(57)【要約】遺伝学的に操作した細菌、その薬剤組成物、および自己免疫障害を処置または防止し、消化管における炎症メカニズムを抑制し、および/または消化管粘膜バリア機能を強化する方法を開示する。
2018512841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）外因性環境条件によって誘導され、以下の：
i．ノンネイティブな抗炎症分子をコードする第一の遺伝子；
ii．ノンネイティブな消化管バリア機能エンハンサー分子をコードする第一の遺伝子；および
iii．生合成経路をコードする遺伝子カセットであり、生合成経路の最終生成物は抗炎症分子および消化管バリア機能エンハンサー分子からなる群より選ばれるもの
の一以上に作動可能に連結される第一のプロモーター
を含む、遺伝学的に操作された細菌。
【請求項２】
第一のプロモーターは低酸素または嫌気条件下で誘導される、請求項1の細菌。
【請求項３】
低酸素または嫌気条件下で誘導される第一のプロモーターは、FNR応答性プロモーター、ANR応答性プロモーター、またはDNR応答性プロモーターである、請求項2の細菌。
【請求項４】
第一のプロモーターはFNR応答性プロモーターである、請求項3の細菌。
【請求項５】
第一のプロモーターは反応性窒素種の存在によって誘導される、請求項1の細菌。
【請求項６】
第一のプロモーターは反応性酸素種の存在によって誘導される、請求項1の細菌。
【請求項７】
第一の遺伝子および/または遺伝子カセットは細菌の染色体上に位置する、請求項1-6のいずれか一項の細菌。
【請求項８】
第一の遺伝子および/または遺伝子カセットは細菌のプラスミド上に位置する、請求項1-7のいずれか一項の細菌。
【請求項９】
抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子は、短鎖脂肪酸、プロピオナート、ブチラート、アセタート、IL-10、IL-27、TGF-β2、TGF-β1、GLP-2、NAPEs、エラフィン、およびトレフォイル因子から選ばれる、請求項1-8のいずれか一項の細菌。
【請求項１０】
抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子は、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、CXCL-8、およびCCL2から選ばれる炎症促進性分子に対して向けられるscFv、アンチセンスRNA、siRNA、およびshRNAから選ばれる、請求項1-8のいずれか一項の細菌。
【請求項１１】
細菌はプロバイオティク細菌である、請求項1-10のいずれか一項の細菌。
【請求項１２】
細菌は、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびラクトコッカス属からなる群より選ばれる、請求項11の細菌。
【請求項１３】
細菌は、エシェリキア・コリ株ニッスルである、請求項12の細菌。
【請求項１４】
細菌は、哺乳動物の消化管内に存在するとき補完される遺伝子において栄養要求体である、請求項1-13のいずれか一項の細菌。
【請求項１５】
哺乳動物の消化管はヒト消化管である、請求項14の細菌。
【請求項１６】
細菌は、ジアミノピメリン酸、またはチミン生合成経路における酵素において栄養要求体である、請求項14または15の細菌。
【請求項１７】
細菌は、細菌に対し毒性がある物質をコードする第二の遺伝子を所有するようにさらに操作され、第二の遺伝子は、哺乳動物の消化管において自然に存在しない環境因子によって、直接的または間接的に誘導される第二のプロモーターの制御下にある、請求項1-16のいずれか一項の細菌。
【請求項１８】
細菌は、細菌に対し毒性がある物質をコードする第三の遺伝子を所有するようにさらに操作され、第三の遺伝子は第一のプロモーターの制御下にあり、および毒性物質の発現は、抗炎症分子、消化管バリアエンハンサー分子、または生合成経路をコードする遺伝子カセットの発現と比較して時間的に遅れる、請求項1-17のいずれか一項の細菌。
【請求項１９】
請求項1-18のいずれか一項の細菌；および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的に許容可能な組成物。
【請求項２０】
経口または直腸施与用に調剤される、請求項19の組成物。
【請求項２１】
自己免疫障害を処置または防止するにあたり、その必要があるペイシェントに、請求項19または20のいずれか一項の組成物を施与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
消化管炎症および/またはの低下した消化管バリア機能に関連する疾患または状態を処置するにあたり、請求項19または20のいずれか一項の組成物をその必要があるペイシェントに施与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
自己免疫障害は、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（CIDP）、慢性再発性多発性骨髄炎（CRMO）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST疾患、本態性混合性クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状IgA病（LAD）、ループス（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（MCTD）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、パリンドロームリウマチ、PANDAS（連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型およびIII型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（UCTD）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症からなる群より選ばれる、請求項21の方法。
【請求項２４】
自己免疫障害は、1型糖尿病、ループス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、若年性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、セリアック病、および強直性脊椎炎からなる群より選ばれる、請求項23の方法。
【請求項２５】
疾患または状態は、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、および下痢性疾患から選ばれる、請求項22の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により、2015年3月2日に出願された米国仮出願第62/127,097号；2015年10月30日に出願された米国出願第62/248,814号；2015年11月16日に出願された米国仮出願第62/256,042号；2016年2月4日に出願された米国仮出願第62/291,461号；2015年3月2日に出願された米国仮出願第62/127,131号；2015年10月30日に出願された米国仮出願第62/248,825号；2015年11月16日付けの米国仮出願第62/256,044号；2016年2月4日に出願された米国仮出願第62/291,470号；2015年6月25日に出願された米国仮出願第62/184,770号；2015年10月30日に出願された米国仮出願第62/248,805号；2015年11月16日に出願された米国仮出願第62/256,048号；2016年2月4日に出願された米国仮出願第62/291,468号；2015年12月22日付けの米国出願第14/998,376号を組込み、そのそれぞれの内容全体が、参照によってそのままここに明示的に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、消化管において炎症性メカニズムを抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および/または自己免疫障害を処置および防止するための組成物および治療上の方法に関する。一定の態様において、本開示は、消化管において炎症を低減し、および/または消化管バリア（腸障壁とも言う）機能を高めることが可能な遺伝学的に操作された細菌に関する。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、消化管炎症を低減し、および/または消化管バリア機能を高めることが可能であり、それによって自己免疫障害が改善または防止される。いくらかの態様では、ここに開示される組成物および方法は、自己免疫障害、ならびに消化管炎症および/または低下した消化管バリア機能に関連する疾患および状態、例は、下痢性疾患、炎症性腸疾患（inflammatory bowel diseases）、および関連疾患を処置または防止するために使用されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
炎症性腸疾患（IBDs）は、T細胞および活性化マクロファージにより典型的に駆動される胃腸管において顕著な局所炎症によって、および宿主循環系からの消化管の内腔内容物を分離する上皮バリアの機能低下によって特徴付けられる疾患のグループである〔Ghishan（ギースハン）ら、2014〕。IBDの病因は、遺伝学的要因および環境的要因の双方に関連しており、および消化管細菌と腸免疫系との間の変動した相互作用によって引き起こされる可能性がある。IBDを処置するための現在のアプローチは免疫系を調節し、および炎症を抑止する治療学に焦点が当てられる。これらの治療には、ステロイド、たとえば、プレドニゾンなどのようなもの、および腫瘍壊死因子（TNF）インヒビター、たとえば、Humira（ヒュミラ）(R)（商標）などのようなものが含まれる〔Cohen（コーエン）ら、2014〕。このアプローチの欠点は、全身免疫抑制に関連し、それには、感染性疾患およびガンに対する罹患率がより一層高いことが含まれる。
【０００４】
他のアプローチは、短鎖脂肪酸ブチラートを、注腸を介して供給することによってバリア機能低下の処置に焦点があてられた。近年、いくつかのグループは、消化管での免疫系の調節において共生細菌による短鎖脂肪酸産生の重要性を実証しており〔Smith（スミス）ら、2013〕、ブチラートが調節性T細胞の分化を誘導し、およびIBDにおける炎症に関連する免疫応答を抑制することにおいて直接役割を果たすことが示された〔Atarashi（アタラシ）ら、2011；Furusawa（フルサワ）ら、2013〕。ブチラートは通常、食物繊維の微生物発酵によって生成され、結腸上皮細胞恒常性およびバリア機能を維持する中心的な役割を果たす〔Hamer（ハマー）ら、2008〕。ブチラート注腸剤を用いた研究は、ペイシェント（主として患者を意味する）にいくらかの利益をもたらすが、この処置は長期療法には実用的ではない。より最近では、IBDを有する患者は健康な患者から糞便移送により処置され、いくらか成功している〔Ianiro（イアニロ）ら、2014〕。この成功は、消化管微生物が疾患の病理学において果たす中心的役割を例示し、一定の微生物機能がIBD疾患プロセスの改善に関連することを示唆する。しかしながら、このアプローチは、感染性疾患をドナーからレシピエントに伝達することに対する安全性の懸念を提起する。さらに、この処置の性質はネガティブスティグマ（否定的とも言う）であり、そして従って広く受け入れられる可能性は低い。
【０００５】
低下した消化管バリア機能はまた、自己免疫疾患の病因において中心的な役割を果たす〔Lerner（ラーナー）ら、2015a；Lernerら、2015b；Fasano（ファザーノ）ら、2005；Fasano、2012〕。上皮細胞の単一の層は、体において免疫細胞から消化管内腔を分離する。上皮は細胞間タイトジャンクションによって調節され、および耐性と非自己抗原に対する免疫との間の平衡を制御する（Fasanoら、2005）。上皮層を破壊することにより、高度に免疫反応性の上皮下組織の病理学的暴露が内腔において膨大な数の外来抗原に対して導かれることがあり（Lernerら、2015a）、結果として増加した罹患率がもたらされ、および腸内および腸管外の自己免疫障害の双方が起こりうる″（Fasanoら、2005）。いくらかの外来抗原は、自己抗原に似ていると考えられ、および既存の自己免疫疾患の進行を促進し、または自己免疫疾患を惹起するエピトープ特異的交差反応を誘発することができる（Fasano、2012）。関節リウマチおよびセリアック病は、たとえば、腸の透過性の増加を伴うと考えられる自己免疫障害である（Lernerら、2015b）。遺伝学的に自己免疫疾患に罹患し易い個体では、細胞間タイトジャンクションの調節不全が疾患発症を引き起こす可能性がある（Fasano、2012）。実際、自己免疫が発達するためには、環境と相互作用する粘膜バリアの防御機能の喪失が必要である（Lernerら、2015a）。
【０００６】
消化管微生物における変化は宿主の免疫応答を変動させる可能性がある〔Paun（ポーン）ら、2015；Sanz（サンス）ら、2014；Sanzら、2015；Wen（ウェン）ら、2008〕。たとえば、1型糖尿病について遺伝学的リスクが高い小児では、疾患について自己免疫を発達させる子供と健康を維持する者との間に消化管内微生物に著しい差異がある〔Richardson（リチャードソン）ら、2015〕。他は、消化管細菌が喘息の防止における潜在的な治療上の標的であり、および肺の炎症における強力な免疫調節能力を見せることが示された〔Arrieta（アーリエータ）ら、2015〕。したがって、胃腸管におけるバリア機能の増強および炎症の減少は、自己免疫疾患の処置または防止のための潜在的な治療メカニズムである。
【０００７】
最近では、抗炎症性分子、たとえば、IL-10などのようなものを生成する微生物を作製し、および治療用物質を消化管において炎症の部位に直接送るためにそれらを患者に経口施与する努力がなされている。このアプローチの利点は、免疫抑制剤の全身投与が避けられ、および治療用物質が胃腸管に直接送られることである。しかしながら、これらの操作された微生物はいくらかの前臨床モデルにおいて有効性を示しているが、患者における有効性は観察されていない。患者の処置における成功の欠如の一つの理由は、多量の非天然タンパク質、たとえば、ヒトインターロイキンの構成上の生産に起因して、微生物の生存能力および安定性が損なわれることである。したがって、消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および/または自己免疫疾患を処置し、およびそれらが望ましくない副作用を回避するものであるためにさらなる治療に対する大きな必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここに開示される遺伝学的に操作された細菌は、治療上の抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を生成することが可能である。遺伝学的に操作された細菌は、それらが誘発性の環境、例は、哺乳動物の消化管に達するまで、機能的にサイレントであり、そこで治療上の分子の発現が誘導される。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は自然に非病原性であり、および消化管炎症を減少させ、および/または消化管バリア機能を増強するために消化管に導入することができ、およびそれによって自己免疫障害をさらに改善または防止しうる。一定の実施態様において、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子は、遺伝学的に操作された細菌によって安定的に生成され、および/または遺伝学的に操作された細菌は、インビボおよび/またはインビトロで安定に維持される。本発明はまた、遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物、および消化管炎症の減少および/または消化管粘膜バリア機能の強化、例は、炎症性腸疾患または自己免疫障害からの利益を享受する疾患を処置する方法も提供する。
【０００９】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、環境条件、例は、哺乳類の消化管で見出される環境条件、たとえば、炎症状態または低酸素状態によって誘導される一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のプロモーターの制御下に一以上の治療上の分子（群、複数でもありうる）を生成する。したがって、いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、反応性酸素種（ROS、活性酸素種とも言う）依存性プロモーター、または反応性窒素種（RNS、活性窒素種とも言う）依存性プロモーター、および対応する転写因子の制御下で一以上の治療上の分子（群）を生成する。いくらかの実施態様では、治療上の分子はブチラート（酪酸塩、酪酸、ブチレートとも言う）であり；誘導性環境において、酪酸塩生合成遺伝子カセットが活性化され、および酪酸塩が生成される。酪酸塩の局所生産は、消化管において調節性（制御性とも言う）T細胞の分化を誘導し、および/または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導性環境、たとえば、消化管などのようなものにおいてだけそれらの治療上の効果を生じ、それによって全身暴露に関連する安全性の問題が低減される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】酪酸塩生産のためのC. difficile（クロストリジウム・ディフィシレ）由来の八遺伝子経路の模式図を示す。pLogic031は、Tet誘導性プロモーター（pBR322バックボーン）の制御下で合成されるC. difficile由来の八遺伝子経路、bcd2-etfB3-etfA3-thiA1-hbd-crt2-pbt-bukを含む。pLogic046は、Treponema denticola（トレポネーマ・デンティコラ）のター(トランス-エノイル-2-レダクターゼ)〔ter（trans-enoyl-2-reductase）〕からの単一の遺伝子により、潜在的な律速段階であるBCD/EFT複合体を置換し、およびter-thiA1-hbd-crt2-pbt-bukを含む。
【図１Ｂ】図1Aと同様である。
【図２】丸で囲んだ遺伝子（bukおよびpbt）を欠失させ、およびブチリル-CoAからCoAを切断するtesBで置換しうるブチラート生成経路の概略図を示す。
【図３】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および酸化窒素（NO）の存在下での抑制解除を示す。上側パネルでは、NOが存在しない場合、NsrR転写因子（グレイサークル（灰色の円）「NsrR」）は、対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；ブラックボックス）はいずれも発現しない。下側のパネルでは、NOの存在下、NsrR転写因子はNOと相互作用し、およびもはや調節配列に結合したり、または抑制したりしない。このことは、ブチラート生合成酵素の発現（グレイアロー（灰色の矢印）およびブラックスクイグル（黒色のくねった線）で示される）および最終的にはブチラートの生成を導く。
【図４】本発明の別の模範的な組換え細菌の遺伝子構成およびNOの存在下での抑制解除を示す。上側パネルでは、NOが存在しない場合、NsrR転写因子（グレイサークル、「NsrR」）は、対応する調節領域に結合し、および抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；ブラックボックス）はいずれも発現しない。下側パネルでは、NOの存在下で、NsrR転写因子はNOと相互作用し、およびもはや調節配列に結合したり、または抑制したりしない。このことは、ブチラート生合成酵素の発現（グレイアローおよびブラックスクイグルで示される）および最終的にはブチラートの生成を導く。
【図５】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成およびH2O2の存在下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、H2O2が存在しない場合、OxyR転写因子（グレイサークル、「OxyR」）はoxySプロモーターに結合するが、ただし誘導しない。したがって、ブチラート生合成酵素（bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；ブラックボックス）のいずれも発現しない。下側のパネルでは、H2O2の存在下、OxyR転写因子はH2O2と相互作用し、および次いでoxySプロモーターを誘導することができる。このことは、ブチラート生合成酵素の発現（グレイアローおよびブラックスクイグルで示される）および最終的にはブチラートの生成を導く。
【図６】本発明の別の模範的な組換え細菌の遺伝子構成およびH2O2の存在下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、H2O2が存在しない場合、OxyR転写因子（グレイサークル、「OxyR」）はoxySプロモーターに結合するが、ただし誘導しない。したがって、ブチラート生合成酵素（ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；ブラックボックス）はいずれも発現しない。下側のパネルでは、H2O2の存在下、OxyR転写因子はH2O2と相互作用し、および次いでoxySプロモーターを誘導することができる。これは、ブチラート生合成酵素の発現（グレイアローおよびブラックスクイグルで示される）および最終的にはブチラートの生成を導く。
【図７】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、酸素（O2）は、FNR（グレイボックス化（灰色で囲んだ）「FNR」）が、FNR応答性プロモーター（「FNRプロモーター」）を二量化し、およびそれを活性化することを防ぎ（「X」によって示される）、好気的条件下で比較的少なくしかブチラートを生成しない。したがって、ブチラート生合成酵素（bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbuk；ブラックボックス）はいずれも発現しない。下側のパネルでは、FNR二量体化（二つのグレイボックス化「FNR」s）、FNR応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現を誘導することにより、ブチラートの生成が導かれ、低酸素条件下でのブチラート生成の増加がある。
【図８】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、酸素（O2）は、FNR（グレイボックス化「FNR」）が、FNR応答性プロモーター（FNRプロモーター）を二量化し、およびそれを活性化するのを防ぎ（「X」によって示される）、好気的条件下で比較的低くブチラートを生成する。したがって、ブチラート生合成酵素（ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbuk；ブラックボックス）はいずれも発現しない。下側のパネルでは、FNR二量体化（二つのグレイボックス化「FNR」s）、FNR応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現の誘導により、ブチラートの生成を導き、低酸素条件下でのブチラート生成の増加がある。
【図９】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、酸素（O2）は、FNR（グレイボックス化FNR）FNR（FNRプロモーター）を二量化し、および活性化するのを防ぎ（「X」によって示される）、好気性条件下での比較的低いプロピオナート（プロピオン酸塩、プロピオン酸、プロピオネートとも言う）生成がある。したがって、プロピオナート生合成酵素（pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、acrC；黒色ボックス）はいずれも発現しない。下側のパネルでは、FNR二量体化（二つのグレイボックス化「FNR」s）、FNR応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現の誘導により、それがプロピオナートの生成を導き、低酸素条件下でのプロピオナート生成の増加がある。
【図１０】模範的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。
【図１１】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、酸素（O2）はFNR（グレイボックス化「FNR」）がFNR応答性プロモーター（「FNRプロモーター」）を二量化し、および活性化するのを防止する（「X」によって示される）好気性条件下で比較的低いプロピオン酸生成がある。したがって、プロピオナート生合成酵素（thrA、thrB、thrC、ilvA、aceE、aceF、lpd；ブラックボックス）のいずれも発現しない。下側のパネルでは、FNR二量体化（二つのグレイボックス化「FNR」s）、FNR応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現の誘導により、それがプロピオナートの生成を導き、低酸素条件下でのプロピオナート生成の増加がある。
【図１２】模範的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。
【図１３】本発明の模範的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。上側のパネルでは、酸素（O2）は、FNR（グレイボックス化「FNR」）がFNR応答性プロモーター（「FNRプロモーター」）を二量化し、および活性化するのを防止する（「X」によって示される）好気性条件下での比較的低いプロピオナート生成がある。したがって、プロピオナート生合成酵素（thrA、thrB、thrC、ilvA、aceE、aceF、lpd、tesB；ブラックボックス）のいずれも発現しない。下側のパネルでは、FNR二量体化（二つのグレイボックス化「FNR」s）、FNR応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現の誘導により、それがプロピオナートの生成を導き、低酸素条件下でのプロピオナート生成の増加がある。
【図１４】模範的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。
【図１５】八遺伝子ブチラートカセットを含むブチラート遺伝子カセット、pLogic031の概略図を示す。
【図１６】ter置換（卵形）を含むブチラート遺伝子カセット、pLogic046の概略図を示す。
【図１７】ブチラート遺伝子カセット、pLogic046の線形概略図を示す。
【図１８】ブチラート生成のグラフを示す。pLOGIC031（bcd）/+O2は好気的に増殖したNissle（ニッスル）含有プラスミドpLOGIC031である。pLOGIC046（ter）/+O2は好気的に増殖したNissle含有プラスミドpLOGIC046である。pLOGIC031（bcd）/-O2は嫌気的に増殖させたNissle含有プラスミドpLOGIC031である。pLOGIC046（ter）/-O2は嫌気的に増殖させたNissle含有プラスミドpLOGIC046である。ter構築物はより一層高いブチラート生成をもたらす。
【図１９】野生型親コントロールと比較してより一層高いレベルのブチラート生成をもたらす、nuoB遺伝子欠失を含むE. coli（Escherichia coli、エシェリキア・コリ、大腸菌とも言う）BW25113ブチラート生成回路を用いたブチラート生成のグラフを示す。nuoBは、呼吸器の成長中にNADHの酸化に関与する主要なタンパク質複合体である。いくらかの実施態様では、NADH酸化の電子輸送へのカップリングを防止することは、ブチラート生成を支持するために使用されるNADHの量を増加させる。
【図２０】pLogic046-tesBの概略図であり、そこではbukおよびpbtは欠失し、およびtesB置換される。
【図２１】ブチラート遺伝子カセット、pLogic046-デルタ.ptb-buk-tesB+の線形概略図を示す。
【図２２】pLOGIC046（プラスミドpLOGIC046、ATC-誘導性ter含有ブチラート構築物を含むNissle株）およびpLOGIC046-デルタ.pbt-buk/tesB +（プラスミドpLOGIC046-デルタpbt.buk/tesB+、ATC-誘発性ter含有ブチラート構築物で、pbt-buk遺伝子の欠失を有するもの、およびtesB遺伝子によるそれらの置換を含むNissle株）を用いるブチラート生成を示す。tesB構築物はより一層高いブチラート生成をもたらす。
【図２３】ter置換を含むブチラート遺伝子カセット、ydfZ-ブチラートの概略図を示す。
【図２４】インビトロでのグルコースおよび酸素の存在下および不存在下におけるSYN363を示す。SYN363は、ydfZプロモーターの制御下でter-thiA1-hbd-crt2-tesB遺伝子が含まれるブチラート遺伝子カセットを含む。
【図２５】IBDのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発マウスモデルにおける消化管バリア機能を測定するグラフを示す。様々な濃度のDSSを施与したマウスの血しょう中に見出されるFITCデキストランの量を消化管バリア機能の指標として測定した。
【図２６】分光光度法によって分析したFITC-デキストランの血清レベルを示す。FITC-デキストランはIBSのDSS誘発マウスモデルにおける消化管バリア機能についての読み取り値である。
【図２７】IBDのインビボモデルにおける糞便サンプルを用いてELISAによって定量されたマウスリポカリン2およびカルプロテクチンのレベルを示す。SYN363はコントロールSYN94と比較して炎症を軽減し、および/または消化管バリア機能を保護する。
【図２８Ａ】ATCまたは酸化窒素誘導性レポーター構築物を示す。これらの構築物は、それらの同族の誘導因子によって誘導されるとき、GFPの発現を導く。コントロール、ATC-誘導性Ptet-GFPレポーター構築物または酸化窒素誘導性PnsrR-GFPレポーター構築物のいずれかを有するプラスミドを伴うNissle（ニッスル）細胞は、ある範囲の濃度にわたって誘導された。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表される。
【図２８Ｂ】図28Aと同様である。
【図２８Ｃ】図28Aと同様である。
【図２９】構成的プロモーターの制御下でNsrRを発現するプラスミド、およびNsrR誘導性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子gfp（緑色蛍光タンパク質）を伴う細菌のドットブロットを示す。IBDは2-3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を有する飲用水を補充することによってマウスにおいて誘導される。化学発光は、DSS処理マウスにおいて誘導されたNsrR調節プロモーターについて示される。
【図３０】NsrR、norBからの調節配列、およびブチロジーニック（butyrogenic）遺伝子カセット（pLogic031-nsrR-norB-ブチラート構築物）をコードする遺伝子を含む模範的なプラスミドの構築物および遺伝子編成を示す。
【図３１】NsrR、norBからの調節配列、およびブチロジーニック遺伝子カセット（pLogic046-nsrR-norB-ブチラート遺伝子カセット）をコードする遺伝子を含む別の模範的なプラスミドの構築物および遺伝子構成を示す。
【図３２】SYN001 + tet（プラスミドを含まないコントロール野生型Nissle）、SYN067 + tet（pLOGIC031 ATC誘導性ブチラートプラスミドを含むNissle）、およびSYN080 + tet（pLOGIC046 ATC-誘導性ブチラートプラスミドを含むNissle）を用いるブチラート生成を示す。
【図３３】pLogic031-nsrR-norB-ブチラート構築物（SYN133）またはpLogic046-nsrR-norB-ブチラート構築物（SYN145）を含み、野生型Nissle（SYN001）と比較してより一層多くのブチラートを生成する遺伝学的に操作されたNissleによるブチラート生成を示す。
【図３４】oxySプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（pLogic031-oxyS-ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む模範的なプラスミドの構築物および遺伝子構成を示す。
【図３５】oxySプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（pLogic046-oxyS-ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む別の模範的なプラスミドの構築物および遺伝子構成を示す。
【図３６】必須遺伝子tnaB、5-メチルテトラヒドロフォラート-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（mtr）、トリプトファントランスポーター、およびトリプトファンをキヌレニンに変換するための酵素IDOおよびTDOを発現するように遺伝学的に操作されたE. coliの概略図を示す。
【図３７】FNR応答性プロモーターの制御下でインターロイキンを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図３８】FNR応答性プロモーターの制御下でSODを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図３９】FNR応答性プロモーターの制御下でGLP-2を発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図４０】FNR応答性プロモーターの制御下でプロピオナート遺伝子カセットを発現するように遺伝学的に操作されたE. coliの概略図を示す。
【図４１】FNR応答性プロモーターの制御下でブチラートを発現するように遺伝学的に操作されたE. coliの概略図を示す。
【図４２】FNR応答性プロモーターの制御下で、キヌレニン、インターロイキン、SOD、GLP-2、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図４３】FNR応答性プロモーターの制御下で、インターロイキン、OSD、GLP-2、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE.coliの模式図を示す。
【図４４】FNR応答性プロモーターの制御下で、SOD、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現ように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図４５】FNR応答性プロモーターの制御下で、インターロイキン、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現ように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含むE. coliの概略図を示す。
【図４６】FNR応答性プロモーターの制御下で、インターロイキン-10（IL-10）、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含む、E. coliの概略図を示す。
【図４７】FNR応答性プロモーターの制御下で、IL-2、IL-10、プロピオナート遺伝子カセット、およびブチラート遺伝子カセットを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含む、E. coliの概略図を示す。
【図４８】FNR応答性プロモーターの制御下で、IL-2、IL-10、プロピオナート遺伝子カセット、ブチラート遺伝子カセット、およびSODを発現するように遺伝学的に操作され、そしてさらにTAT分泌システムを含む、E. coliの概略図を示す。
【図４９】FNR応答性プロモーターの制御下で、IL-2、IL-10、プロピオナート遺伝子カセット、ブチラート遺伝子カセット、SOD、およびGLP-2を発現するように遺伝学的に操作され、そしてTAT分泌システムをさらに含む、E. coliの模式図を示す。
【図５０】E. coli 1917 Nissle染色体内の模範的な組込み部位の地図を示す。これらの部位は、必須の遺伝子発現を妨げることなく、サーキット構成要素が染色体に挿入されうる領域を示す。バックスラッシュ（/）は発散的または収束的に発現した遺伝子の間に挿入が起こることを示すために使用される。生合成遺伝子、たとえば、thyAなどのようなもの内への挿入は、ニュートリエント栄養要求体を作り出すのに有用であることができる。いくつかの実施態様では、個々の回路構成要素は示された部位の一よりも多くに挿入される。
【図５１】複数の作用機序（MoAs）を含むE. coli 1917 Nissle染色体の模範的な概略図を示す。
【図５２】IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、プロピオナートおよびブチラートを生成するための複数の作用機序を含む、E. coli 1917 Nissle染色体の模範的な概略図を示す。
【図５３】IL-10、IL-27、GLP-2、およびブチラートを生成するための複数の作用機序を含む、E. coli 1917 Nissle染色体の模範的な概略図を示す。
【図５４】GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、ブチラート、およびプロピオナートを生成するための複数の作用機序を含む、E. coli 1917 Nissle染色体の模範的な概略図を示す。
【図５５】GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、ブチラート、およびプロピオナートを生成するための複数の作用機序を含む、E. coli 1917 Nissle染色体の模範的な概略図を示す。
【図５６】強制飼養（胃管栄養法とも言う）後の24時間および48時間に検出された、マウス消化管における様々なアミノ酸栄養要求体の生存を示す表である。これらの栄養要求体はBW25113でE. coliのNissle株ではないものを用いて生じさせた。
【図５７】抑制ベースの（抑制系とも言う）キルスイッチの概略図を示す。毒素ベースのシステムでは、AraC転写因子はアラビノースの存在下で活性化され、そしてTetRおよび抗毒素の発現を誘導する。TetRは毒素の発現を妨げる。アラビノースが除去されるとき、TetRおよび抗毒素が作られず、および細胞を殺傷する毒素が生成される。必須の遺伝子ベースのシステムでは、AraC転写因子はアラビノースの存在下で活性化され、および必須遺伝子の発現を誘導する。
【図５８】本開示の別の非制限的な実施態様を示し、そこでは異種遺伝子の発現が外因性環境シグナル、例は、低酸素条件によって活性化される。アラビノースが存在しない場合、AraC転写因子は転写を抑えるコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下では、AraC転写因子はそれがaraBADプロモーターに結合してこれを活性化し、TetR（tet抑制因子（tetリプレッサーとも言う））および抗毒素の発現を誘導することを可能にする構造変化を受ける。抗毒素は組換え細菌細胞中に蓄積するが、TetRは毒素（これはTetR結合部位を有するプロモーターの制御下にあり）の発現を妨げる。しかしながら、アラビノースが存在しないとき、抗毒素およびTetRの双方は発現されない。TetRは毒素の発現を抑えるために存在しないので、毒素は発現され、および細胞を殺す。図58はまた、本開示の別の非制限的な実施態様を示し、そこでは組換え細菌に見出されない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される。アラビノースが存在しない場合、AraC転写因子は、araBADプロモーターの制御下で必須遺伝子の転写を抑えるコンフォメーションを採用し、および細菌細胞は生き残ることができない。アラビノースの存在下で、AraC転写因子は、それが、araBADプロモーターに結合し、およびこれを活性化させ、必須遺伝子の発現を誘導し、および細菌細胞の生存能力を維持するコンフォメーション変化を受ける。
【図５９】本開示の非制限的な実施態様を示し、それは抗毒素が構成的プロモーターから発現され、および異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される。アラビノースが存在しない場合、AraC転写因子は転写を抑えるコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下では、AraC転写因子はそれがaraBADプロモーターに結合してこれを活性化し、TetRの発現を誘導して、それによって毒素の発現を防止されることを可能にするコンフォメーション変化を受ける。しかし、アラビノースが存在しない場合、TetRは発現せず、および毒素は発現して、最終的に抗毒素を克服し、細胞を殺す。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を促進するプロモーターよりも弱いプロモーターであるべきである。このサーキットでは、araC遺伝子は構成的プロモーターの制御下にある。
【図６０】抑制ベースのキラースイッチの概略図を示し、そこで、AraC転写因子がアラビノースの存在下で活性化され、およびTetRおよび抗毒素の発現を誘導する。TetRは毒素の発現を妨げる。アラビノースが除去されるとき、TetRおよび抗毒素は作られず、そして細胞を殺す毒素が生成される。
【図６１】本開示の別の非制限的な実施態様を示し、そこでは異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される。アラビノースが存在しない場合、AraC転写因子は転写を抑えるコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、AraC転写因子は、それがaraBADプロモーターに結合してこれを活性化することを可能にする構造変化を受け、これはTetR（tet抑制因子）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は組換え細菌細胞中に蓄積するが、一方でTetRは毒素（これはTetR結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しないとき、抗毒素およびTetRの双方とも発現されない。 TetRは毒素の発現を抑えるために存在しないので、毒素は発現され、そして細胞を殺す。このサーキットにおいて、araC遺伝子は構成的プロモーターの制御下にある。
【図６２】本開示の一つの非制限的な実施態様を示し、そこでは外因性環境条件、例は、低酸素条件、または一以上の環境シグナルは、異種遺伝子および誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター群からの少なくとも一のリコンビナーゼの発現を活性化する。次いで、リコンビナーゼは、毒素遺伝子を活性化コンフォメーションにフリップし、およびリコンビナーゼの自然な動力学（natural kinetics）は、毒素の発現における時間遅延を作り出し、異種遺伝子が完全に発現されることを可能にする。一旦毒素が発現されると、それは細胞を殺す。
【図６３】本開示の別の非制限的な実施態様を示し、そこでは外因性環境条件、例は、低酸素条件、または一以上の環境シグナルは、異種遺伝子、抗毒素、および誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター群由来の少なくとも一のリコンビナーゼの発現を活性化する。次いで、リコンビナーゼは、毒素遺伝子を活性化コンフォメーションにフリップするが、蓄積された抗毒素の存在は毒素の活性を抑える。一旦外因性の環境条件またはキュー（合図とも言う）（群）がもはや存在しなくなれば、抗毒素の発現は停止される。毒素は構成的に発現され、蓄積し続け、および細菌細胞を死滅させる。
【図６４】本開示の別の非制限的な実施態様を示し、そこでは外因性環境条件、例は、低酸素条件、または一以上の環境シグナルが異種遺伝子および誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター群からの少なくとも一のリコンビナーゼの発現を活性化する。次いで、リコンビナーゼは、少なくとも一の切除酵素を活性化コンフォメーションにフリップする。次いで、少なくとも一の切除酵素は、一以上の必須遺伝子を切除し、老化、および最終的な細胞死をもたらす。リコンビナーゼおよび切除遺伝子の自然な動力学は時間遅延を引き起こし、その動力学は切除される必須遺伝子の数および選定に依存して変動し、および最適化され、数時間または数日もしないうちに細胞死が起こる。複数のネステッド（入れ子状態とも言う）リコンビナーゼの存在を用いて、細胞死のタイミングをさらに制御することができる。
【図６５】活性化ベースのキルスイッチの概略図を示し、そこでは、Piは任意の誘導性プロモーター、例は、FNR応答性プロモーターである。治療用物質が誘発されるとき、抗毒素およびリコンビナーゼが作動し、それは毒素が4-6時間後にON位置に「フリップ」されることになり、それは毒素が発現される前に抗毒素の蓄積をもたらす。誘導シグナルがない場合、毒素だけが作られ、そして細胞は死ぬ。
【図６６】本開示の一つの非制限的な実施態様を示し、そこでは遺伝学的に操作された細菌が同量のHok毒素および短寿命のSok抗毒素を産生する。細胞がプラスミドを失うとき、抗毒素が損なわれ、そして細胞が死ぬ。上部パネルでは、細胞は等しい量の毒素および抗毒素を産生し、そして安定である。中央のパネルでは、細胞はプラスミドを失い、抗毒素は損なわれ始める。下部のパネルでは、抗毒素は完全に損なわれ、そして細胞は死ぬ。
【図６７】操作された安全成分としてのGeneGuard（ジーン・ガード）の使用を示す。すべての操作されたDNAは、条件付きで破壊されることができるプラスミド上に存在する。例は、Wright（ライト）ら、2015を参照。
【図６８】細菌が分泌された治療用タンパク質を消化管内腔に注入することを可能にするための修飾された3型分泌システム（T3SS）を示す。誘導性プロモーター（小さな矢印、上部）、例は、FNR応答性プロモーターは細胞からタグ化ペプチドを分泌する装置を産生するT3分泌システム遺伝子カセット（3つの大きな矢印、上部）の発現を駆動する。誘導性プロモーター（小さな矢印、下部）、例は、FNR応答性プロモーターは調節因子、例は、T7ポリメラーゼの発現を駆動し、それは次いでタグ化された治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する。
【図６９】鞭毛タイプIII（鞭毛III型とも言う）分泌に基づく分泌システムの概略図を示し、そこでは、不完全な鞭毛が使用されて興味がある治療用ペプチド（スター）がペプチドをN末端鞭毛分泌シグナルに組換え的に融合させることにより分泌され、その結果、細胞内で発現されたキメラペプチドを内膜および外膜を介して周囲の宿主環境に流動させることができる。
【図７０】組換えタンパク質の細胞外生産のためのタイプV分泌システムの概略図を示し、そこでは、治療用ペプチド（スター）をN末端分泌シグナル、リンカーおよびオートトランスポーターのベータドメインに融合させることができる。このシステムにおいて、N末端シグナル配列はタンパク質をSecA-YEG機構に導き、それによりタンパク質が内膜を通ってペリプラズムに移動し、続いてその後シグナル配列が開裂される。ベータドメインはBam複合体に補充され、そこで、ベータドメインが折り畳まれ、およびベータ-バレル構造として外膜に挿入される。次いで、治療上のペプチドは、リンカー配列の前にベータ-バレル構造の中空細孔を貫通する。治療上のペプチドは、自己触媒的開裂によって、または膜結合ペプチダーゼ（はさみ）をリンカー中の相補的プロテアーゼ切断部位に標的化することによって、リンカーシステムから解放される。
【図７１】タイプI分泌システムの概略図を示し、それはHlyB（ATP結合カセットトランスポーター）；HlyD（膜融合タンパク質）；およびTolC（外膜タンパク質）を用い、内膜および外膜の双方を通してチャネルを形成し、パッセンジャーペプチドを直接的に細胞質から細胞外空間に移行させる。HlyAの分泌シグナル含有C末端部分は、このペプチドの分泌を媒介するために、治療上のペプチド（スター）のC末端部分に融合される。
【図７２】野生型clbA構築物（上側のパネル）の概略図およびclbAノックアウト構築物（下側のパネル）の概略図を示す。
【図７３】野生型clbA構築物およびclbAノックアウト構築物の模範的な配列を示す。
【図７４】炎症性好中球およびマクロファージおよび調節性T細胞（Treg）を標的とし、上皮バリアの完全性を回復し、および粘膜バリア機能を維持する炎症性腸疾患（IBD）療法についての概略図を示す。好中球およびマクロファージの炎症促進性（前炎症性とも言う）作用（pro-inflammatory action、前炎症作用とも言う）を減少させ、およびTregを増加させることで、上皮バリアの完全性および粘膜バリアが回復する。
【図７５】本開示の遺伝学的に操作された細菌を設計および生産するための非制限的なプロセスの概略図を示し：微生物生理学および疾患生物学（disease biology）に基づく多様な候補アプローチを識別すること、バイオインフォマティクスを用いて候補代謝経路を決定すること、最適化された人工合成バイオティクスに要求される性能標的を決定するためのプロスペクティブなツール（A）；経路構成の組合せ試験を可能にするための最先端のDNAアセンブリー、経路効率を予測するための数学的モデル、専用スイッチの内部安定性、および設計された回路の制御および調整を可能にする部品（B）；コア構造の構築（「シャシー」）、効率的な発現用に設計された回路を最適な染色体位置に安定的に組み込むこと、遺伝学的回路の忠実度および活性を評価するためのユニークな機能アッセイを採用すること（C）；動物モデルにおける合成生物学的局在および通過時間のモニタリングを可能にする染色体マーカー、特定の疾患状態がどのようにGI微生物フローラおよびその環境における合成生物学の挙動に影響を与えるかの理解を拡大する専門マイクロバイオームネットワークおよびバイオインフォマティクスサポート、プロセス開発研究および最適化の室内での発見段階中の活性化が開発候補の前臨床進行への迅速で滑らかな移行を可能にし、特定の疾患動物モデルサポートでの広範囲の経験が堅実で高品質な試験をサポートすること（D）である。
【図７６】本開示の遺伝学的に操作された細菌の上流および下流の生産のための非制限的な製造プロセスの概略図を示す。Aはスターター培養1（SC1）についてパラメータを示し：ループフルグリセロールストック、一晩の持続時間、温度37℃、250rpmで振とうである。Bはスターター培養2（SC2）についてパラメータを示し：SC1から1/100希釈、1.5時間の継続、温度37℃、250rpmで振とうである。Cは、バイオリアクター生産についてパラメータを示し：接種物-SC2、温度37℃、pH設定点7.00、pH不感帯0.05、溶存酸素設定点50％、溶存酸素カスケード撹拌/ガスFLO、撹拌限界300-1200rpm、ガスFLO限界毎分0.5-20標準リットル、継続時間24時間である。Dは収集についてパラメータを示し：4000rpmの速度および継続時間30分間の遠心分離、1×10％グリセロール/PBSの洗浄、遠心分離、10％グリセロール/PBSの再懸濁である。Eは、バイアル充填/保存についてパラメータを示し：1-2mLアリコート、-80℃である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下は実施態様の説明である。
本開示は、遺伝学的に操作された細菌、その製薬上組成物、ならびに消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および/または自己免疫障害を処置または防止する方法を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的操作細菌には、ノンネイティブな（非自然なとも言う）抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成するための少なくとも一の非自然遺伝子および/または遺伝子カセットが含まれる。少なくとも一の遺伝子および/または遺伝子カセットは、誘発性条件、例は、低酸素環境、ROSの存在、またはRNSの存在を感知することが可能な転写因子によって制御される調節領域にさらに作動可能に連結される。遺伝学的に操作細菌は、誘導性環境、例は、消化管内で抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成することが可能である。したがって、遺伝学的に操作された細菌およびそれらの細菌を含む製薬上組成物は、自己免疫障害および/または消化管炎症および/またはIBDを含む消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態を処置または防止するために使用されうる。
【００１２】
本開示がより一層容易に理解されうるように、一定の用語を最初に規定する。これらの規定は、開示の残りの部分に照らして、またこの技術において熟練した技量の者（当業者とも言う）に理解されるように読まれるべきである。他に規定されない限り、ここで使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって不通に理解されるのと同じ意味を有する。追加の規定は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
【００１３】
ここに使用されるように、「消化管炎症および/または消化管バリア機能低下に関連する疾患および状態」には、制限されないが、炎症性腸疾患、下痢性疾患、および関連疾患が含まれる。「炎症性腸疾患」および「IBD」は、ここにおいて互換的に使用され、消化管炎症に関連する疾患の群に言及し、これには、制限されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（diversion colitis）、ベーチェット病、および不確定な大腸炎（indeterminate colitis）が含まれる。ここに使用されるように、「下痢性疾患」には、制限されないが、急性水様性下痢、例は、コレラ；急性血性下痢、例は、赤痢；持続性下痢が含まれる。ここに使用されるように、関連疾患には、制限されないが、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎が含まれる。
【００１４】
上記の疾患および状態に関連する症状には、制限されないが、下痢、血便、口内炎（mouth sores、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（delayed pubertal development）、皮膚の炎症、目の炎症、関節の炎症、肝臓の炎症、および胆管の炎症の一以上が含まれる。
【００１５】
消化管炎症および/または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害でありうる。消化管炎症および/または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害と併発する（co-morbid with）可能性がある。ここに使用されるように、「自己免疫障害」には、制限されないが、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ADEM）、急性壊死性出血性白質脳炎（acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis）、アジソン病（Addison's disease）、無ガンマグロブリン（アガンマグロブリンまたはアマガングロブリンとも言う）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（axonal & neuronal neuropathies）、バロー病（Balo disease）、ベーチェット病（Behcet’s disease）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（cardiomyopathy、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（CIDP）、慢性再発性多発性骨髄炎（chronic recurrent multifocal ostomyelitis、慢性再発性多巣性耳状骨症）（CRMO）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Churgus disease）、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST疾患（CREST病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症とも言う）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性とも言う）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病とも言う）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎とも言う）、円板状ループス（円板状狼瘡とも言う）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（immunoregulatory lipoproteins）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状IgA病（LAD）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（MCTD）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ocular cicatricial pemphigoid）、視神経炎、パリンドロー��リウマチ（回帰性リウマチ）、PANDAS（Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型およびIII型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（postmyocardial infarction syndrome）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Raynauds phenomenon）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（UCTD）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症が含まれる。
【００１６】
ここに使用されるように「抗炎症分子」および/または「消化管バリア機能エンハンサー分子」は、制限されないが、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート（酢酸塩、アセテートとも言う）、IL-2、IL-22、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、キヌレニン、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-アシルホスファチジルエタノールアミン（NAPEs）、エラフィン（またペプチダーゼインヒビター3およびSKALPとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、PGD2、およびキヌレン酸、ならびにここに開示される他の分子が含まれる。そのような分子はまた、炎症促進分子を抑制する化合物、例は、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、および/またはケモカイン、例は、CXCL-8およびCCL2を中和する単鎖可変フラグメント（scFv）、アンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAを含むこともできる。ある分子は、主として抗炎症剤、例は、IL-10、または主に消化管バリア機能増強性、例は、GLP-2でありうる。ある分子は抗炎症性および消化管バリア機能増強性の双方であることができる。抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、単一遺伝子によってコードされてもよく、例は、エラフィンはPI3遺伝子によってコードされる。あるいはまた、消炎および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路、例は、ブチラートによって合成されてよい。これらの分子はまた、治療上の分子と称されうる。
【００１７】
ここに使用されるように、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、ここに説明される抗炎症および消化管バリア機能増強性分子、例は、IL-2、IL- 22、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、キヌレニン、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-アシルホスファチジルエタノールアミン（NAPE）、エラフィンおよびトレフォイル因子、ならびにその他のいずれかをコードする核酸配列に言及することを意味する。核酸配列には、遺伝子配列の全体または機能的分子をコードする部分的な遺伝子配列が含まれうる。核酸配列は、自然配列または合成配列であってもよい。核酸配列には、自然型または野生型配列が含まれてよく、または一以上の挿入、欠失、置換、または他の修飾を有する修飾配列が含まれてよく、たとえば、核酸配列はコドン最適化されうる。
【００１８】
ここに使用されるように、生合成経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロン」は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子、例は、ブチラート、プロピオナート、およびアセタートを生成するために必要とされる二以上の遺伝子に言及する。前記分子を生成可能な遺伝子のセットをコードすることに加え、遺伝子カセットまたはオペロンにはまた、追加的な転写および翻訳要素、例は、リボソーム結合部位も含まれうる。
【００１９】
ここに使用されるように、「ブチロジーニック遺伝子カセット」および「ブチラート生合成遺伝子カセット」は、生合成経路においてブチラートを生成することが可能な遺伝子のセットを指すために交換可能に使用される。内因性ブチラート生合成経路を介してブチラートを生成することができる未修飾細菌には、制限されないが、Clostridium（クロストリジウム属）、Peptoclostridium（ペプトクロスジウム属）、Fusobacterium（フソバクテリウム属）、Butyrivibrio（ブチリビブリオ属）、Eubacterium（ユーバクテリウム属）、およびTreponema（トレポネマ属）が含まれ、およびこれらの内因性ブチラート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌について遺伝子の供給源でありうる。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株（substrain、亜系とも言う）由来のブチラート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および/または亜株由来のブチラート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。ブチロジーニック遺伝子カセットには、たとえば、Peptoclostridium difficile（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）〔Clostridium difficile（クロストリジウム・ディフィシル）とも称される〕由来のブチラート生成経路の八つの遺伝子：bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbukを含むことができ、それらはブチリル-CoAデヒドロゲナーゼサブユニット、電子伝達フラボタンパク質サブユニットベータ、電子伝達フラボタンパク質サブユニットアルファ、アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ、およびブチラートキナーゼをそれぞれコードする〔Aboulnaga（アブルナガ）ら、2013〕。ブチラート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されてもよく、例は、コドン最適化される。Peptoclostridium difficile（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）菌株630および菌株1296はいずれもブチラートを生成することができるが、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbukについて異なる核酸配列を含む。ブチロジーニック遺伝子カセットには、Peptoclostridium difficile菌株630由来のbcd2、etfB3、etfA3、およびthiA1を、およびPeptoclostridium difficile菌株1296由来のhbd、crt2、pbt、およびbukを含むことができる。あるいはまた、Treponema denticola由来の単一遺伝子（ter、トランス2-エノイル-CoAレダクターゼをコードする）は、Peptoclostridium difficile由来のbcd2、etfB3、およびetfA3の遺伝子の三つすべてを機能的に置換することができる。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、Peptoclostridium difficile由来のthiA1、hbd、crt2、pbt、およびbukを、およびTreponema denticola由来のterを含むことができる。あるいはまた、Escherichia Coli（エシェリキア・コリ）からのtesB遺伝子の付加は、Peptoclostridium difficile由来のpbtおよびbuk遺伝子を機能的に置換することができる。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、Peptoclostridium difficile由来のthiA1、hbd、およびcrt2を、Treponema denticola由来のterを、およびEscherichia ColiからのtesBを含むことができ、たとえば、Peptoclostridium difficile菌株630由来のthiA1、Peptoclostridium difficile菌株1296由来のhbdおよびcrt2、Treponema denticola由来のterおよびEscherichia ColiからのtesBである。ブチロジーニック遺伝子カセットは、ブチラートの好気性生合成のための遺伝子および/またはブチラートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含みうる。ブチラート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されていてもよく、たとえば、コドン最適化されていてもよい。模範的なブチラート遺伝子カセットを図1、3、4、5、6、7、および8に示す。
【００２０】
ここに使用されるように、「プロピオナート遺伝子カセット」および「プロピオナート生合成遺伝子カセット」は、生合成経路においてプロピオナートを生成可能な遺伝子のセットに言及する。内在性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる未修飾細菌には、制限されないが、Clostridium propionicum（クロストリジウム・プロピオニカム）、Megasphaera elsdenii（メガスファエラ・エルスデニイ）、およびPrevotella ruminicola（プレボテーラ・ルミニコーラ）が含まれ、これらの内在性プロピオナート生合成経路は、本発明の遺伝子的に操作された細菌について遺伝子の供給源でありうる。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および/または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含みうる。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アクリラート経路のプロピオナート生合成遺伝子、例は、pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、およびacrCを含み、それらは、プロピオナートCoA-トランスフェラーゼ、ラクトイル-CoAデヒドラターゼA、ラクトイル-CoAデヒドラターゼB、ラクトイル-CoAデヒドラターゼC、電子伝達フラボタンパク質サブユニットA、アクリロイル-CoAレダクターゼB、およびアクリロイル-CoAレダクターゼCをそれぞれコードする〔Hetzel（エッツェル）ら、2003、Selmer（セルマー）ら、2002〕。代わりの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、ピルバート経路プロピオナート生合成遺伝子〔例は、Tseng（ツェン）ら、2012参照〕、例は、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、およびlpdを含み、それらは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ1、ホモセリンキナーゼ、L-スレオニンシンターゼ、L-スレオニンデヒドラターゼ、ピルバートデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ、およびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アシル-CoAチオエステラーゼをコードするtesBをさらに含む。プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および/またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含みうる。プロプリオナート（proprionate）生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されていてもよく、たとえば、コドン最適化である。例示的なプロピオナート遺伝子カセットを図9、11、および13に示す。
【００２１】
ここに使用されるように、「アセタート遺伝子カセット」および「アセタート生合成遺伝子カセット」は、生合成経路においてアセタート（アセテート、酢酸塩、酢酸とも言う）を生成することができる遺伝子のセットに言及する。細菌は、たとえば、セルロース、リグニン、および無機ガスなどのような様々な基質を含む多数の炭素源およびエネルギー源からアセタートを合成し、および当技術で知られる異なる生合成メカニズムおよび遺伝子を利用する〔Ragsdale（ラグスデール）、2008〕。内在性アセタート生合成経路を介してアセタートを生成することができる未修飾細菌は、本発明の遺伝学的に操作された細菌のためのアセタート生合成遺伝子の供給源でありうる。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のアセタート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および/または亜株由来のアセタート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。Escherichia coli（エシェリキア・コリ）は、好気的増殖の間にグルコースおよび酸素を消費してアセタートおよび二酸化炭素を生成することができる〔Kleman（クレマン）ら、1994〕。いくつかの細菌、たとえば、Acetitomaculum（アセチトマクラム属）、Acetoanaerobium（アセトアナエロビウム属）、Acetohalobium（アセトハロビウム属）、Acetonema（アセトネマ属）、Balutia（ブラウティア属）、Butyribacterium（ブチリバクテリウム属）、Clostridium（クロストリジウム属）、Moorella（モーレラ属）、Oxobacter（オキソバクター属）、Sporomusa（スポロミュサ属）、およびThermoacetogenium（サーモアセトゲニウム属）などのようなものは、例は、Wood-Ljungdahl pathway（ウッド-ユングダール経路）を使用して、COまたはCO2+H2をアセタートに変換することができるアセトジーニック嫌気性菌である〔Schiel-Bengelsdorf（シーレ-ベンゲルスドルフ）ら、2012〕。種々の細菌種のためのWood-Ljungdahl pathwayの遺伝子が当技術で知られる。アセタート遺伝子カセットはアセタートの好気性生合成のための遺伝子および/またはアセタートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含んでよい。アセタート生合成遺伝子の一以上は機能的に置換または修飾されてよく、たとえば、コドン最適化される。アセタート遺伝子カセットの例をここに記載する。
【００２２】
各遺伝子配列および/または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在してもよい。操作された細菌が一以上の遺伝子配列（群）および一以上の遺伝子カセットを含む実施態様では、遺伝子配列（群）は一以上のプラスミド上に存在することができ、および遺伝子カセット（群）は細菌染色体において存在してよく、およびまたその逆である。さらに、任意の遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーが細菌に存在してもよく、そこでは遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の一以上のコピーは、ここに記載されるように変異または他の方法で変動してもよい。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、コピー数を増強するために、同じ遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーを含むように操作される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる構成要素を含むように操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、一よりも多くの治療上の分子を発現し、および/または一よりも多くの機能を行う操作された細菌を生成するために、異なる遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の一以上のコピーを含むように操作される。
【００２３】
各遺伝子または遺伝子カセットは、誘導性プロモーター、例は、FNR応答性プロモーター、ROS応答性プロモーター、および/またはRNS応答性プロモーターに作動可能に連結されうる。「誘導性プロモーター」は、遺伝子（群）の発現が前記調節領域のインデューサー（誘導物質とも言う）の存在下で増加する、一以上の遺伝子に作動可能に連結された調節領域に言及する。
【００２４】
ここに使用するように「直接誘導性プロモーター」は、調節領域が、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子、例は、ブチラートを生成するための生合成経路をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される調節領域に言及する。前記調節領域の誘導物質の存在下で、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子が発現される。「間接誘導性のプロモーター」は、二以上の調節領域、たとえば、第一の分子をコードする遺伝子、例は、転写因子に作動可能に連結される第一の調節領域を含む調節システムに言及し、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子、例は、ブチラート（または他の抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子）を生成するための生合成経路をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される第二の調節領域を調節可能である。第一の調節領域の誘導物質の存在下で、第二の調節領域を活性化または抑制し、それにより、ブチラート（または他の抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子）の生成が活性化または抑制される。直接誘導性プロモーターおよび間接誘導性プロモーターの双方が「誘導性プロモーター」によって包含される。
【００２５】
ここに使用されるように、「作動可能に連結される」とは、核酸配列、例は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を生成するための遺伝子または遺伝子カセットに言及し、それは、調節領域配列に、核酸配列の発現を許す、例は、シスで作用するマナーで接合する。調節領域は、興味がある遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、およびプロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター調節エレメント、タンパク質結合配列、5'および3'非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンが含まれる。
【００２６】
ここに使用されるように、「外因性環境条件」は、ここに記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定または状況に言及する。語句「外因性環境条件」は、細菌に対する外的環境条件であるが、しかし哺乳動物対象に対して内在性または自然であるものに言及することを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳動物本体に対して内因性であるが、しかし細菌細胞の外部または外因性である環境条件に言及するために交換可能に使用されうる。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の上部胃腸管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の下部胃腸管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件はROSが存在する環境である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件はRNSが存在する環境である。
【００２７】
いくらかの実施態様では、外因性環境条件は、低酸素または嫌気性条件、たとえば、哺乳動物消化管の環境などのようなものである。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は、健常状態または疾患状態の哺乳動物消化管に特異的な分子または代謝物、例は、プロピオナートの存在に言及する。いくらかの実施態様では、治療上の分子を生成するための遺伝子または遺伝子カセットは酸素レベル依存プロモーターに動作可能に連結される。細菌は酸素レベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるシグナル伝達経路は異なる酸素レベルによって誘発され、および異なる動態で起こる可能性がある。ここに使用される「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、一以上の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは、対応する転写因子の結合および/または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。
【００２８】
いくらかの実施態様において、治療上の分子を生成するための遺伝子または遺伝子カセットは、治療上の分子が低酸素、微好気性、または嫌気性条件で発現されるように、酸素レベル依存性調節領域に作動可能に連結される。たとえば、酸素レベル依存性調節領域は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）（例は、ここに記載の遺伝子群のいずれか）に作動可能に連結され；低酸素状態において、酸素レベル依存性調領域は、対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それによって、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）の発現を促進する。酸素レベル依存性転写因子の例には、制限されないが、FNR、ANR、およびDNRが含まれる。対応するFNR応答性プロモーター、ANR応答性プロモーター、およびDNR応答性プロモーターは、当該技術で知られる〔例は、Castiglione（カスティリオーネ）ら、2009；Eiglmeier（アイルメイアー）ら、1989；Galimand（ガリマン）ら、1991；Hasegawa（ハセガワ）ら、1998；Hoeren（フェーレン）ら、1993；Salmon（サモン）ら、2003〕であり、および、非制限的な例を表1に示す。
【表１】
2018512841.tif 000003
【００２９】
ここに使用されるように、「反応性窒素種」および「RNS」は、分子状窒素に由来する高活性分子、イオン、および/またはラジカルに言及するために交換可能に使用される。RNSは、たとえば、ニトロソ化ストレスなどのような細胞の有害作用を引き起こす可能性がある。RNSには、制限されないが、一酸化窒素（NO・）、ペルオキシナイトライト（過酸化亜硝酸）またはペルオキシナイトライトアニオン（ONOO-）、二酸化窒素（・NO2）、三酸化二窒素（N2O3）、ペルオキシ亜硝酸（ONOOH）、およびニトロペルオキシカーボネート（ONOOCO2-）が含まれる（・によって示される不対電子）。細菌は、RNSレベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるRNSシグナル伝達経路は異なるRNSレベルによって誘発され、および異なる動態で起こる。
【００３０】
ここに使用されるように、「RNS誘導性調節領域」は、対応する転写因子の結合および/または活性化が下流遺伝子発現を活性化する、一以上のRNS感受性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し；RNSの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、および/または調節領域を活性化する。いくらかの実施態様では、RNS誘導性調節領域はプロモーター配列を含む。いくらかの実施態様では、転写因子はRNSを感知し、および続いてRNS誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現を活性化する。代わりの実施態様では、転写因子はRNSの不存在下にRNS誘導性調節領域に結合し；RNSの存在下、転写因子はコンフォメーション変化を受け、それによって下流の遺伝子発現を活性化する。RNS誘導性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）、例は、ここに記載の遺伝子のいずれかに作動可能に連結されうる。たとえば、RNSの存在下、転写因子はRNSを感知し、および対応するRNS誘導性調節領域を活性化し、それによって、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットの発現が促進される。したがって、RNSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。
【００３１】
ここに使用されるように、「RNS抑制解除性（RNS-derepressible）調節領域」は一以上のRNS感受性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制し；RNSの存在下、転写因子は調節領域に結合せず、および調節領域を抑制しない。いくらかの実施態様において、RNS抑制解除性調節領域はプロモーター配列を含む。RNS抑制解除性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）に作動可能に連結されうる。たとえば、RNSの存在下、転写因子はRNSを感知し、およびもはや調節領域に結合せず、および/または抑制せず、それによって作動可能に連結する遺伝子配列または遺伝子カセットが抑制解除される。したがって、RNSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
【００３２】
ここに使用されるように、「RNS抑制性調節領域」は一以上のRNS感受性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは対応する転写因子の結合が下流遺伝子発現を抑制し；RNSの存在下、転写因子は調節領域に結合し、および調節領域を抑制する。いくらかの実施態様では、RNS抑制性調節領域はプロモーター配列を含む。いくらかの実施態様においては、RNSを感知する転写因子はプロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、RNSを感知する転写因子はプロモーター配列の上流または下流にあたる調節領域に結合することができる。RNS抑制性調節領域は遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結されうる。たとえば、RNSの存在下、転写因子はRNSを感知し、および対応するRNS抑制性制御領域に結合し、それによって作動可能に連結される遺伝子配列または遺伝子カセットの発現がブロックされる。したがって、RNSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
【００３３】
ここに使用されるように、「RNS応答性調節領域」はRNS誘導性調節領域、RNS抑制性制御領域、および/またはRNS抑制解除性調節領域に言及する。いくらかの実施態様では、RNS応答性調節領域はプロモーター配列を含む。各調節領域は少なくとも一の対応するRNS感知性転写因子に結合することができる。RNSおよびそれらの対応するRNS応答性遺伝子、プロモーター、および/または調節領域を感知する転写因子の例には、制限されないが、表2に示すものが含まれる。
【表２】
2018512841.tif 000004
【００３４】
ここに使用されるように、「活性酸素種」および「ROS」は、分子状酸素から誘導される高度に活性な分子、イオン、および/またはラジカルに言及するために交換可能に使用される。ROSは、好気性呼吸または金属触媒酸化の副産物として生成することができ、およびたとえば、酸化的損傷などのような有害な細胞作用を引き起こす可能性がある。ROSには、制限されないが、過酸化水素（H2O2）、有機過酸化物（ROOH）、ヒドロキシルイオン（OH-）、ヒドロキシルラジカル（・OH）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（・O2-）、一重項酸素（1O2）、オゾン（O3）、カーボナートラジカル、ペルオキシドまたはペルオキシラジカル（・O2-2）、次亜塩素酸（HOCl）、次亜塩素酸イオン（OCl-）、次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）、一酸化窒素（NO・）、および過酸化亜硝酸（ペルオキシナイトライトとも言う）または過酸化亜硝酸アニオン（ONOO-）（不対電子は・で示す）が含まれる。細菌はROSレベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるROSシグナル伝達経路は異なるROSレベルによって誘発され、および異なる動態で起こる〔Marinho（マリニョ）ら、2014〕。
【００３５】
ここに使用されるように、「ROS誘導性調節領域」は一以上のROS感知性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは対応する転写因子の結合および/または活性化が下流遺伝子発現を活性化し；ROSの存在下、転写因子は調節領域に結合し、および/または調節領域を活性化する。いくらかの実施態様では、ROS誘導性調節領域はプロモーター配列を含む。いくらかの実施態様では、転写因子はROSを感知し、および続いてROS誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子はROSの不存在下、ROS誘導性調節領域に結合し；ROSの存在下、転写因子はコンフォメーション変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。ROS誘導性調節領域は遺伝子配列または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されうる。たとえば、ROSの存在下、転写因子、例は、OxyRがROSを感知し、および対応するROS誘導性調節領域を活性化し、それによって、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットの発現が駆動される。したがって、ROSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。
【００３６】
ここに使用されるように、「ROS抑制解除（脱抑制とも言う）性調節領域」は、一以上のROS感知性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制し；ROSの存在下、転写因子は調節領域に結合せず、および抑制しない。いくらかの実施態様において、ROS抑制解除性調節領域はプロモーター配列を含む。ROS抑制解除性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ここに記載されるブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）に作動可能に連結されうる。たとえば、ROSの存在下、転写因子、例は、OhrRは、ROSを感知し、およびもはや調節領域に結合せず、および/または抑制せず、それによって作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットが抑制解除される。したがって、ROSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
【００３７】
ここに使用されるように、「ROS抑制性調節領域」は一以上のROS感知性転写因子が結合することができる核酸配列に言及し、そこでは対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制し；ROSの存在下、転写因子は調節領域に結合し、および調節領域を抑制する。いくらかの実施態様では、ROS抑制性調節領域はプロモーター配列を含む。いくらかの実施態様においては、ROSを感知する転写因子はプロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ROSを感知する転写因子はプロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。ROS抑制性調節領域は遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結されうる。たとえば、ROSの存在下、転写因子、例は、PerRは、ROSを感知し、および対応するROS抑制性調節領域に結合し、それによって作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットの発現がブロックされる。したがって、ROSは遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
【００３８】
ここに使用されるように「ROS応答性調節領域」は、ROS誘導性調節領域、ROS抑制性調節領域、および/またはROS抑制解除性調節領域に言及する。いくらかの実施態様において、ROS応答性調節領域はプロモーター配列を含む。各調節領域は少なくとも一の対応するROS感知性転写因子に結合することができる。ROSおよびそれらの対応するROS応答性遺伝子、プロモーター、および/または調節領域を感知する転写因子の例には、制限されないが、表3に示すものが含まれる。
【表３】
2018512841.tif 000005
【００３９】
ここに使用されるように、「チューナブル（調整可能）調節領域」は転写因子の直接的または間接的コントロール下にある核酸配列に言及し、およびそれはインデューサーのレベルと比較して遺伝子発現を活性化、抑制、抑制解除、またはさもなければ制御することができる。いくらかの実施態様において、調整可能調節領域はプロモーター配列を含む。インデューサー（誘導物質とも言う）は、RNSまたはここに記載の他の誘導物質であってもよく、および調整可能調節領域はRNS応答性調節領域またはここに記載の他の応答性調節領域であってもよい。調整可能調節領域は、遺伝子配列（群）または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）に作動可能に連結されうる。たとえば、一の特定の実施態様では、調整可能調節領域はRNS抑制解除性調節領域であり、RNSが存在するとき、RNS感知性転写因子はもはや調節領域に結合せず、および/または調節領域を抑制せず、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現が可能である。この場合、調整可能調節領域は、RNSレベルと比較して遺伝子または遺伝子カセット発現を抑制解除する。各遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも一のRNSを感知することができる転写因子によって直接または間接にコントロールされる調整可能調節領域に作動可能に連結されうる。
【００４０】
ここに使用されるように、「非自然」核酸配列は、細菌に通常は存在しない核酸配列、例は、内因性配列の余分なコピー、または異種配列、たとえば、細菌の異なる種、株、または亜株、または同じサブタイプ（亜型とも言う）の細菌からの未修飾配列と比較して修飾され、および/または変異される配列に言及される。いくらかの実施態様では、非自然核酸配列は、合成、非自然発生配列である〔例は、Purcell（パーセル）ら、2013参照〕。非自然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットでの一以上の遺伝子でありうる。いくらかの実施態様では、「非自然」は、本質的にお互いに同じ関係では見出されない二以上の核酸配列に言及する。非自然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在しうる。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌において存在してもよく、そこでは、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの一以上のコピーは、ここに記載されるように変えられてよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、コピー数を増強し、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含み、一以上のコピーの異なる調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットを含み、、一よりも多くの治療上の分子を発現し、および/または一よりも多くの機能を実行する操作された細菌を生成するために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。
【００４１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、本質的に前記遺伝子カセットに関連しない直接または間接的に誘導性のプロモーター、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるFNR応答性プロモーターに作動可能に連結される遺伝子カセットを含む。
【００４２】
「構成的プロモーター」は、その制御下でコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができ、および/または作動可能に連結されているプロモーターに言及する。構成的プロモーターおよび機能的変形体（変異体とも言う）は、当技術でよく知られ、および制限されないが、BBa_J23100、構成的Escherichia coli（大腸菌）σSプロモーター（例は、osmYプロモーター（International Genetically Engineered Machine（インターナショナル・ジェネティカリー・エンジニアード・マシーン）（iGEM）Registry of Standard Biological Parts Name（標準生物学的パーツ名称の登録）BBa_J45992；BBa_J45993））、構成的大腸菌σ32プロモーター（例は、htpG熱ショックプロモーター（BBa_J45504））、構成的大腸菌σ70プロモーター（例は、lacqプロモーター（BBa_J54200；BBa_J56015）、大腸菌CreABCDリン酸感知性オペロンプロモーター（BBa_J45951）、GlnRSプロモーター（BBa_K088007）、lacZプロモーター（BBa_K119000；BBa_K119001）；M13K07遺伝子Iプロモーター（BBa_M13101）；M13K07遺伝子IIプロモーター（BBa_M13102）、M13K07遺伝子IIIプロモーター（BBa_M13103）、M13K07遺伝子IVプロモーター（BBa_M13104）、M13K07遺伝子Vプロモーター（BBa_M13105）、M13K07遺伝子VIプロモーター（BBa_M13106）、M13K07遺伝子VIIIプロモーター（BBa_M13108）、M13110（BBa_M13110））、構成的Bacillus subtilis（バチルス・サブティリス）σAプロモーター（例は、プロモーターveg（BBa_K143013）、プロモーター43（BBa_K143013）、PliaG（BBa_K823000）、PlepA（BBa_K823002）、Pveg（BBa_K823003）、構成的バチルス・サブティリスσBプロモーター（例は、プロモーターctc（BBa_K143010）、プロモーターgsiB（BBa_K143011））、サルモネラプロモーター（例は、Salmonella由来のPspv2（BBa_K112706）、Salmonella由来のPspv（BBa_K112707））、バクテリオファージT7プロモーター（例は、T7プロモーター（BBa_I712074；BBa_I719005；BBa_J34814；BBa_J64997；BBa_K113010；BBa_K113011；BBa_K113012；BBa_R0085；BBa_R0180；BBa_R0181；BBa_R0182；BBa_R0183；BBa_Z0251；BBa_Z0252；BBa_Z0253））、およびバクテリオファージSP6プロモーター（例は、SP6プロモーター（BBa_J64998））が含まれる。
【００４３】
「消化管（腸を含む）」は、食物の移動および消化、栄養素の吸収、および廃棄物の排出を担う器官、腺、管、およびシステムに言及する。ヒトでは、消化管は胃腸（GI）管を含み、それは口から始まり、および肛門で終わり、さらに加えて食道、胃、小腸、および大腸を含む。消化管はまた、副器官および腺、たとえば、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などのようなものを含む。上部胃腸管には、食道、胃および小腸の十二指腸が含まれる。下部胃腸管には、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、および大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸、および肛門管が含まれる。細菌は、消化管、例は、胃腸管において、および特に腸において、その全体にわたって見出すことができる。
【００４４】
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことが可能でない細菌に言及する。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくらかの実施体態様では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくらかの実施態様では、非病原性細菌は消化管の常在微生物叢（原生微生物叢とも言う）に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、制限されないが、Bacillus（バチルス属）、Bacteroides（バクテロイデス属）、Bifidobacterium（ビフィドバクテリウム属）、Brevibacteria（ブレビバクテリウム属）、Clostridium（クロストリジウム属）、Enterococcus（エンテロコッカス属）、Escherichia（エシェリキア属）、Lactobacillus（ラクトバチルス属）、Lactococcus（ラクトコッカス属）、Saccharomyces（サッカロミセス属）、およびStaphylococcus（スタフィロコッカス属）で、例は、Bacillus coagulans（バチルス・コアグランス）、Bacillus subtilis（バチルス・サブティリス）、Bacteroides fragilis（バクテロイデス・フラジリス）、Bacteroides subtilis（バクテロイデス・サブティリス）、Bacteroides thetaiotaomicron（バクテロイデス・テタイオタオミクロン）、Bifidobacterium bifidum（ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム）、Bifidobacterium infantis（ビフィドバクテリウム・インファンティス）、Bifidobacterium lactis（ビフィドバクテリウム・ラクティス）、Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）、Clostridium butyricum（クロストリジウム・ブチリカム）、Enterococcus faecium（エンテロコッカス・フェシウム）、Escherichia coli（エシェリキア・コリ）、Lactobacillus acidophilus（ラクトバチルス・アシドフィラス）、Lactobacillus bulgaricus（ラクトバチルス・ブルガリカス）、Lactobacillus casei（ラクトバチルス・カゼイ）、Lactobacillus johnsonii（ラクトバチルス・ジョンソニイ）、Lactobacillus paracasei（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Lactobacillus plantarum（ラクトバチルス・プランタルム）、Lactobacillus reuteri（ラクトバチルス・ロイテリー）、Lactobacillus rhamnosus（ラクトバチルス・ラムノーサス）、Lactococcus lactis（ラクトコッカス・ラクティス）、およびSaccharomyces boulardii（サッカロミセス・ブラウディ）が含まれる〔Sonnenborn（ソネンボーン）ら、2009；Dinleyici（ディンレイシ）ら、2014；米国特許第（U.S. Patent No.）6,835,376号；U.S. Patent No. 6,203,797；U.S. Patent No. 5,589,168；U.S. Patent No. 7,731,976〕。非病原性細菌にはまた、消化管の原生微生物叢に存在する共生細菌も含まれる。自然に病原性の細菌は、病原性を低減または排除するために遺伝学的に操作することができる。
【００４５】
「プロバイオティク」は、生きた、非病原性の微生物、例は、細菌に言及するために使用され、それは微生物の適量を含む宿主有機体に健康上の利益を与えることができる。いくらかの実施態様では、宿主有機体は哺乳動物である。いくらかの実施態様では、宿主有機体はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、菌株、および/またはサブタイプは、目下、プロバイオティクとして認識されている。プロバイオティク細菌の例には、制限されないが、Bifidobacteria（ビフィドバクテリウム属）、Escherichia（エシェリキア属）、Lactobacillus（ラクトバチルス属）、およびSaccharomyces（サッカロミセス属）で、例は、Bifidobacterium bifidum、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Escherichia coli strain Nissle（エシェリキア・コリ株ニッスル）、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、およびSaccharomyces boulardii（Dinleyiciら、2014；U.S. Patent No. 5,589,168；U.S. Patent No. 6,203,797；U.S. Patent 6,835,376）。プロバイオティックは、細菌の変形体または変異体株であってもよい（Arthur（アーサー）ら、2012；Cuevas-Ramos（クエバス-ラモス）ら、2010；Olier（オリエ）ら、2012；Nougayrede（ヌーガイリーデ）ら、2006）。非病原性細菌は、望ましい生物学的特性、例は、生存性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。非病原性細菌は、プロバイオティク特性を提供するように遺伝学的に操作されうる。プロバイオティク細菌は、プロバイオティク特性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。
【００４６】
ここに使用されるように、「安定に維持される」、「安定に発現される」または「安定な」細菌は、非自然遺伝子物質、例は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）を伴い、それが、非自然遺伝物質が保持され、発現され、および/または増殖するように、宿主ゲノムに組み込まれるか、または自己複製性染色体外プラスミド上で増殖される細菌宿主細胞に言及するために使用される。安定な細菌は、インビトロで、例は、培地中で、および/またはインビボで、例は、消化管内で生存および/または増殖することができる。たとえば、安定な細菌群は、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）を含む遺伝子改変細菌であってもよく、そこでは、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列（群）を伴うプラスミドまたは染色体は、遺伝子カセットまたは遺伝子配列が宿主細胞において発現され、および宿主細胞がインビトロおよび/またはインビボで生存および/または増殖することが可能なように、宿主細胞において安定して維持される。いくらかの実施態様において、コピー数は非自然遺伝物質の発現の安定性に影響する。いくらかの実施態様において、コピー数は非自然遺伝物質の発現のレベルに影響する。
【００４７】
ここに使用されるように、用語「処置する」およびその同族語は、疾患または障害、またはその少なくとも一の認識可能な症状の改善に言及する。別の実施態様において、「処置する」とは、必ずしもペイシェント（主として患者を意味する）が認識可能ではない少なくとも一の測定可能な物理的パラメータの改善に言及する。別の実施態様では、「処置する」は、物理的（例は、認識可能な症状の安定化）、生理学的（例は、物理的パラメータの安定化）、または両方のいずれかでも、疾患または障害の進行を抑制することに言及する。別の実施態様において、「処置する」は、疾患または障害の進行を遅くすることまたは進行を逆転させることに言及する。ここに使用されるように、「防止する」およびその同族語は、発症の遅延または与えられる疾患または障害の獲得リスクの低減に言及する。
【００４８】
処置を必要とするものには、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびにその疾患を有する危険性のあるもの、または最終的にはその障害を獲得する可能性のあるものが含まれうる。処置の必要性は、たとえば、障害の発症、障害の存在または進行、または障害を有する対象の処置への受容性に関連する一以上の危険因子の存在によって評価される。消化管炎症および/または消化管バリア機能の低下に関連する自己免疫障害および/または疾患および状態を処置することには、過剰な炎症および/または関連する症状を軽減または排除することを含み、必ずしも根底にある疾患または障害の排除を包含するとは限らない。いくつかの例では、「initial colonization of the newborn intestine is particularly relevant to the proper development of the host’s immune and metabolic functions and to determine disease risk in early and later life（新生児腸の初期コロニー化は、宿主の免疫および代謝機能の適切な発達に、および早期および後期の疾患リスクの決定に特に関連する）」（Sanz（サンス）ら、2015）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌を用いる早期介入（例は、出生前、周産期、新生児）は、疾患または障害の発症を予防または遅延させるのに十分でありうる。
【００４９】
ここに使用されるように、「製薬上組成物」は、たとえば、生理学的に適切な担体および/または賦形剤などのような他の成分を伴う本発明の遺伝学的に操作された細菌の調製物に言及する。
【００５０】
交換可能に使用されうる語句「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」は、有機体に著しい刺激を引き起こさず、および施与される細菌化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤に言及する。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
【００５１】
用語「賦形剤」は、活性成分の施与をさらに容易にするために製薬上組成物に添加される不活性物質に言及する。例には、制限されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および澱粉のタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、およびたとえばポリソルベート20を含む界面活性剤が含まれる。
【００５２】
用語「治療上有効な用量」および「治療上有効な量」は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状、例は、炎症、下痢の改善を生じる化合物の量に言及するために使用される。治療的に有効な量は、たとえば、重症度を処置、防止、低減し、発症を遅延し、および/または自己免疫障害および/または消化管炎症および/または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態の一以上の症状の発生のリスクを軽減するために十分でありうる。治療上有効な量、ならびに治療上有効な施与の頻度は、当該技術で知られ、および以下に議論される方法によって定めることができる。
【００５３】
ここに使用されるように、冠詞「a（ある一つの）」および「an（母音の前の不定冠詞）」は、反対のことが明確に示されていない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解すべきである。
【００５４】
語句「および/または」は、リスト内の要素間で使用されるとき、次のいずれかを意味することを意図し、（1）単一のリストされた要素だけが存在すること、または（2）リストの一よりも多くの要素が存在することである。たとえば、「A、B、および/またはC」は、その選定は、A単独；B単独；C単独；AおよびB；AおよびC；BおよびC；またはA、B、およびCでありうることを示す。語句「および/または」は、リストの要素の「少なくとも一つ」または「一またはそれよりも多く（一以上とも言う）」と交換可能に使用されてもよい。
細菌
【００５５】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、一以上の非自然抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は自然な非病原性細菌である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は共生細菌である。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はプロバイオティク細菌である。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は病原性を低減または排除するために修飾または変異された自然な病原性細菌である。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。模範的な細菌には、制限されないが、Bacillus、Bacteroides、Bifidobacterium、Brevibacteria、Clostridium、Enterococcus、Escherichia coli、Lactobacillus、Lactococcus、Saccharomyces、およびStaphylococcusで、例は、Bacillus coagulans、Bacillus subtilis、Bacteroides fragilis、Bacteroides subtilis、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium longum、Clostridium butyricum、Enterococcus faecium、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus casei、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactococcus lactis、Saccharomyces boulardii、Firmicutes（ファーミキューテス門）のClostridiumクラスターIVおよびXIVa（Eubacterium（ユーバクテリウム属）の種を含む）、Roseburia（ロゼブリア属）、Faecalibacterium（フィーカリバクテリウム属）、Enterobacter（エンテロバクター属）、Faecalibacterium prausnitzii（フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ）、Clostridium difficile（クロストリジウム・ディフィシル）、Subdoligranulum（サブドリグラヌルム属）、Clostridium sporogenes（クロストリジウム・スポロゲネス）、Campylobacter jejuni（キャンピロバクター・ジェジュニ）、Clostridium saccharolyticum（クロストリジウム・サッカロリティカム）、Klebsiella（クレブシエラ属）、Citrobacter（シトロバクター属）、Pseudobutyrivibrio（シュードブチリビブリオ属）、およびRuminococcus（ルミノコッカス属）が含まれる。一定の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、Bacteroides fragilis、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides subtilis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium lactis、Clostridium butyricum、Escherichia coli Nissle、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、およびLactococcus lactisからなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、自然に高レベルのブチラートを生成することができるグラム陽性菌、例は、クロストリジウム属である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、C. butyricum（ブチリカム）ZJUCB、C. butyricum S21、C. thermobutyricum（サーモブチリカム）ATCC 49875、C. beijerinckii（ベイジェリンキイ）、C. populeti（ポプレティ）ATCC 35295、C. tyrobutyricum（チロブチリカム）JM1、C. tyrobutyricum CIP 1-776、C. tyrobutyricum ATCC 25755、C. tyrobutyricum CNRZ 596、およびC. tyrobutyricum ZIU 8235からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、C. butyricum CBM588、タンパク質分泌に非常に敏感なプロバイオティク細菌であり、およびIBDの処置において立証された有効性を有する（Kanai（カナイ）ら、2015）。い��らかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子的に非常に扱いやすく、および工業的タンパク質生産のための一般的なシャーシ（胴体とも言う）であったSacillus（バチルス属）、プロバイティク細菌である。いくらかの実施態様では、細菌は高度に活性な分泌および/または毒性副生成物を有さない（Cutting（カッティング）、2011）。
【００５６】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクの一つに進化したEscherichia coli（大腸菌）Nissle 1917株（E. coli Nissle）、腸内細菌科ファミリーのグラム陰性菌である（Ukena（ウケナ）ら、2007）。その菌株は完全無害で特徴付けられ（Schultz（シュルツ）、2008）、およびGRAS（generally recognized as safe、一般に安全と認められている）状態を有する（Reister（レイスター）ら、2014、強調が加えられる）。ゲノムシーケンシングにより、E. coli Nissleは顕著なビルレンス（病原性とも言う）因子（例は、E. coliα-溶血素、P-線毛アドヘシン（付着因子とも言う））を欠くことが確認された（Schultz、2008）。さらに、E. coli Nissleは病原性接着因子を保有せず、エンテロトキシン（腸毒素とも言う）または細胞毒を生成せず、侵襲性でなく、および泌尿器病原性でもないことが示されている。（Sonnenbornら、2009）。1917年の早くにも、E. coli Nissleは、治療用途のために、薬用カプセルにパッケージングされ、Mutaflor（ムータフロル）と呼ばれた。E. coli Nissleは、以来、インビボでヒトの潰瘍性大腸炎を処置するために（Rembacken（レムバッケン）ら、1999）、インビボでヒトの炎症性腸疾患、クローン病、および嚢炎（回腸嚢炎とも言う）を処置するために（Schultz、2008）、腸管組織侵入性のSalmonella、Legionella（レジオネラ属）、Yersinia（エルシニア属）、およびShigella（シゲラ属）をインビボで抑制するために使用された（Altenhoefer（アルテンホーファー）ら、2004）。E. coli Nissleの治療上の効果および安全性が納得がいくように証明されていることは一般に認められている（Ukenaら、2007）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はE. coli Nissleであり、自然にタイトジャンクション（密着結合とも言う）および消化管バリア機能を促進することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はE. coliであり、および組換えタンパク質技術に非常に適している。
【００５７】
当業者は、ここに開示される遺伝学的修飾が細菌の他の種、菌株、およびサブタイプに適合しうることを理解するであろう。たとえば、クロストリジウムのブチロジーニック経路遺伝子が、ゲノム配列のクロストリジウムおよび関連する種に広く存在することは知られている（Aboulnagaら、2013）。さらに、一以上の異なる種の細菌由来の遺伝子を互いに導入することができ、例は、Peptoclostridium difficile（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）由来のブチロジーニック遺伝子がEscherichia coliで発現された（Aboulnagaら、2013）。
【００５８】
非修飾E. coli Nissleおよび本発明の遺伝学的に操作された細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子によって（Sonnenbornら、2009）、またはキルスイッチの活性化によって、施与後数時間または数日で破壊されうる。そのようにして、遺伝学的に操作された細菌は、継続的な施与を必要とすることがある。インビボでの滞留時間は、遺伝学的に操作された細菌について算出されうる。いくらかの実施態様において、滞留時間はヒト対象について算出される。
抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子
【００５９】
遺伝学的に操作された細菌は、非自然抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子配列（群）および/または遺伝子カセット（群）を含む。いくらかの実施態様では、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するために一以上の遺伝子配列（群）を含む。たとえば、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子配列（群）を含みうる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は、同じ遺伝子の複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は異なる遺伝子をコードする配列である。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は一以上の異なる遺伝子の複数のコピーをコードする配列である。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子カセット（群）を含む。たとえば、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子カセットを含むことができる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じ遺伝子カセットの複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じか、または異なる抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）のいずれかをも生成するための異なる遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは、一以上の異なる抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）の複数のコピーを生成するための遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート、IL-2、IL-22、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-アシルホスファチジルエタノールアミン（NAPEs）、エラフィン（ペプチダーゼインヒビター3またはSKALPとしても知られる）、トレフォイル因子、メラトニン、PGD2、キヌレン酸、およびキヌレニンからなる群より選ばれる。分子は、主として抗炎症剤、例は、IL-10、または主として消化管バリア機能増強剤、例は、GLP-2でありうる。あるいは、分子は、抗炎症性および消化管バリア機能を増強することができる。
【００６０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、単一の遺伝子によってコードされる一以上の抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を発現し、例は、分子がエラフィンであり、およびPI3遺伝子であるか、または分子はインターロイキン-10であり、IL10遺伝子によってコードされる。代わりの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路によって合成される、一以上の抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）、例は、ブチラートをコードする。
【００６１】
一以上の遺伝子配列（群）および/または遺伝子カセット（群）は、高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上で発現されうる。いくらかの実施態様において、プラスミドからの発現は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）の発現を増加させるために有用でありうる。いくらかの実施態様において、染色体からの発現は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）の発現の安定性を増加させるために有用でありうる。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成するための遺伝子配列（群）または遺伝子カセット（群）は、遺伝学的に操作された細菌の一以上の組込み部位で細菌染色体に組み込まれる。たとえば、ブチラート生合成遺伝子カセットの一以上のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための遺伝子配列（群）または遺伝子カセット（群）は、遺伝学的に操作された細菌においてプラスミドから発現される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための遺伝子配列（群）または遺伝子カセット（群）は、E. coli Nissleの次の挿入部位：malE/K、araC/BAD、lacZ、thyA、malP/Tの一以上にて細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を使用することができる（例は、模範的挿入部位について図51を参照）。挿入部位は、例は、生存および/または生存に必要な遺伝子、たとえば、thyAのようなものにおいて（栄養要求体を作り出すために）；ゲノムの活性領域、たとえば、ゲノム複製の部位の近くなどにおいて；および/または意図しない転写のリスクを低減するために、ダイバージェント（分岐や発散などとも言う）プロモーターの間、たとえば、アラビノースオペロンのAraBおよびAraCの間などのようなものにおいて、ゲノム中のどこにあってもよい。
【００６２】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、一以上のブチロジーニック遺伝子カセットを含み、およびブチラートを産生することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切な組のブチロジーニック遺伝子を含み得る（例えば、表4参照）。ブチラート生合成遺伝子を含む未修飾細菌は既知であり、およびそれには、Peptoclostridium、Clostridium、Fusobacterium、Butyrivibrio、Eubacterium、およびTreponemaが含まれ、およびこれらの内因性ブチラート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌のための遺伝子の供給源であってもよい。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のブチラート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Peptoclostridium difficile（ペプトクロスジウム・ディフィシル）、例は、Peptoclostridium difficile株630由来の8つの酪酸生合成経路遺伝子：bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbuk（Aboulnagaら、2013）を含み、および誘導条件下でブチラートを生産することができる。Phptoclostridium difficile株630および株1296は、いずれもブチラートを産生することができるが、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbukについて異なる核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および/または亜株由来のブチロジーニック遺伝子の組合せを含み、および誘導条件下でブチラートを産生することができる。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Peptoclostridium difficile株630由来のbcd2、etfB3、etfA3、およびthiA1、およびPeptoclostridium difficile株1296由来のhbd、crt2、pbt、およびbukを含む。
【００６３】
Clostridium difficileにおいてbcd2、etfA3、およびetfB3遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル-CoAをブチリル-CoAに変換する複合体を形成し、それらは酸素依存性共酸化剤として機能し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、微好気性または酸素制限環境、例は、哺乳類の消化管においてブチラートを産生するように設計され、酸素依存性は消化管においてブチラート生成に悪影響を及ぼし得る。Treponema denticolaの単一遺伝子（ter、トランス-2-エノイル（enoynl）-CoAレダクターゼをコードする）は酸素非依存マナーでこの3遺伝子複合体を機能的に置き換えることができることが示された。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、ter遺伝子、例は、Treponema denticola由来のものを含み、それはbcd2、etfB3、およびetfA3遺伝子の三つすべて、例は、Peptoclostridium difficile由来のものを機能的に置換することができる。この実施態様では、遺伝学的操作細菌は、thiA1、hbd、crt2、pbtおよびbuk、例は、Peptoclostridium difficile由来のもの、およびter、例は、Treponema denticola由来のものを含み、および低酸素条件下、ブチラートを産生することができる（例は、表4参照）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性ブチラート生合成の遺伝子および/または嫌気性または微好気性ブチラート生合成の遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbuk、例は、Peptoclostridium difficile由来のもの；ter、例は、Treponema denticola由来のもの；一以上のbcd2、etfB3、およびetfA3、例は、Peptoclostridium difficile由来のものを含み、および誘導条件下でブチラートを生成する。あるいはまた、Escherichia coli由来のtesB遺伝子は、Peptoclostridium difficile由来のpbtおよびbuk遺伝子を機能的に置換することができる。したがって、いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットは、Peptoclostridium difficile由来のthiA1、hbdおよびcrt2、およびTreponema denticola由来のterおよびE. coli由来のtesBを含み得る。いくらかの実施態様において、ブチラート生合成遺伝子の一以上は機能的に置換または修飾されてもよく、例は、コドン最適化されてもよい。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットは、ブチラートの好気性生合成のための遺伝子および/またはブチラートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、低酸素条件下で安定性を増強し、および/またはブチラート生成を増加させるために、ブチラート生合成遺伝子の一以上が機能的に置換、修飾、および/または変異される。いくらかの実施態様において、ブチラートの局所産生は、消化管における制御性T細胞の分化を誘導し、および/または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。模範的なブチラート遺伝子カセットを図1、2、3、4、5、6、7、および8に示される。
【００６４】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でブチラート生合成カセットを発現し、およびブチラートを産生することができる。それらの遺伝子は、コドン最適化されていてもよく、および翻訳および転写要素が加えられうる。表4は、ブチラート生合成遺伝子カセットにおいて模範的遺伝子の核酸配列を示す。
【００６５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号1-10のいずれか一の核酸配列またはその機能的フラグメントを含む。いくらかの実施態様では、遺伝子的に操作された細菌は、遺伝暗号の重複のために、配列番号1-10のいずれか一と同じポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号11-20のいずれか一のポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号1-10またはそのフラグメントのいずれか一のDNA配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、その配列番号11-20のいずれか1つのポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸を含む。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【００６６】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート遺伝子カセットを含み、およびプロピオナートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なセットのプロピオナート生合成遺伝子を発現することができる（例は、表6参照）。内在性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる未修飾細菌には、制限されないが、Clostridium propionicum、Megasphaera elsdenii、およびPrevotella ruminicolaが含まれ、およびこれらの内因性プロピオナート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌のための遺伝子の供給源であることができる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Clostridium propionicum由来の遺伝子pct、lcd、およびacrを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、例は、pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、およびacrCを含む。代わりの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのピルバート経路遺伝子、例は、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、およびlpdを含み、および随意にtesBをさらに含む。遺伝子は、コドン最適化されていてよく、および翻訳および転写要素が加えられてもよい。表6は、プロピオナート生合成遺伝子カセットにおいて模範的遺伝子の核酸配列を示す。
【００６７】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号21-34および10のいずれか一の核酸配列またはその機能的フラグメントを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号35-48および20のいずれか一のポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号21-34および10のいずれか一またはその機能的フラグメントのDNA配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号35-48および20のいずれか一のポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードするその核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸を含む。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【００６８】
いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、合成プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、E. coliプロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はC. glutamicum（グルタニカム）プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はC. propionicumプロピオナート生合成遺伝子である。プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および/またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含み得る。一以上のプロピオナート生合成遺伝子は、機能的に置換または修飾されてよく、例は、コドン最適化されてもよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株および/または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含み、および誘導条件下でプロピオナートを生成することができる。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、誘導条件下での安定性を増強し、および/またはプロピオナート生成を増加させるために、機能的に置換、修飾、および/または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でプロピオナート生合成カセットを発現し、およびプロピオナートを生成することができる。
【００６９】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、アセタート遺伝子カセットを含み、およびアセタートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、アセタート生合成遺伝子の任意の適切なセットを含み得る。アセタート生合成遺伝子を含む非修飾細菌は当該技術において知られ、および好気性および/または嫌気性条件下で種々の基質を消費してアセタートを生成することができ（例はRagsdale、2008参照）、およびこれらの内因性アセタート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌についての遺伝子の供給源でありうる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜株由来のアセタート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌中の自然アセタート生合成遺伝子が増強される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成遺伝子、例は、Escherichia coli由来のものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、嫌気性アセタート生合成遺伝子、例は、Acetitomaculum、Acetoanaerobium、Acetohalobium、Acetonema、Balutia、Butyribacterium、Clostridium、Moorella、Oxobacter、Sporomusa、および/またはThermoacetogenium由来のものを含む。遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成のための遺伝子、または嫌気性もしくは微好気性アセタート生合成のための遺伝子を含み得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、好気性および嫌気性または微好気性アセタート生合成遺伝子の両方を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および/または亜株に由来するアセタート生合成遺伝子の組合せを含み、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、アセタート生合成遺伝子の一以上は、安定性および/またはアセタート産生を増強するために、機能的に置換、修飾、および/または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でアセタート生合成カセットを発現し、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、代わりの短鎖脂肪酸を産生することができる。
【００７０】
いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、IL-10を産生することができる。インターロイキン-10（IL-10）は、クラス2サイトカインで、サイトカイン、インターフェロン、およびインターフェロン様分子、たとえば、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B、IL-29、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-ω、およびリミチン（limitin）などのようなものを含むカテゴリーにある。IL-10は、二の受容体、IL-10R1およびIL-10R2を通してシグナル伝達する抗炎症性サイトカインである。IL-10および/またはその受容体の欠損は、IBDおよび腸の感受性と関連する（Nielsen（ニールセン）、2014）。IL-10またはプロテアーゼインヒビターを発現する細菌は、たとえば、クローン病および潰瘍性結腸炎などのような状態を改善し得る（Simpson（シンプソン）ら、2014）。遺伝学的に操作された細菌は、IL-10をコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトIL-10を含み得る。いくらかの実施態様において、IL-10をコードする遺伝子は、誘導条件下で安定性を増強し、IL-10産生を増加させ、および/または抗炎症効力を増加させるために、修飾および/または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でIL-10を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でIL-10を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はIL-10をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号49またはその機能的フラグメントを含む核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号49またはその機能的フラグメントの核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。
【化１】
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【００７１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はIL-2を産生することができる。インターロイキン2（IL-2）は調節性T細胞（Treg）のヘルス（健全性）を維持することによって自己免疫を媒介する。Treg細胞は、Foxp3を発現するものを含み、典型的には、自己抗原に対して活性であるエフェクターT細胞を抑制し、およびその際、自己免疫活性を低下させる可能性がある。IL-2はTreg細胞の分化および活性を増強するためのサイトカインとして機能するが、一方で減少したIL-2活性は自己免疫事象を促進することができる。IL-2は活性化CD4+T細胞によって、および活性化CD8+T細胞、活性化樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびNK T細胞を含む他の免疫メディエーターによって生じる。IL-2は、CD25、CD122、およびCD132が含まれる三つの鎖から構成されるIL-2Rに結合する。IL-2は、胸腺におけるTreg細胞の増殖を促進する一方、全身循環におけるそれらの機能および活性を維持する。Treg細胞活性はIBD設定において複雑な役割を果たすと共に、マウスの研究は疾病病因（疾病病理発生とも言う）における保護的役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号50またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号50またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でIL-2を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でIL-2を産生することができる。
【化２】
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【００７２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はIL-22を産生することができる。インターロイキン22（IL-22）サイトカインは、樹状細胞、リンパ系組織インデューサー様細胞、ナチュラルキラー細胞によって産生され、および適応リンパ球上に発現されることができる。Jak-STATシグナル伝達経路の開始を通して、IL-22発現は、抗微生物化合物の発現ならびに細胞増殖関連経路のある範囲を誘発することができ、双方とも組織修復機構を増強する。IL-22は、腸バリアのフィデリティー（忠実度とも言う）および治癒を促進しながら、炎症状態を調節する上で重要である。マウスモデルはIL-22の施与後に改善された腸炎症状態を実証した。また、IL-22はSTAT3シグナル伝達を活性化して高められた粘液産生を促進し、バリア機能を保持する。IBD感受性遺伝子とのIL-22の関連は、同様に疾患の表現型発現を調節し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号51またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号51またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、IL-22を産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でIL-22を産生することができる。
【化３】
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【００７３】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はIL-27を産生することができる。インターロイキン27（IL-27）サイトカインは、活性化抗原提示細胞によって主に発現される一方、IL-27受容体は、中でもT細胞、NK細胞などを含め、ある細胞の範囲に見出される。特に、IL-27は、炎症促進性Tヘルパー17（Th17）細胞の発生を抑制し、これはIBD病因において重要な役割を果たす。さらに、IL-27はIL-10産生Tr1細胞の分化を促進し、およびIL-10産生量を高めることができ、それらの双方は抗炎症効果を有する。IL-27は腸上皮細胞内のMAPKおよびSTATシグナル伝達の活性化を介して、上皮バリア機能に対する保護効果を有する。さらに、IL-27は、細菌増殖を抑える抗菌タンパク質の産生を増強する。バリア機能での改善および細菌増殖の減少はIBD病因におけるIL-27についての好ましい役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号52またはその機能的フラグメント（機能的断片とも言う）をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号52またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、IL-27を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でIL-27を産生することができる。
【化４】
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【００７４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はSODを産生することができる。増加したROSレベルは炎症性腸疾患の病態生理に寄与する。増加したROSレベルは、血管細胞接着分子1（VCAM-1）の高められた発現を導くことがあり、それは、炎症性メディエーターの疾病患部組織への転換を促すことができ、およびより一層大きな程度の炎症負荷をもたらす。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を含む抗酸化システムは、全体のROS負荷を軽減するように機能することができる。しかし、研究は、IBDの設定におけるSODの発現が損なわれ、例えば、IBDにおいてより一層低いレベルで産生され、それにより疾患病状が進行されることを示す。さらなる研究は、大腸炎モデル内でラットにSODを補給することは、結腸脂質過酸化および内皮VCAM-1発現の減少ならびに炎症環境の全体的な改善に関連することを示した。したがって、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号52またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号53またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば、炎症に関連する状態（群）の下で、SODを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でSODを産生することができる。
【化５】
2018512841.tif 000037
【００７５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はGLP-2またはプログルカゴンを産生することができる。グルカゴン様ペプチド2（GLP-2）は、腸内分泌細胞によって産生され、腸の成長を刺激し、および消化管バリア機能を増強する。 GLP-2施与は、IBD、短腸症候群、および小腸腸炎の処置において治療上の可能性を有する（Yazbeck（ヤズベック）ら、2009）。遺伝学的に操作された細菌は、GLP-2またはプログルカゴンをコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトGLP-2またはプログルカゴンを含み得る。いくらかの実施態様において、プロテアーゼインヒビター（抑制剤、阻害剤とも言う）、例は、ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤もGLP-2分解を減少させるために施与される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、分解耐性GLP-2類似体、例は、Teduglutide（テデュグルチド）（Yazbeckら、2009）を発現する。いくらかの実施態様では、GLP-2またはプログルカゴンをコードする遺伝子は、例は、安定性を増強し、GLP-2産生を増加させ、および/または誘導条件下で消化管バリア増強効力を増加させるために、改変および/変異される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でGLP-2またはプログルカゴンを産生することができる。ネズミモデルのIBDにおけるGLP-2施与は、たとえば、TNF-αおよびIFN-γなどのような炎症性メディエーターでの減少だけでなく、粘膜損傷および炎症の減少に関連する。さらに、GLP-2補充はまた、大腸炎/回腸炎モデルにおいて粘膜ミエロペルオキシダーゼの減少をもたらし得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号54またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号54またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、GLP-2を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でGLP-2を産生することができる。
【化６】
2018512841.tif 000038
【００７６】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はキヌレニンを産生することができる。キヌレニンはトリプトファン異化の最初の律速段階で生成される代謝生成物である。このステップは、トリプトファンのキヌレニンへの変換を含み、および遍在的に発現される酵素インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO-1）、または肝臓に主に局在する酵素であるトリプトファンジオキシゲナーゼ（TDO）によって触媒され得る（Alvarado（アルバラド）ら、2015）。IBDを有するヒト患者からの生検は、健康な個体、特に潰瘍形成の部位付近の生検と比較して、IDO-1発現のレベルの上昇を示す（Ferdinande（ファーディナンデ）ら、2008；Wolf（ウルフ）ら、2004）。IDO-1酵素発現は、同様に、トリニトロベンゼンスルホン酸およびデキストラン硫酸ナトリウム誘導性のIBDマウスモデルにおいてアップレギュレートされ；IDO-1の抑制は、各誘導因子によって引き起こされる炎症応答を著しく増大させる（Ciorba（シオルバ）ら、2010；Gurtner（グルトナー）ら、2003；Matteoli（マッテオリ）ら、2010）。キヌレニンは、好中球におけるアポトーシスを直接誘導することも示された（El-Zaatari（エル-ザータリ）ら、2014）。同時に、これらの所見から、IDO-1およびキヌレニンが炎症を制限する役割を果たすことが示唆される。遺伝学的に操作された細菌はキヌレニンを産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン輸送体を産生するための遺伝子または遺伝子カセット、IDO-1を産生するための遺伝子または遺伝子カセット、およびTDOを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み得る。いくらかの実施態様において、キヌレニンを産生するための遺伝子は、例は、安定性を増強し、キヌレニン産生を増加させ、および/または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および/または変異される。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンの取り込みまたは受け入れが増強され、例は、トランスポーターまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構が含まれる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態の下で、キヌレニンを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でキヌレニンを産生することができる。
【００７７】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はキヌレン酸を産生することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン-オキソグルタラートトランスアミナーゼによって触媒される反応におけるキヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。キヌレン酸は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用する（Turski（トゥルスキ）ら、2013）。グルタマート（グルタミン酸塩とも言う）は中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質であることが知られているが、末梢神経系におけるグルタミン酸塩のさらなる役割を示唆する証拠が存在する。たとえば、胃腸管（すなわち、筋層間神経叢、筋叢とも言う）への主要な神経供給におけるNMDAグルタミン酸受容体の活性化は消化管運動の増加を導くが（Forrest（フォレスト）ら、2003）、キヌレン酸で処置したラットは消化管運動性および急性大腸炎の初期相での炎症の減少を見せる（Varga（バーガ）ら、2010）。したがって、IBDペイシェントで報告されたキヌレン酸の上昇したレベルは、腸内ニューロンの活性化の増加に対する代償的応答を表し得る（Forrestら、2003）。遺伝学的に操作された細菌はキヌレン酸を産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくらかの実施態様において、キヌレン酸を産生するための遺伝子は、例は、安定性を増強し、キヌレニン酸産生を増加させ、および/または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および/または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、キヌレン酸を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でキヌレン酸を産生することができる。
【００７８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、IL-19、IL-20、および/またはIL-24を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でIL-19、IL-20、および/またはIL-24を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でIL-19、IL-20および/またはIL-24を産生することができる。
【００７９】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、炎症誘発性分子を抑制することが可能な分子を産生することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切な抑制分子、例は、一本鎖可変断片（scFv）、アンチセンスRNA、siRNA、またはshRNAを発現してよく、それは、一以上の炎症誘発性分子、例は、TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-26、IL-32、アラキドン酸、プロスタグランジン（例は、PGE2）セロトニン、トロンボキサン（例は、TXA2）、ロイコトリエン（例は、LTB4）、ヘポキシリン（hepoxillin）A3、またはケモカインを中和することができる（Keates（キートス）ら、2008；Ahmad（アフマド）ら、2012）。遺伝学的に操作された細菌は、一以上の炎症促進性分子、例は、TNF、IL-17を抑制し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、表8に示される一以上の分子を調節することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は一以上の炎症分子を抑制、除去、分解、および/または代謝することができる。
【表８−１】
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【表８−２】
2018512841.tif 000040
【表８−３】
2018512841.tif 000041
【００８０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、およびさらに炎症分子を阻害することができる分子を産生することができる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、さらに炎症分子を分解することができる酵素を産生することができる。たとえば、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ブチラートを産生するための遺伝子カセット、ならびに炎症分子、例は、PGE2を阻害、除去、分解、および/または代謝するための分子または生合成経路を発現することができる。
【００８１】
RNA干渉（RNAi）は、植物および動物における転写後遺伝子サイレンシング機構である。RNAiは、マイクロRNA（miRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）がショート干渉（低分子干渉とも言う）RNA（siRNA）二本鎖にプロセシングされるとき活性化される（Keates（キーツ）ら、2008）。RNAiは、標的細胞、たとえば、哺乳類細胞のようなものに対するshRNAの製造および配送のために設計される非病原性細菌によってインビトロおよびインビボで活性化されうる（Keatesら、2008）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子のRNAi媒介遺伝子サイレンシングを誘導する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、低酸素条件下でTNFを標的とするsiRNAを産生する。
【００８２】
一本鎖可変断片（scFv）は、「widely used antibody fragments… produced in prokaryotes（原核生物において産生される広く用いられる抗体断片）」である（Frenzel（フレンゼル）ら、2013）。scFvは、伝統的な抗体の定常ドメインを欠き、および単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現する。細菌、たとえば、Escherichia coliなどのようなものは、炎症促進性サイトカイン、たとえば、TNFを標的とするscFvを産生することができる（Hristodorov（フリストドロフ）ら、2014）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を中和するための結合タンパク質を発現する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は低酸素条件下でTNFを標的とするscFvを産生する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を標的とするscFvおよびsiRNAの両方を産生する（例は、Xiao（シャオ）ら、2014参照）。
【００８３】
当業者は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる追加の遺伝子および遺伝子カセットが当該技術で知られ、および本発明の遺伝学的に操作された細菌によって発現され得ることを理解するであろう。いくらかの実施態様において、治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、治療上分子の発現を増強するために、さらなる転写および翻訳エレメント、たとえば、リボソーム結合部位をも含む。
【００８４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、二以上の抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する。一定の実施態様において、二以上の分子は、消化管炎症を減少させるために、および/または消化管バリア機能を強化するために、相乗的に挙動する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、少なくとも一の抗炎症分子および少なくとも一の消化管バリア機能エンハンサー分子を発現する。一定の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、IL-10およびGLP-2を発現する。別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はIL-10およびブチラートを発現する。
【００８５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、プロピオナート、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、IL-10、IL-27、GLP-2、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、ブチラート、およびプロピオナートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、ブチラート、およびプロピオナートが可能である。治療上分子の任意の適切な組合せは遺伝学的に操作された細菌によって産生され得る。
誘導性調節領域
酸素レベル依存性調節
【００８６】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターを含む。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、前記プロモーターを含む酸素レベル依存性プロモーターまたは制御領域に、作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは、治療上分子が低酸素、微好気性、または嫌気性条件で発現されるように、酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。たとえば、低酸素状態では、酸素レベル依存性プロモーターは対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それにより治療上分子の産生が促進される。
【００８７】
一定の実施態様では、遺伝学的操作細菌は、フマラートおよびナイトラート（硝酸）レダクターゼ調節因子（FNR）応答プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよびナイトラート還元（ANR）応答性プロモーターの嫌気的調節、または異化性ナイトラート呼吸調節因子（DNR）応答性プロモーターの制御下で発現され、それらは転写因子FNR、ANR、またはDNRによってそれぞれ調節され得る抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。
【００８８】
一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、FNR応答性プロモーターを含む。E. coliでは、FNRは、好気性から嫌気性までの代謝への転換を制御する主な転写活性化因子である（Unden（アンデン）ら、1997）。嫌気性状態では、FNRは、嫌気的増殖に適応するための何百もの遺伝子を活性化する活性DNA結合タンパク質に二量体化する。好気性状態では、FNRは酸素によって二量化することが防止され、および不活性である。いくらかの実施態様では、複数の異なるFNR核酸配列は遺伝学的に操作された細菌に挿入される。
【００８９】
代替的な実施態様では、プロモーターは、DNR（Trunk（トランク）ら、2010）またはANR（Ray（レイ）ら、1997）などの代替の酸素レベル依存性プロモーターである。P. aeruginosaにおいて、ANRの嫌気的調節は、酸素制限または嫌気的条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要である（Sawers（サワーズ）、1991；Winteler（ウィンテーラー）ら、1996）。P. aeruginosa ANRはE. coli FNRと相同であり、および「required for the expression of physiological functions which are inducible under oxygen-limiting or anaerobic conditions（コンセンサスFNR部位（TTGAT----ATCAA）はANRおよびFNRによって効率的に認識された）」（Wintelerら、1996）。FNRと同様に、嫌気性状態では、ANRは嫌気的成長に適応する多数の遺伝子を活性化する。好気性状態では、ANRは不活性である。Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas syringae、およびPseudomonas mendocinaはすべてANRの機能的類似体を有する（Zimmermann（シメルマン）ら、1991）。ANRによって調節されるプロモーターが当該技術で知られ、例は、arcDABCオペロンのプロモーター（例は、Hasegawaら、1998を参照）。
【００９０】
FNRファミリーはまた、異化性ナイトラート呼吸調節因子（DNR）を含み（Arai（アライ）ら、1995）、「anaerobic nitrate respiration of Pseudomonas aeruginosa（Pseudomonas aeruginosa（シュードモナス・エルジノーサ、緑膿菌）の嫌気性ナイトラート呼吸）」のためにANRと共に必要とされる転写因子である（Hasegawaら、1998）。一定の遺伝子では、FNR結合モチーフはおそらくDNRによってだけ認識される（Hasegawaら、1998）。いくつかの態様において、遺伝子発現は、当該技術で知られる方法によって、例は、リボソーム結合部位を最適化することおよび/またはmRNA安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【００９１】
FNRプロモーター配列は当該技術で知られ、および任意の適切なFNRプロモーター配列（群）を本発明の遺伝学的に操作された細菌に使用することができる。任意の適切なFNRプロモーターを、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための任意の適切な遺伝子または遺伝子カセットと組み合わせてもよい。非制限的なFNRプロモーター配列は表9に提供される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、以下の一以上を含む：配列番号55、配列番号56、nirB1プロモーター（配列番号57）、nirB2プロモーター（配列番号58）、nirB3プロモーター（配列番号59）、ydfZプロモーター（配列番号60）、強いリボソーム結合部位に融合したnirBプロモーター（配列番号61）、強力なリボソーム結合部位に融合したydfZプロモーター（配列番号62）、fnrS、嫌気的に誘導された低分子RNA遺伝子（fnrS1プロモーター配列番号63またはfnrS2プロモーター配列番号64）、crp結合部位に融合したnirBプロモーター（配列番号65）、およびcrp結合部位に融合したfnrS（配列番号66）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、または66、またはそれらの機能的断片のDNA配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。
【表９−１】
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【表９−２】
2018512841.tif 000043
【００９２】
他の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、転写アクチベーター（転写活性化因子）、例は、CRPの結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。迅速に代謝可能な糖質（炭水化物とも言う）、たとえば、グルコースなどのようなものが存在する場合、CRP（サイクリックAMP受容体タンパク質またはカタボライトアクチベータータンパク質またはCAP）は、取り込み、代謝、およびあまり好ましくない炭素源の同化に関与する遺伝子を抑制することによって、細菌において主要な調節的役割を果たす（Wu（ウー）ら、2015）。グルコースに対するこの優先傾向は、グルコース抑制、ならびに炭素代謝産物抑制と呼ばれている（Deutscher（ドイッチャー）、2008；Gorke（ゲルケ）およびStulke（シュルケ）、2008）。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、CRP結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、CRP結合部位に融合されたFNRプロモーターによって制御される。これらの実施態様では、環状AMPは、グルコースが環境中に存在しないときCRPに結合する。この結合は、CRPの立体配座変化を引き起こし、CRPがその結合部位に強く結合することを可能にする。次いで、CRP結合は、直接的タンパク質-タンパク質相互作用を介してFNRプロモーターにRNAポリメラーゼを動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下、サイクリックAMPはCRPに結合せず、および抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写が抑制される。いくらかの実施態様では、転写活性化因子の結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター（例は、FNRプロモーター）を用いて、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する遺伝子または遺伝子カセットは、十分な量のグルコースが存在するとき、例は、インビトロで増殖培地にグルコースを添加することによって、嫌気性条件下で発現されないことを確実にする。
【００９３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜株由来の酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜株由来の酸素レベル感知転写因子、例は、FNR、ANRまたはDNRを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種の酸素レベル依存性転写因子および/またはプロモーターは、同じ条件下に細菌における自然な転写因子およびプロモーターと比較して、低酸素条件下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の産生を増加させる可能性がある。一定の実施態様では、非自然酸素レベル依存性転写因子は、N. gonorrhoeae（ナイセリア・ゴノレエ、淋菌とも言う）由来のFNRタンパク質である（例は、Isabella（イサベラ）ら、2011参照）。いくらかの実施態様では、対応する野生型転写因子を欠失または変異させて野生型活性を減少または排除する。代わりの実施態様では、対応する野生型転写因子は無傷のままであり、および野生型活性を保持する。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【００９４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、酸素レベル依存性転写因子、たとえば、FNR、ANRまたはDNRなどのようなものをコードする野生型遺伝子および同じサブタイプの細菌由来の野生型プロモーターに対して変異した対応するプロモーターを含む。変異したプロモーターは、同じ条件下で野生型プロモーターと比較して、低酸素条件下に抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の産生を増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例は、FNR-、ANR-またはDNR-応答性プロモーター、および同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異した対応する転写因子を含む。変異転写因子は、同じ条件下で野生型転写因子と比較して、低酸素条件下に抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を増加させる。一定の実施態様では、変異酸素レベル依存性転写因子は、二量体化およびFNR活性を増強するアミノ酸置換を含むFNRタンパク質である（例は、Moore（ムーア）ら、2006参照）。いくらかの実施態様では、酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターの両方が、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を低酸素条件下に増加させるために同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【００９５】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、酸素レベル感知転写因子、例は、FNR、ANRまたはDNRで、それはその自然なプロモーター、誘導性のプロモーター、自然なプロモーターよりも強力なプロモーター、例は、GlnRSプロモーター、P（Bla）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるものであり、それをコードする遺伝子を含む。いくらかの場合、発現安定性を高めるために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル依存性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、酸素レベル依存性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、酸素レベル依存性転写因子の発現は、治療上分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、酸素レベル依存性転写因子および治療上分子は、プロモーター領域から発散的に転写される。
【００９６】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、酸素レベル感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例は、fnr遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子および治療上分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子および治療分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは同じプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子および治療分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、酸素レベル感知転写因子をコードする遺伝子および治療分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは同じ染色体上に存在する。
【００９７】
いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体において存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、発現は、当技術で知られる方法、例は、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および/またはmRNA安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【００９８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、そのように、遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は宿主細胞において発現されることができ、そして宿主細胞は、インビトロで、例は、培地において、および/またはインビボで、例は、消化管において、生存および/または増殖することができる。いくらかの実施態様において、細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは低コピープラスミドにて発現される。いくらかの実施態様において、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、低コピープラスミドは非誘導条件下で漏出性発現（leaky expression）を減少させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは高コピープラスミドで発現される。いくらかの実施態様において、高コピープラスミドは遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に発現される。
【００９９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）の複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）はプラスミド上に存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は染色体において存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。
【０１００】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で少なくとも一の抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下同じサブタイプの未修飾細菌と比べて、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍だけ減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるT制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；T調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症性バイオマーカーを、例は、qPCRによってアッセイすること；PCRアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および/またはサイトカインアッセイキットによって測定し得る（Mesoscale、Cayman Chemical、Qiagen）（メソスケール、ケイマン・ケミカル、キアゲン）。
【０１０１】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件の抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子について、同じ条件下の同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍多く生成する。一定の非修飾細菌は検出可能なレベルの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝学的に改変された形態を使用する実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子は低酸素条件下で検出可能であろう。
【０１０２】
一定の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルの測定方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるものは、当該技術において知られている（例は、Aboulnagaら、2013参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル/細菌光学密度（OD）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットでの一以上の遺伝子産物の活性および/または発現を測定することは、ブチラート生産のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地においてブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素状態で、ブチラートの少なくとも約1nM/OD、少なくとも約10nM/OD、少なくとも約100nM/OD、少なくとも約500nM/OD、少なくとも約1μM/OD、少なくとも約10μM/OD、少なくとも約100μM/OD、少なくとも約500μM/OD、少なくとも約1mM/OD、少なくとも約2mM/OD、少なくとも約3mM/OD、少なくとも約少なくとも約10mM/OD、少なくとも約20mM/OD、少なくとも約30mM/OD、または少なくとも約50mM/ODを生成する。
【０１０３】
一定の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はプロピオナートである。プロピオナートレベルの測定方法、質量分析法、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるものは、当該技術で知られる（例は、Hillman（ヒルマン）、1978；Lukovac（ルコバック）ら、2014参照）。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットにおいて一以上の遺伝子産物の活性および/または発現を測定することは、プロピオナート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、およびプロピオナート生成を測定するために溶解させる。代わりの実施態様では、プロピオナート産生を細菌細胞培地において測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、低酸素状態の下で少なくとも約1μM、少なくとも約10μM、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約1mM、少なくとも約2mM、少なくとも約3mM 、少なくとも約5mM、少なくとも約10mM、少なくとも約15mM、少なくとも約20mM、少なくとも約30mM、少なくとも約40mM、または少なくとも約50mMのプロピオナートを生成する。
RNS依存性調節
【０１０４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも一の反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現を直接または間接的に駆動し、したがってRNSレベルと比較して分子の発現を制御することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される。たとえば、調整可能な調節領域はRNS誘導性調節領域であり、および分子はブチラートであり；RNSが、例は、炎症組織において存在するとき、RNS感知転写因子が調節領域に結合および/または活性化し、およびブチロジーニック遺伝子カセットの発現を駆動し、それによって抗炎症および/または消化管バリア増強効果を発揮するブチラートが産生される。その後、炎症が緩和されるとき、RNSレベルが低下し、およびブチラート生成が減少または排除される。
【０１０５】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS誘導性調節領域であり；RNSの存在下で、転写因子がRNSを感知し、およびRNS誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はRNSを感知し、および続いてRNS誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、RNSの非存在下でRNS誘導調節領域に結合し；転写因子がRNSを感知するとき、それはコンフォメーション変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０１０６】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS誘導性調節領域であり、およびRNSを感知する転写因子はNorRである。NorRは、「is an NO-responsive transcriptional activator that regulates expression of the norVW genes encoding flavorubredoxin and an associated flavoprotein, which reduce NO to nitrous oxide（フレーバーブレドキシンおよび関連するフラビンタンパク質をコードするnorVW遺伝子の発現を調節するNO応答性転写活性化因子であり、それはNOを亜酸化窒素に還元する」（Spiro（スピロ）2006）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、NorRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なRNS応答性調節領域を含み得る。NorRによって活性化され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Spiro、2006；Vine（バイン）ら、2011；Karlinsey（カーリンシー）ら、2012；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されたnorVW由来のRNS誘導性調節領域を含む。RNSの存在下で、NorR転写因子はRNSを感知し、およびnorVW調節領域に活性化し、それによって作動可能に連結されたブチロジーニック遺伝子カセットの発現およびブチラート産生が促進される。
【０１０７】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS誘導性調節領域であり、およびRNSを感知する転写因子はDNRである。DNR（異化性ナイトラート呼吸調節因子）は、酸化窒素の存在下で「promotes the expression of the nir, the nor and the nos genes（nir、norおよびnos遺伝子の発現を促進する）」（Castiglioneら、2009）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、DNRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なRNS応答性調節領域を含み得る。DNRによって活性化され得る遺伝子は当技術において知られる（例は、Castiglioneら、2009；Giardina（ジャルディナ）ら、2008参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるnorCB由来のRNS誘導性調節領域を含む。RNSの存在下、DNR転写因子はRNSを感知し、およびnorCB調節領域に活性化し、それによって作動可能に連結されたブチロジーニック遺伝子カセットの発現およびブチラート産生が促進される。いくらかの実施態様では、DNRはPseudomonas aeruginosa（緑膿菌）DNRである。
【０１０８】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑える。RNSの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが抑制解除される。
【０１０９】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS抑制解除調節領域であり、およびRNSを感知する転写因子はNsrRである。NsrRは、「an Rrf2-type transcriptional repressor [that] can sense NO and control the expression of genes responsible for NO metabolism（Rrf2型転写抑制因子で、［それは］NOを感知し、およびNO代謝を担う遺伝子の発現を制御することができる）」（Isabellaら、2009）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、NsrRによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なRNS応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様では、NsrRはNeisseria gonorrhoeae（ナイセリア・ゴノレエ）NsrRである。NsrRによって抑制され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Isabellaら、2009；Dunn（ダン）ら、2010；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるnorB由来のRNS抑制解除調節領域を含む。RNSの存在下、NsrR転写因子はRNSを感知し、およびもはやnorB調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結されるブチロジーニック遺伝子カセットを抑制解除し、およびブチラートを産生する。
【０１１０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然な遺伝子の発現を調節しないRNS感知性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のRNS感知性転写因子を発現し、そこでは、転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌はEscherichia coliであり、およびRNS感知性転写因子はNsrRで、例は、Neisseria gonorrhoeae由来であり、そこでは、Escherichia coliは前記NsrRについての結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０１１１】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はRNS抑制性調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；RNSの存在下、転写因子はRNSを感知し、およびRNS抑制性調節領域に結合し、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、RNS感知性転写因子は、プロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。
【０１１２】
これらの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を発現するために使用される2つの抑制因子活性化調節回路を含み得る。2つの抑制因子活性化制御回路は、第1のRNS感知抑制因子および第2の抑制因子を含み、これは遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結される。これらの実施態様の1つの態様において、RNS感知性抑制因子は遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第2の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第2の抑制因子の例には、制限されないが、TetR、C1、およびLexAが含まれる。第1の抑制因子による結合がない場合（RNSの不存在下で生じる）、第2の抑制因子が転写され、それは遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットの発現を抑制する。第1の抑制因子による結合の存在下で（RNSの存在下で起こり）、第2の抑制因子の発現は抑制され、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットが発現される。
【０１１３】
RNS応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に応じて、遺伝子発現を誘導、抑制解除、または抑制することができる。1つ以上のタイプのRNS感知性転写因子および対応する調節領域配列は、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、1つのタイプのRNS感知性転写因子、例は、NsrR、および対応する1つの調節領域配列、例は、norBからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、1つのタイプのRNS感知性転写因子、例は、NsrR、および2つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、norBおよびaniAからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、2つ以上のタイプのRNS感知性転写因子、例は、NsrRおよびNorR、および2つ以上の対応する調節領域配列、例は、norBおよびnorRからのものそれぞれを含む。1つのRNS応答調節領域は、1よりも多くの転写因子に結合することができてよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、2つ以上のタイプのRNS感知性転写因子および1つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのRNS調節された調節領域の核酸配列は当該技術で知られる（例は、Spiro、2006；Isabellaら、2009；Dunnら、2010；Vineら、2011；Karlinseyら、2012参照）。
【０１１４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、nsrR遺伝子を含み、それはその自然なプロモーター、誘導性プロモーター、自然なプロモーターよりも強力なプロモーター、例は、GlnRSプロモーターまたはP（Bla）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下でRNS感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、RNS感知性転写因子および治療上の分子は、プロモーター領域から発散的に転写される。
【０１１５】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のRNS感知性転写因子のための遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のRNS応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のRNS感知性転写因子および対応するRNS応答性調節領域を含む。異種RNS感知性転写因子および調節領域は、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然な転写因子および調節領域と比較して、RNSの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させることができる。
【０１１６】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、RNS感知性転写因子、NsrR、およびNeisseria gonorrhoeae由来の対応する調節領域、nsrRを含む。いくらかの実施態様では、自然なRNS感知性転写因子、例は、NsrRは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なRNS感知性転写因子、例は、NsrRを欠失または変異させる。
【０１１７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、RNS感知性転写因子をコードする内在性遺伝子、例は、nsrR遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、RNS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０１１８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、RNS感受性転写因子、例は、NsrR遺伝子をコードする野生型遺伝子、および対応する調節領域、例は、norB調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、同じ条件下で野生型調節領域と比較して、RNSの存在下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型RNS応答性調節領域、例は、norB調節領域、および同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される対応する転写因子、例は、NsrRを含む。変異転写因子は、同じ条件下で野生型転写因子と比較して、RNSの存在下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を増加させる。いくらかの実施態様では、RNS感知性転写因子および対応する調節領域の両方が、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現をそのRNSの存在下で増加させるために、同じサブタイプの細菌からの野生型配列に対して変異される。
【０１１９】
NsrRおよびnorBプロモーターをコードする遺伝子を含む模範的なRNS調節構築物の核酸配列を表10および表11に示す。表10は、nsrR、norBの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセット（pLogic031-nsrR-norB-ブチラート構築物；配列番号67）をコードする遺伝子を含む模範的なRNS調節構築物の核酸配列を示す。NsrRをコードする配列は下線および太字で示され、およびNsrR結合部位、すなわち、norBの調節領域は枠で囲まれる。表11は、nsrR、norBの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセット（pLogic046-nsrR-norB-ブチラート構築物；配列番号68）をコードする遺伝子を含む模範的なRNS調節構築物の核酸配列を示す。NsrRをコードする配列は下線および太字で示され、NsrR結合部位、すなわち、norBの調節領域は枠で囲まれる。tetプロモーターを含む模範的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列は表12および表13に示される。表12は、tetプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む模範的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示す（pLogic031-tet-ブチラート構築物；配列番号69）。TetRをコードする配列に下線を引き、および重複するtetR/tetAプロモーターを枠で囲む。表13は、tetプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む模範的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示す（pLogic046-tet-ブチラート構築物；配列番号70）。TetRをコードする配列に下線を引き、および重複するtetR/tetAプロモーターを枠で囲む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号67、68、69、または70、またはその機能的断片のDNA配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【０１２０】
いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびRNSによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体に存在し、およびRNSによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、発現は、当技術で知られる方法によって、例は、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および/またはmRNA安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【０１２１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、そのように遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は宿主細胞において発現されることができ、そして宿主細胞は、インビトロで、例は、培地中で、および/またはインビボで、例は、腸内で、生存および/または増殖することが可能である。いくらかの実施態様において、細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは低コピープラスミド上に発現される。いくらかの実施態様において、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、低コピープラスミドは、非誘導条件下で漏出発現を減少させるために有用であり得る。いくつかの態様において、遺伝子または遺伝子カセットは高コピープラスミド上に発現される。いくらかの実施態様において、高コピープラスミドは遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に発現される。
【０１２２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）の複数のコピーを含むことができる。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は、プラスミド上に存在し、およびRNS応答性調節領域に作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は、染色体に存在し、およびRNS応答性調節領域に作動可能に連結される。
【０１２３】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）のいずれかを、一以上の組込み部位で細菌染色体に組み込むことができる。たとえば、ブチロジーニック遺伝子カセットの一以上のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれたブチロジーニック遺伝子カセットの複数のコピーを有することにより、ブチラートのより一層多くの産生が可能になり、および発現レベルの微調整も可能になる。あるいはまた、治療上の遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）に加えて、ここに記載の異なる回路、たとえば、任意のキルスイッチ回路などのようなものを、一以上の異なる組込み部位で細菌染色体に組み込んで、複数の異なる機能を実行することができた。
【０１２４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、RNSの存在下で少なくとも1つの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて疾患病変を計数すること；末梢血におけるT制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；T調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーを、例は、qPCRによってアッセイすること；PCRアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および/またはサイトカインアッセイキットによって測定することができる（Mesoscale、Cayman Chemical、Qiagen）。
【０１２５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子についてRNSの存在下で、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はRNSの存在下で検出可能であろう。
【０１２６】
一定の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルを測定する方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によってのものは、当該技術において知られる（例は、Aboulnagaら、2013参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル/細菌光学密度（OD）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットにおいて一以上の遺伝子産物の活性および/または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地においてブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、RNSの存在下でブチラートの少なくとも約1nM/OD、少なくとも約10nM/OD、少なくとも約100nM/OD、少なくとも約500nM/OD、少なくとも約1μM/OD、少なくとも約10μM/OD、少なくとも約100μM/OD、少なくとも約500μM/OD、少なくとも約1mM/OD、少なくとも約2mM/OD、少なくとも約3mM/OD、少なくとも約5mM/OD、少なくとも約10mM/OD、少なくとも約20mM/OD、少なくとも約30mM/OD、または少なくとも約50mM/ODを生成する。
ROS依存性調節
【０１２７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも一の活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現を直接的または間接的に駆動し、そうしてROSレベルに対して分子の発現を制御することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される。たとえば、調整可能な調節領域はROS誘導性調節領域であり、および分子はブチラートであり；ROSが存在するとき、例は、炎症組織において、ROS感知性転写因子は調節領域を結合および/または活性化し、およびブチロジーニック遺伝子カセットの発現を駆動し、それによって抗炎症および/または消化管バリア強化効果を発揮するブチラートが産生される。その後、炎症が緩和されるとき、ROSレベルが低下し、およびブチラート産生が減少または排除される。
【０１２８】
いくらかの実施態様では、チューナブル（調整可能な）調節領域はROS誘導性調節領域であり；ROSの存在下で、転写因子はROSを感知し、およびROS誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はROSを感知し、および続いてROS誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、ROSの非存在下で、ROS誘導性調節領域に結合する。転写因子がROSを感知するとき、それはコンフォメーションの変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０１２９】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS誘導性調節領域であり、およびROSを感知する転写因子はOxyRである。OxyRは、「functions primarily as a global regulator of the peroxide stress response（主に過酸化水素ストレス応答の全体的調節因子として機能し」、および多数の遺伝子、例は、「genes involved in H2O2detoxification (katE, ahpCF), heme biosynthesis (hemH), reductant supply (grxA, gor, trxC), thiol-disulfide isomerization (dsbG), Fe-S center repair (sufA-E, sufS), iron binding (yaaA), repression of iron import systems (fur)（H2O2解毒（katE、ahpCF）、ヘム生合成（hemH）、還元剤供給（grxA、gor、trxC）、チオール-ジスルフィド異性化（dsbG）、Fe-S中心修復（sufA-E、sufS）、鉄結合（yaaA）、鉄の取り込みシステムの抑制（fur）」および「OxyS, a small regulatory RNA（OxyS、低分子調節性RNA）」（Dubbs（ダブス）ら、2012）において関与する遺伝子を調節可能である。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、OxyRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。OxyRによって活性化され得る遺伝子はこの技術において知られる（例は、Zheng（ツェン）ら、2001；Dubbsら、2012；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるoxyS由来のROS誘導性調節領域を含む。ROS、例は、H2O2の存在下、OxyR転写因子はROSを感知し、およびoxyS調節領域に対して活性化し、それによって作動可能に連結されたブチロジーニック遺伝子カセットの発現を駆動し、およびブチラートを産生する。いくらかの実施態様において、OxyRはE. coliのoxyR遺伝子によってコードされる。いくらかの実施態様において、oxyS調節領域はE.coliのoxyS調節領域である。いくらかの実施態様では、ROS誘導性調節領域は、katG、dps、およびahpCの調節領域から選定される。
【０１３０】
代わりの実施態様では、調整可能な調節領域はROS誘導性調節領域であり、およびROSを感知する対応する転写因子はSoxRである。SoxRが「activated by oxidation of its [2Fe-2S] cluster, it increases the synthesis of SoxS, which then activates its target gene expression（その[2Fe-2S]クラスターの酸化によって活性化されるとき、それはSoxSの合成を増加させ、次いで、その標的遺伝子発現を活性化する）」（Koo（クー）ら、2003）。「SoxR is known to respond primarily to superoxide and nitric oxide（SoxRは主にスーパーオキシドおよび一酸化窒素に反応することが知られ）（Kooら、2003）、H2O2にも応答することが可能である。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、SoxRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。SoxRによって活性化され得る遺伝子は、当該技術で知られる（例は、Kooら、2003；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されたsoxS由来のROS誘導調節領域を含む。ROSの存在下、SoxR転写因子はROSを感知し、およびsoxS調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結されたブチロジーニック遺伝子カセットの発現を駆動し、およびブチラートを産生する。
【０１３１】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；ROSの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが脱抑制される。
【０１３２】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS抑制解除調節領域であり、およびROSを感知する転写因子はOhrRである。OhrRは、「binds to a pair of inverted repeat DNA sequences overlapping the ohrA promoter site and thereby represses the transcription event（ohrAプロモーター部位と重複する一対の逆方向反復DNA配列に結合し、およびそれによって転写事象を抑制する）」が、酸化型OhrRは「unable to bind its DNA target（そのDNA標的に結合できない）」（Duarte（デュアルテ）ら、2010）。OhrRは、「transcriptional repressor [that]… senses both organic peroxides and NaOCl（有機過酸化物およびNaOClの両方を感知する［ところの］転写抑制因子）」（Dubbsら、2012）であり、「weakly activated by H2O2 but it shows much higher reactivity for organic hydroperoxides（H2O2によって弱く活性化されるが、それは有機ヒドロペルオキシドに対してはるかに高い反応性を示す）」（Duarteら、2010）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、OhrRによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。OhrRによって抑制され得る遺伝子は、当技術において知られる（例は、Dubbsら、2012；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチラート遺伝子カセットに作動可能に連結されるohrAからのROS抑制解除調節領域を含む。ROS、例は、NaOClの存在下、OhrR転写因子はROSを感知し、およびもはやohrA調節領域に結合せず、それによって作動的に結合したブチロジーニック遺伝子カセットを脱抑制し、およびブチラートを産生する。
【０１３３】
OhrRはROS応答性調節因子のMarRファミリーのメンバーである。「Most members of the MarR family are transcriptional repressors and often bind to the -10 or -35 region in the promoter causing a steric inhibition of RNA polymerase binding（MarRファミリーのほとんどのメンバーは転写抑制因子であり、およびしばしばRNAポリメラーゼ結合の立体的抑制を引き起こすプロモーターにおいて-10または-35領域に結合する）」（Bussmann（バスマン）ら、2010）。このファミリーの他のメンバーは、当技術で既知であり、および制限されないが、OspR、MgrA、RosR、およびSarZが含まれる。いくらかの実施態様では、ROSを感知する転写因子はOspR、MgRA、RosR、および/またはSarZであり、および本発明の遺伝学的に操作された細菌はOspR、MgRA、RosR、および/またはSarZによって抑制される遺伝子由来の1つ以上の対応する調節領域配列を含む。OspR、MgRA、RosR、および/またはSarZによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Dubbsら、2012参照）。
【０１３４】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS抑制解除調節領域であり、およびROSを感知する対応する転写因子はRosRである。RosRは、「18-bp inverted repeat with the consensus sequence TTGTTGAYRYRTCAACWA（コンセンサス配列TTGTTGAYRYRTCAACWAで18bpの逆方向反復）」に結合し、および「reversibly inhibited by the oxidant H2O2（酸化剤H2O2によって可逆的に抑制される）」（Bussmannら、2010）、「a MarR-type transcriptional regulator（MarRタイプ転写調節因子）」である。RosRは、制限されないが、「a putative polyisoprenoid-binding protein (cg1322, gene upstream of and divergent from rosR), a sensory histidine kinase (cgtS9), a putative transcriptional regulator of the Crp/FNR family (cg3291), a protein of the glutathione S-transferase family (cg1426), two putative FMN reductases (cg1150 and cg1850), and four putative monooxygenases (cg0823, cg1848, cg2329, and cg3084)（推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（cg1322、rosRの上流およびそれから発散する遺伝子）、知覚性ヒスチジン（sensory histidine）キナーゼ（cgtS9）、Crp/FNRファミリーの推定転写調節因子、グルタチオンSトランスフェラーゼファミリー（cg0823）、二つの推定FMNレダクターゼ（cg1150およびcg1850）、および四つの推定モノオキシゲナーゼ（cg1823、cg1848、cg2329、およびcg3084））」を含む多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Bussmannら、2010）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、RosRによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。RosRによって抑制され得る遺伝子は当技術で既知である（例は、Bussmannら、2010；表1参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるcgtS9由来のROS抑制解除性調節領域を含む。ROS、例は、H2O2の存在下、RosR転写因子はROSを感知し、およびもはやcgtS9調節領域に結合せず、それによって作動可能に結合したブチロジーニック遺伝子カセットを脱抑制し、およびブチラートを産生する。
【０１３５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然遺伝子の発現を調節しないROS感受性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のROS感知性転写因子を発現し、そこでは転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はEscherichia coliであり、およびROS感知性転写因子はRosR、例は、Corynebacterium glutamicum（コリネバクテリウム・グルタニカム）由来であり、そこではEscherichia coliは前記RosRのための結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０１３６】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS抑制性制御領域であり、および対応する転写因子の結合は下流遺伝子発現を抑制し；ROSの存在下、転写因子はROSを感知し、およびROS抑制性制御領域に結合し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑制される。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子はプロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ROS感知性転写因子はプロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０１３７】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はROS抑制性調節領域であり、およびROSを感知する転写因子はPerRである。Bacillus subtilis（枯草菌とも言う）では、PerRは「when bound to DNA, represses the genes coding for proteins involved in the oxidative stress response (katA, ahpC, and mrgA), metal homeostasis (hemAXCDBL, fur, and zoaA) and its own synthesis (perR)（DNAに結合するとき、酸化ストレス応答（katA、ahpC、およびmrgA）、金属恒常性（hemAXCDBL、fur、およびzoaA）およびそれ自身の合成（perR）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する）」（Marinhoら、2014）。PerRは、「global regulator that responds primarily to H2O2（主としてH2O2に応答するグローバルレギュレーター（包括調節因子とも言う））」であり（Dubbsら、2012）、および「interacts with DNA at the per box, a specific palindromic consensus sequence (TTATAATNATTATAA) residing within and near the promoter sequences of PerR-controlled genes（perボックス、PerR制御遺伝子のプロモーター配列内およびその近くに存在する特定のパリンドロームコンセンサス配列（TTATAATNATTATAA）にてDNAと相互作用する）」（Marinhoら、2014）。PerRは、「overlaps part of the promoter or is immediately downstream from it（プロモーターの一部と重複するか、またはプロモーターからのすぐ下流にある）」調節領域に結合することができる（Dubbsら、2012）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、PerRによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。PerRによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Dubbsら、2012；表1参照）。
【０１３８】
これらの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を発現するために使用される2つの抑制因子活性化調節回路を含むことができる。2つの抑制因子活性化調節回路は、第1のROS感知抑制因子、例は、PerR、および第2の抑制因子、例は、TetRを含み、それは遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結される。これらの実施態様の1つの態様において、ROS感知性抑制因子は、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第2の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第2の抑制因子の例としては、TetR、C1、およびLexAが挙げられるが、これらに制限されない。いくらかの実施態様では、ROS感知性抑制因子はPerRである。いくらかの実施態様では、第2の抑制因子はTetRである。この実施態様において、PerR抑制性制御領域はTetRの発現を駆動し、およびTetR抑制性調節領域は遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットの発現を駆動する。PerR結合がない場合（ROSの不存在下で生じる）、tetRが転写され、およびTetRは遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットの発現を抑制する。PerR結合の存在下では（ROSの存在下で起こる）、tetR発現が抑制され、および遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットが発現される。
【０１３９】
ROS応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に依存して、遺伝子発現を誘発、抑制解除、または抑制することができる。たとえば、「OxyR is primarily thought of as a transcriptional activator under oxidizing conditions… OxyR can function as either a repressor or activator under both oxidizing and reducing conditions（OxyRは主に酸化条件下で転写活性化因子と考えられている・・・が、OxyRは酸化状態および還元状態の両方で抑制因子またはアクチベーターとして機能することができ）」（Dubbsら、2012）、およびOxyRは「has been shown to be a repressor of its own expression as well as that of fhuF (encoding a ferric ion reductase) and flu (encoding the antigen 43 outer membrane protein)（それ自体の発現の抑制因子であること、ならびにfhuF（鉄イオンレダクターゼをコードする）およびflu（抗原43外膜タンパク質をコードする）のものであることが示された）」（Zhengら、2001）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、OxyRによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様において、OxyRは上記のように、2つの抑制因子活性化調節回路において用いられる。OxyRによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Zhengら、2001；表1参照）。または、たとえば、RosRは多数の遺伝子を抑制することができるが、一定の遺伝子、例は、narKGHJIオペロンを活性化することもできる。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、RosRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含む。さらに、「PerR-mediated positive regulation has also been observed…and appears to involve PerR binding to distant upstream sites（PerR媒介陽性調節も観察されており、そして.遠隔上流部位へのPerR結合を含むようである）」（Dubbsら、2012）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、PerRによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なROS応答性調節領域を含む。
【０１４０】
1つ以上のタイプのROS感知性転写因子および対応する調節領域配列が、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。たとえば、「OhrR is found in both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can coreside with either OxyR or PerR or both（OhrRは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に見出され、およびOxyRまたはPerRまたは両方とも共存することができる）」（Dubbsら、2012）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、1つのタイプのROS感知性転写因子、例は、OxyR、および1つの対応する調節領域配列、例は、oxySからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、1つのタイプのROS感知性転写因子、例は、OxyR、および2つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、oxySおよびkatGからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、2以上のタイプのROS感知性転写因子、例は、OxyRおよびPerR、および2以上の対応する調節領域配列、例は、それぞれoxySおよびkatAからのものを含む。1つのROS応答性調節領域は、1よりも多くの転写因子に結合することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、2以上のタイプのROS感知性転写因子および1つの対応する調節領域配列を含む。
【０１４１】
いくつかの例示的なOxyR調節された調節領域の核酸配列を表14に示す。OxyR結合部位に下線を付し、および太字で示す。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号71、72、73、または74、またはその機能的断片のDNA配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％相同である核酸配列を含む。
【表１４】
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【０１４２】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、その自然プロモーター、誘導性プロモーター、誘導性プロモーター、自然プロモーターよりも強いプロモーター、例は、GlnRSプロモーターまたはP（Bla）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるROS感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、oxyR遺伝子を含む。いくらかの場合、発現安定性を高めるために誘導性プロモーターの制御下でROS感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子の発現は、治療上分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、ROS感知性転写因子および治療上分子はプロモーター領域から発散的に転写される。
【０１４３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のROS感知性転写因子の遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のROS応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のROS感知受性転写因子および対応するROS応答性調節領域を含む。異種ROS感知性転写因子および調節領域は、ROSの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然転写因子および調節領域と比較して、増加させることができる。
【０１４４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ROS感知性転写因子、OxyR、および対応する調節領域、oxyS、Esherichia coli由来のものを含む。いくらかの実施態様では、自然なROS感知性転写因子、例は、OxyRは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なROS感知性転写因子、例は、OxyRが欠損または変異される。
【０１４５】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ROS感知性転写因子をコードする内因性遺伝子、例は、oxyR遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じものの上に存在する。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０１４６】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ROS感知性転写因子をコードする野生型遺伝子、例は、soxR遺伝子、および対応する調節領域、例は、soxS調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、ROSの存在下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を、同じ条件下で野生型調節領域と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型ROS応答性調節領域、例は、oxyS調節領域、および対応する転写因子、例は、OxyRを含み、それは同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される。変異型転写因子は、ROSの存在下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を、同じ条件下で野生型転写因子と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、ROS感知性転写因子および対応する調節領域の両方が、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現をROSの存在下で増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０１４７】
oxySプロモーターを含む例示的なROS調節構築物の核酸配列を表15および表16に示す。OxyRをコードする例示的な構築物の核酸配列を表17に示す。tetプロモーターを含むテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を表18および表19に示す。表15は、例示的なROS調節型oxySプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む模範的なROS調節構築物の核酸配列を示す（pLogic031-oxyS-ブチラート構築物；配列番号75）。表16はoxySプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なROS調節構築物の核酸配列を示す（pLogic046-oxyS-ブチラート構築物；配列番号76）。表17は、OxyRをコードする例示的な構築物の核酸配列を示す（pZA22-oxyR構築物；配列番号77）。表18は、tetプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示す（pLogic031-tet-ブチラート構築物；配列番号78）。TetRをコードする配列に下線を引き、および重複するtetR/tetAプロモーターを枠で囲む。表19は、tetプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示す（pLogic046-tet-ブチラート構築物；配列番号79）。TetRをコードする配列に下線を引き、および重複するtetR/tetAプロモーターを枠で囲む。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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【表１８−８】
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【表１８−９】
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【表１９−１】
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【表１９−２】
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【表１９−３】
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【表１９−４】
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【表１９−５】
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【表１９−６】
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【表１９−７】
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【０１４８】
いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびROSによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体に存在し、およびROSによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、発現は、当技術で既知の方法によって、例は、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および/またはmRNA安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【０１４９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）を保有する安定に維持されるプラスミドまたは染色体を含み、そのように遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は宿主細胞において発現され得、そして宿主細胞は、インビトロで、例は、培地において、および/またはインビボで、例は、消化管において、生存および/または増殖することができる。いくらかの実施態様において、細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは、低コピープラスミド上に発現される。いくらかの実施態様において、低コピープラスミドは、発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、低コピープラスミドは、非誘導条件下での漏出発現を減少させるために有用であり得る。いくつかの態様において、遺伝子または遺伝子カセットは高コピープラスミド上に発現される。いくらかの実施態様において、高コピープラスミドは、遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に発現される。
【０１５０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）の複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は、プラスミド上に存在し、およびROS応答性調節領域に作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は、染色体に存在し、およびROS応答性調節領域に作動可能に連結される。
【０１５１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、ROSの存在下で少なくとも1つの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比べ、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍だけ減少させる。炎症は、当技術において既知の方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるT制御細胞の分化を検出すること、例は、蛍光活性化選別によるもの；T調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーをアッセイすること、例は、qPCRによるもの；PCRアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および/またはサイトカインアッセイキット（Mesoscale、Cayman Chemical、Qiagen）によって測定することができる。
【０１５２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ROSの存在下、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍より多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を有しないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はROSの存在下で検出可能である。
【０１５３】
一定の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルの測定方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるものは、当技術において既知である（例は、Aboulnagaら、2013参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル/細菌光学密度（OD）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセット中の1つ以上の遺伝子産物の活性および/または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地中でブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ROSの存在下、ブチラートの少なくとも約1nM/OD、少なくとも約10nM/OD、少なくとも約100nM/OD、少なくとも約500nM/OD、少なくとも約1μM/OD、少なくとも約10μM/OD、少なくとも約100μM/OD、少なくとも約500μM/OD、少なくとも約1mM/OD、少なくとも約2mM/OD、少なくとも約3mM/OD、少なくとも約5mM/OD、少なくとも約10mM/OD、少なくとも約20mM/OD、少なくとも約30mM/OD、または少なくとも約50mM/ODを生成する。
複数の作用メカニズム
【０１５４】
いくらかの実施態様において、細菌は、複数の異なる作用を実行する複数の作用機構（MOAs）、例は、同じ生成物の複数のコピーを生成する（例は、コピー数を高める）回路または複数の回路を含むように遺伝学的に操作される。いくらかの実施態様では、遺伝子修飾細菌は、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、プロピオナート、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、IL-10、IL-27、GLP-2、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、ブチラート、およびプロピオナートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、ブチラート、およびプロピオナートのものが可能である。治療上の分子の任意の適切な組合せは、遺伝学的に操作された細菌によって産生され得る。挿入部位の例には、図51に示されるmalE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、dapA、cea、およびその他が含まれるが、これらに制限されない。たとえば、malE/K、insB/I、araC/BAD、およびlacZの4つの異なる挿入部位に挿入されたGLP-2の四コピーを含みうる。あるいはまた、遺伝学的に操作された細菌は、3つの異なる挿入部位、例は、malE/K、insB/I、およびlacZに挿入された三コピーのGLP-2、および3つの異なる挿入部位、例は、dapA、cea、およびaraC/BADに挿入された三コピーのブチラート遺伝子カセットを含みうる。
分泌
【０１５５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の細胞質からの抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌することができる自然な分泌機構（例は、グラム陽性細菌）または非自然な分泌機構（例は、グラム陰性細菌）をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを横切って基質を輸送するために高度化した分泌システムを進化させた。基質、たとえば、小分子、タンパク質、およびDNAなどのようなものは、細胞外空間またはペリプラズム（たとえば、消化管内腔または他の空間など）中に放出され、標的細胞中に注入され、または細菌膜に結合され得る。
【０１５６】
グラム陰性細菌では、分泌機械は、内膜および外膜の一方または両方に広がっていてもよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な二重膜貫通分泌系（double membrane-spanning secretion system）をさらに含む。二重膜貫通型分泌系には、制限されないが、I型分泌系（T1SS）、II型分泌系（T2SS）、III型分泌系（T3SS）、IV型分泌系（T4SS）、VI型分泌系（T6SS）、および多剤排出ポンプ（multi-drug efflux pumps）の抵抗性結節分割（resistance-nodulation-division）（RND）ファミリーが含まれる（Pugsley（パグスレイ）、1993；Gerlach（ガーラック）ら、2007；Collinson（コリンソン）ら、2015；Costa（コスタ）ら、2015；Reeves（リーブス）ら、2015；WO2014138324A1（国際公開第2014/138324 A1号）、参照によりここに組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図68-71に示す。グラム陰性様細胞エンベロープを有するマイコバクテリアはまた、VII型分泌系（T7SS）をコードし得る（Stanley（スタンリー）ら、2003）。T2SSを除いて、二重膜貫通分泌物（double membrane-spanning secretions）は概して、基質をバクテリア細胞質から直接細胞外空間または標的細胞に輸送する。対照的に、T2SSおよび分泌系は、外膜だけに広がるもので二つの段階機構を用いるものであってもよく、そこでは内膜貫通型輸送体によって基質がペリプラズムに最初に転位され、および次いで外膜に移されるか、または細胞外空間中に分泌される。外膜貫通分泌系には、制限されないが、V型分泌または自己輸送体系（T5SS）、毛様体分泌系（curli secretion system）、および線毛アセンブリーのためのシャペロン-アッシャー経路（chaperone-usher pathway）が含まれる（Saier（サイアー）、2006；Costa（コスタ）ら、2015）。
【０１５７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、Shigella（シゲラ属、赤痢菌）、Salmonella（サルモネラ属）、E. coli、ビブリオ（Bivrio）、Burkholderia（バークホルデリア属）、Yersinia（エルシニア属）、Chlamydia（クラミジア属）、またはPseudomonas（シュードモナス属）由来のIII型またはIII型様の分泌系（T3SS）をさらに含む。T3SSは、針状複合体を通して細菌の細胞質から宿主の細胞質にタンパク質を輸送することができる。T3SSは、細菌の細胞質から分子を分泌するが、宿主の細胞質に分子を注入しないように修飾することができる。したがって、分子は、消化管内腔または他の細胞外空間に分泌される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、前記修飾T3SSを含み、および細菌細胞質から抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌することができる。いくらかの実施態様では、分泌分子は分子が細菌から分泌されることを可能にするIII型分泌配列を含む。
【０１５８】
いくらかの実施態様において、鞭毛III型分泌経路（flagellar type III secretion pathway）は抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌するために使用される。いくらかの実施態様において、不完全な鞭毛は、分子を自然な鞭毛成分のN末端鞭毛分泌シグナルに組換え的に融合させることによって治療上の分子を分泌するために使用される。このようにして、細胞内で発現されたキメラ分子を、内膜および外膜を介して周囲の宿主環境に動員することができる。
【０１５９】
いくらかの実施態様において、V型自己輸送体分泌系を用いて、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌する。機構の単純さおよび比較的大きなタンパク質フラックスを扱う能力のために、V型分泌系は組換えタンパク質の細胞外産生にとって魅力的である。図69に示すように、治療上のペプチド（スター）は、N末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインに融合することができる。N末端シグナル配列はタンパク質をSecA-YEG機構に導き、それがタンパク質を内膜通過させてペリプラズムに移動させ、その後シグナル配列の切断が続く。ベータドメインは、ベータドメインが折り畳まれ、およびベータ-バレル構造として外膜に挿入されるBam複合体（‘ベータ-バレルアセンブリ機構’）に補充される。治療上のペプチドは、リンカー配列の前にベータ-バレル構造の中空細孔を貫通する。一旦細胞外環境に曝露されると、治療上のペプチドは、自己触媒的開裂（Bam複合体の左側）によって、またはリンカーにおいてコンプリメンタリープロテアーゼ切断部位（complimentary protease cut site）に対する膜結合ペプチダーゼの標的化（黒色のはさみ；Bam複合体の右側）によって、リンカーシステムから解放される。したがって、いくらかの実施態様では、分泌される分子、たとえば、異種タンパク質またはペプチドなどのようなものは、分子が細菌から分泌されるように、自己輸送体のN末端分泌シグナル、リンカー、およびベータドメインを含む。
【０１６０】
いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌するために溶血素に基づく分泌系が使用される。I型分泌系は、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外空間に直接転位させる利点を提供し、他の分泌型の2段階プロセスを回避する。図71は、尿路病原性Escherichia coliのアルファ-溶血素（HlyA）を示す。この経路は、HlyB、ATP結合カセットトランスポーター； HlyD、膜融合タンパク質、およびTolC、外膜タンパク質を使用する。これらの3つのタンパク質の集合体は、内側膜および外側膜の両方を通るチャネルを形成する。自然には、このチャネルはHlyAを分泌するために使用されるが、しかし、本開示の治療上の分子を分泌するために、HlyAの分泌シグナル含有C末端部分は、治療上の分子（スター）のC末端部分に融合して、この分子の分泌が媒介される。
【０１６１】
代わりの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な単一膜貫通分泌系をさらに含む。単一膜貫通輸送体は、分泌系の成分として作用し得るか、または基質を独立して送り出し得る。そのような輸送体（トランスポーターとも言う）には、制限されないが、ATP結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛/毒性関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、包括的分泌系（例は、E.coliでのSecYEG複合体）、マイコバクテリアおよび種々のタイプのグラム陽性細菌におけるアクセサリー分泌系（例は、Bacillus anthracis（バチルス・アンシラシス）、Lactobacillus johnsonii、Corynebacterium glutamicum、Streptococcus gordonii（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）、Staphylococcus aureus（スタフィロコッカス・アウレウス））、およびツイン-アルギニン透過（TAT）（Saier、2006；Rigel（リゲル）およびBraunstein（ブラウンスタイン）、2008；Albiniak（アルビニアク）ら、2013）が含まれる。包括的分泌系およびTAT系は、開裂可能なN末端シグナルペプチドを有する基質を共にペリプラズム中に送り出すことができ、および生物製剤生産の関連において探求されたことが知られる。しかしながら、TAT系は、折り畳まれた基質を輸送することができ、従って、早すぎるか、または不適切な折り畳みの可能性を排除するという点で、特別な利点を提供し得る。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、TATまたはTAT様の系を含み、細菌細胞質から抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を分泌することができる。当業者は、ここに開示される分泌系が、細菌の異なる種、菌株、およびサブタイプにおいて作用するように修飾され得、および/または異なるエフェクター分子を送るように適合され得ることを理解するであろう。
必須遺伝子および栄養要求体
【０１６２】
ここに使用されるように、用語「必須遺伝子」は、細胞増殖および/または生存のために必要な遺伝子に言及する。細菌の必須遺伝子は、当業者によく知られ、および遺伝子の指向的欠失および/またはランダム変異誘発およびスクリーニングによって識別することができる（例は、Zhang（チャン）およびLin、2009、DEG5.0、原核生物および真核生物の双方における必須遺伝子のデータベース、Nucl.Acids Res.（ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ）、37：D455-D458およびGerdes（ゲルデス）ら、「Essential genes on metabolic maps（代謝マップに関する必須遺伝子）」、Curr. Opin. Biotechnol.（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）、17（5）：448-456、それらのそれぞれの全内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０１６３】
「必須遺伝子」は有機体が存在する状況および環境に依存し得る。たとえば、必須遺伝子の変異、修飾、または切除により、本開示の遺伝学的に操作された細菌が栄養要求株になる可能性がある。栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠如しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌の死滅が起こることを意図する。
【０１６４】
栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠損しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくらかの実施態様では、ここに記載の遺伝学的に操作された細菌のいずれも、細胞生存および/または増殖に必要な遺伝子の欠失または変異を含む。一実施態様では、必須遺伝子はDNA合成遺伝子、たとえば、thyAである。別の実施態様では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、たとえば、dapAである。さらに別の実施態様において、必須遺伝子はアミノ酸遺伝子、たとえば、serAまたはMetAである。細胞生存および/または増殖に必要な任意の遺伝子は、標的にすることができ、制限されないが、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proABおよびthi1を、対応する野生型遺伝子産物が細菌中で産生されない限り含む。たとえば、チミンは、細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり；その不存在下では、細菌は細胞死を受ける。thyA遺伝子は、チミジル酸シンテターゼをコードし、dUMPをdTMPに変換することによってチミン合成における第1段階を触媒する酵素である（Sat（サト）ら、2003）。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、thyA遺伝子が欠失され、および/または無関係な遺伝子で置換されたthyA栄養要求株である。thyA栄養要求株は、インビトロで増殖培地にチミンを添加することによって、またはインビボでヒト消化管内で自然に見出される高チミンレベルの存在下で、十分な量のチミンが存在するときにだけ増殖することができる。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳類の消化管内に存在するときに補完される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがなければ、thyA栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０１６５】
ジアミノピメリン酸（DAP）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、および細菌細胞壁発達に必要である（Meadow（メドウ）ら、1959；Clarkson（クラークスン）ら、1971）。いくらかの実施態様では、ここに記載される遺伝学的に操作された細菌のいずれかは、dapD遺伝子が欠失し、および/または無関係の遺伝子で置換されたdapD栄養要求株である。dapD栄養要求体は、十分な量のDAPが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にDAPを添加することによって増殖することができる。十分な量のDAPがなければ、dapD栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０１６６】
他の実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、uraA遺伝子が欠失され、および/または無関係の遺伝子で置換されたuraA栄養要求体である。uraA遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよび引き続く代謝を促進する膜結合輸送体であるUraAをコードする（Andersen（アンデルセン）ら、1995）。uraA栄養要求体は、十分な量のウラシルが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にウラシルを添加することによって増殖することができる。十分な量のウラシルがなければ、uraA栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で細菌が生存しないことを確実にするために、栄養要求性改変が使用される。
【０１６７】
複雑なコミュニティでは、細菌がDNAを共有することが可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、非栄養要求株からDNAを受け取ることができ、それはゲノム欠失を修復し、および栄養要求株が恒久的に救出される。したがって、一よりも多くの栄養要求性を有する細菌株を操作することにより、栄養要求性を救済するのに十分な時間にDNA転移が起こる可能性を大きく低下させる可能性がある。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および/または増殖に必要な2つ以上の遺伝子の欠失または変異を含む。
【０１６８】
必須遺伝子の他の例としては、制限されないが、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、lpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yefM、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、ftsB、eno、pyrG、chpR、lgt、fbaA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murI、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、lspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、ftsL、ftsI、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、lpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、infB、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsI、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fmt、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yrfF、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、dfp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、lpxA、lpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、lnt、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、lpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymfK、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabI、racR、dicA、ydfB、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ、およびgpsAが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に既知である。
【０１６９】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（SLiDE）細菌細胞である。SLiDE細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でだけ増殖する1つ以上の必須遺伝子に変異を有する合成栄養要求体である（Lopez（ロペズ）およびAnderson（アンダーソン）、「Synthetic Auxotrophs with Ligand-Dependent Essential Genes for a BL21 (DE3) Biosafety Strain（BL21（DE3）バイオセーフティ株についてリガンド依存性必須遺伝子を有する合成栄養要求体）」、ACS Synthetic Biology（ACSシンセティック・バイオロジー）（2015）DOI：10.1021/acssynbio.5b00085参照、その全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０１７０】
いくらかの実施態様では、SLiDE細菌細胞は必須遺伝子において変異を含む。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、pheS、dnaN、tyrS、metG、およびadkからなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345Cの1つ以上を含むdnaNである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345Cを含むdnaNである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188Lの1以上を含むpheSである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188Lを含むpheSである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：L36V、C38A、およびF40Gの1以上を含むtyrSである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異L36V、C38A、およびF40Gを含むtyrSである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：E45Q、N47R、I49G、およびA51Cの1以上を含むmetGである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異E45Q、N47R、I49G、およびA51Cを含むmetGである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：I4L、L5I、およびL6Gの1以上を含むadkである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異I4L、L5I、およびL6Gを含むadkである。
【０１７１】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はリガンドによって補完される。いくらかの実施態様において、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、2-アミノベンゾチアゾール、インドール-3-酪酸、インドール-3-酢酸、およびL-ヒスチジンメチルエステルからなる群より選ばれる。たとえば、metG（E45Q、N47R、I49G、およびA51C）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、2-アミノベンゾチアゾール、インドール-3-酪酸、インドール-3-酢酸、またはL-ヒスチジンメチルエステルによって補完される。dnaN（H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345C）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは2-アミノベンゾチアゾールによって補完される。pheS（F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188L）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2-アミノベンゾチアゾールによって補完される。tyrS（L36V、C38A、およびF40G）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2-アミノベンゾチアゾールによって補完される。adk（I4L、L5I、およびL6G）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。
【０１７２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする一よりも多い変異必須遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、細菌細胞は2つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞は、tyrS（L36V、C38A、およびF40G）およびmetG（E45Q、N47R、I49GおよびA51C）において変異を含む。他の実施態様では、細菌細胞は、3つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞はtyrS（L36V、C38A、およびF40G）、metG（E45Q、N47R、I49G、およびA51C）、およびpheS（F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188L）において変異を含む。
【０１７３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はコンディショナルな（条件的なとも言う）栄養要求体であり、その必須遺伝子（群）は、図57-61に示されるアラビノース系を用いて置換される。
【０１７４】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求株であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ構成要素およびシステムのいずれかなどのようなものも含む。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および/または増殖に必要な必須遺伝子において、たとえば、DNA合成遺伝子において、たとえば、thyA、細胞壁合成遺伝子、たとえば、dapAおよび/またはアミノ酸遺伝子、例えばserAまたはMetAにおいて、欠失または変異を含むことができ、およびまた環境条件（群）および/またはシグナル（群）に応答して（たとえば、記載のアラビノース系などのようなもの）発現する1以上の転写活性化因子によって調節される毒素遺伝子を含むことができ、または外因性環境条件（群）および/またはシグナル（群）（たとえば、ここに記載のリコンビナーゼ系などのようなもの）を感知して発現される1以上のリコンビナーゼによって調節されうる。他の実施態様は、Wright（ライト）ら、「GeneGuard: A Modular Plasmid System Designed for Biosafety（ジーンガード：バイオセーフティのために設計されたモジュラープラスミドシステム）」ACS Synthetic Biology（2015）4：307-316に記載され、その全体の内容を参照によりここに明示的に組み込む）。いくらかの実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求体であり、およびまた、キルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ成分およびシステムなどのようなもの、ならびに別のバイオセキュリティ（生物学的に安全なとも言う）システム、たとえば、コンディショナルな複製の起点（conditional origin of replication）などのようなものを含む（Wrightら、2015）。他の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生する変異細菌をスクリーニングするために栄養要求性改変を使用することもできる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は抗生物質耐性遺伝子をさらに含む。
遺伝学的調節回路
【０１７５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ここに記載の構築物を発現させるための多層遺伝学的調節回路（multi-layered genetic regulatory circuits）を含む（例は、米国仮特許出願第62/184,811号参照、それはその全体が参照によりここに組み込まれる）。遺伝学的調節回路は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するか、または栄養要求体を救出する変異細菌をスクリーニングするために有用である。特定の実施態様では、本発明は、関心がある1以上の遺伝子を産生する遺伝学的に操作された細菌を選定するための方法を提供する。
【０１７６】
いくらかの実施態様において、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびT7ポリメラーゼ調節遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、T7ポリメラーゼをコードする第一の遺伝子で、そこでは、第一の遺伝子は、FNR応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子（例は、ブチラート）を産生するための第二の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第二の遺伝子または遺伝子カセットは、T7ポリメラーゼによって誘導されるT7プロモーターに作動可能に連結され；および抑制因子、lysYをコードする第三の遺伝子で、T7ポリメラーゼを抑制することができるものを含む。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、および治療上の分子（例は、ブチラート）は発現しない。LysYは構成的に発現され（P-lac構成性）、およびさらにT7ポリメラーゼを抑制する。酸素が存在しない場合、FNRは二量体化し、およびFNR応答性プロモーターに結合し、T7ポリメラーゼはlysY抑制を克服するのに十分なレベルで発現され、および治療上の分子（例は、ブチラート）が発現される。いくらかの実施態様では、lysY遺伝子はさらなるFNR結合部位に作動可能に連結される。酸素が存在しない場合、FNRは二量体化して上記のようにT7ポリメラーゼ発現を活性化し、およびまたlysY発現を抑制する。
【０１７７】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびプロテアーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、mf-lonプロテアーゼをコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子は、FNR応答性プロモーターに作動可能に連結され；Tet調節領域（TetO）に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第2の遺伝子または遺伝子カセット；およびTet抑制因子（TetR）に連結されるmf-lon分解シグナルをコードする第3の遺伝子で、TetRがTet制御領域に結合し、および第2の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。mf-lonプロテアーゼは、mf-lon分解シグナルを認識し、TおよびetRを分解することができる。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、抑制因子は分解されず、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、FNRはFNR応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、それによってmf-lonプロテアーゼの発現が誘導される。mf-lonプロテアーゼは、mf-lon分解シグナルを認識し、およびTetRを分解し、および治療上の分子が発現される。
【０１７８】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および抑制因子調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、第1の抑制因子をコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子はFNR応答性プロモーターに作動可能に連結され；構成的プロモーターを含む第1調節領域に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第2遺伝子または遺伝子カセット；および第2の抑制因子をコードする第3の遺伝子で、第2の抑制因子は、第1の調節領域に結合し、および第2の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第3の遺伝子は、構成的プロモーターを含む第2の調節領域に作動可能に連結され、そこでは、第1の抑制因子は第2の調節領域に結合し、および第2の抑制因子の発現を抑制することができる。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、第1の抑制因子は発現せず、第2の抑制因子は発現し、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、FNRはFNR応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、第1の抑制因子は発現し、第2の抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０１７９】
これらの実施態様において有用な抑制因子の例には、制限されないが、ArgR、TetR、ArsR、AscG、LacI、CscR、DeoR、DgoR、FruR、GalR、GatR、CI、LexA、RafR、QacR、およびPtxS（US20030166191）が含まれる。
【０１８０】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および調節RNAで調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、調節RNAをコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子はFNR応答性プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子を産生するための第2の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第2の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子の翻訳を抑制するmRNAヘアピンを産生することができるヌクレオチド配列にさらに連結される。調節RNAは、mRNAヘアピンを除去し、およびリボソーム結合部位を介して翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、調節RNAは発現せず、およびmRNAヘアピンは治療上の分子の翻訳を妨げる。酸素が存在しない場合、FNRは二量体化し、およびFNR応答性プロモーターに結合し、調節RNAが発現され、mRNAヘアピンが排除され、および治療上の分子が発現される。
【０１８１】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびCRISPR調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、Cas9タンパク質；CRISPRガイドRNAをコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子は、FNR応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子を産生するための第2の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第2の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターを含む調節領域に作動可能に連結され；および構成的プロモーターに作動可能に連結される抑制因子をコードする第3遺伝子で、抑制因子が、調節領域に結合し、および第2の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第3の遺伝子は、CRISPRガイドRNAに結合することができるCRISPR標的配列にさらに連結され、そこでは、CRISPRガイドRNAへの前記結合は、Cas9タンパク質による開裂を誘導し、および抑制因子の発現を抑制する。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、ガイドRNAは発現されず、抑制因子は発現され、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、FNRは二量体化し、およびFNR応答性プロモーターに結合し、ガイドRNAは発現され、抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０１８２】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子はFNR応答性プロモーターに作動可能に連結され、および構成的プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生する第2の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第2の遺伝子または遺伝子カセットは、方向が逆転し（3'から5'）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合して、その向きを元に戻し（5'から3'）て、第2の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導することができる。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現されず、遺伝子または遺伝子カセットは3'から5'配向のままであり、および機能的な治療分子は産生されない。酸素が存在しない場合、FNRは二量体化し、およびFNR応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現され、遺伝子または遺伝子カセットは5'から3'方向に戻され、および機能的な治療上の分子が産生される。
【０１８３】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびポリメラーゼおよびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第1の遺伝子で、そこでは、第1の遺伝子は、FNR応答性プロモーターに作動可能に連結され；T7プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第2の遺伝子または遺伝子カセット；T7ポリメラーゼをコードする第3の遺伝子で、T7ポリメラーゼがT7プロモーターに結合し、および治療上の分子の発現を誘導することができるものを含む。T7ポリメラーゼをコードする第3の遺伝子は、向きを逆転され（3'から5'）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合し、その向きを戻す（5'から3'）ことによってT7ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。酸素の存在下では、FNRはFNR応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現せず、T7ポリメラーゼ遺伝子は3'から5'配向のままであり、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、FNRは、二量体化し、およびFNR応答性プロモーターを結合し、リコンビナーゼは発現され、T7ポリメラーゼ遺伝子は5'から3'方向に戻り、および治療上の分子が発現される。
【０１８４】
プラスミド上に発現される合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能することができるが、長期間では能力および/または機能を失うことがある（Danino（ダニノ）ら、2015）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上の分子を産生することができ、および毒素（hok）および短命の抗毒素（sok）を同時に産生する毒素-抗毒素系をさらに含み、プラスミドの損失が長寿命の毒素によって引き起こされる（Daninoら、2015）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、B. subtilis（枯草菌）プラスミドpL20由来のalp7をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Daninoら、2015）。
宿主-プラスミド相互依存性
【０１８５】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はまた、宿主-プラスミド相互依存性を作り出すように修飾されたプラスミドも含む。一定の実施態様において、相互に依存する宿主-プラスミドプラットフォームはGeneGuardである（Wrightら、2015）。いくらかの実施態様では、GeneGuardプラスミドは、（i）条件的複製起点で、そこで、必要な複製開始タンパク質がトランスで提供されるもの；（ii）栄養要求性改変で、ゲノム転座を介して宿主によって救済され、およびリッチメディア（富栄養培地とも言う）での使用にも適合するもの；および/または（iii）核酸配列で、広域スペクトル毒素をコードするものを含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現しない株（例は、野生型細菌）に対してプラスミドDNA自体を不利にすることにより、プラスミドの広がりに対して選定するために使用され得る。いくらかの実施態様では、GeneGuardプラスミドは、抗生物質の選択なしで少なくとも100世代にわたって安定である。いくらかの実施態様では、GeneGuardプラスミドは宿主の増殖を妨害しない。GeneGuardプラスミドは、本発明の遺伝学的に操作された細菌で意図しないプラスミド増殖を大幅に減少させるために使用される。
【０１８６】
相互依存性の宿主-プラスミドプラットフォームは、単独で、または他のバイオセーフティ機構、たとえば、ここに記載されているものなどのようなもの（例は、キルスイッチ、栄養要求性）と組み合わせて使用され得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はGeneGuardプラスミドを含む。他の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、GeneGuardプラスミドおよび/または1以上のキルスイッチを含む。他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、GeneGuardプラスミドおよび/または1以上の栄養要求性を含む。さらに他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、GeneGuardプラスミド、1以上のキルスイッチ、および/または1以上の栄養要求性を含む。
【０１８７】
プラスミド上に発現する合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能するが、長期間に能力および/または機能を失うことがある（Daninoら、2015）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および/または消化管エンハンサー分子を産生することができ、および毒素（hok）および短命の抗毒素（sok）を同時に産生する毒素-抗毒素システムをさらに含み、そこで、プラスミドの損失は、細胞が長命毒素によって殺されるようにする（Daninoら、2015；図66）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、B. subtilisプラスミドpL20由来のalp7をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Daninoら、2015）。
キルスイッチ
【０１８８】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチも含む（例は、米国仮特許出願第62/183,935号、第62/263,329号、および第62/277,654号参照、それらの各々は参照によりその全体においてここに組み込む）。キルスイッチは外部刺激に応答して遺伝学的に操作された細菌を積極的に殺すことを意図する。細菌が生存のために不可欠な栄養素を欠いているために死滅する栄養要求性変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘発する環境内の特定の因子によって引き起こされる。
【０１８９】
キルスイッチを含む細菌は、インビトロ研究目的のために、例は、実験室環境の外部のバイオ燃料生産微生物の広がりを制限するために設計されたものである。疾患を処置するためのインビボ施与のために操作された細菌は、異種遺伝子または遺伝子群（例は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子）の発現および送付の後、または対象が治療上の効果を経験した後に、特定の時間に死ぬようにプログラムされてもよい。たとえば、いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子、例は、GLP-1の発現後ある期間後に細菌を殺すために活性化される。いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現後に遅延した様式で活性化される。あるいは、細菌が疾患部位の外に広がった後、細菌は死滅するように操作されてもよい。具体的には、微生物による対象の長期コロニー形成、対象の内側の関心がある領域外（たとえば、消化管の外側）での微生物の拡散、または対象の外側の微生物の環境への拡散（たとえば、対象の便を通しての環境への広がり）を防ぐことは有用でありうる。キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例には、制限されないが、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞DNAを分解すること、または他の機序によって細胞死を引き起こす他の分子が含まれる。そのような毒素は、個々に、または組み合わせて使用することができる。それらの産生をコントロールするスイッチは、たとえば、転写活性化（トグルスイッチ；例は、Gardner（ガードナー）ら、2000参照）、翻訳（リボソームレギュレーター）、またはDNA組換え（リコンビナーゼ系スイッチ）に基づくことができ、および環境刺激、たとえば、嫌気生活または反応性酸素種のようなものを意味することができる。これらのスイッチは、単一の環境要因によって活性化することができ、または細胞死を誘発するために複数の活性化因子をAND、OR、NANDおよびNOR論理構成において必要とすることがある。たとえば、ANDリボソームレギュレータースイッチは、リシンの発現を誘導するために、テトラサイクリン、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）、およびアラビノースによって活性化され、それは、細胞膜を透過性にし、および細胞を殺す。IPTGは、エンドリシンおよびホリンmRNAの発現を誘導し、それらはその後、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって抑制解除される。細胞死を引き起こすためには、3種すべての誘導物質が存在しなければならない。キルスイッチの例は当技術で既知である（Callura（カルラ）ら、2010）。
【０１９０】
キルスイッチは、環境条件または外部信号に応答して毒素が生成されるように設計する（例は、外部キューに応答して細菌が殺され）か、あるいはまた、環境条件がもはや存在せず、または外部信号が停止されると、毒素が生成されるように設計することができる。
【０１９１】
したがって、いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、たとえば、ROSの存在下で、またはRNSの存在下で、低酸素条件において、外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、1以上のリコンビナーゼ（群）をコードする1以上の遺伝子を含み、それらの発現は環境条件またはシグナルに応答して誘導され、および1以上の組換え事象を引き起こし、それは細胞を死滅させる毒素の発現を最終的に導く。いくらかの実施態様では、少なくとも1つの組換え事象は、それが第1のリコンビナーゼによってフリッピング（反転とも言う）された後に構成的に発現される細菌毒素をコードする逆の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素の構成的発現は遺伝学的に操作された細菌を死滅させる。これらのタイプのキルスイッチシステムでは、一旦操作された細菌細胞が外因性環境条件を感知し、および興味がある異種遺伝子を発現すると、組換え細菌細胞はもはや生存可能ではない。
【０１９２】
本開示の遺伝学的操作細菌が、少なくとも1つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに応答して1以上のリコンビナーゼ（群）を発現する別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性の環境条件または信号に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子を発現する。一実施態様では、少なくとも1つの組換え事象は、第1のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子は、第1の順方向リコンビナーゼ認識配列と第1の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第1のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施態様では、抗毒素は毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死が遅延される。一実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないときに、細菌毒素によって殺される。
【０１９３】
別の実施態様では、少なくとも1つの組換え事象は、第2のリコンビナーゼをコードする逆方向の異種遺伝子の第1のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次に、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子の第2のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。一実施態様では、第2のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第1の順方向リコンビナーゼ認識配列と第1の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第2の順方向リコンビナーゼ認識配列と第2の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第2のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第1のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第2のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は細菌毒素によって殺される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性環境条件に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施態様では、抗毒素は、外因性環境条件が存在するとき、毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死を遅延させる。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないとき、細菌毒素によって死滅する。
【０１９４】
一実施態様では、少なくとも1つの組換え事象は、第2のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第1のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次いで、第3のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第2のリコンビナーゼによるフリッピングが続き、次に、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子の第3のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。
【０１９５】
一実施態様では、少なくとも1つの組換え事象は、第1の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子の第1のリコンビナーゼによるフリッピングである。一実施態様では、第1の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第1の順方向リコンビナーゼ認識配列と第1の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第1の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第1のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第1の切除酵素は第1の必須遺伝子を切除する。一実施態様では、プログラムされた組換え細菌細胞は第1の必須遺伝子が切除された後に生存できない。
【０１９６】
一実施態様では、第1のリコンビナーゼは、第2の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子をさらに反転させる。一実施態様では、第2の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第2の順方向リコンビナーゼ認識配列と第2の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第2の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第1のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第1の必須遺伝子および第2の必須遺伝子が両方とも切除されるとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。一実施態様では、第1のリコンビナーゼによって第1の必須遺伝子が切除されるか、または第2の必須遺伝子が切除されるかのいずれかのとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。
【０１９７】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも1つの組換え事象が生じた後に死滅する。別の実施態様では、少なくとも1つの組換え事象が生じた後、遺伝学的に操作された細菌はもはや生存できない。
【０１９８】
これらの実施態様のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、BxbI、PhiC31、TP901、BxbI、PhiC31、TP901、HK022、HP1、R4、Int1、Int2、Int3、Int4、Int5、Int16、Int7、Int8、Int9、Int10、Int11、Int12、Int13、Int14、Int15、Int16、Int17、Int18、Int19、Int20、Int21、Int22、Int23、Int24、Int25、Int26、Int27、Int28、Int29、Int30、Int31、Int32、Int33、およびInt34、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれるリコンビナーゼであることができる。
【０１９９】
上記のキルスイッチ回路では、毒素は環境因子または信号の存在下で生成される。キルスイッチ回路の別の態様では、毒素は環境因子の存在下で抑制され（生成されず）、および環境条件または外部信号がもはや存在しなくなると生成され得る。そのようなキルスイッチは、抑制ベースのキルスイッチと呼ばれ、および細菌細胞が外部因子またはシグナル、たとえば、アラビノースまたは他の糖などのようなものの存在下だけで生存可能である系を表す。外因性因子またはシグナルの存在下で毒素が抑制される（および外部シグナルが除去された後に活性化される）例示的なキルスイッチ設計は、図57、60、65において示される。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知すると、1以上の異種遺伝子（群）を発現する組換え細菌細胞を提供する。この局面において、組換え細菌細胞は、AraC転写因子をコードするaraC遺伝子、ならびにaraBADプロモーターの制御下にある1以上の遺伝子を含む。アラビノースの不存在下では、AraC転写因子は、araBADプロモーターの制御下で遺伝子の転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、AraC転写因子は、AraBADプロモーターに結合してこれを活性化し、それは毒素遺伝子の発現を抑制する望ましい遺伝子、たとえば、tetRの発現を誘導する構造変化を受ける。この実施態様では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境では、tetR遺伝子は活性化されず、おおび毒素が発現され、それによって細菌が死滅する。アラビノース系はまた、必須遺伝子がアラビノースまたは他の糖の存在下だけで発現され、アラビノースまたは他の糖が環境中に存在しない場合に発現されない必須遺伝子を発現するためにも使用され得る。
【０２００】
したがって、外因性環境においてアラビノースを感知する際に1以上の異種遺伝子（群）が発現されるいくらかの実施態様において、1以上の異種遺伝子は、araBADプロモーター（ParaBAD）の制御下に直接的または間接的に存在する。いくらかの実施態様では、発現された異種遺伝子は、次の：異種の治療上の遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、抑制因子タンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子、たとえば、TetR抑制因子、細菌細胞に見出されない必須タンパク質をコードする異種遺伝子、および/または調節タンパク質またはポリペプチドをコードする異種タンパク質の一以上から選定される。
【０２０１】
アラビノース誘導性プロモーターは、Para、ParaB、ParaC、およびParaBADを含め、当技術において既知である。一実施態様では、アラビノース誘導性プロモーターはE. coli由来である。いくらかの実施態様において、ParaCプロモーターおよびParaBADプロモーターは、一方向において異種遺伝子（群）の発現を制御するParaBADプロモーターを伴って、双方向性プロモーターとして機能し、およびParaC（ParaBADプロモーターに近接近し、およびそれから逆ストランドにあり）、他の方向において異種遺伝子（群）の発現が制御される。アラビノースの存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの不存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０２０２】
本開示の1つの例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的操作細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリン抑制因子タンパク質（TetR）をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaBADプロモーター、AraC転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaCプロモーター、およびテトラサイクリン抑制因子タンパク質（PTetR）によって抑制されるプロモーターに作動可能に連結された細菌毒素をコードする異種遺伝子を有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、AraC転写因子はParaBADプロモーターを活性化し、それはTetRタンパク質の転写を活性化し、それは次に毒素の転写を抑制する。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、AraCはParaBADプロモーターからの転写を抑制し、およびTetRタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、および毒素が発現される。毒素は組換え細菌細胞中に蓄積し、および組換え細菌細胞は死滅する。一実施態様では、AraC転写因子をコードするaraC遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、および従って、構成的に発現される。
【０２０３】
本開示の1の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、毒素はTetRタンパク質による抑制のために発現されず、および抗毒素タンパク質は細胞内に蓄積する。しかし、アラビノースの不存在下では、TetRタンパク質は発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。組換え細菌細胞は、毒素タンパク質が細胞中の抗毒素タンパク質の量と等しいかそれ以上の量で存在するともはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０２０４】
本開示の別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ParaBADプロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、TetRおよび抗毒素が発現され、細胞内に抗毒素が蓄積し、および毒素はTetRタンパク質による抑制のために発現されない。しかしながら、アラビノースの不存在下では、TetRタンパク質および抗毒素の双方が発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が発現されると、組換え細菌細胞はもはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０２０５】
本開示の別の例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも以下の配列：組換え細菌細胞において見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaBADプロモーター（および生存のために必要とされる）、およびAraC転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaCプロモーターを有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、AraC転写因子はParaBADプロモーターを活性化し、それは必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞が生存することを可能にさせる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、AraCはParaBADプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現しない。この場合、組換え細菌細胞はアラビノースの不存在下で死ぬ。いくらかの実施態様では、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaBADプロモーターの配列は、ちょうど上記のTetR/毒素キルスイッチシステムと共に細菌細胞中に存在することができる。いくらかの実施態様において、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたParaBADプロモーターの配列は、ちょうど上記のTetR/毒素/抗毒素キルスイッチシステムと併せて細菌細胞において存在することができる。
【０２０６】
さらに他の実施態様では、細菌は、短命の抗毒素および長命の毒素の双方を産生するプラスミドを伴うプラスミド安定性システムを含みうる。このシステムでは、細菌細胞は等量の毒素および抗毒素を産生して毒素を中和する。しかし、細胞がプラスミドを失う場合/とき、短命の抗毒素が崩壊し始める。抗毒素が完全に崩壊するとき、より一層長命の毒素が細胞を殺す結果として、その細胞が死ぬ。
【０２０７】
いくらかの実施態様では、本開示の操作された細菌は、上記のキルスイッチ回路のいずれかの成分をコードする遺伝子（群）をさらに含む。
【０２０８】
上記の実施態様のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Hok、Fst、TisB、LdrD、Kid、SymE、MazF、FlmA、Ibs、XCV2162、dinJ、CcdB、MazF、ParE、YafO、Zeta、hicB、relB、yhaV、yoeB、chpBK、hipA、マイクロシンB、まいくろしんB17、マイクロシンC、マイクロシンC7-C51、マイクロシンJ25、マイクロシンColV、マイクロシン24、マイクロシンL、マイクロシンD93、マイクロシンL、マイクロシンE492、マイクロシンH47、マイクロシンI47、ミクロシンM、コリシンA、コリシンE1、コリシンK、コリシンN、コリシンU、コリシンB、コリシンIa、コリシン1b、コリシン5、コリシン10、コリシンS4、コリシンY、コリシンE2、コリシンE7、コリシンE8、コリシンE9、コリシンE3、コリシンE4、コリシンE6、コリシンE5、コリシンD、コリシンM、およびクロアシンDF13、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０２０９】
上記の実施態様のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リジン、Sok、RNAII、IstR、RdlD、Kis、SymR、MazE、FlmB、Sib、ptaRNA1、yafQ、CcdA、MazE、ParD、YafN、Epsilon、HicA、relE、prlF、yefM、chpBI、hipB、MccE、MccECTD、MccF、Cai、ImmE1、Cki、Cni、Cui、Cbi、Iia、Imm、Cfi、Im10、Csi、Cyi、Im2、Im7、Im8、Im9、Im3、Im4、ImmE6、クロアシン免疫タンパク質（cloacin immunity protein、Cim）、ImmE5、ImmD、およびCmi、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０２１０】
一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して殺菌性である。一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して静菌性である。
【０２１１】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、栄養要求体である。一実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、 dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB、およびthi1栄養要求株である。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、1よりも多くの栄養要求性を有し、たとえば、それらはΔthyAおよびΔdapA栄養要求性であり得る。
【０２１２】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチ回路、たとえば、ここに提供されるキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび逆毒素配列の制御下に1以上のリコンビナーゼ（群）をコードする1以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする1以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび1以上の逆方向切除遺伝子の制御下に1以上のリコンビナーゼ（群）をコードする1以上の遺伝子をさらに含み、そこで、切除遺伝子（群）は必須遺伝子を削除する酵素をコードする。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする1以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、TetR抑制因子結合部位を有するプロモーターの制御下に毒素をコードする1以上の遺伝子、およびアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターの制御下にTetRをコードする遺伝子、たとえば、ParaBADなどのようなものをさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする1以上の遺伝子をさらに含む。
【０２１３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上のペイロードを含む栄養要求体であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。
【０２１４】
上記の遺伝学的に操作された細菌のいくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌のプラスミド上に存在し、およびプラスミド上で誘導性プロモーターに作動可能に連結される。他の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌染色体に存在し、および染色体において誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
変異誘発
【０２１５】
いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは、検出可能な生成物に、例は、GFPに、作動可能に連結され、および変異体をスクリーニングするために使用することができる。いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは変異誘発され、および変形物は、検出可能な生成物のレベルに基づいて、例は、フローサイトメトリー、検出可能な生成物が蛍光を発するとき蛍光活性化細胞選別（FACS）によって選定される。いくらかの実施態様では、1以上の転写因子結合部位は変異誘発されて結合を増加または減少させる。代わりの実施態様では、野生型結合部位は無傷のままであり、および調節領域の残りは変異誘発に供される。いくらかの実施態様では、誘導性条件下で抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子の発現を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるために、変異プロモーターが本発明の遺伝学的に操作された細菌に挿入される。いくらかの実施態様において、誘導性プロモーターおよび/または対応する転写因子は、合成の、非自然配列である。
【０２１６】
いくらかの実施態様において、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子は、誘発条件下で前記分子の発現および/または安定性を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるように変異される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子カセット中の1以上の遺伝子が、誘導性条件下で前記分子の発現を、同じ条件下に同じサブタイプの非変異細菌と比較して増加させるよう変異される。
製薬上組成物および調剤物
【０２１７】
ここに記載の遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物は、消化管において炎症性機構を抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および/または自己免疫疾患を処置または予防するために使用され得る。1以上の遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物は、単独で、または予防剤、治療剤、および/または薬学的に許容可能な担体と組み合わせて提供される。一定の実施態様では、製薬上組成物は、例は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために、ここに記載の遺伝子修飾を含むように操作される細菌の1つの種、菌株、またはサブタイプを含む。代わりの実施態様において、製薬上組成物は、ここに記載の遺伝子修飾をそれぞれ含むように、例は、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために操作された細菌の2以上の種、菌株、および/またはサブタイプを含む。
【０２１８】
ここに記載の製薬上組成物は、活性成分の製薬上用途のための組成物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む1以上の生理学的に許容可能な担体を用いて慣習的な方法で調剤しうる。製薬上組成物を調剤する方法は、当技術において既知である（例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ）」、Mack Publishing Co.（マック・パブリッシング社）、Easton（イーストン）、PA（ペンシルベニア州）」参照）。いくらかの実施態様において、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または紛体を形成するために、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、慣習的混合、溶解、造粒、レビゲーティング（水簸とも言う）、乳化、エンカプスレーティング（被包とも言う）、エントラッピング（捕捉とも言う）、または噴霧乾燥に供され、それらは腸溶性にコーティングされるか、またはコーティングされていなくてもよい。適切な製剤は施与経路に依存する。
【０２１９】
ここに記載の遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切な剤形（例は、液体、カプセル、サシェ、硬カプセル、軟カプセル、錠剤、腸溶錠、懸濁粉末、顆粒、または経口投与のためのマトリクス持続放出調剤）において、および任意の適切なタイプの施与（例は、経口、局所、注射可能、即時放出、拍動放出、遅延放出、または持続放出）のために製薬上組成物に調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌の適切な投薬量は、約105から1012細菌まで、例は、およそ105細菌、およそ106細菌、およそ107細菌、およそ108細菌、およそ109細菌、およそ1010細菌、およそ1011細菌、またはおよそ1011細菌に及んでよい。組成物は、毎日、毎週、または毎月1回以上施与することができる。組成物は、食餌の前、間、または後に施与することができる。一実施態様では、製薬上組成物は対象が食餌を取る前に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は広く食餌と共に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は、対象が食餌を取った後に施与される。
【０２２０】
遺伝学的に操作された細菌は、1以上の薬学的に許容可能な担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝化剤、界面活性剤、中性またはカチオン性（陽イオン性とも言う）脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または薬剤を含む製薬上組成物に調剤され得る。たとえば、製薬上組成物は、制限されないが、重炭酸（炭酸水素とも言う）カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および界面活性剤の添加を含む。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例は、重炭酸ナトリウムの1モル溶液において（たとえば、胃などのような酸性細胞環境を緩衝するために）調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌は、中性または塩形態として施与および製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、アニオン（陰イオンとも言う）、たとえば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなもので形成されるもの、およびカチオン（陽イオン）、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、などから導き出されるもののようなものから形成されるものが含まれる。
【０２２１】
ここに開示される遺伝学的操作細菌は、局所的に施与され、および軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者によく知られる他の形態において調剤され得る。例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照。一実施態様では、非噴霧可能な局所剤形のために、担体または局所適用に適合可能な、水よりも大きい動粘度を有する1以上の賦形剤を含む粘性から半固形または固形形態が用いられる。適切な調剤物には、制限されないが、溶液、懸濁物、エマルション、クリーム、軟膏、紛体、リニメント剤、サルブ（膏薬とも言う）、などが含まれ、それらは滅菌することができ、または種々の特性、例は、浸透圧に影響を及ぼすために、助剤（例は、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩類）と混合することができる。他の適切な局所投与形態には、噴霧可能なエアロゾル調剤物が含まれ、そこでは、固形または液状の不活性担体と組み合わせられる活性成分が、加圧揮発性物質（例は、気体状推進物質、たとえば、フレオンなどのようなもの）との混合物において、またはスクイズボトルにおいて包装される。加湿剤または湿潤剤も、製薬上組成物および剤形に添加することができる。そのような追加の成分の例は当技術においてよく知られる。一実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、衛生用品として調剤してよい。たとえば、衛生用品は、抗菌調剤物、または発酵生成物、たとえば、発酵ブロスなどのようなものであってもよい。衛生用品は、たとえば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであり得る。
【０２２２】
ここに開示される遺伝学的に操作された細菌は、経口的に投与され、および錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液状物、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、などとして調剤され得る。経口使用のための薬理学的組成物は、錠剤またはドラジェ（糖衣錠）コアを得るために、固形賦形剤を用いること、得られる混合物を随意に、グラインディング（粉砕とも言う）すること、および所望により適切な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理することで作成することができる。適切な賦形剤には、制限されないが、充填材、たとえば、糖で、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含むもの；セルロース組成物で、たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのようなもの；および/または生理学的に許容可能なポリマーで、たとえば、ポリビニルピロリドン（PVP）またはポリエチレングリコール（PEG）などのようなものが含まれる。崩壊剤を添加してもよく、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえば、アルギン酸ナトリウムなどのようなものである。
【０２２３】
錠剤またはカプセルは、薬学的に許容可能な賦形剤、たとえば、結合剤（例は、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）などのようなもの；充填剤（例は、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例は、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、L-ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例は、デンプン、ジャガイモデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉体）；または湿潤剤（例は、ラウリル硫酸ナトリウム）により慣習的な手段によって調製することができる。錠剤は、当技術においてよく知られる方法によってコーティングすることができる。コーティングシェルが存在してよく、および共通の膜には、制限されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物（polyanhydride）、他の生分解可能なポリマー、アルギナート（アルギン酸とも言う）−ポリリジン-アルギン酸（APA）、アルギン酸-ポリメチレン-コ-グアニジン-アルギン酸（A-PMCG-A）、ヒドロキシメチルアクリラート-メチル-メタクリラート（hydroymethylacrylate-methyl methacrylate）（HEMA-HEMA）、多層状HEMA-MMA-MAA、ポリアクリロニトリルビニルクロライド（PAN-PVC）、アクリロニトリル/メタリルスルホン酸ナトリウム（AN-69）、ポリエチレングリコール/ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン/ポリジメチルシロキサン（PEG/PD5/PDMS）、ポリN,N-ジメチルアクリルアミド（PDMAAm）、シリカ質カプセル（siliceous encapsulates）、硫酸セルロース/アルギン酸ナトリウム/ポリメチレン-コ-グアニジン（CS/A/PMCG）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、k-カラギーナン-ローカストビーンガム-ゲルビーズ（k-carrageenan-locust bean gum gel beads）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、ポリメタクリル酸デンプン、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが含まれる。
【０２２４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、消化管または消化管の特定の領域、たとえば、大腸への放出のために腸溶性にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なpHプロファイルは、約1-4（胃）、5.5-6.0（十二指腸）、7.3-8.0（回腸）、および5.5-6.5（結腸）である。いくつかの疾患では、pHプロファイルは修飾されうる。いくらかの実施態様において、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のpH環境で分解される。いくらかの実施態様では、少なくとも2つのコーティングが使用される。いくらかの実施態様では、外側のコーティングおよび内側のコーティングは、異なるpHレベルで分解される。
【０２２５】
経口投与のための液状調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁物、または乾燥生成物の形態をとり得る。このような液状調製物は、薬学的に許容される薬剤、たとえば、懸濁剤（例は、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂（hydrogenated edible fats））；乳化剤（例は、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例は、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存剤（例は、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などのようなものによる慣習的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝剤塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与のための調製物は、ここに記載の遺伝学的に操作された細菌の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に調剤され得る。
【０２２６】
一実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、小児対象への施与に適する組成物において調剤され得る。当技術においてよく知られるように、胃内容排出、pH、消化管透過性、などの異なる速度を含め、チルドレンは多くの側面で成体と異なる（Ivanovska（イワノフスカ）ら、Pediatrics（ペディアトリックス）、134（2）：361-372、2014）。さらに、小児の調剤受容性および嗜好、たとえば、施与経路および味覚属性は、許容可能な小児の服薬遵守を達成するために重要である。したがって、一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、嚥下しやすいか、または溶解可能な剤形、またはより一層美味な組成物、たとえば、風味、甘味料、または味覚遮断剤を添加した組成物などのようなものを含み得る。１の実施態様において、小児対象への施与に適する組成物はまた、成体への施与に適していてもよい。
【０２２７】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁物、エリキシル、懸濁物または溶液として再構成するための粉体、分散性/発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザー・ポップ（freezer pop）、トローチ、チューインガム、オーラル・ティン・ストリップ（oral thin strip、口腔薄片とも言う）、口腔内崩壊錠（orally disintegrating tablet）、サシェ（小さな袋とも言われる）、軟質ゼラチンカプセル、スプリンクル・オーラル・パウダー（散剤経口粉末とも言う）、または顆粒が含まれ得る。一実施態様では、組成物は、キャンディー弾力性、望ましい噛む必要がある粘稠度、およびより一層長い貯蔵寿命を与える、ゼラチンベースから作られたグミ（ゴム状とも言う）キャンディーである。いくらかの実施態様では、グミキャンディーは甘味料または香味料を含むこともできる。
【０２２８】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は香味料を含むことができる。ここに使用するように、「香味料（フレーバー）」は、調剤物に明確な味および香りを提供する物質（液体または固体）である。香味料はまた、調剤物の嗜好性を改善するのに役立つ。香味料には、制限されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
【０２２９】
一定の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、たとえば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与され得る。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されても、錠剤に圧縮されても、または対象の食餌に直接組み込んでもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に取り込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハー、およびその他同種類のものなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外の方法で化合物を投与するには、化合物をその不活性化を防止する物質でコーティングするか、化合物と一緒に投与することが必要な場合がある。
【０２３０】
別の実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、食用に適した生成物、たとえば、食料生成物であってもよい。一実施態様では、食料生成物は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、サワーミルク（酸乳）、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、植物果実ジュース、果汁、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児食（たとえば、乳児用ケーキなどのようなもの）、栄養上の食料生成物、動物飼料、または栄養補給剤である。一実施態様では、食料生成物は、発酵食料、たとえば、発酵乳生成物などのようなものである。一実施態様では、発酵乳生成物はヨーグルトである。別の実施態様において、発酵乳生成物は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクシェイク（ミルクセーキとも言う）、またはケフィアである。別の実施態様では、本発明の組換え細菌を、プロバイオティクスとして作用することが意図される他の生菌細胞を含む調製物において組み合わせる。別の実施態様において、食料生成物は飲料である。一実施態様では、飲料は、果汁系飲料または植物またはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施態様において、食料生成物はゼリーまたはプディング（プリンとも言う）である。本発明の組換え細菌の施与に適する他の食料生成物は当技術においてよく知られる。たとえば、米国特許出願公開第2015/0359894号および第2015/0238545号が参照され、それらの各々の全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる。さらに別の実施態様では、本発明の製薬上組成物は、食料生成物、たとえば、パン、ヨーグルト、またはチーズなどのようなものに注入、噴霧、または散在される。
【０２３１】
いくらかの実施態様では、組成物は、腸溶性にコーティングされ、またはコーティングされていないナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、またはマイクロタブレットを介して、腸管内（小腸内とも言う）投与、内腔内（空腸内とも言う）投与、十二指腸内投与、腹腔内（回腸内とも言う）投与、胃シャント（gastric shunt）投与、または腸内（結腸内とも言う）投与のために調剤される。製薬上組成物はまた直腸組成物、たとえば、坐剤または停留浣腸などのようなものにおいて、例は、慣習的な座薬基剤、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなどのようなものを使用して調剤することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおいて懸濁物、溶液、またはエマルションであってもよく、および懸濁剤、安定化剤および/または分散剤を含んでいてもよい。
【０２３２】
ここに記載される遺伝学的に操作された細菌は、鼻腔内投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で調剤され得、そして好都合には、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な推進剤（例は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用を伴ってデリバリーされる。加圧エアロゾル投与単位は、計量された量を送るためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例は、ゼラチン製のもの）は、化合物および適切な粉体基剤、たとえば、ラクトースまたはデンプンなどのようなものとの粉体混合物を含め、調剤することができる。
【０２３３】
遺伝学的に操作された細菌は、デポー製剤として投与され、および調剤され得る。そのような長時間作用性調剤物は、静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、または注入を含め、移植によってか、または注射によって施与されうる。たとえば、組成物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例は、許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性（sparingly soluble）誘導体として（例は、難溶性塩として）調剤され得る。
【０２３４】
いくらかの実施態様では、ここに開示されるものは、単一剤形において薬学的に許容可能な組成物である。単一剤形は、液状または固形形態であり得る。単一剤形は、改変することなくペイシェント（主として患者を意味する）に直接施与してもよく、または施与に先立ち希釈または再構成してもよい。一定の実施態様では、単一剤形をボーラス形態、例は、複数回の錠剤、カプセル、丸剤、などを含む経口投与を含め、単一注射、単一経口用量で施与することができる。代替実施態様では、単一剤形は、ある期間にわたって、例は、注入によって施与することができる。
【０２３５】
製薬上組成物の単一剤形は、製薬上組成物を、より一層小さなアリコート、単一用量容器、単一用量液状形態、または単一用量固形形態、たとえば、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または粉末などのようなものに分けることによって調製することができ、それらは腸溶性コーティングまたは非コーティングであり得る。固形形態での単一用量は、ペイシェントに施与するのに先立ち、液体、典型的には滅菌水または生理的塩類溶液を添加することによって再構成することができる。
【０２３６】
他の実施態様では、組成物は制御放出システムまたは持続放出システムにおいて送ることができる。一実施態様では、制御されたか、または持続的な放出を達成するためにポンプを使用することができる。別の実施態様では、ポリマー材料を使用して、本開示の療法での制御または持続的な放出を達成することができる（例は、米国特許第5,989,463号参照）。持続放出性（徐放性とも言う）製剤に使用されるポリマーの例には、制限されないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアセタート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが含まれる。徐放性調剤物に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能不純物フリーで、貯蔵時に安定であり、滅菌され、および生分解性であり得る。いくらかの実施態様では、制御放出または徐放性システムを予防または治療上の標的の近傍に配置することができ、それにより全身的投与量のほんの一部しか必要とされない。当業者に既知の任意の適切な技術を使用することができる。
【０２３７】
投薬量レジメンは、治療上の応答を提供するように調節され得る。投薬は、疾患の重篤度および応答性、投与経路、処置の時間経過（数日から数ヶ月から数年にかけて）、および疾患の改善時間を含め、いくつかの要因に依存し得る。たとえば、単一のボーラスを一度に施与することができ、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与してもよく、または治療上の状況によって示されるように用量を減少または増加させることができる。投薬量の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果によって規定される。投薬量値は、緩和すべき状態のタイプおよび重症度によって変動し得る。いずれかの特定の対象について、個々の必要性および治療臨床医の専門的判断に従って、特定の投薬量計画を経時的に調整することができる。ここに提供される化合物の毒性および治療上の効力は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的手順によって決定することができる。たとえば、LD50、ED50、EC50、およびIC50を決定し、および毒性および治療上の効果の間の用量比（LD50/ED50）を治療指数として算出することができる。有害な副作用を示す組成物を使用して、潜在的な損傷を最小限にして副作用を軽減するために注意深く修飾してもよい。施与は、初期に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定することができる。インビトロおよびインビボアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投薬量の範囲を定式化する際に使用することができる。
【０２３８】
成分は、別個に、または密閉式のシール容器、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて乾燥した凍結乾燥粉体または水分フリー濃縮物のような単位剤形において一緒に混合して供給される。施与のモードが注射によるものである場合、注射のための滅菌水または生理的塩類溶液のアンプルを提供して、その結果成分を施与前に混合することができる。
【０２３９】
製薬上組成物は、密閉式のシールされた容器、たとえば、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて包装されてもよい。一実施態様では、製薬上組成物の1以上は、密閉式のシールされた容器内で乾燥した滅菌凍結乾燥粉体または水フリー濃縮物として供給され、および対象への施与のために適切な濃度に再構成（例は、水または生理的塩類溶液により）することができる。ある実施態様では、1以上の予防剤または治療剤または製薬上組成物は、2℃および8℃間で貯蔵された密閉式シール容器内で乾燥滅菌凍結乾燥粉体として供給され、および1時間以内、3時間以内、5時間以内、6時間以内、12時間以内、24時間以内、48時間以内、72時間以内、または再構成後1週間以内に施与される。凍結保護物質は、凍結乾燥剤形のために、主に0-10％のスクロース（最適には0.5-1.0％）で含まれることができる。他の適切な凍結保護物質には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニンが含まれ、そのいずれも0-0.05％の濃度で、およびポリソルベート-80（最適には0.005-0.01％の濃度で含まれる）が含まれることができる。追加の界面活性剤には、制限されないが、ポリソルベート20およびBRIJ界面活性剤が含まれる。製薬上組成物は、注射可能な溶液として調製することができ、およびアジュバントとして有用な薬剤、たとえば、吸収または分散を増加させるために使用されるもの、例は、ヒアルロニダーゼなどのようなものをさらに含むことができる。
処置の方法
【０２４０】
本発明の別の態様は、自己免疫障害、下痢性疾患、IBD、関連疾患、および消化管炎の減少および/または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置する方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、薬の製造のための、ここに記載の細菌の少なくとも1つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫障害、下痢性疾患、IBD、関連疾患、および消化管炎の減少および/または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置するために、ここに記載の細菌の少なくとも1種の遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用について提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫疾患、下痢性疾患、IBD、関連疾患、および消化管炎の減少および/または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患の処置に使用するために、ここに記載の細菌の少なくとも1つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを提供する。
【０２４１】
いくらかの実施態様では、下痢性疾患は、急性水様性下痢、例は、コレラ、急性血性下痢、例は、赤痢、および持続性下痢からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、IBDまたは関連疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（diversion colitis）、ベーチェット病、中間大腸炎（intermediate colitis）、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、疾患または状態は、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ADEM）、急性壊死性出血性白質脳炎（acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis）、アジソン病（Addison's disease）、無ガンマグロブリン（アマガングロブリン）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（axonal & neuronal neuropathies）、バロー病（Balo disease）、ベーチェット病（Behcet’s disease）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（cardiomyopathy、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（CIDP）、慢性再発性多発性骨髄炎（chronic recurrent multifocal ostomyelitis、慢性再発性多巣性耳状骨症）（CRMO）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Churgus disease）、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST疾患（CREST病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎）、円板状ループス（円板状狼瘡）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（immunoregulatory lipoproteins）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状IgA病（LAD）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（MCTD）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ocular cicatricial pemphigoid）、視神経炎、パリンドロームリウマチ（回帰性リウマチ）、PANDAS（Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型およびIII型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（postmyocardial infarction syndrome）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Raynauds phenomenon）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（UCTD）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症からなる群より選ばれる自己免疫疾患である。いくらかの実施態様では、本発明は、制限されないが、下痢、血便、口内炎（mouth sores、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（delayed pubertal development）、および皮膚、眼、関節、肝臓、および胆管の炎症を含め、それらの疾患に関連する一以上の症状（群）を軽減、改善、または排除するための方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、消化管炎症を軽減し、および/または消化管バリア機能を増強するための方法を提供し、それによって全身性自己免疫疾患、例は、喘息（Arrietaら、2015）が改善または防止される。
【０２４２】
本方法は、ここに記載の細菌の少なくとも1つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを伴う製薬上組成物を調製すること、および治療上有効な量において対象に本製薬上組成物を施与することを包含し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、液状懸濁物において経口投与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌をゲルキャップにおいて凍結乾燥し、および経口投与する。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は栄養管を介して施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、直腸に、例は、浣腸によって施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、局所的、小腸内（intraintestinally）、空腸内（intrajejunally）、十二指腸内、回腸内、および/または結腸内（intracolically）に施与される。
【０２４３】
一定の実施態様では、ここに記載の製薬上組成物は、消化管炎症を軽減し、消化管バリア機能を増強し、および/または対象において自己免疫障害を処置または防止するために施与される。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管炎症を、未処置またはコントロール対象におけるレベルと比較して、少なくとも約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれらより多くだけ減少させることができる。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管バリア機能を、未処置またはコントロール対象のレベルと比較して、少なくとも約10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれらより多くだけ増加させることができる。いくらかの実施態様では、炎症および/または消化管バリア機能の変化は、製薬上組成物の施与前および施与後の対象を比較することによって測定される。いくらかの実施態様では、自己免疫障害および/または消化管炎症および/または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態を処置または改善する方法は、疾患または状態の1以上の症状が、少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはそれらよりも多くだけ改善されることを可能にする。
【０２４４】
製薬上組成物の施与の前、その間およびその後に、消化管炎症および/またはバリア機能は、対象において、生物学的サンプル、たとえば、血液、血清、血漿、尿、糞便物質、腹腔液（腹水とも言う）、腸粘膜のスクレイピング、組織から収集した試料、および/または次のもの：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管などのようなものの1以上の内容物から収集した試料において測定することができる。いくらかの実施態様では、本方法は、消化管バリア機能を増強するため、および/または消化管炎症をベースラインレベル、例は、対象において、健康コントロールのレベルに匹敵するものに低下させるため、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管炎症を検出不能レベルまで、または処置前の対象のレベルの少なくとも約1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％または80％未満に低下させるために、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管バリア機能を、処置前の対象のレベルの少なくとも約1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％またはそれらよりも多くだけ高めるために、本発明の組成物の施与を含み得る。
【０２４５】
一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はE. coli Nissleである。遺伝学的に操作された細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子（Sonnenbornら、2009）によって、または施与の数時間後または数日後にキルスイッチの活性化によって破壊され得る。したがって、遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物は、治療上有効な用量および頻度で再施与され得る。別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、施与後数時間または数日以内には破壊されず、および消化管で増殖および定着することができる。
【０２４６】
製薬上組成物は、単独で、または1以上の追加の治療剤、例は、コルチコステロイド、アミノサリチラート（アミノサリチル酸とも言う）、抗炎症剤と組み合わせて施与することができる。いくらかの実施態様において、製薬上組成物は、抗炎症薬物（例は、メサラジン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド（butesonide））、免疫抑制薬物（例は、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス）、抗生物質（例は、メトロニダゾール、オルニダゾール、クラリスロマイシン、リファキシミン、シプロフロキサシン、抗TB）、他のプロバイオティクス、および/または生物学的物質（例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル）（Triantafillidis（トリアンタフィリディス）ら、2011）と組み合わせて施与される。1以上の追加の治療剤の選定における重要な考慮点は、薬剤が本発明の遺伝学的に操作された細菌と適合性でなければならないことであり、例は、薬剤（群）は本細菌を死滅させてはならない。製薬上組成物の投薬量および施与頻度は、症状の重篤度および障害の進行に基づいて選定し得る。施与の適切な治療上有効な用量および/または頻度は、治療を行う医師によって選定することができる。
インビボでの処置
【０２４７】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、インビボで、例は、動物モデルにおいて評価することができる。消化管炎症、消化管バリア機能の低下、および/または自己免疫障害に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデルを使用し得る（例は、Mizoguchi（ミゾグチ）、2012参照）。動物モデルはIBDのマウスモデル、例は、CD45RBHi T細胞トランスファーモデルまたはデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）モデルであり得る。動物モデルは、1型糖尿病（T1D）のマウスモデルであり得、そしてT1Dは、ストレプトゾトシンでの処置によって誘導され得る。
【０２４８】
大腸炎は結腸の内層の炎症によって特徴付けられ、そしてIBDの一形態である。マウスでは、モデル化大腸炎はしばしばT細胞および/またはサイトカインの異常な発現を伴う。IBDの1つの例示的なマウスモデルは、CD4+ T細胞をそのCD45RB発現レベルに従って選別し、および正常ドナーマウスからのCD45RB発現が高いCD4+ T細胞を免疫不全マウスに養子（適合とも言う）移入することによって生じさせることができる。移行のために使用され得る免疫不全マウスの非制限的な例には、重症複合免疫不全（SCID）マウス（Morrissey（モリッシー）ら、1993；Powrie（パウリー）ら、1993）、および組換え活性化遺伝子2（RAG2）欠損マウス（Corazza（コラザ）ら、1999）が含まれる。免疫不全マウスへの、例は、静脈内または腹腔内注射を介して、CD45RBHi T細胞を移行することは、結腸内の上皮細胞過形成、組織損傷、および重度の単核細胞浸潤をもたらす（Byrne（バーン）ら、2005；Dohi（ドヒ）ら、2004；Wei（ウェイ）ら、2005）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、IBDのCD45RBHi T細胞移行マウスモデルにおいて評価され得る。
【０２４９】
マウスの飲料水にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を補充することにより、IBDの別の例示的な動物モデルを生じさせることができる（Martinez（マルチネス）ら、2006；Okayasu（オカヤス）ら、1990；Whittem（ホイットム）ら、2010）。DSSによる処置は、結腸での数日間続く上皮損傷および頑強な炎症を生じる。急性傷害または急性傷害とその後の修復をモデル化するために、単一の処置を用いることができる。急性で処置されたマウスは、血便、直腸出血、下痢、および体重減少を含め、急性大腸炎の兆候を示す（Okayasuら、1990）。対照的に、DSSの反復施与サイクルは慢性炎症性疾患をモデル化するために使用され得る。慢性大腸炎を発症するマウスは、結腸粘膜再生、たとえば、異形成、リンパ濾胞（リンパ球の小胞とも言う）形成、および大腸の短縮などのようなものの徴候を示す（Okayasuら、1990）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、IBDのDSSマウスモデルにおいて評価され得る。
【０２５０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、動物に、例は、経口強制飼養によって施与され、処置の有効性は、例は、内視鏡検査、結腸透光性、フィブリン付着、粘膜および血管病理、および/または便の特性によって定められる。いくらかの実施態様では、動物を屠殺し、および組織試料を採取し、そして分析し、例は、結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍のスコアを付け、および/またはホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性およびサイトカインレベル（例は、IL-1β、TNF -α、IL-6、IFN-γおよびIL-10）について分析する。
参考文献
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【実施例】
【０２５１】
以下の例は、本開示の例示的な実施態様を提供する。当技術において通常の技量の者（当業者とも言う）は、本開示の精神または範囲を変えることなく実行され得る多くの改変および変形を認識するであろう。そのような改変および変形は、本開示の範囲内に包含される。これらの例は本開示を何ら制限しない。
例
【０２５２】
以下の例は、本開示の例示的な実施態様を提供する。当業者は、本開示の精神または範囲を変えることなく実行され得る多くの修飾および変形を認識するであろう。そのような修飾および変形は、本開示の範囲内に包含される。これらの例は本開示を何ら制限しない。
例1．治療上の分子を生成するためのベクターの構築
ブチラート
【０２５３】
エシェリキア・コリのニッスルにおいてブチラートの誘導性産生を促進するために、Peptoclostridium difficile 630由来のブチラート産生経路の8つの遺伝子（bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、およびbuk；NCBI；表4）、ならびに転写および翻訳要素が合成され（Gen9、Cambridge（ケンブリッジ）、MA（マサチューセッツ州））、およびベクターpBR322中にクローニングされる。いくらかの実施態様において、ブチラート遺伝子カセットは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。一定の構築物において、FNR応答性プロモーターは、強力なリボソーム結合部位配列にさらに融合される。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロンにおいて各合成遺伝子を、T7プロモーター/翻訳開始部位に由来する15塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。一定の構築物において、ブチラート遺伝子カセットは、RNS応答調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセットは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセットは、テトラサイクリン誘導性または構成性プロモーターの制御下に置かれる。
【０２５４】
bcd2-etfA3-etfB3遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル-CoAをブチリル-CoAに変換する複合体を形成し、および共酸化剤として酸素に依存する可能性がある。本発明の組換え細菌は、酸素制限された環境（例は、哺乳動物の消化管）においてブチラートを生成するように設計されているので、その酸素依存性は、消化管でのブチラート生成の負の効果を有する可能性がある。Treponema denticolaのトランス-2-エノニル-CoAレダクターゼ（ter、表4）からの単一の遺伝子が、酸素非依存的様式でこの3つの遺伝子の複合体を機能的に置き換えることができることが示された。したがって、第1のブチラートカセットのbcd2-etfA3-etfB3遺伝子をter遺伝子が置換した第2のブチラート遺伝子カセットを合成する（Genewiz（ジーンワイズ）、Cambridge、MA）。ter遺伝子は、Integrated DNA Technologies（インテグレーテッドDNAテクノロジーズ）のオンラインコドン最適化ツール（https://www.idtdna.com/CodonOpt）を用いて、E. coliコドン使用のためにコドン最適化される。第2のブチラート遺伝子カセットならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Gen9、Cambridge、MA）、およびベクターpBR322中にクローニングする。一定の構築物において、第2のブチラート遺伝子カセットは、上記のようにFNR調節領域の制御下に置かれる（表4）。一定の構築物において、ブチラート遺伝子カセットは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセットは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセットは、テトラサイクリン誘導性または構成性プロモーターの制御下に置かれる。
第3のブチラート遺伝子カセットにおいて、pbtおよびbuk遺伝子はtesB（配列番号10）で置換される。TesBはブチリル-coAからブチラートを開裂させ、そのようにpbt-bukの必要性を排除するE.coliに見出されるチオエステラーゼである（図2参照）。
【０２５５】
一実施態様では、tesBは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。別の実施態様では、tesBは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。さらに別の実施態様において、tesBは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物において、記載された異なるブチラート遺伝子カセットは、それぞれ、テトラサイクリン誘導性または構成性プロモーターの制御下に置かれる。たとえば、遺伝学的に操作されたNissle（ニッスル）は、pbtおよびbuk遺伝子が、一酸化窒素応答性調節（配列番号80）の制御下で発現されるtesB（配列番号10）で置換されたブチラート遺伝子カセットを含み、生成される。配列番号80は、Neisseria gonorrhoeae（下線）由来のnsrR抑制因子遺伝子の逆相補体、nsrRおよびブチラート遺伝子カセットおよびそれらのそれぞれのRBS（太字）を制御する発散プロモーターを含む遺伝子間領域、ならびにRBSによって分けられるブチラート遺伝子（ter-thiA1-hbd-crt2-tesB）が含まれる。
【化７−１】
2018512841.tif 000102
【化７−２】
2018512841.tif 000103
【化７−３】
2018512841.tif 000104
【０２５６】
ブチラート、IL-10、IL-22、GLP-2
一定の構築物では、上記のブチラート（酪酸とも言う）産生経路に加えて、E. coli（エシェリキア・コリ、大腸菌とも言う）Nissleは、IL-10、IL-2、IL-22、IL-27、SOD、キヌレニン（kyurenine、キュレニンとも言う）、キヌレン酸（kyurenic acid、キュレイク酸とも言う）、およびGLP-2を生産するために、上記の方法を用いてさらに操作される。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようなブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびIL-10をコードする遺伝子（例は、配列番号49参照）を含む。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびIL-2をコードする遺伝子を含む（例は、50参照）。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびIL-22をコードする遺伝子を含む（例は、51参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびIL-27をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号52参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびSODをコードする遺伝子を含む（例は、53参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびGLP-2をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号54参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびキュレニンまたはキュウリン酸を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびIL-10、IL-22、およびGLP-2をコードする遺伝子を含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、1以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、IL-10、IL-22、IL-2、IL-27
【０２５７】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleをさらに操作して、プロピオナート（プロピオン酸塩とも言う）、およびIL-10、IL-2、IL-22、IL-27から選択される1以上の分子、SOD、キュレニン、キュレニック酸、およびGLP-2を上記の方法を用いて生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleは、プロピオン酸塩、およびIL-10、IL-2、およびIL-22から選択される1以上の分子を産生するようにさらに操作される。一定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリNissleは、プロピオン酸塩、およびIL-10、IL-2、およびIL-27から選択される1以上の分子を産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリラート経路遺伝子、pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、およびacrCをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、およびlpdを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、およびtesBを含む。
【０２５８】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、IL-10をコードする遺伝子（例は、49参照）、IL-27をコードする遺伝子（例は、配列番号52参照）、IL-22をコードする遺伝子（例は、配列番号51参照）、およびIL-2をコードする遺伝子（例は、配列番号50参照）を含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、1以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、IL-10、L-22、SOD、GLP-2、キヌレニン
【０２５９】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleをさらに操作して、IL-10、IL-22、SOD、GLP-2、およびキヌレニンから選択される1以上の分子を上記の方法を用いて産生する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleをさらに操作して、プロピオン酸塩、およびIL-10、IL-22、SOD、GLP-2、およびキヌレニンから選択される1以上の分子を、上記の方法を使用して生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleは、上記の方法を用いてIL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2、およびキヌレニンを産生するようにさらに操作される。一定の実施態様では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリは、上記の方法を用いて、プロピオン酸塩、IL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2、およびキヌレニンを産生するように操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリラート経路遺伝子、pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、およびacrCをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、およびlpdを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、およびtesBを含む。
【０２６０】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、IL-10をコードする遺伝子（例は、49参照）、IL-22をコードする遺伝子（例は、配列番号51参照）、SODをコードする遺伝子（例は、配列番号53参照）、GLP-2をコードする遺伝子（例は、配列番号54参照）、およびキヌレニンを生産するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表10および11参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、1以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、IL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、GLP-2、キヌレニン
【０２６１】
ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleをさらに操作して、IL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、 GLP-2、およびキヌレニンを、上記の方法を用いて生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリNissleは、プロピオン酸およびIL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、GLP-2、およびキヌレニンから選択される1以上の分子を生成するように操作される。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリNissleは、上記の方法を用いてIL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2、およびキヌレニンを産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリラート（アクリレート、アクリル酸とも言う）経路遺伝子、pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、およびacrCをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作される細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、およびlpdを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作される細菌は、thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、およびtesBを含む。
【０２６２】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産する遺伝子カセット、IL-10をコードする遺伝子（例は、49参照）、IL-27をコードする遺伝子（例は、配列番号52参照）、IL-2をコードする遺伝子（例は、配列番号51参照）、IL-2をコードする遺伝子（例は、配列番号50参照）、SODをコードする遺伝子（例は、配列番号53参照）、GLP-2をコードする遺伝子（例は、配列番号54参照）、およびキヌレニンを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号55-66（表9）から選択されるFNR調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、RNS応答性調節領域、例は、norBの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するRNS応答性転写因子、例は、nsrRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表9および10参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ROS応答性調節領域、例は、oxySの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するROS応答性転写因子、例は、oxyRをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表14-17参照）。一定の構築物では、1以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
【０２６３】
いくらかの実施態様において、細菌遺伝子は栄養要求株を生成するために破壊または欠失され得る。これらには、制限されないが、以下に示すように、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
【化８】
2018512841.tif 000105
「Amino Acid」→「アミノ酸」
「Oligonucleotide」→「オリゴヌクレオチド」
「Cell wall」→「細胞壁」
【０２６４】
例2．E. coli形質転換
各プラスミドをE. coli（大腸菌）NissleまたはE. coli DH5aに形質転換する。すべての試験管、溶液、およびキュベットは4℃まで予備チルド冷却する。E. coli NissleまたはE.coli DH5aの一昼夜培養物を5mLの溶原性ブロス（LB）において1：100に希釈し、およびそれが0.4-0.6のOD600に達するまで増殖させる。細胞培養培地は、選択マーカー、例は、プラスミドに適するアンピシリンを含む。次いでE. coli細胞を2,000rpmにて5分間4℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を1mLの4℃の水に再懸濁する。E. coliを再び2,000rpmにて5分間4℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を0.5mLの4℃の水に再懸濁する。E. coliを再び2,000rpmにて5分間4℃で遠心分離し、上清を除去し、および最後に細胞を0.1mLの4℃の水に再懸濁する。エレクトロポレーターは2.5kVに設定される。0.5μgの上記プラスミドの1つを細胞に添加し、ピペットによって混合し、およびピペットにより、滅菌してあるチルド冷却したキュベットに入れる。乾燥したキュベットをサンプルチャンバーに入れ、および電気パルスを適用する。室温でのSOC培地1mLを直ちに加え、および混合物を培養管に移し、そして37℃で1時間インキュベートする。細胞は、アンピシリンを含有するLBプレート上に広げ、および一昼夜インキュベートする。
【０２６５】
代わりの実施態様では、ブチラートカセットは相同組換え（Genewiz、Cambridge、MA）を通してNissleゲノムに挿入することができる。構築物およびヌクレオチド配列の編成はここに提供される。合成されたブチラートカセット構築物を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、NissleのlacZ座に相同なDNAの1000bp配列をR6K起点プラスミドpKD3に加えるために最初にGibson assembly（ギブソンアセンブリ）を使用した。これは、これらのホモロジーアームの間でクローニングされたDNAを標的にして、NissleゲノムのlacZ遺伝子座に組み込まれる。ギブソンアセンブリは、これらのアーム間の断片をクローン化するために使用した。PCRを使用して、相同性アームの全体の配列、ならびにそれらの間のブチラートカセットを含むこのプラスミドからの領域を増幅した。このPCR断片を用いて、エレクトロコンピテントNissle-pKD46を形質転換し、その株はラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含んだ。形質転換後、37℃で20ug/mLのクロラムフェニコール上に平板培養する前に、細胞を2時間培養した。37℃での増殖により、pKD46プラスミドもキュアした。カセットを含む形質転換体はクロラムフェニコール耐性およびlac-マイナス（lac-）であった。
例3．tet誘導性プロモーターを用いる組換えE. coliにおけるブチラートの生産
【０２６６】
図15-17、20および21は、tet-誘導性プロモーターの制御下で上記したブチラートカセットを示す。ブチラート塩の生産は例4において下に記載する方法を用いて評価する。試験されたtet-誘導性カセットには、（1）8つの遺伝子のすべてを含むtet-ブチラートカセット（pLOGIC031）；（2）terが置換されたtet-ブチラートカセット（pLOGIC046）および（3）pbtおよびbuk遺伝子の代わりにtesBが置換されたtet-ブチアーテ（tet-butyarte）カセット。図18は、酸素の存在下および不存在下における株pLOGIC031およびpLOGIC046におけるブチラート生産を示し、そこでは、ブチラート生産に有意差はない。ブチラート産生の亢進は、最終的な2遺伝子（ptb-buk）の欠損および内因性E. coli tesB遺伝子（ブチリルCoAからブチラート部分を切断するチオエステラーゼ）によるそれらの置換を含むpLOGIC046を発現する低コピープラスミドにおいてNissleで示された。
【０２６７】
細胞の一晩培養物をLbで1：100に希釈し、および初期対数期に達するまで1.5時間増殖させ、その時点で無水tetを最終濃度100ng/mlで添加してプラスミド発現を誘導した。誘導2時間後、細胞を洗浄し、および0.5％グルコースを含むM9最小培地にOD600=0.5にて再懸濁した。指示された時間にサンプルを取り出し、および細胞をスピンダウンさせた。上清をLC-MSを用いてブチラート生産について試験した。図22は、ter置換（pLOGIC046）またはtesB置換（ptb-buk欠失）を有するtet-ブチラートカセットを含む株におけるブチラート生産を示し、tesB置換株がより一層多くのブチラート生産を有することを実証する。
【０２６８】
図19は、E.coliのBW25113株を示し、これは、一般的なクローニング株であり、E.coli変異体のKEIOコレクションのバックグラウンドである。NuoB欠損を有するNuoB変異体が得られた。NuoBは、呼吸性増殖（電子輸送を必要とする増殖の形態）の間にNADHの酸化に関与するタンパク質複合体である。NADH酸化の電子輸送への結合の防止は、ブチラート生成を支持するために使用されるNADHの量にて増加を可能にする。図19は、野生型Nissleと比較して、NuoBの欠失がブチラートのより一層多くの産物をもたらすことを示す。
【化９−１】
2018512841.tif 000106
【化９−２】
2018512841.tif 000107
【化９−３】
2018512841.tif 000108
【０２６９】
例4．組換えE. coliにおけるブチラートの生産
ブチラートの生成に対する酸素の影響を決定するために、ブチラートの生成を上記のブチラートカセットを含むE. coliのNissle株で評価する。すべてのインキュベーションを37℃で行う。ブチラートカセットで形質転換されたE.coli株DH5aおよびNissleの培養物をLB中で一晩増殖させ、および次いで0.5％グルコースを含む4mLのM9最小培地に1：200に希釈する。細胞を振盪（250rpm）しながら4-6時間増殖させ、およびCoy嫌気性（Coy anaerobic）チャンバー（90％N2、5％CO2、5％H2を供給する）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。1mLの培養アリコートを、1.5mLのキャップ付き試験管中で調製し、および定常インキュベーター（stationary incubator）内でインキュベートして培養通気を制限する。1つの試験管を各時点（0、1、2、4、および20時間）に取り出し、およびLC-MSによってブチラート濃度を分析して、これらの組換え株におけるブチラート産生が低酸素環境下で達成できることを確認する。
【０２７０】
代わりの実施態様では、オーバーナイトの細菌培養物を新鮮なLB中に1：100に希釈し、および1.5時間増殖させて初期対数期に入るようにした。この時点で、長い半減期の一酸化窒素ドナー（供与体とも言う）（DETA-NO；ジエチレントリアミン-酸化窒素付加物）を最終濃度0.3mMで培養物に添加してプラスミドからの発現を誘導した。誘導から2時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、および細胞を0.5％グルコースを含むM9最小培地に再懸濁した。次いで、培養上清を指示された時点で分析して、ブチラート産生のレベルを評価した。pLogic031-nsrR-norB-ブチラートオペロン構築物を含む遺伝学的に操作されたNissle; SYN133）または（pLogic046-nsrR-norB-ブチラートオペロン構築物；SYN145）は、野生型Nissle（SYN001）と比較して有意により多くのブチラートを産生する。
【０２７１】
遺伝学的に操作されたNissleが生成され、それはpbtおよびbuk遺伝子がテトラサイクリンプロモーター（pLOGIC046-tesB-ブチラート；配列番号：81）の制御下で発現されるtesB（配列番号：24）で置換されるブチラート遺伝子カセットを含む。配列番号81は、tetR抑制因子の逆相補体（下線部）、tetRおよびブチラートオペロンを制御する発散プロモーターおよびそれらのそれぞれのRBS（太字）を含む遺伝子間領域およびRBSによって分けられるブチラート遺伝子（ter-thiA1-hbd-crt2-tesB）を含む。
【化１０−１】
2018512841.tif 000109
【化１０−２】
2018512841.tif 000110
【化１０−３】
2018512841.tif 000111
【０２７２】
一晩の細菌培養物を新鮮LB中に1：100に希釈し、および1.5時間増殖させて初期対数期に入るようにした。この時点で、無水テトラサイクリン（ATC）を100ng/mLの最終濃度で培養物に添加して、プラスミドからのブチラート遺伝子の発現を誘導した。誘導から2時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、および細胞を0.5％グルコース含有M9最小培地に再懸濁した。次いで、培養上清を指示された時点で分析して、ブチラート産生レベルを評価した。pbtおよびbukをtesBに置き換えることにより、より一層高いレベルのブチラート塩生成がもたらされる。
【０２７３】
図24は、グルコースおよび酸素の存在下/不存在下でFNR-ブチラートカセットsyn363（ter置換を有する）を含む株におけるブチラート生産を示す。図24は、細菌がFNRプロモーターからのブチラート産生のためにグルコースおよび嫌気的条件の両方を必要とすることを示す。細胞は、グルコースを含まない培地（LB）または0.5％グルコースを含む培地（RMC）中で好気的にまたは嫌気的に増殖させた。培養サンプルを表示された時間のパイント（pints）で採取し、および上清画分をLC-MSを用いてブチラート濃度について評価した。これらのデータは、SYN363がブチラート産生のためにグルコースを必要とし、グルコースの存在下でブチラート産生が嫌気性FNR調節ydfZプロモーターの制御下に嫌気性条件下で増強され得ることを示す。
例5．IBDのマウスモデルにおけるブチラート発現細菌の有効性
【０２７４】
上記のブチラートカセットを有する細菌を一晩LB中で増殖させる。次いで、細菌を適切な選択マーカー、例は、アンピシリンを含むLB中に1：100に希釈し、および0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および次いで遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸塩緩衝化サリン（生理的塩類溶液）に再懸濁し、および100マイクロリットルを経口強制飼養（経口胃管栄養法とも言う）によりマウスに投与する。細菌強制飼養の前に7日間、3％デキストラン硫酸ナトリウムを伴う飲料水を補充することにより、IBDをマウスに誘導する。マウスを1週間毎日処置し、および適切な選択マーカー、例あ、アンピシリンを補充した寒天プレート上に糞便ホモジネートをプレーティングすることによって糞便サンプル中の細菌を検出する。細菌処理の5日後、内視鏡検査を用いて生存マウスで大腸炎を採点する。内視鏡的損傷スコアは、結腸透光性、フィブリン付着性、粘膜および血管病理、および/または糞便特徴を評価することによって決定される。マウスを屠殺し、および結腸組織を分離する。遠位結腸切片を固定し、そして炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。結腸組織をホモジナイズし、そして酵素アッセイキットを用いてミエロペルオキシダーゼ活性を、およびサイトカインレベル（IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γおよびIL-10）を測定する。
例6．IBDのDSS誘導マウスモデルの作製
【０２７５】
例1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導マウスモデルにおいて試験することができる。動物へのDSSの施与は、腸管上皮への化学的損傷をもたらし、炎症誘発性の腸内容物（例は、内腔抗原、腸内細菌、細菌生成物）が伝染して炎症を引き起こすことを可能にする（Lowら、2013）。DSS処置用にマウスを調製するために、耳パンチ、または任意の他の適切な標識方法を用いてマウスを標識する。マウスはDSS誘導に対する異なる感受性および応答性を示すので、個々のマウスを標識することにより、研究者は各マウスの疾患の進行を追跡することができる。次いで、マウスを秤量し、および必要であれば、平均群重量を平衡化して、群間の有意な体重差を排除する。糞便はまた、DSS施与の前に、その後のアッセイのコントロールとして採取される。炎症の糞便マーカー（例は、サイトカインレベルまたはミエロペルオキシダーゼ活性）についての模範的アッセイを以下に記載する。
【０２７６】
DSS施与のために、オートクレーブ水においてDSS（MP Biomedicals（MPバイオメディカルズ）、Santa Ana（サンタアナ）、CA（カリフォルニア州）；カタログ番号160110）の3％溶液を調製する。次いで、ケージの水ボトルに100mLのDSS水を満たし、およびコントロールマウスにはDSS補給なしで同量の水を与える。この量は一般に5匹のマウスで2-3日間用に十分である。DSSは室温で安定であるが、双方の種類の水は2日ごとに、またはボトルにおいて濁度が観察されるときに交換する。
【０２７７】
DSSの施与量（通常1-5％）およびDSS施与の持続時間を改変すること（Chassaingら、2014）によって、腸炎症の急性、慢性、および解消（resolving）モデルが達成される。たとえば、急性および解消大腸炎は一週間以内を超えてDSSに単回の連続曝露後に達成され得るが、慢性大腸炎は、典型的に、回復期間で断続されたDSSの循環投与によって誘発される（例は、DSS処置の4サイクルを7日間、続いて7-10日間の水）。
【０２７８】
図27は、FNRプロモーターの制御下でDSSマウスモデルにおいてインビボで産生されるブチラート塩が腸防御性であり得ることを示す。LCN2およびカルプロテクチンは両方とも、消化管バリア破壊の尺度である（このアッセイにおけるELISAによる測定）。図27は、Syn 363（ter置換）がSyn 94（野生型Nissle）と比較して（conmpare）炎症を低減し、および/または消化管バリアを保護することを示す。
例7．インビボでの疾患進行のモニタリング
【０２７９】
DSSの初期の施与後、15-30分間空のケージ（寝床材料なし）に単一のマウスを置くことによって、毎日各動物から糞便を採取する。しかし、DSS施与が進行し、および炎症がより頑強になるにつれて、収集に要する時間が増加する。糞便サンプルは滅菌鉗子を用いて収集し、および微量遠心管に入れる。単一のペレットを用いて、以下の採点システムに従って潜血を監視する：0、陰性のヘモカルト（hemoccult）を有する正常な糞便粘稠度；1、陽性のヘモカルトを有する軟便；2、血液の痕跡を有する非常な軟便、および3、可視性直腸出血を伴う水様の便である。このスケールは、腸の出血の比較分析に使用される。残りのすべての便は、炎症マーカーの測定のために予定され、および-20℃で凍結される。
【０２８０】
各動物の体重も毎日測定する。体重は、初期のDSS施与後最初の3日間はわずかに増加し、およびその後出血の開始時に徐々に減少し始める可能性がある。急性大腸炎のマウスモデルについては、DSSは典型的には7日間施与される。しかし、この時間の長さは研究者の裁量により変更され得る。
例8． DSS誘導後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０２８１】
例1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、IBSのDSS誘発動物モデルにおいて試験することができる。細菌は、適切な抗生物質を補充したLB中で一晩増殖させる。次いで、細菌は選択的抗生物質を含有する新鮮なLB中で1：100に希釈し、0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。次いで、細菌をリン酸塩緩衝化塩類溶液（PBS）に再懸濁する。細菌強制飼養の前に7日間3％DSSで飲料水を補充することにより、IBDをマウスに誘導する。DSS処理の7日目に、100μLの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によってマウスに投与する。細菌処理を1日1回、1週間繰り返し、および糞便サンプル中の細菌を、選択的寒天平板上に糞便のホモジネートをプレーティングすることによって検出する。
【０２８２】
細菌処理の5日後、Coloview system（コロビュー・システム）（Karl Storz Veterinary Endoscopy（カール・シュトルツ・ベテリナリー・エンドスコピー）、Goleta（ゴレタ）、CA）を用いて、生存マウスにおいて大腸炎を記録する。1.5-2.0％のイソフルラン麻酔下のマウスでは、結腸を空気で膨脹させ、および近位結腸の約3cmを視覚化することができる（Chassaingら、2014）。内視鏡的損傷は、結腸透光性（スコア0-3）、腸壁へのフィブリン付着（スコア0-3）、粘膜細粒度（スコア0-3）、脈管病理（スコア0-3）、糞便特徴（正常ないし下痢；スコア0-3）、および内腔での血液の存在（スコア0-3）、最大スコア18を生成する。マウスを犠牲にし、および結腸組織を例8および9に記載のプロトコルを用いて分離する。遠位結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。残りの結腸組織をホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性と同様にサイトカインレベル（例は、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、およびIL-10）を以下に記載の方法を用いて測定する。
例9．IBDのげっ歯類モデルの安楽死手順
【０２８３】
屠殺に先立ち4時間前および24時間前に、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）（Invitrogen（インビトロゲン）、Waltham（ウォルサム）、MA（マサチューセッツ州）；カタログ番号B23151）を、供給者の推奨するようにマウスに腹腔内投与することができる。BrdUは、標準的な抗BrdU抗体（Abcam（アブカム）、Cambridge、MA）を用いた免疫組織化学による腸上皮細胞の増殖および/または移動をモニターするために使用される。
【０２８４】
屠殺の日に、マウスは4時間食物を摂取させ、および次いでFITC-デキストラントレーサー（4kDa、0.6mg/g体重）で強制飼養する。糞便ペレットを収集し、およびマウスをFITC-デキストラン投与の3時間後に安楽死させる。次いで、動物を心臓から採血して（cardiac bled）、溶血のない血清を収集する。腸の透光性は、適切に希釈した血清（励起、488nm；発光、520nm）の蛍光強度と相関し、および分光光度法を用いて測定する。マウス血清中の既知量のFITC-デキストランの連続希釈液を用いて標準曲線を作成する。
【０２８５】
あるいはまた、腸炎症は、血清ケラチノサイト由来ケモカイン（KC）、リポカリン2、カルプロテクチン、および/またはCRP-1のレベルに従って定量化する。これらのタンパク質は、炎症疾患活性の信頼できるバイオマーカーであり、およびDuoSet ELISA（ヂュオセットELISA）キット（R＆D Systems（R&Dシステムズ）、Minneapolis（ミネアポリス）、MN）を使用して製造者の指示に従って測定される。これらのアッセイのために、コントロール血清サンプルをKCについては1：2または1：4、およびリポカリン2については1：200に希釈する。DSS処理マウス由来のサンプルは、有意により一層高い希釈度を必要とする。
例10．結腸組織の分離および保存
【０２８６】
マウスから腸組織を分離するために、腹側正中線切開によって各マウスを切り開く。次いで、脾臓を取り出し、および重さを量る。増加した脾臓重量は、一般に、動物における炎症および/または貧血の程度と相関する。非選択寒天プレート上に播種した脾臓溶解物（PBS中100mg/mL）も、散在性腸内細菌の指標である。細菌の蔓延の程度は、FITC-デキストラン透光性データと一致するべきである。
【０２８７】
次に、腸間膜リンパ節を分離する。これらは、免疫細胞集団の特徴付け、および/または消化管細菌のトランスロケーションのアッセイに使用され得る。リンパ節の拡大も、DSS誘発病理の信頼できる指標である。最後に、器官を鉗子で持ち上げて盲腸が見えるまで慎重に引っ張って結腸を取り除く。炎症プロセスにより、結腸組織が薄くなり、短くなり、および腸外組織に付着するので、重度に炎症を起こしたDSS処置マウスからの結腸切開は特に困難である。
【０２８８】
結腸および盲腸は、回盲接合部での小腸、および直腸の遠位端部の肛門から分離される。この時点で、マウスの腸（盲腸から直腸まで）はグロス分析（gross analysis、肉眼的分析とも言う）のために画像化され、および結腸の長さは結腸をまっすぐにして（しかし延伸しないで）測定することができる。次いで、結腸は、回盲接合部での盲腸から分離され、および5または10mLのシリンジ（給餌針付き）を用いて冷PBSで短時間フラッシュされる。フラッシングは、任意の糞便および/または血液を除去する。しかし、ムチン層の組織学的染色または細菌の接着/転位が最終的に予想される場合、PBSで結腸を洗い流すことは避けるべきである。代わりに、結腸は、粘膜構造を維持するためにカルノア液（Carnoy’s solution）（60％エタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸；Johanssonら、2008）に浸漬する。DSS誘発炎症は一般にこの領域では観察されないので、盲腸は捨てることができる。
【０２８９】
フラッシュ後、結腸重量を測定する。炎症を起こした結腸は、組織の浪費により正常結腸と比較して重量減少を見せ、および結腸重量の減少は急性炎症の重症度と相関する。対照的に、大腸炎の慢性モデルでは、炎症は結腸重量の増加と関連することが多い。重量の増加は、マクロファージ、上皮細胞、および多核巨細胞の病巣集合（focal collections）、および/または他の細胞、たとえば、リンパ球、線維芽細胞、形質細胞などのようなものの蓄積に起因する可能性がある（WilliamsおよびWilliams、1983）。
【０２９０】
後のアッセイ用に結腸サンプルを得るため、結腸を適切な数の小片に切断する。アッセイを行うとき、マウスの異なるグループの結腸の同じ領域を比較することが重要である。たとえば、近位結腸を-80℃で凍結し、およびMPO分析のために保存し、中結腸（middle colon）をRNA later（RNAラター）において保存し、およびRNA分離のために保存し、直腸領域を組織学のために10％ホルマリンで固定する。あるいはまた、洗浄した結腸をエクスビボ（ex vivo）で培養してもよい。これらのアッセイの各々についての模範的なプロトコルを以下に記載する。
例11．ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
【０２９１】
げっ歯類の腸における顆粒球浸潤は、炎症と相関し、およびミエロペルオキシダーゼ、好中球顆粒球に豊富に発現されるものの活性レベルによって測定される。ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性は、o-ジアニシジン二塩酸塩（Sigma（シグマ社）、St. Louis（セントルイス）、MO（ミズーリ州）；カタログ番号D3252）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（Sigma；カタログ番号T2885）のいずれかを基板として用いて定量することができる。
【０２９２】
簡潔には、結腸組織のきれいに洗い流されたサンプル（50-100mg）を-80℃で貯蔵物から取り出し、および直ちに氷上に置く。次いで、サンプルを50mMリン酸緩衝液、pH6.0中の0.5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Sigma；カタログ番号H6269）中でホモジナイズする。次いで、ホモジネートを超音波処理により30秒間破壊し、ドライアイスで急速冷凍し、および合計3回の凍結融解サイクルの間解凍した後、最終超音波処理を30秒間行う。
【０２９３】
o-ジアニシジン二塩酸塩でのアッセイのために、サンプルを4℃にて高速（13,400g）で6分間遠心分離する。次いで、上清中のMPOを、1mg/mLのo-ジアニシジン二塩酸塩および0.5x10-4％のH2O2を添加し、光学密度を450nmで測定することにより、96ウェルプレートにおいてアッセイする。褐色がかった黄色は10-20分かけてゆっくりと発色するが；しかし、発色があまりにも速すぎる場合、サンプルをさらに希釈した後、アッセイを繰り返す。ヒト好中球MPO（Sigma；カタログ番号M6908）を標準として、0.5-0.015単位/mLの範囲で使用する。1酵素単位は、25℃で1分間に1.0μmolの過酸化物を分解するために必要な酵素量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特にDSS誘導組織におけるMPO活性を分析するために使用される
【０２９４】
3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を用いたアッセイのために、サンプルを60℃で2時間インキュベートし、および次いで、4,000gにて12分間スピンダウンする。上清中の酵素活性を、630nmで測光的に定量する。アッセイ混合物は、ジメチルスルホキシドに溶解した20mLの上清、10mLのTMB（最終濃度、1.6mM）、および80mMリン酸緩衝液、pH5.4において希釈した70mLのH2O2（最終濃度、3.0mM）からなる。1酵素単位は、1分当たり1吸光度単位の増加をもたらす酵素の量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特に、ここに記載のトリニトロベンゼン（TNBS）によって誘導された組織におけるMPO活性を分析するために使用される。
例12．RNA分離および遺伝子発現分析
【０２９５】
遺伝学的に操作された細菌がインビボで腸炎症をどのように減少させるかについてのさらなる機構的な洞察を得るために、半定量的および/またはリアルタイム逆転写PCRによって遺伝子発現を評価する。
【０２９６】
半定量的分析のために、RNeasy分離キット（Qiagen（キアゲン）、Germantown（ジャーマンタウン）、MD（メリーランド州）；カタログ番号74106）を用いて腸粘膜サンプルから合計RNAを抽出する。RNA濃度および純度は、260および280nmでの吸光度測定値に基づいて決定する。1μgの合計RNAを逆転写し、および以下の遺伝子、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロンγ（IFN-γ）、インターロイキン2（IL-2）、または、炎症に関連する任意の他の遺伝子についてcDNAを増幅する。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を内部標準として使用する。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の反応を、95℃で2分間の融解ステップ、94℃で30秒、63℃で30秒、および75℃で1分の25サイクルを行い、次いで65℃で5分間の最終的伸長ステップを続ける。逆転写（RT）-PCR産物を4％アガロースゲル上でサイズ別に分離し、および臭化エチジウムで染色する。相対的なバンド強度は、標準的な画像分析ソフトウェアを用いて分析する。
【０２９７】
リアルタイムで、定量的な分析のために、RNA抽出まで腸サンプル（50mg）をRNAlater溶液（Sigma；カタログ番号R0901）に貯蔵する。サンプルは-20℃で凍結維持し、長期貯蔵する。RNA抽出の日に、サンプルを解凍し、またはRNAlaterから取り出し、Trizol（トリゾール）（Fisher Scientific（フィッシャー・サイエンティフィク）、Waltham、MA；カタログ番号15596026）を用いて合計RNAを抽出する。任意の適切なRNA抽出方法を使用することができる。DSS誘発サンプルで作業するとき、塩化リチウム法（Chassaingら、2012）を使用してすべての多糖類（DSSを含む）を除去する必要がある。結腸組織中の痕跡量のDSSは、その後のステップでPCR増幅を妨げることが知られる。
【０２９８】
Primer Express(R)（プライマー・エクスプレス商標）ソフトウェア（Applied Biosystems（アプライド・バイオシステムズ）、Foster City（フォスターシティ）、CA）を用いて、免疫応答に関連する種々の遺伝子およびサイトカインのためにプライマーを設計する。合計RNAの分離後、ランダムプライマー、dNTPsおよびSuperscript(R)（スーパースクリプト商標）II酵素（Invitrogen；18064014）を用いて逆転写を行う。次いで、SYBR Green PCR Master Mix（SYBRグリーンPCRマスター・ミックス）（Applied Biosystems；4309155）およびABI PRISM 7000 Sequence Detection System（ABI PRISM 7000シーケンス・デテクション・システム）（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムPCRのために、cDNAを使用するが、任意の適切な検出方法を使用できる。PCR産物は融解分析によって検証される。
例13．組織学
【０２９９】
標準的な組織学的染色を使用して、顕微鏡レベルにて腸炎症を評価する。ヘマトキシリン-エオシン（H＆E）染色によって、細胞の浸潤、上皮の変化、および粘膜の構造の質および次元の視覚化が可能にされる（Erbenら、2014）。Periodic Acid-Schiff（過ヨウ素酸シッフ）（PAS）染色は、炭水化物（糖質とも言う）巨大分子（例は、グリコーゲン、糖タンパク質、ムチン）について染色するために使用される。杯細胞は、たとえば、ムチンの存在のためにPAS陽性である。
【０３００】
大抵の組織学的染色にはスイスロールが推奨され、げっ歯類の腸の全長を検査することができる。これは、腸を部分に分け、縦に開き、および次に、粘膜で外側に圧延する単純な技術である（MoolenbeekおよびRuitenberg、1981）。簡潔には、個々の結腸片を縦に切断し、PBSで湿らせた爪楊枝のまわりに包み、およびカセットに入れる。10％ホルマリン中で24時間固定した後、カセットを染色日まで70％エタノール中に貯蔵する。ホルマリン固定結腸組織は、抗BrdU抗体（Abcam）を用いてBrdUに対して染色することができる。あるいはまた、Ki67を用いて上皮細胞の増殖を視覚化することができる。より一層特異的な標的に対する抗体（例は、免疫組織化学、免疫蛍光）を用いる染色のために、凍結切片を凍結保護包埋媒体、たとえば、Tissue-Tek(R)（ティッシュ-テク商標）OCT（VWR、Radnor（ラドナー）、PA；カタログ番号25608-930）などのようなもののにおいて固定する。
【０３０１】
H＆E染色のために、染色された結腸組織は、上皮損傷、ならびに粘膜、粘膜下組織、および筋肉/漿膜への炎症浸潤の程度に基づいて各セクションに0-3の4つのスコアを割り当てることによって分析する。これらのスコアのそれぞれは、次のように増加する：1、変化が限局性である場合；2、変化がパッチ状である場合；3、変化が拡散する場合である。その後、4つの個々のスコアが各結腸について合計され、その結果、1つの動物につき合計スコア0-36が得られる。コントロール群および罹患群の平均スコアを集計する。代わりの採点システムはここに詳述される。
例14．げっ歯類の結腸のエクスビボ培養
【０３０２】
エキソビボで結腸を培養することにより、腸炎症の重篤度に関する情報を提供することができる。縦方向に切断した結腸（約1.0cm）を、1.0％ペニシリン/ストレプトマイシン（Fisher（フィッシャー社）；カタログ番号BP295950）を伴うHanks’ Balanced Salt Solution（ハンクス平衡塩類溶液）中で3回連続して洗浄する。次に、洗浄した結腸を、1.0％ペニシリン/ストレプトマイシンを伴う1.0mLの無血清RPMI1640培地（Fisher；カタログ番号11875093）を各々含む24ウェルプレートのウェルに入れ、および37℃にて5.0％CO2と共に24時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を集め、および4℃にて10分間遠心分離する。上清は、炎症促進性サイトカインの分析前に-80℃にて貯蔵される。
例15．TNBS誘発後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０３０３】
DSSとは別に、1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、IBDの他の化学的に誘導された動物モデルにおいて試験することもできる。非制限的な例には、オキサゾロン（Boirivantら、1998）、酢酸（MacPhersonおよびPfeiffer、1978）、インドメタシン（Sabiuら、2016）、スルフヒドリルインヒビター（Satohら、1997）、およびトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）（Gurtnerら、2003；Seguiら、2004）によって誘導されるものが含まれる。大腸炎のTNBS誘発マウスモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の効力を決定するために、細菌を、適切な抗生物質を補充したLB中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なLB中で細菌を1：100に希釈し、0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をPBSに再懸濁する。IBDは、0.25mLの50％（vol/vol）エタノール（Seguiら、2004）中の30mgのTNBSの結腸内投与によってマウスにおいて誘導される。コントロールマウスに0.25mLの塩類溶液を施与する。誘発4時間後、100μLの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によりマウスに対して管理する。細菌処理は1日1回、1週間繰り返す。動物の重量を毎日秤量する。
【０３０４】
7日間の細菌処理の後、マウスをチオブタバルビタール（100mg/kg）の腹腔内投与によって屠殺する。結腸組織を鈍的切開（blunt dissection）によって分離し、塩類溶液ですすぎ、および重量を測定する。血液サンプルは、1mL注射筒を使用して無菌条件下で開放心穿刺（open cardiac puncture）によって収集し、エッペンドルフバイアルに入れ、および4℃にて1,500gで10分間回転させる。次いで、上清血清をオートクレーブしたエッペンドルフバイアルに分注し、および定量的比色分析市販キット（R＆D Systems）を用いてIL-6レベルの後の検定のために-80℃で凍結する。
【０３０５】
肉眼的損傷は、盲検の観察者によって解剖顕微鏡下で検査される。腸癒着（スコア0-2）、狭窄（スコア0-3）、潰瘍（スコア0-3）、および肉厚（スコア0-2）の存在/重症度を説明するために確立されたスコアリングシステムを使用する（Mourelleら、1996）。その後、2つの結腸サンプル（50mg）を切除し、液体窒素中で急速凍結し、およびその後のミエロペルオキシダーゼ活性アッセイのために-80℃で貯蔵する。必要に応じて、組織標定のために10％ホルマリン中に追加のサンプルを保存する。次いで、ホルマリン固定した結腸サンプルを、パラフィンに包埋し、および5μm切片をH＆Eで染色する。結腸の顕微鏡的炎症は、以前に規定された基準（AppleyおよびWallace、1995）に従って、0-11のスケールで評価される。
例16．IBDの細胞移入マウスモデルの作製
【０３０６】
例1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、IBDの細胞移入動物モデルにおいて試験することができる。1つの典型的な細胞移入モデルは、大腸炎のCD45RBHi T細胞移入モデルである（Bramhallら、2015；Ostaninら、2009；Sugimotoら、2008）。このモデルは、CD45+ T細胞をCD45RBの発現のそれらのレベルに従って選別し、およびCD45RB発現が高いCD4+ T細胞（CD45RBHiT細胞と称する）を正常ドナーマウスから免疫不全マウス（例は、SCIDまたはRAG-/-マウス）に養子的に移入することによって生じさせる。具体的なプロトコルは以下の通りである。
CD4 T細胞についての豊富化
【０３０７】
いずれかの性のC57BL/6野生型マウス（Jackson Laboratories（ジャクソン・ラボラトリーズ）、Bar Harbor（バーハーバー）、ME（メイン州））を安楽死させた後、マウス脾臓を取り出し、10-15mLのFACS緩衝剤（Ca2+/Mg2+を含まない4％ウシ胎児血清を補充した1X PBS）を含む氷上の100mmペトリ皿中に置く。脾臓は、組織の大きな部分が残らなくなるまで、FACS緩衝剤でコーティングされた2枚のガラススライドを用いて裂かれる。次いで、細胞懸濁物は、10mL注射筒（針なし）を使用して皿から取り出し、および氷上に置かれた50mLコニカルチューブに注射筒から（26ゲージ針を使用して）排出する。ペトリ皿を、50mLコニカルチューブがいっぱいになるまで、同じ針技術を用いてさらに10mLのFACS緩衝剤いより洗浄する。細胞を4℃にて10分間400gで遠心分離することによりペレット化する。細胞ペレットをFACS緩衝剤の流れで穏やかに破壊した後、細胞を計数する。計数に使用した細胞を氷上に保持し、および次のセクションで説明する単色染色用に保存する。他のすべての細胞（すなわち、50mLコニカルチューブに残っているもの）を新しい50mLコニカルチューブに移す。各チューブには最大25×107細胞が含まれている必要がある。
【０３０８】
CD4+ T細胞を濃縮するために、Dynal(R)（ダイナル商標）Mouse CD4 Negative Isolation kit（マウスCD4ネガティブ・アイソレーション・キット）（Invitrogen；カタログ番号114-15D）を製造業者の指示に従って使用する。同等の任意のCD4+ T細胞濃縮法を用いることができる。陰性選択の後、CD4+細胞は上清中に残る。上清を氷上で新しい50mLコニカルチューブに注意深くピペットで入れ、および細胞を4℃にて10分間400gで遠心分離してペレットにする。次いで、すべての50mLチューブからの細胞ペレットを再懸濁し、単一の15mLチューブにプールし、および遠心分離によりもう一度ペレット化する。最後に、細胞を1mLの新鮮なFACS緩衝剤に再懸濁し、および抗CD4-APCおよび抗CD45RB-FITC抗体で染色する。
CD4+ T細胞の蛍光標識
【０３０９】
CD4+ T細胞を標識するために、FACS緩衝剤において予め滴定した抗CD4-APCおよび抗CD45RB-FITC抗体の適切な希釈物を含有する抗体カクテル（およそ1mLのカクテル/5×107細胞）を、1.5mLエッペンドルフチューブに入れ、および容量をFACS緩衝剤で1mLに調整する。次いで、抗体カクテルを15mLチューブにおいて細胞と合わせる。チューブに蓋をし、適切に混合されるのを確実にするように穏やかに逆さにし、およびロッキングプラットフォーム上で4℃にて15分間インキュベートする。
【０３１０】
インキュベーション期間中に、96ウェル丸底染色プレートは、計数した細胞（前のセクションから保存したもの）の等しいアリコートを、単色コントロール染色に対応するプレートの各ウェル中に移すことによって用意する。次いで、これらのウェルをFACs緩衝液で200μLまで満たし、および予め冷却したプレート遠心分離機を用いて細胞を4℃にて3分間300gでペレット化する。遠心分離後、上清を、真空ラインに取り付けた21ゲージの針を用いて捨て、および非特異的結合を防ぐために各ウェルに100μLの抗CD16/32抗体（Fc受容体ブロッキング）溶液を加える。プレートをロッキングプラットフォーム上で4℃にて15分間インキュベートする。次いで、細胞を200μLFACS緩衝液で洗浄し、および遠心分離によってペレット化する。上清を吸引し、廃棄し、および100μLの適切な抗体（すなわち、予め滴定した抗CD4-APCまたは抗CD45RB-FITC）を各単色コントロールに対応するウェルに加える。染色されないコントロールウェル中の細胞を100μLのFACS緩衝液に再懸濁する。プレートをロッキングプラットフォーム上で4℃にて15分間インキュベートする。2回洗浄した後、細胞を200μLのFACS緩衝液に再懸濁し、150-200μLのFACS緩衝液を含む12本の75mmフローチューブに移し、およびチューブを氷上に置く。
【０３１１】
インキュベーション後、抗体カクテルを含む15mLチューブ中の細胞を、4℃にて10分間400gで遠心分離することによってペレット化し、およびFACS緩衝液中に再懸濁して25-50×106細胞/ mLの濃度を得る。
CD4+CD45RBHi T細胞の精製
【０３１２】
CD45RBHi集団およびCD45RBLow集団の細胞選別は、フローサイトメトリーを用いて行う。簡潔には、非染色細胞のサンプルを用いてベースライン自己蛍光を確立し、リンパ球の前方散乱対側方散乱ゲーティングを行う。単色コントロールは、各蛍光色素に適用する適切なレベルの補正を設定するために使用する。しかし、FITCおよびAPC蛍光色素では、概して補償は必要とされない。次いで、単一パラメータのヒストグラム（一重項リンパ細胞上にゲートされたもの）を用いてCD4+（APC +）一重項細胞をゲートし、および第二の一重項パラメータ（CD4+一重項細胞にゲートされたもの）を収集して、ソートゲートを確立する。CD45RBHi集団は、最も明るいCD45RB染色を示す細胞の40％として規定され、その一方で、CD45RBLow集団は、最も暗いCD45RB発現を有する細胞の15％として規定される。これらの集団のそれぞれを個別にソートし、およびCD45RBHi細胞を養子移入に用いる。
養子移入
【０３１３】
CD4+CD45RBHi細胞の精製集団を、6ないし8週齢のRAG-/-雄性マウスに養子移入する。選別された細胞を含む収集チューブにFACS緩衝液を満たし、および細胞を遠心分離によってペレット化する。次いで上清を捨て、および細胞を500μLのPBSに再懸濁する。再懸濁した細胞を、1本のチューブにつき最大5×106細胞を用い、注入チューブに移し、および冷PBSで1×106細胞/mLの最終濃度にまで希釈する。注射チューブは氷上に保持する。
【０３１４】
注入の前に、レシピエントマウスを秤量し、および注射チューブを穏やかに数回反転させて細胞を混合する。混合細胞（0.5mL、約0.5×106細胞）を、26G3/8針を取り付けた1mLシリンジに注意深く引き込む。次いで、細胞をレシピエントマウスに腹腔内注入する。
例17．CD45RBHi T細胞トランスファーモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０３１５】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がCD45RBHi T細胞移入マウスにおいて有効であるかどうかを決定するために、養子移入後の疾患の進行について、各マウスを毎週秤量することによってモニターする。典型的には、移送後最初の3週間に控えめな体重増加が観察され、次に4-5週間では遅いが進行性の体重減少が観察される。体重減少は概して、緩い糞便および下痢の出現を伴う。
【０３１６】
レシピエントマウスが疾患の徴候を発症し始めるので、移入後4または5週で、例1に記載された遺伝学的に操作された細菌を、適切な抗生物質を補充したLB中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なLB中で細菌を1：100に希釈し、0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をPBSに再懸濁し、および100μLの細菌（またはビヒクル）をCD45RBHi T細胞トランスファーマウスに経口強制飼養によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に1日1回1-2週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
例18．遺伝学的マウスモデルのIBDにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０３１７】
例1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、IBDの遺伝学的な（コンジェニックおよび遺伝子改変された）動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、IL-10は抗炎症性サイトカインであり、IL-10をコードする遺伝子はクローン病および潰瘍性大腸炎の両方の感受性遺伝子である（Khorら、2011）。炎症の研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出すために、IL-10またはその受容体の機能障害が用いられる（Bramhallら、2015）。正常条件下で飼育されたIL-10ノックアウト（IL-10-/-）マウスは腸内で慢性炎症を発症する（IyerおよびCheng、2012）。
【０３１８】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がIL-10-/-マウスにおいて有効であるかどうかを定めるために、適切な抗生物質を補充したLB中で一晩細菌を増殖させる。次に、選択性抗生物質を含有する新鮮なLB中で細菌を1：100に希釈し、0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をPBSに再懸濁し、および100μLの細菌（またはビヒクル）をIL-10-/-マウスに経口胃管栄養法によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に1日1回1-2週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
【０３１９】
遺伝学的に操作された細菌を試験するためのプロトコルは、IBDの他の遺伝学的動物モデルと同様である。そのようなモデルには、制限されないが、SAMP1/YitFc（Pizarroら、2011）、ドミナントネガティブN-カドヘリン変異体（NCADデルタ；HermistonおよびGordon、1995）、TNFΔARE（Wagnerら、2013）、IL-7（Watanabeら、1998）、C3H/HeJBir（Elsonら、2000）、およびドミナントネガティブTGF-βレセプターII変異体（Zhangら、2010）；およびノックアウトマウスモデル、例は、TCRα-/-（Mombaertsら、1993；Sugimotoら、2008）、WASP-/-（Nguyenら、2007）、Mdr1a-/-（Wilkら、2005）、IL-2Rα-/-（Hsuら、2009）、Gαi2-/-（Ohmanら、2002）、およびTRUC（Tbet-/-Rag2-/-；Garrettら、2007）が含まれる。
例19．IBDのトランスジェニックラットモデルにおける遺伝学的操作細菌の有効性
【０３２０】
例1に記載の遺伝学的に操作された細菌は、IBDの非ネズミ動物モデルにおいて試験することができる。Fisher（F344）ラットへのヒト白血球抗原B27（HLA-B27）およびヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子の導入は、GI管における自発的な、慢性炎症を誘発する（Alaviら、2000；Hammerら、1990）。本発明の遺伝学的操作細菌がこのモデルにおける消化管炎症を改善することができるかどうかを調べるために、細菌を適切な抗生物質を補充したLB中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なLB中で細菌を1：100に希釈し、0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をPBSに再懸濁し、およびトランスジェニックF344-HLA-B27ラットに経口胃管栄養法により100μLの細菌（またはビヒクル）を投与する。細菌処理を1日1回、2週間繰り返す。
【０３２１】
細菌処理が、25週齢にてF344-HLA-B27ラットに通常存在する肉眼的および組織学的腸病変を軽減するかどうかを定めるために、初期の処置後14日目にすべての動物を屠殺する。GI（胃腸）管を次に、腸間膜境界に沿って開き、トライツ（Treitz）の靱帯から直腸まで切除し、およびフラットベッドスキャナを用いて画像化する。合計の粘膜損傷は、損傷した合計表面積のパーセントとして報告され、標準画像分析ソフトウェアを用いて定量化する。
【０３２２】
顕微鏡分析のために、サンプル（0.5-1.0cm）を小腸および大腸の正常領域および疾患領域の両方から切除する。H＆E染色のために切片（5μm）を処理する前に、サンプルをホルマリンで固定し、およびパラフィンに包埋する。染色された切片を分析し、および以下のように採点する：0、炎症なし；1、軽度の炎症が粘膜下層に広がる；2、中程度の炎症が筋固有層中に広がる；3、重度の炎症。スコアをまとめ、および平均±標準誤差として報告する。
例19．ブチラート生成細菌株は低用量DSS誘導マウスモデルのIBDにおいて消化管炎症を減少させる
【０３２３】
0日目に、40匹のC57BL6マウス（8週齢）を秤量し、および以下の5つの処置群（群当たりn = 8）に無作為化した：H2Oコントロール（グループ1）；0.5％DSSコントロール（グループ2）；0.5％DSS+100mMブチラート（グループ3）；0.5％DSS+SYN94（グループ4）；および0.5％DSS+SYN363（グループ5）。無作為化後、グループ3のケージ水をブチラート（100mM）を補充した水に変え、およびグループ4および5で、それぞれ100μLのSYN94およびSYN363を経口強制飼養によって投与した。1日目に、グループ4および5は、朝に細菌で強制飼養され、計量され、そして夕方に再び強制飼養された。グループ4および5も、2日目および3日目に1日1回強制飼養した。
【０３２４】
4日目に、グループ4および5に、細菌を強制経口投与し、および次いですべてのマウスを秤量した。ケージ水をH2O+0.5％DSS（グループ2、4、および5）に、または100mMブチラート（グループ3）を補充したH2O+0.5％DSSのいずれかに変化させた。グループ4および5のマウスを夕方に再び強制飼養した。5-7日目に、グループ4および5には、朝に細菌が強制飼養され、計量され、および夕方に再び強制飼養された。
【０３２５】
8日目に、すべてのマウスを4時間絶食させ、およびグループ4および5を、食物の除去直後に細菌で強制飼養した。次いで、すべてのマウスを秤量し、およびFITC-デキストラントレーサー（4kDa、0.6mg/g体重）の単回用量で強制飼養した。糞便ペレットを集めたが；しかし、大腸炎が糞便収集を防ぐのに十分に重度であった場合、安楽死後に糞便を採取した。FITC-デキストラン投与後、すべてのマウスを正確に3時間で安楽死させた。次いで、動物を心臓採血し、および血液サンプルを処理して血清を取得した。マウスリポカリン2、カルプロテクチン、およびCRP-1のレベルをELISAによって定量し、およびFITC-デキストランの血清レベルを分光光度法によって分析した（例8も参照）。
【０３２６】
図27は、研究の8日目にELISAによって示される、すべての処置群におけるリポカリン2（LCN2）レベルを示す。LCN2は炎症疾患活性のバイオマーカーであるので、これらのデータは、低用量のDSS誘導性のIBDマウスモデルにおいて、SYN363がLCN2濃度、ならびに消化管炎症を有意に低下させるのに十分なブチラートを産生することを示唆する。
例20：一酸化窒素誘導性レポーター構築物
【０３２７】
ATCおよび一酸化窒素誘導性レポーター構築物を合成した（Genewiz、Cambridge、MA）。これらの同族インデューサーによって誘導されるとき、これらの構築物はGFPを発現し、これはプレートリーダーにおいて395/509nmの励起/発光にて蛍光をモニターすることによって検出される。コントロール、ATC-誘導性Ptet-GFPレポーター構築物、または酸化窒素誘導性PnsrR-GFPレポーター構築物のいずれかを有するプラスミドを保有するNissle細胞を、まず、初期の対数期（〜（約）0.4-0.6のOD600）まで増殖させ、その時点で、LBおよび2倍減少インデューサー（ATCまたは長い半減期のNOドナー、DETA-NO（Sigma））を含む96ウェルマイクロタイタープレートに移した。ATCおよびNOの両方は、様々な濃度にわたってそれらのそれぞれの構築物においてGFPの発現を誘導することができ（図28）；プロモーター活性は相対的な蛍光単位として表される。一酸化窒素誘導性レポーター構築物の例示的な配列が示される。bsrR配列は太字で表示される。gfp配列には下線が引かれる。PnsrR（NO調節プロモーターおよびRBS）はイタリック体である。構成的プロモーターおよびRBSは枠で囲まれる。
【０３２８】
これらの構築物は、それらの同族のインデューサーによって誘導されるとき、GFPの高レベル発現を導き、それはプレートリーダーで395/509nmの励起/発光で蛍光をそれぞれモニターすることによって検出される。ATC誘導性Ptet-GFPレポーター構築物または酸化窒素誘導性PnsrR-GFPレポーター構築物のいずれかを伴うプラスミドを所有するNissle細胞を、初めに早期対数期（OD600=〜0.4-0.6）まで増殖させ、その時点でそれらは、LBを含有し、およびインデューサー（ATCまたは長い半減期のNOドナー、DETA-NO（Sigma））において2倍の減少を有するマイクロタイタープレートに移した。ATCおよびNOの両方が、広範囲の濃度にわたってそれらのそれぞれの構築物においてGFPの発現を誘導することが可能であると観察された。プロモーター活性は相対蛍光単位として表される。
【０３２９】
図29は、NO-GFP構築物（ドットブロット）を示し、一酸化窒素誘導性NsrR-GFPレポーター融合物を有するE. coliのNissleを、カナマイシンを補充したLB中で一晩増殖させた。次いで、細菌はカナマイシンを含有するLB中に1：100に希釈し、および0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および次いで遠心分離によってペレット化した。細菌をリン酸緩衝化生理的塩類溶液において再懸濁し、および100マイクロリットルを経口強制飼養によりマウスに投与した。IBDは、細菌の強制飼養の前に7日間2-3％デキストラン硫酸ナトリウムで飲料水を補充することによってマウスにおいて誘導される。強制飼養4時間後に、マウスを殺し、および細菌を結腸サンプルから回収した。結腸内容物をSDSにおいて沸騰させ、および可溶性画分を用いてGFP検出のためにドットブロットを実行した（NsrR調節プロモーターの誘導）。GFPの検出は、HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合した抗GFP抗体の結合によって実行した。Pierce（ピアス社）化学発光検出キットを用いて検出を視覚化した。図面では、NsrR調節プロモーターがDSS処置マウスにおいて誘導されることが示されるが、未処置マウスにおいて誘導されることは示されない。これは、NO、および従って炎症に応答するNsrRの役割と一致する。
【０３３０】
構成的プロモーターの制御下でNsrRを発現するプラスミドを所有する細菌およびNsrR誘導性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子gfp（緑色蛍光タンパク質）を、カナマイシンを補充したLB中で一晩増殖させた。次いで、細菌は、カナマイシンを含有するLB中に1：100に希釈し、および約0.4-0.5の光学密度まで増殖させ、および次いで遠心分離によってペレット化する。細菌をリン酸緩衝化生理的塩類溶液に再懸濁し、および100マイクロリットルを経口強制飼養によりマウスに投与する。IBDは、細菌の強制飼養の前に7日間、2-3％デキストラン硫酸ナトリウムで飲料水を補充することによってマウスにおいて誘導される。強制飼養4時間後に、マウスを殺し、および細菌を結腸サンプルから回収した。結腸の内容物をSDSにおいて煮沸し、およびGFP検出についてドットブロットを実行するために可溶性画分を使用した（NsrR調節プロモーターの誘導）。HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合した抗GFP抗体の結合によってGFPの検出を実行した。Pierce化学発光検出キットを用いて検出を視覚化した。図15は、NsrR調節プロモーターがDSS処理マウスで誘導されるが、未処理マウスで誘導されないことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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