(57)【要約】  本発明は、単に美容的効果のみがある、人体の一部域における脂肪組織の蓄積を低減又は防止する方法であって、人体の前記一部域において、非発熱条件下で0.4から0.6MHzの範囲の周波数で交流を印加することを含む方法に関する。
2018531114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単に美容的効果のみがある、人体の一部域における脂肪組織の蓄積を低減又は防止する方法であって、人体の前記一部域において、非発熱条件下で0.4から0.6MHzの範囲の周波数で交流を印加することを含み、交流の密度が1から3000μA/mm2であり、交流の印加セッションの各々が30から90分持続することを特徴とする、方法。
【請求項２】
人体が成人の人体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
交流が0.4MHzから0.5MHzの範囲の周波数を有することを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の方法。
【請求項４】
交流が0.448MHzの周波数を有することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
交流の密度が5から500μA/mm2であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該方法において交流の6から20の印加セッションを実施することを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該方法において交流の8から15の印加セッションを実施することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
週に1から5の交流の印加セッションを印加することを特徴とする、請求項6又は請求項7に記載の方法。
【請求項９】
週に3の交流の印加セッションを印加することを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
交流の印加セッションの各々が60分持続することを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
人体の前記一部域が腹部、殿筋、大腿部、ウエスト、背部、腕、「サドルバッグ」又はそれらの組合せであることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容の分野に関し、より具体的には、治療的な効果ではなく単に美容的にのみ効果がある、脂肪組織の蓄積を低減又は防止するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の美容では、広範囲の周波数にわたる物理的信号を用いる処置が使用される。この点について、多種多様な非侵襲的な技術が超音波からレーザまでの範囲で発達してきており、電気及び/又は磁気刺激を、直流及び低周波若しくは超低周波の形態、又は高周波(high frequency)若しくは高周波(radiofrequency)の形態のいずれかで含む(Mulholland, R.S.、Paul M.D.及びChalfoun C.、Clin Plast Surg、2011年、38、503〜520頁、vii-iii、Belenky I.等、Adv Ther、2012年、29、249〜266頁)。具体的には、高周波を用いる処置では、およそ100kHz〜3GHzの周波数の範囲で高周波電磁場又は電流を印加又は使用し、分子摩擦によって組織を温めることを誘発する。
【０００３】
美容の分野において、上記の方法及び処置を適用して、例えば皮膚のたるみ又は弛みを改善し、したがって皺を修正及び低減する(Krueger N.及びSadick N.S.、Cutis、2013年、91、39〜46頁、Abraham M.T.及びMashkevich G.、Facial Plast Surg Clin North Am.、2007年、15、169〜177頁、v.、Alster T.S.及びLupton J.R.、Clin Dermatol、2007年、25、487〜491頁、Sadick N.、Facial Plast Surg Clin North Am、2007年、15、161〜167頁、v.、Chipps L.K.等、J Drugs Dermatol、12(2013)、1215〜1218頁、Tay Y.K.及びKwok C.、J Cosmet Laser Ther、11(2009)、25〜28頁)。別の美容的適用には体型補正が含まれ、その最も視覚的な又は著しい効果は蜂巣炎及び皮下脂肪組織を低減することで体形を整えると言われている(van der Lugt C.等、Dermatol Ther、22(2009)、74〜84頁、Del Pinto E.等、J Drugs Dermatol、5(2006)、714〜722頁、Alexiades-Armenakas M.、Dover J.S.及びArndt K.A.、J Cosmet Laser Ther、10(2008)、148〜153頁、並びにValentim da Silva R.M.等、Dermatol Res Pract、2013(2013)、715〜829頁)。
【０００４】
この最後の効果(体型の調整及び脂肪沈着の低減)は、電熱高周波電流で処置したウサギの実験的研究における良好な結果で実証されており、結合組織の密度の増加と共に、真皮及び皮下の脂肪細胞数の減少が認められる(Ronzio, O.A.、Fisioterapia、31巻、2009年、131〜136頁)。
【０００５】
臨床研究ではまた、脂肪沈着の低減及び皮膚の産後のたるみの改善に適用される高周波処置による良好な結果が報告されている(Brightman L.等、Lasers Surg Med、41(2009)、791〜798頁)。組織レベルにおいて、高周波処置の非侵襲的で経皮的な適用により皮下組織を温め、動物被験体(Belenky I.等、Adv Ther、29(2012)、249〜266頁)及びヒト(Trelles M.A.等、Lasers Med Sci、25(2009)、191〜195頁)の両方において、コラーゲン線維を再構築し、脂肪組織の微小循環を増大する結果となることが示されている。細胞レベルにおいて、電熱高周波処置は、信号の周波数及び強度によって、脂肪細胞の脂肪分解及び壊死を引き起こし得る(Trelles M.A.等、Lasers Med Sci、25(2009)、191〜195頁、Hamida Z.H.等、Appl Physiol Nutr Metab、36(2011)、271〜275頁)。
【０００６】
容量性及び抵抗性電移法(Capacitive and Resistive electric transfer)(CRet)として知られる電熱技術に基づく電気療法は、0.4MHzから0.6MHzの範囲(高周波スペクトルに含まれる範囲)の周波数での交流の使用に基づく非侵襲的戦略からなり、前記交流の作用による処置用の標的の臓器又は組織の温度を上げる。このタイプの技術は、関連疼痛の軽減、炎症の軽減、血液循環の増大、血管及び筋肉の緊張の改善、並びに関節及び軟組織に蓄積された血腫、浮腫及び体液の再吸収の改善により、医学的リハビリテーション及び再生治療に、また例えば組織の傷害又は変性病変により生成される病変の再生のための美的/美容的適用に効果があることが示されている。
【０００７】
CRet療法の場合、処置は、皮膚に容量性又は抵抗性電極で加圧することで、手作業で施され、その結果、その下の標的の組織は、3つの同時刺激、すなわち1つは温熱刺激、もう1つは電気的に誘発される刺激、3つ目は機械的刺激を受ける。現在までの先行技術では、CRetを用いる美容処置は、脂肪分解又は抗脂肪生成効果(antiadipogenic effect)を誘発又は発揮することが示されているが、これは現在まで、温熱及び機械刺激の組合せが処置を施す組織で発揮した効果のみに起因しており、したがって高周波交流がその温度の上昇以外は組織に与える効果はないという仮説である。
【０００８】
特許出願PCT/ES2015/070372号は、in vitroの高周波交流の使用又は印加を開示し、これは、単独で、非発熱(sub-thermal)(電気的)条件下で、皮下脂肪組織由来の間葉幹細胞の増殖を、骨細胞、脂肪細胞又は軟骨細胞等の様々な細胞型に分化させるその能力に影響せずに増大する。
【０００９】
加えて、近年、多くの研究や調査が、細胞に対する電気的成分の効果を分析し、発癌又は腫瘍形成のリスクの可能性を除外するために、非発熱条件下での上記の電気療法の使用に基づいて行われている。前記研究は、療法の電気的成分が効果的に細胞に効果があることを実証しており、その結果、腫瘍細胞株の培養に適用する場合、細胞増殖抑制効果又は細胞毒性効果が観察される。具体的には、以下のことが示されている。
-  ヒト肝細胞癌細胞由来のHepG2細胞株(ATCC受託番号HB-8065)の細胞培養に対する、非発熱条件下で印加される周波数0.57MHzの交流(12〜24時間にわたって4時間毎に印加される、電流密度50μA/mm2、0.57MHzで5分パルス)は、それに対して細胞増殖抑制又は細胞分化効果を発揮する(Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2007年、30、583〜592頁、Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2010年、37、1399〜1405頁、及び、Hernandez-Bule, M.L.等、PLoS ONE、2014年、9、1e84636)。
-  ヒト神経芽細胞腫細胞由来のNB69細胞株(Sigma-Aldrich社のSigmaカタログ番号99072802)の細胞培養に対する、非発熱条件下で印加される周波数0.57MHzの交流(12〜24時間にわたって4時間毎に印加される、電流密度50μA/mm2、0.57MHzで5分パルス)は、細胞毒性効果を発揮する(Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2012年、41、1251〜1259頁)。
【００１０】
前記抗腫瘍効果だけでなく、非発熱条件下で印加される周波数0.57MHzの交流(12〜24時間にわたって4時間毎に印加される、電流密度50μA/mm2、0.57MHzで5分パルス)は、前記交流による処置後に細胞亜集団の生存、壊死及び分布の統計学的に有意な変化が検出されなかったことを考慮すると、健康なドナー由来の末梢血単核細胞の細胞培養において検出可能な効果を生じていないことも開示されている(Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2012年、41、1251〜1259頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許出願PCT/ES2015/070372号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Mulholland, R.S.、Paul M.D.及びChalfoun C.、Clin Plast Surg、2011年、38、503〜520頁、vii-iii
【非特許文献２】Belenky I.等、Adv Ther、2012年、29、249〜266頁
【非特許文献３】Krueger N.及びSadick N.S.、Cutis、2013年、91、39〜46頁
【非特許文献４】Abraham M.T.及びMashkevich G.、Facial Plast Surg Clin North Am.、2007年、15、169〜177頁、v.
【非特許文献５】Alster T.S.及びLupton J.R.、Clin Dermatol、2007年、25、487〜491頁
【非特許文献６】Sadick N.、Facial Plast Surg Clin North Am、2007年、15、161〜167頁、v.
【非特許文献７】Chipps L.K.等、J Drugs Dermatol、12(2013)、1215〜1218頁
【非特許文献８】Tay Y.K.及びKwok C.、J Cosmet Laser Ther、11(2009)、25〜28頁
【非特許文献９】van der Lugt C.等、Dermatol Ther、22(2009)、74〜84頁
【非特許文献１０】Del Pinto E.等、J Drugs Dermatol、5(2006)、714〜722頁
【非特許文献１１】Alexiades-Armenakas M.、Dover J.S.及びArndt K.A.、J Cosmet Laser Ther、10(2008)、148〜153頁
【非特許文献１２】Valentim da Silva R.M.等、Dermatol Res Pract、2013(2013)、715〜829頁
【非特許文献１３】Ronzio, O.A.、Fisioterapia、31巻、2009年、131〜136頁
【非特許文献１４】Brightman L.等、Lasers Surg Med、41(2009)、791〜798頁
【非特許文献１５】Belenky I.等、Adv Ther、29(2012)、249〜266頁
【非特許文献１６】Trelles M.A.等、Lasers Med Sci、25(2009)、191〜195頁
【非特許文献１７】Hamida Z.H.等、Appl Physiol Nutr Metab、36(2011)、271〜275頁
【非特許文献１８】Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2007年、30、583〜592頁
【非特許文献１９】Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2010年、37、1399〜1405頁
【非特許文献２０】Hernandez-Bule, M.L.等、PLoS ONE、2014年、9、1e84636
【非特許文献２１】Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2012年、41、1251〜1259頁
【非特許文献２２】Hernandez-Bule, M.L.、Cell Physiol Biochem、2014年、34、1741〜1755頁
【非特許文献２３】Bradford MM.、Anal Biochem、1976年、72、248〜254頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本特許の発明者等は、広範囲で徹底的な実験の結果、非発熱条件下で0.4から0.6MHzの範囲の周波数での交流のin vitroの印加が、脂肪組織幹細胞の脂肪生成の過程での脂肪の蓄積を低減及び防止することができることを驚くべきことに発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第一の態様は、成人の人体の一部域における脂肪組織の蓄積を低減又は防止するための美容法に関し、その方法は、非発熱条件下で0.4から0.6MHzの範囲の周波数での交流の印加を含む。本発明の前記方法は、治療的な効果ではなく単に美容的にのみ効果がある。
【００１５】
更なる態様において、本発明の美容法を実施するように構成された交流発生装置もまた開示される。
【００１６】
別の態様において、本文書はまた、本発明の美容法を実施する交流発生装置の使用を開示する。
【００１７】
本文書で使用する場合、「成人」及びその複数形は、少なくとも16歳の人を指すのに用いられる。
【００１８】
本文書で使用する場合、「内臓脂肪組織」及びその複数形は、縦隔、腸間膜、性腺周囲、腎周囲及び後腹膜のスケールで見られる脂肪組織を指すのに用いられる。
【００１９】
したがって、先述したように、第一の態様において、本発明は、単に美容的にのみ効果がある、人体の一部域における脂肪組織の蓄積を低減又は防止するための方法であって、人体の前記一部域における非発熱条件下で0.4から0.6MHzの範囲の周波数での交流の印加を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２０】
本発明の美容法は、電流の作用に供する脂肪組織を低減するために、皮膚に印加させる電極により放出された非発熱密度の交流の経皮的な印加による非侵襲的で非外傷性の美容法である。
【００２１】
上に示した条件下での交流の印加は脂肪細胞の分化の初期及び中間段階で抗脂肪生成効果があるので、本発明の美容法はまた、脂肪組織の蓄積の低減及び防止の両方に役立つ。
【００２２】
本発明の美容法は、男性又は女性に、好ましくは成人の人体に実施され得る。
【００２３】
好ましい実施形態において、交流は0.4MHzから0.5MHzの範囲の周波数、より好ましくは0.448MHzの周波数を有する。
【００２４】
先述したように、処置時間及び電流密度に関する条件を、本方法が非発熱条件下で実施される(すなわち、印加された電流の電気的効果のみが、温度上昇を誘発せずに発揮される)ように確定する。好ましくは、本発明の美容法において、交流の密度は、1から3000μA/mm2、より好ましくは5から500μA/mm2であり、交流の6から20の印加セッション、より好ましくは交流の8から15の印加セッションに対して、交流の印加セッションにおける週に1から5のセッションの印加、更により好ましくは週に3の交流の印加セッションの印加で、各交流印加セッションは30から90分、より好ましくは60分持続する。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明の美容法は、皮膚に適用し、人体の当該部域に位置し、交流発生装置に接続された適切な物質(例えば、電気的絶縁被膜がある又はないステンレス鋼)製の電極対を用いて実施される。交流発生装置への電極の接続は、直列又は並列でもよい。本発明の美容法を実施するのに用い得る適切な構成の交流発生装置の例は、とりわけIndiba(登録商標)社により製造された以下の装置である:Activ 902、Activ HCR 902及びELITEモデル。
【００２６】
本発明の美容法が脂肪組織の蓄積を有する又は有する可能性のある人体の任意の部域に適用され得ることは予想される。好ましい実施形態において、本発明の美容法は、腹部、殿筋、大腿部、ウエスト、背部、腕、「サドルバッグ(saddlebag)」又はそれらの組合せ、より好ましくは腹部、「サドルバッグ」又はそれらの組合せにおける脂肪組織の蓄積を低減又は防止するために用いられる。
【００２７】
処置する部位は、先述したように、適切な物質製の電極間に位置させる。
【００２８】
本発明の美容法の主な利点の1つは、刺激と接している皮下脂肪組織を低減するようにのみ働く温熱又は機械的成分に基づく従来の方法と異なり、本発明の美容法は用いられる電極の間に位置する全ての脂肪組織(その形成の低減又は防止)、すなわち皮下脂肪組織及び内臓脂肪組織の両方に影響するという事実である。
【００２９】
更に、本発明の美容法は、白色脂肪組織、褐色脂肪組織又はそれらの組合せ、好ましくは白色脂肪組織を低減するために用いられる。
【００３０】
先述したように、本美容法は、蓄積された脂肪組織を低減する、脂肪組織が蓄積することを防止する、又はそれらの組合せのために用いられる。使用又は効果は、本発明の美容法が用いられる人体の状態、すなわち、脂肪組織の既存の蓄積が既に存在するかどうか、又は、対照的に、本方法が将来の蓄積を防止するために明らかに用いられているかどうかに依存する。しかし、好ましい実施形態において、本美容法は、前記方法が用いられる人体の部域の脂肪組織の蓄積を防止するのに用いられる。
【００３１】
本発明の美容法は、脂肪組織の蓄積を低減又は防止することによる抗脂肪生成効果がある他の美容法又は処置と共に用いられ得、その結果、それらの効果が付加的に又は相乗的に作用し得る。好ましい実施形態において、本発明の美容法は、温熱、電気、若しくは機械的刺激又はそれらの組合せと組み合わされる。
【００３２】
本文書は、本発明の美容法を実施するように構成された制御装置を含む交流発生装置を開示する。
【００３３】
前記装置は、好ましくは、交流発生装置に好ましくは直列で又は並列で接続された適切な物質(例えば、電気的絶縁被膜がある又はないステンレス鋼)製の電極対を含む。より好ましくは、電極は直列で接続される。
【００３４】
交流発生装置に含まれる制御装置は、0.4MHzから0.6MHzの範囲、好ましくは0.4MHzから0.5MHzの範囲の周波数、更により好ましくは0.448MHzの周波数で、交流を生成するように構成されている。
【００３５】
先述したように、本発明の美容法の処置時間及び電流密度の条件を、本方法が非発熱条件下で実施される(すなわち、印加された電流の電気的効果のみが、温度上昇を誘発せずに発揮される)ように確定し、したがって、交流発生装置に含まれる制御装置は、交流を生成し、非発熱条件下で前記電流を印加するように構成されている。好ましくは、交流発生装置に含まれる制御装置は、交流発生装置により生成される交流の密度が、1から3000μA/mm2、更により好ましくは5から500μA/mm2であり、パルス又は個別のセッションで印加される前記交流が、30から90分、好ましくは60分持続するように構成されている。
【００３６】
本発明の美容法を実施するように構成された制御装置は、上に示した本発明の方法を実行するために必要なプログラミングを含有するメモリを含み得る。
【００３７】
本文書において、本発明の美容法を実施する交流発生装置の使用もまた開示される。
【００３８】
前記交流発生装置は、上に示したように、本発明の方法を実施するように構成されている。
【００３９】
より良い理解のために、本発明を、例として与えられる添付図面を参照し、非限定的な実例を参照して、以下でより詳細に説明する。前記実例は、ヒトにおける脂肪生成の過程に関係し(すなわち、in vivo)、したがってヒトにおける本発明の美容法の適用を確証する、遺伝子、タンパク質及び細胞経路に関するin vitroの結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】2、9、16又は23日間の脂肪生成分化培地に保持され、上記の分化培地で最後の48時間に非発熱条件下で交流のパルスで処置された群の各々に存在する脂肪酸の量について得られた結果を示す。前記量は、オイルレッドOで染色し、510nmの吸光度を測定することによって決定する。この図のデータは、対応する分化した対照群の小数として表される。縦軸(y軸)は510nmの吸光度を示し、横軸(x軸)は群、すなわち脂肪組織由来の幹細胞の培養物が脂肪生成分化培地中にあった日数を示す。この図及び以下の図において、アスタリスクは、処置されたサンプル及びそれぞれの対照の間の差異におけるスチューデントのt検定を用いて計算された統計学的に有意なレベルを示す。*:0.01≦p<0.05;**:0.001≦p<0.01;***:p<0.001。
【図２】対照群(AD)及び処置群(AD+CRet)、並びに脂肪生成分化処置に供さなかった脂肪組織由来の幹細胞(ND)におけるPPAR-γタンパク質の発現について得られた結果を示す。図2Aにおいて、免疫ブロットは、負荷制御として用いられ、第一の行がPPAR-γタンパク質に対応し、第二の行がβ-アクチンタンパク質に対応して示される。図2Bは、図2Aで示された免疫ブロットのPPAR-γストリップでの濃度測定分析を示す。前記図2Bにおいて、結果は、2又は9日間にわたって分化した細胞対照群で観察されたPPAR-γストリップの濃度の小数として表されるように見える。図2Bにおいて、縦軸(y軸)は相対濃度(当該のタンパク質の発現量に比例)を示し、横軸(x軸)は結果が指す群を示す。図2A及び図2Bの両方において、最初の3つの列は、2日間にわたって分化させた(又は、ND群の場合は分化せずにこの期間培養を維持した)培養を指し、最後の3つの列は、9日間にわたって分化させた(又は、ND群の場合は分化せずにこの期間培養を維持した)培養を指す。
【図３】対照群(AD)及び処置群(AD+CRet)、並びに脂肪生成分化処置に供さなかった脂肪組織由来の幹細胞(ND)におけるp-MEKタンパク質の発現について得られた結果を示す。図3Aにおいて、免疫ブロットは、負荷制御として用いられ、第一の行がp-MEKタンパク質に対応し、第二の行がβ-アクチンタンパク質に対応して示される。図3Bは、図3Aで示された免疫ブロットのp-MEKストリップでの濃度測定分析を示す。前記図3Bにおいて、結果は、2又は9日間にわたって分化させた脂肪組織由来の幹細胞の培養の対照群で観察されたp-MEKストリップの濃度の小数として表されるように見える。図3Bにおいて、縦軸(y軸)は相対濃度(当該のタンパク質の発現量に比例)を示し、横軸(x軸)は結果が指す群を示す。図3A及び図3Bの両方において、最初の3つの列は、2日間にわたって分化させた(又は、ND群の場合は分化せずにこの期間培養を維持した)培養を指し、最後の3つの列は、9日間にわたって分化させた(又は、ND群の場合は分化せずにこの期間培養を維持した)培養を指す。
【図４】非発熱条件下の交流で処置した群及び9日間、分化させた脂肪組織由来の幹細胞の培養の対照群において、PPAR-γについて得られた免疫蛍光の結果を示す。黒の柱は分化させた対照群(AD)に対応し、水平線の入った柱は処置群(AD+CRet)に対応し、白の柱は脂肪生成分化処置に供さなかった脂肪組織由来の幹細胞(ND)に対応する。結果は、9日間、分化させた対照群で観察された量の小数として表されるように見える。縦軸(y軸)はPPAR-γ(PPAR-γ+)を発現する核の量の正規化を示し、横軸(x軸)は実験群を示す。
【図５】脂肪組織由来の幹細胞における脂肪生成分化法で観察されたPPARG1、PPARG2、FABP4、PLIN、ANGPTL4、SREBP1c、SCD及びFASN遺伝子の発現の差異を示す。全てのグラフにおいて、左から右へ、同じ柱構成に従っている:分化処置なしで2日、分化処置ありで2日、分化処置なしで9日、及び分化処置ありで9日。結果は、分化処置を2日間持続した脂肪組織由来の幹細胞の培養で観察された量の小数として表される。全てのグラフにおいて、縦軸(y軸)は対応するメッセンジャーRNAの相対的発現を示し、横軸(x軸)は群を示す。
【図６】対照群(脂肪生成分化に供した脂肪組織由来の幹細胞)及び処置群(脂肪生成分化に供し、非発熱条件下での交流で処置した脂肪組織由来の幹細胞)の間で観察されたPPARG1、PPARG2、FABP4、PLIN、ANGPTL4、SREBP1c、SCD及びFASN遺伝子の発現の差異を示す。全てのグラフにおいて、同じ柱の構成は、左から右へ、以下の通りである:交流処置なしで2日、交流処置ありで2日、交流処置なしで9日、及び交流処置ありで9日。結果は、交流処置なしで2日間、脂肪生成分化処置に供した脂肪組織由来の幹細胞の培養で観察された量の小数として表される。全てのグラフにおいて、縦軸(y軸)は対応するメッセンジャーRNAの相対的発現を示し、横軸(x軸)は群を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４１】
脂肪組織由来の幹細胞の入手と培養
脂肪組織由来の幹細胞を、健康なドナー、すなわち29から69歳の男女から外科的に得られた皮下脂肪組織から単離した。単離プロトコルは、既に先行技術で詳述されている(Hernandez-Bule, M.L.、Cell Physiol Biochem、2014年、34、1741〜1755頁)。簡潔に言えば、インフォームドコンセント用の並びにサンプルの収集及び処理用のプロトコルは、欧州連合における適切な倫理基準を満たし、Hospital Universitario Ramon y Cajalの臨床試験に対する倫理委員会によって評価、承認された。脂肪組織由来の幹細胞を、血管及び線維化組織の残部を取り除いた0.5〜1cm3に測定された脂肪の片から単離し、1〜2mm3に測定された断片に切断した。前記断片を、1mg/mlの濃度、37℃で40分間、コラゲナーゼA(Roche Applied Science社、Basel、Switzerland)で消化した。消化した組織を、P1000ピペットを用いて分離した。得られた細胞分散体を、300×gで5分間、遠心分離して、間質血管画分を単離した。得られた沈殿物又はペレットを、1%のグルタミン(Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)及び1%のペニシリンストレプトマイシン(Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)を補充した適切な培養培地(MesenPro-RSTM、Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)で再懸濁し、前記沈殿物に存在する細胞を、75cm2 Tの培養フラスコ(Falcon、Corning社、NY、USA)に播種した。4日間の培養後、培地を新しくし、3日後、細胞が集密したときに前記細胞を継代培養した。したがって、細胞を、ハンクス液中0.02%EDTA入り0.05%トリプシン(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)を用いて剥がし、新たな75cm2 Tの培養フラスコに670細胞/cm2の密度で播種した。
【００４２】
以下の実施例は全て、本実施例、第3から第7節に従って得られ、60mmのペトリ皿(Nunc、Roskilde、Denmark)で、2270細胞/cm2の密度で培養した細胞を用いた。
【実施例２】
【００４３】
脂肪組織由来の幹細胞の脂肪生成分化中の脂質含有量に対する、非発熱条件下での交流による処置の効果
先述したように、実施例1、第3から第7節に従って得られた脂肪組織由来の幹細胞を、60mmのペトリ皿(Nunc、Roskilde、Denmark)で、2270細胞/cm2の密度で培養した。
【００４４】
ペトリ皿での4日間の増殖後、培養を、10%のウシ胎仔血清(Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)、1%のグルタミン及び1%のペニシリンストレプトマイシン(Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)、濃度0.25mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX、Gibco、Invitrogen、Camarillo、CA、USA)、濃度200μMのインドメタシン(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)、濃度10μg/mlのインスリン(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)並びに濃度1μMのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)を補充したグルコース高含有のD-MEM(Biowhittaker、PA、USA)からなる脂肪生成分化培地でインキュベートした。培養を、所望の分化時間、2、9、16又は23日間、3〜4日毎に新たな培地に培地を交換しながらこの培地で維持した。培養を、脂肪生成分化処置の最後の48時間、交流(CRet)で処置、又は装置に接続させた電極の存在下で単にインキュベートした(交流を印加しない対照)。
【００４５】
用いられた前記CRet処置及びシステムは、先行技術で詳述されている(Hernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2010年、37、1399〜1405頁、及びHernandez-Bule, M.L.等、Int J Oncol、2007年、30、583〜592頁)。簡潔に言えば、交流への曝露又は交流による処置は、in vitro刺激を目的として設計された無菌ステンレス鋼の電極対を用いて実施した。前記電極は、CRet(交流)で処置した群、及び、先述したように、交流発生装置に接続された電極が電流を印加することなく単に配置された対照群に属するものの両方で、全てのペトリ皿(脂肪組織由来の幹細胞の培養を含有する)に収容した。電極により区切られた領域内に位置する矩形領域の培養細胞のみを、本研究で用いた(皿の残りの表面に位置する細胞は無視した)。
【００４６】
交流への曝露のため、電極対を直列で交流発生装置(Indiba Activ 902モデル、INDIBA(登録商標)社、Barcelona、Spain)に接続した。
【００４７】
先述したように、対照群において、電極対を皿にも挿入した。前記電極も、交流発生装置に接続したが、前記装置は作動させなかった。
【００４８】
交流に曝露又は交流で処置した群に対して、刺激パターンは、周波数0.448MHzで電流密度50μA/mm2の交流の5分パルスで、パルスの間は4時間の休止又は停止で分け、合計48時間となるように構成された。本方法は、電気的処置が非発熱条件下で印加されることを確実にする。
【００４９】
48時間の処置間隔の間、各々の処置群及び対応する対照群を、2つの同一のCO2インキュベータ(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、USA)に分けて、同時に培養した。処置パラメータ及びインキュベータ内の大気条件(温度37℃、相対湿度90%、CO2の分圧5%)は、絶えず監視した。インキュベータ内の電磁気環境は、目的の3つの周波数範囲、すなわち静電気、工業用周波数(50Hz及びその調波)並びに高周波に対して、特別な磁力計を用いて制御した。記録された値は、先行技術で報告されたものと一致し、研究室環境で典型的に見出されるフィールドレベルと対応していた。
【００５０】
先述したように、様々な群を、脂肪生成分化の分化時間、2、9、16又は23日間によって形成した。前記時間枠の各々に対して、ペトリ皿のセットを3つの群に分けた。これらの群のうち2つは分化させたが、そのうち1つは交流で処置し、もう1つは分化させた対照とした。残りの群は対応する時間間隔で分化しないまま継続した。交流による処置は、脂肪生成分化培地での培養物のインキュベーションの終了の48時間前、すなわちそれぞれ0、7、14及び21日から開始した。
【００５１】
上記の群の培養及び処置を実施したら、上に示したように、2、9、16又は23日間、脂肪生成分化培地でインキュベートした培養物により合成される脂肪酸の量を、分化培地の脂肪生成作用及び交流による処置に対する細胞応答を評価するために定量した。したがって、処置後(交流又は対照)、培養物をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、4℃で20分間、4%のパラホルムアルデヒドで固定した。次に、3分間、60%のイソプロパノールで処置することで細胞を透過処理し、次いで培養物を30分間、オイルレッドO(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)で染色した。
【００５２】
染色後、15の顕微鏡視野を各ペトリ皿でランダムに選択し、撮影した。
【００５３】
染色した脂肪酸を5分間、99%のイソプロパノール中でサンプルを撹拌することで抽出し、脂肪酸含有量を510nmの分光光度計で評価した。
【００５４】
図1は脂肪酸の定量化について得られた結果の概要を示す。初期又は中間の脂肪生成分化段階にある皮下脂肪組織由来の幹細胞の培養(2又は9日間、脂肪生成分化培地中で処置又はインキュベートした培養)において、培養における脂肪酸の蓄積の統計学的に有意な低減が観察される。対照的に、培養が脂肪生成分化の進行段階にある場合、実験的試験の最後には、非発熱電流により処置されたサンプルと対照との間に、統計学的に有意な差は検出されなかった。
【００５５】
結果として、得られた結果は、非発熱条件下での交流による処置が脂肪組織細胞の脂肪の蓄積を低減及び防止させることができることを示す。
【実施例３】
【００５６】
脂肪組織由来の幹細胞におけるPPAR-γ及びp-MEKのタンパク質発現に対する、非発熱条件下での交流による処置の効果
PPAR-γは、脂質の代謝及び脂肪細胞の分化において重要な役割を担う転写因子である。一方で、p-MEKは、PPAR-γと直接的に相互作用し、その不活性化及び細胞質への転位を引き起こすタンパク質である。
【００５７】
電気的処置の作用を、上記の2つのタンパク質の発現及び局在性において研究するために、以下の工程を行った。
【００５８】
実施例1、第3から第7節に従って得られた脂肪組織由来の幹細胞を、60mmのペトリ皿(Nunc、Roskilde、Denmark)で、2270細胞/cm2の密度で培養し、上記のプロトコルに従って、2又は9日間、脂肪生成分化培地でインキュベートして、培養の最後の48時間、交流で処置し、又は培養若しくは対照群として処置した。
【００５９】
次に、2つの電極により区切られた皿の表面に存在する細胞を、リン酸緩衝食塩水中で採取し、1200rpmで5分間、遠心分離した。沈殿物又はペレットを、4℃で45分間、濃度10mMのTris-HCl、濃度10mMのKCl、濃度1mMのジチオスレイトール、濃度1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、濃度1mMのフェニルメチルフルオロスルホニル(PMFS)、濃度10μg/mlのロイペプチン、濃度5μg/mlのペプスタチン、濃度100mMのNaF、濃度20mMのβ-グリセロリン酸、濃度20mMのモリブデン酸ナトリウム、0.5%のTriton X-100及び0.1%のSDSを含有する緩衝液での処置によって溶解させた。溶解物を12,000×gで15分間、4℃で遠心分離して、上澄みのタンパク質濃度は、タンパク質を定量するためのブラッドフォード比色法を用いて決定した(Bradford MM.、Anal Biochem、1976年、72、248〜254頁)。
【００６０】
得られて定量されたタンパク質を、1区域当たり30μgのタンパク質をローディングしたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)での電気泳動によって分離し、セミドライ式伝達の方法論(Bio-Rad社、Hercules、CA、USA)を用いて、Odyssey(登録商標)ニトロセルロースメンブレン(LI-COR Biosciences社、Nebraska、USA)に移した。メンブレンは、5%の無脂肪粉乳と共にリン酸緩衝食塩水を用いて遮断し、PPAR-γ81B8に対するウサギモノクローナル抗体(希釈率1:1000、Cell Signalling Technology社、Danvers、Massachusetts、USA)、p-MEK1/2に対するウサギmAbモノクローナル抗体(希釈率1:1000、Cell Signalling Technology社)、又はβ-アクチンに対するマウスモノクローナル抗体(希釈率1:5000、Sigma-Aldrich社)を負荷制御として用いて4℃で一晩インキュベートした。上記の抗体の希釈は、ブロッキングバッファー(リン酸緩衝食塩水中の0.1%のTween及び5%の無脂肪粉乳)で実施した。
【００６１】
PPAR-γに対する上記の抗体により、研究のための目的のPPAR-γの2つのアイソフォーム、すなわちPPAR-γ-1及びPPAR-γ-2を検出することができた。
【００６２】
対応する抗体でインキュベートした後、メンブレンを4回、リン酸緩衝食塩水-Tweenで洗浄し、次いで室温で1時間、IRDye 800CWコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体(希釈率1:10000、LI-COR Biosciences社、Nebraska、USA)、又は適当であればIRDye 680LTヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(希釈率1:15000、LI-COR Biosciences社、Nebraska、USA)とインキュベートした。ストリップの蛍光強度を、LI-COR Odysseyスキャナー(LI-COR Biosciences社、Nebraska、USA)で測定し、Bio-Rad Quantity Oneコンピューターアプリケーション、バージョン4.6.7(Bio-Rad社、Hercules、CA、USA)を用いて評価した。
【００６３】
図2に見られるように、交流による処置は脂肪生成分化培地で2日間インキュベートした細胞培養におけるPPAR-γの発現において効果を示していない。しかし、脂肪生成分化培地で9日間インキュベートし、上で説明したプロトコルに従って交流で処置した細胞培養におけるPPAR-γの量の低下が観察された。
【００６４】
加えて、図3はPPAR-γについて得られたものと一致する、p-MEKについて得られた結果を示す。この場合、脂肪生成分化の過程により、p-MEKタンパク質の発現の低減が誘導される。交流による処置は、脂肪生成分化培地で2日間、インキュベートした細胞培養でのp-MEKの発現を著しく変更しないが、9日間インキュベートした培養において、その発現の著しい増加が誘導される。
【実施例４】
【００６５】
脂肪組織由来の幹細胞におけるPPAR-γの細胞局在性に対する、非発熱条件下での交流による処置の効果
実施例1、第3から第5節に従って得られた脂肪組織由来の幹細胞を、標準的な密度でスライドカバーの上で培養し、9日間、脂肪生成分化条件下で保持して、最後の48時間、交流又は対照の処置に、どちらも上に示したように供した。
【００６６】
細胞を、4℃で20分間、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、-20℃で20分間、エタノール/酢酸(95/5)で透過処理した。次に、細胞を、PPAR-γに対するモノクローナル抗体(希釈率1:50、Santa Cruz Biotechnology社、TX、USA)を用いて4℃で一晩インキュベートし、Alexa Fluor 488(希釈率1:500、Molecular Probes、Life Technologies社、MA、USA)と組み合わせたマウス抗IgG抗体で室温で1時間、蛍光標識した。細胞核は、bisBenzimide H 33258で対比染色した。
【００６７】
得られた結果は図4にまとめる。PPAR-γの転位は核から細胞質へと観察された(図4において、非発熱条件下で交流により処置した培養において核のPPAR-γの免疫蛍光の低下を参照)。核から細胞質へのタンパク質の前記転位はその不活性化を示し、非発熱条件下での交流による処置が脂肪組織細胞における脂肪の蓄積を低減及び防止させることができることを実証する、先に示された全ての結果と一致する。
【実施例５】
【００６８】
脂肪組織由来の幹細胞の脂肪細胞分化に関与する様々な遺伝子の発現の調節に対する、非発熱条件下での交流による処置の効果
実施例1、第3から第7節に従って得られた脂肪組織由来の幹細胞を、60mmのペトリ皿(Nunc、Roskilde、Denmark)で、2270細胞/cm2の密度で培養し、最後の48時間の培養の間、交流又は見せかけの処置(対照群)に供するために、上記のプロトコルに従って、2又は9日間、脂肪生成分化培地でインキュベートした。
【００６９】
前記細胞の全リボ核酸(RNA)は、製造業者の推奨とプロトコルに従って、試薬TriReagent(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)を用いて抽出した。細胞を、1μlのグリコーゲン(20mg/ml、Sigma-Aldrich社、St Louis、MO、USA)を核酸の沈殿のための担体として含有する1mlの試薬TriReagentで均質化した。
【００７０】
500ngの全RNAを用いて、Primer Script RT(商標) Reagent Kit(TaKara(登録商標)社、滋賀、日本)を用いる逆転写により相補デオキシリボ核酸(DNAc)を生成した。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅は、SYBR Green I Masterキット及びLightCycler 480 II装置(Roche Applied Science社、Switzerland)を用いて実施した。最初の変性工程は95℃で5分間であり、95℃で10秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間での増幅サイクルが45回続いた。得られた融解曲線を評価し、反応の生成物を2%のアガロースゲルで分離し、最終的に臭化エチジウムで染色して単一の生成物の存在を確認した。全ての分析は3重で実施し、標的の遺伝子の相対量は、ΔCt法に従って(巨大リボソームタンパク質P0を成文化する)「ハウスキーピング」遺伝子RPLP0の発現に対して正規化した。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーは、table 1(表1)に示す。
【００７１】
【表１】
2018531114.tif 000003
【００７２】
得られた結果は図5及び図6にまとめる。
【００７３】
図5において、脂肪生成過程が進むと、以下の遺伝子の発現が増大することがわかる:PPARG1、PPARG2、FABP4、PLIN、ANGPTL4、SREBP1c、SCD及びFASN。
【００７４】
図6において、非発熱条件下での交流による処置が、脂肪生成分化培地で2日間インキュベートした細胞培養において分析された遺伝子のいずれの発現に対しても統計学的に有意な効果を発揮しないことがわかる。しかし、脂肪生成分化培地で9日間インキュベートし、先に説明したプロトコルに従って交流で処置した細胞培養における遺伝子PPARG1、PLIN、ANGPTL4及びFASNの発現の低減が観察される。統計学的に有意な変化は、残りの遺伝子では観察されなかった。得られた結果は、非発熱条件下での交流による処置が脂肪組織細胞における脂肪組織の蓄積を低減及び防止させることができることを実証する、先に示された全ての結果と一致する。
【００７５】
本発明は、その実施形態及び実施例を参照して提示及び記載されているが、前記実施形態及び実施例は本発明を限定せず、したがって、本明細書、特許請求の範囲及び図面に開示された主題を解釈した後、当業者にとって明確である多くの構成又は他の詳細が変化し得ることは理解される。したがって、全ての変形例及び均等物は、前記変形例及び均等物が以下の特許請求の範囲の最も広い範囲に含まれるとみなされ得る場合、本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
2018531114.tif 000004
【図２】
2018531114.tif 000005
【図３】
2018531114.tif 000006
【図４】
2018531114.tif 000007
【図５】
2018531114.tif 000008
【図６】
2018531114.tif 000009
【配列表】
2018531114000001.app
【国際調査報告】
2018531114.tif 000010
2018531114.tif 000011
2018531114.tif 000012
2018531114.tif 000013
2018531114.tif 000014
2018531114.tif 000015