(57)【要約】本発明は、連続気相を伴うマイクロ流体チップにおいて水溶液の液滴を生成する方法及びシステムに関する。具体的には、本発明に係る液滴生成器は、マイクロ流体チップに統合され、水溶液の液滴を生成してマイクロ流体チップ内に導入する。チップチャネルのネットワーク内を移動する液滴は、チップチャネルの水力学的抵抗によって規定される様式で、オンチップトラップ内に捕捉することができる。マイクロ流体チップ上に捕捉された液滴に対して生物学的反応を行うことができる。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口マイクロチャネルを含むマイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、気相内に水滴を生成する方法であって、該方法は、
第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブ構造を設けることと、
キャピラリーを前記第１のバルブ入口内に前記バルブ出口へ向けて挿入することと、
外側導管に前記キャピラリーを通すことであって、前記キャピラリー及び前記外側導管は、前記入口マイクロチャネルと流体連通状態になることと、
前記第１の入口内において前記外側導管をシールすることと、
圧力を制御して、前記キャピラリーを通して前記入口マイクロチャネル内に水溶液を流すことによって、前記水溶液の液滴を形成することと、及び
前記第２の入口及び前記外側導管を通して前記入口マイクロチャネル内に前記気相を導入することであって、前記液滴は、前記内側キャピラリーの先端部に形成され、続いて、空気によって剪断されることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記気相は、前記外側導管を通して前記入口マイクロチャネル内に連続的に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャピラリーと前記第１のバルブ入口との間にシールを設けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キャピラリーを前記第１の入口に挿通する前に、該キャピラリーの入口をピペットチップの出口に取り付けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液を、ソレノイドバルブによって前記圧力を制御することにより、前記ピペットチップから前記キャピラリーを通して前記マイクロ流体チップの前記入口チャネル内に、空気により脈動させることを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キャピラリー及び前記外側導管は、前記入口マイクロチャネル内に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記内側キャピラリーと前記第１の入口との間の前記シールは、エポキシ樹脂によって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記外側導管を、エポキシ樹脂を用いて前記バルブ出口に対してシールすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロチャネルの前記ネットワークは、一連のループの繰返しを含み、該ループのそれぞれは、上枝及び下枝からなり、該下枝のそれぞれは、水力学式トラップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記下枝のそれぞれは、様々なチャネル幅及び幾何形状を有するチャネルで構成され、前記上枝のそれぞれは、一定幅を有するチャネルで構成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記下枝に対する前記上枝の特定の水力抵抗比は、前記上枝の前記長さを変更するとともに、前記下枝の前記幅を特定の値の設定に維持することによって得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記液滴を、直接捕捉又は間接捕捉を用いることにより、前記水力学式トラップ内に捕捉することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
捕捉された液滴を加熱することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ピペットは、１０μＬ容のピペットである、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記バルブは、Ｔ字路バルブであり、前記第２のバルブ入口は、前記第１のバルブ入口及び前記バルブ出口に対して垂直である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャピラリーは、７５μｍ〜２００μｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記外側導管は、３００μｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記気相を前記第２のバルブ入口を通して前記外側導管に導く前に、前記連続気相を加湿することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記水溶液を前記キャピラリーに連続的に導入するために、シリンジを前記キャピラリーの入口に取り付けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記マイクロ流体チップの前記マイクロチャネルは、ＰＤＭＳにより作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ネットワークにおける前記マイクロチャネルの側壁を、化学蒸着プロセスを通してパリレンでコーティングすることを更に含み、前記側壁は、パリレン蒸着の前にＰＤＭＳエッチング液によって粗面化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、連続気相内に水溶液の液滴を生成するシステムであって、該システムは、
第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブと、
前記第１のバルブ入口内に前記バルブ出口へ向けて挿入されるキャピラリーと、
前記キャピラリーが通され、前記第１の入口内においてシールされる外側導管であって、前記キャピラリー及び該外側導管は、前記マイクロ流体チップのマイクロ流体マイクロチャネルの前記ネットワークと流体連通状態になる、外側導管と、及び
前記水溶液を前記キャピラリー内に前記マイクロ流体チップの前記チャネルネットワーク内へと引き込むことにより、前記水溶液の液滴を形成する圧力調節器であって、前記液滴は、前記第２のバルブ入口及び前記外側導管を通して前記マイクロ流体チップの前記マイクロチャネル内に導入される前記気相によって剪断される、圧力調節器と、
を備える、システム。
【請求項２３】
前記キャピラリーと前記第１のバルブ入口との間にシールを更に備える、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記気相は、前記外側導管を通して前記入口マイクロチャネル内に連続的に導入される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記キャピラリーを前記第１の入口に挿通する前に、該キャピラリーの入口がピペットチップの出口に取り付けられる、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
前記水溶液は、ソレノイドバルブによって前記圧力を制御することにより、前記ピペットチップから前記キャピラリーを通して前記マイクロ流体チップの前記入口チャネル内に脈動される、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記キャピラリー及び前記外側導管は、前記入口マイクロチャネル内に挿入される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２８】
前記内側キャピラリーと前記第１の入口との間の前記シールは、エポキシ樹脂によって作製される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２９】
前記外側導管は、エポキシ樹脂を用いて前記バルブ出口に対してシールされる、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３０】
前記マイクロチャネルの前記ネットワークは、一連のループの繰返しを含み、該ループのぞれぞれは、下枝及び上枝からなり、該下枝のぞれぞれは、水力学式トラップを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３１】
前記下枝のぞれぞれは、様々なチャネル幅及び幾何形状を有するチャネルで構成され、前記上枝のぞれぞれは、一定幅を有するチャネルで構成される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記下枝に対する前記上枝の特定の水力抵抗比は、前記上枝の前記長さを変更するとともに、前記下枝の前記幅を特定の値の設定に維持することによって得られる、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３３】
前記液滴は、直接捕捉又は間接捕捉を用いることにより、前記水力学式トラップ内に捕捉される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３４】
捕捉された液滴を加熱する加熱素子を更に備える、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３５】
前記ピペットは、１０μＬ容のピペットである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項３６】
前記バルブは、Ｔ字路バルブであり、前記第２のバルブ入口は、前記第１のバルブ入口及び前記バルブ出口に対して垂直である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３７】
前記キャピラリーは、７５μｍ〜２００μｍの直径を有する、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３８】
前記外側導管は、３００μｍの直径を有する、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３９】
前記気相を前記第２のバルブ入口を通して前記外側導管内に導く前に、前記連続気相を加湿する加湿器を更に備える、請求項２２に記載のシステム。
【請求項４０】
前記水溶液を前記キャピラリーに連続的に導入するために、シリンジが前記キャピラリーの入口に取り付けられる、請求項２２に記載のシステム。
【請求項４１】
前記マイクロ流体チップの前記マイクロチャネルは、ＰＤＭＳにより作製される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項４２】
前記ネットワークにおける前記マイクロチャネルの側壁は、化学蒸着プロセスを通してパリレンでコーティングされ、前記側壁は、パリレン蒸着の前にＰＤＭＳエッチング液によって粗面化される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項４３】
入口マイクロチャネルを含むマイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、気相内に水滴を生成する方法であって、該方法は、
第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブ構造を設けることと、
内側チューブを前記第１のバルブ入口内に前記バルブ出口へ向けて挿入することと、
外側チューブに前記内側チューブを通すことであって、前記内側チューブ及び前記外側チューブは、前記入口マイクロチャネルと流体連通状態になることと、
前記外側チューブを前記第１の入口内においてシールすることと、
圧力を制御して、前記内側チューブを通して前記入口マイクロチャネル内に水溶液を流すことによって、前記水溶液の液滴を形成することと、及び
前記第２の入口及び前記外側チューブを通して前記入口マイクロチャネル内に前記気相を導入することであって、前記液滴は、前記内側チューブの先端部に形成され、続いて、空気によって剪断されることと、
を含む、方法。
【請求項４４】
マイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、連続気相内に水溶液の液滴を生成するシステムであって、該システムは、
第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブと、
前記第１のバルブ入口内に前記バルブ出口へ向けて挿入される内側チューブと、
前記内側チューブが通され、前記第１の入口内においてシールされる外側チューブであって、前記内側チューブ及び該外側チューブは、前記マイクロ流体チップのマイクロ流体マイクロチャネルの前記ネットワークと流体連通状態になる、外側チューブと、及び
前記水溶液を前記内側チューブ内に前記マイクロ流体チップの前記チャネルネットワーク内へと引き込むことにより、前記水溶液の液滴を形成する圧力調節器であって、前記液滴は、前記第２のバルブ入口及び前記外側導管を通して前記マイクロ流体チップの前記マイクロチャネル内に導入される前記気相によって剪断される、圧力調節器と、
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１５年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１６４３８１号に対する優先権の利益を主張するものであり、その米国仮特許出願の開示内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、マイクロ流体チップに組み込まれる液滴生成器に関する。具体的には、この液滴生成器は、連続気相を伴うマイクロ流体チップにおいて水溶液の液滴を生成する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の検出、及び生化学アッセイ等を行う能力は、医学、法科学、生産加工、作物及び動物の繁殖、並びに他の多くの分野において中核をなす。病態（例えば、癌）、感染性生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝子系統、遺伝子マーカー等を検出する能力は、疾患診断及び予後診断、マーカー利用選抜、事件現場の特徴の正確な特定、産業生物を繁殖させる能力、並びに他の多くの技術に遍在する技術である。対象の核酸の完全性を判断することは、感染症又は癌の病理に関連し得る。サンプル中のタンパク質又は他のマーカーの検出を含む他の生化学アッセイは、疾患及び障害検出と環境安全性との双方に関連する。
【０００４】
少量の核酸を検出する最も有力で基本的な技術のうちの１つは、核酸配列の一部又は全てを多数回複製し、その後、増幅産物を分析することである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）が、数ある異なる増幅技法のうちで最もよく知られているものであろう。
【０００５】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い断片を増幅させるのに有力な技法である。ＰＣＲを用いると、単一の鋳型のＤＮＡ分子から開始して、数百万のＤＮＡのコピーを素早く生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡを一本鎖に変性させ、その変性した鎖にプライマーをアニーリングし、そのプライマーを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長させるという３段階の温度サイクルを含む。このサイクルは、増幅されたＤＮＡのコピーが検出及び分析に十分となるように繰り返される。ＰＣＲについての全般的な詳細は、非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３を参照されたい。
【０００６】
マイクロ流体チップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試験を含む生化学アッセイを行う「ラボオンチップ（lab-on-chip）」デバイスのために開発されている。最大の成長分野は、分子生物学であり、この分野では、チップのシールチャネルにおいてＤＮＡ増幅が行われる。一般的には、光学検出デバイスが、経時的な増幅産物の増加を測定すること（リアルタイムＰＣＲ）及び／又は特定の遺伝子型の存在を特定するために熱融解を行うこと（高分解能融解曲線分析（High Resolution Thermal Melt））に用いられる。
【０００７】
液滴ＰＣＲは、当該技術分野においてよく知られており、従来は、油、フッ素化液体、又は他の任意の非水溶媒若しくは疎水性溶媒等の非混和性流体によって包囲された水滴の形態をとっていた。しかし、油相を用いる液滴ＰＣＲには、いくつかの欠点がある。油中水型液滴の使用には、標準的なＰＣＲに対比して追加の物質（すなわち、油、界面活性剤等）が必要であり、また、タンパク質が、油水界面において油との接触に起因して変性する可能性があり、マイクロ流体チャネルの表面への不可逆的なタンパク質吸着につながり得る。さらに、油の粘度により、他の物質によって達成し得るよりも遅い流速が余儀なくされる。
【０００８】
液滴ＰＣＲは、特に、ラボオンチップ用途で、貫流マイクロ流体チャネル（生化学反応がサンプルにおいて、静止時に行われる場合も、チャネルを通って流れる間に行われる場合もある）、及び液滴をマイクロ流体システム内に収めることができるトラップを組み込んでいるマイクロ流体システムの双方において用いられている。例えば、水力学式トラップが、非特許文献４において記載されている。
【０００９】
非特許文献４は、マイクロ流体システムにおいて液滴を捕捉及び収容するパッシブ型及びアクティブ型の双方の方法の使用を記載している。いくつかの例において、パッシブ型捕捉は、アクティブ型捕捉の場合よりも、多重化を可能にする拡張性が高いため好ましい。非特許文献４は、パッシブ型捕捉の２つの方法、すなわち、図１に示されているように、ループの一連の繰返しを含むマイクロ流体システムの上枝及び下枝の水力学的抵抗に基づく直接捕捉及び間接捕捉を記載している。図１に示されているように、液滴を捕捉するこのシステムは、上述したように油中水システムとともに動作するように設計されている。このようなシステムにおいて液滴を捕捉する効力は、液滴のサイズ及び液滴の間隔に左右され、油中水滴形成の精密制御を必要とする。油の流速は、このようなシステムの性能における主要因であり、システムパラメーターは、液滴の生成において用いられる特定の油又は他の界面活性剤に対して最適化する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sambrook and Russell, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)
【非特許文献２】Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2005)
【非特許文献３】PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis et al., eds., Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990)
【非特許文献４】Bithi and Vanapalli ("Behavior of a train of droplets in a fluidic network with hydrodynamic traps", Biomicrofluidics 4, 044110 (2010))
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、この技術分野において、これらの欠点を克服する、マイクロ流体チップにおいて用いる液滴を調製する代替的なシステム及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの態様において、マイクロ流体チップにおいて気相内に水滴を生成する方法が提供される。本方法は、第１の入口、第２の入口、及び出口を有するバルブを用いることによって実行される。具体的には、本方法は、キャピラリーを第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入することを含む。次のステップにおいて、外側導管にキャピラリーが通され、キャピラリー及び外側導管は、マイクロ流体チップの入口マイクロチャネルと流体連通状態になる。次に、外側導管は、第１の入口内においてシールされる。水溶液の液滴は、圧力を印加して、キャピラリーを通して入口マイクロチャネル内に水溶液を流すことによって形成される。本方法の次のステップは、第２の入口及び外側導管を通して入口マイクロチャネル内に気相を連続的に導入することに関する。液滴は、連続的に内側キャピラリーの先端部に形成され、続いて、空気によって剪断される。
【００１３】
本発明の更に別の態様において、マイクロ流体チップにおいて連続気相内に水溶液の液滴を生成するシステムが提供される。本システムは、第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブを備える。キャピラリーが、第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入される。キャピラリーが通され、第１の入口内においてシールされる外側導管が設けられる。キャピラリー及び外側導管は、マイクロ流体チップのマイクロ流体マイクロチャネルのネットワークと流体連通状態になるように構成されている。さらに、水溶液をキャピラリー内にマイクロ流体チップのチャネルネットワーク内へと引き込むことにより、水溶液の液滴を形成するために、圧力調節器が設けられる。液滴は、第２のバルブ入口及び外側導管を通してマイクロ流体チップのマイクロチャネル内に連続的に導入される気相によって剪断される。
【００１４】
本明細書の一部をなし、本明細書の一部を形成する添付図面は、本発明の種々の実施形態を示す。図面中、同様の参照符号は同一の要素又は機能が類似する要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】関連技術に係るマイクロ流体捕捉装置の概略図である。
【図２Ａ】トラップアレイの一連の構成のレイアウト図である。
【図２Ｂ】本発明の別の実施形態に係るトラップアレイの一連の構成のレイアウト図である。
【図３】トラップの寸法の概略図である。
【図４Ａ】直接水力式捕捉の概略図である。
【図４Ｂ】間接水力式捕捉の概略図である。
【図５Ａ】マイクロ流体チップを作製する方法を示すフローチャートである。
【図５Ｂ】液滴を分解するパリレンコーティングされたＰＤＭＳチャネルにおける流体の流れを示す図である。
【図５Ｃ】液滴が粗面側壁に沿ってスムーズに移動することが可能な、エッチング及びパリレンコーティングされた超疎水性チャネルにおける流体の流れを示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る並流液滴生成器の構成の図である。
【図７Ａ】マイクロ流体チップと流体連通状態にある本発明の一実施形態に係る並流液滴生成器の概略図である。
【図７Ｂ】液滴生成器内の圧力制御システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、複数の実施形態を有し、また当業者に既知の詳細については特許、特許出願及び他の引用文献に依拠する。したがって、特許、特許出願又は他の引用文献を本明細書中で引用する又は繰り返す場合、あらゆる目的でまた記載される陳述のため、引用することによりその全体が本明細書の一部となることを理解されたい。
【００１７】
本発明は、連続気相を伴うマイクロ流体チップにおいて水溶液の液滴を生成する方法及びシステムに関する。具体的には、本発明に係る液滴生成器は、マイクロ流体チップに統合され、水溶液の液滴を生成してマイクロ流体チップ内に導入する。液滴は、チャネルの寸法及び幾何形状によって規定されるチップチャネルの水力学的抵抗に基づいて、オンチップトラップにおいて捕捉される。マイクロ流体チップ上に捕捉された液滴に対して生物学的反応を行うことができる。
【００１８】
図２Ａは、トラップアレイの一連の構成を有するマイクロ流体チップ２０２のレイアウトを示している。マイクロ流体チップ２０２は、サンプル液滴を直接又は間接的に水力によって捕捉するように設計されている。ループ２１０は、サンプル液滴が各トラップ位置に連続して直面するアレイ状に配置されている。各ループ２１０は、サンプル液滴を捕捉するトラップ２１４を有する下枝と、捕捉された液滴を迂回する上枝（バイパス）とからなる。液滴の分解を回避するために、チャネルの幾何形状は、液滴を分解し得る凹角部及び急カーブを排除する設計となっている。具体的には、上枝は、弧状の形状であり、上側トラップ列と下側トラップ列とは、３つの直線マイクロチャネルではなく、Ｕターン部２１６によってつながっている。１つの実施形態において、下枝２０４は、様々なチャネル幅及び幾何形状で構成される。上枝２０６は、一定幅の矩形断面を有するループ形状のチャネルで構成される。ループ２１０は、マイクロ流体チャネル２１２によってつながっている。液滴生成器は、入口チャネル２０８を通してマイクロ流体チップ２０２に接続することができる。下枝及び上枝の水力学的抵抗ＲＵ及びＲＬは、チャネル及びトラップの幾何形状によって規定される。トラップは、トラップの出口部の方が入口部よりもはるかに狭くなるように設計されている。したがって、トラップを出るには、捕捉された液滴は、出口部を押し通るように大きい界面力に打ち勝たなければならない。液滴は、抵抗が最小の経路を通る。したがって、ＲＵ／ＲＬ＜１の場合、液滴はトラップを迂回する。その反対が当てはまる、ＲＵ／ＲＬ＞１の場合、液滴はトラップ内に保持される。
【００１９】
非限定的な例として、チャネル２１２及び２０８の高さは、約１００μｍ〜約３００μｍとすることができ、入口チャネル２０８の幅は、約３００μｍ〜約５００μｍとすることができ、それにより、液滴生成器を入口チャネル２０８に容易に挿入することが可能である。上枝２０６は、約１００μｍ〜約３００μｍ、好ましくは約２００μｍの一定幅の矩形チャネルで構成することができる。上枝（ＲＵ）対下枝（ＲＬ）の異なる水力抵抗比は、上側チャネルの長さを変更するとともに、設定された下側チャネルの幅を維持することによって得ることができる。１つの非限定的な実施形態において、下側チャネルの幅は、８５μｍに設定され、上枝の幅は、２００μｍに設定される。
【００２０】
図２Ｂは、本発明の別の実施形態に係るトラップ構成を示している。入口チャネル２０８は、チャネル２１２に向かってテーパー状に狭まり、図６に示されているような並流液滴生成器を、トラップ列と平行に入口チャネル２０８を通してマイクロ流体チップ２０２内に挿入することを可能にする。トラップは、連続的に列になって接続されているが、この列は、段状に接続されている。図２Ｂは、各列に３つのトラップを含む３つの列を有するトラップのレイアウトを示しているが、列の数及び各列におけるトラップの数は、図２Ｂに示されている実施形態によって限定されない。実際、列及びトラップの任意の選択した数を、マイクロ流体チップ２０２において液滴を捕捉するのに用いることができる。凹角部は液滴を分解しやすいため、トラップの出口部チャネル２１８は、凹角部が形成されないようにトラップの接続チャネル２２０へと延びている。列は、Ｕターン部２１６によってつながっている。１つの非限定的な実施形態において、入口チャネル２０８は、５００μｍ幅であり、一方、チャネル２１２は、３００μｍ幅である。
【００２１】
個別のループ２１０は、図３においてより詳細に示されている。具体的には、図３は、水力式トラップの寸法及び幾何形状を示している。トラップを迂回する上枝２０６は、チャネル区画ｄ１、ｄ２、及びｄ３からなる。トラップを通り抜ける下枝２０４は、チャネル区画ｃ１、ａ、ｂ、及びｃ２からなる。
【００２２】
表１は、１列目に明記されているように、セクションｄ１、ｄ３、ａ、ｂ、ｃ１、ｃ２の異なる長さ（Ｌｄ１、Ｌｄ３、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ１、Ｌｃ２）及び幅（Ｗｄ１、Ｗｄ３、Ｗａ、Ｗｂ、Ｗｃ１、Ｗｃ２）によって特徴付けられる、水力式トラップの異なる設計を示している。上側チャネル（枝）対下側チャネル（枝）の水力抵抗比ＲＬ／ＲＵが、各設計について計算され、表１の最終列に提示されている。具体的には、表１の最終列は、水力学式ループにおける区画ｄ１及びｄ３の長さＬを変更することによって調節された、下枝対上枝の５つの異なる抵抗の比ＲＬ／ＲＵを示している。
【００２３】
【表１】
2018522220.tif 000003
【００２４】
上側チャネル（枝）及び下側チャネル（枝）の異なるセクションに対する水力抵抗Ｒｎは、分析式を用いることにより推定することができる。セクションｄ１、ｄ２、ｄ３、ｃ１、ａ、ｂ、及びｃ２の直線矩形チャネルにおける水力抵抗の概算には、式（１）を用いた。
【００２５】
【数１】
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【００２６】
ここで、μは、空気の動粘度であり、Ｌは、チャネルセクションの長さであり、ｈ及びｗは、チャネルの高さ及び幅である（ｗ＞ｈ）。式（１）の精度は、合計して十分な数ｎの項を選択することによって達成される。例えば、非特許文献４を参照されたい。下側チャネルの方形部分（区画ｃ１及びｃ２）の水力抵抗を、式Ｒ＝２８．４７μＬ／ｈ４に従って推定した。上側チャネルの総抵抗ＲＵ及び下側チャネルの総抵抗ＲＬは、それぞれ、チャネル区画の抵抗の合計として計算することができる。
【００２７】
図４Ａは、マイクロ流体アレイにおける直接水力式捕捉手法を示している。代替的に、図４Ｂは、マイクロ流体アレイにおける間接水力式捕捉手法を示している。図４Ａ及び図４Ｂは、２つの異なる時点において示されるループ２１０（図２）を示している。具体的には、図４Ａにおいて、下側チャネル（枝）２０４の水力学的抵抗ＲＬが上側チャネル（枝）２０６の水力学的抵抗ＲＵよりも小さい場合、連続する液滴の中の第１の液滴は、下枝２０４に入って水力学式トラップ２１４内に捕捉される。液滴１が捕捉された場合、下枝２０４に捕捉された液滴１によって水力学的抵抗の増加が生じるため、後続の液滴２は上枝２０６を選ぶ。代替的に、図４Ｂにおいて、ＲＬがＲＵよりも大きい場合、第１の液滴は、上枝２０６に入り、移動する液滴１の水力学的抵抗に起因して流れを妨げるため、次の液滴２は、下枝２０４の水力学式トラップに入り、トラップ２１４内に捕捉され得る。続いて、次の液滴３は、上枝２０６に進む。
【００２８】
図５は、本発明の１つの実施形態に係るポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のマイクロ流体チップ２０２を作製する方法を示すフローチャートである。ステップ５０２〜５１０は、シリコンウェハー上に種型を作製することに関する。１つの非限定的な実施形態において、ネガ型フォトレジストＳＵ−８  ２０７５を用いて、型を作製することができる。ステップ５０２において、ウェハーは、まず、ピラニア溶液浴で洗浄し、濯ぎ、次いで脱水する。１つの非限定的な実施形態において、脱水は、１２０℃で１０分間行われ得る。２段階のスピンコートプロセス（ステップ５０４）を用いて、チップの特定の厚さを得ることができる。第１のコートを施すために、フォトレジストをウェハー上にスピンコートし、ソフトベークする。次に、フォトレジストの第２の層をスピンコートする。１つの非限定的な実施形態において、フォトレジストを２２５μｍの厚さにスピンコートし、次いで１００℃でソフトベークした。ウェハーを室温まで冷まし、その後、フォトレジストの第２の層を７５μｍの厚さにスピンコートした。第２の層を１００℃で２０分間ソフトベークした。スピンコートプロセスの後、ウェハーは、周囲の温度及び湿度において１時間再水和する。次に、ステップ５０６において、ウェハーをＵＶ光に露光する。１つの非限定的な実施形態において、ウェハーは、２５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に３０秒間露光した。露光後すぐに、ウェハーを６５℃で６分間及び９５℃で１６分間ベークした。ステップ５０８において、未硬化のネガ型フォトレジストを、デベロッパーを用いて軽く撹拌することで除去する。１つの非限定的な実施形態において、未硬化のフォトレジストＳＵ−８を、ＳＵ−８デベロッパーを用いて１８分間軽く撹拌することで除去した。ステップ５１０において、ウェハーを濯ぎ、その後、ベークした。１つの非限定的な例において、ウェハーをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及び脱イオン水で濯ぎ、その後、８０℃で一晩ベークした。
【００２９】
ステップ５１２において、ＰＤＭＳチップを、ステップ５０２〜５１０において作製された型を用いて作製した。１つの非限定的な実施形態において、ＰＤＭＳチップは、基剤と硬化剤とを１０：１の比で混合することによって作製した。厚さ５ｍｍの頂部部品を、ＳＵ−８種型において８０℃のオーブンで１０分間硬化させた。厚さ１ｍｍの底部部品を、ホットプレートを用いてクリーンなシリコンウェハー上に部分的に硬化させた。ホットプレートは、初めは室温であり、その後、ウェハーを配置した後に９０℃に設定した。約２０分後、ＰＤＭＳが僅かに粘着質であり、完全に硬化していないうちに、頂部部品を底部部品に接合し、更に１０分間硬化させた。
【００３０】
ステップ５１４において、チャネルの側壁を、超疎水性、耐蒸気性、又はその双方となるように改質する。１つの非限定的な実施形態において、超疎水性の壁は、ロータス効果によって、及び側壁をＰＤＭＳエッチング液（３：１のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）：フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ））を用いて２分間粗面化することによって形成された。エッチング液は、脱イオン水をチップ内に流すことによって除去する。耐蒸気性チャネルは、化学蒸着プロセスを通して側壁をパリレンでコーティングすることによって作製される。チャネルは、まず側壁をエッチングし、次いでパリレンでコーティングすることによって、超疎水性及び耐蒸気性の双方になる。
【００３１】
図５Ｂ及び図５Ｃは、パリレンでコーティングされたチャネルを通る流体の流れ（図５Ｂ）と、エッチング及びパリレンコーティングされた超疎水性チャネルを通る流体の流れ（図５Ｃ）との比較を示している。図５Ｂ及び図５Ｃによる各チャネルは、２つのループ２１０を有し、２つのループ２１０のそれぞれは、トラップ２１４と、上枝２０６と、下枝２０４とを備える。具体的には、図５Ｂは、液滴を分解するパリレンコーティングされたＰＤＭＳチャネルにおける流体の流れを示している。パリレンによるチャネルの改質は、ＰＤＭＳ側壁の表面エネルギーに影響を与えた。ＰＤＭＳは、接触角が１１５度の非常に疎水性の高い物質である。疎水性表面は、高い表面張力に起因して、水滴が分解するのを防ぐのに役立つ。図５Ａを参照して上述したように、パリレンは、ＰＣＲ中の蒸発を防ぐために、ＰＤＭＳチャネルにおいて非透湿バリアを形成するのに用いられる。しかし、接触角が９２度であるパリレンは、ＰＤＭＳよりも疎水性が低いことで、液滴の分解を引き起こし、その結果、チャネルの至る所にサテライト液滴が観察される。図５Ａに示されているステップ５１４を参照すると、超疎水性チャネルは、チャネル壁をエッチングし、その後、パリレンコーティングすることによって作製される。図５Ｃは、液滴が分解することなく粗面側壁に沿ってスムーズに移動することが可能な、エッチング及びパリレンコーティングされた超疎水性チャネルにおける流体の流れを示している。
【００３２】
マイクロ流体チップ２０２において連続気相内にサンプル水滴を生成するために、並流設計が、図６に示されているような本発明に係る液滴生成器において実施される。１つの非限定的な実施形態において、液滴生成器６０２は、Ｔ字路バルブ６０４と、ピペットチップ６０６と、外側導管６１０に通されたキャピラリー６０８とを備える。Ｔ字路バルブは、第１のバルブ入口６１２と、第２のバルブ入口６１４と、バルブ出口６１６とを有する。１つの非限定的な実施形態において、外側導管６１０は、５分硬化型エポキシ樹脂（5-minute epoxy）を用いてバルブ出口６１６に取り付けられる。キャピラリー６０８の入口は、ピペットチップ６０６の出口に取り付けられ、バルブ入口６１２から真っ直ぐバルブ出口６１６へと挿通される。第１のバルブ入口６１２は、キャピラリー６０８を通してマイクロ流体チップ２０２の入口チャネル２０８内に水溶液を導入するのに用いることができる。第２のバルブ入口６１４は、キャピラリー６０８が通された外側導管６１０を通してマイクロ流体チップ２０２の入口チャネル２０８内に空気を導入するのに用いることができる。ピペットチップ６０６に取り付けられたキャピラリー６０８が、バルブ入口６１２内に挿入されて、バルブ出口６１６を通って出た後、キャピラリー６０８の周囲及びバルブ出口６１６内にシールが設けられる。１つの非限定的な実施形態において、シールは、エポキシ樹脂によって作製することができる。次に、外側導管６１０にキャピラリー６０８が通される。非限定的な例として、エポキシシールが、外側導管６１０とバルブ出口６１６との間に設けられる。非限定的な例として、外側導管６１０の幅は、３００μｍとすることができる。
【００３３】
水溶液は、負圧を用いることでキャピラリー６０８及びピペットチップ６０６内に引き込まれる。具体的には、ピペットチップは、低圧で脈動させることで、キャピラリー６０８を通して水溶液を空気により脈動させ、キャピラリーの先端部に液滴を形成する。低い空気圧は、ソレノイドバルブによって制御される。同時に、Ｔ字路バルブ６０４は、キャピラリー６０８を被覆している外側導管６１０から流れ出る低圧の空気によって満たされる。１つの非限定的な実施形態において、１０μＬ容のピペットを、０．０５バール未満の低圧で７０ｍ秒で脈動させる。この実施形態において脈動される水溶液は、個々の流体液滴を生成する方法を提供する。
【００３４】
更に別の実施形態において、シリンジを用いて水溶液をキャピラリー６０８内に導入する。１つの非限定的な実施形態において、液滴水溶液は、０．２μｍのフィルターで濾過した脱イオン水からなるものとした。水溶液は、シリンジポンプによって１０μＬ／分の速度でキャピラリー６０８内に注入した。０．０５バール未満の連続気相を、バルブ入口６１４内に入り、外側導管６１０から出るように導いた。本実施形態における水溶液の連続的な流れは、流体液滴を連続的に生成する方法を提供する。
【００３５】
図７Ａは、本発明の１つの実施形態に係る、マイクロ流体チップ２０２（図２）に接続された並流液滴生成器６０２（図６）の構成である。具体的には、外側導管６１０に通されたキャピラリー６０８は、マイクロ流体チップ２０２の入口チャネル２０８内に挿入される。外側導管６１０には空気が満たされており、一方、キャピラリー６０８には水溶液が満たされている。シール６１２が、外側導管６１０と入口マイクロチャネル２０８との間に設けられる。
【００３６】
図７Ｂは、液滴生成器６０２と連通状態にある圧力制御システムの概略図である。本発明の１つの実施形態によれば、水溶液は、ピペットによって負圧を印加することにより、キャピラリー６０８及びピペットチップ６１８内に引き込むことができる。連続気相は、第２のバルブ入口６１４を通して外側導管６１０内に導く前に、貯水器７０８を用いることにより加湿される。低い空気圧が印加され、キャピラリーを通して水溶液を空気により脈動させる。非限定的な例において、印加される圧力は、０．０５バールよりも低く、ソレノイドバルブ７０２及び圧力調節器７０４によって制御される。水溶液の液滴がキャピラリー６０８の先端部に生成されると、バルブ６０４は、それと同時に、圧力調節器７０６によって制御された低圧の空気で満たされる。この空気は、キャピラリー６０８を被覆している外側導管６１０から流れ出る。したがって、圧力調節器７０７は、水溶液をキャピラリー内にマイクロ流体チップの入口チャネル２０８内へと引き込むことにより、水溶液の液滴を形成するように構成されている。液滴は、外側導管を通してマイクロ流体チップの入口チャネル２０８内に連続的に導入される気相によって剪断される。
【００３７】
オンチップで生成される液滴は、操作することも可能でなければならない。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、液滴は、蛍光測定用の撮像を行うために静止状態に保持される場合がある。液滴生成器６０２と連通状態にあるマイクロ流体チップ２０２は、図４Ｂに示されているような、間接捕捉手法に対応する幾何学的寸法（ＲＬ＞ＲＵ）を有するように構成することができる。この構成では、水溶液の液滴は、連続的にキャピラリー６０８の先端部に形成され、続いて、外側導管６１０から出る空気によって剪断される。図４Ｂを参照すると、剪断された液滴は、キャピラリーの先端部に形成される後続の液滴によってもたらされる空気流の減少に起因して、チャネルの有限距離にわたって移動する。上側チャネル２０６内で動かない先頭の液滴１は、上側チャネルの水力抵抗を下側チャネル２０４に対して増加させる。したがって、液滴２は、出口が塞がれることにより下側チャネルの水力抵抗が上側チャネルに対して増加するまで、下側チャネルのトラップ２０４を満たす。その場合、先頭の液滴１は、続けて上側チャネル２０６を通る。後続の遅れてくる液滴３は、トラップ２１４が液滴２で満たされている下側チャネルを迂回する。
【００３８】
本発明によるチャネルの改質は、ＰＤＭＳ側壁の表面エネルギーに影響を与える。ＰＤＭＳは、接触角が１１５度の疎水性物質である。疎水性表面は、高い表面張力に起因して、水滴が分解することを防ぐのに役立つ。したがって、サテライト液滴の形成及び液滴の分解を回避することができる。パリレンが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中の蒸発を防ぐために、ＰＤＭＳチャネルにおいて非透湿バリアを形成するのに用いられる。しかし、パリレンは、ＰＤＭＳよりも疎水性が低い（接触角＝９２度）。パリレンコーティングされたＰＤＭＳチャネルの表面エネルギーは、パリレン蒸着の前にＰＤＭＳエッチング液で側壁を粗面化することによって低下させることができる。粗面側壁はロータス効果に起因して超疎水性となるため、液滴は、分解することなく粗面側壁に沿ってスムーズに移動する。したがって、本発明に係るマイクロ流体チップと組み合わされた液滴生成器は、マイクロ流体チップ上で捕捉された液滴に対して生物学的反応を行うのに用いることができる。連続気相は、タンパク質が空気／水界面においてより遅く変性するため、油相の代わりになる。本発明に係るマイクロ流体機構において、水相は、連続気相内に「滴下」される。本発明の空気／水システムは、液滴生成器をマイクロ流体チップに統合することと、水滴をチップ上の規定のマイクロトラップ内に捕捉することとを可能にする。
【００３９】
したがって、１つの実施形態において、入口マイクロチャネルを含むマイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、気相内に水滴を生成する方法が提供される。別の実施形態において、第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブ構造が提供される。別の実施形態において、内側チューブが、第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入される。別の実施形態において、外側チューブに内側チューブが通され、内側チューブ及び外側チューブが入口マイクロチャネルと流体連通状態になる。別の実施形態において、外側チューブは、第１の入口内においてシールされる。更なる一実施形態において、圧力を制御して、内側チューブを通して入口マイクロチャネル内に水溶液を流すことによって、水溶液の液滴を形成する。更なる一実施形態において、気相は、第２の入口及び外側チューブを通して入口マイクロチャネル内に導入され、液滴は、内側チューブの先端部に形成され、続いて、空気によって剪断される。
【００４０】
別の実施形態において、マイクロチャネルのネットワークを有するマイクロ流体チップにおいて、連続気相内に水溶液の液滴を生成するシステムが提供される。１つの実施形態において、本システムは、（ｉ）第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブと、（ｉｉ）第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入される内側チューブと、（ｉｉｉ）内側チューブが通され、第１の入口内においてシールされる外側チューブであって、内側チューブ及び外側チューブは、マイクロ流体チップのマイクロ流体マイクロチャネルのネットワークと流体連通状態になる、外側チューブと、（ｉｖ）水溶液を内側チューブ内にマイクロ流体チップのチャネルネットワーク内へと引き込むことにより、水溶液の液滴を形成する圧力調節器であって、液滴は、第２のバルブ入口及び外側導管を通してマイクロ流体チップのマイクロチャネル内に導入される気相によって剪断される、圧力調節器とを備える。
【００４１】
本発明の更に別の実施形態において、マイクロ流体チップにおいて気相内に水滴を生成する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、第１の入口と、第２の入口と、出口とを有するバルブを用いることによって実行される。別の実施形態において、バルブは、Ｔ字路であり、第２のバルブ入口は、第１のバルブ入口及びバルブ出口に対して垂直である。
【００４２】
１つの実施形態において、本方法は、キャピラリーを第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入することを含む。１つの実施形態において、キャピラリーは、約１０μｍ〜約３００μｍ、好ましくは約７５μｍ〜約２００μｍの直径を有する。別の実施形態において、外側導管にキャピラリーを通すことができ、キャピラリー及び外側導管は、マイクロ流体チップの入口マイクロチャネルと流体連通状態になる。別の実施形態において、外側導管は、第１の入口内においてシールされる。１つの実施形態において、外側導管は、約２０μｍ〜５００μｍ、好ましくは約３００μｍの直径を有する。水溶液の液滴は、圧力を印加して、キャピラリーを通して入口マイクロチャネル内に水溶液を流すことによって形成することができる。更なる一実施形態において、気相は、第２の入口及び外側導管を通して入口マイクロチャネル内に連続的に導入され、液滴は、連続的に内側キャピラリーの先端部に形成され、続いて、空気によって剪断される。別の実施形態において、連続気相は、第２のバルブ入口を通して外側導管内に気相を導く前に加湿される。
【００４３】
本発明の更に別の態様において、マイクロ流体チップにおいて連続気相内に水溶液の液滴を生成するシステムが提供される。システムは、第１のバルブ入口と、第２のバルブ入口と、バルブ出口とを有するバルブを備える。別の実施形態において、バルブは、Ｔ字路であり、第２のバルブ入口は、第１のバルブ入口及びバルブ出口に対して垂直である。
【００４４】
１つの実施形態において、本システムは、第１のバルブ入口内にバルブ出口へ向けて挿入されるキャピラリーを備える。１つの実施形態において、キャピラリーは、約１０μｍ〜約３００μｍ、好ましくは約７５μｍ〜約２００μｍの直径を有する。別の実施形態において、本システムは、キャピラリーが通された外側導管を提供する。別の実施形態において、外側導管は、第１の入口内においてシールされる。１つの実施形態において、外側導管は、約２０μｍ〜５００μｍ、好ましくは約３００μｍの直径を有する。キャピラリー及び外側導管は、マイクロ流体チップのマイクロ流体マイクロチャネルのネットワークと流体連通状態になるように構成されている。更なる一実施形態において、水溶液をキャピラリー内にマイクロ流体チップのチャネルネットワーク内へと引き込むことにより、水溶液の液滴を形成するために、圧力調節器が設けられる。液滴は、第２のバルブ入口及び外側導管を通してマイクロ流体チップのマイクロチャネル内に連続的に導入される気相によって剪断される。別の実施形態において、連続気相は、第２のバルブ入口を通して外側導管内に気相を導く前に加湿される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、キャピラリーと第１のバルブ入口との間にシールが設けられる。更なる一実施形態において、内側キャピラリーと第１の入口との間のシールは、エポキシ樹脂によって作製される。更に別の実施形態において、キャピラリー及び外側導管は、入口マイクロチャネル内に挿入される。更なる一実施形態において、外側導管は、エポキシ樹脂によってバルブ出口に対してシールされる。
【００４６】
更なる一実施形態において、気相は、外側導管を通して入口マイクロチャネル内に連続的に導入される。
【００４７】
別の実施形態において、キャピラリーを第１の入口に挿通する前に、キャピラリーの入口がピペットチップの出口に取り付けられる。いくつかの実施形態において、ピペットは、１０μＬ容のピペットである。更なる一実施形態において、水溶液は、ソレノイドバルブによって圧力を制御することにより、ピペットチップからキャピラリーを通してマイクロ流体チップの入口チャネル内に、空気により脈動される。
【００４８】
更に別の実施形態において、水溶液をキャピラリーに連続的に導入するために、シリンジがキャピラリーの入口に取り付けられる。
【００４９】
更に別の実施形態において、マイクロチャネルのネットワークは、一連のループの繰返しを含み、各ループは、上枝及び下枝からなり、各下枝は、水力学式トラップを備える。いくつかの実施形態において、各下枝は、様々なチャネル幅及び幾何形状を有するチャネルで構成され、各上枝は、一定幅を有するチャネルで構成される。例えば、いくつかの実施形態において、下枝は、約５０μｍ〜約５００μｍ、より好ましくは約８５μｍ〜約４００μｍ、より好ましくは約１００μｍ〜約３００μｍ、及び好ましくは約２００μｍのチャネル幅を有することができる。他の実施形態において、上枝は、約５０μｍ〜約５００μｍ、より好ましくは約８５μｍ〜約４００μｍ、より好ましくは約１００μｍ〜約３００μｍ、及び好ましくは約２００μｍのチャネル幅を有することができる。本発明によって具現されるチャネルの長さ及び幅の例は、表１に見ることができる。
【００５０】
他の実施形態において、上枝対下枝の特定の水力抵抗比は、上枝の長さを変更するとともに、下枝の幅を特定の値の設定に維持することによって得られる。例えば、いくつかの実施形態において、水力比は、０．５〜約２．０、好ましくは約０．９〜約１．６とすることができる。
【００５１】
別の実施形態において、液滴は、直接捕捉又は間接捕捉を用いることにより、水力学式トラップ内に捕捉される。更に別の実施形態において、捕捉された液滴は加熱される。
【００５２】
また更なる一実施形態において、マイクロ流体チップのマイクロチャネルは、ＰＤＭＳにより作製される。別の実施形態において、ネットワークにおけるマイクロチャネルの側壁は、化学蒸着プロセスを通してパリレンでコーティングされる。側壁は、パリレン蒸着の前にＰＤＭＳエッチング液で粗面化される。
【００５３】
本発明を説明する文脈における（中でも、添付の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（“a” and “an”）」及び「前記／該（"the"）」という用語並びに類似の指示語の使用は、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、特に断りのない限り、非限定（open-ended：オープンエンド）用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるものとする。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に他に指定のない限り、この範囲内にある各別個の値について個々に言及する省略方法として機能するよう意図されるものに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中に提示されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「等（such as）」）の使用は、他に主張のない限り、単に本発明をより良く明白にする（illuminate）ように意図されるものに過ぎず、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言葉は、特許請求がされていない任意の要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとは解釈されるべきでない。
【００５４】
本開示の主題について、特徴の様々な組合せ及び部分的組合せを含む幾つかの例示的な実施形態を参照してかなり詳細に記載し示したが、当業者は、他の実施形態並びにその変形形態及び変更形態を、本開示の範囲内に包含されるものとして容易に理解するであろう。さらに、こうした実施形態、組合せ及び部分的組合せの記載は、請求項に係る主題が、請求項に明示的に列挙されているもの以外の特徴又は特徴の組合せを必要とするということを意味するようには意図されていない。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に包含される全ての変更形態及び変形形態を含むように意図されている。
【００５５】
本願において引用される全ての文献（「明細書引用文献」）及び明細書引用文献において引用され又は参照される全ての文献は、引用することによりそれら全体が本明細書の一部をなすものとする。さらに、出願書類又は明細書引用文献の各々において引用され又は言及される任意の製品に対する任意の製造業者の指示又はカタログは、引用することによりそれら全体が本明細書の一部をなすものとする。この本文又はそこにある任意の教示に引用することによって一部をなす文献を本発明の実施に使用することができ、引用することにより本明細書の一部をなす各文献における技術を本発明の実施に使用することもできる。この本文への引用によって一部をなす文献は先行技術と認められるものではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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