(57)【要約】試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ａ）第１の培養期間の間に肝細胞を含む第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップ、ｂ）前記第１の培養期間にわたって前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の前記肝細胞に及ぼす前記試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を規定するステップ、ｃ）前記第１の培養期間より長い第２の培養期間の間に肝細胞を含む第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートするステップを含む。
2018512134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける方法であって、
ａ）第１の培養期間の間に肝細胞を含む第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップ、
ｂ）前記第１の培養期間にわたって前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の前記肝細胞に及ぼす前記試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を規定するステップ、
ｃ）前記第１の培養期間より長い第２の培養期間の間に肝細胞を含む第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートするステップ、
ｄ）前記第２の培養期間にわたって前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の前記肝細胞に及ぼす前記試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を規定するステップ、および
ｅ）前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を、前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性と比較し、それによって前記試験化合物の時系列肝毒性を特徴付けるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性が前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より大きく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示すと特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性が、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より、少なくとも予め規定された閾値だけ大きく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示すと特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性が、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より、最大でも予め規定された閾値だけ大きくはなく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示さないと特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物が、単離肝細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離肝細胞が、固体担体の表面全体に実質的に分散している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記肝細胞が初代肝細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物が、少なくとも１つの規定の間質細胞型をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の培養期間が１２時間から２日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の培養期間が１日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の培養期間が３日から２８日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の培養期間が７日から１４日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の培養期間が１日であり、前記第２の培養期間が７日または１４日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａ）が、前記第１の培養期間の間に肝細胞を含む複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｃ）が、前記第２の培養期間の間に肝細胞を含む複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ）が、前記第１の培養期間にわたって前記試験化合物のＬＣ５０を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｄ）が、前記第２の培養期間にわたって前記試験化合物のＬＣ５０を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）が、前記第１の培養期間にわたって前記試験化合物のＬＣ５０を決定することを含み、ステップｄ）が、前記第２の培養期間にわたって前記試験化合物のＬＣ５０を決定することを含み、ステップｅ）が、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物のＬＣ５０  対  前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物のＬＣ５０の比を決定して、前記試験化合物の時系列毒性スコアを規定することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
新薬の開発における主要な障害は、規制承認を達成するのに十分な効能および安全性の両方を示すであろう薬物候補を前進させることである。有望な候補は、前臨床または臨床の段階で失敗することが多い。開発過程での薬物候補の開発中止の理由は多くあるが、１つのよくある理由は潜在的な肝臓毒性に関係した安全性関連の知見である。肝臓毒性の知見による臨床および後期の前臨床の失敗によって生じる費用を著しく削減し、安全性関連の問題の同定までの時間を短縮し、基礎的創薬研究によって同定される候補化合物に関する意思決定を速くする必要性が当技術分野にある。
【０００２】
成功確率の最も高い候補の選択を裏付けるために現在用いられる一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、肝毒性を検出する能力を欠く。肝毒性は、遺伝毒性（突然変異誘発、染色体異常誘発（ｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ））、ＣＹＰ阻害（時間依存性阻害を含む）、ＣＹＰ誘導、Ｇ−ＳＨ付加物形成、タンパク質への共有結合、ならびにｈＥＲＧ電流阻害、脂肪症、肉芽腫、反応性代謝産物の形成および胆汁うっ滞を含む、１つまたは複数の機構から生じ得る。およそ２４時間またはそれ未満の短期の時点、またはそのような一時点のデータしか得られないインキュベーションによることが多い、短期のまたは急性の試験となるｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞ベースのモデルを含む、従来の肝細胞系によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価は、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性の可能性を十分に予測することとはほど遠い。実際、関連技術に熟練した、携わっている多くの毒物学者は、そのような短期の「急性の」ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から得られるデータが、前臨床の意思決定において有効な価値をほとんどまたは全く有しないと考え、これらのモデルがもたらす可能性がある肝毒性応答の陽性の知見（当技術分野では陽性「肝臓シグナル」とも呼ばれる）にもかかわらず、薬物化合物を開発の後続の（ますます高価な）段階に移行させ続けることが多い。したがって、肝毒性を特徴付ける新しくて改善された方法および系の必要性が当技術分野にある。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
現在のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の限界の１つの理由は、制限されたおよび／または低下する代謝能力のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が２４時間のリードアウトに一般的に制限されることである。本発明は、培養で例えば１４、２１または２８日までの長時間の間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性を維持することが可能な肝細胞培養物を利用する。そのような系の使用に一部基づいて、本発明は、１、２、３、４、５、６、７日もしくはそれを超える、または１４日もしくはそれより長い期間にわたる複数の時点で、培養で肝毒性を測定するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、提供される方法は、先行技術の方法で達成可能なものと比較して改善された方法での試験化合物の肝毒性の可能性の予測を可能にする。一部の実施形態では、本方法は、異なる逐次的な時点で得られる毒性の測定値または推定値の間の関係を定量化するために使用することができる。例えば、２４時間で測定した試験化合物の毒性を７日または１４日で測定した毒性と比較することによって、経時的な毒性の変化が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験化合物の可能性のあるｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を評価するための非常に意味があるツールを提供することが発見された。
【０００４】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ａ）第１の培養期間の間に肝細胞を含む第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップ、ｂ）前記第１の培養期間にわたって前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の前記肝細胞に及ぼす前記試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を規定するステップ、ｃ）前記第１の培養期間より長い第２の培養期間の間に肝細胞を含む第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートするステップ、ｄ）前記第２の培養期間にわたって前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の前記肝細胞に及ぼす前記試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を規定するステップ、およびｅ）前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性を、前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性と比較し、それによって前記試験化合物の時系列肝毒性を特徴付けるステップを含む。一部の実施形態では、前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性は前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より大きく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示すと特定される。一部の実施形態では、前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性は、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より、少なくとも予め規定された閾値だけ大きく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示すと特定される。一部の実施形態では、前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性は、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物の肝毒性より、最大でも予め規定された閾値だけ大きくはなく、前記試験化合物が時系列肝毒性を示さないと特定される。一部の実施形態では、予め規定された閾値は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０から選択される。一部の実施形態では、予め規定された閾値は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。一部の実施形態では、予め規定された閾値は、２から５、３から５、２から４、２から６、４から８、または５から１０である。
【０００５】
一部の実施形態では、前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、単離肝細胞を含む。一部の実施形態では、前記単離肝細胞は、固体担体の表面全体に実質的に分散している。一部の実施形態では、前記肝細胞は初代肝細胞である。一部の実施形態では、前記肝細胞は幹細胞由来である。
【０００６】
一部の実施形態では、前記第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および前記第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、少なくとも１つの規定の間質細胞型をさらに含む。
【０００７】
一部の実施形態では、第１および第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、肝細胞および少なくとも１つの他の細胞型を含むマイクロパターンで構成され、担体材料に接着した培養肝細胞；培養培地の液滴に封入されるかもしくは封入されない、またはミクロビーズに接着した細胞の球状構成で密集した肝細胞；肝細胞がコラーゲンまたは他のゲルもしくはタンパク質の基底層およびオーバーレイ層の間で安定化されている「サンドウィッチ」培養物に沈着した肝細胞；ならびに、天然に存在するかまたは人工の材料の膜、格子、足場または床、例えば、限定なしに、アルギン酸塩に由来する材料で構成される足場もしくは格子、人工半透膜または培養毛細血管で構成される床の内部または表面に埋め込まれる肝細胞の少なくとも１つを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、前記第１の培養期間は１２時間から２日である。一部の実施形態では、前記第１の培養期間は１日である。一部の実施形態では、前記第２の培養期間は３日から２８日である。一部の実施形態では、前記第２の培養期間は７日から１４日である。一部の実施形態では、前記第１の培養期間は１日であり、前記第２の培養期間は７日または１４日である。
【０００９】
一部の実施形態では、「Ｘ」日の培養期間は、少なくとも「Ｘ」日の培養期間である。一部の実施形態では、「Ｘ」日の培養期間は、少なくとも約「Ｘ」日の培養期間である。一部の実施形態では、「Ｘ」日の培養期間は、約「Ｘ」日の培養期間である。
【００１０】
一部の実施形態では、本方法は、少なくとも第３の培養期間をさらに含み、ａ）第１および第２の培養期間より長い第３の培養期間の間に肝細胞を含む第３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップ；ｂ）第３の培養期間にわたって第３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって第３の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を規定するステップ；ならびにｃ）第１、第２または第１および第２の両方の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を、第３の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性と比較し、それによって試験化合物の時系列肝毒性（ｔｉｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を特徴付けるステップをさらに含む。
【００１１】
本方法の一部の実施形態では、比較するステップは、２つまたはそれを超える測定した量の間の算術比を決定すること、または積分法もしくは微分法を利用して２つの測定した量の間の関係を決定すること、または確率的（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ）、推計学的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）もしくはシミュレーションの形態の測定もしくは計算モデルを利用することを含む数値演算を実行することを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ステップａ）は、前記第１の培養期間の間に肝細胞を含む複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートすることを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ステップｃ）は、前記第２の培養期間の間に肝細胞を含む複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を前記試験化合物とインキュベートすることを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ステップｂ）は、前記第１の培養期間にわたって前記試験化合物のＴＣ５０を決定することを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ステップｄ）は、前記第２の培養期間にわたって前記試験化合物のＴＣ５０を決定することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ステップｂ）は、前記第１の培養期間にわたって前記試験化合物のＴＣ５０を決定することを含み、ステップｄ）は、前記第２の培養期間にわたって前記試験化合物のＴＣ５０を決定することを含み、ステップｅ）は、前記第１の培養期間にわたる前記試験化合物のＴＣ５０  対  前記第２の培養期間にわたる前記試験化合物のＴＣ５０の比を決定して、前記試験化合物の時系列毒性スコアを規定することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、フェーズＩ酵素機能が、本発明のラット、イヌおよび霊長類の肝細胞−間質細胞共培養物で長く持続することを示す。７−ヒドロキシクマリン形成の速度を、示した時点で測定した。異なる種で異なるパターンが明白である。しかし、各場合に、フェーズＩ酵素機能は長く持続している。ラットおよびイヌは肝細胞が播種された日から少なくとも３５日間フェーズＩ活性を有し、霊長類は少なくとも２２日間フェーズＩ活性を有する。
【００１８】
【図２】図２は、フェーズＩＩ酵素機能が、本発明のラット、イヌおよび霊長類の肝細胞−間質細胞共培養物で長く持続することを示す。７−ヒドロキシクマリングルクロニド形成の速度を、示した時点で測定した。異なる種で異なるパターンが明白である。しかし、各場合に、フェーズＩＩ酵素機能は長く持続している。ラットおよびイヌは肝細胞が播種された日から少なくとも３５日間フェーズＩＩ活性を有し、霊長類は少なくとも２２日間フェーズＩ活性を有する。
【００１９】
【図３】図３は、初代ヒト肝細胞の３つの異なるロットから作製された肝細胞−間質細胞共培養物での長期持続ＣＹＰ  ３Ａ４機能を示す。１−ヒドロキシミダゾラム形成の速度を測定することによって、ＣＹＰ  ３Ａ４機能を分析した。ベースラインでロット間の多少の変動が観察されたが、全てのロットは細胞が播種された日から３５日間３Ａ４活性を有する。
【００２０】
【図４】図４は、初代ヒト肝細胞の３つの異なるロットから作製された肝細胞−間質細胞共培養物での長期持続ＣＹＰ  ２Ｃ９機能を示す。１−ヒドロキシトルブタミド形成の速度を測定することによって、ＣＹＰ  ２Ｃ９機能を分析した。ベースラインでロット間の多少の変動が観察されたが、全てのロットは細胞が播種された日から３５日間２Ｃ９活性を有する。
【００２１】
【図５】図５は、初代ヒト、イヌ、ラットおよび霊長類肝細胞を使用して確立された肝細胞−間質細胞共培養物での小管の染色を示す。
【００２２】
【図６】図６は、培養の７日目から２５日目までヒト肝細胞−間質細胞共培養物で肝細胞ＣＹＰ  ３Ａ４活性が安定していることを示す。７日目までに、培養初代肝細胞は再構築を完了し、機能を安定化させた。機能は、２５日目まで安定したままである。したがって、安定した機能のウィンドウは、１８日間続く。ほとんどのＤＭＰＫおよびＴｏｘ適用のために、２週間の安定した培養が十分に長い時間であることは注目に値する。
【００２３】
【図７】図７は、培養の７日目から１８日目までヒト肝細胞−間質細胞共培養物のヒト肝細胞の３つの異なるロットのほとんどまたは全てで４つの異なるＣＹＰ酵素が安定したままであることを示す。
【００２４】
【図８】図８は、フェーズＩ代謝のための安定性の複数種ウィンドウを示す。
【００２５】
【図９】図９は、フェーズＩ代謝のための安定性の複数種ウィンドウを示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、ＨｅｐＧ２細胞株を肝細胞−間質細胞共培養物と比較する。フルタミドおよびケトコナゾールは、肝毒性である。データは、毒性親化合物（フルタミドまたはケトコナゾール）のより大きな肝臓クリアランスは、同等レベルの毒性を生成するためにより高い親濃度を必要とすることを示す。トログリタゾン肝毒性は、その肝毒性代謝産物によって媒介される。トログリタゾンの一次反応代謝産物は、ｏ−キノンメチドであることが確認された。この代謝産物は、反応性ｏ−キノンメチド誘導体への置換型のクロマン環系の酸化を通して、Ａ  ＧＳＨコンジュゲーションによって一般的に形成される。データは、毒性代謝産物のより多くの生成は、同等レベルの毒性を生成するためにより低い親濃度を必要とすることを示す。合わせると、これらのデータは、ＨｅｐＧ２単一培養物と比較して、本発明の肝細胞−間質細胞共培養物の優れた予測能力を実証する。
【００２７】
【図１１】図１１は、ヒト、イヌ、霊長類またはラット初代肝細胞を含む肝細胞−間質細胞共培養物に及ぼすシクロホスファミドの多回投薬の肝毒性作用を示す。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ、ｎ＝４、を使用して分析した。データは、投薬の持続時間を延長することがシクロホスファミドの細胞毒性を増加させることを示す。
【００２８】
【図１２】図１２は、６日間の治療（３回用量）の後の、ヒト、イヌ、霊長類またはラット初代肝細胞を含む肝細胞−間質細胞共培養物に及ぼすトログリタゾンの多回投薬の肝毒性作用（計算されたＴＣ５０）を示す。イヌ、サルおよびラットでの結果は、図１２で提示される３つのグラフで、ヒトと各々個々に比較される。
【００２９】
【図１３】図１３は、シクロホスファミドおよびトログリタゾンの結果を要約する。これらは、４つの異なる種で６日間の反復化合物曝露の後に生成された、濃度依存性毒性曲線である。各化合物は、０日目に開始して、２日ごとに投薬された。６日目に、蛍光性レゾルフィンへのリザズリンの変換を測定するために、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒブルーアッセイを使用した。リザズリンはミトコンドリアで有効に還元され、したがって、このアッセイはミトコンドリアの代謝活性を測定する。このデータは、以下の通りにＴＣ５０値（すなわち、投与された用量に応答して培養物の細胞の５０パーセントが死滅する化合物の濃度）を生成するために、次に使用された。トログリタゾンの場合：ＬＣ５０＝３０８μＭ（ヒト）、ＬＣ５０＝２６７μＭ（イヌ）、ＬＣ５０＝２０７μＭ（サル）およびＬＣ５０＝３１７μＭ（ラット）。シクロホスファミドの場合：ＬＣ５０＝５，５２３μＭ（ヒト）、ＬＣ５０＝７，５４１μＭ（イヌ）、ＬＣ５０＝１，９０４μＭ（サル）、ＬＣ５０＝１，５０６μＭ（ラット）。
【００３０】
【図１４】図１４は、ＧＳＨおよびＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒブルーアッセイの比較を示す。このアッセイは、５０＊Ｃｍａｘで行われた。非常に低いアッセイ間の変動性は、この開示の系および方法の有用性および能力のさらなる実証である。
【００３１】
【図１５】図１５は、実施例で使用される２０個のモデル肝臓毒化合物を掲載する。第３の列は、その化合物が公知の強力な肝臓毒素であるか、公知の中等度の肝臓毒素であるか、または肝毒性がないことが知られているかを示す。第２の列は、公知の肝臓毒素によって誘導される肝毒性の予想されるまたは可能性がある機構を示す。
【００３２】
【図１６】図１６は、２４時間でのヒト肝細胞の単一培養物における、ならびに２４時間、７日および１４日でのヒト肝細胞−間質細胞共培養物における、２０個の化合物の各々で観察された肝毒性を提示する。ＴＣ５０値の単位は、マイクロモル濃度である。
【００３３】
【図１７】図１７は、ヒト肝細胞共培養物で観察された時系列毒性シグナルの計算を提示する。
【００３４】
【図１８】図１８は、２４時間でのラット肝細胞の単一培養物における、ならびに２４時間、７日および１４日でのラット肝細胞−間質細胞共培養物における、２０個の化合物の各々で観察された肝毒性を提示する。ＴＣ５０値の単位は、マイクロモル濃度である。
【００３５】
【図１９】図１９は、ラット肝細胞共培養物で観察された時系列毒性シグナルの計算を提示する。
【００３６】
【図２０Ａ】図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃは、単一の表の部分であり、時系列毒性シグナルが試験化合物の公知の毒性機構と相関することを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃは、単一の表の部分であり、時系列毒性シグナルが試験化合物の公知の毒性機構と相関することを示す。
【図２０Ｃ】図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃは、単一の表の部分であり、時系列毒性シグナルが試験化合物の公知の毒性機構と相関することを示す。
【００３７】
【図２１】図２１は、前臨床または臨床段階まで開発された１０個の化合物のセットの時系列毒性シグナルが、観察された毒性と相関することを示す。
【００３８】
【図２２】図２２は、前臨床または臨床段階まで開発された１０個の化合物のセットの時系列毒性シグナルが、観察された毒性と相関することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本系および方法、ならびに他の実施形態が開示され、記載される前に、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が明らかに別途指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれることに注意しなければならない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていないメンバー、要素、方法ステップも排除しない。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「肝毒性」は、遺伝毒性（突然変異誘発、染色体異常誘発）、ＣＹＰ阻害（時間依存性阻害を含む）、ＣＹＰ誘導、Ｇ−ＳＨ付加物形成、タンパク質への共有結合、ならびにｈＥＲＧ電流阻害、脂肪症、肉芽腫、反応性代謝産物の形成および胆汁うっ滞から選択される１つまたは複数の機構によって引き起こされる肝臓損傷を限定なしに含む、化学物質誘発肝臓損傷の任意の形態を含むことができる。
【００４２】
Ａ．肝細胞培養物
この開示は、培養肝細胞に試験化合物を投与するステップを含む、試験化合物の毒性を評価する系および方法を提供する。一部の実施形態では、培養肝細胞は、肝細胞および少なくとも１つの他の細胞型を含むマイクロパターンで構成され、担体材料に接着し；培養培地の液滴に封入されるかもしくは封入されない、またはミクロビーズに接着した細胞の球状構成で密集し；肝細胞がコラーゲンまたは他のゲルもしくはタンパク質の基底層およびオーバーレイ層の間で安定化されている「サンドウィッチ」培養に沈着し；あるいは天然に存在するかまたは人工の材料の膜、足場または床、例えば、限定なしに、アルギン酸塩に由来する材料で構成される足場もしくは格子、人工半透膜または培養毛細血管で構成される床の内部または表面に埋め込まれる。一部の実施形態では、系および方法は、心臓、肝臓、脳、中枢神経系、筋肉、骨もしくは骨髄、肺、胃腸壁、血液脳関門、角膜、男性もしくは女性生殖器、免疫系または体の任意の他の器官から取り出された培養細胞にそれを投与することによって、試験化合物の毒性を評価することを対象とする。
【００４３】
一部の実施形態では、培養肝細胞は、肝細胞および少なくとも１つの他のタイプの細胞を含む細胞共培養物の形態である。一部の実施形態では、培養肝細胞は、少なくとも肝細胞および共培養物で間質の特徴を示すタイプの細胞（間質細胞）を含む細胞共培養物の形態である。
【００４４】
一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、固体担体の表面に配置された肝細胞および少なくとも１つの間質細胞型を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞培養物は、意図的にマイクロパターン化された構成で、固体担体の表面に配置される。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞培養物は、２つのタイプの細胞が互いに散在または混在する構成で、固体担体の表面に配置される。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、一緒に球状構成を呈する肝細胞および少なくとも１つの間質細胞型を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、細胞がそれらの共培養構成を呈するおよび／または維持することを可能にする固体格子の中に配置された肝細胞および少なくとも１つの間質細胞型を含む。肝細胞−間質細胞共培養物の一部の実施形態では、肝細胞および単一の間質細胞型は、共培養物の細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％または少なくとも約９９．９９％に総合的に相当する。肝細胞−間質細胞共培養物の一部の実施形態では、肝細胞および単一の間質細胞型は、共培養物の細胞の総数の上の百分率のいずれか未満を総合的に表す。
【００４５】
一般的に、肝細胞および間質細胞は、１：１０から１０：１の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、２：１０から１０：２の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、２：１０から４：１０の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、４：１０から６：１０の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、６：１０から８：１０の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、８：１０から１：１の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、１：１から１０：８の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、１０：８から１０：６の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、１０：６から１０：４の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、１０：４から１０：２の比で共培養物中に存在する。一部の実施形態では、肝細胞および間質細胞は、約１０：１、１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、９：１０、８：１０、７：１０、６：１０、５：１０、４：１０、３：１０、２：１０または１：１０の比で共培養物中に存在する。
【００４６】
一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、少なくとも２つの間質細胞型を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、共培養物の細胞の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％に各々相当する２つの間質細胞型を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、共培養物の細胞の総数のうちの実質的に異なる百分率を各々表す２つの間質細胞型を含む。一部の実施形態は、２つを超える異なる間質細胞型を含む。一部の実施形態では、共培養物の全ての間質細胞型の機能性の寄与は、本来は主として間質性である。一部の実施形態では、少なくとも１つの間質細胞型は、少なくとも第２の間質細胞型が提供するより大きな間質寄与を細胞培養物に提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの第２の間質細胞型は、本来間質性でない細胞共培養物の全体的機能または能力に寄与する。
【００４７】
肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、初代肝細胞、肝細胞の細胞株、ならびに幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞を限定なしに含む、任意のタイプの肝細胞であってよい。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の全ての肝細胞は、初代肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の全ての肝細胞は、少なくとも１つの肝細胞の細胞株に由来する。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の全ての肝細胞は、幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、初代肝細胞および少なくとも１つの肝細胞の細胞株を含む肝細胞の混合物である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、少なくとも１つの肝細胞の細胞株、ならびに幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞を含む肝細胞の混合物である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、初代肝細胞、ならびに幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞を含む肝細胞の混合物である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、初代肝細胞、少なくとも１つの肝細胞の細胞株、ならびに幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞を含む肝細胞の混合物である。
【００４８】
一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、単一のドナー哺乳動物からの肝細胞を含む。したがって、一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、全て単一のドナー哺乳動物から得られた初代肝細胞を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、複数の肝細胞の細胞株からの肝細胞を含み、ここで、複数の細胞株は全て単一のドナー哺乳動物の細胞から得られる。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、全て単一のドナー哺乳動物から生じる、胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞などの幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞である。
【００４９】
一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、複数のドナー哺乳動物からの肝細胞を含む。したがって、一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、複数のドナー哺乳動物から得られた初代肝細胞を含む。一部の実施形態では、初代肝細胞は、同じ種の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個体の異なるドナー哺乳動物から得られたロットの混合物である。一部の実施形態では、初代肝細胞は、１を超える種の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個体の異なるドナー哺乳動物から得られたロットの混合物である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、複数の肝細胞の細胞株からの肝細胞を含み、ここで、複数の細胞株は複数のドナー哺乳動物の細胞から得られる。一部の実施形態では、肝細胞の細胞株は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個体の異なるドナー哺乳動物から得られた細胞株を含む。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の肝細胞は、全て複数のドナー哺乳動物から生じる、胚性幹細胞、成体幹細胞および／または誘導多能性幹細胞などの幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞の細胞株は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個体の異なるドナー哺乳動物からの幹細胞を分化させることによって形成される肝細胞を含む。
【００５０】
肝細胞は、任意の哺乳動物のものであってよい。一部の実施形態では、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類（カニクイザルなど）、畜産動物（ブタ、ウマ、ウシおよびヒツジなど）、家畜哺乳動物（イヌ、ネコ、モルモット、ミニブタおよびウサギなど）および齧歯類（マウスおよびラットなど）から選択される哺乳動物のものであってよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、肝細胞は初代肝細胞である。初代肝細胞は、低温保存された形態で供給されてもよい（しかし、その必要はない）。低温保存されたヒト肝細胞は、とりわけＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴなどの民間企業から得ることができる。低温保存された非ヒト霊長類肝細胞は、とりわけＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴなどの民間企業から得ることができる。低温保存されたイヌ肝細胞は、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから得ることができる。低温保存されたラット肝細胞は、とりわけＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴなどの民間企業から得ることができる。一部の実施形態では、間質細胞型は、肝細胞と同じ種類の哺乳動物からのものである。一部の実施形態では、間質細胞型は、肝細胞と異なる種類の哺乳動物からのものである。
【００５２】
一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物は、第３の細胞型を含む。一部の実施形態では、第３の細胞型は、間質細胞である。一部の実施形態では、第３の細胞型は、間質細胞ではない。一部の実施形態では、第３の細胞型は、実質細胞である。一部の実施形態では、第３の細胞型は、非実質細胞ではない。一部の実施形態では、第３の細胞型は、伊東細胞、内皮細胞、胆管細胞、免疫媒介性細胞および幹細胞から選択される。一部の実施形態では、免疫媒介性細胞は、マクロファージ、Ｔ細胞、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球および好塩基球から選択される。
【００５３】
一部の実施形態では、第３の細胞型は、クッパー細胞である。一部の実施形態では、クッパー細胞は、共培養物の細胞の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約１０％より多くに相当する。
【００５４】
一部の実施形態では、間質細胞型は、内皮細胞である。一部の実施形態では、間質細胞型は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、間質細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、間質細胞は、細胞株から得られる。一部の実施形態では、間質細胞は、形質転換細胞である。一部の実施形態では、間質細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞または誘導多能性幹細胞から分化する。線維芽細胞などの間質細胞の多数の供与源が当技術分野で公知であり、肝細胞−間質細胞共培養物で利用することができる。一例は、ＮＩＨ  ３Ｔ３−Ｊ２細胞株である（例えば、ＵＳ２０１３／０２６６９３９Ａ１を参照）。
【００５５】
細胞性島構成の第１ステップで肝細胞が担体に付着するように、固体担体の上に肝細胞および間質細胞を配置することによって、培養物での肝細胞機能の一部の態様が改善されることを当技術分野は教示する（ＵＳ２０１３／０２６６９３９Ａ１を参照）。具体的には、そのような方法は、担体の上での肝細胞の細胞性島、間質細胞型などの非実質細胞型に囲まれた肝細胞島の形成に頼る。肝細胞島は、最初に島パターンの固体担体の上に細胞外マトリックス成分または誘導体を置き、次に、肝細胞を細胞外マトリックス成分または誘導体に接着させることによって形成される。非実質細胞型を次に加え、肝細胞を含有しない担体の部分を「充填」させる。そのような系の基本的な特徴は、肝細胞が担体表面全体に分散していないことである。
【００５６】
本発明の肝細胞−間質細胞共培養物の一部の実施形態では、肝細胞は、例えばＵＳ２０１３／０２６６９３９Ａ１に記載されているような細胞性島構成で分布している。しかし、好ましい実施形態では、肝細胞は固体担体の表面全体に実質的に分散し、間質細胞と混在している。一部の好ましい実施形態では、肝細胞は固体担体の表面全体に実質的に分散し、間質細胞と混在しており、肝細胞および間質細胞は、それらの構成が、間質細胞の少なくとも一部の上に部分的もしくは完全に構成された肝細胞の少なくとも一部、および／または肝細胞の少なくとも一部の上に部分的もしくは完全に構成された間質細胞の一部を含むようにそれら自体を再編成している。
【００５７】
本明細書で使用する場合、肝細胞−間質細胞共培養物において固体支持体の上の肝細胞の配置に関して「表面全体に分散している」は、以下の基準の少なくとも１つが共培養物に適用されることを意味する：１）固体担体の表面の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％が少なくとも１つの肝細胞によって覆われる；２）共培養物の肝細胞の少なくとも約２％、少なくとも約５％または少なくとも約１０％が、固体担体と接触している間質細胞の上部に位置する；および３）肝細胞は、固体担体に付着した肝細胞の島を製作するために少なくとも１つの細胞外マトリックス成分の島を含む固体担体に肝細胞を加えることによって固体担体の上に播種されなかった。単一の肝細胞が基準１および基準２の両方を満たすとみなすことができることに、注意すべきである。
【００５８】
好ましい実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の代謝機能は、長く持続する期間である。一部の実施形態では、培養の持続の期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、少なくとも２８日、少なくとも３５日、少なくとも４２日または少なくとも４２日よりも長くの間である。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の代謝機能は、共培養物の肝細胞の、遺伝子発現、細胞機能、代謝活性、形態および／またはそれらの組合せから選択される活性を測定することによって決定される。一部の実施形態では、肝細胞−間質細胞共培養物の機能は、少なくとも１つのＣＹＰ４５０酵素の発現および／または活性のレベルを測定することによって決定される。少なくとも１つのＣＹＰ４５０酵素の代謝発現および／または代謝活性のレベルは、ＣＹＰ４５０酵素のｍＲＮＡの発現の測定によって、ＣＹＰ４５０酵素タンパク質の発現の測定によって、またはＣＹＰ４５０酵素活性の機能的アッセイによって測定することができる。一部の実施形態では、代謝活性はＣＹＰ４５０酵素活性などのいわゆるフェーズＩ代謝性酵素活性である。一部の実施形態では、ＣＹＰ４５０酵素は、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４ＡおよびＣＹＰ４Ｂから選択されるＣＹＰ４５０酵素である。一部の実施形態では、フェーズＩ代謝性酵素活性は、ＭＡＯ活性などの非ＣＹＰ酵素活性である。一部の実施形態では、代謝活性は、ＵＧＴまたはＳＵＬＴ酵素活性などのいわゆるフェーズＩＩ代謝性酵素活性である。
【００５９】
共培養物の代謝機能が対照肝細胞単一培養物の代謝機能より肝細胞−間質細胞共培養物で長く持続する場合は、肝細胞−間質細胞共培養物の代謝機能は長く持続すると考えられる。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも３日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも４日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも７日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも１４日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも２１日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも２８日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも３５日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも４２日間持続する。一部の実施形態では、共培養物の代謝機能は、少なくとも４２日間より長く持続する。
【００６０】
一部の実施形態では、共培養物は、無血清または本質的に無血清の培地で培養される。一部の実施形態では、共培養物は、血清を含有する培地で培養される。一部の実施形態では、培地は、約０．１％の血清、約０．２％の血清、約０．３％の血清、約０．４％の血清、約０．５％の血清、約０．６％の血清、約０．７％の血清、約０．８％の血清、約０．９％の血清、約１％の血清、約２％の血清、約３％の血清、約４％の血清、約５％の血清、約６％の血清、約７％の血清、約８％の血清、約９％の血清または約１０％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、少なくとも約０．１％の血清、少なくとも約０．２％の血清、少なくとも約０．３％の血清、少なくとも約０．４％の血清、少なくとも約０．５％の血清、少なくとも約０．６％の血清、少なくとも約０．７％の血清、少なくとも約０．８％の血清、少なくとも約０．９％の血清、少なくとも約１％の血清、少なくとも約２％の血清、少なくとも約３％の血清、少なくとも約４％の血清、少なくとも約５％の血清、少なくとも約６％の血清、少なくとも約７％の血清、少なくとも約８％の血清、少なくとも約９％の血清または少なくとも約１０％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約０．１％もしくはそれ未満の血清、約０．２％もしくはそれ未満の血清、約０．３％もしくはそれ未満の血清、約０．４％もしくはそれ未満の血清、約０．５％もしくはそれ未満の血清、約０．６％もしくはそれ未満の血清、約０．７％もしくはそれ未満の血清、約０．８％もしくはそれ未満の血清、約０．９％もしくはそれ未満の血清、約１％もしくはそれ未満の血清、約２％もしくはそれ未満の血清、約３％もしくはそれ未満の血清、約４％もしくはそれ未満の血清、約５％もしくはそれ未満の血清、約６％もしくはそれ未満の血清、約７％もしくはそれ未満の血清、約８％もしくはそれ未満の血清、約９％もしくはそれ未満の血清または約１０％もしくはそれ未満の血清を含む。
【００６１】
この開示の一部の実施形態では、系および方法は、４つの異なる哺乳動物種のうちの少なくとも３つからの同等の肝細胞−間質細胞共培養物を提供する。
【００６２】
実施例で提示される実施形態は、ある特定の初代肝細胞−間質細胞共培養物を利用する。しかし、本発明はその構成の細胞培養物に限定されると理解すべきでない。本発明の完全な範囲は、第１および第２の培養期間にわたる毒性を比較することができるように、第１および第２の培養期間にわたって試験化合物を細胞培養物と一緒にインキュベートすることができるように、長期の培養期間にわたって高い代謝機能の状態で細胞（例えば、肝細胞）を維持する、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養系を包含する。
【００６３】
一部の実施形態では、異なる細胞型が肝細胞の代わりに用いられる。例えば、本発明は、肝臓以外の器官（２つの例として、心臓および腎臓など）からの細胞で毒性を測定する実施形態を限定なしに含む。
【００６４】
Ｂ．試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける方法
一部の実施形態では、本発明は、試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける方法を提供する。試験化合物は、限定なしに、治療目的を有するかまたはそれについて調査中の化合物、ならびに環境および工業化学物質を含む任意のタイプの化合物であってよい。
【００６５】
一部の実施形態では、本方法は、第１の培養期間の間に肝細胞を含む第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップを含む。一部の実施形態では、第１の培養期間の間に肝細胞を含む複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートする。第１の培養期間中の１または複数時点で試験化合物を第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物（複数可）に添加することができる（すなわち、第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物（複数可）に試験化合物を投薬することができる）。一般的に、培養物の少なくとも１つの特徴が、複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の間で異なる。例えば、異なる濃度の試験化合物の存在下でおよび／または試験化合物を投薬する頻度を変えることによって、異なる第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物をインキュベートすることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、本方法は、第１の培養期間にわたって第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し（例えば、第１の培養期間の終わりに測定し）、それによって第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を規定するステップを含む。第１の培養期間の間に試験化合物の異なる濃度で試験化合物とインキュベートした肝細胞を含む複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を本方法が利用するならば、本方法は、第１の培養期間にわたって複数の第１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の各々の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定するステップを一般的に含む。一部の実施形態では、第１の培養期間にわたって試験化合物のＴＣ５０値を次に決定する。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法は、第２の培養期間の間に、肝細胞を含む第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートするステップをさらに含む。第２の培養期間は、第１の培養期間より持続時間が一般的に長い。一部の実施形態では、第２の培養期間は、第１の培養期間が含むより多い、試験化合物の個々の投薬回数を含む。一部の実施形態では、第２の培養期間の間に、肝細胞を含む複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を試験化合物とインキュベートする。試験化合物は、第２の培養期間中の１または複数時点で、第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物（複数可）に添加することができる。一般的に、培養物の少なくとも１つの特徴が、複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の間で異なる。例えば、異なる濃度の試験化合物の存在下でおよび／または試験化合物を投薬する頻度を変えることによって、異なる第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物をインキュベートすることができる。
【００６８】
一部の実施形態では、本方法は、第２の培養期間にわたって（例えば、第２の培養期間の終わりに）第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を規定するステップを含む。第２の培養期間の間に試験化合物の異なる濃度で試験化合物とインキュベートした肝細胞を含む複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を本方法が利用するならば、本方法は、第２の培養期間にわたって複数の第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の各々の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定するステップを一般的に含む。一部の実施形態では、第２の培養期間にわたって試験化合物のＴＣ５０値を次に決定する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加の培養期間（すなわち、第２の培養期間の持続時間よりさらに長い持続時間の培養期間）の終わりに少なくとも１つの追加のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の肝細胞に及ぼす試験化合物の少なくとも１つの細胞毒性作用を測定し、それによって第３の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を規定するステップを含む。
【００６９】
一般的に、第１および第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性は、第１および第２の培養期間の完了時に決定される、試験化合物のＴＣ５０値と規定される。一部の実施形態では、生きているおよび／または死んでいる培養物の細胞の数は、生および／または死細胞を数える方法によって決定される。一部の実施形態では、少なくとも１つの毒性過程の出現の程度および／または率を測定する方法が使用される。一部の実施形態では、そのような各培養期間の終わりに測定される試験化合物の肝毒性は、ＴＣ５０／Ｃｍａｘで表される、特定の投薬量が投与されるヒトまたは他の哺乳動物種の血漿中で試験化合物が到達する最高濃度（「Ｃｍａｘ」濃度として知られる）をＴＣ５０値で割った比と規定される。
【００７０】
第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性を、第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性と比較し、それによって試験化合物の時系列肝毒性を特徴付ける。一部の実施形態では、この比較は、第１の培養期間にわたる試験化合物の毒性の程度  対  第２の培養期間にわたる試験化合物の毒性の程度の単純な算術比である。一部の実施形態では、第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性は、第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性より大きく、試験化合物は時系列肝毒性を示していると特定され、そのため、第１の（すなわち、より短く持続する）培養期間の終わりに測定されるＴＣ５０値を第２の（すなわち、より長く持続する）培養期間の終わりに測定されるＴＣ５０値で割った算術計算は、１より大きい数である。本発明は、この比較が、第２の（すなわち、より長く持続する）培養期間の終わりに測定される毒性の単純な測定より正確な、試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の予測因子であるとの本発明者らの驚くべき観察に一部基づく。この結果は予想外であり、この分野における従来の知識とは反対のものである。
【００７１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の規定のリスクが観察されるかどうか決定するために、第１の培養期間の終わりに測定される試験化合物の肝毒性に対する、第２の培養期間の終わりに測定される試験化合物の肝毒性の計算される比、差または変動が、規定の閾値と比較される。一部の実施形態では、閾値は予め規定された閾値である。一部の実施形態では閾値は絶対数（例えば、少なくとも４の値の比）であるが、他の実施形態では、閾値は対照化合物で実験的に決定される比の倍数である。
【００７２】
一部の実施形態では、第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性は、第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性より、少なくとも予め規定された閾値だけ大きく、試験化合物は時系列肝毒性を示していると特定される。一部の実施形態では、第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性は、第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性より、少なくとも予め規定された閾値だけ大きくなく、試験化合物は時系列肝毒性を示していないと特定される。
【００７３】
一部の実施形態では、第２の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性は、第１の培養期間にわたる試験化合物の肝毒性より、少なくとも２，  少なくとも３，  少なくとも４，  少なくとも５，  少なくとも６，  少なくとも７，  少なくとも８，  少なくとも９または少なくとも１０の因数だけ大きい。この因数は、算術的に計算された比、対数的に導かれた数字の間の引き算された差であるか、または任意の他の形態の計算された測定値であってよい。
【００７４】
一部の実施形態では、第１の培養期間は、１２時間から５日間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、１２から３６時間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、１日間から５日間、１日間から３日間または３日間から５日間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、２日間から４日間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、１、２、３、４または５日間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、５日間未満である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、１０から６０分間である。一部の実施形態では、第１の培養期間は、６０分間から１２時間である。好ましい実施形態では、第１の培養期間は、１日間または１２から３６時間である。
【００７５】
一部の実施形態では、第２の培養期間は、３日間から２８日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、７から２８日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、２８日間未満である。一部の実施形態では、第３の培養期間は、第２の培養期間より長い。一部の実施形態では、第２の培養期間は、７から１４日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、１４から２１日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、２１日間から２８日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、１４日間から２８日間である。一部の実施形態では、第２の培養期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間であり、第１の培養期間より長い。一部の実施形態では、第２の培養期間は、１０から６０分間であり、第１の培養期間より長い。一部の実施形態では、第２の培養期間は、６０分間から１２時間であり、第１の培養期間より長い。
【００７６】
第２の培養期間は、第１の培養期間より長い。一部の実施形態では、第２の培養期間は、３、５、７、９、１１もしくは１４日、または１４日を超えて第１の培養期間より長い。
【００７７】
第３の培養期間は、第２の培養期間より長い。一部の実施形態では、第３の培養期間は、１、２、３、５、７、９、１１もしくは１４日、または１４日を超えて第２の培養期間より長い。
【００７８】
本発明は、単純な算術、多変量代数、積分、微分、確率的、推計学的およびシミュレーションの形態の測定および／または計算モデルを利用する実施形態を含む。
【００７９】
Ｃ．試験化合物の細胞毒性作用を測定する方法
一部の実施形態では、試験化合物の細胞毒性作用は、細胞死である。
【００８０】
一部の実施形態では、試験化合物の細胞毒性作用は、細胞死につながる細胞毒性過程である。
【００８１】
一部の実施形態では、本方法は、ＬＣ５０を導くために、複数の第１の培養物および異なる濃度の試験化合物の使用を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、細胞毒性作用は、細胞毒性に関連した細胞属性である。一部の実施形態では、細胞属性は、担体への細胞接着、検出可能な最終生成物への酸化還元色素の細胞内酵素的変換、反応性酸素種（ＲＯＳ）のミトコンドリア膜電位形成、培地への細胞内酵素の放出、タンパク質分泌、細胞副産物分泌および培養物の肝細胞による酸素消費速度から選択される。
【００８３】
担体への細胞接着は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、細胞接着は、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造されるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡ  ＳＰシステムを、本明細書で提供される肝細胞培養物と共に使用することによって評価される。肝細胞培養物は、適する培養担体、例えば、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造されるＥ−Ｐｌａｔｅ  Ｖｉｅｗ９６プレートにおいて確立される。Ｅ−プレートの電極の上の細胞の存在は、電極／溶液界面で局所的なイオン環境に影響し、電極、溶液および細胞を含む電気システムのインピーダンスの増加につながる。より多くの細胞が電極の上に付着するほど、電極インピーダンスの増加はより大きい。さらに、インピーダンスは電極との細胞相互作用の性質に依存する。例えば、増加した細胞接着または展着は、電極インピーダンスのより大きな変化につながる。したがって、細胞指数（ＣＩ）値として提示される電極インピーダンスは、共培養物で細胞の生存率、数、形態および接着をモニタリングするのに使用することができる。検出可能な最終生成物への酸化還元色素の細胞内酵素的変換は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイが使用される。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイは、マルチウェルプレートに存在する生存能力のある細胞の数を推定するための、ホモジニアスな蛍光定量的方法を提供する。単純なプロトコールは、血清を補充した培地で培養した細胞に単一の試薬を直接に追加することを含む。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイは、酸化還元色素（リザズリン）を蛍光性最終生成物（レゾルフィン）に変換する生細胞の能力に基づく。生存能力のある細胞は、リザズリンをレゾルフィンに還元する能力を保持する。生育不能の細胞は、代謝能を急速に失い、指標色素を還元せず、したがって蛍光性シグナルを生成しない。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬は、高度に精製されたリザズリンを含有する緩衝溶液である。成分は、細胞生存率アッセイとしての使用に最適化された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬のスペクトル特性は、レゾルフィンへのリザズリンの還元の際に変化する（図２）。リザズリンは色が濃青色であり、ピンク色で高度に蛍光性である（５７９Ｅｘ／５８４Ｅｍ）レゾルフィンにそれが還元されるまで、固有の蛍光をほとんど有しない。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬の可視光吸光度特性は、レゾルフィンへのリザズリンの還元の際に「ブルーシフト」を経る。リザズリンの吸光度最大値は６０５ｎｍであり、レゾルフィンのそれは５７３ｎｍである。結果を記録するために蛍光または吸光度のいずれかを使用することができる。しかし、蛍光はより感受性で、より少ないデータ計算で済むので好ましい方法である。
【００８４】
反応性酸素種（ＲＯＳ）の形成は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、ＰｒｏｍｅｇａからのＲＯＳ−Ｇｌｏ（商標）Ｈ２Ｏ２アッセイが使用される。ＲＯＳ−Ｇｌｏ（商標）Ｈ２Ｏ２アッセイは、細胞培養または規定の酵素反応で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを直接に測定する、ホモジニアスで迅速および高感度の生物発光アッセイである。誘導体化されたルシフェリン基質が試料とインキュベートされ、Ｈ２Ｏ２と直接に反応してルシフェリン前駆体を生成する。ＲＯＳ−Ｇｌｏ（商標）検出溶液の添加は、前駆体をルシフェリンに変換し、Ｕｌｔｒａ−Ｇｌｏ（商標）組換えルシフェラーゼを提供し、試料中に存在するＨ２Ｏ２のレベルに比例する光シグナルを生成する。このアッセイは血清の有無にかかわらず様々な細胞培養培地で実行することができ、アッセイを実行する前に培養細胞から培地を除去する必要性を排除する。試料操作を必要としない単純な２試薬添加プロトコールに従って、ホモジニアスなアッセイが実行される。このアッセイは、試薬添加後２時間未満で完了することができる。ＲＯＳ−Ｇｌｏ（商標）Ｈ２Ｏ２基質はＨ２Ｏ２と直接に反応し、共役酵素としてのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の必要性を取り除き、したがって、ＨＲＰ阻害に関連した偽のヒットを排除する。
【００８５】
培地への細胞内酵素の放出を検出するアッセイは、任意の適する酵素に基づくことができ、当技術分野で公知の適する試薬を利用することができる。一部の実施形態では、酵素はアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）である。ＬＯＮＺＡからのＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）バイオアッセイキットが、１つの適する例である。それは、損傷を受けた細胞からの酵素アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の放出を測定するように設計された、生物発光の非破壊細胞溶解アッセイキットである。ＡＫは全ての真核細胞に存在する堅固なタンパク質であり、それは細胞が死滅するときに培養培地に放出される。この酵素はＡＤＰを能動的にリン酸化してＡＴＰを形成し、その結果としてのＡＴＰは次に生物発光ホタルルシフェラーゼ反応を使用して測定される。細胞溶解レベルが増加するに従い、上清中のＡＫの量も増加し、そのことはＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）試薬によるより高い光強度の放出をもたらす。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）バイオアッセイキットは、細胞が死滅するときに細胞からＡＫが放出されるという事実を活用するので、細胞溶解の必要性がない（多くの他の細胞毒性アッセイと異なる）。したがって、細胞自体を破壊することなく、上清の反復試料を経時的にとることができる。これは、細胞死の動態分析を可能にする。元の細胞の上で他の試験を実行することを可能にすることによって、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）バイオアッセイキットは、高い含有量のスクリーニングも促進する。ＡＫ検出のために必要とされる全ての成分は単一の試薬の中に含有され、アッセイの実行を非常に単純にしている。キットは顕著な感度を提供し、５桁を超えるダイナミックレンジで、検出限界は１マイクロウェルにつき１０個の細胞である。長期シグナル安定性も、ハイスループットスクリーニング適用におけるバッチ処理のためにアッセイを好適にしている。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）バイオアッセイキットは、少量のＡＫ酵素が高濃度のＡＴＰを生成することができるＡＫ反応の循環的性質を活用する。これは、細胞毒性の非常にかすかな変化の検出を可能にし、偽陰性を低減する。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは細胞培養上清中に存在する細胞性ＡＫを検出し、アッセイを実行するために細胞を溶解する必要性を排除し、同じ試料で複数の試験を実行することを可能にする。アッセイは単一の試薬の単純な添加を必要とし、それは細胞が成長するウェルに、または吸引された培養上清の小さい試料に直接に添加することができる。
【００８６】
培養物の肝細胞による酸素消費速度は、当技術分野で公知の任意の適するアッセイを使用して評価することができる。１つの例は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＸＦ技術およびストレス試験キットである。キットは生細胞におけるエネルギー利用を測定し、マイクロプレートでミトコンドリア呼吸および解糖をリアルタイムで同時に定量化する。ＸＦ技術は、他の方法で一般的である、多数の細胞、フラスコ、電極、色素、放射性物質または細胞の溶解の使用を伴わずに、マイクロプレートにおいて基質利用、ミトコンドリア機能、エネルギー消費および細胞の品質を研究するための堅固で単純な方法を提供する。呼吸および解糖をリアルタイムで同時に測定することによって細胞の代謝表現型を、ならびに病理学的状態下の２つの経路の間のシフトを測定するＸＦアナライザーの特異な能力は、細胞の生理的形質を分子実体によって誘導される毒性と関係させることを可能にする。ＸＦｅアナライザーは、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を概ね２〜５分の間隔で測定する。ＯＣＲはミトコンドリア呼吸の指標であり、ＥＣＡＲは主に解糖の結果である。ＯＣＲおよびＥＣＡＲのリアルタイム測定は、マイクロプレートの中の細胞の単層の上で極めて小さい容量（７μｌ未満）の培地を単離することによって行われる。細胞酸素消費（呼吸）およびプロトン排出（解糖）は、この「一時的マイクロチャンバー」中の溶存酸素および遊離プロトンの濃度に、迅速で容易に測定可能な変化を引き起こし、それらは細胞単層の２００ミクロン上に存在している固体センサープローブによって数秒ごとに測定される。変化率が線形になるまで装置は濃度を測定し続け、次にＯＣＲおよびＥＣＡＲをそれぞれ決定するために傾きを計算する。測定が完了すると、プローブは上昇し、それは上のより多くの培地を一時的マイクロチャンバー中の培地と混合させ、細胞値をベースラインに回復させる。統合化薬物送達系は、ユーザー定義の間隔で１ウェルにつき最高４つの薬物の逐次的な添加を可能にする。ＸＦアッセイの開始の前に、ＸＦ細胞培養マイクロプレートのウェルなどの適する担体に細胞が播種される。アッセイの間、Ｓｅａｈｏｒｓｅによって供給される無重炭酸塩培地が一般的に使用される。しかし、１ウェルにつき複数の異なるアッセイの性能を協調させるのに、代替的な培地を使用することもできると考えられる。アッセイの間に使用するために、最高２つまたは４つの薬物をアッセイカートリッジに追加することができる。ＸＦ測定は非破壊的であるので、同じ細胞集団の代謝速度を経時的に繰り返し測定することができ、その間、最高２つまたは４つの異なる薬物を各ウェルに逐次的に注入することができる。ＸＦアッセイの終了後、細胞生存率などの他のタイプの生物アッセイを同じプレートの上で実行することができる。全アッセイ時間は、一般的に３５〜９０分である。正常な細胞生理を維持するために、温度制御系はＸＦアナライザーの内部環境を３７℃に維持する。
【００８７】
培養物の肝細胞による酸素消費速度を測定するのに使用することができる別の技術は、Ｌｕｘｃｅｌによって商業的に提供されるＭｉｔｏｘｐｒｅｓｓ  Ｘｔｒａである。ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ（登録商標）−Ｘｔｒａ（ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ−Ｘｔｒａ  ＆  ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ−Ｘｔｒａ−ＨＳ）アッセイは、細胞集団による細胞外酸素消費を測定する。
【００８８】
一部の実施形態では、アッセイで特徴付けられる細胞属性は、担体への細胞接着、検出可能な最終生成物への酸化還元色素の細胞内酵素的変換、反応性酸素種（ＲＯＳ）の形成、培地への細胞内酵素の放出、タンパク質分泌、細胞副産物の排出および培養物の肝細胞による酸素消費速度のうちの２、３、４、５、６または７つを含むかまたはそれらからなる。これらの７つの細胞属性のうちの２、３、４、５、６および７つの各順列は、独立して本発明の具体的な実施形態である。
【００８９】
一部の実施形態では、アッセイはアルブミン分泌および／または尿素排出をアッセイすることをさらに含む。
【００９０】
一部の実施形態では、系および方法は、６つの哺乳動物種のうちの少なくとも３つで実行される毒性アッセイを含む。６種は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌおよびラット、マウスおよびミニブタから選択することができる。
【実施例】
【００９１】
以下の実施例は、本発明の使用方法をより完全に記載する役目をする。これらの実施例は例示目的のために提示され、本発明の真の範囲を限定する役目をするべきでない。
【００９２】
（実施例１：初代肝細胞−間質細胞共培養物）
低温保存されたヒト肝細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得た。低温保存された非ヒト霊長類（カニクイザル）肝細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得た。低温保存されたイヌ肝細胞は、ＩＶＴ  Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから得た。低温保存されたラット肝細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（旧称Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得た。低温保存されたヒト肝細胞を液体窒素から取り出して、解凍した。解凍後、細胞を培地に再懸濁し、トリパンブルー排除を使用して細胞数および細胞生存率を決定した。実験的なプレーティングのために使用するまで、間質細胞をＣＯ２インキュベーターの中で育てた。プレーティング当日に、細胞をプレートから剥がし、洗浄し、培地に再懸濁した。細胞数および生存率は、トリパンブルー排除を使用して決定した。
【００９３】
コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレートに１ウェルにつき３０，０００個の肝細胞の密度で、または異なるサイズのウェルに同等の密度で、肝細胞および間質細胞を播種した。肝細胞はウェルの表面全体に実質的に分散していた。播種の前に、間質細胞の成長を停止させた。
【００９４】
肝細胞−間質細胞共培養物の有用性を実証するいくつかの実験の結果を、本明細書に添付される図に提示する。（図番号は図の右下の角に提供される。）
【００９５】
（実施例２：初代肝細胞−間質細胞共培養物の安定したおよび持続する機能性）
図１〜５で報告されるデータは、実施例１に記載される肝細胞−間質細胞共培養物の安定した高い機能性を示す。ヒト代謝活性は、ＣＹＰ特異的代謝産物形成によって特徴付けられた。ＣＹＰ  ３Ａ４活性は、１−ＯＨミダゾラムへのミダゾラムの変換速度によって測定した。ＣＹＰ  ２Ｄ６活性は、デキストロルファン（ｄｅｘｔｒｏｐｈａｎ）へのデキストロメトルファンの変換速度によって測定した。ＣＹＰ  ２Ｃ９活性は、４−ＯＨトルブタミドへのトルブタミドの変換速度によって測定した。イヌ、ラットおよびサルの代謝活性は、クマリンの一次および二次の代謝産物の形成によって特徴付けられた。一次代謝は７−ヒドロキシクマリンの形成速度によって測定し、二次代謝は７−ヒドロキシクマリングルクロニドおよび７−ヒドロキシクマリンスルフェート（ｓｕｆａｔｅ）の形成によって測定した。代謝産物の濃度は、培養で１時間にわたってモニタリングし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を通して分析した。全体として、長期間許容レベルを上回って代謝機能を維持することができることを、結果は示す。
【００９６】
図１は、フェーズＩ酵素機能が、本発明のラット、イヌおよび霊長類の肝細胞−間質細胞共培養物で長く持続することを示す。７−ヒドロキシクマリン形成の速度を、示した時点で測定した。異なる種で異なるパターンが明白である。しかし、各場合に、フェーズＩ酵素機能は長く持続している。ラットおよびイヌは肝細胞が播種された日から少なくとも３５日間フェーズＩ活性を有し、霊長類は少なくとも２２日間有する。
【００９７】
図２は、フェーズＩＩ酵素機能が、本発明のラット、イヌおよび霊長類の肝細胞−間質細胞共培養物で長く持続することを示す。７−ヒドロキシクマリングルクロニド形成の速度を、示した時点で測定した。異なる種で異なるパターンが明白である。しかし、各場合に、フェーズＩＩ酵素機能は長く持続している。ラットおよびイヌは肝細胞が播種された日から少なくとも３５日間フェーズＩＩ活性を有し、霊長類は少なくとも２２日間有する。
【００９８】
図３は、初代ヒト肝細胞の３つの異なるロットから作製された肝細胞−間質細胞共培養物での長期持続ＣＹＰ  ３Ａ４機能を示す。１−ヒドロキシミダゾラム形成の速度を測定することによって、ＣＹＰ  ３Ａ４機能を分析した。ベースラインでロット間の多少の変動が観察されたが、全てのロットは細胞が播種された日から３５日間３Ａ４活性を有する。
【００９９】
図４は、初代ヒト肝細胞の３つの異なるロットから作製された肝細胞−間質細胞共培養物での長期持続ＣＹＰ  ２Ｃ９機能を示す。１−ヒドロキシトルブタミド形成の速度を測定することによって、ＣＹＰ  ２Ｃ９機能を分析した。ベースラインでロット間の多少の変動が観察されたが、全てのロットは細胞が播種された日から３５日間２Ｃ９活性を有する。
【０１００】
図５は、初代ヒト、イヌ、ラットおよび霊長類肝細胞を使用して確立された肝細胞−間質細胞共培養物での小管の染色を示す。
【０１０１】
（実施例３：高い機能安定性の長期ウィンドウ）
図６〜９で報告されるデータは、実施例１に記載される肝細胞−間質細胞共培養物の安定した高い機能性が、非常に上昇した代謝機能レベルおよび狭い酵素活性変動のフレームで２週間の実験の実行を可能にする長期時間ウィンドウにわたって存在することを示す。ヒト代謝活性は、ＣＹＰ特異的代謝産物形成によって特徴付けられた。ＣＹＰ  ３Ａ４活性は、１−ＯＨミダゾラムへのミダゾラムの変換速度によって測定した。ＣＹＰ  ２Ｄ６活性は、デキストロルファンへのデキストロメトルファンの変換速度によって測定した。ＣＹＰ  ２Ｃ９活性は、４−ＯＨトルブタミドへのトルブタミドの変換速度によって測定した。イヌ、ラットおよびサルの代謝活性は、クマリンの一次および二次の代謝産物の形成によって特徴付けられた。一次代謝は７−ヒドロキシクマリンの形成速度によって測定し、二次代謝は７−ヒドロキシクマリングルクロニドおよび７−ヒドロキシクマリンスルフェートの形成によって測定した。代謝産物の濃度は、培養で１時間にわたってモニタリングし、１日目の形成速度に対して正規化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を通して分析した。全体として、長期間の安定性のウィンドウで代謝機能を維持することができ、このことは、細胞機能の下落なしで実験者が長期実験を行うことを可能にすることを、結果は示す。
【０１０２】
図６は、培養の７日目から２５日目までヒト肝細胞−間質細胞共培養物で肝細胞ＣＹＰ  ３Ａ４活性が安定していることを示す。７日目までに、培養された初代肝細胞は再構築を完了し、機能を安定化させた。機能は、２５日目まで安定したままである。
【０１０３】
図７は、培養の７日目から１８日目までヒト肝細胞−間質細胞共培養物でヒト肝細胞の３つの異なるロットのほとんどまたは全てで４つの異なるＣＹＰ酵素が安定したままであることを示す。
【０１０４】
図８は、フェーズＩ代謝のための安定性の複数種ウィンドウを示す。
【０１０５】
図９は、フェーズＩ代謝のための安定性の複数種ウィンドウを示す。
【０１０６】
（実施例４：初代肝細胞−間質細胞共培養物のＨｅｐＧ２細胞との比較）
ＨｅｐＧ２細胞を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間コンフルエントにさせた。初代ヒト肝細胞共培養物を実施例１に従って確立し、実験の前に７日間順化させた。実験の開始時に、細胞を化合物の様々な濃度に４日間曝露し、実験の２日目に１回の反復用量を与えた。４日目に、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＴＰアッセイを実行した。結果を、図１０に提示する。フルタミドおよびケトコナゾールでは、ＨｅｐＧ２細胞毒性曲線と比較してヒト肝細胞共培養物毒性曲線で右シフトが観察された。これは、ヒト肝細胞共培養物における毒性親化合物のより大きな肝臓クリアランスを反映するようであり、このことは、それがＨｅｐＧ２細胞と同等レベルの毒性を生成するために親化合物のより高い濃度を必要とすることを意味する。トログリタゾンでは、ＨｅｐＧ２細胞と比較して初代ヒト肝細胞共培養物毒性曲線で左シフトが観察された。これは、初代肝細胞共培養系での毒性代謝産物のより大きな生成によるものと考えられ、それは同等レベルの毒性を生成するためにより低い親濃度を必要とする。
【０１０７】
（実施例５：多回用量依存性毒性の検出）
図１１〜１３のグラフは、ヒト、イヌ、霊長類およびラットにおいて６日間の反復化合物曝露の後に生成された、濃度依存性毒性曲線を提示する。各化合物は、濃度の全範囲にわたって、２日、４日および６日の治療期間の間に２日ごとに投薬された。６日目に、ミトコンドリアの代謝活性を測定するためにＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒブルーアッセイを使用した。そのデータは、ＴＣ５０値を生成するために次に使用した。各種の中で、毒性の経時的濃度依存性変化があることを、データは実証する。シクロホスファミドの場合、これは毒性代謝産物の形成のために起こると考えられている。データは、異なる種が異なる毒性プロファイルを生成することも示す。図１１〜１３で報告されるデータは、長期間にわたり化合物毒性を分析するための、実施例１に記載される肝細胞−間質細胞共培養物の使用を実証する。図１１で、シクロホスファミドは、濃度の全範囲にわたって、２日、４日および６日の治療期間の間に２日ごとに投与された。データは、医薬品の複数回の投薬が毒性曲線をシフトし、そのため、より遅い毒性形成が観察され得ることを明らかに実証する。これは、当技術分野で公知の他の系では行うことができないものである。とりわけ、このデータは、本発明の系および方法が毒性プロファイルの種間差を検出し、実証することができることを実証する。
【０１０８】
図１１は、ヒト、イヌ、霊長類またはラット初代肝細胞を含む肝細胞−間質細胞共培養物に及ぼすシクロホスファミドの多回投薬の肝毒性作用を示す。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ、ｎ＝４を使用して分析した。データは、投薬の持続時間を延長することがシクロホスファミドの細胞毒性を増加させることを示す。
【０１０９】
図１２は、６日間の治療（３回用量）の後の、ヒト、イヌ、霊長類またはラット初代肝細胞を含む肝細胞−間質細胞共培養物に及ぼすトログリタゾンの多回投薬の肝毒性作用（計算されたＬＣ５０）を示す。イヌ、サルおよびラットでの結果は、図１２で提示される３つのグラフで、ヒトと各々個々に比較される。
【０１１０】
図１３は、シクロホスファミドおよびトログリタゾンの結果を要約する。
【０１１１】
（実施例６：ヒト、イヌ、サルおよびラット初代肝細胞−間質細胞共培養物の比較）
図１４は、ＧＳＨおよびＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒブルーアッセイの比較を提示する。アッセイは、５０＊Ｃｍａｘで行われた。各化合物は、０日目に開始して、２日ごとに投薬された。６日目に、ミトコンドリアの機能を評価するためにＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒブルーアッセイを使用した。非常に低いアッセイ間の変動性は、この開示の系および方法の有用性および能力のさらなる実証である。
【０１１２】
（実施例７：時系列肝毒性アッセイ）
初代肝細胞−間質細胞共培養物の安定した、長く持続する高い機能性（実施例１〜５を参照）は、長期間にわたる培養での肝毒性の分析を可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を予測するこの系の能力を評価するために、公知のｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性プロファイルを有する一群の２０個の化合物を分析した。この群には、強力なｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性または中等度のｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を示すことが知られている化合物、ならびに肝毒性であると考えられていない化合物が含まれた（図１５）。肝毒性であることが知られている化合物には、（１）複雑および多因子性である、（２）未知および／または特異体質の、（３）反応性代謝産物によって媒介される、（４）胆汁酸塩輸送の変更によって媒介される、ならびに（５）胆汁うっ滞である肝毒性を示すことがわかっている化合物が含まれた。
【０１１３】
図１６および１８は、上に詳しく述べた２０個の化合物を、ヒト（図１６）およびラット（図１８）種からの肝細胞をそれぞれ含む肝細胞−間質共培養物に曝露したときの結果を提示する。
【０１１４】
「標準の単一培養」でのヒト細胞は、解凍され、９６ウェルプレートに平板培養された低温保存ヒト肝細胞であった。それらは、２４時間接着させ、次に２４時間、化合物に曝露させた。「標準の単一培養」でのラット細胞は、９６ウェルプレートに平板培養された、新たに単離された細胞であった。細胞は、２４時間接着させ、次に２４時間、化合物に曝露させた。共培養物の全ては、実施例１に従って調製された。化合物の投薬は播種から７日目に始まり、新鮮な化合物を４８時間ごとに追加した。
【０１１５】
図１６および１８で提示されるデータは、単一の時点で毒性を分析することが、この群の化合物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性の堅固な予測因子でないことを示す。例えば、図１６のヒトデータは、２４時間でのクロルプロマジンのＬＣ５０が２１であり、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）のＬＣ５０は１０５であることを示す。それらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれぞれ中等度の肝毒性および肝毒性の欠如を示すことが知られている。対照的に、ボセンタンのＬＣ５０は７５７であり、そのことは、単独で考慮すると、ボセンタンがクロルプロマジンおよびプロパノロールのいずれよりずっと弱い肝臓毒であることを示唆するだろう。しかし、ボセンタンは強力なｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を示すことが実際知られている。同様に、７および１４日でのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝毒性でないかまたは中等度のｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を示すいくつかの化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な肝毒性を示すことが知られている化合物のＬＣ５０値のいくつかより低いＬＣ５０値を有することを示す。図１８で提示されるラットデータは、観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性と公知のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の間の強力な関連を同様に欠如していることを示す。
【０１１６】
より広くは、単一の時点、例えば２４時間で行われる毒性の測定は、予測的有用性をほとんど有さず、前臨床または臨床の薬物開発の後期段階に化合物を進めるかどうかについてあまり多くの信憑性を置かれていないと、関連分野の熟練した実施者によって広く考えられている。例えば、かなり低いＴＣ５０値、例えば１００または５０マイクロモル濃度さえも生成した試験化合物は無視されてもよく、その「陽性の肝臓シグナル」が得られたとしても、その化合物を先に進めるとの決定が必要とする全ての付随する時間および資金の投資によりその化合物は前臨床または臨床開発に進められる。なぜなら、その薬物が前臨床動物種またはヒトでその後試験されたときに、単一時点のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は予測的でも「翻訳的（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）」でもないことが証明されるだろうと薬物開発者が期待し、または考えたからである。さらに、それらが必要となるだろう前臨床開発段階において、毒性の単一時点での測定を評価することができる外部標準がない。１つのそのような標準、「治療ウィンドウ」のサイズまたはそのＴＣ５０と比較したときの薬物によって達成される最大血漿中濃度の関係（すなわち、ＴＣ５０／Ｃｍａｘ）は、必要なときに利用可能でない。なぜなら、前臨床試験が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制当局が試験化合物に治験用新薬資格（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  ｓｔａｔｕｓ）を与える前の段階で行われるからである。したがって、それはヒトへの投与が許可されておらず、治療ウィンドウを計算し、推定するための実験的なＣｍａｘ値を得る可能性がない。関連して、薬物として決して意図的に投与されない環境および工業化学物質の毒性学的試験のために、Ｃｍａｘ値は決して得られない。
【０１１７】
驚くべきことに、図１６および１８のデータの分析において、以下の段落で詳しく述べられるある特定の場合には、２４時間での肝毒性  対  ７日での肝毒性の比、または２４時間での肝毒性  対  １４日での肝毒性の比（以降、それぞれ「２４／７毒性比シグナル」または「２４／１４毒性比シグナル」と、または全て込みで「毒性比シグナル」と呼ばれる）がｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性の有用な予測因子であることが観察された。図１７では、２４時間での肝毒性を７日での肝毒性と、２４時間での肝毒性を１４日での肝毒性と、および７日での肝毒性を１４日での肝毒性と比較する。毒性比シグナルは、図１６で提示される生のＬＣ５０値から形成され、したがって単位を有しない。より高いＬＣ５０値はより低い肝毒性効力を示し、より低いＬＣ５０値はより高い肝毒性効力を示す。したがって、図１７のより高い毒性比シグナルは、後の時点での肝毒性が、より初期の時点での肝毒性より大きいことを示し、図１７のより低い比は、後の時点での肝毒性が、より初期の時点での肝毒性より低いことを示す。図１８に示すラットデータの類似の分析は、図１９に提示する。
【０１１８】
これらのデータに基づいて、意味のある上昇した毒性比シグナルを同定するものとして４の比が選択され、したがって、シグナルが４またはそれより高いならば、試験化合物がおそらくｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性であることを示す。肝毒性閾値のための値の選択における課題は、毒性比シグナルが実験的に価値あるものになるために、それは非常に低い発生率の偽陽性シグナルを生成しなければならず、したがって、あまりに低く設定してはならないことである。そのうえ、それがあまりに高く設定されるならば、それは真の陽性転帰を見逃し始め、後に偽陰性であると見出されるシグナルを生成する可能性がある。したがって、毒性比シグナルカットオフ値は、予測の感度（真の陰性シグナルの高い発生率）および予測の特異性（真の陽性シグナルの高い発生率）として当技術分野で公知であるものの間の有用なトレードオフを組み込む方法で選択することができる。実際には、感度および特異性のバランスをとるための閾値は、しばしば経験的に決定される。
【０１１９】
４の毒性比カットオフ（４またはそれより高い値はｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性の有効な可能性を示し、４またはそれ未満の値はそうではない）を適用することによって、２０個の化合物を図２０Ａ〜２０Ｃに示す２つの群に分離した。この点数化システムは公知のｉｎ  ｖｉｖｏ肝毒性を有する１４のうちの５つの化合物において毒性を予測し、残りの９つにおいて毒性を予測しない。この点数化システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝毒性を示さない６つの化合物のいずれでも肝毒性を正しく予測しなかった。
【０１２０】
注目に値することは、陽性として点数化された５つの化合物は全て、脂質二重層への直接的損傷もしくは胆汁酸塩輸送の変更によって特徴付けられる毒性、または反応性代謝産物によって媒介される毒性を示し、そのように特徴付けられた化合物の１００％は陽性として点数化された。さらに、点数化は、非肝毒性化合物が陽性として点数化されたであろう偽陽性を生成しなかった。言い換えると、このセットの化合物により、４の肝毒性カットオフスコアを利用した毒性比シグナルモデルは、１００％（すなわち、偽陽性なし）の特異性（真の陰性の発生率）を与えた。全体で、２０個の参照化合物の試料セットで評価したときのモデルの感度（真の陽性の発生率）は、だいたい３６％であった。しかし、毒性の予想されるまたは可能性がある機構が、胆汁酸塩輸送への反応性代謝産物が媒介もしくは関与する変更、または肝細胞の脂質二重層への直接的損傷のいずれかであった試料のサブセットに関しては、真の陽性結果（感度）のモデルによる生成の発生率は、１００％であった。前述の機構は、基礎をなす細胞ベースのモデル（この場合、肝細胞および間質細胞の共培養物）の高く安定し、そして長く持続する代謝能力に全て依存し、それと相関する。対照的に、陰性として点数化された９つの公知の肝毒性化合物は、特異体質であるかまたは十分理解されていない毒性を示す。この結果は新規である。なぜなら、肝細胞−間質細胞共培養物の生得的代謝能力を所有する細胞ベースのモデルが存在しなかった初期には、本明細書に開示される陽性の毒性比シグナルを与えた条件を生化学的に生成することが可能なモデルがなかったからである。また結果は予想外である。なぜなら、本明細書に開示される実験が実行されるまで、反応性代謝産物によって媒介されるかまたは胆汁酸塩輸送の変更に起因する肝毒性のサブセットを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが高い感度および高い特異性で確実に同定することができることを予測するための実験的基礎がなかったからである。
【０１２１】
簡単にいえば、毒性比シグナルは、優れた感度（１００％の真の陰性）を実証すること；および反応性代謝産物、胆汁酸塩輸送への変更または脂質二重層への損傷が肝毒性作用の機構と結びつけられる化合物のサブセットに適用されるときに、優れた特異性（１００％の真の陽性）も実証することがここに示される。この知見は全ての化学的および／または分子実体のかなりの割合に適用可能であり、それは、前臨床薬物開発ならびに環境および工業化学物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のための有効なツールの開発を前進させる大きな飛躍となる。他のいかなる現在利用できる細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法も、前進／中止の意思決定について同等に有効なデータを提供しない。したがって、本明細書に開示される方法および系は、さらなる調査および／または開発のための化合物の同定を助けるための、ならびに薬物候補の同定および薬物開発の時間および費用を実質的に削減するための、最も明白には、後期前臨床およびフェーズＩでの開発中止を低減するための、重要な新しいツールを実証する。さらに、本明細書に提示されるデータは医薬試験化合物で生成されるデータを含むが、時系列毒性比シグナルは、代謝的に応答性のｉｎ  ｖｉｔｒｏツールが同様に非常に不足している環境および工業化学実体の安全性リスクの評価において、等しく大きな有用性を有する。
【０１２２】
（実施例８：臨床および前臨床の肝臓毒性の予測）
実施例６で分析した化合物は全て、公知の肝毒性プロファイルを有する、よく研究されたパブリックドメイン参照化合物である。盲検の後向き研究で系および方法の有用性を検証するために、１０個の医薬候補化合物のセットに毒性比シグナルモデルを適用し、そのうちの１つは公知の陰性対照（すなわち、公知の非肝毒性）であり、９つは前臨床創薬段階の間またはフェーズＩ臨床試験の間に医薬開発を継続することを中止された。試験セットの９つの化合物のうち、５つは、肝臓シグナル関連の安全性（すなわち、肝毒性）の理由で前臨床または臨床で中止されたが、４つは安全性関連でない理由で中止された。図２１に示すように、２４時間／７日比および４のカットオフを使用して、「肝臓シグナル」安全性理由のために中止された化合物の５つのうちの２つ（４０％）は、毒性比シグナルによって正しく同定された（化合物ＥおよびＩ）。図２２に示すように、２４時間／１４日比および４のカットオフを使用して、「肝臓シグナル」安全性理由のために中止された化合物の５つのうちの３つ（６０％）は、毒性比シグナルによって正しく同定された（化合物Ｅ、ＨおよびＩ）。２４／７シグナルおよび２４／１４シグナルの両方の場合、毒性比シグナルが、陰性対照化合物「Ｂ」または安全性関連でない理由のために中止された化合物のいずれも陽性と特定しなかった点で、偽陽性はなかった。
【０１２３】
このデータは、時系列肝毒性試験を化合物の初期ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの成分として用いることは、前臨床創薬の後期およびフェーズＩ臨床薬物開発における安全性関連の開発中止を低減し、それによって、環境および工業化学物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性学的試験に類似の改善を施しながら薬物開発における時間および投資費用の削減に実質的に寄与することができることを実証する。
【０１２４】
本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載されたが、当業者は、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、等価物で置換することができることを理解すべきである。さらに、本発明の目的、精神および範囲に、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップを適合させるために、多くの修正を加えることができる。全てのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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