析物類似体、または受容体である）の結合を依然としてもたらすようである。競合アッセイ法は、代替的に、液体試料中の特定の被分析物濃度を定量的に示すために使用されてもよい。
【００２９】
タグ付き成分自体と反応するラテラルフローメンブレン４におけるコントロール受容体のさらなるライン１３も存在する。コントロールライン１３は、タグ付き成分に結合する固定化受容体を含む。コントロールライン１３は、試料が任意の被分析物を含むか否かに関わらず、試験が実施されると着色し始める。このことは、試験が正確に実施されていることを確かめることに役立つ。上述の例において、反応ライン８は、被分析物が試料中に存在するときに色が変わるにすぎない。複数アッセイの実施形態において、複数のコントロールラインが存在してもよい。このように、コントロールラインは、ラテラルフローデバイスによって実施されるべき各試験が実施されたか否かを測定するために使用可能である。本実施例におけるコントロールライン１３は、初期の反応ラインの下流に備えられる。反応ラインの下流にコントロールライン１３を備えることによって、被分析物タグは、試験が実施されたことを示すコントロールラインに結合することができる前に、他の反応ラインを通って流れなければならない。
【００３０】
本件において、ラテラルフローメンブレン４は、約１００μｍの厚さであり、反応ライン８，１２と、コントロールライン１３とは、それぞれ１．０ｍｍ×５．０ｍｍであり、それらの間に２．０ｍｍの間隙を有する。ラテラルフローメンブレンは、ニトロセルロースから形成される。試料パッド６、コンジュゲートパッド５、ラテラルフローメンブレン４、および吸収パッド７は、透過性基板１１上に備えられる。
【００３１】
リファレンスライン１４は、ラテラルフローメンブレン４に備えられ、試験領域１９の構築の間を並べるために使用される。リファレンスライン１４は、典型的には、反応ライン８，１２，またはコントロールライン１３よりも薄い。本実施例におけるリファレンスラインは、０．５ｍｍ×５．０ｍｍであり、コントロールライン１３の間に１．５ｍｍ間隙を有する。
【００３２】
本実施例は、試料中の被分析物の、存在、欠如、または濃度範囲を分析することを開示しているが、この分析は、いくらかの被分析物試験に実施することができる。複数の異なる被分析物の、存在、欠如、または濃度を測定するために様々なタグおよび受容体ラインの範囲を使用することができる。いくつかの被分析物の存在は、異なる、または同一の被分析物の欠如に組み合わせて試験されてもよい。たとえばアッセイなどの試験は、以下の表１に示される。それぞれの場合において、第１アッセイ成分、第２アッセイ成分、標的の被分析物、およびどちらの種類のアッセイか（サンドイッチ、または競合）とともに試験の目的が示される。全てのアッセイは、被分析物、または任意の種類の標識粒子で標識化された被分析物に対する抗体を用いて実施可能である。標識化粒子の例は、金ナノ粒子、着色ラテックス粒子、または蛍光標識を含む。Ｎ行における表から容易に分かるように、他の被分析物についてのアッセイは、アッセイ型がサンドイッチである場合、第１成分として被分析物抗原と、第２成分として被分析物に対する抗体とを用いて構築可能である。アッセイ型が競合である場合（Ｍ行）、被分析物に対する抗体は、第１成分であり、被分析物抗原は、第２成分である。
【表１】
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【００３３】
妊娠試験などの通常の家庭の分析試験は、明らかに２値化された結果を有し、使用者が結果を手作業で解釈することを必要とするが、これに対して、本装置は、被分析物試験の結果として光吸収を測定するために、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）と対向した有機フォトダイオード（ＯＰＤ）とを使用する。上述された実施形態は、試験試料中における被分析物の濃度を示すために、物質による光の吸収を使用するが、蛍光、発光の結果、または化学的もしくは電気化学的反応の結果として、被分析物におけるタグが、発光性であり、光自体を放出する実施形態を同様に想像することができる。
【００３４】
骨髄腫アッセイは、表１においてＡ〜Ｄと付記された行に記載されている。骨髄腫を試験するために、ラムダＦＬＣ濃度に対するカッパＦＬＣ濃度の割合が測定される。
【００３５】
ＯＬＥＤは、公知の特性（強度、波長など）を有する光で試料を照らす。光がＯＰＤによって受け取られると、電流が発生する。この電流を測定することによって、反応ライン８、１２、および周辺の膜に固定された標識によって吸収された光を検出することができる。このことは、試料中に存在するタグ付き被分析物の濃度の指標をもたらす。
【００３６】
ＯＬＥＤは、プラスチック基板（ＰＥＴ）、ガラス基板、またはプラスチック層と無機バリア層とを交互に含むラミネート上に位置する層構造である。ＯＬＥＤは、パターン化されたＩＴＯ（導電性であり透明な酸化インジウムスズ）の層、正孔注入材料の層、活性材料の層、およびカソードから形成される。ＩＴＯ、ならびにさらに重要には活性材料およびカソードの厚さを調整することによって装置の前方放出を最大化することができる。積み重ね形状におけるそのような修飾を用いることによって、装置に垂直に放出された光量を最大化することができる。このことは、ＯＬＥＤによって放出された光の大部分が膜を通り、ＯＰＤに衝突することを意味する。エポキシ保護を有する従来の無機ＬＥＤは、ランバート放射を有し、したがって、顕著な量の光を浪費する。
【００３７】
本実施例において、ＯＬＥＤ２は、発光領域９，１６，１８を含み、検出領域１０，１５，１７を含む有機太陽電池（ＯＰＤ）３を対向して備える。本実施例における全ての３つの領域の放出光の色は、青色である。なぜなら、それらは、同一材料の層から形成されるからである。同様に、本実施例において、ＯＰＤ領域１０，１５，１７の材料は、青色光を検出するために最適化される。
【００３８】
ＯＬＥＤ発光領域９，１６，１８と、ＯＰＤ検出領域１０，１５，１７とは、タグ付き被分析物（予めタグ化されたか否かに関わらず）を捕捉し結合するために準備される結合受容体を含む反応ライン８，１３，１４のフットプリント内に位置するために大きさを合わせて作製される。この場合、０．９ｍｍ×４．９ｍｍピクセルとなる。これは、タグ付き被分析物と周囲のラテラルフローメンブレン４とが相互作用することができるＯＬＥＤからの光の放出割合を最大化する。膜とタグ付き被分析物と相互作用可能である放出光の割合を向上させる別の因子は、ラテラルフローメンブレン４に対する、ＯＬＥＤおよびＯＰＤの両方の近接度である。本実施例において、バリア材料のみが、ＯＬＥＤ／ＯＰＤと膜との間に挟まれ、約１００μｍの厚さを有する。
【００３９】
分析装置１のハウジング５０内に含まれる回路基板２２とバッテリー２３とは、ＯＬＥＤおよびＯＰＤを制御し、電力を供給する。回路基板２２も、試料中に存在する被分析物の量、および／またはその割合を表す定量的値を計算するために、基礎的分析を実施するために適したマイクロ処理装置を含む。
【００４０】
たとえば、ＯＰＤについて、以下の構造が使用可能である。第１層（膜に最も近接した）は、予めパターン化された酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）ガラス基板である。ガラス基板は、ＯＰＤのためのバリア層を提供する。ＩＴＯ層の上部は、５０ｎｍ厚の層を備える。ＢａｙｔｒｏｎＰグレードのポリ（スチレンスルホネート）−ドープ化ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）と、１０ｎｍ厚のポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）フィルム中間層がその上に備えられる。活性層は、１００ｎｍ厚のアルミニウムの装置用上部電極を有する、１６５ｎｍ厚のレジオレギュラーポリ（３−ヘキシルチオフェン）：１−（３−メトキシカルボニルプロピル）−１−フェニル−［６．６］Ｃ６１（Ｐ３ＨＴ：ＰＣＢＭ）である。
【００４１】
これは、本発明の実施形態における使用のために適したＯＰＤの一例に過ぎない。当業者は、そのようなＯＰＤの製造方法と、適切なＯＰＤを製造可能である他の材料とを作製する方法を知っている。
【００４２】
ＯＰＤ活性層は、通常、ドナーとアクセプターとを含み、これらは、ポリマー太陽電池についての技術分野において公知のものから選択されてもよい（たとえば、Li, G., Zhu, R. and Yang Y. (2012) Nature Photonics 6:153-161を参照）。ドナー材料は、アッセイにおいて使用されるべき消光剤に関する波長範囲内のその吸光度に従って選択されてもよい。しかしながら、材料選択の他の要因がＯＰＤの検出スペクトルに影響を与え得る。これらの要因は、アクセプターおよびドナーヘテロ構造の形態を含み、溶媒、および装置を作製するために使用された乾燥条件、活性層の厚さ、電荷輸送層などの隣接層において使用された材料、使用された電極、層の厚さと層材料の屈折率との組み合わせから生じる毛細管効果、ならびに分布ブラッグ反射器などの光取り込み構造によって影響を受け得る。当業者は、したがって、必要とされるアッセイについてのＯＰＤの検出スペクトルを良好に適合させるために使用し得る、多数の構造および材料要因を知っている。
【００４３】
同様に、当業者は、本発明に適したＯＬＥＤを作製するためのいくつかの構造と材料との組み合わせを知っている。ある特定の型のＯＬＥＤにおいて、その構造は、プラスチック基板（ＰＥＴ）、パターン化ＩＴＯの層、正孔注入材料の層、活性材料の層、およびカソードである。特に、ＯＬＥＤの発光スペクトルは、有機ポリマー、または他の小さな分子の選択によって適合させることができる。たとえば、イリジウム含有錯体は、通常良好に規定された燐光放出スペクトルを有し、ピーク波長は、金属が結合するリガンドを変えることによって可視スペクトルにわたって変化させることができる。たとえば、限定されないが、これらの錯体とそれらのピーク発光は、ｆａｃ−ｌｒ（ｐｐｙ）３（５１９ｎｍ），ｆａｃ−ｌｒ（４’，６’−ｄｆｐｐｙ）３（４６７ｎｍ），ｆａｃ−ｌｒ（ａｔｐｙ）３（５８１ｎｍ），（ｐｉｇ）２ｌｒ（ａｃａｃ）（６２２ｎｍ）、（ｎｉｇ）２ｌｒ（ａｃａｃ），ｆａｃ−ｌｒ（ｐｍｉ）３（３８０ｎｍ），および溶液化誘導体またはそのデンドリマー誘導体を含んでもよい。発光性材料の選択に加えて、ＯＬＥＤの他の特徴は、特定の用途について発光スペクトルを適合させるために使用されてもよい。これらの特徴は、発光層のためのホストとして使用される材料、または正孔もしくは電子輸送層などの隣接層における材料、使用される電極、層厚と層材料の屈折率との組み合わせから生じる毛細管効果、ＯＬＥＤに加えられる駆動電圧、分布ブラッグ反射器などの光アウトカップリング構造を含む。当業者は、したがって、必要とされる分析についてＯＬＥＤの発光スペクトルを良好に調整するために使用可能である多数の構造的および材料要因を知っている。
【００４４】
当業者は、たとえば、抗体に結合してもよい消光剤（標的の化合物を標識化するために使用される着色タグ）の選択のための生物学的アッセイ分野における利用可能な選択の範囲を知っている。金ナノ粒子を使用することができ、この場合、緑色光源を使用するべきである。これに代えて、青色ポリスチレン標識を使用することができ、この場合、赤色光源を使用するべきである。また、たとえば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から取得可能である、ｄａｂｃｙｌ、ＱＳＹ（登録商標）、およびＤｙＬｉｇｈｔ（商標）消光剤などの多くの有機消光剤ファミリーを利用可能である。
【００４５】
吸光度アッセイの特異性および感受性を最適化するために、ＯＬＥＤの発光スペクトルＥ、光検出スペクトルＳ、および光吸収成分の吸収スペクトルＡは、正確に合わせられなければならない。吸収スペクトルと発光スペクトルとの間の不適当な組み合わせは、放出されるが、吸収されない波長において低い感受性を有するように検出スペクトルが適合されなければ、望ましくないバックグラウンドシグナルをもたらすであろう。同様に、検出スペクトルが、放出が強けれども、吸収が弱い波長において低い値を有する場合、アッセイの感受性が低下するであろう。スペクトルのわずかな変化（たとえば、図１１を参照）が、ＯＬＥＤ，ＯＰＤ，および消光剤のどの組み合わせが最適な検出をもたらし得るかを確かめるための対物手段を必要とする場合、この三者間の組み合わせは、特に重要でない。
【００４６】
本発明者らは、以下の関係が、ＯＬＥＤの発光スペクトルＥと、光検出スペクトルＳと、吸光度に基づくアッセイのための光吸収成分の吸収スペクトルＡとの間に最適な調和をもたらすことを見出した。
【数３】
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【００４７】
Ｅ，Ｓ，およびＡの間の調和を数学的に表すことができる多数の方法が存在し、本関係は、特に有利な特徴を有する。この関係は、Ｅ．Ｓが、分母と分子との両方に現れるように選択され、このことは、評価される光検出ユニットの任意の群に同一の方法が適用される限り、ＥおよびＳの単位が関係せず、任意の好適な単位であってもよいか、または任意の値に標準化されてもよいとの利点を有する。スペクトルＡは、たとえば、分光計、またはλ１とλ２との間の波長の関数として透過光への入射の対数を測定するための他の手段を用いることなどによって使用において得られるその最も高い吸収状態において特定の試験領域を用いて測定されてもよい。使用において、λ１およびλ２は、これらの限られた波長、少なくともＥ，Ｓ，およびＡの主なスペクトル特性の間に含まれるように選択される。
【００４８】
Ｍの低い値は、光検出ユニットにおける、またはそのような光検出ユニットを含む分析装置における、良好な感受性、および低いバックグラウンドシグナルのために必要とされる、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の良好な組み合わせを表す。したがって、ＯＬＥＤとＯＰＤとを含む光検出ユニットにおいて、Ｍは、約０．４未満である。好ましくは、Ｍは、約０．３未満、より好ましくは約０．２未満、最も好ましくは約０．１未満である。
【００４９】
図４は、本発明に係る分析装置の一実施形態の１行ピクセルパターンを示す。リファレンスライン１４、反応ライン８および１２、ならびにコントロールライン１３は、ラテラルフローメンブレン上に備えられる。ＯＬＥＤおよびＯＰＤ製造工程は、反応ラインおよびコントロールラインを覆うように、任意の寸法および位置のピクセルを作製することを可能とする。図４において、ピクセル輪郭２５，２６，および２７は、ＯＰＤ感受性領域、およびＯＬＥＤピクセルの輪郭を示す点線として示される。これらのピクセルは、反応ライン８，１２（またはコントロールライン１３）を中心とする。また、ピクセル輪郭２５，２６、および２７は、反応ライン８，１２（またはコントロールライン１３）よりも小さい。このように、反応ラインを通ることなく（すなわち、反応ラインまたはコントロールラインの一部を形成しないラテラルフローメンブレンの一部を通る）ＯＬＥＤからＯＰＤに入る光は、最小化され、および／または実質的に消える。いくつかの実施形態において、ピクセルの輪郭は、反応ラインと実質的に同じ広さを有してもよい。反応ライン８，１２は、同一の被分析物についてのアッセイに対応してもよい。このように、液体試料中における被分析物濃度の得られる任意値の精度は、同一試料の複数のアッセイによって最大にすることができる。
【００５０】
図５は、本発明に係る分析装置の一実施形態の２行ピクセルパターンを示す。この実施形態において、２つの平行なラテラルフローメンブレンが存在する。上述したように、リファレンスライン１４は、反応領域２８，２９，３０，３１，３２，３３を、それぞれＯＰＤおよびＯＬＥＤ輪郭３４，３５，３６，３７，３８，３９に並べるために使用される。互いに組み合わせられた反応領域（ライン）を斜めにずらすことによって、２つの隣接する反応領域の間の光の混合は、最小化される。このように、たとえば、ＯＰＤ／ＯＬＥＤ輪郭３７から、ＯＰＤ／ＯＬＥＤ輪郭３４，３５における、ＯＰＤによって検出可能な光の量は、最小化される。このことは、単一の分析装置において、アッセイの特にコンパクトな配置を可能にする。いくつかの実施形態において、それぞれ平行なラテラルフローメンブレンは、様々な被分析物の試験のための各ラテラルフローメンブレンとともに単一の反応領域を含んでもよい。他の実施形態において、それぞれ平行なラテラルフローメンブレンは、同じ被分析物、または被分析物の同じグループの試験のためのラテラルフローメンブレンとともに単一または複数の反応領域を含んでもよい。このことは、液体試料中における被分析物濃度の得られる指標の精度を向上させる。さらなる他の実施形態において、複数の平行なラテラルフローメンブレンにおける複数の試験領域は、様々な方法で同一の被分析物を試験するために使用可能である。このように、片方のラテラルフローメンブレンは、サンドイッチアッセイ法を用いて所定の被分析物を試験することができ、これに対して別のラテラルフローメンブレンは、競合アッセイ法を用いて同じ所定の被分析物を試験することができる。
【００５１】
図６および７は、それぞれ本発明に係る分析装置の一実施形態の、３行および４行ピクセルパターンを示す。ラテラルフローメンブレンに備えられる反応領域４０，４２は、輪郭４１，４３を有する任意の隣接ＯＰＤの輪郭と混じる、輪郭４１，４３を有するＯＬＥＤからの光を最小化するように配置される。上述のように、リファレンスライン１４は、並べるために備えられる。
【００５２】
示された実施形態において、反応ラインおよび／または反応領域は、図３の反応ライン１２に特に示されるように、各ラテラルフローメンブレンのそれぞれの側面に延びるように意図されているが、本発明は、反応ラインおよび／または反応領域が、各ラテラルフローメンブレンのそれぞれの側面に延びない代替的な実施形態に及ぶ。たとえば、反応領域は、ラテラルフローメンブレンの中央に集められてもよい。これに代えて、２つの別の領域が、ラテラルフローメンブレンに並んで提供されてもよい。２つの反応領域の間のラテラルフローメンブレンに間隔があってもよい。いくつかの実施形態において、２つの反応領域は、互いに接触して提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上の領域は、ラテラルフローメンブレンの、近位−遠位方向と幅方向との両方に、間隔を空けるか、またはずれてもよい。反応領域は、たとえば並んで備えられ得る別のラテラルフローメンブレンに提供されてもよい。
【００５３】
本発明の実施形態は、直接的なタグ付加を使用して記載されたが、間接的なタグ付加も可能である。第１抗体が被分析物に結合する実施形態において、タグ粒子は、さらに第１抗体に結合するように構成された抗体に結合してもよい。これによって、同一の標識化抗体は、いくつかの異なる被分析物について使用可能である。
【００５４】
実施形態ではコンジュゲートパッドの使用が示されるが、試料は、被分析物タグと予め処理されてもよいことが明らかであろう。このことは、特に被分析物の濃度が非常に低い場合に、被分析物と被分析物タグとの間の、良好な混合および結合を確実にする。この場合、コンジュゲートパッドは必要ではなく、予め処理された試料は、試料パッド、またはラテラルフローメンブレンに直接に置かれてもよい。複数の被分析物の、存在または濃度が試験されるべきであるいくつかの実施形態において、試料は、標的被分析物のいくつかのみについて予め処理されてもよい。この場合、コンジュゲートパッドは、依然として必要である。
【００５５】
示される実施形態は、定量的測定用であるが、本発明は、１以上の標的被分析物の存在の有無の指標のみが必要である、定性的、または半定性的分析装置に等しく適用可能であることが明らかである。半定性的分析装置において、たとえば複数の濃度レベルの個別の読み取りが必要である。濃度レベルは、測定されるべき濃度範囲にわたって一様に広がる必要はない。
【００５６】
シリコン系無機検出器、またはＧａＡｓおよび／もしくはＩｎＧａＡｓおよび／もしくはＳｂＧａｌｎＡｓ系無機発光体を使用する従来技術の装置に比べて、作製されたＯＰＤおよびＯＬＥＤを用いる実施形態における本発明の利点は、材料費用を増加させることなく、複数のアッセイ（定量的、またはそれ以外）を提供する性能である。従来技術の無機発光体および検出器において、複数の反応領域は、それぞれ単位原価を有する、複数の発光体と検出器とを必要とする。本発明の実施形態において、ＯＰＤおよびＯＬＥＤは、発光体または検出器が必要とするピクセル数に関わらず、単一片から作製されるので、追加の反応領域の供給のための費用がわずかに上昇するのみである。
【００５７】
実施例１
有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）は、図４の実施形態のように３つのピクセルを有し、５２０ｎｍの波長を有する緑色光を発し、有機フォトダイオード（ＯＰＤ）は、ＯＬＥＤと同一のパターンを有する。ラテラルフローメンブレンは、１つのコントロール領域と、２つの試験領域とを含む。第１アッセイは、カッパＦＬＣ抗原であり、第２アッセイは、ラムダＦＬＣ抗原である。カッパおよびラムダＦＬＣ抗原を含む試料が膜に沿って流れると、タグ付き抗体は、試料中、または膜上のカッパおよびラムダＦＬＣ抗原に結合する。試料中における抗原が色を薄めるにつれて、より多くの光が膜を通るので、より多くのシグナルがＯＰＤによって検出される。図８は、カッパおよびラムダＦＬＣアッセイの用量作用曲線を示す。
【００５８】
実施例２
有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）は、図５に示されるような構成を有するが、３つのピクセルのうち２つのみがそれぞれの行において機能する。発光波長は、５２０ｎｍである。有機フォトダイオード（ＯＰＤ）は、ＯＬＥＤと同じパターンを有する。ラテラルフローメンブレンは、１つのコントロール領域と、オピエート抗体の１つの試験領域とを含む。ラテラルフローメンブレン片は、試料を２回同様に流すことによって精度を向上させるために、ＯＬＥＤおよびＯＰＤ対の２つの行に平行に配置される。特定量のオピエート抗原を含む試料を膜に沿って流すと、抗原は、タグ物質（金粒子）に結合し、膜上のオピエート抗体に結合する。試料中の抗原が色を濃くすればするほど、膜を通る光が少なくなるので、弱いシグナルがＯＰＤによって検出される。図９は、オピエートアッセイについての容量作用曲線である。
【００５９】
実施例３
装置は、実質的に図１および２に示されるように作製され、ＯＬＥＤは、溶液処理によって作製され、以下の構造を有する。ガラス／ＩＴＯ／高分子正孔輸送層／高分子ホスト、Ｉｒデンドリマー燐光緑色発光体／Ａｇ
【００６０】
また、本実施例のＯＰＤは、溶液処理によって作製され、以下の構造を有する。ガラス／ＩＴＯ／高分子正孔輸送層／高分子ドナーおよびアクセプター／Ａｇ
【００６１】
本実施例の装置は、光吸収成分が金粒子である、実施例１および２に記載された種類のアッセイのために使用可能である。図１０は、本実施例の光検出ユニットの、発光スペクトル、吸収スペクトル、および検出スペクトルを示す。本実施例のＭ値は、０．１９であった。
【００６２】
実施例４
【表２】
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実施例３に係る方法において、一連のＯＰＤは、ドナーおよびアクセプターを含む活性層に堆積した溶液の厚さが、８４ｎｍ，９９ｎｍ，１４１ｎｍ，および１８７ｎｍの厚さの活性層を含めるために、表２に示されるように変化するように作製された。活性層の厚さの変化は、強度が光電流を示す図１１に示されるようにＯＰＤの検出スペクトルを複雑に変えた。複雑なスペクトル変化は、特定用途のための最適なＯＰＤの選択が、スペクトルのみの目視検査から容易に明らかではないことを意味する。光検出ユニット、たとえば、これらのＯＰＤがＯＬＥＤ発光体と金粒子消光剤とに組み合わせられたものであって、それらのスペクトルが図１０に示されている光検出ユニットの使用のための本実施例のＯＰＤのランキングは、客観的評価を必要とする。この問題は、Ｍ値を用いて解決される。表２は、活性層の厚さ、ＯＬＥＤ発光体と金粒子吸収とを組み合わせて使用したときのそれらのＭ値、ならびにそれらの得られる性能を示す。本開示は、したがって、液体試料中の被分析物濃度を定量的に測定するための分析装置用の光検出ユニットと、それを含む分析装置とを提供する。検出ユニットは、λ１〜λ２の波長範囲内の発光スペクトルＥを有する有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）発光体と、λ１〜λ２の波長範囲内の光検出スペクトルＳを有する有機フォトダイオード検出器（ＯＰＤ）とを含む。検出ユニットは、λ１〜λ２の波長範囲内の吸収スペクトルＡを有する光吸収成分を含む試験領域を有する。試験領域は、発光体および検出器に隣接して位置し、発光ダイオードから試験領域の少なくとも一部を通ってフォトダイオードまでの光路を形成する。式Ｍは、Ｅ，Ｓ，およびＡの間の関係を規定し、Ｍは、０．４未満である。
【００６３】
本明細書の、詳細な説明および特許請求の範囲にわたって、用語「含む」および「包含する」、ならびにそれらの変形は、「含むが、限定されない」ことを意味し、それらは、他の、部分、追加、成分、整数、または工程を排除することを意図していない（そして排除しない）。本明細書の、詳細な説明および特許請求の範囲にわたって、文脈が要求しない限り、単数は、複数を含む。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が要求しない限り、複数および単数として理解されるべきである。
【００６４】
発明の、特定の態様、実施形態、または実施例と組み合わせて記載される、特徴、整数、特性、化合物、化学的部分、または群は、それらが矛盾しない限り、本明細書に記載された、任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用されると理解されるべきである。本明細書に開示された全ての特徴（任意の添付された特許請求の範囲、要約、および図面など）、ならびに／または開示されたような任意の方法または処理の全ての工程は、少なくともいくつかのそのような特徴および／もしくは工程が互いに相容れない組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本発明は、任意の上述の実施形態の細部に限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面など）に開示された特徴の、任意の新規な１つ、もしくは任意の新規な組み合わせ、または開示されたような任意の方法もしくは処理の工程の、任意の新規な１つ、もしくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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