(57)【要約】  本明細書中で提供されるのは、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法において有用な、ハイドロフォビン様タンパク質(HLP)を含む口腔ケア組成物である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法であって、
a) HLP；
b) 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物を歯に適用するステップを含み、ここでHLPは該組成物中に、該組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、前記方法。
【請求項２】
HLPが、配列番号１〜２４に示されるポリペプチド配列、又は配列番号１〜２４に示されるポリペプチド配列から出発して全アミノ酸の5％以下の置換、挿入又は欠失から生じ、且つ出発タンパク質(配列番号１〜２４)の生物学的特性の少なくとも50％を依然として有するポリペプチド配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
HLPがほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記口腔ケア組成物が有効量のフッ化物をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
HLPが、前記組成物中に、該組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％の量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がマウスリンスである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
フッ化物の量が約500ppmのフッ化物である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が歯磨剤である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
歯牙侵食を低減、阻止又は修復するための方法である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
歯の再石灰化を促進するための方法である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
フッ化物の虫歯予防効果を増強するための方法である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
以下：
a) ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されているHLP；
b) 有効量のフッ化物、及び
c) 経口的に許容可能な担体
を含む歯磨剤。
【請求項１３】
歯のエナメル質侵食の修復又は阻止、歯のエナメル質の再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための、
a) HLP；
b) 場合により有効量のフッ化物；
c) 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物であって、HLPが該組成物中に該組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、前記口腔ケア組成物。
【請求項１４】
歯牙侵食の修復又は阻止、歯の再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための、口腔ケア組成物におけるHLP。
【請求項１５】
HLPを含む口腔ケア製品の作製方法であって、以下：
a) 水性バッファー溶液を用いた希釈によりHLP溶液を中和して、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHを有する溶液を得るステップ；
b) a)の溶液生成物を濾過及び遠心分離してHLPを含む濾液を得るステップ；
c) フッ化物及び場合により殺生物剤をb)の濾液生成物に添加するステップ；
d) c)の生成物を経口的に許容可能な担体の成分に混合するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１６】
HLPを含む口腔ケア組成物であって、該口腔ケア組成物が、請求項１５記載の方法により得られるか又は得ることができる、前記口腔ケア組成物。
【請求項１７】
チューインガム組成物であって、
a) ガムベース、
b) 香味料、
c) 甘味料、及び
d) 該チューインガム組成物の約0.01重量％〜約0.5重量％のHLP
を含む、前記チューインガム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLPを含む口腔ケア製品及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯のエナメル質は、歯冠を被覆する石灰化物質の薄く硬い層である。歯のエナメル質の主要なミネラル成分は、結晶形態のリン酸カルシウムであるハイドロキシアパタイトである。歯のエナメル質の化学的侵食は、酸性食品及び飲料、又は胃逆流から生じる胃酸に対する歯の曝露から生じ得る。歯のエナメル質の侵食は、象牙質細管の曝露の増加に起因する歯の感受性の増加、及びより黄色い歯の外観につながる象牙質の可視性の増加をもたらし得る。唾液ペリクル(歯上に堆積した唾液糖タンパク質の薄層)は、侵食性の曝露に対する歯の保護において不可欠である。結果として、口内乾燥症を経験する人々は、より酸侵食損傷を受けやすい。
【０００３】
エナメル質侵食の予防を補助するために開発された既存の方法は、遊離フッ化物源を口腔ケア組成物に組み込むステップを含む。フッ化物は、ハイドロキシアパタイトより低いpHで溶解するため酸損傷に対してより耐性のフルオロアパタイトの形成を通して、エナメル質に対する損傷を低下させる。同様に、より酸耐性のミネラル層を形成することによってエナメル質表面を保護するため、第一スズ塩も歯磨き製剤に組み込まれていた。エナメル質表面をコーティング及び保護するポリマーも報告されている。
【０００４】
酸は、齲蝕原性細菌を含むプラークが糖質を代謝する場合も口腔内で生成される。プラークはプロトン動態及びエナメル質を通じたミネラル拡散を抑制するバリアーを形成するため、プラーク酸は齲蝕病変を引き起こす。歯磨き製剤中へのフッ化物イオンの組み込みは、プラーク酸の影響を軽減するための最も一般的な方法である。フッ化物は脱灰の速度を低下させ、再石灰化を増強する。リン酸カルシウム塩を安定化させ、又はプラークpHを制御して再石灰化を増強するための幾つかのアプローチが開発されている。
【０００５】
歯上における非細菌及び細菌産生酸の影響を軽減するための方法が開発されているが、酸侵食及び細菌の酸の影響からエナメル質を有効に修復する改善された口腔ケア組成物を提供する必要性が依然として存在する。
【０００６】
WO2011/157497は、(組成物の総重量に対するアニオン性界面活性剤の総重量で)1.5％未満のアニオン性界面活性剤、研磨洗浄剤及びハイドロフォビンを含む、発泡可能な口腔ケア組成物について開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2011/157497
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ハイドロフォビン様タンパク質(HLP)が歯牙侵食の影響の修復又は軽減、歯の再石灰化の促進、及びフッ化物の虫歯予防効果の増強において有効であることを予想外に見出した。
【０００９】
例えば、一実施形態において、HLPは、バッファー(例えばNa2HPO4バッファーなどのリン酸バッファー(1.5mM)及びCaCl2(2.5mM))中で希釈してほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えば、pH7〜8、例えば約pH7.5)を有する緩衝化溶液を提供し、この溶液を濾過及び遠心分離してHLPを含む濾液を得ることにより、好適な経口的に許容可能な担体の成分と共に製剤に調製される。この濾液に、殺生物剤(例えば0.1％の塩化セチルピリジニウム)及びフッ化物を添加し得る。次いで、HLPを経口的に許容可能な担体の成分、例えば練り歯磨き又はマウスウォッシュベースと組み合わせて、歯牙侵食の影響を修復又は軽減し、歯の再石灰化を促進し、フッ化物の虫歯予防効果を増強するための口腔ケア組成物を提供することができる。
【００１０】
従ってこの開示は、口腔ケア組成物(組成物1)(例えば歯磨剤)であって：
a) HLP；
b) 経口的に許容可能な担体
を含み、ここでHLPは、上記組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、上記口腔ケア組成物に関する。例えば、本開示は、以下のものを提供する：
1.1. HLPが配列番号22のポリペプチド配列を有する、組成物1。
1.2. フッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.3. HLPが、例えばリン酸バッファーを用いてほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えばpH7〜8)に中和されている、任意の前述の組成物。
1.4. HLPが、殺生物剤(例えば塩化セチルピリジニウム(CPC))を有効濃度(例えば濾液の0.1重量％)で含む、任意の前述の組成物。
1.5. HLPが、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、例えば組成物の総重量の0.2重量％〜2重量％(例えば約0.2重量％、約1重量％、約1.5重量％、又は約2重量％)の量で存在する、任意の前述の組成物。
1.6. 組成物が有効量のフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.7. 100ppm〜2500ppm、例えば250ppm〜750ppmの量のフッ化物、例えば約500ppmのフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.8. 例えば酸化亜鉛、クエン酸亜鉛、乳酸亜鉛、リン酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、アミノ酸との亜鉛錯体、及び前述のいずれかの混合物から選択される経口的に許容可能な亜鉛塩又は酸化物を含み、例えば亜鉛の量が、亜鉛イオンの重量で計算して0.1重量％〜3重量％、例えば約1〜約2重量％である、任意の前述の組成物。
1.9. 経口的に許容可能な第一スズ塩、例えばSnF2又はSnCl2を含む、任意の前述の組成物。
1.10. 組成物が、マウスリンス、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、非研磨ゲル、ムース、フォーム、マウススプレー及びタブレット、例えば歯磨剤(例えば練り歯磨き又はマウスリンス)から選択される形態である、任意の前述の組成物。
1.11. 組成物が、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料び着色料から選択される1種以上の薬剤をさらに含む、任意の前述の組成物。
1.12. 組成物が練り歯磨きである、任意の前述の組成物。
1.13. 1種以上の可溶性リン酸塩塩を含む任意の前述の組成物であって、例えば「可溶性リン酸塩塩」が、25℃で少なくとも1g/100mlの水中溶解度を有する経口的に許容可能なリン酸塩塩を意味し；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩がピロリン酸塩及び/又はポリリン酸塩(例えばトリポリリン酸塩)のナトリウム塩及び/又はカリウム塩であり；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩が、ピロリン酸四ナトリウム(TSPP)、トリポリリン酸ナトリウム(STPP)又はTSPPとSTPPの組み合わせを含み；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩が、組成物の1〜20重量％、例えば2〜8重量％(例えば約5重量％)の量で存在する、上記組成物。
1.14. フッ化物が、フッ化第一スズ、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フルオロケイ酸ナトリウム、フルオロケイ酸アンモニウム、フッ化アミン(例えば、N'-オクタデシルトリメチレンジアミン-N,N,N'-トリス(2-エタノール)-ジヒドロフルオリド)、フッ化アンモニウム、フッ化チタン、ヘキサフルオロ硫酸塩、及びそれらの組み合わせから選択される塩により提供される、任意の前述の組成物。
1.15. 例えばグリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、キシリトール、及びそれらの混合物から選択される湿潤剤を含む(例えば、組成物の少なくとも30重量％、例えば40〜50重量％のグリセリンを含む)歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.16. 例えばアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤並びにそれらの混合物から選択される1種以上の界面活性剤を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、歯磨剤基剤が、アニオン性界面活性剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムエーテル及びそれらの混合物から選択される界面活性剤)を、例えば組成物の約0.3重量％〜約4.5重量％の量で(例えば組成物の1〜2重量％のラウリル硫酸ナトリウム(SLS)を)含む、上記組成物。
1.17. 両性イオン性界面活性剤、例えばベタイン界面活性剤(例えばコカミドプロピルベタイン)を、例えば組成物の約0.1重量％〜約4.5重量％の量で(例えば組成物の0.5〜2重量％のコカミドプロピルベタインを)含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.18. 粘度改質量の、1種以上の多糖ガム(例えばキサンタンガム又はカラギーナン)、シリカ増粘剤、及びそれらの組み合わせを含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.19. ガムストリップ又はフラグメントを含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.20. 香味料、香料及び/又は着色料を含む、任意の前述の組成物。
1.21. 有効量の1種以上の抗細菌剤を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、ハロゲン化ジフェニルエーテル(例えばトリクロサン)、ハーブ抽出物及びエッセンシャルオイル(例えば、ローズマリー抽出物、茶抽出物、モクレン抽出物、チモール、メントール、ユーカリプトール、ゲラニオール、カルバクロール、シトラール、ヒノキトール、カテコール、サリチル酸メチル、没食子酸エピガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸、ミスワク(miswak)抽出物、シーバックソーン抽出物)、ビスグアニド防腐剤(例えば、クロロヘキシジン、アレキシジン又はオクテニジン)、第四級アンモニウム化合物(例えば、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルピリジニウム(TPC)、塩化N-テトラデシル-4-エチルピリジニウム(TDEPC))、フェノール性防腐剤、ヘキセチジン、オクテニジン、サングイナリン、ヨウ化ポビドン、デルモピノール、サリフルオル、金属イオン類(例えば、亜鉛塩類(例えばクエン酸亜鉛)、第一スズ塩類、銅塩類、鉄塩類)、サングイナリン、プロポリス及び酸素化剤(例えば、過酸化水素、緩衝された過酸化ホウ酸ナトリウム又は緩衝された過酸化炭酸ナトリウム)、フタル酸及びその塩、モノパーサル酸(monoperthalic acid)並びにその塩及びエステル、ステアリン酸アスコルビル、オレオイルサルコシン(oleoyl sarcosine)、硫酸アルキル、スルホコハク酸ジオクチル、サリチルアニリド、臭化ドミフェン、デルモピノール、オクタピノール及び他のピペリジン誘導体、ニシン(nicin)調製物、亜塩素酸塩塩；及び前述のいずれかの混合物から選択される抗細菌剤を含む(例えばトリクロサン又は塩化セチルピリジニウムを含む)、上記組成物。
1.22. 例えば、過酸化物、金属亜塩素酸塩類、過ホウ酸塩類、過炭酸塩類、過酸類、次亜塩素酸塩類、及びそれらの組み合わせ；例えば、過酸化水素又は過酸化水素源、例えば過酸化尿素又は過酸化物塩若しくは過酸化物錯体(例えば、過酸化リン酸塩、過酸化炭酸塩、過ホウ酸塩、過酸化ケイ酸塩、又は過硫酸塩の塩など；例えば、過酸化リン酸カルシウム、過ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム過酸化物、過酸化リン酸ナトリウム、及び過硫酸カリウム)からなる群から選択される美白剤を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.23. 細菌の付着を妨げるか又は予防する薬剤(例えばソルブロール又はキトサン)を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.24. 例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、及びそれらの組み合わせから選択される可溶性カルシウム塩を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.25. 生理学的に又は経口的に許容可能なカリウム塩(例えば硝酸カリウム又は塩化カリウム)を、象牙質の感受性を低下させるのに有効な量で含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.26. アニオン性ポリマー(例えば合成アニオン性ポリマー性ポリカルボキシレート)を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、上記アニオン性ポリマーが、無水マレイン酸又はマレイン酸の、別の重合可能なエチレン性不飽和モノマーとの1：4〜4：1コポリマーから選択され；例えば上記アニオン性ポリマーが、約30,000〜約1,000,000(例えば約300,000〜約800,000)の平均分子量(M.W.)を有するメチルビニルエーテル/無水マレイン酸(PVM/MA)コポリマーであり、例えば上記アニオン性ポリマーが、組成物の約1〜5重量％(例えば約2重量％)である、上記組成物。
1.27. ブレスフレッシュナー、香料又は香味料を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.28. 組成物のpHがほぼ中性(例えば約pH7)である、任意の前述の組成物。
1.29. 酸侵食を低減及び阻止し、歯を清浄し、細菌が生成したバイオフィルム及びプラークを低減し、歯肉炎を低減し、齲歯及び虫歯の形成を阻止し、象牙質の過敏性を低減するために使用するための、任意の前述の組成物。
1.30. 歯のエナメル質侵食の低減、阻止又は修復において使用するための、任意の前述の組成物。
1.31. 歯のエナメル質の再石灰化の促進において使用するための、任意の前述の組成物。
1.32. フッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための、任意の前述の組成物。
【００１１】
組成物1の特に新規な実施形態は、
a) 例えば少なくとも20.0％の乾燥物質、少なくとも2.5％の総窒素、4.0〜5.0のpH値、及び1.0％以下の灰含有量を含むHLPであって；部分的に加水分解されたコムギタンパク質が、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されている、上記HLP；
b) 場合により有効量のフッ化物；
c) 経口的に許容可能な担体
を含む歯磨剤であって、例えばHLPの量が0.1重量％〜2重量であり、例えばフッ化物が100ppm〜1000ppm(例えば約500ppm)の量で存在する、上記歯磨剤である。
【００１２】
一態様において、本開示は、歯牙侵食の修復又は阻止、再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための；例えば方法1(以下参照)による以下の方法のいずれかにおいて使用するための、組成物1(以下参照)のいずれかを提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法(方法1)であって、組成物、例えば組成物1(以下参照)のいずれか、例えば：
a) HLP
b) 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物であって、HLPが組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する上記組成物を歯に適用するステップを含む、上記方法を提供する。例えば、本開示は、以下を提供する：
1.1. HLPが配列番号22のポリペプチド配列を有する、方法1。
1.2. HLPがフッ化物を含む、任意の前述の方法。
1.3. HLPが、殺生物剤(例えば、塩化セチルピリジニウム(CPC))を有効濃度(例えば濾液の0.1重量％)で含む、任意の前述の方法。
1.4. HLPが、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、例えば組成物の総重量の0.2重量％〜2重量％(例えば約0.2重量％、約1重量％、約1.5重量％又は約2重量％)の量で存在する、任意の前述の方法。
1.5. 組成物が有効量のフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.6. フッ化物の量が、100ppm〜1000ppm(例えば約500ppmのフッ化物)である、任意の前述の方法。
1.7. 組成物が、マウスリンス、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、非研磨ゲル、ムース、フォーム、マウススプレー及びタブレットから選択される形態である、任意の前述の方法。
1.8. 組成物が、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料及び着色料から選択される1種以上の薬剤をさらに含む、任意の前述の方法。
1.9. 組成物が歯磨剤(例えば練り歯磨き)である、任意の前述の方法。
1.10. 組成物が、組成物1(以下参照)(上記参照)のいずれかから選択される、任意の前述の方法。
1.11. 歯牙侵食(例えばエナメル質の侵食)を低減、阻止又は修復するための方法であって、例えば、組成物が歯牙侵食を有するか又は歯牙侵食を有するリスクが上昇していると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.12. 歯の再石灰化(例えばエナメル質の再石灰化)を促進するための方法であって、例えば、組成物が脱灰を有すると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.13. フッ化物の虫歯予防効果を増強するための方法であって、例えば組成物が、齲歯の初期兆候(例えば初期エナメル質齲蝕)を有するか、又は活発な齲歯を有するか、又は齲歯のリスクが上昇していると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.14. 組成物が有効量のフッ化物を含む、及び/又は方法が、有効量のフッ化物を含む口腔ケア製品、有効量のフッ化物を含むマウスリンス又は練り歯磨きの投与をさらに含む、方法1.15。
【００１４】
別の実施形態において、本開示は、歯牙侵食の修復又は阻止、再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強のための(例えば方法1(以下参照)のいずれかにおける)口腔ケア組成物(例えば組成物1(以下参照)のいずれかによる口腔ケア組成物)の製造における、HLPの使用を提供する。
【００１５】
別の態様において、本開示は、口腔ケア製品(例えば、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強するために有用な口腔ケア製品(例えば、組成物1(以下参照)のいずれかによる製品))の作製方法(方法2)であって、以下：
a) 水性バッファー溶液(例えばリン酸バッファー溶液)を用いた希釈によりHLPを中和して、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えばpH7〜8)を有する溶液を得るステップ；
b) a)の溶液生成物を濾過及び遠心分離してHLPを含む濾液を得るステップ；
c) フッ化物(例えば、フッ化物を含有する経口的に許容可能な塩、例えばフッ化ナトリウム又はモノフルオロリン酸ナトリウムの形態のフッ化物)、及び場合により殺生物剤(例えば、有効量(例えば濾液の0.01〜1重量％、例えば約0.1重量％)の塩化セチルピリジニウム)を、b)の濾液生成物に添加するステップ；
d) c)の生成物を経口的に許容可能な担体の成分に混合して、HLPを組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で含む口腔ケア組成物を得るステップ
を含む、上記方法を提供する。
【００１６】
例えば、本開示は、HLPを含む口腔ケア組成物(例えば組成物1(以下参照)のいずれかによる組成物)であって、上記口腔ケア組成物が、方法2(以下参照)の工程により得られるか又は得ることができる、上記口腔ケア組成物を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる応用可能領域は、本明細書中以降に提供される詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明及び具体的実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみを目的とすることが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】粗さアッセイを用いたBM145の修復効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
好ましい実施形態(1つ又は複数)の以下の記載は、単に例示的な性質のものであり、決して本発明、その利用、又は用途を限定することを意図するものではない。
【００２０】
本明細書全体を通して、範囲は、その範囲内にある各値及び全ての値の記載の省略表現として用いられる。範囲内の任意の値を範囲の終端として選択することができる。さらに、本明細書中で引用される全ての参考文献は、それらの全体を参照することにより本明細書中に組み込まれる。本開示中の定義と引用される参考文献中の定義に矛盾がある場合は、本開示がコントロールする。
【００２１】
別段に特定されない限り、本明細書中の他の場所において表現される全てのパーセント及び量は、重量パーセントを指すと理解されるべきである。所与の量は、その物質の活性重量に基づく。
【００２２】
ハイドロフォビン様タンパク質(HLP)
本発明によるハイドロフォビン様タンパク質(HLP)は、真のハイドロフォビン配列(=ハイドロフォビン)、又はハイドロフォビン様特性(例えば、以下に記載される接触角度の変化)を与える真のハイドロフォビンに関連するポリペプチド配列のいずれかを有する、特定の真菌及び細菌などの生物由来のタンパク質である。
【００２３】
ハイドロフォビンは、糸状菌に特徴的であり他の生物には存在しない、約100AAの小タンパク質である。最近、ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)において、「チャプリン(Chaplin)」とばれ、ハイドロフォビンと同様に高い界面活性特性を有するハイドロフォビン様タンパク質が見出された。チャプリン(Chaplin)は、水／空気界面で集合し、アミロイド様線維を与え得る(Classenら 2003 Genes Dev 1714-1726; Elliotら 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740)。
【００２４】
ハイドロフォビンは、様々な菌構造(例えば、気菌糸、胞子、子実体など)の表面上に水不溶性形態で分布している。ハイドロフォビンの遺伝子は、子嚢菌類(ascomycetes)、不完全菌類(deuteromycetes)及び担子菌類(basidiomycetes)から単離された。幾つかの真菌(例えば、シゾフィルム・コムネ(Schizophyllum commune)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans))は、2つ以上のハイドロフォビン遺伝子を含む。明らかに、様々なハイドロフォビンが菌類の異なる発達段階に関与している。前記ハイドロフォビンは、恐らく異なる機能を担っていると考えられる(van Wetterら, 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershawら, 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33)。
【００２５】
気菌糸を生じるために水の表面張力を低下させることに加えて記載されているハイドロフォビンの生物学的機能はまた、胞子の疎水化である(Woestenら 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bellら1992, Genes Dev., 6, 2382-2394)。さらに、ハイドロフォビンは、地衣類の子実体においてガスチャネルを裏打ちするために、及び菌類病原体により植物表面を識別するシステムの成分として用いられる(Lugonesら、1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Volume 1, 693-697)。
【００２６】
相補性実験は、ハイドロフォビンが、単一クラス内である程度までは機能的に置換され得ることを実証した。先に開示されたハイドロフォビンは、慣用のタンパク質化学精製及び単離法を用いても、中程度の収量及び純度でしか調製することができない。遺伝的方法を用いてより大量のハイドロフォビンを供給する試みもまた、今まで成功していなかった。
【００２７】
HLPは、一般構造式(I)：
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を示し、添字n及びmは0〜500(好ましくは15〜300)の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも20アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス表面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
で表されるポリペプチドにも関する。
【００２８】
C1〜C8により表されるシステインは、還元型であってもよいし、又は本発明のタンパク質中で互いにジスルフィド架橋を形成してもよい。特に好ましいのは、C-C架橋の分子内形成、特に以下の群：C1とC2、C3とC4、C5とC6、C7とC8から選択される、少なくとも1つの、好ましくは2つ、特に好ましくは3つ、極めて特に好ましくは4つの分子内ジスルフィド架橋を有するハイドロフォビンである。システインが、Xにより示される位置においても用いられる場合、一般式中の個々のシステイン位置の番号は、それに応じて変化し得る。
【００２９】
特に有利なポリペプチドは、一般式(II)：
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を示し、添字n及びmは2〜300の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも35アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス表面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
で表されるポリペプチドである。極めて特に有利なのは、一般式(III)：
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を示し、添字n及びmは0〜200の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと省略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも40アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス表面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
で表されるポリペプチドである。
【００３０】
記載される発明の好ましい実施形態は、一般構造式(I)、(II)又は(III)を有するポリペプチドであり、この構造式は、少なくとも1つのクラスIハイドロフォビン、好ましくは少なくとも1つのdewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2、ハイドロフォビン、又はそれらの一部若しくは誘導体を含む。前記ハイドロフォビンは、以下の配列表において構造的に特徴づけられている。複数の(好ましくは2つ又は3つの)構造的に同一のまたは異なるハイドロフォビンを、互いに、及びハイドロフォビンと天然には結合していない対応する好適なポリペプチド配列と結合することも可能である。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号20、22、24に示されるポリペプチド配列、及びそれらをコーディングする核酸配列、特に配列番号19、21、23に定義される配列を有する新規なタンパク質である。配列番号22、22、又は24に示されるポリペプチド配列から出発して全アミノ酸の少なくとも1％、最大10％、好ましくは最大5％(特に好ましくは最大5％)の置換、挿入又は欠失から生じ且つ出発タンパク質の生物学的特性の少なくとも50％を依然として有するタンパク質もまた、特に好ましい実施形態である。ここでタンパク質の生物学的特性とは、実施例1に記載されるような接触角度の変化を意味する。
【００３２】
このようなHLP及びそれらの製造は、例えば、EP1848733に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
これらのタンパク質は、Xn又はXmにより略される少なくとも1つの位置に、ハイドロフォビンに天然には結合していない、少なくとも20個、好ましくは少なくとも35個、特に好ましくは少なくとも50個、特に少なくとも100個のアミノ酸を含むポリペプチド配列(本明細書中以下に融合パートナーとも呼ばれる)を有する。これは、本発明のタンパク質が、ハイドロフォビン部分と融合パートナー部分からなる(天然にはこの形で一緒に生じることはない)という事実を表すことを意図する。
【００３４】
融合パートナー部分は、非常に多数のタンパク質から選択することができる。複数の融合パートナーを1つのハイドロフォビン部分に(例えばハイドロフォビン部分のアミノ末端(Xn)及びカルボキシ末端(Xm)に)結合することも可能である。しかし、例えば、2つの融合パートナーを本発明のタンパク質の単一の位置(Xn又はXm)に結合することも可能である。
【００３５】
特に好ましい融合パートナーは、本発明のタンパク質がガラス表面をコーティングすることを可能とし、タンパク質処理されたガラス表面が実験節(実施例10)に詳細に記載されるような界面活性剤による処理(例えば、1％ SDS/80℃/10分間)に対して耐性になるようにするポリペプチド配列である。
【００３６】
特に好適な融合パートナーは、微生物、特に大腸菌(E. coli)又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)において天然に存在するポリペプチドである。このような融合パートナーの例は、配列yaad(配列番号15及び16)、yaae(配列番号17及び18)、及びチオレドキシンである。前記配列の一部のみ(好ましくは70〜99％、特に好ましくは80〜98％)を含むか、又は前記配列と比較して個々のアミノ酸又はヌクレオチドが変更されている、前記配列の断片又は誘導体も極めて有用である。例えば、付加アミノ酸、特に2つの付加アミノ酸(好ましくはアミノ酸Arg、Ser)を、yaad配列及びyaae配列のC末端に付加することができる。天然配列と比較して、付加アミノ酸(例えば配列番号17及び18におけるアミノ酸No. 2(Gly))を優先してyaae配列に挿入することも可能である。
【００３７】
さらに、2つの融合パートナーの接合部に、核酸レベルで新に創出されるか又は不活性化される制限エンドヌクレアーゼの認識部位の結果である付加アミノ酸を挿入することも可能である。
【００３８】
2018534293.tif 000002
【００３９】
さらに、本発明のタンパク質のポリペプチド配列を、例えばグリコシル化、アセチル化により、あるいは例えばグルタルジアルデヒドを用いた化学的架橋によって修飾することも依然として可能である。
【００４０】
本発明のタンパク質の1つの特性は、表面特性の変化(前記表面が前記タンパク質でコーティングされている場合)である。前記表面特性の変化は、本発明のタンパク質による表面のコーティングの前後に水滴の接触角度を測定し、その2つの測定値の差を決定することにより、実験的に決定することができる。
【００４１】
接触角度の測定のための正確な実験条件は、実験節の実施例1に規定されている。これらの条件下で、本発明のタンパク質は、接触角度を少なくとも20度、好ましくは25度、特に好ましくは30度増大させる特性を有する。
【００４２】
先に開示されたハイドロフォビンのハイドロフォビン部分における極性アミノ酸及び非極性アミノ酸の位置は保存されており、特徴的な疎水性プロットをもたらす。生物物理学的特性及び疎水性における差異により、先に開示されたハイドロフォビンは、I及びIIの2つのクラスに分類された(Wesselsら 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437)。
【００４３】
クラスIハイドロフォビンの集合膜は、(昇温における1％SDSに対しても)高度に不溶性であり、濃縮トリフルオロ酢酸(TFA)又はギ酸によってのみ再解離させることができる。対照的に、集合形態のクラスIIハイドロフォビンの安定性はより低い。クラスIIハイドロフォビンは、(室温で)60％強度のエタノール又は1％SDSによっても再溶解させ得る。
【００４４】
アミノ酸配列の比較は、クラスIIハイドロフォビンにおいて、システインC3とシステインC4の間の領域の長さがクラスIハイドロフォビンより明らかに短いことを明らかにする。
【００４５】
さらに、クラスIIハイドロフォビンは、クラスIよりも多くの荷電アミノ酸を有する。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のタンパク質を製造するための方法に関する。これらのポリペプチドは、公知のペプチド合成法(例えばMerrifieldによる固相合成法)により化学的に製造することができる。
【００４７】
しかし、特に有用なのは、融合パートナー及びハイドロフォビン部分をそれぞれコードする2つの核酸配列(特にDNA配列)が、組み合わせられた核酸配列の遺伝子発現が宿主生物中で所望のタンパク質を生成するような方法で組み合わせられる、遺伝子的方法である。
【００４８】
ここでの好適な宿主生物(産生生物)は、原核生物(古細菌を含む)又は真核生物、特に好塩性細菌及びメタノコッカス属を含む細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞、特に好ましくは大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzea)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シュードモナス属種(Pseudomonas spec.)、乳酸菌(Lactobacillen)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、トリコデルマ・リーゼイ(Torichoderma reesei)、SF9(又は関連細胞)、及びその他の生物であり得る。
【００４９】
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子制御下で本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物、及びまた前記発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。
【００５０】
好ましいのは、特定のコーディング配列の5’上流にプロモーターを、3’下流にターミネーター配列を、また適切であればさらなる慣用の調節エレメントも含む(いずれの場合も前記コーディング配列に機能的に連結されている)、かかる本発明の構築物である。
【００５１】
「機能的連結」は、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び、適切な場合、さらなる調節エレメントの(それぞれの調節エレメントが、コーディング配列の発現に関して意図される用途によるその機能を満たし得るような方法での)連続的配置を意味する。
【００５２】
機能的に連結され得る配列の例は、標的化配列、及びまたエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。さらなる調節エレメントは、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。好適な調節配列の例は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００５３】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の上流に依然として存在していてもよく、適切な場合、これらの調節配列は、天然の調節がオフにされて上記遺伝子の発現が増加するように遺伝子的に改変されている。
【００５４】
好ましい核酸構築物は、プロモーターに機能的に連結されており、増加させるべき核酸配列の発現を可能とする、既に言及した1つ以上のエンハンサー配列も有利に含む。さらなる有利な配列(例えばさらなる調節エレメント又はターミネーター)が、DNA配列の3'末端に挿入されていてもよい。
【００５５】
本発明の核酸は、構築物中に1つ以上のコピーで存在し得る。構築物は、適切であれば、構築物の選択のため、なおさらなるマーカー(例えば抗生物質耐性又は栄養要求性を相補する遺伝子)を含み得る。
【００５６】
本発明の方法に有利な調節配列の例は、cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)、SP6、ラムダ-PR又はラムダ-Pプロモーターなどのプロモーター中に存在し、これらはグラム陰性細菌中で有利に用いられる。有利な調節配列のさらなる例は、グラム陽性プロモーターamy及びSP02、酵母又は真菌のプロモーターADC1、MFアルファ、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に存在する。調節用の人工プロモーターを使用することも可能である。
【００５７】
宿主生物中で発現させるため、核酸構築物は、例えば遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にするプラスミド又はファージなどのベクターに有利に挿入される。プラスミド及びファージだけでなく、「ベクター」は、当業者に公知の任意の他のベクター(すなわち、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、並びに直鎖又は環状DNA及びまたアグロバクテリウム系)も意味する。
【００５８】
これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製してもよいし、染色体的に複製されてもよい。これらのベクターは、本発明の別の実施形態を構成する。好適なプラスミドの例は、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III’’3-B1、tgt11若しくはpBdCl、ストレプトマイセス属(Streptomyces)のpIJ101、pIJ364、pIJ702若しくはpIJ361、バチルス属(Bacillus)のPUB110、pC194若しくはpBD214、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)のpSA77若しくはpAJ667、真菌類のpALS1、pIL2若しくはpBB116、酵母菌の2アルファ、pAG-1、YEp6、YEp13若しくはpEMBLYe23、又は植物のpLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004若しくはpDH51である。前記プラスミドは、可能なプラスミドの小選択である。さらなるプラスミドは当業者に周知であり、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)の本に見出し得る。
【００５９】
有利なことに、上記の核酸構築物は、存在する他の遺伝子を発現させる目的のため、選択される宿主生物及び遺伝子に応じた最適な発現について選択される、発現を増加させるための3’及び/又は5’末端調節配列もさらに含む。
【００６０】
これらの調節配列は、遺伝子及びタンパク質発現が特異的に発現されることを可能にすることが意図される。これは、宿主生物に応じて、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現又は過剰発現されることを意味する場合もあれば、直ぐに発現及び/又は過剰発現されることを意味する場合もある。
【００６１】
これに関連して、調節配列又は調節因子は、好ましくは導入遺伝子の遺伝子発現に有益な影響を及ぼし、これにより上記遺伝子発現を増加させることができる。このようにして、調節エレメントは、プロモーター及び/又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで有利に増強させることができる。しかし、それだけではなく、例えばmRNA安定性を高めることによって翻訳を増強することも可能である。
【００６２】
ベクターの別の実施形態において、本発明の核酸構築物又は本発明の核酸を含むベクターも、直鎖DNAの形態で微生物に好都合に導入され、異種組換え又は相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込まれ得る。前記直鎖DNAは、直鎖化ベクター(例えばプラスミド)で構成されていてもよいし、本発明の核酸構築物又は核酸のみで構成されていてもよい。
【００６３】
生物中の異種遺伝子の最適な発現を達成するため、その生物において用いられる特異的コドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、当該生物の他の既知遺伝子のコンピューター分析に基づいて容易に決定することができる。
【００６４】
本発明の発現カセットは、好適なプロモーターを、好適なコーディングヌクレオチド配列及びターミネーターシグナル又はポリアデニル化シグナルに融合させることにより作製される。この目的のため、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、さらにまたT.J. Silhavy, M.L. Berman及びL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、及びAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されているような、よく知られた組換え技術及びクローニング技術が用いられる。
【００６５】
好適な宿主生物における発現のため、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.ら, Elsevier編、Amsterdam-New York-Oxford、1985)中に見出だし得る。
【００６６】
本発明のベクターは組換え微生物を作製するために使用することが可能であり、この組換え微生物は、例えば少なくとも1つの本発明のベクターで形質転換され、本発明のポリペプチドの産生に使用され得る。有利には、上記の本発明の組換え構築物は好適な宿主系に導入されて発現される。ここでは、前記核酸を特定の発現系において発現させるため、当業者に公知の一般的なクローニング法及びトランスフェクション法、例えば、共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。好適な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら, Wiley Interscience編, New York 1997、又はSambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【００６７】
本発明によれば、相同組み換え微生物を作製することも可能である。この目的のため、本発明の遺伝子又はコーディング配列の少なくとも1つの断片を含むベクターが作製され、このベクターには、適切であれば、本発明の配列を改変する(例えば機能的に破壊する)ために少なくとも1つのアミノ酸欠失、付加又は置換が導入されている(ノックアウトベクター)。導入される配列は、例えば、関連微生物由来の相同体であってもよいし、哺乳動物源、酵母源又は昆虫源に由来するものであってもよい。相同組換えに用いられるベクターは、相同組換え中に内在性遺伝子が変異するか、又は幾つかの他の方法で改変されるが依然として機能的タンパク質をコードするように代替的に設計され得る(例えば、上流調節領域が内在性タンパク質の発現を改変するように改変されていてもよい)。本発明の遺伝子の改変断片は、相同組換えベクター中にある。相同組換えのための好適なベクターの構築は、例えば、Thomas, K.R.及びCapecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００６８】
任意の原核生物又は真核生物は、原理上、本発明の核酸又は核酸構築物のための組換え宿主生物として用いるのに適している。有利に用いられる宿主生物は、細菌、真菌又は酵母などの微生物である。グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌、好ましくはエンテロバクテリアセアエ科(Enterobacteriaceae)、シュードモナダセアエ科(Pseudomonadaceae)、リゾビアセアエ科(Rhizobiaceae)、ストレプトミセタセアエ科(Streptomycetaceae)又はノカルディアセアエ科(Nocardiaceae)の細菌、特に好ましくはエシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、ノカルディア属(Nocardia)、ブルクホルデリア属(Burkholderia)、サルモネラ属(Salmonella)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、又はロドコッカス属(Rhodococcus)の細菌が有利に用いられる。
【００６９】
宿主生物に応じて、本発明の方法において使用される生物は、当業者に公知の方法で増殖又は培養される。微生物は、通常、通常は糖の形態の炭素源、通常は有機窒素源の形態の窒素源(例えば酵母抽出物、又は硫酸アンモニウムなどの塩)、微量元素(例えば鉄、マンガン、マグネシウム塩)、さらに適切な場合はビタミンを含む液体培地中で、0〜100℃、好ましくは10〜60℃の温度で、酸素を吸気させながら増殖される。ここで栄養液体のpHは、固定値に維持されていてもよいし、維持されていなくてもよい(すなわち増殖中に調節される)。増殖は、バッチ様、半バッチ様又は連続的に行うことができる。栄養は、発酵の開始時点で最初に導入されてもよいし、後で半連続的又は連続的に供給されてもよい。酵素は、実施例に記載される方法を用いて生物から単離することもできるし、粗抽出物として反応に用いることもできる。
【００７０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド又はそれらの機能的な、生物学的に活性な断片を組換え的に生産する方法に関し、この方法は、ポリペプチド産生微生物を培養するステップ、適切であれば前記ポリペプチドの発現を誘導し、これらを培養液から単離するステップを含む。このようにして、所望の場合はポリペプチドを工業的スケールで生産することもできる。公知の方法により組換え微生物を培養及び発酵することができる。例えば、TB培地又はLB培地中で、20〜40℃の温度及びpH6〜9で、細菌を増殖させることができる。好適な培養条件は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳細に記載されている。
【００７１】
ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合、細胞はその後破壊され、生産物はタンパク質を単離する公知の方法により溶解物から単離される。細胞は、場合によって、高周波超音波により、高圧により(例えばフレンチプレッシャーセル中で)、オスモリシスにより、界面活性剤、溶菌酵素又は有機溶媒の作用により、ホモジナイザーを用いることにより、あるいは上記に挙げた方法の幾つかの組み合わせによって破壊することもできる。
【００７２】
ポリペプチドは、Q-セファロースクロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー法を用いて、さらにまた限外濾過法、結晶化法、塩析法、透析法及びネイティブゲル電気泳動法などの他の慣用の方法を用いて精製することができる。好適な方法は、例えば、Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [元の標題：The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York、又はScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００７３】
組換えタンパク質を単離するため、特定のヌクレオチド配列によってcDNAを伸長させ、これにより例えば精製を容易にする改変されたポリペプチド若しくは融合タンパク質をコードする、ベクター系又はオリゴヌクレオチドを用いることが有利であり得る。このような好適な改変の例は、アンカーとして機能する「タグ」(例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変)、又は抗体により抗原として認識され得るエピトープである(例えば、Harlow, E.及びLane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載される)。さらなる好適なタグは、例えば、HA、カルモジュリン-BD、GST、MBD；キチン-BD、ストレプトアビジン-BD-Aviタグ、Flagタグ、T7等である。これらのアンカーは、タンパク質を、例えば、固体支持体(例えばクロマトグラフィーカラムに導入しておくことができるポリマーマトリクスなど)、又はマイクロタイタープレート若しくは任意の他の支持体に付着させるために使用することができる。対応する精製プロトコルは、アフィニティータグの商業的供給者から入手することができる。
【００７４】
一部の実施形態において、HLPは、組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する。一部の実施形態において、HLPは、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、又は0.1重量％〜2重量％、又は0.1重量％〜1重量％の量で存在する。他の実施形態において、HLPは、組成物中に、組成物の総重量の0.05重量％〜1重量％、又は0.1重量％〜0.5重量％の量で存在する。さらなる実施形態において、HLPは、組成物中に、組成物の総重量の0.5重量％〜3重量％、又は0.5重量％〜2重量％、又は0.5重量％〜1重量％の量で存在する。なおさらなる実施形態において、HLPは、組成物中に、組成物の総重量の1重量％〜3重量％、又は1重量％〜2重量％の量で存在する。
【００７５】
経口的に許容可能な担体及び任意選択成分
本明細書中で使用される「経口的に許容可能な担体」との表現は、意図される量及び濃度における経口用途に安全且つ許容可能な物質(例えば従来の練り歯磨き及びマウスウォッシュ中に見られるような物質)から作製される担体を示す。このような物質としては、水、又は湿潤剤(例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトールなど)を含有し得る他の溶媒が挙げられる。一部の態様において、「経口的に許容可能な担体」という用語は、HLP及びフッ化物を除く、口腔ケア組成物の全ての成分を包含する。他の態様において、この用語は、加水分解された植物タンパク質、及び/又は任意の他の機能的成分を口腔に送達する役割を果たす不活性な(inert又はinactive)成分を指す。
【００７６】
本発明において使用するための経口的に許容可能な担体としては、例えば、マウスリンス又はマウスウォッシュ、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、ロゼンジ、ガム、ビーズ、可食ストリップ、タブレットなどの作製において用いられる従来の及び公知の担体が挙げられる。担体は、相互の及び組成物の他の成分との適合性について選択されなければならない。
【００７７】
以下の非限定的な例が提供される。練り歯磨き組成物において、担体は、典型的には、組成物の重量で主要分画を占める水/湿潤剤系である。あるいは、練り歯磨き組成物の担体成分は、水、1種以上の湿潤剤、及び加水分解されたコムギタンパク質又は加水分解されたコメタンパク質以外の他の機能的成分を含み得る。マウスリンス製剤又はマウスウォッシュ製剤において、担体は、典型的には、加水分解されたコムギタンパク質又は加水分解されたコメタンパク質が溶解又は分散している水/アルコール液体混合物である。溶解可能なロゼンジにおいて、担体は、典型的には口腔内でゆっくりと溶解する固体マトリックス物質を含む。チューインガムにおいて、担体は、典型的にはガムベースを含むが、可食ストリップにおいては、担体は、典型的には1種以上のフィルム形成ポリマーを含む。
【００７８】
本明細書において提供される口腔ケア組成物は、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料、着色料及び保存料から選択される1種以上の付加的成分をさらに含み得る。これらの成分もまた、担体物質と考えることができる。非限定的な例は以下に提供される。
【００７９】
一実施形態において、本発明の組成物は、例えば、光沢剤として有用な少なくとも1種の研磨剤を含む。任意の経口的に許容可能な研磨剤を使用することができるが、研磨剤の種類、粉末度(粒径)及び量は、組成物の通常の使用中に歯のエナメル質が過剰に摩耗されないように選択されなければならない。好適な研磨剤としては、限定するものではないが、シリカ(例えばシリカゲルの形態)、水和シリカ又は沈降シリカ、アルミナ、不溶性リン酸塩、炭酸カルシウム、樹脂性研磨剤(例えば尿素-ホルムアルデヒド縮合生成物)などが挙げられる。不溶性リン酸塩の中でも、研磨剤として有用なのは、オルトリン酸塩、ポリメタリン酸塩及びピロリン酸塩である。例示的な例は、オルトリン酸二カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸[ベータ]-カルシウム、リン酸三カルシウム、ポリメタリン酸カルシウム及び不溶性ポリメタリン酸ナトリウムである。1種以上の研磨剤が、本発明の口腔ケア組成物中に、組成物の総重量の1重量％〜5重量％の量で、任意選択で存在する。研磨剤の平均粒径は、存在する場合、一般的には0.1〜30μm、好ましくは5〜15μmである。
【００８０】
さらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、発泡及び炭酸ガスの放出により歯及び歯肉に「清浄感」を与えるために有用な少なくとも1種の重炭酸塩の塩を含む。任意の経口的に許容可能な重炭酸塩を使用することが可能であり、例えば、限定するものではないが、アルカリ金属重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウム、重炭酸アンモニウムなどが挙げられる。1種以上の重炭酸塩の塩が、組成物の1重量％〜10重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８１】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、少なくとも1種のpH改変剤を含む。このような薬剤としては、例えば、pHを低下させる酸性化剤、pHを上昇させる塩基性化剤及びpHを所望の範囲内に制御するバッファー剤が挙げられる。例えば、pH2〜10、又は様々な例示的実施形態においてはpH2〜8、3〜9、4〜8、5〜7、6〜10、又は7〜9を与えるために、酸性化剤、塩基性化剤及びバッファー剤から選択される1種以上の化合物を包含することができる。任意の経口的に許容可能なpH改変剤を使用することが可能であり、例えば、限定するものではないが、カルボン酸、リン酸及びスルホン酸、酸塩(例えば、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、リンゴ酸一ナトリウム)、アルカリ金属水酸化物(例えば水酸化ナトリウム)、炭酸塩(例えば炭酸ナトリウム)、重炭酸塩、ホウ酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩(例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ピロリン酸塩の塩)、イミダゾールなどが挙げられる。1種以上のpH改変剤が、経口的に許容可能なpH範囲内に組成物を維持するために有効な総量で、任意選択で存在する。
【００８２】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、例えば、本組成物及びその中に含有される成分に高められた安定性を提供し、洗浄作用を通して歯の表面の清浄を助け、撹拌の際に(例えば、本発明の歯磨剤組成物を用いたブラッシング中に)泡を提供するために有用な少なくとも1種の界面活性剤を含む。任意の経口的に許容可能な界面活性剤、例えばアニオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤又は両性の界面活性剤などを使用することができる。好適なアニオン性界面活性剤としては、例えば、限定するものではないが、C8-20硫酸アルキルの水溶性塩、C8-20脂肪酸のスルホン化モノグリセリド、サルコシン酸塩、タウリン酸塩などが挙げられる。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、限定するものではないが、ポロキサマー、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪アルコールエトキシレート、アルキルフェノールエトキシレート、第三級アミン、酸化物、第三級ホスフィンオキシド、ジアルキルスルホキシドなどが挙げられる。好適な両性界面活性剤は、限定するものではないが、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート又はホスホネートなどのアニオン性基を有するC8-20脂肪族第二級及び第三級アミンの誘導体である。好適な例は、ココアミドプロピルベタインである。1種以上の界面活性剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜10重量％、例えば、0.05重量％〜5重量％、又は0.1重量％〜2重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８３】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、撹拌の際に組成物により生成される泡の量、厚さ又は安定性を増加させるために有用な少なくとも1種の発泡調整剤を含む。任意の経口的に許容可能な発泡調整剤、例えば、限定するものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)などを使用することができる。1種以上のPEGが、組成物の総重量の0.1重量％〜10重量の総量で、任意選択で存在する。
【００８４】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、組成物に所望の稠度及び/又は口当たりを与えるために有用な少なくとも1種の増粘剤を含む。任意の経口的に許容可能な増粘剤、例えば、限定するものではないが、カルボマー(カルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース性ポリマー(例えばヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース(CMC)及びそれらの塩)、天然ガム(例えばカラヤガム、キサンタンガム、アラビアガム及びトラガカント)、コロイド性ケイ酸マグネシウムアルミニウム、コロイド性シリカなどを使用することができる。1種以上の増粘剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜15重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８５】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、例えば、成分の沈降又は分離を阻害するため、又は液体組成物の撹拌の際の成分の再分散を促進するために有用な少なくとも1種の粘度改質剤を含む。任意の経口的に許容可能な粘度改質剤、例えば、限定するものではないが、鉱油、ワセリン、クレイ、シリカなどを使用することができる。1種以上の粘度改質剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜10重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８６】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、空気に曝露された際の練り歯磨きの硬化を防止するために使用し得る少なくとも1種の湿潤剤を含む。任意の経口的に許容可能な湿潤剤、例えば、限定するものではないが、多価アルコール(例えばグリセリン)、ソルビトール、キシリトール又は低分子量PEGなどを使用することができる。ほとんどの湿潤剤は、甘味料としても機能する。1種以上の湿潤剤が、組成物の総重量の1重量％〜50重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８７】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、組成物の味を高める少なくとも1種の甘味料を含む。任意の経口的に許容可能な天然甘味料又は人工甘味料、例えば、限定するものではないが、デキストロース、スクロース、マルトース、デキストリン、マンノース、キシロース、リボース、フルクトース、レブロース、ガラクトース、コーンシロップ、部分的に加水分解されたデンプン、水素化デンプン加水分解物、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、イソマルト、アスパルテーム、ネオテーム、サッカリン及びそれらの塩、ジペプチドベースの強甘味料、シクラメートなどを使用することができる。1種以上の甘味料が、組成物の総重量の0.005重量％〜5重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８８】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、組成物の味を高める少なくとも1種の香味料を含む。任意の経口的に許容可能な天然香味料又は合成香味料、例えば、限定するものではないが、バニリン、セージ、マジョラム、パセリ油、スペアミント油、シナモン油、ウインターグリーン油(メチルサリシレート)、ペパーミント油、クローブ油、ベイ油、アニス油、ユーカリ油、柑橘油、果実油及び精油などを使用することができる。香味料の範囲内には、口内に香り及び/又は他の感覚作用(例えば冷却作用又は加温作用など)を提供する成分も包含される。このような成分としては、例示的に、メントール、メンチルアセテート、メンチルラクテート、ショウノウ、ユーカリ油、ユーカリプトール、オイゲノール、カッシア、オキサノン、α-イリソン、チモール、リナロール、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、N-エチル-p-メンタン-3-カルボキサミン、N,2,3-トリメチル-2-イソプロピルブタンアミド、3-(1-メントキシ)-プロパン-1,2-ジオール、シンナムアルデヒドグリセロールアセタール(CGA)、メントングリセロールアセタール(MGA)などが挙げられる。1種以上の香味料が、組成物の総重量の0.01重量％〜5重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００８９】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、少なくとも1種の着色料を含む。着色料は、多くの機能を果たし得る。これらの機能としては、例えば、歯の表面に白又明色のコーティングを提供すること、歯の表面上の組成物が有効に接触した位置を示すこと、及び/又は消費者に対する魅力を高めるために組成物の外観を改変することが挙げられる。任意の経口的に許容可能な着色料、例えば、限定するものではないが、タルク、マイカ、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、シリカ、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、第二鉄アンモニウムフェロシアン化物、マンガンバイオレット、チタン化マイカ、オキシ塩化ビスマスなどを使用することができる。1種以上の着色料が、組成物の総重量の0.001重量％〜20重量％の総量で、任意選択で存在する。
【００９０】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は保存料を含む。保存料は、パラベン、ソルビン酸カリウム、ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、ポリアミノプロピルビグアニド、カプリル酸、安息香酸ナトリウム及び塩化セチルピリジニウムから選択することができる。一部の実施形態において、保存料は、組成物の総重量の約0.001〜約1重量％の濃度で存在する。
【００９１】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、ガムベース、香味料、甘味料及びHLPを含むチューインガムである。ガムベースは、約4.8％〜約90％、香味料は約0.1％〜約10％、甘味料は約0.1％〜約95％、HLPは約0.01％〜約0.5％存在する。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例は、本発明の組成物及びそれらの使用を説明する。例示される組成物は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９３】
実施例1 - 接触角度の変化
HLPによる表面のコーティング／評価
ガラス(窓ガラス、Sueddeutsche Glas社、マンハイム、ドイツ)：
HLPの濃度：100μg/mL
ガラス板を、50mM酢酸ナトリウム(pH4)＋0.1％Tween 20中で一晩(温度：80℃)インキュベーション。
コーティング後、蒸留水で洗浄
その後、80℃、蒸留水中1％SDS溶液で10分間インキュベーション。
蒸留水で洗浄。
【００９４】
サンプルを空気乾燥させ、5μlの水滴の接触角度(度)を決定する。
【００９５】
Dataphysics Contact Angle System OCA 15+、Software SCA 20.2.0.(2002年11月)装置で接触角度を測定した。製造業者の使用説明書に従って測定を実施した。
【００９６】
未処理のガラスは、30±5°の接触角度を与えた；配列番号20による機能的HLP(yaad-dewA-his6)によるコーティングは、75±5°の接触角度を与えた。
【００９７】
実施例2 - 表面粗さ
ウシの歯を切り取り、研磨し磨いて、およそ体積3mm x 3mm x 2mmを有するエナメル質ブロックを得る。エナメル質の厚さは約1〜2mmであり、象牙質の厚さは約1mmである。エナメル質表面上で全ての測定値を採る。
【００９８】
エナメル質ブロックの表面粗さは、酸腐食の前後に測定される。酸腐食は、エナメル質ブロックを、表面粗さ(Sq)が100〜200に達するまで1％クエン酸溶液(pH3.8)中に配置することによって達成される。このSq値を、腐食したエナメル質の表面粗さとして記録する。(Sqは、基本的には測定される表面の二乗平均平方根高さとして(算術平均高さと対比して)ISO 25178に規定される標準測定であり、従ってSqは、測定領域内の中心平面に由来するプロファイルの全絶対距離の平均に対応し、Sqが高い場合は表面上により顕著な山頂及び谷底が存在する(すなわち表面が比較的粗い)ことを意味し、Sqが低い場合は表面が比較的滑らかであることを意味する)。Na2HPO4バッファー(1.5mM)及びCaCl2(2.5mM)を用いて、HLP(例えばBioMin 145)を最終濃度に希釈する。pH7.5に中和した後、溶液を濾過して遠心分離する。その後、酸腐食したエナメル質ブロックを、BioMin 145を17μM(1ブロック当たり2ml溶液)の濃度で含む溶液と共に60分間インキュベートする。
【００９９】
60分間のインキュベーション期間後、エナメル質ブロックを人工唾液(AS)溶液(0.4g NaCl、0.4g KCl、0.8g CaCl2、0.69g NaH2PO4、1g尿素、1リットル蒸留水；pH 7(1M NaOHを用いて調整))中で22時間インキュベートする。次いで、2回目のHLP BioMin 145によるエナメル質ブロックの処理を行い、再び人工唾液と共に22時間インキュベートする。その後、ブロックを脱イオン(DI)水ですすぎ、空気乾燥させた後、それらの表面粗さを測定する。実験の陰性対照として、0.5％PBSで処理したエナメル質ブロックを使用する。結果は表1に示される。％修復は、(未処理の)酸腐食したエナメル質の表面粗さに対する、タンパク質処理により達成された表面粗さ(Sq)の％低下を表す。
【０１００】
【表１】
2018534293.tif 000003
【０１０１】
図1の、粗さアッセイを用いたBM145の修復効果を参照されたい。
【０１０２】
表1に示されるとおり、BioMin 145は、17μMの濃度で、酸腐食したエナメル質ブロックの表面粗さの低下に有効である。
【０１０３】
実施例2 - ナノインデンテーション
実施例1に記載されるとおりにエナメル質ブロックを作製する。酸腐食は、エナメル質ブロックを1％クエン酸溶液(pH3.8)中に15分間配置することによって達成される。500nm深さにおけるナノ硬度及びヤング率を、腐食の前及び後に測定する。腐食したエナメル質ブロックを、20μMの濃度のHLP(例えばBioMin 145)の溶液と共に30分間インキュベートし(2ml溶液/ブロック)、その後、実施例1に記載されるAS溶液と共に22〜24時間インキュベートする。HLPインキュベーション及びASインキュベーションのステップをさらに2回繰り返し、その後エナメル質ブロックをDI水ですすいで空気乾燥させる。処理されたエナメル質ブロックのナノ硬度及びヤング率を500nm深さで測定し、HLPのエナメル質修復効果を評価する。実験の陽性対照として、500ppmフッ化物溶液を使用する。結果は、表２及び表３に示される。
【０１０４】
【表２】
2018534293.tif 000004
【０１０５】
【表３】
2018534293.tif 000005
【０１０６】
表2及び3に見られるとおり、BioMin 145は、酸腐食したエナメル質の修復において有効である。
【０１０７】
実施例3 - 微小硬度
実施例1に記載されるとおりにエナメル質ブロックを作製する。微小硬度は、ヌープダイヤモンド圧子及び50g負荷を備えたMicromet 6020微小硬度テスター(Buehler社、レイクブラフ、イリノイ州、米国)を用いて測定する。少なくとも300のヌープ硬度(KH)を有するブロックを選択する。このブロックを、30％リン酸中に15秒間浸漬することによって腐食させる。ブロックの左側及び右側のKHを測定する。続いて、ブロックの右側をテープで覆い、その後にブロックを、それぞれ実施例1に記載されるとおりに中和されたHLP(例えばBioMin 93)の20μM溶液で2期間(1期間30分)処理する。(ブロックの右手側のテープは、タンパク質溶液に対するこの右手側の曝露を防ぎ、内部対照としての役割を果たす)。2回の処理の間及び2回目の処理の後、このブロックをDI水で2回(1回につき5分、500PRM)洗浄する。その後、テープを取り除き、ブロックをAS溶液(0.2mM MgCl2、1mM CaCl2.H2O、20mM HEPESバッファー、4mM KH2PO4、16 mM KCl、4.5 mM NH4Cl、300ppm NaF、0.05重量％ NaN3、pH7(1M NaOHで調整))中で7日間インキュベートする。エナメル質ブロックをDI水ですすぎ、すすいだブロックを空気乾燥させた後、再び微小硬度を測定する。パーセントとしての表面微小硬度回復(SMHL、再石灰化％)を、((微小硬度修復−微小硬度腐食)／(微小硬度無傷−微小硬度腐食))*100として計算する。微小硬度アッセイの結果は表4に示される。
【０１０８】
【表４】
2018534293.tif 000006
【０１０９】
表4から、BioMin 93が、酸腐食したエナメル質ブロックのエナメル質表面の再石灰化において有効であることが理解できる。全ての微小硬度試験について、右／内部対照側(こちら側も人工唾液に浸漬され、人工唾液に由来するある程度の修復を受けた)に由来する再石灰化パーセントが結果から差し引かれるため、上記のデータはHLPの示差的効果を示すことに留意されたい。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態が例示及び記載されているが、当業者には、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更及び改変を行い得ることが明らかであろう。
【図１】
2018534293.tif 000007
【配列表】
2018534293000001.app
【国際調査報告】
2018534293.tif 000008
2018534293.tif 000009