(57)【要約】アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物を含む小分子、およびそれらを合成する方法が提供される。また、例えば新生物、がん、および他の疾患などの疾患の処置を目的とする製剤および医薬も提供される。また、治療有効用量の、薬学的に有効な塩または純粋な形態のいずれかとして存在する１つまたは複数の小分子化合物を含有する治療薬、例えば限定されるものではないが、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与用の製剤も提供される。
2018534256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化９】
2018534256.tif 000019
を含む、化合物であって、式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい、
化合物。
【請求項２】
以下：
【化１０】
2018534256.tif 000020
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（２Ｒ，３Ｒ）、（２Ｒ，３Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｓ，３Ｒ）、（２Ｓ，３Ｓ）、（２Ｓ，４Ｒ）、または（２Ｓ，４Ｓ）である立体化学を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ヒト新生物細胞に対して、細胞傷害効果を有することが可能であり、前記細胞傷害効果は、前記ヒト新生物細胞の生存百分率の低減によって定義される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記細胞傷害効果が、１０マイクロモル濃度未満の局所的５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で達成され、前記局所的ＩＣ５０は、前記ヒト新生物細胞の前記生存百分率を５０％に等しい値まで低減する前記化合物の濃度によって定義される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ヒト新生物細胞が、少なくとも１つの新生物に由来し、前記少なくとも１つの新生物が、群：結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、および白血病のうちの１つまたは複数から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
前記ヒト新生物細胞が、少なくとも１つの新生物特徴によって特徴付けられ、前記少なくとも１つの新生物特徴は、群：成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、および特発性のうちの１つまたは複数から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
ヒト細胞に対して、生体エネルギーストレスを及ぼすことが可能であり、前記生体エネルギーストレスは、前記ヒト細胞にとって利用可能である少なくとも１つの栄養素の減少によって特徴付けられ、前記少なくとも１つの栄養素は、群：グルコース、アミノ酸、ヌクレオチド、および脂質のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記ヒト細胞が、新生物細胞および非新生物細胞を含み、前記生体エネルギーストレスが、非新生物細胞と比較して、前記新生物細胞において、より大きな割合の細胞死をもたらす、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ヒト新生物細胞を含む腫瘍の成長を阻害することが可能であり、成長は、少なくとも１つの成長評価によって定義され、前記少なくとも１つの成長評価は、群：腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、または新生物細胞増殖速度における増加のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
１マイクロモル濃度未満またはそれに等しい局所的化合物濃度で、ヒト細胞におけるスフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体１、２、３、４、および５を活性化することができない、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
ヒト障害を処置するための医薬であって、前記医薬は、
治療有効量の、以下：
【化１１】
2018534256.tif 000021
を含む、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物を含有する医薬製剤を含み、式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、５員複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい、
医薬。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、
【化１２】
2018534256.tif 000022
を含む、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記ヒト障害が、少なくとも１つの新生物であり、前記少なくとも１つの新生物は、群：結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、および白血病のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、ヒト新生物細胞に対して、細胞傷害効果を有することが可能であり、前記細胞傷害効果は、前記ヒト新生物細胞の生存百分率の低減によって定義される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１６】
前記細胞傷害効果が、１０マイクロモル濃度未満の局所的５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で達成され、前記局所的ＩＣ５０は、前記ヒト新生物細胞の前記生存百分率を５０％に等しい値まで低減する前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物の濃度によって定義される、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
前記ヒト障害が、少なくとも１つの新生物特徴によって特徴付けられ、前記少なくとも１つの新生物特徴は、群：成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、および特発性のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、ヒト細胞に対して、生体エネルギーストレスを及ぼすことが可能であり、前記生体エネルギーストレスは、前記ヒト細胞にとって利用可能である少なくとも１つの栄養素の減少によって特徴付けられ、前記少なくとも１つの栄養素は、群：グルコース、アミノ酸、ヌクレオチド、および脂質のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１９】
前記ヒト細胞が、新生物細胞および非新生物細胞を含み、前記生体エネルギーストレスが、前記非新生物細胞と比較して、前記新生物細胞において、より大きな割合の細胞死をもたらす、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
前記医薬製剤が、ヒト新生物細胞を含む腫瘍の成長を阻害することが可能であり、成長は、少なくとも１つの成長評価によって定義され、前記少なくとも１つの成長評価は、群：腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、および新生物細胞増殖速度における増加のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、１マイクロモル濃度未満またはそれに等しい局所的化合物濃度で、スフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体１、２、３、４、および５を活性化することができない、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、ヒト被験体の身体内に取り込まれた場合、前記ヒト被験体における有効用量で、徐脈を誘発することができない、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２３】
新生物を処置するための、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物をさらに含む、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物が、群：メトトレキセート、ゲムシタビン、タモキシフェン、タキソール、ドセタキセル、およびエンザルタミドのうちの１つまたは複数から選択される、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
前記ヒト障害が、肥満である、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２６】
ヒト障害を処置する方法であって、前記方法は、
治療有効量の、以下：
【化１３】
2018534256.tif 000023
を含む、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物を含有する医薬製剤を、ヒト被験体に投与することを含み、式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい、
方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が、
【化１４】
2018534256.tif 000024
を含む、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項２８】
前記ヒト被験体を、少なくとも１つのヒト障害を有すると診断することをさらに含む、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのヒト障害が、新生物であり、前記新生物は、群：結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、および白血病のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのヒト障害が、肥満である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬製剤が、前記ヒト被験体において徐脈を刺激しない、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項３２】
前記医薬製剤が、ヒト新生物細胞を含む腫瘍の成長を阻害し、成長は、少なくとも１つの成長評価によって定義され、前記少なくとも１つの成長評価は、群：腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、および新生物細胞増殖速度における増加のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項３３】
前記ヒト障害が、少なくとも１つの新生物特徴によって特徴付けられ、前記少なくとも１つの新生物特徴は、群：成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、および特発性のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項３４】
前記処置が、ＦＤＡ承認標準治療と組み合わされる、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項３５】
前記医薬製剤が、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物と組み合わされる、請求項２６に記載の処置する方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物が、群：メトトレキセート、ゲムシタビン、タモキシフェン、タキソール、ドセタキセル、およびエンザルタミドのうちの１つまたは複数から選択される、請求項３４に記載の処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立がん研究所によって授与された補助金番号Ｔ３２ＣＡ００９０５４、米国国防総省によって授与された補助金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１１−１−０５３５、ならびに米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号Ｒ０１  ＧＭ０８９９１９およびＲ２１  ＣＡ１７８２３０のもとの政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、概して、合成スフィンゴ脂質様分子、これらの分子から形成される医薬、これらの分子を合成する方法、およびこのような治療薬を使用して障害または新生物を処置するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
スフィンゴ脂質とは、スフィンゴシンの脂肪酸誘導体である分子のクラスのことである。これらの分子は、典型的には、細胞膜において見出され、多くの異なるシグナル伝達カスケードを誘起することができる。一般的なスフィンゴ脂質の１つはスフィンゴシンであり、これをリン酸化することで、スフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）を形成することができる。この化学構造を、図１に提供する。
【０００４】
Ｓ１Ｐ受容体は、多くの細胞種の表面において見出される。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐの結合によって活性化される。Ｓ１Ｐ受容体には５種類あり、これらの各々が、別個のシグナル伝達経路を誘起する。Ｓ１Ｐ受容体に対するＳ１Ｐの結合は、細胞増殖および細胞分化、細胞生存、細胞侵入、リンパ球輸送、および細胞移動などの異なる細胞機能を活性化させ得る。
【０００５】
ＦＴＹ７２０は、Ｓ１Ｐ受容体を刺激することによって機能する、免疫抑制剤プロドラッグである。この化学構造を、図２に提供する。その活性化したリン酸化状態において、ＦＴＹ７２０は、５つのＳ１Ｐ受容体のうちの４つに結合する。Ｓ１Ｐ１に対するＦＴＹ７２０−ホスフェートの結合は、受容体を活性化させた後、この受容体を持続的に下方調節し、続いて二次リンパ器官にリンパ球を隔離する。現在、ＦＴＹ７２０は、再発寛解型多発性硬化症（ＭＳ）を処置するために販売されている。従来の刊行物が、異なるＳ１Ｐ受容体アイソフォームへの選択的結合において使用するための、幅広いクラスのＦＴＹ７２０類似体について記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
多くの実施形態において、本発明は、スフィンゴ脂質様分子のアザ環式拘束類似体の性質をもつ小分子、合成する方法、これらの小分子から形成される医薬を対象とし、このような治療薬を使用して障害を処置するための方法が開示される。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明の態様は、以下の分子式：
【化１】
2018534256.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい］
を有する化合物を対象とする。
【０００８】
他の実施形態では、化合物は、以下の特定の分子式を有する。
【化２】
2018534256.tif 000004
【０００９】
なおも他の実施形態では、化合物の立体化学は、（２Ｒ，３Ｒ）、（２Ｒ，３Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｓ，３Ｒ）、（２Ｓ，３Ｓ）、（２Ｓ，４Ｒ）、または（２Ｓ，４Ｓ）である。
【００１０】
さらに多くの実施形態では、化合物は、ヒト新生物細胞に対して、ヒト新生物細胞の生存百分率の低減によって定義される、細胞傷害効果を有することが可能である。
【００１１】
なおもさらに多くの実施形態では、細胞傷害効果は、ヒト新生物細胞の生存百分率を５０％に等しい値まで低減する化合物の濃度によって定義される、適切な局所的５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で達成される。
【００１２】
なおもさらにより多くの実施形態では、ヒト新生物細胞は、結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、または白血病に由来する。
【００１３】
またなおもさらにより多くの実施形態では、ヒト新生物細胞は、成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、または特発性として特徴付けられる。
【００１４】
多くの他の実施形態では、化合物は、ヒト細胞に対して、ヒト細胞にとって利用可能である少なくとも１つの栄養素の減少によって特徴付けられる、生体エネルギーストレスを及ぼすことが可能であり、少なくとも１つの栄養素は、グルコース、アミノ酸、ヌクレオチド、または脂質のうちのいずれか１つである。
【００１５】
さらにより多くの他の実施形態では、生体エネルギーストレスは、非新生物細胞と比較して、新生物細胞において、より大きな割合の細胞死をもたらす。
【００１６】
さらにいっそう多くの実施形態では、化合物は、腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、または新生物細胞増殖速度における増加を阻害することが可能である。
【００１７】
さらによりいっそう多くの実施形態では、化合物は、ヒト細胞におけるスフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体１、２、３、４、および５を活性化することができない。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明の態様は、ヒト障害を処置するための医薬であって、
治療有効量の１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物であり、
【化３】
2018534256.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい］
を含む小分子化合物を含有する医薬製剤を含む、医薬を対象とする。
【００１９】
他の実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、
【化４】
2018534256.tif 000006
を含む。
【００２０】
なおも他の実施形態では、ヒト障害は、結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、白血病、または肥満である。
【００２１】
なおもさらに多くの実施形態では、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、ヒト新生物細胞に対して、ヒト新生物細胞の生存百分率の低減によって定義される、細胞傷害効果を有することが可能である。
【００２２】
なおもさらにより多くの実施形態では、細胞傷害効果は、ヒト新生物細胞の生存百分率を５０％に等しい値まで低減する１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物の濃度によって定義される、適切な局所的５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で達成される。
【００２３】
またなおもさらにより多くの実施形態では、ヒト障害は、成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、または特発性として特徴付けられる。
【００２４】
多くの他の実施形態では、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、ヒト細胞に対して、ヒト細胞にとって利用可能である少なくとも１つの栄養素の減少によって特徴付けられる、生体エネルギーストレスを及ぼすことが可能であり、少なくとも１つの栄養素は、グルコース、アミノ酸、ヌクレオチド、または脂質である。
【００２５】
より多くの他の実施形態では、生体エネルギーストレスは、非新生物細胞と比較して、新生物細胞において、より大きな割合の細胞死をもたらす。
【００２６】
またより多くの他の実施形態では、医薬製剤は、腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、または新生物細胞増殖速度における増加を阻害することが可能である。
【００２７】
さらにいっそう多くの実施形態では、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、スフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体１、２、３、４、および５を活性化することができない。
【００２８】
さらによりいっそう多くの実施形態では、１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、ヒト被験体の身体内に取り込まれた場合、ヒト被験体における有効用量で、徐脈を誘発することができない。
【００２９】
またさらによりいっそう多くの実施形態では、医薬は、新生物を処置するための、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物と組み合わされる。
【００３０】
他の特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物は、メトトレキセート、ゲムシタビン、タモキシフェン、タキソール、ドセタキセル、またはエンザルタミドである。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明の態様は、ヒト障害を処置する方法であって、
治療有効量の１つまたは複数のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物であり、
【化５】
2018534256.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１〜３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、複素環アミンの周囲の３〜５位の間で動いてもよい］
を含む小分子化合物を含有する医薬製剤を、ヒト被験体に投与することを含む、方法を対象とする。
【００３２】
他の実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物は、
【化６】
2018534256.tif 000008
を含む。
【００３３】
なおも他の実施形態では、処置する方法は、ヒト被験体を、少なくとも１つの障害を有すると診断することを含む。
【００３４】
なおもさらに多くの実施形態では、少なくとも１つの障害は、結腸がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、白血病、または肥満である。
【００３５】
なおもさらにより多くの実施形態では、医薬製剤は、ヒト被験体において徐脈を刺激しない。
【００３６】
またなおもさらにより多くの実施形態では、医薬製剤は、腫瘍直径における増加、腫瘍バイオルミネセンスにおける増加、腫瘍体積における増加、腫瘍質量における増加、または新生物細胞増殖速度における増加を阻害する。
【００３７】
多くの他の実施形態では、ヒト障害は、成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、または特発性として特徴付けられる。
【００３８】
より多くの他の実施形態では、処置する方法は、ＦＤＡ承認標準治療と組み合わされる。
【００３９】
さらにいっそう多くの実施形態では、医薬製剤は、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物と組み合わされる。
【００４０】
さらによりいっそう多くの実施形態では、少なくとも１つのＦＤＡ承認化合物は、メトトレキセート、ゲムシタビン、タモキシフェン、タキソール、ドセタキセル、またはエンザルタミドである。
【００４１】
発明を実施するための形態および特許請求の範囲は、以下の図およびデータグラフを参照することでより完全に理解されることになるが、これらは、本発明の例示的実施形態として提示されるものであり、本発明の範囲を完全に列挙するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、従来技術によるスフィンゴシン−１−リン酸の分子構造である。
【００４３】
【図２】図２は、従来技術によるＦＴＹ７２０の分子構造である。
【００４４】
【図３】図３および図４は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【図４】図３および図４は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００４５】
【図５】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図６】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図７】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図８】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図９】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１０】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１１】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１２】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１３】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１４】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１５】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１６】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１７】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１８】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図１９】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図２０】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図２１】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【図２２】図５〜図２２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体を産生するための反応経路である。
【００４６】
【図２３】図２３および図２４は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【図２４】図２３および図２４は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００４７】
【図２５】図２５〜図２７は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の作用機序の態様を説明する概略図である。
【図２６】図２５〜図２７は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の作用機序の態様を説明する概略図である。
【図２７】図２５〜図２７は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の作用機序の態様を説明する概略図である。
【００４８】
【図２８】図２８は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００４９】
【図２９】図２９は、ヒドロキシメチルと比較した、アリールの立体化学の影響の、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の前立腺がん細胞を殺傷する能力に対する影響の研究を要約するデータプロットである。
【００５０】
【図３０】図３０は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００５１】
【図３１】図３１は、ピロリジン環の窒素における電荷の、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の前立腺がん細胞を殺傷する能力に対する効果の研究を要約するデータプロットである。
【００５２】
【図３２】図３２は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の、Ｓ１Ｐ受容体活性化に対する効果の研究を要約するデータプロットである。
【００５３】
【図３３】図３３は、ＦＴＹ７２０と比較した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの無傷細胞における化合物５のリン酸化の効率性の研究を要約するデータプロットである。
【００５４】
【図３４】図３４および図３５は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の、心拍数に対する効果の研究を要約するデータプロットである。
【図３５】図３４および図３５は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の、心拍数に対する効果の研究を要約するデータプロットである。
【００５５】
【図３６】図３６は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の、心拍数に対する効果を示す遠隔測定の読み取り値である。
【００５６】
【図３７】図３７は、本発明の実施形態による治療用小分子類似体の、リンパ球の隔離に対する効果の研究を要約するデータプロットである。
【００５７】
【図３８】図３８および図３９は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【図３９】図３８および図３９は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００５８】
【図４０】図４０は、本発明の様々な実施形態による様々な治療用小分子類似体の、栄養素輸送体の発現をもたらす能力に関する研究を要約するデータプロットである。
【００５９】
【図４１】図４１は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の、結腸直腸がん異種移植モデルにおいて新生物活性をもたらす能力に関する研究を要約するデータプロットである。
【００６０】
【図４２】図４２および図４３は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【図４３】図４２および図４３は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００６１】
【図４４】図４４は、空胞形成、ＣＤ９８喪失、および細胞死を誘発することが可能である、本発明の様々な実施形態によるいくつかのスフィンゴ脂質のグラフ表示である。
【００６２】
【図４５】図４５は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００６３】
【図４６】図４６は、テール鎖長の、本発明の様々な実施形態による様々な小分子類似体に対する効果のグラフ表示である。
【００６４】
【図４７】図４７は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００６５】
【図４８】図４８は、空胞形成、ＣＤ９８喪失、および細胞死を誘発することが可能である、本発明の様々な実施形態によるいくつかの小分子類似体のグラフ表示である。
【００６６】
【図４９】図４９は、本発明の様々な実施形態による治療用小分子類似体の分子構造である。
【００６７】
【図５０】図５０は、空胞形成およびＣＤ９８喪失を誘発することが可能である、本発明の様々な実施形態によるいくつかの小分子類似体のドットプロット表現である。
【００６８】
【図５１−１】図５１Ａ〜５１Ｇは、本発明の実施形態による治療用小分子類似体の分子構造、顕微鏡撮像画像、ならびに小分子類似体の、栄養素輸送体の細胞内移行および代謝変化は誘起するが、Ｓ１Ｐ受容体活性化は誘起しない能力について詳述するグラフデータである。
【図５１−２】図５１Ａ〜５１Ｇは、本発明の実施形態による治療用小分子類似体の分子構造、顕微鏡撮像画像、ならびに小分子類似体の、栄養素輸送体の細胞内移行および代謝変化は誘起するが、Ｓ１Ｐ受容体活性化は誘起しない能力について詳述するグラフデータである。
【図５１−３】図５１Ａ〜５１Ｇは、本発明の実施形態による治療用小分子類似体の分子構造、顕微鏡撮像画像、ならびに小分子類似体の、栄養素輸送体の細胞内移行および代謝変化は誘起するが、Ｓ１Ｐ受容体活性化は誘起しない能力について詳述するグラフデータである。
【００６９】
【図５２】図５２Ａおよび５２Ｂは、本発明の実施形態による小分子類似体によって引き起こされる誘発細胞死が、アポトーシスに対して耐性がある細胞においても起こらないことについて詳述するグラフデータである。
【００７０】
【図５３−１】図５３Ａ〜５３Ｉは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん細胞を選択的に殺傷する能力について詳述するグラフデータである。
【図５３−２】図５３Ａ〜５３Ｉは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん細胞を選択的に殺傷する能力について詳述するグラフデータである。
【図５３−３】図５３Ａ〜５３Ｉは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん細胞を選択的に殺傷する能力について詳述するグラフデータである。
【００７１】
【図５４−１】図５４Ａ〜５４Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん遺伝子を発現しているかまたは腫瘍抑制遺伝子を欠いている細胞を選択的に殺傷する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長を阻害する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５４−２】図５４Ａ〜５４Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん遺伝子を発現しているかまたは腫瘍抑制遺伝子を欠いている細胞を選択的に殺傷する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長を阻害する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５４−３】図５４Ａ〜５４Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、がん遺伝子を発現しているかまたは腫瘍抑制遺伝子を欠いている細胞を選択的に殺傷する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長を阻害する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７２】
【図５５−１】図５５Ａ〜５５Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、空胞形成を誘発する能力について詳述する顕微鏡撮像画像およびグラフデータである。
【図５５−２】図５５Ａ〜５５Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、空胞形成を誘発する能力について詳述する顕微鏡撮像画像およびグラフデータである。
【図５５−３】図５５Ａ〜５５Ｆは、本発明の実施形態による小分子類似体の、空胞形成を誘発する能力について詳述する顕微鏡撮像画像およびグラフデータである。
【００７３】
【図５６−１】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５６−２】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５６−３】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７４】
【図５７−１】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５７−２】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５７−３】図５６Ａ〜５６Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体によって誘発された空胞形成を特徴付ける顕微鏡撮像画像である。図５６Ｆおよび図５７Ａ〜５７Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するウエスタンブロットデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７５】
【図５８−１】図５８Ａ〜５８Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５８−２】図５８Ａ〜５８Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５８−３】図５８Ａ〜５８Ｄは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は妨害するが、活性は妨害しない能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７６】
【図５９−１】図５９Ａ〜５９Ｃは、本発明の実施形態による小分子類似体の、栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘発するための手段としてＰＰ２Ａを活性化する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図５９−２】図５９Ａ〜５９Ｃは、本発明の実施形態による小分子類似体の、栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘発するための手段としてＰＰ２Ａを活性化する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７７】
【図６０−１】図６０Ａ〜６０Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体にはあるが、他のスフィンゴ脂質には無い、２つの別個のＰＰ２Ａ依存性機序によって表面栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘発する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６０−２】図６０Ａ〜６０Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体にはあるが、他のスフィンゴ脂質には無い、２つの別個のＰＰ２Ａ依存性機序によって表面栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘発する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６０−３】図６０Ａ〜６０Ｅは、本発明の実施形態による小分子類似体にはあるが、他のスフィンゴ脂質には無い、２つの別個のＰＰ２Ａ依存性機序によって表面栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘発する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７８】
【図６１−１】図６１Ａ〜６１Ｈは、本発明の実施形態による小分子類似体の、オートファジーフラックス（autophagic  flux）およびマクロピノソーム（macropinosome）分解を低減する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６１−２】図６１Ａ〜６１Ｈは、本発明の実施形態による小分子類似体の、オートファジーフラックス（autophagic  flux）およびマクロピノソーム（macropinosome）分解を低減する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６１−３】図６１Ａ〜６１Ｈは、本発明の実施形態による小分子類似体の、オートファジーフラックス（autophagic  flux）およびマクロピノソーム（macropinosome）分解を低減する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００７９】
【図６２】図６２Ａおよび６２Ｂは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化は改変するが、活性は改変しない能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００８０】
【図６３−１】図６３Ａ〜６３Ｆは、空胞形成が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、本発明の実施形態による小分子類似体の抗新生物効果を増進することについて詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６３−２】図６３Ａ〜６３Ｆは、空胞形成が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、本発明の実施形態による小分子類似体の抗新生物効果を増進することについて詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００８１】
【図６４】図６４Ａおよび６４Ｂは、本発明の実施形態による、空胞形成が細胞死を増進することについて詳述するグラフデータである。
【００８２】
【図６５−１】図６５Ａ〜６５Ｊは、本発明の実施形態による小分子類似体の、前立腺がん細胞を飢えさせ、前立腺腫瘍成長を制限する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６５−２】図６５Ａ〜６５Ｊは、本発明の実施形態による小分子類似体の、前立腺がん細胞を飢えさせ、前立腺腫瘍成長を制限する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【図６５−３】図６５Ａ〜６５Ｊは、本発明の実施形態による小分子類似体の、前立腺がん細胞を飢えさせ、前立腺腫瘍成長を制限する能力について詳述するグラフデータおよび顕微鏡撮像画像である。
【００８３】
【図６６−１】図６６Ａ〜６６Ｃは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前立腺がん細胞における脂質およびアミノ酸の取り込みを遮断する能力について詳述するウエスタンブロットデータ、グラフデータ、および顕微鏡撮像画像であり、一方で、図６６ＤおよびＥは、本発明の実施形態による、新生物細胞に対する選択的毒性を示す。
【図６６−２】図６６Ａ〜６６Ｃは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前立腺がん細胞における脂質およびアミノ酸の取り込みを遮断する能力について詳述するウエスタンブロットデータ、グラフデータ、および顕微鏡撮像画像であり、一方で、図６６ＤおよびＥは、本発明の実施形態による、新生物細胞に対する選択的毒性を示す。
【図６６−３】図６６Ａ〜６６Ｃは、本発明の実施形態による小分子類似体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前立腺がん細胞における脂質およびアミノ酸の取り込みを遮断する能力について詳述するウエスタンブロットデータ、グラフデータ、および顕微鏡撮像画像であり、一方で、図６６ＤおよびＥは、本発明の実施形態による、新生物細胞に対する選択的毒性を示す。
【００８４】
【図６７−１】図６７は、本発明の実施形態による小分子類似体の、前立腺がんの進行を阻害する能力について詳述する顕微鏡撮像画像である。
【図６７−２】図６７は、本発明の実施形態による小分子類似体の、前立腺がんの進行を阻害する能力について詳述する顕微鏡撮像画像である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
ここで、図面およびデータを参照すると、細胞の栄養素輸送体の下方調節の誘起およびリソソーム融合反応の遮断などの様々な治療的機序によって、新生物およびがんなどの障害を処置することが可能である分子、これらの分子から形成される医薬、これらの分子を合成する方法、ならびにこのような治療薬を使用して障害を処置するための方法が開示される。一部の実施形態では、分子は、拘束アザ環式スフィンゴ脂質様化合物である。小分子の追加的な実施形態は、ジアステレオマーの３−および４−Ｃ−アリールピロリジンである。実施形態は、純粋な化合物の形態または薬学的に有効な塩の形態で存在し得る。他の実施形態では、障害の処置を目的とする製剤および医薬が提供される。そのような一部の実施形態では、これらの製剤および医薬は、例えば白血病、前立腺がん、結腸がん、肺がん、膵臓がんおよび乳がんなどのがん、ならびに可能性としては他の疾患、例えば発がん性のＲａｓ変異またはＰＴＥＮ喪失が新生物細胞と関連する疾患などを標的とする。他の実施形態、標的とされる障害は、例えば肥満などの摂食障害に関する。治療用実施形態は、治療有効用量の、薬学的に有効な塩または純粋な形態のいずれかとして存在する１つまたは複数の小分子化合物を含有する。実施形態は、様々な製剤、例えば、限定されるものではないが、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与用の製剤を可能とする。他の追加的な実施形態は、治療量の小分子を使用する、障害のための処置レジメンを提供する。
【００８６】
医薬および処置の実施形態に加えて、実施形態は、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子の、細胞において細胞の生体エネルギーにおける変化を誘発する能力を対象とする。機序の実施形態は、栄養素へのアクセスにおける減少に起因して、生体エネルギーストレスを誘発する。したがって、ストレスは、一部の実施形態では新生物細胞の死を引き起こし、他の実施形態では、ストレスは、正常な健康細胞において毒性をもたらさない。本発明の多くの実施形態は、これらの分子の、細胞表面における栄養素輸送体、低密度リポタンパク質の分解、マクロピノソームの分解、およびオートファジーを減少させる能力を対象とする。
【００８７】
定義
本明細書の目的のために、別途記載されない限り、以下の定義を使用する。
【００８８】
「スフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）」は、脂肪酸に由来し、かついくつかの細胞シグナル応答に関与する、リン酸化された生化学的分子である。この分子の構造は、図１に示されている。
【００８９】
「Ｓ１Ｐ受容体」は、Ｓ１Ｐが標的とする、Ｇタンパク質共役受容体のクラスである。Ｓ１Ｐ受容体１、Ｓ１Ｐ受容体２、Ｓ１Ｐ受容体３、Ｓ１Ｐ受容体４、およびＳ１Ｐ受容体５を含む、５つのサブタイプが存在する。
【００９０】
「プロテインホスファターゼ２（ＰＰ２Ａ）」は、広範な基質特異性および多様な細胞機能をもつ、セリン／スレオニンホスファターゼ活性を有する酵素である。この酵素は、いくつかの発がん性シグナル伝達カスケードを含む、様々なシグナル伝達経路に影響を及ぼすことが公知である。
【００９１】
図２において図示されている「ＦＴＹ７２０」（２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン１，３−ジオール塩酸塩）は、疎水性の脂肪族鎖を有する芳香族部分においてアミノジオール官能性を有する、合成免疫調節剤である。この分子はまた、フィンゴリモドとしても公知であり、再発寛解型多発性硬化症を処置するために、Ｇｉｌｅｎｙａ（商標）という商品名で販売されている。
【００９２】
専門用語
「アシル」は、−Ｒ−Ｃ＝Ｏ基を意味する。
【００９３】
「アルコール」は、飽和アルカン様化合物に結合した−ＯＨ基を有する化合物（ＲＯＨ）を意味する。
【００９４】
「アルキル」は、水素原子をアルカンから除去したときに残る部分構造を指す。
【００９５】
「アルキルホスホネート」は、ホスフェートに結合したアシル基、ＲＣＯ２ＰＯ３２を意味する。
【００９６】
「アルカン」は、単結合のみを含む、炭素および水素の化合物を意味する。
【００９７】
「アルケン」は、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素、Ｒ２Ｃ＝ＣＲ２を指す。
【００９８】
「アルキン」は、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素構造を指す。
【００９９】
「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を特色とする分子構造の一部を指す。
【０１００】
「アリール」は、芳香環に由来する任意の官能基または置換基を指す。
【０１０１】
「アミン」分子は、窒素原子に結合した１つまたは複数の有機置換基を含む化合物、ＲＮＨ２、Ｒ２ＮＨ、またはＲ３Ｎである。
【０１０２】
「アミノ酸」は、カルボキシル基に隣接する炭素原子上にアミノ基を有する二官能性化合物、ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈを指す。
【０１０３】
「アジド」は、Ｎ３を指す。
【０１０４】
「シアニド」は、ＣＮを指す。
【０１０５】
「エステル」は、−ＣＯ２Ｒ官能基を含む化合物である。
【０１０６】
「エーテル」は、同じ酸素原子に結合した２つの有機置換基を有する化合物、すなわちＲ−Ｏ−Ｒ’を指す。
【０１０７】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）、またはヨード（Ｉ）を意味する。
【０１０８】
「炭化水素」は、炭素（Ｃ）および水素（Ｈ）という元素からもっぱら構成される有機化合物を意味する。
【０１０９】
「ホスフェート」、「ホスホネート」、または「ＰＯ」は、リン（Ｐ）および酸素（Ｏ）という元素を含有する化合物を意味する。
【０１１０】
上および全体を通じて、分子式中の「Ｒ」は、任意の好適な有機分子を示すことが意図される。
【０１１１】
Ｃ−アリールアザ環式拘束ピロリジン分子
本発明の実施形態による化合物は、ジアステレオマーの３−および４−Ｃ−アリール２−ヒドロキシメチルピロリジンに基づく。本発明の実施形態による化合物は、図３に図示されており、下にも描写されている。実施形態は、図３に図示されているような分子、このような分子のホスフェート、このような分子のホスホネート、または薬学的に許容されるこれらの塩を含み、式中、
【化７】
2018534256.tif 000009
Ｒ１は、アルキル鎖、（ＣＨ２）ｎＯＨ、ＣＨＯＨ−アルキル、ＣＨＯＨ−アルキン、（ＣＨ２）ｎＯＭｅ、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２）ｎＰＯ３およびそのエステルから選択される任意選択の官能基であり、ここで、Ｍｅは、アルキル、アルケン、またはアルキンであり、
Ｒ２は、脂肪族鎖（Ｃ６〜Ｃ１４）であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アジド（Ｎ３）、エーテル、ＮＯ２、またはシアニド（ＣＮ）を含む、モノ、ジ、トリ、またはテトラ芳香族置換基であり、
ｎは、１、２、または３から選択される、独立して選択される整数であり、
フェニルは、５員炭素環の周囲で、例えば、環の３位から４位へ、５位へと動いてもよい。
さらなる実施形態では、Ｃ−アリール基は、３位または４位に動いてもよく、ここでは、Ｃ−アリール基によって占有されていない位置は、図４に示されており、下にも再現されているように現在Ｈである（すなわち、ＣＨ２）。
【化８】
2018534256.tif 000010
【０１１２】
追加的な実施形態では、アルキル、ＣＨ２ＯＨ、または（ＣＨ２）ｎＯＨ基が５位に付加されてもよい。
【０１１３】
なおも他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３置換基は、それらの位置に関して、フェニル環の周囲で異なる組み合わせを有してもよい。
【０１１４】
なおも他の実施形態では、Ｒ２は、不飽和炭化水素鎖であってもよい。
【０１１５】
なおも他の実施形態では、Ｒ１は、１〜６個の炭素を有するアルキルであってもよい。
【０１１６】
本発明における化合物は、立体異性体（ホスフェート、ホスホネートを含む）、エナンチオマー、ジアステレオマー、シス、トランス、シン、アンチ、溶媒和物（水和物など）、互変異性体として存在してもよく、これらの混合物が、本発明の化合物として企図されることが理解されるであろう。（例えば、図の３ａ〜３ｂ、５ａ、６ａ、７ｃ、および９を参照されたい。）
【０１１７】
化合物がホスフェートまたはホスホネートである多くの実施形態では、Ｒ１は、例えば、（ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ＣＨ＝ＣＨＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステル、ならびに（ＣＨ２）ｎＯＰＯ（ＯＨ）２およびそのエステルであってもよい。
【０１１８】
また、特許請求されている本発明は、薬学的に許容される塩にも関する。「薬学的に許容される塩」は、所望されない毒物学的効果は伴わずに、化合物の望ましい生物学的活性を保持する。塩は、好適な酸、例えば、限定されるものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など；酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、安息香酸、パモ酸、アルギン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などによる塩であってよい。また、組み込まれるカチオンは、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、亜鉛、銅、バリウム、ビスマス、カルシウムなど；または有機カチオン、例えばテトラアルキルアンモニウムおよびトリアルキルアンモニウムカチオンなどを含み得る。酸性塩およびカチオン性塩の組み合わせも有用である。他の酸および／またはカチオンの塩、例えばトリフルオロ酢酸、クロロ酢酸、およびトリクロロ酢酸による塩などが含まれる。
【０１１９】
本発明の実施にとって好適である、他のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子および修飾アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子が、当業者には明らかであろう。一部の分子は、任意のジアステレオマーのＣ−アリールピロリジン化合物を含んでもよい。さらに、これらの分子は、これらの分子が上に示される化合物と構造的に同一でない場合であっても、毒性のあるＳ１Ｐ受容体活性を誘発することなく、新生物成長を阻害するいくつかの作用機序を用い得る。
【０１２０】
Ｃ−アリール拘束ピロリジン分子の合成
実施形態は、適切に置換されたピロロンまたは１−ブロモ−４−オクチルベンゼンから出発する、ジアステレオマーのＣ−アリールピロリジンを含む。アザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物の一部の列記される実施形態は、同様の反応から始まる。
【０１２１】
化合物３：化合物３および４の合成は、ピロロン３ａ（図５の３ａ）の異なる立体異性体で始まる（対して、化合物４の場合は（２Ｓ，４Ｒ））。化合物３は、化合物６、９、および１０の前駆体である。中間体である（２Ｒ，３Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（４−ブロモフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−５−オキソピロリジン−１−カルボキシレート（３ｂ）を合成するために、１，４−ジブロモベンゼン（９．４４ｇ、４０ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、無水Ｅｔ２Ｏ（８６ｍＬ）に溶解させる。この溶液を−２０℃に冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、１６ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を滴下添加する。添加した後、溶液を、−２０℃で１時間撹拌する。その後、この混合物に、ＣｕＢｒ  ＤＭＳ（４．１１ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を一度に添加する。このクプラート混合物を、−２０℃でさらに１時間撹拌した後、−７８℃に冷却する。別の乾燥したフラスコにおいて、３ａ（１．８ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、無水Ｅｔ２Ｏ（２２ｍＬ）に溶解させ、これも−７８℃に冷却する。ＴＭＳＣｌ（１．０２ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を、後者の溶液に添加する。この溶液を、クプラート混合物に、カニューレで滴下して移す。この混合物を−７８℃で１時間撹拌し、１晩かけて室温まで温める。反応をクエンチして、飽和ＮＨ４Ｃｌと０．５ＭのＮＨ４ＯＨとの１：１溶液で３回洗浄した後、ブラインで洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。その後、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１０：１〜６：１）によって精製して、３ｂを得る。
【０１２２】
化合物３ｃ、（２Ｒ，３Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）−５−オキソピロリジン−１−カルボキシレートを合成するために、以下のステップに従う。１−オクチン（３９８μＬ、２．７０ｍｍｏｌ）およびカテコールボラン（ＴＨＦ中１．０Ｍ、２．７０ｍＬ、２．７０ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下において、７０℃で２時間加熱する。この反応混合物を、室温に冷めるまで放置する。ＤＭＥ（２１．９ｍＬ）中の化合物３ｂ（１．１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液を、反応混合物に添加して、その後、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（６２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３の１Ｎ水溶液（１６．８ｍＬ）を添加する。反応混合物を、激しく撹拌しながら、４時間還流させる。混合物を室温まで冷まし、ブライン溶液を添加する。混合物をＥｔ２Ｏで３回抽出し、合わせた有機層をＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、８：１〜６：１）によって精製して、わずかに黄色の油を得る。次いで、この油をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％、１９２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコから空気を吸い出し、Ｈ２によって置き換える。ＴＬＣによって完了が示されると（１晩）、反応混合物を、セライトを通して濾過する。溶媒を減圧下で除去して、水素化生成物である化合物３ｃ（０．８０ｇ、２ステップで６９％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１２３】
中間体である化合物３ｄ（（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート）を合成するために、以下のステップを実施する。無水ＴＨＦ（４．０ｍＬ）中の３ｃ（２５７ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下で、−７８℃に冷却する。この溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．４４ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）を滴下添加する。この混合物を、−７８℃で１時間撹拌する。また、アルゴン雰囲気下の別のフラスコにおいて、無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＰｈＳｅＢｒ（１０４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。次いで、このフェニルセレニルブロミド溶液を、反応混合物に、カニューレで滴下して移す。この混合物を−７８℃で２時間撹拌すると、ＴＬＣにおいて出発物質が目視されなくなる。ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液で反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈すると、２つの相が分離する。水性相をＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去する。フラスコにおいて、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解させ、−７８℃に冷却する。この溶液に、過酸化水素溶液（Ｈ２Ｏ中３０％（ｗ／ｗ）、２０４μＬ）およびピリジン（１６０μＬ、２．２ｍｍｏｌ）を順次添加した。この溶液を、室温に温まるまで放置し、１時間撹拌する。ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液で反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層を合わせ、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１）によって精製して、３ｄ（１９２ｍｇ、２ステップで７５％）を黄色の油として得る。
【０１２４】
中間体である化合物３ｅ（（２Ｒ，３Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）−５−オキソピロリジン−１−カルボキシレート）を、以下のステップを使用して、３ｄから合成する。ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中の３ｄ（１７０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、２８ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコから空気を吸い出し、Ｈ２によって置き換える。ＴＬＣによって完了が示されると（１晩）、反応混合物を、セライトを通して濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１）によって精製して、水素化生成物である化合物３ｅ（１５０ｍｇ、８８％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１２５】
中間体である化合物３ｆ（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−アリル−２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート）を、少なくとも以下のステップによって合成する。化合物３ｅ（１０５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ（２．７ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下で、乾燥したフラスコに添加した後、この溶液を−７８℃に冷却する。水素化トリエチルホウ素リチウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ、８０μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を滴下添加し、混合物を−７８℃で１時間撹拌する。別の乾燥したフラスコにおいて、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（２２．０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、無水ＭｅＯＨ（１．８０ｍＬ）に溶解させ、これも−７８℃に冷却する。この溶液を、反応混合物に、カニューレで滴下して移す。ｐＨがわずかに酸性（ｐＨが約６）であることを確かめ、そうでなければ、さらに多くのｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウムを添加すべきである。この混合物を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層を合わせ、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、粗製Ｏ−メチルアミナール生成物（４８ｍｇ）を黄色の油として得る。次いで、この油を、アルゴン雰囲気下で、無水ＣＨ２Ｃｌ２（０．３４ｍＬ）に溶解させ、この溶液を−７８℃に冷却する。この溶液に、アリルトリメチルシラン（５９μＬ、０．３６５ｍｍｏｌ）および四塩化チタン（ＣＨ２Ｃｌ２中１．０Ｍ、８０μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を順次添加する。橙色の混合物を、−７８℃で１時間撹拌し、水でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層を合わせ、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１）によって精製して、水素化生成物である３ｆ（２０ｍｇ、２ステップで４１％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１２６】
次の中間体である化合物３ｇ、すなわち（２Ｒ，３Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレートを、以下によって合成する。凝縮器を備え付けた乾燥フラスコにおいて、アルゴン雰囲気下で、化合物３ｆ（５７ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１．８ｍＬ）に溶解させる。次いで、化合物３ｆの溶液に、Ｎ−アリルトリチルアミン（５１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）および第二世代グラブス触媒（１４．４ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を順次添加する。この混合物を３日間還流させ、室温まで冷まし、ブラインでクエンチする。この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層を合わせ、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４０：１〜２０：１）によって精製して、二置換アルケン異性体（４０ｍｇ、７０％）を黄色の油として得る。この油（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２（１：１）の溶液（６ｍＬ）に溶解させ、−７８℃に冷却する。オゾンを、濃い青色が持続するようになるまで、溶液に通して泡立てる。ＴＬＣによってアルケン出発物質が観察されなくなる。次いで、残留オゾンを除去するために、青色が観察されなくなるまで、アルゴンを溶液に通して泡立てる。硫化ジメチル（０．４ｍＬ）を慎重に添加し、反応を、室温にゆっくりと温まるまで放置し、１晩撹拌する。溶媒を減圧下で除去する。残留物をＭｅＯＨ（１．９６ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却する。水素化ホウ素ナトリウム（６．８ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加する。そして、反応を０℃で４時間撹拌した。ＴＬＣによってアルデヒド出発物質が観察されなくなる。ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液で反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層を合わせ、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、８：１〜４：１）によって精製して、３ｇ（２３．８ｍｇ、２ステップで７５％）を黄色の油として得る（２３．８ｍｇ、３ステップで４２％）。
【０１２７】
最終的に、化合物３（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｒ）−２，５−ビス（ヒドロキシメチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジニウムクロリド）の合成は、以下のステップで終わる。３ｇ（２１ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、１．６ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、ＴＬＣによって完了が示されるまで、室温で撹拌する（２４〜４８時間）。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、４：１〜１：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、化合物３（１０．０ｍｇ、８８％）を黄色の固体として得る。
【０１２８】
化合物４：化合物４は、図６に図示されているように、化合物３を合成するための手順に従うことで得られた。最初の分子である化合物４ａは、化合物３ａの立体異性体である。
【０１２９】
化合物９：化合物９（（４Ｓ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−４−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−２−オン）の合成は、図７に図示されているように、化合物３ｃで始まる。３ｃ（４０ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、トリフルオロ酢酸（６．２ｍｍｏｌ、０．４８ｍＬ）およびＨ２Ｏ（０．０５ｍＬ）の溶液（９：１）を０℃で添加する。１５分後、溶液を室温まで温め、１晩撹拌する。ＴＬＣによって出発物質が観察されなくなる。溶媒を減圧下で除去する。残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ、１００：８：１）によって精製して、９（１２．０ｍｇ、６３％）を白色の固体として得る。
【０１３０】
化合物１０：化合物１０の合成は、化合物９を合成するための手順に従うことで得られる。図８に示されているように、化合物１０のための合成プロセスは、化合物３ｅで始まる。
【０１３１】
化合物１１：化合物１１の合成は、化合物９を合成するための手順に従うことで得られる。図９に示されているように、化合物１１のための合成プロセスは、化合物４ｅで始まる。
【０１３２】
化合物５：図１０に図示されているように、化合物５の合成は、化合物４ｃで始まる。第１の中間体である５ａ（（２Ｓ，３Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート）を、以下の様式で合成する。無水ＴＨＦ（２．４ｍＬ）中の化合物４ｃ（１２０ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷却する。ボラン硫化ジメチル錯体（ＴＨＦ中２Ｍ、０．３７ｍＬ、０．７４８ｍｍｏｌ）を添加し、反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。ＴＬＣによって出発物質が観察されなくなる。溶媒を減圧下で除去する。残留物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）とともに２回同時蒸発させた後、それをＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去する。そして、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、８：１）によって精製して、５ａ（９４．６ｍｇ、８１％）をわずかに黄色の油として得た。
【０１３３】
次の中間体である化合物５ｂ（（２Ｓ，３Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ヒドロキシメチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート）の合成は、無水ＴＨＦ（１４．３ｍＬ）中の５ａ（２７１ｍｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却することで始まる。フッ化テトラブチルアンモニウム溶液（ＴＨＦ中１Ｍ、０．７５６ｍＬ、０．７５６ｍｍｏｌ）を添加し、反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。ＴＬＣによって出発物質が観察されなくなる。ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１〜４：１）によって精製して、５ｂ（１５５ｍｇ、９２％）を無色の油として得る。
【０１３４】
化合物５（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジニウムクロリド）を合成する最終ステップでは、化合物５ｂ（１５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、０．９８ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、ＴＬＣによって完了が示されるまで、室温で撹拌する（２４〜４８時間）。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、７：１〜４：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、化合物５（１１．０ｍｇ、８８％）を黄色の固体として得る。
【０１３５】
化合物５−Ｐ：図１１に図示されているように、化合物５−Ｐの合成は、化合物５ｂで始まる。最初のステップでは、化合物５ｃ（ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート）を、中間体化合物５ｂから合成する。無水ＴＨＦ（０．４５ｍＬ）中の化合物５ｂ（１４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルＮ，Ｎ−ジエチルホスホラミダイト（３１μＬ、２８ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）および１Ｈ−テトラゾール（１５ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下において室温で順次添加する。混合物をこの温度で１晩撹拌した後、−７８℃に冷却する。この混合物に、ＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍｌ）中のｍ−ＣＰＢＡ（７２％、２５ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応を再度室温まで温める。０．５時間後、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４：１〜２：１）によって精製して、化合物５ｃ（１０ｍｇ、４８％）を無色の油として得る。
【０１３６】
次のステップでは、化合物５−Ｐ（（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−イウム−２−イル）メチル水素ホスフェート）を、化合物５ｃから合成する。５ｂ（５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、０．３４ｍＬ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、室温で２４時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ｉ−ＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ、８：２：１〜８：４：１）によって精製して、５−Ｐ（２．５ｍｇ、７８％）を白色の固体として得る。
【０１３７】
化合物６：化合物６は、化合物５を合成するための手順に従うことで得られる。図１２に図示されているように、化合物６を合成するための出発分子は、中間体化合物３ｃである。
【０１３８】
化合物７：図１３に図示されているように、化合物７を合成するための出発分子は、中間体化合物３ｅである。化合物７は、中間体化合物７ｂ（（２Ｒ，３Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ヒドロキシメチル）−３−（４−オクチルフェニル）ピロリジン−１−カルボキシレート）の合成において差異を有するものの、化合物５を合成するための手順に従うことで得られる。中間体化合物７ｂを合成するために、無水ＴＨＦ（１．１４ｍＬ）中の化合物７ａ（２２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷却する。フッ化テトラブチルアンモニウム溶液（ＴＨＦ中１Ｍ、６１μＬ、０．０６１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。ＴＬＣによって示されるように、出発物質はすべて消費されない。次いで、反応を４８時間４０℃に加熱し、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１〜４：１）によって精製して、７ｂ（１２．５ｍｇ、９２％）を無色の油として得る。
【０１３９】
化合物８：化合物８は、化合物５および７を合成するための手順に従うことで得られる。図１４に図示されているように、化合物６を合成するための出発分子は、中間体化合物４ｅである。
【０１４０】
化合物１２：化合物１２の合成は、図１５に図示されているように、中間体化合物６ｂで始まる。中間体化合物１２ａを合成するために、無水ＣＨ２Ｃｌ２（０．３０ｍＬ）中の化合物６ｂ（３０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（２２μＬ、０．１５４ｍｍｏｌ）を添加し、次いでこの溶液を０℃に冷却する。メタンスルホニルクロリド（９．０μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。反応物を水に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１〜２：１）によって精製して、１２ａ（３４．０ｍｇ、９４％）を無色の油として得る。
【０１４１】
中間体化合物１２ｂを合成するために、無水ＴＨＦ（０．０６ｍＬ）中の化合物１２ａ（２９ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷却する。この溶液に、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ、２４８μＬ、０．２４８ｍｍｏｌ）を添加し、反応を、室温に温まるまで放置し、５時間撹拌する。反応物を水に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１４：１）によって精製して、１２ｂ（２０．７ｍｇ、８９％）を無色の油として得る。
【０１４２】
最終的に、化合物１２を合成するために、１２ｂ（１０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、０．６８ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、室温で１晩撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（１ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、９：１〜３：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、１２（８．０ｍｇ、９６％）を黄色の固体として得た。
【０１４３】
化合物１３：化合物１３は、化合物１２を合成するための手順に従うことで得られる。図１６に図示されているように、化合物１３を合成するための出発分子は、中間体化合物５ｂである。
【０１４４】
化合物１４：図１７は、化合物１４を合成するプロセスを図示している。化合物１４の合成は、中間体化合物６ｂで始まる。無水ＴＨＦ（０．７５ｍＬ）中の化合物６ｂ（３５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷却する。この溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散物、７．２ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加して、その後、ヨウ化メチル（２６ｍｇ、１２μＬ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加する。反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。この混合物を水に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４：１）によって精製して、１４ａ（３３ｍｇ、９２％）を無色の油として得る。
【０１４５】
化合物１４を合成するために、化合物１４ａ（１２ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、０．７５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、室温で１晩撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（１ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、９：１〜４：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、１２（９．９ｍｇ、９８％）を黄色の油として得る。
【０１４６】
化合物１５：化合物１５は、化合物１４を合成するための手順に従うことで得られる。図１８に図示されているように、化合物１５を合成するための出発分子は、中間体化合物５ｂである。
【０１４７】
化合物１６：図１９は、化合物１６を合成するプロセスを図示している。化合物１６ａを、Ｉａｎ  Ｍａｎｎｅｒｓによって報告された、ｐ−ドデシルＣ６Ｈ４Ｂｒを生成する手順（Dorn,  H.ら、Macromolecules、２００３年、３６巻、２９１〜２９７頁）に従って合成する。化合物１６ｂ、１６ｃはすべて公知の化合物である。そして、スペクトルデータは、提案された構造と一致し、文献において報告されているものと整合した。（Barraclough,  P.ら、１９９５年、５１巻、４１９５〜４２１２頁、Van  Huis,  C.  A.ら、J.  J.  Bioorg.  Med.  Chem.、２００９年、１７巻、２５０１〜２５１１頁。）
【０１４８】
中間体化合物１６ａを合成するために、１，４−ジブロモベンゼン（５ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）のジエチルエーテル溶液（１２．５ｍＬ）に、オクチルマグネシウムブロミド溶液（ジエチルエーテル中２．０Ｍ、１０．６ｍＬ、２１．２ｍｍｏｌ）を、アルゴン下において、０℃で滴下添加する。室温で４８時間撹拌した後、混合物を２．５時間還流させ、空気に曝露し、水に注ぎ入れ、ジエチルエーテルで３回抽出する。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去し、残留物を、分取薄層クロマトグラフィー（２０×２０ｃｍ、１０００μｍ、ヘキサン中４プレート）によって精製して、化合物１６ａ（４．４ｇ、７７％）を無色の油として得る。この生成物は、わずかに不純物を含有した。これを、後続の反応においてそのまま使用する。
【０１４９】
中間体化合物１６ｂを合成するために、ジオキサンおよび水（１：１、１００ｍＬ）中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（５ｇ、３８．０ｍｍｏｌ）の溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍＬ）を添加する。この溶液を０℃に冷却する。そして、（Ｂｏｃ）２Ｏ（９．２ｇ、９．７ｍＬ、４１．８ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応を、室温で１晩撹拌する。２ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨを３に維持し、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、粗生成物（８．０ｇ、９１％）を無色の油として得る。この粗製油（１．５ｇ、６．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３２ｍＬ）に溶解させ、トリクロロイソシアヌル酸（１．５ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を一度に添加する。次いで、この混合物を０℃に冷却し、ＴＥＭＰＯ（５１ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）を反応物に添加する。混合物を０℃で０．５時間撹拌した後、室温まで温め、さらに０．５時間撹拌する。ＴＬＣにおいて出発物質が目視されなくなる。その後、水（５ｍＬ）を混合物に添加する。１０分間撹拌した後、有機物を真空中で除去し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、セライトを通して濾過する。ＨＣｌ溶液（１Ｍ、４０ｍＬ）で濾液を酸性化し、水（１０ｍＬ）で４回洗浄し、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、化合物１６ｂ（１．３５ｇ、９１％）を白色の固体として得る。これを、精製せずに、次のステップにおいて直接使用する。
【０１５０】
中間体化合物１６ｃを合成するために、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２７ｍＬ）中の中間体化合物１６ｂ（１．３５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却する。この溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１．７ｍＬ、１７．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７２ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を添加する。５分間撹拌した後、溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．１９ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を添加する。反応を、室温に温まるまで放置し、１晩撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３溶液によって混合物をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、８：１）によって精製して、１６ｃ（０．９６ｇ、５７％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１５１】
中間体化合物１６ｄを合成するために、ＴＨＦ（０．５３ｍＬ）中の１−ブロモ−４−オクチルベンゼン（１６ａ）（９４ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、１４６μＬ、０．３６４ｍｍｏｌ）を、−７８℃で滴下添加する。０．５時間撹拌した後、この混合物に、ＴＨＦ（０．１ｍＬ）中の１６ｃ（４０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を−７８℃でさらに２時間撹拌する。次いで、反応を−４０℃に温め、１晩撹拌する。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を用いて、反応混合物を−４０℃でクエンチし、室温に温まるまで放置する。有機層を分離し、水性層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出する。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１２：１〜８：１）によって精製して、化合物１６ｄ（２１ｍｇ、３２％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１５２】
中間体化合物１６ｅを合成するために、トルエン（０．３ｍＬ）中の１６ｅ（１５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の溶液に、バージェス試薬（１５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を添加する。この混合物を、アルゴン下で４時間加熱して還流させた後、室温まで冷まし、ＥｔＯＡｃで希釈する。混合物を水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去する。そして、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１２：１〜８：１）によって精製して、化合物１６ｅ（１０ｍｇ、６７％）をわずかに黄色の油として得た。
【０１５３】
中間体化合物１６ｆを合成するために、ＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）中の１６ｅ（２０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、４．６ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコから空気を吸い出し、Ｈ２によって置き換える。ＴＬＣによって完了が示されると（１晩）、反応混合物を、セライトを通して濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１２：１〜８：１）によって精製して、水素化生成物である化合物１６ｆ（１９ｍｇ、９５％）を白色の固体として得る。融点（８２．５〜８３．５℃）。
【０１５４】
中間体化合物１６ｇを合成するために、無水ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の水素化アルミニウムリチウム（１．３ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の混合物を０℃に冷却する。次いで、この混合物に、ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の１６ｆ（１５ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。０℃で１時間撹拌した後、水によって反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４：１）によって精製して、化合物１６ｇ（１１．４ｍｇ、９０％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１５５】
最終的に、化合物１６を合成するために、１６ｇ（９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、１．２ｍＬ、４．６２１ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、ＴＬＣによって完了が示されるまで、室温で撹拌する（１〜５時間）。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、８：１〜４：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、化合物５（７．０ｍｇ、９３％）をわずかに黄色の固体として得る。
【０１５６】
化合物１７：化合物１７は、図２０に図示されているように、化合物１６を合成するための手順に従うことで得られた。化合物１７ｂは公知の化合物である。そして、スペクトルデータは、提案された構造と一致し、文献において報告されているものと整合した。（Chabaud,  P.ら、Tetrahedron、２００５年、６１巻、３７２５〜３７３１頁。）
【０１５７】
化合物１８：化合物１８の合成は、図２１に図示されている。化合物１８ａは、化合物１６ｇを合成するための手順に従うことで合成される。
【０１５８】
中間体化合物１８ｂを合成するために、無水ＣＨ２Ｃｌ２（０．８ｍＬ）中の化合物１８ａ（１６ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の溶液に、クラブトリー触媒（５．０ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、この淡橙色の混合物を、７２時間、７０ｐｓｉの水素圧力に供する。溶媒を減圧下で除去して、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１０：１〜８：１）によって精製して、トランス水素化生成物１８ｂ（１１．６ｍｇ、７２％）をわずかに黄色の油として得る。
【０１５９】
最終的に、化合物１８を合成するために、１８ｂ（１１．６ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｍ、０．７５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を、ＴＬＣによって完了が示されるまで、室温で撹拌する（１〜２時間）。溶媒を減圧下で除去し、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）をフラスコに添加し、蒸発させて、残留ＨＣｌを除去する。この粗製混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＨ、８：１〜４：１）によって精製して、黄色の油を得る。この油を水に溶解させ、プラスチックのシリンジフィルター（孔径：０．４５μｍ）を通して濾過し、凍結乾燥させて、１８（８．５ｍｇ、８８％）をわずかに黄色の固体として得る。
【０１６０】
化合物１９：化合物１９の合成は、図２２に図示されている。化合物１９は、化合物１８を合成するための手順に従うことで得られた。化合物１９ａは、１６ｇを合成するための手順に従うことで得られた。
【０１６１】
医薬製剤およびその処置
実施形態では、小分子アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子は、処置するための、治療用医薬へと製剤化される。多くの実施形態は、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子を含有する医薬で処置する方法を対象とする。一部の実施形態では、医薬は、例えば新生物、がん、または肥満などの増殖的成長または過剰な栄養素の消費によって例示される障害を標的とする。他の実施形態は、栄養素の輸送を変更する医薬を有することになる。なおも他の実施形態は、ＰＰ２Ａ酵素を活性化する医薬を有することになる。なおも他の実施形態では、医薬は、酵素、ＦＹＶＥフィンガー含有ホスホイノシチドキナーゼ（ＰＩＫｆｙｖｅ）を誤った場所に局在化させることが可能である。
【０１６２】
多くのこのような実施形態では、治療薬のための投与様式には、限定されるものではないが、経口、経皮、経粘膜（例えば舌下、鼻、膣もしくは直腸）、または非経口（例えば皮下、筋肉内、静脈内、ボーラスもしくは持続注入）が含まれる。必要とされる薬物の実際の量は、罹患している個体のサイズ、年齢、および疾患の重症度などの因子に依存することになる。また、必要とされる薬物の実際の量は、様々なアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物の有効阻害濃度範囲にも依存することになる。下の表１〜６においてより詳細に示され、かつ記載されているように、異なる類似体化合物は、異なる有効阻害濃度範囲を有する。
【０１６３】
一部の実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物は、処置の過程の一部として、治療有効量で投与される。この文脈において使用される場合、「処置」するとは、処置される障害の少なくとも１つの症状を好転させる（ameliorate）こと、または有益な生理学的効果もたらすことを意味する。例えば、このような症状の好転の１つは、新生物の増殖を阻害することであり得る。新生物の増殖の評価は、多くの方法で実施することができ、限定されるものではないが、腫瘍直径における変化、腫瘍バイオルミネセンスにおける変化、腫瘍体積における変化、腫瘍質量における変化、または新生物細胞増殖速度における変化を評価することが含まれる。
【０１６４】
治療有効量は、このような処置の影響を受けやすい疾患または病理学的状態、例えば白血病、前立腺がん、結腸がん、肺がん、膵臓がんもしくは乳がんなどのがん、または発がん性のＲａｓ変異が形質転換細胞に対して複数の代謝的利点を生み出す疾患などの症状を、予防、低減、好転、または排除するのに十分な量であり得る。一部の実施形態では、治療有効量は、栄養素、例えばグルコースまたはアミノ酸などの細胞への輸送を低減するのに十分な量である。
【０１６５】
化合物の投薬量、毒性、および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための、例えば細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比で表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物が使用されてもよいが、非新生物細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を低減するために、罹患組織の部位に対してそのような化合物を標的化させる送達系を設計するための注意が払われるべきである。
【０１６６】
細胞培養物アッセイまたは動物研究から得られたデータを、ヒトにおいて使用する場合の投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。医薬が全身的に提供される場合、そのような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がわずかかまたは毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初は、細胞培養物アッセイから推定され得る。用量は、動物モデルにおいて、循環血漿濃度を達成するように処方されてもよく、あるいは細胞培養物において決定する場合、処置される局所的環境内において、ＩＣ５０（すなわち、新生物成長の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む範囲で処方されてもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１６７】
「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量のことである。例えば、治療量とは、所望される治療効果を達成する量のことである。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防するのに必要な量である予防有効量と、同じであってもあるいは異なっていてもよい。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬量で投与されてもよい。組成物の治療有効量は、選択される組成物に依存する。組成物は、１日当たり１回〜１回または複数回から１週間当たり１回または複数回、例えば１日おきに１回などで投与されてもよい。当業者であれば、ある特定の因子、例えば、限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の一般的健康状態および／または年齢、ならびに他の存在する疾患などが、被験体を有効に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに対して影響を及ぼし得ることを理解するであろう。また、被験体を、治療有効量の本明細書に記載される組成物で処置することは、単回の処置または一連の処置を含み得る。例えば、所望される治療上の結果を達成するために、いくつかに分割された用量が毎日投与されてもよく、１用量が投与されてもよく、あるいは化合物の周期的投与が行われてもよい。単一のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物が投与されてもよく、あるいは様々なアザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子化合物の組み合わせが投与されてもよい。
【０１６８】
これらの化合物の溶解度を改善する薬剤を添加することも可能である。例えば、特許請求される化合物は、選択される投与経路に従って、１つまたは複数の、アジュバントおよび／または薬学的に許容される担体とともに製剤化されてもよい。経口適用の場合、ゼラチン、矯味矯臭剤、またはコーティング材料が添加されてもよい。一般に、溶液または乳濁液の場合、担体は、水溶液またはアルコール／水溶液、乳剤または懸濁剤、例えば生理食塩水および緩衝媒体などを含み得る。非経口的ビヒクルは、とりわけ、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを含み得る。加えて、静脈内ビヒクルは、流体および栄養素補液、電解質補液などを含み得る。
【０１６９】
また、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤が存在してもよい。（一般に、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１６版、Mack、（１９８０年）を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）
【０１７０】
免疫抑制剤化合物ＦＴＹ７２０の抗増殖活性
ＦＴＹ７２０は、周知の免疫抑制剤であり、その化学構造は図２に図示されている。免疫抑制剤として用いられる場合、ＦＴＹ７２０は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリン酸化を必要とするプロドラッグである。いったんリン酸化されると、ＦＴＹ７２０は、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させた後、下方調節して、二次リンパ組織にリンパ球を隔離することによって、機能的アンタゴニストとして作用する。リンパ球を隔離することによって、ＦＴＹ７２０は、これらの免疫細胞を血液循環から除去することで、免疫系を抑制する。
【０１７１】
また、ＦＴＹ７２０は、強力な抗増殖剤でもある。（Lee,  T.  K.ら、（２００５年）Clin.  Cancer  Res.、１１巻、８４５８〜８４６６頁、Azuma,  H.ら、（２００２年）Cancer  Res.、６２巻、１４１０〜１４１９頁、Chua,  C.  W.ら、（２００５年）Int.  J.  Cancer、１１７巻、１０３９〜１０４８頁、Azuma,  H.ら、（２００３年）J.  Urol.、１６９巻、２３７２〜２３７７頁、Neviani,  P.ら、（２００７年）J.  Clin.  Invest.、１１７巻、２４０８〜２４２１頁。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。近年、科学者らは、抗がん剤として使用するためにＦＴＹ７２０を提案し始めている（例えば、Byrd,  J.C.ら、ＵＳ２０１３／０１２３３６６を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。動物モデルにおいては有効であるものの、ＦＴＹ７２０は、その活性リン酸化形態が、Ｓ１Ｐ受容体１およびＳ１Ｐ受容体３に対する作用を通じて重大な徐脈を誘起することから、ヒトがん患者においては使用することができない。（Camm,  J.ら、（２０１４年）Am.  Heart  J.、１６８巻、６３２〜６４４頁、Cohen,  J.  A.、（２０１１年）Ann.  Neurol.、６９巻、７５９〜７７７頁、Sanna,  M.G.ら、（２００４年）J.  Biol.  Chem.、２７９巻、１３８３９〜１３８４８頁。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。このＳ１Ｐ受容体の活性化によって、ＦＴＹ７２０の抗がん薬としての有用性は排除されてきた。
【０１７２】
ＦＴＹ７２０は、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための効果的なＦＤＡ承認薬であり、フィンゴリモドという名称で登録されている（商標名、Ｇｉｌｅｎｙａ）。ＭＳを処置するために使用される用量では、ＦＴＹ７２０は、良好に耐容されることが示されている。しかしながら、がんの処置の場合、有効であるためには増加した用量のＦＴＹ７２０が必要とされる。このＦＴＹ７２０の必要量は、Ｓ１Ｐ受容体１および３の活性化を介して、徐脈を引き起こすことが示されている。（例えば、Lee,  T.  K.ら、Clin.  Cancer  Res.、２００５年、１１巻、８４５８〜８４６６頁、Azuma,  H.ら、Cancer  Res.、２００２年、６２巻、１４１０〜１４１９頁、Chua,  C.  W.ら、Int.  J.  Cancer、２００５年、１１７巻、１０３９〜１０４８頁、Azuma,  H.ら、J.  Urol.、２００３年、１６９巻、２３７２〜２３７７頁、Neviani,  P.ら、J.  Clin.  Invest.、２００７年、１１７巻、２４０８〜２４２１頁、Sanna,  M.  G.ら、J.  Biol.  Chem.、２００４年、２７９巻、１３８３９〜１３８４８頁、およびKoyrakh,  Lら、Am.  J.  Transplant.、２００５年、５巻、５２９〜５３６頁を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）したがって、ＦＴＹ７２０は、がんを処置するその潜在能力にも関わらず、用量制限的な徐脈の副作用によって、がん処置にとって受け入れがたいものとされている。最近、科学者らが、ＦＴＹ７２０がＳ１Ｐ受容体の活性化とは独立して新生物細胞を処置できることを公開した。（Romero  Rosales,  K.ら、（２０１１年）、Biochem.  J.、４３９巻、２９９〜３１１頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）ＦＴＹ７２０が、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の活性化を伴う機序を通じて、アミノ酸およびグルコースのための原形質膜輸送体を下方調節することに続く、飢餓様の死を誘発することが見出された。これは、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させないが、栄養素輸送体の発現を低減する能力を保持するスフィンゴ脂質様分子が、安全かつ有効な抗がん剤となり得ることを示している。
【０１７３】
当該技術分野では、すべての生きた細胞は、それら自体にグルコースおよびアミノ酸などの栄養素を細胞外環境から供給するために、輸送体を発現することが周知である。したがって、新生物細胞の栄養素輸送体の阻害は、非新生物の健康細胞に対しても影響を及ぼす可能性がある。この影響は、健康細胞にとって、有害であり、あるいは有毒ですらあり得る。それでもなお、新生物細胞の栄養素輸送体系を標的とすることは、危険ではあるものの興味深い、がんおよび他の新生物を攻撃するための実験的仮説であり続けた。
【０１７４】
新生物の栄養素輸送体を標的とする処置の可能性の１つは、競合的阻害因子（例えばフロレチン）を使用することである。しかしながら、栄養素輸送体の競合的阻害因子は、有効であるにはミリモル濃度にまで達しなければならないため、抗がん薬の候補としては不良である。一方で、栄養素輸送体の輸送を調節する、進化的に保存されている経路を標的とすることは実現可能であり得る。例えば、スフィンゴ脂質であるフィトスフィンゴシンで処置することで、酵母のアミノ酸輸送体を下方調節すると、順応的に成長停止が誘起される（Chung,  N.ら、J.  Biol.  Chem.、２７６巻、３５６１４〜２１頁（２００１年）。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、天然に存在するスフィンゴ脂質であるセラミドおよびＦＤＡ承認薬であるＦＴＹ７２０も、栄養素輸送体を下方調節し、哺乳動物細胞において飢餓を誘発する（Guenther,  G.  G.ら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１０５巻、１７４０２〜７頁（２００８年）、Romero  Rosales,  K.ら、Biochem.  J.、４３９巻、２９９〜３１１頁（２０１１年）、Welsch,  C.  A.ら、J.  Biol.  Chem.、２７９巻、３６７２０〜３６７３１頁（２００４年）、Azuma,  H.ら、Cancer  Res.、６２巻、１４１０〜１４１９頁（２００２年）、Pchejetski,  D.ら、Cancer  Res.、７０巻、８６５１〜８６６１頁（２０１０年）、Neviani,  P.ら、J.  Clin.  Invest.、１１７巻（２００７年）、Chua,  C.  W.ら、Int.  J.  Cancer、１１７巻、１０３９〜４８頁（２００５年）、Lee,  T.  K.ら、Clin.  Cancer  Res.、１１巻、８４５８〜８４６６頁（２００５年）。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。輸送体の喪失は腫瘍成長を緩徐にするものの、マクロピノサイトーシス経路およびオートファジー経路の活性化によって、特にこれらの経路が両方とも上方調節されている、活性化されたＲａｓを有する腫瘍では、スフィンゴ脂質によって誘発された飢餓に対する耐性がもたらされる場合がある。（Commisso,  C.ら、Nature、４９７巻、６３３〜７頁（２０１３年）、White,  E.、Genes  Dev.、２７巻、２０６５〜２０７１頁（２０１３年）。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、栄養素の取り込みを標的とする望ましい抗新生物化合物は、機序が複雑であることと、それらの化合物が、新生物の成長を緩徐にするためには、栄養素輸送体の発現の下方調節、ならびにミクロピノサイトーシス経路およびオートファジー経路の遮断、ならびに栄養素獲得の他の機序の遮断を含み得る、複数の栄養素輸送体経路を標的とする必要があり得ることとによって、発見することが困難であった。
【０１７５】
他のスフィンゴ脂質様化合物
従来の研究では、一般的なピロリジンコアスキャフォールドＡ（図２３）によって表されるＦＴＹ７２０の拘束アザ環式類似体として、２，３，５−三置換ピロリジンのシリーズが調製されてきた（Hanessian,  S.ら、（２００７年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.、１７巻、４９１〜４９４頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの、（２Ｒ，３Ｒ，５Ｒ）−２，５−ビス−ヒドロキシメチル−３−（４−オクチル）フェニルピロリジン（化合物１）および対応するエナンチオマー（化合物２）のリン酸化バージョンは、ＦＴＹ７２０ホスフェートと比較して、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３よりもＳ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５に対して顕著な選択性を呈した。この観察により、ＦＴＹ７２０のコンフォメーション的に柔軟であるアミノジオール部分の化学修飾が、Ｓ１Ｐ受容体に対する選択的親和性につながり得るということが認められた（Clemens,  J.  J.ら、（２００５年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.、１５巻、３５６８〜３５７２頁、Davis,  M.  D.ら、（２００５年）J.  Biol.  Chem.、２８０巻、９８３３〜９８４１頁、Zhu,  R.ら、（２００７年）J.  Med.  Chem.、５０巻、６４２８〜６４３５頁、Forrest,  M.ら、（２００４年）J.  Pharmacol.  Exp.  Ther.、３０９巻、７５８〜７６８頁。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７６】
別の研究では、合成的により入手しやすい、立体化学的に別個の２−ヒドロキシメチル４−Ｏ−アリールメチルピロリジンのシリーズの、ＦＴＹ７２０の拘束類似体が報告された。これは、（２Ｒ，４Ｓ）−類似体Ｂ（図２４）によって例示されるように、ＢＣＲ−Ａｂｌ発現細胞株において顕著な抗白血病活性を呈した（Fransson,  R.ら、（２０１３年）ACS.  Med.  Chem.  Lett.、４巻、９６９〜９７３頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。エナンチオマーである（２Ｓ，４Ｒ）−ジアステレオマーは活性が６分の１であったため、立体化学的依存性が示された。しかしながら、拘束ＦＴＹ７２０類似体のこのシリーズは、固形腫瘍由来の多くの細胞株を含む他の種類のがん細胞株に対して呈した活性が、遥かに弱かった。
【０１７７】
Ｃ−アリール拘束ピロリジン化合物の機序
したがって、従来の研究とは著しく対照的に、ＦＴＹ７２０のＳ１Ｐ受容体に関連する用量制限的毒性と関与することのない、Ｃ−アリール拘束ピロリジン類似体シリーズに基づく、安全かつ有効な抗がん剤が、本発明の実施形態として提示される。特定の実施形態では、拘束アザ環式スフィンゴ脂質様分子としてのＣ−アリールピロリジンが、新生物成長の有望な阻害因子であることが発見された。したがって、実施形態は、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させない強力な増殖阻害因子としての、拘束アザ環式スフィンゴ脂質様分子としてのＣ−アリールピロリジンを対象とする。さらに、本発明の実施形態、特に化合物ＳＨ−ＢＣ−８９３は、セラミドおよびＦＴＹ７２０の薬理学的に不利な点を有しない、新規の抗新生物スフィンゴ脂質様化合物である。本発明の実施形態は、ＬＤＬ、マクロピノソーム、およびオートファゴソームの分解にとって必須であるリソソーム融合反応を遮断し、同時に、細胞表面からのグルコースおよびアミノ酸の輸送体を下方調節することによって、抗がん活性に対して影響を及ぼす。
【０１７８】
ＦＴＹ７２０などの従来技術の分子は、新生物成長を阻害し、重篤な徐脈を引き起こすことが見出されている（図２５）。一方で、Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物は、新生物成長を阻害するが、徐脈症状を刺激することはない。高用量のＦＴＹ７２０でのＳ１Ｐ受容体の活性化は、徐脈の表現型を刺激することが現在公知である。拘束ピロリジンを有するある特定のスフィンゴ脂質様分子はＳ１Ｐ受容体を活性化させず、したがって、これらの分子は徐脈を引き起こさない（図２５および図３４〜３６）。したがって、本発明の実施形態は、Ｓ１Ｐ受容体の活性化を予防するスフィンゴ脂質様分子の拘束ピロリジン部分を対象とする。
【０１７９】
Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物およびＦＴＹ７２０は、ある生体エネルギー的機序によって、Ｓ１Ｐの活性化から独立して、新生物を阻害および殺傷する。この機序では、スフィンゴ脂質様化合物は、グルコースおよびアミノ酸などの重要な栄養素および生物燃料に対するアクセスを防止することによって、新生物細胞を餓死させる（図２６）。したがって、本発明の多くの実施形態は、新生物細胞から重要な栄養素およびアミノ酸を欠乏させる、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物を対象とする。
【０１８０】
新生物細胞は、いくつかの異なる経路によって栄養素を獲得することができる。これらの経路には、アミノ酸またはグルコース輸送チャネルによって細胞膜を横切る栄養素の通路（１）、ＬＤＬ受容体を介した低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）移入（２）、オートファジー（３）、およびマクロピノサイトーシス（４）が含まれる（図２６）。したがって、本発明の複数の実施形態は、栄養素輸送体、ＬＤＬエンドサイトーシス、オートファジー、またはマクロピノサイトーシスによる栄養素へのアクセスを防止する処置としての拘束スフィンゴ脂質様分子を対象とする。
【０１８１】
この生体エネルギー的機序の詳細な説明図を、図２７に表している。示されるように、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子（１０１）は、栄養素輸送体の細胞内移行経路（１０３）および／または空胞形成経路（１０５）という並行する２つの経路を刺激することができる。全体としては、これらの経路は両方とも、最終的には細胞内栄養素の減少（１１１）および（１２５）につながり、これによって、処置された細胞は、生体エネルギーストレスを受けることになる（１２７）。しかしながら、細胞種が異なれば、ストレスに対する反応も異なる。健康な正常細胞（１２９）は静止状態となり（１３３）、より低い栄養補給速度に対して単に順応する。しかしながら、形質転換された新生物細胞（１３１）は、高レベルの栄養素に対して「依存症」であるため、この生体エネルギーストレスに対して順応することができない。これらの新生物細胞は、栄養素が欠乏しているにも関わらず、高分子を合成しようとする試みを継続し、最終的には蓄えが枯渇したときに細胞死を迎える（１３３）。
【０１８２】
栄養素輸送体の細胞内移行経路（１０３）および空胞形成経路（１０５）はそれぞれ、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子がＰＰ２Ａ複合体を活性化すること（１０７）および（１１３）で始まる。これらの経路は別個であるため、活性化されるＰＰ２Ａ複合体は、これら２つの経路に関して異なったものであると考えられる。ＰＰ２Ａは、９０を超えるアイソフォームを有するヘテロ三量体の複合体であり、したがって、スフィンゴ脂質様分子が異なるＰＰ２Ａ複合体を刺激して、ひいてはこれらの複合体が２つの別個の経路を誘起し得る可能性はかなり高い。
【０１８３】
栄養素輸送体の細胞内移行経路（１０３）では、ＰＰ２Ａの活性化（１０７）は、直接的に、細胞表面からの栄養素輸送体の喪失（１０９）につながる。この輸送体の喪失は、グルコースおよびアミノ酸などの栄養素の細胞外空間からの利用可能性を低減する（１１１）。利用可能な栄養素の低減は、少なくとも部分的に、生体エネルギーストレス（１２７）に寄与する。
【０１８４】
並行する空胞形成経路（１０５）では、ＰＰ２Ａの活性化（１１３）は、キナーゼＰＩＫｆｙｖｅの誤った場所での局在化を引き起こし得る（１１５）。したがって、ＰＩＫｆｙｖｅは細胞の多小胞体と会合せず、ＬＤＬ小胞、マクロピノソーム、およびオートファゴソームとのリソソーム融合（１１７）を減少させる。結果的に、リソソーム融合の欠乏は、ＬＤＬの分解（１１９）、マクロピノソームの分解（１２１）、およびオートファジー（１２３）を減少させ、ひいてはこれらは、細胞外栄養素（１１１）および細胞内栄養素（１２５）それぞれに対する細胞のアクセスを減少させる。ここでも、利用可能な栄養素の低減が、生体エネルギーストレス（１２７）に寄与する。
【０１８５】
生体エネルギーストレスの機序を理解することで、Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物が、あらゆるすべてのがんの種類およびクラスを処置可能であることがわかるようになる。すべての新生物にわたって一貫している特質の１つは、同化作用に対する、柔軟性のない拘束（commitment）である。したがって、任意のがんのクラス、例えば、限定されるものではないが、成長が遅い、成長が速い、侵攻性、悪性、Ｒａｓ陽性、ＰＴＥＮ陰性、良性、転移性、結節性、特発性、固形腫瘍、または血液がんとして特徴付けられる新生物などが、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物に対して感受性であることが予期される。したがって、これらの分子は、ほぼすべてのがん性組織、例えば、限定されるものではないが、白血病、前立腺がん、結腸がん、膵臓がん、または乳がんなどに対して有効であることが予期される。さらに、記載されるスフィンゴ脂質様化合物は、患者間および患者内での新生物の不均質性の合併症を克服すべきである。不均質性を克服することは、腫瘍の遺伝子型に対して特異的な多くの現在の処置にとって一般的である薬物耐性を低減させることにもなる。
【０１８６】
この生体エネルギーストレスモデルからは、Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物が、新生物障害に加えて、ある特定の代謝障害も処置できることが予測され得る。特に、過剰な栄養素を獲得する障害、例えば肥満などを、これらの化合物で処置し得る。細胞における栄養素の取り込みを制限することによって、患者は、過剰な体重を減らすことが予期され得る。Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物は、ヒト患者において有効であることが十分に予期される。下の例示的実施形態において説明されるように、スフィンゴ脂質様化合物は、複数のヒト新生物細胞株、マウスにおける細胞株異種移植片、およびマウスにおける特発性腫瘍に対して有効である。これらのモデルの各々、ならびに患者由来のがんオルガノイドおよびマウスにおける患者由来のがん異種移植片における成功から、これらの分子が、ヒト臨床治験においても最終的には効果的であることが予期される。さらに、これらの化合物が、他のがん処置または医薬、例えば、限定されるものではないが、ＦＤＡ承認標準治療、メトトレキセート、ゲムシタビン、タモキシフェン、タキソール、ドセタキセル、およびエンザルタミドなどと組み合わせてもよく、それらの有効性を向上させ得ることが予期される。
【０１８７】
この生体エネルギー的機序に従って、本発明の多くの実施形態は、ストレスの増加に起因して新生物細胞を殺傷することが可能である、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物を対象とする。他の実施形態では、スフィンゴ脂質様化合物は、正常な健康細胞に対して毒性をもたない。さらに多くの実施形態では、スフィンゴ脂質様化合物は、栄養素輸送体の細胞内移行経路および／または空胞形成経路を刺激する。本発明の実施形態は、細胞外栄養素または細胞内栄養素に対する細胞のアクセスを低減することが可能である、スフィンゴ脂質様化合物を対象とする。より具体的な実施形態は、表面栄養素輸送体の量、ＬＤＬの分解、マクロピノソームの分解、またはオートファジーを減少させることが可能である、これらの化合物を対象とする。さらに、他の実施形態は、ＰＰ２Ａの活性化、ＰＩＫｆｙｖｅの誤った場所での局在化、またはリソソーム融合の減少を対象とする。
【０１８８】
まとめると、本明細書に記載されるＣ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物は、当該技術分野における他のアプローチに内在する致死的な副作用を伴わずに、がんおよび新生物と戦い、受け入れがたいＦＴＹ７２０を、抗がん剤として有効に利用するものである。したがって、小分子アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子、このような小分子に基づく治療薬、ならびにがんおよび他の障害の処置において使用するためにこのような治療薬を組み込む処置レジメンの実施形態が下に提示される。
【実施例】
【０１８９】
例示的実施形態
生物学的データは、障害を処置する様々な実施形態における、前述のアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物の使用を支持している。従来の研究により、ＦＴＹ７２０の柔軟なアミノジオール部分に対する化学修飾が、Ｓ１Ｐ受容体に対する選択的結合に影響を及ぼすことは確立されている。（上で引用した、Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｄａｖｉｓら、Ｚｈｕら、およびＦｏｒｒｅｓｔら。）本開示によるＦＴＹ７２０のアザ環式拘束類似体の実施形態は、新生物細胞を殺傷し、および／またはその成長を阻害し、徐脈のような致死的な副作用のリスクを低減することに留意されたい。したがって、様々な疾患を処置するためにこれらの化合物を使用する実施形態は、従来のアプローチと関連する潜在的な危険を回避する。考察されるように、データは、本開示による小分子アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子の実施形態が、既存のＦＴＹ７２０関連分子および関連する処置方法よりも優れているという提案を支持している。
【０１９０】
アザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子の実施形態の予期される治療有効性は、ＰＣ３およびＤＵ１５前立腺がん細胞を使用する予備研究において実証された、その生物学的活性に起因する。ＳＷ−６２０およびＳＷ−４８０結腸がん細胞、Ａ−５４９肺がん細胞、ＰＡＮＣ−１膵臓がん細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞、ならびにＳｕｐ−Ｂ１５白血病細胞を使用する追加的な研究により、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様小分子の実施形態の生物学的活性が実証された。下で考察されるように、ピロリジンにおける窒素の電荷に対する変更およびリン酸化部位の喪失などの、わずかな化学修飾および構造修飾が、これらの分子の活性に対して異なった影響を及ぼす。ピロリジン（ラクタム）における窒素の電荷に対する変更は、活性の喪失につながった。リン酸化部位の喪失は、活性に対してわずかに影響を及ぼした。したがって、非ラクタム類似体でも、ＦＴＹ７２０対照を上回る治療上の利点を示す。アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物の実施形態は、少なくとも、マクロピノソームおよびオートファゴソームの分解にとって必須であるリソソーム融合反応を遮断し、細胞表面からのグルコースおよびアミノ酸の輸送体を下方調節することによって、腫瘍成長を緩徐にし、がん細胞を殺傷する。
【０１９１】
アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物およびがん細胞に対する効果の最適化：
第１の実施形態では、異なる小分子の殺傷能力を実証するために、細胞培養物アッセイを実行した。先に提示した化合物１〜４（図２３）、化合物５〜８（図２８）、および対照化合物ＦＴＹ７２０（図２）を使用して、良好に樹立されたＰＣ３およびＤＵ１４５前立腺がん株を処置した（図２９および表１）。これらのがん株の増殖を測定するために、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイを実施した。表１に示されているように、化合物１〜８はそれぞれ、その抗がん活性を保持することが可能である。
【表１】
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【０１９２】
化合物５〜８は、化合物１〜４の切断されたバージョンであり、５−ヒドロキシメチル基を含有していない。化合物５および６は、前立腺がん細胞株においてＦＴＹ７２０と同程度に活性であったため、この構造的バージョンは、化合物１〜４の活性を縮小させていなかった。また、これらの知見は、このシリーズのＣ−アリール類似体における立体化学は、抗がん標的との相互作用にとって重要ではないことも示唆している。
【０１９３】
別の例示的実施形態では、ピロリジン環における窒素の電荷が活性にとって重要であるかどうかを決定するために、さらなる細胞培養物アッセイを実行した。特に、ラクタム環を含有する化合物９〜１１（図３０）を、前立腺がん細胞増殖アッセイにおける類似体６〜８（図２８）に対応して比較した。図３１および表１に示されているように、ピロリジンにおける窒素の電荷を中和することは、活性の劇的な喪失をもたらした。これは、標的との静電相互作用が、化合物の活性にとって非常に重要であり得ることを示唆している。
【０１９４】
なおも別の例示的実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体活性に対するリン酸化の効果を実証するために、細胞培養物アッセイを実行した。リン酸化は、徐脈を引き起こす可能性があるＳ１Ｐ受容体の活性に対して影響を及ぼし得る。がん患者におけるＦＴＹ７２０の使用を防止する用量制限的毒性である徐脈は、Ｓ１Ｐ受容体１および３に対するＦＴＹ７２０−Ｐの作用に起因する。（Camm,  J.ら、（２０１４年）Am.  Heart  J.、１６８巻、６３２〜６４４頁、Cohen,  J.  A.、Chun,  J.、（２０１１年）Ann.  Neurol.、６９巻、７５９〜７７７頁、Sanna,  M.G.ら、（２００４年）J.  Biol.  Chem.、２７９巻、１３８３９〜１３８４８頁。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。スフィンゴシンキナーゼによるリン酸化によって、化合物は、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させることができるようになり得る。例えば、ＦＴＹ７２０は、リン酸化された場合に、Ｓ１Ｐ受容体１および３を活性化させることが公知である。化合物５はリン酸化され得るため、化合物５およびそのホスフェートである５−Ｐ（図２８）のＳ１Ｐ受容体に対する活性を評価した（図３２）。予期されたように、陽性対照Ｓ１Ｐは、ナノモル濃度で、その受容体のすべて（１〜５）を活性化させた。対照的に、様々な実施形態によるアザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子の例示的実施形態は、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させないか、あるいはほんのわずかしか活性化させない。特に、細胞培養物に基づくアッセイは、類似体５、５−Ｐ、および６が、Ｓ１Ｐ受容体２、３、４、または５を活性化させなかったことを示している（図３２）。Ｓ１Ｐ受容体１はわずかに活性化されたが、Ｓ１Ｐ対照よりも１０００倍多い用量（＞１ｕＭ）で活性化されたに過ぎなかった。以前の報告では、他のＣ−アリール拘束スフィンゴ脂質様化合物がＳ１Ｐ受容体を刺激することが示されていたこと（Hanessian,  S.ら、（２００７年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.、１７巻、４９１〜４９４頁、上で引用した）を考慮すると、これらの結果は予期せぬものであった。これらの結果は、新生物を処置するためにＦＴＹ７２０および他のスフィンゴ脂質様化合物を使用することを妨げてきたＳ１Ｐ受容体活性を、スフィンゴ脂質様化合物の本実施形態が欠くことを実証している。
【０１９５】
さらなる例示的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究が、類似体５がＰＣ３およびＳＷ６２０細胞においてＦＴＹ７２０よりもわずかに効率的にリン酸化され、培地中に搬出されることを示している（図３３、１６時間インキュベートした後の、前立腺がん（ＰＣ３）または結腸がん（ＳＷ６２０）細胞におけるリン酸化化合物、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって回収された化合物全体のパーセントとして表されている）。これはさらに、Ｓ１Ｐ受容体活性化の喪失が、非効率的なリン酸化の結果ではないことを実証している。
【０１９６】
さらにより例示的な実施形態では、化合物５および５−Ｐを、複数のＳ１Ｐ受容体をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化するそれらの能力に関してさらに調査した。特に、マウスの心拍数およびリンパ球の隔離について調査した。マウスの心拍数は、Ｓ１Ｐ受容体３が活性化された場合に減少し、徐脈が引き起こされるが、一方でヒトでは、この効果はＳ１Ｐ受容体１によって媒介され得る。マウスにおいてもヒトにおいても、Ｓ１Ｐ受容体１が活性化された場合、リンパ球は隔離される。予期されたように、プロドラッグＦＴＹ７２０および活性化された薬物ＦＴＹ７２０−Ｐは両方とも、生理食塩水ビヒクルと比較して、心拍数をおよそ５０％減少させ、有意にリンパ球を隔離した（図３４〜図３７）。一方で、化合物５および５−Ｐは、生理食塩水対照と比較して、心拍数またはリンパ球の隔離に対して有意な影響を及ぼさなかった（図３４〜図３７）。
【０１９７】
図３６に詳述されている遠隔測定の読み取り値において示されているように、ＦＴＹ７２０（Ｂ）は、化合物５（Ｃ）および対照（Ａ、生理食塩水）と比較して、心拍数を緩徐にした。Ａに示されているように、生理食塩水を投与した後、心房脱分極を表す明白に識別できるＰ波と、心室脱分極を表すＱＲＳ群とを有する正常洞調律が、規則的な間隔で観察される。このトレースの心拍数は、１分当たりおよそ６００拍（ＢＰＭ）であった。対照的に、Ｂに示されているように、ＦＴＹ７２０を投与すると、およそ２００ＢＰＭの徐脈がこのトレースにおいて観察された。明瞭なＰ波はもはや存在せず、Ｒ−Ｒのリズムは遥かにより可変的であった。このことは、薬物の注射後の最低の心拍数は、単に洞調律における低減に起因するのではなく、洞房結節伝導（sinoatrial  node  conduction）の抑制に起因することを示していた。最後に、Ｃに示されているように、例示的実施形態の化合物５では、生理食塩水の注射と同様に、注射後も明確かつ一貫したＰ波とＱＲＳ群とを有する正常洞調律が存在した。このトレースの心拍数は、生理食塩水と同様に、およそ６００ＢＰＭであった。
【０１９８】
このｉｎ  ｖｉｖｏデータはともに、例示的実施形態化合物５が、がん患者におけるＦＴＹ７２０の使用を妨げてきた用量制限的Ｓ１Ｐ１活性およびＳ１Ｐ３活性を欠くことを実証している。さらに、活性化合物、例えば５などのリン酸化は、親のＦＴＹ７２０とは異なり、マウスの心拍数に対して有害な効果を有しない。
【０１９９】
なおも別の例では、分子のリン酸化のあらゆる可能性を取り除くために、２−ヒドロキシメチル部分を、メチル部分で置き換えた（化合物１２〜１５）（図３８）。予期されたように、化合物１２および１４は、Ｓ１Ｐ受容体のいずれも活性化させることはできなかった（図２３）。しかしながら、リン酸化不能部分による置き換えは、化合物１２〜１５のがん細胞株の増殖を抑制する能力を制限することもなかった（表１）。予期せぬことに、これらの化合物は、親である２−ヒドロキシメチル化合物およびＦＴＹ７２０とほぼ同程度に強力であった。したがって、これらの分子は、がんの成長を阻害するのに、２−ヒドロキシメチル部分も、化合物のリン酸化も必要ないことを実証している。
【０２００】
別の例示的研究では、活性に対するＣ−アリール環の位置の効果を調査した。化合物１２〜１５におけるＣ−アリールピロリジンの位置を、３位から４位に移して、化合物１６〜１９を創出した（図３９）。がん細胞株増殖アッセイにおける評価は、４−Ｃ−アリールピロリジン１６および１７が、３−Ｃ−アリールピロリジン１２〜１５およびＦＴＹ７２０と同程度に活性であることを実証した（表１）。しかしながら、化合物１８および１９は、活性ではあるものの、効力は低かった（表１）。この結果は、このシリーズにおけるピロリジンコアスキャフォールド上の置換基の相対位置および立体化学が、抗がん活性に対して大きな負の効果を有しないことを示唆している。
【０２０１】
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ増殖アッセイは、表１に表されているような化合物をスクリーニングするために使用したが、細胞増殖抑制性である化合物と細胞傷害性である化合物とを良好には区別しない。したがって、本発明の実施形態による類似体が細胞傷害性であるかどうかを決定するために、生細胞色素排除（vital  dye  exclusion）およびフローサイトメトリーを使用する研究を実行した（表２）。化合物３〜６および１４を試験し、細胞傷害性であり、ＰＣ３前立腺がん細胞において細胞死を誘起することが見出された。ＩＣ５０は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイにおいて観察されたものと同様であった（表１および２）。
【表２】
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【０２０２】
本発明の一部の実施形態、例えば少なくとも前立腺がん細胞株における化合物３〜６、１４の好適な効力を観察したところで、これらの化合物を用いて、他のがん細胞株を試験した。生細胞色素排除アッセイの結果から、結腸（ＳＷ−６２０）、肺（Ａ−５４９）、膵臓（ＰＡＮＣ−１）、乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、および白血病（ＳｕｐＢ−１５）のがん細胞株において、ＦＴＹ７２０と同様の活性が実証された（表３）。表３は、がん細胞株におけるＩＣ５０値を、μΜで示している（ＮＤは、未決定を意味する）。前立腺がん細胞株において活性であった化合物は、ＦＴＹ７２０と同様の効力で、ＢＣＲ−Ａｂｌ陽性白血病細胞も殺傷した。エナンチオマーである４−Ｏ−アリールメチルエーテル化合物２０および２１とは異なり、４−Ｃ−アリール−２−ヒドロキシメチルピロリジン１６〜１９は、ＢＣＲ−Ａｂｌ陽性白血病細胞に対するそれらの活性において、明瞭な立体化学的差異を示さなかった。（Fransson,  R.ら、（２０１３年）ACS.  Med.  Chem.  Lett.、４巻、９６９〜９７３頁。）化合物４〜６、１４は、ＦＴＹ７２０と同様に、肺がん細胞株Ａ−５４９に対してはわずかに活性が低かった。
【表３】
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【０２０３】
本明細書に記載される本発明の実施形態の広範な活性は、上に記載されているような、栄養素輸送体の下方調節を含む、がん細胞に対する生体エネルギー的作用機序と矛盾しない。したがって、栄養素輸送に対する拘束ピロリジンスフィンゴ脂質様分子を直接的に調査するために、いくつかの類似体を用いて、それらのＩＣ５０およびこの２倍の用量で処置した後に、アミノ酸輸送体関連タンパク質４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（４Ｆ２ｈｃ）の表面レベルを調査した。化合物４、５、および６は、ＦＴＹ７２０と同様の有効性で、４Ｆ２ｈｃの表面レベルを低減した（図４０）。これらの結果は、新生物細胞を飢えさせそして殺傷するための生体エネルギー的機序と矛盾しない。
【０２０４】
なおも別の例示的研究では、異種移植腫瘍動物研究における、拘束ピロリジンスフィンゴ脂質様化合物の抗新生物効力。皮下ＳＷ６２０異種移植腫瘍を有するヌードマウスを、腹腔内注射によって、１０ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０、または２０ｍｇ／ｋｇの化合物５もしくは１５で毎日処置した。３種の化合物すべてが、腫瘍成長を阻害した（図４１）。これらの結果は、ピロリジンスフィンゴ脂質様化合物が、生体エネルギー的機序によって新生物を処置することが可能であることを示唆している。さらに、これらの化合物は、例えば水溶性、経口バイオアベイラビリティ、および抗腫瘍活性などのＦＴＹ７２０の有益な能力の多くを保持するものの、もはや徐脈を誘起することはない。したがって、これらの化合物は、新生物用の医薬および処置にとって理想的である。
【０２０５】
アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物、ならびに栄養素輸送、空胞形成および細胞死に対する効果のさらなる最適化
アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物を修飾し、栄養素輸送体タンパク質を下方調節し、細胞質空胞形成を誘発するそれらの能力について分析した。化合物の修飾には、炭化水素鎖の長さ、不飽和度、および付加されている鎖上のアリール部分の存在または不在、ならびに２つの不斉中心における立体化学を変えることが含まれる。一般に、細胞傷害性は、栄養素輸送体の下方調節および空胞形成と正の相関があった。したがって、最大の空胞形成および輸送体喪失をもたらす分子が、最大の抗新生物活性を有することが予期され、したがって、医薬および処置レジメンにとって理想的であり得る。
【０２０６】
上に記載される生体エネルギー的機序に基づき、スフィンゴ脂質およびスフィンゴ脂質様分子は、アロステリック調節部位に結合して、ＰＰ２Ａを活性化させ得る。ＰＰ２Ａは、基質特異性を制御する、９０を超えるアイソフォームを有するヘテロ三量体の複合体である。したがって、スフィンゴ脂質様分子によって、２つの別個のＰＰ２Ａ複合体が活性化されて、２つの別個の表現型：栄養素輸送体の下方調節および空胞形成を誘発することが示唆される。アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物に対する修飾の目的は、どの特色が、栄養素輸送体の下方調節および空胞形成の両方を最大限に誘発するかを特定することである。
【０２０７】
例示的な研究では、栄養素輸送体の下方調節は、フローサイトメトリーによって、アミノ酸輸送体関連タンパク質であるＣＤ９８の表面レベルを定量化することによってモニタリングした。空胞形成については、下の「材料および方法」のセクションにおいてより詳細に説明している空胞形成アッセイによって決定した通り、０〜８４の範囲でスコア付けした。ＩＣ５０は、生細胞色素排除アッセイを介して、マウス造血細胞株ＦＬ５．１２の半分を４８時間で殺傷した濃度を測定することによって決定した。このデータは、様々な天然に存在するスフィンゴ脂質および合成のスフィンゴ脂質様化合物について得た。
【０２０８】
本発明の実施形態による構造−活性相関（ＳＡＲ）ストラテジーは、天然に存在するスフィンゴ脂質であるスフィンゴシン（化合物１０６）およびスフィンガニン（化合物１０７）、ならびに極度に疎水性の（ただし、生理学的な）長鎖セラミドの代わりに使用されることが多い、中程度に可溶性である短鎖Ｃ２−セラミド（化合物１０９）およびジヒドロ−Ｃ２−セラミド（化合物１１０）を用いて得られた結果を根拠とした（図４２および図４３）。スフィンゴシン（１０６）およびスフィンガニン（１０７）は両方とも、栄養素輸送体の喪失および空胞形成を誘起し、それぞれ３．６μＭおよび３．５μＭのＩＣ５０で細胞を効率的に殺傷した（図４４および表４）。Ｃ２−セラミド（１０９）は、スフィンゴシン（１０６）と比較して低減された効力で、栄養素輸送体の喪失を誘起した。これは、２．５μＭのスフィンゴシン（１０６）と同様の輸送体の喪失を引き起こすのに、５０μＭのＣ２−セラミド（１０９）が必要であったためである（表４）。Ｃ２−セラミドは、いかなる用量においても、空胞形成を引き起こさなかった。ＰＰ２Ａを活性化させないという従来の報告と一貫して（Chalfant,  C.  E.ら、Y.  A.  J.  Lipid  Res.、２００４年、４５巻、４９６頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）、ジヒドロ−Ｃ２−セラミド（１１０）は、細胞を殺傷せず、ＣＤ９８の下方調節を効率的に誘起せず、空胞形成をまったく引き起こさなかった（表４および図４４）。Ｃ２−セラミド（１０９）は、スフィンゴシン（１０６）よりも遥かに活性が低かったが、ジメチルスフィンゴシン（１０８）は、ほぼ５倍強力であった（ＩＣ５０＝０．７７μΜ）（表４および図４４）。興味深いことに、スフィンゴシンを飽和させると、空胞形成は低減したが、輸送体の喪失および細胞傷害性は影響を受けなかった。これらの結果は、天然に存在する異なるスフィンゴ脂質構造は、別個のＰＰ２Ａ複合体を活性化させ、栄養素輸送体の下方調節または空胞形成のいずれかにつながり得ることを示唆している。一部のスフィンゴ脂質は、栄養素輸送体の下方調節および空胞形成の経路を両方とも活性化させたが、他のものは一方の経路しか活性化させず、なおも他のスフィンゴ脂質はどちらの経路も活性化しなかった。
【表４】
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【０２０９】
また、天然に存在するスフィンゴ脂質のデータに基づけば、Ｏ−ベンジルおよびＣ−アリールを含有するスフィンゴ脂質様ピロリジン類似体は、栄養素輸送体の下方調節または空胞形成の経路のいずれかを活性化させるそれらの能力において異なり得ることが示唆される。したがって、スフィンゴ脂質様分子のいくつかの改変体を合成し、試験した。この結果は、表４〜表６および図４５〜図５０に含まれている。
【０２１０】
一部の特定の実施形態では、Ｏ−ベンジル化合物１０２および１０３の鎖長は、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、またはＣ１４炭化水素鎖で生成された（図４５）。これらの化合物を、細胞傷害性、栄養素輸送体レベルに対する効果、および空胞形成に関してアッセイした（表４および図４６）。
【０２１１】
（２Ｒ，４Ｓ）および（２Ｓ，４Ｒ）という両方の立体化学シリーズにおいて、完全飽和鎖を有する類似体１１４（Ｃ１２）、１１６（Ｃ１４）、１２１（Ｃ１２）、および１２３（Ｃ１４）は、輸送体アッセイおよび空胞形成アッセイで、活性を喪失した（図４６、表４）。類似体１１５（Ｃ１２）および１２２（Ｃ１２）のように、炭化水素鎖が部分不飽和であった場合は、より長い鎖も耐容された（表４）。類似体１１４および１１５と、それぞれエナンチオマーである１２１および１２２とによって表されるように、両方の立体化学シリーズにおいて、Ｃ１２類似体は不飽和である場合により活性であるという知見は、二重結合を導入することによって、標的タンパク質の疎水性結合部位において、準最適に長い炭化水素鎖のより良好な嵌合を可能にし得ることを示唆している。スフィンゴシン（１１６）が、その飽和同類物であるスフィンガニン（１１７）よりも空胞形成において良好であったことを想起されたい（表４）。
【０２１２】
化合物１１７および１２４は、不飽和Ｃ１４鎖を含有し、強固な空胞形成を誘発せず、輸送体レベルも低減しなかった（表４および図４６）。また、このＯ−ベンジルシリーズにおいて、より短いＣ６炭化水素鎖を有する類似体（化合物１１１、１１２、および１１８）は、Ｃ８炭化水素鎖化合物（１０２、１０３、１１３、および１１９）よりも活性が低かった（表４）。これらの結果は、化合物１１５および１２２のようにＣ１２鎖も部分不飽和であれば耐容されるものの、このシリーズでは、Ｃ８炭化水素鎖長が、輸送体アッセイおよび空胞形成アッセイの両方において最適な効力につながることを示している（表４）。
【０２１３】
興味深いことに、化合物１０３に対応する不飽和の（２Ｓ，４Ｒ）シリーズでは、ピーク空胞形成スコアが、ピーク輸送体喪失スコアよりも高かったが、１０２に対応する不飽和（２Ｒ，４Ｓ）シリーズでは、これらの活性は逆転しており、空胞形成よりも高い輸送体喪失が観察された（図４６）。例えば、（２Ｓ，４Ｒ）不飽和化合物１１９は、（２Ｒ，４Ｓ）不飽和エナンチオマー１１３よりも２倍良好に空胞形成を誘起するが、この傾向は、１１３が、１１９の２倍近くも輸送体喪失を誘発することで逆転している（表４）。輸送体アッセイおよび空胞形成アッセイにおけるエナンチオマー化合物の活性のこれらの差は、飽和化合物１０２および１０３を比較した場合にも明らかではあるが、強固さはより低い。これらの結果は、ある特定のエナンチオマーが、所望される臨床転帰につながり得る所望される特性（例えば、より大きな空胞形成を誘発する）を有し得ることを示唆している。
【０２１４】
１０３の不飽和（２Ｓ，４Ｒ）類似体が、空胞形成アッセイにおいて、匹敵する飽和化合物よりも遥かに活性であることに留意するのも興味深い。部分不飽和は、輸送体喪失も増加させるが、より低い程度しか増加させない。各アッセイにおいて、炭化水素鎖における不飽和は、すべての化合物の活性を増加させたため、不飽和が、（２Ｓ，３Ｒ）１０４のように、構造的に関連するＣ−アリールシリーズの活性も増進し得るかどうかを評価した（図４２および図４５）。不飽和類似体１２５は、アッセイのいずれにおいても、その飽和対応物である１０４よりも有意に活性であるわけではなかった（表４）。しかしながら、化合物１０４は、対応する飽和Ｏ−ベンジル類似体１０３よりも、空胞形成の誘発においては遥かに良好である（表４）。
【０２１５】
Ｏ−ベンジルシリーズと同様に、Ｃ−アリールシリーズ内でも、最適な活性に関する立体化学的依存性が存在することが観察されている。したがって、Ｃ−アリール類似体（２Ｒ，３Ｓ）１０５は、エナンチオマーである（２Ｓ，３Ｒ）１０４ほど良好には空胞形成せず、スコアはそれぞれ５３および８１である（表４）。
【０２１６】
要約すると、１０３によって表されるＯ−ベンジルシリーズにおける（２Ｓ，４Ｒ）立体化学は、より良好な空胞形成につながるが、一方で、１０２の場合のように、エナンチオマーである（２Ｒ，４Ｓ）立体化学は、栄養素輸送体の下方調節を促進する。これらの結果は、別個のＰＰ２Ａヘテロ三量体に対する差次的親和性を反映している可能性がある。両方のアッセイにおいて、Ｃ８炭化水素鎖長が好ましく、この最適なテール長では、不飽和は、活性に対して、わずかな正の効果しか有しない。Ｃ−アリール（２Ｓ，３Ｒ）および（２Ｒ，３Ｓ）類似体１０４および１０５では、それぞれのＯ−ベンジル対応物である１０３および１０２と比較して、より良好な空胞形成が観察される。
【０２１７】
さらに多くの実施形態では、様々な変更を、Ｏ−アルキルピロリジン類似体に関して調査して、スフィンゴシン（１０６）およびスフィンガニン（１０７）と比較した（図４７）。スフィンゴシン（１０６）およびスフィンガニン（１０７）の極性アミノジオール部分を、ピロリジン環と置き換えることは、１２６が親化合物であるスフィンガニンよりも３倍細胞障害性であった点を除き、エナンチオマー類似体１２６〜１２９のＩＣ５０値を劇的には改変しなかった（表５、図４８）。ＣＤ９８輸送体の喪失および空胞形成は、その上昇した細胞傷害性と一貫して、類似体１２６で親よりもわずかに大きかった。しかしながら、不飽和類似体１２７は、随伴するＩＣ５０における増加を伴わずに、スフィンゴシンと比較して、輸送体アッセイおよび空胞形成アッセイにおいて活性の減少を呈した。スフィンゴシン（１０６）およびスフィンガニン（１０７）は、栄養素輸送体タンパク質に対しては同様の効果を有するが、スフィンゴシン（１０６）は、スフィンガニン（１０７）よりも遥かに良好に空胞形成する（図４８）。予期せぬことに、この関係性は拘束類似体においては逆転し、ここでは、エナンチオマーである完全飽和拘束スフィンガニン類似体１２６および１２８は、空胞形成アッセイにおいて、不飽和スフィンゴシン類似体１２７および１２９よりも２〜４倍活性が高かった（表５、図４８）。
【表５】
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【０２１８】
（２Ｒ，４Ｓ）立体異性体が、空胞形成において、（２Ｓ，４Ｒ）バージョンよりもわずかに良好であったものの、立体化学は、Ｏ−アルキルシリーズではわずかな効果しか有しなかった（表５、図４８）。要約すると、Ｏ−ベンジルシリーズとは異なり、拘束は、スフィンゴシン（１０６）の輸送体活性および空胞形成活性に対して負の効果を有したが、スフィンガニン（１０７）に対しては有しなかった。
【０２１９】
なおもさらに多くの実施形態では、いくつかの類似体のピロリジン窒素の電荷を中和して、その後アッセイした（図４９）。予期されたように、塩基性窒素の欠乏を考慮すると、Ｏ−ベンジルシリーズにおけるＮ−アセチル類似体１３１は、Ｃ２−セラミド（１０９）とスフィンゴシン（１０６）との間における効力の同様の差異と類似して、類似体１０２の１０分の１の効力であった（表６）。さらに、類似体１３１は、試験した最高の用量でも空胞形成活性を呈しなかった（表６）。また、空胞形成を非常に効率的に誘発する、１０４および１２５などのＣ−アリール化合物に対するＮ−アセチル化の効果も評価した。輸送体活性の喪失は有意ではなかったが、化合物１３４および１３５は、空胞形成も誘発しなかった（表６）。したがって、Ｃ−アリールシリーズのＮ−アセチル化ピロリジンスフィンゴ脂質様類似体は、栄養素輸送体の下方調節しかもたらさない適用にとっては有用であり得るが、空胞形成に対しては効果を有しない。
【表６】
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【０２２０】
Ｎ−アセチル化が効力を低減させるという知見は、ピロリジンにおける窒素の正電荷が、化合物の活性の増進にとって非常に重要であるという先の観察と矛盾しない。試験したスフィンゴ脂質の中で、ジメチルスフィンゴシン（１０８）が、最良の効力、輸送体喪失、および空胞形成を呈したため（表４〜表６、図４４）、Ｎ−メチル類似体１３０が、ピロリジンスキャフォールドを有するが、良好な模倣物を表すことが推測された。予期せぬことに、Ｎ−メチル類似体１３０の活性は、親１１３以下であり、輸送体喪失および空胞形成を誘発するその能力は低減されていた（表６）。
【０２２１】
ピロリジン窒素原子の塩基性度を増加させることが、効力も増加させ得るかどうかを決定するために、グアニジノ類似体１３２および１３３を生成した（表６）。しかしながら、これらの化合物の効力は、同じシリーズの親化合物１０３および１０２と比較して、５〜７分の１になった。また、空胞形成を誘発する能力は、試験した最高濃度（３０μＭ）においても失われた。これらの結果は、塩基性度は重要であるが、ピロリジン窒素の環境における立体効果が、細胞の標的との相互作用において役割を果たし得ることを示唆している。
【０２２２】
要約すると、拘束アザ環式スフィンゴ脂質様類似体のこれらのＳＡＲ研究は、例えば化合物１１９などの、（２Ｓ，４Ｒ）−Ｏ−ベンジルピロリジンシリーズの不飽和Ｃ８炭化水素鎖を有する化合物が、同じ立体化学を有し、飽和したより長いまたはより短い鎖を伴う類似体よりも、高い全体的活性を有することを示唆している（図５０）。１１９のような（Ｓ，Ｒ）立体化学は、より良好な空胞形成能力と相関し、一方で、エナンチオマーである１０２および１１３のような（Ｒ，Ｓ）化合物は、栄養素輸送体の喪失を誘起することにおいてわずかにより良好である（表４、ならびに図４６および図５０）。しかしながら、Ｃ−アリールシリーズでは、エナンチオマー間での輸送体の下方調節におけるこの差異は無視できるほどになる（化合物１０４および１０５で、それぞれ５４％対４７％）。試験したピロリジン類似体のうち、それぞれ飽和Ｃ−アリール類似体および不飽和Ｃ−アリール類似体である１０４および１２５が、空胞形成および輸送体の喪失の最も強力な誘発物質であり、低いμＭ範囲で強力な細胞傷害性をもたらす（図５０）。このプロファイルを考慮すると、これらの化合物が、高い抗新生物活性を有することが予測される。
【０２２３】
アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物が、新生物細胞における栄養素獲得を妨害する
上で説明したように、スフィンゴ脂質様化合物は、栄養素輸送体を下方調節することによって、新生物成長を抑制することができる。しかしながら、新生物細胞は、細胞表面の栄養素輸送体を使用することに加えて、マクロピノサイトーシスおよびオートファジーによって栄養素を獲得することもできる。ここで、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物が、マクロピノサイトーシスまたはオートファジーを阻害することによって、新生物細胞の栄養素へのアクセスを遮断することができる実施形態を提供する。ある実施形態では、スフィンゴ脂質様化合物は、ＰＰ２Ａを活性化させ、脂質キナーゼＰＩＫｆｙｖｅの誤った場所での局在化をもたらす。別の実施形態では、スフィンゴ脂質様化合物は、サイトゾルの空胞形成を誘起する。なおも他の実施形態では、化合物は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、オートファゴソーム、およびマクロピノソームの分解にとって必須であるリソソーム融合反応を遮断する。実施形態は、活性化Ｒａｓを発現するか、または腫瘍抑制因子ＰＴＥＮを欠く細胞を選択的に殺傷するスフィンゴ脂質様化合物を対象とする。さらに多くの実施形態は、古典的なワールブルク表現型を呈しない新生物を処置する化合物の能力を対象とする。さらに、一部の実施形態は、正常な増殖性組織に有意に影響を及ぼさずに、新生物成長を阻害する化合物の能力を対象とする。
【０２２４】
Ｃ−アリールアザ環式拘束スフィンゴ脂質様化合物の能力に関する原理の証拠として、化合物ＳＨ−ＢＣ−８９３を、一連の例示的実施形態の実験で徹底的に調査した。（本出願において化合物５および化合物１０４とも呼ばれるＳＨ−ＢＣ−８９３の化学構造、ならびにＦＴＹ７２０の化学構造は、図５１Ａに示されている）。いくつかの相関データの表およびグラフとともに、結果を下に提供する（表７および表８、ならびに図５１〜図６７）。実施形態では、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、栄養素輸送体の喪失を誘発し、ＦＴＹ７２０のＳ１Ｐ受容体関連毒性を伴わずに、飢餓を模倣する。ＳＨ−ＢＣ−８９３は、がん患者におけるＦＴＹ７２０の使用を防止する、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体活性を欠いている（図５１Ｂ）。ＳＨ−ＢＣ−８９３は、例えば４Ｆ２ｈｃまたはアラニン−セリン−システイン輸送体２（ＡＳＣＴ２）などのアミノ酸輸送体、および例えばグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）などのグルコース輸送体の選択的細胞内移行を依然として誘起する（図５１Ｃおよび５１Ｄ）。４Ｆ２ｈｃと同様の機能を有するシャペロンタンパク質であるＣＤ１４７などの他の表面タンパク質は、影響を受けない。細胞が栄養について制限されている場合、Ｂｃｌ−ＸＬ過剰発現を介したアポトーシスの遮断は、ＳＨ−ＢＣ−８９３によって誘発された細胞死を防止しなかった（図５１Ｅ、図５２Ａおよび５２Ｂ）。対照的に、輸送体とは独立した、膜透過性の栄養素であるピルビン酸メチルおよびジメチル−α−ケトグルタレートは、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置された細胞をレスキューした（図５１Ｅ）。これらの結果は、ＳＨ−ＢＣ−８９３が、栄養素のアクセスを制限することによって細胞を殺傷することを確認するものである。
【０２２５】
細胞は、酸化的リン酸化を増加させることによって、栄養素の制限に順応する。解糖および酸化的リン酸化の相対速度は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の還元形態の蛍光寿命を測定することによってモニタリングすることができる。高比率の、タンパク質に結合したＮＡＤＨ  対  遊離ＮＡＤＨ（増加した寿命）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、複数の細胞種で、増加した酸化的リン酸化と相関する。オリゴマイシンおよびロテノン／アンチマイシンＡは、当該技術分野において公知の、解糖を誘発する分子であるが、一方で、２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）は、解糖の阻害因子であり、続いて酸化的リン酸化を増加させる。また、グルコースおよびアミノ酸に対するアクセスを取り除くことによる細胞の飢餓も、酸化的リン酸化を増加させることが公知である。
【０２２６】
予期されたように、オリゴマイシンまたはロテノン／アンチマイシンＡで処置された細胞は、解糖を増加させ、結合したＮＡＤＨ画分を減少させることによって、酸化的リン酸化の喪失を補填した（図５１Ｆ）。反対に、解糖阻害因子２−ＤＧおよび飢餓は、酸化的リン酸化および結合型ＮＡＤＨ  対  遊離ＮＡＤＨの比を増加させた。ＳＨ−ＢＣ−８９３は、アミノ酸およびグルコースの飢餓の効果を模倣し、結合したＮＡＤＨ画分および細胞の酸素消費を増加させた（図５１Ｆおよび５１Ｇ）。細胞は、抗炎症薬ＦＴＹ７２０と同様に応答した。したがって、ＳＨ−ＢＣ−８９３によって誘起された代謝変化は、重要な代謝基質に対するアクセスが制限された細胞において見られるものと対応している。
【０２２７】
上に記載された生体エネルギー的機序と一貫して、より高い同化率を有する細胞は、スフィンゴ脂質様化合物に対してより感受性であるべきである。この機序を試験する例示的実施形態では、異なる同化率を有するマウスＦＬ５．１２細胞を、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置した。ＦＬ５．１２細胞の同化率は、それらの必要とする成長因子、ＩＬ−３のレベルをモジュレートすることによって滴定することができる。高いおよび低いＩＬ−３において成長させたＦＬ５．１２細胞を比較することで、一定の遺伝的背景において、上昇した成長因子のシグナル伝達および同化作用の影響を評価することができる。高濃度のＩＬ−３は、好気性解糖を行わせ、倍加時間を迅速にする（１２時間）。ＩＬ−３レベルを低減すると、増殖は緩徐になり、細胞の生存率を損なうことなく、酸化的リン酸化が増加する（図５３Ａおよび５３Ｂ）。ＩＬ−３が低い培地で維持すると、代謝順応に対する必要性が低減され（図５３Ｂ）、細胞は、ＳＨ−ＢＣ−８９３によって誘発される死から保護された（図５３Ａ）。このことから、同化作用が低い細胞（例えば、健康細胞）は、同化作用が高い細胞（例えば、新生物細胞）よりも、スフィンゴ脂質様化合物による処置に対して感受性が低いことが示唆される。実際、本発明の特定の実施形態と一貫して、形質転換されていないマウスＯＰ９骨髄間質細胞および初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、例えばＤＬＤ−１、ＬＳ１８０、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＰＡＮＣ−１などのヒトがん細胞株よりも、ＳＨ−ＢＣ−８９３に対する感受性が低かった（図５３Ｃ）。これらのがん細胞株の多くは、Ｒａｓにおいて活性化変異を有している。事実、Ｌｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｌｏｘ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦにおけるＣｒｅ発現後のＫ−Ｒａｓ活性化は、代謝柔軟性を制限し、細胞をＳＨ−ＢＣ−８９３に対して感作するのに十分であった（図５３Ｄおよび５３Ｅ）（細胞株については、Tuveson  D.A.ら、Cancer  Cell、５巻：３７５〜８７頁、２００４年に記載されている。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の実施形態では、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの喪失が、同様の効果をもたらした（図５４Ａおよび５４Ｂ）。重要なことに、発がん性変異は、Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｄを発現するかまたはＰＴＥＮを欠損したＭＥＦにおいて、表面の栄養素輸送体の下方調節に影響を及ぼさなかった（図５４Ｃ）。
【０２２８】
これらの結果は、正常細胞および形質転換細胞は両方ともＳＨ−ＢＣ−８９３の標的を発現するが、化合物に対する差次的感受性を示すことを指し示している。感受性における差異は、新生物細胞が、代謝作用の減少に順応できないことに起因する。これらの結果と一貫して、柔軟な代謝作用を有する健康細胞、例えば正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＳＨ−ＢＣ−８９３に対して耐性を有したが、一方で、結腸がん細胞ＳＷ６２０は、コロニー形成アッセイにおいて高度に感受性であった（図５３Ｆ）。まとめると、これらのデータは、構成的同化作用が、がん細胞をＳＨ−ＢＣ−８９３に対して感作し、許容可能な治療指数を生成し得るということを示唆している。
【０２２９】
多くの実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質−脂質分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて新生物成長を阻害したかどうかを決定するために、例示的実験を実行した。この実験を実行するために、マウスにおいて、ルシフェラーゼ発現ＳＷ６２０異種移植片を生成した。バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）、ノギス測定、および屠殺実験での腫瘍質量の結果は、ＳＷ６２０腫瘍が、ＳＨ−ＢＣ−８９３およびＦＴＹ７２０によって同程度まで低減されたことを示した（図５３Ｇ〜Ｉおよび図５４Ｄ）。ＳＨ−ＢＣ−８９３は、屠殺時に、腫瘍および血漿の両方において、低いマイクロモル濃度の濃度で存在した（図５４Ｅ）。栄養素へのアクセスは正常細胞および形質転換細胞の両方で制限され得ることを考慮すれば、予期されたように、処置されたマウスでは軽度の体重の減少が起こった（図５４Ｆ）。これらの結果は、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのスフィンゴ脂質様分子が、例えばＲａｓによって引き起こされたがんまたはＰＴＥＮの喪失を伴う腫瘍などの新生物を標的とするための、安全かつ有効な手段を提供し得ることを示唆している。
【０２３０】
本発明のある特定の実施形態は、生体エネルギー的機序と一貫して、マクロピノサイトーシスおよびオートファジーを阻害する、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子を対象とする。この機序の態様は、これらの分子が、栄養素輸送体の表面発現を低減することしかしないと当初は考えられていたため、予期せぬものであった。しかしながら、Ｒａｓ活性化がマクロピノサイトーシスおよびオートファジーを増加させること、およびＳＨ−ＢＣ−８９３が、活性化したＲａｓを有する新生物細胞に対して非常に有効であったという知見を考慮すると、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子が、マクロピノサイトーシス経路およびオートファジー経路にも影響を及ぼし得るという仮説につながった。ＳＨ−ＢＣ−８９３は、形質転換されていない細胞およびがん細胞の両方において、同等に顕著なサイトゾルの空胞形成を誘発することが見出された（図５５Ａ、図５６Ａ、５６Ｂ、および５６Ｃ）。これらの空胞は、腔内小胞（intraluminal  vesicle）（ＩＬＶ）および無構造の部分的に分解された物質を含有し、このことは、それらが、多小胞体（ＭＶＢ）または別の後期エンドサイトーシスコンパートメントに由来するものであることを示唆している（図５５Ｂ）。空胞は、後期エンドソームマーカーであるＬａｍｐ１およびＲａｂ７について陽性であり（図５５Ｃ）、早期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１およびＲａｂ５、ならびに脂質染料ナイルレッドについて陰性であった（図５６Ｄ）。リソソームである可能性がある、酸性化された斑点が、ＧＦＰ−ＬＣ３によってオートファゴソームとしてマークされた物質とともに、空胞内または空胞に近接して観察された（図５５Ｃ、５５Ｄ、および図５６Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのアザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子が、ＭＶＢを膨大させることを示唆している。
【０２３１】
ホスファチジルイノシトール３，５−二リン酸（ＰＩ（３，５）Ｐ２）は、ホスファチジルイノシトール３−リン酸５−キナーゼ（ＰＩ３Ｐ  ５−キナーゼ）の生成物である。ＰＩＫｆｙｖｅは膜融合およびＭＶＢにおけるＩＬＶ形成を調節する。阻害因子ＹＭ２０１６３６でＰＩＫｆｙｖｅ活性を低減すると、ＳＨ−ＢＣ−８９３およびＦＴＹ７２０によって生成されるものと表現型的に同様の、ＰＩ３Ｐ陽性であり、ＰＩ（３，５）Ｐ２陰性の空胞が産生された（図５５Ａ、５５Ｅ、図５６Ａ、および５６Ｆ）。Ｃａ２＋チャネル一過性受容器電位カチオンチャネル、ムコリピンファミリー、メンバー１（ＴＲＰＭＬ１）が、ＭＶＢ膜において見出され、ここでそれは、ＰＩＫｆｙｖｅによって生成されたＰＩ（３，５）Ｐ２によって活性化される。
【０２３２】
ＦＴＹ７２０またはＹＭ２０１６３６で処置された細胞は、（図５５Ｅ）では、液胞膜においてＴＲＰＭＬ１を蓄積した。さらに、ＰＩＫｆｙｖｅの過剰発現、そのスキャフォールドタンパク質Ｖａｃ１４、またはそのエフェクタータンパク質ＴＲＭＰＬ１は、ＦＴＹ７２０またはＹＭ２０１６３６により誘発された細胞における空胞形成をレスキューした（図５５Ｆ）。ＰＩＫｆｙｖｅと会合していないＶａｃ１４の変異体形態は、ＦＴＹ７２０またはＹＭ２０１６３６により誘発された空胞形成から細胞をレスキューしなかったことに留意されたい（図５５Ｆ）。まとめると、これらのデータは、スフィンゴ脂質様分子が、ＰＩＫｆｙｖｅ活性に干渉することによって、ＭＶＢを膨大させ得ることを示唆している。
【０２３３】
阻害因子ＹＭ２０１６３６とは異なり、ＦＴＹ７２０は、予期せぬことに、ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼの活性を阻害することも、ＰＩ（３，５）Ｐ２レベルを低減することもなかった（図５７Ａおよび５７Ｂ）。本発明のある特定の実施形態では、スフィンゴ脂質様分子は、ＰＩＫｆｙｖｅを誤った場所において局在化させ、ＴＲＭＰＬ１とのその会合を防止し、ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼの活性を阻害する代わりに空胞形成を誘発する。予期されたように、ＰＩＫｆｙｖｅは、ＹＭ２０１６３６によって誘発された空胞の境界膜に局在化していたが、ＦＴＹ７２０で処置された細胞では、空胞間の凝集塊中にＰＩＫｆｙｖｅは存在していた（図５７Ｃおよび図５６Ｆ）。内因性ＰＩＫｆｙｖｅおよびＶａｃ１４を認識する検証済み抗体によってこの結果は確認された（図５７Ｃ、図５８Ａおよび５８Ｂ）。
【０２３４】
それらの不同性の作用機序と一貫して、ＹＭ２０１６３６は、ＰＩ（３，５）Ｐ２プローブの膜会合を廃止したが、一方で、ＦＴＹ７２０またはＳＨ−ＢＣ−８９３で処置された細胞では、ＰＩ（３，５）Ｐ２プローブは、ＰＩＫｆｙｖｅとともに、空胞間の斑点に共局在化していた（図５６Ｆ）。また、ＰＩＫｆｙｖｅ（図５７Ｄ）もＰＩ（３，５）Ｐ２（図５８Ｄ）も、ＦＴＹ７２０またはＳＨ−ＢＣ−８９３で処置された細胞では、空胞上のＰＩ（３，５）Ｐ２エフェクタータンパク質ＴＲＰＭＬ１とともに共局在化しなかった。ＴＲＰＭＬ１は、ＹＭ２０１６３６およびＳＨ−ＢＣ−８９３によって誘発された空胞のどちらにも存在していたため（図５５Ｅおよび図５８Ｄ）、ＰＩＫｆｙｖｅは、ＦＴＹ７２０およびＳＨ−ＢＣ−８９３によって誤った場所に局在化されていたが、ＴＲＰＭＬ１はそうではなかった。また、ＦＴＹ７２０およびＳＨ−ＢＣ−８９３は、ＹＭ２０１６３６で処置された細胞において、ＴＲＰＭＬ１陽性の空胞からＰＩＫｆｙｖｅを排除していた（図５７Ｄ）。セラミドは、それが空胞形成活性を欠いていることと一貫して（図５５Ａ）、ＹＭ２０１６３６が存在していてもまたは不在であっても、ＰＩＫｆｙｖｅ−ＴＲＭＰＬ１の共局在化を妨害しなかった（図５７Ｄ）。これらの結果は、スフィンゴ脂質様分子が、ＰＩＫｆｙｖｅを誤った場所に局在化させることによって空胞形成を誘発し、これが、ＰＩ（３，５）Ｐ２の、その膜貫通エフェクタータンパク質であるＴＲＰＭＬ１とは不同性のコンパートメントにおける生成につながることを示している。
【０２３５】
さらに、本発明の多くの実施形態は、ＰＰ２Ａを活性化させる機序を介して、栄養素輸送体の細胞内移行を誘発するアザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子を対象とする。これらの実施形態は、セラミド、ＦＴＹ７２０、およびＳＨ−ＢＣ−８９３が、ＰＰ２Ａを活性化させることによって、栄養素輸送体の喪失を誘起することを反映している（図５９Ａおよび５９Ｂ）。単一の飽和結合によってセラミドとは異なるジヒドロセラミドは、ＰＰ２Ａを活性化させず、細胞を殺傷せず、輸送体の喪失も空胞形成も誘起しない（図５９Ａおよび図６０Ａ）。したがって、ＰＰ２Ａの活性化は、ある特定のスフィンゴ脂質構造に極めて特有のものである。また、ＦＴＹ７２０およびＳＨ−ＢＣ−８９３によるＰＰ２Ａの活性化は、空胞形成も刺激し、ＰＰ２Ａ阻害因子として、カリクリンＡおよびＳＶ４０スモールＴ抗原が、この効果をそれぞれ遮断した（図５９Ｃ）。ＹＭ２０１６３６によって誘発された空胞形成は、ＰＰ２Ａの阻害によっては影響を受けなかったことに留意されたい（図６０Ｂ）。加えて、ＰＰ２Ａの阻害は、ＦＴＹ７２０またはＳＨ−ＢＣ−８９３で処置された細胞において、空胞内の適正な場所にＰＩＫｆｙｖｅを回復させた（図５７Ｄ）。セラミドは、ＰＰ２Ａを活性化させることによって輸送体の喪失を誘起するが、空胞形成を刺激する能力を欠き、ＰＩＫｆｙｖｅを誤った場所に局在化させることがないため、異なる組み合わせ、ＰＰ２Ａヘテロ三量体またはＰＰ２Ａの別個のプールが、栄養素輸送体の細胞内移行および空胞形成経路を促進することが示唆される。この示唆と一貫して、データは、ＦＴＹ７２０およびＳＨ−ＢＣ−８９３によって細胞内移行されたアミノ酸およびグルコース輸送体が、ＰＩＫｆｙｖｅ複合体と共局在化していなかったことを示している（図６０Ｃ）。また、ＹＭ２０１６３６による空胞形成の誘起は、表面栄養素輸送体レベルを減少させず、Ｖａｃ１４を過剰発現させることによる空胞形成の防止は、ＦＴＹ７２０による栄養素輸送体の下方調節に干渉しなかった（図６０Ｄおよび６０Ｅ）。まとめると、これらのデータは、スフィンゴ脂質様化合物が、２つの別個のＰＰ２Ａ依存性機序を通じて、正常細胞および形質転換細胞の両方において、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化および栄養素輸送体の輸送を妨害することを示している。
【０２３６】
他の実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子は、オートファジーを阻害する。さらに多くの特定の実施形態では、スフィンゴ脂質様分子は、ＰＩＫｆｙｖｅおよびＰＩ（３，５）Ｐ２の誤った場所での局在化に起因して、オートファゴソーム−リソソーム融合を防止することによってオートファジーフラックスを阻害する。他の特定の実施形態では、分子は、オートファゴソーム形成を防止することによって、オートファジーフラックスを阻害する。
【０２３７】
当該技術分野では、細胞が、オートファジーフラックスを増加させることによって栄養素ストレスに順応することは公知である。しかしながら、オートファゴソーム−リソソーム融合反応は、ＰＩ（３，５）Ｐ２によって活性化されるＴＲＰＭＬ１チャネルを介したＣａ２＋の放出に依存する。ＰＩＫｆｙｖｅおよびＰＩ（３，５）Ｐ２のＴＲＰＭＬ１との共局在化の欠如（図５７Ｄおよび図５８Ｄ）は、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのスフィンゴ脂質様薬物が、オートファジーフラックスを制限し得ることを示唆した。クロロキン（ＣＱ）は、一過的なオートファゴソームを安定化させる分子である。細胞をＣＧで処置して、オートファゴリソソームを安定化させた後、ＦＴＹ７２０、ＳＨ−ＢＣ−８９３、またはＹＭ２０１６３６で処置した。各処置は、ＬＣ３陽性オートファゴソームのＬＡＭＰ１陽性リソソームとの融合を低減した（図６１Ａおよび６１Ｂ）。また、スフィンゴ脂質様分子およびＹＭ２０１６３６は、細胞当たりのＬＣ３斑点の総数を減少させた。これは、オートファゴソームの形成が低減されたことを示唆している（図６１Ｃ）。ホスファチジルイノシトール５−リン酸（ＰＩ（５）Ｐ）は、グルコースが枯渇した際のオートファゴソーム生合成にとって必須である。ＰＩ（５）Ｐは、ＰＩ（３，５）Ｐ２を脱リン酸化することによって産生されるため、ＰＩ（５）Ｐもまた、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置した細胞では誤った場所に局在化している可能性があり、そのため、オートファゴソーム形成の妨害にも寄与し得る。実際、オートファゴソーム形成と相関することが公知であるＷＩＰＩ２タンパク質を同定することによって発生期のオートファゴソームを検出した実験では、ＦＴＹ７２０およびＳＨ−ＢＣ−８９３による処置は、低栄養素培地において、ＰＩ５Ｐレベルに影響を及ぼすことなく、オートファゴソームの数を低減させた（図６１Ｄ、６１Ｅ、および図６２Ａ）。したがって、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、オートファゴソームの形成および分解の両方を阻害した。対照として、Ｖａｃ１４の過剰発現は、空胞形成を制限し（図５５Ｆ、図６１Ｆ、および図６２Ｂ）、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置した細胞において、オートファジーフラックスをレスキューした（図６１Ａ、６１Ｂ、６１Ｄ、および６１Ｅ）。まとめると、これらのデータは、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子が、ＰＩＫｆｙｖｅを誤った場所に局在化させることによって、形成およびリソソーム融合を含む複数のレベルでオートファジーフラックスを遮断することを示している。
【０２３８】
なおも他の実施形態では、スフィンゴ脂質様化合物は、リソソームとのマクロピノソームの融合を防止することによって、ミクロピノサイトーシスを阻害する。活性化したＲａｓを有する細胞では、マクロピノサイトーシスもまた、栄養素輸送体の下方調節に対する耐性を付与する可能性がある。しかしながら、マクロピノソームの分解には、ＰＩ（３，５）Ｐ２も必要とされる。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ発現細胞が、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）感受性の様式で、デキストランをマクロピノサイトーシスによって効率的に取り込む一方で、ＹＭ２０１６３６およびＳＨ−ＢＣ−８９３の両方が、リソソームとのマクロピノソームの融合を劇的に低減した（図６１Ｇおよび６１Ｈ）。リソソームと融合しないマクロピノソームは、アミノ酸などの栄養素を供給することができない。したがって、ＰＩＫｆｙｖｅの局在化を妨害することによって、スフィンゴ脂質様化合物は、アミノ酸およびグルコースの輸送体を下方調節するのと同時に、リソソーム由来の栄養素へのアクセスを制限する。
【０２３９】
なおもさらに多くの実施形態では、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子は、空胞形成を介して、新生物の細胞死を刺激する。ＳＨ−ＢＣ−８９３の抗新生物活性に対する空胞形成の相対的寄与を評価するために、細胞を、ＹＭ２０１６３６単独（空胞形成のみ）およびセラミド単独（空胞形成を伴わない、輸送体喪失）、ならびに組み合わせで処置した。ＹＭ２０１６３６の細胞傷害性は、単独では最小限でしかないが、セラミドと組み合わされると、この組み合わせは、栄養素輸送体の喪失を増加させることなく、複数のがん細胞株において細胞死を有意に増進した（図６０Ｄ、図６３Ａ、６３Ｂ、図６４Ａ）。また、空胞形成しないＶａｃ１４過剰発現細胞（図５５Ｆおよび図６１Ｆ）は、ＳＨ−ＢＣ−８９３およびＦＴＹ７２０によって誘発される死に対して耐性を有した。しかしながら、Ｖａｃ１４過剰発現細胞は、非空胞形成性スフィンゴ脂質であるセラミドによって誘発される死からは保護されなかった（図６３Ｃ、６３Ｄ、および図６４Ｂ）。まとめると、これらのデータは、空胞形成が、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのスフィンゴ脂質様分子のがん細胞を殺傷する能力に寄与することを示唆している。
【０２４０】
空胞形成が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＳＨ−ＢＣ−８９３の抗新生物活性を増進するかどうかを評価するために、空のベクターまたはＶａｃ１４を発現するＳＷ４８０異種移植片を有するマウスを、ビヒクルまたはＳＨ−ＢＣ−８９３で処置した。腫瘍は、ＳＨ−ＢＣ−８９３により誘発される空胞形成の顕微鏡分析を混乱させてしまう可能性がある腫瘍壊死を制限するために、まだ小さい間に摘出した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られるように、Ｖａｃ１４過剰発現は、ＳＨ−ＢＣ−８９３による空胞形成および成長阻害の両方に対する耐性を付与した（図６３Ｅおよび６３Ｆ）。これらの結果は、空胞形成が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、ＳＨ−ＢＣ−８９３の抗新生物効果に寄与することを実証している。
【０２４１】
したがって、本発明の実施形態は、アザ環式拘束スフィンゴ脂質様分子の治療上の使用を伴って、成長が遅いまたは特発性の新生物において飢餓様表現型を誘発する、処置する方法を対象とする。本発明のなおもさらに多くの実施形態は、スフィンゴ脂質様分子の治療上の使用を伴って、成長が遅いまたは特発性の新生物を殺傷する、処置する方法を対象とする。さらに多くの特定の実施形態は、これらの分子の、良好に耐容されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて毒性を欠く能力を対象とする。
【０２４２】
ＳＨ−ＢＣ−８９３の活性は代謝率と関連していたため、古典的なワールブルク表現型を呈しない成長が遅い腫瘍もまた感受性であるかどうかは明白ではなかった。感受性を決定するために、前立腺において排他的にｐ５３およびＰＴＥＮ発現を欠く（ｐＤＫＯ）、侵襲性の去勢抵抗性前立腺がんのための、遺伝子操作した検証済みマウスモデルにおいて、ＳＨ−ＢＣ−８９３を評価した（Wu  Xら、Am  J  Clin  Exp  Urol.、２０１４年、２巻（２号）：１１１〜２０頁、Schwarzenbock  Sら、Theranostics.、２０１２年、２巻（３号）：３１８〜３３０頁、Chen  Zら、Nature.、２００５年、４３６巻（７０５１号）：７２５〜７３０頁。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらのマウスにおいて発達した腫瘍に由来する細胞（マウス前立腺がん上皮細胞、ｍＰＣＥ）は、低減された解糖を呈し、生存のために細胞外グルコースおよびアミノ酸に依存しなかった（図６５Ａおよび６５Ｂ）。しかしながら、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、結合したＮＡＤＨ画分が増加し、細胞透過性の栄養素がｍＰＣＥ細胞を死から保護していたため、飢餓と一貫した表現型をなおも産生していた（図６５Ａおよび６５Ｃ）。前立腺がん細胞は、成長および生存のために、外因性のＬＤＬに依存している。したがって、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、ｍＰＣＥ細胞に空胞を形成し、４Ｆ２ｈｃを下方調節していただけではなく、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬｒ）の表面レベル、ＬＤＬの取り込み、および脂肪滴の蓄積も劇的に減少させていた（図５５Ｂ、図６５Ｄ〜Ｈ、図６６Ａ、および６６Ｂ）。セラミドおよびＹＭ２０１６３６は両方とも、表面ＬＤＬｒレベルは低減したが、ＬＤＬｒは依然として、異なる細胞内コンパートメントに蓄積していた（図６６Ａ）。ＹＭ２０１６３６およびＳＨ−ＢＣ−８９３はともに、リソソーム融合を遮断するそれらの能力と一貫して（図６１）、ＬＤＬのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅとの共局在化を低減した（図６５Ｆおよび６５Ｇ）。リソソームにおけるＬＤＬ分解の阻害に合わせて、細胞の脂肪滴含有量は、空胞形成の程度と逆に相関していた（図６６Ｂ）。要約すると、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのスフィンゴ脂質様化合物は、栄養素輸送体を下方調節およびリソソームによる栄養素の生成を遮断することによって、前立腺がんなどの成長が遅い新生物を飢えさせる。
【０２４３】
また、飢餓誘発性スフィンゴ脂質様薬物の、成長が遅いまたは特発性の新生物の成長に影響を及ぼす能力を評価した。ｍＰＣＥ皮下同系移植片を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、胃管栄養法によって毎日６０ｍｇ／ｋｇのＳＨ−ＢＣ−８９３を与え、腫瘍成長を６０％減速させた。これは、２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した、ＳＷ６２０異種移植片での結果と同様であった（図５３Ｇ〜Ｉおよび図６５Ｉ）。１２０ｍｇ／ｋｇでは、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、前立腺腫瘍成長を、９０％を超えて阻害した（図６５Ｉ）。また、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、ｐＤＫＯマウスにおいて、特発性腫瘍の成長を６２％（６０ｍｇ／ｋｇ）または８２％（１２０ｍｇ／ｋｇ）減少させた（図６５Ｊ）。組織学的には、ＳＨ−ＢＣ−８９３は、前立腺腫瘍の進行を緩徐にし、侵襲性疾患を排除し、細胞多形態性、過染性、および核非定型性を劇的に低減させた。ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置されたマウスは、前立腺上皮細胞内新生物を排他的に呈したが、一方で、すべてのビヒクルで処置された動物では、腺癌が存在した（図６７）。予期されたように、アミノ酸輸送体が下方調節された場合（図６５Ｄ）、ＴＯＲＣ１依存性であるリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化は、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置された腫瘍では低減された（図６６Ｃ）。ＴＯＲＣ１によって媒介される負のフィードバックの喪失と一貫して、Ａｋｔ活性は、ＳＨ−ＢＣ−８９３によってわずかに上昇した。したがって、ＳＨ−ＢＣ−８９３などのスフィンゴ脂質様化合物は、別個の分子欠陥および代謝特性を有する新生物に対して有効である。
【０２４４】
ＳＨ−ＢＣ−８９３は、正常細胞および形質転換細胞において同等の輸送体喪失および空胞形成をもたらすため、正常細胞の栄養素へのアクセスも制限する（図５１Ｃ、５１Ｅ、図５６Ｂ、および５６Ｃ）。したがって、ＳＨ−ＢＣ−８９３で処置されたｐＤＫＯマウスは、未処置のマウスよりも体重増加が少なかった（図６６Ｄ）。しかしながら、最高用量のＳＨ−ＢＣ−８９３で処置されたマウスでも体重が増加し、処置されたマウスはすべて、正常な挙動および活性レベルを呈した。屠殺時の血液化学分析は、ＳＨ−ＢＣ−８９３が、抗新生物用量において、肝臓または腎臓に対して毒性を有しないことを示した（表７）。１２０ｍｇ／ｋｇのＳＨ−ＢＣ−８９３で処置した動物における、血清クレアチンホスホキナーゼのわずかな上昇は、栄養素の制限に応答した、軽度の筋肉異化作用を示唆している。重要なことに、増殖性の正常な健康組織では、１２０ｍｇ／ｋｇのＳＨ−ＢＣ−８９３で１１週間処置したマウスにおける正常な全血球数および腸陰窩の組織病理学によって証拠づけられるように、ＳＨ−ＢＣ−８９３による影響は最小限であった（表８および図６６Ｅ）。正常組織に対する毒性の欠如は、代謝的に柔軟性が低い腫瘍細胞においては生体エネルギー的危機を誘起する栄養素ストレスに対して、形質転換されていない細胞は順応し得るという知見と矛盾しない（図５３Ｄおよび５３Ｅ）。結論としては、膜輸送を妨害することによって、並行する栄養素アクセス経路を遮断することは、多岐にわたる代謝プログラムを有するがん細胞における構成的同化作用を標的とする、安全かつ有効な手段である。
【表７】
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【表８】
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【０２４５】
形質転換されていない細胞の、ＦＴＹ７２０によって誘発される死に対する相対的耐性は、正常細胞が、ストレス下において代謝的に静止状態となる能力に由来する可能性が高い。具体的には、がん細胞では、生合成および増殖を支持するために、発がん性変異が、グルコースおよびアミノ酸の輸送体発現を駆動する。（McCracken,  A.  N.およびEdinger,  A.  L.、Trends  Endocrinol.  Metab.、２４巻、２００〜８頁（２０１３年）。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）また、発がん性Ｒａｓ変異は、マクロピノサイトーシスによって獲得した細胞外タンパク質の分解を通じて、アミノ酸獲得を後押しする。（Palm,  W.ら、Cell、１６２巻、１〜１２頁（２０１５年）、Commisso,  C.ら、Nature、４９７巻、６３３〜７頁（２０１３年）。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。多くのがん細胞はこの上昇した栄養素の流入に対して「依存症」となる。例えば、分解性酵素であるＬ−アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病に対する有効な療法である。なぜなら、これらの細胞が、その同化作用的要求を満たすのに十分なアスパラギンを合成することができないからである（Pieters,  R.ら、Cancer、１１７巻、２３８〜２４９頁（２０１１年）。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。前臨床研究は、他の種類のがんも、成長および生存のために同様の依存性を呈し、移入されたアルギニン、セリン、またはグリシンに依存していることを示している。（Feun,  L.  G.ら、Curr.  Opin.  Clin.  Nutr.  Metab.  Care、１８巻、７８〜８２頁（２０１５年）、Jain,  M.ら、Science.、３３６巻、１０４０〜１０４４頁（２０１２年）、Maddocks,  O.  D.  K.ら、Nature、４９３巻、５４２〜６頁（２０１３年）。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの結果は、栄養素の取り込みを制限することが、多くの種類の新生物およびがんにとって広範に有効な治療手法であり得ることを示唆している。
【０２４６】
実験材料および方法
初期最適化研究における生物学の手順：
【０２４７】
細胞培養物研究；Ｓｕｐ−Ｂ１５細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、５５μΜのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および抗生物質を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）において、２〜３百万個／ｍＬに維持する。すべての接着細胞を、７０〜８０％コンフルエンスで維持する。細胞は以下の培地において培養する。ＰＣ３およびＡ５４９、１０％のＦＣＳおよび抗生物質を補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏ）；ＤＵ１４５細胞、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および抗生物質を補充したＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏ）；ＳＷ６２０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏ）；Ｐａｎｃ−１細胞、１０％のＦＣＳおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏ）。上の細胞株はすべて、ＡＴＣＣから入手可能である。
【０２４８】
生存率アッセイ：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット、カタログ番号Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、透明底９６ウェル黒色細胞培養プレート（カタログ番号６５５０９０、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）において実施する。１００μｌの体積で、ウェル当たり細胞１，０００個で播種した後、細胞を、薬物添加前少なくとも２４時間にわたり静置する。７２時間後、室温（ＲＴ）で１分間振盪させながら、１０μｌのＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加することによって、細胞を分析のために調製する。次いで、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞溶解試薬（２０μｌ）を添加した後、１分間振盪し、暗所において室温で１０分間インキュベートする。ルミネセンスを、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して検出する。また、ＩＣ５０値を、ＰＣ３細胞において７２時間のフローサイトメトリーによって、ＤＡＰＩ（４’，６ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用する生細胞色素排除によって決定した。ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して決定する。ＳｕｐＢ−１５生存率を、フローサイトメトリーによって決定した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイを、他の細胞株で実施した。
【０２４９】
Ｓ１Ｐ１〜５活性化：異なるヒトＳ１Ｐ受容体サブタイプを安定して過剰発現する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用する。Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ４、およびＳ１Ｐ５を過剰発現するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した、アルファ−ＭＥＭを含有する培地において培養する。Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３を過剰発現するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＲＰＭＩにおいて培養する。刺激の前に、細胞は２４時間無血清にする。刺激は、様々な化合物またはＳ１Ｐの不在下または存在下で、０．１ｍｇ／ｍｌの、脂肪酸を含まないＢＳＡを含有する無血清のＤＭＥＭ中において１０分間実行する。タンパク質溶解物を、（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、４０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、２ｍＭのジチオスレイトール、０．２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）を含有する緩衝液を使用して調製する。細胞を、ＭＳＥ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒにおいて１回、５秒間のバーストによって均質化し、遠心分離し、タンパク質決定のために採取する。同量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％のポリアクリルアミドゲル）によって分離し、ニトロセルロース膜に移し、ウエスタンブロット分析に供する。バンドを、ＩＲＤｙｅ（登録商標）二次抗体を使用して染色し、ＬＩＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｆｃイメージングシステムによって可視化した。ホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ｐ４２／ｐ４４−ＭＡＰＫおよびホスホ−Ｓｅｒ  ＰＫＣ基質に対する抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ製である。ｐ４２全体およびｐ４４全体に対するポリクローナル抗血清を、先に記載したように生成し、特徴付けた。（Huwiler,  A.、Pfeilschifter,  J.、Br.  J.  Pharmacol.、１９９４年、１１３巻、１４５５〜１４６３頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５０】
心拍数：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＤＳＩ  ＴＡ−ＥＴＡＦ２０心電図遠隔測定デバイス（Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を外科的に移植する。心電図データを、ＰｈｙｓｉｏＴｅｌ遠隔測定システムおよびＤａｔａｑｕｅｓｔ  Ａ．Ｒ．Ｔ  ４．０ソフトウェア（ＤＳＩ）を使用して収集し、記録する。この遠隔測定デバイスは、マウスの腹腔内に、生体電位リードを胸壁の定位置に縫合して移植される。疼痛管理のために、手術後は、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１２時間毎に投与し、手術後７日間、抗生物質として、エンロフロキサシン（３ｍｇ／ｋｇ）を１日当たり２回投与する。マウスは、ベースラインの遠隔測定記録を開始する前に、手術後２週間の回復させる。心拍数は、自由に動く意識のあるマウスにおいて採取されるＥＣＧデータから計算される。マウスは、３匹のマウスからなる２つの群に分け、単回用量のビヒクル（０．９％生理食塩水または０．９％生理食塩水中２０％の酸性化ＤＭＳＯ）、１０ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０、ＦＴＹ７２０−ホスフェート、５、または５−Ｐで腹腔内処置を行い、心拍数を連続的に１０時間モニタリングする。マウスは、２週間休ませ、その時点で、実験を、控えの群に割り当てたマウスで繰り返す。これらの実験は、すべての国または地方のガイドラインおよび規制に従って実施し、ＵＣＩ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０２５１】
リンパ球の隔離：８〜２４週齢のメスＣ５７ＢＬ６マウスに、ビヒクル（０．９％生理食塩水または０．９％生理食塩水中２０％の酸性化ＤＭＳＯ）、１０ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０、ＦＴＹ７２０−ホスフェート、５、または５−Ｐを腹腔内注射する。１２時間後、ケタミン／キシラジンによる麻酔の下で、後眼窩洞から血液を収集する。１０μＬの全血を１９０μＬのＡＣＫ赤血球溶解緩衝液に添加し、室温で、３７℃で３〜５分間インキュベートし、白血球を遠心分離によって回収する。有核細胞（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性）を、血球計を使用してカウントして、白血球数を得る。別個に、５０μＬの全血を１ｍＬのＡＣＫ赤血球溶解緩衝液に添加し、室温で３〜５分間インキュベートする。細胞を、ＦＡＣＳ洗浄液（０．０５％のＮａＮ３を伴うＰＢＳ中２％のＦＣＳ）で洗浄し、赤血球溶解を繰り返す。チューブをデカントし、１００μＬのＦＡＣＳブロック（０．０５％のＮａＮ３を伴うＰＢＳ中１０％のＦＣＳ）中に、Ｂ２２０、ＣＤ４、またはＣＤ８を認識する直接的にコンジュゲートした抗体（すべて、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ製）とともに３０分間氷上で再懸濁させる。細胞を、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析する。分析は、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）に限定する。これらの実験は、すべての国または地方のガイドラインおよび規制に従って実施し、ＵＣＩ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。
【０２５２】
ＳＷ６２０およびＳＷ４８０異種移植研究：ＳＷ６２０異種移植研究では、２％のＦＣＳを伴うＰＢＳ中に懸濁させた２５０万個のルシフェラーゼ発現ＳＷ６２０結腸がん細胞を、７週齢のオスヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｓ、Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）の側腹部に皮下注射する。腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達したら、マウスを、平均腫瘍体積および動物の重量が整合するように、群に割り当てる。７匹のマウスを含む４つの群に対して、ビヒクル（０．９％生理食塩水）、１０ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０、または２０ｍｇ／ｋｇの化合物５もしくは化合物１５のいずれかで腹腔内処置を行う。腫瘍の長さおよび幅を、処置の７日目および１１日目にノギスで測定する。腫瘍体積は、式、体積（ｍｍ３）＝長さ［ｍｍ］×（幅［ｍｍ］）２×０．５２を使用して計算する。各腫瘍の体積の経時的な平均倍数変化を示す。
【０２５３】
ＳＷ４８０異種移植研究では、２５０万個の細胞をＮＳＧマウスの側腹部に皮下注射することによって、異種移植片を産生する。いったん腫瘍が１００ｍｍ３に達したら、本発明の様々な実施形態による化合物（例えば、化合物５／１０４）を、示される通りに、腹腔内注射または経口胃管栄養法によって投与する。腫瘍体積は、上の式を使用して計算する。ＢＬＩは、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して測定する。ＳＷ４８０腫瘍を切除し、０．１Ｍのリン酸緩衝液中２．５％のグルタルアルデヒド、ｐＨ７．４で固定して、包埋するまで暗所４℃で保管する。
【０２５４】
これらの実験は、すべての国または地方のガイドラインおよび規制に従って実施し、ＵＣＩ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。
【０２５５】
栄養素輸送体発現：表面４Ｆ２ｈｃ発現を、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートマウス抗ヒト４Ｆ２ｈｃ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６０７７）を使用して、６時間で測定する。分析は、生存細胞に限定する。ＰＥコンジュゲートマウスＩｇＧ１、κ（カタログ番号５５５７４９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、アイソタイプ対照として使用する。細胞を、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター、およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析する。
【０２５６】
質量分析定量化：６ウェルプレートの１つのウェル中の、１００万個のＰＣ３細胞または５００万個のＳＷ６２０細胞を、１０μΜのＦＴＹ７２０または５で１６時間処置する。培地（１００μｌ）をウェルから除去し、１００μｌのアセトニトリルと組み合わせる。細胞を掻き取ることで収集し、ペレット化し、１００μｌのＨＰＬＣグレードの水中に再懸濁させた後、１００μｌのアセトニトリルを添加した。定量化されていない７５ナノグラムの化合物（５のリン酸化の分析の場合、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０−Ｐ、またはＦＴＹ７２０／ＦＹＴ７２０−Ｐの分析の場合、５および５−Ｐ）を、内部標準として働かせるために添加して、試料の調製中に失われた化合物の補正を可能とする。沈澱タンパク質を、遠心分離によって両方の試料から除去し（微量遠心機において１５，０００ｒｐｍで１０分間）、上清を、１００μｌのアセトニトリル＋０．２％の酢酸が入った、氷上の新しいチューブに移す。遠心分離によって、不溶性の物質を再度除去し、上清を、化合物の含有量に関して分析する。２０マイクロリットルのこの脱タンパク試料を、アセトニトリル（＋０．２％の酢酸）勾配溶出を使用する、Ｃ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を備え付けたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ）によって分析する。計器は陽イオンモードで動作させる。多重反応モニタリング用のイオン移行チャネルは、ＦＴＹ７２０の場合３０８→２５５、ＦＴＹ７２０−Ｐの場合３８８→２５５、５の場合２９０→１０４、および５−Ｐの場合３７０→２７２であり、２００ミリ秒の滞留時間を伴う。ＦＴＹ７２０および５の場合、コーン電圧は３０Ｖであり、ＦＴＹ７２０−Ｐおよび５−Ｐの場合、２０Ｖである。純粋な化合物を使用して標準曲線を生成して、定量化を可能にさせる。標準曲線は、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌにおいて直線状であり、Ｒ２は０．９８またはそれよりも大きかった。内部標準の回復は８０〜１２０％の範囲であり、計器の確立された精度と矛盾しない。また、リン酸化された化合物およびリン酸化されていない化合物について同様である。
【０２５７】
細胞分析：生存率および４Ｆ２ｈｃ発現を、生細胞色素排除およびフローサイトメトリーによって決定する。酸素消費を、ＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定する。値は、総タンパク質に対して正規化する。共焦点顕微鏡法を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０またはＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉのいずれかにおいて実施する。空胞形成は、ＤＩＣフィルターを備え付けたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｓを使用してモニタリングした。ＳＷ６２０細胞の足場非依存性成長を、０．５％のアガロース底層とともに０．３５％のアガロースを含有するＤＭＥＭ−１０において測定する。ＰＢＭＮＣは、ＩＲＢプロトコール２０１５−１８８３（Ｅｄｉｎｇｅｒ）および２００１−２０５８（ＩＣＴＳ）の下で、ＵＣＩにおいてＣＴＳＡ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって行われている正常血液ドナープログラムから得られる。ＰＢＭＮＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配沈降を介して、全血から単離される。プレートを、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気下において、３７℃でインキュベートし、１２日後にコロニーをカウントした。
【０２５８】
さらなる最適化研究における生物学の手順：
【０２５９】
化合物：化合物のストック（５〜２５ｍＭ）を水中で調製したが、Ｃ２−セラミド（１０９）、ジヒドロ−Ｃ２−セラミド（１１０）、１４〜１７、２１〜２４、および３１〜３５は、ＤＭＳＯ中で作製し、スフィンゴシン（１０６）、スフィンガニン（１０７）、およびジメチルスフィンゴシン（１０８）は、エタノール中で調製した。
【０２６０】
細胞培養物研究；ＦＬ５．１２細胞（元々はＣｒａｉｇ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから得られたマウス造血細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、５００ｐｇ／ｍｌの組換えＩＬ−３（カタログ番号５７５５０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、５５μΜのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および抗生物質を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）において、１０万〜５０万個／ｍｌに維持した。細胞を、Ｌｏｏｋ−Ｏｕｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（カタログ番号ＭＰ００３５、Ｓｉｇｍａ）を使用して、３カ月毎にマイコプラズマについてスクリーニングした。
【０２６１】
生存率アッセイ：ＩＣ５０値を、４８時間のフローサイトメトリーによって、ＤＡＰＩ（４’，６ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用する生細胞色素排除によって決定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して計算した。
【０２６２】
栄養素輸送体発現：表面ＣＤ９８（４Ｆ２ｈｃ、ＳＬＣ３Ａ２）発現を、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートラット抗マウスＣＤ９８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１２８２０８）を使用して、３時間で測定した。分析は、生存細胞に限定した。ＰＥコンジュゲートラットＩｇＧ２ａ、κ（カタログ番号４００５０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、アイソタイプ対照として使用した。染色のために、２００，０００個の細胞をペレット化し、０．２５μＬの抗ＣＤ９８抗体を含有する、１００μｌのＦＡＣＳブロック（１０％のＦＣＳおよび０．０５％のＮａＮ３を伴うＰＢＳ）中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートし、１ｍｌのＦＡＣＳ洗浄液（２％のＦＣＳおよび０．０５％のＮａＮ３を伴うＰＢＳ）で２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で処理した。
【０２６３】
空胞形成アッセイ：細胞を、明視野顕微鏡法およびＤＩＣフィルターを備え付けたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｓ蛍光顕微鏡を使用して、１００倍で評価した。空胞形成を、別途示される場所を除き、２．５μＭの化合物で３時間インキュベートした後に定量化した。空胞形成スコアを計算するために、実験当たり少なくとも１５個の個別の細胞において、空胞形成の重症度を定性的に評価した。スコアは、以下の通りに個別の細胞に対して割り当てた。０＝空胞なし、１＝非常に小さな空胞、２＝複数の明確な空胞、３＝複数の大きな空胞。ある化合物に関連する空胞形成スコアを計算するには、以下の式を使用した：空胞形成スコア＝［（３×区分３の細胞％）＋（２×区分２の細胞％）＋（１×区分１の細胞％）］／３。
【０２６４】
このスコアは、その細胞が１００％区分３であった化合物が、１００の空胞形成スコアを有するように、３によって除算されている。３回の独立した実験を実行し、空胞形成スコアを平均して、平均＋／−ＳＥＭを生成した。すべての細胞は、盲検化され、スコア付けされた個別の化合物５つが、同様の結果を有することを確認した後に、１人の研究員によってスコア付けされた。
【０２６５】
この定性的空胞形成スコアが、どのくらい良好に真の空胞形成度を反映したかを決定するために、ＩｍａｇｅＪに基づく空胞検出マクロを開発し、検証した。細胞の輪郭を手作業でトレースし、同じ視野の細胞に対応する輪郭のセットを、さらなる処理のために、ＺＩＰ関心領域（ＲＯＩ）ファイルとして保存した。Otsu閾値を各細胞に対して適用した。結果として得られた画像を反転させ、半径２のメディアンフィルターを適用し、分水嶺変換（watershed  transform）を使用して、互いに対して近過ぎる接続された構成要素を分離した。次に、ＩｍａｇｅＪの「粒子分析」機能を使用して、結果として得られた画像中のすべての接続された構成要素を検出し、それらの対応する領域および円形度（circularity）を計算した。２０ピクセルよりも小さい領域または＞０．８の円形度を有する接続された構成要素を、空胞として同定した。その他の接続された構成要素が、不十分な分割の結果であったことを確かめた。この不十分な分割を克服するために、ＩｍａｇｅＪの「最大値検索」機能を使用して、これらの接続された構成要素内部の強度の最大値を検出した。１つよりも多くの最大値が見出された場合、その構成要素を、分水嶺によって分け、各々の新しい構成要素を、独立して、円形度および領域試験に供した。空胞の画像処理結果を、手作業で検出した空胞と比較して、８６％の検出精度が表示された。
【０２６６】
コントラストを上げるために、細胞を、ＣＦＳＥ（５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）で染色した。これらのアッセイでは、２００，０００個の細胞を、目的の化合物において３時間インキュベートした後に、暗所において１μΜのＣＦＳＥ１ｍｌで２０分間染色した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡において評価した。空胞によって占められているサイトゾルのパーセントを、ＩｍａｇｅＪのマクロを使用して決定した。空胞形成パーセントを計算する場合、核は除外した。このマクロを使用して、スフィンゴシン、スフィンガニン、およびジメチルスフィンゴシンで処置した細胞を評価することで、空胞形成スコアが、空胞形成された領域％のおよそ２倍であることが決定され、空胞形成度の半定量的尺度としての空胞形成スコアが検証された。このアルゴリズムおよび共焦点顕微鏡法によって、すべての試料を定量化することは、多数の化合物が評価される場合には実行不可能であった。
【０２６７】
統計。少なくとも３つの独立した実験の平均は、＋／−ＳＥＭで示される（ＣＤ９８喪失または空胞形成）。ＩＣ５０研究の場合、ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで計算された９５％信頼区間とともに与えられる。
【０２６８】
さらなる最適化研究の一般的化学の手順：
【０２６９】
一般的化学の情報：水分感受性化合物が関与するすべての反応は、火炎乾燥したガラス器具において、陽圧の、乾燥した、酸素を含まないアルゴンの下で、ならびに乾燥溶媒において実施した。無水溶媒は、使用前に、陽圧のアルゴンの下で蒸留し、標準的方法によって乾燥させた。ＴＨＦ、エーテル、ＣＨ２Ｃｌ２、およびトルエンは、ＳＤＳ（溶媒送達システム）によって乾燥させた。市販グレードの試薬を、さらなる精製を伴わずに使用した。シリカカラムクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲルで実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ガラスで裏打ちされたシリカゲルプレートにおいて実行した。可視化は、ＵＶ光（２５４ｎｍ）によって、あるいは過マンガン酸カリウム溶液またはモリブデン酸セリウムアンモニウムを用いて染色した後、加熱することによってもたらされる。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−４００およびＡＶ−５００  ＭＨｚ分光計において、室温（２９８Ｋ）で記録された。ケミカルシフトは、ＣＤＣｌ３（δΗ：７．２６ｐｐｍおよびδＣ：７７．０ｐｐｍ）またはＭｅＯＤ（δΗ：３．３１ｐｐｍおよびδＣ：４９．０ｐｐｍ）から参照した百万分率（ｐｐｍ）で報告される。カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。多重度は、多重線（ｍ）、一重線（ｓ）、二重線（ｄ）、三重線（ｔ）、四重線（ｑ）、五重線（ｑｕｉｎ．）、および幅広線（ｂｒ．）として与えられる。赤外スペクトルは、ＦＴ−ＩＲ分光計で記録された。そして、これは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で報告される。旋光度は、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＰ  ３００偏光計で、２５℃において５８９ｎｍで決定した。具体的な旋光度は、１０−１度ｃｍ２ｇ−１という単位で与えられる。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、定量的飛行時間型（ＴＯＦ）検出器に連結された、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いる「Ｃｅｎｔｒｅ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｅ  ｄｅ  ｍａｓｓｅ  ｄｅ  Ｉ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ」によって実施した。純度の分析は、ＨＰＬＣ（ブランクは最終トレースから減じた）によって評価した。溶離液は０．１％のギ酸を有するＨ２Ｏおよび０．１％のギ酸を有するＭｅＯＨであり、流速は０．５０ｍＬ／分（別途明言されない限り）であり、ＵＶ検出は２１４ｎｍであった。カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ８＝１００×４．６ｍｍ、粒径＝５μ。Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ８＝１００×２．１ｍｍ、粒径＝３μ。ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，４Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−（（４−オクチルベンジル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，４Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−（（４−オクチルベンジル）オキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート、（２Ｒ，４Ｓ）−２−（メトキシメチル）−４−（（４−オクチルベンジル）オキシ）ピロリジン塩酸塩、および（２Ｓ，４Ｓ）−２−メチル−４−（（４−オクチルベンジル）オキシ）ピロリジン塩酸塩を、R.  Franssonら、S.  ACS  Med.  Chem.  Lett.、２０１３年、４巻、９６９〜９７３頁に記載されているように調製した。この開示は、参照により���明細書に組み込まれる）。
【０２７０】
一般的方法Ａ：ＴＨＦおよびＤＭＦ中の関連するアルコール（１当量）に、ＮａＨ（３当量）を０℃で少量ずつ添加し、結果として得られた懸濁物を、この温度で３０分間撹拌した。１−ブロモドデカン（３当量）およびヨウ化テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）（０．１当量）を同時に添加し、結果として得られた混合物を、室温に温まるまで放置し、これを４８時間撹拌した。水（１５ｍＬ）を滴下添加した後、この溶液を、酢酸エチル（２回×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜ヘキサン中１０％の酢酸エチル）によって精製して、油を得た。
【０２７１】
一般的方法Ｂ：乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（ｃ＝０．０６Ｍ）中の関連するアリル性エーテル（１当量）に、アルケン（１０当量）および第一世代グラブス触媒（２０ｍｏｌ％）をアルゴン下で添加した。結果として得られた混合物を室温で２４時間撹拌した後、さらなる第一世代グラブス触媒（１５ｍｏｌ％）およびアルケン（１０当量）を添加し、これをさらに２４時間室温で撹拌した。この反応混合物を真空中で濃縮し、シリカカラムクロマトグラフィー（条件については特定の化合物を参照されたい）によって精製して、油を得た。
【０２７２】
一般的方法Ｃ：関連するアルキン（３当量）およびカテコールボラン（ＴＨＦ中１Ｍ、３当量）を、アルゴン下において、７０℃で２時間還流させた。その後、この反応混合物を、室温に冷めるまで放置した。これに、１，２−ジメトキシエタン（１２ｍＬ／ｍｍｏｌ）中の適切な臭化アリール（１当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３ｍｏｌ％）、およびＮａＨＣＯ３水溶液（１Ｍ、１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）を添加した。結果として得られた混合物を、アルゴン下において、８５℃で５時間還流させた。その後、この反応混合物を、室温に冷めるまで放置し、ジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（別途明言されない限り、ヘキサン〜ヘキサン中２０％の酢酸エチル）によって精製して、油を得た。
【０２７３】
一般的方法Ｄ：関連する（Ｅ）−アルケン（１当量）を酢酸エチル（ｃ＝０．０４Ｍ）に溶解させ、これに、Ｐｄ／Ｃ（１０％）を一度に添加した。空気を、真空下でフラスコから除去し、水素のバルーンで置き換えた。結果として得られた混合物を室温で撹拌し（反応時間については特定の化合物を参照されたい）、次いでセライトのパッドを通して濾過して、油を得た。これを、さらなる精製を伴わずに使用した。
【０２７４】
一般的方法Ｅ：乾燥ＴＨＦ中の関連するＴＢＳ保護アルコール（１当量）に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、当量については個別の化合物を参照されたい）を添加し、結果として得られた混合物を、室温で１７時間撹拌した。この反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（別途明言されない限り、ヘキサン中１０％の酢酸エチル〜ヘキサン中３０％の酢酸エチル）によって精製して、油を得た。
【０２７５】
一般的方法Ｆ：１，４−ジオキサン中の関連するＮ−Ｂｏｃ保護アルコール（１当量）に、１，４−ジオキサン中４ＭのＨＣｌ（量については個別の化合物を参照されたい）を添加し、結果として得られた混合物を、室温で１７時間撹拌した。この反応混合物を真空中で濃縮し、さらに２回、１，４−ジオキサンとともに同時蒸発させて、すべてのＨＣｌが除去されたことを確実にした。結果として得られた残留物を、ジエチルエーテルで３回粉砕することによって、あるいはシリカカラムクロマトグラフィー（条件については特定の化合物を参照されたい）によって精製して、生成物を固体として得た。生物学的試験の場合、この固体の一部を最小量のＨＰＬＣグレードの水に溶解させ、濾過し（孔径＝０．４５μｍ）、凍結乾燥させた。
【０２７６】
一般的方法Ｇ：関連するＨＣｌ塩をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回抽出した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、対応する遊離塩基を得た。これを、さらなる精製を伴わずに使用した。この残留物（０．９当量）を最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、アルゴン雰囲気下で、１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−（トリフルオロメチルスルホニル）グアニジン（１当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５当量）を添加した。反応を、室温で１７時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させ、残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、油を得た。
【０２７７】
一般的方法Ｈ：関連するＨＣｌ塩をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回抽出した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、対応する遊離塩基を得た。これを、さらなる精製を伴わずに使用した。この残留物（１当量）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、無水酢酸（１．５当量）を０℃で滴下添加した。反応混合物を、室温に達するまで放置し、これをさらに１７時間撹拌した。残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜ヘキサン中５０％の酢酸エチル）によって精製して、油を得た。
【０２７８】
ＳＨ−ＢＣ−８９３のＩｎ  ｖｉｔｒｏおよびＩｎ  ｖｉｖｏ特徴付けのための手順：
【０２７９】
細胞培養物および試薬。ＯＰ９、ＤＬＤ−１、ＳＷ４８、ＳＷ６２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＡＮＣ−１、ＨＯＳ、ＭＧ−６３、およびＺｒ７５−１細胞は、ＡＴＣＣから得た。ＳＷ４８０細胞は、Ｍａｒｉａｎ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＵＣＩ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）によって供給され、ＨｅＬａ細胞は、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｓｕｅｔｔｅｒｌｉｎ（ＵＣＩ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）によって供給され、ＬＳ１８０細胞は、Ｂｒｕｃｅ  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ（ＵＣＩ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）によって供給され、ＦＬ５．１２細胞は、Ｃｒａｉｇ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）によって供給された。ＳＴＯＰカセットのＣｒｅ媒介欠失を伴う、および伴わないｐ５３−／−；ＬＳＬ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、Ｄａｖｉｄ  Ｔｕｖｅｓｏｎ博士（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ）の厚意で供給された。初代ｐ５３＋／＋；ＰＴＥＮ＋／＋、ｐ５３−／−；ＰＴＥＮ＋／＋、およびｐ５３−／−；ＰＴＥＮ−／−  ＭＥＦは、所内で、標準的技法を使用してＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する胚から生成した。ｐ５３−／−  ＰＴＥＮ−／−マウス前立腺組織から生成したｍＰＣＥ細胞は、１０％のＦＢＳ、２５μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物、５μｇ／ｍｌのウシインスリン、および６ｎｇ／ｍｌの組換えヒト上皮成長因子を伴うＤＭＥＭ中において維持した。ＦＬ５．１２細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５５μΜの２−メルカプトエタノール、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、および５００ｐｇ／ｍｌのｒＩＬ−３を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地において維持した。ＦＬ５．１２細胞は、２週間の培養にわたって、徐々にＩＬ−３濃度を低減することによって、２５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−３で成長するように順応させた。ＤＬＤ−１およびＺｒ７５−１細胞は、ＦＬ５．１２と同様の培地だが、ＩＬ−３は伴わない培地において培養した。ＨｅＬａ、ＯＰ９、ＭＧ−６３、およびＭＥＦ細胞は、１０％のＦＣＳおよび抗生物質を補充した、４．５ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミンを伴うＤＭＥＭにおいて培養した。飢餓培地は、化学成分からアミノ酸およびグルコースを欠くＤＭＥＭを作製し、１０％の透析済みＦＣＳを補充することで産生した。ＬＳ１８０、ＳＷ４８、ＰＡＮＣ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＷ４８０、およびＳＷ６２０細胞は、１０％のＦＣＳ、抗生物質、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。細胞生存率は、１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰＩのいずれかを使用する生細胞色素排除によって測定した。ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ９８による細胞表面４Ｆ２ｈｃレベルの分析は、ＤＡＰＩ排除によって決定された生存細胞に限定した。ＳＷ６２０細胞の足場非依存性成長を、０．５％のアガロース底層とともに０．３５％の低融点アガロースを含有するＤＭＥＭ−１０において測定した。ＰＢＭＣは、ＩＲＢプロトコール２０１５−１８８３（Ｅｄｉｎｇｅｒ）および２００１−２０５８（ＩＣＴＳ）の下で、ＵＣＩにおいてＣＴＳ���−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって行われている正常血液ドナープログラムから得た。Ｐ４０Ｐｘ−ＥＧＦＰプラスミドは、Ｓｅｔｈ  Ｆｉｅｌｄ（ＵＣＳＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって供給され、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｖａｃ１４ＷＴおよびｍＣｈｅｒｒｙ−Ｖａｃ１４Ｌ１５６Ｒプラスミドは、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｅｉｄｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって供給され、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＲＰＭＬ１、ＥＧＦＰ−ＴＲＰＭＬ１、およびｍＣｈｅｒｒｙ−ＭＬ１  Ｎ＊２プラスミドは、Ｈａｏｘｉｎｇ  Ｘｕ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）によって供給され、ＰＩＫｆｙｖｅおよびＶａｃ１４  ｓｈＲＮＡは、Ａｎａｎｄ  Ｇａｎｅｓａｎ（ＵＣＩ、Ｉｒｖｉｎｅ）によって供給された。
【０２８０】
光学顕微鏡法：明視野および落射蛍光顕微鏡法を、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｓ蛍光顕微鏡を使用して実行した。共焦点顕微鏡法を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡またはＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉスピニングディスク共焦点顕微鏡において実施した。抗体は、以下から得た。マウス４Ｆ２ｈｃ（カタログ番号１２８２０８）およびＬａｍｐ１（カタログ番号５３−１０７９−４２）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから、ヒト４Ｆ２ｈｃ（カタログ番号５５６０７７）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、ヒトＧＬＵＴ１（カタログ番号ＮＢ３００−６６６）はＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから、ＬＣ３（カタログ番号４１０８）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、ＰＩＫｆｙｖｅ（カタログ番号４０８２）はＴｏｃｒｉｓから、Ｖａｃ１４（カタログ番号ＳＡＢ４２０００７４）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ＷＩＰＩ２（カタログ番号ＬＳ−Ｃ  １５４５５７−１００）はＬｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。共局在化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアのＪＡＣｏＰプラグインを使用して決定した。マクロピノサイトーシスは、無血清ＤＭＥＭにおいて１６時間インキュベートした後に測定した。（ＬＳＬ）前またはＣｒｅの（ＫＲａｓＧ１２Ｄ）導入後のｐ５３−／−；ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、１６時間血清欠乏にさせた後、マクロピノサイトーシス阻害因子５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ、７５μΜ）で１時間、またはＳＨ−ＢＣ−８９３で６時間処置した。Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎデキストラン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｄ７１７３）（１ｍｇ／ｍＬ）およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ−７５２５）（１：２，０００希釈）を３０分間添加し、生細胞を、スピニングディスク共焦点顕微鏡で評価した。Ｄｉｌ−ＬＤＬ取り込みの場合、ｍＰＣＥは、１０％のチャコール処理血清を伴う培地で２４時間インキュベートした後、２０μｇ／ｍｌのＤｉｌ−ＬＤＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ３４８２）＋／−ＳＨ−ＢＣ−８９３とともに６時間、およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ−７５２５）とともに３０分間インキュベートした。表面ＬＤＬ受容体を検出するために、ＳＨ−ＢＣ−８９３で３時間処置したｍＰＣＥ細胞にＤｉｌ−ＬＤＬを４℃で添加するか、あるいは細胞を、ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ２２５５）で染色した。ＳＷ４８０腫瘍を切除し、０．１Ｍのリン酸緩衝液中２．５％のグルタルアルデヒド、ｐＨ７．４で固定して、包埋するまで暗所４℃で保管した。腫瘍試料を、ＵＣ  ＩｒｖｉｎｅのＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで処理した。
【０２８１】
電子顕微鏡法。ＦＴＹ７２０で処置したＦＬ５．１２細胞を、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％のグルタルアルデヒド／２．５％のホルムアルデヒドで固定し、包埋するまで４℃で保管した。細胞を、１％の四酸化オスミウムで後固定し、続けて脱水し、エポナット１２樹脂（eponat12  resin）に包埋し、超薄切片を切り出し、グリッド上に載せ、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。試料を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で分析した。２つの独立した実験から、代表的な画像を示す。
【０２８２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究。マウスにおいて実行した実験は、Institutional  Animal  Care  and  Use  Committee  of  University  of  California,Irvineに従って、ＵＣＩのＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｃｈａｏ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒと協議して実行したパワー分析（power  analysis）に則って実施した。異種移植片は、１０〜１６週齢のオスまたはメスのＮＳＧマウスの側腹部に、５百万個の細胞を皮下注射することによって産生した。前立腺同系移植片は、同様の様式だが、６〜８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて産生した。いったん腫瘍が１００ｍｍ３に達したら、ＳＨ−ＢＣ−８９３を、示される通りに、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射または経口胃管栄養法によって投与した。腫瘍体積は、式、体積（ｍｍ３）＝長さ［ｍｍ］×（幅［ｍｍ］）２×０．５２を使用して計算した。ＢＬＩは、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して測定した。Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドにおいてｐＤＫＯマウスを生成するために、Ｐｔｅｎｆｌｏｘマウス（ストック番号００４５５９７）およびｐ５３ｆｌｏｘマウス（ストック番号００８４６２）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、ＰＢ−Ｃｒｅ４マウス（系統番号０１ＸＦ５）を、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得た。ｐＤＫＯのオスの同年齢のコホートを、ＵＣ  ＩｒｖｉｎｅのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの協力を得て行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精によって生成した。処置は、６〜７週齢で始めた。正常なマウスに対するＳＨ−ＢＣ−８９３による処置が、尿生殖（ＧＵ）路の重量を改変しなかった（ｎ＝３）ことが決定された後、腫瘍重量を、ｐＤＫＯマウスの完全なＧＵ路を単離して、同年齢のマウスの正常なＧＵ路の平均重量（ｎ＝３）を差し引くことによって決定した。腫瘍試料を、ＵＣ  ＩｒｖｉｎｅのＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで処理および画像化した。血液化学を、ＩＤＥＸＸ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈによって分析し、全血球算定を、Ｈｅｍａｖｅｔ血液学システムを使用して実施した。
【０２８３】
ＮＡＤＨ蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）。Ｔｉ：サファイアレーザーシステム（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｍａｉ  Ｔａｉ）に連結されたＺｅｉｓｓ  ７８０顕微鏡を使用して、寿命画像を獲得した。励起波長は７４０ｎｍであり、二色性フィルター（６９０ｎｍ）を使用して、レーザー光から蛍光シグナルを分離した。６３×１．１５水浸対物レンズを使用した。画像獲得設定は、画像サイズが２５６×２５６ピクセルであり、走査速度が２５．２１マイクロ秒／ピクセルであった。蛍光は、ハイブリッド検出器（ＨＰＭ−１００  Ｈａｍａｍａｔｓｕ）によって検出した。データは、画像の最も明るいピクセルにおいて１００カウントが獲得されるまで収集した。ＦＬＩＭシステムは、各イメージングセッション中に、４．０４ナノ秒の単一指数でフルオレセインの蛍光減衰を測定することによって較正された。ＦＬＩＭ画像のフェーザ変換および単一細胞における平均寿命の分析は、先に記載されているように行った（Digman  MAら、Biophys  J.、２００８年、９４巻（２号）：Ｌ１４〜Ｌ１６頁、Pate  KTら、EMBO  J．、２０１４年、３３巻（１３号）：１４５４〜７３頁、Stringari  Cら、Sci  Rep.、２０１２年、２巻、５６８頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。データは、ＵＣＩのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓにおいて開発されたＳｉｍＦＣＳソフトウェアで処理した。結合したＮＡＤＨ画分を決定する場合、核は除外した。平均＋／−ＳＥＭを示す、ｎ≧２つの独立した実験に由来する４５細胞。
【０２８４】
コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）。ＣＡＲＳイメージングシステムは、（Suhalim  JLら、Biophys  J.、２０１２年、１０２巻（８号）：１９８８〜１９９５頁。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）において詳細に記載されている。細胞を、４％のホルムアルデヒドで固定し、６０×水浸対物レンズで画像化した。試料に対するレーザー出力は１０ｍＷであり、１０ミリ秒のピクセル滞留時間であった。脂肪滴領域は、カスタマイズしたＭａｔｌａｂプログラムを使用して、ＣＡＲＳ画像から推定した。４構成要素のOtsu閾値化方法を使用して、脂肪滴、細胞質、細胞核、および背景を分離した。脂肪滴領域は、細胞質が覆っているピクセルの数に対する、脂肪滴が覆っているピクセルの数として定義した。
【０２８５】
ＰＩＫｆｙｖｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。ＦＬＡＧ−ＰＩＫｆｙｖｅを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ、ＦＬＡＧ−ビーズで精製し、ＦＬＡＧペプチドで溶離した。ＰＩ３Ｐおよびホスファチジルセリン（Ｃ１６）リポソームを、ＦＴＹ７２０を伴う、または伴わない、２×脂質混合物緩衝液［４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ］における超音波処理によって生成した。ＦＬＡＧ−ＰＩＫｆｙｖｅおよび脂質混合物を、室温で１５分間、Ｍｇ２＋−ＡＴＰ溶液［６．５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．１ｍＭのＡＴＰ、および［３２Ｐ］−γ−ＡＴＰ］とともにインキュベートした。４ＭのＨＣｌを添加することによって反応を停止し、ホスホイノシチドを、メタノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。ホスホイノシチドを、シリカ薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、２Ｍの酢酸／１−プロパノール（３５：６５）で分離した。膜を乾燥させ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｉｍａｇｅｒに曝露し、ＰＩ（３，５）Ｐ２スポットからのカウントをＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて定量化した。
【０２８６】
ＨＰＬＣによるＰＩ（３，５）Ｐ２の測定。ＨｅＬａ細胞を、ＰＢＳで２回すすぎ、イノシトール標識培地（５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０％の透析済みＦＣＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、イノシトールを含まないＤＭＥＭ）および１０μＣｉ／ｍｌのミオ−［２−３Ｈ］イノシトールにおいて４８時間インキュベートした。細胞を４．５％の過塩素酸で溶解させ、掻き取り、１４，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。細胞ペレットを１００ｍＭのＥＤＴＡですすぎ、再度遠心分離し、５０μｌの水中に再懸濁させた。脂質を脱アシル化するために、１ｍｌのメタノール／４０％メチルアミン／ブタノール（４５．７％のメタノール、１０．７％のメチルアミン、１１．４％のブタノール）を添加し、次いで、この混合物をガラスバイアルに移し、５５℃で１時間インキュベートした。室温に冷ました後、試料を真空乾燥し、０．５ｍｌの水中に再懸濁させた。同体積のブタノール／エチルエーテル／ギ酸エチル（２０：４：１）で、脂質を２回抽出した。水性相を真空乾燥させ、７５μｌの水中に再懸濁させ、５０μｌの各々の試料をＨＰＬＣによって分析した。ＰＩ（３，５）Ｐ２レベルを、ホスファチジルイノシトール全体の割合として表した。
【０２８７】
ＰＰ２Ａホスファターゼ活性。ＰＰ２Ａ活性を、ＰＰ２Ａ免疫沈降ホスファターゼアッセイキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して測定した。簡潔に述べれば、ＰＰ２Ａの触媒的サブユニットを、４μｇの抗ＰＰ２Ａ、Ｃサブユニットで、ＦＬ５．１２細胞溶解物から免疫沈降させた。４回洗浄した後、免疫沈降したＰＰ２Ａの活性を、Ｃ２−セラミド、ジヒドロ−Ｃ２−セラミド、ＦＴＹ７２０、ＳＨ−ＢＣ−８９３、またはカリクリンＡの存在下または不在下において、製造業者の指示に従って、ホスホペプチドを脱リン酸化することによって評価した。
【０２８８】
ＳＨ−ＢＣ−８９３の質量分析定量化。内部標準として、アセトニトリルと１：１で組み合わされた、５０μｌの血漿または５０μｌの腫瘍ホモジネート（０．２５Ｍのスクロース、２５ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、１：９重量体積）に、７５ｎｇのＦＴＹ７２０を添加した。タンパク質を沈澱させ、遠心分離によって除去し（１５，０００ｒｐｍで１０分間）、上清を、５０μｌのアセトニトリル＋０．２％の酢酸が入った、氷上の新しいチューブに移した。アセトニトリル＋０．２％の酢酸による第２の脱タンパクの後、２０μｌの脱タンパク試料を、アセトニトリル＋０．２％の酢酸による勾配溶出を用いて、Ｃ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を備え付けた、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥを使用するＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。計器は陽イオンモードで動作させた。多重反応モニタリング用のイオン移行チャネルは、ＳＨ−ＢＣ−８９３の場合２９０→１０４であり、２００ミリ秒の滞留時間を伴った。コーン電圧は３０Ｖであった。定量化に使用する標準曲線は、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌにおいて線形であり、Ｒ２は０．９８またはそれよりも大きかった。内部標準の回復は、＞８０％であった。腫瘍濃度は、１ｇｍ＝１ｍＬと仮定して計算した。
【０２８９】
統計的方法およびデータ分析。有意性は、単回のペアワイズ比較については対応ｔ検定を使用して決定した。チューキー法を利用し、複数の比較が行われた場合は、補正したｐ値を報告している。データが正規分布ではなかった腫瘍研究では、処置マウスを対照と比較するために、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．、有意ではない（Ｐ＞０．０５）。ＣＡＲＳ実験の脂肪滴領域では、対照と実験群との間において、平均値は両側ＡＮＯＶＡで比較した。
【０２９０】
均等物の原則
上の説明は、本発明の多くの具体的実施形態を含んでいるが、これらの実施形態は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、本発明の一実施形態の例として解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲は、例証された実施形態によって決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５１−３】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５５−３】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５６−３】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５８−３】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６０−３】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６１−３】
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【図６２】
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【図６３−１】
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【図６３−２】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６５−３】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６６−３】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【国際調査報告】
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