(57)【要約】  本発明は、バイオマーカーとしてプロエンケファリン又はそのフラグメントを用いて、慢性腎疾患（ＣＫＤ）のリスク予測のために適切な手段及び方法に関する。本発明のリスク予測は、健康な対象に対して、及び疾患、例えば高血圧、心血管疾患及びイベント、糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、又は自己免疫疾患を罹患している対象に対することを意図するものである。本発明の主題はまた、健康な及び罹患した個人における腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善の予測方法でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における慢性腎疾患（ＣＫＤ）の発症のリスクを予測するための方法であって、
ａ）前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン（Ｐｒｏ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
ｂ）前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、慢性腎疾患の発症のリスクとを相関させ、ここで閾値を超えるレベルが、慢性腎疾患の増大された発症のリスクを予測するものであること、
を含み
ここで前記対象が、
（ｉ）健康な対象、
（ｉｉ）ＣＫＤを有さない罹患した対象、を包含する群から選択される、
方法。
【請求項２】
前記ＣＫＤを有さない罹患した対象が、体液サンプルが得られた時点で、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、心臓血管疾患、心血管イベント、高血圧、及び/又は自己免疫疾患を有する対象の群を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、体液サンプルが採取された時点において、心血管イベント又は心血管疾患の病歴を有し、ここで前記心血管イベント又は心血管疾患が、心筋梗塞、脳卒中、急性心不全、冠動脈疾患、心不全、慢性心不全、及び慢性又は急性脳血管疾患に関連する心疾患を含む群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、体液サンプルが前記対象から採取された時点において、自己免疫疾患に罹患しているものとして診断されており、ここで前記自己免疫疾患は、シェーグレン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、重症筋無力症、関節の自己免疫性変性疾患、特に関節リウマチ、又は中枢神経系の自己免疫疾患を含む群から選択され、ここで前記対象が腎疾患を羅漢していない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、３ヶ月を超える期間、６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2超の推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）、かつ、３ヶ月を超える期間、腎損傷を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの追加のパラメータが決定され、ここで前記パラメータが、年齢、性別、収縮期血圧及び／又は拡張期血圧（ＳＢＰ及び／又はＤＢＰ）、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、肥満度指数、体脂肪量、除脂肪量（ｂｏｄｙ  ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、ウエスト周囲長、ウエストヒップ比、現在の喫煙、糖尿病遺伝、血清クレアチニンレベル、シスタチンＣレベル、心臓血管疾患（ＣＶＤ）、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、高密度リポコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、全血又は血漿グルコース、血漿インスリン、ＨＯＭＡ（インスリン（μＵ／ｍｌ）×グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）／２２．５）、及び／又はＨｂＡ１ｃ（％）を含む群から選択される、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子マーカーの状態を決定することをさらに含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
パラメータの群が決定され、前記群が：空腹時血糖、収縮期血圧、抗高血圧治療及び肥満度指数（ＢＭＩ）を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプル、又は前記サンプルのいずれかの抽出物を含む群から選択される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロエンケファリン濃度及び／又は体液に見出される他の物質の濃度が、非空腹又は空腹の対象において測定される、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、イムノアッセイにより決定される、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロエンケファリンフラグメントが、配列番号１〜１４に示される配列の何れかに定義されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロエンケファリンフラグメントが、プロエンケファリンＡ１１９−１５６（配列番号６）又はそのフラグメントを含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、慢性腎疾患の発症のリスクの進行をモニターするために、少なくとも１度、時点ｔ０において、及び任意に、少なくとも１度以上の続く時点（ｔ１...ｔｎ）において実施される、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ある閾値超のプロエンケファリンレベルを有する対象の体液が、ＣＫＤの発症について上昇したリスクを有するものとして分類され、ここでＣＫＤの発症についての上昇したリスクに関連する前記閾値が、３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに対する結合剤を用いることにより決定される、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロエンケファリンのレベルが、イムノアッセイ又は質量分析アッセイにより決定される、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
プロエンケファリン又はそのフラグメントに対して特異的に結合する結合剤が使用され、好ましくは、プロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体、抗体フラグメント、又は非Ｉｇ−スカフォールドを含む群から選択される、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記閾値が＜４１ｐｍｏｌ／Ｌであり、そして慢性腎疾患の低発症のリスクを示し、４１〜４９の範囲が、慢性腎疾患の中程度の発症のリスクを示し、そして＞４９ｐｍｏｌ／Ｌの閾値が、慢性腎疾患の高発症のリスクを示す、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及びアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）であるプロエンケファリンの領域内の２つの異なった領域に結合する２つの結合剤を含むアッセイが使用され、ここで前記領域のそれぞれが、少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アッセイ感度が、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、閾値を超える、好ましくは３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｐｍｏｌ／Ｌの閾値である場合、適切な治療的又は予防措置を選択する工程を実施することをさらに含む、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロエンケファリン又はそのフラグメントの決定が、慢性腎疾患の発症のリスクをモニターするために、２回以上実施される、請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、前記対象をリスクグループに階層化するために実施される、請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）健康な対象、又は
（ｉｉ）腎機能不全を有するか、又は有さない、罹患した対象における腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法であって、
前記方法が、以下の工程：
ａ）前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定する工程；及び
ｂ）前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、慢性腎疾患の発症のリスクとを相関させる工程であって、ここで請求項１〜２４の何れか１項に定義される閾値を超えるレベルが、腎機能又は腎不全の悪化の増大されたリスクを予測するものであり、そしてここで閾値以下のレベルが、腎機能又は腎機能不全の悪化のリスクが低いことを予測するものであり、任意には、請求項１〜２５の何れか１項に示される工程を含む、工程
を実施することを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法を実施するためのポイント−オブ−ケア装置（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｄｅｖｉｃｅ）であって、ここで前記ポイント−オブ−ケア装置が、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及び／又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）に対する少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含む、ポイント−オブ−ケア装置。
【請求項２７】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、ポイント−オブ−ケア装置を含み、ここで前記ポイント−オブ−ケア装置が、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）の何れかに対する少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患の分野、特に、健康又は明らかに健康な対象（例えば、非糖尿病対象、心血管疾患を有さない対象、等）、又は疾患、例えば高血圧、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、および/または心臓血管疾患を罹患している対象における（後者の対象は、ＣＫＤを罹患していない）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の発症のリスク、又は腎機能の悪化のリスクを、バイオマーカーとしてプロエンケファリン（Ｐｒｏ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）(ＰＥＮＫ)を用いて、予測するための方法に関するものであり、そのレベルは、本明細書に記載される方法により測定される。
【背景技術】
【０００２】
８〜１６％の世界的推定罹患率、及び開発途上国での不均衡な発症率の予想される増加のために、ＣＫＤは公衆衛生上の問題となっている。一般的に、ＣＫＤは糸球体濾過率（ＧＦＲ）及びアルブミン尿症を測定することにより同定され、そしてステージ分類される。ＣＫＤの病因は複雑であり、そして高血圧、糖尿病及びメタボリックシンドロームが病態生理学に関与していると思われる。腎機能は、循環におけるその役割から、血行動態（ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ）、血管、炎症及び代謝性疾患に影響を及ぼし、そして結果的に、低下した腎臓機能が心血管イベント、入院及び死亡の上昇したリスクと関連している。従って、低下した腎機能のスクリーニング及び早期検出が重要であり、そして従って、特定のグループ、例えば家族性素因を有する対象、並びに糖尿病、高血圧、心臓血管疾患、自己免疫疾患を有する患者のスクリーニングが推薦される。腎機能について通常使用されるマーカーは、クレアチニン及びシステインＣである。しかしながら、血清クレアチニン及び推定ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）は、ＣＫＤの高リスクの対象の同定に関しては、むしろ感受性が低い。従って、新しく且つより敏感なバイオマーカーの同定についての必要性がある。
【０００３】
１９７５年、エンケファリンが初めて発見された内因性オピオイドであった。それらは、第８染色体上のＰＥＮＫ遺伝子によりコードされ、そして他の神経ペプチドに類似しており、活性エンケファリンの生合成は、前駆体プレタンパク質プロエンケファリン（ＰＥＮＫ）のタンパク質分解性切断を含むいくつかの工程を包含し、それを通して、４コピーのメチオニン−エンケファリン及び１コピーの各ロイシン−エンケファリン、ヘキサ−及びオクタ−ペプチドが処理される。前駆体ＰＥＮＫは、神経細胞及び非神経細胞において身体全体で生成される。エンケファリンはほぼ４０年前に発見されたが、それらの役割はまだ十分には理解されていない。以前の２種の観察研究においては、エンケファリンは腎機能に関与していた。近年、ＰＥＮＫの血漿レベルが、急性心筋梗塞後の低下したｅＧＦＲ及び予後と関連することが観察された。
【０００４】
以前、プロエンケファリンの検出は、（ａ）対象における腎機能の診断又はモニターリング、又は（ｂ）対象における腎機能不全の診断、又は（Ｃ）罹患した対象における有害事象のリスクの予測又はモニターリング（前記有害事象は、腎不全、腎機能の喪失、及び末期腎疾患を含む腎機能障害の悪化、又は、腎不全、腎機能の喪失、及び末期腎疾患による死亡を含む群から選択される）、又は（ｄ）治療又は介入の成功の予測又はモニターリング、を補助しうる事が示された。しかしながら、プロエンケファリンが、健康、明らかな健康である対象、又は、例えばメタボリックシンドローム、心臓血管疾患、自己免疫疾患、高血圧、糖尿病を有する患者、又は後者の状態の発症について上昇したリスクを有するが、しかし、腎疾患、特にＣＫＤを罹患していない対象の慢性腎疾患の発症のリスクの予測においてバイオマーカーとして作用することは知られていなかった。
【０００５】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、特定の機能及び構造パラメータが決定された場合、急性腎障害（ＡＫＩ）及び急性腎疾患（ＡＫＤ）とは区別され得る。ＣＫＤは、３ヶ月超の期間、１．７３ｍ２当たり＜６０ｍｌ／分のＧＦＲ、及び３ヶ月を超える期間、腎損傷により特徴づけられるが（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，２０１３；Ｖｏｌ．３：１９−６２）、ＡＫＩにおいては、構造基準は必要とされないが、しかし血清クレアチニン（ＳＣｒ）の７日以内で５０％の上昇、又は０．３ｍｇ／ｄｌ（２６．５μｍｏｌ／ｌ）の増加、又は乏尿症が見られる。ＣＫＤのさらなる基準（３ヶ月を超える期間、以下のいずれか）は、腎損傷のマーカー、例えば増加した糸球体浸透性についてのマーカーとしてのアルブミン尿症（アルブミン排泄速度［ＡＥＲ］≧３０ｍｇ／２４時間；アルブミン：クレアチニン比［ＡＣＲ］≧３０ｍｇ／ｍｍｏｌ）；尿沈渣の異常（例えば、糸球体基底膜（ＧＢＭ）障害における正常赤血球細胞（ＲＢＣ）形態（赤血球大小不同）を有する単離された目に見えない（顕微鏡的）血尿、増殖性糸球体腎炎におけるＲＢＣキャスト、腎盂腎炎又は間質性腎炎におけるＷＢＳキャスト、タンパク質尿症の疾患における卵円形脂肪球又は脂肪キャスト）；電解質、及び管状障害に起因する他の障害；組織学又は推測により検出される異常（例えば、糸球体疾患（例えば糖尿病、自己免疫疾患、薬物、腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｉａ））、血管疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血、血管炎、血栓性細小血管症、細管間質性疾患）、例えば感染症、石、閉塞、薬物毒性、並びに嚢胞性及び先天性疾患）；イメージング（超音波、コンピューター断層撮影、同位体スキャンを伴って又は伴わない磁気共鳴、血管造影）により検出される構造異常（例えば多発性嚢胞腎、異形成腎臓、閉塞による水腎症、梗塞による皮質瘢痕化、腎盂腎炎又は膀胱尿管逆流に関連する腎盂腎炎又、浸潤性疾患による腎臓の腫大または腎臓の拡大、腎動脈狭窄、小及び高エコー腎臓；及び腎移植の病歴）である。さらに、ＡＫＤは、３カ月以下の期間、構造的腎損傷、及びＡＫＩ、又は３カ月以下の期間、１．７３ｍ２当たり＜６０ｍｌ／分のＧＦＲ、又はＧＦＲの≧３５％の低下、又は３カ月以下の期間、ＳＣｒの＞５０％の上昇にも見出される機能的基準により特徴づけられる。それらの異なった疾患の実体間の適切な区別は重要である。本発明は、驚くべきことには、健康な対象、明らかに健康な対象、自己免疫及び／又は心血管疾患、及び／又は高血圧及び／又は糖尿病及び／又はメタボリックシンドロームを有する対象におけるＣＫＤの発症のリスクの予測のための適切な新規マーカーを提供する。それらの患者グループにおける潜在的なリスクの早期検出が、特にＣＫＤの発症又はさらなる進行を予防するのに適切であり得る措置において、実質的な利益をもたらすことは明白である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の主題は、対象における慢性腎疾患（ＣＫＤ）の発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
ａ）前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
ｂ）前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで閾値を超えるレベルが慢性腎疾患の増大された発症のリスクを予測するものであること、含み、
ここで前記対象は、
（ｉ）健康な対象、
（ｉｉ）ＣＫＤを有さない罹患した対象を包含する群から選択される、
方法である。
【０００７】
（ｉ）及び（ｉｉ）、及び下記に言及されるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法に言及される対象は、好ましくは、３か月を超える期間、６０ ｍｌ/分/１．７３ ｍ2よりも高い推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）を有する。
【０００８】
本発明の主題は、対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで上昇したレベルが、ＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで前記対象は、健康な対象、明らかに健康な対象、疾患（例えば、体液のサンプルが得られる時点で、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、心血管疾患又は事象、高血圧、及び/又は自己免疫疾患）を有する対象を含む群であって、前記被験体は、腎疾患を罹患していない、方法である。
【０００９】
本発明の主題はさらに、対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで前記対象は、体液のサンプルが対象から採取される時点で急性心血管イベント又は心血管疾患の診断を有し、ここで前記心血管イベントは、心筋梗塞、脳卒中、急性心不全を含む群から選択され、そして前記対象は腎疾患に罹患しておらず、そして心血管疾患が冠動脈疾患、慢性又は急性の脳血管疾患に関連する心疾患を含む群から、又は動脈硬化症又は心不全、等の心臓イベントを引き起こす疾患から選択され、ここで前記心疾患に罹患している対象は、腎疾患に罹患していない、方法である。
【００１０】
本発明の主題はまた、対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで前記対象は、体液のサンプルが前記対象（腎疾患に罹患していない）から採取される時点で、自己免疫疾患の診断を有する、方法である。
【００１１】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで少なくとも１つの追加のパラメータが決定され、ここで前記パラメータは、年齢、性別、収縮期血圧及び／又は拡張期血圧（ＳＢＰ及び／又はＤＢＰ）、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、肥満度指数（ＢＭＩ）、体脂肪量、除脂肪量（ｂｏｄｙ  ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、ウエスト周囲長、ウエストヒップ比、現在の喫煙、糖尿病遺伝、血清クレアチニンレベル、シスタチンＣレベル、心臓血管疾患（ＣＶＤ）、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、高密度リポコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、全血又は血漿グルコース、血漿インスリン、ＨＯＭＡ（インスリン（μＵ／ｍｌ）×グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）／２２．５）、及び／又はＨｂＡ１ｃ（％）を含む群から選択され、任意にはさらに、遺伝子マーカーの状態の決定を含む、方法である。
【００１２】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで臨床及び実験室パラメータ群が決定され、前記群が、空腹時血糖、収縮期血圧、抗高血圧治療（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）及び肥満度指数を含む、方法である。
【００１３】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで前記プロエンケファリンフラグメントは、プロエンケファリンＡ  １１９−１５９（ＭＲ−ＰＥＮＫ；配列番号６）又はそのフラグメント、又はＭＲ−ＰＥＮＫ含有フラグメントを含む、方法である。ＭＲ−ＰＥＮＫ又はそのフラグメント、又はＭＲ−ＰＥＮＫ含有フラグメントは、イムノアッセイ又は質量分析法を用いて決定され得る。
【００１４】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで前記方法が、ＣＫＤの発症のリスクをモニターするために、少なくとも一度、時点ｔ０において、及び、少なくとも１又は２度以上、続く時点（ｔ１...ｔｎ）において、実施される、方法である。
【００１５】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで高められたレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであること、を含み、
ここで、明らかに健常な対象におけるプロエンケファリンの平均値と任意に比較した場合、特定の閾値レベルを超えるプロエンケファリンレベルを有する対象の体液が、ＣＫＤの発症について上昇したリスクを有するものとして分類される、方法である。本発明によれば、ＣＫＤの発症について上昇したリスクに関連する前記閾値は、３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｍｏｌ／Ｌであってもよい。
【００１６】
本発明の主題はまた、先の実施形態のいずれかで定義されたような対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、
・前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定し；そして
・前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させ、ここで上昇したレベルがＣＫＤの増大された発症のリスクを予測するものであり、前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、閾値を超える場合、好ましくはＣＫＤの発症の上昇したリスクに関連する閾値が、３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｍｏｌ／Ｌである場合、適切な治療又は予防措置を選択する工程をさらに実施すること、を含む方法である。
【００１７】
本発明の主題はまた、
（ｉ）健康な対象、又は
（ｉｉ）腎機能不全を有するか、又は有さない罹患した対象
における腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法であり、ここで前記方法は、以下の工程：
（ａ）前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定する工程；及び
（ｂ）前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善のリスクとを相関させる工程、を含み、ここで閾値を超えるレベルが、患者グループ（ｉ）又は（ｉｉ）における腎機能又は腎不全の悪化の増大されたリスクを予測する、方法である。本発明によれば、腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善の上昇したリスクに関連する前記閾値は、３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｍｏｌ／Ｌであってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
対象は、健康な対象、例えば９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２超、又は６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２超のｅＧＦＲを有するそれらの対象、明らかに健康な対象、例えば９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２超又は６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２超のｅＧＦＲを有するそれらの対象、疾患を有する（例えば、体液のサンプルが得られる時点で、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、心臓血管疾患、又は本明細書で定義されるイベント、高血圧、本明細書で定義される自己免疫疾患を有し、腎疾患を有していない）対象を含む、グループから選択され得る。上記方法を用いて分析され得る対象（ｉｉ）のグループはまた、急性腎障害（ＡＫＩ）を有するそれらの対象も含む。急性腎障害は、腎不全のみならず、腎臓への広範囲の損傷を包含する。本明細書に記載される実施形態の文脈において言及される腎機能又は腎機能障害の悪化又は改善を予測する方法に供されるＡＫＩ患者は、慢性腎疾患（６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満のｅＧＦＲを有する成人）、心不全、肝疾患、糖尿病、急性腎障害の病歴、乏尿（０．５ｍｌ／ｋｇ／時未満の尿排出量）、神経学的又は認知障害や身体障害（介護者に依存しているために体液への制限されたアクセスを意味してもよい）、血液量減少、過去１週間以内、特に血液量減少の場合の、腎毒性を有する薬剤（例えば、非ステロイド性抗炎症薬［ＮＳＡＩＤ］、アミノグリコシド、アンギオテンシン変換酵素［ＡＣＥ］阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト［ＡＲＢｓ］及び利尿薬）の使用、過去１週間以内のヨード化造影剤の使用、泌尿器閉塞の症状または病歴、又は閉塞となり得る状態、敗血症、早期警告スコアの低下、６５歳以上、高血圧症、を有するそれらの患者である。本明細書において使用される場合、用語「腎機能又は腎機能不全の悪化（ｗｏｒｓｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｋｉｎｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）」とは、ＲＩＦＬＥ基準に従って低重度のＡＫＩ等級からより重度の等級への変化を意味し、それは、血清クレアチニン及び尿出力（ＵＯ）の別の基準を包含する。血清クレアチニン基準に関しては、これは、「リスク段階」（高められたクレアチニン×１．５）から「損傷段階」（高められたクレアチニン×２）、又はさらに「障害段階」（高められたクレアチニン×３又は＞４ｍｇ／ｄＬのクレアチニン）又はそれ以上の悪化、場合によっては、ｅＧＦＲの低下を伴う変化を意味する。本明細書において使用される場合、用語「腎機能又は腎機能不全の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）」とは、逆方向への変化、例えば「損傷段階」から「リスク段階」又はそれよりよいものへの変化を意味する。
【００１９】
本発明の主題はまた、前段落に定義されるような方法であり、ここで少なくとも１つの追加のパラメータが決定され、前記パラメータは、年齢、性別、収縮期血圧及び/又は拡張期血圧（ＳＢＰ及び／又はＤＢＰ）、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、肥満度指数（ＢＭＩ）、体脂肪量、除脂肪量、ウエスト周囲長、ウエストヒップ比、現在の喫煙、糖尿病遺伝、血清クレアチニンレベル、シスタチンＣレベル、心臓血管疾患（ＣＶＤ）、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、高密度リポコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、全血又は血漿グルコース、血漿インスリン、ＨＯＭＡ（インスリン（μＵ／ｍｌ）×グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）／２２．５）、及び／又はＨｂＡ１ｃ（％）を含み、任意には、遺伝子マーカーの状態を決定することをさらに含む群から選択される。前段落に定義されるような方法に関連する本発明の１つの副実施形態によれば、前記群は、空腹時血糖、収縮期血圧、抗高血圧治療及びＢＭＩを含む。プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルは、イムノアッセイにより、又は任意の他の適切な方法、例えば質量分析アッセイを用いて決定され得る。前記方法においては、本開示に定義されたような、ＰＥＮＫ又はＭＲ−ＰＥＮＫ（配列番号６）又はそのフラグメントが、イムノアッセイの標的として使用され得る。
【００２０】
本発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、ここで前記方法は、腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善をモニターするために、少なくとも１度、時点ｔ０において、及び任意には、少なくとも１又は２度以上、続く時点（単数又は複数）（ｔ１...ｔｎ）において実施される。
【００２１】
本発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、ここで、明白に健康な対象におけるプロエンケファリンの平均値と、任意に、比較される場合、特定の閾値レベルを超えるプロエンケファリンレベルを有する対象の体液が調べられる。
【００２２】
本発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、ここでＰＥＮＫ又はそのフラグメントと特異的に結合する結合剤は、プロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体、抗体フラグメント、又は非Ｉｇ−スカフォールドを含む群から選択される。それらの方法においては、プロエンケファリンのアミノ酸配列［配列番号１］内の２つの異なった領域に結合する２つの結合剤を含むアッセイを用いることもまた可能である。本発明の好ましい実施形態によれば、前記２つの結合剤は、ＭＲ−ＰＥＮＫのアミノ酸配列［配列番号６］内の２つの異なった領域に結合する。本発明の最も好ましい実施形態によれば、前記２つの結合剤は、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及びアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）である、ＭＲ−ＰＥＮＫのアミノ酸配列［配列番号６］内の２つの異なった領域に結合し、ここで前記領域の個々は、少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。
【００２３】
発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、ここでアッセイは、本開示に定義されるようなプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定するために使用される。
【００２４】
発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、閾値を超える場合、好ましくは３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｐｍｏｌ／Ｌである場合、適切な治療又は予防措置を選択する工程を実施することをさらに含む。
【００２５】
発明の主題はまた、前段落に記載されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法でもあり、ここでプロエンケファリン又はそのフラグメントの前記決定が、複数回、実施される。
【００２６】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記健康な又は明らかに健康な対象は、ベースラインで６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２以上のｅＧＦＲを有する。本発明の文脈において、用語「健康的な（ｈｅａｌｔｈｙ）」とは、問題の対象が何れの疾患も罹患していないことを意味する。本発明の文脈において、用語「明らかに健康な（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｈｅａｌｔｈｙ）」とは、問題の対象が任意に診断された疾患を罹患していないか、又は本明細書において特定される疾患、すなわち高血圧、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は自己免疫疾患とは異なる疾患又は障害の診断を有し、腎疾患を罹患していないことを意味する。用語「健康な対象（ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」はまた、自発的臓器ドナーである対象、例えば潜在的腎臓移植ドナーである対象の群を含む。それらのドナーは、慢性腎疾患の上昇したリスクを有する腎臓移植ドナーとしてそれらの対象を除外するために、本発明の方法に従って試験され得る。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語「自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、身体に通常存在する物質及び組織に対する身体の異常免疫応答から発生する疾患に関するものであり、ここで前記自己免疫疾患は、シェーグレン病；腎臓の自己免疫疾患、例えばＳＬＥ、関節の自己免疫性変性疾患、特にリウマチ様関節炎；又は中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、皮膚の自己免疫疾患、例えば乾癬、及び何れか他の自己免疫疾患を含む群から選択される。
【００２８】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで、さらに、年齢、性別、収縮期血圧及び／又は拡張期血圧（ＳＢＰ及び／又はＤＢＰ）、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、肥満度指数、体脂肪量、除脂肪量（ｂｏｄｙ  ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、ウエスト周囲長、ウエストヒップ比、現在の喫煙、糖尿病遺伝、血清クレアチニンレベル、シスタチンＣレベル、及び以前の心臓血管疾患（ＣＶＤ）を含む群から選択される少なくとも１つの臨床学的パラメータが決定される。さらに、追加のパラメータは、例えば総コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）、低密度リポコレステリン（ＬＤＬ−Ｃ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、高密度リポコレステリン（ＨＤＬ−Ｃ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、全血又は血漿グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）、血漿インスリン（ｍＩＵ）、ＨＯＭＡ（インスリン＊グルコース／２２．５）、及び／又はＨｂＡ１ｃ（％）が決定されることが意図される。さらに、遺伝子マーカーの状態が、例えばゲノム全体の分析を用いて分析されることが意図される。組み合わせて、以下のパラメータ：プロエンケファリンレベル、空腹時血糖、収縮期血圧、抗高血圧治療及びＢＭＩを、ＣＫＤのリスク予測のための本明細書に記載される方法により、測定することが意図される。
【００２９】
本発明の１つの実施形態によれば、サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、唾液サンプル及び尿サンプル、又は上記サンプルのいずれかの抽出物を含む群から選択される。
【００３０】
プロエンケファリン又はそのフラグメントは、非空腹時又は空腹時の対象からのサンプルにおいて測定され得る。空腹時レベルは、採取の前、１０時間又は好ましくは１２時間の非食物摂取を意味する。
【００３１】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸の長さを有するプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、診断アッセイ、好ましくはイムノアッセイにより決定される。プロエンケファリンフラグメントは、プロエンケファリン１１９−１５９（配列番号６）を含むことができるか、又は上記の長さを有するその適切なフラグメントであり得る。
【００３２】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、ＣＫＤの発症のリスクをモニターするために、複数回実施される。前記モニターリングは、行われる予防及び／又は治療措置に対する前記対象の応答を評価するために実施され得る。
【００３３】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで前記方法は、下記にさらに定義されるように、前記対象をリスクグループに分類するために実施される。本発明の特定の実施形態によれば、前記方法が、対象をＣＫＤリスクグループ、例えばＣＫＤを発症する低リスク、中位のリスク又は高リスクを有するそれらのグループに分類するために使用される。ＣＫＤの発症についての低リスクとは、プロエンケファリン値が、ＣＫＤを発症しなかった健康な対象における所定値と比較して、実質的に上昇しないことを意味する。中位のリスクは、プロエンケファリンのレベルが、ＣＫＤを発症しなかった健康な対象における所定値と比較して、上昇した場合に存在するものであり、そして高リスクは、プロエンケファリンのレベルがベースライン測定で有意に上昇されており、そして続く分析で上昇し続ける場合に存在する。上昇した又は有意に上昇したレベルとは無関係に、対象は、低下したｅＧＦＲを有し得ない（すなわち、ｅＧＦＲは、＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2である）。
【００３４】
本発明の主題は、前記段落の何れかに定義されるようなＣＫＤの発症のリスクを予測するための方法であり、ここで本明細書に開示されるような「上昇したレベル（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌ）」のプロエンケファリン又はそのフラグメントを有する対象の体液は、一定閾値レベルを超えるレベルを有する。
【００３５】
用語、ＰＥＮＫのフラグメントとは、本明細書に記載される方法の何れか、例えばイムノアッセイ又は何れか他の方法、例えば分光測定、例えば質量分析を用いて検出され得る何れかのフラグメントを示す。好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくとも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸の長さを有する。特定のフラグメントがまた、配列表に開示され、そして例えば、本明細書に記載される方法、アッセイ及び結合剤を用いて検出され得るＭＲ−ＰＥＮＫ及びそのフラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ含有フラグメントを含む。
【００３６】
「上昇したレベル（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌ）」という表現は、一定の閾値レベルを超えるレベルを意味する。
【００３７】
閾値レベルは、ある状態（例えば、ＣＫＤ）を発症した対象からのサンプル、及び前記状態を発症しなかった対象からのサンプルを測定することにより決定され得る。閾値を決定する１つの可能性は、「正常な（ｎｏｒｍａｌ）」集団（例えば、肥満の状態を発症しなかった対象）及び「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」集団（例えば、肥満の状態を発症した対象）におけるその相対頻度に対する変数の値をプロットするレシーバ動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）の計算である。特定の状態を発症するか、又は発症しない対象のマーカーレベルの分布は、重複する可能性が高いであろう。そのような条件下で、試験は、「正常」と「疾患」とを、１００％正確に区別するものではなく、そしてその試験が正常と疾患とを区別できない重複の領域を示す。閾値が選択され、その閾値を超えて（又は閾値以下で、マーカーが「疾患」によりいかに変化するかに依存する）、試験は異常であると考えられ、そしてそれ以下で、試験は正常であると思われる。ＲＯＣ曲線下の領域は、認識された測定が、状態の正しい同定を可能にするであろう確率の尺度である。ＲＯＣ曲線は、試験結果が必ずしも正確な数値を示さない場合でも、使用され得る。結果をランク付けできる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」サンプルに対する試験結果は、程度に従ってランク付けされる（例えば、１＝低、２＝正常、及び３＝高）。このランク付けは、「正常」集団における結果と相関し、そしてＲＯＣ曲線が作成される。それらの方法は、当業界において良く知られている（Ｈａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８２．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４３：２９−３６）。好ましくは、閾値は、約０．５よりも大きな、より好ましくは約０．７よりも大きな、さらにより好ましくは約０．８よりも大きな、さらにより好ましくは約０．８５よりも大きな、及び最も好ましくは約０．９よりも大きなＰＯＣ曲線領域を提供するように選択される。本文脈において用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、所定の測定値の＋／−５％を示す。ＲＯＣ曲線の水平軸は、（１−特異性）を表し、それは偽陽性の割合と共に上昇する。曲線の縦軸は、感度を表し、それは真の陽性の割合と共に上昇する。従って、選択される特定のカットオフに対し、（１−特異性）の値が決定され得、そして対応する感度が得られる。ＲＯＣ曲線下の領域は、測定されたマーカーレベルが疾患又は状態の正しい同定を可能にする確率の尺度である。従って、ＲＯＣ曲線下の領域は、試験の有効性を決定するために使用され得る。オッズ比（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ）は、２つのバイナリーデータ値間の関連性又は非独立性の強度を記載する、効果サイズの尺度である（例えば、試験陽性グループにおいて発症する事象のオッズに対する、試験陰性グループで発症する事象のオッズの比率）。
【００３８】
閾値は、例えばＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析から得られ、ここで疾患の発症又は重度な状態及び／又は死亡の確率は例えば、集団中のそれぞれのマーカーの四分位数と相関する。この分析によれば、７５パーセンタル以上のマーカーレベルを有する対象は、本発明の疾患を罹患する有意に上昇したリスクを有する。この結果は、従来のリスク因子の調整を伴うＣｏｘ回帰分析によりさらに支持される。すべての他の対象に対する最高の四分位数は、本発明の疾患を罹患する上昇したリスク、又は重度の状態及び／又は死亡の確率と非常に有意に関連している。
【００３９】
他の好ましいカットオフ値は、例えば参照集団の９０、９５又は９９パーセンタイルである。７５パーセンタイルよりも高いパーセンタイルを用いることにより、同定される偽陽性対象の数を低めるが、しかし中位であるが、リスクは依然として高い対象を特定することはできないかも知れない。従って、「偽陽性」を同定することも犠牲にして、対象のリスクの大部分を同定するのにより適切であると思われるかどうか、又は中位のリスクのいくつかの対象を欠いていることを犠牲にして、高リスクの対象を主に同定するのにより適切であると思われるかどうかに依存して、カットオフ値を適合することができる。
【００４０】
そのような統計学的に有意なレベルをいかにして決定するかを当業者は知っている。
【００４１】
本発明の主題はまた、以下の工程を含む方法を実施するためのポイント−オブ−ケア（point-of-care）装置であり、該工程が：（ａ）前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定する工程；及び（ｂ）前記プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルと、ＣＫＤの発症のリスクとを相関させる工程、を含み、ここで上昇したレベルが、前記段落の何れかに言及される、ＣＫＤの高められた発症のリスクについての予測である。前記ポイント−オブ−ケア装置はまた、上記開示に定義されるような腎機能又は腎機能不全の悪化又は改善を予測するための方法にも使用され得る。
【００４２】
本発明の主題は、健康な及び罹患した対象におけるＣＫＤを発症する対象のリスクの予測において、マーカーとしてのプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）又はそのフラグメントの使用である。驚くべきことには、ＰＥＮＫ又はフラグメントが、ＣＫＤを発症するリスクの予測において強力で且つ非常に有意なバイオマーカーであることが示された。
【００４３】
本発明によれば、本明細書に記載される方法に使用される免疫反応性分析物は、ｌｅｕ−エンケファリンでなく、そしてｍｅｔ−エンケファリンでもない。特定の実施形態によれば、前記免疫反応性分析物は、少なくとも５個のアミノ酸を有する中間領域（ｍｉｄ−ｒｅｇｉｏｎａｌ）−プロエンケファリン（ＭＲ−ＰＥＮＫ）、又はそのフラグメントである。従って、体液中のプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する結合剤が本発明の方法に使用される場合、用語「前記対象から得られた体液中の少なくとも５個のアミノ酸のＰＥＮＫ又はそのフラグメントのレベルを決定する」とは、「前記対象から得られた体液中のＰＥＮＫのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を用いることにより免疫反応性分析物のレベルを決定する」と同等である。特定の実施形態によれば、体液中のＰＥＮＫのアミノ酸配列内の領域に結合する結合剤が、本発明の方法に使用される。特定の実施形態によれば、本発明の方法に使用される結合剤は、体液中のＬｅｕ−エンケファリン又はＭｅｔ−エンケファリンのアミノ酸配列内の領域に結合しない。本発明の別の特定の実施形態によれば、少なくとも１つの結合剤は、少なくとも５個のアミノ酸を有するＭＲ−ＰＥＮＫ又はそのフラグメントに結合する。
【００４４】
用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、本明細書において使用される場合、生存しているヒト又は非ヒト生物を言及する。好ましくは、本明細書においては、対象はヒト対象である。対象は、健康であり、明らかに健康であってもよく、それはＣＫＤを有さない罹患している対象であるか、又は特にことわらない限り、高血圧、肥満、心臓血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、及び自己免疫疾患を含む群から選択された、臨床的に現れた障害又は疾患の診断を有するものであってもよい。
【００４５】
前述の実施形態に関連して使用される場合、プロエンケファリン又はそのフラグメントの増大した濃度は、健康であるか、明らかに健康であるか、又は本明細書に言及される障害又は疾患の診断を有するが、しかしＣＫＤを有さない対象における、ＣＫＤの発症のリスクを示す。本発明の実施形態によれば、ＣＫＤの発症のリスクは、対象がプロエンケファリン又はそのフラグメントの増大した濃度を有し、そして同時に、＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2のｅＧＦＲを有する場合、高められる。さらなる実施形態によれば、ＣＫＤの発症のリスクは、本明細書に記載の方法が反復される場合、対象がプロエンケファリン又はそのフラグメントの増大した濃度を有し、そして同時に、＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2のｅＧＦＲを有し、そして対象が、空腹時グルコースの低下及び／又は血漿システインＣ及び／又はクレアチニンの上昇を伴う場合、高められる。例えば、患者がプロエンケファリン又はそのフラグメントの増大した濃度を有し、そして同時に、ベースライン（ｔ０）で＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2のｅＧＦＲを有し、並びに、プロエンケファリン又はそのフラグメントの増大した濃度を有し、そして同時に＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2のｅＧＦＲを有し、そして１又は２以上の後の時点（ｔ１、ｔ２、...ｔｎ）で、空腹時グルコースの低下及び／又は血漿システインＣ及び／又はクレアチニンの上昇を示す場合、ＣＫＤの発症のリスクは高まる。言い換えれば、リスク発症の進展は、本明細書に記載される方法を用いてモニターされ得る。
【００４６】
さらに、１又は２以上の後の時点（ｔ１、ｔ２...ｔｎ）での空腹時グルコースの低下及び／又は血漿システインＣ及び／又はクレアチニンの上昇を任意に伴う、プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルの上昇と組み合わせた、一定期間にわたってのｅＧＦＲの低下は、本明細書に記載される方法を用いて決定され得る。時間の経過とともに空腹時グルコースの低下及び／又は血漿システインＣ及び／又はクレアチニンの上昇を任意に従う、プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルのさらなる上昇は、ＣＫＤの発症の増大したリスクと関連している。
【００４７】
本発明の方法によれば、ベースライン測定（ｔ０）に続いて、必要に応じて、追加の測定（ｔ１〜ｔｎ）が、例えば、毎月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、等の間隔で実施され得る。２回の測定間の間隔は、同一である必要は無い。例えば、ｅＧＦＲが＞６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2であると共に、対象におけるベースライン（ｔ０）で、プロエンケファリンの上昇したレベルが測定される場合、次の測定（ｔ１）は、プロエンケファリンのレベルが低下するか、高められたレベルにて維持するか、又はさらに上昇するか否か、そして対応する医学的介入、すなわち、血圧を低める、タンパク質摂取を低下する、塩摂取を低下する剤、任意には、血清尿酸濃度を低めるための剤の投与、そして／又は、特定の生活習慣の改変、例えば、示される適切な塩、リン酸塩、カリウム及びタンパク質摂取を考慮した食事、体重の減少、より健康的体重の達成（国別の人口統計によれば、ＢＭＩ２０−２５）、喫煙の停止、心血管の健康及び耐性に適合する身体的活動の実施、等の改変、が所望されるか否かを検証するために、ｔ０の直後であってもよい。同様に、ＣＫＤの高められた発症のリスクに関連する重要な補因子の測定が空腹時グルコースの低下、及び／又は血漿システインＣ及び／又はクレアチニンの上昇を示す場合、本明細書に開示される何れかの方法による測定は、それらの因子の進行及びプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルをモニターするために、より短い間隔で反復されるべきである。
【００４８】
また、プロエンケファリン又はそのフラグメントの測定で得られる結果に基づいて、上記に開示されるような適切な医学的介入、及び／又は特定の生活習慣の改変、体重の減少、抗高血圧治療、抗糖尿病薬を用いる治療、免疫調節薬（例えば、メトトレキセート、コルチコステロイド、生物製剤、例えばＩＬ−６、ＩＬ−２等の免疫応答の校正に関与する免疫細胞又はサイトカインを標的化する、抗体又は他の結合剤又はモジュレーター（アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍｂａｂ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、等）による治療が実施され得る。従って、本明細書に記載される対象におけるリスク発症の予測のための測定方法に関するのみならず、適切に治療されていない場合、ＣＫＤの発症のリスクが上昇し得る障害、疾患又は臨床学的状態の治療又は予防方法にも関する。腎機能を支持するか又は置換する治療又は介入は、これだけには限定されないが、血液透析、腹膜透析、血液濾過及び腎移殖を含む、種々の腎代替療法（ｒｅｎａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）を含むことができる。
【００４９】
フォローアップ測定の間、プロエンケファリン又はそのフラグメントの相対的変化は、ＣＫＤの発症のリスクの改善（低下したプロエンケファリン又はそのフラグメント）及び悪化（増大したプロエンケファリン又はそのフラグメント）と相関する。
【００５０】
プロエンケファリン又はそのフラグメントは、腎機能／腎機能不全診断及びフォローアップ（ＮＧＡＬ、血液クレアチニン、クレアチニンクリアランス、システインＣ、ウレア）のための他のマーカーに比較して優れている。優位性（ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ）とは、より高い特異性、より高い感度及び臨床的エンドポイントへのより良い相関を意味する。また、この側面によれば、プロエンケファリン又はそのフラグメントは、上記臨床的マーカーよりも優れている。
【００５１】
本発明の１つの実施形態によれば、用語、プロエンケファリンのフラグメントはまた、Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリンも含むことが理解されるべきである。
【００５２】
本発明の主題はまた、少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが、少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに対する結合剤、少なくとも１つの結合剤を用いることにより決定される方法である。本発明の１つの実施形態によれば、前記結合剤は、少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体、抗体フラグメント、又は非−Ｉｇ−スカフォールドを含む群から選択される。特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。特定の実施形態によれば、前記結合剤は、エンケファリン−ペプチドＭｅｔ−エンケファリン（配合番号３）、及びＬｅｕ−エンケファリン（配列番号４）に結合しない。
【００５３】
特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列内の領域に結合する。別の特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列内の領域に結合する。別の非常に特異的な実施形態によれば、前記結合剤は、プロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ（配列番号６）に結合する。
【００５４】
プロエンケファリンは、以下の配列を有する。
配列番号１（プロエンケファリン１−２４３）
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFMRF
【００５５】
体液において決定され得るプロエンケファリンのフラグメントは、例えば以下のフラグメント群から選択され得る：
配列番号２（シネンケファリン、プロエンケファリン１−７３）
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
配列番号３（Ｍｅｔ−エンケファリン）
YGGFM
配列番号４（Ｌｅｕ−エンケファリン）
YGGFL
配列番号５（プロエンケファリン９０−１０９）
MDELYPMEPEEEANGSEILA
配列番号６（プロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ）
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
配列番号７（Ｍｅｔ−エンケファリン−Arg-Gly-Leu）
YGGFMRGL
配列番号８（プロエンケファリン１７２−１８３）
SPQLEDEAKELQ
配列番号９（プロエンケファリン１９３−２０３）
VGRPEWWMDYQ
配列番号１０（プロエンケファリン２１３−２３４）
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME
配列番号１１（プロエンケファリン２１３−２４１）
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFM
配列番号１２（Ｍｅｔ−エンケファリン−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）
YGGFMRF
【００５６】
Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリンを包含するプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルの決定は、Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリンを包含するプロエンケファリン又はそのフラグメントに対する免疫反応性が決定されることを意味する。結合の領域に依存して、Ｌｅｕ−エンケファリン及びＭｅｔ−エンケファリンを包含するプロエンケファリン又はそのフラグメントの決定のために使用される結合剤は、上記に示される複数の分子に結合することができる。従って、本発明によれば、上記ペプチド及びペプチドフラグメントの何れかのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤（すなわち、配列番号１〜１２の何れかの配列のプロエンケファリン及びフラグメント）を用いることによる免疫反応性分析物のレベルが、前記対象から得られた体液において決定され；そして臨床的関連性の特定の実施形態と相関される。
【００５７】
本発明の方法のよる特定の実施形態によれば、ＭＲ−ＰＥＮＫのレベルが決定される（配列番号６：プロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ）。
【００５８】
より特定の実施形態によれば、免疫反応性分析物のレベルが、ＭＲ−ＰＥＮＫに結合する少なくとも１つの結合剤を用いて決定され、そして続いて、本発明の上記実施形態と、臨床学的関連性の特定の実施形態とが相関され、例えば前記免疫反応性分析物のレベルと、対象におけるＣＫＤの発症のリスクとが相関される。他方では、上記分析物の何れかのレベルが、他の分析法、例えば質量分析により決定され得る。
【００５９】
特定の実施形態によれば、免疫反応性分析物のレベルが、少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントを含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を用いることにより決定される。特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。
【００６０】
特定の実施形態によれば、前記結合剤は、配列番号３で示されるエンケファリンペプチドＭｅｔ−エンケファリン、及び配列番号４で示されるＬｅｕ−エンケファリンに結合しない。
【００６１】
別の特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。
【００６２】
別の特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列を有する領域に結合する。
【００６３】
別の非常に特異的な実施形態によれば、前記結合剤は、プロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ（配列番号６）に結合する。
【００６４】
前述の結合剤は、前記対象から得られる体液における前記ペプチドに結合する。本発明の実施形態によれば、前記結合剤は、少なくとも５個のアミノ酸、又は少なくとも６個のアミノ酸、又は少なくとも７個のアミノ酸、又は少なくとも８個のアミノ酸、又は少なくも９個のアミノ酸、又は少なくとも１０個のアミノ酸、又は少なくとも１２個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体、抗体フラグメント、又は非−Ｉｇ−スカフォールドを含む群から選択される。
【００６５】
より特定の実施形態によれば、体液におけるプロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ（配列番号６）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を用いることによる免疫反応性分析物のレベルが、前記対象から得られる。
【００６６】
特定の実施形態によれば、プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルは、プロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体又はそのフラグメントを用いてイムノアッセイにより測定される。少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定するために有用であるイムノアッセイは、実施例に使用され、そして請求項に言及される工程を包含することができる。すべての閾値及び値は、実施例に従って使用される試験及び校正と相関させて見られるべきである。閾値の絶対値が、使用される校正により影響され得ることを、当業者は知っている。これは、本明細書に与えられるすべての値及び閾値が使用される校正に関して理解されるべきであることを意味する。
【００６７】
本発明によれば、プロエンケファリン又はそのフラグメントに対する結合剤は、抗体、例えばＩｇＧ、典型的な全長免疫グロブリン、又は例えば化学的にカップリングされた抗体（フラグメント抗原結合）としてのＨ鎖及び／又はＬ鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体フラグメント（限定されないが、例えばＦａｂミニ抗体、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体（例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２）を含むＦａｂフラグメント；ＣＨ3ドメインにより二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；例えば異種ドメインの助けによる多量体化を介して形成された、例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して形成された、二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、多量体化された多価及び／又は多特異的ｓｃＦｖフラグメント、二価及び／又は二特異的ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二特異的Ｔ細胞エンゲージャー）、三機能性抗体、多価抗体（例えば、Ｇ以外の異なるクラス）；単一ドメイン抗体、例えばラクダ又は魚免疫グロブリン由来のナノボディ、を含む）、から成る群から選択される。好ましい実施形態によれば、結合剤は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７０４７０号に示されるようにして調製された抗体である。
【００６８】
特定の実施形態によれば、プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルは、プロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する、下記に詳細に記載されるようなアプタマー、非−Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される結合剤を用いるアッセイにより測定される。プロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルを決定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1のプロエンケファリンに対する親和性定数を示し、好ましい親和性定数は１０9Ｍ-1以上、最も好ましくは１０10Ｍ-1以上である。当業者は、より高い用量の化合物の適用により、より低い親和性を補償すると思われ、そしてこの措置が本発明の範囲を逸脱するものではないことを知っている。結合親和性は、例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）で、サービス分析として提供されるＢｉａｃｏｒｅ法を用いて決定され得る。
【００６９】
ヒトプロエンケファリン対照サンプルは、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｉ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／から入手できる。アッセイはまた、合成（この実験については、本発明者は、合成ＭＲ−ＰＥＮＫ、配列番号６を使用した）、又は組換えプロエンケファリン又はそのフラグメントにより校正され得る。
【００７０】
抗体の他に、標的分子を複合体化する他の生物ポリマースキャフォールドは、当業界において周知であり、高い標的特異性の生物ポリマーの生成のために使用されて来た。例としては、アプタマー、シュピーゲルマー、アンチカリン及びコノトキシンを列挙できる。非−Ｉｇスキャフォールドは、タンパク質スキャフォールドであってもよく、そしてそれらはリガンド又は抗原に結合できるので、抗体模倣体として使用され得る。非−Ｉｇスキャフォールドは、テトラネクチンベースの非−Ｉｇスキャフォールド（例えば、米国特許第２０１０／００２８９９５号に記載される）、フィブロネクチンスキャフォールド（例えば、欧州特許第１２６６０２５号に記載される）、リポカリンベースのスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／１５４４２０号に記載される）；ユビキチンスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０７３２１４号に記載される）、トランスファーリングスキャフォールド（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（例えば、米国特許第２００４／００２３３３４号に記載される）、プロテインＡスキャフォールド（例えば、欧州特許第２２３１８６０号に記載される）、アンキリン反復ベースのスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１０／０６０７４８号に記載される）、マイクロタンパク質（好ましくはシスチンノットを形成するマイクロタンパク質）スキャフォールド（例えば、欧州特許第２３１４３０８号に記載される）、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインベースのスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０２３６８５号に記載される）、ＥＧＦＲ−Ａ−ドメインベースのスキャフォールド（例えば、国際公開第２００５／０４０２２９号に記載される）及びＫｕｎｉｔｚドメインベースのスキャフォールド（例えば、欧州特許第１９４１８６７号に記載される）を含む群から選択され得る。
【００７１】
ＣＫＤの発症のリスクを予測するための閾値は、３０〜８０ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３５〜６０ｐｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは４０〜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは４１〜４９ｐｍｏｌ／ＬのＭＲ−ＰＥＮＫであり得る。
【００７２】
１つの特定の実施形態によれば、プロエンケファリンのレベルは、イムノアッセイにより測定され、そして前記結合剤は、少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに対して結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【００７３】
１つの特定の実施形態によれば、使用されるアッセイは、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及びアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）を含むプロエンケファリン内の２つの異なったエピトープに結合する２つの結合剤を含み、ここで前記エピトープの個々は、４、５、６又は８個のアミノ酸を含む。
【００７４】
１つの実施形態によれば、プロエンケファリン又はそのフラグメントを決定するための前記アッセイの感度は、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜１０ｐｍｏｌ／Ｌ、及びより好ましくは＜６ｐｍｏｌ／Ｌである。
【００７５】
本発明の主題は、ＣＫＤの発症のリスクを予測するか又はモニターリングする方法において、対象から得られた体液における配列番号１−１２のペプチド及びフラグメントを含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内のエピトープに結合する少なくとも１つの結合剤の使用である。
【００７６】
本発明の１つの実施形態によれば、前記結合剤は、少なくとも５個のアミノ酸のプロエンケファリン又はそのフラグメントに結合する抗体、抗体フラグメント又は非−Ｉｇ−スキャフォールドを含む群から選択される。特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列を有するエピトープに結合する。特定の実施形態によれば、前記結合剤は、配列番号３で示されるエンケファリンペプチドＭｅｔ−エンケファリン、及び配列番号４で示されるＬｅｕ−エンケファリンに結合しない。特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号１、２、５、６、７、８、９及び１０を含む群から選択される配列中のエピトープに結合する。別の特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結合剤は、配列番号２、５、６及び１０を含む群から選択される配列を有するエピトープに結合する。別の非常に特異的な実施形態によれば、前記結合剤は、プロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫに結合する。さらなる特定の実施形態によれば、少なくとも１つの結合剤は、前記対象から得られた体液におけるプロエンケファリン１１９−１５９、中間領域プロエンケファリン−フラグメント、ＭＲ−ＰＥＮＫ（配列番号６）のアミノ酸配列内のエピトープに、より特定には、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及び／又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）に結合し、ここで前記エピトープの個々は少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。
【００７７】
従って、本発明の方法によれば、上記結合剤の免疫反応性のレベルは、前記対象から得られた体液において決定される。免疫反応性のレベルには、分析物への結合剤の結合反応により、定量的に、半定量的に又は定性的に決定される分析物の濃度を意味し、ここで好ましくは、結合剤は、少なくとも１０8Ｍ-1の分析物への結合の親和性定数を有し、そして結合剤は、抗体又は抗体フラグメント、又は非−ＩｇＧスキャフォールドであり得、そして結合反応はイムノアッセイである。
【００７８】
ＰＥＮＫ及びそのフラグメント、特にＭＲ−ＰＥＮＫを用いる本発明の方法は、健康な対象、明らかに健康な対象、又は前述のセクションに開示される障害又は疾患（例えば、高血圧、心臓血管疾患、自己免疫疾患、糖尿病またはメタボリックシンドローム、等）に罹患している患者におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するか又はモニターする従来の技術に従って使用される方法及びバイオマーカーよりもはるかに優れている。
【００７９】
前述の使用のためのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びそのフラグメントは、炎症とは無関係であるマーカーである。これは、ＮＧＡＬ及びＫＩＭ−１のような既知の腎臓バイオマーカーのほとんどは炎症依存性であるので、重要な特徴であり、これは、対象が例えば敗血症において炎症を有する場合、ＮＧＡＬ又はＫＩＭ−１の上昇が炎症又は腎機能／腎機能不全の何れかが原因であり得ることを意味する。従って、調査される特定の患者集団とは独立した単純なカットオフ値（１つの（１）カットオフ値を意味する）を少なくとも用いることなく、鑑別診断は行われ得ない。ＮＧＡＬ及びＫＩＭ−１に関しては、各患者及びすべての患者は、それらの腎臓マーカーの臨床学的適用を、いくつかの疾患においては困難にし、そして他においては不可能にする、前記対象の炎症状態に依存して、腎機能／腎機能不全についての「個々の（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」閾値を有する。それとは対照的に、対象の炎症状態とは独立した１つのシグナル閾値が、すべての対象について本方法に従って使用され得る。これは、上記マーカーとは対照的に、本方法を、臨床学的ルーチンに適合させる。本発明の方法におけるバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びそのフラグメント、特にＭＲ−ＰＥＮＫは、「真の」腎機能を反映する。対照的に、ＮＧＡＬ及びＫＩＭ−１は、腎損傷及び炎症の両者を反映する。
【００８０】
従って、本発明の主題は、ＣＫＤの発症のリスクを予測するか又はモニターリングするための方法であり、ここで炎症状態に依存しない閾値が使用される。
【００８１】
上記方法の別の利点及びバイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びそのフラグメントの使用は、バイオマーカーとしてのＰＥＮＫ及びフラグメントが、腎機能、腎機能不全、有害事象のリスク、治療又は介入の成功のための非常に初期のバイオマーカーであることである。非常に初期であることは、例えば、それがクレアチニンまたはＮＧＡＬよりも早期にＣＫＤを発症するリスクのある対象の体液中に存在することを意味する。
【００８２】
本発明の主題はまた、前述の実施形態の何れかに従って、対象におけるＣＫＤの発症のリスクを予測するか又はモニターリングするための方法でもあり、ここで単独で、又は他の予後的に有用な実験的又は臨床学的パラメータと一緒に、前記対象から得られた体液におけるプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルが使用され、ここで前記方法は以下の選択肢から選択され得る：
・「健康な」、又は「明らかに健康な」対象、好ましくは、さらなる臨床学的徴候を示さない、及び／又はＣＫＤの高められた発症のリスクに関連する因子（例えば、高収縮期血圧、高ＢＭＩ、空腹時高グルコース、高血圧、等）の実験マーカーを有さない対象の集団における所定のサンプルのアンサンブルにおける前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントのレベルの中央値との比較、
・上記に示されるような「健康な」又は「明らかに健康な」対象の集団における所定のサンプルのアンサンブルにおける前記対象から得られた体液中のプロエンケファリン又はそのフラグメントの分位値（ｑｕａｎｔｉｌｅ）との比較、
・Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析に基づく、又はリスク指標計算、例えばＮＲＩ（Ｎｅｔ  Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）又はＩＤＩ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏ  Ｉｎｄｅｓ）を用いることによる計算。
【００８３】
以下の群から選択される前記さらなる少なくとも１つの実験又は臨床学的パラメータが決定され得る：年齢、性別、全般的健康状態、体重、血糖値測定、アルブミン測定、ＮＧＡＬ、シスタチンＣ、クレアチニンクリアランス、クレアチニン、尿素及びアパッチスコア。
【００８４】
本発明の主題はさらに、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）及びアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）から成る、プロエンケファリンの２つの異なったエピトープ（前記各エピトープは少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む）に結合する２つの結合剤を含むサンプルにおけるプロエンケファリン及びそのフラグメントを決定するためのアッセイである。好ましい実施形態によれば、前記結合剤は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７０４７０号に示されるようにして調製された抗体である。
【００８５】
本発明の１つの実施形態によれば、それは、いわゆるＰＯＣ−試験（ポイント−オブ−ケア）、すなわち完全自動アッセイシステムの要件なしに、患者の近くで、１時間以内で試験の実施を可能にする試験技法であり得る。この技法についての１つの例は、免疫クロマトグラフィー試験技法である。
【００８６】
本発明の実施形態によれば、本明細書に開示される方法でのＰＥＮＫのレベルの決定は、好ましくは、イムノアッセイにより実施される。本発明の１つの実施形態によれば、そのようなアッセイは、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識（但し、それらだけには限定されない）を含む任意の種類の検出技法を用いたサンドイッチイムノアッセイ、好ましくは完全自動アッセイである。本発明の１つの実施形態によれば、そのようなアッセイは、酵素標識されたサンドイッチアッセイである。自動化された、又は完全に自動化されたアッセイの例は、以下のシステムの１つのために使用され得るアッセイを含む：Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）。
【００８７】
種々のイムノアッセイは、知られており、そして本発明のアッセイ及び方法のために使用され得、それらは以下を包含する：ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）、同種酵素増幅イムノアッセイ（「ＥＭＩＴ」）、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化免疫アッセイ（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティックイムノアッセイ及び免疫クロマトグラフィーアッセイ。
【００８８】
本発明の１つの実施形態によれば、前記２つの結合剤の少なくとも１は、検出されるよう標識される。好ましい検出方法は、種々の形式でのイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、及び迅速な試験フォーマット、例えば免疫クロマトグラフィーストリップ試験を含む。
【００８９】
好ましい実施形態によれば、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
【００９０】
アッセイは、同種又は異種アッセイ、競争及び非競争アッセイであり得る。１つの実施形態によれば、アッセイは、非競争イムノアッセイであるサンドイッチアッセイの形で存在し、ここで検出されるべき及び／又は定量化されるべき分子は、第１抗体及び第２抗体に結合されている。前記第１抗体は、固相、例えばビーズ、ウェル又は他の容器の表面、チップ又はストリップに結合され、そして前記第２抗体は、色素、放射性同位体、反応性又は触媒的活性成分により標識されている抗体である。次に、分析物に結合される、標識抗体の量は、適切な方法により測定される。「サンドイッチアッセイ」に関与する一般的な組成及び方法は、十分に確立されており、そして当業者に知られている。
【００９１】
本発明においては、蛍光に基づくアッセイは、色素の使用を含み、ここで前記色素は例えば、以下を含む群から選択され得る：ＦＡＭ（５−又は６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７、キサンテン、６−カルボキシ−２'，４'，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４,，５’−ジクロロ−２’，７’-ジメチルフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ色素、例えばＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、オレゴングリーン、クマリン、例えばウンベリフェロン、ベンズイミド、例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；フェナントリジン、例えばテキサスレッド、ヤキマイエロー、アレクサフルオロ、ＰＥＴ、エチジウムブロマイド、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、及び同様のもの。本発明の文脈においては、化学発酵に基づくアッセイは、（２４）において化学発酵材料について記載される物理的原理に基づく、色素の使用を含む。化学発酵標識は、アクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識などを含むステロイド標識であり得る。好ましい化学発酵色素は、アクリジニウムエステルである。
【００９２】
酵素標識は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸性ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び同様のものであり得る。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「アッセイ（ａｓｓａｙ）」又は「診断アッセイ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙ）」とは、診断の分野に適用される任意のタイプのものであり得る。そのようなアッセイは、特定の親和性を有する１又は２以上の捕捉プローブへの検出されるべき分析物の結合に基づかれ得る。捕捉分子と標的分子又は目的の分子との間の相互作用に関して、親和性定数は好ましくは、１０８Ｍ−１０よりも高い。
【００９４】
本発明においては、「結合剤分子（ｂｉｎｄｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」とは、標的分子又は目的の分子、すなわちサンプルからの分析物（すなわち、本発明においては、ＰＥＮＫ及びそのフラグメント）を結合するために使用される分子である。従って、結合剤分子は、標的分子又は目的の分子を特異的に結合するために、表面電荷、疎水性、親水性、ルイスドナー及び／又はアクセプターの存在又は非存在などの空間的特徴及び表面特徴の両方において適切に形成されるべきである。これにより、結合は例えば、イオン、ファンデルワールス、パイ−ｐｉ、シグマ−ｐｉ、疎水性又は水素結合相互作用又は捕捉分子と標的分子又は目的の分子との間の複数の前述の相互作用の組合せにより媒介され得る。本発明においては、結合剤分子は例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチド又は糖タンパク質を含む群から選択され得る。好ましくは、結合剤分子は、標的分子又は目的の分子に対して十分な親和性を有する抗体、例えばそのフラグメント、及び組換え抗体又は組換え抗体フラグメント、並びに少なくとも１２個の長さのアミノ酸を有する変異鎖由来の前記抗体又はフラグメントの化学的及び／又は生化学的に修飾された誘導体である。
【００９５】
本発明の１つの実施形態によれば、前記２つの結合剤の少なくとも１つは、固相、例えば磁気粒子及びポリスチレン表面に結合される。
【００９６】
本発明の１つの実施形態によれば、前記２つの結合剤の少なくとも１つは、検出されるよう標識される。標識の例は、上記に提供されている。
【００９７】
本発明の別の実施形態によれば、前記２つの結合剤の少なくとも１つは、固相に結合される。固相の例は、上記に提供されている。本発明のさらに別の実施形態によれば、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。本発明のさらなる主題は、本発明のアッセイを含むキットであり、ここで前記アッセイの成分は、１又は２以上の容器に含まれ得る。
【００９８】
１つの実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法を実施するためのポイント−オブ−ケア装置であり、ここで前記ＰＯＣ装置は、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）の何れかに対する、少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含み、ここで前記領域の個々が少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。
【００９９】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法を実施するためのポイント−オブ−ケア装置であり、ここで前記ＰＯＣ装置は、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）の何れかに対する、少なくとも２つの抗体又は抗体フラグメントを含み、ここで前記領域の個々が少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。
【０１００】
１つの実施形態によれば、本発明の方法を実施するためのキットであり、ここで前記ポイント−オブ−ケア装置は、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）の何れかに対する、少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含み、ここで前記領域の個々が少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。１つの実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法を実施するためのキットであり、ここで前記ポイント−オブ−ケア装置は、アミノ酸１３３−１４０（配列番号１３）又はアミノ酸１５２−１５９（配列番号１４）の何れかに対する、少なくとも２つの抗体又は抗体フラグメントを含み、ここで前記領域の個々が少なくとも４又は５個のアミノ酸を含む。
【実施例】
【０１０１】
実施例１−抗体の開発
【０１０２】
抗体を、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７０４７０号に示されるようにして調製した。
【０１０３】
実施例２−健康な対象におけるＰＥＮＫ
【０１０４】
健康な対象（ｎ＝４２１１、平均年齢５６歳）を、ＭＲ−ＰＥＮＫアッセイを用いて測定した。平均値は、４４．７ｐｍｏｌのＭＲ−ＰＥＮＫ  ｐｍｏｌ／Ｌであり、最低値は９ｐｍｏｌ／Ｌであり、そして９９パーセンタイルは、８０ｐｍｏｌ／Ｌであった。アッセイ感度は５．５ｐｍｏｌ／Ｌであったので、すべての健康な対象の１００％が、記載されるＭＲ−ＰＥＮＫアッセイを用いて検出できた。
【０１０５】
実施例３−得られた結果の臨床学的研究及び統計学的分析
【０１０６】
この研究のバックグラウンド集団は、１９２３年−１９４５年及び１９２３年−１９５０年に生まれた２３，０９８人の健康な男性及び女性が１９９１年−１９９６年のベースライン試験に参加したＭａｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎ，（Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ＭＤＣＳ）からの集団ベースの予測研究である。総参加率は約４０．８％であった。１９９１年−１９９４年にＭＤＣ心血管コホート（ＭＤＣ−ＣＣ）において、頸動脈疾患の疫学を研究するために企画された、追加の表現型検査を受けたＭＤＣＳのランダムに選択された６，１０３人の参加者が含まれた。フォローアップ再試験の間、このランダムサンプルを、２００７年−２０１２年のフォローアップ再試験に再招待した。生存しており、且つスウェーデンから移住していない３，７３４人の個人がフォローアップ再試験に参加した。ベースライン（ｎ＝１，４６０）で測定されたＭＲ−ＰＥＮＫレベルの無いすべての個人を排除した後、２，８０１人；２，８４３人及び２，９７８人の個人におけるｅＧＦＲ、血漿クレアチニン及び血漿システインＣの年間変化の間の関連性をそれぞれ試験し、これについては、測定値は、両試験で利用できた。ベースラインでのＭＲ−ＰＥＮＫを濃度と、フォローアップ再試験の存在との間の関係を、ベースラインで６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２よりも高いｅＧＦＲを有する合計２，５６７人の参加者において試験した。
【０１０７】
すべての参加者は、ベースライン試験の間、身体的な試験を受け、そして訓練された看護師により以下の人体特性を評価した：身長（ｃｍ）、体重（ｋｇ）、腰部及び腰囲。収縮期血圧及び拡張期血圧（ｍｍＨＧ）を、訓練を受けた個人により１０分間の休息の後、測定した。除脂肪量及び体脂肪を、生物電気インピーダンス分析（単一周波数分析、ＢＩＡ  １０３；ＪＲＬ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を用いて推定した。社会経済的地位、生活習慣要因、病歴に関する質問は、自己管理アンケートを介して参加者によって回答された。非空腹時血液サンプルを採取し、直ちに−８０℃に凍結し、そしてＤＮＡ抽出のために利用可能な生物学的バンクに保存した。ＭＤＣ−ＣＣの参加者は、血漿クレアチニン（μｍｏｌ／Ｌ）及びシステインＣ（ｍｇ／Ｌ）が測定される空腹時血液サンプルも提供した。さらに、総ＬＤＬコレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリグリセリド（ＴＧ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、低密度リポコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、高密度リポコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、全血グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）、血漿インスリン（μＵ／ｍｌ）、ＨＯＭＡ（インスリン＊グルコース／２２．５）、ＨｂＡ１ｃ（％）を定量化し、そして血圧を、１０分の休息の後、水銀柱血圧計を図いて、仰臥位で測定した。
【０１０８】
フォローアップ再試験の間（２００７年−２０１２年）、以下の人体特性を、ベースライン試験と同様のプロトコールに従って測定した：身長（ｃｍ）、体重（ｋｇ）、腰部及び腰囲（ｃｍ）、収縮期血圧および拡張期血圧（ＳＢＰ及びＤＢＰ）（ｍｍＨＧ）。さらに、コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＨＤＬ−Ｃ（ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）、クレアチニン（μｍｏｌ／Ｌ）、シスタチンＣ（ｍｇ／ｌ）の濃度を、空腹時血液サンプルにおいて定量化した。
【０１０９】
ＭＲ−ＰＥＮＫを、化学発光測定サンドイッチイムノアッセイを用いて、ＭＤＣ−ＣＣベースライン試験で４、６３４人の参加者からの空腹時サンプルにおいて測定した。１，４６０人の個人については、ＭＲ−ＰＥＮＫの空腹時血漿レベルは不足していた。それらはわずかに若く、より高い限界ＢＭＩ及び血漿クレアチニン、並びに低い収縮期血圧、空腹時グルコース及びＭＤＣベースラインでのＨｂＡｌｃ濃度を有したが、しかし性別、血漿脂質、シスタチンＣ又は抗高血圧治療頻度レベルにおいては、参加者では差はなかった（捕捉表Ｔ１）。正常分布を達成するために、本発明者らは、空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫの正に偏った濃度を自然対数により変換した。さらに、連続ＲＭ−ＰＥＮＫ濃度を三分位値（ｔｅｒｔｉｌｅｓ）に分け、第１三分位値（最低のＭＲ−ＰＥＮＫ濃度）を、基準として定義した。女性は男性に比較して、ベースラインで有意に高い平均ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度を有した（一方向ＡＮＯＶＡ  Ｐ値＜０．０００００１）という事実のために、ＭＲ−ＰＥＮＫの空腹時血漿レベルを最初に、性別特異的にグループ分けし、そして次に、それらのグループを組合した。ベースライン及びフォローアップ試験の両者で、血漿からのクレアチニン及びシステインＣの濃度を分析し、そしてそれぞれ、μｍｏｌ／Ｌ及びｍｇ／Ｌで表わした。ＣＫＤを、クレアチニン及びシステインＣの血液濃度を考慮して以前報告されているＣＫＤ−ＥＰＩ−２０１２等式に従って計算し、６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満の推定ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）の存在として定義した。
【０１１０】
統計学的分析
ベースラインでの空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度と、フォローアップ再試験でのＣＫＤのリスクとの間の関連性を、年齢、性別、ＧＦＲ（ｍｌ／分／１．７３ｍ2）の経過フォローアップの調整、及びベースラインでの腎機能についての一般的なリスク因子（収縮期血圧、ＢＭＩ（Ｋｇ／ｍ2）、空腹時グルコース及び抗−高血圧薬）の調整についてのロジスティック回帰を用いて分析した。
【０１１１】
式１：フォローアップの年間平均体重変化（ｋｇ）の例
【０１１２】
【数１】
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【０１１３】
ＳＰＳＳ（バージョン２１、ＩＢＭ）を、臨床学的疫学分析のために使用し、そしてすべての分析を、性別及び年齢について調整した。特定のモデルにおける共変量についての追加の調整を、結果セクションに報告している。０．０５未満の両側Ｐ−値が観察され、そしてその関係が統計学的に有意であると考えられる場合、ヌル仮説は拒絶された。
【０１１４】
ＭＤＣベースライン（１９９１−１９９４）でのＭＲ−ＰＥＮＫと腎機能との間のクロス・セクション分析。
高レベルのＭＲ−ＰＥＮＫは、高齢と有意に関連し、そして男性及び女性の両者においてはいくつかの人体的特性が低下する。さらに、ＴＧ、空腹時血漿グルコース、血漿インスリン及びＨＢｂＡ１ｃの濃度が、ＭＲ−ＰＥＮＫの上昇と共に低下した。クレアチニン及びシステインＣレベルは、最も高い三分位値の個人で有意に高かった（表１）。ＢＭＩ、体脂肪量、空腹時血漿グルコース濃度、除脂肪量、シスタチンＣ又はｅＧＦＲについての基本モデル（年齢及び性別）のさらなる調整は、それらの共変量の何れかが、ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度と、試験された表現型特性との間の観察される関連性を促進したことを明らかにしなかった。
【０１１５】
表１：ＭＲ−ＰＥＮＫレベルの三分位値と、Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ  ｂａｓｅｌｉｎｅ１（１９９１−１９９４）の表現型特性との間のクロス・セクション関係
【表１】
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【０１１６】
１平均及びＳＥとして；２ｐｍｏｌ／Ｌでの性別特異的ＭＲ−ＰＥＮＫ三分位値カットオフ、男性：低：平均３３．０８（１８．３０−３８．５０）、中：平均４２．４５（３８．６０−４６．６０）、高：平均５５．４５（４６．７０−１６４．７０）−女性：低：平均３７．０７（９．００−４３．００）、中：４７．４０（４３．１０−５１．７０）、高：平均６１．７１（５１．８０−５１８．１０）；３年齢及び性別について調整された一般的線形モデル；４空腹時全血を、因子１．１１による掛け算により血漿値に変換した；ＳＢＰ＝収縮期血圧；ＤＢＰ＝拡張期血圧；５Ｃｈi2−テスト
【０１１７】
ベースライン試験での空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度に関連したフォローアップ再試験での腎機能の予期される変化。
次に、ベースラインでの空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度と、ＭＤＣ−ＣＣからの２，９０８人の参加者におけるベースライン再試験とフォローアップ再試験との間の表現型特性の変化との関係を試験した。ｅＧＦＲの低下及びシステインＣ及び血漿クレアチニンの上昇は、経過観察、性別及び対応するベースライン値で年齢調整された線形モデルにおいて有意であった。ベースラインＭＲ−ＰＥＮＫ濃度の最も高い三分位値内に分類された年当たりのフォローアップ調査の男性及び女性に関して、ｅＧＦＲが１．５４３ｍｌ／分／１．７３ｍ2（Ｐtrend＜０．００１）低下し、一方でシステインＣ及び血漿クレアチニンは、それぞれ０．０２６ｍｇ／Ｌ（Ｐtrend＜０．０１）及び０．２２２μｍｏｌ／Ｌ（Ｐtrend＜０．００００１）上昇した（表２）。
【０１１８】
表２：Ｍａｌｍｏ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙでのフォローアップ再試験（２００９−２０１２）の間の、ベースライン試験（１９９１−１９９６）での空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫの三分位値と、腎機能及び他の臨床学的特性の年度別平均変化との関係
【表２】
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【０１１９】
１フォローアップでの年齢、ベースラインでの性別及び値について調整された一般的線形モデルにおいて；ＢＳＡ＝体表面積；２差異は、ベースライン空腹時全血を血漿値（ｘ因子  １．１１）に移して、計算された；ＳＢＰ＝収縮期血圧；ＤＢＰ＝拡張期血圧
【０１２０】
ベースラインでの空腹時血漿ＭＲ−ＰＥＮＫと、フォローアップ再試験でのＣＫＤとの間の関係の予測分析。
６０ｍｌ／分／１．７３ｍ2以上のｅＧＦＲに基づくＣＫＤの罹患率は、１６．６年（１３．４２−２０．３５の年の範囲）の中央値フォローアップ時間の間、２，５６７人の患者において３２．３％であった。フォローアップ時間の間の事象割合は、１９．４６人／１０００人−年であり、そしてＣＫＤの発生は、男性よりも女性において有意により共通していた（２０．９３人対１７．３１／１，０００人−年；Ｘ２  Ｐ値＜０．００１）。本発明者らは、基本的な調整されたロジスティック回帰モデルにおけるＭＲ−ＰＥＮＫレベルの上昇を伴って、フォローアップ再試験でのＣＫＤの有意なリスク発症率の上昇を観察した（ＯＲ：１ＳＤでの増加当たり１．１６５；Ｐtrend＝０．０１２）。ＭＲ−ＰＥＮＫの高いベースライン濃度を有する男性及び女性は、ベースラインで低レベルを有する個人に比較して、ＣＫＤの１／３高いリスク発生率を有した（ＯＲ：１．３４；９５％ＣＩ：１．０６１−１．７０１）。その関連性は、腎機能についてのさらなるリスク因子、例えば空腹時血漿グルコース、収縮期血圧、抗高血圧薬、及びベースラインでのＢＭＩを、１ＳＤ  ｐ−ＥＮＫ濃度の増加当たり１．２３６のＯＲ（Ｐtrend＜０．０１）を導くモデルに加える場合、より強力であった。ベースラインでの最低のＭＲ−ＰＥＮＫレベルに比較して、最高のＭＲ−ＰＥＮＫレベルを有する参加者は、ＣＫＤの５１．４％上昇したリスク発生率を有した（９５％ＣＩ  １．１８４−１．９３６）。性別特異的多変量調整分析が行われる場合、ベースラインでの高ＭＲ−ＰＥＮＫ濃度についてのリスク上昇は、女性において同等であるが（Ｐtrend＝０．００５）、ところが、男性においては、その傾向は類似するが、もはや有意ではなかった（Ｐtrend＝０．０８）。しかしながら、多変量調整モデルにおいて、性別のクロスプロダクト及びＭＲ−ＰＥＮＫ濃度の三分位値の導入は、ＭＲ−ＰＥＮＫ及び性別についての相互作用を示さなかった（Ｐtrend＝０．９９）。感度分析のために、ＣＫＤの潜在的なリスク因子としてＭＤＣベースラインでの糖尿病及びＣＶ疾患を有する一般的患者を除外し、残りの２、４５２人の結果は変化しなかった（ベースラインでの最高のＭＲ−ＰＥＮＫ濃度はＯＲ＝１．５２８；９５％ＣＩ  １．１８８−１．９６５）。
【配列表】
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【国際調査報告】
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