(57)【要約】  本発明は、被験体において遺伝性乾燥赤血球症を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該被検体においてガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子の遺伝子型を決定することを含む、方法に関する。本発明はまた、特にＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ又はｃ．８４４Ｇ＞Ａの保因者であるヒト被験体において遺伝性乾燥赤血球症の治療に使用されるＫＣＮＮ４タンパク質の阻害剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球からのカリウムの流出を特異的に阻害する選択的ガルドスチャネル遮断薬である、遺伝性乾燥赤血球症の治療に使用されるガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）の阻害剤。
【請求項２】
有機分子、アミノ酸及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
イミダゾール系抗真菌剤、クロトリマゾール、メトロニダゾール、エコナゾール、アルギニン、Ｔｒａｍ−３４、カリブドトキシン、ニフェジピン、２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−２−フェニルアセトアミジン、２−（２−クロロフェニル）−２，２−ジフェニルアセトアルデヒドオキシム、２−（２−クロロフェニル）−２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミジン、２，２，２−トリス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミジン、２−（２−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−２−フェニルアセトアミジン、リン酸３−（２−オキサゾリル）−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニルスルホンアミド］フェニルモノエステル、Ｎ−［２−（４，５−ジヒドロオキサゾール−２−イル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４−メトキシ−２−（２−オキサゾリル）フェニル］ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４，５−ジメトキシ−２−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［２−（２−フリル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド及びＮ−［４−メチル−２−（２−オキサゾリル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、並びにセニカポクからなる群から選択され、好ましくはセニカポクであることを特徴とする、請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
コドン３５２におけるアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸変化、コドン２８２におけるバリンからメチオニンへのアミノ酸変化、又はコドン２８２におけるバリンからグルタミンへのアミノ酸変化をそれぞれ起こす、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、又はｃ．８４５Ｔ＞Ａからなる群から選択されるミスセンス突然変異、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ又はｃ．８４４Ｇ＞Ａ、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａの保因者であるヒト被験体の遺伝性乾燥赤血球症の治療に使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
ヒト被験体においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫＣＮＮ４遺伝子の遺伝子型を決定する方法であって、
（ａ）前記被験体から得られる核酸サンプルからｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離する工程と、
（ｂ）ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．１０５５位に存在するヌクレオチドを決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを前記被験体の血液サンプルから得ることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡを前記被験体の網状赤血球から得て、前記ゲノムＤＮＡを前記被験体の白血球から得ることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）を、ハイブリダイゼーション法、選択的増幅、核酸シークエンシング、制限酵素断片長多型解析（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型解析（ＡＦＬＰ）、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）又は質量分析によって行うことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｃ．１０５５位の前記ヌクレオチドを、配列番号３のプローブ及び配列番号４のプローブを用いるリバースドットブロットにより決定することを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト被験体において遺伝性乾燥赤血球症の存在、又はそれに対する素因を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、
（ｉ）前記被験体の生体サンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）前記生体サンプルにおいてガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、又はガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）におけるミスセンス突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの存在を検出する工程と、
を含み、
前記突然変異の存在が、遺伝性乾燥赤血球症のマーカー、又は前記被験体における遺伝性乾燥赤血球症に対する素因を構成する、方法。
【請求項１１】
ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａの存在が、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法に従って前記ヒト被験体においてＫＣＮＮ４遺伝子の遺伝子型を決定することにより検出されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガルドスチャネルにおける突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの存在が、タンパク質シークエンシング、又は特異的にガルドスチャネル変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓに対するリガンドへの結合によって検出されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３のプローブ及び／又は配列番号４のプローブを含む、遺伝性乾燥赤血球症を診断するキット。
【請求項１４】
ヒト被験体においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝性乾燥赤血球症を診断するための配列番号３のプローブ及び／又は配列番号４のプローブの使用。
【請求項１５】
ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕからなる群から選択されるヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体の生物学的に活性のある阻害剤をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験化合物を、ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕそれぞれと接触させることと、配列番号２の野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）と比較した場合に該試験化合物が該チャネルを介したイオン伝導を妨げる能力を判定することと、を含み、配列番号２の野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）と比較した場合に該チャネルを介したイオン伝導を妨げることは、該化合物がヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕを阻害する能力についての指標をもたらす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝性乾燥赤血球症（hereditary xerocytosis）の診断、及びこの障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
水分及び溶質の恒常性は、赤血球の完全性の維持に必須であり、一価陽イオン含量の調節によって制御される。原発性の赤血球の水和障害が幾つか存在し、ナトリウム及びカリウムに対する赤血球膜の浸透性異常によって、赤色細胞の膨張又は収縮を起こすことを特徴とする（非特許文献１）。臨床的には、これらの遺伝性障害は、慢性溶血性貧血を伴い、様々な膜貫通イオンチャネル又は輸送体の欠損が原因となっている（非特許文献２）。
【０００３】
遺伝性乾燥赤血球症（ＨＸ）（［ＯＭＩＭ］１９４３８０）は、原発性の赤血球脱水を特徴とする常染色体優性の先天性溶血性貧血である（非特許文献３）。ＨＸ患者では、赤色血液細胞が細胞内の陽イオン含量の変化、並びに平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）の上昇及び赤血球浸透圧脆弱性の低下に関わる細胞脱水を呈する（非特許文献４）。顕微鏡下で、血液細胞の薄膜は様々な形態異常を示し、その最も特徴的なものが中央淡明、線形又は鎌形であり、そのことがこれらの細胞に対する口唇状赤血球、及びＨＸの代替名である脱水型遺伝性口唇状赤血球症の名の由来である（非特許文献２）。
【０００４】
ＨＸは、赤色細胞膜の機械受容陽イオンチャネルであるＰＩＥＺＯ１をコードするＦＡＭ３８Ａのミスセンス突然変異に関連するものである（非特許文献５、非特許文献６）。機能研究から、ＰＩＥＺＯ１の突然変異がチャネルの不活性化を遅らせ、また顕著な活性化遅滞（latency）を誘導することが明らかになっている（非特許文献７）。最近になって、偽性高カリウム血症に伴う別の種の赤色細胞イオン交換の欠損が、ＡＴＰ結合カセット輸送体ＡＢＣＢ６の突然変異と結び付けられた（非特許文献８）。非特許文献１では、遺伝性乾燥赤血球症についての遺伝子座が１６ｑ２３〜ｑ２４にマッピングされたが、罹患遺伝子は未だ同定されていないとの報告がある。
【０００５】
ガルドスチャネルは、ＫＣａ３．１又はＫＣＮＮ４とも称される陽イオンチャネルである。ガルドスチャネルは、Ｃａ２＋感受性の中間伝導度カリウム選択性チャネルであり、当初は膵臓細胞に存在すると記載されていたが、赤血球を含む多くの細胞型に存在している（非特許文献９）。ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）をコードする遺伝子の遺伝子座は、１９ｑ１３．２にマッピングされている。ガルドスチャネルは、４つの同一のサブユニットで構成されており、各サブユニットが単一遺伝子ＫＣＮＮ４でコードされており、６つの膜貫通ドメインと、５番目の膜貫通ドメインと６番目の膜貫通ドメインとの間に細孔領域とを含んでいる（非特許文献９）。定常状態の条件下において、ガルドスチャネルは不活性である。その機能は、成熟した正常赤血球では完全に解明されていない。外部刺激下で、細胞内Ｃａ２＋が増大した後、ガルドスチャネルの４つのチャネルサブユニットのそれぞれに密に結合しているカルモジュリン分子と相互作用する。カルモジュリンへのＣａ２＋の結合により、チャネルの開放、並びに迅速なＫ＋及び水の流出が起こり、赤血球の脱水及び収縮を引き起こし、この機構はガルドス作用と呼ばれている（非特許文献９、非特許文献１０）。赤色血液細胞は、血液循環中、一定の動きをとり、細胞膜には機械的応力がかかる。オンセルパッチクランプ実験を用いることで、局所的な膜変形が赤色細胞において刺激事象として働き、ガルドスの活性化を引き起こし得ることが分かっており、この機械受容機構によって、赤血球が微小血管系の狭い毛細血管を通るようにその容量及び形態を適合させることが可能となり得ることが示唆されている（非特許文献１１）。最近の研究では、多様な生理学的事象におけるガルドスチャネルの役割が多く記載されており、ガルドスチャネルが大きなヒト疾患パネルにおける興味深い治療標的であると指摘されている（非特許文献１２、非特許文献１３）。
【０００６】
本発明者らは、ガルドスチャネルの機能的領域の１つに位置するミスセンス突然変異（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異）と、８人の罹患ＨＸ患者（persons）を含む２つの血縁関係にないＨＸ家系における慢性溶血及び脱水細胞との突然変異の関係性とを特定した。罹患者は様々な重症度の慢性貧血を示す。その赤色細胞は、楕円赤血球、ヘミゴースト（hemighosts）、破砕赤血球、及び極めて稀な口唇状赤血球等の様々な形態異常を呈する。ミスセンス突然変異は、カルモジュリンと相互作用し、チャネルの開放及びＫ＋の流出に関わる領域に位置する、種間で高度に保存された残基に関するものである。
【０００７】
アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞にて行った機能実験から、残基３５２が突然変異したチャネルは、通常Ｃａ２＋の流入により活性化し、野生型（ｗｔ）チャネルに比べてＫ＋の流出の強さが増大しており、正常チャネルに比べて長期間、開放及び活性の状態を保つことが分かった。ガルドスチャネルのカルモジュリン結合ドメインにおける正電荷を除去する突然変異によって、この活性化パートナーとの相互作用が変わり、チャネルがより活性になると考えられる。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３での実験から、突然変異ＫＣＮＮ４では電流密度が高くなることが確認された。カルモジュリン結合部位が突然変異しているにも関わらず、突然変異体のトラフィッキング特性は、トラフィッキング特性が大きく異なる細胞（ＨＥＫ２９３及びアフリカツメガエル卵母細胞）であっても類似しており、影響を受けない。これらの実験から、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異が、１０分の１のＣａ２＋濃度でも活性化されるようにチャネルのＣａ２＋感受性を変えることが分かった。Ｃａ２＋に対する感受性の上昇に伴う活性化動態の変化（anomaly）が、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４に病原性を付与する。
【０００８】
本発明者らは、ＨＸ生理病理に関与するこのガルドスチャネルにおける２つの他の突然変異、すなわちｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ（Ｖ２８２Ｍ）及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕ（Ｖ２８２Ｅ）の突然変異（非特許文献１４、非特許文献１５）がそれぞれ、Ｒ３５２Ｈ突然変異と同様にＫＣＮＮ４活性の上昇をもたらすことを更に示した。
【０００９】
生物学的診断を行うことができる２つの検査は通常の研究所では行うことができず、その中でも浸透圧抵抗検査は、本事例では通常のものであるＥＭＡ検査に置き換えられることが非常に多くなっているものの、赤血球内のＫ＋判定は現時点で日常的に行われていないことから、これらの患者におけるこの障害の診断は阻まれている。
【００１０】
そのため、新たな遺伝性乾燥赤血球症の診断検査の提供は臨床的関心事である。
【００１１】
加えて、現在この病状には薬理学的治療法がない。
【００１２】
本発明者らは、ＫＣＮＮ４阻害剤クロトリマゾールの誘導体であるセニカポクの突然変異ＫＣＮＮ４を阻害する効力を評価した。セニカポクは、過去に鎌状赤血球症の治療について第ＩＩＩ相試験が行われ、この際に非毒性であることが証明された（非特許文献１６）。トランスフェクトしたＨＥＫ細胞及びヒト赤色血液細胞を用いて、本発明者らは、Ｒ３５２Ｈ突然変異の場合にセニカポクがＫＣＮＮ４電流を阻害することにより、Ｋ＋喪失及び脱水を防ぐのに有効であることを示した。さらに、本発明者らは、Ｖ２８２Ｍ突然変異を持つチャネルが野生型ＫＣＮＮ４と同程度にセニカポクに対して感受性であるが、Ｖ２８２Ｅ突然変異を持つチャネルは極めて感受性が低いことも示した。したがって、これらの結果から、セニカポクが少なくともガルドスチャネルにおけるＲ３５２Ｈ又はＶ２８２Ｍの突然変異に関連する赤色血液細胞の脱水を治療する治療法であると考えられることが強く示唆される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Rinehart et al., 2010
【非特許文献２】Da Costa L, et al., 2013
【非特許文献３】Miller et al., 1971
【非特許文献４】Archer et al., 2014
【非特許文献５】Zarychanski et al., 2012
【非特許文献６】Andolfo et al., 2013a
【非特許文献７】Bae et al., 2013
【非特許文献８】Andolfo et al., 2013b
【非特許文献９】Maher and Kuchel, 2003
【非特許文献１０】Fanger et al., 1999
【非特許文献１１】Dyrda et al., 2010
【非特許文献１２】Wulff and Koehler, 2013
【非特許文献１３】Wulff and Castle, 2010
【非特許文献１４】Andolfo et al., 2015
【非特許文献１５】Glogowska et al., 2015
【非特許文献１６】Ataga et al., 2011
【発明の概要】
【００１４】
したがって、本発明は、遺伝性乾燥赤血球症の治療に使用されるガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）の阻害剤を提供する。
【００１５】
ガルドスチャネルは、ＫＣａ３．１又はＫＣＮＮ４とも称されるＣａ２＋感受性の中間伝導度カリウム選択性チャネルである（非特許文献９）。ガルドスチャネルは、野生型ガルドスチャネル又は突然変異体ガルドスチャネル、例えばガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕ、好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、より好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓとすることができる。
【００１６】
好ましい実施の形態では、ガルドスチャネルは、ヒト起源のものである。野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいてアクセッション番号Ｏ１５５５４（ＧＩ：１７３６６１６０）にて入手可能であり、本明細書では配列番号２と称する。
【００１７】
ガルドスチャネルの阻害剤は、赤血球からのカリウムの流出を特異的に阻害する選択的ガルドスチャネル遮断薬を指す。
【００１８】
ガルドスチャネルの阻害剤は、赤血球からのカリウムの流出を特異的に阻害する能力について候補化合物集団をスクリーニングすることにより特定することができる。赤血球からのカリウムの流出の阻害を測定する方法自体は既知である。このような方法例は、Brugnara et al., 1993a及び1993b、Ellory et al., 1994に記載されている。ガルドスチャネルの阻害パーセント及びガルドスチャネルの阻害剤のＩＣ５０はいずれも、Brugnara et al., 1993bに記載の方法を用いて調べることができる。
【００１９】
ガルドスチャネルの阻害剤の効力は、Brugnara et al., 1993aにて開示されているような方法によって赤血球を用いて調べることができる。
【００２０】
ガルドスチャネルの阻害剤としては、有機分子、アミノ酸及び抗体が挙げられる。
【００２１】
抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。「抗体（"antibody" or "antibodies"）」という用語には、本明細書で使用される場合、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体のフラグメント、又はそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含む抗体の機能フラグメントも包含される。好適な抗体は、ＫＣＮＮ４タンパク質（ガルドスチャネル）に対するものである。有益には、上記抗体は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである。
【００２２】
好ましい実施の形態では、ガルドスチャネルの阻害剤は、イミダゾール系抗真菌剤（Brugnara et al., 1996）、例えばクロトリマゾール（Brugnara et al., 1993a）、メトロニダゾール（Brugnara et al., 1993a）、エコナゾール（Brugnara et al., 1993a）；アルギニン（Romero et al., 2002）；Ｔｒａｍ−３４（１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール）（Wulff et al., 2000）；カリブドトキシン；マウロトキシン（Castle et al., 2002）；ニフェジピン（Brugnara et al., 1993a）；ニトレジンピン（Brugnara et al., 1993a）；セニカポク（ＩＣＡ−１７０４３；ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミド；Ataga et al., 2008、2009）、２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−２−フェニルアセトアミジン、２−（２−クロロフェニル）−２，２−ジフェニルアセトアルデヒドオキシム、２−（２−クロロフェニル）−２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミジン、２，２，２−トリス（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミジン、２−（２−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−２−フェニルアセトアミジン、リン酸３−（２−オキサゾリル）−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニルスルホンアミド］フェニルモノエステル、Ｎ−［２−（４，５−ジヒドロオキサゾール−２−イル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４−メトキシ−２−（２−オキサゾリル）フェニル］ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４，５−ジメトキシ−２−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［２−（２−フリル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド、及びＮ−［４−メチル−２−（２−オキサゾリル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミドを含む、国際公開第００／５００２６号、国際公開第２００４／０１６２２１号、国際公開第２００５／１１３４９０号及び国際公開第２００６／０８４０３１号に記載されるガルドスチャネルに対する選択性及び効力を示すカルシウム活性化カリウム流の阻害剤からなる群から選択され、好ましくはセニカポクである（Stocker et al., 2003も参照されたい）。
【００２３】
より好ましい実施の形態では、ガルドスチャネルの阻害剤はセニカポクである。
【００２４】
ガルドスチャネルの阻害剤自体を投与しても、又は好適な担体又は賦形剤（複数の場合もある）と混合してもよい。阻害剤は全身に使用することができる。全身投与に適した製剤であればどのようなものを使用してもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」という用語は、遺伝性乾燥赤血球症の被験体に、この障害の緩和、軽減、変更、改善、回復、快方又はこの障害への作用を目的とする上記のガルドスチャネルの阻害剤の投与を含む。
【００２６】
被験体は、好ましくはヒト被験体、より好ましくはコドン３５２におけるアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸変化（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）、コドン２８２におけるバリンからメチオニンへのアミノ酸変化（ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ）、又はコドン２８２におけるバリンからグルタミンへのアミノ酸変化（ｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕ）をそれぞれ起こす、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、及びｃ．８４５Ｔ＞Ａからなる群から選択されるミスセンス突然変異、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ又はｃ．８４４Ｇ＞Ａ、より好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａの保因者であるヒト被験体である。
【００２７】
ガルドスチャネルをコードする野生型ヒトＫＣＮＮ４遺伝子の核酸配列（Ｍａｐ：１９ｑ１３．２）は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるアクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０（ＧＩ：５６８８１５５７９）にて入手可能である。
【００２８】
野生型ヒトＫＣＮＮ４遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の核酸配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるアクセッション番号ＮＭ＿００２２５０．２（ＧＩ：２５７７７６５１）にて入手可能であり、本明細書では配列番号１と称する。
【００２９】
野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいてアクセッション番号Ｏ１５５５４（ＧＩ：１７３６６１６０）、又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿００２２５０．２（ＧＩ：２５７７７６５１）にて入手可能であり、本明細書では配列番号２と称する。
【００３０】
上記突然変異を特定する方法を下記に記載する。
【００３１】
特定の実施の形態において、本発明は、コドン３５２におけるアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸変化（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）、コドン２８２におけるバリンからメチオニンへのアミノ酸変化（ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ）、又はコドン２８２におけるバリンからグルタミンへのアミノ酸変化（ｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕ）をそれぞれ起こす、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、及びｃ．８４５Ｔ＞Ａからなる群から選択される、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ及びｃ．８４４Ｇ＞Ａから選択されるミスセンス突然変異より好ましくはミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａの保因者であるヒト被験体の遺伝性乾燥赤血球症の治療に使用されるセニカポク（ＩＣＡ−１７０４３；ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミド）を提供する。
【００３２】
本発明はまた、遺伝性乾燥赤血球症を治療する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の上記ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）の阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、遺伝性乾燥赤血球症を治療する薬剤の調製のための上記ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）の阻害剤の使用を提供する。
【００３４】
本発明はまた、ヒト被験体においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫＣＮＮ４遺伝子の遺伝子型を決定する方法であって、
（ａ）上記被験体から得られる核酸サンプルからｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離する工程と、
（ｂ）ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．１０５５位、ｃ．８４４位又はｃ８４５位、好ましくはｃ．１０５５位に存在するヌクレオチドを決定する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．１０５５位、ｃ．８４４位、又はｃ．８４５位に存在するヌクレオチドに対応するヌクレオチドを決定する」という用語は、上記の単離されたｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかにおいてガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．１０５５位、ｃ．８４４位、又はｃ．８４５位に存在するヌクレオチドに対応するヌクレオチドを決定することを表す。
【００３６】
上記被験体は、遺伝性乾燥赤血球症を患っているか、又は患っていない。
【００３７】
被験体から核酸サンプルを得る方法は、当該技術分野において既知である。被験体からｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを単離する方法も当該技術分野において既知である。
【００３８】
有益には、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを、上記被験体の血液サンプルから、特にｍＲＮＡの単離では上記被験体の網状赤血球から、又はゲノムＤＮＡの単離では上記被験体の白血球から得ることができる。
【００３９】
工程（ｂ）における上記ヌクレオチドを決定する方法は、当該技術分野において既知である単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法を含む。
【００４０】
ＳＮＰの検出方法は、従来技術において記載されており、これには選択的ハイブリダイゼーション法（例えば、リバースドットブロット、ＤＮＡではサザンブロット、ＲＮＡではノーザンブロット）、選択的増幅、核酸シークエンシング、制限酵素断片長多型解析（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型解析（ＡＦＬＰ）、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）、質量分析が挙げられる（Kaplan and Delpech, 2007のレビューを参照されたい）。
【００４１】
特に、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにおいてＳＮＰを決定するのに、それぞれ対応するｍＲＮＡ又はゲノム領域を増幅する必要があり得る。このために、増幅させるＳＮＰを含む配列からヌクレオチド配列を得ることができるＰＣＲプライマーを使用することができる。次いで、ＰＣＲによって増幅されたフラグメントをシークエンシング（例えば、サンガーシークエンシング）又はハイブリダイゼーション法によって分析することができる。ＰＣＲによって増幅されたフラグメントは、多型部位が既知の２種の変異体（野生型又は変異体）を識別する特異的な伸長プライマーによる質量分析計でも分析することができる。
【００４２】
例として、上記のＰＣＲプライマーセットとしては、配列番号５のＰＣＲプライマーと配列番号６のＰＣＲプライマーとのセットが挙げられる。
【００４３】
ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰは、リバースドットブロットによっても決定することができる。野生型配列を決定するのに配列番号３のプローブを使用することができ、ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ変異体（突然変異体）配列を決定するのに配列番号４のプローブを使用することができる。
【００４４】
ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子の突然変異ｃ．８４４又はｃ．８４５の遺伝子型を決定する方法は、非特許文献１４及び非特許文献１５に記載されている。
【００４５】
その遺伝子型決定方法によれば、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．１０５５位に存在するヌクレオチドがアデニン（Ａ）である場合、又はガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．８４４位に存在するヌクレオチドがアデニン（Ａ）である場合、又はガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子のｃ．８４５位に存在するヌクレオチドがアデニン（Ａ）である場合に、被験体は遺伝性乾燥赤血球症を患うと推測することができる。
【００４６】
本発明はまた、ヒト被験体において遺伝性乾燥赤血球症の存在、又はそれに対する素因を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、
（ｉ）上記被験体の生体サンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）上記生体サンプルにおいて、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、及びｃ．８４５Ｔ＞Ａからなる群から選択される、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ及びｃ．８４４Ｇ＞Ａから選択されるミスセンス突然変異、より好ましくはミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａの存在、又はガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）におけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕからなる群から選択される、好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔから選択されるミスセンス突然変異、より好ましくはミスセンス突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの存在を検出する工程と、
を含み、
上記突然変異の存在が、遺伝性乾燥赤血球症のマーカー、又は上記被験体における遺伝性乾燥赤血球症に対する素因を構成する、方法を提供する。
【００４７】
工程（ｉｉ）の好ましい実施の形態では、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ及びｃ．８４５Ｔ＞Ａから選択される、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ及びｃ．８４４Ｇ＞Ａから選択されるミスセンス突然変異、より好ましくはミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａの存在が検出される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、又はｃ．８４５Ｔ＞Ａの存在を検出する」という用語は、上記被験体の核酸サンプル由来のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかでのＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、又はｃ．８４５Ｔ＞Ａに対応する突然変異の存在を検出することを指す。
【００４９】
ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、又はｃ．８４５Ｔ＞Ａの存在は、上記のように、上記ヒト被験体においてＫＣＮＮ４遺伝子の遺伝子型を決定することにより検出することができる。
【００５０】
タンパク質において点突然変異を決定する方法は、当該技術分野において既知である（Kaplan and Delpech, 2007のレビューを参照されたい）。ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）におけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕの突然変異の存在は、タンパク質シークエンシング、又は特異的にガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、若しくはｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕそれぞれに対するリガンド（例えば抗体）への結合によって、特に特異的にガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕそれぞれに対する抗体を使用するウェスタンブロットによって、好ましくはタンパク質シークエンシングによって検出することができる。
【００５１】
本発明はまた、被験体における遺伝性乾燥赤血球症を診断及び治療する方法であって、
（ｉ）上記被験体の生体サンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）上記のように、上記生体サンプルにおいて、ガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４遺伝子におけるｃ．１０５５Ｇ＞Ａ、ｃ．８４４Ｇ＞Ａ、及びｃ．８４５Ｔ＞Ａからなる群から選択される、好ましくはｃ．１０５５Ｇ＞Ａ及びｃ．８４４Ｇ＞Ａから選択されるミスセンス突然変異、より好ましくはミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａが存在するか否か、又はガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）におけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕからなる群から選択される、好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔから選択されるミスセンス突然変異、より好ましくはミスセンス突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓが存在するか否かを検出する工程と、
（ｉｉｉ）生体サンプルにおける工程（ｉｉ）に記載の突然変異の存在が検出された場合に被験体が遺伝性乾燥赤血球症であると診断する工程と、
（ｉｖ）有効量の上記のようなガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）の阻害剤、好ましくはセニカポクを診断済みの被験体に投与する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた、配列番号３のプローブ及び／又は配列番号４のプローブを含む、遺伝性乾燥赤血球症を診断するキットを提供する。
【００５３】
本発明はまた、ヒト被験体においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝性乾燥赤血球症を診断するための配列番号３のプローブ及び／又は配列番号４のプローブの使用を提供する。
【００５４】
本発明はまた、ガルドスチャネルの阻害剤をスクリーニングする方法に関する。このような阻害剤は、赤血球からのカリウムの流出を特異的に阻害する選択的ガルドスチャネル遮断薬として、更に遺伝性乾燥赤血球症の治療に有用である。
【００５５】
上記方法は、結合アッセイ及び／又は機能アッセイを含み、ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕ、好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、より好ましくはｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓを伴って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞系（酵母、細菌、アフリカツメガエル卵母細胞）において、又は動物において行うことができる。
【００５６】
細胞系では、細胞は、生検材料としての又は細胞培養物にて増殖する、ネイティブ細胞、すなわちガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕポリペプチドを通常発現する細胞とすることができる。これらのネイティブ細胞は赤血球に由来するものであるのが好ましい。代替的には、細胞は、ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕを発現する、組換え宿主細胞、特にアフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞である。
【００５７】
したがって、本発明は、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、及びｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕからなる群から選択されるヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体、好ましくは変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、より好ましくは変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの生物学的に活性のある阻害剤をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験化合物を、ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕと接触させることと、配列番号２の野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）と比較した場合に該試験化合物が該チャネルを介したイオン伝導を妨げる能力を判定することとを含み、配列番号２の野生型ヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）と比較した場合に該チャネルを介したイオン伝導を妨げることは、該化合物がヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕを阻害する能力についての指標をもたらす、方法を提供する。
【００５８】
上記方法の好ましい実施の形態では、該方法は、アフリカツメガエル卵母細胞においてヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕをコードする突然変異ｃＤＮＡを含むプラスミドを発現させることと、試験化合物の存在下で電流電圧を測定することとを含み、伝導度の低下は、該試験化合物がヒトガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕを阻害することを示す。
【００５９】
上記方法の別の好ましい実施の形態では、ガルドスチャネル（ＫＣＮＮ４タンパク質）変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ、ｐ．Ｖａｌ２８２Ｍｅｔ、又はｐ．Ｖａｌ２８２Ｇｌｕポリペプチドを発現する赤血球を試験化合物及びＲｂ含有培地に曝す。初期の８６Ｒｂ輸送速度は、赤血球による８６Ｒｂ取り込みの線形最小二乗傾斜等のパラメータから算出することができる。阻害定数は、コンピュータ支援非線形曲線適合を用いた標準法によって算出することができる。
【００６０】
アフリカツメガエル卵母細胞において電流電圧を測定する方法を下記実施例Ｉに記載する。
【００６１】
上記の特徴に加えて、本発明は更に、下記の記載に出てくる他の特徴を含み、この記載は、ガルドスチャネルにおけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異の同定、並びに慢性溶血及び脱水細胞とその突然変異の関係性、並びにガルドスチャネルにおける突然変異により引き起こされる遺伝性乾燥赤血球症の治療へのセニカポクの使用に加えて、添付の図面のことも指す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】赤色血液細胞及びＤＮＡ研究を示す図である。突然変異分離を示す家系図である。
【図１Ｂ】赤色血液細胞及びＤＮＡ研究を示す図である。発端者１及びその母親の血液塗抹標本（ＭＧＧ）である。
【図１Ｃ】赤色血液細胞及びＤＮＡ研究を示す図である。残基３５２の領域におけるＫＣＮＮ４の多種間タンパク質配列アラインメントである。
【図１Ｄ】赤色血液細胞及びＤＮＡ研究を示す図である。ＫＣＮＮ４転写産物シークエンシングであり、上パネルが野生型配列であり、下パネルが突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）を有する転写産物である。
【図１Ｅ】赤色血液細胞及びＤＮＡ研究を示す図である。０．１％〜１％のＮａＣｌ溶液範囲での浸透圧勾配を用いた赤色細胞の浸透圧脆弱性試験である。Ａ：対照、家系１由来の母親及び発端者についてＴ０及び３７℃。Ｂ：対照及び発端者について４℃又は３７℃でＴ２４時間のインキュベーション後。
【図２Ａ】ガルドスチャネル変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの機能分析を示す図である。活性化動態である。ＷＴ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現する卵母細胞について、０ｍＶでの電流を時間の関数としてプロットした（左パネル）。最大電流強度はＷＴ  ＫＣＮＮ４と突然変異ＫＣＮＮ４とで異なり、異なる時点でのＩとＩｍａｘとの比を各条件について算出し、時間の関数としてプロットした。データは、３つの異なるバッチに由来する１５個（ＷＴ）又は２２個（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）の卵母細胞の平均である。矢印は、カルシウムイオノフォア灌流の開放を示す。棒グラフ（右パネル）は、ＷＴ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現する卵母細胞における２２０ｓでの残存電流を定量化したものである。それぞれの記録について、２２０ｓでの電流をＩｍａｘ（約１３５ｓでの）で除算した。データは、１５個（ＷＴ）又は２２個（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）の卵母細胞の平均±標準誤差である。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った。２つの棒グラフには、０．２％のリスク差がある（双方向）。
【図２Ｂ】ガルドスチャネル変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの機能分析を示す図である。定量化を伴う卵母細胞膜におけるＷＴ  ＫＣＮＮ４及び突然変異ＫＣＮＮ４の電流−電圧曲線である。Ｉ／Ｖ曲線は、１μＭ  Ａ２３１８７を含むグルコン酸培地中のＷＴ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現する卵母細胞について記録された最大電流（およそ１３５ｓ）に対応している。データは、１５個（ＷＴ）又は２２個（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）の卵母細胞に対して記録された傾斜の平均である。ＮＩは、対照（非注入）卵母細胞（ｎ＝４）である。挿入図：矢印で示されたＷＴ  ＫＣＮＮ４及び突然変異ＫＣＮＮ４のウェスタンブロット検出（およそ５０ｋＤａ）。
【図２Ｃ】ガルドスチャネル変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの機能分析を示す図である。ＴＲＡＭ−３４阻害：ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異体を発現する卵母細胞において最大電流に達したら、１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４を添加した。これにより、迅速な電流低下が誘導された。５０ｍＶでの最大電流の平均値（白色の棒グラフ）を算出し、ＴＲＡＭ−３４添加後の５０ｍＶでの最小電流の平均値（灰色の棒グラフ）と比較した。データは、４個の卵母細胞の平均±標準誤差である。
【図３Ａ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４発現を示す図である。全細胞構成にて記録されたｗｔ  ＫＣＮＮ４及びｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４の活性化動態である。ＷＴ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４をＨＥＫ２９３細胞において発現させた後、全細胞構成にてパッチ−クランプ実験を行った。電流は、−６０ｍＶの保持電位にて−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの１５０ｍｓの電圧傾斜プロトコルを用いたブレークイン（break-in）の直後に記録した。−２０ｍＶでの電流を時間の関数としてプロットした。値は、１２回〜８回の実験の平均±標準誤差である。
【図３Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４発現を示す図である。ｗｔ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現するＨＥＫ２９３についての代表的な電流／電圧曲線である。挿入図（左上）は、ブレークイン直後及び定常状態での逆転電位を表している。値は、テューキープロットとして表す（ｎ＝１２〜８）。クラスカルウォリス検定の後にテューキーの事後検定を用いて統計分析を行った。
【図３Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４発現を示す図である。ｗｔ  ｓｋ４及び突然変異ｓｋ４における−２０ｍＶでの電流密度を示すテューキープロットである（ｎ＝１２〜８；＊＊＊ｐ＜０．００１）。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った。
【図３Ｄ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４発現を示す図である。インサイドアウトマクロパッチ構成にて記録されたｗｔ  ＫＣＮＮ４及びｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４の電流のＣａ２＋依存性の活性化の代表的なトレースである。電流は、−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの１５０ｍｓの電圧傾斜によって誘起させた。各トレースは、Ｉ／Ｖの右側に示される様々な濃度のＣａ２＋に対応している。
【図３Ｅ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４発現を示す図である。［Ｃａ２＋］ｉに応じて−４５ｍＶで測定した正規化Ｋ＋電流をｗｔ  ＫＣＮＮ４（四角）及びｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異ＫＣＮＮ４（丸）について［Ｃａ２＋］Ｉの関数としてプロットした。実験値（平均±標準誤差）をヒルの式に当てはめた（Origin software（マサチューセッツ州ノーサンプトン））：
【数１】
2018519275.tif 000002
（式中、Ｙは各［Ｃａ２＋］についての−４５ｍＶでの相対ＫＣＮＮ４電流（Ｉ／Ｉｍａｘ）であり、Ｙｍａｘは最大電流（Ｉｍａｘ）であり、Ｋ０．５は見掛けの解離定数であり、ｎはヒル係数である）。挿入図（右下）は、ヒルの式のパラメータＫ０．５及びｎｈを示している。値は、テューキープロットとして表す（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った。
【図４Ａ】バナジン酸塩とのインキュベーション時間を関数とする陽イオン含量を示す図である。５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については黒色円、患者の赤色細胞については黒色四角）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４を含む５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については灰色円、患者の赤色細胞については灰色四角）とインキュベートした赤色細胞におけるＫ＋含量である。乾燥重量１ｇ当たりのμｍｏｌ単位のデータは、平均±標準偏差、ｎ＝３である。
【図４Ｂ】バナジン酸塩とのインキュベーション時間を関数とする細胞容量を示す図である。５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については黒色円、患者の赤色細胞については黒色四角）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４を含む５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については灰色円、患者の赤色細胞については灰色四角）とインキュベートした赤色細胞における細胞水である。乾燥重量１ｇ当たりのμｍｏｌ単位のデータは、平均±標準偏差、ｎ＝３である。
【図４Ｃ】バナジン酸塩とのインキュベーション時間を関数とする陽イオン含量を示す図である。５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については黒色円、患者の赤色細胞については黒色四角）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４を含む５ｍＭ  バナジン酸塩（対照赤色細胞については灰色円、患者の赤色細胞については灰色四角）とインキュベートした赤色細胞におけるＮａ＋含量である。乾燥重量１ｇ当たりのμｍｏｌ単位のデータは、平均±標準偏差、ｎ＝３である。
【図５Ａ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体の特性評価を示す図である。ＷＴ  ＫＣＮＮ４、Ｖ２８２Ｅ  ＫＣＮＮ４、又はＶ２８２Ｍ  ＫＣＮＮ４をＨＥＫ２９３細胞で発現させた後、−６０ｍＶの保持電位にて−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの１５０ｍｓの電圧傾斜プロトコルを用いた全細胞構成でのパッチクランプ実験を行った。８回〜１０回の実験の平均電流／電圧曲線を左側に表す。右パネルでは、値を、ＷＴ  ＫＣＮＮ４及び突然変異ＫＣＮＮ４（Ｖ２８２Ｅ及びＶ２８２Ｍ）でトランスフェクトした細胞において０ｍＶで測定した電流密度を示すテューキー箱ひげ図として表す。クラスカルウォリス検定の後にテューキーの事後検定を用いて統計分析を行った（ｎ＝８〜１０；＊ｐ＜０．０５）。
【図５Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体の特性評価を示す図である。ＷＴ  ＫＣＮＮ４をＨＥＫ２９３細胞で発現させた後、図５Ａに記載のパッチクランプ実験を行った。１μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝８）、又は０．２５μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝４）を用いて記録された細胞の平均電流／電圧曲線を左側に表す。右パネルでは、値をテューキープロットとして表す。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った（ｎ＝４〜８、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体の特性評価を示す図である。Ｖ２８２Ｅ  ＫＣＮＮ４をＨＥＫ２９３細胞で発現させた後、図５Ａに記載のパッチクランプ実験を行った。１μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝１０）、又は０．２５μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝８）を用いて記録された細胞の平均電流／電圧曲線を左側に表す。右パネルでは、値をテューキープロットとして表す。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った（ｎ＝８〜１０、ｎｓ：有意ではない）。
【図５Ｄ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体の特性評価を示す図である。Ｖ２８２Ｍ  ＫＣＮＮ４をＨＥＫ２９３細胞で発現させた後、図５Ａに記載のパッチクランプ実験を行った。１μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝８）、又は０．２５μＭ  遊離Ｃａ２＋を含有する細胞内溶液（ｎ＝８）を用いて記録された細胞の平均電流／電圧曲線を左側に表す。右パネルでは、値をテューキープロットとして表す。マンホイットニー検定を用いて統計分析を行った（ｎ＝８、ｐ＜０．００１）。
【図６Ａ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体に対するセニカポクの効果を示す図である。セニカポクによるＷＴ  ＫＣＮＮ４及び突然変異ＫＣＮＮ４（Ｒ３５２Ｈ、Ｖ２８２Ｍ及びＶ２８２Ｅ）の用量依存性阻害を示す代表的なトレースである（ｎ＝各条件で記録された細胞数）。全細胞パッチクランプ構成で記録された電流は、−６０ｍＶの保持電位にて−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの１５０ｍｓの電圧傾斜によって誘起させた。各トレースは、Ｉ／Ｖの右側に示される様々な濃度のセニカポクに対応している。
【図６Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体に対するセニカポクの効果を示す図である。［セニカポク］に応じて０ｍＶで測定された正規化Ｋ＋電流をＷＴ  ＫＣＮＮ４（黒色四角）、Ｒ３５２Ｈ突然変異ＫＣＮＮ４（黒色丸）及びＶ２８２Ｍ突然変異ＫＣＮＮ４（黒色菱形）について［セニカポク］の関数としてプロットした。実験値（平均±標準誤差）を、ヒルの式を用いて当てはめた。
【図６Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４突然変異体に対するセニカポクの効果を示す図である。各条件についてのＩＣ５０値を示すテューキー箱ひげ図である（ｎ＝５〜１１、＊ｐ＜０．０５）。クラスカルウォリス検定の後にテューキーの事後検定を用いて統計分析を行った。
【図７Ａ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する赤色血液細胞に対するセニカポク及びＴＲＡＭ−３４の効果を示す図である。対照の赤色血液細胞における正味のＫ＋流の動態である。５μＭ  バナジン酸塩を、非存在下にて（丸）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（四角）若しくは０．４μＭ  セニカポク（三角）の存在下にてｔ＝０で赤色細胞に添加した。データは、２名の異なる対照の血液を用いた３回にわたる代表的な一実験に由来する３つのサンプルの平均±標準誤差である。
【図７Ｂ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する赤色血液細胞に対するセニカポク及びＴＲＡＭ−３４の効果を示す図である。患者の赤色血液細胞における正味のＫ＋流の動態である。５μＭ  バナジン酸塩を、非存在下にて（丸）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（四角）若しくは０．４μＭ  セニカポク（三角）の存在下にてｔ＝０で赤色細胞に添加した。データは、単一の患者の血液を用いた３回にわたる代表的な一実験に由来する３つのサンプルの平均±標準誤差である。
【図７Ｃ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する赤色血液細胞に対するセニカポク及びＴＲＡＭ−３４の効果を示す図である。対照の赤色血液細胞における含水量の動態である。５μＭ  バナジン酸塩を、非存在下にて（丸）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（四角）若しくは０．４μＭ  セニカポク（三角）の存在下にてｔ＝０で赤色細胞に添加した。データは、２名の異なる対照の血液を用いた３回にわたる代表的な一実験に由来する３つのサンプルの平均±標準誤差である。
【図７Ｄ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する赤色血液細胞に対するセニカポク及びＴＲＡＭ−３４の効果を示す図である。患者の赤色血液細胞における含水量の動態である。５μＭ  バナジン酸塩を、非存在下にて（丸）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（四角）若しくは０．４μＭ  セニカポク（三角）の存在下にてｔ＝０で赤色細胞に添加した。データは、単一の患者の血液を用いた３回にわたる代表的な一実験に由来する３つのサンプルの平均±標準誤差である。
【図８Ａ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する対照の赤色血液細胞の浸透圧抵抗を示す図である。血液を４℃でインキュベートした。インキュベーションは、非存在下にて（菱形）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（灰色四角）、０．４μＭ  セニカポク（灰色三角、破線）若しくは４μＭ  セニカポク（明灰色のバツ印）の存在下にて行った。データは、２名の異なる対照の血液を用いた２〜３回の異なる実験の代表値である。
【図８Ｂ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する患者の赤色血液細胞の浸透圧抵抗を示す図である。血液を４℃でインキュベートした。インキュベーションは、非存在下にて（菱形）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（灰色四角）、０．４μＭ  セニカポク（灰色三角、破線）若しくは４μＭ  セニカポク（明灰色のバツ印）の存在下にて行った。データは、単一の患者の血液を用いた２〜３回の異なる実験の代表値である。
【図８Ｃ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する対照の赤色血液細胞の浸透圧抵抗を示す図である。血液を３７℃でインキュベートした。インキュベーションは、非存在下にて（菱形）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（灰色四角）、０．４μＭ  セニカポク（灰色三角、破線）若しくは４μＭ  セニカポク（明灰色のバツ印）の存在下にて行った。データは、２名の異なる対照の血液を用いた２〜３回の異なる実験の代表値である。
【図８Ｄ】ＫＣＮＮ４  Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する患者の赤色血液細胞の浸透圧抵抗を示す図である。血液を３７℃でインキュベートした。インキュベーションは、非存在下にて（菱形）、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４（灰色四角）、０．４μＭ  セニカポク（灰色三角、破線）若しくは４μＭ  セニカポク（明灰色のバツ印）の存在下にて行った。データは、単一の患者の血液を用いた２〜３回の異なる実験の代表値である。
【図９】ヒト赤色血液細胞におけるＫＣＮＮ４の電流に対するセニカポクの効果を示す図である。内因性のＫＣＮＮ４の電流を、全細胞パッチクランプ構成を用いて記録した。電流は、−２０ｍＶの保持電位にて−４０ｍＶから＋７０ｍＶまでの８００ｍｓの電圧傾斜プロトコルによって誘起させた。赤色血液細胞を５分間、ＴＲＡＭ−３４（１０μＭ）又はセニカポク（０．５μＭ）と予めインキュベートさせた後、パッチクランプ実験を行った。患者（黄色、ｎ＝４）、セニカポクで処理した患者（緑色、ｎ＝６）又は対照（灰色、ｎ＝５）、ＴＲＡＭ−３４で処理した対照（橙色、ｎ＝４）、又はセニカポクで処理した対照（青色、ｎ＝３）の代表的な電流／電圧曲線を示している。挿入図（右下）は、赤色血液細胞にて記録された電流の定量化を示したものである。値は、テューキープロットとして表す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６３】
実施例Ｉ：遺伝性乾燥赤血球症に関連するガルドスチャネルにおけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異の同定
１．  材料及び方法
血液学的検査：低張生理食塩水溶液中の赤色血液細胞の脆弱性の観察に基づく浸透圧脆弱性検査をサンプリング直後及び４℃又は３７℃での２４時間のインキュベーション後に行った。
【００６４】
ＮＭＲ：ＮＭＲ実験は、イオノフォアＡ２３１８７（Sigma Aldrich）による刺激を用いて４００  ＡＶＡＮＣＥ大口径分光計（Bruker Biospin、マサチューセッツ州ビレリカ）にて行った。
【００６５】
ＮＧＳシークエンシング：エクソームシークエンシングは、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）（Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いたエクソーム濃縮、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ（商標）  ２  ＳｙｓｔｅｍのＩｏｎ  ＰＩ（商標）  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２を用いたテンプレート作製、並びにＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒのＩｏｎ  ＰＩ（商標）  Ｃｈｉｐ  Ｋｉｔ  ｖ２及びＩｏｎ  ＰＩ（商標）  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２（Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いたシークエンシング後に行った。生データを初めに、提供されるソフトウェアスイートによりアライメントして、ＢＡＭファイルを作成した。包括度（coverage）及びシークエンシング深度分析を、ＢＥＤｔｏｏｌｓ  ｓｕｉｔｅ  ｖ２．１７（Quinlan and Hall, 2010）及び社内スクリプトを用いてコンピュータ処理した。変異体を、Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｖａｒｉａｎｔコーラー（バージョン４．０．２）を用いて同定し、Ａｎｎｏｖａｒ（Wang et al., 2010）を含む社内「ＶａｒＡＦＴ」システムを用いてアノテーションを行い、優先順位を付けた。
【００６６】
突然変異は、サンガーシークエンシング（３５００ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）、Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）により新鮮網状赤血球のＤＮＡサンプル及びＫＣＮＮ４転写産物に対して確認した。
【００６７】
アフリカツメガエル卵母細胞における実験：プラスミドｐｃＤＮＡ３ＫＣＮＮ４−ＨＡ（Joiner et al., 2001）を用いて、ＰＣＲにより点突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓを導入した。ヘマグルチニンタグ（ＨＡ）はＫＣＮＮ４のＣ末端に存在していた（Joiner et al., 1997）。本出願人らの倫理委員会にて推奨される手法に従って、雌性のアフリカツメガエルにＭＳ２２２で麻酔をかけた。卵母細胞を採取し、先に公開されているように（Barneaud-Rocca et al., 2011）注入した。
【００６８】
電流の記録は下記のように行った：−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの２秒間の傾斜プロトコル、保持電位−８０ｍＶを、Ｃｌａｍｐｅｘ（ＰＣｌａｍｐ、Molecular Devices Corporation）を用いて適用した。塩化物チャネル活性化を考慮に入れないように、電流の記録は、塩化物をグルコン酸塩（グルコン酸Ｎａ  ８５ｍＭ及びグルコン酸Ｋ  １ｍＭ）に置き換えたＭＢＳ中で行った。接合部電位を、寒天橋及び３Ｍ  ＫＣｌを用いて最小にした。３Ｍ  ＫＣｌを充填した電極は、０．５Ｍオーム抵抗であった。このグルコン酸ＭＢＳにて平衡化した後、グルコン酸ＭＢＳ中、１μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７によってＫＣＮＮ４を活性化した。対照の卵母細胞では、イオノフォア添加では電流が活性化しなかった。
【００６９】
卵母細胞に対するウェスタンブロット：卵母細胞膜を先に記載のように準備した（Martial et al., 2007）。抗ＨＡ抗体（１／１０００、Sigma）を用いてＫＣＮＮ４−ＨＡの免疫検出を行った。異なるサンプルにおけるＫＣＮＮ４の発現レベルを比較するために、細胞膜マーカーβ１  Ｎａ、Ｋ  ＡＴＰアーゼを使用した（１／５００、Sigma）。シグナルを、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ試薬（Millipore）及びＦｕｓｉｏｎ  ＦＸ７（Vilber-Lourmat、フランス）との化学発光反応によって検出した。β１  Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナルに対するＫＣＮＮ４バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４４ソフトウェア（NCBI）を用いて定量化した。
【００７０】
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション：ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）  １０％ＦＢＳペニシリン−ストレプトマイシン中で増殖させた。細胞を、ＣａＰＯ４を用いて１μｇのＷＴ  ｐｃＤＮＡ３−ＫＣＮＮ４−ＨＡ又は点突然変異ｐｃＤＮＡ３−ＫＣＮＮ４−ＨＡ及び０．５μｇのｐＩＲＥＳ−ｅＹＦＰで同時トランスフェクトした。１６時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光標識細胞に対してパッチ−クランプ記録を行った。
【００７１】
パッチ−クランプ電気生理：ガラスピペット（Brand、ドイツ、ウェルトヘイム）を、水平型のピペットプラー（Ｐ−９７、Sutter Instrument Co．、カリフォルニア州ノバート）にて作製し、３ＭΩ〜５ＭΩの範囲の最終抵抗を得た。全細胞実験については、バッチ溶液をＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、グルコース  ２９ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  ２５ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整する）とした。細胞内溶液は、ＫＣｌ  ３０ｍＭ、グルコン酸Ｋ  １００ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨを７．２に調整する）、ＣａＣｌ２  ４．１９ｍＭ（１μＭ  遊離カルシウムに相当する）、ＭｇＡＴＰ  ２ｍＭとした。電流は、−６０ｍＶの保持電位にて−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの傾斜プロトコルを用いて室温で測定した（サンプリング周波数  １０ｋＨｚ、フィルタリング  １ｋＨｚ）。
【００７２】
インサイドアウト記録：ＫＣＮＮ４のカルシウム依存性を、ＫＣｌ  ３０ｍＭ、グルコン酸Ｋ  １００ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整する）、４．９１ｍＭ；４．１９ｍＭ；３．６１ｍＭ；２．８２ｍＭ；１．７ｍＭと様々な濃度のＣａＣｌ２（１０−５Ｍ；１０−６Ｍ；５×１０−７Ｍ；２．５×１０−７Ｍ；１０−７Ｍの遊離カルシウム）の細胞内（浴）溶液を用いて調べた。Ｍａｘｃｈｅｌａｔｏｒを用いて、遊離Ｃａ２＋濃度を算出した（http://maxchelator.stanford.edu/CaEGTA-TS.htm）。細胞外溶液：ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、グルコース  ２９ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  ２５ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整する）。電流は、−１２０ｍＶから８０ｍＶまでの電圧傾斜（１５０ｍｓ）によって惹起させ、１ｋＨｚでフィルタリングを行い、１０ｋＨｚのサンプリング周波数にて得た。全てのトレースを液体接合部電位に対して補正した。用量応答実験のために、−４５ｍＶでの電流の正規化値を遊離Ｃａ２＋濃度に対してプロットした。
【００７３】
全てのパッチ−クランプ実験を、ＰＣ制御したＥＰＣ  ９パッチ−クランプ増幅器（HEKA、ドイツ、ランブレヒト／プファルツ州）を用いて行った。電流を得て、Ｐｕｌｓｅ＋Ｐｕｌｓｅｆｉｔソフトウェア（HEKA）を用いて分析した。
【００７４】
免疫組織：ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＮ４−ＨＡの免疫検出を、抗ＨＡ抗体（Sigma-Aldrich）を用いて行った。
【００７５】
赤色細胞の陽イオン含量及び容量測定：家系１のインフォームドコンセントを得た（informed）患者及び健常なボランティアから新鮮静脈血を静脈穿刺によって得た。２４時間、インキュベーションを行い、血液サンプルを３７℃又は４℃で保存した。
【００７６】
バナジン酸塩実験：血液を室温でＮａＣｌ（１４７ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４（１０ｍＭ）を含有する媒体で４回洗浄した。次いで、赤色細胞懸濁液を、３７℃、３０％ヘマトクリットにてインキュベートし、５ｍＭ  バナジン酸塩を単独で、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４とともに添加した。サンプリング時間の数分前に、４００μｌの細胞懸濁液を採り、３個のナイロンチューブに入れ、これを正確なサンプリング時間にて４℃、２００００ｇで１０分間、遠心分離した。細胞外のイオン含量の測定のために上清を回収した。赤色細胞のペレットを抽出し、直後に湿重量を計測した。一晩加熱した後（８０℃）、乾燥重量を測定した。血中（packed）細胞間の捕捉媒体に対応する３．６４％の補正を行い、含水量を算出した。細胞内のイオンは、５ｍｌのｍｉｌｌｉＲｈｏ水（Millipore）中の４℃での一晩のインキュベーションによって乾燥ペレットから抽出した。EppendorfのＥＬＥＸ６３６１を用いたフレーム分光法によってＮａ＋及びＫ＋を測定した。
【００７７】
２．  結果
初めに、浮腫を伴わない重度の子宮貧血について、胎児（発端者１）を調べたところ、２７週間で１回の子宮内輸血が必要であった（Ｈｂ：３０ｇ／ｌ）。早産後、胎児に出生直後、２週齢（Ｈｂ：６５ｇ／ｌ）及び６週齢（Ｈｂ：７０ｇ／ｌ）にて３回の追加の輸血を行った後、６週間、ＥＰＯで治療した。治療下で、網状赤血球数は徐々に増加し、Ｈｂ値は３ヶ月齢で９０ｇ／ｌで安定した。更なる輸血は不必要であった。現在、４歳１０ヶ月齢の発端者は、軽度の貧血及び脾腫を呈した。病歴から、発端者の母親（mother's proband）が幼児期に原因不明の中等度の慢性溶血性貧血を患っていたことが明らかとなった。母親は乳児期から青年期に亘って定期的な輸血レジメンによる治療を受けた。キレート療法を８歳から開始し、２５歳で脾臓摘出術を受けた。成人期では、出産時に１回、パルボウイルスＢ１９に感染時にもう１回の２回、輸血を行った。フランス系のこの家系（家系１）の他の４人の親族も、慢性溶血性貧血を患っていた（図１Ａ）。４人のうち３人が脾臓摘出術を受けており、２人が定期的な輸血及び長期のキレート療法を受けていた。
【００７８】
第２の血縁関係にない家系（家系２）の２５歳の発端者（発端者２）は、幼少期に中等度の慢性溶血性貧血を患っていた。発端者は、輸血を受けたことがなく、胆石症のために胆嚢摘出術を受けていた。発端者の父親はポーランド系であり、重度の溶血性貧血を患い、脾臓摘出術及び随時の輸血による治療を行っていたことが報告された。発端者の２歳の息子は、正常妊娠（normal pregnancy carried to term）を経て生まれ、良好な忍容性を示す慢性溶血性貧血を呈していた。発端者１、その母親、発端者２及びその息子の血液学的パラメータを下記表１にまとめる。貧血に加えて、４人全てにＭＣＨＣ値の個別の上昇が見られる。
【００７９】
【表１】
2018519275.tif 000003
【００８０】
発端者１の血液塗抹の顕微鏡検査から、１％未満の標的赤血球、多染性赤色血液細胞、涙滴赤血球、ヘモグロビン分布が異常であり得る楕円赤血球、ヘミゴースト、咬傷赤血球、接続赤血球、破砕赤血球及び稀な口唇状の赤色細胞を含む軽度の変形赤血球症が示された（図１Ｂ）。発端者１の母親及び発端者２については、変形赤血球症がより顕著であり、有棘赤血球の存在の点で奇形は類似していた（図１Ｂ）。赤色血液細胞の好塩基性斑点はなかった。
【００８１】
ＥＭＡ検査、赤色細胞膜タンパク質の電気泳動及びヘモグロビン試験は、発端者ら全てで正常であった。血液薄膜上に口唇状赤血球がほとんどなく、エクタサイトメトリー（ektacytometry）を繰り返したところ、４人全ての検査した罹患者で正常であるとみなされたことから、脱水遺伝性有口赤血球症（xerocytosis）の診断は、初期には保たれなかった。
【００８２】
全エクソームシークエンシングを、発端者、罹患した発端者の母親及び罹患していない発端者の妹の家系１の３人の被験体に対して行った。変異体は、ｄｂＳＮＰ１３７に対して、罹患者のみに存在するヘテロ接合型のエクソン突然変異についてフィルタリングを行った。３３の遺伝子がエクソンのヘテロ接合型の非同義突然変異を持つことが認められ、その中でもガルドスチャネルをコードするＫＣＮＮ４は、赤色細胞における発現のために最も矛盾のない候補であった。サンガーシークエンシングによって確認されたミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ）は、カルモジュリン相互作用領域に位置しており、種間で高度に保存された残基を伴い（図１Ｃ）、コンピュータによる分析によって、最大値１に対して０．９９２のスコアにて病原性であると予測された（Ｐｏｌｙｐｈｅｎ：http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）。慢性溶血に罹患した２人及び罹患していない１人の家系１の他の３人の親族において突然変異分離を調べたところ、突然変異と結び付く表現型の優性遺伝と一致した。家系２の２人の罹患した被験体におけるＫＣＮＮ４のダイレクトシークエンシングの後、同じミスセンス突然変異ｃ．１０５５Ｇ＞Ａが、どちらの被験体においてもヘテロ接合型の条件で同定された。正常サイズの転写産物が突然変異についてヘテロ接合体であったことから、スプライシングは置換による影響を受けなかった（図１Ｄ）。発端者１におけるエクソームシークエンシングのデータを用いて、ＦＡＭ３８において、ＰＩＥＺＯ１をコードし、これまでＨＸの主な原因とされてきた突然変異が存在しなかったことが確認された。
【００８３】
次いで、更なる研究を発端者１及びその母親に対して行った。浸透圧脆弱性を調べ、赤色細胞の脱水を確認した。母親及び息子がどちらも、３７℃での２４時間のインキュベーション後に異常なプロファイルを示し、正常対照と比べて減少した塩濃度にて５０％の赤色細胞の溶解が得られた（図１Ｅ）。このプロファイルは、４℃で２４時間後に同じ分析を行った場合には正常対照と類似し、これにより、エクタサイトメトリーを４℃でのインキュベーション後に行ったことから、エクタサイトメトリーが正常であった理由が説明される。サンプリング後の様々な時間及び温度の条件における血漿Ｋ＋濃度を電位差測定により測定したところ、正常範囲内であった。Ｃａ２＋刺激下でのＫ＋の動的流出を、イオノフォアＡ２３１８７による刺激を用いた赤血球懸濁液の３９Ｋ  ＮＭＲにより評価した。Ｃａ２＋活性化後のＫ＋放出の短時間の遅延を除いて、摂動は観察されなかった（データ図示せず）。
【００８４】
加えて、赤色細胞の脱水は通常、溶血性貧血を伴い、これは、Ｇ６ＰＤ欠損細胞及びＨｂＳ細胞の正常な赤色血液細胞の両方において先に示されるように、収縮がホスファチジルセリン（ＰＳ）曝露を刺激するためである（Lang et al., 2004、Weiss et al., 2011）。陽イオン漏出と溶血性貧血との関係性は、Ｂａｎｄ  ３突然変異を含む他の膜タンパク質突然変異でも観察されている（Bruce et al., 2005）。本試験では、ガルドスチャネルに突然変異を含む患者において、家系１ではかなり重度の貧血である一方で、家系２の人及びＰＩＥＺＯ１突然変異を有する人は正常又は準正常のＨｂレベルを呈するという疾患重症度の違いが観察された（Carella et al., 1998、Houston et al., 2011）。実際、家系１の罹患者のうち２人では、発端者は極めて重度な子宮内貧血エピソードを伴う顕著な貧血を呈し（他に同定された原因なし、特に母胎不適合なし）、母親は多くの事例で多くの輸血が必要であった。このことから、これらの患者において、長期のＣａ２＋活性化によって起こり、ＰＳ曝露をもたらすスクランブラーゼ活性化に対する感受性が高まり得ることが示唆される。発端者の母親が定期的な輸血及びＤｅｆｅｒｒｉｐｒｏｘによる治療を受けており、発端者自身が鉄過剰を患うには若すぎたこともあり、慢性貧血に起因する鉄過剰を家系１で評価することが難しい。第２の家系では、患者は慢性溶血性貧血で見られるような中等度の鉄過剰を呈している。
【００８５】
次いで、ガルドスチャネル変異体ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓの機能を、アフリカツメガエル卵母細胞における突然変異ｃＤＮＡを含むプラスミドの発現により調べた。電流電圧曲線により、ミスセンス突然変異ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓが野生型チャネルと比べてチャネルを介するイオン伝導度を妨げないことが分かった（図２Ａ）。カルシウムイオノフォアにより誘導されたＷＴチャネル及びｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓチャネルの活性化相は類似していたが、ＷＴ  ＫＣＮＮ４活性が最大に達した後、減少しているのに対し、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異体の活性は、数分間、比較的一定に保たれている。ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓにより高く維持された電流は、ピークから２分を超えて記録することが難しかった。逆転電位（−１２０ｍＶ）はＷＴチャネルと突然変異チャネルとで類似していたが、アフリカツメガエル卵母細胞におけるｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４発現により誘起された電流はＷＴで観察されるものよりも高かった（図２Ｂ）。ウェスタンブロットにより、これらのタンパク質がどちらも同様のレベルで発現していることが確認され、このことから、突然変異チャネルで観察された伝導度の増大が突然変異に直接関連していることが示唆される。これらのデータから、突然変異がより長期の活性化状態へとチャネル活性の調節を変えることが示される。従来のＫＣＮＮ４阻害剤であるＴＲＡＭ−３４を用いて行った阻害試験では電流発生の低減が起こり、このことから、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ変異体が阻害に対して感受性であることが示される（図２Ｃ）。
【００８６】
ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を更に特性評価するために、ＨＥＫ２９３細胞をＷＴチャネル又は突然変異チャネルでトランスフェクトした。突然変異は原形質膜へのチャネルのアドレッシング（addressing）を妨げない。全細胞記録により、ＷＴ  ＫＣＮＮ４又はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現するＨＥＫ２９３細胞でカルシウム依存性活性化の動態が異なることが分かる（図３Ａ）。前者では、Ｃａ２＋がピペットから細胞内区画へと拡散しながら、電流が徐々に現れる。これに対して、後者の場合、突然変異体についてブレークイン直後に電流が活性化され、記録時には更に増大している。卵母細胞実験と同じように、最大電流密度がｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４を発現する細胞において増大している（図３Ａ〜図３Ｃ）。これらの結果から、突然変異がカルシウムに対するチャネル感受性を増大させることが示唆される。ＷＴについてブレークインと定常状態との間で観察される逆転電位の左方向へシフトにより、チャネルを活性化させるＣａ２＋拡散に起因する遅延が確認される。この遅延はｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ  ＫＣＮＮ４では観察されない。巨大切り採り（giant excised）インサイドアウトパッチ−クランプ実験を行うことにより、突然変異ＫＣＮＮ４に対するＷＴ  ＫＣＮＮ４のカルシウム感受性を更に調べた。図３Ｄには、電圧及び膜の内面に適用されたＣａ２＋濃度の関数としてのＫ＋電流の代表的なトレースを示している。図３Ｅでは、−４５ｍＶでの電流をＣａ２＋濃度の関数としてプロットしている。定量的分析により、ＷＴ  ＫＣＮＮ４のカルシウム依存性が０．９５±０．０９μＭの見掛けのＫｄを有するのに対し、ｐ．Ａｒｇ３５２Ｈｉｓ突然変異体の見掛けのＫｄは、０．２１±０．０２μＭであることが分かった。ヒル係数は、ＷＴ  ＫＣＮＮ４と突然変異型ＫＣＮＮ４とで統計的な差がない（それぞれ、３．７５±１．４５及び３．３±０．８５、ｎ＝４）。
【００８７】
電気生理学的データによれば、ＫＣＮＮ４は対照と比べて患者の赤色細胞でのより低いカルシウム濃度により活性化されると考えられる。対照又は患者の赤色細胞におけるガルドスチャネル活性化の動態に対する細胞内Ｃａ２＋の増大の影響を評価するために、正味のカリウム流をバナジン酸塩で処理した赤色細胞において測定した。バナジン酸塩が、カルシウムポンプを阻害し、更にカルシウム流入を活性化させることにより、赤色細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度を増大させる（Varecka and Carafoli, 1982、Bennekou et al., 2012）。図４には、１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４を含む又は含まない５ｍＭ  バナジン酸塩の存在下での対照又は患者の赤色細胞のＫ＋含量を示している。バナジン酸塩は、１時間では対照の赤色細胞における細胞内Ｋ＋含量を有意に変化させなかったのに対し、患者の赤色細胞では細胞内Ｋ＋の有意な減少が観察され、この減少はＴＲＡＭ−３４によって妨げられた。図４Ｂに示されるように、Ｋ＋流出は細胞容量の減少と相関関係にある。Ｎａ＋含量の有意な変化は、対照及び患者の赤色細胞のどちらでも観察されなかった（図４Ｃ）。
【００８８】
３７℃又は４℃で２４時間保存した血液中の赤色細胞のＫ＋含量を下記表２に示す。
【００８９】
【表２】
2018519275.tif 000004
【００９０】
対照赤色細胞では、３７℃で２４時間後にＫ＋含量が２１．１μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ．減少している。この変動は、４℃で２４時間保存した血液でも同様である（−２４．１μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ．）。これに対して、Ｋ＋喪失は、４℃で２４時間保存した患者の血液での３５．３μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ．と比べて、３７℃で保存した患者の赤色細胞では９３．８μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ．である。
【００９１】
実施例ＩＩ：ガルドスチャネルにおける突然変異により引き起こされる遺伝性乾燥赤血球症のサブセットの治療のためのセニカポクの使用
１．  材料及び方法
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＫＣＮＮ４−ＨＡを用いて、上記のようにＰＣＲにより点突然変異Ｖ２８２Ｍ及びＶ２８２Ｅを導入した。
【００９２】
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション：ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）  １０％ＦＢＳ  １％ペニシリン−ストレプトマイシン中で増殖させた。細胞を、ＣａＰＯ４を用いて１μｇの野生型（ＷＴ）又は点突然変異ｐｃＤＮＡ３−ＫＣＮＮ４−ＨＡ及び０．５μｇのｐＩＲＥＳ−ｅＹＦＰで同時トランスフェクトした。１６時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光標識細胞に対してパッチ−クランプを行った。
【００９３】
パッチ−クランプ電気生理：ガラスピペット（Brand、ドイツ、ウェルトヘイム）を、水平型のピペットプラー（Ｐ−９７、Sutter Instrument Co．、カリフォルニア州ノバート）にて作製し、３ＭΩ〜５ＭΩの範囲の最終抵抗を得た。ＨＥＫ細胞における全細胞実験については、バッチ溶液をＮａＣｌ  １４５ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整する）（３２０ｍＯｓｍ）とした。細胞内溶液は、ＫＣｌ  １４５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整する）、ＣａＣｌ２  ０．８７ｍＭ  ＥＧＴＡ  １ｍＭ（１μＭ  遊離カルシウムに相当する。Ｍａｘｃｈｅｌａｔｏｒソフトウェアを遊離Ｃａ２＋濃度の算出に使用した（http://maxchelator.stanford.edu/CaEGTA-TS.htm））（３０５ｍＯｓｍ）とした。電流は、−６０ｍＶの保持電位にて−１２０ｍＶから＋８０ｍＶまでの傾斜プロトコルを用いて室温で測定した（サンプリング周波数  １０ｋＨｚ、フィルタリング  １ｋＨｚ）。
【００９４】
ヒト赤色血液細胞における全細胞実験については、ガラスピペット（Brand、ドイツ、ウェルトヘイム）を、垂直型のピペットプラー（ＰＩＰ５；HEKA、ドイツ、ランブレヒト／プファルツ州）にて作製し、１７ＭΩ〜２０ＭΩの範囲の最終抵抗を得た。ピペット及び浴には同じ溶液を使用し、ＫＣｌ  １５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ  ７．４（３２０ｍＯｓｍ）を含んでいた。電流は、−２０ｍＶの保持電位にて８００ｍｓの間、−４０ｍＶから＋７０ｍＶまでの傾斜プロトコルを用いて室温で測定した（サンプリング周波数  １０ｋＨｚ、フィルタリング  １ｋＨｚ）。全てのパッチ−クランプ実験を、ＰＣ制御したＥＰＣ  ９パッチ−クランプ増幅器（HEKA、ドイツ、ランブレヒト／プファルツ州）を用いて行った。電流を得て、Ｐｕｌｓｅ＋Ｐｕｌｓｅｆｉｔソフトウェア（HEKA）を用いて分析した。
【００９５】
血液学的検査：家系１のインフォームドコンセントを得た（informed）患者（上記を参照されたい）及び健常なボランティアから新鮮静脈血を静脈穿刺によって得た。低張生理食塩水溶液での浸透圧脆弱性検査を、１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４又は０．４μＭ若しくは４μＭ  セニカポクの存在下又は非存在下において４℃又は３７℃での２５時間のインキュベーション後に赤色血液細胞に対して行った。
【００９６】
赤色血液細胞の陽イオン含量及び容量の測定：新たに採った血液を室温で、ＮａＣｌ  １４７ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ（ＮａＯＨで緩衝化、ｐＨ  ７．４）（３２０ｍＯｓｍ）を含む媒体で４回洗浄した。次いで、赤色血液細胞懸濁液を、３７℃、３０％ヘマトクリットにてインキュベートし、５ｍＭ  バナジン酸塩を単独で、又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４若しくは様々な濃度のセニカポクとともに添加した。サンプリング時間の数分前に、４００μｌの細胞懸濁液を採り、３個のナイロンチューブに入れ、これを正確なサンプリング時間にて４℃、２００００ｇで１０分間、遠心分離した。細胞外のイオン含量の測定のために上清を回収した。赤色細胞のペレットを抽出し、直後に秤量した。次いで、一晩加熱した後（８０℃）、乾燥重量を測定した。血中細胞間の捕捉媒体に対応する３．６４％の補正を行い、含水量を算出した。細胞内のイオンは、５ｍｌのｍｉｌｌｉＲｈｏ水（Millipore）中の４℃での一晩のインキュベーションによって乾燥ペレットから抽出した。ＰＦＰ７（Jenway）を用いたフレーム分光法によってＮａ＋及びＫ＋を測定した。統計値：マンホイットニー検定を、赤色血液細胞実験における患者に対する対照又は阻害剤に対する対照の比較に用いた。
【００９７】
２．  結果
ＨＸと結び付くＫＣＮＮ４の様々な突然変異を調べ、比較するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＸ赤色血液細胞に対してパッチ−クランプを行う難しさを克服することのできる信頼性のある異種発現系として使用した。
【００９８】
ＫＣＮＮ４突然変異体Ｖ２８２Ｍ及びＶ２８２Ｅの電流特徴
ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴ  ＫＣＮＮ４又はＶａｌ２８２での２つの突然変異体、すなわちＶ２８２Ｅ及びＶ２８２Ｍ  ＫＣＮＮ４で一過性トランスフェクトした後、電流を全細胞構成で記録した。図５Ａから、Ｖａｌ２８２での２つの置換がＷＴと比べて電流密度を増大させたことが分かる。これらの電流のカルシウム感受性を評価するために、同じ実験を、２つの異なる細胞内Ｃａ２＋濃度：ＷＴ  ＫＣＮＮ４のＥＣ５０に対応する１μＭ及びＲ３５２Ｈ突然変異体のＥＣ５０に対応する０．２５μＭにて行った（上記を参照されたい）。図５Ｂ及び図５Ｃから、２つの細胞内カルシウム濃度でのＶ２８２Ｅ  ＫＣＮＮ４及びＷＴ  ＫＣＮＮ４の活性が類似していることが分かる。しかしながら、このカルシウム感受性はＶ２８２Ｍ突然変異体では観察されず、細胞内Ｃａ２＋  ０．２５μＭと１μＭとで電流密度が類似している（図５Ｄ）。
【００９９】
セニカポクに対する感受性
ＨＸと結び付く３つの異なる突然変異のセニカポク感受性を、各コンストラクトで一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞にて評価した。図６Ａには、様々な濃度のセニカポクを関数とするＷＴ  ＫＣＮＮ４及び突然変異ＫＣＮＮ４についての代表的な電流／電圧曲線を示している。Ｖ２８２Ｅはセニカポクに対してほぼ不感受性であることが観察され、１０μＭ  セニカポクにおいて僅かな阻害しか観察されなかった。これに対して、Ｒ３５２Ｈ突然変異体は、ＷＴチャネルよりもセニカポクに対する感受性が極めて高い。ＷＴチャネルとＶ２８２Ｍチャネルとは類似のセニカポク感受性を呈している。図６Ｂは、ＷＴと、２つの突然変異体Ｒ３５２Ｈ及びＶ２８２Ｍとの阻害の用量応答曲線をまとめたものである。ＷＴ及びＶ２８２Ｍは、ＩＣ５０が１０ｎＭ付近と有意差はない。これに対して、Ｒ３５２Ｈ突然変異体は、ＩＣ５０＝０．３ｎＭとＷＴよりもおよそ３０倍感受性が高い（図６Ｃ）。
【０１００】
Ｒ３５２Ｈ突然変異を有する赤色細胞に対するセニカポクの効果
新鮮血液サンプルを、ガルドスチャネルに対するＲ３５２Ｈ突然変異を持つ患者から得た。阻害剤がＨＥＫ２９３細胞と同様に赤色血液細胞においても突然変異ガルドスチャネルに対して有効であり得るか否かを調べるために、その効果を、１）ガルドスチャネル活性化後のＫ＋喪失、２）赤色血液細胞の浸透圧抵抗、及び３）赤色血液細胞のＣａ２＋活性化Ｋ＋電流に対して評価した。セニカポクは、血液を用いた実験において高いヘモグロビン濃度を構成させるためにＨＥＫ２９３細胞よりも高い濃度で使用した。
【０１０１】
１）赤色血液細胞のＫ＋喪失
ガルドスチャネルは、細胞内Ｃａ２＋の増大により活性化した。バナジン酸塩を、先に記載のようにＣａ２＋ポンプの遮断及び細胞内Ｃａ２＋の増大に使用した（Bennekou et al., 2012、Rapetti-Mauss et al., 2015）。図７に、対照（Ａ）及び患者（Ｂ）の赤色血液細胞において５ｍＭ  バナジン酸塩により誘導されるＫ＋喪失の動態を示している。このＫ＋喪失は細胞容量の減少と相関しており（図７Ｃ及び図７Ｄ）、細胞内Ｎａ＋含量は変化がなかった（図示せず）。この図から、ＴＲＡＭ−３４及びセニカポクはどちらも、ＷＴ又はＲ３５２Ｈガルドスチャネルを有する赤色血液細胞においてＫ＋喪失及び細胞水喪失を低減することができたことが分かる。
【０１０２】
バナジン酸塩との１時間のインキュベーション後、対照と比べて大きなＫ＋流出が患者の赤色血液細胞にて観察された：−５３±１６μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ.に対する−９２±１４μｍｏｌ／ｇ  ｄ．ｗ．、３つの独立実験の平均±標準誤差（ｐ＜０．０５にて差は有意である）。６０分の時点で、対照赤色血液細胞では、１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４によってＫ＋喪失が９７±１％阻害されており、患者赤色血液細胞では、９２±３％阻害されている（３つの独立実験の平均±標準誤差、患者及び対照の赤色血液細胞の両方においてＴＲＡＭ−３４に対する対照ｐ＜０．０５）。０．４μＭのセニカポクは、患者及び対照の赤色血液細胞それぞれについてＫ＋喪失を７９±１２％及び８４±４％阻害した（患者及び対照の赤色血液細胞の両方においてセニカポクに対する対照ｐ＜０．０５、患者の赤色血液細胞に対して対照では有意差なし）。１０倍高いセニカポク濃度（４μＭ）は単一時点（６０分）で評価した。４μＭ  セニカポクでは、６０分後にバナジン酸塩によるＫ＋喪失は、対照及び患者の赤色血液細胞それぞれにおいて９５±４％及び９４±９％低減した（患者及び対照の赤色血液細胞の両方においてセニカポクに対する対照ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
２）浸透圧抵抗
新たに採った血液を、ＴＲＡＭ−３４（１０μＭ）又はセニカポク（４μＭ又は０．４μＭ）の存在下において３７℃又は４℃で２５時間保存し、対照条件と比較した。浸透圧抵抗は、４℃でインキュベートした血液では患者と対照とで類似しており、セニカポクは効果がない（図８Ａ及び図８Ｂ）。これに対して、３７℃での患者の赤色血液細胞の浸透圧抵抗は、対照赤色血液細胞と比べて左方向にシフトしており、患者及び対照の赤色血液細胞の５０％溶血はそれぞれ、０．４５及び０．５の相対オスモル濃度であった（図８Ｃ及び図８Ｄの黒色菱形の曲線）。曲線の傾きも、対照血液と比べて患者において激減している。セニカポクとのインキュベーションが対照血液の浸透圧抵抗曲線を変えなかったのに対し（図８Ｃ）、患者赤色血液細胞に対してのみセニカポクの用量依存性の効果がある。患者赤色血液細胞では、浸透圧抵抗が右方向にシフトし、セニカポクの存在下において曲線の峻度が増大している（図８Ｄの三角及びバツ印）。ＴＲＡＭ−３４は、対照及び患者の赤色血液細胞において浸透圧抵抗を、４℃ではほんの僅か、及び３７℃ではより顕著に低減させることができる。検査前に、ＴＲＡＭ−３４が対照赤色血液細胞と同様に患者において強い溶血を誘導したことが観察された。これはセニカポクでは観察されなかった。
【０１０４】
３）赤色血液細胞のネイティブ電流（native current）
図９には、全細胞構成での患者（Ｒ３５２Ｈ突然変異）及び対照の赤色血液細胞にて記録されたガルドスチャネルの活性を示している。対照と比べて患者赤色血液細胞にて有意な電流の増大が観察されている。電流はどちらも０．５μＭ  セニカポク又は１０μＭ  ＴＲＡＭ−３４により完全に妨げられる。
【０１０５】
参考文献
【数２】
2018519275.tif 000005
2018519275.tif 000006
【図１Ａ】
2018519275.tif 000007
【図１Ｂ】
2018519275.tif 000008
【図１Ｃ】
2018519275.tif 000009
【図１Ｄ】
2018519275.tif 000010
【図１Ｅ】
2018519275.tif 000011
【図２Ａ】
2018519275.tif 000012
【図２Ｂ】
2018519275.tif 000013
【図２Ｃ】
2018519275.tif 000014
【図３Ａ】
2018519275.tif 000015
【図３Ｂ】
2018519275.tif 000016
【図３Ｃ】
2018519275.tif 000017
【図３Ｄ】
2018519275.tif 000018
【図３Ｅ】
2018519275.tif 000019
【図４Ａ】
2018519275.tif 000020
【図４Ｂ】
2018519275.tif 000021
【図４Ｃ】
2018519275.tif 000022
【図５Ａ】
2018519275.tif 000023
【図５Ｂ】
2018519275.tif 000024
【図５Ｃ】
2018519275.tif 000025
【図５Ｄ】
2018519275.tif 000026
【図６Ａ】
2018519275.tif 000027
【図６Ｂ】
2018519275.tif 000028
【図６Ｃ】
2018519275.tif 000029
【図７Ａ】
2018519275.tif 000030
【図７Ｂ】
2018519275.tif 000031
【図７Ｃ】
2018519275.tif 000032
【図７Ｄ】
2018519275.tif 000033
【図８Ａ】
2018519275.tif 000034
【図８Ｂ】
2018519275.tif 000035
【図８Ｃ】
2018519275.tif 000036
【図８Ｄ】
2018519275.tif 000037
【図９】
2018519275.tif 000038
【配列表】
2018519275000001.app
【国際調査報告】
2018519275.tif 000039
2018519275.tif 000040
2018519275.tif 000041