(57)【要約】  一般構造（式Ｉ）のインドロトリプトリン化合物を開示する。これらの化合物において、Ｒ１は水素、ハロゲンおよびＯＨから選択され；Ｒ２は（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシであり；ならびにＲ３は水素およびハロゲンから選択される。前記化合物は癌を処置するのに有用である。
2018519339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2018519339.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲンおよびＯＨから選択され；
Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシであり；ならびに
Ｒ３は、水素およびハロゲンから選択される］
の化合物。
【請求項２】
Ｒ３が塩素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がメトキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が水素またはＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がメトキシである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が塩素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
化合物：
【化２】
2018519339.tif 000019
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
化合物：
【化３】
2018519339.tif 000020
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
（４ｃＳ，７ａＲ）エナンチオマー：
【化４】
2018519339.tif 000021
である、請求項７に記載のエナンチオマー。
【請求項１０】
（４ｃＳ，７ａＲ）エナンチオマー：
【化５】
2018519339.tif 000022
である、請求項８に記載のエナンチオマー。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体および請求項１から１０のいずれかに記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の化合物を投与することを含む、ＥＧＦＲを過剰発現する癌を処置する方法。
【請求項１３】
前記癌が、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、食道癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、非小細胞肺癌、難治性乳癌、腎癌および結腸癌から選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年７月２日出願の米国特許仮出願第６２／１８７，８７３号の優先権を主張するものであり、前記仮出願の開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【連邦政府による資金提供を受けた研究】
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＮＩＨ  ＧＭ  ０７７５１６の下で政府支援を得て為された。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【発明の分野】
【０００３】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するインドロトリプトリンファミリーの化合物に関する。これらの化合物は様々な癌を処置するのに有用である。
【発明の背景】
【０００４】
トリプトファン二量体（またはビスインドール）は、構造的および機能的に多様なクラスの天然産物である。これらの中で最もよく研究されているのは、インドロカルバゾールであるスタウロスポリンおよびレベッカマイシンであり、これらはそれぞれキナーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤である。１つの非常に有力であるが、しかし現在まで、まれにしか遭遇されず、そのため十分に検討されていない、トリプトファン二量体のファミリーがインドロトリプトリンである。インドロトリプトリンは、インドールに縮合した核の三環式トリプトリン環を含有する。発酵に基づく天然産物発見プログラムで特徴付けられた２つの天然に存在するインドロトリプトリンが、クラドニアミドおよびＢＥ−５４０１７である。どちらも強力なヒト細胞の細胞傷害性を示す。
【発明の概要】
【０００５】
１つの態様では、本開示は、式Ｉ：
【化１】
2018519339.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲンおよびＯＨから選択され；
Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシであり；ならびに
Ｒ３は、水素およびハロゲンから選択される］
の化合物を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は塩素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、およびＲ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、Ｒ２はメトキシであり、およびＲ３は塩素である。
【０００７】
別の態様では、本開示は、式Ｉ：
【化２】
2018519339.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲンおよびＯＨから選択され；
Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシであり；ならびに
Ｒ３は、水素およびハロゲンから選択される］
の構造を有する化合物の薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は塩素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、およびＲ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、Ｒ２はメトキシであり、およびＲ３は塩素である。
【０００９】
別の態様では、本開示は、式Ｉ：
【化３】
2018519339.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲンおよびＯＨから選択され；
Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシであり；ならびに
Ｒ３は、水素およびハロゲンから選択される］
の構造を有する化合物に細胞を暴露することを含む、癌を処置する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は塩素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、およびＲ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨであり、Ｒ２はメトキシであり、およびＲ３は塩素である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲを過剰発現する癌である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、食道癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される癌である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、難治性乳癌、腎癌および結腸癌から選択される癌である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の化合物を含有する医薬組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明の実施は、特に異なる指示がない限り、当分野の技術範囲内で分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、これらの方法の多くを例示のために以下で説明する。そのような技術は文献中で十分に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，ｅｄ．，２００４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｚｄｉｎ  ａｎｄ  Ｌｕｋｙａｎｏｖ，ｅｄｓ．，２００９）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｈｏｂｏｋｅｎ  ＮＪ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１０）；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．，ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５）．Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｓ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４（４）４５３−６０９（２００２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ参照。上記で論じた公表文献は、もっぱら本出願の出願日以前のそれらの開示に関して提供されるものである。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【定義】
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。本発明のために、次の用語を以下で定義する。
【００１７】
「１つの（ａ、ａｎ）」という冠詞は、この冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
【００１８】
「または」の使用は、特に明記されない限り「および／または」を意味する。本出願で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびこの用語の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、数字または工程を排除することを意図しない。本出願で使用される場合、「およそ」および「約」という用語は等価物として使用される。およそ／約と共にまたはこれらなしで本出願において使用される任意の数字は、関連分野の当業者によって認識される通常の変動をカバーすることが意図されている。特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、特に明記されない限りまたは文脈から明白でない限り、いずれかの方向で言及される参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下（より大きいまたはより小さい）に含まれる値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００１９】
本明細書全体を通して、用語および置換基はそれらの定義を保持する。
【００２０】
特に明記または図示されない限り、本明細書で図示される構造体は、この構造体のすべての立体異性（例えばエナンチオマー、ジアステレオマーおよびシス−トランス異性）形態、例えば各不斉中心についてのＲおよびＳ配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）および（Ｅ）配座異性体を包含することも意図されている。それゆえ、本発明の化合物の単一の立体化学的異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマーおよびシス−トランス異性体（または配座異性体）混合物は本発明の範囲内である。特に明記されない限り、本発明の化合物のすべての互変異性体は本発明の範囲内である。
【００２１】
本明細書で使用されるラセミ、アンビスケールミックおよびスケールミック化合物または鏡像異性的に純粋な化合物の図式的表示は、Ｍａｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．６２，１１４−１２０（１９８５）から採っている：実線および破線の楔形は、キラルな要素の絶対配置を示すのに使用され；波線は、それが表す結合が生み出し得るいかなる立体化学的意味合いも指示せず；太い実線および破線は、図示されている相対配置を示すが、ラセミ体の特徴を表す幾何学的記述子であり；ならびに楔形の輪郭線および点線または破線は、不定の絶対配置の鏡像異性的に純粋な化合物を示す。したがって、式Ｘは、その対の純粋なシスエナンチオマーの両方を包含することが意図されている：
【化４】
2018519339.tif 000006
【概略】
【００２２】
天然微生物群集によってコードされる化学的多様性は、実験室条件下では環境細菌の大部分が培養不可能であることおよび生合成経路が沈黙化することに関連する制約のために著しく研究が遅れている。土壌は何千ものユニークな細菌種を含有しており、これらは潜在的に、何万もの機能的に調査されていない天然産物生合成遺伝子クラスターを内包する。メタゲノムクローニング法の開発により、土壌環境中に存在する膨大な生合成多様性を捕捉するライブラリを構築するために土壌から直接抽出されたＤＮＡ（環境ＤＮＡ、ｅＤＮＡ）を使用することが可能である。これらのライブラリは、調査されていない土壌生合成遺伝子クラスターを機能的に検討する手段を提供し、それゆえ、配列誘導性天然産物発見プログラムのための資源である。これらのライブラリを使用して、本発明者らは臨床的に適切な生物学的活性を有する新規化合物を同定した。
【００２３】
最も基本的な態様では、本発明は、構造：
【化５】
2018519339.tif 000007
を有する化合物ならびに前記化合物および前記化合物を含有する医薬組成物を使用する方法に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、構造：
【化６】
2018519339.tif 000008
を有する前記化合物の薬学的に許容される塩または溶媒和物ならびに前記化合物の薬学的に許容される塩または溶媒和物および前記化合物の薬学的に許容される塩または溶媒和物を含有する医薬組成物を使用する方法に関する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は塩素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はメトキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は水素またはＯＨである。
いくつかの実施形態では、本開示は、生の化学物質としての本明細書に記載の化合物の患者への投与を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物としての本明細書に記載の化合物の投与を提供する。さらなる態様によれば、本発明は、１つ以上の医薬担体、希釈剤または賦形剤および場合により１つ以上の他の治療成分と共に本明細書で開示される化合物を含有する医薬組成物を提供する。担体、希釈剤および賦形剤は、製剤の他の成分と適合的であり、およびその受容者に有害でないという意味で「許容され」（例えば「薬学的に許容され」）なければならない。
【００２６】
許容される担体、希釈剤および賦形剤は当分野で公知であり、これらには、限定されることなく、米国食品医薬品局によりヒトまたは家畜における使用に関して許容されると承認されている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤または乳化剤が含まれる。例示的な薬学的に許容される担体には、糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質不含水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤中で使用される任意の他の適合性物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
「薬学的に許容される塩」は、酸付加塩および塩基付加塩の両方を包含する。
【００２８】
「薬学的に許容される酸付加塩」とは、生物学的にまたはそれ以外でも望ましくないものではない、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持しており、ならびに無機酸、例えば、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば、限定されないが、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸等で形成される塩を指す。
【００２９】
「薬学的に許容される塩基付加塩」とは、生物学的にまたはそれ以外でも望ましくないものではない、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することによって調製される。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等が含まれるが、これらに限定されない。例えば無機塩には、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれるが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンならびに塩基性イオン交換樹脂、例えばアンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態で使用される例示的な有機塩基には、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインが含まれる。
【００３０】
湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、防腐剤および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。
【００３１】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；ならびに（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「患者」は、ヒトおよび哺乳動物（例えばマウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌおよびウマ）を包含する。多くの実施形態では、患者は、哺乳動物、特に霊長動物、とりわけヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、家畜、例えば畜牛、ヒツジ、ヤギ、雌牛、ブタ等；家禽、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ等；ならびに飼い慣らされた動物、特にペット、例えばイヌおよびネコである。いくつかの実施形態では（例えば特に研究状況では）、患者哺乳動物は、例えばげっ歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長動物またはブタ、例えば近交系ブタ等である。
【００３３】
本明細書で使用される「処置」または「処置すること」は、疾患または状態の症状または病状への任意の望ましい作用を包含し、処置される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の変化または改善でさえも包含し得る。「処置」または「処置すること」は、必ずしも疾患または状態またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を意味しない。この処置を受ける患者は、処置を必要とする任意の患者である。臨床的改善の例示的なマーカーは当業者に明らかである。いくつかの実施形態では、「処置すること」または「処置」は、成果を生じさせるために患者に化合物（例えば本明細書で開示される化合物の薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物または本明細書で開示される化合物を含有する医薬組成物）を送達することを包含する。化合物は、患者への投与によって送達され得る。
【００３４】
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した、妥当な利益／危険度比に相応する化合物、材料、組成物および／または剤形を指すのに使用される。
【００３５】
本明細書に記載の化合物に「細胞を暴露すること」は、限定されることなく、インビトロまたはインビボで細胞を接触させることを包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物に細胞を暴露することは、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物または本明細書で開示される化合物を含有する医薬組成物を患者に投与することによる。
【００３６】
患者への投与のための製剤には、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内および関節内を含む）、直腸ならびに局所（皮膚、口腔、舌下および眼内を含む）投与に適するものが含まれる。ほとんどの場合、非経口投与が好ましい。最も適切な経路は、受容者の状態および障害に依存し得る。製剤は、好都合には単位剤形で提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。
【００３７】
経口投与に適する本発明の製剤は、各々所定量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤もしくは錠剤などの個別単位として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型液体乳剤もしくは油中水型液体乳剤として提供され得る。活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはパスタ剤としても提供され得る。錠剤は、場合により１つ以上の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、界面活性剤または分散剤と混合して、粉末または顆粒などの自由流動形態の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤化された粉末化化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は、場合により被覆されるかまたは割線が入っていてもよく、その中の活性成分の持続、遅延または制御放出を提供するように製剤化され得る。
【００３８】
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性滅菌注射溶液が含まれる。非経口投与用製剤には、懸濁化剤および増粘剤を含有してもよい、水性および非水性滅菌懸濁液も含まれる。製剤は、単回用量または多回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供されてよく、使用の直前に滅菌液体担体、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、先に述べた種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【実施例】
【００３９】
実施例１：
多重プロモーター交換戦略を用いた、遺伝子クラスターを活性化するための一連の構成的に活性な二方向プロモーターカセットの評価
一連の構成的に活性な二方向プロモーターカセットの構築およびこれらのカセットを遺伝子クラスターに効率的に導入できることにより、本発明者らは、多重プロモーター交換戦略を用いて遺伝子クラスターを活性化するためのこれらの有用性を評価しようと試みた。最初に、トリプトファン二量体、レベッカマイシン（Ｒｅｂ）または芳香族ポリケチド、テタリマイシン（Ｔａｍ）のいずれかをコードすることが公知の十分に特徴付けられた天然産物生合成遺伝子クラスターを使用してこれを検討した。Ｒｅｂクラスターは本質的に転写的に活性であるが、Ｔａｍクラスターは転写的にサイレントであることが公知である。この試験で使用したＲｅｂ遺伝子クラスターは、最初にアリゾナ州の土壌のメタゲノムから単離され、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）に導入された場合、天然にレベッカマイシンを産生することが見出された。Ｒｅｂ遺伝子クラスターは３つのプロモーター：本発明者らのプロモーターカセットを試験するのに使用したｒｅｂＧ遺伝子とｒｅｂＯ遺伝子の間の反対方向に配向された２つのプロモーターおよびｒｅｂＲ遺伝子の上流の３番目のプロモーター、を含むと予測される。ｒｅｂＧ遺伝子とｒｅｂＯ遺伝子の間の二方向プロモーター部位をＴＲＰ１二方向プロモーターカセットに置き換え、一方ｒｅｂＲ遺伝子の上流域内の一方向プロモーターは、１個のプロモーターだけが組換えに使用されるアンプリコンに組み込まれた（すなわち一方向プロモーターカセット）、ＭＥＴ１５カセットに置き換えた。次にこの構築物を、異種発現試験のために酵母から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を介してＳ．アルバスに移動させた。野生型Ｒｅｂ遺伝子クラスターまたはプロモーター交換したＲｅｂ遺伝子クラスターで形質転換したＳ．アルバスの培養物からの有機抽出物のＨＰＬＣ分析は、レベッカマイシンの産生に有意差を示さず、本発明者らのプロモーター再構築ツールが転写的にサイレントな天然産物生合成遺伝子クラスターからの分子産生を誘導できることを示唆した。
【００４０】
Ｔａｍ遺伝子クラスターは、抗生物質、テタリマイシンＡおよびＢをコードするｅＤＮＡ由来のＩＩ型（芳香族）ポリケチドシンターゼ生合成遺伝子クラスターである。Ｓ．アルバスでは、この遺伝子クラスターは、遺伝子クラスター特異的ＳＡＲＰファミリーの正の調節因子であるｔａｍＩを人為的に上方調節しない限り、転写的にサイレントである。Ｔａｍ遺伝子クラスターは、４つのプロモーター領域によって駆動される８つの生合成オペロンを含むと予測される。本発明者らは、２回のＴＡＲを用いて４つのプロモーター領域全部を合成プロモーターカセットに置き換えた。１回目の酵母形質転換では、ＬＥＵ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３ベースのプロモーターカセットを、４０ｂｐのホモロジーアームを用いてＴａｍ遺伝子クラスターに並行して挿入した。次に、５００ｂｐのホモロジーアームを有するプロモーターカセットを各々の再構築した遺伝子クラスターから増幅した。２回目のＴＡＲでは、５００ｂｐのホモロジーアームを有するＬＥＵ２、ＭＥＴ１５およびＴＲＰ１ベースのプロモーターカセットを、ＨＩＳ３プロモーターカセットを保持するＴａｍ遺伝子クラスターに同時に挿入した。Ｔａｍクラスターへの４つのプロモーターカセット全部の挿入の成功を、ＰＣＲを用いて再構成された遺伝子クラスターを遺伝子型判定することによって確認した。プロモーター再構築Ｔａｍクラスターを大腸菌Ｓ１７に形質転換し、異種発現試験のためにＳ．アルバス内に結合した。プロモーター再構成ＴａｍクラスターまたはＳＡＲＰ調節エレメントの誘導発現を介して活性化した野生型クラスターのいずれかで形質転換したＳ．アルバスからの培養ブロス抽出物のＬＣ−ＭＳ分析は、基本的に同じレベルのテタリマイシン産生を示し、完全なプロモーター再構成がこの遺伝子クラスターによる代謝産物産生のネイティブなレベルを複製できることを示唆した。
【００４１】
活性化を必要とするサイレント遺伝子クラスターは、ますます（メタ）ゲノムＤＮＡ配列決定データセットに出現しつつある。本発明者らは、本発明者がＬｚｒ遺伝子クラスターと称する、これまで特徴付けられていなかったサイレントな、本発明者が天然では死んでいると信じる、ｅＤＮＡ由来のインドロトリプトリン遺伝子クラスターを活性化し、強力なヒト細胞傷害性を有する新規インドロトリプトリン代謝産物を生成するために本発明者らのプロモーター構築法を使用した。インドロトリプトリンは、インドールに縮合した核の三環式トリプトリン環を含有する。発酵に基づく天然産物発見プログラムで特徴付けられた２つの天然に存在するインドロトリプトリンが、クラドニアミドおよびＢＥ−５４０１７である。どちらも強力なヒト細胞の細胞傷害性を示す。観察されたインドロトリプトリンの天然の多様性を拡大し、潜在的にそれらの治療可能性を改善するために、トリプトファン二量体化酵素をコードする遺伝子を標的とする変性プライマーを用いてｅＤＮＡコスミドライブラリをＰＣＲスクリーニングした。これは、クラドニアミドおよびＢＥ−５４０１７遺伝子クラスターに酷似する、Ｌｚｒ遺伝子クラスターの発見をもたらした；しかし、これは、いかなる公知のインドロトリプトリンの生合成においても使用されないテーラリング酵素（例えばエクストラハロゲナーゼおよびシトクロムｐ４５０オキシダーゼ）をコードしており、新規インドロトリプトリンコンジナーをコードすることを示唆する。Ｌｚｒ遺伝子クラスターを、２つのオーバーラップするｅＤＮＡコスミドクローン（ＡＺ２５−２９２およびＡＺ２５−１５３）に関する以前に保管されたアリゾナ砂漠土壌のｅＤＮＡライブラリから回収した。完全長Ｌｚｒ遺伝子クラスターを、ＴＡＲおよびｐＴＡＲａベースの経路特異的な大腸菌：酵母：ストレプトミセスシャトル捕獲ベクターを用いてこれら２つのコスミドから再構築し、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＢＡＣ−ＡＺ２５−２９２／１５３を生成した。このＢＡＣを異種発現試験のためにＳ．アルバスに導入したが、この菌株は、本発明者らが試験したすべての培養条件下でいかなる検出可能なクローン特異的代謝産物も産生することができず、Ｌｚｒ遺伝子クラスターがＳ．アルバスにおいてサイレントであることを示した。本発明者らは、本発明者のプロモーター置換ツールを試験するためにこのサイレントな潜在的遺伝子クラスターを使用した。
【００４２】
Ｌｚｒ遺伝子クラスターの外縁を、ＢＥ−５４０１７およびクラドニアミド遺伝子クラスターとの比較ならびにコアインドロトリプトリン生合成遺伝子を取り囲む遺伝子のＢＬＡＳＴ分析に基づいて定義した。インドロトリプトリンの生合成は十分に特徴付けられており、Ｌｚｒ遺伝子クラスター中の大部分の遺伝子の機能を予測することを可能にしている。インドロトリプトリン生合成の４つの重要な段階は、クロモピロール酸を形成するオキソトリプトファンの二量体化；インドロカルバゾールを形成するアリール−アリール酸化カップリング；インドロトリプトリンを形成するインドール環の１つの「フリッピング」；および最終産物を生成するテーラリングを含む。Ｌｚｒ遺伝子クラスターは、３つの二方向プロモーター領域と１つの一方向プロモーター領域によって制御される７つの転写単位を含むと思われる。このクラスターは、好都合には、３つの二方向プロモーター領域Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の連続的な活性化が、それぞれインドロトリプトリン生合成における第一、第二および第三段階を達成するのに必要な遺伝子の発現を駆動すると予想されるように編成される。一連の単一カセット挿入において、本発明者らは、各々の二方向Ｌｚｒプロモーター領域を合成プロモーターカセットに置き換えた。予想されたように、Ｐ１およびＰ１＋Ｐ２置換構築物はそれぞれクロモピロールおよびインドロカルバゾール中間体を生成した。Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３置換遺伝子クラスターは、しかしながら、予想されたインドロトリプトリン中間体ではなくインドロカルバゾール中間体を生成した。Ｃ４ｃ／Ｃ７ａジオールを組み入れる酸化酵素をコードすると予測される遺伝子、ｌｚｒＸ１の詳細な検討は、一塩基欠失が、トランケートされた、おそらく非機能性のｌｚｒＸ１遺伝子（すなわち偽遺伝子）をもたらしたことを示唆した。したがって、Ｌｚｒ遺伝子クラスターは、サイレントであるだけでなくｌｚｒＸ１遺伝子の破壊のために死んでいると思われる。
【００４３】
理想的には、遺伝子クラスター活性化ツールは、それゆえ、プロモーターの置換を介してサイレント遺伝子クラスターを覚醒できるだけでなく、密接に関連する遺伝子クラスター中に認められる機能性ホモログと偽遺伝子との交換を介して死んでいる遺伝子クラスターを「蘇生させる」柔軟性も有するべきである。Ｌｚｒクラスターを蘇生させるために、本発明者らは、目的の遺伝子クラスターに合成プロモーターと新しい遺伝子の両方を同時挿入することを可能にするように本発明者のプロモーター交換法を拡大適用した。この場合は、ｌｚｒＸ１偽遺伝子の完全長ホモログであるＢＥ−５４０１７遺伝子クラスターからのａｂｅＸ１遺伝子およびプロモーター選択カセットを独立してＰＣＲ増幅し、２０ｂｐのオーバーラップを有するアンプリコンを生成した。次に２回目のＰＣＲを実施し、生じたアンプリコンを、４０ｂｐのＬｚｒクラスター特異的ホモロジーアーム、２個のプロモーター、完全長ａｂｅＸ１酸化遺伝子およびＬＹＳ２マーカー遺伝子を含有する単一カセットに連結した。次にこのカセットを標準的なＴＡＲプロモーター交換反応で使用し、破壊されたｌｚｒＸ１遺伝子およびＰ３プロモーター領域の両方を置き換えた。このカセットのＰ３部位への導入後、新たなＰ１＋Ｐ２＋Ｐ３再構築遺伝子クラスターは、Ｓ．アルバスに、本発明者らがラザリミドＣと称する新しいインドロカルバゾール、および本発明者らがラザリミドＢと称する新しいインドロトリプトリンベースの代謝産物（化合物６）を産生する能力を付与することが認められた。
【化７】
2018519339.tif 000009
【００４４】
実施例２：
一方向合成プロモーターカセットでのＰ４の置換によるＬｚｒ遺伝子クラスターの再構成の完了
Ｌｚｒ遺伝子クラスターの再構成を完了するために、本発明者らはＰ４を一方向合成プロモーターカセットに置き換えた。この完全再構築Ｌｚｒ遺伝子クラスターを用いた異種発現試験は、これまでの再構築された構築物で形質転換したＳ．アルバスの培養物中では見られなかった１個のさらなる重要な代謝産物の存在を示した。本発明者らがラザリミドＡという慣用名を与えた化合物７を、完全再構築Ｌｚｒ遺伝子クラスターで形質転換したＳ．アルバスの大規模培養物から精製し、ＨＲＥＳＩＭＳ、ならびに１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲを用いてその構造を解明した。
【化８】
2018519339.tif 000010
【００４５】
ラザリミドシリーズの代謝産物の一般構造を、ラザリミド中間体であるラザリミドＣの結晶構造でさらに確認した。ラザリミドＡ（７）は、そのハロゲン化パターンおよびフリップされたインドール部分の酸化の両方によってクラドニアミドおよびＢＥ−５４０１７とは異なる。この生化学の詳細は、２０１５年７月６日に公表された、Ｍｏｎｔｉｅｌ，Ｋａｎｇ，Ｃｈａｎｇ，Ｃｈａｒｌｏｐ−Ｐｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｙ，「Ｙｅａｓｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳに見出すことができる。
【００４６】
実施例３：
化合物の細胞傷害性の測定
公知のインドロトリプトリンは強力なヒト細胞株毒素であるので、ラザリミドＣ、新規化合物６および７、ならびに対照としてクラドニアミドＡをＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌細胞に対する細胞傷害性に関して試験した。クラドニアミドＡ、ラザリミドＣならびに化合物６および７に関して認められたＩＣ５０は、それぞれ４０．４ｎＭ、２５．８μＭ、１１．６ｎＭおよび８．４ｎＭであった。
【００４７】
結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２４７）を使用して、化合物を３組重複して抗増殖活性に関して試験した［その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１（５）：１７５１−１７５６（１９８１）参照］。アッセイのために、凍結ＨＣＴ−１１６細胞を解凍し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したマッコイ５Ａ改変培地（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。細胞を１回継代培養し、次に対数増殖期の細胞をトリプシン処理によって採取した。トリプシン処理した細胞を９６ウェルプレートに接種し（１，０００細胞／ウェル）、５％ＣＯ２の存在下に３７℃で一晩インキュベートした。化合物６、７、ラザリミドＣおよびクラドニアミド（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートにわたって培地に連続的に希釈し（５０μｇ／ｍＬから出発して２倍希釈）、１００μＬをアッセイプレート中の適切なウェルに移した。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後クリスタルバイオレット比色アッセイを用いて生存能に関して評価した［Ｚｉｖａｄｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃＡＭＰ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．」Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１）：Ｒ１０１−１１２（２００５）参照］。ＤＭＳＯ対照ウェルと比較して、化合物処理したウェルにおいて５９０ｎｍの吸光度に基づいて細胞生存能を記録した。
【００４８】
クラドニアミドＡ、ラザリミドＣならびに化合物６および７に関して認められたＩＣ５０は、それぞれ４０．４ｎＭ、２５．８μＭ、１１．６ｎＭおよび８．４ｎＭであった。
【００４９】
実施例４：
本明細書で開示される化合物についての一般的合成方法
本発明の化合物の一般的合成をスキーム１に示す。
【化９】
2018519339.tif 000011
【化１０】
2018519339.tif 000012
【００５０】
スキーム１において、Ｒ１ａは、水素、ハロゲンまたは保護されたヒドロキシルである。Ｒ１ａが保護されたヒドロキシルである場合、以下で述べるように、脱保護の最終段階を実施し、Ｒ１＝ＯＨを得る。
【００５１】
具体的な合成は以下に従う：
【化１１】
2018519339.tif 000013
【００５２】
インドロトリプトリン６ａおよび７の合成は、Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０１２），１４（１７），４４１８−４４２１の手順に従う。Ｋｉｍｕｒａ（同上）に述べられている方法によって得られる、アシルインドール１を、還流で１の１グラムにつき酢酸１０ｍＬ中２当量のヒドラジン２と反応させる。反応物を冷却し、酢酸エチルで希釈して、飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチングする。有機層を水、次に飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、ストリッピングし、粗物質３を得て、これを精製せずに次の段階で使用する。
【００５３】
ビスインドール３をトルエンに溶解する；１．８当量のＮ−メチルマレイミドおよび触媒量のＳｎＣｌ２（０．１６当量）を添加する。反応が実質的に完了するまで混合物を還流させる。トルエンをストリッピングして除去し、生成物４を、酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルでのクロマトグラフィによって精製する。
【００５４】
スクシンイミジルビスインドール４を、高温（例えば２００℃）にてニトロベンゼン中１当量のパラジウムブラックで処理することによって環化する。反応混合物をシリカゲルでろ過し、シクロヘキサン／クロロホルムで溶出してニトロベンゼンを除去し、次にクロロホルム／メタノール／トリフルオロ酢酸で溶出して生成物５をシリカから分離する。溶出液を濃縮し、酢酸エチルに溶解して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、次に水、次にブラインで洗浄する。これをＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、クロロホルム／メタノールで溶出するシリカゲルカラムに通し、純粋な５を得る。
【化１２】
2018519339.tif 000014
【００５５】
完全に構築された環系５を、１当量の四酸化オスミウムを用いてピリジンに溶解し、出発物質が消費されるまで４０℃で加熱する。過剰の飽和ＮａＨＳＯ３水溶液を添加し、混合物を高温（例えば４０−６０℃）で数時間激しく撹拌する。混合物を酢酸エチルに抽出し、水、次にブラインで洗浄する。これをＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、クロロホルム／メタノールで溶出するシリカゲルカラムに通し、純粋なシスジオール６を得る。シスジオールの個々のエナンチオマーは、酢酸エチル／ヘキサンを用いるＤａｉｃｅｌ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＣ（登録商標）ＩＣなどのキラル媒質でのクロマトグラフィによって入手し得る。
【００５６】
生成物７のために、シスジオール６ｂをエタノールに溶解し、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で処理する。エタノールをストリッピングして除去し、生成物を酢酸エチルに抽出して、水、次にブラインで洗浄する。これをＮａ２ＳＯ４で乾燥し、酢酸エチルを除去する。
【００５７】
置換フェニルヒドラジン２ａ（Ｒ＝Ｈ）はＡｌｄｒｉｃｈから市販されている。置換フェニルヒドラジン２ｂは、市販の２−クロロ−４−ニトロフェノールを塩基の存在下に塩化メタンスルホニルで処理し、次いでニトロを還元して（例えばエタノール中のパラジウム触媒での水素化によって）、水性酸（例えばＨＣｌまたはＨ２ＳＯ４）の存在下にアニリンを亜硝酸ナトリウムと反応させることによって得られる。
【００５８】
ラザリミドＡ（７）を、最初に、上述したように４つのプロモーターカセット（Ｐ１−Ｐ４）およびａｂｅＸ１酸化遺伝子と共に再構築Ｌｚｒ遺伝子クラスターを保持するＳ．アルバスの抽出物から単離した。ＨＲＥＳＩＭＳスペクトルにおいてｍ／ｚ  ４８６．０２６０（［Ｍ−Ｈ］−）で観察された擬分子イオン（ｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｏｎ）は、分子式Ｃ２２Ｈ１５Ｃｌ２Ｎ３Ｏ６を裏付ける。ＨＲＥＳＩＭＳスペクトルは強力なＭ＋２およびＭ＋４シグナルを示し、２個の塩素の存在を指示した。バイオインフォマティクス解析から予想されたように、７の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、１１．５９ｐｐｍの特徴的なインドールＮＨ（Ｈ−１３）、２．８６ｐｐｍのＮ−Ｍｅ（Ｈ−１４）および８ｐｐｍ付近の芳香族シグナルを含む、インドロトリプトリンファミリーの化合物に特徴的なシグナルを示した。ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣスペクトルの分析は、フラグメントａおよびフラグメントｂと表される２つのサブ構造体を確立した。Ｈ−１（δＨ  ７．５１）とＨ−２（δＨ  ７．１７、オルトカップリング、Ｊ＝８．６Ｈｚ）の間およびＨ−２とＨ−４（δＨ  ７．８８、メタカップリング、Ｊ＝１．７Ｈｚ）の間のＣＯＳＹ相関は、Ｈ−１３（δＨ  １１．５９、ＮＨ）からＣ−１３ａ（δＣ  １３６．６）およびＣ−１２ｂ（δＣ  １２７．９）へ、Ｈ−１（δＨ  ７．５１）からＣ−３（δＣ  １２４．７）およびＣ−４ａ（δＣ  １２６．０）へ、Ｈ−２（δＨ  ７．１７）からＣ−４（δＣ  １１９．４）およびＣ−１３ａ（δＣ  １３６．６）へ、ならびにＨ−４からＣ−４ａ（δＣ  １２６．０）およびＣ−１３ａ（δＣ  １３６．６）へのＨＭＢＣ相関と共に、インドロトリプトリンファミリーの化合物において典型的に認められる、Ｃ−３に塩素化およびＣ−４ｂとＣ−１２ｂに付加的な二置換を有するインドール部分の存在を指示した。Ｈ−１４（δＨ  ２．８６）からＣ−５（δＣ  １７４．２）およびＣ−７（δＣ  １７１．４）へ、Ｃ４ｃ−ＯＨ（δＨ  ７．１６）からＣ−４ｂ（δＣ  １０３．８）、Ｃ−４ｃ（δＣ  ７４．８）、Ｃ−７ａ（δＣ  ８７．１）およびＣ−５（δＣ  １７４．２）へ、ならびにＣ７ａ−ＯＨ（δＨ  ８．１７）からＣ−４ｃ（δＣ  ７４．８）、Ｃ−７ａ（δＣ  ８７．１）およびＣ−７（δＣ  １７１．４）へのＨＭＢＣ相関は、Ｃ−４ｃおよびＣ−７ａに付加的な置換を有するＮ−メチル−ジヒドロキシスクシンイミドの構造を明らかにした。このスクシンイミド部分は、Ｃ４ｃ−ＯＨ（δＨ  ７．１６）およびＨ−４（δＨ  ７．８８）からＣ−４ｂ（δＣ  １０３．８）へのＨＭＢＣ相関によって塩素化インドール部分に結合され、サブ構造体ａを確立した。サブ構造体ｂもＨＭＢＣ相関によって定義した。Ｃ１０−ＯＨ（δＨ  ９．８１）からＣ−９（δＣ  １１８．０）、Ｃ−１０（δＣ  １４７．２）およびＣ−１１（δＣ  １０２．５）へ、Ｈ−８（δＨ  ８．０４）からＣ−１０（δＨ  １４７．２）およびＣ−１１ａ（δＣ  １２１．２）へ、Ｈ−１１（δＨ  ７．１６）からＣ−７ｃ（δＣ  １３０．４）およびＣ−９（δＣ  １１８．０）へ、ならびに１２−ＯＭｅ（δＨ  ４．０２）およびＨ−１１（δＨ  ７．１６）からＣ−１２（δＣ  １３５．７）へのＨＭＢＣ相関は、���ブ構造体ｂがＣ−９に塩素化、Ｃ−１０にヒドロキシル化およびＣ−１２にメトキシル化ならびに２つの付加的な置換を有する別のインドール部分であることを指示する。
【００５９】
サブ構造体ａとｂを結合するＨＭＢＣ相関は、構造体全体にわたる第四級炭素の存在のために認められなかった。しかし、インドロトリプトリン骨格の存在は、公知のインドロトリプトリンとの炭素化学シフト比較、ＮＯＥＳＹ相関データおよび遺伝子クラスターのバイオインフォマティクス解析に基づいて推定することができた。Ｃ４ｃ（δＣ  ７４．８）の化学シフトと比較してＣ−７ａ（δＣ  ８７．１）のダウンフィールドシフトされた化学シフトは、Ｃ−７ａが窒素置換されていることを示唆する。インドロトリプトリン構造体の存在は、１２−ＯＭｅとＨ−１３（ＮＨ）の間で認められたＮＯＥ相関によってさらに確認された。Ｃ４ｃ−ＯＨとＣ７ａ−ＯＨの間で認められたＮＯＥ相関は、これら２つのヒドロキシル基の間の「シス」配置を示唆し、７の構造決定を完了させた。前記考察で用いたナンバリングシステムは以下に示すとおりである：
【化１３】
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【００６０】
これはＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓによって使用されるナンバリングシステムとはいくぶん異なっており、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓは、インドロトリプトリンアルカロイドの索引作成において以下のナンバリングを割り当てている：
【化１４】
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【００６１】
以下の特許請求の範囲では、内的整合性のために、４ｃ−７ａナンバリングを使用しており、これは、対応するキラル炭素としてのＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓの８ａ−５ａのナンバリングに相当する。
【００６２】
【化１５】
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ラザリミドＣのＸ線結晶構造に基づき、７の構造体中のヒドロキシル基を担持する立体中心炭素Ｃ−４ｃおよびＣ−７ａの絶対配置を推定することができる。ラザリミドＣのＸ線結晶学はＣ−４ｃの配置を「Ｓ」と割り当て、この炭素の絶対配置は酸化を介したインドール環フリッピング段階の間同じままである可能性が高く、したがってＣ−４ｃとＣ−７ａのヒドロキシル基間で認められた「シス」関係と合わせて、７の構造体中のＣ−４ｃおよびＣ−７ａの絶対配置はそれぞれ「Ｓ」および「Ｒ」と推定された。この割り当ては、クラドニアミドＡについて報告された絶対配置と一致する。
【００６３】
ラザリミドＢ（６）を、３つのプロモーターカセット（Ｐ１−Ｐ３）およびａｂｅＸ１酸化遺伝子と共に再構築Ｌｚｒ遺伝子クラスターを保持するＳ．アルバスの抽出物から単離した。ＨＲＥＳＩＭＳスペクトルにおいて４７０．０３２０（［Ｍ−Ｈ］−）で観察された分子イオンは、Ｃ２２Ｈ１５Ｃｌ２Ｎ３Ｏ５の分子式を指示する。６のＨＲＥＳＩＭＳスペクトルも、Ｍ＋２およびＭ＋４に対応する強力なシグナルを示し、２個の塩素の存在を指示した。ラザリミドＢ（６）の構造は、化合物７とのＮＭＲスペクトルの比較によって決定した。化合物６は、フリップされたインドール環部分に対応すると予測される化学シフトのセットを除き、７のものとほぼ同一の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータを示した。１Ｈプロトンスペクトルにおいて、化学シフトおよび分裂パターンの両方で相違が認められた。第一に、１つの付加的なプロトンシグナルが観察され、これはＨ−８（δＨ  ８．１１、Ｊ＝１．８Ｈｚ）およびＨ−１１（δＨ  ７．７５、Ｊ＝８．５Ｈｚ）とのＣＯＳＹ相関を示した。これは、化合物６がＰ４５０ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むオペロンについてのプロモーター置換なしで得られるという事実と共に、化合物６が７の非ヒドロキシル化類似体であることを指示した。
【００６４】
本明細書中で参照されるおよび／または出願データシートに列挙される上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
本発明の特定の実施形態を例示のために本明細書で説明したが、前記から、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を行い得ることが理解される。したがって、本発明は、付属の特許請求の範囲による場合以外は限定されない。
【国際調査報告】
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