(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者の薬理学的処置への応答を予測するのに有用な方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンを含む抗ＨＢＶ療法での処置によって利益を得る可能性がある患者を同定する方法であって、
患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定すること
を含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ療法での処置によって利益を得る可能性があることを指摘する、上記方法。
【請求項２】
ＨＢＶ感染に罹った患者のインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療での治療に対する応答性を予測する方法であって、
患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定すること
を含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療での治療に応答性を有する可能性がより高いことを指摘する、上記方法。
【請求項３】
ＡＨＢＶ感染を有する患者がインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療による利益を示すと予想される見込みを決定するための方法であって、
患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定すること
を含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療による利益の見込みの増加を有することを指摘する、上記方法。
【請求項４】
インターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療の治療効果を最適化するための方法であって、
患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定すること
を含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療による利益の見込みの増加を有することを指摘する、上記方法。
【請求項５】
患者においてＨＢＶ感染を治療するための方法であって、
（ｉ）患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中のｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在を決定すること、および
（ｉｉ）前記患者にインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療の有効量を投与することによって、ＨＢＶ感染を治療すること
を含む、上記方法。
【請求項６】
インターフェロン処置に対するＨＢＶに感染した患者の２４週以上の処置追跡調査におけるＳ−損失（応答者対不応答者）を予測するための方法であって、
前記ヒト対象からのサンプルを提供すること、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を検出すること、および前記患者が、ｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子が存在する場合、２４週以上の処置追跡調査におけるＳ−損失（応答者対不応答者）として測定されるインターフェロン処置に対して高い応答率を有すると決定すること
を含む、上記方法。
【請求項７】
インターフェロンが、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａおよびインターフェロンアルファ−２ｂの群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
インターフェロンが、式：
【化１】
2018519839.tif 000046
（式中、ＲおよびＲ’はメチルであり、ＸはＮＨであり、ｎおよびｎ’は個々にまたは両方とも、４２０または５２０のいずれかである）
を有するペグインターフェロンアルファ−２ａコンジュゲートである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者の薬理学的処置への応答を予測するのに有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界で３億５千万〜４億の人々に感染しており、毎年、感染に起因する肝硬変、肝不全、および肝細胞癌が原因で１００万人が死亡することが記録されている。感染因子であるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、経皮的、性的、および周産期に伝染する可能性があるＤＮＡウイルスである。アジアにおける感染の罹患率（≧８％）は、欧州や北米（＜２％）より相当高い（Dienstag J.L.、Hepatitis B Virus Infection.、N. Engl. J. Med. 2008；359：1486〜1500）。アジアでは、感染した母親から周産期にうつったＨＢＶの発生率は他よりかなり高く、曝露された者のうち９０％超において慢性的な感染を引き起こす（ＷＨＯファクトシート第２０４号；２００８年８月改訂）。加えて、幼児期の間に慢性的な感染状態になる成人の２５％が、ＨＢＶ関連の肝臓がんまたは肝硬変により死亡する（ＷＨＯファクトシート第２０４号；２００８年８月改訂）。インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）は、抗ウイルス経路の有力な活性化剤であり、加えて多数の免疫調節機能を媒介する（Muller U.、Steinhoff U.、Reis L.F.ら、Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense、Science 1994；264：1918〜21）。
【０００３】
ＨＢＶの治療における１８０μｇ／週の用量のペガシス（PEGASYS）（登録商標）（ペグ化ＩＦＮアルファ２ａ、４０ＫＤ、ペグ−ＩＦＮ）の効能が、２つの大規模な重要な研究で実証された。一方の研究は、ＨＢｅＡｇ陰性患者でなされ（ＷＶ１６２４１）、他方の研究は、ＨＢｅＡｇ陽性患者でなされた（ＷＶ１６２４０）。
【０００４】
ＷＶ１６２４１は、２００１年６月から２００３年８月の間に実行され、４８週間にわたり、５５２人のＨＢｅＡｇ陰性のＣＨＢ患者を、３つの処置群：ペグ−ＩＦＮ単剤療法、ペグ−ＩＦＮ＋ラミブジンまたはラミブジン単独のうち１つにランダム化した。処置中断の２４週間後に評価されたウイルス学的応答（ＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０，０００コピー／ｍＬと定義される）は、ペグ−ＩＦＮを受けたグループと同等であり（４３％および４４％）、どちらの処置群もラミブジングループ（２９％）より優れていた（Marcellin P.、Lau G.K.、Bonino F.ら、Peginterferon alfa-2a alone, lamivudine alone, and the two in combination in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B、N. Engl. J. Med. 2004；351：1206〜17）。
【０００５】
研究ＷＶ１６２４０は、２００２年１月から２００４年１月の間に実行された。この研究において、８１４人のＨＢｅＡｇ陽性ＣＨＢ患者を、４８週間にわたり、ＷＶ１６２４１の場合と同じ処置群、すなわちペグ−ＩＦＮ単剤療法、ペグ−ＩＦＮ＋ラミブジンまたはラミブジン単独にランダム化した。処置中断の２４週間後に評価された応答から、ペグ−ＩＦＮ単剤療法グループにおけるＨＢｅＡｇセロコンバージョンが、ペグ−ＩＦＮ＋ラミブジンおよびラミブジン単剤療法のそれぞれでは２７％および１９％であるのと比較して、３２％の割合であることが示された（Lau G.K.、Piratvisuth T.、Luo K.X.ら、Peginterferon Alfa-2a, Lamivudine, and the Combination for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B、N. Engl. J. Med. 2005；352：2682〜95）。制御されたＨＢＶ臨床研究のメタ分析から、ペグ−ＩＦＮ含有処置は、ＣＨＢ患者において、ラミブジンレジメンよりも有意なＨＢｓＡｇクリアランスまたはセロコンバージョンを促進したことが実証されている（Li W.C.、Wang M.R.、Kong L.B.ら、Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion：a meta-analysis of controlled clinical trials、BMC Infect. Dis. 2011；11：165〜177）。
【０００６】
より近年、Neptuneの研究（ＷＶ１９４３２）は、５月２００７年から２０１０年４月の間に実行され、ＨＢｅＡｇ陽性患者において２４または４８週間のいずれかにわたり９０または１８０μｇ／週のいずれかで投与されたペグ−ＩＦＮを比較した（Liaw Y.F.、Jia J.D.、Chan H.L.ら、Shorter durations and lower doses of peginterferon alfa-2a are associated with inferior hepatitis B e antigen seroconversion rates in hepatitis B virus genotypes B or C、Hepatology 2011；54：1591〜9）。処置終了後の２４週目に効能を決定した。この研究から、より低い用量およびより短い処置の持続時間の両方が、これまでにＷＶ１６２４０研究で使用されていた承認された用量および持続時間より劣っていたことが実証され、したがって承認された治療レジメン、すなわち４８週間で１８０μｇ／週のレジメンが、ＨＢｅＡｇ陽性ＣＨＢの患者にとって最も有益であることが確認された。
【０００７】
しかしながら、ペグ−ＩＦＮはＣＨＢの治療にうまく使用されてきたという事実にもかかわらず、治療応答に対する宿主因子（遺伝学的および非遺伝学的）およびウイルス因子の影響はほとんど知られていない。
【０００８】
ＨＢＶの病因においてウイルスおよび環境因子が重要な役割を果たすが、遺伝学的影響が存在することは明らかである。小規模な遺伝学的研究から、ＨＢＶ感染の転帰において宿主の免疫／炎症因子（例えばＨＬＡ、サイトカイン、阻害分子）が関与する可能性があることが示唆されているが、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）から、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＰ遺伝子領域にわたる１１個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、日本人およびタイ人のＨＢＶコホートにおける持続的な慢性Ｂ型肝炎ウイルスキャリアの発展と有意な関連を有することが明らかに実証された（Kamatani Y.、Wattanapokayakit S.、Ochi H.ら、A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians. Nat. Genet. 2009；41：591〜595）。それに続きこの発見はさらに、ＴａｑＭａｎベースの遺伝子型解析アッセイを使用した別個の中国人コホートの研究でも確認された（Guo X.、Zhang Y.、Li J.ら、Strong influence of human leukocyte antigen (HLA)-DP gene variants on development of persistent chronic hepatitis B virus carriers in the Han Chinese population、Hepatology 2011；53：422〜8）。さらに、別個のＧＷＡＳおよび複製分析は、日本人および韓国人の集団においてＨＬＡ−ＤＰ遺伝子座と持続的なＨＢＶ感染に対する保護的作用との間に有意な関連があるという類似の結果で結論付けた（Nishida N.、Sawai H.、Matsuura K.ら、Genome-wide association study confirming association of HLA-DP with protection against chronic hepatitis B and viral clearance in Japanese and Korean. PLos One2012；7：e39175）。最終的に、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座内の２つの追加のＳＮＰ（ｒｓ２８５６７１８およびｒｓ７４５３９２０）は、ＣＨＢ感受性に対して独立したＨＬＡ−ＤＱバリアントの作用を有することが見出された（Mbarek H.、Ochi H.、Urabe Y.ら、A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population、Hum. Mol. Genet.2011；20：3884〜92）。総合すると、アジア人の集団において、ロバストな遺伝学的証拠から、ＨＬＡ領域における多型性のバリエーションが、アジア人の集団における急性感染後の慢性Ｂ型肝炎の進行に有意に寄与することが示唆される。
【０００９】
制御されたＨＢＶ臨床試験のメタ分析から、従来のＩＦＮアルファ−またはペグ化ＩＦＮアルファ（２ａまたは２ｂ）を含有する治療が、ＣＨＢ患者において、ラミブジンレジメンよりも有意なＨＢｓＡｇクリアランスまたはセロコンバージョンを促進したことが実証されている（Li W.C.、Wang M.R.、Kong L.B.ら、Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion:a meta-analysis of controlled clinical trials、BMC Infect. Dis. 2011；11：165〜177）。しかしながら、ペグ−ＩＦＮはＣＨＢの治療にうまく使用されてきたという事実にもかかわらず、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のレベルにおける治療応答と宿主因子の影響との関係に関してほとんど知られていない。ペグ化インターフェロンアルファは、リバビリン（ＲＢＶ）と組み合わせて、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療にうまく使用されてきた。どのようにＨＣＶ患者がペグ−ＩＦＮ／ＲＢＶ治療に応答するかにおける主要な科学的な発見は、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を介して、第１９染色体における遺伝子ＩＬ２８Ｂ周辺の遺伝学的多型が、治療転帰に強く関連することである（Ge D.、Fellay J.、Thompson A.J.ら、Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance、Nature 2009；461：399-401；Tanaka Y.、Nishida N.、Sugiyama M.ら、Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C、Nat. Genet. 2009；41：1105〜9；Suppiah V.、Moldovan M.、Ahlenstiel G.ら、IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy、Nat. Genet. 2009；41：1100〜4）。ＩＬ２８Ｂによってコードされたタンパク質はＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ３）であり、同じ染色体領域にＩＬ２８ＡおよびＩＬ２９を有するサイトカイン遺伝子クラスターを形成する。ＩＬ２８Ｂは、ウイルス感染により誘導される可能性があり、抗ウイルス活性を有する。しかしながら、ペグ−ＩＦＮで治療したＣＨＢ患者において、ＩＬ２８Ｂ領域周辺の特定のＳＮＰ（例えばｒｓ１２９８９７６０、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ１２９８０２７５）の治療応答との関連に対して、限定的ながら多少の矛盾するデータが存在する（Lampertico P.、Vigano M.、Cheroni C.ら、Genetic variation in IL28B polymorphism may predict HBsAg clearance in genotype D, HBeAg negative patients treated with interferon alfa、AASLD 2010；Mangia A.、Santoro R.、Mottolaら、Lack of association between IL28B variants and HBsAg clearance after interferon treatment、EASL 2011；de Niet A.、Takkenberg R.B.、Benayed R.ら、Genetic variation in IL28B and treatment outcome in HBeAg-positive and -negative chronic hepatitis B patients treated with Peg interferon alfa-2a and adefovir、Scand. J. Gastroenterol. 2012、47：475〜81；Sonneveld M.J.、Wong V.W.、Woltman A.M.ら、Polymorphisms near IL28B and serologic response to peginterferon in HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B、Gastroenterology 2012；142：513〜520）。
【００１０】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型は、慢性Ｃ型肝炎においてペグ化インターフェロン（ペグ−ＩＦＮ）ベースの療法に対する応答を予測する。Holmesらは、大部分がアジア人のＣＨＢコホートにおいてＩＬ２８Ｂ遺伝子型がペグ−ＩＦＮ治療転帰に関連するかどうかを調査した。９６人の患者でＩＬ２８Ｂ遺伝子型を決定した（Holmesら、IL28B genotype is not useful for predicting treatment outcome in Asian chronic hepatitis B patients treated with pegylated interferon-alpha、J. Gastroenterol. Hepatol.、2013、28(5)：861〜6）。８８％がアジア人であり、６２％がＨＢｅＡｇ陽性であり、１３％がＭＥＴＡＶＩＲステージＦ３〜４であった。追跡調査時間の中央値は３９．３ヶ月であった。患者の大部分はＣＣＩＬ２８Ｂ遺伝子型を保有していた（８４％）。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型は、ＨＢｅＡｇステータスによれば異なっていなかった。主要評価項目は、ＨＢｅＡｇ陽性患者の２７％およびＨＢｅＡｇ陰性患者の６１％で達成された。いずれのグループにおいてもＩＬ２８Ｂ遺伝子型と主要評価項目との間に関連はなかった。さらに、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に係るＨＢｅＡｇ損失単独、ＨＢｓＡｇ損失、ＡＬＴ正規化、またはオントリートメントのＨＢＶ  ＤＮＡレベルにおいて差はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Dienstag J.L.、Hepatitis B Virus Infection.、N. Engl. J. Med. 2008；359：1486〜1500
【非特許文献２】ＷＨＯファクトシート第２０４号；２００８年８月改訂
【非特許文献３】Muller U.、Steinhoff U.、Reis L.F.ら、Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense、Science 1994；264：1918〜21
【非特許文献４】Marcellin P.、Lau G.K.、Bonino F.ら、Peginterferon alfa-2a alone, lamivudine alone, and the two in combination in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B、N. Engl. J. Med. 2004；351：1206〜17
【非特許文献５】Lau G.K.、Piratvisuth T.、Luo K.X.ら、Peginterferon Alfa-2a, Lamivudine, and the Combination for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B、N. Engl. J. Med. 2005；352：2682〜95
【非特許文献６】Li W.C.、Wang M.R.、Kong L.B.ら、Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion：a meta-analysis of controlled clinical trials、BMC Infect. Dis. 2011；11：165〜177
【非特許文献７】Liaw Y.F.、Jia J.D.、Chan H.L.ら、Shorter durations and lower doses of peginterferon alfa-2a are associated with inferior hepatitis B e antigen seroconversion rates in hepatitis B virus genotypes B or C、Hepatology 2011；54：1591〜9
【非特許文献８】Kamatani Y.、Wattanapokayakit S.、Ochi H.ら、A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians. Nat. Genet. 2009；41：591〜595
【非特許文献９】Li W.C.、Wang M.R.、Kong L.B.ら、Peginterferon alpha-based therapy for chronic hepatitis B focusing on HBsAg clearance or seroconversion:a meta-analysis of controlled clinical trials、BMC Infect. Dis. 2011；11：165〜177
【非特許文献１０】Ge D.、Fellay J.、Thompson A.J.ら、Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance、Nature 2009；461：399-401
【非特許文献１１】Tanaka Y.、Nishida N.、Sugiyama M.ら、Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C、Nat. Genet. 2009；41：1105〜9
【非特許文献１２】Suppiah V.、Moldovan M.、Ahlenstiel G.ら、IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy、Nat. Genet. 2009；41：1100〜4
【非特許文献１３】Lampertico P.、Vigano M.、Cheroni C.ら、Genetic variation in IL28B polymorphism may predict HBsAg clearance in genotype D, HBeAg negative patients treated with interferon alfa、AASLD 2010
【非特許文献１４】Mangia A.、Santoro R.、Mottolaら、Lack of association between IL28B variants and HBsAg clearance after interferon treatment、EASL 2011
【非特許文献１５】de Niet A.、Takkenberg R.B.、Benayed R.ら、Genetic variation in IL28B and treatment outcome in HBeAg-positive and -negative chronic hepatitis B patients treated with Peg interferon alfa-2a and adefovir、Scand. J. Gastroenterol. 2012、47：475〜81
【非特許文献１６】Sonneveld M.J.、Wong V.W.、Woltman A.M.ら、Polymorphisms near IL28B and serologic response to peginterferon in HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B、Gastroenterology 2012；142：513〜520
【非特許文献１７】Holmesら、IL28B genotype is not useful for predicting treatment outcome in Asian chronic hepatitis B patients treated with pegylated interferon-alpha、J. Gastroenterol. Hepatol.、2013、28(5)：861〜6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ペグ−ＩＦＮで治療された明確な臨床転帰を有するＣＨＢ患者で全血サンプル収集して、どのように宿主遺伝因子が治療応答およびＨＢＶ疾患の生物学に影響を与えるかを機構的に理解することが、ペグ−ＩＦＮ治療に応答する可能性が高い患者を同定する将来的な臨床診察、さらに新しいＨＢＶ薬の開発にとって大いに有益となることは十分正当性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、インターフェロンなどの抗ＨＢＶ剤での抗ＨＢＶ治療に応答すると予想される患者を同定するための方法を提供する。
【００１４】
本発明の一実施態様は、インターフェロンを含む抗ＨＢＶ療法での治療によって利益を得る可能性がある患者を同定する方法であって、患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定することを含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療での治療によって利益を得る可能性があることを指摘する、上記方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様は、ＨＢＶ感染に罹った患者のインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療での治療に対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定することを含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療での治療に応答性を有する可能性がより高いことを指摘する、上記方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる別の実施態様は、ＨＢＶ感染を有する患者がインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療による利益を示すと予想される見込みを決定するための方法であって、患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定することを含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療による利益の見込みの増加を有することを指摘する、上記方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる別の実施態様は、インターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療の治療効果を最適化するための方法であって、患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を決定することを含み、ここでｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在は、患者が、抗ＨＢＶ治療による利益の見込みの増加を有することを指摘する、上記方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様は、患者においてＨＢＶ感染を治療するための方法であって、（ｉ）患者から得られたサンプル中で、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中のｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子の存在を決定すること、および（ｉｉ）前記患者にインターフェロンを含む抗ＨＢＶ治療の有効量を投与することによって、ＨＢＶ感染を治療することを含む、上記方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の実施態様は、インターフェロン治療に対するＨＢＶに感染した患者の２４週以上の治療追跡調査におけるＳ−損失（応答者対不応答者）を予測するための方法であって、（ｉ）前記ヒト患者からのサンプルを提供すること、第１染色体における遺伝子ＦＣＥＲ１Ａ中の単一ヌクレオチド多型の存在を検出すること、および（ｉｉ）前記患者が、ｒｓ７５４９７８５における少なくとも１つのＡ対立遺伝子が存在する場合、２４週以上の治療追跡調査におけるＳ−損失（応答者対不応答者）として測定されるインターフェロン治療に対して高い応答率を有することを決定することを含む、上記方法を提供する。
【００２０】
一部の実施態様において、インターフェロンは、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａおよびインターフェロンアルファ−２ｂの群から選択される。
【００２１】
一部の実施態様において、インターフェロンはペグインターフェロンアルファ−２ａコンジュゲートであり、式：
【００２２】
【化１】
2018519839.tif 000002
【００２３】
（式中、ＲおよびＲ’はメチルであり、ＸはＮＨであり、ｎおよびｎ’は個々にまたは両方とも、４２０または５２０のいずれかである）
を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＧＷＡＳマーカーセットにおける染色体ごとのマーカーの数の棒グラフである。９２６，４５３個のマーカーのうち１，００７個のマーカーは、ゲノム配置が不明のためプロットされなかった。
【図２】図２は、祖先分析のためのスクリープロットである。
【図３】図３は、ＨａｐＭａｐ個体のみに関する第１の２つの祖先主成分である。集団コードは、表３に列挙された通りである。
【図４】図４は、ＨａｐＭａｐ個体に関する第１の２つの祖先主成分であり、集団グループに従って色付けされた（表３）。ＰＧｘ−ＣＮ−最終に取り入れられると予想される患者（黒色の十字）およびＰＧｘ−ｎｏｎ−ＣＮ−最終に取り入れられると予想される患者（灰色の十字）を上に重ねる。
【図５】図５は、評価項目2についてのマンハッタンプロットである。
【図６】図６は、評価項目2についてのＱＱプロットである。
【図７】図７は、評価項目２についてのマンハッタンプロットである。
【図８】図８は、評価項目２についてのＱＱプロットである。
【図９】図９は、評価項目３についてのマンハッタンプロットである。
【図１０】図１０は、評価項目３についてのＱＱプロットである。
【図１１】図１１は、評価項目４についてのマンハッタンプロットである。
【図１２】図１２は、評価項目４についてのＱＱプロットである。
【図１３】図１３は、評価項目５についてのマンハッタンプロットである。
【図１４】図１４は、評価項目５についてのＱＱプロットである。
【図１５】図１５は、評価項目６についてのマンハッタンプロットである。
【図１６】図１６は、評価項目６についてのＱＱプロットである。
【図１７】図１７は、ＦＣＥＲ１Ａにおけるマーカーに加えて１０ｋｂフランキング配列についての、加法モデル下における単変量関連プロットである。
【図１８】図１８は、ＦＣＥＲ１Ａにおけるマーカーの単変量連鎖不平衡（Ｄ’）分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書で定義された用語は、本発明に関連する分野において通常の技術を有する者が一般的に理解しているのと同等の意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」などの用語は、単数形の物体のみを指すのではなく、例示のためにその具体例が使用される場合がある一般的クラスを包含することが意図される。本明細書における用語は、本発明の具体的な実施態様を説明するのに使用されるが、特許請求の範囲で概説される場合を除き、それらの使用は本発明の範囲を定めない。
【００２６】
用語「サンプル」または「生体サンプル」は、個体から単離した組織または流体のサンプルを指し、例えば、これらに限定されないが、組織生検、血漿、血清、全血、脊髄液、リンパ液、皮膚の外側の部分、気道、腸管および尿生殖路、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、臓器などが挙げられる。さらに、インビトロにおける細胞培養成分（これらに限定されないが、培養培地中での細胞の成長により生じる馴化培地、ウイルスに感染したと推定される細胞、組換え細胞、および細胞要素など）のサンプルも挙げられる。
【００２７】
用語「インターフェロン」および「インターフェロン−アルファ」は、本明細書で同義的に使用され、ウイルス複製および細胞増殖を阻害し、免疫応答をモジュレートする高度に相同な種特異的なタンパク質のファミリーを指す。典型的な好適なインターフェロンとしては、これらに限定されないが、組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、例えばシエーリング社（Schering Corporation、ニュージャージー州ケニルワース）より入手可能なイントロン（Intron）（登録商標）Ａインターフェロン、組換えインターフェロンアルファ−２ａ、例えばホフマン−ラロシュ（Hoffmann-La Roche、ニュージャージー州ナトリー）より入手可能なロフェロン（Roferon）（登録商標）−Ａインターフェロン、組換えインターフェロンアルファ−２Ｃ、例えばベーリンガーインゲルハイムファーマシューティカル社（Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc.、コネチカット州リッジフィールド）より入手可能なベロフォー（Berofor）（登録商標）アルファ２インターフェロン、インターフェロンアルファ−ｎ１、天然型アルファインターフェロンの精製ブレンド、例えば住友製薬（Sumitomo、日本）より入手可能なスミフェロン（Sumiferon）（登録商標）またはグラクソ−ウェルカム社（Glaxo-Wellcome Ltd.、英国ロンドン）より入手可能なウェルフェロン（Wellferon）（登録商標）インターフェロンアルファ−ｎ１（ＩＮＳ）、またはコンセンサスアルファインターフェロン、例えば米国特許第４，８９７，４７１号および４，６９５，６２３号（特にそれらの実施例７、８または９）で説明されるもの、およびアムジェン社（Amgen, Inc.、カリフォルニア州ニューベリーパーク）より入手可能な特定の製品、またはすなわちインターフェロンサイエンス（Interferon Sciences）によって製造された、およびパーデュー・フレデリック社（Purdue Frederick Co.、コネチカット州ノーウォーク）よりアルフェロン（Alferon）という商品名で入手可能な、天然型アルファインターフェロンの混合物であるインターフェロンアルファ−ｎ３が挙げられる。インターフェロンアルファ−２ａまたはアルファ−２ｂの使用が好ましい。インターフェロンとしては、以下で定義されるようなペグ化インターフェロンを挙げることができる。
【００２８】
用語「ペグ化インターフェロン」、「ペグ化インターフェロンアルファ」および「ペグインターフェロン」は、本明細書で同義的に使用され、インターフェロンアルファ、好ましくはインターフェロンアルファ−２ａおよびアルファ−２ｂのポリエチレングリコールで改変されたコンジュゲートを意味する。典型的な好適なペグ化インターフェロンアルファとしては、これらに限定されないが、ペガシス（Pegasys）（登録商標）およびペグ−イントロン（Peg-Intron）（登録商標）が挙げられる。
【００２９】
用語「対立遺伝子」および「対立遺伝子バリアント」は、本明細書で使用される場合、イントロン、エクソン、イントロン／エクソンジャンクション、ならびに遺伝子もしくはその部分と結合した３’および／もしくは５’非翻訳領域を包含する遺伝子の対になった形態を指す。一般的に、対立遺伝子は、相同な染色体上の同じ遺伝子座または位置を占有する。対象が遺伝子の２つの同一な対立遺伝子を有する場合、その対象は、その遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合型といわれる。対象が遺伝子の２種の異なる対立遺伝子を有する場合、その対象は、その遺伝子に関してヘテロ接合型といわれる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドにおいて互いに異なっている場合があり、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を包含し得る。
【００３０】
用語「多型」は、本明細書で使用される場合、エクソンおよびイントロンを包含する核酸、またはそれらの部分（例えば、対立遺伝子バリアント）の１つより多くの形態が共存することを指す。少なくとも２種の異なる形態、すなわち２種の異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の部分は、遺伝子の多型領域と称される。多型領域は、単一のヌクレオチド、すなわち「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」であってもよく、その同一性は異なる対立遺伝子で異なる。また多型領域は、数個のヌクレオチド長さであってもよい。
【００３１】
多型検出のための多数の方法が公知であり、本発明と共に使用することができる。一般的に、これらは、直接的（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション）または間接的（二次分子、例えば、タンパク質配列またはタンパク質結合への変化の同定）のいずれかで、基礎となる核酸配列中の１つまたはそれより多くの突然変異を同定することを包含する。
【００３２】
多型を検出するための１つの周知の方法は、突然変異または多型部位とオーバーラップし、突然変異または多型領域周辺に約５、１０、２０、２５、または３０ヌクレオチドを有するプローブを使用する、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションである。キットで使用する場合、例えば、対立遺伝子バリアント、例えば単一ヌクレオチド多型に特異的にハイブリダイズすることが可能な数種のプローブが使用者に提供されるか、または固相支持体、例えばビーズまたはチップにさらに結合される。
【００３３】
単一ヌクレオチド多型である「ｒｓ７５４９７８５」は、ＳＮＰのデータベースにおいてその受託番号によって識別されるＳＮＰを指し（dbSNP、www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）、ヒト第１染色体においてＦＣＥＲ１Ａ遺伝子中に配置されている。ＦＣＥＲ１Ａは、免疫グロブリンイプシロン（ＩｇＥ）Ｆｃ受容体サブユニットアルファをコードする。ＩｇＥ受容体は、アレルギー性応答のイニシエーターである。２つまたはそれより多くの高親和性ＩｇＥ受容体がアレルゲンに結合したＩｇＥ分子によって一緒になると、ヒスタミンなどの媒介物質が放出される。この遺伝子によってコードされたタンパク質は、受容体のアルファサブユニットを表す。
【００３４】
【表１−１】
2018519839.tif 000003
【実施例】
【００３５】
目的および評価項目
目的は、慢性Ｂ型肝炎を有する患者におけるペガシスを含有するレジメンでの治療に対する応答に関連する遺伝学的バリアントを決定することであった。
【００３６】
以下の評価項目を、患者グループごとに考慮した。
以下の評価項目を考慮した：
１．  ＨＢｅ陽性患者：２４週以上の追跡調査におけるＥ−セロコンバージョンまたはＳ−損失
２．  ＨＢｅ陽性患者：２４週以上の追跡調査における（Ｅ−セロコンバージョン＋ＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌ）またはＳ−損失
３．  ＨＢｅ陰性患者：２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失
４．  ＨＢｅ陽性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＥ−セロコンバージョンまたはＳ−損失、およびＨＢｅ陰性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失（１および３）
５．  ＨＢｅ陽性の場合、２４週以上の追跡調査における（Ｅ−セロコンバージョン＋ＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌ）またはＳ−損失、およびＨＢｅ陰性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失（２および３）
６．  ２４週以上の追跡調査におけるＳ−損失。
【００３７】
全ての評価項目および全てのマーカーに関して、遺伝子型と評価項目との間の関連がないという帰無仮説を、関連が存在するという両側対立仮説に対して試験した。
研究設計
会社主催の臨床試験からのデータ、および一般的な診療における患者からのデータからの累積メタ分析は、進行中である。組み合わされたデータは、最終的な分析において、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体有りまたは無しで、少なくとも２４週間ペガシスで処置された最大１６６９人の患者を含むものとなり、２４週間の追跡調査データが利用可能である。
【００３８】
以下の試験／患者源が、組み入れに考慮された：
・ＲＧＴ（ＭＬ２２２６６）
・Ｓ−コレート（S-Collate）（ＭＶ２２００９）
・ＳｏＮ（ＭＶ２２４３０）
・スイッチ（Switch）（ＭＬ２２２６５）
・組合せ（Combo）
・新しいスイッチ（New Switch）（ＭＬ２７９２８）
・必要性（NEED）
・ＰＥＧ．Ｂｅ．リバー（PEG.Be.Liver）のイタリア人のコホート
・Teerha教授（タイ）：臨床診察患者および一部のレガシー（legacy）Ｐｈ３患者
・Hongfei Zhang教授（中国北京）：臨床診察患者および一部のレガシーＰｈ３患者
・Yao Xie教授（中国北京）：臨床診察患者
・Xin Yue Chen教授（中国北京）：臨床診察患者。
【００３９】
慢性Ｂ型肝炎を有する成人患者（男性または女性患者≧１８歳）は、研究への組み入れのために以下の基準を満たしていなければならない：
・以前にロシュの研究に登録されており、慢性Ｂ型肝炎に関して、少なくとも２４週間、ペグ−ＩＦＮ±ヌクレオシド類似体（ラミブジンまたはエンテカビル（entacavir））またはペグ−ＩＦＮ±ヌクレオチド類似体（アデホビル）で治療され、処置後２４週以上追跡調査されていること、または；
・一般的な診察で慢性Ｂ型肝炎に関して、標準的治療に従ってペグ−ＩＦＮで治療された者、さらに、現行の製品特徴概要（ＳＰＣ）／ローカルラベルに賛同して、ローカルラベルによるペグ−ＩＦＮ療法に対する禁忌を有さず、少なくとも２４週間、ペグ−ＩＦＮで治療されており、採血時間に利用可能な２４週以上の処置後応答を有する者であること、
・患者がＨＡＶ、ＨＣＶ、またはＨＩＶに感染していないこと
・患者が、以下の入手可能な医療記録（病歴／継続的な研究データベースまたは医療的診察ノートのいずれかからの）：
・人口統計（例えば年齢、性別、民族学的な起源）
・療法前のＨＢｅＡｇステータス、公知のまたは未知のＨＢＶ遺伝子型
・経時的なＰＣＲ試験によるＩＵ／ｍｌでのＨＢＶ  ＤＮＡ量（例えばベースライン、オントリートメント：１２および２４週、処置後：２４週）
・定量的なＨＢｓＡｇ試験（入手できない場合、定性的なＨＢｓＡｇ試験）および経時的な抗ＨＢｓ（例えばベースライン、オントリートメント：１２および２４週、処置後：２４週）
・経時的な血清ＡＬＴ（例えばベースライン、オントリートメント：１２および２４週、処置後：２４週）
を有すると予想されること。
全ての患者は積極的なレジメンを受けたと予想されることに留意されたい。
【００４０】
分析集団
患者の大部分は、中国からの患者になる。
統計的分析の目的のために、４つの分析集団を、以下のように定義した：
・ＰＧｘ−ＦＡＳは、少なくとも１つの遺伝子型を有する全ての患者であり、
・ＰＧｘ−ＧＴは、遺伝学的データが品質検査に合格したＰＧｘ−ＦＡＳのサブセットであり、
・ＰＧｘ−ＣＮは、それらがＨａｐＭａｐバージョン３からのＣＨＢおよびＣＨＤ参照対象とクラスターを形成するという意味で、共通の遺伝的背景を有するＰＧｘ−ＧＴのサブセットであり（以下を参照）、
・ＰＧｘ−ｎｏｎ−ＣＮは、ＰＧｘ−ＣＮに当てはまらないＰＧｘ−ＧＴの残りである。
追加の接尾辞（suffices）が、ＨＢｅ陽性およびＨＢｅ陰性サブセットそれぞれに対してＨＢｅＰｏｓまたはＨＢｅＮｅｇとして、さらに分析のステージに従って中間１・・・中間３、および最終として追記される。
【００４１】
遺伝子マーカー
ＧＷＡＳマーカーパネルは、７５０，０００種より多くのＳＮＰマーカーおよび２５０，０００種より多くのエクソンマーカーからなるイルミナ・オムニエクスプレス・エキソーム（Illumina OmniExpress Exome）マイクロアレイ（www.illumina.com）であった。品質検査に合格したマーカーのグループを、ＧＷＡＳマーカーセットと称する。
【００４２】
データ分析に関する一般的な考察
ＧＷＡＳは、仮説なしである。未調整のｐ＜５×１０−８を有するマーカーを、ゲノムワイドで有意とみなした。統計学的検出力のために、複数の評価項目または複数回の分析ごとの調整を行わなかった。
【００４３】
以下の表１は、ＰＧｘ−ＦＡＳ−中間１における１３７人の患者、現行のＰＧｘ−ＦＡＳ−中間２における６５３人の患者、およびＰＧｘ−ＦＡＳ−最終における１６６９人の患者のベースラインおよび人口統計特徴の概要を示す。追加された患者は、しばしば男性であり、「東洋人」と自己報告する可能性はかなり低いが、現在「アジア人」と自己報告するパーセンテージが大幅に増加している。彼らは、より低いベースラインＡＬＴの中央値を有する。
【００４４】
【表１−２】
2018519839.tif 000004
【００４５】
患者による品質検査
あらゆる自己報告された人種（ＰＧｘ−ＦＡＳ−最終）の全１６６９人の患者において、未処理のＧＷＡＳデータに基づき、以下の基準を評価した。
・＜５％の遺伝子型データの損失
・＜３０％のゲノムワイドでのヘテロ接合性
・＜３０％の別のサンプルとの遺伝子型一致
・Ｘ染色体データと一致する報告された性別
・＜３０％の別のサンプルとの遺伝子型一致。
【００４６】
全てのサンプルが、＜３０％のゲノムワイドでのヘテロ接合性の基準を満たした。４つのサンプルが、５％またはそれより高い失われた遺伝子型を有していた。６つのサンプルが、報告された性別と一致するＸ染色体のホモ接合性レベルを示した。これら１０個全てが除外された。さらなる２３個のサンプル対が１親等に一致する高い遺伝子型一致を示し、各対の一方が除外された。
【００４７】
この方式で、３３人の患者をさらなる分析から除外した。以下の表２に、それらの詳細を示す。遺伝学的データが上記の基準を満たす残りの１６３６人の患者は、ＰＧｘ−ＧＴ−最終セットに組み入れられた。
【００４８】
【表２】
2018519839.tif 000005
【００４９】
マーカーによる品質検査
マーカーをデータの損失に関して評価した。５％より多くのデータの損失を示す者をさらなる分析から除外した。
全体で＜５％の損失を示す合計９２６，４５３個のマーカーをＧＷＡＳマーカーセットに組み入れた。図１に、それらの染色体による分布を示す。
【００５０】
祖先の多変量分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、データセットの次元数を低減させるための技術である。これは、変数のセットを、元のセットにおける情報のほとんどを表す無相関な変数のより小さいセットに直線的に変換する（Dunteman、1989）。現在の研究において、マーカー変数は、自己報告された民族の分類と比較した主成分に変換されている。目的は、関連を試験するための準備として、同種の遺伝的背景を共有する個体のクラスターを決定することである。
【００５１】
祖先分析のための１３４，５７５個のマーカーの好適なセットを、中間分析１の統計報告で説明したようにして得た。このセットのうち、１３１，９７４個は、現行のデータにおいて少なくとも５％の頻度を有していた。それゆえに１３１，９７４個のマーカーを使用してＰＣＡを適用し、１６３６人の研究個体および９８８人のＨａｐＭａｐ参照個体にわたり遺伝子型解析した（表３）。
【００５２】
【表３】
2018519839.tif 000006
【００５３】
図２は、固有値のスクリープロットを示す。情報の大部分が第１の２つの祖先主成分から得られ、それに続く成分からの情報の獲得はほとんどないことは明かである。
図３は、ＨａｐＭａｐ参照データのみに関するＰＣＡの結果を示す。この二次元表示では、４つのクラスターが認識できる。左上から時計回りに読めば、彼らは、東南アジア人（黄色／青色／緑色）、メキシコ人（深緑色）および南アジア人の血統（灰色）、および北欧および西欧人（青色／赤色）およびアフリカ人の血統（青色／オレンジ色／ピンク色／栗色）である。
【００５４】
図４は、研究参加者を十字として上に重ねた同じデータを示す。ＰＧｘ−ＣＮ−最終に組み入れられた患者は、黒色の十字で示され、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終に組み入れられた患者は、灰色の十字で示される。以前の中間分析で観察された通り、ＰＧｘ−ＣＮ−最終の研究参加者は、参照セットより遺伝学的に多様な個体グループを表す。研究参加者は、東南アジアの異なる国々から抽出された可能性が高い。
【００５５】
それゆえに、遺伝学的分析の目的のために、ＰＧｘ−ＣＮ−最終を、中国人および日本人参照個体周辺のクラスター中に当てはまる１１２０人の患者で構成した。プロットされた祖先が明らかにそのクラスターから離れている合計５１６人の患者が、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終を構成した。
【００５６】
以下の表４に、各分析の患者数を示す。評価項目は、以下のように番号付けされる：
１．  ＨＢｅ陽性患者：２４週以上の追跡調査におけるＥ−セロコンバージョンまたはＳ−損失
２．  ＨＢｅ陽性患者：２４週以上の追跡調査における（Ｅ−セロコンバージョン＋ＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌ）またはＳ−損失
３．  ＨＢｅ陰性患者：２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失
４．  ＨＢｅ陽性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＥ−セロコンバージョンまたはＳ−損失、およびＨＢｅ陰性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失（１および３）
５．  ＨＢｅ陽性の場合、２４週以上の追跡調査における（Ｅ−セロコンバージョン＋ＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌ）またはＳ−損失、およびＨＢｅ陰性の場合、２４週以上の追跡調査におけるＨＢＶ  ＤＮＡ＜２０００ＩＵ／ｍｌまたはＳ−損失（２および３）
６．  ２４週以上の追跡調査におけるＳ−損失。
【００５７】
６１人の患者がＨＢｅデータを有していなかったことから、彼らに関して評価項目１〜５を決定できなかったことに留意されたい。さらに、分析のうち３つは、患者が３０人未満の少なくとも１つのグループを含有することから、情報を与ることが期待できなかった。全ての分析は、遺伝の加法モデル下で、および遺伝の優性形式下で２回実行された。
【００５８】
【表４】
2018519839.tif 000007
【００５９】
共変量の評価
ゲノムワイド関連分析に関する共変量を決定するために、一連の変数を、後退ステップワイズ回帰を使用して各評価項目との関連に関して試験した。それぞれのケースにおいて、フルモデルは以下の変数を含有していた：
・年齢
・性別
・Ｌｏｇ（ベースラインＨＢＶ  ＤＮＡ）
・Ｌｏｇ（ＡＬＴ）
・遺伝子型
・付随するヌクレオチド／ヌクレオシド類似体（ＮＡ／Ｎｔａ）
・研究
・第１の祖先主成分
・第２の祖先主成分。
【００６０】
後退ステップを赤池情報量規準（ＡＩＣ）に基づき採用し、共変量を、患者セットおよび評価項目の組合せごとに別々に選択した。ＨＢｅステータスで層別化されていない評価項目６についてのＰＧｘ−ＧＴ−最終の分析において、推定の東南アジア人祖先に関する指標変数をインポーズした。全ての例において研究ごとの調整を適用した。
【００６１】
まれなおよびまれではないマーカー
対立遺伝子頻度は民族ごとに様々であることが公知である。目的とする３つの主要なグループにＧＷＡＳ分析を実行するために、対立遺伝子頻度を、ＰＧｘ−ＣＮ−最終、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終、およびＰＧｘ−ＧＴ−最終ごとに別々に推測した。サンプルサイズの差のために、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終には５％（ｎ＝５１６）、ＰＧｘ−ＣＮ−最終には２％（ｎ＝１１２０）、およびＰＧｘ−ＧＴ−最終には１．５％（ｎ＝１６３６）の頻度閾値を使用して、マーカーをまれなまたはまれではないとして分類した。この方式において、ゲノムワイド関連分析に利用可能なそれぞれ６０５８９８、５８９２５４および６５１７９７個のまれではないマーカーが存在した。
【００６２】
単変量関連分析
方法
以下のような２つの方法でマーカーをコード化した。まず第一に、それらを、マイナー対立遺伝子の数によって与えられる加法モデルに従ってコード化した。第２に、それらを、マイナー対立遺伝子の運搬に基づく遺伝の優性モデルに従ってコード化した。
【００６３】
３つの患者セットおよび６つの評価項目により、それぞれ２つの遺伝形式下で３６回の関連分析を実行した。以下のモデルを、多変量ロジスティック回帰を使用して当てはめた：
評価項目＝切片＋［共変量］＋マーカー。
共変量を、上記で選択されたようにして適用した（セクション８．４）。
【００６４】
各マーカーの有意性を、ｔ検定を使用して決定した。ＧＷＡＳ分析それぞれにつきゲノム対照ラムダを計算し、ＱＱ−プロットを検査したが、検定統計量のインフレーションの明確な証拠は見出されなかった（DevlinおよびRoeder、1999）。最大のラムダは１．０５であった。
【００６５】
全てのマーカーを、ＰＧｘ−ＧＴ−最終、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終およびＰＧｘ−ＣＮ−最終におけるハーディ−ワインベルク平衡（ＨＷＥ）からの逸脱に関して、カイ二乗検定を使用して試験した。関連分析出力の解釈を補助するために、その結果を使用した。以下の表形式の結果において、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）とハーディ−ワインベルグの結果の両方を、関連する祖先によって定義された患者グループごとに示す。
【００６６】
評価項目１に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型
・ＰＧｘ−ＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、性別、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ
・ＰＧｘ−ＧＴ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、性別、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ。
【００６７】
図５および６は、それぞれ評価項目2に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。第１の２つのＱＱ−ロットは、４５度のラインを超えた偏差を示し、これは、ＰＧｘ−ＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終単独で偶然に期待値より低いｐ値が存在することを示す。
【００６８】
ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終に関するＱＱ−プロットはどちらも４５度のライン未満であり、これは、低下した統計学的検出力を示し、最終の２つのマンハッタンプロットは、それに応じて平坦である。特筆すべきことに、これらの最後の２つの分析に存在した応答者は２１人のみであった。
【００６９】
表５〜８に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。どちらの遺伝形式下においてもＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終でｐ＜１０−５を示すマーカーはなかった。
【００７０】
【表５】
2018519839.tif 000008
【００７１】
【表６】
2018519839.tif 000009
【００７２】
【表７】
2018519839.tif 000010
【００７３】
【表８】
2018519839.tif 000011
【００７４】
評価項目２に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型
・ＰＧｘ−ＣＮ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、年齢、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ
・ＰＧｘ−ＧＴ−ＨＢｅＰｏｓ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、年齢、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ。
【００７５】
図７および８は、それぞれ評価項目２に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。表９〜１２に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。どちらの遺伝形式下においてもＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＮｅｇ−最終でｐ＜１０−５を示すマーカーはなかった。特筆すべきことに、応答者は１８人のみであり、ＱＱ−プロットは下方にカーブしたことがわかり、マンハッタンプロットは下に下がっていた。
【００７６】
【表９】
2018519839.tif 000012
【００７７】
【表１０】
2018519839.tif 000013
【００７８】
【表１１】
2018519839.tif 000014
【００７９】
【表１２】
2018519839.tif 000015
【００８０】
評価項目３に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＮｅｇ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）
・ＰＧｘ−ＣＮ−ＨＢｅＮｅｇ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、第２のＰＣ、研究
・ＰＧｘ−ＧＴ−ＨＢｅＮｅｇ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、ＰＣ１、ＰＣ２。
【００８１】
図９および１０は、それぞれ評価項目３に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。表１３〜１８に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。特筆すべきことに、低下した統計学的検出力の証拠がいくつかあるにもかかわらず、第１染色体における単一のマーカーは、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−ＨＢｅＮｅｇ−最終において、両方の遺伝形式に関してｐ＜１０−６を示した。
【００８２】
【表１３】
2018519839.tif 000016
【００８３】
【表１４】
2018519839.tif 000017
【００８４】
【表１５】
2018519839.tif 000018
【００８５】
【表１６】
2018519839.tif 000019
【００８６】
【表１７】
2018519839.tif 000020
【００８７】
【表１８】
2018519839.tif 000021
【００８８】
評価項目４に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型
・ＰＧｘ−ＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ
・ＰＧｘ−ＧＴ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ、ＰＣ１。
【００８９】
図１１および１２は、それぞれ評価項目４に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。表１９〜２４に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。
【００９０】
【表１９】
2018519839.tif 000022
【００９１】
【表２０】
2018519839.tif 000023
【００９２】
【表２１】
2018519839.tif 000024
【００９３】
【表２２】
2018519839.tif 000025
【００９４】
【表２３】
2018519839.tif 000026
【００９５】
【表２４】
2018519839.tif 000027
【００９６】
評価項目５に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型
・ＰＧｘ−ＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ
・ＰＧｘ−ＧＴ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、研究、付随するＮＡ／Ｎｔａ、ＰＣ１
図１３および１４は、それぞれ評価項目５に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。表２５〜３０に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。加法モデル下で、ＣＥＮＰＯ（動原体タンパク質Ｏ）に非同義的変化を有する示唆的関連（ｐ＝８．０５ｅ−０６）がＰＧｘ−ＣＮ−最終で観察された。
【００９７】
【表２５】
2018519839.tif 000028
【００９８】
【表２６】
2018519839.tif 000029
【００９９】
【表２７】
2018519839.tif 000030
【０１００】
【表２８】
2018519839.tif 000031
【０１０１】
【表２９】
2018519839.tif 000032
【０１０２】
【表３０】
2018519839.tif 000033
【０１０３】
評価項目６に関する結果
共変量は以下の通りであった：
・ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型
・ＰＧｘ−ＣＮ−最終：Ｌｏｇ（ＨＢＶ）、遺伝子型、付随するＮＡ／Ｎｔａ、ＰＣ１
・ＰＧｘ−ＧＴ−最終：Ｌｏｇ（ＡＬＴ）、遺伝子型、付随するＮＡ／Ｎｔａ、ＣＮ。
【０１０４】
図１５および１６は、それぞれ評価項目６に関するマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを示す。表３１〜３６に、ｐ＜１０−５を示すマーカーの詳細を示す。ＦＣＥＲ１Ａ（ＩｇＥのＦｃフラグメント、アルファポリペプチドの高親和性Ｉ受容体）の３’ＵＴＲ中の第１染色体における単一のマーカーは、ＰＧｘ−ＣＮ−最終に関してｐ＜１０−６および決定的な結果を示した。
【０１０５】
【表３１】
2018519839.tif 000034
【０１０６】
【表３２】
2018519839.tif 000035
【０１０７】
【表３３】
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【０１０８】
【表３４】
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【０１０９】
【表３５】
2018519839.tif 000038
【０１１０】
【表３６】
2018519839.tif 000039
【０１１１】
解釈
全ての評価項目を用いた関連分析においてゲノムワイドでの有意性（ｐ＜５×１０−８）を達成したマーカーはなかったが、１０個の関連がｐ＜１×１０−６を超えていた。
【０１１２】
示唆的関連の大部分は遺伝子間領域に存在するが、２７個のマーカーは２４個の遺伝子の境界内にマッピングされた。以下の表３７に、それらを列挙する。
強調された遺伝子の一部は、Ｂ型肝炎関連の肝細胞癌のメカニズムにおいて、直接的または間接的のいずれかで関与していた。例えば、フォン−ウィルブランド因子（ＶＦＷ）は、Ｂ型肝炎ウイルス関連のヒト肝細胞癌における腫瘍成長の公開されたバイオマーカーである（Liuら、2014）。また、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質も、肝癌細胞の増殖および移動を媒介するためのＬＡＳＰ１発現の調節において役割を果たすことが示されている（Tangら、2012）。表形式の単一の非同義的変化はＣＥＮＰＯにある。肝癌細胞において、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質突然変異体がＣＥＮＰ−Ａ発現を上方調節することが特筆されている（Liuら、2012）。
【０１１３】
【表３７−１】
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【０１１４】
【表３７−２】
2018519839.tif 000041
【０１１５】
まれなおよびまれではないバリアントの組み合わされた分析
方法
統計学的検出力は大きく対立遺伝子頻度の影響を受けることが公知であるため、新規の方法は、まれなバリアントの分析のために出現したものである。「破壊（collapsing）」または「凝集（aggregate）」方法は、遺伝子座全体におけるまれな対立遺伝子の累積との関連に関して試験することを可能にする。ゲノムワイドでのマーカーセットに注釈を付けて遺伝子ベースのセットを定義し、配列カーネル関連試験（ＳＫＡＴ）を適用して、遺伝子ごとの共通のバリアントとまれなバリアント両方の共同分析を可能にした（Wuら、2011；Ionita-Lazaら、2013）。
【０１１６】
少なくとも示唆的な有意性（ｐ＜１０−５）を示す遺伝子を列挙した表を作成した。
評価項目１に関する結果
評価項目１に関して、ｐ＜１０−５を示す遺伝子同定した分析はなかった。
【０１１７】
評価項目２に関する結果
評価項目2に関して、ｐ＜１０−５を示す遺伝子同定した分析はなかった。
評価項目３に関する結果
２つの遺伝子、すなわちＬＯＣ１００５０６６８６およびＣ１５ｏｒｆ６１は、ＰＧｘ−ＧＴ−最終においてｐ＜１０−５を示したが、各発見は、単一の共通マーカーにのみ基づくものであった。
【０１１８】
【表３８】
2018519839.tif 000042
【０１１９】
評価項目４に関する結果
評価項目４に関して、ｐ＜１０−５を示す遺伝子同定した分析はなかった。
評価項目５に関する結果
１つの遺伝子がＰＧｘ−ＣＮ−最終においてｐ＜１０−５を示したが、結果に寄与するまれなマーカーはなかった。これは、上述した発見を裏付けるものである。
【０１２０】
【表３９】
2018519839.tif 000043
【０１２１】
評価項目６に関する結果
１つの遺伝子、ＦＣＥＲ１Ａは、ＰＧｘ−ＣＮ−最終においてｐ＜１０−５を示した。ここでもこれは、上述した発見を裏付けているが、その遺伝子における全てのマーカーの共同分析は、この時点で関連はゲノムワイドでの有意性に関する閾値を超えていることを意味する。
【０１２２】
【表４０】
2018519839.tif 000044
【０１２３】
ＦＣＥＲ１Ａの議論
ＦＣＥＲ１Ａは、免疫グロブリンイプシロン（ＩｇＥ）Ｆｃ受容体サブユニットアルファをコードする。ＩｇＥ受容体は、アレルギー性応答のイニシエーターである。２つまたはそれより多くの高親和性ＩｇＥ受容体がアレルゲンに結合したＩｇＥ分子によって一緒になると、ヒスタミンなどの媒介物質が放出される。この遺伝子によってコードされたタンパク質は、受容体のアルファサブユニットを表す。
【０１２４】
Ｓ−損失（評価項目６）とＦＣＥＲ１Ａとの関連は、遺伝子の３’ＵＴＲにおける単一の低頻度マーカーによって生じる。図１７は、関連がフランキングマーカーと共有されていないことを示す。図１８は、問題のマーカー、ｒｓ７５４９７８５が、遺伝子の残部にわたる連鎖不平衡のブロックからはずれていることを示す。
【０１２５】
表４１に示す遺伝子型対応答のクロス集計表を使用して、以下の予備的な推測値：感受性＝２４％；特異性＝９７％；陽性適中率＝２５％；陰性適中率＝９３％を得る。２５％の陽性適中率は、全体的なＳ−損失の割合である７％（８０／１０９５）と比較して３倍強化されたことを表す。独立したデータからの不偏の推測が必要である。
【０１２６】
マーカー、ｒｓ７５４９７８５のマイナー対立遺伝子頻度は低く、ＰＧｘ−ＣＮ−最終では２％であり、ＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終ではそれより高く１５％である。関連は、加法モデル下でｐ＝０．６１４３、優性モデル下でｐ＝０．５５５８を示すＰＧｘ−ｎｏｎＣＮ−最終にはまったくない。全体的な頻度は、遺伝子型頻度がハーディ−ワインベルク平衡からの著しい逸脱を示すＰＧｘ−ＧＴ−最終において、６％である。希釈により、ＰＧｘ−ＧＴ−最終におけるｐ値は、それぞれｐ＝０．０２８１およびｐ＝０．００６５である。関連は、確認される場合、東南アジア人グループにのみ存在する連鎖不平衡現象（１つまたはそれより多くの原因となるバリアントとの）によって生じると予想される。
【０１２７】
【表４１】
2018519839.tif 000045
【０１２８】
ソフトウェア
特注のｐｅｒｌスクリプト（Wallら、1996）を使用して、データを再フォーマットし、祖先分析のためにマーカーを選択し、表を作成した。ＰＬＩＮＫバージョン１．０７（Purcellら、2007）を使用して、遺伝学的ＱＣ分析を実行し、研究データをＨａｐＭａｐデータ、および関連分析と統合した。ＥＩＧＥＮＳＯＦＴ  ４．０（Pattersonら、2006；Priceら、2006）をＰＣＡに使用した。Ｒバージョン２．１５．２（R Core Team、2012）をグラフィック作成に使用した。
【０１２９】
本明細書において開示されたおよび特許請求された組成物および／または方法の全ては、本発明の開示の観点から余計な実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施態様に関して説明してきたが、本発明の概念、本質および範囲から逸脱することなく、組成物および／または方法へ、ならびに本明細書で説明される方法の工程または工程の順序において改変が適用できることは、当業者にとって明らかであると予想される。当業者に明らかなこのような全ての類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本質、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１３０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2018519839.tif 000050
【図５】
2018519839.tif 000051
【図６】
2018519839.tif 000052
【図７】
2018519839.tif 000053
【図８】
2018519839.tif 000054
【図９】
2018519839.tif 000055
【図１０】
2018519839.tif 000056
【図１１】
2018519839.tif 000057
【図１２】
2018519839.tif 000058
【図１３】
2018519839.tif 000059
【図１４】
2018519839.tif 000060
【図１５】
2018519839.tif 000061
【図１６】
2018519839.tif 000062
【図１７】
2018519839.tif 000063
【図１８】
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【国際調査報告】
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