(57)【要約】  本発明は、細菌細胞培養物中で多糖を生成するための培地および発酵方法に関する。一態様では、本発明は、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む複合培養培地に関する。別の態様では、本発明は、約５０ｍＭ超の総濃度のアミノ酸を有する限定培地に関する。本発明のさらなる態様は、多糖を生成する細菌を生育させるための、流加および灌流による発酵方法の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖を生成する細菌細胞を培養する培地であって、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む培地。
【請求項２】
植物加水分解産物が、大豆加水分解産物である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
大豆加水分解産物が、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ４６０１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ５６０３（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＩ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ７（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＨＥＦＴＯＮＥ  Ｄ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＥ５０Ｍ、ＳＥ５０ＭＫ、大豆ペプトン、ＢＡＣＴＯ  ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ２２０７（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ  ｆｌｏｕｒ（ＡＤＭ）および大豆ミールからなる群から選択される、請求項２に記載の培地。
【請求項４】
大豆加水分解産物が、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
植物加水分解産物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約７５ｇ／Ｌの間である、請求項１から４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
植物加水分解産物の濃度が、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
植物加水分解産物の濃度が、約２８ｇ／Ｌである、請求項６に記載の培地。
【請求項８】
酵母抽出物が、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物または合成酵母抽出物である、請求項１から７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
酵母抽出物が、限外ろ過された酵母抽出物である、請求項８に記載の培地。
【請求項１０】
限外ろ過された酵母抽出物が、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
酵母抽出物の濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
酵母抽出物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
酵母抽出物の濃度が、約１０ｇ／Ｌである、請求項１２に記載の培地。
【請求項１４】
炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
炭素供給源が、グルコースである、請求項１４に記載の培地。
【請求項１６】
炭素供給源の濃度が、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１７】
炭素供給源の濃度が、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間である、請求項１６に記載の培地。
【請求項１８】
炭素供給源の濃度が、約８０ｇ／Ｌである、請求項１７に記載の培地。
【請求項１９】
大豆加水分解産物、限外ろ過された酵母抽出物、およびグルコースを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２０】
リン酸塩を含有する成分をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２１】
リン酸塩を含有する成分が、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４である、請求項２０に記載の培地。
【請求項２２】
少なくとも１種のアミノ酸、ビタミン、ヌクレオシドまたは無機塩をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２３】
多糖を生成する細菌細胞を培養する培地であって、約５０ｍＭ超の総濃度のアミノ酸を有する培地。
【請求項２４】
約１．５ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間の総濃度のグリシンを含む、請求項２３に記載の培地。
【請求項２５】
グリシンの総濃度が、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間である、請求項２４に記載の培地。
【請求項２６】
グリシンの総濃度が、約７．５ｍＭである、請求項２５に記載の培地。
【請求項２７】
約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間の総濃度のアルギニンを含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２８】
アルギニンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間である、請求項２７に記載の培地。
【請求項２９】
アルギニンの総濃度が、約４．０ｍＭである、請求項２８に記載の培地。
【請求項３０】
約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間の総濃度のシステインを含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の培地。
【請求項３１】
システインの総濃度が、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間である、請求項３０に記載の培地。
【請求項３２】
システインの総濃度が、約０．４ｍＭである、請求項３１に記載の培地。
【請求項３３】
約５．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間の総濃度のセリンを含む、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の培地。
【請求項３４】
セリンの総濃度が、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間である、請求項３３に記載の培地。
【請求項３５】
セリンの総濃度が、約７．５ｍＭまたは約１０ｍＭである、請求項３４に記載の培地。
【請求項３６】
約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間の総濃度のグルタミンを含む、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項３７】
グルタミンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間である、請求項３６に記載の培地。
【請求項３８】
グルタミンの総濃度が、約４．０ｍＭである、請求項３７に記載の培地。
【請求項３９】
約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間の総濃度のチロシンを含む、請求項２３から３８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項４０】
チロシンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約３．５ｍＭの間である、請求項３９に記載の培地。
【請求項４１】
チロシンの総濃度が、約２．９ｍＭまたは約３．０ｍＭである、請求項４０に記載の培地。
【請求項４２】
約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間の総濃度のアスパラギンを含む、請求項２３から４１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項４３】
アスパラギンの総濃度が、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間である、請求項４２に記載の培地。
【請求項４４】
アスパラギンの総濃度が、約２０．０ｍＭである、請求項４３に記載の培地。
【請求項４５】
アスパラギンを含有しない、請求項２３から４１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項４６】
カリウム塩をさらに含む、請求項２３から４５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項４７】
カリウム塩が、塩化カリウムまたは硫酸カリウムである、請求項４６に記載の培地。
【請求項４８】
カリウム塩の総濃度が、約０．１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、請求項４６から４７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項４９】
カリウム塩の総濃度が、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間である、請求項４８に記載の培地。
【請求項５０】
カリウム塩の総濃度が、約０．９ｇ／Ｌである、請求項４９に記載の培地。
【請求項５１】
炭素供給源をさらに含む、請求項２３から５０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５２】
炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、請求項５１に記載の培地。
【請求項５３】
炭素供給源が、グルコースである、請求項５２に記載の培地。
【請求項５４】
約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の総濃度の炭素供給源を含む、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５５】
炭素供給源の総濃度が、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間である、請求項５４に記載の培地。
【請求項５６】
炭素供給源の総濃度が、約５０ｇ／Ｌである、請求項５５に記載の培地。
【請求項５７】
炭酸水素ナトリウムをさらに含む、請求項２３から５６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５８】
約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間の濃度の炭酸水素ナトリウムを含む、請求項５７に記載の培地。
【請求項５９】
炭酸水素ナトリウムの濃度が、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間である、請求項５８に記載の培地。
【請求項６０】
炭酸水素ナトリウムの濃度が、約０．８４ｇ／Ｌである、請求項５９に記載の培地。
【請求項６１】
酵母抽出物をさらに含む、請求項２３から６０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６２】
酵母抽出物が、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物および合成酵母抽出物からなる群から選択される、請求項６１に記載の培地。
【請求項６３】
酵母抽出物が、限外ろ過された酵母抽出物である、請求項６２に記載の培地。
【請求項６４】
限外ろ過された酵母抽出物が、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、請求項６３に記載の培地。
【請求項６５】
酵母抽出物の濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６６】
酵母抽出物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、請求項６５に記載の培地。
【請求項６７】
酵母抽出物の濃度が、約１０ｇ／Ｌである、請求項６６に記載の培地。
【請求項６８】
少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸；カリウム塩、炭素供給源を含み、酵母抽出物を任意選択により含む、請求項２３から６７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６９】
少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間のグリシン、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間のカリウム塩、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間の炭素供給源、および約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の酵母抽出物を含む、請求項６８に記載の培地。
【請求項７０】
少なくとも約６０ｍＭのアミノ酸、約７．５ｍＭのグリシン、約０．９ｇ／Ｌの塩化カリウム、５０ｇ／Ｌのグルコース、および約１０ｇ／Ｌの限外ろ過された酵母抽出物を含む、請求項６９に記載の培地。
【請求項７１】
多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）請求項１から７０のいずれか一項に記載の培地をバイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、発酵により生育させるステップとを含み、前記生育が、培地への栄養素の一定速度での添加を含む、方法。
【請求項７２】
栄養素が、炭素供給源である、請求項７１に記載の生育方法。
【請求項７３】
炭素供給源が、グルコースである、請求項７２に記載の生育方法。
【請求項７４】
生育させた細菌が、少なくとも９．０の細胞密度を示す、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項７５】
生育させた細菌が、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示す、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項７６】
多糖を生成する細菌が、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項７７】
多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）請求項１から７０のいずれか一項に記載の培地をバイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、灌流により生育させるステップとを含み、生育が、（ｉ）培養物から、使用済みの培地を除去すること、（ｉｉ）新鮮な培地を添加すること、および（ｉｉｉ）細菌を保持することを含む、方法。
【請求項７８】
灌流速度が、約０．０７ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間である、請求項７７に記載の生育方法。
【請求項７９】
灌流速度が、約０．６７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間である、請求項７８に記載の生育方法。
【請求項８０】
灌流速度が、約１．２０ＶＶＨである、請求項７９に記載の生育方法。
【請求項８１】
灌流速度が可変である、請求項７７に記載の生育方法。
【請求項８２】
灌流を第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで増加させる、請求項８１に記載の生育方法。
【請求項８３】
灌流を第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで減少させる、請求項８１に記載の生育方法。
【請求項８４】
灌流の持続期間が、約１時間〜約１５時間の間である、請求項７７から８３のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項８５】
灌流の持続期間が、約１時間〜約１０時間の間である、請求項８４に記載の生育方法。
【請求項８６】
灌流の持続期間が、約７時間である、請求項８５に記載の生育方法。
【請求項８７】
生育させた細菌の細胞の成長が、回分発酵システムにおける細胞の成長よりも少なくとも２倍大きい、請求項７７から８６のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項８８】
生育させた細菌が、少なくとも２０．０の細胞密度に達している、請求項７７から８７のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項８９】
生育させた細菌が、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの多糖の濃度に達している、請求項７７から８８のいずれか一項に記載の生育方法。
【請求項９０】
多糖を生成する細菌が、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される、請求項７７から８９のいずれか一項に記載の生育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞培養物中で多糖を生成するための培地および発酵方法に関する。一態様では、本発明は、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む複合培養培地に関する。別の態様では、本発明は、約５０ｍＭ超の総濃度のアミノ酸を有する限定培地に関する。本発明のさらなる態様は、多糖を生成する細菌を生育させるための、流加および灌流による発酵方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面の多糖は、ペプチドグリカン層、細胞壁および莢膜を含む最も外側の細菌細胞膜または細菌細胞表面上に少なくとも一部が位置する多糖を指す。細胞表面の多糖、特に、莢膜多糖は、治療剤としていっそう重要性を増している。典型的には、細胞表面の多糖は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答の誘発と関連がある。多糖ワクチンのいくつかの例として、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす侵襲性疾患、例として、肺炎、熱性菌血症および髄膜炎の予防のための２３価ワクチンであるＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が引き起こす侵襲性疾患の予防のための４価ワクチンであるＭＥＮＣＥＶＡＸ（登録商標）；いずれもサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｖｉが引き起こす腸チフス熱を予防するＴＹＰＨＥＲＩＸ（登録商標）およびＴＹＰＨＩＭ  ＶＩ（登録商標）が挙げられる。
【０００３】
多糖は、それら自体で免疫原性を示すが、多糖のタンパク質担体へのコンジュゲーションが、免疫原性を、特に、乳児および高齢者において改善するために使用されている。ワクチン内部に含有させる多糖を表面上に呈示する細菌に対しては、当該多糖とタンパク質担体との化学結合が免疫応答を誘発し、したがって、疾患を予防する。したがって、病原性細菌に由来する多糖を使用するワクチン接種には、宿主の免疫をブーストするための戦略となる可能性がある。
【０００４】
多糖とタンパク質とのコンジュゲートワクチンがいくつか現時点で利用可能であり、必要性が満たされていない治療領域に対処するためにさらにいくつかが開発の途上にある。例えば、侵襲性の肺炎球菌疾患から保護するために使用される肺炎球菌コンジュゲートワクチン３種、すなわち、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（いくつかの国ではＰＲＥＶＥＮＡＲ（登録商標）と呼ばれている）（７価ワクチン）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）（１０価ワクチン）、およびＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）（１３価ワクチン）が、世界市場で利用可能である。ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（登録商標）、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）およびＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（登録商標）は、髄膜炎菌血清群Ｃコンジュゲートワクチンであり、一方、ＭＥＮＶＥＯ（登録商標）、ＭＥＮＡＣＴＲＡ（登録商標）およびＮＩＭＥＮＲＩＸ（登録商標）は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５から保護する４価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンである。ＨＩＢＥＲＩＸ（登録商標）は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型が引き起こす疾患を予防する。
【０００５】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）としてもまた公知のストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶの１価の、多糖とタンパク質とのコンジュゲートが個々に、妊娠していない成人における第一相および第二相臨床治験において評価されたことがある（Ｂｒｉｇｔｓｅｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１８５（９）：１２７７〜１２８４（２００２）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８８（１）：６６〜７３（２００３）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８９（６）：１１０３〜１１１２（２００４）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１）：５５〜６３（２００７））。ＩＩ−ＴＴとＩＩＩ−ＴＴとの２価グリココンジュゲートワクチン、ならびにＩａ−ＣＲＭ１９７、Ｉｂ−ＣＲＭ１９７およびＩＩＩ−ＣＲＭ１９７グリココンジュゲートを含む３価ワクチンもまた研究されたことがある（Ｂａｋｅｒ、ＪＩＤ、２００３；Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０１１９３９２０、ＮＣＴ０１４１２８０１およびＮＣＴ０１４４６２８９）。しかし、いずれのＧＢＳワクチンもまだ承認されるに至っていない。
【０００６】
また、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が引き起こす手術部位の感染を予防するために、莢膜多糖とタンパク質とのコンジュゲートを含むワクチンが開発されつつある（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、８（１１）：１５８５〜１５９４（２０１２））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、多糖を細菌細胞培養により生成するための改善されたシステムを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらおよびその他の必要性を満たすために、本発明は、細菌細胞培養物中で多糖を生成するための培地および発酵方法に関し、本発明には、全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１５年１１月１７日出願の米国仮特許出願第６２／２５６，３４７号に開示されている発明が含まれる。以下の条項において、本発明のいくつかの態様および実施形態を記載する。
【０００９】
本発明の一態様は、多糖を生成する細菌細胞を培養する培地であって、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む培地に関する。一実施形態では、植物加水分解産物は、大豆加水分解産物、例として、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ４６０１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ５６０３（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＩ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ７（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＨＥＦＴＯＮＥ  Ｄ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＥ５０Ｍ、ＳＥ５０ＭＫ、大豆ペプトン、ＢＡＣＴＯ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ２２０７（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＡＤＭ））、ＮＵＴＲＩＳＯＹ（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ  ＦＬＯＵＲ（ＡＤＭ）または大豆ミールであり得る。別の実施形態では、大豆加水分解産物の濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約７５ｇ／Ｌの間、例として、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、または約２８ｇ／Ｌであり得る。
【００１０】
さらなる実施形態では、酵母抽出物は、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物または合成酵母抽出物であり得る。特定の実施形態では、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。さらに別の実施形態では、酵母抽出物の濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、例として、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、または約１０ｇ／Ｌである。
【００１１】
一実施形態では、炭素供給源は、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースまたはマンノースであり得る。特定の実施形態では、炭素供給源はグルコースである。さらなる実施形態では、炭素供給源の濃度は、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、例として、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、または約８０ｇ／Ｌである。
【００１２】
一実施形態では、培地は、リン酸塩を含有する成分、例として、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４をさらに含む。
【００１３】
別の実施形態では、培地は、少なくとも１種のアミノ酸、ビタミン、ヌクレオシドまたは無機塩をさらに含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、多糖を生成する細菌細胞を培養する、化学的に限定された培地であって、約５０ｍＭ超の総濃度のアミノ酸を有する培地に関する。一実施形態では、培地は、約１．５ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間、例として、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、または約７．５ｍＭの総濃度のグリシンを含む。別の実施形態では、培地は、約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、例として、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、または約４．０ｍＭの総濃度のアルギニンを含む。さらなる実施形態では、培地は、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、例として、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間、または約０．４ｍＭの総濃度のシステインを含む。さらに別の実施形態では、培地は、約５．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間、例として、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、または約７．５ｍＭの総濃度のセリンを含む。別の実施形態では、培地は、約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、例として、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、または約４．０ｍＭの総濃度のグルタミンを含む。さらなる実施形態では、培地は、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、例として、約１．０ｍＭ〜約３．５ｍＭの間または約２．９ｍＭ〜約３．０ｍＭの間の総濃度のチロシンを含む。さらに別の実施形態では、培地は、約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、例として、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、または約２０．０ｍＭの総濃度のアスパラギンを含む。特定の実施形態では、培地は、アスパラギンを含有しない。
【００１５】
一実施形態では、培地は、カリウム塩、例として、塩化カリウムまたは硫酸カリウムをさらに含む。ある実施形態では、カリウム塩の総濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、例として、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、または約０．９ｇ／Ｌである。
【００１６】
一実施形態では、培地は、炭素供給源、例として、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースまたはマンノースをさらに含む。特定の実施形態では、炭素供給源はグルコースである。ある実施形態では、炭素供給源の総濃度は、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、例として、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、または約５０ｇ／Ｌであり得る。
【００１７】
一実施形態では、培地は、炭酸水素ナトリウムをさらに含む。ある実施形態では、炭酸水素ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、例として、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、または約０．８４ｇ／Ｌであり得る。
【００１８】
一実施形態では、培地は、酵母抽出物、例として、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物または合成酵母抽出物をさらに含む。特定の実施形態では、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。さらなる実施形態では、酵母抽出物の濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、例として、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、または約１０ｇ／Ｌである。
【００１９】
特定の実施形態では、培地は、少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸；カリウム塩、炭素供給源を含み、酵母抽出物を任意選択により含む。
【００２０】
別の実施形態では、培地は、少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間のグリシン、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間のカリウム塩、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の炭素供給源、および約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の酵母抽出物を含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、培地は、少なくとも約６０ｍＭのアミノ酸、約７．５ｍＭのグリシン、約０．９ｇ／Ｌの塩化カリウム、５０ｇ／Ｌのグルコース、および約１０ｇ／Ｌの限外ろ過された酵母抽出物を含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）本発明の培地をバイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、発酵により生育させるステップとを含み、前記生育は、培地への栄養素の一定速度での添加を含む、方法に関する。一実施形態では、栄養素は、炭素供給源、例として、グルコースである。一実施形態では、細菌が、少なくとも９．０の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度を示すまで、生育を実施する。別の実施形態では、生育させた細菌は、少なくとも９．０の６００ｎｍにおけるＯＤにより決定される細胞密度を示す。別の実施形態では、細菌が少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示すまで、生育を実施する。別の実施形態では、生育させた細菌は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示す。さらなる実施形態では、多糖を生成する細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）上記の記載に従う培地を、バイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、灌流により生育させるステップとを含み、生育は、（ｉ）培養物から、使用済みの培地を除去すること、（ｉｉ）新鮮な培地を添加すること、および（ｉｉｉ）細菌を保持することを含む、方法に関する。一実施形態では、灌流速度は、約０．０７の１時間当たりの、開始培養物体積に対するフィード体積（ＶＶＨ）〜約２．００ＶＶＨの間、例として、約０．６７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、または約１．２０ＶＶＨである。別の実施形態では、灌流速度は可変である。例えば、一実施形態では、灌流は、第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで増加させる。別の実施形態では、灌流は、第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで減少させる。
【００２４】
一実施形態では、灌流の持続期間は、約１時間〜約１５時間の間、例として、約１時間〜約１０時間の間、または約７時間である。
【００２５】
別の実施形態では、生育させた細菌の細胞の成長は、回分発酵システムにおける細胞の成長よりも少なくとも２倍大きい。一実施形態では、細菌が、少なくとも２０．０の６００ｎｍにおけるＯＤにより決定される細胞密度を示すまで、生育を実施する。さらなる実施形態では、生育させた細菌は、少なくとも２０．０の６００ｎｍにおけるＯＤにより決定される細胞密度を示す。さらに別の実施形態では、細菌が少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示すまで、生育を実施する。さらに別の実施形態では、生育させた細菌は、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示す。
【００２６】
さらなる実施形態では、多糖を生成する細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、多糖を細菌細胞培養により生成するための培地および方法を提供する。特に、本発明は、被包性細菌の莢膜多糖の生成を最大化するシステムを提供する。
【００２８】
本組成物および方法を記載する前に、本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は、変化させることができることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、制限する意図はないことも理解されたい。
【００２９】
本発明の実行または試験において、本明細書に記載する方法および材料に類似するかまたはそれらと同等である任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書で言及する刊行物は全て、それらの全体が参照により組み込まれている。
【００３０】
本明細書で使用する用語は、当業者が認識し、当業者に公知である意味を有するが、利便性および完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を、本明細書の下記および全体を通して記載する。
【００３１】
単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数形への言及を含む。したがって、例えば、「方法」について言及する場合には、１つもしくは複数の方法、ならびに／または本明細書に記載する型および／もしくは本開示等の読解により当業者に明らかになるであろう型のステップが含まれる。
【００３２】
用語「約」または「およそ」は、統計学的に意味のある範囲内の値を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、典型的には、２０％以内、より典型的にはその上、１０％以内、さらにより典型的には、５％以内であり得る。用語「約」または「およそ」が包含する許容可能な変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者により容易に理解され得る。本出願内で範囲に言及する場合は常に、当該範囲に属するあらゆる整数もまた、本発明の実施形態であることを企図する。
【００３３】
用語「回分培養」（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は、本明細書で使用する場合、細胞を培養する方法であって、培地および細胞自体を含めた、細胞を培養する際に最終的に使用されるであろう構成成分全てを、培養プロセスの開始時に提供する方法を指す。回分培養は、典型的にはある時点で停止し、培地中の細胞および／または構成成分を収集し、任意選択により精製する。
【００３４】
用語「バイオリアクター」は、本明細書で使用する場合、細菌細胞培養物の成長のために使用する任意の槽を指す。バイオリアクターは、細菌細胞の培養に有用である限り、任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０；５０；１００；２５０；５００；１，０００；２，５００；５，０００；８，０００；１０，０００；もしくは１２，０００リットル以上、または間にある任意の体積であり得る。典型的には、培養期間の間は、これらに限定されないが、ｐＨおよび温度を含めた、バイオリアクターの内部条件を制御する。バイオリアクターは、ガラス、プラスチックまたは金属を含めた、本発明の培養条件下で、培地中に細菌細胞培養物を懸濁させて保持するのに適切である任意の材料から構成することができる。用語「生成用バイオリアクター」は、本明細書で使用する場合、目的の多糖の生成において使用する最終的なバイオリアクターを指す。大規模な細胞培養による生成用バイオリアクターの体積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１，０００；２，５００；５，０００；８，０００；１０，０００；もしくは１２，００００リットル以上、または間にある任意の体積であり得る。当業者であれば、本発明の実行において使用するのに適切なバイオリアクターを理解し、選ぶことが可能である。
【００３５】
用語「莢膜多糖（ｃａｐｕｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅまたはｃａｐｕｓｕｌｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は、グリコポリマーを指し、こうしたグリコポリマーは、グリコシド連結によりつながる、１つまたは複数の単糖の反復単位を含む。莢膜多糖は典型的には、細菌細胞の周囲にカプセル様の層を形成する。
【００３６】
用語「細胞密度」は、本明細書で使用する場合、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。
【００３７】
用語「細胞生存率」は、本明細書で使用する場合、培養物中の細胞の、所与のセットの培養条件または実験の変更形態下で生存する能力を指す。また、この用語は、本明細書で使用する場合、特定の時期における培養物中の生きている細胞と死んでいる細胞との総数に関する、当該時期において生存中である細胞の部分も指す。
【００３８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法においてそれらに与えられている意味を有し得、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる。そのような用語は、特定の成分またはセットの成分を、いずれのその他の成分も除外することなく含むことを指す。
【００３９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｉｔ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し、すなわち、これらの用語は条件固定型であることを意味する。したがって、これらの用語は、特定の成分またはセットの成分を含み、全てのその他の成分を除外することを指す。
【００４０】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語は、米国特許法においてそれらに与えられている意味を有し、例えば、それらの用語により、本発明の新規のまたは基本的な特徴から外れない追加の成分またはステップを含むことが可能になる；すなわち、それらの用語により、本発明の新規のまたは基本的な特徴から外れる、追加の、記載されていない成分またはステップは除外され、それらの用語により、先行技術、例として、本明細書に引用するかまたは参照により本明細書に組み込まれている当技術分野の文献の成分またはステップは除外される；とりわけ、その理由は、特許性のある、例えば、新規の、自明でない考案である実施形態を、先行技術に比して、例えば、本明細書に引用するかまたは参照により本明細書に組み込まれている文献に比して定義することが、本記載の目標であるからである。
【００４１】
用語「培養物」、「細胞培養物」および「細菌細胞培養物」は、本明細書で使用する場合、細胞集団の生存および／または成長に適切な条件下の培地中に懸濁している細菌細胞集団を指す。これらの用語は、本明細書で使用する場合、細菌細胞集団と当該集団が懸濁している培地とを含む組合せを指すことができ、このことは、当業者に明らかである。
【００４２】
用語「二糖」は、本明細書で使用する場合、グリコシド結合により一緒になって連結している、２つの単糖の単位または部分から構成される多糖を指す。
【００４３】
用語「流加培養」は、本明細書で使用する場合、細胞を培養する方法であって、培養プロセスの開始に続いて、何らかの時期において、追加の構成成分を培養物に提供する方法を指す。提供する構成成分は典型的には、培養プロセスの間に枯渇してしまった、細胞のための栄養補充物質を含む。流加培養は、典型的にはある時点で停止し、培地中の細胞および／または構成成分を収集し、任意選択により精製する。
【００４４】
「培地」、「細胞を培養する培地」、「細菌を培養する培地」および「培養培地」というこれらの用語は、本明細書で使用する場合、成長しつつある細菌細胞に栄養を与える栄養素を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、細胞が最低限の成長および／または生存のために必要とする必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー供給源、脂質ならびに微量元素を提供する。また、溶液は、ホルモンおよび増殖因子を含めた、成長および／または生存を、最低限の速度を上回って増強する構成成分も含有することができる。溶液は、好ましくは、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に調合する。培地はまた、「限定培地」、すなわち、タンパク質、加水分解産物、または不明の組成の構成成分を含有しない無血清培地である場合もある。限定培地は、動物に由来する構成成分を含有せず、全ての構成成分が、公知の化学構造を有する。
【００４５】
用語「代謝老廃物」は、本明細書で使用する場合、特に、莢膜多糖の生成に関して、細胞培養物に何らかの形で有害である正常なまたは正常でない代謝プロセスの結果として、細胞培養により生成される化合物を指す。例えば、代謝老廃物は、細胞培養物の成長もしくは生存率に有害である場合があり、または生成される莢膜多糖の量を減少させる場合がある。例示的な代謝老廃物として、グルコース代謝の結果として生成する乳酸塩、およびグルタミン代謝の結果として生成するアンモニウムが挙げられる。本発明の１つの目標は、細菌細胞培養物中の代謝老廃物の生成の緩慢化、そうした代謝老廃物の低下であり、またはそうした代謝老廃物の排除でもある。
【００４６】
「単糖」は、本明細書で使用する場合、オリゴ糖中の単一の糖残基を指す。
【００４７】
「オリゴ糖」は、本明細書で使用する場合、単糖の単位または部分を２つ以上含有する化合物を指す。オリゴ糖の文脈内では、個々のモノマーの単位または部分は、ヒドロキシル基を通して、別の単糖の単位または部分に結合しているかまたは結合することができる単糖である。オリゴ糖は、保護されている、単一の残基の糖からの化学合成かまたは生物学的に生成された多糖の化学分解のいずれかにより調製することができる。代わって、オリゴ糖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素による方法により調製することもできる。
【００４８】
用語「灌流培養」は、本明細書で使用する場合、細胞を培養する方法であって、培養プロセスの開始に続いて、追加の構成成分を、培養物に連続的または半連続的に提供する方法を指す。提供する構成成分は典型的には、培養プロセスの間に枯渇してしまった、細胞のための栄養補充物質を含む。培地中の細胞および／または代謝老廃物等の構成成分を一部、典型的には連続的または半連続的な方式で収集し、任意選択により精製する。
【００４９】
用語「多糖」（ＰＳ）は、少なくとも５つの単糖の単位または部分の、線状または分枝状のポリマーを指す。明確には、より多くの数の反復単位を、本明細書では多糖と呼び、この場合、ｎは約５つ超、例として、約１０個超である。
【００５０】
用語「糖」は、本明細書で使用する場合、単一の糖部分または単糖単位、ならびに共有結合的に連結して、二糖、オリゴ糖および多糖を形成している、２つ以上の単一の糖部分または単糖単位の組合せを指す。用語「糖」は、用語「炭水化物」と交換可能に使用することができる。
【００５１】
用語「播種」は、本明細書で使用する場合、バイオリアクターまたは別の槽に、細胞培養物を提供するプロセスを指す。細胞は、別のバイオリアクターまたは槽中であらかじめ増殖させておくことができる。代わって、細胞を、凍結しておき、バイオリアクターまたは槽に細胞を提供する直前に、解凍することもできる。この用語は、単一細胞を含めた、任意の数の細胞を指す。
【００５２】
用語「タイター」は、本明細書で使用する場合、所与の量の培地体積で除算した、細菌細胞培養により生成された多糖の総量を指す。タイターは典型的には、培地１リットル当たりの多糖のミリグラムの単位で表現する。
【００５３】
用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、交換可能に使用し、動物において免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成を含む医薬組成物を指す。
【００５４】
細菌
細胞壁多糖を有する任意の細菌を、本発明に従って利用することができる。好ましい実施形態では、細菌は被包性細菌である。本発明に従って使用することができる被包性細菌の非限定的な例として、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の連鎖球菌属の種、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ならびにエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）が挙げられる。より好ましい実施形態では、細菌は、細心の注意を要する成長要件を有する。細心の注意を要する細菌として、これらに限定されないが、連鎖球菌属の種（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））が挙げられる。
【００５５】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）としてもまた公知のストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）には、１０種の異なる血清型があり、それらはいずれも、本発明において使用することができる。それらの血清型には、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸが含まれる。ＧＢＳ莢膜多糖は全て、分枝状の反復構造を有し、末端に、細菌の病原性に必要である、α２−３連結シアル酸を有する。本発明において使用することを企図するＧＢＳ株のいくつかの例として、これらに限定されないが、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−１１３８）、５１５（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣアクセッション番号：３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣアクセッション番号：１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣアクセッション番号：３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣアクセッション番号：３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣアクセッション番号：１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣアクセッション番号：３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣアクセッション番号：１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ−７３２；ＡＴＣＣアクセッション番号：３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣアクセッション番号：４９４４６）、ＣＺ−ＮＩ−０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９−ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＢＡＡ−６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ−ＰＷ−１１９、７２７１、ＣＺ−ＰＷ−０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ−ＮＩ−０１６、ＩＴ−ＰＷ−６２、およびＩＴ−ＰＷ−６４が挙げられる。
【００５６】
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には、９０種超の異なる血清型があり、それらはいずれも、本発明において使用することを企図する。例として、これらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｌ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ａ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５、３８、３９、４０および４２が挙げられる。本発明において、例えば、一実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆまたは３３Ｆを使用することができる。本発明において、別の実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを使用することができる。
【００５７】
同様に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の任意の被包性株も、本発明において使用することができる。好ましくは、血清型５または８の莢膜多糖を生成する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株、例として、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｂｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗｍａｎ、ＰＳ８０、ＪＬ２７８およびＪＬ８１２を企図する。
【００５８】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５の任意の株を、本発明において使用することができる。
【００５９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の任意の株を、本発明において使用することができる。
【００６０】
サルモネラ・チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）Ｖｉの任意の株を、本発明において使用することができる。
【００６１】
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ｂ型の任意の株を、本発明において使用することができる。
【００６２】
肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の任意の株を、本発明において使用することができる。
【００６３】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）を、本発明において使用することができる。
【００６４】
本発明において使用することができるフェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の例示的な株として、表１に列挙するものが挙げられる。
【００６５】
【表１−１】
2018533366.tif 000002
【００６６】
【表１−２】
2018533366.tif 000003
【００６７】
さらに、任意の数の、細胞壁多糖を有する市販および非市販の細菌も、本発明に従って利用することができる。当業者であれば、いくつかの細菌は、異なる栄養要件を有し、かつ／または最適な成長には、異なる培養条件を必要とする場合があるであろうことを理解し、必要に応じて条件を改変することが可能であろう。
【００６８】
多くの場合、多糖を高いレベルで生成する細菌の株を選択するかまたは遺伝子工学的に操作する。いくつかの実施形態では、多糖を高いレベルで生成するように、細菌細胞を遺伝子工学的に操作する。
【００６９】
細胞を培養する培地
本発明は、細菌細胞培養物中での多糖の生成を最大化する多様な培地処方を提供する。
【００７０】
複合培地
特に、細心の注意を要する細菌および／または細胞壁多糖を生成する細菌のための細菌細胞培養物はしばしば、複合培地、例として、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロス、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス、ＧＣ培地、血液ブイヨンまたはブレインハートインフュージョンブロス中で成長させる。したがって、細菌の成長および多糖の生成を最大化するために、複合培地を開発した。一態様では、本発明は、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む複合培養培地に関する。
【００７１】
適切な植物加水分解産物として、これらに限定されないが、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ４６０１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ５６０３（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＩ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ（Ｑｕｅｓｔ）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ７（Ｑｕｅｓｔ）、ＳＨＥＦＴＯＮＥ  Ｄ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＥ５０Ｍ、ＳＥ５０ＭＫ、大豆ペプトン、ＢＡＣＴＯ  ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ２２０７（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ  ｆｌｏｕｒ（ＡＤＭ）、および大豆ミールが挙げられる。好ましい実施形態では、植物加水分解産物は、大豆加水分解産物である。好ましくは、大豆加水分解産物は、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。
【００７２】
培養培地中の植物加水分解産物の濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約７５ｇ／Ｌの間、例として、約５ｇ／Ｌ〜約６５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約５５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約７５ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約６５ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約５５ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌの間、約２０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約２０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの間、または約２０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、培養培地中の植物加水分解産物の濃度は、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約２８ｇ／Ｌである。
【００７３】
本発明において使用するのに適切な酵母抽出物は、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物および合成酵母抽出物を含むことができる。一態様では、酵母抽出物は、ＢＤ  ＢＢＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＤ  ＢＡＣＴＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹ  ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ  ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、またはＨＹ  ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。別の態様では、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、またはＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。さらなる態様では、酵母抽出物は、合成酵母抽出物、例として、ＢＤ  ＲＥＣＨＡＲＧＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。最も好ましくは、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）である。
【００７４】
培養培地中の酵母抽出物の濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、例として、約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、または約１５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、培養培地中の酵母抽出物の濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約１０ｇ／Ｌである。
【００７５】
任意の炭素供給源を、本発明の培養培地中で使用することができる。適切な炭素供給源は、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、および／またはマンノースを含む。好ましくは、培養培地中の炭素供給源は、グルコースである。
【００７６】
培養培地中の炭素供給源の濃度は、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、例として、約２５ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約７０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、または約７０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、培養培地中の炭素供給源の濃度は、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約８０ｇ／Ｌである。
【００７７】
したがって、発明者らは、植物加水分解産物と酵母抽出物と炭素供給源との組合せが、最大の細菌細胞成長および多糖生成を支援するのに役立つことを発見した。一態様では、本発明は、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む培養培地に関する。植物加水分解産物は、当技術分野で公知の任意の適切な植物加水分解産物、例として、上記に記載したものであり得る。好ましくは、加水分解産物は、大豆加水分解産物である。より好ましくは、大豆加水分解産物は、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。当技術分野で公知の任意の酵母抽出物、例として、上記に記載したものを使用することができる。好ましい実施形態では、酵母抽出物は、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）である。
【００７８】
一態様では、本発明の複合培養培地は、リン酸塩を含有する成分、例として、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４を含むことができる。
【００７９】
別の態様では、培養培地は、成長を増強することが当技術分野で公知の多様なその他の因子、例として、アミノ酸、ビタミン、ヌクレオシドおよび無機塩を含むことできる。
【００８０】
さらに別の態様では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかを使用して、本発明の複合培地を使用する細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度が、少なくとも１５．０、例として、少なくとも１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０または３０．０になるまで、生育を実施する。好ましい実施形態では、細胞密度が少なくとも１５．０になるまで、生育を実施する。さらに別の態様では、本発明の複合培地を使用する細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度は、少なくとも１５．０、例として、少なくとも１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０または３０．０であり得る。好ましい実施形態では、細胞密度は、少なくとも１５．０である。
【００８１】
ＧＢＳ多糖の収率を、シアル酸の濃度を測定することによって決定することができる。ペレット化した細胞を、当技術分野で周知の方法により消化することによって、細胞に結合している多糖から、シアル酸を放出させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって、消化物をアッセイすることができる。次いで、シアル酸の値に、反復単位重量変換係数をかけることによって、多糖の濃度を決定する。例えば、ＧＢＳのそれぞれの血清型についての変換係数を、以下に示す：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ＝３．２４；ＩＩおよびＶ＝４．２９；ならびにＩＶ＝３．７７。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはその他の被包性細菌についての多糖の定量化は、最初に、洗剤、例として、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）もしくはＮ−ラウリル−サルコシンナトリウム（ＮＬＳ）を用いる処理；高温での酸処理；塩基処理；および／または機械的溶解により、細胞壁から莢膜多糖を放出させることによって行う。次いで、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣを使用して、放出させた、未精製溶解液中の多糖を、認証済みの標準物質に対してアッセイする。
【００８２】
一態様では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかを使用して、本発明の複合培地を使用する細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度が、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ；３００ｍｇ／Ｌ；３５０ｍｇ／Ｌ；４００ｍｇ／Ｌ；４５０ｍｇ／Ｌ；５００ｍｇ／Ｌ；５５０ｍｇ／Ｌ；６００ｍｇ／Ｌ；６５０ｍｇ／Ｌ；または７００ｍｇ／Ｌになるまで、生育を実施する。好ましい実施形態では、多糖の濃度が少なくとも約６００ｍｇ／Ｌになるまで、生育を実施する。一態様では、本発明の複合培地を使用する細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度は、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ；３００ｍｇ／Ｌ；３５０ｍｇ／Ｌ；４００ｍｇ／Ｌ；４５０ｍｇ／Ｌ；５００ｍｇ／Ｌ；５５０ｍｇ／Ｌ；６００ｍｇ／Ｌ；６５０ｍｇ／Ｌ；または７００ｍｇ／Ｌであり得る。好ましい実施形態では、多糖の濃度は、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌである。
【００８３】
限定培地
しかし、複合培地には、一貫性を欠く可能性があることを考慮して、化学的に限定された培地もまた、細菌の成長および多糖の生成を最大化するために検討した。驚くべきことに、出願人に独占所有権のある、哺乳動物細胞を培養する培地が、細胞の成長および多糖の生成の両方を予想外に高めることを発見した；これらの培地は、全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，２９４，４８４号に開示されている。具体的には、本発明者らは、約５０ｍＭ超のアミノ酸の総濃度を有する限定培地が、細胞の成長および多糖の生成の両方を予想外に高めることを見出した。例示的な、哺乳動物細胞を培養する培地を、下記の表２に示す。本発明の培地処方と比較して、従来の培地処方は、比較的低いレベルの総アミノ酸から始まる。例えば、ＤＭＥ−Ｆ１２として公知の、細胞を培養する従来の培地（ダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２培地との５０：５０の混合物）は、７．２９ｍＭのアミノ酸の総含有量を有し、ＲＰＭＩ−１６４０として公知の、細胞を培養する従来の培地は、６．４４ｍＭのアミノ酸の総含有量を有する（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれている、Ｈ．Ｊ．Ｍｏｒｔｏｎ、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、６：８９〜１０８（１９７０）；Ｒ．Ｇ．Ｈａｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、５３：２８８〜２９３（１９６５）；Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｎ．、１９９：５１９〜２４（１９６７）を参照されたい）。
【００８４】
【表２−１】
2018533366.tif 000004
【００８５】
【表２−２】
2018533366.tif 000005
【００８６】
したがって、本発明は、少なくとも約５０ｍＭ、例として、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、および少なくとも７５ｍＭのアミノ酸の総濃度を有する、細胞を培養する培地に関する。好ましい実施形態では、アミノ酸の総濃度は、少なくとも６０ｍＭである。
【００８７】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のグリシンの総濃度は、約１．５ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間、例として、約１．５ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約１．５ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約７．５ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、または約７．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のグリシンの総濃度は、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間であり、最も好ましくは、約７．５ｍＭである。
【００８８】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のアルギニンの総濃度は、約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、例として、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、または約１５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のアルギニンの総濃度は、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間であり、最も好ましくは、約４．０ｍＭである。
【００８９】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のシステインの総濃度は、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、例として、約０．１ｍＭ〜約４．５ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約４．０ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約３．０ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約４．５ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約４．０ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約３．５ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約３．０ｍＭの間、約０．４ｍＭ〜約２．５ｍＭの間、または約０．４ｍＭ〜約２．０ｍＭの間であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のシステインの総濃度は、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間であり、最も好ましくは、約０．４ｍＭである。
【００９０】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のセリンの総濃度は、約５．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間、例として、約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、または約２０．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のセリンの総濃度は、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間であり、最も好ましくは、約７．５ｍＭである。
【００９１】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のグルタミンの総濃度は、約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、例として、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約４．０ｍＭ〜約７．５ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、または約１５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のグルタミンの総濃度は、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間であり、最も好ましくは、約４．０ｍＭである。
【００９２】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のチロシンの総濃度は、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、例として、約０．１ｍＭ〜約４．５ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約４．０ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約３．０ｍＭの間、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約４．５ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約４．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約３．５ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約３．０ｍＭの間、約１．０ｍＭ〜約２．５ｍＭの間、または約１．０ｍＭ〜約２．０ｍＭの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のチロシンの総濃度は、約１．０ｍＭ〜約３．５ｍＭの間であり、最も好ましくは、約２．９ｍＭまたは約３．０ｍＭである。
【００９３】
本発明のある態様では、細菌細胞を培養する培地中のアスパラギンの総濃度は、約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、例として、約５．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間、約５．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、約１０．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約４０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間、約１５．０ｍＭ〜約２５．０ｍＭの間、または約１５．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のアスパラギンの総濃度は、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間であり、最も好ましくは、約２０．０ｍＭである。
【００９４】
本発明の別の態様では、細胞を培養する培地は、アスパラギンを含有しない。
【００９５】
本発明者らはまた、カリウムは、多糖の生成に有益な塩であり、成長とは無関係であることも見出した。したがって、本発明の一態様では、細胞を培養する培地は、カリウム塩、例として、塩化カリウムまたは硫酸カリウムを含む。
【００９６】
一実施形態では、細胞を培養する培地中のカリウム塩の濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、例として、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．７ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．６ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．７ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．６ｇ／Ｌの間、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約０．７ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約０．６ｇ／Ｌの間、約０．３ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、または約０．５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間であり得る。好ましい実施形態では、細菌細胞を培養する培地中のカリウム塩の総濃度は、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約０．９ｇ／Ｌである。
【００９７】
本発明の一態様では、細胞を培養する本発明の培地は、炭素供給源を含有する。適切な炭素供給源は、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、および／またはマンノースを含む。好ましい実施形態では、炭素供給源は、グルコースである。
【００９８】
細菌細胞を培養する培地中の炭素供給源の総濃度は、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、例として、約２５ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの間、約２５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間、約７０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間、または約７０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間の範囲であり得る。好ましい実施形態では、培養培地中の炭素供給源の濃度は、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約５０ｇ／Ｌである。
【００９９】
別の態様では、細胞を培養する培地を、嫌気的に成長させる細菌の炭酸水素ナトリウム必要量に適合するように改変する。嫌気的に成長させる、多糖を生成する細菌のいくつかの例として、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。一実施形態では、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを、培地に添加する。例えば、炭酸水素ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．７ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．６ｇ／Ｌの間、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌの間、約０．５ｇ／Ｌ〜約０．７ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間、または約０．７５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの間であり得る。好ましくは、炭酸水素ナトリウムの濃度は、約０．８４ｇ／Ｌ、または約１．８ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌの間である。
【０１００】
本発明の一態様では、細菌細胞を培養する限定培地は、酵母抽出物を含む。本発明において使用するのに適切な酵母抽出物は、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物および合成酵母抽出物を含むことができる。一態様では、酵母抽出物は、ＢＤ  ＢＢＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＤ  ＢＡＣＴＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹ  ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ  ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ  ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、またはＨＹ  ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。別の態様では、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、またはＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である。さらなる態様では、酵母抽出物は、合成酵母抽出物、例として、ＢＤ  ＲＥＣＨＡＲＧＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。最も好ましくは、酵母抽出物は、限外ろ過された酵母抽出物、例として、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）である。
【０１０１】
培養培地中の酵母抽出物の濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、例として、約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの間、約１５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの間、または約１５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間であり得る。好ましい実施形態では、培養培地中の酵母抽出物の濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間であり、最も好ましくは、約１０ｇ／Ｌである。
【０１０２】
本発明の一態様は、少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸；カリウム塩、炭素供給源を含み、酵母抽出物を任意選択により含む、細胞を培養する限定培地に関する。
【０１０３】
一実施形態では、細胞を培養する培地は、少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間のグリシン、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間のカリウム塩、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間の炭素供給源、および約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の酵母抽出物を含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、細胞を培養する培地は、少なくとも約６０ｍＭのアミノ酸、約７．５ｍＭのグリシン、約０．９ｇ／Ｌの塩化カリウム、５０ｇ／Ｌのグルコース、および約１０ｇ／Ｌの限外ろ過された酵母抽出物を含む。
【０１０５】
さらに、上記に列挙した条件のうちのいずれかを、単独でまたは多様に相互に組み合わせてのいずれかで使用することができることも、当業者は認識するであろう。当業者は、上記の特徴の１つ、一部または全部を示す培地処方を利用することによって、細胞の成長および／または生存率を最適化すること、ならびに多糖の生成を最大化することが可能になるであろう。
【０１０６】
本発明において開示するこれらの培地処方のうちのいずれにも必要に応じて、特定のイオン（例として、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝剤、ビタミン、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解産物、またはグルコースもしくはその他のエネルギー供給源を任意選択により補充することができる。これらの任意選択の補充物質は、培養開始時に添加してもよく、または枯渇した栄養素を補充するためにかもしくは別の理由で、後の時点で添加してもよい。開示する培地処方中に含めることができる、望ましいまたは必要な補充物質はいずれも、当業者により理解されるであろう。
【０１０７】
別の態様では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかにより、本発明の限定培地を使用する細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度が、少なくとも９．０、例として、少なくとも９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０になるまで、生育を実施する。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかにより、細胞密度が少なくとも９．０になるまで、生育を実施する。
【０１０８】
シアル酸を含有する多糖、例として、ＧＢＳについては、多糖の収率を、シアル酸の濃度を測定することによって決定することができる。ペレット化した細胞を、当技術分野で周知の方法により消化することによって、細胞に結合している多糖から、シアル酸を放出させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって、消化物をアッセイする。次いで、シアル酸の値に、反復単位重量変換係数をかけることによって、多糖の濃度を決定する。例えば、ＧＢＳのそれぞれの血清型についての変換係数を、以下に示す：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ＝３．２４；ＩＩおよびＶ＝４．２９；ならびにＩＶ＝３．７７。
【０１０９】
一態様では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかを使用して、本発明の限定培地を使用する細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度が、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、５５０ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、６５０ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、１２００ｍｇ／Ｌ、１５００ｍｇ／Ｌ、または２０００ｍｇ／Ｌになるまで、生育を実施する。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法のうちのいずれかを使用して、多糖の濃度が少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌになるまで、生育を実施する。一態様では、本発明の限定培地を使用する細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、５５０ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、６５０ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、１２００ｍｇ／Ｌ、１５００ｍｇ／Ｌ、または２０００ｍｇ／Ｌであり得る。好ましい実施形態では、多糖の濃度は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌである。
【０１１０】
発酵方法
本発明は、多糖を生成する細菌を生育させるための発酵方法を提供する。一態様では、多糖の生成を最大化するために、本発明の生育方法を、本明細書に記載する複合培地および限定培地と組み合わせて使用する。
【０１１１】
種の成長
一実施形態では、本発明の方法における多糖を生成する細菌の成長は、少なくとも２つの相、すなわち、種の成長の相および発酵の相において進行する。まず種培養物を、ストック培養物、例えば、ワーキング細胞バンクからの植菌により成長させる。この種を使用して、第２の種培養物への植菌または比較的大きな発酵培養物への植菌のいずれかを行う。当技術分野で理解されているように、使用する種培養物の数は、例えば、発酵のステップのサイズおよび体積に依存し得る。
【０１１２】
したがって、一態様では、本発明は、多糖を生成する細菌を培養する方法に関する。この方法は、細胞の成長を促進する条件下にある第１の培養培地中で、多糖を生成する細菌細胞を培養するステップと、前記第１の培養のステップ後に、第２の培養培地に前記第１の培地の全部または一部を植菌するステップと、細胞の成長および／または多糖の生成を促進する条件下で、前記植菌した第２の培地を培養するステップとを含む。この方法は、前記第２の培地から多糖を単離するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、多糖を生成する細菌を、種培養物と呼ばれている第１の培養培地中で成長させる。一実施形態では、種培養物は、上記の記載に従う培養培地、および培地中で成長させた、ストック培養物からの植菌を含む。一実施形態では、第１の培養培地と第２の培養培地とが同じである。別の実施形態では、第１の培養培地と第２の培養培地とが異なる。
【０１１３】
一般に、種の成長の１つ（または複数の）相を実施して、保存されていた培養物に由来する微生物の分量をスケールアップし、その結果、それらの微生物を、発酵の相のための植菌材料として使用することができる。発酵培養物に植菌するために使用する生存細胞の体積および分量は、保存されていた培養物から採取する場合よりもむしろ、活発に成長しつつある培養物（例えば、種培養物）から採取する場合に、正確に制御することができる。
【０１１４】
さらに、発酵培地に植菌するために、種の成長の２つ以上（例えば、２または３つ）の相を使用して、多糖を生成する細菌の分量をスケールアップすることもできる。代わって、所望により、発酵の相において、保存されていた培養物から直接植菌することによって、多糖を生成する細菌の成長を直接進行させることもできる。
【０１１５】
発酵の相を開始するために、多糖を生成する細菌を含有する種培養物の一部または全部を使用して、発酵培養培地に植菌することができる。種培養物の、発酵培地に植菌するために使用するのに適切な濃度を、当業者であれば決定することができる。
【０１１６】
大規模な環境では、最大の細胞成長および／または多糖生成をもたらすために、発酵を使用することができる。一実施形態では、多糖を生成する細菌を、発酵培養物として成長させる。一実施形態では、第１の培地中で成長させた種培養物から、発酵培養物に植菌し、発酵培養を、第２の培地中で実施する。一実施形態では、第２の培地は、上記の記載に従う複合培地または限定培地であり得る。別の実施形態では、第１の培地と第２の培地とが同じである。
【０１１７】
流加発酵のプロセス
一実施形態では、上記に記載した複合培地および限定培地を使用する流加培養のシステムにおいて、多糖を生成する細菌細胞を培養する。流加システムでは、培養を、細胞を植菌して開始し、培養の間に少なくとも１つの栄養素を添加して補充し、細胞の収集を単回行って終結させる。一実施形態では、栄養素は、一定速度で添加する。
【０１１８】
一態様では、炭素供給源は、培養の間に添加する栄養素である。炭素供給源は、複合培地および／または限定培地のための上記に記載した任意の炭素供給源であり得る。好ましい実施形態では、炭素供給源は、グルコースである。
【０１１９】
本発明のある態様では、回分する炭素供給源の量／フィードする炭素供給源の量は、約１０％／９０％、１５％／８５％、２０％／８０％、２５％／７５％または３０％／７０％であり得る。例えば、好ましい実施形態では、炭素供給源の総濃度の２０％を回分し、培養の過程にわたり、残りの８０％を一定速度でフィードする。別の実施形態ではまた、炭素供給源の総濃度の２０％を回分し、培養の過程にわたり、残りの炭素供給源を一定でない速度でフィードすることもできる。
【０１２０】
さらに別の態様では、細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度が、少なくとも９．０、例として、少なくとも９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０になるまで、流加発酵のプロセスを実施する。好ましい実施形態では、細胞密度が少なくとも９．０になるまで、流加発酵のプロセスを実施する。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明の流加培養のシステムによる細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度は、少なくとも９．０、例として、少なくとも９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０であり得る。好ましい実施形態では、細胞密度は、少なくとも９．０である。
【０１２２】
シアル酸を含有する多糖、例として、ＧＢＳについては、多糖の収率を、シアル酸の濃度を測定することによって決定することができる。ペレット化した細胞を、当技術分野で周知の方法により消化することによって、細胞に結合している多糖から、シアル酸を放出させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって、消化物をアッセイする。次いで、シアル酸の値に、反復単位重量変換係数をかけることによって、多糖の濃度を決定する。例えば、ＧＢＳのそれぞれの血清型についての変換係数を、以下に示す：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ＝３．２４；ＩＩおよびＶ＝４．２９；ならびにＩＶ＝３．７７。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはその他の被包性細菌についての多糖の収率は、最初に、洗剤、例として、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）もしくはＮ−ラウリル−サルコシンナトリウム（ＮＬＳ）を用いる処理；高温での酸処理；塩基処理；および／または機械的溶解により、細胞壁から莢膜多糖を放出させることによって定量化することができる。次いで、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣを使用して、放出させた、未精製溶解液中の多糖を、認証済みの標準物質に対してアッセイする。
【０１２３】
一態様では、細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度が、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、５５０ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、６５０ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、１２００ｍｇ／Ｌ、１５００ｍｇ／Ｌ、または２０００ｍｇ／Ｌになるまで、流加発酵のプロセスを実施する。好ましい実施形態では、多糖の濃度が少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌになるまで、流加発酵のプロセスを実施する。
【０１２４】
一態様では、本発明の流加培養のシステムによる細菌細胞培養物の、ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより決定される多糖の濃度は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、５５０ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、６５０ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、１２００ｍｇ／Ｌ、１５００ｍｇ／Ｌ、または２０００ｍｇ／Ｌであり得る。好ましい実施形態では、多糖の濃度は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌである。
【０１２５】
灌流発酵のプロセス
一実施形態では、灌流培養のシステムにおいて、多糖を生成する細菌細胞を培養する。上記に記載した複合培地および限定培地を使用する灌流培養において、最大の多糖生成を得ることができることを、発明者らは発見した。灌流システムの利点は、新鮮な培地を連続的に添加することができることである。さらに、このシステムでは、細胞生存率を維持しながら、代謝老廃物を、生成の間に除去することもできる。
【０１２６】
灌流培養のシステムは、新鮮な培地を細胞に提供し、かつ同時に、使用済みの培地を除去することを含むことができる；使用済みの培地は、細胞を実質的に含有しないか、またはバイオリアクター中の細胞の濃度よりも実質的に低い細胞の濃度を含む。灌流培養では、例えば、ろ過、超音波ろ過、遠心分離または沈降により、細胞を保持することができる。
【０１２７】
一実施形態では、使用済みの培地を、細胞から分離し、除去し、一方、細胞は、バイオリアクター中に保持するかまたはバイオリアクターに戻す。分離のステップは、通常のフローろ過および／またはクロスフローろ過であり得る。一実施形態では、前記ろ過システムは、中空糸フィルターを含む。別の実施形態では、前記ろ過システムは、フラットシートカセットを含む。別の実施形態では、細胞は、使用済みの培地から、遠心分離のステップにより分離する。別の実施形態では、細胞は、使用済みの培地から、超音波による分離のステップにより分離する。別の実施形態では、細胞は、使用済みの培地から、沈降システムにより分離する。
【０１２８】
一実施形態では、灌流速度は、約０．０７ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、例として、約０．０７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．６７ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．５３ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．４０ＶＶＨの間、約０．０７ＶＶＨ〜約０．２７ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．６７ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．５３ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．４０ＶＶＨの間、約０．１３ＶＶＨ〜約０．２７ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約０．６７ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約０．５３ＶＶＨの間、約０．２７ＶＶＨ〜約０．４０ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間、約０．４０ＶＶＨ〜約０．６７ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間、約０．５３ＶＶＨ〜約０．６７ＶＶＨの間、約０．６７ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間、約０．６７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間、約０．６７ＶＶＨ〜約１．２０ＶＶＨの間、約０．６７ＶＶＨ〜約１．０７ＶＶＨの間、約０．６７ＶＶＨ〜約０．９３ＶＶＨの間、または約０．６７ＶＶＨ〜約０．８０ＶＶＨの間であり得る。一実施形態では、灌流速度は、約０．６７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間であり、好ましくは、約１．２０ＶＶＨである。
【０１２９】
一態様では、灌流培養の持続期間は、約１時間〜約１５時間の間、例として、約１時間〜約１４時間の間、約１時間〜約１３時間の間、約１時間〜約１２時間の間、約１時間〜約１１時間の間、約１時間〜約１０時間の間、約１時間〜約９時間の間、約１時間〜約８時間の間、約１時間〜約７時間の間、約１時間〜約６時間の間、約１時間〜約５時間の間、約５時間〜約１５時間の間、約５時間〜約１４時間の間、約５時間〜約１３時間の間、約５時間〜約１２時間の間、約５時間〜約１１時間の間、約５時間〜約１０時間の間、約５時間〜約９時間の間、約５時間〜約８時間の間、または約５時間〜約７時間の間であり得る。一実施形態では、灌流培養の持続期間は、約１時間〜約１０時間の間であり、好ましくは、約７時間である。
【０１３０】
特定の一態様では、灌流速度は、培養の持続期間にわたり可変であり得る（増加または減少させることができる）。一実施形態では、灌流システムは、第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで増加させる。別の実施形態では、灌流システムは、第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで減少させる。追加の実施形態では、灌流速度は、複数回変化させることができる。
【０１３１】
一態様では、灌流速度は、培養の持続期間にわたり一定に保つ。
【０１３２】
本発明の別の態様では、灌流システムにおける細胞の成長は、回分発酵システムにおける細胞の成長よりも、少なくとも１．１倍、例として、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４または２．５倍大きくなり得る。好ましい実施形態では、灌流システムにおける細胞の成長は、回分発酵システムにおける細胞の成長よりも少なくとも２倍大きい。
【０１３３】
さらに別の態様では、細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度が、少なくとも２０．０、例として、少なくとも２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０または６０．０になるまで、灌流発酵のプロセスを実施する。好ましい実施形態では、細胞密度が少なくとも２０．０になるまで、灌流発酵のプロセスを実施する。
【０１３４】
さらに別の態様では、本発明の灌流システムによる細菌細胞培養物の、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により決定される細胞密度は、少なくとも２０．０、例として、少なくとも２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０または６０．０であり得る。好ましい実施形態では、細胞密度は、少なくとも２０．０である。
【０１３５】
本発明の別の態様では、灌流システムにおける多糖の濃度は、回分発酵システムにおける多糖の濃度よりも、少なくとも１．５倍、例として、少なくとも１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４または３．５倍高い。好ましい実施形態では、灌流システムにおける多糖の濃度は、回分発酵システムにおける多糖の濃度よりも少なくとも２倍高い。
【０１３６】
シアル酸を含有する多糖、例として、ＧＢＳについては、多糖の収率を、シアル酸の濃度を測定することによって決定することができる。ペレット化した細胞を、当技術分野で周知の方法により消化することによって、細胞に結合している多糖から、シアル酸を放出させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって、消化物をアッセイする。次いで、シアル酸の値に、反復単位重量変換係数をかけることによって、多糖の濃度を決定する。例えば、ＧＢＳのそれぞれの血清型についての変換係数を、以下に示す：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ＝３．２４；ＩＩおよびＶ＝４．２９；ならびにＩＶ＝３．７７。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはその他の被包性細菌についての多糖の収率は、最初に、洗剤、例として、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）もしくはＮ−ラウリル−サルコシンナトリウム（ＮＬＳ）を用いる処理；高温での酸処理；塩基処理；および／または機械的溶解により、細胞壁から莢膜多糖を放出させることによって定量化することができる。次いで、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣを使用して、放出させた、未精製溶解液中の多糖を、認証済みの標準物質に対してアッセイする。
【０１３７】
一態様では、細菌細胞培養物の、シアル酸の濃度により決定される多糖の濃度が、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約６５０ｍｇ／Ｌ；７００ｍｇ／Ｌ；７５０ｍｇ／Ｌ；８００ｍｇ／Ｌ；８５０ｍｇ／Ｌ；９００ｍｇ／Ｌ；９５０ｍｇ／Ｌ；１，０００ｍｇ／Ｌ；１，５００ｍｇ／Ｌ；または２，０００ｍｇ／Ｌになるまで、灌流発酵のプロセスを実施する。好ましい実施形態では、多糖の濃度が少なくとも約６００ｍｇ／Ｌになるまで、灌流発酵のプロセスを実施する。
【０１３８】
一態様では、本発明の灌流システムによる細菌細胞培養物の、ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより決定される多糖の濃度は、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌ、例として、少なくとも約６５０ｍｇ／Ｌ；７００ｍｇ／Ｌ；７５０ｍｇ／Ｌ；８００ｍｇ／Ｌ；８５０ｍｇ／Ｌ；９００ｍｇ／Ｌ；９５０ｍｇ／Ｌ；１，０００ｍｇ／Ｌ；１，５００ｍｇ／Ｌ；または２，０００ｍｇ／Ｌであり得る。好ましい実施形態では、多糖の濃度は、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌである。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例により、本発明のいくつかの実施形態を実証する。しかし、これらの実施例は、例証のためのものに過ぎず、本発明の条件および範囲に関して全面的に決定的であることは意図しないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が示されている場合には、特定の範囲を上回る条件および特定の範囲を下回る条件のいずれもまた、好都合である程度は一般に下がるが、使用することができることを理解すべきである。別段の特定がない限り、本明細書で言及する部およびパーセントは全て、重量ベース、温度は全て、セ氏温度で表現する。
【０１４０】
さらに、以下の実施例は、標準的な技法を使用して実施し、それらの技法は、当業者にとって周知のかつ日常的なものであり、ただし、そうでない場合には詳細に記載した。上記で書き留めたように、以下の実施例は、例示の目的で提示するのであって、いかなる場合であっても、それらを本発明の範囲を制限するものであると解釈してはならない。
【０１４１】
（実施例１）
本発明の限定培地
出願人に独占所有権のある、哺乳動物細胞を培養する限定培地（「Ｒ１７」）を、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を成長させるために改変して、「改変型ＡＳ３」培地（「ｍＡＳ３」ともまた呼ぶ）を創製した。改変型ＡＳ３培地は、下記の表３の構成成分を用いて調合した。血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、１４および２３Ｆのために調製する培地は、３０ｇ／Ｌのデキストロースおよび０．６ｇ／Ｌの硫酸マグネシウムを用いて調合した。血清型１、３、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａおよび１９Ｆの場合には、３０ｇ／Ｌのデキストロースを、リアクター中の培地に添加した。
【０１４２】
【表３】
2018533366.tif 000006
【０１４３】
Ｒ１７粉末中のアミノ酸、ビタミンおよび塩の組成の完全な説明を、下記の表４に提供する。
【０１４４】
【表４】
2018533366.tif 000007
【０１４５】
２Ｌのバイオリアクター中で、温度を、３６℃に制御し、ｐＨを、ＮａＯＨを塩基滴定剤として使用して７．０に制御して、回分発酵を実施した。血清型１、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａおよび１９Ｆについては、Ｎ２のオーバーレイを用いて、血清型６Ｂ（２）、１４および２３Ｆについては、空気を用いて、発酵槽を不活性化し、血清型５については、オーバーレイは使用しなかった。発酵物を、２００ＲＰＭで撹拌した。結果を、下記の表５に示す。
【０１４６】
【表５】
2018533366.tif 000008
【０１４７】
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１３種は、化学的に限定された改変型ＡＳ３培地を使用する回分培養において、首尾よく成長した。
【０１４８】
（実施例２）
市販されている限定培地と本発明の限定培地との比較
イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）は、市販されている、細胞を培養する限定培地であり、ＧＢＳの多様な血清型を使用して、Ｒ１７と比較試験した。嫌気的に成長させるＧＢＳの炭酸水素ナトリウム必要量に適合するように、ラベルの使用説明から、それぞれの処方を改変した。また、細菌培養物中で達成可能なより高い細胞密度を支援するために、それぞれの培地に、高い濃度のグルコースも補充した。細菌用培地として改変したＥＭＥＭ（「細菌用ＥＭＥＭ」）についての処方を、以下に示す：２０．２ｇ／ＬのＥＭＥＭ粉体、１．１７ｇ／ＬのＬ−グルタミン、０．８４ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および８０ｇ／Ｌのグルコース。ＧＢＳの成長のために、（実施例１の記載に従う）ＧＢＳ  ｍＡＳ３の、ｍＡＳ３の組成を特別に作り（以下、「ＧＢＳ  ｍＡＳ３」）、これを以下に示す：（３００ｍＭの酸性シスチン原液に代わって）０．２１ｇ／ＬのＬ−システインＨＣｌ、（１ｍＬ／Ｌに代わって）２ｍＬ／Ｌの微量元素Ｅ、１０００×、０．８４ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および（２５ｇ／Ｌのデキストロース無水に代わって）８０ｇ／Ｌのグルコース。
【０１４９】
１０Ｌのバイオリアクターの規模で、温度を、３７℃に制御し、ｐＨを、ＮａＯＨを塩基滴定剤として使用して７．０に制御して、発酵を実施した。Ｎ２のオーバーレイを用いて、回分体積に関して０．１ｖｖｍで、発酵槽を不活性化し、発酵物を十分にかき混ぜて撹拌して、１／時間のｋＬａを達成した。結果を、下記の表６に示す。
【０１５０】
【表６】
2018533366.tif 000009
【０１５１】
成長および多糖の濃度の両方において、ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地は、細菌用ＥＭＥＭ培地に対して、驚くべき優位性を示した。
【０１５２】
（実施例３）
複合培地と本発明の限定培地との比較
実施例１の記載に従う改変型ＡＳ３培地と大豆加水分解産物に基づく複合培地（ＢＰＤｖ３）とを、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の多様な血清型について比較した。２８ｇ／ＬのＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、５４ｇ／Ｌのグルコース、３．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．０１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．２５ｇ／Ｌのウリジン、０．２５ｇ／Ｌのアデノシン、０．０３ｇ／Ｌのナイアシンアミド、０．０３ｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ、０．００７５ｇ／Ｌのパントテン酸、および０．００３ｇ／ＬのＰＡＢＡから、ＢＰＤｖ３を構成した。血清型１２Ｆのための培地には、１ｇ／Ｌのグルタミン酸一ナトリウムを補充し、血清型８のための培地は、０．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウムおよび３６ｇ／Ｌのグルコースを含有するように改変した。改変型ＡＳ３培地において、複合培地と比較して、多糖のタイターの一貫した改善は得られなかったが、改変型ＡＳ３培地は、ほとんど全ての血清型において成長の改善を示した（表７を参照されたい）。
【０１５３】
【表７】
2018533366.tif 000010
【０１５４】
（実施例４）
アミノ酸の消費
ＧＢＳ血清型ＩＩＩの発酵の過程の間のアミノ酸の消費の分析を実施して、アミノ酸が枯渇するかどうかを決定した。植菌前および収集時の（実施例２の記載に従う）ＧＢＳ  ｍＡＳ３中のアミノ酸の濃度の分析を、表８に提示する。
【０１５５】
【表８】
2018533366.tif 000011
【０１５６】
必要であることが予測されたアミノ酸は枯渇しなかったが、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）がそれらに対しておそらく原栄養株であるアミノ酸４種は枯渇した。アルギニン、グリシンおよびセリンは、定量化の限界未満まで枯渇した。ＨＰＬＣの方法による測定が困難であるシステインは、いずれの試料採取時においても検出されなかった。その他のアミノ酸は全て、収集時に依然として過剰であった。
【０１５７】
次いで、多様なＧＢＳの血清型の発酵において、ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地に、これら４種の枯渇したアミノ酸を、ベースの粉末Ｒ１７処方に関して４×の濃度で補充した（１６ｍＭのａｒｇ、１．６ｍＭのｃｙｓ、６ｍＭのｇｌｙ、および４０ｍＭのｓｅｒ）。結果を、下記の表９に示す。
【０１５８】
【表９】
2018533366.tif 000012
【０１５９】
ＣＧＲＳ補充培地を用いて試験した６種の血清型全てにおいて、成長の顕著な改善が観察された。全ての血清型について、多糖のタイターが増加したわけではないが、成長の改善により、さらなる試験が奨励された。
【０１６０】
（実施例５）
枯渇したアミノ酸のさらなる分析
枯渇したアミノ酸のそれぞれの、成長の改善に対する重要性を、実験において評価し、この場合、ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして使用して、これら４種のそれぞれを培地から順次に除去した。グリシンが唯一、成長の改善に寄与することが予想外に見出された（表１０を参照されたい）。
【０１６１】
【表１０】
2018533366.tif 000013
【０１６２】
このことは、ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして再び使用して、これら４種のアミノ酸のそれぞれを個々に補充した、フォローアップ研究において確認された。グリシンが、これら４種の枯渇したアミノ酸のうち、成長および多糖の生成を改善する唯一のアミノ酸であることが、この研究により確認された（表１１を参照されたい）。
【０１６３】
【表１１】
2018533366.tif 000014
【０１６４】
次いで、グリシンを唯一の補充物質として添加することの重要性を、ＧＢＳのいくつかの血清型において試験した。ＧＢＳ  ｍＡＳ３、４種のアミノ酸全てを補充したＧＢＳ  ｍＡＳ３、およびグリシンのみを補充したＧＢＳ  ｍＡＳ３の性能を比較した。結果を、下記の表１２に示す。
【０１６５】
【表１２】
2018533366.tif 000015
【０１６６】
一般に、成長を改善するのに、グリシンのみを補充すれば十分であり、改善は、４種のアミノ酸全てによる補充とほぼ同等であった。しかし驚くべきことに、グリシンのみによる補充は、ＧＢＳ  ｍＡＳ３、および４種のアミノ酸全てによる補充よりも、多糖の高いタイターをもたらした。
【０１６７】
（実施例６）
グリシンの濃度の比較
グリシン単独の添加に伴う、多糖の予想外に高い生成を考慮して、ＧＢＳ  ｍＡＳ３処方への６ｍＭのグリシンの添加で、最大の成長および多糖のタイターが得られるかどうかを決定するために、実験を実施した。この実験では、ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして使用して、０．１５ｍＭ〜１２３．２ｍＭのグリシンの添加を比較した。下記の表１３のデータから、わずか１．５ｍＭのグリシンまたは６１．６ｍＭものグリシンの添加が、６ｍＭのグリシンの添加で認められるのと同じ、多糖のタイターの改善を支援することが示されている。
【０１６８】
【表１３】
2018533366.tif 000016
【０１６９】
（実施例７）
ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地の非必須構成成分の決定
発酵の全体を通してかつ終点において炭素供給源が過剰にあることを保証するために、ＧＢＳ  ｍＡＳ３処方、およびグリシンを含有する、実施例５および６のその誘導処方に、８０ｇ／Ｌのグルコースを含有させた。一般に、成長および多糖の生成が停止していた場合、約３０ｇ／Ｌのグルコースが、消費されずに残留していた（データ未公開）。したがって、より効率的な培地を得ることができるかどうかを決定するために、実験を実施した。ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして用いて、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌおよび５０ｇ／Ｌのグルコースの濃度を有するグリシン補充ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地を試験した。５０ｇ／Ｌのグルコースの濃度により、残余のグルコースは生じず、また、多糖のタイターも損なわれないことが、下記の表１４のデータから示されている。
【０１７０】
【表１４】
2018533366.tif 000017
【０１７１】
同様に、Ｒ１７粉末に添加するアミノ酸および塩全ての重要性についても、ドロップアウト実験においてそれぞれを１種ずつ除くことによって調べた。この研究は、グリシン補充ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地中で、ＧＢＳの血清型Ｖを用いて実施した。下記の表１５のデータから、チロシン、グルタミンおよびシステインは成長に必須であり、一方、アスパラギンはそうではなく、全ての塩が非必須であることが示されている。
【０１７２】
【表１５】
2018533366.tif 000018
【０１７３】
（実施例８）
ビタミンおよび塩／微量元素の消費
グリシン補充ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地中で、ＧＢＳ血清型ＩＩＩをモデルとして使用して、残余のビタミンおよび塩／微量元素を、開始濃度と比して評価した。総数１３種のビタミン、すなわち、ビオチン、コリンシアノコバラミン（ｃｈｏｌｉｎｅ  ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、葉酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ニコチンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、パントテン酸、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンについて調べた。発酵の間に、１２種のアミノ酸は、濃度の顕著な変化を示さなかった。ナイアシンアミドは、発酵の過程の間に枯渇してゼロになることが見出されたが、ナイアシンの蓄積が伴うことにより、このビタミンファミリーは枯渇しないことが指し示されるであろう（データ未公開）。
【０１７４】
塩および微量元素３２種を分析した。これらのうち１８種が検出限界未満であった。それらの１８種を以下に示す：銀、アルミニウム、ヒ素、ベリリウム、カドミウム、クロム、銅、水銀、リチウム、マンガン、ニッケル、鉛、ルビジウム、セレニウム、スズ、チタン、タリウムおよびバナジウム。検出可能な塩および微量元素１４種のうち１２種は、最初の、培地への植菌から、収集後まで、濃度の実質的な低下を示さなかった（表１６を参照されたい）。濃度の低下を示したのは、亜リン酸およびカリウムの２種であった。亜リン酸は、細胞の成長のために消費されるので、その濃度の低下が予測されたが、亜リン酸は、成長制限性ではなく、その理由は収集時に過剰に残留したからである。しかし、カリウムの濃度の低下は予想外であった。
【０１７５】
【表１６】
2018533366.tif 000019
【０１７６】
これらのデータは、２種の研究をもたらし、この場合、ＧＢＳ血清型ＩＩＩの発酵において、グリシン補充ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地に、追加の２倍量の塩化カリウム（０．３１ｇ／ＬのＲ１７粉末に０．６ｇ／Ｌを追加）を添加することの効果を調べた。表１７に示す結果から、ＫＣｌ濃度の増加は、成長とは無関係に、多糖のタイターにとって有益であったことが示されている。
【０１７７】
【表１７】
2018533366.tif 000020
【０１７８】
さらなる研究では、より完全な範囲のＫＣｌの濃度（ベースの粉末（ｂａｓａｌ  ｐｏｗｄｅｒ）Ｒ１７中に含有される０．３１ｇ／ＬのＫＣｌに０．０３ｇ／Ｌ〜２４ｇ／Ｌを追加）を、成長および多糖の合成に対するそれらの効果について調べた。表１８に示す結果から、Ｒ１７粉末に追加した０．３〜２４ｇ／ＬのＫＣｌの濃度により、成長および多糖の生成の改善がもたらされることが示されている。
【０１７９】
【表１８】
2018533366.tif 000021
【０１８０】
（実施例９）
ｍＡＳ３ｏｐｔ５０培地の処方
ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地おいて、グリシンおよびＫＣｌの増加、グルコースの濃度の減少、ならびにマグネシウム、アスパラギンおよびＮａＣｌの削除を組み込んで、培地を構成した（「ｍＡＳ３ｏｐｔ５０」）。ＧＢＳの血清型６種について、新しい処方を、ＧＢＳ  ｍＡＳ３培地と比較して試験した。表１９に示すように、改めて調合した培地は、成長、およびそれに伴う、多糖のタイターの実質的な改善をもたらす。
【０１８１】
【表１９】
2018533366.tif 000022
【０１８２】
（実施例１０）
ｍＡＳ３ｏｐｔ５０における、多糖の収率に対するグリシンおよびＫＣｌの寄与
ドロップアウトのアプローチを使用して、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０培地において、多糖の収率に対するグリシンおよびＫＣｌの補充の重要性を実証した。表２０に示すデータから、いずれもが高い収率の支援において重要であることが明らかに示されている。
【０１８３】
【表２０】
2018533366.tif 000023
【０１８４】
（実施例１１）
ｍＡＳ３ｏｐｔ５０の、複合培地および酵母抽出物を補充した複合培地との比較
開始複合培地（「ＨＰ」）は、大豆加水分解産物に基づく処方であった：２８ｇ／ＬのＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、３．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．０１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、および８０ｇ／Ｌのグルコース。この培地中でのＧＢＳの血清型６種の発酵は、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０中よりも実質的に低い成長およびタイターをもたらした。したがって、ＨＰに、限外ろ過された酵母抽出物であるＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）１０ｇ／Ｌを補充した（「ＨＰＹＥ」）。ＨＰＹＥ培地は、ＨＰ培地と比較して、細胞密度および多糖のタイターを実質的に改善していた。ＨＰＹＥは、ほとんど全ての血清型において、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０と比較して、成長の増加を示し、一方、ＨＰＹＥ培地中の多糖のタイターは、若干より低かった。全てのデータを、下記の表２１に示す。
【０１８５】
【表２１】
2018533366.tif 000024
【０１８６】
（実施例１２）
複合培地中の酵母抽出物の量の増減
最適な成長および多糖の生成をもたらすために、酵母抽出物の量の増減を実施して、補充する酵母抽出物の濃度を決定した。ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして使用して、酵母抽出物の補充の効果を、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌおよび４０ｇ／Ｌで用いて判定した。表２２に示すように、これらのデータから、わずか２．５ｇ／Ｌの酵母による補充が、成長および莢膜多糖の生成を刺激するのに十分であることが示された。しかし、補充した酵母抽出物の最適濃度は、１０ｇ／Ｌであった；その理由は、より高い量を添加しても、追加の利益が得られなかったからである。
【０１８７】
【表２２】
2018533366.tif 000025
【０１８８】
（実施例１３）
限定培地への酵母抽出物の補充
複合培地における、多糖のタイターに対する酵母抽出物による補充のプラスの影響を考慮して、ＧＢＳ  ｍＡＳ３への、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）による補充について調べる実験を実施した。限外ろ過された酵母抽出物を補充したＧＢＳ  ｍＡＳ３（「Ｒ１７ＹＥ」）を、ＧＢＳ  ｍＡＳ３およびｍＡＳ３ｏｐｔ５０と比較した。Ｒ１７への酵母抽出物の補充は、多糖のタイターを、ＧＢＳ  ｍＡＳ３およびｍＡＳ３ｏｐｔ５０の両方と比較して、劇的に改善した（表２３を参照されたい）。
【０１８９】
【表２３】
2018533366.tif 000026
【０１９０】
次いで、種々の濃度の、限外ろ過された酵母抽出物による補充と、種々の濃度の、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている「合成」酵母抽出物（ＢＤ  ＲＥＣＨＡＲＧＥ）による補充とを比較するための研究を実施した。ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして使用した。表２４に示すデータから、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物は（限外ろ過されたものまたは合成のもののいずれであっても）、成長の改善をもたらすが、多糖のタイターの対応する増加はないことが示されている。合成酵母抽出物による補充は、ＧＢＳ  ｍＡＳ３対照よりも、成長を改善するが、限外ろ過された酵母抽出物を用いて得られる最大のタイターはもたらさない。
【０１９１】
【表２４】
2018533366.tif 000027
【０１９２】
（実施例１４）
グルコースの一定したフィードによる発酵の分析
多様なＧＢＳの血清型をモデルとして使用して、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０培地を用いて、グルコースの一定したフィードを、多糖のタイターの支援におけるその効果について調べた。５０ｇ／Ｌのグルコースの回分と、グルコースのフィードによる発酵（１０ｇ／Ｌのグルコースを回分し、残りの４０ｇ／Ｌを、ＥＦＴ３〜４時間において開始して、一定速度で７時間かけてフィードした）とを比較すると、全ての血清型にわたり、同等の成長および多糖のタイターが得られることが示された（表２５を参照されたい）。これ以外の、発酵を制御するパラメータは、実施例２で提示したパラメータであった。
【０１９３】
【表２５】
2018533366.tif 000028
【０１９４】
（実施例１５）
ＨＰＹＥ培地およびＧＢＳ  ｍＡＳ３培地を用いるグルコース流加発酵
また、ＧＢＳの血清型Ｖをモデルとして使用して、ＨＰＹＥ培地およびＧＢＳ  ｍＡＳ３培地についての流加発酵も調べた。発酵を、１０ｇ／Ｌのグルコースを回分して開始し、次いで、ＥＦＴ３〜４時間後に、７０ｇ／Ｌのグルコースを、５時間かけてフィードした。これ以外には、実施例２の記載に従って、発酵物を調合した。表２６に提示するデータから、流加のアプローチは、ＧＢＳ  ｍＡＳ３について、回分のアプローチと比して、ほぼ同等の生産性をもたらすことが示されている。ＨＰＹＥにおいて、フィードするアプローチは、多糖の生成を支援するが、生産性は、回分よりも若干低い。
【０１９５】
【表２６】
2018533366.tif 000029
【０１９６】
（実施例１６）
灌流発酵
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１３種に対して、実施例１に記載した改変型ＡＳ３培地を使用する灌流実験を実施した。培地に植菌し、２Ｌのバイオリアクター中の回分モードで、ＯＤ６００が３〜７に達するまで約４〜１０時間運転した。次いで、培養物を、灌流システムを通して循環させ、この場合、使用済みの培地および老廃物を除去し、新鮮な培地の導入により、培養物体積を保った。灌流を、０．１３ＶＶＨの初速度で開始し、３〜５時間かけて０．８０ＶＶＨまで徐々に引き上げ、この時点で、灌流バッチを終了した。下記の表２７に示すデータから、実施例１の回分発酵と比較して、バイオマスのレベルの顕著な増加、およびそれに対応する、多糖の生成の増加が示されている。
【０１９７】
【表２７】
2018533366.tif 000030
【０１９８】
（実施例１７）
３種の異なる培地における、灌流による発酵方法と回分による発酵方法との比較
ＧＢＳ  ｍＡＳ３またはＨＰＹＥをベースの培地として使用する灌流実験を実施した。１×の培地（０．５×のグルコースを含有する）に植菌し、（５Ｌの作業体積を）回分モードで約３時間運転した。ＯＤが１〜５ＯＤに近づくと、０．５×の培地を用いる灌流を、０．１３ＶＶＨの初速度で開始し、およそ１時間行った。速度を６〜７時間かけて１．２０ＶＶＨまで引き上げ、この時点で、灌流バッチを終了した。下記の表２８に示す、ＧＢＳ  ｍＡＳ３の灌流についてのデータから、回分モードに比して、細胞密度のおよそ１．４〜２倍の増加、およびそれに伴う、多糖のタイター増加が示されている。
【０１９９】
【表２８】
2018533366.tif 000031
【０２００】
ＨＰＹＥ複合培地に基づく灌流についてのデータを、下記の表２９に示す。一般に、灌流の結果、回分に比して、細胞密度の２倍超の増加、および多糖のタイターの２〜３．５倍の改善が得られた。
【０２０１】
【表２９】
2018533366.tif 000032
【０２０２】
血清型ＩＶをモデルとして使用して、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０に基づく培地における灌流も同様に実施した。収集時に得たＯＤ６００は１６．７であり、多糖の生成は６６７ｍｇ／Ｌであった。比較すると、実施例８に提示した、ｍＡＳ３ｏｐｔ５０による回分発酵は、１０．４の細胞密度および３６０ｍｇ／Ｌの多糖の生成の値をもたらし、約１．９倍の生産性の改善を証明した。
【０２０３】
要約すると、灌流発酵の結果、利用した３種の培地全てにおいて、回分の性能に比して、約２倍またはより良好な多糖の生産性の増加が得られた。
【０２０４】
本発明の態様
本発明の追加の実施形態を、以下の条項により記載する。
Ｃ１．多糖を生成する細菌細胞を培養する培地であって、植物加水分解産物、酵母抽出物および炭素供給源を含む培地。
Ｃ２．植物加水分解産物が、大豆加水分解産物である、Ｃ１に記載の培地。
Ｃ３．大豆加水分解産物が、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ４６０１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹＰＥＰ５６０３（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＩ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、Ｎ−Ｚ−ＳＯＹ  ＢＬ７（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＨＥＦＴＯＮＥ  Ｄ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＳＥ５０Ｍ、ＳＥ５０ＭＫ、大豆ペプトン、ＢＡＣＴＯ  ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ２２０７（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ  ｆｌｏｕｒ（ＡＤＭ）および大豆ミールからなる群から選択される、Ｃ２に記載の培地。
Ｃ４．大豆加水分解産物が、ＨＹＰＥＰ１５１０（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、Ｃ３に記載の培地。
Ｃ５．植物加水分解産物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約７５ｇ／Ｌの間である、Ｃ１からＣ４のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ６．植物加水分解産物の濃度が、約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、Ｃ５に記載の培地。
Ｃ７．植物加水分解産物の濃度が、約２８ｇ／Ｌである、Ｃ６に記載の培地。
Ｃ８．酵母抽出物が、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物または合成酵母抽出物である、Ｃ１からＣ７のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ９．酵母抽出物が、限外ろ過された酵母抽出物である、Ｃ８に記載の培地。
Ｃ１０．限外ろ過された酵母抽出物が、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、Ｃ９に記載の培地。
Ｃ１１．酵母抽出物の濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、Ｃ１からＣ１０のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ１２．酵母抽出物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、Ｃ１１に記載の培地。
Ｃ１３．酵母抽出物の濃度が、約１０ｇ／Ｌである、Ｃ１２に記載の培地。
Ｃ１４．炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、Ｃ１からＣ１３のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ１５．炭素供給源が、グルコースである、Ｃ１４に記載の培地。
Ｃ１６．炭素供給源の濃度が、約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間である、Ｃ１からＣ１５のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ１７．炭素供給源の濃度が、約５０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌの間である、Ｃ１６に記載の培地。
Ｃ１８．炭素供給源の濃度が、約８０ｇ／Ｌである、Ｃ１７に記載の培地。
Ｃ１９．大豆加水分解産物、限外ろ過された酵母抽出物、およびグルコースを含む、Ｃ１からＣ１８のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ２０．リン酸塩を含有する成分をさらに含む、Ｃ１からＣ１９のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ２１．リン酸塩を含有する成分が、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４である、Ｃ２０に記載の培地。
Ｃ２２．少なくとも１種のアミノ酸、ビタミン、ヌクレオシドまたは無機塩をさらに含む、Ｃ１からＣ２１のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ２３．多糖を生成する細菌細胞を培養する培地であって、約５０ｍＭ超の総濃度のアミノ酸を有する培地。
Ｃ２４．約１．５ｍＭ〜約６０．０ｍＭの間の総濃度のグリシンを含む、Ｃ２３に記載の培地。
Ｃ２５．グリシンの総濃度が、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間である、Ｃ２４に記載の培地。
Ｃ２６．グリシンの総濃度が、約７．５ｍＭである、Ｃ２５に記載の培地。
Ｃ２７．約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間の総濃度のアルギニンを含む、Ｃ２３からＣ２６のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ２８．アルギニンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間である、Ｃ２７に記載の培地。
Ｃ２９．アルギニンの総濃度が、約４．０ｍＭである、Ｃ２８に記載の培地。
Ｃ３０．約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間の総濃度のシステインを含む、Ｃ２３からＣ２９のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ３１．システインの総濃度が、約０．１ｍＭ〜約３．５ｍＭの間である、Ｃ３０に記載の培地。
Ｃ３２．システインの総濃度が、約０．４ｍＭである、Ｃ３１に記載の培地。
Ｃ３３．約５．０ｍＭ〜約７５．０ｍＭの間の総濃度のセリンを含む、Ｃ２３からＣ３２のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ３４．セリンの総濃度が、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間である、Ｃ３３に記載の培地。
Ｃ３５．セリンの総濃度が、約７．５ｍＭまたは約１０ｍＭである、Ｃ３４に記載の培地。
Ｃ３６．約１．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間の総濃度のグルタミンを含む、Ｃ２３からＣ３５のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ３７．グルタミンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの間である、Ｃ３６に記載の培地。
Ｃ３８．グルタミンの総濃度が、約４．０ｍＭである、Ｃ３７に記載の培地。
Ｃ３９．約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭの間の総濃度のチロシンを含む、Ｃ２３からＣ３８のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ４０．チロシンの総濃度が、約１．０ｍＭ〜約３．５ｍＭの間である、Ｃ３９に記載の培地。
Ｃ４１．チロシンの総濃度が、約２．９ｍＭまたは約３．０ｍＭである、Ｃ４０に記載の培地。
Ｃ４２．約５．０ｍＭ〜約５０．０ｍＭの間の総濃度のアスパラギンを含む、Ｃ２３からＣ４１のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ４３．アスパラギンの総濃度が、約１０．０ｍＭ〜約３０．０ｍＭの間である、Ｃ４２に記載の培地。
Ｃ４４．アスパラギンの総濃度が、約２０．０ｍＭである、Ｃ４３に記載の培地。
Ｃ４５．アスパラギンを含有しない、Ｃ２３からＣ４１のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ４６．カリウム塩をさらに含む、Ｃ２３からＣ４５のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ４７．カリウム塩が、塩化カリウムまたは硫酸カリウムである、Ｃ４６に記載の培地。
Ｃ４８．カリウム塩の総濃度が、約０．１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、Ｃ４６からＣ４７のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ４９．カリウム塩の総濃度が、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間である、Ｃ４８に記載の培地。
Ｃ５０．カリウム塩の総濃度が、約０．９ｇ／Ｌである、Ｃ４９に記載の培地。
Ｃ５１．炭素供給源をさらに含む、Ｃ２３からＣ５０のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ５２．炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、Ｃ５１に記載の培地。
Ｃ５３．炭素供給源が、グルコースである、Ｃ５２に記載の培地。
Ｃ５４．約２５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の総濃度の炭素供給源を含む、Ｃ５１からＣ５３のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ５５．炭素供給源の総濃度が、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間である、Ｃ５４に記載の培地。
Ｃ５６．炭素供給源の総濃度が、約５０ｇ／Ｌである、Ｃ５５に記載の培地。
Ｃ５７．炭酸水素ナトリウムをさらに含む、Ｃ２３からＣ５６のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ５８．約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間の濃度の炭酸水素ナトリウムを含む、Ｃ５７に記載の培地。
Ｃ５９．炭酸水素ナトリウムの濃度が、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの間である、Ｃ５８に記載の培地。
Ｃ６０．炭酸水素ナトリウムの濃度が、約０．８４ｇ／Ｌである、Ｃ５９に記載の培地。
Ｃ６１．酵母抽出物をさらに含む、Ｃ２３からＣ６０のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ６２．酵母抽出物が、酵母自己溶解物、限外ろ過された酵母抽出物および合成酵母抽出物からなる群から選択される、Ｃ６１に記載の培地。
Ｃ６３．酵母抽出物が、限外ろ過された酵母抽出物である、Ｃ６２に記載の培地。
Ｃ６４．限外ろ過された酵母抽出物が、ＡＭＢＥＲＦＥＲＭ５９０２（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＢＤ  ＤＩＦＣＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＹＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥ（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４１（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４４４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）、ＨＹ−ＹＥＳＴ４５５（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）またはＨＹ−ＹＥＳＴ５０４（Ｋｅｒｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）である、Ｃ６３に記載の培地。
Ｃ６５．酵母抽出物の濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの間である、Ｃ６１からＣ６４のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ６６．酵母抽出物の濃度が、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間である、Ｃ６５に記載の培地。
Ｃ６７．酵母抽出物の濃度が、約１０ｇ／Ｌである、Ｃ６６に記載の培地。
Ｃ６８．少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸；カリウム塩、炭素供給源を含み、酵母抽出物を任意選択により含む、Ｃ２３からＣ６７のいずれか一項に記載の培地。
Ｃ６９．少なくとも約５０ｍＭのアミノ酸、約５．０ｍＭ〜約１５．０ｍＭの間のグリシン、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌの間のカリウム塩、約２５ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌの間の炭素供給源、および約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの間の酵母抽出物を含む、Ｃ６８に記載の培地。
Ｃ７０．少なくとも約６０ｍＭのアミノ酸、約７．５ｍＭのグリシン、約０．９ｇ／Ｌの塩化カリウム、５０ｇ／Ｌのグルコース、および約１０ｇ／Ｌの限外ろ過された酵母抽出物を含む、Ｃ６９に記載の培地。
Ｃ７１．多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）Ｃ１からＣ７０のいずれか一項に記載の培地をバイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、発酵により生育させるステップとを含み、前記生育が、培地への栄養素の一定速度での添加を含む、方法。
Ｃ７２．栄養素が、炭素供給源である、Ｃ７１に記載の生育方法。
Ｃ７３．炭素供給源が、グルコースである、Ｃ７２に記載の生育方法。
Ｃ７４．生育させた細菌が、少なくとも９．０の細胞密度を示す、Ｃ７１からＣ７３のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ７５．生育させた細菌が、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌの多糖の濃度を示す、Ｃ７１からＣ７４のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ７６．多糖を生成する細菌が、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される、Ｃ７１からＣ７５のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ７７．多糖を生成する細菌を生育させる方法であって、ａ）Ｃ１からＣ７０のいずれか一項に記載の培地をバイオリアクターに添加するステップと、ｂ）培地に、多糖を生成する細菌を播種するステップと、ｃ）細菌を、灌流により生育させるステップとを含み、生育が、（ｉ）培養物から、使用済みの培地を除去すること、（ｉｉ）新鮮な培地を添加すること、および（ｉｉｉ）細菌を保持することを含む、方法。
Ｃ７８．灌流速度が、約０．０７ＶＶＨ〜約２．００ＶＶＨの間である、Ｃ７７に記載の生育方法。
Ｃ７９．灌流速度が、約０．６７ＶＶＨ〜約１．３３ＶＶＨの間である、Ｃ７８に記載の生育方法。
Ｃ８０．灌流速度が、約１．２０ＶＶＨである、Ｃ７９に記載の生育方法。
Ｃ８１．灌流速度が可変である、Ｃ７７に記載の生育方法。
Ｃ８２．灌流を第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで増加させる、Ｃ８１に記載の生育方法。
Ｃ８３．灌流を第１の速度で開始し、速度を第２の速度まで減少させる、Ｃ８１に記載の生育方法。
Ｃ８４．灌流の持続期間が、約１時間〜約１５時間の間である、Ｃ７７からＣ８３のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ８５．灌流の持続期間が、約１時間〜約１０時間の間である、Ｃ８４に記載の生育方法。
Ｃ８６．灌流の持続期間が、約７時間である、Ｃ８５に記載の生育方法。
Ｃ８７．生育させた細菌の細胞の成長が、回分発酵システムにおける細胞の成長よりも少なくとも２倍大きい、Ｃ７７からＣ８６のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ８８．生育させた細菌が、少なくとも２０．０の細胞密度に達している、Ｃ７７からＣ８７のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ８９．生育させた細菌が、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの多糖の濃度に達している、Ｃ７７からＣ８８のいずれか一項に記載の生育方法。
Ｃ９０．多糖を生成する細菌が、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からなる群から選択される、Ｃ７７からＣ８９のいずれか一項に記載の生育方法。
【国際調査報告】
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