(57)【要約】  ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）から神経堤幹細胞（ＮＣＳＣｓ）を経由してライディッヒ細胞（ＬＣｓ）へと分化する体外指向性分化誘導方法を提供する。
2018534934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法。
【請求項２】
以下のステップ（１）とステップ（２）を含むヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法であって、
ステップ（１）において、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）をヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）に分化誘導し、
ステップ（２）において、ステップ（１）で得られたヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）をライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）に分化誘導する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を低接着性培養皿に接種して培養することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を神経分化培養液中でヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）に分化誘導することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を神経分化培養液中で培養し、胚体形成後に、神経堤幹細胞培養液で接着培養することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を消化した後、再懸濁させ、懸濁細胞を低接着性培養皿に接種し、神経分化培養液で浮遊培養し、胚体を形成した後、胚体をフィブロネクチンでコーティングした培養プレートに接種し、神経堤幹細胞培養液で接着培養し、接着培養された細胞をフローサイトメーターを通してヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）であるＰ７５＋／ＨＮＫ１＋二重陽性細胞を選別することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記低接着性培養皿は、ペトリ皿であることを特徴とする請求項３又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記神経分化培養液に、体積百分率が５０−８０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）ＤＭＥＭ、体積百分率が５−２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、体積百分率が０．５−５％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記神経分化培養液に、体積百分率が８０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、体積百分率が１８％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、体積百分率が１％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経堤幹細胞培養液に、体積百分率が０．１−５％のＮ２、体積百分率が０．５−１０％のＢ２７、体積百分率が０．５−５％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれ、そこに、１−１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１−１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）をさらに加えることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経堤幹細胞培養液に、体積百分率が１％のＮ２、体積百分率が２％のＢ２７、体積百分率が１％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれ、そこに、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）をさらに加えることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経堤幹細胞培養液は、１：０．１−１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とを混合し、体積百分率が０．１−５％のＮ２、体積百分率が０．５−１０％のＢ２７、体積百分率が０．５−５％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、１−１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１−１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）をさらに加えることによって得られることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経堤幹細胞培養液は、１：１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とを混合し、体積百分率が１％のＮ２、体積百分率が２％のＢ２７、体積百分率が１％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）をさらに加えることによって得られることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（２）は、ステップ（１）で得られたｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓを増幅した後、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液に交換して分化誘導することにより、ライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）を得ることを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に体積百分率が０．１％−２０％の子牛血清（ＦＣＳ）、０．１−１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、０．１−２０ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、５−１００ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１−５０ｎｇの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を加えることによって得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に体積百分率が２％の子牛血清（ＦＣＳ）、１ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、１ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、７０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を加えることによって得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
テストステロンレベルを向上させる薬物の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られたライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）の使用。
【請求項１８】
テストステロンレベル低下に関連する疾患の治療薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られたライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）の使用。
【請求項１９】
前記テストステロンレベルは、血清テストステロンレベルである請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１１月２７日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１５１０８４５０２１．８の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
本発明は、幹細胞及び組織工学の技術分野に関し、具体的には、ヒト誘導多能性幹細胞からライディッヒ細胞（ＬＣｓ）への分化誘導方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライディッヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ，  ＬＣｓ）は、精巣の曲精細管間の疎性結合組織に分布しており、それが分泌するテストステロンは、成人男性の体内のテストステロンの主要な供給源である。現在、ＬＯＨ（加齢男性性腺機能低下症候群）の主要な治療法は外因性アンドロゲン補充療法とされているが、この治療法には、補充用量を把握することが困難であること、生理的テストステロンの分泌特性をシミュレーションすることができないこと、長期投与の必要があり、それに伴い様々な合併症及び副作用が発生することなどの欠点がある。外因性アンドロゲンには、多くの欠点があることから、現在、僅かなアンドロゲン低下疾患の患者が外因性アンドロゲン薬物による治療を受けている。そのため、アンドロゲン低下疾患を治療するための新規な方法の開発が切望されている。ＬＣ移植は、ＬＯＨ等のテストステロン欠乏関連疾患を治療する最適な治療法であり、人体のテストステロン分泌の生理学的特性をより良好にシミュレーションすることにより、血清テストステロン濃度及び精巣局所テストステロン濃度を効果的に増加させ、より良好な治療効果を得ることができると共に、治療過程で発生する不良な結果をできるだけ避けることができる。しかし、ＬＣは、由来源が不明であり、また、入手が困難で、数が少なく、増幅が困難であるなどの欠点があるので、その臨床応用に制限がある。現在、ライディッヒ細胞の一般的な分離方法は、密度勾配遠心分離法である（Ｇｅ  ＲＳ，  Ｄｏｎｇ  Ｑ，  Ｓｏｔｔａｓ  ＣＭ，  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，  Ｚｉｒｋｉｎ  ＢＲ，  Ｈａｒｄｙ  ＭＰ．  Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｒａｔ  ｓｔｅｍ  Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００６；  １０３：  ２７１９−２７２４；Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｅ，  Ｌｉｎ  ＣＹ，  Ｊｉｎ  Ｓ，  Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｓｏｔｔａｓ  ＣＭ，  Ｇｅ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ｌｅｙｄｉｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１２；  １５３：  ５００２−５０１０．）。
【０００３】
誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ｉＰＳ細胞）は、胚性幹細胞と類似する自己複製能及び多分化能を持つと共に、自己の成体細胞に由来することができるため、胚性幹細胞に存在する倫理的問題及び免疫原性等の問題を克服でき、ヒト疾患の発症メカニズムの研究、組織細胞補充療法の展開を行うための重要な細胞源となっている。個体由来の成体細胞が転写因子（ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びｃ−ＭＹＣ）導入により多能幹細胞にリプログラミングされることで、自家移植を可能にする。ｉＰＳ細胞を「種」とする細胞は、それを体外で大量に増幅させ、特定の組織細胞に分化誘導することができる。
【０００４】
ＬＣの可能な由来源は、副腎性腺原基（ａｄｒｅｎａｌ−ｇｏｎａｄａｌ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ）、神経堤（ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ）、中腎（ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ）又は体腔上皮（ｃｏｅｌｏｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）を含む［Ｂａｒｓｏｕｍ，  Ｉ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．  Ｙａｏ，  Ｆｅｔａｌ  Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ，  ２０１０．  ３１（１）：  ｐ．  １１−５．］。Ｄａｖｉｄｏｆｆの研究により、精巣間葉系前駆細胞が神経幹細胞マーカーＮｅｓｔｉｎ及び周皮細胞マーカーＮＧ２を発現することが発見され、それはＬＣ細胞が神経堤に由来する可能性があることをさらに実証している［Ｄａｖｉｄｏｆｆ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆｆ，  Ｒ．，  Ｅｎｉｋｏｌｏｐｏｖ，  Ｇ．，  Ｒｉｅｔｈｍａｃｈｅｒ，  Ｄ．，  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ，  Ａ．Ｆ．，  Ｍuｌｌｅｒ，  Ｄ．，  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ２００４．  １６７（５）：  ｐ．  ９３５−４４．］。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ｉＰＳ）が体外で神経堤幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＮＣＳＣｓ）を経由して成熟したライディッヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ，  ＬＣｓ）へと分化できることを発見した。本発明は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）から神経堤幹細胞（ＮＣＳＣｓ）を経由してライディッヒ細胞（ＬＣｓ）へと分化する体外指向性分化誘導方法を提供し、動物モデルによりｈｉＰＳ細胞由来のＬＣｓが老化又は損傷したＬＣｓを再生する能力を有することを実証し、性腺機能低下症患者、特にＬＯＨ患者に新たなテストステロン補充方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、以下の解決策により実現される。
本発明は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法を提供する。
【０００７】
さらなる実施形態において、上記方法では、主にヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を「種」細胞とし、まず、ｈｉＰＳ細胞を特定の組織細胞に分化誘導する。この特定の組織細胞は、体外でライディッヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ，  ＬＣｓ）へさらに指向性分化することができる。上記特定の組織細胞は、ヒト神経堤幹細胞であることが好ましい。
【０００８】
さらなる実施形態において、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法は、以下のステップ（１）〜（２）を含む。
ステップ（１）において、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）をヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）に分化誘導する。
ステップ（２）において、ステップ（１）で得られたヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）をライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）に分化誘導する。
【０００９】
さらなる実施形態において、上記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を低接着性培養皿、好ましくは、ペトリ皿に接種して培養することを含む。
【００１０】
さらなる実施形態において、上記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を神経分化培養液中でヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）に分化誘導することを含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、上記ステップ（１）は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を神経分化培養液中で培養し、胚体を形成した後、神経堤幹細胞培養液で接着培養することを含む。
【００１２】
具体的な実施形態において、本発明のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法のステップ（１）には、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を消化して再懸濁させ、懸濁細胞を低接着性培養皿、好ましくは、ペトリ皿に接種し、神経分化培養液を用いて浮遊培養することで胚体を形成し、次いで、胚体をフィブロネクチンでコーティングした培養プレートに接種し、神経堤幹細胞培養液を用いて接着培養し、接着培養された細胞からフローサイトメーターによりＰ７５＋／ＨＮＫ１＋二重陽性細胞を選別することを含む。該Ｐ７５＋／ＨＮＫ１＋二重陽性細胞は、ヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）である。
【００１３】
具体的な実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ培養液を用いてヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）を再懸濁させる。
【００１４】
当分野で既知の神経分化培養液を用いることができる。好ましい実施形態において、神経分化培養液には、５０−８０％（Ｖ／Ｖ）のＫｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）ＤＭＥＭ、５−２０％（Ｖ／Ｖ）のＫｎｏｃｋｏｕｔＳＲ、０．５−５％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれる。さらなる好ましい実施形態において、神経分化培養液には、８０％（Ｖ／Ｖ）のＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、１８％のＫｎｏｃｋｏｕｔＳＲ、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれる。
【００１５】
当分野で既知の神経堤幹細胞培養液を用いることができる。好ましい実施形態において、神経堤幹細胞培養液には、１：０．１−１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地が混合されている。さらなる好ましい実施形態において、神経堤幹細胞培養液には、１：１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地が混合されている。
【００１６】
さらなる好ましい実施形態において、神経堤幹細胞培養液には、０．１−５％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、０．５−１０％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、０．５−５％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれ、さらに、１−１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１−１００ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を加える。好ましくは、上記神経堤幹細胞培養液には、１％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、２％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれ、さらに、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を加える。
【００１７】
さらなる好ましい実施形態において、上記神経堤幹細胞培養液は、１：０．１−１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を混合し、０．１−５％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、０．５−１０％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、０．５−５％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１−１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１−１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）を加えることによって得られる。
【００１８】
具体的な実施形態において、神経堤幹細胞培養液は、１：１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とを混合し、１％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、２％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を加えることによって得られる。
【００１９】
具体的な実施形態において、胚体形成の５日後、フィブロネクチンでコーティングした培養プレートに接種する。好ましい実施形態において、上記フィブロネクチンでコーティングした培養プレートは、ポリリジン／ゼラチン／フィブロネクチンでコーティングしたものである。
【００２０】
具体的な実施形態において、接着培養されている細胞が容器に付着してから５−７日後、フローサイトメーターにより選別する。
【００２１】
具体的な実施形態において、本発明のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）からライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導方法のステップ（２）には、ステップ（１）で得られたヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）を増幅させ、次いで、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液に交換し、分化誘導を行うことにより、ライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）を得ることを含む。
【００２２】
具体的な実施形態において、上記ステップ（２）では、ヒト神経堤幹細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）を６０％の密度に増幅させたときに、ＬＣ分化培養液に交換する。
【００２３】
好ましい実施形態において、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）ＬＣｓ分化培養液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に体積百分率が０．１％−２０％（Ｖ／Ｖ）の子牛血清（ＦＣＳ）、０．１−１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、０．１−２０ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、５−１００ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１−５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）を加えることによって得られる。
【００２４】
好ましい実施形態において、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に２％（Ｖ／Ｖ）の子牛血清（ＦＣＳ）、１ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、１ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、７０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を加えることによって得られる。
【００２５】
具体的な実施形態において、上記ステップ（２）の誘導時間は、１４日である。
【００２６】
本発明は、テストステロンレベル向上薬物の製造、及びテストステロンレベル低下による関連疾患の治療薬の製造における、本発明のライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）の使用をさらに提供する。
【００２７】
具体的な実施形態において、本発明のライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）は、血清テストステロンレベルを向上させることができる。
【００２８】
本発明で用いられる「ｈＮＣＳＣｓ」又は「ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ」は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）から分化誘導して得られたヒト神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ）である。
【００２９】
本発明で用いられる「ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ」又は「ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ」は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）から分化誘導して得られたヒト神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ）から分化誘導して得られたライディッヒ細胞（ＬＣｓ）である。
【００３０】
本発明の解決策は、ヒトｉＰＳ細胞系を神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ）に分化誘導し、さらに、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）に分化誘導することである。その具体的な手順は、以下のようである。
【００３１】
ステップ（１）：ヒトｉＰＳ細胞系（ｈｉＰＳＣｓ）から神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ又はｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）への分化誘導
1）細胞懸濁液を調製する。具体的には、ヒトｉＰＳ細胞系（ｈｉＰＳＣｓ）を小塊状に消化した後、懸濁させる。
ここで、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ培養液を用いて細胞を再懸濁させる。
2）分化誘導を行う。具体的には、懸濁細胞を低接着性培養皿に接種し、神経分化培養液を用いて培養して胚体構造を形成する。
ここで、神経分化培養液には、例えば、８０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、１８％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、１％の二重抗体、１ｍＭのＬ−グルタミン酸、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが含まれ得る。
3）接着培養を行う。具体的には、形成した胚体をフィブロネクチンでコーティングした培養プレートに接種し、接着培養を行う。
ここで、接種のタイミングは胚体形成の５日後であってもよい。培養プレートは、ポリリジン／ゼラチン／フィブロネクチンでコーティングできる。培養プレートに神経堤幹細胞培養液を添加してもよい。上記神経堤幹細胞培養液は、１：１の割合でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を混合し、１％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、２％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン酸及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを加えることによって得られてもよい。
４）フローソーティングを行う。具体的には、フローサイトメーターを用いて神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ又はｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）であるＰ７５＋／ＨＮＫ１＋の細胞を選別する。
上記神経堤幹細胞培養液は、１：１の割合でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を混合し、１％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、２％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン酸、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを加えることによって得られてもよい。
【００３２】
ステップ（２）：ステップ（１）で得られた神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ又はｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ）をライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ又はｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）へと分化誘導する。
ステップ（２）において、ステップ（１）で得られた神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ）を増幅させ、ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液中で１４日分化誘導することにより、ライディッヒ細胞（ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）を得る。
【００３３】
ここで、神経堤幹細胞培養液中で得られた神経堤幹細胞（ｈＮＣＳＣｓ）を増幅させることができる。さらに、ｈＮＣＳＣｓを６０％の密度に増幅させたときにＬＣｓ分化培養液に交換することができる。ＬＣｓ分化培養液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に体積百分率が０．１％−２０％の子牛血清（ＦＣＳ）、０．１−１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、０．１−２０ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、５−１００ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１−５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）を加えたものであってもよい。得られたｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓは、３β−ＨＳＤ、Ｐ４５０Ｃ１７、ＳｔＡＲ、ＳＦ−１を発現し、テストステロンを分泌する。
【００３４】
本発明の方法により得られたライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）を、ライディッヒ細胞を除去したラット動物モデル（ラットライディッヒ細胞の特異的アポトーシス誘導因子であるエタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ）を用いて構築したライディッヒ細胞のアポトーシスモデル、即ち、ＥＤＳモデル）に移植し、該細胞の精巣微環境における作用を評価する。その結果、該細胞を移植することにより、血清テストステロンの濃度を向上できることを発見した。従って、本発明の方法により得られたライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）は、テストステロンレベル低下関連疾患の治療薬の製造に使用することができる。
【００３５】
本発明は、ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導及び細胞選別することにより神経堤幹細胞を取得し、体外誘導培地で神経堤幹細胞を分化誘導することにより、ライディッヒ細胞を取得し、テストステロンを分泌する。本発明のライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）を、ＥＤＳでライディッヒ細胞を除去したラットモデルに移植することにより、モデル動物の血清テストステロンレベルを向上させることができる。
【００３６】
本明細書での「Ｖ／Ｖ」は、各成分が培養液又は培地に占める体積百分率を指す。
【００３７】
本発明者らは、長期的で詳細な研究により、ＬＯＨ等のテストステロン欠乏症の治療に新しいアイデアを提供した。即ち、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）をライディッヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌｓ，  ＬＣｓ）の由来源とし、実験によりｈｉＰＳ細胞由来のＬＣは老化又は損傷したＬＣ細胞を再生する能力を有し、人体がテストステロンを分泌する生理学的特性をより良くシミュレーションすることができ、血清テストステロン濃度及び精巣局所テストステロン濃度を共に効果的に向上させ、より良好な治療効果を得るとともに、治療過程で発生する不良な結果を最大限に避けることができる。それによって、従来の外因性アンドロゲン薬物治療法が体内テストステロンの生理学的状況をシミュレーションすることができず、補充用量を把握することが困難であること、長期投薬の必要があり、それに伴い様々な合併症及び副作用が発生することなどの欠点を克服する一方、ＬＣの由来源が不明であることによる、入手が困難で、数が少なく、増幅が困難であるなどの欠点を解決する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ｈｉＰＳＣｓからｈＮＣＳＣｓへの分化誘導過程における胚体形成及び浮遊培養後の白色光写真、並びに分化後のＮＣＳＣｓマーカーの免疫蛍光染色図である。図１Ａ−Ｃは、白色光写真であり、ここで、図１Ａは増幅培養されるｈｉＰＳＣｓであり、図１Ｂは浮遊培養される胚体であり、図１Ｃは接着培養される胚体であり、神経花環構造を形成し、外へ遊走する。図１Ｄは、分化後の細胞におけるＮＣＳＣｓ特異的マーカーの発現（免疫蛍光染色）である。ここで、Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍである。
【図２】図２は、ｈＮＣＳＣｓに生物学的特性分析を行った白色光及び蛍光染色写真である。図２Ａは、フローサイトメーターによりＮＣＳＣｓマーカーであるＨＮＫ１及びＰ７５のｈｉＰＳＣｓにおける発現を検出する図である。図２Ｂは、フローサイトメーターによる選別後に接着培養されるｈＮＣＳＣｓの白色光写真である。図２Ｃは、浮遊培養後のｈＮＣＳＣｓの白色光写真である。図２Ｄは、増幅培養されるｈＮＣＳＣｓにおけるＮＣＳＣｓ特異的マーカーであるＰ７５及びＳｏｘ１０の発現図である。ここで、Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍである。
【図３】図３は、ｈＮＣＳＣｓから末梢ニューロン及びシュワン細胞への分化の白色光及び免疫蛍光染色写真である。図３Ａは、白色光レンズで観察されたｈＮＣＳＣから末梢ニューロンへの分化前後の細胞形態である。図３Ｂ−Ｄは、免疫蛍光染色結果である。図３Ｂは、ｈＮＣＳＣｓが分化してペリフェリン＋／Ｔｕｊ１＋末梢ニューロンを形成することを示す。図３Ｃは、ｈＮＣＳＣｓからＴＨ＋／Ｔｕｊ１＋末梢交感神経ニューロンへの分化を示す。図３Ｄは、ｈＮＣＳＣｓが分化してＧＦＡＰ＋／Ｓ１００Ｂ＋シュワン細胞を形成することを示す。ここで、Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍである。
【図４】図４は、ｈＮＣＳＣｓからｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣへと分化誘導する白色光及び組織化学染色写真である。図４Ａは、白色光レンズで観察されたｈＮＣＳＣｓからｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣへの分化誘導の前後の細胞形態である。図４Ｂは、化学染色方法によりｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣを適切な分化誘導液中で一定の時間培養した後のアリザリンレッドＳ染色図、トルイジンブルー染色図、及びオイルレッドＯ染色図である。図４Ｃは、ｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣを適切な分化誘導液中で一定の時間培養した後のαＳＭＡ染色図である。ここで、Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍである。
【図５】図５は、ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓにおけるＬＣマーカーが発現する図である。
【図６】図６は、ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓが体外培養条件下でテストステロンを分泌する図である。
【図７】図７は、ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ移植の、ＥＤＳモデルラットの血清テストステロンレベルに対する影響を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
理解できるように、本明細書で述べる実施形態は、例示的なものであり、本発明を制限しない。本発明の範囲を逸脱しない限り、本発明の主要な特徴は種々の実施形態に適用できる。通常の実験だけにより、多くの均等物が本明細書で述べる特定のステップに適用できることは、当業者にとって、想到又は確認できるものである。これらの均等物は、本発明の範囲内にあり、且つ添付される特許請求の範囲に含まれると考えられる。
【００４０】
本発明の目的、技術解決策、及び利点をより明らかにするために、以下、図面及び実施例を結合して本発明をさらに詳細に説明する。本明細書で述べる具体的な実施例は本発明を解釈するものに過ぎず、本発明を限定しないことが理解されるべきである。また、以下に述べる本発明の各実施形態に係る技術特徴は、互いに矛盾がない限り、組み合わせることができる。
【００４１】
実施例１  ｈｉＰＳ細胞系からｈＮＣＳＣｓへの分化
１）細胞懸濁液の調製
構築されたヒトｉＰＳ細胞系（ｈｉＰＳＣｓ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１３，２２（１１）：  ２２２１  −３３）を使用した。ｈｉＰＳＣｓ細胞は、図１Ａに示すように、マトリゲル上に増幅培養されるときに呈偏平なクローン様に成長し、細胞の配列が緊密である。ｈｉＰＳＣｓ細胞を０．５  ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡにより小塊状に消化し、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ培養液で細胞を再懸濁させた。ここで、用いられるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）である。
２）分化誘導
懸濁細胞を回収し、ペトリ皿に接種し、神経分化培養液（８０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、１８％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン酸、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で浮遊培養し、明るい球状の胚体を形成した（図１Ｂを参照）。本実施例において、上記神経分化培養液は、上記の処方に限られない。上記神経分化培養液として、本発明に記載の神経分化培養液に体積百分率が５０−８０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、体積百分率が５−２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、体積百分率が０．５−５％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールのうちのいずれか１種を含むものを採用する場合にも、図１Ｂに示す効果を達成することができた。ここで、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ及びＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲは、いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入できる。
３）接着培養
浮遊培養により胚体を形成してから５日後、球状胚体をポリリジン／ゼラチン／フィブロネクチンでコーティングした培養プレートに接種し、接着培養を行った。神経堤幹細胞培養液（１：１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とを混合し、１％（Ｖ／Ｖ）のＮ２、２％（Ｖ／Ｖ）のＢ２７、１％（Ｖ／Ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、１ｍＭのＬ−グルタミン酸及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１３２５６０２９）及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＯ．６２２５３−６３−８）を加えることによって得られたもの）を使用し、培養液を一日おきに交換した。細胞が容器に付着してから２日後、図１Ｃに示すように、細胞集団の中央部位に明らかな神経花環構造が認められ、細胞が外へ遊走することが観察された。本実施例において、上記神経堤幹細胞培養液は、上記の処方に限られない。上記神経堤幹細胞培養液として、１：０．１−１の割合でＤＭＥＭ−Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とを混合し、体積百分率が０．１−５％のＮ２、体積百分率が０．５−１０％のＢ２７、体積百分率が０．５−５％のストレプトマイシン−ペニシリン混合液、０．５−５ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５−０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加え、さらに、１−１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１−１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）のうちのいずれか１種を加えることによって得られた本発明に記載の神経堤幹細胞培養液を採用する場合にも、図１Ｃに示す効果を達成することができた。
接着培養された細胞を免疫蛍光染色により検出した結果、図１Ｄに示すように、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２等のマーカーが主に神経花環の中央部位の細胞で発現し、神経堤幹細胞特異的マーカーであるＡＰ２α、Ｓｏｘ１０、Ｐ７５、ＨＮＫ１等が主に外へ遊走する細胞で発現することを発見しており、それは、胚体培養段階を経てさらに接着培養することにより、ｈｉＰＳＣｓをｈＮＣＳＣｓに分化誘導できることを示している。
４）フローソーティング
容器に付着してから５日後、胚体を単一の細胞を消化し、抗Ｐ７５及びＨＮＫ１のフローサイトメトリー用抗体で細胞を標識した後、Ｐ７５＋／ＨＮＫ１＋二重陽性細胞のフローソーティングを行った。選別するときにピペットで培養液を吸い出した後、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅを加えて分化したｈｉＰＳＣｓを消化し、３７℃で３−５分間作用して細胞が丸く、透明になったことが観察された後、培地を加えて消化を停止させ、ピペットチップで細胞を分散させ、次いで、ナイロン篩で細胞を篩にかけ、１５００ｒｍｐで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳを加え均一に混合させた後、２０μＬの細胞懸濁液を吸い取り、細胞をカウントした。残りの細胞をＩｇＧ陰性対照群、Ｐ７５抗体単一標識群、ＨＮＫ１抗体単一標識群、及びＰ７５＋／ＨＮＫ１＋抗体サンプル群の４群に分けて抗体で標識した（２０μＬ抗体／１０６細胞）。フローサイトメーター（ＢＤ  ｉｎｆｌｕｘ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いてＩｇＧ陰性対照群の細胞懸濁液をフローソーティングすることにより、陰性蛍光信号領域を陰性対照として選別し、蛍光強度が陰性対照の１０倍以上である細胞を収集した。フロー検出分析により、分化誘導後に約８０−９０％のｈｉＰＳＣｓ細胞がＮＣＳＣ特異的マーカーＨＮＫ１及びＰ７５を発現することが発見され（図２Ａ）、それは、誘導により多くの細胞がｈＮＣＳＣｓに分化することを示している。
【００４２】
フローソーティングにより、精製したｈＮＣＳＣｓを得ることができる。５×１０４  −１×１０５細胞／ｃｍ２で接着培養を行った。図２Ｂに示すように、接着培養される細胞の形態は比較的均一である。ｈＮＣＳＣｓを消化して継代した後、低接着性培養プレートに接種した。図２Ｃに示すように、細胞は、サイズが比較的均一な神経球体を形成した。選別して得られたｈＮＣＳＣｓ細胞に対し免疫蛍光検出を行った結果、図２Ｄに示すように、細胞がＮＣＳＣｓ特異的マーカーであるＰ７５、Ｓｏｘ１０等の発現を維持した。これは、既存の培養増幅条件下では、細胞がＮＣＳＣｓの特性を維持できることを示している。
【００４３】
ｈＮＣＳＣｓに対し生物学的特性を同定した。具体的には、ｈＮＣＳＣｓをポリリジン／ゼラチン／フィブロネクチンでコーティングしたマルチウェルプレートに接種した後、対応する細胞の誘導培地を交換して分化誘導した。図３Ａに示すように、末梢ニューロンが分化誘導して２週間後に、細胞体が丸くなり、細長い糸状突起が生じたような細胞形態の顕著な変化が観察された。３−４週後に、細胞を染色して同定した結果、図３Ｂ及び３Ｃに示すように、ペリフェリン＋／Ｔｕｊ１＋の末梢ニューロン、ＴＨ＋／Ｔｕｊ１＋の交感神経ニューロンの出現が見られた。シュワン細胞誘導液を用いてｈＮＣＳＣｓを分化誘導し、４週後に染色した結果、図３Ｄに示すように、ＧＦＡＰ＋／Ｓ１００ｂ＋のシュワン細胞の出現が見られた。
【００４４】
ｈＮＣＳＣｓをＭＳＣ細胞培養液（低糖ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）中で分化誘導して７日後に、ＭＳＣ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  間葉系幹細胞）に分化し、図４Ａに示すように、細胞形態が紡錘状となり、渦巻き状に成長することが観察された。ｈＮＣＳＣｓから誘導したＭＳＣ（ｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣ）に対しさらに多方向分化能を同定した。具体的には、適切な分化誘導液中で一定の時間培養した後、図４Ｂに示すように、アリザリンレッドＳ染色により石灰化結節形成が見られ、ｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣが骨芽細胞に分化したことが実証され、トルイジンブルー染色によりｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣが軟骨細胞に分化したことが実証され、オイルレッドＯ染色により脂肪滴形成が見られ、ｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣが脂肪細胞に分化したことが実証された。適切な分化誘導液中で一定の時間培養した後、図４Ｃに示すように、αＳＭＡ染色によりｈＮＣＳＣｓ−ＭＳＣが平滑筋細胞に分化したことを示した。それによって、培養されたｈＮＣＳＣｓは、多方向分化能を有することを示している。
【００４５】
実施例２  ｈＮＣＳＣｓからライディッヒ細胞（ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ又はｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）への分化誘導
増幅して得られたｈＮＣＳＣｓ細胞が６０％の密度に達したときにライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳＨ３００２３．０１８）に体積百分率が２％の子牛血清（ＦＣＳ）、１ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）（Ｓｉｇｍａ，Ｔ２８７７）、１ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）（Ｓｉｇｍａ，Ｌ６４２０）、７０ｎｇ／ｍｌインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，１００−１１）、１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，５００−Ｐ４７）を加えたもの）に交換して１４日誘導することで細胞を分化した後、細胞上清を収集し、細胞を固定した。免疫蛍光により成熟ＬＣｓ関連マーカーの発現（ＬＣｓマーカー３β−ＨＳＤ、Ｐ４５０ｃ１７、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）、及びステロイド生成因子１  （ＳＦ−１））を検出した結果、図５に示すように、免疫染色分析より、ｈＮＣＳＣｓから分化誘導した細胞（ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）が３β−ＨＳＤ、Ｐ４５０Ｃ１７、ＳｔＡＲ、ＳＦ−１を発現することが明らかになった。テストステロンＥＬＩＳＡ検出により培養液におけるテストステロンレベルを測定した。図６に示すように、体外で分化したｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓのテストステロン分泌が徐々に増加することを示し、それは、ｈＮＣＳＣｓが成熟したライディッヒ細胞に分化できることを実証している。なお、本実施例において、上記ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液は、上記の処方に限られない。上記ライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液として、本発明に記載のライディッヒ細胞（ＬＣｓ）分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に体積百分率が０．１％−２０％の子牛血清（ＦＣＳ）、０．１−１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）、０．１−２０ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、５−１００ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、１−５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）のうちのいずれか１種を加えたもの）を採用する場合にも、図５、６に示す効果を達成することができる。
【００４６】
実施例３  ｈｉＰＳ−ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ（又はｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ）の体内での作用
前の研究より明らかなように、ラットライディッヒ細胞の特異的アポトーシス誘導因子であるエタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ）で４日処理することでライディッヒ細胞を消耗し切ることができる。従って、ラットにＥＤＳを腹腔内注射してＥＤＳモデルを構築した。３群の成体ラットをそれぞれ正常対照群、ＥＤＳ−対照群、細胞移植群として選択した。正常対照群は、０日目及び４日目にそれぞれ同じ体積の生理食塩水を腹腔内注射した。ＥＤＳ−対照群ラットは、０日目にＥＤＳ（７５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射し、４日目に精巣内に２０μｌの生理食塩水（１０μｌ／片側精巣）を注射した。細胞群のラットは、０日目にＥＤＳ（７５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射し、４日目に、ＬＣ培養液中で５−７日培養したｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ（１．５ｘ１０６を１０μｌのＰＢＳ／片側精巣に再懸濁）をラット精巣内に移植した。移植後の１０日目に血清テストステロン濃度を測定した。図７に示すように、ｈＮＣＳＣｓ−ＬＣｓ移植により血清テストステロンのレベルを向上させることができる。
【００４７】
本発明の上記実施形態は本発明の原理を例示的に説明又は解釈するためのものに過ぎず、本発明を制限しないことが理解されるべきである。従って、本発明の趣旨及び範囲内で行われるいずれの変更、均等な置換え、改善などはすべて本発明の保護範囲に含まれるべきである。また、本発明に添付される特許請求の範囲は、その範囲及び境界、又は個の範囲及び境界の等価形式内のすべての変形例及び修正例を含むことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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