(57)【要約】  本開示は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を使用したｉｎ  ｓｉｔｕでの特異的内在核酸の分子間近接性検出用の試薬および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含む遺伝子操作型、非天然のクラスター化規則的配置短回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合したオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブを含む複合体。
【請求項２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
Ｃａｓ９タンパク質が２つの機能的ヌクレアーゼドメイン、１つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および（ｉｉ）共有または非共有結合によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および（ｉｉ）共有または非共有結合によりガイドＲＮＡと結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
（ａ）第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合した第２のオリゴヌクレオチド、（ｂ）第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡと結合した第２のオリゴヌクレオチド、または（ｃ）核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブをさらに含む、請求項４または５に記載の複合体。
【請求項７】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体、および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブをさらに含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、（ｉｉ）抗種族間二次抗体と結合した第１および第２のオリゴヌクレオチド、および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体を含むプローブを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
少なくとも１つの追加的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をさらに含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが一本鎖であるか、および／またはステム、ループ、および／またはヘアピン二次構造を含み、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが標準ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合体を含むキット。
【請求項１３】
細胞中の内在核酸を検出するための方法であって、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含む少なくとも１つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることであって、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質がＲＮＡにより結合用内在核酸にガイドされ、それによって結合型近接性検出用プローブ複合体が形成されること、およびｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することを含む方法。
【請求項１４】
近接性検出用プローブ複合体が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および内在核酸中の第１の部位に標的化されるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃａｓ９タンパク質が２つの機能的ヌクレアーゼドメイン、１つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドが共有または非共有結合によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合しているか、または第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドが共有または非共有結合によりガイドＲＮＡと結合している、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
近接性検出用プローブ複合体が、（ａ）内在核酸中の第２の部位を標的化する第２のガイドＲＮＡを含む第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチド、（ｂ）内在核酸中の第２の部位を標的化する第２のガイドＲＮＡを含む第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の第２のガイドＲＮＡと結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチド、または（ｃ）核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体に結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブをさらに含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
近接性検出用プローブ複合体が、内在核酸中の核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体を含む第２のプローブ、および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１と第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドが抗種族間二次抗体と結合しており、近接性検出用プローブ複合体がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
内在核酸中の第２または追加的部位を対象とする第２または追加的ガイドＲＮＡを含む第２または追加的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と細胞を接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
近接性検出用オリゴヌクレオチドが一本鎖であるか、および／またはステム、ループ、および／またはヘアピン二次構造を含み、近接性検出用オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが標準ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
内在核酸が核染色体ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または非コードＲＮＡである、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が初代細胞、細胞株細胞であるか、または対象から得た組織もしくは体液試料内に存在する、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が生存状態、固定状態、または凍結状態である、請求項１３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応が近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）または近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｐｒｏｘＨＣＲ）を含む、請求項１３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含むプローブ、および分子間近接性によりｉｎ  ｓｉｔｕで内在核酸を検出するための前記プローブを含む複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の核ゲノムＤＮＡは、クロマチンにパッケージ化され、染色体として核内に配置されている。クロマチンの空間的組織化および特異的染色体領域の相対的位置は、正常細胞機能および疾患における遺伝子制御と密接に関連する。高度の配列相補性を有する染色体部分のみと結合する蛍光プローブを使用する細胞遺伝学的技法である蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が、特異的クロマチンドメイン、遺伝子、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の両方を含めたＲＮＡを視覚化するため使用されている。しかしながら、この技法は、プローブハイブリダイゼーション用二本鎖ゲノムＤＮＡを変性させるのに厳しい処置を必要とし、このような処置はクロマチン構造の完全性および／または染色体組織化とＲＮＡ二次構造、安定性ならびにそのタンパク質およびクロマチンとの相互作用に影響を与える。したがって、穏やかな反応条件を利用し確かなシグナル増幅をもたらす、クロマチンおよびＲＮＡｉｎ  ｓｉｔｕイメージング技法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の様々な態様の中で特に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む遺伝子操作型、非天然のクラスター化規則的配置短回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）［Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  （ＣＲＩＳＰＲ）］関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合したオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブを含む複合体を提供する。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。幾つかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は２つの機能的ヌクレアーゼドメイン、１つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は機能的ヌクレアーゼドメインを含まず全ヌクレアーゼ活性を欠く。別の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は全ヌクレアーゼ活性を欠き少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。幾つかの実施形態では、複合体は（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）（ｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合した第２のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡと結合した第２のオリゴヌクレオチド、または（ｉｉｉ）核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。さらなる実施形態では、複合体は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。追加的実施形態では、複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、抗種族間二次抗体（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と結合した第１および第２のオリゴヌクレオチド、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体を含むプローブを含む。幾つかの反復例では、抗種族間二次抗体と結合した第１および第２のオリゴヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ含有プローブを含む複合体は、少なくとも１つの追加的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をさらに含む。特定の実施形態では、前述の複合体のオリゴヌクレオチドは一本鎖であるか、および／またはステム、ループ、および／またはヘアピン二次構造を含む。他の実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオ��ド、またはそれらの組合せを含み、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは標準ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。
【０００４】
本開示のさらなる態様は、前述の複合体のいずれか１つを含むキットを包含する。
【０００５】
本開示のさらに別の態様は、細胞中の内在核酸を検出するための方法を提供する。この方法は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含む少なくとも１つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることであって、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質がＲＮＡにより結合用内在核酸にガイドされ、それによって結合型近接性検出用プローブ複合体が形成されること、およびｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することを含む。幾つかの実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および内在核酸中の第１の部位に標的化されるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および共有または非共有結合によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。幾つかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は２つの機能的ヌクレアーゼドメイン、１つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は機能的ヌクレアーゼドメインを含まず全ヌクレアーゼ活性を欠く。別の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は全ヌクレアーゼ活性を欠き少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。幾つかの実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は、（ａ）内在核酸中の第２の部位を標的化する第２のガイドＲＮＡを含む第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチド、（ｂ）内在核酸中の第２の部位を標的化する第２のガイドＲＮＡを含む第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および共有または非共有結合により第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の第２のガイドＲＮＡと結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチド、または（ｃ）核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体に結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブをさらに含む。他の実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および内在核酸中の第１の部位に標的化されるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体である第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および内在核酸中の核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体、および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。追加的実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および内在核酸中の第１の部位に標的化されるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および抗種族間二次抗体と結合した第１および第２のオリゴヌクレオチドを���むプローブを含み、近接性検出用プローブ複合体はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む。この実施形態の幾つかの反復例では、内在核酸中の第２または追加的部位を対象とする第２または追加的ガイドＲＮＡを含む第２または追加的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と細胞を接触させる。様々な実施形態では、内在核酸は核染色体ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または非コードＲＮＡである。特定の実施形態では、細胞は初代細胞、細胞株細胞であるか、または対象から得た組織もしくは体液試料内に存在する。他の実施形態では、細胞は生存状態、固定状態、または凍結状態である。追加的実施形態では、ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応は近接ライゲーションアッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＬＡ）または近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ｐｒｏｘＨＣＲ）を含む。
【０００６】
本開示の他の態様および反復例は以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、２つのｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体の近接ゲノム結合によるゲノム遺伝子座の検出、および近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によるシグナル増幅を図示する。シグナル増幅は、ｄＣａｓ９タンパク質と共有または非共有結合した一本鎖核酸分子によって開始される。
【０００８】
【図２】図２は、ＰＬＡ適合性ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体と近接タンパク質Ｘに対するＰＬＡ適合性抗体の近接ゲノム結合によるゲノム遺伝子座と近接タンパク質Ｘの検出、およびＰＬＡベースのシグナル増幅を例証する。
【０００９】
【図３】図３は、ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体と近接タンパク質Ｘに対するＰＬＡ適合性抗体の近接ゲノム結合によるゲノム遺伝子座と近接タンパク質Ｘの検出を図示する。ＰＬＡベースの増幅は、ＰＬＡ適合性抗Ｃａｓ９抗体を利用する。
【００１０】
【図４】図４は、ガイドＲＮＡ分子と共有または非共有結合した一本鎖核酸分子によってＰＬＡシグナルが開始される、２つのＰＬＡ適合性Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体の近接ゲノム結合によるゲノム遺伝子座の検出を例証する。
【００１１】
【図５】図５は、ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用したゲノム遺伝子座の検出、およびポリクローナル（ウサギ）抗Ｃａｓ９抗体ならびに抗ウサギＰＬＡ（＋）および（−）プローブを使用したＰＬＡによるシグナル増幅の開始を図示する。
【００１２】
【図６】図６は、（ゲノム遺伝子座に並んだガイドＲＮＡで構築される）ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用したゲノム遺伝子座の検出、およびポリクローナル（ウサギ）抗Ｃａｓ９抗体ならびに抗ウサギＰＬＡ（＋）および（−）プローブを使用したＰＬＡによるシグナル増幅の開始を例証する。
【００１３】
【図７】図７は、染色体の概略図を表す。ＣＥＮＰ−Ａ（左）がヒストンＨ３（右）を置換するのでセントロメアクロマチンは独特である。
【００１４】
【図８】図８Ａ〜Ｄは、ｄＣａｓ９、ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびマイナーサテライトｃｒＲＮＡまたは陰性対照１（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡのいずれかで形成されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ複合体を用いてヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）Ｕ２ＯＳ細胞のイメージを示す。ＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］アッセイを、抗Ｃａｓ９および／または抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を使用して実施した。オーバーレイしたイメージは、赤色（Ｃｙ５）でＤｕｏｌｉｎｋシグナル、青色（ＤＡＰＩ）で核（ＤＮＡ）、および緑色（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  Ａｔｔｏ４８８）でアクチンを示す。図８Ａは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方と接触させた細胞を示す。図８Ｂは、陰性対照ｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方と接触させた細胞を表す。図８Ｃは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡおよび抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体と接触させた細胞を示す。図８Ｄは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡおよび抗Ｃａｓ９抗体と接触させた細胞を表す。
【００１５】
【図９】図９Ａは、テロメアならびに関連ＴＲＦ１およびＴＲＦ２タンパク質を図式的に例証する。図９Ｂは、ＤＮＡ（ＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣ、配列番号１９）またはＣＡＡＵＣＣＣＡＡＵＣ（配列番号２０）を含むテロメラーゼ鋳型ＲＮＡと塩基対形成するテロメアＤＮＡ（５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’、配列番号１８）のテロメア反復配列ＴＴＡＧＧＧ（下線部）と、ＴＲＦ１およびＴＲＦ２タンパク質の結合を例証する。
【００１６】
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、ｄＣａｓ９、ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびテロメアｃｒＲＮＡまたは陰性対照１（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡのいずれかで形成されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ複合体を用いてヌクレオフェクトしたＵ２ＯＳ細胞のイメージを示す。ＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］アッセイを、抗Ｃａｓ９および／または抗ＴＲＦ２抗体を使用して実施した。オーバーレイしたイメージは、赤色（Ｃｙ５）でＤｕｏｌｉｎｋシグナル、および青色（ＤＡＰＩ）で核（ＤＮＡ）を示す。図１０Ａは、テロメアｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＴＲＦ２Ａ抗体の両方と接触させた細胞を示す。図１０Ｂは、陰性対照ｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＴＲＦ２抗体の両方と接触させた細胞を表す。図１０Ｃは、テロメアｃｒＲＮＡおよび抗Ｃａｓ９抗体と接触させた細胞を示す。図１０Ｄは、テロメアｃｒＲＮＡおよび抗ＴＲＦ２抗体と接触させた細胞を表す。
【００１７】
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、ｄＣａｓ９、ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびマイナーサテライトｃｒＲＮＡまたは陰性対照１（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡのいずれかで形成されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ複合体とインキュベートした固定Ｕ２ＯＳ細胞のイメージを示す。ＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］アッセイを、抗Ｃａｓ９および／または抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を使用して実施した。オーバーレイしたイメージは、赤色（Ｃｙ５）でＤｕｏｌｉｎｋシグナル、および青色（ＤＡＰＩ）で核（ＤＮＡ）を示す。図１１Ａは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方と接触させた細胞を示す。図１１Ｂは、陰性対照ｃｒＲＮＡ、および抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方と接触させた細胞を表す。図１１Ｃは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡおよび抗Ｃａｓ９抗体と接触させた細胞を示す。図１１Ｄは、マイナーサテライトｃｒＲＮＡおよび抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体と接触させた細胞を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を使用したｉｎ  ｓｉｔｕでの特異的内在核酸の分子間近接性検出用の試薬および方法を提供する。タイプＩＩのクラスター化した規則的配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系によってコードされるタンパク質などのＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質は、強力で柔軟な核酸結合性を有する。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、如何なるエネルギー依存的ヘリカーゼ活性も不在の状態で二本鎖ＤＮＡを巻き戻す不思議な能力に焦点を当てながら、生化学的および構造的詳細が非常に研究されている（Sternberg et al.,Nature,2014,506(7490):62-67）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、固定細胞および組織の正常な核におけるＤＮＡの反復配列を標識するための、非常に特異的で有効な酵素プローブとして使用されている（Deng et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,2015,112(37):E5123-32）。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の検出能力は近接性検出によって劇的に増大する。本明細書で提供するのは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む近接性検出用プローブ複合体、ｉｎ  ｓｉｔｕで内在核酸を検出するための前記近接性検出用プローブ複合体の使用法、および前記近接性検出用プローブ複合体を含むキットである。
【００１９】
Ｉ．近接性検出用プローブ複合体
本開示の一態様は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含む近接性検出用プローブ複合体を提供する。ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってよい。本明細書で開示する近接性検出用プローブ複合体は、標的核酸へのプローブの結合を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む少なくとも１つのプローブ、および増幅近接性検出アッセイによって結合プローブの検出を容易にする近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む。一般に、近接性検出用オリゴヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合する。幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、プローブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（図１参照）またはガイドＲＮＡ（図４参照）と直接結合させることが可能である。他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体と結合させることが可能である（図３参照、ゲノム部位１におけるプローブ）。さらなる実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを抗種族間二次抗体と結合させることが可能であり、近接性検出用プローブ複合体はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む（図５および６参照）。以下で詳述するように、近接性検出用プローブ複合体は追加的プローブをさらに含むことができる。
【００２０】
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含むプローブ
近接性検出用プローブ複合体は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含む結合部分と少なくとも１つの近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブを含む。ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってよい。
【００２１】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
本明細書で開示する近接性検出用プローブ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む少なくとも１つのプローブを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然で遺伝子操作型の系ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質。近接性検出用プローブ複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、様々な細菌および古細菌において存在する、タイプＩ（すなわちＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、またはＩＦ）、タイプＩＩ（すなわちＩＩＡ、ＩＩＢ、またはＩＩＣ）、タイプＩＩＩ（すなわちＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）、またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲ系に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）［例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）］、フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．）［例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）］、アカリオクロリス種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）、アセトハロビウム種（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アシディチオバチルス種（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アリシクロバチルス種（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アロクロマチウム種（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．）、アモニフェクス種（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｓｐ．）、アナバエナ種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、アルスロスピラ種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）、カルジセルロシルプトー種（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓｐ．）、カンジダタス種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐ．）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、クロコスファエラ種（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、シアノゼセ種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、エクシグオバクテリウム種（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フィネゴルディア種（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｓｐ．）、クテドノバクター種（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、リングビア種（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）、マリノバクター種（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、メタノハロビウム種（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、マイクロスシーラ種（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｓｐ．）、マイクロコレウス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｓｐ．）、マイクロシスティス種（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、ナトラナエロビウス種（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｓｐ．）、ネイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ニトロソコッカス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ノジュラリア種（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、ノストック種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、オスキラトリア種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、ポラロモナス種（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ペロトマクラム種（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シュードアルテロモナス種（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ペトロトガ種（Ｐｅｔｒｏｔｏ��ａ  ｓｐ．）、プレボテラ種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ストレプトスポランジウム種（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐ．）、シネココッカス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、またはサーモシプホ種（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｓｐ．）に由来し得る。
適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非制限的な例には、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆタンパク質、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、およびこれらの誘導体または変異体が含まれる。具体的実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＩのＣａｓ９タンパク質、タイプＶのＣｐｆ１タンパク質、またはこれらの誘導体であってよい。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であってよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であってよい。代替実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はフランシセラ・ノビシダＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であってよい。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はフランシセラ・ノビシダＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）であってよい。
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する、少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインも含むことができる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片に由来し得る。一般に、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわちＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えばＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインは一緒に作用し一本鎖を切断して、ＤＮＡ中の二本鎖を破壊する（Jinek et al.,Science,2013,337:816-821）。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は修飾Ｃａｓ９タンパク質に由来し得る。例えば、１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含有するように、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体を修飾することができる。詳細には、ヌクレアーゼドメインの１つを欠失または突然変異させて、そのヌクレアーゼドメインがもはや機能的ではない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように、Ｃａｓ９由来タンパク質またはその誘導体を修飾することができる。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性状態である実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は二本鎖ＤＮＡの一本鎖を切断することができる（すなわち、このようなタンパク質は「ニッカーゼ」と呼ばれる）。ニッカーゼは、ＤＮＡ中の二本鎖破壊をもたらすことはできない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への転換は、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体をニッカーゼに転換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニン（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）への転換は、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体をニッカーゼに転換する。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体が二本鎖核酸に切れ目を入れるかまたはそれを切断することができないように、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの両方を修飾または削除することができる（このようなタンパク質はデッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９と呼ばれる）。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＤ１０ＡとＨ８４０Ａ（またはＤ１０ＡとＨ８３９Ａ）突然変異を含む可能性がある。幾つかの実施形態では、誘導タンパク質が全ヌクレアーゼ活性を欠くように、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体の全ヌクレアーゼドメインを修飾または削除することができる。
【００２４】
前に記載した実施形態のいずれかにおいて、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、および完全遺伝子合成などの周知の方法、ならびに当技術分野で公知である他の方法を使用し、１つまたは複数の欠失突然変異、挿入突然変異、および／または置換突然変異によって、任意または全てのヌクレアーゼドメインを不活性化することができる。
【００２５】
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含むことができる。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸の延長部分を含む。核局在化シグナルは当技術分野で公知である（例えば、Lange et al.,J.Biol.Chem.,2007,282:5101-5105を参照）。例えば一実施形態では、ＮＬＳはＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）などのモノパータイト配列（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり得る。別の実施形態では、ＮＬＳはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）などのバイパータイト配列（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり得る。ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置し得る。
【００２６】
さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つの細胞膜透過性ドメインをさらに含むことができる。一実施形態では、細胞膜透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質由来の細胞膜透過性ペプチド配列であり得る。一例として、ＴＡＴ細胞膜透過性配列はＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）であり得る。別の実施形態では、細胞膜透過性ドメインは、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５）、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞膜透過性ペプチド配列であり得る。さらに別の実施形態では、細胞膜透過性ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号６またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号７）であり得る。追加的実施形態では、細胞膜透過性ドメインは、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号８）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞膜透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列であり得る。細胞膜透過性ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置し得る。
【００２７】
さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つのマーカードメインも含むことができる。マーカードメインの非制限的な例には、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグがある。幾つかの実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非制限的な例には、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えばｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ色蛍光タンパク質（例えばｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が含まれる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグおよび／またはエピトープタグであり得る。例示的なタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが含まれるが、これらに限定されない。マーカードメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置し得る。
【００２８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は市販の供給源から得ることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターにクローニングすることができ、標準的手順を使用して細菌または真核生物細胞からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を発現させ精製することができる。さらに他の実施形態では、コード核酸としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を提供することができる。例えば、コード核酸はメッセンジャーＲＮＡであり得る。あるいは、コード核酸はＤＮＡである可能性があり（例えば、ベクターの一部である可能性があり）、この場合コードＤＮＡは適切なプロモーター制御配列（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＭＴＶなどの真核生物／哺乳動物プロモーター）に作動可能に連結し得る。コード核酸は、目的の細胞中での発現用にコドン最適化することができる。
【００２９】
ガイドＲＮＡ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はガイドＲＮＡも含む。ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と相互作用して、染色体配列または内在核酸中の特異的標的部位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を誘導し、この場合ガイドＲＮＡの５’末端は標的配列内の特異的プロトスペーサー配列と塩基対形成する。
【００３０】
配列の直後（下流）にコンセンサス配列が続くこと以外、標的部位に配列の制約はない。このコンセンサス配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）としても公知である。例えば、Ｃａｓ９に関するＰＡＭ配列は３’−ＮＧＧ、３’−ＮＧＧＮＧ、３’−ＮＮＡＧＡＡＷ、および３’−ＡＣＡＹを含み、Ｃｐｆ１に関するＰＡＭ配列は５’−ＴＴＮを含む（この場合Ｎは任意のヌクレオチドとして定義し、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義し、ＹはＣまたはＴのいずれかとして定義する）。幾つかの実施形態では、標的部位は、遺伝子のコード領域中、遺伝子のイントロン中、遺伝子の制御領域中、遺伝子間のスペーサー領域中、非コード領域中などに存在し得る。遺伝子はタンパク質コード遺伝子またはＲＮＡコード遺伝子であり得る。他の実施形態では、標的部位はＲＮＡ分子中に存在し得る。
【００３１】
それぞれのガイドＲＮＡは３つの領域、５’末端に核酸配列中の標的部位と相補的である第１の領域、ステムループ構造を形成する第２の内部領域、およびほぼ一本鎖を維持する第３の３’領域を含む。それぞれのガイドＲＮＡの（５’末端における）第１の領域は、それぞれのガイドＲＮＡが特異的標的部位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をガイドするように異なる。それぞれのガイドＲＮＡの第２の領域と第３の領域は、全てのガイドＲＮＡにおいて同一であり得る。
【００３２】
ガイドＲＮＡの第１の領域は核酸配列中の標的部位と相補的であり、したがってガイドＲＮＡの第１の領域は、標的部位と塩基対形成することができる。（ｃｒＲＮＡとも呼ばれる）それぞれのガイドＲＮＡの第１の領域は、標的配列と相補的である配列を含む。様々な実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は約１０ヌクレオチド〜約２５を超えるヌクレオチドを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と核酸配列中の標的部位の間で塩基対形成する領域は約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５を超えるヌクレオチド長であり得る。具体的実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は約２０ヌクレオチド長である。一例として、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡはＧＮ１７−２０ＧＧを含むことができる。
【００３３】
一実施形態では、多数の非重複特有ｃｒＲＮＡを設計して標的内在核酸を並べることができる。例えば、多数のｃｒＲＮＡを使用して２ｋｂゲノム標的領域の両鎖を並べることができる。標的ゲノム遺伝子座への多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の動員後、三次元のより大きな空間的クロマチン外観をもたらし目的のゲノム遺伝子座の近接性検出が容易になる。
【００３４】
ガイドＲＮＡは、二次構造を形成する第２の領域も含む。幾つかの実施形態では、二次構造はステム（またはヘアピン）およびループを含む。ループとステムの長さは変わり得る。例えば、ループは約３〜約１０ヌクレオチド長の範囲である可能性があり、ステムは約６〜約２０塩基対長の範囲である可能性がある。ステムは１〜約１０ヌクレオチドの１つまたは複数の隆起を含み得る。したがって、第２の領域の全長は約１６〜約６０ヌクレオチド長の範囲である可能性がある。具体的実施形態では、ループは約４ヌクレオチド長でありステムは約１２塩基対を含む。
【００３５】
ｔｒａｃｒＲＮＡはそれぞれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に共通しているので、ｔｒａｃｒＲＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）エピトープを用いて５’末端でタグ化して、別の抗体（抗ＤＩＧ）を提供して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を検出することができる。
【００３６】
ガイドＲＮＡは、ほぼ一本鎖を維持する第３の領域を３’末端にさらに含む。したがって、第３の領域は目的の細胞中の如何なる核酸配列とも相補性がなく、ガイドＲＮＡの残り部分とも相補性はない。第３の領域の長さは変わり得る。一般に、第３の領域は約４ヌクレオチド長を超える。例えば、第３の領域の長さは約５〜約３０ヌクレオチド長の範囲である可能性がある。
【００３７】
幾つかの実施形態では、ガイドＲＮＡは単分子を含む。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは２つの別分子を含む可能性がある。（ｃｒＲＮＡとも呼ばれる）第１のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第１の領域、およびガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の片半分（ｏｎｅ  ｈａｌｆ）を含む可能性がある。（ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれる）第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の他半分（ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｈａｌｆ）、およびガイドＲＮＡの第３の領域を含む可能性がある。したがって、この実施形態では、第１および第２のＲＮＡ分子は、互いに相補的であるヌクレオチドの配列をそれぞれ含有する。例えば、一実施形態では、第１および第２のＲＮＡ分子は、他の配列と塩基対形成する（約６〜約２０ヌクレオチドの）配列をそれぞれ含む。
【００３８】
ガイドＲＮＡは、標準リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドアナログを含む可能性がある。ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチド、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分が修飾されたヌクレオチドの公知のアナログを指す。幾つかの実施形態では、ガイドＲＮＡは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む可能性がある。
【００３９】
標準的オリゴヌクレオチド合成手順を使用して、ガイドＲＮＡを化学的に合成することができる。例えば、ｃｒＲＮＡを化学的に合成することができる。あるいは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写によってガイドＲＮＡを合成することができる。このため、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡはプロモーター配列（例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター）に作動可能に連結させることが可能であり、ポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）によってインビトロでガイドＲＮＡを生成することができる。幾つかの実施形態では、ｃｒＲＮＡを化学的に合成することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡをインビトロで転写することができる。あるいは、目的の真核生物細胞中での発現用のコードＤＮＡ分子として、ガイドＲＮＡを提供することができる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結させることが可能である。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの例には、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬＲＮＡプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
（ｉｉ）近接性検出用オリゴヌクレオチド
近接性検出用プローブ複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ含有プローブは、近接性検出用オリゴヌクレオチドも含む。近接性検出用オリゴヌクレオチドは、プローブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合させることが可能である。
【００４１】
幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドは一本鎖核酸であり得る。他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドは一本鎖および二本鎖領域を含み得る。すなわち、近接性検出用オリゴヌクレオチドはステム、ループ、および／またはヘアピン領域を含み得る。
【００４２】
近接性検出用オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。デオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチド（例えばイノシン）、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート）が修飾されたヌクレオチドの公知のアナログを指す。幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドの３’末端は１つまたは複数のブロッキングヌクレオチドを含み得る。適切なブロッキングヌクレオチドの非制限的な例には、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチド、３’−ＯＮＨ２ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、およびプロピレンヌクレオチドが含まれる。具体的実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドの３’末端は３つの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含み得る。
【００４３】
近接性検出用オリゴヌクレオチドの長さは変わり得る。一般に、近接性検出用オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド長の範囲である可能性がある。幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長の範囲である可能性がある。他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドは約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド長の範囲である可能性がある。
【００４４】
近接性検出用オリゴヌクレオチドは工業的に得ることができる。あるいは、標準的オリゴヌクレオチド合成手順を使用して、近接性検出用オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００４５】
幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、プローブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と直接結合させることが可能である（図１参照）。結合は共有または非共有結合による結合であってよい。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、共有結合によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合させることが可能である。結合は直接的、またはリンカーもしくはアダプター分子による結合であってよい。タンパク質にオリゴヌクレオチドを共有結合させるための技法は当技術分野で周知である。あるいは、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、非共有結合によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合させることが可能である。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、水素結合またはイオン結合によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合させることが可能である。
【００４６】
他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、プローブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡと直接結合させることが可能である（図４参照）。結合は共有または非共有結合による結合であってよい。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、共有結合によってガイドＲＮＡの３’末端、５’末端、または内部ヌクレオチドと結合させることが可能である。あるいは、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、非共有結合によってガイドＲＮＡと結合させることが可能である。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡの３’末端における領域と塩基対形成し得る。
【００４７】
追加的実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、プローブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と間接的に結合させることが可能である。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合させることが可能である（図３参照、ゲノム部位１におけるプローブ）。抗ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。近接性検出用オリゴヌクレオチドと抗体の間の結合は共有または非共有結合による結合であってよい。幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、共有結合によって抗体と結合させることが可能である。結合は直接的、またはリンカーもしくはアダプター分子による結合であってよい。タンパク質または抗体にオリゴヌクレオチドを連結またはコンジュゲートさせるための技法は当技術分野で周知である。他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、非共有結合によって抗ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ抗体と結合させることが可能である。例えば、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、水素結合またはイオン結合によって抗体と結合させることが可能である。
【００４８】
近接性検出用オリゴヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と間接的に結合させるさらに他の実施形態では、第１（および第２の）近接性検出用オリゴヌクレオチドを抗種族間二次抗体と結合させることが可能であり（近接性検出用プローブ複合体はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む）（図５および６参照）。（前に詳述したように）近接性検出用オリゴヌクレオチドと抗体の間の結合は共有または非共有結合による結合であってよい。抗種族間二次抗体は、抗ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質抗体が産生される種（例えばウサギ、マウスなど）を対象とする。抗種族間二次抗体と結合した２つ以上の近接性検出用オリゴヌクレオチドを複合体が含む場合、その２つ以上の近接性検出用オリゴヌクレオチドの配列および／または構造は異なる。具体的実施形態では、複合体は抗種族間二次抗体と結合した第１および第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含み、この場合第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドの配列および／または構造は第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドのそれと異なる。
【００４９】
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を含む特異的な第１のプローブ
幾つかの実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第１のプローブは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および共有または非共有結合によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む。代替実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第１のプローブは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体と結合した第１のオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第１のプローブは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および抗種族間二次抗体と結合した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、複合体はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。様々な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、ニッカーゼ活性を有し、または修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。幾つかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。
【００５０】
（ｂ）追加的プローブ
一般に近接性検出用プローブ複合体は、１つまたは複数の追加的プローブをさらに含む。第２の（または追加的）プローブは、異なるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る結合部分、およびその配列および／または構造が第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドのそれと異なる第２の（または追加的）追加的近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む。例えば、第１または第２の近接性検出用プローブオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に１つまたは複数のブロッキングヌクレオチドを含む可能性がある。あるいは、第１または第２の近接性検出用プローブオリゴヌクレオチドは、異なる配列および／または異なるヘアピン構造を含む可能性がある。幾つかの場合、第１および第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドは（＋）および（−）オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【００５１】
第１のプローブの第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡを介して）結合した実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は第２のプローブをさらに含み得る。第２のプローブは結合部分と第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含み、この場合第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドは第１のプローブの第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドのそれとは異なる配列および／または構造を有する。幾つかの実施形態では、第２のプローブの結合部分は別のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である可能性があり、第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドは、共有または非共有結合により第２のプローブの第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと結合させることが可能である（図１および図４参照）。他の実施形態では、第２のプローブの結合部分は核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体である可能性があり、第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドは、核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合させることが可能である（図２参照）。核酸関連タンパク質は、一般的転写因子、特異的転写因子、転写制御タンパク質、クロマチン結合タンパク質、クロマチン再構成タンパク質または酵素、クロマチン修飾酵素（例えばメチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼなど）、ＤＮＡ結合タンパク質、ヒストンタンパク質、修飾ヒストンタンパク質、スプライシングタンパク質／因子、ＲＮＡ修飾タンパク質、ＲＮＡプロセシングタンパク質、ＲＩＳＣタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、非コードＲＮＡプロセシング因子などであり得る。核酸修飾は、メチル化、ヒドロキシル化、アセチル化、ホルミル化、アシル化、カルボキシル化、チオール化、アルキル化、アミノ化、エステル化、リン酸化、またはこれらの組合せによって修飾されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり得る。
【００５２】
第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを抗ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ抗体を介してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と間接的に結合させた実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は第２のプローブをさらに含み得る。第２のプローブは結合部分と第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含み、この場合第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドの配列および／または構造は第１のプローブの第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドのそれとは異なる。幾つかの実施形態では、（前に詳述したように）第２のプローブの結合部分は核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体である可能性があり、第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドは、核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合させることが可能である（図３参照、ゲノム部位２）。
【００５３】
抗種族間二次抗体を介してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを間接的に結合させた他の実施形態では、近接性検出用プローブ複合体は当該抗種族間抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドをさらに含む可能性があり（図５参照）、この場合第１と第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドの配列および／または構造は異なる。近接性検出用プローブを抗種族間抗体と結合させた追加的実施形態では、複合体は１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をさらに含むことができ、これは当該抗種族間抗体を介して近接性検出用オリゴヌクレオチドと間接的に結合させることが可能である（図６参照）。それぞれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は異なるガイドＲＮＡを含む。
【００５４】
表Ａは第１のプローブと第２のプローブの様々な組合せを列記する。
【表１】
2018531596.tif 000002
【００５５】
ＩＩ．内在核酸を検出するための方法
本開示の別の態様は、細胞中の内在核酸をｉｎ  ｓｉｔｕで検出し視覚化するための方法を包含する。この方法は、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質を含む少なくとも１つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることであって、ＲＮＡガイド型核酸結合タンパク質がＲＮＡにより結合用内在核酸にガイドされ、それによって結合型近接性検出用プローブ複合体が形成されること、およびｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することを含む。
【００５６】
一般に、近接性検出用プローブ複合体は、内在核酸中の第１の部位を対象とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と直接的または間接的に結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブを含む。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。様々な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、ニッカーゼ活性を有し、または修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。幾つかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。一般に複合体は、（内在核酸中の近接第２部位を対象とする別のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または近接して位置するタンパク質または核酸修飾を対象とする抗体であり得る）結合部分、および第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドと異なり結合部分と直接的または間接的に結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブをさらに含む。結合によって、近接性検出用プローブ複合体の第１のプローブと第２のプローブは近接して位置し、ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応によって検出し視覚化することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応は近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ、Soederberg,et al.,Nature Methods,2006,2(12):995-1000参照）または近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｐｒｏｘＨＣＲ、Koos et al.,Nature Communications,2015,6:72941DOI:10.1038/ncomms8294参照）であってよい。
【００５７】
（ａ）近接性検出用プローブ複合体と細胞の接触
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む少なくとも１つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることを含む。近接性検出用プローブ複合体は前のセクション（Ｉ）中に記載する。
【００５８】
幾つかの実施形態では、（ａ）内在核酸中の第１の部位に標的化される第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）内在核酸中の第２の部位に標的化される第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と、細胞を接触させることが可能である（表Ａならびに図１および４中の複合体１、２、４、および５を参照）。
【００５９】
他の実施形態では、（ａ）内在核酸中の第１の部位に標的化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）内在核酸と関連した近接位置タンパク質を対象とする抗体または内在核酸中の核酸修飾を対象とする抗体、および核酸関連タンパク質を対象とする抗体または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と、細胞を接触させることが可能である（表Ａおよび図２中の複合体３および６を参照）。
【００６０】
他の実施形態では、（ａ）内在核酸中の第１の部位に標的化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）内在核酸と関連した近接位置タンパク質を対象とする抗体または内在核酸中の核酸修飾を対象とする抗体、および核酸関連タンパク質を対象とする抗体または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と、細胞を接触させることが可能である（表Ａおよび図３中の複合体７を参照）。
【００６１】
さらなる実施形態では、内在核酸中の第１の部位に標的化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および抗種族間二次抗体と結合した第１と第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含むプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることが可能であり、この場合近接性検出用プローブ複合体はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む（表Ａおよび図５中の複合体８を参照）。この実施形態の幾つかの反復例では、内在核酸中の第２または追加的部位を対象とする第２または追加的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と細胞を接触させることが可能であり、この場合ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、抗ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質一次抗体および抗種族間二次抗体を介して第１および第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドと間接的に結合させることが可能である（表Ａおよび図６中の複合体９を参照）。
【００６２】
近接性検出用プローブ複合体と細胞の接触は一工程または複数工程で行うことができる。例えば、細胞を第１のプローブと接触させることが可能であり、次いで後の時点で細胞を第２のプローブと接触させることが可能である。同様に、細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む第１のプローブと接触させることが可能であり、次いでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体および／または核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と接触させることが可能である。幾つかの実施形態では、細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む第１のプローブと接触させ、次いでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体と接触させ、次いで抗種族間二次抗体と接触させることが可能である。
【００６３】
以下で詳述するように、近接性検出用プローブ複合体と接触させる細胞は生存状態、固定状態、または凍結状態であってよい。一般に、接触は約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で実施することができる。
【００６４】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブと生存細胞を接触させることが可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブは、様々な手段によって細胞中に導入することができる。適切なデリバリー手段には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティックス、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、インペルフェクション、オプティカルトランスフェクション、専売物質による核酸の取り込み、およびリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介したデリバリーが含まれる。具体的実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブをヌクレオフェクションによって細胞中に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブは、ガイドＲＮＡ（例えば、合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体形成した組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９）を含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入することができ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを個別に細胞中に導入することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）を細胞中に導入した後、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（すなわち、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）とガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞中に導入した後に、細胞中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を構築することができる。適切な時間期間後、細胞を固定することができ（以下参照）、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体および／または核酸関連タンパク質もしくは核酸修飾を対象とする抗体または（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする抗体、次に抗種族間二次抗体と接触させることが可能である。任意の接触工程間に適切なバッファーで細胞を洗浄することができる。
【００６５】
他の実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブと固定細胞を接触させることが可能である。一般に使用される様々な固定剤のいずれかを使用して細胞を固定することができる。適切な固定剤には、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、メタノール、アセトン、酢酸、エタノール、グルタルアルデヒド、ヨードホルム、乳酸、ピクリン酸、亜鉛、またはこれらの組合せが含まれる。固定剤および固定プロセス中の濃度は細胞または試料のタイプに応じて変わる。一実施形態では、メタノールと酢酸（１：１）の混合物を用いて細胞を固定することができる。別の実施形態では、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定することができる。一般に、ＲＮＰ複合体としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブを細胞中に導入する（上記参照）。
【００６６】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの界面活性物質および／またはプロテアーゼを含む溶液とのインキュベーションによって細胞を透過性にすることができる。適切な界面活性物質の非制限的な例には、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、セチルアルコール、デシルグルコシド、ジギトニン、ラウリルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０、リューコパーム、ＮＰ−４０、ノノキシノール−９、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ｎ−オクチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド、オレイルアルコール、オクチルグルコシド、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、サポニン、ステアリルアルコール、またはこれらの組合せが含まれる。適切なプロテアーゼには、非制限的に、プロテイナーゼＫ、カスパーゼ、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、およびトリプシンが含まれる。幾つかの実施形態では、Ｔｗｅｅｎ−２０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液と細胞をインキュベートすることができる。界面活性物質またはプロテアーゼおよびインキュベーション時間中の濃度は、細胞または試料のタイプに応じて変わり得る。
【００６７】
一般に、二本鎖染色体ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに転換するため、化学または熱変性プロセスに細胞を施すことはない。しかしながら幾つかの実施形態では、細胞を変性溶液に接触させ染色体ＤＮＡを変性させることが可能である。変性溶液は酸性またはアルカリ性であってよい。酸性溶液は塩酸などの酸を含み、アルカリ性溶液はアルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）などの塩基を含む。変性溶液中および変性工程間の酸または塩基の濃度は、細胞または試料のタイプに応じて変わり得る。他の実施形態では、細胞を加熱して染色体ＤＮＡを変性させることが可能である。例えば、ホルムアミド含有溶液の存在下で、約７０℃〜約８０℃の温度まで細胞を加熱することができる。加熱工程の時間は細胞または試料のタイプに応じて変わり得る。
【００６８】
内在核酸がＲＮＡである実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系含有プローブとの接触をＰＡＭ提示オリゴヌクレオチドの存在下で実施することができる（すなわちＰＡＭｍｅｒ、O'Connell et al.,Nature,2014,516:263-266参照）。ＰＡＭｍｅｒはトランスでガイドＲＮＡに提示され得る。ＰＡＭｍｅｒは、標準もしくは修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。
【００６９】
近接性検出用プローブ複合体の第１および第２プローブとの接触後、細胞は少なくとも１つの結合型近接性検出用プローブ複合体を含む。
【００７０】
（ｂ）結合型近接性検出用プローブ複合体の視覚化
本発明の方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することをさらに含む。ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応は、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｐｒｏｘＨＣＲ）、または不溶性産物もしくは近接性検出用プローブ複合体と連結した産物を生成する別の増幅方法であってよい。
【００７１】
ＰＬＡ。ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応がＰＬＡを含む実施形態では、方法は１つまたは複数のコネクターオリゴヌクレオチドと細胞を接触させることをさらに含む（Soederberg,et al.,Nature Methods,2006,2(12):995-1000参照）。一般に１つまたは複数のコネクターオリゴヌクレオチドは、近接性検出用プローブ複合体の第１および第２近接性検出用オリゴヌクレオチドと配列相補性を有する一本鎖核酸であり、コネクターオリゴヌクレオチドの１つは細胞の内在核酸中に存在しない特有配列を含む。コネクターオリゴヌクレオチドは、標準もしくは修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。コネクターオリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド長の範囲であり得る。幾つかの実施形態では、コネクターオリゴヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド長の範囲であり得る。具体的実施形態では、２つの一本鎖コネクターデオキシオリゴヌクレオチドと細胞を接触させる。コネクターオリゴヌクレオチドとの接触によって、コネクターオリゴヌクレオチドは、非常に近接した第１および第２近接性検出用オリゴヌクレオチドと塩基対形成またはハイブリダイズする。
【００７２】
本発明の方法は、ハイブリダイズ型コネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして特有配列を含む環状ライゲーション産物を形成するリガーゼと、細胞を接触させることをさらに含む。リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、またはＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼであってよい。リガーゼは中温性または熱安定性であってよい。具体的実施形態では、リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである。ライゲーション反応は、適切なリガーゼバッファーの存在下、および約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で実施する。
【００７３】
本発明の方法は、ローリングサークル増幅により特有配列を含む環状ライゲーション産物を増幅して、特有配列の反復を含むローリングサークル増幅産物を形成することをさらに含む。したがって、この方法は、ローリングサークル複製用ポリメラーゼと細胞を接触させることを含む。ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ｂｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼであってよい。ポリメラーゼは中温性または熱安定性であってよい。具体的実施形態では、ポリメラーゼはｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである。増幅反応は、適切なポリメラーゼバッファー、ｄＮＴＰ、および他の試薬を含む増幅溶液の存在下で実施する。増幅反応は約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で実施する。
【００７４】
本発明の方法は、コネクターオリゴヌクレオチド中の特有配列と配列相補性を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドと、細胞を接触させることをさらに含む。したがって標識オリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅産物内の反復特有配列とハイブリダイズする。標識オリゴヌクレオチドの蛍光標識は蛍光緑色であってよく（例えば、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ４８８、またはフルオレセインおよびＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、およびＴＲＩＴＣなどのその誘導体で例えば標識することができる）、オレンジであってよく（例えば、Ｃｙ３またはＡｌｅｘａ５４６で例えば標識することができる）、赤色であってよく（例えば、テキサスレッド、Ａｌｅｘａ５９４、またはローダミンおよびＲＯＸなどのその誘導体で例えば標識することができる）、またはファーレッドであってよい（例えば、Ｃｙ５で例えば標識することができる）。標識オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。具体的実施形態では、標識オリゴヌクレオチドは約１８〜２２ヌクレオチド長であり得る。蛍光標識オリゴヌクレオチドは前に記載した増幅溶液の一部であり得る。
【００７５】
結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化する最後の工程は、標準型蛍光顕微鏡および画像解析用ソフトウエアプログラムを使用して、ローリングサークル複製産物とハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光を検出することを含む。不連続な蛍光スポットは内在核酸の位置を示す。目的の内在核酸の同一性と位置に応じて、細胞は１つまたは複数の不連続な蛍光スポットを含み得る。
【００７６】
ｐｒｏｘＨＣＲ。ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応がｐｒｏｘＨＣＲを含む実施形態では、方法は１つまたは複数の追加的オリゴヌクレオチドと細胞を接触させることをさらに含む（Koos et al.,Nature Communications,2015,6:72941DOI:10.1038/ncomms8294参照）。例えば、アクチベーターオリゴヌクレオチド、少なくとも１つの５’蛍光標識ヘアピンオリゴヌクレオチド、少なくとも１つの３’蛍光標識ヘアピンオリゴヌクレオチド、およびイニシエーターオリゴヌクレオチドと細胞を接触させることが可能である。一般にアクチベーターおよびヘアピンオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域、およびステム、ループ、ヘアピン、または他の二次構造を含む。一般にイニシエーターオリゴヌクレオチドは一本鎖である。オリゴヌクレオチドは約２０〜約１００ヌクレオチド長の範囲である可能性があり、標準もしくは修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。蛍光標識はＰＬＡセクション中で前に記載した通りであり得る。蛍光標識増幅産物は、ＰＬＡセクション中で前に記載した通りに視覚化することができる。
【００７７】
（ｃ）内在核酸
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する方法によって検出される内在核酸は核染色体ＤＮＡであり得る。例えば、核ＤＮＡにおいて特異的染色体またはゲノム遺伝子座を検出することができる。特異的染色体またはゲノム遺伝子座は、遺伝子のコード領域、遺伝子のイントロン、遺伝子の制御領域、ＣｐＧ島細胞、遺伝子間のスペーサー領域、非コード領域、セントロメア領域、テロメア領域、トリヌクレオチドリピートを含む領域内などに存在し得る。遺伝子は、タンパク質コード遺伝子またはＲＮＡコード遺伝子であり得る。幾つかの実施形態では、染色体またはゲノム遺伝子座は、疾患または障害と関連した遺伝子の、改変または修飾、例えば欠失、挿入、置換（例えばＳＮＰ）、トランスバージョンなどであり得る。一般に、近接性検出用プローブ複合体は、同一染色体においてシスで最大約２ｋｂ離れ得る染色体またはゲノム遺伝子座中の２つの異なる部位を標的化する。
【００７８】
他の実施形態では、本明細書で開示する方法によって検出される内在核酸はＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその断片であり得る。ｍＲＮＡはポリアデニル化状態または非ポリアデニル化状態であり得る。あるいは、ＲＮＡ分子は非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり得る。例えばｎｃＲＮＡは、高分子非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、高分子遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ−ｔＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子仁ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹＲＮＡ、ＹＲＮＡ、スプライシングリーダーＲＮＡ（ＳＬＲＮＡ）、テロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）、これらの断片、またはこれらの組合せであり得る。
【００７９】
他の追加的実施形態では、本明細書で開示する方法によって検出される内在核酸は、ミトコンドリアまたはプラスチドゲノム中に位置し得る。
【００８０】
幾つかの実施形態では、特異的内在核酸を検出するための方法を研究目的で使用することができる。他の実施形態では、特異的内在核酸を検出するための方法を診断目的で使用することができる。
【００８１】
（ｄ）細胞
様々な細胞を、本明細書で開示する方法中で使用することができる。一般に、細胞は真核生物細胞である。様々な態様では、細胞はヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または真核生物単細胞であり得る。例示的態様では、細胞は哺乳動物細胞である。細胞は初代細胞または細胞株細胞であり得る。細胞は成体細胞、胚細胞、または幹細胞であり得る。細胞は正常細胞、疾患細胞、またはがん細胞であり得る。
【００８２】
幾つかの実施形態では、細胞はヒト細胞株細胞であり得る。適切な細胞株の非制限的な例には、ＤＵ１４５（転移性がん）、ＳＷ４９０（結腸がん）、ＤＬＤ−１（結腸がん）、ＫＭ２０Ｌ２（結腸がん）、ＣＯＬＯ２０５（結腸がん）、ＨＣＣ−２９９８（結腸がん）、ＨＣＴ−１１６（結腸がん）、ＨＣＴ−１５（結腸がん）、ＨＴ２９（結腸がん）、ＫＭ１２（結腸がん）、ＳＷ−６２０（結腸がん）、ＳＦ−２６８（ＣＮＳ）、ＳＦ−２９５（ＣＮＳ）、ＳＦ−５３９（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−１９（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−７５（ＣＮＳ）、Ｕ２５１（ＣＮＳ）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）、ＨＬ−６０（ＴＢ）（白血病）、Ｋ−５６２（白血病）、ＭＯＬＴ−４（白血病）、ＲＰＭＩ−８２２６（白血病）、ＳＲ（白血病）、Ａ５４９（非小細胞肺がん）、ＥＫＶＸ（非小細胞肺がん）、ＨＯＰ−６２（非小細胞肺がん）、ＨＯＰ−９２（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ２３（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（非小細胞肺がん）、ＬＯＸＩＭＶＩ（メラノーマ）、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（メラノーマ）、Ｍ１４（メラノーマ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（メラノーマ）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（メラノーマ）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（メラノーマ）、ＳＫ−ＭＥＬ−５Ｕ（メラノーマ）、ＡＣＣ−２５７（メラノーマ）、ＵＡＣＣ−６２（メラノーマ）、ＩＧＲ−ＯＶ１（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−４ＯＶＣＡＲ−５（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）、７８６−０（腎臓）、Ａ４９８（腎臓）、ＡＣＨＮ（腎臓）、ＣＡＫＩ−１（腎臓）、ＲＸＦ３９３（腎臓）、ＳＮ１２Ｃ（腎臓）、ＴＫ−１０（腎臓）、ＵＯ−３１（腎臓）、ＰＣ−３（前立腺）、ＤＵ−１４５（前立腺）、ＭＣＦ７（乳房）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳房）、ＨＳ５７８Ｔ（乳房）、ＢＴ−５４９（乳房）、およびＴ−４７Ｄ（乳房）が含まれる。
【００８３】
他の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞株細胞であり得る。適切な哺乳動物細胞株の非制限的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウスミエローマＮＳ０細胞、マウス胚線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウスメラノーマＢ１６細胞、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞、マウスメラノーマＳＰ２／０細胞、マウス胚細胞由来間葉系Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳房ＥＭＴ６細胞、マウスヘパトーマＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウスミエローマＪ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞、マウスメラノーマＸ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞、ラットグリア芽腫９Ｌ細胞、ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞、ラット神経芽腫Ｂ３５細胞、ラットヘパトーマ細胞（ＨＴＣ）、バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞、ラット骨肉腫Ｄ１７細胞、ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞、サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞、サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞、アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞、およびヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）が含まれる。哺乳動物細胞株の包括的一覧は、アメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ中に見出すことができる（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。
【００８４】
さらに他の実施形態では、対象から得た組織試料または体液試料内に細胞が存在し得る。例えば、組織試料または体液試料は、外科手術による切除、切除生検、切開生検、コア生検、または吸引式針生検によって除去することができる。対象はヒト、非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、家畜動物など）、または非哺乳動物脊椎動物（例えば、魚類、鳥類など）であり得る。前に詳述したように固定剤を使用して、組織試料を凍結または固定することができる。固定した組織試料は、パラフィン、パラプラスト、または当技術分野で公知である同様の包埋媒体などの、包埋媒体中に包埋することができる。
【００８５】
ＩＩＩ．キット
本開示のさらなる態様は細胞中の内在核酸を検出するためのキットを内含し、この場合キットは、セクション（Ｉ）（ａ）中で前に定義したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む少なくとも１つのプローブを含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、キットは、（ａ）第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と、第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と、第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。
【００８７】
他の実施形態では、キットは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と、第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡと直接結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）内在核酸関連タンパク質を対象とする抗体または内在核酸中の核酸修飾を対象とする抗体、核酸関連タンパク質を対象とする抗体または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。
【００８８】
他の実施形態では、キットは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第１の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および（ｂ）内在核酸関連タンパク質を対象とする抗体または内在核酸中の核酸修飾を対象とする抗体、核酸関連タンパク質を対象とする抗体または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。
【００８９】
さらなる実施形態では、キットセルは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、抗種族間二次抗体、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第１および第２の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの反復例では、キットは２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、３つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、または３つを超えるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。
【００９０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、ニッカーゼ活性を有し、または修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。具体的実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含み、修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。
【００９１】
幾つかの実施形態では、精製タンパク質としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を提供することができる。他の実施形態では、コード核酸（すなわち、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を提供することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、目的の細胞中での発現用にコドン最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、５’キャップ構造および／または３’ポリアデニル化構造であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、プロモーター制御配列（以下参照）、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルなど）、および／または転写終結配列に作動可能に連結させることが可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、（例えば、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ファージミド、コスミド、人工／微小染色体など）ＤＮＡコンストラクトの一部であり得る。幾つかの実施形態では、目的の細胞中での発現用に、プロモーター制御配列にＤＮＡを作動可能に連結させることが可能である。適切な哺乳動物プロモーター制御配列には、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、延長因子（ＥＤ１）−αプロモーターなどが含まれる。他の実施形態では、インビトロｍＲＮＡ合成用ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に、ＤＮＡを作動可能に連結させることが可能である。例えばプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６プロモーター配列、またはＴ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６プロモーター配列の変形であり得る。さらなる実施形態では、インビトロでの細菌または真核生物細胞発現用プロモーター配列に、ＤＮＡを作動可能に連結させることが可能である。適切な細菌プロモーターには、非制限的に、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、（ｔｒｐとｌａｃプロモーターのハイブリッドである）ｔａｃプロモーター、前述のいずれかのその変形、および前述のいずれかのその組合せが含まれる。適切な真核生物プロモーターの非制限的な例は当技術分野で周知であり、前に列記した哺乳動物プロモーター配列を含む。
【００９２】
特定の実施形態では、キットは、１つまたは複数のガイドＲＮＡのインビトロ転写用の、少なくとも１つのベクター系をさらに含むことができる。例えばベクター系は、インビトロＲＮＡ合成用ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含むことができる。ファージプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６プロモーターまたはこれらの変異型であり得る。他の実施形態では、キットは、１つまたは複数のガイドＲＮＡのインビボ発現用の少なくとも１つのベクター系を含むことができる。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結させることが可能である。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの例には、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬＲＮＡプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ベクター系は、目的のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの挿入用マルチクローニングサイトを含有する、ポリリンカー領域をさらに含むことができる。ベクター系は、複製起点、選択マーカー遺伝子、および／または増幅もしくはシークエンシングプライマー部位をさらに含むことができる。
【００９３】
さらに他の実施形態では、キットは、ｉｎ  ｓｉｔｕ近接性依存増幅反応用の少なくとも１つの試薬をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、キットはＰＬＡ用の少なくとも１つの試薬を含むことができる。ＰＬＡ試薬は、１つまたは複数のコネクターオリゴヌクレオチド、リガーゼ、ライゲーション試薬、ポリメラーゼ、増幅用試薬、蛍光標識検出用オリゴヌクレオチド、またはこれらの組合せであってよい。他の実施形態では、キットは、ｐｒｏｘＨＣＲ用アクチベーター、標識検出器、および／またはイニシエーターオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００９４】
定義
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参照文献は、本発明中で使用する多くの用語の一般的定義を当業者に示す。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale and Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書中で使用する以下の用語は、他に指定しない限り、それらが帰する意味を有する。
【００９５】
本開示またはその好ましい態様の要素を導入するとき、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つまたは複数の要素が存在することを意味するものとする。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は包含的であるものとし、列記した要素以外に追加的要素が存在し得ることを意味するものとする。
【００９６】
本明細書中で使用する用語「相補的」または「相補性」は、特異的水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の関係を指す。塩基対形成は標準的ワトソンクリック型塩基対形成であり得る（例えば、５’−ＡＧＴＣ−３’は相補配列３’−ＴＣＡＧ−５’と対形成する）。塩基対形成はフーグスティ−ン型または逆フーグスティ−ン型水素結合でもあり得る。典型的にはデュプレックス領域に関して相補性が測定され、したがって例えばオーバーハングは除く。塩基対のある部分のみが相補的である場合、デュプレックス領域の二本鎖の間の相補性は部分的であり一定割合（例えば７０％）として表すことができる。相補的ではない塩基は「ミスマッチ状態」である。デュプレックス領域の全ての塩基対が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）である可能性もある。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「内在」は、細胞に固有（ｎａｔｉｖｅ）である核酸を指す。
【００９８】
本明細書中で使用する用語「遺伝子」は、遺伝子産物をコードする（エクソンおよびイントロンを含む）ＤＮＡ領域、および制御配列がコードおよび／または転写配列と隣接しているかどうかとは無関係に、遺伝子産物の生成を制御するようなＤＮＡ領域を指す。したがって遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００９９】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖または環状構造、および一本鎖または二本鎖型いずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語がポリマーの長さに関して限定されると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、および塩基、糖および／またはホスフェート部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定ヌクレオチドのアナログは同じ塩基対形成特異性を有する。すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対形成する。
【０１００】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわちアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、修飾プリンまたはピリミジン塩基または修飾リボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチド（例えばイノシン）または非天然ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分における修飾の非制限的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子と他の原子の置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。
【０１０１】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技法は当技術分野で公知である。典型的には、このような技法は、遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較することを含む。ゲノム配列もこの形式で決定し比較することができる。一般に同一性は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチド、またはアミノ酸とアミノ酸の対応性を指す。２つ以上の（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）配列は、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。核酸またはアミノ酸配列であれ、２つの配列の同一性パーセントは、２つのアライメントした配列間の完全マッチをより短い配列の長さで割り１００を掛けた数である。核酸配列に関するおよそのアライメントは、Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USAによって開発されGribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)によって標準化されたスコアリングマトリックスを使用することによりアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するための、このアルゴリズムの例示的な実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって「ＢｅｓｔＦｉｔ」多用途アプリケーションにおいて示される。配列間の同一性パーセントまたは類似率を計算するのに適した他のプログラムは当技術分野で一般に公知であり、例えば別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両鎖、カットオフ＝６０、期待値＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０配列、選別＝ハイスコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用して使用することができる。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋウエブサイトに見出すことができる。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は本発明の特定の態様を例証する。
【０１０３】
実施例１：ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用したセントロメアの検出
セントロメアサテライトＤＮＡはタンデムリピート型、非コード配列の巨大アレイを含み、セントロメアクロマチンはヒストンＨ３がＣＥＮＰ−Ａで置換されている点において特有である（図７参照）。本明細書中で開示する方法を使用してセントロメアを検出できるかどうか決定するため、マイナーサテライト反復配列またはメジャーサテライト反復配列を標的化するＣａｓ９系を含むプローブを構築し、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）［例えば、ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）アッセイ］およびＣＥＮＰ−Ａに対する抗体と組み合わせて使用した。
【０１０４】
組換えｄＣａｓ９（すなわち、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ二重突然変異体；１ｐｍｏｌ）と、マイナーサテライト反復配列、メジャーサテライト反復配列のいずれかを標的化する合成ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡ（２ｐｍｏｌ）およびｃｒＲＮＡ（２ｐｍｏｌ）、または（如何なる公知のヒト配列も標的化しない）陰性対照１配列を組み合わせることにより、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプローブを形成した。使用したＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列は表１中に示した通りであった。標準試薬および機器を使用しＲＮＰを用いて、Ｕ２ＯＳ細胞をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞は完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、抗生物質含まず）中に１：１０希釈し、８ウエルチャンバーカバーガラススライドに接種した。手順中の全ての後工程に関して、４０μｌ試薬／ウエルを使用した。６時間後、細胞を室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で５分間１０分の１体積の１．２５Ｍグリシンを用いてクエンチし（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）、ＰＢＳを用いて洗浄し、浸透処理バッファー（０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間浸透処理し、室温で１時間ＰＬＡ用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。
【表２】
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【０１０５】
ＰＬＡアッセイを、抗Ｃａｓ９抗体（マウス、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、１：３０００希釈）および抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体（ウサギ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１：１０００希釈）を用いて実施し、これらは４℃で終夜インキュベートした。細胞はＰＬＡ用洗浄バッファーＡで洗浄した（２×５分間）。希釈ＰＬＡ二次抗体−ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗マウス（−）］（１：５希釈）を加え、３７℃で１時間予め加熱した加湿チャンバー内でスライドをインキュベートした。細胞は、軽くオービタルシェーカーで振盪しながら、ＰＬＡ用洗浄バッファーＡで洗浄した（２×５分間、室温）。ライゲーション反応を実施し、細胞を洗浄し、ほぼＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ］ユーザーガイド中に記載されたように増幅反応を実施した（ファーレッドキット）。細胞をＤＡＰＩ（ＤＮＡ用）およびＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ−Ａｔｔｏ４８８（アクチン用）で染色し、洗浄しＰＢＳを多量に注ぎ、スライドガラスで覆い、透明なネイルポリッシュ硬化剤をコーナーに密封し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０６】
陰性対照（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡを使用したとき（図８Ｂ）またはメジャーサテライトｃｒＲＮＡを使用したとき（データ示さず）ではなく、マイナーサテライト反復配列を標的化するｃｒＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰを形成したときのみ（図８Ａ）、赤い小さなスポットとしてセントロメアを視覚化した。ＰＬＡ増幅は、抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方を使用して誘発した（図８Ａ）。抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体のみ（図８Ｃ）または抗Ｃａｓ９抗体のみ（図８Ｄ）いずれかの使用によってＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］シグナルは生成せず、ＰＬＡ増幅の二重特異性および近接依存性を示した。
【０１０７】
実施例２  ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用したテロメアの検出
ＴＲ１およびＴＲ２は、染色体の末端でテロメア反復配列と結合したタンパク質である（図９Ａ、Ｂ参照）。ＴＲＦ２およびＴＲＦ１はテロメア反復配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’と結合する。以下の変更点において、実施例１中で前に記載したのと類似した手順を使用して、Ｕ２ＯＳ細胞においてテロメアを検出した。（ａ）テロメア反復配列を標的化するｃｒＲＮＡ（５’−ＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ−３’、配列番号１３）でＲＮＰ複合体を構築したこと、および（ｂ）（４℃で終夜）抗Ｃａｓ９抗体（マウス、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、１：３０００希釈）および抗ＴＲＦ２抗体（ウサギ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１：１０００希釈）抗体を用いてＰＬＡアッセイを実施したこと。
【０１０８】
陰性対照１（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡを使用したとき（図１０Ｂ）ではなく、テロメア反復配列を標的化するｃｒＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰを形成したときのみ（図１０Ａ）、赤い小さなスポットとしてテロメアを視覚化した。ＰＬＡ増幅は、抗Ｃａｓ９抗体と抗ＴＲＦ２抗体の両方を使用したとき誘発した（図１０Ａ）。抗Ｃａｓ９抗体のみ（図１０Ｃ）または抗ＴＲＦ２抗体のみ（図１０Ｄ）いずれかの使用によってＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］シグナルは生成せず、ＰＬＡ増幅の二重特異性および近接依存性を示した。
【０１０９】
実施例３  ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用した固定細胞におけるセントロメアの検出
Ｕ２ＯＳ細胞を室温で１０分間１％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で５分間１０分の１体積の１．２５Ｍグリシンを用いてクエンチし、ＰＢＳを用いて洗浄した。細胞は浸透処理バッファー（０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間浸透処理し、室温で１時間ＰＬＡ用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。組換えｄＣａｓ９（１ｐｍｏｌ）と、マイナーサテライト反復配列、メジャーサテライト反復配列のいずれかを標的化する合成ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡ（２ｐｍｏｌ）およびｃｒＲＮＡ（２ｐｍｏｌ）、または（如何なる公知のヒト配列も標的化しない）陰性対照１配列を組み合わせることにより、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体としてＣＲＩＳＰＲを形成した。ＤＩＧ−ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列は表１中に示す。ブロッキング後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。細胞をＰＢＳ（３０μＬ）で覆い、スライドはハイブリダイゼーション用カバー［ＨＹＢＲＩＳＬＩＰ（商標）、ＧｒａｃｅＢｉｏＬａｂｓ］で密封し、５分間８０℃でスライド（および細胞）をインキュベートすることによって染色体ＤＮＡを変性させた。ＰＢＳを吸引し、（Ｃａｓ９バッファー：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、１％スクロースで１：１０に希釈した）ＲＮＰを加え、スライドはハイブリダイゼーション用カバーで密封し、スライドハイブリダイザー［ＴＨＥＲＭＯＢＲＩＴＥ（登録商標）；Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］において３７℃で終夜（１６時間）インキュベートした。実施例１においてほぼ前に記載したようにＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］アッセイを始める前に、ＰＬＡ用洗浄バッファーＡで（カバージャーにおいてそれぞれ２×５分間）細胞を洗浄した。
【０１１０】
陰性対照（ＮＣ１）ｃｒＲＮＡを使用したとき（図１１Ｂ）またはメジャーサテライトｃｒＲＮＡを使用したとき（データ示さず）ではなく、マイナーサテライト反復配列を標的化するｃｒＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰを形成したときのみ（図１１Ａ）、赤い小さなスポットとしてセントロメアを視覚化した。ＰＬＡ増幅は、抗Ｃａｓ９抗体と抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の両方を使用して誘発した（図１１Ａ）。抗Ｃａｓ９抗体のみ（図１１Ｃ）または抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体のみ（図１１Ｄ）いずれかの使用によってＰＬＡ［ＤＵＯＬＩＮＫ（登録商標）］シグナルは生成せず、ＰＬＡ増幅の二重特異性および近接依存性を示した。
【０１１１】
実施例４  ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を使用したゲノム遺伝子座の検出
精製組換えｄＣａｓ９（すなわち、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ二重突然変異体）は、（標的特異的ゲノム遺伝子座と並んだ）ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡプールおよびｔｒａｃｒＲＮＡと複合体形成してｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成し、これらを使用してゲノム遺伝子座を認識することができる。例えば、１つまたは複数のガイドＲＮＡをＡＡＶＳ１、ＥＭＸ１、またはＫｒａｓ中標的部位周辺２ｋｂ領域内（すなわち、１ｋｂ上流と１ｋｂ下流）に設計することができる。ヒトガイドＲＮＡ標的（および非標的）を以下に示す。
１．ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡ（標的部位：ＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧ；配列番号１４）
２．ＥＭＸ１−ｇＲＮＡ（標的部位：ＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ；配列番号１５）
３．Ｋｒａｓ−ｇＲＮＡ（標的部位：ＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ；配列番号１６）
４．非標的１（標的部位：ＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＴＡＴＡＴＴ；配列番号１７）
【０１１２】
ｄＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、実施例１〜３においてほぼ前に記載したように生存または固定細胞に加えることができ、ＰＬＡアッセイを使用して局在複合体を検出することができる。このため、細胞は抗Ｃａｓ９抗体（ウサギ）とインキュベートすることができ、次いで（＋）および（−）オリゴを含む抗ウサギＰＬＡプローブ、次に［（＋）および（−）オリゴと架橋形成し内部非哺乳動物反復配列を有する］コネクターオリゴとインキュベートすることができる。次に、（＋）および（−）プローブが約４０ｎｍ以内に近接して位置する時は必ず、ライゲーション反応によって環状ＤＮＡ鋳型が形成する。これらの環状ＤＮＡ分子は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用したローリングサークル増幅の鋳型として働く。増幅鋳型の非哺乳動物反復配列と特異的にハイブリダイズする蛍光（例えばファーレッド）オリゴプローブを使用して、局在増幅ＤＮＡを視覚化することができる。Ｃｙ５フィルターを備える蛍光顕微鏡を使用して観察したスポット状の鮮やかな赤色シグナルはＰＬＡシグナルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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