(57)【要約】  遺伝子操作またはベクターなしで、２つの微生物種の間で染色体ＤＮＡを導入する方法が記載される。この方法から生じる株は、両方の親由来の遺伝子型の組み合わせを発現することができるキメラ微生物ハイブリッドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを使用しない、２つの異なる微生物の親株の間での染色体の水平遺伝子導入方法であって、第１と第２の親株の細胞を、固形成長培地上または液体成長培地に一緒に組み合わせることを含み、前記成長培地、および／または前記成長培地の周囲もしくはそれと接触する環境が、それぞれの親株についての少なくとも１つの別々のストレス要因を含有し、前記第１と第２の親微生物ハイブリッド株の遺伝子ハイブリッドであり、前記第１の親株から前記第２の親株に導入された遺伝子材料由来の少なくとも１つの表現型形質を発現する、微生物ハイブリッド株が製造される、方法。
【請求項２】
前記第１と第２の親株が、異なる微生物種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物ハイブリッドが、両方の親株から与えられた遺伝子材料由来の表現型形質を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
それぞれのストレス要因が、成長を約８０％〜約１００％阻害するのに十分である濃度またはレベルにて存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物の親株が、細菌または真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物ハイブリッド株が、１つまたは複数の病態の生物学的治療である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物ハイブリッド株が、それがもたらされた前記微生物の親株と比較し、１つもしくは複数の産業応用に対する増大または低下した適応性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物ハイブリッド株が、それがもたらされた前記微生物の親株と比較し、新規商品を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物ハイブリッド株が、プロバイオティック特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物ハイブリッド株の少なくとも１つの親が、安全（ＧＲＡＳ）と一般に認められる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物ハイブリッドが、ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム、ストレプトコッカス、クロストリジウム、マイコプラズマ、バチルス、スタフィロコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ペディオコッカス、エンテロコッカス、エンテロバクテリアッセ、エシェリキア、シュードモナス、バクテリオデス（Bacteroidetes）、またはアクチノバクテリアの細菌種である親株由来のＤＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物ハイブリッドが、サッカロマイセス、シゾサッコロミセス（Schizosacchoromyces）、シェフェロマイセス、ザイゴサッカロミセス、ヤロウイア、ピキア、デッケラ、クリベロマイセス、カンジダ、メチニコビア、またはトルラスポラの真菌種である親株由来のＤＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラクトバチルス種が、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・デルブリュッキ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カルバータス、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、またはラクトバチルス・ロイテリである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビフィドバクテリウム種が、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroids）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（B bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・デンチクム（B. denticum）、ビフィドバクテリウム・フィーカレ、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・サーマシドフィルム（B. thermacidophilum）、またはビフィドバクテリウム・ツルミエンス（B. tsurumiense）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サッカロマイセス種が、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディ、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S. pastorianus）、サッカロマイセス・フラギリス（S. fragilis）またはサッカロマイセス・バヤヌス（S. bayanus）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造される、微生物ハイブリッド株。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法により製造される、生物学的治療用微生物株。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法により製造される、プロバイオティック微生物株。
【請求項１９】
商品を産生する、請求項１に記載の方法により製造される、微生物株。
【請求項２０】
組換えＤＮＡ技術を使用せず、２つの異なる微生物の親株または種からもたらされる天然に生じない微生物ハイブリッド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１７日に提出した米国仮出願第６２／２５６，６２５号、および２０１６年７月１５日に提出した米国出願第１５／２１２，０６８号に基づく優先権を主張し、その両方が、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、遺伝子操作なしで２つの微生物種の間で染色体ＤＮＡを導入する方法、特に、ベクターを使用せずに水平遺伝子導入により表現型を加えるか、または削除するために使用され得る方法に関する。この方法から生じる株は、両方の親由来のＤＮＡの組み合わせを発現することができるキメラ微生物ハイブリッドである。
【背景技術】
【０００３】
背景
細菌および真菌は、様々な商業的応用を有し、アルコール飲料、食品、駆除剤、食品添加物、バイオ燃料、プロバイオティクス、および医薬の製造において使用される。一般には天然で遭遇しない表現型形質の組み合わせを有する微生物が、生物学的治療のような、幾つかの応用に頻繁に必要である。野生型微生物株は、生存および複製のため進化的発生を示す。しかしながら、商業的応用は、産業プロセスを最適化し、かつ微生物の天然の環境内では大抵有利ではない量で産物を産生する形質の混在した株を大抵必要とする。株の変更ならびに改良方法を開発して、新規商品を創出し、および／または収益性を増大させた。従来の株の変更は、３つの異なるアプローチにより支配され、後述の通り、それぞれが、それ独自の制限を伴う。
【０００４】
第１の古典的な変異原性は、既存の遺伝子の化学的に誘導された点変異およびシフト変異に頼る。これらの変異の大部分は、どっちつかずであるか、または有害でありさえする（Eyre-Walker, et al. (2007) Nature Reviews Genetics 8:610-618）。生じる変異は完全にランダムであり、変異原が適用された後に選択培地を使用することにより、所望の株が見出される。１つの制限は、他の株または種由来の外来遺伝子を加えるために変異原性を使用することができないことである。加えて、変異原性のラウンドの繰り返しは、無性集団のゲノムが、不可逆的な方法で有害な変異を蓄積するプロセスである、「マラーのラチェット」の対象になり得る。変異原性のそれぞれの新規ラウンドは、有害な変異の蓄積に起因して、生存可能な改良された変異体を見出すことをより困難にする。株の他の改良方法は組換えを含み、それがマラーのラチェットを回避するのを助ける。
【０００５】
株の変更の第２の方法は組換えであり、そこでは、ハイブリッドが、プロトプラスト融合のような技術を通じて形成される。この技術は、親の細胞壁をまず取り除くこと、次に、生じたプロトプラストを、自発的または誘導された融合を通じて融合させることにより、２つの異なる株を一緒に融合させる。これにより、ときに、個々の親株より高い生産性を持つ、倍数性を有する微生物および植物を創出することができる。標的遺伝子が未知であるか、または多遺伝子形質が導入されることを必要とするとき、この方法により、通常には接合し得ない、有用である株の組換えが可能になる。融合は、両方の親の全ゲノムの組み合わせをもたらす。それは、倍数性で十分に機能する作物およびカビの変更のため最も上出来に使用されてきた方法である。幾つかの酵母において、核合体が普通は数世代後に生じるとすぐに、導入された核の１つは、組換えが生じる前に失われ得る。プロトプラスト融合は、グラム陰性細菌については成功せず、グラム陽性細菌において、プロトプラスト融合の幾つかの成功が存在するが、成功率は極めて低く、故に、それは頻繁には使用されない。バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）のような、同種の株の間での、低い成功率のハイブリッド形成が存在する（Schaeffer, P. et al (1976) Proc Natl Acad Sci 73(6):2151-2155）。プロトプラストは、最初の野生型細胞培養物から２．５×１０-８の率でまず形成された。次に、プロトプラストを融合して、親プロトプラストの対形成当たり最大４×１０-３の率にてハイブリッドを創出した。これは、１つのオリジナルの親細胞当たりのハイブリッドの最高最終頻度が、たった６．４×１０-１２であることを意味する。異なる種由来のプロトプラストを組み合わせることは、なお低い成功率を有し、大抵の場合では、細菌において水平遺伝子導入の信頼可能な、または経済的に実行可能なオプションではない。
【０００６】
株を変更する第３の方法は、多くの成功例において証明され、ベクターを介した水平遺伝子導入である、遺伝子操作である。研究者らは、所望の表現型を発現させるために、どの遺伝子を導入することが必要かを知っていなければならない。遺伝子操作は、広範な代謝の知識を必要とし、正しくない仮説により頻繁に制限される。大抵の方法論は、複製の開始点および適当なプロモーターと共に、切り取られた目的の外来遺伝子を含有する、構築されたプラスミドを必要とする。次に、このプラスミドは、クローニングされ、形質転換、形質導入、もしくは接合、またはヨシダ効果を介した摩擦を介して宿主種に挿入されなければならない。トランスポゾンはまた、インビトロである種から別の種に導入され、染色体ＤＮＡに自発的に取り込まれ得るが、この技術はまた、導入を開始するための人工ベクターを最初に必要とする。遺伝子組換え体（ＧＭＯ）の成長速度または代謝機能において無視できる変化をもたらす、広範な、左右されない技術が、エシェリキア・コリ（E. coli）について公開された。しかしながら、他の種は、あまり解明されておらず、挿入されたプラスミドの不完全な遺伝子発現、最初の形質転換に対する抵抗性を呈し得るか、または外来プラスミドを容易に喪失した。別の主な欠点は、生じた株のＧＭＯとしての分類であり、それは、幾つかの産業応用を制限するか、または排除し得る。
【０００７】
産業用微生物株を改変する目的で水平遺伝子導入を行う、代わりの、非ＧＭＯで、経済的に実行可能な方法が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な概要
ベクターを使用せずに、水平遺伝子導入を通じてキメラ微生物ハイブリッドを製造する方法が、本明細書において提供される。これらの方法は、一連の環境圧および選択ツールを使用して、微生物種に渡る遺伝子導入のため、天然の接合、形質転換、または別の機序を使用して指向進化を行う。多くの刊行物は、天然に生じる生物のゲノム配列データを使用して、例えば、形質転換、形質導入、接合、摩擦による、または幾つかの他の遺伝子導入現象による、天然での多様な種の間での外遺伝子導入の仮説を支持している。しかしながら、この現象は、ベクターまたはバクテリオファージを使用しない、異なる種に渡る実験室設定においては生じないことが報告されている。理論により結び付けられることを望んではいないが、本明細書において開示される方法は、多様な微生物種に渡る遺伝子導入が、環境が、複製がもはや可能でないようなレベルのストレスに至ったときに関与する最後の頼みの綱の生存機序であり得ることを証明する。
【０００９】
方法は、ベクターを加えることなく、天然の接合、形質転換、または場合により、別の機序を介して異なる種に渡り遺伝子導入が生じることを促す、二重選択圧を使用することを含む。加えて、方法は、遺伝子導入を促進するために、遺伝子発現に関与する前ストレス要因を使用してもよいし、または使用しなくてもよい。方法に従い選択される微生物細胞が、本明細書において記載される。
【００１０】
１つの態様において、キメラ微生物ハイブリッドを作る方法が提供される。方法は、親ドナーが、親宿主に導入するための表現型を発現するか、または目的の遺伝子を含有する、２つの異なる株または種を対形成させることを含む。別々の培養物における、親は、１つの培養物にそれらを組み合わせることに先立ち、さらなる、予め決定された環境ストレス要因下に置かれてもよい。この任意選択のストレス要因後、次に、親は、液体培地中に一緒に置かれ、次に、濃縮される。濃縮は、天然の沈殿、乾燥、凍結乾燥、蒸発、遠心分離または細胞をフィルターに通すことにより、行われ得る。次に、フィルターおよび／または濃縮された細胞は、それぞれの株もしくは種についての排他的な環境ストレス要因を含有する選択圧プレートまたは液体の上に置かれる。幾つかの実施形態において、これらのストレス要因は、それぞれの親株について別々かつ優遇である。幾つかの実施形態において、適当なストレス要因は、培地の代わりにインキュベーション環境の一部である。それぞれのストレス要因は、微生物株の複製および成長が、例えば、少なくとも約９５％〜約１００％、止まるのに十分な濃度またはレベルにて加えられる。微生物のコロニーは、当該コロニーの表現型を評価することにより、選択される。幾つかの実施形態において、生じるキメラは、両方の親の遺伝子ハイブリッドであり、選択培地または周囲の環境において宿主の環境ストレス要因に応答して新規表現型を発現する。このプロセスから生じる株は、本明細書において「キメラ」または「微生物ハイブリッド」と呼ばれる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、別の生物への導入に先立ち生物からまず取り出されたＤＮＡを導入するためのベクターもしくは他の遺伝子操作、分子クローニング、または組換えＤＮＡ技術を使用することなく、微生物株の間で遺伝子材料を導入する、２つの異なる微生物の親株の間での染色体の水平遺伝子導入の方法が提供される。方法は、固形成長培地上または液体成長培地に、第１と第２の微生物の親株の細胞を一緒に組み合わせることを含む。成長培地、および／または成長培地の周囲もしくはそれと接触する環境は、親株のそれぞれについて少なくとも１つの別々のストレス要因を含み、第１と第２の親株の遺伝子ハイブリッドであり、第１の親株から第２の親株に導入された遺伝子材料由来の少なくとも１つの表現型形質を発現する微生物ハイブリッド株が、製造される。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、両方の親株から与えられた遺伝子材料由来の表現型形質を発現する。
【００１２】
様々な所望の特性を有する微生物ハイブリッドが、製造され得る。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、１つまたは複数の病態のための生物学的治療であり、すなわち、１つあるいは複数の病態を処置する方法における生物学的治療として、または生物学的治療組成物もしくは製剤において使用され得る。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、それらがもたらされた微生物の親株と比較し、１つもしくは複数の産業応用に対する増大したまたは低下した適応性を有する。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッド株は、それがもたらされた微生物の親株と比較し、１つまたは複数の新規商品を産生する。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッド株は、プロバイオティック特性を有し、すなわち、プロバイオティックとして、またはプロバイオティック組成物もしくは製剤において使用されてもよい。
【００１３】
微生物の親株は、細菌または真菌であり得る。幾つかの実施形態において、第１および第２の親株は、異なる微生物種である。幾つかの実施形態において、第１および第２の親株は、同種の異なる株である。
【００１４】
幾つかの実施形態において、第１および第２の微生物の親の少なくとも一方または両方が、安全（ＧＲＡＳ）と一般に認められる。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドはＧＲＡＳである。
【００１５】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、バチルス（Bacillus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エンテロバクテリアッセ（Enterobacteriaceae）、エシェリキア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、バクテリオデス（Bacteriodetes）、およびアクチノバクテリア（Actinobacteria）属から選択される細菌種である一方または両方の親株由来のＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム、ストレプトコッカス、クロストリジウム、マイコプラズマ、バチルス、スタフィロコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ペディオコッカス、エンテロコッカス、エンテロバクテリアッセ、エシェリキア、シュードモナス、バクテリオデス（Bacteriodetes）、およびアクチノバクテリア属から選択される細菌種と遺伝子型を同定する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、ラクトバチルス種の一方もしくは両方の親株由来のＤＮＡを含有し、ならびに／または例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfransciscensis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・カルバータス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、およびラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から選択される、ラクトバチルス種と遺伝子型を同定する。
【００１７】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、ビフィドバクテリウム種の一方もしくは両方の親株由来のＤＮＡを含有し、ならびに／または例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（Bifidobacterium asteroids）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・デンチクム（Bifidobacterium denticum）、ビフィドバクテリウム・フィーカレ（Bifidobacterium faecale）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（Bifidobacterium merycicum）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム（Bifidobacterium ruminantium）、ビフィドバクテリウム・サーマシドフィルム（Bifidobacterium thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・ツルミエンス（Bifidobacterium tsurumiense）から選択される、ビフィドバクテリウム種と遺伝子型を同定する。
【００１８】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、サッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、シェフェロマイセス（Schefferomyces）、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、ヤロウイア（Yarrowia）、ピキア（Pichia）、デッケラ（Dekkera）、クリベロマイセス（Klyveromyces）、カンジダ（Candida）、メチニコビア（Metschnikowia）、およびトルラスポラ（Torulaspora）属から選択される真菌種の一方または両方の親株由来のＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、サッカロマイセス、シゾサッカロミセス、シェフェロマイセス、ザイゴサッカロミセス、ヤロウイア、ピキア、デッケラ、クリベロマイセス、カンジダ、メチニコビア、およびトルラスポラ属から選択される真菌種と遺伝子型を同定する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、サッカロマイセス種の一方もしくは両方の親株由来のＤＮＡを含有し、ならびに／または例えば、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・フラギリス（Saccharomyces fragilis）、およびサッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）から選択される、サッカロマイセス種と遺伝子型を同定する。
【００２０】
幾つかの実施形態において、ストレス要因のそれぞれは、ストレス要因に感受性がある微生物の親の成長を、およそ少なくとも約８０％〜約１００％、または少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％のいずれか、または約８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％〜１００％のいずれか阻害するのに十分である濃度にて存在する。
【００２１】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、抗生物質または抗真菌物質である。１つの実施形態において、抗生物質または抗真菌物質は、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度にて成長培地に含まれる。
【００２２】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、有機化合物、例えば、植物油において見出される有機化合物である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる有機化合物は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度である。
【００２３】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は溶媒である。１つの実施形態において、溶媒は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度で成長培地に加えられる。
【００２４】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は高温である。１つの実施形態において、大気温度は、約２１℃〜約１３０℃である。
【００２５】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は低温である。１つの実施形態において、大気温度は、約-２００℃〜約２１℃である。
【００２６】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は紫外線である。１つの実施形態において、紫外線継続時間は、少なくとも約２分の１秒かつ２秒以下である。
【００２７】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は浸透圧性である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる浸透圧性ストレス要因は、約５ｍＭ〜約１０Ｍの濃度のグルコースのような糖である。
【００２８】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は無機化合物である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる無機化合物は、少なくとも約１ｐｇ／ｍｌの濃度である。
【００２９】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は電離放射線である。１つの実施形態において、培養物は、約１Ｇｙ／分と同等の低さから約２５０Ｇｙ／分と同等の高さの電離放射線の対象にされる。
【００３０】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、大気ガスの組成物である。１つの実施形態において、酸素（Ｏ２）は、大気、例えば、嫌気性大気に少なくとも約０．２％ｖ／ｖの濃度にて加えられる。別の実施形態において、大気酸素は、０％または実質的に０％ｖ／ｖの濃度に制限される。
【００３１】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ビタミンもしくは補助因子であるか、またはその不足である。幾つかの実施形態において、ビタミンまたは補助因子は、成長培地に含まれないか（０％）、または非常に低いレベル（実質的に０％ｗ／ｗ）に制限される。１つの実施形態において、ビタミンまたは補助因子は、例えば、０％または実質的に０％ｗ／ｗに制限された濃度の、ビオチンである。
【００３２】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ｐＨを下げるために使用される酸である。１つの実施形態において、加えられる酸の量は、約０．１ｍＭ〜約１０Ｍの濃度である。
【００３３】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ｐＨを上げるために使用される塩基である。１つの実施形態において、加えられる塩基の量は、約０．１ｍＭ〜約１０Ｍの濃度である。
【００３４】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は炭水化物供給源である。１つの実施形態において、成長培地における、親が成長のため代謝することができる炭水化物供給源の量は、０％または実質的に０％ｗ／ｗの濃度に制限される。
【００３５】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は窒素供給源である。幾つかの実施形態において、窒素供給源は、成長培地に含まれないか（０％）、または非常に低いレベル（実質的に０％ｗ／ｗ）に制限される。１つの実施形態において、窒素供給源は、例えば、０％または実質的に０％ｗ／ｗに制限された濃度の、成長培地中の１つもしくは複数のアミノ酸またはタンパク質である。
【００３６】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は生物学的毒素である。１つの実施形態において、毒素は、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度にて成長培地に含まれる。
【００３７】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ペプチド、例えば、微生物ペプチドである。１つの実施形態において、ペプチドは、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。
【００３８】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、防腐剤、例えば、食品防腐剤である。１つの実施形態において、防腐剤は、約０．５ｍＭ〜約１Ｍの濃度にて成長培地に含まれる。
【００３９】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は除草剤である。１つの実施形態において、除草剤は、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。
【００４０】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、真菌剤または殺菌剤である。１つの実施形態において、真菌剤または殺菌剤は、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。
【００４１】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は駆除剤である。１つの実施形態において、駆除剤は、濃度１ｐｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇにて成長培地に含まれる。
【００４２】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、別の微生物の使用済み発酵ブロスの濾液である。例えば、１つの実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）発酵から濾過された使用済みブロスが、ストレス要因として使用される。１つの実施形態において、濾過された使用済みブロスは、成長培地に約１％〜約９０％ｖ／ｖの濃度にて加えられる。
【００４３】
微生物の親株は、微生物または真菌であり得る。幾つかの実施形態において、親株は、同じ界に分類されない。１つの実施形態において、親株は、同じ門に分類されない。
【００４４】
幾つかの実施形態において、両方の意図される宿主とドナー株は、相前後して適用される異なる環境ストレス要因を有する。
【００４５】
幾つかの実施形態において、適用される前ストレス要因は、遺伝子導入の選択環境と異なる多様なものである。
【００４６】
幾つかの実施形態において、ドナー株であることが意図される親は、宿主になることができる。
【００４７】
幾つかの実施形態において、上記した環境ストレス要因のいずれかを、遺伝子導入が第１のストレス要因で生じた後の第２のストレス要因として使用して、株選択を狭めるか、または特殊化してもよい。
【００４８】
幾つかの実施形態は、両方の親由来の幾つかの遺伝子を保持する微生物ハイブリッドをもたらす。
【００４９】
幾つかの実施形態は、倍数体である微生物ハイブリッドをもたらし、これは、それらが、両方の親由来の全ゲノムを保持することを意味する。
【００５０】
本明細書において記載される方法により製造される微生物ハイブリッドは、ベクターを使用しない水平遺伝子導入を経験している。
【００５１】
微生物ハイブリッドはキメラであるとみなされ、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００５２】
幾つかの実施形態において、生じた微生物ハイブリッド（単一コロニー由来）は、それらが成長する環境に依存して、複数の表現型を呈してもよい。
【００５３】
キメラ微生物ハイブリッドを製造する方法は、（ａ）成長を、少なくとも約１０％、だが約９０％以下阻害するのに十分なそれぞれの別々の親株に前ストレス要因を適用すること；（ｂ）液体培地において２つの親を一緒に組み合わせ、次に、それらを、フィルター、例えば、細胞を濃縮するのに十分に小さい孔サイズを有するフィルター、例えば、０．２μｍのフィルター上で一緒に濃縮すること；（ｃ）フィルターを、細胞側を下に二重選択プレート上に置くこと、またはフィルターを、二重選択液体培地に入れること、ここで、二重選択プレートまたは液体培地は、両方の株の成長を、約１００％阻害するのに十分な、量の１つまたは複数の環境ストレス要因を含有する；（ｄ）フィルターを、第１の二重選択プレート（遺伝子導入プレート）から、または二重選択液体培地から取り出し、フィルターを液体中でボルテックスし、遠心分離し、それぞれのペレットを再懸濁し、第２の二重選択プレート上にプレーティングすること；（ｅ）第２の二重選択プレート上で成長するコロニーを選択することを含み得る。場合により、生じる生じた微生物ハイブリッドは、キメラ形質について評価されてもよい。１つの実施形態において、方法は、（ｆ）（ｅ）における第２の選択プレート由来のコロニーを、工程（ｃ）において使用されたのとおよそ同じ量の環境ストレス要因を含む固形培地を含有する、第３のセットの選択プレート上に画線すること；（ｇ）第３の選択プレートを細菌コロニーの成長に適した条件下でインキュベーションすること；（ｈ）工程（ｆ）および（ｇ）を繰り返すこと；ならびに（ｉ）第４および最後の選択プレート上で成長するコロニーを選択すること；（ｊ）場合により、結果を狭めるため、または第２の表現型の導入について評価するために、ストレス要因を第２の選択として適用すること；ならびに（ｋ）場合により、生じた微生物ハイブリッドをキメラ表現型および／または遺伝子型について評価することをさらに含む。
【００５４】
生じた微生物ハイブリッドは、さらなる株の変更のためこの方法を使用するための新規親宿主またはドナー株として使用されてもよい。
【００５５】
本明細書において開示される方法に従い製造された微生物ハイブリッド株、例えば、細胞への導入に先立ちもたらされる、生物から取り除かれた外来ＤＮＡを導入するための、組換えＤＮＡ技術、またはベクターを介したＤＮＡの導入もしくは他の技術を介したＤＮＡの導入を使用することなく、２つの異なる微生物株あるいは種からもたらされる天然に生じない微生物ハイブリッドが提供される。様々な実施形態において、微生物ハイブリッド株は、生物学的治療活性、プロバイオティック活性、および／または目的の商品を製造する能力を含むが、これらに限定されない、有用かつ所望の特性を有し得る。
【００５６】
本明細書において記載される方法に従い製造される微生物ハイブリッドを、成長培地において、ハイブリッドの成長および目的の化合物または商品の産生に適した条件下で培養すること、ならびに場合により、化合物または商品を成長培地から回収することを含む、商品化合物のような目的の化合物を製造する方法が提供される。
【００５７】
本明細書において記載される方法に従い製造される生物学的治療もしくはプロバイオティック活性を有する微生物ハイブリッドの有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、生物学的治療またはプロバイオティックで処置可能である状態を有する個体を処置する方法であって、生物学的治療またはプロバイオティック活性に応答する個体の状態が、軽減され、回復し、低減されるか、または除去される、方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、３７℃での７２時間の嫌気性インキュベーション後の成長を示す、キメラ微生物ハイブリッドのハイブリッド性質を呈する。プレートは、実施例２において記載される最小培地を含有していた。紫色から黄色への色調の変化は、酸の産生および増加を示す（写真はグレースケールであることに注意）。図１Ａ中の親ドナーは、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）であり、培地に存在しない必須アミノ酸を作るその原栄養性（protrophic）能力を反映して、強い成長を示す。図１Ｂ中の親宿主ラクトバチルス・プランタルムは、その本来のアミノ酸栄養要求性に起因して、全く成長していない。１０種のうち３種のキメラ株が、図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅにおいて示され、これらは、微生物ハイブリッドの間で見られる様々な成長を表す。図１ＣはキメラＣ-１であり、図１ＤはキメラＣ-８であり、図１ＥはキメラＣ-９である。図１Ｄ中の矢印は、プレートの上部にて成長している単一の黄色のコロニーに注目させるためにそこにある。
【００５９】
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、４２℃での２４時間の好気性インキュベーション後の成長を示す。プレートは、実施例２において記載される強化タンパク質培地を含有していた。図２Ａ中の親ドナーは、クロストリジウム・ベイジェリンキであり、４２℃にて酸素の存在下で複製するその無能さを反映して、成長を示さない。図２Ｂ中の親宿主ラクトバチルス・プランタルムは、酸素中、４２℃にて強い成長を示す。１０種のうち３種のキメラ株が、図２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅにおいて示され、それらは、微生物ハイブリッドの間で見られる様々な成長を表し、図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅにおいて描写されるのと同じキメラである。図２ＣはキメラＣ-１であり、図２ＤはキメラＣ-８であり、図２ＥはキメラＣ-９である。図２Ｅ中の矢印は、プレートの上部にて成長している単一のコロニーに注目させるためにそこにある。どちらの親も、図１Ａ〜１Ｅと図２Ａ〜２Ｅの組み合わせた条件下で自力での成長を示さなかった。しかしながら、全１０種の生じたキメラ株は、最小培地上で４２℃にて好気的に成長することができる。
【００６０】
【図３】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、嫌気的に４８時間３５℃にて行われたビオメリューのＣＨ５０試験の結果を呈する。４８種の異なる炭素供給源について、炭水化物代謝を嫌気的に試験した。濃い灰色の斜線のボックスは、遺伝子導入前に２つの親の間で共有された炭水化物代謝機能性を表す。淡い灰色の形質は、クロストリジウム親（Ｐ-Ｃ．ｂ．）に固有のものである。黒色の形質は、ラクトバチルス親（Ｐ-Ｌ．ｐ．）に固有のものである。それぞれの列において着色した形質は、そのカラムの炭素供給源の代謝についての正の結果を表す。キメラ株（Ｃ-１：Ｃ-１０）の全てが、親株と比較したとき、能力の組み合わせを有することに注意されたい。白色の斜線の形質であるグルコン酸カリウム代謝は、説明するのがなお難しい。これは、１０種のうち９種のキメラが、それらの親の両方と異なり、代謝することができる炭素供給源である。理論により結びつけられることを望まないが、両方の親株が、存在する両方のコピーと共に、機能を与えられたこの遺伝子の非機能的コピーを有することが可能である。
【００６１】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、６種の異なる抗生物質の抗生物質感受性を決定するためのキメラ試験を示す。プレートの上部にて１２：００の位置で始まり、プレートの周りを時計回りに移動する、これらの抗生物質は、アモキシシリン／クラウブリン酸（２０μｇ／１０μｇ）、アジスロマイシン（１５μｇ）、カルベニシリン（５μｇ）、シプロフロキシン（５μｇ）、メトロニダゾール（５μｇ）、およびバンコマイシン（３０μｇ）である。クロストリジウム親が、図４Ａにおいて描写され、全６種の抗生物質に感受性がある。図４Ｂにおいて示される、ラクトバチルス親は、標準的な感受性チャートに基づき抵抗性であると考えられるが、アモキシシリン／クラウブリン酸の周りに幾らかの透明化を示す。ラクトバチルス親は、アジスロマイシンに感受性がある。カルベニシリン領域の透明化は、標準的な感受性チャートに従い、「抵抗性」とみなされる。Ｃ-１を除く、図４ＤにおいてＣ-７により表されるキメラの全てが、ラクトバチルス親と同様の感受性および抵抗性を保持していた。図４Ｃにおいて示されるＣ-１は、新規形質と予想されるメトロニダゾール抵抗性と共に、５／６種の抗生物質に対して感受性があるので、クロストリジウム親に近い抗生物質感受性を有する。
【００６２】
【図５】図５は、希釈した改変ＢＨＩ培地における、親と比較したキメラの成長を示す。全ての株が、親ラクトバチルスアミノ酸栄養要求体Ｐ-Ｌ．ｐ．、および市販のラクトバチルス２９９ｖと比較して、希釈した濃度の培地にて増大した成長を示す。成長は、嫌気性チャンバーにおいて３５℃にて４８時間であった。Ｃ-１は、４２℃にて成長することを好むので、予想より低い成長を示した。成長が、より高い温度にて改善されるであろうことが疑われる。３５℃は、クロストリジウム親の成長を確実にするために選ばれた。クロストリジウム・ベイジェリンキ（C. beijerinckii）Ｐ-Ｃ．ｂ．は、低い成長速度を有し、そのようなものとして、１．４％ｗ／ｗおよび２．８％ｗ／ｗのＢＨＩの濃度は、７２時間までに検出可能な成長を示さなかった（データは示していない）。
【００６３】
【図６】図６は、そのラクトバチルス親および市販のラクトバチルス２９９ｖと比較した、ラクトバチルスキメラＣ-２の成長を示す。両方の「ｐＨ７．６出発」と「ｐＨ６．８出発」培地は、１２ｇ／Ｌのさらなる糖（ｐＨ７．６における全てのグルコース、ｐＨ６．８における結腸の糖）を含む２０％ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天および１ｇ／Ｌ酵母抽出物を含有する培地からもたらされたグルコース約０．５グラムを有した。ＣＦＵは、最終ｐＨにより制限される両方の糖種類において同等である傾向がある。ラクトバチルスは、一般に、７より高いｐＨで出発する異なる時間を有する。ヒトの大腸は、８．０（小腸の後）から５．０までのｐＨ範囲を有する。ラクトバチルスキメラ（Ｃ-２）は、より高いｐＨにて成長を始める能力を有するので、その親（２９９ｖ）と比較し、ヒトの大腸の盲腸においてより早く成長を始めることができるべきである。培地は、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの一晩培養物から播種され、２４時間３７℃にて維持された嫌気性チャンバー内でインキュベーションされた。
【００６４】
【図７】図７は、Ｃ-９の５日齢のプレート（最小培地を含む）から１００×対物レンズで撮られた顕微鏡写真の接写を描写する。Ｃ-９を成長させるのに使用された培地は、図８Ａにおいて見られるものと類似の形態を有するリッチ培地上で嫌気的に成長させたプレート由来の単一コロニーから出発させた。成長は、酸素の存在下３７℃にてであった。両方のラクトバチルスとクロストリジウム形態が、顕微鏡写真において見られる。幾つかの内生胞子は、５：００の位置の近くで見られ、並びに１１：００の位置の近くの胞子を開放した。
【００６５】
【図８】図８は、同じ条件で成長させたプレート由来の単一コロニーの撮影された４枚の顕微鏡写真（１００×対物レンズ）を示す。成長は、嫌気的に７日間３７℃にて成長させた改変ＢＨＩプレート上であった。図８Ａは、親ラクトバチルス・プランタルムの顕微鏡写真である。図８Ｂは、クロストリジウム親の顕微鏡写真であり、それは、胞子および溶解された内生胞子由来のデブリが散乱している。図８Ｃは、両方の図８Ｃと８Ｄの形態表現型を有するコロニーを作る能力があるキメラＣ-９の顕微鏡写真である。図８Ｃは、近接して一緒に成長しているコロニーを示し、一方、図８Ｄ中のコロニーは、遠く離れている。図８Ｄ中のコロニーは、特に、最小培地上の、好気性条件に移されたとき、図７において見られる通り、少数の胞子形成となるだろう。
【００６６】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディの２つの顕微鏡写真を含み、リッチ培地における出芽（図９Ａ）、それに対してストレス性培地（図９Ｂ）における水平遺伝子導入（本明細書において記載される方法を使用する）中にみられる物理的結合が見られる。遺伝子を交換している酵母は、出芽することができないが、生存のため最後の手段としてこの遺伝子導入方法を使用することができる。同様の観察を、株は分裂することができないが、ストレス性条件下で依然としてＤＮＡを交換することができる細菌培養物において行った（顕微鏡写真は示していない）。
【００６７】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、ビオメリューの２０  Ｃ  Ａｕｘ酵母同定キットを使用した、３０〜３１℃での７２時間成長の結果を示す。２０種の異なる炭素供給源について、炭水化物代謝を好気的に試験した。灰色の斜線のボックスは、遺伝子導入方法が適用される前に２つの親の間で共有された炭水化物代謝機能を表す。白色の形質は、メチニコビア親に固有のものである。黒色の形質は、サッカロマイセス親に固有のものである。それぞれの列における「＋」と印をつけられた形質は、そのカラムの炭素供給源の代謝について正の結果を表し、「＋＋」は、過剰な成長を示した。キメラ株の全て（ＹＣ-１：ＹＣ-１１）が、親株と比較されたとき、能力の組み合わせを有することに注意されたい。
【図１０Ｂ】同上。
【００６８】
【図１１】図１１は、酵母株による毒素ＡおよびＢの中和を示す、ＥＬＩＳＡ結果を示す。酵母培養物を、単一コロニーから、好気的に２４時間ＹＰＤ培地においてインキュベーター-シェーカー内で３０℃にて成長させた。培養物がスピンダウンされ、上清が廃棄され、細胞が、５ｇ／Ｌ酵母抽出物を添加された嫌気性ＢＨＩ培地に再懸濁された。酵母細胞は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）１５まで再懸濁され、嫌気的に１８時間３７℃にてインキュベーションされた。クロストリジウム・ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３はまた、グリセロールストックから、嫌気的に２４時間３７℃にて成長させた。次に、それぞれの酵母培養物は、酵母培養物のＯＤを変動させながら、ＯＤ６００１．５のＶＰＩ１０４６３と、比１：１でＶＰＩ１０４６３培養物と別々に組み合わされた。共培養物は、嫌気的に２時間３７℃にてインキュベーションされた。次に、共培養物は、濾過され、毒素ＡおよびＢのＥＬＩＳＡ（ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ）を介して試験された。グラフにおいて、０％毒素ＡおよびＢの中和は、ＶＰＩ１０４６３をインキュベーションし、ＢＨＩ培地を新たに添加した陰性対照により表される。ドナー株メチニコビア・ロイカウフィ（M. reukaufii）は、３７℃での延長した嫌気性曝露に起因して不活性であり、恐らく、クロストリジウム・ディフィシルのため栄養素を提供することに起因して、毒素産生のブーストを生じた。全４種のキメラ酵母ハイブリッドは、毒素ＡおよびＢを中和する増大した能力を有し、改善は、サッカロマイセス・ボウラディ（S. boulardii）宿主親と比較して、１４〜２０％高い中和範囲であった。恐らく、この増大した能力は、３０℃での抗毒素能力が、抗毒素がここで３７℃にて機能したハイブリッド株に導入された、ドナー親メチニコビア・ロイカウフィからもたらされた。
【００６９】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、生じたキメラ微生物ハイブリッドと比較して、両方の親についてのビオメリューａｐｉ  ５０  ＣＨ結果を示す。親宿主ビフィドバクテリウム・フィーカレは、このアッセイにより検出された、丁度１２種の炭素供給源を代謝することができ、一方、生じたキメラ（Ｃ-５、Ｃ-７、およびＣ-９）は、最大１８種の炭素供給源を代謝することができる。遺伝子導入方法中のビフィドバクテリウムのストレス要因は、培地においてアミノ酸を欠くが、これらの６種のさらなる炭素供給源を代謝する能力のようなさらなる形質は、アミノ酸合成遺伝子が加えられるのと同時に外側に導入された。
【００７０】
【図１３】図１３は、そのグラム陰性ドナー親Ｐ-１（グリモンテラ・セネガレンシス（Grimontella senegalensis））およびそのグラム陽性宿主親Ｐ-２（ビフィドバクテリウム・フィーカレ）と比較した、キメラビフィドバクテリウム・フィーカレ株Ｃ-５の成長を示す。ブロムクレゾールパープルを含有するＭ９ラフィノース培地５ミリリットルアリコートは、ＢＨＩプレート由来の単一コロニーを播種された。培養物は、４８時間３７℃にて嫌気性チャンバーにおいてインキュベーションされた。成長は、酸産生に起因する培地の淡い色により見られる、Ｃ-５培養物においてのみ検出された。Ｐ-１は、炭素供給源としてラフィノースを利用できず、Ｐ-２は、存在するタンパク質またはアミノ酸なしで、成長することができないので、どちらの野生型親も培地において成長しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明は、キメラ微生物ハイブリッドを製造する方法を提供する。
【００７２】
本明細書において別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, seconded., John Wiley and Sons, New York (1994)、およびHale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者に、本発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料が、本発明の実施もしくは試験において使用することができる。
【００７３】
本明細書において提供される数値範囲は、範囲を定義している数字を含む。
【００７４】
定義
「キメラ生物」または「キメラ」は、２つもしくはそれ以上の微生物種由来の機能遺伝子を含有する単細胞生物を指す。
【００７５】
「微生物」または「微生物株」は、細菌もしくは真菌細胞、例えば、酵母のような単細胞生物を指す。
【００７６】
用語「組換え」は、異なる遺伝子の組み合わせ、最終的には、親におけるものと異なる染色体を有する固有の子孫の形成をもたらす、染色体の間での遺伝子の交換のプロセスまたは行為である。
【００７７】
「接合」は、直接的な細胞と細胞の接触による、または２つの細胞間の架橋様結合による微生物の間での遺伝子材料の導入である。
【００７８】
「ハイブリッド」は、２つの遺伝子的に異なる変種、種、または属由来の生物から繁殖させた生物である。
【００７９】
「遺伝子操作」は、生物において新規形質を産生するため、またはタンパク質もしくはホルモンのような、生物学的物質を作るために遺伝子を変更し、クローニングする科学である。
【００８０】
「表現型」は、遺伝子型および環境に依存した、生物の観察可能な特徴である。
【００８１】
「遺伝子型」は、生物の遺伝子構成である。
【００８２】
本明細書において「遺伝子導入」とも呼ばれる、「水平遺伝子導入」は、異なる種のゲノムの間でのＤＮＡの伝達である。
【００８３】
「ベクター」は、複製され、および／または発現され得る、外来の遺伝子材料を１つの細胞から別の細胞に人工的に運ぶための媒体として使用されるＤＮＡ分子である。外来のＤＮＡを含有するベクターは、組換えＤＮＡと呼ばれる。例は、プラスミドおよびトランスポゾンを含む。
【００８４】
「組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子」は、そうでなければゲノムにおいて見出されない配列を創出する、複数の供給源から遺伝子材料を一緒にもたらすための遺伝子組換えの実験室の方法（例えば、分子クローニング）により形成されるＤＮＡ分子である。
【００８５】
「株の変更」は、種において遺伝子発現を変化させるための天然もしくは人工的手段を通じたＤＮＡの付加または欠損である。
【００８６】
「変異原性」は、変異原への曝露を通じてヌクレオチド配列を変化させる行為である。
【００８７】
「変異原」は、遺伝子もしくは染色体の遺伝子的変化または喪失に起因して、細胞において永久的な遺伝子変化（変異）（正常な細胞成長中に生じるもの以外）を引き起こす生物学的、化学的、あるいは物理的剤、プロセス、あるいは物質である。
【００８８】
「プロトプラスト」は、機械的、化学的、もしくは酵素的手段のいずれかを使用して完全にまたは部分的に取り除かれたその細胞壁を有する、生きている植物、細菌、あるいは真菌細胞である。
【００８９】
「プラスミド」は、細菌の様々な株の間で見られる染色体外部の遺伝子配列である。
【００９０】
「形質転換」、細菌ドナー細胞からもたらされ、コンピテントなレシピエント細胞に取り込まれる、ヒストンのない細胞内ＤＮＡフラグメントによる微生物の間での遺伝子情報の導入。
【００９１】
「形質導入」は、バクテリオファージを介した細菌細胞への、またはウィルスを介した真核生物細胞へのＤＮＡの挿入を指す。
【００９２】
「真核生物の細胞」は、膜により囲まれた核を含有し、そのＤＮＡがタンパク質（ヒストン）により染色体に一緒に結合される、酵母のような、より高等な生物または真菌の細胞である。真核生物の細胞はまた、小胞体のような、細胞内コンパートメント、ならびにミトコンドリア、ゴルジ体、およびソソームのような、原核生物の細胞において見出されない多数の特殊小器官を含有する。
【００９３】
「原核生物の細胞」は、真の核を有しない、細菌のような、生物の細胞である。
【００９４】
「トランスポゾン」は、転位を起こし得る染色体セグメント、特に、宿主ＤＮＡにおいて相補的配列がない場合、染色体、ファージ、およびプラスミドＤＮＡの間で全体として転位され得る細菌ＤＮＡのセグメントである。
【００９５】
「ヨシダ効果」は、人工的に行われ得るか、または地震のような摩擦現象中に天然に生じ得る、細胞壁摩擦を伴うプラスミド導入の方法である。
【００９６】
「ＧＭＯ」（米国において定義される）は、遺伝子操作を通じて開発された遺伝子組換え体である。
【００９７】
「環境ストレス要因」は、ホメオスタシスを脅かす、細胞の周囲のものにおける要因である。
【００９８】
「ホメオスタシス」は、特に、生理学的プロセスにより維持される、相互依存的な要素の間での相対的に安定な平衡状態への傾向である。
【００９９】
「原栄養体」は、必要とされる栄養素を合成する能力がある生物または細胞である。例えば、原栄養体は、必須アミノ酸を自己合成してもよい。
【０１００】
「栄養要求体」は、成長に必要な栄養素を産生する能力がない生物または細胞である。例えば、栄養要求体は、１つまたは複数の必須アミノ酸を産生する能力がなくてもよい。
【０１０１】
「有機化合物」は、分子が炭素および水素を含有する気体、液体、または固体化学物質の多くの種類の任意のメンバーである。
【０１０２】
「浸透圧性ストレス要因」は、その細胞膜を渡る水の移動の迅速な変化を生じる、細胞の周りの溶質濃度の変化を生じる環境における因子である。
【０１０３】
「補助因子」は、タンパク質の生物学的活性に必要とされる非タンパク質化学物質である。これらのタンパク質は、一般に、酵素であり、補助因子は、生化学的形質転換において手助けをする「ヘルパー分子」とみなすことができる。
【０１０４】
「親ドナー」は、本明細書において記載される遺伝子導入方法を介して別の種または株に導入されるべき所望の表現型を提供する微生物株である。
【０１０５】
「親宿主」は、本明細書において記載される遺伝子導入方法を介して別の種または株から外来ＤＮＡを受け取る微生物株である。
【０１０６】
「倍数性」は、生物が１つまたは複数のさらなるセットの染色体を獲得している状態である。
【０１０７】
「表現型の可塑性」は、異なる環境に曝露されたとき、１つより多くの表現型を生み出す１つの遺伝子型の能力、例えば、環境の変化に応答してその表現型を変化させる生物の能力である。
【０１０８】
「野生型」は、天然で生じる微生物を指す。
【０１０９】
「親株」は、キメラがもたらされる微生物株を指す。
【０１１０】
用語「培養する」は、細胞、例えば、微生物細胞の集団を、成長に適した条件下で、液体または固形培地において成長させることを指す。
【０１１１】
用語「からもたらされる」は、１つの特定の材料が、別の特定の材料においてその起源を見出すか、または別の特定の材料に関連して記載され得る特性を有することを一般に示す。
【０１１２】
「少数の胞子形成」は、コロニーの数メンバーのみが胞子を形成する、微生物株である。
【０１１３】
略語「ＭＩＣ」は、最小阻害濃度を指す。
【０１１４】
略語「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を指す。
【０１１５】
「出芽」は、例えば、新規個体が、成熟生物の主部上の伸長部（「芽」）から形成する、酵母における、無性複製の形態である。これらの伸長部は、有糸分裂の細胞分裂によって成長する。
【０１１６】
「毒素Ａ」は、クロストリジウム・ディフィシルの病原性株により産生されるエンテロトキシンである。この毒性の毒素は、細胞の活性の変化を導く、グリコシル化により真核生物の宿主細胞のＧＴＰアーゼ酵素を修飾することにより作用する。
【０１１７】
「毒素Ｂ」は、クロストリジウム・ディフィシルの病原性株により産生される細胞毒である。この毒性の毒素は、真核生物の細胞を標的にするよう作用し、これにより、シグナル形質導入機序を妨害し、細胞構造、細胞と細胞の結合、および細胞溶解の機能不全化を引き起こす。
【０１１８】
「使用済み発酵ブロス」は、成長を停止した微生物培養物の上清を指す。
【０１１９】
略語「ＧＲＡＳ」は、食品において許可される物質を述べるためにＦＤＡにより創出されたカテゴリーである、「安全と一般に認められる」を指す。
【０１２０】
「溶媒」は、固体または別の液体もしくはガスを溶解する能力がある液体あるいはガスを指す。理論により結びつけられることを望まないが、溶媒は、細胞膜流動性および脂質相安定性の維持に影響を与えることにより、微生物のストレス要因として作用し得る。
【０１２１】
「A」、「an」および「the」は、文脈が別段明瞭に規定しない限り、複数の参照物を含む。
【０１２２】
キメラ微生物ハイブリッドを製造する方法
キメラ微生物ハイブリッドを製造する方法が提供される。以下の工程の幾つかまたは全てが行われてもよい。
【０１２３】
（１）２つの微生物株または種が選ばれ、一方が所望の親宿主であり、他方が所望の親ドナーである。適当な親宿主は、生じるキメラハイブリッド株の最終的な所望の表現型、例えば、形態学表現型を発現し、一方、親ドナーは、宿主が現在発現していない、宿主において所望される表現型形質を発現する株である。１つの実施形態において、株は、異なる界に分類されてもよい。別の実施形態において、株は、異なる門に分類されてもよい。加えて、親ドナーはまた、親宿主において発現される表現型を欠いていなければならない。これらの固有の表現型の両方、ドナーにおける１つ、および宿主における１つが、プロセス培地または周囲の環境に取り込まれ得るかのいずれかの少なくとも１つの対応する環境ストレス要因を有しなければならない。
【０１２４】
（２）有効性をもたらすために、それぞれの親の種が、生存して、固形または液体培地上で単一のコロニーを形成することができる、最大（または最小）量の選択された条件を決定するために、最小阻害濃度（ＭＩＣ）試験を行うことが頻繁に必要である。ＭＩＣはまた、コロニー形成単位（ＣＦＵ）が他の親についてと同じ条件において成長することを可能にしない、環境ストレス要因の量を提供する。
【０１２５】
（３）ＭＩＣ情報が得られると（例えば、（２）において決定されるか、または既に公知のいずれか）、両方のストレス要因、例えば、２つの微生物株のそれぞれについてのストレス要因を含有する、固形培地または液体培地を含むプレートが作られてもよい。あるいは、ストレス要因の一方または両方は、培地の代わりに、遺伝子導入方法が行われる周囲環境において含有されてもよい（例えば、大気ガスの百分率もしくはインキュベーション温度）。目的の細胞は、親ドナーについて約１×１０８／ｍｌの密度まで、そして親宿主について約２〜３×１０８／ｍｌまで成長させてもよい。遺伝子導入方法を開始する前幾分かの時間、例えば、開始する前少なくとも３０分間、両方の株が影響を受けやすい、それほど重大でない環境的前ストレス要因が適用されてもよい。あるいは、それぞれの株が個々に影響を受けやすい異なるストレス要因が、遺伝子導入方法の開始に先立ち、適用されてもよい。幾つかの実施形態において、これらの前ストレス要因を適用して、遺伝子導入を増大させることが重要であるか、または望ましいが、上出来なキメラ結果を有するために必須ではない。前ストレス要因は、２つの親株を一緒に組み合わせる前に典型的に適用される。遺伝子導入のため親を準備する手助けをする、これらの前ストレス要因を決定するために、ＭＩＣが助言される。ＭＩＣ下で十分であるが、幾つかの細胞死をもたらす、より低い濃度が使用されてもよい。
【０１２６】
（４）適用可能であるなら、またはキメラ微生物ハイブリッドの製造における最初の工程としての前ストレス要因インキュベーション後、それぞれの親由来の細胞、例えば、対数期の細胞、例えば、中期から後期対数期の細胞が、一緒に組み合わされ、例えば、乾燥、凍結乾燥、蒸発、濾過、遠心分離、または沈殿により濃縮される。
【０１２７】
１つの実施形態において、フィルターおよび／または細胞ペレットは、次に、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。１つの実施形態において、それぞれの親由来の細胞５ｍｌが、計１０ｍｌで一緒に組み合わされ、例えば、０．２μｍのフィルター上への濾過により濃縮され、続いて、フィルターが、ＰＢＳのような、細胞の完全性を維持するのに適した溶液で洗浄される。１つの実施形態において、フィルターは、ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄される。この遺伝子導入フィルターおよび／または濃縮された細胞は、次に、例えば、上の（１）において決定され、（２）において言及される固形の二重選択培地に上を下にして置かれるか、もしくは液体の二重選択培地に丁度覆われるまで、チューブ、例えば、コニカルチューブに入れられるかのいずれかである。遺伝子導入フィルターは、次に、適当に選択された条件下で、幾分かの時間、例えば、４８時間インキュベーションされる。
【０１２８】
１つの実施形態において、細胞は、遠心分離により濃縮され、ＰＢＳで２回洗浄され、次に、少量の、二重ストレス要因を含有する液体に入れられる。次に、液体遺伝子導入培地は、適当に選択された条件下で、幾分かの時間、例えば、４８時間インキュベーションされる。
【０１２９】
１つの実施形態において、細胞は、乾燥または凍結乾燥により濃縮される。次に、これらの乾燥された細胞は、少量の、二重ストレス要因を含有する液体に加えられる。次に、液体遺伝子導入培地は、適当に選択された条件下で、幾分かの時間、例えば、４８時間インキュベーションされる。
【０１３０】
（５）インキュベーション後、固形培地由来の遺伝子導入フィルター、または濃縮された液体培地は、適量の液体溶液、例えば、ＰＢＳ１ｍｌを含む、無菌チューブ、例えば、微量遠心チューブに入れられる。加えて、任意の目に見えるバイオフィルムが、遺伝子導入プレートから掻爬され、同じチューブ、例えば、微量遠心チューブ内部に入れられる。両方の固形および液体培地フィルターインキュベーションのため、フィルターを含有するチューブおよび／または濃縮された細胞を含有する液体は、撹拌され、例えば、ボルテックスされ、次に、細胞は、液体から分離される、例えば、遠心機において、例えば、８０００ＲＣＦにて１０分間スピンダウンされる。ある量、例えば、８００μｌの上清が取り除かれる。細胞ペレットは、残りの上清、例えば、２００μｌと共に再懸濁され、選択培地上にプレーティングされる。上清が取り除かれ、細胞ペレットが、適当な体積の溶液、例えば、ＰＢＳ２００μｌに再懸濁され、次に、選択培地、例えば、所望の選択剤を含有する固形もしくは半固形培地に、および／または環境選択条件に置かれる。プレートを、所望の条件において最大５日間インキュベーションして、ＣＦＵを決定する。典型的には、コロニーは、プレーティングの１２時間後と同じくらいの早さで出現してもよいが、成長するのに最大５日間かかり得る。
【０１３１】
１つの実施形態において、液体から分けられた生じた細胞は、所望の形質についてキメラを選択するために、連続反応器に入れられ得る（プレーティングの代わり）。１つの実施形態において、二重ストレス要因は、１つの株のみが残るまで、量を増大させながら加えられる。１つの実施形態において、希釈率を増大して、最速で成長するキメラを単離することができる。
【０１３２】
（６）幾つかの株は、片利共生的に一緒に成長し、および／またはプレート上の細胞片からもたらされる誘起堆積物に寄生して生きていくので、ＣＦＵを形成する偽陽性が存在し得る。加えて、幾つかの株が、単一コロニー導入を介して次の世代に染色体性に導入しない順応を発現することが観察された。偽陽性を除外するために、全てのＣＦＵは、新規選択プレート上に、単一コロニーに再画線されてもよい。幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドが、選択培地から選択培地に戻ってまず移動するのはあまりにストレス性である幾つかの場合が存在するので、選択培地への１つおよびリッチ培地への１つの、２重再画線が好ましい。加えて、コロニーは、死ぬより前に選択培地からそれらを移動させるのに十分長く生存しなくてもよい。コロニーがリッチな培地上で出現するが、選択培地上では出現しないなら、リッチから二重選択培地へのさらなる単一コロニー移動を行い、表現型が依然として存在するかを決定する。新規微生物ハイブリッド株はまた、一時的なエピジェネティックな順応を除外するために、保存後にその新規表現型を保持しなければならない（例えば、低温貯蔵性、または単一コロニーからの胞子形成）。どちらかの親株が、宿主またはドナーになり得る。それ故、新規ハイブリッドの形態が記述される。典型的には、微生物ハイブリッドは、それが発現する主な形態表現型として分類するだろう（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ）。
【０１３３】
（７）任意選択工程として、生じた微生物ハイブリッドは、例えば、それは、ＭＩＣを有せず、まだ物質または条件に抵抗性であることが依然望まれるので、１次ストレス要因として使用するのが難しいストレス要因を含有するか、またはその存在下であるさらなるプレート上に画線されてもよい。この工程を使用して、オリジナルの親宿主の所望の表現型が保持されていることを確認してもよい。
【０１３４】
（８）キメラ微生物ハイブリッド株を、表現型試験および／もしくは遺伝子型試験を介して評価して、どの表現型ならびに／または遺伝子が親宿主に導入されたかを決定する。上出来なキメラ微生物ハイブリッドは、両方の親由来の形質および遺伝子を有するだろう。
【０１３５】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、抗生物質または抗真菌物質である。１つの実施形態において、抗生物質または抗真菌物質は、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、抗生物質または抗真菌物質は、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、もしくは９５０μｇ／ｍｌのいずれか、または約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約２５０μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ〜約６００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ〜約９００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、もしくは約５００μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。様々な実施形態において、抗生物質は、以下の抗生物質分類：アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド、オキサゾリジノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、またはテトラサイクリンの１つに分類される。１つの実施形態において、アミノグリコシドは、ゲンタマイシン、カナマイシン、またはネオマイシンである。１つの実施形態において、アンサマイシンはリファキシミンである。１つの実施形態において、カルバペネムは、エルタペネム、イミペネム、またはメロペネムである。１つの実施形態において、セファロスポリンは、セファドロキシル、セフォキシチン、セフォペラゾン、セフェピム、またはセフトビプロールである。１つの実施形態において、糖ペプチドは、バンコマイシンまたはテイコプラニンである。１つの実施形態において、リンコサミドは、クリンダマイシンまたはリンコマイシンである。１つの実施形態において、マクロライドは、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、またはエリスロマイシンである。１つの実施形態において、オキサゾリジノンはリネゾリドである。１つの実施形態において、ペニシリンは、ペニシリンＧ、アモキシシリン、オーグメンチン、アンピシリン、カルベニシリン、またはメチシリンである。１つの実施形態において、ポリプチドは、バシトラシン、コリスチン、またはポリミキシンＢである。１つの実施形態において、キノロンは、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ナリジクス酸、またはノルフロキサシンである。１つの実施形態において、スルホンアミドは、マフェニドまたはスルファジメトキシンである。１つの実施形態において、テトラサイクリンは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンである。１つの実施形態において、抗生物質は、リファンピシン、クロラムフェニコール、チ���ンフェニコール、メトロニダゾール、またはムピロシンである。
【０１３６】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、例えば、オリーブ油、桂皮油、ペパーミント油、タイム油、ローズマリー油、丁子油、パラフィン系油（parrafinic oil）、ミント油、またはニンニク油のような植物油において見出される、有機化合物である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる有機化合物は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度にある。幾つかの実施形態において、有機化合物は、少なくとも約１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌもしくは９５０ｍｇ／ｍｌのいずれか、または約１ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、約２５０ｐｇ／ｍｌ〜約７５０ｐｇ／ｍｌ、約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｐｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、もしくは約５００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５０ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌ、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、有機化合物は、オーレウーロペンのようなフェノール化合物である。幾つかの実施形態において、有機化合物は、脂肪酸、モノグリセリド、またはアルデヒドである。
【０１３７】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は溶媒である。１つの実施形態において、溶媒は、成長培地に約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度にて加えられる。幾つかの実施形態において、溶媒は、少なくとも約１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌもしくは９５０ｍｇ／ｍｌのいずれか、または約１ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、約２５０ｐｇ／ｍｌ〜約７５０ｐｇ／ｍｌ、約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｐｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、もしくは約５００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５０ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌ、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、溶媒は、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ベンゼン、１-ブタノール、２-ブタノール、２-ブタノン、ｔ-ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、デカン、１-２-ジクロロエタン、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ジグリム、１，２-ジメトキシ-エタン（ＤＭＥ）、ジメチル-ホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，４-ジオキサン、エタノール、酢酸エチル、エチレングリコール、グリセリン、ヘプタン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ヘキサメチルホスホルトリアミド（ＨＭＰＴ）、ヘキサン、ヘプタン、メタノール、メチルｔ-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、塩化メチレン、Ｎ-メチル-２-ピロリジノン（ＮＭＰ）、ニトロメタン、ノナン、オクタン、ペンタン、リグロイン、１-プロパノール、２-プロパノール、ピリジン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、トリエチルアミン、ｏ-キシレン、ｍ-キシレン、またはｐ-キシレンである。
【０１３８】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は高温である。１つの実施形態において、大気温度は、約２１℃〜約１３０℃である。幾つかの実施形態において、大気温度は、少なくとも約２１℃、２５℃、５０℃、７５℃、１００℃、もしくは１２５℃のいずれか、または約２１℃〜約５０℃、約２５℃〜約７５℃、約５０℃〜約１００℃、約７５℃〜約１２５℃、約９０℃〜約１３０℃、約２１℃〜約１００℃、もしくは約１００℃〜約１３０℃のいずれかである。
【０１３９】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は低温である。１つの実施形態において、大気温度は、約-２００℃〜約２１℃である。幾つかの実施形態において、大気温度は、約-２００℃〜約-１７５℃、約-１７５℃〜約-１５０℃、約-１２５℃〜約-１００℃、約-１００℃〜約-７５℃、約-７５℃〜約-５０℃、約-５０℃〜約-２５℃、約-２５℃〜約０℃、約０℃〜約２１℃、もしくは約-２００℃〜約-１００℃、約-１００〜約０℃、もしくは約-５０℃〜約２１℃の、少なくとも約-２００℃、-１７５℃、-１５０℃、-１２５℃、-１００℃、-７５℃、-５０℃、-２５℃、０℃、または１５℃のいずれかである。
【０１４０】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は紫外線である。１つの実施形態において、紫外線継続時間は、少なくとも約２分の１秒かつ約２分以下である。幾つかの実施形態において、紫外線継続時間は、少なくとも約０．５、１、５、１０、５０、もしくは１００秒のいずれか、または約０．５〜約１、約１〜約５、約２〜約１０、約５〜約２５、約１５〜約５０、約２５〜約７５、約８０〜約１２０、約０．５〜約５０、約２５〜約１２０、もしくは約６０〜約１２０秒のいずれかである。
【０１４１】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は浸透圧である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる浸透圧性ストレス要因は、約５ｍＭ〜約１０Ｍの濃度の塩化ナトリウムのような塩である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる浸透圧性ストレス要因は、約５ｍＭ〜約１０Ｍの濃度のグルコースのような糖である。幾つかの実施形態において、浸透圧性ストレス要因は、少なくとも約５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、２．５Ｍ、５Ｍ、７．５Ｍ、もしくは９．５Ｍのいずれか、または約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１Ｍ、約７５０ｍＭ〜約１．５Ｍ、約１Ｍ〜約２．５Ｍ、約２Ｍ〜約５Ｍ、約２．５Ｍ〜約７．５Ｍ、約５Ｍ〜約１Ｍ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約１０Ｍのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。
【０１４２】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は無機化合物である。１つの実施形態において、成長培地に加えられる無機化合物は、少なくとも約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度にある。幾つかの実施形態において、無機化合物は、少なくとも約１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌもしくは９５０ｍｇ／ｍｌのいずれか、または約１ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、約２５０ｐｇ／ｍｌ〜約７５０ｐｇ／ｍｌ、約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｐｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、または約５００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５０ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌ、約１ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、無機化合物は、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、二酸化ケイ素、酸化チタン、二酸化塩素、塩化鉄、硫酸銅、銀ナノ粒子、または酸化コバルトである。
【０１４３】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は電離放射線である。１つの実施形態において、コバルト６０またはセシウム１３７を含むJ. L. Shepherdからの自給式照射設備一式を使用して、約１Ｇｙ／分と同様の低さ〜約２５０Ｇｙ／分と同様の高さまでの放射線で播種された試料約０．１ｍｌ〜約１リットルを照射する。幾つかの実施形態において、放射線レベルは、少なくとも約１Ｇｙ／分、５Ｇｙ／分、１０Ｇｙ／分、２５Ｇｙ／分、５０Ｇｙ／分、１２５Ｇｙ／分、１５０Ｇｙ／分、１７５Ｇｙ／分、２００Ｇｙ／分、２２５Ｇｙ／分、もしくは２４５Ｇｙ／分、または約１Ｇｙ／分〜約５Ｇｙ／分、約２．５Ｇｙ／分〜約７．５Ｇｙ／分、約５Ｇｙ／分〜約１０Ｇｙ／分、約７．５Ｇｙ／分〜約２５Ｇｙ／分、約１０Ｇｙ／分〜約５０Ｇｙ／分、約２５Ｇｙ／分〜約７５Ｇｙ／分、約５０Ｇｙ／分〜約１００Ｇｙ／分、約７５Ｇｙ／分〜約１５０Ｇｙ／分、約１００Ｇｙ／分〜約１５０Ｇｙ／分、約１２５Ｇｙ／分〜約１７５Ｇｙ／分、約１５０Ｇｙ／分〜約２００Ｇｙ／分、約１７５Ｇｙ／分〜約２５０Ｇｙ／分、約１Ｇｙ／分〜約５０Ｇｙ／分、約５０Ｇｙ／分〜約１５０Ｇｙ／分、約１００Ｇｙ／分〜約２００Ｇｙ／分、もしくは約１５０Ｇｙ／分〜約２５０Ｇｙ／分のいずれかである。
【０１４４】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は大気ガスの組成物である。１つの実施形態において、酸素（Ｏ２）は、大気に、例えば、嫌気性大気に、少なくとも約０．２％ｖ／ｖ〜約１００％ｖ／ｖの濃度にて加えられる。幾つかの実施形態において、酸素は、大気に、少なくとも約１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、５０％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、７０％ｖ／ｖ、８０％ｖ／ｖ、もしくは８５％ｖ／ｖ、もしくは９０％ｖ／ｖ、もしくは９５％ｖ／ｖのいずれか、または約１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ〜約２５％ｖ／ｖ、約２０％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖ、約４０％ｖ／ｖ〜約６０％ｖ／ｖ、約５０％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、約７０％ｖ／ｖ〜約８５％ｖ／ｖ、約７５％ｖ／ｖ〜約１００％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ〜約４０％ｖ／ｖ、約２５％ｖ／ｖ〜約６０％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ〜約７０％ｖ／ｖ、もしくは約５０％ｖ／ｖ〜約１００％ｖ／ｖのいずれかの濃度にて加えられる。別の実施形態において、大気酸素は、０％または実質的に０％ｖ／ｖの濃度に制限される。
【０１４５】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ビタミンもしくは補助因子であるか、またはその不足である。幾つかの実施形態において、ビタミンまたは補助因子は、成長培地に含まれないか（０％）、または非常に低いレベル（実質的に０％ｗ／ｗ）に制限される。１つの実施形態において、ビタミンまたは補助因子は、例えば、０％もしくは実質的に０％ｗ／ｗに制限された濃度の、ビオチンである。
【０１４６】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は酸である。１つの実施形態において、加えられる酸の量は、約０．１ｍＭ〜約１０Ｍの濃度にある。幾つかの実施形態において、酸は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、２．５Ｍ、５Ｍ、７．５Ｍ、もしくは９．５Ｍのいずれか、または約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約０．７５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．７５ｍＭ〜約１．２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１Ｍ、約７５０ｍＭ〜約１．５Ｍ、約１Ｍ〜約２．５Ｍ、約２Ｍ〜約５Ｍ、約２．５Ｍ〜約７．５Ｍ、約５Ｍ〜約１Ｍ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約１０Ｍのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、酸は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、乳酸、塩酸、硫酸、酪酸、ソルビン酸、亜硫酸、ホウ酸、クエン酸、亜硝酸、硝酸、炭酸、安息香酸、アスコルビン酸、イソ-アスコルビン酸、酢酸、サリチル酸、アスピリン、スルファジアジン、イブプロフェン、リン酸、エリソルビン酸、プロピオン酸、酒石酸、過塩素酸、臭化水素酸、イオン化水素酸（hydroiotic acid）、シアン化水素酸、フッ化水素酸、亜リン酸、セレン化水素酸、硫化水素酸、またはシュウ酸である。
【０１４７】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ｐＨを増大するために使用される塩基である。１つの実施形態において、加えられる塩基の量は、約０．１ｍＭ〜約１０Ｍの濃度にある。幾つかの実施形態において、塩基は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、２．５Ｍ、５Ｍ、７．５Ｍ、もしくは９．５Ｍのいずれか、または約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約０．７５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．７５ｍＭ〜約１．２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１Ｍ、約７５０ｍＭ〜約１．５Ｍ、約１Ｍ〜約２．５Ｍ、約２Ｍ〜約５Ｍ、約２．５Ｍ〜約７．５Ｍ、約５Ｍ〜約１Ｍ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約１０Ｍのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、塩基は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジエチルアミド、ナトリウムアミド、水素化ナトリウム、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、二酸化ケイ素と水酸化アルミニウムの混合物、酸化マグネシウムと二酸化ケイ素の混合物、酸化カルシウムと二酸化ケイ素の混合物、活性炭、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム（ソーダ灰）、骨炭、水酸化アンモニウム、アンモニア、アニリン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジブチルアミン、トリブチルアミン、ｎ-ブチルアミン、次亜塩素酸塩（hypochorite）、シアン化物、リン酸塩、ケイ酸塩、水酸化物、アルピリジン、コデイン、アンフェタミン、またはエピネフリンである。
【０１４８】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は炭水化物供給源である。１つの実施形態において、成長培地中の、親が成長のため代謝することができる炭水化物供給源の量は、０％または実質的に０％ｗ／ｗの濃度に制限される。
【０１４９】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は窒素供給源である。幾つかの実施形態において、窒素供給源は、成長培地に含まれないか（０％）、または非常に低いレベルに制限される（実質的には０％ｗ／ｗ）。１つの実施形態において、窒素供給源は、例えば、０％または実質的に０％ｗ／ｗに制限された濃度の、成長培地中の１つもしくは複数のアミノ酸またはタンパク質である。
【０１５０】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は生物学的毒素である。１つの実施形態において、毒素は、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、生物学的毒素は、少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは９５０ｍｇ／ｍｌのいずれか、または約１００ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、約２５０ｐｇ／ｍｌ〜約７５０ｐｇ／ｍｌ、約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｐｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、もしくは約５００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５０ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍｌのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。１つの実施形態において、毒素は、例えば、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度の、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）由来の毒素Ａ、Ｂ、またはＣＤＴである。幾つかの実施形態において、毒素は、細菌種により産生される外毒素、エンテロトキシン、または内毒素である。
【０１５１】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、ペプチド、例えば、微生物ペプチドである。１つの実施形態において、ペプチドは、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、もしくは９５０ｍｇ／ｋｇのいずれか、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ、約７５０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、ペプチドは、バクテリオシン、抗毒素、抗原、またはクオラムセンシングペプチドである。
【０１５２】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、防腐剤、例えば、食品防腐剤である。１つの実施形態において、防腐剤は、約０．５ｍＭ〜約１Ｍの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、防腐剤は、少なくとも約０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、もしくは１Ｍのいずれか、または約０．５ｍＭ〜約０．２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約７．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０Ｍ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１Ｍ、もしくは約１００ｍＭ〜約１Ｍのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、防腐剤は、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、イソアスコルビン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、ウッドスモーク、ソルビン酸カルシウム、エチルラウロイルアルギン酸塩、４-ヘキシルレゾルシノール、メチル-ρ-ヒドロキシ安息香酸塩、メチルパラベン、安息香酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、乳酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピル-ρ-ヒドロキシ安息香酸塩、プロピルパラベン、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、二酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、二炭酸ジメチル、ナタマイシン、ソルビン酸カリウム、二酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、Ｌ-システイン、Ｌ-システイン塩酸塩、グアヤクガム、レシチン、クエン酸レシチン、クエン酸モノグリセリド、クエン酸モノイソプロピル、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウム、第３ブチルヒドロキノン、またはトコフェロールである。
【０１５３】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は除草剤である。１つの実施形態において、除草剤は、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、除草剤は、少なくとも約１ｐｇ／ｋｇ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ、５００ｐｇ／ｋｇ、７５０ｐｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、５０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ  ５００ｎｇ／ｋｇ、７５０ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、もしくは９５０ｍｇ／ｋｇのいずれか、または約１ｐｇ／ｋｇ〜約５００ｐｇ／ｋｇ、約２５０ｐｇ／ｋｇ〜約７５０ｐｇ／ｋｇ、約５００ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約７５０ｐｇ／ｋｇ〜約２５０ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約５００ｎｇ／ｋｇ、約２５０ｎｇ／ｋｇ〜約７５０ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ〜約７５０μｇ／ｋｇ、もしくは約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、除草剤は、アトラジン、ニコスルフロン、カルフェントラゾン、ナプタラム、２，４-ジクロロフェノキシ酢酸（２-４Ｄ）、キザロホップ、ベネフィン、ベンタゾン、プロメトリン、メソトリオン、フルミオキシジン（flumioxzin）、クロマゾン、エタルフルラリン、テトラクロロテレフタル酸ジメチル（ＤＣＰＡ）、ナプロパミド、ダイクォット、ｓ-メトラクロール、ｓ-ジプロピルチオカルバミン酸エチル（ＥＰＴＣ）、アメトリン、ジメタンアミド、フルアジホップ、オキシルフルオロフェン（oxylfluorfen）、パラコート、ジウロン、プロナミド、アラクロール、テンボトリオン、リニュロン、リムスルフロン、セトキシジム、ベンスリド、ペンディメタリン、ピラゾン、シクロエート、マレイン酸ヒドラジド、グリホサート、ハロスルフロン、ペラルゴン酸、クレトジム、メトリブジン、リムスルフロン、ターバシル、エタルフルラリン、フェンメディファム、クロピラリド、ブチル化、４-（２-メチル-４-クロロフェノキシ）酪酸（ＭＣＰＢ）、ペブレート、またはトリフルラリンである。
【０１５４】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、真菌剤または殺菌剤である。１つの実施形態において、真菌剤または殺菌剤は、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、真菌剤または殺菌剤は、少なくとも約１ｐｇ／ｋｇ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ、５００ｐｇ／ｋｇ、７５０ｐｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、５０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ  ５００ｎｇ／ｋｇ、７５０ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、もしくは９５０ｍｇ／ｋｇのいずれか、または約１ｐｇ／ｋｇ〜約５００ｐｇ／ｋｇ、約２５０ｐｇ／ｋｇ〜約７５０ｐｇ／ｋｇ、約５００ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約７５０ｐｇ／ｋｇ〜約２５０ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約５００ｎｇ／ｋｇ、約２５０ｎｇ／ｋｇ〜約７５０ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ〜約７５０μｇ／ｋｇ、もしくは約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、真菌剤または殺菌剤は、アシベンゾラル-Ｓ-メチル、硫酸ストレプトマイシン、バクテリオファージ、ホセチルＡｌ、メフェノキサム、重炭酸カリウム、オキシ塩化銅、水酸化銅、硫酸銅、ペンタクロロニトロベンゼン（ＰＣＮＢ）、ジクロラン、プロピコナゾール、ピラクロストロビン、オクタン酸銅、水酸化銅、クロロタロニル、シモキサニル、フェンヘキサミド、ボスカリド、トリフロキシストロビン、ペンチオピラド、ジメトモルフ、トリフロキシストロビン、パラフィン系オイル、水酸化銅、フルオピラム、マンコゼブ、フルジオキソニル、チアベンダゾール、マンジプロパミド、硫黄、重炭酸カリウム、リン酸一カリウム、フルアジナム、ポリオキシンＤ、二酸化水素、リン酸カリウム、フルオピコリド、プロパモカルブ、トリフルミゾール、アゾキシストロビン、キノキシフェン、ミクロブタニル、シアゾファミド、フェマジオン（femadione）、マンジプロパミド、メフェノキサム、イプロジオン、ピリメタニル、石油、もしくはメトロフェノン（metrofenone）である。
【０１５５】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は駆除剤である。１つの実施形態において、駆除剤は、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、駆除剤は、少なくとも約１ｐｇ／ｋｇ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ、５００ｐｇ／ｋｇ、７５０ｐｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、５０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ  ５００ｎｇ／ｋｇ、７５０ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、もしくは９５０ｍｇ／ｋｇのいずれか、または約１ｐｇ／ｋｇ〜約５００ｐｇ／ｋｇ、約２５０ｐｇ／ｋｇ〜約７５０ｐｇ／ｋｇ、約５００ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約７５０ｐｇ／ｋｇ〜約２５０ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約５００ｎｇ／ｋｇ、約２５０ｎｇ／ｋｇ〜約７５０ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ〜約７５０μｇ／ｋｇ、もしくは約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇのいずれかの濃度にて成長培地に含まれる。幾つかの実施形態において、駆除剤は、アバメクチン、アセフェート、ビフェナゼート、チアメトキサム、イミダクロプリド、フェンピロキシメート、イミダクロプリド、アザジラクチン、ペルメトリン、マラチオン、エスフェンバレレート、アセタミプリド、インドキサカルブ、アザジラクチン、ベータ-シフルトリン、クロチアニジン、フロニカミド、フルベンジアミド、ビフェントリン、スピノサド、カルバリル、クロルピリホス、スルホキサフロル、テブフェノジド、クロルアントラニリプロール、テルブホス、チアメトキサム、鉱油、フェンプロパトリン、メタアルデヒド、ガンマ-シハロトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、ジメトエート、ジフルベンズロン、ピリプロキシフェン、シアントラニリプロール、ビフェナゼート、テフルトリン、ピメトロジン、クロルピリホス、ゼータ-シペルメトリン、ホスメット、メトキシフェノジド、アセキノシル、ラムダ-シハロトリン、イミダクロプリド、マラチオン、大豆油、硫黄、スピロテトラマト、オキシデメトンメチル、シフルメトフェン、スピロメシフェン、エマメクチン安息香酸塩、氷晶石、クロルフェナピル、ピレトリン、フィプロニル、ノバルロン、ジノテフラン、綿実油、アセキノシル、リン酸鉄、ブプロフェジン、ニーム油、シロマジン、オキサミル、またはエトキサゾールである。
【０１５６】
１つの実施形態において、環境ストレス要因は、別の微生物の使用済み発酵ブロスの濾液である。例えば、１つの実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル発酵から濾過された使用済みブロスは、ストレス要因として使用される。１つの実施形態において、濾過された使用済みブロスは、約１％ｖ／ｖ〜約９０％ｖ／ｖの濃度にて成長培地に加えられる。幾つかの実施形態において、使用済みブロスは、少なくとも約１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、５０％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、７０％ｖ／ｖ、８０％ｖ／ｖ、もしくは８５％ｖ／ｖのいずれか、または約１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ〜約２５％ｖ／ｖ、約２０％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖ、約４０％ｖ／ｖ〜約６０％ｖ／ｖ、約５０％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、約７０％ｖ／ｖ〜約８５％ｖ／ｖ、約７５％ｖ／ｖ〜約９０％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ〜約４０％ｖ／ｖ、約２５％ｖ／ｖ〜約６０％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ〜約７０％ｖ／ｖ、もしくは約５０％ｖ／ｖ〜約９０％ｖ／ｖのいずれかの濃度にて成長培地に加えられる。
【０１５７】
親微生物株は、細菌または真菌であり得る。幾つかの実施形態において、微生物株は、ラクトバチルス、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、オエノコッカス（Oenococcus）、ワイセラ（Weissella）、ビフィドバクテリウム、ガードネレラ（Gardnerella）、クロストリジウム、ディオノコッカス（Deionococcus）、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、アナエロバクター（Anaerobacter）、コプロバチルス（Coprobacillus）、オキソバクター（Oxobacter）、スポロバクター（Sporobacter）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、ヘリオバクテリウム（Heliobacterium）、オシロスピラ（Oscillospira）、ペプトコッカス（Peptococcus）、デハロバクター（Dehalobacter）、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）、コプロコッカス（Coprococcus）、ラクノスピラ（Lachnospira）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ムーレラ（Moorella）、リステリア（Listeria）、マイコプラズマ、バチルス、パエニバチルス（Paenibacillus）、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリキア、サルモネラ（Salmonella）、クレブシエラ（Klebsiella）、シュードモナス、ビブリオ（Vibrio）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ハロモナス（Halomonas）、バクテロイデス（Bacteroides）、プレボテラ（Prevotella）、バルトネラ（Bartonella）、ポルフィロモナス（Porphyromonas）、アクチノミセス（Actinomyces）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、カウロバクター（Caulobacter）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、ロドバクター（Rhodobacter）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）、マグネトバクテリウム（Magnetobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ザイモモナス（Zymomonas）、リケッチア（Rikettsia）、エルフテリア（Eleftheria）、サッカロマイセス、シゾサッコロミセス（Schizosocchoromyces）、シェフェロマイセス、ザイゴサッカロミセス、ヤロウイア、ピキア、デッケラ、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、カンジダ、メチニコビア、またはトルラスポラの種である。１つの実施形態において、細菌株は、ラクトバチルス種、例えば、ラクトバチルス・プランタルム（L. plantarum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（L. sanfranciscensis）、ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・カルバータス（L. curvatus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、ラクトバチルス・ブフネリ（L. buchneri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、またはラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）である。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、親株は、同じ界に分類されない。１つの実施形態において、親株は、同じ門に分類されない。
【０１５９】
幾つかの実施形態において、両方の意図される親宿主とドナー株は、相前後して適用される異なる環境ストレス要因を有する。
【０１６０】
幾つかの実施形態において、適用される前ストレス要因は、遺伝子導入の選択環境と異なる多様なもの（例えば、異なる選択剤または環境条件）である。
【０１６１】
幾つかの実施形態において、ドナー株であることが意図される親は、宿主になることができる。
【０１６２】
幾つかの実施形態は、両方の親由来の幾つかの遺伝子を保持する微生物ハイブリッドをもたらす。
【０１６３】
幾つかの実施形態は、倍数体、すなわち、両方の親由来の全ゲノムまたは実質的に全ゲノムを保持している、微生物ハイブリッドをもたらす。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、微生物ハイブリッドは、それがもたらされる２つの微生物の親株の１つの種と遺伝子型を同定する。例えば、微生物ハイブリッドは、両方の微生物の親由来のＤＮＡを含有するけれども、それは、１つの親のみの由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡを保持し得、それにより、その親の種と遺伝子型を同定する。
【０１６５】
生じた微生物ハイブリッドは、ベクターを使用せずに、水平遺伝子導入を経験した。
【０１６６】
微生物ハイブリッドは、キメラであるとみなされる。
【０１６７】
生じた微生物ハイブリッド（単一コロニーから）は、それらを成長させる環境に依存して、複数の表現型を呈し得る。
【０１６８】
キメラ微生物ハイブリッド
キメラ微生物ハイブリッドは、本明細書において開示される方法から生じる株であり、ハイブリッド表現型および遺伝子型を有する。それらは、ベクターを使用しない、インビトロの外側遺伝子導入の結果である。キメラ微生物は、両方の親宿主と親ドナー由来のＤＮＡを保持し、発現する。
【０１６９】
１つの実施形態において、キメラ微生物ハイブリッドは、親宿主の表現型または遺伝子型を親ドナーと比較することにより、確認することができる。幾つかの実施形態において、宿主株は、染色体遺伝子の約０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％のいずれか、または少なくとも約０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９５％、９８％、もしくは９９％のいずれかを親ドナー株と共有するだろう。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、キメラ微生物ハイブリッドは、代謝のための炭素供給源、両方の親株が成長することができない二重選択プレート上での成長、またはどの遺伝子が、遺伝子導入中に得られ、および／もしくは失われたかを正確に示す全ゲノム配列を検査することにより、確認される。
【０１７１】
キメラ微生物ハイブリッドの使用方法
キメラ微生物ハイブリッドは、多くの商業および産業応用を有する。新規商品を創出するため、もしくは現在の商業的微生物の収益性を改善するために形質を加えるか、または差し引くことは、広範な効力のある使用、ならびにアルコール製造、発酵食品、除草剤製造、真菌剤製造、殺菌剤製造、駆除剤製造、食品添加物および保存剤、バイオ燃料および生化学の製造、プロバイオティクス、生きた生物学的治療、薬効のある食べ物、ならびに医薬を含むが、これらに限定されない、かかる産業における商品の製造を含む。
【０１７２】
幾つかの実施形態において、本明細書において開示される株の改良法を使用して、発酵食品産業において新規商品を作るのにより適している（例えば、野生型株と比較し、改善された適応性を有する）キメラ株を作ってもよい。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）のような微生物において高温抵抗性のような極めて重要な産業的形質を、発酵が異なる風味付けがされた、チーズまたはヨーグルトのような乳製品をもたらす他の生物に導入することができた。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、本明細書において開示される株の改良法を使用して、同じ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子型同定の野生型株が作ることができない産業商品を作るキメラ株を作ってもよい。幾つかの実施形態において、商品は、バイオマスまたは細胞材料の製造；バクテリオシン、溶媒もしくは他の化合物のような細胞外代謝物の製造；酵素、プロテアーゼもしくは他のタンパク質のような細胞内成分の製造；またはヨーグルトもしくはチーズにおけるような発酵物質の形質転換を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、本明細書において開示される株の改良法を使用して、一般的な健康プロバイオティクスとして使用されるべき野生型株より適しているキメラ株を作ってもよい。胞子を形成する能力、より速い成長、高温抵抗性、および酸耐性のような形質は、現行のプロバイオティクスの有効性を改善することができた。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、本明細書において開示される株の改良法を使用して、泌尿生殖器感染症；炎症性腸症候群、過敏性腸症候群、大腸炎、およびクローン病を含む腸の炎症；コレラのようなエンテロトキシン介在性感染症；クロストリジウム・ディフィシル感染症を含む抗生物質に付随する下痢（ＡＡＤ）；急性下痢；食中毒；湿疹を含むアトピー性皮膚炎；ざ瘡；細菌性腟症；酵母感染症；毒素性ショック症候群；壊死性腸炎（ＮＥＣ）；う歯；ビタミン欠乏症；高血圧；高コレステロール；潰瘍；肥満；小児呼吸感染症；鼻の病原体；アレルギー；関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、脈管炎、円形脱毛症、ループス、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、セリアック病、グレーブス病、および橋本の甲状腺炎（thryoiditis）を含む自己免疫疾患；ラクトース不耐性；ＩＩ型糖尿病；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のような薬剤耐性細菌感染症；痛風；感染性疾患；心疾患、ならびに癌を含むが、これらに限定されない、疾患または状態を処置するための生きた生物学的治療としての野生型株より適しているキメラ株を作ってもよい。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、キメラ株を使用して、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）を予防し、治療してもよい。アミノ酸原栄養性およびでんぷん代謝のような新規形質は、腸の感染中に存在するもののような、低い栄養素環境において成長をサポートするだろう。結腸上皮細胞への増大した接着、抗毒素Ａ産生、抗毒素Ｂ産生またはバクテリオシン産生のような、他の形質を野生型株に加えて、ＣＤＩ処置のための治療性質を導入することもできる。
【０１７７】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図し、制限することを意図しない。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
エタノール前ストレス要因でのラクトバチルス・プランタルムアミノ酸栄養要求性除去
この実験における所望の親宿主は、ラクトバチルス・プランタルムであった。取得させるべき表現型は、親ドナーであるクロストリジウム・ベイジェリンキが提供した。遺伝子導入の所望の形質は、アミノ酸原栄養性、またはタンパク質もしくはアミノ酸を含有しない最小培地上での生存であり、クロストリジウム親は、最小培地上で３５〜３７℃にて嫌気的に成長することができる。ラクトバチルス親は、タンパク質または加えられたアミノ酸を含まない培地上で成長することができない。
【０１７９】
ストレス要因についてのＭＩＣを決定した。クロストリジウム・ベイジェリンキの成長に最適な温度は３２℃であり、ＭＩＣ３９℃を伴った。ラクトバチルス・プランタルムは、３７℃の成長に最適な温度を有し、ＭＩＣ４４℃を伴った。選択した遺伝子導入培地は、アミノ酸またはタンパク質を含有しない最小培地であった。クロストリジウム親は偏性嫌気性菌であり、一方、ラクトバチルス親は通性嫌気性菌である。この遺伝子導入のため選んだ大気条件は、好気的であり、嫌気的開始を伴った。遺伝子導入後、プレートを、４２℃に設定した好気性インキュベーターに移動した。
【０１８０】
前ストレス要因条件は、最大０．２Ｍの幾つかの濃度にてエタノールを含む、幾つかの溶媒を含むものであった。前ストレス要因を使用しない対照も行った。
【０１８１】
全ての培養物用培地は、２％ｗ／ｗグルコースを含む改変強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）であった。前ストレス要因の適用に先立ち、培養物を、同じ改変ＲＣＭにおいて、３７℃の嫌気性チャンバーにおいてＯＤ６００１．０まで成長させた。
【０１８２】
親宿主ラクトバチルス・プランタルムの同等の開始ＣＦＵは、１．２５×１０９細胞を含有する総体積５ｍｌについて、２．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。一方、所望のドナークロストリジウム・ベイジェリンキは、５×１０８細胞を含有する総体積５ｍｌについて、同等のＣＦＵ１×１０８ＣＦＵ／ｍｌを有していた。
【０１８３】
前ストレス要因あり、またはなしで３０分間インキュベーション後、それぞれの条件について、両方の親培養物を一緒に混ぜ、無菌の０．２μｍのフィルターにて濾過した。次に、フィルターを、無菌ＰＢＳ１０ｍｌを含むシリンジを介して洗浄した。それぞれのフィルターを、脱酸素化した最小培地プレートに逆さに置いた。プレートを、嫌気性チャンバーから取り出し、４２℃に設定した好気性インキュベーターに入れた。プレートを、４８時間インキュベーションした。
【０１８４】
４８時間後、それぞれの条件由来のフィルターを、寒天プレートから取り出し、１．５ｍｌの微量遠心チューブ内のＰＢＳ１ｍｌに入れた。フィルターを含有する微量遠心チューブを、ボルテックスし、次に、８０００ＲＦＣにて１０分間スピンダウンした。上清８００ｍｌを取り除き、細胞ペレットを、残りの上清２００μｌに再懸濁した。次に、それぞれの条件について、全懸濁液を、プレーティングの直前に嫌気性チャンバーから取り出した単一の新鮮な好気性最小プレートにプレーティングした。プレートが乾燥したら、それらを、チャンバーから取り出し、４２℃に設定した好気性インキュベーターに入れた。
【０１８５】
プレートを、コロニーについて毎日チェックした。次に、２つの異なるプレート、１つの最小培地プレートおよび１つのリッチ培地にプレーティング後３〜５日にて、単一コロニーから、単一コロニーを再度画線した。２日後、再度リッチ培地プレートから最小プレートに、単一コロニーを再度画線した。次に、再度画線し、最終セットの最小培地プレート上で単一コロニーまでもう一度成長したコロニーのみを、分析した。
【０１８６】
結果
原栄養体ハイブリッドをもたらす遺伝子導入の頻度は、２００ｍＭエタノール前ストレス要因条件について１×１０-８であった。適用した前ストレス要因を含まない条件から生じたコロニーはなかった。生じたキメラ微生物ハイブリッドＣ-１の分析を、実施例２由来の９つのキメラと共に並行して行った。以下の実施例２は、より詳細な結果を提供する。
【０１８７】
実施例２
ＵＶ前ストレス要因でのラクトバチルス・プランタルムアミノ酸栄養要求性除去
所望の親宿主は、ラクトバチルス・プランタルムであった。導入すべき所望の表現型は、親ドナーであるクロストリジウム・ベイジェリンキが提供した。遺伝子導入の所望の形質は、アミノ酸原栄養性、またはタンパク質もアミノ酸も含有しない最小培地プレート上での生存であった。
【０１８８】
クロストリジウム・ベイジェリンキは、最小培地上で３５℃にて嫌気的に成長することができる。ラクトバチルス・プランタルムは、タンパク質または加えたアミノ酸を含まない培地上で成長することができない。クロストリジウム・ベイジェリンキの成長に最適な温度は３２℃であり、ＭＩＣ３９℃を伴う。ラクトバチルス親株は、３７℃の成長に最適な温度を有し、ＭＩＣ４４℃を伴う。選択した遺伝子導入培地は、タンパク質またはアミノ酸を含有しない最小培地であった。
【０１８９】
前ストレス要因は、短いバーストの紫外線（ＵＶ）光を含む２つの異なる条件を含むものであった。１つの条件は、両方の親についてサイクルの間に１０分の休止を伴った３×２秒の期間、蓋を取ったペトリ皿において好気性バイオセイフティーキャビネット内で紫外線を適用した。第２の条件は、クロストリジウム親についてのストレス要因を含まない、ラクトバチルス親のみについてと同じＵＶストレス要因を適用し、３５℃での嫌気的インキュベーションを継続した。適用した前ストレス要因を含まない、両方の親が３５℃の嫌気性チャンバー内で３０分間のインキュベーションを継続した条件と共に、別々の培養において全ての株に前ストレスを与えた。
【０１９０】
全ての培養物用培地は、２％ｗ／ｗグルコースを含む改変ＲＣＭであった。前ストレス要因の適用に先立ち、培養物を、３５℃の嫌気性チャンバーにおいて同じ改変ＲＣＭ中ＯＤ６００１．０まで成長させた。宿主ラクトバチルス・プランタルム株の同等の開始ＣＦＵは、１．２５×１０９細胞を含有する総体積５ｍｌについて、２．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。一方、所望のドナークロストリジウム・ベイジェリンキ株は、５×１０８細胞を含有する総体積５ｍｌについて、同等のＣＦＵ１×１０８ＣＦＵ／ｍｌを有していた。
【０１９１】
前ストレス要因あり、またはなしで３０分間インキュベーション後、それぞれの条件について、両方の親培養物を一緒に混ぜ、０．２μｍのフィルターにて濾過した。次に、フィルターを、無菌ＰＢＳ１０ｍｌを含むシリンジを介して洗浄した。フィルターを、脱酸素化した最小培地プレートに逆さまに置いた。プレートを、酸素を除去する触媒を含まない大部分空気の詰まったボックス内部に置き、次に、嫌気性チャンバーから取り出し、４２℃に設定した好気性インキュベーターに入れた。プレートを、４８時間インキュベーションした。インキュベーションボックス内部の正確な酸素百分率は測定しなかった。
【０１９２】
インキュベーション後、それぞれの条件由来のフィルターを、１．５ｍｌの微量遠心チューブ内のＰＢＳ１ｍｌに入れた。フィルターを含有する微量遠心チューブを、ボルテックスし、次に、８０００ＲＦＣにて１０分間スピンダウンした。上清８００ｍｌを取り除き、細胞ペレットを、残りの上清２００μｌに再懸濁した。次に、それぞれの条件について、全懸濁液を、遺伝子導入の直前に嫌気性チャンバーに入れた単一の新鮮な好気的最小プレートにプレーティングした。プレートが乾燥したら、それらを、酸素を除去する触媒を含まない脱酸素化した大部分空気の詰まったボックスに入れ、次に、４２℃に設定した好気性インキュベーターに入れた。
【０１９３】
プレートを、コロニーについて毎日チェックした。次に、１つが最小培地プレートを含み、１つがリッチ培地を含む、２つの異なるプレートに単一コロニーからプレーティングした後３〜５日にて、単一コロニーを再度画線した。２日後、再度リッチ培地プレートから最小プレートに、単一コロニーを再度画線した。次に、最終セットの最小培地プレート上で単一コロニーまで成長したコロニーのみを分析した。
【０１９４】
結果
原栄養体ハイブリッドをもたらす遺伝子導入の頻度は、ＵＶ前ストレス要因のみのラクトバチルスについて１×１０-８であった。これは、２００ｍＭエタノールについて実施例１において観察したのと同じ頻度であった。二重ＵＶ前ストレス要因条件における上出来の原栄養体ハイブリッドは、５×１０-８の増大した頻度を有していた。最終的に、いずれかの親についての前ストレス要因も含まない条件は、クロストリジウム・ベイジェリンキドナー細胞当たり３×１０-８の頻度を有していた。計１０種の株を分析し、キメラ微生物ハイブリッドであることを見出した。
【０１９５】
第１の微生物ハイブリッドを、画線し、オリジナルの遺伝子導入フィルターを置いたのと同じ二重選択環境においてインキュベーションした。図１Ａ〜１Ｅは、嫌気性チャンバーにおいて３７℃にて７２時間後の、ブロムクレゾールパープル指示薬を含有する最小培地（タンパク質もアミノ酸もない）上での成長を示す。紫色から黄色への色の変化は、酸の産生および増加を表す。意図した親ドナークロストリジウム・ベイジェリンキは、強い成長を伴って図１Ａにおいて見られる。意図した親宿主ラクトバチルス・プランタルムは、幾つかの必須アミノ酸についての本来の栄養要求性に起因して、成長を伴わず図１Ｂにおいて見られる。３つのキメラハイブリッドの選択を、図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅにおいて示し、全てが、培地におけるアミノ酸なしでの成長の程度の変動を呈し、それらが、必須アミノ酸形成についての新規原栄養体であることを確かにする。
【０１９６】
図２Ａ〜２Ｅは、図１Ａ〜１Ｅと同様だが、酵母抽出物１リットル当たり４グラムを加え、ブロムクレゾールパープルを含まない培地上で、２４時間後の好気性インキュベーターにおける４２℃での成長を示す。これらの条件において、クロストリジウム親（図２Ａ）は成長を有さず、ラクトバチルス親（図２Ｂ）は成長した。キメラ微生物ハイブリッド（図２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅ）は、変動する量で成長し、これは、酸素の存在下でより高い温度にて増殖するそれらの能力を示す。
【０１９７】
図３Ａ〜３Ｃは、４８種の異なる炭水化物における成長の指示薬としてブロムクレゾールパープルを使用した、ビオメリューＣＨ５０試験の結果を示す。少なくとも１つの株が陽性である形質のみが、図３Ａ〜３Ｃにおいて含まれる。淡い灰色の斜線の形質は、クロストリジウム親に特異的であり、黒色の斜線の形質は、他の親ラクトバチルス・プランタルムに特異的である。濃い灰色の形質は、両方の親が遺伝子導入前に呈したものである。全ての生じたハイブリッドは、炭水化物代謝について表現型の混在を呈した。宿主からドナーに導入された表現型の数は、多数の遺伝子が、遺伝子導入中に導入されたことを示唆している。この株の変更方法において、必須アミノ酸産生遺伝子の導入に加えて、炭素代謝特性を変動するさらなる機能遺伝子の導入はまた、利用可能な炭水化物供給源を代謝する能力を増大させることにより、ある種の低栄養素環境における生存を助け得ることに注意するのは興味深い。例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）形態表現型を有するハイブリッドの全てが、それらのラクトバチルス親と異なり、ここで、でんぷんおよびソルビトールを代謝することができる。
【０１９８】
キメラ微生物ハイブリッドを、それらの親と比較して、どのくらいのそれらの抗生物質抵抗性を示すかをチェックした。酵母抽出物および５％ｗ／ｗヒツジ血液を含有する改変ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）上で、６種の抗生物質：アモキシシリン／クラウブリン酸（２０μｇ／１０μｇ）、アジスロマイシン（１５μｇ）、カルベニシリン（５μｇ）、シプロフロキシン（５μｇ）、メトロニダゾール（５μｇ）、およびバンコマイシン（３０μｇ）を試験した。改変ＢＨＩにて成長させたＯＤ６０００．５の培養物２００μｌを、それぞれのプレート上に広げた。プレートを１５分間乾燥させた。上で挙げた抗生物質の種類および量を含有するディスクを、１２：００の位置にあるアモキシシリン／クラウブリン酸で始めて、プレート上に置き、次に、上で挙げた順に時計回りに置いた。プレートを、嫌気的に４８時間３７℃にてインキュベーションした。Ｃ-１を除くキメラの全てが、ラクトバチルス親の同様の感受性および抵抗性を保持していた。しかしながら、クロストリジウム形態を与えたＣ-１は、ドナー親と共通のより多くの数の特徴を有するように思われ、これは、クロストリジウム・ベイジェリンキが、意図したドナーの代わりの宿主であったことを示唆している。結果を図４Ａ〜４Ｄにおいて示す。クロストリジウム親（図４Ａ）は、試験した全６種の構成物質に感受性である。図４Ｃは、キメラＣ-１が、メトロニダゾールについてラクトバチルス親（図４Ｂ）由来の１つのさらなる抗生物質抵抗性を手に入れたことを明確に示す。他の９つのキメラの全てが、親ラクトバチルス株と同じ結果を保持し、結果は、図４Ｄにおいて描写したキメラと全て同等であった。遺伝子導入前またはその最中に、選択培地のいずれにおいても構成物質はなく、故に、メトロニダゾールに対するＣ-１の抵抗性は、ラクトバチルス親から気付かずに導入された。
【０１９９】
全１０種の微生物ハイブリッドを、水で漸進的に希釈したリッチ培地において成長するそれらの能力について、評価した。５ｇ／Ｌ酵母抽出物および微量金属を含む改変ＢＨＩを、水中で連続希釈して、栄養素を制限した培地における微生物ハイブリッド株の成長を評価した。アミノ酸独立栄養生物として低栄養素培地に恐らく良好に適したキメラ株は、最小培地におけるそれらのラクトバチルス親より良好に果たすべきである。結果を図５において見ることができ、ここで、キメラＣ-１以外の全てが、３７℃にてより少ない総栄養素にて成長する説得力のある増大した能力を有していた。インキュベーション温度を増大させると、Ｃ-１がより高い温度を好み（４２℃−図２Ｃを参照）、最も恐らくは、両方のビオメリュー評価（図３Ａ〜３Ｃ）および最小液体培地評価（図５）において増大した能力を示したであろうことを後に見出した。
【０２００】
クロストリジウム・ディフィシルに対する特に高いタンパク質分解酵素活性を示した（データは示していない）キメラの１種を、ヒト結腸の状態を模倣するよう設計された培地における成長についてチェックした。高い開始ｐＨを有する培地における改善した成長（盲腸、または大腸の第１の部分において見られる）、ならびに結腸の糖における全体的改善が、図６においてキメラＣ-２について見られる。「ｐＨ７．６出発」培地は、２０％ＢＨＩ、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、および１２ｇ／Ｌグルコースを含有していた。「＋結腸の糖」培地は、２０％ＢＨＩ、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、６ｇ／Ｌでんぷん、４ｇ／Ｌペクチン、および２ｇ／Ｌキシランを含有していた。全ての培養物を、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌで播種し、２４時間嫌気的に３７℃にて成長させた。キメラ株Ｃ-２は、高いｐＨにて開始し、かつ結腸の糖において成長能力を改善した。これにより、株が、より早く、クロストリジウム・ディフィシル感染した患者の結腸に至る前に恐らくより高い濃度まで成長を始めることが可能になる。これらの能力（結腸の糖における成長、およびより高いｐＨでの成長）は、患者において治療株の増大した倍加を介してより有効な治療をもたらす。
【０２０１】
幾つかのキメラ株が表現型の可塑性を示すこと、すなわち、それらが、それらが成長する環境次第で別の形態を発現し得ることは注意されるべきである。これは、少なくともある場合では、全ゲノムまたはゲノムの巨大な部分が導入され、および／または保持され得ること、およびかかる場合が、細菌における倍数性の可能性のある例であることの証拠である。例えば、Ｃ-９は、嫌気的環境内で密に接触したコロニーにおいてラクトバチルスと形態的に似ているが、他と密に接触しない単一コロニーにおいて少数の胞子形成となり、これにより、好気的環境においてクロストリジウムに似た内生胞子を作る（図６）。胞子形成は嫌気的には観察しなかったが、よりクロストリジウム様のコロニーが、他と密に接触していないそれらのコロニーにおいて見られた（図７）。液体培地において、図８Ｃおよび８Ｄにおいて見られるどちらかの形態から出発した液体培養物は、ラクトバチルスの基本的な形態表現型を有している。しかしながら、好気的プレート由来の熱ショック胞子から出発した全ての培養物は、嫌気的に成長したときでさえ、形態的にクロストリジウムであった。胞子出発培養物は、約５％のラクトバチルス形態を呈するが、４８時間での培養物の最終ｐＨはおおよそ４．５にとどまり、対して胞子出発からは、最終ｐＨ３．５が見られた。この表現型の可塑性は、遺伝子情報の巨大容量の導入を示し、従って、本発明者らの新用語の「キメラ」微生物ハイブリッドである。
【０２０２】
両方の実施例１と２において、宿主親のみ、またはドナー親のみを、遺伝子導入フィルター上で濃縮した場合、両方の親について対照遺伝子導入を行った。成長したコロニーはなく、これは、上の実施例において記載したキメラ形質が、自発的変異または同種の細胞間での組換えに起因しないという証拠を付与する。
【０２０３】
実施例３
サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディソルビトール代謝付加
この実験における所望の親宿主は、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディであった。獲得すべき表現型は、親ドナーメチニコビア・リューカフィー（Metschnikowia reukaffi）野生花蜜酵母が提供した。遺伝子導入の所望の形質は、ソルビトール代謝、または唯一の炭水化物供給源としてソルビトールを含むタンパク質リッチな培地上での生存であった。花蜜酵母ドナーは、この同じ、ソルビトールを含有するタンパク質リッチな培地上で２３〜３４℃にて好気的に成長することができる。サッカロマイセス親は、唯一の炭素供給源としてソルビトールを含む最小培地上で成長することができないが、それは、炭素供給源としてでんぷんまたはグルコースを含む最小培地上で成長することができる。
【０２０４】
ストレス要因のＭＩＣを決定した。メチニコビア・リューカフィー（M. reukaffi）の成長に最適な温度は２９℃であり、ＭＩＣ３５〜３６℃を伴う。サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディ（S. cerevisiae var. boulardii）は、３４℃の成長に最適な温度を有し、ＭＩＣ４４℃を伴う。選択した遺伝子導入培地は、２％ソルビトールと共に酵母抽出物を含有していた。選んだドナー環境ストレス要因は、ＭＩＣ結果より若干高く、それが宿主になる機会を低減した。遺伝子導入後、プレートを、３７℃に設定した好気性インキュベーターに移動した。要約すると、温度は、メチニコビア・ロイカウフィの遺伝子導入ストレス要因であり、一方、唯一の炭素供給源としてのソルビトールは、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディの遺伝子導入ストレス要因であった。
【０２０５】
２つの実験群が存在した。１つの群は、２秒間の間隔のＵＶ光、続いて１０分間の回復の３ラウンドに別々に曝露した酵母の両方の培養物を有していた。前ストレス要因の陰性対照はまた、室温にて３０分間だが、加えたストレスなく、分けた株を維持した。全ての培養物用培地は、２％ｗ／ｗグルコースを含む改変ＢＨＩであった。前ストレス要因の適用に先立ち、培養物を、同じ改変ＢＨＩにおいてＯＤ６００１．０まで好気性インキュベーターにおいて３３℃にて成長させた。親宿主サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディの同等の開始ＣＦＵは、１．５×１０７細胞を含有する総体積５ｍｌについて、３×１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。一方、所望のドナーメチニコビア・ロイカウフィは、１×１０７細胞を含有する総体積５ｍｌについて、同等のＣＦＵ２×１０６ＣＦＵ／ｍｌを有していた。
【０２０６】
断続的ＵＶ曝露あり、またはなしでの３０分間のインキュベーション後、それぞれの条件について、両方の親培養物を一緒に混ぜ、無菌のニトロセルロース０．２μｍのフィルター上にて濾過した。次に、フィルターを、無菌ＰＢＳ１０ｍｌを含むシリンジを介して洗浄した。それぞれのフィルターを、タンパク質を含有するソルビトールプレートに逆さまに置いた。プレートを、３７℃に設定した好気性インキュベーターに入れ、７２時間インキュベーションした。
【０２０７】
インキュベーション後、それぞれの条件由来のフィルターを、寒天プレートから取り出し、１．５ｍｌの微量遠心チューブ内のＰＢＳ１ｍｌに入れた。フィルターを含有する微量遠心チューブを、ボルテックスし、次に、８０００ＲＦＣにて１０分間スピンダウンした。上清６００ｍｌを取り除き、細胞ペレットを、残る上清４００μｌに再懸濁した。次に、それぞれの条件についてそれぞれの懸濁液２００μｌを、酵母抽出物を含有する単一の新鮮な好気性ソルビトールプレートにプレーティングした。プレートが乾燥したら、それらを、３７℃に設定した好気性インキュベーターに入れた。
【０２０８】
プレートを、コロニーについて毎日チェックした。次に、さらなる選択を、７２時間の成長後に行った。コロニーを、ソルビトールを含む１つの最小培地プレート（タンパク質もアミノ酸もなし）、ならびにソルビトールと共に、タンパク質、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢを含有する１つのリッチ培地プレートである、単一コロニーのための２つの異なるプレート上に、二重に画線した。２日後、再度毒素含有プレートから最小プレートに、単一コロニーを再度画線した。次に、画線し、最終セットの最小培地プレート上で単一コロニーまでもう一度成長したコロニーのみを分析した。
【０２０９】
結果
ソルビトールを代謝するハイブリッドをもたらす遺伝子導入の頻度は、前ストレス要因なしについて１．７×１０-５であり、ＵＶ前ストレス要因を使用して２×１０-５であった。最小培地ならびにクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの追加選択は、コロニー数を１０倍低減した。これは、細菌の遺伝子導入において見られるものより顕著に高い。酵母細胞間での遺伝子導入現象であったと信じられているものは、図９Ａにおける遺伝子導入顕微鏡写真を、図９Ｂにおける通常の出芽と比較して、図９Ａ〜９Ｂにおいて示される通り、顕微鏡下で見られた。１１種のキメラ細菌ハイブリッドを分析した。
【０２１０】
全てのキメラ微生物ハイブリッドが、酵母抽出物および２％ソルビトールを含有する固形培地上３７℃にて成長することができた（データは示していない）。全１１種のキメラ株をまた、ビオメリューの酵母ＩＤキット（２０  Ｃ  ＡＵＸ）を使用して、液体培地における炭水化物代謝についてもチェックした。全てのビオメリュー成長試験を、それらの指示毎に３０〜３１℃にて行った。全１１種が、３７℃のソルビトールプレート上で陽性であったにも関わらず、１１種のうち６種のみのキメラ酵母ハイブリッドが、３０〜３１℃のビオメリューの培地中のソルビトールについて陽性であった。必要な酵素温度の差が、この差に関与しているかもしれない。実施例２においてと全く同じく、酵母キメラハイブリッドは、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて見られる両方の親由来の炭水化物代謝表現型を示した。
【０２１１】
両方の酵母親は、毒素ＡおよびＢの中和について異なる作用機序を有することが疑われる。毒素を、遺伝子導入中の環境ストレス要因として直接使用しなかったにも関わらず、それらを、遺伝子導入後の選択のため使用した。幾つかのハイブリッドは、メチニコビア・ロイカウフィ親の毒素を中和する能力をサッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディに導入し、一方、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディ毒素タンパク質分解酵素を保持していることが疑われる。本発明者らは、次の通り、ＥＬＩＳＡを使用して抗毒素の可能性についてハイブリッド酵母を試験した：キメラ微生物ハイブリッドを、好気的に３０℃にて２４時間振盪しながら、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地にて成長させた。細胞をスピンダウンし、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）１５にて嫌気性ＢＨＩ培地に再懸濁した。再懸濁液を、１８時間嫌気的に３７℃にてインキュベーションした。同日に、クロストリジウム・ディフィシルＶＰＩ１０４６３培養を、嫌気的にグリセロールストックから、５ｇ／Ｌ酵母抽出物を添加したＢＨＩ培地において開始し、２４時間成長させた。次に、それぞれの酵母培養物を、酵母培養物のＯＤを変動させながら、ＯＤ６００１．５のＶＰＩ１０４６３と、比１：１でＶＰＩ１０４６３培養物と別々に組み合わせた。共培養物を、嫌気的に２時間３７℃にてインキュベーションし、次に濾過した。共培養物から濾過したブロスを、ＥＬＩＳＡを介して毒素ＡおよびＢについてチェックし、結果を図１１において示す。酵母培養物用の新鮮添加ＢＨＩ培地を置き換え、依然、比１：１でＶＰＩ１０４６３ブロスと混合した対照により、０％中和レベルを決定した。親花蜜酵母メチニコビア・ロイカウフィは、１８時間後３７℃にて不活性化され、嫌気的３７℃条件において抗毒素を産生しなかった。事実、この熱で殺したメチニコビア・ロイカウフィのＶＰＩ１０４６３との２時間共培養は、毒素対照より多くの産生毒素をもたらした。ＶＰＩ１０４６３が、死んだ酵母を栄養素供給源として使用して、培地＋ＶＰＩ１０４６３対照より高いレベルの毒素ＡおよびＢを産生したと仮定される。試験した４種のキメラ酵母ハイブリッドＹＣ-１、ＹＣ-５、ＹＣ-９、およびＹＣ-１１は、増大した毒素の中和を示し、これは野生型サッカロマイセス・ボウラディ親より１４〜２０％の改善を伴った。ＶＰＩ１０４６３毒素ＡおよびＢを中和するハイブリッド株の増大した能力は、メチニコビア・ロイカウフィから宿主親サッカロマイセス・ボウラディへの抗毒素遺伝子の導入に起因すると推定される。
【０２１２】
実施例４
グラム陰性ドナーを介したビフィドバクテリウム・フィーカレ（B. faecale）アミノ酸栄養要求性除去
所望の親宿主は、ビフィドバクテリウム・フィーカレであった。導入すべき所望の表現型は、親ドナーグリモンテラ・セネガレンシスが提供した。遺伝子導入についての所望の形質は、アミノ酸原栄養性、またはタンパク質もアミノ酸も含有しない最小培地プレート上での生存であった。
【０２１３】
グリモンテラ・セネガレンシス（G. senegalensis）は、最小培地上で３７℃にて嫌気的に成長することができる。ビフィドバクテリウム・フィーカレは、タンパク質または加えたアミノ酸を含まない培地上で成長することができない。ビフィドバクテリウム・フィーカレは、炭素供給源としてラフィノースを利用することができ、一方、グリモンテラ・セネガレンシスはできない。
【０２１４】
選択した遺伝子導入培地は、タンパク質もアミノ酸も含有しない最小培地（Ｍ９）であった。Ｍ９基礎培地に加えた唯一の炭素供給源は、ラフィノースであった。どちらの親も、この培地上で嫌気的に３７℃にて成長できなかった。使用した前ストレス要因はなかった。
【０２１５】
親培養物を成長させるための培地は、２％ｗ／ｗグルコースを含む改変ＲＣＭであった。前ストレス要因の適用に先立ち、培養物を、同じ改変ＲＣＭにおいて、ＯＤ６００１．０まで嫌気性チャンバーにおいて３５℃にて成長させた。宿主ビフィドバクテリウム・フィーカレの同等の開始ＣＦＵは、２．５×１０９細胞を含有する総体積５ｍｌについて、５×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。一方、所望のドナーグリモンテラ・セネガレンシスは、１×１０９細胞を含有する総体積５ｍｌについて、同等なＣＦＵ２×１０８を有した。
【０２１６】
両方の親培養物を一緒に混ぜ、無菌のニトロセルロース０．２μｍのフィルター上で濾過した。次に、フィルターを、無菌ＰＢＳ１０ｍｌを含むシリンジを介して洗浄した。フィルターを、脱酸素化したＭ９ラフィノースプレート上に逆さまに置いた。プレートを、嫌気性チャンバーにおいて３７℃にて７２時間インキュベーションした。
【０２１７】
インキュベーション後、それぞれの条件由来のフィルターを、１．５ｍｌの微量遠心チューブ内のＰＢＳ１ｍｌに入れた。フィルターを含有する微量遠心チューブをボルテックスし、次に、８０００ＲＦＣにて１０分間スピンダウンした。上清６００ｍｌを取り除き、細胞ペレットを、残る上清４００μｌに再懸濁した。２００μｌそれぞれを、プレーティングに先立ちチャンバーにおいて２４時間脱酸素化した２つの新鮮Ｍ９ラフィノースプレート上に広げた。プレートを、嫌気性チャンバー内で３７℃にて７２〜１２０時間インキュベーションした。
【０２１８】
プレートを、コロニーについて毎日チェックした。次に、単一コロニーを、１つが最小培地を含み、１つがリッチ培地を含む、２つの異なるプレート上に単一コロニーからプレーティング後３〜５日にて、再度画線した。２日後、単一コロニーを、再度リッチ培地プレートから最小プレートまで再度画線した。次に、最終セットの最小培地プレート上で単一コロニー状態まで成長したコロニーのみを分析した。
【０２１９】
結果
原栄養体ハイブリッドをもたらす遺伝子導入の頻度は、従前の細菌の遺伝子導入においてよりずっと高かった。頻度率１．１×１０-６について、計２，３００コロニーが存在した。これらのうち３種のキメラ微生物ハイブリッドのみを詳細に分析し、それらを、プレート上でのそれらの異なる形態について選択した。
【０２２０】
第１のキメラ微生物ハイブリッドを、ビオメリュー５０  ＣＨを介して炭素消費について分析した。ビフィドバクテリウム・フィーカレは、高い酸産生者ではなく、試験は、ラクトバチルス、およびグリモンテラ（Grimontella）の様な他の酸産生者に理想的であるので、故に、幾つかの炭素供給源が無かった。どちらかの親が代謝することがでなかった、幾つかの新たな炭素供給源を、キメラは代謝することができた。図１２は、４８時間でのキメラ対親のビオメリュー５０ＣＨ試験の結果を示す。ドナー株グラム陰性種グリモンテラ・セネガレンシスは、１９種の炭素供給源を代謝することができ、宿主株グラム陽性種ビフィドバクテリウム・フィーカレは、１２種の炭素供給源を代謝することができる。生じたビフィドバクテリウムキメラは、野生型親より６種多い、最大１８種の異なる炭素供給源を代謝することができた。
【０２２１】
図１３は、その親グリモンテラ・セネガレンシス（Ｐ１）およびビフィドバクテリウム・フィーカレ（Ｐ２）と比較した、１つのキメラＣ-５の結果を示す。液体培地は、固形遺伝子導入培地から寒天を引いたのと同等であった。ｐＨ降下を介して成長を検出するために、ブロムクレゾールパープルを培地に加えた。図１３におけるＣ-５培養物の淡い色は、その親の両方と比較して、Ｍ９ラフィノース培地における成長を示し、接種後の色の変化を示さない。５ミリリットルの体積のＭ９ラフィノース培地に、ＢＨＩプレート由来の単一コロニーを接種し、４８時間嫌気的に３７℃にて成長させた。
【０２２２】
前述の発明は、理解の明確化の目的で、説明および例示を手段として少し詳しく記載されるが、ある種の変更および修飾が、添付の請求の範囲において説明される、発明の精神および範囲から逸脱することなく、実行され得ることは、当業者に明らかだろう。それ故、説明は、添付の請求の範囲において説明される、本発明の範囲の制限と解釈されるべきではない。本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のため、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているのと同程度まで全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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