(57)【要約】  本発明は、ＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープと反応性がある免疫学的結合パートナー、およびＣ末端エピトープを検出し定量化するための免疫学的結合パートナーを使用したイムノアッセイの方法を提供する。本発明は、細胞外マトリックスの形成率を調べる方法、およびインスリン増感剤で治療するのに適した対象を確認するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープと反応性がある免疫学的結合パートナー。
【請求項２】
Ｃ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれる前記Ｃ末端エピトープと特異的に結合する、請求項１に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項３】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１または２に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項４】
前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長型である．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ−ＣＯＯＨを認識しないかまたはそれと特異的に結合しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項５】
伸長型アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する、アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性の比が、１に対して１０より大きい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項６】
前記Ｃ末端アミノ酸配列の切断型である．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ−ＣＯＯＨを認識しないかまたはそれと特異的に結合しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項７】
切断型アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する、アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性の比が、１に対して１０より大きい、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項８】
試料におけるＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープを検出するためのイムノアッセイの方法であって、前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープを含む試料と請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナーを接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの結合の量を決定するステップとを含む方法。
【請求項９】
前記Ｃ末端エピトープがＣ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生体液における前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの量を定量化するために使用される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体液が血清、血漿、尿または羊水である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記イムノアッセイが競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイがラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法によって決定した前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの量と前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの標準正常値を関連付けて、正常レベルからの変化を評価するステップをさらに含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞外マトリックスの形成率を調べる方法であって、生体液試料における請求項９で定義したエピトープを含むＶＩ型コラーゲンα３断片のレベルの測定値を得るために、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法によりアッセイを実施するステップを含む方法。
【請求項１６】
ＶＩ型コラーゲンα３断片の測定レベルを、同一試料におけるＶＩ型コラーゲンの分解のバイオマーカーの測定レベルと比較する指標を作成するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インスリン増感剤による治療に適した対象を同定するための方法であって、
ｉ）請求項１０の方法に従って、対象から得た生体液におけるＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープの量を定量化するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）により決定した上昇値とインスリン増感剤による治療に適した対象とを関連付けるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記インスリン増感剤がチアゾリジンジオンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ末端エピトープがＣ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップｉｉ）の上昇値が第２または第３の三分位値の範囲内の値に相当する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップｉｉ）の上昇値がＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの６．３ｎｇ／ｍＬ以上に相当する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
生物試料におけるＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープの量を決定するためのアッセイキットであって、本発明の免疫学的結合パートナー、および、以下の少なくとも１つ：
ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート
前記抗体と反応性があるペプチド、これは、ビオチニル化ペプチドであるビオチン−Ｌ−ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ（Ｌは任意選択のリンカー）であってよい
任意選択的に、サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するためのビオチニル化二次抗体
Ｃ末端配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨを含むキャリブレーターペプチド
抗体ＨＲＰ標識キット
抗体放射標識キット
アッセイ視覚化キット
を含む、アッセイキット。
【請求項２３】
前記Ｃ末端エピトープがＣ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれる、請求項２２に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ末端に存在するエピトープと結合する抗体、および前記エピトープを検出するイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉の量と機能は、年齢、一定範囲の病状、および不活動状態と共に、ならびにしばしばこの３つの組合せが原因で消失する。個体は５０歳から１年あたり１〜２％の骨格筋を消失すること（Ｈｕｇｈｅｓ）、筋肉量の２〜３％が不動状態中１週間あたりで消失し（Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、悪液質ではさらに急速に消失することが報告されている。高齢者または入院中個体における筋肉機能の障害は（併存）疾患状態および死亡率と関係がある（Ｃｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ）。先進国における人口の年齢の増大と共に、機能的自立の維持がそれ故ますます重要になっている。筋肉消失の診断法および管理法は、画像検査、例えば磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）および二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）に未だ依存している（Ｃｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ）。しかしながら、このような検査は、通常の臨床試験で使用するには高価または不便のいずれかである。クレアチニンおよび３−メチルヒスチジンなどの尿および血清バイオマーカーも、筋肉消失の管理を手助けするのに使用される。しかしながら、これらのアッセイの大きな変動性と低い確実性によって、それらの使用は制限される（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ  ２０１３）。要約すると、筋肉機能の診断および予後評価、ならびにアンチカタボリック治療の結果のモニタリングにおいて使用することができるバイオマーカーが早急に必要である（Ｓｈａｒｆ）。
【０００３】
筋肉量の消失は、筋肉細胞外タンパク質の不均衡な代謝回転によって誘導される（Ｒｅｎｎｉｅ  ２０１０およびＷｅｌｌｅ  ２００２）。タンパク質、特に細胞外タンパク質の代謝回転によってタンパク質分解断片が循環中に放出され得るので、タンパク質代謝の定量的または定性的変化は、筋肉の量または機能のモニタリングにおいて使用することができるバイオマーカー概略を与え得る（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ  ２０１３）。
【０００４】
コラーゲンは、筋肉の受動的伸張に貢献し得る、骨格筋の重要な細胞外タンパク質である（Ｇｒａｎｚｉｅｒ）。
【０００５】
ＩＩＩ型コラーゲンは骨以外のＩ型コラーゲン含有組織の大部分で発現され、結合組織、筋肉組織および皮膚などの重要な成分である（Ｇｅｌｓｅ）。ＰＩＩＩＮＰはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドであり、これは成熟ＩＩＩ型コラーゲン合成中に除去される（Ｎｉｅｍｅｌａ）。それはホルモン治療のアナボリック応答と関係があることが報告されている（Ｂｈａｓｉｎ  ２００９およびＣｈｅｎ  ２０１１）。近年、Ｎ末端プロコラーゲンのＮ−プロテアーゼ切断部位を標的化したモノクローナル抗体を施用することによる、新たなＥＬＩＳＡキットが開発され、これはＩＩＩ型コラーゲンの真の合成を評価することが可能である（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ２０１３）。
【０００６】
ＶＩ型コラーゲンは、細胞の基底膜内に独自の微小線維網を形成することができる特有な細胞外コラーゲンである。それは、コラーゲン、バイグリカン、およびプロテオグリカンを含めた、他のマトリックスタンパク質と相互作用することができる（Ｋｕｏ  １９９７、Ｂｉｄａｎｓｅｔ  １９９２およびＳｔａｌｌｃｕｐ  １９９０）。筋肉中では、ＶＩ型コラーゲンは筋線維鞘の一部であり、筋肉内細胞外マトリックスへの筋線維の固定に関与し、したがって力の伝達に関与する（Ｂｏｎａｌｄｏ  １９９０およびＫｅｅｎｅ  １９８８）。さらに、ＶＩ型コラーゲンの突然変異は、ベスレムミオパチーおよびウールリッヒ型先天性筋ジストロフィーを引き起こす可能性がある（Ｌａｍｐｅ）。ＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ末端は、分泌後に成熟ＶＩ型微小線維から切断除去されることが報告されている（Ａｉｇｎｅｒ  ２００２およびＬａｍａｎｄｅ  ２００６）。
【０００７】
しかしながら、ＶＩ型コラーゲンは筋肉および筋肉消失にのみ関与しているわけではない。
【０００８】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性的炎症、構造変化、および小気道狭窄が原因の永続的気流制限によって特徴付けられる、不均質にゆっくりと進行する疾患である（世界的問題．．．）。肺の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主な構造タンパク質はコラーゲン、エラスチン、およびプロテオグリカンである。ＥＣＭ再編成は健常な組織維持の一部であり、この場合古いタンパク質は分解され新たなタンパク質が形成される（Ｃｏｘ）。しかしながら、過度のＥＣＭ再編成は、ＣＯＰＤにおいて肺機能の消失を促進する構造変化を誘導する。ＣＯＰＤにおける重要な課題は、疾患進行のバイオマーカーの同定である（Ｖｅｓｔｂｏ）。肺構造タンパク質の評価によるＥＣＭの研究によって、疾患活動性と予後のバイオマーカーを与えることができる。
【０００９】
増悪は、疾患活動性が増大する期間であり、肺機能の消失を加速させ（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ２００２））、生活の質を低下させ（Ｓｅｅｍｕｎｇａｌ）、死を引き起こす（Ｓｏｆｅｒ−Ｃａｔａｌｕｎａ）まで、ＣＯＰＤ進行が誘導される。全ＣＯＰＤ段階の患者が増悪を経験し得るが、彼らは疾患重症度の増大をより頻繁に経験する（Ｈｕｒｓｔ）。それらの発生を予測することは難しく、将来的増悪の最も確実な予測因子は増悪歴である（Ｈｕｒｓｔ  ２０１０およびＤｏｎａｌｄｓｏｎ  ２００６）。増悪はＣＯＰＤ発病における重要な事象であるが、これらの事象中の肺組織の構造変化に関してはほとんど知られていない。安定状態のＣＯＰＤと比較して、増悪時にＣＯＰＤ患者の喀痰中の組織メタロプロテイナーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ−１）のレベルは低下し（Ｍｅｒｃｅｒ）、破滅的環境を示唆する一方で、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）のレベルは上昇することが知られている。
【００１０】
近年の研究によって、ＥＣＭには内分泌器官の性質があり、その構造タンパク質は、細胞遊走、分化、および血管新生を含めた細胞プロセスを遠位で調節できるシグナル伝達分子を生成することが明らかになった。これらの分子は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する強力な抗血管新生ペプチドエンドスタチン、ならびにそれぞれＩＶ型、ＶＩＩ型、およびＸＶ型コラーゲンから放出されるタムスタチン、バスタチン、およびレスチンを含む（Ｋａｒｓｄａｌ、２０１５）。
【００１１】
構成鎖α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、およびα３（ＶＩ）で構成される３重らせん分子であるマイクロフィラメント間質性ＶＩ型コラーゲンは、大部分の結合組織中、主に脂肪組織中で発現され（Ｐａｒｋ、２０１２）、そこで他のＥＣＭタンパク質とのその相互作用によって細胞を固定する（Ｍａｋ、２０１２）。マイクロフィラメントの形成中、その３重らせんコアはタンパク質分解によってそのプロペプチドから放出される（Ａｉｇｎｅｒ、２００２；Ｌａｍａｎｄｅ、２００６）。ここで、α３（ＶＩ）鎖のＣ末端プロペプチドのさらなる切断によって、新たに同定されたアディポカインであるエンドトロフィンが生成する（本明細書では「Ｐｒｏ−Ｃ６」と呼ぶ）。エンドトロフィンは、主に脂肪組織によって生成され、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）の上方制御、脂肪組織線維化、血管新生、炎症を誘導し、動物モデルでは、インスリン感受性、食物摂取、エネルギー収支、および脂肪組織炎症など幾つかの代謝機能を不都合に調節することが示されている（Ｓｕｎ、２０１４；Ｄａｎｋｅｌ、２０１４；Ｐａｒｋ、２０１３；Ｋｈａｎ、２００９；Ｐａｓａｒｉｃａ、２００９）。これらの発見は、血中エンドトロフィンのレベルは、代謝機能障害を有する患者、特に２型糖尿病を有する患者を分類および／またはモニタリングするのに有用であり得ることを示唆する。
【００１２】
チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のアゴニストであり、これらは広く使用され、インスリン感受性を改善し、グルコースレベルを低下させ、インスリンの需要を減らすそれらの能力によって２型糖尿病を治療する（Ｃｈｏ、２００８；Ｃｈａｒｂｏｎｎｅｌ、２０１０）。しかしながら、ピオグリタゾンなどのＴＺＤの使用は、心不全（Ｈｏｍｅ、２００９）、体重増加（Ｔａｋａｄａ、２００７）、末梢性浮腫（Ｋａｒａｌｌｉｅｄｄｅ、２００７）、および女性における骨消失（Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ、２００４）などの関連有害事象（ＡＥ）によって実質上制限されている。ＰＰＡＲγアゴニストのＡＥを最少にするための試みでは、一部のＰＰＡＲγ下流シグナルのみを誘発するＰＰＡＲγの部分的活性化剤であるバラグリタゾンなどが開発されている（Ｂｅｒｇｅｒ、２００５；Ａｇｒａｗａｌ、２０１２）。このような部分的アゴニストによって、少ないＡＥで優れた糖制御が実現する（Ｌａｒｓｅｎ、２００８）。治療応答者を最適に定義し得る血清バイオマーカーは、このようなグリタゾンの有効性と安全性をさらに改善する可能性がある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、α３鎖のＣ末端を標的化するモノクローナル抗体とＥＬＩＳＡキットをこの度開発した。本発明者らは、このキット、およびそれを用いて測定する反応性を本明細書において「Ｐｒｏ−Ｃ６」と呼ぶ。
【００１４】
本発明者らは、Ｐｒｏ−Ｃ６のレベルは筋肉代謝回転率を反映すること、およびタンパク質再編成断片のバイオマーカーにより全身で評価したＥＣＭ再編成は、疾患活動性が高いＣＯＰＤの増悪中に加速されることも立証した。
【００１５】
本発明者らは、血清中の高レベルのエンドトロフィン（すなわち「Ｐｒｏ−Ｃ６」）によって２つのインスリン増感剤（バラグリタゾンとピオグリタゾン）に対する応答を予測し、副作用を低減し、ＰＰＡＲγアゴニスト治療の恩恵を受ける２型糖尿病を有する患者を特定できることも立証した。
【００１６】
ここで、本発明は、ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープと反応性がある免疫学的結合パートナーを提供する。
【００１７】
前記免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれる前記Ｃ末端エピトープと特異的に結合することが好ましい。
【００１８】
前記免疫学的結合パートナーは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。免疫学的結合パートナーは、以下でさらに説明するような結合特異性を有する抗体断片であってよい。
【００１９】
前記免疫学的結合パートナーは、．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ酸配列が伸長されたもの（伸長型のアミノ酸配列）を認識しないかまたはそれと結合しないことが好ましい。
【００２０】
前記免疫学的結合パートナーは、．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ酸配列が切り詰められたもの（切断型のアミノ酸配列）を認識しないかもしくはそれと結合しない（またはさらに認識しないかもしくはそれと結合しない）ことが好ましい。
【００２１】
伸長型のアミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ−ＣＯＯＨに対する前記抗体の親和性および／または切断型のアミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ−ＣＯＯＨに対する前記抗体の親和性に対する、アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨに対する前記抗体の親和性の比は、１に対して１０より大きいことがさらに好ましい。
【００２２】
より一般的には、前記伸長型のアミノ酸配列に対する前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する、アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性の比は、好ましくは１に対して１０より大きく、好ましくは１に対して５０より大きく、好ましくは１に対して１００より大きく、好ましくは１に対して５００より大きく、好ましくは１に対して１０００より大きく、最も好ましくは１に対して１０，０００より大きい。
【００２３】
さらに好ましくは、前記切断型のアミノ酸配列に対する前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する、アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨに対する前記免疫学的結合パートナーの親和性の比は、１に対して１０より大きく、好ましくは１に対して５０より大きく、好ましくは１に対して１００より大きく、好ましくは１に対して５００より大きく、好ましくは１に対して１０００より大きく、最も好ましくは１に対して１０，０００より大きい。
【００２４】
本発明は、試料におけるＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープを検出するためのイムノアッセイの方法であって、前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープを含む試料と前に記載した免疫学的結合パートナーを接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの結合の量を決定するステップを含む方法を含む。
【００２５】
前記Ｃ末端エピトープは、Ｃ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれることが好ましい。
【００２６】
前記方法は、生体液における前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの量を定量化するために使用してもよい。
【００２７】
前記生体液は、例えば血清、血漿、尿または羊水であってよい。
【００２８】
前記イムノアッセイは、競合アッセイまたはラジオイムノアッセイもしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのサンドイッチアッセイであってよい。
【００２９】
このような方法は、前記方法によって決定した前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの量と前記ＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ末端エピトープの標準正常値を関連付けて、正常レベルからのその変化を評価するステップをさらに含むことができる。
【００３０】
本発明は、細胞外マトリックスの形成率を調べる方法であって、生体液試料におけるＣ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれるエピトープを含むＶＩ型コラーゲンα３断片のレベルの測定値を得るために、前に記載した方法によりアッセイを実施するステップを含む方法を含む。
【００３１】
このような方法は、ＶＩ型コラーゲンα３断片の測定レベルを、同一試料におけるＶＩ型コラーゲンの分解のバイオマーカーの測定レベルと比較する指標を作成するステップをさらに含むことができる。このような分解のバイオマーカーは、ＭＭＰ分解ＶＩ型コラーゲンの断片であってよい。Ｖｅｉｄａｌ  ２０１１中およびＷＯ２０１０／１１５７４９中に記載されたように、このようなアッセイはＮ末端配列ＹＲＧＰＥＧＰＱＧＰ．．．に対する抗体反応性に基づくものであってよい。
【００３２】
本発明者らは、床上安静の型での長期無負荷およびその後の再負荷に応じた血清学的コラーゲンペプチドバイオマーカーの調節を調べており、ＣＯＰＤ増悪事象においてこれらのバイオマーカーを同様に試験した。
【００３３】
床上安静の調査では、対象を振動対策デバイス有りまたは無しで８週間床上安静状態で固定し、次に通常の身体活動により再可動させた。両群共に固定状態中に筋肉の量と強度が消失し、安静群より対照群において、よりわずかに消失した。両群共に再可動中に筋肉の量と強度が回復した。
【００３４】
固定状態中、ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドのバイオマーカー（ＰＲＯ−Ｃ３）と本発明のＶＩ型コラーゲンバイオマーカー（ＰＲＯ−Ｃ６）は、一時的にある程度類似したパターンを示す。本発明のそれは固定開始後当初はわずかに下降する一方で、ＰＲＯ−Ｃ３とＰＲＯ−Ｃ６はいずれも経時的に固定期間と共に最終的に増大する。
【００３５】
再可動開始時には、わずかな初期低下を再度観察し、次いで、ＰＲＯ−Ｃ６の一部においてＲＶＥ群より対照において高い増大、次に両バイオマーカーにおけるベースラインへの回復を観察することができる。
【００３６】
Ｃ６Ｍバイオマーカーは床上安静の無負荷にはほとんど応答しないが、再負荷に応答してわずかに上昇し、群間で有意な差はない。
【００３７】
したがってＰＲＯ−Ｃ６は、身体活動の変化およびＬＢＭ（除脂肪体重）の変化と関連した再編成のバイオマーカーであるとみなすことができる。ベースラインでの低いＰＲＯ−Ｃ６は、回復と消失両方のＬＢＭの変化の影響をより受けやすい表現型と関連がある。したがって、この配列に関するアッセイを使用して、不本意な固定状態、例えば入院の影響を特に受けやすい個体、筋肉消失のリスクが高い個体を確認することができ、したがってＬＢＭ消失に対処する治療決定をすることができる。
【００３８】
さらに、結合組織再編成、特に筋肉代謝回転の速度をモニタリングし、その速度を調節する治療薬候補の有効性に関する情報を与えるために、このアッセイを使用することができる。
【００３９】
本発明のバイオマーカーは、ＣＯＰＤ増悪事象の診断を手助けするために、またはどの患者がその状態のより急速な悪化を被る可能性があるかに関して予後予測を与えるために使用してもよく、それによって彼らは臨床試験に移行するのにより適した患者となり得る。
【００４０】
本発明のバイオマーカーは、チアゾリジンジオンクラスの化合物（例えば、バラグリタゾンまたはピオグリタゾン）などのインスリン増感剤に対する応答を予測するために使用することもできる。本発明のバイオマーカーはインスリン増感剤に最適に応答し得る患者の確認およびモニタリングを可能にし、これによって２型糖尿病および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療におけるＰＰＡＲγアゴニストのベネフィットリスク比を改善する。これに関連して、本発明は、インスリン増感剤で治療するのに適した対象を確認するための方法であって、
ｉ）本発明のＰｒｏ−Ｃ６アッセイ法を使用して対象から得た生体液におけるＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープの量を定量化するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）により決定した上昇値とインスリン増感剤で治療するのに適した対象を関連付けるステップと
を含む方法をさらに提供する。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、生物試料におけるＶＩ型コラーゲンα３鎖のＣ５ドメインのＣ末端エピトープ、好ましくはＣ末端アミノ酸配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ中に含まれるＣ末端エピトープの量を決定するためのアッセイキットであって、本発明の免疫学的結合パートナー、および、以下の少なくとも１つ：
ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート
前記抗体と反応性があるペプチド、これは、ビオチニル化ペプチドであるビオチン−Ｌ−ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨ（Ｌは任意選択のリンカー）であってよい、
任意選択的に、サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するためのビオチニル化二次抗体
Ｃ末端配列．．．ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ−ＣＯＯＨを含むキャリブレーターペプチド
抗体ＨＲＰ標識キット
抗体放射標識キット
アッセイ視覚化キット
を含む、アッセイキットを提供する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「免疫学的結合パートナー」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などの抗体の特異的結合断片も含む。したがって、前記免疫学的結合パートナーは、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】モノクローナル抗体１０Ａ３のペプチド特異性試験の結果を、標準ペプチド、伸長型ペプチド、および切断型ペプチドの連続２倍希釈によって生じたＯＤシグナルとして示す図である。ＳＴＤペプチド＝ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ、伸長型ペプチド＝ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ、および切断型ペプチド＝ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ。ＥＬＩＳＡの性質上、低いＯＤは強い反応性に相当する。
【図２】ヒト血清および羊水と、モノクローナル抗体１０Ａ３との反応性の試験の結果を示す図である。パネルＡは、競合ＥＬＩＳＡ中でＯＤとして測定した抗体結合が、ヒト血清およびヒト羊水により部分的に阻害されたことを示す。パネルＢは、ヒト血清（レーン１、２）および羊水（レーン３、４）における特異的バンドを示すウエスタンブロットであり、標準ペプチドの存在下でバンドが遮断され得ることを示す（レーン６〜９）。
【図３】３種の異なる血漿と血清で測定したＰｒｏ−Ｃ６レベルの線形回帰分析からの結果を示す図であり、血清レベルと各種血漿の間の強い相関関係を示す（Ｐ＜０．０００１）。
【図４】上から順に３つのパネルにおいて、床上安静および再可動（ＢＢＲ）試験における経時的なＰＲＯ−Ｃ３、ＰＲＯ−Ｃ６およびＣ６Ｍレベルを示す図である。
【図５】上から順にパネルＡ、ＢおよびＣにおいて、実施例３中で測定したバイオマーカーレベルを示す図である。
【図６】パネルＡ、ＢおよびＣにおいて、実施例３中で測定したＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびＶＩ型コラーゲンの分解／形成マーカー比のレベルを示す図である。
【図７】血清中グルコースおよび血中ＨｂＡ１ｃに対する断食の影響を示す図である。ベースライン血清Ｐｒｏ−Ｃ６に従った、小群における断食中のベースラインから治療終了（第２６週）までの血清中グルコース（左側のパネル）および血中ＨｂＡ１ｃ（右側のパネル）の経時的絶対変化（三分位値）。
【図８】ベースラインにおけるＰｒｏ−Ｃ６と比較した、２６週の治療期間中の断食における血清中グルコース（左側のパネル）および血中ＨｂＡ１ｃ（右側のパネル）の平均絶対変化を示す図である。２６週の治療期間前（Ｘ／’）および最後の（‘／Ｘ）プラセボに対する治療の有意水準（ダネット検定により調整）。ｎａ：不適切、ｎｓ：有意性なし、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図９】上位２つのエンドトロフィン三分位値（＞７．７ｎｇ／ｍＬ）対最小三分位値（≦７．７ｎｇ／ｍＬ）で第２６週における応答者に関するオッズ比を示す図である。ＨｂＡ１ｃにおける１％（３．８３、９５％ＣＩ（１．６２；９．０４）、ｐ＜０．００２）または０．５％（３．８５、９５％ＣＩ（１．９４；７．６１）、ｐ＜０．００１）の臨床上有意な変化に関するオッズ比。
【図１０】２６週の治療期間中のＨＯＭＡ−ＩＲの平均絶対変化を示す図である。２６週の治療期間前（Ｘ／’）および最後の（‘／Ｘ）プラセボに対する治療の有意水準（ダネット検定により調整）。ｎａ：不適切、ｎｓ：有意性なし、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１１】左側のパネルは、血清中Ｐｒｏ−Ｃ６レベルに対する治療の影響の図である。血清中Ｐｒｏ−Ｃ６は、ベースラインＰｒｏ−Ｃ６の三分位値に従い治療の最後（第２６週）までのベースラインと比較した変化率として表す。これらの図は最小二乗推定値（±標準誤差）を示す。右側のパネルは、２６週の治療期間前（Ｘ／’）および最後の（‘／Ｘ）プラセボに対する治療の有意水準（ダネット検定により調整）を使用して、ベースラインと比較したＰｒｏ−Ｃ６の平均変化の図である。ｎａ：不適切、ｎｓ：有意性なし、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１２】２６週の治療期間中の下肢体積の平均絶対変化を示す図である。２６週の治療期間前（Ｘ／’）および最後の（‘／Ｘ）プラセボに対する治療の有意水準（ダネット検定により調整）。ｎａ：不適切、ｎｓ：有意性なし、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【実施例】
【００４４】
［実施例１：Ｐｒｏ−Ｃ６用抗体の開発］
本発明者らは、免疫原性ペプチドとしてＶＩ型コラーゲンα３鎖の末尾１０アミノ酸（３１６８’ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ’３１７７）を使用して特定のエピトープに対するモノクローナル抗体を作製した。モノクローナル抗体開発に使用した方法は以前に記載された通りであった（Ｂａｒａｓｃｕｋ）。簡単に言うと、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを、２００μｌの乳化抗原および６０μｇの免疫原性ペプチドを用いて皮下免疫処置した。安定した血清力価レベルに達するまで、連続免疫処置を２週間間隔でフロイント不完全アジュバントにおいて実施し、２回目の免疫処置マウスから採血した。それぞれの採血時に、血清力価を検出し、最大抗血清力価および最良天然反応性を有するマウスを融合用に選択した。選択したマウスは１カ月間休養させ、次いで細胞融合用の脾臓を単離する３日前に、１００μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液に溶かした５０μｇ免疫原性ペプチドを用いて静脈内追加抗原刺激した。
【００４５】
融合手順は他の所で記載されている（Ｇｅｆｔｅｒ）。簡単に言うと、マウス脾臓細胞をＳＰ２／０ミエローマ融合パートナー細胞と融合させた。融合細胞は９６ウェルプレート中で培養し、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ここで、標準限界希釈法を使用してモノクローナル抗体の増殖を促進した。選択ペプチドに特異的であり伸長型のペプチド（ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、中国）または切断型のペプチド（ＫＰＧＶＩＳＶＭＧ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）のいずれとも交差反応性がない細胞株を選択しサブクローニングした。最後に、ＩｇＧカラムを使用して抗体を精製した。
【００４６】
＜Ｐｒｏ−Ｃ６アッセイプロトコール＞
アッセイ開発に使用したＥＬＩＳＡプレートは、Ｒｏｃｈｅ製のストレプトアビジンでコーティングされたプレート（ｃａｔ．：１１９４０２７９）であった。全てのＥＬＩＳＡプレートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製（ＣＡ、米国）の、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ、ＥＬＩＳＡリーダーで分析した。本発明者らは、製造者（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）の説明書に従い、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｌｉｎｋ  ＨＲＰ標識キットを使用して、選択したモノクローナル抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識した。９６ウェルのストレプトアビジンプレートは、コーティングバッファー（４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に溶かしたビオチニル化合成ペプチド：ビオチン−ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、中国）でコーティングし、２０℃で３０分間インキュベートした。２０μＬの標準ペプチドまたはインキュベーションバッファー（４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＢＳＡ、５％のＬｉｑｕｉｄＩＩ、ｐＨ７．４）中に希釈した試料を適切なウェルに加え、次いで、１００μＬのＨＲＰ結合モノクローナル抗体１０Ａ３を加え、４℃で２１時間インキュベートした。最後に、１００μＬのテトラメチルベンジニジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  ｃａｔ．４３８ＯＨ）を加え、プレートは暗所において２０℃で１５分間インキュベートした。前述の全てのインキュベーションステップは３００ｒｐｍでの振とうを含んでいた。それぞれのインキュベーションステップ後、プレートは洗浄バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ）により５回洗浄した。ＴＭＢ反応は１００μＬの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止させ、４５０ｎｍおよび参照としての６５０ｎｍで測定した。
【００４７】
＜Ｐｒｏ−Ｃ６の技術的評価＞
検出下限（ＬＬＯＤ）を２１のゼロ試料（すなわちバッファー）から決定し、平均＋３×標準偏差として計算した。アッセイ内変動とアッセイ間変動は、各実験が試料の二重測定からなる、８ＱＣ試料の１２の個別の実験により決定した。希釈回収率は４血清試料および４ヘパリン血漿試料において決定し、１００％試料から希釈した試料の回収率として計算した。
【００４８】
［実施例２：筋肉消失試験におけるＰｒｏ−Ｃ６］
＜ベルリン床上安静試験におけるＰｒｏ−Ｃ３、Ｃ６Ｍアッセイの測定＞
α３鎖のＣ末端のレベルは、新たに形成される成熟ＶＩ型コラーゲンのレベルを反映すると予想される。ＶＩ型コラーゲンの合成を調べるため、本発明者らは、α３鎖のＣ末端を標的化する前述のＰｒｏ−Ｃ６−ＥＬＩＳＡキットを開発した。さらに、ＶＩ型コラーゲンはＭＭＰの基質でもある（Ｖｅｉｄａｌ  ２０１１）。以前の試験は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の両方が筋萎縮と関係があることを示した（Ｒｅｚｎｉｃｋ  ２００３およびＧｉａｎｎｅｌｌｉ  ２００５）。したがって、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によって生成するＶＩ型コラーゲン分解断片がこのようなプロセスにおける関心対象となる。
【００４９】
この試験において、本発明者らは、筋萎縮と肥大のヒトモデルとして床上安静固定および再可動を使用し、ベルリン床上安静試験でＩＩＩ型およびＶＩ型コラーゲンの代謝回転を直接測定する以下の３つのバイオマーカー：（Ｃ末端α３（ＶＩ）鎖を測定する）Ｐｒｏ−Ｃ６、および（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によって分解されるＶＩ型コラーゲン断片を測定する）Ｃ６Ｍ（Ｖｅｉｄａｌ  ２０１１）、および（ＩＩＩ型コラーゲンの真の合成を測定する）Ｐｒｏ−Ｃ３（Ｎｉｅｌｓｅｎ）を測定した。
【００５０】
ベルリン床上安静試験は他の所で記載されている（Ｒｉｔｔｗｅｇｅｒ  ２００６およびＢｅｌａｖｙ  ２００９）。簡単に言うと、２０人の健康な若い男性を動員し、厳密な８週間の床上安静試験を施した。次いで２０人の若い男性をランダムに２群に分けた。抵抗性振動療法エクササイズ群（ＲＶＥ）群には、１週間毎に１１回の抵抗性振動療法エクササイズを割り当てた。抵抗性振動療法エクササイズは、ベッド端で振動療法エクササイズ器具により、ウエストおよびショルダーストラップ、ならびにプレートに対象を引き寄せるためのハンドルを備える振動プレートに対象を引き寄せることによって実施した。対照群（ＣＴＲＬ）には、８週間の床上安静中いかなるエクササイズも実施させなかった。試験２日前（ＢＤＣ−２）、床上安静期間中（ＢＲ＋）および後の回復期（Ｒ＋）に血清試料を得た。血清試料は、さらなる測定まで−８０℃で保存した。両群の筋肉量は、この３期間中にＭＲＩとＤＸＡによって評価した。
【００５１】
Ｐｒｏ−Ｃ３およびＣ６Ｍアッセイのプロトコールは他の所で記載されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ２０１３およびＫｕｏ  １９９７）。Ｐｒｏ−Ｃ３アッセイは、ＩＩＩ型コラーゲンのプロペプチド断片のレベルを測定する。Ｃ６Ｍアッセイは、成熟ＶＩ型コラーゲンのＭＭＰ分解断片を測定する。簡単に言うと、Ｐｒｏ−Ｃ３アッセイでは、９６ウェルのストレプトアビジンプレートをビオチニル化合成ペプチドでコーティングし、２０℃で３０分間インキュベートした。２０μＬの標準ペプチドまたは１：２に希釈した血清試料を適切なウェルに加え、次いで、１００μＬのＨＲＰ結合モノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ−６２を加え、４℃で２０時間インキュベートした。最後に、１００μＬのＴＭＢを加え、プレートは暗所において２０℃で１５分間インキュベートした。ＴＭＢ反応は１００μＬの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止させ、４５０ｎｍおよび参照としての６５０ｎｍで測定した。Ｃ６Ｍアッセイでは、ビオチニル化合成ペプチドを９６ウェルのストレプトアビジンプレートにコーティングする。２０μＬの標準ペプチドまたは１：２に希釈した血清試料、次いで、１００μＬのＨＲＰ結合モノクローナル抗体を加え、２０℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢによる発色後、プレートを読み取った。
【００５２】
＜結果＞
選択した抗体１０Ａ３は、Ｃ末端のＣＯＬ６Ａ３の末尾の１０アミノ酸：３１８６’ＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴ’３１７７を特異的に認識したが、伸長型のペプチドＫＰＧＶＩＳＶＭＧＴＡも切断型のペプチドＫＰＧＶＩＳＶＭＧも認識しなかった（図１）。選択した抗体の天然反応性は、ヒト血清プールおよびヒト羊水プールを使用して評価した。競合ＥＬＩＳＡでは、血清と羊水の両方によりシグナルが部分的に阻害された（図２、パネルＡ）。この抗体が１０ｋＤ付近のバンドを認識し、一方で標準ペプチドの存在下でシグナルが完全に遮断された結果を、ウエスタンブロットにより確認した（図２、パネルＢ）。
【００５３】
０．１５ｎｇ／ｍｌ〜５８．３９ｎｇ／ｍｌの範囲という条件で、Ｐｒｏ−Ｃ６競合ＥＬＩＳＡの測定範囲をＬＬＯＤおよびＵＬＯＤによって決定した。アッセイ間変動とアッセイ内変動はそれぞれ１５．２％と４．８％である。ヒト血清およびヘパリン血漿における希釈回収率はいずれも１００±２０％内であった（表１）。ヘパリン血漿、クエン酸血漿およびＥＤＴＡ血漿のそれぞれとヒト血清間の相関関係は比較的高く（図３、ｐ＜０．０００１）、これは異なる血液調製法にもかかわらずＰｒｏ−Ｃ６レベルが一定であったことを示した。
【００５４】
【表１】
2018511601.tif 000002
【００５５】
試料は連続２倍希釈ステップにおいて希釈し、これらの連続希釈において濃度を測定した。測定した濃度と希釈倍率とをかけることにより希釈回収率を得て、非希釈（開始）試料の濃度の割合として表した。この表は、シグナルは直線的に弱まり＋／−２０％内および８倍希釈範囲内に留まることを示す。
【００５６】
＜ベルリン床上安静試験におけるバイオマーカーのプロファイル＞
ベルリン床上安静試験（ＢＢＲ）において測定した前述の３バイオマーカーのレベルは図４中に見られる。時間地点「ＢＲ」は床上安静固定の時間地点を表し、時間地点「Ｒ」は再可動の時間地点を表す。接尾の数字は床上安静または再可動期間までの日数を表す。「ａ」はベースラインとの有意差を表し、「ｂ」は固定期間の最終時間地点との有意差を表す。データは平均＋／−ＳＥＭとして表す。
【００５７】
図４中に見られるように、ＰＲＯ−Ｃ３は、固定による約２０％の初期減少（ＢＲ３からＢＲ１２までベースラインと有意に異なる、全時間地点に関してｐ＜０．００４）、次に固定の最後の増大（ＢＲ４０がベースラインと有意に異なる、ｐ＝０．０５）という形での有意な時間効果を示した。興味深いことに、再可動の開始時に、初期減少（時間地点Ｒ３〜Ｒ２８がベースラインより有意に高い、全時間地点に関してｐ＜０．０３、かつＲ３が固定の最終時間地点、ＢＲ５６より有意に高い、ｐ＝０．０２）、次に増大で同様のパターンを観察することができた。最後の２箇所の時間地点、再可動開始後１３週で、バイオマーカーレベルはベースラインに戻った。有意な群間の差も、有意な時間＊治療相互作用効果もなかった。
【００５８】
本発明者らが、ＰＲＯ−Ｃ３の個々のバイオマーカーレベルとＬＢＭおよびその変化を比較したところ、本発明者らは、ＰＲＯ−Ｃ３の個々のレベルはベースラインでＬＢＭと有意に相関関係があったことを発見した（Ｒ２＝０．２８６９、Ｒ＝０．５３６、ｐ＝０．０１４９）。さらに本発明者らは、ＢＲ４７におけるそのピークでのバイオマーカーのレベルは、固定状態中に失われたＬＢＭの量と有意に相関関係があったことを発見した（Ｒ２＝０．２０５６、Ｒ＝０．４５３、ｐ＝０．０４４７）。
【００５９】
ＰＲＯ−Ｃ６バイオマーカーは、固定の行程中経時的に変化し、約１週間の固定後には増大し（有意な時間効果、ｐ＜０．０００１）、固定の最後の数週間にはベースラインより約３０％高いピークレベルに達した（ＢＲ１９からＲ２８までベースラインより有意に高かった、ＢＲ４７でピーク、ｐ＝０．０００２）。固定期間中、群間の差はなかった（有意な治療効果または治療＊時間相互作用もなかった）。
【００６０】
再可動中、時間と時間＊治療相互作用効果の両方が表面化した。これは、再可動１週間でピークに達した増大（固定最終日、ＢＲ５６と比較して２０％の増大、ｐ＝０．０１１）、次にベースライン値への段階的回復の型であった。Ｒ７時間地点での大きな変動が原因で、相互作用効果は如何なる事後検定においても表面化しなかった。
【００６１】
本発明者らが、ＰＲＯ−Ｃ６の個々のバイオマーカーレベルとＬＢＭおよびその変化を比較したところ、本発明者らは、ＰＲＯ−Ｃ６のレベルはＬＢＭと全く関係なかったが、固定中のＬＢＭの変化とプラスの関係があり、ＰＲＯ−Ｃ６の高レベルはＬＢＭの消失の少なさと関連があることを意味することを発見した（Ｒ２＝０．２７９４、Ｒ＝０．５２９、ｐ＝０．０１６６）。本発明者らは、ＰＲＯ−Ｃ６は再可動中に（再）回復するＬＢＭの量とマイナスの関係があり、高レベルは再可動中のＬＢＭの（再）回復の少なさと関連があることを意味することも発見した（Ｒ２＝０．３３６５、Ｒ＝０．５８０、ｐ＝０．００７３）。
【００６２】
Ｃ６Ｍバイオマーカーは固定によってほとんど影響を受けなかったが（固定時間期間中の時間効果なし）、再可動の初期に３０〜４０％一時的に増大した（ｐ＜０．０００１で固定期間中に有意な時間効果）。固定中に治療効果はなく、Ｃ６Ｍシグナルの増大はＲＶＥ群中よりＣＴＲＬ群中で大きかったようであるが、これが有意な状態に達することはなかった（時間＊治療相互作用が有意な状態に達することはなく、したがって事後検定は行わなかった）。これらの群間に差はなかった。
【００６３】
本発明者らが、ＰＲＯ−Ｃ６の個々のバイオマーカーレベルとＬＢＭおよびその変化を比較したところ、本発明者らは、ＰＲＯ−Ｃ６のレベルはＬＢＭと全く関係なかったが、固定中の筋肉消失とプラスの関係があり（Ｒ２＝０．２７９４、Ｒ＝０．５２９、ｐ＝０．０１６６）、再可動中の筋肉量の（再）回復とマイナスの関係があったことを発見した（Ｒ２＝０．３３６５、Ｒ＝０．５８０、ｐ＝０．００７３）。
【００６４】
【表２】
2018511601.tif 000003
【００６５】
ＰＲＯ−Ｃ６は、身体活動の変化およびＬＢＭの変化と関連した再編成のバイオマーカーであるとみなされる。ベースラインでの低いＰＲＯ−Ｃ６は、回復と消失両方のＬＢＭの変化の影響をより受けやすい表現型と関連がある。
【００６６】
［実施例３：ＣＯＰＤにおけるＰＲＯ−Ｃ６］
＜試験設計＞
医療コンサルタントによって２０１１年および２０１２年中にＣＯＰＤ増悪であるとみなされた病院に入院中の患者を、入院の２４時間以内に動員した。血液試料を増悪時と回復時に回収し、４週間のフォローアップ往診を入院後平均３０日実施した（ＩＱＲ２８〜３４）。フォローアップ往診時に、標準的な気管支拡張後肺活量測定を患者に施し、６分間歩行距離（６ＭＷＤ）試験を実施した。患者の報告された測定値は、フォローアップ往診時の、医学研究審議会（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）（ＭＲＣ）の呼吸困難スケールを使用した呼吸困難のアセスメント、および喫煙歴を含んでいた。
【００６７】
試験対象患者基準には、顧問医によってなされた入院時の急性ＣＯＰＤ増悪の臨床診断結果を用いた。肺炎に関する医師の診断結果または放射線痕跡は除外基準であった。この試験は、フォローアップ往診時に確認した気道閉塞（０．７未満の１秒間努力呼気量（ＦＥＶ１）と努力肺活量（ＦＶＣ）の比）を有する６９の患者をペア試料で含んでいた。
【００６８】
＜ＥＣＭ再編成のバイオマーカー＞
血清およびヘパリン血漿試料は分析するまで−８０℃において保存した。Ｃ３Ｍ、Ｃ４Ｍ、Ｐｒｏ−Ｃ３、Ｐ４ＮＰ７Ｓ、ＥＬＭ７、およびＥＬ−ＮＥを血清において測定し、一方Ｃ６Ｍ、Ｐｒｏ−Ｃ６、およびＶＣＡＮＭをヘパリン血漿において測定した。細胞外マトリックス再編成を評価するためこの試験において使用した、アッセイの概要を表４中に表す。
【００６９】
【表３】
2018511601.tif 000004
【００７０】
基準値は製造者（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって提供されたものであり、関連マトリックス、すなわち血清（Ｃ３Ｍ、Ｃ４Ｍ、Ｐｒｏ−Ｃ３、Ｐ４ＮＰ７Ｓ、ＥＬＭ７、ＥＬ−ＮＥ）またはヘパリン血漿（Ｃ６Ｍ、Ｐｒｏ−Ｃ６、ＶＣＡＮＭ）における健常集団のバイオマーカーレベルを指す。ＳＤ、標準偏差。ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテイナーゼ。
【００７１】
患者の統計データおよび臨床的特徴を表５中に要約する。患者は大部分が男性（７１％）で以前の喫煙者であった（５５％）。彼らは平均［ＩＱＲ］３［２〜６］日入院し、フォローアップ往診は入院後３０［２８〜３４］日で実施した。
【００７２】
【表４】
2018511601.tif 000005
【００７３】
増悪時および３０日フォローアップ時の臨床的に安定した疾患期に放出されたタンパク質断片の循環レベルを表６中に表す。
【００７４】
【表５】
2018511601.tif 000006
【００７５】
結果は、増悪時およびフォローアップ時のタンパク質断片の循環レベルを比較した幾何平均［９５％信頼区間］および対応するＰ値として表す。
【００７６】
ＩＩＩ型コラーゲン（Ｃ３Ｍ）、ＩＶ型コラーゲン（Ｃ４Ｍ）、ＶＩ型コラーゲン（Ｃ６Ｍ）、およびエラスチン（ＥＬＭ７とＥＬ−ＮＥ）の分解断片は、フォローアップ時と比較して増悪時に有意に増大した（全てＰ＜０．０００１、図５、パネルＡとＢ）。対照的に、ベルシカン分解の断片（ＶＣＡＮＭ）は有意に減少した平均レベルを増悪時に示した（Ｐ＜０．０００１、図５、パネルＢ）。タンパク質形成と関係した断片のレベルは、フォローアップ時と比較して増悪時に、ＩＩＩ型コラーゲンに関しては有意に変化しなかったが、ＩＶ型コラーゲンに関しては増大し（Ｐ＜０．０００１）ＶＩ型コラーゲンに関しては減少した（Ｐ＜０．０００１）（図５、パネルＣ）。タンパク質断片の循環レベルに対する喫煙の影響を調べるため、現在および以前の喫煙者に分析を個別に実施し、結果は類似していた（データ示さず）。
【００７７】
コラーゲンの分解と形成の間の収支を、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶＩ型コラーゲンに関する断片の分解と形成の間の比を計算することによって調べた（図６）。平均分解／形成比［９５％ＣＩ］は、ＩＩＩ型コラーゲン（２．３３［２．０３〜２．６６］対１．７２［１．５１〜１．９６］、Ｐ＜０．０００１）およびＶＩ型コラーゲン（３．６１［２．８６〜４．５６］対２．００［１．６４〜２．４４］、Ｐ＜０．０００１）に関して増悪時に有意に増大した。対照的に、ＩＶ型コラーゲンの分解／形成比は増悪時に０．１８［０．１７〜０．２０］であり、フォローアップ時は０．２０［０．１９〜０．２２］に増大した（Ｐ＝０．０００８）。
【００７８】
フォローアップ時に、ＢＭＩはＣ３Ｍ（ρ＝−０．２７１、Ｐ＝０．０２９）、Ｐｒｏ−Ｃ３（ρ＝−０．３５７、Ｐ＝０．０１０）、およびＰｒｏ−Ｃ６（ρ＝−０．３３８、Ｐ＝０．０１７）とマイナスの関連があった。年齢はＣ６Ｍ（ρ＝−０．２４９、Ｐ＝０．０３９）およびＰｒｏ−Ｃ６（ρ＝−０．３１０、Ｐ＝０．０２６）とマイナスの関連があった。喫煙年数、ＭＲＣスコア、入院の長さ、喀痰生成、または白血球細胞数との関連は見られなかった。Ｐｒｏ−Ｃ３のレベルはＦＥＶ１予想値％（予想％）およびＦＶＣ予想％とプラスの関連があり、これらは年齢、性別、ＢＭＩ、喫煙年数、および喫煙状態の補正後依然として有意であった（表４）。６ＭＷＤはＣ３Ｍ、Ｃ４Ｍ、Ｃ６Ｍ、およびＰ４ＮＰ７Ｓとマイナスの関連があった（表４）。年齢、性別、ＢＭＩ、喫煙年数、および喫煙状態の補正後、Ｃ３ＭおよびＣ６Ｍとの関連は依然有意であったが、一方Ｃ４Ｍはボーダーラインでは有意であり、Ｐ４ＮＰ７Ｓは有意ではなかった（表７）。
【００７９】
【表６】
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【００８０】
結果は各マーカーに関するスピアマンの順位相関係数（ρ）として表す。有意性ρを示すマーカーに関する多変量相関係数を括弧内に記載する。多変量線形回帰解析は、他の注釈変数として年齢、性別、ＢＭＩ、喫煙年数、および喫煙状態を含んでいた。有意性レベル：ΣＰ＜０．０７、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＦＥＶ１、１秒間努力呼気量。％ｐｒｅｄ、予想値の割合。ＦＶＣ、努力肺活量。６ＭＷＤ、６分間歩行距離。
【００８１】
全てのアッセイは、分解もしくは形成中にＭＭＰ切断によって生じるタンパク質断片、または内部タンパク質配列のいずれかを対象とするモノクローナル抗体を利用した。この試験中で使用したアッセイの概要およびそれらの技術仕様は表４中に与える。全ての試料は各アッセイの定量化範囲内で測定し、検出下限（ＬＬＯＤ）未満の値を有する任意の試料にＬＬＯＤの値を割り当てた。
【００８２】
前述の結果は、タンパク質再編成断片のバイオマーカーにより全身で評価したＥＣＭ再編成は、疾患活動性が高いＣＯＰＤの増悪中に加速されることを立証する。
【００８３】
［実施例４：ＩＩ型糖尿病におけるＰｒｏ−Ｃ６］
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の完全アゴニストを用いた糖尿病患者の治療は、インスリン感受性を改善するが、体重増加、心不全、末梢性浮腫、および骨消失と関連がある。ＶＩ型プロコラーゲンのα３鎖のＣ末端断片（Ｐｒｏ−Ｃ６とも呼ばれる）であるエンドトロフィンは、脂肪組織マトリックス再編成と代謝制御の両方に関与する。本発明者らは、この新規なアディポカインがＰＰＡＲγアゴニストに最適に応答する２型糖尿病（ＤＭ２）患者を確認することができ、リスクベネフィット比を改善し得るかどうか評価するための、エンドトロフィンに関する血清アッセイを確立した。
【００８４】
＜試験設計＞
ＢＡＬＬＥＴＳ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｅｔｈ  Ｌｉｖｅｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）試験は、安定的インスリン療法での２型糖尿病を有する対象における６カ月のバラグリタゾンまたはピオグリタゾン治療の有効性と安全性を決定するための、フェーズＩＩＩの、ランダムな、二重盲検、並行群、プラセボおよび活性コンパレーター対照臨床試験であった。そのベースライン統計データ、ＣＯＮＳＯＲＴダイアグラム、ならびに有効性および安全性データは以前に公開されている（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ、２０１１）。本発明の試験では、本発明者らは、以前に記載されたように（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ、２０１１）均一に４群に分散させた２９９対象（プラセボ、２用量のバラグリタゾン、および１用量のピオグリタゾン）からなるＢＡＬＬＥＴＳ試験の集団をプロトコール毎に使用し、いずれもベースラインおよび最大６個のフォローアップパラメーターは療法下で血糖制御およびＰｒｏ−Ｃ６決定と関係があった。
【００８５】
＜統計解析＞
この統計解析は、血清中Ｐｒｏ−Ｃ６のベースライン測定値を有する集団由来の対象をプロトコール毎に含んでいた。それらのベースラインＰｒｏ−Ｃ６値に基づいて、３つの三分位値の１つに対象を分類した。三分位値１は６．２ｎｇ／ｍＬ以下のベースライン血清中Ｐｒｏ−Ｃ６を有する対象を含み、三分位値２は６．３ｎｇ／ｍＬ〜７．７ｎｇ／ｍＬのベースライン血清中Ｐｒｏ−Ｃ６を有し、および、三分位値３は７．８ｎｇ／ｍＬ以上のベースライン血清中Ｐｒｏ−Ｃ６を有していた。３つの小群間のベースライン特性は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較し、それぞれの三分位値における性別の割合の比較はフィッシャーの正確検定によって比較した。
【００８６】
スピアマンの順位相関係数の計算を、血清中Ｐｒｏ−Ｃ６、断食中血清グルコース（ＦＳＧ）、血中ＨｂＡ１ｃ、体格指数（ＢＭＩ）、ならびにインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）および脂肪肝指数（ＦＬＩ）の誘導パラメーターのベースラインレベルで実施した。ＨＯＭＡ−ＩＲは血清中グルコースおよびインスリンを含めた恒常性モデルアセスメント（Ｆｅｉｇｈ、２０１１）に従い計算し、ＦＬＩは（Ｂｅｄｏｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ、２００６によって記載されたように）以下の等式を使用して計算した。
【数１】
2018511601.tif 000008
【００８７】
ベースラインからのＦＳＧ、血中ＨｂＡ１ｃ、および血清中Ｐｒｏ−Ｃ６の変化を、３つの三分位値のそれぞれにおいて時間と治療の関数として試験した。最小二乗平均（ＬＳ平均）および標準誤差を、従属変数としてベースラインからの変化を用いた混合効果反復測定モデル（ベースラインレベル、往診（治療１２週後）および治療終了時（２６週後）、ならびに、ベースラインレベル対往診および治療終了時対往診の相互作用（固定された効果）、ならびに、対象に対する無構造の共分散構造分析）から推測した。
【００８８】
それぞれの対象に関して、ベースラインからの平均変化はトラペゾイダル法により曲線下面積として計算し、ＬＳ平均および標準誤差は、従属変数として平均変化、共分散分析値としてベースラインレベル、および一定効果として治療値を用いた共分散分析モデル（ＡＮＣＯＶＡ）から推測した。各々の活性治療群内のそれぞれの三分位値をプラセボ群と比較し、有意性のレベルはダネットの多重比較法で調節した。ベースラインからの平均変化が０と異なったかどうかのアセスメントはＬＳ平均の標準誤差に基づいた。
【００８９】
全ての統計値の計算はＳＡＳソフトウエアパッケージを使用して実施した。この試験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖの識別番号ＮＣＴ００５１５６３２で登録されている。
【００９０】
＜結果＞
血清中エンドトロフィンは代謝パラメーターと相関関係がある
ＢＡＬＬＥＴ試験における代謝パラメーターおよび安全性データによって評価した治療の有効性は以前に公開されている（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ、２０１１）。メタボリックシンドローム関連パラメーターとエンドトロフィンのベースライン相関関係は表８中に表す。
【００９１】
【表７】
2018511601.tif 000009
【００９２】
エンドトロフィンレベルはＨＯＭＡ−ＩＲ、ＦＬＩ、トリグリセリド、およびＢＭＩと有意に相関関係があったが、ＦＳＧおよびＨｂＡ１ｃとは相関関係がなく、この結果は、実際にエンドトロフィンが脂肪細胞機能、脂肪量、およびインスリン感受性の幾つかの態様と関係があるアディポカインであることを支持した。エンドトロフィンレベルは、コレステロールレベルまたは肝臓酵素とは相関関係がなかった。
【００９３】
６カ月の治療期間の最後に、プラセボ群において、エンドトロフィンとこれらの代謝パラメーターの間の相関関係が維持された（表９、１０Ａ）。しかしながら、いずれかのＰＰＡＲγアゴニストで治療した群では、ＨＯＭＡ−ＩＲとエンドトロフィンの間の相関関係は失われ、一方でエンドトロフィンとＢＭＩまたはＦＬＩの間の相関関係は継続し、さらに強くなる傾向さえ示した（表１０Ｂ〜Ｃ）。
【００９４】
【表８】
2018511601.tif 000010
【００９５】
【表９】
2018511601.tif 000011
【００９６】
【表１０】
2018511601.tif 000012
【００９７】
エンドトロフィンによってグリタゾン療法に対する応答者を確認する
体重およびＢＭＩは、全４治療群中で下部三分位値より上部三分位値において高かった（表１）。治療群間でグルコース恒常性の差は見られなかった。
【００９８】
ＦＳＧおよびＨｂＡ１ｃの絶対レベルは、試験中ゼロとして設定したベースラインと比較したエンドトロフィンの２つの上部三分位値においてのみであるが、プラセボと比較して全３治療群中で低下した（図７Ａ〜Ｆ）。
【００９９】
ベースラインから治療終了（第２６週）までのＦＳＧの平均絶対変化を経時的に評価すると（図８、左側のパネル）、ＦＳＧの減少は大きく（約２．５ｍＭ）、下部三分位値と比較すると２つの上部三分位値において統計的に有意であり、この場合ベースラインと比較した減少は全治療群にわたり有意ではなかった。同様にＨｂＡ１ｃに関して（図８、右側のパネル）、２６週間の治療期間中のエンドトロフィンレベルの平均絶対変化は、いずれもプラセボおよびベースラインレベルと比較したところ、下部三分位値ではなく２つの上部三分位値においてのみ有意であった。療法に対する応答性を調べたところ、ベースライン血清中エンドトロフィンの２つの上部三分位値における患者は、グリタゾン療法に対して臨床上有意な応答を示す可能性が著しく高かった。これらの患者において、１％超および０．５％超のＨｂＡ１ｃの減少に関するオッズ比はそれぞれ４．１（ｐ＜０．００１）および４．３（ｐ＜０．００１）であった（図９）。療法下において（ＨＯＭＡ−ＩＲにより）インスリン感受性の変化を評価したところ、エンドトロフィンの上部三分位値における対象は最高の改善を再度示し（図１０Ａ〜Ｃ）、最大三分位値は統計的有意性をわずかに欠いていた。興味深いことに、療法の様々な有効性にもかかわらず、エンドトロフィンレベルの三分位値の間に体重増加の顕著な差はなかった（データ示さず）。
【０１００】
ベースラインと比較した変化率として表した、（治療の中間点および最後を試験するための）治療と時間の関数としての血清中エンドトロフィンに対する影響を図１１中に示す。エンドトロフィンのレベルは２つの最低三分位値に関してプラセボ群と治療群の両方で増大したが、最高三分位値では増大しなかった。
【０１０１】
＜有害事象＞
下肢浮腫は、水の移動が原因の体積増大として測定したところ、ベースライン血清中エンドトロフィン三分位値と相関関係があった。グリタゾン療法は下部および中間三分位値において下肢体積の増大をもたらしたが、一方で上部三分位値では治療群とプラセボ群の間に差はなかった（図１２）。血清中エンドトロフィンの異なる三分位値におけるＡＥおよび重症ＡＥ（ＳＡＥ）は表１１中に表す。エンドトロフィンレベルに従い階層化したところ、３つの異なる治療群においてＡＥまたはＳＡＥの発生の有意な差はなかった。表１１中のＳＡＥと図１２中に報告した下肢浮腫の間の差は、定量測定値である下肢体積と患者の報告されたアウトプットである浮腫の報告値の関数である（図１０）。
【０１０２】
【表１１Ａ】
2018511601.tif 000013
【表１１Ｂ】
2018511601.tif 000014
【０１０３】
＜考察＞
血清中エンドトロフィン（Ｐｒｏ−Ｃ６）によって、２型糖尿病患者において、インスリン増感剤、ピオグリタゾンおよびバラグリタゾンに対する応答を予測した。したがって、２つの上部三分位値におけるＰｒｏ−Ｃ６血清中レベルを有する患者は、下部三分位値における患者と比較したところ４倍を超える治療応答性を有する可能性がある。グリタゾンは非致死性心不全および骨折などの安全問題と関連があるので、最少ＡＥで最も治療効果を得る最適応答者の確認は、依然として非常に有効なインスリン増感剤と考えられるこれらの薬剤を、継続して使用するのに重要である。ちょうど一致して、ＦＰＧおよびＨｂＡ１ｃ三分位値の減少に応答した上部三分位値におけるベースラインＰｒｏ−Ｃ６の患者は、グリタゾン治療に関する主要ＡＥの１つである下肢浮腫の増大を発症しなかった。これらの有効性と安全性を組合せたデータは、グリタゾンで治療した患者に関する副作用を予想する改善利点と非常に関連があり、これは患者の他の徴候を再考慮する際にも当てはまるはずであり、特に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療が考えられる。
【０１０４】
肥満症におけるエンドトロフィン媒介性の代謝機能障害は、エネルギー消費の減少と結びついた脂肪組織における前炎症状態および線維症の誘導を介して誘導される可能性が高い。したがって、その抑制によってインスリン感受性が改善され脂肪組織炎症を弱め（Ｓｕｎ、２０１４）、これは血清中エンドトロフィンレベルの上昇はＰＰＡＲγアゴニストに対する応答を示すものであるという、本発明者らの発見とよく相関する。さらに、エンドトロフィン前駆体、プロコラーゲンα３（ＶＩ）のｍＲＮＡレベルは肥満脂肪組織において上方制御され、脂肪組織炎症と線維症が再度平行し、一般に脂肪細胞と脂肪組織のモジュレーターとしてのＶＩ型プロコラーゲンの重要な役割を支持する（Ｄａｎｋｅｌ、２０１４）。ＥＣＭおよび特にＶＩ型プロコラーゲンおよびエンドトロフィンは、脂肪性肝疾患およびその重症型、ＮＡＳＨ、２型糖尿病と少なくとも部分的な重複を示す肝臓の代謝障害・線維症と非常に関連があり得る。したがって本発明者らは、この新規なバイオマーカーは、インスリン抵抗性と肝臓線維症の両方の治療を要するサブ集団においてインスリン増感剤が有用であり得、ＮＡＳＨ患者の診断および管理においても役立つと予想する。ここで、線維症ＮＡＳＨを明らかにするためには、ＥＣＭ、特にコラーゲン／ＶＩ型コラーゲン、および脂肪肝への移行におけるそれらの機能的役割をさらに調べる必要がある。これと一致して、本発明の試験において本発明者らは、ＮＡＳＨ炎症活性と相関があり重症度の肝臓線維症を予測するＦＬＩ指標と、血清中トリグリセリドとの強い相関関係を観察した（Ｂｅｄｏｇｎｉ、２００６）。ＮＡＳＨ関連線維症におけるＶＩ型コラーゲンの役割を支持するに際して、従来の試験は活性化瘢痕形成領域におけるその顕著な発現を実証し（Ｂｕｒｔ、１９９０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、１９９２）、（エンドトロフィンドメインを欠く）ＶＩ型コラーゲンコア構造の血清中レベルの増大はげっ歯類（Ｖｅｉｄａｌ、２０１１）および患者（Ｌｅｂｅｎｓｚｔｅｊｎ、２００６；Ｓｔｉｃｋｅｌ、２００１）における進行した肝臓線維症、および門脈圧の上昇と関連があることが示されている（Ｌｅｅｍｉｎｇ、２０１３）。プロコラーゲンα３（ＶＩ）の発現はＰＰＡＲγによって制御され、これは本発明者らの発見とちょうど一致する。実際、プロコラーゲンα３（ＶＩ）のｍＲＮＡは、ＰＰＡＲγに対するｓｉＲＮＡで処理した脂肪細胞培養物におけるそのｍＲＮＡの増大、および、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンで治療した２型糖尿病患者（特に高いベースライン組織レベルのプロコラーゲンα３（ＶＩ）ｍＲＮＡを有する患者）の皮下脂肪組織におけるその転写産物の減少により実証されたように、ＰＰＡＲγによって抑制される。これらのデータによって、ベースラインから治療終了までの、エンドトロフィン／Ｐｒｏ−Ｃ６血清中レベルとＨｂＡ１ｃまたはＨＯＭＡ−ＩＲの間の相関関係の変化、特にグリタゾン治療後のエンドトロフィンと代謝パラメーターの間の相関関係の欠如を部分的に説明することができる。したがって、末梢脂肪組織において（プロコラーゲンα３（ＶＩ）ｍＲＮＡにより測定した）エンドトロフィン前駆体の発現は、重度に肥満の���インスリン抵抗性患者においてＢＭＩまたは全体脂肪量に依存しなかった。別の臨床試験では、肥満対象における組織エンドトロフィンレベルは慢性炎症および全身インスリン抵抗性と相関関係があった（Ｐａｒｋ、２０１３）。プロコラーゲンＶＩ、脂肪組織線維症およびグルコース感受性の低下の間の直接的関連のさらなる証拠は、白色脂肪組織中コラーゲンＶＩの不在下での（機能性レプチン遺伝子を欠く）ｏｂ／ｏｂマウスにおける試験によって与えられる。これらのマウスは、脂肪組織線維症および炎症の不在下で有意に改善されたインスリン感受性を有していた（Ｋｈａｎ、２００９）。初見では、これらのデータは、本発明者らの試験において見られた血清中エンドトロフィンとＢＭＩ、ＦＬＩ、およびＨＯＭＡ−ＩＲの間の強い相関関係と矛盾するようである。しかしながら、タンパク質分解によるアディポカインエンドトロフィンの生成に関する充分な前提条件ではなく、プロコラーゲンＶＩの存在のみが必要である。したがって、エンドトロフィン生成プロテアーゼを同定すること、およびその上流制御を特徴付けることは興味深い。さらに、レプチンはＶＩ型プロコラーゲンの発現を誘導し、これはレプチン抵抗性、代謝機能障害、およびエンドトロフィンの間の関連をさらに支持する。
【０１０５】
前に論じたように、ＥＣＭは現在まで大部分が不活化足場であると考えられてきた。ＶＩ型コラーゲンは、ベスレムミオパチー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、手足−肢帯筋ジストロフィー、および常染色体劣性筋硬化症などの筋肉障害を引き起こし、その３構成鎖をコードする遺伝子ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、およびＣＯＬ６Ａ３の突然変異によって大部分が認識されている（Ｌａｍｐｅ、２００５；Ｂｏｎａｌｄｏ、１９９８；Ｂｕｓｈｂｙ、２０１４）。これは代謝機能障害との興味深い関連をもたらす。筋肉はインスリン抵抗性の重要なレギュレーターとなるからである。したがって、全ての利用可能な証拠は、ＶＩ型コラーゲンは不活化ＥＣＭ成分を超えるものであり、インスリン抵抗性と関連した脂肪（および肝臓）代謝機能障害、２型糖尿病、およびＮＡＳＨの重要なメディエーターであることを強く示唆する。
【０１０６】
結論として、脂肪細胞および脂肪組織に顕著に由来する循環エンドトロフィンは、インスリン抵抗性に対して上昇し、インスリン増感剤に対する応答性を予測するものである。これによってインスリン増感剤に最適に応答し得る患者を確認およびモニタリングすることができ、このことが２型糖尿病およびおそらくＮＡＳＨの治療においてＰＰＡＲγアゴニストのベネフィットリスク比を改善する。
【０１０７】
本明細書中、明らかに他のことを示さない限り、語句「または」は、条件の１つのみが適合することを必要とする演算子「排他的論理和（exclusive or）」と対照的に、言及する条件の一方もしくは両方が適合するとき真の値に戻る演算子の意味で使用する。語句「含む」は、「からなる」を意味することではなく「包含する」の意味で使用する。前で承認した全ての従来の教示は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中の如何なる従来公開文書の承認も、それらの教示が本明細書の日付時点でオーストラリアまたは他の国において共通の一般知識であったことを容認または描写するものであると考えるべきではない。
【０１０８】
［文献］
【表１２Ａ】
2018511601.tif 000015
【表１２Ｂ】
2018511601.tif 000016
【表１２Ｃ】
2018511601.tif 000017
【表１２Ｄ】
2018511601.tif 000018
【表１２Ｅ】
2018511601.tif 000019
【表１２Ｆ】
2018511601.tif 000020
【表１２Ｇ】
2018511601.tif 000021
【表１２Ｈ】
2018511601.tif 000022
【表１２Ｉ】
2018511601.tif 000023
【表１２Ｊ】
2018511601.tif 000024
【表１２Ｋ】
2018511601.tif 000025
【表１２Ｌ】
2018511601.tif 000026
【表１２Ｍ】
2018511601.tif 000027
【図１】
2018511601.tif 000028
【図２−１】
2018511601.tif 000029
【図２−２】
2018511601.tif 000030
【図３】
2018511601.tif 000031
【図４】
2018511601.tif 000032
【図５】
2018511601.tif 000033
【図６】
2018511601.tif 000034
【図７】
2018511601.tif 000035
【図８−１】
2018511601.tif 000036
【図８−２】
2018511601.tif 000037
【図９】
2018511601.tif 000038
【図１０】
2018511601.tif 000039
【図１１】
2018511601.tif 000040
【図１２】
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【配列表】
2018511601000001.app
【国際調査報告】
2018511601.tif 000042
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