(57)【要約】本発明は、脂肪肝を予防または治療するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝を予防または治療するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための組成物の製造のための化合物の使用であって、当該化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、使用。
【請求項２】
当該化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
当該化合物が、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項４】
当該化合物が、エリオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロース、サッカリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項５】
当該化合物が、（１）サッカリンとマンニトールの組合せ、（２）メントールとマンニトールの組合せ、（３）スクラロースとマンニトールの組合せ、（４）エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、（５）エリオジクチオールとスクラロースの組合せ、（６）メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ、および（７）スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せからなる群から選択されるものである、請求項１記載の使用。
【請求項６】
当該化合物が、さらに、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンフェロール、ウルソール酸、シリマリン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペリチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クエルシトリンおよび／またはバイカレインを含む、請求項１〜５いずれか１項記載の使用。
【請求項７】
当該組成物が、対象体の肝脂肪含量を減少させるために使用される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
当該組成物が、対象体の肝細胞における脂肪含量を減少させるために使用される、請求項６記載の使用。
【請求項９】
当該組成物が、対象体の肝損傷を減少させるために使用される、請求項６記載の使用。
【請求項１０】
当該肝損傷が肝組織損傷または肝機能不全を包含する、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
当該組成物が、肝臓抗酸化活性を増強するために使用される、請求項６記載の使用。
【請求項１２】
肝疾患または他の関連障害が、急性および慢性アルコール性脂肪肝、急性および慢性非アルコール性脂肪肝、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性肝硬変およびアルコール性肝硬変からなる群から選択される、請求項６記載の使用。
【請求項１３】
当該組成物が、非アルコール性脂肪性肝疾患を有する患者または肥満個体に投与され得る、請求項１〜５いずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
当該組成物が、薬物、食品添加物または健康食品である、請求項１〜５いずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、ホモオリエンチン、キシリトール、ルテオリンおよびスウェルチアマリンからなる群から選択される２種類以上の化合物を含む組成物。
【請求項１６】
ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸およびブチル化ヒドロキシアニソールからなる群から選択される２種類以上の化合物を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリンおよびスウェルチアマリンからなる群から選択される２種類以上の化合物を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
エリオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンからなる群から選択される２種類以上の化合物を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
（１）サッカリンとマンニトールの組合せ、（２）メントールとマンニトールの組合せ、（３）スクラロースとマンニトールの組合せ、（４）エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、（５）エリオジクチオールとスクラロースの組合せ、（６）メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ、および（７）スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せからなる群から選択される組合せを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
さらに、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンフェロール、ウルソール酸、シリマリン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペリチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クエルシトリンおよび／またはバイカレインを含む、請求項１５〜１９いずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
当該化合物が、各々または組み合わせて、対象体の肝脂肪含量の減少または関連障害の寛解に有効な量で当該組成物中に存在する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
当該化合物が、各々または組み合わせて、対象体の肝細胞における肝脂肪含量の減少に有効な量で当該組成物中に存在する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
当該化合物が、各々または組み合わせて、対象体の肝損傷の減少に有効な量で当該組成物中に存在する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２４】
当該肝損傷が肝組織損傷または肝機能不全を包含する、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
当該化合物が、各々または組み合わせて、肝臓抗酸化活性の増強に有効な量で当該粗製物中に存在する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２６】
当該化合物が、各々または組み合わせて、脂肪肝、急性および慢性アルコール性脂肪肝、急性および慢性非アルコール性脂肪肝、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性肝硬変およびアルコール性肝硬変の処置または予防に有効な量で当該組成物中に存在する、請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
当該組成物が薬物、食品添加物または健康食品である、請求項２０記載の組成物。
【請求項２８】
脂肪肝の予防または治療、肝機能の保護、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害の寛解を必要とする対象体における脂肪肝の予防または治療、肝機能の保護、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害の寛解の方法であって、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、ホモオリエンチン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリン、およびこれらの組合せからなる群から選択される化合物の有効量を当該対象体に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
肝脂肪含量の減少または関連障害の寛解のための組成物を製造するための化合物の使用であって、当該化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、使用。
【請求項３０】
当該化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
当該化合物が、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９記載の使用。
【請求項３２】
当該化合物が、リオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロース、サッカリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９記載の使用。
【請求項３３】
当該化合物が、（１）サッカリンとマンニトールの組合せ、（２）メントールとマンニトールの組合せ、（３）スクラロースとマンニトールの組合せ、（４）エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、（５）エリオジクチオールとスクラロースの組合せ、（６）メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ、および（７）スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ. 請求項２９記載の使用。
【請求項３４】
当該化合物が、さらに、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンフェロール、ウルソール酸、シリマリン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペリチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クエルシトリンおよび／またはバイカレインを含む、請求項２９〜３３のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝を予防または処置するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝臓は、動物の体内の消化器系の一部であり、多くの消化液を生産および分泌する主要臓器でもある。肝臓はまた、吸収、代謝、解毒および免疫防御はどの機能を有する。肝臓は、脂肪の代謝にとって重要な臓器であり、高脂肪食の消化、吸収、分解、合成および輸送に重要な役割を果たす。血液から肝臓によって摂取される遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、最終的にはトリグリセリド（ＴＧ）に合成され、次いで、肝臓内に貯蔵されるか、または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の形態で肝臓から血液循環内に輸送される。したがって、肝臓が損傷すると、脂質（特に、ＴＧ）は、異常に代謝され、肝細胞内に蓄積される。
【０００３】
正常な状況下では、脂肪は、肝臓の３重量％を構成する。臨床的に、「脂肪性肝疾患（ＦＬＤ）」は、肝臓内の脂肪が肝臓の５重量％を超えていること、または肝組織切片において１０％を超える肝細胞が小胞脂肪変化を示すことを意味する2（非特許文献１）。疾患の原因により、脂肪肝はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または薬物のような他の因子由来の他の脂肪性肝疾患に分けることができる。脂肪性肝疾患は、脂肪変態または脂肪肝、脂肪性肝炎などの出現により病理学的に特徴付けられる。脂肪肝に罹患している肝細胞のパーセンテージから、脂肪肝は軽度（＜３３％）、中程度（３３〜６６％）および重度（＞６６％）に分類される3,9,21（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。以前は、脂肪肝は良性および可逆性状態と考えられ、故に、あまり重大に受け取られていなかったが、最近の試験で、それが重度の肝線維症および肝硬変および肝癌にいたることが判明している。肥満人口が増えるに連れ、ＦＬＤの有病率も増加する。
【０００４】
欧米諸国での肝疾患の主因は慢性過剰飲酒であり、それ故に、肝疾患の大部分はアルコール病変により引き起こされる。しかし、過去１５〜２０年間にわたって、ＮＡＦＬＤは欧米諸国で肝機能不全について考慮すべき疾患の第一原因となってきている2（非特許文献１）。Thalerは、１９６２年にＮＡＦＬＤについて記載した。１９８０年に、Ludwigは、糖尿病および高脂血症を有する肥満女性患者群に見られる随伴するＮＡＦＬＤから「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」を提案した。その後、１９８６年に、Schaffnerは、ＮＡＳＨがＮＡＦＬＤの経過における線維症誘発のメカニズムに重要な役割を果たすことを再び強調した21（非特許文献４）。１９９８年までに、Dayは、ＮＡＳＨを有する患者の１５〜５０％が種々の程度の線維症誘発に罹患していることを発見し4（非特許文献５）、したがって、臨床医はＮＡＦＬＤに注意を払い始めた。現在、ＡＦＬＤに加えて、ＮＡＳＨは、臨床業務においてＮＡＦＬＤの自然の進行における単なる１ステージではない；ＮＡＳＨの存在により、ＮＡＦＬＤはもはや良性肝疾患とは考えられていない。
【０００５】
現在、北米、南米、日本、北欧、南欧、オーストラリアおよび中東におけるＦＬＤの研究において、ＮＡＦＬＤの有病率は少なくとも１０〜３９％であることが判明し、死後の検死解剖組織学的検査により、ＮＡＦＬＤ有病率が約２０％であり、その中で随伴するＮＡＳＨの発症率が約３〜１８％であることが示された。肥満の人々のＮＡＦＬＤ有病率は最大５７〜７４％（正常な人々の４.６倍）であり、その中の２０〜２５％がＮＡＳＨ病変に罹患し、２〜３％が肝硬変に罹患した。台湾では、過去３０年の間、経済環境および食生活の改善により、ＮＡＦＬＤ有病率が年ごとに増えていった。近年、台湾におけるＮＡＦＬＤ有病率は、日本におけるＮＡＦＬＤ有病率（９〜１３％）に近い１２〜３７％になってきており、非肥満の人々のＮＡＦＬＤ有病率は約１０％であるが、病的な肥満の人々（ＢＭＩが３０を超える）のＮＡＦＬＤ有病率は８０％と高い15,23（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
英国では、ＮＡＦＬＤのメカニズムに関し、DayおよびJamesが、多数の臨床研究および動物実験に基づいて２ヒット仮説を提案した。脂肪肝は、第一ヒットにより生じ、脂肪性肝炎は第二ヒットにより生じる。第一ヒットは、肥満、高脂血症などによって引き起こされる肝臓における脂肪の過剰蓄積により促される。第二ヒットは、酸化的ストレスおよびミトコンドリアにおける活性酸素種（ＲＯＳ）の影響に起因し、肝細胞膜の脂質過酸化、元の炎症性サイトカインおよびフリーラジカルの遊離、ならびに星状細胞活性化による線維症をもたらし、肝細胞壊死に至る4,5,19（非特許文献５、非特許文献８、非特許文献９）。ＮＡＳＨのメカニズムは、肝細胞におけるトリグリセリド過酸化、酸化的ストレス、ＲＯＳ応答、脂質過酸化増加、または、一連の自己免疫性相互作用に至るサイトカインおよび肝臓酵素増加を含む12（非特許文献１０）。
【０００７】
脂肪肝の原因は、主に、動物脂肪、タンパク質、炭水化物の長期過剰摂取に関連しており、過剰カロリーが脂肪に変換されて体内に蓄積され、肥満および脂肪肝に至る。脂肪肝の患者は、正常血中ＧＯＴ／ＧＰＴ値を有し得る。それ故に、脂肪肝の正確な診断は腹部超音波を使用すべきであり、これは、現在９７％を超える精度を提供する。
【０００８】
現在、ＦＬＤに対する特異的治療効果を有する理想的な薬物はなく、その処置ガイドラインは、薬物を使用することによる潜在的リスク因子の改善または慢性疾患の進行制御を目的とする。脂肪肝の原因に応じた対症療法の適用が推奨される。例えば、過体重によって引き起こされる脂肪肝に罹患する者は、適度に体重を減らすべきである。アルコール性脂肪肝を有する者は誰でも、状態改善のために、飲酒を止め、バランスの良い食事を食べる必要がある。長期接触により肝臓を損傷させて脂肪性肝疾患に至る化学物質または薬物は、即時に使用停止すべきである。Ｃ型肝炎、高血中脂質などのような疾患によって引き起こされる脂肪肝は、Ｃ型肝炎処置または血中脂質管理のような原因疾患を処置することによって処置すべきである。過剰のトリグリセリドが身体的因子によって引き起こされるならば、脂肪性肝疾患は体重を減らすことによって改善することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Clark JM and Diehl AM. (2003) Nonalcoholic fatty liver disease: an underrecognized cause of cryptogenic cirrhosis. JAMA 289: 300-304
【非特許文献２】Carlisle R, Galambos JT, Warren WD. (1979) The relationship between conventional liver tests, quantitative function tests, and histopathology in cirrhosis. Dig Dis Sci 24: 358-362
【非特許文献３】Guo HX, Liu DH, Ma Y, Liu JF, Wang Y, Du ZY, Wang X, Shen JK and Peng HL. (2009) Long-term baicalin administration ameliorates metabolic disorders and hepatic steatosis in rats given a high-fat diet. Acta Pharmacol Sin 30: 1505-1512
【非特許文献４】Mulhall BP, One JP and Younossi ZM. (2002) Non-alcoholic fatty liver disease: an overview. J Gastroenterol Hepatol 17: 1130-1143
【非特許文献５】Day CP and James OFW. (1998) Steatohepatitis: a tale of two ‘hits’? Gastroenterology 114: 842-845
【非特許文献６】Keiding S, Johansen S, Winkler K. (1982) Hepatic galactose elimination kinetics in the intact pig. Scand J Clin Lab Invest 42: 253-259
【非特許文献７】Nistor A, Bulla A, Filip DA and Radu A. (1987) The hyperlipidemic hamster as a model of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis 68: 159-173
【非特許文献８】Dowman JK, Tomlinson JW and Newsome PN. (2010) Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Q J Med 103: 71-83
【非特許文献９】Lin SC, Lin YH, Chen CF, Chung CY and Hsu SH. (1997) The hepatoprotective and therapeutic effects of propolis ethanol extract on chronic alcohol-induced liver injuries. Am J Chin Med 25: 325-332
【非特許文献１０】Hu OY, Hu TM and Tang HS. (1995) Determination of galactose in human blood by high-performance liquid chromatography: comparison with an enzymatic method and application to the pharmacokinetic study of galactose in patients with liver dysfunction. J Pharm Sci 84: 231-235
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、血清トリグリセリドおよびコレステロールを下げるために一般に臨床で使用される薬物は、しばしば副作用、例えば、肝毒性、筋痛、筋炎、横紋筋融解症のようなミオパチーなどが不随する。脂質低下薬に関して、筋毒性は最も顕著な副作用である。特に、スタチンは筋毒性の最高発生率を示し、フィブリン酸がそれに続く。さらに、脂質低下薬は、肝臓に血中脂質を「運搬」する「脂肪運搬」効果を有しており、肝臓にはすでに脂肪が蓄積されているので大量に流入する脂質の処理が困難となり、肝臓における脂肪の過剰蓄積を導き、脂肪肝を悪化させる。脂質低下薬は、ＦＬＤの処置に適さないことが分かる。
【００１１】
したがって、依然として、脂肪肝および脂肪肝によって引き起こされる肝疾患の予防および処置、肝機能の保護、ならびに関連障害の寛解に有効な成分を見出すことが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、脂肪肝の予防もしくは治療、肝機能の保護、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害の寛解の有効性を有する１種類またはそれ以上の賦形剤（フラボノイド化合物を包含する）を提供し、ここで、当該化合物は、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄（oxide red）、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１３】
したがって、一の態様において、本発明は、脂肪肝を予防または治療するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための組成物の製造のための、本明細書に記載の化合物の使用を提供する。本発明は、また、当該化合物を投与することを含む、脂肪肝の予防または治療、肝機能の保護、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害の寛解の方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、当該化合物は、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、赤色酸化鉄、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、当該化合物は、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、当該化合物は、エリオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロース、サッカリンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、当該化合物は、（１）サッカリンとマンニトールの組合せ、（２）メントールとマンニトールの組合せ、（３）スクラロースとマンニトールの組合せ、（４）エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、（５）エリオジクチオールとスクラロースの組合せ、（６）メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ、および（７）スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１種類以上の化合物は、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンフェロール、ウルソール酸、シリマリン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペリチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クエルシトリンおよびバイカレインからなる群から選択される１種類以上の化合物と一緒に投与される。
【００１９】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、対象体の肝脂肪含量を減少させることができる。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、対象体の肝細胞中の脂肪含量を減少させることができる。
【００２１】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、肝組織損傷または肝機能不全のような対象体の肝損傷を低下させることができる。
【００２２】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、対象体の肝臓抗酸化活性を増強することができる。
【００２３】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性肝硬変およびアルコール性肝硬変（ＩＣＤ−９−ＣＭ診断コード：５７１.８、５７１.０、５７１.１、５７１.２、５７１.３、５７１.４、５７１.５、５７１.９）を包含するがこれらに限定されない種々のタイプの肝脂肪蓄積によって引き起こされる関連障害を寛解させるために使用され得る。
【００２４】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物を摂取するのが好適である対象体は、脂肪性肝疾患の患者または肥満の人々である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、薬物、食品添加物または健康食品に製剤化され得る。
【００２６】
別の態様において、本発明は、上記の化合物から選択される２種類以上の化合物をふくむ組成物を提供する。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、エリオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンからなる群から選択される２種類以上の化合物を含む。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、（１）サッカリンとマンニトールの組合せ、（２）メントールとマンニトールの組合せ、（３）スクラロースとマンニトールの組合せ、（４）エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、（５）エリオジクチオールとスクラロースの組合せ、（６）メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せ、および（７）スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せからなる群から選択される組合せを含む。
【００２９】
本発明は、これ以上説明しなくとも上記の説明に基づいて当業者が最も広い範囲で利用することができると考えられる。したがって、以下の説明は、例示的なものに過ぎず、決して本開示の残りの部分を限定するものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明を例示するために、以下に実施態様が示される。しかしながら、本発明は、示される好ましい実施態様に限定されないことは理解されるべきである。図面には次のことが記載される。
【００３１】
【図１】図１は、脂肪肝を誘発し、その後、群別に異なる試験物質で４週間処置したマウスから採取した肝組織切片を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
他に示さない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「ａ］または「ａｎ」とは、他に示さない限り、数に関して、少なくとも１つ（１または１よりも多いこと）を意味する。
【００３４】
本発明は、上記の化合物の１種類以上が肝脂肪含量の減少および関連障害の寛解に効果を有することを開示する。かくして、本発明は、脂肪肝を予防または治療するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための組成物の製造のための、本明細書に記載の化合物の使用を提供する。本発明は、また、脂肪肝の予防または治療、肝機能の保護、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害の寛解の方法を提供する。当該方法は、必要とする対象体に、本明細書に記載の化合物の有効量を投与することを含む。本発明は、また、脂肪肝を予防または治療するため、肝機能を保護するため、または脂肪肝によって引き起こされる肝疾患もしくは他の関連障害を寛解させるための組成物を提供する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「肝脂肪含量」とは、対象体の肝臓に蓄積される脂肪の含量をいい、ここで、当該脂肪は、トリグリセリド（ＴＧ）およびコレステロールのような一般的に定義される脂質を含む。本明細書で使用する場合、用語「肝脂肪含量の減少」とは、一般に、対象体における異常肝脂肪含量の減少、すなわち異常肝脂肪含量の減少、より具体的には、異常肝脂肪含量の正常レベルまでの低下をいう。例えば、正常な状況下、脂肪は肝臓の３重量％を構成する。肝臓における脂肪が肝臓の５重量％を超えたら、それは異常脂肪蓄積と判定される（上記肝脂肪含量は例示のための相対的パーセンテージであり、民族性および他の因子により変わり得る）。特定の実施態様において、本明細書で使用する用語「肝脂肪含量の減少」とは、対象体における異常肝脂肪含量が、例えば、肝臓の５重量％以上から、肝臓の３重量％まで減少することを意味することができる。肝脂肪含量は、超音波分析、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）および肝臓生検を包含するがこれらに限定されない標準的分析法により評価することができる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「肝機能」とは、肝臓により行われる１つ以上の生理学的機能をいう。肝機能は、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）分析またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）分析のような多くの常用アッセイにより分析することができる。本発明により、本明細書に記載の化合物は、肝機能改善および肝臓の損傷防止を含む、肝機能の保護に使用することができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「肝疾患」とは、肝機能不全に至る可能性がある、ある因子によって引き起こされる肝細胞傷害または損傷をいう。本発明により、本明細書に記載の化合物を、脂肪肝によって引き起こされる肝疾患を寛解させるために使用することができる。より具体的には、本明細書で使用する用語「肝損傷」とは、正常な肝臓と比較して、組織学的または生化学的機能不全を有する肝臓をいう。特定の実施態様において、本明細書で使用する場合、用語「肝損傷」とは、アルコール性または非アルコール性因子、例えば、高脂肪食または肥満によって引き起こされる肝臓病変をいう。特定の実施態様において、用語「肝損傷」とは、脂肪肝、小葉炎症、肝細胞肥大化および肝細胞により産生される小胞脂肪滴から選択される１以上の特徴を有する肝組織損傷であり得る。特定の実施態様において、用語「肝損傷」とは、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の活性から決定することができる、肝臓の生化学的機能不全であり得る。ＡＬＴまたはＡＳＴの活性が高いほど肝臓の生化学的機能の重篤な機能不全を示す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「肝臓抗酸化活性」とは、酸化ストレスに対抗する活性または能力をいう。本発明の化合物による対象体の肝臓抗酸化活性の増強としては、酸化ストレスの減少、または抗酸化系のメンバーの酵素活性もしくは含量の増強が挙げられるが、これらに限定されない。抗酸化系のメンバーは、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）および／またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であり得る。
【００３９】
本発明により、本明細書に記載の化合物としては、肝脂肪含量の減少および関連障害の寛解に使用され得る一般的な賦形剤およびバイオフラボノイドが挙げられる。本明細書に記載の用語「関連障害」としては、脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性肝硬変およびアルコール性肝硬変（ＩＣＤ−９−ＣＭ診断コード：５７１.８、５７１.０、５７１.１、５７１.２、５７１.３、５７１.４、５７１.５、５７１.９）を包含するがこれらに限定されない、肝脂肪の異常蓄積によって引き起こされる障害が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「予防」とは、疾患または疾患の症状もしくは状態の予防的手段をいい、当該疾患または疾患の症状もしくは状態に罹患している患者であるとまだ診断されていないが該疾患にかかりやすいかまたはその傾向にあり得る対象体への１種類以上の活性薬剤の適用または投与を包含するがこれらに限定されない。予防的手段の目的は、疾患または疾患の症状もしくは状態の発生を回避すること、予防することまたは遅らせることである。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「処置」とは、疾患または疾患の症状もしくは状態の治療的手段をいい、当該疾患または疾患の症状もしくは状態または疾患増悪に罹患している対象体への１種類以上の活性薬剤の適用または投与を包含するがこれらに限定されない。治療的手段の目的は、疾患、疾患の症状もしくは状態、疾患によって引き起こされる障害または疾患増悪を処置すること、治癒すること、緩和すること、軽減すること、改変すること、治療すること、寛解させること、改善すること、または作用することである。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「個体」または「対象体」としては、ヒトまたは非ヒト動物、特に哺乳動物、例えばコンパニオンアニマル（例えば、イヌおよびネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」とは、処置される対象体において所望の生物学的有効性または治療効果を達成する活性成分の量、例えば対象体において肝脂肪含量を減少させるかまたは関連障害を寛解させる活性成分の量をいう。
【００４４】
輸送および取り込みの目的で、本発明の活性成分の有効量は、好適な剤形の医薬組成物を形成するために薬学的に許容される担体を用いて製剤化され得る。投与経路にしたがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、組成物の総重量に基づいて約０.１重量％〜約１００重量％の活性成分を含む。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、担体が組成物の活性成分に適合すること（かつ、活性成分の効果に影響を及ぼさないこと）、および、好ましくは、担体が活性成分を安定化することができ、処置される対象体にとって安全であることを意味する。担体は、活性成分の希釈剤、ビヒクル、賦形剤、または媒体であり得る。好適な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、シュークロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。当該組成物は、さらに、滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン；甘味剤；ならびに矯味矯臭剤を含むことができる。患者へ投与した後、本発明の組成物は、活性成分の急速放出、徐放または遅延放出の効果をもたらし得る。
【００４６】
本発明によると、当該組成物は、何れかの剤形、例えば、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、フラットなカプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、ソフトおよびハードゼラチンカプセル剤、坐剤、滅菌注射液剤、および包装された散剤であり得る。
【００４７】
本発明の組成物は、経口、非経口（例えば筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内）、経皮、坐薬および鼻腔内方法のような、任意の生理学的に許容される経路で投与され得る。非経口投与は、好ましくは、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースのような他の物質を含み得る滅菌水性溶液を使用する。当該水性溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化され得る（好ましくは、ｐＨ３〜９を有する）。当業者は、滅菌条件下における公知の標準薬理学的技術によって、好適な非経口組成物を調製することができる。
【００４８】
本発明は、また、以下の具体例によって説明されるが、これらは証明目的で提供されるのであって、本発明を限定するものではない。当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、本発明によって開示された特定の具体例に対してさまざまな変更を行うことができ、なおも同じまたは同様の結果が得られることが明らかである。
【実施例】
【００４９】
１．材料および方法
１.１  細胞株および細胞培養培地
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いて、脂肪含量の減少における本発明の種々の化合物の活性を分析した。
【００５０】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、以下の実験を実施するため表１に示すＤＭＥＭ培地Ｎｏ．Ａ〜Ｆを調製した。
【００５１】
【表１】
2018534323.tif 000002
ＤＭＥＭ培地Ｎｏ．Ａ〜Ｆを２〜８℃で保存し、実験前に３７℃の水浴で温めた。
【００５２】
１.２  細胞数および生存率試験
死細胞は０.４％のトリパンブルーを取り込み、色を示す；他方、生細胞は、細胞膜が無傷のため当該色素を取り込まず、透明な色を示す。細胞懸濁液１００μＬおよび同体積の０.４％トリパンブルーを均一に混合して混合物を得た。当該混合物の一部（約２０μＬ）を血球計数器のチャンバー上の溝に加え、次いで、光学顕微鏡下で観察するためにカバースリップで覆った。生細胞は染色されず、死細胞は青色であった。
【００５３】
１.３  オレイン酸による誘発によるＨｅｐＧ２細胞株からの脂肪肝細胞の形成
ＨｅｐＧ２細胞株（１５×１０6細胞）をＤＭＥＭ培地Ｎｏ．Ｂで培養し、５％ＣＯ2のインキュベーター内で３７℃にて２４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ培地Ｎｏ．Ｃ（無血清培地）中で２４時間培養し、最後に、ＤＭＥＭ培地Ｎｏ．Ｄ（オレイン酸塩／アルブミン複合体を含む）でさらに４８時間培養してＨｅｐＧ２細胞株を誘導し、脂肪肝細胞を得た。
【００５４】
１.４  各群の脂肪肝細胞の処理
ＨｅｐＧ２細胞系を以下の６つの群に分けた：（１）ブランク：無処理；（２）ＤＭＳＯ群：ブランクからの細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理した；（３）対照：オレイン酸で脂肪肝細胞の形成を誘発した；（４）ビヒクル群：オレイン酸で誘発して得られた脂肪肝細胞をＤＭＳＯで処理した；（５）陽性対照：脂肪肝細胞をシリマリンで処理した；および（６）試験群：脂肪肝細胞を本発明の種々の化合物で処理した。
【００５５】
１.５  細胞中のＴＧの測定
７２時間のインキュベーション後、各群から得た処理細胞をＰＢＳで連続して２回洗浄し、次いで、トリプシン／ＥＤＴＡ  ０.５ｍｌと共に３分間インキュベートした。その後、ＰＢＳ  ２ｍＬで細胞を掻き取り、次いで、遠心管に移して、超音波で破砕した。細胞抽出物を２０μＬ取り出して、タンパク質の含量を測定した。ＴＧ測定は、市販の試薬の組合せ（Randox）を用いて行った。上記で得られたＴＧ含量をタンパク質含量で割って、細胞中の相対ＴＧ含量を表す比を得た。
【００５６】
１.６  実験用動物
保健省によって発表された「健康食品の肝臓保護および健康管理の有効性を評価する方法」の説明書で推奨されているＢ６マウスを動物試験に選んだ。４匹以上のマウスを各群の予備試験に用い、１２匹以上のマウスを各群の確認試験に用いた。通常の明／暗サイクル（点灯午前７時〜午後７時、消灯午後７時〜午前７時）下、５５±１５％の相対湿度の動物室で２３±２℃にて飼育した体重１８〜２３ｇの雄性マウスをBioLASCO（台北）から購入し、国防医学院の実験動物センターに収容した。動物実験は国家衛生研究院の動物実験の指針に従って実施した。マウスに通常の飼料を３〜５ｇ／日、水を無制限に、１〜２週間与え、健康状態を調べた。マウスの体重を週１回記録した。
【００５７】
１.７  動物のグループ分け
試験動物を、ブランク、高脂肪食対照（ＨＦＤ）、陽性対照（ＰＳ）および試験群に無作為に分けた。ブランクの動物には通常の飼料を与えた。ＨＦＤの動物には高脂肪飼料を与えた。ＰＳの動物には高脂肪飼料を与え、さらにシリマリン（５ｍｇ／ｋｇ／日）を管で補給した。試験群の動物には高脂肪飼料を与え、さらに試験化合物を管で強制的に与えた。
【００５８】
１.８  試験方法
ブランクの動物には通常の飼料を１２週間普通に与え、一方、ＨＦＤ、ＰＳおよび試験群の動物には高脂肪飼料を１２週間普通に与えた。８週間給餌した後、ブランクおよびＨＦＤの動物には１日１回脱イオン水を管で与えた；ＰＳの動物には１日１回シリマリンを管で与えた；試験群の動物には４週間または８週間にわたり１日１回試験化合物を与えた。
【００５９】
試験前、ならびに試験後８週目、１２週目および１６週目に、頬または心臓から採血した。試験の終了時に、すべてのマウスの体重を測定し、次いで、屠殺し、同時に頬または心臓から採血した。マウスの血液検体を室温で１時間静置して凝固させ、次いで、冷却遠心分離器で４℃にて１５,７００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。その後、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣＨＯ／ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）を含む肝機能の生化学的指数を自動血液生化学分析装置で検出した。
【００６０】
さらに、屠殺したマウスの腹部から腹部脂肪および肝臓標本を採取し、計量して脂肪および肝臓の重量を比較し、体重に対する肝臓重量の比を得た。肝臓の最も大きな右葉から体積約１cm3の組織ブロックを２つ切り取り、１０％中性ホルマリン溶液中で固定し、次いで、切片化および組織病理学的観察用Ｈ＆Ｅ染色のためにパラフィンで包埋した。さらに、肝臓の残りを、保存ならびにトリグリセリドおよび総コレステロールの肝臓中含量の検出のために冷凍した。さらにまた、臨床で用いられる残存肝機能の定量化のために米国ＦＤＡおよび台湾衛生福利部により認識され推奨されているガラクトース・シングルポイント法（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ）により各群の動物の肝機能を分析した。試験の終了時点で、動物１ｋｇあたりガラクトース（Ｇ.Ｓ.Ｐ.（登録商標）０.４ｇ／ｍＬ）０.５ｇを静脈内投与した。投与から１時間後、ろ紙を用いて全血約０.５ｍｌを採取し、マウスの肝機能を評価した。ＧＳＰの値が高いほど、残存肝機能は悪い（FDA: “Guidance for Industry: Pharmacokinetics in Patients with Impaired. Hepatic Function-Study Design, Data Analysis and Impact on Dosing and. Labeling. 2003）。
【００６１】
１.９  組織病理学的組織切片作製
試験の終了時に、全てのマウスを屠殺した。肝臓の最も大きな右葉から体積約１cm3の組織ブロックを１つ切り取り、１０％中性ホルマリンで固定し、次いで、種々の濃度のエタノール（３０％、５０％、７０％、９５％、９９.５％）およびキシレン中で脱水およびヒアリン化した。その後、キシレンを熱パラフィン溶液に置き換えた。最後に、組織をパラフィン溶液で包埋した。完成したパラフィン標本をミクロトームにより、厚さ５μｍのパラフィン切片に切断した。切片をクリーンスライド上に貼り付け、３７℃で乾燥させ、次いで、Ｈ＆Ｅ染色法によって染色した。
【００６２】
１.１０  ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）
肝組織切片をキシレン中で３０分間脱パラフィンし、次いで、９９.５％、９５％、７０％、５０％および３０％のエタノールでそれぞれ３０分間連続的に再水和した。蒸留水に１０分間浸漬した後、切片を染色することができた。切片を最初にヘマトキシリンに３０秒間浸漬して細胞核を染色し、次いで、蒸留水で数分間洗浄し、エオシンで２〜５分間染色し、再び蒸留水で数分間洗浄した。染色処理が終わった後、切片を５０％、７０％、９５％および１００％水性エタノールでそれぞれ３０秒間２回脱水し、キシレンで２回ヒアリン化し、最後に封入剤で封入し保存した。
【００６３】
１.１１  組織病理学的観察
進行中の肝傷害がある場合、肝細胞の病変、脂肪蓄積、壊死または線維化を観察するために、肝組織をＨ＆Ｅ染色して肝脂肪蓄積の程度を評価した。すべての組織病理学的切片を、主観的観察におけるバイアスを排除するために肝臓の最も大きな右葉の同じ位置から切り取り、次いで、病理学的染色に付した。病理学における半定量分析の評価に関しては、試験デザインを知らずにすべての切片をスコア化（ＮＡＳスコア）し16、比較する二重盲検分析を行った医師または獣医病理学者が確認しなければならなかった。最後に、統計的方法によって各群の微分解析を行った。
【００６４】
１.１２  肝臓の抗酸化能力の分析
屠殺した動物から肝組織約０.１ｇを採取し、バイオマッシャーで１０分間遠心分離することによりホモジナイズした。ホモジナイズした組織に９重量倍（ｗ／ｗ）の緩衝液（ｐＨ７.４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ）を添加し、次いで、次の使用のためにボルテックスミキサーで十分に混合した。得られた肝組織ホモジナイゼーション溶液試料を、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンレダクターゼ（Ｇｒｄ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を含む、肝臓抗酸化系の種々のメンバーの分析のために用いた。関連分析の方法は、例えば、台湾衛生福利部が発表した「健康食品の肝臓保護および健康管理の有効性を評価する方法」の草案などの公知の文献に見出すことができる。
【００６５】
１.１３  統計的分析
すべてのデータを平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。試験結果の統計学的有意差は、Ｓｏｃｉａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅプログラムのＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン１３、SPSS Inc.）を用いた一元ＡＮＯＶＡの計算によって決定された。その後、グループ間の有意差を確認するため、事後検定（post-hoc test）において最小意差法を用いて多重比較を行った。グループ間の平均差は、ｐ＜０.０５の場合に有意であると判断される。
【００６６】
２．結果
２.１  細胞実験
細胞実験では、陽性対照（シリマリン）において測定されたＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧ量減少の結果を表２に示した。
【００６７】
【表２】
2018534323.tif 000003
【００６８】
一定濃度の試験化合物を用いて測定したＨｅｐＧ２脂肪細胞におけるＴＧ含量減少の結果を表３に示す。この結果は、試験化合物は、対照と比較して、一定の試験濃度の条件下で、誘発されたＨｅｐＧ２細胞から形成された脂肪肝細胞中に異なる程度のＴＧ含量減少効果を示したことを示している。ＴＧの減少率（％）の計算式は次のとおりであった：
[１ − (試験群のＴＧ含量 − ブランクのＴＧ含量) ／ (オレイン酸誘発群のＴＧ含量 − ブランクのＴＧ含量)] × １００％。
【００６９】
【表３−１】
2018534323.tif 000004
【表３−２】
2018534323.tif 000005
【００７０】
【表４】
2018534323.tif 000006
【００７１】
【表５】
2018534323.tif 000007
【００７２】
【表６】
2018534323.tif 000008
【００７３】
２.２  動物実験
動物実験において、通常の飼料を与えたブランクの動物を除き、脂肪肝を誘発するためにすべての動物を処置した。８週間後、各群の動物に、初期の飼料に加えて種々の処置を４週間または８週間施した。ブランクおよびＨＦＤの動物には脱イオン水を与えた；ＰＳの動物にはシリマリンを与えた；試験群の動物には、プエラリン、フロリジン、エリオジクチオール、スクラロース、マンニトール、サッカリン、ヘスペリチン、メントール、およびそれらのうちのいくつかの組合せを含む、異なる試験化合物を与えた。
【００７４】
２.２.１  動物の体重、肝重量および体脂肪重量に対する影響ならびに試験化合物の安全性評価
動物実験の結果から、各群の動物の肝重量、体脂肪重量、および体重増加を表４−１および表４−２に示した。
【００７５】
【表７】
2018534323.tif 000009
【００７６】
【表８】
2018534323.tif 000010
【００７７】
結果は、脂肪肝が誘発された動物において腹部脂肪重量が増加したことが示された。試験化合物、マンニトール、メントールおよびスクラロースの投与は、それぞれ、動物において腹部脂肪重量を有意に減少させる。
【００７８】
さらに、試験化合物を投与した後、試験群の動物において異常状態は観察されなかった。試験中に動物は死亡しなかった。試験化合物により引き起こされる疾患または臨床的症状の発生は、試験後の屠殺動物の剖検から観察されなかった。したがって、試験化合物は安全であった。
【００７９】
２.２.２  試験化合物は肝臓内の脂質含量を減少させるのに有効である
図１は、マウスにおいて脂肪肝が誘発され、当該マウスの肝門領域付近（胆管、門脈、肝動脈を含む）の肝細胞が多くの大きな小胞脂肪滴で覆われており、肝細胞肥大化が出現したことを示しており、これは、誘発により脂肪肝の動物モデルが成功裏に樹立されたことを示している。
【００８０】
当該動物実験の結果は、複数の試験化合物が４週間または８週間の投与後に動物肝臓における脂質減少の効果を示すことを示している。結果を表５−１および表５−２に示した。
【００８１】
【表９】
2018534323.tif 000011
【００８２】
【表１０】
2018534323.tif 000012
【００８３】
結果は、脂肪肝が誘発されたマウスの肝臓においてＴＧおよびＴＣが増加したことを示している。試験化合物、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントールおよびスクラロースの投与は、それぞれ、肝臓におけるＴＧを有意に減少させており、特に、エリオジクチオールによる４週間の処置は、肝臓ＴＧ含量の約６７％減少という優れた効果を奏している（ｐ＜０.００５）。さらに、試験化合物、ヘスペリチン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンの投与は、それぞれ、肝臓におけるＴＣを有意に減少させており、特に、サッカリンによる４週間の処置は、肝臓ＴＣ含量の約５６％減少という優れた効果を奏している（ｐ＜０.００５）。
【００８４】
２つの試験化合物の組合せの投与に関して、サッカリンとマンニトールの組合せ、メントールとマンニトールの組合せ、スクラロースとマンニトールの組合せ、エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、またはエリオジクチオールとスクラロースの組合せは、肝臓ＴＧを効果的に減少させることができ、特に、メントールとマンニトールの組合せによる４週間の処置は、肝臓ＴＧ含量の約７７％減少という優れた効果を奏しており（ｐ＜０.００５）；エリオジクチオールとスクラロースの組合せによる８週間の処置は、肝臓ＴＧ含量の約７８％減少という優れた効果を奏している（ｐ＜０.００５）。さらに、スクラロースとマンニトールの組合せ、エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、またはエリオジクチオールとスクラロースの組合せは、肝臓ＴＣ含量を有意に減少させることができ（p＜０.００５）、特に、エリオジクチオールとスクラロースの組合せによる８週間の処置は、肝臓ＴＣ含量の約７７％減少という優れた効果を奏している（ｐ＜０.００５）。
【００８５】
３つの試験化合物の組合せの投与に関して、メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せまたはスクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、肝臓ＴＧを効果的に減少させることができ、特に、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せによる８週間の処置は、肝臓ＴＧ含量の約７９％減少という優れた効果を奏している（ｐ＜０.００５）。さらに、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、肝臓ＴＣを有意に減少させることができる。
【００８６】
２.２.３  試験化合物は肝損傷を減少させるのに有効である
２.２.３.１  肝組織における肝脂肪および肝損傷の減少における効果
動物実験の結果は、複数の試験化合物が、４週間の試験期間中の肝組織における肝脂肪および肝損傷の減少における効果を示すことを示している。図１は、脂肪肝を有する動物が、肝門領域付近（胆管、門脈、肝動脈を含む）の肝細胞を覆う多くの大きな小胞脂肪滴および肝細胞肥大化を包含する肝組織の損傷を有することを示している。対照的に、シリマリン、メントール、エリオジクチオールまたはマンニトールによる４週間の処置後は、肝組織切片における肝細胞内の大きな小胞脂肪滴が有意に減少し、一方、シリマリンで処置されたマウスにおいては、小さな破損した小滴の一部が依然として観察されているが、メントール、エリオジクチオールまたはマンニトールで処置されたマウスの肝組織の形態は、ブランク群の動物のものと類似しており、これは、脂肪性肝疾患がより軽度であることを示している。さらに、ＮＡＳスコア付けの結果を表６に示している。
【００８７】
【表１１】
2018534323.tif 000013
【００８８】
ＮＡＳ（非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（Nonalcoholic Fatty Liver Disease Activity Score））は、非アルコール性脂肪性肝疾患の活動性スコアを示し［Hepatology. 2005 Jun;41(6):1313-21］、これは、脂肪症、小葉炎症および肝細胞肥大化の度合の包括的評価に関する。スコア表を表７に示している。スコアが高いほど重篤な肝損傷を示す。
【００８９】
【表１２】
2018534323.tif 000014
【００９０】
結果は、脂肪肝を有するマウスが肝組織に損傷を有すること（ＮＡＳの増加）を示している。試験化合物、エリオジクチオールおよびマンニトールの投与は、それぞれ、肝損傷を有意に減少させることができる。２つの試験化合物、メントールとマンニトールの組合せの投与が優れた効果を奏すること、すなわち、肝損傷の出現がほとんどなく、ＮＡＳがブランクのものと同一であることは注目に値する。
【００９１】
２.２.３.２  肝機能不全の減少における効果
動物実験の結果は、複数の試験化合物が４週間または８週間の投与期間中に動物における肝機能不全を減少させることができることを示している。結果を表８−１および表８−２に示している。
【００９２】
【表１３】
2018534323.tif 000015
【００９３】
【表１４】
2018534323.tif 000016
【００９４】
ＡＬＴおよびＡＳＴは、肝臓の生化学的機能不全を反映する酵素指標として最も一般的に用いられる。通常の状況下では、これらの酵素は肝細胞に存在する。しかしながら、肝細胞が損傷を受けると、それらが漏れる。血清ＡＬＴ値および血清ＡＳＴ値の増加は、一般に肝臓炎症および肝機能不全を反映する。
【００９５】
結果は、脂肪肝を有する動物が肝機能不全に罹患していること（ＡＬＴ値およびＡＳＴ値が上昇していること）を示している。試験化合物、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンの投与は、それぞれ、ＡＬＴ値およびＡＳＴ値を有意に減少させることができ、特に、マンニトールによる４週間の処置は、ＡＬＴ値の約６４％低下（ｐ＜０.００５）およびＡＳＴ値の約６０％低下（ｐ＜０.００５）という優れた効果を奏している。
【００９６】
２つの試験化合物の組合せの投与に関して、メントールとマンニトールの組合せまたはエリオジクチオールとスクラロースの組合せは、ＡＬＴ値を有意に減少させることができ；メントールとマンニトールの組合せ、スクラロースとマンニトールの組合せ、またはサッカリンとマンニトールの組合せは、ＡＳＴ値を有意に減少させることができる。特に、メントールとマンニトールの組合せによる４週間の処置は、ＡＬＴ値の約７６％低下（ｐ＜０.００５）およびＡＳＴ値の約６２％低下（ｐ＜０.００５）という優れた効果を奏してる。
【００９７】
３つの試験化合物の組合せの投与に関して、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、ＡＬＴ値を有意に低下させることができる（ｐ＜０.００５）。
【００９８】
２.２.４  試験化合物は肝臓抗酸化活性を増強することができる
動物実験の結果は、複数の試験化合物が４週間の試験期間中の動物における肝臓抗酸化活性の増強において有効であることを示している。結果を表９−１および表９−２に示している。
【００９９】
【表１５】
2018534323.tif 000017
【０１００】
【表１６】
2018534323.tif 000018
【０１０１】
Ｇｐｘ、ＧＳＨ、ＧｒｄおよびＳＯＤは、肝臓における酸化ストレスを減少させることおよび肝臓が酸化ストレスによって引き起こされる損傷を受けるのを防ぐことができる肝臓抗酸化系の一般的な構成要素である。Ｇｐｘ値、ＧＳＨ値、Ｇｒｄ値およびＳＯＤ値の増加は、肝臓がより良好な抗酸化活性を維持していることを示す。
【０１０２】
結果は、脂肪肝を有するマウスが抗酸化活性を低下させていることを示している。試験化合物、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジンおよびマンニトールの投与は、それぞれ、抗酸化活性を有意に増強することができ、特に、マンニトールによる４週間の処置は、Ｇｐｘレベル、ＧＳＨレベル、ＧｒｄレベルおよびＳＯＤレベルの実質的な増加という優れた効果（ｐ＜０.００５）を奏している。
【０１０３】
上記を考慮して、本発明において提供される化合物は、肝臓の脂肪含量を減少させること、肝損傷を減少させること、肝臓抗酸化活性を増強することができる。これらの化合物は、低分子の天然植物フェノール化合物に属し、果実および野菜、穀物、根茎、花、茶および赤ワインなどに広範囲に存在している。加えて、これらの化合物は、動物実験により安全であることが確認されており、そして、肝脂肪を減少させ、脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性硬変、ならびにアルコール性硬変（ＩＣＤ−９−ＣＭ診断コード：５７１.８、５７１.０、５７１.１、５７１.２、５７１.３、５７１.４、５７１.５、５７１.９）のような関連障害を寛解させるための、健康食品または薬物に開発される可能性を有することが判明している。
【０１０４】
参考文献
1. Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, Neuschwander-Tetri BA and Bacon BR. (1999) Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol 94: 2467-2674.
2. Clark JM and Diehl AM. (2003) Nonalcoholic fatty liver disease: an underrecognized cause of cryptogenic cirrhosis. JAMA 289: 300-304.
3. Carlisle R, Galambos JT, Warren WD. (1979) The relationship between conventional liver tests, quantitative function tests, and histopathology in cirrhosis. Dig Dis Sci 24: 358-362.
3. Cua IH. & George J. (2005) Non-alcoholic fatty liver disease. Hosp Med 66: 106-111.
4. Day CP and James OFW. (1998) Steatohepatitis: a tale of two ‘hits’? Gastroenterology 114: 842-845.
5. Dowman JK, Tomlinson JW and Newsome PN. (2010) Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Q J Med 103: 71-83.
6. Food and Drug Administration (2003) Guidance for Industry: Pharmacokinetics in Patients with Impaired Hepatic Function: Study Design, Data Analysis, and Impact on Dosing and Labeling. US Department of Health and Human Services, FDA, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research.
7. French SW. (2001) Intragastric ethanol infusion model for cellular and molecular studies alcoholic liver disease. J Biomed Sci 8: 20-27.
8. Gauthier MS, Favier R and Lavoie JM. (2006) Time course of the development of non-alcoholic hepatic steatosis in response to high-fat diet-induced obesity in rats. Br J Nutr 95: 273-281.
9. Guo HX, Liu DH, Ma Y, Liu JF, Wang Y, Du ZY, Wang X, Shen JK and Peng HL. (2009) Long-term baicalin administration ameliorates metabolic disorders and hepatic steatosis in rats given a high-fat diet. Acta Pharmacol Sin 30: 1505-1512.
10. Herold C, Heinz R, Niedobitek G, Schneider T, Hahn EG, Schuppan D. (2001) Quantitative testing of liver function in relation to fibrosis in patients with chronic hepatitis B and C. Liver 21: 260-265. 
11. Hu OY, Tang HS, Chang CL. (1994) The influence of chronic lobular hepatitis on pharmacokinetics of cefoperazone--a novel galactose single-point method as a measure of residual liver function. Biopharm Drug Dispos 15: 563-576.
12. Hu OY, Hu TM and Tang HS. (1995) Determination of galactose in human blood by high-performance liquid chromatography: comparison with an enzymatic method and application to the pharmacokinetic study of galactose in patients with liver dysfunction. J Pharm Sci 84: 231-235.
13. Hu OY, Tang HS, Sheeng TY, Chen TC and Curry SH. (1995) Pharmacokinetics of promazine in patients with hepatic cirrhosis--correlation with a novel galactose single point method. J Pharm Sci 84: 111-114.
14. Keiding S, Johansen S, Tonnesen K. (1977) Kinetics of ethanol inhibition of galactose elimination in perfused pig liver. Scand J Clin Lab Invest 37: 487-494.
15. Keiding S, Johansen S, Winkler K. (1982) Hepatic galactose elimination kinetics in the intact pig. Scand J Clin Lab Invest 42: 253-259.
16. Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N, Kiernan TW and Wollman J. (1981) Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1: 431-435.
17. Leclercq IA, Farrell GC and Field J. (2000) CYP2E1 and CYP4A as microsomal catalysts of lipid peroxides in murine nonalcoholic steatohepatitis. J Clin Invest 105: 1067-1075.
18. Lindskov J. (1982) The quantitative liver function as measured by the galactose elimination capacity. I. Diagnostic value and relations to clinical, biochemical, and histological findings in patients with steatosis and patients with cirrhosis. Acta Med Scand 212: 295-302.
19. Lin SC, Lin YH, Chen CF, Chung CY and Hsu SH. (1997) The hepatoprotective and therapeutic effects of propolis ethanol extract on chronic alcohol-induced liver injuries. Am J Chin Med 25: 325-332.
20. Liu CH, Huang MT and Huang PC. (1995) Sources of triacylglycerol accumulation in livers of rats fed a cholesterol-supplemented diet. Lipids 30: 527-531.
21. Mulhall BP, One JP and Younossi ZM. (2002) Non-alcoholic fatty liver disease: an overview. J Gastroenterol Hepatol 17: 1130-1143. 
22. Nanji AA. (2004) Another animal model for nonalcoholic steatohepatitis: how close to the human condition? Am J Clin Nutr 79: 350-351.
23. Nistor A, Bulla A, Filip DA and Radu A. (1987) The hyperlipidemic hamster as a model of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis 68: 159-173. 
24. Sanyal AJ, Campbell-Sargent C and Mirshahi F. (2001) Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities. Gastroenterology 120: 1183-1192.
25 Sass DA, Chang P and Chopra, KB. (2005) Nonalcoholic fatty liver disease: a clinical review. Dig Dis Sci 50: 171-180.
26. Schaefer EJ. (1997) Effects of dietary fatty acids on lipoproteins and cardiovascular disease risk: summary. Am J Clin Nutr 65: 1655S-1656S. 
27. Schaffner F and Thaler H. (1986) Nonalcoholic fatty liver disease. Prog Liver Dis 8: 283-298.
28. Sullivan MP, Cerda JJ, Robbins FL, Burgin CW and Beatty RJ. (1993) The gerbil, hamster, and guinea pig as rodent models for hyperlipidemia. Lab Anim Sci 43: 575-578. 
29. Tang HS and Hu OY. (1992) Assessment of liver function using a novel galactose single point method. Digestion 52: 222-231.
30. Tominaga K, Kurata JH and Chen YK. (1995) Prevalence of fatty liver in Japanese children and relationship to obesity. Dig Dis Sci 40: 2002-2009.
31. Zhang Z, Wang H, Jiao R, Peng C, Wong YM, Yeung VS, Huang Y and Chen ZY. (2009) Choosing hamsters but not rats as a model for studying plasma cholesterol lowering activity of functional foods. Mol Nutr Food Res 53: 921-930. 
32. Zou Y, Li J, Lu C, Wang J, Ge J, Huang Y, Zhang L and Wang Y. (2006) High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatitis. Life Sci 79: 1100-1107.
33. Zhang D, Xie L, Jia G, Cai S, Ji B, Liu Y, Wu W, Zhou F, Wang A, Chu L, Wei Y, Liu J and Gao F. (2011) Comparative study on antioxidant capacity of flavonoids and their inhibitory effects on oleic acid-induced hepatic steatosis in vitro. Eur J Med Chem 46: 4548-4558.
【図１】
2018534323.tif 000019
【国際調査報告】
2018534323.tif 000020
2018534323.tif 000021
2018534323.tif 000022
2018534323.tif 000023
2018534323.tif 000024
2018534323.tif 000025
2018534323.tif 000026
2018534323.tif 000027