(57)【要約】  ＤＮＡ試料の配列を決定する方法が開示される。ナノポアベースの配列決定装置が提供される。ナノポアベースの配列決定装置が、導電性層を含む。装置は、導電性層の上に配置された作用電極をさらに含む。装置は、作用電極の上に配置された側壁をさらに備え、側壁および作用電極が、電解質が収容され得るウェルを形成し、側壁の少なくとも上部が、フルオロポリマー材料によって形成される撥水性部分を含む。ＤＮＡ試料は、ナノポアベースの配列決定装置を使用して配列決定される。
2018533010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ試料の配列を決定する方法であって、
導電性層、
前記導電性層の上に配置された作用電極、および、
前記作用電極の上に配置された側壁であって、前記側壁および前記作用電極が、電解質が収容され得るウェルを形成し、前記側壁の少なくとも上部が、フルオロポリマー材料によって形成される撥水性部分を含む、
とを備える、ナノポアベースの配列決定装置を提供するステップ、ならびに、
前記ナノポアベースの配列決定装置を使用してＤＮＡ試料を配列決定するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記フルオロポリマー材料が、ＣｙｔｏｐおよびＴｅｆｌｏｎからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分の厚さが、約１０オングストロームと約１００マイクロメートルの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル上の上側水平撥水性表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル内側の垂直撥水性表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記側壁の少なくとも下部が、誘電体層を含み、前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記誘電体層の上に配置された、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フルオロポリマー材料によって形成された前記撥水性部分および前記誘電体層を合わせた厚さが、１から１０マイクロメートルの間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記誘電体層が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）材料を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記作用電極が、まばらに間隔をあけられた窒化チタン（ＴｉＮ）柱状構造を有するスポンジ状で多孔質なＴｉＮ作用電極を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記側壁が、
前記ウェルの下部を囲む部分、および、
前記ウェルの上部を囲む部分、
を含み、
前記ウェルの前記上部を囲む前記部分が、前記ウェルの前記下部の上の張出部を形成し、前記張出部が、フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
導電性層、
前記導電性層の上に配置された作用電極、および、
前記作用電極の上に配置された側壁、
を備え、
前記側壁および前記作用電極が、電解質が収容され得るウェルを形成し、前記側壁の少なくとも上部が、フルオロポリマー材料によって形成される撥水性部分を含む、ナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１２】
前記フルオロポリマー材料が、ＣｙｔｏｐおよびＴｅｆｌｏｎからなる群から選択される、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１３】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分の厚さが、約１０オングストロームと約１００マイクロメートルの間である、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１４】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル上の上側水平撥水性表面を含む、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１５】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル内側の垂直撥水性表面を含む、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１６】
前記側壁の少なくとも下部が、誘電体層を含み、前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記誘電体層の上に配置された、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１７】
前記フルオロポリマー材料によって形成された前記撥水性部分および前記誘電体層を合わせた厚さが、１から１０マイクロメートルの間である、請求項１６に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１８】
前記誘電体層が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）材料を含む、請求項１６に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項１９】
前記作用電極が、まばらに間隔を空けられたチタン窒化物（ＴｉＮ）柱状構造を有するスポンジ状で多孔質なＴｉＮ作用電極を含む、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項２０】
前記側壁が、
前記ウェルの下部を囲む部分、および、
前記ウェルの上部を囲む部分、
を含み、
前記ウェルの前記上部を囲む前記部分が、前記ウェルの前記下部の上の張出部を形成し、前記張出部が、フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分を含む、請求項１１に記載のナノポアベースの配列決定装置。
【請求項２１】
ナノポアベースの配列決定装置を構成する方法であって、
導電性層を構成するステップ、
前記導電性層の上に配置された作用電極を構成するステップ、および、
前記作用電極の上に配置された側壁を構成するステップ、
を含み、
前記側壁および前記作用電極が、電解質が収容され得るウェルを形成し、前記側壁の少なくとも上部が、フルオロポリマー材料によって形成される撥水性部分を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記フルオロポリマー材料が、ＣｙｔｏｐおよびＴｅｆｌｏｎからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分の厚さが、約１０オングストロームと約１００マイクロメートルの間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル上の上側水平撥水性表面を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記ウェル全体に及ぶ脂質二重層の形成を支援する前記ウェル内側の垂直撥水性表面を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記側壁の少なくとも下部が、誘電体層を含み、前記フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分が、前記誘電体層の上に配置された、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記フルオロポリマー材料によって形成された前記撥水性部分および前記誘電体層を合わせた厚さが、１から１０マイクロメートルの間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記誘電体層が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）材料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記作用電極が、まばらに間隔をあけられた窒化チタン（ＴｉＮ）柱状構造を有するスポンジ状で多孔質なＴｉＮ作用電極を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記側壁が、
前記ウェルの下部を囲む部分、および、
前記ウェルの上部を囲む部分、
を含み、
前記ウェルの前記上部を囲む前記部分が、前記ウェルの前記下部の上の張出部を形成し、前記張出部が、フルオロポリマー材料よって形成された前記撥水性部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、「ＵＳＥ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＯＰＯＬＹＭＥＲＳ  ＡＳ  Ａ  ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＦＩＬＭ  ＴＯ  ＳＵＰＰＯＲＴ  ＬＩＰＩＤ  ＢＩＬＡＹＥＲ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＢＡＳＥＤ  ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（ナノポアベースのＤＮＡ配列決定のための脂質二重層形成を支援するための撥水性膜としてのフルオロポリマーの使用）」と題する、２０１５年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／２４４，６８０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]近年の半導体産業における超小型化の進歩によって、生物工学者は、従来の大きな検知ツールをますます小さいフォームファクタに、いわゆるバイオチップ上にパッケージングすることを始められるようになった。バイオチップをより丈夫に、効率的に、かつ費用効果の高いものにする技術を開発することが、望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0003]本発明の各種実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面において開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】[0004] 図１は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す図である。
【図２】[0005] 図２は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す図である。
【図３】[0006] 図３は、予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す図である。
【図４】[0007] 図４は、予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す図である。
【図５】[0008] 図５は、脂質二重層の形成を支援するフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル５００のある実施形態の断面図である。
【図６】[0009] 図６は、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のウェルの複数の円形開口６０２の上面図である。
【図７−１】[0010] 図７Ａ〜図７Ｄは、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層と、増大された電気化学的キャパシタンスを有するＴｉＮ作用電極とを備える、ナノポアベースの配列決定チップの非ファラデー性電気化学的セルを構成するための、プロセス７００の実施形態のステップである。
【図７−２】図７Ｅ〜図７Ｈは、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層と、増大された電気化学的キャパシタンスを有するＴｉＮ作用電極とを備える、ナノポアベースの配列決定チップの非ファラデー性電気化学的セルを構成するための、プロセス７００の実施形態のステップである。
【図８】[0011] 図８は、金属層８０４上に堆積されたスポンジ状で多孔質のＴｉＮ層８０２の断面図である。
【図９】[0012] 図９は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル９００の断面写真である。
【図１０】[0013] 図１０は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１０００の別の実施形態の断面図である。
【図１１】[0014] 図１１は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１１００の別の実施形態の断面図である。
【図１２】[0015] 図１２は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１２００の別の実施形態の断面図である。
【図１３】[0016] 図１３は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１３００の別の実施形態の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
[0017]本発明は、多数の方法で実装可能であり、多数の方法は、プロセス、装置、システム、組成物、コンピュータ可読記憶媒体上で具現化されるコンピュータプログラム製品、および／または、プロセッサ、例えばプロセッサに結合されたメモリに記憶されるおよび／またはメモリによって提供される命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。この明細書では、これらの実施態様または本発明がとり得る他の任意の形は、技術と称されることがある。一般に、開示されたプロセスのステップの順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。別途記載されていない限り、タスクを実行するように構成されたものとして記載されるプロセッサまたはメモリのような構成要素は、そのタスクを所定の時間に実行するように一時的に構成される一般的な構成要素またはそのタスクを実行するために製造された特定の構成要素として実装されてもよい。本明細書において、「プロセッサ」という用語は、データ、例えばコンピュータプログラム命令を処理するように構成された１つまたは複数の装置、回路および／または処理コアを意味する。
【０００６】
[0018]以下、本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細な説明が、本発明の原理を示す添付の図面とともに提供される。本発明は、この種の実施形態に関連して記載されているが、本発明は、任意の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は、多数の代替物、変更物および均等物を包含する。
多数の具体的な詳細は、以下の説明に記載され、本発明の完全な理解を提供する。これらの詳細は、例のために提供され、本発明は、これらの具体的な詳細の一部または全部を用いずに特許請求の範囲に従って実施され得る。明確性のために、本発明に関連する技術分野において公知である技術的な材料は、本発明が不必要に不明瞭にならないように詳述されていない。
【０００７】
[0019]内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において見込みを示してきた。電位が導電性流体に浸漬されたナノポア全体に印加されたとき、ナノポアを通過するイオンの伝導に起因するわずかなイオン電流が観察可能である。電流の量は、ポアサイズに影響される。
【０００８】
[0020]ナノポアベースの配列決定チップは、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列決定のために用いられてもよい。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。
【０００９】
[0021]図１は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す。膜１０２は、セルの表面にわたって形成される。いくつかの実施形態では、膜１０２は、脂質二重層である。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質１１４は、セルの表面上に直接配置される。ある実施形態では、単一のＰＮＴＭＣ１０４は、電気穿孔法によって膜１０２内に挿入される。アレイ内の個々の膜は、化学的にも電気的にも互いに接続されていない。それゆえ、アレイ内の各セルは、独立した配列決定機械であり、ＰＮＴＭＣと結合した単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物上で作用し、そうでなければ不透過性の二重層を介してイオン電流を調節する。
【００１０】
[0022]図１を続けて参照すると、アナログ測定回路１１２は、ある体積の電解質１０８によって覆われた作用電極１１０に接続されている。その体積の電解質１０８は、イオン不浸透性膜１０２によって、バルク電解質１１４から分離される。ＰＮＴＭＣ１０４は、膜１０２を横切り、イオン電流がバルク液体から作用電極１１０へと流れるための唯一の経路を提供する。セルは、バルク電解質１１４と電気的に接している対電極（ＣＥ）１１６も含む。セルは、参照電極１１７も含み得る。ある実施形態では、作用電極１１０は、金属電極である。別の実施形態では、電極は、導電性の材料を含む。
【００１１】
[0023]いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されるべき鋳型２０２およびプライマーは、セル２００に導入される。この鋳型−プライマー複合体に対して、異なってタグ付けされた４つのヌクレオチド２０８は、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ２０４と複合体を形成すると、タグの尾部は、ナノポア２０６の筒内に位置決めされる。ナノポア２０６の筒内に保たれるタグは、固有のイオン遮断信号２１０を生成し、それにより、付加された塩基を、タグの異なる化学構造により電子的に同定する。
【００１２】
[0024]図３は、予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す。ナノポア３０１は、膜３０２内に形成されるか、または挿入されている。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）は、ナノポアと結合している。いくつかの場合では、ポリメラーゼ３０３は、ナノポア３０１に共有結合している。ポリメラーゼ３０３は、配列決定されるべき核酸分子３０４と結合している。いくつかの実施形態では、核酸分子３０４は環状である。いくつかの場合では、核酸分子３０４は線状である。いくつかの実施形態では、核酸プライマー３０５は、核酸分子３０４の一部にハイブリダイズされている。ポリメラーゼ３０３は、ヌクレオチド３０６のプライマー３０５上への、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として用いる取込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、タグ種（「タグ」）３０７を備える。
【００１３】
[0025]図４は、予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す。段階Ａは、図３において説明したような構成要素を示す。段階Ｃは、ナノポア内に装填されるタグを示す。「装填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１０，０００ｍｓの間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグでもよい。いくつかの場合では、予め装填されるタグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、タグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高い、例えば９０％から９９％である場合、タグは予め装填される。
【００１４】
[0026]段階Ａにおいて、タグ付けされたヌクレオチド（４つの異なるタイプ：Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つ）は、ポリメラーゼと結合していない。段階Ｂにおいて、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと結合している。段階Ｃにおいて、ポリメラーゼは、ナノポアにドッキングする。タグは、ドッキングの間、電気的な力、例えば、膜および／またはナノポア全体に印加される電圧により発生させた電界の存在下で発生する力によってナノポア内に引き込まれる。
【００１５】
[0027]結合したタグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子と塩基対合しない。これらの塩基対合しなかったヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合しなかったヌクレオチドは、一時的にのみポリメラーゼと結合するので、図４に示すプロセス４００は、典型的には、段階Ｄを越えて進行しない。例えば、対合しなかったヌクレオチドは、段階Ｂにおいて、または、プロセスが段階Ｃに入った少し後に、ポリメラーゼによって拒絶される。
【００１６】
[0028]ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアのコンダクタンスは、約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）である。段階Ｃにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。特に、タグがナノポア内に保たれるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、図２の信号２１０を参照）は、タグの異なる化学構造により生成され、それにより、付加された塩基を電子的に同定する。サイクル（すなわち、段階ＡからＥまたは段階ＡからＦ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能になる。段階Ｄにおいて、放出されたタグは、ナノポアを通過する。
【００１７】
[0029]いくつかの場合では、図４の段階Ｆに見られるように、成長している核酸分子内に組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過することになる。組み込まれていないヌクレオチドは、いくつかの例では、ナノポアによって検出され得るが、その方法は、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれなかったヌクレオチドとを、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて区別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され、一方、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出される。
【００１８】
[0030]図１に示すように、脂質二重層は、セルの表面にわたって形成される。具体的には、セルの各々は、その底部に電極を有するセンサウェルを含み、脂質二重層は、センサウェル上を覆って形成される。センサウェル上を覆う脂質二重層の形成を支援するために、撥水性であるウェル間の表面が望ましい。撥水性表面を形成する１つの技術は、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）膜のシラン処理による。本出願においては、フルオロポリマーが、撥水性層を形成するために使用され、ナノポアベースのＤＮＡ配列決定のための脂質二重層形成を支援する。フルオロポリマーは、複数の強い炭素−フッ素結合を有するフッ化炭素ベースの重合体である。撥水性層を形成するために使用可能なフルオロポリマーの例は、それだけに限定されないが、Ｃｙｔｏｐ（商標）およびＴｅｆｌｏｎ（商標）ＡＦを含む。Ｃｙｔｏｐ（商標）およびＴｅｆｌｏｎ（商標）ＡＦは、以下、それぞれＣｙｔｏｐおよびＴｅｆｌｏｎと呼ぶこととする。ある態様では、フルオロポリマーベースの撥水性層（例えば、図５のフルオロポリマー層５２０、図７のフルオロポリマー層７２０Ａまたは７２０、図９のフルオロポリマー撥水性側壁９２０、図１０のフルオロポリマー層１０２０、図１１のフルオロポリマー層１１２２、図１２のフルオロポリマー撥水性層１２２０、または図１３のフルオロポリマー層１３２０）は、適切な厚さを有する。ある実施形態では、本撥水性層の厚さは、異なる測定の単位で示され、単位は、それだけには限らないが、オングストローム（Å）、ナノメートル（ｎｍ）、またはマイクロメートルを含む。ある他の実施形態では、撥水性層は、（ｉ）約１０Åと約２０マイクロメートルとの間、（ｉｉ）約３０Åと約１０マイクロメートルとの間、（ｉｉｉ）約４０Åと約７マイクロメートルとの間、（ｉｖ）約５０Åと約５マイクロメートルとの間、（ｖ）約６０Åと約３マイクロメートルとの間、または（ｖｉ）約８０Åと約１マイクロメートルとの間である。他の実施形態では、撥水性層は、約１０Å、約２０Å、約３０Å、約４０Å、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、または約１００Åである。追加の実施形態では、厚さは、約０．２マイクロメートルと約１００マイクロメートルとの間である。ある実施形態では、厚さは、約０．２マイクロメートル、約０．３マイクロメートル、約０．４マイクロメートル、約０．５マイクロメートル、約０．６マイクロメートル、約０．７マイクロメートル、約０．８マイクロメートル、約０．９マイクロメートル、約１マイクロメートル、約２マイクロメートル、約３マイクロメートル、約４マイクロメートル、約５マイクロメートル、約６マイクロメートル、約７マイクロメートル、約８マイクロメートル、約９マイクロメートル、約１０マイクロメートル、約１５マイクロメートル、約２０マイクロメートル、約２５マイクロメートル、約３０マイクロメートル、約３５マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約４５マイクロメートル、約５０マイクロメートル、約５５マイクロメートル、約６０マイクロメートル、約６５マイクロメートル、約７０マイクロメートル、約７５マイクロメートル、約８０マイクロメートル、約８５マイクロメートル、約９０マイクロメートル、約９５マイクロメートル、または約１００マイクロメートルである。他の実施形態では、厚さは、（ｉ）約０．５ｎｍと約１０００ｎｍとの間、または（ｉｉ）約１ｎｍと約１００ｎｍとの間である。別の実施形態では、フルオロポリマー層の厚さは、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約１．５ｎｍ、約２ｎｍ、約２．５ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍである。
【００１９】
[0031]図５は、脂質二重層の形成を支援するフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル５００のある実施形態の断面図を示す。セル５００は、側壁５０９および底部を有するウェル５０５を含む。ウェル５０５の底部は、作用電極５０２を備える。ウェル５０５は、作用電極５０２の覆いのない部分上の開口を有する。いくつかの実施形態では、作用電極の覆いのない部分上の開口は、円形または八角形である。図６は、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のウェルの複数の円形開口６０２の上面図を示す。いくつかの実施形態では、ウェル５０５は、約１アトリットルと約１ナノリットルとの間の体積を収容し得る（含む、または含み得る）。
【００２０】
[0032]いくつかの実施形態では、作用電極５０２は、金属電極である。いくつかの実施形態では、作用電極５０２は、円形または八角形であり、誘電体層５０４は、作用電極５０２を囲む壁を形成する。非ファラデー性伝導のために、作用電極５０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金などの金属、窒化チタン、およびグラファイトで形成され得る。例えば、作用電極５０２は、白金を電気めっきした白金電極であってもよい。別の例では、作用電極５０２は、窒化チタン（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。ＴｉＮ作用電極に関連付けられる電気化学的キャパシタンスは、個別の電極表面積を最大化することによって、増大し得る。個別の作用電極５０２の表面積は、重量単位毎（例えば、ｍ２／ｋｇ）または体積単位毎（例えば、ｍ２／ｍ３またはｍ−１）または底部面積毎（例えば、ｍ２／ｍ２）の電極表面の総面積である。表面積が増加するので、作用電極の電気化学的キャパシタンスが増加し、コンデンサが充電済みになる前、より多くのイオンが、同一の印加電位により変位される。作用電極５０２の表面積は、ＴｉＮ電極を「スポンジ状」または多孔質にすることで、まばらに間隔をあけられたＴｉＮの柱状構造によって、増大され得る。
【００２１】
[0033]作用電極５０２は、上面および底面を有する。作用電極５０２の上面は、ウェル５０５の底部を構成し、一方、作用電極５０２の底面は、導電性または金属層５０３と接触している。導電性層５０３は、セル５００をナノポアベースの配列決定チップの残りの部分に接続する。いくつかの実施形態では、導電性層５０３は、ＣＭＯＳ基盤５０１上にある。
【００２２】
[0034]いくつかの実施形態では、誘電体層５０４は、作用電極５０２を囲む壁を形成する。いくつかの実施形態では、ウェル５０５の側壁５０９は、誘電体層５０４の上にある。本発明で使用するのに適した誘電体材料（例えば、図５では誘電体層５０４、図１０では誘電体層１００７で示すように）は、それだけには限らないが、磁器（セラミック）、ガラス、マイカ、プラスチック、酸化物、窒化物（一窒化ケイ素すなわちＳｉＮ、および窒化ケイ素すなわちＳｉ３Ｎ４）、酸窒化ケイ素、金属酸化物、金属窒化物、金属ケイ酸塩、遷移金属酸化物、遷移金属窒化物、遷移金属ケイ酸塩、金属酸窒化物、金属アルミン酸塩、ケイ酸ジルコニウム、アルミン酸ジルコニウム、酸化ハフニウム、絶縁材料（例えば、重合体、エポキシ、フォトレジスト、など）、またはそれらの組合せを含む。当業者には、他の誘電体材料が、本発明での使用に適していることが理解されよう。
【００２３】
[0035]ウェル５０５は、作用電極５０２上のある体積の塩類溶液５０６をさらに含む。一般に、セル５００の異なる溶液（例えば、塩類溶液５０６またはバルク電解質５０８）は、オスモライトを含む。本明細書で使用する場合、用語「オスモライト」は、溶液内に溶かされるとき、その溶液の浸透圧モル濃度を増大させる任意の可溶性化合物を示す。本発明で使用されるオスモライトは、それだけには限らないが、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）などのイオン塩類と、グリセロール、エリトリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンニサイドマンニトール、グリコシルグリセロール、ブドウ糖、フルクトース、蔗糖、トレハロース、およびイソフルオロサイドなどの多価アルコールと砂糖と、デキストラン、レバン、およびポリエチレングリコールなどの重合体と、グリシン、アラニン、アルファ−アラニン、アルギニン、プロリン、タウリン、ベタイン、オクトピン、グルタミン酸塩、サルコシン、ｙ−アミノ酪酸、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（「ＴＭＡＯ」）などのいくつかのアミノ酸とそれらの派生物とを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＦｉｓｈｅｒらのＵ．Ｓ．２０１１００５３７９５をさらに参照のこと）。
【００２４】
[0036]セル５００は、バルク電解質５０８に電気的に接する対電極（ＣＥ）を含む。セル５００は、参照電極５１２を任意選択で含み得る。いくつかの実施形態では、対電極５１０は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルのすべてに共通である。
【００２５】
[0037]図５に示すように、膜は、ウェル５０５の側壁５０９の上面の上に形成され、ウェル５０５全体に及ぶ。例えば、膜は、側壁５０９の上に形成された脂質単一層５１８を含む。膜がウェル５０５の開口に達したとき、脂質単一層は、ウェルの開口全体に及ぶ脂質二重層５１４に遷移する。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質５０８は、ウェル上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ／ナノポア５１６は、脂質二重層５１４内に挿入される。ある実施形態では、二重層内への挿入は、電気穿孔法による。ナノポア５１６は、脂質二重層５１４を横切り、バルク電解質５０８から作用電極５０２へのイオン電流のための唯一の経路を提供する。電解液は、ウェル５０５の内側、すなわちトランス側（塩類溶液５０６を参照のこと）、およびかなりさらに大きい外部貯蔵部５２２、すなわち、シス側（バルク電解質５０８を参照のこと）の両方に存在する。外部貯蔵部５２２内のバルク電解質５０８は、ナノポアベースの配列決定チップの複数のウェルの上にある。脂質二重層５１４は、ウェル５０５を覆って延在し、単一層が側壁５０９の上面に付着された所で脂質単一層５１８に遷移する。この形状は、電気的かつ物理的にウェル５０５を封止し、ウェルをより大きい外部貯蔵部から分離する。水および溶存ガスなどの中性分子は、脂質二重層５１４を通過し得るのに対して、イオンは通過し得ない。脂質二重層５１４内のナノポア５１６は、イオンが、ウェル５０５の内外に伝導される単一の経路を提供する。
【００２６】
[0038]核酸配列決定のために、ポリメラーゼがナノポア５１６に付着される。核酸の鋳型（例えば、ＤＮＡ）は、ポリメラーゼによって保持される。例えば、ポリメラーゼは、鋳型に対して相補的なモノヌクレオチド六リン酸（ＨＭＮ）を溶液から取り込むことによって、ＤＮＡを合成する。固有で重合体のタグが、各ＨＭＮに取り付けられる。取込みの間、タグは、対電極５１０と作用電極５０２との間の電圧により生み出される電界の勾配の支援のもと、ナノポアに装填される。タグは、ナノポア５１６を部分的に閉塞させ、ナノポア５１６を通過するイオン電流での測定可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、交流（ＡＣ）バイアスまたは直流（ＤＣ）電圧が、電極間に印加される。
【００２７】
[0039]センサウェル上の脂質二重層の形成を支援するために、側壁５０９は、フルオロポリマー層５２０を備える。フルオロポリマーは、複数の強い炭素−フッ素結合を有するフッ化炭素ベースの重合体である。撥水性層を形成するために使用され得るフルオロポリマーの例は、それだけに限定されないが、Ｃｙｔｏｐ（商標）、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）ＡＦを含む。
【００２８】
[0040]フルオロポリマー層５２０は、撥水性の上面および垂直面を提供し、膜の密着性（例えば、ナノポアを備える脂質二重層）および脂質単一層から脂質二重層への膜の遷移を支援する。セル５００上の膜は、フルオロポリマー層５２０の上面の上に形成された脂質単一層５１８を含む。膜がウェル５０５の開口に達したとき、脂質単一層は、ウェルの開口全体に及ぶ脂質二重層５１４に遷移する。脂質単一層５１８はまた、フルオロポリマー層５２０の垂直面のすべてまたは一部である側壁５０９の垂直面のすべてまたは一部に沿って延在してもよい。
【００２９】
[0041]フルオロポリマー層５２０は、作用電極５０２が、底部に配置されているウェル５０５を囲む側壁５０９を形成する。いくつかの実施形態では、フルオロポリマー層５２０は、１マイクロメートルと１０マイクロメートルとの間の厚さを有する。いくつかの実施形態では、側壁５０９の底部は、薄い保護層５０７を備える。ある例では、保護層５０７は、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）を使用して形成される。ある態様では、本発明は、作用電極上に堆積された保護層（例えば、図５の保護層５０７、または図７の保護層７０７）を提供する。ある実施形態では、保護層は、フルオロポリマー層と作用電極との間に存在する。ある他の実施形態では、保護層は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む。別の実施形態では、保護層は、適切な厚さを有する。他の実施形態では、本保護層の厚さは、異なる測定の単位で示され、単位は、それだけには限らないが、オングストローム（Å）、ナノメートル（ｎｍ）、またはマイクロメートルを含む。ある他の実施形態では、保護層は、（ｉ）約１０Åと約２０マイクロメートルとの間、（ｉｉ）約３０Åと約１０マイクロメートルとの間、（ｉｉｉ）約４０Åと約７マイクロメートルとの間、（ｉｖ）約５０Åと５マイクロメートルとの間、（ｖ）約６０Åと約３マイクロメートルとの間、（ｖｉ）約８０Åと約１マイクロメートルとの間、または（ｖｉｉ）約１０Åと約３００Åとの間である。他の実施形態では、保護層は、約１０Å、約２０Å、約３０Å、約４０Å、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、約１００Å、約２００Å、約３００Å、約４００Å、約５００Å、約６００Å、約７００Å、約８００Å、約９００Å、または約１０００Åである。ある他の実施形態では、保護層の厚さは、約１０ｎｍと約１０００ｎｍとの間である。別の実施形態では、厚さは、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍである。追加の実施形態では、保護層の厚さは、約０．２マイクロメートルと約１００マイクロメートルとの間である。ある実施形態では、保護層の厚さは、約０．２マイクロメートル、約０．３マイクロメートル、約０．４マイクロメートル、約０．５マイクロメートル、約０．６マイクロメートル、約０．７マイクロメートル、約０．８マイクロメートル、約０．９マイクロメートル、約１マイクロメートル、約２マイクロメートル、約３マイクロメートル、約４マイクロメートル、約５マイクロメートル、約６マイクロメートル、約７マイクロメートル、約８マイクロメートル、約９マイクロメートル、約１０マイクロメートル、約２０マイクロメートル、約３０マイクロメートル、約３５マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約４５マイクロメートル、約５０マイクロメートル、約５５マイクロメートル、約６０マイクロメートル、約６５マイクロメートル、約７０マイクロメートル、約７５マイクロメートル、約８０マイクロメートル、約８５マイクロメートル、約９０マイクロメートル、約９５マイクロメートル、または約１００マイクロメートルである。
【００３０】
[0042]セル５００では、ウェル５０５の開口の基底面積（脂質二重層５１４の基底面積と同一である）および作用電極５０２の基底面積が、それぞれ側壁５０９および誘電体層５０４の寸法によって、決定される。作用電極５０２の基底面積は、ウェル５０５の開口の基底面積に対して、より大きい、または等しい。
【００３１】
[0043]図７Ａ〜７Ｈは、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層と、増大された電気化学的キャパシタンスを有するＴｉＮ作用電極とを備える、ナノポアベースの配列決定チップの非ファラデー性電気化学的セルを構成するための、プロセス７００の実施形態の多様なステップを示す。
【００３２】
[0044]ステップＡでは、誘電体７０４（例えば、ＳｉＯ２）の層が、導電性層７０３（例えば、Ｍ６）およびＣＭＯＳ基盤７０１の上に堆積される。導電性層７０３は、セルからチップの残部へ信号を送達する回路を含む。例えば、回路は、セルから積分コンデンサへ信号を送達する。いくつかの実施形態では、誘電体７０４の層は、導電性層７０３の上に約４０００Å（１オングストロームは１０−１０メートル）の厚さを有する。
【００３３】
[0045]ステップＢでは、誘電体７０４の層は、孔７０４Ｂを形成するためにエッチングされる。孔７０４Ｂは、導電性層７０３の上面を露出させ、スポンジ状で多孔質のＴｉＮ電極を成長させるための空間を提供する。
【００３４】
[0046]ステップＣでは、スポンジ状で多孔質のＴｉＮ層７０２Ａが、ステップＢで形成された孔７０４Ｂを充填するために堆積される。スポンジ状で多孔質のＴｉＮ電極７０２Ａは、電解質に接触可能な高い比表面積を提供する粗くまばらに間隔をあけられたＴｉＮ柱状構造またはＴｉＮ結晶の柱を形成するように成長、堆積される。スポンジ状で多孔質のＴｉＮ層７０２Ａの層は、原子層堆積、化学蒸着、物理蒸着（ＰＶＤ）スパッタリング堆積などの異なる堆積技術を使用して堆積され得る。例えば、層７０２Ａは、窒素を含む前駆体（例えば、ＮＨ３またはＮ２）と組み合わせてＴｉＣｌ４を使用した化学蒸着によって、堆積されてもよい。層７０２Ａはまた、チタンおよび窒素を含む前駆体（例えば、テトラキス−（ジメチルアミド）チタン（ＴＤＭＡＴ）またはテトラキス−（ジエチルアミド）チタンＴＤＥＡＴ）を組み合わせてＴｉＣｌ４を使用した化学蒸着によって、堆積されてもよい。層７０２Ａはまた、ＰＶＤスパッタリング堆積によって堆積され得る。例えば、チタンは、Ｎ２環境で反応性スパッタリングされても、またはＴｉＮターゲットから直接スパッタリングされてもよい。各々の堆積方法の条件は、まばらに間隔をあけられたＴｉＮ柱状構造またはＴｉＮ結晶の柱を堆積するように調整され得る。例えば、層７０２Ａが、チタン（Ｔｉ）ターゲットからＤＣ（直流）反応性マグネトロンスパッタリングによって堆積されるとき、堆積システムは、ＴｉＮが、より低速でより緩やかに堆積されＴｉＮ結晶の柱を形成することができるように、低温、低基板バイアス電圧（シリコン基板とＴｉターゲットとの間のＤＣ電圧）、および高圧力（例えば、２５ｍＴ）を使用するように調整され得る。いくつかの実施形態では、堆積される層７０２Ａの深さは、孔７０４Ｂの深さの約１．５倍である。堆積される層７０２Ａの深さは、５００オングストロームと３マイクロメートルとの間の厚さである。堆積される層７０２Ａの直径または幅は、２０ｎｍと１００マイクロメートルとの間である。図８は、金属層８０４上に堆積されたスポンジ状で多孔質のＴｉＮ層８０２の断面図を示す。図８に示すように、スポンジ状で多孔質のＴｉＮ層８０２は、ガラスのような柱状構造を含む。
【００３５】
[0047]図７Ｄを続けて参照すると、ステップＤでは、過剰なＴｉＮ層が除去される。例えば、過剰なＴｉＮ層は、化学機械研磨（ＣＭＰ技術）を使用して除去されてもよい。孔７０４Ｂ内に堆積された残りのＴｉＮは、スポンジ状の多孔質のＴｉＮ作用電極７０２を形成する。
【００３６】
[0048]ステップＥでは、作用電極７０２が形成された後、保護層７０７が、作用電極７０２および誘電体７０４の上に堆積される。ある例では、保護層７０７は、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）を使用して形成される。いくつかの実施形態では、適切な厚さ（本明細書で説明されるような）を有する保護層が形成される。ある他の実施形態では、保護層７０７は、約１０オングストロームと約５０マイクロメートルとの間の厚さを有する。
【００３７】
[0049]ステップＦでは、フルオロポリマー撥水性層７２０Ａ（例えば、Ｃｙｔｏｐ層）が、保護層７０７の上に堆積される。例えば、Ｃｙｔｏｐ層は、トラックを使用してスピン塗布される。いくつかの実施形態では、適切な厚さ（本明細書で説明されるような）を有するフルオロポリマー層７２０Ａが堆積される。ある実施形態では、フルオロポリマー層７２０Ａの厚さは、約０．５マイクロメートルと約６マイクロメートルとの間である。
【００３８】
[0050]ステップＧでは、フルオロポリマー層７２０Ａは、保護層７０７の上面の一部を露出させるウェル７０５を形成するためにエッチングされる。例えば、ウェルは、フッ素ベースのプラズマを使用してエッチングされ得る。
【００３９】
[0051]ステップＨでは、露出させられた保護層７０７の一部分が、作用電極７０２の上面の一部を露出させるためにエッチングされる。例えば、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）が使用され得る。いくつかの実施形態では、ウェル７０５の直径（ｄ１）は、２０ｎｍと１００マイクロメートルとの間である。
【００４０】
[0052]図９は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル９００の断面写真を示す。電気化学的セル９００は、導電性層９０３上の作用電極９０２を含む。電気化学的セル９００は、フルオロポリマー撥水性の側壁９２０および底部を有するウェル９０５を含む。ウェル９０５の底部は、作用電極９０２を備える。図９に示すように、フルオロポリマー側壁９２０の上面および垂直面ならびに作用電極９０２の上面は、試料調製材料によって覆われている。
【００４１】
[0053]図１０は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１０００の別の実施形態の断面図を示す。電気化学的セル１０００および電気化学的セル５００（図５を参照のこと）は、誘電体層５０４、ＣＭＯＳ５０１、導電性層５０３、作用電極５０２、塩類溶液５０６、側壁５０９、ウェル５０５、脂質単一層５１８、脂質二重層５１４、ナノポア５１６、バルク電解質５０８、対電極５１０、参照電極５１２、および外部貯蔵部５２２を含む同一の部品の番号を共有する（図５および１０で同一の数字によって示されるように）。
【００４２】
[0054]セル５００とセル１０００との間の１つの差は、側壁５０９の組成である。セル５００では、側壁５０９は、フルオロポリマー層５２０および側壁の基底部の薄い保護層５０７を備える。セル１０００では、フルオロポリマー撥水性層１０２０および誘電体層１００７が、ウェル５０５を囲む絶縁側壁５０９を共に形成する。特に、側壁５０９の上部は、フルオロポリマー撥水性層１０２０であり、側壁５０９の底部は、誘電体層１００７であるので、その結果、側壁５０９の下部垂直面は、親水性または撥水性の何れかであるが、一方、側壁５０９の上側水平面および側壁５０９の上部垂直面は、撥水性となる。ある実施形態では、誘電体層１００７は、一般に未処理の状態で親水性であるＳｉＯ２を含む。別の実施形態では、誘電体層１００７は、ウェル５０５の側壁を形成する面を含む。ある実施形態では、側壁面は、表面を本質的に撥水性にするように変更されたＳｉＯ２を含む。例えば、疎水基が、ウェル５０５の側壁を形成する表面上のＳｉＯ２に化学的に結合され得る。ある実施形態では、疎水基は、それだけには限らないが、アルキルまたはポリジメチルシロキサン鎖を含む。フルオロポリマー層１０２０によって提供される撥水性上面および撥水性垂直表面は、膜の密着性（例えば、ナノポアを備える脂質二重層）および脂質単一層から脂質二重層への膜の遷移を支援する。いくつかの実施形態では、フルオロポリマー層１０２０および誘電体層１００７を合わせた厚さが、適切な厚さ（本明細書で説明されるような）として提供される。ある実施形態では、フルオロポリマー層１０２０の厚さは、約１００ナノメートル（ｎｍ）と約１０マイクロメートルとの間である。いくつかの実施形態では、誘電体層１００７は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を使用して形成される。しかしながら、本明細書で説明されるように、他の材料が、誘電体層１００７を形成するために使用されてもよい。
【００４３】
[0055]図１１は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１１００の別の実施形態の断面図を示す。セル１１００は、より小さい基底面積を有する脂質二重層およびより大きい基底面積を有する作用電極を形成するための杯状ウェルへ開かれたより小さい開口を有する。ウェルへの開口の基底面積（脂質二重層の基底面積と同一である）および電解質へ露出させられた作用電極の上部基底面積が、互いに別々に調整され得る。
【００４４】
[0056]セル１１００は、導電性または金属層１１０１を含む。金属層１１０１は、セル１１００をナノポアベースの配列決定チップの残りの部分に接続する。いくつかの実施形態では、金属層１１０１は、金属６層（Ｍ６）である。セル１１００は、金属層１２０１より高い位置に作用電極１１０２および誘電体層１１０３をさらに含む。いくつかの実施形態では、作用電極１１０２の基底域は、円形または八角形であり、誘電体層１１０３は、作用電極１１０２を囲む壁を形成する。セル１１００は、作用電極１１０２より高い位置の誘電体層１１０４、および誘電体層１１０３をさらに含む。誘電体層１１０４は、ウェル１１０５の下部（１１０５Ａ）を囲む絶縁側壁を形成する。いくつかの実施形態では、誘電体層１１０３および誘電体層１１０４は共に、単体の誘電体を形成する。誘電体層１１０３は、作用電極１１０２に隣接して水平に堆積された部分であり、誘電体層１１０４は、作用電極より高い位置に堆積された部分である。いくつかの実施形態では、誘電体層１１０３および誘電体層１１０４は、誘電体の別体であり、それらは別々に成長され得る。誘電体層１１０３および１１０４を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、一窒化ケイ素（ＳｉＮ）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、その他を含む。
【００４５】
[0057]セル１１００は、誘電体層１１０４の上方に親水性層１１２０（例えば、窒化チタン、ＴｉＮ）および撥水性層１１２２をさらに含む。親水性層１１２０および撥水性層１１２２は共に、ウェル１１０５の上部（１１０５Ｂ）を囲む絶縁側壁を形成する。親水性層１１２０および撥水性層１１２２は共に、ウェル１１０５の下部（１１０５Ａ）の上方の張出部を形成する。あるいは、親水性層１１２０は、任意選択である。撥水性層１１２２は、ウェル１１０５の上部１１０５Ｂを囲む絶縁側壁を形成する。撥水性層１１２２は、ウェル１１０５の下部（１１０５Ａ）の上方の張出部を形成する。撥水性層１１２２は、ＣｙｔｏｐおよびＴｅｆｌｏｎなどのフルオロポリマーを用いて形成される。いくつかの実施形態では、撥水性層１１２２は、適切な厚さ（本明細書で説明されるような）を有する。別の実施形態では、撥水性層１１２２の厚さは、約１００オングストロームと２マイクロメートルとの間である。撥水性層１１２２と親水性層１１２０との間の境界部は、安定した脂質二重層の形成を支援する。脂質二重層は、撥水性層１１２２と親水性層１１２０との間の境界部で形成される。
【００４６】
[0058]ウェル１１０５の上部１１０５Ｂは、作用電極の上方に開口１１０５Ｃを有する。いくつかの実施形態では、作用電極の上方の開口１１０５Ｃは、円形であり、開口の基底面積は、π×（ｄ／２）２であって、ここでｄは開口の直径である。いくつかの実施形態では、作用電極の上方の開口１１０５Ｃは、八角形である。開口１１０５Ｃおよびウェル１１０５の上部１１０５Ｂの基底面積はそれぞれ、ウェル１１０５の下部１１０５Ａの底部基底面積より小さい。脂質二重層が、開口１１０５Ｃ全体に及ぶので、開口１１０５Ｃの基底面積の削減は、脂質二重層の基底面積の削減を、さらに脂質二重層に関連付けられるキャパシタンスの削減をもたらす。ウェル１１０５の下部１１０５Ａは、ウェル１１０５の上部１１０５Ｂの底部基底面積よりも大きな底部基底面積を有する大きな貯蔵部／杯形状を提供する。ウェル１１０５の下部１１０５Ａの底部基底面積の増大が、電解質／塩類溶液１１０６と直接接触する電極の上部基底面積を増大させ、それにより作用電極に関連付けられる電気化学的キャパシタンスを増大させる。
【００４７】
[0059]ウェル１１０５の内側では、塩類溶液／電解質１１０６が、作用電極１１０２の上に堆積される。塩類溶液１１０６は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つを含み得る。いくつかの実施形態では、塩類溶液１１０６は、約３マイクロメートル（μｍ）の厚さを有する。塩類溶液１１０６の厚さは、０から５マイクロメートルまでの範囲であり得る。
【００４８】
[0060]タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質１１０８は、ウェルの上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ／ナノポアは、電気穿孔法によって脂質二重層内に挿入される。ナノポアは、脂質二重層を横切り、バルク電解質１１０８から作用電極１１０２へのイオン電流のための唯一の経路を提供する。バルク電解質１１０８は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つをさらに含み得る。
【００４９】
[0061]セル１１００は、対電極（ＣＥ）１１１０を含む。セル１１００は、電気化学的電位センサとして役割を果たす参照電極１１１２をさらに含む。いくつかの実施形態では、対電極１１１０は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルのすべてに共通である。
【００５０】
[0062]いくつかの実施形態では、作用電極１１０２は、増大された電気化学的キャパシタンスを有する窒化チタン（ＴｉＮ）作用電極である。作用電極１１０２に関連付けられる電気化学的キャパシタンスは、個別の電極表面積を最大化することによって、増大し得る。個別の作用電極１１０２の表面積は、重量単位毎（例えば、ｍ２／ｋｇ）、体積単位毎（例えば、ｍ２／ｍ３またはｍ−１）、または底部面積毎（例えば、ｍ２／ｍ２）の電極表面の総面積である。表面積が増加するので、作用電極の電気化学的キャパシタンスが増加し、コンデンサが充電済みになる前、より多くのイオンが、同一の印加電位により変位される。作用電極１１０２の表面積は、ＴｉＮ電極を「スポンジ状」または多孔質にすることで、増大され得る。ＴｉＮスポンジは、電解質を吸収し、電解質と接触する大きな有効表面積を形成する。
【００５１】
[0063]図１２は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１２００の別の実施形態の断面図を示す。セル１２００は、増大された電流をセル内で供給可能なボウル状またはカップ状の作用電極を有する。セル１２００は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルのうちの１つである。
【００５２】
[0064]セル１２００と先に開示された他のセル（例えば、セル５００、セル１０００、およびセル１１００）との間の差の１つは、それらの作用電極の形状および構造である。セル５００、セル１０００、およびセル１１００内の作用電極は、ウェルの底部に配置された平坦な電極である。セル１２００の作用電極１２０２は、ボウル状の電極であり、それはまた、ふたのない箱状、カップ状、またはバケツ状でもあり得る。ボウル状作用電極１２０２は、底部に平坦部１２０２Ａを有し、ボウルの基底を形成する。基底域は、円形または八角形であり得る。ボウル状作用電極１２０２は、平坦部に垂直に（または平坦部からある角度で）、平坦部の周縁部に沿って延在する周壁１２０２Ｂをさらに含む。平坦部１２０２Ａの上面および周壁１２０２Ｂの内部表面の両方が、電解質１２０６に露出させられる電極表面域を提供する。周壁１２０２Ｂは、垂直のデバイスの場所、すなわち基板平面に直交する空間を活用する。平坦部１２０２Ａの幅（または直径）は、図１２の１２０３Ａによって示され、周壁１２０２Ｂの高さは、図１２の１２０３Ｂによって示される。いくつかの実施形態では、幅１２０３Ａは、１から１００マイクロメートルの間であり、高さ１２０３Ｂは、１００ｎｍから２０マイクロメートルの間である。ある実施形態では、幅１２０３Ａは、約５．５マイクロメートル、高さ１２０３Ｂは、約３．５マイクロメートルである。１２０３Ｂと１２０３Ａとの比は、作用電極１２０２のアスペクト比と呼ばれる。アスペクト比は、１未満または１より大であり得る。
【００５３】
[0065]作用電極１２０２は、セル１２００内で、平坦な作用電極と比較して、増大された電流を提供可能である。いくつかの実施形態では、セル１２００に提供可能な電流は、作用電極１２０２のアスペクト比を調整することによって調整され得る。
【００５４】
[0066]作用電極１２０２はまた、増大されたキャパシタンスを提供することができる。電極１２０２の平坦部１２０２Ａの上面および周壁１２０２Ｂの内部表面の両方が、電解質１２０６に露出させられる電極表面域を提供し、そのことにより、作用電極１２０２に関連付けられるキャパシタンスが増大する。
【００５５】
[0067]セル１２００では、フルオロポリマー撥水性層１２２０が、膜の密着性（例えば、ナノポアを備える脂質二重層）および脂質単一層から脂質二重層への膜の遷移を支援するための撥水性上面を提供する。セル１２００は、任意選択の誘電体層１２０４を含み得、フルオロポリマー層１２２０は、誘電体層１２０４上に配置される。いくつかの実施形態では、フルオロポリマー層１２２０および誘電体層１２０４を合わせた厚さは、１から１０マイクロメートルの間である。フルオロポリマー層１２２０の厚さは、１００ｎｍから１０マイクロメートルの間である。いくつかの実施形態では、誘電体層１２０４は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を使用して形成される。しかしながら、本明細書で説明されるように、他の材料が、誘電体層１２０４を形成するために使用されてもよい。
【００５６】
[0068]図１３は、脂質二重層の形成を支援するためのフルオロポリマー撥水性層を含むナノポアベースの配列決定チップ内の電気化学的セル１３００の別の実施形態の断面図を示す。電気化学的セル１３００および電気化学的セル５００（図５を参照のこと）は、誘電体層５０４、ＣＭＯＳ５０１、導電性層５０３、作用電極５０２、塩類溶液５０６、側壁５０９、ウェル５０５、脂質単一層５１８、脂質二重層５１４、ナノポア５１６、バルク電解質５０８、対電極５１０、参照電極５１２、および外部貯蔵部５２２を含む同一の部品の番号を共有する（図５および１３で同一の数字によって示されるように）。
【００５７】
[0069]セル５００とセル１３００との間の１つの差は、側壁５０９の組成である。セル５００では、側壁５０９は、フルオロポリマー層５２０および側壁の基底部の薄い保護層５０７を備える。セル１３００では、フルオロポリマー撥水性層１３２０および誘電体層１３０７が、ウェル５０５を囲む絶縁側壁５０９を共に形成する。特に、側壁５０９の上側水平面および側壁５０９の垂直面の上部は、フルオロポリマー撥水性層１３２０によって覆われ、側壁５０９の垂直面の下部は、誘電体層１３０７であり、その結果、側壁５０９の下部垂直面は、撥水性ではないが、一方、側壁５０９の上側水平面および側壁５０９の上部垂直面は、撥水性となる。フルオロポリマー層１３２０によって提供される撥水性上面および撥水性垂直表面は、膜の密着性（例えば、ナノポアを備える脂質二重層）および脂質単一層から脂質二重層への膜の遷移を支援する。フルオロポリマー層１３２０によって覆われた側壁５０９の上部垂直面の厚さは、１３２０Ａとして示される。誘電体面である側壁５０９の下部垂直面の厚さは、１３０７Ａとして示される。いくつかの実施形態では、１３２０Ａおよび１３０７Ａを合わせた厚さは、１から１０マイクロメートルの間である。側壁の上面の上のフルオロポリマーの厚さは、適切な厚さ（本明細書で説明されるような）で提供される。ある他の実施形態では、側壁の上面の上のフルオロポリマー層の厚さは、約１００ｎｍと約５０マイクロメートルとの間である。いくつかの実施形態では、誘電体層１３０７は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を使用して形成される。しかしながら、本明細書で説明されるように、他の材料が、誘電体層１３０７を形成するために使用されてもよい。
【００５８】
[0070]上述した実施形態は、理解の明確性のために多少詳細に記載されてきたが、本発明は、提供された詳細に限定されるものではない。本発明を実施する多くの代替の方法が存在する。開示された実施形態は、例示的であり限定的ではない。
【００５９】
[0071]各々の個別の出版物、特許、特許出願書類、および／または他の文書が、個別に示され、あらゆる目的で参照により組み込まれるように、本明細書で引用されたすべての出版物、特許、特許出願書類、および／または他の文書は、開示全体であらゆる目的で参照することにより、同様に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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