(57)【要約】本発明は、患者内の細菌性バイオフィルムを治療するために用いられる、（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を含む併用療法を提供する。また、そのために用いられる組成物と方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を含む、患者内の細菌性バイオフィルムの治療における使用のための併用療法。
【請求項２】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の使用のための併用療法。
【請求項３】
前記バイオフィルムが上気道および／または下気道に在る、請求項１または２に記載の使用のための併用療法。
【請求項４】
前記バイオフィルムが、グラム陰性および／またはグラム陽性細菌を含むかあるいはそれらから成る、請求項１から３のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項５】
前記バイオフィルムが、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サンギス菌、レジオネラニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、およびそれらのいずれかの混合物から独立して選択される細菌を含む、請求項１から４のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項６】
前記バイオフィルムが、連鎖球菌を含むかあるいは連鎖球菌から成る、請求項１から５のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項７】
前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス・ミティスおよび／または肺炎連鎖球菌を含むかあるいはそれらから成る、請求項１から６のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項８】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシン、またはキモトリプシン、またはそれらの混合物の成分である、請求項１から７のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項９】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、自然発生のものである、請求項１から８のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、海洋セリンプロテアーゼである、請求項９に記載の使用のための併用療法。
【請求項１１】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タラ、スケトウダラ、サケ、あるいはオキアミから得ることができる、請求項１０に記載の使用のための併用療法。
【請求項１２】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タイセイヨウマダラから得ることができる、請求項１１に記載の使用のための併用療法。
【請求項１３】
前記海洋セリンプロテアーゼが、トリプシン、例えばトリプシン  Ｉである、請求項１２に記載の使用のための併用療法。
【請求項１４】
トリプシンの活性が０．１から１６Ｕ／ｇの範囲内である、請求項１３に記載の使用のための併用療法。
【請求項１５】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWWSAAHCYKSVLRVRLGEH HIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECA ADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAG YLEGGKDSCQGDSGGPWCNGVLQGWSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１]
のアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列から成る、または前記アミノ酸配列のトリプシン活性を保つその断片、変異体、誘導体、または融合体である、請求項１から１４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、自然発生源からのものを精製したものである、請求項１から１５のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１７】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、遺伝子組み換えタンパク質である、請求項１から１５のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１８】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、非−自然発生のものである請求項１７に記載の使用のための併用療法。
【請求項１９】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルバペネム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロランフェニコル、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から１８のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項２０】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、テトラサイクリン、セフォタキシム、バンコマイシン、エリソロマイシン、およびオキサシリンから成る群から選択される、請求項１から１９のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項２１】
ただ一つの抗生物質化合物を含んでいる、請求項１から２０のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項２２】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療における使用のためのセリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドであり、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物と組み合わせて用いられるポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが請求項８から１８のいずれか一項で定義されている、請求項２２に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２４】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、請求項１９から２１のいずれか一項で定義されている、請求項２２または２３に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２５】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療のための薬剤の調剤におけるセリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドの使用であり、前記ポリペプチドは一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物との組み合わせにより使用される。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが請求項８から１８のいずれか一項で定義されている、請求項２５に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２７】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１９から２１のいずれか一項で定義されている、請求項２５または２６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２８】
（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を、医薬的に許容される緩衝剤、賦形剤、希釈剤または支持体とともに含んでいる医薬組成物。
【請求項２９】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、請求項８から１８のいずれか一項で定義されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、請求項１９から２１のいずれか一項で定義されている、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、０．００１から１０μＭまでの濃度で存在する、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、０．１重量％から５重量％、例えば０．１％から２％、０．５％から１．５％、好ましくは、１％の濃度で存在する、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
患者の固形腫瘍を治療する方法であり、（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を治療的に効果のある分量で患者へ投与することを含んでいる方法。
【請求項３４】
前期患者がヒトである請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記バイオフィルムが上および／あるいは下気道にある、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記バイオフィルムがグラム陰性および／またはグラム陽性細菌を含んでいるか、あるいはその細菌から成る、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記バイオフィルムが肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サンギス菌、レジオネラニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、およびそれらのいずれかの混合物から独立して選択される細菌を含んでいる、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記バイオフィルムが連鎖球菌を含んでいるかその菌から成る、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記バイオフィルムがストレプトコッカス・ミティスおよび／または肺炎連鎖球菌を含んでいるかあるいはその菌から成る、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが請求項８から１８のいずれか一項で定義されている、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１９から２１のいずれか一項で定義されている、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが口中スプレーで送り出される、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の併用療法の有効量を患者に送り出すための医療装置であり、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の組成物の貯蔵器と前記組成物を前記装置から放出する手段を含んでいる装置。
【請求項４４】
前記装置が口中スプレーである、請求項４３に記載の医療装置。
【請求項４５】
前記装置が鼻腔スプレーである、請求項４３に記載の医療装置。
【請求項４６】
細菌性バイオフィルムの成長を生体外で死滅させる、禁ずる、または防止するための方法であり、バイオフィルム（または、バイオフィルムの成長が防止されるべき表面）を請求項１から２１のいずれか一項に記載の併用療法に曝すことを含んでいる方法。
【請求項４７】
前記ペプチドが請求項８から１８のいずれか一項に定義されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１９から２１のいずれか一項に定義されている、請求項４６または４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再発性上気道および下気道感染症に存在するものなど、細菌性バイオフィルムの治療および防止のための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、細胞外基質（ＥＣＭ）にはめ込まれた微生物細胞集団から成る不均一な複合的な３Ｄ基質である。それらは、単に受動的な細胞の集まりではなく、局所的な生態系を形成する構造的および動的に複雑な生物システムである。バイオフィルム内の微生物細胞は、特別な機能を協同して受け持っているように見える。防御的なＥＣＭを協同して形成することによって、バイオフィルムは、微生物に保護された成長形態を提供し、それによって、微生物は多様な環境で定住が可能となっている。バイオフィルムの成長形態は、細菌が、宿主の免疫システムおよび抗生物質やそれに似たような静菌剤や殺菌剤を妨害することを可能にさせている。このようにバイオフィルムの伸張は、細菌が抗生物質に対する耐性を示すことを可能にしている。バイオフィルム中で成長する細菌は、それらの浮遊する、すなわち自由生活型の相対物より、滅することが困難である。（参照、ｄｅｌ  Ｐｏｚｏ＆Ｐａｔｅｌ，２００７、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２：２０４−９：Ｓｔｅｗａｒｔ＆Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，２００１，Ｌａｎｃｅｒ  ３５８：１３５−８）
【０００３】
バイオフィルムは、実質的にあらゆる生物学的または非生物学的表面に付着する、一種類あるいは多種類の細胞群からなる。その様な多くの細胞群において、細胞は互いに付着している。古細菌、原生生物、真菌類、および藻類と同様、細菌種の大多数は表面へ付着したり互いに付着する能力を持ち、バイオフィルム構造を形成する。バイオフィルムの形成は、典型的には、自由に漂っている微生物が表面へ付着することから始まる。多数の遺伝子の発現が変化した時、浮遊する細胞が表現型の遷移を起こし、自由生活型からバイオフィルム成長型へと変ずる。最初に入り込むものが、初めは弱く可逆的な付着で表面に付き、その付着が、ピリ線毛などのような細胞付着構造を作ることによってより強くなる。いったん入植がはじまると、バイオフィルムは、細胞分裂と発現と新しい細菌の結合が相まって成長する。最初に入植したものが、より多様な付着点を供給しまたバイオフィルムを共に保つ基質の形成を始めることによって、他の細胞の到来を促進する。
【０００４】
バイオフィルムは、自然界、家庭内、工場、病院環境など多様な環境において形成することができ、そこで、状況によって積極的あるいは消極的な種々の影響を及ぼす。
【０００５】
医療現場において、バイオフィルムは、表面上に細菌の頑固な貯蔵所を形成する。バイオフィルムは、直接患者にまた患者の直近の環境の両方に起きることができる。患者に現に直接存在するバイオフィルムは、通常、再生性の感染と関連しており、一方直近の環境から患者への細菌の移動は、初期および再生性の感染が関係している。病院環境におけるバイオフィルムの例としては、カテーテルや他の形状のチューブや、心臓弁や人工関節などの移植片に付くバイオフィルムなどである。
【０００６】
工場環境におけるバイオフィルムは、必須なものあるいは有害なもの両方であり得る。例えば、最近の有効な微生物的バイオリアクターの開発においては、バイオフィルムが埋め込まれた電極が電気を発電するのに用いられている。バイオフィルムは、また例えばセルロース等の化合物の生物学的製造工場として開発が進められている。
【０００７】
国際特許出願ＷＯ００／７８３３２は、タイセイヨウマダラのようなタラから得たトリプシンや、キモトリプシンを含む魚セリンプロテアーゼを、種々の疾病や不調の治療および／または予防するために使用することを提供している。これらの疾病としては、例えば、ウィルス、細菌、真菌が引き起こす炎症性疾患や感染性疾患および病因として、受容体結合機構が関連する疾病などがある。
【０００８】
Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）やＧｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、酵素を用いたバイオフィルムの除去の可能性について検討している。しかし、酵素のみの使用は、細菌の破壊には十分ではなく、細菌は、時間と適当な環境が与えられ、再び表面や付近の表面に付着しバイオフィルムを再生成する（Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔａｌ．，２０１３）。
【０００９】
タラから得られたトリプシンは、病巣清掃術によって死滅した皮膚の除去を促進することが示されておりそれによって正常表皮修復過程を手助けしている。冷たい環境下から得られたタラトリプシンやセリンプロテアーゼのような親水性の海洋酵素の使用の主な問題は、そのような酵素が、熱による非活性化を受けやすいことと、ゆえに室温では比較的不安定なことである（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。化粧品、医薬物、や薬剤へのタラトリプシンの使用は酵素の安定性の改善にかかっている。
【００１０】
バイオフィルムは、身体において、全ての感染の80％との推測もあるほど、幅広い微生物感染に関連していることが分かっている（参照、”微生物バイオフィルムの研究(Research on microbial biofilms （PA-03-047）”，ＮＩＨ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００２−１２−２０)。バイオフィルムが関わっている炎症のプロセスには、尿路感染、カテーテル感染、中耳感染症、コンタクトレンズのコーティングなどの一般的問題や、心内膜炎、のう胞性線維症の炎症、人工関節や心臓弁など永久的に埋め込んだ装置の炎症など一般的ではないがより致命的なプロセスが含まれている。
【００１１】
興味深いことに、表面に付着しバイオフィルムとして成長した細菌などの微生物は、従来の抗生物質治療に対して易損性がより低い。抗生物質に対する感受性の低減は、移植片に関連した炎症などバイオフィルム炎症のしつこさにつながっている。バイオフィルムにおける防御機構は、従来の抗生物質に対する抵抗機構とは性質が異なっているようである。バイオフィルムにおいては、抗生物質の浸透の低さ、栄養の制限、成長の遅さ、ストレス適応応答、生残菌細胞の形成が、多層防御を構成すると仮説され得る。
【００１２】
さらに、バイオフィルム培養菌は、遺伝子型抵抗を発現せずとも、一般的に化学療法による根絶に対して非常に難治である。従って、治療の選択肢は限られており、新規の抗バイオフィルム活性を持つ抗微生物剤がますます重要である。
【００１３】
それ故、細菌性バイオフィルム（医療と非―医療環境の両方において）の成長を死滅させ、禁じ、防ぐための新たな方法が必要である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の第一の態様は、（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドおよび（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物から成る、患者内の細菌性バイオフィルムの処置に使用される併用療法を提供することである。
【００１５】
"併用療法"とは、二つあるいはそれ以上の治療剤による、同時あるいは並行したあらゆる治療を含んでいる。故に、このような治療法は、該ポリペプチドと抗生物質化合物の別々の服用と、同様に、両治療剤が混合されて含まれている単一の組成物を提供することも含んでいる。
【００１６】
"処置"とは、組み合わせられた治療剤の、治療および予防への両適用を含んでいる。治療への適用に関して、当業者であれば、併用療法が、存在する細菌性バイオフィルムを撲滅するか、あるいは部分的に効能をもたらす（バイオフィルムを形成する細菌群の大きさを縮小させるおよび／あるいはバイオフィルムを形成する細菌群の成長を遅らせるなど）ことを理解するであろう。同じように、予防への適用に関して、併用療法は、バイオフィルム形成を完全に防止するか、または、細菌性バイオフィルムによる炎症の可能性および／あるいはそのひどさを抑えるなどの部分的効能をもたらす。
【００１７】
一つの実施形態において、患者は、ヒトである。しかし、本発明の併用療法は、例えば、ペット動物および／あるいは農場家畜（犬、猫、馬、牛、豚、羊、等を含む）の細菌性バイオフィルムの処置など、獣医学的環境でも有用である。
【００１８】
抗生物質およびセリンプロテアーゼ（トリプシンなど）は、個々には、バイオフィルム炎症を解決することはできない。抗生物質は、幅広い効果の程度で、全身的および局所的細菌性炎症の治療に用いることができるが、バイオフィルムの細胞外基質に侵入することができず、バイオフィルム内の細菌を死滅させる効能は限られている。抗生物質は、故に、バイオフィルムから派生する炎症を完全に解消することはできない。
【００１９】
セリンプロテアーゼ（トリプシンなど）は、細菌の細胞外基質を溶解させることができ、また生物学的または無機的物質に付着する細菌を放すこととその再付着を防止することもできる。しかし、細菌は、トリプシン治療では、死滅させられず、時を得て、表面に付着する能力を回復することができる。
【００２０】
このように、セリンプロテアーゼまたは抗生物質の個別の服用では、完全にバイオフィルム炎症を解決することはできない。
【００２１】
本発明は、セリンプロテアーゼ（トリプシンなど）と従来の抗生物質化合物を組み合わせて服用した時の、細菌性バイオフィルムへの予期しない相乗効果の発見により成された。驚くべきことに、この選択された活性薬剤の組み合わせは細胞外基質とバイオフィルムの細菌の両方を相乗的に破壊することができる。理論に束縛されることは望まないが、バイオフィルムの細胞外基質を崩壊させることによって、セリンプロテアーゼは、抗生物質をバイオフィルムにより深く入り込ませ、そこに存する細菌細胞へ接近させることができる。これによって、抗生物質は、もしそうでなければ細胞外基質のバリアー効果によって働きを邪魔されることになるが、その機能を細菌上に発揮することが許される。
【００２２】
当業者であれば、上述の併用療法は、微生物バイオフィルムが見つけられるあらゆる環境において、該バイオフィルムの成長を死滅させ、禁じ、防ぐために用いることができることを理解するであろう。このように、バイオフィルムは、不活性な支持体あるいは生きている支持体のいずれかと関連づけられる。
【００２３】
一つの実施形態において、バイオフィルムは生きている支持体と関連づけられる。例えば、バイオフィルムは、ヒトあるいは動物の身体内の表面上に成長し、あるいは成長することが可能である。
【００２４】
それ故、上記定義したように、本発明は、バイオフィルムの存在するあるいは成長と関連する状況の処置または防止に使用するための併用療法を提供する。
【００２５】
例えば、上記の併用療法は、身体内で次の部位の一つにおいて、微生物バイオフィルムの成長と関連する不調あるいは状況を治療または防止するために用いられる。
（ａ）気道（例えば、上気道および／あるいは下気道の再起性細菌感染症）、
（ｂ）尿管（例えば、膀胱炎）、
（ｃ）副鼻腔（例えば、慢性副鼻腔炎）、
（ｄ）耳（例えば、内耳感染症）、
（ｅ）心臓（例えば、心内膜炎）、
（ｆ）前立腺（例えば、慢性細菌性前立腺炎）、
（ｇ）骨（例えば、骨髄炎）、
（ｈ）肺（例えば、肺炎などののう胞性線維症における炎症）、
（ｉ）腎臓（例えば、伝染性腎結石および腹膜透析において）、および／あるいは
（Ｊ）皮膚。
【００２６】
更なる実施形態において、バイオフィルムは、不活性な支持体に関連している。このように、バイオフィルムは、ヒトまたは動物の体に移植されたあるいはその他の挿入された装置の表面において成長または成長が可能である。
【００２７】
例えば、上述の併用療法は、次の身体内の不活性な表面の一つに成長する微生物バイオフィルムに関連する感染を治療または防止するために用いられる。
（ａ）カテーテル（例えば、血管内あるいは尿路用途）、
（ｂ）ステント（例えば、冠状動脈のステント）、
（ｃ）シャント（例えば、中枢神経系のシャント）、
（ｄ）挿入管または気管切開チューブ、
（ｅ）眼科の装置（例えば、コンタクトレンズ、強膜バックル、眼球内レンズ）、
（ｆ）人工関節（すなわち、関節形成やその他の整形外科装置の移植）、
（ｇ）人工心臓弁、および／または
（ｈ）乳房インプラント。
【００２８】
このように、上述の併用療法は、院内感染の治療や予防に特に適していることが理解されるであろう。
【００２９】
一つの実施形態において、バイオフィルムはグラム陰性および／またはグラム陽性の細菌を含んでいるか、またはそれらから成る。
【００３０】
このように、細菌は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）あるいは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）からなる群から選ばれる細菌などグラム陽性細菌である。例えば、この細菌は、黄色ブドウ球菌（例えば、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ）等のブドウ球菌である。あるいは、この細菌は、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよび／またはサンギス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）など連鎖球菌である。
【００３１】
細菌は、またレジオネラなどのグラム陰性細菌である。
【００３２】
一つの好ましい実施形態において、バイオフィルムは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、インフルエンザ菌（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ）、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、サンギス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、およびそれらの混合物からなる属から個別に選ばれる細菌を含んでいる。
【００３３】
このように、該バイオフィルムは、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、あるいはこれらの混合物らから個別に選択される細菌を含んでいる。
【００３４】
例えば、バイオフィルムは、ストレプトコッカス・ミティスおよび／あるいは肺炎連鎖球菌などの連鎖球菌を含むか、あるいはこれらから成っている。
【００３５】
本発明の併用療法は、患者に、薬剤的有効量が投与される。ここで用いられる「治療上有効量」、または「有効量」、または「治療上有効」は、付与の状況や服用の摂生計画において、治療効果（例えば、細菌性バイオフィルムの成長を根絶する、大きさを減少させる、あるいは遅らせることなど）をもたらす量を言う。この量は、必要な添加物や希釈剤、すなわち、支持体や服用賦形剤など、と関連する、望まれる治療効果を生み出すための計算された活性な物質のあらかじめ決められた量である。さらに、この量は、宿主の活性、機能、および応答における臨床的に著しい欠損を、抑えるか、あるいは最も好ましくは防ぐための治療上有効な量を意味する。あるいは、治療上有効量とは、宿主の臨床上著しい状況を改善するための十分な量である。当行者に理解されるように、化合物の量は、その特定の活性によって多様に異なる。服用適量は、必要な希釈剤と関連した、望ましい治療効果を引き起こすためにあらかじめ決められた量の活性組成物を含んでいる。本発明の組成物の製造方法と適用法において、治療上有効量の活性成分が提供される。治療上有効量は、当業界でよく知られているように、通常の技量を持つ医学または獣医学の当業者であれば、年齢、体重、性別、状態、合併症、その他の病気、等の患者の特性に基づいて決めることができる。薬剤的有効量の投与は、個別の服用単位あるいは、複数のより少ない服用単位の形での一回の投与か、小分けにされた一回分の服用量を特定の期間ごとに複数回に分けて投与するか、両方で実行することができる。あるいは、長い期間にわたる継続的な点滴として投与してもよい。
【００３６】
始めに、本発明の併用療法における非常に重要な成分は、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドである。
【００３７】
セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、タンパク質のペプチド結合、ここでセリンはポリペプチドの活性点において求核アミノ酸として働くのであるが、を開裂させることができ、また自然発生的また非―自然発生した触媒的ポリペプチドを含んでいる（ＥＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３．４．２１により定義されている）。セリンプロテアーゼ活性は、キモトリプシンのような（すなわち、トリプシンや、キモトリプシン、やエラスターゼ）またはスブチリシンのようなものである。
【００３８】
一つの実施形態において、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、トリプシン活性を禁ずる。例えば、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、真核生物起源または原核生物起源の自然発生的なトリプシンであるか、またはトリプシンの突然変異したものである。特定的に含まれるのは、タイセイヨウマダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）、大西洋および太平洋サケ（例えば、Ｓａｌｍｏｎ  ｓａｌａｒ、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓの種）、スケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）からのトリプシンやそれらの突然変異体（以下に示す）などの低温適応トリプシンである。
【００３９】
トリプシンの三つの主だったアイソザイムは、タイセイヨウマダラから特徴づけられ、トリプシン  Ｉ、ＩＩ、とＩＩＩと呼ばれる（参照、Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４、ここに開示されていることは、本出願の参照として組み込まれる）。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣＯ９０３９７参照。
【００４０】
加えて、タイセイヨウマダラは、キモトリプシンの二つの主だったアイソザイムを表し、キモトリプシンＡとＢと名付けられている。（参照、Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ＆Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ９９８：３２７−３３５，ここに開示されていることは、本出願の参照として組み込まれる  ）。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ５５２４２．１．参照。
【００４１】
一つの実施形態において、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、タイセイヨウマダラ（Gadus morhua）のトリプシンアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列が一致するアミノ酸配列を含んでいるか、またはその配列から成っている、すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、
16
I
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWWSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
I
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
I
WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
I
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１]
（ここで、アミノ酸配列と番号は、タンパク質立体構造データバンク[ＰＤＢ]エントリー「２ＥＥＫ」に従っている）。
【００４２】
多くのプロテアーゼのように、タイセイヨウマダラからのトリプシンＩは、成熟した活性なトリプシンを生成するために切りはなされたプロペプチド（または「活性化」）配列を含む不活性前駆体、あるいは酵素原、として生成される。トリプシンのための初期発現生成物は、シグナル配列、これは除去された次の発現であるが、も含んでいる。
【００４３】
シグナル配列を含んでいる、タイセイヨウマダラからのトリプシンＩのための酵素原配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ユニプロットデータベース登録番号Ｐ１６０４９−１と対応する）。
【００４４】
【表１】
2018521143.tif 000003
【００４５】
ここで、
シグナルペプチド＝アミノ酸１から１３（下線付き）
プロペプチド＝アミノ酸１４から１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０から２４１
【００４６】
ここで用いられる「アミノ酸」の用語は、標準的な２０の遺伝子的に暗号化されたアミノ酸と、これらに対応するＤ−型（自然のＬ−型と比較すると）立体異性体、オメガアミノ酸およびその他の自然発生のアミノ酸、従来にないアミノ酸（例えば、α，α-二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、等）、および化学的に派生されたアミノ酸である（以下参照）。
【００４７】
アミノ酸が「アラニン」、「Ａｌａ」、または「Ａ」などのように特定的に列挙されている場合、明確な言及がなければそれらは、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンの両方のことである。
【００４８】
アミノ酸が「アラニン」、「Ａｌａ」、または「Ａ」などのように特定的に列挙されている場合、明確な言及がなければそれらは、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンの両方をさす。その他の従来にないアミノ酸も、望ましい機能が、ポリペプチドによって保たれる限り、本発明のポリペプチドの成分として適当である。ポリペプチドを示すため、記号化された各アミノ酸残基は、適当な所では、通常のアミノ酸の慣用名に対応して、一文字で表わされている。
【００４９】
通常通り、ここではアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向であらわされている。
【００５０】
通常、本発明の組成物中に採用されているポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むか、あるいはそれらから成る。
【００５１】
セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８%または９９%の配列相同性を持っているアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれらから成っていてもよい。
【００５２】
このように、一つの実施形態において、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれらから成っていてもよい。
【００５３】
該ポリペプチドは、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の突然変異体または変異体のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれらから成っている。「変異体」は、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と１００％相同なアミノ酸配列を持っていないことを意味する、すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の一つまたは二つ以上のアミノ酸が突然変異していなければならない。例えば、該ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同なアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれらから成っており、より好ましくは、該配列に少なくとも６０％、７０％、または８０％または８５％または９０％の相同性、さらにより好ましくは、該アミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性である。このように、アミノ酸が特定の位置で除かれているか置換されていてもよく、一つあるいは二つ以上のアミノ酸が挿入／加えられていてもよい。当業者であれば、置換とは、伝統的であっても、非伝統的であってもよいことは理解されるであろう。
【００５４】
相同性百分率は、例えば、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７，ここに開示されていることは、本出願の参照として組み込まれる  ）Ｅｘｐａｓｙ施設サイト：（http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html）で、グローバルアライメントオプション、得点マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャプ開始ペナルティー―１４、ギャプ伸展ペナルティー−４パラメータ―として用いて計算される。あるいは、二つのポリペプチド間の配列の相同性百分率は、適当なコンピュータプログラムを用いて計算できる。例えば、ウィンスコンシン大学の遺伝子電子計算グループのギャププログラムや光学的に配列されたポリペプチドとの関連づけで相同性百分率は計算できると理解されたい。
【００５５】
該整列は、あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０に記載されているように、またこの内容は本出願に参照として組み込まれる）によって実行することもできる。用いられるパラメータは以下のとおりである。
−高速対整列化パラメータ（ｆａｓｔ  ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：Ｋ−組（語）サイズ  （Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ）;１、ウィンドウサイズ（ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ）;５、ギャプペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）;  ３、上位対角線の数（ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｏｐ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ）；５、得点法：ｘ  ｐｅｒｃｅｎｔ。
【００５６】
−多重整列化パラメータ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：ギャップ開始ペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）；１０、ギャプ伸展ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）；０．０５。
−得点マトリックス:  ＢＬＯＳＵＭ。
【００５７】
あるいは、局所配列の整列化を決定するためにＢＥＳＴＦＩＴプログラムが用いられてもよい。
【００５８】
このように、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢへの国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１００６（公開番号ＷＯ２０１５／１５０７９９）にあるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の変異体であってもよい。
【００５９】
当業者であれば、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、二者択一的に上記定義されたアミノ酸配列のいずれかの断片、この断片は抗細菌活性を示すものであるが、を含むか、またはこれらから成ることを理解するであろう。
【００６０】
「断片」とは、限定はしないが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または２などの、上記アミノ酸配列のいずれかの少なくとも隣り合う５個のアミノ酸を言う。例えば、断片は、上記アミノ酸配列のいずれかの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、あるいはそれ以上の隣り合うアミノ酸を含んでいる。
【００６１】
抗微生物（すなわち、抗細菌性）活性を保つ、上に定義されたセリンプロテアーゼポリペプチドの相同性を確かめる方法は当分野で公知である。例えば、異なる断片の連なりは、ＷＯ２０１５／１５０７９９に記載されている発現方法を用いて、公知の組換え方法論によって生成され、その後、試験管内で代表的な微生物（細菌種、ウィルスおよび／あるいは真菌種など）に曝露され、どの断片が該微生物の成長および／あるいは増殖を（部分的または全面的に）禁じているかを決定した。
【００６２】
一つの特に好ましい実施形態において、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、自然発生のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらから成る。このように、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、真核生物起源または原核生物起源の、自然発生のトリプシンのアミノ酸配列から成る。特定的に含まれるのは、タイセイヨウマダラ（Gadus morhua）、大西洋および太平洋サケ（たとえば、Salmon salar、Oncorhynchusの種）、スケトウダラ（Theragra chalcogramma）からのトリプシンなどの低温適応トリプシンである。例えば、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸を含むか、または、これらから成る。
【００６３】
その様な、自然発生のセリンプロテアーゼは、源生物（例えば、タイセイヨウマダラ）から精製または組換えによって発現してもよい。
【００６４】
このように、当業者であれば、そのような自然発生の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、自然界で見つけられたものと異なる形で提供し得ることを理解するであろう。例えば、本発明のポリペプチドは、自然発生の真核生物トリプシンのアミノ酸配列から成ってもよいが、自然界に発現されるタンパク上に存在するグリコシル化成分は欠いている。
【００６５】
該ポリペプチド成分は、用いられているセリンプロテアーゼの効能／毒性によって、様々な濃度で調剤することができる。好ましくは、該処方は、活性薬剤を、例えば少なくとも０.０１μΜ、少なくとも０.１μΜ、少なくとも１μΜ、少なくとも１０μΜ、少なくとも１００μΜ、または少なくとも５００μΜなど、少なくとも０.００１μΜの濃度で含んでいる。都合よくは、活性薬剤を、例えば５００μΜまで、１００μΜまで、１０μΜまで、1μΜまで、０．１μΜまで、あるいは０．０１μΜまでなど、１ｍＭの濃度で含んでいる。一つの実施形態において、セリンプロテアーゼポリペプチドは０．００１から１０μΜまでの間の濃度で処方に含まれている。このように、治療的処方はポリペプチドをバイオフィルム群の細菌の成長を死滅あるいは遅らせるのに十分な量で含んでいる。
【００６６】
この態様の一つの実施形態において、セリンプロテアーゼポリペプチド（例えば、タラトリプシン）の活性は、０．００１Ｕ／ｇから３２Ｕ／ｇである。
【００６７】
本発明の併用療法の重要な、更なる成分は、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物である。
【００６８】
公知の抗生物質のいずれも用いることができる。例えば、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物は、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルバペネム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロランフェニコル、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、およびそれらの混合物である。
【００６９】
一つの好ましい実施形態において、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、テトラサイクリン、セフォタキシム、バンコマイシン、エリスロマイシン、およびオキサシリンからなる群から選ばれる。
【００７０】
当業者であれば、本発明の併用療法は、単一の抗生物質化合物か複数の抗生物質化合物から成ることを理解するであろう。
【００７１】
本発明の併用療法において用いられる抗生物質の濃度は、該分野の一般常識に従って、用いられる特定の抗生物質と治療されるバイオフィルムの兆候および／または位置によって決まる。一般的には、抗生物質は、例えば０．１から5％（重量で）など、０．１％から５％（重量で）の間の濃度で処方されるであろう。
【００７２】
本発明の第二の関連する態様は、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドの患者内の細菌性バイオフィルム治療への使用であるが、ここで該ポリペプチドは一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物と組み合わせ用いられる。
【００７３】
本発明の第三の関連する態様は、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドを患者内の細菌性バイオフィルムの治療用の薬剤の調合に提供することであるが、該ポリペプチドは一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物と組み合わせ用いられる。
【００７４】
本発明の第二および第三の態様との関係で用いるのに適したセリンプロテアーゼポリペプチドと抗生物質化合物の例としては上に詳述している。
【００７５】
本発明の第四の態様は、医薬的に許容される緩衝剤、賦形剤、希釈剤、あるいは支持体とともに（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を含んでいる医薬組成物を提供する。
【００７６】
本発明の第四の態様との関係で、用いるのに適したセリンプロテアーゼポリペプチドと抗生物質化合物の例としては上に詳述している。
【００７７】
一つの実施形態において、セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、例えば少なくとも０．０１μΜ、少なくとも０．１μΜ、少なくとも１μΜ、少なくとも１０μΜ、少なくとも１００μΜ、あるいは少なくとも５００μΜなど、少なくとも０．００１μΜの濃度で存在する。都合よくは、該組成物は、活性薬剤を、例えば５００μΜまで、１００μΜまで、１０μΜまで、1μΜまで、０．１μΜまで、あるいは０．０１μΜまでなど、１ｍＭの濃度で含んでいる。一つの実施形態において、セリンプロテアーゼポリペプチドは０．００１から１０μΜまでの間の濃度で該組成物に含まれている。
【００７８】
タラから得られるトリプシンを用いる場合、組成物におけるその濃度は、０．００１Ｕ／ｇから３２Ｕ／ｇ（すなわち、最終組成物の１グラム中の活性単位として測定される）である。
【００７９】
一つの実施形態において、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物は、重量で０．１％から５％、例えば０．１％から２％、０．５％から１．５％、好ましくは１％の濃度で存在する。
【００８０】
医薬組成物は、当該分野で公知の、ヒトや動物に投与するため、十分保存に対して安定であり適した方法で調剤することができる。例えば、該治療組成物は、例えば、凍結乾燥、スプレー冷却、臨界粒子形成から粒子形成を使用することによって、高減圧化で凍らせ乾燥されてもよい。
【００８１】
「医薬的に許容できる」とは、本発明のポリペプチドのトリプシン活性の効果を減じない無毒性の物質のことを言う。その様な医薬的に許容できる緩衝剤、支持体、あるいは賦形剤は当該分野でよく知られている。（参照、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９０）  ａｎｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｋｉｂｂｅ，  Ｅｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００），この開示は参照として本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
「緩衝剤」の用語は、ｐＨを安定化させる目的を持つ酸―塩基混合物を含む水溶液を意味する。緩衝剤の例としては、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ，ＳＳＰＥ，ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴＥＳがある。
【００８３】
「希釈剤」の用語は、治療調剤におけるペプチドを希釈する目的を持つ水溶性あるいは非―水溶性溶液を意味する。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、あるいは油（例えば、紅花油、トウモロコシ油、ピーナッツオイル、あるいはごま油）のうちの一つあるいは二つ以上である。
【００８４】
「賦形剤」は、炭水化物、高分子、脂質、および鉱物のうちの一つあるいは二つ以上である。炭水化物の例としては、乳糖、ブドウ糖、しょ糖、マンニトール、およびシクロデキストリンがあり、これらは、例えば親油性化を促進するために組成物に加えられる。高分子の例としては、デンプン、セルロースエーテル、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル  セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギニン酸塩、カラギーナン，ヒアルロン酸とその誘導体、ポリアクリル酸アクリル酸、ポリスルフォネート、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド／ポリプロピレンオキサイド共重合体、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール/ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンがあり、これらはすべて異なる分子量を持ち、例えば、粘性の調整のためや、バイオ付着を達成するため、あるいは化学的およびタンパク分解による分解から保護するために組成物に加えられる。脂質の例としては、すべて異なるアシル鎖長と飽和を持つ脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリ−グリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、また卵レシチン、大豆レシチン、水添された卵および大豆レシチンがあり、これらは高分子と同じような理由により組成物に加えられる。鉱物の例としては、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、および酸化チタンがあり、これらは液体の蓄積の低減や優れた含量特性の利を得るため組成物に加えられる。
【００８５】
一つの実施形態において、ポリペプチドは、塩化カルシウムなど安定化剤とともに提供される。
【００８６】
さらに、本発明の組成物に含まれるものは、紫外線吸収剤（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルメチル  ＰＡＢＡ  オクチルエステル、オクチルメチル桂皮酸エステル、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、モノ−2−エチルジ−Ｐ−メトキシ桂皮酸エステル、グリセリルヘキサン酸エステル２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン-５-ナトリウムスルフォネート）、低級アルコール（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、保存剤（例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、フェノキシエタノール）、殺菌剤（例えば、クロロヘキシジン、塩酸塩，トリクロロカルバニリド、トリクロサン、ジンクピリチオン）、銀（例えば、銀単体、酸化銀、硝酸銀、スルファジアジン銀、銀ナノ粒子）、着色剤（例えば、染料、顔料）、香味料（例えば、メントール、カンファ、チモール、ユーカリプトール）、粉末、香料（例えば、エッセンシャルオイル、動物有機体の香料、人工香料）、ビタミン（例えば、ビタミンＡとその誘導体、ビタミンＥとその誘導体、ビタミンＣとその誘導体、パントテン酸、ビタミンＨ，ビタミンＢとその誘導体）、尿素，水溶性高分子（例えば、ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン、カルボキシルビニル高分子、キサンタンガム、ヒアルロン酸）、緩衝剤（例えば、グルタミン酸ナトリウム、アルギニン、アスパラ銀酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム）、抗生物質、抗真菌剤、抗ウィルス剤、および抗寄生虫薬であってよい。
【００８７】
セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドは、ポリペプチド剤の放出に適していると知られているいかなるタイプの治療組成物として処方することができる。
【００８８】
一つの実施形態において、該ポリペプチドと抗生物質化合物は、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールあるいは油（紅花油、トウモロコシ油、ピーナッツオイル、綿実油、ごま油など）、トラガカントガムおよび／または種々の緩衝剤に単純に溶解してもよい。例えば、ポリペプチドが経口投与（口中スプレーなど）として処方される場合、治療組成物は、水、グリセロールやメンソールに溶解したポリペプチドを含んでいる。口中スプレー調剤の例としては、ＣｏｌｄＺｙｍｅ（登録商標） （Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢ社製造， Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）としてスカンジナビア内で市販されている。
【００８９】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上述のポリペプチドと抗生物質化合物を浸透圧的に活性な溶液として提供する。例えば、該ポリペプチドと抗生物質化合物は、グリセロールまたはグリセリン中に調剤される。理論に束縛されることは望まないが、そのような浸透圧的に活性な溶液は、微生物細胞から細胞外環境へと液体の移動を促進するものと思われる。このことが、例えば、中咽頭などの上皮細胞による細菌やウィルスなどの微生物細胞の取り込みを禁ずる（少なくとも部分的に）薄く活性な障壁を作ることによって、順に本発明のポリペプチドの治療効果を促進するものと思われる。
【００９０】
更なる実施形態において、本発明の治療組成物は、他の医薬的に許容できる支持体に加え、ミセルのような凝集体、不溶性単層、あるいは液晶として存在する脂質などの両親媒性薬剤とともに、該ポリペプチドと抗生物質化合物が組み合わされている形状である、リポソームの形状をしている。リポソーム処方に適した脂質は、限定はしないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、胆汁酸、等である。適した脂質は、また、血流循環時間をひき延ばすため水溶性頭部において、ポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記脂質も含む。その様なリポソーマル製剤の調剤は、例えばＵＳ４，２３５，８７１に見出すことができ、ここに開示されている内容は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本発明の治療組成物は、また、生分解性の微粒子の形状でもよい。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡの共重合体（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ無水物が、微粒子の製造における生分解性重合体として広く用いられてきた。その様な微粒子製剤は、ＵＳ５，８５1，４５1およびＥＰ０２１３３０３に見出すことができ、ここに開示されている内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００９２】
更なる実施形態において、本発明の治療組成物は、ポリマーゲルの形状で提供され、ここでデンプン、セルロースエステル、セルロース  カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル  セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸，ポリビニルイミダゾール、ポリスルフォネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド／ポリプロピレンオキサイド共重合体、加水分解の程度の異なるポリビニルアルコール／ポリビニルアセテートおよびポリビニルピロリドンなどのポリマーが、ペプチドを含む溶液の濃度を濃くするために用いられる。ポリマーはまたゼラチンあるいはコラーゲンを含んでいてもよい。
【００９３】
本発明の治療組成物は、ポリペプチドの相乗効果のためイオンや所定のｐＨを含んでいる。加えて、該組成物は、殺菌などの従来の治療用処理がほどこされまた／あるいは防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、フィラーなどの従来の補助剤を含んでいてもよい。
【００９４】
一つの好ましい実施形態において、治療組成物は、ＥＤＴＡ、キシリトール、ソルビトール、プロピレングリコール、およびグリセロールのうちの一つあるいは二つ以上とともに、のポリペプチドと抗生物質化合物をトリスまたはリン酸緩衝液に含んでいる。
【００９５】
本発明による治療組成物は、当業者によく知られており、適している、いずれかの経路を通して服用することができる。このように、可能性のある服用経路は、吸引、舌下、非経口（静脈内、皮下、髄腔内）、局所、眼、鼻、肺、非経口、膣、および直腸を含んでいる。また、移植によっても可能である。
【００９６】
ある選択的実施形態において、該治療組成物は非経口的、例えば、静脈的、脳室内的、関節腔内、動脈内、腹腔内、髄腔内、側脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、あるいは皮下的に服用でき、あるいは該組成物は融合技術によって服用することができる。該組成物は、他の物質、例えば血液と等張にするための塩やブドウ糖、を含む無菌の水溶液の形で簡便に用いることができる。必要ならば、該水溶液は、適するように（好ましくは、ｐＨ３から９に）緩衝されるべきである。適した非経口処方薬の調剤は、無菌の条件下で、当業者に公知の標準的医薬的技術をもってたやすく成し得る。
【００９７】
非経口投与に適した処方剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および目的とする受容者の血液と処方剤を等張にするための溶質を含む水溶性また非水溶性の無菌の注射液と、さらに懸濁剤および増ちょう剤を含む水溶性また非水溶性の無菌の懸濁液とを含んでいる。該処方剤は、封止されたアンプルや薬びんなどの、ユニットドースまたはマルチドース容器に入れられ、凍結乾燥（高減圧凍結乾燥）条件下で保存され、使用直前に、無菌の液体支持体、例えば水、を注射用に加えればよい様にされている。用事注射溶液および懸濁液は、すでに述べた種類の無菌の粉末、顆粒、および錠剤から準備できる。
【００９８】
あるいは、該治療組成物は、鼻腔内的にあるいは吸引により投与してもよい（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンや、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、（ＨＦＡ１３４Ａ３あるいは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）などのハイドロフルオロアルカン、二酸化酸素、あるいはその他の適したガスなど適当な高圧ガスを用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはディスペンサーからエアゾールスプレイの形式による）。加圧エアゾールの場合、服用量単位は、測定された量を送り出すために弁を提供することで決められる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはディスペンサーは、例えば、エタノールと高圧ガスの混合物、この混合物はさらにソルビタントリオレエートなどの潤滑剤を含んでいてもよいが、を用いた活性ポリペプチド溶液または懸濁液を含んでいる。吸引器あるいは注入器内で使用されるためのカプセルやカートリッジ（例えば、ゼラチンから作られている）は、本発明の化合物の粉末混合物と乳糖あるいはデンプンなど適した粉末塩基を含むように処方される。
【００９９】
より発展的には、ポリペプチドは、気道の粘膜へ届けるのにふさわしい形で提供される。
【０１００】
本発明の第四の態様は、患者の固形腫瘍を治療するための方法を提供するが、この方法は、治療的に有効な量の（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を患者に投与することを含んでいる。
【０１０１】
本発明の第五の態様との関係において用いられる、適したセリンプロテアーゼポリペプチドと抗生物質化合物の例は上に詳述している。
【０１０２】
「治療」は、組み合わせられた治療剤の治療的および予防的両方の用法を含んでいる。当業者であれば、併用療法とは、細菌性バイオフィルムを完全に死滅させること、あるいは部分的受益（バイオフィルムを構成する細菌群の大きさの減少および／またはバイオフィルムを構成する細菌群の成長を遅延）を与えることであると理解するであろう。
【０１０３】
一つの実施形態において、患者はヒトである。しかし、本発明の方法は、例えば、ペット動物および／あるいは農場家畜（犬、猫、馬、牛、豚、羊、等を含む）内の細菌性バイオフィルムの処置など、獣医学的環境でも有用である。
【０１０４】
当業者であれば、ここで述べられた方法は、バイオフィルムが見つけられるあらゆる環境において、微生物バイオフィルムを死滅させる、禁ずる、または防止するために用いられることを理解するであろう。このように、バイオフィルムは、不活性支持体あるいは生きている支持体いずれかと関連している。
【０１０５】
一つの実施形態において、バイオフィルムは、生きている支持体と関連している（上記参照）。例えば、バイオフィルムは、ヒトあるいは動物の身体内で表面上に成長するかまたは成長しやすい。このように、本発明は、バイオフィルムの存在または成長と関連した状況の治療あるいは防止用に、上に定義した化合物を提供することである。例えば、患者は、バイオフィルム形成と関連して、上気道および／または下気道が感染しているか、あるいは感染しやすい。
【０１０６】
更なる実施形態において、バイオフィルムは不活性支持体と関連している（上記参照）。このように、バイオフィルムは、ヒトあるいは動物の身体内で移植されたあるいは別に挿入された装置の表面に成長するか成長しやすい。
【０１０７】
このように、ここで述べられた方法は、特に院内感染の治療や防止に特に適していることは理解されるであろう。
【０１０８】
一つの実施形態において、バイオフィルムは、グラム陰性および／またはグラム陽性細菌を含むかまたはそれらの細菌から成る。
【０１０９】
このように、細菌は、ブドウ球菌または連鎖球菌からなる群から選ばれるようなグラム陽性細菌である。例えば、細菌は黄色ブドウ球菌（例えば、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ）などのブドウ球菌である。あるいは、細菌は、ミュータンス連鎖球菌および／またはサンギス菌などの連鎖球菌である。
【０１１０】
細菌は、また、レジオネラなどグラム陰性細菌である。
【０１１１】
一つの好ましい実施形態において、バイオフィルムは、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サンギス菌、レジオネラニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、およびそれらのあらゆる混合物か個々に選ばれる細菌を含んでいる。
【０１１２】
例えば、該バイオフィルムは、ストレプトコッカス・ミティスおよび／または肺炎連鎖球菌などの連鎖球菌である。
【０１１３】
本発明の方法において、併用療法は、患者に薬剤的有効量で投与する。ここで用いられている、「治療上有効量」、または「有効量」、または「治療上有効」は所与の条件と投与の摂生法に対し治療効果をもたらす量をいう（上記参照）。
【０１１４】
本発明の第六の態様は、本発明の第一の態様に従った併用療法の有効量を患者に放出するための医療装置を提供することであり、該装置は、本発明の第四の態様に従った組成物の貯蔵器と該組成物を該装置から放出する手段を含んでいる。
【０１１５】
例えば、該装置は、本発明の第一の態様に従った併用療法を気道の粘膜にまで放出するのに適した口中スプレーあるいは鼻腔スプレーである。
【０１１６】
一つの実施形態において、本発明は、上述の組成物で飽和されているか、塗布されているか、さもなければ処置されている移植可能な医療装置を提供する。
【０１１７】
例えば、該医療装置は、血管内装置、カテーテル、シャント、挿入管または気管切開チューブ、眼科の装置、人工関節、人工心臓弁、および乳房インプラントからなる群から選ばれる移植可能な医療装置である。「移植可能な装置」には、例えばコンタクトレンズなど、身体の内面または外面に装着される装置を含む。
【０１１８】
該移植可能な医療装置は、使用前は、封止された無菌の容器に包装されていることが好ましい。
【０１１９】
本発明の第七の態様は、生体外で細菌性バイオフィルムの成長を死滅させる、禁ずる、あるいは防止するための方法を提供することであり、該方法は、バイオフィルム（あるいはバイオフィルムの成長が防止されるべき表面）を本発明の第一の態様に従った併用療法に曝すことを含んでいる。例えば、上に述べた本発明の組成物は、家庭内環境（例えば、台所作業表面、シャワー、パイプ、床、等）あるいは、商用または工業環境（例えば、冷却システム内、パイプ、床表面、等）などの表面や基材上の微生物バイオフィルムの成長を防ぐための殺菌溶液あるいは洗い薬として用いてもよい。
【０１２０】
その様な洗い溶液は、さらに表面活性剤あるいは界面活性剤を含んでいてもよい。適した界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤（例えば、脂肪族スルフォネート）、両性および／または双性イオン界面活性剤（例えば、脂肪族四級アンモニウム、フォスフォニウム、およびスルフォニウム化合物の誘導体）、および非イオン界面活性剤（例えば、脂肪族アルコール、酸、アミド、またはアルキルフェノールとアルキレンオキサイド）がある。便宜上、表面活性剤は、０．５から５重量％の濃度である。
【０１２１】
生体外および生体内の両方の使用において、本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも５分間目的の表面に曝すのがよい。例えば、曝す時間は、少なくとも１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間、５時間、１２時間および２４時間である。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
次の図は、本明細書の一部であり、本発明のある態様をさらに示すために含めた。本発明は、ここに示した特定の実施形態の詳細な説明と図と組み合わせて参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【０１２３】
【図１】バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果。図は、タラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせが、それぞれ単独よりもバイオフィルムを崩壊させるのにより効果的であることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育されバイオフィルムのモデルとして用いられた。バイオフィルムは、抗生物質、または抗生物質とタラトリプシンの組み合わせで処理された。バイオフィルムは、クリスタルバイオレットで染められ、次に酢酸に溶解された。バイオフィルムの形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、一定の抗生物質、この場合テトラサイクリン、エリスロマイシン、オキサシリンおよびセフォタキシム、とタラトリプシンの組み合わせが、抗生物質のみの場合に比べ細菌性バイオフィルムの崩壊により効果があることが結論付けられる。しかし、バンコマイシンは、トリプシンとの組み合わせで、モデルのバイオフィルムに対する効能の有意な増強は示されなかった。横棒上のＰ値は、スチューデントのｔ検定で評価した時、二つの処理法の違いが有意であることを示している。
【０１２４】
【図２】バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果。図は、タラトリプシンと、テトラサイクリンまたはセフォタキシムとの組み合わせが、いずれか単独よりバイオフィルムの崩壊により効果があることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育されバイオフィルムのモデルとして用いられた。バイオフィルムは、タラトリプシン、抗生物質、またはこの二つの物質の組み合わせを用いて処理された。バイオフィルムは、クリスタルバイオレットで染められ、次に酢酸に溶解された。バイオフィルムの形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、このモデルの場合、タラトリプシンと、抗生物質のテトラサイクリンまたはセフォタキシムの組み合わせが、タラトリプシンまたは抗生物質のみの場合に比べ細菌性バイオフィルムの崩壊により効果があることが結論付けられる。横棒の上のＰ値は、ＡＮＯＶＡ分析により評価したとき、効果の有意性を示している。
【０１２５】
【図３】バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果バイオフィルム離散に対するタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果。画像は、タラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせが、いずれか単独な場合に比べ、バイオフィルムの離散により効果があることを鮮明に可視化している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、タラトリプシン、抗生物質、またはこの二つの物質の組み合わせを用いて処理された。バイオフィルムは次にクリスタルバイオレットで染色された。研究の結果に基づいて、タラトリプシンと抗生物質の組み合わせが、抗生物質のみの場合に比べ細菌性バイオフィルムの崩壊により効果があることが結論付けられる。バンコマイシンにより示されるように、抗生物質によるバイオフィルムの処理はバイオフィルム形成を増強させるが、カラム７と８で証明されているように、タラトリプシンの存在によりその効果が相殺されている。
【０１２６】
画像は、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスから成るバイオフィルムを、４時間生育し、続いてタラトリプシン（ｃｔ）、抗生物質、またはタラトリプシン／抗生物質の組み合わせによる処理がなされた９６ウェルプレートを示している。各カラムは、一種類の処理または処理の組み合わせを表しており、一方列は。上から下へと濃度が下がっていることを示している。処理後、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットで染色され、より暗い色はより多くのバイオフィルムが残っていることを示す。画像は、いずれのものでも単独より、抗生物質とタラトリプシンの組み合わせがより効果的であることを示している。このことは、薬剤単独ではバイオフィルム形成を増長するように見え、一方タラトリプシンとの組み合わせにおいては、バンコマイシンはタラトリプシンの効能を増強させることができるという点で、バンコマイシンの場合特に意味深い。最下の列はブランクを表し、そこでは最初の６穴は処理なしのバイオフィルムを表し次の６穴はバイオフィルムの不在を表す。左側の表は、各列／希釈で用いられたタラトリプシンと抗生物質の濃度を表す。
【０１２７】
画像は、トリプシンがどのように一定の抗生物質の効能を増強しているのかを示している、おそらくバイオフィルム崩壊させそれによって抗生物質を細菌に近寄らせているのであろうと思われる。
【０１２８】
【図４】クリスタルバイオレットによるバイオフィルムの染色後、可視的に表れたスーパーバイオフィルムにおけるタラトリプシンの効果クリスタルバイオレットによるバイオフィルムの染色後、可視的に表れたスーパーバイオフィルムにおけるタラトリプシンの効果。図は、バイオフィルムの不在がクリアウェルにより観察されるように、タラトリプシンがスーパーバイオフィルムを濃度依存方法で崩壊させることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせによるスーパーバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、タラトリプシンまたはプラセボで２分間処理され、ウェルは、バイオフィルムの存在（ブラックウェル）またはその不在（クリアウェル）を測定するために染色された。研究の結果に基づいて、タラトリプシンは、スーパーバイオフィルムの崩壊において非常に効果的であることが結論付けられる。
【０１２９】
写真画像は、９６ウェルプレート、そこで肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスから成るバイオフィルムが４時間生育され続いてタラトリプシンまたはプラセボで処理されたのであるが、そのプレートを示している。各カラムは、一つの濃度を表し、始めの三つの列は、タラトリプシン処理の複写物を表し、下の三つの列は同じ希釈でタラトリプシンなしの処方の複写物を示している。処理後、バイオフィルムはクリスタルバイオレットで染色され、暗い色はより多くのバイオフィルムが残っていることを示した。該画像は、タラトリプシンが、高い濃度の時バイオフィルムの除去に効果があり、しかし低い濃度の時には追加のファクターを必要としていることを示している。
【０１３０】
【図５】スーパーバイオフィルムにおけるタラトリプシンの効果クリスタルバイオレットによる染色と酢酸中への溶解後の分光光度法で測定されたスーパーバイオフィルムにおけるタラトリプシンの効果。図は、タラトリプシンが、スーパーバイオフィルムを濃度依存方法で崩壊させることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、タラトリプシンまたはプラセボで処理され、ウェルは、クリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルムの形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、タラトリプシンは、細菌性バイオフィルムの崩壊に非常に効果があることが結論付けられる。データは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）のバーとともにバーにより表示されている。プラセボとタラトリプシンで処理された細菌性バイオフィルムの希釈液のデータは、互いに隣合せてある。アスタリスク＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１、また＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表すが、有意差の程度をアスタリスク（＊）で示してあるように、同じ希釈液のプラセボと比べ、Ｐ−酵素のバイオフィルム形成のログ削減は、横棒より上にある。スチューデントのｔ検定を用いて有意性を計算した。
【０１３１】
【図６】異なる濃度でのタラトリプシンによるスーパーバイオフィルムのログ削減異なる濃度でのタラトリプシンによるスーパーバイオフィルムのログ削減。図は、タラトリプシンがスーパーバイオフィルムを濃度依存方法で崩壊させることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、タラトリプシンまたはプラセボで処理され、ウェルはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、削減は対数表示でプラセボで処理されたバイオフィルムと比べられた。研究の結果に基づいて、タラトリプシンは、８Ｕ／ｇ以上の濃度で２分未満で、細菌性バイオフィルムの崩壊に非常に効果的であることが結論付けられる。ここで、ログ削減の３は９９．９％のバイオフィルの除去を表し、ログ削減の４は９９．９９％のバイオフィルの削減である。
【０１３２】
【図７】タラトリプシンによる前処理のバイオフィルム形成における効果タラトリプシンによる前処理のバイオフィルム形成における効果。図は、３７℃で９６ウェルマイクロタイタープレート内の培養に先立ち、バイオフィルムを形成する細菌、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティス、へのタラトリプシンによる前処理は、その細菌のバイオフィルム形成能力に与える影響において濃度依存性を持つことを示している。タラトリプシンとプラセボで手短に処理された後、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムはマイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムを４時間成長させた後、ウェルはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、タラトリプシンは、細菌性バイオフィルム形成の防止に非常に効果的であることが結論付けられる。データは、ボックスプロットで表わされ、ここで、上の四角は、第三四分位を示し、四角の中ほどに近い水平ラインは中央値を示し、下の四角は、第一四分位を示す。四角の上から縦のラインが伸び最大値を示し、四角の下から他の縦のラインが伸び最小値を示す。
【０１３３】
【図８】タラトリプシンによる前処理のバイオフィルム形成における効果タラトリプシンによる前処理のバイオフィルム形成における効果。図は、浮遊する細菌のバイオフィルム形成を可能にするのに先立ち、該細菌がタラリプシンにより処理される時、該トリプシンは、濃度依存方法でバイオフィルムの形成を防止できることを示している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、タラトリプシンまたはプラセボで処理された後、マイクロタイタープレート内で生育された。バイオフィルムが４時間成長できるようにした後、ウェルはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、タラトリプシンは、細菌性バイオフィルム形成の防止に非常に効果的であることが結論付けられる。統計上の有意差は、スチューデントのｔ検定により評価されるように、ボックスの上にある符号で示されるが、ここでは、ｎ．ｓ．はｐ ＞０．０５を、* はｐ ＜ ０．０５を、 **はｐ＜０．０１を、および***は ｐ＜０．００１を示している。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：タラトリプシン組成物による、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの付着の抑制
図１と図２に示したように、タラトリプシンまたはプラセボで処理された後、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムが、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムが４時間成長した後、ウェルはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、タラトリプシン組成物が、細菌性バイオフィルムの形成の防止に非常に効果があったことが結論付けられる。バイオフィルムの形成に先立つ、細菌のタラトリプシン組成物による処理は、生体外におけるバイオフィルム形成に対して濃度依存効果があることを示した。タラトリプシンは、バイオフィルム形成を濃度依存の方法で防止する。タラトリプシンまたはプラセボで処理された後、肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムが、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムの４時間の成長が可能とされた後、ウェルはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。研究の結果に基づいて、タラトリプシンが、細菌性バイオフィルム形成を防止するのに非常に効果的であることが結論付けられる。データは、ボックスプロットとして示され、ここで、上の四角は第三四分位を示し、四角の中ほどに近い水平ラインは中央値を示し、下の四角は第一四分位を示す。四角の上から縦のラインが伸び最大値を示し、四角の下から他の縦のラインが伸び最小値を示す。プラセボとタラトリプシンで処理された細菌のデータは同じグラフに配置されている。箱の重なりは、バイオフィルム形成に違いのないことを示すものであろう。統計上有意な違いは、スチューデントのｔ検定での評価で、箱の上にある符号によって示されているが、ここではｎ．ｓ．は ｐ＞０．０５を、* はｐ＜ ０．０５を、**はｐ＜０．０１を、また ***はｐ＜０．００１をしめしている。結果は、図１，２に表示されている。
【０１３５】
図４、５、６、７、および８は、タラトリプシンが、濃度依存による方法で、細菌を表面から取り除くこと、また細菌の表面への付着を部分的に防ぐことの両方でかなり有能であることを示している。タラトリプシンは、細菌にとって致命的ではないので、これだけでは、しかしながら、細菌性炎症を完全に根絶するのに十分ではない。
【０１３６】
実施例２:トリプシン組成物による優れたバイオフィルム崩壊のためのタラトリプシンと抗生物質の組み合わせ  
肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムがマイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、抗生物質または抗生物質とタラトリプシンの組み合わせで処理された。該バイオフィルムはクリスタルバイオレットで染色され、続いて酢酸で溶解された。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。タラトリプシンと抗生物質の組み合わせが、抗生物質のみより、細菌性バイオフィルムの崩壊により効果的であることが結論付けられた（参照、図３）。横棒上のＰ値は、スチューデントのｔ検定で評価した時、二つの処理法の違いが有意であることを示している。図１に見られるように、タラトリプシンによる治療と組み合わせて選択された抗生物質を用いることは、タラトリプシンの使用が、試験された５つの内４つにおいて、抗生物質の効果を有意に強化していることを示している。図２にあるデータは、バイオフィルムがクリスタルバイオレットで染色され続いて酢酸に溶解された結果である。バイオフィルム形成は、４９２ｎｍの光吸収によって測定され、未処理のバイオフィルムの基準に適合させた。横棒の上のＰ値は、ＡＮＯＶＡ分析により評価したとき、効果の有意性を示している。データは、抗生物質による治療とタラトリプシンの局所的組み合わせによる使用は、抗生物質だけの場合と比べ、バイオフィルムの崩壊に対して改善することを示している。タラトリプシンと抗生物質の組み合わせが、抗生物質によるバイオフィルムの崩壊を良くすることが新発見された。バイオフィルム炎症を治療するとき、タラトリプシンの添加が、より低い濃度での抗生物質の使用を可能にする。図３は、バイオフィルム離散におけるタラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせの効果を示している。画像は、タラトリプシンと選択された抗生物質の組み合わせが、いずれか単独な場合に比べ、バイオフィルムの離散により効果があることを鮮明に可視化している。肺炎連鎖球菌とストレプトコッカス・ミティスの組み合わせを用いたバイオフィルムは、マイクロタイタープレート内で生育された。該バイオフィルムは、タラトリプシン、抗生物質、またはこの二つの物質の組み合わせを用いて処理された。バイオフィルムは次にクリスタルバイオレットで染色された。研究の結果に基づいて、タラトリプシンと抗生物質の組み合わせが、抗生物質のみの場合に比べ細菌性バイオフィルムの崩壊により効果的であることを結論付けられる。
【０１３７】
［先行技術文献］
Ａｕｇｕｓｔｉｎ，  Ｍ．、Ｔ．  Ａｌｉ−Ｖｅｈｍａｓ，とＦ．Ａｔｒｏｓｈｉ，２００４，”細菌性バイオフィルムに対する酵素的浄化剤および殺菌剤の評価（Assessment of enzymatic cleaning agents and disinfectants against  bacterial biofilms）" Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７， ｐ．５５-６４.
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Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，  Ｂ．，Ｌ．Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ，  Ｓ．Ｏｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ，  Ａ．  Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，２０１０，低温適用タイセイヨウマダラ（Gadus morhua）トリプシン  Ｉの特性−動的パラメータ、自己分解、および熱安定性，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｂ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．１５５、ｐ．１８６−１９４．
【図１】
2018521143.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月10日(2017.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療における使用のための併用療法であって、前記併用療法が、
（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を含み、前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとから成る群から選択される海洋セリンプロテアーゼである、併用療法。
【請求項２】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の使用のための併用療法。
【請求項３】
前記バイオフィルムが上気道および／または下気道に在る、請求項１または２に記載の使用のための併用療法。
【請求項４】
前記バイオフィルムが、グラム陰性および／またはグラム陽性細菌を含むかあるいはそれらから成る、請求項１から３のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項５】
前記バイオフィルムが、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サンギス菌、レジオネラニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、およびそれらのいずれかの混合物から独立して選択される細菌を含む、請求項１から４のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項６】
前記バイオフィルムが、連鎖球菌を含むかあるいは連鎖球菌から成る、請求項１から５のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項７】
前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス・ミティスおよび／または肺炎連鎖球菌を含むかあるいはそれらから成る、請求項１から６のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項８】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとの混合物として提供される、請求項１から７のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項９】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タラ、スケトウダラ、サケ、あるいはオキアミから得ることができる、請求項１から８のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１０】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タイセイヨウマダラから得ることができる、請求項９に記載の使用のための併用療法。
【請求項１１】
前記海洋セリンプロテアーゼが、トリプシン、例えば トリプシンＩである、請求項１０に記載の使用のための併用療法。
【請求項１２】
トリプシンの活性が０．１から１６Ｕ／ｇの範囲内である、請求項１１に記載の使用のための併用療法。
【請求項１３】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWWSAAHCYKSVLRVRLGEH HIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECA ADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAG YLEGGKDSCQGDSGGPWCNGVLQGWSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGW VRDTMANY
[ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１]
のアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列から成る、請求項１から１２のいずれかに記載の併用療法。
【請求項１４】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、自然発生源からのものを精製したものである、請求項１から１３のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１５】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、遺伝子組み換えタンパク質である、請求項１から１３のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１６】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルバペネム、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロランフェニコル、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１から１５のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１７】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、テトラサイクリン、セフォタキシム、バンコマイシン、エリソロマイシン、およびオキサシリンから成る群から選択される、請求項１から１６のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１８】
ただ一つの抗生物質化合物を含んでいる、請求項１から１７のいずれかに記載の使用のための併用療法。
【請求項１９】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療における使用のためのセリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドであって、前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとから成る群から選択される海洋セリンプロテアーゼであり、および前記ポリペプチドが一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物と組み合わせて用いることを目的とする、ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが請求項８から１５のいずれか一項で定義されている、請求項１９に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２１】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が、請求項１６から１８のいずれか一項で定義されている、請求項１９または２０に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２２】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療のための薬剤の調剤におけるセリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドの使用であって、前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとから成る群から選択される海洋セリンプロテアーゼであり、および前記ポリペプチドが、一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物との組み合わせにより使用される、ポリペプチドの使用。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが請求項８から１５のいずれか一項で定義されている、請求項２２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２４】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１６から１８のいずれか一項で定義されている、請求項２２または２３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２５】
患者内の細菌性バイオフィルムの治療のための方法であって、前記方法が、
（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を、治療的に効果のある分量で患者へ投与することを含み、前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとから成る群から選択される海洋セリンプロテアーゼである、方法。
【請求項２６】
前記患者がヒトである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオフィルムが上および／あるいは下気道にある、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオフィルムがグラム陰性および／またはグラム陽性細菌を含んでいるか、あるいはその細菌から成る、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオフィルムが肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミティス、緑膿菌、インフルエンザ菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、サンギス菌、レジオネラニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、およびそれらのいずれかの混合物から独立して選択される細菌を含んでいる、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオフィルムが連鎖球菌を含んでいるかその菌から成る、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記バイオフィルムがストレプトコッカス・ミティスおよび／または肺炎連鎖球菌を含んでいるかあるいはその菌から成る、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが請求項８から１５のいずれか一項で定義されている、請求項２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１６から１８のいずれか一項で定義されている、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが口中スプレーで送り出される、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の併用療法の有効量を患者に送り出すための医療装置であって、前記装置が、医薬組成物の貯蔵器と前記組成物を前記装置から放出する手段とを含み、前記医薬組成物が、（ａ）セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドと（ｂ）一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物を、医薬的に許容される緩衝剤、賦形剤、希釈剤または支持体とともに含み、および前記セリンプロテアーゼ活性をもつポリペプチドが、トリプシンとキモトリプシンとから成る群から選択される海洋セリンプロテアーゼである、医療装置。
【請求項３６】
前記装置が口中スプレーである、請求項３５に記載の医療装置。
【請求項３７】
前記装置が鼻腔スプレーである、請求項３５に記載の医療装置。
【請求項３８】
細菌性バイオフィルムの成長を生体外で死滅させる、禁ずる、または防止するための方法であり、バイオフィルム（または、バイオフィルムの成長が防止されるべき表面）を請求項１から１８のいずれか一項に記載の併用療法に曝すことを含んでいる方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが請求項８から１５のいずれか一項に定義されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記一つあるいは二つ以上の抗生物質化合物が請求項１６から１８のいずれか一項に定義されている、請求項３８または３９に記載の方法。
【国際調査報告】
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