(57)【要約】  癌患者を分子標的療法で治療した後のチロシンキナーゼ中の突然変異の出現は、薬物耐性獲得の主要な機構を表す。ここでは、髄芽細胞腫などにおけるヘッジホッグ（Ｈｈ）経路阻害剤に対する耐性をもたらすセルペンチン受容体スムースンド（ＳＭＯ）の突然変異を記載する。ＳＭＯの保存された残基中のアミノ酸置換は、Ｈｈシグナル伝達を維持するが、Ｈｈ経路阻害剤ＧＤＣ−０４４９がＳＭＯと結合してこの経路を抑制することを不能にする。いくつかの実施形態では、本開示は、新規の突然変異体ＳＭＯタンパク質及び核酸、ならびにＳＭＯ突然変異を検出するためのスクリーニング方法、及び薬物耐性を呈する突然変異体ＳＭＯを特異的に調節する薬物をスクリーニングするための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸２４１で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体ＳＭＯを試験化合物と接触させること、及び前記化合物と前記突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することを含み、前記試験化合物と突然変異体ＳＭＯとの結合により、前記試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤であることが示される、方法。
【請求項２】
アミノ酸２４１で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体ＳＭＯを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び前記細胞内のＧｌｉの活性を検出することを含み、Ｇｌｉ活性の存在により、前記試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤でないことが示される、方法。
【請求項３】
アミノ酸４６９で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体ＳＭＯを試験化合物と接触させること、及び前記化合物と前記突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することを含み、前記試験化合物と突然変異体ＳＭＯとの結合により、前記試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤であることが示される、方法。
【請求項４】
アミノ酸４６９で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体ＳＭＯを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び前記細胞内のＧｌｉの活性を検出することを含み、Ｇｌｉ活性の存在により、前記試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤でないことが示される、方法。
【請求項５】
配列番号６に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む、単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項６】
前記配列番号６のアミノ酸を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む、請求項５に記載の単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でメチオニン（Ｍ）を含む、請求項５または６に記載の単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項８】
配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む、単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項９】
前記配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でチロシン（Ｙ）を含む、請求項８または９に記載の単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質。
【請求項１１】
ヘッジホッグ経路阻害剤阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、前記細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくは前記ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、前記細胞が、請求項５〜１０のいずれかに記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現する、接触させることと、ｂ）前記試験薬剤が前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、前記試験薬剤が前記対照と比べて前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、前記試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する前記試験薬剤の能力が、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、前記細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくは前記ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、前記細胞が、５〜１０のいずれかに記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現する、接触させることと、ｂ）前記試験薬剤が前記細胞の成長及び／または増殖を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、前記試験薬剤が前記対照と比べて前記細胞の成長及び／または増殖を阻害する場合には、前記試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項１４】
前記対照が、野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記対照が、前記試験薬剤と接触させた前記細胞と同じ突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞であり、前記対照が、前記突然変異体ＳＭＯタンパク質が部分的または完全に耐性である対照薬剤で処理される、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記対照薬剤が、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５、及び／または化合物５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験薬剤が、突然変異体ＳＭＯタンパク質と結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質とは結合しない、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記試験薬剤が、突然変異体ＳＭＯタンパク質及び野生型ＳＭＯタンパク質の両方と結合する、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記試験薬剤が、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞における前記ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験薬剤が、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞の成長及び／または増殖の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２２】
前記突然変異体ＳＭＯタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でメチオニン（Ｍ）を含む、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
配列番号５の親核酸配列を含み、前記配列が、アミノ酸２４１をコードする配列を、異なるアミノ酸をコードするように変化させる突然変異を含む、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
配列番号１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記突然変異体ＳＭＯタンパク質が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でチロシン（Ｙ）を含む、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号５の親核酸配列を含み、前記配列が、アミノ酸４６９をコードする配列を、異なるアミノ酸をコードするように変化させる突然変異を含む、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
請求項２１〜２３または２４〜２６のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２７に記載のベクターを含み、かつそれを発現することができる、宿主細胞。
【請求項３０】
ヘッジホッグ経路阻害剤阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、前記細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくは前記ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、前記細胞が、請求項２７に記載のベクターを発現する、接触させることと、ｂ）前記試験薬剤が前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、前記試験薬剤が前記対照と比べて前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、前記試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する前記試験薬剤の能力が、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、前記細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくは前記ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、前記細胞が、請求項２７に記載のベクターを発現する、接触させることと、ｂ）前記試験薬剤が前記細胞の成長及び／または増殖を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、前記試験薬剤が前記対照と比べて前記細胞の成長及び／または増殖を阻害する場合には、前記試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項３３】
試料中の突然変異体ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、前記試料から、突然変異を含むことが疑われるＳＭＯの第１の細胞外ループのカルボキシ末端またはその断片に対応する核酸を増幅することと、前記増幅された核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＳＭＯ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することと、を含む、方法。
【請求項３４】
前記電気泳動移動度がポリアクリルアミドゲル上で決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の突然変異ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、前記試料から、突然変異を含むことが疑われるＳＭＯの膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端またはその断片に対応する核酸を増幅することと、前記増幅された核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＳＭＯ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することと、を含む、方法。
【請求項３６】
前記電気泳動移動度がポリアクリルアミドゲル上で決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試料中の少なくとも１つのＳＭＯ突然変異を同定する方法であって、前記試料由来の核酸を、アミノ酸２４１をコードする配列をトレオニン以外のアミノ酸に変化させる突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることと、前記ハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、方法。
【請求項３８】
前記プローブが検出可能に標識されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸前記試料中の前記ＳＭＯ遺伝子またはその断片を増幅し、前記プローブと接触させる、請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
試料中の少なくとも１つのＳＭＯ突然変異を同定する方法であって、前記試料由来の核酸を、アミノ酸４６９をコードする配列をシステイン以外のアミノ酸に変化させる突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることと、前記ハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、方法。
【請求項４２】
前記プローブが検出可能に標識されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸前記試料中の前記ＳＭＯ遺伝子またはその断片を増幅し、前記プローブと接触させる、請求項４０〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であるヒト対象において腫瘍を同定する方法であって、前記腫瘍の試料中の突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在を決定することを含み、前記突然変異ＳＭＯ遺伝子が、アミノ酸２４１で突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、前記ＳＭＯタンパク質が、アミノ酸２４１で突然変異を含み、前記突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在により、前記腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に対して耐性であることが示される、方法。
【請求項４６】
ＧＤＣ−０４４９による治療に対して感受性がないか、もはや感受性がない腫瘍を有する前記対象を、前記突然変異ＳＭＯに結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記突然変異の存在または不在を核酸試料の検査によって決定する、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記突然変異の存在または不在をタンパク質試料の検査によって決定する、請求項４５〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であるヒト対象において腫瘍を同定する方法であって、前記腫瘍の試料中の突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在を決定することを含み、前記突然変異ＳＭＯ遺伝子が、アミノ酸４６９での突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、前記ＳＭＯタンパク質が、アミノ酸４６９での突然変異を含み、前記突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在により、前記腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に対して耐性であることが示される、方法。
【請求項５０】
ＧＤＣ−０４４９による治療に対して感受性がないか、もはや感受性がない腫瘍を有する前記対象を、前記突然変異ＳＭＯに結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記突然変異の存在または不在を核酸試料の検査によって決定する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記突然変異の存在または不在をタンパク質試料の検査によって決定する、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
異常なヘッジホッグシグナル伝達を有する細胞の増殖または成長を阻害する方法であって、前記細胞にブロモドメイン阻害剤を投与することを含み、前記細胞が、配列番号１のアミノ酸位置２４１または４６９に対応するアミノ酸位置のうちのいずれか１つ以上で突然変異を有するスムースンドタンパク質を発現する、方法。
【請求項５４】
前記細胞が対象中にある、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が癌細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞がＳＵＦＵ突然変異をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞がヒト細胞であり、前記細胞が、前記ＳＵＦＵ遺伝子のコピーの喪失をもたらす１０ｑ欠失突然変異を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１０ｑ欠失が、さらに前記ＰＴＥＮ遺伝子のコピーの損失をもたらす、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ブロモドメイン阻害剤が、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＪＱ１、またはＪＱ２である、請求項５３〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
アミノ酸２４１をコードする配列中に突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、核酸プローブ。
【請求項６１】
前記プローブが、前記突然変異ＳＭＯまたは前記その断片をコードする前記核酸に相補的である、請求項６０に記載のプローブ。
【請求項６２】
約１０〜約５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項６０に記載のプローブ。
【請求項６３】
検出可能な標識をさらに含む、請求項６０に記載のプローブ。
【請求項６４】
アミノ酸４６９をコードする配列中に突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、核酸プローブ。
【請求項６５】
前記プローブが、前記突然変異ＳＭＯまたは前記その断片をコードする前記核酸に相補的である、請求項６４に記載のプローブ。
【請求項６６】
約１０〜約５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項６４に記載のプローブ。
【請求項６７】
検出可能な標識をさらに含む、請求項６４に記載のプローブ。
【請求項６８】
請求項５〜７のいずれかに記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、アミノ酸２４１でトレオニンを有する野生型ＳＭＯに結合しない、抗体。
【請求項６９】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはこれらの抗原結合断片である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７０】
前記抗体が、細胞毒性剤にコンジュゲートされている、請求項６８または６９に記載の抗体。
【請求項７１】
前記抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項６８または６９に記載の抗体。
【請求項７２】
前記抗体が、ＳＭＯ活性を阻害する、請求項６８〜７１のいずれかに記載の抗体。
【請求項７３】
請求項８〜１０のいずれかに記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体のエピトープが、アミノ酸４６９でシステインを有する野生型ＳＭＯに結合しない、抗体。
【請求項７４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはこれらの抗原結合断片である、請求項７３に記載の抗体。
【請求項７５】
前記抗体が、細胞毒性剤にコンジュゲートされている、請求項７３または７４に記載の抗体。
【請求項７６】
前記抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項７３または７４に記載の抗体。
【請求項７７】
前記抗体が、ＳＭＯ活性を阻害する、請求項７３〜７６のいずれかに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１５年２月４日出願の米国仮出願第６２／１１２，０７４号の優先権の恩典を主張する。前述の出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
分子標的癌治療薬は、臨床において優れた活性を示している。最も著名な例の一部には、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ突然変異胃腸管系間質腫瘍（ＧＩＳＴ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ及びＥＧＦＲ突然変異非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるエルロチニブが含まれる（Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．及びＲ．Ａ．Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（２）：１７２−１８７）。これらの薬剤を用いた治療は、これらの分子異常を有する患者集団において劇的な抗腫瘍応答をもたらしている。しかしながら、優れた初期の臨床応答にもかかわらず、ほとんどの患者は、薬物耐性の獲得が原因で最終的には進行する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．及びＪ．Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１８（１）：７３−７９）。結果的に、耐性の機構の同定は、耐性の出現を潜在的に克服または回避することができる、より合理的な薬物の組み合せ及び「第２世代」阻害剤の開発への扉を開いた。
【０００３】
髄芽細胞腫は、子供において最も一般的な脳の悪性腫瘍を表す、小脳の原始的な神経外胚葉性腫瘍である（Ｐｏｌｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ｗ．Ｒ．及びＮ．Ｊ．Ｔａｒｂｅｌｌ（２００７）Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．４（５）：２９５−３０４）。髄芽細胞腫に対する治療の１つの形態は、補助放射線療法である。生存率の改善にもかかわらず、補助放射線は消耗性の副作用と関連付けられ、したがって、新しい分子標的療法の必要性を支持している。
【０００４】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、髄芽細胞腫の病因に直接関係があるとされている。ほとんどの場合、阻害性受容体ＰＴＣＨ１の機能喪失型突然変異に起因する、構成的Ｈｈシグナル伝達は、弧発例のおよそ３０％で示されている（Ｚｕｒａｗｅｌ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２７（１）：４４−５１、Ｋｏｏｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：ｅ３０８８、Ｄｅｌｌｏｖａｄｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：５３９、Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｆ．Ｊ．ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５：１０２６）。Ｐｔｃｈ１についてヘテロ接合性のマウス（Ｐｔｃｈ１＋／−）は、髄芽細胞腫を自然発生することがあり、Ｈｈ経路阻害剤による治療は、腫瘍の消失及び延命をもたらす（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｌ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２９）：１１０９−１１１３、Ｒｏｍｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６（３）：２２９−２４０）。しかしながら、新規のＨｈ経路阻害剤ＧＤＣ−０４４９で治療された患者は、最初は治療に対する劇的な応答を示したが（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（提出済み））、結局は、治療に対する持続性のある応答を有することができず、腫瘍が再発することが最近観察された。
【０００５】
ＢＣＣは、最も一般的なヒト癌であり、主にＨｈ経路の過剰活性化によって引き起こされる（Ｏｒｏら、１９９７；Ｘｉｅら、１９９８）。Ｈｈシグナル伝達経路と癌との間の関連性は、髄芽細胞腫（ＭＢ）及びＢＣＣに高度に感受性があるゴーリンまたは基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）を患う患者において最初に発見された。これらの患者は、通常、Ｈｈリガンドの受容体をコードするＰａｔｃｈｅｄ  １（ＰＴＣＨ１）におけるヘテロ接合生殖系列突然変異を保有する（Ｈａｈｎら、１９９６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９６）。Ｈｈリガンド結合は、セルペンチン膜貫通（ＴＭ）シグナル伝達物質スムースンド（ＳＭＯ）のＰＴＣＨ１抑制を軽減する。弧発性ＢＣＣの大多数は、ＰＴＣＨ１における不活性化突然変異及びヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）によって引き起こされ、残りの大部分は、ＳＭＯにおける活性化突然変異を有する（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００５）。ＳＭＯは、融合（ＳＵＦＵ）及びタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）のサプレッサーの阻害によってＧＬＩ転写因子の活性化及び核局在化を促進する。ＳＵＦＵは、細胞質におけるＧＬＩ転写因子の結合及び隔離によってＨｈ経路を負に調節する（Ｓｔｏｎｅら、１９９９）。ＳＵＦＵにおける機能喪失突然変異も、ゴーリン症候群と関連付けられる（Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、２００９；Ｓｍｉｔｈら、２０１４；Ｔａｙｌｏｒら、２００２）。弧発性ＢＣＣのおよそ５０％が  ＴＰ５３突然変異も有する（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００６】
いくつかのＨｈ経路阻害剤（ＨＰＩ）が、ＢＣＣ及びＭＢの両方について現在臨床研究中である（Ａｍａｋｙｅら、２０１３）。以前はＧＤＣ−０４４９として知られていたビスモデギブは、転移性及び局所進行性ＢＣＣの治療のために認可されているＳＭＯ阻害剤である（Ｓｅｋｕｌｉｃら、２０１２）。ビスモデギブで治療されたＢＣＣ患者の大部分は、完全奏効及び部分奏効の両方を含む臨床的利益を経験する（Ｓｅｋｕｌｉｃら、２０１２）。
【０００７】
しかしながら、概算見積は、進行性ＢＣＣ患者の最大２０％が治療後最初の１年以内にビスモデギブへの耐性を生じることを示す（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｏｒｏ、２０１２）。これまで、臨床におけるビスモデギブへの後天的耐性の機能的にのみ特徴付けられた機構は、転移性ＭＢを患う患者に由来した。ＳＭＯ−Ｄ４７３Ｈ突然変異が再発性転移性腫瘍からの生検において検出され、インビトロの薬物結合を無効にすることが示された（Ｙａｕｃｈら、２００９）。４つの他の臨床ＳＭＯ突然変異がビスモデギブ耐性ＢＣＣにおいて最近報告されたが、機能的には検査されなかった（Ｂｒｉｎｋｈｕｉｚｅｎら、２０１４；Ｐｒｉｃｌら２０１４）。さらなるＳＭＯ突然変異、ＧＬＩ２などの下流Ｈｈ経路成分の増幅、ならびにホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）キナーゼ及び非定型タンパク質キナーゼＣ  ι／λ（ａＰＫＣ−ι／λ）を含むバイパスシグナル経路の活性化を含む、ＳＭＯ阻害剤へのいくつかの耐性機構が臨床前モデルから明らかとなっている（Ａｔｗｏｏｄら、２０１３；Ｂｕｏｎａｍｉｃｉら、２０１０；Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）。しかしながら、どの機構が患者において耐性を引き起こすのかは依然として不明である。
【０００８】
ＧＤＣ−０４４９で治療したときの薬物耐性を克服するために、さらなるＧＤＣ−０４４９耐性突然変異体ＳＭＯタンパク質を同定し、そのような突然変異体ＳＭＯタンパク質のＳＭＯ活性を調節する化合物を見出すことが、当技術分野において緊急に必要である。さらに、そのＳＭＯ遺伝子型の自然な変動または突然変異及び耐性の獲得のいずれかによって治療に対して耐性であり得る患者を診断する方法が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、ある特定の実施形態において、腫瘍の化学療法耐性に関連するものなどの単離された突然変異体ＳＭＯ核酸及びタンパク質、ならびにＳＭＯ突然変異体に結合するか、またはＳＭＯ活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法に関し、また、癌の診断及び治療、特に、診断的及び／または予後判定的である突然変異の検出、ならびに薬物耐性腫瘍の治療にも関する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸２４１で突然変異を組み込んでいる突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、該突然変異体ＳＭＯを試験化合物と接触させること、及び該化合物と該突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することを含み、該試験化合物と該突然変異体ＳＭＯとの結合により、該試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤であることが示される、方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸２４１で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、該突然変異体ＳＭＯを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び該細胞内のＧｌｉの活性を検出することを含み、Ｇｌｉ活性の存在により、該試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤でないことが示される、方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸４６９で突然変異を組み込んでいる突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、該突然変異体ＳＭＯを試験化合物と接触させること、及び該化合物と該突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することを含み、該試験化合物と該突然変異体ＳＭＯとの結合により、該試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤であることが示される、方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸４６９で突然変異を組み込む突然変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、該突然変異体ＳＭＯを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び該細胞内のＧｌｉの活性を検出することを含み、Ｇｌｉ活性の存在により、該試験化合物が突然変異体ＳＭＯの阻害剤でないことが示される、方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、アミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む、単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、アミノ酸２４１でメチオニン（Ｍ）を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、アミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む、単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、アミノ酸４６９でチロシン（Ｙ）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）試験薬剤が細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、試験薬剤が対照と比べて細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する試験薬剤の能力は、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）試験薬剤が細胞の成長及び／または増殖を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、試験薬剤が対照と比べて細胞の成長及び／または増殖を阻害する場合には、試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対照は、野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、試験薬剤と接触させた細胞と同じ突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞であり、対照は、突然変異体ＳＭＯタンパク質が部分的または完全に耐性である対照薬剤で処理される。いくつかの実施形態では、対照薬剤は、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５、及び／または化合物５である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質と結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質とは結合しない。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質及び野生型ＳＭＯタンパク質の両方と結合する。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞の成長及び／または増殖の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸２４１でトレオニン以外のアミノ酸を含む、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸２４１でメチオニン（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、アミノ酸２４１をコードする配列を、異なるアミノ酸をコードするように変化させる突然変異を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸４６９でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸４６９でチロシン（Ｙ）を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、アミノ酸４６９をコードする配列を、異なるアミノ酸をコードするように変化させる突然変異を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示の核酸のいずれかを含むベクターを提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のベクターのいずれかを含み、かつそれを発現することができる宿主細胞を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に開示のベクターのいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）試験薬剤が細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、試験薬剤が対照と比べて細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する試験薬剤の能力は、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に開示のベクターのいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）試験薬剤が細胞の成長及び／または増殖を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、試験薬剤が対照と比べて細胞の成長及び／または増殖を阻害する場合には、試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の突然変異体ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、該試料から、突然変異を含むことが疑われるＳＭＯの第１の細胞外ループのカルボキシ末端またはその断片に対応する核酸を増幅することと、増幅された核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＳＭＯ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で決定される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の突然変異体ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、該試料から、突然変異を含むことが疑われるＳＭＯの膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端またはその断片に対応する核酸を増幅することと、増幅された核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＳＭＯ遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で決定される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の少なくとも１つのＳＭＯ突然変異を同定する方法であって、該試料由来の核酸を、アミノ酸２４１をコードする配列をトレオニン以外のアミノ酸に変化させる突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることと、該ハイブリダイゼーションを検出することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、プローブは、アンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸該試料中のＳＭＯ遺伝子またはその断片を増幅し、該プローブと接触させる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の少なくとも１つのＳＭＯ突然変異を同定する方法であって、該試料由来の核酸を、アミノ酸４６９をコードする配列をシステイン以外のアミノ酸に変化させる突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させることと、該ハイブリダイゼーションを検出することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、プローブは、アンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸該試料中のＳＭＯ遺伝子またはその断片を増幅し、該プローブと接触させる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であるヒト対象において腫瘍を同定する方法であって、該腫瘍の試料中の突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在を決定することを含み、該突然変異ＳＭＯ遺伝子が、アミノ酸２４１で突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質が、アミノ酸２４１で突然変異を含み、該突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在により、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に対して耐性であることが示される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に対して感受性がないか、もはや感受性がない腫瘍を有する該対象を、該突然変異ＳＭＯに結合する化合物で治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該突然変異の存在または不在を核酸試料の検査によって決定する。いくつかの実施形態では、該突然変異の存在または不在をタンパク質試料の検査によって決定する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であるヒト対象において腫瘍を同定する方法であって、該腫瘍の試料中の突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在を決定することを含み、該突然変異ＳＭＯ遺伝子が、アミノ酸４６９で突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質が、アミノ酸４６９で突然変異を含み、該突然変異ＳＭＯ遺伝子または突然変異ＳＭＯタンパク質の存在により、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に対して耐性であることが示される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に対して感受性がないか、もはや感受性がない腫瘍を有する該対象を、該突然変異ＳＭＯに結合する化合物で治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該突然変異の存在または不在を核酸試料の検査によって決定する。いくつかの実施形態では、該突然変異の存在または不在をタンパク質試料の検査によって決定する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、異常なヘッジホッグシグナル伝達を有する細胞の増殖または成長を阻害する方法であって、該細胞にブロモドメイン阻害剤を投与することを含み、該細胞が、配列番号１のアミノ酸位置２４１または４６９に対応するアミノ酸位置のうちのいずれか１つ以上で突然変異を有するスムースンドタンパク質を発現する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は対象中にある。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＳＵＦＵ突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞であり、該細胞は、ＳＵＦＵ遺伝子のコピーの喪失をもたらす１０ｑ欠失突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１０ｑ欠失は、ＰＴＥＮ遺伝子のコピーの喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＪＱ１、またはＪＱ２である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸２４１をコードする配列中に突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、突然変異ＳＭＯまたは該その断片をコードする該核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜約５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な標識をさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸４６９をコードする配列中に突然変異を組み込んでいる突然変異ＳＭＯタンパク質またはその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、突然変異ＳＭＯまたは該その断片をコードする該核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜約５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な標識をさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかに特異的に結合する抗体であって、該抗体がアミノ酸２４１でトレオニンを有する野生型ＳＭＯに結合しない、抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはこれらの抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、本抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、本抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、抗体は、ＳＭＯ活性を阻害する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかに特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープがアミノ酸４６９でシステインを有する野生型ＳＭＯに結合しない、抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはこれらの抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、本抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、本抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、抗体は、ＳＭＯ活性を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ−１Ｉ】野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト突然変異体ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ａは配列番号１を示す。図１Ｂは配列番号２を示す。図１Ｃは配列番号３を示す。図１Ｄは配列番号４を示す。図１Ｅは配列番号５を示す。図１Ｆは配列番号６を示す。図１Ｇは配列番号７を示す。図１Ｈは配列番号８を示す。図１Ｉは配列番号９を示す。
【図２】ビスモデギブ耐性ＢＣＣにおけるヘッジホッグ経路シグナル伝達レベルを決定するために行った実験の結果を示す。
【図３】治療前及び治療後の生検におけるＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異の頻度を決定するために行った実験の結果を示す。
【図４】Ｗ２８１突然変異を有するＳＭＯ突然変異体のビスモデギブ結合ポケットを示す。
【図５Ａ】ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異体がＰＴＣＨに対して感受性があるかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図５Ｂ】ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異体がビスモデギブに対して感受性があるかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図５Ｃ】ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ、及びＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌ突然変異体が活性化突然変異であるかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図５Ｄ】ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ突然変異体がＰＴＣＨに対して感受性があるかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図５Ｅ】ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ突然変異体がビスモデギブに対して感受性があるかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図５Ｆ】ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ及びＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃがビスモデギブとの結合障害を有するかどうかを決定するために行った実験の結果を示す。
【図６Ａ】Ｈｈ経路の概略図を示す。
【図６Ｂ】肺に転移した患者１２（ＰＴ１２）由来の孤発性ＢＣＣの初期奏功及び疾患進行を示すスキャン写真を示す。赤色の矢印は、治療前（ＰｒｅＲｘ）、ならびにビスモデギブ治療の４カ月後（病変サイズの減少を示す）及び３７カ月後（疾患増悪を強調する）の胸部のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンにおける標的病変を示す。
【図６Ｃ】最初はビスモデギブに応答したが、その後、示す長さの治療の後で再発（黒色の矢印）したゴーリン症候群患者（ＰＴ１０）由来の２つの局所進行性ＢＣＣの写真を示す。
【図６Ｄ】ビスモデギブ治療前及び１１カ月後の患者９．１（ＰＴ０９．１）由来の局所進行性孤発性ＢＣＣのヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した部分を示す。再発した病変が非治療腫瘍の組織構造を維持したことに留意されたい。スケールバーは５０μｍを表す。
【図６Ｅ】ビスモデギブ耐性及び正常皮膚生検におけるＧＬＩ１及びＭＫＩ６７発現レベルを示すグラフである。ピアソンの積率相関係数（Ｒ）＝０．９６。正規化した読み出し計数を示す。
【図６Ｆ】１２人の再発性ＢＣＣ患者において同定されたＨｈ経路遺伝子及びＴＰ５３における遺伝的変化の表形式の概要である。生殖系列ＰＴＣＨ１変異体をゴーリンＢＣＣについて報告し、一方で孤発性ＢＣＣについては体細胞突然変異のみを示す。２つの領域が明白に異なる生検を、ＰＴ０６、ＰＴ０８、及びＰＴ０９について同じ初発腫瘍の再成長時に得た。２つの別々のＢＣＣが患者ＰＴ１０において耐性を発現した。ＬＯＨをＳＮＰアレイからのマイナー対立遺伝子頻度によって決定した。緑色のボックスは、後に突然変異体対立遺伝子のコピー数の増大が伴うＬＯＨ事象を強調する。対立遺伝子特異的発現をＲＮＡｓｅｑによって決定した。
【図７】未治療の孤発性ＢＣＣにおいて同定されたＳＭＯ変異体を示す表である。ＳＭＯ−Ａ２３９Ｖはこれまでに報告されていない（ＣＯＳＭＩＣ／ｄｂＳＮＰ）が、他の全ては報告済の発癌性突然変異である。注記：標的化変異体コーリングはＳＭＯ−Ａ２３９Ｖを同定したが、異なる読み値カットオフ及び低い感受性に起因して、体細胞変異体コーラーＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓは同定しなかった。
【図８Ａ】本研究で同定したＳＭＯ突然変異の表形式の概要を示す。全ての突然変異は、それらが同じ患者由来の血液中でも他の組織中でも検出されなかったため、体細胞性であった。
【図８Ｂ】ＳＭＯ  ＴＭ領域の結晶構造（灰色の螺旋；Ｗａｎｇら、２０１３）にドッキングしたビスモデギブ（黄色）の計算モデルを示す。これまでに特性評価されていない突然変異体残基を緑色で強調する。
【図８Ｃ−Ｆ】生検前及び生検後のＳＭＯ突然変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、パイロシーケンス法によって決定して、ＰＴ０３、ＰＴ０４、及びＰＴ１２（８Ｃ）についてはＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、ＰＴ０９（８Ｄ）についてはＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍ、ＰＴ１０（８Ｅ）についてはＳＭＯ−Ｃ４６９Ｙ及びＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍ、ならびにＰＴ１１（８Ｆ）についてはＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆに対応する位置での野生型（青色）ヌクレオチドまたは突然変異体（赤色）ヌクレオチドいずれかの組み込み頻度を示す。ＳＭＯ突然変異はヘテロ接合性であることが予期され、ＳＭＯコピー数は最大Ｙ軸値を決定することに留意されたい（ＰＴ０３、ＰＴ０４、ＰＴ１２、ＰＴ１０、及びＰＴ１１については５０％（ＳＭＯコピー数は２）、ＰＴ０９については２５％（ＳＭＯコピー数は４））。突然変異体ヌクレオチドの組み込みは、全ての前処理試料においてパイロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル（５％未満）以内であると見なされた。４連アッセイからのデータを血液対照と比較してプロットする。エラーバーはデータの範囲を表す。
【図８Ｇ】最初はビスモデギブに応答したが、その後、示す期間の後で再発したＰＴ１１由来の局所進行性ＢＣＣ（白色の矢印）の写真を示す。
【図９】ＳＭＯのタンパク質ドメイン内の未治療のＢＣＣ（薄灰色−Ｓ２７８Ｉ）、耐性ＢＣＣ（黒色）、またはその両方（薄灰色−Ｌ４１２Ｆ、Ｗ５３５Ｌ）において同定した突然変異の場所を示す概略図である。アスタリスクは、これまでに報告されている発癌性突然変異を強調する。ＴＭ螺旋を青色の円柱で表す。
【図１０Ａ】ＳＭＯ（灰色）と結合しているビスモデギブ（黄色）のトップダウン図を示し、薬物結合ポケットに対するＷ２８１、Ｖ３２１、Ｉ４０８、及びＣ４６９（全て緑色）の近接性を明らかにしている計算ドッキングモデルを示す。
【図１０Ｂ】左は、ビスモデギブ（黄色）に対するＶ３２１及びＷ２８１（ともに緑色）の位置を示す。中央は、ＰＴ０２由来のＣ２８１突然変異体がビスモデギブとの相互作用を分断する可能性が高いことを示す。右は、ＰＴ０９由来のＭ３２１突然変異体がＷ２８１の立体構造に影響すると予測されることを示す。
【図１０Ｃ】Ｉ４０８（左）のバリン（右）への突然変異がＨ４７０及びＶ４０４（その両方ともビスモデギブと相互作用する）のパッキングに影響すると予測されることを示す。この突然変異は、全体的なタンパク質骨格構造におけるさらに大きな変化を引き起こし、したがって、セカンドシェル効果を介した薬物結合に影響し得る。全てのパネルにおいて、突然変異残基は赤色の文字で強調する。
【図１１Ａ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値をＳＭＯ−ＷＴ活性に対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１１Ｂ】示す割合のＰＴＣＨ１対ＳＭＯ発現コンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーターアッセイからの結果を示すグラフである。値をＰＴＣＨ１コトランスフェクトなしの活性に対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１１Ｃ】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＳＭＯ薬物結合ポケット突然変異体の細胞表面発現を示す表である。示す値は、１０，０００の細胞事象についてのＦＡＣＳならびに空ベクターでトランスフェクトした細胞及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に対するゲーティングによって決定した、ＳＭＯの細胞表面発現を有する生細胞のパーセンテージである。
【図１１Ｄ】非形質導入（ウイルスなし）、対照ウイルス（ｔＲＦＰのみ）、またはＣｒｅウイルス（ｔＲＦＰ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰｃｒｅ）のいずれかに感染させた患者の、ＳＨＨとともにまたはＳＨＨなしで培養した小脳顆粒ニューロン前駆細胞のメチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みからの結果を示すグラフである。メチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを１分当たりの計数（ＣＰＭ）で表し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１１Ｅ】１０，０００の細胞事象についてのＦＡＣＳ及び非形質導入細胞に対するゲーティングによって決定した、示すウイルスコンストラクトによる感染後のｔｄＴｏｍａｔｏ発現について陽性であるＰｔｃｈ１ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｔｐ５３ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＰＰＴ）小脳顆粒ニューロン前駆細胞（ＣＧＮＰ）のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図１１Ｆ】定量的ＲＴ−ＰＣＲによるパネルＥからのＰＰＴ  ＣＧＮＰにおけるヒトＳＭＯ  ｍＲＮＡレベルの定量化を示す棒グラフである。データは、マウスハウスキーピング遺伝子Ｒｐｌ１９に対する２−ΔＣｔ値であり、３連実験の平均＋／−ＳＤとしてプロットする。
【図１２Ａ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における、ビスモデギブによる用量応答後の正規化したＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値を非治療活性に対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−標準偏差（ＳＤ）である。ＩＣ５０値を、非線形回帰適合化の後に計算した。
【図１２Ｂ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞との［３Ｈ］−ビスモデギブの結合を示す棒グラフである。ＥＶは空ベクターを意味し、薬物結合は１分当たりの計数（ｃｐｍ）で測定した。特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することによって過剰の非標識ビスモデギブとの競合の後に計算した。示すデータは平均＋／−ＳＤである。
【図１２Ｃ】一次ＣＧＮＰのウイルス形質導入スキームの図である。形質導入したＣＧＮＰのみがＳＨＨの非存在下で増殖し、ＳＭＯ変異体がビスモデギブの存在下で増殖を促進する能力を具体的に試験することを可能にする。
【図１２Ｄ】ＳＨＨリガンドの除去後のビスモデギブによる用量応答に続く示すウイルスで形質導入したＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化したメチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを示す一連のグラフである。各グラフは、同じ対照データを示す。プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１３Ａ】合計２１残基（濃灰色の球）が、ＳＭＯ  ＴＭ構造（灰色の螺旋）に結合したビスモデギブ（薄灰色の球）の４．５Å以内の原子を有することが予測されることを示すモデルである。
【図１３Ｂ】Ｎ２１９、Ｄ３８４、及びＳ３８７が水素結合ネットワーク（破線）を形成することを示すモデルである。これらの残基のうちのいずれかの突然変異は、ビスモデギブ結合ポケットの形状を変化させる可能性が高い。
【図１３Ｃ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトし、１μＭのビスモデギブで処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示す。値を各コンストラクトについて非処理活性レベルに対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１４Ａ】ＳＭＯ  ＴＭ領域の結晶構造（灰色の螺旋；Ｗａｎｇら、２０１３）にドッキングしたビスモデギブ（薄灰色の球）の計算モデルを示す。薬物結合ポケットに対して遠位の突然変異残基を暗灰色で強調する。
【図１４Ｂ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性からの結果を示す棒グラフである。値をＳＭＯ−ＷＴの活性レベルに正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１４Ｃ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における、ビスモデギブによる用量応答後の正規化したＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１４Ｄ】ＳＨＨリガンドの除去後のビスモデギブによる用量応答に続く示すウイルスで形質導入したＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化したメチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを示すグラフである。プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１５Ａ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における、ビスモデギブによる用量応答後の正規化したＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１５Ｂ】示す割合のＰＴＣＨ１対ＳＭＯ発現コンストラクトでトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーターアッセイからの結果を示すグラフである。値をＰＴＣＨ１コトランスフェクトなしの活性に対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。
【図１５Ｃ】示すＳＭＯコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞との［３Ｈ］−ビスモデギブの結合を例示する棒グラフである。トランスフェクトしていない細胞（Ｕｎ）及び空ベクター（ＥＶ）でトランスフェクトした細胞を対照として含めた。薬物結合を１分当たりの計数（ｃｐｍ）で測定し、特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することによって過剰の非標識ビスモデギブとの競合の後に計算した。
【図１５Ｄ】ＨＥＫ−２９３細胞における活性化ＳＭＯ突然変異体の細胞表面発現を示す表である。示す値は、１０，０００の細胞事象についてのＦＡＣＳならびに空ベクターでトランスフェクトした細胞及びＰＩに対するゲーティングによって決定した、ＳＭＯの細胞表面発現を有する生細胞のパーセンテージである。
【図１５Ｅ】ＳＨＨリガンドの除去後のビスモデギブによる用量応答に続く示すウイルスで形質導入したＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化したメチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを示すグラフである。プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。２つの独立した実験を示す。
【図１６Ａ】様々なＳＭＯ変異体で形質導入し、５００ｎＭの示す化合物で処理したＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化したメチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを示す。検査した野生型（ＷＴ）またはＳＭＯ突然変異体に対するデータの各セットについて、以下の処理条件の各々に対するデータを、左から右へ、以下の順序で棒により表す：ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５、及び化合物５。値を薬物なしの増殖レベルに対して正規化し、プロットしたデータは３連実験の平均＋／−ＳＤである。薬物の存在下でのＳＭＯ−ＷＴの残存増殖は、これらの一次ＣＧＮＰ培養の線維芽細胞及びグリア汚染に起因することに留意されたい。
【図１６Ｂ】１６Ａと同じデータを示すが、形質導入したＣＧＮＰを１μＭビスモデギブまたはＪＱ１のいずれかで処理した。残存増殖はＪＱ１によるＳＭＯ−ＷＴにおいてより少なく、このことは、この化合物がＨｈ依存性細胞増殖も阻害することを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示の１つの発見は、ヘッジホッグ依存性腫瘍の化学療法に対する耐性と関連する突然変異事象がスムースンド（ＳＭＯ）で生じ、この事象が、シクロパミン及びＧＤＣ−０４４９などのヘッジホッグシグナル伝達を阻害する化合物による治療に対する腫瘍の耐性を付与することである。本開示は、ヘッジホッグシグナル伝達に依存的な癌の予後判定剤、診断剤、及び治療剤として有用な組成物及び方法を提供する。
【００３９】
本明細書で記載または参照する技法及び手順は、一般に十分に理解され、従来の方法を用いて当業者によって一般的に利用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載されている、広く利用されている方法などがある。引用文献は、その全体が参照により組み込まれている。
【００４０】
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に示される任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれている任意の文書と矛盾する場合は、以下に示される定義が優先するものとする。
【００４１】
本開示をさらなる詳述に進む前に、本開示は特定の組成物または処理ステップに限定されないため、異なり得ることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な使用法を当業者に提供する。
【００４３】
アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号のいずれかによって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に受け入れられている一文字コードによって参照され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「及び／または」は、２つの指定の特徴または構成要素の一方の、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として理解されるべきであることを指摘しておくことが有用である。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの具体的な開示として、各々が本明細書において個々に示されるのとまさに同じように、理解されるべきである。
【００４５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、少なくとも、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質、変異体、またはその断片のいずれかを包含する。
【００４６】
本明細書中の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物活性を示す限りは抗体断片を網羅する。
【００４７】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定され、かつ分離及び／または回収されたものである。その天然の環境の夾雑物成分は、抗体の研究、診断的または治療的な使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、ローリー方法によって決定したとき、抗体の９５重量％超まで、いくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（２）例えば、スピニングカップシーケネーターの使用によって、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）例えば、クマシーブルーもしくは銀染色を用いる、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００４８】
「ネイティブ抗体」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各々の軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖と連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各々の重鎖及び軽鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々の重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く、ある数の定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）、そのもう一方の末端に定常ドメインを有しており、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。
【００４９】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称してもよい。これらのドメインは、通常、抗体の最も変化しやすい部分であり、抗原結合部位を含む。
【００５０】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なることを指し、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合及び特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたって均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、３つのＨＶＲによって接続された、主にベータ−シート立体配置を取る４つのＦＲ領域を含み、これは、ベータ−シート構造を接続し、場合によっては、その一部を形成するループを形成する。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域によって極めて近接して結び付けられ、他方の鎖のＨＶＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示す。
【００５１】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明白に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００５２】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。主要な免疫グロブリンクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分けることができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知であり、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に概して記載されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的な会合によって形成された、より大きな融合分子の一部であってもよい。
【００５３】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「完全抗体」という用語は、以下に定義する抗体断片ではなく、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すよう、本明細書では互換的に使用される。本用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５４】
本明細書の目的のための「裸の抗体」は、細胞傷害性部分または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体である。
【００５５】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を含み、いくつかの実施形態では、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディー；直鎖抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
【００５６】
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及びその名前が容易に結晶化するその能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００５７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖のＦｖ種は、非共有結合的に密に会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が、二本鎖のＦｖ種のものと類似した「二量体」構造で会合できるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合させることができる。各々の可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合の特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲしか含まない半分のＦｖ）さえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
【００５８】
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、当初は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も既知である。
【００５９】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００６０】
「ダイアボディー」という用語は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に含む、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作り出すことを強いられる。ダイアボディーは、二価または二重特異性であることができる。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）に、より完全に記載されている。トリアボディー及びテトラボディーも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００６１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る潜在的な突然変異、例えば、天然に存在する突然変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の特徴が個別の抗体の混合物ではないことを示す。特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体には、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から標的に結合する単一のポリペプチド配列を選択することが含まれるプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの、独特のクローンの選択であることができる。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物中でのその産生を改善するため、そのインビボでの免疫原性を低下させるため、多特異性抗体を創出するためなどの目的でさらに変化させることができ、また、変化した標的結合配列を含む抗体も本開示のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。通常、異なる決定基（エピトープ）を対象とした異なる抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象としている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが、通常、他の免疫グロブリンに汚染されていないという点で有利である。
【００６２】
「モノクローナル」という修飾語は、抗体の特徴が実質的に均一な抗体の集団から得られたものであることを示し、該修飾語は、抗体を特定の方法によって産生することを要するものと解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法ＤＮＡ（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：  ６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：  ５８１−５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全てを有する動物中でヒトまたはヒト様抗体を産生させる技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、及び第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：  ８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：  ８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）．１３：６５−９３（１９９５）を参照）。
【００６３】
本明細書中のモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体の断片が具体的に含まれる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照）。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば、マカクザルを関心の抗原で免疫化することによって産生された抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。
【００６４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種のＨＶＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させるために行なうことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、このドメイン内では、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００６５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、かつ／または本明細書に開示されたヒト抗体を作製する技術のうちのいずれかを用いて作製されたものを指す。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で既知の様々な技術を用いて産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載されている方法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原刺激に応答してそのような抗体を産生するように変化させられているが、その内在性の遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化されたｘｅｎｏｍｏｕｓｅに抗原を投与することによって調製することができる（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００６６】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ネイティブ抗体では、Ｈ３及びＬ３が６つのＨＶＲのうちで最大の多様性を示し、特にＨ３は、抗体に細かい特異性を付与することにおいて独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる、天然に存在するラクダ科抗体は、軽鎖の非存在下で機能的であり、かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００６７】
ある数のＨＶＲの描写が用いられており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造ループの場所に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの折衷物を表しており、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。これらのＨＶＲの各々に由来する残基を以下に記載する。
【００６８】
ループＣ接触
−−−−  −  −−−−−−−
Ｌ１  ＬＬＬ  Ｌ３０−Ｌ３６
Ｌ２  ＬＬＬ  Ｌ４６−Ｌ５５
Ｌ３  ＬＬＬ  Ｌ８９−Ｌ９６
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ  Ｈ  Ｈ３０（Ｋａｂａｔ付番）
Ｈ１  ＨＨＨ  Ｈ３０（Ｃｈｏｔｈｉａ付番）
Ｈ２  ＨＨＨ  Ｈ４７−Ｈ５８
Ｈ３  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９  Ｈ９３−Ｈ１０１
ＨＶＲは、以下のような「伸長したＨＶＲ」を含んでもよい：ＶＬ中の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、前出のＫａｂａｔらに従って付番されている。
【００６９】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義したようなＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７０】
「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基の付番」または「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置の付番」という用語、及びその変化形は、前出のＫａｂａｔらにおける抗体の編成の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに用いられる付番システムを指す。この付番システムを用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、または可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろの単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後ろの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、相同性領域での抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列との整列によって、所定の抗体について決定することができる。
【００７１】
Ｋａｂａｔ付番システムは、通常、可変ドメイン中の残基（軽鎖の残基１〜１０７付近及び重鎖の残基１〜１１３付近）に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ付番システム」または「ＥＵ指標」は、通常、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基に言及するときに使用される（例えば、前出のＫａｂａｔらに報告されているＥＵ指標）。「ＫａｂａｔのＥＵ指標」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基の付番を指す。本明細書で特に記述しない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔ付番システムによる残基付番を意味する。本明細書で特に記述しない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への言及は、ＥＵ付番システムによる残基付番を意味する（例えば、米国仮出願第６０／６４０，３２３号、ＥＵ付番の図を参照されたい）。
【００７２】
「親和性成熟した」抗体は、その１つ以上のＨＶＲ中に１つ以上の変化を有する抗体であり、これらの１つ以上の変化は、それらの変化（複数可）を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対するナノモル濃度またはさらにはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当技術分野で既知の特定の手順を用いて産生することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬのドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＨＶＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム突然変異生成は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
【００７３】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するかまたは低下させる抗体である。特定のブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００７４】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」は、関心のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを部分的にまたは完全に模倣する抗体である。
【００７５】
「成長阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を防止するかまたは低下させる抗体である。例えば、抗体は、Ｓｍｏまたは突然変異体を発現する癌細胞の増殖をインビトロ及び／またはインビボで防止するかまたは低下させることができる。
【００７６】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮小、小胞体の拡張、細胞の断片化、及び／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成などの標準的なアポトーシスアッセイによって決定される、プログラム細胞死を誘導する抗体である。
【００７７】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化が含まれる。
【００７８】
本明細書中の「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端までのストレッチと定められている。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ付番システムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製時に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去することができる。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、ならびにＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。
【００７９】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、例えば、本明細書中の定義に開示されている様々なアッセイを用いて評価することができる。
【００８０】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトＦｃ領域には、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、及びネイティブ配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびに天然に存在するこれらの変異体が含まれる。
【００８１】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾、いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸の置換によってネイティブ配列Ｆｃ領域のものと異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域中の約１〜約１０個のアミノ酸置換、いくつかの実施形態では、約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、いくつかの実施形態では、ネイティブ配列Ｆｃ領域との及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域との少なくとも約８０％の相同性、またいくつかの実施形態では、それとの少なくとも約９０％の相同性、またいくつかの実施形態では、それとの少なくとも約９５％の相同性を保有する。
【００８２】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載している。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ネイティブなヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するものであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、それらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的にスプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲｓは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）で総説されている。他のＦｃＲは、将来同定されることになるものを含め、本明細書中の「ＦｃＲ」という用語によって包含される。
【００８３】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語には、母親ＩｇＧの胎児への移動（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、ならびに免疫グロブリンの恒常性の調節に関与する、新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎの結合を測定する方法は周知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８（１２）：５９２−５９８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７−６４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６（２００４）、ＷＯ  ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。
【００８４】
インビボでのヒトＦｃＲｎとの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株で、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲとの結合が改善されたかまたは減少した抗体変異体を記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照されたい。
【００８５】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。特定の実施形態では、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能（複数可）を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は、ネイティブな供給源から、例えば、血液から単離することができる。
【００８６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ）表面に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒素で標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害性の一形態を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）に要約されている。関心の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号もしくは第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルで評価することができる。
【００８７】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）と、その同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体との結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施することができる。変化したＦｃ領域アミノ酸配列を有するポリペプチド変異体（変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド）及び増大または減少したＣ１ｑ結合能力は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１  Ｂ１号及びＷＯ１９９９／５１６４２に記載されている。例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【００８８】
「Ｆｃ領域を含む抗体（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ−ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ付番システムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製時に、または抗体をコードする核酸の組換え操作によって除去することができる。したがって、本開示によるＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、全てのＫ４４７が除去された抗体、またはＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合物を含むことができる。
【００８９】
「結合親和性」は、通常、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。特に示さない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当技術分野で周知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体が、通常、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向にあるのに対し、高親和性抗体は、通常、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向にある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で周知であり、そのうちのいずれかを本開示の目的に使用することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的かつ例示的な実施形態を以下に記載する。
【００９０】
一実施形態では、本開示による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイによって記載されているように、関心の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の漸増量の未標識抗原の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、その後、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体がコーティングされたプレートで捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２〜５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を関心のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致）。その後、関心のＦａｂを一晩インキュベートする。しかしながら、平衡に達するのを保証するために、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温でインキュベートする（例えば、１時間）。その後、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）で８回洗浄する。プレートを乾燥させた後、１５０μｌ／ウェルのシンチレーション剤（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各々のＦａｂの濃度を、競合的結合アッセイでの使用のために選択する。
【００９１】
別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）の固定された抗原ＣＭ５チップとともに使用する表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化したデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）にまで希釈した後、５μｌ／分の流速で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成する。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。反応速度の測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃、約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュアー結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合及び解離のセンサーグラムを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。ｏｎ速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、ｏｎ速度は、ストップフローを備えたスペクトロフォメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるような、漸増濃度の抗原の存在下における、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍの帯域通過）を使用することによって決定することができる。
【００９２】
本発明による「ｏｎ速度」、「会合の速度」、「会合速度」、または「ｋｏｎ」は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して上記のように決定することもできる。
【００９３】
本明細書で使用される「実質的に類似する」または「実質的に同じ」という用語は、当業者によって、２つの値間の差異が、該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴との関連において、生物学的及び／または統計的にほとんどまたは全く有意ではないものとみなされるような、２つの数値（例えば、一方は、本開示の抗体に関連するものであり、もう一方は、参照／比較抗体に関連するものである）間の十分に高い度合の類似度を示す。該２つの値間の差異は、例えば、参照／比較値の関数として約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／または約１０％未満である。
【００９４】
本明細書で使用される「実質的に低下した」または「実質的に異なる」という語句は、当業者によって、２つの値間の差異が、該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴との関連において、統計的に有意であるものとみなされるような、２つの数値（通常、一方は、分子に関連するものであり、もう一方は、参照／比較分子に関連するものである）間の十分に高い度合の差異を示す。該２つの値間の差異は、例えば、参照／比較分子の値の関数として、約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、約４０％より大きい、及び／または約５０％より大きい。
【００９５】
「精製された」は、分子が、それが含まれる試料の少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００９６】
「単離された」核酸分子は、それが通常、例えば、その天然の環境中で関連している少なくとも１つの他の核酸分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子には、通常は核酸分子を発現する細胞内に含まれているが、染色体外か、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体の位置に存在する核酸分子がさらに含まれる。
【００９７】
「単離された」タンパク質は、それが通常、例えば、その天然の環境中で関連している少なくとも１つの他の細胞成分から分離されているタンパク質である。いくつかの実施形態では、「単離された」タンパク質は、そのタンパク質が通常は発現されない細胞における発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離されたタンパク質は組換えタンパク質である。
【００９８】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションし得る環状二本鎖ＤＮＡを指す。別の種類のベクターはファージベクターである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されたときに宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、または単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用されてもよい。
【００９９】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子またはその断片である。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによるか、または合成反応によってポリマーに取り込ませることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に与えてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾（複数可）を含み得る。他の修飾の種類には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数を類似体に置換すること、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を有するもの及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなどのヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ（ｐｌｙ）−Ｌ−リジンなど）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が含まれる。さらに、糖の中に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換えるか、標準的な保護基によって保護するか、もしくはさらなるヌクレオチドとのさらなる連結を調製するために活性化することができるか、または固体もしくは半固体の支持体にコンジュゲートさせてもよい。５’及び３’末端のＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを標準的な保護基へと誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。１つ以上のリン酸ジエステル結合を代替の連結基によって置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されないが、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２���「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを任意に含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及された全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１００】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、短い、通常は一本鎖の、通常は合成されたポリヌクレオチドを指し、これは、通常、長さが約２００ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうである必要はない。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は相互排他的ではない。ポリヌクレオチドの上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも同等かつ完全に適用可能である。
【０１０１】
本明細書で使用される「Ｓｍｏ」または「ＳＭＯ」または「スムースンド」という用語は、特に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意のネイティブなスムースンドタンパク質または核酸を指す。この用語は、「完全長」の処理されていないＳＭＯ、及び細胞内での処理から生じる任意の形態のＳＭＯを包含する。この用語は、ＳＭＯの天然に存在する変異体、例えば、スプライシング変異体または対立遺伝子変異体も包含する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「突然変異体ＳＭＯ」または「突然変異体ＳＭＯポリペプチド」または「突然変異体ＳＭＯタンパク質」は、ヒトＳＭＯの位置２４１でＳＭＯの第１の膜貫通における突然変異を有するＳＭＯ、ヒトＳＭＯの位置２８１でＳＭＯの第２の膜貫通において突然変異を有するＳＭＯ、ヒトＳＭＯの位置４０８でＳＭＯの第５の膜貫通ドメインにおける突然変異を有するＳＭＯ、ヒトＳＭＯの位置４５９または４６９でＳＭＯの膜貫通ドメイン６における突然変異を有するＳＭＯ、及び／またはヒトＳＭＯの位置５３３または５３５でＳＭＯの膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端部分における突然変異を有するＳＭＯを指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「突然変異体ＳＭＯ」または「突然変異体ＳＭＯポリペプチド」または「突然変異体ＳＭＯタンパク質」は、配列番号１の位置２４１、２８１、４０８、４１２、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５位置に対応する１つ以上のアミノ酸で突然変異を含むスムースンドポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、配列番号１の位置２４１、２８１、４０８、４１２、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５に対する１つ以上のアミノ酸での突然変異は、Ｔ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌを含む。同様に、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、野生型ヒトＳＭＯの前述の位置のうちのいずれか１つ以上で変形を有するとして説明される。本開示は、本明細書に記載の突然変異体ポリペプチドまたは核酸のいずれも、配列識別子に対して記載されるか、または野生型ヒトＳＭＯに対して記載され得ることを企図している。さらに、突然変異体は、配列番号１に対して記載されるか、または他の配列識別子のうちのいずれかに対して記載され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療している」などの変化形）は、治療されている個体または細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため、または臨床病理の経過中に行なうことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行の速度の減少、病状の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、疾患もしくは障害の発症を遅延させるために、または疾患もしくは障害の進行を遅くするために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する場合、「治療すること」または「治療」または「軽減」は、治療される状態の１つ以上の症状の重症度を改善、軽減、及び／または減少させることを指す。例として、癌を治療することは、癌の１つ以上の症状の進行または発症を改善（患者の状態を改善すること）、軽減、遅延、または減速させること、その重症度を減少させることを指す。例えば、癌を治療することは、腫瘍サイズの減少、腫瘍サイズ増大速度の減少、サイズ増大の停止、転移数の減少、疼痛の減少、生存期間の増加、及び無増悪生存期間の増加のうちのいずれか１つ以上を含む。
【０１０３】
「治療すること」または「治療」または「軽減」は、治療される状態の１つ以上の症状の重症度を改善、軽減、及び／または減少させることを指す。例として、癌を治療することは、癌の１つ以上の症状の進行または発症を改善（患者の状態を改善すること）、軽減、遅延、または減速させること、その重症度を減少させることを指す。例えば、癌を治療することは、腫瘍サイズの減少、腫瘍サイズ増大速度の減少、サイズ増大の停止、転移数の減少、疼痛の減少、生存期間の増加、及び無増悪生存期間の増加のうちのいずれか１つ以上を含む。「診断すること」は、疾患または腫瘍の際立った特徴を同定または決定するプロセスを指す。癌の場合、診断プロセスは、重症度または疾患増悪に基づく病期判定または腫瘍分類として表されることもある。
【０１０４】
「診断すること」は、疾患または腫瘍の際立った特徴を同定または決定するプロセスを指す。癌の場合、診断プロセスは、重症度または疾患増悪に基づく病期判定または腫瘍分類として表されることもある。
【０１０５】
「個体」、「対象」、または「患者」は、ヒトなどの脊椎動物である。特定の実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ）、競技用動物、ペット（例えば、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類、マウス、ならびにラットが含まれる。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１０６】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性があるさらなる成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は滅菌性であることができる。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、発熱物質を含まない。
【０１０７】
「滅菌」製剤は、無菌性であるか、または全ての生きた微生物及びその胞子を含まない。「有効量」は、必要な投薬量で、かつ必要な期間、所望の治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１０８】
本開示の物質／分子の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び重量、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療的有効量は、物質／分子の任意の毒性効果または有害効果を治療上有益な効果が上回る量を包含する。「予防有効量」は、必要な投薬量で、かつ必要な期間、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。通常、予防的用量は、疾患の前または疾患の初期段階の対象において使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも少なくなるが、必ずしもそうである必要はない。
【０１０９】
本明細書で使用される「細胞毒性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは予防し、かつ／または細胞の死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２  、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤、核酸分解性酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（その断片及び／または変異体を含む）、ならびに以下に開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことが意図される。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１１０】
「毒素」は、細胞の成長または増殖に対して有害な効果を有することができる任意の物質である。
【０１１１】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミンを含む、エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射液（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（���録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作したナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなどの白金剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関係があるとされるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンならびに遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照）；ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））などのセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファルニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；及び上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの組み合せ療法の略記であるＣＨＯＰ；及びオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせた治療レジメンの略記であるＦＯＬＦＯＸなどの、上記のうちの２つ以上の組み合せが含まれる。
【０１１２】
本明細書で定義される化学療法剤には、癌の成長を促進することができるホルモンの効果を調節するか、低下させるか、遮断するか、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療剤」が含まれる。それらは、限定されないが：タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及びＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））及びＥＭ８００などの、アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン（そのような薬剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲの代謝回転を増加させ、かつ／またはＥＲレベルを抑制し得る）；フォルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド性アロマターゼ阻害剤、ならびにアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤を含む、アロマターゼ阻害剤であり、他のアロマターゼ阻害剤にはボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）−イミダゾールが含まれる；ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、ならびにトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）を含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸（ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）及びフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む、性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方調節物質（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド、及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組み合せを含む、ホルモン自体であってもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合の「成長阻害性薬剤」は、細胞（例えば、ＳＭＯを発現する細胞）の成長をインビトロまたはインビボのどちらかで阻害する化合物または組成物を指す。したがって、成長阻害性薬剤は、Ｓ期の細胞（例えば、ＳＭＯを発現する細胞）パーセンテージを有意に低下させる物であり得る。成長阻害性薬剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の時点で）遮断する薬剤が含まれる。古典的なＭ期遮断剤には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤がある。さらなる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば、１３ページに見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、どちらもイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促進し、脱重合を防止することによって微小管を安定化し、細胞内の有糸分裂の阻害をもたらす。
【０１１４】
「突然変異体ＳＭＯアンタゴニスト」は、ヒトＳＭＯの位置２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、または５３５でアミノ酸置換を有する、ＳＭＯの生物活性を阻害する化合物であり、このアミノ酸置換は、この位置の野生型アミノ酸を任意の他のアミノ酸へと変化させる。いくつかの実施形態では、ＳＭＯの生物活性は、ヘッジホッグで刺激したときにシグナルをＧｌｉ転写因子の活性化へと伝達する能力である。
【０１１５】
本明細書で使用される「ヘッジホッグ経路阻害剤」という用語は、細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる薬剤を指すことが意図される。特定の実施形態では、ヘッジホッグアンタゴニストは、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のうちのいずれかを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、配列番号１の２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、または５３５に対応する１つ以上のアミノ酸で（例えば、野生型ヒトＳＭＯにおける対応する位置に）突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、以下の突然変異のいずれかを含むスムースンドポリペプチドを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる：Ｔ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌ。
【０１１６】
Ｉ．核酸
本発明の核酸には、単離された突然変異体ＳＭＯをコードする配列が含まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、ビスモデギブに対して部分的または完全に耐性である突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ヘッジホッグシグナル伝達経路においてタンパク質をコードする遺伝子にさらなる突然変異を有する細胞においてビスモデギブに対して部分的または完全に耐性である突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、さらなる突然変異は、本明細書に記載のｐａｔｃｈｅｄ及び／またはＳＵＦＵ突然変異のうちのいずれかである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２３９に対応するアミノ酸位置でアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置２３９に対応するアミノ酸位置でアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、配列番号１の位置２３９に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置７１５、７１６、及び／または７１７に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置７１５、７１６、及び／または７１７に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２４１に対応するアミノ酸位置でトレオニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置２４１に対応するアミノ酸位置でトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、配列番号１の位置２４１に対応するアミノ酸位置でメチオニン（Ｍ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置７２１、７２２、及び／または７２３に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置７２１、７２２、及び／または７２３に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２８１に対応するアミノ酸位置でトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置２８１に対応するヌクレオチド位置でトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の位置２８１に対応するアミノ酸位置でシステイン（Ｃ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５のヌクレオチド位置８４１、８４２、及び／または８４３に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置８４１、８４２、及び／または８４３に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４０８に対応するアミノ酸位置でイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置４０８に対応するアミノ酸位置でイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の位置４０８に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１２２２、１２２３、及び／または１２２４に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置１２２２、１２２３、及び／または１２２４に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４５９に対応するアミノ酸位置でアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置４５９に対応するアミノ酸位置でアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の位置４５９に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１３７５、１３７６、及び／または１３７７に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置１３７５、１３７６、及び／または１３７７に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４６９に対応するアミノ酸位置でシステイン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置４６９に対応するアミノ酸位置でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の位置４６９に対応するアミノ酸位置でチロシン（Ｙ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１４０５、１４０６、及び／または１４０７に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置１４０５、１４０６、及び／または１４０７に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置５３３に対応するアミノ酸位置でセリン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置５３３に対応するアミノ酸位置でセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の位置５３３に対応するアミノ酸位置でアスパラギン（Ｎ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１５９７、１５９８、及び／または１５９９に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５の位置１５９７、１５９８、及び／または１５９９に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、本開示は、突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置５３５に対応するアミノ酸位置でトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が配列番号１の位置５３５に対応するアミノ酸位置でトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１のアミノ酸位置５３５に対応するヌクレオチド位置でロイシン（Ｌ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１６０３、１６０４、及び／または１６０５に対応するヌクレオチド位置で親野生型ＳＭＯからの少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５との同一性パーセントは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるが、但し、配列番号５のヌクレオチド位置１６０３、１６０４、及び／または１６０５に対応するヌクレオチド位置に少なくとも１つの突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、核酸が表４に示すアミノ酸変化のうちのいずれか１つ以上を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように、少なくとも１つの突然変異を含む、配列を含む（実施例６を参照）。
【０１１８】
本開示はまた、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである断片中の、上記の突然変異の領域にまたがるほどの核酸の断片も企図している。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、長さが２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドである。断片は、上記の突然変異の領域から完全長の突然変異体ＳＭＯをコードする核酸分子にまで及ぶ任意の長さであり得る。単離された突然変異体ＳＭＯ及びその断片は、例えば、ハイブリダイゼーションのために、本開示の予後判定アッセイ及び診断アッセイのためのプライマー及びプローブを生成するために、ならびに組換え系での発現のために（例えば、免疫原として使用するための及び本明細書に記載の本開示のアッセイで使用するための突然変異体ＳＭＯタンパク質またはその一部を生成するために）使用することができる。
【０１１９】
本開示は、本開示の方法において突然変異体ＳＭＯ核酸分子を同定するために使用し得る核酸プローブを提供する。突然変異体ＳＭＯを有することが疑われる組織またはＳＭＯの状態が未知である組織に由来する核酸試料を、突然変異体ＳＭＯに対する特異的プローブを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）に記載されているものなどの標準的な手順を用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ＳＭＯをコードする核酸を組織から増幅し、本開示の特異的プローブでプロービングして、突然変異体ＳＭＯの不在または存在を決定することができる。ＰＣＲ法は当技術分野で周知である（前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）。
【０１２０】
突然変異体ＳＭＯをコードするヌクレオチド配列（またはその相補配列）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ならびにアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの作製における使用を含む、分子生物学の分野における様々な用途を有する。突然変異体ＳＭＯをコードする核酸は、本明細書に記載の組換え技術による突然変異体ＳＭＯポリペプチドの調製にも有用であり、この場合、これらの突然変異体ＳＭＯポリペプチドは、例えば、本明細書に記載の抗突然変異体ＳＭＯ抗体の調製において用途を見出し得る。
【０１２１】
完全長の突然変異体ＳＭＯ核酸、またはその部分は、突然変異体ＳＭＯを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。
【０１２２】
任意に、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、完全長の突然変異体ＳＭＯヌクレオチド配列の少なくとも突然変異領域に由来し得る。
【０１２３】
例として、スクリーニング方法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するために、既知のＤＮＡ配列を使用して突然変異体ＳＭＯのコード領域を単離することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐもしくは３５Ｓなどの放射性ヌクレオチド、またはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識を含む、種々の標識によって標識し得る。本開示の突然変異体ＳＭＯ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識プローブを使用して、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのようなライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定することができる。ハイブリダイゼーション産物はポリアクリルアミドゲル上で分離することができる。さらに、ＳＭＯ突然変異は、実施例に記載の方法を使用して決定することができる。中等度のストリンジェンシー及び高いストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらに提供されている。
【０１２４】
そのようなライブラリースクリーニング方法で同定された配列は、ＳＭＯ及び突然変異体ＳＭＯの既知の配列と比較し、整列させることができる。第１、第２、第５、第６、もしくは第７の膜貫通ドメインでの、膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端領域での、または膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端領域での配列同一性は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。
【０１２５】
ＳＭＯをコードする核酸の他の有用な断片には、標的突然変異体ＳＭＯ  ｍＲＮＡ（センス）または突然変異体ＳＭＯ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本開示によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異領域を含む突然変異体ＳＭＯ  ＤＮＡのコード領域の断片を含む。そのような断片は、通常、少なくとも約１４個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、約１４〜３０個のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９、及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８に記載されている。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯ核酸のうちのいずれかの発現を阻害することができる核酸を提供する。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸配列との結合は、二重鎖の分解の増強、転写もしくは翻訳の早期終結を含むいくつかの手段のうちの１つによるか、または他の手段による、標的配列の転写または翻訳を遮断する二重鎖の形成をもたらす。そのような方法は本発明によって包含されている。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて突然変異体ＳＭＯタンパク質の発現を遮断することができ、これらの突然変異体ＳＭＯタンパク質は、ＧＤＣ−０４４９などの化学療法剤に対する哺乳動物内の癌の耐性において役割を果たすことができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（またはＷＯ９１／０６６２９に記載されているものなどの他の糖連結）を有し、かつそのような糖連結が、内在性ヌクレアーゼに対して耐性であるオリゴヌクレオチドをさらに含む。耐性のある糖連結を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素分解に抵抗することができる）が、標的ヌクレオチド配列に結合することができるための配列特異性を保持している。
【０１２７】
突然変異体ＳＭＯタンパク質の発現を阻害するのに有用なアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持しているもの及び骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、かつ当技術分野において時折言及されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む、メチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート、及びアミノアルキルホスホロアミデートを含む、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホネート、ならびに通常の３’−５’連結を有するボラノ−ホスホネート、これらの２’−５’連結類似体、及び１つ以上のヌクレオチド間連結が３’から３’、５’から５’、または２’から２’への連結である、逆転した極性を有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、逆転した極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間連結で単一の３’から３’への連結、すなわち、脱塩基（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆転したヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩、及び遊離酸の形態も含まれる。リン含有連結の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、及び第５，６２５，０５０号が含まれ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、核酸は、修飾ヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド骨格を含む。いくつかの実施形態では、中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。そのようなオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号、及び第５，６７７，４３９号が含まれ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結、すなわち、骨格とが両方とも、新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は保持されており、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号が含まれ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００に見出すことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上で言及した米国特許第５，４８９，６７７号に記載のホスホロチオエート骨格及び／またはヘテロ原子骨格、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然のホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される）、ならびに上で言及した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を組み込む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上で言及した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１３１】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含有することもできる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケイニル（ａｌｋｅｙｎｙｌ）、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、該アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、式中、ｎ及びｍは、１〜約１０である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２  ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。いくつかの実施形態では、修飾には、本明細書において以下の実施例に記載されている、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）が含まれる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’の炭素原子と連結されており、それにより二環式の糖部分が形成されている、ロックされた核酸（ＬＮＡ）が含まれる。連結は、いくつかの実施形態では、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメテリン（ｍｅｔｈｅｌｙｎｅ）（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中、ｎは１または２である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上、または２’−５’連結のオリゴヌクレオチド中の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行なわれてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有していてもよい。そのような修飾された糖構造の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、及び第５，７００，９２０号が含まれ、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドには、核酸塩基（多くの場合、当技術分野において単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換も含まれ得る。本明細書で使用される「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３または−ＣＨ２−Ｃ＝ＣＨ）ウラシル及びシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの、他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンも含まれ得る。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、ＴＨＥ  ＣＯＮＣＩＳＥ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐｐ．８５８−８５９に開示されているもの、ならびにＥｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＧＥＷＡＮＤＴＥ  ＣＨＥＭＩＥ，ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９１，３０：６１３によって開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものが、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるの��特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、また、この置換は、可能性のある塩基置換であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合でにはさらにそうである。修飾核酸塩基の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１；５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，６８１，９４１号、及び第５，７５０，６９２号が含まれ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートを化学的に連結させることを伴う。本開示の化合物は、第１級または第２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本開示のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、陽イオン脂質、リン脂質、陽イオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。本開示との関連における、薬力学的特性を増強する基には、オリゴマーの取り込みを改善する基、分解に対するオリゴマーの耐性を増強する基、及び／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本開示との関連における、薬物動態特性を増強する基には、オリゴマーの取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には、限定されないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４９−５４、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４）、パ��ミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの、脂質部分が含まれる。本開示のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、スルファ薬、抗糖尿病薬、抗細菌薬、または抗生物質にコンジュゲートされていてもよい。オリゴヌクレオチド−薬物コンジュゲート及びその調製は、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７；５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１；５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号；５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６８８，９４１号、及び第６，６５６，７３０号に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
所与の化合物中の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの２つ以上が、単一の化合物、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド中に組み込まれていてもよい。本開示には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本開示との関連における、「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、各々が少なくとも１つの単量体単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、通常、オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞取り込み、及び／または標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するように、オリゴヌクレオチドが修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。それゆえ、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大いに増強する。その結果、多くの場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、より短いオリゴヌクレオチドで同程度の結果を得ることができる。本開示のキメラアンチセンス化合物は、上記のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造物として形成させることができる。いくつかの実施形態では、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’末端に少なくとも１つの２’修飾糖（例えば、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）を組み込み、かつＲＮアーゼＨ活性を付与するために、少なくとも４つの連続的な２’−Ｈ糖を有する領域を取り込んでいる。そのような化合物は、当技術分野でハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。いくつかの実施形態では、ギャップマーは、３’末端及び５’末端に、少なくとも４つの連続的な２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって隔てられた２’修飾糖（例えば、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）の領域を有しており、いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート骨格連結を組み込んでいる。そのようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号、第５，２５６，７７５号、第５，３６６，８７８号、第５，４０３，７１１号、第５，４９１，１３３号、第５，５６５，３５０号、第５，６２３，０６５号、第５，６５２，３５５号、第５，６５２，３５６号、及び第５，７００，９２２号が含まれ、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
本開示に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技法によって好都合かつ慣習的に作製することができる。そのような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの販売業者によって販売されている。当技術分野で既知のそのような合成のための任意の他の手段を、それに加えてまたはその代わりに用いてもよい。同様の技法を使用してホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することが周知である。本開示の化合物は、取り込み、分布、及び／または吸収を助けるための、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤として、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合するか、これらとともに封入するか、これらとコンジュゲートするか、またはこれらと別の方法で関連させてもよい。そのような取り込み、分布、及び／または吸収を助ける製剤の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号、及び第５，５９５，７５６号が含まれ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１００４８に記載されているものなどの有機部分、及びポリ−（Ｌ−リジン）などの、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。またさらに、エリプチシンなどのインターカレート剤、及びアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することができる。
【０１３９】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４によって媒介されるＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子移入ベクターを使用することによるものを含む、任意の遺伝子移入方法によって、標的核酸配列を含む細胞内に導入し得る。一実施形態では、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを好適なレトロウイルスベクターに挿入する。標的核酸配列を含む細胞を、インビボまたはエクスビボのどちらかで、組換えレトロウイルスベクターと接触させる。好適なレトロウイルスベクターには、限定されないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶに由来するもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ、及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１を参照）が含まれる。
【０１４０】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成によって、標的ヌクレオチド配列を含む細胞内に導入してもよい。好適なリガンド結合分子には、限定されないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。いくつかの実施形態では、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、リガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力を実質的に妨害することもないし、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート型の細胞内への進入を遮断することもない。
【０１４１】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞内に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、いくつかの実施形態では、内在性リパーゼによって細胞内で解離する。
【０１４２】
アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、通常、長さが少なくとも約５ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ヌクレオチドであり、この文脈において、「約」という用語は、言及されたヌクレオチド配列の長さ±その言及された長さの１０％を意味する。
【０１４３】
突然変異体ＳＭＯをコードするヌクレオチド配列を使用して、そのＳＭＯをコードする遺伝子をマッピングするための、及び遺伝的障害を有する個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。インサイチュハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、及びライブラリーを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングなどの既知の技術を使用して、本明細書で提供されるヌクレオチド配列を染色体及び染色体の特定の領域にマッピングすることができる。
【０１４４】
潜在的な突然変異体ＳＭＯアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡコンストラクトであり、この場合、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的とされるｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンス技術を使用して、三重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、これらの方法はどちらも、ポリヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとの結合に基づいている。例えば、本明細書中の突然変異体ＳＭＯをコードする核酸を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計し（三重螺旋−Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３、Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６、Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０を参照）、それにより、突然変異体ＳＭＯの転写及び産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子から突然変異体ＳＭＯへの翻訳を遮断する（Ｏｋａｎｏ（１９９１）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０）、ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＳ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）。上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されて、突然変異体ＳＭＯの産生を阻害し得るように、細胞に送達することもできる。アンチセンスＤＮＡを使用する場合、いくつかの実施形態では、翻訳開始部位、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０の位置に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用し得る。
【０１４５】
本核酸のうちのいずれも、突然変異体ＳＭＯタンパク質の発現、及びその発現された突然変異体スムースンドタンパク質（例えば、野生型ヒトＳＭＯなどの野生型ＳＭＯに対するＴ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌ突然変異を有するスムースンドタンパク質）のための天然の標的または結合パートナーの同定における使用に好適である。また、本核酸を使用して、突然変異体スムースンド生物活性を研究し、突然変異体スムースンド及びその結合パートナーを様々な細胞及び組織から精製し、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる成分を同定し得る。
【０１４６】
ＩＩ．小分子
突然変異体ＳＭＯの可能性のあるアンタゴニストには、野生型ＳＭＯ中でＧＤＣ−０４４９によって占有される部位に結合し、それにより、突然変異体ＳＭＯの生物活性を遮断する小分子が含まれる。小分子の例には、限定されないが、小ペプチドまたはペプチド様分子、例えば、可溶性ペプチド、及び非ペプチジル合成有機または無機化合物が含まれる。
【０１４７】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的な標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレアーゼ切断によって作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、既知の技術によって同定することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１、及びＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日公開）を参照されたい。
【０１４８】
転写を阻害するために使用される三重螺旋形成中の核酸分子は、一本鎖であり、かつデオキシヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、それが、フーグスティーン塩基対形成則を介する三重螺旋形成を促進するように設計されており、このフーグスティーン塩基対形成則は、通常、二重鎖の一方の鎖上にプリンまたはピリミジンのかなり大きなストレッチを必要とする。さらなる詳細については、例えば、前出のＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号を参照されたい。
【０１４９】
これらの小分子は、本明細書において上で考察したスクリーニングアッセイのうちのいずれか１つ以上によって、及び／または当業者に周知の任意の他のスクリーニング技術によって同定することができる。
【０１５０】
ＩＩＩ．タンパク質
本開示は、単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供する。野生型ヒトＳＭＯは配列番号１に示されている。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、ビスモデギブに対して部分的または完全に耐性である。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、ヘッジホッグシグナル伝達経路においてタンパク質をコードする遺伝子にさらなる突然変異を有する細胞においてビスモデギブに対して部分的または完全に耐性である突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、さらなる突然変異は、本明細書に記載のｐａｔｃｈｅｄ及び／またはＳＵＦＵ突然変異のうちのいずれかである。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２３９に対応するアミノ酸位置でアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置２３９に置換が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置２３９に対応するアミノ酸位置でアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置２３９に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２４１に対応するアミノ酸位置でトレオニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置２４１に置換が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置２４１に対応するアミノ酸位置でトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置２４１に対応するアミノ酸位置でメチオニン（Ｍ）を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置２８１に対応するアミノ酸位置でトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置２８１に置換が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置２８１に対応するアミノ酸位置でトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置２８１に対応するアミノ酸位置でシステイン（Ｃ）を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４０８に対応するアミノ酸位置でイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置４０８に突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置４０８に対応するアミノ酸位置でイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置４０８に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４５９に対応するアミノ酸位置でアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置４５９に突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置４５９に対応するアミノ酸位置でアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置４５９に対応するアミノ酸位置でバリン（Ｖ）を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置４６９に対応するアミノ酸位置でシステイン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置４６９に突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置４６９に対応するアミノ酸位置でシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置４６９に対応するアミノ酸位置でチロシン（Ｙ）を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置５３３に対応するアミノ酸位置でセリン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置５３３に突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置５３３に対応するアミノ酸位置でセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置５３３に対応するアミノ酸位置でアスパラギン（Ｎ）を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列を含む単離された突然変異体ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の位置５３５に対応するアミノ酸位置でトリトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、アミノ酸位置５３５に突然変異が存在する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、該アミノ酸配列は、配列番号１の位置５３５に対応するアミノ酸位置でトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、配列番号１の位置５３５に対応するアミノ酸位置でロイシン（Ｌ）を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、このＳＭＯタンパク質は、表４に示すアミノ酸突然変異のうちの少なくとも１つを含む（実施例６を参照）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号６に示されており、該配列中、アミノ酸２４１は、本出願に関して、トレオニン（Ｔ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはメチオニン（Ｍ）である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号２に示されており、該配列中、アミノ酸２８１は、本出願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはシステイン（Ｃ）である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号７に示されており、該配列中、アミノ酸４０８は、本出願に関して、イソロイシン（Ｉ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号３に示されており、該配列中、アミノ酸４５９は、本出願に関して、アラニン（Ａ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号８に示されており、該配列中、アミノ酸４６９は、本出願に関して、システイン（Ｃ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはチロシン（Ｙ）である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号９に示されており、該配列中、アミノ酸５３３は、本出願に関して、セリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはアスパラギン（Ｎ）である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。いくつかの実施形態では、突然変異体ヒトＳＭＯは、配列番号４に示されており、該配列中、アミノ酸５３５は、本出願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す「Ｘａａ」として示されている。いくつかの実施形態では、Ｘａａはロイシン（Ｌ）である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質のうちのいずれかは、配列番号１〜９のいずれかの位置１に対応するＮ末端メチオニンを欠く。
【０１６８】
突然変異体ＳＭＯ及びその断片は、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯ核酸を使用して、当技術分野で周知であるように組換え系で産生させることができる。そのような核酸を、当技術分野で周知であるような発現ベクターに組み込み、タンパク質の提案される用途に応じて原核細胞または真核細胞であり得る宿主細胞内にトランスフェクトし得る。例えば、完全長突然変異体ＳＭＯまたはその断片（断片は、少なくとも、ＳＭＯの第１の膜貫通及びヒトＳＭＯの位置２１４、ＳＭＯの第２の膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置２８１、ＳＭＯの第５の膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置４０８、ＳＭＯの第６の膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置４５９もしくは４６９、ならびに／またはＳＭＯの第７の膜貫通及びヒトＳＭＯの位置５３３もしくは５３５を含む）を免疫原として使用して、本開示の抗体を産生させるか、または本開示の抗体を精製し得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質またはその断片は、野生型ＳＭＯポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）の同じ生物活性のうちの少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸２４１または４５９に対応するアミノ酸位置で突然変異を有するＳＭＯタンパク質）は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）と比較して増加した基礎生物活性レベルを有する。「生物活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）」、または「機能的」という用語は、ＳＭＯタンパク質またはその断片が野生型ＳＭＯタンパク質と関連する機能、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路の形質導入及び／またはＧｌｉ１発現の誘導のうちの少なくとも１つを実行する能力を意味する。ある特定の実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、キネシンモータータンパク質Ｃｏｓｔａｌ−２と結合する。「生物活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）」、及び「機能的」という用語は本明細書では互換的に使用される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質のうちのいずれか（例えば、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のうちのいずれか）は、ヘッジホッグシグナル伝達を伝えることができる。「能力を有する」または「することができる」という用語は、記載のタンパク質が、好適な条件（例えば、生理学的条件または標準的な研究室条件）下で記される生物活性を実行することを意味する。ある特定の実施形態では、「できる（ｃａｎ）」という用語は、この能力（例えば、所与の配列に「結合することができる」または「結合する」）を説明するために使用し得る。例えば、ＳＭＯタンパク質（例えば、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のうちのいずれか）がヘッジホッグシグナル伝達を促進する能力を有するか、またはそれを促進することができる場合に、ＳＭＯタンパク質は、正常な生理学的条件下で細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を促進することができる。当業者であれば、ポリペプチドが記載の生物活性を実行する能力を有するか、またはそれを実行することができるかどうかを試験するためにどの条件が必要であるかを理解する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＭＯ及び突然変異体ＳＭＯタンパク質は、スムースンド機能獲得型突然変異を含む。いくつかの実施形態では、機能獲得型スムースンド突然変異は、構成的に活性なスムースンドタンパク質をもたらす。ある特定の実施形態では、スムースンドにおける突然変異は、スクリーニングアッセイに関して上で示したように、配列番号１における特別な位置に対応する位置などの特定の位置のうちのいずれかで突然変異を含む。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０２８９５０及びＷＯ２０１２０４７９６８を参照されたい。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置５３５に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置５６２に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、位置５３５での、または配列番号１におけるその対応する位置でのＷ５３５Ｌである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１のＲ５６２Ｑに対応する突然変異（位置５６２での、または配列番号１の位置５６２に対応する位置でのＲ５６２Ｑ突然変異）である。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置４１２に対応する位置での突然変異、例えば、配列番号１のそのような位置でのＬ４１２Ｆである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、それをある特定のスムースンド阻害剤に対して耐性にする代替の突然変異を有する。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置５１８で、または配列番号１の位置５１８に対応する位置で、代替のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、配列番号１のアミノ酸位置５１８に対応するアミノ酸位置でのＥ５１８ＫまたはＥ５１８Ａ置換である。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置４７３で、または配列番号１の位置４７３に対応する位置で、アミノ酸変化を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＭＯタンパク質のうちのいずれか（例えば、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれか）は、別の薬剤に融合される。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、別のポリペプチドに融合される。
【０１７３】
本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質うちのいずれも、突然変異体スムースンドタンパク質（例えば、Ｔ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌ突然変異を有するスムースンドタンパク質）のための天然の標的または結合パートナーの同定における使用に好適である。また、本突然変異体ＳＭＯタンパク質を使用して、突然変異体スムースンド生物活性を研究し、突然変異体スムースンド及びその結合パートナーを様々な細胞及び組織から精製し、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる成分を同定し得る。
【０１７４】
ＩＶ．抗体
Ａ．抗突然変異体ＳＭＯ抗体
一態様では、本開示は、ＳＭＯ、特に、突然変異体ＳＭＯに結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗体のいずれも、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯポリペプチドのいずれかに特異的に結合する。例えば、突然変異体ＳＭＯポリペプチドは、本開示の抗体が特異的に結合するエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、配列番号１の位置２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５に対応するアミノ酸位置で突然変異が存在する、ＳＭＯタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質と特異的に結合しないか、または配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質と比較して突然変異体ＳＭＯタンパク質と選択的に結合する（例えば、結合は突然変異体ＳＭＯタンパク質に選択的である）。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１の位置２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５に対応するアミノ酸位置のいずれか１つで突然変異を欠くＳＭＯタンパク質と結合しない。
【０１７５】
一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２  断片である。一実施形態では、抗突然変異体ＳＭＯ抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体は精製されている。特定の実施形態では、組成物は、癌の治療のための医薬製剤である。
【０１７６】
１．抗体断片
本開示は抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によるか、または組換え技術によって生成することができる。特定の状況下では、完全抗体ではなく、抗体断片を使用することに利点がある。断片のサイズがより小さいために、迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改善がもたらされ得る。ある特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい。
【０１７７】
抗体断片を産生するために、様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解的消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生させることができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌で発現させ、大腸菌から分泌させることができ、したがって、大量のこれらの断片の容易な産生が可能となる。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増大したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生させるための他の技術は、当業者には明らかとなる。特定の実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４、及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、したがって、それらは、インビボ使用時の低下した非特異的結合に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかでエフェクタータンパク質との融合を生じるように構築することができる。前出のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような、「直鎖抗体」であってもよい。そのような直鎖抗体は単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１７８】
２．ヒト化抗体
本開示はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、その中に導入された、非ヒトである供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、これらは通常、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって、本質的に実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、その場合、インタクトなヒト可変ドメインには実質的に満たないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかの超可変領域残基、及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体中の類似部位の残基によって置換されている、ヒト抗体である。
【０１７９】
ヒト化抗体を作製する際に使用するべき軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。その後、齧歯類のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして許容する。例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１を参照されたい。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用し得る。例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３を参照されたい。
【０１８０】
通常、抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに望ましい。この目的を達成するために、１つの方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析の過程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込みある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する増大した親和性などの、所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列及び輸入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を与えることに直接かつ最も実質的に関与している。
【０１８１】
３．ヒト抗体
本開示のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を、上記のような既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本開示のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：  ３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。
【０１８２】
現在、免疫化後に、内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内在性抗体の産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列突然変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することによって、抗原刺激後にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。
【０１８３】
遺伝子シャフリングを使用して、非ヒト、例えば、齧歯類の抗体からヒト抗体を得ることができ、この場合、ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によって、本明細書に記載されるようなファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のどちらかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換え、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を創出する。抗原を用いた選択によって、非ヒト鎖／ヒト鎖のキメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離がもたらされ、この場合、ヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖を除去するときに破壊された抗原結合部位を回復する、すなわち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を支配する（刷り込む）。残りの非ヒト鎖を置き換えるためにこのプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ残基もＣＤＲ残基も有さない、完全にヒトの抗体を提供する。
【０１８４】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方はＳＭＯに対するものであり、もう一方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＳＭＯの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を用いて、ＳＭＯを発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。これらの抗体は、ＳＭＯ結合アーム、及び例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテンなどの、細胞毒性剤に結合するアームを保有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１８５】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で既知である。従来、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうちの１つしか正しい二重特異性構造を有しない。親和性クロマトグラフィーステップによって通常行なわれる正しい分子の精製はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０１８６】
異なる手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合される。融合は、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。特定の実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物にコトランスフェクトする。これは、その構築で使用される不等比の３つのポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際の大きな自由度を提供する。しかしながら、等比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比が特に重要でない場合は、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１８７】
この手法の一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及びもう一方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。免疫グロブリン軽鎖が二重特異性分子の半分にしか存在しないことで、容易な分離方法が提供されるため、この非対称性構造が、不要な免疫グロブリン鎖の組み合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが分かった。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の精製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１８８】
別の手法によれば、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化するように、１対の抗体分子間の界面を操作することができる。界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖（複数可）と同一または同等の大きさの代償的「空隙」を第２の抗体分子の界面上に創出する。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終生成物よりもヘテロ二量体の収率を増加させる機構が提供される。
【０１８９】
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体のうちの一方をアビジンと結合させ、もう一方をビオチンと結合させることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、及びＥＰ０３０８９）、提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製し得る。好適な架橋剤は当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１９０】
二重特異性抗体を抗体断片から作製する技術も文献中に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクト抗体をタンパク質分解によって切断し、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。その後、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へと変換する。その後、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つをＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。生成される二重特異性抗体は、酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。
【０１９１】
最近の進歩により、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易となり、このＦａｂ’−ＳＨ断片を化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成させることができる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’断片は、大腸菌から別々に分泌させられ、インビトロでの方向性のある化学結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することもできた。
【０１９２】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製及び単離する様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させられた。この抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、その後、再び酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載されている「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構を提供している。この断片は、同じ鎖上での２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインが、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対合することが強いられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１９３】
３つ以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１９４】
５．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内在化（及び／または異化）されることができる。本開示の抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外のものである）多価抗体（例えば、四価抗体）であることができ、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生させることができる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。特定の実施形態では、二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（または該領域からなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域、及びＦｃ領域のアミノ末端側の３つ以上の抗原結合部位を含む。特定の実施形態では、多価抗体は、３〜約８個の抗原結合部位を含む（または該抗原結合部位からなる）。１つのそのような実施形態では、多価抗体は、４つの抗原結合部位を含む（または該抗原結合部位からなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、該ポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでもよく、ここで、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域の鎖、またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域の鎖を含んでもよい。本明細書中の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含み得る。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。ここで企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意にＣＬドメインをさらに含む。
【０１９５】
６．単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、単一のポリエプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）鎖である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部からなる。
【０１９６】
７．抗体変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な変化を導入することによるか、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または該残基中への挿入、及び／または該残基の置換が含まれる。最終的なコンストラクトが所望の特徴を保有するという条件で、最終的なコンストラクトに達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合せを行なうことができる。アミノ酸の変化は、対象抗体のアミノ酸配列を作製するときに、その配列中に導入してもよい。
【０１９７】
突然変異生成のための可能性のある場所である、抗体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基または基が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼすために、中性のまたは負電荷を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置き換えられている。その後、さらなる変異体またはその他の変異体を、置換部位にまたは置換部位の代わりに導入することによって、置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸の場所を絞り込む。したがって、アミノ酸配列の変動を導入する部位は事前に決定されているが、突然変異の性質自体は事前に決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異生成を標的コドンまたは標的領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１９８】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲に及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのためのもの）または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合が含まれる。
【０１９９】
特定の実施形態では、本開示の抗体を変化させて、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させる。ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のどちらかがポリペプチド中に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンへの、糖であるＮ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用される場合もある。
【０２００】
抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、上記の（Ｎ−結合型グリコシル化部位用の）トリペプチド配列のうちの１つ以上が創出または除去されるように、アミノ酸配列を変化させることによって、好都合に達成される。この変化は、（Ｏ−結合型グリコシル化部位については）もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、欠失、または置換によって行なうこともできる。
【０２０１】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着している炭水化物を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合によって通常付着させられる、分岐状のバイアンテナ型オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体中のオリゴ糖の修飾は、ある特定の改善された特性を有する抗体変異体を創出するために行ってもよい。
【０２０２】
例えば、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。そのような変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、第ＵＳ  ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例には：ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質のフコシル化に欠損があるＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；特許出願第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、ならびにノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８のノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【０２０３】
例えば、抗体のＦｃ領域に付着したバイアンテナ型オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、バイセクト型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、低下したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２０４】
特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣをさらに改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４（Ｅｕ残基付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。そのような置換は、上記の変動のいずれかと組み合わせて生じ得る。
【０２０５】
特定の実施形態では、本開示は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を保有する抗体変異体を企図しており、このエフェクター機能のために、この抗体変異体は、抗体のインビボ半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は不必要または有害である多くの用途のための望ましい候補となる。特定の実施形態では、所望の特性だけが維持されていることを保証するために、抗体のＦｃ活性を測定する。インビトロ及び／またはインビボの細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくはＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを保証することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃ（ＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。関心の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用してもよい（例えば、フローサイトメトリーについては、ＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定を、当技術分野で既知���方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。
【０２０６】
１つ以上のアミノ酸置換を有する他の抗体変異体が提供される。置換突然変異生成のための関心の部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変化も企図される。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しで表１に示されている。「例示的な置換」と命名されたより実質的な変化は、表１に提供され、あるいはアミノ酸クラスに関連して以下にさらに記載される通りである。アミノ酸置換を関心の抗体中に導入し、産生物を、例えば、改善された抗原結合、減少した免疫原性、改善されたＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの所望の活性についてスクリーニングし得る。
【表１−１】
2018512597.tif 000002
【表１−２】
2018512597.tif 000003
【０２０７】
抗体の生物学的特性の修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはヘリックス立体構造としての置換領域中のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす置換を選択することによって達成し得る。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性によって分類し得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０２０８】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分類し得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２０９】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。また、そのような置換された残基は、保存的置換部位に、または残りの（非保存的）部位に導入してもよい。
【０２１０】
置換変異体の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。通常、さらなる開発のために選択された、得られた変異体（複数可）は、それらを作製した親抗体と比べて修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。例示的な置換変異体は、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して好都合に生成し得る、親和性成熟した抗体である。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を突然変異させて、各々の部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このようにして作製された抗体を、各々の粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質の少なくとも一部（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩの産物）との融合体として、繊維状ファージ粒子からディスプレイさせる。その後、ファージディスプレイされた変異体を、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾する候補超可変領域部位を同定するために、スキャニング突然変異生成（例えば、アラニンスキャニング）を行なって、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはさらに、抗体と抗原の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述したものを含む当技術分野で既知の技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されれば、変異体のパネルを、本明細書に記載したものを含む当技術分野で既知の技術を使用するスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する変異体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０２１１】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、限定されないが、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または以前に調製された抗体変異体もしくは非変異体型抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（もしくは部位特異的）突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、及びカセット突然変異生成による調製が含まれる。
【０２１２】
本開示の抗体のＦｃ領域中に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、それにより、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのものを含む１つ以上のアミノ酸の位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。
【０２１３】
本説明及び当技術分野の教示に従って、いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、野生型対応物の抗体と比較して、例えば、Ｆｃ領域中に１つ以上の変化を含み得ることが企図される。それでもなお、これらの抗体は、その野生型対応物と比較して、治療的有用性に必要な実質的に同じ特徴を保持する。例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されているような、変化した（すなわち、改善されたまたは減少した）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすある特定の変化を、例えば、Ｆｃ領域中で行なうことができると考えられる。Ｆｃ領域変異体の他の例に関するＤｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ）及びＷＯ２００４／０５６３１２号（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲに対する改善されたまたは減少した結合を有する抗体変異体を記載している。これらの特許公開の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれている。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照されたい。増大した半減期、ならびに母親ＩｇＧの胎児への移行に関与する（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する改善された結合を有する抗体は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ以上の置換を中に有するＦｃ領域を含む。変化したＦｃ領域アミノ酸配列及び増大または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６，１９４，５５１  Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公開の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれている。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【０２１４】
別の態様では、本開示は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含む抗体を提供し、該修飾は、ヘテロ二量体化を容易にし、かつ／またはヘテロ二量体化を促進する。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチド内への隆起及び第２のＦｃポリペプチド内への空隙の導入を含み、この場合、隆起は、第１のＦｃポリペプチドと第２のＦｃポリペプチドの複合体形成を促進するように空隙中に配置可能である。これらの修飾を有する抗体を生成する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているように、当技術分野で既知である。
【０２１５】
さらに別の態様では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システインを操作した抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を創出することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。本明細書でさらに記載されているように、それらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能な部位に配置され、かつ該反応性チオール基を使用して、抗体を薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせ得る。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）のうちのいずれか１つ以上をシステインと置換してもよい。
【０２１６】
８．抗体誘導体
本開示の抗体を、当技術分野で既知であり、かつ容易に利用可能なさらなる非タンパク質部分を含むように、さらに修飾することができる。いくつかの実施形態では、抗体の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分岐状または非分岐状であってもよい。抗体に付着したポリマーの数は様々に異なってもよく、２つ以上のポリマーが付着している場合、これらは同じまたは異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に用いられるポリマーの数及び／または種類は、限定されないが、改善されるべき抗体の具体的な特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０２１７】
別の実施形態では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱し得る非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってもよく、限定されないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近くの細胞を死滅させる温度にまで非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
【０２１８】
Ｂ．抗体を作製するある特定の方法
１．ある特定のハイブリドーマに基づく方法
本開示のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載され、ヒト−ヒトハイブリドーマに関して、例えば、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）にさらに記載されているハイブリドーマ法を使用して作製することができる。
【０２１９】
さらなる方法には、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生に関して、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０２２０】
様々な他のハイブリドーマ技術については、例えば、ＵＳ２００６／２５８８４１、ＵＳ２００６／１８３８８７（完全ヒト抗体）、ＵＳ２００６／０５９５７５、ＵＳ２００５／２８７１４９、ＵＳ２００５／１００５４６、ＵＳ２００５／０２６２２９、ならびに米国特許第７，０７８，４９２号及び第７，１５３，５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を産生する例示的なプロトコルは、以下のように記載されている。一実施形態では、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主動物を免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生させるか、または産生することができるリンパ球を誘発させる。抗体は、突然変異体ＳＭＯまたはその断片を含むポリペプチド、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジクリノミコレート（ｄｉｃｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）などのアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物内で惹起させる。突然変異体ＳＭＯまたはその断片を含むポリペプチドは、その一部が本明細書にさらに記載されている、組換え法などの、当技術分野で周知の方法を使用して調製することができる。免疫化した動物由来の血清を抗突然変異体ＳＭＯ抗体についてアッセイし、追加免疫を任意に投与する。抗突然変異体ＳＭＯ抗体を産生する動物由来のリンパ球を単離する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
【０２２１】
その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のある骨髄腫細胞を使用し得る。例示的な骨髄腫細胞には、限定されないが、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどの、マウス骨髄腫株が含まれる。ヒトモノクローナル抗体の産生用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２２２】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好適な培養培地、例えば、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む培地中に播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。いくつかの実施形態では、例えば、Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（３），１０５−１０８（２００６）に記載されているように、無血清ハイブリドーマ細胞培養法を使用して、胎仔ウシ血清などの動物由来血清の使用を減らす。
【０２２３】
ハイブリドーマ細胞培養物の生産性を改善するツールとしてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１１−１２２（２００５）に記載されている。具体的には、標準的な培養培地を特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、またはタンパク質加水分解物の画分で強化し、アポトーシスを、３〜６アミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドによって顕著に抑制することができる。ペプチドは、ミリモル濃度またはそれよりも高い濃度で存在する。
【０２２４】
ハイブリドーマ細胞を成長させている培養培地を、突然変異体ＳＭＯに結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイし得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定してもよい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析によって決定することができる。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を参照されたい。
【０２２５】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させ得る。例えば、前出のＧｏｄｉｎｇを参照されたい。この目的のための好適な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。タンパク質をハイブリドーマ細胞から単離するための１つの手順は、ＵＳ２００５／１７６１２２及び米国特許第６，９１９，４３６号に記載されている。この方法は、結合プロセスでリオトロピック塩などの最小限の塩を使用すること、いくつかの実施形態では、溶出プロセスで少量の有機溶媒も使用することを含む。
【０２２６】
２．ある特定のライブラリースクリーニング方法
本開示の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体をスクリーニングすることによって作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、そのようなライブラリーを所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が当技術分野で既知である。そのような方法は、一般に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に記載されている。例えば、関心の抗体を生成する１つの方法は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されているようなファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
【０２２７】
原理的に、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片をディスプレイするファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。そのようなファージライブラリーは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは抗原に吸着させられ、したがって、ライブラリー中の非結合クローンから分離される。その後、結合クローンを抗原から溶出させ、抗原の吸着／溶出のさらなるサイクルによってさらに濃縮することができる。本開示の抗体はいずれも、関心のファージクローンを選択するための好適な抗原スクリーニング手順を設計し、次いで、関心のファージクローン由来のＦｖ配列、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載の好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗体クローンを構築することによって得ることができる。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、どちらも３つの超可変ループ（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）から各々１つずつの、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、ＶＨ及びＶＬが短い柔軟なペプチドを介して共有結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてか、またはそれらが、各々定常ドメインに融合され、非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのどちらかで、ファージ上に機能的にディスプレイされることができ、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載の通りである。本明細書で使用されるように、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と総称される。
【０２２９】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリー中でランダムに組換えることができ、その後、これを、抗原結合クローンについて検索することができ、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載の通りである。免疫化した供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性の抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されているような免疫化を全く用いることなく、ナイーブなレパートリーをクローニングして、広範囲の非自己及び自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブなライブラリーを、再編成されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、高度に可変性のあるＣＤＲ３領域をコードするために、及びインビトロで再編成を達成するために、ランダムな配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、合成により作製することもでき、これは、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載の通りである。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、繊維状ファージを使用して、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体断片をディスプレイさせる。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）によって記載されているような、ＶＨ及びＶＬドメインが、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上で接続されている単鎖Ｆｖ断片として、または例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）によって記載されているような、一方の鎖がｐＩＩＩに融合され、もう一方が、野生型コートタンパク質の一部を置き換えることによってＦａｂ−コートタンパク質の構造のアセンブリがファージ表面上にディスプレイされるようになる細菌宿主細胞ペリプラズム中に分泌されるＦａｂ断片として、ディスプレイさせることができる。
【０２３１】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から回収された免疫細胞から得られる。抗突然変異体ＳＭＯクローンが有利となるように偏ったライブラリーが望ましい場合、対象を突然変異体ＳＭＯで免疫化して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築のために回収する。好ましい実施形態では、抗突然変異体ＳＭＯクローンが有利となるように偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、突然変異体ＳＭＯ免疫化によって、突然変異体ＳＭＯに対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを担持する（及び機能的内在性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて抗突然変異体ＳＭＯ抗体応答を生成させることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成は、以下に記載されている。
【０２３２】
抗突然変異体ＳＭＯ反応性細胞集団のさらなる濃縮は、突然変異体ＳＭＯ特異的な膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離するための好適なスクリーニング手順を使用することによって、例えば、突然変異体ＳＭＯ親和性クロマトグラフィーを使用する細胞分離、または蛍光色素で標識した突然変異体ＳＭＯへの細胞の吸着と、それに続くフロー活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって得ることができる。
【０２３３】
あるいは、免疫化していないドナー由来の脾臓細胞及び／またはＢ細胞もしくは他のＰＢＬの使用は、可能な抗体レパートリーのより良好な表示を提供し、突然変異体ＳＭＯが抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用した抗体ライブラリーの構築も可能にする。インビトロでの抗体遺伝子構築を組み込んだライブラリーについては、幹細胞を対象から回収して、再編成されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。関心の免疫細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン（ｌｕｐｒｉｎｅ）、イヌ科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ科、及びトリ種などの種々の動物種から得ることができる。
【０２３４】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を関心の細胞から回収し、増幅する。再編成されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離し、次いで、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されているように、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端に一致するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができ、それにより、発現用の多様なＶ遺伝子レパートリーが作製される。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）及びＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されているように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマー、及びＪセグメント内に基づくフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅については、バックプライマーが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されているようにリーダーエクソン中に、また、フォワードプライマーが、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されているように定常領域内に基づくこともできる。相補性を最大化するために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）またはＳａｓｔｒｙら（１９８９）に記載されているように、プライマー中に縮重を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、ライブラリーの多様性は、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各々のＶ遺伝子ファミリーを標的としたＰＣＲプライマーを用いることによって最大化し、これは、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されているように、またはＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されている通りである。増幅したＤＮＡを発現ベクター内クローニングするために、稀少な制限部位を、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）に記載されているように、一方の末端でのタグとしてＰＣＲプライマー中に、またはＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されているように、タグ付けしたプライマーを用いるさらなるＰＣＲ増幅によって導入することができる。
【０２３５】
合成によって再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから得ることができる。ヒトＶＨ遺伝子部分の大部分は、クローニング及びシーケンシングされており（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）に報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３）に報告されている）；これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要な立体構造を含む）を用いて、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されているように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。ＶＨレパートリーは、全ての配列多様性を単一の長さの長いＨ３ループに集中させて作製することもでき、これは、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されている通りである。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及びシーケンシングされており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３））に報告されている）、該セグメントを使用して、合成軽鎖レパートリーを作製することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリーは、様々なＶＨ及びＶＬのフォールド、ならびにＬ３及びＨ３の長さに基づいて、構造的にかなり多様な抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅後、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従って、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントをインビトロで再配列することができる。
【０２３６】
抗体断片のレパートリーは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーをいくつかの方法で一緒に組み合わせることによって構築することができる。各々のレパートリーを異なるベクター中で創出し、ベクターを、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されているように、インビトロで、または例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されているｌｏｘＰ系などの、コンビナトリアル感染によってインビボで、組換えることができる。インビボ組換え手法では、大腸菌の形質転換の効率によって強いられるライブラリーの大きさの制限を克服するために、Ｆａｂ断片の二本鎖の性質が利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーを、一方はファージミド中に、もう一方はファージベクター中に、別々にクローニングする。その後、各々の細胞が異なる組み合せを含み、ライブラリーの大きさが存在する細胞の数（約１０１２個のクローン）によってのみ制限されるように、２つのライブラリーをファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせる。どちらのベクターも、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコン上に組換えられ、ファージビリオン中に同時にパッケージングされるように、インビボ組換えシグナルを含む。これらの巨大なライブラリーは、良好な親和性の多数の多様な抗体を提供する（約１０−８ＭのＫｄ−１）。
【０２３７】
あるいは、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されているように、同じベクター中に連続的にクローニングするか、または例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されているように、ＰＣＲによって１つにアセンブルし、その後、クローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリを用いて、柔軟なペプチドスペーサーをコードするＤＮＡを用いてＶＨ  ＤＮＡとＶＬ  ＤＮＡを結合させ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成させることもできる。さらに別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されているように、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」を使用して、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とをリンパ球内でＰＣＲによって組み合わせ、その後、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０２３８】
ナイーブのライブラリー（天然物または合成物のいずれか）によって産生された抗体は、中等度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）であることができるが、親和性成熟は、前出のＷｉｎｔｅｒら（１９９４）に記載されているように、２次ライブラリーから構築及び再選択することによってインビトロで模倣することもできる。突然変異は、例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法またはＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法において、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）に報告されている）を使用することによって、インビトロでランダムに導入することができる。さらに、親和性成熟は、例えば、関心のＣＤＲにまたがるランダム配列を担持するプライマーを使用するＰＣＲを用いて、１つ以上のＣＤＲを、選択された個々のＦｖクローンにおいてランダムに突然変異させ、より高い親和性のクローンについてスクリーニングすることによって行なうことができる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中の突然変異生成を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出する方法を記載している。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されているように、ファージディスプレイによって選択されたＶＨまたはＶＬドメインを、免疫化していないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと組換えて、数ラウンドの鎖再シャフリングでより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術により、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生が可能となる。
【０２３９】
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で既知の様々な技術によって達成することができる。例えば、突然変異体ＳＭＯは、吸着プレートのウェルをコーティングするために使用するか、吸着プレートに付着しているもしくはセルソーティングで使用される宿主細胞上で発現させるか、またはストレプトアビジンがコーティングされたビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートさせるか、またはファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。
【０２４０】
ファージライブラリー試料を、ファージ粒子の少なくとも一部を吸着剤と結合させるのに好適な条件下で、固定された突然変異体ＳＭＯと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理的条件を模倣するように選択する。固相に結合したファージを洗浄し、次に酸で溶出させ、その後、例えばＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されているように酸によって、もしくは例えばＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されているようにアルカリによって、または例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法と同様の手順での突然変異体ＳＭＯ抗原競合によって、溶出させる。ファージは、１回の選択ラウンドで２０〜１，０００倍濃縮することができる。さらに、濃縮されたファージを細菌培養物中で成長させ、さらなる選択ラウンドに供することができる。
【０２４１】
選択の効率は、洗浄時の解離の反応速度、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が抗原と同時に触れることができるかどうかを含む、多くの因子によって決まる。速い解離反応速度（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価のファージディスプレイ、及び固相中の抗原の高いコーティング密度の使用によって保持することができる。高い密度は、多価の相互作用によってファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に働きもする。遅い解離反応速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されているような長い洗浄及び一価のファージディスプレイ、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されているような抗原の低いコーティング密度の使用によって促進することができる。
【０２４２】
突然変異体ＳＭＯに対して、異なる親和性を有するファージ抗体を、親和性がわずかしか異ならない場合であっても、選択することが可能である。しかしながら、（例えば、一部の親和性成熟技術で実施されているような）選択された抗体のランダム突然変異は、大半が抗原と結合し、わずかのものだけがより高い親和性を有する、多くの突然変異体を生じさせる可能性が高い。突然変異体ＳＭＯを制限すれば、稀少な高親和性のファージが競合して除去される可能性がある。全てのより高い親和性の突然変異体を保持するために、ファージを、過剰のビオチン化突然変異体ＳＭＯとインキュベーションすることができるが、ビオチン化突然変異体ＳＭＯは、突然変異体ＳＭＯの標的モル濃度親和性定数よりも低いモル濃度の濃度とする。その後、高親和性結合ファージを、ストレプトアビジンがコーティングされた常磁性ビーズによって捕捉することができる。そのような「平衡捕捉」により、抗体を、わずか２倍しか高くない親和性を有する突然変異体クローンをより低い親和性を有する大過剰のファージから単離することを可能にする感度で、その結合の親和性に応じて選択することが可能となる。固相に結合したファージを洗浄する際に使用される条件を操作して、解離反応速度に基づいて識別することもできる。
【０２４３】
抗突然変異体ＳＭＯクローンは、活性に基づいて選択することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、ＧＤＣ−０４４９耐性腫瘍細胞などの、突然変異体ＳＭＯを自然に発現する生細胞に結合する抗突然変異体ＳＭＯ抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、野生型ＳＭＯ中のＧＤＣ−０４４９によって結合される領域と同じ領域に結合する抗突然変異体ＳＭＯ抗体を提供する。そのような抗突然変異体ＳＭＯ抗体に対応するＦｖクローンは、（１）抗突然変異体ＳＭＯクローンを上記のようなファージライブラリーから単離し、任意に、単離されたファージクローンの集団を好適な細菌宿主中で成長させることによって、この集団を増幅すること；（２）それぞれ、それに対する遮断活性及び非遮断活性が望まれる突然変異体ＳＭＯ及び第２のタンパク質を選択すること；（３）抗突然変異体ＳＭＯファージクローンを固定された突然変異体ＳＭＯに吸着させること；（４）過剰の第２のタンパク質を用いて、第２のタンパク質の結合決定基と重複するかまたは該決定基と共有される突然変異体ＳＭＯ結合決定基を認識する全ての望ましくないクローンを溶出させること；ならびに（５）ステップ（４）の後に吸着したままであり続けるクローンを溶出させることによって選択することができる。任意に、所望の遮断／非遮断特性を有するクローンを、本明細書に記載の選択手順を１回または複数回繰り返すことによってさらに濃縮することができる。
【０２４４】
本開示のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、関心の重鎖及び軽鎖コード領域をハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって）容易に単離及びシーケンシングされる。単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、その後、これを、トランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内で所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組換え発現に関する総説の文献には、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が含まれる。
【０２４５】
完全長または部分長の重鎖及び／または軽鎖をコードするクローンを形成させるために、本開示のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖及び／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列と組み合わせることができる（例えば、適切なＤＮＡ配列を前出のＫａｂａｔらから得ることができる）。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができること、ならびにそのような定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されるであろう。１つの動物（例えば、ヒト）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、その後、別の動物種の定常領域ＤＮＡと融合されて、「ハイブリッド」の完全長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成するＦｖクローンが、本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある特定の実施形態では、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合させて、完全長または部分長のヒト重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成させる。
【０２４６】
本発明のハイブリドーマに由来する抗突然変異体ＳＭＯ抗体をコードするＤＮＡは（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法と同様に）例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列をハイブリドーマクローンに由来する相同なマウス配列の代わりに用いることによって修飾することもできる。ハイブリドーマまたはＦｖクローン由来の抗体または断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を共有結合させることによって、さらに修飾することができる。このようにして、本開示のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローン由来抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。
【０２４７】
３．ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して産生させることもできる。抗突然変異体ＳＭＯ抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用の複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及びシーケンシングすることができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、通常、限定されないが、以下のうちの１つまたは複数：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列が含まれる。
【０２４８】
ａ）シグナル配列成分
本開示の抗体は、直接的にだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え産生させてもよく、この異種ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、いくつかの実施形態では、宿主細胞によって認識及びプロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブ抗体のシグナル配列を認識及びプロセッシングしない原核宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス属及びクルイベロミセス属のα因子リーダーを含む）、もしくは酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物のシグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２４９】
ｂ）複製起点
発現ベクター及びクローニングベクターはいずれも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。通常、クローニングベクター中では、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列が含まれる。そのような配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に好適であり、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞のクローニングベクターに有用である。通常、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点が典型的に使用され得るが、これは、単にそれが初期プロモーターを含有しているからに過ぎない）。
【０２５０】
ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するか、または（ｃ）例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０２５１】
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を停止させる薬物が利用される。異種遺伝子による形質転換が成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、その結果、選択レジメンを切り抜けて生き残る。そのような優性選択の例では、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンが使用される。
【０２５２】
哺乳動物細胞の好適な選択マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの、抗体をコードする核酸を取り込む能力を有する細胞の同定を可能にするものである。
【０２５３】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で培養することによって同定される。これらの条件下では、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換させた核酸とともに増幅される。内在性ＤＨＦＲ活性に欠損があるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）を使用し得る。
【０２５４】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地中で培養することによって同定される。これらの条件下では、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換させた核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上記のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用し得る。
【０２５５】
あるいは、関心の抗体、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択マーカーの選択剤を含む培地中での細胞成長によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２５６】
酵母で使用するための好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。したがって、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの非存在在下における成長によって形質転換を検出する有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって相補される。
【０２５７】
さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターをクリベロミセス属酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が、Ｋ．ラクチスについて報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。クルイベロミセス属の工業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための、安定な複数コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０２５８】
ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用するのに好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが好適である。また、細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに機能的に連結されたシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
【０２５９】
プロモーター配列は真核生物について既知である。ほとんど全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て、真核生物発現ベクターに好適に挿入されている。
【０２６０】
酵母宿主とともに使用するための好適なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素のプロモーターが含まれる。
【０２６１】
成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現で使用するための好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０２６２】
哺乳動物宿主細胞内でのベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御することができ、但し、そのようなプロモーターは、宿主細胞株と適合性がある。
【０２６３】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現させる系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関する文献であるＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２６４】
ｅ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による、本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子について、多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかしながら、通常、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例として、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターを活性化させるためのエンハンサーエレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５’または３’側の位置でベクターに挿入されてもよいが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０２６５】
ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または他の多細胞生物からの有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び場合によっては３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６号及びその中に開示されている発現ベクターを参照されたい。
【０２６６】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書中のベクター中のＤＮＡをクローニングするか、または発現させるための好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的のための好適な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、霊菌、及びシゲラ属、ならびにバチルス属、例えば、枯草菌及びＢ．リケニフォルミス（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０号に開示されているＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば、緑膿菌、及びストレプトミセス属が含まれる。１つの可能性のある大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株が好適である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。
【０２６７】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、治療的抗体が、単独で腫瘍細胞の破壊における有効性を示す細胞毒性剤（例えば、毒素）にコンジュゲートされている場合などの、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌内で産生させることができる。完全長抗体は、循環中でのより長い半減期を有する。大腸菌内での産生は、より速くかつ費用効率がより高い。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している米国第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。大腸菌内での抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、抗体を可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離してもよく、また、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡまたはプロテインＧカラムに通して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するプロセスと同様に実施することができる。
【０２６８】
原核生物に加え、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、または一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、いくつかの他の属、種、及び株が一般に利用可能かつ本明細書で有用であり、分裂酵母；例えば、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアヌスなどのクルイベロミセス属宿主；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・レエシア（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワニオミセス・オクシデンタリスなどのシュワニオミセス属；例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラディウム属などの糸状菌、ならびに偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビなどのアスペルギルス属宿主などがある。治療的タンパク質の産生のための酵母及び糸状菌の使用を考察している総説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０２６９】
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、結果として、部分的にまたは完全にヒトのグリコシル化様式を有する抗体の産生がもたらされる、特定の真菌及び酵母株を選択することができる。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（ピキア・パストリスのグリコシル化経路のヒト化を記載している）、及び前出のＧｅｒｎｇｒｏｓｓらを参照されたい。
【０２７０】
グリコシル化された抗体の発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。数々のバキュロウイルス株及び変異体、ならびにヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコなどの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に利用可能であり、そのようなウイルスを、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのための、本開示による本明細書中のウイルスとして使用し得る。
【０２７１】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ（ウキクサ科）、アルファルファ（タルウマゴヤシ）、及びタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０２７２】
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の繁殖は慣習的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２５５−２６８くを参照されたい。
【０２７３】
宿主細胞を、抗体産生用の上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２７４】
ｈ）宿主細胞の培養
本開示の抗体を産生させるために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれかを、宿主細胞用の培養培地として使用してもよい。これらの培地のうちのいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補助物質を当業者に知られる適切な濃度で含めることもできる。例えば、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択される宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２７５】
ｉ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム空間で産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解断片のどちらかの微粒子残屑を、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間かけて解凍する。細胞残屑は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、通常、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用してまず濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのうちのいずれかに含めてタンパク質分解を阻害してもよく、また、抗生物質を含めて外来性汚染菌の成長を防止してもよい。
【０２７６】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプによって決まる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７−１５７５）。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラム上での画分、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２７７】
任意の予備的精製工程（複数可）の後、関心の抗体及び夾雑物を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出バッファーを使用する、いくつかの実施形態では、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行なわれる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し得る。
【０２７８】
一般に、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製する様々な方法は、当技術分野で十分に確立され、上記の方法と一致しており、かつ／または当業者によって関心の特定の抗体に適切であるとみなされる。
【０２７９】
Ｃ．免疫コンジュゲート
本開示はまた、化学療法剤、薬物、成長阻害因子、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの、１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲート（「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と互換的に呼ばれる）を提供する。
【０２８０】
免疫コンジュゲートは、癌の治療において、細胞毒性剤、すなわち、細胞の成長または増殖を中止または阻害する薬物の局所送達に使用されている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６、Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）ｉ  ３：２０７−２１２、Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２、米国特許第４，９７５，２７８号）。コンジュゲートされていない薬物の全身投与が、正常細胞及び排除しようとしている腫瘍細胞に対して許容されないレベルの毒性をもたらし得る場合、免疫コンジュゲートは、腫瘍への薬物部分の標的送達、及びその中での細胞内蓄積を可能にする（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．１５，１９８６）ｐｐ．６０３−０５、Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ）ｐｐ．４７５−５０６。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はどちらも、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが含まれる（前出のＲｏｗｌａｎｄら（１９８６））。抗体−毒素コンジュゲートで使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３号；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）などの小分子毒素が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞毒性効果を発揮し得る。細胞毒性薬の中には、大きい抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされた場合、不活性になるかまたは活性が弱くなる傾向にあるものもある。
【０２８１】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、正常Ｂリンパ球及び悪性Ｂリンパ球の表面に見られるＣＤ２０抗原に向けられたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体とチオ尿素リンカー−キレート剤によって結合された１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体とから構成される抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７、Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２、Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３、Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＬＩＮは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与は、ほとんどの患者において重篤かつ持続的な血球減少をもたらす。カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体から構成される抗体−薬物コンジュゲートである、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、２０００年に、注射による急性骨髄性白血病の治療用に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６、米国特許第４９７０１９８号、第５０７９２３３号、第５５８５０８９号、第５６０６０４０号、第５６９３７６２号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７３００１号）。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結されたｈｕＣ２４２抗体から構成される抗体−薬物コンジュゲートである、カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、結腸癌、膵癌、胃癌、及び他の癌などの、ＣａｎＡｇを発現する癌の治療のために、第ＩＩ相治験に進んでいる。メイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成される抗体−薬物コンジュゲートである、ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、前立腺腫瘍の潜在的治療のために開発中である。アウリスタチンペプチドのアウリスタチンＥ（ＡＥ）、及びドラスタチンの合成類似体であるモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）がキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（上皮癌表面のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液学的悪性腫瘍表面のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４）、治療用に開発中である。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、抗体及び化学療法剤または他の毒素を含む。免疫コンジュゲートの作製に有用な化学療法剤が本明細書に記載されている（例えば、上記）。使用可能な酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２号を参照されたい。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲートされた抗体の産生のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０２８３】
抗体と、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの、１つ以上の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書で企図される。
【０２８４】
１．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた抗体（完全長または断片）を含む。
【０２８５】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木メイテナス・セラタから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、特定の微生物も、メイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが判明した（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体及び類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、第４，２４８，８７０号、第４，２５６，７４６号、第４，２６０，６０８号、第４，２６５，８１４号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３１７，８２１号、第４，３２２，３４８号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６４，８６６号、第４，４２４，２１９号、第４，４５０，２５４号、第４，３６２，６６３号、及び第４，３７１，５３３に開示されている。
【０２８６】
メイタンシノイド薬物部分は、（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的利用しやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体へのコンジュゲーションに好適な官能基を用いた誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、かつ（ｉｖ）種々の腫瘍細胞株に対して効果的であるので、それらは、抗体薬物コンジュゲート中の魅力的な薬物部分である。
【０２８７】
メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法、及びその治療的使用は、例えば、その開示が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、及び欧州特許ＥＰ０  ４２５  ２３５  Ｂ１号に開示されている。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に向けられたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。このコンジュゲートは、培養結腸癌細胞に対して細胞毒性が高いことが見出され、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）は、メイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にコンジュゲートされた免疫コンジュゲートを記載している。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は、１細胞当たり３×１０５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してインビトロで試験された。薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物と同様の程度の細胞毒性を達成し、これは、抗体１分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートはマウスで低い全身細胞毒性を示した。
【０２８８】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはメイタンシノイド分子のどちらの生物活性も顕著に減少させずに、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結させることによって調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている）。抗体１分子当たりにコンジュゲートされた平均３〜４個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を及ぼさずに、標的細胞の細胞毒性を増強させるのに効力を示しているが、抗体１つ当たり毒素１分子でさえも、裸の抗体の使用を超えて細胞毒性を増強させると考えられる。メイタンシノイドは当技術分野で周知であり、既知の技術によって合成するか、または天然源から単離することができる。好適なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、ならびに本明細書において上で言及した他の特許及び非特許出版物に開示されている。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び芳香環中またはメイタンシノール分子の他の位置で修飾されているメイタンシノール類似体、例えば、様々なメイタンシノールエステルである。
【０２８９】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための多くの連結基が当技術分野で知られており、これには、例えば、その開示が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号またはＥＰ特許０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）、及び２００４年１０月８日出願の米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示されているものが含まれる。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示されているように調製することができる。連結基には、上で特定されている特許に開示されているような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、またはエステラーゼに不安定な基が含まれ、ジスルフィド及びチオエーテル基が、いくつかの実施形態で使用され得る。さらなる連結基が本明細書に記載及び例示されている。
【０２９０】
抗体及びメイタンシノイドのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製し得る。いくつかの実施形態では、カップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０２９１】
リンカーは、連結の種類に応じて、様々な位置でメイタンシノイド分子に付着させ得る。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用したヒドロキシル基との反応によって形成させてもよい。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位置、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で起こり得る。一実施形態では、連結は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ−３位置で形成される。
【０２９２】
２．アウリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン、またはドロスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）ペプチド類似体及び誘導体のアウリスタチンにコンジュゲートされた抗体を含む（米国特許第５６３５４８３号、第５７８０５８８）。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂及び細胞分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（ＵＳ５６６３１４９）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に付着させ得る（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０２９３】
例示的なアウリスタチン実施形態には、その開示がその全体として参照により本明細書に明示的に組み込まれる、２００４年１１月５日出願の米国特許出願第１０／９８３，３４０号、“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”に開示されている、Ｎ末端で連結されたモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが含まれる。
【０２９４】
典型的には、ペプチドに基づく薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成させることによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知である液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）に従って調製することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国第５６３５４８３号、米国第５７８０５８８号、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７、Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５、及びＰｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３の方法に従って調製することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−７８４、２００４年１１月５日出願の米国第１０／９８３，３４０号、“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”（例えば、リンカー、及びリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製する方法を開示している）も参照されたい。
【０２９５】
３．カリケアマイシン
他の実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満の濃度で二本鎖ＤＮＡの切断を生じさせることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙのもの）を参照されたい。使用し得るカリケアマイシンの構造類似体には、限定されないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθＩ１が含まれる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの前述の米国特許）。抗体をコンジュゲートさせることができる別の抗腫瘍薬は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡはどちらも細胞内作用部位を有しており、形質膜を容易には横断しない。したがって、抗体媒介性の内在化を介したこれらの薬剤の細胞取り込みは、その細胞毒性効果を大いに増強する。
【０２９６】
４．他の細胞毒性剤
抗体にコンジュゲートさせることができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシル、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と総称される、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載の薬剤ファミリー、ならびにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
【０２９７】
使用可能な酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０２９８】
本発明は、抗体と、核酸分解活性（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）を有する化合物との間で形成された免疫コンジュゲートをさらに企図している。
【０２９９】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は、高放射性原子を含み得る。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートされた抗体の生成に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識、例えば、再度のヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含み得る。
【０３００】
放射性標識または他の標識は、既知の方法でコンジュゲート中に組み込み得る。例えば、ペプチドは、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用して、生合成させてもよく、または化学的アミノ酸合成によって合成してもよい。Ｌａｂｅｌｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、及びＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して付着させることができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付着させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を使用して、ヨウ素−１２３を組み込むことができる。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は他の方法を詳細に記載している。
【０３０１】
抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製し得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０３０２】
化合物は、限定されないが、クロスリンカー試薬：（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されたＡＤＣを明示的に企図している。２００３−２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇの４６７〜４９８ページを参照されたい。
【０３０３】
５．抗体薬物コンジュゲートの調製
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）中で、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して、１つ以上の薬物部分（Ｄ）、例えば、抗体１つ当たり約１〜約２０個の薬物部分（ｐ＝１〜約２０）にコンジュゲートされている。下に示す式のＡＤＣは、（１）共有結合を介して、Ａｂ−Ｌを形成させるための、抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応と、それに続く、薬物部分Ｄとの反応、及び（２）共有結合を介して、Ｄ−Ｌを形成させるための、薬物部分の求核基と二価リンカー試薬との反応と、それに続く、抗体の求核基との反応を含む、当業者に既知の有機化学の反応、条件、及び試薬を用いて、いくつかの経路によって調製し得る。ＡＤＣを調製するためのさらなる方法が本明細書に記載されている。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ
【０３０４】
リンカーは、１つ以上のリンカー成分から構成され得る。例示的なリンカー成分には、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が含まれる。さらなるリンカー成分が当技術分野で既知であり、その一部が本明細書に記載されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年１１月５日出願の米国第１０／９８３，３４０号、“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”を参照されたい。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには：バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）が含まれる。例示的なトリペプチドには：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が含まれる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基には、天然に存在するもの、ならびに少数アミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸類似体、例えば、シトルリンが含まれる。アミノ酸リンカー成分を設計し、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素切断に対するその選択性について最適化することができる。
【０３０６】
抗体上の求核基には、限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合、糖のヒドロキシルまたはアミノ基が含まれる。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキル及びベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤での処理によるリンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にし得る。したがって、各々のシステイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核剤を形成する。アミンからチオールへの変換を生じさせるリジンと２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応によって、さらなる求核基を抗体に導入することができる。１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む突然変異体抗体を調製する）ことによって、反応性チオール基を抗体（またはその断片）に導入し得る。
【０３０７】
抗体薬物コンジュゲートはまた、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するための抗体の修飾によって生成させてもよい。グリコシル化された抗体の糖を、例えば、過ヨウ素酸酸化剤を用いて酸化させ、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成させることができる。得られるイミンシッフ塩基基は、安定な連結を形成してもよく、または例えば、水素化ホウ素試薬によって還元されて安定なアミン連結を形成してもよい。一実施形態では、グリコシル化された抗体の炭水化物部分と、グラクトース（ｇｌａｃｔｏｓｅ）オキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応は、薬物上の適切な基と反応することができるタンパク質中のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を生じさせることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含むタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの生成をもたらすことができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６、米国第５３６２８５２号）。そのようなアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核剤と反応させることができる。
【０３０８】
同様に、薬物部分上の求核基には、限定されないが：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキル及びベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基：を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が含まれる。
【０３０９】
あるいは、抗体及び細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製し得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって隔離されているかのいずれかの、コンジュゲートの２つの部分をコードする各々の領域を含み得る。
【０３１０】
さらに別の実施形態では、抗体を、腫瘍のプレターゲッティングで利用する「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートさせることができ、この場合、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、次いで、クリアリング剤を用いて未結合のコンジュゲートを循環から除去し、その後、細胞毒性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲートされた抗体の産生のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３１１】
Ｖ．方法
Ａ．抗体を用いた突然変異体ＳＭＯの診断方法及び検出方法
一態様では、本開示の抗体は、生体試料中の突然変異体ＳＭＯの存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的または定性的な検出を包含する。ある特定の実施形態では、生体試料は、細胞または組織、例えば、腫瘍組織を含む。
【０３１２】
一態様では、本開示は、生体試料中の突然変異体ＳＭＯの存在を検出する方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、抗突然変異体ＳＭＯ抗体と突然変異体ＳＭＯとの結合が許容される条件下で、生体試料を抗突然変異体ＳＭＯ抗体と接触させること、及び抗突然変異体ＳＭＯ抗体と突然変異体ＳＭＯの間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
【０３１３】
一態様では、本開示は、突然変異体ＳＭＯの発現と関連付けられる障害または条件、例えば、突然変異体ＳＭＯの発現と関連付けられる薬物耐性を診断する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、試験細胞を抗突然変異体ＳＭＯ抗体と接触させること；抗突然変異体ＳＭＯ抗体と突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することによって、試験細胞による突然変異体ＳＭＯの発現のレベルを（定量的または定性的に）決定すること；及び試験細胞による突然変異体ＳＭＯの発現のレベルを対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞またはそのような正常細胞と同程度のレベルで野生型ＳＭＯを発現する細胞）による突然変異体ＳＭＯの発現のレベルと比較することを含み、該対照細胞と比較して試験細胞による突然変異体ＳＭＯの発現のレベルがより高い場合は、突然変異体ＳＭＯの発現の増大と関連する障害の存在を示す。ある特定の実施形態では、試験細胞は、突然変異体ＳＭＯの発現の増大と関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。ある特定の実施形態では、障害は、癌または腫瘍などの細胞増殖性障害である。例えば腫瘍試料中で、ＳＭＯ発現における不均一性があり得ることが理解される。こうして、試料において、試料中の細胞のサブセットのみが突然変異体ＳＭＯを発現し得、そのような発現が、例えば、薬物耐性と関連付けるのに十分であることが理解される。したがって、発現を検査することは、試料中の発現を検査すること、及び試料中の細胞のサブセットにおける突然変異体ＳＭＯタンパク質を検出することを伴う。
【０３１４】
本開示の抗体を使用して診断し得るかまたは薬物耐性を検査することができる例示的な疾患には、限定されないが、髄芽細胞腫、膵臓癌基底細胞癌が含まれる。
【０３１５】
ある特定の他の方法を使用して、抗体と突然変異体ＳＭＯとの結合を検出することができる。そのような方法には、限定されないが、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当技術分野で周知の抗原結合アッセイが含まれる。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、抗体を標識する。標識には、限定されないが、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して検出される、酵素またはリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼと共役した、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが含まれる。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、抗体を不溶性マトリックス上に固定する。固定は、抗突然変異体ＳＭＯ抗体を、溶液中に遊離したまま残る全ての突然変異体ＳＭＯから分離することを必要とする場合がある。これは、従来、水不溶性のマトリックスもしくは表面への吸着のような、アッセイ手順の前に抗突然変異体ＳＭＯ抗体を不溶化することによるか（Ｂｅｎｎｉｃｈら、米国第３，７２０，７６０号）、または共有結合によるか（例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用する）、または抗突然変異体ＳＭＯ抗体と突然変異体ＳＭＯとの間での複合体の形成後に、例えば、免疫沈降によって抗突然変異体ＳＭＯ抗体を不溶化することによるかのいずれかで達成される。
【０３１８】
診断または検出の上記実施形態はいずれも、抗突然変異体ＳＭＯ抗体の代わりにまたはそれに加えて、本開示の免疫コンジュゲートを使用して実施し得ることが理解される。
【０３１９】
Ｂ．核酸プローブを用いて突然変異体ＳＭＯを検出する方法
一態様では、本明細書に記載の核酸プローブは、生体試料中の突然変異体ＳＭＯ核酸の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的または定性的な検出を包含する。ある特定の実施形態では、生体試料は、細胞または組織、例えば、腫瘍組織を含む。
【０３２０】
一態様では、本開示は、生体試料中の突然変異体ＳＭＯをコードする核酸の存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、生体試料由来の核酸を本明細書に記載のプローブと接触させること、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションが許容される条件下でプローブを核酸にハイブリダイズさせること、及びプローブと核酸試料との間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
【０３２１】
突然変異体ＳＭＯをコードする核酸は、限定されないが、本明細書に記載のプローブの使用、もしくはＰＣＲ増幅、ｒｔＰＣＲシーケンシング、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）、ＤＮＡの示差制限消化（ＤＮＡの制限酵素消化による差異）、ハイブリダイゼーションによるものを含む、当技術分野で既知の任意の方法、または当技術分野で既知の任意の他の方法を使用して検出し得る。
【０３２２】
これらの方法では、細胞における本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯの検出は、突然変異体ＳＭＯの発現の増大と関連する障害（すなわち、ＧＤＣ−０４４９などのＳＭＯ阻害剤による治療に対する耐性）の存在を示す。ある特定の実施形態では、試験細胞は、突然変異体ＳＭＯの発現と関連する耐性腫瘍を有することが疑われる個体から得られる。上で詳述したように、突然変異は、腫瘍試料由来の細胞のサブセットなどの試料由来の細胞のサブセットにおけるものであってもよいことが理解される。
【０３２３】
本開示の抗体を使用して診断し得る例示的な障害には、限定されないが、髄芽細胞腫、膵臓癌基底細胞癌が含まれる。
【０３２４】
Ｃ．細胞に基づくアッセイで突然変異体ＳＭＯを検出する方法
突然変異体ＳＭＯは、限定されないが、腫瘍試料または突然変異体ＳＭＯを含むことが疑われる組織の組織学的調製物の腫瘍試料インビトロ免疫組織化学的染色などの、突然変異体ＳＭＯ検出抗体と細胞試料の表面との結合を含む、当技術分野で既知の細胞に基づくアッセイにおいて検出し得る。Ｈｈシグナル伝達が起こるかどうかを（例えば、経路成分の活性化、Ｇｌｉの発現などを測定することによって）決定するために、組織試料をＧＤＣ−０４４９及びヘッジホッグと接触させる機能的アッセイがある。ＧＤＣ−０４４９を使用して分断することができる、Ｈｈシグナル伝達経路を使用する任意の機能的アッセイを本開示の方法で使用して、突然変異体ＳＭＯの存在及び活性を決定し得る。
【０３２５】
Ｄ．突然変異体ＳＭＯに結合する化合物についてスクリーニングする方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができるヘッジホッグ経路阻害剤についてスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、単一の薬剤または個別の数の薬剤のスクリーニングである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、薬剤のプールのスクリーニングである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、ハイスループットスクリーニングである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、化合物のライブラリー（単数または複数）（例えば、小分子のライブラリー、アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリー、抗体またペプチドのライブラリー）のスクリーニングである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、一次アッセイのみか、または一次アッセイ及び１つ以上の二次アッセイを伴い得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、アッセイ（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達アッセイ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で既知のＧｌｉ１発現アッセイのいずれかを使用して、薬剤に応答したＧｌｉ１核酸またはタンパク質発現を検査することによる）、突然変異体ＳＭＯタンパク質結合アッセイ（例えば、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯ結合アッセイのいずれかを使用することによる）、細胞増殖アッセイ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で既知の細胞増殖アッセイのいずれかを使用することにより）において評価することができる。スクリーニングアッセイにおける使用は、本開示の突然変異体ＳＭＯタンパク質及び核酸への例示的な使用である（例えば、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、無細胞アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおいて使用することができ、突然変異体ＳＭＯ核酸をベクター中で提供し、スクリーニングアッセイに好適な宿主細胞または宿主生物において突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現させるために使用することができる。
【０３２６】
本開示は、突然変異体ＳＭＯに結合する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。任意の特定の作動様式に拘泥するものではないが、ＧＤＣ−０４４９が野生型ＳＭＯに結合して、突然変異体ＳＭＯには結合しないのと同じように、突然変異体ＳＭＯの阻害剤として作用する化合物であれば、突然変異体ＳＭＯに結合するであろうと考えられる。したがって、突然変異体ＳＭＯタンパク質またはその断片、例えば、膜貫通ドメイン（ＴＭ６）の全てまたは一部を含む断片を発現させ、化合物のライブラリーを使用する結合アッセイを当技術分野で既知の任意の手段によって実行し得る。また、ＧＤＣ−０４４９の可能性のある接触点に基づくモデリング手法を使用して、ＧＤＣ−０４４９のバリエーションによって表されるより小さい化合物ライブラリーを使用し、その後、突然変異体ＳＭＯとＧＤＣ−０４４９のバリエーションとの類似の接触点をモデリングしてもよい。そのようなモデリングプログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で既知である任意のものであり得る。野生型と突然変異体ＳＭＯの両方の阻害剤となる、突然変異体ＳＭＯ及び野生型ＳＭＯに結合する化合物を同定し得る。あるいは、突然変異体ＳＭＯには結合するが、野生型ＳＭｏには結合せず、それゆえ、突然変異体ＳＭＯのみに対する阻害剤となる化合物を発見してもよい。ある特定の実施形態では、結合及び／または何らかの他の読み出し（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達）を評価し、野生型ＳＭＯまたは好適な対照（例えば、空ベクター）についてのものと比較する。
【０３２７】
一実施形態では、スクリーニングされるべき化合物は、ＧＤＣ−０４４９の変異体などの小分子化合物である。他の実施形態では、突然変異体ＳＭＯに結合する化合物は、ＧＤＣ−０４４９と野生型ＳＭＯとの結合部位と同じ領域中にあるエピトープを特異的に認識する抗体である。一実施形態では、抗体は、突然変異体ＳＭＯのＴＭ６のカルボキシ末端部分の領域に結合し、突然変異体ＳＭＯ活性を阻害する。
【０３２８】
あるいは、またはさらに、化合物を、突然変異体ＳＭＯ活性を阻害するその能力についてスクリーニングしてもよい。これらの実施形態では、突然変異体ＳＭＯを発現する細胞のヘッジホッグシグナル伝達を阻害するこれらの化合物の能力を評価し得る。これらのアッセイは、インタクトのヘッジホッグシグナル伝達経路を有するが、野生型ＳＭＯの代わりにまたはそれに加えて突然変異を有する組換えＳＭＯを発現する細胞で実施し得る。これらのアッセイでは、候補阻害剤の存在または非存在下でヘッジホッグとともにインキュベートした場合に、活性のあるヘッジホッグシグナル伝達を有する細胞の能力を決定する。ヘッジホッグシグナル伝達が候補化合物の存在下で阻害される場合、そのような化合物は、ヘッジホッグ阻害剤である。いくつかの実施形態では、細胞は、野生型及び突然変異体ＳＭＯの両方を発現しており、ＧＤＣ−０４４９及び候補阻害剤とともにインキュベートする。他の実施形態では、細胞は、突然変異ＳＭＯのみを発現しており、Ｈｈ及び候補阻害剤のみとともに（すなわち、ＧＤＣ−０４４９の非存在下で）インキュベートしてもよい。Ｈｈシグナル伝達がそのような細胞で低下するかまたは阻害される場合、化合物は、突然変異体ＳＭＯの阻害剤である。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の試験薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）試験薬剤が細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、試験薬剤が対照と比べて細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、試験薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対照（または比較の基準）は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）を発現している細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、試験薬剤と接触させた細胞と同じ突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞であり、対照は、処理されないか、または突然変異体ＳＭＯタンパク質が部分的または完全に耐性である対照薬剤で処理される。いくつかの実施形態では、対照薬剤は、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５、及び／または化合物５である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質と結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質とは結合しない。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質及び野生型ＳＭＯタンパク質の両方と結合する。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、細胞をある量の薬剤と接触させることであって、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、または増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を有し、該細胞が、本明細書に記載の突然変異体ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する、接触させることと、ｂ）薬剤が細胞の成長及び／または増殖を阻害するかどうかを対照と比較して決定することであって、薬剤が対照と比べて細胞の成長及び／または増殖を阻害する場合には、薬剤がヘッジホッグ経路阻害剤として同定される、決定することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対照は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）を発現している細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、試験薬剤と接触させた細胞と同じ突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞であり、対照は、処理されないか、または突然変異体ＳＭＯタンパク質が部分的または完全に耐性である対照薬剤で処理される。いくつかの実施形態では、対照薬剤は、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５、及び／または化合物５である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質と結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質とは結合しない。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質及び野生型ＳＭＯタンパク質の両方と結合する。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現している細胞の成長及び／または増殖の阻害において野生型ＳＭＯタンパク質を発現している細胞よりも有効である。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法で使用される細胞は、培養下にある。いくつかの実施形態では、培養細胞と接触させる薬剤は、細胞培養中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％においてヘッジホッグシグナル伝達を部分的または完全に阻害するのに十分なものである。いくつかの実施形態では、培養細胞と接触させる薬剤は、細胞培養中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の細胞の増殖率及び／または生存率を低下させるのに十分なものであり、該細胞は、ヘッジホッグを発現または過剰発現しているか、あるいは活性なヘッジホッグシグナル伝達を有する。
【０３３２】
他の実施形態では、細胞は動物中にある。いくつかの実施形態では、動物は哺乳動物または他の脊椎動物である。いくつかの実施形態では、動物は出生後である。いくつかの実施形態では、動物は小児である。いくつかの実施形態では、動物は成体である。インビトロの細胞に言及するとき、これらの細胞は、任意の脊椎動物種、例えば、齧歯動物、ハムスター、またはヒトなどの哺乳動物のものであり得る。インビトロであってもインビボであっても、細胞は、原発性癌細胞、転移性癌細胞、または癌細胞株などの癌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は髄芽細胞腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は基底細胞癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は母斑性基底細胞癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はゴーリン症候群細胞である。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子において１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の突然変異はｐａｔｃｈｅｄにおけるものである。いくつかの実施形態では、ｐａｔｃｈｅｄ突然変異は機能喪失型突然変異である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の突然変異はスムースンドにおけるものである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、スムースンド機能獲得型突然変異である。いくつかの実施形態では、機能獲得型スムースンド突然変異は、構成的に活性なスムースンドタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、その１つ以上の突然変異は、サプレッサー・オブ・フューズドにおけるものであり、細胞は、サプレッサー・オブ・フューズド（ＳｕＦｕまたはＳＵＦＵ）機能喪失を有する。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、ＳｕＦｕ活性の部分的な機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、ＳｕＦｕ活性の完全な機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、ビスモデギブに対する耐性を付与する。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかで試験される薬剤は、小分子である。他の実施形態では、本薬剤はポリペプチドである。他の実施形態では、本薬剤はｓｉＲＮＡアンタゴニストである。
【０３３５】
本明細書に記載のスクリーニング方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯ  ＤＮＡは、細胞において外因的に発現される。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯ  ＤＮＡは、細胞において安定して発現される。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯ  ＤＮＡは、細胞において一時的に発現される。
【０３３６】
本開示で使用可能な様々なヘッジホッグ経路阻害剤の成長阻害効果は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、内因的に、またはそれぞれの突然変異体ＳＭＯ遺伝子によるトランスフェクションの後で突然変異体ＳＭＯポリペプチドを発現する細胞を使用して、評価し得る。例えば、好適な腫瘍細胞株、及び突然変異体ＳＭＯをコードするＤＮＡでトランスフェクトした細胞を、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤を様々な濃度で用いて数日間（例えば、２〜７日間）処理し、クリスタルバイオレット、ＭＴＴで染色するか、または何らかの他の比色またはルシフェラーゼ系（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ）アッセイによって分析してもよい。増殖を測定する別の方法は、３Ｈ−チミジン取り込みを、そのようなヘッジホッグ経路阻害剤の存在下または非存在下で処理した細胞によって比較することによる。処理後、細胞を採取し、ＤＮＡに組み込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターにおいて定量化する。適切な陽性対照は、選択された細胞株の処理を含み、細胞株は、その細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体または小分子を有する。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、当技術分野で既知の様々な方法で決定することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ヘッジホッグ経路シグナル伝達遺伝子において１つ以上の突然変異を有するものである。いくつかの実施形態では、そのようなヘッジホッグ経路阻害剤は、未処理の腫瘍細胞と比較して約１０〜２５％、約２５〜１００％、約３０〜１００％、約５０〜１００％、または約または７０〜１００％、インビトロまたはインビボでヘッジホッグ発現腫瘍細胞の細胞増殖を阻害することになる。成長阻害は、細胞培養中、約０．５〜３０μｇ／ｍｌ、約０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜１μＭ、約１μＭ〜５μＭ、または５μＭ〜１０μＭのヘッジホッグ経路阻害剤濃度で測定し得、ここでは、成長阻害を腫瘍細胞のアンタゴニストへの曝露後１〜１０日に決定する。アンタゴニストは、体重１ｋｇ当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇでのアンタゴニスト及び／またはアゴニストの投与が、本抗体または小分子アンタゴニストの最初の投与から約５日〜３カ月以内、いくつかの実施形態では、約５〜３０日以内に腫瘍サイズの低下または腫瘍細胞増殖の低下をもたらす場合に、インビボで成長阻害性である。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、細胞死滅を誘導するヘッジホッグ経路阻害剤を選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー、または７ＡＡＤ取り込みによって示される膜統合性の喪失を対照と比較して評価し得る。ＰＩ取り込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で実行することができる。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現する発現腫瘍細胞を、培地のみ、または適切なヘッジホッグ経路阻害剤を含有する培地とともにインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理の後、細胞を洗浄し、細胞塊の除去のために、３５ｍｍの濾過器で蓋をした１２×７５試験管（試験管当たり１ｍｌ、処理群当たり試験管３本）に等分する。次に試験管にＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を投入する。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメトリー及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または当業者が分析に使用する任意の他の装置を使用して分析し得る。その後、ＰＩ取り込みによって決定して統計的に有意なレベルの細胞死滅を誘導するこれらのヘッジホッグ経路阻害剤を選択し得る。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯポリペプチド上でエピトープに結合するヘッジホッグ経路阻害剤についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなどの慣習的な交差遮断アッセイを実行することができる。このアッセイを使用して、試験抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド、または他の有機分子が、既知のヘッジホッグ経路阻害剤と同じ部位またはエピトープに結合するかどうかを決定することができる。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングを当技術分野で既知の方法によって実行し得る。例えば、突然変異体ＳＭＯタンパク質配列に、アラニンスキャニング、または免疫学的に明白に異なるＧＰＣＲタンパク質を有するキメラを作製することなどによって突然変異を起こさせ、接触残基を同定することができる。突然変異体抗原をまずポリクローナル抗体との結合について試験して、適当な折り畳みを保障する。異なる方法においては、突然変異体ＳＭＯタンパク質の異なる領域に対応するペプチドを、試験抗体、または試験抗体と特性評価済みもしくは既知のエピトープとを有する抗体との競合アッセイで使用することができる。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質または候補ヘッジホッグ経路阻害薬剤を、共有結合または非共有結合によって、固相、例えば、マイクロタイタープレートに固定する。非共有結合は、一般に、固体表面を、突然変異体ＳＭＯタンパク質または候補のヘッジホッグシグナル伝達薬剤の溶液でコーティングし、乾燥させることによって達成される。あるいは、固定される突然変異体ＳＭＯの標的部分に特異的な固定した抗体、例えば、モノクローナル抗体を使用して、それを固体表面に固着させることができる。このアッセイは、検出可能な標識によって標識してもよい固定されていない成分を、固定された成分、例えば、固着した成分を含むコーティングした表面に加えることによって実行し得る。反応が完了したら、未反応成分を、例えば洗浄によって除去してもよく、固体表面に固着した複合体を検出する。元は固定されていなかった成分が検出可能な標識を担持する場合、表面に固定された標識の検出は、複合体化が生じたことを示す。元は固定されていなかった成分が標識を担持しない場合、複合体化は、例えば、固定された複合体に特異的に結合する標識した抗体を使用することによって検出することができる。
【０３４０】
候補のヘッジホッグ経路阻害剤が、本明細書で同定するヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチドと相互作用するが、それと直接的に結合しない場合、そのポリペプチドとのその相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイし得る。そのようなアッセイには、例えば、架橋、免疫共沈降、及び勾配またはクロマトグラフィーカラムを通した共精製などの伝統的な手法が含まれる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者ら（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）．３４０：２４５−２４６（１９８９）、Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））によって記載され、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されているように、酵母系遺伝系を使用してモニタリングすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性剤は、２つの物理的に個別の分子ドメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、もう一方は転写活性ドメインとして機能する。前述の出版物に記載されている酵母発現系（一般に「２ハイブリッド系（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）」と称される）は、この特性を活用し、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合するものと、候補の活性化タンパク質が活性化ドメインに融合するものという、２つのハイブリッドタンパク質を用いる。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下にあるＧＡＬ１−ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用しているポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼの発色基質を用いて検出する。２ハイブリッド技法を使用して２つの特異的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。このシステムは、特異的なタンパク質の相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングすること、及びこれらの相互作用に不可欠なアミノ酸残基を突き止めることにも拡大可能である。
【０３４１】
アッセイは、当技術分野で十分に特徴付けられている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞に基づくアッセイを含む、様々な形式で行うことができる。
【０３４２】
ヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチドと他の細胞内または細胞外成分（例えば、Ｃｏｓｔａｌ−２）との相互作用に干渉する薬剤は、当業者に周知の手段によって試験することができる。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯポリペプチド及び細胞内または細胞外成分を含有する反応混合物は、２つの産生物の相互作用及び結合を可能にする条件下及び時間で調製する。いくつかの実施形態では、候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、試験化合物の非存在下及び存在下で反応を実行する。加えて、第３の反応混合物にプラセボを加えて陽性対照として働かせてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内または細胞外成分との間の結合（複合体形成）を本明細書において上に記載したようにモニタリングする。対照反応（複数可）において生じるが試験薬剤を含有する反応混合物では生じない複合体の形成は、試験薬剤が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用に干渉することを示す。
【０３４３】
本開示は、前述のアッセイステップのいずれか１つまたは組み合わせを使用してヘッジホッグシグナル経路阻害剤を同定するための方法を企図している。換言すると、様々なスクリーニングアッセイを組み合わせて、例えば、特定の活性を有するアンタゴニストを特定するか、または１つのアッセイにおいて突然変異体ＳＭＯに拮抗する薬剤が、独立したアッセイにおいてもヘッジホッグシグナル伝達を阻害することを確認することができる。いずれの特定アッセイまたは方法についても、結果を、陽性及び／または陰性対照を含む１つ以上の適切な対照と比較し得る。
【０３４４】
ヘッジホッグ経路阻害剤をスクリーニング及び／または同定するための前述のアッセイ方法のいずれについても、薬剤は、単独またはプールでスクリーニングし得る。薬剤は、薬剤のライブラリー、または候補薬剤のセットからスクリーニングしてもよい。スクリーニングし得る好適な薬剤には、限定されないが、抗体、抗体断片、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、及び小分子（例えば、ブロモドメイン阻害剤）が含まれる。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のスクリーニング方法のいずれかで使用される細胞は、遺伝子中に１つ以上の突然変異を含み、これがヘッジホッグシグナル伝達の活性化または増加をもたらす。いくつかの実施形態では、この１つ以上の突然変異は、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子におけるものであり、機能のｐａｔｃｈｅｄ喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子におけるこの１つ以上の突然変異は、以下の突然変異のうちの１つ以上を有するタンパク質をコードする突然変異体遺伝子をもたらす：Ｓ６１６Ｇ、ｆｓ２５１、Ｅ３８０＊、Ｑ８５３＊、Ｗ９２６＊、Ｐ１３８７Ｓ，、ｓｐ２６６７、Ｑ５０１Ｈ、ｆｓ１０１７、ｆｓ１０８、またはＡ１３８０Ｖ。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達の活性化または増加をもたらす遺伝子における１つ以上の突然変異は、スムースンドにおけるものであり、細胞はスムースンド突然変異を有する。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、スムースンド機能獲得型突然変異である。いくつかの実施形態では、機能獲得型スムースンド突然変異は、構成的に活性なスムースンドタンパク質をもたらす。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０２８９５０及びＷＯ２０１２０４７９６８を参照されたい。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置５３５に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置５６２に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、位置５３５での、または配列番号１におけるその対応する位置でのＷ５３５Ｌである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１のＲ５６２Ｑに対応する突然変異（位置５６２での、または配列番号１の位置５６２に対応する位置でのＲ５６２Ｑ突然変異）である。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置４１２に対応する位置での突然変異、例えば、配列番号１のそのような位置でのＬ４１２Ｆである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、それをある特定のスムースンド阻害剤に対して耐性にする代替の突然変異を有する。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置５１８で、または配列番号１の位置５１８に対応する位置で、アミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、配列番号１のアミノ酸位置５１８に対応するアミノ酸位置でのＥ５１８ＫまたはＥ５１８Ａ置換である。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置４７３で、または配列番号１の位置４７３に対応する位置で、アミノ酸変化を含む。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、この１つ以上の突然変異は、ヘッジホッグ遺伝子におけるものであり、ヘッジホッグタンパク質の過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、ソニックヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、インディアンヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、デザートヘッジホッグタンパク質である。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、その１つ以上の突然変異は、サプレッサー・オブ・フューズドにおけるものであり、細胞は、サプレッサー・オブ・フューズド（ＳｕＦｕまたはＳＵＦＵ）機能喪失を有する。いくつかの実施形態では、結果は、ＳｕＦｕ活性における機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、髄芽細胞腫、髄膜腫、腺様嚢胞癌、基底細胞癌、及び横紋筋肉腫癌細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｇｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載されている突然変異のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、表１もしくは２に記載の突然変異のいずれか、または全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｇｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載されている突然変異のうちのいずれかである。
【表２−１】
2018512597.tif 000004
【表２−２】
2018512597.tif 000005
【０３４９】
略記：ＭＢ、髄芽細胞腫；ＭＢＥＮ、大規模な小結節形成を伴うＭＢ；ＮＡ、該当なし；ＮＯＳ、特定不能。
【表３】
2018512597.tif 000006
【０３５０】
略記：ＵＶ、未知の変異体（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｖａｒｉａｎｔ）。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、配列番号１０における以下のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置で突然変異を含む：位置１５、１８４、１２３、２９５、１８７。ある特定の実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、Ｐ１５Ｌ、Ｑ１８４Ｘ、Ｒ１２３Ｃ、Ｌ２９５ｆｓ、またはＰ１８７Ｌのうちの１つ以上を含み、この突然変異は、その位置、または配列番号１０における前述の位置に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、ＳｕＦＵ突然変異は、配列番号１１のｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ）、ｃ．７２ｄｅｌＣ、ｃ．７２ｉｎｓＣ、１４３ｉｎｓＡ、ｃ．８４６ｉｎｓＣ、またはＩＶＳ１−１Ａ−＞Ｔに対応する突然変異のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３１：３０６−３１０（例えば、ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ（＝ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）、１１２９ｄｅｌ，Ｐ１５Ｌ、及びＮｇの２つ（ａｌｌ＋ＬＯＨ））；Ｓｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １０：３３７−３４２，２０１１（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ；ｃ．８４８ｉｎｓＣ）；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １４９Ａ：１５３９−１５４３（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １３４：３９９−４０３（例えば、１４３ｉｎｓＡ；ＩＶＳ１−１Ａ＞Ｔ）；Ｋｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １１：  ５６５−７０（例えば、ｃ．５５０Ｃ＞Ｔ（Ｑ１８４Ｘ））；Ａａｖｉｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９１：  ５２０−５２６（例えば、ｃ．３６７Ｃ＞Ｔ（Ｒ１２３Ｃ））；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３：２９６５−２９６８（例えば、ｘ８８１＿８８２ｉｎｓＧ（Ｌ２９５ｆｓ））；またはＲｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １５２：  ４３−５１（例えば、ｃ５６０Ｃ＞Ｔ（Ｐ１８７Ｌ））に記載されている突然変異のいずれかである。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞であり、染色体１０重複及び／または１０ｑの一部分の欠失を有し、該部分はＳＵＦＵ及びＰＴＥＮを含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｆｓ１０１７  ＳＵＦＵ突然変異を含む。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかで使用される細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が活性な細胞である。いくつかの実施形態では、本細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が構成的に活性な細胞である。いくつかの実施形態では、本細胞は、ヘッジホッグタンパク質またはヘッジホッグアゴニストによって刺激されている細胞である。いくつかの実施形態では、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性は、Ｇｌｉ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＧｌｉ１レベルまたは活性をモニタリングすることによって決定される。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかで使用される細胞は、培養細胞である。いくつかの実施形態では、本開示は、複数の細胞を含む培養物を接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本細胞は脊椎動物中にある。いくつかの実施形態では、本細胞は哺乳動物中にあり、細胞を接触させることは、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤をこの哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト対象である。いくつかの実施形態では、本細胞は癌細胞であり、かつ／または哺乳動物は癌と診断された哺乳動物である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、結腸、肺、前立腺、皮膚、血液、肝臓、腎臓、乳房、膀胱、骨、脳、髄芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胃、卵巣、食道、膵臓、または精巣癌細胞からなる群から選択される癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、髄芽細胞腫細胞、基底細胞癌細胞、または母斑性基底細胞細胞癌細胞（ゴーリン症候群細胞）である。
【０３５５】
ある特定の実施形態では、薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定したら、この薬剤を製剤化し、細胞または動物系アッセイにおいてさらに検査することができる。例えば、この薬剤を細胞または動物系癌モデルにおいて試験して、抗癌剤としての効力を検査することができる。
【０３５６】
ＶＩ．治療方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のスムースンド突然変異のいずれかを有するスムースンドタンパク質を発現している細胞の分化段階、生存、及び／または増殖を調節する方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞は対象（例えば、ヒト患者）中にある。いくつかの実施形態では、細胞は培養下にあり、本方法はインビトロ法を含む。ある特定の実施形態では、細胞は癌細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は不要または異常な細胞増殖を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のスムースンド突然変異のいずれかを含むスムースンドタンパク質を含むか、またはそれを発現することが事前に決定されている。ある特定の実施形態では、細胞は、配列番号１の２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５のうちのいずれか１つ以上に対応するアミノ酸で、野生型ヒトＳＭＯに対する突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現することが事前に決定されている。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１のＴ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌに対応するアミノ酸での置換のいずれかを含むスムースンドポリペプチドを発現する。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を低下させる方法であって、該細胞が、本明細書に記載のスムースンド突然変異のいずれかを有するスムースンドタンパク質を発現し、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、またはヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路の成分）において１つ以上の突然変異を含み、その１つ以上の突然変異が、リガンドの非存在下で増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化をもたらす、方法を提供し、本方法は、細胞を有効量のヘッジホッグ経路阻害剤である薬剤と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、本薬剤は、突然変異体スムースンドタンパク質に選択的に結合し、それを阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、本薬剤は、細胞において突然変異体スムースンドタンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。他の実施形態では、本薬剤はブロモドメイン阻害剤である。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、癌を有する対象を抗癌治療薬で治療する方法であって、該対象が、突然変異体ＳＭＯタンパク質を含み、かつ／またはそれを発現することが決定されており、該突然変異体ＳＭＯタンパク質が、配列番号１の位置２３９に対応する位置でアラニン以外のアミノ酸を有する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する方法であって、この細胞が、配列番号１の位置２３９に対応する位置でアラニン以外のアミノ酸を有する突然変異体ＳＭＯタンパク質を発現する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、癌を有する対象を診断する方法であって、ａ）対象から試料を得るステップ、ｂ）該試料を、配列番号１の位置２３９に対応する位置でアラニン以外のアミノ酸を有する突然変異体ＳＭＯタンパク質をコードする核酸の存在について試験するステップであって、該試料が突然変異体ＳＭＯタンパク質を含む場合に、該対象が癌を有する、ステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は基底細胞癌である。いくつかの実施形態では、突然変異体ＳＭＯタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置２３９に対応するアミノ酸位置でバリンを有する。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の不要な成長、増殖、または生存を阻害する方法であって、該細胞が、本明細書に記載のスムースンド突然変異のいずれかを有するスムースンドタンパク質を発現し、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、またはヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子において１つ以上の突然変異を含み、その１つ以上の突然変異が、リガンドの非存在下で増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化をもたらす、方法を提供し、本方法は、細胞を有効量のヘッジホッグ経路阻害剤である薬剤と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、本薬剤は、突然変異体スムースンドタンパク質に選択的に結合し、それを阻害する薬剤である。いくつかの実施形態では、本薬剤は、細胞において突然変異体スムースンドタンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。いくつかの実施形態では、本薬剤はブロモドメイン阻害剤である。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍細胞の成長、増殖、または生存を阻害する方法であって、腫瘍細胞が、本明細書に記載のスムースンド突然変異のいずれかを有するスムースンドタンパク質を発現し、該細胞が、ヘッジホッグタンパク質に応答するか、またはヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子において１つ以上の突然変異を含み、その１つ以上の突然変異が、リガンドの非存在下で増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／もしくはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化をもたらす、方法を提供し、本方法は、細胞を有効量のヘッジホッグ経路阻害剤である薬剤と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、本薬剤は、突然変異体スムースンドタンパク質に選択的に結合し、それを阻害する薬剤である。いくつかの実施形態では、本薬剤は、細胞において突然変異体スムースンドタンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。他の実施形態では、本薬剤はブロモドメイン阻害剤である。いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤を、それを必要としている患者に投与することを含む。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法のいずれかを用いて処理した細胞は、遺伝子中に１つ以上の突然変異を含み、これがヘッジホッグシグナル伝達の活性化または増加をもたらす。いくつかの実施形態では、この１つ以上の突然変異は、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子におけるものであり、機能のｐａｔｃｈｅｄ喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子におけるこの１つ以上の突然変異は、以下の突然変異のうちの１つ以上を有するタンパク質をコードする突然変異体遺伝子をもたらす：Ｓ６１６Ｇ、ｆｓ２５１、Ｅ３８０＊、Ｑ８５３＊、Ｗ９２６＊、Ｐ１３８７Ｓ，、ｓｐ２６６７、Ｑ５０１Ｈ、ｆｓ１０１７、ｆｓ１０８、またはＡ１３８０Ｖ。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達の活性化または増加をもたらす遺伝子における１つ以上の突然変異は、スムースンドにおけるものであり、細胞はスムースンド突然変異を有する。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、スムースンド機能獲得型突然変異である。いくつかの実施形態では、機能獲得型スムースンド突然変異は、構成的に活性なスムースンドタンパク質をもたらす。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０２８９５０及びＷＯ２０１２０４７９６８を参照されたい。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置５３５に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置５６２に対応する位置での突然変異である。ある特定の実施形態では、突然変異は、位置５３５での、または配列番号１におけるその対応する位置でのＷ５３５Ｌである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１のＲ５６２Ｑに対応する突然変異（位置５６２での、または配列番号１の位置５６２に対応する位置でのＲ５６２Ｑ突然変異）である。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、配列番号１の位置４１２に対応する位置での突然変異、例えば、配列番号１のそのような位置でのＬ４１２Ｆである。いくつかの実施形態では、スムースンド突然変異は、それをある特定のスムースンド阻害剤に対して耐性にする代替の突然変異を有する。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置５１８で、または配列番号１の位置５１８に対応する位置で、アミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、配列番号１のアミノ酸位置５１８に対応するアミノ酸位置でのＥ５１８ＫまたはＥ５１８Ａ置換である。いくつかの実施形態では、スムースンドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置４７３で、または配列番号１の位置４７３に対応する位置で、アミノ酸変化を含む。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、この１つ以上の突然変異は、ヘッジホッグ遺伝子におけるものであり、ヘッジホッグタンパク質の過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、ソニックヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、インディアンヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質は、デザートヘッジホッグタンパク質である。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、その１つ以上の突然変異は、サプレッサー・オブ・フューズドにおけるものであり、細胞は、サプレッサー・オブ・フューズド（ＳｕＦｕまたはＳＵＦＵ）機能喪失を有する。いくつかの実施形態では、結果は、ＳｕＦｕ活性における機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、髄芽細胞腫、髄膜腫、腺様嚢胞癌、基底細胞癌、及び横紋筋肉腫癌細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｇｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載されている突然変異のうちのいずれかである。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、表１もしくは２に記載の突然変異のいずれか、または全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｇｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載されている突然変異のうちのいずれかである。
【表４】
2018512597.tif 000007
【０３６６】
略記：ＭＢ、髄芽細胞腫；ＭＢＥＮ、大規模な小結節形成を伴うＭＢ；ＮＡ、該当なし；ＮＯＳ、特定不能。
【表５】
2018512597.tif 000008
【０３６７】
略記：ＵＶ、未知の変異体（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｖａｒｉａｎｔ）。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、配列番号１０における以下のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置で突然変異を含む：位置１５、１８４、１２３、２９５、１８７。ある特定の実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、Ｐ１５Ｌ、Ｑ１８４Ｘ、Ｒ１２３Ｃ、Ｌ２９５ｆｓ、またはＰ１８７Ｌのうちの１つ以上を含み、この突然変異は、その位置、または配列番号１０における前述の位置に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、ＳｕＦＵ突然変異は、配列番号１１のｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ）、ｃ．７２ｄｅｌＣ、ｃ．７２ｉｎｓＣ、１４３ｉｎｓＡ、ｃ．８４６ｉｎｓＣ、またはＩＶＳ１−１Ａ−＞Ｔに対応する突然変異のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３１：３０６−３１０（例えば、ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ（＝ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）、１１２９ｄｅｌ，Ｐ１５Ｌ、及びＮｇの２つ（ａｌｌ＋ＬＯＨ））；Ｓｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １０：３３７−３４２，２０１１（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ；ｃ．８４８ｉｎｓＣ）；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １４９Ａ：１５３９−１５４３（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １３４：３９９−４０３（例えば、１４３ｉｎｓＡ；ＩＶＳ１−１Ａ＞Ｔ）；Ｋｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １１：  ５６５−７０（例えば、ｃ．５５０Ｃ＞Ｔ（Ｑ１８４Ｘ））；Ａａｖｉｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９１：  ５２０−５２６（例えば、ｃ．３６７Ｃ＞Ｔ（Ｒ１２３Ｃ））；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３：２９６５−２９６８（例えば、ｘ８８１＿８８２ｉｎｓＧ（Ｌ２９５ｆｓ））；またはＲｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １５２：  ４３−５１（例えば、ｃ５６０Ｃ＞Ｔ（Ｐ１８７Ｌ））に記載されている突然変異のいずれかである。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞であり、染色体１０重複及び／または１０ｑの一部分の欠失を有し、該部分はＳＵＦＵ及びＰＴＥＮを含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｆｓ１０１７  ＳＵＦＵ突然変異を含む。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかで処理される細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が活性な細胞である。いくつかの実施形態では、本細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が構成的に活性な細胞である。いくつかの実施形態では、本細胞は、ヘッジホッグタンパク質またはヘッジホッグアゴニストによって刺激されている細胞である。いくつかの実施形態では、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性は、Ｇｌｉ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＧｌｉ１レベルまたは活性をモニタリングすることによって決定される。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかで処理される細胞は、培養細胞である。いくつかの実施形態では、本開示は、複数の細胞を含む培養物を接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本細胞は脊椎動物中にある。いくつかの実施形態では、本細胞は哺乳動物中にあり、細胞を接触させることは、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤をこの哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト対象である。いくつかの実施形態では、本細胞は癌細胞であり、かつ／または哺乳動物は癌と診断された哺乳動物である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、結腸、肺、前立腺、皮膚、血液、肝臓、腎臓、乳房、膀胱、骨、脳、髄芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胃、卵巣、食道、膵臓、または精巣癌細胞からなる群から選択される癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、髄芽細胞腫細胞、基底細胞癌細胞、または母斑性基底細胞細胞癌細胞（ゴーリン症候群細胞）である。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法のうちのいずれかで使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の突然変異体スムースンドタンパク質のうちのいずれかの発現を阻害するポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、本明細書に開示の突然変異体スムースンドタンパク質のうちのいずれかをコードする核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、野生型スムースンドタンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする核酸）にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に開示の突然変異体スムースンドポリペプチドのいずれかをコードするｍＲＮＡ転写産物を標的にするＲＮＡｉアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉアンタゴニストはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１９〜２３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖であり、一端または両端で短い突出（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、本明細書に開示の突然変異体スムースンドポリペプチドのいずれかをコードするｍＲＮＡ転写産物を標的にする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡは、野生型スムースンドタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物（例えば、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする核酸）を標的にしない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡを含む。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法のうちのいずれかで使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の突然変異体スムースンドポリペプチドのうちのいずれかに特異的に結合する小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路においてスムースンドの下流で作用するポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、小分子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路とは明白に異なる経路においてポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、小分子はブロモドメイン阻害剤である。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤はＢＲＤ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、各々全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｉｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：３０５−３１２、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ，５：２８８−２９６、Ｇａｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，２４（２）：１８５−１９９に記載されているブロモドメイン阻害剤のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＪＱ１、ＪＱ２、ＢＩ−２５３６及びＴＧ−１０１３４８にょるＢＲＤ４である。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法のうちのいずれかで使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の突然変異体スムースンドポリペプチドのうちのいずれかに特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヘッジホッグシグナル伝達経路においてスムースンドの下流で作用するポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかに従って薬剤と接触させた細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる阻害剤（例えば、ＨＰＩ）とも接触させる。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる阻害剤は、ベラトラム（ｖｅｒａｔｒｕｍ）型のステロイド系アルカロイドである。いくつかの実施形態では、このベラトラム型のステロイド系アルカロイドは、シクロパミン、またはＫＡＡＤ−シクロパミンもしくはその任意の機能的誘導体（例えば、ＩＰＩ−２６９６０９またはＩＰＩ−９２６）である。いくつかの実施形態では、ベラトラム型のステロイド系アルカロイドは、ジェルビンまたはその任意の機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、さらなる阻害剤は、ビスモデギブ、ソニデギブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、もしくはＬＹ２９４０６８０、またはそれらの任意の機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、さらなる阻害剤は、ベラトラムアルカロイドまたはビスモデギブに化学的に関係していないスムースンド阻害剤であり、これには、限定されないが、ソニデギブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、ＬＹ２９４０６８０、エリベッジ、ＢＭＳ−８３３９２３（ＸＬ３１９）、ＬＤＥ２２５（エリスモデギブ（Ｅｒｉｓｍｏｄｅｇｉｂ））、ＰＦ−０４４４９９１３、ＮＶＰ−ＬＤＥ２２５、ＮＶＰ−ＬＥＱ５０６、ＴＡＫ−４４１、ＸＬ−３１９、ＬＹ−２９４０６８０、ＳＥＮ４５０、イトラコナゾール、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、またはＰＦ−０４４４９９１３が含まれる。いくつかの実施形態では、さらなる阻害剤は、Ａｍａｋｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９（１１）：１４１０−１４２２（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる阻害剤は抗体である。いくつかの実施形態では、本抗体は、ヘッジホッグタンパク質に結合する、例えば、特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる阻害剤はＲＮＡｉアンタゴニストである。
【０３７６】
治療または診断を必要とする対象には、異常なヘッジホッグシグナル伝達を既に有する対象、及び異常なヘッジホッグシグナル伝達を有する傾向にある対象、またはそれが予防される対象が含まれる。例えば、対象は、本開示の方法に従って、ヘッジホッグ経路阻害剤を受けた後で、患者が以下のうちの１つ以上の観察可能及び／または測定可能な低下または不在を示す場合に、異常なヘッジホッグシグナル伝達についてうまく「治療される」：腫瘍細胞の数の低下もしくはそのような細胞の不在；腫瘍サイズの低下；軟組織及び骨への癌の蔓延を含む周辺器官への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の遅延、及びいくつかの実施形態では、停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延、及びいくつかの実施形態では、停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；ならびに／または特定の癌と関連する症状のうちの１つ以上のある程度の緩和；低下した罹患率及び死亡率、ならびに生活の質の問題の改善。そのようなヘッジホッグ経路阻害剤は、既存の癌細胞の成長を防止し、かつ／またはそれを殺滅し得る範囲で、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。これらの兆候または症状の低下は、患者によっても感じられ得る。さらに、ヘッジホッグ経路阻害剤への曝露の成功は（特に、腫瘍応答が測定可能でない場合）、皮膚穿孔生検または毛包のいずれかにおけるＧｌｉ１発現によってモニタリングすることができる（ビスモデギブについて行われる通り）。
【０３７７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示のヘッジホッグ経路阻害剤のうちのいずれかによる治療を受けた対象は、ビスモデギブに対して耐性である突然変異体スムースンドタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載のスムースンド突然変異のうちのいずれかを含むスムースンドタンパク質を発現する。ある特定の実施形態では、対象は、配列番号１の２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５のうちのいずれか１つ以上に対応するアミノ酸位置で突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号１のＴ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌに対応するアミノ酸位置での突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかによる治療の前に、対象は、本明細書に記載のスムースンド突然変異のうちのいずれかを含むスムースンドタンパク質を発現することが決定されている。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかによる治療の前に、対象は、配列番号１の２４１、２８１、４０８、４５９、４６９、５３３、及び／または５３５のうちのいずれか１つ以上に対応するアミノ酸で突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現することが決定されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかによる治療の前に、対象は、配列番号１のＴ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌに対応するアミノ酸での突然変異を含むスムースンドポリペプチドを発現することが決定されている。
【０３７８】
疾患における成功した治療及び改善を評価するための上記のパラメータは、医師にはよく知られている慣習的な手順によって容易に測定可能である。癌治療については、例えば、疾患無増悪期間（ＴＴＰ）を評価すること及び／または奏功率（ＲＲ）を決定することによって、効力を測定することができる。転移は、病期分類試験、ならびに転移の程度を決定するためのカルシウムレベル及び他の酵素についての試験によって決定することができる。ＣＴスキャンを行って、腫瘍または癌の外の領域への蔓延を探すこともできる。予後判定、診断、及び／または治療のプロセスに関する本明細書に記載の開示は、例えば、Ｇｌｉ１発現の決定及び検査を伴う。
【０３７９】
疾患（例えば、癌）の治療、その症状の軽減、またはその診断を目的とした「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレットなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は出生後である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は小児である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は成体である。
【０３８０】
１つ以上のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与には、同時（並行）、及び任意の順序での連続投与が含まれる。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の癌のうちのいずれかから選択される癌、または腫瘍の１つ以上の細胞がヘッジホッグ経路成分において本明細書に記載の突然変異のうちのいずれかなどの突然変異を含む癌の治療に使用される。腫瘍は、あるレベルの不均一性を有し得る細胞を含むことが、一般に理解されるべきであり、本明細書で具体的に記述される。したがって、腫瘍中の全ての細胞が特定の有害な突然変異を含む必要はない。したがって、本開示は、治療される癌または腫瘍が、ヘッジホッグ経路の成分において本明細書に記載の突然変異のうちのいずれかなどの突然変異を有する細胞を（そのような突然変異が腫瘍の全細胞に存在する場合であっても）含む方法を企図している。
【０３８２】
ヘッジホッグ経路阻害剤の使用は、罹患組織及び／または細胞が高いヘッジホッグ経路活性化を呈する障害を特異的に標的にし得ることがさらに企図されている。ヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるＧｌｉ１及びＧｌｉ２を含むＧｌｉ遺伝子の発現は、幅広い範囲または組織及び障害にわたってヘッジホッグシグナル伝達と最も一貫して相関する一方、Ｇｌｉ３はそれほどではない。Ｇｌｉ遺伝子は、ヘッジホッグシグナル伝達の完全な作用を誘発するために必要とされる多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子をコードする。しかしながら、Ｇｌｉ３転写因子は、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のリプレッサーとしても作用することができるため、Ｇｌｉ３の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の影響の減少を引き起こし得る。Ｇｌｉ３が転写活性物質として作用するのか、またはリプレッサーとして作用するのかは、翻訳後事象に依存するため、Ｇｌｉ３タンパク質の活性化形態（対抑制形態）を検出するための方法（ウェスタンブロットなど）もヘッジホッグ経路活性化の信頼性のある測定であることが予測される。Ｇｌｉ１遺伝子は、多様な癌、過形成、及び未熟肺において強く発現され、ヘッジホッグ経路の関係する活性化のためのマーカーとしての役割を果たす。さらに、高いＧｌｉ遺伝子発現を有する未熟肺などの組織は、ヘッジホッグ阻害剤によって強い影響を受ける。したがって、Ｇｌｉ遺伝子発現の検出は、ヘッジホッグアンタゴニストによる治療の利益を特に受けることになる組織及び疾患を同定するための強力な予測ツールとして使用し得ることが企図される。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１発現レベルは、転写産物の直接的検出か、またはタンパク質レベルもしくは活性の検出のいずれかによって検出される。転写産物は、Ｇｌｉ１転写産物またはそれから合成されるｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションまたはプローブに主に依存する幅広い技法のいずれかを使用して検出し得る。周知の技法には、転写レベルのノーザンブロット、逆転写酵素ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルを検出するための方法には、ウェスタンブロット、免疫沈降、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（いくつかの実施形態では、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されている標準に対して比較する））、及び質量分析が含まれる。質量分析は、特定の試料中の多くの異なるタンパク質レベルのハイスループット同定を可能にするために、一連の精製ステップと組み合わせてもよい。質量分析及び２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾などを含むタンパク質への翻訳後修飾を同定するために使用することもできる。Ｇｌｉ活性はまた、基質ＤＮＡへの結合または標的プロモーターのインビトロ転写活性化を分析することによって評価してもよい。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリントアッセイ、及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは全て、ＤＮＡ上のＧＵ結合部位に結合することができるタンパク質の存在を評価するために使用し得る方法である。Ｊ  ＭｏＩ．Ｍｅｄ  ７７（６）：４５９−６８（１９９９）、Ｃｅｌｌ  １００（４）：４２３−３４（２０００）、Ｄｅｖ��ｌｏｐｍｅｎｔ  １２７（１９）：４９２３−４３０１（２０００）。
【０３８３】
Ｇｌｉ１はヘッジホッグ活性化中に極めて普遍的に発現されるため、いかなる程度のＧｌｉ１過剰発現も、ヘッジホッグ経路阻害剤が有効な治療薬となることの決定に有用であるはずである。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１は、正常な対照細胞／組織／対象よりも少なくとも２倍高いレベルで発現されるはずである。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１発現は、正常な細胞／組織／対象よりも４、６、８、または１０倍高い。
【０３８４】
ある特定の実施形態では、Ｇｌｉ１転写レベルを測定し、異常に高いＧｌｉ１レベルを示す病変または障害組織をヘッジホッグ経路阻害剤で治療する。他の実施形態では、治療する状態は、治療する組織においてＧｌｉ１発現レベルの測定を行わなくても、ヘッジホッグ経路の異常な活性化との顕著な相関を有することが分かっている。未熟肺組織、肺癌（例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌腫）、乳癌（例えば、下位導管癌腫（ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、下位小葉癌腫（ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｌｏｂｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、管状腺癌腫）、前立腺癌（例えば、腺癌）、及び良性前立腺肥大は全て、ある特定の症例において激しく上昇したＧｌｉ１発現レベルを示す。したがって、Ｇｌｉ１発現レベルは、これらの組織のどれをヘッジホッグ経路阻害剤で治療するべきかを決定するための強力な診断手段である。さらに、尿路上皮細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の泌尿生殖器癌）もある特定の症例において上昇したｇｌｉ−ｌレベルを有することになるという実質的に相関する証拠がある。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の喪失が膀胱癌において一般的であることが知られている。Ｐｔｃｈ１遺伝子がこの位置に存在し、多くの他の癌種のように、Ｐｔｃｈｌ機能喪失が恐らく過剰増殖の部分的な原因である。したがって、そのような癌は、高いＧｌｉ１発現を示し、ヘッジホッグアンタゴニストによる治療に特に適している。
【０３８５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヘッジホッグ経路阻害剤のうちのいずれかは、ｐｔｃｈ−１及び／またはｐｔｃｈ−２突然変異、例えば、ｐａｔｃｈｅｄ−１またはｐａｔｃｈｅｄ−２機能喪失突然変異を有する腫瘍を有する対象の治療に使用される。ｐｔｃｈ−１及びｐｔｃｈ−２の発現はまた、ヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるが、典型的にはｇｌｉ遺伝子と同じ程度までではなく、その結果、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣る。ある特定の組織において、発現されるのはｐｔｃｈ−１またはｐｔｃｈ−２の一方のみであるが、ヘッジホッグ経路は極めて活性である。例えば、精巣発生において、デザートヘッジホッグが重要な役割を果たし、ヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２のみが発現される。したがって、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路活性化のためのマーカーとしては個々で信頼性を欠き得るが、両方の遺伝子の同時測定は、ヘッジホッグアンタゴニストによって治療される組織についてのより有用なインジケータとして企図される。
【０３８６】
脊椎動物における分化した組織の順序立った空間的配置の形成へのヘッジホッグシグナル伝達の広範な関与を踏まえると、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤は、インビトロとインビボとの両方で数々の異なる脊椎動物組織を生成及び／または維持するためのプロセスに使用し得る。本ヘッジホッグ経路阻害剤は、必要に応じて、上記の製剤のうちのいずれでもあり得る。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、本ヘッジホッグ経路阻害剤は、悪性髄芽細胞腫及び他の原発性ＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍のための治療レジメンの一部として使用することができる。原発性脳腫瘍である髄芽細胞腫は、小児において最も一般的な脳腫瘍である。髄芽細胞腫は、後頭蓋窩で生じる未分化神経外胚葉性（ＰＮＥＴ）腫瘍である。これらは、全小児脳腫瘍の約２５％を占める。組織学的には、これらは、真性ロゼットで一般的配列される小円形細胞腫瘍であるが、星状膠細胞、上衣細胞、またはニューロンへのいくらかの分化を示し得る。ＰＮＥＴは、松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む脳の他のエリアにおいて生じ得る。テント上領域において生じるこれらのものは、一般に、予後が悪化する。
【０３８８】
髄芽細胞腫／ＰＮＥＴは、切除後にＣＮＳのどこかで再発することが知られており、さらには骨に転移し得る。したがって、治療前検査は、「落とした転移」の可能性を排除するために、脊髄の検査を含むべきである。ガドリニウム増強ＭＲＩがこの目的での脊髄造影の大部分に取って代わっており、慣習的な手順としてＣＳＦ細胞診断を術後に得る。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、本ヘッジホッグ経路阻害剤は、上衣腫に対する治療プログラムの一部として使用される。上衣腫は、小児における小児脳腫瘍の約１０％を占める。全体的には、これらは、脳室の上衣内壁から生じ、ロゼット、カナル、及び血管周囲ロゼットを顕微鏡的に形成する腫瘍である。上衣腫を患うと報告された５１人の小児のＣＨＯＰシリーズにおいて、３／４が組織学的に良性であり、約２／３が第４室の領域から生じ、１／３がテント上領域において提示された。提示時の年齢は、出生時から４歳がピークである。平均年齢は約５歳である。この疾患を患う非常に多くの小児が乳児であるため、彼らは多様な療法を必要とする。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤は、様々な腫瘍へのヘッジホッグシグナル伝達の関与、または発症中のそのような組織におけるヘッジホッグもしくはその受容体の発現に基づいて、異常調節されたヘッジホッグ活性を有する腫瘍の成長を阻害するために使用することができる。そのような腫瘍には、限定されないが、ゴーリン症候群に関係する腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、髄膜腫など）、ｐｔｃｈ突然変異と関連する腫瘍（例えば、血管腫、横紋筋肉腫など）、Ｇｌｉ１増幅に起因する腫瘍（例えば、膠芽腫、肉腫など）、Ｓｍｏ機能障害に起因する腫瘍（例えば、基底細胞癌など）、ｐｔｃ相同体であるＴＲＣ８と結び付く腫瘍（例えば、腎癌腫、甲状腺癌腫など）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば、骨癌など）、Ｓｆｔ／ｘ誘導性腫瘍（例えば、肺癌、軟骨肉腫など）、ヘッジホッグタンパク質を過剰発現している腫瘍、及び他の腫瘍（例えば、乳癌、泌尿生殖器癌（例えば、腎臓、膀胱、尿管、前立腺など）、副腎癌、消化管癌（例えば、胃、小腸など）が含まれる。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤は、いくつかの形態の癌を治療するためにも使用し得る。これらの癌には、限定されないが、前立腺癌、膀胱癌、肺癌（小細胞及び非小細胞を含む）、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜もしくは他の子宮癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎の癌、膣の癌、尿道の癌、胆嚢癌、食道癌、または膵臓癌が含まれる。さらなる癌の種類には、骨格筋または平滑筋の癌、胃癌、小腸の癌、唾液腺の癌、肛門癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌、及び鼻咽頭癌が含まれる。本開示のヘッジホッグアンタゴニストで治療することができるさらなる例示的な癌の形態には、ヘッジホッグ発現細胞を含む癌が含まれる。本開示のヘッジホッグアンタゴニストで治療することができるまたさらなる例示的な癌の形態には、Ｇｌｉ発現細胞を含む癌が含まれる。一実施形態では、癌は、ｐａｔｃｈｅｄ−１における突然変異を特徴としない。いくつかの実施形態では、癌は、スムースンド及び／またはＳｕＦｕ突然変異を特徴とする。
【０３９２】
ある特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤を使用して、基底細胞癌を有する対象を治療してもよい。特定の実施形態では、基底細胞癌は母斑性基底細胞癌である。特定の実施形態では、対象はゴーリン症候群を有する。
【０３９３】
前述のものは、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤のためのインビトロ及びインビボによる使用の単なる例である。ヘッジホッグ経路阻害剤はまた、突然変異体スムースンド生物活性を研究するため、突然変異体スムースンド及びその結合パートナーを様々な細胞及び組織から精製するため、ならびにヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる成分を同定するために、突然変異体スムースンドタンパク質（例えば、Ｔ２４１Ｍ、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｃ４６９Ｙ、Ｓ５３３Ｎ、及び／またはＷ５３５Ｌ突然変異を有するスムースンドタンパク質）のための自然の標的または結合パートナーを同定することにおける使用に好適である。
【０３９４】
ある特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、開示の抗体のうちのいずれかである。本開示の抗体は、例えば、インビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療方法で使用し得る。一態様では、本開示は、インビボまたはインビトロのいずれかで、癌を治療し、不要な細胞増殖を阻害し、癌の転移を阻害し、かつ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、抗体と突然変異体ＳＭＯとの結合が許容される条件下で、細胞を本開示の抗体に曝露することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、細胞は、骨髄性白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、腎細胞癌細胞、及び膠芽腫細胞である。一実施形態では、本開示の抗体は、突然変異体ＳＭＯの活性を阻害するために使用することができ、この方法は、突然変異体ＳＭＯの活性が阻害されるように、突然変異体ＳＭＯを本開示の抗体に曝露することを含む。
【０３９５】
一態様では、本開示は、癌を治療する方法であって、個体に有効量の本開示の抗体を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、癌を治療する方法は、個体に、本開示の抗体を含む有効量の医薬製剤と、任意に、以下に提供するものなどの、少なくとも１つの追加の治療剤とを投与することを含む。
【０３９６】
本開示の抗体は、治療において単独でまたは他の組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、本開示の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤及び／またはアジュバントと共投与することができる。特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０３９７】
上述のそのような組合せ療法は、組合せ投与（この場合、２種以上の治療剤が同じまたは個別の製剤中に含まれる）及び個別投与を包含し、その場合、本開示の抗体の投与は、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与の前に、その投与と同時に、及び／またはその投与の後に起こることができる。本開示の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０３９８】
一実施形態では、本開示の抗体は、突然変異体ＳＭＯの発現及び／または活性の増大と関連する障害を患っている個体の突然変異体ＳＭＯに結合させる方法であって、個体の突然変異体ＳＭＯが結合されるように個体に抗体を投与することを含む、方法で使用される。一実施形態では、突然変異体ＳＭＯはヒト突然変異体ＳＭＯであり、個体はヒトである。
【０３９９】
本開示の抗体（及び任意の追加の治療剤またはアジュバント）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の好適な手段によって、かつ所望する場合、局所的治療、病巣内投与のために投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下への投与が含まれる。さらに、抗体は、特に漸減用量の抗体を用いる、パルス注入によって好適に投与される。投与が短期間のものであるかまたは持続的なものであるかに一部依存して、投薬は、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によるものであることができる。
【０４００】
本開示の抗体の結合標的の位置を、抗体の調製及び投与において考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本開示の特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞に導入されるべき抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、細胞内でイントラボディとして発現させることができる。本明細書で使用される「イントラボディ」という用語は、例えば、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５（１９９７）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１６３−１７０（２００４）、米国特許第６，００４，９４０号及び第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０７７９４５号に記載されているような、細胞内で発現され、標的分子に選択的に結合することができる抗体またはその抗原結合部分を指す。細胞内抗体を作製するための遺伝子治療の使用に関しては、例えば、１９９６年３月１４日公開のＷＯ９６／０７３２１も参照されたい。
【０４０１】
イントラボディの細胞内発現は、所望の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸（抗体または抗原結合断片をコードする遺伝子と通常関連している野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠く）を標的細胞に導入することによって達成し得る。本開示の抗体の全てまたは一部をコードする１つ以上の核酸は、細胞内標的ポリペプチドに結合して標的ポリペプチドの活性を調節することができる１つ以上のイントラボディが発現されるように、標的細胞に送達することができる。核酸を細胞に導入する任意の標準的な方法を使用することができ、これには、限定されないが、マイクロインジェクション、バリスティックインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ならびに関心の核酸を担持するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びワクシニアベクターを用いるトランスフェクションが含まれる。
【０４０２】
ある特定の実施形態では、核酸（任意にベクターに含まれる）は、インビボ及びエクスビボの方法によって患者の細胞に導入し得る。インビボ送達の一例では、核酸を、患者に直接、例えば、治療的介入が必要とされる部位に注射する。インビボ送達のさらなる例では、核酸を、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）ならびに脂質に基づく系（遺伝子の脂質媒介性移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）によるトランスフェクションを使用して細胞に導入する。特定の遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、ならびにＷＯ９３／２５６７３及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。エクスビボ治療の一例では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を、直接的に、または例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜の中に封入して、患者に投与する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号を参照されたい）。核酸のエクスビボ送達に一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０４０３】
別の実施形態では、内在化抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強するある特定の特徴を保有することができるか、またはそのような特徴を保有するように修飾することができる。これを達成するための技術は、当技術分野で既知である。例えば、抗体の陽イオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい）。リポフェクションまたはリポソームを使用して、抗体を細胞内に送達することもできる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質に特異的に結合する最も小さい阻害性断片が有利である場合がある。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成され、かつ／または組換えＤＮＡ技術によって産生されることができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照されたい。
【０４０４】
標的細胞内への抗体の進入は、当技術分野で既知の他の方法によって増強することができる。例えば、ある特定の配列、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔまたはアンテナペディアホメオドメインタンパク質に由来する配列は、細胞膜を横断する異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６：４３２５−４３２９を参照されたい。
【０４０５】
抗体の結合標的が脳内に位置する場合、本開示の特定の実施形態は、血液脳関門を横断する抗体を提供する。血液脳関門を横断して分子を輸送するための、いくつかの当技術分野で既知の手法が存在し、これには、限定されないが、物理的方法、脂質に基づく方法、幹細胞に基づく方法、ならびに受容体及びチャネルに基づく方法が含まれる。
【０４０６】
血液脳関門を横断して抗体を輸送する物理的方法には、限定されないが、血液脳関門を完全に迂回するもの、または血液脳関門に開口を形成することによるものが含まれる。迂回法には、限定されないが、脳内への直接注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：３９８−４０６（２００２）を参照）、組織内注入／対流増強送達（例えば、Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．を参照）、ならびに脳内への送達装置の埋込み（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）、及びＧｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒｓ（商標），Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照）が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定されないが、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照）、浸透圧（例えば、高張マンニトールの投与によるもの（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，血液脳関門及びその操作の意義（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １＆２，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、例えば、ブラジキニンまたは透過処理剤Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第第５，１１２，５９６号、第５，２６８，１６４号、第５，５０６，２０６号、及び第５，６８６，４１６号を参照）、ならびに抗体をコードする遺伝子を含むベクターを用いる、血液脳関門をまたぐニューロンのトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照）が含まれる。
【０４０７】
血液脳関門を横断して抗体を輸送する脂質に基づく方法には、限定されないが、抗体を、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片と結合されているリポソーム中に封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３を参照）、及び抗体を低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照）中にコーティングすることが含まれる。
【０４０８】
血液脳関門を横断して抗体を輸送する幹細胞に基づく方法は、関心の抗体を発現するように神経前駆細胞（ＮＰＣ）を遺伝子操作し、その後、治療されるべき個体の脳に幹細胞を移植することを必要とする。Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００５年１２月１５日、先行オンライン出版（齧歯類及び霊長類モデルの脳に移植したとき、神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作されたＮＰＣがパーキンソン病の症状を軽減したことを報告している）を参照されたい。
【０４０９】
血液脳関門を横断して抗体を輸送する受容体及びチャネルに基づく方法には、限定されないが、糖質コルチコイド遮断薬を使用して血液脳関門の透過性を増加させること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、第２００３／０１６２６９５号、及び第２００５／０１２４５３３号を参照）；カリウムチャネルを活性化させること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照）；抗体にトランスフェリンをコーティングし、１つ以上のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照）、ならびに抗体を陽イオン化すること（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照）が含まれる。
【０４１０】
本開示の抗体は、医療実施基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与される。これに関連して考慮される因子には、治療される具体的な障害、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医療従事者に既知の他の因子が含まれる。抗体は、必ずしもその必要はないが、場合により、問題になっている障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び上で考察された他の因子によって決まる。これらは、通常、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路で、もしくは本明細書に記載の投薬量の約１〜９９％で、または経験的／臨床的に適切であることが明らかにされている任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０４１１】
疾患の予防または治療のために、本開示の抗体の適切な投薬量（単独でまたは１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療されるべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのかということ、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量によって決まる。抗体は、一度にまたは一連の治療の間、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、患者への投与のための初期候補投薬量であることができる。１つの典型的な１日投薬量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間またはそれより長くにわたる繰り返し投与については、状態に応じて、通常、疾患症状の所望の抑制が起こるまで治療を持続させる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、もしくは１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つ以上の用量（またはその任意の組み合せ）を患者に投与することができる。そのような用量は、間欠的に、例えば、週に１回または３週に１回（例えば、患者が約２〜約２０用量、または例えば、約６用量の抗体を受容するように）投与することができる。初期のより高い負荷用量と、それに次ぐ、１つ以上のより低い用量を投与することができる。例示的な投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量と、それに次ぐ、週に１回の約２ｍｇ／ｋｇの抗体の維持量を投与することを含む。しかしながら、他の投薬量レジメンが有用である場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０４１２】
上記の治療方法はいずれも、抗突然変異体ＳＭＯ抗体の代わりにまたはそれに加えて本発明の免疫コンジュゲートを使用して実施し得ることが理解されよう。
【０４１３】
ＶＩＩ．医薬製剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヘッジホッグ経路阻害剤または本開示に従うヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかは、薬学的組成物中で製剤化され得る。
【０４１４】
本開示に従って使用されるヘッジホッグ経路阻害剤の薬学的組成物は、所望の純度を有する薬剤（複数可）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００））と混合することによって保管のために調製し得る。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及び他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどの等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩生成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、本開示に従う、及び／または本明細書に記載のヘッジホッグ経路阻害剤の製剤のいずれも、治療される特定の症状に必要な、１つ超の活性化合物、いくつかの実施形態では、互いに悪影響を及ぼさない、相補的活性を有する化合物を含み得る。ある特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤及び第２の活性剤は、ともに製剤化される（例えば、両方の薬剤を含む製剤または組成物）ことが認識されるべきである。他の実施形態では、２つ（またはそれ以上）の活性剤を別々に製剤化して、その結果、別々の製剤を、一緒にまたは別々に、マーケティング、販売、保管、及び使用することができるようにする。別々に製剤化する場合、本開示は、それらを同じ時間または異なる時間に投与することができ、ある特定の実施形態では、組み合わせて同時投与し得ることを企図する。
【０４１６】
例えば、前述の治療薬（複数可）に加えて、さらなる抗体、例えば、第２のそのような治療薬、または他の何らかの標的（例えば、腫瘍の成長に影響する成長因子）に対する抗体を製剤に含めることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ阻害剤（例えば、ロボトキニン（ｒｏｂｏｔｋｉｎｉｎ））を製剤に含めることが望ましいことがある。あるいは、またはさらに、組成物は、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害薬剤、抗ホルモン剤、及び／または心臓保護剤をさらに含んでもよい。そのような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。いくつかの実施形態では、さらなる活性化合物はステロイド系アルカロイドである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドは、シクロパミン、またはＫＡＡＤ−シクロパミンもしくはジェルビンもしくはその任意の機能的誘導体（例えば、ＩＰＩ−２６９６０９またはＩＰＩ−９２６）である。いくつかの実施形態では、さらなる活性化合物は、ビスモデギブ、ソニデギブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、もしくはＬＹ２９４０６８０、またはそれらの任意の誘導体である。いくつかの実施形態では、さらなる活性化合物は、Ａｍａｋｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９（１１）：１４１０−１４２２（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、さらなる活性化合物は、ベラトラムアルカロイドまたはビスモデギブに化学的に関係していない別のスムースンド阻害剤であり、これには、限定されないが、エリベッジ、ＢＭＳ−８３３９２３（ＸＬ３１９）、ＬＤＥ２２５（エリスモデギブ（Ｅｒｉｓｍｏｄｅｇｉｂ））、ＰＦ−０４４４９９１３、ＮＶＰ−ＬＤＥ２２５、ＮＶＰ−ＬＥＱ５０６、ＴＡＫ−４４１、ＸＬ−３１９、ＬＹ−２９４０６８０、ＳＥＮ４５０、イトラコナゾール、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、またはＰＦ−０４４４９９１３が含まれる。上述のように、本開示は、第２の活性剤がヘッジホッグ経路阻害剤と一緒に（例えば、２つの活性剤を含む単一の製剤として）製剤化される製剤、及び２つの活性剤が２つの別々の製剤または組成物中に存在する実施形態を企図している。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のものなどの本開示のヘッジホッグ経路阻害剤のうちのいずれかはまた、例えば、コアセルベーション技法によってか、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに、封入してもよい。そのような技法は、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙに開示されている。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、本開示のヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかは、持続放出調製物中で製剤化される。持続放出調製物の好適な例には、本抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、成形品、例えば、フイルムまたはマイクロカプセルの形態で存在する。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０４１９】
本開示の方法における使用のための本開示の組成物の量は、標準的な臨床技法によって決定することができ、特定の症状または使用に応じて変化し得る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導いた用量反応曲線から外挿し得る。
【０４２０】
ある特定の実施形態では、薬学的調製物を含む本開示の組成物は、非発熱性である。換言すると、ある特定の実施形態では、本組成物は、実質的に発熱物質を含まない。一実施形態では、本開示の製剤は、内毒素及び／または関連する発熱性物質を実質的に含まない発熱物質不使用製剤である。内毒素には、微生物内部に閉じ込められ、その微生物が分解または死亡するときにのみ放出される毒素が含まれる。発熱性物質には、細菌及び他の微生物の外膜由来の熱誘導性熱安定性物質（糖タンパク質）も含まれる。これらの物質の両方は、ヒトへの投与時に、熱、低血圧、及びショックを引き起こし得る。可能性のある悪影響に起因して、内毒素は、少量であっても、静脈内投与される製薬溶液から除去しなければならない。Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用のための単一の１時間の期間で体重１キログラム当たりの用量当たり５内毒素単位（ＥＵ）という上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を、比較的大きな用量で及び／または長い期間にわたって（例えば、患者の一生涯の間など）投与する場合、有害で危険な内毒素は少量であっても危険となり得る。ある特定の実施形態では、組成物中の内毒素及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、本ヘッジホッグ経路阻害剤は、滅菌製剤において製剤化される。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０４２２】
ＩＸ．製造品及びキット
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のヘッジホッグ経路阻害剤などの本開示のヘッジホッグ経路阻害剤は、製造品において調製される。同様に、突然変異体ＳＭＯポリペプチドなどの本開示のポリペプチド及び核酸は、製造品として調製されてもよい。いくつかの実施形態では、製造品は、容器と、ヘッジホッグシグナル伝達の全体的または部分的な阻害のため、あるいはヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化に起因する障害または状態の治療のための使用を示す、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。他の実施形態では、製造品は、容器と、スクリーニングアッセイにおける使用を示す、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、癌症状を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針にょって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋またはバイアルであってもよい。組成物中の少なくとも１つの活性剤はヘッジホッグ経路阻害剤である。ラベルまたは添付文書は、ヘッジホッグ経路阻害剤を投与するため、またはＳＭＯポリペプチドもしくは核酸もしくはベクターもしくは宿主細胞を使用するための指示をさらに含むことになる。さらに、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びブドウ糖液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的な観点及びユーザーの観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、様々な他の目的、例えば、突然変異体ＳＭＯタンパク質発現細胞殺滅アッセイ、ヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチドの細胞からの精製または免疫沈降に有用なキットが提供される。突然変異体ＳＭＯタンパク質の単離及び精製のため、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）と結合させた各突然変異体ＳＭＯタンパク質結合試薬を含むことができる。例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおける、インビトロでの突然変異体ＳＭＯタンパク質の検出及び定量化のために、そのような分子を含むキットが提供され得る。いくつかの実施形態では、本製造品のように、キットは、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、容器は、本開示とともに使用可能な少なくとも１つのそのようなヘッジホッグ経路阻害剤試薬を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、例えば、希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含むさらなる容器を含めてもよい。いくつかの実施形態では、ラベルまたは添付文書は、組成物の説明、及び意図されるインビトロまたは診断的使用のための指示を提供し得る。
【実施例】
【０４２４】
本開示をここまでで概して説明してきたが、本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されることになり、これらの実施例は、単に本開示のある特定の態様及び実施形態を例示する目的で含めたのであって、本開示を限定することは意図していない。
【０４２５】
実施例１：ビスモデギブ耐性基底細胞癌の遺伝子分析
標的療法（例えば、癌療法）に対する臨床応答は、薬物耐性を付与する遺伝子変化の獲得に起因して短命に終わり得る。耐性機構の同定は、新規の治療戦略の指針となるであろう。不適切なＨｈシグナル伝達は、基底細胞癌（ＢＣＣ）を含むいくつかの癌と結び付けられる。ＰＴＣＨにおける機能喪失突然変異（約９０％）及びＳＭＯにおける活性化突然変異（約１０％）が、ＢＣＣにおける主要な駆動因子である。ビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９）への耐性の臨床機構を、再発した基底細胞癌のエクソーム、ＲＮＡ、及びコピー数分析を使用して同定した。
【０４２６】
図２に示すように、ビスモデギブ耐性は、ビスモデギブ耐性ＢＣＣを患う患者における上昇したヘッジホッグ経路シグナル伝達と関連した。ビスモデギブ耐性ＢＣＣのエクソームシーケンシング及びコピー数分析の結果を以下で表３に示す。
【表６】
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【０４２７】
遺伝子型決定により、さらなるビスモデギブ耐性腫瘍におけるＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異の第３の事例が明らかとなった。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖは、分析した９人の耐性患者のうち３人で治療後の生検において見出された再発性突然変異である。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異は、治療後にのみ存在し、４２個の独立した未治療ＢＣＣ試料には存在しなかった。（図３参照）。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ突然変異は、ＳＭＯを活性化することができる。
【０４２８】
ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ突然変異も再発性ＢＣＣにおいて検出された。図４に示すように、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃは、ビスモデギブ結合ポケット中にある。
【０４２９】
ＷＴ−ＳＭＯ、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、ＰＴＣＨ、または空ベクター（ＥＶ）を、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中でＧＬＩ１ルシフェラーゼレポーターでコトランスフェクトした。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖが、ＰＴＣＨ１及びビスモデギブに対する感受性が減少した活性化突然変異であることが示された。（図５Ａ〜５Ｃ。エラーバーは標準偏差を表す。）ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃは、ＳＭＯ−ＷＴと同じだけＰＴＣＨ阻害に感受性である。（図５Ｄ−５Ｅ。エラーバーは標準偏差を表す。）示すコンストラクトでトランスフェクトした２９３細胞を、５０μＭの冷ビスモデギブを用いてまたは用いずに、５ｎＭの［３Ｈ］−ビスモデギブとともにインキュベートした。特異的結合＝全体−非特異的結合。（図５Ｅ。エラーバーは標準偏差を表す。）
【０４３０】
臨床ＳＭＯ突然変異のサブグループは２つあるように見える。１）薬物感受性が低減した活性化サブグループ（Ａ４５９Ｖ及びＷ５３５Ｌを含む）、ならびに２）Ｐｔｃｈ感受性を維持するが、ビスモデギブ結合ポケットの立体構造を分断する突然変異サブグループ（Ｄ４７３Ｈ及びＷ２８１Ｃを含む）。
【０４３１】
実施例２：ビスモデギブ耐性及び非治療ＢＣＣのゲノム分析
ビスモデギブ耐性と関連する突然変異を特定するために、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を、ゴーリン症候群（ｎ＝５）及び孤発性（ｎ＝６）患者由来のＢＣＣに行い、標的化ＳＭＯシーケンシングを、さらなるゴーリン患者由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に行った。すべての患者は、最初はビスモデギブの臨床的利益を経験したが、その後治療を受けている間に進行した。
【０４３２】
ビスモデギブ耐性ＢＣＣ由来の合計１６個の生検が分析されるように、患者のうちの４人から２つの明白に異なる生検を収集した。患者は、転移性（図６Ｂ）または局所進行性ＢＣＣ（図６Ｃ）と診断され、薬物耐性病変がＢＣＣであったことが組織学的に確認された（図６Ｄ）。比較のために、非治療ゴーリン症候群（ｎ＝１６）及び孤発性（ｎ＝２７）ＢＣＣ患者由来の腫瘍をＷＥＳに供した。２つの明白に異なる生検をゴーリン患者のうちの５人から得て、これにより合計４８個の非治療ＢＣＣ生検を得た。ゴーリン患者由来の非治療ＢＣＣ試料の平均体細胞突然変異は、３３．５／メガベース（Ｍｂ）であり、６．２〜６８．９／Ｍｂで変動し、孤発性患者については、５０．５／Ｍｂであり、２．４〜１６２．２／Ｍｂの範囲であった。これらの率は、黒色腫を含む他の癌と比較して高く（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２０１３）。体細胞突然変異スペクトルの大域分析により、両方のコホートにおいてシトシンからチミンへの（Ｃ＞Ｔ）移行突然変異の優位性が明らかになり、これは、紫外線光誘導性突然変異生成を示す（Ｍｉｌｌｅｒ、１９８５）。
【０４３３】
ＲＮＡ−ｓｅｑを使用する再発性ＢＣＣ生検（ｎ＝１１）の転写分析により、Ｈｈ標的遺伝子ＧＬＩ１が、正常皮膚試料のコレクションよりも１０倍高く（ＤＥＳｅｑ２，ｐ＜０．００３）発現されたことが分かった（図６Ｅ）。さらに、ＧＬＩ１発現レベルは、増殖マーカーＭＫＩ６７の発現レベルと高度に相関し（Ｒ＝０．９６）、これは、ＢＣＣ再成長を駆動するＨｈシグナル伝達の再活性化と一致した。したがって、分析は、Ｈｈシグナル伝達を再活性化してビスモデギブによるＳＭＯ阻害をバイパスする遺伝子機構を同定することに集中した。この目的で、選択された癌遺伝子における突然変異（Ｋａｎｄｏｔｈら、２０１３）及び正準Ｈｈ経路成分を同定した。次に、ビスモデギブ耐性ＢＣＣにおける全ゲノムコピー数変化及びＬＯＨを、一塩基多型（ＳＮＰ、ｎ＝１１）及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ、ｎ＝４）アレイを使用して決定した。
【０４３４】
実施例３：ＢＣＣ開始におけるＰＴＣＨ１及びＳＭＯ突然変異
ＢＣＣ遺伝学についてのこれまでの報告（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０１４；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００５）と一致して、再発性ゴーリン（１００％）の全て及び孤発性（７５％）ＢＣＣの大部分が腫瘍サプレッサーＰＴＣＨ１における突然変異を示し、これは、遺伝子の長さ全体にわたって生じ、恐らく有害である。７つは短縮型であり、４つはエクソンスプライシングに影響する可能性が高く、２つはＣｏｎｄｅｌアルゴリズム（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ及びＬｏｐｅｚ−Ｂｉｇａｓ、２０１１）によって有害であると予測される。ゴーリン患者ＢＣＣ（ＰＴ１２）も、ＰＴＣＨ１における変化によって開始した可能性が高かった。ＰＴＣＨ１変化を持たない再発性孤発性腫瘍（ｎ＝２）は、既知の発癌性突然変異ＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌを有した（Ｘｉｅら、１９９８）。これらのＰＴＣＨ１及びＳＭＯ変異体は、最初に応答し、続いてビスモデギブ耐性を示したＢＣＣにおける開始事象である可能性が高い。
【０４３５】
ＰＴＣＨ１変異体の頻度についての同様の傾向が非治療ゴーリン（９０％）及び孤発性（７８％）ＢＣＣにおいて観察され、同定された既知の発癌性ＳＭＯ突然変異が３つの弧発例において観察された（図７）。再発性ＢＣＣがゴーリン（５０％）症例と孤発性（５７％）症例との間で同様のＴＰ５３変異体頻度を示した一方で、非治療コホートでは、ＴＰ５３変異体はゴーリンＢＣＣ（２４％）よりも孤発性ＢＣＣ（５９％）において頻繁に観察され、これは、非治療孤発性ＢＣＣにおいて観察されたより高い突然変異率を反映し得る。
【０４３６】
実施例４：ＳＭＯ変異体のビスモデギブ依存性選択
驚くべきことに、再発性腫瘍生検の大部分は、薬物標的ＳＭＯに突然変異を有し（１１／１６、６９％）、ほとんどがＰＴＣＨ１変異体と共に生じた。これに対し、ＳＭＯ変異体は、非治療ゴーリンＢＣＣには完全に不在であり、４／２７（１５％）の非治療孤発性ＢＣＣにのみ存在した。再発性ＢＣＣにおいて同定されたＳＭＯ突然変異を図８Ａに要約する。ＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆ、ＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌ、及びＳＭＯ−Ｓ５３３Ｎ突然変異は、発癌駆動因子としてこれまでに報告されており（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８；Ｓｗｅｅｎｅｙら、２０１４；Ｘｉｅら、１９９８）、一方でＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ及びＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍは、ビスモデギブ耐性ＢＣＣにおいて最近同定された（Ｂｒｉｎｋｈｕｉｚｅｎら、２０１４）。非治療ＢＣＣコホート、またはＨｈ駆動型癌のこれまでの遺伝子分析（Ｂｒａｓｔｉａｎｏｓら、２０１３；Ｃｌａｒｋら、２０１３；Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０１４；Ｋｏｏｌら、２０１４；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８）において観察されなかった、ＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍ、ＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖ、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、及びＳＭＯ−Ｃ４６９Ｙを含む４つのＳＭＯ突然変異が発見され、これは、それらのビスモデギブ耐性への関与を強く示す。この研究からの全てのＳＭＯ突然変異は、ＴＭ領域内に位置し（図８Ｂ及び９Ａ）、いくつかの種に由来するＳＭＯタンパク質の間で高度に保存される残基におけるアミノ酸置換を付与し、これは、ＳＭＯ機能におけるそれらの重要性を反映している可能性が高い。
【０４３７】
耐性機構は、デノボで、またはより可能性が高いものとしては治療前腫瘍に存在するマイナーサブクローンの選択によって、獲得され得る。両シナリオにおいて、治療による薬物耐性に関与する変化の強化が観察され得ることが予期された。ＳＭＯ突然変異体の薬物依存性選択を評価するために、治療前腫瘍における突然変異の検出及び治療後のＳＭＯ突然変異を有する腫瘍細胞の割合を検査した。この目的で、６人の患者から入手可能であった治療前ＦＦＰＥ腫瘍試料をシーケンシングし、治療後腫瘍クローン性について分析した。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖを３人の患者からの治療後生検において検出したが、対応する治療前生検におけるバックグラウンドレベルを超えて検出可能ではなかった（図８Ｃ）。同様に、ＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍ、ＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍ、及びＳＭＯ−Ｃ４６９Ｙに対応するヌクレオチド変化は、治療後試料においてのみバックグラウンドレベルを超えて検出可能であり、このことは、デノボで生じたか、または本アッセイの検出限界を下回るレベルで最初に存在した、ＳＭＯ突然変異体細胞の薬物誘導性選択と一致していた（図８Ｄ及び８Ｅ）。興味深いことに、これまでに報告されたＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆ突然変異は、患者ＰＴ１１由来の治療前試料と治療後試料との両方において容易に検出され、これは、この変異体がこの腫瘍に対する発癌駆動因子である可能性が高いことを示唆した（図８Ｆ）。突然変異体ヌクレオチドの頻度は治療の際に減少するように見えることに留意されたく、これは治療後試料におけるより高いレベルの正常組織の汚染に起因する。コピー数及びＳＮＰアレイ分析により、この腫瘍が、最初はＰＴＣＨ１についての２倍体であり、治療後にＰＴＣＨ１コピー数喪失を獲得したことが明らかになった。理論に束縛されるものではないが、この患者が最初はビスモデギブに応答した（図８Ｈ）という事実は、低減したＰＴＣＨ１レベル（コピー喪失によって）が、この発癌性突然変異の文脈では、投薬中に腫瘍の再成長を促進し得る可能性を提起する。
【０４３８】
ＳＭＯ突然変異が再発性ＢＣＣにおいて優勢なクローン中に存在したかどうかに取り組むために、ＰＴＣＨ１及びＳＭＯ変異体の腫瘍細胞画分を、ＷＥＳからの対立遺伝子頻度、ならびにＳＮＰアレイからのコピー数及び腫瘍容量情報を使用して計算した（Ｇｒｅｅｎｍａｎら、２０１０；Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌら、２０１２；Ｓｔｊｅｒｎｑｖｉｓｔら、２０１１）。ヘテロ接合生殖系列ＰＴＣＨ１突然変異は、ゴーリン患者由来の生検における正常な皮膚の汚染、及び観察される場合には腫瘍細胞における後続のＬＯＨの原因であった。ＰＴ０９を除き、ＳＭＯは再発性ＢＣＣにおいて２倍体であったため、完全クローン性ヘテロ接合性ＳＭＯ変異体の予期された対立遺伝子頻度は、腫瘍内容物の５０％であり、これを次に、観察されたアレル頻度と比較した。ＰＴＣＨ１突然変異は、腫瘍細胞の８０％超で存在し、このことは、これらの腫瘍における発癌駆動因子であるＰＴＣＨ１における有害事象と一致していた。正常汚染及び観察された対立遺伝子頻度に基づくと、全てのＳＭＯ突然変異が、これらのビスモデギブ耐性ＢＣＣにおいて腫瘍細胞の６０％超で存在することが予期され、このことは、薬物治療の際のそれらの選択と一致していた。
【０４３９】
実施例５：ＳＭＯの薬物結合ポケットにおける突然変異はビスモデギブに対する耐性を付与する
本研究で発見したＳＭＯ突然変異の特性を洞察するために、最近解明されたＳＭＯ  ＴＭ領域の結晶構造を利用した（Ｗａｎｇら、２０１３）。ビスモデギブのＳＭＯ構造への計算ドッキングにより、ＳＭＯ−Ｗ２８１、ＳＭＯ−Ｖ３２１、ＳＭＯ−Ｉ４０８、及びＳＭＯ−Ｃ４６９が薬物結合ポケットの近位に位置することが明らかになった（ＤＢＰ、図１０Ａ）。ＳＭＯ−Ｗ２８１の芳香族インドールは、ビスモデギブのピリジン環との辺対面（ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）パイスタッキング相互作用を形成し、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ突然変異体のそれほど嵩高でない硫黄への置換によって分断される狭い疎水性のポケットを形成するのを助ける（図１０Ｂ、真ん中のパネル）。さらに、バリン３２１からメチオニンへの突然変異は、Ｗ２８１の位置決定に干渉する可能性が高く、薬物結合に二次的影響を与える（図１０Ｂ、右のパネル）。Ｗ２８１とは異なり、残基Ｉ４０８は、試験した計算モデルにおいて薬物と直接的に接触せず、代わりにこれは、喪失時に、これらの残基の立体構造を変化させることによって結合に影響することが予期されるそのデルタメチル基との結合ポケット残基Ｈ４７０及びＶ４０４に対してパックする（図１０Ｃ）。Ｃ４６９の嵩高のチロシンへの置換は、結合ポケットに対する立体効果を励起してその立体構造を分断し得ることが予期された。
【０４４０】
ＤＢＰにおける突然変異の機能的影響を試験するために、Ｇｌｉ−ルシフェラーゼ系Ｈｈレポーターアッセイを使用した。ＤＢＰ突然変異は、ビスモデギブのＩＣ５０を、８０ｎＭのＩＣ５０を有したＳＭＯ−ＷＴのものよりも１２〜４９倍増加させた（図１２Ａ）。これらのＩＣ５０値は本アッセイにおけるＳＭＯの過剰発現に起因する過大評価であることに留意するべきである（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）。各ＤＢＰ突然変異は、ＳＭＯ−ＷＴと比較して基礎活性のわずかな（１．５倍未満）増加を示したが（図１１Ａ）、ＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖ以外の全てがＰＴＣＨ１過剰発現によって容易に阻害された（図１１Ｂ）。次に［３Ｈ］標識化ビスモデギブのＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖ及びＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃへの結合を試験すると、それぞれ、ＩＣ５０の最小及び最大の増加を呈した（図１２Ａ）。両方の突然変異がＳＭＯ−ＷＴと同様に細胞表面レベルで発現されたが、ビスモデギブ結合障害を示した（図１２Ｂ及び１１Ｃ）。
【０４４１】
腫瘍退縮を誘導するためには、Ｈｈ経路が転写レベルで９０％超阻害される必要があることが、臨床前腫瘍モデルにおいて示されている（Ｗｏｎｇら、２０１１）。これらのＳＭＯ突然変異がビスモデギブの存在下で細胞増殖に与える影響をよりよく理解するために、小脳顆粒ニューロン前駆体（ＣＧＮＰ）細胞のウイルス形質導入についてのアッセイを開発した。Ｈｈ駆動型腫瘍細胞が培養中にそのＨｈ経路依存性を急速に喪失することが、これまでに述べられている（Ｓａｓａｉら、２００６）。しかしながら、ＣＧＮＰは、Ｈｈ依存性の様式で、インビボで増殖し、一定期間、培養中でそのＨｈ経路依存性を維持する（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ−Ｒｅｙａ及びＳｃｏｔｔ、１９９９）。Ｐｔｃｈ１ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｔｐ５３ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＰＰＴ）パップから単離したＣＧＮＰを、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）−Ｃｒｅ融合タンパク質とともに、ＳＭＯ変異体を発現しているレンチウイルスコンストラクトに感染させた（図１２Ｃ）。Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｐｔｃｈ１の喪失を誘導し、それにより形質導入されたＣＧＮＰのみが外因性ソニックヘッジホッグリガンド（ＳＨＨ、図１１Ｄ）の非存在下で増殖し得ることを保証する。これにより、ＳＨＨリガンドを除去した後で、様々なＳＭＯ突然変異体がビスモデギブ及び他の阻害剤の存在下で増殖を促進する能力を試験することが可能となった。メチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みによる増殖を監視した一方、Ｃｒｅ依存性タンデム二量体（ｔｄ）Ｔｏｍａｔｏ発現により、感染した細胞の可視化及び定量化が可能になった。ＳＭＯ突然変異のほとんどが、ＴＰ５３突然変異を有し、ＰＴＣＨ１の喪失によって駆動された腫瘍において同定されたため、このシステムにより、より良好なモデル患者遺伝学も可能となった。ＳＭＯ−ＷＴ及びＣｒｅに感染させたＰＰＴ  ＣＧＮＰは、約２２ｎＭのＩＣ５０を有し、増殖は、１００ｎＭのビスモデギブで最大限に阻害された。対照的に、全てのＤＢＰ突然変異がビスモデギブ感受性に対して劇的な効果を有し、感染した細胞は高レベルのビスモデギブ（１μＭ超、図１２Ｄ）で増殖を続けた。驚くべきことに、ＳＭＯ−Ｗ２８１ＣまたはＳＭＯ−Ｃ４６９Ｙのいずれかに感染させた細胞は、５μＭのビスモデギブの存在下であっても非治療に近いレベルで増殖を続け、これは、これらの残基の薬物結合における直接的な役割を反映している可能性が高い。Ｃｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター発現に対する蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって、ＣＧＮＰが同様の頻度で感染したこと、及び定量的逆転写（ｑＲＴ）ＰＣＲによって、ＳＭＯ変異体が等レベルで発現されたことを確認した。
【０４４２】
実施例６：ＳＭＯ薬物結合ポケットの突然変異によるビスモデギブへの耐性の予測
他のＤＢＰ突然変異が薬物耐性を促進し得るかどうかを調査するために、計算モデルを使用して、原子がビスモデギブの４．５Å以内に位置する２１個のＳＭＯ残基を同定した（図１３Ａ）。アルゴリズムを使用して、本研究からのＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ及びＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖを含む、これらのＤＢＰ残基に非同義的変化をもたらした１６０個の異なる単一ヌクレオチド変異体を同定した（表４）。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【０４４３】
配列番号１の位置２１９、２２１、２８１、３８４、４０８、及び５１８に対応するアミノ酸は、ビスモデギブ結合ポケットにある。配列番号１の位置２４１、３２１、３８７、４５９、４６９、及び４７３に対応するアミノ酸は、臨床突然変異と関連付けられるが、ＳＭＯとの結合時にビスモデギブの４．５オングストローム以内には見出されない。ＳＭＯ−Ｄ４７３はこの方法では同定されなかったが、ＳＭＯ結晶構造により、Ｄ４７３が、Ｒ４００、Ｈ４７０、Ｅ５１８、及びＮ５２１を含むビスモデギブに直接接触するいくつかの残基との水素結合ネットワークを形成することが明らかとなった（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙａｕｃｈら、２００９）。ＳＭＯＥ５１８は、突然変異時にビスモデギブ感受性に影響する残基としてアラニンスキャン突然変異生成によって既に同定された（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）。この手法はまた、水素結合ネットワークを通してＳＭＯ立体構造を安定させることが予測される、Ｎ２１９及びＤ３８４を含むＳＭＯ阻害剤ソニデギブ（ＬＤＥ２２５）に対する耐性の前臨床モデルに既に関係があるとされた残基（表４；Ｂｕｏｎａｍｉｃｉら、２０１０）を同定した（図１３Ｂ）。驚くべきことに、ＳＭＯ−Ｎ２１９Ｄ、ＳＭＯ−Ｄ３８４Ｎ、及びＳＭＯ−Ｓ３８７Ｎは全て、Ｇｌｉルシフェラーゼに基づくＨｈレポーターアッセイにおけるＳＭＯ−ＷＴと比較して低減したビスモデギブに対する感受性を示した（図１３Ｃ）。さらに、ＳＭＯ阻害剤ＬＹ２９４０６８０及びビスモデギブが１４個の接触残基を共有することが見出された（表４）。理論に束縛されるものではないが、これは、化学的に明白に異なる阻害剤が重複するＳＭＯ残基と相互作用すること、及び阻害剤間の交差耐性が臨床にて生じ得ることを示唆する。
【０４４４】
実施例７：薬物結合ポケットを越えるＳＭＯ突然変異がビスモデギブ耐性を付与する
ビスモデギブ結合ポケットに対して遠位に位置するＳＭＯ突然変異はまた、ビスモデギブ耐性と関連した（図１４Ａ）。興味深いことに、ＳＭＯ−Ｔ２４１ＭとＳＭＯ−Ａ４５９Ｖとの両方が、確立されている発癌性突然変異よりも低い程度ではあるものの、ＳＭＯ−ＷＴと比べて増加した基礎活性を示す（図１４Ｂ）。この上昇した活性は、ビスモデギブ（図１４Ｃ及び１５Ａ）とＰＴＣＨ１過剰発現（図１５Ｂ）との両方による阻害に対する低減した感受性と相関し、ＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍ及びＳＭＯ−Ａ４５９ＶはビスモデギブのＩＣ５０をそれぞれ約３倍及び９倍シフトさせた。さらに、全ての試験した活性化突然変異が、ＳＭＯ−ＷＴに対して同等の細胞表面発現レベルにもかかわらず、ビスモデギブ結合障害を示した（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。
【０４４５】
ＰＰＴ  ＣＧＮＰアッセイを使用して、非ＤＢＰ  ＳＭＯ突然変異がビスモデギブの存在下で増殖に与える影響を調査した。ＣＧＮＰを発現しているＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍ、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、及びＳＭＯＷ５３５Ｌは、高濃度のビスモデギブにて増殖を続けた（図１４Ｄ及び１５Ｅ）。これらのデータは、ＧＰＣＲについて観察されたように、ＳＭＯ構築を不安定化して、活性化を促進し、アンタゴニストへの親和性を低減する、ＤＢＰの外の突然変異と一致している（Ｇｅｔｈｅｒら、１９９７）。しかしながら、例えばＳＭＯ−Ｔ２４１Ｍの場合には基礎活性をわずかしか増大させなかったこれらの突然変異によって、ＤＢＰに対する可能性のあるアロステリック効果を除外することはできない（図８Ｂ）。ＰＴＣＨ１野生型であり発癌性ＳＭＯ突然変異を有したいくつかのＢＣＣ（ＰＴ０１、ＰＴ０７、及びＰＴ１１由来）は、これらのＳＭＯ突然変異がビスモデギブ阻害に対する感受性を低減するという事実にもかかわらず、最初治療に応答した（図１５Ａ）。これは、ＳＭＯ突然変異体のビスモデギブへの感受性におけるＰＴＣＨ１機能喪失に関する役割を示唆し得る。
【０４４６】
実施例８：ビスモデギブ耐性を克服するための治療オプション
複数のＳＭＯ突然変異がビスモデギブへの耐性を付与することができると確証したことを受けて、次に化学的に明白に異なるＳＭＯ阻害剤がビスモデギブ耐性を克服し得るかどうかを評価した。ＬＹ２９４０６８０及びＬＤＥ２２５は、様々な癌に対して現在臨床試験中であり（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）、化合物５は、ＳＭＯ−Ｄ４７３Ｈに対して前臨床での効力を示したＳＭＯ阻害剤である（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）。全ての化合物が同様にＰＰＴ  ＣＧＮＰを発現しているＳＭＯ−ＷＴの増殖を阻害した一方で、ＳＭＯ突然変異体発現細胞は、程度は異なるものの、増殖を続けた（図１６Ａ）。様々なＳＭＯ阻害剤間のこの観察された交差耐性は構造予測と一致しており、ＳＭＯアンタゴニストを組み合わせることが後天的耐性を克服するために好適な治療オプションではないことを示唆する。さらに、再発性ＳＵＦＵ及び再発した腫瘍におけるＧＬＩ２変異体の同定は、ＳＭＯの下流のＨｈ経路の標的化をさらに支持する。開発されているＧＬＩ阻害剤は現在のところ効力及びバイオアベイラビリティを欠くが、最近の研究により、ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ４が、ＧＬＩプロモーターを占有し、Ｈｈ経路の転写生産に必要とされることが見出された（Ｌｏｎｇら、２０１４；Ｔａｎｇら、２０１４）。ビスモデギブ耐性ＳＭＯ突然変異体を発現しているＰＰＴ  ＣＧＮＰは、ブロモドメイン阻害剤ＪＱ１の存在下で低減した増殖を示す（図１６Ｂ）。
【０４４７】
実施例２〜９のための物質及び方法
患者及び組織標本
連邦ガイドラインに従い、かつ臨床試験ＳＨＨ３９２５、ＳＨＨ４４７６ｇ、及びＳＴＥＶＩＥに参加している協力センターの治験審査委員会によって承認された書面のインフォームドコンセントを受け取った後、ビスモデギブで治療した患者由来の試料を収集した。ビスモデギブ耐性機構の分析のため、これまでに記載のように（ＬｏＲｕｓｓｏら、２０１１；Ｓｅｋｕｌｉｃら、２０１２）、事前の治験責任医師が評価した治療の臨床的利益を経験した、局所進行性または転移性ＢＣＣを患う１２人の患者から疾患増悪時に生検を得た。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩＲＢによって承認されたプロトコルに従って比較のために、４３人の非治療患者由来の生検を収集し、シーケンシングした。
【０４４８】
遺伝子分析
１５個のビスモデギブ耐性ＢＣＣ試料、４８個の非治療ＢＣＣ、及び５２個の適合血液試料由来のＤＮＡをＷＥＳに供した。腫瘍生検のＷＥＳを、６７倍超の最低平均カバレッジで獲得した。コピー数を、ＳＮＰまたはＣＧＨアレイによってビスモデギブ耐性ＢＣＣについて評価した。１１個の耐性ＢＣＣ試料由来のＲＮＡをＲＮＡ−ｓｅｑに供した。７個のＦＦＰＥ試料由来のＤＮＡをパイロシーケンス法によって分析した。５個の正常な皮膚試料（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ製）由来のＲＮＡ−ｓｅｑデータを、ＢＣＣ患者試料との比較のための基準遺伝子発現として使用した。
【０４４９】
動物
全てのマウスを、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．の動物使用ガイドラインならびにカリフォルニア州の法的及び倫理的実務を遵守する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルに従って収容及び維持した。
【０４５０】
機能分析
ＳＭＯ突然変異体を、記載のように（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１；Ｙａｕｃｈら、２００９）ｐＲＫ５−ＳＭＯ  ベクター中で生成し、記載のように（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）Ｇｌｉ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて利用するか、または初代ＣＧＮＰ培養の形質導入のためにレンチウイルスベクターにクローニングするかのいずれかを行った。増殖を、メチル−［３Ｈ］−チミジン組み込みを使用してアッセイした（Ｋｏｏｌら、２０１４）。［３Ｈ］−ビスモデギブのＳＭＯ突然変異体への結合を、記載のように（Ｄｉｊｋｇｒａａｆら、２０１１）ＨＥＫ−２９３細胞中で実行した。
【０４５１】
患者試料
連邦及び協力センターにある治験審査委員会（ＩＲＢ）のガイドラインに従う書面のインフォームドコンセントを受け取った後、再発性腫瘍試料を収集した。非治療孤発性ＢＣＣ試料を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎのＩＲＢによって承認されたプロトコルＨＵＭ０００６９０５２及びＨＵＭ０００５００８５に従って収集した。非治療ゴーリン患者試料を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩＲＢによって承認されたプロトコル２０１２−０２９に従って収集した。
【０４５２】
組織学
ＦＦＰＥ及びＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に埋め込んだ試料を、標準的な手順に従って分割し、Ｈ＆Ｅ染色した。画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して得た。
【０４５３】
ＤＮＡ及びＲＮＡ単離
凍結したＢＣＣ腫瘍を、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ）またはＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を加えたＲＬＴ中で均質化した。核酸を、製造業者のプロトコルに従ってＡｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ＦＦＰＥ腫瘍切片を、Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、マクロ解剖し、脱パラフィン化し、抽出した。
【０４５４】
エクソーム捕捉及びシーケンシング
エクソーム捕捉を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｍｅキット（５０Ｍｂ）を使用して行った。エクソーム捕捉ライブラリーをＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ）上でシーケンシングして、２×７５ｂｐのペアエンドデータを生成した。
【０４５５】
変異体コーリング
エクソーム−Ｓｅｑの読み値を、ｇｓｎａｐ（Ｗｕ及びＮａｃｕ、２０１０）バージョン２０１３−１０−１０を「−Ｍ  ２  −ｎ  １０  −Ｂ  ２  −ｉ  １  −−ｐａｉｒｍａｘ−ｄｎａ＝１０００  −−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０００  −−ｇｍａｐ−ｍｏｄｅ＝ｎｏｎｅ  −−ｃｌｉｐ−ｏｖｅｒｌａｐ」のパラメータで使用して、ＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に対して整列させた。ローカル再整列を、ＧＡＴＫ  Ｉｎｄｅｌ  Ｒｅａｌｉｇｎｅｒ（ＤｅＰｒｉｓｔｏら、２０１１）を使用して行った。重複した読み値を、Ｐｉｃａｒｄを使用して除去した。腫瘍及び適合正常試料ファイルに対する体細胞突然変異体コーリングを、ＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓ２を初期設定パラメータで使用して行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）。ｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ  １３１（Ｓｈｅｒｒｙら、２００１）において表されたがＣＯＳＭＩＣ  ｖ６２（Ｆｏｒｂｅｓら、２０１０）においては不在であった既知の生殖系列変化形を、全ての試料についてフィルタリングして除外した。全ての非同義体細胞突然変異が遺伝子機能に与える影響をＣｏｎｄｅｌ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｉｇａｓ、２０１１）を使用して予測した。全ての変異体にＥｎｓｅｍｂｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６３を使用してアノテートした。
【０４５６】
ＲＮＡシーケンシング及びデータ分析
ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ）を使用して調製した。このライブラリーを、レーン当たり３で多重化し、ＨｉＳｅｑ  ２０００上でシーケンシングして、試料当たり少なくとも約３０００万のペアエンド（２×７５ｂｐ）読み値を得た。ＲＮＡ−ｓｅｑ読み値を、ｇｓｎａｐ（Ｗｕ及びＮａｃｕ，２０１０）バージョン２０１３−１０−１０を「−Ｍ  ２  −ｎ  １０  −Ｂ  ２  −ｉ  １  −Ｎ  １  −ｗ  ２０００００  −Ｅ  １  −−  ｐａｉｒｍａｘ−ｒｎａ＝２０００００  −−ｃｌｉｐ−ｏｖｅｒｌａｐ」のパラメータで使用して、ＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に対して整列させた。遺伝子当たりの発現計数を、ＮＣＢＩ及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子アノテーションならびにＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡ配列によって定義して、対内で一致し、各遺伝子座に対して固有に整列している読み値の数を計数することによって得た。差次的遺伝子発現分析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＤＥＳｅｑ２パッケージ（Ａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ、２０１０）を使用して行った。
【０４５７】
配列データ処理
全てのシーケンシング読み値を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＳｈｏｒｔＲｅａｄパッケージ（Ｍｏｒｇａｎら、２００９）を使用して品質について検査した。全ての試料が正しく同定されたことを確認するために、全てのエクソーム及びＲＮＡ−ｓｅｑデータ変異を交差比較し、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓ２パケージを使用して遺伝子一貫性についてチェックした。全ての患者の対形成した試料は、正しく適合し、９０％のカットオフを使用して、いずれの他の患者とも適合しなかった。
【０４５８】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）
腫瘍試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨ  １Ｍマイクロアレイ上でアッセイした。ヒト男性ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐ／Ｎ  Ｇ１４７１）を参照として使用した。バックグラウンド減算したシグナル強度の個々のｌｏｇ２比を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７から得た。ｌｏｇ２比を、ゲノムＧＣ量に１Ｍｂのウィンドウを使用して、ＧＣ量ウェーブ効果（Ｄｉｓｋｉｎら、２００８）について補正した。各プローブについての結果として得られたｌｏｇ２比の値を、一度に１試料及び１染色体で、ｃｇｈＦＬａｓｓｏアルゴリズム（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ及びＷａｎｇ，２００８）を使用してセグメント化した。セグメント化は、ラムダ１＝０及びラムダ２  ＝１０００＊現在の染色体のプローブの画分というパラメータを使用して行った。所与のセグメントのゲノム境界内の全てのプローブにそのセグメント内のプローブの平均コピー数値を付与した。
【０４５９】
ＳＮＰアレイ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＯｍｎｉ  ２．５−８アレイを、（Ｒｕｄｉｎら、２０１２）によって開発された方法のこれまでに使用した変更したバージョンを使用して処理した。以前のように、正常な試料の大型パネルを使用して、各ＳＮＰについての２つのプローブの挙動を研究した。現在の分析には、４５０個のＨａｐＭａｐ正常試料を使用した。以前のように、各試料における各プローブについての未加工シグナルを、所与の対立遺伝子の０、１、または２の正確な基調コピーが、ＰＩＣＮＩＣの隠れマルコフモデルによって求められるように、１、２、または３にマッピングされたスケールに変換した。各対立遺伝子に対するプローブＡ及びＢについてのこれらの値を使用して、コピー数の比（ＣＮＲ、式１）及びシータ（式２）を計算した。ＣＮＲは、所与の遺伝子座での全コピー数の、全体的な試料倍数性、すなわち、ゲノム全体にわたる平均コピー数の比として解釈することができる。ＣＮＲ値を、ゲノムＧＣ量に１Ｍｂのウィンドウを使用して、ＧＣ量ウェーブ効果（Ｄｉｓｋｉｎら、２００８）について補正した。
【０４６０】
式１：ＣＮＲ＝（Ａ＋Ｂ）／４
式２：シータ＝２／π＊逆正接（Ｂ／Ａ）
次に、ＣＮＲ及びシータをＰＩＣＮＩＣの前処理ステップに入力し、このステップでは、ゼロのコピーが存在するときのＣＮＲについてのバックグラウンド値α、通常細胞汚染から来るシグナルの画分π、及び全ての調べたＳＮＰ位置にかけての大域倍数性または平均コピー数φを見積もる。この見積りは、ゲノムにわたるＣＮＲの最初のセグメント化を必要とする。本作業では、ＣＢＳ（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ及びＯｌｓｈｅｎ、２００７）またはＰＩＣＮＩＣの内部アルゴリズムのいずれよりも正確なセグメント化を提供することが分かっているｃｇｈＦＬａｓｓｏ（ラムダ１＝０及びラムダ２＝１０００のＬ２Ｌ１ＶｉｔＰａｔｈ（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ及びＷａｎｇ、２００８））を使用した。さらに、α、π、及びφを見積もるためのＰＩＣＮＩＣの手順を補正して、染色体Ｘ及びＹについての性別特異的予測コピー数（パイ）を使用した。最終的に、これら３つのパラメータについての分布前のＰＩＣＮＩＣのオリジナルは、このアレイプラットフォームには不適切であることが分かった。代わりに、αを、平均０．７及び標準偏差０．０５でガウス分布としてモデル化し、πを、アルファパラメータ０．０５及びベータパラメータ１００でベータ分布としてモデル化し、φを、形状パラメータ６．７１４３及びスケールパラメータ０．３５でガンマ分布としてモデル化した。
【０４６１】
α、π、及びφを各試料について見積もったら、ＰＩＣＮＩＣのＨＭＭを適用して、データをセグメント化し、整数の対立遺伝子特異的コピー数を生成した。対立遺伝子特異的コピー数の小さい方が０と等しかったゲノムセグメントがＬＯＨの領域である。
【０４６２】
ＨＭＭ適合は、ほとんどの試料中でほとんどの染色体について概して極めて正確であったが、ＣＮＲがときに２つの隣り合った整数について予測された値の間であったことが観察された。これは、生物学的現実を反映していないと考えられる２つの隣り合ったＨＭＭ状態間でのジッターを産出した。これを解決するために、ＰＩＣＮＩＣのＨＭＭによって産出された全コピー数の整数推定を、ｃｇｈＦＬａｓｓｏ（ＣＮＲ）によって産出された非制限値で置き換えた。報告された全コピー数を産出し、正常な汚染を調整するために、α、π、及びθの推定をＰＩＣＮＩＣによりｃｇｈＦＬａｓｓｏ結果に適用した：
式３。
【数１】
2018512597.tif 000014
式４。
【数２】
2018512597.tif 000015
【０４６３】
腫瘍細胞画分
腫瘍細胞画分を記載のように（Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌら、２０１２）計算した。簡潔に述べると、所与の突然変異を担持する腫瘍細胞を以下の式を使用して決定した：
【数３】
2018512597.tif 000016
式中、ｒは、ＳＮＰアレイによって決定した腫瘍細胞である生検における細胞の画分であり、ｒは、関心の塩基にわたる全読み値Ｒのうちの変異体対立遺伝子を報告する読み値の数であり、ｈＴ及びｈＮは、それぞれ、腫瘍中のその塩基でのゲノム及び正常なゲノムのコピー数である。全ての頻度をパーセンテージに変換した。いくつかの腫瘍細胞頻度は、このモデルが生殖系列突然変異またはコピー中立的なＬＯＨを考慮しないため、１００％を超えた。検証した生殖系列突然変異について、汚染組織における異なる比の突然変異体読み値を考慮するように調整した。
【数４】
2018512597.tif 000017
【０４６４】
ビスモデギブ結合モデル
ＬＹ２９４０６８０が結合したＳＭＯの結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＪＫＶ）がドッキングの開始点として働いた。Ｍａｅｓｔｒｏバージョン９．５（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）において利用可能なプログラムのＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒスイートを使用して、ＰｒｅｐＷｉｚによるタンパク質調製、Ｌｉｇｐｒｅｐによるビスモデギブのリガンド調製、Ｇｌｉｄｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎによるドッキングを、Ｇｌｉｄｅドッキングにおける以下の変更を除く全てのステップに初期設定パラメータを保持して実行した。ドッキング後の最小化を行うために５０のポーズを含め、ストレイン補正項をオンにした。上位１０個のポーズを分析用に書き出し、その全てが同様の結合様式を付与した。ピリジン及び隣接するオルトクロロフェニル環は、アミドねじれ角における変動がメチルスルホン及びその付着した環の位置におけるわずかな変動を引き起こしながらも、ほぼ同じ位置に留まった。最上位のポーズを本研究における数値に選択したが、上記の変動は、突然変異効果に関するいずれの解釈も変えなかったであろう。図２Ｂ、３Ａ−Ｃ、５Ａ−Ｂ、及び６Ａを、ＭＯＥ  ２０１３．０８０１（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を使用して準備した。結合ポケット及びＩｌｅ−４０８相互作用について示す表面積は、溶媒接触可能表面積である。
【０４６５】
パイロシーケンシング
突然変異特異的ＰＣＲ（ＢＳＰ）プライマーを、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアｖ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して設計した。ＰＣＲ  プライマーを、順方向プライマーまたは逆方向プライマーのいずれかに対する５’ビオチン標識によって合成して、ＰＣＲ産物のストレプトアビジンセファロースビーズへの結合を促進した。シーケンシングプライマーを、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアｖ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して５’−ビオチン標識ＰＣＲプライマーの逆方向で設計した。ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２５μｌの反応物中で増幅し、２０μｌのＰＣＲ産物をＰｙｒｏｍａｒｋ  Ｑ２４（Ｑｉａｇｅｎ）上でのシーケンシングに使用した。ＰＣＲ産物を１０分間ストレプトアビジンセファロースビーズとともにインキュベートした後、７０％のエタノール、Ｐｙｒｏｍａｒｋ変性溶液、及びＰｙｒｏｍａｒｋ洗浄緩衝液で洗浄した。次に、変性したＰＣＲ産物を、０．３μＭのシーケンシングプライマーを使用してシーケンシングした。パイログラムを可視化し、配列品質について検査し、ＳＭＯ位置Ｔ２４１、Ｌ４１２、Ａ５４９、及びＣ４６９での突然変異体パーセントを、ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウェアバージョン２．０．４（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して決定した。
【０４６６】
コピー数アッセイ
ゲノムＤＮＡを、血液、治療前腫瘍試料、及び治療後腫瘍試料から単離し、反応当たり１０ｎｇを４連Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において鋳型として使用して、ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＴＣＨ１及びＲＮＡＳＥ  Ｐ（参照）コピー数を決定した。
【０４６７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡの１〜４μｇを、大容量ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写した。定量的ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ配列は、要請に応じて利用可能である。
【０４６８】
プラスミド
ＳＭＯ点突然変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってｐＲＫ５−ＳＭＯにおいて生成した。ＳＭＯ点突然変異体をｐＲＫ５−ＳＭＯ−Ｆｌａｇ及びｐＲＫ７−ｇＤ−ＳＭＯ−ｍｙｃにクローニングした。ｐＲＫ５−ＰＴＣＨ１及びｐＲＫ５−ｅＧＦＰは、（Ｙａｕｃｈら、２００９）によってこれまでに記載されている。ＨｈルシフェラーゼレポーターＧｌｉ−ＢＳコンストラクトは（Ｍｕｒｏｎｅら、１９９９）によってこれまでに記載されており、ウミシイタケトランスフェクション対照プラスミドｐＲＬ−ＴＫはＰｒｏｍｅｇａ製である。ｐＧＥＩＧＣは、ｐＧＩＰＺ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＺｅｏＲ−ＣＭＶｉｅ−ｔＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＲ−ｓｈＲＮＡ−ＷＲＥ内容物を、ＥＦ１αプロモーターを含む断片、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び高感度緑色蛍光タンパク質のＣ末端に融合したＣｒｅ−リコンビナーゼ（ｅＧＦＰ−Ｃｒｅ；Ｈａｒｆｅら、２００４）で代置することによって創出したＨＩＶ系自己不活性化レンチウイルスベクターである。全てのコンストラクトをシーケンシングによって確認し、クローニングの詳細、ベクターマップ、及び配列ファイルは、要請に応じて利用可能である。
【０４６９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＣＣ）を、４ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、及び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ中で１．７５×１０Ｅ５細胞／ウェルにて６ウェルプレートに播種した。１６時間後、細胞を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、４００ｎｇの発現コンストラクト、４００ｎｇの９ｘ−Ｇｌｉ−ＢＳ、及び２００ｎｇのｐＲＬ−ＴＫでトランスフェクトした。ＰＴＣＨ１阻害実験のため、細胞を、２００ｎｇのＳＭＯ発現コンストラクト、及びＰＴＣＨ１対空ベクターの様々な比を含むさらに２００ｎｇのＤＮＡでトランスフェクトした。６時間後、１つのウェルからの細胞をトリプシン処理し、１２ウェルプレートの４つのウェルにわたって再分配した。１６時間後、培地のＦＢＳ量を０．５％に低減させて、一次繊毛の形成を誘導し、小分子Ｈｈ阻害剤をインキュベーション濃度で添加した。蛍ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて２４時間後に決定し、Ｗａｌｌａｃ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して読み取った。値をウミシイタケルシフェラーゼ活性で割り、トランスフェクション効率について正規化した。個々の実験を２連または３連で実行し、少なくとも１回繰り返した。用量応答データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ中で４パラメータ方程式に適合させた：
【数５】
2018512597.tif 000018
式中、「Ｙ」は正規化したＧｌｉ−ルシフェラーゼシグナルまたは正規化したチミジン組み込み（阻害剤を含まなかった対照の画分として計算した）であり、「Ｘ」は阻害剤濃度である。上及び下（Ｂ）の値は、各試料について等しくなくてはならない。「Ｈ」は丘の傾斜である。
【０４７０】
［３Ｈ］−ビスモデギブ結合アッセイ
２×１０Ｅ６  ＨＥＫ−２９３細胞を１０ｃｍプレートに播種し、１６時間後にＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して３μｇの空ベクターまたはＳＭＯ発現コンストラクトのいずれかでトランスフェクトした。細胞を、４０時間後に１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で採集し、室温（ＲＴ）で１０時間、４％のＰＦＡを含むＰＢＳ中に固定した後、これらを１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄し、ウェル当たり１００，０００細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、５０μＭの非標識ビスモデギブの非存在下または存在下で、ＲＴで１時間、５ｎＭの［３Ｈ］−ビスモデギブ（Ｓｅｌｃｉａ）とともにインキュベートし、続いて、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してフィルタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に移した。ウェル当たり４０μｍのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ｆｌｕｉｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を加え、１分当たりの計数を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴを使用して評価した。全ての試料を３連で分析した。特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することによって過剰の非標識ビスモデギブとの競合の後に計算した。
【０４７１】
ｇＤ−ＳＭＯ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析
１ｘ１０Ｅ６  ＨＥＫ−２９３細胞を１０ｃｍプレートに播種し、６時間後にＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して３μｇのｇＤ−ＳＭＯ発現コンストラクトでトランスフェクトした。細胞を、４８時間後に１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で取り除いた後、抗ｇＤ抗体（５Ｂ６、１μｇ／ｍｌにて）とともに３０分間インキュベートし、１：１００のビオチン−ＳＰコンジュゲートＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、及び１：５０のＲ−フィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジン（ともにＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）とともに２回の２０分のインキュベーションを続けた。細胞をヨウ化プロピジウム（５００ｎｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、ＨＴＳ  ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
【０４７２】
ウイルス産生及び力価決定
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、１０％の加熱不活性化したＦＢＳを含むＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ中で１．５×１０Ｅ６細胞／プレートにて１５ｃｍ皿にプレーティングした。レンチウイルス上清を、６μｇのｐＧＥＩＧＣ−ＳＭＯ、１２μｇのパッケージングベクターΔ８．９（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７）、３μｇのエンベロープベクターｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びトランスフェクション試薬ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してコトランスフェクションによって調製した。培地をトランスフェクションから１２後に置き換え、ウイルス上清を２４時間後に収集し、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過し、さらなる処理まで４℃で保管した。ウイルス上清を、１時間３０分、１００，０００ｘｇでの超遠心分離によって２００倍に濃縮した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ及びＴｒｏｎｏ、２０００）。ウイルスペレットをＣＧＮＰ媒体中に再懸濁し、−８０℃で保管した。ウイルス力価を、６ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルでプレーティングしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について決定した。細胞を１２時間接着させた後、培地を、２ｍｌの１：４００希釈または１：４０００希釈のいずれかのウイルス濃縮物で置き換えた。ウェル当たりの細胞の数をウイルス添加時に計数し、６ウェルの平均を使用してウイルス力価を計算した。ウイルス上清を６０時間細胞上に留めた後、細胞を採集し、ＦＡＣＳによって蛍光タンパク質発現について分析した。ウイルス力価を、方程式［細胞数／１００×蛍光細胞％］×１０００（ウイルス濃縮物１μｌ当たり）に従って形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌで計算した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ及びＴｒｏｎｏ、２０００）。１５％より少ない蛍光細胞をもたらした形質導入のみを力価計算に使用した。
【０４７３】
マウス
Ｐｔｃｈ１ｌｏｘｐ株は、Ｒ．Ｔｏｆｔｇａｒｄ  ａｎｄ  Ｓ．Ｔｅｇｌｕｎｄ（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｋａｓｐｅｒら、２０１１）からの寛大な贈与であった。Ｔｐ５３ｌｏｘｐ株は、Ａ．Ｂｅｒｎｓ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｊｏｎｋｅｒｓら、２００１）からの寛大な贈与であった。Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ．ｔｄＴｏｍａｔｏ株は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（在庫番号００７９０９；Ｍａｄｉｓｅｎら、２０１０）から購入した。全てのマウスは、カリフォルニア州の法的及び倫理的実務を遵守する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．の動物使用ガイドラインに従って収容及び維持した。
【０４７４】
ＣＧＮＰの単離及び形質導入
生後５〜７日のＰｔｃｈ１ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ．ｔｄＴｏｍａｔｏ  Ｔｐ５３ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスからの小脳を０．０５％のトリプシン中で１０分間３７℃にて解離させた。細胞を、１０分間４℃の５１４ｘｇでの遠心分離によって収集し、ＣＧＮＰ培地（１×Ｂ２７（ビタミンＡなし、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．４５％のグルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭのＫＣｌ、０．４％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００ｎｇ／ｍｌのオクチル化組換えＳＨＨを含む、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中に再懸濁し、０．４５μｍのフィルター（Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過した。細胞をポリ−Ｄ−リジンをコーティングした６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に５×１０Ｅ５細胞／ウェルでプレーティングし、１の感染多重度（ＭＯＩ）でレンチウイルスに感染させた。２４時間後、細胞をトリプシン処理によって採集し、ＣＧＮＰ培地中に収集し、下流用途のために再度プレーティングした。
【０４７５】
メチル−［３Ｈ］−チミジン組み込み
ＨＰＩが増殖に与える影響を検査するために、ウイルス的形質導入したＣＧＮＰを、ＳＨＨを含まないＣＧＮＰ培地中で２５，０００細胞／ウェルにてポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングした。阻害剤濃度を３連ウェルにおいて試験すると、ビスモデギブについて２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、及び５０００ｎＭ、ＬＤＥ２２５について５００ｎＭ、ＬＹ２９４０６８０について５００ｎＭ、化合物５について５００ｎＭ、ＪＱ１について１μＭ、及びＤＭＳＯ（最高濃度のビヒクル対照）について０．１％であった。２４時間後、細胞を１μのＣｉ／ｍｌメチル−［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でパルスして、さらに１６〜２４時間培養した。細胞を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して９６ウェルフィルター  プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に採集し、組み込まれた放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で液体シンチレーション分光測光法によって定量化した。
【０４７６】
化合物
ＧＤＣ−０４４９、化合物５、及びＪＱ−１を、ＷＯ２００６０２８９５６、Ｗ０２００７０５９１５７、及びＦｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓら、２０１０に記載のように調製した。ＬＤＥ２２５（ＨＹ−１６５８２）及びＬＹ２９４０６８０（ＨＹ−１３２４２）はＭｅｄｃｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ製であった。
【０４７７】
引用文献
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●Ｂｕｏｎａｍｉｃｉ，Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｒ．，Ｖａｔｔａｙ，Ａ．，Ｈｓｉａｏ，Ｋ．，Ｙｕａｎ，Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．，Ｏｓｐｉｎａ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩ３Ｋ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２，５１ｒａ７０．
●Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｏｒｏ，Ａ．Ｅ．（２０１２）．Ｉｎｉｔｉａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｏｗｔｈ  ａｆｔｅｒ  ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４８，１３２４−１３２５．
●Ｃｌａｒｋ，Ｖ．Ｅ．，Ｅｒｓｏｎ−Ｏｍａｙ，Ｅ．Ｚ．，Ｓｅｒｉｎ，Ａ．，Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｃｏｔｎｅｙ，Ｊ．，Ｏｚｄｕｍａｎ，Ｋ．，Ａｖｓａｒ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ＮＦ２  ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＴＲＡＦ７，ＫＬＦ４，ＡＫＴ１，ａｎｄ  ＳＭＯ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１０７７−１０８０．
●Ｄａｓ  Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ，Ｄ．Ｄ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，６１０６−６１１０．
●Ｄｉｊｋｇｒａａｆ，Ｇ．Ｊ．，Ａｌｉｃｋｅ，Ｂ．，Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ｌ．，Ｊａｎｕａｒｉｏ，Ｔ．，Ｗｅｓｔ，Ｋ．，Ｍｏｄｒｕｓａｎ，Ｚ．，Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｄ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｒ．，Ｒｏｂａｒｇｅ，Ｋ．，Ｓｕｔｈｅｒｌｉｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＤＣ−０４４９  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，４３５−４４４．
●Ｇｅｔｈｅｒ，Ｕ．，Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．，Ｓａｎｄｅｒｓ−Ｂｕｓｈ，Ｅ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．（１９９７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｇｏｎｉｓｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２，２５８７−２５９０．
●Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｉｇａｓ，Ｎ．（２０１１）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ＳＮＶｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓｎｅｓｓ  ｓｃｏｒｅ，Ｃｏｎｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８８，４４０−４４９．
●Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｂｉｇｎｅｌｌ，Ｇ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ａ．，Ｅｄｋｉｎｓ，Ｓ．，Ｈｉｎｔｏｎ，Ｊ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，Ｓｗａｍｙ，Ｓ．，Ｓａｎｔａｒｉｕｓ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｗｉｄａａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．ＰＩＣＮＩＣ：ａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １１，１６４−１７５．
●Ｈａｈｎ，Ｈ．，Ｗｉｃｋｉｎｇ，Ｃ．，Ｚａｐｈｉｒｏｐｏｕｌｏｕｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｇａｉｌａｎｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｈａｎｌｅｙ，Ｓ．，Ｃｈｉｄａｍｂａｒａｍ，Ａ．，Ｖｏｒｅｃｈｏｖｓｋｙ，Ｉ．，Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｕｎｄｅｎ，Ａ．Ｂ．，Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｔｃｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｖｏｉｄ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  ８５，８４１−８５１．
●Ｉｎｕｋａｉ，Ｍ．，Ｔｏｙｏｏｋａ，Ｓ．，Ｉｔｏ，Ｓ．，Ａｓａｎｏ，Ｈ．，Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｓ．，Ｓｏｈ，Ｊ．，Ｓｕｅｈｉｓａ，Ｈ．，Ｏｕｃｈｉｄａ，Ｍ．，Ａｏｅ，Ｋ．，Ａｏｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  Ｔ７９０Ｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｉｎｏｒ  ｃｌｏｎｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，７８５４−７８５８．
●Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｒａｙｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｚａｎｙ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｙ，Ｍ．Ｓ．（２０１４）．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｙ  ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３４，２１３−２２０．
●Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｒｏｔｈｍａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｌ．Ｖ．，Ｂａｒｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｏｎｉｆａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｇ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．（１９９６）．Ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｐａｔｃｈｅｄ，ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｎｅｖｕｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１６６８−１６７１．
●Ｋａｎｄｏｔｈ，Ｃ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｖａｎｄｉｎ，Ｆ．，Ｙｅ，Ｋ．，Ｎｉｕ，Ｂ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｘｉｅ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ｆ．，Ｗｙｃｚａｌｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｃｒｏｓｓ  １２  ｍａｊｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０２，３３３−３３９．
●Ｋａｔｒｉｔｃｈ，Ｖ．，Ｃｈｅｒｅｚｏｖ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．Ｃ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ５３，５３１−５５６．
●Ｋｉｊｉｍａ，Ｃ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｏｋａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ，Ｋ．（２０１２）．Ｔｗｏ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｎｅｖｏｉｄ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ＰＴＣＨ１  ｏｒ  ＳＵＦＵ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １１，５６５−５７０．
●Ｋｏｏｌ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｊａｇｅｒ，Ｎ．，Ｎｏｒｔｈｃｏｔｔ，Ｐ．Ａ．，Ｐｕｇｈ，Ｔ  Ｊ．，Ｈｏｖｅｓｔａｄｔ，Ｖ．，Ｐｉｒｏ，Ｒ．Ｍ．，Ｅｓｐａｒｚａ，Ｌ．Ａ．，Ｍａｒｋａｎｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｒｅｍｋｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＳＨＨ  Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｓ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２５，３９３−４０５．
●Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ，Ｊ．（２０１２）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ  ８，９９９−１０１４．
●Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｋａｗａｇｏｅ，Ｒ．，Ｓａｓａｉ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｈ．Ｒ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．，ａｎｄ  ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．（２００７）．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−ｏｆ−ｆｕｓｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，６４４２−６４４７．
●Ｌｏｎｇ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｌａｎｃｏ，Ｊ．，Ｐａｓｔｏｒｉ，Ｃ．，Ｖｏｌｍａｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ．，Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ，Ａ．，Ｂａｉ，Ｆ．，Ｐｅｉ，Ｘ．Ｈ．，Ａｙａｄ，Ｎ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｄ．Ｊ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ＢＥＴ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ−ＢＥＴ１５１  ａｃｔｓ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｔｏ  ａｂｒｏｇａｔｅ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｄｒｉｖｅｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
●ＬｏＲｕｓｓｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｉｂｅｓ，Ｒ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｏｒａｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｎｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｈａｎｇ，Ｉ．，Ｄａｒｂｏｎｎｅ，Ｗ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ（ＧＤＣ−０４４９）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ，  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７，２５０２−２５１１．
●Ｍｅｔｃａｌｆｅ，Ｃ．，Ａｌｉｃｋｅ，Ｂ．，Ｃｒｏｗ，Ａ．，Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ，Ｍ．，Ｄｉｊｋｇｒａａｆ，Ｇ．Ｊ．，Ｐｅａｌｅ，Ｆ．，Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．（２０１３）．ＰＴＥＮ  ｌｏｓｓ  ｍｉｔｉｇａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｏ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，７０３４−７０４２．
●Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９８５）．Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８２，４５−６５．
●Ｎｅｄｅｌｃｕ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｊａｏ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓａｌｉｃ，Ａ．（２０１３）．Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｉｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，５５７−５６４．
●Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｓ．，Ｇｏｒｇｏｕｌｉｓ，Ｖ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓ，Ｔ．Ｄ．（２０１０）．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，２２０−２２８．
●Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌ，Ｓ．，Ｖａｎ  Ｌｏｏ，Ｐ．，Ｗｅｄｇｅ，Ｄ．Ｃ．，Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．，Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｕ，Ｋ．Ｗ．，Ｒａｉｎｅ，Ｋ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｌｉｆｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ２１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ  １４９，９９４−１００７．
●Ｏｒｏ，Ａ．Ｅ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｂｏｎｉｆａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．（１９９７）．Ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，８１７−８２１．
●Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，Ｌ．，Ｇｈｉｏｒｚｏ，Ｐ．，Ｎａｓｔｉ，Ｓ．，Ｂａｔｔｉｓｔｕｚｚｉ，Ｌ．，Ｃｕｓａｎｏ，Ｒ．，Ｍａｒｚｏｃｃｈｉ，Ｃ．，Ｇａｒｒｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｃａｒｒａ，Ｇ．Ｂ．（２００９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＳＵＦＵ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｇｏｒｌｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １４９Ａ，１５３９−１５４３．
●Ｐｅｓｚ，Ｋ．Ａ．，Ｂｉｅｎｉｅｋ，Ａ．，Ｍａｋｏｗｓｋａ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓａｓｉａｄｅｋ，Ｍ．Ｍ．（２０１３）．Ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ：  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４０，２５−２９．
●Ｐｒｉｃｌ，Ｓ．，Ｃｏｒｔｅｌａｚｚｉ，Ｂ．，Ｄａｌ  Ｃｏｌ，Ｖ．，Ｍａｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌａｕｒｉｎｉ，Ｅ．，Ｆｅｒｍｅｇｌｉａ，Ｍ．，Ｌｉｃｉｔｒａ，Ｌ．，
●Ｐｉｌｏｔｔｉ，Ｓ．，Ｂｏｓｓｉ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｐｅｒｒｏｎｅ，Ｆ．（２０１４）．Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｄｉｃｔａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ｉｎ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．
●Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｗｏｌｔｅｒ，Ｍ．，Ｋｎｏｂｂｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．，Ｓｃｈｏｎｉｃｋｅ，Ａ．，Ｓｃｈａｒｗａｃｈｔｅｒ，Ｃ．，Ｋｕｍａｒ，Ｋ．，Ｂｌａｓｃｈｋｅ，Ｂ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．（２００５）．Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＴＣＨ，ＳＭＯＨ，ＳＵＦＵＨ  ａｎｄ  ＴＰ５３  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １５２，４３−５１．
●Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｗｏｌｔｅｒ，Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｍｅｇａｈｅｄ，Ｍ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｔ．，Ｌｉｃｈｔｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．（１９９８）．Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＭＯＨ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，１７９８−１８０３．
●Ｓａｓａｉ，Ｋ．，Ｒｏｍｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｄ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｃ．，ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．（２００６）．Ｓｈｈ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，４２１５−４２２２．
●Ｓｅｋｕｌｉｃ，Ａ．，Ｍｉｇｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｏｒｏ，Ａ．Ｅ．，Ｄｉｒｉｘ，Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｙｏｏ，Ｓ．，Ａｒｒｏｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂａｓａｌ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６６，２１７１−２１７９．
●Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｅｔｚ，Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｂｈａｓｋａｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｄａｌｙ，Ｓ．Ｂ．，Ｕｒｑｕｈａｒｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｈｏｌａｈ，Ｚ．，Ｏｕｄｉｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＵＦＵ  Ｃａｕｓｅ  Ｇｏｒｌｉｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  Ｒｅｄｅｆｉｎｅ  ｔｈｅ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  ＰＴＣＨ１  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．
●Ｓｔｊｅｒｎｑｖｉｓｔ，Ｓ．，Ｒｙｄｅｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｄ．（２０１１）．Ｍｏｄｅｌ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ＳＮＰ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｄａｔａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０，１５９−１７３．
●Ｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｕｒｏｎｅ，Ｍ．，Ｌｕｏｈ，Ｓ．，Ｙｅ，Ｗ．，Ａｒｍａｎｉｎｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｇｕｒｎｅｙ，Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．，Ｂｒｕｓｈ，Ｊ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ａ．，ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａ．（１９９９）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ，  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｇｌｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２（  Ｐｔ  ２３），４４３７−４４４８．
●Ｓｖａｒｄ，Ｊ．，Ｈｅｂｙ−Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ，Ｋ．，Ｐｅｒｓｓｏｎ−Ｌｅｋ，Ｍ．，Ｒｏｚｅｌｌ，Ｂ．，Ｌａｕｔｈ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ａ．，Ｅｒｉｃｓｏｎ，Ｊ．，Ｔｏｆｔｇａｒｄ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｅｇｌｕｎｄ，Ｓ．（２００６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  １０，１８７−１９７．
●Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｔ．，ＭｃＣｌａｒｙ，Ａ．Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｉｓｃｏｃｈｏ，Ｊ．，Ｎｅａｈｒｉｎｇ，Ｌ．，Ｋｗｅｉ，Ｋ．Ａ．，Ｑｕ，Ｋ．，Ｇｏｎｇ，Ｘ．，Ｎｇ，Ｔ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＳＭＯ  ａｎｄ  ＢＲＡＦ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４６，７２２−７２５．
●Ｔａｎｇ，Ｙ．，Ｇｈｏｌａｍｉｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｓ．，Ｗｉｌｌａｒｄｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ｌｅｅ，Ａ．，Ｂａｎｄｏｐａｄｈａｙａｙ，Ｐ．，Ｂｅｒｇｔｈｏｌｄ，Ｇ．，Ｍａｓｏｕｄ，Ｓ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｂ．，Ｖｕｅ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｐｕｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＢＥＴ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，７３２−７４０．
●Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｒａｆｆｅｌ，Ｃ．，Ｈｕｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｍａｉｎｐｒｉｚｅ，Ｔ．Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ａｇａｔｅｐ，Ｒ．，Ｃｈｉａｐｐａ，Ｓ．，Ｇａｏ，Ｌ．，Ｌｏｗｒａｎｃｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＵＦＵ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅ  ｔｏ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３１，３０６−３１０．
●Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｋａｔｒｉｔｃｈ，Ｖ．，Ｈａｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｓｉｕ，Ｆ．Ｙ．，Ｒｏｔｈ，Ｂ．Ｌ．，Ｃｈｅｒｅｚｏｖ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．Ｃ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｇｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，３３８−３４３．
●Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｙ．，Ｓｏ，Ｐ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｂｏｖｅ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｊｒ．（２０１１）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３１，２２９８−２３０５．
●Ｗｅｃｈｓｌｅｒ−Ｒｅｙａ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．（１９９９）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｂｙ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２２，１０３−１１４．
●Ｗｏｎｇ，Ｈ．，Ａｌｉｃｋｅ，Ｂ．，Ｗｅｓｔ，Ｋ．Ａ．，Ｐａｃｈｅｃｏ，Ｐ．，Ｌａ，Ｈ．，Ｊａｎｕａｒｉｏ，Ｔ．，Ｙａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．，ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｅ．（２０１１）．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ−ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７，４６８２−４６９２．
●Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｍｕｒｏｎｅ，Ｍ．，Ｌｕｏｈ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｙａｎ，Ａ．，Ｇｕ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｂｏｎｉｆａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｌａｍ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂａｓａｌ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，９０−９２．
●Ｙａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｉｊｋｇｒａａｆ，Ｇ．Ｊ．，Ａｌｉｃｋｅ，Ｂ．，Ｊａｎｕａｒｉｏ，Ｔ．，Ａｈｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｈｏｌｃｏｍｂ，Ｔ．，Ｐｕｊａｒａ，Ｋ．，Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｊ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，５７２−５７４．
●Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．（２０１０）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，Ｒ１０６．
●ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．，Ｂａｎｋｓ，Ｅ．，Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒ．，Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｋ．Ｖ．，Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｒｔｌ，Ｃ．，Ｐｈｉｌｉｐｐａｋｉｓ，Ａ．Ａ．，ｄｅｌ  Ａｎｇｅｌ，Ｇ．，Ｒｉｖａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｎｎａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−−−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３，４９１−−−４９８．
●Ｄｉｓｋｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｈｏｕ，Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｇｌｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．，Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ，Ｈ．，Ｂｕｃａｎ，Ｍ．，Ｍａｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｋ．（２００８）．Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ−−−ｇｅｎｏｍｅ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，ｅ１２６．
●Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．，Ｑｉ，Ｊ．，Ｐｉｃａｕｄ，Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｂ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ，Ｏ．，Ｍｏｒｓｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｅａｔｅｓ，Ｔ．，Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｔ．Ｔ．，Ｆｅｌｌｅｔａｒ，，ｅｔ．ａｌ．（２０１０）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ｏｆ  ＢＥＴ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，１０６７−−−１０７３．
●Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｂｉｎｄａｌ，Ｎ．，Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｓ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｋｏｋ，Ｃ．Ｙ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，Ｊｉａ，Ｍ．，Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｒ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｋ．，Ｍｅｎｚｉｅｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＯＳＭＩＣ：ｍｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９，Ｄ９４５−−−９５０．
●Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｇ．，Ｂｉｎｄａｌ，Ｎ．，Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｓ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｅ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｋｏｋ，Ｙ．，Ｊｉａ，Ｍ．，Ｅｗｉｎｇ，Ｒ．，Ｍｅｎｚｉｅｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．ＣＯＳＭＩＣ（ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）：ａ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８，Ｄ６５２−６５７．
●Ｇｏｎｚａｌｅｚ−−−Ｐｅｒｅｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−−−Ｂｉｇａｓ，Ｎ．（２０１１）．  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ＳＮＶｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓｎｅｓｓ  ｓｃｏｒｅ，Ｃｏｎｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８８，４４０−４４９．
●Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．，Ｓｃｈｅｒｚ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｉｓｓｉｍ，Ｓ．，Ｔｉａｎ，Ｈ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．（２００４）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ−−−ｂａｓｅｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｓｈｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｄｉｇｉｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １１８，５１７−５２８．
●Ｊｏｎｋｅｒｓ，Ｊ．，Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｕｌｄｅｎ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｌｋ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（２００１）．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢＲＣＡ２  ａｎｄ  ｐ５３  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９，４１８−４２５
●Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．，Ｊａｋｓ，Ｖ．，Ａｒｅ，Ａ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ａ．，Ｓｃｈｗａｇｅｒ，Ａ．，Ｓｖａｒｄ，Ｊ．，Ｔｅｇｌｕｎｄ  Ｓ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．ａｎｄ  Ｔｏｆｔｇａｒｄ，Ｒ．（２０１１）．Ｗｏｕｎｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，４０９９−４１０４．
●Ｍａｄｉｓｅｎ，Ｌ．，Ｚｗｉｎｇｍａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｓｕｎｋｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｏｈ，Ｓ．Ｗ．，Ｚａｒｉｗａｌａ，Ｈ．Ａ．，Ｇｕ，Ｈ．，Ｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｈａｗｒｙｌｙｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３，１３３−１４０．
●Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，２６０７−２６０８．
●Ｍｕｒｏｎｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，．（１９９９）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ  ９，７６−８４．
●Ｒｕｄｉｎ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４４，１１１１−１１１６．
●Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９，３０８−３１１．
●Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｐ．（２００８）．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ９，１８−２９．
●Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３，６５７−６６３．
●Ｗｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，８７３−８８１．
【０４７８】
参照による組み込み
本明細書で言及する全ての出版物及び特許は、個々の出版物または特許の各々が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４７９】
主題の開示の特定の実施形態を考察してきたが、上の明細書は例示的であって限定的ではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を概観すると、当業者には本開示の多くの変形が明らかとなるであろう。本開示の全範囲は、均等物の全範囲と併せた特許請求の範囲、及びそのような変形と併せた明細書を参照することによって決定されるべきである。前述の実施例は、例示目的のものであるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するものとみなされるべきでない。
【０４８０】
配列リスト
配列番号１−−ヒト野生型スムースンドアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５６２２．１）
【配列表１−１】
【０４８１】
2018512597.tif 000019
【配列表１−２】
【０４８２】
2018512597.tif 000020
配列番号２−−ＳＭＯのアミノ酸位置２８１で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表２−１】
【０４８３】
2018512597.tif 000021
【配列表２−２】
【０４８４】
2018512597.tif 000022
配列番号３  ＳＭＯのアミノ酸位置４５９で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表３−１】
【０４８５】
2018512597.tif 000023
【配列表３−２】
【０４８６】
2018512597.tif 000024
配列番号４  ＳＭＯのアミノ酸位置５３５で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表４−１】
【０４８７】
2018512597.tif 000025
【配列表４−２】
【０４８８】
2018512597.tif 000026
配列番号５（ＷＴ  ＳＭＯ）
【配列表５−１】
【０４８９】
2018512597.tif 000027
【配列表５−２】
【０４９０】
2018512597.tif 000028
配列番号６−−ＳＭＯのアミノ酸位置２４１で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表６−１】
【０４９１】
2018512597.tif 000029
【配列表６−２】
【０４９２】
2018512597.tif 000030
配列番号７−−ＳＭＯのアミノ酸位置４０８で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表７−１】
【０４９３】
2018512597.tif 000031
【配列表７−２】
【０４９４】
2018512597.tif 000032
配列番号８−−ＳＭＯのアミノ酸位置４６９で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表８−１】
【０４９５】
2018512597.tif 000033
【配列表８−２】
【０４９６】
2018512597.tif 000034
配列番号９−−ＳＭＯのアミノ酸位置５３３で突然変異を有するヒトスムースンドアミノ酸配列
【配列表９−１】
【０４９７】
2018512597.tif 000035
【配列表９−２】
【０４９８】
2018512597.tif 000036
配列番号１０−融合（ＳｕＦｕ）アミノ酸配列のヒトサプレッサー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６１６９．２）
【配列表１０】
【０４９９】
2018512597.tif 000037
配列番号１１−融合（ＳｕＦｕ）ｃＤＮＡ配列のヒトサプレッサー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６１６９．２）
【配列表１１−１】
【０５００】
2018512597.tif 000038
【配列表１１−２】
【０５０１】
2018512597.tif 000039
【配列表１１−３】
【０５０２】
2018512597.tif 000040
【図１Ａ】
2018512597.tif 000041
【図１Ｂ】
2018512597.tif 000042
【図１Ｃ】
2018512597.tif 000043
【図１Ｄ】
2018512597.tif 000044
【図１Ｅ】
2018512597.tif 000045
【図１Ｆ】
2018512597.tif 000046
【図１Ｇ】
2018512597.tif 000047
【図１Ｈ】
2018512597.tif 000048
【図１Ｉ】
2018512597.tif 000049
【図２】
2018512597.tif 000050
【図３】
2018512597.tif 000051
【図４】
2018512597.tif 000052
【図５Ａ】
2018512597.tif 000053
【図５Ｂ】
2018512597.tif 000054
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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