(57)【要約】  本発明は、２つ以上のペプチドループが足場に対する結合点の間に内在するように、分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、膜型タイプ１メタロプロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）の高親和性結合剤であるペプチドを記載する。本発明はまた、画像化および標的化がん治療で有用性を有する１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートしている、このようなペプチドを含む薬物コンジュゲートも記載する。
2018502825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＴ１−ＭＭＰに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、前記ペプチドリガンドが、式（Ｉ）のアミノ酸配列：
−Ｃｉ−Ｘ１−Ｕ／Ｏ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ５−Ｃｉｉ−Ｅ６−Ｄ７−Ｆ８−Ｙ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩を含み、
ここで、
Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンド。
【請求項２】
Ｘ１が、以下のアミノ酸Ｙ、Ｍ、ＦまたはＶ、例えば、Ｙ、ＭまたはＦ、具体的には、ＹまたはＭ、さらに具体的にはＹのうちのいずれか１つから選択される、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
Ｕ／Ｏ２が、Ｕ、例えば、Ｎ、またはＯ、例えば、Ｇから選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
Ｘ３が、ＵまたはＺから選択され、ここでＵが、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される、極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、ＺがＤまたはＥから選択される、極性の負に荷電されたアミノ酸残基を表し、具体的には、３位のＵは、Ｑから選択されるか、または３位のＺは、Ｅから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載されるペプチドリガンド。
【請求項５】
Ｘ４がＪから選択され、ここでＪが、Ｆ、ＷおよびＹから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
Ｘ１０がＺから選択され、ここでＺが、ＤまたはＥ、例えば、Ｄから選択される極性の負に荷電されたアミノ酸残基を表す、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
Ｘ１１がＯから選択され、ここでＯが、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶ、例えば、Ｉから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表す、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉａ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｕ／Ｏ−Ｕ／Ｚ−Ｊ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｚ−Ｏ−Ｃｉｉｉ−（配列番号６）（Ｉａ）
であり、
式中、Ｕ、Ｏ、ＪおよびＺが、前に定義されるとおりであるか、または
式（Ｉｂ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号７）（Ｉｂ）であるか；または
式（Ｉｃ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号８）（Ｉｃ）であるか；または
式（Ｉｄ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ−Ｎ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号９）（Ｉｄ）であるか；または
式（Ｉｅ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）（Ｉｅ）
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
式（Ｉ）の前記ペプチドが、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）；
−Ｃｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）；
−Ｃｉ−Ｆ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０２）（配列番号１１）；
−Ｃｉ−Ｖ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０３）（配列番号１２）；
−Ｃｉ−Ｆ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０４）（配列番号１３）；
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｙ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７−Ｎ０５７）（配列番号１４）；および
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−４４−Ｎ００２）（配列番号１５）、
例えば、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）；および
−Ｃｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）、
特に、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）
から選択される配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸での置換、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積または等電子アミノ酸での置換）、スペーサー基の付加、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ−アルキル化、１つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびに、システイン、リジン、グルタミン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後生体直交型修飾から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
前記修飾が、適切なアミノ反応性化学反応を用いるＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学反応を用いるＣ末端修飾を含む、請求項１０に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
前記Ｎ末端修飾が、Ａｌａ、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ基またはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基など、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環性ペプチドのその標的に対する活性の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含む、請求項１０または１１に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
前記Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾が、細胞毒性剤の付加を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１４】
アミノ酸１位および／または９位において修飾を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１５】
１つまたは複数のアミノ酸残基の、１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基による置換を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１６】
前記非天然のアミノ酸残基が４位において置換され、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；３，４−ジクロロフェニルアラニン；およびホモフェニルアラニン、例えば、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；および３，４−ジクロロフェニルアラニン、具体的には、１−ナフチルアラニンから選択される、請求項１５に記載のペプチドリガンド。
【請求項１７】
前記非天然のアミノ酸残基が９位および／または１１位において置換され、９位について４−ブロモフェニルアラニンもしくはペンタフルオロ−フェニルアラニン、および／または１１位についてｔｅｒｔ−ブチルグリシンから選択される、請求項１５または１６に記載のペプチドリガンド。
【請求項１８】
前記非天然のアミノ酸残基、例えば、９位に存在するアミノ酸残基が、４−ブロモフェニルアラニンから選択される、請求項１７に記載のペプチドリガンド。
【請求項１９】
前記非天然のアミノ酸残基、例えば、１１位に存在するアミノ酸残基が、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンから選択される、請求項１７に記載のペプチドリガンド。
【請求項２０】
複数の修飾、例えば、以下の修飾のうちの２、３、４または５以上、具体的には、以下の１位および／または５位のＤ−アラニン、４位の１−ナフチルアラニン、９位の４−ブロモフェニルアラニンおよび１１位のｔｅｒｔ−ブチルグリシンの５つの修飾のうちの全てを含む、請求項１５に記載のペプチドリガンド。
【請求項２１】
１位の前記アミノ酸残基が、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニンで置換されている、請求項１０に記載のペプチドリガンド。
【請求項２２】
５位の前記アミノ酸残基が、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アラニンまたはＤ−アルギニンで置換されている、請求項１０に記載のペプチドリガンド。
【請求項２３】
前記薬学的に許容される塩が、遊離の酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２４】
ヒト、マウスおよびイヌのＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインの高親和性結合剤である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２５】
ＭＴ１−ＭＭＰに関して選択性であり、ただしＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１５およびＭＭＰ−１６とは交差反応しない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２６】
１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートしている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
前記エフェクターおよび／または官能基が、細胞毒性剤または金属キレーターを含む、請求項２６に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
細胞毒性剤が、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの切断可能な結合によって二環性ペプチドに連結している、請求項２７に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
前記細胞毒性剤が、以下の構造：
【化１】
2018502825.tif 000036
を有するＤＭ１、
または以下の構造：
【化２】
2018502825.tif 000037
を有するＭＭＡＥから選択される、請求項２７または請求項２８に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
以下の構造：
【化３】
2018502825.tif 000038
を有する化合物である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
化合物が、以下の構造：
【化４】
2018502825.tif 000039
を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
前記細胞毒性剤がメイタンシノイドであり、式（ＩＩ）の化合物：
【化５】
2018502825.tif 000040
から選択され、
式中、ｎが１〜１０の整数を表し、
Ｒ１およびＲ２が独立して、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基、例えば、水素またはメチルを表す、請求項２７または請求項２８に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
ｎが１を表し、Ｒ１およびＲ２が両方とも水素（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ１）を表すか；または
ｎが２を表し、Ｒ１が水素を表し、Ｒ２がメチル基（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ３）を表すか、または
ｎが２を表し、Ｒ１およびＲ２が両方ともメチル基（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ４）を表す、請求項３２に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
前記コンジュゲートの二環性ペプチド構成要素が、式（ＩＩＩ）に示される構造：
【化６】
2018502825.tif 000041
を有し、
式中、ｍが０〜１０から選択される整数を表し、
Ｒ３およびＲ４が独立して、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基、例えば、水素またはメチルを表す、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
前記細胞毒性剤が、式（ＩＶ）：
【化７】
2018502825.tif 000042
に記載のリンカーによって二環性ペプチドに連結しており、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基、例えば、水素またはメチルを表し、
毒素は、任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを表し、
ｎが、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍが、１〜１０から選択される整数を表す、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３６】
化合物（ＩＶ）の前記毒素がメイタンシンであり、式（Ｖ）の化合物：
【化８】
2018502825.tif 000043
を含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基を表し、
二環が、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを表し、
ｎが、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍが、１〜１０から選択される整数を表す、請求項３５に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３７】
ｎが１を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素、すなわち、式（Ｖ）ａの化合物：
【化９】
2018502825.tif 000044
を表すか、または
ｎが１を表し、Ｒ１がメチルを表し、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素、すなわち、式（Ｖ）ｂの化合物：
【化１０】
2018502825.tif 000045
を表すか、または
ｎが２を表し、Ｒ１およびＲ２が両方とも水素を表し、Ｒ３およびＲ４が両方ともメチル、すなわち、式（Ｖ）ｃの化合物：
【化１１】
2018502825.tif 000046
を表すか、または
ｎが２を表し、Ｒ１およびＲ３が両方ともメチルを表し、Ｒ２およびＲ４が両方とも水素、すなわち、式（Ｖ）ｄの化合物：
【化１２】
2018502825.tif 000047
を表す、請求項３６に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３８】
ＢＴ１７ＢＤＣ−９
【化１３】
2018502825.tif 000048
ＢＴ１７ＢＤＣ−１７
【化１４】
2018502825.tif 000049
ＢＴ１７ＢＤＣ−１８
【化１５】
2018502825.tif 000050
ＢＴ１７ＢＤＣ−１９
【化１６】
2018502825.tif 000051
および
ＢＴ１７ＢＤＣ−２０
【化１７】
2018502825.tif 000052
例えば、ＢＴ１７ＢＤＣ−９、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９、具体的には、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９から選択される、請求項２６または請求項２７に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３９】
スキームＩ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１項に記載の合成経路を含む、請求項３８に記載の薬物コンジュゲートを調製するためのプロセス。
【請求項４０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドリガンド、または請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項４１】
がん、具体的には、固形腫瘍、例えば非小細胞肺がんの予防、抑制または処置における使用のための、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個以上のペプチドループが分子足場への結合点の間に内在するように、分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、膜型タイプ１メタロプロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）の高親和性結合剤であるペプチドを記載する。本発明はまた、画像化および標的化がん治療で有用性を有する１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基に対してコンジュゲートしている、このようなペプチドを含む薬物コンジュゲートも記載する。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗がん薬のオクトレオチド（octreotide）のように、数種の環状ペプチドが、既に診療所において使用することに成功している（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７  （７），  ６０８−２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。通常、大環状分子は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，  １０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６  （５５６５），  １５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン（upain）−１（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０  （１），  １−１０）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
その環状立体配置のため、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたらす。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに及ぶその選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例証されてきた（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１  （１１），  １７４９−５１）。大環状化により達成される有利な結合特性は、例えばバンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシン等、２個以上のペプチド環を有する多環性ペプチドにおいてさらにより明らかである。
【０００４】
様々な研究チームが、今までに、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ  （１９８５），  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ；  Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用している（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。
【０００５】
ファージディスプレイベースのコンビナトリアルアプローチが開発され、目的の標的に対する二環性ペプチドの大型のライブラリが生成されてスクリーニングされた（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５  （７），  ５０２−７およびＷＯ２００９／０９８４５０）。要約すると、３個のシステイン残基と、２個のランダムな６アミノ酸領域とを含有する（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）に共有結合させることにより環化させた。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、ＭＴ１−ＭＭＰに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および上記ポリペプチドの上記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが上記分子足場上に形成され、上記ペプチドリガンドが、式（Ｉ）のアミノ酸配列
−Ｃｉ−Ｘ−Ｕ／Ｏ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）（Ｉ）
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩を含み、
ここで、
Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンドが提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基、例えば、細胞毒性剤、具体的には、ＤＭ１およびＭＭＡＥにコンジュゲートしている、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基、例えばキレーター基を保有する放射性核種、具体的には、ＤＯＴＡにコンジュゲートしている、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含むコンジュゲートが提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、がん、具体的には、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置における使用のための、本明細書に定義されるペプチドリガンドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】１７−６９−０７−Ｎ２１９のマウス血漿安定性。いくつかのイオンを、リガンド中で示されるとおり、モニターし、２つのトランジションもＭＲＭ方式でモニターした。イオンの間に優れた相関がある。３７℃でマウス血漿中のペプチドの半減期は６時間である。
【図２】マウスにおける二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ００４のＰＫプロファイル。１時点あたり２匹の動物。
【図３】安定化されていない１７−６９−０７−Ｎ２１９と比較した、２つの安定化された１７−６９−０７分子（９位に４−ブロモフェニルアラニンを有する：１７−６９−０７−Ｎ２４４、９位に４−ブロモフェニルアラニンを有さない：１７−６９−０７−Ｎ２３１）の（Ａ）マウスおよび（Ｂ）ヒト血漿安定性。相互によく関連している、所定の分析物についてのいくつかのＭＲＭトランジションをモニターした。このグラフの目的のために、トランジションの１つだけを示す。
【図４】ＨＴ−１０８０異種移植片マウスにおける、１７７Ｌｕ１７−６９−０７−Ｎ１４４の生体内分布。
【図５】ＨＴ−１０８０異種移植片マウスにおける、１７７Ｌｕ１７−６９−０７−Ｎ２４６の生体内分布。
【図６】ＨＴ−１０８０異種移植片マウスにおける、１７７Ｌｕ１７−６９−０７−Ｎ２４８の生体内分布。
【図７】（Ａ）ＢＴ１７ＢＤＣ−１および９についての時間に対する平均腫瘍容積のプロット。投与は、０、２、４、７、９、および１１日目に行った。（Ｂ）：薬物関連の毒物学および動物の全般的な健康状態の指標である、処置の間の体重。
【図８】１７〜６９という固定されたループ２残基を有するライブラリを用いた親和性成熟由来の配列アウトプットの列挙。右側にある配列のロゴプロットは、ループ１残基１、２、３、４および５中の残基の全体的な優先度を示す。
【図９】上側：ＥＢＣ−１異種移植片マウス中のＢＴ１７ＢＤＣ−１７について、平均腫瘍容積対時間のプロット。投与は、０、２、４、７、９、１１および１４日目に行った。下側：薬物関連の毒物学および動物の全般的な健康状態の指標である、処置の間の体重。
【図１０】上側：ＥＢＣ−１異種移植片マウス中のＢＴ１７ＢＤＣ−１８について、平均腫瘍容積対時間のプロット。投与は、０、２、４、７、９、１１および１４日目に行った。下側：薬物関連の毒物学および動物の全般的な健康状態の指標である、処置の間の体重。
【図１１】上側：ＥＢＣ−１異種移植片マウス中のＢＴ１７ＢＤＣ−１９について、平均腫瘍容積対時間のプロット。投与は、０、２、４、７、９、１１および１４日目に行った。下側：薬物関連の毒物学および動物の全般的な健康状態の指標である、処置の間の体重。
【図１２】上側：ＥＢＣ−１異種移植片マウス中のＢＴ１７ＢＤＣ−２０について、平均腫瘍容積対時間のプロット。投与は、０、２、４、７、９、１１および１４日目に行った。下側：薬物関連の毒物学および動物の全般的な健康状態の指標である、処置の間の体重。
【図１３】対応する用量群に対する特定のＢＤＣに関連する、経時的な腫瘍容積の曲線下面積（ＡＵＣ）のプロット。曲線適合は、標準のＩＣ５０式を用いて、ゼロ時点での腫瘍容積について正規化された全ての利用可能なデータポイントを用いて行った。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野などの当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照）標準の技法が使用される。
【００１３】
［命名法］
ナンバリング
式（Ｉ）の化合物内のアミノ酸残基位置を参照する場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は、ナンバリングから省く。なぜなら、それらは不変であり、したがって、式（Ｉ）の化合物内のアミノ酸残基のナンバリングは、下記のように
−Ｃｉ−Ｘ１−Ｕ／Ｏ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ５−Ｃｉｉ−Ｅ６−Ｄ７−Ｆ８−Ｙ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）
と示される。本明細書の目的のために、全ての二環性ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）と環化されて、三置換の１，３，５−トリスメチルベンゼン構造を生じるとみなされる。ＴＢＭＢとの環化は、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉ上で生じる。
【００１４】
二環性ペプチドコア配列
本明細書に開示される各々の二環性ペプチドは、第１のＮ末端システイン（Ｃｉ）と最後のＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）との間のアミノ酸配列として定義される、固有のコア配列数を割り当てられた。識別子１７−６９−０７の実施例では、コア配列は、ＣｉＹＮＥＦＧＣｉｉＥＤＦＹＤＩＣｉｉｉ（配列番号２）であり、「１７−６９−０７」または「（１７−６９−０７）」と呼ばれる。
【００１５】
ペプチドコード
本明細書に開示される特定の二環性ペプチドはまた、１７−６９−０７−Ｎ２４１のようなペプチドコードを用いて固有の識別子を割り当てられており、ここではＮ２４１は、１７−６９−０７二環コア配列の特定の誘導体を示す。１７−６９−０７の種々の誘導体は、異なるＮ数、すなわち、Ｎ００１、Ｎ００２、Ｎｘｘｘを有する。
【００１６】
分子フォーマット
二環コア配列へのＮ末端伸長またはＣ末端伸長を、ハイフンで隔てて、コア配列の左側または右側に加える。例えば、Ｎ末端のβＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａｌａテールは、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）
として示され、βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−ＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号３）という全長配列を有する。
【００１７】
改変
二環コア配列内の非天然のアミノ酸置換は、分子フォーマットの記載後に示す。例えば、１７−６９−０７中のチロシン１が、Ｄ−アラニンで置換され、この記載は、（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１であり、全配列は、Ｃ（Ｄ−Ａｌａ１）ＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号４）として記載される。
【００１８】
Ｎ末端またはＣ末端テールを、コア配列に対する修飾をも含む二環性ペプチドに結合した場合、一例としては１７−６９−０７−Ｎ２４１を用いることによって、この分子フォーマットの記載は、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）ＤＡｌａ１  １ＮＡｌ４  ＤＡｌａ５  ｔＢｕＧｌｙ１１である。
【００１９】
したがって、１７−６９−０７−Ｎ２４１の全アミノ酸配列は、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−Ｃ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ（配列番号５）である。
【００２０】
［ペプチドリガンド］
本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２つ以上の反応基（すなわちシステイン残基）、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基（本明細書中で言及するＣｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉ）を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。
【００２１】
式（Ｉ）の１、３、４、１０および１１位のＸは、アラニンスキャンの結果に従う任意のアミノ酸（表５を参照のこと）、およびこれらの位置での十分耐容された置換を可能にする選択アウトプット（図８）を表し得ることが当業者に理解される。
【００２２】
一実施形態では、式（Ｉ）の１位のＸは、アミノ酸、Ｙ、Ｍ、ＦまたはＶのうちのいずれか１つから選択される。さらなる実施形態では、式（Ｉ）の１位のＸは、Ｙ、ＭまたはＦから選択される。なおさらなる実施形態では、式（Ｉ）の１位のＸは、ＹまたはＭから選択される。なおまださらなる実施形態では、式（Ｉ）の１位のＸは、Ｙから選択される。
【００２３】
一実施形態では、式（Ｉ）の２位のＵ／Ｏは、Ｕ、例えばＮから選択される。代替的な実施形態では、式（Ｉ）の２位のＵ／Ｏは、Ｏ、例えばＧから選択される。
【００２４】
一実施形態では、式（Ｉ）の３位のＸは、ＵまたはＺから選択され、ここでＵは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、Ｚは、ＤまたはＥから選択される極性の負に荷電されたアミノ酸残基を表す。さらなる実施形態では、式（Ｉ）の３位のＵは、Ｑから選択される。代替的な実施形態では、式（Ｉ）の３位のＺは、Ｅから選択される。
【００２５】
一実施形態では、式（Ｉ）の４位のＸは、Ｊから選択され、ここでＪは、Ｆ、ＷおよびＹから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表す。さらなる実施形態では、式（Ｉ）の４位のＪは、Ｆから選択される。代替的な実施形態では、式（Ｉ）の４位のＪは、Ｙから選択される。代替的な実施形態では、式（Ｉ）の４位のＪは、Ｗから選択される。
【００２６】
一実施形態では、式（Ｉ）の１０位のＸは、Ｚから選択され、ここでＺは、ＤまたはＥから選択される、極性の負に荷電されたアミノ酸残基を表す。一実施形態では、式（Ｉ）の１０位のＺは、Ｄから選択される。
【００２７】
一実施形態では、式（Ｉ）の１１位のＸはＯから選択され、ここでＯは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表す。一実施形態では、式（Ｉ）の１１位のＯは、Ｉから選択される。
【００２８】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｕ／Ｏ−Ｕ／Ｚ−Ｊ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｚ−Ｏ−Ｃｉｉｉ−（配列番号６）（Ｉａ）；
であり、ここで
Ｕ、Ｏ、ＪおよびＺは、本明細書において前に定義されるとおりである。
【００２９】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号７）（Ｉｂ）である。
【００３０】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｃ）の化合物、
−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号８）（Ｉｃ）である。
【００３１】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｄ）の化合物、−Ｃｉ−Ｙ／Ｍ−Ｎ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（配列番号９）（Ｉｄ）である。
【００３２】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｅ）の化合物、−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）（Ｉｅ）である。
【００３３】
なおさらなる実施形態では、式（Ｉ）のペプチドは、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）；
−Ｃｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）；
−Ｃｉ−Ｆ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０２）（配列番号１１）；
−Ｃｉ−Ｖ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０３）（配列番号１２）；
−Ｃｉ−Ｆ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０４）（配列番号１３）；
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｙ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７−Ｎ０５７）（配列番号１４）；および
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−４４−Ｎ００２）（配列番号１５）
から選択される配列を含む。
【００３４】
この実施形態のペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する親和性成熟後の強力な候補物であることが特定された（実施例１ならびに表１および８を参照のこと）。
【００３５】
なおさらなる実施形態では、式（Ｉ）のペプチドは、
−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）、および
−Ｃｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）から選択される配列を含む。
【００３６】
この実施形態のペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する親和性成熟、コア二環配列の合成、および競合実験を用いる親和性の定量的測定後に、最高の親和性候補であることが特定された（実施例１および表１〜３を参照のこと）。
【００３７】
なおまださらなる実施形態では、式（Ｉ）のペプチドは、−Ｃｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、最も強力であり、式（Ｉ）内のペプチドリガンドのファミリーの安定なメンバーであることが特定された（実施例１〜４を参照のこと）。
【００３８】
一実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒトのＭＴ１−ＭＭＰと完全に交差反応性である。さらなる実施形態では、本発明の具体的に例示されたペプチドリガンドは、マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒトＭＴ１−ＭＭＰと完全に交差反応性である。例えば、データをここに示しており、これによって、１７−６９−０７の非安定化誘導体および安定化誘導体（すなわち、１７−６９−０７−Ｎ２１９および１７−６９−０７−Ｎ２４１）の両方が完全に交差反応性であることが実証される（表１３を参照のこと）。
【００３９】
なおさらなる実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、ＭＴ１−ＭＭＰに関して選択性であるが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１５およびＭＭＰ−１６とは交差反応しない。デーを本明細書に示しており、ここでは、１７−６９−０７コア配列、および安定化されたバリアント１７−６９−０７−Ｎ２５８は、ＭＴ１−ＭＭＰの固有の選択性であることが実証される（表１４を参照のこと）。
【００４０】
［ペプチドリガンドの利点］
本発明の特定の二環性ペプチドは、多数の有利な特性を有しており、これによって、注射、吸入、経鼻、眼、口腔または局所投与について適切な薬物様の分子とみなすことができる。このような有利な特性としては以下が挙げられる。
−  種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態学的評価のための典型的な要件である。
−  プロテアーゼ安定性。二環性ペプチドリガンドは理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー型（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）」）プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を実証するべきである。プロテアーゼ安定性は、二環リード候補が動物モデルで開発可能であり、ヒトに信頼性をもって投与可能であるように、異なる種の間で維持されなければならない。
−  望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的に重要である、荷電および親水性対疎水性残基の割合、ならびに分子内／分子間のＨ結合の関数である。
−  循環中の最適血漿半減期。臨床指標および処置計画次第で、急性の疾患管理の状況では、短い曝露用の二環性ペプチドを開発する必要がある場合もあるし、または循環中で保持を増強している二環性ペプチドを開発する必要がある場合があり、したがって、より慢性の疾患状態の管理に最適である。望ましい血漿半減期を誘導する他の要因は、薬剤の持続性曝露に起因する、付随する毒物学に対する、最大の治療効率のための持続性曝露の必要性である。
【００４１】
［薬学的に許容される塩］
塩形態は、本発明の範囲内であることが理解され、式（Ｉ）の化合物に対する言及はこのような化合物の塩形態を含む。
【００４２】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ＩＳＢＮ：  ３−９０６３９−０２６−８，  Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，  ３８８  ｐａｇｅｓ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載の方法などの従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から合成してもよい。一般には、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基形態と、適切な塩基または酸とを水中で、もしくは有機溶媒中で、または２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。
【００４３】
酸付加塩（一塩または二塩）は、無機および有機の両方の広範な種々の酸と形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸および（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂を用いて形成された一塩または二塩が挙げられる。
【００４４】
塩の具体的な１グループは、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシラート）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、およびラクトビオン酸から形成された塩からなる。１つの具体的な塩は、塩酸塩である。別の具体的な塩は、酢酸塩である。
【００４５】
化合物が陰イオン性であるか、または陰イオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−であってもよい）官能基を有する場合、塩が、有機塩基または無機塩基と形成されて、適切な陽イオンを形成し得る。適切な無機陽イオンの例としては、限定されないが、アルカリ金属イオン、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋、アルカリ土類金属陽イオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、ならびに他の陽イオン、例えば、Ａｌ３＋またはＺｎ＋が挙げられる。適切な有機陽イオンの例としては、限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換されているアンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられる。いくつかの適切な置換されたアンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニン由来のイオンである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物が、アミン機能を含む場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によってアルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。このような第四級アンモニウム化合物は、式（Ｉ）の範囲内である。
【００４７】
［修飾された誘導体］
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾された誘導体は本発明の範囲内であることが理解される。このような修飾された誘導体として適した例としては、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾から選択される１つまたは複数の修飾、１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基による１つまたは複数のアミノ酸残基の置き換え（例えば、１つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸による１つまたは複数の極性アミノ酸残基の置き換え；他の天然でない等比体積または等電子アミノ酸での１つまたは複数の非極性のアミノ酸残基の置き換え）；スペーサー基の付加；１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基による１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の置き換え；アラニンによる１つまたは複数のアミノ酸残基の置き換え、１つまたは複数のＤアミノ酸残基による１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の置き換え；二環のペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮアルキル化；代用の結合による１つまたは複数のペプチド結合の置き換え；ペプチド骨格長の改変；別の化学基による１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の置換、前記アミノ酸を官能化するための適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬によるアミノ酸、例えば、システイン、リジン、グルタミン酸塩／アスパラギン酸塩およびチロシンの修飾、ならびに官能化に適切である直行性の反応性を誘導するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキンまたはアジド保有部分による官能化を可能にする、アジドまたはアルキン基保有アミノ酸の導入または置き換え、が挙げられる。
【００４８】
一実施形態では、この修飾された誘導体は、アミノ酸の１位および／または９位の修飾を含む。データを本明細書に示しており、これによって、これらの位置、特にチロシンが存在する位置が、タンパク質分解に最も感受性であることが示される。
【００４９】
一実施形態では、この修飾された誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、この修飾された誘導体が、適切なアミノ反応性化学を用いるＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を用いるＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端またはＣ末端修飾は、限定されないが、細胞毒性剤、ラジオキレーター（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団を含むエフェクター基の付加を含む。
【００５０】
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾は、Ｎ末端アセチル基、例えば本明細書に開示される１７−６９−０７−Ｎ００４を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細書ではＣｉと呼ばれる基）は、無水酢酸または他の適切な試薬で、ペプチド合成の間にキャップされて、Ｎ末端アセチル化されている分子がもたらされる。この実施形態は、アミノペプチダーゼの潜在的認識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドの分解の可能性を回避する。
【００５１】
代替的な実施形態では、このＮ末端修飾は、Ａｌａ、Ｇ−Ｓａｒ１０−ＡまたはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基などの、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的に対する二環性ペプチドの活性の保持を容易にする、分子スペーサー基の付加を含む。データを本明細書に示しており、これによって、二環性ペプチド１７−６９−０７に対するこれらの基の付加が標的タンパク質に対する活性を変更しないことが示される（表１１−１２）。
【００５２】
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｃ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書ではＣｉｉｉと呼ばれる基）は、ペプチド合成の間、アミドとして合成されて、Ｃ末端アミド化されている分子がもたらされる。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドのタンパク質分解の可能性を低下させる。
【００５３】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換を含む。この実施形態では、分解性のプロテアーゼによって認識もされず、標的活性になんの悪影響も有さない等比体積／等電子側鎖を有する非天然のアミノ酸が選択され得る。
【００５４】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解がコンホメーション的および立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然のアミノ酸を用いてもよい。具体的には、これらは、プロリンアナログ、巨大な（bulky）側鎖、Ｃα−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸、単純な誘導体（アミノ−シクロプロピルカルボン酸である）に関する。
【００５５】
一実施形態では、非天然のアミノ酸残基は、４位で置換される。データを本明細書に示しており、これによって、多数の非天然のアミノ酸残基が、この位置で十分耐容されることが示される（表８を参照のこと）。さらなる実施形態では、この非天然のアミノ酸残基、例えば、４位に存在する残基は、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；シクロヘキシルグリシン、フェニルグリシン；ｔｅｒｔ−ブチルグリシン；３，４−ジクロロフェニルアラニン；シクロヘキシルアラニン；およびホモフェニルアラニンから選択される。
【００５６】
なおさらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、４位に存在するアミノ酸残基は、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；および３，４−ジクロロフェニルアラニンから選択される。データを本明細書に示しており、これによって、これらの置換が、親和性を、未修飾の野性型配列と比較して向上させたことが示される（表８を参照のこと）。
【００５７】
なおさらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、４位に存在するアミノ酸残基は、１−ナフチルアラニンから選択される。データを本明細書に示しており、これによって、この置換は、野性型と比較して親和性の最大レベルの向上（７倍より大きい）が得られたことが示される（表８を参照のこと）。
【００５８】
一実施形態では、非天然のアミノ酸残基を、９位および／または１１位で導入する。データを本明細書に示しており、これによって、多数の非天然のアミノ酸残基がこれらの位置で十分耐容されることが示される（表９を参照のこと）。
【００５９】
さらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、９位に存在するアミノ酸残基は、４−ブロモフェニルアラニン、ペンタフルオロ−フェニルアラニンから選択される。
【００６０】
さらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、１１位に存在するアミノ酸残基は、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンから選択される。
【００６１】
なおさらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、９位存在するアミノ酸残基は、４−ブロモフェニルアラニンから選択される。データを本明細書に示しており、これによって、Ｔｙｒ９タンパク質分解認識ポイントの変更が示される（表９を参照のこと）。
【００６２】
なおさらなる実施形態では、非天然のアミノ酸残基、例えば、１１位に存在するアミノ酸残基は、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンから選択される。データを本明細書に示しており、これによって、活性の増強が示され、立体的障害によってタンパク質分解性加水分解から近接するアミノ酸骨格を強力に保護することが示される（表９を参照のこと）。
【００６３】
一実施形態では、修飾された誘導体は、複数の上述の修飾、例えば、２、３、４または５以上の修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、以下の修飾のうちの２、３、４または５以上、例えば、以下の、１位および５位のＤ−アラニン、４位の１−ナフチルアラニン、９位の４−ブロモフェニルアラニン、および１１位のｔｅｒｔ−ブチルグリシンの５つの修飾のうちの全てを含む。データを本明細書に示しており、これによって、この多重置換（１７−６９−０７−Ｎ２５２；１７−６９−０７−Ｎ２４４および１７−６９−０７−Ｎ２５５）が、野性型よりも優れた活性にともなって耐容されることが示される（表１０〜１２を参照のこと）。なおさらなる実施形態では、この修飾された誘導体は、以下の修飾、１位および５位のＤ−アラニン、４位の１−ナフチルアラニンおよび１１位のｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。データを本明細書に示しており、これによって、この多重置換（１７−６９−０７−Ｎ２３９）が、野性型よりも優れた活性にともなって耐容されることが示される（表１１を参照のこと）。
【００６４】
一実施形態では、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）に対するスペーサー基の付加を含む。
【００６５】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基での置換を含む。この実施形態によって、得られた二環性ペプチドリガンドの医薬品安定性プロファイルを改善するという利点が得られる。
【００６６】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基の１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基での置換を含む。別の実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の１つまたは複数の荷電アミノ酸残基での置換を含む。荷電対疎水性アミノ酸残基の正確な均衡は、二環性ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に対して影響を与え、これにより血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基（特にアルギニン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を与え得る。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物への曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製することができる。加えて、荷電対疎水性アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低下させることができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。
【００６７】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基での置換を含む。この実施形態は、立体障害によって、およびＤ−アミノ酸の傾向によって（βターンコンホメーションを安定化させる）タンパク質分解安定性を増加させるためと考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＰＮＡＳ，  １０２（２），  ４１３−４１８）。
【００６８】
さらなる実施形態では、１位のアミノ酸残基は、Ｄ−アラニンなどのＤ−アミノ酸が置換される。データを本明細書に示しており、これによって、結果としての分解なしで活性の保持が実証される（表６を参照のこと）。
【００６９】
さらなる実施形態では、５位のアミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アラニンまたはＤ−アルギニンが置換される。データを本明細書に示しており、これによって、結果として分解させることなく、活性の保持が実証される（表７を参照のこと）。
【００７０】
一実施形態では、修飾された誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去、およびアラニンでの置換を含む。この実施形態によって、潜在的なタンパク質分解性攻撃部位を除去するという利点が得られる。
【００７１】
上述の修飾の各々は、ペプチドの効力または安定性を意図的に改善するために供されることに留意されたい。修飾に基づくさらなる活性改善は、以下の機序を通じて達成され得る。
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、より低いオフレートにつながる疎水性部分を組み込むこと
−  長期にわたりイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオンレートおよびより高い親和性をもたらすこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ，  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９６），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４２７−３１を参照のこと、および
−  例えば、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約すること、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、骨格の二面角を制約すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によって、ペプチドに追加的な制約を組み込むこと。
（総説のため、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  （２０１０），  １６，  ３１８５−２０３およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （２００９），  １６，  ４３９９−４１８を参照）。
【００７２】
［同位体変化］
本発明は、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識化合物、すなわち、式（Ｉ）の化合物（式中、１つまたは複数の原子が、同じ原子数を有する原子によって置き換えられるが、原子質量または原子数が、自然に通常みられる原子質量または原子数とは異なる）、および式（Ｉ）の化合物（式中、関連の（放射性）同位体を保持できる金属キレート基が、結合される（「エフェクター」と命名）、および式（Ｉ）の化合物（式中、特定の官能基が、関連の（放射性）同位体または同位体で標識された官能基で共有結合的に置き換えられる）を含む。
【００７３】
本発明の化合物中に含むのに適切な同位体の例は、水素の同位体、例えば、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）、炭素の同位体、例えば、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ、塩素の同位体、例えば、３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば、１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ、窒素の同位体、例えば１３Ｎおよび１５Ｎ、酸素の同位体、例えば１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏ、リンの同位体、例えば３２Ｐ、イオウの同位体、例えば３５Ｓ、銅の同位体、例えば６４Ｃｕ、ガリウムの同位体、例えば６７Ｇａまたは６８Ｇａ、イットリウムの同位体、例えば９０Ｙ、およびルテチウムの同位体、例えば１７７Ｌｕ、およびビスマスの同位体、例えば２１３Ｂｉを含む。
【００７４】
特定の同位体的に標識された式（Ｉ）の化合物、例えば、放射性同位体を組み込む化合物は、薬物および／または基質の組織分布研究で有用であり、ならびに腫瘍および他の場所などの疾患組織上のＭＴ１−ＭＭＰ標的の有無を臨床的に評価するために有用である。式（Ｉ）の化合物はさらに、標識された化合物および他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体の間の複合体の形成を検出または特定するために用いられ得る有用な診断特性をさらに有し得る。検出または特定する方法は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光性物質などの標識剤で標識される化合物を使用し得る（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などで標識される化合物を使用してもよい。放射活性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）、および炭素−１４、すなわち、１４Ｃは、組み込みの容易さ、およびすぐ検出できる手段であるという観点で、この目的に特に有用である。
【００７５】
重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）のような重い方の同位体による置換によって、より大きい代謝安定性から生じる特定の治療利点、例えば、インビボ半減期の延長、または投薬必要性の減少が生じ得、したがって、ある状況では好ましい場合がある。
【００７６】
ポジトロン放出同位体、例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどによる置換は、標的占有率を検査するために、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究で有用であり得る。
【００７７】
６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、および１７７Ｌｕなどの、金属キレートエフェクター基への同位体の組み込みは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像化を使用する腫瘍特異的抗原を可視化するために有用であり得る。具体的には、このような生体内分布データは、本明細書において実施例３に示す。
【００７８】
限定さるものではないが、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および２１３Ｂｉなどの金属キレートエフェクター基への同位体の組み込みは、標的放射線治療の選択肢であり得、それによって式（Ｉ）の金属−キレーター保有化合物は、標的タンパク質および作用部位に対する治療用の放射性核種を保持する。
【００７９】
式（Ｉ）の同位体標識の化合物は、一般には、当業者に公知の従来技術によって、または以前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識の試薬を用いて、添付の実施例に記載のプロセスと同様のプロセスによって調製してもよい。
【００８０】
［結合活性］
本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合するか、さもなければ相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなるように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的におけるリガンドの作用の効力（例えば、結合親和性または阻害のレベル等）は、必ずしもその特異性に関係しない。
【００８１】
本明細書における結合活性は、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得られる定量的結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所定の標的濃度で結合しているペプチドリガンドの量を指す。
【００８２】
多重特異性は、２種以上の標的に結合する能力である。通常、結合ペプチドは、そのコンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することができる。しかし、２種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記のように当技術分野において既知の通り、二重特異的抗体を開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、２種以上の標的に結合することができ、したがって多重特異的となり得る。好適には、これは、２種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的となることができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方または他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立的に結合していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に妨害するであろうと予想される。
【００８３】
二重特異的リガンドと２つの関連の標的を含む特異性を有するリガンドとの間に基本的な相違が存在する。第１の事例では、リガンドは両方の標的について個々に特異的であり、それぞれと特異的な様式で相互作用する。例えば、リガンド中の第１のループは、第１の標的に結合し得、第２のループは第２の標的に結合し得る。第２の事例では、リガンドは非特異的であり、これは、リガンドは、例えば、両方に共通の標的のエピトープと相互作用することによって、２つの標的の間で違いがあることはないことによる。
【００８４】
本発明の状況では、例えば、標的およびオルソログについて活性を有するリガンドは、二重特異性リガンドであり得ることが可能である。しかし、一実施形態では、このリガンドは二重特異性ではなく、正確性の低い特異性を有し、その結果、このリガンドは、標的と１つまたは複数のオルソログの両方に結合する。一般には、標的とそのオルソログの両方に対して選択されていないリガンドは、二重特異性に向かう選択的圧力がないせいで、二重特異性である可能性が低い。二環性ペプチドのループ長は、関連の少ないホモログに対する高い選択性を維持したままで、良好な標的およびオルソログの交差反応性が得られるように適合された結合表面を提供するために決定的であり得る。
【００８５】
このリガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性のうちの少なくとも１つは、選択されるリガンドついて一般的であり、その特異性のレベルは、本明細書に開示される方法によってモジュレートされ得る。第２のまたはさらなる特異性は共有される必要はなく、本明細書に示される手順の対象となる必要もない。
【００８６】
標的は、ペプチドリガンドが結合する、さもなければ相互作用する分子またはその一部である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得るが、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要としない。
【００８７】
分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに１つまたは複数の構造的特長を与えることができる、任意の分子である。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの結合点を少なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上のシステイン残基（Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉ）と反応して共有結合を形成することができる。それらは、単にジスルフィド結合（分子の還元性の切断および付随する分解に供される）を形成するのではなく、安定な共有チオエーテル連結を形成する。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。
【００８８】
［分子足場］
分子足場は、例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０ならびにそこに引用されている参考文献、特に、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１において記載されている。
【００８９】
前述の文書に記されている通り、分子足場は、有機小分子等、小分子でもよい。
【００９０】
一実施形態では、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体などの、そのような実体の短いポリマーを含み得る。
【００９１】
一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば低い毒性の化合物である。適切な化合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が含まれる。
【００９２】
一実施形態では、分子足場は巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
【００９３】
一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。
【００９４】
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アルキルハロゲン化物、およびアシルハロゲン化物などのペプチドと連結を形成する化学基を含んでもよい。
【００９５】
一実施形態では、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含み得る、またはそれからなり得る。
【００９６】
一実施形態では、分子足場は２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に結合した３つの追加的なメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプチドとのさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点を有する。
【００９７】
本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含む広範な官能基から選択される。
【００９８】
システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用することができる足場反応基は、アルキルハロゲン化物、（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも命名される）。
【００９９】
具体例には、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢにより例証される足場反応基）またはヨードアセトアミドが含まれる。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである。本発明において分子足場として使用され得るマレイミドの例には、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが含まれる。セレノシステインは、また、システインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインに言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステインを置換することが典型的には許容される。
【０１００】
［エフェクターおよび官能基］
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートしている、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０１０１】
エフェクターおよび／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、ポリペプチド内のアミノ酸に、または分子足場に結合され得る。
【０１０２】
適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を含む。例えば、エフェクター基は、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域（ＩｇＧ分子のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に通常存在する領域等）を含むこともできる。
【０１０３】
本発明の本態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または７日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。
【０１０４】
官能基は、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大環状ペプチドの取り込みを助ける官能基その他を含む。
【０１０５】
細胞へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとすることができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子を含む。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基を含む。ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Drosophila）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）等に由来するペプチド等、ペプチドは、例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５巻，  Ｐａｒｔ  ４，  ｐ８２１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されている。細胞膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチン（penetratin）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４頁）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７頁）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に付けることができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を含む（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させることができる。
【０１０６】
ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスは、抗体、およびＦａｂ、Ｆｖまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を含む。特に、インビボにおけるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用いることができる。
【０１０７】
多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み入れることもできる。
【０１０８】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態では、これは、１日間以上のｔβ半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態では、これは、１２〜２６時間の範囲内であろう。
【０１０９】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、医薬関連の複合金属放射性同位体に適切な金属キレーターから選択される。このようなエフェクターは、前記放射性同位体と複合された場合、がん治療について有用な薬剤であり得る。適切な例としては、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＨＡ、ＳａｒＡｒおよびその他が挙げられる（標的放射線核種治療、Ｔｏｄ  Ｓｐｅｅｒ，Ｗｏｌｔｅｒｓ／Ｋｌｕｖｅｒ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）。
【０１１０】
可能なエフェクター基としてはまた、酵素、例えば、酵素／プロドラッグ治療での使用のためのカルボキシペプチダーゼＧ２などが挙げられ、ここでこのペプチドリガンドは、ＡＤＥＰＴにおいては抗体と代えられる。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態では、官能基は、がん治療の細胞毒性剤のような薬物から選択される。適切な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリンアナログ、アザチオプリンおよびメルカプトプリンを含む抗代謝剤またはピリミジンアナログ；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして知られた、パクリタキセルを含むタキサン；カンプトテシンを含むトポイソメラーゼ阻害剤；イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤などが挙げられる。さらに別の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植において用いられる）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシンなどを含む抗腫瘍抗生物質を含むことができる。
【０１１２】
本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞毒性剤は、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルオーリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。
【０１１３】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体であり、以下の構造、
【化１】
2018502825.tif 000003
を有する細胞毒性剤である。
【０１１４】
モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、合成の抗悪性腫瘍剤であり、以下の構造、
【化２】
2018502825.tif 000004
を有する。
【０１１５】
データは、実施例４および５において本明細書に示しており、これによって、ＤＭ１またはＭＭＡＥを含有する毒素にコンジュゲートしているペプチドリガンドの効果が示される。
【０１１６】
一実施形態では、細胞毒性剤は、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの切断可能な結合によって二環性ペプチドに連結している。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の妨害を制御するために、そしてこれによって切断の速度および細胞毒性剤の同時の放出を制御するために修飾される。
【０１１７】
公開された研究によって、ジスルフィド結合のいずれかの側に対して立体障害を導入することによって、還元に対するジスルフィド結合の感受性を改変する能力が確立された（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。立体障害の程度が大きいほど、細胞内グルタチオンおよびまた細胞外（全身性）還元剤による還元の速度は低下し、結果として、毒素が、細胞の内側および外側の両方で放出されにくくなる。したがって、循環中のジスルフィド安定性における最適条件の選択（毒素の望ましくない副作用を最小限にする）に対する、細胞内環境における効率的な放出（治療効果を最大にする）は、ジスルフィド結合のいずれかの側における妨害の程度を注意深く選択することによって達成され得る。
【０１１８】
ジスルフィド結合のいずれかの側にある妨害は、分子構築物の標的化実体（ここでは、二環性ペプチド）または毒素側のいずれかに対して１つまたは複数のメチル基を導入することを通じてモジュレートされる。
【０１１９】
したがって、一実施形態では、細胞毒性剤は、式（ＩＩ）の化合物
【化３】
2018502825.tif 000005
から選択されるメイタンシノイドであり、
式中、ｎは、１〜１０から選択される整数を表し；
Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基を表す。
【０１２０】
本明細書において用いられるＣ１−６アルキルという用語は、それぞれ１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分岐した飽和の炭化水素基を指す。このような基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルまたはヘキシルなどが挙げられる。
【０１２１】
「ヘテロシクロル」および「カルボシクリル」という用語は本明細書において用いる場合、文脈が他を示すのでない限り、芳香族および非芳香族の環系の両方を含むものとする。したがって、例えば、「ヘテロシクロル基」および「カルボシクリル基」という用語は、それらの範囲内に、芳香族、非芳香族の、不飽和の、部分的に飽和のおよび完全に飽和のカルボシクリル環系またはヘテロシクリル環系を含む。一般には、文脈が他を示すのでない限り、このような基は、単環式または二環性（縮合および架橋された二環性基を含む）であってもよく、例えば、３〜１２環員、さらに一般的には５〜１０環員を含んでもよい。
【０１２２】
式（ＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は独立して、水素またはメチルを表す。
【０１２３】
式（ＩＩ）の化合物の一実施形態では、ｎは１を表し、Ｒ１およびＲ２は両方とも水素を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ１）。
【０１２４】
式（ＩＩ）の化合物の代替的な実施形態では、ｎは２を表し、Ｒ１は水素を表し、Ｒ２はメチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ３）。
【０１２５】
式（ＩＩ）の化合物の一実施形態では、ｎは２を表し、Ｒ１およびＲ２は両方ともメチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ４）。
【０１２６】
式（ＩＩ）の細胞毒性剤は、ジスルフィド結合を形成し得、式（Ｉ）の二環性ペプチドとのコンジュゲート構造では、チオール毒素（ＩＩ）とチオール二環ペプチド（ＩＩＩ）との間のジスルフィド結合性は、いくつかの可能な合成スキーム（スキームＩＩおよびスキームＩＩＩに記載される２つ）を通じて導入されることが理解される。
【０１２７】
一実施形態では、コンジュゲートの二環性ペプチド構成要素は、式（ＩＩＩ）に示される構造
【化４】
2018502825.tif 000006
を有し、式中、ｍは、０〜１０から選択される整数を表し、
Ｒ３およびＲ４は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基を表す。
【０１２８】
式（ＩＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｒ３およびＲ４は独立して、水素またはメチルを表す。
【０１２９】
Ｒ３およびＲ４が両方とも水素である、式（ＩＩＩ）の化合物を、妨害されていないとみなし、Ｒ３およびＲ４の一方または両方がメチルを表す式（ＩＩＩ）の化合物を妨害されているとみなす。
【０１３０】
式（ＩＩＩ）の二環性ペプチドが、ジスルフィド結合および式（ＩＩ）の細胞毒性剤とのコンジュゲート構造を形成し得、チオール毒素（ＩＩ）とチオール二環ペプチド（ＩＩＩ）との間のジスルフィド結合性は、１つはスキームＩＩに記載されている、いくつかの可能な合成スキームを通じて導入されることが理解される。
【０１３１】
一実施形態では、細胞毒性剤は、式（ＩＶ）
【化５】
2018502825.tif 000007
に記載されるリンカーによって二環性ペプチドに連結しており、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基を表し、
毒素は、本明細書に記載される任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、本明細書に定義される任意の適切な二環性ペプチドを表し、
ｎは、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍは、１〜１０から選択される整数を表す。
【０１３２】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはメチルを表す。
【０１３３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々水素である場合、ジスルフィド結合は、妨害が最小であって、還元に対して最も感受性である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、各々がメチルであり、ジスルフィド結合は最も妨害されており、還元に対する感受性が最小である。水素およびメチルの部分的置換によって、還元、ならびにそれにともなう切断および毒素の放出に対する耐性の段階的な増大が生じる。
【０１３４】
一実施形態では、化合物（ＩＶ）の毒素は、メイタンシンであり、コンジュゲートは式（Ｖ）の化合物、
【化６】
2018502825.tif 000008
を含み、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、Ｃ１−６アルキル基またはカルボシクリル基またはヘテロシクリル基を表し、
二環は、本明細書に記載される任意の適切な二環性ペプチドを表し、
ｎは、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍは、１〜１０から選択される整数を表す。
【０１３５】
式（Ｖ）の化合物のさらなる実施形態では、ｎは１を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素、すなわち、式（Ｖ）ａの化合物
【化７】
2018502825.tif 000009
を表す。
【０１３６】
式（Ｖ）ａのＢＤＣは、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７として公知である。ＢＤＣであるＢＴ１７ＢＤＣ−１７の中の妨害されていないジスルフィドは、ＢＴ１７ＢＤＣ−９と等価であり、そのため、二環性ペプチド部分が異なる。ＢＴ１７ＢＤＣ−９は、非安定化配列（１７−６９−０７−Ｎ２１９）を使用するが、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７は、毒素ジスルフィド構築物に対してアミド結合される、安定化二環性ペプチドの対応物（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を使用する。ｎ＝１であるメイタンシンのこの非妨害誘導体は、ＤＭ１と命名される。
【０１３７】
式（Ｖ）の化合物のさらなる実施形態では、ｎは１を表し、Ｒ１はメチルを表し、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々は水素、すなわち、式（Ｖ）ｂの化合物
【化８】
2018502825.tif 000010
を表す。
【０１３８】
式（Ｖ）ｂのＢＤＣは、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８として公知であり、二環性ペプチド側に単一の妨害性のメチル基を含み、抗体薬物コンジュゲートの状態では、還元剤、例えばジチオスレイトールに対してその感受性が７分の１に低下する（非妨害のジスルフィドと比較して）（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。還元に対する感受性の低下は、毒素放出速度の低さと相関している。ｎ＝１であるメイタンシンのこの非妨害の誘導体は、ＤＭ１と命名される。ＢＴ１７ＢＤＣ−１８は、毒素ジスルフィド構築物に対してアミド結合される安定化二環性ペプチド対応物（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を使用する。
【０１３９】
式（Ｖ）の化合物のさらなる実施形態では、ｎは２を表し、Ｒ１およびＲ２は両方とも水素を表し、Ｒ３およびＲ４は両方ともメチル、すなわち、式（Ｖ）ｃの化合物
【化９】
2018502825.tif 000011
を表す。
【０１４０】
式（Ｖ）ｃのＢＤＣは、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９として公知であり、メイタンシン側の上に２つの妨害性メチルを含み、抗体薬物コンジュゲートの状態では、ジチオスレイトールなどの還元剤に対してその感受性が１４分の１に低下する。還元に対する感受性の低下は、毒素放出速度の低下と相関している。ｎ＝２であるメイタンシンの妨害された誘導体は、ＤＭ４と命名される。ＢＴ１７ＢＤＣ−１９は、毒素ジスルフィド構築物にアミド結合される安定化二環性ペプチド対応物（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を使用する。
【０１４１】
式（Ｖ）の化合物のさらなる実施形態では、ｎは２を表し、Ｒ１およびＲ３は両方ともメチルを表し、Ｒ２およびＲ４は両方とも水素、すなわち、式（Ｖ）ｄの化合物、
【化１０】
2018502825.tif 000012
を表す。
【０１４２】
式（Ｖ）ｄのＢＤＣは、ＢＴ１７ＢＤＣ−２０として公知であり、メイタンシン側の１つの妨害性メチル基、および二環ペプチド側の１つの妨害性メチル基を含み、そして抗体薬物コンジュゲートの状態では、ジチオスレイトールのような還元剤に対して、その感受性が１７０分の１に低下する。還元に対する感受性の低下は、毒素放出速度の低下と相関する。ｎ＝２であるメイタンシンの妨害された誘導体は、ＤＭ３と命名される。ＢＴ１７ＢＤＣ−２０は、毒素ジスルフィド構築物にアミド結合される安定化二環性ペプチド対応物（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を使用する。
【０１４３】
実際、抗体薬物コンジュゲートの状態では、動物モデルにおける耐容性に対する有効性のバランスによって、その最適条件は、あるレベルの妨害、すなわち、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９中にも存在するＤＭ４の妨害と関連することが示された（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２２，  ７１７）。
【０１４４】
一実施形態では、このコンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−９、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７（式（Ｖ）ａの化合物）、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８（式（Ｖ）ｂの化合物）、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９（式（Ｖ）ｃの化合物）およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０（式（Ｖ）ｄの化合物）から選択される。データは、実施例５ならびに表１６および１７に示しており、これによって、ＢＴ１７ＢＤＣ−９、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０の有益な特性が実証される。
【０１４５】
さらなる実施形態では、このコンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−９、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７（式（Ｖ）ａの化合物）、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８（式（Ｖ）ｂの化合物）およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９（式（Ｖ）ｃの化合物）から選択される。データを実施例５ならびに表１６および１７に示しており、これによって、これらのコンジュゲートが、標的化がん治療における使用のための適切な分子とみなされたことが実証される。
【０１４６】
さらなる実施形態では、このコンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７（式（Ｖ）ａの化合物）、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８（式（Ｖ）ｂの化合物）およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９（式（Ｖ）ｃの化合物）から選択される。データは、実施例５ならびに表１６および表１７に示しており、これによって、これらのコンジュゲートが、標的化がん治療における使用のための適切な分子とみなされ、有効用量で十分耐容されることが実証される。
【０１４７】
［合成］
本発明のペプチドは、標準的な技術によって、続いてインビトロでの分子足場での反応によって、合成的に製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が用いられてもよい。これによって、さらなる下流の実験またはバリデーションのために可溶性の材料の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上述）に開示されるもののような従来の化学を用いて達成され得る。
【０１４８】
したがって、本発明はまた、本明細書に示されるように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、下に説明されるような任意選択のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲートで行われる。
【０１４９】
任意選択的に、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する場合に置換されてもよい。
【０１５０】
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、それによって複数の特異性を導入するために伸長されてもよい。
【０１５１】
ペプチドを伸長するために、標準的な固相または溶液相化学を用いてよく、直交的に保護されたリジン（およびアナログ）を用いて、ループのＮ末端もしくはＣ末端において、またはループ内で化学的に伸長されてもよい。標準の（バイオ）コンジュゲーション技術を用いて、活性化または活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入してもよい。あるいは、さらには、例えば（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載のように、断片縮合もしくは天然の化学的ライゲーションによって、または酵素によって、例えば、（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｄｅｃ  ２０；９１（２６）：１２５４４−８、またはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，  Ｉｓｓｕｅ  ２２，  １５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，  Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載のようにサブチリガーゼを用いて行ってもよい。
【０１５２】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じてさらなるコンジュゲーションによって伸長または修飾されてもよい。これは、細胞の還元環境に一度入れば、お互いから第１のペプチドおよび第２のペプチドを解離させるという追加の利点を有する。この場合、分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）は、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に添加され得る；次いで、さらなるシステインまたはチオールは、第１のペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され、その結果このシステインまたはチオールのみが第２のペプチドの遊離のシステインまたはチオールと反応して、ジスルフィド連結された二環性ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１５３】
同様の技術を、２つの二環性および二重特異性の大員環の合成／カップリングに等しく適用して、可能性としては四重特異的な分子を作成する。
【０１５４】
さらに、他の官能基またはエフェクター基の追加は、適切な化学を用いて同じ方式で達成され得、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または側鎖を介してカップリングする。一実施形態では、このカップリングは、これがいずれの実体の活性もブロックしないような方式で行われる。
【０１５５】
本発明のさらなる態様によれば、スキームＩ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つに記載の合成経路を含む、本明細書に定義される薬物コンジュゲートを調製するためのプロセスが提供される。
【０１５６】
［医薬組成物］
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
【０１５７】
一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な賦形剤または担体と共に利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含めた、水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどのシックナーから選択し得る。
【０１５８】
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１５９】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として使用されてもよいし、または他の薬剤と併せて使用されてもよい。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物に様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明のタンパク質リガンド、またはさらには標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明によって選択されたポリペプチド）の組み合わせとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前にプールするかどうかに拘らない。
【０１６０】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。限定されるものではないが、免疫療法を含む治療のために、本発明のペプチドリガンドは、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
【０１６１】
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するためにレベルを上方調節する必要があり得ることが理解されよう。
【０１６２】
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的な応用では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般に体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。
【０１６３】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のペプチドリガンドは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはインビトロで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるか、または他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。
【０１６４】
［治療的な使用］
本発明の二環性ペプチドは、膜型タイプ１メタロプロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ１４としても公知）の高親和性結合剤として特定の有用性を有する。ＭＴ１−ＭＭＰは、直接的には、その構成要素のいくつかを分解することによって、および間接的には、プロＭＭＰ２を活性化することによって、細胞外マトリックス再構築に主な役割を果たす膜貫通メタロプロテアーゼである。ＭＴ１−ＭＭＰは、腫瘍血管形成（Ｓｏｕｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６（６），５５５−５６４）にとって重要であり、種々の固形腫瘍で過剰発現され、したがって、本発明のＭＴ１−ＭＭＰ結合性二環ペプチドは、がん、具体的には、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの標的処置において特定の有用性を有する。一実施形態では、本発明の二環性ペプチドは、ヒトＭＴ１−ＭＭＰに特異的である。さらなる実施形態では、本発明の二環性ペプチドは、マウスＭＴ１−ＭＭＰに特異的である。さらなる実施形態では、本発明の二環性ペプチドは、ヒトおよびマウスのＭＴ１−ＭＭＰに特異的である。なおさらなる実施形態では、本発明の二環性ペプチドは、ヒト、マウスおよびイヌのＭＴ１−ＭＭＰに特異的である。
【０１６５】
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、インビボ治療および予防適用、インビトロおよびインビボ診断適用、インビトロアッセイおよび試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あるいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用において有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせることができる。
【０１６６】
少なくとも９０〜９５％の均一性である実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与に好ましく、９８〜９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に、製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，  （１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）。
【０１６７】
本発明のペプチドリガンドのエフェクター基およびコンジュゲートは、典型的にはがんの、具体的には、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置における使用が見出される。
【０１６８】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、がん、具体的には、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置における使用のための本明細書に定義されるペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートが提供される。
【０１６９】
本発明のさらなる態様によれば、がん、具体的には、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんを予防、抑制または処置する方法が提供され、これは、その必要な患者に対して、本明細書に定義されるペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含む。
【０１７０】
処置され得る（または阻害され得る）がん（およびそれらの良性の対応物）の例としては、限定されないが、上皮性起源の腫瘍（腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんおよび他のがんを含む種々の種類の腺腫およびがん）、例えば、膀胱および尿路、乳房、消化管のがん（例としては、食道、胃（胃がん）、小腸、結腸、直腸および肛門）、肝臓（肝細胞がん）、胆嚢および胆管系、膵外分泌腺、腎臓、肺のがん（例えば、腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支肺胞がんおよび中皮腫）、頭頚部のがん（例えば、舌がん、口腔がん、咽頭、喉頭、鼻咽頭、扁桃腺、唾液腺、鼻腔および副鼻腔）、卵巣、卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋、子宮内膜、甲状腺のがん（例えば、甲状腺濾胞がん）、副腎、前立腺、皮膚および付属器のがん（例えば、黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮細胞がん、角化棘細胞腫、形成異常母斑）；血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）ならびに前がん状態血液学的障害および境界悪性腫瘍の障害、例としては、血液学的悪性腫瘍およびリンパ系の関連の病態（例えば、急性リンパ球性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ球性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性Ｂ細胞型リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後リンパ球増殖性障害）、ならびに血液学的悪性腫瘍および骨髄系列の関連状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍、例えば、軟部組織の肉腫、骨または軟骨、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮細胞肉腫、胃腸間質性腫瘍、良性および悪性の組織球腫、および隆起性皮膚線維肉腫；中枢神経系または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫およびグリア芽細胞腫、髄膜腫、上衣細胞腫、松果体腫瘍およびシュワン細胞腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様がん）；眼球および付属器の腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；生殖細胞および栄養膜腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛がん）；ならびに小児および胚の腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および原始的な神経外胚葉性腫瘍）；または、先天性かそうでなければ、患者を悪性腫瘍にかかりやすくさせる症候群（例えば、色素性乾皮症）が挙げられる。
【０１７１】
本明細書における「予防」という用語の言及には、疾患の誘導前の保護的組成物の投与を含む。「抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをいう。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。
【０１７２】
疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を可能にし、動物モデルの使用を可能にする。
【０１７３】
次の実施例を参照することにより、次に、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１７４】
［材料および方法］
＜ファージ選択＞
６×６の二環ファージライブラリを、Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００９）、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５（７）、５０２−５０７、ＷＯ２００９／０９８４５０、ＷＯ２０１３／０５０６１５およびＷＯ２０１３／０５０６１６に記載のとおり作製した。ファージディスプレイ選択は、ビオチン化ヒトＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインに対する前記６×６ファージライブラリを用いて行った。
【０１７５】
＜タンパク質発現＞
ヒト遺伝子由来の残基Ｃｙｓ３１９−Ｇｌｙ５１１であるＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシン様リピート（ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインとしても公知）は、ｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ４２（ＩＢＡ）発現ベクターを用いて、分泌されたＮ末端Ｈｉｓ６タグ化可溶性タンパク質として、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現された。発現後、タンパク質を、ゲル濾過後にニッケル−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。バッチ間のばらつきはまた、ヘモペキシンドメイン結合性の二環の有無において蛍光熱シフト実験によってもモニターした。
【０１７６】
＜ペプチド合成＞
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが製造した、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチドシンセサイザー、およびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈが製造したＳｙｒｏ  ＩＩシンセサイザーを用いた、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。標準のＦｍｏｃ−アミノ酸類を使用し（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）、以下の側鎖保護基を用いた、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）およびＴｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）。カップリング試薬は、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であって、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を、ベースとして使用し、脱保護は、ＤＭＦ（ＡＧＴＣ）中の２０％のピペリジンで達成した。合成は、０．３７ｍｍｏｌ／ｇｒのＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を用いて行い、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を４倍過剰で利用して、ベースはアミノ酸に関して４倍過剰であった。アミノ酸を０．２ＭでＤＭＳＯ中に、ＨＣＴＵを０．４ＭでＤＭＦ中）、およびＤＩＰＥＡを１．６ＭでＮ−メチルピロリドン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）中に溶解した。条件は、カップリング反応がＤＭＦ中に２０〜５０％のＤＭＳＯを含むような条件であって、これによって、固相合成の間に凝集および欠失を低下させ、収率を向上させた。カップリング時間は一般には３０分であって、脱保護時間は２×５分間であった。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）を、１時間カップリングして、以下の残基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ２０分および１時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの切断は、１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／ジチオスレイトールを用いて３時間で行った。切断後、使用済みの樹脂を濾過によって取り除き、濾液を、−８０℃で冷却された３５ｍＬのジエチルエーテルに添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、冷エーテルを用いてペプチドペレットを２回以上洗浄した。次いで、ペプチドを５〜１０ｍＬのアセトニトリル−水中に再溶解して凍結乾燥した。わずかな試料を、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））による粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を１０ｍＬの６Ｍ塩酸グアニジウム（Ｈ２Ｏ中に含まれる）中に採取し、０．５ｍＬの１Ｍのジチオスレイトールを補充し、Ｃ８  Ｌｕｎａ分取ＨＰＬＣ  カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上にロードした。溶媒（Ｈ２Ｏ、アセトニトリル）を０．１％のヘプタフルオロ酪酸を用いて酸性化した。勾配は、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを用いて、１５〜２０ｍＬ／分の流速で、１５分で３０〜７０％のアセトニトリルにわたって行った。純粋な直鎖ペプチド物質を含有する画分（ＭＡＬＤＩによって特定されるとおり）を混ぜ合わせて、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）で修飾��た。このために、直鎖ペプチドを、Ｈ２Ｏを用いて最大約３５ｍＬまで希釈し、アセトニトリル中に含まれる約５００μＬの１００ｍＭのＴＢＭＢを添加して、その反応を、Ｈ２Ｏに含まれる５ｍＬの１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で開始した。その反応を、ＲＴで約３０〜６０分間進行させて、一旦凍結乾燥させ、その反応を終わらせた（ＭＡＬＤＩで判定）。凍結乾燥後、修飾されたペプチドを、上記のとおり精製したが、ただしＬｕｎａ  Ｃ８はＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で置き換え、酸は０．１％トリフルオロ酢酸に変えた。正確なＴＭＢ−修飾物質を含有する純粋な画分をプールして、凍結乾燥して、貯蔵のために−２０℃で保持した。
【０１７７】
全てのアミノ酸は、他に注記しない限り、Ｌ−コンホメーションのものを用いた。
【０１７８】
保護された前駆体ＤＯＴＡ（ｔＢｕ）３（ＴＣＩ、ＣＡＳ  １３７０７６−５４−１）を用いて固相ペプチド合成の間、ＤＯＴＡをペプチド鎖にカップリングした。
【０１７９】
非天然のアミノ酸を、上記の一般的方法を用いてペプチド配列中に組み込んだ。
【０１８０】
本明細書で使用される非天然のアミノ酸前駆体の列挙を、下の表にまとめる。
【表１Ａ】
2018502825.tif 000013
【表１Ｂ】
2018502825.tif 000014
【０１８１】
薬物動態学的研究に用いるペプチドは、水の中の０．１％ＴＦＡから凍結乾燥して、化合物のＴＦＡ塩または遊離の酸を得た。
【０１８２】
＜前駆体二環性ペプチドとして１７−６９−０７−Ｎ２１９を用いたＢＤＣの合成＞
２つの二環薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）を、前駆体ペプチドとして１７−６９−０７−Ｎ２１９を用いて合成した。活性化されたｖｃＭＭＡＥまたはジスルフィド−ＤＭ１構築物（ＤＭＳＯ中に溶解）を、水性条件（１００リン酸ナトリウムｐＨ８）中、１７−６９−０７−Ｎ２１９を１．４×過剰で用いて直接コンジュゲートした（スキームＩおよびＩＩを参照のこと）。濃度は、９ｍｇ／ｍＬペプチド以上であった。反応に続いてＬＣ／ＭＳを行い、３．５時間後に完了と判定した。続いて、Ｃ１８セミ分取カラムを用いた標準逆相精製を行った。９５％より大きい純度の画分を単離して、凍結乾燥した。この物質は、測定できる量の遊離の毒素は含まなかった。インビトロおよびインビボの研究のために、凍結乾燥粉末を、濃縮ＤＭＳＯストック（１００ｍｇ／ｍＬ）として採取し、さらなる使用のために適切な緩衝液中に希釈した。
【０１８３】
＜前駆体二環性ペプチドとして１７−６９−０７−Ｎ２４１を用いたＢＤＣの合成＞
ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０の合成のために、ジスルフィドメイタンシノイドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）
【化１１】
2018502825.tif 000015
を用い、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは、それぞれ、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０について、式（Ｖ）ａ、（Ｖ）ｂ、（Ｖ）ｃ、（Ｖ）ｄの化合物について本明細書で上記されたとおりである。
【０１８４】
ＢＴ１７ＢＤＣ−１８はさらに、下に、およびスキームＩＩＩに記載されるように、別の経路を通じて合成した。ここで１７−６９−０７−Ｎ２７７は、ＤＭＳＯ中で、１７−６９−０７−Ｎ２４１とＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート）とを反応させることによって合成した。１７−６９−０７−Ｎ２４１の濃度は、１０ｍＭ以上であって、室温で、ＳＰＰは１．３倍過剰、ジイソプロピルエチルアミンは２０倍過剰であった。この反応は、ＬＣＭＳで判定して、１時間で完全と判定された。精製は、上記のように逆相によって行った。適切な画分を凍結乾燥した。
【０１８５】
１７−６９−０７−Ｎ２７７を、窒素ガスブランケット下で、室温で２１時間、半水性条件（５０％ジメチルアセトアミドおよび５０％の１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０に２ｍＭのＥＤＴＡを補充）中、１．１５当量のＤＭ１（遊離のチオールとして）を用いてジスルフィド交換した。反応物中の１７−６９−０７−Ｎ２７７の濃度は、１０ｍＭ以上であった。これに続いて、Ｃ１８セミ分取カラムを用いる標準的な逆相精製を行った。９５％を超える純度の画分を単離して凍結乾燥した。この物質は、測定可能な量の遊離の毒素は含まなかった。インビトロおよびインビボの研究のために、凍結乾燥粉末を、上記のとおり水性処方物中で可溶化するか、または適切な緩衝液中に直接採取した。
【０１８６】
＜ＭＴ１−ＭＭＰに対する二環性結合剤の解離速度定数の決定＞
直接結合蛍光偏光（異方性）アッセイ
直接結合蛍光偏光または異方性アッセイは、一定濃度の蛍光トレーサー（ここでは、研究すべき、フルオレセイン型二環性ペプチド）を、結合パートナー（ここでは、ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメイン）を用いて滴定することによって行った。結合パートナーの濃度が滴定の間に増大するので、偏光シグナルは、結合および未結合の材料の画分に対する割合が変化する。これによって、解離速度（Ｋｄ）の決定が定量的に可能になる。アッセイデータは、標準的なリガンド結合式を用いて当てはめることができる。
【０１８７】
典型的には、トレーサーの濃度は、トレーサー：滴定剤の対のＫｄよりも理想的には十分低く、選択される濃度は、通常は、約１ｎＭ以下である。滴定剤（結合パートナー）濃度は、０．１ｎＭから最大では通常５μＭまで変化する。この範囲は、蛍光偏光の最大変化が観察され得るように選択する。使用される緩衝液は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝化生理食塩水である。実験は、ブラック３８４ウェル低結合／低容積プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３８２０）中で行い、蛍光偏光シグナルは、ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ  ＦＳプレートリーダーを用いて測定した。
【０１８８】
本明細書中で呼ばれる蛍光トレーサーは、５，６−カルボキシフルオレセインを用いて蛍光化された二環性ペプチドである。蛍光標識化は、サルコシンスペーサー（通常はＳａｒ５）によって、二環コア配列から隔てられる、ペプチドのＮ末端アミノ基で行ってもよい。これは、Ｎ末端アミノ基がペプチドに固有である場合、Ｆｍｏｃ固相合成の間に、または合成後（ＴＢＭＥおよび精製での環化後）に行われ得る。蛍光標識化はまた、Ｃ末端に、通常は、最初のＣ末端残基として導入されたリジンで行ってもよく、この残基は次に、サルコシンスペーサー（通常はＳａｒ６）によって二環コア配列から隔てられている。したがって、Ｎ末端トレーサーは、Ｃ末端蛍光標識化構築物について、Ｆｌｕｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ５−Ａ（二環コア配列）および（二環コア配列）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）として記載された分子フォーマットを有してもよい。実施例で用いられる蛍光トレーサーは、Ａ−（１７−６９）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、Ａ−（１７−６９−０７）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、およびＡ−（１７−６９−１２）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）である。１７−６９蛍光ペプチドの酸性の性質に起因して、それらは、通常は、濃縮ＤＭＳＯストックとして調製され、それから希釈液を、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８緩衝液中で調製した。
【０１８９】
蛍光偏光（異方性）を用いる競合アッセイ
ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシン（Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ）ドメイン（ＰＥＸ）に対するそれらの高い親和性に起因して、１７−６９−０７および１７−６９−１２の蛍光標識された誘導体（それぞれ、１７−６９−０７−Ｎ０４０および１７−６９−１２−Ｎ００５と示される）を、競合実験（検出のためのＦＰを用いる）に用いてもよい。蛍光性ＰＥＸ−結合トレーサーとのＰＥＸの事前に形成された複合体を、遊離の非蛍光標識された二環性ペプチドで滴定する。全ての１７−６９ベースのペプチドは、同じ部位で結合すると期待されるので、滴定剤は、ＰＥＸから蛍光性トレーサーにとって代わる。複合体の解離は、定量的に測定され得、標的タンパク質に対する競合因子（滴定剤）のＫｄが決定され得る。競合方法の利点は、非蛍光標識の二環性ペプチドの親和性が、正確かつ迅速に決定され得るということである。
【０１９０】
トレーサーの濃度は、通常は、Ｋｄ以下（ここでは、１ｎＭ）であり、結合タンパク質（ここでは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシン）は、１５倍過剰であり、その結果トレーサーの＞９０％が結合される。引き続き、非蛍光性競合因子二環性ペプチド（通常は、ほぼ二環性コア配列）が滴定され、その結果、標的タンパク質の蛍光トレーサーにとって代わる。トレーサーの取り換えを、測定して、蛍光偏光の低下と関連付ける。蛍光偏光における低下は、非蛍光性滴定剤と結合した標的タンパク質の画分と比例しており、したがって、標的タンパク質に対する滴定剤の親和性の尺度である。
【０１９１】
生のデータは、蛍光トレーサー、滴定剤、および結合タンパク質の間の平衡を記載する三次方程式の解析解にあてはめられる。このあてはめは、直接結合ＦＰ実験によって別々に決定され得る（前のセクションを参照のこと）、標的タンパク質に対する蛍光トレーサーの親和性の値を必要とする。曲線のあてはめは、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  １２．０を用いて行い、Ｚｈｉ−Ｘｉｎ  Ｗａｎｇ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６０（１９９５）１１１〜１１４）に記載の式の適合したバージョンを用いた。
【０１９２】
＜血漿安定性プロファイリング＞
方法＃１：
迅速な血漿安定性プロファイリングアッセイを開発し、これは、親の塊の質量分光測定検出（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびにその血漿プロテアーゼ誘導性断片を使用した。断片の性質を評価することによって、好ましい切断部位を決定してもよい。ここでは、１〜１．５ｍＭのペプチドストック（ＤＭＳＯ中）を、直接マウス／ラット／ヒトの血漿に希釈して（Ｓｅｒａ  ｌａｂｓ、抗凝血剤としてクエン酸塩を用いる）、５０μＭのペプチドという最終濃度を得て、３７℃で最大４８時間インキュベートした。５μＬの試料を適切な時点で採取して、−８０℃で凍結した。分析のために、試料を解凍して、２５μＬの３：３：１のアセトニトリル：メタノール：水と混合し、１３ｋで５分間遠心分離した。５μＬのペプチド含有上清を吸引して、アセトニトリル：Ｈ２Ｏの１：１混合物中に含有される３０ｍＭの重炭酸アンモニウムと混合した。次いで、この１μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットして、乾燥し、マトリックス（αシアノけい皮酸、Ｓｉｇｍａ、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１：１アセトニトリル：水中の飽和溶液として調製した）を、サンプル（１μＬ）の上に積層し、乾燥してＭＡＬＤＩ  ＴＯＦを用いて解析した。これは、異なる二環ペプチド配列の間の血漿安定性における比較変化を検出するように作用し、かつ好ましい切断部位を決定するように優れたツールとして機能する定量的アッセイであることに注目すべきである。
【０１９３】
方法＃２
二環性ペプチドの血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中２００μＭ）を、最終濃度が１０μＭとなるように、血漿（ヒトまたはマウス）と混合した。４０μＬのサンプルを、最大８時間まで周期的に採取し、−８０℃で凍結した。ＬＣ−ＭＳ解析の前に、サンプルを解凍して、３容積（ここでは、１２０μＬ）の１：１アセトニトリル／ＭｅＯＨ水と混合した。乳濁物を３０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離し、ペプチド含有上清を、参照として同じペプチドの血漿抽出標準曲線を用いながら、二重／三重荷電の種、およびそのＭＳ／ＭＳ断片について、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｄ装置を用いて定量した。血漿中の分解の半減期を用いて、分子の比較の安定性を評価した。
【０１９４】
＜マウスにおける１７−６９−０７の薬物動態、代謝の特定＞
１７−６９−０７−Ｎ００４の薬物動態
マウスの薬物動態は、二環性ペプチド１７−６９−０４−Ｎ００４を用いて獲得し、これは、１．１９ｍｇ／ｍＬの溶液の５ｍＬ／ｋｇボーラスとして単回静脈内の５．９２５ｍｇ／ｋｇ用量として１２匹の雄性ＣＤ１マウスの１群に投与した。処方した溶液は、投与の直前に１．９ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水により希釈して、２３．７ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯストックの１００μＬから調製し、ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯからなるビヒクルをｐＨ７．４で得た。血液サンプルは、投与後０．０８、０．５、１、２および４時間で、末端の麻酔下で心穿刺によって、１時点あたり２匹の動物から採取し、血漿を得るためにＥＤＴＡチューブに移した。血漿サンプルを−２０℃で直ちに凍結した。分析のために、サンプルを迅速に解凍し、５０μＬのアリコートを、３容積の抽出溶媒（分析の内部標準を含む、１０ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８、アセトニトリルおよびメタノールの２：９：９混合物）で処理した。沈殿したタンパク質を、遠心分離によって取り出し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。サンプルの定量は、対照のマウス血漿で作成した較正線を参照した。薬物動態パラメータは、Ｓｕｍｍｉｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳｅｒｖｉｃｅｓからソフトウェアパッケージＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ２．０を用いてノンコンパートメント解析によって決定した。
【０１９５】
［用語の定義］
Ｃｍａｘ：最大の測定濃度；
Ｔｍａｘ：最大濃度測定の時間；
ＡＵＣ  ０−ｔ：血漿薬物濃度下面積／時間曲線（０分から最終の定量化可能なデータポイントまで）；および
ＡＵＣ  ０−∞：血漿薬物濃度下面積／時間曲線（０分から最終半減期に基づいて最終データポイントを超えて推定）
【０１９６】
マウス血漿中の二環性ペプチド代謝物の特定
３つの血漿サンプルを、マウスにおける１７−６９−０７−Ｎ００４のインビボ代謝物の可能性の解析のために（０．５、１および２時間）用いることが可能である。解析は、ＨＰＬＣ−ＭＳ、およびＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計で行った。血液循環中のペプチド代謝物について調べるアプローチは、仮定の代謝物の正確な量（１０ｐｐｍウインドウ）を算出することであった（それぞれ、ループ１および／またはループ２の切断のための１または２回の水（＋１８、＋３６）の添加；その後、単一アミノ酸の喪失、またはループ１および／またはループ２からのアミノ酸ストレッチの喪失）。第２に、ブランクのマウス血漿との総イオンクロマトグラムを比較することによって、手技的なサーチを行った。
【０１９７】
ＨＴ−１０８０異種移植片マウスにおけるＢＴ１７ＢＤＣ−１およびＢＴ１７ＢＤＣ−９の有効性
皮下ＨＴ−１０８０異種移植片腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、ＢＤＣまたはビヒクル（ＰＢＳ）で処置した。ＢＤＣを、２週間の間毎週３回投与し、腫瘍が約１５０〜２００ｍｍ３と測定された時に投与を開始した。マウスをモニターして、腫瘍容積の測定および体重は、週に３回記録した。
【０１９８】
〔実施例１：  ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインを用いる高親和性を有する二環性ペプチドの特定〕
二環性ペプチドファージライブラリを生成するために以前に確立された方法を使用して、ＭＴ１−ＭＭＰのヒトヘモペキシンドメインに対して選択を行った。連続的に低下する濃度の標的を使用するナイーブなライブラリからの３回の選択後、アウトプットに対して配列決定を行った。二環性ペプチド１７−６９（ＣＫＮＲＧＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ）（配列番号１６）が、最も豊富な配列アウトプットとして特定され、標的に対する定量的結合は、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎによって検証した。
【０１９９】
３つの小さいファージライブラリを生成して、１７−６９配列のうち３部分の各々の完全な配列のカバーを得た。これらの３つのライブラリを、ヘモペキシンタンパク質に対する２回の選択に供した。興味深いことに、最も見込みのある配列決定アウトプットは、５×６の二環性ペプチドであったが、出発するライブラリは、６×６フォーマットのものであった。標的タンパク質に対する二環性ペプチドの親和性が高いほど、短いループ長が選択された可能性がある。ファージライブラリの構築の間に組み込まれるプライマーが不正確に合成された結果、より短いループ長が生じる。
【０２００】
主な配列決定アウトプットは、ペプチド１７−６９−０７であって、配列ＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号２）を有する。
【０２０１】
５×６フォーマットが最も有益であると思われたという観察、および５×６の結合剤との間の差異が必要であったという観察に基づいて、２つ以上のライブラリを生成して、二環性ペプチド１７−６９−０２、１７−６９−０３、１７−６９−０４および１７−６９−１２を生成した第１のループの意図的な短縮を試験する。これらは、図１に開示される配列内に含まれる。
【０２０２】
特定の残基についての傾向は見られたが、結合アッセイは、それらがアッセイの上限に達したので、最良の結合剤との間を識別できなかった。
【０２０３】
最も頻繁に生じる配列は、アルファスクリーニング（ここでは全てのシグナルは、もとの１７−６９配列と比較して高かった）を用いて、ヘモペキシン結合についてアッセイした（表１を参照のこと）。
【０２０４】
【表２】
2018502825.tif 000016
【０２０５】
１７−６９−ベースの親和性成熟クローンの全てが、アッセイ上限に近いシグナルを生じたので、表１に示すプロットによっては、最良のクローンを明確に特定できない。したがって、いくつかのペプチドを、蛍光標識された誘導体（１７−６９、１７−６９−０７および１７−６９−１２）として合成し、直接結合蛍光性偏光（ＦＰ）実験に用いた。ここで、フルオレセインは、コア配列に対してＮ末端またはＣ末端のいずれかで、二環性配列からリンカー（通常はＳａｒ６）によって隔てられる（表２）。
【０２０６】
【表３】
2018502825.tif 000017
【０２０７】
１７−６９−０７および１７−６９−１２の蛍光標識された誘導体（１７−６９−０７−Ｎ０４０および１７−６９−１２−Ｎ００５と示される）は、それぞれ、０．５２および３．１ｎＭの解離速度で強力な結合を示した。それらは、もとの非成熟の１７−６９配列（１７−６９−Ｎ００４）よりも顕著に改善される。５×６フォーマットを含む配列は、親和性成熟ライブラリの状況内で高親和性を誘導すると思われる。
【０２０８】
ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメイン（ＰＥＸ）に対するそれらの高い親和性に起因して、１７−６９−０７および１７−６９−１２の蛍光標識された誘導体（それぞれ、１７−６９−０７−Ｎ０４０および１７−６９−１２−Ｎ００５と呼ばれる）を、続く競合実験（検出のためにＦＰを用いる）のために用いた。ここで、蛍光性ＰＥＸ結合トレーサーとのＰＥＸの事前の形成された複合体を、遊離の蛍光標識されていない二環性ペプチドで滴定する。全ての１７−６９ベースのペプチド（保存された第２のループモチーフＣＥＤＦＹＤＩＣ；配列番号１７を含有）は、同じ部位に結合すると期待されるので、滴定剤によりＰＥＸから蛍光トレーサーに置き換えられることになる。複合体の解離は、定量的に測定され得、競合因子（滴定剤）のＫｄが決定され得る。競合方法の利点は、蛍光標識されていない二環性ペプチドの親和性が、正確かつ迅速に決定され得るということである。
【０２０９】
ここでは、１７−６９−０７および１７−６９−１２コア配列が、ＰＥＸに対する高い親和性を単独で担うことを検証することが重要であった。したがって、ペプチドを、Ｎ末端およびＣ末端のアラニンを有するバリアントとして合成し、それによって、ファージ粒子上で発現された配列を密接に模倣するが、蛍光標識された構築物で用いられたＳａｒ５／６分子スペーサーを欠いている。
【０２１０】
競合実験によって決定された親和性は、蛍光標識された誘導体で得られたものとほとんど同一であって、これによってコア二環性配列が、ＰＥＸに対する高い親和性結合を担うことが明白に示された（表３）。さらに、この蛍光標識された構築物によって、分子スペーサーおよびエフェクター基のＣ末端連結（ここでは、−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（フルオレセイン）が耐容されることが示される。
【０２１１】
【表４】
2018502825.tif 000018
【０２１２】
〔実施例２：  １７−６９−０７コア配列のタンパク質分解性の安定性〕
［１７−６９−０７のマウス血漿安定性］
男性における治療適用のために、および動物種における前臨床アセスメントのためには、リード二環ペプチドが、静脈内投与後の循環中で十分に安定であることが妥当である。十分なレベルの二環ペプチドが、その標的に結合し得、その生物学的機能を発揮するような十分な安定性が必要である。
【０２１３】
前臨床モデルでは、マウス、ラット、ウサギ、およびカニクイザルなどの種を使用する場合が多い。第１の場合、二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２１９を、本明細書で上記される方法を用いてマウス血漿の存在下で安定性について評価した（方法＃２）。二環コア配列は、１７−６９−０７配列のもとの天然のタンパク質を構成するアミノ酸を保持し、さらに、エフェクター基のコンジュゲーションに用いられるＮ末端分子スペーサーを含む（配列：Ｇ−Ｓａｒ１０−ＡＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ；配列番号２０）。ＰＥＸに対する１７−６９−０７−Ｎ２１９の親和性は、分子スペーサーの存在にかかわらず保持された（Ｋｄ＝０．８２ｎＭ）。
【０２１４】
この化合物は、６時間という半減期であるエクスビボのマウス血漿中で適度の安定性を示した（図１を参照のこと）。
【０２１５】
［１７−６９−０７中のエクスビボ／インビボのタンパク質分解性切断部位の特定］
マウス血漿中の１７−６９−０７−Ｎ２１９の分解の化学的性質を理解する労力では、サンプルを、任意の潜在的な分解生成物についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて解析した。質量スペクトルによって、チロシンの損失の可能性が示され、これは、ループ開口（加水分解）ならびにループ１のＴｙｒ１および／またはループ２のＴｙ９の除去を意味する。
【０２１６】
１７−６９−０７の最小のコア二環性ペプチドを構成する、最小の二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ００４（Ａｃ−ＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号２）を用いるマウス薬物動態（ＰＫ）研究を行って、インビボ循環からのクリアランスおよび排出の速度を確立した。得られた血液サンプルをさらに解析して、１７−６９−０７−Ｎ００４の任意の潜在的なタンパク質分解生成物について血漿サンプルを分析した。
【０２１７】
ＰＫのプロファイルを図２に示す。
【０２１８】
【表５】
2018502825.tif 000019
【０２１９】
表４によって、ペプチドが１４分という排泄半減期を有すること、および２０．７ｍＬ／分／ｋｇで排出されることが示される。クリアランス速度は、マウスで観察される糸球体濾過速度よりも大きく（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２００４）Ｖｏｌ．２８６  ｎｏ．３，Ｆ５９０−Ｆ５９６にまとめる）、これによって、ペプチドが、追加の手段、例えば、血漿および内皮のプロテアーゼによって駆動されるタンパク質分解によって排出されることが示される。
【０２２０】
インビボのタンパク質分解が、クリアランスに有意に寄与するか否かに取り組むため、ｔ＝０．５、１および２時間でとった血漿サンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術を用いて二環断片のための標的解析に供した。
【０２２１】
多数のタンパク質分解代謝物を特定してもよく、最も強力なシグナルを有する断片を、降順で下に列挙する。
Ａｃ−ＣｉＹＮＥＦＧＣｉｉＥＤＦＹＤＩＣｉｉｉ（配列番号２）：
ループ１におけるＹＮＥの切除；
ループ１におけるＹＮＥＦ（配列番号２１）の切除；
ループ１におけるＹＮＥＦＧ（配列番号２２）の切除（ループ全体が除去される）；
ループ１および／または２中のＹの切除；
ループ２におけるＹＤの切除；
ループ２におけるＦＹＤの切除；
ループ２におけるＹＤＩの切除；および
ループ２におけるＥＤＦＹＤＩ（配列番号２３）の切除（ループ全体が除去される）
【０２２２】
上位３つの代謝物が中程度のシグナルレベルで存在する一方、それ以外の断片は微量でしか検出できなかった。
【０２２３】
まとめると、エクスビボおよびインビボの両方の代謝物は、Ｔｙｒ１／９でまたはその付近での最初の切断に集中するようであり、その後に近傍での残基の連続的な除去が続く。これによって最終的にループのいずれかまたは両方がその全体として除去される。
【０２２４】
［１７−６９−０７配列のタンパク質分解安定性および活性増強］
タンパク質分解からペプチド配列を安定化するためのアプローチは、多数ある（概説に関しては、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５−２０３，およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８）、ならびにＷＯ２００９／０９８４５０、ＷＯ２０１３／０５０６１５およびＷＯ２０１３／０５０６１６を参照のこと）。要するに、それらは、プロテアーゼに対して認識ポイントを提供するアミノ酸の置換、切断部位でのアミノ酸骨格の変更（すなわち、Ｎ−メチル化、擬ペプチド結合など）、隣接する結合の立体的障害（すなわち、β置換のアミノ酸）、およびＤ鏡像異性体アミノ酸の包含を含む。これらの修飾のいくつか（すなわち、Ｎ−メチル化、Ｄ−アミノ酸）は、切断部位から最大２残基離れて位置する場合でさえ、加水分解からタンパク質分解切断部位を保護／遮蔽し得る。これはタンパク質分解攻撃から配列を保護するためには比較的単純な方法であるが、標的タンパク質に対する活性を劇的に変更しないような安定化変更を組む込むことは、さらにかなり困難である。
【０２２５】
前のセクションで示される１７−６９−０７のエクスビボ／インビボのタンパク質分解データから、Ｔｙｒ１／９および近傍の残基は、二環性ペプチドの安定性に関する潜在的部位であることが明らかである。ペプチドの首尾よい安定化を評価するための定量的手段は、マウスおよびヒト血漿中でのその半減期の増大による。
【０２２６】
最初の場合、各々の位置をアラニンで置き換えた、１７−６９−０７の１１個の誘導体を生成した（「アラニンスキャン」と命名）。この種の情報は、特定の残基のエネルギー的寄与および役割を示唆し、タンパク質分解認識ポイントを潜在的に除去する。
【０２２７】
【表６】
2018502825.tif 000020
【０２２８】
１７−６９−０７−Ｎ００４は、キャッピングされたＮ末端を含む、野性型の、未修飾のペプチド（Ｎ末端アセチル化、「Ａｃ」と命名）である。Ａｌａ置換のいくつかは、特に、配列内の１、３、４、１０および１１では十分耐容される。これらの残基の側鎖は、標的に対する高い親和性結合のために必要ないので、これらの特定の配列位置における式（Ｉ）の化合物は広く定義される。
【０２２９】
これによって、残基１の置換（Ｔｙｒ１）は極めて魅力的な可能性となる。なぜなら、タンパク質分解性の認識ポイントの１つが除去され得るからである。Ａｌａ５によるＧｌｙ５の置換は、化学的変化がわずか（メチル基の付加）であるにもかかわらず、活性の劇的な低下を生じるので魅力的な置換である。Ｇｌｙ５は、一般的なＲａｍａｃｈａｎｄｒｏｎチャートの外のφ／ψ角度を採用することが可能である。これらの角度は、Ｄ−アミノ酸によって潜在的に誘導され得る。追加の利点には、この部位に隣接するペプチド結合の安定化がある。
【０２３０】
この理由のために、部分的なＤ−アラニンスキャンを行って、活性の維持に関してそれらが耐容されるか否かを評価した。配列中のＤアミノ酸の包含は、それらのタンパク質分解について安定性の効果のおかげで極めて望ましい。
【０２３１】
【表７】
2018502825.tif 000021
【０２３２】
Ｔｙｒ１の代わりのＤ−Ａｌａ１は、野性型の１０倍未満の親和性で結合する。それにもかかわらず、活性の大きな損失を誘導することなくタンパク質分解性の認識ポイントであるＴｙｒ１が除去され、安定化アミノ酸によって置き換えられるので、関心を惹くものである。
【０２３３】
注目すべきは、Ｄ−Ａｌａ５によるＧｌｙ５の置換は十分耐容され、なぜなら野性型と比較した親和性は不変のままであるからである。
【０２３４】
この状況では、Ｄ−Ａｒｇ５もまた耐容され（したがって、Ｄ−Ｐｒｏを除く全てのＤアミノ酸である可能性が高い、表６を参照のこと）、これは、分子のさらなる開発の間に、物理化学的特性が変化する必要があるか否かが関心となり得る（表７）。
【０２３５】
【表８】
2018502825.tif 000022
【０２３６】
次に、配列の４位の疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸の特定の優先度を示すファージの選択アウトプットに起因して、天然のチロシンおよびトリプトファンを含む、選択芳香族アミノ酸を組み込む一連の誘導体を合成した（表８）。
【０２３７】
【表９】
2018502825.tif 000023
【０２３８】
１Ｎａｌ：１−ナフチルアラニン；２ＮＡｌ：２−ナフチルアラニン；Ｃｈｇ：シクロヘキシルグリシン、Ｐｈｇ：フェニルグリシン；ｔＢｕＧｌｙ：ｔｅｒｔ−ブチルグリシン；３，４−ＤＣＰｈｅ４：３，４−ジクロロフェニルアラニン；Ｃｈａ：シクロヘキシルアラニン；およびＨＰｈｅ：ホモフェニルアラニン。
【０２３９】
４位の置換のいくつかによって、野性型と比較して親和性が向上し、これらとしては、チロシン、トリプトファン、１および２−ナフチルアラニン（１／２Ｎａｌ）ならびに３，４ジクロロフェニルアラニン（３，４−ＤＣＰｈｅ）が挙げられる。最も強力な置換は、１−ナフチルアラニンであり、これは親和性を７倍に向上させる。
【０２４０】
１７−６９−０７のループ２中の特定の残基を、分子の安定性を向上する目的で試験した。これらは、残基９を含み、この残基は、潜在的なＴｙｒ９認識ポイントを含む。残基１１はまた、置換を許容され（表５）、Ｔｙｒ９認識ポイントに近接するので魅力的である。
【０２４１】
【表１０】
2018502825.tif 000024
【０２４２】
興味深いのは、４−ブロモフェニルアラニン（４ＢｒＰｈｅ）であり、これは、Ｔｙｒ９タンパク質分解認識ポイントおよびｔｅｒｔ−ブチルグリシン（ｔＢｕＧｌｙ）を変更し、これが、親和性をわずかに向上させ、重要なことには、立体的障害によるタンパク質分解性加水分解から近接するアミノ酸骨格を強力に保護する。
【０２４３】
［１７−６９−０７の全体的タンパク質分解保護を達成するための多重部位置換］
以前のセクションは、タンパク質分解の安定性および／または親和性向上のアミノ酸の包含を可能にする１７−６９−０７配列内の多数の位置を開示した。
【０２４４】
単一の分子中でこれらの修飾を組み合わせる試みでは、Ｔｙｒ１→Ｄ−Ａｌａ１、Ｐｈｅ４→１ナフチルアラニン４、Ｇｌｙ５→Ｄ−Ａｌａ５、Ｔｙｒ９→４ＢｒＰｈｅ９およびＩｌｅ１１→ｔＢｕＧｌｙ１１置換を組み込んだ分子を合成した。顕著に、全ての修飾は呼応して耐容され、活性は、野性型分子のものよりも優れている（表１０および１１）。
【０２４５】
【表１１】
2018502825.tif 000025
【０２４６】
分子のさらなる開発の間、このような二環性ペプチドに対するエフェクター基の結合を予想して、Ｎ末端グリシンで開始され、Ｃ末端アラニンで終わるＮ末端サルコシン分子スペーサー（１０連続のＳａｒ、Ｓａｒ１０と示す）を有するバージョンを生成した。この実験の目的に関して、Ｎ末端Ｇｌｙを、アセチル基でキャッピングして、正の荷電を除去した。
【０２４７】
【表１２】
2018502825.tif 000026
【０２４８】
このデータによって、活性が保持されるか、または改善されるので、二環コア配列内の分子スペーサー（示したとおり、Ｎ末端に結合）およびアミノ酸置換の両方ともが十分耐容されることが示される。
【０２４９】
表１２は、表１１に示される分子の非アセチル化（非）安定化誘導体を示す。それらの安定性を、マウスおよびヒトの血漿中で定量的に評価して、非安定化１７−６９−０７−Ｎ２１９と比較した改善を実証した（図１）。
【０２５０】
【表１３】
2018502825.tif 000027
【０２５１】
図３Ａは、もとの非安定化野性型分子１７−６９−０７−Ｎ２１９と比較して、それぞれ、五置換および四置換された分子１７−６９−０７−Ｎ２４４および１７−６９−０７−Ｎ２３１のマウス血漿安定性を示す。３７℃のマウス血漿中におけるペプチドの半減期は、非増強野性型分子についての６時間と比較して、＞＞２０時間である。
【０２５２】
図３Ｂは、もとの非安定化野性型分子１７−６９−０７−Ｎ２１９と比較して、それぞれ、五置換および四置換された分子１７−６９−０７−Ｎ２４４および１７−６９−０７−Ｎ２３１のヒト血漿安定性を示す。３７℃のマウス血漿中におけるペプチドの半減期は、非増強野性型分子についての６時間と比較して、＞＞２０時間である。
【０２５３】
まとめると、１７−６９−０７二環性コア配列（Ｔｙｒ１→Ｄ−Ａｌａ１、Ｐｈｅ４→１ナフチルアラニン４、Ｇｌｙ５→Ｄ−Ａｌａ５、Ｔｙｒ９→４ＢｒＰｈｅ９およびＩｌｅ１１→ｔＢｕＧｌｙ１１）中の最大５位置までの標的化置換によって、血漿安定性において、活性の向上および有意な改善がある優れた分子が生成された。
【０２５４】
［安定化１７−６９−０７誘導体（１７−６９−０７−Ｎ２４１）の選択性］
この安定化された、誘導体１７−６９−０７−Ｎ２４１を含む分子スペーサーを、他の種由来のＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインに対する親和性についてＦＰ競合によって試験した。データを表１３にまとめる。
【０２５５】
【表１４】
2018502825.tif 000028
【０２５６】
１７−６９−０７の非安定化および安定化誘導体の両方とも、完全に交差反応性である。
【０２５７】
１７−６９−０７−Ｎ２４１Ｎ末端の蛍光標識された誘導体（配列：フルオレセイン−（ｂＡｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１  １Ｎａｌ４  Ｄ−Ａｌａ５  ｔＢｕＧｌｙ１１の１７−６９−０７−Ｎ２５８と命名）を、関連するヒトメタロプロテイナーゼに対して試験した。このデータによって、１７−６９−０７コア配列、およびこの安定化バリアントが、ＭＴ１−ＭＭＰに関して固有に選択性であることが実証される（表１４）。
【０２５８】
【表１５】
2018502825.tif 000029
【０２５９】
〔実施例３：  キレーターにコンジュゲートしている１７−６９−０７のタンパク質分解に対して安定化されたバリアントのインビボでの解析〕
金属キレーターに連結されたペプチドは、診断および治療に複数の適用を有する。特定の画像化用および治療用の放射性同位体は、キレーター上に「ロード」され得る一方で、ペプチドは、前記同位体を標的へと運ぶ。この方法では、腫瘍特異的抗原は、例えば、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴスキャナーを用いて可視化できる。標的化された放射線治療に関しては、治療のための放射性核種（例えば、９０Ｙおよび１７７Ｌｕ）は、キレーター−ペプチド上にロードされて、腫瘍関連抗原に結合することにより腫瘍に対して選択的に運ばれる。放射性核種は、それらが放射する高いエネルギー照射によって抗腫瘍活性を発揮する。
【０２６０】
［キレーター連結１７−６９−０７二環性ペプチドの合成］
５つの誘導体を合成し、ここでは、金属キレーターＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）を、１７−６９−０７二環性ペプチドのＮ末端アラニンに連結した。
【０２６１】
【表１６】
2018502825.tif 000030
【０２６２】
１７−６９−０７−Ｎ１４４は、１７−６９−０７の野性型配列であり、ここでＤＯＴＡは、１アミノ酸スペーサーとして機能するＮ末端アラニンに直接連結される。この分子は、ＭＴ１−ＭＭＰに対する完全な活性を保持する。治療／画像化放射性核種をロードされた場合に活性が保持されることを実証するため、キレーターに、自然の（コールド）１７５ルテニウムを、安全な置換としてロードした。活性は保持された。完全に安定化されたバリアント、１７−６９−０７−Ｎ２４８はまた、ＤＯＴＡコンジュゲートの状況でも活性が保持された。
【０２６３】
１７−６９−０７−Ｎ１４４の完全Ｄ−アミノ酸等価物である、対照の分子、１７−６９−０７−Ｎ２４６を調製した。Ｄアミノ酸に隣接するアミド結合は、プロテアーゼから保護され、ＭＴ１−ＭＭＰに対する活性を欠いているため、この分子は、タンパク質分解に対して完全に耐性である。重要なことに、このペプチドは、正確な同じ配列および化学組成を保持する。
【０２６４】
［ＨＴ１０８０異種移植片マウス中の１７７Ｌｕ−ロード１７−６９−０７−Ｎ１４４の生体内分布］
ＨＴ−１０８０細胞（ＭＴ１−ＭＭＰを豊富に発現することが知られている）を雄性６週齢ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの右わき腹に皮下接種した。腫瘍を、約１週間増殖させた。
【０２６５】
１５０ピコモルの１７−６９−０７−Ｎ１４４ペプチドに、標準の複合技術を用いて１ＭＢｑのγ−およびβ−エミッタ１７７Ｌｕをロードした。次に、腫瘍保有マウス１匹あたり１５０ピコモルのロードされた１７−６９−０７−Ｎ１４４を注射した（１７μｇ／ｋｇの等価）。１時点あたり３匹の動物を安楽死させ、種々の臓器および腫瘍を切り出して、秤量し、続いて、腫瘍／臓器組織の１グラムあたりのγ放射カウントを決定した。得られたプロットは、インビボのマウスにおいてペプチドの局在化の定量的指標を示す。具体的には、ＨＴ１０８０腫瘍中の選択的蓄積は、インビボでＭＴ１−ＭＭＰ結合を示す。
【０２６６】
図４は、生体内分布データをまとめる。顕著なことに、二環性ペプチドは、腫瘍に特異的であって、１４分の循環中の推定の半減期にかかわらず、最大２４時間まで持続するようである。これは、腫瘍細胞への取り込みを示す可能性が高い。有意な局在化は、腎臓で可視化され、これは、ペプチドに一過性に結合する腎臓アミノ酸トランスポーターに起因する可能性が高い。他の全ての臓器は、分子の有意な取り込みを示さない。注目すべきことに、マウスヘモペキシンドメインは、ヒト対応物と完全な相同性を共有し、このことは、マウスＰＥＸが、他の場所で発現される場合、対応するシグナルが観察されることを示している。
【０２６７】
異種移植片モデルにおける腫瘍取り込みが、選択性であり、ＰＥＸ結合に起因するか否かを評価するために、１７−６９−０７−Ｎ１４４のＤ−アミノ酸対応物である、ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２４６を用いて追加の研究を行った（図５）。
【０２６８】
活性である二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ１４４により得られた生体内分布パターンと比較して、ＭＴ１−ＭＭＰ非結合１７−６９−０７−Ｎ２４６二環性ペプチドは腫瘍を標的しないことが明確であり、これによって１７−６９−０７−Ｎ１４４の腫瘍シグナルは、インビボでＭＴ１−ＭＭＰ標的結合によって駆動されることが確認された。
【０２６９】
最終的に、生体内分布に対する１７−６９−０７配列のタンパク質分解性の安定性の効果を評価するために、二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２４８（ＤＯＴＡ−Ａ−（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１  １Ｎａｌ４  Ｄ−Ａｌａ５  ４ＢｒＰｈｅ９  ｔＢｕＧｌｙ１１）を、同一の生体内分布研究で使用した（図６）。
【０２７０】
著しいことに、ペプチドのタンパク質分解安定性の向上は、１７−６９−０７−Ｎ１４４と比較して、任意の所定の時点において腫瘍取り込みの全体的な倍加につながり、これによって、もとの非安定化１７−６９−０７配列と比較して分子の優れた特性が例証される。
【０２７１】
この効果は、この実施例に記載されるコンジュゲートを用いて、放射性核種標的化治療について、および毒素コンジュゲートの二環性ペプチドの状況での両方ともで、有利な治療係数を生じ得ると予想される（実施例４）。
【０２７２】
〔実施例４：  細胞毒性剤との非安定化二環性ペプチドのコンジュゲーション〕
標的がん治療のために、極めて強力な細胞毒性薬を、標的化物（ここでは、二環性ペプチド）に対して切断可能リンカーを通じて結合し、この標的化物が、腫瘍関連の細胞表面発現されたタンパク質に結合する。過剰発現された腫瘍関連細胞表面タンパク質標的は、細胞の内側へと取り込まれるその能力について選択される。腫瘍関連の細胞表面タンパク質に対する細胞毒性剤コンジュゲートの標的化物の結合の際、全体的な分子複合体は、細胞の内側に取り込まれる。全身の循環から別個の細胞内環境への移行後、細胞毒性薬を細胞内条件によって標的化物から切断し、次いで切断された薬物は、細胞周期停止を通じて標的化細胞死を誘導し、それに続くアポトーシスによって、その抗腫瘍活性を発揮する。
【０２７３】
二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２１９（実施例２および３を参照のこと）は、Ｇｌｙ−Ｓａｒ１０−Ａｌａ分子スペーサー（Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）に対してＮ末端上に連結した野性型二環性コア配列から構成され、ここで全長の配列の記載は、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ−ＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ；配列番号２０）である。（１７−６９−０７）のこの誘導体は、０．８ｎＭのＫｄでＭＴ１−ＭＭＰに対して完全な活性（表１２）を保持する。分子スペーサーのＮ末端における遊離の固有のアミノ基を、理想的には、極めて強力な細胞毒性物質などのエフェクター基とのコンジュゲーションのために配置する。Ｎ末端Ｇｌｙ上のコンジュゲーション部位と二環コア配列との間のＳａｒ１０リンカーによって与えられる長い分子内距離が、有意な分子サイズのエフェクター基とのコンジュゲーション後の標的結合活性の完全な保持を保証するために採用される。標的タンパク質に対する二環コア配列の活性が保持される限り、さらに短い分子スペーサーを随意に選択してもよい。
【０２７４】
ＭＴ１−ＭＭＰを標的する、二環性ペプチド薬物コンジュゲート（ＢＤＣと命名）によるコンセプトデータの確証を得るために、１７−６９−０７−Ｎ２１９の２つのコンジュゲートを調製し、これは、微小管重合阻害性毒素ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン）またはＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ、（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドとしても公知）のいずれかを使用した。
【０２７５】
ＭＭＡＥコンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−１と命名され、自己犠牲パラ−アミノベンジル−カルボニル基（ＰＡＢＣ）を含むバリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）リンカーによって、１７−６９−０７−Ｎ２１９前駆体から分離される。Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーは、細胞内リポソーム中で遭遇したカテプシンＢリッチ環境によって選択的に切断され（加水分解され）、加水分解後、ＰＡＢＣは犠牲になり、ＭＭＡＥを活性な毒素種として放出する。Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣリンカーは、循環中で安定であり、したがって、細胞内部移行の際にのみ毒素を放出する。
【０２７６】
コンジュゲートの構造、およびＢＴ１７ＢＤＣ−１の調製のための合成スキームをスキームＩに示す。
【化１２】
2018502825.tif 000031
【０２７７】
ＢＤＣ１７ＢＤＣ−１の調製のための合成のストラテジー。完全に精製された、ＴＭＢ環化１７−６９−０７−Ｎ２１９二環前駆体は、グルタリル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルボニル−ＭＭＡＥ（一般には、ｖｃ−ＭＭＡＥまたはＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥとして略称される）のスクシンイミドエステルと反応し、コンジュゲートＢＤＣ１７ＢＤＣ−１が生じる。
【０２７８】
１７−６９−０７−Ｎ２１９のＤＭ１コンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−９と命名され、細胞内環境中で遭遇する還元環境によって切断可能であり得るジスルフィド結合によって１７−６９−０７−Ｎ２１９前駆体から隔てられる。還元は、細胞の内側に約１０ｍＭの濃度で存在する、細胞内グルタチオンを通じて行われると考えられる。対照的に、血液循環中のグルタチオンおよび遊離の還元剤の濃度はかなり低く（＜１０μＭ）、したがって、毒素は、細胞内環境中で優先的に放出され、ここで、毒素は、その細胞殺傷活性を明らかにし得る。
【０２７９】
コンジュゲートの構造、およびＢＴ１７ＢＤＣ−９の調製のための合成スキームを、スキームＩＩに示す。
【化１３】
2018502825.tif 000032
【０２８０】
ＢＤＣ１７ＢＤＣ−９の調製のための合成ストラテジー。完全に精製された、遊離のＮ末端アミンを含む、ＴＭＢ環化１７−６９−０７−Ｎ２１９二環前駆体は、ジスルフィド−ＤＭ１のスクシンイミドエステルと反応し（示した構造）、コンジュゲートＢＤＣ１７ＢＤＣ−９を生じる。
【０２８１】
したがって、ＢＤＣ１７ＢＤＣ−１およびＢＤＣ１７ＢＤＣ−９中の毒素の放出は、機構として別個であり、すなわち、前者は、細胞内タンパク質分解条件を通じてであり、後者は、細胞内還元条件による。
【０２８２】
２つのＢＤＣを、インビトロの細胞毒性研究で使用して、ＨＴ１０８０のような細胞培養物に対する低ナノモル／ピコモル活性を示した（データ示さず）。
【０２８３】
インビボのマウス異種移植片モデル（ＨＴ１０８０腫瘍を保有する）では、両方のＢＤＣとも、ビヒクルの対照と比較して、注射の９日後、腫瘍容積の有意な低下を生じた。この投薬レジメンを図７（矢印）に示す。腫瘍は、触診によって判定されるとおり、両方のＢＤＣに関して１４日で完全に消失した（図７）。著しいことに、ＢＤＣ１７ＢＤＣ−１およびＢＤＣ１７ＢＤＣ−９の両方に関する動物の重量は、概して安定であり、これは、治療目的に十分であり得る治療ウインドウを示す。
【０２８４】
〔実施例５：  細胞毒性剤とのタンパク質分解的に安定化された二環性ペプチドのコンジュゲーション〕
１位のＤ−アラニン、４位の１−ナフチルアラニン、５位のＤ−アラニン、および１１位のα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン（９位の４−ブロモフェニルアラニンの有無）という修飾を含む二環性コア配列１７−６９−０７は、エクスビボの血漿およびインビボにおいて、タンパク質分解安定性が向上していた（実施例２、３）。
【０２８５】
二環薬物コンジュゲートの状況では、二環コア配列が安定であるほど、全身のクリアランスの低下およびタンパク質分解が亢進した腫瘍微小環境における安定性の増大に起因して、腫瘍露出がさらに大きくなり得る可能性が高い。細胞の内側へのＢＤＣのＭＴ１−ＭＭＰ駆動の取り込みの増大が生じ得、治療有効性の増大につながり得る。
【０２８６】
安定化二環性ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２４１を、非安定化１７−６９−０７−Ｎ２１９に対して全体的に同様の分子レイアウトで設計した（実施例３および４に記載）。これは、以下の配列：
（Ｂ−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＣ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ（配列番号５）
を有し、これは、前のとおりＴＢＭＢと環化される。
【０２８７】
１７−６９−０７−Ｎ２１９の中のように、前に使用したグリシンではなく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（Ｐｕｒｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ（１９７３），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２，１８４５）との、特にこの実施例では細胞毒性剤のＮＨＳエステルとの、カップリングの間のジケトピペラジン副生成物形成を最小限にするために、Ｎ末端ベータ−アラニンを選択した（スキームＩ、ＩＩ）。
【０２８８】
サルコシン十量体スペーサーを、１７−６９−０７−Ｎ２１９中に保持し、それによって、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する二環ペプチドの結合の完全な保持を確実にする。
【０２８９】
メイタンシン毒素クラスは、実施例４に記載のマウス異種移植片モデルにおける有効性および耐容性に基づいて、１７−６９−０７−Ｎ２４１に対するコンジュゲーションについて選択し、ジスルフィド切断リンカーを再度選択した。
【０２９０】
４つのＢＤＣを（本明細書上記では、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０と呼ぶ）を調製し、その結果、毒素および１７−６９−０７−Ｎ２４１はともに不変であったが、還元／切断に対するジスルフィド結合の感受性は、イオウ原子に隣接する妨害の程度をモジュレートすることによって変更された。
【０２９１】
コンジュゲートに対する合成経路は、スキームＩＩに記載のとおりであり、ここでは、１７−６９−０７−Ｎ２１９が１７−６９−０７−Ｎ２４１で置き換えられる。
【０２９２】
ＢＴ１７ＢＤＣ−１８については、ＤＭ１と反応させて完全なコンジュゲートを形成する、ピリジルジスルフィド二環前駆体（１７−６９−０７−Ｎ２７７と命名）の生成のための追加の経路を含んだ。この合成経路は、スキームＩＩＩに記載される。
【化１４】
2018502825.tif 000033
【０２９３】
ＢＴ１７ＢＤＣ−１８の調製のための合成ストラテジー。完全に精製したＴＭＢ環化１７−６９−０７−Ｎ２４１二環前駆体（遊離のＮ末端アミンを含有）を、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート））と反応させて、中間体１７−６９−０７−Ｎ２７７を得た。次いで、これを遊離のチオールとしてＤＭ１と反応させて、所望のコンジュゲートＢＴ１７ＢＤＣ−１８を得る。
【０２９４】
［ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０のインビトロの特徴付け］
４つのＢＤＣを、ヒトＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインに対する活性の保持、エクスビボのマウス、ラットおよびヒト血漿における安定性、ならびにジチオスレイトールのような還元剤に対する安定性などのいくつかのインビトロのパラメータについて評価した。
【０２９５】
データを下の表１６にまとめる。
【表１７】
2018502825.tif 000034
【０２９６】
このデータによって、血漿安定性は、ジスルフィド結合の性質によって支配され（還元に対する感受性によってモジュレートされるとおり）、二環性ペプチドの性質によっては支配されないことが示された。なぜなら、全てのＢＤＣが、試験された３つの種由来の血漿中で安定である同じ二環性ペプチド（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を含んでいるからである。
【０２９７】
さらに、ヒトにおける腎濾過により駆動されるこの分子サイズのペプチドの予想されるクリアランスは、ヒト血漿中のＢＤＣの分解半減期よりも数倍早い、２〜４時間の推定半減期を有していることから（＞１４時間、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８／１９／２０、表１６を参照のこと）、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０は、治療用途に適切なヒト血漿中における安定性を示す。したがって、ＢＤＣのバルクは、腎臓でクリアランスされると予想され、ある画分のみが循環中で分解され、これらのＢＤＣは、可能性として治療目的に適切になる。
【０２９８】
［ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８、ＢＴ１７ＢＤＣ−１９およびＢＴ１７ＢＤＣ−２０のインビボ有効性］
安定化二環コア配列を含む全てのＢＤＣを、ヒト肺扁平細胞がん株ＥＢＣ−１を用いたインビボのマウス異種移植片モデルにおいて、それらの有効性について試験した。
【０２９９】
ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９は、有効であって、９日で腫瘍を消失させた（図９、１０および１１）。ＢＴ１７ＢＤＣ−１７は、良好な有効性、ただし高用量ではある程度の体重低下を示した。ＢＴ１７ＢＤＣ−２０は、一定重量に基づいて耐容されたが、有効ではなく、腫瘍の大きさの最低限度の低下しか生じなかった（図１２）。
【０３００】
経時的な腫瘍容積の曲線下面積（ＡＵＣ）およびＢＤＣをとって、対応する用量群に対してプロットした（図１３）。この結果から５０％の腫瘍ＡＵＣ低下を得るための有効用量（ＥＤ５０）を決定してもよく、これを表１７にまとめる。
【０３０１】
【表１８】
2018502825.tif 000035
【０３０２】
したがって、ＢＴ１７ＢＤＣ−９、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９は、有効性に基づいた標的がん治療での使用のための適切な分子であり、ＢＴ１７ＢＤＣ−１７、ＢＴ１７ＢＤＣ−１８およびＢＴ１７ＢＤＣ−１９が、有効性用量で十分耐容される。
【図１】
2018502825.tif 000053
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018502825.tif 000059
【図８】
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【図９】
2018502825.tif 000061
【図１０】
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【図１１】
2018502825.tif 000063
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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