(57)【要約】本開示の実施形態は、発現構築物の使用に関連し、構築物中、少なくとも１つのポリＡシグナルは、発現可能な転写物の上流、例えば、転写物の５’ＵＴＲ内に埋め込まれている。ある特定の実施形態において、ポリＡシグナルは、リガンド結合アプタマーに含まれていて、リガンドがアプタマーに結合すること、または結合がないことにより、発現可能な転写物の帰結が指示される。特定の実施形態において、リガンドが不在の場合、５’ＵＴＲにポリＡを有する発現転写物は、発現するがその後分解される一方、リガンドの存在は、発現可能な転写物が発現した際に分解を阻害する。複数のリガンド結合アプタマーが、同一発現構築物上に存在することができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現の調節のためのシステムであって、該ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって：
ａ）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び
ｂ）発現可能なポリヌクレオチド
を含む、
システム。
【請求項２】
前記ポリＡ切断シグナルを含む前記リガンド結合アプタマーは、前記発現可能なポリヌクレオチドの５’非翻訳領域内に存在する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記システムは、前記リガンドを発現するポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記リガンドを発現する前記ポリヌクレオチドは、前記アプタマー及び発現可能なポリヌクレオチドを含む前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドと同一のものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記リガンドを発現する前記ポリヌクレオチドは、前記アプタマー及び発現可能なポリヌクレオチドを含む前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、前記発現可能なポリヌクレオチドの前記５’非翻訳領域に、２つ、３つ、またはそれより多くのポリＡシグナルを含む、請求項３から６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは：
ａ）少なくとも１つのポリＡシグナル；
ｂ）前記少なくとも１つのポリＡシグナルを含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び
ｃ）少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域、少なくとも１つのＧリッチ領域、または少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域と少なくとも１つのＧリッチ領域の両方、
を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、前記リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＧリッチ領域の上流に存在する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、前記リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＧリッチ領域の上流に存在する、請求項３に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、前記アプタマーは、２つのポリＡシグナル及び２つのＵ／ＵＧリッチ領域を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くのアプタマーを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、５’から３’の直線方向で、同じ方向を向いている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、５’から３’の直線方向で、異なる方向を向いている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つのＧリッチ領域を含む、請求項１４から１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記Ｇリッチ領域は、前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって最も３’側のアプタマー中にある、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記Ｇリッチ領域は、前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって２番目のアプタマー中にある、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つ以上のアプタマー間で塩基対形成していない、請求項１４から１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つ以上のアプタマー間で塩基対形成している、請求項１４から１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの２つの異なるアプタマーのループの少なくとも一部の間で、塩基対形成している、請求項１４から２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
アプタマー内の２つのループ間のヌクレオチド数は、１０〜２５ヌクレオチドである、請求項１から２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
アプタマー内の２つのループ間のヌクレオチド数は、１８〜２０ヌクレオチドである、請求項１から２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
前記リガンドは、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、薬物、代謝産物、またはそれらの組み合わせである、請求項１から２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
アプタマーは、長さが、１４〜２５０ヌクレオチドである、請求項１から２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子、治療遺伝子、または細胞の代謝状態を変更する産物をもたらす遺伝子である、請求項１から２６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、ベクターの少なくとも一部分である、請求項１から２７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２９】
前記リガンドを発現する前記ポリヌクレオチドは、ベクターの少なくとも一部分である、請求項３に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、または直鎖ＤＮＡである、請求項２８または２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、前記リガンドをコードする、請求項１から３０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記発現可能なポリヌクレオチドの発現は、組織特異的プロモーターにより制御される、請求項１から３１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３３】
遺伝子発現の調節方法であって、以下の工程：
ａ）システムを用意する工程であって、前記システムはポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含み、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは５’から３’に向かって：
１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；
２）発現可能なポリヌクレオチド；及び
３）任意選択でリガンド発現構築物；を含む工程、及び
ｂ）前記システムを適切な条件に供する工程であって、前記発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡが所望のものでない場合、前記リガンドは、前記リガンド結合アプタマーに結合しないか、または前記システムもしくはその環境に存在せず、かつ前記発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解される工程；または
ｃ）前記リガンド発現構築物を含む前記システムを適切な条件に供する工程であって、前記発現可能なポリヌクレオチドの発現が望まれる場合、前記リガンドは、前記アプタマーに結合する、及び／または前記システムもしくはその環境に存在し、かつ前記発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解されない工程、
を含む、方法。
【請求項３４】
遺伝子発現の調節方法であって、以下の工程：
ａ）システムを用意する工程であって、前記システムはポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含み、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは５’から３’に向かって：
１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；
２）発現可能なポリヌクレオチド；及び
３）任意選択でリガンド発現構築物；を含む工程、及び
ｂ）前記システムを適切な条件に供する工程であって、前記リガンドが、前記システムもしくはその環境に存在しない、または前記リガンド結合アプタマーに結合しない場合、前記発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解される前記工程；または
ｃ）前記リガンド発現構築物を含む前記システムを適切な条件に供する工程であって、前記リガンドが前記アプタマーに結合する場合、前記発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解されず、かつ遺伝子産物は、前記発現可能なポリヌクレオチドから発現可能である工程、
を含む、方法。
【請求項３５】
前記方法は、細胞中で行われる、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記リガンドは、前記細胞にとって内因性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は、幹細胞、癌細胞、または遺伝子の遺伝子治療を必要とする疾患細胞もしくは欠損細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子は、ジストロフィン、アルブミン、または第ＩＸ因子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項３３から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法は、哺乳類で行われる、請求項３３から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、個体の１つまたは複数の細胞で行われ、前記リガンドは、グルコースであり、前記個体は、糖尿病、糖尿病前症、もしくは糖尿病合併症を有しており、及び／または前記発現可能なポリヌクレオチドは、インシュリンである、請求項３３から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法は、個体の１つまたは複数の細胞で行われ、前記リガンドは、癌バイオマーカーの遺伝子産物であり、かつ前記発現可能なポリヌクレオチドは、自殺遺伝子である、請求項３３から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法は、個体で行われ、前記発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子であり、前記レポーター遺伝子の前記発現の場所及び／または強度は、前記個体の１つまたは複数の細胞中のリガンドの、空間分布、時間変動、またはこれらの両方に関する情報を提供する、請求項３３から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
さらに、前記リガンドと適切に結合する前記アプタマーを設計する工程を含む、請求項３３から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法は、個体、組織、または細胞で行われ、前記発現可能なポリヌクレオチドは、検出可能な遺伝子産物をコードし、前記個体、組織、または細胞の個々がイメージングされる、請求項３３から４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
個体用治療のモニタリング方法であって、前記個体に：
ａ）ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、：
１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び
２）発現可能なポリヌクレオチド；を含む、ベクター、及び／または
ｂ）前記ａ）のベクターを含む１つまたは複数の細胞、
を提供する工程を含み、
前記リガンドは、前記治療の有効性の指標であるタンパク質の特定遺伝子産物である、方法。
【請求項４９】
前記ａ）のベクター及び／または前記ｂ）の細胞は、前記治療前、前記治療中、及び／または前記治療後に、前記個体に提供される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
個体における病的状態の存在、危険性、または易罹患性のアッセイ方法であって、前記個体に以下：
ａ）ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、：
１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び
２）発現可能なポリヌクレオチド；を含む、ベクター、及び／または
ｂ）前記ａ）のベクターを含む１つまたは複数の細胞、
を提供する工程を含み、
前記発現可能なポリヌクレオチドの発現、または発現可能なポリヌクレオチドの発現の不在は、前記リガンドが存在して前記アプタマーと結合したかどうかを同定し、前記個体またはその細胞中の前記リガンドの個々の存在または不在は、前記病的状態の存在、易罹患性、または危険性の指標である、方法。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが５’から３’に向かって、以下：
ａ）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び
ｂ）発現可能なポリヌクレオチド
を含む、ポリＡアプタマーポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記リガンド結合アプタマーは、前記発現可能なポリヌクレオチドの５’非翻訳領域に位置する、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、さらに、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域、少なくとも１つのＧリッチ領域、または少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域と少なくとも１つのＧリッチ領域の両方を含む、請求項５０または５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、前記リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＧリッチ領域の上流に存在する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、前記リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＧリッチ領域の上流に存在する、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項５１から５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項５９】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
前記細胞は、ヒトに存在する、請求項５８から６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
請求項１から３２のいずれか１項に記載のシステムを含む、細胞。
【請求項６３】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６４】
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である、請求項６３に記載の細胞。
【請求項６５】
請求項５１から４５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項６６】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６７】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項６６に記載のベクター。
【請求項６８】
前記ベクターは、プラスミドである、請求項６５に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号第６２／２５４，４３５号の優先権を主張し、この出願はそのまま全体が、本明細書中に参照として援用される。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により認められた１ＲＯ１ＥＢ０１３５８４−０２の下、政府支援でなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の実施形態は、少なくとも、細胞生物学、分子生物学、遺伝子調節、遺伝子治療、幹細胞治療、医薬、分子イメージング、バイオセンサー、及び診断法に関する。
【背景技術】
【０００４】
導入遺伝子の発現を正確に制御する能力は、特定遺伝子産物の機能を解明するために、または安全範囲内で治療タンパク質を生成させるために、常に不可欠であった。現在、複数の遺伝子制御システムが利用可能であり１−３、それらは、非常に強力な実験道具であることが実証されている。しかしながら、それらの有用性にも関わらず、そのようなシステムは、ハイブリッド転写トランスアクチベーター及び専用プロモーターに依存しているために、いくらか実用面の制約を抱えている。そのような制約として、以下が挙げられる：（ｉ）２つの転写単位を必要とすること、１つはトランスアクチベーター発現のためのもの、もう一つは制御しようとする導入遺伝子の発現のためのものであり、結果として、このようなシステムを使用するには、２つの発現構築物を同時に導入する必要がある。（ｉｉ）ハイブリッドトランスアクチベーターの発現に由来する毒性の可能性（例えば、外来タンパク質であるトランスアクチベーターに向けられた宿主免疫応答の誘導、内因性転写に対するトランスアクチベーターの効果など）。（ｉｉｉ）専用プロモーターを必要とするが故の、そのようなシステムを組織特異的様式で遺伝子制御に応用することの難しさ。（ｉｖ）実験及び治療用途に利用可能な小分子インデューサーの数が限られていること（利用可能なシステムの数が限られているため）。こうした制約は、ＲＮＡのみを含む、本質的にＲＮＡのみからなる、またはＲＮＡのみからなり、どのようなトランスアクチベータータンパク質も専用プロモーターも含まない遺伝子制御システムにより克服することが可能である。遺伝子発現を制御するための完全にＲＮＡに基づく機構の存在が、報告されている。詳細には、自己触媒的リボザイムの調節に基づくシステムが記載されており４、これは、遺伝子治療及び生物学研究においてより幅広く応用できるＲＮＡのみのシステムの開発に合理的な説得力を与えている。
【０００５】
トランスアクチベーターを使用した転写制御に基づく遺伝子制御システムとは対照的に、本明細書中提供されるポリＡに基づくシステムは、どのようなタンパク質トランスアクチベーター産物の発現も必要とせず、どのような専用プロモーター配列要素の使用にも依存せず、したがって、理論的には、任意の内因性遺伝子または改変ベクター転写単位に「埋め込む」ことができる「ポータブル」制御システムとなる。そのため、本システムは、１つの転写単位（１つの発現構築物）しか必要とせず、本システムを使用することで組織特異的（空間的）及び時間的様式で導入遺伝子を制御することができるようなプロモーター順応性がある。ポリアデニル化は、全ての哺乳類細胞で起こる普遍的過程であるため、記載される本システムは、広く応用可能である。
【０００６】
既存技術の限界故にフル活用されていなかった遺伝子制御の別の重要な応用領域は、遺伝子制御システムを使用して、特定細胞タンパク質の発現または病的事象をｉｎ  ｖｉｖｏで検出するバイオセンサーとして機能させる能力である。そのようなバイオセンサープラットフォームは、生体分子レベルでの変動に関するｉｎ  ｖｉｖｏでの時間的情報及び空間的情報を提供することが可能であり、インプット情報を使用して、細胞の挙動を調節するあるいはイメージングまたは検出のためのレポーターシグナルを生成させることができる。例えば、リガンドとして発癌性タンパク質と結合する遺伝子制御システムは、結合に反応して、遺伝子の特定セットのスイッチのオンオフを切り替える。こうした遺伝子は、定量的検出またはイメージングのためのレポーターシグナルを生成させること、代謝経路の課程に影響を及ぼすこと、または治療タンパク質を発現させることができる。特定細胞タンパク質の分子センシングは、疾患の根底にある生細胞の生化学的異常を描出することを可能にすると思われる。そのような技術は、特定マーカータンパク質の発現をモニタリングすることにより、臨床治療の進行をモニタリングするのに有用であると思われ、さらに、特定の実施形態においては、新規治療パラダイムの試験及び開発を可能にする重要なプラットフォームを形成する。そのうえさらに、そのような技術は、生物学的過程ならびに疾患発症における特定遺伝子産物の役割を理解するのに有用であると思われる。
【０００７】
現代のプロテオミクス技術は、内因性細胞タンパク質を可視化または同定する有用な方法を複数提供してきた。質量分析５などの方法は、哺乳類の細胞または組織に存在する数百のタンパク質分子の同定を可能にする。しかしながら、これらの方法は、その過程において細胞及び組織を破壊し、生きた動物またはヒト中の特定細胞タンパク質を検出することを目指す目標とは相容れない。シグナル生成モチーフと結合した抗体を使用する方法は、細胞膜外の特定タンパク質を可視化するのには有力であるものの、生細胞内で発現タンパク質の大部分を占める細胞内タンパク質を検出またはイメージングするのには不適切である。ｉｎ  ｖｉｖｏで特定生体タンパク質を検出する有用な方法がないことは、バイオセンシングのための新規戦略が必要であることを指摘するものであり、そのような新規戦略があれば、基礎的生物学過程及び疾患状態を理解するのに大きな影響を与えると思われる。
【０００８】
本開示は、生来タンパク質の発現を検出するため、及びまた生細胞中の関心対象の遺伝子を制御するために、ＲＮＡスイッチに基づくアプローチを使用する方法及びシステム及び組成物を提供することで、当該分野の長年の切実な要求を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の実施形態は、ポリアデニル化のアプタマー介在型調節を用いた遺伝子制御の外因的制御に関する。本開示の実施形態は、リガンドがポリＡシグナルを包含するアプタマーに結合するというゲートキーパー作用により統制されるポリＡ切断の調節を介した、哺乳類遺伝子発現に関する。
【００１０】
本開示の実施形態は、ポリアデニル化のアプタマー介在型調節を用いた、特定ポリヌクレオチドの発現を制御する分子スイッチに関する。特定の実施形態において、分子スイッチは、５’ＵＴＲポリＡシグナルに基づいたＲＮＡスイッチ（本明細書中、ポリＡスイッチまたはポリＡセンサーと称する場合もある）である。
【００１１】
特定の実施形態において、本開示のシステムは、生細胞、組織、または生体で１つまたは複数の細胞内「署名」（ｓｉｇｕｎａｔｕｒｅ）を検出するバイオセンサーシステムとして利用される。「署名」は、問題になっている１つまたは複数の遺伝子の発現；１種または複数の内因性で生成した化合物、例えばタンパク質または代謝産物などの有無；疾患状態、または正常状態、または治療効果、あるいはそれらの組み合わせの指標となる分子（複数可）の有無；などを反映することができる。システムは、１つまたは複数の細胞または組織の、もしくは生体の代謝状態または生理状態を示すことができる。
【００１２】
特定の実施形態において、システムは、ポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを内部に含む１つまたは複数のリガンド結合アプタマー；及び発現可能なポリヌクレオチド、を含み；このシステムは、リガンドがシステムまたはその環境に存在しない場合、もしくはリガンドがリガンド結合アプタマーに結合していない場合に、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡが分解されるような適切な条件に曝される。実施形態によっては、システムは、リガンドがアプタマーに結合している場合、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡが分解されず、かつ遺伝子産物が発現可能なポリヌクレオチドから発現可能であるような適切な条件に供される。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本開示のシステムは、問題になっている１つまたは複数の特定遺伝子の発現を調節する能力に関する。本システムは、５’ＵＴＲポリＡシグナルに基づいたＲＮＡスイッチを阻害することができ、それにより遺伝子（複数可）の発現を招くことができる特定リガンドを採用することにより、遺伝子（複数可）の発現を調節することを可能にする。本システムは、小分子などのリガンドを用いて、例えば、組織特異的及び／または時間特異的様式をはじめとする様式で、発現を制御する個別化遺伝子発現を可能にする。特定の実施形態において、本システムは、ある特定環境中の内因性リガンドについての情報を提供するための、個別化アプタマー／発現可能なポリヌクレオチドの組み合わせを使用するバイオセンサーシステムとして作用する。
【００１４】
１つの実施形態において、遺伝子発現を調節するシステムが存在し、このシステムはポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、ａ）それぞれ少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に有する少なくとも１つのリガンド結合アプタマー（もっとも、代替実施形態では、全てのアプタマーがポリＡ切断シグナルを有するのではない）；及びｂ）発現可能なポリヌクレオチド、を含む。特定の実施形態において、ポリＡ切断シグナルを有するリガンド結合アプタマーは、発現可能なポリヌクレオチドの５’非翻訳領域内に存在する。特定の実施形態において、本システムは、リガンドを発現するポリヌクレオチドを含む。態様によっては、リガンドを発現するポリヌクレオチドは、アプタマー及び発現可能なポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと同一ポリヌクレオチドである。他の場合において、リガンドを発現するポリヌクレオチドは、アプタマー及び発現可能なポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。
【００１５】
ある特定の実施形態において、本開示に包含されるポリヌクレオチドは、発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲに、２つ、３つ、またはそれより多くのポリＡシグナルを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ａ）少なくとも１つのポリＡシグナル；ｂ）リガンド結合アプタマー；及びｃ）少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域、少なくとも１つのＧリッチ領域、または少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域及び少なくとも１つのＧリッチ領域の両方、を含む。システムの実施形態によっては、リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域を含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する。他の態様において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する。特定の態様において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＧリッチ領域の上流に存在する。態様によっては、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＧリッチ領域の上流に存在する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、アプタマーは、２つのポリＡシグナル及び２つのＵ／ＵＧリッチ領域を含む。ポリヌクレオチドが２つ以上のアプタマーを含む場合、ポリヌクレオチドは、ある特定の態様において、１つのＧリッチ領域しか含まない場合がある。そのような場合、Ｇリッチ領域は、ポリヌクレオチドの最も３’側にあるアプタマー上に位置する場合もあるし、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、２番目のアプタマーに位置する場合もある。
【００１６】
本開示の実施形態によっては、リガンドは、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、薬物、代謝産物、またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、アプタマーは、長さが１４〜２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子、治療遺伝子、または細胞の代謝状態を変更する産物をもたらす遺伝子である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、ベクターの少なくとも一部分である。リガンドを発現するポリヌクレオチドは、プラスミド、ウイルスベクター、または直鎖ＤＮＡなどのベクターの少なくとも一部分の場合がある。特定の実施形態において、発現可能なポリヌクレオチドは、リガンドをコードする。発現可能なポリヌクレオチドの発現は、態様によっては、組織特異的プロモーターにより制御される場合がある。
【００１７】
ある特定の実施形態において、遺伝子発現を調節する方法が存在し、本方法は、以下の工程を含む：ａ）システムを用意する工程、このシステムはポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって：１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；２）発現可能なポリヌクレオチド；及び３）任意選択で、リガンド発現構築物、を含み；及びｂ）システムを適切な条件に供する工程、この工程において、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡが望ましくない場合、リガンドはリガンド結合アプタマーに結合しない、またはシステムもしくはその環境中に存在せず、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解され；またはｃ）リガンド発現構築物を含むシステムを適切な条件に供する工程、この工程において、発現ポリヌクレオチドの発現が望まれる場合、リガンドは、アプタマーに結合する、及び／またはシステムもしくはその環境中に存在し、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解されない。
【００１８】
１つの実施形態において、遺伝子発現を調節する方法が存在し、本方法は、以下の工程を含み：ａ）システムを用意する工程、このシステムはポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって：１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；２）発現可能なポリヌクレオチド；及び３）任意選択で、リガンド発現構築物を含み；及びｂ）システムを適切な条件に供する工程、この工程において、リガンドは、システムもしくはその環境中に存在しない、またはリガンド結合アプタマーに結合せず、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解され；あるいはｃ）リガンド発現構築物を含むシステムを適切な条件に供する工程、この工程において、リガンドは、アプタマーに結合し、発現可能なポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡは分解されず、遺伝子産物は、発現可能なポリヌクレオチドから発現可能である。特定の実施形態において、本方法は、細胞、例えば、幹細胞、癌細胞、または遺伝子（ジストロフィン、アルブミン、または第ＩＸ因子など）の遺伝子治療の必要がある疾患細胞もしくは欠損細胞などで行われる。特定の態様において、リガンドは、細胞に内因性のものである。特定の態様において、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、ヒトをはじめとする哺乳類で行われる。他の態様において、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。実施形態によっては、本方法は、個体の１つまたは複数の細胞で行われ、リガンドはグルコースであり、個体は、糖尿病、糖尿病前症、または糖尿病合併症を有し、及び／または発現可能なポリヌクレオチドはインシュリンである。態様によっては、本方法は、個体の１つまたは複数の細胞で行われ、リガンドは癌バイオマーカーの遺伝子産物であり、発現可能なポリヌクレオチドは自殺遺伝子である。特定の態様において、本方法は、個体で行われ、発現可能なポリヌクレオチドはレポーター遺伝子であり、レポーター遺伝子の発現の場所及び／または強度は、個体の１つまたは複数の細胞中のリガンドの、空間分布、時間変動、またはその両方についての情報を提供する。実施形態によっては、本方法はさらに、リガンドと適切に結合するようにアプタマーを設計する工程を含む。特定の実施形態において、本方法は、個体、組織、または細胞で行われ、発現可能なポリヌクレオチドは、検出可能な遺伝子産物をコードし、個体、組織、または細胞が、個々に、イメージングされる。
【００１９】
ある特定の実施形態において、個体の治療をモニタリングする方法が存在し、本方法は、個体に、以下：ａ）ポリヌクレオチドを含むベクター、ポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び２）発現可能なポリヌクレオチド、を含み；及び／またはｂ）ａ）のベクターを抱える１つまたは複数の細胞、を提供する工程を含み、リガンドは、治療の有効性の指標となるタンパク質の特定遺伝子産物である。特定の実施形態において、ａ）のベクター及び／またはｂ）の細胞は、治療前、治療中、及び／または治療後に、個体に提供される。
【００２０】
１つの実施形態において、個体における病的状態の存在、危険性、または易罹患性を評価する方法が存在し、本方法は、個体に、以下：ａ）ポリヌクレオチドを含むベクター、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、１）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及び２）発現可能なポリヌクレオチドを含み；及び／またはｂ）ａ）のベクターを抱える１つまたは複数の細胞、を提供する工程を含み、発現可能なポリヌクレオチドが発現すること、または発現可能なポリヌクレオチドの発現がないことは、リガンドが存在してアプタマーに結合したかどうかを同定するものであり、個体またはその細胞におけるリガンドの有無それぞれが、病的状態の存在、易罹患性、または危険性の指標である。
【００２１】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドが存在し、このポリヌクレオチドは、５’から３’に向かって、ａ）少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを各内部に含む少なくとも１つのリガンド結合アプタマー；及びｂ）発現可能なポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、リガンド結合アプタマーは、発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲに位置する。態様によっては、ポリヌクレオチドは、さらに、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域、少なくとも１つのＧリッチ領域、または少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域及び少なくとも１つのＧリッチ領域の両方を含む。他の態様において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する。特定の場合において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域の上流に存在する。特定の場合において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、少なくとも１つのポリＡシグナルは、少なくとも１つのＧリッチ領域の上流に存在する。特定の態様において、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって、リガンド結合アプタマーは、１つ、２つ、またはそれより多くのＧリッチ領域の上流に存在する。
【００２２】
他の実施形態は、本開示により包含されるポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞に関する。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞であり、細胞は、ヒトの中に存在する場合がある。実施形態によっては、細胞は、本開示により包含されるシステムのいずれかを含む。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞であり、細胞は、ヒトの中に存在する場合がある。特定の実施形態において、本開示により包含され、かつ本開示により包含されるポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターが存在する。特定の場合において、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどである。特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ポリＡシグナル切断の調節を介した特定細胞内タンパク質のイメージングの実例的戦略を示す。５’ＵＴＲ内で操作されたポリＡシグナル（ｐＡ）の効率的な切断は、ｍＲＮＡの破壊及びレポーターシグナル発現の損失を招く。ポリＡ部位と結合したアプタマーにリガンドタンパク質が結合することで、切断がブロックされ、その結果、インタクトｍＲＮＡが保存されて、レポーターシグナル発現が可能になる。三角は、ｐＡ切断部位を示す。明確にするため、３’ＵＴＲに通常存在するｐＡは省略してある。下段画像は、ポリＡスイッチをコードするＤＮＡプラスミドを、リガンドタンパク質（ｔａｔ）をコードするプラスミドとともに（右側）またはなし（左側）で、ヒト２９３Ｔ細胞に同時形質移入することにより得られた。リガンドタンパク質の存在は、イメージングにより容易に検出可能な生物発光レポーターシグナルの発現を、明らかに誘導した。
【図１Ｂ】小分子−アプタマー相互作用が、ポリＡ切断を調節することを示す。小分子と結合する改変ｐＡを持つアプタマーを、遺伝子の５’ＵＴＲに挿入する。５’ＵＴＲポリＡ切断は、ｍＲＮＡの３’部分の破壊を招き、したがって遺伝子が発現しない。しかしながら、投与された小分子がアプタマーに結合することで、５’ＵＴＲポリＡをブロックして、インタクトｍＲＮＡの生成を招き、したがってタンパク質が発現する。ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを、黒線で示し、目的の遺伝子を橙色四角で示す。小分子リガンドは、桃色六角で示し、切断部位は、黒色三角で示す。
【図１Ｃ】アプタマー内で操作されたポリＡ構成要素の詳細な図を示す；
【図２】３’ＵＴＲで通常生じるポリアデニル化が、ｍＲＮＡ切断、５’断片へのポリＡテール付加、及び３’断片の分解に関与することを示す；
【図３】ウシ成長ホルモンのポリＡ切断部位（青色三角）が安定ＲＮＡステム中に隠された場合、ポリアデニル化が、測定によれば１００％から４０％へと大幅に減少したことを示す。（出典Ｇｉｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９）［配列番号１；配列番号２］；
【図４】ポリＡセンサーシステムが、既存のアプタマー技術及びイメージングレポーターを利用して柔軟な分子イメージングプラットフォームを形成することを可能にすることを示す。ｐＡ：ポリＡシグナル。ＩＦＰ：赤外蛍光タンパク質。Ｌｕｃ：ルシフェラーゼ；
【図５】ポリＡシグナルが、５’ＵＴＲで効率的に切断され得ることを示す。様々なポリＡモチーフでの切断効率を、フローサイトメトリー分析により、間接的に測定した。Ｘ軸は、ＧＦＰ発現レベルを示す。赤色対角線は、ＧＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陰性細胞を分ける。最下段の配置が最も少ない緑色細胞をもたらしたが、これは２つのポリＡシグナルコピーがＧＦＰレベルの大幅な低下を招いたことによる［配列番号３］；
【図６】「クランプ」アプローチを示す。リガンド結合は、アプタマーを、安定二重鎖ステム構造に効果的にロックし、三角で示す切断部位を物理的にブロックする；
【図７Ａ】ウイルスｔａｔタンパク質を検出するように設計されたポリＡセンサーの用量依存的反応を示す。レポーター発現レベルは、形質移入されたプラスミド量に関して、様々なリガンド構築物投与量でＩＶＩＳ２００生物発光撮像装置により視覚化された。各ウェルには、おおまかに１００００の細胞が入っていた。不活性ポリＡベクターの発現レベルが、基準となる１００％誘導である。
【図７Ｂ】ウイルスｔａｔタンパク質を検出するように設計されたポリＡセンサーの用量依存的反応を示す。誘導「増倍数」は、様々な投与量で、形質移入されたリガンド構築物の存在下対不在下でのレポーターシグナル（ルシフェラーゼ）の比として計算した。レポーターシグナルは、ルミノメーターで測定する。３種の異なるポリＡセンサー（活性ｐＡを持つセンサー、不活性ｐＡを持つセンサー、またはｐＡのない対照プラスミド）を、様々なリガンド投与量で、形質移入されたプラスミドの量に関して示す。
【図７Ｃ】ウイルスｔａｔタンパク質を検出するように設計されたポリＡセンサーの用量依存的反応を示す。ルシフェラーゼｍＲＮＡ発現のノーザン解析を、全てのプラスミドベクターが共有する５’ＵＴＲに対するプローブで視覚化した。ＴａｔのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡに対するプローブで視覚化した。ＧＡＰＤＨに対するプローブを、内部対照として使用する。ｐＡ：ポリＡシグナル。結果から、リガンド（ｔａｔ）の存在が、インタクト全長導入遺伝子ｍＲＮＡ（ランド５、上部バンド）を招くことが確認された；
【図８Ａ】テトラサイクリン結合アプタマー（ｃｂ３２ｔｃアプタマー）の例において、ポリＡ切断効率が、ポリＡシグナルの位置に依存することを示す。（配列番号４）。テンプレートとして使用したｔｃアプタマー（左側パネル）及びポリＡシグナル（ＡＡＵＡＡＡ）を配置した位置を、示す。ポリＡシグナルを作製する目的でｔｃアプタマー内に作った変異を、青文字で示す。
【図８Ｂ】テトラサイクリン結合アプタマー（ｃｂ３２ｔｃアプタマー）の例において、ポリＡ切断効率が、ポリＡシグナルの位置に依存することを示す。プロットは、テトラサイクリン（ｔｃ）なしで測定した相対ルシフェラーゼ活性を示し、すなわち、ポリＡ切断効率を反映している。ポリＡスイッチを持たない親プラスミドの活性を１００％に設定する。この系列では、Ａ６配置が、最も高いポリＡ切断効率を示す。Ａ６の白抜き棒グラフは、不活性ポリＡ（ＣＡＣＡＣＡ）対照のものである；
【図９Ａ】構築物Ａ６に基づいて、効率の調節に対するＰ１ステムの長さ及びＧＵリッチ領域の位置の効果を示す。赤色線は、２つのポリＡシグナルを示す。Ｐ１長、及びＧＵリッチ領域とＢ１−２の間の距離は、ｂｐ単位で与えられる。遺伝子発現の誘導は、１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での構築物の相対ルシフェラーゼ活性により示される。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる。Ｐ１長が様々でありＧＵ距離が２ｂｐである構築物。結果は、Ｐ１長が１２ｂｐであると、ｔｃによる遺伝子発現が誘導されることを示す。
【図９Ｂ】構築物Ａ６に基づいて、効率の調節に対するＰ１ステムの長さ及びＧＵリッチ領域の位置の効果を示す。赤色線は、２つのポリＡシグナルを示す。Ｐ１長、及びＧＵリッチ領域とＢ１−２の間の距離は、ｂｐ単位で与えられる。遺伝子発現の誘導は、１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での構築物の相対ルシフェラーゼ活性により示される。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる。Ｐ１長が１２ｂｐであるがＧＵリッチ距離が様々である構築物。ＧＵリッチ距離が５ｂｐまたは８ｂｐであると、ｔｃによる遺伝子発現が最も良好に誘導される。
【図９Ｃ】構築物Ａ６に基づいて、効率の調節に対するＰ１ステムの長さ及びＧＵリッチ領域の位置の効果を示す。赤色線は、２つのポリＡシグナルを示す。Ｐ１長、及びＧＵリッチ領域とＢ１−２の間の距離は、ｂｐ単位で与えられる。遺伝子発現の誘導は、１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での構築物の相対ルシフェラーゼ活性により示される。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる。Ｐ１長が様々であるがＧＵ距離が８ｂｐに固定された構築物。ＧＵ距離が８ｂｐに固定されている場合、Ｐ１長が１１ｂｐまたは１２ｂｐであると、ｔｃによる遺伝子発現が最も良好に誘導される；
【図１０Ａ】ループ中の第二のポリＡシグナルが、ポリＡ切断に、より重要な役割を果たしたことを示す。（配列番号５；配列番号６；配列番号７）Ｐ１長が１２ｂｐで２ｂｐのＧＵ距離を持つ構築物。
【図１０Ｂ】ループ中の第二のポリＡシグナルが、ポリＡ切断に、より重要な役割を果たしたことを示す。（配列番号５；配列番号６；配列番号７）Ｐ１長が１２ｂｐで８ｂｐのＧＵ距離を持つ構築物。左側：様々な構築物の模式図。活性ポリＡシグナルを赤色線で示し、不活性ポリＡシグナルを青色線で示し、活性から不活性ポリＡシグナル（ＣＡＣＡＣＡ）に変換する変異を青文字にしてある。右側：１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での相対ルシフェラーゼ活性。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる。両方の場合において、ループ中の第二のポリＡシグナルが、ポリＡ切断に、より重要な役割を果たした；
【図１１Ａ】新たなＰ１ステムに部分的に埋め込まれたポリＡシグナルを示し、これは調節効率の改善を招く。（配列番号８；配列番号９）試験した構築物の模式図。構築物Ａ８とＡ８＊は、青色四角で示すとおり、１つのＡ−Ｕ対が異なっている。
【図１１Ｂ】新たなＰ１ステムに部分的に埋め込まれたポリＡシグナルを示し、これは調節効率の改善を招く。１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での相対ルシフェラーゼ活性。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる；
【図１２Ａ】Ａ８構築物に基づいて、Ｐ１領域を改変した例を示す。構築物の模式図。Ａ８ｇ構築物は、ポリＡシグナルを挟む２つのｔｃアプタマーを用いる。Ａ８ｈ構築物は、ポリＡシグナルを挟む１つのｔｃアプタマー及び１つのネオマイシンアプタマーを用いる。
【図１２Ｂ】Ａ８構築物に基づいて、Ｐ１領域を改変した例を示す。１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での相対ルシフェラーゼ活性。なお、ポリＡシグナルの５’に続けて追加のＧ−Ｃ塩基対を挿入すると、これはＰ１ステムを安定化させるものであるが、ポリＡ活性の損失を招く（構築物Ａ８ｆ）。このことから、Ｐ１ステムを安定化させることによりポリＡシグナルを効率的に不活化することができることが確認される。また、２つのｔｃアプタマーでポリＡシグナルを挟むと、調節効率がさらに改善される（構築物Ａ８ｇ）。全ての場合において、１５μｇ／ｍｌのｔｃを用いるが、Ａ８ｈは例外で、１５μｇ／ｍｌのｔｃ及び１５ｕｇ／ｍｌのネオマイシンを用いた；
【図１３Ａ】ポリＡ切断が、ｔｃ結合核のＢ１−２バルジ周囲で起こることを示す。（［配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２］）５’ＵＴＲポリアデニル化ｍＲＮＡ断片のサンガー配列決定法の結果。黒色垂線は、ポリＡテールを５’ＵＴＲ断片に付加する位置を示す。
【図１３Ｂ】ポリＡ切断が、ｔｃ結合核のＢ１−２バルジ周囲で起こることを示す。（配列番号１３）同定されたポリＡ切断部位を、ｔｃ結合核のＢ１−２バルジ周囲で、黒色矢印で指し示す；
【図１４Ａ】ポリＡ−ＧＵ距離の改変、予想される切断部位、及び調節効率に対するそれらの効果を示す。（配列番号１４）Ａ８から派生した、様々なＰ１長の娘構築物の模式図（Ａ８ａ、Ａ８ｂ、Ａ８ｃ、Ａ８ｄ）。矢印は、図１３のデータに基づいて予想される、各構築物の主要ポリＡ切断部位を指し示す。
【図１４Ｂ】ポリＡ−ＧＵ距離の改変、予想される切断部位、及び調節効率に対するそれらの効果を示す。１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での様々なＰ１長の構築物の相対ルシフェラーゼ活性。この結果は、Ａ８が依然として最も効率的な配置であることを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、第４２位での変異を調べた結果、より良好な調節効率を持つ構築物が明らかになったことを示す。正方形で囲って印をつけた位置は、変異不耐性であることが知られており、一方丸で囲ったものは、全て、ヌクレオチド交換がｔｃ結合に影響しない位置を示す。第Ａ１３位及び第Ａ４２位は、非標準塩基対形成を形成し、これらを変異試験用に選択した。結果は、Ａ４２Ｇ変異が、調節効率の改善を招くことを示す（構築物Ａ８−Ａ４２Ｇ）［配列番号１５］。（１５Ｂ）１５μｇ／ｍｌのｔｃの不在下（黒塗棒グラフ）及び存在下（白抜き棒グラフ）での相対ルシフェラーゼ活性。ｔｃありとなしとでの相対ルシフェラーゼ活性の比として求められた調節効率は、プロット下の数字で与えられる；
【図１６】非変性ゲルを用いた、アプタマーへのｔｃの結合を視覚化したものを示す。設計したポリＡスイッチ（５ｕＭ）を含有するＲＮＡアプタマーをＩｎ  ｖｉｔｒｏで転写して、これをｔｃ（５０ｕＭ）ありまたはなしでインキュベートし、非変性１０％ポリアクリルアミドゲルに添加した。Ｔｃは、３６５ｎｍのＵＶで励起させて、蛍光発光により直接視覚化した（中段パネル、青色）。次いで、ゲルをＳＹＢＲゴールドとともにインキュベートして、ＲＮＡを染色した（上段パネル、赤色）。ｔｃとＲＮＡの同時局在化を、重ね合わせにより実証する（下段パネル）。ｔｃチャネルからのピクセル強度を、ＲＮＡチャネルからのものに対して正規化し、相対ｔｃシグナルとする。構築物Ａ８−Ａ４２Ｇは、Ａ８と、またはｃｂ３２と比較した場合に、より高いｔｃ親和性を有するようである。構築物Ａ８−Ａ４２Ｇ＊は、アプタマー内のｔｃ結合部位に変異を有するが、これらは非常に少ないｔｃ結合をもたらした；
【図１７】Ａ８−Ａ４２Ｇの用量依存的調節を実証する。Ａ８−Ａ４２Ｇ構築物（青色円）、不活性アプタマー対照Ａ８−Ａ４２Ｇ＊（赤色円）、及び不活性ｐＡ対照（ＡＡＵＡＡＡからＣＡＣＡＣＡへの変異、緑色三角）の相対誘導増倍数を示す。各データ点は、ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に相当する；
【図１８Ａ】効率的ポリＡ切断及び調節を可能にする、追加のポリＡスイッチ位置ならびに様々なアプタマー配置を示す；
【図１８Ｂ】効率的ポリＡ切断及び調節を可能にする、追加のポリＡスイッチ位置ならびに様々なアプタマー配置を示す；
【図１８Ｃ】効率的ポリＡ切断及び調節を可能にする、追加のポリＡスイッチ位置ならびに様々なアプタマー配置を示す；
【図１９】実例的アプタマーの改変例を示す。アプタマー１０３Ｇを、記載の位置で改変して、１０３ＧＰ２及び１０３ＧＳ３というアプタマーを製造した［配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８］；
【図２０】実例的１０３Ｇ、１０３ＧＰ２、及び１０３ＧＳ３アプタマーの対応するルシフェラーゼ発現レベル及び誘導を提示する。構築物１０３ＧＰ２は、４２３倍という最も高い理論上のダイナミックレンジ、及び３０倍という最も高いｔｃによる誘導を示す。
【図２１】１０３ＧＰ２のＰ２領域の多様な改変、及び遺伝子発現の誘導に対するそれに応じた影響を実証する［配列番号１９］。
【図２２】１０３ＧＰ３のＬ３領域の多様な改変、及び遺伝子発現の誘導増倍数に対するそれに応じた影響を実証する［配列番号２０］。
【図２３】１０３ＧＰ３のＬ１領域の多様な改変、及び遺伝子発現の誘導に対するそれに応じた影響を実証する［配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５］。
【図２４】Ｐ１を安定化させ、その結果ポリＡ活性の顕著な阻害を招く、塩基対形成の改変の例を示す。改変領域は、明青色四角で囲まれている［配列番号２６；配列番号２７］。
【図２５】異なる方向の２つのアプタマーに挟まれたポリＡシグナルを持つポリＡセンサー構築物、ＧＰ２の例を提示する［配列番号２８、２９、３０］。
【図２６】２つのＧＰ２アプタマーが背中合わせに接続されていて、代替折り畳み形状を可能にする配置を有するポリＡセンサー構築物、ＧＰ２ＳＬＧＰ２の例を示す。５’ＧＰ２アプタマーを、ヘルパーと呼び、３’ＧＰ２アプタマーをセンターと呼ぶ。両方とも活性ポリＡシグナルを有するが、センターアプタマーのみが、Ｇリッチ領域を有する。
【図２７】ヘルパーＧＰ２及びセンターＧＰ２のステム／ループＩＩ領域（四角で囲んだ領域）の長さ及び配列における多様性を実証し、遺伝子発現誘導に対する、それらに応じた影響を示す。様々な構築物間での配列多様性を示す［配列番号３１〜５８］。
【図２８】ＧＰ２ＳＬＧＰ２［配列番号５９］、Ｃ１２［配列番号６０］、及びＤ１１Ａ［配列番号６１］の実例的ポリＡセンサーの完全配列を提示する。
【図２９】ＧＰ２ＳＬＧＰ２の用量依存的調節を実証する。各データ点は、ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に該当する。平均誘導増倍数を標準偏差と合わせて示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１０４倍に達した。
【図３０】Ｃ１２の用量依存的調節を実証する。各データ点は、ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に該当する。平均誘導増倍数を標準偏差と合わせて示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１５１倍に達した。
【図３１】Ｄ１１Ａの用量依存的調節を実証する。各データ点は、ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に該当する。平均誘導増倍数を標準偏差と合わせて示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１２７倍に達した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
アプタマーとは、レセプターのように折り畳まれて、特定リガンドと結合する短いＲＮＡ配列である１９−２１。特定リガンドに対して高い親和性を持つアプタマーを創出する効率的な‘ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化の８、１２方法が、十分に確立されている７、９、２２。アプタマーの結合親和性は、ナノモル範囲に到達する場合が多く、抗体の結合親和性に匹敵する。これに関して、アプタマーは、ＲＮＡでできた抗体と見ることができる。アプタマーを抗体と区別するものは、その大きさが小さいこと（５０塩基未満のことが多い）及びそのモジュラー性質である。これらの特性により、アプタマーは、その結合機能を失うことなく、他のＲＮＡ構造体と一体化してそれを制御することができる。アプタマーは、試験管中で、リガンド依存的様式で自己切断ＲＮＡリボザイムを変換して操作し、分子スイッチのように機能することが、実証されている２３、２４。
【００２５】
自然は、遺伝子発現を制御するのに、アプタマー機構を「リボスイッチ」の形で活用することに成功している２５。多くの自然発生アプタマーが細菌で見られ、インプットリガンドがアプタマーに結合することで、ＲＮＡ切断の他に、転写減衰、翻訳阻害、及び選択的スプライシングの機構を介して、遺伝子発現を調節する２５、２６。全ての細菌遺伝子のうち推定２〜３％及び数知れないほどの酵母菌遺伝子が、この様式で制御されていると思われる２７。アプタマー介在型機構を通じて、レポーター遺伝子発現の場所及び強度は、経時的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの特定細胞内リガンドの空間分布及び時間変動を反映すると思われる。ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、近赤外または赤外蛍光タンパク質（例えば）などのレポーター遺伝子産物は、例えば、生物発光撮像装置またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）などの最新撮像装置によりモニタリングすることができる。近赤外または赤外蛍光タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全身撮像技法に有用である。このアプローチは、研究対象の未変性タンパク質をあらかじめ標識化または操作する必要がなく、よって、それまではｉｎ  ｖｉｖｏで対処することが困難であった部類の測定に対処できる。
【００２６】
ＲＮＡアプタマーは、特定リガンドを高い親和性で認識するが、アプタマー結合により生成するシグナルを増幅する強力な方法がこれまで欠けていた。わずかな研究で、アプタマーを使用してリボザイム切断を制御することが報告され、アプタマーを哺乳類細胞で、特定リガンドに反応する分子スイッチとして機能させることができたものの、そのようなセンサーが提示する乏しいダイナミックレンジ（５倍未満の誘導範囲が多い）、及び高い漏出発現２８、２９は、それらの使用にとって深刻な制約であった。
【００２７】
アプタマーを哺乳類細胞でセンシング装置として利用することの妨げとなっているのは、リガンド／アプタマーの結合とレポーター遺伝子発現を結びつける強力なスイッチング／増幅機構の不在であると考えることができる。本開示は、アプタマーとレポーター遺伝子（または、例えば、導入遺伝子など）を、効率的に結合して、生細胞で特定分子署名を検出するまたは導入遺伝子の発現を制御することができるように、そのようなスイッチング／増幅機構を提供する。本明細書中記載されるとおり、１つの実施形態は、リガンドアプタマー相互作用を介したポリＡシグナル切断の調節が関与する。
【００２８】
「ａ」及び「ａｎ」という語は、請求項も含めて本明細書中、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇという語と連携して使用される場合、「１つまたは複数の」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の、開示される要素、方法工程、及び／または本開示の方法からなる、または本質的にそれらからなる場合がある。本明細書中記載される方法または組成物はどれでも、本明細書中記載される他の方法または組成物、開示される実施形態のいずれに関しても実行することができ、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、依然として同様または類似の結果を得ることができることが企図される。
【００２９】
本開示は、哺乳類細胞で特定分子署名または状態の高感度検出を可能にする、あるいは哺乳類細胞で小分子、例えば、薬物または薬物様分子などを用いて、導入遺伝子の発現を制御する、効率的分子スイッチの創出に、ポリＡ切断の力を利用することに関する。改変分子スイッチは、ポリアデニル化のアプタマー介在型調節により、レポーター遺伝子または導入遺伝子（例えば）の発現を制御することができる（図１Ａ及び図１Ｂ）。ポリアデニル化は、全ての哺乳類細胞に普遍的に存在する必須のｍＲＮＡプロセシング機構である。哺乳類ポリＡシグナルは、通常、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する。新たなポリＡ部位を、正常な転写単位では決して位置することがない５’ＵＴＲに人為的に作製した場合、ポリＡシグナルの効率的切断は、そのｍＲＮＡの破壊を招き、したがって、遺伝子が発現しなくなる。しかしながら、リガンド分子が改変ポリＡシグナルに結合することで切断が効率的にブロックされ、その結果、インタクトｍＲＮＡが保存されて、遺伝子発現を誘導することが可能になる。
【００３０】
［Ｉ．ポリＡに基づくスイッチの実施形態総論］
【００３１】
本開示は、発現構築物中、遺伝子などの発現可能なポリヌクレオチドの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）以外の場所に存在するポリＡシグナルを、概して及び意図的に利用するシステムに関する。特定の実施形態において、ポリＡシグナルの異所的所在は、本開示のシステムの実施が、関心対象の発現可能なポリヌクレオチドを調節することを可能にする。特定の実施形態において、ポリＡシグナルは、発現するポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）の翻訳開始部位の上流に存在し、特定の実施形態においては、ポリＡシグナルはｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する。特定の実施形態において、発現可能なポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写が可能である。特定の実施形態において、発現構築物の設計は、意図的に、ポリＡシグナルを、発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲに配置する。
【００３２】
ある特定の実施形態において、５’ＵＴＲにポリＡシグナルが存在することの狙いは、ｍＲＮＡの分解であり、この能力が、本開示のシステムで活用される。特定の実施形態において、ポリＡシグナルは、１つまたは複数のリガンドが結合できるアプタマーを伴っており、リガンドのアプタマーへの結合が、ｍＲＮＡを分解するか否かを指図する。特定の実施形態において、ｍＲＮＡが発現することが望まれる場合、アプタマーに結合するリガンドが提供される。場合によっては、リガンドが特定環境（例えば、細胞、組織、または生体）中に存在するかどうかという疑問に対して、そのリガンドが結合することができる特定のポリＡ／アプタマーによる調節により、特定の発現可能なポリヌクレオチドが発現するかどうかにより答えがでる。リガンドがアプタマーに結合し、ｍＲＮＡが発現する実施形態において、本システムは、シグナルの増幅を可能にする。なぜなら、１つのｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を産生することが可能だからである。
【００３３】
図１Ａ及び図１Ｂに示すとおり、特定リガンドのアプタマーへの結合は、ポリＡ切断をブロックし、その結果、インタクトｍＲＮＡが保存され、したがって、レポーターシグナル（開示のバイオセンサーシステムにおけるものなど）または治療遺伝子などの特定遺伝子（開示の遺伝子制御システムにおけるものなど）が発現する；リガンドはどのような種類のものでも可能であり、例えば、タンパク質または小分子が挙げられる。特定の実施形態において、バイオセンサー実施形態のシステムのリガンドは、特定細胞、組織、または生体にとって内因性であり、一方、遺伝子制御システムの場合のシステムのリガンドは、必ずしも内因性リガンドではない。
【００３４】
特定の実施形態において、ポリＡシグナルを含む構築物中、アプタマーは、自身の中にポリＡシグナルを含む。実施形態によっては、アプタマーは、１つまたは複数のポリＡシグナル、例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのポリＡシグナルを含む（図１１を参照）。ＣＡＣＡＣＡでＡＡＵＡＡＡを置き換えると、ポリＡシグナルは大幅に不活性化される、すなわち、ポリＡシグナルがブロックされた場合の遺伝子発現レベルの理論上の上限に似る。ＣＡＣＡＣＡ対ＡＡＵＡＡＡの発現レベル比は、増倍数での遺伝子誘導の理論上のダイナミックレンジを見積もるのに使用される。場合によっては、ポリＡシグナルは、標準ＡＡＵＡＡＡ配列と比較して配列に１つ、２つ、またはそれより多くの変更を有するなどの改変を有する。例えば、ＡＡＵＡＡＡの代わりに、別の配列を使用することができ、そのような配列として、少なくとも、ＡＵＵＡＡＡ、ＡＧＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、ＣＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＡＣＡ、ＡＡＵＡＧＡ、ＡＡＡＡＡＧ、またはＡＣＵＡＡＡが挙げられる。２つ以上のポリＡシグナルを構築物に用いる実施形態において、ポリＡシグナルは、同じ場合も、異なる場合もある。
【００３５】
特定の実施形態において、ポリＡ切断部位近くでのＲＮＡ構造の調節を用いて、ポリＡ切断の活性を向上させる、及び／またはリガンド結合を向上させる。特定の実施形態において、ポリＡシグナルの、アプタマー中またはアプタマー近くへの配置を最適化して、ポリＡ部位の切断の改善及び／またはリガンドのアプタマーへの結合を可能にする（例えば、図１２を参照）。アプタマー内でのポリＡ部位の間隔は、最適化することができ、アプタマー内の概して中央に位置してもしなくてもよい。ポリＡシグナルの位置は、アプタマーの隣接部位が互いに近くで並列することができ、リガンドがアプタマーに結合することを可能にするようになっている場合がある（例にすぎないが、図６を参照）。
【００３６】
ポリＡシグナルを含む構築物の実施形態において、１つまたは複数の他の配列を利用して、リガンドの結合を向上させる及び／またはポリＡ切断部位での切断を向上させることができる。特定の実施形態において、ポリＡシグナルを含む構築物は、ポリＡシグナルの下流に、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのＧリッチ領域も含む。特定の実施形態において、ポリＡシグナルを含む構築物は、ポリＡシグナルの下流に、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのＵ／ＵＧリッチ領域も含む。ある特定の実施形態において、１つまたは複数のＧリッチ領域は、少なくとも１つのＵ／ＵＧリッチ領域の下流にある。特定アプタマー中の１つまたは複数の特定ステムもしくはループの長さ、及び／またはポリＡシグナル、Ｇリッチ領域、及び／またはＵ／ＵＧリッチ領域の位置は、特定の実施形態において、調節効率に影響を及ぼす場合があり（図５、図１０、図１３〜２５）、当業者なら、定法を用いて適切な配置を最適化することができる。
【００３７】
ポリＡスイッチを含む構築物の配置は、任意の適切な手段により行うことができるが、特定の実施形態において、構築物は、細胞、組織、または生体中に存在し、外来物としてベクター（ウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴、レンチウイルスなど）またはプラスミドなど）上に存在する場合も、細胞のゲノム内に存在する場合もある。ポリＡスイッチ及び発現可能なポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、標的細胞、組織、または生体に、ネイキッド核酸として提供される場合があり、それらは、適切なキャリア（リポソームまたはナノ粒子など）内に含まれている場合も、ベクター上に存在して、ベクター自身が適切なキャリアを有する場合もある。
【００３８】
特定の実施形態において、アプタマーは、特定リガンドと結合するように設計され、そうでなければ、例えば、アプタマーのライブラリーをスクリーニングすることで得ることも可能であるし、既存アプタマーからモデリングすることも可能である。アプタマーの異なる領域を改変して、リガンドの結合及び／またはポリＡ部位での切断を最適化することができる。特定の実施形態において、ポリＡシグナルの位置は、ポリＡ切断の効率と関連する（例えば、図８を参照）。１つの例において、アプタマーＡ８を調節して（図１３〜図１５を参照）、効率に対して得られる効果を検討する。同じく、例として、表１に、模範的Ａ８アプタマーに基づいた、リガンド結合部位の変異分析の結果を示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
当業者は、高い親和性で化合物を標的とするアプタマーを創出する定法７−１２を心得ている。
【００４１】
特定の実施形態において、２つ以上の別々のポリＡスイッチを利用するシステムが採用される。第一アプタマーと第二アプタマーが同一ではなく、第一リガンドと第二リガンドが同一ではない特定の実施形態において、１つのポリＡ構築物は、第一リガンドと結合する第一アプタマー応答性であることができ、別のポリＡ構築物は、第二リガンドと結合する第二アプタマー応答性であることができる。他の場合において、複数のアプタマーを有するポリＡ構築物は、同じリガンドに反応することができる。
【００４２】
［ＩＩ．バイオセンサーシステムの実施形態］
【００４３】
本開示は、５’ＵＴＲポリＡに基づくＲＮＡスイッチを提供し、このスイッチは、生細胞の細胞内署名を検出するための既存技術に勝る複数の重要な利点をもたらすものであり、本明細書中、バイオセンサーアプローチとして採用される。第一に、そのようなセンサーからのレポーターシグナルは、ヒト生細胞でごくわずかな漏出発現しか示さず、特定リガンドタンパク質を検出する際、シグナルは、１００倍超で効果的に誘導されたことが、本明細書中示される。この信号対雑音比は、ヒト生細胞でこれまでに達成されていたよりも少なくとも１桁高い大きさであり、様々な実験設定で新規応用を可能にすると思われるダイナミックレンジを与える。第二に、ポリＡセンサーは、標識、タグ、または染色を必要とせずに生細胞中の内因性タンパク質を非侵襲性検出／撮像することを可能にし、これまで対処することが困難であった部類の測定に対処できる。最後に、既存のアプタマー技術を本発明のイメージングレポーターシステムと効率的に連結することにより、本方法は、広範囲のタンパク質リガンドを分子撮像により検出するプラットフォームを可能にする。すなわち、ポリＡセンサーは、分子検出において現在可能なものよりもはるかに広い用途がある、ｉｎ  ｖｉｖｏで分子署名を検出する独自の能力を提供し、撮像用の臨床使用可能なレポータープローブ（すなわち、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＮＩＲＦ）を用いて、診療に変換することさえ可能である。
【００４４】
そのようなバイオセンサーは、例えば、疾患の特定リガンドのレベルに関して空間的ならびに時間的情報を提供し、インプット情報を用いて、治療目的を達成するために細胞挙動を調節することができる。例えば、ポリＡバイオセンサーの例の１つは、リガンドとしてグルコースを認識するように操作されたものであり、それに応じて、改変インシュリンタンパク質の発現を調節して、糖尿病患者のグルコースレベルを調節する。同様のポリＡバイオセンサーは、安全スイッチとしても機能することができる。例えば、バイオセンサーは、幹細胞中の癌バイオマーカーの存在を検出するように操作することができる。正常幹細胞が誤って癌細胞に変換された場合、バイオセンサーは、自己破壊のため自殺遺伝子のスイッチを入れると思われる。
【００４５】
特定の実施形態において、バイオセンサーシステムに採用される場合の、ポリＡを利用したスイッチのリガンド分子の例として、少なくとも、細胞代謝産物；核酸（調節核酸、例えばｍｉＲＮＡまたは分子に干渉するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）などを含む）；小分子；細胞タンパク質（例えば、疾患状態と関連したタンパク質、例えば、癌タンパク質など）、またはウイルス感染により産生されるウイルスタンパク質が挙げられる。
【００４６】
実施形態によっては、発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子産物、または治療遺伝子産物をコードする。実施形態によっては、レポーター遺伝子産物は、融合タンパク質として治療遺伝子産物と融合している場合がある。他の実施形態において、レポーター遺伝子産物及び治療遺伝子産物の発現は、ＩＲＥＳを用いて、１つのｍＲＮＡから別々に翻訳される。レポーター遺伝子の例として、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。治療遺伝子の例として、インシュリン、成長ホルモン、ジストロフィン、アルブミン、第ＩＸ因子などが挙げられる。他の場合では、本システムは、レポーター遺伝子産物をコードする発現可能なポリヌクレオチド及び治療遺伝子産物をコードする別個の発現可能なポリヌクレオチドを利用し、それらの発現は、同一または異なるリガンド結合アプタマーにより統制される場合がある。レポーター遺伝子産物用及び治療遺伝子産物用の構築物（複数可）は、同じベクター上にある場合も、異なるベクター上にある場合もある。
【００４７】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、直線様式で、５’から３’に向かって機能的に連結した２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くのアプタマーを含む。アプタマーは、実質的に同じ配列または構造を有しても有していなくてもよく、それぞれが、ポリＡシグナルを含んでも含まなくてもよい。複数のポリＡシグナルが、１つのアプタマー内、または複数のアプタマー内に存在する場合、ポリＡシグナルは、同一であってもなくてもよい。特定の実施形態において、１つのポリヌクレオチドは、複数のアプタマーを含むが、Ｇリッチ領域は１つしか含まず、Ｇリッチ領域は、場合によっては、ポリヌクレオチドのどのアプタマーに存在してもよいが、特定の場合においては、ポリヌクレオチドの５’から３’に向かって第二のアプタマー上、または分子の最も３’側にあるアプタマー上に存在する。２つ以上のアプタマーを含むポリヌクレオチドの折り畳みは、様々な因子に依存して変わる可能性があり、そのような因子として、ポリヌクレオチドの長さ及びその配列が挙げられるが、特定の場合において、１つのポリヌクレオチドは、複数の折り畳み配置で作用することができる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、アプタマーがアプタマー間でどのような塩基対形成もしないように構成される（例えば、図２６の左側図）が、他の場合では、アプタマー間に少なくとも何か塩基対形成がある（アプタマーの配列の大部分に沿ったものを含む）、例えば、図２６の右側図。折り畳み配置によっては、１つのアプタマーのステムループは、同一分子の別のアプタマーのステムループと対向して構成される（図２６の右側図を参照）。
【００４８】
実施形態によっては、２つ以上のアプタマーを含むポリヌクレオチドは、直線的に、５’から３’に向かって、ある特定の配列により分離されている。ある特定の配列は、ランダムの場合も、Ｇリッチ領域のように規定されている場合もある。ある特定の場合において、２つのループ間の５’から３’に向かっての直線的長さは、特定の長さのものである。例えば、２つのループ間のヌクレオチド数は、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜２５、１１〜２４、１１〜２３、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜２５、１２〜２４、１２〜２３、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜２５、１３〜２４、１３〜２３、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜２５、１４〜２４、１４〜２３、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜２５、１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１６〜１７、１７〜２５、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１７〜１８、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、２１〜２２、２２〜２５、２２〜２４、２２〜２３、２３〜２５、２３〜２４、または２４〜２５ヌクレオチドの場合がある。アプタマー中またはポリヌクレオチド中の２つのループ間のヌクレオチド数は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の場合がある。特定の場合において、２つの異なるアプタマーの少なくとも一部分の間に塩基対形成がある複数のアプタマーの配置において、１つのループと別のループとの間の距離は、アプタマーのステムループ２配列を含めて（図２６を参照）、１０〜２５ヌクレオチド、例えば、１８〜２０ヌクレオチドである。
【００４９】
［ＩＩＩ．バイオセンサーシステムの使用方法］
【００５０】
本開示の実施形態において、特定の所望の生物学的状態をセンシングまたは検出するための本開示のシステムの利用方法が存在し、目的として、例えば、ある特定細胞、組織、及び／または生体をはじめとするある特定場所または環境中の１つまたは複数の組成物の有無の検出が挙げられる。バイオセンサーシステムは、空間的及び／または時間的様式で、特定環境または場所について情報を提供することができる。バイオセンサーシステムは、特定の疾患状態またはそれに対する易罹患性もしくは危険性について情報を提供することができる。バイオセンサーシステムは、個体が、特定疾患を有する、または特定疾患を有する危険性があるかどうか、あるいは個体が疾患の治療に反応するかどうかを判定する方法に使用することができる。バイオセンサーシステムは、ある特定の治療が個体に有効であるかどうかの情報を提供することができる。
【００５１】
特定の実施形態において、バイオセンサーシステム用のリガンドは、細胞、組織、または個体にとって、内因性である。リガンドは、あらゆる時点及びあらゆる組織において、内因的に発現する場合も、そうでない場合もある。内因性リガンドは、組織特異的、または時間特異的様式で発現する場合がある。ある特定の実施形態において、本システムのポリヌクレオチドを含むベクターは、個体のある特定組織または領域を標的とするように指向化されており、この組織または領域は、特定内因性リガンドを有するまたは有さないことが疑われる。
【００５２】
バイオセンサーシステムを利用する実施形態において、発現可能なポリヌクレオチドの発現は、ポリＡスイッチ以外の１つまたは複数の実体により制御される場合がある。すなわち、場合によっては、ある特定の環境でまたはある特定の時間設定（例えば、生物学的発達のある特定段階または疾患ステージなど）で発現を許容または阻害する１つまたは複数の転写配列要素が存在する場合がある。ポリＡスイッチシステムの発現がある特定環境中で起こることが望ましい場合、ポリヌクレオチドの発現は、組織特異的プロモーターにより制御することができる。組織特異的プロモーターの選択は、問題の環境により決まる場合があり、組織特異的プロモーターの例は、当該分野で既知であり、例えば、ＴｉＰｒｏＤなどのデータベースで利用可能である。
【００５３】
１種または複数の治療が個体に有効であるかどうかを判定することが望ましい場合、治療に関する特定指標化合物の有無を検出するためなどで本システムを個体に使用してから、治療を提供することができ、次いで、治療が提供された後に１回または複数回、本システムを個体に使用して特定指標化合物の有無を検出することができる。他の実施形態において、本システムは、治療が提供された後に初めて、１回または複数回、個体に対して治療をモニタリングするため、例えば治療の効果の指標である特定化合物の有無を同定するためなどに使用される。
【００５４】
場合によっては、バイオセンサーシステムを採用して情報を提供するが、他の実施形態では、バイオセンサーシステムは、治療目的で利用される場合がある（及び任意選択で、情報も提供する場合がある）。例えば、本システムは、リガンドとして代謝産物を認識することができ、代謝産物リガンドがアプタマーに結合する際に、代謝産物がマーカーである（またはその存在もしくはレベルが病的状態もしくはその易罹患性の指標である）病的状態の治療をもたらす遺伝子産物の発現を許容する場合がある。他の実施形態において、発現可能なポリヌクレオチドは、それ自身は治療遺伝子産物ではないが、有害な病的状態またはその易罹患性もしくは危険性の指標であるリガンドが存在する場合に発現する自殺遺伝子産物であり；特定の実施形態において、リガンドは、例えば、癌性または前癌性である細胞中に存在するようになる。
【００５５】
本開示のバイオセンサーシステムにおいてアプタマーを調節することができるリガンドの例として、少なくとも、細胞代謝産物、小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）、正常及び異所性細胞タンパク質、ウイルス及び他の病原により発現した外来タンパク質、細胞死を誘導する自殺タンパク質などが挙げられる。
【００５６】
本開示のバイオセンサーシステムにおいてアプタマーを調節することができるリガンドの例として、少なくとも、細胞代謝産物、小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）、細胞タンパク質、などが挙げられる。
【００５７】
［ＩＶ．遺伝子制御システムの実施形態］
【００５８】
遺伝子発現を制御する能力は、特定遺伝子産物の機能を解明する、または特定タンパク質のレベルを操作して治療効果をもたらす目的で、常に有用であった。本開示の実施形態において、ポリＡスイッチをｍＲＮＡの５’ＵＴＲに埋め込んだ場合、ポリＡシグナルの切断は、ｍＲＮＡの分解を招き、したがって導入遺伝子発現が失われる。ポリＡスイッチを阻害することができる薬物様小分子（例えば）は、インタクトｍＲＮＡの保存をもたらし、したがって、遺伝子発現を誘導する。本明細書中他の部分で記載されるとおり、そのようなスイッチにより制御される導入遺伝子発現は、ヒト生細胞で非常に低い漏出発現しか示さず、小分子（この場合は、テトラサイクリン）を投与した際、導入遺伝子発現は、効率的に３０倍超で誘導された。この遺伝子制御システムの最適化及び一般化を行うことで、多くの個別化遺伝子制御システムの創出につなげることができ、例えば、個別化遺伝子制御システムはそれぞれ、ＦＤＡ承認小分子薬などのリガンドにより制御されるものである。トランスアクチベーターを用いた転写制御に基づく現行の遺伝子制御システムとは対照的に、本明細書中記載されるポリＡに基づくシステムは、どのようなタンパク質トランスアクチベーター産物（重篤な宿主免疫応答を引き起こす可能性がある）の発現も必要とせず、かつどのような専用プロモーター配列要素の使用にも依存せず、したがって、任意の内因性遺伝子または改変ベクター転写単位中に「埋め込む」ことができる「ポータブル」制御システムとなる。そのため、本システムは、１つの転写単位（１つの発現構築物）しか必要とせず、組織特異的（空間的）及び時間的様式で導入遺伝子を制御するのに使用可能であるようなプロモーター順応性を有する。そのような遺伝子制御システムは、安全な小分子をＲＮＡに基づく非免疫原性ポリＡスイッチと組み合わせているので、臨床用途ならびに生物学的研究において使用する上で非常に安全性が高いと思われる。
【００５９】
特定の実施形態において、遺伝子制御システムは、小化合物を、ポリＡに基づくスイッチ用のリガンド分子として使用する。小化合物の例として、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、クロロテトラサイクリン、サンサイクリン、メタサイクリン、またはチゲサイクリンなど）またはそれらの機能的誘導体；アミノグリコシドまたはそれらの機能的誘導体；ラパマイシンまたはそれらの機能的誘導体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、デフォロリムス、リダフォロリムス）；及びＦＤＡ承認薬またはそれらの機能的誘導体が挙げられる。遺伝子制御システムの他の実施形態において、小分子以外のリガンド、例えばタンパク質、ペプチド、核酸などが使用され、特定の実施形態において、本システムのリガンドは、適切なキャリアに入れられて提供される。
【００６０】
ある特定の実施形態において、遺伝子制御システムは、２つ以上のアプタマーを使用して、異なるリガンド、例えば、異なるテトラサイクリン類似体に個別に反応させる。すなわち、１つのポリＡスイッチシステムをテトラサイクリンなどのリガンドに反応するように作ることができる場合には、アプタマーＲＮＡ配列を変異させて異なるテトラサイクリン類似体（ドキシサイクリンなど）に反応するようにすることにより、多くの個別化遺伝子制御システムを創出することができる。
【００６１】
実施形態によっては、発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子産物、または治療遺伝子産物をコードする。実施形態によっては、レポーター遺伝子産物は、融合タンパク質として治療遺伝子産物と融合している場合がある。他の実施形態において、レポーター遺伝子産物及び治療遺伝子産物の発現は、１つのｍＲＮＡから、ＩＲＥＳを用いて、別々に翻訳される。レポーター遺伝子の例として、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。治療遺伝子の例として、インシュリン、成長ホルモン、ジストロフィン、アルブミン、第ＩＸ因子などが挙げられる。他の場合、本システムは、レポーター遺伝子産物をコードする発現可能なポリヌクレオチド及び治療遺伝子産物をコードする別個の発現可能なポリヌクレオチドを使用し、それらの発現は、同じまたは異なるリガンド結合アプタマーにより統制される場合がある。レポーター遺伝子産物用及び治療遺伝子産物用の構築物（複数可）は、同じベクター上または異なるベクター上にある場合がある。
【００６２】
［Ｖ．遺伝子制御システムの使用方法］
【００６３】
特定の実施形態において、本開示のシステムは、遺伝子制御用途に使用することができ、その用途では、特定の発現可能なポリヌクレオチドが、特定場所で及び／または特定の事象もしくは時点で発現することが望まれる。ある特定の実施形態において、遺伝子発現の制御は、特定遺伝子産物の機能の解明を可能にし、一方他の実施形態では、遺伝子発現の制御は、治療効果をもたらす。場合によっては、導入遺伝子の発現可能なポリヌクレオチドは、発現することが望まれず（例えば、ある特定の時点及び／または場所において）、リガンドは、導入遺伝子と一緒に提供されない場合があるか、その発現が阻害される場合があり、リガンドが発現することが望まれるときに初めて発現して、導入遺伝子（例えば、ある特定の調節配列要素を持つもの）の発現のためにそのアプタマーと結合することができる。
【００６４】
ある特定の実施形態において、遺伝子制御システム実施形態用のリガンドは、細胞、組織、または生体にとって内因性のものではない。特定の実施形態において、遺伝子制御用のシステムのリガンドは、薬物または薬物様分子（少なくともいくつかの実施形態において、薬物様は、典型的には分子量が５００ダルトン未満の小分子化合物と定義される）である。特定の実施形態において、遺伝子制御システムのリガンドは、任意の適切な様式の１種、例えば、経口、筋肉内、吸入によるなどで、個体に提供される。
【００６５】
ある特定の実施形態において、ポリＡスイッチに基づく遺伝子制御システムは、正負のフィードバックループを持つ自己調節システムとして構成することができる。遺伝子をそれ自身の産物により調節することは、自己調節として知られるが、これは、独特の応用特性を生み出すことができる。特定の実施形態において、ポリＡスイッチは、自己調節システムとして機能するように構成することができる。すなわち、ポリＡスイッチの制御下にある遺伝子の産物は、それ自身の発現を正または負に調節することができる。負の自己調節は、遺伝子産物が、それ自身の発現を抑制する場合に生じる。これは、定常状態発現の頑健性を高めることが知られており、細胞中の遺伝子発現レベルの変動を縮小する。（１）ポリＡスイッチで構成することができる負の自己調節の一例は、グルコースを検出するように設計されたバイオセンサーシステムである。この場合、ポリＡスイッチは、リガンドとしてグルコースを認識するアプタマーを用いて操作され、グルコースの結合に反応して、インシュリンタンパク質をコードする導入遺伝子の発現を作動させる。誘導されたインシュリン発現は、グルコースレベルを低下させ、その結果、インシュリンの発現が減少する。対照的に、正の自己調節は、遺伝子産物が、それ自身の発現を促進する場合に生じる。これは、双安定状態を作り出すことが知られている。すなわち、いったん導入遺伝子がそのリガンドにより活性化されると、その遺伝子は、高発現状態にロックされて、最初のインプットリガンドが消失した後でさえも、自身をＯＮに維持することができる（２−６）。ポリＡスイッチで構成することができる正のフィードバックシステムの一例は、ウイルスｔａｔタンパク質を検出するように設計されたバイオセンサーシステムである。この場合、ポリＡスイッチは、リガンドとしてｔａｔを認識するアプタマーを用いて操作され、ｔａｔの結合に反応して、ｔａｔタンパク質をコードする導入遺伝子の発現を作動させる。最初に導入されたｔａｔタンパク質が、より多くのｔａｔタンパク質の発現を誘導する。これは、正のフィードバックループを確立し、システムを高発現状態にロックして、自身をＯＮに維持する。
【００６６】
［ＶＩ．本開示のキット］
【００６７】
本明細書中記載される組成物のどれでも、キットに含めることができる。非限定的な例において、本開示に包含される任意のポリヌクレオチド、リガンド、またはベクターを、キットに含めることができる。
【００６８】
キットは、本開示の組成物を適切に等分割したもの（複数可）を含むことができる。キットの構成要素（複数可）は、水性媒体に入れて、または凍結乾燥状いずれかでパッケージ化することができる。キットの容器手段は、概して、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または他の容器手段を含むことになり、その中に、構成要素を、好ましくは適切に等分割して、入れることができる。キットに複数の構成要素が存在する場合、キットは、概して、第２、第３、または他の追加容器を含むことになり、その中にさらなる構成要素を別々に入れることができる。しかしながら、構成要素を様々な組み合わせでバイアルに入れることもできる。本発明のキットは、典型的には、市販用に容器を密に詰めて収容する手段も含むことになる。そのような容器として、例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器が挙げられ、その中に所望のバイアルを保持させる。
【００６９】
キットの構成要素が、１種及び／または複数の溶液に含まれて提供される場合、溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。組成物は、シリンジ使用可能な組成物に配合することもできる。この場合、容器手段は、それ自身、シリンジ、ピペット、及び／または他の同様な装置であることが可能であり、そこから、配合物を、身体の感染部位に施す、動物に注射する、及び／またはキットの他の構成要素に施す及び／または他の構成要素と混合することさえもできる。しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供することもできる。試薬及び／または構成要素が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒もまた、別の容器手段に入れて提供することができることが、想定されている。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本開示の好適な実施形態を実証するために挙げられている。当業者には当然のことながら、実施例に開示される技法は、本開示を実施するのにうまく機能するように、本発明者らが発見した本技術に倣うものであり、したがって、その実施に好適な様式を構成するものとみなすことができる。しかしながら、当業者なら、本開示に照らして、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお類似または同様の結果が得られることを認めるはずである。
【００７１】
［実施例１］
［開示の革新性］
［ポリＡ切断の力を利用した細胞内センサーシステムの作製］
【００７２】
ポリアデニル化は、全ての哺乳類細胞に普遍的に存在する必須のｍＲＮＡプロセシング機構である。ヒストン遺伝子を除いて、哺乳類タンパク質をコードする全てのｍＲＮＡは、およそ２００〜３００のアデノシン残基からなる３’末端を有する３０、３１。ポリＡテールの形成は、連続した２工程を含む：プレｍＲＮＡの切断、及びそれに続く新たに切断された３’末端へのポリＡテール付加。このポリアデニル化過程は、プレｍＲＮＡに存在する配列要素により、及び多くの多量体タンパク質因子からなるポリアデニル化機構により指示される。ポリＡテール付加の前に、プレｍＲＮＡは切断されなければならない。切断部位は、高度に保存されたＡＡＵＡＡＡシグナルと、下流のＵまたはＧＵリッチモチーフとの間にある（図２）。切断は、「Ａ」ヌクレオチドの後ろで優先的に起こる３２。重要なことは、切断された３’ＲＮＡ断片が、キャップ構造を失ったために速やかに分解されることである。
【００７３】
複数の報告から、ポリＡ部位内のＲＮＡ二次構造は、哺乳類細胞中のポリアデニル化効率に大きな影響を及ぼす可能性があることが示されている６，３３，３４。１つの研究では、安定化ＲＮＡステム内の切断部位をただ隠すだけで、切断／ポリアデニル化の程度が大幅に低下したことが報告された６（図３）。このことは、切断が局所ＲＮＡ構造により効率的に制御される可能性があることを示唆する。１つの実施形態において、タンパク質結合の検出及びレポーター遺伝子発現の制御は、ポリＡ切断部位近くのＲＮＡ構造のこの単純だが効果的な調節に基づく。図１に示すとおり、新たなポリＡ部位を、正常な転写単位ではそれらが絶対に局在しない５’ＵＴＲに、人為的に作製した場合、そのポリＡシグナルの効率的切断によって、切断されキャップのとれた３’ｍＲＮＡ断片の速やかな分解のため、ｍＲＮＡの分解及びレポーター遺伝子発現が失われる。遺伝子の後方で３’ＵＴＲに位置する正常ポリＡシグナルとは異なり、５’ＵＴＲに人為的に挿入されたポリＡシグナルは、ｍＲＮＡ中で「自殺単位」として機能する。ｍＲＮＡは、切断部位にアプタマーを挿入することにより、自殺から救出することができる。特定リガンドがアプタマーに結合することにより、切断をブロックし、その結果インタクトｍＲＮＡが保存され、したがってレポーターシグナルまたは導入遺伝子産物が発現する。本明細書中他の部分で記載されるとおり、そのようなポリＡ切断介在型センサーは、アプタマー結合を介したリガンドのダイナミックセンシングを通じた特異性、及びレポーター遺伝子または導入遺伝子のリガンド依存性指数関数的増幅による感度の両方を提供する。
【００７４】
［遺伝子でコード可能なイメージングツールとしてのポリＡセンサーの利点］
【００７５】
ポリＡセンサー配列は、送達用プラスミドまたはウイルスベクター（例えば）の型式でＤＮＡとしてコードすること、または細胞（幹細胞または癌細胞など）もしくは移植用及び遺伝子導入用途のマウスのゲノムに遺伝子操作で導入することが可能である。遺伝子でコードされたセンサーの１つの重要な利点は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの空間分布を限定し、及びそれらの時間的間隔を制御する能力である。非標的組織の広い範囲を非意図的に染色する可能性がある化学染料プローブとは異なり、ＲＮＡセンサーの発現は、組織特異的プロモーターをＤＮＡベクターに含ませて使用することにより、標的細胞または組織に有効に限定することができる。特定の実施形態において、これらのさらなる安全特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのバックグラウンドノイズを減少させるだけでなく、センサーがその標的リガンドに結合することから生じる副作用の可能性を明らかに最小限に抑えると思われる。そのうえさらに、シグナル増幅を欠いた検出方法とは異なり、細胞中の１つのコードされたＤＮＡコピーは、数百の同一ＲＮＡセンサーを生成することができ、次いでセンサーは、数千を超えるレポータータンパク質を生成することができ、さらにレポータータンパク質による酵素反応を通じて、結果的に、シグナルの指数関数的増幅をもたらすことができる。
【００７６】
［ポリＡセンサーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで分子署名（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をモニタリングするために重大な障壁を乗り越えることができる］
【００７７】
ポリＡセンサーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、センシング、増幅を、シグナル検出／イメージングと連結することにより、切望されていた生体タンパク質モニタリング機構を提供する。上記のとおり、タンパク質は化学相互作用のための官能基を豊富に有しているため、高い親和性でタンパク質を標的とするためのアプタマーを作製する方法は、十分に確立されている７−１２。例えば、数例挙げるとすると、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質３５、３６、トロンビン３７、血管内皮増殖因子３８、ＤＮＡ修復タンパク質Ｋｕ３９、及び腫瘍制御因子オステオポンチン４０と特異的に結合するアプタマーが作製されてきた。アプタマーの特異性は、転写因子ＮＦ−ｋＢのＰ５０アイソフォームとＰ６５アイソフォーム４１、４２またはタンパク質キナーゼＥＲＫ２の未ホスホリル型とホスホリル型４３など同一タンパク質の異なるアイソフォームを認識することさえ可能にする。これらの例は、疾患関連タンパク質及びそれらの代謝状態を認識する上でのアプタマーの有効性を実証する。
【００７８】
イメージングレポーターの分野も急速に発展しつつある。例えば、ＧＦＰは、遺伝子発現のレポーターとして生物学の多くの分野に大変革をもたらしたが、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングでのそれらの使用は、主に光学撮像の組織透過性の限界故に、透明組織に限定されてきた。深部組織を透過することができる励起／発光波長を持ち、全身イメージングに適した改変赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）が開発されてきている４４。その上、放射性基質［１８Ｆ］ＦＨＢＧと結合したチミジンキナーゼが、臨床の場でｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＥＴイメージングに使用可能であることが実証されてきている４５−４７。さらに最近では、ＧＦＰの発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモニタリングする新たな核磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）法が開発され、磁気共鳴を介した非侵襲性イメージングへのＧＦＰの使用を新たにもたらした４８。
【００７９】
すなわち、アプタマーに基づくセンシング及びレポーターに基づく検出／イメージングは、それらの意図する機能において強力であるが、組み合わせることで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分子署名検出などにおいてより一層強力となる。欠けているものは、これら２つの機能を連結することができ、「アプタマーのセンシング」を、現在の撮像様式または他の検出方法で検出することができる「レポーター発現」へと翻訳する強力な生物学的増幅器である。これを実現する実施形態を一般化した概略図を図４に示す。特定のタンパク質リガンドをモニタリングするため、高親和性アプタマーを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化を通じて、最初に作製する。ポリＡスイッチは、生物学的増幅器として機能するが、これは、アプタマーとイメージングレポーターとを連結して、センシング装置を形成する。そのようなセンシング装置は、コード化してＤＮＡベクターに導入し、適切なウイルスまたは非ウイルス転移方法を用いて標的細胞／組織に送達することができる。細胞リガンドの存在下、アプタマーの結合は、レポーター遺伝子のリガンド依存性指数関数的増幅を通じて強力なシグナルを生成する。重要なことは、アプタマーの柔軟性が、広範囲の生来タンパク質を検出する可能性を許容し、レポーター選択の柔軟性が、異なる検出様式を介した可視化を許容することである。すなわち、提案されるポリＡセンサーは、既存技術を用いて、柔軟で非侵襲性のｉｎ  ｖｉｖｏ分子検出戦略を可能にするものであり、この分子検出戦略は天然分子署名の存在及び濃度に依存する。
【００８０】
この１０年間に、高処理配列決定及びＤＮＡマイクロアレイから得られた爆発的な量の遺伝子発現データは、将来、疾患のバイオマーカーとして利用できる可能性があるタンパク質及びそれらの変異アイソフォームを何百種ともたらした。ｉｎ  ｖｉｖｏで分子署名を探査することは、診断に役立つだけでなく、特定タンパク質バイオマーカーの増加に基づいた細胞増殖、代謝の変化、及び治療反応の測定も提供する（例えば）。ある特定の実施形態において、ポリＡセンサーは、これまで対処することが困難であったこの部類の測定に対処し、分子検出において、現在可能な範囲よりも大幅に広がった用途を提供する。
【００８１】
特定の実施形態において、本開示の方法及び組成物は、導入遺伝子の発現を正確に制御する能力を提供するが、現在使用されている遺伝子発現試薬、例えばハイブリッド転写トランスアクチベーター及び特殊プロモーターなどへの依存を回避する。特定の実施形態において、本方法は、複数の発現構築物を使用しなければならないことを回避し、ハイブリッドトランスアクチベーターの発現による毒性（外来タンパク質であるトランスアクチベーターに対して向けられる宿主免疫応答の誘導を含む）の可能性を回避し、専用プロモーターの必要性に伴う困難を回避し、さらに実験用途及び治療用途で利用可能な数の限られた小分子インデューサー（利用可能なシステムが限られた数しかないため）を使用しなければならないことを回避する。
【００８２】
その代わりに、本開示のポリＡに基づくシステムは、どのようなタンパク質トランスアクチベーター産物の発現も必要とせず、どのような専用プロモーター配列要素の使用にも依存しない。すなわち、本システムは、任意の内因性遺伝子または改変ベクター転写単位に「埋め込む」ことができる「ポータブル」制御システムを提供する。そのため、本システムは、１つの転写単位（１つの発現構築物）しか必要とせず、そのプロモーターは、プロモーターを使用することで組織特異的（空間的）及び時間的様式で導入遺伝子を制御することができるような順応性がある。ポリアデニル化が全ての哺乳類細胞に存在する普遍的性質であることで、本システムは、広く応用可能となっている。
【００８３】
［実施例２］
［実例的初期実験］
この実施例に記載される初期実験は、ポリＡセンサーシステムの開発を示す。具体的には、複数のポリＡシグナルの分析を通じて、標準発現ベクターの５’ＵＴＲに埋め込んだ場合に、ヒト細胞で効率的に切断されるポリＡ切断介在型センサーが開発される。重要なことは、ここで記載されるのが、ポリＡ切断効率に影響することなく、センサーの一部分として特定リガンドと結合するように設計されたアプタマー配列だということである。最後に、ヒト生細胞でリガンドタンパク質を同時発現することにより、センサーは、そのリガンドを容易に検出し、１００倍超に増加したレポーターシグナルを招く。結果から、特定標識を含まない細胞内タンパク質の検出が、ヒト生細胞で容易に達成されること、及び誘導の度合いは、信号対雑音比で測定した場合に、多くの用途で有用であると思われる範囲になることが、実証される。
【００８４】
［ヒト細胞中、５’ＵＴＲで効率的に機能するポリＡモチーフの同定］
【００８５】
ポリＡ切断の調節を介してタンパク質を検出及び撮像する総合戦略は、５’ＵＴＲでのポリＡシグナルの高度に効率的な切断に大きく依存する（図１）。第一工程は、細胞での効率的なポリＡ切断を可能にする、ポリＡシグナル候補ならびに関連する上流及び下流モチーフを試験することであった。ポリＡ切断効率を試験するため、哺乳類発現ベクターが関与する一過性形質移入アッセイ４９を、ＧＦＰまたはルシフェラーゼレポーター（例にすぎない）とともに使用した。ポリＡシグナル配列候補を、発現ベクター内のレポーター遺伝子または導入遺伝子の５’ＵＴＲにクローン導入した。不活性ポリＡシグナル（ＡＡＵＡＡＡからＣＡＣＡＣＡへの変異）を持つ対照ベクター５０も作って、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質移入後の活性ポリＡシグナルによる切断の効率と比較するための、発現レベルの上限とした。
【００８６】
複数の異なるポリＡシグナルならびに関連する上流及び下流モチーフを、初期分析に使用した。試験したこれらポリＡシグナルの大部分は、５’ＵＴＲにおいて異なる度合いでレポーター遺伝子発現を抑制するそれらの能力に反映されるとおり、ヒト細胞である度合いで機能するように見えたものの、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ研究室が発表した１種の合成ポリＡ５１は、特定の実施形態において、試験条件下で特に有用であった。切断活性のレベルが他より見かけ上高いことに基づいて、このポリＡを、さらなる試験目的に使用した。切断活性の効率を改善するため、ポリＡ配列に一連の改変を行って評価した。もっとも目立ったことは、Ｇリッチ配列の配置５２がポリＡ部位の下流であると、切断が著しく向上し、おそらくこれは、Ｇリッチ配列により引き起こされる転写の一過性停止による５３、５４。Ｇリッチ領域のコピー数を１から２に増やすと、切断はさらに向上した。「ＡＡＵＡＡＡ」を２コピー直列で配置することも、切断を目に見えて増加させた（図５を参照）。得られる、「２ＡＡＵＡＡＡ＋スペーサー＋Ｇ／Ｕリッチ領域＋２Ｇリッチ領域」の組み合わせを含むポリＡ配置を、その後の試験で、一般テンプレートとして用いた。
【００８７】
特定の実施形態において、「ＡＡＵＡＡＡ」とＧ／Ｕリッチ領域の間のスペーサー長を１４塩基から２５塩基に変更すること、またはスペーサーをアプタマーに置き換えることは、ポリＡ切断効率にほとんど影響を及ぼさず、試験した範囲内でスペーサー長は自由であること及び様々な長さのアプタマー配列を収容できることを示す。すなわち、ポリＡシグナルは、ヒト細胞中、５’ＵＴＲで効率的に切断可能であり、スペーサー内での配列変更も変更によっては十分耐性がある。
【００８８】
［ヒト細胞中の細胞内リガンドを検出するためのポリＡに基づくセンサーにアプタマーを操作して導入する試み］
【００８９】
ポリＡシグナルが細胞中５’ＵＴＲで切断される能力を実証するため、特定の実施形態において、リガンド結合アプタマーを操作して、ポリＡセンサーの一部分とする。これにより、センサーは、特定のタンパク質リガンドと結合することができ、その結果、切断が阻害され、したがって、レポーター発現が誘導される。具体的な実施形態として、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質と結合するアプタマーを使用した。この結合は、他の補因子が関与しない単純な１対１相互作用であり、解離定数Ｋｄは０．１ｎＭ３５、３６で、抗体により達成される親和性に匹敵する。効率的センサーを作製するため、「クランプ」と称する操作原理を用いる「合理的設計」アプローチを利用した（図６）。今回、アプタマーは、戦略的に、ＡＡＵＡＡＡシグナルと隣接するように配置し、スペーサー領域の大部分を置き換える。得られるＲＮＡは、２つの主要立体構造間で切り替わるように設計される：一方は、リガンドがセンサーに結合し、したがってスペンサー領域を「クランプ」するもの；他方は、センサーが結合しておらず、スペーサーが、主に一本鎖として存在するもの。第一の立体構造において、リガンド結合は、スペーサーを安定二本鎖ステム構造に効率的にロックし、このことが、ポリＡ介在型切断を大幅に減少させる６、３３、３４。そのうえさらに、リガンドは、切断部位に物理的にドッキングし、切断を開始するために必要とされるポリＡ関連細胞タンパク質の接近を本質的にブロックする。
【００９０】
この「クランプ」原理に基づいて、４０を超える様々な構築物を設計し、その中で、スペーサーの安定性及び長さ、ならびにスペーサー内のアプタマーの配置を調節して、「結合」状態（リガンドが存在、切断なし）及び「非結合」状態（リガンド不在、切断）間のレポーター活性の比を最大化した。この設計シリーズをヒト細胞で試験することにより、この「クランプ」戦略が、卓越したスイッチング挙動を持つ高感度センサーをもたらすことが明らかとなった。１つの設計は、非結合状態での非常に低い漏出発現、及び細胞にリガンドが存在する場合の強力なレポーターシグナル誘導を示した（以下を参照）。上記の操作実施形態は、それらが、生細胞において細胞内リガンドを検出する目的で機能的センサー／増幅器を建設するのに、改変ＲＮＡを、どのように効率的に利用することができるかという例を確立したとおり、効率的なポリＡに基づくセンサーシステムを作り出す。
【００９１】
［細胞中での細胞内リガンドに応じたポリＡセンサーの機能の実証］
【００９２】
改変ポリＡセンサーを用いて、リガンド発現ベクターを、センサーベクターと一緒に、２９３Ｔ細胞に形質移入することは、ルシフェラーゼレポーターシグナルの劇的な増加を招いたことが示された（図７）。リガンドが存在しない場合、そのようなセンサーからのレポーターシグナルは、非常に低い漏出発現を示した（図７ａ、不活性ポリＡ対照の発現レベルの１％未満）。この漏出発現は、リガンドの存在下対不在下でのレポーターシグナルの比として「増倍数」で誘導を計算するための基準レベルを提供する。重要なことは、センサーの反応が「調整可能」であり、用量依存様式で、細胞中のリガンドの量を反映したことである。そのうえさらに、誘導は、最高１２０倍（図７ｂ）、または参照として不活性ポリＡセンサーの発現レベルを用いて理論上誘導可能な範囲の約７６％（図７Ａ）にまで達した。この誘導度合いは、ヒト生細胞でこれまでに達成さたものよりも大きさが約２桁大きく、センサープラットホーム用の基準を形成するのに十分である。対照的に、不活性ポリＡまたはポリＡセンサーが埋め込まれていない親ベクターで形質移入した細胞では、目立った誘導は観察されず（図７Ｂ）、誘導の原因となる機構が、実際に、ポリＡシグナルに介在されることを示す。
【００９３】
ｍＲＮＡレベルにおいて、反応も、提案される機構と一致することを確立するため、ノーザン解析を、リガンド結合に反応したルシフェラーゼｍＲＮＡについて行った。図７Ｃに示すとおり、リガンドが存在しない場合（レーン４）、ルシフェラーゼｍＲＮＡは観察されず、切断されたｍＲＮＡが迅速に分解されたことを示唆した。対照的に、リガンドの存在は、ルシフェラーゼｍＲＮＡの量を顕著に増加させた（レーン５）。そのうえさらに、参照の切断５’断片よりも僅かに高いバンドが、活性センサーを保有する細胞で観察され（レーン４、５、レーン１との比較）、切断された５’断片がポリアデニル化されていたことを示唆した。ＲＴ−ＰＣＲ及び次いでｃＤＮＡ配列決定を用いて、ポリＡテールが、実際に、５’切断断片の末端で、予想される切断部位に付加していたことを確認した。まとめると、これらの結果は、リガンド結合が、ポリＡ切断をブロックし、誘導のためのインタクトｍＲＮＡを保存した機構とほぼ一致する。
【００９４】
ＲＮＡに基づくセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏでの有用性についての以前の実証
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に機能するハンマーヘッド型リボザイムの自己切断に基づく別のＲＮＡセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏ実験が行われてきている４、５５。このリボザイムを用いてＲＮＡセンサーが構築されたが、このＲＮＡセンサーでは、５’ＵＴＲに埋め込まれたリボザイムの自発的自己切断がｍＲＮＡの分解を招き、したがってレポーター遺伝子発現が失われる。リボザイムの小分子阻害剤であるトヨカマイシンの存在は、リボザイム自己切断をブロックし、その結果、インタクトｍＲＮＡが保存され、したがって、レポーター発現が誘導される。リボザイムに基づくセンサーの機能をｉｎ  ｖｉｖｏで実証するため、リボザイムに基づくＲＮＡセンサーをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作製し、宿主組織としてヌードマウスの目に送達した。対照として、不活性リボザイムをコードするＡＡＶを送達して、ハムストリング筋肉を感染させた。次いで、分子トヨカマイシンを、マウスの背側皮膚に薬物ペレットを埋め込むことで投与した。マウスを、ＩＶＩＳ２００イメージング装置で撮像して、光子検出に基づいてルシフェラーゼ発現の定量的測定を行った５６、５７。トヨカマイシン処置の前後に撮影したマウスの代表的画像は、センサーが網膜中のトヨカマイシンの存在を検出することができ、最高１８０倍になるルシフェラーゼレポーター発現誘導をもたらしたことを示した４。対照的に、ルシフェラーゼ発現の増加は、不活性リボザイムを保有する筋肉では観察されなかった。これらの結果から、標的組織に送達されたウイルスベクターにコードされたＲＮＡセンサーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に機能することができ、誘導されたレポーターシグナルの強度は、全身イメージングで容易に検出可能であったことが実証された。これらの研究は、機構としてアプタマーもポリＡ切断も使用していなかったが、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのための一般的実験設定を改変することで、生マウスでのポリＡセンサーの有用性を実証することができる。
【００９６】
ＨＩＶ  ｔａｔ用に開発された最適化センサーは、ＨＩＶ感染した血液細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで検出及び撮像するために使用することができる一例である。あるいは、このまたは別のセンサーを操作して、細胞株に導入し、安定な「センサー細胞」を作製して、患者の血液中の感染性ＨＩＶ粒子数を測定する（ｔｉｔｅｒ）ことができる。近年の爆発的なバイオマーカー発見は、疾患の分子署名として同様に利用できる可能性があるさらなるタンパク質を何百ともたらしてきた。こうした分子署名をｉｎ  ｖｉｖｏで探査することは、診断だけでなく、特定タンパク質の評価に基づく治療反応のモニタリングにも役立つ。本技術は、これら及び他の特定細胞タンパク質を検出／撮像するのに有用であり、これまで達成することが困難であった部類の測定に対処する。ポリＡセンサーにより検出可能な分子署名のスペクトルは、タンパク質だけでなく、他の生体分子、及びＦＤＡ承認小分子も含むことができる。赤外４４、ＰＥＴ４５−４７、またはＭＲＩ４８により撮像可能な次世代の臨床利用可能なレポーターと合わせて、ポリＡセンサーは、分子イメージングに幅広い用途がある。
【００９７】
ＦＤＡ承認薬を用いた遺伝子制御用ポリＡスイッチの有用性の実証
【００９８】
図１９に示すとおり、ポリＡシグナルは、リガンドとしてテトラサイクリンを認識するアプタマーに、効率的に操作して導入することができる。テトラサイクリンは、臨床使用及び安全性記録の長い歴史を持つＦＤＡ承認薬である。テトラサイクリンが存在しない場合、導入遺伝子またはレポーター遺伝子は、非常に低い漏出発現を示し（図２０）、不活性ポリＡ対照の発現レベルの０．２％未満であった。テトラサイクリン投与に際して、導入遺伝子またはレポーター遺伝子の発現は、作動して約３０倍まで増えた。テトラサイクリンによる誘導は、用量依存的であり（図１７）、安全なＦＤＡ承認薬による導入遺伝子発現の正確な制御を可能にする。
【００９９】
［実施例３］
［複数のアプタマーを含むポリＡアプタマー］
本開示のいくつかの実施形態において、ポリＡアプタマー分子は、２、３、４、５、またはそれより多くのアプタマーを含み、特定の場合において、アプタマーは、１つの分子の５’から３’方向に沿って、直線的に連結されている。異なるアプタマー間には、非アプタマー配列が存在する場合もしない場合もある。特定の実施形態において、複数のアプタマーが存在する場合、１つのアプタマーは、別のアプタマーとの関係において、アプタマーの向きが逆の場合がある（すなわち、１つのアプタマーの５’から３’への方向は、第二のアプタマーの３’から５’への方向と逆転する）（図１８Ａ（中央図）及び図２５）が、代替例においては、第二のアプタマーは、同じ向きにある（図１８Ａ（最右側図）。１つまたは複数のアプタマーを含む構築物の特定例において、Ｇリッチ領域は、分子の最も３’側の末端に、またはその近くに存在し、Ｇリッチ領域の例は、ＭＡＺ領域である（図２５）。すなわち、図２５は、新規構築物ＧＰ２を例示し、この中で、ポリＡシグナルは、異なる向きの２つのアプタマーに挟まれている。設計は、図１８に記載される配置の１つに基づいている。５μｇ／ｍＬのＴｃで処理した場合、図２１に記載される１０３ＧＰ２の誘導が１０倍であったのに比べて、ＧＰ２は、１２．６倍という誘導の改善を示した。ＧＰ２のＰ２ｂ領域の多様な改変及びそれに応じた遺伝子発現誘導に対する影響も示す。
【０１００】
実施形態によっては、ポリＡアプタマー分子は、直線的に連結された２つのアプタマーを含むが、分子は、様々な形状の三次元形状を有することができる。図２６は、新規構築物ＧＰ２ＳＬＧＰ２を例示し、この中で、２つのＧＰ２アプタマーは、背中合わせに接続されている。５’ＧＰ２アプタマーをヘルパーと称し、３’ＧＰ２アプタマーをセンターと称する。両方とも、活性ポリＡシグナルを有するが、センターアプタマーのみが、Ｇリッチ領域を有する。この配置は、２種の異なる構造、デフォルト構造とスーパー構造Ｃとの間での択一的折り畳みを可能にするように設計されている。５μｇ／ｍＬのＴｃで処理した場合、ＧＰ２ＳＬＧＰ２は、ＧＰ２の１２．６倍誘導に比べて７０倍という劇的に改善された誘導を示す。三次元構造に発展する複数のアプタマーが存在する場合において、２つのループの配列は、一列に並ぶ場合がある（図２６の右側図を参照）。複数のアプタマーが分子に存在する場合において、特定の実施形態では１つのＧリッチ領域のみが分子に存在し、場合によっては、Ｇリッチ領域は、第二アプタマー上に（５’から３’に向かって）存在する可能性があるか、または分子の最も３’側のアプタマー上に存在する。
【０１０１】
図２７は、図２６の右側図と似通った、図２５に列挙するループＰ２ｂのＧＰ２配列を有する特定のスーパー構造分子を示す。ヘルパーＧＰ２及びセンターＧＰ２のステム／ループＩＩ領域（四角で囲った領域）の長さ及び配列の多様性、ならびに対応する遺伝子発現誘導に対する影響を示す。異なる構築物間の配列多様性を、赤で示す。スーパー構造Ｃの構造で折り畳まれている場合、ＧＰ２ＳＬＧＰ２の中央ステムは、１８ｂｐに等しい長さを有し、一方Ｃ１２は、２０ｂｐに等しい長さを有する。構築物Ｃ１２は、５μｇ／ｍＬのＴｃで誘導が９４倍に達したが、一方で構築物Ｄ１１Ａは、５μｇ／ｍＬのＴｃで誘導が８４倍に達した。両方とも、５μｇ／ｍＬのＴｃでＧＰ２ＳＬＧＰ２の７０倍誘導を大幅に上回った。特定の実施形態において、ループ２の配列（図２７の四角で囲った領域）は、領域を、ループではなく二本鎖領域として存在させた。図２６（右側画像）及び図２７に示すとおりのスーパー構造分子において、四角で囲ったＬ２領域も含めたポリＡ（ｐＡ）「ドッグボーン」間の領域の長さは、１０〜２５ヌクレオチド、例えば、１８〜２０ヌクレオチドなどである。
【０１０２】
例にすぎないが、図２８は、ＧＰ２ステムループ配列（図２５を参照）、Ｃ１２ステムループ配列（図２５を参照）、及びＤ１１Ａステムループ配列（図２５を参照）を含むＧＰ２ＳＬＧＰ２ポリＡセンサー構築物の完全配列を提示する。それらが持つ、発現を誘導する能力を特性決定するため、３種の分子を、様々な濃度のテトラサイクリン（Ｔｃ、結合ポケット用リガンドの例として）で試験した。図２９は、ＧＰ２ＳＬＧＰ２の用量依存的調節を実証する。各データ点は、Ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に相当する。平均誘導増倍数を標準偏差とともに示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１０４倍に達した。図３０は、Ｃ１２配列を含む構築物の用量依存的調節を実証する。各データ点は、Ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に相当する。平均誘導増倍数を標準偏差とともに示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１５１倍に達した。図３１は、Ｄ１１Ａ配列を含む構築物の用量依存的調節を実証する。各データ点は、Ｔｃありとなしとでのルシフェラーゼ活性の比として求められた相対誘導増倍数に相当する。平均誘導増倍数を標準偏差とともに示す。誘導は、１５μｇ／ｍＬのＴｃで１２７倍に達した。
【０１０３】
本出願の範囲は、本明細書中記載される、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及び工程の特定の実施形態に限定されないものとする。
【０１０４】
［参考文献］
本明細書中言及される全ての刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示すものである。本明細書中全ての刊行物は、個々の刊行物がそれぞれ、具体的かつ個別に、そのまま全体が参照として援用されると示されたのと同じぐらいに、参照として援用される。
【０１０５】
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【０１０８】
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【０１１０】
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【０１１１】
７．  Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｏｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６７，  ３１５−３３５  （１９９６）．
【０１１２】
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【０１１４】
１０．  Ｌｅｅ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒｓ，  Ｌ．Ａ．  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ａ．Ｄ．  Ａｐｔａｍｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，  Ｄ９５−１００  （２００４）．
【０１１５】
１１．  Ｎｉｍｊｅｅ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｒｕｓｃｏｎｉ，  Ｃ．Ｐ．  ＆  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ，  Ｂ．Ａ．  Ａｐｔａｍｅｒｓ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ５６，  ５５５−５８３  （２００５）．
【０１１６】
１２．  Ｔｕｅｒｋ，  Ｃ．  ＆  Ｇｏｌｄ，  Ｌ．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  ５０５−５１０  （１９９０）．
【０１１７】
１３．  Ｂｅｃｓｋｅｉ，  Ａ．  ＆  Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ｌ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｂｙ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，  ５９０−５９３  （２０００）．
【０１１８】
１４．  Ｂｅｃｓｋｅｉ，  Ａ．，  Ｓｅｒａｐｈｉｎ，  Ｂ．  ＆  Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ｌ．  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ：  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｒａｄｅｄ  ｔｏ  ｂｉｎａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２０，  ２５２８−２５３５  （２００１）．
【０１１９】
１５．  Ｃａｒｒｉｅｒ，  Ｔ．Ａ．  ＆  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｄ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１，  ２５−３６  （１９９９）．  
【０１２０】
１６．  Ｄｅｍｏｎｇｅｏｔ，  Ｊ．，  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍ．  ＆  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｒ．  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ．  Ｃｏｍｐｔｅｓ  ｒｅｎｄｕｓ  ｄｅ  Ｉ’Ａｃａｄｅｍｉｅ  ｄｅｓ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｓｅｒｉｅ  ＩＩＩ，  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｅ  ｌａ  ｖｉｅ  ３２３，  ６９−７９  （２０００）．
【０１２１】
１７．  Ｆｅｒｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｊｒ．  Ｓｅｌｆ−ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ａｎｄ  ｂｉｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，  １４０−１４８  （２００２）  ．
【０１２２】
１８．  Ｉｓａａｃｓ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｈａｓｔｙ，  Ｊ．，  Ｃａｎｔｏｒ，  Ｃ．Ｒ．  ＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．Ｊ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，  ７７１４−７７１９  （２００３）  ．
【０１２３】
１９．  Ｆａｍｕｌｏｋ，  Ｍ．，  Ｈａｒｔｉｇ，  Ｊ．Ｓ．  ＆  Ｍａｙｅｒ，  Ｇ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｐｔａｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １０７，  ３７１５−３７４３  （２００７）．
【０１２４】
２０．  Ｊｅｎｉｓｏｎ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｇｉｌｌ，  Ｓ．Ｃ．，  Ｐａｒｄｉ，  Ａ．  ＆  Ｐｏｌｉｓｋｙ，  Ｂ．  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，  １４２５−１４２９  （１９９４）．
【０１２５】
２１．  Ｎａｖａｎｉ，  Ｎ．Ｋ．  ＆  Ｌｉ，  Ｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｓｅｎｓｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １０，  ２７２−２８１  （２００６）．
【０１２６】
２２．  Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｍ．Ｐ．，  Ｋｎｕｄｓｅｎ，  Ｓ．Ｍ．  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ａ．Ｄ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｎａｌｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｐｔａｚｙｍｅ  ｌｉｇａｓｅ  ａｒｒａｙ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１２，  １０６−１１２  （２００３）．
【０１２７】
２３．  Ｂｒｅａｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，  ３１−３９  （２００２）．
【０１２８】
２４．  Ｔａｎｇ，  Ｊ．  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４，  ４５３−４５９  （１９９７）．
【０１２９】
２５．  Ｍａｎｄａｌ，  Ｍ．  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ５，  ４５１−４６３  （２００４）．
【０１３０】
２６．  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  Ｗ．Ｃ．，  Ｎａｈｖｉ，  Ａ．，  Ｒｏｔｈ，  Ａ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，  ２８１−２８６  （２００４）．
【０１３１】
２７．  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  Ｗ．Ｃ．  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９，  ４８７−５１７  （２００５）．
【０１３２】
２８．  Ｗｉｎ，  Ｍ．Ｎ．  ＆  Ｓｍｏｌｋｅ，  Ｃ．Ｄ．  Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４，  １４２８３−１４２８８  （２００７）．
【０１３３】
２９．  Ｗｉｎ，  Ｍ．Ｎ．  ＆  Ｓｍｏｌｋｅ，  Ｃ．Ｄ．  Ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＮＡ  ｄｅｖｉｃｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，  ４５６−４６０  （２００８）．
【０１３４】
３０．  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎ．  Ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ３’  ｅｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，  ２７２−２７８  （２００４）．
【０１３５】
３１．  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｆｕｒｇｅｒ，  Ａ．  ＆  Ｄｙｅ，  Ｍ．Ｊ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １０８，  ５０１−５１２  （２００２）．
【０１３６】
３２．  Ｃｈｅｎ，  Ｆ．，  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  Ｃ．Ｃ．  ＆  Ｗｉｌｕｓｚ，  Ｊ．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３，  ２６１４−２６２０  （１９９５）．
【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
３５．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｒ．，  Ｂａｂａ，  Ｔ．  ＆  Ｋｕｍａｒ，  Ｐ．Ｋ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ａｐｔａｍｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１．  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ５，  ３８９−３９６  （２０００）．
【０１４０】
３６．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ５，  ３７１−３８８  （２０００）．
【０１４１】
３７．  Ｌｏｎｇ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｌｏｎｇ，  Ｍ．Ｂ．，  Ｗｈｉｔｅ，  Ｒ．Ｒ．  ＆  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ，  Ｂ．Ａ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．  ＲＮＡ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ  １４，  ２５０４−２５１２  （２００８）．  
【０１４２】
３８．  Ｎｇ，  Ｅ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ，  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｐｔａｍｅｒ  ｆｏｒ  ｏｃｕｌａｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，  １２３−１３２  （２００６）．
【０１４３】
３９．  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｙｏｏ，  Ｓ．，  Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌｏ，  Ａ．，  Ｂｅｌｙａｅｖ，  Ｉ．  ＆  Ｓｏｌｄａｔｅｎｋｏｖ，  Ｖ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｋｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １４，  １５３−１５９  （２００４）．
【０１４４】
４０．  Ｍｉ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７，  １５３−１６１  （２００９）．
【０１４５】
４１．  Ｃａｓｓｉｄａｙ，  Ｌ．Ａ．  ＆  Ｍａｈｅｒ，  Ｌ．Ｊ．，  ３ｒｄ  Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ＲＮＡ  ｄｅｃｏｙｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，  ３９３０−３９３５  （２００３）．
【０１４６】
４２．  Ｒｅｉｔｅｒ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｍａｈｅｒ，  Ｌ．Ｊ．，  ３ｒｄ  ＆  Ｂｕｔｃｈｅｒ，  Ｓ．Ｅ．  ＤＮＡ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｂｙ  ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，  １２２７−１２３６  （２００８）．
【０１４７】
４３．  Ｖａｉｓｈ，  Ｎ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８１０−８１５  （２００２）．
【０１４８】
４４．  Ｓｈｕ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，  ８０４−８０７  （２００９）．
【０１４９】
４５．  Ｈｕｎｇ，  Ｓ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｒｏｍａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ７７４９−７７５６  （２００５）．
【０１５０】
４６．  Ｙａｇｈｏｕｂｉ，  Ｓ．Ｓ．  ＆  Ｇａｍｂｈｉｒ，  Ｓ．Ｓ．  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ＨＳＶ１−ｔｋ）  ｏｒ  ｍｕｔａｎｔ  ＨＳＶ１−ｓｒ３９ｔｋ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ［１８Ｆ］ＦＨＢＧ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，  ３０６９−３０７５  （２００６）．
【０１５１】
４７．  Ｙａｇｈｏｕｂｉ，  Ｓ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  １８Ｆ−ＦＨＢＧ  ＰＥＴ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ６，  ５３−５８  （２００９）．
【０１５２】
４８．  Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｓｓａａｄ，  Ｃ．Ａ．，  Ｈｉｌｓｅｎｂｅｃｋ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ｆ．  ＆  Ｐａｕｔｌｅｒ，  Ｒ．Ｇ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  （ＭＲＩ）  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＦＰ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  （ＭＴＣ）．  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ  ５０，  ３７５−３８２  （２０１０）．  
【０１５３】
４９．  Ｏｒｙ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｎｅｕｇｅｂｏｒｅｎ，  Ｂ．Ａ．  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｒ．Ｃ．  Ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｈｕｍａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ／ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，  １１４００−１１４０６  （１９９６）．
【０１５４】
５０．  Ｓｈｅｅｔｓ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｏｇｇ，  Ｓ．Ｃ．  ＆  Ｗｉｃｋｅｎｓ，  Ｍ．Ｐ．  Ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＡＡＵＡＡＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙ  （Ａ）  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，  ５７９９−５８０５  （１９９０）．
【０１５５】
５１．  Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｎ．，  Ｂｒｉｇｇｓ，  Ｄ．，  Ｇｉｌ，  Ａ．  ＆  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎ．Ｊ．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ｓｉｔｅ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３，  １０１９−１０２５  （１９８９）．
【０１５６】
５２．  Ａｓｈｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  ＭＡＺ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｇｅｎｅｓ．  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  １３，  ５６５６−５６６７  （１９９４）．
【０１５７】
５３．  Ｇｒｏｍａｋ，  Ｎ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｓ．  ＆  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎ．Ｊ．  Ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６，  ３９８６−３９９６  （２００６）．
【０１５８】
５４．  Ｙｏｎａｈａ，  Ｍ．  ＆  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎ．Ｊ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐａｕｓｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ３，  ５９３−６００  （１９９９）．
【０１５９】
５５．  Ｙｅｎ，  Ｌ．，  Ｍａｇｎｉｅｒ，  Ｍ．，  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｒ．，  Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，  Ｂ．Ｒ．  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｒ．Ｃ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  ＲＮＡ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ  １２，  ７９７−８０６  （２００６）．
【０１６０】
５６．  Ｃｏｎｔａｇ，  Ｃ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  ６６，  ５２３−５３１  （１９９７）．
【０１６１】
５７．  Ｃｏｎｔａｇ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｏｌｏｍｕ，  Ｉ．Ｎ．，  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，  Ｄ．Ｋ．  ＆  Ｃｏｎｔａｇ，  Ｃ．Ｈ．  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４，  ２４５−２４７  （１９９８）．
【０１６２】
本開示及びその利点を詳細に説明してきたものの、当然ながら、添付の請求項により定義されるとおりの本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、交換、及び改変を、その中で行うことが可能である。その上、本出願の範囲は、明細書中記載されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及び工程の特定実施形態に限定されないものとする。当業者なら、本開示の内容から、既存のまたは今後開発されると思われる、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及び工程で、本明細書中記載される実施形態と実質的に同じ機能を行うものまたは実質的に同じ結果をもたらすものを、本開示に従って利用することができるとすぐにわかるだろう。したがって、添付の請求項は、それらの範囲内において、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程を包含するものとする。
【図１Ａ】
2018533955.tif 000004
【図１Ｂ】
2018533955.tif 000005
【図１Ｃ】
2018533955.tif 000006
【図２】
2018533955.tif 000007
【図３】
2018533955.tif 000008
【図４】
2018533955.tif 000009
【図５Ａ】
2018533955.tif 000010
【図５Ｂ】
2018533955.tif 000011
【図５Ｃ】
2018533955.tif 000012
【図６】
2018533955.tif 000013
【図７Ａ】
2018533955.tif 000014
【図７Ｂ】
2018533955.tif 000015
【図７Ｃ】
2018533955.tif 000016
【図８Ａ】
2018533955.tif 000017
【図８Ｂ】
2018533955.tif 000018
【図９Ａ】
2018533955.tif 000019
【図９Ｂ】
2018533955.tif 000020
【図９Ｃ】
2018533955.tif 000021
【図１０Ａ】
2018533955.tif 000022
【図１０Ｂ】
2018533955.tif 000023
【図１１Ａ】
2018533955.tif 000024
【図１１Ｂ】
2018533955.tif 000025
【図１２Ａ】
2018533955.tif 000026
【図１２Ｂ】
2018533955.tif 000027
【図１３Ａ】
2018533955.tif 000028
【図１３Ｂ】
2018533955.tif 000029
【図１４Ａ】
2018533955.tif 000030
【図１４Ｂ】
2018533955.tif 000031
【図１５Ａ】
2018533955.tif 000032
【図１５Ｂ】
2018533955.tif 000033
【図１６】
2018533955.tif 000034
【図１７】
2018533955.tif 000035
【図１８Ａ】
2018533955.tif 000036
【図１８Ｂ】
2018533955.tif 000037
【図１８Ｃ】
2018533955.tif 000038
【図１９】
2018533955.tif 000039
【図２０】
2018533955.tif 000040
【図２１】
2018533955.tif 000041
【図２２】
2018533955.tif 000042
【図２３】
2018533955.tif 000043
【図２４】
2018533955.tif 000044
【図２５】
2018533955.tif 000045
【図２６】
2018533955.tif 000046
【図２７】
2018533955.tif 000047
【図２８】
2018533955.tif 000048
【図２９】
2018533955.tif 000049
【図３０】
2018533955.tif 000050
【図３１】
2018533955.tif 000051
【配列表】
2018533955000001.app
【国際調査報告】
2018533955.tif 000052
2018533955.tif 000053