(57)【要約】サンプル中の抗原結合物質を検出するための方法を提供する。本発明の方法の態様は、近接に基づく抗原結合ポリヌクレオチドの高感度な会合による、抗原結合物質とポリヌクレオチド結合抗原との凝集を検出することを含む。本発明の方法の態様は、核酸の増幅を通じて、このような近接に基づく会合を検出する方法も含む。加えて、本発明の方法の様々な実施形態を実施するのに有用な組成物、例えば試薬、キット及び器具を提供する。2018512862.tif 000006
2018512862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗原結合物質の検出方法であって、
ａ）前記サンプルを、第１のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた、抗原である第１の分子、及び第２のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた、抗原である第２の分子に、前記第１の分子と前記第２の分子に結合した前記抗原結合物質を含む複合体を形成させるのに十分な条件で、接触させる工程と、
ｂ）アンプリコンを形成させるために、前記複合体の前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドを結合させる工程と、
ｃ）増幅産物を生成するために、前記アンプリコンを増幅する工程と、
ｄ）前記増幅産物を検出する工程であって、前記増幅産物の検出によって、前記抗原結合物質の検出を可能にする、前記工程と
を含む前記方法。
【請求項２】
前記第１の分子の前記抗原と前記第２の分子の前記抗原が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原結合物質が抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原がポリペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記結合工程が、架橋ポリヌクレオチドを前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合工程が、前記第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を前記第２のポリヌクレオチドの相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドの前記相補的なヌクレオチド配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記結合工程が、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドをライゲーションすることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルをスプリントポリヌクレオチドと接触させる工程をさらに含み、前記結合工程が、前記スプリットポリヌクレオチドを前記第１のポリヌクレオチドもしくは前記第２のポリヌクレオチド、または前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドの両方にライゲーションすることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のポリヌクレオチドと、前記第２のポリヌクレオチドと、前記架橋ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、前記ライゲーションが、前記サンプルをＤＮＡリガーゼと接触させることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
架橋ポリヌクレオチドを前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程と、前記ハイブリダイズ工程後に、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドをライゲーションする工程と、前記ライゲーション工程後に、前記架橋ポリヌクレオチドを特異的に分解する工程とを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋ポリヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオシドアナログを含み、前記分解工程が、前記サンプルを１つ以上の塩基除去試薬と接触させることを介して、前記１つ以上のヌクレオシドアナログの塩基を除去することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の塩基除去試薬が、グリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼまたはこれらを組み合わせたものを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のヌクレオシドアナログが、デオキシリボウラシルを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅工程が、等温増幅を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出工程が、前記増幅産物の定量に基づいて、前記サンプル中の前記抗原結合物質の量を測定することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅工程が、定量ＰＣＲを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１５ｎｇ／ｍｌ未満の濃度の、前記サンプル中の前記抗原結合物質の存在を検出する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度の、前記サンプル中の前記抗原結合物質の存在を検出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗ポリヌクレオチド抗体を有する疑いのある対象から前記サンプルが入手される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ある状態を有する疑いのある対象から前記サンプルが入手される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態が感染を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記状態が、自己免疫障害または炎症性障害を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記状態が、新生物に対する免疫応答である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記状態が、腫瘍随伴症候群である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記新生物が、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、肝臓がん及び甲状腺がんからなる群から選択されるがんである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態が代謝性疾患を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記代謝性疾患が糖尿病である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが組織サンプルである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組織サンプルが血液サンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記血液サンプルが血清サンプルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが、排出体液または半固体である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記排出体液または半固体が、尿、唾液、涙、汗、膿及び糞便からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、前記抗原結合物質を産生するように構成された細胞に由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、ハイブリドーマであり、前記抗原結合物質が、前記ハイブリドーマによって産生される抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、前記抗原結合物質を産生するように構成された実験動物に由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血液サンプルが血清サンプルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルが、排出体液または半固体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記排出体液または半固体が、尿、唾液、涙、汗、膿及び糞便からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触工程が、前記サンプルを遊離ＤＮＡと接触させることをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
抗原である前記第１の分子と前記第１のポリヌクレオチド、及び抗原である前記第２の分子と前記第２のポリヌクレオチドがどちらも、抗原：ポリヌクレオチドが１：１〜１：４であるモル比でコンジュゲートされている、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
抗原結合物質を検出するためのキットであって、
ａ）第１のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた第１の抗原であって、前記抗原結合物質の第１の抗原結合部位で、前記抗原結合物質に特異的に結合する、前記第１の抗原と、
ｂ）第２のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた第２の抗原であって、前記抗原結合物質の第２の抗原結合部位で、前記抗原結合物質に特異的に結合する、前記第２の抗原と、
を含む前記キット。
【請求項４６】
前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする架橋ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記第２のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項４５〜４６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４８】
前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチドまたは前記架橋ポリヌクレオチドのうちの１つ以上に特異的にハイブリダイズするスプリントポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４９】
前記第１の抗原と前記第２の抗原が同じである、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５０】
リガーゼをさらに含む、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５１】
１つ以上の増幅試薬をさらに含む、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
キットの構成要素ａ）及びｂ）が単一の容器に存在する、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５３】
キットの構成要素ａ）及びｂ）が別々の容器に存在する、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
抗原結合物質の多重化された検出のためのライブラリーであって、
ａ）特有のプライマー結合部位を含むポリヌクレオチドにそれぞれコンジュゲートされた２つの同じ抗原を各抗原対が含む、複数の抗原対と、
ｂ）抗原対の特有のプライマー結合部位に対する相補的な配列を各プライマー対が含む、複数のプライマー対であって、前記抗原対が抗原結合物質に結合すると、前記抗原対の前記ポリヌクレオチドが、前記プライマー対によって特異的に増幅できるアンプリコンを形成し、それによって、前記抗原結合物質の多重化された検出を可能にする、前記複数のプライマー対と
を含む前記ライブラリー。
【請求項５５】
前記複数の抗原対の抗原が、自己免疫疾患抗原を含む、請求項５４に記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記複数の抗原対の抗原が、がん抗原を含む、請求項５４〜５５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記複数の抗原対の抗原が、病原体抗原を含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項５８】
各抗原対の前記ポリヌクレオチドが、互いに対して相補的な配列を含む、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項５９】
各抗原対の前記ポリヌクレオチドがそれぞれ、架橋ポリヌクレオチドに対して相補的な配列を含む、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記複数の抗原対が、単一の容器内にある、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項６１】
前記複数のプライマー対の各プライマー対が、別々の容器またはマルチウェルプレートの別々のウェルに存在する、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１５年４月１７日に提出された米国特許仮出願第６２／１４９，３２４号に基づく恩典を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより拠出されたＧＭＯ０５９９０７−１３号助成金の下、米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
テキストファイルとして提供する配列表の、参照による援用
「ＢＥＲＫ−２８４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というテキストファイルとして、２０１６年４月１５日に作成した４ＫＢのサイズの配列表を本明細書とともに提供する。このテキストファイルの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
序論
利用可能な多くの生体分子検出アッセイ方法のうち、ラテックス粒子の凝集を含む、粒子の凝集に基づく方法は、生物学研究、ならびにヒト及び動物用医療において、特には、流体試験サンプル中の抗体を検出するために、広く使用され続けている。凝集アッセイの手順には、簡潔、応用範囲が広い、無害といった利点がある。また、凝集アッセイは、概して迅速であり、短期間で結果が得られる。これらの利点にもかかわらず、凝集アッセイは、検出限界が劣っており、かつ／または凝集アッセイでは大量のサンプルが必要であることから、解析目的では酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が好まれ、凝集アッセイは一般的に見過ごされている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
サンプル中の抗原結合物質の検出方法を提供する。この方法の態様には、近接に基づく抗原結合ポリヌクレオチドの高感度な会合によって、ポリヌクレオチド結合抗原を伴う抗原結合物質が凝集したことを検出することが含まれる。この方法の態様は、核酸の増幅を通じて、上記のような近接に基づく会合を検出する方法も含む。加えて、本発明の方法の様々な実施形態を実施するのに有用な組成物、例えば試薬、キット及び器具を提供する。
【０００６】
本開示の態様は、サンプル中の抗原結合物質の検出方法であって、ａ）サンプルを、第１のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた、抗原である第１の分子、及び第２のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた、抗原である第２の分子に、前記第１の分子と前記第２の分子に結合した抗原結合物質を含む複合体を形成させるのに十分な条件で、接触させる工程と、ｂ）アンプリコンを形成させるために、この複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを結合させる工程と、ｃ）増幅産物を生成するために、このアンプリコンを増幅する工程と、ｄ）この増幅産物を検出する工程であって、この増幅産物の検出によって、抗原結合物質の検出を可能にする前記工程、とを含む方法を含む。いくつかのケースでは、第１の分子の抗原と、第２の分子の抗原は同じである。いくつかのケースでは、抗原結合物質は抗体、例えば、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）である。いくつかのケースでは、抗原はポリペプチドである。いくつかのケースでは、上記の結合工程は、架橋ポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む。いくつかのケースでは、上記の結合工程は、第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチドの相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることを含む。いくつかのケースでは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの相補的なヌクレオチド配列は、少なくとも６ヌクレオチド長である。いくつかのケースでは、上記の結合工程は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドをライゲーションすることを含む。いくつかのケースでは、本発明の方法は、サンプルをスプリントポリヌクレオチドと接触させる工程をさらに含み、結合工程は、このスプリットポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドもしくは第２のポリヌクレオチド、または第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの両方にライゲーションすることを含む。いくつかのケースでは、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、架橋ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、ライゲーションは、サンプルをＤＮＡリガーゼと接触させることを含む。いくつかのケースでは、本発明の方法は、架橋ポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程と、ハイブリダイズ工程後に、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドをライゲーションする工程と、ライゲーション工程後に、架橋ポリヌクレオチドを特異的に分解する工程とを含む。いくつかのケースでは、架橋ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシドアナログを含み、分解工程は、サンプルを１つ以上の塩基除去試薬と接触させることを介して、１つ以上のヌクレオシドアナログの塩基を除去することを含む。いくつかのケースでは、この１つ以上の塩基除去試薬は、グリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼまたはこれらを組み合わせたものを含む。いくつかのケースでは、１つ以上のヌクレオシドアナログは、デオキシリボウラシルを含む。いくつかのケースでは、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を含む。いくつかのケースでは、増幅工程は、等温増幅を含む。いくつかのケースでは、検出工程は、増幅産物の定量に基づいて、サンプル中の抗原結合物質の量を測定することを含む。いくつかのケースでは、増幅工程は、定量ＰＣＲを含む。いくつかのケースでは、本発明の方法は、１５ｎｇ／ｍｌ未満の濃度の、サンプル中の抗原結合物質の存在を検出する。いくつかのケースでは、本発明の方法は、１００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度の、サンプル中の抗原結合物質の存在を検出する。いくつかのケースでは、サンプルは、抗ポリヌクレオチド抗体を有する疑いのある対象から得る。いくつかのケースでは、サンプルは、ある状態を有する疑いのある対象から得る。いくつかのケースでは、この状態は、感染を含む。いくつかのケースでは、この状態は、自己免疫性障害または炎症性障害を含む。いくつかのケースでは、この状態は、新生物に対する免疫応答を含む。いくつかのケースでは、この状態は、腫瘍随伴症候群である。いくつかのケースでは、新生物は、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、肝臓がん及び甲状腺がんからなる群から選択されるがんである。いくつかのケースでは、状態は、代謝性疾患を含む。いくつかのケースでは、代謝性疾患は、糖尿病である。いくつかのケースでは、サンプルは、組織サンプルである。いくつかのケースでは、組織サンプルは、血液サンプルである。いくつかのケースでは、血液サンプルは、血清サンプルである。いくつかのケースでは、サンプルは、排出体液または半固体である。いくつかのケースでは、排出体液または半固体は、尿、唾液、涙、汗、膿及び糞便からなる群から選択される。いくつかのケースでは、サンプルは、抗原結合物質を産生するように構成された細胞に由来する。いくつかのケースでは、その細胞はハイブリドーマであり、抗原結合物質は、ハイブリドーマによって産生された抗体である。いくつかのケースでは、サンプルは、抗原結合物質を産生するように構成された実験動物に由来する。いくつかのケースでは、サンプルは、血液サンプルである。いくつかのケースでは、血液サンプルは、血清サンプルである。いくつかのケースでは、サンプルは、排出体液または半固体である。いくつかのケースでは、排出体液または半固体は、尿、唾液、涙、汗、膿及び糞便からなる群から選択される。いくつかのケースでは、接触工程はさらに、サンプルを遊離ＤＮＡと接触させることを含む。いくつかのケースでは、抗原である第１の分子と第１のポリヌクレオチド、及び抗原である第２の分子と第２のポリヌクレオチドはどちらも、抗原：ポリヌクレオチドが１：１〜１：４であるモル比でコンジュゲートされている。
【０００７】
本開示の態様は、抗原結合物質を検出するためのキットであって、ａ）第１のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた第１の抗原であって、抗原結合物質の第１の抗原結合部位で、抗原結合物質に特異的に結合する前記第１の抗原と、ｂ）第２のポリヌクレオチドにコンジュゲートされた第２の抗原であって、抗原結合物質の第２の抗原結合部位で、抗原結合物質に特異的に結合する前記第２の抗原を含むキットを含む。いくつかのケースでは、キットはさらに、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする架橋ポリヌクレオチドを含む。いくつかのケースでは、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかのケースでは、キットはさらに、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドまたは架橋ポリヌクレオチドのうちの１つ以上に特異的にハイブリダイズするスプリントポリヌクレオチドを含む。いくつかのケースでは、第１の抗原と第２の抗原は同じである。いくつかのケースでは、キットはさらに、リガーゼを含む。いくつかのケースでは、キットはさらに、１つ以上の増幅試薬を含む。いくつかのケースでは、キットの構成要素は、単一の容器に存在する。いくつかのケースでは、キットの構成要素は、別々の容器に存在する。
【０００８】
本開示の態様は、抗原結合物質の多重化された検出のためのライブラリーであって、ａ）特有のプライマー結合部位を含むポリヌクレオチドにそれぞれコンジュゲートされた２つの同じ抗原を各抗原対が含む、複数の抗原対と、ｂ）抗原対の特有のプライマー結合部位に対して相補的な配列を各プライマー対が含む、複数のプライマー対とを含むライブラリーであり、抗原対が抗原結合物質に結合すると、抗原対のポリヌクレオチドが、プライマー対によって特異的に増幅できるアンプリコンを形成させ、それによって、抗原結合物質の多重化された検出を可能にする、ライブラリーを含む。いくつかのケースでは、複数の抗原対の抗原は、自己免疫疾患抗原を含む。いくつかのケースでは、複数の抗原対の抗原は、がん抗原を含む。いくつかのケースでは、複数の抗原対の抗原は、病原体抗原を含む。いくつかのケースでは、各抗原対のポリヌクレオチドは、互いに対して相補的な配列を含む。いくつかのケースでは、各抗原対のポリヌクレオチドはそれぞれ、架橋ポリヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。いくつかのケースでは、複数の抗原対は、単一の容器内にある。いくつかのケースでは、複数のプライマー対の各プライマー対は、別々の容器またはマルチウェルプレートの別々のウェルに存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明は、添付の図面と併せて読むと、下記の詳細な説明から最も深く理解される。慣習に従って、図面の様々な要素は縮尺どおりではないことを強調する。それどころか、様々な要素の寸法は、明確にするために、適宜に拡大または縮小されている。図面に含まれているのは、下記の図である。
【００１０】
【図１】凝集した抗原と抗原結合物質の実施形態を示している。
【図２】ポリヌクレオチド結合抗原の近接会合によって形成されたポリヌクレオチド二本鎖の実施形態を示している。
【図３】ポリヌクレオチド結合抗原と架橋ポリヌクレオチドの近接会合によって形成されたポリヌクレオチド複合体の実施形態を示している。
【図４】ポリヌクレオチド結合抗原と、架橋ポリヌクレオチドと、スプリントポリヌクレオチドの近接会合によって形成されたポリヌクレオチド複合体の実施形態を示している。
【図５】ポリヌクレオチド結合抗原と架橋ポリヌクレオチドの近接会合によって形成されたポリヌクレオチド複合体の実施形態を示している。
【図６】ポリヌクレオチド結合抗原の近接会合によって形成されたポリヌクレオチド複合体であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体の実施形態を示している。
【図７】ポリヌクレオチド結合抗原の近接会合によって形成されたポリヌクレオチド複合体であって、会合した環状化オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体の実施形態を示している。
【図８】凝集−ライゲーションによる高感度免疫複合体モニタリングプラットフォームによる抗体検出の概略を示している。
【図９Ａ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｂ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｃ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｄ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｅ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｆ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｇ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｈ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｉ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図９Ｊ】様々なサンプルタイプと標的を用いた場合の高い感度と、凝集を介する抗体検出の多重化に対する適性を示している。
【図１０】表１を示している。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、様々なサンプルタイプにおいて、様々な検出ポリヌクレオチドを用いた場合の、抗ビオチン抗体によるビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集と、その定量的な検出結果を示している。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、様々なサンプルタイプにおいて、様々な検出ポリヌクレオチドを用いた場合の、抗マウスＩｇＧ抗体によるマウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集と、その定量的な検出結果を示している。
【図１３】抗ＧＦＰ抗体によるＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集と、そのｑＰＣＲベースの定量結果を示している。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、対応する抗体を介したマウスＩｇＧ−ＤＮＡとビオチン−ＤＮＡの凝集の定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）ベースの多重化された検出の結果を示している。
【図１５】様々な濃度の多価ポリクローナル抗マウス抗体と一価抗マウス消化Ｆａｂ断片の、ｑＰＣＲによる検出及び定量結果の比較を示している。
【図１６】様々な濃度のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の、ｑＰＣＲによる検出及び定量結果の比較を示している。
【図１７】ＰＢＳまたは血清における様々な抗体に関して、本明細書に記載されている方法の実施形態を用いて実験的に割り出した検出限界（ＬＯＤ）を示している。
【図１８Ａ】本開示の方法で、標的抗体検出の、サンプル中の抗核酸抗体による干渉を回避できることを示している。
【図１８Ｂ】本開示の方法で、標的抗体検出の、サンプル中の抗核酸抗体による干渉を回避できることを示している。
【図１８Ｃ】本開示の方法で、標的抗体検出の、サンプル中の抗核酸抗体による干渉を回避できることを示している。
【図１８Ｄ】本開示の方法で、標的抗体検出の、サンプル中の抗核酸抗体による干渉を回避できることを示している。
【図１９】競合ＤＮＡを用いずに、抗ＤＮＡ血漿及び正常血漿における抗ＧＦＰ抗体を検出した結果を示している。
【図２０】ポリヌクレオチドのＧＦＰ抗原へのコンジュゲートの概略図と、このようなコンジュゲート反応の効率性を銀染色によって解析したものを示している。
【図２１】本開示の一実施形態による代表的なリアルタイムｑＰＣＲ測定プロットを示している。
【図２２】抗原とＤＮＡのコンジュゲート比がアッセイ性能に及ぼす効果を示している。
【図２３】本開示の一実施形態による、小分子−ＤＮＡコンジュゲート体合成の反応スキームの概略図を示している。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｂは、本明細書に記載されているような凝集検出アッセイにおけるＨＩＶ抗体の単独型の検出と多重化された検出を示している。
【図２５】ヒト口腔流体サンプル中のＨＩＶ抗体を検出する凝集アッセイによって割り出した場合の、ＨＩＶ陰性対象集団とＨＩＶ陽性対象集団の分離を示している。
【図２６】２つの異なるＨＩＶ抗体を検出するＨＩＶ凝集アッセイの臨床的感度と特異性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
「凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）」及び「凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）という用語は、同義的に用いられており、本明細書で使用する場合、抗原と抗原結合物質が結合して複合体になることを指し、この複合体は、２つ以上の抗原と、１つの抗原結合物質を含む。概して、凝集では、多価の抗原結合物質、すなわち、抗原である２つ以上の分子に結合する抗原結合物質を利用する。多価の抗原結合物質は、多くの抗原と抗原結合物質が凝集して複合体になるように促すことができる。凝集においては、抗原は、一価または多価であってよい。特定の実施形態では、凝集は、一価の抗原と多価の抗原結合物質を利用することによって生じる。特定の実施形態では、凝集は、一価の抗原と二価の抗原結合物質を利用することによって生じる。特定の実施形態では、凝集は、多価の抗原に結合する多価の抗原結合物質を利用することによって生じる。特定の実施形態では、凝集は、多価の抗原に結合する二価の抗原結合物質を利用することによって生じる。特定の実施形態では、凝集は、二価の抗原に結合する多価の抗原結合物質を利用することによって生じる。特定の実施形態では、凝集は、二価の抗原に結合する二価の抗原結合物質を利用することによって生じる。本明細書で使用する場合、凝集複合体の成分は、会合及び／または相互作用できるように、近接した状態に保つことができる。いくつかのケースでは、反応混合物の特定の成分は、凝集複合体内で近接した状態に保たれているときに、それらの相互作用の特質及び／またはその反応混合物におけるそれらの成分の相対濃度が原因で、相互作用、例えば、凝集の検出に必要な相互作用の可能性が著しく高いだけであることがある。
【００１２】
「抗原」という用語は、本明細書で使用する場合、いずれかの天然または合成の免疫原性物質を指す。免疫原性物質としては、外来のものである物質と、生物の体内において天然に見られる物質が挙げられる。したがって、外来の免疫原性物質の導入により、生物が、その外来の免疫原性物質に対する全身免疫応答または特異的免疫応答を示すように誘導することができる。別のケースでは、生物の体内での免疫原性物質の産生により、その生物が、ネイティブな免疫原性物質に対する特定のまたは全身の自己免疫応答を示すように誘導することができる。本明細書で使用する場合、抗原には、化学物質、小分子、生体分子（例えば、核酸）、巨大分子、ペプチド、ポリペプチド、細胞断片、細胞、単細胞生物、多細胞生物、これらの断片及びこれらを組み合わせたものが含まれるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、抗原は、その抗原に結合する物質が知られている抗原、例えば、そのポリペプチドに結合する抗体が知られているポリペプチドであってよい。いくつかのケースでは、抗原は、その抗原に結合する物質が不明である抗原、例えば、そのポリペプチドに結合する抗体が不明であるポリペプチドであってよい。例えば、抗体を産生させることのできる抗原として、天然と合成の両方のポリペプチド及びペプチドを使用することが、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｅｄ．Ｂｕｒｎｓ，Ｒ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５に記載されており、この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００１３】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す目的で、同義的に用いられており、本開示の目的においては、最小長が少なくとも８個のアミノ酸であってよい。オリゴペプチド、オリゴマー、マルチマーなどは典型的には、アミノ酸からなる、より長い鎖を指し、また、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸が直線状に配置されているものから構成されており、生物によって、組み換えによって、または合成によって生成されるか、また、天然のアミノ酸であるか、非天然のアミノ酸であるかに関わらず、この定義に含まれる。完全長タンパク質と、８個超のアミノ酸からなるこれらの断片の両方とも、この定義に含まれる。この用語には、ポリペプチドの共翻訳修飾（例えば、シグナルペプチドの切断）と翻訳後修飾（例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質切断（例えば、フューリンまたはメタロプロテアーゼによる切断）など）を有するポリペプチドも含まれる。さらに、本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、天然型配列に対する欠失、付加及び置換（当業者には知られているように、概して、保存的な性質のものである）のような修飾を含むタンパク質を指す。ただし、そのタンパク質が所望の活性を維持することを条件とする。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発法によるように、意図的なものであることも、または、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅やその他の組み換えＤＮＡ法によるエラーによるように、偶発的なものであることもできる。
【００１４】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で使用する場合、同義的に用いられており、広くは、分子全体、インタクト分子またはこれらの断片、ならびに改変及び／またはコンジュゲートされている改変及び／もしくはコンジュゲート抗体またはこれらの断片を指してよい。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域におけるアミノ酸配列の違いに基づき、５種類のクラスに分けることができる。ある所定のクラス内の免疫グロブリンはいずれも、非常に似た重鎖定常領域を有することになる。それらの違いは、配列調査によって、または、より一般的には、血清学的手段によって（すなわち、これらの違いに注目した抗体の使用によって）検出できる。免疫グロブリンのクラスには、ＩｇＧ（γ重鎖）、ＩｇＭ（Ｍμ重鎖）、ＩｇＡ（α重鎖）、ＩｇＤ（δ重鎖）及びＩｇＥ（ε重鎖）が含まれる。
【００１５】
抗体または免疫グロブリンとは、一対の低分子量軽（Ｌ）鎖及び一対の重（Ｈ）鎖という二対のポリペプチド鎖（４つとも、ジスルフィド結合によって相互接続されている）からなる、構造的に関連した糖タンパク質のクラスを指すことができる。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けがなされており、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。簡潔に述べると、各重鎖は典型的には、重鎖可変領域（ＶＨと略称される）と重鎖定常領域（ＣＨと略称される）から構成されている。この重鎖定常領域は典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインから構成されている。各軽鎖は典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬと略称される）と、軽鎖定常領域（本明細書では、ＣＬと略称する）から構成されている。軽鎖定常領域は典型的には、ＣＬという１つのドメインから構成されている。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに、超可変性の領域（すなわち、配列が超可変可能であり及び／または構造的に定義されたループの形態であり得る超可変領域）に細分してよく、この領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ともいい、ＣＤＲには、ＣＤＲよりも保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）という）が挟み込まれている。
【００１６】
完全なインタクト抗体またはほぼインタクトな抗体は概して多価であり（多価とは、抗原である２つ以上の分子に同時に結合できることを意味する）、その一方で、抗体断片は、一価であってもよい。生物によって、免疫応答の一部として産生される抗体は概して、単特異性を有する（単特異性とは、概して単一種の抗原に結合することを意味する）。多価の単特異性抗体、すなわち、単一種の抗原である２つ以上の分子に結合する抗体は、単一の抗原エピトープに結合することができ（例えば、モノクローナル抗体）、または多数の異なる抗原エピトープに結合することもできる（例えば、ポリクローナル抗体）。
【００１７】
多数種の抗原に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、当業者であれば容易に作製できるので、本明細書で使用する「抗体」という用語の使用に適宜含めてよい。また、多価抗体断片は、例えば、２つの一価抗体断片を連結することによって、作製できる。したがって、二価及び／または多価抗体断片を「抗体」という用語の使用に適宜含めてよい。多価の単特異性抗体断片または多特異性（例えば、二重特異性）抗体断片を生成するために、任意の利便的かつ適切な組み合わせで連結できる抗体断片、例えば、下記の抗体断片を当業者は容易に認識すると見られるからである。
【００１８】
抗体断片としては、エピトープ決定基に結合できる抗原結合断片（Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２などを含むＦａｂまたはＦ（ａｂ））、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖまたはＦｖ）、「第三世代」（３Ｇ）分子などが挙げられるが、これらに限らない。これらの抗体断片は、対象の抗原に選択的に結合する能力をいくらか保持しており、その断片の例としては、下記のものが挙げられるが、これらに限らない。
【００１９】
（１）Ｆａｂ（抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片）は、全抗体を酵素のパパインで消化して、インタクトな軽鎖と１つの重鎖の一部をもたらすことによって生成できる。
【００２０】
（２）抗体分子の断片であるＦａｂ’は、全抗体をペプシンで処理してから還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部をもたらすことによって得ることができ、１つの抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。
【００２１】
（３）（Ｆａｂ）２は、全抗体を酵素のペプシンで処理し、その後、還元を行わないことによって得ることができる抗体断片である。
【００２２】
（４）Ｆ（ａｂ）２は、２つのジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ’断片のダイマーである。
【００２３】
（５）Ｆｖは、二本鎖として発現された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子工学により操作された断片として定義される。
【００２４】
（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子工学によって融合した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子工学により操作された分子として定義され、このような一本鎖抗体は、ディアボディ、トリアボディ、テトラアボディなどのようなマルチマーの形態（多特異性であってもなくてもよい）であってよい（例えば、ＷＯ９４／０７９２１及びＷＯ９８／４４００１を参照のこと）。
【００２５】
（７）「３Ｇ」は、単一のドメイン（典型的には、軽鎖を持たない可変重鎖ドメイン）と「小型化」抗体分子（典型的には、非必須ドメインが取り除かれたフルサイズのＡｂまたはｍＡｂ）を含む。
【００２６】
「組み換え」という用語は、核酸分子を説明するために本明細書で使用する場合、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、ウイルス由来、半合成由来及び／または合成由来のポリヌクレオチドであって、その由来元または操作により、天然においては付随するポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部を付随しないポリヌクレオチドを意味する。組み換えという用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合には、組み換えポリヌクレオチドからの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。組み換えという用語は、宿主細胞またはウイルスに関して使用する場合には、組み換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞またはウイルスを意味する。本明細書では、組み換えは、物質（例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクター）に関しては、その物質が、異種の物質（例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクター）の導入によって改変されていることを指す目的でも用いる。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では、ポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）を含むように、同義的に用いられている。この用語は、その分子の一次構造のみを指す。すなわち、この用語には、三本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語には、メチル化及び／またはキャッピングなどによって改変された部分を持つ分子と、未改変形態のポリヌクレオチドも含まれる。さらに詳細には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−配糖体またはＣ−配糖体であるいずれかの他のタイプのポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含むその他のポリマー、ポリマー、ならびに他の合成の配列特異的核酸ポリマー（ただし、それらのポリマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるように、塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含むものとする）が含まれる。ポリヌクレオチドには、「ヌクレオシドアナログ」または「ヌクレオチドアナログ」（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡにおけるような天然のヌクレオシド及びヌクレオチドのヌクレオシドアナログまたはヌクレオチドアナログである）を１つ以上含むものも含まれる。ヌクレオシドアナログと、ヌクレオシドアナログの合成または改変で用いる試薬の非限定例としては、例えば、１，３，９−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチル尿酸、１，Ｎ６−エテノ−２’−デオキシアデノシン、１，Ｎ６−エテノアデニン、ｌ−アリル−３，７−ジメチル−８−フェニルキサンチン、１−アリル−３，７−ジメチル−８−スルホフェニルキサンチン、１−シクロヘキシルウラシル、１−メチルチミン、１−メチル尿酸、２，３’−アンヒドロチミジン、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチルアデノシン、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチルシチジンハイドロクロリド、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチルウリジン、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベンゾイルウリジン、２’，３’−ジデオキシ−５−ヨードウリジン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイルウリジン、２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−６−メルカプトプリンリボシド、２’，３’−Ｏ−イソプロピリデングアノシン、２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン、２’−デオキシアデノシン一水和物、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシシチジルイル（３’→５’）−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシグアノシン一水和物、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノプリン、抗白血病の２−クロロ−２’−デオキシアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシンアデノシンレセプターアゴニスト、２−ジメチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、２−メルカプトプリン、２−チオウラシル、３’−デオキシグアノシン、３’−Ｏ−メチルウリジン、３−メチルアデニン、３−メチルウラシル、４，５，６−トリアミノピリミジンサルフェート、４−アミノ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキシ−５−ニトロソピリミジン、４−アミノ−５−カルボキシ−２−エチルメルカプトピリミジン、４−クロロウラシル、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｌ−フコシドグリコシダーゼ基質、４−チオウリジン、５，６−ジヒドロデオキシウリジン、５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシンハイドロクロリド、５’−アミノ−５’−デオキシチミジン、５’−デオキシ−５’−（メチルチオ）アデノシン、５’−デオキシアデノシンメチルチオアデノシン／Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＭＴＡ／ＳＡＨ）ヌクレオシダーゼ基質、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン、５’−Ｏ−トリチルチミジン、５−カルベトキシウラシル、５−カルボキシ−２−チオウラシル、５−クロロ−２’−デオキシウリジンチミジンアナログ、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリル）ウラシル、５−フルオロウリジン、５−ヨード−２，４−ジメトキシ−ピリミジン、５−ヨード−２’−デオキシシチジン、５−ヨードシトシン、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルシトシンハイドロクロリド、５−メチルウリジン、５−ｎ−プロピルウラシル、５−プロピル−２−チオウラシル、５−スルファミノウラシル、６−（ジメチルアミノ）プリン、６−アザウラシル、６−アザウリジン、６−クロロプリンリボシド、６−シアノプリン、６−エトキシプリン、６−エチルメルカプトプリン、６−メルカプトプリン−２’−デオキシリボシド、６−メチルメルカプトプリンリボシド、６−メチルプリン、６−ｎ−ブトキシプリン、結晶性の６−ｎ−ヘプチルメルカプトプリン、６−ｎ−プロポキシプリン、６−フェニル−２−チオウラシル、６−プロピル−２−チオウラシル、６−セレノプリン、７−メチルグアノシン、８−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジメチルキサンチン、８−ブロモ−２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチルグアノシン、８−ブロモアデノシン、９−（２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン、９−エチルグアニン、９−メチル尿酸、アデホビルジピボキシル、アロプリノールリボシド、ブロモ核酸、グリシテイン、グアノシン、グアニルイル（２’→５’）アデノシン、グアニルイル（３’→５’）シチジン、グアニルイル（３’→５’）ウリジン、ヒポキサンチン、インドキシルβ−Ｄ−グルコシド、イソシトシン、イソキサントプテリン、キネチンリボシド、Ｎ２−イソブチリル−３’−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシグアノシン、Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン、Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン３’−Ｏ−コハク酸、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ４−アセチルシチジン、Ｎ４−アミノシチジン、Ｎ４−アニソイルシチジン、Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン、Ｎ４−オクタデシルシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン、オロチン酸カリウム塩、オロチジン、オキシプリノール、Ｒ（−）−ＰＤ１２８，９０８ハイドロクロリド、Ｓ−（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）−６−チオグアノシン、Ｓ−（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）−６−チオイノシン、Ｓｅ−（ｐ−ニトロベンジル）−６−セレノイノシン、チミジルイル（３’→５’）−２’−デオキシアデノシン、チミジルイル（３’→５’）チミジン、チミン１−β−Ｄ−アラビノフラノシド、トリフルオロチミジン、ウラシル１−β−Ｄ−アラビノフラノシド、ゼアチンリボシドなどが挙げられるが、これらに限らない。
【００２８】
「ポリヌクレオチド結合抗原」及び「抗原結合ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、概して、そのポリヌクレオチド結合抗原がさらされる可能性の高い予測される反応条件及び／または任意の他の関連する条件下で、ポリヌクレオチドと抗原が解離する可能性が低いかまたは解離しないことが知られているような形で、本明細書に記載の抗原に結合されている本明細書に記載のポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドと抗原は、直接的な結合、例えば共有結合、及び間接的な結合、例えば、リンカー分子またはポリヌクレオチドと抗原を結合させるその他の媒介物の使用による結合を含む、ポリヌクレオチドと抗原を結合させる任意の利便的または適切な方法によって結合できる。
【００２９】
「アンプリコン」とは、本明細書で使用する場合、核酸増幅反応における増幅核酸の起源または開始核酸である核酸複合体を指す。「核酸複合体」とは、合わさった２つ以上の核酸を指し、例えば、二本鎖、三本鎖、四本鎖、五本鎖、六本鎖などが挙げられるが、これらに限らない。核酸複合体の核酸は、ワトソン−クリック塩基対形成を含む水素結合相互作用を通じて合わさる、例えば、ハイブリダイズできる。いくつかのケースでは、核酸複合体の２つ以上の核酸は、個々の核酸分子の２つの末端の共有結合を通じて、例えば、核酸の共有結合を触媒する酵素、すなわちリガーゼの使用を通じてライゲーションできる。増幅反応では、最初のアンプリコンに起因する増幅産物から、追加の増幅産物を増幅してもよく、したがって、アンプリコンという用語は、後で、さらなる増幅で使用される増幅反応産物も指すことがあるが、本明細書で使用する場合、アンプリコンは概して、増幅の開始元である最初のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体を指す。
【００３０】
「リガーゼ」という用語は、本明細書で言及する場合、１つの核酸分子または複数の核酸分子の２つの隣接する末端の共有結合を触媒する酵素を総称的に指す。例えば、核酸リガーゼは、例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む一本鎖または二本鎖核酸において、並置された５’リン酸と３’ヒドロキシル末端間におけるホスホジエステル結合の形成を触媒しうる。リガーゼは、相補的な核酸にハイブリダイズした核酸をライゲーションする場合もあれば、または相補的な核酸の非存在下でライゲーションする場合もある。いずれかの従来のリガーゼを本明細書に記載されている方法で使用でき、例えば、天然のリガーゼ、合成または組み換えリガーゼ、変異リガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、突出末端リガーゼ、平滑末端リガーゼ、ニック修復リガーゼ、耐熱性リガーゼ、非耐熱性リガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、コレラウイルスＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼなどが挙げられるが、これらに限らない。
【００３１】
「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、プライマー伸長産物の合成を誘導する条件下、例えば、ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼのような重合誘導物質の存在下、かつ好適な温度、ｐＨ、金属濃度及び塩濃度に置かれたときに、相補的な核酸鎖の合成を開始させる機能を果たすオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは概して、プライマー伸長産物の合成でのその用途と適合する長さのものであり、８〜１００ヌクレオチド長の範囲（１０〜７５ヌクレオチド長、１５〜６０ヌクレオチド長、１５〜４０ヌクレオチド長、１８〜３０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、２１〜５０ヌクレオチド長、２２〜４５ヌクレオチド長、２５〜４０ヌクレオチド長など）であってよく、１８〜４０ヌクレオチド長、２０〜３５ヌクレオチド長、２１〜３０ヌクレオチド長及び示した範囲内のいずれかの長さが含まれる。いくつかのケースでは、プライマーは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲（１５〜４５ヌクレオチド長、１８〜４０ヌクレオチド長、２０〜３０ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長など）及び示した範囲内のいずれかの長さであることができる。いくつかの実施形態では、プライマーは通常、約１０ヌクレオチド長以下、１２ヌクレオチド長以下、１５ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、２１ヌクレオチド長以下、２２ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、４５ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下または７０ヌクレオチド長以下である。
【００３２】
「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイズ」という用語は、ワトソン−クリック塩基対形成によって複合体を形成するのに十分に相補的であるヌクレオチド配列間で複合体を形成することを指す。例えば、プライマーが標的（鋳型）と「ハイブリダイズする」場合には、このような複合体（またはハイブリッド体）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始させるＤＮＡポリメラーゼに必要となるプライミング機能を果たすのに十分に安定している。
【００３３】
２つのヌクレオチド配列は、それらの分子が塩基対構成の相同性を共有しているときに、互いに「相補的」であるか、または「相補性」を有する。「相補的な」ヌクレオチド配列は、適切なハイブリダイズ条件下で、特異性によって結合して、安定した二本鎖を形成することになる。例えば、第１の配列の一部が、アンチパラレル方向または逆向き相補的な方向で、第２の配列の一部に結合できるときには、２つの配列は相補的であり、その際、５’→３’の方向の、第１の配列の相補的な領域が、第２の配列における３’→５’の方向の相補的な配列に結合し、一方の配列のＡはもう一方の配列のＴ（Ｕ）と、一方の配列のＴ（Ｕ）はもう一方の配列のＡと、一方の配列のＧはもう一方の配列のＣと、一方の配列のＣはもう一方の配列のＧとそれぞれアラインされる。ＲＮＡ配列は、相補的なＧ＝ＵまたはＵ＝Ｇ塩基対も含むことができる。したがって、２つの配列は、「相補的」であるためには、完全な相同性を持つ必要はない。通常、２つの配列は、その分子の所定の長さにおいて、ヌクレオチドの少なくとも約８５％の塩基対構成（いくつかのケースでは、その分子の所定の長さにおいて、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％及び１００％の塩基対構成を含むがこれらに限らない）が共通しているときには、十分に相補的である。
【００３４】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プライマーがその相補的な結合パートナーには優先的にハイブリダイズするかまたは特異的に結合し、他の配列には、結合パートナーよりも低い程度で結合するか、または他の配列にはまったく結合しない条件を指す。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイズを通じて互いに結合し合う場合、このようなハイブリダイズを可能にする十分な条件は、ストリンジェントな条件を含みうる。
【００３５】
「特異的に結合する」または「選択的に結合する」とは、分子が、関心対象の標的に優先的に結合するか、他の分子よりも高い親和性で標的に結合することを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は、実質的に相補的な配列に結合し、関連のない配列には結合しない。特異的結合は、溶液または反応混合物において、ある分子に、他の分子または部分よりも優先的に非共有結合または共有結合すること（例えば、抗体が、他の利用可能なポリペプチドよりも、特定のポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合すること）を指してもよい。いくつかの実施形態では、ある１つの分子の、その特異的結合対象である別の分子に対する親和性は、１０−５Ｍ以下（例えば、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、１０−１５Ｍ以下または１０−１６Ｍ以下）のＫＤ（解離定数）によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合強度を指し、結合親和性が高くなるほど、ＫＤは低くなる。
【００３６】
「生体サンプル」には、個体から得られる様々なタイプのサンプルが含まれ、生体サンプルは、診断アッセイまたはモニタリングアッセイで使用できる。この定義には、生体由来の血液サンプルとその他の液体サンプル、生検検体のような固体組織サンプル、組織培養液、組織培養液に由来する細胞、及びその子孫が含まれる。この定義には、入手後に、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのような特定の成分の濃縮などのいずれかの方法で操作されているサンプルも含まれる。「生体サンプル」という用語には、臨床サンプルが含まれ、培養液中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生体液及び組織サンプルも含まれる。「生体サンプル」という用語には、尿、唾液、脳脊髄液、間質液、眼液、滑液、血漿及び血清のような血液分画などが含まれる。「生体サンプル」という用語には、固体組織サンプル、組織培養サンプル及び細胞サンプルも含まれる。
【００３７】
「評価」という用語には、任意の形態の測定が含まれ、ある要素が存在するか否かを割り出すことが含まれる。「割り出す」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」及び「アッセイする」という用語は、同義的に用いられており、これらの用語には、定量的な測定と定性的な測定が含まれる。評価は、相対評価であっても絶対評価であってもよい。「〜の存在の評価」には、存在するものの量を割り出すこと、及び／または存在の有無を割り出すことが含まれる。本明細書で使用する場合、「割り出す」、「測定する」、「評価する」及び「アッセイする」という用語は、同義的に用いられており、定量的な測定と定性的な測定の両方が含まれる。
【００３８】
本発明についてさらに説明する前に、本発明は、記載されている特定の実施形態には限定されず、したがって、当然ながら、本発明は、変形させてよいことを理解されたい。本明細書で使用されている専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するようには意図されておらず、したがって、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。
【００３９】
値の範囲が示されている場合には、その範囲の上限と下限の間の各値（文脈上明らかに別に解すべき場合を除き、その下限の単位の１／１０まで）と、その示されている範囲内の任意の他の示されている値または間の値とが本発明内に含まれると理解されたい。これらのより狭い範囲の上限と下限は、その狭い範囲に独立して含めてよく、その上限と下限は、示されている範囲におけるいずれかの具体的に除外される限定に従って、本発明内に含まれる。示されている範囲に、上限値と下限値の一方または両方が含まれる場合、その含まれている限界値の一方または両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【００４０】
別段の定めのない限り、本明細書で使用されている技術用語と科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等のいずれかの方法及び材料を、本発明の実施または試験の際に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されているすべての文献は、引用されているその文献と関連させて、方法及び／または材料を開示及び説明する目的で、参照により、本明細書に援用される。
【００４１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別に解すべき場合を除き、複数形の言及物が含まれることに留意されたい。したがって、例えば、「抗原」への言及には、複数のその抗原が含まれ、「抗原」への言及には、１つ以上の抗原と、当業者に知られているその等価物への言及が含まれる等である。特許請求の範囲は、いずれかの任意の要素を除外するように書かれていることがあることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙との関連で「唯一」、「のみ」などの排他的な用語を使用するため、または「否定的な」限定を使用するための根拠として機能させることを意図している。
【００４２】
明確にするために、別々の実施形態において説明されている、本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて供給してもよいことは明らかである。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態において説明されている、本発明の様々な特徴は、別々に、またはいずれかの好適なサブコンビネーションで供給してもよい。本発明に関連する実施形態のいずれの組み合わせも、本発明に明確に含まれ、それぞれの組み合わせが個々に、かつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。加えて、様々な実施形態及びその要素のサブコンビネーションのすべてが、本発明に明確に含まれ、そのようなサブコンビネーションがそれぞれ、個々に、かつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。
【００４３】
本明細書で論じられている刊行物は、本願の提出日以前の開示内容について示されているに過ぎない。本明細書中のいかなる記載も、本発明が、先行発明に基づき、そのような刊行物に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈すべきではない。さらに、示されている刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、刊行日を別個に確認する必要がある場合もある。
【００４４】
詳細な説明
方法
上に概説したように、本開示の実施形態は、ポリヌクレオチド結合抗原を伴う抗原結合物質が凝集して複合体になることを通じて、サンプルに抗原結合物質が存在することを検出する方法に対するものである。この方法の態様は、その複合体の凝集抗原のポリヌクレオチドが近接に基づいて会合することと、その後、その会合を検出することを含む。
【００４５】
抗原及び抗原結合物質
本発明の方法の態様は、抗原結合物質の検出に、ポリヌクレオチド結合抗原を使用することを含む。本明細書で使用する場合、「抗原結合物質」とは、抗原に特異的に結合するとともに、記載されている方法の目的においては、抗原と抗原結合物質が凝集して複合体になるのを媒介できる任意の物質を意味する。いくつかのケースでは、例えば、図１を参照すると、抗原と抗原結合物質との複合体（１００）は最低でも、抗原（１０２）である２つの分子に結合した、抗原結合物質（１０１）を１分子含みうる。したがって、抗原結合物質とは、本明細書で使用する場合、単一抗原である少なくとも２つの分子に同時に結合する生体分子及び／または異なる抗原である少なくとも２つの分子に同時に結合する生体分子を指してよい。いくつかのケースでは、抗原（１０５）が、２分子以上の抗原結合物質に同時に結合する能力により、抗原と抗原結合物質との複合体（１０３）は、抗原結合物質（１０４）を少なくとも２分子含みうる。
【００４６】
したがって、本方法の抗原結合物質は、２つ以上の抗原結合部位を含んでよい。このような複数の抗原結合部位は、単一の抗原に対する特異性または多数の異なる抗原に対する特異性を有してよい。本方法の抗原は、２つ以上の抗原結合物質結合部位を含んでよい。このような複数の抗原結合物質結合部位は、単一の抗原結合物質に対する特異性または多数の異なる抗原結合物質に対する特異性を有してよい。結合相互作用のこのような多様性により、複合体の形成と、抗原と抗原結合物質を凝集させて極めて近接させることが促される。
【００４７】
いくつかのケースでは、抗原結合物質は、凝集と抗原−抗体複合体の形成を媒介するように、抗原である２つ以上の分子に結合する抗体または多価抗体断片であってよい。いくつかのケースでは、多価または二価抗体が結合する抗原は、二価または多価抗原となり、各抗体が２つ以上の抗原に結合することと、各抗原が２つ以上の抗体に結合することによって、凝集を媒介するようになる。したがって、抗体−抗原複合体は、抗原である２つの分子に結合した単一の抗体及び／または２つ以上の抗原に結合した複数の抗体（その２つ以上の抗原は、それぞれ２つ以上の抗体に結合している）を含んでよい。本明細書に記載されているように、抗体は、単特異性であっても、多特異性であってもよいので、抗体−抗原複合体は、単一種の抗原を含むものと、２種以上の抗原を含むものを含んでよい。いくつかのケースでは、抗体は、二重特異性であり、各抗体が、異なる抗原である２つの異なる分子に結合して、凝集を媒介するようになっている。したがって、二重特異性抗体−抗原複合体は、２つの異なる抗原である２つの分子に結合した単一の二重特異性抗体及び／または２つの異なる抗原である２つの分子に結合した複数の二重特異性抗体（それらの抗原はそれぞれ、２つ以上の抗体に結合している）を含んでよい。当業者であれば、本明細書に定められているような凝集複合体の上記の成分によって考え得る様々な相互作用を容易に分かるであろう。サンプルに抗体が存在することによって凝集が媒介されるこのような複合体は、例えば、非結合抗原と比べて、抗体結合抗原を極めて近接させて配置させる。
【００４８】
本方法の抗原は、その抗原に結合した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことになる。そのポリヌクレオチドは、下にさらに詳細に説明されているように、いずれかの従来の方法を介して、抗原に結合していてよい。関心対象の抗原に結合したポリヌクレオチドは、部分的には、採用する検出方法、抗原をポリヌクレオチドに結合する方法、検出する特異的抗原結合物質（複数可）などによって異なることになる。本開示の抗原結合ポリヌクレオチドの長さは、様々となり、１５個以上のヌクレオチドとなり、１５個のヌクレオチド〜２００個のヌクレオチドまたはそれを超える範囲であってよく、例えば、２０個以上のヌクレオチド、２５個以上のヌクレオチド、３０個以上のヌクレオチド、３５個以上のヌクレオチド、４０個以上のヌクレオチド、４５個以上のヌクレオチド、５０個以上のヌクレオチド、５５個以上のヌクレオチド、６０個以上のヌクレオチド、６５個以上のヌクレオチド、７０個以上のヌクレオチド、７５個以上のヌクレオチド、８０個以上のヌクレオチド、９０個以上のヌクレオチド、９５個以上のヌクレオチド、１００個以上のヌクレオチド、１５〜２００個のヌクレオチド、２０〜２００個のヌクレオチド、２５〜２００個のヌクレオチド、３０〜２００個のヌクレオチド、３５〜２００個のヌクレオチド、４０〜２００個のヌクレオチド、４５〜２００個のヌクレオチド、５０〜２００個のヌクレオチド、１５〜１００個のヌクレオチド、２０〜１００個のヌクレオチド、２５〜１００個のヌクレオチド、３０〜１００個のヌクレオチド、３５〜１００個のヌクレオチド、４０〜１００個のヌクレオチド、４５〜１００個のヌクレオチド、５０〜１００個のヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限らない。
【００４９】
本開示のポリヌクレオチドは、記載されているように、少なくとも１つの別のポリヌクレオチドに結合して、別のポリヌクレオチドとのポリヌクレオチド複合体（例えば、二本鎖、三本鎖など）の形成を促す少なくとも１つの相補性領域を含むことになる。記載した方法によれば、理論に拘束されるものではないが、相補的な水素結合を通じたポリヌクレオチド複合体の形成は、少なくとも２つの複合体形成ポリヌクレオチドが互いに近接する時間を増やすことにより相補的なポリヌクレオチド間結合の可能性を高めることによって促される。このように、ポリヌクレオチド複合体形成ポリヌクレオチドの近接時間を増やすことは、抗原結合ポリヌクレオチドの抗原結合物質媒介性凝集によって実現される。
【００５０】
一実施形態では、抗原に結合した第１のポリヌクレオチドは、同様に抗原（第１のポリヌクレオチドと同じ抗原または異なる抗原を含む）に結合する第２のポリヌクレオチドに相補的である相補性領域を含んでよい。いくつかのケースでは、第１ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の相補性領域が、それらの２つのポリヌクレオチドのハイブリダイズに十分である。特定のケースでは、第１の抗原結合ポリヌクレオチドと第２の抗原結合ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、複合体の形成がなければ、ハイブリダイズが本質的に起こらないほど十分に弱い。
【００５１】
別の実施形態では、抗原に結合した第１のポリヌクレオチドは、抗原に結合していないポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されているような架橋ポリヌクレオチドまたはスプリントポリヌクレオチドを含む）に相補的である相補性領域を含んでよい。いくつかのケースでは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが、本質的に互いにハイブリダイズしないように、抗原に結合した第１のポリヌクレオチドは、第２の抗原結合ポリヌクレオチドに対する有意な相補性を持つ領域を本質的に含まなくてもよい。
【００５２】
多くの場合、特定のポリヌクレオチドは、別の１つのポリヌクレオチド、すなわち、第２の抗原結合ポリヌクレオチドまたは抗原に結合していないポリヌクレオチドのみに対する相補性を有してよいが、そのようなポリヌクレオチドは、これに限られる必要はなく、いくつかのケースでは、２つ以上の異なるポリヌクレオチドに対する相補性を有してもよい。例えば、特定の実施形態では、抗原に結合した第１のポリヌクレオチドは、多数の相補性領域（例えば、第２の抗原結合ポリヌクレオチドに対する第１の相補性領域、及び抗原に結合していないポリヌクレオチドに対する第２の相補性領域を含む）を含んでよい。多くの場合、抗原に結合していないポリヌクレオチドは、２つ以上の異なるポリヌクレオチド（例えば、２つ以上の抗原結合ポリヌクレオチド、２つ以上の抗原結合ポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド（抗原に結合しない）などを含む）に対する相補性を有することになる。
【００５３】
本開示の２つのポリヌクレオチド間の相補性領域は、様々となり、６個以上の連続した塩基対であってよく、６個の連続した塩基対〜５０個の連続した塩基対の範囲またはそれを超える範囲であってよく、例えば、６〜５０個の連続した塩基対、６〜４５個の連続した塩基対、６〜４０個の連続した塩基対、６〜３５個の連続した塩基対、６〜３０個の連続した塩基対、６〜２５個の連続した塩基対、６〜２０個の連続した塩基対、６〜１５個の連続した塩基対、６〜１０個の連続した塩基対、１０〜５０個の連続した塩基対、１０〜４５個の連続した塩基対、１０〜４０個の連続した塩基対、１０〜３５個の連続した塩基対、１０〜３０個の連続した塩基対、１０〜２５個の連続した塩基対、１０〜２０個の連続した塩基対、１０〜１５個の連続した塩基対、７個以上の連続した塩基対、８個以上の連続した塩基対、９個以上の連続した塩基対、１０個以上の連続した塩基対、１１個以上の連続した塩基対、１２個以上の連続した塩基対、１３個以上の連続した塩基対、１４個以上の連続した塩基対、１５個以上の連続した塩基対、１６個以上の連続した塩基対、１７個以上の連続した塩基対、１８個以上の連続した塩基対、１９個以上の連続した塩基対、２０個以上の連続した塩基対、６個の連続した塩基対、７個の連続した塩基対、８個の連続した塩基対、９個の連続した塩基対、１０個の連続した塩基対、１１個の連続した塩基対、１２個の連続した塩基対、１３個の連続した塩基対、１４個の連続した塩基対、１５個の連続した塩基対、１６個の連続した塩基対、１７個の連続した塩基対、１８個の連続した塩基対、１９個の連続した塩基対、２０個の連続した塩基対、２１個の連続した塩基対、２２個の連続した塩基対、２３個の連続した塩基対、２４個の連続した塩基対、２５個の連続した塩基対などが挙げられるが、これらに限らない。
【００５４】
本発明の方法の態様によれば、用いるポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよく（部分または完全な一本鎖または二本鎖を含む）、プライマー結合部位を含んでも含まなくてもよい。いくつかのケースでは、第１のポリヌクレオチドは、アンプリコンの半分を含み、そのアンプリコンの残りの半分を含む第２のポリヌクレオチドと十分に近接した状態で維持されると、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが結合して、完全なアンプリコンを構成するようになる。いくつかのケースでは、第１及び／または第２のポリヌクレオチドは、１つのアンプリコンの半分未満を含んでよく、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが、会合するほど十分に近接していても、アンプリコンを完成させるのに１つ以上の追加のポリヌクレオチドが必要となるようになっていてもよい。いくつかのケースでは、反応、例えば、化学反応または酵素反応を利用して、本明細書に記載されている方法に従って形成させる複合体の２つ以上のポリヌクレオチドを結合させて、アンプリコンまたはアンプリコンの一部を含む単一のポリヌクレオチドを生成させてよい。
【００５５】
次に、図２に示されている非限定的な実施形態を参照する。いくつかのケースでは、第１の抗原（２００）に結合した第１のポリヌクレオチド（２０１）は、第１及び第２の抗原（２００及び２０２）と１つ以上の抗原結合構成要素とを含む複合体の形成によって、第２の抗原（２０２）に結合した第２のポリヌクレオチド（２０３）と比較的近接した状態に維持された場合は、第２のポリヌクレオチド（２０３）とアンプリコンを形成するのに十分である。少なくともいくつかの相補的な核酸配列を含む第１及び第２のポリヌクレオチド（２０１及び２０３）は、十分な水素結合相互作用を通じて結合して、それらのポリヌクレオチドのうちの一方の伸長開始点として機能し得る核酸二本鎖（２０４）を形成させる。
【００５６】
次に、図３に示されている非限定例を参照する。いくつかのケースでは、第１の抗原（３００）に結合した第１のポリヌクレオチド（３０１）は、第１及び第２の抗原（３００及び３０２）と１つ以上の抗原結合構成要素とを含む複合体の形成によって、第１及び第２のポリヌクレオチド（３０１及び３０３）が比較的近接した状態に維持された場合は、第２の抗原（３０２）に結合した第２のポリヌクレオチド（３０３）及び架橋ポリヌクレオチド（３０５）とアンプリコンを形成するのに十分である。どちらも架橋ポリヌクレオチド（３０５）と相補的な核酸配列を少なくともいくつか含む第１及び第２のポリヌクレオチド（３０１及び３０３）は、十分な水素結合相互作用を通じて架橋ポリヌクレオチドに結合して、それらのポリヌクレオチドのうちの一方の伸長開始点として機能し得る核酸複合体（３０４）を形成する。任意の選択肢として、第１及び第２のポリヌクレオチド（３０１及び３０３）は、例えば、１つ以上のプライマーを加えるか、または架橋ポリヌクレオチドをプライマーとして用いることによってライゲーションして、アンプリコンとして機能し得る連続的なポリヌクレオチドを形成してよい。別の実施形態（図４を参照のこと）では、第１及び第２のポリヌクレオチド（４０１及び４０３）は、架橋ポリヌクレオチド（４０５）に対する相補性を有するスプリントポリヌクレオチド（４０６）にライゲーションしている。
【００５７】
ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの長さ沿いの任意の利便的な点（３’末端または５’末端を含む）で、所望の抗原に結合してよい。いくつかのケースでは、アンプリコンの第１の抗原結合ポリヌクレオチドは、抗原にその３’末端で結合しており、アンプリコンの第２の抗原結合ポリヌクレオチドは、抗原にその５’末端で結合している。いくつかのケースでは、第１の抗原結合ポリヌクレオチドと第２の抗原結合ポリヌクレオチドはどちらも、それぞれの抗原にその３’末端で結合している。いくつかのケースでは、第１の抗原結合ポリヌクレオチドと第２の抗原結合ポリヌクレオチドはどちらも、それぞれの抗原にその５’末端で結合している。
【００５８】
別の実施形態（図５を参照のこと）では、第１及び第２の抗原結合ポリヌクレオチド（５０１及び５０３）はどちらも、それぞれの抗原（５００及び５０２）にその５’末端または３’末端で結合しているとともに、架橋ポリヌクレオチド（５０５）に結合して、核酸複合体を形成させ、この核酸複合体から、伸長を開始できる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「架橋ポリヌクレオチド」という用語は、各ポリヌクレオチド上の相補的な領域またはポリヌクレオチド末端の相補的な領域と同時にハイブリダイズすることによって、２つ以上の別々のポリヌクレオチドまたは単一のポリヌクレオチドの２つの末端をつなぐ任意のポリヌクレオチドを指す。特定のケースでは、架橋ポリヌクレオチドは、第１の抗原結合ポリヌクレオチドの第１の相補的な領域及び第２の抗原結合ポリヌクレオチドの第２の相補的な領域と同時にハイブリダイズすることによって、２つの抗原結合ポリヌクレオチドをつなぐ。架橋ポリヌクレオチドは、部分一本鎖または完全一本鎖（部分一本鎖及び部分二本鎖を含む）であってよい。本開示の架橋ポリヌクレオチドの長さは、様々となり、１０個以上のヌクレオチドであってよく、１０〜１００個以上のヌクレオチドの範囲であってよく、例えば、１０〜１００個のヌクレオチド、１２〜１００個のヌクレオチド、１４〜１００個のヌクレオチド、１６〜１００個のヌクレオチド、１８〜１００個のヌクレオチド、２０〜１００個のヌクレオチド、２２〜１００個のヌクレオチド、２４〜１００個のヌクレオチド、２６〜１００個のヌクレオチド、２８〜１００個のヌクレオチド、３０〜１００個のヌクレオチド、１０〜５０個のヌクレオチド、１２〜５０個のヌクレオチド、１４〜５０個のヌクレオチド、１６〜５０個のヌクレオチド、１８〜５０個のヌクレオチド、２０〜５０個のヌクレオチド、２２〜５０個のヌクレオチド、２４〜５０個のヌクレオチド、２６〜５０個のヌクレオチド、２８〜５０個のヌクレオチド、３０〜５０個のヌクレオチド、１０〜４０個のヌクレオチド、１２〜４０個のヌクレオチド、１４〜４０個のヌクレオチド、１６〜４０個のヌクレオチド、１８〜４０個のヌクレオチド、２０〜４０個のヌクレオチド、２２〜４０個のヌクレオチド、２４〜４０個のヌクレオチド、２６〜４０個のヌクレオチド、２８〜４０個のヌクレオチド、３０〜４０個のヌクレオチド、１０〜３０個のヌクレオチド、１２〜３０個のヌクレオチド、１４〜３０個のヌクレオチド、１６〜３０個のヌクレオチド、１８〜３０個のヌクレオチド、２０〜３０個のヌクレオチド、１２個以上のヌクレオチド、１３個以上のヌクレオチド、１４個以上のヌクレオチド、１５個以上のヌクレオチド、１６個以上のヌクレオチド、１７個以上のヌクレオチド、１８個以上のヌクレオチド、１９個以上のヌクレオチド、２０個以上のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１３個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、２９個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチドなどが挙げられる。
【００６０】
架橋ポリヌクレオチドは、２つ以上のポリヌクレオチドを「架橋」して、ポリヌクレオチド複合体を形成できる。いくつかのケースでは、架橋ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド末端（同じ核酸または異なる核酸の末端を含む）とハイブリダイズして、それらの末端が、ポリヌクレオチド複合体の中で隣接するようにして、例えば、その隣接する末端のライゲーションを可能にするようにしてよい。いくつかのケースでは、架橋ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド末端（同じ核酸または異なる核酸の末端を含む）とハイブリダイズして、それらの末端が、得られたポリヌクレオチド複合体において隣接しないように、例えば、それらの末端が直接ライゲーションできないように、それらの末端が隣接しないようにしてよい。いくつかのケースでは、例えば、ポリヌクレオチド複合体の２つの末端が隣接していない場合、それらの２つの末端の間の空間において、スプリントポリヌクレオチドがハイブリダイズして、そのスプリントポリヌクレオチドの末端が、上記の２つの末端のうちの１つ以上に隣接する位置にくるようにしてよい。「スプリントポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、概して一本鎖または部分一本鎖及び部分二本鎖であってよいとともに、ポリヌクレオチド複合体、例えば、架橋ポリヌクレオチドを使用することによって形成される複合体の２つのポリヌクレオチド末端の間の１つ以上のギャップを埋める目的で用いてよいポリヌクレオチドを指す。いくつかのケースでは、スプリントポリヌクレオチドは、架橋ポリヌクレオチドの１つ以上の部分に対する相補性を有してよい。いくつかのケースでは、スプリントポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のポリヌクレオチドの末端は、スプリントポリヌクレオチドにライゲーションしていてよい。
【００６１】
いくつかのケースでは、本開示の架橋ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシドアナログを含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の架橋ポリヌクレオチドは、１つ以上のデオキシリボウラシル（すなわち、デオキシリボースウラシル、２’−デオキシウリジンなど）ヌクレオシド／ヌクレオチドを含んでよい。特定のケースでは、架橋ポリヌクレオチドは、２つ以上（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上などが挙げられるが、これらに限らない）のヌクレオシドアナログを含んでよい。いくつかのケースでは、ヌクレオシドアナログの数（架橋ポリヌクレオチドの総塩基に対する割合）は、１％以上であり、例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上などが挙げられるが、これらに限らない。
【００６２】
特定の実施形態では、本開示の方法は、架橋ポリヌクレオチドの特異的分解を含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、架橋ポリヌクレオチド内にヌクレオシドアナログが存在することにより、例えばライゲーション後に、架橋ポリヌクレオチドの標的分解が可能になる。いくつかのケースでは、ヌクレオシドアナログを含む架橋ポリヌクレオチドは、そのヌクレオシドアナログに特異的な１つ以上の塩基除去機構を通じて、架橋ポリヌクレオチドの特異的分解を媒介する。このようなプロセスでは、例えば、本発明の方法において、例えばライゲーション工程後に、サンプルを１つ以上の特異的ヌクレオシド除去試薬と特定の点で接触させることによって特定のヌクレオシドアナログを特異的に除去するための試薬を利用してよい。例えば、１つ以上のデオキシリボウラシルを含む架橋ポリヌクレオチドを２つの抗原結合ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせてそれらの２つの抗原結合ポリヌクレオチドのライゲーションを促し、このライゲーション後に、例えば、１つ以上のウラシル特異的除去試薬を用いることによって、架橋ポリヌクレオチドを分解する。
【００６３】
このような特異的除去試薬としては、特定のヌクレオシドアナログの特異的除去を促したり、及び／または特定のヌクレオシドアナログと隣接する１つ以上のホスホジエステル結合の切断を促したりする試薬が挙げられる。したがって、有用な塩基除去試薬としては、グリコシラーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼを挙げてよい。特定の実施形態では、例えば、１つ以上のデオキシリボウラシルが架橋ポリヌクレオチドに組み込まれている場合には、有用なウラシル特異的除去試薬としては、ウラシルの特異的除去を促したり、及び／またはウラシル除去の前または後に、ウラシルと隣接する１つ以上のホスホジエステル結合の切断を促したりする試薬を挙げてよい。ウラシル特異的除去試薬の非限定例としては、例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどが挙げられるが、これらに限らない。したがって、いくつかのケースでは、ヌクレオシドアナログを含む架橋ポリヌクレオチドを特異的に分解することは、サンプルを１つ以上の塩基除去試薬と接触させることを含んでよい。
【００６４】
上記のように、いくつかのケースでは、抗原結合ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、完全二本鎖または部分二本鎖であってよい。一実施形態（図６を参照のこと）では、第１の抗原結合ポリヌクレオチド（６０１）は、第２の部分二本鎖の抗原結合ポリヌクレオチド（６０３）に結合して核酸複合体を形成するのに十分な相補性を有し、この核酸複合体から、第１及び第２の抗原（６００及び６０２）が抗原結合物質の１つ以上の分子と複合体を形成したときに伸長を開始できる。
【００６５】
いくつかのケースでは、得られる複合体の第１の抗原結合ポリヌクレオチド及び第２の抗原結合ポリヌクレオチド、ならびに／または任意の架橋ポリヌクレオチド及び／もしくはスプリントポリヌクレオチド間の相補性は、凝集なしでは、ポリヌクレオチド複合体を有意に形成するのに不十分である。例えば、いくつかのケースでは、ポリヌクレオチド結合抗原が、凝集複合体において１つ以上の抗原結合物質に結合することにより近接しているときのみに、下流のプロセス、例えば、ライゲーション、伸長、増幅などに必要な複合体形成が本質的に行われるように、相補性（特定の複合体のすべての相補性、またはより大きい複合体の２つ以上の成分の相補性を含む）は十分に無力である。
【００６６】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されているようなハイブリダイズとポリヌクレオチド複合体の形成は、反応混合物の１つ以上の試薬の濃度によって影響を受ける。例えば、いくつかのケースでは、凝集が無い状態でのポリヌクレオチド複合体の形成速度が、凝集複合体内でのポリヌクレオチド複合体の形成速度よりも有意に低くなるように、反応混合物の１つ以上の成分の濃度は十分に低い。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチド結合抗原が遊離状態でのポリヌクレオチド複合体形成速度が、ポリヌクレオチド結合抗原が凝集した状態でのポリヌクレオチド複合体形成速度よりも有意に低くなるように、ポリヌクレオチド結合抗原の相対濃度は、十分に低い。この関連において、「有意に低い」とは、遊離成分と凝集成分におけるポリヌクレオチド複合体形成速度の差が十分であり、例えば、本明細書に記載されているような特定の検出方法を用いて、遊離状態と凝集状態を区別できるアッセイを構築できるようになっていることを意味する。
【００６７】
増幅
アンプリコン、アンプリコンを形成できる合わさったポリヌクレオチドまたはアンプリコンを形成できる延長ポリヌクレオチドが形成されたら、増幅産物を生成させるために、アンプリコンが増幅されうる。下にさらに詳細に説明されているように、増幅産物の生成には、任意の利便的な増幅方法を用いてよく、この方法は、形成される具体的なポリヌクレオチド複合体及び／または全体的な検出アッセイの具体的な要件に左右され得る。アンプリコンの形成は、抗原結合物質の媒介によってポリヌクレオチド結合抗原が凝集することに依存するので、増幅産物の存在により、サンプル中の抗原結合物質の存在及び／または抗原結合物質の量を示すことができる。
【００６８】
いくつかのケースでは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行ってよい。代表的なＰＣＲ増幅反応では、反応混合物は概して、プライマー伸長反応で使用される１つ以上のプライマー、例えば、ＰＣＲプライマー（幾何級数的な（もしくは指数関数的な）増幅で使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマー、または線形増幅で使用される単一のプライマーなど）と組み合わされている鋳型核酸を含む。したがって、いくつかのケースでは、上記の核酸複合体のハイブリダイズ部分は、増幅反応のための「プライマー」として機能し得る。例えば、線形増幅を用いる場合には、上記の核酸複合体のハイブリダイズ核酸の単一の遊離３’末端は、増幅のためのプライマーとして機能し得る。いくつかのケースでは、１つ以上の追加の核酸を加えて、形成された核酸複合体において、プライマーとして機能させてよい。例えば、いくつかのケースでは、２つの抗原結合ポリヌクレオチドをライゲーション反応で連結してよく、２つの追加のプライマーを加えて、新たにライゲーションした核酸セグメント、すなわち鋳型の増幅を促してよい。いくつかのケースでは、上記の核酸複合体のハイブリダイズ核酸の単一の遊離３’末端は、第１のプライマーとして機能してよく、第２のプライマーを加えて、増幅を促してよい。
【００６９】
鋳型核酸（以下では、便宜上、鋳型ＤＮＡという）が接触するあらゆるオリゴヌクレオチドプライマーは、アニーリング条件下で相補的な鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするのに十分な長さのプライマーであろう。プライマーは概して、少なくとも６ｂｐ長であり、例えば、少なくとも１０ｂｐ長、少なくとも１５ｂｐ長、少なくとも１６ｂｐ長、少なくとも１７ｂｐ長、少なくとも１８ｂｐ長、少なくとも１９ｂｐ長、少なくとも２０ｂｐ長、少なくとも２１ｂｐ長、少なくとも２２ｂｐ長、少なくとも２３ｂｐ長、少なくとも２４ｂｐ長、少なくとも２５ｂｐ長、少なくとも２６ｂｐ長、少なくとも２７ｂｐ長、少なくとも２８ｂｐ長、少なくとも２９ｂｐ長、少なくとも３０ｂｐ長が挙げられるが、これらに限らず、また、６０ｂｐ長以上もの長さであってもよく、プライマーの長さは概して、１８〜５０ｂｐ長の範囲であり、例えば、約２０〜３５ｂｐ長が挙げられるが、これに限らない。いくつかのケースでは、鋳型ＤＮＡのプライマー伸長、線形増幅または指数関数的な増幅が望ましいかに応じて、鋳型ＤＮＡは、単一のプライマーまたは２つのプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）と接触させてよい。本方法で用いられうるＰＣＲの方法としては、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号及び同第５，５１２，４６２号に記載されているものが挙げられるが、これらに限らず、これらの特許の開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
【００７０】
上記成分に加えて、本方法で生成されるＰＣＲ反応混合物は、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ）を含んでよい。所望のポリメラーゼ活性は、１つ以上の別々のポリメラーゼ酵素によってもたらしてよい。多くの実施形態では、この反応混合物は、少なくともファミリーＡポリメラーゼを含み、関心対象の代表的なファミリーＡポリメラーゼとしては、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ（天然のポリメラーゼ（Ｔａｑ）及びその誘導体とホモログ（Ｋｌｅｎｔａｑ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：２２１６−２２２０に記載されているもの。この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）など）を含む）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼ（天然のポリメラーゼ（Ｔｔｈ）及びその誘導体とホモログを含む）などが挙げられるが、これらに限らない。実行する増幅反応が、忠実度の高い反応である特定の実施形態では、その反応混合物は、例えば、ファミリーＢポリメラーゼによって付与できるような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素をさらに含んでよく、関心対象のファミリーＢポリメラーゼとしては、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）（例えば、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：５５７７に記載されているようなもの。この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）、パイロコッカス属種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ−Ｄ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）（例えば、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９１）１０８：１−６に記載されているようなもの。この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）、パイロコッカス・ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）などが挙げられるが、これらに限らない。概して、反応混合物は、存在する４つの天然の塩基に対応する４つの異なるタイプのｄＮＴＰ、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを含み、いくつかのケースでは、１つ以上の修飾ヌクレオチドｄＮＴＰを含んでよい。
【００７１】
ＰＣＲ反応は概して、反応混合物をアニーリング用の適切な温度、伸長／延長用の適切な温度及び変性用の適切な温度間に、所定の回数サイクリングさせることによって行う。このような温度と回数は様々であり、具体的な反応成分（例えば、ポリメラーゼ及びプライマーを含む）と、得られるＰＣＲ産物の予測される長さに左右されるであろう。いくつかのケースでは、例えば、ネステッドＰＣＲ、すなわち２段階のＰＣＲを用いる場合、サイクリング反応は、段階的に行ってよく、例えば、特定のサイクリングプログラムを有するか、または特定の温度（複数可）を用いる第１の段階に従ってサイクリングを行った後に、特定のサイクリングプログラムを有するか、または特定の温度（複数可）を用いる第２の段階に従ってサイクリングする。
【００７２】
多段階のＰＣＲプロセスは、増幅の開始後に、１つ以上の試薬を追加することを含んでも、含まなくてもよい。例えば、いくつかのケースでは、ポリメラーゼを使用して伸長させることによって、増幅を開始してよく、反応の初期局面の後、追加の試薬（複数可）（例えば、１つ以上の追加のプライマー、追加の酵素など）を反応系に加えて、第２の反応局面を促してよい。いくつかのケースでは、第１のプライマーまたは第１のプライマーセットによって増幅を開始してよく、初期反応局面の後、追加の試薬（複数可）（例えば、１つ以上の追加のプライマー、追加の酵素など）を反応系に加えて、第２の反応局面を促してもよい。特定の実施形態では、初期増幅局面は、「プレ増幅」と称する場合もある。
【００７３】
いくつかのケースでは、等温条件下で、例えば、等温増幅によって増幅を行ってよい。等温増幅方法は概して、ＤＮＡ鎖を分離する酵素的手段（例えば、鎖置換ポリメラーゼまたはヘリカーゼなど）を用いて、一定温度で増幅を促すので、ＤＮＡを変性させるための熱サイクリングが不要になる。本方法においては、任意の利便的かつ適切な等温増幅手段を用いてよく、環状型等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）などが挙げられるが、これらに限らない。ＬＡＭＰでは概して、標的ＤＮＡの複数の別々の領域、例えば、６〜８個の別々の領域を認識できる複数のプライマー、例えば、４〜６個のプライマーを使用する。合成は概して、２つのプライマーとともに、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによって開始して、ループ構造を形成させて、その後の増幅ラウンドを促す。ＬＡＭＰは、迅速かつ感度が高い。加えて、いくつかのケースでは、専門機器を使用せずに、例えば、肉眼によって、ＬＡＭＰ増幅反応中に生成されるピロリン酸マグネシウムを可視化できる。ＳＤＡには概して、鎖限定型制限エンドヌクレアーゼまたはニッキング酵素によって、プライマーに含まれる部位に作られたニックから開始させるために、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージ（クレノウ）断片ポリメラーゼ、クレノウ断片（３’−５’エキソ−）など）の使用が伴う。ＳＤＡでは、ニッキング部位は概して、各ポリメラーゼ置換工程で再生成され、その結果、指数関数的な増幅が行われる。ＨＤＡでは概して、二本鎖ＤＮＡをほどいて、鎖を分離するヘリカーゼと、ほどいたＤＮＡにアニーリングできるプライマー、例えば、２つのプライマーと、延長のための鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＮＥＡＲは概して、例えばニッキング酵素によって作られたニックから伸長を開始させる鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを伴う。ＮＥＡＲは迅速かつ感度が高く、標的配列から多くの短い核酸を素早く生成する。
【００７４】
いくつかのケースでは、ハイブリッドな増幅方法をもたらすために、増幅方法全体を組み合わせても、または、様々な増幅方法の局面を組み合わせ直してもよい。例えば、いくつかのケースでは、例えば、初期鋳型、すなわちアンプリコン、または１回目の増幅ラウンドもしくは複数回の増幅ラウンドをもたらすために、ＰＣＲの局面を用いてよく、その後、さらなる増幅のために、等温増幅方法を用いてよい。いくつかのケースでは、等温増幅方法または等温増幅方法の局面を用いた後に、等温増幅反応の産物をさらに増幅するために、ＰＣＲを用いてもよい。いくつかのケースでは、第１の増幅方法を用いて、サンプルをプレ増幅してよく、第２の増幅方法を用いて、さらなる処理（例えば、さらなる増幅または解析を含む）を行ってよい。非限定例としては、サンプルをＰＣＲによってプレ増幅してよく、ｑＰＣＲによってさらに解析してよい。
【００７５】
いくつかのケースでは、プレ増幅工程を用いるかまたは用いずに、下記の増幅工程と検出工程を組み合わせてもよい。いくつかのケースでは、用いる具体的な増幅方法によって、例えば、検出試薬を用いるかまたは用いずに、増幅反応を目視確認することによって、増幅産物の定性的な検出を可能にする。一実施形態では、凝集した抗原結合ポリヌクレオチドを等温増幅、例えば、ＬＡＭＰによって増幅し、その増幅によって、増幅反応物において、効率的な増幅、すなわち、サンプルに抗原結合物質が存在することを示す可視的変化を引き起こす。いくつかのケースでは、例えば、リアルタイムＰＣＲ（本明細書においては、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ともいい、下にさらに詳細に説明されている）で行うように、増幅中に増幅反応をモニタリングすることによって、増幅工程と検出工程を組み合わせる。
【００７６】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法では、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）及び近接伸長アッセイ（ＰＥＡ）で用いられる方法、例えば、増幅方法と、その成分を用いてもよく、例えば、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、結合誘導ＤＮＡアセンブリー（ＢＩＮＤＡ）、ニッキング酵素による蛍光シグナル増幅（ＮＥＦＳＡ）及び例えば、Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｅｎｓｏｒｓ，１３，１３５３−１３８４（この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない。
【００７７】
非限定例としては、図７を参照すると、いくつかのケースでは、２つの抗原結合ポリヌクレオチド（７０１及び７０３）の結合抗原（７００及び７０２）の凝集によって促進される、２つの抗原結合ポリヌクレオチド（７０１及び７０３）の会合によって、例えばライゲーションを通じて、環状化オリゴヌクレオチド（７０７）（任意の選択肢として、架橋ポリヌクレオチド（７０５）を伴ってもよい）の環状化が可能になる。環状化ポリヌクレオチドの環状化によって、抗原結合ポリヌクレオチドのうちの１つが、例えばＲＣＡによって伸長可能になる。いくつかのケースでは、ＲＣＡによる伸長及び／または増幅には、抗原結合ポリヌクレオチドの１つ以上の繰り返し配列の生成が伴う。
【００７８】
検出
増幅産物の存在は、任意の利便的な方法によって割り出してよい（定性的な割り出しまたは定量的な割り出しを含む）。いくつかのケースでは、増幅産物の存在は、例えば、増幅反応における物理的変化であって、標的ポリヌクレオチド複合体の効率的な増幅を示す変化を通じて、定性的に割り出してよい。
【００７９】
いくつかのケースでは、増幅核酸の非特異的検出のための検出プロトコールまたは増幅核酸の特異的検出のためのプロトコールによって、増幅産物を検出したり、及び／または増幅産物の量を測定したりする。関心対象の非特異的検出プロトコールの代表的なものとしては、例えばインターカレーションによって二本鎖核酸産物を選択的に検出するシグナル発生系を用いるプロトコールが挙げられる。このような実施形態で使用される代表的な検出可能な分子としては、核酸と複合体を形成すると蛍光を増大させる蛍光核酸染色物質（フェナントリジニウム色素など）（そのモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを含む）が挙げられる。フェナントリジニウム色素の例としては、エチジウムホモダイマー、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド及びその他のアルキル置換フェナントリジニウム色素が挙げられる。別の実施形態では、核酸染色物質としては、アクリジン色素、またはそのホモダイマーもしくはヘテロダイマー（アクリジンオレンジ、アクリジンホモダイマー、エチジウム−アクリジンヘテロダイマーまたは９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジンなど）が挙げられる。さらに別の実施形態では、核酸染色物質は、インドールまたはイミダゾール色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）またはＤＩＰＩ（４’，６−（ジイミダゾリン−２−イル）−２−フェニルインドール）など）である。その他の許容される核酸染色物質としては、７−アミノアクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、ＬＤＳ７５１、所定のソラレン（フロクマリン）、スチリル色素、金属複合体（ルテニウム複合体など）及び遷移金属複合体（例えば、Ｔｂ３＋及びＥｕ３＋が組み込まれたもの）が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、核酸染色物質は、核酸と会合すると蛍光を増大させるシアニン色素、またはシアニン色素のホモダイマーもしくはヘテロダイマーである。いくつかのケースでは、米国特許第４，８８３，８６７号、米国特許第５，５８２，９７７号、米国特許第５，３２１，１３０号及び米国特許第５，４１０，０３０号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている色素を用いてよく、ＴＯＴＯ、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＢＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯ及びＹＯ−ＰＲＯ（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の商品名で市販されている核酸染色物質が挙げられる。いくつかのケースでは、米国特許第５，４３６，１３４号、米国特許第５，６５８，７５１号及び米国特許第５，８６３，７５３号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている色素を用いてよく、ＳＹＢＲ、ＳＹＴＯ、ＳＹＴＯＸ、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ、ＯＬＩＧＲＥＥＮ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の商品名で市販されている核酸染色物質が挙げられる。さらに別の実施形態では、核酸染色物質は、アザベンズアゾリウムまたはポリアザベンズアゾリウム複素環（アザベンズオ��サゾール、アザベンズイミダゾールまたはアザベンゾチアゾールなど）が組み込まれているモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマーのシアニン色素であって、核酸と会合すると蛍光を増大させる色素であり、ＳＹＴＯ、ＳＹＴＯＸ、ＪＯＪＯ、ＪＯ−ＰＲＯ、ＬＯＬＯ、ＬＯ−ＰＲＯ（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の商品名で市販されている核酸染色物質が挙げられる。
【００８０】
さらに別の実施形態では、増幅産物に特異的であるシグナル発生系は、二本鎖分子とは対照的に、概して、増幅を検出するのに用いてよい。これらの実施形態では、シグナル発生系は、増幅産物に見られる配列に特異的に結合するプローブ核酸を含んでよく、このプローブ核酸は、直接または間接的に検出可能な標識で標識されていてよい。直接検出可能な標識は、追加の試薬を用いずに、直接検出できる標識であり、間接的に検出可能な標識は、１つ以上の追加の試薬を用いることによって検出可能な標識であり、例えば、標識は、２つ以上の成分で構成されているシグナル発生系の構成要素である。いくつかの実施形態では、標識は、直接検出可能な標識であり、関心対象の直接検出可能な標識としては、蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、化学発光標識などが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識であり、このような実施形態で用いる標識試薬は、蛍光タグ化ヌクレオチド（複数可）、例えば、蛍光タグ化ＣＴＰ（Ｃｙ３−ＣＴＰ、Ｃｙ５−ＣＴＰなど）などである。標識プローブ核酸を生成するためにヌクレオチドをタグ化するのに用いてよい蛍光部分としては、フルオレセイン、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、Ａｌｅｘａ５５５、Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０などが挙げられるが、これらに限らない。上記のような他の標識も用いてよい。
【００８１】
シグナル発生系が蛍光シグナル発生系である実施形態では、シグナル検出は典型的には、反応混合物から得られる蛍光シグナルの変化を検出して、アッセイ結果を得ることを含む。換言すると、反応混合物によって生成される蛍光シグナルのいずれかの変調を評価する。この変化は、用いる標識の性質に応じて、蛍光の増大または減少であり得、特定の実施形態では、蛍光の増大である。任意の利便的な手段、例えば、好適な蛍光光度計（耐熱性キュベットまたはプレートリーダー蛍光光度計など）を用いて、サンプルにおける蛍光の増大をスクリーニングしてよい。蛍光は好適には、既知の蛍光光度計を用いてモニタリングする。これらの装置から得られるシグナル、例えば、光電子増倍管の電圧の形態のシグナルは、データプロセッサーボードに送られ、各サンプル管に関連したスペクトルに変換される。多数の反応容器、例えば、多数のチューブ、マルチウェルプレートなどを同時に評価することができる。
【００８２】
いくつかのケースでは、ポリヌクレオチド複合体の特定のポリヌクレオチド、例えば、抗原結合ポリヌクレオチド、架橋ポリヌクレオチド、環状化オリゴヌクレオチドなどの伸長及び／または増幅により、１つ以上の特異的核酸配列が複製され、その１つ以上の特異的核酸配列のリピートを含む１つ以上の鎖が得られる。このような繰り返し配列は、例えば、繰り返し特異的配列に特異的なプローブ核酸のハイブリダイズを通じて検出できる。特定のケースでは、繰り返し特異的配列に特異的なタグ化プローブ核酸、例えば、蛍光タグ化プローブ核酸、酵素的タグ化プローブ核酸、放射線標識タグ化プローブ核酸などを用いて、繰り返し特異的配列を含む延長ポリヌクレオチドまたは増幅産物を検出してよい。いくつかのケースでは、タグ化プローブ核酸を延長ポリヌクレオチドまたは増幅産物の繰り返し配列にハイブリダイズさせることにより、延長ポリヌクレオチドまたは増幅産物にハイブリダイズしたタグ化プローブ核酸の多さ（その結果、検出可能なタグの局所濃度が高くなる）によって、延長ポリヌクレオチドまたは増幅産物を検出可能になる。
【００８３】
例えば、いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法に従って生成される増幅産物または伸長産物には、抗原結合ポリヌクレオチドの１つ以上の配列のリピートに含まれており、その繰り返し配列ユニットに特異的なタグ化プローブ核酸を用いることを通じて、それらのリピートを検出する。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法に従って生成される増幅産物または伸長産物には、架橋ポリヌクレオチドの１つ以上の配列のリピートが含まれており、その繰り返し配列ユニットに特異的なタグ化プローブ核酸を用いることを通じて、それらのリピートを検出する。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法に従って生成される増幅産物または伸長産物には、環状化オリゴヌクレオチドの１つ以上の配列のリピートが含まれており、その繰り返し配列ユニットに特異的なタグ化プローブ核酸を用いることを通じて、それらのリピートを検出する。
【００８４】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている伸長及び／または増幅方法のうちの１つ以上、例えば、ＰＣＲ増幅、等温増幅（例えば、ＲＣＡ）などによって、繰り返し核酸配列を生成してよく、１つ以上の蛍光標識プローブ核酸を伸長及び／または増幅産物にハイブリダイズさせることを通じて、伸長及び／または増幅産物を検出可能にしてよい。このような検出可能な伸長及び／または増幅産物は、蛍光を検出するための任意の利便的な手段（例えば、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリーなどが挙げられるが、これらに限らない）を通じて同定してよい。いくつかのケースでは、検出可能な伸長及び／または増幅産物の同定により、伸長及び／または増幅産物の由来元である複合体の抗原結合物質と会合した分子、粒子、細胞、組織、生物などの検出または同定が可能になる。例えば、いくつかのケースでは、蛍光プローブに結合した伸長及び／または増幅産物は、抗原結合物質を産生した細胞に依然として付随し、例えば、蛍光顕微鏡によるその細胞の同定及び／または例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるその細胞の単離を可能にしうる。
【００８５】
上記のように、いくつかのケースでは、増幅をリアルタイムでモニタリングして、検出及び／または定量を行ってよい。検出プロトコールが、例えば、ｑＰＣＲ反応プロトコールで用いられているようなリアルタイムプロトコールである場合、反応全体を通じて、頻繁に、例えば、１０ミリ秒に１回、または１０ミリ秒に１回よりも高い頻度もしくは低い頻度でデータが収集されうる。各サイクル中に、サンプル由来の反応性分子の蛍光をモニタリングすることによって、様々な方法で、増幅反応の進行をモニタリングできる。例えば、融解ピーク下面積を算出して、それらのデータをサイクル数に対してプロットすることによって、例えば、融解ピークによって得られるデータを解析できる。
【００８６】
例えば、事前に選択した蛍光部分（色素など）の「適合性」を用いて、上記のようにして生成したスペクトルを分解して、各シグナル部分（すなわち、フルオロフォア）を表すピークを形成できる。各シグナルの強度値を表すピーク下面積を割り出すことができ、ピーク下面積は、必要な場合には、相互の比率として表すことができる。シグナルの強度及び／または比の微分は、標識プローブにおける変化を反応を通してまたは異なる反応条件（温度など）で記録することを可能にする。これらの変化は、オリゴヌクレオチドプローブと標的配列との間の結合現象、または標的配列に結合したオリゴヌクレオチドプローブの分解に関連している。微分ピーク下面積の積分は、標識作用に関する強度値を算出することを可能にする。
【００８７】
混合物を蛍光変化についてスクリーニングすると、サンプルを増幅反応の最後に１回スクリーニングするか、または反応中に複数回、（例えば、リアルタイムＰＣＲモニタリングで行うように）例えば各サイクル後にスクリーニングするかに応じて、１つ以上のアッセイ結果が得られる。
【００８８】
本明細書に記載されている方法によれば、例えば、特定の検出閾値を上回っているかまたは下回っているかで抗原結合物質の存在を検出しても、または測定、例えば、特定の検出閾値を上回って存在するときにサンプル中の抗原結合物質の実際の量または濃度を測定してもよい。対象の抗原結合物質検出反応の実際の検出閾値は様々であると考えられ、例えば、検出する抗原結合物質、使用する具体的な増幅方法、使用する検出方法などに左右される。いくつかのケースでは、対象の検出方法の検出閾値は、１５ｎｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲であり得、１５ｎｇ／ｍｌ未満、１４ｎｇ／ｍｌ未満、１３ｎｇ／ｍｌ未満、１２ｎｇ／ｍｌ未満、１１ｎｇ／ｍｌ未満、１０ｎｇ／ｍｌ未満、９ｎｇ／ｍｌ未満、８ｎｇ／ｍｌ未満、７ｎｇ／ｍｌ未満、６ｎｇ／ｍｌ未満、５ｎｇ／ｍｌ未満、４ｎｇ／ｍｌ未満、３ｎｇ／ｍｌ未満、２ｎｇ／ｍｌ未満、１ｎｇ／ｍｌ未満、５００ｐｇ／ｍｌ未満、４００ｐｇ／ｍｌ未満、３００ｐｇ／ｍｌ未満、２００ｐｇ／ｍｌ未満、１００ｐｇ／ｍｌ未満、９０ｐｇ／ｍｌ未満、８０ｐｇ／ｍｌ未満、７０ｐｇ／ｍｌ未満、６０ｐｇ／ｍｌ未満、５０ｐｇ／ｍｌ未満、４０ｐｇ／ｍｌ未満、３５ｐｇ／ｍｌ未満、３０ｐｇ／ｍｌ未満、２５ｐｇ／ｍｌ未満、２０ｐｇ／ｍｌ未満、１９ｐｇ／ｍｌ未満、１８ｐｇ／ｍｌ未満、１７ｐｇ／ｍｌ未満、１６ｐｇ／ｍｌ未満、１５ｐｇ／ｍｌ未満、１４ｐｇ／ｍｌ未満、１３ｐｇ／ｍｌ未満、１２ｐｇ／ｍｌ未満、１０ｐｇ／ｍｌ未満等を含みうる。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている具体的な検出方法の検出閾値は、サンプルにおいて検出できる抗原結合物質の最小モルで表してよく、このような検出閾値は、２００アトモル〜１００ゼプトモルの範囲であり得、例えば、２００アトモル、１９０アトモル、１８０アトモル、１７０アトモル、１６０アトモル、１５０アトモル、１４０アトモル、１３０アトモル、１２０アトモル、１１０アトモル、１００アトモル、９０アトモル、８０アトモル、７０アトモル、６０アトモル、５０アトモル、４０アトモル、３０アトモル、２０アトモル、１０アトモル、１アトモル、９００ゼプトモル、８００ゼプトモル、７００ゼプトモル、６００ゼプトモル、５００ゼプトモル、４００ゼプトモル、３５０ゼプトモル、３００ゼプトモル、２５０ゼプトモル、２００ゼプトモル、１９０ゼプトモル、１８０ゼプトモル、１７０ゼプトモル、１６０ゼプトモル、１５０ゼプトモル、１４０ゼプトモル、１３０ゼプトモル、１２０ゼプトモル、１１０ゼプトモル、１００ゼプトモル等を含むが、これらに限らない。
【００８９】
検出（増幅産物の定性的または定量的な測定を含んでも含まなくてもよい）の後、検出結果を評価して、抗原結合物質がサンプルに存在する可能性を割り出してもよい。このような評価を行う際には、いくつかのケースでは、対象の反応物を１つ以上のコントロール反応物または参照値と比較してもよい。本方法のコントロール反応物としては、ポジティブコントロール、例えば、関心対象の抗原結合物質を含むことが知られており、及び／または関心対象の抗原を既知量含むことが知られている反応物が挙げられる。コントロール反応物はまた、ネガティブコントロール、例えば、重要な試薬、例えば、抗原、ポリメラーゼ、重要なポリヌクレオチドなどを含まないことが知られている反応物も含みうる。検出反応結果と比較されうる参照値としては、事前に行った任意のコントロール反応から得られた参照測定値、コントロール反応から得られた検量線、ポジティブまたはネガティブコントロールから得られた一連の蛍光測定値、ユーザーが定めた参照値、メーカーから供給された参照値などが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、対象の反応の評価は、尺度、例えば、参照値の尺度との比較を含んでもよく、これを用いて、サンプルに存在する抗原結合物質の量を推定できる。
【００９０】
多重化
本明細書に記載されている方法によれば、サンプルにおける標的抗原結合物質の存在が容易にスクリーニングされる。この方法は、単一の標的抗原結合物質の検出と多重解析（サンプルにおいて、２つ以上の異なる標的抗原結合物質をアッセイする解析）に適する。後者の多重状況では、用いられうる異なるポリヌクレオチド結合抗原セットの数は典型的には、約２〜約２０以上、例えば、上限が１００以上、１０００以上などの範囲であり、例えば、２〜５０、２〜１００、１０〜１００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００などが挙げられるが、これらに限らない。一実施形態では、多重アッセイでは、一意的タグ化ポリヌクレオチドに結合した様々な異なる抗原を用いて、特定の一意的タグ化ポリヌクレオチドの増幅によって、増幅したタグ化ポリヌクレオチドの特定の抗原に対応する抗原結合物質の存在を示すようにしてよい。したがって、対象のアッセイでは、核酸のタグ付け及び／または「バーコード付加」法を用いて、サンプル中の複数の抗原結合物質の検出及び／または定量を可能にしうる。核酸バーコードで一意的にタグ付けされた異なる抗原であって、本明細書に記載されているような多重アッセイに含めてよい抗原の数は様々であり得、例えば、抗原結合ポリヌクレオチドにおいてバーコード用に利用可能なポリヌクレオチドの長さ、凝集アッセイ及び／またはポリヌクレオチド結合に悪影響を及ぼさずに反応物に存在し得る抗原濃度の物理的限界などによってのみ限定され得る。
【００９１】
したがって、いくつかのケースでは、単一の反応において、抗原結合物質のパネルをスクリーニングしてもよく、パネル上の各抗原結合物質の存在または量が評価されうる。二重アッセイにおける増幅産物の検出及び測定の際には、上記の検出方法を並列で用いてよい。いくつかのケースでは、多重アッセイ及び非多重アッセイのいずれにおいても、増幅産物の検出及び／または測定に、核酸シーケンシング方法を用いてよい。例えば、いくつかのケースでは、例えば、複数の増幅産物が産生された多重アッセイにおいて、定量的なシーケンシングを用いて、各増幅産物の相対的な量または存在を割り出して、高感度かつ高度に多重化された形で、単一のサンプル中の多くの異なる抗原結合物質を評価可能にしてもよい。
【００９２】
特定の実施形態では、本開示の多重アッセイをプール反応物において行って、複数のアンプリコンを形成させてよく、その後、形成されたアンプリコンを定量して、多重アッセイの個々の抗原結合物質の量を得てもよい。例えば、一実施形態では、１つ以上の抗原結合物質を含むかまたは含むと思われるサンプルに、複数の異なるポリヌクレオチド結合抗原を加えてもよい。そして、抗原の凝集と、（任意の選択肢としての架橋ポリヌクレオチドの使用による）ポリヌクレオチドのライゲーションにより、サンプルに存在する抗原結合物質に応じたアンプリコンが形成される。したがって、形成された各アンプリコンの相対量は、サンプル中の各抗原結合物質の相対量に対応するであろう。すなわち、形成されたアンプリコンの定量を通じて、各抗原結合物質を定量できる。
【００９３】
形成されたアンプリコンの定量は、任意の利便的な方法によって行ってよく、用いる具体的な方法は、検出する異なる抗原結合物質の数、所望の検出感度、所望の定量感度、所望の定量ダイナミックレンジなどに部分的に左右され得る。定量は、プール反応物で行ってよく、またはアンプリコン形成反応物を定量のために小分けにしてよい。例えば、いくつかのケースでは、アンプリコンを形成させてよいとともに、プールサンプルにおいて、例えば、アンプリコンの定量的なシーケンシングを通じて、定量を行ってよい。別のケースでは、アンプリコンを形成させてよいとともに、サンプルを小分けにして、例えば、アンプリコンにハイブリダイズするプライマーを用いたｑＰＣＲによって、各アンプリコンを個々に定量することによって、定量を行ってよい。
【００９４】
多重アッセイの一実施形態では、各抗原は、結合抗原に対して特有の配列と架橋ポリヌクレオチドのためのユニバーサルな配列とを含むポリヌクレオチドにコンジュゲートされる。その特有の配列は、プライマー結合部位であってもプライマー結合部位を含んでいてもよい。ユニバーサルな配列は、架橋ポリヌクレオチドの一部（半分を含む）に相補的であり、２つの抗原が凝集したら、２つの抗原結合ポリヌクレオチドのユニバーサルな配列に架橋ポリヌクレオチドが同時に結合できるほど、結合したポリヌクレオチドが近接して、２つの抗原結合ポリヌクレオチドがライゲーション可能になるようになっていてよい。続いて、特定の抗原のプライマー結合部位に特異的なプライマーセットをそれぞれ含むとともに、特定の抗原に対応する特異的アンプリコンに対してｑＰＣＲを実施可能にする個々の反応系に、ライゲーション反応によって形成された複数のアンプリコンを含むサンプルを分注してもよい。したがって、プールの特定の各アンプリコンの増幅を通じて、サンプルに元々存在する各抗原結合物質の量を割り出すことができる。
【００９５】
本開示の多重アッセイは、ポリヌクレオチド結合抗原のライブラリーを用いて行ってよい。このようなライブラリーは、スクリーニングする抗原の数及び／またはタイプに応じて様々であろう。したがって、いくつかのケースでは、本開示のライブラリーは、そのライブラリーに含まれるポリヌクレオチド結合抗原のタイプによって分類され得、例えば、病原体への感染に応じて宿主によって産生される抗体を検出するためのまたはさもなければ感染のバイオマーカーとして機能する様々な病原体抗原を含む病原体ライブラリー、自己免疫疾患の一部として対象によって産生される抗体を検出するためのまたはさもなければ、自己免疫疾患のバイオマーカーとして機能する様々な自己抗原を含む自己免疫ライブラリー、がんもしくは腫瘍の存在に応じて対象によって産生される抗体を検出するためのまたはさもなければ、がんのバイオマーカーとして機能する様々な抗原を含むがんライブラリー、加齢またはその他の神経障害により対象によって産生される抗体を検出するための様々なサイトカイン抗原を含むサイトカインライブラリー等を含む。ライブラリーにおける異なるポリヌクレオチド結合抗原の数は様々であり、１０個以下〜１０００個以上の範囲であり得、例えば、１０〜１０００個、２０〜１０００個、３０〜１０００個、４０〜１０００個、５０〜１０００個、６０〜１０００個、７０〜１０００個、８０〜１０００個、９０〜１０００個、１００〜１０００個、１００〜９００個、１００〜８００個、１００〜７００個、１００〜６００個、１００〜５００個、１００〜４００個、１００〜３００個、１００〜２００個、１０〜９００個、１０〜８００個、１０〜７００個、１０〜６００個、１０〜５００個、１０〜４００個、１０〜３００個、１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜１００個、３０〜１００個、４０〜１００個、５０〜１００個、６０〜１００個、７０〜１００個、８０〜１００個、９０〜１００個、１２個、２４個、３６個、４８個、９６個、３８４個等を含むが、これらに限らない。ライブラリーの異なるポリヌクレオチド抗原は、物理的に、例えば、別の容器もしくはマルチウェルプレートの別のウェルに分けてもよく、または物理的に分けなくてもよく、すなわち、単一の溶液、単一の容器などにプールしてもよい。
【００９６】
いくつかのケースでは、ポリヌクレオチド結合抗原のライブラリーは、各抗原から定量するために、プライマー、例えば、プライマー対の対応するライブラリーを含んでよい。一実施形態では、ポリヌクレオチド結合抗原のプールライブラリーは、各抗原の特有のアンプリコンを特異的に増幅して定量するために、対応するプライマー対ライブラリーを有するであろう。いくつかのケースでは、このようなプライマーライブラリーは、マルチウェルプレートの個々のウェル中にプライマー対をそれぞれ含んでもよく、それにより、各ウェルが、ライゲーション反応のアリコートを各ウェルに加えた際の、特定の抗原に特異的な特定のアンプリコンの増幅及び定量用に構成される。すなわち、ライブラリーの各アンプリコン／抗原の定量によって、最初のサンプルに存在することを検出するようにライブラリーが構成されている各抗体の量を割り出すことができる。例えば、いくつかのケースでは、１２個の異なるポリヌクレオチド結合抗原を有するライブラリーは、対応する１２ウェルのプライマーライブラリーを有し、その各ウェルは、１２個の抗原のうちの１つに特異的なアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対を含む。別のケースでは、２４個の異なるポリヌクレオチド結合抗原を有するライブラリーは、対応する２４ウェルのプライマーライブラリーを有し、その各ウェルは、２４個の抗原のうちの１つに特異的なアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対を含む。さらに別のケースでは、４８個の異なるポリヌクレオチド結合抗原を有するライブラリーは、対応する４８ウェルのプライマーライブラリーを有し、その各ウェルは、４８個の抗原のうちの１つに特異的なアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対を含む。さらに別のケースでは、９６個の異なるポリヌクレオチド結合抗原を有するライブラリーは、対応する９６ウェルのプライマーライブラリーを有し、その各ウェルは、９６個の抗原のうちの１つに特異的なアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対を含む。別のケースでは、３８４個の異なるポリヌクレオチド結合抗原を有するライブラリーは、対応する３８４ウェルのプライマーライブラリーを有し、その各ウェルは、３８４個の抗原のうちの１つに特異的なアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対を含む。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチド結合抗原ライブラリーは、プライマー対のマルチウェルプレートに供給された対応するプライマー対よりもよりも多い抗原を有し、これは、例えばプライマーライブラリーが、抗原ライブラリーのアンプリコンのすべての増幅を可能にするためにプライマー対の多数のプレートを含む場合を含む。
【００９７】
本開示のライブラリーは、本明細書に記載されているような方法のすべてまたは一部を行うための１つ以上の追加の試薬（例えば、ライゲーション、増幅、検出などのための追加の試薬を含む）も含んでよい。いくつかのケースでは、追加の試薬は、プールライブラリーに含まれていてよい。例えば、いくつかのケースでは、ライゲーションのための試薬、例えばリガーゼは、ポリヌクレオチド結合抗原のプールライブラリー内に含まれていてよい。いくつかのケースでは、追加の試薬は、マルチウェルプレートの個々のウェルに含まれていてよい。例えば、いくつかのケースでは、増幅のための試薬、例えばポリメラーゼ、ｄＮＴＰなどは、マルチウェルプレートプライマーライブラリーのウェル内に含まれていてよい。記載されているようなライブラリーには、適切なバッファー、塩などが含まれていても含まれていなくてもよい。いくつかのケースでは、ライブラリー及び／またはその成分、例えばプライマーライブラリーは、凍結乾燥形態で供給してよいとともに、使用時に再水和してよい。
【００９８】
有用性
本明細書に記載されている方法及び組成物には、サンプルに存在する抗原結合物質の検出及び／または定量において、特定の有用性がある。このような検出では、様々な技術分野において様々な用途を見出すことができ、例えば、基礎科学的研究（例えば、生物医学研究、生化学研究、免疫学研究、分子生物学研究、微生物学研究、細胞生物学研究、遺伝学など）、医学及び／または薬学研究（例えば、創薬研究、薬剤設計研究、薬剤開発研究、薬理学、毒物学、医薬品化学、前臨床研究、臨床研究、オーダーメイド医療など）、医療、疫学、公衆衛生、バイオテクノロジー、畜産学、獣医学、農学、材料科学、分子検出、分子診断学などが挙げられるが、これらに限らない。
【００９９】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法は、対象から得た生体サンプル中の抗原結合物質の検出での用途が見出されている。「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト、家畜、ペット、実験動物、バイオプロダクション動物（例えば、バイオプロダクト、例えば、抗体を生成させるのに用いる動物）などを含む動物を指す。いくつかのケースでは、サンプルは、哺乳動物の対象に由来する（例えば、哺乳動物の組織、哺乳動物の細胞、哺乳動物の体液、哺乳動物の排出体液、哺乳動物の半固体分泌物などを含む）。
【０１００】
このようなサンプルの由来元であってよい関心対象の哺乳動物としては、例えば、ヒト、有蹄動物（例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギ、ウマ、ラクダまたは広くは有蹄家畜などのいずれかの種または亜種）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、ネコ、イヌ、霊長類動物などが挙げられるが、これらに限らない。
【０１０１】
いくつかのケースでは、サンプルは、ヒト以外の動物に由来してよく、ヒト以外の哺乳動物が挙げられるが、これに限らない。サンプルの由来元であってよいヒト以外の哺乳動物としては、上に列挙されているものが挙げられるが、これらに限らない。サンプルの由来元であってよいヒト以外の動物としては、上に列挙されているものと、加えて、例えば、鳥類（すなわち、例えば、ニワトリ、カモなどのトリ）、両生動物（例えば、カエル）、魚類などが挙げられるが、これらに限らない。
【０１０２】
いくつかのケースでは、対象が特定の状態にあるか評価するために、本明細書に記載されている方法を用いて、ヒトに由来するサンプル中の抗原結合物質の存在を検出したり、及び／またはその量を測定したりする。このようなケースでは、対象に由来する抗原結合物質は概して、単特異性抗原結合物質、例えば、単特異性抗体（例えば、単特異性ポリクローナル抗体を含む）であろう。ヒトまたはヒト以外の対象において測定する単特異性抗体は、疾患抗原に対する単特異性を有する抗体であってよく、その疾患抗原は、宿主に対して内因性（すなわち、宿主由来の抗原、すなわち自己抗原）であってよく、または、宿主に対して外因性（すなわち、非宿主由来の抗原または感染病原体由来の抗原）であってよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、例えば、対象の状態を、存在の判断または鑑定の形で、及びいくつかのケースでは診断の形で評価し、ある状態である対象に対する療法を決定し、ある状態である対象をモニタリングするなどのために使用される。いくつかのケースでは、本明細書に記載されているような方法を用いて対象の状態を評価することは、技術者による対象の現在の健康状態の評価、すなわち、対象の予後の「診断評価」、すなわち、考え得る治療レジメンの「予後評価」、すなわち、「治療評価」及び／または療法への応答性、すなわち、「予後評価」を含む報告書を作成することを含む。したがって、本方法はさらに、診断評価、予後評価、治療評価またはモニタリング評価、及びこれらを組み合わせたものの結果を示す報告を作成または出力する工程を含んでよく、その報告は、電子媒体の形態（例えば、コンピューターモニターへの電子表示）または有形媒体の形態（例えば、紙もしくはその他の有形媒体に印刷した報告書）で提供することができる。
【０１０４】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されているような評価は、例えば、治療の有効性を評価するか、最も良い治療タイミングを割り出すか、または治療の修正が必要か判断するために、治療レジメンの一部として行う。例えば、いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法に従って、治療前サンプルを採取して評価してよく、その評価から、治療プロトコールを選択する。別のケースでは、治療の有効性を評価するために、治療後サンプルを採取して、本明細書に記載されている評価に従って、治療前サンプルと比較する。別のケースでは、追加療法のタイミングの最良な判断をするために、１回以上の治療後評価を行う。
【０１０５】
本明細書に記載されている検出方法の対象となる状態（ヒト及びヒト以外の動物の状態を含む）としては、対象の免疫系及び／または免疫応答に関わる状態が挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、対象の状態は、病原体由来（例えば、感染）であってよく、別のケースでは、対象の状態は、対象由来（例えば、自己免疫疾患）であってよく、いくつかのケースでは、状態の由来元は不明であってよい。
【０１０６】
感染状態は、本明細書で使用する場合、様々であり得、宿主生物に外来抗原が存在するいずれかの状態を含み、一般的な感染症、新興感染症、症候性感染、無症候性感染などが挙げられるが、これらに限らない。感染状態の非限定例としては、ここで列挙するものが挙げられるが、これらに限らず、それらは、その状態を引き起こす例示的な病原体とともに示されている。例えば、アシネトバクター感染（アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ））、放線菌症（アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス・ゲレンセリアエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｒｅｎｃｓｅｒｉａｅ）及びプロピオニバクテリウム・プロピニクス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ））、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症）（トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ））、エイズ（後天性免疫不全症候群）（ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス））、アメーバ赤痢（エントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、アナプラズマ病（アナプラスマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属）、炭疽（バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム感染（アルカノバクテリウム・ヘモリティクム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ））、アルゼンチン出血熱（フニンウイルス）、回虫症（アスカリス・ルンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス症（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属）、アストロウイルス感染（アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ））、バベシア症（バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属）、バシラス・セレウス感染（バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ））、細菌性肺炎（多数の細菌）、細菌性腟炎（ＢＶ）（多数の細菌）、バクテロイデス感染（バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属）、バランチジウム症（バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ））、バイリサスカリス感染（バイリサスカリス（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ）属）、ＢＫウイルス感染（ＢＫウイルス）、黒色砂毛症（ピエドライア・ホルタエ（Ｐｉｅｄｒａｉａ  ｈｏｒｔａｅ））、ブラストシスチス・ホミニス感染（ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ））、ブラストミセス症（ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ））、ボリビア出血熱（マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ）ウイルス）、ボレリア感染（ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属）、ボツリヌス症（及び乳児ボツリヌス症）（クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、ブラジル出血熱（Ｓａｂｉａ）、ブルセラ症（ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属）、腺ペスト（エンテロバクテリアセエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌）、バークホルデリア感染（通常、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）及びその他のバークホルデ���ア属種）、ブルーリ潰瘍（マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ））、カリシウイルス感染（ノロウイルス及びサポウイルス）（カリチウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ））、カンピロバクター症（カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属）、カンジダ症（モニリア症、鵞口瘡）（通常、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）及びその他のカンジダ属種）、猫ひっかき病（バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ））、蜂巣炎（通常、Ａ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症）（トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ））、軟性下疳（ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ））、水痘（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、チクングンヤ熱（アルファウイルス）、クラミジア感染症（クラミジア・トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、クラミドフィラ・ニューモニア感染（台湾急性呼吸器因子またはＴＷＡＲ）（クラミドフィラ・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、コレラ（ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、クロモブラストミコーシス（通常、フォンセカエ・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｐｅｄｒｏｓｏｉ））、肝吸虫症（クロノルチス・シネンシス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、クロストリジウム・ディフィシレ感染（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、コクシジオイド症（コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）及びコクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ））、コロラドダニ熱（ＣＴＦ）（コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ））、感冒（急性ウイルス性鼻咽頭炎、急性コリーザ）（通常、ライノウイルス及びコロナウイルス）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）（ＰＲＮＰ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）、クリプトコックス症（クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、クリプトスポリジウム症（クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属）、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）（通常、アンシロストーマ・ブラジリエンス（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、多数のその他の寄生虫）、シクロスポラ症（サイクロスポーラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ））、嚢虫症（タエニア・ソリウム（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ））、サイトメガロウイルス感染（サイトメガロウイルス）、デング熱（デングウイルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３及びＤＥＮ−４）−フラビウイルス）、Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ感染（緑藻類のデスモデスムス・アルマトゥス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ））、二核アメーバ症（ジエントアメーバ・フラギリス（Ｄｉｅｎｔａｍｏ���ｂａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ））、ジフテリア（コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、裂頭条虫症（ジフィロボトリウム（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ））、メジナ虫症（トラクンクルス・メジネシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ））、エボラ出血熱（エボラウイルス（ＥＢＯＶ））、エキノコックス症（エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属）、エーリキア症（エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属）、ぎょう虫症（ぎょう虫感染）（エンテロビウス・ベルミクラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ））、エンテロコッカス感染（エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属）、エンテロウイルス感染（エンテロウイルス属）、発疹チフス（リケッチア・プロバゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ））、伝染性紅斑（第五病）（パルボウイルスＢ１９）、突発性発疹（第六病）（ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７））、肥大吸虫症（ファスシオロプシス・ブスキ（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｂｕｓｋｉ））、肝蛭症（ファスシオラ・ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）及びファスシオラ・ギガンチア（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ））、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（ＰＲＮＰ）、フィラリア症（フィラリア上科（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ））、スロストリジウム・ペルフリンゲンスによる食中毒（スロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、自由生活アメーバ感染（多数の病原体）、フゾバクテリウム感染（フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属）、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死）（通常、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、その他のクロストリジウム属種）、ゲオトリクム症（ゲオトリクム・カンジウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ））、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）（ＰＲＮＰ）、ジアルジア症（ギアルディア・インテスティナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ））、鼻疽（バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ））、顎口虫症（グナトストーマ・スピニゲルム（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ  ｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ）及びグナトストーマ・ヒスピドゥム（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ  ｈｉｓｐｉｄｕｍ））、淋病（ナイセリア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、鼡径部肉芽腫（ドノヴァン症）（クレブシエラ・グラヌロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ））、Ａ群連鎖球菌感染（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、Ｂ群連鎖球菌感染（ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ヘモフィルス・インフルエンザエ感染（ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、手足口病（ＨＦＭＤ）（エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１））、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）（シンノンブルウイルス）、ハートランドウイルス疾患（ハートランドウイルス）、ヘリコバクター・ピロリ感染（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、０１１１及びＯ１０４：Ｈ４）、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）（ブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科）、Ａ型肝炎（Ａ型肝炎ウイルス）、Ｂ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルス）、Ｃ型肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｄ型肝炎（Ｄ型肝炎ウイルス）、Ｅ型肝炎（Ｅ型肝炎ウイルス）、単純ヘルペス（単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２））、ヒストプラスマ症（ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））、鉤虫感染（アンシロストーマ・ドゥオデナレ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）及びネカトル・アメリカヌス（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ））、ヒトボカウイルス感染（ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ））、ヒトエウィンギイエールリヒア症（エールリヒア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ））、ヒト顆粒球性アナプラズマ病（ＨＧＡ）（アナプラスマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ））、ヒトメタニューモウイルス感染（ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ））、ヒト単球性エールリヒア症（エールリヒア・カフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、ヒトパラインフルエンザウイルス感染（ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ））、膜様条虫症（ヒメノレピス・ナナ（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）及びヒメノレピス・ジミヌタ（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ））、エプスタイン・バーウイルス感染性単核球症（Ｍｏｎｏ）（エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））、インフルエンザ（フルー）（オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ））、イソスポーラ症（イソスポラ・ベリイ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ））、川崎病（未知の病原体）、角膜炎（多数の病原体）、キンゲラ・キンガエ感染（キンゲラ・キンガエ（Ｋｉ
ｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ））、クールー（ＰＲＮＰ）、ラッサ熱（ラッサウイルス）、レジオネラ症（レジオネラ病）（レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、レジオネラ症（ポンティアック熱）（レジオネラ・ニューモフィラ）、リーシュマニア症（リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属）、ハンセン病（マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・レプロマトーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ））、レプトスピラ症（レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属）、リステリア症（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、ライム病（ライムボレリア症）（通常、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）及びその他のボレリア属種）、リンパ性フィラリア症（象皮病）（ウケレリア・バンクロフチ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）及びブルギア・マライ（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ））、リンパ球性脈絡髄膜炎（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））、マラリア（プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属）、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ）（マールブルグウイルス）、麻疹（麻疹ウイルス）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）（中東呼吸器症候群コロナウイルス）、類鼻疽（ホイットモア病）（バークホルデリア・プセウドマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、髄膜炎（多数の病原体）、髄膜炎菌性疾患（ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、横川吸虫症（通常、メタゴニムス・ヨカガワイ（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ  ｙｏｋａｇａｗａｉ））、微胞子虫症（ミクロスポリジア・フィルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ  ｐｈｙｌｕｍ））、伝染性軟属腫（ＭＣ）（伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、サル痘（サル痘ウイルス）、ムンプス（ムンプスウイルス）、発疹熱（地方性発疹チフス）（リケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ））、肺炎マイコプラスマ（マイコプラスマ・ニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、マイセトーマ（多くの種の細菌（アクチノミセトーマ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｍａ））及び真菌（ユーミセトーマ（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｍａ）））、ハエウジ症（寄生性双翅目ハエ幼虫）、新生児結膜炎（新生児眼炎）（最も一般的には、クラミジア・トラコーマティス及びナイセリア・ゴノルロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、ノカルジア症（通常、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）及び他のノカルディア属種）、オンコセルカ症（河川盲目症）（オンコセルカ・ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ））、パラコクシジオイド症（南アメリカブラストミセス症）（パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、肺吸虫症（通常、パラゴニムス・ウェステルマニ（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）及び他のパラゴニムス属種）、パスツレラ症���パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属）、病原性腸疾患（例えば、腸内細菌の病原性株（例えば、病原性クロストリジウム・ディフィシレ、病原性サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、病原性バシラス・セレウス、病原性ヘリコバクター・ピロリ、病原性カンピロバクターなどを原因とするものを含む）、アタマジラミ寄生症（アタマジラミ）（ペディクルス・ヒューマヌス・カピティス（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ））、コロモジラミ寄生症（ヒトジラミ）（ペディクルス・ヒューマヌス・コルポリス（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ））、ケジラミ寄生症（ケジラミ）（フィチルス・プビス（Ｐｈｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ））、骨盤腹膜炎（ＰＩＤ）（多数の病原体）、百日咳（ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、ペスト（エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ））、肺炎球菌感染（ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）（ニューモシスチス・ジロヴェシイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ））、肺炎（多数の病原体）、ポリオ（ポリオウイルス）、プレボテラ感染（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属）、原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）（通常、ナエグレリア・フォウレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ））、進行性多巣性白質脳症（ＪＣウイルス）、オウム病（クラミドフィラ・プシタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ））、Ｑ熱（コキシエラ・ブルネティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ））、狂犬病（狂犬病ウイルス）、鼠咬熱（ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）またはスピリルム・ミヌス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｉｎｕｓ））、呼吸器合胞体ウイルス感染（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、リノスポリジウム症（リノスポリジウム・セーベリー（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｅｂｅｒｉ））、ライノウイルス感染（ライノウイルス）、リケッチア感染（リケッチア属）、リケッチア痘（リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ））、リフトバレー熱（ＲＶＦ）（リフトバレー熱ウイルス）、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）（リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ））、ロタウイルス感染（ロタウイルス）、風疹（風疹ウイルス）、サルモネラ症（サルモネラ属）、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）（ＳＡＲＳコロナウイルス）、疥癬（サルコプテス・スカビエイ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ））、住血吸虫症（シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属）、敗血症（多数の病原体、例えば、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）を含む）、細菌性赤痢（シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属）、帯状疱疹（帯状ヘルペス）（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、天然痘（痘瘡）（バリオラ・メジャー（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）またはバリオラ・マイナー（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍｉｎｏｒ））、スポロトリクス症（スポロトリクス・シェ���キイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ））、ブドウ球菌性食中毒（スタフィロコッカス属）、ブドウ球菌感染（スタフィロコッカス属）、糞線虫症（ストロンギロイデス・ステルコラリス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ））、亜急性硬化性全脳炎（麻疹ウイルス）、梅毒（トレポネーマ・パルリドゥム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ））、条虫症（Ｔａｅｎｉａ属）、破傷風（開口障害）（クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ））、須毛白癬（床屋疹しん）（通常、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属）、頭部白癬（通常、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ））、体部白癬（通常、トリコフィトン属）、股部白癬（いんきんたむし）（通常、エピデルモフィトン・フロコッスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）及びトリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ））、手白癬（トリコフィトン・ルブルム）、黒癬（通常、ホルテア・ウェルネッキイ（Ｈｏｒｔａｅａ  ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ））、足白癬（水虫）（通常、トリコフィトン属）、爪白癬（爪甲真菌症）（通常、トリコフィトン属）、癜風（なまず）（マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属）、トキソカラ症（眼幼虫移行症（ＯＬＭ））（トキソカラ・カニス（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）またはトキソカラ・カチ（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｔｉ））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症（ＶＬＭ））（トキソカラ・カニスまたはトキソカラ・カチ）、トラコーマ（クラミジア・トラコーマティス）、トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ））、旋毛虫症（トリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ））、トリコモナス症（トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ））、鞭虫症（鞭虫感染）（トリチュリス・トリチュラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ））、結核（通常、マイコバクテリウム・ツーベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、ツラレミア（フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））、腸チフス（サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ、血清型チフィ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム感染（ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ））、渓谷熱（コッシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）またはコッシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ））、ベネズエラ馬脳炎（ベネズエラ馬脳炎ウイルス）、ベネズエラ出血熱（グアナリトウイルス）、ウイルス性肺炎（多数のウイルス）、西ナイル熱（西ナイルウイルス）、白色砂毛（トリコスポロン・ベイゲリイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ））、エルシニア・シュードツベルクローシス感染（エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂ��ｒｃｕｌｏｓｉｓ））、エルシニア症（エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ））、黄熱（黄熱ウイルス）、ジカウイルス疾患（ジカウイルス）、接合真菌症（ムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の系統（ムコール症）及びエントモフィトラレス（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｌｅｓ）の系統（エントモフトラ症））などである。概して本明細書では、記載されている方法による、感染状態の検出は、病原体由来抗原に対する１つ以上の抗原結合物質（例えば、宿主由来抗体）であって、宿主に由来するサンプルに存在する抗原結合物質を検出することによって、感染に対する宿主免疫応答を検出することを含む。
【０１０７】
したがって、いくつかのケースでは、本発明の方法には、対象由来のサンプルまたはその他のタイプのサンプル中の病原体に対する１つ以上の抗体またはその成分の存在を検出することによって、対象由来のサンプルまたはその他のタイプのサンプル中の病原体の存在を検出する用途を見出すことができる。本発明の方法に従って検出されうる病原体としては、例えば、ウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体、原虫病原体などが挙げられるが、これらに限らない。容易に分かるように、新たに発見された病原体がサンプル内に存在することは、本開示の１つ以上の実施形態に従って、ポリヌクレオチドコンジュゲート抗原として使用するために、抗原成分を病原体から単離することによってアッセイされうる。
【０１０８】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法は、ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶ１抗原、ＨＩＶ２抗原、ＨＩＶ１／２抗原、ｐ２４、ｇｐｌ２０、ｇｐｌ６０、ｇｐ４１、ｇｐ３６などが挙げられるが、これらに限らない）に対する抗体の存在を検出及び／または測定するであろう。
【０１０９】
自己免疫状態は、本明細書で使用する場合、様々であり得、対象自体の免疫細胞が、健常な組織を攻撃したり、及び／または対象が、対象由来の抗原に対して免疫応答を起こしたりするあらゆる状態を含み、症候性自己免疫疾患、無症候性自己免疫疾患、急性自己免疫疾患、慢性自己免疫疾患、移植誘発性自己免疫疾患などが挙げられるが、これらに限らない。理論に拘束されるものではないが、いくつかのケースでは、自己免疫疾患は、外来物質の存在によって誘発され得るが、活性化した免疫応答は、その外来物質に対して特異的に向けられるとは限らない。概して自己免疫状態の影響を受ける、体の区域としては、例えば、血管、結合組織、内分泌組織（例えば、甲状腺組織、膵臓組織など）、関節組織、筋肉組織、造血組織（例えば、赤血球などを含む）、上皮組織（例えば、皮膚及び消化管を含む）が挙げられるが、これらに限らない。自己免疫状態及び自己免疫関連の状態の非限定例としては、例えば、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂質血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索ニューロパチー、神経ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前は「ウェゲナー」肉芽腫症と呼ばれていた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本病、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型自己免疫性多腺性疾患、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、脈管炎、水疱性皮膚病、白斑、ウェゲナー肉芽腫症（現在は、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）という）などが挙げられるが、これらに限らない。概して本明細書では、記載されている方法に従って自己免疫状態を検出することは、対象由来の抗原に対する１つ以上の抗原結合物質（例えば、対象由来の自己免疫抗体）であって、対象に由来するサンプルに存在する抗原結合物質を検出することによって、対象の自己免疫応答を検出することを含む。いくつかのケースでは、特定の自己免疫疾患は、多数の異なる自己抗体の存在によって特徴付けられ得、したがって、本明細書に記載されているような、検出の多重化方法を用いて、自己免疫関連自己抗体のパネルのレベルを検出または測定してもよい。
【０１１０】
本開示の方法には、１つ以上の臨床的に関連する自己抗体（例えば、新生物に対して対象が産生する１つ以上の自己抗体が挙げられるがこれに限らない）を検出する用途を見出すことができ、例えば、その新生物が、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、肝臓がん及び甲状腺がんのうちの１つ以上である場合が挙げられるが、これらに限らない。特定のケースでは、検出は、疾患の症状の存在前に行ってよい。別のケースでは、検出は、疾患の症状の存在後（例えば、１つ以上の疾患の症状の出現後であるが、治療前、治療中、治療後、またはこれらの組み合わせを含む）に行ってよい。
【０１１１】
有用な自己抗体は、がん自己抗体（すなわち、がんの存在を示す抗体）を含みうる。がんの存在を特定または予測できるがん自己抗体は、例えば、前立腺がん自己抗体（例えば、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）、ブロモドメイン含有２（ＢＲＤ２）、カルデスモン１（ＣＡＬＤ１）、真核生物翻訳開始因子４γ１（ＥＩＦ４Ｇ１）、カリクレイン−３（ＫＬＫ３）、ニューヨーク食道扁平上皮細胞癌１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、パーキンソン病タンパク質７（ＰＡＲＫ７）、ＰＣ４及びＳＦＲＳ１相互作用タンパク質１（ＰＳＩＰ１）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２２（ＲＰＬ２２）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲＤＢＰ）、トランスフェリンレセプター（ＴＦＲＣ）、タリン１（ＴＬＮ１）、Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ｂ（ＸＡＧＥ１Ｂ）などの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）、乳がん自己抗体（例えば、α２−ＨＳ糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、ＡＳＢ９アンキリンリピート及びＳＯＣＳボックス含有９（ＡＳＢ９）、早期発症型乳がん１（ＢＲＣＡ１）、早期発症型乳がん２（ＢＲＣＡ２）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）遺伝子、真核生物伸長因子−２キナーゼ（ＥＥＦ２Ｋ）、ｅｒｂ−ｂ２レセプターチロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｍｙｃ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サイクリン依存性キナーゼインヒビター２Ａ（ｐｌ６）、ＰＡＲＫ７、ＲＥＬＴ腫瘍壊死因子レセプター、セリン活性部位含有１（ＳＥＲＡＣ１）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）などの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）、肺がん自己抗体（例えば、アネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）、がん抗原１（ＣＡＧＥ１）、ＣＥＡＣＡＭ遺伝子、エノラーゼ１（ＥＮＯｌ）、ＥＲＢＢ２、ＧＢＵ４−５、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＭＵＣ１、Ｍｙｃ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ホスホグリコレートホスファターゼ（ＰＧＰ）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）、ＴＰ５３、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質θ（ＹＷＨＡＱ）などの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）、大腸がん自己抗体（例えば、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、ＣＥＡＣＡＭ遺伝子、ＧＲＰ、ＨＳＰ６０、ＩＭＰ（イノシン５’−モノホスフェート）デヒドロゲナーゼ１（ＩＭＰＤＨ１）、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＫＯＣ）、ムチン５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）、Ｍｙｃ、ヌクレオビンディン１（ＮＵＣＢ１）、ヌクレオポリン６２ｋＤａ（ＮＵＰ６２）、ｐｌ６、Ｆａｓ（ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー６）（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＴＰ５３などの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）、胃がん自己��体（例えば、ＣＥＡＣＡＭ遺伝子、ＧＲＰ、ＭＵＣ１、ＴＰ５３などの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）、肝臓がん自己抗体（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＤＣＰ）、ＤＥＡＤ−ボックスヘリカーゼ３、Ｘ連鎖（ＤＤＸ３Ｘ）、ＥＥＦ２Ｋ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、甲状腺癌、ヒュルトレ細胞（ＨＣＣ）、不均一核内リボ核酸タンパク質Ａ２（ＨＮＲＮＰＡ２）、ＨＳＰ７０、ＮＵＰ６２、ポリシスチン１、一過性レセプター電位チャネル相互作用（ＰＢＰ）、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ）、ＳＯＤ２、ＴＰ５３、ＴＰＩなどの遺伝子産物に特異的に結合するバイオマーカー自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）などを含みうるが、これらに限らない。したがって、いくつかのケースでは、本開示の対象は、がんである対象、がんの疑いのある対象及び／またはがん治療を受けたことがあるかもしくは受けている対象を含み得、がんとしては、例えば、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、肝臓がんなどが挙げられるが、これらに限らない。
【０１１２】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、１つ以上の腫瘍随伴症候群（すなわち、体内のがんによって生じるが、がん細胞の局在によるものではない症候群）を有しうるかまたはその疑いがありうる。腫瘍随伴症候群としては、例えば、内分泌腫瘍随伴症候群（例えば、クッシング症候群、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高カルシウム血症、低血糖症、カルチノイド症候群、多血症、高アルドステロン症などを含む）、神経学的腫瘍随伴症候群（例えば、ランバート・イートン無筋力症症候群（ＬＥＭＳ）、傍腫瘍性小脳変性症、脳脊髄炎、辺縁系脳炎、脳幹脳炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調症候群、抗ＮＭＤＡレセプター脳炎、多発性筋炎などを含む）、皮膚粘膜腫瘍随伴症候群（例えば、黒色表皮症、皮膚筋炎、レーザー・トレラー徴候、壊死融解性移動性紅斑、スイート症候群、葉状皮膚乳頭腫症、壊疽性膿皮症、後天性汎発性多毛症などを含む）、血液学的腫瘍随伴症候群（例えば、顆粒球増加症、多血症、トルソー徴候、非細菌性血栓性心内膜炎、貧血などを含む）、膜性糸球体腎炎、腫瘍性骨軟化症、シュタウファー症候群、腫瘍性熱などが挙げられるが、これらに限らない。したがって、本発明の方法は、例えば、対象における自己抗体の検出によって、１つ以上の腫瘍随伴症候群もしくは腫瘍随伴症候群と関連する新生物が対象に存在することを特定しうるか、またはこの存在を予測しうる。
【０１１３】
いくつかのケースでは、本開示の方法は、皮膚筋炎と関連する自己抗体（例えば、ＭＯＲＣファミリーＣＷ型ジンクフィンガー３（ＮＸＰ２）、３連モチーフ含有３３（ＴＩＦ１γ）、低分子ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＳＡＥ）などの１つ以上の遺伝子産物に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１４】
いくつかのケースでは、本開示の方法は、全身性硬化症と関連する自己抗体（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに対する自己抗体が挙げられるが、これに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１５】
いくつかのケースでは、本開示の方法は、ランバート・イートン無筋力症症候群と関連する自己抗体（電位依存性カルシウムチャネル遺伝子の１つ以上の遺伝子産物に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１６】
いくつかのケースでは、本開示の方法は、重症筋無力症と関連する自己抗体（タイチン、リアノジンレセプターなどの１つ以上の遺伝子産物に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１７】
）いくつかのケースでは、本開示の方法は、腫瘍随伴性天疱瘡と関連する自己抗体（デスモプラキンＩ、デスモプラキンＩＩ、エンボプラキン、プレクチン、ペリプラキンなどの１つ以上の遺伝子産物に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１８】
いくつかのケースでは、本開示の方法は、腫瘍随伴性神経疾患と関連する自己抗体（Ｈｕ（抗神経自己抗体１（ＡＮＮＡ１）、Ｙｏ（プルキンエ細胞細胞質抗体タイプ１（ＰＣＡ−１））、Ｒｉ（抗神経自己抗体２（ＡＮＮＡ２）、Ｍａ１／２（腫瘍随伴性抗原Ｍａ１／２  ＰＮＭＡ１／２）、ＣＶ２（ＣＶ２／ＣＲＭＰ５−Ａｂ）、アンフィファイシン、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）ボックス１（ＳＯＸ１）、Ｚｉｃファミリーメンバー４（Ｚｉｃ４）、Ｔｒ（Δ／Ｎｏｔｃｈ様上皮細胞成長因子関連レセプター（ＤＮＥＲ））、タンパク質キナーゼＣγ（ＰＫＣγ）、ＣＡＲＰＶＩＩ、Ｃａ／ＡＲＨＧＡＰ２６などの１つ以上の遺伝子産物／抗原に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含む。
【０１１９】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、神経障害であるか、神経障害の疑いがあるか、または神経障害の治療をしている対象を含み得、神経障害としては、例えば、自己免疫成分による神経障害（例えば、神経炎症疾患、炎症性神経筋疾患など）が挙げられ、例えば、重症筋無力症、多発性硬化症などが挙げられるが、これらに限らない。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、神経障害と関連する自己抗体（例えば、電位依存性カリウムチャネル複合体（例えば、ＶＧＫＣ、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２など）の成分に結合する自己抗体、ＮＭＤＡレセプター（例えば、ＮＲ２）に結合する自己抗体、ＡＭＰＡレセプターに結合する自己抗体、ＧＡＢＡＡ／Ｂレセプターに結合する自己抗体、ジペプチジルペプチダーゼ様タンパク質−６（ＤＰＰＸ）に結合する自己抗体、ＩｇＬＯＮ５に結合する抗体、重症筋無力症の病原性成分に結合する自己抗体、または概して重症筋無力症と関連する自己抗体（例えば、抗アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）抗体、抗筋性特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）抗体、抗リポタンパク関連タンパク質（ＬＲＰ）４、アグリンに対する抗体、コルタクチンに対する抗体などが挙げられるが、これらに限らない）、多発性硬化症の病原性成分に結合する自己抗体または概して多発性硬化症と関連する自己抗体（例えば、抗アクアポリン４抗体、抗ミエリン抗体（抗ＭＯＧ、抗ＭＢＰなど）、抗ＫＩＲ４．１抗体、抗ＳＰＡＧ１６抗体などが挙げられる）が挙げられるが、これらに限らない）の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２０】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、胆汁性肝硬変であるか、胆汁性肝硬変の疑いがあるか、または胆汁性肝硬変の治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上の胆汁性肝硬変関連抗体（例えば、抗Ｍ２ミトコンドリア抗体が挙げられるが、これに限らない）の検出または測定を通じて、胆汁性肝硬変の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２１】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、自己免疫性リウマチ性疾患であるか、自己免疫性リウマチ性疾患の疑いがあるか、または自己免疫性リウマチ性疾患の治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上の自己免疫性リウマチ性疾患関連抗体（例えば、抗核抗体、抗ＳＳＡ自己抗体（抗シェーグレン症候群関連抗原Ａ）、抗シェーグレン症候群タイプＢ（ＳＳＢ）抗体、抗スミス抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗リン脂質抗体、抗シトルリン化タンパク質抗体などが挙げられるが、これらに限らない）の検出または測定を通じて、自己免疫性リウマチ性疾患の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２２】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、特発性炎症性筋疾患（ＩＩＭ）（別個に、多発性筋炎（ＰＭ）及び皮膚筋炎（ＤＭ）ともいう）であるか、ＩＩＭの疑いがあるか、またはＩＩＭの治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上のＩＩＭ関連抗体（例えば、抗Ｊｏ−１抗体、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ自己抗体（例えば、Ｊｏ−１（ヒスチジル）抗体、ＰＬ−７（スレオニル）抗体、ＰＬ−１２（アラニル）抗体、ＯＪ（イソロイシル）抗体、ＥＪ（グリシル）抗体、ＫＳ（アスパラギニル）抗体、Ｚｏ（フェニルアラニル）抗体及びＨａ（チロシル）抗体など）、抗Ｍｉ−２抗体、抗ＭＤＡ５抗体、抗ＮＸＰ２抗体、抗ＳＡＥ抗体、ならびに抗ＴＩＦ１γ（ｐ１５５／１４０）抗体などが挙げられるが、これらに限らない）の検出または測定を通じて、ＩＩＭの存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２３】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、非炎症性筋壊死であるか、非炎症性筋壊死の疑いがあるか、または非炎症性筋壊死の治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上の非炎症性筋壊死関連抗体（例えば、抗３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）抗体が挙げられるが、これらに限らない）の検出または測定を通じて、非炎症性筋壊死の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２４】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、全身性硬化症及び混合性結合組織病であるか、全身性硬化症及び混合性結合組織病の疑いがあるか、または全身性硬化症及び混合性結合組織病の治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上の全身性硬化症または混合性結合組織病関連抗体（例えば、抗ＰＭ−Ｓｃｌ抗体、抗Ｋｕ抗体及び抗Ｕ１ＲＮＰ抗体などが挙げられるが、これらに限らない）の検出または測定を通じて、全身性硬化症及び／または混合性結合組織病の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２５】
いくつかのケースでは、本開示の対象は、代謝性疾患（例えば、糖尿病（例えば１型糖尿病を含む））であるか、代謝性疾患の疑いがあるか、または代謝性疾患の治療をしている対象であってよい。したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法は、１つ以上の代謝性疾患関連抗体（例えば、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗体、抗チロシンホスファターゼ様分子抗体、抗ＩＡ−２抗体及び抗インスリン抗体（例えば、１型糖尿病を検出及び／またはモニタリングするのに有用であるようなもの）が挙げられるが、これらに限らない）の検出または測定を通じて、代謝性疾患の存在を特定または予測することを含みうる。
【０１２６】
いくつかのケースでは、本開示の障害、及び対象における状態を特定するためのまたは対象における状態の予後診断の一部としての本明細書に記載される方法を用いて検出されうる自己抗体は、例えば、Ｚａｅｎｋｅｒ＆Ｚｉｍａｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．（２０１３）２２（１２）：２１６１−８１、Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００１）１０８（１０）：１４１７−２２、Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１５）１４：５５５−５６３（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものを含むが、これらに限らない。
【０１２７】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法には、治療後、例えば、手術後、がん治療後、感染状態の治療後、自己免疫状態の治療後などの患者をモニタリングする用途を見出すことができる。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法を用いて、がんの手術治療後の対象をモニタリングしてもよい（例えば、手術によってがんを除去した後に、がんの有無と関連する自己抗体レベルをモニタリングしてもよい）。例えば、一実施形態では、本明細書に記載されている方法を用いて、甲状腺摘出術後に、１つ以上のサイログロブリン自己抗体をモニタリングしてもよい。
【０１２８】
いくつかのケースでは、本開示の方法には、１つ以上の抗サイログロブリン抗体、１つ以上の抗Ｃ１ｑ抗体、１つ以上の抗ＭＰＯ抗体、１つ以上の抗トランスグルタミナーゼ抗体、１つ以上の抗Ｓｍ／ＲＮＰ抗体、１つ以上の抗ＧＡＤ６５抗体、１つ以上の抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体、１つ以上の抗ＪＯ−１抗体、１つ以上の抗ＩＡ−２抗体、１つ以上の抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体、１つ以上の抗ＰＲ３抗体、１つ以上の抗Ｓｍ  Ｂ／Ｂ’抗体、１つ以上の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体、１つ以上の抗Ｕ１−ｓｎＲＮＰ−Ｃ抗体、１つ以上の抗グリアジン抗体、１つ以上の抗ヒストンＨ３抗体、１つ以上の抗Ｈ２Ｂ抗体、１つ以上の抗ＳｍＤ抗体、１つ以上の抗ヒストンＨ４抗体または１つ以上の抗インスリンＨ抗体を検出する用途が見いだされる。したがって、いくつかのケースでは、本発明の方法の抗原は、１つ以上のサイログロブリン抗原、１つ以上のＣ１ｑ抗原、１つ以上のＭＰＯ抗原、１つ以上のトランスグルタミナーゼ抗原、１つ以上のＳｍ／ＲＮＰ抗原、１つ以上のＧＡＤ６５抗原、１つ以上のＲｏ／ＳＳＡ抗原、１つ以上のＪＯ−１抗原、１つ以上のＩＡ−２抗原、１つ以上のＬａ／ＳＳＢ抗原、１つ以上のＰＲ３抗原、１つ以上のＳｍ  Ｂ／Ｂ’抗原、１つ以上のＣＥＮＰ−Ａ抗原、１つ以上のＵ１−ｓｎＲＮＰ−Ｃ抗原、１つ以上のグリアジン抗原、１つ以上のヒストンＨ３抗原、１つ以上のＨ２Ｂ抗原、１つ以上のＳｍＤ抗原、１つ以上のヒストンＨ４抗原または１つ以上のインスリンＨ抗原であってよい。特定の多重アッセイでは、特定のアッセイは、本明細書に記載されているように、各個が１つのポリヌクレオチドにコンジュゲートされた複数の抗原の組み合わせを含んでよく、それらの抗原は、サイログロブリン抗原、Ｃ１ｑ抗原、ＭＰＯ抗原、トランスグルタミナーゼ抗原、Ｓｍ／ＲＮＰ抗原、ＧＡＤ６５抗原、Ｒｏ／ＳＳＡ抗原、ＪＯ−１抗原、ＩＡ−２抗原、Ｌａ／ＳＳＢ抗原、ＰＲ３抗原、Ｓｍ  Ｂ／Ｂ’抗原、ＣＥＮＰ−Ａ抗原、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ−Ｃ抗原、グリアジン抗原、ヒストンＨ３抗原、Ｈ２Ｂ抗原、ＳｍＤ抗原、ヒストンＨ４抗原及び／またはインスリンＨ抗原のいずれであっても、またはこれらから選択したものであってもよい。
【０１２９】
いくつかのケースでは、本方法には、サンプルに存在する１つ以上の抗原結合物質に関する測定値を正規化する用途が見いだされる。例えば、いくつかのケースでは、サンプルに存在する第２の抗原結合物質のレベルに従って、特定の抗原結合物質のレベルを正規化してよい。いくつかのケースでは、サンプルに存在する１つ以上の免疫グロブリンのレベルに従って、抗原結合物質のレベルを正規化してよい。いくつかのケースでは、サンプル中の免疫グロブリンのレベルは、免疫グロブリンの欠乏を示しうる。
【０１３０】
本明細書に記載されているような方法を行う際には、任意の利便的なサンプルを用いてよい。いくつかのケースでは、対象から得たサンプル、例えば、患者サンプルとしては、例えば、組織サンプル（例えば、生検サンプル）が挙げられるが、これに限らない。組織サンプルとは、本明細書で使用する場合、概して、細胞とその他の成分を含むサンプルを指し、様々であり得るが、概して、皮膚組織サンプル、筋肉組織サンプル、腫瘍組織サンプル、血液サンプル、骨サンプル、骨髄サンプル、脳組織サンプル、結合組織サンプルなどが挙げられる。いくつかのケースでは、例えば、組織サンプルが固体または半固体である場合には、本明細書に記載されているような方法で使用する前に、組織サンプルを液化してよく、または細胞サンプルを解離及び／もしくはホモジナイズしてよい。いくつかのケースでは、例えば、組織が液体組織サンプル、例えば、血液である場合には、このような前処理は不要である。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法は、前処理なしに、固体または半固体の組織サンプル、例えば、組織切片、または固体もしくは半固体組織から得た細胞の細胞学的サンプルで、例えば、組織学的方法または細胞学的方法で行うようにして行ってよい。したがって、いくつかのケースでは、本方法には、例えば、抗原結合物質、組織学的サンプルまたは細胞学的サンプルを特定するための染色における用途を見出すことができる。
【０１３１】
特定の実施形態では、本開示の抗原結合物質の検出方法の特異性は、サンプルにおける抗ポリヌクレオチド抗体の存在とは無関係である。したがって、記載されているアッセイは、サンプルに抗ポリヌクレオチド抗体が存在するか否かにかかわらず、行うことができる。いくつかのケースでは、本開示のサンプルは、抗ポリヌクレオチド抗体を含むことが知られているサンプルであってよい。いくつかのケースでは、本開示のサンプルは、抗ポリヌクレオチド抗体を含んでいる疑いのあるサンプルであってよい。「抗ポリヌクレオチド抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、対象の免疫系によって産生される抗体であって、１つ以上のポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体を含み、例えば、抗ＤＮＡ自己抗体、抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）抗体などが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３２】
抗ＤＮＡ抗体は、一般集団で多少見られ、特定の対象（自己免疫疾患になる素因を有する対象を含む）は、血液中に抗ＤＮＡ抗体を示す可能性が高くなる。加えて、特定の状態は、抗ＤＮＡ抗体の存在及び／または抗ＤＮＡ抗体レベルの増加と相関するかまたは相関し得る。このような状態としては、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性疾患（例えば、抗リン脂質抗体症候群、関節リウマチ、ＣＲＥＳＴ（皮下石灰沈着、レイノー病、食道蠕動低下、手指皮膚硬化及び毛細血管拡張症）、強皮症、脈管炎、若年性関節リウマチ、混合性結合組織疾患など）、悪性疾患（例えば、リンパ腫及びその他のがん）、感染症（例えば、結核及びその他の感染）、内分泌障害、肝炎（例えば、自己免疫性肝炎、慢性Ｂ型肝炎など）、サルコイドーシス、家族性地中海熱、特発性血小板減少性紫斑病、リウマチ性心疾患、重症筋無力症、末期腎不全、潰瘍性大腸炎、てんかん、線維筋痛症、骨軟骨炎、変形性関節症、エバンス症候群、皮膚乾癬、発疹、多発性硬化症などが挙げられるが、これらに限らない。例えば、抗ＤＮＡ抗体の存在または抗ＤＮＡ抗体レベルの増加を伴う対象と状態としては、例えば、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）．（２００７）４６（７）：１０５２−６、Ａｔｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｕｄｉ  Ｍｅｄ  Ｊ．（２０１０）３１（７）：７８１−７及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２００１）９８（４）：１７９３−８（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３３】
いくつかのケースでは、患者サンプル（例えば、血液、血清など）は、抗ポリヌクレオチド抗体（例えば、上記の状態及び一般的なヒト患者集団と関連付けられる抗ＤＮＡ抗体を含む）を含んでもよく、含む可能性が高くてもよく、または含む疑いがあってもよい。特定のケースでは、抗ポリヌクレオチド抗体が、理論に拘束されるものではないが、標的抗原結合物質による所望の抗原の凝集を妨げたり、及び／またはポリヌクレオチド結合抗原と抗ポリヌクレオチド抗体との偽陽性凝集を引き起こしたりすることによって、凝集アッセイを妨げ得ることを本開示の発明者は発見した。いくつかのケースでは、抗ポリヌクレオチド抗体が、本明細書に記載されているような凝集アッセイに及ぼす悪影響は、非結合（すなわち、遊離）ポリヌクレオチドを凝集反応系に加えることによって軽減されうる。
【０１３４】
特定のケースでは、本開示の方法は、遊離ＤＮＡ、例えば、遊離ｓｓＤＮＡを凝集反応物に加えることを含み、これは、抗ＤＮＡ抗体を含むことが知られているかまたは予測されるサンプルにこのような遊離ＤＮＡを加える場合と、抗ＤＮＡ抗体の存在が知られていないかまたは予測されないサンプルに遊離ＤＮＡを予防的に加える場合とを含む。凝集反応系中の遊離ＤＮＡの有用な量は、様々であり、有用な濃度は、０．１μＭ以下〜１ｍＭ以上の範囲であってよく、例えば、０．１μＭ〜１ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ、２μＭ〜１ｍＭ、３μＭ〜１ｍＭ、４μＭ〜１ｍＭ、５μＭ〜１ｍＭ、６μＭ〜１ｍＭ、７μＭ〜１ｍＭ、８μＭ〜１ｍＭ、９μＭ〜１ｍＭ、１０μＭ〜１ｍＭ、０．１μＭ〜１００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、２μＭ〜１００μＭ、３μＭ〜１００μＭ、４μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜１００μＭ、６μＭ〜１００μＭ、７μＭ〜１００μＭ、８μＭ〜１００μＭ、９μＭ〜１００μＭ、１０μＭ〜１００μＭなどが挙げられるが、これらに限らない。凝集反応系における有用な遊離ＤＮＡ（すなわち、競合ＤＮＡまたはブロッキングＤＮＡ）は概して、抗原結合ポリヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチド（例えば、架橋ポリヌクレオチド、スプリントポリヌクレオチドなど）に対して、有意な相同性を有さず、この場合、「有意な相同性」は、通常の反応条件下でハイブリダイズするのに十分な相同性とみなされる。したがって、このような遊離ＤＮＡの構造（例えば、長さ、ヌクレオチド含有量、配列など）は、大きく変動するであろう。いくつかのケースでは、遊離ＤＮＡは、５０個以下〜１００個以上のヌクレオチドの範囲であってよく、例えば、５０〜１００個のヌクレオチド、５０〜９５個のヌクレオチド、５０〜９０個のヌクレオチド、５０〜８５個のヌクレオチド、５０〜８０個のヌクレオチド、５５〜１００個のヌクレオチド、６０〜１００個のヌクレオチド、６０〜９０個のヌクレオチド、６０〜８０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、６５個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、７５個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、８５個のヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、遊離ＤＮＡのＧ／Ｃ含有量は、５０％以下であり、例えば、３０％〜５０％、３５％〜５０％、４０％〜５０％、４５％〜５０％などが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３５】
いくつかのケースでは、組織サンプルは、血液サンプルである。血液サンプルは、全血サンプルとして解析してもよく、または部分的または完全に分画してもよい。いくつかのケースでは、分画血液サンプルによって、血清サンプル（その血清サンプルに対して、本明細書に記載されている検出方法が行われうる）または血漿血清サンプル（その血漿血清サンプルに対して、本明細書に記載されている検出方法が行われうる）を作製してもよい。
【０１３６】
いくつかのケースでは、非侵襲的に及び／または対象にいずれの損傷もなしにサンプルを採取するように、サンプルは、排出体液または半固体であってよい。関心対象の排出体液及び／または半固体としては、例えば、尿、唾液、涙、汗、膿及び糞便が挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、本方法の高い感度によって、従来の凝集方法及び／またはＥＬＩＳＡでは不可能である排出体液または半固体中の抗原結合物質の検出が可能になる。
【０１３７】
いくつかのケースでは、例えば、バイオテクノロジー用途及び／または医薬用途において、特定の抗原結合物質を生成したり、及び／または特定の抗原結合物質を標的とする物質の活性をスクリーニングしたりするプロセスにおける工程として、サンプルは、特定の抗原結合物質の存在についてアッセイされうる、及び／または特定の抗原結合物質の量について測定（例えば、滴定）されうる。いくつかのケースでは、本明細書に記載される方法の用途が見いだされるサンプルは、研究室で作られる細胞サンプルである。このような研究用細胞サンプルは、インビトロまたはインビボで作製してよい。いくつかのケースでは、細胞サンプルは、インビトロ由来のハイブリドーマであり、対象の抗原結合物質は、そのハイブリドーマによって産生される抗体である。いくつかのケースでは、細胞サンプルは、インビボ由来のハイブリドーマであり、対象の抗原結合物質は、そのハイブリドーマによって産生される抗体である。したがって、いくつかのケースでは、本明細書に記載されている本方法及び本明細書に記載されている多重方法には、ハイブリドーマのスクリーニングにおける用途が見いだされる。ハイブリドーマのスクリーニングは、所望の天然抗体または合成によって産生される所望の抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）などが挙げられるが、これらに限らない）の検出について行ってもよい。記載の方法の用途が見いだされるハイブリドーマ作製方法と解析方法は、当業者であれば容易に理解でき、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｅｄ．Ｂｕｒｎｓ，Ｒ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５（この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられる。
【０１３８】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法に従って、関連する伸長ポリヌクレオチドまたは生成される増幅産物を検出することを通じて、抗原結合物質を発現する細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ハイブリドーマ細胞などが、抗原結合物質、例えば、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、抗体などを発現するものであることを特定してよい。いくつかのケースでは、検出可能なプローブ核酸、例えば、蛍光タグ化プローブ核酸を用いて、ポリヌクレオチド結合抗原と抗原結合物質の凝集に基づき生成される伸長及び／または増幅産物を検出してもよく、それによって、伸長及び／または増幅産物と関連する細胞の特定が可能になる。例えば、いくつかのケースでは、検出可能なプローブ核酸、例えば、蛍光タグ化プローブ核酸を用いて、ポリヌクレオチド結合抗原と抗体の凝集に基づき生成される伸長及び／または増幅産物を検出してもよく、それによって、抗体を産生した細胞の特定が可能になる。いくつかのケースでは、このような特定によって、特定した細胞の抗体の抗原への相対的結合の定量が可能になる（例えば、抗原−抗体結合または優れた抗原−抗体結合によって、抗体を産生する細胞の特定が可能になる）。いくつかのケースでは、例えば、多数の異なる細胞を並列に、すなわち多重形式でアッセイする場合、上記のような特定によって、抗体の産生に基づいて、及び／または比較的優れた抗体の産生に基づいて、（例えば、ＦＡＣＳによって）細胞の選別が可能になる。
【０１３９】
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法には、抗体を作製するために免疫した宿主動物をスクリーニングする用途が見いだされる。任意の利便的な宿主動物抗体産生系を、本明細書に記載されている方法と組み合わせて使用でき、例えば、上記の対象動物が挙げられるが、これらに限らない。
【０１４０】
バイオテクノロジー用途及び／または医薬用途には、単特異性及び多特異性（例えば、二重特異性）の抗原結合構成要素の使用及び／または産生が含まれるので、本明細書に記載される本方法は、概して、単特異性または多特異性抗原結合物質、例えば、単特異性または多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の検出用に構成されうる。
【０１４１】
上記の用途は、本発明の方法を限定するものとは決してみなされず、本明細書に記載されている組成物は、本明細書に記載されていない追加の有用性を有し得る。
【０１４２】
組成物及びキット
本開示は、本明細書に記載されている方法を実施するのに有用な組成物、例えば試薬、キット及び器具を含む。本明細書に記載されている試薬のいずれかには、抗原結合物質を検出するための方法またはキットにおいて個々に用途を見出すことができる。例えば、本開示は、記載されている凝集アッセイにおいて有用なポリヌクレオチド結合抗原を提供する。
【０１４３】
上述のとおり、ポリヌクレオチド結合抗原は、任意の利便的な方法によって生成されうる。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドと抗原は、例えば単結合によって直接連結してよく、あるいは、例えば、好適なリンカー、例えば、ポリマーリンカー、化学リンカーまたは１つ以上の連結分子もしくは連結部分を用いることを通じて、間接的に連結してよい。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドの抗原への結合は、１つ以上の共有結合的相互作用によるものであってよい。いくつかのケースでは、抗原は、ポリヌクレオチドに結合するために、例えば、反応性官能基を加えるかまたは作製することによって官能化されうる。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドは、抗原に結合するために、例えば、反応性官能基を加えるかまたは作製することによって官能化してよい。官能化抗原及び／またはポリヌクレオチドは、コンジュゲートするために、任意の利便的な反応性官能基を含むように改変してもよい。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドは、１つ以上の官能基（アミン官能基、例えば、末端アミン官能基、カルボン酸官能基、例えば、末端カルボン酸官能基、またはスルフヒドリル基、チオール官能基、例えば、チオール化またはチオール修飾オリゴヌクレオチドで見られるものなどを含む）を含むように官能化される。
【０１４４】
アミン官能基及び／またはカルボン酸官能基及び／またはスルフヒドリル基でポリヌクレオチドを官能化するとともに、抗原がポリペプチド抗原であるケースでは、官能化ポリヌクレオチドとポリペプチド抗原は、任意の利便的なタンパク質コンジュゲート方法によってコンジュゲートしてよく、その方法としては、タンパク質架橋が挙げられるが、これに限らず、タンパク質架橋としては、例えば、グルタルアルデヒド架橋、カルボジイミド架橋、スクシンイミドエステル架橋、イミドエステル架橋、マレイミド架橋、ヨードアセトアミド架橋、ベンジジン架橋、過ヨウ素酸架橋、イソチオシアネート架橋などが挙げられるが、これらに限らない。このようなコンジュゲート方法では任意の選択肢として、ポリペプチド抗原のアミノ酸残基の反応性側鎖基（例えば、そのタンパク質のアミノ酸残基Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＡｒｇの反応性側鎖基。すなわち、ポリペプチド連結基は、アミノ反応性、チオール反応性、ヒドロキシル反応性、イミダゾリル反応性またはグアニジニル反応性であってよい）を用いてよい。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドの親和性官能基にコンジュゲートする、化学選択的な反応性官能基を用いてよい。対象のポリペプチド抗原に含めるための化学選択的な反応性官能基としては、アジド基、アルキニル基、ホスフィン基、システイン残基、Ｃ末端チオエステル、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル、ヒドラジド、ＰＦＰ−エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、アミノオキシ−、アルデヒド、ケト、クロロアセチル、ブロモアセチル及びビニルスルホンが挙げられるが、これらに限らない。さらなる例示的な官能基、ならびにそのような官能基を用いる架橋方法及びコンジュゲート方法は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８（この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【０１４５】
天然か合成かにかかわらず、コンジュゲートする抗原及びポリヌクレオチドに存在する具体的な官能基に応じて、いくつかのケースでは、有用なコンジュゲート試薬としては、例えば、ホモ二官能性コンジュゲート試薬（例えば、（ビス（２−［スクシンイミドオキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン、１，４−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ブタン、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタートレート、スルホジスクシンイミジルタートレート、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルサクシネート）など）、ヘテロ二官能性コンジュゲート試薬（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−（ρ−マレイミドフェニル）イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−（ρ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（ρ−マレイミドフェニル）ブチレート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロリド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロリド、マレイミドＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）、光反応性コンジュゲート試薬（例えば、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンジルオキシスクシンイミド、ρ−アジドフェニルグリオキサール一水和物、Ｎ−（４−［ρ−アジドサリチルアミド］ブチル）−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、ビス（β−［４−アジドサリチルアミド］−エチル）ジスルフィド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネート、スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−プロピオネート、スルホスクシンイミジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネートなど）を挙げられうるが、これらに限らない。
【０１４６】
チオール官能基でポリヌクレオチドを官能化するケース（例えば、チオール化オリゴヌクレオチド）では、対象の抗原へのコンジュゲートは、本明細書に記載されているようなスルホ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）コンジュゲートを用いることによって行ってよい。
【０１４７】
ポリヌクレオチドを小分子にコンジュゲートするケースでは、例えば、小分子における利用可能な反応性基、及びポリヌクレオチドにおける特定の修飾の有無を含む様々な要因に応じて、ポリヌクレオチドを小分子に共有結合させるのに、任意の利便的なコンジュゲート方法を使用できる。いくつかのケースでは、アミン反応性架橋剤（例えば、ＮＨＳエステル（例えば、本明細書に記載されているようなものを含む）が挙げられるが、これらに限らない）によって、アミン官能化ポリヌクレオチドを所望の小分子にコンジュゲートしてよい。
【０１４８】
いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドを抗原に結合する際には、ポリヌクレオチドにすでに存在する既存の官能部分を使用する。いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドを抗原にコンジュゲートする際に用いる官能部分をポリヌクレオチドに付加して、官能化ポリヌクレオチドを生成する。官能化ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを修飾することによって、または修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに付加することによって生成してもよい。このような修飾ヌクレオチドは、いくつかのケースでは、官能化ヌクレオチドと称することもある。
【０１４９】
修飾ヌクレオチドは、任意の利便的な方法によって、ポリヌクレオチドに導入してよく、その方法としては、例えば、合成／化学合成（例えば、固相オリゴヌクレオチド合成、ホスホロアミダイト合成など）、組み換え合成、酵素的取り込みなどが挙げられるが、これらに限らない。対象の抗原への結合を形成させるのに有用な修飾ヌクレオチドとヌクレオチド修飾としては、例えば、クリックケミストリーによる官能化（例えば、アジド官能化、アルキン官能化、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）官能化など）で有用なもの、核酸標識で有用なもの、光架橋で有用なもの、アクリルホスホロアミダイト連結で有用なもの、ピロホスフェート連結／ライゲーションで有用なものなど、例えば、３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリフォスフェート、５−（３−アジドプロピル）−ウリジン−５’−トリフォスフェート、５−エチニル−２’−ウリジン５’−トリフォスフェート、８−アジド−アデノシン−５’−トリフォスフェート、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−３’−デオキシアデノシン−５’−トリフォスフェート、シチジン−５’−ホスフェート−３’−（１５−アジド−４，７，１０，１３−テトラオキサ−ペンタデカノイル−６−アミノヘキシル）ホスフェート、γ−（２−アジドエチル）−アデノシン−５’−トリフォスフェート、γ−（６−アジドヘキシル）−アデノシン−５’−トリフォスフェート、γ−［（６−アジドヘキシル）−イミド］−アデノシン−５’−トリフォスフェート、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−アデノシン−５’−トリフォスフェート、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−２’デオキシ−アデノシン−５’−トリフォスフェート、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−３’−デオキシアデノシン−５’−トリフォスフェート、３’−アジド−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−トリフォスフェート、５−（１５−アジド−４，７，１０，１３−テトラオキサ−ペンタデカノイル−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン−５’−トリフォスフェート、Ｎ６−プロパルギル−アデノシン−５’−トリフォスフェート、アデノシン−５’−［γ−（プロパルギル）］トリフォスフェート、アデノシン−５’−［γ−（プロパルギル）−イミド］トリフォスフェート、２−エチニル−アデノシン−５’−トリフォスフェート、５−（オクタ−１，７−ジイニル）−２’−デオキシシチジン５’−トリフォスフェート、５−（オクタ−１，７−ジイニル）−２’−デオキシウリジン５’−トリフォスフェート、５−エチニル−２’−デオキシウリジン５’−トリフォスフェート、５−ジベンジルシクロオクチン−２’−デオキシウリジン５’−トリフォスフェート、２−アミノプリン−２’−デオキシリボシド−トリフォスフェート、５−アミノアリル−２’−デオキシシチジン−５’−トリフォスフェート、５−アミノアリル−２’−デオキシウリジン−５’−トリフォスフェート、５−プロパルギルアミノ−２’−デオキシシチジン−５’−トリフォスフェート、５−プロパルギルアミノ−２’−デオキシウリジン−５’−トリフォスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリフォスフェート、４−チオウリジン−５’−トリフォスフェート、５−ブロモウ��ジン−５’−トリフォスフェート、５’−アクリダイト修飾、５’−アデニル化修飾などが挙げられるが、これらに限らない。
【０１５０】
いくつかのケースでは、対象の抗原へのポリヌクレオチドの結合は、１つ以上の官能性リンカーによって媒介される。官能性リンカーとは、本明細書で使用する場合、分子同士を結合するための１つ以上の官能基を有するいずれかの好適なリンカーを指す。例えば、いくつかのケースでは、本開示のポリヌクレオチドのヌクレオチドは、官能基（例えば、アミノ官能基、チオール官能基、ヒドロキシル官能基、イミダゾリル官能基、グアニジニル官能基、アルキン官能基、アジド官能基、歪みアルキン官能基など）を含む生体分子リンカーに結合してよい。非限定例としては、本開示のポリヌクレオチドのヌクレオチドは、官能基を含む官能性ビオチンでビオチン化してよい。
【０１５１】
いくつかのケースでは、ポリヌクレオチドを所望の抗原に結合するのに有用なこれらの修飾ヌクレオチドとしては、市販業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ、イェーナ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州グランドアイランド）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州アーバイン）、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ファーミングデール）などが挙げられるが、これらに限らない）から入手可能なものが挙げられうる。
【０１５２】
本開示のポリヌクレオチドコンジュゲート抗原の生成は、コンジュゲート後、抗原とポリヌクレオチドのモル比、例えば抗原とＤＮＡのモル比に影響を及ぼすコンジュゲート反応効率を考慮する場合がある。抗原とポリヌクレオチドのモル比が、記載されているアッセイにおける凝集に影響を及ぼすことを本開示の発明者は発見した。理論に拘束されるものではないが、抗原の比率が低く、ポリヌクレオチドの比率が高いと、いくつかのケースでは、（例えば、抗原と抗原結合物質の結合表面のアクセスを阻害することによって、）凝集が阻害されると見られる。多くの場合、コンジュゲート後の抗原とポリヌクレオチドのモル比は、１：５を上回り、例えば、１：４を上回る、１：３を上回る、１：２を上回るなどのモル比を含むが、これらに限らない。特定のケースでは、コンジュゲート後の抗原とポリヌクレオチドのモル比は、１：１〜１：５の範囲であり、例えば、１：１〜１：４、１：１〜１：３、１：１〜１：２などが挙げられるが、これらに限らない。別のケースでは、記載されているような凝集アッセイで用いるためには、コンジュゲート後の抗原とポリヌクレオチドのモル比は、本質的に１：１、本質的に１：２、本質的に１：３などである。
【０１５３】
本開示は、本凝集アッセイと、記載されている抗原結合物質の検出とに関連する器具も提供する。このような器具としては、研究設備（例えば、電気、化学試薬、温度コントロール、冷蔵などの設備）が最小限でも、または研究設備がなくても、本明細書に記載されている凝集アッセイを実施可能にする「実施使用」器具、例えば、ディップスティックアッセイ器具、ラテラルフローアッセイ器具、スライドベース器具などを挙げてよいが、これらに限らない。研究室の環境で使用するための器具も含まれ、例えば、生成される増幅産物の正確な定量を用いる器具（例えば、ＰＣＲ器具、ｑＰＣＲ器具、蛍光光度計、シンチレーションカウンター、顕微鏡、プレートリーダー、核酸シーケンシング器具などを含む）が挙げられる。いくつかのケースでは、本明細書に記載されているような方法を実施するための器具として使用するために、等温増幅器具（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｅｎｓｏｒｓ  １２，８３１９−８３３７（この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものなど）を改良してよい。
【０１５４】
さらに別の態様では、本開示は、例えば上記のような、本方法を実施するためのキットを提供する。本キットは、上記のような方法を実施するのに有用な、本明細書に記載の試薬、器具または組成物（例えば、記載されているポリヌクレオチド結合抗原、架橋ポリヌクレオチド、スプリントポリヌクレオチド、酵素試薬（例えばリガーゼ）などのうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限らない）の任意の組み合わせを含んでよい。本キットはさらに、１つ以上の試薬調製試薬を含んでよく、例えば、抗原を官能化するための試薬（例えば、ポリヌクレオチドを対象の抗原に容易にコンジュゲートするための官能化ポリヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチドを官能化するための試薬（例えば、官能化ヌクレオチド（すなわち、１つ以上の反応性基を含むヌクレオチド）、ポリヌクレオチド及び／または抗原をコンジュゲートするための試薬（例えば、本明細書に記載されているような１つ以上のコンジュゲート及び／または架橋のための試薬またはリンカーを含む）を含むがこれらに限らない。
【０１５５】
加えて、本キットはさらに、評価、例えば、対象から得たサンプルに、１つ以上の抗原結合物質が存在するか否かの評価を行えるように、アッセイ試薬、または例えば患者サンプルなどのサンプルのアッセイを行うのに有用な試薬を含んでよい。このようなアッセイ試薬としては、例えば、検出試薬、サンプル調製試薬、増幅試薬（例えば、ＰＣＲ試薬及び／または等温増幅試薬及び／またはｑＰＣＲ試薬など）、ならびに凝集試薬（例えば、ポリヌクレオチド結合抗原など）、バッファー、希釈剤などを挙げてよいが、これらに限らない。このようなアッセイキットはさらに、サンプル採取要素、例えば、サンプル採取容器及び／またはサンプル採取器具などを含んでよい。上記の要素は、別々の容器に存在してよく、または、１つ以上の要素を単一の容器、例えば、ガラスもしくはプラスチックのバイアルもしくはチューブの中で組み合わせてもよい。
【０１５６】
キットはさらに、コントロール試薬とコントロールサンプルを含んでよく、例えば、コントロールサンプル（例えば、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプルなど）、較正試薬（例えば、蛍光較正試薬など）を含むがこれらに限らない。
【０１５７】
上記の成分に加えて、本キットはさらに、本方法を実施するための説明書を含んでよい。これらの説明書は、本キットに様々な形態で存在してよく、１つ以上の形態がキットに存在してよい。これらの説明書が存在してよい形態の１つは、好適な媒体または基質、例えば、情報が印刷される１枚または複数枚の紙、キットのパッケージ、添付文書などに印刷した情報である。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ、リムーバブルディスク（例えば、フラッシュメモリーデバイス）などであろう。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所の情報にアクセスするためにインターネットを介して利用できるウェブサイトアドレスである。任意の利便的な手段がキットに存在してよい。
【実施例】
【０１５８】
下記の実施例は、本発明の作製及び使用方法の完全な開示と説明を当業者に対して行う目的で示されており、本発明者が本発明としてみなすものの範囲を限定するようには意図されていないとともに、下記の実験が、実施したすべてまたは唯一の実験であることを表すようにも意図されていない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関しては、正確になるように尽力したが、多少の実験誤差と偏差を考慮されたい。別段の定めのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。標準的な略記、例えば、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロベース）、ｐｌ（ピコリットル）、ｓまたはｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈまたはｈｒ（時間）、ａａ（アミノ酸）、ｋｂ（キロベース）、ｂｐ（塩基対）、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｉ．ｍ．（筋内）、ｉ．ｐ．（腹腔内）、ｓ．ｃ．（皮下）などが用いられている場合がある。
【０１５９】
下記の実施例では、別段に定められているか、または明らかに関連性がない場合を除き、本明細書に示されている方法と材料を概ね適用した。
【０１６０】
ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、そのままの形態で購入した。ＤＮＰ−ＤＮＡコンジュゲート体の合成は、アミン−ＤＮＡ（５’または３’）（アイオワ州コーラルビル）を、対応するスクシンイミジルエステルと大過剰で反応させることによって行い、順次的なエタノール沈殿（下記参照）によって精製した。スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を用いたリジン−チオール架橋によって、タンパク質−ＤＮＡコンジュゲート体を調製した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中でＳＭＣＣとともにインキュベートすることによって、マレイミドによってリジンを活性化した。チオール−ＤＮＡ（５’または３’）をＤＴＴで還元してから、マレイミド官能化タンパク質とともに一晩、４℃でインキュベートした（さらなる詳細は、下記参照）。この小分子−ＤＮＡコンジュゲート体の特徴付けを高分解能質量分析によって行ったとともに、タンパク質−ＤＮＡコンジュゲート体をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び銀染色によって解析して、適切な質量シフトを観察した。
【０１６１】
抗原−ＤＮＡコンジュゲート体の合成
組み換えインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を再懸濁させて、反応バッファー（５５ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中の１ｍｇ／ｍＬ溶液を作ることによって、インスリン−ＤＮＡコンジュゲート体を合成した。このタンパク質溶液１０μＬに、１μＬのスルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の４ｍＭ無水ＤＭＳＯ溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。チオール化ＤＮＡ（ＩＤＴ）を反応バッファーに１００μＭまで再懸濁させた。続いて、１００μＭのチオール化ＤＮＡストック３マイクロリットルを５０μＬの反応バッファーに加えた。この溶液に、４μＬのＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１００ｍＭ溶液を加えて、酸化チオール化−ＤＮＡを還元した。続いて、この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。分画分子量（ＭＷＣＯ）７ｋのゲルマイクロスピンカラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を反応バッファーで平衡化した。還元したオリゴヌクレオチドを平衡化マイクロスピンカラムによって２回脱塩した。ＭＷＣＯ３ｋの遠心フィルターカラム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、未反応スルホ−ＳＭＣＣをインスリン溶液から除去して、最終量６０μＬにした。続いて、チオール化ＤＮＡとインスリン溶液を混合し、一晩４℃で反応させてから、ＭＷＣＯ１０ｋのフィルターカラムによって精製した。ＢＣＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってコンジュゲート体濃度を割り出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によってコンジュゲート効率を解析した。図２０には、代表的な銀染色が示されている（サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像してから、銀染色によって総タンパク質／ＤＮＡを可視化した。レーン１は非改変ＧＦＰであり、レーン２はＧＦＰ−２Ａコンジュゲート体であり、レーン３はＧＦＰ−２Ｂコンジュゲート体である。タンパク質に１４ｋＤのオリゴヌクレオチドを付加したことにより、有意な質量シフトがレーン２及び３において観察された。レーン２及び３のラダー形成は、多数のオリゴヌクレオチドを単一のタンパク質に付加したことによるものである）とともに、スルホ−ＳＭＣＣによるＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートの反応スキームの概略が示されている。コンジュゲート体のＤＮＡと抗原の比は、紫外・可視分光法によって推定した。抗原−ＤＮＡコンジュゲート体は、短期使用の際には４℃で保存し、または−８０℃での長期保存する際には小分けにした。ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体、マウス−ＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体及びサイログロブリン−ＤＮＡコンジュゲート体を同様に、ただし、わずかに修正を加えて合成した。簡潔に述べると、未反応ＳＭＣＣを、ＭＷＣＯ７ｋのゲルマイクロスピンカラムによってろ過した。遠心フィルターカラム（ＧＦＰ：ＭＷＣＯ３０ｋカラム、マウスＩｇＧ：ＭＷＣＯ１００ｋカラム、サイログロブリン：ＭＷＣＯ１００ｋカラム）によって、コンジュゲート体を非コンジュゲートＤＮＡから精製した。
【０１６２】
最後に、ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体を、ＩＤＴから購入した。ＤＮＰ−ＤＮＡコンジュゲート体は、以下のように合成した。２５ミリグラムのＤＮＰ−ＮＨＳエステル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無水ＤＭＳＯに溶解して、５０ｍＭ溶液を作製した。５’または３’アミン官能化ＤＮＡ（ＩＤＴ）をｄｄＨ２Ｏに再懸濁して、１ｍＭ溶液を作製した。４０μＬの１ｍＭ  ＤＮＡ溶液を３００μＬのＰＢＳに５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３とともに加えた。８０μＬのＮＨＳエステル溶液を２日間かけて室温において一定の回転混合下で加えた。続いて、２．５倍量のエタノールと０．１倍量の１０Ｍ酢酸アンモニウムを加えることによって、改変ＤＮＡを沈殿してから、４時間インキュベートした。１５分、４℃で遠心分離することによって、沈殿したＤＮＡをペレット化してから、氷冷した７０％エタノール−Ｈ２Ｏ中で、穏やかに洗浄した。続いて、そのペレットを１００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁してから、上記のような沈殿によって再度精製して、未反応小分子が完全に除去されるようにした。２回目の沈殿後、ペレットをｄｄＨ２Ｏで希釈して、１００μＭストック溶液を作製し、この溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。高解像度ＬＣ−ＭＳによって合成を確認した。
【０１６３】
凝集−ＰＣＲ（ＡＤＡＰ）による抗体検出
対の抗原−ＤＮＡコンジュゲート体１フェムトモルを２μＬのインキュベートバッファーＣ（ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。２マイクロリットルの分析対象物をこのコンジュゲート体に加えてから、３７℃で３０分インキュベートした。１１６μＬのライゲーションミックス（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＤＴＴ、２５μＭのＮＡＤ、０．０２５Ｕ／μＬのリガーゼ、１００ｎＭの架橋オリゴ、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ＝７．５）を加えてから、３０℃で１５分インキュベートした。１０マイクロリットルのウラシル除去ミックス（０．０２５Ｕ／μＬ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏ）を加え、１５分、３０℃でインキュベートした。その溶液２５マイクロリットルを２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）２５μＬに、１０ｎＭのプライマーとともに加えてから、ＰＣＲによって増幅した（９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、１２サイクル）。続いて、この反応物をｄｄＨ２Ｏに１：２０で希釈した。希釈したＰＣＲサンプル８．５μＬを２×ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０μＬに、プライマー１．５μＬとともに加えた（終濃度６９０ｎＭ）。リアルタイムＰＣＲ検出システムのＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６またはＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５のいずれかでｑＰＣＲを行った。
【０１６４】
アフィニティ精製した抗インスリン抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ビオチン抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ＧＦＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＡＤＡＰアッセイを上記のように、ただし下記の修正を加えて行った。バッファーでの希釈では、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体２μＬを、２μＬの段階希釈したバッファーＣ中抗体（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）と混合した。ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）での希釈では、抗体をウシ胎児血清に加えて、２ｗｔ％／ｗｔ抗体溶液を得てから、ＡＤＡＰアッセイのために、その溶液をバッファーＣで段階希釈した（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）。同じ調製を行ったアイソタイプ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をネガティブコントロールとして横並びで解析した。
【０１６５】
抗血清由来の抗ＤＮＰ抗体に対するＡＤＡＰ検出アッセイ
上記のように、ただし、下記の修正を加えて、抗ＤＮＰ抗血清（Ａｂｃａｍ）に対するＡＤＡＰ  ＰＣＲ検出アッセイを行った。ＤＮＰコンジュゲートキャリアタンパク質を接種したウサギから、抗ＤＮＰ抗血清を得て、さらなる精製は行わなかった。ＡＤＡＰ検出のために、ＤＮＰ−ＤＮＡコンジュゲート体２マイクロリットルを、２μＬの段階希釈したバッファーＣ中抗ＤＮＰ抗血清（濃度範囲：０．４〜０．０００２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。
【０１６６】
抗サイログロブリン患者血漿に対するＡＤＡＰ検出アッセイ
上記のように、ただし、下記の修正を加えて、抗サイログロブリン陽性患者血漿（ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ）に対するＡＤＡＰ検出アッセイを行った。ＡＤＡＰ検出のために、サイログロブリン−ＤＮＡコンジュゲート体２マイクロリットルを、２μＬの段階希釈したバッファーＣ中患者血漿（希釈係数：１００〜１０６）と混合した。
【０１６７】
抗ビオチン抗体と抗マウスＩｇＧ抗体に対する多重ＡＤＡＰ
上記のように、ただし、下記の修正を加えて、抗ビオチン抗体と抗マウスＩｇＧ抗体に対する多重ＡＤＡＰアッセイを行った。ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体（表２におけるような配列１）１μＬとマウス−ＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体（表２におけるような配列２）１μＬを、２μＬの段階希釈した（１）バッファーＣ中抗ビオチン抗体（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）、（２）バッファーＣ中抗マウス抗体（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）、（３）バッファーＣ中抗ビオチン抗体及び抗マウス抗体の両方（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）のいずれかと混合した。この抗原・抗体混合物を上記のように処理及び解析した。
【０１６８】
抗ビオチン抗体と全ＩｇＧに対する多重ＡＤＡＰ及びＰＬＡ検出
ＡＤＡＰ及びＰＬＡ１９−２２（近接ライゲーションアッセイ）を併せて用いて、所定のサンプル中の特異的抗体と総抗体量を定量した。上記のように、ただし、下記の修正を加えて、抗ビオチン及び全ＩｇＧに対する多重ＡＤＡＰ検出アッセイを行った。ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体（配列１）１μＬと抗ヤギＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体（配列２）１μＬを、２μＬの段階希釈した（１）バッファーＣ中ヤギ抗ビオチン抗体（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）、（２）バッファーＣ中ヤギＩｇＧ（濃度範囲：１０２〜１０−４μｇ／ｍｌ）またはバッファーのみ（ブランク）、（３）バッファーＣ中の抗ビオチン及びヤギＩｇＧの両方（全ＩｇＧは０．７μｇ／ｍｌで固定し、抗ビオチン抗体の割合は１００％から０％まで様々であった）またはバッファーのみ（ブランク）のいずれかと混合した。抗原と抗体の混合物を上記のように処理及び解析した。
【０１６９】
抗インスリン抗体の直接ＥＬＩＳＡ検出
組み換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）を再懸濁して、ＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｍＬとした。そのインスリン溶液７５μＬを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレート（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のウェルに加えた。そのプレートをプラスチックの膜で覆い、インスリンをそのプレートに一晩、４℃で吸着させた。過剰な上清をデカントし、ウェルをＰＢＳ中の５％ＢＳＡで一晩、４℃でブロックした。抗インスリン抗体をＰＢＳで希釈し、室温で１時間結合させた。上清をデカントし、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。二次抗体−ＨＲＰプローブ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：５０００でＰＢＳ中の５％ＢＳＡにおいて希釈し、ウェルに加え、室温で１時間インキュベートさせた。上清をデカントしてから、ＰＢＳで４回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加え、１５分発光させてから、２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えることによってクエンチした。吸光度を４５０ｎｍでプレートリーダーにおいて測定した。
【０１７０】
抗ＤＮＡ抗体からの干渉の回避
抗ＤＮＡ抗体陽性患者血漿をＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎから購入した。上記のように、ただし、わずかに修正を加えて、抗ＤＮＡ血漿のＡＤＡＰ検出を行った。抗ＧＦＰ抗体の検出では、抗ＧＦＰ抗体を抗ＤＮＡ血漿と正常血漿に加えた。ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体を含む２μＬ溶液とともに、１００μＭの競合ＤＮＡを含めて、または競合ＤＮＡなしで、２μＬの段階希釈抗ＧＦＰ溶液のサンプルをインキュベートした。競合ＤＮＡは、ＩＤＴから購入した
2018512862.tif 000003
という配列を有するものである。
【０１７１】
抗サイログロブリン自己抗体に対する放射線免疫アッセイ及び電気化学発光アッセイ
Ｔｇ−ＲＩＡ（Ｋｒｏｎｕｓ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｃｃｅｓｓ  ＴｇＡｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＴｇＡｂ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をメーカーの指示に従って行った。これらのアッセイは、ＷＨＯ標準血清６５／９３に対して標準化されている。
【０１７２】
データ解析
ブランクに加えて、バッファーＣにおける各抗体サンプルに対して、ＡＤＡＰ測定を３回繰り返して行った。同じ希釈系列ならびに同じライゲーション、除去及びプレ増幅工程調製物からアリコートを取ったが、ｑＰＣＲ解析のために、それらを３つの異なるウェルに入れることによって、この繰り返し測定を行った。抗ビオチン抗体の段階希釈液に対するＡＤＡＰアッセイから得た代表的なリアルタイムｑＰＣＲ測定プロットが図２１に示されている（破線は、閾値蛍光値である）。ソフトウェアＢｉｏ−Ｒａｄによって、１つの閾値蛍光値を自動的に選択した。各曲線において、選択した閾値値に対応する蛍光値を示したＰＣＲサイクル数をサイクル閾値（Ｃｔ）として定めた。ΔＣｔは、ブランクのＣｔ値からサンプルのＣｔ値を減じた値として定める。ΔＣｔの値は、初期アンプリコン濃度に比例している。そして、このアンプリコン濃度は、初期希釈系列に存在する標的抗体の量にも比例している。ＡＤＡＰ測定のために、各段階希釈系列から２μＬの体積を取った。したがって、各測定における抗体分子の数は、（２×１０−６Ｌ）×抗体濃度（Ｍ）×アボガドロ数である。カスタムソフトウェアを用いて、抗体希釈系列に対する非線形４パラメーターロジスティックフィットを割り出した。ＡＤＡＰアッセイの検出限界は、バッファーＣのみのブランクの平均ΔＣｔ値と、そのブランクの３つの標準偏差の和として定める。各検出限界の値は、対応するブランクに対して計算する。
【０１７３】
ＡＤＡＰにおけるアッセイ内及びアッセイ間変動
ＡＤＡＰ測定を抗ＧＦＰ抗体に対してトリプリケートで、同じプレートで６回繰り返すことによって、ＡＤＡＰにおけるアッセイ内変動を割り出した。アッセイ内変動は、トリプリケートの標準偏差をトリプリケートの平均値で除した値として定め、一貫して＜１％である。ＡＤＡＰにおけるアッセイ間変動は、抗ＧＦＰ抗体濃度をトリプリケートで、５つの異なるプレートで、異なる日に測定することによって評価する。アッセイ間変動は、５つの異なるプレートから得た濃度の標準偏差を、５つの異なるプレートから得た濃度の平均値で除した値によって定め、＜３％である。ＡＤＡＰのアッセイ内変動とアッセイ間変動はいずれも、許容される生物医学アッセイ変動値（アッセイ内変動に関しては１０％、アッセイ間変動に関しては１５％）よりもはるかに小さい。ＡＤＡＰの優れたアッセイ内性能とアッセイ間性能は、全体的な操作工程が少なく、洗浄工程と遠心分離工程がないことによるものである可能性が高い。他のアッセイでは、徹底的な洗浄と遠心分離が必要とされることにより、精度と再現性が損なわれる可能性がある。
【０１７４】
実施例１：インスリン、ＤＮＰ、ＩｇＧ及びサイログロブリン抗体のＰＣＲベースの凝集−ライゲーションアッセイ検出
凝集−ライゲーションアッセイ（「ＳＩＭＰＡＬ」（凝集−ライゲーションによる高感度免疫複合体モニタリングプラットフォーム）と称されているとともに、「ＡＤＡＰ」（凝集−ＰＣＲによる抗体検出）ともいう）では、ＰＣＲアンプリコンを２分割して、それぞれプライマー部位を持つようにした。この半部をそれぞれ、組み換え抗原に共有結合させ、下流断片が、５’ホスフェート基を有するようにして、ＤＮＡリガーゼの基質とした。このアッセイでは、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体に結合して抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を凝集させる抗体とともに、上記の抗原−ＤＮＡコンジュゲート体１〜２μＬをピコモル濃度でインキュベートした。凝集したコンジュゲート体は、互いの近くに保持され、ＤＮＡリガーゼと短い架橋オリゴヌクレオチドで処理すると、２つの半部のライゲーションが促される。未結合のままの抗原−ＤＮＡコンジュゲート体は、希薄すぎて、ライゲーションされない。続いて、再構成したＰＣＲアンプリコンをプレ増幅し、蛍光ベースの定量ＰＣＲによって定量する（図８）。
【０１７５】
この抗体検出実験では、各抗原−ＤＮＡコンジュゲート体１フェムトモルを２μＬのバッファーで希釈し、サンプルに加え、インキュベートして結合させた。次に、ＤＮＡリガーゼと架橋オリゴヌクレオチドとを含むライゲーション混合物１２０μＬを加え、３０℃で１５分インキュベートした。このライゲーション混合物を希釈し、標準的なサーモサイクラーにおいて、１３ラウンドのＰＣＲによってプレ増幅した。得られたＰＣＲ産物を希釈し、ｑＰＣＲによって解析した。
【０１７６】
インスリン−ＤＮＡコンジュゲート体とともにインキュベートしたときのα−インスリン抗体の濃度に対する添加量依存性応答を５桁にわたって観察した（例えば、図９Ａ参照）。ＰＢＳ、ウシ血清及びヒト唾液で希釈した抗体で得られた結果によって示されているように、異なる生物学的希釈剤において非常に類似した結果が得られたことから、複合体混合物において、この試験が機能できることが示されている。有意な変動は観察されなかった。血清における検出限界は、１７０ゼプトモルの抗体で、濃度は１５ｐｇ／ｍｌであった。対応するアイソタイプコントロールとともにインキュベートしたところ、いずれのケースでも、シグナルは生成されなかった。タンパク質及び小分子ハプテン抗原−ＤＮＡコンジュゲート体（ＧＦＰ、マウス−ＩｇＧ及びビオチンなど）のパネルを試験したところ、同様の検出限界が見られた（図１０に示されている表１）。
【０１７７】
また、全ＤＮＰ抗血清を用いて、ＤＮＰ−ＤＮＡコンジュゲート体を凝集させた。ＡＤＡＰによる解析は、わずか０．７４ｎｇの全抗血清タンパク質由来のウサギ血清において、凝集を検出することができた（図９Ｊ）。この結果によって、ＡＤＡＰが、全血清から得た天然産生抗体を高感度に検出できるとともに、小分子に対する抗体を検出する（この検出は、従来の検出アッセイでは特定の難点がある）可能性を有することが示されている。
【０１７８】
周知の標準に対して本アッセイの感度を評価するために、直接ＥＬＩＳＡとの比較を行ったところ、検出限界が８６５倍向上した（図９Ｂ及び表１）。アイソタイプコントロール抗体を含むサンプルをアッセイすることによってＡＤＡＰの特異性を割り出したところ、検出可能なシグナルは生成されなかった（図９Ｇ）。加えて、関連性のない抗原−ＤＮＡコンジュゲート体でアッセイを行ったところ、検出可能なシグナルは観察されなかった（図９Ｈ）。
【０１７９】
多重構成でもアッセイを行った。核酸を検出するのに利用可能な配列空間により、異なる抗原の凝集について報告するために任意の配列を設計及び割り当てることができる。これは、いくつかの理由から有用である。例えば、１型糖尿病などの多くの疾患には、多数の自己抗体バイオマーカーがある（例えば、インスリン、膵島抗原２（ＩＡ−２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８））。異なる抗原に結合する特異的核酸を用いて、多数の抗原に対する抗体を同時及び別々に検出して、診断の信頼性を高めることができる。このアッセイの多重実施形態のさらなる利点は、従来の抗体試験では典型的には見過ごされる総免疫グロブリン濃度を考慮する抗体試験を可能にすることである。免疫グロブリン濃度を見過ごすと、免疫グロブリンの欠乏（例えば、セリアック病患者でよくみられる問題）がみられる患者において偽陰性が発生する可能性がある。他の標的抗体に加えて、免疫グロブリンレベルを検出するための結合アッセイを用いると、異常に低い免疫グロブリンレベルによる陰性結果を探し出すことができる。
【０１８０】
ビオチン及びマウスＩｇＧを含む直交的な抗原−ＤＮＡコンジュゲート体のセットを生成した。セット１プライマーが、セット２アンプリコンを増幅しないとともに、セット２プライマーが、セット１アンプリコンを増幅しないが、共通の架橋オリゴヌクレオチドを共有するように、これらのアンプリコンを設計した（表２参照）。抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を上述のように合成し、セット１オリゴをビオチンで標識し、セット２オリゴをマウスＩｇＧで標識した。これらの２つの抗原−ＤＮＡコンジュゲート体をプールしてから、ビオチンのみ、マウスＩｇＧのみ、または両方に結合する抗体とともにインキュベートし、続いて、凝集について解析した。抗ビオチン抗体とともにインキュベートしたサンプルでは、セット１プライマーのみでシグナルが見られ、抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートしたサンプルでは、セット２プライマーのみでシグナルが見られた。混合サンプルでは、両方のプライマーセットでシグナルが生成された（図９Ｄ。図１４Ａ〜１４Ｃも参照）。
【０１８１】
全ＩｇＧ及び抗体の多重化された検出のために、抗ＩｇＧポリクローナル抗体の単一バッチから、抗ＩｇＧ近接プローブを生成した。このバッチを２つに分割し、各プールをセット２ＰＣＲアンプリコンの上流断片または下流断片のいずれかで改変した。ポリクローナル抗体が、近くのエピトープに結合すると、これらの２つのアンプリコン分割体が接近し、ライゲーションとＰＣＲによる検出が可能になる。ＩｇＧの総量は一定に保たれるが、ＩｇＧの割合、換言すればα−ビオチンは変化するように、ヤギα−ビオチン抗体をヤギＩｇＧ中に希釈した。セット２プライマーによるｑＰＣＲ解析では、シグナルの変化は見られず、すべてのサンプルにおけるＩｇＧの濃度が一定であることに対応していた一方で、α−ビオチン抗体の割合が増えるにつれて、セット１プライマーから生成されるシグナルは増大した（図９Ｉ）。このデータによって、抗原特異的抗体の検出によって、全抗体レベルの検出を多重化できることが示されている。
【０１８２】
患者サンプルからの診断用抗体の検出を試験した。サイログロブリン自己抗体は、自己免疫性甲状腺炎を媒介するとともに、自己免疫性甲状腺炎の診断指標となる。また、がんに対応して、治療のために甲状腺摘出術を行った後には、有害な腫瘍の完全な除去を確認するための指標として、サイログロブリン力価を用いることが多い。サイログロブリン自己抗体は、サイログロブリンアッセイを妨げ得るので、回復をモニタリングするための重要なバイオマーカーである。現時点では、放射線免疫アッセイが依然として、サイログロブリン自己抗体を検出するためのゴールドスタンダードである。
【０１８３】
試験においてサイログロブリン自己抗体陽性であった患者から得た血漿と比較して、プールした健常ヒト血漿に対してサイログロブリン−ＤＮＡコンジュゲート体によってＳＩＭＰＡＬ解析を行った。１：１００，０００で希釈した後でも、サイログロブリン陽性サンプル（２μｌ）からロバストなシグナルが観察されたとともに、健常なサンプルからはバックグラウンドがほぼ見られなかった（図９Ｅ）。ＦＤＡに認可されている３つの臨床研究アッセイ（Ｋｒｏｎｕｓ／ＲＳＲ放射線免疫アッセイ及び２つの電気化学発光アッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ及びＲｏｃｈｅ））を用いて、同じサンプルをアッセイした。印象的なことに、ＡＤＡＰでは、これらの標準的なアッセイよりも３〜４桁低い検出限界で、抗サイログロブリン抗体が検出された（図９Ｆ）。
【０１８４】
結論としては、開発したアッセイは、ＰＣＲを用いて、複合体混合物に存在する抗体を検出する。このアッセイは、ＥＬＩＳＡの検出限界報告値に匹敵するか、またはＥＬＩＳＡの検出限界報告値を上回るとともに、２μＬのサンプル中の数ゼプトモルほどの抗体を検出する能力を有する。均質な溶液相免疫アッセイとして、凝集−ライゲーションアッセイでは、表面固定化抗原アッセイのタンパク質の変性とエピトープの遮蔽の問題が回避される。非洗浄免疫アッセイとして、ＥＬＩＳＡの発色を妨げる洗浄工程の煩雑な最適化が除去される。開発したアッセイには、サンドイッチＥＬＩＳＡで必要とされるような一意的な対の抗体の単離が不要である。意義深いことに、このアッセイは、多くの臨床現場で容易に入手可能である標準的なｑＰＣＲ装置と試薬のみで行うことができる。このアッセイでは、超低量の抗原−ＤＮＡコンジュゲート体（６０ｋＤａの抗原コンジュゲート体１００μｇから約１．７百万回アッセイできる）と、標準的なライゲーション酵素を使用する。
【０１８５】
図８：ＳＩＭＰＡＬ、すなわちＡＤＡＰによる抗体検出：抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を、抗体含有分析対象物とともにインキュベートする。この抗体が、コンジュゲート体に結合して、コンジュゲート体を凝集させて、架橋オリゴヌクレオチドとＤＮＡリガーゼを加えたときにライゲーションするのに好都合な位置に、コンジュゲート体を配置する。架橋オリゴヌクレオチドを加水分解させ、新たなアンプリコンをＰＣＲによってプレ増幅する。続いて、このプールをｑＰＣＲによって解析して、相対的な抗体レベルを割り出す。
【０１８６】
図９Ａ〜９Ｊ：ＳＩＭＰＡＬ、すなわちＡＤＡＰによって、複合体マトリックス中の抗体の高感度かつ多重化可能な検出を可能にする。α−インスリン抗体をＰＢＳ、ウシ胎児血清またはヒト唾液のいずれかで希釈してから、インスリン−ＤＮＡコンジュゲート体でＳＩＭＰＡＬ解析を行った（図９Ａ）。ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体とマウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体のいずれも、α−ビオチン抗体（図９Ｄ、左）もしくはα−マウスＩｇＧ抗体（図９Ｄ、中央）、または両方（図９Ｄ、右）のいずれかとともにインキュベートしてから、ＳＩＭＰＡＬ  ｑＰＣＲ解析を行った。凝集アッセイとＥＬＩＳＡアッセイを直接比較したところ、ＳＩＭＰＡＬの方が、感度が優れていることが示された（図９Ｂ）。等量のα−インスリン抗体をＰＢＳで希釈してから、ＳＩＭＰＡＬまたは直接ＥＬＩＳＡのいずれかによって解析した。試験でα−サイログロブリン抗体陽性であった患者から得たヒトサンプルを解析し、正常なヒト血漿と精製抗体と比較した（図９Ｃ）。α−ビオチンに結合したオリゴに対して特異的なプライマーセット１と、α−マウスＩｇＧに対して特異的なプライマーセット２を用いて、α−ビオチンのみ、α−マウスＩｇＧのみ、ならびにα−ビオチン及びα−マウスＩｇＧの両方を含むサンプルにおいて、ＳＩＭＰＡＬを行った（図９Ｄ）。試験でサイログロブリン自己抗体陽性であった患者から得た血漿（α−サイログロブリン陽性）と比較して、３つの別の希釈液（１：１０、１：１０００、１：１００，０００）で、プールした健常ヒト血漿（正常）に対してサイログロブリン−ＤＮＡコンジュゲート体による診断用抗体α−サイログロブリンの検出を行った（図９Ｅ）。抗サイログロブリン陽性ヒト血漿の同じサンプルをＡＤＡＰ、ＦＤＡに認可された放射線免疫アッセイ（Ｋｒｏｎｕｓ  ＲＩＡ）、ならびに２つの電気化学発光アッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ及びＲｏｃｈｅ  ＥＣＬ）によって解析した（図９Ｆ）。血清中の段階希釈アイソタイプＩｇＧの解析によって、ＡＤＡＰの特異性を調べたところ、検出可能なシグナルは観察されなかった（図９Ｇ）。エラーバーは、３つのサンプルの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、小さすぎて可視化できていない。
【０１８７】
抗インスリン抗体をウシ血清においてインスリン−ＤＮＡコンジュゲート体またはマウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体とともにインキュベートしてから、ＡＤＡＰによって解析した（図９Ｈ）。予測されるように、抗インスリン抗体は、インスリン−ＤＮＡコンジュゲート体を凝集させ、シグナルを生成させるが、マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体は凝集させない。マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体は、関連性のないこのタンパク質に対する親和性を有さないので、シグナルを生成させないからである。この結果から、ＡＤＡＰが、同種の抗原−抗体ペアに対して特異的であることが示されている。ＡＤＡＰと近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）による、抗抗原抗体の多重化された検出と、全抗体レベルの検出（図９Ｉ）：一定量の全ＩｇＧを含むが、抗ビオチン抗体の割合が異なるサンプルとともに、ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体と抗ＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体をインキュベートした。これらのサンプルをＡＤＡＰとＰＬＡによって解析した。エラーバーは、３つのサンプルの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、小さすぎて可視化できていない。
【０１８８】
ウサギ抗血清をＰＢＳで段階希釈することによって、ウサギ抗血清由来の抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）のＡＤＡＰによる検出と解析を行った（図９Ｊ）。抗原ナイーブ血清の希釈系列をネガティブコントロールとして解析した。
【０１８９】
（表２）オリゴヌクレオチド配列
2018512862.tif 000004
＊Ｕ＝デオキシリボウラシル
【０１９０】
上記によって、ＡＤＡＰには、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡを含む従来の抗体検出方法を上回る利点が多くあることが示されている。ＡＤＡＰでは、非常に小さい体積のサンプルを使用するとともに、溶液局面における試薬消費量が非常に少なく、洗浄工程がなく、反応は非放射性である。ＡＤＡＰパラメーターと、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡのパラメーターとの比較は、下記の表３に示されている。ＡＤＡＰとＥＬＩＳＡの値は、内部実験から算出した。ＲＩＡ値は、過去に報告された結果（例えば、Ｆａｌｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８６：８９−９９（この文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）参照）から割り出した。
【０１９１】
（表３）ＡＤＡＰ、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡのアッセイパラメーター：
2018512862.tif 000005
【０１９２】
実施例２：ビオチン抗体、ＤＮＰ抗体、ＩｇＧ抗体及びＧＦＰ抗体に対するＰＣＲベースの凝集−ライゲーションアッセイ
バッファー２μＬ中に１フェムトモルの各コンジュゲート体において、ＤＮＡリガーゼと架橋オリゴヌクレオチドを含む希釈溶液中で、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体をインキュベートし、この架橋オリゴヌクレオチドが、両方の鎖の中央の２０ｂｐ領域とハイブリダイズした。続いて、このライゲーション混合物を希釈し、１３ラウンドのＰＣＲによってプレ増幅した。その後、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎの検出を用いて、得られたＰＣＲ産物をｑＰＣＲによって解析した。凝集抗体の濃度に対する添加量依存性応答を観察したところ、検出限界は、約３７．５アトモルの抗体であった（図１１Ａ〜１１Ｃ）。ウシ血清で希釈した抗体において、同様の検出限界が観察された。対応するアイソタイプコントロールとともにインキュベートしたところ、いずれのケースでも、シグナルは生成されなかった。用いる配列の適用範囲の広さを確定するために、直交的なＤＮＡ−抗原コンジュゲート体セットを合成し、実験を繰り返した。この配列は、わずかに高い性能を発揮し、検出限界は、３．７５アトモルの抗体であった。
【０１９３】
タンパク質ベースの抗原で、この検出方策を試験した。マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体をα−マウスｐＡｂの希釈系列とともにインキュベートした。ライゲーション及びプレ増幅後、サンプルをｑＰＣＲによって解析した。抗体濃度に応じた添加量依存性シグナルが観察された（図１２Ａ〜１２Ｃ）。同様に、抗体と抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を血清においてプレインキュベートしたところ、検出効率に対する影響はみられなかった。
【０１９４】
アイソタイプコントロールでは、バックグラウンドを上回るシグナルは生成されなかった。ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体で、これらの実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた（図１３）。
【０１９５】
アッセイを多重で行うために、ビオチン（配列セット１）及びマウス−ＩｇＧ（配列セット２）を含む直交的な抗原−ＤＮＡコンジュゲート体セットを生成した。セット１プライマーが、セット２アンプリコンを増幅せず、セット２プライマーが、セット１アンプリコンを増幅しないように、これらのアンプリコンを設計した。２つの抗原−ＤＮＡコンジュゲート体をプールしてから、マウスＩｇＧのみ（図１４Ｂ）、ビオチンのみ（図１４Ａ）、またはこれらの両方（図１４Ｃ）のいずれかに結合する抗体とともにインキュベートし、続いて、凝集を解析した。抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートしたサンプルでは、セット１プライマーにおいてのみシグナルが示され、抗ＧＰＰ抗体とともにインキュベートしたサンプルでは、セット２プライマーのみでシグナルが示され、混合サンプルでは、両方のプライマーセットでシグナルが生成された（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【０１９６】
図１１Ａ〜１１Ｃ：α−ビオチン抗体によるビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集をｑＰＣＲによって検出する。バッファー（図１１Ａ、図１１Ｃ）または血清（図１１Ｂ）で希釈した様々な濃度のα−ビオチン抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに、ビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体をインキュベートした。続いて、サンプルをＤＮＡリガーゼで処理してから、ｑＰＣＲによって解析した。図１１Ｃでは、直交的なＤＮＡ配列を用いて、複製能を示した。Ｙ軸の値は、ブランクと比較したΔＣＴとして示されている。エラーバーは、トリプリケートの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、小さすぎて可視化できていない。
【０１９７】
図１２Ａ〜１２Ｃ：マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集をｑＰＣＲによって高感度に検出する。バッファー（図１２Ａ、図１２Ｃ）または血清（図１２Ｂ）で希釈した様々な濃度のα−マウスＩｇＧ抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに、マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート体をインキュベートした。続いて、サンプルをＤＮＡリガーゼで処理してから、ｑＰＣＲによって解析した。図１２Ｃでは、直交的なＤＮＡ配列を用いて、複製能を示した。Ｙ軸の値は、ブランクと比較したΔＣＴとして示されている。エラーバーは、トリプリケートの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、小さすぎて可視化できていない。
【０１９８】
実施例１及び２における上記の内容によって、ＡＤＡＰが、広範な抗原分子量に対応することが示されており、ビオチン（約０．２４ｋＤａ）、ＧＦＰ（２６ｋＤａ）及びマウスＩｇＧ（１５０ｋＤａ）に対する抗原−抗体ペアに対するアッセイがすべて示されている（図１７）。３つのすべてのペアにおいて、ＡＤＡＰでは一貫して、低アトモルの抗体が検出された（例えば、表１、図１１Ａ〜１１Ｃ、図１２Ａ〜１２Ｃ及び図１３を参照）。
【０１９９】
図１３：ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集をＰＣＲベースの凝集−ライゲーションアッセイによって検出する。バッファーで希釈した様々な濃度の抗ＧＦＰ抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに、ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体をインキュベートした。続いて、サンプルをＤＮＡリガーゼで処理して、ｑＰＣＲによって解析した。Ｙ軸の値は、ブランクと比較したΔＣＴとして示されている。いずれの実験も、トリプリケートで行った。抗ＧＦＰ抗体またはアイソタイプコントロール抗体を血清で希釈したところ、同様の結果が得られた。エラーバーは、トリプリケートの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、小さすぎて可視化できていない。
【０２００】
図１４Ａ〜Ｂ：抗原凝集の多重化された検出：直交配列を有するマウスＩｇＧ−ＤＮＡとビオチン−ＤＮＡコンジュゲート体をプールし、マウスＩｇＧのみ（図１４Ｂ）、ビオチンのみ（図１４Ａ）、またはマウスＩｇＧとビオチンの両方（図１４Ｃ）に結合する抗体とともにインキュベートした。Ｙ軸の値は、ブランクと比較したΔＣＴとして示されている。これらの結果から、ＡＤＡＰを用いる多重抗体検出の直交性が示されている。
【０２０１】
図１７：ＡＤＡＰは、広範な分子量分布にわたる抗原に結合するゼプトモルからアトモル単位の抗体を検出する。ＰＢＳまたはウシ血清に加えた抗体を解析することによって、抗ビオチン抗体（抗原分子量０．２４ｋＤａ）、抗インスリン抗体（抗原分子量５．８ｋＤａ）、抗ＧＦＰ抗体（抗原分子量２７ｋＤａ）及び抗マウスＩｇＧ抗体（抗原分子量１５０ｋＤａ）におけるＡＤＡＰの検出限界を割り出した。エラーバーは、３つのサンプルの標準偏差を表している。
【０２０２】
実施例３：多価抗体のＰＣＲベースの増幅／検出
本明細書に記載されているような凝集ベースアッセイによる、サンプル中の抗原結合物質の増幅と検出は、抗原結合物質の多価性に依存する。本明細書に記載されているようなＰＣＲベースの凝集アッセイにおけるポリヌクレオチド結合抗原を用いて、サンプルにおいて、濃度に依存する形で、ｑＰＣＲによって、多価ポリクローナル抗マウス抗体（ｐＡｂ  α−マウス）を検出及び定量した（図１５）。ポリクローナル抗体（ｐＡｂ  α−マウス）において、ロバストなシグナルが生成されたが、消化一価抗体断片（Ｆａｂ  α−マウス）とネガティブコントロール抗体断片（Ｆａｂコントロール）では、ＰＣＲベースの凝集アッセイにおけるポリヌクレオチド結合抗原を用いたｑＰＣＲでは、いずれの試験濃度でも、有意なシグナルは生成されなかった（図１５）。
【０２０３】
ポリヌクレオチド結合抗原との多価抗体複合体形成に増幅が依存する、ＰＣＲベースの増幅／検出アッセイでは、同程度の検出限界で、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体が検出された（図１６）。このようなアッセイでは、α−ＧＦＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とα−ＧＦＰポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の検出のダイナミックレンジは、同等ではなかった（ポリクローナル抗体では約６桁、モノクローナル抗体では４桁）ことから、ｐＡｂの検出と定量の方が、ｍＡｂの検出と定量よりもダイナミックレンジが広いことが示された。ｍＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）の定量曲線の変曲点には、サンプルにおいて、加えたｍＡｂの濃度が、加えた抗原−ＤＮＡコンジュゲート体の濃度とほぼ同等となる点が反映されており、理論に拘束されるものではないが、これによって、ｍＡｂの個々の分子間の抗原エピトープ結合部位に対する競合を示すことができる。これらの所見によって、記載したアッセイにおける機構的挙動または凝集が明らかになるとともに、異なるダイナミックレンジを予測できるとはいえ、ＡＤＡＰは、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方の検出に非常に適していることも示されている。
【０２０４】
図１５：ポリヌクレオチド結合抗原を用いるｑＰＣＲ増幅／検出による、様々な濃度の多価ポリクローナル抗マウス抗体（ｐＡｂ  α−マウス）と一価抗マウス消化Ｆａｂ断片（Ｆａｂ  α−マウス）の検出と定量の比較。
【０２０５】
図１６：ポリヌクレオチド結合抗原を用いるｑＰＣＲ増幅／検出による、様々な濃度のポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ｐＡｂ）とモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（ｍＡｂ）の検出と定量の比較。
【０２０６】
図１５及び図１６のいずれにおいても、エラーバーは、３つのサンプルの標準偏差を表しているが、多くのデータポイントでは、エラーバーは、小さすぎて可視化できていない。
【０２０７】
実施例４：抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉の回避
ＡＤＡＰにおける内因性抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉を調べた。このような抗体は潜在的に、抗原に依存しない形で、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を凝集させることができ、その結果、偽陽性が生じる。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫性障害の患者は、高力価で抗ＤＮＡ抗体を産生することが多い。抗ＤＮＡ抗体は概して、健常な成人の約１０％にも少量で存在する。
【０２０８】
抗ＤＮＡ抗体を有することが独立して実証された患者血漿を得た。患者血漿よりもかなり低いレベルの抗ＤＮＡ抗体を有するネガティブコントロールとして、正常血漿も得た。ヒト血漿には、天然の抗ＧＦＰ抗体は存在しないはずなので、ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体をコントロール抗原として用いて、抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉の程度を観察した。
【０２０９】
予測されるように、抗ＤＮＡ陽性患者血漿からは強力なシグナルが観察され、正常血漿からも、弱いものの、ロバストなシグナルが観察され（図１８Ａ）、これらの抗体が、ＡＤＡＰ解析を妨げ得ることが示された。興味深いことに、抗ＧＦＰ抗体に加えた後、抗ＤＮＡ陽性患者血漿と正常血漿の両方において、同じ添加量応答曲線が観察された（図１９）。この観察結果は、抗ＤＮＡ抗体の存在にかかわらず、高親和性抗ＧＦＰ抗体が凝集イベントとＡＤＡＰシグナルを支配するという見解と一致している。
【０２１０】
十分に慎重を期して、抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉の可能性を回避する一般的な解決策を模索した。そのために、遊離ＤＮＡを競合物質として滴下して、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を偽凝集から「保護」した（図１８Ｂ）。１００μＭの競合ＤＮＡでは、抗ＤＮＡ抗体からの偽シグナルは観察されなくなった（図１８Ｂ〜１８Ｃ）。競合ＤＮＡがＡＤＡＰの性能を低下させないことを確認するために、抗ＧＦＰ抗体と競合ＤＮＡの両方を抗ＤＮＡ陽性血漿と正常血漿に加えた（図１８Ｄ）。これらのサンプルのＡＤＡＰ解析によって、抗ＤＮＡ抗体からの干渉がない予測添加量応答が示された。ヒト血漿における抗ＧＦＰ抗体の検出限界は、バッファーにおける検出限界と同等であった（それぞれ、４８アトモルおよび２７アトモル；前者はヒト血漿の検出限界が３．６±０．５ｎｇ／ｍｌであったことを示している）。また、これらの結果は、競合ＤＮＡを加えると、ヒト血漿サンプルにおいて干渉を回避できるようになることが示されている。
【０２１１】
図１８Ａ〜１８Ｄ：遊離ＤＮＡとの競合による、抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉の回避。抗ＤＮＡ自己抗体からの干渉の調査：ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体を用いて、抗ＤＮＡ陽性患者血漿と健常な正常血漿を解析した（図１８Ａ）。抗一本鎖ＤＮＡ抗体（ｓｓＤＮＡ）を含むグループと、抗ｄｓＤＮＡ抗体（ｄｓＤＮＡ）を含むグループに、患者サンプルを分けた。いずれのサンプルタイプにおいても、希釈係数１及び１０で、干渉を観察した（図１８Ｂ）。競合ＤＮＡを未希釈の患者血漿と正常血漿に滴下した。競合ＤＮＡを加えることによって、バックグラウンドシグナルが抗体に干渉することを排除した。図１８Ａにおける実験を繰り返した（ただし、干渉を排除する１００μＭの競合ＤＮＡを加えた）（図１８Ｃ）。精製ＧＦＰ抗体を抗ＤＮＡ陽性血漿と正常血漿に加えた。すべてのサンプルにおいて、１００μＭの競合ＤＮＡの存在下で、ＧＦＰ抗体の検出を行って、ＡＤＡＰの性能を損なわないことを確認した（図１８Ｄ）。
【０２１２】
図１９：抗ＤＮＡ血漿と正常血漿における抗ＧＦＰ抗体の、競合ＤＮＡを用いない検出：抗ＧＦＰ抗体を抗ＤＮＡ血漿または正常血漿で希釈してから、ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体をプローブとして用いたＡＤＡＰによって解析した。図１８Ａに示されているように、抗ＤＮＡ血漿と正常血漿では、１：１希釈液と１：１０希釈液において干渉が観察されるが、抗ＧＦＰ抗体の存在下では干渉は観察されない。これは、高親和性抗ＧＦＰ抗体がＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体の凝集を支配し、それによって、抗ＤＮＡ抗体からの干渉を阻止することによるものと見られる。
【０２１３】
実施例５：抗原−ＤＮＡコンジュゲート体の合成
高感度ＡＤＡＰアッセイの中核は、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体の作製である。タンパク質抗原では、これらの成分は、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）とチオール化オリゴヌクレオチドを用いて、リジン−チオール架橋によって合成した。簡潔に述べると、ＰＢＳにおけるスルホ−ＳＭＣＣとの反応によって、マレイミドを精製抗原のリジンに導入した（図２０）。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を介した還元によって、チオール化オリゴヌクレオチドを活性化した。抗原とオリゴヌクレオチドの両方を脱塩し、プールし、一晩反応させた。サイズ排除スピンカラムを用いた高度な精製によって、未反応試薬を除去した。抗原とＤＮＡのコンジュゲート比を紫外・可視分光法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって割り出した。典型的には、１：２の抗原・ＤＮＡコンジュゲート比によって、ＡＤＡＰアッセイにおいて最適なシグナルが生成された。抗原−ＤＮＡコンジュゲートの程度が高いほど、抗体結合のためのエピトープを遮蔽する傾向があるので、それにより、アッセイ感度が低下することが明らかとなった（図２２）。
【０２１４】
小分子抗原では、１段階コンジュゲートで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル活性化誘導体をアミン修飾オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした（図２３）。得られた小分子−ＤＮＡコンジュゲート体を高分解能質量分析によって特徴付けた。タンパク質ベースの抗原とは対照的に、小分子は、そのサイズにより、含まれる抗体エピトープがかなり少ない。したがって、エピトープの抗体への到達性を保持したままのコンジュゲート部位を設計するのが重要である。ジニトロフェノール（ＤＮＰ）−ＤＮＡコンジュゲート体においては、同じコンジュゲート部位を用いて、試験抗体（ＤＮＰがリジン側鎖に連結されたＤＮＰ−ＢＳＡコンジュゲート体）に対する免疫原を生成した。
【０２１５】
図２２：抗原：ＤＮＡコンジュゲート比がＡＤＡＰの性能に及ぼす作用：低い抗原：ＤＮＡ比（１：２）または高い抗原：ＤＮＡ比（１：６）のいずれかで、オボアルブミン（ＯＶＡ）−抗原ＤＮＡコンジュゲート体を合成した。オボアルブミンコンジュゲート体をモノクローナル抗ＯＶＡ抗体のバッファーでの希釈系列とともにインキュベートし、ＡＤＡＰ解析を行う。過剰にコンジュゲートしたオボアルブミンでは、アッセイ性能が有意に低下したことが示され、普通にコンジュゲートしたオボアルブミンでは、予測されるように、濃度依存的なシグナルが示された。理論に拘束されるものではないが、これは、抗原をオリゴヌクレオチドと過剰コンジュゲートしたときのエピトープの遮蔽によるものとみられる。
【０２１６】
図２３：小分子−ＤＮＡコンジュゲート体を合成するための反応スキーム：スクシンイミジルエステル活性化ＤＮＰをアミン修飾ＤＮＡと１工程で反応させることによって、ＤＮＰ−ＤＮＡコンジュゲート体を合成する。続いて、このコンジュゲート生成物を質量分析法によって特徴付ける。
【０２１７】
実施例６：ＡＤＡＰアッセイによる口腔サンプルのＨＩＶスクリーニング
ＨＩＶスクリーニングを受ける個体数が増えると、感染性の高い伝染源を公衆衛生官が遮断する能力が向上する。血清／血漿ベースのＨＩＶ検査は、確定診断のための標準的な方法であるが、この形式で採取できるサンプルの数は、低コンプライアンスと安全性の問題により、限られている。口腔流体サンプルは、採取プロセスが非侵襲的であるとともに、はるかに安全であるので、より大きな集団から得ることができる。
【０２１８】
しかしながら、口腔流体中の抗体レベルは、血清または血漿で見られるレベルよりも約１０００倍低い。現在ＦＤＡに認可されている口腔流体検査は、ＨＩＶ感染後の最初の２〜６週間（患者が、ＨＩＶを移す可能性が最も高い期間）以内に、極めて低レベルの抗体を検出するには、解析感度が不足している。非常に低いレベルの抗体を検出できる高感度な口腔流体アッセイであれば、この重要なウィンドウ期に患者を特定できると同時に、スクリーニングを受け得る患者の数が増大する。
【０２１９】
この課題に対応するために、ＨＩＶに特異的な抗原−ＤＮＡコンジュゲートプローブ（ｐ２４、ｇｐｌ２０、ｇｐｌ６０、ｇｐ４１、ｇｐ３６など）を用いるＨＩＶ特異的ＡＤＡＰアッセイを設計した。ＨＩＶに関して、口腔流体中の抗体を検出するためのアッセイでは、宿主の免疫応答におけるＨＩＶが動的プロセスであることを考慮する必要がある。Ｂ細胞が、まずＩｇＭを放出し、その後、クラススイッチを起こして、ＩｇＧを産生する。ごく初期の段階にこの疾患を特定するためには、口腔流体アッセイは、両方のアイソタイプにおけるウイルス特異的抗体を検出する必要がある。ＡＤＡＰでは、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体の多価性と凝集力を利用して、抗体−抗原結合において、増幅可能なｄｓＤＮＡの形成を促すので、両方の抗体アイソタイプを検出するのに非常に適している。この方法によるＨＩＶの検出の難しさを構成しているのは、口腔サンプル中の抗体が本来的に低いレベルであることと、感染したばかりの個体におけるウイルス特異的抗体のレベルが低いことが重なっていることである。
【０２２０】
初期検査で、ＡＤＡＰは、２μｌのサンプルにおいて、数アトモルの抗ｐ２４抗体（ＨＩＶ感染個体から精製したもの）を検出することが示された（図２４Ａ）。２つの異なる関連抗体（抗ｇｐ１２０及び抗ｐ２４）の多重化された検出も示された（図２４Ｂ）。
【０２２１】
さらに大規模な検査では、４４個の保存口腔流体サンプルからなるコホートにおいて、ＡＤＡＰによって、抗ｐ２４抗体と抗ｇｐ１２０抗体の存在をアッセイした（図２５及び図２６）。このような検査により、ＨＩＶ陽性患者集団において、有意に高いレベルの抗ｐ２４及び抗ｇｐ１２０が検出されたことが明らかになり、設計したＡＤＡＰアッセイによって、ＨＩＶ陽性集団を正常な口腔サンプル集団と区別できることが示された。両方の抗原を併せて検討したところ、このアッセイでは、感度は９５％、特異性は１００％であった。さらに、ネガティブコントロール（ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲート体）では、ＨＩＶ陽性患者集団とＨＩＶ陰性患者集団との間に有意な差は見られなかった。
【０２２２】
これらの結果から、ＡＤＡＰアッセイが、実際の口腔サンプルにおいて、ＨＩＶ抗体を検出する機能を果たすことが示されている。
【０２２３】
図２４Ａ〜２４Ｂ：ＡＤＡＰ技術による、抗体の超高感度検出：ＡＤＡＰは、抗ｐ２４抗体を検出し、２μＬのサンプルにおいてアトモルレベルの感度を示す（図２４Ａ）。アイソタイプコントロール抗体を添加した血清をアッセイすることによって、ＡＤＡＰの特異性を確認した。ネガティブコントロール実験からはシグナルは検出されなかった。抗ｇｐ１２０抗体と抗ｐ２４抗体の多重化された検出（図２４Ｂ）：Ｇｐ１２０抗原とｐ２４抗原をＤＮＡ配列でコードし、それぞれプライマー１またはプライマー２のいずれかによって増幅した。それらの同種抗体は、ｇｐｌ２０ではプライマー１（破線の棒）またはｐ２４ではプライマー２（無地の棒）を用いて、ＡＤＡＰアッセイによって検出される。技術的複製に起因する、個々のデータポイントのエラーバーの大半は、小さすぎて見えない（ΔＣｔ：サイクル閾値の変化（コントロールサンプルに対するｑＰＣＲシグナルを記録する標準的な手段））。
【０２２４】
図２５：ヒト口腔流体サンプルにおけるＡＤＡＰベースの抗体検出：抗ｇｐ１２０（左）またはｐ２４抗体（中央）を検出するＡＤＡＰアッセイは、ＨＩＶ陽性集団（「ｐ」）とＨＩＶ陰性集団（「ｎ」）に分ける。抗ＧＦＰ抗体（右）を検出するＡＤＡＰアッセイでは、これらの２つの集団間の差はあまり見られない。
【０２２５】
図２６：ｇｐｌ２０及びｐ２４に基づく臨床的感度と特異性：４４個の口腔流体サンプルに対する初期ＡＤＡＰアッセイでは、１μＬの口腔流体を用いたところ、９５％の感度、１００％の特異性が実現された。追加の抗原（例えば、ｇｐ１６０及びｇｐ４１）を含めると、アッセイの性能がさらに高まる（●＝陽性口腔流体、〇＝陰性口腔流体）。
【０２２６】
実施例７：多重抗体検出
単一のサンプルの少量のアリコートから得た多数の異なる抗体を並列検出するために、多重抗体探索キットを設計した。自己免疫疾患と関連する最も一般的な抗原を含む９６個の抗原（代表的な例としては、サイログロブリン、Ｃ１ｑ、ＭＰＯ、トランスグルタミナーゼ、Ｓｍ／ＲＮＰ、ＧＡＤ６５、Ｒｏ／ＳＳＡ、ＪＯ−１、ＩＡ−２、Ｌａ／ＳＳＢ、ＰＲ３、Ｓｍ  Ｂ／Ｂ’、ＣＥＮＰ−Ａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ−Ｃ、グリアジン、ヒストンＨ３、Ｈ２Ｂ、ＳｍＤ、ヒストンＨ４及びインスリンＨが挙げられる）を用いて、初期の９６ウェル検出プレートベースのアッセイを設計した。
【０２２７】
まず、抗原−ＤＮＡコンジュゲートのために、抗原を分子量によって２つのグループに分類する（「グループＡ」＝分子量９ｋＤａ超、「グループＢ」＝分子量９ｋＤａ未満）。
【０２２８】
様々な異なる抗原をそれぞれ独立して、特有のプライマー結合領域と、架橋オリゴヌクレオチドの半分に対して相同性を有する末端のユニバーサルな領域を含む特有のポリヌクレオチドにコンジュゲートする。ユニバーサルな配列によって、すべての抗原のライゲーション工程において、同じ架橋オリゴを使用可能になる。２つの特有のプライマー部位（すなわち、架橋オリゴによって連結された各ポリヌクレオチド上の部位）が、各抗原の同一性を定義する。記載されている方法は、優れた潜在的な多重能力を有し、したがってそれほど制限されないが、ここで説明されている実施形態では、従来の９６ウェルのｑＰＣＲ増幅及び検出器具に適合させるために、９６重の初期形態を用いた。
【０２２９】
抗原−ＤＮＡコンジュゲート体の形成を促すための過剰なＤＮＡ（１３ｋＤａ）を用いることによって、グループＡ由来の抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を合成する。過剰なＤＮＡは、ＭＷＣＯ２０ｋＤａのフィルタープレートによって、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体（２２ｋＤａ超）から分離する。反応生成物の形成を促すための過剰な抗原を用いることによって、グループＢの抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を合成する。ＭＷＣＯ１０ｋＤａのフィルタープレートによって、遊離抗原（９ｋＤａ未満）を抗原−ＤＮＡコンジュゲート体（少なくとも１３ｋＤａ）から分離する。
【０２３０】
グループＡおよびグループＢの例示的な抗原として、それぞれヒストンＨ３（１５ｋＤａ）およびインスリン（５．８ｋＤａ）についてこのプロセスを説明する。簡潔に述べると、ヒストンＨ３では、５モル当量のスルホ−ＳＭＣＣを１ｍｇのヒストンＨ３とともに２時間、室温でインキュベートする。同時に、１００μＭのチオール化ＤＮＡをＤＴＴとともに１時間、３７℃でインキュベートする。ヒストンとＤＮＡの両方を、（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．から入手可能なような）脱塩プレートによって、未反応小分子から分離する。続いて、活性化ヒストンとＤＮＡを一晩、４℃でインキュベートする。次に、その反応混合物をＭＷＣＯ２０ｋＤａの９６ウェルフィルタープレートに分注し、未反応ＤＮＡから効率的に分離する。生成物の純度と、プレートの個々の各ウェルからの収量は、電気泳動及び紫外・可視分光法によって確認できる。
【０２３１】
ＭＷＣＯ１０ｋＤａのカットオフフィルタープレートを用いて、インスリン−ＤＮＡコンジュゲート体を同様に調製する（ただし、主な違いは、過剰な抗原を、限られたＤＮＡとともにインキュベートする点である）。したがって、ＭＷＣＯ１０ｋＤａのフィルタープレートを用いて、ヒストンＨ３に関して説明したようなＤＮＡではなく、抗原を除去する。
【０２３２】
２４ウェルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と銀染色によって、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体のコンジュゲート効率について特徴付けることができ、銀染色によって、３つのすべての成分（抗原−ＤＮＡコンジュゲート体、未コンジュゲート抗原、遊離ＤＮＡ）を可視化できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、純粋抗原との移動度の差を比較することによって、抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を確認できる。抗原に対するＤＮＡコンジュゲート比は、紫外・可視分光法とＢＣＡアッセイによって確認でき、紫外・可視分光法では、ＤＮＡ量に関する情報が明らかになり、ＢＣＡアッセイでは、タンパク質濃度について明らかになる。（適切な標準物質との）これらの２つの測定間の比によって、コンジュゲート比が示され、この実施形態では、１：２の抗原：ＤＮＡ比が目標とされる。
【０２３３】
広範な抗原分子量（例えば、９ｋＤａ（インスリン）、２９ｋＤａ（ＧＦＰ）、６５ｋＤａ（ＧＡＤ６５）及び６６０ｋＤａ（サイログロブリン））にわたって、良好な抗原−ＤＮＡコンジュゲートが行われた。加えて、膜タンパク質抗原（概して疎水性が高い）による抗原−ＤＮＡコンジュゲート体も良好に生成された（例えば、ｇｐ１２０）。
【０２３４】
開発した多重ＡＤＡＰアッセイをヒト患者血清サンプル（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者及び関節リウマチ（ＲＡ）患者のサンプルを含む）で確認する。アッセイでは、ＳＬＥ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ、Ｊｏ−１、Ｒｏ−５２）及びＲＡ患者で産生されることが知られている抗体に結合する必須の自己抗原を含む。多重化ＡＤＡＰアッセイを用いて得られた結果と、感度の向上は、同じサンプルを用いたタンパク質マイクロアレイに対して、独立して確認できる。
【０２３５】
一般的な多重アッセイプロトコールでは、２μＬのサンプルを２μＬのプローブ（併せてプールした９６個のすべての抗原−ＤＮＡコンジュゲート体を含む）と１５分混合する。次に、１１６μＬのライゲーション混合物（ユニバーサルな架橋オリゴ、リガーゼ及びバッファーを含む）を加える。このライゲーション工程は、３０℃で１５分行う。得られたライゲーション生成物を９６ウェルのｑＰＣＲプレートに分注する（このプレートの各ウェルには、特有のプライマー対が予め充填されている）。ｑＰＣＲマスターミックスを２０μＬの最終体積まで加えることによって、標準的なｑＰＣＲ装置で定量を行う。プロセス全体に必要なサンプル消費量は最小限であり、標準的な研究設備を用いて、２時間未満で完了できる。
【０２３６】
本発明の具体的な実施形態を参照しながら、本発明について説明してきたが、当業者であれば、本発明の真の趣旨と範囲から逸脱しなければ、様々な変化を加えてよいとともに、均等物に置き換えてよいことを理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つのプロセス工程または複数のプロセス工程を本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために、多くの修正を加えてよい。このようないずれの修正形態も、添付の請求項の範囲内であるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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