(57)【要約】  本発明は、融合タンパク質を作製する方法を提供するものであって、該方法は、ａ）第１のタンパク質と第２のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第１のタンパク質および該第２のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、該ペプチドリンカーは、反応することによって、該第１のタンパク質を該第２のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、ｂ）前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第３のタンパク質は、（ａ）の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第３のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって、（ａ）において用いられる該ペプチドリンカー対は、（ｂ）において用いられる前記ペプチドリンカー対に対して直交している、方法である。また、ペプチドリンカー、および融合タンパク質合成における該リンカーの直交した対の使用も提供する。また、該リンカーを含む組み換えタンパク質、該タンパク質及びリンカーをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、ならびに該ベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞も検討される。
2018521640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
ａ）第１のタンパク質と第２のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第１のタンパク質および該第２のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第１のタンパク質を該第２のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
ｂ）前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第３のタンパク質は、（ａ）の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第３のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって、
（ａ）において用いられる該ペプチドリンカー対は、（ｂ）において用いられる前記ペプチドリンカー対に対して直交している、方法。
【請求項２】
融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
ａ）第１のペプチドリンカーを含む第１のタンパク質を提供することと、
ｂ）該第１のタンパク質と、第２のペプチドリンカーおよび第３のペプチドリンカーを含む第２のタンパク質とを、該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとの間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第１のタンパク質と該第２のタンパク質とを結合することと、
ｃ）該結合された第１のタンパク質および第２のタンパク質と、第４のペプチドリンカーを含む第３のタンパク質とを、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第２のタンパク質と該第３のタンパク質とを結合して融合タンパク質を形成することと、を含む、方法であって、
該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとが、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、前記融合タンパク質を伸長させるステップをさらに含み、前記融合タンパク質に結合される前記新規タンパク質は、前記融合タンパク質中で先にイソペプチド結合を形成するのに用いられた前記ペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対の一部を成すペプチドリンカーを含み、前記新規タンパク質のペプチドリンカーは、前記融合タンパク質中のタンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる、方法であり、該方法は、該新規タンパク質と該融合タンパク質とを、該新規タンパク質が前記融合タンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、分岐構造、直鎖構造、または環状構造を有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、環状化可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、自発的である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、前記反応に添加された成分によって誘導される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドリンカー対は、それぞれイソペプチドタンパク質由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドリンカー対は、それぞれ異なるイソペプチドタンパク質由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イソペプチドタンパク質は、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導する前記成分は、ペプチドリガーゼであり、好ましくは、該ペプチドリガーゼは、前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドリガーゼは、イソペプチドタンパク質由来であり、好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、イソペプチド結合の形成を誘導する前記ペプチドリンカー対と同じイソペプチドタンパク質由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーの１つ以上が、ブロッキング基を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブロッキング基は、同系ペプチドリンカー対の間におけるイソペプチド結合の形成を防ぐ、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドリンカー対の各ペプチドリンカーは、アミノ酸を少なくとも６個含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
各対の一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を６〜５０個含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を５０〜３００個含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各対の一方のペプチドリンカーは、リジン残基を含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アスパラギン残基またはアスパラギン酸残基を含み、これらの残基は、イソペプチド結合の形成に関わる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドリガーゼは、アミノ酸を５０〜３００個含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記直交したペプチドリンカー対は、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５５位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、９４位にスレオニン残基を含み、１００位にグリシン残基を含み、１０６位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（３）配列番号９に示すアミノ酸配列、または配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（４）配列番号１０９に示すアミノ酸配列、または配列番号１０９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１１位にグリシン残基を含み、場合によっては２０位にイソロイシン残基を含み、２１位および２２位にプロリン残基を含み、２３位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（５）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、７位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５６位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１０位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（６）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、７位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号３３に示すアミノ酸配列、または配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および、
（７）配列番号１７に示すアミノ酸配列、または配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１１位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、２４１位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１６２位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
のいずれか１つから選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記直交したペプチドリンカー対は、（１）および（４）、（１）および（５）、（１）および（６）、（１）および（３）、（１）および（２）、（２）および（５）、（２）および（６）、（３）および（５）、（３）および（６）、（４）および（５）、または（４）および（６）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、固相上で行われる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記融合タンパク質を、前記固相から溶出させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含む、配列、
（ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５５位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、９４位にスレオニン残基を含み、１００位にグリシン残基を含み、１０６位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
（ｉｉｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、
（ｉｖ）配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列、
（ｖ）配列番号９に示すアミノ酸配列、または配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列であって、好ましくは、配列番号１０９に示すアミノ酸配列、または配列番号１０９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１１位にグリシン残基を含み、場合によっては２０位にイソロイシン残基を含み、２１位および２２位にプロリン残基を含み、２３位にリジン残基を含む、配列、あるいは、
（ｖｉ）配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカー。
【請求項２４】
（ａ）前記（ｉ）のペプチドリンカーは、配列番号３８に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、
（ｂ）前記（ｉｉ）のペプチドリンカーは、配列番号３９に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、
（ｃ）前記（ｉｉｉ）のペプチドリンカーは、配列番号４２に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、
（ｄ）前記（ｉｖ）のペプチドリンカーは、配列番号４３に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、
（ｅ）前記（ｖ）のペプチドリンカーは、配列番号４６に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、
（ｆ）前記（ｖｉ）のペプチドリンカーは、配列番号４７に示すアミノ酸配列を有する、
請求項２３に記載のペプチドリンカー。
【請求項２５】
請求項２３の（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｉ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項２６】
請求項２３の（ｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｉｉ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項２７】
請求項２３の（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｉｉｉ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項２８】
請求項２３の（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｉｖ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項２９】
請求項２３の（ｖｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｖ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項３０】
請求項２３の（ｖ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができ、好ましくは、配列番号９または配列番号１０９に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる、請求項２３の（ｖｉ）に記載のペプチドリンカー。
【請求項３１】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法で用いるペプチドリンカー対であって、該ペプチドリンカー対は、
（１）請求項２３の（ｉ）に記載のペプチドリンカーおよび請求項２３の（ｉｉ）に記載のペプチドリンカー、
（２）請求項２３の（ｉｉｉ）に記載のペプチドリンカーおよび請求項２３の（ｉｖ）に記載のペプチドリンカー、または
（３）請求項２３の（ｖ）に記載のペプチドリンカーおよび請求項２３の（ｖｉ）に記載のペプチドリンカー、
を含む、ペプチドリンカー対。
【請求項３２】
ポリペプチドおよび請求項２３〜３０のいずれか１項に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、配列番号５０〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列、または配列番号５０〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有し、該ポリペプチドは、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載のペプチドリンカーを含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
請求項２３〜３０のいずれか１項に記載のペプチドリンカーまたは請求項３２または３３に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３５】
前記核酸分子は、配列番号３、４、７、８、１１、１２、４０、４１、４４、４５、４８、４９、もしくは６０〜６９に示すヌクレオチド配列、または配列番号３、４、７、８、１１、１２、４０、４１、４４、４５、４８、４９、もしくは６０〜６９に示す配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の核酸分子および／またはベクターを含有する、組み換え宿主細胞。
【請求項３８】
（ａ）請求項２３の（ｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｖ）、または請求項２５、２７もしくは２９のいずれか１項に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および
（ｂ）請求項２３の（ｉｉ）、（ｉｖ）、もしくは（ｖｉ）、または請求項２６、２８もしくは３０のいずれか１項に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および／または、
（ｃ）請求項２３の（ｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｖ）、または請求項２５、２７もしくは２９のいずれか１項に記載のペプチドリンカーをコードする核酸分子、および／または、
（ｄ）請求項２３の（ｉｉ）、（ｉｖ）、もしくは（ｖｉ）、または請求項２６、２８もしくは３０のいずれか１項に記載のペプチドリンカーもしくはポリペプチドリンカーをコードする核酸分子、
を含むキットであって、
場合によっては、前記（ａ）および／または（ｂ）の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのペプチドリンカーに対して直交しているペプチドリンカー対の一部である、さらなるペプチドリンカーを含む、キット。
【請求項３９】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質。
【請求項４０】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも１つ含む、固体基質。
【請求項４１】
前記基質は、アレイである、請求項４０に記載の固体基質。
【請求項４２】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも２つ含む、融合タンパク質のライブラリ。
【請求項４３】
融合タンパク質を作製するための、少なくとも２つの直交したペプチドリンカー対の使用であって、各ペプチドリンカー対は、反応してイソペプチド結合を形成する、使用。
【請求項４４】
前記融合タンパク質、イソペプチド結合、ペプチドリンカー、およびペプチドリガーゼは、請求項１〜３１のいずれか１項に記載されたものである、請求項４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質（すなわち、以下で述べるような、２つ以上のタンパク質が共有結合してなるポリマー）の合成（すなわち、作製、生成、または組み立て）に関し、特に、互いに反応してイソペプチド結合を形成するペプチドリンカーの直交した対（orthogonal pairs）を用いるモジュール方式の（例えば、段階的な）融合タンパク質の合成に関する。本発明は、融合タンパク質を合成する新規の方法、特に固相合成法の提供に関する。有利なことに、例えば融合タンパク質アレイなどの融合タンパク質を含む様々な製品の作製に、本方法を用いることができる。また、本発明は、ペプチドリンカー、および融合タンパク質合成における該リンカーの直交した対の使用を提供する。また、該リンカーを含む組み換えタンパク質、該タンパク質及びリンカーをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、ならびに該ベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞も提供する。また、該組み換えポリペプチドおよび／または核酸分子／ベクターを含むキットも提供する。また、本発明の方法によって得られる融合タンパク質、およびアレイ、ライブラリなどの該融合タンパク質を含む製品も検討される。
【背景技術】
【０００２】
生物学的事象は、通常、複数のタンパク質の共同的な作用に依存しており、複合体におけるタンパク質の正確な配置が、その機能を左右したり、また決定したりする。したがって、制御された様式で個々のタンパク質を複合体中に配置できると、これは、タンパク質の機能を特徴付けるのに有用な手段となる。また、複数のタンパク質を連結していわゆる「融合タンパク質」を形成することによって、有用な特性を有する分子を得ることができる。例えば、ワクチン上の繰り返し抗原構造のように、１種類のタンパク質をクラスター化すると、多くの場合、生体信号が大きく増強される。また、異なる活性を有するタンパク質をクラスター化することによっても、酵素による基質チャネリングなどの活性が向上した複合体を得ることができる。
【０００３】
しかしながら、異なる種類のタンパク質をクラスター化してある特定の人工的「融合タンパク質」とすることは、非常に多くの問題に直面している。例えば、個々のタンパク質またはタンパク質ドメインを遺伝子的に接続して、１本の長い読み枠（open reading frame）とすることができるが、タンパク質合成におけるエラーおよび誤った折り畳みが、ただちに限定要因となる。別の方法では、タンパク質またはタンパク質ドメインを個別に発現した後、これらの「モジュール」または「ユニット」を結合することに焦点を当てている。例えば、ある方法では、ビオチン／アビジンなどの十分に特徴付けられた相互作用パートナーを含有するようにタンパク質を改変し、これによって、非共有結合的相互作用によるタンパク質の複合体形成を可能にすることに焦点を当てている。他の方法は、タンパク質内の反応性基、特にシステイン残基に依拠し、共有結合、すなわちジスルフィド結合によってタンパク質を結合している。しかしながら、最良の非共有結合または可逆的な共有結合であっても、融合タンパク質は転位し得る。したがって、既存の方法は、分離することが困難な融合タンパク質および／または還元条件などの様々な環境において不安定である融合タンパク質を含む不定混合物を生じる限りに、制限される。
【０００４】
融合タンパク質を合成するシステムの重要な特徴としては、該融合タンパク質内の個々のタンパク質（すなわち、モジュール、ドメイン、またはユニット）間の分子的に定義された結合や、あらゆる鋳型に対する非依存性、各タンパク質（すなわち、モジュール、ドメイン、またはユニット）の発現の容易さなどが挙げられる。一般的には混合物内の不完全鎖に起因する異種産物の想定外の合成を、わずか数段階で最小化するためには、各反応において収量がほぼ定量的であることも非常に望ましい。また、融合タンパク質内の各モジュールの機能に対する妨害を最小限にするために、個々のモジュールは、大きなタンパク質融合ドメインではなく比較的小さなペプチドタグを用いて改変されることも好ましい。しかしながら、これらの基準を満たすことができる既存の融合タンパク質合成法はなかった。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、改良された融合タンパク質合成法が必要とされ、また望まれており、モジュール方式（例えば、段階的）で高収率な融合タンパク質合成法に、イソペプチド結合を形成して不可逆的な共有結合を生じるペプチドリンカーを用いることができることが見出されている。
【０００６】
イソペプチド結合は、カルボキシル基／カルボキサミド基とアミノ基との間に形成されるアミド結合であり、カルボキシル基またはアミノ基のうちの少なくとも一方は、タンパク質主鎖（タンパク質骨格）外に存在する。このような結合は、生物学的条件化において化学的に不可逆であり、たいていのプロテアーゼに対して抵抗性を有している。実際のところ、タンパク質間のイソペプチド結合は、測定された中で最も強いタンパク質相互作用であることが確認されている。
【０００７】
例えば、トランスグルタミナーゼなどの酵素による酵素触媒作用によって、イソペプチド結合を形成することができる。一般的に、イソペプチド結合は、例えば、細胞外マトリクス構造の安定化または血栓の補強など、自然環境においてタンパク質複合体の強度および／または安定性を向上させていることが見出されている。
【０００８】
イソペプチド結合は、ＨＫ９７バクテリオファージのキャプシド形成およびグラム陽性細菌の線毛において同定されているように、自発的に生じる場合もある。自発的なイソペプチド結合は、近傍のグルタミン酸またはアスパラギン酸によって促進される、アスパラギンまたはアスパラギン酸のＣγ基に対するリジンのε−アミノ基の求核攻撃によって、タンパク質が折り畳まれた後で形成されるということが提案されている。
【０００９】
自発的にイソペプチド結合を形成することができるタンパク質は、互いに共有結合しそれによって不可逆的に相互作用するペプチドタグ／結合パートナー対の開発に、有利に用いられている（参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１１／０９８７７２などを参照）。この場合、自発的にイソペプチド結合を形成することができるタンパク質は、個別の断片として発現されてペプチドタグおよびペプチドタグの結合パートナーを生じ得、２つの断片は、イソペプチド結合の形成によって共有結合的に再構成することができる。ペプチドタグと結合パートナーとの対によって形成されるイソペプチド結合は、非共有結合的な相互作用であればすぐに解離するような条件下、例えば、長期間（数週間など）にわたる高温（９５℃以上など）高圧という条件下や、または厳しい化学処理（例えば、ｐＨ２〜１１、有機溶媒、界面活性剤、または変性剤など）が行われる条件下において、安定である。
【００１０】
要するに、ペプチドタグ／結合パートナー対は、自発的にイソペプチド結合を形成することができるタンパク質（イソペプチドタンパク質）であれば、どのタンパク質に由来するものであってもよく、タンパク質ドメインは個別に発現されて、イソペプチド結合に含まれる一方の残基（リジンなど）を含むペプチドタグと、イソペプチド結合に含まれるもう一方の残基（アスパラギンまたはアスパラギン酸など）を含むペプチド結合パートナーとを生じる。場合によっては、ペプチドタグまたは結合パートナーのうちの一方が、イソペプチド結合を形成するのに必要な他の残基（グルタミン酸など）を１つ以上含む。しかしながら、イソペプチド結合の形成に関わる残基を含むドメインを、個別に、すなわち別々の３つのペプチド（ドメイン、モジュール、またはユニット）として、発現することができるということが見出されている。この場合、ペプチドタグは、イソペプチド結合に含まれる一方の残基（リジンなど）を含み、ペプチド結合パートナーは、イソペプチド結合に含まれるもう一方の残基（アスパラギンまたはアスパラギン酸など）を含み、第３のペプチドは、イソペプチド結合の形成に関わる他の残基（グルタミン酸など）を１つ以上含む。３つのペプチドをすべて混合することによって、反応してイソペプチド結合を形成する残基を含む２つのペプチド間、すなわちペプチドタグと結合パートナーとの間にイソペプチド結合が形成される。したがって、第３のペプチドは、ペプチドタグと結合パートナーとの連結を媒介するが、得られる構造の一部を成すことはない。すなわち、第３のペプチドは、ペプチドタグまたは結合パートナーと共有結合することはない。したがって、第３のペプチドを、タンパク質リガーゼまたはペプチドリガーゼと見なし得る。これは、対象のタンパク質と融合させる必要のあるペプチドタグおよび結合パートナーのサイズを最小化し、それによって、ペプチドタグまたは結合パートナーの追加に起因する望まない相互作用、例えば誤った折り畳みなどが起こる可能性を減少させるので、特に有用である。
【００１１】
以下でより詳細に説明するように、イソペプチド結合を自発的に１つ以上形成することができる各種タンパク質（いわゆる「イソペプチドタンパク質」）が同定されており、上述したように、これらを改変して、ペプチドタグ／結合パートナー対および場合によってはペプチドリガーゼを作製し得る。イソペプチド結合を自発的に１つ以上形成することが知られているタンパク質の構造との構造比較によって、イソペプチド結合を自発的に１つ以上形成することができるタンパク質が、さらに同定され得る。特に、例えば主要なピリンタンパク質であるＳｐｙ０１２８などの公知のイソペプチドタンパク質の結晶構造との結晶構造比較によって、とりわけ、イソペプチドタンパク質の形成に関わっていることが多いＬｙｓ−Ａｓｎ／Ａｓｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ残基の比較によって、イソペプチド結合を自発的に形成することができる他のタンパク質が同定され得る。さらに、標準的なデータベース検索手段を使用するタンパク質構造データバンク（Protein Data Bank）を用い、公知のイソペプチドタンパク質の構造類似体をスクリーニングすることによって、他のイソペプチドタンパク質が同定され得る。ＳＰＡＳＭサーバ（http://eds.bmc.uu.se/eds/spana.php?spasm）を用いて、イソペプチド結合のＬｙｓ−Ａｓｎ／Ａｓｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐの三次元構造の鋳型を標的としてもよいし、配列相同性のみからイソペプチドタンパク質が同定されてもよい。
【００１２】
特に、ＷＯ２０１１／０９８７７２（参照により本明細書に援用される）に説明されているように、イソペプチド結合を形成するタンパク質を新規に設計してもよい。ロゼッタ（Rosetta）を用いてイソペプチドタンパク質を新規に設計することができ、このソフトウェアは、http://depts.washington.edu/ventures/UW Technology/Express Licenses/rosetta.phpで見ることができる（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒｏｓｅｔｔａ， Ｄａｓ．Ｒ， Ｂａｋｅｒ．Ｄ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，７７，３６３〜８２も参照）。さらに、http://biodev.extra.cea.fr/rasmot3d/においてＲＡＳＭＯＴ−３Ｄ ＰＲＯサーバを用いて、残基の適切な向きについてタンパク質データベースを検索することができる。
【００１３】
有利なことに、本件の発明者らは、このようなペプチドタグ／結合パートナー対をペプチドリンカーとして用いて、複数のタンパク質を共有結合的に結合し得ること、すなわち融合タンパク質を作製し得ることを確認している。特に、発明者らは、ペプチドタグ／結合パートナーペプチドの直交した（すなわち、互いに反応しない、または同系（cognate）でない）対を、２つ以上のタンパク質を融合（例えば、連結や結合）するために、すなわち融合タンパク質を作製（合成、構築、組み立て）するために、利用することを実証している。下記実施例において詳細に説明するように、本発明の方法および使用は、一連のイソペプチド結合形成に基づいてタンパク質を結合して鎖状にするための、モジュール方式（例えば、段階的）で高収率な方法を提供する。特に、本明細書で説明される方法および使用によって、統計的混合状態を生じることなく、制御された（すなわち、特定の、標的とする）タンパク質鎖の伸長が可能となる。不可逆的な結合、すなわちイソペプチド結合によって各タンパク質ユニット（モジュール、ドメイン）が結合されている融合タンパク質を生じるので、従来の方法よりもとりわけ有利である。このように、結合が、システイン残基の反応に依存していないので、遊離システイン残基および／またはジスルフィド結合を含有するタンパク質にも適用可能である。さらに、鎖中に含有させる各タンパク質ユニットは、２つの小さなペプチドタグで改変するだけでよく、タンパク質中の様々な位置、すなわちタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部部位に、これらのペプチドタグを組み入れることができる。したがって、融合タンパク質の各タンパク質ユニットは、遺伝子的に完全にコードされていてもよく、すなわち、本方法は、非天然（すなわち標準的でない）アミノ酸の使用や、またはアミノ酸残基の翻訳後修飾に依存するものではない。このように、本発明は、非常に特異的で、中間体を精製する必要のない、融合タンパク質合成のための容易で大規模に実現可能な方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法の代表例を図１に示す。図１は、本発明の固相法の実施形態を示している。しかしながら、これは、本発明の範囲を限定することを意図するものでは一切なく、下記説明から、他の各種変更が当業者には明らかであり、これらの変更は、添付の特許請求の範囲で規定される通り、本発明に包含されることが意図される。
【００１５】
図１は、スパイタグ（SpyTag）／スパイキャッチャー（SpyCatcher）およびスヌープタグ（SnoopTag）／スヌープキャッチャー（Snoop Catcher）という名称の２対のペプチドリンカーを示し、ここで、各対、すなわち各「タグ」および「キャッチャー」は、特異的かつ自発的に反応してイソペプチド結合を形成し、それによって「タグ」ペプチドを「キャッチャー」ペプチドに結合する。この場合、各対は互いに直交しているが、これは互いに反応しないという意味であり、すなわち、スパイタグおよびスパイキャッチャーは、スヌープキャッチャーまたはスヌープタグのいずれとも、反応してイソペプチド結合を形成することはできない。以下でより詳細に説明するように、いくつかの実施形態において、「タグ」をペプチドタグと見なしてもよく、「キャッチャー」ペプチドを結合パートナータンパク質と見なしてもよい。
【００１６】
このように、ステップ１においては、第１のタンパク質であるＭＢＰｘ（マルトース結合タンパク質の改変体であり、以下で説明する）が提供され、ここでは、本タンパク質は、例えば、単一の読み枠におけるＭＢＰｘポリペプチドおよびスパイキャッチャーペプチドリンカーをコードする核酸分子の組み替え発現によって改変され、ペプチドリンカーであるスパイキャッチャー（すなわち、第１のペプチドリンカー対の第１の構成要素）を組み込んでいる。本代表例においては、伸長した融合タンパク質を固相（アミロース樹脂）に固定することができる精製用タグまたは固定用タグとして、ＭＢＰｘタンパク質を用いている。しかしながら、これが本発明に必須の特徴ではないことは、下記議論から明らかであろう。例えば、本方法は、不均一系（すなわち固相）であってもよいし、均一系（すなわち溶液中）であってもよい。不均一系の場合は、適切な精製用／固定用タグが用いられればよく、すなわち、タグがタンパク質タグまたはペプチドタグであることは必須ではない。
【００１７】
ステップ２においては、第１のタンパク質（ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー）を、２つのペプチドリンカーを組み込むように改変された第２のタンパク質（Ａ）と接触させる。一方のペプチドリンカーは、第１のリンカー対の第２の構成要素（スパイタグ）であり、その第１の構成要素(スパイキャッチャー)は、第１のタンパク質のドメインを形成している。もう一方のペプチドリンカーは、第２のペプチドリンカー対の第１の構成要素（スヌープタグ）である。上述したように、第２のリンカー対は、第１のリンカー対とは反応しない。したがって、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させると、第１のリンカー対が（例えば自発的に）反応して、スパイキャッチャーペプチドリンカーとスパイタグペプチドリンカーとの間に特異的なイソペプチド結合を形成し、それによって、第１のタンパク質（ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー）と第２のタンパク質（スパイタグ−Ａ−スヌープタグ）を結合して融合タンパク質を形成する。
【００１８】
ステップ３においては、融合タンパク質（ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー−スパイタグ−Ａ−スヌープタグ）を、スヌープキャッチャーおよびスパイキャッチャーという２つのペプチドリンカーを含むさらなるタンパク質と接触させる。このように、一方のペプチドリンカー（スヌープキャッチャー）は、第２のペプチドリンカー対の第２の構成要素であり、もう一方のペプチドリンカー（スパイキャッチャー）は、第１のペプチドリンカー対に由来するものである。これらのペプチドリンカーは、例えばペプチドスペーサーなどのスペーサーを介して結合されていてもよいし、最終的な融合タンパク質に組み込まれるタンパク質を介して結合されていてもよい。融合タンパク質（ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー−スパイタグ−Ａ−スヌープタグ）を、さらなるタンパク質（スヌープキャッチャー−スパイキャッチャー）と接触させると、第２のリンカー対が（例えば自発的に）反応してイソペプチド結合を形成し、それによって、融合タンパク質を伸長させる。別の見方をすると、スヌープキャッチャー−スパイキャッチャータンパク質の追加、すなわち融合タンパク質への反応基（反応性ペプチドリンカー）の追加は、さらなる伸長のための融合タンパク質の機能化または活性化と見なされ得る。
【００１９】
ステップ４においては、ステップ３で得た伸長後の融合タンパク質（ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー−スパイタグ−Ａ−スヌープタグ−スヌープキャッチャー−スパイキャッチャー）を、Ａタンパク質に類似した２つのペプチドリンカーを組み込んださらなるタンパク質（Ｂ）と接触させる（スパイタグ−Ｂ−スヌープタグ）。そしてまた、イソペプチド結合が、互いに反応することができるペプチドリンカー間、すなわちスパイキャッチャーおよびスパイタグの第１の対の間に形成されて、融合タンパク質をさらに伸長させる。
【００２０】
所望の融合タンパク質のタンパク質ユニットがすべて結合するまで、このプロセスを繰り返し得ることは、明らかであろう。例えばマルトースを用いて、融合タンパク質を固相から容易に溶出させて、さらなる精製を行わずに用いることができる。なお、融合タンパク質の末端タンパク質は、ペプチドリンカーを１つだけ組み込むように改変される必要があり、このペプチドリンカーは、融合タンパク質の中で、最後から２番目のタンパク質ユニットなどのタンパク質中の遊離ペプチドリンカーと反応することができる。実施例で述べるように、発明者らは、１０個のタンパク質ユニットを含有する融合タンパク質の合成を例示しており、この融合タンパク質について、ゲル電気泳動および質量分析によって検証を行った。
【００２１】
理論に拘束されることを望むものではないが、例えばスヌープタグ／スヌープキャッチャーやスパイタグ／スパイキャッチャーなどのペプチドリンカーにおけるアミノ酸残基の向きが正確であれば、求核攻撃およびペプチドリンカー間での不可逆的イソペプチド結合の形成が促進される。上記したように、これらの各対において、リジンが、アスパラギン酸またはアスパラギンのいずれかと反応する。スパイタグペプチドは、反応性アスパラギン酸を有しているため、スヌープキャッチャーの反応性アスパラギンとは反応することはできない。スヌープタグペプチドは、反応性リジンを有しているため、スパイキャッチャーの反応性リジンと反応することはできない。したがって、これらの２つのペプチドリンカー対は互いに直交しており、本発明の方法において、直交したペプチドリンカー対を用いて融合タンパク質を生成させることができたということは、明らかであろう。この場合、強固でプログラム可能な融合タンパク質を生成することができるのは、ペプチドリンカー対の直交性、つまり互いに反応しない性質のためである。特に、伸長する融合タンパク質鎖を固相に付着させた場合は、反応モジュール（すなわち、融合タンパク質に次に追加されるタンパク質）を過剰に加え、それによって反応を完了へと進めることができる。このことは、未反応の構成要素を容易に洗い流すことができるために、各ステップにおいて分離（すなわち、伸長する融合タンパク質の、未反応成分からの分離）が不要であるということを意味している。このように、一度に１ステップずつ伸長させることによって、わずかな直交的結合を利用して鎖を伸長させることが可能になる。したがって、本発明の発明者らが開発した方法は、特に融合タンパク質産物の安定性および個々の反応ステップの容易さということに関して、前述のタンパク質連結方法よりも優れている。
【００２２】
したがって、最も広義には、本発明は、融合タンパク質を作製するのに少なくとも２つの直交したペプチドリンカー対を用いることと見なされ得、各ペプチドリンカー対が反応して、イソペプチド結合を形成する。
【００２３】
特に、各ペプチドリンカー対のペプチドリンカーが、互いに反応してイソペプチド結合を形成する。上記したように、各ペプチドリンカーは、融合タンパク質のユニット（ドメインまたはモジュールなど）を形成するタンパク質の一部（ドメインなど）を成す。換言すると、互いに結合されるタンパク質は、ペプチドリンカーを少なくとも１つ（例えば、ペプチドリンカーを２つ、３つ、または４つ）組み込むように改変されていてもよく、融合タンパク質を作製するのに用いられる各ペプチドリンカー対は、該融合タンパク質を作製するのに用いられる少なくとも１つの他のペプチドリンカー対に対して直交している。
【００２４】
このように、いくつかの実施形態においては、タンパク質ユニット（ドメインまたはモジュールなど）を少なくとも２つ含有する融合タンパク質を作製するのに、ペプチドリンカーの直交した対が用いられる。例えば、図１に示す代表的な実施形態においては、タンパク質Ａをタンパク質Ｂに連結するのに用いられるタンパク質を、リンカーユニットと見なし得、すなわち、リンカーユニット（リンカータンパク質）は、ただタンパク質Ａをタンパク質Ｂに連結するためだけに機能している。したがって、融合タンパク質を、機能性タンパク質、すなわちリンカーとしての機能以外の機能を有するタンパク質を少なくとも２つ含有する、または含むものと見なし得る。他の実施形態においては、融合タンパク質を、タンパク質を少なくとも３つ（すなわち、その機能に関係なく）含有する、または含むものと見なし得る。
【００２５】
さらなる実施形態においては、融合タンパク質を、機能性タンパク質を少なくとも３つ含有する、または含むものと見なし得る。例えば、図１に示す代表的な実施形態を参照すると、タンパク質Ａをタンパク質Ｂに連結するのに用いられるリンカータンパク質が、ペプチドリンカーに加えてタンパク質（機能性タンパク質など）を含有している場合は、融合タンパク質のタンパク質ユニット（ドメインまたはモジュール）と見なし得る。したがって、融合タンパク質を、機能性タンパク質、すなわちリンカー以外の機能を有するかまたはリンカーの機能に加えてさらに機能を有するタンパク質を少なくとも３つ含有する、または含むものと見なし得る。
【００２６】
別の見方をすると、本発明は、融合タンパク質を作製する（例えば、生成する、合成する、または組み立てる）方法を提供し、該方法は、
ａ）第１のタンパク質と第２のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第１のタンパク質および該第２のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、（互いに）反応することによって、該第１のタンパク質を該第２のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
ｂ）前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第３のタンパク質は、（ａ）の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、（互いに）反応することによって、該第３のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって、
（ａ）の、または（ａ）において用いられる該ペプチドリンカー対は、（ｂ）の、または（ｂ）において用いられる前記ペプチドリンカー対に対して直交している、方法である。
【００２７】
さらに別の見方をすると、本発明は、融合タンパク質を作製する（例えば、生成する、合成する、または組み立てる）方法を提供し、該方法は、
ａ）第１のペプチドリンカーを含む第１のタンパク質を提供することと、
ｂ）該第１のタンパク質と、第２のペプチドリンカーおよび第３のペプチドリンカーを含む第２のタンパク質とを、該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとの間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第１のタンパク質と該第２のタンパク質とを結合することと、
ｃ）該結合された第１のタンパク質および第２のタンパク質と、第４のペプチドリンカーを含む第３のタンパク質とを、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第２のタンパク質と該第３のタンパク質とを結合して融合タンパク質を形成することと、を含む、方法であって、
該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとが、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対である、方法である。
【００２８】
上記の通り、いくつかの実施形態においては、第２のタンパク質は、第１のタンパク質と第３のタンパク質との間のリンカーとして機能し得る。したがって、融合タンパク質を、「機能性」タンパク質、すなわち２つのタンパク質ユニット（モジュール、ドメインなど）を結合する機能以外の機能を有するタンパク質を、２つ含むものと見なし得る。このように、いくつかの実施形態においては、第２のタンパク質を、リンカータンパク質、すなわち、ペプチドリンカーの直交した異なる対由来のペプチドリンカーを少なくとも２つと、場合によってはペプチドスペーサーなどのスペーサードメインとを含有するタンパク質と見なし得る。
【００２９】
このように、いくつかの実施形態においては、第２のタンパク質を、該第１のタンパク質が該第３のタンパク質に結合（連結）することができるように、第１のタンパク質を機能化または活性化するリンカータンパク質と見なし得る。同様に、融合タンパク質にさらなるタンパク質を追加する場合（すなわち、融合タンパク質を伸長させる場合）、リンカータンパク質を用いて融合タンパク質中の１つ以上のタンパク質を機能化または活性化し、該１つ以上のタンパク質が該さらなるタンパク質に結合できるようにし得る。
【００３０】
上述したように、直交したペプチドリンカー対を使用することによって、多くのタンパク質ユニットを含有する融合タンパク質を作製するのが容易になる。したがって、融合タンパク質と、融合タンパク質中のタンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーを少なくとも１つ含むさらなるタンパク質とを接触させることによって、さらなるタンパク質を融合タンパク質に追加し得る（すなわち、融合タンパク質が伸長（例えば、延長、拡張）され得る）。この場合、新規タンパク質のペプチドリンカーは、融合タンパク質中で先にイソペプチド結合を形成するのに用いられたペプチドリンカー対に対して直交している。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態においては、本方法は、前記融合タンパク質を伸長させるステップをさらに含み、前記融合タンパク質に結合される前記新規タンパク質（すなわち、追加のタンパク質またはさらなるタンパク質）は、融合タンパク質中で先にイソペプチド結合を形成するのに用いられたペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対の一部を成すペプチドリンカーを含み、前記新規タンパク質のペプチドリンカーは、前記融合タンパク質中のタンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる、方法であり、該方法は、該新規タンパク質と該融合タンパク質とを、該新規タンパク質（特に、該新規タンパク質のペプチドリンカー）が前記融合タンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることを含む。
【００３２】
このように、いくつかの実施形態においては、前記第３のタンパク質を、追加のタンパク質または新規のタンパク質などの、融合タンパク質に追加される「さらなる」タンパク質と見なし得る。したがって、融合タンパク質を伸長させることを、上記方法のステップ（ｃ）を繰り返すことと見なし得、前記さらなるタンパク質のペプチドリンカーは、先に融合タンパク質に追加されたタンパク質を接続するのに用いられたペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対である。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、融合タンパク質に追加される前記新規タンパク質（すなわち、さらなるタンパク質または追加のタンパク質）は、少なくとも第２のペプチドリンカーを（例えば、融合タンパク質鎖をさらに伸長させるために）含む。したがって、前記第２のペプチドリンカー（および前記新規タンパク質のさらなるペプチドリンカー）は、前記融合タンパク質と前記新規タンパク質とを結合（連結）するのに用いられたペプチドリンカー対に対して直交している。
【００３４】
したがって、またさらなる実施形態においては、該融合タンパク質を作製する方法は、該融合タンパク質を伸長させるステップを含んでいてもよく、ここで該第３のタンパク質は、第５のペプチドリンカーを含んでおり、また、該方法は、該融合タンパク質と、第６のペプチドリンカーを含む第４のタンパク質とを、該第５のペプチドリンカーと該第６のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成し、それによって該第３のタンパク質と該第４のタンパク質とを結合して該融合タンパク質を伸長させる条件下で接触させるステップを含む、方法であって、該第５のペプチドリンカーと第６のペプチドリンカーとが、該第３のペプチドリンカーと第４のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対を形成する、方法である。
【００３５】
図１に示すように、直交したペプチドリンカー対を２つ用いることによって、複数のタンパク質ユニット（例えば、３つ以上のタンパク質ユニットであって、例えば４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個またはそれ以上のタンパク質ユニットであり、例えば、１２個、１５個、２０個またはそれ以上のタンパク質ユニットである）を含む融合タンパク質を生成することができる。したがって、いくつかの実施形態においては、前記第５のペプチドリンカーと第６のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対は、前記第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対と同一である。
【００３６】
したがって、またさらなる実施形態においては、融合タンパク質はさらに伸長されてもよく、ここで該第４のタンパク質は、第７のペプチドリンカーを含んでおり、また、該方法は、該融合タンパク質と、第８のペプチドリンカーを含む第５のタンパク質とを、該第７のペプチドリンカーと該第８のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成し、それによって該第４のタンパク質と該第５のタンパク質とを結合して該融合タンパク質を伸長させる条件下で接触させるステップを含む、方法であって、該第７のペプチドリンカーと第８のペプチドリンカーとが、該第５のペプチドリンカーと第６のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対を形成する、方法である。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、前記第７のペプチドリンカーと第８のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対は、前記第３のペプチドリンカーと第４のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対と同一である。
【００３８】
上述のステップを繰り返すことによって、前記融合タンパク質鎖が伸長され得ることは明らかであり、例えば、前記第５のタンパク質は、第９のペプチドリンカーを含み、第６のタンパク質は、第１０のペプチドリンカーを含み、該第９のペプチドリンカーと第１０のペプチドリンカーとが、該第７のペプチドリンカーと第８のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対を形成する。いくつかの実施形態においては、前記第９のペプチドリンカーと第１０のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対は、前記第１のペプチドリンカーと第３のペプチドリンカー、および／または該第５のペプチドリンカーと第６のペプチドリンカーとからなる前記ペプチドリンカー対と同一である。
【００３９】
このように、いくつかの実施形態においては、少なくとも２つの直交したペプチドリンカー対を交互に用いることによってタンパク質を結合（連結）し、融合タンパク質を形成してもよい。別の見方をすると、融合タンパク質に追加される前記新規のタンパク質またはさらなるタンパク質は、先に融合タンパク質に追加されたタンパク質を結合するのに用いられたペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対の一部を成すペプチドリンカーを少なくとも１つ含む。
【００４０】
直交したペプチドリンカー対を２つ用いることによって、本発明を首尾よく行うことができる一方、本発明の方法および使用において、３つ以上の直交したペプチドリンカー対を利用し得ることは明らかであろう。したがって、上記の代表例に関して、いくつかの実施形態においては、第５のペプチドリンカーと第６のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対は、第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対とは違うものであり、好ましくは直交している。以下で述べるように、直交するペプチドリンカーの対を3つ以上用いることによって、例えば分岐構造のような複雑な融合タンパク質構造を作製することが可能となる。そこで、以下で詳しく述べるように、発明者らは、本発明のさらなる実施形態を形成する直交したペプチドリンカー対をいくつか開発した。
【００４１】
例えば、３つのタンパク質１、２、および３を含む融合タンパク質を、上述した方法にしたがって作製し得、ここで、タンパク質１はペプチドリンカーＡを含み、タンパク質２はペプチドリンカーＡ’およびペプチドリンカーＢを含み、タンパク質３はペプチドリンカーＢ’を含むものである。この場合、ペプチドリンカーＡおよびペプチドリンカーＡ’（ペプチドリンカー対）が反応してイソペプチド結合を形成し、ペプチドリンカーＢおよびペプチドリンカーＢ’（ペプチドリンカー対）が反応してイソペプチド結合を形成するものであり、ペプチドリンカー対Ａ／Ａ’およびペプチドリンカー対Ｂ／Ｂ’は直交している（すなわち、他方の対と反応してイソペプチド結合を形成することはない）。第３の直交したペプチドリンカー対を用いることによって、分岐構造を作製することが可能となる。例えば、タンパク質２は、第３のペプチドリンカーＣを含んでいてもよく、第４のタンパク質４が、ペプチドリンカーＣ’を含んでいてもよく、ここで、ＣおよびＣ’（ペプチドリンカー対）が反応してイソペプチド結合を形成し、ペプチドリンカーＡ／Ａ’、ペプチドリンカーＢ／Ｂ’、およびペプチドリンカーＣ／Ｃ’は直交している。ＣおよびＣ’がイソペプチド結合を形成することが可能な条件下で、融合タンパク質１−２−３をタンパク質４と接触させると、得られる融合タンパク質は、分岐する、すなわち１−２（−４）−３となる（図１３Ａ参照）。あるいは、ＢおよびＢ’がイソペプチド結合を形成することが可能な条件下で、融合タンパク質１−２−４をタンパク質３と接触させて、分岐融合タンパク質１−２（−４）−３を作製し得る。当業者であれば、直交するペプチドリンカーの対を３つ用いることによって、複雑な分岐構造を生成することができ、さらなる直交したペプチドリンカー対を用いることによって、分岐構造をさらに複雑なものにすることができるということが理解されるであろう。特に、直交したペプチドリンカー対を3つ以上用いると、非対称分岐構造を有利に生成することができる。
【００４２】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明の方法および使用において、直交したペプチドリンカー対を２つよりも多く、例えば直交したペプチドリンカー対を３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上用いる。
【００４３】
直交したペプチドリンカー対を２つ用いることによって、分岐が形成されてもよい。例えば、５つのタンパク質１〜５を含む分岐融合タンパク質を、タンパク質のうちの１つに追加のペプチドリンカーを含むことによって作製し得、例えば、タンパク質２が、２つの直交したペプチドリンカー対の４つのペプチドリンカーを含み得る。この代表的な実施形態においては、タンパク質１は、ペプチドリンカーＡを含み、タンパク質２は、ペプチドリンカーＡ’と３つのペプチドリンカーＢとを含む。タンパク質３、タンパク質４、およびタンパク質５は、それぞれペプチドリンカーＢ’を含み、ここで、ペプチドリンカーＡおよびペプチドリンカーＡ’（ペプチドリンカー対）は、反応してイソペプチド結合を形成し、ペプチドリンカーＢおよびペプチドリンカーＢ’（ペプチドリンカー対）は、反応してイソペプチド結合を形成するものであり、ペプチドリンカー対Ａ／Ａ’およびペプチドリンカー対Ｂ／Ｂ’は直交している。したがって、融合タンパク質１−２をタンパク質３〜５と接触させることによって、タンパク質３〜５がすべて、互いに独立してタンパク質２に接続された分岐融合タンパク質を得ることができる（図１３Ｂ参照）。タンパク質３〜５は、同じタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよいということは明らかであろう。さらに、タンパク質３〜５のうちの１つ以上が、直交したペプチドリンカー対のペプチドリンカーをさらに含むことによって、融合タンパク質の各分岐を伸長させる（例えば、別々に独立して伸長させる）ことが容易になる。
【００４４】
このように、いくつかの実施形態においては、融合タンパク質は分岐していてもよい。他の実施形態においては、融合タンパク質は直鎖状であってもよい。いくつかの実施形態においては、例えば、直交したペプチドリンカー対を３つ以上用いる場合は、融合タンパク質は非対称な分岐を含んでいてもよく、すなわち、融合タンパク質は非対称な構造を有していてもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、本発明は、分岐融合タンパク質を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明は、直鎖融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００４５】
「分岐」なる語は、２つ以上のタンパク質ユニットが、融合タンパク質の同じ内部タンパク質ユニット（非末端タンパク質ユニット）に、互いに独立して、すなわち独立して（個別に）形成されたイソペプチド結合を介して、結合（接続、連結）されている融合タンパク質のことをいう。内部タンパク質ユニットまたは非末端タンパク質ユニットは、融合タンパク質の他のタンパク質ユニットのうちの少なくとも２つに、イソペプチド結合によって結合（接続、連結）しているタンパク質として定義することができる。末端タンパク質ユニットは、融合タンパク質の他のタンパク質ユニットのうちの１つのみに、イソペプチド結合を介して結合（接続、連結）しているタンパク質として定義することができる。したがって、図１３に示す上述した代表例においては、イソペプチド結合を介してタンパク質１およびタンパク質３に接続しているので、タンパク質２が内部タンパク質ユニットまたは非末端タンパク質ユニットであり、タンパク質４およびタンパク質５を、融合タンパク質の「分岐」と見なすことができる。タンパク質１、タンパク質３、タンパク質４、およびタンパク質５を、末端タンパク質ユニットと見なすことができる。したがって、分岐融合タンパク質は、末端タンパク質ユニットを３つ以上含む。
【００４６】
「直鎖状」なる語は、内部タンパク質ユニットのすべてが、融合タンパク質の他のタンパク質ユニット２つのみに結合し、それによってタンパク質ユニットの直鎖を生じている融合タンパク質のことをいう。したがって、直鎖状融合タンパク質に含まれる末端タンパク質ユニットは、２つだけである。
【００４７】
さらに他の実施形態においては、融合タンパク質は、環状であってもよい。例えば、上記の融合タンパク質１−２−３について、タンパク質１がペプチドリンカーＣも含有し、タンパク質３がペプチドリンカーＣ’も含有している場合は、タンパク質１およびタンパク質３をイソペプチド結合によって結合し、それによって環状タンパク質を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態においては、直鎖状タンパク質を、環状化可能である、すなわち環状融合タンパク質を形成できるものと見なし得る。この場合、以下で述べるように、ペプチドリンカーのうちの１つ以上をブロックまたは保護して、その反応を防止または遅延させてもよい。したがって、上記の例を用いると、ペプチドリンカーＣおよび／またはペプチドリンカーＣ’をブロックした場合は、融合タンパク質は、環状化可能な直鎖状融合タンパク質となり、Ｃおよび／またはＣ’を脱ブロックして、ペプチドリンカーが反応してイソペプチド結合を形成できるようにすることによって、環状化され得る。
【００４８】
このように、いくつかの実施形態においては、本発明は、環状融合タンパク質または環状化可能な融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００４９】
このように、「環状」なる語は、概して、末端タンパク質ユニットを含有しない融合タンパク質のことをいう。しかしながら、内部タンパク質ユニットのうちの１つ以上が、融合タンパク質において、イソペプチド結合によって他のタンパク質ユニットのうちの少なくとも３つに結合している環状融合タンパク質を含む「分岐環状融合タンパク質」を作製できるということは、明らかであろう。
【００５０】
本明細書における「直交する」なる語は、例えば、互いに反応することができない分子、または互いに反応することができる同様の分子と比較して反応効率が低い分子などの、互いに対する反応性が低い分子のことをいう。本発明のペプチドリンカー、特にペプチドリンカー対に関して、「直交する」なる語は、他のペプチドリンカー対と反応してイソペプチド結合を形成することができないペプチドリンカー対、あるいは、例えば、自発的にイソペプチド結合を形成することができる内在性タンパク質、または互いに反応して効率よくイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカー対などの同様の分子と比較して、反応効率が低いペプチドリンカー対のことをいう。反応できないということは、試料中のペプチドリンカーのうち５％以下、例えば４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下が反応してイソペプチド結合を形成することと見なされ得る。効率が低いということは、各ペプチドリンカー対がイソペプチド結合を形成できる能力と比較して、直交したペプチドリンカーの対が反応してイソペプチド結合を形成する効率が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満であることと見なされ得る。逆に、反応して効率よくイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対は、少なくとも９５％の効率、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の効率で反応し得る、すなわち、イソペプチド結合を形成することができる条件下で、試料中のペプチドリンカー対のうち少なくとも９５％のペプチドリンカーが反応してイソペプチド結合を形成する。例えば、ＡおよびＡ’がＢおよび／またはＢ’と反応してイソペプチド結合を形成することができないか、または、ＡとＡ’との間および／またはＢとＢ’との間でのイソペプチド結合の形成と比較して、ＡおよびＡ’がＢおよび／またはＢ’と反応してイソペプチド結合を形成する効率が５％未満の場合に、２つのペプチドリンカー対Ａ／Ａ’およびＢ／Ｂ’が直交していると見なし得る。
【００５１】
別の見方をすると、イソペプチド結合の形成を可能に、または容易にする条件下で、互いに反応して効率よくイソペプチド結合を形成する２つのペプチドリンカーを、同系ペプチドリンカー対と定義し得、ここで、「同系」なる語は、共に機能する成分、すなわち互いに反応してイソペプチド結合を形成する成分のことをいう。したがって、イソペプチド結合の形成を可能に、または容易にする条件下で、互いに反応して効率よくイソペプチド結合を形成する２つのペプチドリンカーを、「相補的」ペプチドリンカー対と称することもできる。したがって、直交したペプチドリンカー対を、非同系対または非相補対と見なし得る。例えば、上述した代表例に基づくと、ペプチドリンカー対Ａ／Ａ’を、同系または相補的ペプチドリンカー対と見なし得、一方、ＡおよびＡ’が、イソペプチド結合の形成を可能に、または容易にする条件下で、Ｂおよび／またはＢ’と効率よく反応してイソペプチド結合を形成することができない限りにおいて、Ａ／Ａ’とＢ／Ｂ’とは非同系対または非相補対である。
【００５２】
本発明の方法および使用において用いるペプチドリンカーは、イソペプチド結合を自発的に形成することができるタンパク質由来のものであってもよい。特に、「イソペプチド結合を自発的に形成することができるタンパク質」（本明細書においては、「イソペプチドタンパク質」とも称する）は、酵素もしくは他の物質の非存在下において、かつ／または化学修飾を行わないで、そのタンパク質鎖内に、すなわち分子内に、イソペプチド結合を形成し得るものである。したがって、イソペプチド結合を形成するための２つの反応性残基は、単一のタンパク質鎖内に含まれている。そのため、分子間でのみ、すなわち他のペプチド鎖またはタンパク質鎖もしくはタンパク質ユニットとの間でのみ、イソペプチド結合を形成するタンパク質は、本発明で用いるイソペプチドタンパク質とは見なされない。特に、分子間イソペプチド結合を有するＨＫ９７キャプシドサブユニットは除外される。
【００５３】
本明細書における「イソペプチド結合」なる語は、カルボキシル基またはカルボキサミド基とアミノ基との間に形成されるアミド結合のことをいい、これらの基のうちの少なくとも１つは、タンパク質主鎖由来ではないか、または、見方を変えると、タンパク質骨格の一部ではない。イソペプチド結合は、単一のタンパク質内に形成される場合もあれば、２つのペプチド間またはペプチドとタンパク質との間に生じる場合もある。したがって、イソペプチド結合は、単一のタンパク質において分子内に形成される場合もあれば、分子間で、すなわち２つのペプチド／タンパク質分子間、例えば、２つのペプチドリンカー間などにおいて形成される場合もある。典型的には、イソペプチド結合は、リジン残基と、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、もしくはグルタミン酸残基、またはタンパク質鎖もしくはペプチド鎖の末端カルボキシル基との間に生じる場合もあれば、タンパク質鎖またはペプチド鎖のアルファ−アミノ末端と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸との間に生じる場合もある。イソペプチド結合に含まれる対を成す各残基は、本明細書においては、反応性残基と称する。本発明の好ましい実施形態においては、イソペプチド結合は、リジン残基とアスパラギン残基との間、またはリジン残基とアスパラギン酸残基との間に生じ得る。特に、イソペプチド結合は、リジンの側鎖のアミンとアスパラギンのカルボキサミド基またはアスパラギン酸のカルボキシル基との間に生じ得る。
【００５４】
イソペプチド結合に含まれる残基間の距離は、残基内の特定のＣ原子から測定される。したがって、イソペプチド結合にリジンが含まれている場合は、その距離はリジンのＣ−イプシロン原子から測定され、イソペプチド結合にアスパラギン酸が含まれている場合は、その距離はアスパラギン酸のＣ−ガンマ原子から測定され、イソペプチド結合にアスパラギンが含まれている場合は、その距離はアスパラギンのＣ−ガンマ原子から測定され、イソペプチド結合にグルタミン酸が含まれている場合は、その距離はグルタミン酸のＣ−デルタ原子から測定される。イソペプチド結合に含まれる反応性残基のこれらの原子（そこからの距離が算出される）は、本明細書においては、「関連原子」と称する。
【００５５】
典型的には、イソペプチド結合を形成するためには、反応性リジン残基および反応性アスパラギン残基／アスパラギン酸残基（ならびに、特に、それらの関連原子：リジンにおいてはＣ−イプシロン原子であり、アスパラギン／アスパラギン酸においてはＣ−ガンマ原子）などの反応性残基が、例えばそれらが由来するイソペプチドタンパク質において、空間的に互いに極めて近接して配置されるべきである。したがって、特に、リジンおよびアスパラギン／アスパラギン酸（ならびに、特に、それらの関連原子）などの反応性残基は、折り畳まれたタンパク質（それらが由来する）において、互いに４オングストローム以内に存在しており、また、互いに３．８オングストローム以内、３．６オングストローム以内、３．４オングストローム以内、３．２オングストローム以内、３．０オングストローム以内、２．８オングストローム以内、２．６オングストローム以内、２．４オングストローム以内、２．２オングストローム以内、２．０オングストローム以内、１．８オングストローム以内、または１．６オングストローム以内に存在していてもよい。特に、反応性残基（とりわけ、それらの関連原子）は、それらが由来するイソペプチドタンパク質において、互いに１．８１オングストローム以内、２．６３オングストローム以内、または２．６０オングストローム以内に存在していてもよい。
【００５６】
概して、本発明のペプチドリンカーが由来し得るイソペプチドタンパク質は、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を、例えばリジンおよびアスパラギン／アスパラギン酸などのイソペプチド結合の形成に関わる他の２つの反応性アミノ酸残基に、極めて近接した状態で含み得る。特に、グルタミン酸残基のＣ−デルタ原子またはアスパラギン酸残基のＣ−ガンマ原子は、折り畳まれたタンパク質の構造中、反応性アスパラギン残基／アスパラギン酸残基から５．５オングストローム以内に存在し得る。例えば、グルタミン酸（例えば、そのＣ−デルタ原子）は、イソペプチド結合に含まれる反応性アスパラギン残基／アスパラギン酸残基からは、例えばそのＣ−ガンマ原子からだと、５．４オングストローム、５．２オングストローム、５．０オングストローム、４．８オングストローム、４．６オングストローム、４．４オングストローム、４．２オングストローム、４．０オングストローム、３．８オングストローム、３．６オングストローム、３．４オングストローム、３．２オングストローム、または３．０ オングストローム以内に存在し得る。特に、グルタミン酸残基、例えばそのＣ−デルタ原子は、アスパラギン残基／アスパラギン酸残基からは、例えばそのＣ−ガンマ原子からだと、４．９９オングストローム、３．８４オングストローム、または３．７３オングストロームのところに存在し得る。
【００５７】
さらに、グルタミン酸残基、例えばそのＣ−デルタ原子は、イソペプチド結合に含まれる反応性リジン残基からは、例えばそのＣ−イプシロン原子からだと、６．５オングストローム以内に存在し得、例えば６．３オングストローム、６．１オングストローム、５．９オングストローム、５．７オングストローム、５．５オングストローム、５．３オングストローム、５．１オングストローム、４．９オングストローム、４．７オングストローム、４．５オングストローム、４．３オングストローム、または４．１オングストローム以内に存在し得る。特に、グルタミン酸残基、例えばそのＣ−デルタ原子は、反応性リジンからは、例えばそのＣ−イプシロン原子からだと、６．０７オングストローム、４．８０オングストローム、または４．４２オングストロームのところに存在し得る。
【００５８】
グルタミン酸残基（またはアスパラギン酸残基）は、前述したように、イソペプチド結合の形成を誘導するのに役立ち得る。
【００５９】
上述したように、本発明の方法および使用において用いるペプチドリンカーは、イソペプチドタンパク質の反応性ドメインを２つまたは３つのドメインに分割することによって得られ得る。したがって、各ペプチドリンカー対は、リジン残基を含むペプチドと、アスパラギン酸残基またはアスパラギン残基を含むペプチドとからなり、これらの残基（すなわち、リジンおよびアスパラギン酸、またはリジンおよびアスパラギン）は、イソペプチド結合の形成に関わって（すなわち、反応してイソペプチド結合を形成して）、それによってこれらのペプチドリンカーを接続（連結）する。
【００６０】
いくつかの好ましい実施形態においては、これらのペプチドリンカー間のイソペプチド結合は、自発的に形成される。したがって、一方のペプチドリンカーは、ペプチドリンカーのリジン残基とアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基との間におけるイソペプチド結合の形成を容易にする、例えば誘導または触媒する、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含む。いくつかの実施形態においては、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基は、上記説明した１つ以上の近接基準を満たしている。
【００６１】
このように、これらのペプチドリンカー間のイソペプチド結合が自発的に形成される実施形態においては、一方のペプチドリンカーをペプチドタグと見なし得、他方のペプチドリンカー（すなわち、イソペプチド結合の形成を容易にする、例えば誘導または触媒する、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含むリンカー）を、ペプチド結合パートナー、すなわち、以下でさらに述べるようなペプチドタグに対する結合パートナーと見なし得る。
【００６２】
本明細書における「自発的」なる語は、他の試薬（酵素触媒など）の非存在下、および／または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いた天然型化学的ライゲーションもしくは化学的カップリングなどのタンパク質またはペプチドの化学修飾を行うことなく、タンパク質中、またはペプチド間もしくはタンパク質間（例えば、２つのペプチド間またはペプチドとタンパク質との間、すなわち本発明のペプチドリンカー間）において形成することができる、イソペプチド結合または共有結合などの結合のことをいう。したがって、ペプチドまたはタンパク質を、Ｃ末端チオエステルを有するように改変する天然型化学的ライゲーションは、行われない。
【００６３】
このように、イソペプチド結合を、タンパク質が単独で単離される場合に、自発的に形成することができ、あるいは、共有結合またはイソペプチド結合を、２つのペプチド間またはペプチドとタンパク質との間（すなわち本発明のペプチドリンカー間）において、単独で、または化学修飾を行うことなく、形成することができる。したがって、自発的なイソペプチド結合または共有結合は、酵素もしくは他の外因性物質非存在下において、または化学修飾を行うことなく、形成され得る。しかしながら、特に、近接すると誘導される様式で（proximity-induced manner）結合を形成できるようにするためには、自発的なイソペプチド結合または共有結合には、タンパク質内において、または結合に関与するペプチド／タンパク質の一方（すなわち一方のペプチドリンカー）において、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基が存在することが必要であり得る。
【００６４】
イソペプチド結合または共有結合は、タンパク質が生成したほぼ直後、またはペプチドタグおよび結合パートナーなどの本発明のペプチドリンカーを含む２つ以上のタンパク質が接触したほぼ直後、例えば１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、もしくは３０分以内、または１時間以内、２時間以内、４時間以内、８時間以内、１２時間以内、１６時間以内、２０時間以内、もしくは２４時間以内に、自発的に形成され得る。結合は、例えば、ｐＨが５．０、５．５、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５などの４．０〜９．０の範囲で、温度が１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１２℃、１５℃、１８℃、２０℃、２２℃、または２５℃などの０〜４０℃の範囲のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などの様々な条件下において形成され得る。当業者であれば、他の適切な条件を容易に決定するであろう。
【００６５】
このように、いくつかの実施形態においては、「イソペプチド結合を形成することができる条件下において」本明細書で定義されるペプチドリンカーを含むタンパク質を接触させることは、例えば、ＰＢＳまたはＴＢＳなどの緩衝液を用いて平衡化された緩衝溶液中、あるいは固相（カラムなど）上などの緩衝条件下において、該タンパク質を接触させることを含む。接触させるステップは、例えばｐＨが４．５〜８．５、５．０〜８．０、５．５〜７．５の範囲であり、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、または約８．０などである４．０〜９．０の範囲の適切なｐＨにおいて行われ得る。さらに、またはあるいは、接触させるステップは、例えば温度が約１〜３９℃、約２〜３８℃、約３〜３７℃、約４〜３６℃、約５〜３５℃、約６〜３４℃、約７〜３３℃、約８〜３２℃、約９〜３１℃、または約１０〜３０℃の範囲であり、約１０℃、約１２℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、または約２５℃などである約０〜４０℃の範囲の適切な温度において行われ得る。当業者であれば、本発明の方法で用いるペプチドリンカーの特性に応じて、条件を適用する必要があるということを理解し、どの条件が適切であるかを容易に決定することができるであろう。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、「イソペプチド結合を形成することができる条件下において」本明細書で定義されるペプチドリンカーを含むタンパク質を接触させることは、例えばペプチドリンカーの反応性を向上または改善する分子などの化学シャペロンの存在下において、該タンパク質を接触させることを含む。いくつかの実施形態においては、化学シャペロンは、ＴＭＡＯ（トリメチルアミンＮ−オキシド）である。いくつかの実施形態においては、ＴＭＡＯなどの化学シャペロンは、反応時、濃度が例えば少なくとも約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約１．０Ｍ、約１．５Ｍ、約２．０Ｍ、または約２．５Ｍであって、約０．２〜３．０Ｍ、０．５〜２．０Ｍ、１．０〜１．５Ｍなどの範囲などである、少なくとも約０．２Ｍの濃度で存在する。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、該ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成は、自発的ではない、すなわち、イソペプチド結合の形成は、反応に添加される成分によって誘導または触媒される。イソペプチド結合の形成を誘導または触媒する成分は、ペプチドであってもよく、例えば、トランスグルタミナーゼといった酵素などのポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態においては、イソペプチド結合の形成を誘導または触媒する成分は、イソペプチドタンパク質由来のペプチドであってもよく、すなわち、ペプチドリンカーのリジン残基とアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基との間におけるイソペプチド結合の形成を容易にする、例えば誘導または触媒する、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含むイソペプチドタンパク質のドメインまたは断片由来のペプチドであってもよい。特に２つのペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる限りにおいて、ペプチドリンカーのリジン残基とアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基との間におけるイソペプチド結合の形成を容易にする、例えば誘導または触媒する、ペプチドを、タンパク質リガーゼまたはペプチドリガーゼと見なし得る。
【００６８】
このように、該ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成が自発的でない、すなわち、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導する成分（例えば、ペプチドリガーゼなどのペプチド）が、個別に提供される実施形態においては、ペプチドリンカーの両方を、以下で述べるようなペプチドタグと見なし得る。したがって、ペプチドリンカー（ペプチドタグ）間におけるイソペプチド結合の形成を誘導するペプチドを、ペプチドリガーゼまたはペプチドリンカー対結合パートナーと見なし得る。
【００６９】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明はさらに、結合させるタンパク質を、これらのタンパク質間におけるイソペプチド結合の形成を可能にする条件下において、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分（ペプチドなど）と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分は、これらのタンパク質のペプチドリンカーのリジン残基とアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基との間におけるイソペプチド結合の形成を誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含むペプチドである。
【００７０】
ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分（ペプチドなど）を反応に添加するのは、接続するタンパク質を互いに接触させる前であってもよいし、その後であってもよいし、それと同時であってもよい。いくつかの実施形態においては、接続するタンパク質を互いに接触させた後に、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分（ペプチドなど）を反応に添加してもよい。
【００７１】
ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分（ペプチドなど）を用いることは、大きな介在性ペプチドドメインの非存在下で、融合タンパク質のタンパク質ユニットを接続（連結）することができるため、特に有利である。別の見方をすると、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができる成分（ペプチドなど）を用いることによって、小さなペプチドリンカー（ペプチドタグなど）を用いることが容易になる、すなわち、ペプチドリンカー間でイソペプチド結合を形成することができる同系ペプチドリンカー対において、各ペプチドリンカーのペプチド配列を最小のものにすることが容易になる。
【００７２】
いくつかの実施形態においては、同系ペプチドリンカー対およびペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導することができるペプチドは、同じイソペプチドタンパク質由来である。
【００７３】
イソペプチド結合を自発的に形成することができるタンパク質は、このような結合を少なくとも１つ形成することができてもよく、イソペプチド結合を１つより多く、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上、含んでいてもよい。特に、タンパク質中に、自発的に形成されたイソペプチド結合が１つより多く存在している場合は、イソペプチドタンパク質から、異なるペプチドリンカー対をいくつか開発することができる場合がある。いくつかの実施形態においては、同じイソペプチドタンパク質由来の異なるペプチドリンカー対は、直交していてもよい。本発明においては、イソペプチド結合を１つだけ、または２つだけ含むイソペプチドタンパク質から、各ペプチドリンカー対を開発することが好ましい。
【００７４】
自発的にイソペプチド結合を１つ以上形成することができる公知のタンパク質としては、例えば、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＳｐｙ０１２８（Ｋａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５６），１６２５〜８）、Ｓｐｙ０１２５（Ｐｏｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（４４），３３８５８〜６６）、およびＦｂａＢ（Ｏｋｅら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１（２），１６７〜８０）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＣｎａ（Ｋａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５６），１６２５〜８）；フェカーリス菌（Enterococcus faecalis）のＡＣＥ１９タンパク質（Ｋａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５６），１６２５〜８）；セレウス菌（Bacillus cereus）由来のＢｃｐＡピリン（Ｂｕｄｚｉｋら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００７，１０６（４７），１９９９２〜７）；Ｂ群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）由来のマイナーピリンＧＢＳ５２（Ｋａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５６），１６２５〜８）；ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）由来のＳｐａＡ（Ｋａｎｇら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００９，１０６（４０），１６９６７〜７１）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来のＳｐａＰ（Ｎｙｌａｎｄｅｒら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔ Ｃｏｍｍｕｍ．，２０１１，６７（Ｐｔ１），２３〜６）；肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来のＲｒｇＡ（Ｉｚｏｒｅら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１０，１８（１），１０６〜１５）、ＲｒｇＢ（Ｅｌ Ｍｏｒｔａｊｉら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（１６），１２４０５〜１５）、およびＲｒｇＣ（Ｅｌ Ｍｏｒｔａｊｉら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（１６），１２４０５〜１５）；ならびにストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）由来のＳｓｐＢ（Ｆｏｒｓｇｒｅｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０，３９７（３），７４０〜５１）などが挙げられる。上述したように、本発明の方法及び使用で用いるペプチドリンカー（特に同系ペプチドリンカー対）を生成するのに、これらのうちのいずれのタンパク質が用いられてもよい。
【００７５】
結合して融合タンパク質を形成するタンパク質におけるペプチドリンカーの配置または配列は、特に重要ではない。例えば、所望の融合タンパク質の第１のタンパク質は、ペプチドタグ（Ａ）を含んでいてもよく、また第２のタンパク質は、第１のタンパク質のペプチドタグと同系のペプチド結合パートナー（Ａ’）と、第３のタンパク質のペプチドタグと同系のペプチド結合パートナー（Ｂ’）とを含んでいてもよい。あるいは、所望の融合タンパク質の第１のタンパク質は、ペプチド結合パートナー（Ａ’）を含んでいてもよく、また第２のタンパク質は、第１のタンパク質のペプチド結合パートナーと同系のペプチドタグ（Ａ）と、第３のタンパク質のペプチド結合パートナーと同系のペプチドタグ（Ｂ）とを含んでいてもよい。この場合、２つのタンパク質を結合する（例えば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを結合する、融合タンパク質をさらなるタンパク質と結合するなど）のに用いるペプチドリンカー対は、融合タンパク質を伸長させるのに用いるペプチドリンカー対に対して直交していればよい。以下で述べるように、直交したペプチドリンカーは、様々な方法で実現され得る。
【００７６】
したがって、いくつかの好ましい実施形態においては、第１のペプチドリンカー対（Ａ／Ａ’）は、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＡ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＡ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含み、第２のペプチドリンカー対（Ｂ／Ｂ’）は、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＢ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＢ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含む。上述した例を用いると、ＡがＢ’と反応するのに適した経路はなく、またＢがＡ’と反応するのに適した経路はない。したがって、ペプチドリンカー対は、互いに直交している。
【００７７】
さらなる実施形態においては、第１のペプチドリンカー対（Ａ／Ａ’）は、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＡ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＡ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含み、第２のペプチドリンカー対（Ｂ／Ｂ’）は、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＢ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＢ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含む。あるいは、第１のペプチドリンカー対（Ａ／Ａ’）は、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＡ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＡ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含み、第２のペプチドリンカー対（Ｂ／Ｂ’）は、反応性アスパラギン酸残基または反応性アスパラギン残基を有するペプチドリンカーＢ（ペプチドタグなど）を１つと、反応性リジン残基を有するペプチドリンカーＢ’（ペプチド結合パートナーなど）を１つ含む。これらの実施形態においては、ペプチドリンカー（ペプチドタグ）ＡおよびＢは、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ）の「アンカー」残基の大きさが実質的に異なるように選択されてもよく、その結果、ＡおよびＢ’ならびにＢおよびＡ’の非共有的結合（すなわち、ＡとＢ’との間、およびＢとＡ’との間の相互作用）が生じなくなることによって、交差反応が確実に最小限となる。
【００７８】
「アンカー残基」なる用語は、同系ペプチドリンカー対のうちの一方のペプチドリンカー（ペプチド結合パートナーなど）のβ−ストランド中のアミノ酸残基であって、ペプチドリンカーの疎水性コアの方を向き、同系ペプチドリンカー対のもう一方のペプチドリンカー（ペプチドタグなど）由来の反応性残基を受け入れるアミノ酸残基のことをいう。β−ストランドでは、溶媒の方を向く残基と、疎水性タンパク質コアの方を向く残基とが交互に存在しており、残基の方向は、ペプチドリンカーが由来するイソペプチドタンパク質において自発的にイソペプチド結合を形成するドメインの構造によって規定される。このことは、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、またはクライオ電子顕微鏡法などの、当該技術分野において公知の適当な方法によって求められ得る。
【００７９】
小さなアンカー残基としては、アラニンおよびバリンが挙げられる。中型のアンカー残基としては、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンが挙げられる。大きなアンカー残基としては、フェニルアラニンおよびトリプトファンが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態においては、小さなアンカー残基のうちの少なくとも１つが、中型のアンカー残基または大きなアンカー残基と置換されていてもよい。いくつかの実施形態においては、中型のアンカー残基のうちの少なくとも１つが、小さなアンカー残基または大きなアンカー残基と置換されていてもよい。またさらなる実施形態においては、大きなアンカー残基のうちの少なくとも１つが、中型のアンカー残基または小さなアンカー残基と置換されていてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、直交したペプチドリンカー対は、異なるイソペプチドタンパク質由来であってもよいし、同じイソペプチドタンパク質の異なるドメイン由来であってもよい。いくつかの実施形態においては、直交したペプチドリンカー対は、新規に作製されたものであってもよい。
【００８１】
新規に作製されるペプチドリンカー対は、好ましくはグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基と共に、イソペプチド結合を自発的に形成するのに必要な反応性アミノ酸残基を２つ有するべきである。したがって、上述したように、ペプチドリンカーのうちの一方は、反応性リジン残基を含み、ペプチドリンカーのうちのもう一方は、反応性アスパラギン残基または反応性アスパラギン酸残基を含む。好ましい実施形態においては、ペプチドリンカーのうちの一方は、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導する、または容易にするグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基も含む。しかしながら、上述したように、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導する、または容易にするグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含む成分（例えば、ペプチドリガーゼなどのペプチド）が、個別に提供されてもよい。
【００８２】
同系ペプチドリンカー対のペプチドリンカーのどちらもが、イソペプチド結合の形成に関わる反応性残基の両方は含まない、すなわち、同系ペプチドリンカー対の各ペプチドリンカーは、反応性残基、すなわちリジン残基またはアスパラギン酸残基／アスパラギン残基を１つ含む。
【００８３】
ペプチドリンカーのうちの一方が、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を誘導する、または容易にするグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含む実施形態においては、典型的には、該グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基は、イソペプチド結合に含まれるリンカーの残基から６．５オングストローム以内に存在しており、例えば、６．０オングストローム以内、５．５オングストローム以内、５．０オングストローム以内、４．５オングストローム以内、４．０オングストローム以内、３．５オングストローム以内、または３．０オングストローム以内に存在している。これらの距離は、特に、各残基の関連原子、すなわちイソペプチド結合の形成に関わる原子間の距離のことである。２つのペプチドリンカーが互いに近づけられた場合、例えば、第１のタンパク質と第２のタンパク質を接触させた場合、結合に含まれる２つの反応性残基（より具体的には、その関連原子）は、空間的に互いに４オングストローム以内に存在すべきであり、好ましくは、３．８オングストローム以内、３．６オングストローム以内、３．４オングストローム以内、３．２オングストローム以内、３．０オングストローム以内、２．８オングストローム以内、２．６オングストローム以内、２．４オングストローム以内、２．２オングストローム以内、２．０オングストローム以内、１．８オングストローム以内、または１．６オングストローム以内に存在すべきである。
【００８４】
当業者であれば、新規にイソペプチドタンパク質を設計する場合は、イソペプチド結合形成に関わる残基のｐＫａも考慮すべきであることを、すぐに認めるであろう。例えば、反応性リジン残基は、中性ｐＨにおいてリジンが疎水性コアに埋まっていることを必要とする場合がある反応の前に、脱プロトン化されることが好ましい。
【００８５】
好ましくは、直交したペプチドリンカー対は、異なるイソペプチドタンパク質由来であってもよいし、同じイソペプチドタンパク質の異なるドメイン由来であってもよいが、直交したペプチドリンカー対を、同じイソペプチドタンパク質から、特にイソペプチドタンパク質の同じドメインから、作製することができる。例えば、同系ペプチドリンカー対のうちの一方のペプチドリンカーは、その対のもう一方のペプチドリンカーと反応しない（または効率よく反応しない）ように改変されてもよい。その改変は、ペプチドリンカー間の反応を防ぐ改変を無効にする、または除去することによって、ペプチドリンカー対が反応して効率よくイソペプチド結合を形成する能力が復元されるように、可逆的であってもよい。したがって、例えば、ブロッキング基の付加によってＡを改変するなど、同系ペプチドリンカー対Ａ／Ａ’のペプチドリンカーの一方が改変されて、ペプチドリンカーＢを生じてもよく、ここで、ＢはＡ’またはＡと効率よく反応してイソペプチド結合を形成することはできない。Ｂからブロッキング基を除去することによって、Ａ’と反応してイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーＢ’が生じる。
【００８６】
可逆的保護基または除去保護基の使用は、当該技術分野においてよく知られている。したがって、直交したペプチドリンカー対を作製するために、同系ペプチドリンカー対のうちの一方のペプチドリンカーにブロッキング基を付加することは、ペプチドリンカーに保護基を付加すること、またはペプチドリンカーをケージングすることと見なされ得る。ブロッキング基（保護基、遮蔽基、またはケージング基など）は、ペプチドリンカー対のもう一方のペプチドリンカーと効率よく反応してイソペプチド結合を形成する、ペプチドリンカーの能力を復元する、当該技術分野において公知の適切な方法によって除去されてもよい。ブロッキング基の除去（脱保護、脱遮蔽、脱ケージングなど）は、ブロッキング基の性質に応じて、化学反応によって行われてもよいし、酵素反応によって行われてもよいし、光反応によって行われてもよい。適切なブロッキング基の例としては、立体的に反応を阻害し、タバコエッチウイルスプロテアーゼなどの酵素を用いて除去され得るタンパク質などのかさ高い部位（bulky moieties）（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０１２ Ｊａｎ １５；２０（２）：５７１〜８２． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１１．０７．０４８． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｌ ３０． Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｌｅｒｉｃｈｅ Ｇ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ Ｌ，Ｗａｇｎｅｒ Ａ．に概説されている）；テトラジンを用いた反応によって、化学的に脱ケージングされるトランス−シクロオクテン−ケージドリジン（Ｎ−（（（Ｅ）−シクロオクト−２−エン−１−イル）−オキシ）カルボニル−Ｌ−リジン）（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１４ Ｄｅｃ；１０（１２）：１００３〜５． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．１６５６． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｎｏｖ ２． Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃａｇｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｌｉ Ｊ，Ｊｉａ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＰＲ）；または、当該技術分野においてよく知られている、適切な波長の光によって脱ケージングされるｏ−ニトロベンジルもしくはクマリン基でケージングされたリジン（例えば、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ． ２０１３ Ｊａｎ ９；１１３（１）：１１９〜９１． ｄｏｉ：１０．１０２１／ｃｒ３００１７７ｋ． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｄｅｃ ２１． Ｐｈｏｔｏｒｅｍｏｖａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ: ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｋｌａｎ ，Ｓｏｌｏｍｅｋ Ｔ，Ｂｏｃｈｅｔ ＣＧ，Ｂｌａｎｃ Ａ，Ｇｉｖｅｎｓ Ｒ，Ｒｕｂｉｎａ Ｍ，Ｐｏｐｉｋ Ｖ，Ｋｏｓｔｉｋｏｖ Ａ，Ｗｉｒｚ Ｊ．を参照）などが挙げられる。
【００８７】
ブロッキング基の使用を、さらなる直交したペプチドリンカー対の作製に限定する必要はない。例えば複数の反応において、ブロッキング基は、例えば、融合タンパク質の伸長を制御するのに特に有用であり得る。例えば様々な異なる融合タンパク質を含むアレイを作製するために、例えば、複数の融合タンパク質を単一の固相基質上で合成してもよい。例えば核酸アレイの生成と同様に光反応性ブロッキング基を用いて、固相上の各融合タンパク質を物理的に分離すれば、基質上のペプチドリンカーの選択的脱ブロッキングを容易に行えるであろう。ペプチドリンカーを選択的に脱ブロッキングすることによって、一度の伸長反応において、単一の融合タンパク質または融合タンパク質の複数組（例えば、固相上の特定の位置に存在している）を伸長させることが可能になり、また、続く反応において異なる融合タンパク質または異なる融合タンパク質の組を伸長させることが可能になる。
【００８８】
したがって、いくつかの実施形態においては、１つ以上のペプチドリンカーが、ブロッキング基、すなわち可逆的ブロッキング基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、融合タンパク質を、ブロッキング基を除去する紫外線、化学薬品、または酵素などと接触させることによって、ブロッキング基を除去してもよい。
【００８９】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、融合タンパク質のペプチドリンカーのブロッキング基を脱ブロッキングまたは除去するステップを含んでいてもよい。
【００９０】
代表的な実施形態においては、本発明は、融合タンパク質を作製する（例えば、生成する、合成する、または組み立てる）方法を提供し、該方法は、
ａ）第１のタンパク質と第２のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第１のタンパク質および該第２のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、（互いに）反応することによって、該第１のタンパク質を該第２のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
ｂ）前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第３のタンパク質は、（ａ）の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、（互いに）反応することによって、該第３のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって
（ａ）の該ペプチドリンカー対は、（ｂ）の前記ペプチドリンカー対に対して直交しており、
前記結合タンパク質の前記さらなるペプチドリンカーは、ブロッキング基を含み、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件は、前記結合タンパク質を処理して前記ブロッキング基を除去することを含む、方法である。
【００９１】
いくつかの実施形態においては、結合タンパク質を該第３のタンパク質と接触させるステップの前に、ブロッキング基を除去してもよい（ペプチドリンカーを脱ブロッキングしてもよい）。いくつかの実施形態においては、結合タンパク質を該第３のタンパク質と接触させるステップの後、またはそのステップと同時に、ブロッキング基を除去してもよい（ペプチドリンカーを脱ブロッキングしてもよい）。
【００９２】
本明細書における「ペプチドリンカー」なる語は、概して、イソペプチドタンパク質から直接設計されたものであってもよいし、直接由来するものであってもよい、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドのことをいい、例えば、ペプチドリンカーは、イソペプチドタンパク質の断片であってもよいし、その改変体であってもよい。ペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドが意味するものの大きさの境界については、標準的な規定はないが、典型的には、ペプチドを、アミノ酸を２〜２０個含むものと見なし得、オリゴペプチドを、アミノ酸を２１〜３９個含むものと見なし得、ポリペプチドを、アミノ酸を少なくとも４０個含むものと見なし得る。したがって、本明細書において定義されるペプチドリンカーを、アミノ酸を少なくとも６個、例えば６〜３００個含むものと見なし得る。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、ペプチドタグと称されてもよく、また、その長さは、６〜５０個のアミノ酸、例えば７〜４５個のアミノ酸、８〜４０個のアミノ酸、９〜３５個のアミノ酸、１０〜３０個のアミノ酸、１１〜２５個のアミノ酸などであってもよく、例えば、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸を含んでいてもよいし、これらの数のアミノ酸からなるものであってもよい。ペプチドリンカーまたはペプチドタグは、イソペプチド結合を介して第２のペプチドリンカーに特異的に共有結合し、ここで、別のペプチドリンカーは、以下で述べるように、ペプチドタグまたはペプチド結合パートナーと見なされ得る。互いに反応して（例えば、特異的にかつ効率よく）イソペプチド結合を形成する２つのペプチドリンカー（例えば、ペプチドタグおよびペプチドタグ、またはペプチドタグおよびペプチド結合パートナー）は、ペプチドリンカー対、特に同系ペプチドリンカー対と定義され得る。
【００９４】
したがって、上述したように、ペプチドリンカーは、リジンまたはアスパラギン／アスパラギン酸などの、イソペプチド結合の形成に関わるアミノ酸残基を少なくとも１つ、含んでいなくてはならない。したがって、ペプチドリンカー対の各ペプチドリンカーは、イソペプチド結合の形成に関わる、異なるすなわち相補的な、反応性アミノ酸残基を含んでいなくてはならない。すなわち、一方のペプチドリンカーはリジン残基を含み、もう一方のペプチドリンカーはアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカー対は、ペプチドタグを２つ含む。典型的には、２つのペプチドタグは、反応して自発的にイソペプチド結合を形成しない。すなわち、上述したように、該ペプチドタグ／ペプチドリンカーの間におけるイソペプチド結合の形成を誘導または触媒する成分（例えば、ペプチドリガーゼなどのペプチド）の添加を必要とする。
【００９６】
いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカー（すなわち、同系ペプチドリンカー対のうちの一方のペプチドリンカー）は、ペプチド結合パートナーと称されてもよく、これは、イソペプチドタンパク質に由来するかまたはこれから設計されるペプチド（特にオリゴペプチドまたはポリペプチド）と定義され得、また、イソペプチド結合を介して（好ましくは自発的な反応によって）ペプチドタグに共有結合し得る。いくつかの実施形態においては、ペプチド結合パートナーは、それが共有結合するペプチドタグ、すなわち、それに対応するペプチドタグまたはペプチドリンカーとして、同じイソペプチドタンパク質から設計されてもよいし、同じイソペプチドタンパク質に由来するものであってもよい。
【００９７】
概して、ペプチド結合パートナーは、それに対応するペプチドタグよりも大きく、ペプチドタグと比較して、より大きなイソペプチドタンパク質の断片または部分を含んでいるか、またはその断片または部分からなる。特に、ペプチド結合パートナーは、イソペプチド結合の形成に関わる残基（すなわちリジンまたはアスパラギン／アスパラギン酸）に加えて、ペプチドタグおよびペプチド結合パートナーなどのペプチドリンカー間のイソペプチド結合の形成を容易にするか、または誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含む。
【００９８】
したがって、ペプチド結合パートナーは、ペプチドタグを構成するように設計された断片と重なるイソペプチドタンパク質断片を含んでいてもよいし、ペプチドタグの断片と比較して、不連続かつ別々のイソペプチドタンパク質断片を含んでいてもよい。したがって、ペプチド結合パートナーの配列は、設計されたペプチドタグの配列と重複があってもよいし、ペプチドタグおよびペプチド結合パートナーは、イソペプチドタンパク質の２つの不連続な断片を含むか、それらからなるものであってもよい。いくつかの実施形態においては、ペプチドタグは、イソペプチドタンパク質の配列に基づいていなくてもよく、例えば、ペプチドタグ（ペプチドリンカー）を新規に設計してもよい。
【００９９】
ペプチド結合パートナーの大きさは、特に限定されないが、本発明の方法および使用において用いるペプチドリンカーの大きさは、実用上、最小限に抑えることが好ましい。
【０１００】
したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカー（ペプチド結合パートナーなど）は、その長さが５０〜３００個のアミノ酸、例えば、６０〜２５０個のアミノ酸、７０〜２２５個のアミノ酸、８０〜２００個のアミノ酸であってもよく、例えば、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、または２００個のアミノ酸を含んでいてもよいし、これらの数のアミノ酸からなるものであってもよい。
【０１０１】
したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカー対は、ペプチドタグとペプチド結合パートナーとを含み、該ペプチドリンカーは、自発的に反応してイソペプチド結合を形成する。
【０１０２】
ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合形成が自発的でない場合（例えば、ペプチドリンカーがどちらもペプチドタグである場合）、該ペプチドタグ／ペプチドリンカーの間におけるイソペプチド結合の形成を誘導または触媒するペプチドは、上述したように、イソペプチドタンパク質またはペプチド結合パートナー由来のペプチド（ペプチドリガーゼなど）と見なされ得る。特に、前記ペプチドは、ペプチドリンカー間におけるイソペプチド結合の形成を容易にするか、または誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含むが、重要なことには、リガーゼは、ペプチドリンカー対のいずれかのペプチドリンカーと反応してイソペプチド結合を形成するアミノ酸残基を含まない。いくつかの実施形態においては、ペプチドリガーゼは、その長さが５０〜３００個のアミノ酸、例えば、６０〜２５０個のアミノ酸、７０〜２２５個のアミノ酸、８０〜２００個のアミノ酸であってもよく、例えば、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、または２００個のアミノ酸を含んでいてもよいし、これらの数のアミノ酸からなるものであってもよい。
【０１０３】
したがって、このように、ペプチドリンカー（ペプチドタグおよび／またはペプチド結合パートナーなど）は、イソペプチドタンパク質のタンパク質配列全体からなるものではなく、それよりも長さが短い。例えば、ペプチドリンカーは、イソペプチドタンパク質に存在するアミノ酸残基の５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満の数のアミノ酸残基からなるものであり得る。
【０１０４】
ペプチドリンカーまたはペプチドリンカー対は、イソペプチドタンパク質（特にその１つ以上の断片）の配列に基づくものとすることができるが、当業者であれば、ペプチドリンカーの配列は、それが由来するイソペプチドタンパク質の一部の配列とは異なるものであってもよいということを、容易に理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーまたはペプチドリンカー対は、それが由来するイソペプチドタンパク質の配列と比較して、突然変異または変化を含んでいてもよい。以下で述べるように、例えば、ペプチドリンカー間における自発的なイソペプチド結合形成の反応速度を向上させるなど、ペプチドリンカーの安定性および／または機能を向上させるために、いくつかの突然変異をペプチドリンカー配列に導入してもよい。
【０１０５】
したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、イソペプチドタンパク質の断片を含むか、またはその断片からなるものであってもよく、ここで、その断片は、上記説明した大きさの基準を満たしており、それが由来するイソペプチドタンパク質の相当領域に対する配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である。
【０１０６】
さらに、上述したように、イソペプチドタンパク質は、公知のイソペプチドタンパク質の構造類似体（structural homologues）、すなわち、公知のイソペプチドタンパク質と配列類似性または配列同一性を有するタンパク質を探索することによって同定されてもよい。このような類似体は、機能的に同等なタンパク質と見なされ得、本発明のペプチドリンカーの作製に役立ち得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法および使用において用いるペプチドリンカー対は、適切なイソペプチドタンパク質に由来するものであってもよい。上記のように、当該技術分野において、様々なイソペプチドタンパク質が知られている。例えば、ペプチドリンカーは、主要なピリンタンパク質であるＳｐｙ０１２８由来であってもよい。Ｓｐｙ０１２８は、配列番号２３に示すアミノ酸配列を有し、配列番号２４に示すヌクレオチド配列にコードされている。このタンパク質には、イソペプチド結合が２つ形成されている。イソペプチド結合の一方は、配列番号２３における１７９位のリジンと、配列番号２３における３０３位のアスパラギンとの間（反応性残基の間）に形成されている。自発的なイソペプチド結合を誘導するグルタミン酸残基は、配列番号２３の２５８位に見出される。したがって、配列番号２３に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、３０３位の反応性アスパラギンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、１７９位の反応性リジンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、２５８位のグルタミン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、２５８位のグルタミン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして、提供されてもよい。
【０１０８】
主要なピリンタンパク質であるＳｐｙ０１２８のイソペプチド結合のもう一方は、配列番号２３の３６位のリジン残基と、配列番号２３の１６８位のアスパラギン残基との間に生じる。イソペプチド形成を誘導するグルタミン酸残基は、配列番号２３の１１７位に見出される。したがって、配列番号２３に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、３６位の反応性リジン残基を含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、１６８位の反応性アスパラギンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、１１７位のグルタミン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、１１７位のグルタミン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして、提供されてもよい。
【０１０９】
フェカーリス菌（E. faecalis）由来のアドヘシンタンパク質（adhesin protein）のドメインであるＡＣＥ１９も、自発的にイソペプチド結合を形成する。ＡＣＥ１９は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有し、配列番号２８に示すヌクレオチド配列にコードされている。
【０１１０】
イソペプチド結合は、配列番号２７の１８１位のリジン残基と、配列番号２７の２９４位のアスパラギン残基との間に生じる。この結合は、配列番号２７の２１３位のアスパラギン酸残基によって誘導される。したがって、配列番号２７に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、２９４位の反応性アスパラギン残基を含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、１８１位の反応性リジン残基を含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、２１３位のアスパラギン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、２１３位のアスパラギン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして、提供されてもよい。
【０１１１】
配列番号２９に示すアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌（S. aureus）のコラーゲン結合ドメインは、自発的に形成されるイソペプチド結合を１つ含む。イソペプチド結合は、配列番号２９の１７６位のリジンと、配列番号２９の３０８位のアスパラギンとの間に生じる。このイソペプチド結合を誘導するアスパラギン酸残基は、配列番号２９の２０９位に存在する。したがって、配列番号２９に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、１７６位の反応性リジンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、３０８位の反応性アスパラギンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、２０９位のアスパラギン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、２０９位のアスパラギン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして、提供されてもよい。
【０１１２】
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＦｂａＢは、ドメインＣｎａＢ２を含む。これは、配列番号２５に示すアミノ酸配列を有し、配列番号２６に示すヌクレオチド配列にコードされ、自発的に形成されるイソペプチド結合を１つ含む。ＣｎａＢ２ドメインのイソペプチド結合は、配列番号２５の１５位のリジンと、配列番号２５の１０１位のアスパラギン酸残基との間に形成される。このイソペプチド結合を誘導するグルタミン酸残基は、配列番号２５の６１位に存在する。したがって、配列番号２５に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、１５位の反応性リジンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、１０１位の反応性アスパラギン酸を含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、６１位のグルタミン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、６１位のグルタミン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして（配列番号３４など）、提供されてもよい。
【０１１３】
ＲｒｇＡタンパク質は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来の接着タンパク質であり、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有し、配列番号２２に示すヌクレオチド配列にコードされている。イソペプチド結合は、配列番号２１の７４２位のリジンと、配列番号２１の８５４位のアスパラギンとの間に形成される。この結合は、配列番号２１の８０３位のグルタミン酸残基によって誘導される。したがって、配列番号２１に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、８５４位の反応性アスパラギンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、７４２位の反応性リジンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。いくつかの実施形態においては、一方のペプチドリンカーは、８０３位のグルタミン酸残基も含有する断片を含む。いくつかの実施形態においては、８０３位のグルタミン酸残基を含むタンパク質断片は、個別に、すなわち上述したペプチドリガーゼとして、提供されてもよい。
【０１１４】
ＰｓＣｓタンパク質は、ストレプトコッカス・インテルメディウス（Streptococcus intermedius）由来のｐｏｒ分泌システムＣ末端ソーティングドメインタンパク質の断片である。これは、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有し、配列番号３２に示すヌクレオチド配列にコードされている。イソペプチド結合は、配列番号３１の４０５位のリジンと、配列番号３１の４９６位のアスパラギン酸との間に形成される。したがって、配列番号３１に示すイソペプチドタンパク質から開発されたペプチドリンカー対は、好ましくは、４９６位の反応性アスパラギン酸を含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーと、４０５位の反応性リジンを含むタンパク質断片を含むペプチドリンカーとを含む。
【０１１５】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明の方法において用いるペプチドリンカー対は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有するイソペプチドタンパク質に由来するものであってもよいし、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質に由来するものであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態においては、上記イソペプチドタンパク質の配列は、それが比較される配列（配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３１）に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１１７】
好ましくは、上述したイソペプチドタンパク質由来のペプチドリンカーは、上述の大きさの基準および配列同一性の基準を満たす。
【０１１８】
配列同一性は、当該技術分野において公知の適切な手段によって、例えば、ｐａｍ因子が可変であって、ギャップ作成ペナルティを１２．０に設定し、ギャップ伸長ペナルティを４．０に設定し、ウインドウを２アミノ酸としたＦＡＳＴＡ ｐｅｐ−ｃｍｐを使用するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データバンクを用いて決定され得る。アミノ酸配列の同一性を決定する他のプログラムとしては、ウィスコンシン大学によるジェネティクス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）・バージョン１０・ソフトウェアパッケージのベストフィット（BestFit）プログラムが挙げられる。このプログラムは、初期値として、ギャップ作成ペナルティを−８、ギャップ伸長ペナルティを２、平均一致を２．９１２、平均不一致を−２．００３としたＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを用いている。
【０１１９】
好ましくは、該比較は配列の全長にわたって行われるが、例えば、連続した２００個未満のアミノ酸、１００個未満のアミノ酸、または５０個未満のアミノ酸など、より小さい比較ウインドウに対して行われてもよい。
【０１２０】
好ましくは、このような配列同一性の近いタンパク質は、列挙した配列番号に示すポリペプチドと機能的に同等である。本明細書において、「機能的同等」とは、親分子（すなわち、配列相同性を示す分子）と比べて、自発的にイソペプチド結合を形成する効力がいくらか減少している場合もあるが、好ましくは、同程度に有効な分子であるか、より有効な分子である、上述したイソペプチドタンパク質の類似体のことをいう。
【０１２１】
いくつかの実施形態においては、直交したペプチドリンカー対は、上述したイソペプチドタンパク質のうちのいずれか２つ以上に由来するものであってもよい。好ましい実施形態においては、第１のペプチドリンカー対は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するイソペプチドタンパク質に由来するものであり、第２の、直交したペプチドリンカー対は配列番号２５に示すアミノ酸配列を有するイソペプチドタンパク質に由来するものである。以下で述べるように、いくつかの実施形態においては、直交した２つのペプチドリンカー対は、例えば配列番号２１に示す、同じイソペプチドタンパク質に由来するものであってもよい。直交した他のペプチドリンカー対は、配列番号２１および配列番号２３、配列番号２１および配列番号２７、配列番号２１および配列番号２９、配列番号２１および配列番号３１、配列番号２５および配列番号２７、配列番号２５および配列番号２９、または配列番号２５および配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するイソペプチドタンパク質に由来するものであってもよい。当業者であれば、本明細書、特に実施例に開示された方法に基づいて、２つのペプチドリンカー対が直交しているかどうかを決定することができるであろう。例えば、異なるペプチドリンカー対由来のペプチドリンカーの様々な組み合わせを、例えば溶液中で、１〜２４時間などの適切な期間、イソペプチド結合の形成を容易にする条件下、例えばｐＨが７で温度が２５℃である、ｐＨ４〜９で１〜４０℃のＰＢＳ中で、接触させてもよい。例えばゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）によって試料を解析し、すなわち連結したペプチドを探すことによって、ペプチドリンカーのうちのどれが反応しどれが反応しなかったかを決定してもよい。例えば、図７を参照のこと。したがって、本発明の方法において用いる直交したペプチドリンカー対は、イソペプチドタンパク質の適切な組み合わせに由来するものであってもよい。
【０１２２】
発明者らは、本発明の方法および使用に特に役立つペプチドリンカー対を開発した。この点について、発明者らは、ペプチドリンカー対は、上述したＲｒｇＡタンパク質由来のものであってもよいことを確認した。しかしながら、下記実施例で詳しく述べるように、発明者らは、ペプチドリンカーの反応性を向上させるために、天然のＲｒｇＡ配列を基準として、ペプチドリンカーに突然変異を導入した。具体的には、グリシン残基をスレオニン残基で置換して、β−ストランドを安定化し、アスパラギン酸残基をグリシン残基で置換して、反応部位に近いヘアピンターンを安定化した。
【０１２３】
したがって、本発明は、ペプチドリンカーを提供するものであって、該ペプチドリンカーは、
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含む、配列、あるいは
（ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５５位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、９４位にスレオニン残基を含み、１００位にグリシン残基を含み、１０６位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカーである。
【０１２４】
いくつかの実施形態においては、（ｉ）のペプチドリンカーは、配列番号３８に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または（ｉｉ）のペプチドリンカーは配列番号３９に示すアミノ酸配列を有する。
【０１２５】
さらなる実施形態においては、本発明は、ペプチドリンカーを提供するものであって、該ペプチドリンカーは、
（ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、あるいは
（ｉｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカーである。
【０１２６】
いくつかの実施形態においては、（ｉ）のペプチドリンカーは、配列番号４２に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または（ｉｉ）のペプチドリンカーは配列番号４３に示すアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
またさらなる実施形態においては、本発明は、ペプチドリンカーを提供するものであって、該ペプチドリンカーは、
（ｉ）配列番号９に示すアミノ酸配列、または配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、あるいは
（ｉｉ）配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカーである。
【０１２８】
いくつかの実施形態においては、（ｉ）のペプチドリンカーは、配列番号１０９に示すアミノ酸配列、または配列番号１０９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１１位にグリシン残基を含み、好ましくは２０位にイソロイシン残基を含み、２１位および２２位にプロリン残基を含み、２３位にリジン残基を含む、配列を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態においては、（ｉ）のペプチドリンカーは、配列番号４６に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または（ｉｉ）のペプチドリンカーは配列番号４７に示すアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態においては、上記のペプチドリンカー配列は、それが比較される配列（配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１０９）に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１３１】
好ましい実施形態においては、上記各（ｉ）で述べたペプチドリンカーは、上記各（ｉｉ）で述べたアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、またはその変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、またはその変異体と自発的にイソペプチド結合を形成することができる。同様に、配列番号５および配列番号６のペプチド、またはその変異体は、互いに、自発的にイソペプチド結合を形成することができ、配列番号９および配列番号１０のペプチド、またはその変異体（配列番号１０９など）は、互いに（配列番号１０９および配列番号１０など）、自発的にイソペプチド結合を形成することができる。
【０１３２】
したがって、本発明は、本発明の方法および使用において用いることができるペプチドリンカー対を提供するものであって、該ペプチドリンカー対は、
（１）配列番号１および配列番号２のペプチドリンカー、または上述したような、例えば配列番号３８および配列番号３９である、その変異体、
（２）配列番号５および配列番号６のペプチドリンカー、または上述したような、例えば配列番号４２および配列番号４３である、その変異体、
（３）配列番号９および配列番号１０のペプチドリンカー、または上述したような、例えば配列番号４６および配列番号４７である、その変異体、あるいは、
（４）配列番号１０９および配列番号１０のペプチドリンカー、または上述したような、その変異体、
を含む、ペプチドリンカー対である。
【０１３３】
したがって、上述した各ペプチドリンカー対は、同系ペプチドリンカー対と定義され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態においては、上述した各ペプチドリンカー対（すなわち、各同系ペプチドリンカー対）を、他のペプチドリンカー対に対して直交している（すなわち、同系でない）と見なし得る。例えば、対（１）は、対（２）、対（３）および／または対（４）に対して直交しており、対（２）は、対（１）、対（３）および／または対（４）に対して直交しており、対（３）は、対（１）および／または対（２）に対して直交しており、対（４）は、対（１）および／または対（２）に対して直交している。いくつかの実施形態においては、これらの直交した対は、本発明の方法および使用において用いる好ましいペプチド（同系）リンカーの直交した（同系でない）対を代表するものである。さらに好ましい直交したペプチドリンカー対を以下で述べる。
【０１３５】
上述したように、本発明のペプチドリンカーは、融合タンパク質の合成に特に役立ち、ペプチドリンカーは、別のタンパク質ユニットに結合（連結）されて融合タンパク質を形成するタンパク質ユニットに組み入れられる（例えば、タンパク質ユニットのドメインを形成する、またはタンパク質ユニットに結合される）。したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、上述したポリペプチドおよびペプチドリンカーを含む組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドを提供する。
【０１３６】
本発明のペプチドリンカーが、例えば、ＷＯ２０１１／０９８７７２（参照により本明細書に援用される）で説明されているペプチドタグなどとして、他の方法および使用に役立ち得るということは、明らかであろう。
【０１３７】
本発明の方法および使用において用いられ得る他のペプチドリンカーは、
（ｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、７位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、あるいは、
（ｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５６位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１０位にリジン残基を含む、配列、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号３３に示すアミノ酸配列、または配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列、あるいは、
（ｉｖ）配列番号１７に示すアミノ酸配列、または配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１１位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、あるいは、
（ｖ）配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、２４１位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１６２位にリジン残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカーである。
【０１３８】
いくつかの実施形態においては、上記のペプチドリンカー配列は、それが比較される配列（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号３３）に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１３９】
本発明の方法および使用において用いられ得る他のペプチドリンカー対は、
（５）配列番号１３および配列番号１４のペプチドリンカー、または上述したような、その変異体、
（６）配列番号１３および配列番号３３のペプチドリンカー、または上述したような、その変異体、あるいは
（７）配列番号１７および配列番号１８のペプチドリンカー、または上述したような、その変異体、
を含む、ペプチドリンカー対である。
【０１４０】
同系ペプチドリンカー対が、上記（６）で述べた対を含むいくつかの実施形態においては、反応には、イソペプチド結合の形成を誘導または触媒する成分も含まれる。例えば、反応には、ペプチドリガーゼが含まれ、好ましくは、該ペプチドリガーゼは、配列番号３４に示すアミノ酸配列、または配列番号３４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態においては、上記のペプチドリガーゼ配列は、それが比較される配列（配列番号３４）に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１４２】
上記（１）〜（７）から選択されるペプチドリンカー対のうち、直交した対を本発明の方法および使用において用い得るが、特に好ましい直交したペプチドリンカー対としては、上述した以下の対のうちのいずれか１つが挙げられる：（１）および（４）、（１）および（５）、（１）および（６）、（１）および（３）、（１）および（２）、（２）および（４）、（２）および（５）、（２）および（６）、（３）および（５）、（３）および（６）、（４）および（５）、および（４）および（６）。
【０１４３】
他のタンパク質に結合して融合タンパク質を形成するタンパク質内におけるペプチドリンカーの位置は、特に重要ではない。したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、組み換えポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または融合タンパク質に結合されるタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置していてもよい。いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、組み換えポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または融合タンパク質に結合されるタンパク質の内部に位置していてもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーを、組み換えポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または融合タンパク質に結合されるタンパク質のＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、または内部ドメインと見なし得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態においては、融合タンパク質に組み入れられる、または接続されるタンパク質と、ペプチドリンカーとの間に、ペプチドスペーサーなどのスペーサーを１つ以上含むことが、有用である場合がある。したがって、タンパク質とペプチドリンカーとが、互いに直接結合されてもよいし、スペーサー配列を１つ以上用いて、間接的に結合されてもよい。したがって、スペーサー配列によって、組み換えポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または融合タンパク質に結合されるタンパク質のそれぞれの部分のうちの２つ以上の間をあけるか、または離し得る。いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーのＮ末端またはＣ末端に、スペーサーが存在していてもよい。いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーの両側に、スペーサーが存在していてもよい。
【０１４５】
スペーサー配列の厳密な特徴は、重要ではなく、その長さおよび／または配列は可変であってもよい。例えば、１〜４０残基であってもよく、より具体的には、２〜２０残基、１〜１５残基、１〜１２残基、１〜１０残基、１〜８残基、または１〜６残基であってもよく、例えば、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基またはそれ以上であってもよい。代表的な例においては、スペーサー配列は、もしも存在するのであれば、１〜１５残基、１〜１２残基、１〜１０残基、１〜８残基、または１〜６残基などであってもよい。残基の特徴は重要ではなく、例えば、中性アミノ酸または脂肪族アミノ酸など、どのようなアミノ酸であってもよく、あるいは、疎水性アミノ酸であってもよいし、極性アミノ酸であってもよいし、荷電したアミノ酸であってもよいし、プロリンなどの構造形成アミノ酸であってもよい。いくつかの好ましい実施形態においては、リンカーは、セリンおよび／またはグリシンに富む配列である。
【０１４６】
したがって、典型的なスペーサー配列は、Ｓ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｍ、Ａ、またはＥなどの単一アミノ酸残基、あるいはこのような残基の１つ以上からなるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドを含む。代表的かつ好ましいスペーサー配列は、配列番号３６または配列番号３７に示すアミノ酸配列を有する。
【０１４７】
本発明の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、精製を（例えば、本発明の方法および使用において用いる前、および／または以下で述べるように融合タンパク質を伸長させる間）容易にするために、精製用部位または精製用タグを含んでいてもよい。適切なものであれば、どのような精製用部位または精製用タグがポリペプチドに組み込まれてもよく、このような部位は当該技術分野においてよく知られている。例えば、いくつかの実施形態においては、組み換えペプチドまたは合成ペプチドは、Ｈｉｓ−タグ配列などのペプチド精製用タグまたはペプチド精製用部位を含んでいてもよい。このような精製用部位または精製用タグは、ポリペプチド内のどの位置に組み込まれていてもよい。いくつかの好ましい実施形態においては、精製用部位は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置しているか、またはそれらの近く（すなわちアミノ酸５つ分、１０個分、１５個分、２０個分離れたところ）に位置している。
【０１４８】
本発明の代表的な組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、配列番号５０〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列、または配列番号５０〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、上述したペプチドリンカーを含む。
【０１４９】
好ましくは、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、上述した配列同一性の要件を満たしており、例えば、それが比較される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１５０】
上述したように、本発明の利点は、接続されて融合タンパク質を形成するタンパク質に組み込まれたペプチドリンカー（本発明の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドなど）を、完全に、遺伝的にコードし得るという事実にある。したがって、さらなる態様においては、本発明は、上述したペプチドリンカーまたはポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態においては、上述したペプチドリンカーをコードする核酸分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号１１０のいずれか１つに示すヌクレオチド配列、あるいは配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号１１０のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態においては、上述した組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６０〜６９のいずれか１つに示すヌクレオチド配列、あるいは配列番号６０〜６９のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【０１５３】
好ましくは、上記の核酸分子は、それが比較される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１５４】
核酸配列の同一性は、例えば、設定値が初期値かつｐａｍ因子が可変であって、ギャップ作成ペナルティを１２．０、ギャップ伸長ペナルティを４．０、ウインドウを６ヌクレオチドとしたＧＣＧパッケージを用いるＦＡＳＴＡ検索などによって、決定され得る。好ましくは、該比較は、配列の全長にわたって行われるが、例えば、連続した６００個未満のヌクレオチド、５００個未満のヌクレオチド、４００個未満のヌクレオチド、３００個未満のヌクレオチド、２００個未満のヌクレオチド、１００個未満のヌクレオチド、または５０個未満のヌクレオチドなど、より小さい比較ウインドウに対して行われてもよい。
【０１５５】
本発明の核酸分子は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドのみならず、ワトソン−クリック型またはそれに類似の塩基対相互作用に加わることができる合成ヌクレオチド残基で構成されていてもよい。好ましくは、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１５６】
上述した核酸分子は、発現制御配列、または組み換えＤＮＡクローニング媒体もしくはこのような組み換えＤＮＡ分子を含有するベクターに、作動可能に結合させ得る。このことによって、対象の細胞に導入された遺伝子によって発現される遺伝子産物として、本発明の方法および使用において用いるタンパク質を細胞内で発現すること、例えば本発明のポリペプチドなどを発現することが可能になる。遺伝子発現は、対象の細胞において有効なプロモーター側から行われ、ゲノムへの組み込みのための、または非依存的な複製もしくは一過性トランスフェクション／発現のための、直鎖状または環状核酸（ＤＮＡなど）ベクターの形態で挿入されてもよい。適切な形質転換技術またはトランスフェクション技術は、文献にてよく説明されている。あるいは、ネイキッド核酸（ＤＮＡなど）分子を、本発明のタンパク質およびポリペプチドを作製するため、かつ本発明において用いるため、細胞に直接導入してもよい。あるいは、インビトロにおける転写によって、核酸をｍＲＮＡに変換し、インビトロにおける翻訳によって、該当するタンパク質を生成してもよい。
【０１５７】
適切な発現ベクターは、例えば、本発明の核酸分子に一致する読み枠に結合される翻訳制御因子（開始コドン、終止コドン、リボソーム結合部位など）および転写制御因子（プロモーター−オペレーター領域、終結終止配列など）などの適切な制御配列を含む。適切なベクターとしては、プラスミドおよびウイルス（バクテリオファージおよび真核生物ウイルスの両方を含む）が挙げることができる。適切なウイルスベクターとしては、バキュロウイルスや、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニア／痘症ウイルスも挙げられる。当該技術分野においては、他にも多くのウイルスベクターが説明されている。好ましいベクターとしては、ｐＧＥＸ−ＫＧ、ｐＥＦ−ｎｅｏ、およびｐＥＦ−ＨＡなどの細菌用発現ベクターおよび哺乳類用発現ベクターが挙げられる。
【０１５８】
上述したように、本発明のポリペプチドは、さらなる配列（ポリペプチドの精製を容易にするためのペプチド／タンパク質タグなど）を含んでいてもよく、したがって、好都合なことには、Ｈｉｓ−タグやマルトース結合タンパク質などのさらなるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡに核酸分子を融合させて、発現時に融合タンパク質が生じるようにしてもよい。
【０１５９】
したがって、さらなる態様から見ると、本発明は、上述した核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。
【０１６０】
本発明の他の態様は、本発明に係る組み換え核酸分子を調製する方法を含み、該方法は、本発明のペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を、ベクター核酸に挿入することを含む。
【０１６１】
好ましくはベクターに含まれる本発明の核酸分子は、適切な手段によって細胞に導入され得る。適切な形質転換技術またはトランスフェクション技術は、文献にてよく説明されている。様々な技術が知られており、これらの技術を用いて、このようなベクターを、発現用の原核細胞または真核細胞に導入してもよい。この目的のための好ましい宿主細胞としては、昆虫細胞系、酵母、哺乳類細胞系、またはＢＬ２１／ＤＥ３株などの大腸菌（E. coli）が挙げられる。本発明は、核酸分子、特に、上述したベクターを含有する、形質転換またはトランスフェクションされた原核宿主細胞または真核宿主細胞にもわたるものである。
【０１６２】
したがって、別の態様においては、上述した核酸分子および／またはベクターを含有する組み換え宿主細胞が提供される。
【０１６３】
「組み換え」とは、核酸分子および／またはベクターが、宿主細胞に導入されていることを意味する。宿主細胞は、核酸分子の内因性複製物を元々含有していてもよいし、含有していなくてもよいが、核酸分子および／またはベクターの外因性複製物またはさらなる内因性複製物が導入されていると、組み換えである。
【０１６４】
本発明のさらなる態様は、先に述べた本発明のペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドを調製する方法を提供するものであって、該方法は、上述した核酸分子を含有する宿主細胞を、該ペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドをコードする該核酸分子が発現される条件下で培養することと、それによって生じた該分子（ペプチドリンカーおよび／またはポリペプチド）を回収することとを含む。発現されたペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドは、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、本発明のペプチドリンカーおよび／またはポリペプチド、あるいは本発明の方法および使用において用いるペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドは、例えば、アミノ酸または人工的に生成された小さなペプチドをライゲーションすることによって、あるいは、より好都合なことには、先に述べた該ポリペプチドをコードする核酸分子の組み換え発現によって、人工的に生成されてもよい。
【０１６６】
本発明の核酸分子は、当該技術分野において公知の適切な手段によって、人工的に生成されてもよい。
【０１６７】
したがって、本発明のペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドは、単離・精製された組み換えペプチドリンカーもしくは合成ペプチドリンカー、または組み換えポリペプチドもしくは合成ポリペプチドであってもよい。上述したように、「ポリペプチド」なる語は、本明細書においては、「タンパク質」なる語と交換可能に用いられる。上述したように、典型的には、ポリペプチドまたはタンパク質なる語は、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基であって、例えば、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個のアミノ酸であり、例えば４０〜１０００個、５０〜９００個、６０〜８００個、７０〜７００個、８０〜６００個、９０〜５００個、１００〜４００個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。
【０１６８】
同様に、本発明の核酸分子は、単離・精製された組み換え核酸分子もしくは合成核酸分子であってもよい。
【０１６９】
したがって、別の見方をすると、本発明のペプチドリンカー、ポリペプチド、および核酸分子は、好ましくは、非自然の、すなわち非天然型の、分子である。
【０１７０】
本明細書においては、標準的なアミノ酸命名法を用いる。したがって、アミノ酸残基の正式名称は、一文字コードまたは三文字略語と交換可能に用いられ得る。例えば、リジンを、ＫまたはＬｙｓに替えて用いることができ、イソロイシンを、ＩまたはＩｌｅに替えて用いることがでいる。さらに、アスパラギン酸塩（aspartate）およびアスパラギン酸（aspartic acid）、ならびにグルタミン酸塩（glutamate）およびグルタミン酸（glutamic acid）は、本明細書において交換可能に用いられ、それぞれ、ａｓｐまたはＤ、あるいはｇｌｕまたはＥに替えて用いることができる。
【０１７１】
本発明のペプチドリンカーおよびポリペプチド、ならびに本発明の使用において用いるペプチドリンカーおよびポリペプチドは、組み換えによって作製されることが想定され、これは、本発明の好ましい実施形態であるが、本発明のペプチドリンカーは、融合タンパク質に接続されたタンパク質に、他の手段によって連結されてもよいということは明らかであろう。換言すると、ペプチドリンカーおよびタンパク質は、適切な手段、例えば組み換えによって、個別に作製され、次いで、連結（接続）されて、本発明の方法において用いることができるペプチドリンカー−タンパク質複合体を形成してもよい。例えば、本発明のペプチドリンカーは、上述したように、人工的に、または組み換えによって作製され、化学的リンカーまたは化学的スペーサーなどの非ペプチドリンカーまたは非ペプチドスペーサーを介して、タンパク質（これは、本発明の方法にしたがって融合タンパク質に結合される）に連結されてもよい。
【０１７２】
したがって、いくつかの実施形態においては、融合物に組み入れられるペプチドリンカーおよびタンパク質は、結合によって直接接続されてもよいし、結合基を介して間接的に接続されてもよい。結合基が用いられる場合、このような基は、結合基を介してペプチドリンカーとタンパク質成分とが共有結合するように、選択され得る。対象の結合基は、タンパク質成分の性質に応じて、様々なものがあり得る。結合基が存在する場合、これは、多くの実施形態において、生物学的に不活性である。
【０１７３】
様々な結合基が当業者には知られており、また、本発明において用いられる。代表的な実施形態においては、概して、結合基は少なくとも約５０ダルトンであって、通常は少なくとも約１００ダルトンであり、結合基がスペーサーを含有する場合は、例えば１００００００ダルトンを限度として１０００ダルトンより大きくてもよいが、概して約５００ダルトンを越えることはなく、通常は約３００ダルトンを越えることはない。概して、このようなリンカーは、ペプチドリンカーおよびタンパク質成分と共有結合できる反応性官能基がいずれかの末端をなすスペーサー基を含む。対象のスペーサー基としては、脂肪族不飽和炭化水素鎖、酸素（ポリエチレングリコールなどのエーテル）または窒素（ポリアミン）などのヘテロ原子を含有するスペーサー、ペプチド、炭水化物、ヘテロ原子を含有する可能性のある環状系または非環状系を挙げることができる。金属イオンが存在すると、２つ以上のリガンドと配位結合して複合体を形成するように、スペーサー基が、金属と結合するリガンドを含むものであってもよい。具体的なスペーサーの構成分子としては、１，４−ジアミノヘキサン、キシリレンジアミン、テレフタル酸、３，６−ジオキサオクタン二酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸、１，１’−エチレンビス（５−オキソー３−ピロリジンカルボン酸）、４，４’−エチレンジピペリジンなどが挙げられる。潜在的な反応性官能基としては、求核性官能基（アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド）、求電子性官能基（アルデヒド、エステル、ビニルケトン、エポキシド、イソシアネート、マレイミド）、環状付加反応、ジスルフィド結合の形成、または金属への結合が可能な官能基などが挙げられる。具体的な例としては、第１級アミンおよび第２級アミン、ヒドロキサム酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、炭酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、およびマレイミドなどが挙げられる。対象のブロッキング試薬に用いられ得る具体的なリンカー基としては、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、酒石酸ジスクシンイミジル、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオン酸、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸、グルタルアルデヒド、およびスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸などのヘテロ官能性化合物、ならびに３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）などが挙げられる。
【０１７４】
いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーおよび／またはタンパク質中の残基を１つ以上改変して、これらの分子の連結を容易にし、かつ／あるいはペプチドリンカーおよび／またはタンパク質の安定性を向上させることは、有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態においては、本発明のペプチドリンカー、ポリペプチド、またはタンパク質、あるいは本発明において用いるペプチドリンカー、ポリペプチド、またはタンパク質は、非天然アミノ酸または非標準アミノ酸を含んでいてもよい。
【０１７５】
いくつかの実施形態においては、本発明のペプチドリンカー、ポリペプチド、またはタンパク質、あるいは本発明において用いるペプチドリンカー、ポリペプチド、またはタンパク質は、非従来的な（non-conventional）アミノ酸、すなわち、標準的な遺伝コードではコードされない側鎖を有し、本明細書においては「非コードアミノ酸」と称する、アミノ酸を、１つ以上、例えば少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、含んでいてもよく、例えば、１０個、１５個、２０個またはそれ以上の非従来的なアミノ酸を含んでいてもよい（表１などを参照）。これらは、代謝過程で形成されるオルニチンもしくはタウリンなどのアミノ酸、および／または９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）などで保護されたアミノ酸もしくはベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）基を有するアミノ酸などの人工的に改変されたアミノ酸から選択されてもよい。
【０１７６】
本発明のペプチドリンカーまたはポリペプチド、あるいは本発明において用いるペプチドリンカーまたはポリペプチドにおいて用い得る非標準アミノ酸または構造類似アミノ酸としては、例えば、Ｄアミノ酸、アミド等電子体（Ｎ−メチルアミド、レトロ逆アミド（retro-inverse amide）、チオアミド、チオエステル、ホスホン酸塩、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）−ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオ、またはアルカン）、Ｌ−Ｎメチルアミノ酸、Ｄ−αメチルアミノ酸、Ｄ−Ｎ−メチルアミノ酸などが挙げられる。表１に、非従来的なアミノ酸、すなわち非コードアミノ酸の例を挙げる。
【０１７７】
【表１】
2018521640.tif 000003
2018521640.tif 000004
【０１７８】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、例えば固相を用いて（上述したように）不均一系で行われてもよく、本方法においては、伸長する融合タンパク質、好ましくは融合タンパク質鎖における第１のタンパク質または第２のタンパク質、を固相上に固定し、洗浄ステップを用いてもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、本方法は固相法（すなわち不均一法）である。別の見方をすると、本方法は、固相または固体基質上で行われる。固相アッセイの使用は、有利である。例えば、洗浄ステップを行うことで、ペプチドリガーゼや、ペプチドリンカーの脱ブロッキング（脱ケージング、脱遮蔽、脱保護）に関わる成分など、次の反応（すなわち融合タンパク質へのさらなるタンパク質の付加）に干渉し得る過剰な未反応タンパク質および／または成分の除去を援助することができる。
【０１７９】
融合タンパク質の固相への固定化は、様々な方法で行われ得る。融合タンパク質の固定化、すなわち担体への結合は、あらゆる簡便な方法で行われてもよい。いくつかの実施形態においては、融合タンパク質の第１のタンパク質または第２のタンパク質が、固相担体に固定化される。したがって、いくつかの実施形態においては、本方法は、第１のタンパク質を固相担体に固定化するステップを含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、本方法は、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む結合タンパク質を、固相担体に固定化するステップを含んでいてもよい。
【０１８０】
したがって、固定化の様式または手段、および固相担体は、当該技術分野において広く知られ、文献にて説明されている任意の数の固定化手段および固相担体から、好みに応じて選択されてもよい。したがって、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質中の少なくとも１つのタンパク質のドメインまたは部位を介して、直接、担体に結合（例えば、化学的に架橋結合）されてもよい。いくつかの実施形態においては、融合タンパク質は、リンカー基によって、または中継結合基によって（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互反応によって）、間接的に結合されてもよい。したがって、融合タンパク質は、固相担体に共有結合してもよいし、非共有的に結合してもよい。結合は、可逆的結合（例えば、切断可能な結合）であってもよいし、不可逆的結合であってもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、結合は、酵素によって切断されてもよいし、化学的に切断されてもよいし、光によって切断されてもよい。例えば結合は、感光性結合であってもよい。
【０１８１】
したがって、いくつかの実施形態においては、融合タンパク質に含まれるタンパク質は、固定化手段（例えば、担体に備えられたストレプトアビジンまたは抗体などの結合パートナー、すなわち同系結合パートナーに結合することができるビオチンまたはハプテンなどの親和性結合パートナー）を備えていてもよい。いくつかの実施形態においては、担体に固定化されるタンパク質は、マルトース結合タンパク質、抗体などの結合タンパク質であってもよい。融合タンパク質と固相担体との間の相互作用は、洗浄ステップが可能となるくらいに、強固でなければならない。すなわち、融合タンパク質と固相担体との間の相互作用は、洗浄ステップによって分断されない（大きくは分断されない）。例えば、各洗浄ステップによって、固相から除去されるまたは溶出する融合タンパク質は、５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、または０．１％未満であることが好ましい。この点において、発明者らは、マルトースに対する結合親和性が向上し、それによって本発明の方法に特に役立つ改変マルトース結合タンパク質を開発した。
【０１８２】
したがって、本発明のさらなる態様は、配列番号７０に示すアミノ酸配列、または配列番号７０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するマルトース結合タンパク質を提供する。
【０１８３】
いくつかの実施形態においては、上記のマルトース結合タンパク質は、それが比較される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０１８４】
好ましくは、配列番号７０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するマルトース結合タンパク質は、配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等である。すなわち、配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同じか、またはそれよりも高い親和性で、マルトースと結合することができる。例えば、本発明のマルトース結合タンパク質のマルトースに対する結合親和性は、０．２μＭ未満であり、例えば、０．１μＭ以下、０．０８μＭ以下、０．０５μＭ以下、０．０３μＭ以下、または０．０１μＭ以下である。好ましい実施形態においては、配列番号７０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するマルトース結合タンパク質は、３１２位および３１７位にバリンを含む。
【０１８５】
本発明は、上述したマルトース結合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。いくつかの実施形態においては、核酸分子は、配列番号７１に示すヌクレオチド配列、または配列番号７１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態においては、マルトース結合タンパク質は、本明細書で述べるペプチドリンカーを含む（例えば、連結されている）。またさらなる実施形態においては、マルトース結合タンパク質は、上述したアミノ酸配列を２つ以上（例えば、２つまたは３つ）有する。すなわち、繰り返し配列を有する。
【０１８７】
融合タンパク質、例えば融合タンパク質に組み入れられた第１のタンパク質の固定化は、融合タンパク質に組み入れられるさらなるタンパク質（第２のタンパク質など）との接触前に行われてもよいし、接触後に行われてもよい。さらに、このような「固定化可能な」融合タンパク質は、担体と共に、さらなるタンパク質と接触させてもよい。
【０１８８】
固相担体は、固定化や分離などに現在広く用いられている、または提案されている、公知の担体またはマトリクスのいずれであってもよい。これらの形態としては、粒子（例えば、磁気ビーズであってもよいし、常磁性ビーズであってもよいし、非磁気ビーズであってもよい）、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、毛細管、スライド、アレイもしくはマイクロタイターストリップ、チューブ、プレート、またはウェルなどのいずれであってもよい。
【０１８９】
担体は、ガラス製、シリカ製、ラテックス製、またはポリマー材料製のいずれであってもよい。融合タンパク質が結合する表面積が大きい材料が適している。このような担体の表面は、凹凸があってもよく、例えば、粒子、繊維、ウェブ、焼結体または篩などの多孔性または粒状のものであってもよい。ビーズなどの粒状材料は、結合容量が大きいので有用であり、特にポリマービーズが有用である。
【０１９０】
好都合なことには、本発明にしたがって用いられる粒状固相担体は、球状のビーズを含む。ビーズの大きさは重要ではないが、その直径のオーダーは、例えば、少なくとも１μｍ、好ましくは少なくとも２μｍであってもよく、好ましくは、最大直径は１０μｍ以下、例えば、６μｍ以下であってもよい。
【０１９１】
大きさが実質的に均一である（例えば、直径の標準偏差が５％未満の大きさである）単分散粒子は、反応の再現性が非常に一定であるという点で、有利である。代表的な単分散ポリマー粒子は、ＵＳ−Ａ−４３３６１７３で説明されている技術によって作製され得る。
【０１９２】
しかしながら、取り扱いおよび分離の助けとなるという点では、磁気ビーズが有利である。本明細書における「磁気」なる語は、磁界に置かれた際に、担体に磁気モーメントが付与され得、そのため、磁界の作用によって担体の変位が可能であることを意味する。換言すると、磁気粒子を含む担体は、磁気凝集によって容易に除去され得、それによって、イソペプチド結合形成ステップの後に、粒子を分離する速くて簡便で効率的な方法が提供される。
【０１９３】
いくつかの実施形態においては、固相担体は、アミロース樹脂である。
【０１９４】
最後から２番目のタンパク質と、最後のタンパク質との間のイソペプチド結合が形成されると、固相担体からタンパク質を除去する、または溶出させることが望ましい。したがって、いくつかの実施形態においては、本方法は、固相担体から融合タンパク質を溶出させる、または除去するステップを含む。
【０１９５】
上記したように、ある種のプロトコールにおいては、本発明の方法によって、アレイなどの同一の固相担体上で、２つ以上の融合タンパク質を同時に作製するようにしてもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、本発明の方法を、複合的および／またはハイスループットな様式であると見なしてもよい。
【０１９６】
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明の方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態においては、融合タンパク質は、固体基質上に固定化される。したがって、またさらなる実施形態においては、本発明は、本発明の方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質を少なくとも１つ含む固体基質を提供する。いくつかの実施形態においては、固体基質は、本発明の方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質（配列が異なる融合タンパク質）を２つ以上含むアレイ（すなわちタンパク質アレイ、特に融合タンパク質アレイ）の形態であってもよい。いくつかの実施形態においては、アレイは、融合タンパク質、すなわち異なる（構造または配列が異なる）融合タンパク質を、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個、または少なくとも１００００個、含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質を、２つ以上混合して、融合タンパク質ライブラリを形成してもよい。したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、本発明の方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質を少なくとも２つ含む融合タンパク質ライブラリを提供する。いくつかの実施形態においては、ライブラリは、融合タンパク質、すなわち異なる（構造または配列が異なる）融合タンパク質を、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個、または少なくとも１００００個、含む。いくつかの実施形態においては、ライブラリは、ビーズまたは粒子などの固体基質上に固定化された融合タンパク質を含む。例えば、ビーズまたは粒子などの固体基質は、それぞれ異なる融合タンパク質を含んでいてもよい。
【０１９８】
本発明の方法を、不均一な実施形態を用いて例示したが、本方法は、均一系（すなわち溶液）に用いられてもよいことが、本明細書の開示から容易に明らかとなるであろう。しかしながら、融合タンパク質の混合物の生成を避けるために、いくつかの実施形態においては、伸長後の各反応において、融合タンパク質を他の成分から分離する必要があるであろう。分離または精製は、適切な手段によって行われ得る。例えば、融合タンパク質鎖のうちの１つのタンパク質は、精製用のタグを含んでいてもよいし、アフィニティクロマトグラフィなどの反応中、融合タンパク質の他の成分からの分離を容易にする結合タンパク質（マルトース結合タンパク質など）であってもよい。さらに、またはあるいは、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、超遠心法、遠心ろ過、透析、透析ろ過などの、他の精製／分離法を用いてもよい。
【０１９９】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、イソペプチド結合を形成するステップの後に、融合タンパク質を分離または精製するステップを含んでいてもよい。
【０２００】
さらなる実施形態においては、本発明は、キット、特に、本発明の方法または使用、すなわち融合タンパク質の作製または合成において用いるキットを提供し、該キットは、
（ａ）上述したペプチドリンカーを含む組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる、上述したペプチドリンカーを含む組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および／または、
（ｃ）上述したペプチドリンカーをコードする核酸分子、特にベクター、および／または、
（ｄ）（ｂ）の核酸分子にコードされているペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーをコードする核酸分子、特にベクター
を含むキットであって、
場合によっては、前記（ａ）および／または（ｂ）の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのペプチドリンカーに対して直交しているペプチドリンカー対の一部である、さらなるペプチドリンカーを含む。
【０２０１】
本発明の方法および使用は、インビトロにおける方法および使用、すなわちインビトロにおける融合タンパク質の合成方法と定義されてもよい。
【０２０２】
本発明の方法は、特定のタンパク質を結合して融合タンパク質を形成することに限定されないということは、明らかであろう。したがって、本方法においては、本明細書で述べるタンパク質またはポリペプチド、すなわち所望のタンパク質またはポリペプチドを、どれでも用い得る。換言すると、本発明においては、融合タンパク質に含む、または組み入れることを望むタンパク質またはポリペプチドをどれでも用い得る。さらに、本発明の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、本発明のペプチドリンカーに結合されたタンパク質を含み得る。タンパク質は、適切な供給源由来のものであってもよいし、そこから得られたものであってもよい。例えば、タンパク質は、インビトロで翻訳されたものであってもよいし、生物（真核生物、原核生物）の細胞試料もしくは組織試料、またはそれらに由来する体液もしくは標本、さらには、細胞培養液、細胞標本、細胞溶解物などのような試料などの生物試料および臨床試料から精製されたものであってもよい。タンパク質は、例えば土壌試料もしくは水試料、または食品試料をも含む、環境試料に由来してもよいし、そこから得られてもよく、例えばそのような試料から精製されてもよい。試料は、新たに調製されてもよく、例えば保存中に、都合のよい方法で前処理されてもよい。
【０２０３】
上記したように、好ましい実施形態においては、融合タンパク質に組み入れられるタンパク質は、組み換えによって作製されてもよく、したがって、該タンパク質をコードする核酸分子は、真核細胞または原核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、およびオルガネラを全て含む、ウイルス材料または細胞材料などの適切な供給源に由来するものであってもよいし、そこから得られたものであってもよい。したがって、このような生物材料は、全ての種類の哺乳類細胞、非哺乳類細胞、植物細胞、藍藻を含む藻類、真菌、細菌、原生動物などを含み得る。いくつかの実施形態においては、融合タンパク質に結合されるタンパク質は、合成タンパク質であってもよい。
【０２０４】
代表例として、本発明に係る融合タンパク質に接続されるタンパク質は、酵素、構造タンパク質、抗体、抗原、プリオン、受容体、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、ホルモンなど、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態においては、本発明の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および本方法に用いる組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、イソペプチドタンパク質でもないし、ペプチドリンカーが由来するイソペプチドタンパク質とは異なるイソペプチドタンパク質でもない。
【０２０６】
いくつかの実施形態においては、融合タンパク質は、繰り返し構造を含んでおり、例えば、同じタンパク質が結合していてもよい。別の見方をすると、融合タンパク質は、同じ配列を有するタンパク質ユニットを２つ以上含有していてもよい。融合タンパク質が、同じ配列を有するタンパク質ユニットを２つ以上含有している場合、これらのタンパク質ユニットは、連続的であって、例えば、タンパク質ユニットを接続するペプチドリンカーのみによって分離されていてもよく、また、連続的でなくても、一連でなくてもよい（例えば、異なる配列を有する１つ以上のタンパク質によって分離されている）。いくつかの好ましい実施形態においては、融合タンパク質は、異なる配列を有するタンパク質を少なくとも２つ含み、例えば、異なる配列を有するタンパク質を少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、含む。異なる配列を有するタンパク質は、融合タンパク質の目的に応じて、適切な順序で配置され得る。
【０２０７】
またさらなる実施形態においては、タンパク質は、本明細書で述べるペプチドリンカー２つ以上と、場合によっては該ペプチドリンカーを接続するペプチドスペーサーなどのスペーサー１つ以上とからなるものであってもよい。この場合、上述したように、タンパク質を、機能しないタンパク質、またはリンカータンパク質／リンカーペプチドと見なし得る。これらの実施形態においては、融合タンパク質のもう一方のタンパク質は、異なるタンパク質または機能性タンパク質である。すなわち、ペプチドリンカーおよびスペーサーとは異なる配列を有する。したがって、いくつかの実施形態においては、融合タンパク質は、配列番号５６〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列、または配列番号５６〜５９のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を１つ以上含んでおり、該タンパク質は、上述したペプチドリンカーを少なくとも２つ含む。例えば、機能しないタンパク質は、融合タンパク質の第２のタンパク質として、すなわち、第１のタンパク質と第３のタンパク質とを結合する第２のタンパク質として用いられてもよいし、融合タンパク質の第４のタンパク質として、すなわち、第３のタンパク質と第５のタンパク質とを結合する第４のタンパク質として用いられてもよい。この代表例においては、第２のタンパク質および第４のタンパク質は、同じタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、融合タンパク質のタンパク質ユニットは、リンカータンパク質を交互に含んでいてもよく、例えば、機能性タンパク質−リンカータンパク質−機能性タンパク質や、リンカータンパク質−機能性タンパク質−リンカータンパク質などであってもよい。
【０２０８】
いくつかの実施形態においては、上記のタンパク質は、それが比較される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する。
【０２０９】
「融合タンパク質」は、共有結合によって、好ましくは本明細書で述べるイソペプチド結合によって、結合しているタンパク質ユニットを少なくとも２つ、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上含む、例えばタンパク質ユニットを１５個、２０個、２５個、または５０個含むポリマーとして定義され得る。タンパク質ユニットは、連続したアミノ酸を少なくとも４０個含む分子として定義され得、好ましくは、タンパク質はインビボにおいて機能を有するものであり、例えば、タンパク質は、１つ以上の生体成分に対して特異的に反応することが出来るものであって、例えば、インビボにおいて活性を有するものである。したがって、融合タンパク質を、共有結合によって、好ましくは本明細書で述べるイソペプチド結合によって、結合しているタンパク質ユニットを少なくとも２つ、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上含む、例えばタンパク質ユニットを１５個、２０個、２５個、または５０個含む巨大構造体、高分子、巨大分子、またはポリタンパク質と見なし得る。
【０２１０】
本発明において、融合タンパク質の２つ以上のタンパク質についての「結合する」、「結合した」、または「結合している」なる語は、該タンパク質を、共有結合を介して、特に該タンパク質に組み入れられているペプチドリンカー（該タンパク質のドメインを形成するペプチドリンカーなど）の間に形成されるイソペプチド結合を介して、接続（joining）または連結することをいう。
【０２１１】
ここまで、共に反応してイソペプチド結合を形成するリンカー対に関して、本発明を説明したが、各（同系）リンカー対は、別の見方をすると、反応してイソペプチド結合を形成する（該タンパク質を結合／連結する）別々の、または分離可能な、２つの部分（２つのタグや、タグと結合パートナー）から形成される単一のペプチドリンカーと見なされ得る。したがって、この観点からだと、本発明を、融合タンパク質を作製するために直交した２つのペプチドリンカーを使用することと見なし得、各ペプチドリンカーは、反応してイソペプチド結合を形成する分離可能な２つの部分を含むか、またはそれらからなるものであり、またリンカーの各部分は、結合（連結）されるタンパク質に組み入れられる（タンパク質のドメインを形成する）。
【０２１２】
本明細書で述べる方法および使用、ならびに本明細書で述べる方法によって得られた、または得ることができる融合タンパク質は、広範囲に役立つ。別の見方をすると、本明細書で述べる方法によって作製された融合タンパク質は、様々な産業において用いられ得る。例えば、本発明の方法は、予防接種用の融合タンパク質を作製するのに有用であり得る。この場合、本方法は、直接注射される鎖、またはウイルス様粒子（ＶＬＰＳ）を修飾するのに用いられる鎖に、タンパク質抗原を結合するのに有用であり得る。なぜなら、抗原の多量化によって、免疫応答が大きく増強されるからである。
【０２１３】
本発明の方法は、基質チャネリングなどの酵素的性質が向上した融合タンパク質を作製するのに有用であり得る。この点において、酵素は、細胞内の経路において共に機能することが多く、従来より、細胞外（インビトロ）において複数の酵素を接続することは難しかった。したがって、本発明の方法を用いて、多段階の酵素経路の活性を増強することができ、このことは、様々な工業的転化や診断に有用であり得る。
【０２１４】
本発明の融合タンパク質の安定性に関する性質も、増強され得る。すなわち、融合タンパク質のタンパク質ユニットの安定性は、個別のタンパク質としてのそれらの安定性と比較して、増強され得る。特に、融合タンパク質は、タンパク質ユニットの熱安定性を向上させ得る。この点において、酵素は、多くのプロセスで役に立つ手段であるが、不安定で回復しにくいものである。酵素ポリマーは、温度やｐＨ、有機溶媒に対する安定性が高く、工業プロセスにおいて、酵素ポリマーを用いることに対する要望が高まっている。しかしながら、本発明以前は、酵素ポリマーの生成には、通常、グルタルアルデヒドの非特異的な反応が用いられていたが、これによって、潜在的に有用な酵素の多くが、損傷を受けたり変性したり（すなわち、活性が低下）する。本発明に係るイソペプチド結合を介した鎖（ポリマー）へのタンパク質の部位特異的な結合は、例えば動物用飼料に添加された診断薬や酵素において、酵素の復元力を増強することが期待される。特に好ましい実施形態においては、酵素は、上述したように、環状化によって安定化されてもよい。
【０２１５】
本発明の方法は、抗体ポリマーの作製にも役立つ。この点において、抗体は、医薬品類において最も重要なものの１つであり、表面に付着させて用いられる。しかしながら、抗原の試料への混合、および、ひいては該試料中における該抗原の捕捉は、表面付近では非効率的である。抗体鎖を伸長させることによって、捕捉効率の向上が期待される。これは、循環腫瘍細胞の単離に特に有用であり、現時点で、早期の癌診断を可能にする最も有望な方法の１つである。また、特異性が異なる抗体を、所望の順序で組み合わせることができる。
【０２１６】
またさらなる実施形態においては、本発明の方法は、細胞シグナル伝達を活性化する薬剤の作製に役立ち得る。この点において、細胞機能を活性化する最も効果的な方法の多くは、タンパク質リガンドを介するものである。しかしながら、現実には、タンパク質リガンドは、通常、単独では機能せず、他のシグナル伝達分子との特異的な組み合わせによって機能する。したがって、本発明の方法によって、テーラーメイドな融合タンパク質（tailored fusion proteins）（すなわちタンパク質団）を生成することができ、これによって、細胞シグナル伝達の活性化が最適となる。これらの融合タンパク質（タンパク質団）を用いて、細胞の生存、分割、または分化を制御し得る。
【０２１７】
またさらなる実施形態においては、本発明のペプチドリンカー、特に本発明のペプチドリンカー対は、幹細胞増殖用のヒドロゲルの生成、生体材料の調製、染料を用いた抗体の機能化、または環状化による酵素の安定化に有用であり得る。
【０２１８】
次に、本発明を、以下の限定されない実施例において、以下の図面を参照してより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１は、スヌープタグ／スヌープキャッチャーおよびスパイタグ／スパイキャッチャーという直交したペプチドリンカー対を２つ用いた融合タンパク質の固相合成の代表例の概略図を示す。
【図２】図２は、スヌープタグおよびスヌープキャッチャーのペプチドリンカー対が由来するＲｒｇＡタンパク質におけるイソペプチド結合形成の概略図を示す（タンパク質構造データバンクＩＤ ２ＷＷ８に基づいて番号を付けている）。
【図３】図３は、スヌープタグ−ＭＢＰのスヌープキャッチャーとの反応の特性を、スヌープタグの反応性Ｌｙｓをアラニンへ変異させたコントロール（ＫＡ）またはスヌープキャッチャーの反応性Ａｓｎをアラニンへ変異させたコントロール（ＮＡ）と並べて明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図４】図４の（Ａ）は、スヌープキャッチャーのスヌープタグ−ＭＢＰに対する比を１：１または２：１としたスヌープタグ反応の経時変化を表すグラフを示し、（Ｂ）は、スヌープキャッチャーのスヌープタグ−ＭＢＰに対する比を２：１としたスヌープタグ−ＭＢＰのスヌープキャッチャーとの反応の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示し、（Ｃ）は、スヌープキャッチャーのスヌープタグ−ＭＢＰに対する比を１：１、２：１、または４：１としたスヌープタグ反応の経時変化を表すグラフを示し、（Ｄ）は、スヌープキャッチャーのスヌープタグ−ＭＢＰに対する比を４：１としたスヌープタグ−ＭＢＰのスヌープキャッチャーとの反応の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図５】図５の（Ａ）は、スヌープタグ−ＭＢＰとスヌープキャッチャーとの間におけるイソペプチド結合形成のｐＨ依存性を表す棒グラフを示し、（Ｂ）は、スヌープタグ−ＭＢＰとスヌープキャッチャーとの間におけるイソペプチド結合形成の温度依存性を表す図を示す。
【図６】図６の（Ａ）は、スヌープタグ−ＭＢＰとスヌープキャッチャーとの間におけるイソペプチド結合形成の、塩、還元剤、および界面活性剤に対する依存性を表す棒グラフを示し、（Ｂ）は、スヌープタグ−ＭＢＰとスヌープキャッチャーとの間におけるイソペプチド結合形成のＴＭＡＯ依存性を表すグラフを示す。
【図７】図７は、スヌープタグ／スヌープキャッチャーおよびスパイタグ／スパイキャッチャーの直交した反応性の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図８】図８の（Ａ）は、ＰｓＣｓタグ／ＰｓＣｓキャッチャー、スヌープタグ／スヌープキャッチャー、およびスパイタグ／スパイキャッチャーの直交した反応性の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示し、（Ｂ）は、ＲｒｇＡタグ／ＲｒｇＡキャッチャー、スヌープタグ／スヌープキャッチャー、およびスパイタグ／スパイキャッチャーの直交した反応性の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図９】図９の（Ａ）は、融合タンパク質の固相合成を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１〜３は、ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ、およびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを個別に示す。ＭＢＰｘ−スパイキャッチャーをアミロース樹脂に結合させ、スヌープタグ−アフィボディ（Affibody）−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを用いた段階的な反応を行った。各段階後、試料の一定分量を、マルトースを用いて樹脂から溶出させた（レーン４〜１３）。試料は、さらなる精製を行わずに解析した。（Ｂ）は、融合タンパク質の固相合成を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１〜３は、ビオチン−スパイキャッチャー、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ、およびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを個別に示す。ビオチン−スパイキャッチャーをストレプトアビジンアガロースに結合させ、スヌープタグ−アフィボディ−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを用いた段階的な反応を行った。各段階後、試料の一定分量を、ビオチンを用いてアガロースから溶出させた（レーン４〜１３）。試料は、さらなる精製を行わずに解析した。
【図１０】図１０の（Ａ）は、十量体融合タンパク質であるビオチン−スパイキャッチャー：（スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ：スパイキャッチャー−スヌープキャッチャー）4：スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグの同一性を分析するエレクトロスプレーイオン化質量分析を表すグラフを示し、（Ｂ）は、十量体融合タンパク質であるＭＢＰｘ−スパイキャッチャー：（スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ：スパイキャッチャー−スヌープキャッチャー)4：スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグのサイズ排除クロマトグラフィ解析を表すグラフを示す。挿入図は、分子量の基準を示す。
【図１１】図１１の（Ａ）は、十量体融合タンパク質であるＭＢＰｘ−スパイキャッチャー：（スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ：スパイキャッチャー−スヌープキャッチャー)4：スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグの熱安定性を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示し、（Ｂ）は、十量体融合タンパク質であるビオチン−スパイキャッチャー：（スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ：スパイキャッチャー−スヌープキャッチャー）4：スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグの時間依存的な安定性を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図１２】図１２は、融合タンパク質の固相合成を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１〜３は、ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー、スヌープタグ−ｍＥＧＦＰ−スパイタグ、およびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを個別に示す。ＭＢＰｘ−スパイキャッチャーをアミロース樹脂に結合させ、スヌープタグ−ｍＥＧＦＰ−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを用いた段階的な反応を行った。各段階後、試料の一定分量を、マルトースを用いて樹脂から溶出させた（レーン４〜９）。試料は、さらなる精製を行わずに解析した。（Ｂ）は、融合タンパク質の固相合成を解析する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１〜３は、ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー、スヌープタグ−スパイタグ−Ａｆｆｉ３、およびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを個別に示す。（Ａ）と同様に段階的な反応を行い、解析した。
【図１３】図１３は、本発明の方法を用いて得ることができる分岐融合タンパク質の簡易な構造を２つ表す図を示す。
【図１４】図１４は、ＭＢＰと融合させた変異型ＲｒｇＡタグ（ＲｒｇＡタグ２．０、配列番号１１１）をＲｒｇＡキャッチャーと反応させた場合の活性を、ＭＢＰと融合させた非変異型ＲｒｇＡタグ（配列番号９）をＲｒｇＡキャッチャーと反応させた場合の活性と比較する、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図１５】図１５は、ＲｒｇＡキャッチャーと反応させた様々なＲｒｇＡタグペプチドリンカー変異体（ＳＵＭＯと融合させた）の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図１６】図１６は、ＲｒｇＡタグ２のＲｒｇＡキャッチャーに対する比を１：１、２：１、または４：１としたＲｒｇＡタグ２反応の経時変化を表すグラフを示す。挿入グラフは、反応開始後８分間の反応を示す。
【図１７】図１７は、スヌープタグ、スヌープキャッチャー、スパイタグ、スパイキャッチャー、およびＲｒｇＡタグ２に対するＲｒｇＡキャッチャーの反応性の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【図１８】図１８は、ＲｒｇＡタグ２／ＲｒｇＡキャッチャー、スヌープタグ／スヌープキャッチャー、およびスパイタグ／スパイキャッチャーの直交した反応性の特性を明らかにする、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【０２２０】
［実施例］
（実施例１−自発的イソペプチド結合を形成する同系ペプチドリンカー対の設計および合成）
ＲｒｇＡ（配列番号２１）は、ヒトにおいて敗血症、肺炎、および髄膜炎を引き起こし得るグラム陽性細菌である肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来のアドヘシンである。自発的なイソペプチド結合は、ＲｒｇＡのＤ４免疫グロブリン様ドメインにおいて、Ｌｙｓ７４２残基とＡｓｎ８５４残基との間で形成される（図２）。発明者らは、Ｄ４ドメインを、スヌープタグと命名されたペプチドリンカー（７３４位の残基と７４８位の残基との間、配列番号１）の対と、スヌープキャッチャーと命名したタンパク質（７４９位の残基と８６０位の残基との間、配列番号２）とに分割した。
【０２２１】
しかしながら、発明者らは、本発明で用いる安定したペプチドリンカー対を形成するためには、スヌープキャッチャーペプチドリンカーに変異を２つ導入する必要があることを見出した。この点において、発明者らは、スヌープキャッチャーにＧ８４２Ｔ変異を導入してβ−ストランドを安定化させ、またＤ８４８Ｇ変異を導入して反応部位に近いヘアピンターンを安定化させた。
【０２２２】
スヌープタグペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびＨｉｓ−タグと融合させた組み換えポリペプチドとして発現させた（配列番号５０）。スヌープキャッチャーは、Ｈｉｓ−タグと融合させた組み換えポリペプチドとして発現させた（配列番号３９）。スヌープタグ−ＭＢＰおよびスヌープキャッチャーは、可溶性タンパクとして、大腸菌（Escherichia coli）のサイトゾルにおいて効率よく発現され、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィによって、その精製を行った。スヌープタグ−ＭＢＰおよびスヌープキャッチャーは、混合するだけで、ＳＤＳ存在下での煮沸に対して安定な複合体を形成した（図３）。反応性があると見なされているスヌープタグのＬｙｓ７４２の変異（スヌープタグＫＡ−ＭＢＰ）および反応性があると見なされているスヌープキャッチャーのＡｓｎ８５４の変異（スヌープキャッチャーＮＡ）によって、反応は起こらなくなった（図３）。エレクトロスプレーイオン化質量分析によって、スヌープキャッチャーと合成スヌープタグペプチドとの間におけるイソペプチド結合によりＮＨ3が失われていることが立証され、また、大腸菌（E. coli）での過剰発現において一般的に生じるアセチル化副生物およびグルコニル化副生物も観察された。
【０２２３】
スヌープキャッチャーのスヌープタグ−ＭＢＰに対する比を１：１とすると、収率が８０％に達するまで反応が進んだ。しかしながら、スヌープキャッチャーを２倍過剰にすると、スヌープタグ−ＭＢＰは定量的に反応した（図４Ａおよび４Ｂ）。同様に、スヌープタグ−ＭＢＰを過剰にすると、スヌープキャッチャーは１００％まで消費された（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０２２４】
発明者らは、さらに、反応はｐＨ６〜９において効率的に進行するが、ｐＨ５においては進行が遅くなることを立証した（図５Ａ）。反応は室温で最も速く進行するが、４℃および３７℃においても起こった（図５Ｂ）。スヌープタグおよびスヌープキャッチャーにはシステインは存在しないので、期待通り、反応はジチオスレイトール（ＤＴＴ）の影響を受けなかった。反応をＰＢＳ中、さらにトリトン（Triton）Ｘ−１００やトゥィーン（Tween）２０などの界面活性剤存在下または高塩濃度（１Ｍ ＮａＣｌ）において行った場合、特定の緩衝液成分が必要となることはなかった（図６Ａ）。化学シャペロンであるトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）によって、適度な向上が見られた（図６Ｂ）。
【０２２５】
中性条件においては、通常、アミド結合の自発的な加水分解は長い年月を要するが、この特定のタンパク質環境下において、加水分解が加速するかを調べた。過剰量の別のスヌープタグ結合タンパク質またはアンモニアと競合することによるスヌープタグ−ＭＢＰ／スヌープキャッチャーの相互作用の切断を探索したが、可逆性は観察されなかった。
【０２２６】
スヌープタグ／スヌープキャッチャーのペプチドリンカー対とは異なる方向にＤ４免疫グロブリン様ドメインを分割することによって、ＲｒｇＡタンパク質から、さらなるペプチドリンカー対を開発した。このペプチドリンカー対を、ＲｒｇＡタグ（配列番号９）およびＲｒｇＡキャッチャー（配列番号１０）と命名した。ＰｓＣｓタンパク質（配列番号３１）に基づいたペプチドリンカー対も開発し、ＰｓＣｓタグ（配列番号５）およびＰｓＣｓキャッチャー（配列番号６）と命名した。
【０２２７】
上述したスヌープタグ／スヌープキャッチャー対と類似した様々な条件下で、各ペプチドリンカー対は、イソペプチド結合を自発的に形成することができる。
【０２２８】
（実施例２−ペプチドリンカー対の交差反応性の研究）
反応して自発的にイソペプチド結合を形成するペプチドタグおよび結合パートナーである、スパイタグおよびスパイキャッチャー（配列番号１３および１４）が、以前に開発されている（ＷＯ２０１１／０９８７７２）。
【０２２９】
スヌープタグは反応性Ｌｙｓを有し、一方スパイタグは反応性Ａｓｐを有しているので、発明者は、スヌープタグ／スヌープキャッチャー対およびスパイタグ／スパイキャッチャー対は、完全に直交している、すなわち、交差反応性を示さないという仮説を立てた。様々な組み合わせでペプチドリンカーを混合すると、各同系ペプチドリンカー対は効率的に反応することがわかったが、一晩インキュベートした後であっても、各対の間において交差反応は見られなかった（図７）。この結果から、スヌープタグ／スヌープキャッチャー対は、スパイタグ／スパイキャッチャーに対して直交していることが確認された。
【０２３０】
また、発明者は、スヌープタグ／スヌープキャッチャー対およびスパイタグ／スパイキャッチャー対に対する、ＰｓＣｓタグ／ＰｓＣｓキャッチャー対およびＲｒｇＡタグ／ＲｒｇＡキャッチャー対の交差反応性も調べた。図８Ａおよび８Ｂに示すように、「ＰｓＣｓ」対と「スパイ」対または「スヌープ」対との間において、有意な交差反応性は見られなかった。同様に、「ＲｒｇＡ」対と「スパイ」対または「スヌープ」対との間において、有意な交差反応性は見られなかった。したがって、各ペプチドリンカー対は、他のペプチドリンカー対に対して直交している。
【０２３１】
（実施例３−直交した２つのペプチドリンカー対を用いた融合タンパク質の合成）
発明者らは、「スパイ」ペプチドリンカー対および「スヌープ」ペプチドリンカー対を用いることによって、このような直交したペプチドリンカー対を用いて、融合タンパク質の合成に成功できるということを実証した。
【０２３２】
大腸菌ＭＢＰとアミロース樹脂との相互作用は、アフィニティ精製に広く用いられている。ＭＢＰ融合物は、典型的には、うまく折り畳まれて発現され、樹脂に対する非特異的な結合は少ない。ＭＢＰは、マルトースを用いて選択的に穏やかに溶出されるので、プロテアーゼを除去する必要がない。野生型ＭＢＰのマルトースに対する親和性は、１．２μＭであり、これはタンパク質精製において実用的であるが、融合タンパク質の合成において洗浄および鎖の伸長を複数回行うには不十分である。したがって、発明者らは、変異型ＭＢＰを開発して、そのマルトースに対する結合安定性を向上させた。まず、発明者らは、Ａ３１２Ｖの変異およびＩ３１７Ｖの変異を導入し、１７２位、１７３位、１７５位、および１７６位の残基を欠失させることによって、ポリペプチド配列を改変した。次に、ＭＢＰ変異体（配列番号７０）を直列状に結合させて、ＭＢＰｘ（Ｈｉｓ6−ＭＢＰｍｔ−リンカーＭＢＰｍｔ）を生成した。
【０２３３】
最初の鎖の構築のために、発明者らは、大腸菌のサイトゾルにおいて効率的に発現される非免疫グロブリン骨格であるアフィボディを組み入れた。ＨＥＲ２に対するアフィボディを、スヌープタグのＮ末端およびスパイタグのＣ末端に結合させた（スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ、配列番号７２）。螺旋状のスペーサーを介してスヌープキャッチャーに接続されたスパイキャッチャー（スパイキャッチャー−スヌープキャッチャー（配列番号５６）、これもまた、大腸菌において、可溶性タンパク質として効率的に発現される）を用いて、アフィボディユニットを接続した（図１）。各結合は共有結合であるので、鎖を合成した後、マルトースを添加して樹脂から溶出させ、上清を煮沸し、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって融合タンパク質の伸長を追跡した（図９Ａ）。ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー（アミロース樹脂に結合している）は、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグと定量的に反応した（図９Ａ、レーン５）。その後、このコンストラクトは、スパイキャッチャー−スヌープキャッチャーと定量的に反応した（図９Ａ、レーン６）。スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを順次追加することによって、鎖を効率的に伸長させることができ、生成物を１０ユニット分の長さまで伸長させた（十量体；図９Ａ、レーン１３）。
【０２３４】
異なる種類の固相結合による固相伸長を説明するために、改変スパイキャッチャータンパク質であるＡｖｉタグ−スパイキャッチャーを生成して、部位特異的にＮ末端をビオチン化した。ビオチン化スパイキャッチャーをストレプトアビジン被覆ビーズに結合させた後、同様にして十量体の長さの融合タンパク質鎖を構築し、遊離ビオチンを用いて溶出させた（図９Ｂ）。
【０２３５】
構築された十量体を確認するため、エレクトロスプレーイオン化質量分析を行ったところ、観察された質量と予想された質量との間に良い相間が見られた（図１０Ａ）。質量分析は、同一性の良い指標を与えるが、より小さい分子量の副生物がより効率的にイオン化されるので、純度を評価するのはＳＤＳ−ＰＡＧＥの方がより良い。アフィボディは、通常、単量体であり、自己会合はほとんど起こらないので、十量体が会合体を形成したかどうかを解析するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＳＥＣは、球状タンパク質の基準を用いて検量すると、十量体が会合していない場合に予想される非会合体の質量に一致する主要な１つのピークを示し、これは、この条件下において、十量体の自己会合が最小限であったことを表している（図１０Ｂ）。
【０２３６】
熱安定性を評価するために、十量体を様々な温度で短時間加熱したところ、７０℃であっても大部分が可溶なままであった（図１１Ａ）。また、保存した際の十量体の完全性を調べたところ、１〜４日後に、分解および可溶性の減少はほとんど観察されなかった（図１１Ｂ）。
【０２３７】
ＡｆｆｉＨＥＲ２を最初に鎖へ組み入れてから拡張していく際に、イソペプチド結合を直交的に形成させることによって、他のタンパク質ユニットを効率的に組み入れできることが示された（図１２）。この場合、蛍光タンパク質の融合タンパク質鎖を生成した（図１２Ａ）。また、直列状に結合されたＨＥＲ２に対するアフィボディを、両方のタグのＮ末端に接続させることによって、びん洗浄用ブラシ型融合タンパク質ポリマー（Bottle-brush fusion protein polymers）（スヌープタグ−スパイタグ−Ａｆｆｉ−Ａｆｆｉ−Ａｆｆｉ)も作製した（図１２Ｂ）。
【０２３８】
要約すると、発明者は、ペプチドリンカー間における自発的なイソペプチド結合の形成によって融合タンパク質を合成する、モジュール式の手法を開発した。本発明の方法にしたがって生成された融合タンパク質は、不可逆的なアミド結合によって結合されているので、（プロテアーゼから保護されている場合は）ある期間にわたって安定であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって容易に解析することができる。開始ステップ、伸長ステップ、および放出ステップは、酸化還元状態と無関係に、穏やかな条件で行われるので、広範囲のタンパク質に適用可能であろう。鎖を単一方向にのみ伸長させると、生成物は分子的に限定され、機能の再現性や正確な調整にとって好都合である。また、上述したびん洗浄用ブラシ型ポリマーの構造に示されるように、サブユニットは、Ｎ末端からＣ末端の方向に接続される必要もない。モジュールの化学修飾も必要ではなく、時間がかかり制御が困難な生体共役反応を行わなくて済むので、本方法は、組み換えタンパク質を発現することができる研究室であればどこでも利用可能である。自発的なイソペプチド結合の形成は、元々の反応性が低い２つの官能基−アミンとカルボン酸またはカルボキサミド−の間における簡易な反応経路という点で有利であり、副生物はほとんど生じない。
【０２３９】
本実施例では、「スパイ」ペプチドリンカー対および「スヌープ」ペプチドリンカー対を用いた融合タンパク質の合成について説明したが、本発明に係る直交したペプチドリンカー対は、どれでも本発明の方法に用い得、上述したように、直交したペプチドリンカー対を３つ以上用いることは、例えば分岐構造または環状構造などの複雑な構造を有する融合タンパク質を合成するのに特に有利であるということは、明らかであろう。
【０２４０】
（実施例４−ＲｒｇＡタンパク質に基づく改良同系ペプチドリンカー対の設計および合成）
ＲｒｇＡタグ／ＲｒｇＡキャッチャーのペプチドリンカー対と比較して、活性が向上したペプチドリンカー対を作製することを目的として、実施例１で説明したＲｒｇＡタグに様々な改変を施した。
【０２４１】
発明者は、１１位にアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ１１Ｇ）を含む変異型ＲｒｇＡタグペプチドリンカーを合成し、これをＲｒｇＡタグ２．０と命名した（下記表２参照）。ＲｒｇＡタグ２．０（配列番号１１１）およびＲｒｇＡタグ（配列番号９）を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合した融合タンパク質として発現させ、ＲｒｇＡキャッチャーに対する反応性を比較した。ｐＨ７．４で室温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で６時間、反応を行った。各反応には、１０μＭの各タンパク質を用いた。
【０２４２】
図１４は、ＲｒｇＡキャッチャーに対するＲｒｇＡタグ２．０の反応性が、ＲｒｇＡタグと比較して、大きく向上していることを示している。
【０２４３】
発明者は、ＲｒｇＡタグ（配列番号９）と比較して、伸長、短縮、置換、およびこれらの組み合わせを含む様々な変異を有するペプチドリンカーを、さらに８つ合成した。変異型ＲｒｇＡタグペプチドリンカーの配列を表２に示す。置換および伸長箇所には下線を付した。
【０２４４】
【表２】
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【０２４５】
変異型ＲｒｇＡタグペプチドリンカーを、ＳＵＭＯ（ユビキチン様）タンパク質に結合した融合タンパク質として発現させ、ＲｒｇＡキャッチャー（配列番号１０）に対する融合タンパク質の反応性を調べた。ｐＨ７．４で室温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３０分間、反応を行った。各反応には、１０μＭの各タンパク質を用いた。図１５は、改変ＲｒｇＡタグペプチドリンカーのうち、ＲｒｇＡタグ２．０、ＲｒｇＡタグ２．３、ＲｒｇＡタグ２、およびＲｒｇＡタグ２．７の４つのみが、ＲｒｇＡキャッチャーに対して観察可能な反応性を示したことを示す。しかしながら、上述したように、ＲｒｇＡタグと比較して活性が向上したＲｒｇＡタグ２．０と比べて、ＲｒｇＡ２では、活性が有意に向上した。したがって、ＲｒｇＡタグと比較すると、ＲｒｇＡタグ２は、ＲｒｇＡキャッチャーに対する反応性が有意に向上した。
【０２４６】
図１６は、ＲｒｇＡタグ２（ＳＵＭＯとの融合タンパク質の形態）とＲｒｇＡキャッチャーとの反応の速度を示し、ＲｒｇＡタグ２が過剰であれば、反応速度が上昇することが示されている。しかしながら、全ての濃度のＲｒｇＡタグ２において、反応は、完了に近づいた。すなわち、ＲｒｇＡキャッチャーを１００％近く消費した。
【０２４７】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＲｒｇＡタグ２において活性が有意に向上したのは、ＲｒｇＡタグに対して修飾／変異を組み合わせた結果であると仮定される。この場合、天然ＲｒｇＡの配列に基づいてＣ末端を伸長させたことによって、ＲｒｇＡキャッチャーペプチドリンカーとの相互作用が好ましいものになったと考えられる。さらに、ＲｒｇＡタグ２の中間部におけるＤからＧへの変異（すなわち、側鎖サイズの減少）によって、ペプチドのヘアピンターン（結晶構造において、完全長のドメインに存在しているように見える）が安定化されると仮定される。
【０２４８】
（実施例５−改良ＲｒｇＡタグ２ペプチドリンカーの交差反応性の研究）
スヌープタグ／スヌープキャッチャーペプチドリンカー対およびスパイタグ／スパイキャッチャーペプチドリンカー対に対する、ＲｒｇＡタグ２／ＲｒｇＡキャッチャーペプチドリンカー対の交差反応性を、上記実施例３で説明したのと同様にして調べた。ＲｒｇＡタグ２ペプチドリンカーを、実施例４で説明したように、ＳＵＭＯに結合した融合タンパク質として発現させた。
【０２４９】
図１７は、ＲｒｇＡキャッチャーペプチドリンカーと、スパイタグペプチドリンカーまたはスヌープタグペプチドリンカーとの間に、有意な交差反応性は見られなかったことを示す。図１８は、ＲｒｇＡタグ２ペプチドリンカーと、スパイキャッチャーペプチドリンカーまたはスヌープキャッチャーペプチドリンカーとの間に、有意な交差反応性は見られなかったことを示す。したがって、各ペプチドリンカー対は、他のペプチドリンカー対に対して直交している。
【０２５０】
（材料および方法）
＜クローニング＞
ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ社（Roche））を用いて、全てのＰＣＲおよび部位特異的変異の導入を行った。ギブソン・アセンブリ（Gibson Assembly）（登録商標）・マスターミックス（ＮＥＢ社）を、製造元の説明書にしたがって用いた。コンストラクト（constructs）は、まず、化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５α（ライフテクノロジー社（Life Technologies））にクローニングされた。
【０２５１】
ｐＥＴ２８ａスパイタグ−ＭＢＰ（アドジーン（Addgene）プラスミドＩＤ３５０５０）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＢｉｒＡ、およびｐＤＥＳＴ１４−スパイキャッチャー（ジェンバンク（GenBank）ＪＱ４７８４１１、アドジーンプラスミドＩＤ３５０４４）については、Ｂ．Ｚａｋｅｒｉら、２０１２年（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９，Ｅ６９０〜６９７）に記載されている。
【０２５２】
ＤＮＡワークス（DNAWorks）プライマーを用いて構築した、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）のアドヘシンＲｒｇＡの７４９〜８６０位の残基（タンパク質構造データバンクＩＤ ２ＷＷ８に基づいて番号を付けている）由来の構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩで切断してｐＥＴ２８ａにサブクローニングすることによって、ｐＥＴ２８ａスヌープキャッチャーを生成した。スヌープタグとの反応を最適化するために、このコンストラクトにおいて、５’−ＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧ（配列番号７３）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジ（QuikChange）によりＧ８４２Ｔの変異を導入し、５’−ＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＡＣＣ（配列番号７４）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによりＤ８４８Ｇの変異を導入した。スヌープキャッチャーの長さは１３２残基（ｆＭｅｔを用いた切断により推定）であり、Ｎ末端にトロンビン切断部位とＨｉｓ6タグとを有する。フォワードプライマー５’−ＡＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧ（配列番号７５）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジにより、ｐＥＴ２８ａスヌープキャッチャーのＮ８５４をＡとすることによって、ｐＥＴ２８ａスヌープキャッチャーＮＡを作製した。
【０２５３】
ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−ＭＢＰを、二段階で生成した。まず、５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号７６）、５’−ＡＡＡＣＴＧＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号７７）、５’−ＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧ（配列番号７８）、および５’−ＴＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧ（配列番号７９）を用いた部位特異的リガーゼ非依存変異導入（ＳＬＩＭ）ＰＣＲ（Ｃｈｉｕら，２００４年）によって、ＲｒｇＡのＤ４ドメインのＮ末端β−ストランドに基づいた反応性ペプチド（７３４〜７４８位の残基）を、ｐＥＴ２８ａ−スパイタグ−ＭＢＰにクローニングした。ペプチドのＣ末端の３残基を、５’−ＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧ（配列番号８０）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって除去した。スヌープタグの活性のない形態であるｐＥＴ２８ａスヌープタグＫＡ−ＭＢＰを、５’−ＧＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＡＧＴＧＧ（配列番号８１）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって、ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−ＭＢＰにおいてＫ７４２をＡとすることによって生成した。
【０２５４】
ＭＢＰのＣ末端において、重複伸長ＰＣＲによってスパイキャッチャーをＧｌｙ／Ｓｅｒスペーサーと融合することにより、ｐＥＴ２８ａＭＢＰ−スパイキャッチャーを生成した。フォワードプライマー５’−ＧＴＴＣＧＧＧＣＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号８２）およびリバースプライマー５’−ＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＡＧ（配列番号８３)を用いて、ｐＤＥＳＴ１４−スパイキャッチャーからスパイキャッチャーを増幅した。フォワードプライマー５’−ＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣ（配列番号８４）およびリバースプライマー５’−ＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＡＧＴＣＴＧＣＧ（配列番号８５）を用いて、ｐＥＴ２８ａスパイタグ−ＭＢＰからＭＢＰを増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物を混合し、再びスパイキャッチャーフォワードプライマーおよびＭＢＰリバースプライマーを用いて増幅させ、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、ｐＥＴ２１にサブクローニングした。アミロースに対するＭＢＰ−スパイキャッチャーの親和性を高めるために、まず、フォワードプライマー５’−ＧＴＣＴＴＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣ（配列番号８６）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって、ＭＢＰにＡ３１２Ｖの変異およびＩ３１７Ｖの変異を導入した。１７２位、１７３位、１７５位、および１７６位の残基を、５’−ＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧ（配列番号８７）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって、ＭＢＰから欠失させた。次に、５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣ（配列番号８８）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって、スパイキャッチャーのＮ末端を短くした。アミロース樹脂からの解離をさらに抑えるために、この変異型ＭＢＰを直列状に結合して、ＭＢＰｘ−スパイキャッチャー（Ｎ末端Ｈｉｓ6タグ−ＭＢＰｍｔ−スペーサー−ＭＢＰｍｔ−スペーサー−スパイキャッチャー）とした。フォワードプライマー５−ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＧ（配列番号８９）、リバースプライマー５−ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＧ（配列番号９０）、フォワードプライマー５−ＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号９１）、およびリバースプライマー５−ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧ（配列番号９２）を用いたギブソン・アセンブリによって、ＭＢＰｘを増幅し、ＭＢＰｘ−スパイキャッチャーと融合させた。
【０２５５】
ｐＥＴ２８ａスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを段階的に作製した。初めに、スヌープキャッチャーのＮ末端において、スパイキャッチャーをＧｌｙ／Ｓｅｒスペーサーと融合し、次いで、Ｇｌｙ／Ｓｅｒスペーサーをα−ヘリックス状スペーサー（配列：ＰＡＮＬＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＱＬＥＫ；配列番号９３）と置換した。フォワードプライマー５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣ（配列番号９４）およびリバースプライマー５’−ＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＴＧ（配列番号９５）を用いて、ｐＤＥＳＴ１４−スパイキャッチャーからスパイキャッチャーの部位を増幅した。フォワードプライマー５’−ＣＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＧＣＴＧＣ（配列番号９６）およびリバースプライマー５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＡＴＣＧＧＴＴＣ（配列番号９７）を用いて、ｐＥＴ２８ａスヌープキャッチャーからスヌープキャッチャーの部位をクローニングした。スパイキャッチャーおよびスヌープキャッチャーを融合させた後、フォワードプライマー５’−ＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＣ（配列番号９８）およびリバースプライマー５’−ＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＣ（配列番号９９）を用いて、Ｇｌｙ／Ｓｅｒスペーサーを安定なα−ヘリックス状リンカーと置換した。フォワードプライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣ（配列番号１００）およびその逆方向の相補鎖を用いたクイックチェンジによって、スパイキャッチャーのＮ末端から３５残基を欠失させた。
【０２５６】
フォワードプライマー５’−ＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１０１）およびリバース５’ＣＡＴＣＡＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＧ（配列番号１０２）を用いたギブソン・アセンブリによって、ｐＥＴ２８ａ−Ｋタグ−ＡｆｆｉＨｅｒ２−スパイタグから、ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグ（Ｎ末端Ｈｉｓ6タグ−スヌープタグ−スペーサー−ＨＥＲ２に対するアフィボディ−スペーサー−スパイタグ）を生成した。
【０２５７】
５’−ＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴＡＡＡＣＧＧＧＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＴＣＧＣＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＧＣ（配列番号１０３）および５’−ＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＣＣ（配列番号１０４）を用いた逆ＰＣＲによって、ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−ＡｆｆｉＨｅｒ２−スパイタグから、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに対するアフィボディであるｐＥＴ２８ａスヌープタグ−ＡｆｆｉＴａｑ−スパイタグを生成した。
【０２５８】
ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグのＢａｍＨＩサイトにおいてｍＥＧＦＰを置換し、スペーサーを伸長させるＰＣＲを行うことによって、ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−ｍＥＧＦＰ−スパイタグをクローニングした。Ｇｌｙ／Ｓｅｒスペーサーによって結合されたＡｆｆｉＨＥＲ２の直列的な複製物をＰＣＲで構築することによって、ｐＥＴ２８ａスヌープタグ−スパイタグ−Ａｆｆｉ３を生成した。
【０２５９】
５’−ＧＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧ（配列番号１０５）、５’−ＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧ（配列番号１０６）、５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴＧ（配列番号１０７）、および５’−ＴＧＣＣＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴＧ（配列番号１０８）を用いるＳＬＩＭ ＰＣＲによって、ｐＤＥＳＴ１４−スパイキャッチャーから、Ｎ末端を部位特異的にビオチン化するペプチドタグを含有するＡｖｉタグ−スパイキャッチャーをクローニングした。
【０２６０】
変異体およびコンストラクトは全て、塩基配列決定法によって確認した。
【０２６１】
＜タンパク質の発現および精製＞
タンパク質は、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ＲＩＰＬ（アジレント社（Agilent））で発現させた。ｐＥＴ２８ａベクターの場合は、０．５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ中、ｐＥＴ２１の場合は、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ中において、３７℃で一晩、コロニーを増殖させた。一晩培養した培養液を、適切な抗生物質とともに０．８％のグルコースを含有するＬＢで１：１００に希釈し、ＯＤ600が０．５〜０．６になるまで、２００ｒｐｍ、３７℃で増殖させ、０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて２００ｒｐｍ、３０℃で４時間、誘導をかけた。標準的な方法を用いてタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ（キアゲン社（Qiagen））で精製し、ＴＢＳ（ｐＨ８．０の５０ｍＭ トリス（Tris）ＨＣｌおよび５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて三度透析を行った。
【０２６２】
ＭＢＰｘ−スパイキャッチャーを精製する場合は、Ｎｉ−ＮＴＡから溶出させた後、４℃で透析を行うことによって緩衝液をｐＨ８．０の２０ｍＭ トリスＨＣｌに交換し、クォータナリハイパフォーマンス（quaternary high performance）（Ｑ−ＨＰ）樹脂（ＧＥヘルスケア社（GE Healthcare））にロードして、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、０〜０．１５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントによって、カラム容量の１０倍量（すなわち１０ｍＬ）を溶出させた。流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ、０．１５〜０．３５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントでさらなる溶出ステップを行い、０．５ｍＬずつ、画分を回収した。回収した画分を、ＴＢＳに対して透析し、ビバスピン（Vivaspin）遠心濃縮器５ｋＤａカットオフ（ＧＥヘルスケア社）を用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２６３】
４℃にて、ｐＨ５．８の２０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）に対してスヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグを透析し、スルホプロピルハイパフォーマンス（sulfopropyl high performance）（ＳＰ−ＨＰ）樹脂（ＧＥヘルスケア社）にロードした。０．２〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントによってタンパク質を溶出させ、１ｍＬずつ、画分を回収した。溶出させた画分を、ビバスピン遠心濃縮器５ｋＤａカットオフ（ＧＥヘルスケア社）を用いて１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ｐＨ８．０のＴＢＳに対して透析して、−８０℃で保存した。
【０２６４】
スパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを精製する場合は、Ｎｉ−ＮＴＡから溶出させた後、４℃で透析を行うことによって緩衝液をｐＨ８．０の２０ｍＭ トリスＨＣｌに交換し、クォータナリハイパフォーマンス（Ｑ−ＨＰ）樹脂にロードして、０．２〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントによって溶出させた。回収した画分を、ＴＢＳに対して透析し、ビバスピン遠心濃縮器５ｋＤａカットオフを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２６５】
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＡＴＰ、３８０μＭ Ｄ−ビオチン、および７μＭ ＧＳＴ−ＢｉｒＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ中、２５℃で１時間、精製したＡｖｉタグ−スパイキャッチャーをビオチン化した。１時間のインキュベーション後、さらなるＧＳＴ−ＢｉｒＡを最終濃度が１４μＭとなるように加え、２５℃でさらに１時間インキュベートし、反応を行った。反応混合液を、ハイキャップグルタチオンマトリクス（Hi-Cap Glutathione matrix）（キアゲン社）のスラリー５０μＬと、回転させながら３０分間、２５℃でインキュベートすることによって、ＧＳＴ−ＢｉｒＡを除去した。４，０００ｇで１分間、樹脂をスピンダウンした。上清を回収し、４℃で一晩、ＰＢＳに対して透析した。ビオチン化の完了を確認するために、説明したように、ストレプトアビジンゲルシフトアッセイを行った。
【０２６６】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
エクセルシュアロック（XCell SureLock）ゲルコンテナ（ライフテクノロジー社）を用い、示したパーセントのポリアクリルアミドゲル上、２００ＶでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。インスタントブルークマシーステイン（Instant Blue Coomassie stain）（トリプルレッド社（Triple Red Ltd.））を用いてゲルを染色し、ゲルドックＸＲイメージャー（Gel Doc XR imager）およびイメージラボ３．０ソフトウェア（Image Lab 3.0 software）（バイオ・ラッド社（Bio-Rad））を用いて濃度を測定することによって、バンドの解析を行った。高Ｍw物質の解像度を向上させるためにトリス−酢酸を用いた図９Ａ以外は全て、ランニングバッファーとしてトリス−グリシンを用いた。
【０２６７】
＜イソペプチド結合の再構成＞
スヌープタグとスヌープキャッチャーとの間における共有結合の形成を評価するために、１．５Ｍ トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））を含有するｐＨ８．０のＴＢＳに、それぞれ１０μＭの最終濃度でタンパク質を混合した。ＴＭＡＯは、化学シャペロンとして機能する。６×ＳＤＳローディングバッファー（ｐＨ６．８の０．２３Ｍ トリス−ＨＣｌ、２４%ｖ／ｖ グリセロール、１２０μＭ ブロモフェノールブルー、０．２３Ｍ ＳＤＳ）を添加することによって、反応を止めた。次に、バイオ・ラッドＣ１０００サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間、試料を加熱し、その後、１６％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０２６８】
直交性を調べるため、１０μＭのスヌープタグ−ＭＢＰと１０μＭのスヌープキャッチャーまたはスパイキャッチャーとを、ｐＨ８．０のＴＢＳ中、２５℃で１時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。同様に、１０μＭのスパイタグ−ＭＢＰと１０μＭのスヌープキャッチャーまたはスパイキャッチャーとを、上述したようにインキュベートした。
【０２６９】
他のペプチドリンカー対の場合は、１０μＭのＲｒｇＡタグ−ＭＢＰまたは１０μＭのＰｓＣｓタグ−ＭＢＰと、１０μＭのスヌープキャッチャー、スパイキャッチャー、スヌープタグ−ＭＢＰ、またはスパイタグ−ＭＢＰとを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、２５℃で２４時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０２７０】
ｐＨ依存性を評価するために、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０におよぶ広いｐＨ範囲において適切に緩衝能を発揮できるように選択されたコハク酸−リン酸−グリシン緩衝液（１２．５Ｍ コハク酸、４３．７５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、４３．７５ｍＭ グリシン）に、各タンパク質を１０μＭで混合し、２５℃で１５分間、インキュベートした。
【０２７１】
温度効果を決定するために、１．５Ｍ ＴＭＡＯを含有するｐＨ８．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4）に、示した温度で１５分間、１０μＭのスヌープタグ−ＭＢＰと１０μＭのスヌープキャッチャーを混合した。トリス緩衝液のｐＨは、実質的に、温度に応じて変化するので、ＴＢＳの代わりにＰＢＳを用いた。
【０２７２】
緩衝液の組成に対する感受性を調べるために、ｐＨ８．０のＰＢＳ、ｐＨ８．０のＴＢＳ、あるいは１％ トリトンＸ−１００（ｗ／ｖ）、１％ トゥイーン２０（ｖ／ｖ）、１０ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、または１０ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ８．０のＴＢＳ、あるいは１Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の５０ｍＭトリス中、２５℃で１５分間、タンパク質をインキュベートした。
【０２７３】
スヌープタグ−ＭＢＰとスヌープキャッチャーとを、１．５Ｍ ＴＭＡＯを含有するｐＨ８．０のＴＢＳ中、示された濃度で反応させ、２５℃で様々な時間インキュベートすることによって、反応速度を求めた。上述したように、ＳＤＳローディングバッファーで反応を止め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。再構成の割合を、共有結合した付加物のバンド強度を１００倍し、スヌープタグ−ＭＢＰ、スヌープキャッチャー、および共有結合した付加物のバンド強度の合計で除したものとして算出した。
【０２７４】
競合するタグとの可逆性を調べるために、１０μＭのスヌープキャッチャーを、１５μＭのスヌープタグ−ＭＢＰと共に６時間インキュベートした後、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグを最終濃度１３０μＭで１６時間添加した。温度は全て２５℃とした。アンモニアとの可逆性を調べるために、１０μＭのスヌープキャッチャーを、１．５ＭのＴＭＡＯを含有するｐＨ８．０のＴＢＳ中で、１０μＭのスヌープタグ−ＭＢＰと共に２時間インキュベートした後、ｐＨ８．０のＴＢＳまたはｐＨ９．０のＮＨ4Ｃｌ（最終濃度１Ｍ）を１６時間添加した。温度は全て２５℃とした。
【０２７５】
＜質量分析＞
２０μＭのスヌープタグ−ＭＢＰと２０μＭのスヌープキャッチャーとを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、２５℃で２時間インキュベートした。マイクロマスＬＣＴ飛行時間型エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（マイクロマス社（Micromass））を用いて質量分析を行い、最大エントロピーアルゴリズムおよびＶ４．００．００ソフトウェア（ウォーターズ社（Waters））を用いて、ｍ／ｚスペクトルを分子質量に変換した。ＥｘＰＡＳｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍを用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端をｆＭｅｔで切断し、形成されたイソペプチド結合の１７．０Ｄａを除いた分子質量を予測した。大腸菌においてＨｉｓ−タグを付加したタンパク質を発現させると、非酵素的なグルコニル化が観察されることが多く、１７８Ｄａが付加される。同様に、大腸菌で発現させたタンパク質は、いくらかのアセチル化を受ける場合もある。
【０２７６】
１０ｋＤａカットオフのアミコンウルトラ（Amicon Ultra）０．５ｍＬ遠心フィルター（ミリポア社（Millipore））を用いて、十量体を１５μＭまで濃縮し、２００ｍＭの酢酸アンモニウムにバッファー置換した。２５０ｍＭの酢酸アンモニウムに溶解させた１０ｍｇ／ｍＬのヨウ化セシウムを用いて校正した第一世代のシナプトハイディフィニションマススペクトロメトリー（Synapt High Definition Mass Spectrometry）四重極飛行時間型質量分析計（ウォーターズ社）を用いて、測定を行った。２．５μＬずつ分取した試料を、自身で調製した金被覆キャピラリーを用いたナノエレクトロスプレーイオン化によって、送出した。機器のパラメータとしては、供給源圧力を６．０ｍｂａｒ、キャピラリー電圧を１．２０ｋＶ、コーン圧力を１５０Ｖ、トラップエネルギーを３０Ｖ、伝達エネルギーを１０Ｖ、バイアス電圧を５Ｖ、トラップ圧力を０．０１６３ｍｂａｒとした。マスリンクス（MassLynx）ｖ４．１（ウォーターズ社）を用いて、質量スペクトルを平滑化してピーク中心を求め、質量を特定した。
【０２７７】
＜融合タンパク質の固相合成＞
アミロース樹脂（ＮＥＢ社）のスラリー４０μＬを１ｍＬのポリ・プレップ（poly-prep）カラム（バイオ・ラッド社）に入れ、１ｍＬのミリＱ（MilliQ）水で洗浄し、ｐＨ８．０のＴＢＳ １ｍＬで平衡化した。最終体積が８０μＬのｐＨ８．０のＴＢＳに含まれる、３２０ｐｍｏｌの直列ＭＢＰｘ−スパイキャッチャーを樹脂に添加し、サーモミキサーコンフォート（ThermoMixer comfort）（エッペンドルフ社（Eppendorf））を用いて７００ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で１時間インキュベートした。自然流下によって、未反応のタンパク質をカラムから除去し、１ｍＬの洗浄バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の５０ｍＭトリスＨＣｌ）を用いて樹脂を洗浄した。最終体積が８０μＬのｐＨ８．０のＴＢＳに含まれる、３ｎｍｏｌのスヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグを樹脂に添加し、７００ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で１時間インキュベートした。自然流下によって、未反応のスヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグをカラムから除去し、１ｍＬの洗浄バッファーを用いて樹脂を洗浄した。１．５ＭのＴＭＡＯを含有するｐＨ８．０のＴＢＳに含まれる、４ｎｍｏｌのスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを樹脂に添加し、７００ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で２時間インキュベートした。自然流下によって、未反応のスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーをカラムから除去し、１ｍＬの洗浄バッファーを用いて樹脂を洗浄した。上述した条件にしたがって、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを順次付加することによって、鎖を作製した。樹脂の洗浄後、５０ｍＭのＤ−マルトース（シグマ社（Sigma））を含有するｐＨ８．０のＴＢＳ ４０μＬを添加し、７００ｒｐｍで振盪させながら２５℃で１０分間インキュベートすることによって、鎖を溶出させた。カラムを、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに入れ、１７，０００ｇで１０秒間遠心分離を行うことによって、鎖を回収した。スヌープタグ−ｍＥＧＦＰ−スパイタグを含有する鎖、およびスヌープタグ−スパイタグ−Ａｆｆｉ３を含有する鎖を、全く同様にして合成した。
【０２７８】
各ステップ後ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、前述したように試料を溶出させ、６×ＳＤＳローディングバッファーを混合し、９５℃で５分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０２７９】
ビオチン化スパイキャッチャーを基にして構築する場合は、単量体アビジン樹脂（サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）のスラリー４０μＬを１ｍＬのポリ・プレップカラムに入れ、上記の通り洗浄し、平衡化した。最終体積が８０μＬのｐＨ８．０のＴＢＳに含まれる、４μＭのビオチン化スパイキャッチャーを樹脂に添加し、７００ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で１時間インキュベートした。自然流下によって、未反応のビオチン化スパイキャッチャーをカラムから除去し、１ｍＬの洗浄バッファーを用いて樹脂を洗浄し、上述したように、スヌープタグ−Ａｆｆｉ−スパイタグおよびスパイキャッチャー−スヌープキャッチャーを順次付加した。樹脂の洗浄後、１ｍＭのＤ−ビオチンを含有するｐＨ８．０のＴＢＳ ４０μＬを添加し、７００ｒｐｍで振盪させながら２５℃で４時間インキュベートすることによって、鎖を溶出させた。前述したように鎖を回収し、１６％のトリス−グリシンゲルおよび８％のトリス−グリシンゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析を行った。
【０２８０】
＜ゲルろ過クロマトグラフィ＞
スーパーデックス（Superdex）２００ＧＬ １０／３００カラム（ベッド体積は２４ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィによって、十量体鎖を解析した。ゲルろ過の基準（６７０ｋＤａのチログロブリン、１５８ｋＤａのＩｇＧ、４４ｋＤａのオボアルブミン、１７ｋＤａのミオグロビン、および１．３５ｋＤａのビタミンＢ１２）（バイオ・ラッド社）を用いて、カラムを校正した。アクタ（AKTA）精製装置１０（ＧＥヘルスケア社）を用いて２８０ｎｍの吸光度のグラフを測定しながら、５００ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の５０ｍＭトリスＨＣｌを０．４ｍＬ／ｍｉｎで流して試料を溶出させた。
【０２８１】
＜鎖の安定性試験＞
温度安定性試験のために、最終体積が３０μＬのｐＨ８．０の１５０ｍＭ 酢酸アンモニウムに含まれる、３μＭの十量体鎖を、バイオ・ラッドＣ１０００サーマルサイクラーを用いて２５℃、３７℃、５０℃、６０℃、または７０℃で３分間インキュベートし、１０℃になるまで１秒に３℃の割合で冷却した。その後、１７，０００ｇ、４℃で３０分間、試料をスピンダウンして凝集物を除去し、８％トリス−グリシンゲルを用い、クマシー染色を行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、上清を解析した。時間依存的な安定性試験のために、０．１％のアジ化ナトリウム、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、およびＥＤＴＡフリー混合プロテアーゼ阻害剤（ロシュ社）を含有する最終体積が３０μＬのｐＨ８．０の１５０ｍＭ 酢酸アンモニウムに含まれる、３μＭの十量体鎖を、２５℃で１日または４日インキュベートした。各時点において、１７，０００ｇ、４℃で３０分間、試料をスピンダウンし、８％トリス−グリシンゲルを用い、クマシー染色を行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、上清を解析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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