(57)【要約】癌の再発の可能性を検出する方法が開示される。より具体的には、本発明は、癌の再発の可能性と相関する核酸指標を同定する方法およびそのような指標を使用する方法を開示する。2018531620.tif 000015
2018531620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、対象において癌が再発する可能性を判定するための方法：
対象から得られた生物学的サンプル中の核酸分子の配列を分析し、変異誘発物質によって認識または標的指向される1つまたは複数のモチーフにおけるある変異タイプの複数の変異について、該複数の変異のコドン文脈を決定し、それによって、該核酸分子内の複数の変異コドンの各々について変異の位置および変異タイプを同定する工程であって、対応する変異コドンの3つの位置のいずれにおいて個々の変異が生じているかを決定することによって、個々の変異のコドン文脈が決定される、工程、
複数の変異コドンの3つの位置のうちの1つにおけるある変異タイプの変異のレベルが、癌の再発と相関する既定のしきい値を上回る場合に、対象において癌が再発する可能性があると判定する工程。
【請求項２】
変異誘発物質が、内因性デアミナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
変異誘発物質が、AID、APROBEC3B、APOBEC3GおよびADARからなる群より選択される、請求項1および2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
ADARが、ADAR1またはADAR2である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
生物学的サンプルが、癌もしくは腫瘍を有するまたは癌もしくは腫瘍の発症リスクを有する組織を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
癌が卵巣癌である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるWRCGSSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるTCGAモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項９】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-3部位におけるATCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるGCGGCモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるCCGXモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１２】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるZCCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるSGGRRモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるTCCGモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１５】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-2部位におけるGCGCモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１６】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-2部位におけるCCGGCモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１７】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるRAWAモチーフにおけるAからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１８】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるWTAWモチーフにおけるAからGへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項１９】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-1部位におけるSARAモチーフにおけるAからGへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項２０】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-2部位におけるTWTYモチーフにおけるTからCへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項２１】
癌が再発する可能性があるという判定が、前記核酸分子のMC-3部位におけるTWTYモチーフにおけるTからCへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項6記載の方法。
【請求項２２】
癌が急性骨髄性白血病（AML）である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-1部位におけるCCZモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-2部位におけるSWCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-3部位におけるXNGNSモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-2部位におけるGSAモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-1部位におけるSGXWモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-3部位におけるCXGSモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-3部位におけるYXGNXモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-3部位におけるYYGNXモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
癌が再発する可能性があるという判定が、生物学的サンプル由来の前記核酸分子のMC-1部位におけるWNGNZモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる、請求項22記載の方法。
【請求項３２】
1.87個を超える変異を有する生物学的サンプルは、癌または腫瘍が再発する可能性があることを意味する、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
再発が60ヵ月以内に起こる可能性がある、請求項33記載の方法。
【請求項３４】
生物学的サンプルが、癌に冒された組織タイプから得られる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
生物学的サンプルが、卵巣、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ、造血、膀胱、肺、腎臓、直腸、子宮および頭頸部の組織または細胞を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
癌が、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、子宮頸癌、リンパ癌、造血癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、卵巣癌、子宮癌および頭頸部癌より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
対象における癌を処置または予防するための療法の使用であって、請求項1にしたがい癌または腫瘍が再発する可能性があると判定されていることに基づき、該対象が該療法に供される、使用。
【請求項３８】
療法が、放射線療法、手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および／または免疫療法を含む、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
化学療法がデアミナーゼ阻害剤である、請求項38記載の使用。
【請求項４０】
デアミナーゼ阻害剤が、AID阻害剤、APOBEC3G阻害剤、APOBEC1阻害剤もしくはAPOBEC3H阻害剤またはADAR阻害剤から選択される、請求項39記載の使用。
【請求項４１】
以下の工程を含む、対象における癌を処置または予防する方法：
（i）該対象における該癌が存在する組織について、請求項1記載の方法によりC-PASを同定する工程、（ii）該対象から生物学的サンプルを得る工程であって、該生物学的サンプルが、該癌を有するまたは該癌を発症するリスクを有する細胞の組織を含む、工程、（iii）C-PASの有無について該生物学的サンプル中の核酸分子を分析し、該癌または腫瘍が再発する可能性があるかどうかを判定する工程、および（iv）該対象において該癌が再発する可能性があると判定されたことに基づき、該対象を療法に供する工程。
【請求項４２】
以下の工程を含む、対象における癌の再発の可能性を示す癌進行関連指標（C-PAS）を同定するための方法：
第1の対象グループについて核酸配列を分析して、変異誘発物質によって認識または標的指向される1つまたは複数のモチーフにおけるある変異タイプの複数の変異についてそれらの変異のコドン文脈を決定し、それによって、該核酸配列内の複数の変異コドンの各々について変異の位置および変異タイプを同定する工程であって、個々の変異のコドン文脈が、対応する変異コドンの3つの位置のいずれにおいて個々の変異が生じているかを決定することによって決定され、第1の対象グループが、癌を有するまたは以前に癌を有していた対象からなる、工程、
複数の変異コドンの3つの位置のうちの1つにおけるある変異タイプの変異のレベルが、変異が無作為かつコドン文脈非依存的に起こった場合に生じ得る予想数値を超えている場合に、標的指向された体細胞変異誘発（TSM）が起こったと判定する工程、および
TSMまたはTSMを含む核酸配列が第2の対象グループと第3の対象グループの間で区別可能である場合に、TSMをC-PASの一部であると同定する工程であって、第2の対象グループは、癌を有する対象または癌が再発することが分かっている対象からなり、第3の対象グループは、癌が再発しないことが分かっている対象からなる、工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2015年8月26日に出願された「Methods of detecting cancer recurrence」を発明の名称とするオーストラリア仮出願第2015903456号からの優先権を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、癌の再発の可能性を検出する方法に関する。より具体的に、本発明は、癌の再発の可能性と相関する核酸指標を同定する方法およびそのような指標を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書における、先行公開物（もしくはそれ由来の情報）または公知事項の参照は、その先行公開物（もしくはそれ由来の情報）または公知事項が、本明細書が関連する取り組みの分野における共通の一般知識の一部を形成していることの同意または承認または何らかの形式の示唆ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
ヒトゲノムは、転写の際に一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖（dsRNA）形態のいずれかを脱アミノすることができる多くの酵素をコードするよう進化した。これらのデアミナーゼ酵素は、強力な抗ウイルス応答を形成し、そのような高い変異率を生き抜くことができるウイルスはごくわずかである。しかし、DNAおよびRNAデアミナーゼ活性の調節が故障すると、これらの酵素は、転写の際に正常な体細胞組織内の核酸を攻撃する。その結果は、望ましくないデノボ変異の蓄積であり、これは最終的に疾患、例えば癌を引き起こし得る（Paz et al., 2007; Honjo et al., 2008; Steele and Lindley., 2010; およびLindley and Steele., 2013を参照のこと）。
【０００５】
デアミナーゼには、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼという2つの異なるファミリーが存在する。シチジンデアミナーゼファミリーの酵素は、ssDNA内のシトシンを脱アミノする（実質的に、シトシンをウラシルに置き換える）ことができる示差的に発現される酵素群を形成する。最も広く研究されているシチジンデアミナーゼは、活性化誘導型デアミナーゼ（AID）である。AIDは主として、免疫グロブリン（Ig）体細胞超変異（SHM）およびIgクラススイッチ組み換えを起こす活性化されたB細胞において発現されるが、AID活性は、長い年月をかけて、ほとんどの体細胞組織において同定されている。それは、非リンパ細胞において癌を引き起こす初期の変異誘発イベントに関与し（Okazaki et al, 2003を参照のこと）、転写の際に核内のssDNAの転写鎖（TS）および非転写鎖（NTS）の両方を標的とすることが示されている（Maul and Gearheart, 2010; Basu et al., 2011; およびLindley 2013を参照のこと）。エストロゲン受容体複合体がAIDプロモーター領域に結合し（Pauklin 2009を参照のこと）、AIDのメッセンジャーRNA発現の増加を誘導し、乳房および卵巣組織におけるAID産生を20倍超増加させることも実験的に実証されている。したがってエストロゲンアンタゴニスト、例えば広く処方されているタモキシフェンは、体細胞組織におけるAID産生を阻害するのに効果的である。
【０００６】
アポリポタンパク質B-mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様シチジンデアミナーゼ（APOBEC）は、11種またはそれ以上のオルソロガスなシチジンデアミナーゼのファミリーを形成する。この酵素ファミリーは、多くの癌の発症に寄与することが公知となっており（Roberts 2013を参照のこと）、大部分は組織特異的である（Conticello 2008、表2を参照のこと）。例えば、APOBEC1は小腸において高濃度で見出され、APOBEC2は骨格筋および心筋において有意なレベルで見出され、APOBEC4は精巣において見出され、APOBEC3Hは血液、胸腺および甲状腺において見出される。
【０００７】
ヒトAPOBEC3デアミナーゼは、転写時のレトロウイルスおよびDNAウイルスならびに感受性cDNA中間体を含む裸のDNAを含むさまざまなDNAベースの寄生体に対する自然免疫の提供を含む様々な機能を有する。それらはAIDおよびAPOB mRNA編集酵素APOBEC1の進化上の前駆体に関連し、進化上の前駆体でさえあり得る。
【０００８】
最も研究されているAPOBEC3デアミナーゼは、APOBEC3GおよびAPOBEC3Bである。これらの酵素は両方とも、すべてではないにしても多くの体細胞組織において有意なレベルで発現される。APOBEC3Gは、レトロトランスポゾンおよび他のウイルスを強力に制限する進化上保存されたシチジンデアミナーゼである。それは最初に、HIV制限に関与する主要因子として同定された（Sheehy, 2002を参照のこと）。様々な研究は、APOBEC3Bにより触媒される脱アミノ化が様々な癌における高い比率の変異を担っていること（Leonard et al, 2013; およびSasaki, 2014を参照のこと）およびこのプロセスが卵巣癌（Burns et al, 2013aを参照のこと）および乳癌（Burns 2013bを参照のこと）においてDNA損傷の慢性的要因を提供することを示唆している。
【０００９】
アデノシンデアミナーゼは、完全または部分的な二本鎖RNA（dsRNA）に結合し、アデノシンをイノシンに変換する（実質的に、AをIに置き換える）。イノシンは、翻訳時に、グアノシンとしてコードする（Bass 2002を参照のこと）。ヒトにおいては、ADAR1、ADAR2およびADAR3遺伝子が同定されている。各々のADARについて異なるスプライス変種が存在することが十分確立されているが、各スプライス変種が標的化のために異なるデアミナーゼ結合ドメイン（DBD）を示し得るかどうかまたはどのように示し得るのかは知られていない（Farajollahi and Maas, 2010を参照のこと）。様々な体細胞組織で多型を示す多くの変種ADAR種が発現される（George et al, 2005を参照のこと）。
【００１０】
ADAR1の2つの免疫学的に関連する形態が、多くの体細胞組織に存在することが示されている（George and Samuel, 1999を参照のこと）。ADAR2は、多くの組織で、ヒト脳において特に高い濃度で見出される。核と細胞質の間を行き来するADAR1を除いて、大部分のADARタンパク質は核内に局在する。アデノシンデアミナーゼは、腫瘍形成において役割を果たすことが示唆されているが、それらがそうするメカニズムは未だ確立されていない。
【００１１】
ADARによる編集は、真核生物においてRNAおよびタンパク質の多様化をもたらし、それらのRNA編集の役割は、高等生物ほど重要である。それらの役割は、RNA内の編集部位の逆転写を通じたエクソンの記録、レトロトランスポゾン由来反復エレメントの編集およびmRNA配列の修飾を含む（Farajollahi and Maas, 2010を参照のこと）。ADAR編集が遺伝子発現に対して及ぼす多岐にわたる影響から、ADAR1およびADAR2の立体構造および発現の調節不良は、癌の表現型と結び付けられている。RNA編集活性の全体的減少は、疾患の進行に関連付けられ（Gallo and Galardi, 2008を参照のこと）、ADAR1は、腫瘍促進因子として、ADAR2は、腫瘍抑制因子として同定されている（Chan et al, 2014を参照のこと）。したがって、プレmRNAにおけるタンパク質をコードするエクソンの異常なAからIへの編集により生じる多様性は、ヒト癌における遺伝子発現を大きく変化させる。
【００１２】
異常なシチジンおよびアデノシンデアミナーゼ活性が腫瘍形成プロセスに大きく関与することは、現在広く認められている。しかし、癌を検出するのに適した具体的なバイオマーカーは未だ解明されていない。これまでの研究により、我々は、デアミナーゼの標的指向選択性が以前に考えられていたよりもずっと特異的であることを理解し始めている。蓄積された乳がん変異データにおいて行われたTP53変異の研究から、標的指向された体細胞変異の発生に関与する分子メカニズムが、転写時にssDNAのレベルでコドンの読み取り枠構造を検知する能力および非転写鎖（NTS）上のシトシンと転写鎖（TS）上のそれらを区別する能力に基づいていることが分かった（Lindley 2013を参照のこと）。
【００１３】
米国だけでも毎年約24,000名の女性が卵巣癌と診断され、その平均5年生存率は、わずか44％前後である（Howlader et al, 2013を参照のこと）。大部分の卵巣癌患者は、侵襲的な手術およびその後の白金タキサン化学療法を用いた処置を受ける。処置を受けた者の中で、6ヵ月以内に患者の25％前後で白金耐性癌が再発する（Miller, 2009を参照のこと）。大部分の死亡例は後期段階での診断の結果であるので、寄与する遺伝的要因を理解することは、新しいスクリーニングストラテジーを開発する上で重要な工程である。
【００１４】
介入（すなわち、手術、放射線、医薬またはそれ以外の手段によるもの）後の疾患の再発または進行を予測するための遺伝子アッセイにおいて使用することができる卵巣癌および他の癌のバイオマーカーを同定する手段が、当技術分野で特に必要とされている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は一部、標的指向された体細胞変異（TSM）現象が、腫瘍形成時に起こる多くの体細胞変異の供給源として個々のデアミナーゼ結合ドメイン（DBD)を同定することを可能にするという決定に基づいている。この同定により、疾患の進行に伴い新しいDBDが生成されることが発見された。したがって、本明細書に開示される方法は、疾患進行指標（「癌進行関連指標」（C-PAS）と称される）に関連するDBDのアイソフォームを定義するヌクレオチドモチーフを同定するために使用される。1つの局面において、本発明は、1つまたは複数のC-PASを使用して対象における癌の再発（または進行）の可能性を予測する新しい遺伝子アッセイを提供する。
【００１６】
その最も広範な形態において、本発明は、以下の工程を含む、対象において癌が再発する可能性を判定するための方法を提供する：（a）対象から得られた生物学的サンプル中の核酸分子の配列を分析し、変異誘発物質によって認識または標的指向された1つまたは複数のモチーフにおけるある変異タイプの複数の変異について、それらの変異のコドン文脈（codon context）を決定し、それによって該核酸分子内の複数の変異コドンの各々について変異の位置および変異タイプを同定する工程であって、個々の変異のコドン文脈が、対応する変異コドンの3つの位置のいずれにおいて個々の変異が生じているかを決定することによって決定される、工程、および（b）複数の変異コドン内の3つの位置のうちの1つにおけるある変異タイプの変異のレベルが、癌の再発と相関する既定のしきい値を上回る場合に、対象において癌が再発する可能性を判定する工程。
【００１７】
この方法の1つの利点は、癌が再発する可能性の判定に基づき、癌を有するまたは有していた対象に対する処置計画を作成することができることである。例えば、対象において癌が再発する可能性があると判定される場合、対象は、高度の抗癌療法を継続し得る。逆に、対象において癌が再発する可能性が低いと判定される場合、対象は、現行の抗癌療法を中断、縮小または変更し得る。
【００１８】
このタイプのいくつかの態様において、核酸分子は、対象から得られた生物学的サンプル中に存在する。好ましくは、生物学的サンプルは、対象内の、癌に冒されているまたは以前にに冒されていた組織から得られる。癌に冒されたまたは癌を発症するリスクが高いことが分かっている組織から得られる生物学的サンプルを使用することによって、組織特異的なDBDを同定し、高い特異度および感度の診断／予後試験を構築することができる。
【００１９】
いくつかの態様において、TSMを引き起こす変異誘発物質は、AID、APOBECおよびADARを含む、それらからなるまたはそれらから本質的になる群より選択される。いくつかの態様において、単一の変異誘発物質によって引き起こされる標的指向された体細胞変異誘発が評価される。他の態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10を超える変異誘発物質によって引き起こされる標的指向された体細胞変異誘発が評価される。
【００２０】
実例として、サンプルが卵巣組織サンプルであり、変異誘発物質がAIDの腫瘍形成性アイソフォームである場合、癌が再発する可能性があるという判定は、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのWRCGSSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる。
【００２１】
別の例において、サンプルが卵巣組織サンプルであり、変異誘発物質がAPOBEC3Bである場合、癌が再発する可能性があるという判定は、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位もしくはMC-3部位でのTCGAモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-3部位でのATCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる。
【００２２】
さらに別の例において、サンプルが卵巣組織サンプルであり、変異誘発物質がAPOBEC3Gである場合、癌が再発する可能性があるという判定は、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのGCGGCモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのCCGXモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのZCCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのSGGRRモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのTCCGモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-2部位でのGCGCモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-2部位でのCCGGCモチーフ（すなわち、C-PAS）におけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる。
【００２３】
さらに別の例において、サンプルが卵巣組織サンプルであり、変異誘発物質が腫瘍形成性ADARアイソフォーム、例えばADAR1である場合、癌が再発する可能性があるという判定は、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのRAWAモチーフにおけるAからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのWTAWモチーフにおけるAからGへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-1部位でのSARAモチーフにおけるAからGへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル中に存在する核酸分子のMC-2部位もしくはMC-3部位でのTWTYモチーフにおけるTからCへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる。
【００２４】
本発明の別の実例において、対象は、急性骨髄性白血病（AML）を有するまたはそれを発症するリスクを有する。例えば、サンプルが血液サンプルであり、変異誘発物質が腫瘍形成性APOBECアイソフォームである場合、癌が再発する可能性があるという判定は、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でのCCZモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-2部位でのSWCSモチーフにおけるCからTへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-3部位でのXNGNSモチーフにおけるGからAへの変異が既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-2部位でのGSAモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でのSGXWモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-3部位でのCXGSモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-3部位でのYXGNXモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-3部位でのYYGNXモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合、または生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でのWNGNZモチーフにおけるGからAへの変異のレベルが既定のしきい値を上回る場合になされる。
【００２５】
好ましい態様において、核酸分子は、1つまたは複数の変異誘発物質により標的指向された複数の定義されたモチーフにおける標的指向された体細胞変異のレベルについて特徴づけられる。例えば、いくつかの態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10を超えるモチーフにおける標的指向された体細胞変異が決定される。
【００２６】
いくつかの態様において、癌は、TSMのレベル（すなわち、C-PASにおいて同定されるもの）が既定のしきい値を上回る場合に、再発する可能性があると評価される。既定のしきい値は、対象グループ間を区別するのに適した任意の方法によって定義され得る。これに関して、既定のしきい値とは、再発する可能性がある癌と再発する可能性が低い癌とを区別するのに適した値に設定される、サンプルあたり一定数の標的指向された体細胞変異であり得る。例えば、実施例4に明確に示されているように（例えば、表7を参照のこと）、卵巣癌の克服に成功し再発がないことが分かっている対象は、単一の変異誘発物質に起因する最大1つのC-PASをサンプル中に有することが実証されている。したがって、非限定的な例として、卵巣癌の再発の可能性が上昇していることを判定するための既定のしきい値は、1つのC-PASであり得る。この例において、核酸分子内に1を超えるC-PASを有する任意の対象は、癌の再発の可能性が高いとみなされる。同様に、核酸分子内に1未満のC-PASを有する個体は、癌の再発の可能性が低いと判定される。
【００２７】
あるいは、既定のしきい値がTSMの指標となるサンプル変異の頻度を参照する場合、既定のしきい値は、特定の変異が無作為に起こる場合に予想される変異の頻度であり得る。したがって、生物学的サンプル中に存在する核酸分子において予想以上の変異頻度が観察される場合、TSMが起こった、C-PASが同定され得るおよび癌が再発する可能性があるという判定がなされ得る。
【００２８】
いくつかの態様において、この方法は、任意の癌の再発の可能性を判定するのに適している。例えば、癌は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、子宮頸癌、リンパ癌、造血癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、子宮癌および頭頸部癌の中から選択され得る。典型的に、生物学的サンプルは、癌が存在する組織から調製される。例えば、対象が卵巣癌を有するまたは卵巣癌を発症するリスクを有する場合、生物学的サンプルは、卵巣細胞または組織から調製される。同様に、対象が乳癌を有するまたは乳癌を発症するリスクを有する場合、生物学的サンプルは、乳房細胞または組織から調製される。本発明の方法を実施するのに適した他の生物学的サンプルは、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ、造血、膀胱、肺、腎臓、直腸、子宮および頭頸部の組織または細胞を含むがこれらに限定されない。
【００２９】
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、対象における癌の再発の可能性を示す癌進行関連指標（「C-PAS」）を同定する方法を提供する：第1の対象グループにおいて核酸配列を分析して、変異誘発物質によって認識または標的指向された1つまたは複数のモチーフにおけるある変異タイプの複数の変異について、該複数の変異のコドン文脈を決定し、それによって該核酸配列内の複数の変異コドンの各々について変異の位置および変異タイプを同定する工程であって、対応する変異コドンの3つの位置のいずれにおいて個々の変異が生じているかを決定することによって、個々の変異のコドン文脈が決定され、第1の対象グループは、癌を再発した対象からなる、工程；複数の変異コドンの3つの位置のうちの1つにおけるある変異タイプの変異のレベルが、その変異が無作為かつコドン文脈非依存的に起こる場合に生じ得ると予想されるレベルを上回る場合に、標的指向された体細胞変異誘発（TSM）が起こったと判定する工程；およびTSMまたはTSMを含む核酸配列が第2の対象グループと第3の対象グループの間で区別可能である場合に、TSMがC-PASの一部であると同定する工程であって、第2の対象グループは、癌を有するまたは癌が再発することが分かっている対象からなり、第3の対象グループは、癌が再発することが分かっていない対象からなる、工程。
【００３０】
さらに別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、対象における癌を処置するまたはがんの再発を阻止する方法を提供する：（i）対象における癌が存在する組織について、上記および本明細書の他箇所に記載される方法によりC-PASを同定する工程、（ii）対象から生物学的サンプルを得る工程であって、生物学的サンプルが、癌を有するまたは癌を発症するリスクを有する組織または細胞を含む、工程、（iii）C-PASの有無について生物学的サンプル中の核酸分子を分析し、癌または腫瘍が再発する可能性があるかどうかを判定する工程、および（iv）対象において癌が再発する可能性があると判定されたことに基づき、対象を療法に供する工程。
【００３１】
なおさらに別の局面において、本発明は、癌を患っている対象または癌が再発する可能性がある対象に処置計画または療法を実施する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、上記および本明細書の他箇所に記載される同定・決定法にしたがい癌が再発する可能性があるかどうかを判定する工程、および癌の再発の可能性に基づき対象を対象に最も適した処置計画に供する工程を含む。癌を処置するための適切な処置計画は、当技術分野で周知であり、以下に詳細に記載されている。いくつかの態様において、療法または処置計画は、放射線療法、手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および／または免疫療法を含む。
【００３２】
対象において癌の再発の可能性があると判定された場合、対象に適切な処置計画が策定され、実施される。本発明の方法の利点は、ひとたび生物学的サンプル中の核酸分子においてTSMが決定されれば、対象の個人的なTSMプロフィールに照らして個人向けの処置計画を策定することができることである。例えば、TSMが生物学的サンプル中のAIDの異常または調節不良によって引き起こされたと同定された場合、化学療法は、AID阻害剤、APOBEC3G阻害剤の形式であり得る。他の例においては、対象から得られた生物学的サンプルにおいて観察される個々のTSMに依存して、APOBEC1阻害剤またはAPOBEC3H阻害剤、ADAR阻害剤がより適切であり得る。
【００３３】
対象において癌が再発する可能性が低いと判定された場合、対象が受けている現行の処置計画は、中断、縮小または変更され得る。癌（例えば、卵巣癌またはAML）の処置に関して現在当技術分野で標準となっている処置計画は、多くの望ましくない副作用を有する。したがって、癌が再発する可能性が低いという判定に基づき対象が受けている処置計画を中断および／または縮小することは有益である。
【００３４】
本発明の例は、ここから、添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】標的モチーフを定義するヌクレオチドの数が3ヌクレオチドから6ヌクレオチドに段階的に増加するにしたがいGからAへの変異の標的指向特異度がどの程度増加するのかを示すグラフを示している。AID脱アミノ化活性に関連する周知のGYWモチーフから始まる、変異コドン内の第2のヌクレオチド部位（MC-2、5プライム（5’）から3プライム（3’）に向かって読む）の、GからCおよびGからTと比較したGからAへの変異の数のプロット。このモチーフにおいて、W=A/T、S=C/GおよびY=T/Cである。選択されたモチーフはすべて、変異コドン内の第2の部位（すなわち、MC-2部位）を標的指向する選択性を示し、支配的に生じる変異はGからAである。MC-2部位におけるGからの各変異タイプの比率が示されている。各モチーフについての、すべての可能性のある変異および変異コドン内の標的部位を示す標的指向された体細胞変異（TSM）3x3表が、含まれている。MC-1、MC-2およびMC-3は、5プライム（5’）から3プライム（3’）に向かって読む、変異コドン（MC）内の変異の位置を表す。各モチーフについてのタイプおよび変異コドン内の位置による予想される変異の分布からの偏差についての統計学的有意性のカイ二乗レベル（＜0.001、8df）が、カラムの最も右側に示されている。
【図２】陽性または陰性の癌進行関連指標（C-PAS）試験結果を示す110個の高等級漿液性卵巣腺癌サンプルにおける生存可能性を予測するカプラン・マイヤープロットを提供する。
【図３】処理システムを用いた核酸分子内の標的指向された体細胞変異誘発を検出するプロセスの概要を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
1. 定義
それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと同様または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語が以下で定義されている。
【００３７】
「1つの（a）」および「ある（an）」という冠詞は、本明細書において、1つまたは2つ以上（すなわち、少なくとも1つの）その冠詞の文法上の目的語を表すために使用される。例として、「糖分子バイオマーカー（a glycospecies biomarker）」は、1つの糖分子バイオマーカーまたは2つ以上の糖分子バイオマーカーを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「および／または」とは、付随して列挙されている項目の1つまたは複数の任意かつすべての可能性のある組み合わせを表し、かつそれらを包含し、択一的に解釈される場合（または）は組み合わせを含まない。
【００３９】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、近似的に、〜のあたり、おおよそ、または〜付近を意味する。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、その示されている数値範囲の上下限を拡張することによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、数値を、10％の分散によって示されている値の上下に修飾する。したがって、約50％は、45％〜55％の範囲を意味する。本明細書において終点によって示されている数値範囲は、その範囲内に含まれるすべての数値および分数を含む（例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.90、4および5を含む）。そのすべての数値および分数が「約」という用語によって修飾されるとみなされることも理解される。
【００４０】
本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、対象または患者から抽出され得る、未処理であり得る、処理され得る、希釈され得るまたは濃縮され得るサンプルを表すために使用される。適宜、生物学的サンプルは、毛髪、皮膚、爪、組織または体液、例えば唾液もしくは血液を含むがこれらに限定されない、患者の身体の任意の部分から選択される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、変異を参照していう「コドン文脈」という用語は、変異が起こるコドン内のヌクレオチド位置を表す。本発明の目的のために、変異コドン（MC、すなわち、変異を含むコドン）内のヌクレオチド位置は、MC-1、MC-2およびMC-3と称され、それぞれ、コドンの配列が5’から3’に向かって読まれたときの第1、第2および第3のヌクレオチド位置を表す。したがって、「変異のコドン文脈を決定する」というフレーズまたは類似フレーズは、変異コドン内のどのヌクレオチド位置、すなわち、MC-1、MC-2またはMC-3で変異が起こったかを決定することを意味する。
【００４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、「含む（comprise）」という単語およびその派生語、例えば、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、言及されている整数もしくは工程または整数群もしくは工程群を含むが、任意の他の整数もしくは工程または整数群もしくは工程群を排除しないことを暗示していると理解される。「からなる」は、「からなる」というフレーズの後に続いているものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」というフレーズは、列挙されている要素が要求されまたは必須となり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」は、そのフレーズの後に列挙されている任意の要素を含み、かつ列挙されている要素に関して本開示で詳述されている活性または作用と干渉しないまたはそれらに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。
【００４３】
「対照対象」という用語は、本発明に関連して使用される場合、癌に冒されていることが分かっている対象（陽性対照）または癌状態に冒されていないまたはそのように診断されないことが分かっている対象（陰性対照）を表し得る。健常である、すなわち、癌に罹患していないことが分かっている対照対象は、試験されていない／未知の別の疾患を患っている可能性があることに留意されたい。対照対象および健常対照は、標準として取得および使用されるデータを含む、すなわち、それは複数の異なる対象に対して繰り返し使用され得ることも理解される。別の言葉で言うと、例えば、対象サンプルを対照サンプルと比較する場合、対照サンプル由来のデータは、異なる実験セットにおいて取得され得る、例えば、それは、多数の健常対象から得られる平均であり得、対象のデータを取得したときに実際には取得されないことがあり得る。
【００４４】
「相関する」という用語は、概ね、1つのタイプのデータと別のデータまたは状態の間の関係を決定することを表す。様々な態様において、TSMと癌の有無を相関付けることは、癌に罹患している対象におけるまたは癌を有さないことが分かっている人におけるTSMのレベルを決定することを含む。特定の態様において、TSMのレベルは、受信者動作特性（ROC）曲線を用いて癌の再発に相関付けられる。
【００４５】
「遺伝子」は、ゲノム上の特定の位置を占有する遺伝単位を意味し、転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）を含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「可能性」という用語は、特定の数学的モデルに基づく、TSMが起こったかどうか、および標的指向された体細胞変異を含む核酸分子を有する対象が癌の再発を経験するかどうかの尺度として使用される。例えば、可能性の上昇は、相対的なものまたは絶対的なものであり得、定性的または定量的に表わされ得る。例えば、対象が癌を発症する可能性またはリスクの上昇は、単に（本明細書に教示されるようにして）標的指向された体細胞変異の数を決定すること、および、過去の集団研究に基づき試験対象を「可能性またはリスクの上昇」カテゴリーに入れることによって表され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、この方法は、標的指向された体細胞変異の数または比率を、予め選択されたまたはしきい値の数または比率と比較する工程を含む。しきい値は、診断、可能性または予後のリスクを予測する上で許容できる能力を提供するものが選択され得る。実例において、第1の集団が第1の状態またはリスクを有し、第2の集団が第2の状態またはリスクを有する（任意で、例えば、「健常状態」および「癌」または「低いリスク」および「高いリスク」と呼ばれる）2つの集団において変数値をその相対頻度に対してプロットすることによって、受信者動作特性（ROC）曲線が計算される。
【００４８】
再発を起こすおよび再発を起こさない対象における変異数の分布は、重複し得る。そのような状況下で、試験は、再発する癌と再発しない癌を100％の精度で完全に区別しない。それを上回ると試験が「陽性」とみなされ、それを下回ると試験が「陰性」とみなされるしきい値が選択される。ROC曲線下面積（AUC）は、行われた測定がある状態を正確に同定する蓋然性の尺度であるC統計量を提供する（例えば、Hanley et al, Radiology 143: 29-36 (1982)を参照のこと）。「曲線下面積」または「AUC」という用語は、受信者動作特性（ROC）曲線の曲線下面積を表し、これらは両方とも当技術分野で周知である。AUCの測定は、分類器の精度を全データ範囲にわたり比較するのに有用である。より大きなAUCを有する分類器は、関心対象の2つのグループ（例えば、健常状態の変異の状況と癌の変異の状況）間で未知のものを正確に分類する能力がより高い。ROC曲線は、2つの集団（例えば、癌を有する症例と癌を有さない対照）の間を区別または識別する上での特定の特徴の性能をプロットするのに有用である。典型的に、全集団（例えば、症例および対照）にまたがる特徴データが、単一の特徴の値に基づき昇順に仕分けされる。次に、その特徴についての各値について、そのデータの真陽性および偽陽性率が計算される。感度は、その特徴についての値を上回る症例の数を計数し、次いでそれを総症例数で割ることによって決定される。特異度は、その特徴についての値を下回る対照の数を計数し、次いでそれを総対照数で割ることによって決定される。この定義は、対照と比較して症例において特徴が大きくなるシナリオを表しているが、この定義はまた、対照と比較して症例において特徴が小さくなるシナリオにも適用される（そのようなシナリオにおいては、その特徴についての値を下回るサンプルが計数される）。ROC曲線は、単一の特徴についておよび他の単一のアウトプットについて作成され得る、例えば2つまたはそれ以上の特徴の組み合わせが、単一の値を生成するよう数学的に結合（例えば、加算、減算、乗算など）され得、そしてこの単一の値がROC曲線にプロットされ得る。加えて、単一のアウトプット値を生成する複数の特徴の任意の組み合わせ（例えば、1つまたは複数の他のエピジェネティックマーカー）が、ROC曲線にプロットされ得る。これらの特徴の組み合わせは、試験を含み得る。ROC曲線は、試験の特異度に対する試験の感度のプロットであり、その際、感度は通常垂直軸に示され、特異度は水平軸に示される。したがって、「AUC ROC値」は、分類器が無作為に選択された陰性の例よりも無作為に選択された陽性の例を上位にランク付けするであろう蓋然性に等しい。AUC ROC値は、2つのグループが連続するデータである場合に考慮されるそれらの2つのグループにおいて得られたスコア間の差の中央値について試験するマン・ホイットニーU検定またはウィルコクソン順位検定と同等であると考えられ得る。
【００４９】
あるいは、または加えて、しきい値は、同じ患者からより早期の変異状況の結果を得ることによって確立され得、それに対してより後期の結果が比較される。これらの態様において、個体は実質的に、彼ら自身の「対照グループ」として扱われる。別の態様において、しきい値は、患者由来の非疾患または健常組織由来の核酸分子内の標的指向された体細胞変異の数を分析することによって確立され得、それが疾患または癌性組織由来の核酸分子内の標的指向された体細胞変異の数を分析するために比較され得る。
【００５０】
本発明に関して使用される「診断」という用語は、癌の再発の可能性を判定するプロセスを表す。対象由来の生物学的サンプル中に存在する核酸分子におけるTSMの決定は、対象における癌の再発の可能性と相関する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「健常」対象は、癌を有さず、癌の再発を有する可能性が低い対象である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、TSMに関して言う「レベル」は、生物学的サンプル中に存在する核酸分子内のTSMの数、比率または量を表す。TSMの数、比率または量は、絶対値であり得または相対値であり得、それらは当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定され得る。
【００５３】
「変異誘発物質」という用語は、DNAまたはRNAの変異誘発を引き起こし得る内因性作用物質（すなわち、そのDNAを含む細胞に対して内因性である、またはその細胞によって産生される作用物質）を表す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「変異タイプ」は、その変異を含む特定のヌクレオチド置換を表し、CからT、CからA、CからG、GからT、GからA、GからC、AからT、AからC、AからG、TからA、TからCおよびTからGへの変異の中から選択される。したがって、例えば、CからTの変異タイプは、標的化されたまたは変異したヌクレオチドCが置換ヌクレオチドTで置き換えられる変異を表す。
【００５５】
本明細書で使用される「核酸」は、DNA、cDNA、mRNA、RNA、rRNAまたはcRNAを表す。この用語は典型的に、30ヌクレオチド残基長より長いポリヌクレオチドを表す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「再発する」、「再発」等の用語は、癌または腫瘍に対する最初の処置が行われた後の対象における腫瘍または癌性細胞の再成長を表す。腫瘍は、元の部位においてまたは身体の別の部分で再発し得る。1つの態様において、再発する腫瘍は、その対象が処置を受けた元の腫瘍と同じタイプである。例えば、対象が卵巣癌腫瘍を有しており、その処置を受け、その後に別の卵巣癌腫瘍を発症した場合、腫瘍が再発したということである。加えて、癌は、それが当初発生した臓器もしくは組織とは異なる臓器もしくは組織において再発し得るまたはそのような臓器もしくは組織に転移し得る。
【００５７】
「感度」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的サンプルが陽性である、例えば予想される診断がなされる場合に、本発明の診断または予測方法またはキットが、陽性の結果を提供する可能性を表す。感度は、真陽性結果の数を真陽性および偽陰性の和で割ることによって計算される。感度は本質的に、本発明が、予想される診断がなされない者から予想される診断がなされる者をどの程度正確に識別するかの尺度である。統計的方法およびモデルは、その感度が少なくとも約60％であり、例えば少なくとも約65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％であり得るように選択され得る。
【００５８】
「体細胞変異」という用語は、受胎後に生じる体細胞（すなわち、生殖細胞でないもの）のDNA内での変異を表す。「体細胞変異誘発」は、したがって、体細胞変異を起こすプロセスを表す。
【００５９】
「特異度」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的サンプルが陽性でない、例えば予想される診断がなされない場合に、本発明の診断または予測方法またはキットが、陰性の結果を提供する可能性を表す。特異度は、真陰性結果の数を真陰性および偽陽性の和で割ることによって計算される。特異度は本質的に、本発明が、予想される診断がなされる者から予想される診断がなされない者をどの程度除外するかの尺度である。統計的方法およびモデルは、その特異度が少なくとも約60％であり、例えば少なくとも約65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％であり得るように選択され得る。
【００６０】
「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、任意の動物対象、特に哺乳動物対象を表す。実例として、適切な対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、本明細書で定義される状態の臨床兆候を示す。本明細書で使用される場合、「臨床兆候」、または単に「兆候」という用語は、対象に存在する疾患の客観的証拠を表す。本明細書で言及されている疾患に関連する症状および／または兆候ならびにそのような兆候の評価は、従来的なものであり、当技術分野で公知である。疾患の兆候の例は、疾患によって異なる。癌の兆候は、腫瘍形成、転移および血管形成を含み得る。典型的に、対象が疾患を有するかどうかおよび対象が処置に応答するかどうかは、その疾患に関連する兆候の評価によって判定され得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「標的指向された体細胞変異誘発」および「TSM」という用語は、1つまたは複数の変異誘発物質によって引き起こされる体細胞変異誘発のプロセスを表し、ここで、変異誘発はモチーフ内の標的化されたヌクレオチドにおいて起こり、該標的化されたヌクレオチドはコドン内の特定位置（例えば、５’から３’に向かって読んで、MC-1、MC-2およびMC-3と称される、それぞれ、変異コドンの第1、第2または第3の位置）に存在し、該標的化されたヌクレオチドは特定の置換ヌクレオチドに変異する（すなわち、変異は特定の変異タイプのものである、例えば、CからTであってCからAまたはCからGではない）。したがって、TSMが起こっているという判定は、変異タイプ（例えば、CからT）、変異が起こるモチーフ（例えば、WRC）および変異のコドン文脈、すなわち、変異が起こるコドン内の位置（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3）の分析を必要とする。「標的指向された体細胞変異原」は、したがって、TSMに起因する変異を表す。
【００６２】
本明細書で使用される「処置する（treat）」および「処置する（treating）」という用語は、それ以外のことが示されていない限り、その目的が標的指向された状態もしくは障害（例えば、癌）またはそれに関連する1つもしくは複数の症状の再発を部分的にまたは完全にのいずれかで阻止する、改善するまたは鈍化（減少）させることである、治療的処置および予防的（prophylactic）または予防的（preventative）手段の両方を表す。この用語はまた、本明細書において、癌、特に癌または腫瘍の発症を遅らせる、それらを阻止する（例えば、減少させるもしくはそれらの成長を停止させる）、それらの影響を軽減する、またはそれらを患った患者の寿命を延ばすことを表すために使用される。処置を必要とする者は、障害を有すると診断された者、障害を有することが疑われる者、障害にかかり易い者、および障害が予防されるべき者を含む。したがって、本明細書において処置される対象は、障害を有すると診断された者または障害にかかり易いもしくは障害に対する感受性を有する者であり得る。いくつかの態様において、処置は、本発明の方法にしたがう1つまたは複数の治療剤の投与による原発性、限局性または転移性癌組織の根絶、除去、調節または制御を表す。他の態様において、そのような用語は、そのような疾患を有する対象への1つまたは複数の治療剤の投与による癌の最小化またはその拡散の遅延を表す。他の態様において、そのような処置は、疾患の原因となる細胞の除去を表す。本明細書で使用される「処置」という用語は、それ以外のことが示されていない限り、処置する行動を表す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「処置計画」という用語は、予防的および／もしくは予防的計画（すなわち、癌もしくは腫瘍の発症前の計画）、または治療的計画（すなわち、癌の発症後の計画）を表す。「処置計画」という用語は、天然物質および薬剤（すなわち、「医薬」）ならびに化学療法、放射線療法、陽子線療法、免疫療法、ホルモン療法、光線療法、凍結療法、凍結手術、毒素療法またはアポトーシス促進療法、高密度焦点超音波、食事療法、理学療法または運動療法、外科的介入およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の他の処置計画を包含する。
【００６４】
当業者は、本明細書に記載される局面および態様が具体的に記載されているもの以外の変更および改変を受け入れることができることを理解するであろう。本開示は、すべてのそのような変更および改変を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で言及されているまたは本明細書に示されている工程、特徴、組成物および化合物のすべてを、個別にまたは集合的に、ならびにそれらの工程または特徴の任意の2つ以上の任意かつすべての組み合わせを含む。
【００６５】
2. 略称
本願を通して以下の略称が使用されている。
ADAR＝RNA作用性アデノシンデアミナーゼ
AID＝活性化誘導型シチジンデアミナーゼ
APOBEC＝アポリポタンパク質B-mRNA編集酵素触媒性ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ
DBD＝デアミナーゼ結合ドメイン
NTS＝非翻訳鎖
SHM＝体細胞超変異
TSM＝標的指向された体細胞変異
nt＝ヌクレオチド
nts＝ヌクレオチド
aa＝アミノ酸
kb＝キロ塩基またはキロ塩基対
kDa＝キロダルトン
ds＝二本鎖
ss＝一本鎖
d＝日
h＝時間
s＝秒
【００６６】
（表２）IUPACヌクレオチド記号
2018531620.tif 000003
【００６７】
3. 体細胞変異誘発に関与する変異誘発物質
本発明は、一部、TSMに関連する1つまたは複数の特定の変異が対象において癌が再発する可能と相関するという予想外の発見に基づいている。本発明は、そのような変異を同定する方法およびそれらの変異を検出することによって対象において癌が再発する可能性を判定する方法を包含する。
【００６８】
内因性因子（例えば、酵素）は、体細胞変異誘発を引き起こすまたは体細胞変異誘発において役割を果たす変異誘発物質として作用し得る。内因性因子は、シチジンデアミナーゼ（例えば、活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）およびアポリポタンパク質B-mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ）、アデノシンデアミナーゼ、例えば、RNA作用性アデノシンデアミナーゼ、およびエラープローンDNAポリメラーゼ、例えば、DNAポリメラーゼ等を含むがこれらに限定されない。特に、これらのデアミナーゼの多くは、各組織タイプに存在する個々のアイソフォームを有する。
【００６９】
3.1 活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID)
活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID)は、適応免疫において重要な酵素であり、B細胞において免疫グロブリン遺伝子の体細胞超変異（SHM）およびクラススイッチ組み換えに関与する。AIDは、シチジンからウラシル（CからU）に脱アミノさせることによってSHMを誘発し、免疫グロブリン可変領域遺伝子（VDJ）を多様化させ、新しい抗原結合部位を生成する。通常、Cの（例えば、CからTへの）変異は、非転写鎖（NTS）上で起こるシトシンの脱アミノの結果である。逆に、Gの（例えば、GからAへの）変異は、転写鎖（TS）上で起こるシトシンの脱アミノの結果である。
【００７０】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、AIDは、核酸配列WRCG/CGYW（W=A/T；R=A/GおよびY=T/C）を含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子の非転写鎖（NTS)上のMC-1および／またはMC-3部位におけるWRCGモチーフにおいて予想以上に高いレベルのCからTへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。生物学的サンプル由来の核酸分子の（TS)上のMC-2部位におけるCGYWモチーフにおいて予想以上に高いレベルのGからAへの変異が観察される場合もまた、TSMが起こった可能性がある。
【００７１】
3.2. アポリポタンパク質B-mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ
AIDに加えて、ヒトゲノムは、自然免疫およびRNA編集に関与することが公知のいくつかの相同なAPOBECシチジンデアミナーゼをコードしている（Smith et al. (2012), Semin. Cell. Dev. Biol. 23: 258-268）。ヒトにおいて、少なくともAPOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3GおよびAPOBEC3Hが、自然免疫の提供および／または細胞性のmRNA編集に関与する。
【００７２】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含み、APOBEC3Bは、核酸配列TCG/CGAを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1および／またはMC-3部位でTCGモチーフにおいて予想以上に高いレベルのCからTへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。加えて、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でのCGAモチーフにおいて予想以上に高いレベルのGからAへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００７３】
本発明のいくつかの態様において、APOBEC3Gは、核酸配列CCGを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でCCGモチーフにおいて予想以上に高いレベルのCからTへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００７４】
本発明のいくつかの態様において、APOBEC3Gは、核酸配列CGGを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-2部位でCGGモチーフにおいて予想以上に高いレベルのGからAへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００７５】
他の態様において、癌は白血病（例えば、急性骨髄性白血病（AML））であり、生物学的サンプルは末梢血を含む。AMLにおいて、APOBECアイソフォームにより引き起こされるTSMの増加は、癌が再発または進行するリスクの上昇を示す。このタイプの実例として、予想以上に高いレベルの以下の変異の少なくとも1つが核酸分子において観察される場合、TSMが起こった可能性がある：MC-1部位のCCZモチーフにおけるCからTへの変異；MC-2部位のSWCSモチーフにおけるCからTへの変異；MC-3部位のXNGNSモチーフにおけるGからAへの変異；MC-2部位のGSAモチーフにおけるGからAへの変異；MC-1部位のSGXWモチーフにおけるGからAへの変異；MC-3部位のCXGSモチーフにおけるGからAへの変異；MC-3部位のYXGNXモチーフにおけるGからAへの変異；MC-3部位のYYGNXモチーフにおけるGからAへの変異；およびMC-1部位のWNGNZモチーフにおけるGからAへの変異。
【００７６】
3.3 RNA作用性アデノシンデアミナーゼ（ADAR）
RNA編集は、ゲノムDNAによってコードされているものとは異なるRNA配列を生成し、それによって遺伝子産物および機能を多様化させる転写後プロセシング機構である。高等真核生物において最もよく見られるRNA編集のタイプは、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼまたはADAR酵素の作用を通じて二本鎖RNA（dsRNA）内のアデノシン残基をイノシンに変換する（AからIへの編集）。
【００７７】
ADARは、ヒトにおいてADAR遺伝子によってコードされる酵素である。ADAR1酵素は、アデノシンからイノシンへの変換を通じてdsRNAを不安定化させる。ADAR1酵素は、コードおよび非コードRNAを含む細胞およびウイルスのRNAを修飾する。ADAR1は、造血に必要とされるRNA編集酵素である。ADAR1+/-キメラ胚は、胎生第14日より前に造血系の欠陥によって死亡する。ADAR1発現のレベルの調節が、肝臓における初期赤血球生成に重要である。ADAR遺伝子における変異は、遺伝性対側性色素異常症に関連する。異なるアイソフォームをコードする選択的転写スプライス変種が特徴づけらている。
【００７８】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列WAYを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-2部位でWAYモチーフにおいて予想以上に高いレベルのAからGへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００７９】
このタイプのいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列RAWAを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でRAWAモチーフにおいて予想以上に高いレベルのAからTへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００８０】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列WTAWを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でWTAWモチーフにおいて予想以上に高いレベルのAからGへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００８１】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列SARAを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-1部位でSARAモチーフにおいて予想以上に高いレベルのAからGへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００８２】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列TWTYを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-2部位でTWTYモチーフにおいて予想以上に高いレベルのTからCへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００８３】
本発明のいくつかの態様において、癌が卵巣癌（例えば、漿液性卵巣腺癌）であり、生物学的サンプルが卵巣細胞および／または組織を含む場合、ADAR1は、核酸配列TWTYを含むモチーフを標的とする。特に、生物学的サンプル由来の核酸分子のMC-3部位でTWTYモチーフにおいて予想以上に高いレベルのTからCへの変異が観察される場合、TSMが起こった可能性がある。
【００８４】
4. TSMを検出する方法
本明細書で実証されているように、一部の変異誘発物質は、1つまたは複数の特定モチーフにおいてヌクレオチドの変異誘発を引き起こすだけでなく、そのモチーフおよび変異するヌクレオチドは、コドン文脈の中で認識される、すなわち、変異するヌクレオチドは、コドン構造内の特定位置にある、例えば、変異コドン内の（5’から3’に向かって）第1、第2または第3のヌクレオチドである。置換（replacement）または置換（substituting）ヌクレオチドに関しても明確な選択性が見られる。変異誘発物質によるこのモチーフ特異的およびコドン文脈特異的な標的指向の組み合わせは、本明細書でTSMと称される。非限定的な例として、表5に示されるように、核酸分子の非転写鎖のWRCGモチーフにおけるCの変異は、変異コドンの第1の位置（MC-1）において優先的に発生し得、それはTへの（すなわち、CからTへの）変異であり得る。したがって、核酸分子の標的指向された体細胞変異が起こるかどうかの可能性は、核酸分子の配列を分析し、1つまたは複数の特定モチーフ（例えば、WRCGSSモチーフ）における変異タイプ（例えば、CからT）の変異のコドン文脈を決定することによって判定され得る。そのモチーフにおけるその変異タイプの変異の位置にコドンのバイアスがない場合（すなわち、変異が本質的に、コドン内の各位置に均等に分布している場合）、その変異が偶発的に起こったものであり、変異誘発物質によるTSMの結果として起こったものではない可能性が非常に高い。しかし、核酸分子内のコドン内の1つの特定位置（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3部位）においてその変異タイプの変異の比率または数が高い場合、これは、TSMが起こったことまたは起こった可能性があることを示している。
【００８５】
上記の変異の「予想される数または比率」は、変異が他の変異およびコドン文脈に非依存的である、すなわち、コドン内の各位置の各標的化されたヌクレオチドにおける変異の分布が本質的に均等である場合に予想される変異の数または比率である。したがって、例えば、MC-1、MC-2およびMC-3位または部位で発生する変異を評価する場合、3つの部位のいずれか1つ（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3）におけるあるヌクレオチド（例えば、C）から他の3つのヌクレオチドのいずれか1つ（例えば、G、AまたはT）への変異は、9つの変異あたり1つ（すなわち、CからG、AまたはTのいずれか1つへで3分の1の可能性、いずれかの部位で3分の1の可能性、全体として9分の1の可能性）または機会のおよそ11％で発生することが予想される。変異コドン内のヌクレオチド位置の2つのみ、例えばMC-1およびMC-2部位で発生する変異を評価する場合、2つの部位のいずれか（例えば、MC-1またはMC-2）におけるあるヌクレオチド（例えば、C）から他のヌクレオチドのいずれか1つ（例えば、G、AまたはT）への変異は、6つの変異あたり1つまたは機会のおよそ17％で発生することが予想される（すなわち、CからG、AまたはTのいずれか1つへで3分の1の可能性、いずれかの部位で2分の1の可能性、全体として6分の1の可能性）。同様に、1つの部位のみ（例えば、MC-1）で発生する変異を評価する場合、あるヌクレオチド（例えば、C）から他のヌクレオチドのいずれか1つ（例えば、G、AまたはT）への変異は、3つの変異あたり1つまたは機会のおよそ33％で発生することが予想される。
【００８６】
典型的に、TSMが1つまたは複数の変異誘発物質の作用の結果として起こり、コドンの3つの部位（例えば、MC-1、MC-2およびMC-3）で評価がなされる場合、その変異誘発物質に関連する特定の変異は、その機会の少なくともまたは約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上で観察される。2つの部位（例えば、MC-1およびMC-2、MC-1およびMC-3、またはMC-2およびMC-3）で評価がなされる場合、その変異誘発物質に関連する特定の変異は典型的に、その機会の少なくともまたは約30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上で観察される。1つの部位のみ（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3）で評価がなされる場合、その変異誘発物質に関連する特定の変異は典型的に、その機会の少なくともまたは約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上で観察される。
【００８７】
4.1 AID、APOBECおよびADARによるTSM
上記のおよび本明細書の他箇所に記載されるように、卵巣癌において、AIDは、モチーフWRCG/CGYWを特異的に標的指向することが見出され、下線が付されたヌクレオチドが変異する。本明細書で実証されているように、MC-2部位でGが標的化され、GからAへの変異が起こることに関して有意な選択性が見られる。したがって、核酸分子のMC-2部位でのCGYWモチーフにおけるGからAへの変異の予想以上に高い数または比率は、AIDがその核酸のTSMの原因である可能性が高いこと、ならびにAIDが、生物学的サンプルを取得した卵巣細胞および／または組織において活性を有することを示している。これもまた本明細書で実証されているように、ここでも非限定的な例として卵巣癌を用いると、MC-1部位でCが標的とされ、CからTへの変異が起こることに関して有意な選択性が見られる。したがって、核酸分子のMC-1部位でのWRCGモチーフにおけるCからTへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸でTSMがおそらく起こったこと、ならびにAIDが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。
【００８８】
また、卵巣癌において、APOBEC3Gは、CGG/CCGモチーフを特異的に標的化することが見出された。本明細書に記載される研究は、MC-2部位でGが標的化され、GからAへの変異が起こることに関して有意な選択性が見られることを実証している。したがって、核酸分子のMC-2部位でのCGGモチーフにおけるGからAへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸でTSMがおそらく起こったこと、ならびにAPOBEC3Gが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。MC-1および／またはMC-3部位でCが標的化され、CからTへの変異が起こることに関しても有意な選択性が見られる。したがって、核酸分子のMC-1および／またはMC-3部位でのCCGモチーフにおけるCからTへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸で体細胞変異誘発がおそらく起こったこと、ならびにAPOBEC3Gが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。
【００８９】
APOBEC3Bは、卵巣癌サンプルにおいて、TCG/CGAモチーフを特異的に標的化することが見出された。本明細書に記載される研究は、MC-1および／またはMC-3部位でCが標的化され、CからTへの変異が起こることに関して有意な選択性が見られることを実証している。したがって、核酸分子のMC-1および／またはMC-3部位でのTCGモチーフにおけるCからTへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸でTSMがおそらく起こったこと、ならびにAPOBEC3Bが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。MC-1部位でGが標的化され、GからAへの変異が起こることに関しても有意な選択性が見られる。したがって、核酸分子のMC-1部位でのCGAモチーフにおけるCからTへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸で体細胞変異誘発がおそらく起こったこと、ならびにAPOBEC3Bが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。
【００９０】
最後に、ADAR1は、卵巣癌においてWAYモチーフを標的化することが知られている。本明細書に記載される研究は、MC-2部位でAが標的化され、AからGへの変異が起こることに関して有意な選択性が見られることを実証している。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でのWAYモチーフにおけるAからGへの変異の予想以上に高い数または比率は、その核酸でTSMが起こった可能性があること、ならびにADARが、核酸分子を取得した細胞および／または組織において活性を有する可能性があることを示している。
【００９１】
4.2 他の変異誘発物質に関するモチーフの同定
本明細書に明確に示されているように、変異誘発物質は、特定のコドン文脈の中で、あるモチーフのあるヌクレオチドを標的化する。したがって、そのような物質による標的指向された体細胞変異は通常、コドン構造の中の1つの位置（例えば、MC-1であって、MC-2またはMC-3でない）かつ1つのモチーフ（例えば、CCG）において1つの変異タイプ（例えば、CからTであって、CからGまたはCからAでない）をもたらす。上記のように、そのモチーフにおけるおよび特定のコドン文脈の中での特定の変異タイプに関して核酸配列を分析することによって、そのモチーフにおいて単に変異が発生した以上のTSMが起こったかどうかのより正確な指標が試験された。
【００９２】
このコドン文脈に関するバイアスは、他の変異誘発物質に関するモチーフを同定するために使用され得る。ある変異誘発物質に関連することが知られている変異タイプ（例えば、GからT）の体細胞変異の発生に関して核酸分子を分析することによって、またその変異のコドン文脈およびその変異に隣接するヌクレオチドを評価することによって、その変異誘発物質に関するモチーフが同定され得る。特定の変異（例えば、GからT）が、コドン内の特定の位置（例えば、MC-3）において、無作為に起こるよりも高頻度で起こる場合、すなわち、変異が起こる好ましいヌクレオチド位置が存在する場合、この位置での変異が変異誘発物質による標的指向された体細胞変異の結果として起こる可能性がある。好ましいヌクレオチド位置（例えば、MC-3）における変異に隣接するヌクレオチドを分析することによって、その変異に共通する、したがって変異誘発物質によって標的化されるモチーフが同定され得る。
【００９３】
したがって、本発明はまた、変異誘発物質によって標的化されるモチーフを同定する方法を提供する。この方法は、その変異誘発物質に関連する変異タイプが主としてコドンの1つの位置または部位（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3）において起こるかどうかを判定するよう核酸分子の配列を分析する工程を含む。変異タイプおよび部位が一致する場合、その変異ヌクレオチドを含む共通モチーフを同定するよう、その変異ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドが同定される。より詳細に、この方法は、変異誘発物質に関連することが知られている変異タイプの体細胞変異を同定するよう核酸分子の配列を分析する工程、予想以上に高い頻度で変異が起こる好ましいヌクレオチド位置を同定するようその変異のコドン文脈を決定する工程、およびその変異に共通するモチーフを同定するよう好ましいヌクレオチド位置においてその変異に隣接するヌクレオチドを同定する工程を含む。
【００９４】
変異誘発物質に関連する変異タイプが未だ分かっていない場合にも同様のプロセスが適用され得る。そのような例において、核酸分子の配列はまず、体細胞変異を同定するために分析され、そして変異が無作為に起こったときに予想されるよりも高い頻度でコドン内のある位置（例えば、MC-3）において（すなわち、好ましいヌクレオチド位置において）起こる任意の変異タイプ（例えば、GからT)も同定される。次に、その変異に共通するモチーフが存在するかどうかを判定するために、好ましいヌクレオチド位置においてその変異に隣接する配列が評価される。存在する場合、このモチーフがおそらく、変異誘発物質の標的である。
【００９５】
他の例において、変異誘発物質の既知のモチーフが、変異タイプに関するコドンのバイアスおよび選択性を決定するためにさらに分析され得る。核酸配列は、そのコドン内のあるヌクレオチド位置のある変異タイプに関して選択性が存在するかどうかを評価するために、そのモチーフにおける変異に関連するコドン文脈および変異タイプを決定するよう、本明細書に、例えば実施例1に記載されるように評価され得る。例えば、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3FおよびAPOBEC3Hは、TCモチーフ、またはより厳密にTCWモチーフを標的化すると考えられる。1つまたは複数の核酸分子の配列は、そのモチーフにおいて変異を起こすコドン文脈を決定する、すなわち、CがMC-1、MC-2またはMC-3にあるかどうか、およびどのタイプの変異が起こるか（例えば、CからA、CからTまたはCからG）を決定するために分析され得る。一致する変異タイプ、モチーフおよびコドン文脈が同定されれば、この基準または診断ルール集は、TSMが核酸分子内で起こったかどうかをより正確に判定する、したがって核酸分子を取得した細胞において変異誘発物質が活性を有するかどうかを判定するために使用され得る。
【００９６】
上記の方法を用いてモチーフおよび／または診断ルールを同定するために、分析される核酸分子は、典型的に、変異誘発物質と接触したことが分かっているもしくはそのように疑われる核酸であるか、または変異誘発物質と接触したことが分かっているもしくはそのように疑われる細胞から得られた核酸である。例えば、その核酸分子を含む細胞は、核酸配列を分析する前に、インビトロで変異誘発物質に暴露され得る。他の例において、核酸分子は、変異誘発物質に暴露されたことが分かっている対象由来の組織または細胞から取得され得る。その知見を検証するために、複数の生物学的サンプルを用いた複数の研究が実施され得る。
【００９７】
4.3 他の組織タイプに関するモチーフの同定
実施例に示されているように、個々のデアミナーゼアイソフォームについて特徴づけられるDBDは、特定の組織タイプに特異的である。したがって、1つの特定の組織タイプから得られた生物学的サンプルにおけるTSMのレベルの予測は、その組織タイプにのみ特異的である。したがって、好ましい態様において、TSMモチーフは、癌に冒されていることが分かっている組織由来の生物学的サンプルにおいて同定され、対応する健常組織（例えば、癌が存在しないことが分かっている、および癌を発症するリスクがない組織）と比較される。
【００９８】
例として、生物学的サンプルは、組織、血液および／または細胞を含み得る。いくつかの例において、生物学的サンプルは、生検体である。さらに、生物学的サンプルは、身体の任意の部分由来であり得、任意のタイプの細胞または組織、例えば、乳房、前立腺、肝細胞、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ、造血、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮および頭もしくは頚部組織もしくは細胞、または末梢血もしくは脳脊髄液由来の細胞を含み得る。いくつかの例において、核酸分子は、癌を有することが疑われるもしくはそのリスクがある対象由来の細胞もしくは組織サンプルから得られる、または癌を有する対象由来の細胞もしくは組織サンプルから得られる。
【００９９】
4.4 TSMに関する核酸分子の評価
核酸分子の配列を取得および評価するための当技術分野で公知の任意の方法が、本発明の方法において使用され得る。本発明の方法を用いて分析される核酸分子は、任意の核酸分子であり得るが、通常はDNA（cDNAを含む）である。典型的に、核酸分子は、哺乳動物核酸分子、例えばヒト核酸分子である。上記のように、核酸分子は、任意の生物学的サンプルから取得され得る。
【０１００】
核酸分子は、1つの遺伝子の一部もしくはすべて、または2つもしくはそれ以上の遺伝子の一部もしくはすべてを含み得、それは本発明の方法にしたがい分析されるこの遺伝子または遺伝子群の配列である。例えば、核酸分子は、TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2または一酸化窒素シンターゼ（NOS)遺伝子のすべてまたは一部を含み得る。いくつかの例において、核酸分子は、全ゲノムまたは全エクソームを含み、それは本発明の方法において分析される全ゲノムまたは全エクソームの配列である。
【０１０１】
本発明の方法を使用する際、核酸分子の配列は、予め決定され得る。例えば、配列は、データベースまたは他の記憶媒体に保存され得、この配列が本発明の方法にしたがい分析される。他の例において、核酸分子の配列は、本発明の方法を利用する前にまず最初に決定されなければならない。特定の例において、核酸分子はまた、最初に生物学的サンプルから単離され得る。
【０１０２】
核酸を取得するおよび／または核酸の配列決定を行う方法は、当技術分野で周知であり、任意のそのような方法が、本明細書に記載される方法のために使用され得る。いくつかの例において、この方法は、配列決定前に単離された核酸を増幅することを含み、適当な核酸増幅技術は当業者に周知である。核酸配列決定技術は、当技術分野で周知であり、単一もしくは複数の遺伝子、または全エクソームもしくは全ゲノムに適用され得る。これらの技術は、例えば、「サンガー配列決定」に基づくキャピラリー配列決定法（Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467）（すなわち、連鎖停止配列決定を利用する方法）、および数千〜数百万の分子の同時配列決定を可能にする「次世代配列決定」技術を含む。そのような方法は、ルシフェラーゼを使用して個々のヌクレオチドがDNA鋳型に付加されるたびにシグナルを読み取るピロシーケンス；各サイクルで単一のヌクレオチドをDNA鋳型に付加する可逆的ダイターミネーター（dye terminator）を使用する「sequencing by synthesis」技術（Illumina）；および固定長のオリゴヌクレオチドの選択的ライゲーションによって配列決定を行うSOLiD（商標）配列決定（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection; Life Technologies）を含むがこれらに限定されない。これらの次世代配列決定技術は、全エクソームまたは全ゲノムの配列決定に特に有用である。
【０１０３】
核酸分子の配列が得られたら、次に単一点体細胞変異が同定される。単一点変異は、その配列を対照配列と比較することによって同定され得る。対照配列は、対照個体、例えば疾患を有さない健常個体由来の生物学的サンプルから得られる核酸分子の配列；対照サンプル、例えば健常非疾患組織由来のサンプルから得られる核酸分子の配列であり得、または体細胞変異を含まないことが分かっているコンセンサス配列であり得る。いくつかの例において、対照配列は、過去の時点で対象由来の生物学的サンプルから得られた核酸分子の配列であり得る。例えば、対照サンプルは、対象を処置計画に供する前またはその間に取得され得、分析されるサンプルは、処置後のものであり得る（対象が処置に応答しているかどうかを判定するため、および癌または腫瘍の再発の可能性を判定するため）。単一点変異を同定することに加えて、変異を含むコドンおよびコドン内の変異の位置（MC-1、MC-2またはMC-3）が同定される。モチーフを同定するために、隣接する5’および3’コドンのヌクレオチドも同定される。典型的に、本発明の方法において、核酸分子の非転写鎖（cDNA配列に相当）の配列が分析される。いくつかの例において、転写鎖の配列が分析される。
【０１０４】
本明細書に示されているように、本発明の方法を用いると、TSMが特定の変異誘発物質の作用の結果として起こったかどうかを統計学的有意性をもって判定するためには、モチーフにおける少数の変異を分析するだけでよい。いくつかの例において、本発明の方法を用いて分析される特定のモチーフにおける変異の数は、わずか2つの変異であり得る。例えば、見かけ上健常な患者が分析される核酸内に2つの体細胞変異しか有さず、これらの両方がMC-2部位でのGYWモチーフにおけるGからAへの変異であることが見出される場合、このパターンが偶然発生する可能性は、0.04238である（p＜95％、カイ二乗試験を使用、9-1=9 df）。あるいは、各変異が偶然発生する可能性は、1/9であると言うことができ（すなわち、上記のように、GからAへの変異が1/3の可能性、変異がMC-2部位におけるものであることが1/3の可能性）、したがって2つの変異のうちの2つがこのパターンで起こる可能性は1/81（または0.012346）である。しかし、当業者に理解されるように、統計学的有意性は、特定のモチーフにおいてより多くの変異が分析される場合に向上し得る。したがって、いくつかの例において、本発明の方法を用いて分析される特定のモチーフにおける変異の数は、少なくとも20であり得る。処置前または処置後の対象由来の多くの核酸含有生物学的サンプルは、40またはそれ以上の変異を有し、一部は最大400またはそれ以上の変異を有する。したがって、本発明の方法を用いて分析される特定のモチーフにおける変異の数は、少なくともまたは約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300またはそれ以上であり得る。
【０１０５】
5. 癌進行関連マーカー（C-PAS）
本発明はまた、TSMのサブセットが癌の再発の可能性に関連することを開示する（本明細書で「癌進行関連指標」（C-PAS）と称する）。C-PASは、変異誘発物質（例えば、AID、APOBEC、ADAR等）によって特異的に標的指向される個々の核酸配列を検出することによって同定され得、これらは癌の再発の指標となる。
【０１０６】
5.1 C-PASの同定
いくつかの態様において、本発明は、癌を有するまたは癌を有していた対象由来の生物学的サンプル中に存在する核酸におけるC-PASの同定を含む。C-PASであるとみなされるために、2つのルールが適用され得る。第1に、C-PASにおいて同定される変異誘発物質による単一ヌクレオチド置換は、有意な（すなわち、単一のタイプおよびコドン文脈の）標的指向選択性を示さなければならない。これにより、その核酸モチーフが単一のデアミナーゼの変異誘発活性に関連すること、および生じるTSMパターン（すなわち、C-PAS）が偶然によってのみ発生するものでないことが確実になる。C-PASとみなされる核酸モチーフの第2の基準は、再発する癌由来のサンプルと再発しない癌由来のサンプルの間で、C-PASにおいてサンプルあたりの平均標的指向変異数に増加がなければならないことである。
【０１０７】
したがって、C-PASを同定する方法は、核酸分子の配列を分析し、変異誘発物質に関連するある変異タイプがあるコドンの1つの位置または部位（例えば、MC-1、MC-2またはMC-3）で支配的に生じるかどうかを判定することを含む。変異タイプおよび部位が一致する場合、その変異ヌクレオチドを含む共通モチーフを同定するために、その変異ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドが同定される。より詳細に、この方法は、核酸分子の配列を分析し、その変異誘発物質に関連することが分かっている変異タイプの体細胞変異を同定すること、変異が予想以上の頻度で起こる好ましいヌクレオチド位置を同定するためにその変異のコドン文脈を決定すること、およびその変異に共通するモチーフを同定するために、好ましいヌクレオチド位置においてその変異に隣接するヌクレオチドを同定することを含む。その後、統計学的有意性の判定に関して当技術分野で周知の方法を用いて、C-PASにおけるTSMが、再発する可能性がある癌と再発する可能性が低い癌の間を区別できるかどうかを判定するための分析が行われる。
【０１０８】
上記の方法を用いてモチーフおよび／または診断ルールを同定するために、分析される核酸は典型的に、再発した癌を有することが分かっているもしくはそう考えられる、または以前に癌を有しておりそれが再発しなかった対象由来の細胞または組織から得られた核酸である。複数の生物学的サンプルを用いる複数の研究が、この知見を検証するために実施され得る。
【０１０９】
この点で、かつ非限定的な実例として、対象において癌（例えば、卵巣癌、AML等）の再発の可能性を判定するのに適したC-PASが表3に提供されている。
【０１１０】
（表３）同定されたC-PASおよびコドン文脈
2018531620.tif 000004
【０１１１】
C-PASの個々の同定および特徴づけは、TSMが核酸分子内で起こったかどうかに関する迅速な判定を可能にする。さらに、変異誘発物質（例えば、デアミナーゼ）によって特異的に標的化される部位をさらに定義することによって、対象において癌が再発する可能性を判定する上でのより高い特異度および感度がもたらされると予想される。この点に関して、C-PASの同定および特徴づけは、評価される癌の特定の組織サンプルにおいて実施されなければならない。表3に示されるように、異なるC-PASが、関心対象の各組織タイプにおいて同定され、これらの配列は、本明細書に記載されるC-PAS同定法を実施する前に予想することができない。
【０１１２】
上記および本明細書の他箇所に記載される方法の実例として、核酸内のC-PASにおけるTSMのレベルが、無作為の（すなわち、標的指向されていない）変異誘発が起こった場合に予想されるレベルを上回ると判定される場合、対象において癌が再発する可能性が高い。逆に、C-PASにおけるTSMのレベルが、無作為の（すなわち、標的指向されていない）変異誘発が起こった場合に予想されるレベルと同程度またはそれを下回る場合、癌または腫瘍が対象において再発しない可能性が高い。
【０１１３】
6. TSMおよびC-PASを検出するためのキットおよびシステム
本明細書に記載される、対象においてTSMを検出して癌または腫瘍が再発し得る可能性をさらに同定するために必要とされる必須の材料および試薬ならびに関連方法はすべて、キットとしてひとまとめにされ得る。例えば、本発明の方法が最初に分析される核酸を単離および／または配列決定する工程を含む場合、その単離および／または配列決定を容易にするための試薬を含むキットが想定される。そのような試薬は、例えば、DNAの増幅のためのプライマー、ポリメラーゼ、dNTP（標識されたdNTPを含む）、陽性および陰性対照、ならびに緩衝液および溶液を含み得る。そのようなキットはまた、通常、適切な手段で、個々の試薬の各々のための別個の容器を含む。キットはまた、そのキットを使用するための様々なデバイスおよび／または印刷された説明書を特徴とする。
【０１１４】
いくつかの態様において、本明細書に概略的に記載される方法は、少なくとも一部、処理システム、例えば、適切にプログラムされたコンピュータシステムによって実施される。上記方法を実施できるようにするマイクロプロセッサ実行アプリケーションソフトウェアを有するスタンドアローン型コンピュータが使用され得る。あるいは、この方法は、少なくとも一部、分散型アーキテクチャの一部として動作する1つまたは複数の処理システムによって実施され得る。例えば、処理システムは、変異タイプ、変異のコドン文脈および／または1つもしくは複数の核酸配列内のモチーフを同定するために使用され得る。いくつかの例において、使用者によって処理システムに入力されるコマンドは、これらの決定を行う際に処理システムを支援する。
【０１１５】
1つの例において、処理システムは、バスを通じて相互接続された、少なくとも1つのマイクロプロセッサ、メモリ、入力／出力デバイス、例えばキーボードおよび／またはディスプレイ、ならびに外部インターフェースを含む。外部インターフェースは、処理システムを端末デバイス、例えばコミュニケーションネットワーク、データベースまたは記憶デバイスに接続するために利用され得る。マイクロプロセッサは、本発明の方法を実施できるようにするため、および任意の他の必要とされる処理、例えばコンピュータシステムとのコミュニケーション、を行うために、メモリに保存されたアプリケーションソフトウェアの形態の指令を実行する。アプリケーションソフトウェアソフトウェアは、1つまたは複数のソフトウェアモジュールを含み得、適切な実行環境、例えばオペレーティングシステム環境等で実行され得る。
【０１１６】
別の例において、処理システムは、データベースまたは他のソースから配列情報および他の関連データをアップロードするために使用され得る。本明細書に開示される方法に適するよう構築されたアルゴリズムが、例えば図3に示されるように、データに適用され得る。この例において、入力データ［1］および試験パラメータ（例えば、使用されるモチーフ）［2］が、システムにアップロードまたは入力される。次いで、コドン文脈データならびにサンプルの詳細およびヌクレオチド配列に関連する他の情報を用いてデータを整列させ、変異に関連付けることによって、関心対象のゲノム領域内の変異に関して塩基置換テーブルが作成される［3,4,5］。次の工程は、コドン内の各ヌクレオチド位置での各モチーフにおける各変異タイプの同時発生の同定を含む［6］。そのデータは、各診断の信頼性のレベルによる相対的可能性等級を含めて［8］、コドン文脈と各モチーフの各変異タイプの同時発生を記録するために表にされる［7］。結果は、その変異および関連する臨床情報の発生に関与する可能性がある変異誘発物質（または分子構造）および生化学的プロセスを同定するために関連付けられる［8］。出力レポートは、入力として使用されたサービスリクエスト情報にしたがい生成され［9］、読み取り可能な出力が生成される［10］。
【０１１７】
7. 診断および治療用途
標的指向された体細胞変異誘発が起こったかどうかを検出するためならびにC-PASの同定および特徴づけのための本明細書に記載される方法は、多くの有用な診断および治療用途を有する。体細胞変異誘発は、多くの癌の存在に関連することが公知である。同様に、一部の変異誘発物質は、多くの癌の発生および進行に関連することが公知である。本明細書に記載される方法（例えば、1つまたは複数の変異誘発物質により引き起こされたTSMの存在および／または程度）を用いて、対象における癌の再発の可能性が、判定され得る。そのような判定は、癌を有しているまたは癌を有していた対象のための処置計画の策定を容易にし得る。例えば、判定は、現行の処置計画が継続されるべきか、縮小されるべきかまたは中止されるべきかを判定することを支援し得る。加えて、1つまたは複数の変異誘発物質に起因する標的指向された体細胞変異の継続評価は、癌が進行しているかもしくは退行しているかおよび／または処置計画の成功もしくは失敗を評価するために使用され得る。例えば、同一対象においてサンプル、例えば生検由来の核酸内で検出される標的指向された体細胞変異の数の経時的な増加は、癌の悪化または処置計画に対する無応答を示し得、変異の数の安定化または減少は、その状態の緩和または処置計画に対する望ましい応答を示し得る。
【０１１８】
特定の例において、本発明の方法は、対象における癌の診断または対象において癌が再発する可能性の判定を網羅し得る。例えば、対象において癌が再発する可能性は、対象由来の生物学的サンプル由来の核酸分子を分析して、1つまたは複数の変異誘発物質によりTSMが起こったかどうかを判定することによって、評価され得る。TSMが起こった場合、対象において癌が再発する可能性があるという判定がなされ得る。
【０１１９】
いくつかの例において、上記の診断ルールは、対象において癌が再発する可能性を判定するために使用される。例えば、癌は、AID、APOBEC3G、APOBEC3HおよびADARについて上記されているように、核酸分子のMC-1部位でTCGAモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-3部位でATCSモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でGCGGCモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でCCGXモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でZCCGモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でSGGRRモチーフにおいて観察されるGからAへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でTCCGモチーフにおいて観察されるCからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-2部位でGCGCモチーフにおいて観察されるGからAへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-2部位でCCGGCモチーフにおいて観察されるGからAへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；観察される数もしくは比率；核酸分子のMC-1部位でRAWAモチーフにおいて観察されるAからTへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でWTAWモチーフにおいて観察されるAからGへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-1部位でSARAモチーフにおいて観察されるAからGへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；核酸分子のMC-2部位でTWTYモチーフにおいて観察されるTからCへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合；および／または核酸分子のMC-3部位でTWTYモチーフにおいて観察されるTからCへの変異の数もしくは比率が予想以上に高い場合に、再発する可能性があると判定され得る。他の例において、本明細書に記載される方法を用いて他の変異誘発物質について判定された診断ルールが、対象において癌が再発する可能性を検出するために使用される。
【０１２０】
いくつかの例において、対象の特定の領域または部位由来の細胞または組織、例えば、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ、造血、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、頭頸部の組織または細胞を含むサンプルにおいて標的指向された体細胞変異が検出される場合、対象がその組織または細胞に関連する癌を有するまたは癌を発症する可能性があるという判定がなされる。したがって、例えば、対象が乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ、造血、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、頭頸部癌を有するまたはそれらの癌を発症する可能性があるという判定がなされ得る。
【０１２１】
特定の例において、特定タイプの癌の再発の可能性を検出するために使用される生物学的サンプルは、癌のタイプに適合される。例として、対象が卵巣癌を患っているまたは卵巣癌を患っていた場合、TSMを同定するサンプルは、卵巣組織または細胞由来のものである。
【０１２２】
癌の再発の可能性を判定するための使用に加えて、TSMの規模（すなわち、核酸内の変異誘発物質に起因する標的指向された体細胞変異の総数）がまた、癌が進行しているかもしくは退行しているか、および／または処置計画が機能しているかどうかの判定を支援するために使用され得る。上記のように、TSMの数が多いほど、対象において癌が再発する可能性が高い。さらに、対象において標的指向された体細胞変異の数が経時的に増加している場合、癌が進行しているおよび／または対象が癌もしくは腫瘍に応答していない可能性が高い。逆に、対象において標的指向された体細胞の数が経時的に減少している場合、癌が退行しているおよび／または対象が処置計画に上手く応答している可能性が高い。
【０１２３】
本発明の方法はまた、治療または予防プロトコルも網羅する。癌が再発する可能性が低いと判定される例において、プロトコルは、処置の強度を下げるよう、または患者を処置計画から完全に取り除くよう改定され得る。癌が再発する可能性があると判定される例において、その可能性を下げるよう設計されたプロトコルが、対象のために設計され、適用され得る。例えば対象のために、適当な治療プロトコルが設計され、実施され得る。これは、例えば、放射線療法、手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および／または免疫療法を含み得る。いくつかの例において、療法前にその診断を確認するために、さらなる診断テストが実施され得る。
【０１２４】
放射線療法は、DNA損傷を誘導する放射線および波、例えば、γ照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体等を含む。療法は、局部腫瘍部位に上記の形式の放射線を照射することによって行われ得る。これらの因子のすべてが、DNAの前駆体に対する広範囲のDNA損傷、DNAの複製および修復ならびに染色体の集合および維持に影響する可能性が高い。
【０１２５】
X線の線量範囲は、長期間（3〜4週）用の50〜200レントゲンの一日線量から2000〜6000レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体の線量範囲は多様であり、その同位体の半減期、発生する放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１２６】
放射線療法の非限定的な例は、原体外部照射療法（50〜100グレイを4〜8週かけて分割して与えられる）、単発または分割高線量率小線源療法、永久密封小線源療法、全身用放射性同位体（例えば、ストロンチウム89）を含む。いくつかの態様において、放射線療法は、放射線増感剤と組み合わせて実施され得る。放射線増感剤の実例は、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオゾール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィンおよびチラパザミンを含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
化学療法剤は、以下のカテゴリーの任意の1つまたは複数から選択され得る：
（i）腫瘍医学において使用される、抗増殖／抗新生物薬およびそれらの組み合わせ、例えばアルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えば、抗葉酸剤、例えば、フルオロピリジン、例えば5-フルオロウラシルおよびテガフール、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ダクチノマイシンおよびミトラマイシン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンカ・アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン、ならびにタキソイド、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトテシン）；
（ii）細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、エストロゲン受容体下方調節剤（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、UHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン）ならびに5α-レダクターゼの阻害剤、例えばフィナステリド；
（iii）癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、例えばマリマスタットおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；
（iv）成長因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤は、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗erbb2抗体トラツズマブ［ハーセプチン（商標）］および抗erbb1抗体セツキシマブ［C225］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MEK阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮成長因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、他のEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン（ゲフィチニブ、AZD1839）、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン（エルロチニブ、OSI-774）および6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリ-n-4-アミン（CI 1033））、例えば血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤および例えば肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤；
（v）抗血管新生剤、例えば、血管内皮成長因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ［アバスチン（商標）］、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856およびWO 98/13354に開示されるような化合物）ならびに他のメカニズムによって作用する化合物（例えば、リノマイド、インテグリンαvβ3機能の阻害剤およびアンギオスタチン）；
（vi）血管損傷剤、例えば、コンブレスタチンA4ならびに国際特許出願WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434およびWO02/08213に開示される化合物；
（vii）アンチセンス療法、例えば、上で列挙されている標的に指向するもの、例えば、ISIS 2503、抗rasアンチセンス；ならびに
（viii）例えば、異常な遺伝子、例えば異常なp53または異常なGDEPT（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチに取って代わるアプローチ、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるもの、ならびに化学療法または放射線療法に対する患者の耐性を高めるアプローチ、例えば、多剤耐性遺伝子療法を含む、遺伝子療法アプローチ。
【０１２８】
免疫療法アプローチは、例えば、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるエクスビボおよびインビボアプローチ、例えば、サイトカイン、例えばインターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を用いたトランスフェクション、T細胞アネルギーを低下させるアプローチ、トランスフェクトされた免疫細胞、例えばサイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞を用いるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞株を用いるアプローチ、および抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む。これらのアプローチは、一般に、免疫エフェクター細胞ならびに癌細胞を標的指向および破壊する分子の使用に基づく。免疫エフェクターは、例えば、悪性細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。この抗体は単独で療法のエフェクターとして機能し、またはそれは細胞殺傷を実際に促進する他の細胞を動員し得る。この抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に連結され得、標的化剤としてのみ機能し得る。あるいは、エフェクターは、悪性細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。
【０１２９】
他の癌療法の例は、光線療法、凍結療法、毒素療法またはアポトーシス促進療法を含む。当業者は、このリストが、癌および他の過形成性病巣に利用可能な処置様式のタイプに関して排他的なものでないことを理解するであろう。
【０１３０】
いくつかの例において、標的指向された体細胞変異を引き起こす変異誘発物質の可能性のある正体が決定される場合、療法または予防手段は、その変異誘発物質の阻害剤の対象への投与を含み得る。阻害剤は、例えば、siRNA、miRNA、タンパク質アンタゴニスト（例えば、変異誘発物質のドミナントネガティブ変異体）、低分子阻害剤、抗体およびそのフラグメントを含み得る。例えば、APOBECシチジンデアミナーゼおよびAIDに特異的な市販のsiRNAおよび抗体が広く利用可能であり、当業者に公知である。APOBEC3G阻害剤の他の例は、Li et al. (ACS. Chem. Biol,. (2012) 7(3): 506-517）によって記載される低分子を含み、その多くはカテコール部分を含み、これらはオルトキノンへの酸化後にスルフヒドリル反応性となることが公知である。APOBEC1阻害剤はまた、ドミナントネガティブ変異体APOBEC1ポリペプチド、例えばmu1(H61K/C93S/C96S)変異体（Oka et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 1456-1460）を含むがこれに限定されない。
【０１３１】
典型的に、治療剤は、薬学的に許容される担体と共に、およびそれらの意図される目的を達成するのに効果的な量で、薬学的組成物として投与される。対象に投与される活性化合物の用量は、長期にわたる対象における有益な応答、例えば、癌の症状の減少、もしくは症状からの解放、および／または腫瘍もしくは癌細胞の減少、退行もしくは除去を達成するのに十分であるべきである。投与される薬学的に活性な化合物の量は、その年齢、性別、体重および全般的健康状態を含む、処置される対象に依存し得る。これに関して、投与される活性化合物の正確な量は、医師の判断に依存し得、当業者は、過度の実験を行うことなく、治療剤の適切な用量および適切な処置計画を直ちに決定し得る。
【０１３２】
本発明は、対象における癌もしくは腫瘍の存在もしくは発生を診断もしくは監視する、および／または療法の効果に対する応答を監視する目的で、予防医学の分野において実施され得る。
【０１３３】
本発明が容易に理解され実施され得るよう、ここから、以下の非限定的な例によって特定の好ましい態様を説明する。
【実施例】
【０１３４】
実施例1
変異のストランドバイアスパターンは他の癌と共通する
以前の研究は、再構成された免疫グロブリン可変領域遺伝子座において観察される体細胞超変異（SHM）参照パターンが、すべてのワトソン・クリック相補体で見られる有意なストランドバイアスによって特徴づけられることを示した（例えば、Steele and Lindley, 2010を参照のこと）。本研究は、この顕著なSHM様のストランドバイアスのかかったパターンが肺腺癌、肺小細胞癌、乳管癌、扁平上皮癌および悪性黒色腫において起こる体細胞変異においても観察されることの最初の証拠を提供する。そのために、TCGA漿液性卵巣腺癌変異データセットにおけるストランドバイアスパターンもまたこのストランドバイアスを示すかどうかを判定した。その結果は、多くの癌において、異常なIg SHMと体細胞点変異の発生の間に因果関係が存在することを強く示唆している。これはすなわち、SHMに関与する潜在的標的、例えばAIDおよびADAR1、ならびに転写共役修復（TCR）経路を調節するプロセスが関与することを示唆している。
【０１３５】
表4に示されるストランドバイアス変異データは、部分的にまたは全体的に、非リンパ組織において発生する様々な他の癌におけるストランドバイアスパターンと非常に類似している。すなわち、漿液性卵巣腺癌において観察される変異の可能性のある根本的原因は、他の体細胞組織の腫瘍における変異に関して観察されるそれと同じである。この結果は、選択された194個の漿液性卵巣腺癌サンプルの変異データを分析するために、AID/APOBECおよびADARファミリーのデアミナーゼを含む標的指向された体細胞変異（TSM)アプローチを採用するもっともな理由を提供する。
【０１３６】
（表４）エクソーム変異における体細胞変異のパターン
2018531620.tif 000005
【０１３７】
材料および方法
データソース
体細胞変異データのソースは、The Cancer Genome Atlas（TCGA 2013）に保管されている429個の臨床的に注釈を付けられたステージII〜IVの漿液性卵巣腺癌サンプルのコホートである。Kanchi et al（2014）によるこれらのサンプルの以前の分析は、一致する生殖系列および腫瘍組織サンプルのエクソームワイド配列決定を用いる最初の大規模研究であった。
【０１３８】
腫瘍および生殖系列組織の供給源は、TCGA-XX-XXX-YYY-ZZZ（Cancer Genome Atlas Research Network, 2013）における3番目のハイフンの後のコードにより示される。例えば、YYYの領域の以下のコードは、以下のようにその供給源を示す：10は、血液由来正常（Blood Derived Normal）を示し；11は、固形組織正常（Solid Tissue Normal）を示し；12は口腔細胞正常（Buccal Cell Normal）を示す。元サンプルの多くは、配列決定前に増幅されたものである。ZZZの位置の文字コードは、使用された増幅方法を示す。例えば、DはDNAを示し（全ゲノム増幅なし）；GはGENOMEPLEX（RUBICON）DNを用いて生成された全ゲノム増幅物（WGA）を示し；WはREPLI-G（QIAGEN）DNAを用いて生成された全ゲノム増幅物（WGA)を示す。
【０１３９】
DNAは、エクソーム捕捉によって配列決定され、その後にIlluminaまたはSOLiDプラットフォームにおいて配列決定された。腫瘍および生殖系列のサンプル対由来の配列データを、BWA 0.5.9を用いてヒト参照のNCBI Build 36と整列させ、PICARD 1.29を用いて脱二重化した（Kanchi et al., 2014における方法の節を参照のこと）。
【０１４０】
サンプルの選択
DNA変異データを、Educational Research In Codon-context（ERIC）バージョン1.6を用いて分析した。このアプリケーションは、研究支援ツールとして開発された。それは、分析用のDNA変異データの分析およびコンパイルのプロセスを自動化するEXCEL VBAスクリプトで記述されている。このプログラムのルーチンは、各変異の周囲のヌクレオチド配列文脈を同定するために、および変異コドン（MC）のヌクレオチド構造内の各変異の位置を決定するために、ENSEMBL遺伝子転写物（Cunningham et al., 2015）を使用する。
【０１４１】
このデータにコンパイルされた変異データセットを加えた後、ERICを使用して、関心対象の規定のモチーフ上にあり、3〜6ヌクレオチドからなる変異を呼び出し、表にした。選択されたモチーフのヌクレオチドをコンフィギュレーション設定に入力したら、選択されたモチーフのすべての変異の表を、3x3 TSM表内で変異の分布が明らかになるよう表にした（Lindley 2013を参照のこと）。得られたTSM表は、変異の分布（例えば、GからA、GからCまたはGからT）および変異コドン内の3つの可能性のあるヌクレオチド位置（すなわち、5’から3’に向かってMC-1、MC-2またはMC-3位）に関するそれらの位置を示している。
【０１４２】
データ分析
最初の工程として、蓄積された変異データセットにおいてストランドバイアス変異分析を行った。次いで、そのストランドバイアスパターンを、他の組織型における様々な癌のストランドバイアスパターンと比較した。蓄積されたデータのストランド変異バイアスパターンを、（Steele and Lindley, 2010；およびLindley and Steele, 2013に記載されるように）各変異タイプの相対比率を4x4表形式で表にすることによって作成した。
【０１４３】
ストランドバイアス変異データパターンを分析した後、次の工程は、AID/APOBEC3G/APOBEC3BおよびADARファミリーのデアミナーゼが多くの変異の原因となっている可能性を検証することである。この工程を完了するために、鍵となるデアミナーゼに関連することが以前に見出されているモチーフについてのTSM表を表にした。重複しない標的指向選択性（「モチーフ」）は、AIDに対するWRCG/CGYW、およびAPOBEC3Gに対するCCG/CGGを含む（Beale, 2004を参照のこと）。ADAR活性については、モチーフWAYが選択され、APOBEC3Bについては、モチーフTCG/CGAが使用される（Burns et al., 2013aを参照のこと）。APOBEC3B変異は漿液性卵巣癌において有意に上方調節されることが以前に示されていること、およびいくつかの好ましい3ヌクレオチド標的モチーフが漿液性卵巣癌において同定されていることに留意されたい（Leonard et al., 2013を参照のこと）。
【０１４４】
すべてのAID/APOBEC/ADARファミリーのメンバーは、複数の活性なDBDを有することが知られているので、鍵となるデアミナーゼのキメラ性を、以下の調査アプローチを用いて検証した。
【０１４５】
これは、転写鎖（TS）上のAID選択標的モチーフであるGYWから始まる5プライム（5’）および3プライム（3’）の核文脈の変化の影響を最初に分析することによって行った。ERIC v.1.6を用いて、3ヌクレオチドモチーフGYWから開始して、我々は、3ヌクレオチドから6ヌクレオチドにヌクレオチド数を段階的に増加させた。各々の伸長において、我々は、変異コドンの構造内における標的指向選択性または生じる支配的な変異タイプを変化させない追加ヌクレオチドを選択した。
【０１４６】
第2に、AIDおよびADARファミリーに対する異なるモチーフについての標的指向選択性の5プライム（5’）および3プライム（3’）文脈における変化が変異コドンの3ヌクレオチド構造内の変異のタイプおよび変異の優先標的部位のいずれかまたは両方をどのように変化させ得るかを調査するために、表を構築した。これは、これらのデアミナーゼの多型的性質を調査するため、および5プライム（5’）および3プライム（3’）ヌクレオチド文脈における変化が変異コドン内の優先標的部位（MC）および／または生じる変異のタイプをどのように変化させ得るかを理解するためのものである。
【０１４７】
これらの2つの工程は、TSMプロファイリング法がDBDの異なるアイソフォームを同定することができることを確認するため、および任意の1つのアイソフォームの結合ドメインを定義する高度に特異的な標的モチーフの可能性のある最適長を示すために含まれる。
【０１４８】
実施例2
TSMプロフィールはAID/APOBEC3G/APOBEC3BおよびADAR1デアミナーゼ活性を示す
AID（WRCG/CGYW、ここでW=A/T、Y=T/CおよびR=A/G）、APOBEC3G（CCG/CGG）、APOBEC3B（TCG/CGA）およびADAR1（WAY、ここでW=A/TおよびY=T/C）について選択されたモチーフのTSMプロフィールが、表5に示されている。3x3データセットの各モチーフの変異について、予想からの偏差の統計学的有意性のカイ二乗レベルが示されている。すべての3x3データセットは、有意性レベルp＜0.001（8df）で、特定タイプの、および好ましい標的部位での変異に対する強い選択性を示している。各デアミナーゼについてDBDのアイソフォームが存在することが知られているが、選択されたデアミナーゼ間で重複がないことを確実にするために、各デアミナーゼの支配的なDBDに対するモチーフが選択されたことに留意されることが重要である。
【０１４９】
（表５）同定されたC-PASおよびコドン文脈
2018531620.tif 000006
【０１５０】
表5のデータは、漿液性卵巣癌サンプルに関してこれまで報告されていなかった高度に有意なコドンバイアスパターンを明らかにしている。各例において、観察される帰無仮説からの偏差は、高度に有意である。AIDおよびAPOBEC3Gモチーフに関して、NTSにおけるシチジン脱アミノについてのこの統計学的に有意なMC-1へのバイアスは、圧倒的多数のCからTへの移行をもたらし、TSにおけるシチジン脱アミノについてのMC-2へのバイアスは、圧倒的多数のGからAへの移行をもたらす。3ヌクレオチドADARモチーフWAYに関して、支配的な変異タイプは、MC-2部位を選択的に標的化するGからAへの移行である。これらの体細胞変異標的は、蓄積された乳癌変異データにおけるTP53遺伝子変異に関する以前の研究と一致する（Lindley, 2013を参照のこと）。
【０１５１】
さらに、図1は、ヌクレオチドの数を3ヌクレオチドから6ヌクレオチドに段階的に増加させるにしたがい増加するAIDの触媒ドメインに対するモチーフの標的化特異度のグラフ表示を提供する。図1Aのグラフは、各モチーフの標的指向選択性が増加するにしたがいバックグラウンド変異の相対数がどの程度減少するかを示している。MC-2部位で起こるGからAへの変異の数は、3ヌクレオチドモチーフGYWにおけるグアノシンのすべての変異の52％から増加し、6ヌクレオチドモチーフSCGYWWにおけるグアノシンのすべての変異の91％に増加する。可能性のあるグアノシンの変異（GからA/C/T）の範囲にわたる3x3 TSM変異分布、およびMCの構造内の標的部位を示す表が含まれる（図1Bを参照のこと）。予想からの偏差についての統計学的有意性のカイ二乗レベルが、各モチーフの変異について有意レベルp＜0.001で示されている（8 df）。
【０１５２】
これらのデータから導かれる主な結論は、AID結合ドメインに対する標的指向選択性が、4またはそれ以上のヌクレオチドのモチーフによって最もよく定義されることである。すなわち、変異部位を標的化する生化学的結合メカニズムは、高度に特異的であり、それらは以前の研究が示唆していたよりも多くのヌクレオチドに関係する。AIDについての周知の3ヌクレオチドモチーフを出発点として用いたこの実施例はまた、他のデアミナーゼにおける標的指向選択性の可能性のある範囲の変種同型的性質（variant isomorphic nature）を特徴づける上での有用なアプローチとしてTSMプロファイリングの使用を実証している。したがって、TSM法はまた、脱アミノ化に関与する根底にある3次元生体分子相互作用の性質についての新しい予測を試験する有用な構想的ツールを提供する。
【０１５３】
実施例3
DBDの異なるアイソフォームは標的部位が相違する
ADAR DBDの異なるアイソフォームが標的指向選択性を変化させ得ることを検証するため、WAまたはAWの塩基組成を含む様々なADARモチーフの標的指向選択性を特定し比較した。我々はまた、3ヌクレオチド塩基モチーフWRC/GYWを用いて、AIDデアミナーゼドメインの可能性のあるアイソフォームにおけるMCヌクレオチド構造内の好ましい標的ヌクレオチド位置の場所の変化を同定した。その結果が表6に示されている。予想からの偏差の統計学的有意性のカイ二乗レベルが、3x3データセットの各モチーフの変異について、有意性レベルp＜0.001（8 df）で示されている。
【０１５４】
（表６）同定されたC-PASおよびコドン文脈
2018531620.tif 000007
【０１５５】
表6を参照すると、異なるDBDに対する体細胞標的指向選択性が、生じる支配的な変異タイプの変化もしくはMCヌクレオチド構造内での好ましい標的部位の変化のいずれかまたはこれらの両方をもたらし得ることを確認することができる。
【０１５６】
例として漿液性卵巣腺癌サンプルを用いて、表6は、CWAモチーフに対するADARデアミナーゼの作用について、MC-2部位におけるAからGへの変異を生じる支配的なTSMパターン（p＝5.21E-55；8 df）が観察されることを示している。同様に、SCGYWモチーフに対するAIDデアミナーゼの作用について、MC-2部位における支配的な数のGからAへの変異が観察される（p＝1.13E-91；8 df）。AIDデアミナーゼ作用に関連するGYWモチーフのDBDアイソフォームの場合、SCGYWは、MC-2部位を標的指向する支配的な数のGからAへの変異を生じる（p＝1.13E-91、8 df）。しかし、CからAへの単一ヌクレオチド変化を導入することによって、SAGYWモチーフは、MC-3部位を標的指向する支配的な数のGからCへの変異を生じる（p＝6.13E-05、8 df）。同様に、CからGへの単一ヌクレオチド変化を導入することによって、WGGYWモチーフは、MC-1部位を標的指向する支配的な数のGからTへの変異を生じる（p＝4.77E-08、8 df）。核文脈に対する他の変化もまた、変異タイプおよび／またはMC内の変異部位に関して標的部位の相違が発生することを実証している。このTMS法は、単一のデアミナーゼの触媒結合ドメインを定義する可能性のあるアイソフォームの異なる標的指向選択性を同定するために使用することができると結論付けられる。
【０１５７】
このデータは、体細胞組織におけるデアミナーゼ標的部位選択において選択・スイッチングメカニズムが役割を果たしていることおよびSHM様変化の開始が腫瘍形成プロセスに関与していることを明確に示している。これは、本明細書に記載されるTSM法が腫瘍形成プロセスの間のDBDにおける相違を特徴づけるため、ならびに発生する変異の標的部位選択性およびタイプの両方に対するそれらの影響を特定するために使用することができることを意味する。したがって我々は、特定のDBDが疾患の進行に関与し得ることを同定するための訓練データセットとして漿液性卵巣腺癌データを使用することを検討した。
【０１５８】
実施例4
C-PASの同定および再発／予後の予測におけるそれらの使用
このTSM法を用いて、我々は、漿液性卵巣腺癌サンプルにおいて疾患進行指標に関連する様々なDBDを同定した。これらのDBDは、上記の鍵となる選択基準を満たし（実施例1を参照のこと）、これらは以降、本明細書で癌進行関連指標（C-PAS）と呼ぶ。本明細書で同定されたC-PASは、それらのそれぞれのモチーフのヌクレオチド配列によって定義され、したがってデノボ変異の導入を担う特定のデアミナーゼの結合部位を特定する。臨床情報が利用可能な疾患進行指標は、病期および無疾患生存時間を含む。表7は、これらの癌進行指標に関連することが見出されているAID、APOBEC3G、APOBEC3BおよびADARデアミナーゼ活性に関連するデアミナーゼ標的モチーフを示している。これらのデアミナーゼの各々は、腫瘍形成において役割を果たすことが知られている点およびすべての（またはほぼすべての）体細胞組織タイプにおいて見出される点で普遍的である。
【０１５９】
表7を参照すると、最初の診断時から60ヵ月以内に疾患の再発がなかった生存患者のコホートについて、サンプルあたりのC-PASにおける変異の平均数は、0.50である。最初の診断から60ヵ月以内に再発があった患者のコホートについて、サンプルあたりの変異の平均数は、3倍を超えて増加し1.87となっている。各コホートにおけるサンプルあたりのC-PAS変異の平均数を比較すると、ピアソンの積率相関（r）は0.68である（p＜0.001レベルで有意）。これらのデータは、最初の診断後5年以内の疾患の再発の可能性を判定するためにC-PASを使用することができることを示唆している。
【０１６０】
（表７）再発および予後に関するC-PAS
2018531620.tif 000008
【０１６１】
サンプルあたりの平均変異数を癌または腫瘍ステージごとに比較すると、ステージIIA〜IIIBのサンプルあたりの平均変異数は3.1であることが分かる。ステージIIICにおけるサンプルあたりの同定されたC-PASの平均変異数は4.1であり、ステージIVでは3.2である。ステージIIA〜IIIBとステージIIICでサンプルあたりの平均変異数を比較すると、ピアソンの積率相関rは0.28である（p n＜0.05レベルで有意でない）。しかし、ステージIIICのサンプルあたりの平均変異数をステージIVサンプルと比較すると、ピアソンの積率相関rは0.69である（p＜0.001レベルで有意）。
【０１６２】
予想外に、この研究に含まれたC-PASのセットにおける平均変異数は、ステージIIICサンプルと比較してステージIVで有意に少ない。この減少は、単一ヌクレオチド変種（SNV）を呼び出すために使用される組織サンプリング法によって説明され得る。見かけ上正常または健常な組織における体細胞ゲノム変種は、腫瘍形成に影響を及ぼし得るが、これがどの程度発生するかはあまり理解されていない。Tomasetti et al. (2013)は、癌における単一点変異の半分またはそれ以上が腫瘍の発生前に生じたものであることを示唆している。最近、Martincorena et al (2015）は、見かけ上健常なヒト上皮細胞の4分の1超が癌を引き起こす体細胞変異を有することを見出した。見かけ上正常な組織においてTSMプロセスが活性になったら、組織内の個々の体細胞が様々な範囲の遺伝的変化を有する可能性がある。後期ステージIV癌における見かけ上健常な組織は、ステージIIICにおいて同定されたC-PASに関連する変異の多くを有し得る。したがって、SNVを呼び出すためにTCGAによって使用される組織マッチング法は、両方のサンプルにおいて同定されるそれらの変種を除外し得る。このことは、C-PASに関連する変異の多くが生成される変異データセットから除外され得ることを意味し、それがその減少を部分的に説明し得る。しかし、大まかに言うと、これらの結果およびそれらの有意性は、SHM様「スイッチングメカニズム」が後期ステージIIIC癌において活性化され得、新たなDBDの生成を誘導し得るという考え方を支持している。
【０１６３】
表6の結果から、同定されたC-PASを使用して、どの患者が疾患を再発するまたは進行させる可能性が高いかを予測するための予後アッセイにおけるそれらの効果を調査した。SNVを呼び出すために使用された方法には一定の限界があるが、C-PASの訓練データセットを、最初の診断から5年で再発させる患者と再発させない患者の間を区別することを試みる「初回通過」参照試験として使用した。
【０１６４】
同定されたC-PASの各々についてのモチーフにおいて発生した変異の数を、各サンプルで表にした。同定されたC-PASのいずれにおいても変異が発生しなかった場合、陰性試験結果を、1つまたは複数の変異が発生した場合、陽性試験結果を、記録した。各サンプルの変異データおよび試験結果は提供されない。
【０１６５】
図2は、陽性試験結果を示した高等級漿液性卵巣腺癌サンプルについての無疾患生存期間を予測し、これを陰性試験結果を示したものと比較するカプラン・マイヤープロットを示している。試験結果による2つのコホート間の差は、非常に有意である。コックスP値は、1.57E-05であり、ログランクP値は7.86E-07である。感度および特異度の測定値も図2に含まれている。最終訪問時点で60ヵ月未満の無進行生存期間が記録された52個のサンプル、無進行生存データが欠落している31個のサンプルおよびこれらの分析から除外された不明の死因で死亡した個体由来の1個のサンプルに関して収集されたデータ。図2を参照して、陽性試験結果を示した患者のわずか12％が、30ヵ月後に疾患を再発しなかった。60ヵ月後、陽性試験結果を示した96名のうち1名の患者のみが疾患を再発しなかった。この結果は、疾患の再発の可能性の予測におけるTSMプロファイリングアプローチの潜在的臨床利用性を実証している。図2に示される試験の感度および特異度の測定値を参照して、感度の測定値は95％であり、特異度は90％である。
【０１６６】
この実施例は、1つまたは複数のヌクレオチド変化に関与するDBDアイソフォームが標的部位を差別化すること、および生じる形質転換が腫瘍形成時に生じる新たなDBDアイソフォームを同定するために使用され得ることを実証している。それはまた、同定されたC-PASが疾患進行の可能性を予測するための新規の遺伝子試験の開発の基礎を提供することを実証している。この実施例に開示される方法は、我々に、腫瘍形成時に個体において生じるDBDの同型形態におけるいくつかの重要な相違を同定するための根本的に新しいゲノム分析ツールキットを提供する。TSMプロファイリングは、異常なデアミナーゼ活性に関連する疾患の診断にとって重要な情報を提供するために使用することができる。
【０１６７】
実施例5
急性骨髄性白血病（AML）におけるC-PASの同定
本発明の適用のコンセプトの例のさらなる証明を提供するため、異なる組織タイプを冒している癌サンプル（すなわち、急性骨髄性白血病（AML））由来のサンプルを、臨床的に関連するC-PASについて評価した。表8は、臨床記録および一致する配列データが公衆に提供されているサンプルの数の要約を提供する。
【０１６８】
（表８）別の癌サンプルに関する臨床データ
2018531620.tif 000009
【０１６９】
VCF形式の単一ヌクレオチド変種（変異）情報は、TCGA変異ファイルから抽出する。他の変種、例えば挿入／欠失または構造変種は無視する。このグループ選択基準に合致するサンプルを、独自のオンラインCodon Reference Information System（または「CRIS」プロセッサ）を用いて分析した。.vcfデータファイルのゲノム座標を用いて、SNVのエクソン文脈を決定した。SNVがエクソンのENSEMBLE hg38コード配列（cds）内の3塩基対またはそれ以上である場合、そのコード配列の鎖およびフェーズを報告する。結合モチーフの曖昧さを避けるために、イントロン／エクソン境界領域の3塩基対によって定義される領域内のSNVのコドン文脈を分析した。2以上のエクソンが同定される場合、カノニカルな転写の順にエクソンを選択する。
【０１７０】
各コドンの3ヌクレオチド構造内のSNVのいずれかの側の塩基を同定するため、SNV位置の周囲の9塩基ゲノムウィンドウを分析する。完全な3コドンは、5プライム（5’）から3プライム（3’）に向かって読まれ、それぞれMC-1、MC-2およびMC-3と注釈付けされている第1、第2または第3のいずれかのヌクレオチド位置において変異を含む変異コドン（MC）、変異コドンのいずれかの側の5’および3’コドンである。SNVが負鎖上の遺伝子に位置する場合、3コドンの逆相補体が抽出される。
【０１７１】
CRISプロセッサを使用して、デアミナーゼ（例えば、AID（WRC/GYW）、ADAR1（WA/TW）、APOBEC3G（CC/GG）およびAPOBEC3B（TCA/TGA））のDNA/RNA標的指向選択性に関連することが分かっている主標的モチーフについてモチーフ検索を実施した。4〜5ntまでの標準および非重複モチーフも、SNVに関してAID、ADAR1、APOBEC3GおよびAPOBEC3Bモチーフを検索するのに使用する。結果を、各コドンおよび各変異タイプについて表にする。
【０１７２】
より詳細に、この実施例は、（i）急性骨髄性白血病（AML）における腫瘍形成時に発生する変異の可能性のある供給源を同定するため、および（ii）無進行生存を予測するための新しい変異指標を同定するための代表的なインシリコ変異データ分析法を開示する。上で詳述されているように、無進行生存を予測するために同定された新しいC-PASは、その疾患が最初の診断時から60ヵ月未満の期間内に進行または再発した患者のコホートにおいて有意に多い数が存在する。すなわち、この実施例においてアッセイ構築の基礎として同定および使用された新しい変異指標は、60ヵ月を超える生存についての負の予測の決定因子となるAPOBEC/ADAR DBDホモログである。C-PASのサブセットは、その疾患が60ヵ月以内に進行（または再発）する患者と無疾患を維持する患者の間を区別するための試験として使用される。
【０１７３】
この実施例には、癌の再発の可能性を予測するアッセイを構築するために同定されたC-PASのサブセットを使用する方法が記載されている。この研究で使用された臨床情報は、cBioPortalウェブサイト（www.cbioportal.org/data sets.jsp；2015年12月20日にアクセスした）から、単一の癌研究を問い合わせすることによって得た。TCGA AML（TCGA, New Eng. J. Med. Res., 2013）を選択した。この研究において、200個の臨床的に注釈を付けられた成人のデノボAML症例のゲノムを、全ゲノム配列決定（50症例）または全エクソーム配列決定（150症例）のいずれかを用いて、RNAおよびマイクロRNA配列決定ならびにDNAメチル化分析にしたがって分析した。2016年2月4〜8日に、各患者のTCGAサンプルおよび患者ID、対応するCOSMIC.vcf変異データファイルにアクセスし、ダウンロードした。
【０１７４】
本研究への参加のための、サンプルのサブセットの選択基準を、以下の選択基準を用いて選択した：（i）TCGA識別子、最終訪問時の疾患状況、生存状況（生存／死亡）、無疾患状況（無疾患／再発または進行）および無疾患月を含む臨床データシートの入手性；ならびに（ii）適合するTCGA識別子を含むCOSMIC.vcf変異データファイルの入手性。臨床データはまた、以下の２つのコホートのいずれかに患者を含めるためにも使用することができる：60ヵ月を上回って無疾患かつ「生存」を維持した患者および60ヵ月以内に癌が再発および／または進行した患者。
【０１７５】
表9は、以前に記載された方法を用いてAML変異データセットから同定されたC-PASの同定を示している。この実施例において、比較されるコホートの各々にける変異の数ではなく、少なくとも1または複数のC-PAS変異を有する患者の数が示されている。C-PASは、変異タイプ、標的モチーフおよびそのコドン文脈によって示されており、MC-1〜3は、変異ヌクレオチドの位置を示している（5プライムから3プライムに向かって読む）。
【０１７６】
（表９）各C-PASにおける変異数を示す結果の表
2018531620.tif 000010
【０１７７】
表9は、各サンプルで見出されたC-PASの各々における総変異数を示すサンプルのサブセットについての結果の表を示している。60ヵ月の時間枠内でAMLの再発または進行を予測する予測試験を構築するためにC-PASの選択されたパネルが使用されている。試験結果は、疾患の進行または再発に関連するC-PASを示す部位に変異が存在する場合に、陽性の結果を与えると考えられる。すなわち、陽性の試験結果は、その疾患が60ヵ月以内に再発および／または進行する可能性が高いことを示す。陰性の試験結果は、癌の進行および／または再発に関連することが分かっている部位において変異が見出されない（または変異が無作為に起こった場合に予想されるのに等しいまたはそれ未満である）ことが見出される場合に報告される。
【０１７８】
本明細書で引用されているあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する「先行技術」として利用可能であることの承認とみなされるべきでない。
【０１８０】
本明細書を通じて、その目的は、本発明を任意の1つの態様または個々の特徴の集合に限定することなく、本発明の好ましい態様を説明することである。したがって当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示されている特定の態様において様々な改変および変更を行うことができることを理解するであろう。すべてのそのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１８１】
書誌情報
2018531620.tif 000011
2018531620.tif 000012
2018531620.tif 000013
2018531620.tif 000014
【図１】
2018531620.tif 000016
【図２】
2018531620.tif 000017
【図３】
2018531620.tif 000018
【国際調査報告】
2018531620.tif 000019
2018531620.tif 000020
2018531620.tif 000021
2018531620.tif 000022
2018531620.tif 000023