(57)【要約】  本発明は、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法に関する。かかる方法は、胎児の細胞（および／または胎児の胎盤）を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において差次的なメチル化を示すものを包含する、ＤＮＡの２つ以上の領域の特定の構成および／または検出および／または分析の１つ以上に基づく。かかる方法は、前記妊娠女性から取られたサンプルを利用し、このサンプルは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含む。かかる方法は；特に、胎児のトリソミーなどの染色体異数性の検出／診断にとって、および／または妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかもしくは発生する増大したリスクを検出することにとって、診断的な、予後的な、および／または予測的な有用性を有する。本発明は、かかる方法の実施に用いられ得る、有用であり得る、または関係し得る組成物、キット、コンピュータプログラム製品、および他の態様にもまた関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法であって、
前記方法が：
（ａ）  前記妊娠女性から取られたサンプルを提供し、このサンプルが、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含むステップと；
（ｂ）  前記サンプル中に存在するＤＮＡを、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理するステップと；
（ｃ）  前記サンプル中の染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記染色体上に位置する２つ以上の第１の標的の差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）におけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第１の標的ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第１の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変はＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量は、前記サンプル中の第１の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｄ）  前記サンプル中の１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記参照染色体上に位置する２つ以上の参照ＤＭＲにおけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記参照ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬によるかかる参照ＤＭＲのＤＮＡの改変は、ＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記参照ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の参照ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）  ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量、好ましくは比を決定し、前記相対量の１つ以上が胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出が、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用いる、
方法。
【請求項２】
ステップ（ｅ）において、前記相対量または比が閾値および／または参照分布と比較され、
前記閾値および／または参照分布よりも高いかまたは低い前記相対量または比の１つ以上は、胎児の染色体異数性の存在を指示する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照ＤＭＲの２つ以上が異なる参照染色体上に位置する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｆ）  胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化されない少なくとも１つの他の領域（ＯＲ）を検出することによって、前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を決定し、前記試薬によるＯＲの改変がＤＮＡのメチル化に対して非感受性であるステップ、
を含み、
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）およびステップ（ｆ）における前記検出が、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲおよび前記他の領域について、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つおよび前記ＯＲの少なくとも１つに用いる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＲが１つ以上の参照染色体上に位置し、好ましくは前記ＯＲの少なくとも１つが前記参照ＤＭＲの少なくとも１つと同じ参照染色体上に位置する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ）’  前記サンプル中の異なる染色体異数性に関わる染色体である第２の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記異なる染色体異数性に関わる染色体上に位置する２つ以上の第２の標的ＤＭＲにおけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第２の標的ＤＭＲが、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第２の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変がＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第２の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の第２の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）’  ステップ（ｃ）’から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量、好ましくは比を決定し、前記相対量の１つ以上が胎児の異なる染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
ステップ（ｃ）およびステップ（ｃ）’およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）における前記検出が、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記第２の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つおよび前記第２の標的ＤＭＲの少なくとも２つおよび任意のＯＲに用いる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｅ）’において、前記相対量または比が閾値および／または参照分布と比較され、
前記閾値および／または参照分布よりも高いかまたは低い前記相対量または比の１つ以上は、胎児の異なる染色体異数性の存在を指示する、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）における前記検出に先立って、またはその一部として、前記ＤＭＲおよび／または前記任意のＯＲを含む各ＤＮＡ領域が増幅される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）に用いられる各検出可能な標識が、蛍光、タンパク質、低分子、または放射性標識からなる群から独立して選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）および／または任意のステップ（ｃ）’における前記検出が、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または任意の第２の標的ＤＭＲの１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる、定量的リアルタイムＰＣＲを含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）における前記検出が、そのそれぞれが前記参照ＤＭＲの１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いる、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲを含む、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｆ）における前記検出が、前記ＯＲの１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる、定量的リアルタイムＰＣＲを含む、
請求項４に従属するときの先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＯＲが、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つの約２０ｂｐおよび２０ｋｂの間上流または下流に、および／またはそれと同じ遺伝子内に位置する、
請求項４に従属するときの先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｆ）における前記検出が、前記ＯＲの少なくとも２つを用いることを含み；好ましくは、前記ＯＲの数がステップ（ｄ）において用いられる参照ＤＭＲの数と同じであり；より好ましくは、前記ＯＲの１つが、ステップ（ｄ）において用いられる参照ＤＭＲと同じ染色体上に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し、前記ＯＲの互いが、前記参照ＤＭＲの別のものと同じ染色体上に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置する、
請求項４に従属するときの先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｆ）における前記検出が：（ｘ）同じ検出可能な標識を前記ＯＲのそれぞれに用いてなされる、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｆ）における前記検出が、そのそれぞれが前記ＯＲの１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いる、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲを含む、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出ベッセル中において、有効に互いと同時に、前記ＤＭＲおよび任意のＯＲのそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲによってなされる、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、全血、血液画分、尿、唾液、汗、涙、痰、母乳、乳吸引物、膣分泌物、膣洗液、および結腸洗液からなる群から選択される体液のサンプルであり；より好ましくは前記サンプルが血漿または血清サンプルである、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とする前記ＤＮＡ種が循環セルフリーＤＮＡであり、前記サンプルが血液画分、例えば血漿または血清である、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する前記試薬が、バイサルファイトを含む、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する前記試薬は、メチル化されていないＤＮＡをメチル化されたＤＮＡよりも選択的に消化する主剤を含み、好ましくは、前記主剤は：
・  少なくとも１つのメチル化感受性の酵素；
・  少なくとも１つのメチル化感受性の制限酵素；ならびに／または
ＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩ、およびＺｒａＩからなる群から選択される主剤、
を含む、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記染色体異数性に関わる染色体が：２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体、好ましくは２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、最も好ましくは２１番染色体からなるリストから選択されるヒト染色体であり；前記染色体異数性が、前記染色体の異数性、好ましくは前記染色体のトリソミーである、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記異なる染色体異数性に関わる染色体が：２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体、好ましくは１８番染色体または１３番染色体、最も好ましくは１８番染色体からなるリストから選択される異なるヒト染色体であり；前記異なる染色体異数性が、前記異なる染色体の異数性、好ましくは前記異なる染色体のトリソミーである、
請求項６に従属するときの請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記染色体異数性に関わる染色体および前記異なる染色体異数性に関わる異なる染色体が：２１番および１８番染色体、２１番および１３番染色体、ならびに１８番および１３番染色体からなるリストから選択されるヒト染色体のペアであり；前記染色体異数性および前記異なる染色体異数性が、それぞれの染色体の異数性、好ましくはそれぞれの染色体のトリソミーである、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
各参照染色体が：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２番染色体、１４、１５、１６、１７番染色体、１９番染色体、２０番染色体、２２番染色体、および２３番染色体からなるリスト、好ましくは５番染色体または１２番染色体から独立して選択されるヒト染色体である、
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つの参照ＤＭＲがヒト５番染色体上に位置し、別の参照ＤＭＲがヒト１２番染色体上に位置する、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の標的ＤＭＲのそれぞれがヒト２１番染色体、ヒト１８番染色体、またはヒト１３番染色体、好ましくはヒト２１番染色体上に位置し；任意に、存在する場合には、前記第２の標的ＤＭＲのそれぞれがヒト１８番染色体またはヒト１３番染色体上に位置する、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡにおいて高メチル化され、母親ＤＮＡにおいて低メチル化される、
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含む、
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＷＯ２０１１／０９２５９２のＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ７、ＥＰ８、ＥＰ９、ＥＰ１０、ＥＰ１１、およびＥＰ１２［配列番号３３〜４４］からなるリストから選択されるものを包含する、ＷＯ２０１１／０９２５９２に開示されているもの；あるいは
・  ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、およびＥＲＧ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１ｏｒｆ２９、およびＨＬＣＳ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  Ｃ２１ｏｒｆ５７、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列；あるいは
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９、および２６１からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列；あるいは
・  マスピン、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列、
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する、
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する、
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記参照ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＰＣＤＨＧＡ１、ＳＯＸ１４、およびＳＰＮ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する、
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
決定の複数のセットがステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）についてなされ、
前記決定の各セットは、前記サンプルのＤＮＡの異なるアリコートを用いて、異なるベッセル中において、有効に決定の複数のセットの互いのメンバーと同時になされる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
決定の前記複数のセットが、２および約５０の間のセット、例えば２および約２０の間、２および約１０の間、または約５および約１５の間のセットであり；好ましくは、決定の前記複数のセットが：前記決定の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２セットからなる群から選択される、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｅ）および任意のステップ（ｅ）’において決定される相対量または比が、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）についてなされる、決定の前記複数のセットから、好ましくは、各セットについて決定されるＤＮＡの平均量、例えば各セットについて決定されるＤＮＡの平均、中央値、またはモード量、好ましくは各セットについて決定されるＤＮＡの平均量を用いることにより、決定される、
請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルに対して実施され、各方法が、別個のベッセル中において、有効に、複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施される、
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数のサンプルが、２および約５００の間のサンプル、例えば２および約２００の間、２および約１００の間、または約５および約１５０の間のサンプルであり；好ましくは、前記複数のサンプルが、それぞれが異なる妊娠女性から取られた約：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００，１２０、および１４０サンプルからなる群から選択される、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記決定ステップのそれぞれにおいて、前記第１の標的ＤＮＡ種のおよび前記任意の第２の標的ＤＮＡ種の前記決定される量のそれぞれが、各ケースにおいて、前記サンプル中の前記第１の標的ＤＮＡ種および前記任意の第２の標的ＤＮＡ種対トータルＤＮＡの相対濃度として表される、
請求項４に従属するときの先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
・  ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）に用いられる同じＤＭＲに関して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中のＤＮＡの量を決定するステップと；
・  ＤＮＡの前記標準サンプルから検出されるシグナルのそれぞれを、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）において検出されるそれぞれのシグナルと比較するステップと、
をさらに含む、
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＤＮＡの標準サンプルが既知濃度のヒトゲノムＤＮＡのサンプルである、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記決定ステップのそれぞれにおいて、前記第１の標的ＤＮＡ種および前記任意の第２の標的ＤＮＡ種および参照ＤＮＡ種の前記決定される量のそれぞれが、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表される、
請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
第１の標的ＤＮＡ種の量が、第１の標的ＤＭＲの１つにおけるメチル化の検出量から決定され、第１の標的ＤＮＡ種の量が、第１の標的ＤＭＲの別のものにおけるメチル化の検出量から決定される、
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
２つ以上の相対量、好ましくは比が、ステップ（ｅ）において、第１の標的ＤＮＡ種の２つ以上の量について、それぞれ前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上に関して決定される、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記相対量または比の２つ以上は胎児の染色体異数性の存在または不在を指示する、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｅ）において、前記相対量または比の２つ以上が閾値および／または参照分布と比較され、
前記閾値および／または参照分布よりも高いかまたは低い前記相対量または比の２つ以上が、胎児の染色体異数性の存在を指示する、
請求項２に従属するときの請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
閾値および／または参照分布が複数のサンプルから決定され、例えば請求項３７〜３８に記載の方法をかかるサンプルに対して実施することにより、各サンプルは異なる妊娠女性から取られ、；任意に、例えば請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法を実施することにより、決定の複数のセットが、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）について、各サンプルについてなされる、
請求項２に従属するときの請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
かかる複数のサンプルの２つ以上の群が群毎の原則で分析され、例えば各群が別個のラン、アッセイ、またはマイクロタイタープレートによって分析され、閾値および／または参照分布が、サンプルの各群から決定される量または比の正規化によって決定される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
サンプルの群間における前記正規化が、サンプル特異的な量または比（例えば、かかるサンプルについてなされる決定のセットの平均）と前記特異的なサンプルと同じ群中の全サンプルについて決定される量または比の平均（例えば、中央値）との間における違いを考慮することによって実施される、
請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
胎児の染色体異数性の存在が、かかる胎児に関して、第１の標的ＤＭＲの１つ以上に関して決定される量または比の閾値および／または参照分布と比較して、外れ値であるサンプル特異的な量または比によって指示される、
請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
胎児の染色体異数性の存在が、かかる胎児に関して：（ａ）（推定上の）正倍数体である複数の他の胎児に関してのサンプル特異的な量または比のクラスターの外に；および／または（ｂ）染色体異数性を有する胎児を表す複数の他のサンプルに関してのサンプル特異的な量または比のクラスター内に、位置する数値クラスター内に位置するサンプル特異的な量または比によって指示され；好ましくは、胎児を表す前記複数の他のサンプルが、約：２〜１０、１２〜１５、１６〜２５、２６〜３０、３２〜４０、４２〜５０、５２〜７５、７８〜１００、１０５〜１２５、１３０〜１５０、１５５〜１７５、１８０〜２００、２０５〜２５０、２５５〜３００、３０５〜３５０、３５５〜４００、４０５〜４５０、４５５〜５００、および５００よりも多くの他のかかるサンプルからなる群から選択される、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記妊娠女性から取られた前記サンプルが、ステップ（ｂ）に先立って、前記サンプル中に存在するＤＮＡを抽出するために処理される、
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロセスが前記サンプルからトータルセルフリーＤＮＡを抽出するか、または前記プロセスが、胎児セルフリーＤＮＡを抽出および／もしくは濃縮する、
請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを検出するための方法であって、
前記方法が：
（ｉ）  請求項４に従属するときの請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと；
（ｉｉ）  サンプル中に存在する胎児ＤＮＡの少なくとも１つの量、例えば絶対または相対量を決定するステップと；
（ｉｉｉ）  決定される胎児ＤＮＡの量を閾値および／または参照分布と比較するステップと、
を含み、
前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れが、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示する、
方法。
【請求項５５】
組成物であって：
・  請求項１０に記載の２つ以上の標識プローブを含み、
各プローブは、前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つを検出するためのものである、
組成物。
【請求項５６】
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つを増幅するためのものである）；および／または
・  請求項１１に記載の２つ以上の標識プローブ（各プローブは、前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つを検出するためのものである）；および／または
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つを増幅するためのものである）、
を含む、
請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
・  プライマーの少なくとも１つのさらなるペア（好ましくは、プライマーの２つのさらなるペア）（各ペアは、請求項４〜５３のいずれか一項に記載の前記少なくとも１つのＯＲの１つを増幅するためのものである）；および／または
・  請求項１２に記載の少なくとも１つのさらなる標識プローブ（好ましくは２つのさらなる標識プローブ）（各プローブは、前記ＯＲの少なくとも１つを検出するためのものである）
を含む、
請求項５５または５６に記載の組成物。
【請求項５８】
・  請求項１０に記載の２つ以上のさらなる標識プローブ（各プローブは、前記２つ以上の第２の標的ＤＭＲの１つを検出するためのものである）；および／または
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のさらなるペア（各ペアは、請求項６〜５３のいずれか一項に記載の前記２つ以上の第２の標的ＤＭＲの１つを増幅するためのものである）、
を含む、
請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
キットであって、
好ましくは、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するためおよび／または妊娠女性が医学的状態を患うかもしくは発生する増大したリスクを検出するためであり、
前記キットが、
・  プライマーおよび／またはプローブの組み合わせ、
を含み（前記組み合わせは請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の通りである）、
・  任意に、さらに：
（ｉ）  前記プライマーおよびプローブを用いて請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのおよび／または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物を製造するかもしくは用いるための、印刷されたマニュアルまたは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ；ならびに／あるいは
（ｉｉ）  請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法の実施および／または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他の請求項、コンポーネント、または試薬（かかる実施または製造に有用な、本願において開示されるいずれかのかかる請求項、コンポーネント、または試薬を包含する）、
を含む、
キット。
【請求項６０】
次のコンポーネントの１つ以上を含む、請求項５９に記載のキット：
・  前記妊娠女性から取られるべき血液などの組織サンプルを収集および／または保存するための手段（好ましくは、前記手段は血液収集チューブである）；ならびに／あるいは
・  前記妊娠女性から取られるべきサンプルからＤＮＡ、好ましくはセルフリーＤＮＡを抽出するための手段（好ましくは、前記手段はセルフリーＤＮＡ抽出キットである）；ならびに／あるいは
・  請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法の文脈において前記手段の１つもしくは両方を同定する、得る、および／または用いるための、印刷されたマニュアルもしくは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ。
【請求項６１】
コンピュータプログラム製品であって：
計算システムをコントロールして、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を、前記妊娠女性から取られたサンプルから検出するための演算を行うおよび／または管理するための、複数の命令をエンコードしたコンピュータ読み出し可能な媒体、
を含み、
そのサンプルは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含み、前記サンプル中に存在するＤＮＡは、請求項１〜５３のいずれか一項に記載のようにメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理され；
前記演算が：
・  （ｉ）請求項１〜５３のいずれか一項のステップ（ｃ）に記載のように、前記サンプル中に存在する染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量をそれぞれが表す２つのシグナルと；（ｉｉ）請求項１〜５３のいずれか一項のステップ（ｄ）に記載のように、前記サンプル中に存在する１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を表す１つのシグナルとを受け取るステップと；
・  染色体異数性が、前記妊娠女性が身籠っている胎児に存在するかどうかのクラス分けを、（ｉｉ）において受け取られるシグナルによって表される参照染色体の量と比較した、（ｉ）において受け取られる少なくとも１つのシグナルによって表される染色体異数性に関わる染色体の少なくとも１つの相対量に基づいて決定し、少なくとも１つが、胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含む、
コンピュータプログラム製品。
【請求項６２】
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において決定されるＤＮＡの前記量を表すシグナルが、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時に生成され；任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用いる、
請求項６１に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６３】
前記演算が、閾値および／または参照分布との比較をなすことによってかかるクラス分けを実施し、
前記閾値および／または参照分布よりも高いかまたは低い前記相対量または比の１つ以上が、胎児の染色体異数性の存在を指示する、
請求項６１または６２に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６４】
前記演算が、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルからの前記閾値および／または参照分布を、前記複数のサンプルに関して複数のシグナル（ｉ）および（ｉｉ）を受け取ることによって計算し；任意に、前記複数のサンプルが、サンプルの１つ以上の群において、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法によって分析され、前記方法が、所与の群中の各サンプルに対して、別個のベッセル中において、有効に、かかる群中の複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施される、
請求項６３に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６５】
前記演算が：
・  請求項４に記載の（ｉｉｉ）前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を表すさらなるシグナルを受け取るステップと；
・  （ｉ）および／または（ｉｉ）において受け取られる少なくとも１つのシグナルによる（ｉｉｉ）において受け取られるシグナルの考察によって、サンプル中に存在する胎児ＤＮＡの量、例えば絶対または相対量を決定するステップと、
をさらに含む、
請求項６１〜６４のいずれか一項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６６】
前記演算が：
・  存在する胎児ＤＮＡの前記量を閾値および／または参照分布と比較することに基づいて、妊娠女性が、妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを有するかどうかのクラス分けを決定し、前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れが、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示するステップ、
をさらに含む、
請求項６５に記載のコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法に関する。かかる方法は、胎児の細胞（および／または胎児の胎盤）を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において差次的なメチル化を示すものを包含する、ＤＮＡの２つ以上の領域の特定の構成および／または検出および／または分析の１つ以上に基づく。かかる方法は、前記妊娠女性から取られたサンプルを利用し、このサンプルは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含む。かかる方法は、特に胎児のトリソミーなどの染色体異数性の検出／診断にとって、および／または妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかもしくは発生する増大したリスクを検出することにとって、診断的な、予後的な、および／または予測的な有用性を有する。本発明は、かかる方法の実施に用いられ得る、有用であり得る、または関係し得る組成物、キット、コンピュータプログラム製品、および他の態様にもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の先進国においては、多くの妊娠女性が出生前検査を受け、その主な目標は発生中の胎児の染色体異数性の同定である。最近まで、絨毛検査（ＣＶＳ）または羊水検査などのほとんど全ての信頼できるかかる出生前検査は侵襲的であり、かかる検査の診断精度が９７．％から９９．８％の間と報告されているにもかかわらず、手続きに関係する流産の少なからぬリスクを負っていた（総説は非特許文献１参照）。胎児染色体異数性のための従来の非侵襲的な出生前検査は、超音波診断および／または種々の生化学的な母親血清マーカーの分析によるスクリーニングを包含する。しかしながら、これらの検査は主としてダウン症候群（２１番染色体トリソミー（Ｔ２１）およびより小程度にＴ１８）の検出を標的とする。しかしながら、７５％から９６％のみという報告された検出率（利用するスクリーニングアプローチに依存する）および５％から１０％の範囲である偽陽性率によって、かかる超音波診断および母親血清分析は一般的にはスクリーニング手続きとしてのみ考えられており、両方とも、スクリーニング陽性のケースにおいて、胎児の染色体異常の確定診断のためには、ＣＶＳまたは羊水検査によるフォローアップを要求する（非特許文献１）。
【０００３】
母親の循環中の胎児を起源とするセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の発見（非特許文献２）は、胎児の性決定（非特許文献２）および母親がＲｈＤ陰性である妊娠の胎児ＲｈＤ検査（非特許文献３）のためのアッセイを包含する、非侵襲的な出生前検査（ＮＩＰＴ）のためのアッセイの開発のための代替的なアプローチを提供してきた。しかしながら、かかる胎児ｃｆＤＮＡは、母親血漿から単離されたトータルｃｆＤＮＡのわずかな画分として存在するということがあって（非特許文献４）、母親血漿からの胎児ｃｆＤＮＡに基づいて用いる胎児染色体異数性の検出は未だに難しい。ハイスループット次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーの適用は、母親血漿中のｃｆＤＮＡへの胎児および母親の寄与分両方のシーケンシングを可能にしており、近年にのみ、例えば商業的な検査の出現および一般的な利用可能性によって、２１番染色体およびある種の他の一般的な胎児異数性についてＮＧＳに基づくＮＩＰＴを日常的に妊娠女性に提供することが可能となった。商業的に利用可能な検査は、「ＭＡＴＥＲＮＩＴ２１」（www.sequenom.com）、「ＰＲＥＮＡＴＥＳＴ」（www.lifecodexx.com）、「ＶＥＲＩＦＩ」（www.illumina.com）、またはＩＯＮＡ（www.premaitha.con）などのランダムＮＧＳを用い得、または指向的アプローチを用い得る。この目的は、シーケンシング前に関心のある特異的なゲノム領域を濃縮して、信頼できる統計分析（例えば、「ＨＡＲＭＯＮＹ」www.ariosadx.comまたは「ＰＡＮＯＲＡＭＡ」www.natera.com）、多型分析、またはデジタルＰＣＲ（総説は非特許文献５参照）を行うために必要とされる配列タグの数を縮減することである。
【０００４】
今日までに、シーケンシングアプローチに従うかかる商業的に利用可能なＮＩＰＴは、マッシブパラレルシーケンサーなどの複雑で非常に高価な設備の使用を要求し、大体は分析に先立つかなりのサンプル処理の必要を原因とする数日から最大で１０日のターンアラウンドを有する。例えば、ＮＧＳによる胎児異数性のためのＮＩＰＴは、単離されたｃｆＤＮＡの数百万個の個々の断片のいわゆる「シーケンシングライブラリー」を構築する時間および費用がかかるステップを要求する。デジタルＰＣＲに従う代替的なＮＩＰＴは、非常に特殊な局在的な研究ラボ以外では典型的には利用可能ではなく、比較的低いスループットである設備およびテクノロジーの使用を要求する（非特許文献６）。
【０００５】
ｃｆＤＮＡからのＮＩＰＴのこの有意な制約を認識して、何人もの研究者が、胎児異数性のためのＮＩＰＴを実施する代替的な、特により安価でより迅速なやり方を研究および開発することを求めてきた。ＮＩＰＴのためのそれらの代替の多くは、母親血漿中に見出される胎児ＤＮＡの胎児特異的な特性（例えば、胎児ｃｆＤＮＡの特異的な種または多型）の使用にフォーカスしてきた。特に、母親ＤＮＡと比較して胎児ＤＮＡにおいて特異的にメチル化されるＤＮＡの領域の存在は、関心のある胎児染色体のＮＩＰＴのためのかかるエピジェネティックマーカーの使用へのかなりの注力につながった。
【０００６】
母親血漿中の胎児ＤＮＡを特異的に同定するためのエピジェネティックマーカーの使用の第１の実証は、２００２年ほども昔になされたが（非特許文献７；特許文献１）、それが多型依存的であったために、用いられたマーカーの有用性はある種の胎児−母親ペアに限定された。より一般的に適用可能な胎児特異的エピジェネティックマーカーはセルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＢメンバー５（マスピンとしてもまた公知）遺伝子（「Ｕ−マスピン」または「Ｕ−セルピンＢ５」）のメチル化形態であり、候補遺伝子アプローチに従って２００５年に同定された（非特許文献８）。マスピン遺伝子はヒト１８番染色体上に位置し、原理は、胎児１８トリソミーの非侵襲的同定がかかるエピジェネティックマーカーを用いて実施され得るということを初めて実証した（非特許文献９；特許文献２）。
【０００７】
かかる原理的実証によって、エピジェネティックに同定された胎児ｃｆＤＮＡ中の例えば２１番染色体由来の配列を、別の常染色体または性染色体に由来する参照配列と相対的に定量することによって、かかるエピジェネティックマーカーを胎児異数性のＮＩＰＴに活用するというゴールを有して（例えば非特許文献１０）、いくつものグループが、さらなる胎児エピジェネティックマーカー、特に２１番染色体などの胎児異数性に関連する染色体上のものを同定することに着手した（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６）。
【０００８】
それらのエピジェネティックマーカーのある種のものは、ＮＩＰＴのツールとして研究された。実際に、ホスホジエステラーゼ９Ａ遺伝子のメチル化されていない形態（Ｕ−ＰＤＥ９Ａ）は胎児の２１トリソミーのＮＩＰＴ検査に用いられている（非特許文献１３）。別の研究においては、ホロカルボキシラーゼシンセターゼ遺伝子のメチル化された形態（Ｍ−ＨＬＣＳ）が、Ｙ染色体上の胎児遺伝子マーカーのＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子の濃度に対して正規化された相対的な２１番染色体量を比較するための胎児エピジェネティックマーカーとして用いられている。このエピジェネティクス−遺伝子（「ＥＧＧ」）アプローチは、胎児２１トリソミーの非侵襲的検出に有用であるということが実証された（非特許文献１４）。異なるアプローチを用いて、Papageorgiouらは、全血からの母親ＤＮＡと比較して胎児特異的な差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）２１番染色体の相対量を定量するための免疫沈降および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）のアプローチの使用を記載して、トリソミーのケースにおける２１番染色体量の軽微な過剰が検出され得、かつ胎児２１トリソミーの診断指標であり得ると主張した（非特許文献１５）。彼らは、１つのＤＭＲではなくＤＭＲの組み合わせが、正常および２１トリソミーのケースの正確なＮＩＰＤを与えることができ得るという仮説を立てた。後の研究において、より大型の盲検化された検証研究において、かかるアプローチが１００％感度および９９．２特異性を実証するということが報告された（非特許文献１６）。かかるアプローチは、面倒で技術的に難しいメチル化されたＤＮＡの免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）ステップを要求するのみでなく、かかるアプローチを用いることについての有意な技術的な懸念が提起されている（非特許文献１７）。特に、かかるアプローチを用いることによって、多量のセルフリー胎児ＤＮＡまたは多数の胎児細胞を母親血液中に偶々放出する正倍数体胎児と比較して、母親血液中の２１番染色体マーカーの胎児由来ＤＮＡメチル化の上昇したレベルの観察が、２１トリソミーを有する胎児の存在に起因すると結論づけることは可能ではない。ＭｅＤｉＰアプローチの彼らの解説記事において、Tongらは、２１番染色体外の胎児エピジェネティックマーカーを用いて胎児ＤＮＡ濃度の変動をコントロールするための正規化ステップが包含され得るが、３番染色体上の遺伝子ＲＡＳＳＦ１を用いる以前に公開された研究が、ＥＧＧアプローチと比較して、かかる正規化の効果は、主として胎児ＤＮＡを含有する胎盤組織についてさえも典型的には最適ではないということを指示しているということを示唆している（非特許文献１４）。
【０００９】
しかしながら、最近の研究において、メチル化されたＤＮＡを母親プライマーから濃縮するためのステップから出発して、Limらは従来のｑＰＣＲを用いて、参照の３番染色体（Ｍ−ＲＡＳＳＦ１Ａ）と比較した２１番染色体の相対量を測定して（Ｍ−ＨＬＣＳを用いる）、胎児２１トリソミーの非侵襲的な出生前検出における９０％の感度および９２．５％の特異性を報告している（非特許文献１８）。Tongらによって報告された初期の仕事（非特許文献１４）のこの一見の改善にもかかわらず、Limのアプローチには改善の余地があるということが報告されている（非特許文献１９）。実際に、胎児２１トリソミーのＮＩＰＴに胎児エピジェネティックマーカーを用いることの性能を改善するやり方を探るために、ChimはLimと同様の他の研究の目立った特徴を表にしている（表Ａ参照。非特許文献１９から転用）
【００１０】
【表１】
2018533953.tif 000002
【００１１】
Chimは：（ａ）デジタルＰＣＲが、従来の定量的なものと比較してより良好な感度および特異性を与えるように見えると概言しており、ｑＰＣＲの指数的だがアナログ的な性質をデジタルＰＣＲの「１」または「０」シグナルに翻訳して、デジタル計数プラットフォームがより高精度で正確な定量を促すはずであるということを示唆しており；（２）胎児遺伝子マーカーの使用は、相対的な染色体量分析のために参照染色体を定量するためには、胎児エピジェネティックマーカーよりもむしろより良好な感度および特異性を与えるように見える。実際に、類似のエピジェネティクス−エピジェネティクスアプローチと比較したＥＧＧアプローチの彼らの比較研究において、Tongらによって得られた結果（非特許文献１４）を同様に提出して、Chimは、胎児エピジェネティックマーカーすなわち３番染色体上に位置するＭ−ＲＡＳＳＦ１Ａに対するその正規化を記載しており、Tongらは、研究された２１トリソミー胎盤の半分よりも多くの２１番染色体の相対量が正倍数体（正常）参照区間とオーバーラップし、２５％という実用的でない感度につながるということを見出した（表Ｂ参照）。
【００１２】
【表２】
2018533953.tif 000003
【００１３】
よって、胎児異数性の改善されたＮＩＰＴの長年の必要と、２００２年からの、そうするための胎児特異的なエピジェネティックマーカーを用いる理論的可能性とがあるにもかかわらず、今日までにそうするための満足のいく、信頼できる、敏感な、特異的な、費用効果的な、および／または技術的に直截的なアプローチはない。実際に、彼の最近の総説においてさえ、Chimは改善の必要が尚あるということを主張しており、デジタルＰＣＲプラットフォームおよび胎児遺伝子マーカーによる正規化の使用のみがかかるエピジェネティクスに基づく検査の性能をさらに改善するであろうと結論づけている。しかしながら、デジタルＰＣＲアプローチは技術的に難しい機器の使用を要求し、それらは非常に特殊な局在的な研究ラボを以外では典型的には利用可能ではなく、胎児遺伝子マーカー（すなわち、母親ゲノムとは遺伝子的に異なるもの）の使用は、かかる遺伝子的な違いが存在するある種の胎児−母親ペアのみにかかる検査の適用可能性を限定し（例えば、男性胎児かつ遺伝子マーカーとしてのＺＦＹの使用）、胎児異数性のＮＩＰＴが解釈され得る前にかかる遺伝子的な違いについての追加の性または遺伝子検査を要求する。
【００１４】
従って、上の観点の１つ以上から、胎児の染色体異数性の存在を検出、指示、または診断するための改善された方法、ならびに関係する他の態様、特に、非侵襲的であり、および／またはより従来の処理、技術、および／または検出ステップ／設備を用い、それゆえにより迅速に、より費用効果的に、および／またはコミュニティーの中でより広く実施され得る方法の必要がある。
【００１５】
従って、これらまたは他の問題の１つ以上に対処する代替的な、改善された、より単純な、より安価な、および／または統合的な手段または方法を提供することが本発明の目的である。本発明の底にあるかかる目的は、本願の何処かに開示または定義される主題によって、例えば付属の請求項の主題によって解決される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０２０９７４
【特許文献２】ＷＯ２００５／１１８８５２
【特許文献３】ＷＯ２００７／１３２１６６
【特許文献４】ＷＯ２００７／１３２１６７
【特許文献５】ＷＯ２０１１／０３４６３１
【特許文献６】ＷＯ２０１１／０９２５９２
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Norwitz & Levy 2013, Rev Obs Gyn 6:48
【非特許文献２】Lo et al 1997, Lancet 350:485
【非特許文献３】Lo 1998, N Eng J Med 229:1734
【非特許文献４】Lo et al 1998, Am J Hum Genet 63:768
【非特許文献５】Go et al 2011, Human Reprod Update 17:372
【非特許文献６】Hindson et al 2011, Anal Chem 83:8604
【非特許文献７】Poon et al 2002, Clin CHem 48:35
【非特許文献８】Chim et al 2005, PNAS 102:14753
【非特許文献９】Tong et al 2006, Clin Chem 52:2194
【非特許文献１０】Old et al 2007, Reprod Biomed Online
【非特許文献１１】Chim at al 2008, Clin Chem 54:500
【非特許文献１２】Papageorgiou et al 2009. Am J Pathol 174:1609
【非特許文献１３】Lim et al 2011, PLoS One 6:e27709
【非特許文献１４】Tong et al 2010, Clin Chem 56:90
【非特許文献１５】Papageorgiou et al 2011, Nat Med 17:510
【非特許文献１６】Tsaliki et al 2012, Prenat Diag 21:996
【非特許文献１７】Tong et al 2012, Nat Med 18:1327
【非特許文献１８】Lim et al 2014, Clin Chem Lab Med 52:641
【非特許文献１９】Chim 2014, Clin Chem Lab Med 52:585
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一般的に、かつ簡略な記載として、本発明の主な態様は次のように記載され得る：
【００１９】
第１の態様において、かつ本願においてさらに記載、定義、請求、または別様に開示され得る通り、本発明は、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法に関し、前記方法は：
（ａ）  前記妊娠女性から取られたサンプルを提供し、このサンプルが、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含むステップと；
（ｂ）  前記サンプル中に存在するＤＮＡを、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理するステップと；
（ｃ）  前記サンプル中の染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記染色体上に位置する２つ以上の第１の標的の差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）におけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第１の標的ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第１の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変はＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量は、前記サンプル中の第１の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｄ）  前記サンプル中の１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記参照染色体（単数または複数）上に位置する２つ以上の参照ＤＭＲのメチル化の存在を検出することによって決定し、前記参照ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬によるかかる参照ＤＭＲのＤＮＡの改変がＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記参照ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の参照ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）  ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）を決定し、前記相対量（単数または複数）の１つ以上が、胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
好ましくは、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用いる。
【００２０】
第２の態様において、かつ本願においてさらに記載、定義、請求、または別様に開示され得る通り、本発明は、妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを検出するための方法に関し、前記方法は：
（ｉ）  第１の態様の方法を実施し、かかる方法が、さらに：
（ｆ）  胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化されない少なくとも１つの他の領域（ＯＲ）を検出することによって、前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を決定するステップを含み、前記試薬によるそのＯＲ（単数または複数）の改変はＤＮＡのメチル化に対して非感受性であり、好ましくは、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）およびステップ（ｆ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲおよび前記他の領域（単数または複数）について、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つと前記ＯＲ（単数または複数）の少なくとも１つとに用いるステップと；
（ｉｉ）  サンプル中に存在する胎児ＤＮＡの少なくとも１つの量、例えば絶対または相対量を決定するステップと；
（ｉｉｉ）  決定された胎児ＤＮＡの量を閾値および／または参照分布と比較するステップと、
を含み、
前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れは、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、各ケースにおいて本願において記載、定義、請求、または別様に開示され得る組成物、キット（またはそのコンポーネント）、およびコンピュータプログラム製品にもまた関し、かかる他の態様は、本発明の方法に関係し得、それに有用であり得、またはそれへのもしくはそれとの関連においての使用のためであり得る。
【００２２】
図を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は：（ａ）第１の差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出方法に用いられる差次的にメチル化される領域（単数または複数）（「ＤＭＲ」）および他の領域（単数または複数）（「ＯＲ」）の概略図と；（ｂ）第２の差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出方法に用いられる差次的にメチル化される領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（単数または複数）（「ＯＲ」）の概略図とを図示している。
【図２】図２は、例１において用いられる差次的にメチル化される領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図を図示している。
【図３】図３は、既知の胎児性別を有する研究の双生児ケースについて差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出方法によって測定された（例１）、胎児ｃｆＤＮＡ画分に対する男性特異的ＤＮＡの量（Ｙ染色体リプレゼンテーション）の相関を図示している。
【図４】図４は、単一ＤＭＲの別個の反応を用いて検出された参照染色体の検出と比較して、差次的なメチル化に基づく多重ＤＮＡ検出方法を用いる参照染色体の検出の改善された感度を図示している。単一ＤＭＲとしてのＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＴＢＸ３どちらか単独、または多重（同じ標識を用いる）としてのＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３を用いる、サンプル中の参照染色体に由来する胎児ｃｆＤＮＡの検出（例２）のために要求されるＰＣＲサイクル数（Ｃｐ）。
【図５】図５は、例３のコンピュータプログラム製品によって実施される演算の概略図を図示している。
【図６】図６は、本発明の方法として例４において用いられる差次的にメチル化される領域（「ＤＭＲ」）（および任意の他の領域（「ＯＲ」））の概略図を図示している。
【図７】図７は、５９サンプルの第１のランからの各サンプルについて、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する別の標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体の量の比［Ｙ軸］に対する、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する１つの標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体（５および１２）の量の比［Ｘ軸］のスキャッタープロットを図示しており、かかる量は、例４に記載されている本発明の方法によって決定される。２１トリソミー（Ｔ２１）を有する胎児を身籠もる女性を表す点は「＋」を付されており、非Ｔ２１サンプルから識別可能である。
【図８】図８は、全３つのラン、トータルで１６８サンプルからの各サンプルについて、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する別の標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体の量の正規化された比に対する、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する１つの標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体（５および１２）の量の正規化された比［Ｘ軸］のスキャッタープロットを図示しており、かかる量は、例４に記載されている本発明の方法によって決定される。２１トリソミー（Ｔ２１）を有する胎児を身籠もる女性を表す点は「＋」を付されており、例えば示されている点線の境界線によって区分されるように、非Ｔ２１サンプルから識別可能にクラスタリングされる。例４で言う外れ値の非Ｔ２１サンプルは（Ｔ２１クラスター内ではなく）Ｘ軸の範囲外にあるということに注意。
【図９】図９は、ラン数に対する、区分曲線の中心点（０．５，０．５５）からの図８の各点の距離のスキャッタープロットを図示している。明瞭な分離が、全てのランにおいて、非Ｔ２１サンプル（この図では、「＋」によって表されている）から９つのＴ２１サンプル（この図では、「ｏ」によって表されている）の間において示されている。
【図１０】図１０は、全３つのラン、トータルで１６８サンプルからの各サンプルについて、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する別の標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体の量の比のＺスコアに対する、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する１つの標的ＤＭＲによって決定された）対参照染色体（５および１２）の量の比のＺスコア［Ｘ軸］のスキャッタープロットを図示しており、かかる量は、例４に記載されている本発明の方法によって決定される。２１トリソミー（Ｔ２１）を有する胎児を身籠もる女性を表す点は「＋」を付されており、非Ｔ２１サンプルから識別可能にクラスタリングされる。例４で言う外れ値の非Ｔ２１サンプルは（Ｔ２１クラスター内ではなく）Ｘ軸の範囲外にあるということに注意。
【図１１】図１１は、あるｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの３サンプルを包含する）の各サンプルについて、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する別の標的ＤＭＲ：ＤＳＣＡＭによって決定された［ｘ軸］）対参照染色体の量の正規化された比に対する、２１番染色体の量（２１番染色体上に位置する１つの標的ＤＭＲ：Ｃ２１ｏｒｆ５７によって決定された）対参照染色体（５および１２）の量の正規化された比［ｙ軸］のスキャッタープロットを図示しており、かかる量は、（表６に記載されている以外は）例４に記載されているアッセイによって記載されている本発明の方法によって決定される。２１トリソミー（Ｔ２１）を有する胎児を身籠もる女性を表す点は開いた四角形を付されており、黒い四角形を付された非Ｔ２１サンプルから識別可能にクラスタリングされる。いずれかの偽陽性は「＋」を付されており、いずれかの偽陰性は「Ｘ」を付されている。
【図１２】図１２は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．１によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５６サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの４サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。図１１のように、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣ２１ｏｒｆ５７であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【図１３】図１３は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．２によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの３サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。図１１のように、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣ２１ｏｒｆ５７であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【図１４】図１４は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．３によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの２サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。図１１のように、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣ２１ｏｒｆ５７であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【図１５】図１５は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．４によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの３サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。図１１のように、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣ２１ｏｒｆ５７であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【図１６】図１６は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．５によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの２サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。このアッセイにおいて、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣ２１ｏｒｆ２９であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【図１７】図１７は、例１０に記載されているアッセイＶ１０．６によって記載されているｑＰＣＲラン、トータルで５８サンプル（２１トリソミーを有する胎児を身籠もる女性からの２サンプルを包含する）からの各サンプルについて、スキャッタープロットを図示している。点は図１１のように定義されている。このアッセイにおいて、ｙ軸２１番染色体ＤＭＲはＣＧＩ１４９であり、ｘ軸２１番染色体ＤＭＲはＤＳＣＡＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明、ならびにその特定の限定しない態様および／または実施形態は、より詳細には次のように記載され得る：
【００２５】
第１の態様において、かつ本願においてさらに記載、定義、請求、または別様に開示され得る通り、本発明は、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法に関し、前記方法は：
（ａ）  前記妊娠女性から取られたサンプルを提供し、このサンプルが、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含むステップと；
（ｂ）  前記サンプル中に存在するＤＮＡを、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理するステップと；
（ｃ）  前記サンプル中の染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記染色体上に位置する２つ以上の第１の標的の差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）におけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第１の標的ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第１の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変がＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の第１の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｄ）  前記サンプル中の１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記参照染色体（単数または複数）上に位置する２つ以上の参照ＤＭＲにおけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記参照ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬によるかかる参照ＤＭＲのＤＮＡの改変はＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記参照ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の参照ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）  ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）を決定し、前記相対量（単数または複数）の１つ以上が胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
好ましくは、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用いる。
【００２６】
本願に記載される用語は、一般的に、別様に指示されない限りそれらの一般的な意味によって理解されるべきである。用語「含む」または「含んでなる」が本願において用いられるところでは、他の要素を排除しない。本発明の目的のためには、用語「からなる」は、用語「含んでなる」の特定の実施形態であると考えられる。以下において、ある群が少なくともある種の数の実施形態を含むと定義される場合には、これは、それらの実施形態の全ておよび／またはそれらのみからなる群を開示しているともまた理解されるべきである。本願において用いられるところでは、「および／または」は、別のものありまたはなしでの、２つの指定された特徴またはコンポーネントのそれぞれの具体的な開示として取られるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、ちょうどそれぞれが本願において個々に提示されている場合のように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示として取られるべきである。本発明の文脈において、用語「約」および「およそ」は、当業者が当該特徴の技術的効果を尚保証すると理解するであろう正確度の区間を指す。用語は、典型的には、指示されている数値からの±２０％、±１５％、±１０％、および例えば±５％の偏差を指示する。当業者によって理解されるであろう通り、所与の技術的効果についての数値の具体的なかかる偏差は、技術的効果の性質に依存するであろう。例えば、天然のまたは生物学的な技術的効果は、一般的には、人工のまたは工学的な技術的効果のものよりも大きいかかる偏差を有し得る。単数形名詞を言うときに不定冠詞または定冠詞、例えば「a」、「an」、または「the」が用いられるところでは、これは、それ以外の何かが具体的に記されない限りその名詞の複数形を包含する。
【００２７】
本発明のある種の実施形態において、妊娠女性はヒトまたは非ヒト動物であり、特定の実施形態において、かかる非ヒト動物は、馬、羊、牛、豚、鶏、マウス、およびラットからなる群から選択され得る。より具体的な実施形態において、妊娠女性は、医学的状態、例えば本願において開示される医学的状態の１つ以上を発生するかまたはそれに罹る（もしくはそれを患う）増大したリスクがあることを疑われ得る。本発明のかかる方法は、ヒトまたは動物の体に対して実施されることを意図されない；例えば、それはインビトロの様式で実施されることを意図される。
【００２８】
本発明のある種の実施形態において、前記ＤＮＡ種および／または前記異なってメチル化されたＤＮＡはセルフリーＤＮＡであり、特定のかかる実施形態においては、循環セルフリーＤＮＡである。１つの特定の実施形態において、前記ＤＮＡ種、およびそれと混ざった異なってメチル化されたＤＮＡは、循環セルフリーＤＮＡである。用語「セルフリーＤＮＡ」（または「ｃｆＤＮＡ」）は当分野において認識されており、細胞外に、例えば個体の体液（例えば、血液または血液画分）中に見出されるＤＮＡの意味を包含する。「循環」もまた当分野において認識されている用語であり、実体または物質（例えばｃｆＤＮＡ）が個体の循環系、例えば血液系またはリンパ系中に存在する、検出される、同定される、またはそれから単離されるという意味を包含する。特に、ｃｆＤＮＡが「循環している」ときには、それは細胞中に位置せず、それゆえに血液の血漿もしくは血清中に存在し得、またはそれはリンパ液のリンパ中に存在し得る。
【００２９】
用語「差次的にメチル化される領域」または「ＤＭＲ」は、当業者によって認識されるであろう。これはまた、サンプル中の前記（胎児）ＤＮＡ種とそれが混ざった別の（母親）ＤＮＡとの間において（例えば、ＣｐＧモチーフにおいて）差次的にメチル化される染色体ＤＮＡ中の領域を言うことも意図される。例えば、本発明に用いられるＤＭＲは胎児と母親ＤＮＡとの間において差次的にメチル化される。本発明の特定の実施形態において、ＤＭＲは胎児ＤＮＡにおいては高メチル化され、母親ＤＮＡにおいては低メチル化される。すなわち、かかる領域においては、別の（母親）ＤＮＡと比較して前記（胎児）ＤＮＡ種においてより大きい度合いの（すなわち、より多くの）メチル化を見せ、例えば、所与のＤＭＲにおけるメチル化に利用可能な部位の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはより多くが、別の（母親）ＤＮＡの同じ部位と比較して前記（胎児）ＤＮＡ種においてメチル化される。特定の実施形態において、領域は母親ＤＮＡにおいては約１０％未満メチル化され、胎児ＤＮＡにおいては約３０％よりも多く（例えば、約５０％よりも多く）メチル化される。
【００３０】
当業者によって理解されるであろう通り、用語「量」は、濃度、ゲノム当量、モル数、または質量などの変数、およびかかる変数のいずれかの代用物である値を表し得る。例えば、（定量的）シグナルまたは測定、例えばアナログまたはデジタル（計数）定量技術によって生成されたものもまた、「量」と考えられ得る。特に、定量的ＰＣＲを用いる本発明の方法の実施形態では、量は、ｑＰＣＲ機器によって収集された測定、例えばＣｔ（閾値サイクル）［ライトサイクラー専門用語ではＣｐ、クロスポイントサイクルともまた呼ばれる］：ｑＰＣＲからの（蛍光）シグナルが閾値と交差するサイクル数によって表され得る。当業者によって理解されるであろう通り、かかるＣｔ（またはＣｐ）数は、定量化されようとするＤＮＡ鋳型（例えば、差次的にメチル化されるＤＮＡ種）の初期濃度（量）と逆相関する。
【００３１】
本発明の方法のステップ（ｅ）において、ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量（単数または複数）は、胎児の染色体異数性の存在または不在を指示する。例えば、正倍数体サンプルについて予想されるものと比較して（例えば、１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量との比較によって）、（第１の）標的ＤＮＡ種（染色体異数性に関わる染色体である）の量の過剰または増大が、標的ＤＮＡ種の過剰量が存在するということを表し、染色体異数性に関わる染色体の余剰の部分的なまたは完全なコピーが胎児に存在するということを指示する。特に、標的ＤＮＡ種の量のかかる過剰は、部分的なまたは完全な染色体トリソミー、例えばヒト２１トリソミー（Ｔ２１）を指示し得る。対照的な例においては、正倍数体サンプルについて予想されるものと比較して（例えば、１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量との比較によって）、（第１の）標的ＤＮＡ種（染色体異数性に関わる染色体である）の量の不足（deficient）または縮減は、標的ＤＮＡ種の縮減した量が存在するということを表し、染色体異数性に関わる染色体の少なくとも１コピーの全てまたは一部が胎児に不在であるということを指示する。特に、標的ＤＮＡ種のかかる縮減した量は、部分的なまたは完全な染色体喪失（例えば、モノソミー）、例えばターナー症候群（４５，Ｘ）を指示し得る。
【００３２】
ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量は、理論的観点から比較され得る。例えば、ヒトトリソミー（例えばＴ２１、Ｔ１８、および／またはＴ１３）では、（第１の）標的ＤＮＡ種（染色体異数性に関わる染色体である）の量は、理論的には、参照ＤＮＡ種（１つ以上の参照染色体である）の量と比較して３：２に同等な量比を有するはずである。しかしながら、標的および／または参照染色体（および／またはＤＭＲ）の異なる領域についての検出感度および定量の違いによって、かかる理論比は実際には達成可能でなくあり得る。従って、胎児の染色体異数性の存在は、ステップ（ｃ）から決定される量がステップ（ｄ）から決定される量とは同等ではないところで指示され得、量同士の同等はそれらが同じ値を有するということを意味しない。実際に、胎児の染色体異数性の存在は、正倍数体胎児について予想されるものと比較して、例えばステップ（ｄ）から決定される量からのステップ（ｃ）から決定される量の違い、ひずみ、または別様に偏りによって指示され得る。
【００３３】
当業者によって理解されるであろう通り、胎児の染色体異数性の存在（または不在）の確定的な指示は、全ての状況またはサンプルにおいて可能であるわけではなくあり得る。従って、本発明は、ステップ（ｅ）において、胎児の染色体異数性の存在（または不在）の指示が、確定的な指示よりもむしろ可能性が高いかまたは可能性がある存在（または不在）として表される方法をもまた企図する。かかる企図される方法は、より多くの確実性、信頼度、または確定診断を提供するために追加の診断検査が実施されるというシグナルまたはフラグとなる追加のステップを包含する実施形態を包含する。かかる爾後の検査は、胎児異数性の検出のための異なるＮＩＰＴ（例えば、例１に記載されているＮＧＳに基づくＮＩＰＴ）を包含し得、および／またはＣＶＳもしくは羊水検査を包含し得る。
【００３４】
本発明のかかる方法のある種の実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用いることによってなされ；特定のかかる実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記少なくとも２つの参照ＤＭＲのそれぞれに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記少なくとも２つの第１の標的ＤＭＲのそれぞれに用いることによってなされる。
【００３５】
本発明のかかる方法の代替的な実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに用いてなされ；特定のかかる実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記少なくとも２つの第１の標的ＤＭＲのそれぞれに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記少なくとも２つの参照ＤＭＲのそれぞれに用いることによってなされる。
【００３６】
本発明のかかる方法のさらなる代替的な実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に；（ｙ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に用いてなされ、（ｘ）に用いられる検出可能な標識（単数または複数）は、（ｙ）に用いられる検出可能な標識（単数または複数）とは異なる。
【００３７】
本発明のかかる方法の代替的な実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は：（ｘ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれに；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれに用いてなされる。
【００３８】
特定のある種の実施形態においては、異なる検出可能な標識（単数または複数）がかかる第１の標的ＤＭＲに用いられ、同じく参照ＤＭＲに用いられ、ＯＲ（単数または複数）が方法に用いられる場合には、同じくかかるＯＲ（単数または複数）に用いられる。
【００３９】
本発明のある種の実施形態においては、ステップ（ｃ）において、２つよりも多くの第１の標的ＤＭＲが用いられ得る。例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または９つよりも多くの第１の標的ＤＭＲが用いられ得る（例えば、かかる第１の標的ＤＭＲの約１０、１５、２０、３０、５０、または５０よりも多く）。前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに異なる検出可能な標識（単数または複数）が用いられる本発明の実施形態においては、別の第１の標的ＤＭＲの１つ以上（好ましくは、２、３、４、５、または５よりも多く）が、さらなる異なる検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出され得る。代替的に、前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つおよび別の第１の標的ＤＭＲの１つ以上（好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、または８よりも多く）に用いられる異なる検出可能な標識（単数または複数）は、前記第１の標的ＤＭＲの前記２つの１つに用いられる同じ検出可能な標識（単数または複数）を有し得る。例えば、２つの第１の標的ＤＭＲは同じ検出可能な標識（単数または複数）を有し得、２つのさらなる第１の標的ＤＭＲは異なる検出可能な標識（単数または複数）を有し得る。かかる実施形態はさらなる利点を本発明に提供し得、例えば特異性の一層さらに増大した感度を提供し、追加の検出可能な標識に訴えなければならないことがない。マルチチャンネル検出設備の費用および技術的な要求と、例えば蛍光標識では、検出スペクトルおよび色のブリーチングのオーバーラップとがあって、この数は実際には限定され得る。
【００４０】
メチル化されていないＤＮＡと比較してメチル化されたＤＮＡを差次的に（例えば、選択的に）改変する試薬が本発明に用いられる。例えば、バイサルファイトを含む試薬によるＤＮＡの処理はシトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は無影響のまま残す。それゆえに、バイサルファイト処理は、個々のシトシン残基のメチル化ステータスに依存する特異的な変化をＤＮＡ配列中に導入し、ＤＮＡのセグメントのメチル化ステータスについての１ヌクレオチド解像度の情報を産出する。この情報をリトリーブするためには、かかる１ヌクレオチドの変化を識別し得るＰＣＲプライマーおよび／またはプローブの使用を包含する種々の分析が、変改された配列に対して行われ得る。
【００４１】
代替的には（または加えて）、かかる試薬は、ＤＮＡメチル化状態に感受性である制限酵素を含み得る。かかる制限酵素の認識配列の切断は、酵素の認識部位中の特定の塩基が修飾、例えばメチル化されるときにブロックされ得るかまたは損なわれ得る。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、試薬は、メチル化感受性の制限酵素、例えば本願において開示されるメチル化感受性の制限酵素を含み；かかるメチル化感受性の制限酵素の２つ、３つ、４つ、５つ、またはより多くを含む実施形態を包含する。
【００４２】
ステップ（ｂ）に先立って、サンプルは、その中に存在するＤＮＡを単離、濃縮、および／または精製するために処理され得る。例えば、血漿サンプルはｃｆＤＮＡ単離プロセスまたはキットを用いて処理されて、胎児および／または胎児の胎盤を起源としない（例えば、母親起源の）差次的にメチル化されたＤＮＡと一緒の前記ＤＮＡ種の混合物を含む（非天然の）爾後の溶液を提供し得る。（ｂ）における処理のステップは、前記試薬（例えば、メチル化感受性の制限酵素）を含む別個の溶液を、サンプルの混ざったＤＮＡに（例えば、かかる混ざったＤＮＡを含む非天然の溶液に）加えるステップを含み得；および／またはある種の条件を維持すること（もしくはそれに変更すること）を含み得る。特に、前記試薬が１つ以上のメチル化感受性の制限酵素を含むときには、（ｂ）の処理するステップは、ＤＮＡおよび酵素（単数または複数）を一緒に約３７℃で約５ｍｉｎおよび３００ｍｉｎの間、例えば約３０ｍｉｎおよび９０ｍｉｎの間、または約６０ｍｉｎインキュベーションすることを含み得、任意に、かかる混合物をより高い温度（例えば、約５０℃および９０℃の間、例えば約８０℃）でインキュベーションして、酵素（単数または複数）を不活性化するステップを含み得る。ある種の実施形態において、（ｂ）の処理ステップのために形成される組成物は、天然に存在せずにあり得る。例えば、溶液（もしくは緩衝液）の成分の特定の塩；および／または１つ以上の細菌由来の制限酵素（もしくはその非天然変異体）と一緒の（例えば、ヒト）ｃｆＤＮＡの混合物は、非天然組成物または混合物であり得る。さらにその上、本発明の方法のいずれかは、インビトロ製造された核酸分子、例えばＰＣＲ反応のＤＮＡ産物（例えば、「ＰＣＲ産物」）を製造し得る（それゆえに、本発明の組成物はそれを含み得る）。かかるインビトロ製造された核酸分子の１つ以上は、非天然であり得る。なぜなら、それらは、少なくとも１つの検出可能な標識を包含するヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを含み、かかる核酸分子がかかる標識プライマーおよび／またはプローブのポリメラーゼ伸長（または部分的なヌクレアーゼ消化）によって生成されており、それゆえに、検出可能な標識を包含するかかる核酸分子の少なくとも画分を提供し、その結果、核酸分子の核酸配列は天然に存在する配列（またはその断片）を含み得るが、かかるインビトロ製造された核酸分子は、（少なくとも）それが包含する非天然の検出可能な標識ゆえに非天然であるからである。特定の実施形態においては、ステップ（ｂ）に先立って、前記妊娠女性から取られたサンプルは前記サンプル中に存在するＤＮＡを抽出するために処理され得る；例えば、前記プロセスはトータルセルフリーＤＮＡを前記サンプルから抽出し得、または前記プロセスは胎児セルフリーＤＮＡを抽出および／または濃縮し得る。
【００４３】
本発明の方法のある種の実施形態において、ステップ（ｅ）において決定された相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）は閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上（好ましくは２つ以上）は、胎児の染色体異数性の存在を指示する。閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）は先行研究から来得、コントロールサンプルのものを包含し得、またはそれらは本発明の方法によって分析される複数のサンプルから生成され得る。例えば、いくつもの異なるサンプル（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、９０、１０、１２０、１５０、１７５、２００、２５０、５００、または約５００よりも多くのサンプル；特に約６０サンプル、より具体的には５００を超えるサンプル）がそのように分析され、１つのまたは他の個々のサンプルが、大部分の他のサンプルからの類似の量の集団からの外れ値である（ｃ）からの量または（ｅ）からの相対量を示す場合には、これは、個々のサンプルが取られた妊娠女性が身籠っている胎児が染色体異数性を有するということを指示する。上に記載されているように、ステップ（ｅ）において決定される相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）が閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較される場合であっても、胎児の染色体異数性の存在（または不在）の確定的な指示は、全ての状況またはあらゆるサンプルにおいて可能なわけではなくあり得るということは理解されるであろう。従って、本発明のかかる実施形態においては、染色体異数性の確定的な指示よりもむしろ可能性が高いかまたは可能性がある存在（または不在）が指示されるものをもまた包含し、より多くの確実性または確定診断を提供するために追加の診断検査が実施されるというシグナルまたはフラグとなる追加のステップを包含する実施形態を包含する。例示的な追加の診断検査は、本願の他所に記載されているもののいずれか、特に例えば例１に記載されているＮＧＳに基づくＮＩＰＴを包含する。
【００４４】
代わりにまたは追加して、染色体異数性が胎児に存在するという指示は：（ｉ）参照ＤＮＡ種の量を表す目安もしくはシグナルに関して予想されるもの（例えば、参照ＤＭＲから決定されるもの）と比較して、第１の標的ＤＮＡ種の量を表す目安もしくはシグナルの増大（もしくは減少）（例えば、第１の標的ＤＭＲの１つまたは他のものから決定されるもの）；および／または（ｉｉ）参照分布の考察から、サンプルから決定された第１の標的ＤＮＡ種の量を表す目安もしくはシグナル（例えば、第１の標的ＤＭＲの１つまたは他のものから決定されるもの）がどこに入るかを考えることによって評価され得る。
【００４５】
ある種の実施形態において、閾量（単数または複数）は、標準のコントロールによって確立され得；例えば、既知サンプル（もしくは複数の既知サンプル）から一度にまたは別個に実験的に確立され得、および／または（例えば、あるサンプルまたは複数の既知サンプルから）例えば同じラン中の検査サンプル（単数または複数）と約同時に確立される閾量（単数または複数）であり得、特に、１つ以上の既知サンプルが１つ以上の（別個の）ウェル中に置かれ、１つ以上の検査サンプルが他のウェル中に置かれたマイクロタイタープレートのウェル中に含有されたサンプルに対して、本発明の方法を実施することによって閾量（単数または複数）を確立することによる。本発明の他の実施形態においては、閾量および／または量の参照分布との比較が、第１の（または第２の）標的ＤＮＡ種（すなわち、染色体異数性に関わる染色体）の量対参照ＤＮＡ種（すなわち、参照染色体）の量の相対量（例えば、比）からなされる。例えば、理論的観点から、２１番ヒト染色体の正常な二倍体セットを起源とする第１の標的ＤＮＡ種の量は、例えば２番染色体の参照（二倍体）セットを起源とする参照ＤＮＡ種の量に対して約２：２（すなわち、１：１）比を示すことが予想されるであろう。しかしながら、２１トリソミーの場合には、かかる比は約３：２であることが予想されるであろう。ここで当業者によって理解されるであろう通り、他の染色体（または部分的な染色体）異数性は、他の理論比、例えば１：２を、完全な染色体の喪失、または第２のＤＮＡ種の位置を含む参照染色体と比較して第１のＤＮＡ種の位置の部分的欠失などの部分的な喪失のケースにおいて示すことが予想されるであろう。ある種の実施形態において、例えばメチル化の違いなどによって区別されない場合には、異数体胎児ｃｆＤＮＡとの混合物としての正倍数体母親ｃｆＤＮＡなどの他のＤＮＡの存在（すなわち、かかる他のＤＮＡとの混合物中の）が、（正倍数体）母親および（異数体）胎児ｃｆＤＮＡの相対量に依存して改変されたかかる比をもたらし得る。これもまた当業者によって理解されるであろう通り、改変されたかかる比は、他の因子、例えば各アンプリコンの相対的な反応（例えばＰＣＲ反応）効率性からもたらされ得る。従って、かかる実施形態のある種のものにおいて、閾量は、２：２（１００％）よりも（検出可能におよび／または有意に）大きいかまたは小さい比、例えば約３：２（１５０％）、約２：３（６６％）、約１：２（５０％）、もしくは約２：１（２００％）であり；約２００％超、約５０％未満である閾量および／もしくは比を包含し、または約１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１０５％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、および５５％からなるリストから選択されるものである。代替的に、特定の実施形態においては、閾量は、ターナー症候群（完全な正倍数体「４６，ＸＸ」核型よりもむしろ「４５，Ｘ」核型を有するヒト女性）などにおいては、単に第１の（または第２の）ＤＮＡ種の検出可能な量がないということによって決定され得る。しかしながら、上に記載されているように、標的および／または参照染色体（および／またはＤＭＲ）の異なる領域についての検出感度および定量の違いから、かかる理論比は実際に達成可能ではなくあり得る。従って、胎児の染色体異数性の存在は、ステップ（ｃ）から決定される量がステップ（ｄ）において決定される量と同等であるところで指示され得、量同士の同等は、それらが同じ値を有するということを意味しない。実際に、胎児の染色体異数性の存在は、正倍数体胎児について予想されるものと比較して、例えばステップ（ｄ）から決定される量からの、ステップ（ｃ）から決定される量の違い、ひずみ、または別様に偏りによって指示され得る。
【００４６】
ある種の実施形態において、パラメータ（例えば、平均、中央値、標準偏差、中央値絶対偏差、またはＺスコア）は、各ラン、プレート、または検出／分析データセット中のサンプルのセットに関して算出される。かかる実施形態のある種のものにおいて、かかる算出されたパラメータは、かかるラン、プレート、またはデータセットにおいて検出／分析された検査サンプルから外れ値（例えば、トリソミーサンプル）を同定するために用いられる（例えば、「ラン特異的な」分析）。特定の実施形態において、かかるパラメータは、いずれかの外れ値の素性の知識なしに全ての検査サンプルから算出される（例えば、「盲検」分析）。他の特定の実施形態において、かかるパラメータは、（外れ値でない）標準であることが既知の参照サンプル（例えば、正倍数体胎児からのｃｆＤＮＡを含有することが既知のサンプル）、またはかかる標準であることが推定される（もしくはそうである可能性が低い）検査サンプルのセットから算出される。
【００４７】
サンプル分布と参照分布との間における違い、または参照分布からのサンプル外れ値を比較および検出することは、当業者には公知であろう。パラメトリックおよびノンパラメトリック統計検定の使用、例えば（片側または両側）ｔ検定、マン・ホイットニーの順位和検定、および他のものの使用を包含し、Ｚスコア、例えば中央値絶対偏差に基づくＺスコアの使用を包含する（例えば、Stumm et al 2014, Prenat Diagn 34:185などによって用いられている）。分布を参照分布（またはそれからの外れ値）と比較するときに、本発明のある種の実施形態においては、比較は、平均、中央値、または個々のサンプルの分離が参照分布の約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、１．９５、１．９７、２．０超、もしくは約２．０標準分布超（「ＳＤ」）である場合に；および／または個々のサンプルが、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．７５、４．０、４．５、５．０超、もしくは約５．０超のＺスコアで参照分布から分離する場合に、識別される（および／または有意に異なるとして同定される）。
【００４８】
ある種の実施形態において、データセットの文脈において、Ｚスコア（またはパラメータのレプリケートの分布パターンに基づく同等の統計値）が算出されて、外れ値のデータポイント（単数または複数）（例えば、子癇前症に罹るかもしくはそれを発生する増大したリスクを有すると予測されるかもしくは有する妊娠女性を同定することを求める検査の文脈などにおいて、ＤＮＡ種の過剰量を表すか、または染色体異数性を患う胎児を同定することを求める検査の文脈などにおいて、参照染色体に対して１つの染色体の過剰量を表す）を同定し、かかるデータポイントを表すデータがデータセットから除去され、爾後のＺスコア分析がデータセットについて実施されて、さらなる外れ値を同定することを求め得る。かかる反復的Ｚスコア分析は、特に、場合によっては１つのランにおける２つ以上の異数性サンプルが１回のＺスコア分析を歪め得るところで、および／または偽陽性を確認するためのフォローアップ検査が利用可能であり、それゆえに、偽陰性を回避することが偽陽性の（初期の）同定よりも（that）潜在的に重要であるところで、本発明の方法を用いる胎児染色体異数性の検出に役立ち得る。
【００４９】
本発明の方法の実施は、第１の（または第２の）標的ＤＮＡ種（例えば、染色体異数性に関係する染色体またはその一部、例えばヒト２１番染色体から）および参照ＤＮＡ種（例えば、参照染色体またはその一部、例えば１２番、５番、または２番染色体から）の相対的な検出（または量）を可能にし得、それゆえに、胎児の染色体異数性の素早く単純で費用効果的な検出、同定、または診断を助け得る。かかるアプローチは多くのラボにおいてより容易に確立および実施され得、例えば、比較的単純な、確実で費用効果的な定量的ＰＣＲマシンを要求し；高価で特殊なハイスループット次世代シーケンシングマシンを要求しない。実際に、本発明のかかる実施形態のある種のものにおいて、前記第１の標的ＤＭＲのステップ（ｃ）における検出および前記参照ＤＭＲのステップ（ｄ）における前記検出は、かかるＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出ベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に用いる。同じ反応／検出ベッセル中において有効に同時に実施される実施形態において、第１の（または第２の）標的および参照ＤＮＡ種の相対的な検出、同定、または定量（標的ＤＭＲおよび参照ＤＭＲによる）は、有利には、第１の（または第２の）標的ＤＭＲの少なくとも２つを、参照ＤＭＲ、および用いられる場合には任意のステップ（ｆ）において検出されるそれらの対応するＯＲから識別し得る検出可能な標識の使用によってなされ得る。特定のさらなるかかる実施形態において、検出（ｃ）および（ｄ）が同じ反応／検出ベッセル中において有効に同時に実施されるところでは、ステップ（ｃ）における前記検出およびステップ（ｄ）における前記検出が、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲによってなされるところを包含し、前記ＤＭＲのそれぞれおよび用いられる場合には各ＯＲに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる。
【００５０】
本発明の全ての態様において、染色体異数性の存在が、胎児異常および／または先天性障害に関連する染色体異常のトータルのまたは部分的なかかる異数性である実施形態が包含される。例えば、かかる染色体異常は：トリソミー（例えば、２１トリソミー、１８トリソミー、または１３トリソミー）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群、または脆弱Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、プラダー・ウィリー症候群、猫鳴き症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、または２２ｑ１１欠失症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、カナバン（Canvan）病、および神経線維腫からなる群から選択され得る。最も関係するのは、有病率、それゆえに医学的および社会的影響の点で、かかる染色体異常がトリソミー、例えば２１トリソミー、１８トリソミー、または１３トリソミーからなるリストから選択されるものであるところである。
【００５１】
妊娠女性がヒトである本発明の実施形態において、染色体異数性に関わる染色体は、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体、好ましくは２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体からなるリストから選択されるヒト染色体であり得る。特定のかかる実施形態において、染色体異数性に関わる染色体はヒト２１番染色体である。かかる実施形態のいずれかのある種のものにおいて、前記染色体異数性は前記染色体の異数性であり得る。本発明の全ての態様において、染色体異数性は、前記染色体のモノソミーまたはトリソミーであり、これは当業者に公知であろう通り前記染色体の部分的なまたは完全な異数性、例えば部分的なまたは完全なモノソミーまたはトリソミーであり得、「部分的な」異数性は、染色体の一部の喪失または増加によって引き起こされる遺伝物質の不均衡の意味を包含する。例えば、部分的な異数性は不均衡な転座の状況を包含し得、個体は、２つの異なる染色体の破断および融合によって形成された派生染色体を負う。この例において、個体は、１つの染色体の一部の３コピー（２つの正常なコピー、および派生染色体上に存在する部分）と、派生染色体に包含された別の染色体の一部の１コピーのみとを有するであろう。
【００５２】
対応して、妊娠女性がヒトである本発明の実施形態において、参照染色体（単数または複数）の１つ以上は、ヒト１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２番染色体、ヒト１４、１５、１６、１７番染色体、ヒト１９番染色体、ヒト２０番染色体、ヒト２２番染色体、およびヒト２３番染色体からなるリストから選択されるものである。特定のかかる実施形態において、参照染色体はヒト５番染色体またはヒト１２番染色体である。
【００５３】
本発明のある種の実施形態において、前記参照ＤＭＲの２つ以上は異なる参照染色体上に位置する。例えば、ある種の実施形態において、前記参照ＤＭＲの１つはヒト５番染色体上に位置し、前記参照ＤＭＲの別のものはヒト１２番染色体上に位置する。
【００５４】
しかしながら、本発明の範囲内には、参照染色体として用いられる染色体の１つ（またはより多く）が、染色体異数性に関連し得る染色体だが、検出方法が適用されようとする染色体異数性に関わるものとは異なる染色体である実施形態もまた包摂される。例えば、本発明の方法が、ヒト妊娠女性が身籠っている胎児の２１トリソミーを検出するために実施されようとする場合には、例えばヒト１８番染色体またはヒト１３番染色体、特に１３番染色体が「参照」染色体として用いられ得る。かかる例においては、胎児が２１トリソミーおよび１３トリソミー両方を負う見込みは僅かであって、１３番染色体と比較しての２１番染色体の過剰は、２１番染色体のトリソミーを指示するであろう。対応して、同じアッセイの使用だが、ここでは代わりに検出方法が適用されようとする染色体異数性に関わる染色体としての１３番染色体の考察によって、２１番染色体と比較しての１３番染色体の過剰（１３番染色体と比較しての２１番染色体の縮減と同等）は１３番染色体のトリソミーを指示するであろう。「参照」染色体のかかる選択および本発明の方法の実施／考察は、染色体異数性に関わる１つよりも多くの染色体における異数性の存在（または不在）を１回のアッセイで検出する可能性を提供するという具体的な利点を有するであろう。かかるアッセイは時間および費用を節約するであろうのみならず、１つのサンプルからのかかる１つよりも多くの染色体異数性の存在の検出をもまた可能にするであろう；母親サンプル中に典型的に存在する胎児由来ＤＮＡの比較的低いレベルがあって、これは、より少しのサンプリング、または妊娠女性から取られるより少ないサンプルを要求するであろう。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに：
（ｆ）  胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化されない少なくとも１つの他の領域（ＯＲ）を検出することによって、前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を決定し、前記試薬によるそのＯＲ（単数または複数）の改変がＤＮＡのメチル化に対して非感受性であるステップ、
を含み、
好ましくは、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）およびステップ（ｆ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲおよび前記他の領域（単数または複数）について、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、１つの実施形態においては：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に；および／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）および前記ＯＲ（単数または複数）の少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）に用いる。代替的な実施形態において、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）およびステップ（ｆ）における検出は：異なる検出可能な標識（単数または複数）を、前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）、前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）、および前記の少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）に用いてなされ得る。
【００５６】
ＤＭＲとは対照的に、「他の領域」（「ＯＲ」）は、本発明に用いられる場合には、サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡ種とそれが混ざった母親（material）起源のＤＮＡとの間において（有意に）差次的にメチル化されない。例えば、用いられる条件および試薬の性質の下では、混ざった（母親）ＤＮＡの他の領域と比較して、前記（胎児）ＤＮＡ種の他の領域におけるかかる試薬による改変の間に）検出可能な違いがない。かかる違いのなさは、他の領域がメチル化のための部位を含まない場合に、かかる部位が存在する場合であってメチル化の度合いの違いがない場合に、または他の領域に存在するメチル化のいずれかの部位を認識しない試薬の使用によって達成され得る。従って、本発明の代替的な実施形態においては、任意のステップ（ｆ）に用いられる少なくとも１つのＯＲは、前記（胎児）ＤＮＡ種と別の（母親）ＤＮＡとの間においてメチル化の（有意な）違いが前記試薬によって認識または検出されない（またはされ得ない）（あるいは認識可能または検出可能ではない）ものである。
【００５７】
本発明の方法のある種の実施形態において、前記ＯＲ（単数または複数）は１つ以上の参照染色体（単数または複数）上に位置する。ヒト妊娠女性のケースにおいては、前記参照染色体（単数または複数）の１つ以上は、ヒト１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２番染色体、ヒト１４、１５、１６、１７番染色体、ヒト１９番染色体、ヒト２０番染色体、ヒト２２番染色体、およびヒト２３番染色体からなるリストから選択されるものであり得る。特定のかかる実施形態において、参照染色体はヒト５番染色体またはヒト１２番染色体である。ある種の特定の実施形態において、前記ＯＲの少なくとも１つは、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つと同じ参照染色体（単数または複数）上に位置し得、例えば前記参照ＤＭＲの１つおよび前記ＯＲの１つは、両方ともヒト５番染色体またはヒト１２番染色体上に位置し得る。他の実施形態において、前記ＯＲ（単数または複数）は染色体異数性に関わる染色体（単数または複数）上に位置する。
【００５８】
ＯＲ（単数または複数）（それほど差次的にメチル化されない）は、本発明に用いられる場合には、本発明に用いられる（例えば、参照）ＤＭＲの１つ以上とオーバーラップしないであり得る。例えば、ＯＲは、（例えば、参照）ＤＭＲの１つ（または全て）から約１０ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、または１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、もしくは１０ｋｂよりも多く遠くに位置し得、例えば、前記（例えば参照）ＤＭＲの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置する（それと同じ遺伝子内に位置する実施形態を包含する）。特に、本発明に用いられる場合に、ＯＲのゲノム位置は、一般的に、本願において用いられる（例えば、参照）ＤＭＲの少なくとも１つのゲノム位置と、ゲノムの同じ部分に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し得る（それと同じ遺伝子内に位置する実施形態を包含する）。特にｃｆＤＮＡの胎児画分の文脈において、かかるＤＮＡ種の検出（および特に定量）は、ＯＲがそのように参照ＤＭＲの１つとゲノムの同じ部分に位置する場合には、（例えば、感度、正確度、および／または精度の点で）向上する。理論によって拘束されることなしに、かかる同様に位置するＤＭＲ（単数または複数）およびＯＲでは、特にかかる文脈において用いられるときには、ゲノム上におけるクロマチン／ヌクレオソームパッキングの、それゆえにゲノムＤＮＡの異なる領域の安定性／分解の変動の効果は和らげられ、その結果、ＯＲ（トータルＤＮＡを検出する）と比較して（例えば、参照）ＤＭＲ（例えば、参照胎児染色体ＤＮＡ種を検出する）の安定性／分解のいずれかの違いは少ないということが信じられ、それゆえに、かかるＤＭＲおよびＯＲの間におけるゲノム上における（有意に）差次的なクロマチン／ヌクレオソームパッキングによって生ずる定量的違いによってそれが（有意に）混乱することなしに、相対的な（および絶対的な）定量がなされ得る。
【００５９】
本発明は、混合物中のトータルＤＮＡの量の検出を提供するための、任意のステップ（ｆ）における１つのＯＲの任意の使用を包含する。しかしながら、本発明は、１つよりも多くのＯＲを用いる実施形態をもまた包摂する。例えば、本発明は、ステップ（ｆ）における前記検出が前記ＯＲの少なくとも２つ、例えば前記ＯＲの２つ、３つ、または４つを用いることを含むかかる実施形態を包含する。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、任意のステップ（ｆ）に用いられる前記ＯＲの数はステップ（ｄ）に用いられる参照ＤＭＲの数と同じである。例えば、２つの参照ＤＭＲが用いられる場合には、２つの他の領域がかかる実施形態に用いられ、３つの参照ＤＭＲが用いられる場合には、３つの他の領域が用いられる（例えば、図１に図示されている）。
【００６０】
本願の他所に記載されるように、本発明は、任意のＯＲが、一般的に、本願において用いられるＤＭＲ（例えば、参照ＤＭＲ）の少なくとも１つのゲノム位置の、ゲノムの同じ部分に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置する実施形態を包含する（それと同じ遺伝子内の実施形態を包含する）。これもまた本願の他所に記載されるように、本発明のある種の実施形態は、ＯＲが、一般的に、本願において用いられるＤＭＲ（例えば、標的ＤＭＲ）の少なくとも１つのゲノム位置の、ゲノムの同じ部分に、例えば、その約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置するところを包含する（それと同じ遺伝子内の実施形態を包含する）。ある種の実施形態において、ＯＲはかかるＤＭＲとオーバーラップしない。従って、複数のＯＲが本発明に用いられる場合には、かかるＯＲの２つ以上がゲノム中において２つ以上のＤＭＲ（例えば、参照ＤＭＲ）と同様に位置する実施形態が包含される。例えば、前記ＯＲの１つは、ステップ（ｄ）に用いられる参照ＤＭＲの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し得（それと同じ遺伝子内の実施形態を包含する）、前記ＯＲ（例えば、第２のＯＲ）の互いは、前記（例えば、オーバーラップしない）ＤＭＲ（例えば、第２の参照ＤＭＲ）の別のものの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置する（それと同じ遺伝子内の実施形態を包含する）。ある種の実施形態においては、追加のＯＲがＤＭＲ（例えば、参照ＤＭＲ）とオーバーラップし得る。
【００６１】
本発明に用いられるＯＲは、一般的にＤＭＲ（例えば、参照ＤＭＲ）とゲノムの同じ部分に位置するときには、約１６ｋｂから２０ｂｐ、１４ｋｂから２０ｂｐ、１２ｋｂから２０ｂｐ、１０ｋｂから２０ｂｐ、８ｋｂから２０ｂｐ、６ｋｂから２０ｂｐ、５ｋｂから２０ｂｐ、４ｋｂから２０ｂｐ、３ｋｂから２ｂｐ、１６ｋｂから２０ｂｐ、１ｋｂから２０ｂｐ、５００ｂｐから２０ｂｐ、２００ｂｐから２０ｂｐ、２０ｋｂから１５ｋｂ、１５ｋｂから１０ｋｂ、１２ｋｂから８ｋｂ、１０ｋｂから８ｋｂ、１１ｋｂから７ｋｂ、１１ｋｂから１０ｋｂ、９ｋｂから８ｋｂ、８ｋｂから６ｋｂ、６ｋｂから４ｋｂ、４ｋｂから２ｋｂ、２ｋｂから５００ｂｐ、１ｋｂから１００ｂｐ、５００ｂｐから５０ｂｐ、４００ｂｐから２００ｂｐ、および５００ｂｐから１００ｂｐ、および５００ｂｐから３００ｂｐの間からなる群から選択される距離以内の前記ＤＭＲの１つの上流または下流に位置し得る。特定の実施形態において、本発明に用いられる各ＯＲは一般的に、用いられるＤＭＲ（例えば、参照ＤＭＲ）の異なるものに位置する。
【００６２】
複数のＯＲが用いられる場合には、本発明は、任意のステップ（ｆ）における検出が、同じ検出可能な標識を前記ＯＲのそれぞれに用いてなされ、および／またはそれぞれが前記ＯＲの１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いる定量的多重リアルタイムＰＣＲを含む実施形態を包含する。
【００６３】
本発明の方法のある種の実施形態において、ステップ（ｆ）における検出は、実施される場合には、前記ＯＲの少なくとも２つを用いることを含む。特定のかかる実施形態において、前記ＯＲの数は、ステップ（ｄ）に用いられる参照ＤＭＲの数と同じであり得る。かかる実施形態のさらなるものにおいて、前記参照ＤＭＲの１つおよび前記ＯＲの１つは両方とも１つの参照染色体（例えば、ヒト５番染色体）上に位置し得、第２の参照ＤＭＲおよび前記ＯＲの第２のものは、両方とも別の参照染色体（例えば、ヒト１２番染色体）上に位置し得る。ある種のかかるさらなる実施形態において、前記ＯＲの１つは、ステップ（ｄ）において用いられる参照ＤＭＲの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し、前記ＯＲの互いは、前記参照ＤＭＲの別のものの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置する。
【００６４】
本発明のある実施形態において、種々のＤＮＡ領域、すなわちＤＭＲ（単数または複数）（および、包含される場合にはＯＲ（単数または複数））の検出は、単純化されたプロセスによって起こり得る。対応して、本発明の１つの特徴は、種々のＤＮＡ領域、すなわちＤＭＲ（および包含される場合にはＯＲ（単数または複数））の検出が、単純化されたプロセスによって起こり得るということである。例えば、サンプルからのＤＮＡの１つのアリコートを用いて、かかるＤＮＡ領域が１つのベッセル中において検出され得る。この特徴は、方法（単数または複数）を単純化し得、より効率的で正確な検出を（とりわけ、検出が定量的であるときの実施形態において）提供し得る。用語「ベッセル」は当分野において認識され、ベッセルの実施形態（例えば、チューブ、マイクロタイタープレートのウェル、ナノウェル、キャピラリー反応ベッセルなど）を包含し、その中で、方法に含まれるプロセスまたは手続き、例えば本発明の方法の反応および／または検出プロセスまたはステップが起こる。他のかかるベッセルは、用いられる検出テクノロジーに対して適切に、油／水エマルションの液滴、ナノ粒子、またはハイブリダイゼーションチャンバーを包含し得る。本発明のある種の実施形態において、用いられる検出可能な標識は、標的ＤＭＲのそれぞれについて異なり得、および／または各参照ＤＭＲについて同じであり得、および／または各ＯＲ（包含される場合）について同じであり得る。ただし、本質的に同時に検出されるときには、標的ＤＭＲに用いられる標識（単数または複数）は、参照ＤＭＲ（単数または複数）に（および、用いられる場合にはＯＲに）用いられる標識（単数または複数）とは異なる（すなわち、別個に検出され得る）。代替的には、本発明のある種の実施形態において、用いられる検出可能な標識は各ＤＭＲについて異なり得（例えば、同じではない）、および／または各ＯＲ（包含される場合）について異なり得る（例えば、同じではない）。本発明の方法に用いられる検出可能な標識は、各参照ＤＭＲについて同じであり得、ある種の実施形態においては、各ＯＲ（包含される場合）について同じであり得る。ただし、標的ＤＭＲに用いられる標識（単数または複数）は、参照ＤＭＲに用いられる標識（単数または複数）とは異なる（すなわち、別個に検出され得る）。そして、ＯＲ（用いられる場合）に用いられる標識（単数または複数）とは異なる。「同じ」である検出可能な標識は、構造的に異なるが、採用される検出テクノロジーによって有意に区別され得ないので機能的に（本質的に）同様である標識をもまた包含し得る。例えば、構造的に異なる蛍光色素は、それらの励起および放出スペクトルが（実質的にまたは本質的に）同様であるか、またはそれらが同じ波長（単数または複数）によって同時に励起および検出され得る度合いまでオーバーラップする場合には、「同じ」と考えられ得る。好適な標識（および検出モダリティー）は本願の他所にさらに記載される。好ましくは、ＤＭＲ（単数または複数）およびＯＲ（単数または複数）（包含される場合）の検出は、有効に同時になされ得る。例えば、同じ（反応／検出）ベッセル内において、全てのかかる領域（およびそれゆえに前記ＤＮＡ種およびトータルＤＮＡ）が、互いから約５ｓ、１ｓ、０．５ｓ、１００ｍｓ、１０ｍｓ、１ｍｓ、１００ｕｓ、１０ｕｓ、または１ｕｓ未満（特に、互いから約０．５ｓ未満、より具体的には約１００ｍｓ未満）以内に検出され得、例えばベッセルもしくは反応／混合物をいずれかの爾後のベッセル、アッセイ、もしくは設備に移すことがなく、または例えば検出プロセスをＤＭＲ（単数もしくは複数）もしくはＯＲ（単数もしくは複数）（のいずれか／どちらか）について別個に適合もしくは再校正することがない。検出可能な標識（単数または複数）、例えば前記第１の標的ＤＭＲ（単数または複数）のための少なくとも１つおよび参照ＤＭＲ（単数または複数）のための少なくとも１つの使用は、非天然であるコンポーネント、プロセス、および／またはステップを利用する。例えば、２つの特異的な標識の組成物は、特異的なＤＮＡ領域と一緒には（一般的に）天然に見出されないであろう。特に、プローブに基づく定量的ＰＣＲに用いられる短いプローブは、天然ゲノム中に見出されるものの断片であるＤＮＡ配列を含み得るが、１つ以上の標識（例えば蛍光色素）にリンクされたときには非天然である特異的な標識断片を形成する。
【００６５】
図式的な記載として、本発明の１つの実施形態に用いられる第１の標的ＤＭＲ（単数または複数）、参照ＤＭＲ、用いられる場合にはＯＲ（単数または複数）、および検出可能な標識（単数または複数）の一般的な編成の概略図が図６に提出されている。（１ａ）染色体異数性に関わる染色体上に位置する１つの第１の標的ＤＭＲ（ＤＭＲ１）におけるＤＮＡのメチル化の存在が、検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出される；（１ｂ）同じ染色体異数性に関わる染色体上に位置する第２の第１の標的ＤＭＲ（ＤＭＲ２）におけるＤＮＡのメチル化の存在が、異なる検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出される；（１’）２つの参照ＤＭＲにおけるＤＮＡのメチル化の存在が、同じ検出可能な標識（単数または複数）（しかし、第１の標的ＤＭＲを検出するために用いられるものとは異なる）によって検出される；（３’）参照ＤＭＲの検出は、２つの任意の他の領域（「ＯＲ１」および「ＯＲ２」））の文脈において、同じ検出可能な標識（単数または複数）（しかし、ＤＭＲを検出するために用いられるものとは異なる）を用いて検出され得る；（２）かかるＯＲの１つ以上は参照ＤＭＲと同じ染色体に位置し得る；特に、（４）ＯＲは参照ＤＭＲとゲノムの同じ部分に（例えば、その約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に）あり得る。
【００６６】
本発明の文脈において、本発明の方法に用いられるいずれかの特定のＤＭＲ（例えば、第１の標的ＤＭＲまたは参照ＤＭＲ）におけるメチル化は、少なくとも１つのＯＲの文脈において検出され得る。図式的な記載として、ＤＭＲ検出の１つの実施形態に用いられるかかるＤＭＲ（単数または複数）、ＯＲ（単数または複数）、および検出可能な標識（単数または複数）の１つの可能な一般的な編成の概略図が、図１（ａ）に提出されている。（１）ＤＭＲ１におけるＤＮＡ中のメチル化の存在は、ＤＭＲ１のゲノムの同じ部分に（例えば、その約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に）位置する他の領域（「ＯＲ１」）の文脈において検出される。（２）任意に、追加のＤＭＲおよび／またはＯＲ（例えば、ＤＭＲ２および／またはＯＲ２、最大でＤＭＲｎおよびＯＲｎ）が検出され得、かかる追加のＤＭＲおよびＯＲのペアは、それぞれ、互いとゲノムの同じ部分において（例えば、互いの約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に）同位置であり得る。任意に、（３）ＤＮＡ中のメチル化の存在は、同じ標的染色体上に位置するかもしくは１つ以上の参照染色体上に位置している複数のＤＭＲにおいて、同じ検出可能な標識（単数もしくは複数）を用いて検出され、および／または（４）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１および任意にＯＲ２、または最大でＯＲｎを用いて検出されるトータルＤＮＡの量は、ＤＭＲ（単数または複数）におけるメチル化を検出するために用いられるものとは異なる検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出される（任意に、用いられる検出可能な標識（単数または複数）は、同じ標的染色体上に位置するかもしくは１つ以上の参照染色体上に位置している全てのＯＲについて同じである）。
【００６７】
本発明の文脈において、同じ標的染色体上に位置または１つ以上の参照染色体上に位置するときに２つ以上のＤＭＲ（例えば、第１の標的ＤＭＲまたは参照ＤＭＲ）におけるメチル化が用いられるときにもまた、同じ検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出され得る。図式的な記載として、かかるＤＭＲ検出の１つの実施形態に用いられるかかるＤＭＲ、ＯＲ（単数または複数）（用いられる場合）、および検出可能な標識（単数または複数）の一般的な編成の概略図が図１（ｂ）に提出されている。（１）ＤＮＡ中の２つ以上のＤＭＲ、ＤＭＲ１およびＤＭＲ２（任意に、最大でＤＭＲｎ）におけるメチル化の存在は、同じ標的染色体上に位置または１つ以上の参照染色体上に位置するときに、各ケースにおいて、同じ検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出される。（２）任意に、他の領域（「ＯＲ」）が、ＤＭＲの１つのゲノムの同じ部分に（例えば、その約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に）位置し得る）。（３）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１、および任意にＯＲ２、または最大でＯＲｎ）を用いて検出されるトータルＤＮＡの量は、ＤＭＲにおけるメチル化を検出するために用いられるものとは異なる検出可能な標識（単数または複数）を用いて検出される（任意に、用いられる検出可能な標識（単数または複数）は、同じ標的染色体上に位置または１つ以上の参照染色体上に位置するときに全てのＯＲについて同じである）。（４）任意に、２つよりも多くのＤＭＲにおけるメチル化が検出され、および／またはトータルＤＮＡの量が１つよりも多くのＯＲにおいて検出される。
【００６８】
本発明における特徴のかかる組み合わせの使用は、効率性改善および／またはアウトカムの相乗的向上の機会を提供する。例えば、特に参照染色体の前記（胎児）ＤＮＡ種の（or）検出（例えば、定量的な量の検出）の改善された感度および／または正確度および／または特異性および／または精度が、かかる組み合わせの使用によって得られ得る；その改善の度合いは、単独の各特徴の使用と比較して相乗的であり得る；例えば、組み合わされた特徴の使用によって得られる向上は、個々に各特徴の使用によって得られる各向上の合計よりも大きい。本発明のある種の実施形態において、アッセイまたは検査は、かかる検査に望まれる総体的な感度（真陽性率）、特異性（真陰性率）、および／または無効率を提供する；例えば：１００％、ほとんど１００％、９７％超（特に、９７．５％超）、もしくは９５％超の感度；９５％超、特に９６％超の特異性；および／または１０％未満（特に、７％未満）、例えば６％または５％未満の無効率。特定の実施形態において、本発明のアッセイまたは検査は、９５％超の感度、９０％超の特異性、および１０％未満の無効率を提供し得、より具体的には、９７％超の感度、９５％超の特異性、および７％未満の無効率を提供し得る。
【００６９】
ここで本発明の開示に従って当業者には明らかであろう通り、ステップ（ｃ）に類似の追加のステップが、方法において、第２の標的染色体（例えば、参照染色体（単数または複数）に対して相対的な）のメチル化を検出、それゆえにその量を決定／定量化／比較するために実施され得、かかる第２の標的染色体もまた（例えば、異なる）染色体異数性に関わる（例えば、異なる）染色体である。妊娠女性が身籠っている胎児の２つの（またはより多くの）異なる染色体異数性の存在を検出可能なかかる方法は、費用、スピード、および利便性の点で具体的な利点を有する。
【００７０】
従って、それから、本発明のある種の実施形態において、方法は、さらに：
（ｃ）’  前記サンプル中の異なる染色体異数性に関わる染色体である第２の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記異なる染色体異数性に関わる染色体上に位置する２つ以上の第２の標的ＤＭＲにおけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第２の標的ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第２の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変がＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第２の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量は、前記サンプル中の第２の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）’  ステップ（ｃ）’から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）を決定し、前記相対量（単数または複数）の１つ以上が、胎児の異なる染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
好ましくは、ステップ（ｃ）およびステップ（ｃ）’およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記第２の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ得、任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に；ならびに／または（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）および前記第２の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）および任意のＯＲ（単数または複数）に用いる。
【００７１】
第２の標的ＤＭＲの文脈において、かかる第２の標的ＤＭＲに用いられる検出可能な標識（単数または複数）の種々の可能な編成は、第１の標的ＤＭＲについて記載されている通りであり得、しかしながら、ある種の実施形態においては、かかる第１の標的ＤＭＲに用いられるものとは異なる検出可能な標識（単数または複数）がかかる第２の標的ＤＭＲに用いられ、同じく参照ＤＭＲに用いられ、ＯＲ（単数または複数）が方法に用いられる場合には、同じくかかるＯＲ（単数または複数）に用いられるということを定める。
【００７２】
本発明のかかる実施形態の文脈において、方法が、ヒト妊娠女性が身籠っている胎児の２つ以上の染色体異数性を検出することを求めるように実施されるときには、異なる染色体異数性に関わる染色体は、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体からなるリストから選択されるヒト染色体であり得、特に、かかる染色体は第１の標的染色体とは異なる。例えば、異なる染色体異数性に関わる染色体は、ヒト１８番染色体または１３番染色体、特にヒト１８番染色体であり得：前記異なる染色体異数性は前記異なる染色体の異数性、例えば前記異なる染色体のトリソミーである。
【００７３】
特定のかかる実施形態において、方法が、ヒト妊娠女性が身籠っている胎児の２つ以上の染色体異数性を検出することを求めるように実施されるときには、前記染色体異数性に関わる染色体と異なる染色体異数性に関わる前記異なる染色体とは：ヒト２１番および１８番染色体、ヒト２１番および１３番染色体、ヒト１８番および１３番染色体からなるリストから選択されるヒト染色体のペアであり得；前記染色体異数性および前記異なる染色体異数性は、それぞれの染色体の異数性、好ましくはそれぞれの染色体のトリソミーである。
【００７４】
より具体的なかかる実施形態において、方法が、ヒト妊娠女性が身籠っている胎児の２つ以上の染色体異数性を検出することを求めるように実施されるときに、前記第１の標的ＤＭＲのそれぞれは、ヒト２１番染色体、ヒト１８番染色体、またはヒト１３番染色体、好ましくはヒト２１番染色体上に位置し得；任意に、存在する場合には、前記第２の標的ＤＭＲのそれぞれはヒト１８番染色体またはヒト１３番染色体上に位置し得る。
【００７５】
本発明は、ステップ（ｃ）（およびステップ（ｅ））へのさらなる類似の追加のステップが実施されるところをもまた包摂する；各さらなる類似の追加のステップは、異なる染色体異数性（例えば、２つ、３つ、４つ、または４つよりも多くの染色体異数性）が胎児に存在するかどうかを指示するためのさらなる標的ＤＭＲを用いる。例えば、１つのステップ（ｃ）（およびステップ（ｅ））はヒト２１番染色体の異数性を検出するように構成され得、第１の追加のステップ（ｃ）（およびステップ（ｅ））はヒト１８番染色体の異数性を検出するように構成され得、第２の追加のステップ（ｃ）（およびステップ（ｅ））はヒト１３番染色体の異数性を検出するように構成され得る。
【００７６】
ステップ（ｃ）（またはステップ（ｅ））に適用可能であるとして本願に記載されるいずれかの可能な実施形態は、かかる類似の追加のステップ（ｃ）（またはステップ（ｅ））のいずれかに、例えばステップ（ｃ）’（またはステップ（ｅ）’）に等しく適用可能であり得る。例えば、ステップ（ｅ）’を有する本発明の特定のかかる実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）’において、前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）が閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上が、胎児の異なる染色体異数性の存在を指示するところをさらに包含し得る。
【００７７】
ある種の実施形態においては、本発明のいずれかの方法のステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）の一部として起こる検出に先立って、またはその一部として、前記ＤＭＲ（単数もしくは複数）および／または前記任意のＯＲ（単数もしくは複数）をそれぞれ含む各ＤＮＡ領域が増幅される。ＤＮＡの増幅はいずれかの好適な複製プロセスを用いて実施され得、特定のかかる実施形態において、ＤＭＲ（単数もしくは複数）および／または任意のＯＲ（単数もしくは複数）のそれぞれは、各ＤＭＲおよび／またはＯＲについて好適に設計されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。当業者は、本発明の方法への使用のためのかかるＰＣＲプライマーを難なく設計できるであろう。例えば、プライマー設計アルゴリズムおよびプログラム、例えばＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ９（Ｓｃｉ−Ｅｄソフトウェア）、ベクターＮＴＩ（ライフテクノロジーズ）、またはウェブに基づくツール、例えばwww.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/もしくはmolbiol-tools.ca/PCR.htmに見出されるものの使用による。ＰＣＲ増幅を含む本発明の実施形態は、さらに、ＰＣＲの実施に関係する具体的なステップ、例えば本願に記載されるもののいずれか、または特に：（Ａ）二本鎖の標的ＤＮＡ、かかるＤＮＡの領域（例えば、本願に記載されるＤＭＲまたは任意のＯＲ）を増幅するように設計されたプライマーのペア（例えば、本願において開示されるプライマーのペア）（第１のプライマーは標的ＤＮＡの第１鎖上の配列に相補的であり、第２のプライマーは標的ＤＮＡの第２鎖上の配列に相補的である）、Ｔａｑポリメラーゼ、ならびにアデニン、チミン、シトシン、およびグアニンを含む複数の遊離ヌクレオチドを含む反応混合物を提供するステップと；（Ｂ）反応混合物を第１の所定の温度に第１の所定の時間だけ加熱して、標的ＤＮＡの鎖を互いから分離するステップと；（Ｃ）第１および第２のプライマーを標的ＤＮＡの第１および第２鎖上のそれらの相補配列とハイブリダイゼーションさせ、Ｔａｑポリメラーゼにプライマーを伸張させる条件において、反応混合物を第２の所定の温度に第２の所定の時間だけ冷却するステップと；（Ｄ）ステップ（Ｂ）および（Ｃ）を少なくとも２０回繰り返すステップとを含み得る。
【００７８】
用語「プローブに基づく」定量的ＰＣＲは当分野において認識されており、異なるブランド名（例えば、ロシュの「ＴａｑＭａｎ」ＰＣＲ）で記載および市販されている種々の実施形態を包摂し、所与のアンプリコン（例えば、ＤＭＲまたは他の領域）の検出に特異的である（例えば、蛍光）レポータープローブを用いる。プローブに基づく定量的ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）をレポーターとして用いる定量的ＰＣＲとは別物である。なぜなら、かかる二本鎖ＤＮＡ結合色素はいずれかの二本鎖アンプリコンに非特異的に（non-specially）結合し、例えばＤＭＲ（単数または複数）（すなわち、前記ＤＮＡ種）の検出と他の領域（単数または複数）の検出（すなわち、トータルＤＮＡの検出）とを識別するためには用いられ得ないからである。当業者は理解するであろう通り、ＰＣＲの特異的なアンプリコンはアンプリコンに１つのプローブを用いてまたは複数のプローブ（例えば、２つまたは３つのプローブ）を用いることによって検出され得る。特に、プローブに基づく定量的ＰＣＲは、標識オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を検出するプロセスが組み込まれた増幅反応を包含し得、これは、核酸ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を用いて、ハイブリダイゼーションした二重鎖からアニーリングした標識オリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）を切断し、検出のための標識オリゴヌクレオチド断片を放出する。かかるアプローチおよびプロセスは当分野において公知であり、より一般的な点でGelfand et al（ＵＳ５８０４３７５、ＥＰ０５４３９４２、および関係するファミリーメンバー）および／またはLivak et al（ＵＳ６２５８５６９、ＥＰ０７９２３７４、および関係するファミリーメンバー）によって記載されており、プローブが、結合したときに標識の検出可能性を抑えるクエンチャー分子との組み合わせで検出可能な標識を含むところを包含し、その結果、検出可能な標識が反応混合物中に放出され（クエンチャーから離れ）、それゆえに検出され得る前に、５’−３’ヌクレアーゼ（およびそれゆえに増幅）が起こることが要求される。さらにその上、代替的にまたは加えて、「プローブに基づく」定量的ＰＣＲアプローチは、例えばReed et alによって記載されているオリゴヌクレオチド−フルオロフォア−クエンチャー−副溝結合剤コンジュゲートを含むプローブの使用によって向上し得る（ＵＳ６７２７３５６、ＥＰ１２３５９３８、および関係するファミリーメンバー）。例示的なクエンチャー分子はＢＨＱ１、ＢＨＱ３、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＢＨＱ２、ＢＢＱ６５０を包含する。
【００７９】
かかるプローブに基づく定量的ＰＣＲは、アナログ的なアプローチによって、ライトサイクラーなどのマシンを用いて実施され得、（例えば、経時的な）シグナルの強度が測定され、検出を定量的に決定するために用いられる。かかる検出のためのシステムおよびアプローチは、Woudenberg et al（ＵＳ６９２９９０７、ＥＰ０７０６６４９、および関係するファミリーメンバー）および／またはHiguchi（ＵＳ５９９４０５６、ＥＰ０５１２３３４、および関係するファミリーメンバー）によって記載されている。代替的には、検出されるＤＮＡの量を定量化するための方法として、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、すなわち、増幅イベント数を決定するように複数イベントで実施されるＰＣＲ。例えば、ナノウェルまたは液滴（ｄｄＰＣＲ）中で実施されるｄＰＣＲ。ｄｄＰＣＲテクノロジーの商業的に利用可能なサプライヤーはバイオラッドおよびレインダンスを包含する。
【００８０】
当業者は、ＤＭＲおよび／またはＯＲ（単数または複数）のプローブに基づく定量的ＰＣＲ検出にとって好適なプライマーおよびプローブ（および好適な標識、例えば色素を有する）を設計できるであろう；例えば、本願の他所に記載されるプライマー／プローブ設計ソフトウェアを用いることによる。公知であろう通り、特に試薬が１つ以上のメチル化感受性の制限酵素、例えば本願において開示されるもの（またはその組み合わせ）を含むときには、ＰＣＲプライマーは、方法に用いられるメチル化特異的改変試薬に特異的なメチル化部位（単数または複数）とオーバーラップし得る。特定のかかる実施形態において、所与のＤＭＲのためのＰＣＲプライマーの１つまたは他方（または、一緒に考えられるときには両方）は、２つのまたは３つのかかるメチル化部位（例えば、メチル化感受性の制限酵素の２つまたは３つの制限部位であって、それらのそれぞれがメチル化部位を含み得るかまたは含む）とオーバーラップし得る。代替的にまたは加えて、ＤＭＲのためのプライマーは、１つ、２つ、３つ、またはより多くのかかるメチル化部位、例えば最大で１０、１５、２０、２５、または５０個のかかるメチル化部位をフランキングするように設計され得、特に、１つ、２つ、３つ、またはより多くのかかるメチル化部位（より具体的には、２つおよび４つの間のかかるメチル化部位）の制限部位、例えば最大で１０、１５、２０、２５、または５０個のメチル化感受性の制限酵素をフランキングし、それらのそれぞれはメチル化部位を含み得るかまたは含む。
【００８１】
他の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）に用いられる検出可能な標識は、蛍光、タンパク質、低分子、または放射性標識からなる群から独立して選択される。例えば、同じである蛍光標識（同様のまたはオーバーラップする励起および／または放出スペクトルを有することによってを包含する）がＤＭＲ（単数または複数）に用いられ得、励起および／または放出スペクトル（特に、異なる放出スペクトル）を有する蛍光標識が任意のＯＲ（単数または複数）の検出に用いられ得る。当業者は、本発明への使用にとって適切なかかる蛍光標識（単数または複数）を、例えばＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｑｕａｓａｒ、およびテキサスレッドおよびＬＣＣｙａｎ５００、６ＦＡＭ、Ｃｙ５、およびＬＣＲｅｄ６１０、およびＬＣＲｅｄ６４０からなる群から選択できるであろう。蛍光標識は対応するクエンチャー部分とともに用いられ得る；かかる標識−クエンチャーペアの選択は当分野において周知であり、ＬＣＣｙａｎ５００／ＢＨＱ１、Ｃｙ５／ＢＨＱ３、６ＦＡＭ／Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＬＣＲｅｄ６１０／ＢＢＱ６５０、およびＬＣＲｅｄ６４０／ＢＨＱ３からなるリストから選択される標識−クエンチャーペアを包含し得る。
【００８２】
他の実施形態において、検出可能な標識はタンパク質または低分子タグであり得、これは例えば特異的抗体およびＥＬＩＳＡ型検出アプローチを用いて検出され得る。種々のＤＭＲおよび／または任意のＯＲ（単数または複数）の同じまたは異なる標識および適切な検出に適用可能な同じタンパク質もしくは低分子または検出可能に異なるタンパク質もしくは低分子の使用もまた、本発明に用いられる検出可能な標識（単数または複数）に利用され得る。異なる放射性標識同士は、それらの放出エネルギー、透過／励起特性、および粒子の型によって識別され得る（例えば、アルファおよびベータ粒子を識別することによる）。他の検出可能な標識（例えば、核酸によってコードされたタグ）もまた本発明に採用され得る。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、例の方法のステップ（ｃ）および／またはステップ（ｃ）’における検出は、プローブに基づく定量的リアルタイムＰＣＲを含み、例えば、第１の標的ＤＭＲ（単数もしくは複数）および／または任意の第２の標的ＤＭＲ（単数もしくは複数）の１つに特異的である少なくとも１つの標識プローブを用いることによる。複数のＤＭＲおよび／または任意のＯＲ（単数または複数）のＰＣＲ増幅が同じ反応によってなされる実施形態において、かかるＰＣＲは「多重」と考えられ得る（または、２つのＤＭＲおよび／またはＯＲ（単数または複数）のみがそのように増幅される場合には「二重」）。同じ様に、加えてまたは代替的に、本発明の方法のステップ（ｄ）における検出は、プローブに基づく定量的リアルタイムＰＣＲを含み得、例えば、前記参照ＤＭＲ（単数または複数）の１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いることによる。同じ様に、加えてまたは代替的に、本発明の方法の任意のステップ（ｆ）における検出もまた、プローブに基づく定量的リアルタイムＰＣＲを含み得、例えば、前記ＯＲ（単数または複数）の１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いることによる。
【００８４】
本発明の方法に用いられるプライマーおよび／またはプローブは、例えばメチル化ＣｐＧからウラシルへのバイサルファイト変換に従って、配列特異的な検出によって（my）ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化を検出するように構成または設計され得る。限定しない例として、かかる検出は、本願の他所に記載のようにＭＳＰまたはＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔによって起こり得る。
【００８５】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｃ）における検出は、プローブに基づく定量的リアルタイムＰＣＲを含み、例えば少なくとも２つの標識プローブを用いることにより、それらのそれぞれは前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つに特異的である；および／またはステップ（ｄ）における前記検出は、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲを含み、少なくとも２つの標識プローブを用い、それらのそれぞれは前記参照ＤＭＲの１つに特異的である。
【００８６】
本発明の他の実施形態において、ステップ（ｆ）における前記検出は定量的リアルタイムＰＣＲを含み、前記ＯＲ（単数または複数）の１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる。
【００８７】
前記ＯＲ（単数または複数）の２つ以上が用いられるときに、本発明は、任意のステップ（ｆ）における検出が：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記ＯＲのそれぞれに用いてなされる；および／またはステップ（ｆ）における前記検出が、それぞれが前記ＯＲの１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いるプローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲを含む、実施形態を包含する。
【００８８】
特定の実施形態において、１つ以上の（好ましくは全ての）検出ステップ（すなわち、ＤＭＲ（単数または複数）およびＯＲ（単数または複数）について要求されるもの）は、１プロセスステップまたは反応で、プローブに基づく定量的多重（例えば、ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲを用いて効率的で有効な様式で実施される。例えば、本発明の特定の実施形態において、前記検出ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）は、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出ベッセル中において、有効に互いと同時に、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲによってなされ、前記ＤＭＲおよび任意のＯＲ（単数または複数）のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる。特定のかかる実施形態において、試薬は、１つ以上のメチル化感受性の制限酵素、例えば本願において開示されるもの（またはその組み合わせ）を含む。
【００８９】
本発明は、さらなる手続き、例えば１つ以上のコントロール手続きをもまた包含し得る。例えば、本発明は、改変ステップのコントロールとして（例えば、制限酵素消化のコントロールとして）働くＤＮＡ領域の第３のクラスの検出を対象とする１つ以上のステップを包含し得る。例えば、かかる実施形態もまたプローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲを用いて実施され得、かかるコントロール領域が、領域のかかるクラスに用いられるさらなる検出可能な標識を有するプライマー／プローブ（単数または複数）のさらなるセットによって増幅および検出される。
【００９０】
本発明において、前記標的および参照ＤＮＡ種は胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とし、前記サンプルは妊娠女性からである。ある種の実施形態において、サンプルは非侵襲的な様式で得られ得る。例えば、前記ＤＮＡ種は、血液収集チューブなどの従来の手段によって妊娠女性から得られた血液または血液画分（例えば、血漿または血清）であるサンプルから検出された、循環セルフリーＤＮＡである。かかる実施形態において、サンプルは母親起源を有するＤＮＡを含み得る；すなわち、それは妊娠女性の細胞（およびそれゆえにゲノム）を起源とする。
【００９１】
本発明の全ての態様において、サンプルが組織サンプルまたは体液のサンプルである実施形態が存在する。特に、サンプルは全血または（例えば、血漿もしくは血清などの）血液画分である。代替的な実施形態において、サンプルは、尿、唾液、汗、涙、痰、母乳、乳吸引物、膣分泌物、膣洗液、および結腸洗液からなる群から選択される体液である。より具体的な実施形態において、サンプルは、妊娠女性からの血漿もしくは血清サンプルであり、または妊娠女性からの尿である。他の実施形態において、サンプルは大体（または本質的に）細胞を不含であり、および／または全血サンプルではない。
【００９２】
本発明の全ての態様の特定の実施形態において、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とする前記ＤＮＡ種は循環セルフリーＤＮＡであり、前記サンプルは血液画分、例えば血漿または血清である。
【００９３】
本発明は、ＤＭＲ（単数または複数）（例えば、第１もしくは第２の標的ＤＭＲおよび／または参照ＤＭＲ）が胎児ＤＮＡにおいて高メチル化され、母親ＤＮＡにおいて低メチル化される実施形態を包含する。ある種の実施形態において、かかるＤＭＲは、遺伝子、例えば本願において開示される遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域、もしくはエキソン、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し得る。代替的に、ＤＭＲはかかる遺伝子のイントロン中に、またはゲノムの非コード領域中に位置し得る。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、かかるゲノムおよび／または遺伝子はヒトゲノムまたは遺伝子である。
【００９４】
具体的には、本発明には、前記ＤＭＲ（単数または複数）が前記試薬に特異的な少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位（単数または複数）を含む実施形態が包含され、例えば、前記試薬に特異的な３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１０個よりも多く、例えば約１５、２０、２５、５０、または５０個よりも多くのメチル化部位（単数または複数）を含む。
【００９５】
染色体異数性に関わる染色体上に位置するＤＭＲの文脈において、本発明は、かかる染色体上に位置するいずれかの好適なＤＭＲ、例えば本願の何処かに記載されるものを包摂する。
【００９６】
本発明の特定の実施形態において、例えば方法がヒト２１番染色体の染色体異数性の検出を求めるように構成されるときには、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、ＷＯ２０１１／０９２５９２に開示されているものから独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置し、Lim et al 2014, BMC Medical Genomics 7:1においてさらに研究されているように）ＷＯ２０１１／０９２５９２のＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ７、ＥＰ８、ＥＰ９、ＥＰ１０、ＥＰ１１、およびＥＰ１２（ＷＯ２０１１／０９２５９２の配列番号３３〜４４）からなるリストから選択されるもの（on）を包含する。
【００９７】
本発明の他の特定の実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＡＩＲＥ（ＥＮＳＧ０００００１６０２２４；ヒト自己免疫調節遺伝子；Ｃｈｒ２１：４４，２８５，８３８〜４４，２９８，６４８フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、ＳＩＭ２（ＥＮＳＧ０００００１５９２６３；ヒトＳｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄホモログ２；Ｃｈｒ２１：３６，６９９，１３３〜３６，７４９，９１７フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、およびＥＲＧ（ＥＮＳＧ０００００１５７５５４；ヒトＥＴＳ関連遺伝子；Ｃｈｒ２１：３８，３８０，０２７〜３８，６６１，７８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリストから独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する。
【００９８】
本発明の他の特定の実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＰＤＥ９Ａ（ＥＮＳＧ０００００１６０１９１；ヒトホスホジエステラーゼ９Ａ；Ｃｈｒ２１：４２，６５３，６３６〜４２，７７５，５０９フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２（ＥＮＳＧ０００００２３４００８；ヒトタンパク質ホスファターゼ１制御（阻害因子）サブユニット２偽遺伝子２遺伝子；Ｃｈｒ２１：３５，８８７，１９５〜３５，８８７，８０７フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、ＣＢＲ１（ＥＮＳＧ０００００１５９２２８；ヒトカルボニルレダクターゼ１遺伝子；Ｃｈｒ２１：３６，０６９，９４１〜３６，０７３，１６６フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、ＤＳＣＡＭ（ＥＮＳＧ０００００１７１５８７；ヒトダウン症候群細胞接着分子遺伝子；２１番染色体：４０，０１０，９９９〜４０，８４７，１３９リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、Ｃ２１ｏｒｆ２９（ＥＮＳＧ０００００１７５８９４；ヒトトロンボスポンジン型ラミニンＧドメインおよびＥＡＲリピート遺伝子；２１番染色体：４４，４９７，８９２〜４４，７１１，５８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、ＨＬＣＳ（ＥＮＳＧ０００００１５９２６７；ヒトホロカルボキシラーゼシンセターゼ遺伝子；２１番染色体：３６，７５０，８８８〜３６，９９０，２３６リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列、特に、各ケースにおいて、ＷＯ２００７／１３２１７６に開示されている領域からなるリストから独立して選択される；あるいは：ＣＧＩ１３７、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｔｏ−Ｆｅｍ１Ａ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ＣＧＩ００９、およびＣＧＩ１３２、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列、特に、各ケースにおいて、ＷＯ２００７／１３２１７６に開示されている領域からなるリストから選択される領域および／もしくは遺伝子中に位置する。あるいは、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、Ｃ２１ｏｒｆ５７である領域および／もしくは遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１８２３６２；ｙｂｅＹメタロペプチダーゼ；２１番染色体：４６，２８６，３３７〜４６，２９７，７５１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。あるいは、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、Ｃ２１ｏｒｆ２９である領域および／もしくは遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１７５８９４；２１番染色体：４４，４９７，８９２〜４４，７１１，５８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。あるいは、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、ＣＧＩ１４９である領域および／または遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１１５５６１；荷電多胞体タンパク質３、ＣＨＭＰ３；ＨＧＮＣ：２９８６５；２番染色体：８６，５０３，４３１〜８６，５６３，４７９リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６４．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中にそれぞれ位置する（Chim at al 2008; Yin et al, 2014; Prenat Diagn 34:63）。特定のかかる実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも１つ（または少なくとも１つの任意の第２の標的ＤＭＲ）は、ＤＳＣＡＭもしくはＣ２１ｏｒｆ５７もしくはＣ２１ｏｒｆ２９もしくはＣＧＩ１４９、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する；例えば、前記第１の（または任意の第２の）標的ＤＭＲの１つはＤＳＣＡＭ中に位置し、前記第１の（または任意の第２の）標的ＤＭＲの別のものは、Ｃ２１ｏｒｆ５７（またはＣ２１ｏｒｆ２９もしくはＣＧＩ１４９）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。
【００９９】
本発明の他の特定の実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９、および２６１からなるリストから独立して選択される、例えば：配列番号ＮＯ３７、２５７、２５８、および２５９、特に、母親ＤＮＡに対して相対的に胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されるとしてＷＯ２０１１／０３４６３１に開示されているいずれかのかかる領域および／もしくは遺伝子からなるリストから独立して選択される領域および／もしくは遺伝子中に位置する。本発明のかかる特定の実施形態のある種のものにおいて、前記第１の標的ＤＭＲの１つはＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号３７（本願の配列番号５１）である領域および／または遺伝子中に位置し、前記第１の標的ＤＭＲの別のものはＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号２５８（本願の配列番号１８５）である領域および／または遺伝子中に位置し、あるいは前記第１の標的ＤＭＲの別のものはＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号２３９（本願の配列番号１８２）である領域および／または遺伝子中に位置し、あるいは前記第１の標的ＤＭＲの別のものは、ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号３９（本願の配列番号１２５）である領域および／または遺伝子中に位置し、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から約１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、もしくは１０ｂｐ以内上流および／もしくは下流に位置する。
【０１００】
本発明の代替的な実施形態において、例えば方法がヒト１８番染色体の染色体異数性の検出を求めるように構成されるときには、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩ（ＥＮＳＧ０００００１０１５５８；ＶＡＭＰ（小胞結合膜タンパク質）結合タンパク質Ａ；１８番染色体：９，９１４，００２〜９，９６０，０２１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８０．２）、およびマスピン（ＥＮＳＧ０００００２０６０７５；セルピンＢ５としてもまた公知；セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＢ（オボアルブミン）メンバー５；１８番染色体：６３，４７６，７６１〜６３，５０５，０８５フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８０．２）から独立して選択される領域および／もしくは遺伝子、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。特定のかかる実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、胎児とその母親との間において差次的にメチル化されるとしてＥＰ１７５１３０７に記載されているマスピン（別名「セルピンＢ５」）遺伝子の領域、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。あるいは、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、活性化Ｔ細胞核因子、細胞質性１である領域および／または遺伝子（ＮＦＡＴＣ１；ＥＮＳＧ０００００１３１１９６；１８番染色体：７９，３９５，８５６〜７９，５２９，３２５フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８０．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。あるいは、前記第１の標的ＤＭＲ、および／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ、ＷＯ２０１１／０３４６３１のｃｈｒ１８ｇｒ０００９４である領域および／または遺伝子、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。
【０１０１】
本発明の他の代替的な実施形態において、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２（例えば、ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ：３１／本願の配列番号ＮＯ：１７、またはＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ：２３／本願の配列番号ＮＯ：９）、特に、母親ＤＮＡに対して相対的に胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されるとしてＷＯ２０１１／０３４６３１に開示されているいずれかのかかる領域および／もしくは遺伝子からなるリストから独立して選択される領域および／もしくは遺伝子中に位置するか、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から約１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、もしくは５ｂｐ以内上流および／もしくは下流に位置し、特に、かかる領域および／もしくは遺伝子から２０ｂｐ未満上流および／もしくは下流に、より具体的にはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｂｐ未満上流および／もしくは下流に位置する。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態において、例えば方法がヒト１３番染色体の染色体異数性の検出を求めるように構成されるときには、前記第１の標的ＤＭＲおよび／または前記任意の第２の標的ＤＭＲは、それぞれ：ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０、特に、母親ＤＮＡに対して相対的に胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されるとしてＷＯ２０１１／０３４６３１に開示されているいずれかのかかる領域および／もしくは遺伝子からなるリストから独立して選択される領域および／もしくは遺伝子中に位置する。
【０１０３】
参照染色体上に位置するＤＭＲの文脈において、本発明は、かかる染色体上に位置するいずれかの好適なＤＭＲ、例えば本願の何処かに記載されるものを包摂する。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態において、例えば方法が参照染色体の検出を求めるように構成されるときには、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つは、（好ましくは、それぞれ前記参照ＤＭＲの２つ以上（of more））：ＲＡＳＳＦ１Ａ（ＥＮＳＧ００００００６８０２８；Ｒａｓ結合（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリーメンバー１；３番染色体：５０，３２９，７８２〜５０，３４０，９８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６５．２）、ＴＢＸ３（ＥＮＳＧ０００００１３５１１１；Ｔボックス３；１２番染色体：１１４，６７０，２５４〜１１４，６８４，１６４リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７４．２）、ＣＤＣ４２ＥＰ１（ＥＮＳＧ０００００１２８２８３；ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質（Ｒｈｏ−ＧＴＰａｓｅ結合）１；２２番染色体：３７，５６０，４４７〜３７，５６９，４０５フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８４．２）、ＰＣＤＨＧＡ１（ＥＮＳＧ０００００２０４９５６；プロトカドヘリンガンマサブファミリーＡ１；５番染色体：１４１，３３０，５７１〜１４１，５１２，９８１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６７．２）、およびＳＰＮ（ＥＮＳＧ０００００１９７４７１；シアロホリン；１６番染色体：２９，６６２，９７９〜２９，６７０，８７６フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７８．２）からなるリストから選択される；またはＳＯＸ１４（ＥＮＳＧ０００００１６８８７５；ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）ボックス１４；３番染色体：１３７，７６４，２８４〜１３７，７６６，３３８フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６５．２）およびＺＦＹ（ＥＮＳＧ００００００６７６４６；Ｙ連鎖ジンクフィンガータンパク質；Ｙ染色体：２，９３５，２８１〜２，９８２，５０６フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８６．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列から独立して選択される領域および／もしくは遺伝子中に位置する。あるいは、ＭＧＣ１５５２３（ＥＮＳＧ０００００１５７６３７；「ＳＬＣ３８Ａ１０」、溶質輸送体ファミリーＡ１０としてもまた公知；１７番染色体：８１，２４５，０００〜８１，２９５，５４７リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７９．２）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。特定のかかる実施形態において、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つは、ＴＢＸ３もしくはＰＣＤＨＧＡ１、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する；例えば、前記参照ＤＭＲの１つはＴＢＸ３中に位置し、前記参照ＤＭＲの別のものは、ＰＣＤＨＧＡ１、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ��もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。
【０１０５】
本発明の他の特定の実施形態において、前記参照ＤＭＲは、それぞれ：ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９および９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなるリストから独立して選択される、例えば：ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号ＮＯ５２、１１８、および１４２、特に、母親ＤＮＡに対して相対的に胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されるとしてＷＯ２０１１／０３４６３１に開示されているいずれかのかかる領域および／もしくは遺伝子からなるリストから独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する。本発明のかかる特定の実施形態のある種のものにおいて、前記参照ＤＭＲの１つ（one or）は、ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号５２（本願の配列番号６６）である領域および／または遺伝子中に位置し、前記参照ＤＭＲの別のものは、ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号１１８（本願の配列番号１０２）である領域および／または遺伝子中に位置する。
【０１０６】
表Ｃは、ＷＯ２０１１／０３４６３１およびＷＯ２０１１／０９２５９２において用いられている配列識別子から本発明において用いられている配列識別子への変換を示している。
【０１０７】
【表３−１】
2018533953.tif 000004
【０１０８】
【表３−２】
2018533953.tif 000005
【０１０９】
【表３−３】
2018533953.tif 000006
【０１１０】
【表３−４】
2018533953.tif 000007
【０１１１】
【表３−５】
2018533953.tif 000008
【０１１２】
本発明の全ての態様の特定の実施形態において、同じ染色体上に位置する２つのＤＭＲが用いられる場合には、それらはゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分には位置しない。例えば、かかるＤＭＲ同士は、約２０ｋｂよりも多く、または約１５ｋｂ、１０ｋｂ、８ｋｂ、６ｋｂ、４ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、もしくは２００ｂｐよりも多くだけ分離され得る。代替的には、同じ染色体上に位置する２つの（またはより多くの）ＤＭＲが本発明に用いられるときに、ある種の実施形態において、それらは同じ領域または遺伝子（例えば、本願に記載されるもの）中に位置し得、さらに互いとオーバーラップし得るということが企図される。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態において、前記参照ＤＭＲの２つが用いられる（または２つよりも多くの参照ＤＭＲが用いられようとする）ときには、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）は、ＲＡＳＳＦ１Ａおよび／もしくはＴＢＸ３および／もしくはＰＣＤＨＧＡ１であるゲノムおよび／もしくは遺伝子（好ましくは、これはヒトである）のある部分、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し；ならびに／あるいは前記参照ＤＭＲの少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）は、ＲＡＳＳＦ１Ａの約位置４，７００ｂｐおよび５，６００ｂｐの間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２３２７０．１：ホモ・サピエンスＲａｓ結合（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）、３番染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号１３）；および／またはＴＢＸ３の約位置１，６６０ｂｐおよび２，４００ｂｐの間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８３１５．１：ホモ・サピエンスＴボックス３（ＴＢＸ３）、１２番染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号１４）、および／またはＰＣＤＨＧＡ１中において、ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０、ＧＩ：５６８８１５５９３；配列番号２１７）の１４１，３３０，５７１から１４１，５１２，９８１の間に、またはかかる配列の約１４１，４９２，４５０から１４１，４９２，７５０、もしくは１４１，４９２，５５０から１４１，４９２，７００、もしくは１４１，４９２，５８０から１４１，４９２，７６９０の間に位置する。より具体的な実施形態において：（ｉ）１つの参照ＤＭＲは、ＲＡＳＳＦ１Ａの約位置４，７００ｂｐおよび５，６００ｂｐの間に位置するものを含み、第２の参照ＤＭＲは、ＴＢＸ３の約位置１，６６０ｂｐおよび２，４００ｂｐの間に位置するものを含む：または（ｉｉ）１つの参照ＤＭＲは、ＰＣＤＨＧＡ１の約位置約１４１，４９２，４５０から１４１，４９２，７５０もしくは１４１，４９２，５５０から１４１，４９２，７００もしくは１４１，４９２，５８０から１４１，４９２，７６９０の間に位置するものを含み（ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０、ＧＩ：５６８８１５５９３）、第２の参照ＤＭＲは、ＴＢＸ３の約位置１，６６０ｂｐおよび２，４００ｂｐの間に位置するものを含む。
【０１１４】
特定の実施形態において、参照ＤＭＲは、ＲＡＳＳＦ１Ａ中において、ＲＡＳＳＦ１Ａの約位置４，９００ｂｐおよび５，５００ｂｐ、５，０００ｂｐおよび５，４００ｂｐ、もしくは５，１００ｂｐおよび５，３００ｂｐの間に位置し；ならびに／またはＴＢＸ３中において、ＴＢＸ３の約位置１，８００ｂｐおよび２，２６０ｂｐ、１，９２０ｂｐおよび２，１６０ｂｐ、もしくは１，９２０ｂｐおよび２，０８０ｂｐの間に位置し（例えば、配列番号２０３）；ならびに／またはＤＳＣＡＭ中において、約位置４０，８４１，６００ｂｐおよび４０，８４１，９００ｂｐ、４０，８４１，６２５ｂｐおよび４０，８４１，８４０ｂｐ、もしくは４０，８４１，６５０ｂｐおよび４０，８４１，７９０ｂｐの間に位置し；ならびに／またはＰＣＤＨＧＡ１の約位置１４１，４９２，４５０から１４１，４９２，７５０、１４１，４９２，５５０から１４１，４９２，７００、もしくは１４１，４９２，５８５から１４１，４９２，６９０の間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０、ＧＩ：５６８８１５５９３）、例えば配列番号２２１である。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態において、前記第１の（または第２の）標的ＤＭＲの２つが用いられる（あるいは２つよりも多くの第１または第２の標的ＤＭＲが用いられようとする）ときには、前記第１の（または第２の）標的ＤＭＲの少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）は、ＤＳＣＡＭおよび／またはＣ２１ｏｒｆ５７であるゲノムおよび／または遺伝子（好ましくはこれはヒトである）のある部分、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する；ならびに／あるいは、前記第１の（または第２の）標的ＤＭＲの少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ）は、ＤＳＣＡＭの約位置４０，８４１，５８４および４０，８４２，０２０の間に位置し；（ダウン症候群細胞接着分子；ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス２１番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿００００２１．９、ＧＩ：５６８８１５５７７、領域４０，０１０，９９９から４０，８４７，１１３；配列番号２００）；および／またはＣ２１ｏｒｆ５７から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流に位置し（ＹＢＥＹ；２１番染色体：４６，２８６，３３７〜４６，２９７，７５１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２；かかる遺伝子は、２５０ｂｐ上流／下流のフランキング領域を包含する。配列番号２１８）；および／またはＣ２１ｏｒｆ２９から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流に位置し（トロンボスポンジン型ラミニンＧドメインおよびＥＡＲリピート、ＴＳＰＥＡＲＭ；ＨＧＮＣ：１２６８；２１番染色体：４４，４９７，８９２〜４４，７１１，５８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）；および／またはＣＧＩ１４９から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流に位置する（荷電多胞体タンパク質３、ＣＨＭＰ３；ＨＧＮＣ：２９８６５；２番染色体：８６，５０３，４３１〜８６，５６３，４７９リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６４．２）。
【０１１６】
特定の実施形態において、第１の（または第２の）標的ＤＭＲは、ＤＳＣＡＭ中において、ＤＳＣＡＭの約位置４０，８４１，６００ｂｐおよび４０，８４１，９００ｂｐ、４０，８４１，６２５ｂｐおよび４０，８４１，８４０ｂｐ、または４０，８４１，６５０ｂｐおよび４０，８４１，７９０ｂｐの間に位置し（ホモ・サピエンス２１番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿００００２１．９、ＧＩ：５６８８１５５７７領域の参照による）、例えば配列番号２０１であり；および／またはＣ２１ｏｒｆ５７の約２００ｂｐ、１５０ｂｐ、もしくは１００ｂｐ以内上流もしくは下流に、例えば２１番染色体フォワード鎖ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２の約位置４６，２９７，７００から４６，２９７，９４０、４６，２９７，７５０から４６，２９７，９００、もしくは４６，２９７，７９０から４６，２９７，８９０の間に位置し、例えば配列番号２１９であり；および／またはＣ２１ｏｒｆ２９の約２００ｂｐ、１５０ｂｐ、もしくは１００ｂｐ以内上流または下流に、例えば２１番染色体フォワード鎖ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２の約位置４４，７０９，１００から４４，７０９，９００、４４，７０９，３００から４４，７０９，７００、もしくは４４，７０９，４００から４４，７０９，６００の間に位置し、例えば配列番号２３１であり；および／またはＣＧＩ１４９の約２００ｂｐ、１５０ｂｐ、もしくは１００ｂｐ以内上流または下流に、例えば２１番染色体フォワード鎖ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２の約位置４６，６６７，１００から４６，６６７，９５０、４６，６６７，３００から４６，６６７，７５０、もしくは４６，６６７，４００から４６，６６７，６５０の間に位置し、例えば配列番号２３２である。
【０１１７】
１つの限定しない例として、本発明の１つの実施形態においては：（ｉ）前記第１の標的ＤＭＲの１つはＤＳＣＡＭ中に位置し、前記第１の標的ＤＭＲの別のものは、Ｃ２１ｏｒｆ５７（またはＣ２１ｏｒｆ２９もしくはＣＧＩ１４９）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し；（ｉｉ）前記参照ＤＭＲの１つはＴＢＸ３中に位置し、前記参照ＤＭＲの別のものは、ＰＣＤＨＧＡ１、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。特定のかかる実施形態において：（ｉ）前記第１の標的ＤＭＲの１つは配列番号Ｎｏ：２０１を含み、前記第１の標的ＤＭＲの別のものは配列番号２１９（または配列番号２３１もしくは２３２）を含み；（ｉｉ）前記参照ＤＭＲの１つは配列番号２０３を含み、前記参照ＤＭＲの別のものは配列番号２２０を含む。
【０１１８】
例１に用いられる差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出のＤＭＲおよび他の領域（「ＯＲ」）の一般的な編成は、図２によって図式的に表される：（１ａ）ＤＭＲ１はＲＡＳＳＦ１Ａのエキソン２中に見出され、ＯＲ１はＲＡＳＳＦ１Ａのエキソン４中に位置し、ＤＭＲ１はＲＡＳＳ１Ａゲノム配列の位置５０，３４０，６７２ｂｐおよび５０，３４０，７８４ｂｐの間に位置し、ＯＲ１は位置５０，３３１，６０４ｂｐおよび５０，３３１，７０２ｂｐの間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００３．１２ホモ・サピエンス３番染色体、ＧＲＣｈ３８初期アセンブリ）、ＤＭＲ１およびＯＲ１を８，９６９ｂｐの距離だけ分離する。（１ｂ）ＤＭＲ２はＴＢＸ３のプロモーター領域中に見出され、ＤＭＲ２はＴＢＸ３ゲノム配列の位置１１４，６８７，０９５ｂｐおよび１１４，６８７，１８９ｂｐの間に位置し、ＯＲ２は位置１１４，６７６，３８４ｂｐおよび１１４，６７６，４５４ｂｐの間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１２．１２ホモ・サピエンス１２番染色体、ＧＲＣｈ３８初期アセンブリ）、ＤＭＲ２およびＯＲ２を１０，６４０ｂｐの距離だけ分離する。（２）２つのＤＭＲにおけるＤＮＡのメチル化は、プローブに基づく定量的ＰＣＲを用いて、それぞれのフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）ＰＣＲプライマーならびに領域特異的なプローブを用いて検出され、各プローブは同じ標識（Ｐ＊）によって標識される。（３）トータルＤＮＡは、２つのＯＲにおいて、プローブに基づく定量的ＰＣＲを用いて、それぞれのフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）ＰＣＲプライマーならびに領域特異的なプローブを用いて検出され、ＯＲの各プローブは、２つのＤＭＲに用いられる標識とは異なる同じ標識（Ｐ＊＊）によって標識される。プライマーおよびプローブ配列ならびにプローブ標識の詳細は表１に提示されている。
【０１１９】
本発明の１つの限定しない実施形態に用いられるＤＭＲおよび他の領域（「ＯＲ」）の一般的な編成は図６によって図式的に表される：（１ａ）１つの第１の標的ＤＭＲ（ＤＭＲ１）は、例えばＤＳＣＡＭ中に見出され（ダウン症候群細胞接着分子；ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス２１番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿００００２１．９、ＧＩ：５６８８１５５７７、領域４０，０１０，９９９から４０，８４７，１１３；配列番号２００）、例えば配列番号５１に位置するものであり、（１ｂ）別の第１の標的ＤＭＲ（ＤＭＲ２）は、例えばＣ２１ｏｒｆ５７の２５０ｐｂ以下上流または下流の領域に見出され（ＹＢＥＹ；２１番染色体：４６，２８６，３３７〜４６，２９７，７５１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２；かかる遺伝子は２５０ｂｐ上流／下流フランキング領域を包含する。配列番号２１８）、例えば配列番号１８５に位置するものであり；（１’）第１の参照ＤＭＲ（ＤＭＲ１’）は、ＴＢＸ３のプロモーター領域中に見出され（例えば、配列番号６６中に位置するもの）、ＯＲ１’は（ヒト１２番染色体上のＴＢＸ３中に位置し（２ａ’）、ＤＭＲ１’はＴＢＸ３ゲノム配列の位置１１４，６８７，０９３ｂｐおよび１１４，６８７，１９１ｂｐの間に位置し、ＯＲ１’は位置１１４，６７６，３８４ｂｐおよび１１４，６７６，４５４の間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１２．１２ホモ・サピエンス１２番染色体、ＧＲＣｈ３８初期アセンブリ）、ＤＭＲ１’およびＯＲ１’を約１０，６００ｂｐおよび１０，８１０ｂｐの間の距離だけ分離し（４ａ’）；第２の参照ＤＭＲ（ＤＭＲ２’）はＰＣＤＨＧＡ１中に見出され（例えば、配列番号１０２に位置するもの）、ＯＲ２’は（５番ヒト染色体上のＰＣＤＨＧＡ１中に位置し（２ｂ’）、ＤＭＲ２’はＰＣＤＨＧＡ１ゲノム配列の位置１４１，４９２，５９３〜１４１，４９２，６８７の間に位置し、ＯＲ２’は位置１４１，４９２，９１８〜１４１，４９３，００９の間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０、ＧＩ：５６８８１５５９３）；ＤＭＲ２’およびＯＲ２’を約３００ｐｂの間の距離だけ分離する（４ｂ’）。代替的に、（１ａ）ＤＭＲ１および／または（１ｂ）ＤＭＲ２は：（ｘ）例えばＣ２１ｏｒｆ２９の２５０ｐｂ以下上流または下流の領域に見出され得（ＴＳＰＥＡＲＭ；ＨＧＮＣ：１２６８；２１番染色体：４４，４９７，８９２〜４４，７１１，５８０リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２）；例えば、配列番号２３１に位置するものであり；あるいは（ｙ）例えばＣＧＩ１４９の２５０ｐｂ以下上流または下流の領域に見出され得（ＣＨＭＰ３；ＨＧＮＣ：２９８６５；２番染色体：８６，５０３，４３１〜８６，５６３，４７９リバース鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６４．２）、例えば、配列番号２３２に位置するものである）。
【０１２０】
図６によって図式的に表される本発明の実施形態において、２つの第１の標的ＤＭＲのそれぞれは、異なる検出可能な標識（単数または複数）（１ａ）および（１ｂ）によって検出され；２つの参照ＤＭＲ（ＤＲＭ１’およびＤＭＲ２’）は、同じ検出可能な標識（単数または複数）（１’）によって検出され；任意の２つのＯＲ（ＯＲ１’およびＯＲ２’）は、同じ検出可能な標識（単数または複数）（３’）によって検出される。
【０１２１】
本発明のある種の実施形態は、その方法、組成物、キット（もしくはそのコンポーネント）、および／またはコンピュータプログラム製品の文脈において、前述のＤＭＲ、ＯＲ、プライマーおよび／またはプローブの配列の１つ以上、特に表１、表Ｄ、もしくは表５、または表Ｅ、表８、もしくは表１０に記載されているもののいずれかを含むか、またはその使用を含む。かかる実施形態のある種のものにおいて、所与のプローブは、表１、表Ｄ、もしくは表５、または表Ｅ、表８、もしくは表１０に記載されている配列と、表１、表Ｄ、もしくは表５、または表Ｅ、表８、もしくは表１０に記載されている標識およびクエンチャーのペアいずれか１つとを含む（任意に、副溝結合部分を有する）。特に、プローブは、かかるプローブについて表１、表Ｄ、もしくは表５、または表Ｅ、表８、もしくは表１０に記載されている配列と標識およびクエンチャーのペアとの組み合わせを含み得る（任意に、副溝結合部分を有する）。本発明の他の実施形態は、特にその方法、組成物、キット（もしくはそのコンポーネント）および／またはコンピュータプログラム製品の文脈において、２つ以上の（例えば、全ての）前述のＤＭＲ、ＯＲ、プライマーおよび／またはプローブの配列の具体的な組み合わせ、特に表１に記載されているプライマー／プローブの組み合わせおよび／または表５に記載されているプライマー／プローブの組み合わせを含むかまたはその使用を含み、表Ｄからのプライマーまたはプローブ；より具体的には、アッセイバージョンＶ１０．３について表Ｅに記載されているプライマー／プローブの組み合わせを包含する。
【０１２２】
用語「メチル化部位（単数または複数）」は、当分野において認識され、例えば、好ましくはメチル化感受性の制限酵素、例えば本願の他所において開示されるものによって認識される短いヌクレオチド配列（例えば、長さ４、６、８、１０、または１２ｂｐであるもの）中のＣｐＧモチーフを包摂する意味を有する。
【０１２３】
類似に、特に１つ以上のＯＲを利用する本発明の実施形態の文脈において、ＯＲは、ゲノムの特定の部分および／または遺伝子中に位置するときに、遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域、またはエキソン中に位置し得、あるいは、代替的に、かかる遺伝子のイントロン中に、またはゲノムの非コード領域中に位置し得る。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、かかるゲノムおよび／または遺伝子はヒトゲノムまたは遺伝子である。特定の実施形態において、ＯＲが本発明に用いられ、１つ以上のＤＭＲを特徴とするゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分に位置するときには（好ましくは、本発明に用いられるＤＭＲとオーバーラップしない）、それは、ゲノムおよび／もしくは遺伝子のある部分、例えばＲＡＳＳＦ１Ａおよび／もしくはＴＢＸ３および／もしくはＰＣＤＨＧＡ１である遺伝子（例えばヒト、および／または特に前記ＤＮＡ種が胎児ｃｆＤＮＡであるとき）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し、あるいは：ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＰＣＤＨＧＡ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４、およびＳＰＮ、およびＤＳＣＡＭ、およびＣ２１ｏｒｆ５７、およびＣ２１ｏｒｆ２９、およびＣＧＩ１４９、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなる群から選択される。ＤＭＲと同位置でないときに（例えば、第２のまたは複数の他の領域が用いられるときに）、ある種の実施形態において、かかる他の領域は（例えば、ヒト）ハウスキーピング遺伝子中に位置し得る（例えば、ＧＡＰＤＨ、ベータ−アクチン、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、またはＲＮＡＳＥＰ）。類似に、特に１つ以上のＯＲを用いる本発明の他の実施形態の文脈において、ＯＲは、ゲノムの特定の部分および／または遺伝子中に位置し得、遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域、またはエキソン中に位置し得、あるいは、代替的に、かかる遺伝子のイントロン中にまたはゲノムの非コード領域中に位置し得る。本発明の全ての態様の特定のかかる実施形態において、かかるゲノムおよび／または遺伝子はヒトゲノムまたは遺伝子である。特定の実施形態において、本発明に用いられるＯＲは、（例えば、ヒト）ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、ベータ−アクチン、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、もしくはＲＮＡＳＥＰ）、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置する。代替的に、前記ＯＲは、１つ以上のＤＭＲを特徴とするゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分に位置し得（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＰＣＤＨＧＡ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４、もしくはＳＰＮ、もしくはＤＳＣＡＭ、もしくはＰＣＤＨＧＡ１、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置するもの）、好ましくは、本発明に用いられるＤＭＲとオーバーラップしない。
【０１２４】
１つ以上のＯＲを用いる本発明の全ての態様の特定の実施形態において、前記ＯＲは、前記試薬に特異的なメチル化部位がないゲノムのある部分を含み、前記ＯＲは、（例えば、ヒト）ＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＴＢＸ３遺伝子（例えば、それぞれ配列番号１３および１４）もしくはＤＳＣＡＭ（配列番号２００）もしくはＰＣＤＨＧＡ１（配列番号２１７）もしくはＣ２１ｏｒｆ５７（かかる遺伝子は、２５０ｂｐ上流／下流フランキング領域を包含する。配列番号２１８）もしくはＣ２１ｏｒｆ２９もしくはＣＧＩ１４９、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し、前記他の領域の２つ以上が検出ステップ（ｃ）に用いられ、第１の他の領域がかかるＲＡＳＳＦ１Ａの約位置１４，２２０ｂｐおよび１３，３５０ｂｐの間に位置し、第２の他の領域がかかるＴＢＸ３の約位置１２，４００ｂｐおよび１３，０００ｂｐの間に位置するより具体的な実施形態を包含する。特定の実施形態において、他の領域は、ＲＡＳＳＦ１Ａ中において、かかるＲＡＳＳＦ１Ａの約位置１４，２３０ｂｐおよび１４，３４０ｂｐ、１４，２３０ｂｐおよび１４，３３０ｂｐ、１４，２３０ｂｐおよび１４，３２０ｂｐ、もしくは１４，２３０ｂｐおよび１４，３１０ｂｐの間に位置し；および／またはＴＢＸ３中において、かかるＴＢＸ３の約位置１２，４００ｂｐおよび１２，９４０ｂｐ、１２，７００ｂｐおよび１２，８５０ｂｐ、もしくは１２，７１０ｂｐおよび１２，７９０ｂｐの間に位置し（例えば、配列番号２０４）；および／またはＤＳＣＡＭ中において、ＤＳＣＡＭの約位置４０，８４１，１５０ｂｐおよび４０，８４１，５２５ｂｐ、４０，８４１，２００ｂｐおよび４０，８４１，４７５ｂｐ、または４０，８４１，２５０ｂｐおよび４０，８４１，４２５ｂｐの間に位置し（ホモ・サピエンス２１番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿００００２１．９、ＧＩ：５６８８１５５７７領域の参照による）、例えば配列番号２０２であり；ならびに／あるいはＰＣＤＨＧＡ１中において、ＰＣＤＨＧＡ１の約位置１４１，４９２，８００〜１４１，４９３，１００、１４１，４９２，８５０〜１４１，４９３，０５０、１４１，４９２，９００〜１４１，４９３，０２０、１４１，４９２，９１８〜１４１，４９３，００９の間に位置し（ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０）、例えば配列番号２２１である。代替的に、ＯＲは、エキソン中に、例えばかかるＲＡＳＳＦ１Ａの約位置１３，７９０ｂｐおよび１３，８８０ｂｐ、もしくは１４，４９０ｂｐおよび１４，６００ｂｐの間に、またはかかるＴＢＸ３の約位置８，０４０ｂｐおよび８，１８０ｂｐもしくは６，２３０ｂｐおよび６，３５０ｂｐの間に位置し得る；あるいは、ＯＲは、イントロン中に、例えばかかるＲＡＳＳＦ１Ａの約位置１０，５００ｂｐおよび１１，９０ｂｐの間に、またはかかるＴＢＸ３の約位置１０，０００ｂｐおよび１１，０００ｂｐの間に位置し得る。代替的に、ＯＲ、例えば配列TCCGTGTGCTCCACCCTTTGAATTCAGAACGACATAGTGGATACTCCGTGGGGCTGCTGGAATCTTCCaTTCcCACTGCCTTATCTT（配列番号２０２）はＤＳＣＡＭ中に位置し得、これは次のプローブおよびプライマーによって増幅および検出され得る：
【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
【表５−１】
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【０１２７】
【表５−２】
2018533953.tif 000011
【０１２８】
ここで、妊娠女性の循環系に（例えば、血漿中に）存在する胎児ｃｆＤＮＡ（および／またはトータルｃｆＤＮＡ）のレベルが、子癇前症の１つ以上の形態、例えば早発型の子癇前症、軽度および／または重度の子癇前症のマーカーであるという強力な証拠がある（Hahn et al 2011, Placenta 32(Supl):S17参照）。本発明は、妊娠女性の血漿中に存在する胎児ｃｆＤＮＡの効率的な、有効な、敏感な、および／または低いばらつきの検出／定量に特定の有用性を示し、本発明はそれに特定の有用性を有する。従って、本発明の特定の実施形態において、個体は、妊娠に関連した医学的状態に罹るかまたはそれを発生することに易罹患性である（例えば、ヒト）妊娠女性であり；特に、前記妊娠に関連した医学的状態は子癇前症である。代替的には、本願において用いられる医学的状態「に易罹患性の」個体は、医学的状態に罹るかまたはそれを発生すること「を疑われる」または「に易罹患性であるリスクがあると考えられる」として記載され得る；ある種の実施形態において、本発明は、医学的状態への易罹患性、それに罹るかもしくはそれを発生するリスク、またはそれを患うかまたは発生することについて、個体をスクリーニングおよび／または診断するために用いられる。
【０１２９】
代替的な実施形態において、個体は、妊娠に関連した医学的状態に罹るかまたはそれを発生することに易罹患性である（または易罹患性であるリスクがあると考えられる）（例えばヒト）妊娠女性であり、早産、子宮内胎児発育遅延、およびバニシングツインからなる群から選択される。特に、例１との比較によって、本発明の感度は、本発明の方法によって決定されるｃｆＤＮＡレベルとマッシブパラレルシーケンシングアプローチによって決定されるようなＹ染色体配列のカウントによって決定されるものとの間における相違が、単児妊娠であると、および／またはかかる（混合した性の）双子妊娠の１人または他のものの相対的な発生および健康を辿っていると以前に信じられていた（混合した性の）双子妊娠において、バニシングツインの１つ以上のケースを同定する上で有用であり得るようなものである。本発明は、ｃｆＤＮＡから（例えば、パラレルシーケンシングアプローチを用いることによって）決定されるＹ染色体配列のカウントと比較した胎児ｃｆＤＮＡの相対値の考察によって、双子妊娠の性別決定にもまた利用され得る。これらの点において、他の染色体に対するある種の短いＹ染色体配列の相同性に起因して、母親血液中のランダムｃｆＤＮＡのマッシブパラレルシーケンシングを用いるアプローチは、典型的には、女性の全妊娠において「Ｙ染色体」配列の非常に低い頻度（例えば、全配列の約０．００３％および０．００４％の間、または全配列の約０．００１５％および０．０１％、もしくは０．００２％および０．００５％の間）をいつも計数するということが注意されるべきである。よって、約０．００５％の、または約０．００３％、０．００４％、０．００６％、もしくは０．００７％の間の「Ｙ染色体」配列カウントのカットオフが女性サンプルに採用され得る。
【０１３０】
本発明の全ての態様において、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬は、バイサルファイト、および／またはメチル化されていないＤＮＡをメチル化されたＤＮＡよりも選択的に消化する主剤を含み得る（例えば、かかる主剤はメチル化されていないＤＮＡを消化し得るが、メチル化されたＤＮＡをし得ない）。特定の実施形態において、試薬主剤は：少なくとも１つのメチル化感受性の酵素；少なくとも１つのメチル化感受性の制限酵素；ならびに／またはＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩ、およびＣａｃ８ＩおよびＰｈｏＩからなる群から選択される主剤を含む。特定の実施形態において、前記試薬は、ＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩ、およびＡｃｉＩからなる群から選択されるものである。
【０１３１】
関係する実施形態において、試薬は、本願において開示される試薬のいずれかの２つ以上を含み得る。例えば、それは２つ、３つ、４つ、５つ、またはより多くの（例えば、最大で７つ、８つ、または１０個の）メチル化感受性の制限酵素を含み得、ＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩ、およびＨｐａＩＩからなる群から選択されるメチル化感受性の制限酵素の２つまたは３つを含むかまたは本質的にそれからなる試薬を包含する。
【０１３２】
差次的なメチル化を研究するためのバイサルファイトまたはメチル化感受性の制限酵素の使用は当業者には周知であろう。当業者は、標準的なテキストの教示または公開された方法の適合、例えばPoon et al (2002)、Nygren et al (2010)、またはYegnasubramanian; et al (2006, Nuc Acid Res 34:e19)を適用し得る。例解として、本発明者は、本願において、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬として、メチル化感受性の制限酵素の使用を採用する例を提供する。バイサルファイトを試薬として用いるさらなる例解として、バイサルファイト改変されたＤＮＡメチル化部位が、例えばメチル化特異的なＰＣＲを用いて（例えば、バイサルファイト改変された配列に選択的に結合するプライマーおよび／またはプローブを用いて）、および／またはかかるバイサルファイト改変によってその認識部位が作られる制限酵素の爾後の使用によって、検出され得るということは当業者には明らかであろう。メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）はHerman et alによって記載されており（ＵＳ６２００７５６、ＥＰ０９５４６０８、および関係するファミリーメンバー）；プローブに基づくＰＣＲを用いるＭＳＰのさらなる開発（「ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ」として公知）はLaird et alによって記載されている（ＵＳ６３３１３９３、ＥＰ１１８５６９５、および関係するファミリーメンバー）。
【０１３３】
本発明の全ての態様の特定の実施形態において、ＤＮＡ（および／または（and/or or）前記トータルＤＮＡ）の場合には、第１もしくは第２の標的ＤＮＡ種および／または（and/of）参照種の定量的量が検出および／または決定されることになる。従って、かかる実施形態において、前記検出および／または決定ステップの１つ以上（例えば、それぞれ）は定量的検出を含み、前記ＤＮＡ種の前記検出量は、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種対トータルＤＮＡの相対濃度として表される。例えば、本発明のある種の実施形態において、前記決定ステップのそれぞれにおいて、前記第１の標的ＤＮＡ種のおよび前記任意の第２の標的ＤＮＡ種の前記決定される量のそれぞれは、各ケースにおいて、前記サンプル中の前記第１の標的ＤＮＡ種および前記任意の第２の標的ＤＮＡ種対トータルＤＮＡの相対濃度として表される。第３の（または第４の）標的ＤＮＡ種が検出される実施形態においては、本（resent）発明は、かかる第３の（または第４の）標的ＤＮＡ種の量が相対濃度として表されることをもまた企図する。
【０１３４】
トータルＤＮＡの絶対量が既知である場合には、対応して、ＤＮＡ種のいずれかの絶対量（例えば、μｇ／ｍＬなどの濃度またはＥｇ／ｍＬなどのゲノム当量によって表される）がかかる相対濃度から決定され得る。ある種の実施形態では、サンプルのトータルＤＮＡの絶対量は：ステップ（ｃ）に用いられる同じ他の領域（単数または複数）を用いて既知量のＤＮＡの標準サンプル中のトータルＤＮＡの量を検出および／または決定するさらなるステップと；ＤＮＡの前記標準サンプルから検出されるシグナルをステップ（ｃ）において検出されるシグナルと比較するさらなるステップと、を包含することによって決定され得る。（既知量／濃度の）ＤＮＡのかかる標準サンプルは、商業的ソースから難なく利用可能であり、とりわけ希釈系列を用いて調製および分析される場合には、サンプル中に存在するトータルＤＮＡの絶対量を（標準曲線からの内挿／見積もりによって）決定するために難なく効率的に用いられ得る。実際に、かかる標準曲線は、本質的に任意のＯＲについて記載されているように（しかし、標準ベッセル／反応の別個のセットによって）、好ましくはＤＭＲ／ＯＲ（単数または複数）の検出と同じランによって作成および分析され得；同じ反応マスターミックスさえ用い得る。従って、ＤＮＡコントロールの「ＤＭＲ（単数または複数）」はかかる標準ＤＮＡについて検出され得るが、かかるシグナルは標準曲線を生成することを要求されない。従って、かかる標準ＤＮＡサンプルからのシグナルが比較するために用いられる場合に、前記検出および／または決定ステップのそれぞれが定量的検出を含むある種の実施形態においては、前記ＤＮＡ種の前記検出される量は前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表され得る。
【０１３５】
従って、本発明の方法の１つの実施形態においては、さらに：
・  既知量のＤＮＡの標準サンプル中のＤＮＡの量を、ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）に用いられる同じＤＭＲに関して決定するステップと；
・  ＤＮＡの前記標準サンプルから検出されるシグナルのそれぞれを、ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）中のステップにおいて検出されるそれぞれのシグナルと比較するステップと、
を含む。
【０１３６】
ＤＮＡの標準サンプルを利用する本発明の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡの標準サンプルが既知濃度のヒトゲノムＤＮＡのサンプルであるかかる実施形態のある種のものを包含する。例えば、既知濃度のかかるヒトゲノムＤＮＡは、インビトロ培養されたヒト細胞、例えば染色体の正倍数体または異数性（例えばＴ２１）の組どちらかを有することが既知のものに由来し得る（例えば、それから単離または精製され得る）。本発明の代替的な実施形態において、ＤＮＡの標準サンプルは既知濃度のＤＮＡの合成または組換体サンプルである。
【０１３７】
ここで当業者に明らかであろう通り、ＤＮＡの標準サンプルは一様に、適切に、差次的に、または別様にメチル化されずにあり得る（特に、ヒト細胞培養物から単離される場合）。従って、本発明は、ＤＮＡの標準サンプルが、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬（例えば、本願に記載される試薬）によって処理されない実施形態を包含する。
【０１３８】
本発明の１つの特定の実施形態において、前記決定ステップのそれぞれにおいて、前記第１の標的ＤＮＡ種および前記任意の第２の標的ＤＮＡ種および参照ＤＮＡ種の前記決定される量のそれぞれは、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種絶対量によって表される。しかしながら、本発明の１つの態様は、１つ以上の（例えば、２つの）第１の標的ＤＮＡ種（すなわち、染色体異数性に関わる染色体）の決定される量と参照ＤＮＡ種（すなわち、参照染色体）の決定される量との比較（または、相対量または比の考察）に関するので、かかる比較が実施され得、絶対量の考察を要求しない。説明として、「シグナル−標的染色体」／「シグナル−トータルＤＮＡ」対「シグナル−参照染色体」／「シグナル−トータルＤＮＡ」の比は、「シグナル−トータルＤＮＡ」成分の約分ゆえに、「シグナル−標的染色体」対「シグナル−参照染色体」の比と同じである。従って、本発明は、胎児に存在する染色体異数性の存在（または不在）の同定が、サンプル中に存在するトータルＤＮＡの量の知識または考察なしにステップ（ｅ）において実施される実施形態をもまた包含する。例えば、ステップ（ｅ）における決定は、ｑＰＣＲから生成されるＣｔ（またはＣｐ）数から直接的になされ得る。なぜなら、それらは定量化されようとするＤＮＡ種の初期濃度（量）と逆相関するからである。
【０１３９】
本発明のある種の実施形態においては、決定の複数のセットが、ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）についてなされ、前記決定の各セットは、前記サンプルのＤＮＡの異なるアリコートを用いて、例えば異なるベッセル中において、有効に決定の複数のセットの互いのメンバーと同時になされる。かかる複数の各メンバーは、（例えば、同じ妊娠女性から取られた）同じサンプルのアッセイの「レプリケート」と考えられ得る。レプリケートはアッセイの方法に効率的に組み込まれ得、例えば、異なるベッセル、例えば本発明のｑＰＣＲ実施形態に用いられるものなどの同じ（または異なる）マイクロタイタープレート上の異なるウェル中において実施されるようにかかるレプリケートアッセイを構成することによる。
【０１４０】
サンプルのレプリケートを用いる本発明の実施形態において、サンプルのレプリケート（決定の複数のセット）の前記数は、２および約５０（セット）の間、例えば２および約２０の間、２および約１０の間、または約５および約１５（セット）の間であり得る；好ましくは、決定のレプリケート（複数のセット）の前記数は：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２（前記決定のセット）からなる群；特に前記決定の約３および１０セットの間、より具体的には前記決定の約６セットから選択される。例えば、マイクロタイタープレートを用いるアッセイの実施形態では、レプリケートの数は、かかるマイクロタイタープレートの（異なる）ウェルのかかる数によって実施される同じサンプルのアリコートに対して実施される本発明の方法によって表され得る。
【０１４１】
方法によるレプリケートの包含と任意にそれらの分析とは、例えば方法のロバストネス、誤差、または他のばらつき、それゆえにそれから決定されるＤＮＡの量の１つ以上について追加の情報を提供し得る。実際に、かかるレプリケートを用いる本発明のある種の実施形態において、ステップ（ｅ）および／または任意のステップ（ｅ）’において決定される相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）は、ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および／または任意のステップ（ｃ）’および／または任意のステップ（ｆ）においてなされる決定の前記複数のセットから決定される。かかる実施形態において、かかる量は、（レプリケートの）各セットについて決定されるＤＮＡの平均量、例えば（レプリケートの）各セットについて決定されるＤＮＡの平均、中央値、またはモード量、好ましくは（レプリケートの）各セットについて決定されるＤＮＡの平均量を用いることによって決定され得る。
【０１４２】
代替的にまたは加えて、本発明の方法は、それぞれが異なる（例えば、ヒト）妊娠女性から取られた複数の異なるサンプルに対して実施され得る（レプリケートありまたはなしで）。かかる実施形態において、とりわけ、いずれかの分子タグ付け方法論の不在のときには、前記方法は、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルに対して実施され、各方法は別個のベッセル中において、有効に複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施される。ここで当業者によって理解されるであろう通り、方法は、各サンプルについて、例えばマイクロタイタープレートの異なるウェル中で実施され得る。
【０１４３】
異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルについて本発明の方法を実施するときには、それは、２および約５００の間の（または５００よりも多くの）サンプル、例えば２および約２００の間、２および約１００の間、または約５および約１５０の間のサンプルである、いくつもの（複数の）かかる異なるサンプルに対して実施され得る；好ましくは、前記複数のサンプルは、約：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、および１４０サンプル（または１５０よりも多くのサンプル）；特に、それぞれが異なる妊娠女性から取られた約６０サンプルからなる群から選択される。
【０１４４】
特に、ここで、本発明の開示に従って複数の（例えば、ヒト）妊娠女性から取られた複数のサンプルの方法の実施は、当業者には可能であろう；例えば、マイクロタイタープレートに基づくｑＰＣＲシステム、例えばロシュからのライトサイクラーの使用による。かかる複数のサンプルは、同じマイクロタイタープレートの異なるウェル中に位置し得、または異なるマイクロタイタープレート上に位置し得る。かかる複数のサンプルの包含および分析は、とりわけ各サンプルについて複数のレプリケートの組み合わせの場合に、染色体異数性の存在（または不在）の同定が、より多くの確実性または信頼度でなされることを可能にし得る。例えば、全ての（異なる）サンプルについて決定される量の変動の相対規模と比較して、種々のレプリケートの所与のサンプルの決定される量（例えば、標準偏差）の変動の相対規模は、染色体異数性の検出のためのステップ（ｅ）（または任意のステップ（ｅ）’）における追加の情報を提供し得る。例えば、レプリケート間における量の大きい違いと小さい相対的な変動は、別のサンプルからの違いが存在するというより多くの信頼度を与えるであろう。
【０１４５】
１つのラン（例えば、マイクロタイタープレート）による複数のサンプル（および／またはレプリケート）の包含は、１つのランと別のランとの比較を可能にするという利点をもまた提供し得る；各ランは、少なくともいくつかの異なるサンプルを含有する。ラン間における比較は、異なるランに共通のコントロールまたは標準サンプルの使用によってもまた助けられ得、これは、ラン間における測定または算出量の正規化を可能にし得る。しかしながら、各ランのいくつもの異なるサンプル（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１３０、１４０、１５０、または１５０よりも多く）；特に、各ランの約６０個の異なるサンプルによって、１つのランから決定される量は、正規化方法、例えば当業者（the person or ordinary skill）に公知または本願の他所に記載のものによって他のランと比較され得る。
【０１４６】
本発明のある種の実施形態の１つの特徴は、染色体異数性に関わる染色体の量が、かかる染色体上に位置する２つの（またはより多くの）第１の（または第２の）標的ＤＭＲを用いて見積もられ、または決定されるということである。かかる２つの（またはより多くの）ＤＭＲのそれぞれから決定される量の使用および／または考察は、胎児に存在する（または不在の）染色体異数性があるという指示に追加の確実性または信頼度を提供し得る。例えば、１つの標的ＤＭＲのみに関する決定された量が、染色体異数性が存在するということを指示する場合には、これは、２つの（またはより多くの）標的ＤＭＲに関する決定された量が染色体異数性が存在するということを指示している結果よりも、確実性または信頼度がない指示だと考えられ得る。
【０１４７】
従って、本発明は、第１の標的ＤＮＡ種の量が第１の標的ＤＭＲの１つにおけるメチル化の検出量から決定され、第１の標的ＤＮＡ種の量が第１の標的ＤＭＲの別のものにおけるメチル化の検出量から決定される実施形態を包含する。ここで明らかであろう通り、類似の実施形態が、任意の第２の標的ＤＭＲの２つ（またはより多く）から決定される量について用いられ得る。
【０１４８】
特定のかかる実施形態において、２つ以上の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）は、ステップ（ｅ）（および／または任意のステップ（ｅ）’）において、第１の標的ＤＮＡ種の２つ以上の量について、それぞれ前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上に関して決定され得る。
【０１４９】
ある種の実施形態において、これらの２つの（またはより多くの）量の組み合わされた分析は、かかる２つ以上の量のかかる平均または中央値と考えられ得る。代替的には、本願に記載されるように、特定の実施形態において、ステップ（ｅ）（および／または任意のステップ（ｅ）’）において決定される相対量（単数または複数）または比の２つ以上（好ましくはそれぞれ）は、胎児の染色体異数性の存在または不在を考える、決定する、または指示するために独立してまたは別個に用いられ得る。かかる「二次元的」考察または分析は、スキャッタープロット、例えば図７に示されているものを用いて；および／または図８に示されているもののように多数の異なるサンプルおよびレプリケートの使用に従って（任意に、ラン間における正規化によって）、表されるかまたは視覚化され得る。ここで明らかであろう通り、標的ＤＭＲとしての２つよりも多くの（例えば、第３の）ＤＭＲの使用は、分析に一層のさらなる確実性または信頼度を提供するであろう。本発明は、例えば染色体異数性の同定をさらに助けるための「三次元的」分析を提供するために、一層の追加の標的ＤＭＲの使用を具体的に企図する。
【０１５０】
第１の（または第２の）標的ＤＭＲから決定される標的染色体の量のそれぞれは、量の閾値または参照分布に関して考えられ得る。特に、本発明のある種の実施形態は、ステップ（ｅ）において、前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の２つ以上（好ましくはそれぞれ）が閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され得るときであり、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の２つ以上（好ましくはそれぞれ）は、胎児の染色体異数性の存在を指示する。
【０１５１】
本願に記載される閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）量は、外部記録もしくは情報から同定もしくは提供され得、または本発明の方法に従って分析された複数のサンプルおよび決定された量の使用、考察、および／もしくは分析から決定され得る。従って、特定の実施形態において、閾値および／または参照分布は複数のサンプルから決定され得、各サンプルは異なる妊娠女性から取られ、例えば、上に記載されている方法をかかるサンプルに対して実施することによる；任意に、決定のレプリケート（複数のセット）が、ステップ（ｃ）および／またはステップ（ｄ）および任意のステップ（ｃ）’および任意のステップ（ｆ）について、各サンプルについて、例えば本願に記載される方法を実施することによってなされる。
【０１５２】
本発明の方法において複数のサンプルおよび／またはレプリケートを分析するときに、サンプル（および／またはレプリケート）同士は、異なる群またはランに（例えば、ｑＰＣＲ実験においては異なるマイクロタイタープレートに）編成され得る。かかる実施形態においては、かかる複数のサンプル／レプリケートの２つ以上の群が群毎の原則で分析され得、例えば各群が別個のラン、アッセイ、またはマイクロタイタープレートによって分析され、閾値および／または参照分布が、サンプルの各群から決定される量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の正規化によって決定される。「正規化」は、１つの群のサンプル／レプリケートから決定される結果（例えば、量）が別の群のものと比較される／比較可能であることを可能にするいずれかの好適な方法として考えられ得る。例えば、１つのラン（またはマイクロタイタープレート）によって実施された分析を別のラン（またはマイクロタイタープレート）のものと比較できる。種々の正規化アプローチが当業者に利用可能であろう。サンプルの群間における前記正規化が、サンプル特異的な量または比（例えば、かかるサンプルについてなされる決定のセットの平均）と前記特異的なサンプルと同じ群中の全サンプルについて決定される量または比の平均（例えば、中央値）との間における違いを考えることによって実施され得るところを包含する；特に、例４に記載され、図８に表されている通りである。
【０１５３】
サンプル特異的な量のかかる数があって、胎児の染色体異数性の存在は、第１の標的ＤＭＲの１つ以上（好ましくは２つまたはそれぞれ）に関して決定された量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較して、外れ値であるかかる胎児に関して、サンプル特異的な量または比によって指示され得る。特定のかかる実施形態において、胎児の染色体異数性の存在は、かかる胎児に関して：（ａ）（推定上の）正倍数体である複数の他の胎児に関してのサンプル特異的な量または比のクラスターの外に；および／または（ｂ）染色体異数性を有する胎児を表す複数の他のサンプルに関してのサンプル特異的な量または比のクラスター内に、位置する数値クラスター内に位置するサンプル特異的な量または比によって指示され得；好ましくは、胎児を表す前記複数の他のサンプルは、約：２〜１０、１２〜１５、１６〜２５、２６〜３０、３２〜４０、４２〜５０、５２〜７５、７８〜１００、１０５〜１２５、１３０〜１５０、１５５〜１７５、１８０〜２００、２０５〜２５０、２５５〜３００、３０５〜３５０、３５５〜４００、４０５〜４５０、４５５〜５００、および５００よりも多くの他のかかるサンプルからなる群から選択される。関係する実施形態において、クラスターは、量のスキャッタープロット中の視覚化された円形または卵形の形状によって定義され得、かかる円形または卵形の形状の座標は、方法によって分析されたサンプルから予め定義または算出され得る。それから、２つ以上の標的ＤＭＲにおいて決定される参照染色体と比較した標的染色体の量（単数または複数）が、かかる座標に対して相対的に考えられ得、かかる境界線内にある量を有するサンプルは、そのサンプルが取られた妊娠女性が身籠っている胎児に染色体異数性が存在するということを指示する。明らかであろう通り、確実性または信頼度の種々の度合いによって異数性サンプルを同定するように、異なる境界線が設定され得る。例えば、境界線近くにあるもの、または境界線の外だが第２の境界線内にあるもの（いわゆる「グレーゾーン」）は、さらなる分析または検査に付され得る。実際に、本発明の方法は、従来技術のＮＩＰＴアッセイ（例えば、異数性の次世代シーケンシングに基づくＮＩＰＴ）のプレスクリーニングとして、かかる従来技術のＮＩＰＴアッセイによって検査されるべきサンプル数を有意に縮減するための手段として実施され得る。例えば、境界線（例えば、「グレーゾーン」の始まりであるもの）の定義は、陰性である多数のサンプル、すなわち正倍数体胎児を身籠もっている妊娠を同定し、それからのみに従来技術のＮＩＰＴアッセイを用いて明瞭に陰性ではないはるかに少数のサンプルを検査するために用いられ得る。数パーセントの偽陽性率を有するスクリーニングとして働く診断アッセイでさえも、とりわけかかるアッセイが低い偽陰性率を有する場合には、高度に効率的なプレスクリーニングを提供し得る。
【０１５４】
他の実施形態においては、Ｚスコア分析とのかかるクラスター／円形／楕円形分析の組み合わせが実施され得る。例えば、かかるクラスター／円形／楕円形分析は正倍数体サンプルを同定するために実施され得、Ｚスコア分析（例えば、本願に記載されるもの）は異数体サンプルを同定するために実施され得る。それから、染色体異数性の同定のより大きい確実性（certainly）が、かかる異なる分析技術との調和性を示すサンプルには属するであろう。
【０１５５】
かかる分析に先立ってまたはその一部として、方法から決定されたサンプル、目安、シグナル、および／または量の１つ以上は、１つ以上の品質管理プロセスまたはステップに付される。例えば、サンプル中に存在するおよび／またはそれから抽出されるＤＮＡの濃度および／または断片化パターンが、ステップ（ｂ）に先立って考えられ得、サンプルは分析に包含されないか、または（高濃度のケースにおいて）ＤＮＡが希釈されるかどちらかとなる。
【０１５６】
本発明の特定のかかる実施形態においては、ステップ（ｂ）に先立って、ＤＮＡの濃度が測定され得、例えばＤＮＦ−４７４高感度ＮＧＳキット（アドバンスト（Advances）アナリティカルテクノロジーズ社；アンケニー、ＵＳＡ）によって、フラグメントアナライザー（アドバンスト（Advances）アナリティカルテクノロジーズ社；アンケニー、ＵＳＡ）を用いる。サイズの８０から２２０ｂｐおよび平均で１６５ｂｐのピーク付近に位置し得る第１の有意なピークのＤＮＡ濃度が決定され得、このピークは単離されたセルフリーＤＮＡを表し得る。ある種の実施形態において、このピークの約０．３ｎｇ／ｕＬよりも高いＤＮＡ濃度を示すサンプルは、約０．３ｎｇ／ｕＬに希釈される。かかる希釈は、低濃縮サンプルと比較してＤＮＡ濃度のあまりの多量に起因するサンプルの偽陽性予測を回避することを助け得る。かかる断片分析に適用され得る別のＱＣ基準は、セルフリーＤＮＡの断片化（例えば、約１００ｂｐ未満のサイズにおいて起こるギザギザのピークによって表される）および／またはゲノムＤＮＡによるコンタミネーションを有するサンプルを検出する（および例えば排除する）ことを包含する。
【０１５７】
本発明のいずれかの態様に組み込まれ得る他の可能な品質管理基準は、次の１つ以上が真である場合にのみサンプルからのデータが分析に包含されるものを包含する：
・  データを生成する存在するレプリケート数が、約４、５、６、７、または８超である；ならびに／あるいは
・  用いられるＤＭＲまたは任意のＯＲの１つ以上のｑＰＣＲチャンネルにおける平均Ｃｐが、約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６未満である；ならびに／あるいは
・  用いられるＤＭＲまたは任意のＯＲの１つ以上のｑＰＣＲチャンネルにおける平均Ｃｐ値の標準偏差が、約０．５、０．６、０．７、０．９、０．９、もしくは１．０未満、または約１．１、１．２、１．３、１．４、もしくは１．５未満である；ならびに／あるいは
・  全てのレプリケートが、用いられるｑＰＣＲチャンネル、ＤＭＲ、および任意のＯＲの全てにおいて有効値を有する；ならびに／あるいは
・  断片分析において、サンプルが、約１００ｂｐよりも下のギザギザのピークおよび／またはゲノムＤＮＡからのコンタミネーションを示さない；ならびに／あるいは
・  ｃｆＤＮＡの濃度が、約０．０５、０．１、０．１５、０．２ｎｇ／ｕＬ超、および／または約０．３、０．４、もしくは０．５ｎｇ／ｕＬ未満である；ならびに／あるいは
・  トータルＤＮＡを測定するｑＰＣＲチャンネルにおける平均Ｃｐが、約２２、２４、２５、２６、２７、または２８超である。
【０１５８】
サンプル中に存在するトータルＤＮＡ（および、それゆえに例えばｃｆＤＮＡの胎児画分）、および胎児の染色体異数性の同定が決定される本発明の実施形態において、本発明のかかる方法は、妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを検出するために適用され得る。
【０１５９】
従って、本発明の別の態様は、妊娠女性が妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを検出するための方法に関し、前記方法は：
（ｉ）  上に記載されている本発明の方法を実施するステップと；
（ｉｉ）  サンプル中に存在する胎児ＤＮＡの少なくとも１つの量、例えば絶対または相対量を決定するステップと；
（ｉｉｉ）  決定された胎児ＤＮＡの量を閾値および／または参照分布と比較するステップと、
を含み、
前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れは、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示する。
【０１６０】
代わりにまたは加えて、かかるリスクは：（ｉ）より後期の妊娠では胎児ｃｆＤＮＡのより高い〜倍の増大が利用され得るということを決定の計算に入れて（Zeybek et al 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632）、胎児ｃｆＤＮＡの〜倍の増大（例えば、１．５、３、３．５、または４倍の増大）（かかる女性について、閾量と比較して決定される）；および／または（ｉｉ）低リスク女性または子癇前症を患うかもしくは発生しなかったものから決定されたものなどの量の参照分布の考察から、女性から決定されたｃｆＤＮＡの量がどのパーセンタイルに入るか、を考えることによって評価され得る。例えば、胎児ｃｆＤＮＡ画分がかかる分布の９０パーセンタイルに入る場合には、女性は軽度または重度の子癇前症に罹る増大したリスクを有すると考えられる（Jakobsen et al 2013, Transfusion 53:1956）。好適な閾量を決定する上で他の関わる因子が考えられ得る。例えば、乳癌をもまた患っている妊娠女性は、両方の因子に起因する彼女の血漿中に存在するＲＡＳＳＦ１Ａにおけるメチル化のより高い偏りを有し得る。
【０１６１】
類似に、本発明のかかる態様のある種の実施形態は、さらに：検出された前記ＤＮＡ種の量を閾量および／または量の参照分布と比較するステップを包含し、前記閾値に対して過剰な（または前記集団と比較して外れ値でない）前記ＤＮＡ種の量は、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常の診断が、好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別個のアリコートに対して行われ得るということを指示する。例えば、胎児ｃｆＤＮＡ画分が母親血漿中に存在するトータルｃｆＤＮＡの約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％超（特に、胎児ｃｆＤＮＡ画分の約４％超、より具体的には約３％超）である場合には、爾後の検査を有効に実施して、胎児ｃｆＤＮＡの１つ以上の特性を研究するために、例えばかかる胎児ｃｆＤＮＡに含まれる変異の染色体異常の公算または存在を研究するために（例えば、マッシブパラレルシーケンシングに基づくＮＩＰＴを用いる）、十分な画分または胎児ｃｆＤＮＡがあるであろう。双子妊娠のケースにおいて、本発明者は、双子妊娠のＮＩＰＴのためのｃｆＤＮＡの最小限の胎児画分が、８％、または約５％、６％、７％、９％、もしくは１０％であると考えられ得るということを決定しており、一致した遺伝子型を有する一絨毛膜性双子妊娠では（稀な例外を除く。Chen et al, 2013, Am J Med Genet A, 161A:1817）、４％、または約２％、３％、もしくは５％の胎児ｃｆＤＮＡ画分が十分であろう。
【０１６２】
本発明の追加の態様は、ある種の組成物に関する（例えば、本発明の方法に有用である、用いられる、またはその一部として生成されるもの）。組成物は種々のコンポーネントの混合物または他の組み合わせであり得る。従って、本発明は組成物にもまた関し、前記本発明の組成物は２つの（またはより多くの）標識プローブ（例えば核酸プローブ、例えばｑＰＣＲのためのもの）を含み、各プローブは、前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの（or）１つを検出するためである（例えば、配列番号５１に位置するＤＭＲを検出するための１つのプローブ、および配列番号１８５に位置するＤＭＲを検出するための別のプローブ）。特定のかかる実施形態において、組成物中に存在するかかるプローブの（or）２つ以上は、異なる検出可能な標識（単数または複数）によって標識される。プローブ（および標識）は、本願において開示される第１の標的ＤＭＲのいずれか、特に表１および／または表５および／または表Ｅおよび／または表８および／または表１０において開示されるもののためであり得る。組成物は、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つよりも多くの第１の標的ＤＭＲを検出するための、本願の他所に記載のように検出可能な標識（単数または複数）によって標識されたプローブを含み得る。
【０１６３】
かかる態様のある種の実施形態において、組成物はさらに次の追加のコンポーネントの１つ以上を含み得る：
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つを増幅するためであり、例えば、組成物中のプローブが検出するためである第１の標的ＤＭＲを増幅するためである）（例えば、配列番号５１に位置するＤＭＲを増幅するための１つのプライマーペア、および配列番号１８５に位置するＤＭＲを増幅するための別のプライマーペア）；ならびに／あるいは
・  ２つ以上の標識プローブ（例えば、核酸プローブ、例えばｑＰＣＲのためのもの）（各プローブは、前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つを検出するためである）（例えば、配列番号６６に位置するＤＭＲを検出するための１つのプローブ、および配列番号１０２に位置するＤＭＲを検出するための別のプローブ）。特定のかかる実施形態において、組成物中に存在するかかるプローブの（or）２つ以上は、同じ検出可能な標識（単数または複数）によって標識される。プローブ（および標識）は、本願において開示される参照ＤＭＲ、特に表１および／または表５および／または表Ｅに開示されているもののいずれかのためであり得る；ならびに／あるいは
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つを増幅するためであり、例えば組成物中のプローブが検出するためである参照ＤＭＲを増幅するためである）（例えば、配列番号６６に位置するＤＭＲを増幅するための１つのプライマーペア、および配列番号１０２に位置するＤＭＲを増幅するための別のプライマーペア）。
【０１６４】
かかる態様の代替的なまたは追加の実施形態において、組成物はさらに次の追加のコンポーネントの１つ以上を含み得る：
・  プライマーの少なくとも１つのさらなるペア（好ましくは、プライマーの２つのさらなるペア）（各ペアは、前記少なくとも１つのＯＲの１つを増幅するためである）ならびに／あるいは
・  少なくとも１つのさらなる標識プローブ（好ましくは、２つのさらなる標識プローブ）（各プローブは、前記ＯＲの少なくとも１つを検出するためである）。特定のかかる実施形態において、組成物中に存在するかかるプローブの２つ以上（two or more or）は、同じ検出可能な標識（単数または複数）によって標識される。プローブ（および標識）は、本願において開示されるＯＲ、特に表１および／または表Ｄおよび／または表５および／または表Ｅに開示されているもののいずれかのためであり得る。
【０１６５】
かかる態様のさらなる代替的なまたは追加の実施形態において、組成物は、さらに、１つ、２つ（tow）、３つ（there）、またはより多くの第２の標的ＤＭＲを増幅および／または検出するための追加のコンポーネントの１つ以上を含み得、特に、かかる第２の標的ＤＭＲは、第１の標的ＤＭＲとは染色体異数性に関わる異なる染色体上に位置する。
【０１６６】
本発明の一層のさらなる追加の態様は、キット（例えば、別個のコンポーネントのキット；例えば、それぞれがキットの異なるコンポーネントを保持するホルダーまたはベッセルのキット）に関し、かかるキットはプライマーおよび／またはプローブの組み合わせを含み、前記組み合わせは本発明の組成物のいずれかの文脈において記載されている。例えば、本発明のキットは、（別個にまたは混合物としてパッケージングまたは含有された）２つの（またはより多くの）標識プローブ（例えば、核酸プローブ、例えばｑＰＣＲのためのもの）を含有し得、各プローブは前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つを検出するためである（例えば、配列番号５１に位置するＤＭＲを検出するための１つのプローブ、および配列番号１８５に位置するＤＭＲを検出するための別のプローブ）；例えば、キット中に存在するかかるプローブ（or）２つ以上は、異なる検出可能な標識（単数または複数）によって標識される。追加のプローブおよび／またはプライマー（例えば、本発明の組成物の文脈において記載されているもの）が、任意に本発明のキット中に存在し得る（例えば、配列番号５１に位置するＤＭＲを増幅するための１つのプライマーペア、および配列番号１８５に位置するＤＭＲを増幅するための別のプライマーペア；ならびに／または、例えば、配列番号６６に位置するＤＭＲを検出するための１つのプローブ、および配列番号１０２に位置するＤＭＲを検出するための別のプローブ；ならびに／または配列番号６６に位置するＤＭＲを増幅するための１つのプライマーペア、および配列番号１０２に位置するＤＭＲを増幅するための別のプライマーペア）。
【０１６７】
特定の実施形態において、キットまたは組成物中に存在するかかるプローブおよび／またはプライマーの配列は、配列特異的な様式でバイサルファイト変換されたＤＮＡを検出するように改変され得る；例えば、かかる配列改変されたプライマーまたはプローブは、本発明の方法のＭＳＰまたはＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ実施形態に用いられ得、または有用であり得る。
【０１６８】
本発明のキットは、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するために、および／または妊娠女性が医学的状態を患うかもしくは発生する増大したリスクを検出するために用いられ得、または有用であり得る。
【０１６９】
さらなる実施形態において、本発明のキットは追加のコンポーネントを含み得る。例えば、加えて、キットは：（ｉ）前記プライマーおよび／もしくはプローブを用いて本発明の方法を実施するための、および／もしくは本発明の組成物を製造するかもしくは用いるための、印刷されたマニュアルもしくは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ；ならびに／あるいは（ｉｉ）本発明の方法の実施および／または本発明の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他のアイテム、コンポーネント、もしくは試薬（かかる実施もしくは製造に有用な、本願において開示されるいずれかのかかるアイテム、コンポーネント、もしくは試薬を包含する）を含み得る。例えば、キットは、さらに、上に示されているメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを異なって改変する試薬、Ｔａｑポリメラーゼ、および／または反応緩衝液などを含み得る。
【０１７０】
加えて、さらなる限定しない例として、本発明のキットは次のコンポーネントの１つ以上を含み得る：
・  前記妊娠女性から取られるべき血液などの組織サンプルを収集および／または保存するための手段（好ましくは、前記手段は血液収集チューブである）；ならびに／あるいは
・  前記妊娠女性から取られるべきサンプルからＤＮＡ、好ましくはセルフリーＤＮＡを抽出するための手段（好ましくは、前記手段はセルフリーＤＮＡ抽出キットである）；ならびに／あるいは
・  本発明の方法の文脈において前記手段の１つもしくは両方を同定する、得る、および／または用いるための、印刷されたマニュアルもしくは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ；ならびに／あるいは
・  本発明のコンピュータプログラム製品、またはどのようにかかるコンピュータプログラム製品へのアクセスを得るか、またはそれから結果を生成するかについての取扱説明。
【０１７１】
組成物またはキットの特定の実施形態において、それに含まれるプライマーまたはプローブの１つ以上は、表１、表Ｄおよび／または表５および／または表Ｅおよび／または表８および／または表１０に記載されているもの（任意に、かかるプローブについてそこに記載されている検出可能な標識（単数または複数）を有する）から選択されるプライマーまたはプローブ配列を含む（またはそれからなる）。かかる実施形態のある種のものにおいて、組成物またはキットは、表５に記載されている（またはアッセイバージョンＶ１０．１、Ｖ１０．２、Ｖ１０．３、Ｖ１０．４、Ｖ１０．５、およびＶ１０．６のそれぞれに関して、特にアッセイバージョンＶ１０．３に関して、表Ｅに記載されている）プライマーのペアおよびプローブを、（ｘ）第１の標的ＤＭＲの２つ；および（ｙ）参照ＤＭＲの２つ、および任意に（ｚ）ＯＲの１つまたは２つのそれぞれについて含む；特に、第１の標的ＤＭＲのプローブは異なって標識され、２つの参照ＤＭＲのプローブは同じ検出可能な標識（単数または複数）によって標識され、存在する場合には、２つのＯＲのプローブは同じ検出可能な標識（単数または複数）によって標識される。
【０１７２】
特定の実施形態において、プローブは、かかるプローブについてそれぞれの表に記載されているように標識／クエンチャー（および任意に副溝結合部分）によって標識され得る。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、本願において定義されるプライマーもしくはプローブの、または増幅されたＤＭＲのいずれかの配列からなる（またはそれを含む）核酸、好ましくは合成の、単離された、および／または精製された核酸に関する。特定の実施形態において、プライマーは、検出可能な標識に共有結合的にリンクされる。特定の実施形態において、かかるプローブおよび／またはプライマーの配列は、配列特異的な様式でバイサルファイト変換されたＤＮＡを検出するように改変され得る；例えば、かかる配列改変されたプライマーまたはプローブは、本発明の方法のＭＳＰまたはＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ実施形態に有用であり得る。
【０１７４】
代替的な態様において、本発明のキットは、かかる核酸の１つ以上を：（ｉ）方法の文脈において前記核酸を同定する、得る、および／または用いるための、印刷されたマニュアルもしくは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ；ならびに／あるいは（ｉｉ）本発明のコンピュータプログラム製品、またはどのようにかかるコンピュータプログラム製品へのアクセスを得るか、もしくはそれから結果を生成するかについての取扱説明と一緒に含み得る。かかるキットは、さらに、追加のコンポーネント、例えば本発明の方法の実施および／または本発明の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他のアイテム、コンポーネント、または試薬を含み得、かかる実施または製造に有用な、本願において開示されるいずれかのかかるアイテム、コンポーネント、または試薬を包含する。
【０１７５】
本発明の別のさらなる態様はコンピュータプログラム製品に関し、計算システムをコントロールして、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を、前記妊娠女性から取られたサンプルから検出するための演算を行うおよび／または管理するための、複数の命令をエンコードしたコンピュータ読み出し可能な媒体を含み、そのサンプルは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含み、前記サンプル中に存在するＤＮＡは、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理され、かかるものは本発明の方法において実施され；
前記演算は：
・  （ｉ）例えば本発明の方法のステップ（ｃ）に記載されているように、前記サンプル中に存在する染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量をそれぞれが表す２つの（またはより多くの）シグナル；および（ｉｉ）例えば本発明の方法のステップ（ｄ）に記載されているように、前記サンプル中に存在する１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を表す１つのシグナルを受け取るステップと；
・  （ｉｉ）において受け取られるシグナルによって表される参照染色体の量と比較して（ｉ）において受け取られる少なくとも１つのシグナル（好ましくは２つのシグナル）によって表される染色体異数性に関わる染色体の少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つの）相対量（単数または複数）に基づいて、染色体異数性が、前記妊娠女性が身籠っている胎児に存在する可能性が高いかどうかのクラス分けを決定し、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）が、胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含む。
【０１７６】
本発明のコンピュータプログラム製品のある種の実施形態において、相対量は、（ｉ）において受け取られるシグナルの２つ（またはより多く）から算出または別様に生成され得、例えば、平均、中央値、および／またはＺスコアである。
【０１７７】
コンピュータプログラム製品の他のある種の実施形態においては、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において決定されるＤＮＡの前記量を表すシグナルが、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時に生成され得；任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つ（好ましくはそれぞれ）に用いる。
【０１７８】
コンピュータプログラム製品によってコントロールされる演算は、閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）との比較をなすことによってかかるクラス分けを実施し得、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上（好ましくは２つ以上）は、胎児の染色体異数性の存在を指示する。特に、前記演算は、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルから、前記複数のサンプルに関して複数のシグナル（ｉ）および（ｉｉ）を受け取ることによって前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）を計算する；任意に、前記複数のサンプルは、サンプルの１つ以上の群において、本発明の方法によって分析され、前記方法は、所与の群中の各サンプルに対して、別個のベッセル中において、有効にかかる群中の複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施される。
【０１７９】
コンピュータプログラム製品のある種の実施形態において、前記演算は、さらに：
・  存在する胎児ＤＮＡの前記量を閾値および／または参照分布と比較することに基づいて、妊娠女性が、妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを有するかどうかのクラス分けを決定し、前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れは、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示するステップ；ならびに／または
・  品質管理算出、プロセス、もしくはステップ、例えばここで開示されるもの、
の１つ以上を含む。
【０１８０】
本発明のある種の実施形態においては、品質管理算出、プロセス、またはステップがいずれかの決定ステップに先立って実施され得る。このやり方で、要求されるＱＣ基準に合格しないサンプル／分析は、いずれかのさらなるステップ、プロセス、または分析には包含されない。
【０１８１】
具体的な問題または環境への本発明の教示の適用、ならびに本発明の変形またはそれへの追加の特徴（例えば、さらなる態様および実施形態）の包含は、本願に含有される教示に照らして当業者の能力内であろうということが理解されるべきである。
【０１８２】
文脈が別様に述べていない限り、上に提示されている特徴の記載および定義は本発明のいずれかの特定の態様または実施形態に限定されず、記載されている全ての態様および実施形態に等しく適用される。
【０１８３】
本願において引用される全ての参照、特許、および公開は、それらの全体として参照によってここに組み込まれる。
【０１８４】
ここで、本発明のある種の態様および実施形態を、例として、本願において提示される記載、図、および表の参照によって例解する。本発明の方法、使用、および他の態様のかかる例は代表的であるのみであり、本発明の範囲をかかる代表的な例にのみ限定すると取られるべきではない。
【０１８５】
例１（比較）：バニシングツインのケースを包含する多胎妊娠において、ＭＧＳに基づくＮＩＰＴに先立つ定量ステップへの差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出方法の使用
【０１８６】
サンプル収集、処理、およびＤＮＡ抽出：
【０１８７】
多胎（一、二、および三絨毛膜性双生児および三つ子妊娠）を妊娠した女性からの３６個の血液サンプルを、２０１２年１１月６日および２０１３年１１月１６日の間に、研究・開発（Ｒ＆Ｄ）目的で、日常的な非侵襲的な出生前検査（ＮＩＰＴ）ラボ手続きの一部として収集した。１つの血液サンプルは三つ子を妊娠した女性から来ており、残りの３５サンプルは双子妊娠から来た。多胎妊娠を身籠もる各妊娠女性から、それぞれが７〜１０ｍｌの静脈血を有する２つのサンプルを、ＳｔｒｅｃｋセルフリーＤＮＡ血液収集チューブ（Ｓｔｒｅｃｋ）を用いて収集した。血液サンプルは４日という最長配送時間で診断ラボに運送された。本願において分析した妊娠女性からの他の血液サンプルは同様に収集した。
【０１８８】
血漿調製を、遠心（４℃における１０ｍｉｎの１６００ｇ）および血漿分離、次に第２の遠心ステップ（４℃における１０ｍｉｎの１６０００ｇ）によって行なった。トータルセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の抽出は、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（キアゲン）によって、製造者プロトコールに従って、３．０〜４．０ｍｌ血漿を用いて、６０ｕｌのＡＶＥ緩衝液（キアゲン）の最終溶出体積で行なった。
【０１８９】
ＤＮＡ定量：
【０１９０】
差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出を用いて、相対濃度および絶対量両方としての胎児ｃｆＤＮＡ画分を決定するために、胎児セルフリーＤＮＡ（胎児ｃｆＤＮＡ）をトータルセルフリーＤＮＡ（トータルｃｆＤＮＡ）に関して検出および定量した。溶出されたセルフリーＤＮＡから、１１ｕｌを、ＣｐＧメチル化感受性酵素ＨｈａＩ（０．４Ｕ／ｕｌ）、ＨｐａＩＩ（０．３Ｕ／ｕｌ）、およびＢｓｔＵＩ（０．３Ｕ／ｕｌ）によって、ＣｕｔＳｍａｒｔ（商標）緩衝液（ニュー・イングランド・バイオラボ）を用いる２２ｕｌ反応によって消化した。反応を３７℃において６０ｍｉｎ、６０℃において６０ｍｉｎインキュベーションした。消化反応からの１０ｕｌを、簡略に次のように記載されるプローブに基づく定量的ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして用いた（反応は二重で実施した）。
【０１９１】
２倍濃縮ＰＣＲマスターミックス（Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ多重ＰＣＲキット、キアゲン）を用いて２５ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡとの間において差次的にメチル化される（ＤＭＲとしての）それぞれの領域のＣｐＧメチル化感受性の制限酵素部位にかかっているプライマーを、かかるＤＭＲのＦＡＭ標識プローブとの組み合わせで用いた。胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡとの間において差次的にメチル化されない（ＯＲとしての）他の領域のいずれかの制限酵素部位にかかっていないプライマーを、かかるＯＲのＶＩＣ標識プローブとの組み合わせで用いる。この例に用いたプライマーおよび標識プローブの配列は表１に記載されており、プローブに基づく定量的（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲ（ライトサイクラー４８０ＩＩ装置；ロシュ）に用いたサーモサイクラープロファイルは表２に記載されている。この例において、２つのＤＭＲの存在を検出するために用いられたプローブは、同じ検出可能なフルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）蛍光部分によってそれぞれ標識されており、それぞれは同じ副溝結合性の（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）部分を有し、２つのＯＲの存在を検出するために用いられたプローブは、同じ検出可能なＶＩＣ（ライフテクノロジーズ）蛍光部分によってそれぞれ標識されており、それぞれは同じＭＧＢＮＦＱ部分を有する。
【０１９２】
【表６】
2018533953.tif 000012
【０１９３】
【表７】
2018533953.tif 000013
【０１９４】
この例に用いられる差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出アッセイ設計は、母親ＤＮＡにおいて低メチル化され、胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されると記載されている２つのマーカーＤＭＲと（Nygren, et al, 2010: Clin Chem 56, 1627; Chan et al, 2006: Clin Chem 42, 2211; Chiu et al, 2007: Am J Pathol 170, 941）、それらのＤＭＲの約２０ｂｐおよび２０ｋｂの間にそれぞれ位置する、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間において差次的にメチル化されない２つの他の領域（ＯＲ）とに基づく。特に、ＲＡＳＳＦ１Ａ中に位置するメチル化非感受性箇所は、ＲＡＳＳＦ１Ａ中に位置するメチル化感受性箇所の８ｋｂおよび９ｋｂの間（８．９７ｋｂ）下流に位置し、ＴＢＸ３中に位置するメチル化非感受性箇所は、ＴＢＸ３に位置するメチル化感受性箇所の１０ｋｂおよび１１ｋｐの間（１０．６４ｋｂ）下流に位置する。図２は、この例において用いられる２つのＤＭＲおよび２つの他の領域のそれぞれの編成および検出モダリティーを図示している。
【０１９５】
プローブに基づく定量的パラレルＰＣＲ反応を、標準として既知濃度を有する男性ゲノムＤＮＡ（プロメガ）の系列希釈を鋳型に用いて行った（同じＰＣＲラン内の別個の反応による）。胎児ｃｆＤＮＡ画分を、ＦＡＭチャンネル（ＤＭＲ；すなわち、胎児ｃｆＤＮＡを検出する）対ＶＩＣチャンネル（ＯＲ；すなわち、トータルｃｆＤＮＡを検出する）のシグナルの相対的定量によって算出し、トータルｃｆＤＮＡ絶対量を、既知濃度の標準ＤＮＡの希釈系列から得られたＶＩＣチャンネルと比較された、サンプルから得られたＶＩＣチャンネルのシグナルの絶対的な定量によって算出した。かかる相対的および絶対的定量はライトサイクラー４８０ソフトウェアリリース１．５．０（ロシュ）を用いて実施した。
【０１９６】
胎児異数性を同定するための母親血漿ＤＮＡシーケンシングおよびデータ分析：
【０１９７】
ＤＮＡシーケンシングライブラリーを、イルミナからのＮＥＢＮｅｘｔ−Ｕｌｔｒａ（商標）ＤＮＡライブラリープレップキットを用いて調製した。ライブラリーは、ハミルトンＳＴＡＲｐｌｕｓロボットによって自動化された製造者プロトコールに従って調製した。ライブラリー品質および数量は、バイオアナライザ装置（アジレント）およびＱｂｉｔフルオロメータ（インビトロジェン）を用いて測定した。ライブラリー定量に基づいて、希釈、およびプールあたり１２サンプルの等モルのプールを調製した。プールされたサンプルを、イルミナｖ３フローセルの１レーン上で、イルミナＨｉＳｅｑ２０００シーケンサーによってシーケンシングした。クローンクラスターを、ＴｒｕＳｅｑＳＲクラスターキットｖ３−ｃＢｏｔ−ＨＳを用いて、ｃＢｏｔクラスター生成システムによって、製造者プロトコールに従って生成した。胎児染色体異数性を同定するためのバイオインフォマティクス分析を、胎児２１トリソミーの存在を指示するＺスコア≧３によって、以前に記載されているように行った（Stumm et al 2014, Prenat Diag 34:185）。このＮＧＳに基づく方法からの胎児異数性について陽性の検査結果のケースにおいては、結果を侵襲的診断方法によって確認した。
【０１９８】
結果：
【０１９９】
本例の方法によって決定されたｃｆＤＮＡの特性、％胎児画分、および血液サンプルについてかかるＮＧＳに基づく方法によって決定された異数性検査結果が、表３に与えられている。胎児２１トリソミーを指示する、ＮＧＳに基づく２つの陽性検査結果があった。両方とも羊水検査後の核型分析によって確認された。それゆえに、このＮＧＳに基づく研究の偽陽性率は０％であった。１つの血液サンプルは、一致した核型［４７，ＸＹ，＋２１］を有する一絨毛膜性双生児を表し、別のものは、一致しない核型［４７，ＸＹ，＋２１、および４６，ＸＸ］を有する二絨毛膜性双生児を表した。両方のサンプルにおいて、胎児画分はそれぞれ１８．０および２４．８％ほども高かった。すべての他のＮＧＳに基づくＮＩＰＴ結果は２１、１８、および１３トリソミーについて陰性であった。この研究に包含された妊娠において、これまでに偽陰性のＮＩＰＴ結果の証拠はなかった。
【０２００】
【表８−１】
2018533953.tif 000014
【０２０１】
【表８−２】
2018533953.tif 000015
【０２０２】
従来技術のＮＧＳに基づくＮＩＰＴによる双子妊娠における胎児異数性の信頼できる検出は、母親血液中の各胎児からの十分に多量の胎児ｃｆＤＮＡに依存する。各双生児の寄与分が検出閾値よりも上であるということを保証するためには、胎児ｃｆＤＮＡ画分の下限がどのように定義されるべきかについて、異なるデータおよび考察が公開されている（Leung et al 2013, Prenat Diag 33:675; Qu et al 2007, Am J Pathol 170:941; Struble et al 2013, Fetal Diagn Ther Dec 7 Epub ahead of print）。これは、一致しない核型を有する二絨毛膜性双子妊娠にとってとりわけ重要である。上に記載されている研究においては、Ｙ染色体リプレゼンテーション由来の双子妊娠について、２人の胎児の１人のみが男性である場合には、最小限の胎児ｃｆＤＮＡ画分の定義のための補足情報を用いた。本例の方法を用いて、両方の胎児に由来する胎児ｃｆＤＮＡの合計（summary）を反映するトータル胎児ｃｆＤＮＡ画分が決定され得る。次世代シーケンシングからのＹ染色体リプレゼンテーションを用いて、胎児ｃｆＤＮＡ量が男性胎児について決定され得る（Stumm et al 2014に記載されている）。それゆえに、混合した胎児性別のケースにおいては、各胎児の寄与量は、本例の方法によって測定される胎児ｃｆＤＮＡ画分からのＹ染色体リプレゼンテーションによって決定される胎児ｃｆＤＮＡの量の差し引きによって決定され得る。既知の性別のケースについて、本例の方法によって決定された胎児ｃｆＤＮＡ画分を、次世代シーケンシングからのＹ染色体リードから得られた値と比較した（図３参照）。男性特異的ｃｆＤＮＡの量（ｙ軸）対本例の方法によって測定された胎児ｃｆＤＮＡ画分（ｘ軸）の相関がある。それゆえに、男性／男性の性別を有する双子妊娠では、［ｙ＝ｘ］がおよそ真であり、女性／男性の性別ではそれは［ｙ＝０．５ｘ］、女性／女性では［ｙ＝１］である。同様の値を有するケースの性別は男性／男性であり、低いＹ染色体リプレゼンテーションを有する異なる値のケースにおいては、性別は女性／女性である。Ｙ染色体リプレゼンテーションとしての胎児画分のパーセンテージの約半分を示す中間的なケースは、混合した性別である。図３に提出されているデータは、双子妊娠について従来技術のＮＧＳに基づくＮＩＰＴ結果を用いて胎児性別を決定することが可能であるのみならず、本例の方法によって決定されるｃｆＤＮＡの胎児画分の量の測定がＹ染色体配列の頻度カウントと比較して正確であるということをもまた示している。他方で、これらのデータは、双子妊娠の各胎児がトータル胎児ｃｆＤＮＡ画分のおおよそ約半分に寄与するという仮説を支持している。これは、双子妊娠においては胎児ｃｆＤＮＡの量の２倍が要求されるであろうという結論につながり、それゆえに、双子妊娠の従来技術のＮＧＳに基づくＮＩＰＴのためのｃｆＤＮＡの推奨される最小限の胎児画分は８％であると考えられ得る。
【０２０３】
一致した遺伝子型を有する一絨毛膜性双子妊娠では（稀な例外を除く。Chen et al 2013, Am J Med Genet A 161A:1817）、ちょうど単胎妊娠のように、４％という胎児ｃｆＤＮＡ画分が胎児異数性を検出するために十分であろう。しかしながら、日常的なラボＮＩＰＴサービスでは、１つの深刻な問題点が、一および二絨毛膜性妊娠のためのかかる異なる品質基準の関与に異を唱えている：絨毛膜性の決定は、在胎期間と、超音波診断診察を行う医師の実際の経験とに依存する。絨毛膜性は多胎妊娠の第１三半期には明瞭に検出可能であるが、後のステージにおいては、検出はより困難になって来る（Sperling et al 2001, Acta Obstet Gynecol Scand 80:287）。よって、双子妊娠について最小限の胎児ｃｆＤＮＡ画分を一般的に定義することがより安全な戦略であり、これは一絨毛膜性および二絨毛膜性の多胎妊娠に適用可能である。
【０２０４】
バニシングツインの同定：
【０２０５】
胎児ｃｆＤＮＡ画分が本例の方法を用いて測定されたＮＩＰＴ異数性検査の２つのケースにおいて、２１トリソミー（それぞれＺスコア１３．５および３．４）を同定したが、本例の方法によって測定されたトータル胎児ｃｆＤＮＡ画分とＹ染色体リプレゼンテーションによって測定されたｃｆ胎児ＤＮＡ量との間には顕著な相違もまた観察された。
【０２０６】
ケースＡでは、血液サンプルの２つの分析（第１およびバックアップサンプル）から、本例の方法によって測定されたトータル胎児ｃｆＤＮＡ画分がそれぞれ２０．７％および２４．８％であると見積もった。一方、次世代シーケンシングからのＹ染色体リプレゼンテーションによる胎児ｃｆＤＮＡはそれぞれ９．２％および９．３％であった。妊娠は混合した性の双子妊娠であり得るということが推測され、医師に報告され、これは、死亡した双生児が超音波スキャンの間に第１０週に観察されたということを確認した。妊娠の第３三半期に取られたさらなる血液サンプル（３８＋２）は２１トリソミーについて陰性であることが判明し、Ｙ染色体リプレゼンテーションによって測定された胎児ｃｆＤＮＡ量は、ＱｕａｎｔＹｆｅＸによって測定された胎児量と相関した（２１．７％および２１．４）。これは、生存中の胎児の核型分析によって決定された男性性別と一致した。誕生時に、紙様胎児が胎盤組織に見出され、これからは細胞培養および次のＧＴＧ分染法にとって十分量の細胞が単離され得、２１トリソミー陽性の女性核型が確認された（４７，ＸＸ，＋２１）。
【０２０７】
ケースＢでは、軽微に増大したＹ染色体リプレゼンテーションがモニターされ、それぞれ３．０％および２．７％という男性特異的なｃｆ胎児ＤＮＡを指示した。本例の方法によって測定された胎児ｃｆＤＮＡ画分見積もりはそれよりもはるかに上であったため（１３．４％および１０．０％）、我々は、測定された胎児画分のこの相違から、一致しない性別を有する２体の胎児が胎児画分に寄与しており、男性胎児が２１トリソミーの患者であるという仮説を立てた。この示唆は、おおよそ３％というＹ染色体特異的な胎児ｃｆＤＮＡ量と３．０のカットオフ値付近の上昇したＺスコアとの相関に由来した。診察は明瞭に単児妊娠について要請されたので、男性特異的な胎児ｃｆＤＮＡは、バニシングツイン、恐らく２１トリソミーのキャリアから出ていることが疑われた。これは、ＮＩＰＴの同意書においては認識または指示どちらもされていなかった。それゆえに、結果は２１番染色体については不明確であると報告され、潜在的なバニシングツインに関する知らせを包含する矛盾するデータは、超音波診断によるさらなる解明のために担当医師に報告された。担当医師は、爾後に、妊娠が双生児として出発し、後には単児妊娠として継続していたということを確認した。生存中の外見上健康な胎児の性別は女性であると確認された。それゆえに、２１トリソミーについて増大したＺスコアを引き起こした胎児ｃｆＤＮＡは、明瞭に死亡した男性胎児に帰せられ得る。
【０２０８】
例２（比較）：同じ検出可能な部分（単数または複数）を各差次的にメチル化される領域に用いる、２つの差次的にメチル化される領域を用いる参照染色体の改善された検出感度
【０２０９】
本発明者は、同じ検出可能な部分（単数または複数）を前記ＤＭＲ（および差次的にメチル化されない２つの他の領域（ＯＲ））のそれぞれに用いて２つのＤＭＲを検出する複雑な多重反応が、それぞれ別個のＰＣＲ反応によって１つのＤＭＲ（および１つのＯＲ）を検出する以前の検出反応よりも、胎児由来の参照染色体を検出する上で敏感であったということを観察している（図４）。
【０２１０】
別の差次的なメチル化に基づくＤＮＡ検出方法においては、それぞれヒト３番および１２番染色体上に位置する２つのＤＭＲ（例１に記載されているＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３中に見出されるもの）を、ＤＮＡおよび反応の同じアリコートによって、有効に同時に（プローブに基づく定量的（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲを用いて）、２つのＯＲ（例１に記載されているようにＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３中に見出されるもの）とともに、検出した（４つの希釈について）。同じ検出可能な部分（単数または複数）を前記ＤＭＲのそれぞれに（および、前記ＤＭＲに用いられる検出可能な部分（単数または複数）とは異なる検出可能な部分（単数または複数）を前記少なくとも１つのＯＲに）用いた。比較して、各ＤＭＲ（および対応するＯＲ）が独立して別個の反応によって検出された場合には、より高サイクル数（Ｃｐ）での検出によって示されるように、ｃｆＤＮＡ中の胎児由来参照染色体の検出はより敏感でなかった。領域／マーカー、プライマー／プローブ、および検出方法論は実質的に例１に記載されている通りであった。ただし、１遺伝子座反応では、所与の遺伝子（ＲＡＳＳＦ１ＡまたはＴＢＸ３）からのＤＭＲ（および対応するＯＲ）のみを１反応によって同時に検出した。
【０２１１】
対照的に、異なる検出可能な部分（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子座にはＦＡＭかつＴＢＸ３遺伝子座にはＶＩＣ）を用いる２つのＤＭＲの多重反応を用いるｃｆＤＮＡ中の胎児に由来する参照染色体の検出は、さらにより敏感でないということが決定されている（さらに、いずれかのＯＲと同時に検出することが困難である）；理論によって拘束されることなしに、色補正のより高度な複雑さ、別個に検出可能な蛍光マーカーの限定された数、および／またはとても多くの蛍光マーカーが同じ反応中に存在することによる「ブリーチング」効果に起因すると信じられる。
【０２１２】
定量的ＰＣＲ検出の指数的性質があって、検出のより高感度（すなわち、より低サイクル数）は、定量のより高い正確度に等しいであろう。なぜなら、標準曲線の補正およびデータポイント間の内挿は、より高サイクル数での検出と相関するＤＮＡ（すなわち、参照染色体の定量）の量について生ずるものよりも小さい誤差を被るであろうからである。
【０２１３】
例３（比較）：妊娠女性が子癇前症を患うかまたは発生する増大したリスクの検出のための、差次的なメチル化に基づくＤＮＡ定量方法の使用（仮想例）。
【０２１４】
比較例の方法を用いて、妊娠女性を、子癇前症を患うかまたは発生するそれらのリスクについて次のように評価する。第１に、かかるリスクを評価されるべき女性から血液サンプルを収集し、実質的に例１に記載されている手続きに従ってかかるサンプルの血漿からトータルｃｆＤＮＡを抽出する。第２に、実質的に例１に記載されている方法を用いて、血漿中に存在する胎児ｃｆＤＮＡおよびトータルｃｆＤＮＡの相対および／または絶対量を決定し、胎児および／またはトータルｃｆＤＮＡの絶対量はゲノム当量の量として表され得る（「Ｅｑ」）。第３に、ｃｆＤＮＡおよび／またはトータルｃｆＤＮＡのかかる決定された量を閾量または量の参照分布と比較し、胎児ｃｆＤＮＡまたはトータルｃｆＤＮＡの量がかかる閾値を超え、および／またはかかる分布における外れ値である場合には、女性が子癇前症を患うかまたは発生する増大したリスクがあると決定する。
【０２１５】
例えば、公開された閾値を用いて（Papantoniou et al 2013, Prenat Diag 33:682）、トータルｃｆＤＮＡが約７，５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合には、または胎児ｃｆＤＮＡ画分が約５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合には、女性はかかる増大したリスクを有すると決定される。代わりにまたは追加して、かかるリスクは：（ｉ）より後期の妊娠では胎児ｃｆＤＮＡのより高い〜倍の増大が利用され得るということを決定の計算に入れて（Zeybek et al 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632）、胎児ｃｆＤＮＡの〜倍の増大（例えば、１．５、３、３．５、または４倍の増大）（かかる女性について、閾量と比較して決定される）；および／または（ｉｉ）低リスク女性または子癇前症を患うかもしくは発生しなかった女性から決定された量の参照分布の考察から、女性から決定されたｃｆＤＮＡの量がどのパーセンタイルに入るか、を考えることによって評価され得る。例えば、胎児ｃｆＤＮＡ画分がかかる分布の９０パーセンタイルに入る場合には、女性は軽度または重度の子癇前症に罹る増大したリスクを有すると考えられる（Jakobsen et al 2013, Transfusion 53:1956）。
【０２１６】
この例において、リスクの検出は、図５によって表される演算を行うコンピュータプログラム製品を用いて実施される。演算（Ａ）は、それぞれが胎児およびトータルｃｆＤＮＡを表すシグナル（１）および（２）を受け取り、これらは、コンピュータプログラム製品によって、女性の血漿中に存在する胎児（またはトータル）ｃｆＤＮＡの相対および／または絶対量を表すパラメータ（４）を決定するために用いられる。この演算は、任意に、標準ＤＮＡの絶対量を表すシグナル（３）を受け取り得る。第２の演算（Ｂ）は、かかる決定されたパラメータ（４）を閾量（５）および／または量の参照集団（６）と比較して、（７）かかる比較に基づいて、女性が子癇前症に罹るかまたはそれを発生する増大リスクがあると決定されるか否かを決定および報告する。
【０２１７】
例４：２１トリソミーを検出するためのＮＩＰＴのための、直接的で効率的な方法としての本発明の方法の使用
【０２１８】
本発明は、２１トリソミー胎児を身籠もった妊娠女性から得られたｃｆＤＮＡサンプルを同定することができた。
【０２１９】
本発明の方法の１つの多重ＰＣＲ反応において、５８人のヒト妊娠女性から得られたｃｆＤＮＡサンプル中に存在する胎児２１番染色体ＤＮＡ種の量を、２つの標的ＤＭＲのそれぞれにおいて決定し、ｃｆＤＮＡサンプル中に存在する（参照染色体としての）胎児５番および１２番染色体の参照ＤＮＡ種の量を、２つの参照ＤＭＲ（図６参照）の使用によって、各妊娠女性に関して決定した。胎児２１番染色体種（２つの標的ＤＭＲのそれぞれから見積もられた）とかかる胎児染色体参照種（２つの参照ＤＭＲの両方から見積もられた）との相対量を比として算出し、各比を用いて、各ヒト妊娠女性について２つの比のそれぞれのサンプル特異的な平均（ｎ＝６レプリケート）を表示するスキャッタープロットをプロットした（図７）。このスキャッタープロットは、２１トリソミー（「Ｔ２１」）を有する胎児を身籠もっていることが既知の妊娠女性から得られたサンプルをそれぞれ表す３つの「＋」点が、外れ値として容易に認識され得るということを示している。このスキャッタープロットは、本発明の方法の１つの有利な特徴をもまた実証しており、その中では１つの非Ｔ２１サンプルが２１番染色体上の１つの標的ＤＭＲの外れ値として観察され、別のものでは観察されなかった。かかるマーカーの少なくとも２つを分析し得る方法および分析、例えば本発明の方法の使用によってのみ、このサンプルはＴ２１サンプルよりもむしろ非Ｔ２１集団からの外れ値として正しく同定されたであろう。例えば、Ｘ軸によって表される標的ＤＭＲのみが考えられた場合には、または両方の標的ＤＭＲの平均が考えられた（すなわち、両方の標的ＤＭＲが一緒に考えられた）場合には、かかるサンプルはＴ２１サンプルであると誤同定されていたであろう。
【０２２０】
図７に示されているデータは、５８人のヒト妊娠女性から取られた全５８サンプルから１つのｑＰＣＲランによって生成した。しかしながら、１１０人のヒト妊娠女性から取られた追加の１１０サンプルを、同じ本発明の方法によって、２つのさらなるｑＰＣＲランによって爾後に分析し、各ランはそれぞれ５４および５６人のヒト妊娠女性からのサンプルを分析した。３つの別個のランから生成したデータの正規化によって、トータルで全１６８サンプルを１つのスキャッタープロットによって視覚化し得た（図８）。非Ｔ２１サンプルからの全ての９つのＴ２１サンプルのクラスターの分離が明瞭に見られ；例えば、示されている曲線状の境界線（点線）によって区分される。ラン間の正規化は、１つのランからの全レプリケートの適用可能な比の中央値の値を、次のように各サンプルの各比の平均から差し引くことによってなされた。もたらされた正規化された値は、２を加えることによって正の値への変換後に対数目盛を用いてプロットした。
【０２２１】
数多くのサンプル（この例においては１６８）を複数のラン（この例では３）によって分析する本発明の方法のロバストネスを、ラン１から３のそれぞれについて、区分曲線の中心点（この例では０．５，０．５５）からの図８の各点の距離（ラン毎）の、非Ｔ２１サンプル（この図では、「＋」によって表されている）からのトータルで９つのＴ２１サンプル（この図では、「ｏ」によって表されている）のラン非依存的な分離を考えることによって実証する（図９）。全９サンプルが、偽陰性または偽陽性の結果なしに首尾よくクラス分けされた。
【０２２２】
胎児２１番染色体ＤＮＡ種の量を、２つの標的ＤＭＲを用いて決定した：（ｉ）第１のかかるＤＭＲは、ヒト染色体２１ｑ２２．２上に位置するＤＳＣＡＭ遺伝子（ダウン症候群細胞接着分子；ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス２１番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿００００２１．９、ＧＩ：５６８８１５５７７、領域４００１０９９９から４０８４７１１３；配列番号２００）中に位置し；（ｉｉ）第２のＤＭＲは、Ｃ２１ｏｒｆ５７の約２５０ｂｐ以内上流／下流に位置する（ＹＢＥＹ；２１番染色体：４６，２８６，３３７〜４６，２９７，７５１フォワード鎖、ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６８３．２；かかる遺伝子は、ヒト染色体２１ｑ２２．３上に位置する２５０ｂｐ上流／下流フランキング領域、配列番号２１８を包含する。
【０２２３】
胎児参照染色体ＤＮＡ種の量を、２つの参照ＤＭＲを用いることによって決定した：（ｉ）第１のかかるＤＭＲは、ヒト染色体１２ｑ２４．２１上に位置するＴＢＸ３遺伝子（上に記載されている）中に存在し；（ｉｉ）第２のかかるＤＭＲは、染色体５ｑ３１．３上に位置するＰＣＤＨＧＡ１遺伝子（プロトカドヘリンガンマサブファミリーＡ１；ＮＣＢＩ参照配列ホモ・サピエンス５番染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２初期アセンブリ：ＮＣ＿０００００５．１０、ＧＩ：領域１４１，３３０，５７１から１４１，５１２，９８１；配列番号２１７）中に存在する。各複数の反応においては、ＴＢＸ３中のＤＭＲから約１０Ｋｂに位置する第１のＯＲ（上を参照）およびＰＣＤＨＧＡ１中のＤＭＲから約３００ｂｐに位置する第２のＯＲをもまた増幅した。用いたそれぞれのＤＭＲ（およびＯＲ）の配列は表４に記載されている。
【０２２４】
【表９】
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【０２２５】
１６８人のヒト妊娠女性（Ｔ２１を有する胎児を身籠もっていることが既知である９人を包含する）からのｃｆＤＮＡサンプルを、例１に記載されているように、収集、調製、ならびにＣｐＧメチル化感受性酵素ＨｈａＩ、ＨｐａＩ、およびＢｓｔＵＩによって消化した。表４に記載されている４つの別個の遺伝子座のプローブに基づく定量的多重ＰＣＲ反応を、例１に記載されているように各かかるサンプルのレプリケート（ｎ＝６）に対して実施した。ただし、用いたＰＣＲ緩衝液はＰｅｒｆｅＣＴａ多重ｑＰＣＲ−ＴｏｕｇｈＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａバイオサイエンシズ）であり、表５に記載されているＰＣＲプライマーおよび標識プローブ（クエンチャーを有する）を用い、サンプルをそれぞれ５８、５４、および５６サンプルの３つのランに分割した。かかる本発明のアッセイからなる各ランは、１つの３８４ウェルマイクロタイタープレート（ロシュ）においてライトサイクラー４８０ＩＩ（ロシュ）によって実施された。
【０２２６】
【表１０】
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【０２２７】
かかるアッセイのフォーマットは一般的に図６に図示される通りであり、かかる図のＤＭＲ１はヒト２１番染色体のＤＳＣＡＭ遺伝子中に位置し、かかる図のＤＭＲ２はヒト２１番染色体のＣ２１ｏｒｆ５７遺伝子の約２５０ｂｐ以内上流／下流に位置し、かかる図のＤＭＲ１’はヒト１２番染色体のＴＢＸ３遺伝子中に位置し、かかる図のＤＭＲ２’はヒト５番染色体のＰＣＤＨＧＡ１遺伝子中に位置する。２１番染色体上の標的ＤＭＲと５番および１２番染色体上の参照ＤＭＲとの相対量または比を算出する目的には、ＯＲは要求されない。なぜなら、それぞれの染色体の胎児画分を算出するために用いられる場合に、かかる値は数式において約分されるであろうからである。それゆえに、ＯＲの使用から見積もられ得るトータルＤＮＡの量は、胎児のＴ２１ステータスを分析するためには要求されないが、トータルＤＮＡから胎児ｃｆＤＮＡの画分を算出するためには尚利用され得る；例えば、例６および／もしくは７に記載されている目的に、ならびに／または可能なもしくは追加の品質管理目安として（例えば、例６）、または例７に記載されているなどの他の診断の目的に。表５から観察されるであろう通り、ＤＳＣＡＭ中に位置する２１番染色体標的ＤＭＲのためのプローブは、Ｃ２１ｏｒｆ５７の約２５０ｂｐ上流／下流以内に位置する２１番染色体標的ＤＭＲのためのプローブとは異なって標識される；ＴＢＸ３中に位置する１２番参照染色体参照ＤＭＲおよびＰＣＤＨＧＡ１中に位置する５番染色体上のものもまた、同じ標識（標的ＤＭＲとは異なる）によって標識される。最後に、トータルＤＮＡの見積もりに要求される場合には、２つのＯＲは両方とも同じ標識によって標識され、これは多重アッセイに用いられる別の標識とも異なる。総体的には、４つの標識が用いられ、これは、２１番染色体の量が各標的ＤＭＲについて独立して見積もられることと、参照染色体の量がより敏感に検出されることとを可能にする（例２参照）。例えば、検査サンプルとして各ｑＰＣＲプレート（ラン）中に提供され得る既知濃度の標準ＤＮＡの希釈系列から得られるそれぞれのＤＭＲ（またはＯＲ）のシグナル（例１に記載されている）と比較された、サンプルからの各ＤＭＲ（またはＯＲ）のそれぞれのシグナルの参照による。かかる相対的および絶対的定量はライトサイクラー４８０ソフトウェアリリース１．５．０（ロシュ）を用いて実施した。２１番染色体標的ＤＮＡ＋種の各％胎児ｃｆＤＮＡと両方の参照染色体参照ＤＮＡ種の％胎児ｃｆＤＮＡとの平均の［ｎ＝６レプリケート］サンプル特異的な比を、各サンプルについて算出し、各プレートについて、全てのレプリケートの総体的な中央値を算出した。分析は上に記載されている通りであった。
【０２２８】
例５：既知の内部正倍数体標準の参照なしに、ＮＩＰＴによって２１トリソミーを検出するための反復的Ｚスコア分析
【０２２９】
反復的Ｚスコアアプローチの適用によって、本発明者は、Ｚスコア分析において、平均および標準偏差の見積もりにおける既知の正倍数体サンプルの参照なしに、検査サンプルから全ての既知の２１トリソミーサンプルを同定することができた。
【０２３０】
例４において分析されたサンプルの各ラン（ｑＰＣＲプレート）からのデータを、次のように再分析した。第１に、サンプルの各レプリケート（ｎ＝６）の各２１番染色体標的ＤＭＲ対参照染色体ＤＭＲの平均比を算出し、かかるラン（プレート）中に存在する全サンプルについて、サンプルが正倍数体またはトリソミーであることが既知であるかどうかの参照なしに、各比の総体的な平均および標準偏差を算出した。第２に、かかるラン特異的な平均および標準偏差に基づいて、各標的ＤＭＲに関連する各比の（ラン特異的な）別個のＺスコアを、ラン中に存在する各サンプルについて算出した。第３に、各ＤＭＲについて、かかる比を１．９５に等しいかまたはより大きいものについてチェックし、かかる外れ値のＺスコアによって表されるいずれかのかかるサンプルは、独立して、２つの標的ＤＭＲのそれぞれについて、Ｚスコア算出因子のいずれかの爾後の決定に用いられるそれぞれの参照セットサンプルから排除した（ラン特異的な平均比および標準偏差。各比の第２の平均および標準偏差を、独立して、各標的ＤＭＲについて、参照データセット中の残りのサンプルに関してのデータによって算出し、かかるセット中の全サンプルの各比の第２のＺスコア分析を実施するために用いた。第４に、もたらされたＺスコア（すなわち、第１の反復的消去後に算出されたもの）は、上の第３のステップのように各標的ＤＭＲについて独立して外れ値をチェックされ、１，９５に等しいかまたはより大きいＺスコアと関連したサンプルは、各ＤＭＲに関してＺスコアを算出するために用いられる参照データセットから排除される。それから、第３の平均および標準偏差を、それぞれの参照データセット中の残りのサンプルに関してのデータによって各比について各標的ＤＭＲについて独立して算出し、かかるセット中の全サンプルの各比について第３のＺスコア分析を実施するために用いた。この反復プロセスを２０回繰り返した。それぞれのＤＭＲ参照セットから一度排除されたサンプルは、それぞれのサンプルのＺスコアが１つの反復的消去後に再び１．９５よりも下に変化する場合であっても、参照データセット中に再度包含されなかった。もたらされたサンプルのＺスコアが、各比およびサンプルについて図１０に示されており、これは正倍数体およびＴ２１サンプルの完全な分離を表示している（２つの比のそれぞれについて約３．０超のＺスコアによって；および／または２つのＺスコアの平均が約３．０超であることによって；および／または例４／図９に記載のものと類似のクラスターもしくは距離アプローチによって表される）。３の平均Ｚスコアよりも上の値を得る二倍体外れ値は、規則を定義することによって排除した：一致しない結果（マーカー１および２）は違いの程度についてコントロールする。違いが４．０よりも上であった場合には、それらは非陽性／無効であった。
【０２３１】
例６：胎児ｃｆＤＮＡ画分を見積もるための本発明の方法の使用
【０２３２】
妊娠女性から単離されたトータルｃｆＤＮＡ中の胎児ＤＮＡの％画分を、２つの参照染色体上に存在する２つの（共通に標識された）参照ＤＭＲと、それらのそれぞれのＤＭＲとそれぞれ同じ遺伝子内の２つの（共通に標識された）ＯＲとを用いて測定されたＤＮＡの量の比を算出することによって見積もった。ｃｆＤＮＡの胎児画分についての情報は、爾後の分析、例えば例１に記載されているＮＧＳに基づく分析を許すための十分な胎児ＤＮＡがサンプル中に存在するかどうかを決定することを包含する品質管理目的に用いられ得る。
【０２３３】
例７：妊娠女性が子癇前症を患うかまたは発生する増大したリスクを検出するための、本発明の方法の使用（仮想例）
【０２３４】
妊娠女性が身籠っている胎児が異数体であるかどうかを決定することに加えて、例４に記載されている本発明のアッセイのフォーマット（すなわち、トータルＤＮＡを測定するための少なくとも１つの（on）ＯＲを負っているもの）を用いて、次のように、妊娠女性が子癇前症を患うかまたは発生するリスクがあるかどうかをもまた決定する。
【０２３５】
例４に実質的に記載されている方法を用いて、血漿中に存在する胎児ｃｆＤＮＡおよびトータルｃｆＤＮＡの相対および／または絶対量が決定され、胎児および／またはトータルｃｆＤＮＡの絶対量はゲノム当量の量として表され得る（「Ｅｑ」）。第３に、ｃｆＤＮＡおよび／またはトータルｃｆＤＮＡのかかる決定された量を閾量または量の参照分布と比較し、胎児ｃｆＤＮＡまたはトータルｃｆＤＮＡの量がかかる閾値を超える、および／またはかかる分布において外れ値である場合には、女性は、子癇前症を患うかまたは発生する増大したリスクがあると決定する。かかるリスクを評価する公開された値および他のやり方は、例３に記載されているものを包含する。本発明のかかる方法は、例３に記載されている（図５によって表される）コンピュータプログラム製品を利用してかかるリスクを検出するためのシグナルを生成するために用いられ得る。
【０２３６】
例８：本発明のキットの調製および供給（仮想例）
【０２３７】
本発明のキットは、表５にリスト化されているプライマーおよびプローブのそれぞれについて緩衝溶液を形成することによって調製される。各緩衝溶液のアリコート（例えば、２００ｕｌ）を別個のエッペンドルフチューブ中に置き、かかるチューブは厚紙容器中にパッケージングされる。
【０２３８】
代替的なキットにおいては、表５にリスト化されているプライマーおよびプローブのそれぞれの混合物を含む１つの緩衝溶液を調製する。
【０２３９】
さらなる代替的なキットにおいて、厚紙容器は、さらに、表５に記載されている２つの第１の標的ＤＲＭを検出するために用いられるプローブのアリコートを包含する。
【０２４０】
キットの厚紙容器は、さらに、印刷された取扱説明マニュアルを含有し、その中のコンポーネントを（他のコンポーネントと一緒に）用いて本発明の方法を実施して、胎児の染色体異数性を検出することを求めることをユーザーに指図する。
【０２４１】
例９：収集されたサンプルによる試行（仮想例）
【０２４２】
異数体または正倍数体胎児を身籠っていることが既知の数多くの妊娠女性から収集したいくつものサンプルを、本発明の方法によって（例えば、例４に記載されているアッセイを用いることによって）、盲検化された様式（すなわち、研究者はどのサンプルが妊娠女性のどのクラスからであるのかを知らない）で分析して、染色体異数性（例えば、２１トリソミー）を有する胎児を身籠っていると信じられるサンプルを（例えば、正しく）同定することを求める。分析が実施された後に、サンプルを盲検解除し（すなわち、それらが実際にトリソミー胎児を身籠っているかどうか。例えば、ＮＧＳおよび／または他の検査によって決定される）、かかる情報を比較して、本発明の方法の感度および特異性の見積もりまたは目安を生成する。
【０２４３】
例１０：２１トリソミーを検出するためのＮＩＰＴのための本発明の直接的で効率的な方法の他の実施形態
【０２４４】
本発明の方法の有用性は、ＤＭＲ、ＯＲ、および蛍光標識／クエンチャーの具体的な組み合わせを用いて、例４において実証されている。しかしながら、本発明者は、かかる方法がかかる具体的な組み合わせに限定されないということを実証した。なぜなら、ＤＭＲ、ＯＲ、および／または蛍光標識／クエンチャーの他の組み合わせもまた、本発明のかかる方法がＮＩＰＴによって２１トリソミーを直接的に効率的に検出し得るということを示しているからである。表６は、かかる実証を実施するために用いられた種々の順序および／または組み合わせを示している。
【０２４５】
【表１１】
2018533953.tif 000018
【０２４６】
各セットが５６または５８人の妊娠女性から得られたｃｆＤＮＡのサンプルのセットを、別個のｑＰＣＲテストランを作るためにかかるサンプルの大きいコレクションから選択し、各テストランは、２１トリソミー胎児であることが既知の妊娠からの２つから４つの間のｃｆＤＮＡサンプルを包含した（以前に、商業的に利用可能な次世代シーケンシングに基づくＮＩＰＴ方法によって決定および確認された：ＰＲＥＮＡＴＥＳＴ（登録商標）、ＬｉｆｅＣｏｄｅｘｘ−ＡＧ、コンスタンツ、独国）。
【０２４７】
例４に記載されている方法を各ｑＰＣＲテストランによって行い、各ランからのデータを分析し、図８に示されているものと類似にＤＭＲ比を算出、補正、および提出した；ただし、例１０において試験された種々のアッセイ実施形態では、標識（および対応するクエンチャー）の異なる順序を用い、２つのケースにおいては、第２のＣｈｒ２１ＤＭＲを用いた。各それぞれのアッセイについて、ＤＭＲ／ＯＲは表６に示すように用いた。第２の列に記載されているアッセイでは、表５に記載された例４とプライマー配列、プローブ配列、およびプローブ−標識／クエンチャーの同じ組み合わせを用いる。Ｖ１０．１からＶ１０．４として記載されているアッセイでは、表５に記載された例４と同じプライマー配列およびプローブ配列を用いたが、プローブ−標識（および対応するクエンチャー）は表６に提示されている通りであった。Ｖ１０．５およびＶ１０．６として記載されるアッセイでは、Ｖ１０．１／１０．４と同じプライマー配列、プローブ配列、およびプローブ−標識／クエンチャーを用いた。ただし、Ｃ２１ｏｒｆ５７中に位置するＤＭＲの代わりに代替的な第２の（標的）Ｃｈｒ２１ＤＭＲ：Ｃ２１ｏｒｆ２９をＶ１０．５に、ＣＧＩ１４９をＶ２．６に用いた。これらの２つの代替的な第２の（標的）Ｃｈｒ２１ＤＭＲのそれぞれの配列は表７に示されており、Ｖ１０．５およびＶ１０．６に用いられた対応するプライマーおよびプローブ配列および標識／クエンチャーは表８に記載されている。
【０２４８】
【表１２】
2018533953.tif 000019
【０２４９】
【表１３】
2018533953.tif 000020
【０２５０】
図１１から１７によって示されているように（各ケースにおいて、ｘ軸は１つのＣｈｒ２１ＤＭＲとしてのＤＳＣＡＭを表し；ｙ軸は別のＣｈｒ２１ＤＭＲを表す）、これらの異なる実施形態のそれぞれは、各ランにおいて非Ｔ２１サンプルから識別可能にクラスタリングされた２１トリソミーを検出するためのＮＩＰＴのための、本発明の直接的で効率的な方法であるということが実証された。１つのアッセイバージョン（Ｖ１０．１）においてのみ、全てのアッセイに適用された同じ予め定義された円形のカットオフ境界線の外にある真陽性サンプルによって「偽陰性」が起こることが見出された；それらの２つの偽陰性のうち１つは、両方のマーカーについて実質的により高いマーカー比を有することによって匿名であると容易に同定された。少数の偽陽性がいくつかのアッセイにおいて起こり、ランにおいて定量された真陰性の０％（Ｖ１０．４およびＶ１０．５）から４％（Ｖ２．１）までばらついた。しかし、当業者によって理解されるであろう通り、例えば異数性の診断検査においては、偽陽性と比較して最小の偽陰性を有することがはるかに重要である。この例において用いた予め定義された円形のカットオフ境界は、７００を超えるサンプルを用いたｑＰＣＲテストランの大型のランダム化された盲検化されたセットから得られたデータの分析に従って以前に定義されたものであった。これは１５個のＴ２１サンプルを例４に記載されているアッセイフォーマットで包含して、かかる検査に望まれる総体的な感度（真陽性率）、特異性（真陰性率）、および無効率を提供した；例えば：１００％、ほとんど１００％、９７％超（好ましくは、９７．５％超）、もしくは９５％超の感度；９５％超、好ましくは９６％超の特異性；および／または１０％未満（好ましくは７％未満）、例えば６％もしくは５％未満の無効率。
【０２５１】
例１１：１８トリソミーを検出するためのＮＩＰＴの直接的で効率的な方法としての本発明の方法の使用（仮想例）
【０２５２】
例１０に記載されている異数性ＤＭＲ／標識組み合わせの１つ以上を、次によって簡略に記載されるように１８トリソミー（Ｔ１８）を検出するためのＮＩＰＴの基礎として用いる。Ｔ１８妊娠（より稀な異数性）からの限定された数のサンプルを用いて、例４または例１０に記載されている方法を（例えば（or example）、Ｖ１０．３と類似に）用いる。ただし、１つの（または２つの）１８番染色体ＤＭＲが例えば２つの２１番染色体ＤＭＲの代わりに用いられる。例えば、表９に記載されている２つの１８番染色体ＤＭＲはかかるアッセイに用いられ得、対応するプライマーおよびプローブ配列、ならびに用いられる標識／クエンチャーは表１０に記載されている。
【０２５３】
ここで当業者によって理解されるであろう通り、かかるアッセイに用いられ得るＮＦＡＴＣ２および／またはｃｈｒ１８−ｇｒ０００９４遺伝子／領域の厳密な領域、ならびに対応するプライマー／プローブの正確な位置／配列は、さらに最適化され得る（例えば、下に示されている領域および配列の約３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、または５ｂｐ以内上流および／または下流である領域を用いることによる；好ましくは、その約３５０ｂｐおよび２００ｂｐ、または２００ｂｐおよび５ｂｐの間）。さらにその上、さらなるメチル化感受性の制限酵素が、例１０に記載されているものに加えて用いられて、例えばメチル化されていないｃｆＤＮＡの消化を向上させ得る。かかる追加のメチル化感受性の制限酵素はＡｃｉＩ、Ｃａｃ８Ｉ、および／またはＰｈｏＩを包含し得る。
【０２５４】
【表１４】
2018533953.tif 000021
【０２５５】
【表１５】
2018533953.tif 000022
【０２５６】
上から判断して、本発明が次の項目にもまた関するということは理解されるであろう：
１．  妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するための方法であって、前記方法が：
（ａ）  前記妊娠女性から取られたサンプルを提供し、このサンプルが、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを、母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含むステップと；
（ｂ）  前記サンプル中に存在するＤＮＡを、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理するステップと；
（ｃ）  前記サンプル中の染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記染色体上に位置する２つ以上の第１の標的の差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）におけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記第１の標的ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬による第１の標的ＤＭＲのＤＮＡの改変はＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量は、前記サンプル中の第１の標的ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｄ）  前記サンプル中の１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を、前記サンプル中の前記参照染色体（単数または複数）上に位置する２つ以上の参照ＤＭＲにおけるメチル化の存在を検出することによって決定し、前記参照ＤＭＲは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化され、前記試薬によるかかる参照ＤＭＲのＤＮＡの改変は、ＤＮＡのメチル化に対して感受性であり、前記参照ＤＭＲの１つ以上におけるメチル化されたＤＮＡの検出量が、前記サンプル中の参照ＤＮＡ種の前記量を指示するステップと；
（ｅ）  ステップ（ｃ）から決定される量およびステップ（ｄ）から決定される量の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）を決定し、前記相対量（単数または複数）の１つ以上が胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと、
を含み、
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用い；好ましくは：
ステップ（ｅ）において、前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）は閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上は、胎児の染色体異数性の存在を指示する。
２．  項目１の方法であって、
前記参照ＤＭＲの２つ以上が異なる参照染色体上に位置する。
３．  項目１または２の方法であって、
さらに：
（ｆ）  胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡと母親起源のＤＮＡとの間において異なってメチル化されない少なくとも１つの他の領域（ＯＲ）を検出することによって、前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を決定し、前記試薬によるそのＯＲ（単数または複数）の改変は、ＤＮＡのメチル化に対して非感受性であるステップ、
を含み、
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）およびステップ（ｆ）における前記検出は、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲおよび前記他の領域（単数または複数）について、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時になされ、（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つおよび前記ＯＲ（単数または複数）の少なくとも１つに用い；任意に：
（Ａ）前記ＯＲ（単数または複数）は１つ以上の参照染色体（単数または複数）上に位置し、好ましくは、前記ＯＲの少なくとも１つは前記参照ＤＭＲの少なくとも１つと同じ参照染色体（単数または複数）上に位置し；ならびに／または
（Ｂ）前記ＯＲは、前記参照ＤＭＲの少なくとも１つと同じ遺伝子の約２０ｂｐおよび２０ｋｂの間上流または下流に、および／またはその内に位置する。
４．  項目３の方法であって、
（Ａ）ステップ（ｆ）における前記検出が、前記ＯＲの少なくとも２つを用いることを含み；好ましくは、前記ＯＲの数がステップ（ｄ）において用いられる参照ＤＭＲの数と同じであり；より好ましくは、前記ＯＲの１つがステップ（ｄ）において用いられる参照ＤＭＲと同じ染色体上に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し、前記ＯＲの互いが前記参照ＤＭＲの別のものと同じ染色体上に、例えばその約２０ｂｐおよび約２０ｋｂの間上流または下流に位置し；
（Ｂ）ステップ（ｆ）における前記検出が：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記ＯＲのそれぞれに用いてなされる。
５．  項目１から４のいずれか１つの方法であって、前記検出ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出ベッセル中において、有効に互いと同時に、プローブに基づく定量的多重リアルタイムＰＣＲによってなされ、前記ＤＭＲおよび任意のＯＲ（単数または複数）のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いる。
６．  項目１から５のいずれか１つの方法であって、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とする前記ＤＮＡ種が循環セルフリーＤＮＡであり、前記サンプルは血液画分、例えば血漿または血清である。
７．  項目１から６のいずれか１つの方法であって、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する前記試薬が：（Ａ）バイサルファイト；または（Ｂ）メチル化されていないＤＮＡをメチル化されたＤＮＡよりも選択的に消化する主剤を含み、好ましくは、前記主剤が：
・  少なくとも１つのメチル化感受性の酵素；
・  少なくとも１つのメチル化感受性の制限酵素；ならびに／または
ＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩ、およびＺｒａＩからなる群から選択される主剤、
を含む。
８．  項目１から７のいずれか１つの方法であって、
１つの参照ＤＭＲがヒト５番染色体上に位置し、別の参照ＤＭＲがヒト１２番染色体上に位置し；好ましくは：
前記第１の標的ＤＭＲのそれぞれが、ヒト２１番染色体、ヒト１８番染色体、もしくはヒト１３番染色体、好ましくはヒト２１番染色体上に位置し；任意に：
（Ａ）前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡにおいて高メチル化され、母親ＤＮＡにおいて低メチル化され；および／または
（Ｂ）前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位（単数または複数）を含む。
９．  項目１から８のいずれか１つの方法であって、
（Ａ）前記第１の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＷＯ２０１１／０９２５９２のＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ７、ＥＰ８、ＥＰ９、ＥＰ１０、ＥＰ１１、およびＥＰ１２［配列番号３３〜４４］からなるリストから選択されるもの（on）を包含する、ＷＯ２０１１／０９２５９２に開示されているもの；あるいは
・  ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、およびＥＲＧ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１ｏｒｆ２９、およびＨＬＣＳ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  Ｃ２１ｏｒｆ５７、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列；あるいは
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９、および２６１からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置し；あるいは
（Ｂ）前記第１の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列；あるいは
・  マスピン、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列、
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置し；あるいは
（Ｃ）前記第１の標的ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなるリスト、
から独立して選択される領域および／または遺伝子中に位置する。
１０．  項目１から９のいずれか１つの方法であって、
前記参照ＤＭＲが、それぞれ：
・  ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＰＣＤＨＧＡ１、ＳＯＸ１４、およびＳＰＮ、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列からなるリスト；あるいは
・  ＷＯ２０１１／０３４６３１の配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなるリスト、
から独立して選択される領域および／あるいは遺伝子中に位置する。
１１．  項目１から１０のいずれか１つの方法であって、
（Ａ）前記第１の標的ＤＭＲの１つがＤＳＣＡＭ中に位置し、前記第１の標的ＤＭＲの別のものが、Ｃ２１ｏｒｆ５７、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し；（Ｂ）前記参照ＤＭＲの１つがＴＢＸ３中に位置し、前記参照ＤＭＲの別のものが、ＰＣＤＨＧＡ１、またはかかる領域および／もしくは遺伝子から１０ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、もしくは５０ｂｐ以下上流および／もしくは下流のＤＮＡ配列中に位置し；好ましくは：（ｉ）前記第１の標的ＤＭＲの１つが配列番号２０１を含み、前記第１の標的ＤＭＲの別のものが配列番号２１９を含み；（ｉｉ）前記参照ＤＭＲの１つが配列番号２０３を含み、前記参照ＤＭＲの別のものが配列番号２２０を含む。
１２．  項目１から１１のいずれか１つの方法であって、
（Ａ）決定の複数のセットが、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）についてなされ、前記決定の各セットが、前記サンプルのＤＮＡの異なるアリコートを用いて、異なるベッセル中において、有効に決定の複数のセットの互いのメンバーと同時になされ；
（Ｂ）ステップ（ｅ）において決定される相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）が、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）についてなされる決定の前記複数のセットから決定され、好ましくは、各セットについて決定されるＤＮＡの平均量、例えば各セットについて決定されるＤＮＡの平均、中央値、またはモード量、好ましくは各セットについて決定されるＤＮＡの平均量を用いることによる。
１３．  項目１から１２のいずれか１つの方法であって、
（Ａ）第１の標的ＤＮＡ種の量が、第１の標的ＤＭＲの１つにおけるメチル化の検出量から決定され、第１の標的ＤＮＡ種の量が、第１の標的ＤＭＲの別のものにおけるメチル化の検出量から決定され；
（Ｂ）２つ以上の相対量（単数または複数）、好ましくは比（単数または複数）が、ステップ（ｅ）において、第１の標的ＤＮＡ種の２つ以上の量について、それぞれ前記第１の標的ＤＭＲの１つ以上に関して決定され；
（Ｃ）前記相対量（単数または複数）または比の２つ以上が、胎児の染色体異数性の存在または不在を指示し；好ましくは：
ステップ（ｅ）において、前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の２つ以上が、閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の２つ以上が、胎児の染色体異数性の存在を指示する。
１４．  項目１から１３のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｅ）において、前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）が閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較され、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上は、胎児の染色体異数性の存在を指示し；閾値および／または参照分布は複数のサンプルから決定され、各サンプルは異なる妊娠女性から取られ、項目１から１２のいずれか１つに記載されている方法をかかるサンプルに対して実施することにより、前記方法は、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルに対して実施され、各方法は、別個のベッセル中において、有効に複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施され；任意に、決定の複数のセットが、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）および任意のステップ（ｆ）について、各サンプルについて、例えば項目１２に記載されている方法を実施することによってなされ；任意に：
（Ａ）かかる複数のサンプルの２つ以上の群が群毎の原則によって分析され、例えば各群が別個のラン、アッセイ、またはマイクロタイタープレートによって分析され、閾値および／または参照分布が、サンプルの各群から決定される量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の正規化によって決定され；好ましくは：
サンプルの群間における前記正規化は、サンプル特異的な量または比（例えば、かかるサンプルについてなされる決定のセットの平均）と前記特異的なサンプルと同じ群中の全サンプルについて決定される量または比の平均（例えば、中央値）との間における違いを考えることによって実施され；ならびに／あるいは
（Ｂ）胎児の染色体異数性の存在が、かかる胎児に関して、第１の標的ＤＭＲの１つ以上に関して決定される量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）と比較して外れ値であるサンプル特異的な量または比によって指示され；好ましくは：
胎児の染色体異数性の存在は、かかる胎児に関して：（ａ）（推定上の）正倍数体である複数の他の胎児に関してのサンプル特異的な量または比のクラスターの外に；および／または（ｂ）染色体異数性を有する胎児を表す複数の他のサンプルに関してのサンプル特異的な量または比のクラスター内に、位置する数値クラスター内に位置するサンプル特異的な量または比によって指示され；好ましくは、胎児を表す前記複数の他のサンプルは、約：２〜１０、１２〜１５、１６〜２５、２６〜３０、３２〜４０、４２〜５０、５２〜７５、７８〜１００、１０５〜１２５、１３０〜１５０、１５５〜１７５、１８０〜２００、２０５〜２５０、２５５〜３００、３０５〜３５０、３５５〜４００、４０５〜４５０、４５５〜５００、および５００よりも多くの他のかかるサンプルからなる群から選択される。
１５．  キットであって、好ましくは妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を検出するためおよび／または妊娠女性が医学的状態を患うかもしくは発生する増大したリスクを検出するためであり、
前記キットは：
・  プライマーおよび／またはプローブの組み合わせ、
を含み、
前記組み合わせは、２つ以上の標識プローブを含み、任意に、各プローブは異なる検出可能な標識を有し、各プローブは前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つに特異的であり、それを例えば定量的リアルタイムＰＣＲによって検出するためであり；任意に、組み合わせは、さらに：
（Ａ）：
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、項目１から１４のいずれかに記載されている前記２つ以上の第１の標的ＤＭＲの１つを増幅するためである）；および／または
・  ２つ以上の標識プローブ（任意に、各プローブは同じ検出可能な標識を有し、各プローブは前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つに特異的であり、それを例えば定量的リアルタイムＰＣＲによって検出するためである）；および／または
・  ＰＣＲプライマーの２つ以上のペア（各ペアは、項目１から１４のいずれかに記載されている前記２つ以上の参照ＤＭＲの１つを増幅するためである）；ならびに／あるいは
（Ｂ）：
・  プライマーの少なくとも１つのさらなるペア（好ましくは、プライマーの２つのさらなるペア）（各ペアは、項目３から１４のいずれかに記載されている前記少なくとも１つのＯＲの１つを増幅するためである）；および／または
・  少なくとも１つのさらなる標識プローブ（好ましくは２つのさらなる標識プローブ）（任意に、各プローブは同じ検出可能な標識を有し、各プローブは前記ＯＲの少なくとも１つに特異的であり、それを例えば定量的リアルタイムＰＣＲによって検出するためである）；
を含み、
・  任意に、前記キットは、さらに：
（ｉ）  前記プライマーおよびプローブを用いて項目１から１４のいずれか１つの方法を実施するための印刷されたマニュアルもしくは説明書を含むコンピュータ読み出し可能なメモリ；ならびに／または
（ｉｉ）  項目１から１４のいずれか１つの方法の実施に有用な１つ以上の他のアイテム、コンポーネント、もしくは試薬（かかる実施または製造に有用な本願において開示されるいずれかのかかるアイテム、コンポーネント、もしくは試薬を包含する）、
を含む。
１６．  コンピュータプログラム製品であって：
計算システムをコントロールして、妊娠女性が身籠っている胎児の染色体異数性を、前記妊娠女性から取られたサンプルから検出するための演算を行うおよび／または管理するための、複数の命令をエンコードしたコンピュータ読み出し可能な媒体、
を含み、
そのサンプルは、胎児の細胞および／または胎児の胎盤を起源とするＤＮＡを母親起源の異なってメチル化されたＤＮＡとの混合物として含み、前記サンプル中に存在するＤＮＡは、項目１から１４のいずれか１つに記載されているように、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを差次的に改変する試薬によって処理され；
前記演算は：
・  項目１から１４のいずれか１つのステップ（ｃ）に記載されている（ｉ）前記サンプル中に存在する染色体異数性に関わる染色体である第１の標的ＤＮＡ種の量をそれぞれが表す２つのシグナルと；項目１から１４のいずれか１つのステップ（ｄ）に記載されている（ｉｉ）前記サンプル中に存在する１つ以上の参照染色体である参照ＤＮＡ種の量を表す１つのシグナルと：を受け取るステップと；
・  （ｉｉ）において受け取られるシグナルによって表される参照染色体の量と比較した（ｉ）において受け取られる少なくとも１つのシグナルによって表される染色体異数性に関わる染色体の少なくとも１つの相対量（単数または複数）に基づいて、染色体異数性が前記妊娠女性が身籠っている胎児に存在するかどうかのクラス分けを決定し、少なくとも１つは胎児の染色体異数性の存在または不在を指示するステップと；
を含み、
任意に：
（Ａ）ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において決定されるＤＮＡの前記量を表すシグナルが、前記第１の標的ＤＭＲおよび前記参照ＤＭＲについて、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じベッセル中において、有効に同時に生成され；任意に：（ｘ）同じ検出可能な標識（単数または複数）を前記参照ＤＭＲの少なくとも２つに；（ｙ）異なる検出可能な標識（単数または複数）を前記第１の標的ＤＭＲの少なくとも２つに用い；ならびに／あるいは
（Ｂ）前記演算は、閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）との比較をなすことによってかかるクラス分けを実施し、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）よりも高いかまたは低い前記相対量（単数もしくは複数）または比（単数もしくは複数）の１つ以上は、胎児の染色体異数性の存在を指示し；好ましくは：
前記演算は、それぞれが異なる妊娠女性から取られた複数のサンプルから、前記複数のサンプルに関して複数のシグナル（ｉ）および（ｉｉ）を受け取ることによって、前記閾値（単数もしくは複数）および／または参照分布（単数もしくは複数）を計算し；任意に、前記複数のサンプルは、サンプルの１つ以上の群において、項目１から１４のいずれか１つの方法によって分析され、前記方法は、所与の群中の各サンプルに対して、別個のベッセル中において、有効に、かかる群中の複数のサンプルの互いのメンバーと同時に実施され；ならびに／あるいは
（Ｃ）前記演算は、さらに：
・  項目３に記載されている（ｉｉｉ）前記サンプル中のトータルＤＮＡの量を表すさらなるシグナルを受け取るステップと；
・  （ｉ）および／または（ｉｉ）において受け取られる少なくとも１つのシグナルによる（ｉｉｉ）において受け取られるシグナルの考察によって、サンプル中に存在する胎児ＤＮＡの量、例えば絶対または相対量を決定するステップと；
を含み、好ましくは：
前記演算が、さらに：
・  存在する胎児ＤＮＡの前記量を閾値および／または参照分布と比較することに基づいて、妊娠女性が、妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを有するかどうかのクラス分けを決定し、前記閾値および／または参照分布からのＤＮＡの前記胎児の量の増大または外れが、妊娠女性が前記妊娠に関連した医学的状態を患うかまたは発生する増大したリスクを指示するステップを、
含む。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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