(57)【要約】  本発明は、抗ＰＶＲＩＧ抗体及びそれを使用する方法を対象とする。【選択図】図１
2018512443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前
記患者に投与することを含み、前記患者の前記ＣＴＬのサブセットが活性化される、方法
。
【請求項２】
患者のＮＫ細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与するこ
とを含み、前記患者の前記ＮＫ細胞のサブセットが活性化される、方法。
【請求項３】
患者のγδＴ細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与する
ことを含み、前記患者の前記γδＴ細胞のサブセットが活性化される、方法。
【請求項４】
患者のＴｈ１細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与する
ことを含み、前記患者の前記Ｔｈ１細胞のサブセットが活性化される、方法。
【請求項５】
患者における調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数及び／またはそ
の活性を減少させるまたは排除する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与す
ることを含む、方法。
【請求項６】
患者におけるインターフェロン−γ産生及び／または炎症促進性サイトカイン分泌を増
加させる方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項７】
患者における癌を治療する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を前記患者に投与すること
を含み、前記癌が治療される、方法。
【請求項８】
患者におけるＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の相互作用を阻害する方法であって、抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記患者が癌を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵
臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒
色腫皮膚癌（扁平細胞及び基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨ
ＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ
−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫及び食道癌から
なる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３
、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９
、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３
、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８
、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４
、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０
、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０
５０からなる群から選択される抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、
ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、請求項１８９〜１０のいずれ
かに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５
０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５
１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７
．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ
．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ
．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２
、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６
、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９及びＣＨＡ．７．５５
０からなる群から選択される抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖ
ｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、請求項１８９〜１０のいずれか
に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４
、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０
、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４
、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９
、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４
、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０
、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０
５０からなる群から選択される、請求項１８９〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
癌を診断する方法であって、
ａ）患者からの組織を抗ＰＶＲＩＧ抗体と接触させることと、
ｂ）癌の存在の指標としての前記組織におけるＰＶＲＩＧの過剰発現の存在を決定する
ことと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記組織が血液試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が固形腫瘍の生検である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が標識される、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体と結合する第２の標識された抗体が、前記試料と接触させられる
、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＰＶＲＩＧ抗原結合ドメインであって、
ａ）抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む重
鎖可変ドメインと、
ｂ）前記抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｌＣＤＲ１ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む軽
鎖可変ドメインと、を含み、
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００
３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００
９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１
３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１
８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２
４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４
０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５
０、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０
８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１
６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．
７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．
７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．
７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、
ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、
ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９及びＣＨＡ．７．５５０からなる群から選択さ
れる、抗ＰＶＲＩＧ抗原結合ドメイン。
【請求項２０】
前記抗体が一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり、前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ド
メインが、ｓｃＦｖリンカーを介して共有結合している、請求項１９に記載の抗ＰＶＲＩ
Ｇ抗原結合ドメイン。
【請求項２１】
抗ＰＶＲＩＧ抗体であって、
ａ）抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む重
鎖可変ドメインと、
ｂ）前記抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む
軽鎖可変ドメインと、を含み、
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００
３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００
９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１
３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１
８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２
４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４
０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５
０、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００
４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１
０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１
４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１
９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３
３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４
６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５０、ＣＨＡ．７．５０
２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１
０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１
８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．
７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．
７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．
７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、
ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、
ＣＨＡ．７．５４９及びＣＨＡ．７．５５０からなる群から選択される、抗ＰＶＲＩＧ抗
体。
【請求項２２】
結合に対して抗体と競合する抗ＰＶＲＩＧ抗体であって、
ａ）抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む重
鎖可変ドメインと、
ｂ）前記抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む
軽鎖可変ドメインと、を含み、
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００
３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００
９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１
３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１
８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２
４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４
０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５
０、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００
４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１
０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１
４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１
９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３
３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４
６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５０、ＣＨＡ．７．５０
２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１
０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１
８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．
７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．
７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．
７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、
ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、
ＣＨＡ．７．５４９及びＣＨＡ．７．５５０からなる群から選択される、抗ＰＶＲＩＧ抗
体。
【請求項２３】
ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６
、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１
、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５
、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１
、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３
、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６
、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選
択される抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む組成物。
【請求項２４】
ｈ５１８−１、ｈ５１８−２、ｈ５１８−３、ｈ５１８−４、ｈ５１８−５、ｈ５２４
−１、ｈ５２４−２、ｈ５２４−３、ｈ５２４−４、ｈ５３０−１、ｈ５３０−２、ｈ５
３０−３、ｈ５３０−４、ｈ５３０−５、ｈ５３８．１−１、ｈ５３８．１−２、ｈ５３
８．１−３、ｈ５３８．１−４、ｈ５３８．２−１、ｈ５３８．２−２、及びｈ５３８．
２−３からなる群から選択される抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む組成物。
【請求項２５】
核酸組成物であって、
ａ）抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む重
鎖可変ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）前記抗ＰＶＲＩＧ抗体由来のｖｌＣＤＲ１ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣ
ＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸と、を含み、
前記抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００
３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００
９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１
３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１
８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２
４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４
０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５
０、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、及びＣＨＡ．７．
５３８からなる群から選択される、核酸組成物。
【請求項２６】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項２５に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項２５に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベ
クター組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の前記第１の核酸と、請求項２５に記載の前記第２の核酸と、を含む
発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の発現ベクター組成物を含む、前記発現ベクター組成物を
含む宿主細胞。
【請求項２９】
抗ＰＶＲＩＧ抗体を作製する方法であって、
ａ）請求項２８に記載の宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項３０】
患者の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する方法であって、請求項１９〜２４に記
載の抗体を前記患者に投与することを含み、前記患者の前記ＣＴＬのサブセットが活性化
される、方法。
【請求項３１】
患者のＮＫ細胞を活性化する方法であって、請求項１９〜２４に記載の抗体を前記患者
に投与することを含み、前記患者の前記ＮＫ細胞のサブセットが活性化される、方法。
【請求項３２】
患者のγδＴ細胞を活性化する方法であって、請求項１９〜２４に記載の抗体を前記患
者に投与することを含み、前記患者の前記γδＴ細胞のサブセットが活性化される、方法
。
【請求項３３】
患者のＴｈ１細胞を活性化する方法であって、請求項１９〜２４に記載の抗体を前記患
者に投与することを含み、前記患者の前記Ｔｈ１細胞のサブセットが活性化される、方法
。
【請求項３４】
患者における調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数及び／またはそ
の活性を減少させるまたは排除する方法であって、請求項１９〜２４に記載の抗体を前記
患者に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
患者におけるインターフェロン−γ産生及び／または炎症促進性サイトカイン分泌を増
加させる方法であって、請求項１９〜２４に記載の抗体を前記患者に投与することを含む
、方法。
【請求項３６】
患者におけるＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の相互作用を阻害する方法であって、請求項１
９〜２４に記載の抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
患者における癌を治療する方法であって、請求項１９〜２４のいずれかに記載の抗体を
前記患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、２０１５年２月１９日出願のＵＳＳＮ  ６２
／１１８，２０８、及び２０１５年３月３１日出願のＵＳＳＮ  ６２／１４１，１２０、
及び２０１５年１０月１日出願のＵＳＳＮ  ６２／２３５，８２３に対する優先権を主張
するものであり、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込
まれる。
【０００２】
ナイーブＴ細胞は、生産的に活性化されるようになるためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ
）からの２つの独立したシグナルを受容しなければならない。第１のシグナル１は、抗原
特異的であり、Ｔ細胞抗原受容体がＡＰＣ上の適切な抗原−ＭＨＣ複合体に出会うと生じ
る。免疫応答の運命は、そのＡＰＣで発現されるリガンドを結合するＴ細胞共刺激分子を
介して送達される、第２の抗原非依存性シグナル（シグナル２）によって決定付けられる
。この第２のシグナルは、刺激性（正の共刺激）または抑制性（負の共刺激または共抑制
）のいずれかであり得る。共刺激シグナルの不在下、または共抑制シグナルの存在下では
、Ｔ細胞活性化は損なわれるかまたは中断され、これが抗原特異的不応答性（Ｔ細胞アネ
ルギーとして知られる）状態につながり得るか、またはＴ細胞アポトーシス死をもたらし
得る。
【０００３】
共刺激分子ペアは通常、ＡＰＣ上で発現されるリガンド及びＴ細胞上で発現されるそれ
らの同種の受容体からなる。共刺激分子のリガンド／受容体ペアの原型は、Ｂ７／ＣＤ２
８及びＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌである。Ｂ７ファミリーは、免疫応答への刺激性または抑制
性入力を提供し得る、構造的に関連する細胞表面タンパク質リガンドからなる。Ｂ７ファ
ミリーのメンバーは、構造的に関連しており、このうち細胞外ドメインが、少なくとも１
つの可変または定常免疫グロブリンドメインを含有する。
【０００４】
正及び負の共刺激シグナルは両方とも、細胞媒介性免疫応答の調節において必要不可欠
な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は、免疫調節の有効な標的であること
が判明している。この知識に基づいて、共刺激分子を標的とすることを伴ういくつかの治
療的アプローチが開発されてきており、癌の予防及び治療において、癌患者における免疫
応答をオンにすること、または免疫応答がオフになるのを予防することによって有用であ
ること、また、自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防及び治療、ならびに同種移植拒絶に対
しても、それぞれ、これらの病的状態を有する対象における無制御な免疫応答をオフにす
ることによって、または負の共刺激（または共抑制）による「オフシグナル」の誘導によ
って、有用であることが示された。
【０００５】
Ｂ７リガンドによって送達されるシグナルの操作は、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び
移植片拒絶の治療において有望性を示してきた。治療的戦略には、共刺激ペアのリガンド
もしくは受容体に対するモノクローナル抗体を用いた、またはその適切なリガンドに結合
しそれを遮断し得る共刺激受容体から構成される可溶性融合タンパク質を用いた、共刺激
の妨害が含まれる。別のアプローチは、抑制リガンドの可溶性融合タンパク質を用いた共
抑制の誘導である。これらのアプローチは、共刺激（これは細胞生存遺伝子を誘導する）
の不在下でＴ細胞がアポトーシス誘導の影響を高度に受けやすくなることを恐らくは理由
とする、自己反応性または同種反応性Ｔ細胞（これは、それぞれ自己免疫疾患または移植
における病的過程に関与する）の最終的な消失に少なくとも部分的に依存する。故に、病
原体から防御する免疫系の能力を損なうことなく共刺激シグナルを調節することが可能で
ある新規の薬剤が、かかる病的状態の治療及び予防に高度に有利である。
【０００６】
共刺激経路は、腫瘍発達において重要な役割を果たす。興味深いことに、腫瘍は、Ｂ７
−ＣＤ２８及びＴＮＦファミリーにおける共刺激因子の抑制を通してＴ細胞活性化を妨げ
ることによって、ならびに調節Ｔ細胞を誘引することで抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制すること
によって、免疫による破壊を回避することが示されてきた（Ｗａｎｇ（２００６），  “
Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４
＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ”，  Ｓｅｍｉｎ．Ｃａ
ｎｃｅｒ．Ｂｉｏｌ．１６：７３−７９、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．（２００
５），  “Ｔｈｅ  Ｂ７  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ”，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５−４８、Ｗａｔｔｓ（２００５），  “ＴＮＦ／ＴＮＦＲ  
Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅ
ｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３−６８、
Ｓａｄｕｍ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏ
ｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｕｎｉｑｕｅ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｓｃａｐｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔａｒｇ
ｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ
．Ｒｅｓ．１３（１３）：４０１６−４０２５を参照されたい）。かかる腫瘍で発現され
る共刺激分子は、魅力的な癌バイオマーカーとなってきており、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
としての役目を果たし得る。更に、共刺激経路が、腫瘍転移においてＴ細胞依存性免疫応
答を開始及びエフェクター機能の両方のレベルで減弱する、免疫チェックポイントとして
特定されてきた。操作された癌ワクチンが改善され続けるにつれて、かかる免疫チェック
ポイントが、治療的な抗腫瘍応答を誘導するワクチンの能力に対する主要な障壁であるこ
とが明白になりつつある。この点において、共刺激分子は、免疫寛容を阻止し、免疫系を
刺激するための戦略を提供する、能動的（ワクチン接種）及び受動的（抗体媒介性）癌免
疫療法のための免疫賦活剤としての役目を果たすことができる。
【０００７】
過去１０年間にわたって、種々の共刺激タンパク質に対する作用物質及び／または拮抗
物質が、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー、及び癌の治療のために開発されてきた
。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））はＲ
Ａの治療のために、突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ、Ｎｕｌｏｊｉｘ
（登録商標））は急性腎臓移植拒絶の予防のために認可され、抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｉｐｉ
ｌｉｍｕｍａｂ、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））においては、黒色腫の治療のために最近認
可されている。Ｍｅｒｃｋ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））及びＢＭＳ（Ｏｐｄｉｖｏ
（登録商標））の抗ＰＤ−１抗体等の、他の共刺激調節因子が認可されてきており、癌治
療のために認可されてきており、また、ウイルス感染に対しても試験段階にある。
【０００８】
したがって、ＰＶＲＩＧ免疫調節抗体を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、患者の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する方法であって、抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体を患者に投与することを含み、患者のＣＴＬのサブセットが活性化される、方法
を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
患者のＮＫ細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を患者に投与することを
含み、患者のＮＫ細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明の更
なる目的である。  
【００１１】
患者のγδＴ細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を患者に投与すること
を含み、患者のγδＴ細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明
の追加の目的である。
【００１２】
患者のＴｈ１細胞を活性化する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を患者に投与すること
を含み、患者のＴｈ１細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明
の更なる目的である。
【００１３】
ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の相互作用に関連する状態を有する患者においてこの相互作
用を阻害する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を患者に投与することを含む、方法を提供
することが、本発明の追加の目的である。
【００１４】
患者における癌を治療する方法であって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を患者に投与することを含
み、該癌が治療される、方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
【００１５】
上記に概説される方法であって、該抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ
．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ
．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ
．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ
．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ
．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ
．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ
．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される抗体由来のｖｈＣＤＲ
１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を
含む、方法を提供することが、本発明の追加の目的である。
【００１６】
上記に概説される方法であって、該抗ＰＶＲＩＧ抗体が、結合に対して、ＣＰＡ．７．
００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．
００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．
０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．
０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．
０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．
０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．
０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される抗体由
来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌ
ＣＤＲ３配列を含む抗体と競合する、方法を提供することが、本発明の追加の目的である
。
【００１７】
上記に概説される方法であって、該抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ
．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ
．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ
．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ
．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ
．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ
．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ
．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される、方法を提供すること
が、本発明の更なる目的である。
【００１８】
上記に概説される方法であって、該抗ＰＶＲＩＧ抗体が、結合に対して、ＣＰＡ．７．
００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．
００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．
０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．
０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．
０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．
０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．
０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される抗体と
競合する、方法を提供することが、本発明の追加の目的である。
【００１９】
上記に概説される方法であって、該抗ＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ
．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ
．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ
．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４
、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０
、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８
．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７
．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７
．５４９、ＣＨＡ．７．５５０、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７
．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７
．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７
．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７
．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７
．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７
．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ
．７．０５０からなる群から選択される抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣ
ＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、方法を提供すること
が、本発明の更なる目的である。
【００２０】
該ＰＶＲＩＧ抗体が、結合に対して、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨ
Ａ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨ
Ａ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、
ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２
６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３
４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．
５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．
７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、ＣＨＡ．
７．５５０、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．
７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．
７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．
７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．
７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．
７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．
７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からな
る群から選択される抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ
１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＶＲＩＧ抗体からなる群から選択さ
れる抗体と競合する、上記に概説される方法を提供することが、本発明の追加の目的であ
る。
【００２１】
癌を診断する方法であって、ａ）患者からの組織を抗ＰＶＲＩＧ抗体と接触させること
と、ｂ）癌の存在の指標としての組織におけるＰＶＲＩＧの過剰発現の存在を決定するこ
とと、を含む、方法を提供することが、本発明の更なる目的である。抗ＰＶＲＩＧ抗体は
、本明細書に記載され、上記に概説される通りであり得る。
【００２２】
ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６
、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１
、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５
、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１
、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３
、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６
、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選
択される抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣ
ＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配列を含む抗ＰＶＲＩＧ抗体である抗体を含む、抗原結合ドメイ
ンを提供することが、本発明の追加の目的である。
【００２３】
ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６
、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１
、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５
、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１
、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３
、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６
、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選
択される抗ＰＶＲＩＧ抗体である、抗ＰＶＲＩＧ抗原結合ドメイン（抗体を含む）組成物
を提供することが、本発明の更なる目的である。
【００２４】
ｈ５１８−１、ｈ５１８−２、ｈ５１８−３、ｈ５１８−４、ｈ５１８−５、ｈ５２４
−１、ｈ５２４−２、ｈ５２４−３、ｈ５２４−４、ｈ５３０−１、ｈ５３０−２、ｈ５
３０−３、ｈ５３０−４、ｈ５３０−５、ｈ５３８．１−１、ｈ５３８．１−２、ｈ５３
８．１−３、ｈ５３８．１−４、ｈ５３８．２−１、ｈ５３８．２−２、及びｈ５３８．
２−３（図９０に図示される）からなる群から選択される抗ＰＶＲＩＧ抗体である、抗Ｐ
ＶＲＩＧ抗原結合ドメイン（抗体を含む）組成物を提供することが、本発明の更なる目的
である。
【００２５】
ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８
、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６
、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７
．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７
．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７
．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、Ｃ
ＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、Ｃ
ＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、ＣＨＡ．７．５５０、ＣＰＡ．７．００１、Ｃ
ＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、Ｃ
ＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、Ｃ
ＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、Ｃ
ＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、Ｃ
ＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、Ｃ
ＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、Ｃ
ＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される抗体由来のｖｈＣ
ＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３配
列を含む抗ＰＶＲＩＧ抗体である抗体を含む、抗原結合ドメインを提供することが、本発
明の追加の目的である。
【００２６】
ａ）抗体由来のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン
をコードする第１の核酸と、ｂ）抗体由来のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ
３を含む軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸とを含む、核酸組成物を提供すること
が、本発明の更なる目的である。抗体は、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、Ｃ
ＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、Ｃ
ＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、Ｃ
ＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、Ｃ
ＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、Ｃ
ＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、Ｃ
ＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、Ｃ
ＰＡ．７．０５０、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、Ｃ
ＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、Ｃ
ＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０
．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５
２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５
３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ
．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ
．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、ＣＨＡ．７．５５０、ＣＰＡ
．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ
．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ
．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ
．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ
．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ
．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ
．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、及びＣＰＡ．７．０５０からなる群から選択される
。
【００２７】
本明細書及び上記に概説される第１及び第２の核酸を含む発現ベクター組成物を提供す
ることが、本発明の追加の目的である。
【００２８】
単一の発現ベクターまたは２つの発現ベクターのいずれかとして発現ベクター組成物を
含む宿主細胞を提供することが、本発明の更なる目的である。
【００２９】
ａ）抗体が産生される条件下で本発明の宿主細胞を発現ベクター（複数可）と共に培養
することと、ｂ）該抗体を回収することとを含む、抗ＰＶＲＩＧ抗体を作製する方法を提
供することが、本発明の追加の目的である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の作用機序の概略図。
【図２】種々の正常なヒト組織におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現を提示する。
【図３】末梢血及び骨髄に由来する種々の免疫集団におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現を提示する（ＧＳＥ４９９１０に基づく）。
【図４】種々のＣＤ３＋リンパ球集団におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現を提示する（ＧＳＥ４７８５５に基づく）。
【図５Ａ】特定の細胞集団におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現を提示する。図５Ａは、レーザーキャプチャー顕微鏡観察によって得られた特定の細胞集団におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現に憤慨する（ＧＳＥ３９３９７に基づく）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、正常な患者及び癌患者由来のＣＤ４  Ｔ細胞におけるｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現、ならびに流入領域リンパ節からの発現型ＣＤ４  Ｔ細胞発現及びＴＩＬ型乳癌患者を提示する（ＧＳＥ３６７６５に基づく）。
【図５Ｃ】図５Ｃ  は、濾胞性リンパ腫腫瘍及び扁桃に由来するＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡによるＰＶＲＩＧ発現を提示する（ＧＳＥ２７９２８に基づく）。
【図６】ＧＴＥｘに基づく正常な組織におけるＰＶＲＩＧ発現を提示する。発現レベルは、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）値（１００万リード数当たりキロベース当たりで特定されたフラグメント）で示される。１を上回る値は、高発現と見なされる。組織は、発現中央値によって最上位から最下位まで順位付けされる。プロット上の各小点は、単一の試料を表す。
【図７】ＴＣＧＡに基づく癌性組織におけるＰＶＲＩＧ発現を提示する。発現レベルは、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）値（１００万リード数当たりキロベース当たりで特定されたフラグメント）で示される。１を上回る値は、高発現と見なされる。組織は、発現中央値によって最上位から最下位まで順位付けされる。プロット上の各小点は、単一の試料を表す
【図８】タンパク質相互作用、経路及び疾患関連性の３つのカテゴリにおけるエンリッチメント解析結果のヒートマップ図を示す。結果は、行毎の平均ｐ値によって最上位から最下位まで順位付けされる。各カテゴリからの上位１０の結果のみが示される。灰色の正方形はｐ値＜０．０５を示す。ヒートマップにおける各列は、高度に相関した遺伝子の一覧が導出された（少なくとも５０個の試料を用いてｒ＞０．５５）正常組織または癌組織に対応する。ヒートマップに示されるように、ＰＶＲＩＧは、免疫応答及び免疫疾患と強力に関連付けられるＴ細胞遺伝子発現シグネチャと相関する。
【図９】正常な皮膚対黒色腫におけるＰＶＲＩＧ発現を提示する（ＧＴＥｘ及びＴＣＧＡ解析）。かかる過剰発現は、追加の固形腫瘍において観察され、腫瘍微小環境における浸潤性リンパ球及びＮＫ細胞からの結果であった。正常なコンディクション（ｃｏｎｄｉｃｔｉｏｎ）においては、浸潤性免疫細胞は何ら存在せず、したがって、ＰＶＲＩＧ発現レベルは非常に低い。
【図１０】ＴＣＧＡ試料からの黒色腫におけるＰＶＲＩＧ及びＰＤ１の、肺腺癌、結腸腺癌及び黒色腫におけるいくつかのＴ細胞マーカーとの相関を提示する。マーカーＣＤ３は、Ｔ細胞に対する一般的マーカーであり、これもまたＮＫＴ細胞上で発現される。ＣＤ４及びＣＤ８マーカーは、Ｔ細胞の特性評価された亜集団に対して使用される。
【図１１】ヒトＰＢＬ上のＰＶＲＩＧの発現を示す。２つのドナーに由来するヒトＰＢＬが、ＰＶＲＩＧ発現について評価された。ドナー６１及びドナー  ４０の両方が、抗ＰＶＲＩＧ特異的Ａｂによる有意な染色を示した。
【図１２】ＰＶＲＩＧ−Ｉｇが、試験された４つ全てのヒト黒色腫細胞株ＭＥＬ−２３、Ｍｅｌ−６２４及びＭｅｌ−６２４．３８ならびにｍｅｌ−８８８への強力な結合を表すことを示す。結合は、操作された黒色腫特異的Ｔ細胞との共培養によっては影響を受けない。灰色の線は、アイソタイプ対照に対応し、黒色の線は、ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇに対応する。
【図１３】ＰＶＲＩＧの、Ｔ細胞及びＴ細胞の亜集団との相関。ＣＤ３Ｇは、Ｔ細胞受容体複合体の構成要素であり、ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞に対するマーカーであり、ＣＤ８Ａは、細胞傷害性Ｔ細胞を特定するために使用されるＣＤ８タンパク質の構成要素である。ＰＶＲＩＧは、ここに示される肺腺癌、結腸腺癌及び黒色腫を含む、多くの種類の腫瘍においてＴ細胞と高度に相関した。
【図１４】確認／特異性スクリーンからの代表的画像を提示する。一次スクリーンからの全てのヒット、及びＥＧＦＲ発現ベクター（陰性対照）が、二連で再整列／発現され、２０ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧで探索された。高い強度を伴う特異的ヒットが緑色で示される（ＰＶＲＬ２）。非特異的ヒットが黒色で示される。別の弱いヒット（ＭＡＧ）は、他のリガンドに結合することが後に示され、故にそれが特異的でないことを示唆した。
【図１５Ａ】マウスＣＤ４  Ｔ細胞活性化に対する種々のＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ  Ｍ：Ｍタンパク質の効果を提示する。材料及び方法で記載されるように、プレートを１０μｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ  Ｉｇ（バッチ番号１９８）または対照ｍＩｇＧ２ａの存在下で、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。ウェルを２ｕｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８の存在下で、ウェル当たり１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−マウスＴ細胞でプレートした。（Ａ）ＣＤ６９の発現を刺激後４８時間目でフローサイトメトリーによって分析した、代表的なヒストグラムが示される。各バーは二連培養の平均であり、エラーバーが標準偏差を示す。
【図１５Ｂ】（Ｂ）培養上清を刺激後４８時間目で収集し、マウスＩＬ−２及びＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。結果が二連  試料の平均±標準誤差として示される。
【図１５Ｃ】（Ｃ）培養上清を刺激後４８時間目で収集し、マウスＩＬ−２及びＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。結果が二連  試料の平均±標準誤差として示される。
【図１５Ｄ】（Ｄ）固定化したＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ  Ｉｇ（図９２ＢＢ、表面ＣＤ６９上（Ｄ）及びＩＦＮγ分泌（Ｅ）の用量応答効果が提示される。各バーは三連培養の平均であり、エラーバーが標準誤差を示す。
【図１５Ｅ】（Ｄ）固定化したＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ  Ｉｇ（図９２ＢＢ、表面ＣＤ６９上（Ｄ）及びＩＦＮγ分泌（Ｅ）の用量応答効果が提示される。各バーは三連培養の平均であり、エラーバーが標準誤差を示す。
【図１６】特異的抗体を用いたＰＶＲＩＧ形質導入ＰＢＬに対するＦＡＣＳ解析を提示する。該タンパク質について陽性染色を示す細胞の（空ベクター形質導入と比べた）パーセントが提供される。
【図１７】特異的抗体を用いたＰＶＲＩＧ（Ｆ４  ＴＣＲと共発現されたか、またはＦ４  ＴＣＲ及びＮＧＦＲ形質導入ＰＢＬとのバイシストロン性（バイシストロン性）ベクターにあるかのいずれか、に対するＦＡＣＳ解析を提示する。該タンパク質について陽性染色を示す細胞の（空ベクター形質導入と比べた）パーセントが提供される。
【図１８Ａ】形質導入された特異的ＴＣＲからのベータ鎖の細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナル抗体を用いた、実験１（図１８Ａ）に関する及び実験２（図１８Ｂ）におけるＴＣＲ形質導入された刺激されたＰＢＬに対して行われたＦＡＣＳ解析を提示する。陽性染色を示す細胞のパーセントが提供される。
【図１８Ｂ】形質導入された特異的ＴＣＲからのベータ鎖の細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナル抗体を用いた、実験１（図１８Ａ）に関する及び実験２（図１８Ｂ）におけるＴＣＲ形質導入された刺激されたＰＢＬに対して行われたＦＡＣＳ解析を提示する。陽性染色を示す細胞のパーセントが提供される。
【図１９】Ｆ４発現ＰＢＬ上のＰＶＲＩＧの発現が、ＳＫ−ＭＥＬ２３、ＭＥＬ−６２４及びＭＥＬ−６２４．３８と共培養すると、空ベクターの発現と比較してＩＦＮγ分泌の低減を引き起こすことを示す。
【図２０Ａ】共形質導入によるＰＢＬにおけるＰＶＲＩＧ及びＦ４の発現（図２０Ａ）は、黒色腫細胞株との共培養においてＩＦＮγ分泌に影響を及ぼさない。バイシストロン性ベクターを用いたＰＢＬにおけるＰＶＲＩＧ及びＦ４の発現（図２０Ｂ）は、ＳＫ−ＭＥＬ２３、ＭＥＬ−６２４及びＭＥＬ−６２４．３８と共培養すると、空ベクターの発現と比較してＩＦＮγ分泌の低減を引き起こす。
【図２０Ｂ】共形質導入によるＰＢＬにおけるＰＶＲＩＧ及びＦ４の発現（図２０Ａ）は、黒色腫細胞株との共培養においてＩＦＮγ分泌に影響を及ぼさない。バイシストロン性ベクターを用いたＰＢＬにおけるＰＶＲＩＧ及びＦ４の発現（図２０Ｂ）は、ＳＫ−ＭＥＬ２３、ＭＥＬ−６２４及びＭＥＬ−６２４．３８と共培養すると、空ベクターの発現と比較してＩＦＮγ分泌の低減を引き起こす。
【図２１】バイシストロン性ベクターを用いたＰＢＬにおけるＰＶＲＩＧ及びＦ４の発現が、黒色腫細胞株と共培養すると、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性の低減を引き起こすことを示す。
【図２２】低レベル、変化なし及び高レベルの疲弊したＴ細胞の３つの亜群におけるＰＶＲＩＧ発現を示す。疲弊したＴ細胞は、ＣＤ８Ａ、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３及びＴＩＧＩＴの４つのマーカーの高レベルの発現に基づいて選択された。低発現試料は、いかなる検出可能なレベルのＰＶＲＩＧも有するものがなかったため、示されない。
【図２３】異所的に発現されたヒトＰＶＲＩＧタンパク質のウェスタンブロット分析。ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇ（レーン２）をコードする発現構築物と共にまたは空ベクター（レーン１）と共に事前にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞プールの全細胞抽出物を、抗ｆｌａｇ抗体（２３Ａ）または抗ＰＶＲＩＧ抗体（２３Ｂ）を用いてＷＢによって分析した。
【図２４】ＨＥＫ２９３細胞の細胞表面発現は、ＦＡＣＳ解析によるとヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇタンパク質を異所的に発現した。抗ＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ（Ａｂｎｏｖａ）を用いて、ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇタンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を解析した。空ベクターを発現する細胞を陰性対照として用いた。ヤギ抗マウスＰＥ標識二次Ａｂによって検出を行い、ＦＡＣＳによって解析した。
【図２５】本実施例において使用されたヒトＰＶＲＩＧの完全長配列（２つの異なるメチオニン開始点を示す）及びＰＶＲＩＧ  Ｆｃ融合タンパク質を図示する。シグナルペプチドは下線が引かれ、ＥＣＤは二重下線が引かれ、Ｆｃドメインは点線の下線が引かれている。
【図２６】実施例５に示されるＰＶＲＩＧの結合パートナーである、ヒトポリオウイルス受容体関連２タンパク質（ＰＶＬＲ２、別名ネクチン−２、ＣＤ１１２またはヘルペスウイルス侵入メディエーターＢ、（ＨＶＥＢ））の配列を図示する。ＰＶＬＲ２は、ヒト形質膜糖タンパク質である。
【図２７】ＰＶＲＩＧを過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞へのＰＶＲＩＧ抗体特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何学的ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。正方形の付いた黒色の破線は、代表的な抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１）でのＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞の染色を示し、丸の付いた黒色の実線は、同じ抗体でのＨＥＫ親細胞の染色を示す。
【図２８】ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを種々の癌細胞株においてｑＰＣＲによって評価した。示されるデータは、２（−ΔΔＣｔ）法によって評価した、Ｅｘｐｉ細胞におけるレベルに対する倍率変化としての細胞株におけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの相対的発現である。
【図２９】ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを、選別されたＰＢＭＣサブセットにおいてｑＰＣＲによって評価した。示されるデータは、２（−ΔΔＣｔ）法によって評価した、ＨＥＫ  ＧＦＰ  細胞におけるレベルに対する倍率変化としての各サブセットにおけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの相対的発現である。Ｄ４７〜Ｄ４９は、３つの個々のドナーを表す。ＣＤ４はＣＤ４  Ｔ細胞を表し、ＣＤ８はＣＤ８  Ｔ細胞を表し、ＣＤ１４  は単球を表し、ＣＤ５６はＮＫ細胞を表す。
【図３０Ａ】図３０Ａ：ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを、選別されたＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４）及びＮＫ細胞（ＮＫ）において、ナイーブ及び活性化条件下でｑＰＣＲによって評価した。ＣＤ４  Ｔ細胞をヒトＴ細胞刺激因子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ及び５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で３日間刺激した。ＮＫ細胞を５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２において３日間刺激した。示されるデータは、２（−ΔΔＣｔ）法によって評価した、Ｅｘｐｉ細胞におけるレベルに対する倍率変化としての各サブセットにおけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの相対的発現である。Ｊｕｒｋａｔは、陽性対照として含まれる。Ｄ４７〜Ｄ４９は、３つの個々のドナーを表す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂ  ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを、選別されたＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ４）において、ナイーブ及び活性化条件下でｑＰＣＲによって評価した。ＣＤ８  Ｔ細胞をヒトＴ細胞刺激因子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ及び１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で３日間刺激した。示されるデータは、２（−ΔΔＣｔ）法によって評価した、Ｅｘｐｉ細胞におけるレベルに対する倍率変化としての各サブセットにおけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの相対的発現である。Ｊｕｒｋａｔは、陽性対照として含まれる。Ｄ４９、７０、及び７１は、３つの個々のドナーを表す。
【図３１Ａ】ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧで操作された細胞株、ＨＥＫ  親細胞、ＣＡ４６細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧ結合特性。ＨＥＫ  ＯＥはＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を表し、ＨＥＫ  ｐａｒはＨＥＫ親細胞を表す。Ｊｕｒｋａｔ及びＣＡ４６データに関しては、ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。信頼性のない適合は、抗体結合特性が適切な数学的適合要件を満たさないことを示す。いくつかの抗体は、不十分な結合特性、特異性、または製造性に起因していくつかの条件下では試験されなかった。
【図３１Ｂ】ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧで操作された細胞株、ＨＥＫ  親細胞、ＣＡ４６細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧ結合特性。ＨＥＫ  ＯＥはＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を表し、ＨＥＫ  ｐａｒはＨＥＫ親細胞を表す。Ｊｕｒｋａｔ及びＣＡ４６データに関しては、ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。信頼性のない適合は、抗体結合特性が適切な数学的適合要件を満たさないことを示す。いくつかの抗体は、不十分な結合特性、特異性、または製造性に起因していくつかの条件下では試験されなかった。
【図３２Ａ】初代ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル一過性過剰発現細胞、及びカニクイザル初代ＰＢＭＣへのＰＶＲＩＧ結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥはｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。いくつかの抗体は、図３１のように、不十分な結合特性、特異性、または製造性に起因していくつかの条件下では試験されなかった。加えて、選定した抗体は、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に結合するそれらの能力または機能性に基づいて、カニクイザルＰＢＭＣサブセットのスクリーニングのために格付けされた。ＣＤ４  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの発現は、ＣＤ８  Ｔ細胞についての表に記載されているものと同様である。
【図３２Ｂ】初代ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル一過性過剰発現細胞、及びカニクイザル初代ＰＢＭＣへのＰＶＲＩＧ結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥはｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。いくつかの抗体は、図３１のように、不十分な結合特性、特異性、または製造性に起因していくつかの条件下では試験されなかった。加えて、選定した抗体は、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に結合するそれらの能力または機能性に基づいて、カニクイザルＰＢＭＣサブセットのスクリーニングのために格付けされた。ＣＤ４  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの発現は、ＣＤ８  Ｔ細胞についての表に記載されているものと同様である。
【図３３】ＣＡ４６及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としてのＦＡＣＳによる絶対幾何学的ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。三角形の付いた黒色の実線は、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１）でのＣＡ４６細胞の染色を示し、正方形の付いた黒色の実線は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の染色を示す。ＯＶ−９０（逆三角形の付いた破線）及びＮＣＩ−Ｈ４４１１（菱形の付いた破線）を陰性対照として示す。
【図３４Ａ】ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体交差活性。データは、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対する負の結合因子（ａ〜ｂ、ＣＰＡ．７．０２１）及び正の結合因子（ｃ〜ｄ、ＣＰＡ．７．０２４）である抗体の例を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムは対照抗体を示し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を示す。細胞を５ｕｇ／ｍｌの濃度の各抗体で染色した。
【図３５】ｃＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを、ｑＰＣＲによって、選別されたカニクイザルＰＢＭＣサブセットにおいて評価した。示すデータは、ｃＰＶＲＩＧ遺伝子２つの異なるエリアを対象にする２つのプライマーセットによって検出した、３頭のカニクイザルドナーからの平均Ｃｔ値である。
【図３４Ｂ】ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体交差活性。データは、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対する負の結合因子（ａ〜ｂ、ＣＰＡ．７．０２１）及び正の結合因子（ｃ〜ｄ、ＣＰＡ．７．０２４）である抗体の例を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムは対照抗体を示し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を示す。細胞を５ｕｇ／ｍｌの濃度の各抗体で染色した。
【図３４Ｃ】ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体交差活性。データは、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対する負の結合因子（ａ〜ｂ、ＣＰＡ．７．０２１）及び正の結合因子（ｃ〜ｄ、ＣＰＡ．７．０２４）である抗体の例を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムは対照抗体を示し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を示す。細胞を５ｕｇ／ｍｌの濃度の各抗体で染色した。
【図３４Ｄ】ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体交差活性。データは、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に対する負の結合因子（ａ〜ｂ、ＣＰＡ．７．０２１）及び正の結合因子（ｃ〜ｄ、ＣＰＡ．７．０２４）である抗体の例を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムは対照抗体を示し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を示す。細胞を５ｕｇ／ｍｌの濃度の各抗体で染色した。
【図３６Ａ】ｃＰＶＲＩＧタンパク質を、ＦＡＣＳによって、ａ）ＣＤ１６＋リンパ球（ＮＫ細胞）、ｂ）ＣＤ１４＋ＣＤ５６＋骨髄細胞（単球）、及びｃ）ＣＤ３＋リンパ球（Ｔ細胞）に対して評価した。データを絶対幾何学的ＭＦＩとして示し、黒色の実線はバックグラウンド蛍光レベルを示す。データは、３頭のカニクイザルドナーにおいて試験した発明者らによる抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体パネルの試料を表す。
【図３６Ｂ】ｃＰＶＲＩＧタンパク質を、ＦＡＣＳによって、ａ）ＣＤ１６＋リンパ球（ＮＫ細胞）、ｂ）ＣＤ１４＋ＣＤ５６＋骨髄細胞（単球）、及びｃ）ＣＤ３＋リンパ球（Ｔ細胞）に対して評価した。データを絶対幾何学的ＭＦＩとして示し、黒色の実線はバックグラウンド蛍光レベルを示す。データは、３頭のカニクイザルドナーにおいて試験した発明者らによる抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体パネルの試料を表す。
【図３６Ｃ】ｃＰＶＲＩＧタンパク質を、ＦＡＣＳによって、ａ）ＣＤ１６＋リンパ球（ＮＫ細胞）、ｂ）ＣＤ１４＋ＣＤ５６＋骨髄細胞（単球）、及びｃ）ＣＤ３＋リンパ球（Ｔ細胞）に対して評価した。データを絶対幾何学的ＭＦＩとして示し、黒色の実線はバックグラウンド蛍光レベルを示す。データは、３頭のカニクイザルドナーにおいて試験した発明者らによる抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体パネルの試料を表す。
【図３７Ａ】実施例５に示すように、ＰＶＲＩＧのその対応物ＰＶＲＬ２との相互作用の妨害に成功することが決定されたＦａｂについてのＣＤＲ配列を示す。
【図３７Ｂ】実施例５に示すように、ＰＶＲＩＧのその対応物ＰＶＲＬ２との相互作用の妨害に成功することが決定されたＦａｂについてのＣＤＲ配列を示す。
【図３８Ａ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｂ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｃ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｄ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｅ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｆ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｇ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｈ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｉ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｊ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｋ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｌ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｍ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｎ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｏ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｐ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｑ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｒ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｓ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｔ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｕ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｖ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｗ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｘ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｙ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｚ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３８ＡＡ】ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合の妨害との両方を行う、列挙する本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３９Ａ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｂ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｃ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｄ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｅ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｆ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｇ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図３９Ｈ】ＰＶＲＩＧに結合するが、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しない、８個の本発明のヒトＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ配列についての、可変重及び軽ドメイン、完全長重鎖及び軽鎖、ならびに可変重及び可変軽ＣＤＲのアミノ酸配列を図示する。
【図４０Ａ】ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しないものを含む、ＰＶＲＩＧに結合するように生成された全てのＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ抗体配列についてのＣＤＲを図示する。
【図４０Ｂ】ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しないものを含む、ＰＶＲＩＧに結合するように生成された全てのＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ抗体配列についてのＣＤＲを図示する。
【図４０Ｃ】ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しないものを含む、ＰＶＲＩＧに結合するように生成された全てのＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ抗体配列についてのＣＤＲを図示する。
【図４０Ｄ】ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害しないものを含む、ＰＶＲＩＧに結合するように生成された全てのＣＰＡ抗ＰＶＲＩＧ抗体配列についてのＣＤＲを図示する。
【図４１Ａ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｂ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｃ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｄ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｅ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｆ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｇ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｈ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｉ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｊ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｋ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｌ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｍ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｎ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｏ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｐ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｑ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｒ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｓ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｔ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｕ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｖ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｗ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｘ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｙ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１Ｚ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１ＡＡ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１ＢＢ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１ＣＣ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４１ＤＤ】列挙する本発明のＣＨＡ抗体、ＣＨＡ．７．５０２、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、ＣＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、ＣＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０（これらはマウス配列由来（ハイブリドーマ由来）の可変重及び軽配列を含む）の各々の可変重鎖及び軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示する。
【図４２】実施例１１からのビニング結果を図示する。ビニングなし：ＣＰＡ．７．０２９及びＣＰＡ．７．０２６（抗原への結合なし）。
【図４３】３５個の抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂについての抗原の対妨害（「０」、赤色のボックス）またはサンドイッチング（「１」、緑色のボックス）の２値行列。行列の左側に垂直方向に列挙したＭＡｂは、ＰｒｏｔｅＯｎアレイに共有的に固定したｍＡｂである。行列の上部に水平方向に列挙したＭＡｂは、予混合した抗原を注射した分析物であった。クローンＣＰＡ．７．０４１は分析物としてのみ研究した。黒色のボックスは、ｍＡｂの垂直方向の妨害パターンに従う４つのエピトープビンを描く。
【図４４】図４３の２値行列における各ｍＡｂの垂直方向の結合パターンの階層的クラスタリング樹状図。各群内で同一のエピトープ妨害パターンを有するｍＡｂのビンが４つある。ビン１及びビン２の間の唯一の差異は、ビン１のｍＡｂがクローンＣＰＡ．７．０３９への抗原結合を妨害するのに対し、ビン２のｍＡｂは抗原をＣＰＡ．７．０３９でサンドイッチし得ることである。クローンＣＰＡ．７．０５０は、抗原を全ての他のクローンでサンドイッチし得る。
【図４５Ａ−４５Ｒ】ビン＃１についての代表的なデータである、全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３６についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．０３６の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．３６は、ＣＰＡ．７．０５０（ＪＪ）を除く全ての他のｍＡｂへの抗原結合を妨害する。
【図４５Ｓ−４５ＪＪ】ビン＃１についての代表的なデータである、全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３６についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．０３６の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．３６は、ＣＰＡ．７．０５０（ＪＪ）を除く全ての他のｍＡｂへの抗原結合を妨害する。
【図４６Ａ−４６Ｒ】ビン＃２についての代表的なデータである、全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３４についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．３４の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．３４は、ＣＰＡ．７．０３９（ＤＤ）及びＣＰＡ．７．０５０（ＪＪ）を除く全ての他のｍＡｂへの抗原結合を妨害する。
【図４６Ｓ−４６ＪＪ】ビン＃２についての代表的なデータである、全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３４についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．３４の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．３４は、ＣＰＡ．７．０３９（ＤＤ）及びＣＰＡ．７．０５０（ＪＪ）を除く全ての他のｍＡｂへの抗原結合を妨害する。
【図４７Ａ−４７Ｒ】全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３９についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。ＣＰＡ．７．０３９は、ビン＃３中で唯一のｍＡｂである。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．０３９の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。パネルＣ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｚ、ＥＥ、ＧＧ、ＨＨ、ＩＩ、及びＪＪは、抗原のサンドイッチングを示す。
【図４７Ｓ−４７ＪＪ】全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０３９についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。ＣＰＡ．７．０３９は、ビン＃３中で唯一のｍＡｂである。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．０３９の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。パネルＣ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｚ、ＥＥ、ＧＧ、ＨＨ、ＩＩ、及びＪＪは、抗原のサンドイッチングを示す。
【図４８Ａ−４８Ｒ】全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０５０についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。ＣＰＡ．７．０５０は、ビン＃４中で唯一のｍＡｂである。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．５０の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．０５０自体の上に抗原を注射したパネルＪＪのみが、抗原妨害を示す。
【図４８Ｓ−４８ＪＪ】全ての他の固定されたｍＡｂとのＣＰＡ．７．０５０についての抗原妨害パターンを示すセンサーグラム。ＣＰＡ．７．０５０は、ビン＃４中で唯一のｍＡｂである。各パネルは、異なる固定されたｍＡｂを有する異なるＰｒｏｔｅＯｎチップアレイスポットを表す。青色の応答は抗原のみの対照である。黒色の応答は、モル過剰の抗原におけるＣＰＡ．７．５０の予混合溶液である。灰色の応答は、ｍＡｂのみの対照の注射である。ＣＰＡ．７．０５０自体の上に抗原を注射したパネルＪＪのみが、抗原妨害を示す。
【図４９】実施例１２のＳＰＲ実験の結果を示す。
【図５０Ａ−５０Ｑ】捕捉されたヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質上に注射した上清における複数の濃度の抗ＰＶＲＩＧ  ｆａｂ（黒色の線）のＳＰＲセンサーグラムデータ。赤色の線は、相互作用のｋａ及びｋｄを推定するための複数の濃度のｆａｂに対する１：１の全体的動態適合を示す。文字は、表１に列挙するクローンを示し、この表１は、結果として得られる速度定数及び算出したＫＤも列挙している。
【図５１Ａ】捕捉されたヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質に結合するクローンＣＰＡ．７．００９（Ａ）、ＣＰＡ．７．００３（Ｂ）、及びＣＰＡ．７．０１４（Ｃ）結合についてのＳＰＲセンサーグラム。これらは、センサーグラムが複雑な多相動態を示した例であるため、速度定数を確実に推定することはできなかった。
【図５１Ｂ】捕捉されたヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質に結合するクローンＣＰＡ．７．００９（Ａ）、ＣＰＡ．７．００３（Ｂ）、及びＣＰＡ．７．０１４（Ｃ）結合についてのＳＰＲセンサーグラム。これらは、センサーグラムが複雑な多相動態を示した例であるため、速度定数を確実に推定することはできなかった。
【図５１Ｃ】捕捉されたヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質に結合するクローンＣＰＡ．７．００９（Ａ）、ＣＰＡ．７．００３（Ｂ）、及びＣＰＡ．７．０１４（Ｃ）結合についてのＳＰＲセンサーグラム。これらは、センサーグラムが複雑な多相動態を示した例であるため、速度定数を確実に推定することはできなかった。
【図５２Ａ】実施例５における「更なる検証研究４」からの妨害研究の結果を示す。
【図５２Ｂ】実施例５における「更なる検証研究４」からの妨害研究の結果を示す。
【図５３】同種活性化の後で、ＰＶＲＩＧの発現が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞ならびに二重負ガンマデルタＴ細胞上で上方調節されたことを示す。この上方調節は、試験した２ドナーのうちの一方のＰＢＭＣにおいて観察された。
【図５４】実施例１Ｇで試験したヒト細胞株を示す。
【図５５】実施例１Ｇで試験したマウス細胞株を示す。
【図５６Ａ】種々のヒト癌細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧの転写産物発現。いくつかの細胞株におけるヒト転写産物の検証を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。柱状図は、ＴａｑＭａｎプローブＨｓ０４１８９２９３＿ｇ１を使用して観察されたデータを表す。Ｃｔ値を表中で詳述する。Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ７８、及びＨＬ６０において高い転写産物を、ＴＨＰ１及びＲＰＭＩ８２２６細胞株においてより低いレベルを示す解析。
【図５６Ｂ】種々のヒト癌細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧの転写産物発現。いくつかの細胞株におけるヒト転写産物の検証を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。柱状図は、ＴａｑＭａｎプローブＨｓ０４１８９２９３＿ｇ１を使用して観察されたデータを表す。Ｃｔ値を表中で詳述する。Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ７８、及びＨＬ６０において高い転写産物を、ＴＨＰ１及びＲＰＭＩ８２２６細胞株においてより低いレベルを示す解析。
【図５６Ｃ】種々のヒト癌細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧの転写産物発現。いくつかの細胞株におけるヒト転写産物の検証を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。柱状図は、ＴａｑＭａｎプローブＨｓ０４１８９２９３＿ｇ１を使用して観察されたデータを表す。Ｃｔ値を表中で詳述する。Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ７８、及びＨＬ６０において高い転写産物を、ＴＨＰ１及びＲＰＭＩ８２２６細胞株においてより低いレベルを示す解析。
【図５７Ａ】種々のマウス細胞株におけるマウスＰＶＲＩＧの転写産物発現。いくつかの細胞株におけるマウス転写産物の検証を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。柱状図は、ＴａｑＭａｎプローブＣＣ７０Ｌ８Ｈを使用して観察されたデータを表す。Ｃｔ値を表中で詳述する。ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｒｅｎｃａ、ＳａＩ／Ｎ、及びＪ７７４Ａ．１において高い転写産物を、ＣＴ２６及びＢ１０４−１−１細胞株においてより低いレベルを示す解析。
【図５７Ｂ】種々のマウス細胞株におけるマウスＰＶＲＩＧの転写産物発現。いくつかの細胞株におけるマウス転写産物の検証を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。柱状図は、ＴａｑＭａｎプローブＣＣ７０Ｌ８Ｈを使用して観察されたデータを表す。Ｃｔ値を表中で詳述する。ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｒｅｎｃａ、ＳａＩ／Ｎ、及びＪ７７４Ａ．１において高い転写産物を、ＣＴ２６及びＢ１０４−１−１細胞株においてより低いレベルを示す解析。
【図５８】ＰＶＲＩＧタンパク質の内因性発現を、種々の細胞株の全細胞抽出物を使用して、市販の抗ヒトＰＶＲＩＧウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４７４９７）によるＷＢによって分析した。ヒトＰＶＲＩＧを異所的に過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞（レーン２）または空ベクターでトランスフェクトした細胞（レーン１）の抽出物を、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。
【図５９】ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧ転写産物のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔヒト癌細胞株を、ヒトＰＶＲＩＧ  ＴａｑＭａｎプローブ＃Ｈｓ０４１８９２９３＿ｇ１を使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって分析し、上記の表で示した２つのハウスキーピング遺伝子の幾何学的平均によって正規化した。Ｃｔ値を表中で詳述する。技術的３連ＰＣＲ反応の標準偏差を示す。
【図６０】ヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔヒト細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧタンパク質の膜発現。ヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を、モノクローナル抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ  Ｉｎｃ、ＣＰＡ．７．０２１（左のパネル、緑色の線）またはＩｇＧ２  アイソタイプ対照抗体（左のパネル、青色の線）、及びＳｉｇｍａ  Ａｂ（右のパネル、赤色の線）またはＩｇＧ（右のパネル、青色の線）で染色した。スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を、同じ抗ＰＶＲＩＧ（オレンジ色）またはアイソタイプ対照（ｍＡｂ染色については左のパネル、赤色の線；Ｓｉｇｍａ  Ａｂについては右のパネル、緑色の線）で染色した。細胞を洗浄した後、ＰＥ−ヤギ抗マウス二次標識ＡｂをＳｉｇｍａ  Ａｂのみに加えた。
【図６１】ノックダウンによって確認したｑＰＣＲとＦＡＣＳとの間の相関を示す細胞株を強調する、本報告に記載の所見の概要を示す。ＨＳＫＧ−ハウスキーピング遺伝子、＋−陽性、ＮＴ−試験せず、Ｘ−陰性、ＫＤ−ノックダウン。
【図６２】ノックダウンによって確認したｑＰＣＲとＦＡＣＳとの間の相関を示す細胞株を強調する、本報告に記載の所見の概要を示す。ＨＳＫＧ−ハウスキーピング遺伝子、＋−陽性、ＮＴ−試験せず、Ｘ−陰性、ＫＤ−ノックダウン。
【図６３Ａ】列挙する本発明のＣＰＡ抗体の各々のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示し、ＣＰＡ．７．００１〜ＣＰＡ．７．０５０はヒト配列である（ファージディスプレイから）。
【図６３Ｂ】列挙する本発明のＣＰＡ抗体の各々のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示し、ＣＰＡ．７．００１〜ＣＰＡ．７．０５０はヒト配列である（ファージディスプレイから）。
【図６３Ｃ】列挙する本発明のＣＰＡ抗体の各々のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示し、ＣＰＡ．７．００１〜ＣＰＡ．７．０５０はヒト配列である（ファージディスプレイから）。
【図６３Ｄ】列挙する本発明のＣＰＡ抗体の各々のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を図示し、ＣＰＡ．７．００１〜ＣＰＡ．７．０５０はヒト配列である（ファージディスプレイから）。
【図６４Ａ】実施例１Ｂにおけるスクリーニングの結果を示す。
【図６４Ｂ】実施例１Ｂにおけるスクリーニングの結果を示す。
【図６５】実施例１Ｉで使用した抗体の詳細及び染色濃度
【図６６Ａ】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列を図示する。
【図６６Ｂ】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列を図示する。
【図６６Ｃ】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列を図示する。
【図６７】いくつかのヒトＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ断片を図示する。
【図６８】実施例１３に示すようなＣＰＡ．７．０２１についての結合曲線を図示する。
【図６９Ａ】ＣＤ１３７及びＰＤ−１表面発現の検出。ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及びＴＩＬを活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。休止細胞または活性化された細胞を、まずリンパ球（ＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａ）についてゲーティングした後、生細胞ゲーティングを行い、一重項（ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａ）、ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞について更にゲーティングし、ＣＤ１３７及びＰＤ１について更にゲーティングした。異なる時点での（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＴＩＬ上のＰＤ−１（左）及びＣＤ１３７（右）の表面発現を、活性化の経過にわたってアイソタイプ対照に対して正規化した。
【図６９Ｂ】ＣＤ１３７及びＰＤ−１表面発現の検出。ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及びＴＩＬを活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。休止細胞または活性化された細胞を、まずリンパ球（ＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａ）についてゲーティングした後、生細胞ゲーティングを行い、一重項（ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａ）、ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞について更にゲーティングし、ＣＤ１３７及びＰＤ１について更にゲーティングした。異なる時点での（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＴＩＬ上のＰＤ−１（左）及びＣＤ１３７（右）の表面発現を、活性化の経過にわたってアイソタイプ対照に対して正規化した。
【図６９Ｃ】ＣＤ１３７及びＰＤ−１表面発現の検出。ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及びＴＩＬを活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。休止細胞または活性化された細胞を、まずリンパ球（ＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａ）についてゲーティングした後、生細胞ゲーティングを行い、一重項（ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａ）、ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞について更にゲーティングし、ＣＤ１３７及びＰＤ１について更にゲーティングした。異なる時点での（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＴＩＬ上のＰＤ−１（左）及びＣＤ１３７（右）の表面発現を、活性化の経過にわたってアイソタイプ対照に対して正規化した。
【図７０Ａ】休止及び活性化されたＣＤ４＋  Ｔ及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ発現。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の発現。アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ４＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ８＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプと比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７０Ｂ】休止及び活性化されたＣＤ４＋  Ｔ及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ発現。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の発現。アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ４＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ８＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプと比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７０Ｃ】休止及び活性化されたＣＤ４＋  Ｔ及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ発現。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の発現。アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ４＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＣＤ８＋細胞上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプと比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７１Ａ】休止及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１及び２０９を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＴＩＬ  ２０９上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照と比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７１Ｂ】休止及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１及び２０９を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＴＩＬ  ２０９上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照と比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７１Ｃ】休止及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１及び２０９を活性化し、Ｍ＆Ｍに記載のように４つの時点で経時的にモニタリングした。細胞を生死判定色素で染色した後、抗ＰＶＲＩＧ及びアイソタイプ対照（７．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）ＴＩＬ  Ｍａｒｔ１上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。（Ｂ）ＴＩＬ  ２０９上の発現アイソタイプ対照と比較した、２４、４８、７２時間、及び１４４時間についての一重項ゲーティング後の生きている休止（時点０）及び活性化されたＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現。得られた蛍光強度値の幾何学的平均を示す。（Ｃ）活性化の経過にわたるヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照と比較した抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂによる倍率誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）染色の正規化。
【図７２】単球由来ＤＣ上のＰＶＲＬ２の発現。アイソタイプ対照（実線の付いた円形）と比べた時間（日数）の関数としてのＰＶＲＬ２発現（破線の付いた三角形）を示す。分化後の日数は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の単球への添加の後の時間を示す。
【図７３Ａ】ＭＬＲにおけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの発現。増殖（ＣＦＳＥ低）及び非増殖Ｔ細胞（ＣＦＳＥ高）上のＰＶＲＩＧの発現を示す。データは、３つの個別のＣＤ３  Ｔ細胞ドナー及び様々なＰＶＲＩＧ抗体からのものである。ＣＦＳＥをＸ軸上で測定し、ＰＶＲＩＧ発現をＹ軸上で測定した。上部の３シリーズの散布図はＣＤ４  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ発現を示し、下部の３シリーズはＣＤ８  Ｔ細胞上の発現を示す。
【図７３Ｂ】ＭＬＲにおけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの発現。増殖（ＣＦＳＥ低）及び非増殖Ｔ細胞（ＣＦＳＥ高）上のＰＶＲＩＧの発現を示す。データは、３つの個別のＣＤ３  Ｔ細胞ドナー及び様々なＰＶＲＩＧ抗体からのものである。ＣＦＳＥをＸ軸上で測定し、ＰＶＲＩＧ発現をＹ軸上で測定した。上部の３シリーズの散布図はＣＤ４  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ発現を示し、下部の３シリーズはＣＤ８  Ｔ細胞上の発現を示す。
【図７４Ａ】ＭＬＲにおけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの正規化した発現。分析した全ての抗体にわたる３つの個々のＣＤ３  Ｔ細胞ドナーからのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と比べたＰＶＲＩＧの発現を示す。
【図７４Ｂ】ＭＬＲにおけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの正規化した発現。分析した全ての抗体にわたる３つの個々のＣＤ３  Ｔ細胞ドナーからのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と比べたＰＶＲＩＧの発現を示す。
【図７５Ａ】ＰＶＲＩＧ抗体は、ＭＬＲにおけるＴ細胞増殖を増加させる。示されるＰＶＲＩＧ抗体で処理したＭＬＲアッセイからのＣＦＳＥが低い細胞のパーセンテージを示す。各グラフは、１つの個々のＣＤ３  Ｔ細胞ドナーを表す。
【図７５Ｂ】ＰＶＲＩＧ抗体は、ＭＬＲにおけるＴ細胞増殖を増加させる。示されるＰＶＲＩＧ抗体で処理したＭＬＲアッセイからのＣＦＳＥが低い細胞のパーセンテージを示す。各グラフは、１つの個々のＣＤ３  Ｔ細胞ドナーを表す。
【図７６】Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ抗体のＦＡＣＳ系エピトープ解析。発明者らのハイブリドーマキャンペーンに由来するコンジュゲートしていないＰＶＲＩＧ抗体ならびに関連対照とＴ細胞をプレインキュベートした後のコンジュゲートしたＣＰＡ．７．０２１（ファージキャンペーン由来）の結合のレベルを示す。ＭＬＲに由来するＣＦＳＥが低いＴ細胞に対して解析を行った。
【図７７】ＰＶＲＩＧを過剰発現するように操作したＨＥＫ細胞に向けたＰＶＲＩＧ抗体特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何学的ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。正方形の付いた黒色の破線は、代表的な抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８）でのＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞の染色を示し、丸の付いた黒色の実線は、同じ抗体でのＨＥＫ親細胞の染色を示す。
【図７８】ＰＶＲＩＧ抗体はＪｕｒｋａｔ細胞に向けた特異性を示す。データは、増加する抗体濃度の関数としてのＦＡＣＳによる絶対幾何学的ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。正方形の付いた黒色の破線は、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８）でのＪｕｒｋａｔ細胞の染色を示し、丸の付いた黒色の実線は、ｍＩｇＧ１対照抗体での染色を示す。
【図７９Ａ】ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧで操作された細胞株、ＨＥＫ親細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＨＥＫ  ＯＥはＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を表し、ＨＥＫ  ｐａｒはＨＥＫ親細胞を表す。Ｊｕｒｋａｔデータに関しては、ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。どの結合も、抗体が試験した細胞株と結合しないことを示さなかった。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図７９Ｂ】ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧで操作された細胞株、ＨＥＫ親細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＨＥＫ  ＯＥはＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を表し、ＨＥＫ  ｐａｒはＨＥＫ親細胞を表す。Ｊｕｒｋａｔデータに関しては、ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。どの結合も、抗体が試験した細胞株と結合しないことを示さなかった。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図８０Ａ】一次ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、及びカニクイザル一次ＰＢＭＣに対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥはｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒを計算した濃度を示す。試験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に対する結合の不在に起因して試験しなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさなかった抗体を示す。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図８０Ｂ】一次ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、及びカニクイザル一次ＰＢＭＣに対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥはｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒを計算した濃度を示す。試験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に対する結合の不在に起因して試験しなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさなかった抗体を示す。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図８１Ａ】ＦＡＣＳ系競合アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の妨害能力の概要。抑制のＩＣ５０を示す。いずれのＩＣ５０も、これらの抗体が非遮断薬であることを示さない。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図８１Ｂ】ＦＡＣＳ系競合アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の妨害能力の概要。抑制のＩＣ５０を示す。いずれのＩＣ５０も、これらの抗体が非遮断薬であることを示さない。ハイライトした抗体は、目的の抗体の「上位４つ」である。
【図８２】ｓｉＲＮＡを用いたエレクトロポレーションから２４時間後にＴＩＬにおいて行ったＫＤ検証。ＴＩＬをＦＡＣＳによって解析した抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＰＤ−１で染色した。関連Ａｂで染色したＳＣＲに対するＫＤ集団のパーセンテージを計算した。
【図８３】ＫＤ  ＴＩＬ（ＭＡＲＴ−１特異的）を黒色腫細胞６２４と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養し、抗ＣＤ８ａ抗体及び抗ＣＤ１３７抗体で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。幾何学平均蛍光強度をプロットする（Ａ）。共培養上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ及びＴＮＦレベルを検出した（Ｂ、Ｃ）。処理効果のパーセンテージを、各処理をＳＣＲ対照と比較することによって計算した。図は、２つの別々の実験の代表的なデータを示す。処理を、３連試料のスチューデントｔ−検定（＊Ｐ  ０．０５、＊＊Ｐ  ≦０．０１）によって比較した。
【図８４】ＫＤ  ＴＩＬ（Ｆ４  ｇｐ１００特異的）を黒色腫細胞６２４と共に１：３のエフェクター：標的比で１８時間共培養し、抗ＣＤ８ａ抗体及び抗ＣＤ１３７抗体で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。幾何学平均蛍光強度をプロットする（Ａ）。共培養上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγレベルを検出した（Ｂ）。処理効果のパーセンテージを、各処理をＳＣＲ対照と比較することによって計算した。図は、２つの別々の実験の代表的なデータを示す。処理を、３連試料のスチューデントｔ−検定（＊Ｐ  ０．０５、＊＊Ｐ  ≦０．０１）によって比較した。
【図８５Ａ】からのＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）及びＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。処理を、３連試料のスチューデントｔ−検定（＊Ｐ  ０．０５、＊＊Ｐ  ≦０．０１）によって比較した。
【図８５Ｂ】からのＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）及びＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。処理を、３連試料のスチューデントｔ−検定（＊Ｐ  ０．０５、＊＊Ｐ  ≦０．０１）によって比較した。
【図８６Ａ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８６Ｂ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８６Ｃ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８６Ｄ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８６Ｅ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８６Ｆ】ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）及びＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図８７Ａ】ＴＩＬ（Ｆ４）を、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＰＤ１（ｍＡｂ  １Ｂ８、Ｍｅｒｃｋ、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）及びＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。
【図８７Ｂ】ＴＩＬ（Ｆ４）を、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＰＤ１（ｍＡｂ  １Ｂ８、Ｍｅｒｃｋ、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と１：１のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）及びＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。
【図８８Ａ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｂ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｃ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｄ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｅ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｆ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｇ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｈ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８８Ｉ】Ｉは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記す。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システムｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創立者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列及び接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／（ＡｂＭ）からのＣｈｏｔｈｉａに従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る；＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る；＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図８９Ａ】５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図８９Ｂ】５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図８９Ｃ】５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図８９Ｄ】５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図８９Ｅ】５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図９０】図８８及び図８９のヒト化ＶＨ及びＶＬ  ＣＨＡ抗体を組み合わせるためのスキームを図示する。「ｃｈｉｍＶＨ」及び「ｃｈｉｍＶＬ」は、ヒトＩｇＧ定常ドメインに結合したマウス可変重及び軽配列である。
【図９１】一次ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、及びカニクイザル一次ＰＢＭＣに対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥはｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒを計算した濃度を示す。試験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に対する結合の不在に起因して試験しなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさなかった抗体を示す。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った４つの抗体である（図９０参照）。
【図９２】ＦＡＣＳ系競合アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の妨害能力の概要。抑制のＩＣ５０を示す。いずれのＩＣ５０も、これらの抗体が非遮断薬であることを示さない。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った４つの抗体である（図９０参照）。
【図９３Ａ】ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との間の相互作用を妨害するＰＶＲＩＧ抗体の効果。（ａ〜ｂ）データは絶対ｇＭＦＩの変化を示し、これは相互作用を分断するために４つのＰＶＲＩＧ抗体を加えるときの可溶性ＰＶＲＩＧのＨＥＫ細胞への結合の変化を表す。各アッセイにおける各抗体のＩＣ５０値も示す。Ａ）データは、抗体を抗原と共にプレインキュベートするときの可溶性ＰＶＲＩＧのＨＥＫ細胞との分断を示す。
【図９３Ｂ】Ｂ）データは、抗体に抗原を同時に加えるときの可溶性ＰＶＲＩＧのＨＥＫ細胞との分断を示す。
【図９３Ｃ】Ｃ）データは絶対ｇＭＦＩの変化を示し、これは相互作用を分断するために４つのＰＶＲＩＧ抗体を加えるときの可溶性ＰＶＲＬ２  ＦｃのＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞への結合の変化を表す。各抗体のＩＣ５０値を示す。ＮＤは決定せずを表す。
【図９４Ａ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｂ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｃ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｄ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｅ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｆ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｇ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９４Ｈ】Ｒｅｈ細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９５Ａ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９５Ｂ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９５Ｃ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９５Ｄ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９５Ｅ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９５Ｆ】Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２（ａ）、ＣＰＡ．７．００５（ｂ）、ＣＰＡ．７．０２１（ａ−ｃ）、及びＣＰＡ．７．０５０（ｃ）の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＲｅｈ細胞に対して漸増した、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｄ）一定数のＮＫ対Ｒｅｈ細胞（５：１）でＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．０２１の濃度を変化させることがＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に与える効果を検査した。ＤＮＡＭ−１（ｅ）及びＴＩＧＩＴ（ｆ）を、パネルａ〜ｃで概説する条件によるアッセイにおいて検査した。
【図９６Ａ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｂ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｃ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｄ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｅ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｆ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｇ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９６Ｈ】ＭＯＬＭ−１３細胞上のＮＫ細胞受容体及びリガンド発現。ａ）ＰＶＲＩＧ、ｂ）ＤＮＡＭ−１、ｃ）ＴＩＧＩＴ等のＮＫ細胞受容体の発現を示す。ｄ）ＰＶＲ、ｅ）ＰＶＲＬ２、ｆ）ＵＬＢＰ２／５／６、ｇ）ＵＬＢＰ３、及びｈ）ＭＩＣＡ／Ｂ等のＮＫ受容体リガンドの発現を示す。塗りつぶした灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、黒線の中空のヒストグラムは目的の抗体を表す。
【図９７Ａ】ＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。ａ）５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．００５、及びＣＰＡ．７．０２１の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＭＯＬＭ−１３細胞に対して漸増した、ＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｂ）ＴＩＧＩＴをパネルａと同様に検査した。
【図９７Ｂ】ＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することに対するＰＶＲＩＧ抗体の効果。ａ）５ｕｇ／ｍｌのＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．００５、及びＣＰＡ．７．０２１の効果を、ＮＫ細胞の数を一定数のＭＯＬＭ−１３細胞に対して漸増した、ＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにおいて検査した。ｂ）ＴＩＧＩＴをパネルａと同様に検査した。
【図９８】細胞生化学アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の妨害能力の概要。アッセイの並べ替え及び配向、ならびに抑制のＩＣ５０を示す。（Ｐ）は、ＰＶＲＩＧ抗体をＨＥＫ細胞への添加前にＰＶＲＩＧ抗原と共にプレインキュベートするアッセイの並べ替えを示す。（ＮＰ）は、ＰＶＲＩＧ抗体及びＰＶＲＩＧ抗原のＨＥＫ細胞への同時添加を示す。増加した結合は、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞へのＰＶＲＬ２  Ｆｃの結合が阻害されるのではなくむしろ増強されたことを示す。
【図９９】Ｒｅｈ及びＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害アッセイにおける選定したＰＶＲＩＧ抗体の活性の概要。対照に対する細胞傷害性における倍率変化を、ＰＶＲＩＧ抗体を用いた条件における殺傷の絶対レベル（％）を、対照抗体による殺傷の絶対レベル（％）で割ることによって計算した。倍率変化を、５：１のエフェクター対標的の割合から計算した。
【図１００】ＰＶＲＩＧオルソログの配列アラインメント。ヒト、カニクイザル、マーモセット、及びアカゲザルＰＶＲＩＧ細胞外ドメインのアラインメントした配列。ヒトとカニクイザルとの間の差異を黄色でハイライトする。
【図１０１】抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体と、カニクイザル、ヒト、カニクイザル／ヒトハイブリッドＰＶＲＩＧ変異体との結合。抗体の野生型カニクイザルＰＶＲＩＧ（●）、Ｈ６１ＲカニクイザルＰＶＲＩＧ（■）、Ｐ６７ＳカニクイザルＰＶＲＩＧ（▲）、Ｌ９５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧ（▼）、及び野生型ヒトＰＶＲＩＧ（◆）との結合を示す。ＥＬＩＳＡ  シグナルを抗体濃度の関数としてプロットする。
【図１０２】抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のエピトープ群及びカニクイザル交差活性の相関。
【図１０３Ａ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｂ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｃ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｄ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｅ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｆ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｇ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｈ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｉ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｊ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｋ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｌ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｍ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｎ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｏ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｐ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｑ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｒ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｓ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｔ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｕ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｖ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｗ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｘ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｙ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３Ｚ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＡ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＢ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＣ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＤ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＥ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＦ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＧ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＨ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＩ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＪ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＫ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＬ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＭ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＮ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＯ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＰ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＱ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＲ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＳ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＴ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＵ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＶ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＷ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＸ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＹ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＡＺ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＡ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＢ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＣ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＤ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＥ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＦ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＧ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＨ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＩ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＪ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＫ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＬ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＭ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＮ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＯ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＰ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＱ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＲ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＳ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＴ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＵ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＶ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＷ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【図１０３ＢＸ】本発明に役立ついくつかの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．序論
癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力を持たないものと見なすことができる。多
くの場合、これらの転換した（例えば、癌性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内での
Ｔ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機序が存在し、これを
、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、
特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免
疫療法」と称されることがある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ
、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、及びＯｐｄｉｖｏ等のＴ細胞チェックポイント阻害抗体が、いくつ
かの最近認可されたものである。これらの抗体は、それらがＴ細胞性免疫の通常は負の調
節因子を妨害するため、一般に「チェックポイント阻害剤」と称される。共刺激性及び共
抑制性両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合する
ことができると一般に理解されている。一般的に、これらの抗体は、通常の状況下では細
胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を予防または抑制する、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１等
のチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する。チェックポイントタンパク質を阻害す
ることにより、例えば、これらのタンパク質を結合する抗体の使用を介して、腫瘍に対す
る増加したＴ細胞応答を達成することができる。つまり、これらの癌チェックポイントタ
ンパク質は免疫応答を抑制し、タンパク質が、例えばチェックポイントタンパク質に対す
る抗体を使用して妨害されるとき、免疫系が活性化されることで免疫刺激につながり、そ
の結果、癌及び感染性疾患等の状態の治療をもたらす。
【００３２】
本発明は、本明細書では「ＰＶタンパク質」とも称されることがある、ヒトポリオウイ
ルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有タンパク質または「ＰＶＲＩＧ」に対する抗
体の使用を対象とする。ＰＶＲＩＧは、ＮＫ及びＴ細胞の細胞表面上で発現され、他の既
知の免疫チェックポイントといくつかの類似点を共有する。
【００３３】
新規の免疫チェックポイントを特定するために、計算アルゴリズムを使用してヒトゲノ
ムを解析した。細胞表面タンパク質であり、Ｉｇドメインを有し、腫瘍微小環境内の免疫
細胞上、具体的には、受容体であると推測される腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）上で発現
されることが予期される遺伝子を特定した。単一ＩｇＶドメインを有し、細胞内ＩＴＩＭ
様モチーフを有するタンパク質を特定し、これらは、免疫チェックポイントとして作用し
、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞に対する抑制効果を有することを示唆する。計算的に特定
した後、ＰＶＲＩＧがリンパ球上及び腫瘍微小環境内のリンパ球上で発現され、ＮＫ及び
Ｔ細胞に対して抑制効果を有することを実証する発現研究（ノックダウン実験及びＰＶＲ
ＩＧに向けられた抗体の両方によって実証）を含む、種々の検証実験を行った。ＰＶＲＬ
２を、ＰＶＲＩＧの対応物であると特定／確認した。ＰＶＲＩＧと結合する抗体を生成し
た後、ＰＶＲＩＧとの結合と、ＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の相互作用の妨害との両方を行
うこれらのサブセットを特定した。
【００３４】
したがって、ＰＶＲＩＧがそのリガンド（ＰＶＲＬ２）によって結合されるとき、ＮＫ
及びＴ細胞の標的細胞に対する免疫応答を減弱させるように作用する（即ち、ＰＤ−１／
ＰＤＬ１に類似した）抑制シグナルが励起される。ＰＶＲＬ２のＰＶＲＩＧへの結合の妨
害により、ＰＶＲＩＧのこの抑制シグナルが遮断され、その結果、ＮＫ及びＴ細胞の免疫
応答が調節される。ＰＶＲＬ２との結合を妨害するＰＶＲＩＧに対する抗体の利用は、Ｎ
Ｋ及びＴ細胞による癌細胞の殺傷を増強し得る治療的アプローチである。ＰＶＲＩＧに結
合し、そのリガンドであるＰＶＲＬ２の結合を妨害する妨害抗体を生成した。
【００３５】
実施例の節に示すように、ＰＶＲＩＧの発現は、既知の免疫チェックポイントタンパク
質であるＰＤ−１の発現と正相関した。加えて、ＰＶＲＩＧの導入（細胞外ドメイン（Ｅ
ＣＤ）融合タンパク質として）によりＴ細胞の活性化が阻害されることが示されたため、
抗ＰＶＲＩＧ抗体の使用はＴ細胞活性化につながる。したがって、抗ＰＶＲＩＧ抗体を使
用して、癌等のＴ細胞またはＮＫ細胞活性化が所望される状態を治療することができる。
【００３６】
ＰＶＲＩＧ妨害抗体がＮＫ及びＴ細胞に与える機能的効果は、以下のパラメータにおけ
る変化を測定することによって、インビトロで（また、以下でより十分に説明するように
、いくつかの場合にはインビボで）評価することができる：増殖、サイトカイン放出、及
び細胞表面マーカー。ＮＫ細胞については、細胞増殖、細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ、グラ
ンザイム、及びパーフォリン発現の増加によって、または標的細胞の殺傷を直接測定する
ことによって測定した、標的細胞を殺傷する能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ
−γ及びＴＮＦ）、及び細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加は、免疫調節、
例えば、癌細胞の増強された殺傷を示す。Ｔ細胞については、増殖の増加、活性化の細胞
表面マーカーの発現（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、及びＰＤ１）の増加、
細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、及びサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）は、免疫調節、
例えば、癌細胞の増強された殺傷を示す。
【００３７】
したがって、本発明は、ヒトＰＶＲＩＧ  ｐｐｓと結合する抗原結合ドメインを含む抗
体と、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を活性化して、癌及び感染性疾患等の疾患、ならびに
増加した免疫活性が治療をもたらす他の状態を治療する方法とを提供する。
【００３８】
ＩＩ．ＰＶＲＩＧタンパク質
本発明は、ＰＶＲＩＧタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本文脈における
「タンパク質」は、「ポリペプチド」と互換的に使用され、ペプチドも含む。本発明は、
ＰＶＲＩＧタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ＰＶＲＩＧは、シグナルペプ
チド（アミノ酸１から４０に及ぶ）、細胞外ドメイン（アミノ酸４１から１７１に及ぶ）
、膜貫通ドメイン（アミノ酸１７２から１９０に及ぶ）、及び細胞質ドメイン（アミノ酸
１９１から３２６に及ぶ）を有する３２６アミノ酸長の膜貫通ドメインタンパク質である
。完全長ヒトＰＶＲＩＧタンパク質を図２５に示す。開始コドンであり得るメチオニンは
２つあるが、成熟タンパク質は同一である。
【００３９】
したがって、本明細書で使用する場合、「ＰＶＲＩＧ」または「ＰＶＲＩＧタンパク質
」または「ＰＶＲＩＧポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の既知のまたは野生
型ＰＶＲＩＧを非限定的に含む、任意のかかるタンパク質、またはその変異体、コンジュ
ゲート、または断片、ならびに任意の天然に存在するスプライス変異体、アミノ酸変異体
またはアイソフォーム、及び特にＰＶＲＩＧのＥＣＤ断片を任意選択で含んでもよい。Ｐ
ＶＲＩＧの「可溶性」形態という用語もまた、「可溶性外部ドメイン（ＥＣＤ）」または
「外部ドメイン」または「細胞外ドメイン（ＥＣＤ）」、ならびに「ＰＶＲＩＧポリペプ
チドの断片」という用語とも互換的に使用され、これは、以下の任意選択のポリペプチド
のうちの１つ以上を広範囲に指し得る：
【００４０】
ＰＶＲＩＧタンパク質は、ＰＶＲ様Ｉｇ折り畳みドメインである細胞外ドメイン内の免
疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＰＶＲ様Ｉｇ折り畳みドメインは、他のＢ７ファ
ミリーメンバーへの類似性により、機能的対応物結合に関与し得る。細胞外ドメインのＰ
ＶＲ様Ｉｇ折り畳みドメインは、ドメイン内システイン残基間に形成される１つのジスル
フィド結合を含み、これは、この折り畳みに典型的であり、構造・機能に重要であり得る
。これらのシステインは、残基２２及び９３（または９４）に位置する。一実施形態では
、ＰＶＲＩＧ抗体の試験に使用することができるＰＶＲＩＧ可溶性断片が提供される。
【００４１】
ＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ断片がＰＶＲＩＧタンパク質の定義に含まれる。任意選択で、ＰＶ
ＲＩＧ  ＥＣＤ断片はまた、ＰＶＲＩＧタンパク質の機能領域を含むことが当然に予測さ
れる、図６７に列挙するポリペプチド配列のうちのいずれか１つを指す。この予測は、Ｉ
ｇタンパク質の複合体（例えば、ＣＴＬＡ４及びＣＤ８６の複合体を説明するＰＤＢ  Ｉ
Ｄ  １ｉ８５）を含む解いた３Ｄ構造によるタンパク質複合体のセットの系統的解析に基
づく。各ＰＤＢからの各「共同構造（ｃｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」分子間接触残基を収
集し、ＰＶＲＩＧの配列にプロジェクションした。いくつかの接触マップによって支持さ
れた相互作用している残基のクラスターを有するいくつかの領域を特定し、一連のペプチ
ドとして合成したら、これが無傷の完全長タンパク質の構造を模倣し、それによりＰＶＲ
ＩＧが免疫及び特異的免疫細胞型に与える影響のうちの１つ以上を調節することが、当然
に予期される。本発明の少なくとも一部の実施形態に従い、図６７に列挙するポリペプチ
ド配列によって表されるＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ断片は、以下のように位置する（図２５のヒ
トＰＶＲＩＧ  ＥＣＤと比較して、ＥＣＤの第１のアミノ酸から計数する）：ＰＶＲＩＧ
断片Ａは４６〜６６位に位置し；ＰＶＲＩＧ断片Ｂは４６〜７９位に位置し；ＰＶＲＩＧ
断片Ｃは６３〜７９位に位置し；ＰＶＲＩＧ  断片Ｄは９１〜１０６位に位置し；ＰＶＲ
ＩＧ  断片Ｅは９１〜１１４位に位置し；ＰＶＲＩＧ  断片Ｆは１１〜２５位に位置し；
ＰＶＲＩＧ  断片Ｇは３〜２４位に位置し；ＰＶＲＩＧ  断片Ｈは１８〜３６位に位置し
；ＰＶＲＩＧ  断片Ｉは２９〜５２位に位置し；ＰＶＲＩＧ  断片Ｊは７３〜９８位に位
置する。
【００４２】
本明細書に記述し、以下でより十分に説明するように、ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲ
Ｌ２による活性化の防止（例えば、最も一般的には、ＰＶＲＩＧとＰＶＬＲ２との相互作
用を妨害することによって）との両方を行う抗ＰＶＲＩＧ抗体（抗原結合断片を含む）は
、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞活性化を増強するために使用され、また癌及び病原体感染
等の疾患の治療に使用される。
【００４３】
ＩＩＩ．抗体
したがって、本発明は抗ＰＶＲＩＧ抗体を提供する。ポリオウイルス受容体関連免疫グ
ロブリンドメイン含有タンパク質、Ｑ６ＤＫＩ７またはＣ７ｏｒｆ１５とも称されるＰＶ
ＲＩＧは、図２５に示すＲｅｆＳｅｑ受託識別子ＮＰ＿０７６９７５に示されるアミノ酸
及び核酸配列に関係する。本発明の抗体は、以下でより十分に概説するように、ＰＶＲＩ
Ｇ細胞外ドメインに特異的である。
【００４４】
以下で考察するように、「抗体」という用語が一般に使用される。本発明において使用
を見出す抗体は、以下に記載の、従来の抗体、ならびに抗体誘導体、断片、及び模倣体を
含む、本明細書に記載のいくつかの形式をとることができる。一般に、「抗体」という用
語は、以下でより十分に説明するように、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む任意
のポリペプチドを含む。抗体は、本明細書に記載のポリクローナル、モノクローナル、異
種、同種、同系、またはそれらの修飾形態であってもよく、モノクローナル抗体が多くの
実施形態において特別に使用を見出す。一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＰＶＲＩ
Ｇ分子に特異的または実質的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノク
ローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の特定のエピトー
プと免疫反応することができる１種類のみの抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指
し、一方「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相
互作用することができる複数の種類の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。モ
ノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一の
結合親和性を示す。
【００４５】
従来の完全長抗体構造単位は、典型的には、四量体で構成される。各四量体は、典型的
には、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には、
約２５ｋＤａの分子量）と、１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量
）を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖としてクラス分けされる。本発明は
、ＩｇＧクラスを対象とし、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含
むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。このため、「アイソタイプ
」は、本明細書で使用される場合、それらの定常領域の化学及び抗原特性によって定義さ
れる免疫グロブリンサブクラスのいずれかを意味する。本明細書では「ＣＰＡ」と称する
例示的な抗体は図３８に示すようにＩｇＧ１重定常領域に基づくが、本発明の抗ＰＶＲＩ
Ｇ抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列、またはこれらの組み合わせを使用す
るものを含む。例えば、当該技術分野で既知であるように、異なるＩｇＧ  アイソタイプ
は、望ましい場合もそうでない場合もある異なるエフェクター機能を有する。したがって
、本発明のＣＰＡ抗体は、ＩｇＧ１定常ドメインを、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ
４定常ドメインと交換することもでき（図６６に図示）、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４が、いく
つかの状況において、例えば製造の容易性のために、特別な使用を見出し、あるいは低減
したエフェクター機能が所望の場合には、一部の状況において後者が所望される。
【００４６】
ＣＨＡ表記の列挙した抗体について、これらはハイブリドーマ（「Ｈ」表記）において
生成したマウス抗体であるため、一般に、これらは、概してフレームワーク領域（重可変
領域及び軽可変領域の各々についてＦ１〜Ｆ４）において当該技術分野で既知であるよう
にヒト化した後、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常重及び軽ドメ
インにグラフティングする（図６６に図示）。ここでも、以下でより十分に説明するよう
に、ＩｇＧ４が特別な使用を見出す。
【００４７】
各鎖のアミノ末端部分は、「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」として当該技術分野及
び本明細書では一般に称される、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ
酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖及び軽鎖のＶドメインの各々について３つ
のループが集約されて、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（本
明細書では「ＣＤＲ」と称される）を指し、これにおいて、アミノ酸配列における変形が
最も顕著である。「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが抗体間で配列において
大きく異なることを指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。その代わり、Ｖ
領域は、「超可変領域」と称される極可変性のより短い領域によって分離される１５〜３
０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変のストレッチで構成
される。
【００４８】
各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−Ｃ
ＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で配列された３つの超可変領域（「相補性決定
領域」、「ＣＤＲ」）及び４つのＦＲで構成される。
【００４９】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤ
Ｒ１；「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３
）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖
を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸
残基を含み（場合によっては、付番は、当業者には理解されるであろう通り、わずかにシ
フトする；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  
ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５  ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈ
ｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））かつ／または超可変ループを形成
する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（
ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３
２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を含む
（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０
１−９１７）。本発明の特異的ＣＤＲは、以下に記載され、また図４０に示される。
【００５０】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。
Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程
度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、そ
のリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭ
ＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５  ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照さ
れたい）。
【００５１】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖におけるいくつかの免疫グロブリンドメ
インがいくつかある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確に異なる
三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジ
ドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の文脈におい
て、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの文脈
における「ＣＨ」ドメイン  は以下の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔの通りＥＵ
インデックスに従う１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵイ
ンデックスに従う２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵイン
デックスに従う３４１〜４４７位を指す。
【００５２】
したがって、本発明は、本明細書で概説するように使用される可変重ドメイン、可変軽
ドメイン、重定常ドメイン、軽定常ドメイン、及びＦｃドメインを提供する。「可変領域
」は、本明細書で使用される場合、実質的にＶκまたはＶλのいずれかでコードされる１
つ以上のＩｇドメイン、ならびに／または、それぞれ、カッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グ
ロブリン遺伝子座を構成するＶＨ遺伝子を含む、免疫グロブリンの領域を意味する。した
がって、可変重ドメインはｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈ
ＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含み、可変軽ドメインはｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１
−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。本明細書
における「重定常領域」は、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。「
Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書で使用される場合、第１
の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域、及び一部の場合にはヒンジ部
分を含むポリペプチドを意味する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最
後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域
免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。Ｉ
ｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧについては、Ｆｃドメイ
ンは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）、及びＣγ１（Ｃ
γ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間のより下のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり
得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６またはＰ
２３０を含むと定義され、これにおいて、付番はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに
従う。一部の実施形態では、以下でより十分に説明するように、例えば、１つ以上のＦｃ
γＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を改変するためのアミノ酸修飾がＦｃ領域に行
われる。
【００５３】
このため、「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ
ドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それらを
含むアミノ酸修飾に従って定義される。このため、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは
、親Ｆｃ  ポリペプチドに対する４３４位で置換セリンを有するＦｃ変異体であり、ここ
での付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃ  ポリ
ペプチドに対する置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴア
ミノ酸の素性は特定されていない場合があり、その場合、前述の変異体は４２８Ｌ／４３
４Ｓと称される。置換が提供される順序は任意であり、つまり、例えば、４２８Ｌ／４３
４ＳはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同じＦｃ変異体である（以降同様）ことに留意されたい
。抗体に関して本発明で考察する全ての位置について、別途記述のない限り、アミノ酸位
置付番はＥＵインデックスに従う。
【００５４】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及
びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離している
この領域、または完全長抗体、抗体断片、もしくはＦａｂ融合タンパク質との関連でのこ
の領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域
」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理
解されるであろう通り、それらは、一般に、２つの鎖で構成されている。
【００５５】
本明細書全体を通して、ＩＭＴＧ付番システムまたはＫａｂａｔ付番システムのいずれ
かは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖
可変領域の残基１〜１１３）を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ
．（上記参照）（１９９１））。Ｋａｂａｔで見られるようなＥＵ付番は、一般に、定常
ドメイン及び／またはＦｃドメインに使用される。
【００５６】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成
に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内
の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側
鎖等の分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。
単一抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。
【００５７】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ば
れる）及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドに
よって効果的に遮断されるアミノ酸残基（言い換えれば、このアミノ酸残基は、特異的抗
原結合ペプチドのフットプリント内にある）を含み得る。
【００５８】
エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、
直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産
生される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって産生され
たものである。立体配座エピトープ及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で後
者ではなく前者への結合が失われるという点で区別され得る。
【００５９】
エピトープは、典型的には、特有の空間立体配座内に、少なくとも３個、より一般的に
は、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗
体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を
示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。特異的ビニングについては、以下に記載
される。
【００６０】
抗体の「抗原結合部分」（「抗原結合断片」、「抗体断片」、及び「抗体誘導体」とも
互換的に使用される）も「抗体」の定義内に含まれる。つまり、本発明の目的のために、
本発明の抗体は、それがＰＶＲＩＧ抗原に結合する最低限の機能要件を有する。当業者に
は理解されるであろう通り、抗原に結合する能力を保持するにも関わらず、（ｉ）ＶＬ、
ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメイン
からなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（２つの連結されたＦａｂ断片を含む
二価断片）、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＶＨドメイン及びＶＬドメインが
ペプチドリンカーによって連結され、これにより、これらの２つのドメインが会合して抗
原結合部位を形成することが可能になる）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３（参照により全
体が組み込まれる））、（ｉｖ）「ダイアボディ」または「トリボディ」（遺伝子融合に
よって構築される多価または多特異性断片）（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０
００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９、ＷＯ９４／１３８０
４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８（参照により全体が組み込まれる））、（ｖ
）「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」（「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と称される
ことがあり、齧歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示されるもの）、テンジクザメ
、及びラクダ科Ｖ−ＨＨ  ｄＡｂ等の他の種由来の単一抗体可変ドメインを含む）、（ｖ
ｉ）ＳＭＩＰ（小分子免疫医薬品）、キャメルボディ、ナノボディ、及びＩｇＮＡＲを含
むが、これらに限定されない、代替構造も有する多数の抗原断片及び誘導体が存在する。
【００６１】
なお更に、抗体またはその抗原結合部分（抗原結合断片、抗体断片、抗体部分）は、そ
の抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有会合または非
共有会合によって形成される大きい免疫接着分子（「融合タンパク質」と称されることも
ある）の一部であり得る。免疫接着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのス
トレプトアビジンコア領域の使用、ならびに二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製する
ためのシステイン残基、マーカーペプチド、及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用を含む
。抗体部分、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、それぞれ、全抗体のパパイン消
化またはペプシン消化等の従来の技法を使用して全抗体から調製され得る。更に、抗体、
抗体部分、及び免疫接着分子は、本明細書に記載の標準の組み換えＤＮＡ技法を使用して
得ることができる。
【００６２】
概して、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、組み換えである。本明細書で使用される「組み
換え」とは、広範に、産物、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクター
に関して、細胞、核酸、タンパク質、もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質
の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、または
その細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。故に、例えば、組み換え細
胞は、その細胞の天然（非組み換え）型には見られない遺伝子を発現するか、または別様
に異常に発現されるか、過小発現されるか、または全く発現されない天然遺伝子を発現す
る。
【００６３】
本明細書で使用される「組み換え抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発
現、作製、または単離された全ての抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対
してトランスジェニックもしくは導入染色体性である動物（例えば、マウス）、またはそ
れから調製されたハイブリドーマ（以下に更に記載される）から単離された抗体、（ｂ）
ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから
単離された抗体、（ｃ）組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗
体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴
う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含む。かかる組み
換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由
来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組み換えヒト
抗体が、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対するトランスジェニック動
物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け得るため、組み換え抗体のＶ
Ｈ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、かつそれに
関連する一方で、インビボではヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない場
合がある配列である。
【００６４】
Ａ．任意の抗体操作
本発明の抗体は、アミノ酸置換によってアミノ酸配列を改変するように修飾または操作
され得る。
【００６５】
「アミノ酸置換」または「置換」とは、本明細書では、親ポリペプチド配列内の特定の
位置のアミノ酸の異なるアミノ酸との置き換えを意味する。具体的には、一部の実施形態
では、置換は、その生物内またはいずれの生物内のいずれにも天然には存在しない、その
特定の位置では天然に存在しないアミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙ
とは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置き換えられる変異体ポリペプチド、この場
合、Ｆｃ変異体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ
酸は変化させない（例えば、（アルギニンをコードする）ＣＧＧを（依然としてアルギニ
ンをコードする）ＣＧＡと交換して、宿主生物の発現レベルを増加させる）ように操作さ
れたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新
たな遺伝子の作製にも関わらず、そのタンパク質が、それが開始した同じアミノ酸をその
特定の位置に有する場合、それは、アミノ酸置換ではない。
【００６６】
本明細書に論じられるように、アミノ酸置換は、ＰＶＲＩＧタンパク質に対するＣＤＲ
の親和性を改変し（以下により完全に概説されるよう、結合の増加及び低減の両方を含む
）、本抗体の追加の機能特性も改変するために行われ得る。例えば、本抗体は、Ｆｃ領域
内に修飾を含むように、典型的には、本抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期
、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／または抗原依存性細胞傷害性を改変するように操作
され得る。更に、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う抗体は、化学修飾される（例
えば、１つ以上の化学的部分が本抗体に結合し得る）か、またはそのグリコシル化を改変
するように修飾されて、この場合も同様に本抗体の１つ以上の機能特性を改変することが
できる。かかる実施形態については、以下に更に記載される。Ｆｃ領域内の残基の付数は
、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの付数である。
【００６７】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が改変さ
れる、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチについては、米国
特許第５，６７７，４２５号（Ｂｏｄｍｅｒら）に更に記載されている。ＣＨ１のヒンジ
領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするように
、または本抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。
【００６８】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、本抗体の生物学的半減期を減少させるよ
うに突然変異される。より具体的には、１つ以上のアミノ酸突然変異は、本抗体が天然Ｆ
ｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して正常な機能が損なわれたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｙｌタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ
３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチについては、米国特許第６，１６５，
７４５号（Ｗａｒｄら）に更に詳細に記載されている。
【００６９】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、一般に、ＦｃγＲ受容体への結合を改変するた
めに、Ｆｃ領域内で行われ得る。本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「Ｆｃγ
Ｒ」、または「ＦｃｇａｍｍａＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺
伝子によってコードされる任意の数のタンパク質ファミリーを意味する。ヒトにおいて、
このファミリーとしては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（アイソフォームＦｃγＲＩａ、Ｆｃ
γＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含む）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）（アイソフォームＦｃ
γＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１等）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−
１及びＦｃγＲＩＩｂ−２等）、及びＦｃγＲＩＩｃを含む）；ならびにＦｃγＲＩＩＩ
（ＣＤ１６）（アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８等）
及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−Ｎ
Ａ２等）を含む）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅ
ｔｔ  ８２：５７−６５（参照により全体が組み込まれる））、ならびに任意の発見され
ていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが
、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む
が、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲとしては、Ｆｃγ
ＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ−１（ＣＤ１６）、及び
ＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の発見されていないマウスＦｃγＲ
またはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００７０】
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために行われ得るいくつかの有用
なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る
。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（ＦｃγＲを発現する
非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引
き起こす細胞媒介性反応である抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらすことが
知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結
合の減少も有益であり得る。本発明において使用を見出すアミノ酸置換は、米国第１１／
１２４，６２０号（特に図４１）及び米国特許第６，７３７，０５６号（いずれも参照に
よりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に列記されるもの、具体的にはそ
れらに開示される変異体を含む。使用を見出す具体的な変異体としては、２３６Ａ、２３
９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２
８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３
９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２９９Ｔ、及び２９７Ｎが挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００７１】
加えて、本発明の抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。種々の
アプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号（Ｗａｒｄ）に記載
されるように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つ以上
が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加するために、本抗体は、米国特許第５
，８６９，０４６号及び同第６，１２１，０２２号（Ｐｒｅｓｔａら）に記載されるよう
に、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結
合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。血清半減期を増加さ
せるための更なる突然変異は、米国特許第８，８８３，９７３号、同第６，７３７，０５
６号、及び同第７，３７１，８２６号に開示されており、４２８Ｌ、４３４Ａ、４３４Ｓ
、及び４２８Ｌ／４３４Ｓを含む。
【００７２】
なお他の実施形態では、Ｆｃ領域は、本抗体のエフェクター機能を改変するように、少
なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによって改変される
。例えば、本抗体が、エフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗
体の抗原結合能力を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２
９７、３１８、３２０、及び３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ
酸残基に置き換えられ得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ
受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチについては、米国特許第５，６
２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号（いずれもＷｉｎｔｅｒら）に更に詳細に
記載されている。
【００７３】
別の例では、本抗体が改変されたＣ１ｑ結合及び／または低減もしくは消失された補体
依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２
から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このア
プローチについては、米国特許第６，１９４，５５１号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）に更に詳
細に記載されている。
【００７４】
別の例では、アミノ酸位置２３１及び２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変され、
それにより、補体を固定する抗体の能力が改変される。このアプローチについては、ＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ９４／２９３５１号（Ｂｏｄｍｅｒら）に更に記載されている。
【００７５】
更に別の例では、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２
、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２
、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３
、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２
、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３
、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２
、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７
、４３８、もしくは４３９の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細
胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する本抗体の能力を増加させ、かつ／またはＦｃγ受容体に
対する本抗体の親和性を増加させるように修飾される。このアプローチについては、ＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ）に更に記載されている。更に、Ｆｃγ
ＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位
がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，
Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０
４）．２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、及び３３９位での特異的突然変異が、
ＦｃｙＲＩＩＩへの結合を改善することが示されている。加えて、以下の組み合わせ突然
変異体：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、
及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａが、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示さ
れている。更に、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ等
の突然変異が、ＦｃＲｎへの結合を改善し、抗体の循環半減期を増加させる（Ｃｈａｎ  
ＣＡ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ  ＰＪ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
１０：３０１−３１６を参照されたい）。
【００７６】
なお別の実施形態では、本抗体は、インビボでのＦａｂアーム交換を抑止するように修
飾され得る。具体的には、このプロセスは、機能的に一価である二重特異性抗体を効果的
にもたらす他のＩｇＧ４抗体間でのＩｇＧ４半分子（重鎖１つ＋軽鎖１つ）の交換を伴う
。重鎖のヒンジ領域及び定常ドメインに対する突然変異がこの交換を抑止する（Ａａｌｂ
ｅｒｓｅ，ＲＣ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５
：９−１９を参照されたい）。
【００７７】
なお別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化抗
体が作製され得る（即ち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば
、抗原に対する本抗体の親和性を増加させるか、またはＡＤＣＣ等のエフェクター機能を
低減するように改変され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上の
グリコシル化部位、例えば、Ｎ２９７を改変することによって達成され得る。例えば、１
つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化領域の排除をもたらし、それにより、その
部位でのグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸置換が行われ得る。
【００７８】
加えてまたはあるいは、改変された種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシ
ル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体が作
製され得る。かかるグリコシル化パターンの改変が抗体のＡＤＣＣ能力を増加させると実
証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、本抗体をグリコシル化機構が改変された
宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞に
ついては、当該技術分野で説明されており、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組
み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞と
して使用され得る。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を
欠き、これにより、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体が
、それらの炭水化物上のフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９  Ｆ
ＵＴ８細胞株は、２つの置換ベクターの使用によるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内でのＦＵＴ８
遺伝子の標的破壊によって作製される（米国特許公開第２００４０１１０７０４号（Ｙａ
ｍａｎｅら）及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照されたい）。別の例として、ＥＰ１
，１７６，１９５（Ｈａｎａｉら）は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的
に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、かかる細胞株で発現
された抗体は、α１，６結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を
呈する。Ｈａｎａｉらは、フコースを、本抗体のＦｃ領域に結合するか、または酵素活性
を有しないＮ−アセチルグルコサミンに付加するための低酵素活性を有する細胞株、例え
ば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）についても記載して
いる。ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号（Ｐｒｅｓｔａ）は、フコースをＡｓｎ（
２９７）結合炭水化物に結合させる能力が低減し、その宿主細胞で発現された抗体の低フ
コシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について記載している（Ｓｈｉ
ｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７
３３−２６７４０）。ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号（Ｕｍａｎａら）は、操作さ
れた細胞株で発現された抗体が、本抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａ
ｃ構造の増加を呈するように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば
、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ
））を発現させるように操作された細胞株について記載している（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａ
ｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。あるいは、本抗体
のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断され得る。例えば、フコシダーゼα
−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ
．ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【００７９】
本発明によって企図される本明細書における抗体の別の修飾は、例えば、半減期を高め
るための、他の水溶性部分、典型的には、ポリマーのペグ化または付加である。抗体は、
例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化され得る。抗
体をペグ化するために、抗体またはその断片は、典型的には、１つ以上のＰＥＧ群がその
抗体または抗体断片に結合する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、
ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させられる。好ましくは、ペグ化
は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはア
ルキル化反応によって行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール
」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレ
ングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミド等の他のタンパク質を誘導体化
するために使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含するよう意図されている
。ある特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク
質をペグ化するための方法が当該技術分野で既知であり、本発明の少なくとも一部の実施
形態に従う抗体に適用され得る。例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６（Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａら）及びＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ｉｓｈｉｋａｗａら）を参照されたい。
【００８０】
ＦｃγＲ及び／もしくはＦｃＲｎに対する結合親和性を改変し、かつ／またはインビボ
血清半減期を増加させるために行われる置換に加えて、以下に更に詳細に記載されるよう
に、追加の抗体修飾が行われ得る。
【００８１】
いくつかの場合には、親和性突然変異が行われる。ＣＤＲでのアミノ酸修飾は、「親和
性突然変異」と称されることがある。「親和性成熟」抗体は、１つ以上のＣＤＲに１つ以
上の改変（複数可）を有するものであり、それらの改変（複数可）を有しない親抗体と比
較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。いくつかの場合には、まれではある
が、その抗原に対する抗体の親和性を低減することが望ましくあり得るが、これは、一般
に、好ましくない。
【００８２】
一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、本発明のＶＩＳＧ１抗体のＣＤＲの
うちの１つ以上で行われる。一般に、１個のみ、または２個もしくは３個のアミノ酸がい
ずれの単一ＣＤＲで置換され、一般に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１
０個より多くの変化が一組のＣＤＲ内に加えられない。しかしながら、任意のＣＤＲでの
置換なし、１つの置換、２つの置換、または３つの置換の任意の組み合わせが、独立して
、任意に、任意の他の置換と組み合わせられ得ることを理解されたい。
【００８３】
親和性成熟は、「親」抗体と比較してＰＶＲＩＧ抗原に対する本抗体の結合親和性を少
なくとも約１０％〜５０−１００−１５０％以上、または１〜５倍増加させるために行わ
れ得る。好ましい親和性成熟抗体は、ＰＶＲＩＧ抗原に対するナノモル親和性または更に
はピコモル親和性を有する。親和性成熟抗体は、既知の手技によって産生される。例えば
、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟につ
いて記載しているＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  
１０：７７９−７８３を参照されたい。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダ
ム突然変異誘発については、例えば、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３、Ｓｈｉｅｒ  ｅｔ  ａ
ｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１
９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａ
ｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９、及びＨａｗｋｉｎ
ｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載され
ている。
【００８４】
あるいは、アミノ酸修飾は、本発明の抗体のＣＤＲのうちの１つ以上で行われ得、例え
ば、抗原に対する抗体の親和性を著しく改変しない「サイレント」である。これらは、（
本発明の抗体をコードする核酸に対して行われ得る）発現の最適化を含むいくつかの理由
で行われ得る。
【００８５】
したがって、変異ＣＤＲ及び抗体が本発明のＣＤＲ及び抗体の定義に含まれ、つまり、
本発明の抗体は、本発明の列挙される抗体のＣＤＲのうちの１つ以上にアミノ酸修飾を含
み得る。加えて、以下に概説されるように、アミノ酸修飾は、独立して、任意に、フレー
ムワーク及び定常領域を含むＣＤＲ外の任意の領域でも行われ得る。
【００８６】
ＩＶ．ＰＶＲＩＧ抗体
本発明は抗ＰＶＲＩＧ抗体を提供する。（便宜上、「抗ＰＶＲＩＧ抗体」及び「ＰＶＲ
ＩＧ抗体」は互換的に使用される）。本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、図２５に図示するよ
うに、ヒトＰＶＲＩＧ、及び好ましくはヒトＶＩＳＧ１のＥＣＤと特異的に結合する。
【００８７】
ＰＶＲＩＧまたはＰＶＲＩＧエピトープへの特異的結合は、例えば、少なくとも約１０
−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、
少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ
、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上のＫＤを有する抗体によっ
て呈され得、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に
特異的に結合する抗体は、ＰＶＲＩＧ抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して
、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、
またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【００８８】
しかしながら、実施例に示すように、ＮＫ及びＴ細胞の表面上で発現されるＰＶＲＩＧ
への最適な結合のためには、本抗体は、好ましくは５０ｎＭ未満、及び最も好ましくは１
ｎＭ未満のＫＤを有し、０．１ｎＭ未満ならびに１ｐＭ及び０．１ｐＭ未満が本発明の方
法において使用を見出す。
【００８９】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、ＰＶＲＩＧ抗原または
エピトープについてのＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なく
とも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍
、またはそれを超えて大きい抗体によって呈され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗
原相互作用の会合速度を指す。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、
１０ｎＭ以下、もしくは１ｎＭ以下（つまり、より高い結合親和性）、または１ｐＭ以下
のＫＤでヒトＰＶＲＩＧと結合し、ＫＤは、既知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（
ＳＰＲ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＫＩＮＥＸＡ、最も典型的に
は２５℃または３７℃でのＳＰＲによって決定される。
【００９１】
Ａ．特異的抗ＰＶＲＩＧ抗体
本発明は、６つのＣＤＲのいくつかの特異的な列挙するセットを含む完全長抗体を含む
抗原結合ドメインを提供する。
【００９２】
以下のように標識される本明細書に記載の抗体。本抗体は、参照番号、例えば「ＣＰＡ
．７．０１３」を有する。これは、例えば、図３８及び図３９に図示するように、可変重
鎖及び可変軽鎖の組み合わせを表す。「ＣＰＡ．７．０１３．ＶＨ」はＣＰＡ．７．０１
３の可変重部分を指し、一方で「ＣＰＡ．７．０１３．ＶＬ」は可変軽鎖である。「ＣＰ
Ａ．７．０１３．ｖｈＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．７．０１３．ｖｈＣＤＲ２」、「ＣＰＡ．
７．０１３．ｖｈＣＤＲ３」、「ＣＰＡ．７．０１３．ｖｌＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．７．
０１３．ｖｌＣＤＲ２」、及び「ＣＰＡ．７．０１３．ｖｌＣＤＲ３」は、ＣＤＲが示さ
れるを指す。「ＣＰＡ．７．０１３．ＨＣ」は、この分子の重鎖全体（例えば、可変及び
定常ドメイン）を指し、「ＣＰＡ．７．０１３．ＬＣ」は、同じ分子の軽軽鎖全体（例え
ば、可変及び定常ドメイン）を指す。「ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ１」は、ヒトＩｇＧ１の
定常ドメイン（故にＨ１；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列は図６６に
示す）を含む可変重及び軽ドメインを含む完全長抗体を指す。したがって、「ＣＰＡ．７
．０１３．Ｈ２」は、ヒトＩｇＧ２に連結したＣＰＡ．７．０１３可変ドメインであり得
る。「ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ３」は、ヒトＩｇＧ３に連結したＣＰＡ．７．０１３  可
変ドメインであり得、「ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ４」は、ヒトＩｇＧ４に連結したＣＰＡ
．７．０１３可変ドメインであり得る。
【００９３】
本発明は、可変重及び軽ドメイン、ならびに完全長重及び軽鎖を更に提供する。
【００９４】
多くの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト（ファージに由来する）であり、ＰＶＲＩ
Ｇ及びＰＶＬＲ２の結合を妨害する。図５２に示すように、受容体−リガンド相互作用の
結合と妨害との両方を行うＣＰＡ抗体は以下の通りであり、これらの構成要素も概説され
る。
【００９５】
ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００１．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００１．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００１．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００１．ＬＣ及びＣＰＡ．７．００１．Ｈ１、ＣＰＡ
．７．００１．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００１．Ｈ３、ＣＰＡ．７．００１．Ｈ４；ＣＰＡ．
７．００１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００１．
ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００１．ｖｌＣＤＲ２
、及びＣＰＡ．７．００１．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００３．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００３．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００３．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００３．ＬＣ、ＣＰＡ．７．００３．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．００３．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００３．Ｈ３、ＣＰＡ．７．００３．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．００３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００３．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００３．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．００３．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００４．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００４．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００４．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００４．ＬＣ、ＣＰＡ．７．００４．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．００４．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００４．Ｈ３  ＣＰＡ．７．００４．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．００４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００４．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００４．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．００４．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００６．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００６．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００６．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００６．ＬＣ、ＣＰＡ．７．００６．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．００６．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００６．Ｈ３  ＣＰＡ．７．００６．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．００６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００６．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００６．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．００６．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００８．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００８．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００８．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００８．ＬＣ、ＣＰＡ．７．００８．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．００８．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００８．Ｈ３  ＣＰＡ．７．００８．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．００８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００８．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００８．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．００８．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．００９．ＶＨ、ＣＰＡ．７．００９．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．００９．ＨＣ、ＣＰＡ．７．００９．ＬＣ、ＣＰＡ．７．００９．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．００９．Ｈ２、ＣＰＡ．７．００９．Ｈ３  ＣＰＡ．７．００９．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．００９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００９．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．００９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００９．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．００９．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１０．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１０．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１０．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１０．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１０．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１０．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１０．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１０．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１０．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１０．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１０．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１１．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１１．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１１．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１１．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１１．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１１．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１１．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１１．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１１．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１１．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１１．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１２．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１２．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１２．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１２．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１２．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１２．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１２．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１２．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１２．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１２．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１２．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１３．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１３．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１３．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１３．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１３．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１３．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１３．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１３．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１３．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１４．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１４．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１４．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１４．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１４．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１４．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１４．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１４．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１４．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１４．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１４．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１５．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１５．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１５．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１５．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１５．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１５．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１５．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１５．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１５．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１５．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１５．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１７．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１７．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１７．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１７．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１７Ｈ１、ＣＰＡ．７
．０１７．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１７．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１７．Ｈ４；ＣＰＡ．７．
０１７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０００１７１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１７
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１８．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１８．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１８．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１８．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１８．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１８．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１８．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１８．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１７．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１７．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０１９．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１９．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１９．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１９．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１９．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１９．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１９．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０１９．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０１９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１９．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１９．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０１９．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２１．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２１．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２１．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２１．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２１．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２１．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２１．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０２１．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０２１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０２１．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２１．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０２１．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２２．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２２．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２２．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２２．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２２．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２２．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２２．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０２２．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０２２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．００２２０
１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２２．ｖｌＣＤ
Ｒ２、及びＣＰＡ．７．０２２．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２３．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２３．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２３．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２３．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２３．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２３．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２３．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０２３．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０２３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０２３．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２３．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０２３．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０２４．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２４．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２４．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２４．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２４．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２４．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２４．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０２４．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０２４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０２４．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２４．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０２４．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３３．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０３３．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０３３．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０３３．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０３３．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０３３．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０３３．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０３３．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０３３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０３３．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０３３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３３．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０３３．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３４．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０３４．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０３４．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０３４．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０３４．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０３４．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０３４．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０３４．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０３４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０３４．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０３４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３４．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０３４．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０３６．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０３６．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０３６．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０３６．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０３６．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０３６．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０３６．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０３６．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０３６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０３６．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０３６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３６．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０３６．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４０．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４０．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４０．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４０．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４０．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４０．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４０．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０４０．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０４０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４０
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４０．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０４０．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４６．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４６．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４６．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４６．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４６．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４６．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４６．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０４６．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０４６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４６．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４６．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０４６．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４７．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４７．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４７．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４７．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４７．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４７．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４７．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０４７．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０４７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４７．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．００４７０１．ｖｌＣＤ
Ｒ２、及びＣＰＡ．７．０４７．ｖｌＣＤＲ３；
ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０４９．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４９．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４９．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４９．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４９．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４９．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４９．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０４９．Ｈ４；ＣＰＡ．７
．０４９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４９．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４９．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０４９．ｖｌＣＤＲ３；ならびに
ＣＰＡ．７．０５０、ＣＰＡ．７．０５０．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０５０．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０５０．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０５０．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０５０．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０５０．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０５０．Ｈ３  ＣＰＡ．７．０５０．Ｈ４、ＣＰＡ．７
．０５０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０５０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０５０．ｖ
ｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０５０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０５０．ｖｌＣＤＲ２、
及びＣＰＡ．７．０５０．ｖｌＣＤＲ３。
【００９６】
加えて、図５２に示すように、ＰＶＲＩＧに結合したがＰＶＲＩＧ及びＰＶＬＲ２の相
互作用を妨害しなかった、いくつかの本明細書で生成されるＣＰＡ抗体が存在し、その配
列のうちの８個のみが図４０で本明細書に含まれ、その構成要素は、
ＣＰＡ．７．０２８、ＣＰＡ．７．０２８．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２８．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２８．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２８．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２８．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２８．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２８．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０２８．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０２８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０２８
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２８．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０２８．ｖｌＣＤＲ３。
【００９７】
ＣＰＡ．７．０３０、ＣＰＡ．７．０３０．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０３０．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０３０．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０３０．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０３０．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０３０．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０３０．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０３０．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０３０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０３０
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０３０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３０．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０３０．ｖｌＣＤＲ３。
【００９８】
ＣＰＡ．７．０４１、ＣＰＡ．７．０４１．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４１．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４１．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４１．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４１．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４１．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４１．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０４１．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０４１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４１
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４１．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０４１．ｖｌＣＤＲ３。
【００９９】
ＣＰＡ．７．０１６、ＣＰＡ．７．０１６．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０１６．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０１６．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０１６．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０１６．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０１６．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０１６．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０１６．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０１６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０１６
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０１６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０１６．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０１６．ｖｌＣＤＲ３。
【０１００】
ＣＰＡ．７．０２０、ＣＰＡ．７．０２０．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０２０．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０２０．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０２０．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０２０．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０２０．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０２０．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０２０．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０２０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０２０
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０２０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０２０．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０２０．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０１】
ＣＰＡ．７．０３８、ＣＰＡ．７．０３８．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０３８．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０３８．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０３８．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０３８．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０３８．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０３８．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０３８．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０３８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０３８
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０３８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０３８．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０３８．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０２】
ＣＰＡ．７．０４４、ＣＰＡ．７．０４４．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４４．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４４．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４４．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４４．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４４．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４４．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０４４．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０４４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４４
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４４．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０４４．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０３】
ＣＰＡ．７．０４５、ＣＰＡ．７．０４５．ＶＨ、ＣＰＡ．７．０４５．ＶＬ、ＣＰＡ
．７．０４５．ＨＣ、ＣＰＡ．７．０４５．ＬＣ、ＣＰＡ．７．０４５．Ｈ１、ＣＰＡ．
７．０４５．Ｈ２、ＣＰＡ．７．０４５．Ｈ３、及びＣＰＡ．７．０４５．Ｈ４；ＣＰＡ
．７．０４５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．７．０４５
．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．７．０４５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．７．０４５．ｖｌＣＤＲ
２、及びＣＰＡ．７．０４５．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０４】
本明細書で考察されるように、本発明は、上で概説されるように、ＣＤＲにおける変異
体を含む、上記の構成要素の変異体を更に提供する。加えて、可変重鎖は、本明細書の「
ＶＨ」配列と、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得、かつ／あ
るいは、Ｆｃ変異体を使用する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個また
はそれよりも多くのアミノ酸変化を含み得る。本明細書の「ＶＬ」配列と、８０％、９０
％、９５％、９８％、または９９％同一であり得、かつ／あるいは、Ｆｃ変異体を使用す
る場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸
変化を含み得る可変軽鎖が提供される。同様に、本明細書の「ＨＣ」及び「ＬＣ」配列と
、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、かつ／あるいは、Ｆｃ変
異体を使用する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多
くのアミノ酸変化を含む重鎖重及び軽鎖が提供される。
【０１０５】
更に、本発明は、ハイブリドーマから生成されたマウス抗体である、いくつかのＣＨＡ
抗体を提供する。当該技術分野で周知のように、６個のＣＤＲは、ヒトフレームワーク可
変重及び可変軽領域に入れられる場合、または可変重及び軽ドメインがヒト化される場合
に有用である。
【０１０６】
したがって、本発明は、ＣＤＲの以下のＣＨＡセットを含む抗体、通常は完全長または
ｓｃＦｖドメインを提供し、その配列は図４１に示される：
ＣＨＡ．７．５０２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５０２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５０２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０２．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５０２．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０７】
ＣＨＡ．７．５０３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５０３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５０３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０３．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５０３．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０８】
ＣＨＡ．７．５０６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５０６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５０６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０６．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５０６．ｖｌＣＤＲ３。
【０１０９】
ＣＨＡ．７．５０８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５０８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５０８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５０８．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５０８．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１０】
ＣＨＡ．７．５１０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５１０．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５１０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１０．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５１０．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１１】
ＣＨＡ．７．５１２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５１２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５１２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１２．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５１２．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１２】
ＣＨＡ．７．５１４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５１４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５１４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１４．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５１４．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１３】
ＣＨＡ．７．５１６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５１６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５１６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１６．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５１６．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１４】
ＣＨＡ．７．５１８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５１８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５１８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５１８．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５１８．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１５】
ＣＨＡ．７．５２０＿１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２０＿１．ｖｈＣＤＲ２、Ｃ
ＨＡ．７．５２０＿１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２０＿１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ
．７．５２０＿１．ｖｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２０＿１．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１６】
ＣＨＡ．７．５２０＿２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２０＿２．ｖｈＣＤＲ２、Ｃ
ＨＡ．７．５２０＿２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２０＿２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ
．７．５２０＿２．ｖｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２０＿２．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１７】
ＣＨＡ．７．５２２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５２２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２２．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２２．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１８】
ＣＨＡ．７．５２４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５２４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２４．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２４．ｖｌＣＤＲ３。
【０１１９】
ＣＨＡ．７．５２６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５２６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２６．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２６．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２０】
ＣＨＡ．７．５２７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５２７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２７．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２７．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２１】
ＣＨＡ．７．５２８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５２８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５２８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５２８．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５２８．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２２】
ＣＨＡ．７．５３０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５３０．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３０．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３０．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２３】
ＣＨＡ．７．５３４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５３４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３４．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３４．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２４】
ＣＨＡ．７．５３５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５３５．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３５．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３５．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２５】
ＣＨＡ．７．５３７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５３７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３７．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３７．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２６】
ＣＨＡ．７．５３８＿１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３８＿１．ｖｈＣＤＲ２、Ｃ
ＨＡ．７．５３８＿１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３８＿１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ
．７．５３８＿１．ｖｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３８＿１．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２７】
ＣＨＡ．７．５３８＿２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５３８＿２．ｖｈＣＤＲ２、Ｃ
ＨＡ．７．５３８＿２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５３８＿２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ
．７．５３８＿２．ｖｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５３８＿２．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２８】
ＣＨＡ．７．５４３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４３．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４３．ｖｌＣＤＲ３。
【０１２９】
ＣＨＡ．７．５４４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４４．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４４．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３０】
ＣＨＡ．７．５４５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４５．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４５．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４５．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３１】
ＣＨＡ．７．５４６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４６．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４６．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３２】
ＣＨＡ．７．５４７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４７．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４７．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３３】
ＣＨＡ．７．５４８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４８．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４８．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３４】
ＣＨＡ．７．５４９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５４９．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５４９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５４９．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５４９．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３５】
ＣＨＡ．７．５５０．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５５０．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．７
．５５０．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．７．５５０．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．７．５５０．ｖ
ｌＣＤＲ２、及びＣＨＡ．７．５５０．ｖｌＣＤＲ３。
【０１３６】
上記のように、ＣＤＲのこれらのセットはまた、上記のようなアミノ酸変異体であって
もよい。
【０１３７】
加えて、可変重鎖及び可変軽鎖のフレームワーク領域は、当該技術分野で既知であるよ
うにヒト化することができ（時折、変異体が必要に応じてＣＤＲにおいて生成される）、
このため、図４１のＶＨ及びＶＬ鎖のヒト化変異体を生成することができる。更に、続い
てヒト化可変重及び軽ドメインを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からの
定常領域などのヒト定常領域と融合させることができる。
【０１３８】
特に、当該技術分野で既知であるように、マウスＶＨ及びＶＬ鎖は、例えば、ヒト化方
法について全体が参照により本明細書に組み込まれるＹｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：Ｗ３４−Ｗ４０（２０１３）において概説されるようにＮ
ＣＢＩウェブサイトのＩｇＢＬＡＳＴプログラムを使用して、当該技術分野で既知である
ようにヒト化することができる。ＩｇＢＬＡＳＴは、マウスＶＨ及び／またはＶＬ配列を
採取し、それを既知のヒト生殖細胞系配列のライブラリと比較する。本明細書に示される
ように、本明細書で生成されるヒト化配列について、使用したデータベースは、ＩＭＧＴ
ヒトＶＨ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、２７３生殖細胞系配列）及びＩＭＧＴヒトＶＬカッパ遺伝
子（Ｆ＋ＯＲＦ、７４生殖細胞系配列）であった。例となる５つのＣＨＡ配列を選択した
：ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、ＣＨＡ．７．５
３８＿２、及びＣＨＡ．７．５２４（ＶＨ及びＶＬ配列については図４１を参照）。この
ヒト化の実施形態のために、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６（対立遺伝子１）を、アク
セプター配列及びヒト重鎖ＩＧＨＪ４（対立遺伝子１）接合領域（Ｊ遺伝子）として５つ
全てについて選択した。４つ（ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．
５３８＿１、及びＣＨＡ．７．５３８＿２）のうちの３つについては、ヒト生殖細胞系Ｉ
ＧＫＶ１−３９（対立遺伝子１）をアクセプター配列として選択し、ヒト軽鎖ＩＧＫＪ２
（対立遺伝子１）（Ｊ遺伝子）を選択した。Ｊ遺伝子は、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇのｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム、ＩＭＧＴ（登
録商標）にてコンパイルされたヒト接合領域配列から選択した。ＣＤＲを、ＡｂＭ定義（
ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照）に従って定義した。図８８は
、ヒト化配列、ならびにＰＶＲＩＧへの結合を最適化するためのいくつかの可能性のある
変化を図示する。
【０１３９】
ＣＨＡ抗体の特異的ヒト化抗体は、図８８、図８９、及び図９０に示すものを含む。当
業者には理解されるであろう通り、各ヒト化可変重（ヒト化重、ＨＨ）及び可変軽（ヒト
化軽、ＨＬ）配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の定常領域と組
み合わせることができる。つまり、ＣＨＡ．７．５１８．ＨＨ１は第１のヒト化可変重鎖
であり、ＣＨＡ．７．５１８．ＨＨ１．１は、ＩｇＧ１定常領域を伴う「ＨＨ１」ヒト化
配列を含む完全長重鎖である（ＣＨＡ．７．５１８．ＨＨ１．２はＩｇＧ２を伴うＣＨＡ
．７．５１８．ＨＨ１である等）。
【０１４０】
一部の実施形態では、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体のＶＨ及
びＶＬ配列が「ミックスアンドマッチ」（ｍｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ）されて
他の抗ＰＶＲＩＧ抗体を創出することができる抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む。かかる「ミック
スアンドマッチ」抗体のＰＶＲＩＧ結合は、上記の結合アッセイを使用して試験すること
ができる。例えば、ＥＬＩＳＡ）。一部の実施形態では、ＶＨ及びＶＬ鎖をミックスアン
ドマッチし、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列を構造的に類似したＶＨ配列で代置する
。同様に、一部の実施形態では、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列  を構造的に類似し
たＶＬ  配列で代置する。例えば、相同的抗体のＶＨ及びＶＬ配列は、ミックスアンドマ
ッチに特に適している。
【０１４１】
したがって、本発明の抗体は、（ａ）本明細書に列挙される配列、（ｂ）（ａ）で指定
したＣＤＲアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ
よりも多くのアミノ酸置換だけ異なる配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）で指定した配列と
の９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ
酸配列；（ｄ）本明細書に列挙されるアミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレ
オチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択され
るＣＤＲアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
加えて、本明細書に列挙するＰＶＲＩＧ抗体との同一性を共有する抗体がＰＶＲＩＧ抗
体の定義に含まれる。つまり、ある特定の実施形態では、本発明に従う抗ＰＶＲＩＧ抗体
は、それぞれ好ましい抗ＰＶＲＩＧ  免疫分子の単離された抗ＰＶＲＩＧアミノ酸配列と
相同であるアミノ酸配列を含む重及び軽鎖可変領域を含み、ここで、本抗体は、親抗ＰＶ
ＲＩＧ抗体の所望の機能特性を保持する。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配
列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数及び各ギャップの
長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（即ち、相同
性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間の同一性パ
ーセントの決定は、以下の非限定的な例において記載するように、数学アルゴリズムを使
用して達成することができる。
【０１４３】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０残基重量テーブル（ｗｅｉ
ｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャッ
プペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれてい
るＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，
４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて
、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ
２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ
量、及び１、２、３、４、５、または６の長さ量を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケ
ージ（市販されている）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及
びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリ
ズムを使用して決定することができる。
【０１４４】
加えてまたはあるいは、本発明のタンパク質配列を更に「クエリ配列」として使用して
、例えば関連配列を特定するために、公的なデータベースに対して検索を行うことができ
る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行う
ことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、
ワード長＝３で行って、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う抗体分子と相同である
アミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るため
に、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のように利
用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には
、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメー
タを使用することができる。
【０１４５】
一般に、ＰＶＲＩＧ抗体間の比較のための同一性パーセンテージは、少なくとも７５％
、少なくとも８０％、少なくとも９０％であり、少なくとも約９５、９６、９７、９８、
または９９％の同一性パーセントが好ましい。同一性パーセンテージは、全アミノ酸配列
、例えば重鎖もしくは軽鎖全体にかかるか、または鎖の一部にかかるものであり得る。例
えば、可変領域全体にかけて（例えば、同一性が可変領域にかけて９５または９８％同一
である場合）、または定常領域全体にかけて、またはＦｃドメインのみにかけて同一性を
共有するものが、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体の定義に含まれる。
【０１４６】
加えて、ＣＤＲは同一であるが、可変ドメイン（または重鎖もしくは軽鎖全体）におい
て変化を有し得る配列が含まれる。例えば、ＰＶＲＩＧ抗体には、ＣＤＲは図６３に示す
ものと同一であるが、可変領域にかけての同一性がより低い、例えば、９５または９８％
の同一性パーセントであり得るものが含まれる。
【０１４７】
Ｂ．結合について列挙される抗体と競合するＰＶＲＩＧ抗体
本発明は、列挙される抗体だけでなく、ＰＶＲＩＧ分子と特異的に結合するために列挙
される抗体（ＰＶＲＩＧと特異的に結合する本明細書に列挙されるＣＰＡ及びＣＨＡ数）
と競合する追加の抗体も提供する。実施例１１に示すように、本発明のＰＶＲＩＧ抗体は
、異なるエピトープビンに「ビン分別」される。４つの別個のビンを本明細書で概説する
；１）ＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００５、ＣＰＡ．７．０
０７、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０
１６、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２０、ＣＰＡ．７．０
２１、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０２８、ＣＰＡ．７．０３２、ＣＰＡ．７．０
３３、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０３７、ＣＰＡ．７．０３８、ＣＰＡ．７．０
４３、ＣＰＡ．７．０４６、及びＣＰＡ．７．０４１の全てが入るエピトープビン；２）
ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１４、
ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０３４、
ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４５、及びＣＰＡ．７．０４７の全てが入るエピト
ープビン；３）ビン１がＣＰＡ．７．０３９結合を妨害し、ビン２がリガンドをＣＰＡ．
７．０３９でサンドイッチするという点においてビン１とビン２との区別を定義するＣＰ
Ａ．７．０３９、ならびにＣＰＡ．７．０５０を有するビン４）。
【０１４８】
故に、本発明は、ビン１にある抗体、ビン２にある抗体、ビン３にある抗体、及び／ま
たはビン４にある抗体と結合について競合する抗ＰＶＲＩＧ抗体を提供する。
【０１４９】
列挙される抗体と競合する追加の抗体は、当該技術分野で既知であるように、また以下
で概して概説するように、生成される。競合的結合研究は、一般に、ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏ
ｒｅ（登録商標）結合アッセイ、ならびにＥＬＩＳＡ及び細胞系アッセイを使用して、当
該技術分野で既知であるように行うことができる。
【０１５０】
Ｃ．追加の抗体の生成
ヒトＰＶＲＩＧに対する追加の抗体は、実施例において概説するもの等の周知の方法を
使用して、当該技術分野で周知の通りに成すことができる。このため、追加の抗ＰＶＲＩ
Ｇ抗体は、マウスの免疫付与（例えば、Ａｌｄｅｖｒｏｎによって使用されるもの等のＤ
ＮＡ免疫付与を使用する場合がある）、その後の、抗体精製及び回収を伴うヒトＰＶＲＩ
Ｇタンパク質に対するスクリーニング及びハイブリドーマ生成等の従来の方法によって生
成することができる。
【０１５１】
Ｖ．核酸組成物
本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体をコードする核酸組成物、ならびに核酸及び核酸でトランス
フェクトした宿主細胞を含む発現ベクター、及び／または発現ベクター組成物も提供され
る。当業者によって理解されるであろう通り、本明細書に示すタンパク質配列は、遺伝暗
号の縮退に起因して、任意の数の可能性のある核酸配列によってコードされ得る。
【０１５２】
ＰＶＲＩＧ抗体をコードする核酸組成物は、抗体の形式に依存することになる。２つの
重鎖及び２つの軽鎖を含む従来の四量体抗体は、重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコード
する核酸という２つの異なる核酸によってコードされる。これらは、当該技術分野で既知
であるように、宿主細胞に形質転換した単一の発現ベクターまたは２つの発現ベクターの
中に入れることができ、ここでそれらが発現されて本発明の抗体を形成する。一部の実施
形態では、例えばｓｃＦｖ構築物を使用する場合、可変重鎖−リンカー−可変軽鎖をコー
ドする単一の核酸が通常使用され、これを宿主細胞への形質転換のために発現ベクターの
中に挿入し得る。核酸は、シグナル及び分泌配列、調節配列、プロモーター、複製起点、
選択遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない、適当な転写及び翻訳制御配列を含む
発現ベクターの中に入れることができる。
【０１５３】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組み換え抗体を発現させるための好ましい哺
乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥ
Ｋ２９３、及び当該技術分野で既知であるような他の細胞が含まれる。
【０１５４】
全細胞において、細胞溶解物において、または部分的に精製されているかもしくは実質
的に純粋な形態において存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバン
ディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周
知の他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、
他の細胞核酸またはタンパク質から精製されるときに、「単離される」または「実質的に
純粋にされる」。
【０１５５】
ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片を、可動性リ
ンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断
片に動作可能に連結させて、その結果、ＶＨ及びＶＬ配列が連続した一本鎖タンパク質と
して、ＶＬ及びＶＨ領域が可動性リンカーによって接合された状態で発現され得るように
する（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−
４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９
９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照）。
【０１５６】
ＶＩ．抗ＰＶＲＩＧ抗体の製剤化
前述の方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬
学的組成物に製剤化することができる。好適な担体には、治療用組成物と組み合わせたと
きに、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ一般に患者の免疫系と反応性ではな
い任意の物質が含まれる。例としては、いくつかの標準的な薬学的担体、例えば、無菌リ
ン酸緩衝生理食塩水、静菌水等のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されな
い（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ  １６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０を参照）。許容される
担体、賦形剤、または安定剤は、用いる用量及び濃度ではレシピエントに対して非毒性で
あり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオ
ニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘ
キサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノ
ール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのア
ルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール
；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブ
ミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの
親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もし
くはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキス
トリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、ト
レハロース、もしくはソルビトールなどの糖；甘味剤及び他の風味剤；微結晶性セルロー
ス、ラクトース、コーン、及び他のデンプンなどの充填剤；結合因子；添加剤；着色剤；
ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；なら
びに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体を含む薬学的組成物は、酸付加塩及び塩基付加塩
の両方を含むことを意味する薬学的に許容される塩として存在する等、水溶性形態であっ
てもよい。「薬学的に許容される酸付加塩」は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫
酸、硝酸、リン酸等、及び有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビ
ン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息
香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホ
ン酸、サリチル酸等によって形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物
学的に、ないしは別様に不適切でない塩を指す。「薬学的に許容される塩基付加塩」には
、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マ
グネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等に由来するものが含まれる。ア
ンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩が特に好ましい。
薬学的に許容される有機非毒性塩基に由来する塩には、１級、２級、及び３級アミン、天
然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびにイソプロピルアミン、
トリメチルアミン、ジエチルアミン、及びエタノールアミン等の塩基性イオン交換樹脂の
塩が含まれる。インビボ投与に使用されることになる製剤は無菌であることが好ましい。
これは、滅菌濾過膜を介した濾過または他の方法によって容易に達成される。
【０１５８】
好ましくは無菌水溶液の形態である本発明の抗体を含む薬学的組成物の投与は、皮下及
び静脈内を含むがこれらに限定されない様々な方法で行われ得る。皮下投与は、患者が薬
学的組成物を自己投与し得るため、状況次第で好ましくあり得る。多くのタンパク質治療
薬は、皮下投与に許容される最大量の治療有効量の製剤を可能にするために十分に強力で
はない。この問題は、アルギニン−ＨＣｌ、ヒスチジン、及びポリソルベートを含むタン
パク質製剤の使用によって一部解決し得る（ＷＯ  ０４０９１６５８を参照）。本発明の
Ｆｃポリペプチドは、例えば、増加した効能、改善した血清半減期、または増強した可溶
性に起因して、皮下投与により適している可能性がある。
【０１５９】
当該技術分野で既知であるように、タンパク質治療薬は、ＩＶ注入またはボーラスによ
って送達されることが多い。本発明の抗体も、かかる方法を使用して送達し得る。例えば
、投与は、注入ビヒクルとして０．９％の塩化ナトリウムを用いた静脈内注入によっても
よい。
【０１６０】
加えて、いくつかの送達系の任意のものが当該技術分野で既知であり、本発明のＦｃ変
異体を投与するために使用し得る。例としては、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア（
例えば、ＰＬＡ／ＰＧＡミクロスフェア）などへのカプセル化が挙げられるが、これらに
限定されない。あるいは、膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質、またはゲル状物質の
埋め込みを使用してもよい。持続放出系は、ポリマー材料またはマトリックス、例えば、
ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸と
エチル−Ｌ−グタメート（ｇｕｔａｍａｔｅ）とのコポリマー、エチレン酢酸ビニル、Ｌ
ＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）等の乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシブリル酸（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｒｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含ん
でもよい。本明細書に開示の抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化してもよい。リポ
ソームは、治療薬の哺乳動物への送達に有用な、種々の種類の脂質、リン脂質、及び／ま
たは界面活性剤を含む小型のビヒクルである。本抗体を含むリポソームは、当該技術分野
で既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２：３６８８、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７７：４０３０、米国特許第４，４８
５，０４５号、米国特許第４，５４４，５４５号、及びＰＣＴ  ＷＯ  ９７／３８７３１
に記載されているものによって調製される。循環時間が増強したリポソームは、米国特許
第５，０１３，５５６号に開示されている。リポソームの成分は、生体膜の脂質配列に似
た二層構成で一般的に配列される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コ
レステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を
含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定義
された孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径のリポソームを生む。化学療
法剤または他の治療的に活性な薬剤が任意選択でリポソーム内に含まれる（Ｇａｂｉｚｏ
ｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８１：
１４８４）。
【０１６１】
本抗体はまた、液滴形成技法、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしく
はゼラチンマイクロカプセル、またはポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル
を使用する）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、
マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、ならびにマクロエマルションを
含むがこれらに限定されない方法によって調製されるマイクロカプセル中に封入してもよ
い。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に開示されてい
る。持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例としては、マトリックスが
成形品の形態である固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、例えば、フィルムまた
はマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、
ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビ
ニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸
とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩グタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸
ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢
酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸
コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、ならびにポリ−ＤＬ−ラクチド−
コ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれた所望の生物活性分子で構成され
るミクロスフェアに基づく送達系であるＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）（Ａｌｋｅｒｍｅ
ｓから市販されている）が挙げられる。
【０１６２】
投薬量及び投薬頻度は、好ましい実施形態では、治療的または予防的に有効であるよう
に選択される。当該技術分野で既知であるように、タンパク質分解、全身対局所送達、及
び新たなプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、全体的な健康、性別、食生活、
投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度に対する調整が必要であり得、これは、当業
者によって慣習的な実験を用いて確認可能となる。
【０１６３】
製剤中の抗体の濃度は、約０．１〜１００重量％で変動し得る。好ましい実施形態では
、Ｆｃ変異体の濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲である。患者を治療するために、
治療有効量の本発明のＦｃ変異体を投与し得る。本明細書における「治療有効量」は、そ
れを投与した目的である効果を生む用量を意味する。正確な用量は治療の目的によること
になり、既知の技法を使用して当業者によって確認可能であろう。投薬量は、体重１ｋｇ
当たり０．０００１〜１００ｍｇ以上、例えば体重１ｋｇ当たり０．１、１、１０、また
は５０ｍｇの範囲であってもよく、１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【０１６４】
ＶＩＩ．抗ＰＶＲＩＧ抗体を使用するための方法
作製後、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体はいくつかの異なる用途における使用を見出す。
【０１６５】
Ａ．治療的使用
本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、一般にＰＶＲＩＧと関連する状態を有するヒト対象等の
患者を治療することにおける使用を見出す。「治療」という用語は、本明細書で使用する
場合、本例では癌の治療に関する療法的治療及び予防または予防手段の両方を指すが、以
下でも記載するように、抗体及び薬学的組成物の使用は、感染疾患、敗血症、及び／もし
くは自己免疫状態の治療法、ならびに／または遺伝子療法に続く望ましくない免疫活性化
の阻害も提供する。治療を必要としているものには、既に癌を患っているもの、及び癌が
予防されるべきものが含まれる。よって、本明細書における治療される哺乳動物は、癌を
有すると診断されていてもよく、または癌にかかりやすいかもしくは癌に感受性であって
もよい。本明細書で使用する場合、「治療すること」という用語は、有害な影響を予防す
ること、その発症を遅延させること、治癒すること、逆転すること、減弱させること、軽
減すること、最低限に抑えること、抑制すること、停止させること、または上記の癌性疾
患、障害、もしくは状態の認識可能な症状を安定化することを指す。これは、上記のよう
な癌を管理することも含む。「管理する」は、疾患の重症度を低減すること、疾患の発作
の頻度を低減すること、かかる発作の期間を低減すること、かかる発作の重症度を低減す
ること、癌細胞成長または増殖を遅延させる／低減すること、少なくとも１つの症状の進
行を遅延させること、少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの緩和等を意味する
。例えば、免疫刺激性抗ＰＶＲＩＧ免疫分子は、標的細胞、例えば、癌、感染または病原
細胞に対するＴ細胞またはＮＫまたはサイトカイン免疫を促進し、それにより、疾患状態
に関与する細胞を枯渇させることによって癌または感染性疾患を治療するはずである。逆
に、免疫抑制性抗ＰＶＲＩＧ免疫分子は、自己免疫、炎症、またはアレルギー状態等の一
部の免疫疾患の疾患病理に関与するＴ細胞もしくはＮＫ活性及び／またはまたは炎症性サ
イトカインの分泌を低減し、それにより、かかる状態と関連し得る疾患病理及び組織破壊
（例えば、リウマチ性関節炎状態と関連する関節破壊）を治療または緩和するはずである
。
【０１６６】
ＰＶＲＩＧ本発明の抗体は、治療有効量で提供される。本発明の少なくとも一部の実施
形態に従う「治療有効量」の抗ＰＶＲＩＧ  免疫分子は、好ましくは、疾患症状の重症度
の減少、無疾患症状期間の頻度及び期間の増加、生存期間の増加、疾患寛解、または疾患
の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防もしくは低減をもたらす。例えば、Ｐ
ＶＲＩＧ陽性腫瘍の治療について、「治療有効量」は、好ましくは、治療されていない対
象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ま
しくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、細胞成長または腫
瘍成長を抑制する。化合物が腫瘍成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍における効能を予測す
る動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者
に既知のアッセイによって化合物が抑制する能力、かかるインビトロの抑制を検査するこ
とによって評価することができる。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させ
るか、あるいは対象において症状を緩和することができる。
【０１６７】
当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択する特定の組成物また
は投与経路などの因子に基づいて、治療有効量を決定することができるであろう。
【０１６８】
１．癌治療
本発明のＰＶＲＩＧ抗体は、癌の治療において際立った使用を見出す。一般に、本発明
の抗体は、癌性細胞を直接攻撃するというよりは、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体が概してＰ
ＶＲＩＧの活性を阻害することによって免疫系を刺激するという点において、免疫調節性
である。このため、腫瘍成長及び発展に不可欠な分子経路を阻害すること、ならびに／ま
たは腫瘍細胞を枯渇させることを目的とする腫瘍標的化療法とは異なり、癌免疫療法は、
患者自身の免疫系を刺激して癌細胞を排除し、息の長い腫瘍破壊を提供することを目的と
する。種々のアプローチを癌免疫療法において使用することができ、腫瘍特異的Ｔ細胞応
答を誘導するための治療用癌ワクチン、及び免疫抑制経路を除去するための免疫刺激抗体
（即ち、抑制性受容体の拮抗物質＝免疫チェックポイント）がその一部である。
【０１６９】
標的化療法または従来の抗癌療法による臨床応答は、癌細胞が耐性を発現し、腫瘍の再
発が起きるため、一過性である傾向にある。しかしながら、過去数年の癌免疫療法の臨床
使用により、この種の療法が永続的な臨床応答を有し得、長期的な生存率に対する劇的な
影響を示すことが示されている。しかしながら、応答は長期的ではあるが、少数の患者し
か応答しない（多数の患者が応答するが応答は一過性である従来のまたは標的化療法とは
対照的）。
【０１７０】
腫瘍が臨床で検出されるまでに、腫瘍は、免疫耐性及び免疫抑制特性を獲得すること、
ならびに種々の機序及び種々の免疫細胞を通して免疫抑制腫瘍微小環境を創出することに
よって、既に免疫防御系をかいくぐっている。
【０１７１】
したがって、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、癌の治療において有用である。作用の免疫
腫瘍学的機序の性質に起因して、ＰＶＲＩＧは、必ずしも特定の癌の種類上で過剰発現さ
れるか、またはそれと相関する必要はなく、これはつまり、目標は、抗ＰＶＲＩＧ抗体に
Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化の抑制を解除させて、免疫系が癌を狙うようにすることである
。
【０１７２】
「癌」は、本明細書で使用する場合、悪性の成長または腫瘍（例えば、調節されていな
い細胞成長）を引き起こす異常かつ無制御な細胞分化を特徴とする任意の腫瘍性疾患（侵
襲性または転移性問わず）を広義に指す。「癌」または「癌性」という用語は、本明細書
で使用する場合、悪性の成長または腫瘍を引き起こす異常かつ無制御な細胞分化を特徴と
する任意の腫瘍性疾患（侵襲性、非侵襲性、転移性を問わず）を包含すると理解されるべ
きであり、その非限定的な例が本明細書に記載される。これは、調節されていない細胞成
長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を含む。癌の例は、実施例におい
て例示し、本明細書にも記載する。
【０１７３】
抗ＰＶＲＩＧ抗体を使用して治療することができる癌の非限定的な例には、癌腫、リン
パ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。かかる癌のよ
り具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の
扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚
癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または
子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、及び種々の
型の頭頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ
）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；
高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性Ｎ
ＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシ
ュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リン
パ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫、
ならびに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が含まれる。
【０１７４】
本発明による治療に適した他の癌には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病
またはリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な
例には、結腸直腸、膀胱、卵巣、黒色腫、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌
、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌を含む）、膵
臓癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺
癌、肝癌、及び種々の型の頭頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジ
キンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪
性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性
度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リン
パ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病
（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白
血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管
増殖、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫など）、及びメイグス症候群が含まれる。好ましくは
、癌は、結腸直腸癌、乳癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎
臓細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭
頚部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。例とな
る実施形態では、癌は、早期または末期（転移性を含む）膀胱、卵巣、または黒色腫であ
る。別の実施形態では、癌は結腸直腸癌である。本発明の治療に適した癌性状態には、Ｐ
ＶＲＩＧを発現するかまたは発現しない癌が含まれ、更に、非転移性または非侵襲性癌な
らびに侵襲性または転移性癌が含まれ、これらにおいては、免疫、間質、または病変細胞
によるＰＶＲＩＧ発現が抗腫瘍応答及び抗侵襲性免疫応答を抑制する。本発明の方法は、
血管新生腫瘍の治療に特に好適である。
【０１７５】
実施例に示すように、ＰＶＲＩＧは、種々の起源のいくつかの異なる腫瘍において、過
剰発現し、かつ／または腫瘍リンパ球浸潤と相関する（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＰ
Ｄ−１発現との相関によって示される）ため、任意の癌の治療に有用であり、これらの癌
には、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、
胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮
膚癌（扁平及び基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（非ホジキンリン
パ腫（ＮＨＬ）及びホジキンリンパ腫（ＨＤ））、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、）、Ｔ
細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚
細胞腫瘍、中皮腫、及び食道癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本明細書における「癌療法」は、癌を予防もしくは治療するか、または癌の症状のうち
の１つ以上を緩和する任意の方法を指す。典型的には、かかる療法は、免疫刺激性抗ＰＶ
ＲＩＧ抗体（抗原結合断片を含む）を、単独で、あるいは化学療法もしくは放射線療法、
または他の生物製剤との組み合わせで、その活性を強化するために、即ち、ＰＶＲＩＧの
発現が抗腫瘍応答及び化学療法もしくは放射線療法の効能または生物製剤の効能を抑制す
る個体において、投与することを含むことになる。
【０１７７】
２．癌における併用療法
当該技術分野で既知であるように、疾患状態に特異的な、免疫療法標的を標的化する治
療用抗体及び追加の治療薬を含む併用療法は、極めて有望である。例えば、免疫療法の分
野では、抗ＰＤ−１のような免疫腫瘍抗体による化学療法剤（小分子薬または抗腫瘍抗体
のいずれか）を使用するため、本明細書で概説する抗ＰＶＲＩＧ抗体が同じように置き換
えられ得る、いくつかの有望な併用療法が存在する。抗癌活性を呈する任意の化学療法剤
を本発明に従って使用することができ、種々の非限定的な例は本明細書に記載されている
。
【０１７８】
併用療法の効能の劇的な増加についての根底にある科学的根拠は、単剤療法としての免
疫チェックポイント妨害が、強力な抗腫瘍免疫応答が既に存在するときにのみ、経路の妨
害時に「解放（ｕｎｌｅａｓｈ）」されることになる腫瘍退縮を誘導することを主張する
。しかしながら、大部分の患者及び腫瘍型においては、図１に示すように、内因性抗腫瘍
免疫応答が弱いため、免疫チェックポイント妨害を有効にするために抗腫瘍免疫の誘導が
必要とされる。本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、ＰＶＲＩＧ特異的抗体、抗
体断片、コンジュゲート、及びそれを含む組成物が、併用療法の癌免疫療法において全て
の型の癌の治療に使用される。
【０１７９】
「と組み合わせて」及び「共投与」という用語は、正確に同じ時間での該予防または治
療薬の投与に限定されない。その代わり、これらの用語は、抗ＰＶＲＩＧ抗体及び他の薬
剤（単数または複数）が、それらが共に作用して、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体または他の
薬剤（単数または複数）のいずれかのみによる治療と比較して増加した利益を提供するよ
うに、連続してある時間間隔内で投与されることを意味する。抗ＰＶＲＩＧ抗体及び他の
薬剤（単数または複数）は相加的に作用することが好ましく、またそれらは相乗的に作用
することが特に好ましい。かかる分子は、意図する目的に効果的な量で組み合わせて存在
するのが好適である。熟練した医師であれば、経験的に、または薬剤の薬物動態及び作用
様式を考慮することによって、各治療薬の適切な用量（単数または複数）、ならびに投与
の適切なタイミング及び方法を決定することができる。
【０１８０】
したがって、本発明の抗体は、１つ以上の他の治療レジメンまたは薬剤と同時に投与し
得る。追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、抗ＰＶＲＩＧ抗体の効能または安全性
を改善し得る。また、追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、ＰＶＲＩＧ抗体の作用
を改変するのではなく、同じ疾患または併存疾患を治療してもよい。例えば、本発明のＰ
ＶＲＩＧ抗体は、化学療法、放射線療法、または化学療法と放射線療法の両方と共に患者
に投与してもよい。
【０１８１】
本発明のＰＶＲＩＧ抗体は、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長抑制剤、抗
ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制剤、血
液細胞の増殖を促進する薬剤、血管新生抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）
抑制剤、または他の治療薬を含むがこれらに限定されない、１つ以上の他の予防または治
療薬と組み合わせて投与してもよい。
【０１８２】
少なくとも一部の実施形態に従うと、抗ＰＶＲＩＧ免疫分子は、ケア癌治療の当該技術
分野で既知の標準のいずれかと組み合わせて使用し得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｃａｎｃｅｒで見出すことができる通り）。
【０１８３】
例えば、併用療法は、本明細書に記載の少なくとも１つの他の治療薬もしくは免疫調節
剤、他の化合物もしくは免疫療法、または免疫刺激戦略と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
を含み得る。腫瘍ワクチン、養子Ｔ細胞療法、Ｔｒｅｇ枯渇、抗体（例えば、ベバシズマ
ブ、エルビタックス）、ペプチド、ペプチボディ、小分子、細胞傷害及び細胞増殖抑制薬
剤などの化学療法剤（例えば、パクリタキセル、シスプラチン、ビノレルビン、ドセタキ
セル、ゲムシタビン、テモゾロミド、イリノテカン、５ＦＵ、カルボプラチン）、インタ
ーフェロン及びインターロイキン等の免疫修飾薬、免疫刺激抗体、成長ホルモンまたは他
のサイトカイン、葉酸、ビタミン、ミネラル、アロマターゼ阻害剤、ＲＮＡｉ、ヒストン
デアセチラーゼ阻害薬、プロテアソーム阻害剤、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、
シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、及びそれ自体では
患者にとって毒性または準毒性であるレベルでしか有効ではないシクロホスファミドヒド
ロキシウレアが含まれるが、これらに限定されない。シスプラチンは、４週間に１回、１
００ｍｇ／用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０〜
７５ｍｇ／用量ｍｌとして静脈内投与される。
【０１８４】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、抗ＰＶＲＩＧ抗体と組み合わせて使用す
ることができる治療薬は、抗腫瘍応答を増強する他の増強剤、例えば、他の抗免疫チェッ
クポイント抗体、または内因性抗腫瘍応答を増加させるように主に調節される他の増強剤
、例えば、放射線療法、寒冷療法、抗腫瘍免疫応答を増強する従来的／伝統的な化学療法
、抗腫瘍免疫応答を増強する標的化療法、抗血管新生療法、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣ等の免
疫抑制細胞を標的化する治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法、治療用癌ワクチン、
養子細胞移入である。
【０１８５】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、抗癌活性を有することが示されている、ビ
スホスホネート、特にアミノ−ビスホスホネート（ＡＢＰ）と組み合わせて使用される。
ＡＢＰと関連する活性の一部は、不活性及び適応免疫の界面をまたぎ、強力な抗腫瘍活性
を有するヒトγδＴ細胞にある。
【０１８６】
標的化療法はまた、腫瘍細胞の免疫原性死を引き起こすことによって、または免疫エフ
ェクター機序を従事させることによって、腫瘍特異的免疫応答を刺激することできる（Ｇ
ａｌｌｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｄｒｕｇ  ｄ
ｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １１，ｐａｇｅｓ  ２１５−２３３）。
【０１８７】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従い、癌治療用に抗ＰＶＲＩＧ免疫分子と組み合
わせるための薬剤として使用される標的化療法は、本明細書に記載の通りである。
【０１８８】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来サプ
レッサー細胞（ＭＤＳＣ）等の調節性免疫抑制細胞を標的化する治療薬と組み合わせて使
用される。いくつかの一般に使用される化学療法剤は、Ｔｒｅｇの非特異的な標的化をも
たらし、ＴｒｅｇまたはＭＤＳＣの数または免疫抑制能力を低減する（Ｆａｃｃｉａｂｅ
ｎｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７２（９）２１６２−７１、
Ｂｙｒｎｅ  ＷＬ．ｅｔ  ａｌ  ２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１：６９１５２０
、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ．ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ  Ｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ  ２００９  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，ｐａｇｅｓ  １６２−１７４）。この点で、一
部の化学療法薬によるメトロノーム療法は、調節細胞の変調を介して、免疫抑制効果では
なく免疫刺激をもたらす。このため、本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、癌免
疫療法のための抗ＰＶＲＩＧ  免疫分子は、非限定的に、シクロホスファミド、ゲムシタ
ビン、ミトキサントロン、フルダラビン、フルダラビン、ドセタキセル、パクリタキセル
、サリドマイド、サリドマイド誘導体から選択される薬物と組み合わせて使用される。
【０１８９】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、新規のＴｒｅｇ特異的標的剤と組み合わせ
て使用され、これは、１）抗ＣＤ２５  ｍＡｂであるダクリズマブ、バシリキシマブ等の
、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体の認識を通してＴｒｅｇを直接標的化する枯渇または殺傷抗体
、あるいは２）デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ）（ヒトＩＬ−２とジフテリア毒
素との融合タンパク質）、またはＬＭＢ−２（ＣＤ２５に対するｓｃＦｖと緑膿菌外毒素
との間の融合）等のリガンド標的化毒素、ならびに３）ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＯＸ４０
、及びＧＩＴＲ等の抗体標的化Ｔｒｅｇ細胞表面受。容体、あるいは４）これまでに特定
したものなどの他のＮＫ受容体を標的化する抗体、小分子、または融合タンパク質を含む
【０１９０】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ様受容体）作用物質を含
む；エクトヌクレオチダーゼ阻害剤またはＡ２Ａアデノシン受容体の阻害剤等のアデノシ
ン作用（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｒｇｉｃ）経路に干渉する薬剤；フレソリムマブ（ｆｒｅｓ
ｏｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ（ｍ
ｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、トラベデルセン、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ２１０９７６等の
ＴＧＦ−β阻害剤；ＣＣＲ４／ＣＣＬ２／ＣＣＬ２２  経路等のケモカイン受容体阻害剤
を含む腫瘍組織へのＴｒｅｇ補充の妨害を含む、Ｔｒｅｇ誘導及び／または機能を分断す
るための選択肢のうちのいずれかと併用される。
【０１９１】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＩＤＯ（インドールアミン−２，３−ジオ
キシゲナーゼ）阻害剤等の免疫抑制活性を発揮するサイトカイン及び酵素の阻害剤；ＩＬ
−１０、ＩＬ−３５、ＩＬ−４、及びＩＬ−１３等の免疫抑制性微小環境を促進する抗炎
症性サイトカインの阻害剤；Ｔｒｅｇを低減しＤＣの分化を促すＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ
（登録商標）を含む、免疫抑制性腫瘍微小環境を阻害する選択肢のうちのいずれかと併用
される。
【０１９２】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、レチノイン酸、オールトランス型レチノイ
ン酸（ＡＴＲＡ）等の、ビタミンＤ３、またはビタミンＡ代謝産物による抑制機能を有し
ない成熟骨髄細胞へのその分化を促進すること；ＣＯＸ２阻害剤、シルデナフィルのよう
なホスホジエステラーゼ５阻害剤、ニトロアスピリン等のＲＯＳ阻害剤によるＭＤＳＣ抑
制活性の抑制を含む、ＭＤＳＣ（骨髄由来抑制細胞）を標的化するための選択肢のうちの
いずれかと併用される。
【０１９３】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、免疫刺激抗体、または抗腫瘍免疫応答を増
強する他の薬剤と併用される（Ｐａｒｄｏｌｌ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１２；２０９
（２）：２０１−２０９）。免疫刺激抗体は、免疫機能を直接調節することによって、即
ち、他の抑制標的を妨害することによって、または免疫刺激タンパク質を増強することに
よって、抗腫瘍免疫を促進する。本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、癌免疫療
法のための抗−ＰＶＲＩＧ免疫分子は、イピリムマブ、トレメリムマブ等の抗ＣＴＬＡ４
ｍＡｂ；ニボルマブＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６／ＯＮＯ−４５３８、Ａ
ＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５等の抗ＰＤ−１、ＢＭＳ−９３６５５９／Ｍ
ＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ等の抗ＰＤＬ
−１拮抗物質；ＩＭＰ−３２１等の抗ＬＡＧ−３）、抗ＴＩＭ−３、抗ＢＴＬＡ、抗Ｂ７
−Ｈ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＶＩＳＴＡ；ＣＰ−８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズ
マブ等の抗ＣＤ４０  ｍＡｂを含む、免疫刺激タンパク質を標的化する作用抗体；ＢＭＳ
−６６３５１３ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６等の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ；抗ＯＸ
４０等の抗ＯＸ４０  ｍＡｂ；ＴＲＸ５１８等の抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ；ＣＤＸ−１１２７
等の抗ＣＤ２７  ｍＡｂ；ならびに抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂを含む、追加の免疫チェックポイ
ントを標的にする拮抗抗体と併用される。
【０１９４】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体はサイトカインと併用される。いくつかのサイ
トカインは、なかでもＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ
−１８及びＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（インターフ
ェロン  α）、ＩＦＮβ、ならびにＩＦＮγを含む、癌免疫療法のための抗腫瘍免疫応答
を増強する薬剤として臨床前または臨床開発中である。しかしながら、療法の効能は、深
刻な副作用及び不良な薬物動態特性によって阻まれる場合が多い。このため、サイトカイ
ンの全身投与に加えて、抗体−サイトカイン融合分子（免疫サイトカイン）、ポリエチレ
ングリコールへの化学的共役（ＰＥＧ化）、自己全腫瘍細胞におけるサイトカインの形質
転換発現、サイトカイン遺伝子のＤＮＡワクチンへの組み込み、サイトカイン遺伝子を送
達するための組み換えウイルスベクター等を含む、治療用サイトカインの送達及びその腫
瘍部位への局在化のための種々の戦略を、その薬物動態ならびにその効能及び／または毒
性を改善するために用い得る。免疫サイトカインの場合には、サイトカインの腫瘍特異的
抗体または抗体断片への融合により、標的化した送達、それにより改善した効能及び薬物
動態、ならびに低減した副作用が可能となる。
【０１９５】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は癌ワクチンと併用される。治療用癌ワクチン
は、Ｔ細胞の改善した下準備、及び改善した抗原提示を可能にし、抗腫瘍免疫応答を増強
するための治療薬として使用することができる（Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２
０１１，Ｎａｔｕｒｅ，４８０：２２−２９、Ｓｃｈｌｏｍ  Ｊ，２０１２，Ｊ  Ｎａｔ
ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ；１０４：５９９−６１３）。
【０１９６】
いくつかの種類の治療用癌ワクチンが臨床前及び臨床開発中である。これらには、例え
ば以下のものが含まれる。
【０１９７】
１）手術中に除去された癌細胞を、それらの免疫原性を増強するように処理し、患者に
注射して腫瘍細胞における抗原に対する免疫応答を誘導する、全腫瘍細胞ワクチン。この
腫瘍細胞ワクチンは、同種、即ち、患者自身の腫瘍であるか、または所与の腫瘍型の２つ
または３つの確立された特性評価されたヒト腫瘍細胞株であり得、これは例えば、ＧＶＡ
Ｘワクチンプラットフォームである。
【０１９８】
２）免疫系をブーストするために、腫瘍抗原（またはいくつかの腫瘍抗原の組み合わせ
）、通常はタンパク質またはペプチドを、投与する（場合により、アジュバントと共に、
及び／または免疫調節剤もしくはＧＭ−ＣＳＦ等の樹状細胞の誘引剤と共に）、腫瘍抗原
ワクチン。この腫瘍抗原はある特定の種類の癌に特異的であり得るが、これらは特定の患
者用に作製されるものではない。
【０１９９】
３）ベクターに基づく腫瘍抗原ワクチン及びＤＮＡワクチンは、抗腫瘍免疫応答を刺激
するための抗原の安定した供給を提供する方法として使用することができる。腫瘍抗原を
コードするベクターは患者に注射され（場合により、炎症性または他の誘引剤、例えばＧ
Ｍ−ＣＳＦと共に）、インビボで細胞によって取り込まれて、その後所望の免疫応答を誘
発し得る特異的抗原を作製する。ベクターを使用して、一度に１つ超の腫瘍抗原を送達し
て免疫応答を増加させ得る。加えて、組み換えウイルス、細菌、または酵母菌ベクターは
、それら自体の免疫応答をトリガするはずであり、これは、全体的な免疫応答も増強させ
得る。
【０２００】
４）選択的に癌細胞に感染する複製条件的単純ヘルペスウイルスの腫瘍内注射を伴う、
ＯｎｃｏＶｅｘ／Ｔ−ＶＥＣ等の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。ＧＭ−ＣＳＦを発現する
ようにも操作されるこのウイルスは、癌細胞の内部で複製して、その溶解を引き起こし、
新たなウイルス及び数々の腫瘍抗原を放出し、その過程でＧＭ−ＣＳＦを分泌する。この
ため、かかる腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、腫瘍微小環境においてＤＣの機能を増強し
て、抗腫瘍免疫応答を刺激する。
【０２０１】
５）樹状細胞ワクチン（Ｐａｌｕｃｋａ  ａｎｄ  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，２１０２，
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２６５−２７７）：樹状細胞（ＤＣ）、貧
食腫瘍細胞、及び腫瘍特異的Ｔ細胞に対する本腫瘍抗原。このアプローチでは、ＤＣを、
癌患者から単離し、腫瘍特異的Ｔ細胞の提示のために準備する。このためには、いくつか
の方法を使用することができる：ＤＣに腫瘍細胞または溶解物を充填する；ＤＣに腫瘍抗
原の融合タンパク質またはペプチドを重点する；腫瘍抗原のＤＣ標的化ｍＡｂへの結合。
ＤＣを刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ等）の存在下で処理し、エクスビボで活性化し成熟させた
後、癌細胞への免疫応答を誘発するために患者に再度注入し戻す。樹状細胞は、刺激性サ
イトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ等）を分泌するように操作した、照射した全腫瘍細胞を注射す
ることによって、インビボで準備することもできる。同様のアプローチを、単球を用いて
実行することができる。進行性前立腺癌の治療のために認可されている治療用癌ワクチン
Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）が樹状細胞ワクチンの一例である。
【０２０２】
一部の実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、エクスビボ特定及び自己天然腫瘍特異的Ｔ
細胞の拡大、続いてこれを癌患者に養子導入し戻すことを伴う、養子Ｔ細胞療法または養
子細胞移入（ＡＣＴ）と併用される（Ｒｅｓｔｉｆｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６２（４）：７２７−３６（２０１３）
Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ  ４  ２０１２）。エクスビボ拡大後に患者に注入し戻された細胞は、
腫瘍へと促され、その破壊を媒介する。この養子移入の前に、宿主を放射線及び／または
化学療法によって免疫枯渇させ得る。リンパ枯渇、養子細胞移入、及びＴ細胞成長因子（
ＩＬ−２等）の組み合わせは、腫瘍患者における長期の腫瘍根絶につながり得る。より新
規のアプローチは、腫瘍関連抗原への特異性を付与するための正常な末梢血Ｔ細胞のエク
スビボの遺伝子修飾を伴う。例えば、抗腫瘍応答が特に良好であるＴ細胞のＴＣＲのクロ
ーンをウイルス発現ベクターに挿入し、治療される患者由来の自己Ｔ細胞を感染させるた
めに使用し得る。別の選択肢は、Ｔボディとしても知られる本質的にキメラの免疫グロブ
リン−ＴＣＲ分子であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用である。ＣＡＲは、抗体様特
異性を有し、Ｔ細胞を活性化することができるＴＣＲ細胞内ドメイン上にグラフティング
される標的細胞の表面上のＭＨＣ非制限的構造（細胞外標的結合モジュール）を認識する
（Ｒｅｓｔｉｆｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
．６２（４）：７２７−３６（２０１３）Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ  ４  ２０１２、及びＳｈｉ
ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４９３：１１１−１１５  ２０１３）。
【０２０３】
ＰＶＲＩＧ抗体及び１つ以上の他の治療薬は、順番にまたは同時に投与することができ
る。組成物は、薬剤（免疫複合体として）に結合させることができ、または薬剤とは別に
投与することができる。後者の場合（個別投与）、組成物は、薬剤の前、後、または薬剤
と同時に投与することができ、あるいは他の既知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、放
射線と一緒に共投与することができる。
【０２０４】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従うヒト化抗ＰＶＲＩＧ  免疫分子の化学療法剤
との共投与は、ヒト腫瘍細胞への細胞傷害効果を生む異なる機序によって動作する２つの
抗癌剤を提供する。かかる共投与は、薬物への耐性の発現または腫瘍細胞の抗原性の変化
（抗体と非反応性にし得る）に起因する問題を解決し得る。他の実施形態では、対象を、
例えば、対象をサイトカインで治療することによって、ＦｃｙまたはＦｃｙ受容体の発現
または活性を調節する、例えば、強化または阻害する薬剤で更に治療し得る。
【０２０５】
標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組成
物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）に結合したエフェクター細胞も、
治療薬として使用することができる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファー
ジ、好中球、または単球等のヒト白血球であり得る。他の細胞には、好酸球、ナチュラル
キラー細胞、及び他のＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体保持細胞が含まれる。所望の場合、
エフェクター細胞は、治療される対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細
胞は、生理学的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与す
る細胞の数は、１０−８〜１０−９程度であり得るが、治療目的に応じて変動することに
なる。一般に、量は、標的細胞、例えば、ＰＶＲＩＧタンパク質を発現している腫瘍細胞
での局在を得るため、及び例えば、貧食による細胞殺傷を生じさせるために十分な量とな
る。投与経路も異なり得る。
【０２０６】
標的特異的エフェクター細胞による療法は、標的とする細胞の除去のための他の技法と
併せて行うことができる。例えば、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組成物（例
えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）及び／またはこれらの組成物を持ったエ
フェクター細胞を使用する抗腫瘍療法を、化学療法と併せて使用することができる。加え
て、併用免疫療法を使用して、２つの明確に異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細
胞拒絶に向けてもよい。例えば、抗Ｆｃ−γＲＩまたは抗ＣＤ３に結合した抗ＰＶＲＩＧ
免疫分子を、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体特異的結合因子と併せて使用してもよい。
【０２０７】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従う二重特異性及び多特異性分子はまた、細胞表
面上の受容体のキャッピング及び除去等によってエフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦ
ｃγＲレベルを調節するために使用することもできる。抗Ｆｃ  受容体の混合物もこの目
的に使用できる。
【０２０８】
補体に結合するＩｇＧ１、−２、もしくは−３、またはＩｇＭ由来の部分等の相補的
結合部位を有する、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う治療用組成物（例えば、ヒ
ト抗体、代替的骨格多特異性及び二重特異性分子、ならびに免疫複合体）も、補体の存在
下で使用することができる。一実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う
結合因子及び適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団のエクスビボ治療
は、補体、または補体を含む血清の添加によって補完される。本発明の少なくとも一部の
実施形態に従う結合因子でコーティングした標的細胞の貧食は、補体タンパク質の結合に
よって改善させ得る。別の実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組成
物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）でコーティングした標的細胞は、
補体によって溶解され得る。更に別の実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態
に従う組成物は補体を活性化しない。
【０２０９】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従う治療用組成物（例えば、ヒト抗体、代替的骨
格多特異性及び二重特異性分子、ならびに免疫複合体）は、補体と一緒に投与することも
できる。このため、本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、ヒト抗体、多特異性ま
たは二重特異性分子、及び血清または補体を含む組成物が存在する。これらの組成物は、
補体が、ヒト抗体、多特異性または二重特異性分子に近接して位置する点で有利である。
あるいは、ヒト抗体、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う多特異性または二重特異
性分子、及び補体または血清は、個々に投与することができる。
【０２１０】
抗ＰＶＲＩＧ  免疫分子は、本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、抗体を中和
するものとして使用することができる。中和抗体（Ｎａｂ）は、特定の抗原に結合してそ
れを中和するかまたは阻害することによって、その生物学的効果を阻害することができる
抗体である。。ＮＡｂは、その活性に必要な重要な表面分子を妨害することか、または標
的細胞上のその受容体への薬剤の結合に干渉することによって、薬剤の生物学的活性を部
分的または完全に無効にする。
【０２１１】
本発明の更なる態様に従い、本治療薬を使用して、癌細胞に対して向けられたもの等の
Ｔ細胞活性の病理的抑制を予防することができる。
【０２１２】
このため、本発明の更なる態様に従い、本明細書で列挙する癌を治療する方法、ならび
に／または治療薬のうちのいずれかを含み、薬学的に許容される希釈剤または担体を更に
含む、有効量の治療薬及び／もしくは薬学的組成物のうちのいずれか１つを、それを必要
とする対象に投与することによって免疫刺激を促進するための方法を提供する。
【０２１３】
少なくとも一部の実施形態に従い、免疫細胞、好ましくはＴ細胞を治療薬とインビボま
たはエクスビボで接触させて、免疫応答を調節することができる。治療薬と接触させるＴ
細胞は、α／β及びγ／δＴ細胞受容体を含むＴ細胞受容体を発現する任意の細胞である
ことができる。Ｔ細胞には、ＣＤ４及びＣＤＳも発現するＴ細胞サブセットを含む、ＣＤ
３を発現する全ての細胞を含む。Ｔ細胞には、ナイーブ及びメモリー細胞とＣＤ８＋細胞
傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）等のエフェクター細胞との両方が含まれる。Ｔ細胞には、Ｔ
ｈ１、Ｔｃ１、Ｔｈ２、Ｔｃ２、Ｔｈ３、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ、濾胞
ヘルパー細胞（ＴＦＨ）、及びＴｒ１細胞等の細胞も含まれる。Ｔ細胞は、ｉＮＫＴ、α
／βＮＫＴ及びγ／δＮＫＴ細胞といったＮＫＴ細胞、ならびに同様の固有クラスのＴ細
胞系列も含まれる。
【０２１４】
また、ＰＶＲＩＧ妨害抗体を、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞に腫瘍
細胞を標的とさせる二重特異性抗体と併用することができる（例えば、米国特許第５，９
２２，８４５号及び同５第，８３７，２４３号を参照）。二重特異的抗体を使用して、２
つの別々の抗原を標的にすることができる。例えば、抗Ｆｃ  受容体／抗腫瘍抗原（例え
ば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージに腫瘍部位を標的とさせる
ために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化し得る。こ
れらの応答のＴ細胞アームは、ＰＶＲＩＧ妨害の使用によって増補され得る。あるいは、
抗原は、腫瘍抗原及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用
によってＤＣに直接送達してもよい。
【０２１５】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を逃れる。これらの機序の多くは、腫瘍
によって発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これ
らには、なかでも、ＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．＆Ｏ’Ｇａ
ｒｒａ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）
、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２
７４：１３６３−１３６５）が含まれる。これらの実体の各々に対する抗体を抗ＰＶＲＩ
Ｇと併用して、免疫抑制剤の影響に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答を促し得る。
【０２１６】
宿主免疫抑制性を活性化するために使用し得る他の抗体を、抗ＰＶＲＩＧと併用するこ
とができる。これらには、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子が
含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に置き換えることができ（Ｒ
ｉｄｇｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、Ｐ
ＶＲＩＧ抗体と併用することができる（Ｉｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕ
ｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ
．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１Ｂ
Ｂ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３
：６８２−６８５（１９９７）、及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１
９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）等のＴ細胞共刺激分子に対する抗体、
ならびにＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号、インプリムマブ（ｉ
ｍｐｌｉｍｕｍａｂ））またはＢＴＬＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００
３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６７０−９）、Ｂ７−Ｈ４（Ｓｉｃａ，Ｇ  Ｌ  ｅｔ
ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：８４９−６１）ＰＤ−１等の負の共刺激
分子の活性を妨害する抗体の活性化は、Ｔ細胞活性化レベルの増加も提供し得る。
造血起源の種々の腫瘍を治療するために、骨髄移植が現在使用されている。移植片対宿主
病はこの治療の結果であるが、治療的利益が移植片対腫瘍応答から得られる場合がある。
ＰＶＲＩＧ妨害を使用して、ドナーに移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させる
ことができる。
【０２１７】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のために、エクスビボ活性化、ならびに抗原特異的Ｔ細
胞の拡大及びこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を伴う実験的治療プロトコルもい
くつかある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ  ２８５：５４６−５１）。これらの方法は、ＣＭＶ等の感染因子へのＴ細胞応答を
活性化するためにも使用し得る。抗ＰＶＲＩＧ免疫分子の存在下でのエクスビボの活性化
は、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性を増加させることが予期され得る。
【０２１８】
任意選択で、ＰＶＲＩＧに対する抗体は、癌細胞、精製した腫瘍抗原（組み換えタンパ
ク質、ペプチド、及び炭水化物分子）、細胞、及び免疫刺激サイトカインをコードする遺
伝子でトランスフェクトした細胞（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１７３：４９１９−２８）等の免疫原性剤と組み合わせることができる。使用できる腫瘍
ワクチンの非限定的な例としては、結腸癌の治療のためのＭＵＣ１のペプチド、ペプチド
ｓ  ｏｆ  卵巣癌の治療のためのＭＵＣ−１／ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭのペプチド、または
サイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞（以下で更に
考察する）が挙げられる。
【０２１９】
ヒトにおいて、ＲＣＣ等の一部の腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＰＶＲＩ
Ｇ妨害によるＴ細胞活性化の閾値を上げることによって、宿主における腫瘍応答が活性化
されると期待され得ることが予期される。
【０２２０】
ＰＶＲＩＧ妨害は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせたときに最も効果的である可
能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Ｒ
ｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０−
６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂ
ｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄ
ｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８、Ｆｏｏｎ，Ｋ．２００
０，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８を参
照；また、Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，  Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３  ｉｎ  ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ｅｔ  ａ
ｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎを参照）。これらの戦
略のうちの１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これ
らの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されるときに最
も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提
示の強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９
９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９−４３）。
【０２２１】
種々の腫瘍における遺伝子発現及び大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍
特異的抗原の定義につながった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ  Ａ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ  １０：２８１−７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において及び
腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラニン細胞抗原ｇｐ１００、
ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主
中で見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。ＰＶＲＩＧ妨害は、こ
れらのタンパク質への免疫応答を生成するために、腫瘍中で発現される組み換えタンパク
質及び／またはペプチドのコレクションと併用してもよい。これらのタンパク質は、通常
、免疫系によって自己抗原と見なされるため、それに耐性である。腫瘍抗原はまた、タン
パク質テロメラーゼを含んでもよく、これは、染色体のテロメアの合成に必須であり、ヒ
ト癌の８５％超において、限定数の体細胞組織中でのみ発現される（Ｋｉｍ，Ｎ  ｅｔ  
ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１３）。（これらの体細胞
組織は、種々の手段によって免疫攻撃から保護され得る）。腫瘍抗原はまた、２つの無関
係の配列間でタンパク質配列を改変するかもしくは融合タンパク質を創出する体細胞突然
変異（即ち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂ１）、またはＢ細胞腫瘍から
のイディオタイプを原因として、癌細胞中で発現される「新生抗原」であり得る。
【０２２２】
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣ
Ｖ）、及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＨＳＶ）等のヒト癌に関係するウイルスから
のタンパク質を含み得る。ＰＶＲＩＧ妨害と併用され得る腫瘍特異的抗原の別の形態は、
腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これら
の熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、かつこれらのＨＳ
Ｐは、腫瘍免疫の励起のための抗原提示細胞への送達において極めて効率的である（Ｓｕ
ｏｔ，Ｒ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５−
１５８８、Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１
７−１２０）。
【０２２３】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を準備するために使用することができる強力な抗
原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで産生させ、種々のタンパク質及びペプチド抗原
、ならびに腫瘍細胞抽出物を充填することができる（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（
１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８−３３２）。ＤＣはまた、これ
らの腫瘍抗原を発現するように遺伝子的手段によって形質導入してもよい。また、ＤＣは
、免疫付与を目的として腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ
．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２−３３６）。ワクチン接種
の方法として、ＤＣ免疫付与をＰＶＲＩＧ妨害と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫
瘍応答を活性化してもよい。
【０２２４】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従う治療薬の癌ワクチン接種のためのアジュバン
トとしての使用：
【０２２５】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫付与は、癌療法及び予防に有望なアプローチであ
るが、腫瘍細胞によって発現される自己抗原と関連する耐性機序等のいくつかの困難及び
制限に直面する。Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）等の共刺激分子は、動
物モデルにおける遺伝子系及び細胞系ワクチンの効能を改善させており、臨床試験におい
てアジュバントとして調査中である。このアジュバント活性は、共刺激シグナルの増強に
よって、または腫瘍細胞によって発現される負の共刺激因子によって発信される抑制シグ
ナルの妨害によって達成することができる（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００
８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．；３１（７）：６４４−５５）。
【０２２６】
本発明の少なくとも一部の実施形態に従い、ＰＶＲＩＧタンパク質のいずれか１つに特
異的な、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体及び／または抗原結合断片及び／ま
たはそれを含むコンジュゲート、ならびに／あるいは代替的骨格のうちのいずれか１つを
、癌ワクチン接種のためのアジュバントとして使用することができる。少なくとも一部の
実施形態に従うと、本発明は、ＰＶＲＩＧタンパク質のいずれか１つに特異的な、ポリク
ローナルもしくはモノクローナル抗体及び／または抗原結合断片及び／またはそれを含む
コンジュゲート、ならびに／あるいは代替的骨格のうちのいずれか１つを、有効量で患者
に投与することを含む、ＴＡＡに対する免疫付与を改善させるための方法を提供する。
【０２２７】
一部の実施形態では、本発明は、以下のうちの１つ以上を、それを必要とする対象にお
いて行うためのＰＶＲＩＧ抗体の使用を提供する：（ａ）炎症促進性サイトカインの上方
調節；（ｂ）Ｔ細胞増殖の増加及び／または拡大；（ｃ）Ｔ細胞によるインターフェロン
−γまたはＴＮＦ−α産生の増加；（ｄ）ＩＬ−２分泌の増加；（ｅ）抗体応答の刺激；
（ｆ）癌細胞成長の阻害；（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞免疫の促進；（ｈ）ＣＤ４＋及び／ま
たはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の促進；（ｉ）Ｔ細胞抑制の軽減；（ｊ）ＮＫ細胞活性の促進
；（ｋ）癌細胞のアポトーシスまたは溶解の促進；及び／または（ｌ）癌細胞に対する細
胞傷害性または細胞増殖抑制性。
【０２２８】
他の実施形態では、本発明は、ＰＶＲＩＧの少なくとも１つの免疫抑制効果に拮抗する
ための、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う免疫刺激抗体、抗原結合断片、または
そのコンジュゲート（任意選択で薬学的組成物中で）の使用を提供する。
【０２２９】
かかる抗体、抗原結合断片、またはそのコンジュゲートは、任意選択で、好ましくは、
以下の効果のうちの少なくとも１つを媒介する。
【０２３０】
（ｉ）免疫応答を増加させる、（ｉｉ）αβ及び／またはγδＴ細胞の活性化を増加さ
せる、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させる、（ｉｖ）ＮＫ及び／またはＮＫＴ
細胞活性を増加させる、（ｖ）αβ及び／またはγδＴ細胞抑制を軽減させる、（ｖｉ）
炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させる；（ｖ
ｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させる、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させる、（
ｘ）Ｔｈ２応答を減少させる、（ｘｉ）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞
数及び／または活性化を減少させるかまたは排除する。
【０２３１】
３．治療の評価
概して、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、癌を患う患者に投与され、効能は、本明細書に
記載するいくつかの方法で評価される。このため、例えば、癌量、腫瘍のサイズ、転移の
存在または程度の評価などの効能の標準的なアッセイを実行しながら、免疫腫瘍学的治療
を免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロ及びインビボアッ
セイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍組織量、サイズ、侵
襲性、ＬＮ関与、転移等といった「古典的な」測定と併せて、免疫状態の変化の評価（例
えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）を行うことができる。このため
、以下のいずれかまたは全てを評価することができる：ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増
殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活
性及び／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性及びＮＫ媒介性細胞枯渇に対する
ＰＶＲＩＧの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化及び増殖ならびにＴｒｅｇ−もしくは骨髄由来
サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するＰＶＲＩＧの増
強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔもしくは
他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α産生に対するＰＶＲＩＧ
の影響。
【０２３２】
一部の実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞
のＫｉ６７細胞内染色、及び３Ｈ−チミジン組み込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価
することによって行われる。
【０２３３】
一部の実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、Ｐ
Ｄ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒
のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパ
ク質レベルを評価することによって行われる。
【０２３４】
一般に、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野で既知である通りに行われる。例えば、
Ｇｏｏｄｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２
９（３）：５８９（２００５）、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｂｉｏｌ
．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  １１／１５／１５  ９（Ｓｕｐｐｌ．１）：２９−４６、Ｃａｍｐ
ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ、２６  ｓｕｐｐｌ．１：
Ｓ９７−Ｓ１１０を参照されたい。これらの遺伝子発現測定技法は、参照により明示的に
本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
概して、タンパク質発現測定は、同様に、当該技術分野で既知である通りに行われる。
例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌ
ｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１３：９８４：１−１２、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭ
ｅｄ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ３６１５９０，８  ｐ
ａｇｅｓ，Ｂｅｃｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ  ２０１１  Ｊｕｎｅ  １
７：７２２（２）：１７１−１８２を参照されたい。これらの測定技法は、参照により明
示的に本明細書に組み込まれる。
【０２３６】
お一部の実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜
透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、及びヌクレオチド取り込み活性等の多数の
細胞パラメータを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性
活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの特定の例としては、トリパン
ブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴ及び／または
ＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが挙げ
られるが、これらに限定されない。
【０２３７】
一部の実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性
を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定され
ないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。
【０２３８】
したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行う
ことができる：（ｉ）免疫応答を増加させる、（ｉｉ）αβ及び／またはγδＴ細胞の活
性化を増加させる、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させる、（ｉｖ）ＮＫ及び／
またはＮＫＴ細胞活性を増加させる、（ｖ）αβ及び／またはγδＴ細胞抑制を軽減させ
る、（ｖｉ）炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加
させる；（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させる、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増
加させる、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させる、（ｘｉ）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくと
も１つの細胞数及び／または活性化を減少させるかまたは排除する。
【０２３９】
効能を測定するためのアッセイ
一部の実施形態では、Ｔ細胞活性化は、実施例２３に記載のように、混合リンパ球反応
（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適
切な増加を以下に概説する。
【０２４０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または
脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答
の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以
下に概説する。
【０２４１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び／またはγδＴ細胞の活性化の増
加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に
概説する。
【０２４２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えば癌細胞のような標的細
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、ま
たは例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は
免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２４３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えば癌細胞のような標的細
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、ＣＤ１０
７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫ及び／またはＮＫ
Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切
な増加を以下に概説する。
【０２４４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び／またはγδＴ細胞抑制の増加ま
たは減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説
する。
【０２４５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、または
Ｌｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定される炎症促
進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。
活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２４６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、または
Ｌｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるＩＬ−
２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増
加を以下に概説する。
【０２４７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、または
Ｌｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるインタ
ーフェロン−γ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活
性の適切な増加を以下に概説する。
【０２４８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１応答の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２４９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ２応答の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２５０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによっ
て、またはＩＨＣによって測定される調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数
及び／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切
な減少は、以下に概説する増加と同じである。
【０２５１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによっ
て、またはＩＨＣによって測定されるＭ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定
する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じであ
る。
【０２５２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＭ２マクロファージ腫瘍形成促進
活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以
下に概説する増加と同じである。
【０２５３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによっ
て、またはＩＨＣによって測定されるＮ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答
の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。
【０２５４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増
加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説
する増加と同じである。
【０２５５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の抑制の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２５６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えば癌細胞のような標的細
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、ま
たは例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免
疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２５７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、αβ及び／またはγδＴ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応
答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。
【０２５８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び／またはγδＴ細胞応答の増加ま
たは減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説
する。
【０２５９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、
または増殖によって、または例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等のような活性化マーカー
の発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。。
【０２６０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カ
ルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性
を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２６１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カ
ルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞に対する細胞傷害または細胞増殖抑制効果の刺激の増加または減少を測定する。活性
の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２６２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カ
ルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞の直接的な殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活
性の適切な増加を以下に概説する。
【０２６３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイ測定は、例えば、サイトカイン分泌によっ
て、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１
７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増
加を以下に概説する。
【０２６４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カ
ルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、補
体依存性細胞傷害性及び／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加または減
少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２６５】
一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、例えば癌細胞のような標的細胞の直接的な
殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、
ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定
される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ
６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、及びサイトカイ
ン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、
ＩＬ−１７Ａ）の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一貫する免疫調節を示し得る。
【０２６６】
一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、例えば癌細胞のような標的細胞の直接的
な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、ＣＤ１０７ａ等のよ
うな活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞
傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、及びパーフォリン発現を増加
させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦ）、及び細胞表面  受容
体発現（例えば、ＣＤ２５）が、癌細胞の増強された殺傷と一貫し得る免疫調節を示し得
る。
【０２６７】
一実施形態では、γδＴ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増
殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０２６８】
一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活
性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０２６９】
活性または応答の適切な増加（または減少、上で概説したものと同程度に適切なもの）
は、参照試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体を含まない
試験試料におけるシグナルと比べた、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％
、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様
に、ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｏｆ参照または対照試料と比較して少なくとも１倍、２倍、３
倍、４倍、または５倍の増加が、効能を示す。
【０２７０】
４．病原体感染の治療
少なくとも一部の実施形態に従うと、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、癌を治療することができる
のと同じ理由で、任意選択で感染疾患の治療に使用し得る。慢性感染症は、ウイルス特異
的Ｔ細胞応答の異なる程度の機能障害を特徴とする場合が多く、この異常が、宿主が執拗
な病原体を排除できない主な理由である。機能性エフェクターＴ細胞が感染の早期にまず
生成されるが、これらは、異質な抗原への持続的な露出の結果として、慢性感染症の経過
中に徐々に機能を喪失し、Ｔ細胞疲弊を引き起こす。疲弊したＴ細胞は、ｈｉｇｈ    等
のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びＬＡＧ３等の複数の共抑制受容体を高レベルで発現する
（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；
２１：１７９−１８６、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００
９；１８２：５８９１−５８９７、Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ  ２００７；８：２３９−２４５）。疲弊したＴ細胞によるＰＤ−１過剰発現が、ＨＩ
Ｖ、ＨＣＶ、及びＨＢＶを含む慢性ウイルス感染を患っている患者において臨床的に観察
された（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０
０９；２１：１７９−１８６、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  
２００９；１８２：５８９１−５８９７、Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ  ２００７；８：２３９−２４５）。他のウイルス、最近、及び寄生虫を含む更
なる病原体におけるこの経路についていくらかの調査が行われている（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ  ２０１１，Ａｒｔ
．ＩＤ  ４５１６９４、Ｂｈａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  
Ｓｃｉ．２０１１；１０８（２２）：９１９６−２０１）。例えば、ＰＤ−１経路は、標
準的な盲腸ライゲーション及び穿刺法によって誘導した敗血症モデルを使用した細菌感染
の制御に関与することが示された。ノックアウトマウスにおけるＰＤ−１の不在がこのモ
デルにおいて敗血症誘導死から保護した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００
９：１０６；６３０３−６３０８）。
【０２７１】
Ｔ細胞疲弊は、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４等の共抑制経路の妨害によって逆転するこ
とができるため（Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３：
４２８４−９１、Ｇｏｌｄｅｎ−Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００９
；８３：９１２２−３０、Ｈｏｆｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ  ２０１１，Ａｒｔ．ＩＤ  ４５１６９４）、抗ウイルス免疫機
能の回復が可能である。ウイルス感染を治療するための共抑制妨害の治療可能性は、ＰＤ
−１／ＰＤ−Ｌ１  経路の妨害によって広く研究され、これは、アカゲザルにおける急性
及び慢性免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染（Ｖａｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２
００９；４５８：２０６−２１０）、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）等
の慢性ウイルス感染のマウスモデル（Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０
０６；４３９：６８２−７）、及びＳＪＬ／Ｊマウスにおけるタイラーマウス脳脊髄炎ウ
イルス（ＴＭＥＶ）モデル（Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．
２０１１；６：ｅ１８５４８）を含むいくつかの感染症の動物モデルにおいて有効である
ことを示した。これらのモデルにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１妨害は、抗ウイルス応答
を改善し、執拗なウイルスのクリアランスを促進した。加えて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１妨
害は、血漿における特異的抗ウイルス抗体の産生の上昇として現れる液性免疫を増加させ
、これと細胞応答の改善とが組み合わさって、血漿ウイルス量の減少及び生存率の増加を
もたらす。
【０２７２】
本明細書で使用される場合、「感染障害及び／または疾患」及び／または「感染症」と
いう用語は、互換的に使用され、個々の宿主生命体における病原性生物因子の存在及び／
または成長によって引き起こされる任意の障害、疾患、及び／または状態を含む。本明細
書で使用される場合、「感染症」という用語は、臨床的に顕在な疾病（即ち、疾患の特徴
的な医学的兆候及び／または症状）を呈し、かつ／またはその経過のほとんどもしくは全
てで無症候性である、上記の障害、疾患、及び／または状態を含む。本明細書で使用され
る場合、「感染症」という用語はまた、低減した増殖及びサイトカイン産生として現れる
機能不全を特徴とする疲弊Ｔ細胞表現型につながる異質な抗原の持続によって引き起こさ
れる障害、疾患、及び／または状態を含む。本明細書で使用される場合、「感染障害及び
／または疾患」及び／または「感染症」という用語は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感
染、及び／または寄生虫感染によって引き起こされる以下に挙げる感染障害、疾患、及び
／また状態のうちのいずれかを更に含む。
【０２７３】
抗ＰＶＲＩＧ抗体は、単独で、または任意選択で本明細書に記載の細菌感染、ウイルス
感染、真菌感染の治療に使用される１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与すること
ができる。
【０２７４】
つまり、感染した対象は、免疫に対する少なくとも１つのＰＶＲＩＧ媒介性効果、例え
ば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＮＫ活性に対するその抑制効果及び／または炎症性サイト
カインの産生に対するその抑制効果に拮抗するか、あるいはＴＲｅｇに対するＰＶＲＩＧ
の刺激効果を阻害することで、感染細胞または病原体の枯渇または殺傷を促進し、対象の
免疫細胞による病原体または感染細胞の増強した殺傷に基づく疾患寛解をもたらす可能性
がある抗ＰＶＲＩＧ抗体を投与される。
【０２７５】
５．敗血症の治療
少なくとも一部の実施形態に従い、抗ＰＶＲＩＧ抗体は敗血症の治療に使用される。本
明細書で使用される場合、「敗血症」または「敗血症関連状態」という用語は、敗血症、
重症敗血症、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、菌血症、敗血症（
Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、毒血症、敗血症性症候群を包含する。
【０２７６】
抑制タンパク質の上方調節は、敗血症における免疫抑制の根底にある重要な機序のうち
の１つとして最近浮上した。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１経路は、例えば、敗血症の転帰の決定
因子であり、抗菌免疫応答による効果と損害との間の微妙なバランスを調節しているよう
に見える。実験モデルにおける敗血症の間、腹膜マクロファージ及び血中単球はＰＤ−１
レベルを顕著に増加させ、これは、細胞障害の発現と関連した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ
２００９  ＰＮＡＳ  １０６：６３０３−６３０８）。同様に、敗血症性ショックを有
する患者においては、末梢Ｔ細胞上のＰＤ−１及び単球上のＰＤＬ−１の発現が劇的に上
方調節された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１  Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  １５：Ｒ７０
）。最近の動物研究により、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤＬ−１
経路の妨害が敗血症における生存率を改善したことが示された（Ｂｒａｈｍａｍｄａｍ  
ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８８：２３３−２４０、Ｚｈａｎ
ｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １４：Ｒ２２０、Ｃｈａｎｇ
ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １７：Ｒ８５）。同様に、抗Ｃ
ＴＬＡ４抗体によるＣＴＬＡ−４の妨害は敗血症における生存率を改善した（Ｉｎｏｕｅ
ｅｔ  ａｌ  ２０１１  Ｓｈｏｃｋ  ３６：３８−４４、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２
０１３  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １７：Ｒ８５）。総合すると、これらの発見は、
負の共刺激分子を含む抑制タンパク質の妨害が、敗血症の有害作用を予防するための可能
性のある治療的アプローチであることを示唆する（Ｇｏｙｅｒｔ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ
，Ｊ  Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．，８８（２）：２２５−２２６，２０１０）。
【０２７７】
一部の実施形態に従い、本発明は、抗ＰＶＲＩＧ抗体を、単独で、または敗血症の初期
の超炎症性段階におけるサイトカインストームを妨害する療法等の敗血症の治療に有効な
既知の治療薬と、及び／もしくは敗血症誘導性免疫抑抑制段階を克服するための免疫刺激
効果を有する療法と組み合わせて使用する、敗血症の治療を提供する。
【０２７８】
「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎ
ｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ｓｈｏｃｋ」（Ｄｅｌ
ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３９：
１６５−２２８）によって推奨される敗血症に対する治療処置の標準との組み合わせは、
その一部が以下に記載される。
【０２７９】
全ての可能性のある病原体に対する活性を有する広域抗生物質（細菌及び／または真菌
−治療は、敗血症が診断されるが、特定の病原体が特定されないときに開始する）−例、
セフォタキシム（Ｃｌａｆｏｒａｎ（登録商標））、チカルシリン及びクラブラン酸（Ｔ
ｉｍｅｎｔｉｎ（登録商標））、ピペラシリン及びタゾバクタム（Ｚｏｓｙｎ（登録商標
））、イミペネム及びシラスタチン（Ｐｒｉｍａｘｉｎ（登録商標））、メロペネム（Ｍ
ｅｒｒｅｍ（登録商標））、クリンダマイシン（Ｃｌｅｏｃｉｎ）、メトロニダゾール（
Ｆｌａｇｙｌ（登録商標））、セフトリアキソン（Ｒｏｃｅｐｈｉｎ（登録商標））、シ
プロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（登録商標））、セフェピム（Ｍａｘｉｐｉｍｅ（登録商
標））、レボフロキサシン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ（登録商標））、バンコマイシン、または
列挙した薬物の任意の組み合わせ。
昇圧剤：例：ノルエピネフリン、ドーパミン、エピネフリン、バソプレシン。
ステロイド：例：ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、またはフルドロコルチゾン（静
脈内または別の方法）。
変力療法：例：心筋機能障害を有する敗血症患者へのドブタミン。
【０２８０】
組み換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）、例えば、ドロトレコギンアルファ（
活性化）（ＤｒｏｔＡＡ）。
【０２８１】
β−遮断薬は、局所及び全身性炎症を更に軽減する。
【０２８２】
代謝介入、例えば、ピルビン酸塩、コハク酸塩、または高用量インシュリン置換。
【０２８３】
敗血症のための新規の有力な療法との併用：
ｓＰＬＡ２−ＩＩＡの選択的阻害剤（ＬＹ３１５９２０ＮＡ／Ｓ−５９２０等）。論理
的根拠：炎症中に放出されるＩＩＡ群分泌ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２−ＩＩＡ）は
重度の敗血症において増加し、血漿レベルは生存率に反比例する。
【０２８４】
リン脂質エマルション（ＧＲ２７０７７３等）。論理的根拠：臨床前研究及びエクスビ
ボ研究は、リポタンパク質が内毒素に結合して中和することを示し、実験動物研究は、リ
ポタンパク質が投与されたときの敗血症性死からの保護を実証する。内毒素中和は、リポ
タンパク質粒子中のリン脂質の量と相関する。
【０２８５】
抗ＴＮＦ−α抗体：論理的根拠：腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が、敗血症において
観察される多くの病態生理学的兆候及び症状を誘発する。
【０２８６】
抗ＣＤ１４抗体（ＩＣ１４等）。論理的根拠：ＣＤ１４等の上流認識分子が、発病にお
いて重要な役割を果たす。細菌細胞壁成分は、骨髄細胞上のＣＤ１４及び共受容体に結合
し、細胞活性化及び前炎症性メディエーターの産生をもたらす。抗ＣＤ１４モノクローナ
ル抗体（ＩＣ１４）が、内毒素血症の動物及びヒトモデルにおけるリポ多糖誘導応答を低
減することが示されている。
【０２８７】
トール様受容体（ＴＬＲ）及びそれらの下流シグナル伝達経路の阻害剤。論理的根拠：
感染微生物が、それらの表面上に高度に保存された巨大分子（例えば、リポ多糖、ペプチ
ドグリカン）を呈する。これらの巨大分子が免疫細胞の表面上でパターン認識受容体（ト
ール様受容体［ＴＬＲ］と呼ばれる）によって認識されると、宿主の免疫応答が開始され
る。これは、敗血症を特徴付ける過剰な全身性炎症応答に寄与し得る。いくつかのＴＬＲ
、具体的には、グラム陰性細菌外膜リポ多糖または内毒素の受容体であるＴＬＲ４の阻害
が、敗血症のための有力な療法として評価されている。ＴＬＲ４発現及び経路を標的とす
る種々の薬物が敗血症における治療可能性を有する（Ｗｉｔｔｅｂｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ  
２０１０  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ  １０  Ａｒ
ｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５６８３９６）。これらの中には、ＴＬＲ４を標的とする抗体、可溶
性ＴＬＲ４、スタチン（ロスバスタチン（登録商標）、シンバスタチン（登録商標）等）
、ケタミン、ニコチン類似体、エリトラン（Ｅ５５６４）、レサトルビド（ＴＡＫ２４２
）がある。加えて、クロロキン等の他のＴＬＲ拮抗物質、ＴＬＲ−２の中和抗体での阻害
（抗ＴＬＲ−２）。
【０２８８】
ＳＯＣＳ１に対する作用によるランソプラゾール（サイトカイン分泌のサプレッサー）
タラクトフェリンまたは組み換えヒトラクトフェリン。論理的根拠：ラクトフェリンは
、分泌及び免疫細胞に見られる抗感染及び抗抗炎症特性を有する糖タンパク質である。ヒ
トラクトフェリンの組み換え型であるタラクトフェリンアルファは、同様の特性を有し、
胃腸粘膜障壁の完全性の維持に重要な役割を果たす。タラクトフェリンは、敗血症の動物
モデル、及び重度の敗血症を有する患者における臨床試験における有効性を示した（Ｇｕ
ｎｔｕｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１３；４１（３）：
７０６−７１６）。
【０２８９】
乳脂肪球ＥＧＦ因子ＶＩＩＩ（ＭＦＧ−Ｅ８）−アポトーシス細胞の食作用を促進する
アポトーシス細胞と食細胞との間の架橋分子である。
【０２９０】
「コリン作動性抗炎症経路」の作用物質、例えば、ニコチン及び類似体。論理的根拠：
迷走神経の刺激により、サイトカイン、または免疫系メディエーターの産生が低減され、
炎症が遮断される。「炎症反射」と呼ばれるこの神経「回路」は、「コリン作動性抗炎症
経路」と呼ばれる機構である、マクロファージ上で発現されるニコチン性アセチルコリン
受容体（α７ｎＡＣｈＲ）のα７サブユニットに対する、神経終末から放出されるアセチ
ルコリンの特異的作用によって行われる。迷走神経刺激または薬理学的α７作用物質によ
るこの経路の活性化は、複数の全身性炎症モデル、ショックモデル、及び敗血症モデルに
おける組織損傷を予防する（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｊ  Ｎｉｐｐｏｎ
Ｍｅｄ  Ｓｃｈ．７９：４−１８、Ｈｕｓｔｏｎ  ２０１２  Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ
．１３：１８７−１９３）。
【０２９１】
インフラマソーム経路を標的とする治療薬。論理的根拠：インフラマソーム経路は、敗
血症における炎症応答に大いに寄与し、重要な要素は、局所炎症から有害な超炎症宿主応
答への移行の推進に関与する（Ｃｉｎｅｌ  ａｎｄ  Ｏｐａｌ  ２００９  Ｃｒｉｔ．Ｃ
ａｒｅ  Ｍｅｄ．３７：２９１−３０４、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｊ  
Ｎｉｐｐｏｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｈ．７９：４−１８）。
【０２９２】
幹細胞療法。論理的根拠：間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、損傷組織に在し、常在幹細胞を活
性化し、パラクリンシグナルを分泌して全身性及び局所炎症応答を制限し、免疫細胞を有
益に調節し、危険に曝された組織でのアポトーシスを低減して血管新生を刺激することに
よって組織治癒を促進し、かつ直接抗菌活性を呈する能力により、複数の有益な特性を呈
する。これらの効果は、敗血症動物モデルにおける臓器機能不全の軽減及び生存率の改善
と関連しており、ＭＳＣが有用な治療補助剤であり得るという証拠を提供している（Ｗａ
ｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１７３：１１３
−２６）。
【０２９３】
抗ＰＶＲＩＧ抗体と他の免疫調節薬、例えば、免疫刺激抗体、サイトカイン療法、免疫
調節薬物との併用。かかる薬剤は、特に敗血症誘導性低炎症及び免疫抑制状態等の免疫防
御（先天性及び／または適応性にかかわらず）が低下している状況下で、免疫応答性の増
加をもたらす。宿主免疫を増大させる治療薬による敗血症誘導性免疫麻痺の逆転は、二次
感染の発生を低減し、免疫抑制と立証された患者における転帰を改善し得る（Ｈｏｔｃｈ
ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３：２６０
−２６８、Ｐａｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．１７：１１８）。
【０２９４】
免疫刺激抗体は、免疫機能を調節することによって、即ち、他の抑制タンパク質を遮断
することによって、または共刺激タンパク質を増強することによって、免疫応答を促進す
る。敗血症の実験モデルは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、またはＣＴＬＡ−４等の阻害タンパ
ク質の抗体遮断による免疫刺激が、敗血症における生存率を改善したことを示しており（
Ｂｒａｈｍａｍｄａｍ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８８：２
３３−２４０、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １４
：Ｒ２２０、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １７：
Ｒ８５、Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１  Ｓｈｏｃｋ  ３６：３８−４４）、敗血症
誘導性免疫抑制の有害な影響を予防するための有力な療法としてのかかる免疫刺激剤を指
摘している（Ｇｏｙｅｒｔ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｊ  Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．８８（２
）：２２５−２２６，２０１０）。免疫刺激抗体としては、以下のものが挙げられる：１
）抑制免疫チェックポイントを標的とする拮抗抗体（抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（イピリムマ
ブ、トレメリムマブ等）、抗ＰＤ−１（ニボルマブＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１
０６／ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、ラムブロジルマブＭＫ−３４７
５等）、抗ＰＤＬ−１拮抗物質（ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４
７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ等）、ＩＭＰ−３２１等の抗ＬＡＧ−３）
、抗ＴＩＭ−３、抗ＢＴＬＡ、抗Ｂ７−Ｈ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＶＩＳＴＡを含む）。２
）免疫刺激タンパク質を増強する作用抗体（抗ＣＤ４０  ｍＡｂ（ＣＰ−８７０，８９３
、ルカツムマブ、ダセツズマブ等）、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３ウレ
ルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６等）、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（抗ＯＸ４０等）、抗ＧＩＴ
Ｒ  ｍＡｂ（ＴＲＸ５１８等）、抗ＣＤ２７  ｍＡｂ（ＣＤＸ−１１２７等）、及び抗Ｉ
ＣＯＳ  ｍＡｂを含む）。
【０２９５】
免疫エフェクター細胞を直接刺激し、かつ免疫応答を増強するサイトカイン：ＩＬ−２
、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１、ＩＬ−
２３、ＩＬ−２７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（インターフェロンα）、ＩＦＮβ、ＩＦＮ
γは、敗血症療法のための抗ＧＥＮ抗体と組み合わせて使用され得る。論理的根拠：サイ
トカインベースの療法は、患者自身の免疫系を刺激する直接的な試みを具現する。敗血症
の実験モデルは、ＩＬ−７及びＩＬ−１５等のサイトカインの投与により、Ｔ細胞生存能
が促進され、敗血症における生存率の改善がもたらされることを示している（Ｕｎｓｉｎ
ｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：３７６８−３７７９、Ｉ
ｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１４０１−１４０９）
。インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）は、単球の敗血症誘導性免疫麻痺をインビトロで逆
転させる。インビボ研究により、ＩＦＮγがヒトにおける免疫麻痺をインビボで部分的に
逆転させることが示された。ＩＦＮγ及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）は、敗血症を有する患者のエクスビボで刺激された白血球の免疫能力を回復
させる（Ｍｏｕｋｔａｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．２０１０；１４：
Ｐ１７、Ｌｅｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒ
ｅ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  １８６，ｐｐ  ８３８−８４５，２０１２）。
【０２９６】
サイモシンα１等の免疫調節薬物。論理的根拠：サイモシンα１（Ｔα１）は、先天性
免疫系及び適応性免疫系の両方の内因性調節因子としての役割を果たす天然に存在する胸
腺ペプチドである。これは、Ｂ型及びＣ型肝炎等のウイルス感染、ある特定の癌を含む免
疫機能障害に関連する疾患の治療のために、かつワクチン増強のために、世界中で使用さ
れている。注目すべきことに、免疫調節調査における最近の進展により、敗血症患者にお
けるＴａ１治療の有益な効果が示されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃ
ａｒｅ  ２０１３，１７：Ｒ８）。
【０２９７】
上述の敗血症療法において、好ましくは、敗血症を有するか、または悪性感染（例えば
、抗生物質または他の薬剤に耐性を示すもの）により敗血症を発症する危険性のある対象
には、本発明による免疫刺激抗ＰＶＲＩＧ抗体または抗原結合断片が投与され、この抗体
は、免疫に対する少なくとも１つのＰＶＲＩＧ媒介性効果、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞ま
たはＮＫ活性に対するその抑制効果及び／または炎症性サイトカインの産生に対するその
抑制効果に拮抗するか、あるいはＴＲｅｇ療法に対するＰＶＲＩＧの刺激効果を阻害し、
それにより感染細胞または病原体の枯渇または殺傷を促進し、対象の内因性免疫細胞によ
る病原体または感染細胞の強化された殺傷に基づいて疾患寛解をもたらす可能性がある。
敗血症が臓器不全を急速にもたらし得るという理由から、この実施形態では、抗ＰＶＲＩ
Ｇ抗体断片がインタクトな抗体よりも素早く敗血症及び感染部位に到達し得るため、イン
タクトな抗体ではなくＦａｂ等の抗ＰＶＲＩＧ抗体断片を投与することが有益であり得る
。かかる治療レジメンでは、この疾患が時に急速な罹患性であるため、抗体半減期につい
てはさほど懸念しなくてもよい。
【０２９８】
Ｂ．診断的使用
提供される抗ＰＶＲＩＧ抗体はまた、ＰＶＲＩＧを過剰発現する腫瘍の、撮像を含むイ
ンビトロまたはインビボでの診断において使用を見出す。しかしながら、本明細書で考察
するように、免疫腫瘍学的標的タンパク質としてのＰＶＲＩＧは、必ずしも癌細胞上では
なく、むしろ癌における免疫浸潤物内で過剰発現されることに留意されたい。一部の場合
、癌診断をもたらすのは、むしろ、作用の機序、Ｔ細胞及びＮＫ細胞等の免疫細胞の活性
化である。したがって、癌を診断するために抗ＰＶＲＩＧ抗体を使用することができる。
【０２９９】
特に、ＰＶＲＩＧを過剰発現しているために抗ＰＶＲＩＧ抗体によって診断され得る腫
瘍に浸潤している免疫細胞には、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子
宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、
肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平及び基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、
リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性
白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、及
び食道癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０３００】
一般に、診断は、いくつかの方法で行うことができる。一実施形態では、生検試料等の
患者からの組織を、一般的には標識されているＰＶＲＩＧ抗体と接触させ、その結果、抗
体が内因性ＰＶＲＩＧと結合するようにする。シグナルのレベルを、同じ患者または参照
試料のいずれかに由来する正常な非癌性組織のレベルと比較して、癌の存否を決定する。
生検試料は、固形腫瘍、血液試料（リンパ腫及び白血病、例えば、ＡＬＬ、Ｔ細胞リンパ
腫等に由来する）に由来し得る。
【０３０１】
一般に、本実施形態では、抗ＰＶＲＩＧは、例えば、当該技術分野で周知であるように
、蛍光光度計または他の光学検出系を使用して検出されるフルオロフォアまたは他の光標
識で標識する。代替的な実施形態では、二次標識抗体を、当該技術分野で既知であるよう
に、例えば、異なる哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）由来の抗ヒトＩｇＧ
抗体を使用して試料と接触させ、サンドイッチアッセイを形成する。あるいは、抗ＰＶＲ
ＩＧ  ｍＡｂを直接標識し（即ち、ビオチン）、当該技術分野の標識剤に向けられた二次
Ａｂによって検出を行うことができる。
【０３０２】
ＰＶＲＩＧの過剰発現が見られたら、治療を、本明細書で概説する本発明に従う抗ＰＶ
ＲＩＧ抗体の投与に進め得る。
【０３０３】
他の実施形態では、インビボ診断を行う。一般に、本実施形態では、抗ＰＶＲＩＧ抗体
（抗体断片を含む）を患者に注射し、撮像を行う。この実施形態では、例えば、抗体を、
光標識、またはｍＡｂ（断片を含む）の放射性標識であるガドリニウムキレート剤等のＭ
ＲＩ標識で一般的には標識する。
【０３０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、診断と治療との両方、または診断のみ
に使用される。抗ＰＶＲＩＧ抗体を診断と治療との両方に使用する場合、一部の実施形態
は、同じ抗体を両方に使用できる場合が一部はあるが、診断用抗体が治療用抗体と結合に
ついて競合しないように２つの異なるエピトープに対する２つの異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体
に依存する。例えば、これは、本明細書で概説するもの等の、異なるビンにある、例えば
、ＰＶＲＩＧ上で異なるエピトープと結合する抗体を使用して行うことができる。このた
め、診断用抗体及び治療用抗体を含む組成物が本明細書に含まれ、一部の実施形態では、
診断用抗体は本明細書に記載のように標識される。加えて、治療用及び診断用抗体の組成
物は、本明細書に概説する他の薬物と共投与することもできる。
【０３０５】
診断における使用に特に有用な抗体としては、ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００
３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００
９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１
３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１
８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２
３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３
６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４
９、及びＣＰＡ．７．０５０を含む、列挙する抗体、または変異体配列を有するＣＤＲを
利用する抗体、またはＣＰＡ．７．００１〜ＣＰＡ．７．０５０のうちのいずれかと結合
について競合するもの、特に、ＰＶＲＩＧに結合し、かつ受容体結合を妨害するものが挙
げられるが、これらに限定されない。加えて、ＣＰＡ．７．０１６、ＣＡＰ．７．０２０
、ＣＰＡ．７．０２８、ＣＰＡ．７．０３０、ＣＰＡ．７．０３８、ＣＰＡ．７．０４４
、及びＣＰＡ．７．０４５を含む、結合するが妨害はしないものも使用することができる
。
【０３０６】
当業者には理解されるように、エクスビボまたはインビトロアッセイには、マウス抗体
を使用することができるため、他の形式にあるＣＤＲセットを含む、以下のうちのいずれ
かに由来する可変重及び軽ドメインを診断に使用することができる：ＣＨＡ．７．５０２
、ＣＨＡ．７．５０３、ＣＨＡ．７．５０６、ＣＨＡ．７．５０８、ＣＨＡ．７．５１０
、ＣＨＡ．７．５１２、ＣＨＡ．７．５１４、ＣＨＡ．７．５１６、ＣＨＡ．７．５１８
、ＣＨＡ．７．５２０．１、ＣＨＡ．７．５２０．２、ＣＨＡ．７．５２２、ＣＨＡ．７
．５２４、ＣＨＡ．７．５２６、ＣＨＡ．７．５２７、ＣＨＡ．７．５２８、ＣＨＡ．７
．５３０、ＣＨＡ．７．５３４、ＣＨＡ．７．５３５、ＣＨＡ．７．５３７、ＣＨＡ．７
．５３８．１、ＣＨＡ．７．５３８．２、ＣＨＡ．７．５４３、ＣＨＡ．７．５４４、Ｃ
ＨＡ．７．５４５、ＣＨＡ．７．５４６、ＣＨＡ．７．５４７、ＣＨＡ．７．５４８、Ｃ
ＨＡ．７．５４９、及びＣＨＡ．７．５５０由来。
【０３０７】
多くの実施形態では、診断用抗体は標識される。本明細書における「標識される」は、
本明細書に開示の抗体に、スクリーンまたは診断手順における検出を可能にするために１
つ以上の元素、同位体、または化学的化合物が結合することを意味する。一般に、標識は
、いくつかのクラスに分けられる：ａ）抗体によって認識される融合パートナーとして組
み込まれるエピトープであり得る、免疫標識、ｂ）放射性または重同位体であり得る、同
位体標識、ｃ）蛍光及び比色色素、または他の標識方法を可能にするビオチン等の分子を
含み得る、小分子標識、ならびにｄ）粒子（超音波標識用のバブルを含む）または身体撮
像を可能にする常磁性標識等の標識。標識は、当該技術分野で既知であるように、いずれ
の位置で抗体に組み込んでもよく、またタンパク質発現中にインビトロまたはインビボで
組み込んでもよい。
【０３０８】
診断は、以下に記載のように全身撮像を可能にする診断用抗体の投与によってインビボ
で、あるいは患者から取り出した試料においてインビトロで行うことができる。本文脈に
おける「試料」は、体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣分泌物、汗、な
らびに精液を含むがこれらに限定されない）、ならびに関連組織の生検から得られるもの
等の組織試料を含むがこれらに限定されない、任意の数のものを含む。
【０３０９】
一部の実施形態では、インビボ撮像が行われ、これには、超音波、ＣＴスキャン、Ｘ線
、ＭＲＩ、及びＰＥＴスキャン、ならびに身体表面付近の腫瘍に対して光標識を使用する
もの等の光学技法が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１０】
ＰＶＲＩＧに関連する疾患のインビボ撮像は、任意の好適な技法によって行い得る。例
えば、９９Ｔｃ標識、または別の．ベータ．線放射同位体による標識を使用して、抗ＰＶ
ＲＩＧ抗体を標識してもよい。この技法の変形は、ガンマカメラ技法を通した撮像を改善
するために磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の使用を含んでもよい。
【０３１１】
一実施形態では、本発明は、抗ＰＶＲＩＧ抗体を検出促進剤にコンジュゲートし、コン
ジュゲートした抗体を血流への注射等によって宿主に投与し、宿主における標識された抗
体の存在及び位置をアッセイする、インビボ撮像法を提供する。この技法及び本明細書で
提供する任意の他の診断方法によって、本発明は、ヒト患者またはヒト患者から採取した
生体試料における疾患に関係する細胞の存在についてスクリーニングするための方法を提
供する。
【０３１２】
診断用撮像のために、放射性同位体を、直接的に、または媒介官能基を使用することに
よって間接的に、抗ＰＶＲＩＧ抗体に結合させてもよい。有用な媒介官能基には、エチレ
ンジアミン四酢酸塩及びジエチレントリアミン五酢酸キレート剤などのキレート剤（例え
ば、米国特許第５，０５７，３１３号を参照）が含まれ、放射性同位体コンジュゲート抗
ＰＶＲＩＧ抗体を伴う診断アッセイにおいて、患者に送達されるコンジュゲート抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体の用量は、典型的には、検出及び正確な測定を可能にすることになる、最小の半
減期、最小の体内保持、及び最小量の同位体の最良の組み合わせのための同位体の選択に
よって、可能な限り低いレベルで維持する。
【０３１３】
放射性同位体及び放射線不透過性薬剤に加えて、診断方法は、色素にコンジュゲートさ
れる抗ＰＶＲＩＧ抗体（ビオチン−ストレプトアビジン複合体によるもの等）、造影剤、
蛍光化合物または分子、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性
イオン）（例えば、ＭＲＩ技法及びＭＲＩ増強剤抗体にコンジュゲートした抗体の調製を
説明している、米国特許第６，３３１，１７５号を参照されたい）を使用して行い得る。
かかる診断／検出薬剤は、磁気共鳴画像法における使用のための薬剤、及び蛍光化合物か
ら選択され得る。
【０３１４】
抗ＰＶＲＩＧ抗体に放射性金属または常磁性イオンを充填するためには、イオンと結合
するための多数のキレート基が結合する尾の長い試薬と反応させることが必要であり得る
。かかる尾は、ポリリジン、多糖、または例えば、ポルフィリン、ポリアミン、クラウン
エーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的に有用であることが知
られている同様の基等のキレート基が結合することができるペンダント基を有する他の誘
導体化したまたは誘導体化可能な鎖等のポリマーであってもよい。
【０３１５】
キレート剤は、標準的な技法を使用して抗ＰＶＲＩＧ抗体に結合させ得る。キレート剤
は、通常、免疫反応性の損失が最小であり、凝集及び／または内部架橋が最小である、分
子への結合の形成を可能にする基によって抗ＰＶＲＩＧ抗体に連結する。
【０３１６】
有用である可能性がある組み合わせの例としては、放射性撮像には、１２５Ｉ、１２３
Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、９９Ｔｃ、９４Ｔ
ｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、５Ｏ、及び７６Ｂｒ等の６０〜４，０００ｋｅＶの一般的なエネル
ギー範囲にある診断用同位体と共に使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡ及びそのモノメチ
ル及びシクロヘキシル類似体が挙げられる。
【０３１７】
標識には、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識
、超音波造影剤、及び光活性剤が含まれる。かかる診断剤は周知であり、任意のかかる既
知の診断剤を使用し得る。診断剤の非限定的な例としては、放射性核種、例えば、１１０
Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６
７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１
２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１
Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２
Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他の．ガンマ．−、．ベータ
．−、または陽電子放射体を挙げることができる。
【０３１８】
役立つ常磁性イオンとしては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、
鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩＩ）、銅（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ
）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナ
ジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩ
Ｉ）またはエルビウム（ＩＩＩ）を挙げることができ、金属造影剤としては、ランタン（
ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、またはビスマス（ＩＩＩ）を挙げることができる
。
【０３１９】
超音波造影剤は、ガス充填リポソーム等のリポソームを含み得る。放射線不透過性薬剤
は、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物といった化合物から選択され
得る。
【０３２０】
これら及び同様のキレート剤は、マンガン、鉄、及びガドリニウム等の非放射性金属と
複合体化される場合に、抗ＰＶＲＩＧ抗体と関連するＭＲＩ診断方法に有用であり得る。
ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡ等の大環状キレート剤は、種々の金属及び放射性金属
、特に、それぞれ、ガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共にする場合に役立
つ。かかる金属−キレート剤複合体は、目的の金属に対して環サイズを調整することによ
って非常に安定にし得る。２２３Ｒａ等の安定して結合した核種のために目的とする大環
状ポリエーテル等の他の環種のキレート剤も、診断方法において好適である。
【０３２１】
このため、本発明は、抗ＰＶＲＩＧ抗体コンジュゲートが、造影剤（磁気共鳴画像法、
コンピュータ断層撮影法、または超音波造影増強剤用のもの等）、または例えば、．ガン
マ．−、．ベータ．−、．アルファ．−、オージェ電子−、もしくは陽電子放射同位体で
あり得る放射性核種とコンジュゲートされる、診断用抗ＰＶＲＩＧ抗体コンジュゲートを
提供する。
【０３２２】
抗ＰＶＲＩＧ抗体はまた、例えば、特定の細胞、組織、または血清中で目的の抗原の発
現を検出することにおいて有用であり得る。診断用途には、抗体は、典型的に、インビト
ロアッセイのために検出可能な部分で標識されることになる。当業者には理解されるであ
ろう通り、インビトロ試験における使用に好適な標識は豊富にある。本発明のこの態様に
おける使用に好適な染料には、ユーロピウム及びテルビウムのものを含む蛍光ランタニド
複合体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオジン、エリスロシ
ン、クマリン、メチル−クマリン、量子ドット（「ナノ結晶」とも称される；参照により
本明細書に組み込まれる米国第０９／３１５，５８４号を参照）、ピレン、マラサイト（
Ｍａｌａｃｉｔｅ）グリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａ
ｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、アレク
サ色素（Ａｌｅｘａ、フィコエリトシン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）、ボディパイ、及
び参照により本明細書に明示的に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに
よるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの第６版に記載されている他
のものを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２３】
その後、染色した組織を、腫瘍中のＰＶＲＩＧ関連ペプチドの量の指標として計数して
放射能について評価してもよい。かかる技法の使用によって得た画像を使用して、例えば
、ＰＶＲＩＧを侵襲性癌細胞の存在についてのバイオマーカーとして使用する背景におい
て、患者、哺乳動物、または組織中のＰＶＲＩＧの生体内分布を評価してもよい。
【実施例】
【０３２４】
２０１５年２月１９日出願のＵＳＳＮ、ＵＳＳＮ  ６２／１１８，２３５、及び２０１
５年３月３１日出願のＵＳＳＮ  ６２／１４１，１６８に対する優先権を主張する、「Ｐ
ＶＲＩＧ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＭＥ
ＮＴ」と題された２０１６年２月１９日出願のＵＳＳＮ  ＸＸを参照し、これらの全ては
、全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０３２５】
実施例１：ＰＶＲＩＧタンパク質の発現解析
実施例１Ａ：
ＧＤＳ３１１３データセット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇ
ｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ＧＤＳｂｒｏｗｓｅｒ？ａｃｃ＝ＧＤＳ３１１３）を解析して、リン
パ器官特異的パターンを有する遺伝子を特定した。ＰＶＲＩＧを、末梢血、骨髄、脾臓、
リンパ節、扁桃腺、及び胸腺を含む一次及び二次リンパ器官における高い発現に起因して
、リンパ球特異的であるとして特定した（図２）。他の組織型は、陰性であったか、また
はバックグラウンドレベルの発現を示した。免疫細胞の全集団内のどの特定の細胞型がＰ
ＶＲＩＧを発現するかを調査するために、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂ
ｕｓ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧＥＯ）からの追加のデータセット
を、本明細書の「方法」の節に記載するように解析した。末梢血及び骨髄に由来する免疫
細胞集団に対して解析を行った。ＰＶＲＩＧは、ＣＤ８  Ｔ細胞ナイーブ、エフェクター
、及びメモリーを含む、Ｂ細胞行数及びＴ細胞行数の両方においてリンパ球中で発現され
た（図３）。加えて、ＰＶＲＩＧは、ＮＫ細胞中で発現され、ｉＮＫＴ集団中で最も高い
発現を有した（図４）。リンパ球のｉＮＫＴ集団は、実験モデルにおいて合成の作用物質
で刺激されると、抗腫瘍免疫の強力な活性化因子として作用する。しかしながら、一部の
状況では、ｉＮＫＴ細胞は、抗腫瘍免疫のサプレッサー及び調節因子として作用し得る（
Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；２０１２：７２０８０３）。更に、ｉＮ
ＫＴ細胞に基づく免疫療法の早期の臨床試験において、リガンドパルス抗原提示細胞治療
及び／またはインビトロで活性化されたｉＮＫＴ細胞の注入が肺癌及び頭頚部癌において
安全であり、耐容性良好であったことを示した（Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  
Ａｕｇ；１４０（２）：１６７−７６．）。
【０３２６】
ＰＶＲＩＧ発現に関する要な疑問は、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が腫瘍微小環境に
おいてＰＶＲＩＧの発現を保持するかどうかであった。濾胞性リンパ腫、乳癌、及び結腸
癌からのＴＩＬの発現データの解析により、腫瘍に浸潤するＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧの
明白な発現を示した。結腸癌の例では、発現がＣＤ４５陽性集団（白血球特異的マーカー
）のみで見出され、ＥＰＣＡＭ陽性集団（上皮特異的マーカー）またはＣＤ４５陰性ＥＰ
ＣＡＭ陰性（間質細胞集団）では見出されないため、免疫浸潤性細胞への特異性が見られ
た。ＣＤ４５はリンパ球特異的マーカーではないが、他の発現の記述は、それがリンパ球
集団上で発現されることを暗示する（図５Ａは結腸癌、図５Ｂは乳癌、図５Ｃは濾胞性リ
ンパ腫）。
【０３２７】
本明細書で示すｍＲＮＡ発現データは、ＰＶＲＩＧがリンパ球及び腫瘍浸潤性リンパ球
（ＴＩＬ）において発現されることを示す。これらの結果は、ＰＶＲＩＧ阻害活性と併せ
て、Ｔ細胞における分子の阻害的役割を示し、ＰＶＲＩＧへの阻害抗体がＴＩＬでのＰＶ
ＲＩＧの抑制的役割を高め、それによりＴＩＬが癌に対する免疫応答を誘導できるように
なることを示唆する。示される作用機序は腫瘍細胞に対する直接的な効果ではなく腫瘍に
浸潤するＴＩＬを対象とするため、免疫浸潤を伴う任意の癌がＰＶＲＩＧ阻害抗体を使用
する治療の候補である。
【０３２８】
方法：生データをＧＥＯサイトからＳＯＦＴフォーマットでダウンロードした。生デー
タがＭＡＳ５フォーマットであった場合は、データを操作せずに取得した。データがＬｏ
ｇ  ＭＡＳ５であった場合には、データを線形データに変換した。データがＲＭＡフォー
マットであった場合は、ＣＥＬファイル（生データ）をダウンロードし、ＭＡＳ５を使用
して再解析した。生のＣＥＬファイルを利用することができなかった場合、ＲＭＡフォー
マットを使用した。
【０３２９】
次に、データを、Ａｆｆｙデータについての９５パーセンタイルに従って乗法によって
正規化した。解析したデータセット：ＧＳＥ４９９１０、ＧＳＥ４７８５５、ＧＳＥ３９
３９７、ＧＳＥ３６７６５、ＧＳＥ２７９２８。
【０３３０】
実施例１Ｂ
トランスクリプトーム参照をＵＣＳＣ既知遺伝子モデル（ｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎ
ｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｄａｔａｂａ
ｓｅ／ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ．ｔｘｔ．ｇｚ）に基づいて生成した。全てのＲＮＡシーケン
シングリードをまずトランスクリプトーム配列に整列させた。アイソフォームは多くのエ
クソンを共有するため、このアラインメントにより非固有マッピングを可能にした。次に
、トランスクリプトームマッチに基づいて各リードにゲノム座標及びエクソンジャンクシ
ョンを割り当てた。残りのマッピングされていないリードを、１つ以上のエクソンジャン
クションを考慮することによってゲノムに直接整列させた。最後に、リード数をＢｏら（
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１０，２６（４）：４９３−５００）によって説明
されているように正規化し、Ｔｒａｐｎｅｌｌら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０
１０  Ｍａｙ；２８（５）：５１１−５）によって説明されているように遺伝子発現値に
変換した。
【０３３１】
図６に示すように、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥ
ｘ）データ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｇ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ
４５／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｇ．２６５３．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｔｅｘｐ
ｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／）に基づくと、ＰＶＲＩＧは、主に血液細胞において、
種々の正常な組織においてはより少ない程度に、発現される。同じ結果がＴｈｅ  Ｃａｎ
ｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏ
ｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からの癌性組織において観察され、ここでは、高い発現がＢ−
細胞リンパ腫及びＡＭＬのような血液の癌において見られる（図７）。遺伝子発現シグネ
チャを、発現パターンがＰＶＲＩＧと高度に相関した遺伝子を特定することによって、Ｇ
ＴＥｘ及びＴＣＧＡデータを使用して種々の癌及び正常な組織について生成した。
【０３３２】
相関分析を腫瘍型ごとに実施し、両方の遺伝子が同じ腫瘍型において少なくとも５０試
料で０ＲＰＫＭを超えて発現された相関のみを考慮に入れた。これらの遺伝子発現シグネ
チャを、相互作用タンパク質、経路、及び疾患遺伝子の濃縮度について試験した。エンリ
ッチメントｐ値を各腫瘍型について計算し、平均−ｌｏｇ（ｐ値）を使用してスコアリン
グ遺伝子セットを順位付けした。図８に示すように、リンパ球及びＴ−細胞の明確なシグ
ネチャが種々の癌において観察された。例えば、タンパク質相互作用において最上位のス
コアを得た遺伝子はＩＬ２であり、これは、ＩＬ２と相互作用することが知られている遺
伝子が、大部分の癌にわたって偶然に予想を上回ってＰＶＲＩＧと相関することを意味す
る。更なる分析により、癌組織におけるＰＶＲＩＧ発現が通常より高いことが示された。
図５では、ＰＶＲＩＧの平均発現レベルは大部分の正常な固体組織にわたって１を下回っ
たが、図６では、多くの癌において明らかに１より高かった。例として、図７で並べて比
較すると、黒色腫ＰＶＲＩＧは正常な皮膚より高く発現された（図９）。癌における過剰
発現の源を更に特性評価した。ＰＶＲＩＧは、Ｔ細胞において高度に発現され、癌におけ
るＴ細胞のマーカーと高度に相関した。図１０では、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８とのＰ
ＶＲＩＧ相関を、３種の癌、即ち、肺腺癌、結腸腺癌、及び黒色腫における例として示す
。加えて、ＰＶＲＩＧは、Ｔ細胞上で発現されることが知られている癌における免疫療法
のための有効な標的であるＰＤ１と高度に相関する（図１０）。
【０３３３】
これらの遺伝子発現シグネチャを、相互作用タンパク質、経路、及び疾患遺伝子の濃縮
度について試験した。図８に示すように、リンパ球及びＴ−細胞の明確なシグネチャが種
々の癌において観察された。ＰＶＲＩＧのＰＤ１との相関を更に分析すると、乳、肺、膵
臓、及び腎臓を含む種々の腫瘍においてそれらの発現間の高い相関を示した（表２）。Ｐ
Ｄ−１及びＰＶＲＩＧの両方が、活性化されたＴ細胞上で高度に発現される。ＰＶＲＩＧ
は、癌におけるＴ細胞マーカー、即ち、ＣＤ８Ａ、ＣＤ４、及びＣＤ３Ｇとの高い相関を
示した（図１３）。総合すると、これらのデータは、ＰＶＲＩＧの癌発現が腫瘍浸潤性リ
ンパ球と関連付けられることを示す。
【０３３４】
方法：遺伝子相関：ＦＰＫＭ値をｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋０．１）に変換した。値が遺伝
子のうちの少なくとも１つについてｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋０．１）＜ｌｏｇ２（０．１）
を満たす試料を除外した。回帰線についてのピアソン積率相関係数（ＰＣＣ）及び最小二
乗推定量を２つのリスト（遺伝子当たり１リスト）について計算した。値が０．５よりも
小さいＰＣＣ、ならびに２つの遺伝子の発現レベル間の線形相関を試験した際に有意な値
を示さなかったＰＣＣを除外した。
【０３３５】
遺伝子エンリッチメント解析：経路、相互作用、及び疾患データを、ＧｅｎｅＧｏ  Ｍ
ｅｔａｃｏｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｇｅｎｅｇｏ．ｃｏｍ）、Ｒｅａｃｔ
ｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）、及びＫＥＧＧ経路（ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）から得た。所与の遺伝子リスト内で
濃縮度の高い経路及びプロセスを特定するために、超幾何学に基づくエンリッチメント解
析を実行した。超幾何学的ｐ値を、Ｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊ
ｅｃｔ．ｏｒｇ）をコマンドｐｈｙｐｅｒ（ｘ−１、ｍ、ｎ−ｍ、ｋ、及びｌｏｗｅｒ．
ｔａｉｌ＝ＦＡＬＳＥ）で使用して計算した。ここで、ｘは経路のメンバーである遺伝子
リストからの遺伝子の数、ｍは経路中の遺伝子の数、ｎは全経路中の固有の遺伝子の総数
、及びｋは少なくとも１つの経路中に存在したリストからの遺伝子の数である。結果とし
て得られるｐ値は、遺伝子リストのサイズを所与として、特定経路についての偶然による
濃縮の尤度を示す。  同じ解析手順を、所与の遺伝子と相互作用する全ての遺伝子を経路
として扱った遺伝子相互作用、または全ての関連する遺伝子を経路として扱った疾患と関
連する遺伝子に適用した。図６４を参照されたい。
【０３３６】
ＰＶＲＩＧ発現は癌における疲弊したＴ細胞と関連付けられた。以下４つのマーカー：
ＣＤ８、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及びＴＩＧＩＴの高い（第４の四分位）発現を有するＴ
ＣＧＡからの癌試料を選択した。次に、癌試料を、高レベル、変化なし、及び低レベルの
４つのマーカーの組み合わせた発現に分けた。ＰＶＲＩＧは、低い発現マーカーのいずれ
においても検出されなかった（疲弊したＴ細胞が少ないかまたは無い）。高レベルの疲弊
したＴ細胞と関連する腫瘍の大部分が高レベルのＰＶＲＩＧを発現した（図２２）。
【０３３７】
実施例１Ｃ：
ヒト及び非ヒト霊長類ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ、ならびに細胞株及び一次白血球中のタンパ
ク質を評価した。
【０３３８】
プロトコル
操作された過剰発現細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、抗ヒトＰＶＲＩＧ
抗体の特異性を評価した：ＨＥＫ  親及びＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞。これらの
細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋グルタマック
ス（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞については、０．５
ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）も、陽性選択のために培地に添加した。Ｆ
ＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり５０，０００〜１
００，０００細胞を９６ウェルプレートに播種した。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ヒトＩｇＧ
１、ｈＩｇＧ１）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で、または３０分
〜１時間の氷上での３０ｕｇ／ｍｌから開始した８点滴定シリーズとして添加した。滴定
シリーズは、１：３または１：３．３倍いずれかの連続希釈として実施した。ＦＡＣＳ  
Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを得て、Ｆｌｏｗ
Ｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使用して
解析した。
【０３３９】
ヒト細胞株のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体の発現及
び特異性を評価した：Ｊｕｒｋａｔ、ＣＡ４６、ＮＫ−９２、ＯＶ−９０、ＨｅｐＧ２、
及びＮＣＩ−Ｈ４４１。Ｊｕｒｋａｔ、ＣＡ４６、及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、ＲＰＭ
Ｉ培地＋１０％のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ピル
ビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）
中で培養した。ＮＫ−９２細胞を、ＲＰＭＩ培地＋２５％のウシ胎仔血清、グルタマック
ス、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び５
００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）中で培養した。ＯＶ−９０細胞を、
最終濃度１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含
有するＭＣＤＢ  １０５培地（Ｓｉｇｍａ）と、最終濃度１５％のウシ胎仔血清を有する
最終濃度２．２  ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有するＭｅｄｉａ  １９９（Ｓｉｇｍａ
）との１：１の混合物中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎仔血
清＋グルタマックス中で培養した。ＦＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採
取し、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００細胞を９６ウェルプレートに播種した
。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｈＩｇＧ１）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍ
ｌ）で、または３０分〜１時間の氷上における３０ｕｇ／ｍｌから開始した８点滴定シリ
ーズとして添加した。滴定シリーズは、１：３または１：３．３倍いずれかの連続希釈と
して実施した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏ及び
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０３４０】
ナイーブヒト一次白血球のＦＡＣＳ解析：一次白血球を末梢血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂ
ｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）のＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配単離によって
得た。単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）としての白血球を、１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉ
ｇｍａ）、９０％のウシ胎仔血清混合物中１×１０７〜５×１０７細胞／ｍｌの密度で液
体窒素中で凍結させた。ＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧのタンパク質発現を評価するために、ヒ
ト抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計した。抗ヒ
トＰＶＲＩＧ抗体（ｈＩｇＧ１）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で
、または一部の場合には３０分〜１時間の氷上における１０もしくは３０ｕｇ／ｍｌから
開始した８点滴定シリーズとして添加した。
【０３４１】
端的には、抗体カクテル混合物を、事前のＦｃ  受容体妨害及び生死染色（Ａｑｕａ  
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）時に５×１０５  〜１×１
０６細胞／ウェルで播種した蘇生したＰＢＭＣに添加した。抗体カクテルを、氷上で３０
分〜１時間、ＰＢＭＣと共にインキュベートした。次に、ＰＢＭＣを洗浄し、ＦＡＣＳ  
Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用するＦＡＣＳによってデータを得た。ＦｌｏｗＪｏ及びＰｒｉｓ
ｍソフトウェアを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットには、ＣＤ５６薄
暗ＮＫ細胞、ＣＤ５６明ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、非在来型Ｔ細胞（
例えば、ＮＫＴ細胞及びγδＴ細胞）、Ｂ細胞、及び単球が含まれた。
【０３４２】
活性化されたヒトエフェクターリンパ球のＦＡＣＳ解析：一部の場合には、ＰＶＲＩＧ
の発現を、全ＰＢＭＣから単離したかまたは全ＰＢＭＣ調製物中の活性化されたエフェク
ターリンパ球サブセット上で評価した。エフェクターリンパ球を、サイトカインの組み合
わせ、抗体及びサイトカインの組み合わせ、または病原性産物を用いて刺激した。活性化
された細胞上のＰＶＲＩＧ発現のＦＡＣＳ解析を、ナイーブ一次白血球について上述した
ように行った。
【０３４３】
刺激されたＮＫ細胞上のＰＶＲＩＧ発現を研究するために、ＣＤ５６＋細胞を単離し、
ＮＫ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％のウシ胎仔血清、グルタマックス、ペニシリン／ストレ
プトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びベータ−メルカプトエタノ
ール［Ｇｉｂｃｏ］）において１〜３日間、サイトカインの種々のカクテル中で培養した
。ＮＫ細胞を、製造業者の指示に従って抗ヒトＣＤ５６＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ
）のいずれかを使用して選別した。ＮＫ細胞を刺激するために使用したサイトカインのカ
クテルは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２／ＩＬ−１２、ＩＬ−２／ＩＬ
−１５、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５を含んだ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０３４４】
刺激されたＴ細胞上のＰＶＲＩＧ発現を研究するため、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞
を、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用
して単離した。単離した細胞を、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％のウシ胎仔血清、グルタ
マックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム）
中で種々の活性化条件の存在下で３日間培養した。単離したＴ細胞を刺激するために使用
した条件は、ＩＬ−２、またはＴ細胞をある特定の表現型（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔ
ｈ１７、及びＴ  調節表現型）に駆動するサイトカインカクテルを用いたヒトダイナビー
ズ（ｄｙｎａｂｅａｄ）刺激（ＣＤ３／ＣＤ２８抗体に結合したビーズ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。Ｔｈ１駆動サイトカインは、組み換えＩＬ−１２（Ｒ＆
Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び抗ＩＬ−４中和抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）である。Ｔｈ２駆
動条件は、組み換えＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び抗ＩＦＮ−ガンマ中和抗体
（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）である。Ｔｈ１７駆動条件は、組み換えＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦ−ベータ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、ならびに抗ＩＬ−４及び抗  ＩＦＮγ中和抗体である。Ｔ調節駆動条件は
、組み換えＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−２、ならびに抗ＩＬ−４及び抗ＩＦＮγ中和抗体で
ある。
【０３４５】
代替的に、活性化されたＴ細胞も、３日間のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）
抗原（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）との刺激された全
ＰＢＭＣ培養において、またはＣＤ４＋Ｔ細胞を２もしくは５日間同種樹状細胞と共培養
する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、解析した。
【０３４６】
ヒト極性単球のＦＡＣＳ解析：ＰＶＲＩＧ発現を、極性単球に由来する樹状細胞上で評
価した。この場合、ＣＤ１４＋細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒト単球富化を製造業者の
指示に従って使用して富化した。ＣＤ１４＋細胞富化の後、単球を、ＲＰＭＩ＋１０％の
ウシ胎仔血清、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピ
ルビン酸ナトリウム、及びベータ−メルカプトエタノール中での４日間のＧＭ−ＣＳＦ（
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）との培養時に、樹状
細胞に極性化した。
【０３４７】
ｑＰＣＲによるヒト細胞株及び白血球のＲＮＡ発現解析：ｑＰＣＲによってＲＮＡ発現
について評価した細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＡ４６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、及びｅｘ
ｐｉ  ２９３細胞であった。Ｊｕｒｋａｔ、ＣＡ４６、Ｒａｊｉ、及びＤａｕｄｉ細胞を
、ＲＰＭＩ培地＋１０％のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸、ピルビン酸
ナトリウム、及びペニシリン／ストレプトマイシン中で培養した。Ｅｘｐｉ  ２９３細胞
を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ＋グルタマックス中で培養した。ＯＶ−９０、ＨｅｐＧ２
、及びＮＣＩ−Ｈ４４１  ＲＮＡを、癌細胞株アトラスのバイオインフォマティクススク
リーンによって解析した。ｑＰＣＲによってＲＮＡ発現について評価した細胞株について
、細胞を対数増殖期に採取し、１，０００，０００細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、３
５０ｕｌのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解した。ＲＬＴ緩衝液中で溶解した細胞
を使用まで−８０℃で保管した。
【０３４８】
ＲＮＡ発現について評価した白血球は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８
＋Ｔ細胞、及びＣＤ１４＋単球であった。細胞集団を、ヒトＣＤ５６＋、ＣＤ４＋、ＣＤ
８＋、及びＣＤ１４＋陽性セレクションキットを製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔ
ｅｃ）の指示に従って使用して単離した。分類後、細胞を３５０ｕｌのＲＬＴ緩衝液中で
溶解し、使用まで−８０℃で保管した。一部の場合には、活性化されたＰＢＭＣサブセッ
ト（活性化条件は上で概説した）を、培養物から採取し、３５０ｕｌのＲＬＴ緩衝液中で
溶解し、使用まで−８０℃で保管した。
【０３４９】
使用日に、ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニキットを製造業者の指示に従って使用して、溶
解した細胞から生成した。ｃＤＮＡを、高性能ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して生成した
。ｃＤＮＡを使用するｑＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎプライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  ｆａｓｔ  ａｄｖａｎｃ
ｅｄ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用して行った。使用したＰＶＲＩＧプライマーセットはＴ
ａｑｍａｎカタログ番号：Ｈｓ０４１８９２９３＿ｇ１であった。使用したベータ−アク
チンハウスキーピングプライマーセットはＴａｑｍａｎカタログ番号：Ｈｓ０１０６０６
６５＿ｇ１であった。転写産物の発現をＣｔ値の定量化によって評価し、相対的発現を２
（−ΔΔＣｔ）法によって計算した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｔｅｐ
Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ機器上でデータを得た。
【０３５０】
カニクイザルＰＶＲＩＧ操作過剰発現細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、
抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃＰＶＲＩＧ）との交差活性を評価し
た：ｅｘｐｉ親及びｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ過剰発現細胞。これらの細胞を、ＤＭＥＭ＋
１０％のウシ胎仔血清＋グルタマックス中で培養した。ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ一過性過
剰発現細胞を、Ｎｅｏｎトランスフェクション系を使用して、ｃＰＶＲＩＧ  ＤＮＡの親
Ｅｘｐｉ細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。ＦＡＣＳ解析のために、ｅ
ｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞をトランスフェクションから１〜３日後に使用した。Ｅｘｐｉ
細胞を対数増殖期から採取した。各種類、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個
の細胞を９６ウェルプレートに播種した。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｈＩｇＧ１）及びその
対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で、または３０分〜１時間の氷上における１
００ｕｇ／ｍｌから開始した８点滴定シリーズとして添加した。滴定シリーズは、１：３
または１：３．３倍いずれかの連続希釈として実施した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを
使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏ及びＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０３５１】
ナイーブ一次カニクイザル白血球のＦＡＣＳ解析：一次カニクイザル（ｃｙｎｏ）白血
球を、発現解析前２４時間以内に採血した新鮮血から得た。血液はＢｉｏｒｅｃｌａｍａ
ｔｉｏｎから得た。カニクイザルＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧのタンパク質発現を評価するた
めに、ヒト抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計し
た。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｈＩｇＧ１）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／
ｍｌ）で添加した。
【０３５２】
端的には、抗体カクテル混合物を、事前のＦｃ  受容体妨害及び生死染色時に５×１０
５  〜１×１０６細胞／ウェルで播種したＰＢＭＣに添加した。抗体カクテルを、氷上で
３０分〜１時間、ＰＢＭＣと共にインキュベートした。次に、ＰＢＭＣを洗浄し、ＦＡＣ
Ｓ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用するＦＡＣＳによってデータを得た。Ｐｒｉｓｍソフトウェ
アを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットは、ＣＤ１６＋リンパ球、ＣＤ
１４＋／ＣＤ５６＋単球／骨髄細胞、及びＣＤ３＋Ｔ細胞を含んだ。
【０３５３】
一次カニクイザル白血球のＲＮＡ発現解析：ＲＮＡ発現について評価した一次白血球は
、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋、及びＣＤ５６−／ＣＤ１６−サブセットであった。細胞集団
を、非ヒト霊長類ＣＤ５６及びＣＤ１６陽性セレクションキットを製造業者（Ｍｉｌｔｅ
ｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の指示に従って使用して単離した。分類後、細胞を３５０ｕｌの
ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、使用まで−８０℃で保管した。
【０３５４】
使用日に、ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニキットを製造業者の指示に従って使用して、溶
解した細胞から生成した。ｃＤＮＡを、高性能ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して生成した
。ｃＤＮＡを使用するｑＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎプライマー及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  ｆａｓｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使
用して行った。アカゲザルＰＶＲＩＧを検出するための２セットのプライマーは、Ｃｏｍ
ｐｕｇｅｎ  ＵＳＡ，Ｉｎｃによって設計され、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって製造された
。配列及びプライマーコードは以下である。
プライマーセット１
順方向：ＣＴＴＧＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧ
逆方向：ＴＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣ
プライマーセット２
順方向：ＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＣＣＴＴ
逆方向：ＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧ
【０３５５】
ベータ−アクチンプライマーをハウスキーピングに使用し、使用したプライマーセット
はＴａｑｍａｎカタログ番号：Ｍｆ０４３５４３４１＿ｇ１であった。転写産物の発現を
Ｃｔ値の定量化によって評価し、相対的発現を２（−ΔΔＣｔ）法によって計算した。ま
た、ＰＶＲＩＧプライマー及びベータ−アクチンプライマーを用いて生成した産物を、２
．５％のアガロースゲルを使用して従来のＲＴ−ＰＣＲによってサイズ解析した。Ａｐｐ
ｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ機器を使用してｑＰＣＲ
データを得た。
【０３５６】
結果
ＰＶＲＩＧ抗体は過剰発現細胞上でＰＶＲＩＧを認識する：ＰＶＲＩＧに特異的であっ
た抗体についてスクリーンするために、ファージキャンペーンから生成された抗体が、Ｐ
ＶＲＩＧを過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞株に結合する能力を評価した。ヒト
ＩｇＧ１への再フォーマット時のこのキャンペーンに由来する抗体の大部分がＨＥＫ  ｈ
ＰＶＲＩＧ細胞に結合したが、親和性は様々であった。更に、これらの抗体の大部分はＨ
ＥＫ親細胞株への低いバックグラウンド結合も示し、これはＰＶＲＩＧに対する高い特異
性を示す。図２７は、ＰＶＲＩＧ抗体の特異性の一例を示す。このファージキャンペーン
において生成された対照と比較したＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対する抗体の全結合特性
の概要を図３１に示す。
【０３５７】
ヒトＰＶＲＩＧ  ＲＮＡは様々な癌細胞株において発現される：抗体によるＰＶＲＩＧ
タンパク質発現の評価に使用し得る細胞株についてまずスクリーンするために、バイオイ
ンフォマティクスによって評価してＰＶＲＩＧ  ＲＮＡが高かった細胞株について癌細胞
株アトラスを検査した。ｑＰＣＲ解析によって検証するために選択したＰＶＲＩＧ  ＲＮ
Ａの高い発現主体であった商業的に容易に入手できた４つの細胞株を見出した。これらの
細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＡ４６、Ｒａｊｉ、及びＤａｕｄｉであった。
【０３５８】
ｑＰＣＲ解析を実施したとき、４つ全ての細胞株においてＰＶＲＩＧ  ＲＮＡがバイオ
インフォマティクス解析と一貫したことを検出した（図２８）。陰性対照として、比較的
低いＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現を有したＥｘｐｉ細胞を含めた。
【０３５９】
ヒトＰＶＲＩＧ  ＲＮＡはＴ細胞及びＮＫ細胞中で発現される：発明者らの抗体によっ
て検出してＰＶＲＩＧタンパク質に対して陽性である可能性が高いサブセットについてＰ
ＢＭＣをまずスクリーンするために、主要なＰＢＭＣサブセットを選別し、ｑＰＣＲによ
ってＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現を検査した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８
＋Ｔ細胞、及びＣＤ１４＋単球におけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡのレベルを、Ｊｕｒｋａｔ、
ＨＥＫ親、及びＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞株におけるレベルと比較した。図２９に示すよ
うに、ＨＥＫ  ＧＦＰ細胞に対して正規化したとき、ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡが最も高く、Ｃ
Ｄ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞において最大５０倍高かった。
図２８と同様、Ｊｕｒｋａｔ細胞も陽性発現を示した。対照的に、ＣＤ１４＋単球はＨＥ
Ｋ  ＧＦＰ細胞と比べて高いＰＶＲＩＧ発現を示さず、これはＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現が
非常に低いことを示す。
【０３６０】
ナイーブＰＢＭＣの解析に加えて、選定した集団（エフェクターリンパ球）も種々の刺
激条件下で活性化し、ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの発現を評価した。より具体的には、ＮＫ細胞
を刺激サイトカインの種々の組み合わせによって活性化し、一方でＴ細胞は、極性化サイ
トカインを用いてまたは用いずに、ヒト活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓまたはブドウ球菌エン
テロトキシンＢ（ＳＥＢ）によってポリクローナル的に活性化した（詳細についてはプロ
トコルの節を参照）。図３０Ａ及びＢに示すように、ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現は、種々の
刺激条件でＮＫ細胞及びＴ細胞の両方において概して増加し、その程度は個々のドナーに
依存した。より具体的には、図３０ａは、ナイーブ及び活性化ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＫ細
胞におけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現を示す。図３０ｂは、ナイーブ及び活性化ＣＤ８  Ｔ
細胞におけるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現を示す。
【０３６１】
ＰＶＲＩＧ抗体は、ナイーブ及び活性化一次免疫サブセットにおいて最も顕著にＮＫ細
胞上のＰＶＲＩＧタンパク質を認識する：ナイーブ及び活性化ＰＢＭＣサブセットにおけ
るＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現のＲＮＡ発現パターンを確認する際には、発明者らによるＰＶ
ＲＩＧ抗体パネルを使用してタンパク質発現を評価した。ナイーブＰＢＭＣサブセットに
おけるＰＶＲＩＧ発現をまず評価した。最も高いレベルのＰＶＲＩＧを示す集団はＮＫ細
胞であった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は低レベルのＰＶＲＩＧ示し、一方でＢ細胞及
び単球は検出可能な発現を有しなかった。発明者らの抗体によって検出されたＮＫ細胞及
びＣＤ８＋Ｔ細胞上の発現の概要を図３２に示す。他のより少数のサブセットもＰＶＲＩ
Ｇ発現を示し、ＮＫＴ細胞及びγδＴ細胞等の従来型ではないＴ細胞を含んだ。ＰＢＭＣ
サブセット上の発現パターンは、調達し解析した全ドナーにわたってよく似ていた。
【０３６２】
ＰＶＲＩＧタンパク質を種々の刺激条件（ポリクローナル刺激、サイトカイン刺激、及
びＭＬＲを含む）の後に評価すると、ＰＶＲＩＧの着実な上方調節は、ＮＫ細胞ならびに
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むいずれのＰＢＭＣサブセットでもなかった。更に、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて樹状細胞に対してインビトロで極性化した単球は、非極
性化単球で見られたものと一致して、検出可能なＰＶＲＩＧ発現を示さなかった。
【０３６３】
ＰＶＲＩＧがＰＶＲＩＧ抗体の一部によって細胞株上で検出された：ＰＶＲＩＧタンパ
ク質発現についてのＰＢＭＣのスクリーニングに加えて、それが癌細胞株上でも発現され
たかどうかの理解を望んでいた。ＲＮＡ発現によって特定した陽性細胞株を使用して（図
２８）、発明者らの抗体をＪｕｒｋａｔ及びＣＡ４６細胞上でスクリーニングすることを
選択し、これは、それらが発明者らのハウスキーピング遺伝子に対して最も低い絶対Ｃｔ
値を示したためである。また、ＯＶ−９０、ＮＣＩ−Ｈ４４１、及びＨｅｐＧ２を含む発
明者らの抗体の特異性を更に検証するために、様々な陰性の細胞株を選択した。発明者ら
の抗体の一部は、Ｊｕｒｋａｔ及びＣＡ４６細胞上でＰＶＲＩＧタンパク質発現を検出し
たが（図３１）、陰性の細胞株ではしなかった。Ｊｕｒｋａｔ及びＣＡ４６でのＰＶＲＩ
Ｇ検出の例を、代表的な抗体であるＣＰＡ．７．０２１を用いて図３３に示す。Ｊｕｒｋ
ａｔ及びＣＡ４６での発現は互いに一致し、発現の強度は２つの細胞株にわたって類似し
ていた。
【０３６４】
ＰＶＲＩＧ抗体は、Ｅｘｐｉ細胞上で一過性に発現されたカニクイザルＰＶＲＩＧを検
出する：カニクイザルにおける薬理学的研究に対する発明者らの抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体の
臨床前適合性を評価するために、発明者らの抗体がカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃＰＶＲＩ
Ｇ）と交差反応するかどうかの理解を望んでいた。発明者らの抗体の一部は、Ｅｘｐｉ細
胞に一過性トランスフェクトしたｃＰＶＲＩＧを検出することができた（図２９）。陰性
染色を生じた抗体（ＣＰＡ．７．０２１）及び陽性染色を生じた抗体（ＣＰＡ．７．０２
４）の例を図３４に示す。
【０３６５】
ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡがカニクイザルＰＢＭＣにおいて検出される：カニクイザルＰＢＭ
Ｃ上でのＰＶＲＩＧタンパク質の評価の前に、まずカニクイザルＰＢＭＣサブセットにお
けるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現プロファイルを決定することを望んでいた。ｃＰＶＲＩＧプ
ライマーセットが存在しなかったため、ｃＰＶＲＩＧ遺伝子上の２つの明確に異なる部位
に向けた２つのセットを設計した。一方のプライマーセットはｃＰＶＲＩＧのＸ２変異体
に特異的であったが、他方のセットはＸ１変異体とＸ２変異体との両方を拾うことができ
た。図３５に示すように、両方のプライマーセットが、互いに比較して同様のレベルでｃ
ＰＶＲＩＧ  ＲＮＡを検出することができた。更に、単球と比較してエフェクターリンパ
球（ＮＫ及びＴ細胞）において明確に異なるＰＶＲＩＧ  ＲＮＡシグネチャが存在するヒ
トＰＢＭＣとは異なり、ｃＰＶＲＩＧ  ＲＮＡは、評価した全ドナー由来の全ＰＢＭＣサ
ブセットにわたって同様のレベルで発現された。
【０３６６】
カニクイザルＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧタンパク質発現は非常に低いかまたは陰性である
：カニクイザルＰＢＭＣに関するｃＰＶＲＩＧ  ＲＮＡプロファイルを確立した後、抗ヒ
トＰＶＲＩＧ抗体の選定したパネルを使用してカニクイザルＰＢＭＣ上のｃＰＶＲＩＧタ
ンパク質の存在についてスクリーニングした。ＰＢＭＣのスクリーニングに選択した抗体
は、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に結合するその能力及び／または機能活性に基づいた。。図
３６に示すように、様々な抗体に由来するＣＤ１６＋リンパ球サブセット（ＮＫ細胞）上
のｃＰＶＲＩＧの低レベルの発現は検出することができたが、ＣＤ３＋リンパ球サブセッ
ト（Ｔ細胞）またはＣＤ１４＋  ＣＤ５６＋骨髄サブセット（単球）上ではできなかった
。このデータにも関わらず、対照を超えて陽性検出を示した抗体（黒色の実線で図示する
）は、ｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に結合することができたものと相関しなかった。例えば、
ＣＰＡ．７．０２１による染色のレベルは、前者がｃＰＶＲＩＧ一過性細胞に結合しない
にも関わらず、ＣＰＡ．７．０２４を上回った（図３６参照）。
【０３６７】
要約及び結論：抗体ファージプラットフォームを使用して、ヒトＰＶＲＩＧ  抗原に向
けたモノクローナル抗体を生成することに成功した。操作された過剰発現細胞及び一式の
癌細胞株を使用して、発明者らの抗体がＰＶＲＩＧ抗原に高度に特異的であり、ＲＮＡ発
現と相関するタンパク質発現を検出できることを示した。ヒトＰＢＭＣサブセットの解析
の際に、ＰＶＲＩＧタンパク質がＮＫ細胞上で最も高く発現され、従来のＣＤ３＋Ｔ細胞
上では低く発現し、Ｂ細胞及び骨髄細胞上では検出可能ではないことが示された。発現は
、これらの細胞型を種々の刺激条件に露出させた際、堅実には変化しなかった。また、発
明者らの抗体のパネルがカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＰＶＲＩＧ抗原と交差反応性であるこ
とを、その過剰発現細胞への結合を評価することによって示した。しかしながら、この抗
体パネルのｃｙｎｏ  ＰＢＭＣへの低レベルの結合、ＲＮＡとのタンパク質相関の欠如、
及び過剰発現細胞と結合するその能力の不一致（ＰＢＭＣと比較して）の組み合わせは、
ＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧ抗原が非常に低い／負であり得るか、またはそれが過剰発現細胞
と比較して異なる／より複雑な形態で発現されることを示す。
【０３６８】
実施例１Ｄ：
健常なドナー由来のＰＢＭＣサブセットにおけるＰＶＲＩＧの発現：健常なドナー由来
のＰＢＭＣサブセットにおけるＰＶＲＩＧの発現を試験した（ゲーティング戦略は図１ａ
に示す）。試験した試料において、ＰＶＲＩＧは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（データ割愛）、ＣＤ
８α＋γδＴ細胞（データ割愛）、二重負γδＴ細胞（データ割愛）上で発現し、健常な
ドナーＰＢＭＣ（ｎ＝５）のＣＤ４＋Ｔ細胞（データ割愛）でもより軽度に発現すること
を示した。
【０３６９】
実施例１Ｅ
卵巣癌腹水、ＭＳＳ、ＣＲＣのＰＢＬ、ならびに休止及び同種活性化された健常なＰＢ
ＭＣにおけるＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、及びＨＬＡ−ＤＲとのＰＶＲＩＧの共発現：ＰＶＲＩ
Ｇは卵巣癌腹水におけるＣＤ８＋Ｔ細胞上でＴＩＧＩＴと共発現される（データ割愛）。
この試料では、様々なレベルのＰＶＲＩＧ発現が観察され、これはＰＤ−１発現のものと
重複する。低レベルのＨＬＡ−ＤＲは低レベルのＰＶＲＩＧ発現と相関した。非常に低レ
ベルのＰＶＲＩＧがＣＤ４＋Ｔ細胞上で観察され、この特定の試料においてであり、ＰＤ
１、ＴＩＧＩＴ、及びＨＬＡ−ＤＲとの相関がないことを示す。
【０３７０】
ＭＳＳ  ＣＲＣ患者のＰＢＬにおいては、ＰＶＲＩＧはＣＤ８＋Ｔ細胞上でＴＩＧＩＴ
と共発現される（データ割愛）。ＰＶＲＩＧの低い発現レベルがこの試料において観察さ
れ、これは、低レベルのＴＩＧＩＴ及びＨＬＡ−ＤＲと相関した。この患者由来のＴＩＬ
は、表面ＰＶＲＩＧについての染色が陽性であり、ＰＤ１及びＴＩＧＩＴについても陽性
であった小さいＣＤ８＋集団を有した（データ割愛）。細胞内染色は、ＰＤ−１の発現パ
ターンを反映する顕著なＰＶＲＩＧ染色を明らかにし、これは、ＰＤ１−ＰＶＲＩＧ−及
びＰＤ１＋ＰＶＲＩＧ＋である２つの明確に異なる集団を示す（データ割愛）。細胞内Ｐ
ＶＲＩＧ＋  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋及びＴＩＧＩＴ＋とより良好に相関する
ようである。ＰＶＲＩＧは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上で検出可能ではなく、少数のみのＣ
Ｄ４＋細胞がＰＤ１＋集団において陽性の細胞内ＰＶＲＩＧ染色を示した。細胞内ＰＶＲ
ＩＧ＋集団が非常に小さいことにより、ＰＶＲＩＧがＴＩＧＩＴ及びＨＬＡ−ＤＲと共発
現されるかどうかを決定することは困難である。
【０３７１】
健常なＰＢＭＣにおいて、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ染色は、ＰＤ−１及びＴＩＧ
ＩＴの発現パターンを反映し、これは、明確に異なるＰＤ１−ＰＶＲＩＧ−及びＰＤ１＋
ＰＶＲＩＧ＋集団、ならびに明確に異なるＴＩＧＩＴ−ＰＶＲＩＧ−及びＴＩＧＩＴ＋Ｐ
ＶＲＩＧ＋集団を示す（データ割愛）。ＰＶＲＩＧはＣＤ４＋細胞上で検出されなかった
。興味深いことに、同種活性化の後で、ＰＶＲＩＧ及びＰＤ−１の共発現がＣＤ４＋上で
観察された（しかしＣＤ８＋上では観察されなかった）（データ割愛）。
【０３７２】
概要すると、ＰＶＲＩＧは、卵巣癌腹水由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＳＳ  ＣＲＣ患者の
ＰＢＬにおいてＴＩＧＩＴと、ならびにＰＤ−１健常なドナーのＰＢＭＣと、及び健常な
ドナー由来の同種活性化されたＰＢＭＣのＣＤ４＋  Ｔ細胞においてＰＤ１と共発現する
ことが示された。
【０３７３】
実施例１Ｆ
正常なＰＢＭＣ、尿膜管癌、結腸直腸癌、卵巣癌腹水、及び肺癌由来のリンパ球集団上
のＰＶＲＩＧの発現：結果：ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ならびにＣＤ４＋
及びＣＤ８＋ＮＫＴ細胞上のＰＶＲＩＧの発現を、健常なドナーのＰＢＭＣ及び扁桃腺に
おいて、ならびに尿膜管癌、結腸直腸癌、卵巣癌腹水、肺癌、及び黒色腫由来のＴＩＬに
おいて解析した。
【０３７４】
健常なドナーのＰＢＭＣ（ｎ＝５）及び卵巣癌腹水ＴＩＬ（ｎ＝１）において、高レベ
ルのＰＶＲＩＧ発現がＮＫ細胞（データ割愛）及びＣＤ８＋ＮＫＴ細胞（データ割愛）上
で検出され、ＣＤ８＋Ｔ細胞（データ割愛）及びＣＤ４＋ＮＫＴ（データ割愛）でもより
軽度の発現が検出された。ＣＤ４＋Ｔ細胞も、一部のＰＢＭＣにおいてＰＶＲＩＧについ
ての染色が陽性であったが、発現のレベルは極めて低かった（データ割愛）。
【０３７５】
加えて、試験した６個の結腸直腸癌ＴＩＬ中２個からのＣＤ４＋Ｔ細胞上、ならびに肺
癌ＴＩＬ（ｎ＝３）（データ割愛）及び尿膜管癌ＴＩＬ（ｎ＝１）由来のＮＫ細胞におい
て、ＰＶＲＩＧ発現が検出された。
【０３７６】
ＰＶＲＩＧ発現は黒色腫ＴＩＬでは検出されず、これは、試験した試料においてＴＩＬ
が不在であったためである。
【０３７７】
実施例１Ｇ
更なる評価を行い、ヒト及びマウス細胞株においてＰＶＲＩＧを過剰発現する更なる組
織を特定した。
【０３７８】
試薬：ヒトＰＶＲＩＧ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）Ｈｓ０４１８９２９３＿ｇ１、カタログ＃４３３１１８２、ハウスキーピング遺伝子（
ＨＳＫＧ）のためのＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ヒト
ＲＰＬ１９  Ｍｍ  ０１５７７０６０＿ｇＨ、ヒトＨＰＲＴ１  Ｈｓ０２８００６９５＿
ｍ１、ヒトＳＤＨＡ  Ｈｓ００４１７２００＿ｍ１、ヒトＰＢＧＤ  Ｈｓ００６０９２９
６＿ｇ１、及びヒトＴＡＴＡ  Ｂｏｘ  Ｈｓ００３７５８７４＿ｇ１。マウスＰＶＲＩＧ
ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＣＣ７０Ｌ８Ｈ、ＣＣ
６ＲＮ１９  Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎプローブ。ハウスキーピング遺伝子（ＨＳＫＧ
）のためのＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）マウスＲＰＬ
１９：Ｍｍ０２６０１６３３＿ｇ１。ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、パーツ番号４４４４５５７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ）及びＣＬＳ（Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｓｅｒｖｉｃｅ）からの市販のヒト及びマウス癌
細胞株は表１で詳述する。ヒト及びマウス細胞株からのＲＮＡ抽出を、ＲＮＡｅａｓｙ  
Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４０１４）を用いて行った。ｃＤＮＡを
、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３６８８１４を使用
して産生させた。市販のマウスポリクローナル抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ  ＭａｘＰａｂ（Ｂ０
１）、Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ０００７９０３７−Ｂ０１、１：２００希釈。マウ
スＩｇＧ１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＭＧ１００、１：２０
０希釈。市販のマウスポリクローナル抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ
ＡＢ１４０７９３５、１０ｕｇ／ｍｌ。Ｃｈｒｏｍ  ｐｕｒｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、全
分子、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０１５−０００−００３、１０ｕｇ／ｍｌ。Ｇｏａ
ｔ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ−ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５−１１６−１４
６、１：１００希釈。Ｃｕｓｔｏｍ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｔ−Ａｎｔｉ  ｍｏｕ
ｓｅ  ＰＶＲＩＧ、バッチ番号２０１５３４５６Ｃ．１、Ａｌｄｅｖｒｏｎ、１０ｕｇ／
ｍｌ。Ｃｕｓｔｏｍ  Ｒａｔ  ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ、バッチ番号ＧＶ２０８８４．１、Ａ
ｌｄｅｖｒｏｎ、１０ｕｇ／ｍｌ。Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｒａｔ−ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ
、カタログ番号１１２−１１６−１４３、１：１００希釈。ＡＦ６４７にコンジュゲート
した抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２４  ｍＩｇＧ１、１０ｕｇ／ｍｌ。ＡＦ６４７
にコンジュゲートした抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０５０  ｍＩｇＧ１、１０ｕｇ／
ｍｌ。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．００５  ｍＩｇ
Ｇ１、１０ｕｇ／ｍｌ。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７
．００２  ｍＩｇＧ１、１０ｕｇ／ｍｌ。ＡＦ６４７にコンジュゲートしたＳｙｎａｇｉ
ｓ  ＩｇＧ１、１０ｕｇ／ｍｌ。ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＰＶＲＩＧ−Ｃ
ＰＡ．７．０２１  ｍＩｇＧ１、１０ｕｇ／ｍｌ。ＡＦ６４７にコンジュゲートしたＳｙ
ｎａｇｉｓ  ＩｇＧ２、１０ｕｇ／ｍｌ。ウサギポリクローナル抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂ、Ｓ
ｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４７４９７、１：３００希釈。Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ  ウ
サギ−ＨＲＰ、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１１−０３５−００３、１：１００希釈
。ＶｉｏＢｌｕｅ、Ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔａｉｎ  ４５０、ＢＤ  
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６２２４７、１：１０００希釈。Ｈｕｍａｎ  Ｔ
ｒｕｓｔａｉｎ  ＦｃＸ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２。ラット抗マ
ウスＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｆｃブロック、ＢＤ、カタログ番号５５３１４２。Ｉｎｇｅｎ
ｉｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｍｉｒｕｓ、カタログ番号
ＭＩＲ５０１１４。ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡ
−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｌ−０３２７０３−０２。Ｏ
Ｎ  ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ｎｏｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａ
ｃｏｎ、カタログ番号  Ｄ−００１８１０−０１−０５。本研究で使用したヒト細胞株を
図５４に示す。
【０３７９】
転写発現。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：ヒト及びマウス細胞株のＲＮＡ（
１−５ｕｇ）抽出物（表１及び２に詳述）を、製造業者のプロトコルに従って行った。ｃ
ＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って調製した（２０ｕｌのｃＤＮＡ混合反応物中で希
釈した１ｕｇのＲＮＡ）。１：１０で希釈した上記のように調製したｃＤＮＡ（反応当た
り２５ｎｇのＲＮＡを表す）を、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブを使用して（材料及
び方法１．１  １〜４に詳述）、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。検出
を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２ｋデバイスを使用して行った。反応が閾値レベルの蛍
光を達成したサイクル（Ｃｔ＝閾値サイクル）を記録し、ＲＴ反応における相対的転写産
物量を計算するために使用した。絶対量を、方程式Ｑ＝２＾−Ｃｔを使用して計算した。
結果として得た相対量を、ハウスキーピング遺伝子ｍＲＰＬ１９またはｈＲＰＬ１９の相
対量に対して正規化した。
【０３８０】
ウェスタンブロット（ＷＢ）によるタンパク質発現検出：ヒト細胞株におけるヒトＰＶ
ＲＩＧの発現を、全細胞抽出物を使用してＷＢによって解析した（癌細胞株について４５
ｕｇ、ならびに過剰発現細胞株及び陰性対照細胞株について３０ｕｇ）。市販のウサギポ
リクローナル抗ヒトＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４７４９７
、５％のＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１：３００希釈、続いてコンジュゲートした二次Ａｂヤギ抗
ウサギ−ペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１１−０３５−００３）、
５％の乳ＴＢＳＴ中１：２０，０００希釈。
【０３８１】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるタンパク質発現解析：ＰＶＲＩＧタンパク質
の細胞表面発現をＦＡＣＳによって解析した。ヒトまたはマウス細胞株を、ＰＢＳ中１：
１０００で希釈したＶｉｏＢｌｕｅ試薬で染色した。細胞を室温で１５分間インキュベー
トした後、ＰＢＳで一度洗浄した。内因性タンパク質解析のための細胞株を、材料の節に
おいて上に列挙したＦｃ  受容体遮断溶液と共に事前インキュベートした（２．５μｌ／
反応のヒト遮断薬及び１μｌ／反応のマウス遮断薬を製造業者の手順に従って使用した）
。ヒトＰＶＲＩＧタンパク質を検出するために、細胞を、市販のポリクローナル抗ヒトＰ
ＶＲＩＧ、または１０ｕｇ／ｍｌもしくは１：２００の濃度に希釈した（それぞれ、Ｓｉ
ｇｍａ  Ａｂ及びｍＡｂ、またはＡｂｎｏｖａ  Ａｂについて）カスタムモノクローナル
抗ヒトＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ（Ｉｎｃ産生、上の材料及び方法の節に詳述）、または同じ濃
度のＩｇＧ１  アイソタイプ対照、続くヤギ抗マウスＰＥコンジュゲートＡｂで染色した
。
【０３８２】
マウスＰＶＲＩＧタンパク質を検出するために、細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈
したカスタムラットポリクローナル抗マウスＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、
または同じ濃度のアイソタイプ対照としてのラットＩｇＧ全分子、続く１：１００希釈の
ロバ抗ラット−ＰＥコンジュゲートＡｂで染色した。
【０３８３】
ＰＶＲＩＧノックダウン：内因性ヒトＰＶＲＩＧのノックダウンをｓｉＲＮＡの一過性
トランスフェクションによって実行した。１００ｐｍｏｌのＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡプー
ルまたはスクランブルｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、材料及び方法において上で
列挙したように、また製造業者の手順に従って、Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ
デバイス及びＭＩＲＵＳ  Ｉｎｇｅｎｉｏエレクトロポレーション溶液を使用して、エレ
クトロポレーションによって行った。トランスフェクションから４８時間後、ｑＲＴ−Ｐ
ＣＲ及びＦＡＣＳによる更なる解析のために細胞を収集した。
【０３８４】
結果：ｑＲＴ−ＰＣＲによるヒト及びマウス細胞株におけるＰＶＲＩＧ転写産物の内因
性発現
【０３８５】
ヒト細胞株：ヒト細胞株におけるＰＶＲＩＧ転写産物の存在を検証するために（図５４
に列挙する）、ｑＲＴ−ＰＣＲを、材料及び方法において上述したように特異的ＴａｑＭ
ａｎプローブを使用して行った。図５６に示す通り、ヒトＰＶＲＩＧ転写産物は、Ｔａｑ
ＭａｎプローブＨｓ０４１８９２９３＿ｇ１を使用して、Ｊｕｒｋａｔ（Ａ、Ｂ）、ＨＵ
Ｔ７８（Ａ、Ｂ）、及びＨＬ６０（Ｂ）細胞株において比較的高いレベルで観察された。
より低い転写産物レベルがＴＨＰ１、ＲＰＭＩ８２２６（Ｂ）細胞株において観察された
。全ての他の細胞株は、転写産物をほとんどまたは全く示さない。
【０３８６】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるマウス細胞株におけるＰＶＲＩＧ転写産物の内因性発現：マウス
細胞株におけるＰＶＲＩＧ転写産物の存在を検証するために（図５５に列挙する）、ｑＲ
Ｔ−ＰＣＲを、材料及び方法において上述したように特異的ＴａｑＭａｎプローブを使用
して行った。図５７に示すように、マウスＰＶＲＩＧ転写産物は、ＴａｑＭａｎプローブ
ＣＣ７０Ｌ８Ｈを使用して、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｒｅｎｃａ、ＳａＩ／Ｎ、及びＪ７７４Ａ
．１（Ａ）細胞株において比較的高いレベルで観察された。より低い転写産物レベルがＣ
Ｔ２６（Ａ）及びＢ−１０４−１−１（Ｂ）細胞株において観察された。全ての他の細胞
株は、非常に低い転写産物しか示さない。
【０３８７】
ＷＢによるヒト細胞株におけるＰＶＲＩＧタンパク質の内因性発現：ＰＶＲＩＧタンパ
ク質の内因性発現についてのＷＢ解析を、上記の材料及び方法に記載のように市販の抗ヒ
トＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０４７４９７）を使用して図５４に詳述する
種々のヒト癌細胞株溶解物に対して実行した。陽性対照として、安定したＨＥＫ２９３細
胞プール過剰発現ＰＶＲＩＧの全細胞抽出物を使用し、一方で、空ベクターでトランスフ
ェクトした細胞を陰性対照として機能させた。図５８に示す通り、約３５ｋＤに対応する
タンパク質バンドが、陽性対照ＨＥＫ２９３過剰発現細胞（レーン２）において、及び細
胞株（レーン３）において検出された。ヒトＰＶＲＩＧの発現は、陰性対照として働く空
ベクター細胞（レーン１）においてもＺＲ７５−１ヒト細胞株（レーン４）においても検
出されなかった。
【０３８８】
ＦＡＣＳによるヒト及びマウス細胞株におけるＰＶＲＩＧタンパク質の内因性発現：
【０３８９】
ヒト細胞株：ヒトＰＶＲＩＧの細胞表面内因性発現を検証するために、種々のヒト細胞
株（図５４で詳述）を、上記の材料及び方法に記載のように試験した。細胞株を、市販の
Ａｂ（Ａｂｎｏｖａ）またはアイソタイプ対照、続いて二次ヤギ抗マウスＰＥ  Ａｂで染
色した。ＦＡＣＳによる解析を行った。アイソタイプ対照結合と比較して、Ａｂｎｏｖａ
抗体の結合がＪｕｒｋａｔヒト癌細胞株において観察された。Ａｂｎｏｖａ  Ａｂの結合
は試験した他の細胞株においては観察されなかった：アイソタイプ対照結合と比較したＣ
ａｐａｎ２及びＺＲ７５−１について、追加のＦＡＣＳ解析を、種々のヒト細胞株に対し
てＳｉｇｍａ販売のＡｂを使用して行うと（Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ７８、Ｋａｒｐａｓ２
９９、及びＮＫ−ＹＴＳ）、結合はＪｕｒｋａｔ細胞のみで観察されたが、他の細胞株で
は結合は観察されなかった（データ割愛）。
【０３９０】
Ｊｕｒｋａｔ細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧの内因性確認のための更なる解析を、本発
明の種々のモノクローナル抗体の結合を試験することによって行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞
株を、ＡＦ６４７にコンジュゲートした５つの抗ヒトＰＶＲＩＧカスタムｍＡｂ（ＣＰＡ
．７．０２４、ＣＰＡ．７．０５０、ＣＰＡ．７．００５、ＣＰＡ．７．００２、及びＣ
ＰＡ．７．０２１）、またはＡＦ６４７にコンジュゲートした関連アイソタイプ対照Ａｂ
で染色し、ＦＡＣＳによる解析を行った。Ｊｕｒｋａｔヒト細胞株におけるヒトＰＶＲＩ
Ｇの発現が、アイソタイプ対照発現と比較して、ＣＰＡ．７．０２１及びＣＰＡ．７．０
５０のみで観察された。ヒトＰＶＲＩＧへの結合は、他の３つのｍＡｂを使用することに
よってではＪｕｒｋａｔ細胞株において観察されなかった。
【０３９１】
マウス細胞株：マウスＰＶＲＩＧの細胞表面内因性発現を検証するために、種々のマウ
ス細胞株：Ｊ７７４Ａ．１、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＳａＩ／Ｎ、及びＲｅｎｃａ（図５５で詳
述）を、上記の材料及び方法に記載のように試験した。細胞株を、カスタムポリクローナ
ルラット抗マウスＰＶＲＩＧ  Ａｂ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）によって、またはアイソタイプ
対照（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、続いて二次ヤギ抗ラットＰＥ  Ａｂによって染色した。ＦＡ
ＣＳによる解析を行った。マウスＰＶＲＩＧタンパク質への結合は、Ａｌｄｅｖｒｏｎポ
リクローナルＡｂによって試験したマウス細胞株のいずれにおいても観察されなかった（
データ割愛）。
【０３９２】
ヒト細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧのノックダウン：Ｊｕｒｋａｔ細胞株におけるＰＶ
ＲＩＧタンパク質の内因性発現を更に確認するために、ヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡプー
ルを、材料及び方法に記載のようにノックダウンに使用した。ｓｉＲＮＡ  トランスフェ
クションから４８時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳによる更なる解析のために採取し
た。
【０３９３】
ｑＰＣＲによって試験したヒト細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧのノックダウン：図５９
に示すように、ヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡプールでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ
細胞におけるヒトＰＶＲＩＧ転写産物レベルは、材料及び方法に記載のようにｑＲＴ−Ｐ
ＣＲによって解析して、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞（左のヒス
トグラムバー）と比較して著しく低減した（右のヒストグラムバー）。
【０３９４】
ＦＡＣＳによって試験したヒト細胞株におけるヒトＰＶＲＩＧのノックダウン：同じｓ
ｉＲＮＡトランスフェクト細胞におけるヒトＰＶＲＩＧ膜発現の更なる解析をＦＡＣＳに
よって行った。図６０に示すように、ヒトＰＶＲＩＧタンパク質の膜発現は、スクランブ
ルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞（オレンジ色）と比較して、ＰＶＲＩＧ  ｓｉ
ＲＮＡでトランスフェクトした細胞（ＣＰＡ．７．０２１ｍＡｂについては緑色またはＳ
ｉｇｍａ  Ａｂについては赤色）において低減する。Ｊｕｒｋａｔ細胞株における倍率変
化（抗ＰＶＲＩＧ対アイソタイプ対照）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｂを使用することによって８
倍から３．３倍に、あるいはＣＰＡ．７．０２１  ｍＡｂを使用することによって１５．
３倍から２．８倍に減少する。
【０３９５】
この報告は、ヒト及びマウス細胞株中のＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方での
細胞株におけるＰＶＲＩＧ内因性発現についての予備データを含む。
【０３９６】
種々のヒト癌細胞株を、ＰＶＲＩＧの内因性発現についてｑＲＴ−ＰＣＲ、ＷＢ、及び
ＦＡＣＳによって試験した。
【０３９７】
それぞれ図４Ａ及び４Ｂに示すように、市販のポリクローナルＡｂ（Ｓｉｇｍａ及びＡ
ｂｎｏｖａ）及びマウスモノクローナルＡｂ（Ｉｎｃ）を使用することによって、ヒトＰ
ＶＲＩＧの細胞表面発現がＪｕｒｋａｔ細胞株において観察された。これらの観察は、図
１Ａ及びＢに示すようにＲＮＡ転写レベルと、また図３に示すようにＷＢ結果と相関する
。
【０３９８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞株における内因性ヒトＰＶＲＩＧの追加の確認をノックダウン実験に
よって行い、図５に示すように、ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＲＮ
Ａ転写産物の明白な低減を確認し、同様に、市販のＡｂ及びモノクローナルＡｂによって
、図６に示すようにＪｕｒｋａｔ細胞株におけるタンパク質細胞表面発現の低減が観察さ
れた。
【０３９９】
種々のマウス細胞株を、ＰＶＲＩＧの内因性発現についてｑＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳ
によって試験した。図２Ａ及びＢに示すように、転写レベルで、ＰＶＲＩＧの存在がＪ７
７４Ａ．１、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＳａＩ／Ｎ、及びＲｅｎｃａ細胞株で観察された。しかし
、マウスＰＶＲＩＧの膜発現は、ポリクローナルＡｂ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）によって検出
したこれらの試験した細胞株において観察されなかった（データ割愛）。図６１及び図６
２は、ノックダウンによって確認したｑＰＣＲとＦＡＣＳとの間の相関を示す細胞株を強
調する、本報告に記載の所見の概要を示す。
【０４００】
実施例１Ｈ
この実験の目的は、ヒト黒色腫試料から単離し、黒色腫特異的抗原及びＩＬ２の存在下
で繁殖させた休止または活性化ヒト（腫瘍浸潤性リンパ球）ＴＩＬ上のＰＶＲＩＧタンパ
ク質の発現を評価することである。ヒトＰＶＲＩＧの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に向けさ
せたヒトｍＡｂを産生させた。ＦＡＣＳ解析によって細胞上のＰＶＲＩＧの発現を検査す
るために、これらのＡｂをＡｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ６４７で直接標識した。
【０４０１】
材料及び方法
ＴＩＬ：この実験シリーズでは、３名の黒色腫患者の切除した転移に由来する３つの異
なる腫瘍−浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用した：１）ＴＩＬ−４１２−  ＨＬＡ−Ａ２
−Ｍａｒｔ１特異的、２）ＴＩＬ−Ｆ４−  ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的、及び３）
ＴＩＬ−２０９−  ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的。ヒトＴＩＬ（＞９０％  ＣＤ８＋
）を実験開始２４時間前に解凍した。細胞を、３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅ
ｇｅｎｄ  ５０９１２９）を補充した１２ｍｌのＴＩＬ培地（ＩＭＤＭ＋１０％のヒト血
清＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１％のＮａ−ピルビン酸塩＋１％の非必須アミノ酸＋１％
のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で解凍した。細胞を２４時間凍結から回復させた。
【０４０２】
アッセイ条件：回復後、ＴＩＬを４つの異なる条件で試験した：１）休止−３００Ｕ／
ｍｌのＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５８９１０６）を用いる、２）１  μ
ｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅクローンＯＫＴ３
、カタログ番号１６−００３７−８５）＋２  μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８  ａｂ（ｅＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅクローンＣＤ２８．２、カタログ番号１６−０２８９−８５）＋３００Ｕ
／ｍｌのＩＬ２を使用するＴ細胞のポリクローナル活性化を用いる、３）Ｍｅｌ８８８（
ＬＩＭＳ  ＩＤ：ＣＬ−２１６）黒色腫細胞（ＨＬＡ−Ａ２陰性）との共培養（１：１）
、及び４）Ｍｅｌ６２４（ＬＩＭＳ  ＩＤ  ＣＬ−２１８）黒色腫細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋
Ｍａｒｔ１／ｇｐ１００陽性）との共培養（１：１）。
【０４０３】
休止／活性化／共培養の１２時間後、細胞を、ＰＶＲＩＧ発現ならびにＰＶＲＩＧ経路の
他のメンバー及び他の表面マーカーの発現について、ＦＡＣＳによって試験した。
【表１】
2018512443.tif 000003
【０４０４】
細胞染色：細胞を１２時間後に採取し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、室温で２０分
間、１／１０００の固定性生死判定染料ｅｆｌｕｏｒ  ４５０（ＢＤ  ｈｏｒｉｚｏｎ、
カタログ番号５６２２４７）を補充したＰＢＳで染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回
洗浄し、氷上で１５分間、１／２５のヒトＴｒｕｅｓｔａｉｎ  ＦＣ−Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉ
ｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）を補充したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ
＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５％のアジド）で染色した。ＦＣ妨害後、細胞を、Ａｂ及び
表１に列挙する濃度によって３０分間氷上で染色した。
【０４０５】
染色後、細胞を１回洗浄し、解析のためＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。補償ビーズ（
ＢＤ、５５２８４３）を使用して補償較正を行った。一滴のビーズを上記の抗体で３０分
間染色した。ビーズ染色を細胞染色と同じ濃度で行った。ビーズ染色後、標準的な手順に
従ってＭａｃｓＱｕａｎｔ  ＦＡＣＳマシン上で補償を行った。全ての試料をＭＡＣＳＱ
ｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で得て、データを、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｆｌｏ
ｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。
【０４０６】
ＰＶＲＩＧはヒト休止ＴＩＬ上で発現される：３００Ｕ／ｍｌのＩＬ２と共に１２時間
培養した休止ＴＩＬをＰＶＲＩＧ発現について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。ＴＩ
Ｌのためのゲーティング戦略：リンパ球をまずＦＣＳ：ＳＳＣグラフにおいてサイズ及び
粒度に従ってゲーティングし、次に単細胞をＦＳＣ−Ｈ及びＦＳＣ−Ａに従ってゲーティ
ングし、次に生細胞をＶｉｏｂｌｕｅ：ＦＳＣグラフにおいて生死判定色素染色に従って
ゲーティングし、ＣＤ８＋細胞をＣＤ８：ＦＳＣグラフにおいてＣＤ８染色に従ってゲー
ティングした。その後、ＰＶＲＩＧの発現レベルをヒストグラムにおいてＰＶＲＩＧ染色
に従ってプロットした。
【０４０７】
ヒトＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現は抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂによる活性化の際に下方
調節される：抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂ＋ＩＬ２と共に１２時間培養したヒトＴＩＬを
、ＰＶＲＩＧ発現について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。検査した３つ全てのＴＩ
Ｌの表面上のＰＶＲＩＧ発現は、休止ＴＩＬと比較して、活性化の際に下方調節される（
データ割愛）。
【０４０８】
ヒトＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現はＭｅｌ８８８との共培養の際にわずかに下方調節され
る：Ｍｅｌ８８８細胞と共に１２時間共培養したヒトＴＩＬを、ＰＶＲＩＧ発現について
染色し、ＦＡＣＳによって解析した。検査した３つ全てのＴＩＬの表面上のＰＶＲＩＧ発
現は、休止ＴＩＬと比較して、Ｍｅｌ８８８との共培養の際にわずかに下方調節される。
【０４０９】
ヒトＴＩＬ上のＰＶＲＩＧ発現はＭｅｌ６２４との共培養の際に下方調節される：Ｍｅ
ｌ６２４細胞と共に１２時間共培養したヒトＴＩＬを、ＰＶＲＩＧ発現について染色し、
ＦＡＣＳによって解析した。検査した３つ全てのＴＩＬの表面上のＰＶＲＩＧ発現は、休
止ＴＩＬと比較して、Ｍｅｌ６２４との共培養の際にわずかに下方調節される。
【０４１０】
休止ＴＩＬ上の他の経路メンバーの発現：ＩＬ２と共に１２時間共培養したヒトＴＩＬ
を、ＣＤ９６、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴ、及びＤＮＡＭ１の発現について染色し
、ＦＡＣＳによって解析した。ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、及びＤＮＡＭ１は、３つ全ての検
査したＴＩＬ上で発現される。ＰＶＲも３つ全てのＴＩＬの表面上で発現されるが、レベ
ルは比較的低い。ＰＶＲＬ２は、ＴＩＬのいずれでも検出されない。
【０４１１】
抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ａｂによって活性化したＴＩＬ上の他の経路メンバーの発現
：抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ａｂと共に１２時間培養したヒトＴＩＬを、ＣＤ９６、ＰＶ
Ｒ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴ、及びＤＮＡＭ１の発現について染色し、ＦＡＣＳによって
解析した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂによる活性化の際、ＣＤ９６は下方調節され、Ｐ
ＶＲはわずかに上方調節され、ＴＩＧＩＴはわずかに上方調節され、ＤＮＡＭ１も上方調
節される。
【０４１２】
Ｍｅｌ８８８と共に共培養したＴＩＬ上の他の経路メンバーの発現：Ｍｅｌ８８８細胞
と共に１２時間共培養したヒトＴＩＬを、ＣＤ９６、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴ、
及びＤＮＡＭ１の発現について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。Ｍｅｌ８８８との共
培養の際、ＣＤ９６は下方調節され、ＰＶＲは大きく上方調節され、ＴＩＧＩＴ及びＤＮ
ＡＭ１は下方調節され、ＰＶＲＬ２もわずかに誘導される。
【０４１３】
Ｍｅｌ６２４と共に共培養したＴＩＬ上の他の経路メンバーの発現：Ｍｅｌ６２４細胞
と共に１２時間共培養したヒトＴＩＬを、ＣＤ９６、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴ、
及びＤＮＡＭ１の発現について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。ゲーティング戦略を
図１に従って行った。Ｍｅｌ６２４との共培養の際、ＣＤ９６は下方調節され、ＰＶＲは
大きく上方調節され、ＴＩＧＩＴは安定しているかまたはわずかに上方調節され、ＤＮＡ
Ｍ１は下方調節され、ＰＶＲＬ２はわずかに誘導される。
【０４１４】
ＴＩＬ上のＰＤ１の発現：ＩＬ２のみと共に１２時間培養したか、または抗ＣＤ３＋抗
ＣＤ２８  ａｂによって活性化したか、またはＭｅｌ８８８もしくはＭｅｌ６２４細胞と
共に共培養したヒトＴＩＬを、ＰＤ１の発現について染色し、ＦＡＣＳによって解析した
。図１６及び図１７で見ることができるように、ＰＤ１は、休止ＴＩＬ４１２上のみで発
現される。ＰＤ１発現の変化はＭｅｌ８８８との共培養の際には見られないが、Ｍｅｌ６
２４との共培養時または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂによる活性化時に、ＰＤ１は３つ全
てのＴＩＬにおいて上方調節される。
【０４１５】
概要及び結論：試験した全ＴＩＬについて：
●抗ＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１  ａｂはＴＩＬを染色する（最大２．６倍）
●ＰＶＲＩＧ発現は抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂによる１２時間の活性化時またはＭｅ
ｌ６２４との共培養時に下方調節される（ほぼバックグラウンドレベルまで）。
●休止ＴＩＬはＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、及びＤＮＡＭ１を発現する（それぞれ、最大３
５、１２、及び７９倍）
●ＣＤ９６発現は、活性化時（最大３５〜約１１倍）または無関係の（ＨＬＡ−Ａ２−
）黒色腫との共培養時に下方調節される
●ＤＮＡＭ１発現は、αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｂとの活性化時（最大７９〜１０２倍）
に上方調節されるが、ＴＩＬのＭｅｌとの共培養時に強く下方調節される（８倍まで）。
●ＴＩＧＩＴ発現は、ＴＩＬのｍｅｌ８８８細胞株との共培養時にわずかに下方調節さ
れ、Ｍｅｌ６２４との共培養時または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ａｂによる活性化時には、
わずかな上方調節を伴って安定していた。
●ＰＤ１発現は活性化時に上方調節される（０〜最大１８倍）
●高レベルのＰＶＲが黒色腫とのＴＩＬの共培養後に検出された（２未満〜最大１８倍
）。
【０４１６】
休止ＴＩＬ−４１２はＰＤ１について陽性染色を示す。ＴＩＬ−Ｆ４もＰＤ１について
わずかに陽性であるが、ＴＩＬ−２０９は陰性である。異なる条件での試験した全パラメ
ータの発現レベルにおける変化の概要は、表２で見ることができる。
【０４１７】
表２：
【表２】
2018512443.tif 000004
【０４１８】
実施例１Ｉ：休止及び活性化ヒトＴ細胞及びＴＩＬ上のＰＶＲＩＧの発現
この実施例の目的は、休止及び活性化ヒト単離一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上、な
らびにヒト黒色腫試料から単離し、黒色腫特異的抗原及びＩＬ２の存在下で繁殖させたＴ
ＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ球）上のＰＶＲＩＧタンパク質の発現を評価することであった。
ヒトＰＶＲＩＧの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するヒトｍＡｂを産生させた。ＦＡＣＳ
解析によって細胞上のＰＶＲＩＧの発現を検査するために、これらのＡｂをＡｌｅｘａ  
ｆｌｏｕｒ  ６４７で直接標識した。
【０４１９】
材料及び方法
ＴＩＬ：この実験シリーズでは、３名の黒色腫患者の切除した転移に由来する２つの異
なるＴＩＬを使用した：
ＴＩＬ−Ｍａｒｔ１−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１特異的
ＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的
【０４２０】
ヒトＴＩＬ（＞９５％  ＣＤ８＋）を実験開始２４時間前に解凍した。細胞を、３００
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ５０９１２９）を補充した１２ｍｌのＴＩ
Ｌ培地（ＩＭＤＭ＋１０％のヒト血清＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１％のＮａ−ピルビン
酸塩＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で解凍した。細胞を２４時
間回復させた。
【０４２１】
一次Ｔ細胞：この実験シリーズでは、２つの異なるドナーを使用した：
ドナー＃１４７由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋
ドナー＃１８６由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋
【０４２２】
ヒト一次細胞（純度９５％超）を実験開始２４時間前に解凍した。細胞を、３００Ｕ／
ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ５０９１２９）を補充したＲＰＭＩ完全培地（
ＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１％のＮａ−ピルビン酸塩＋１％
のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で解凍した。細胞を２４時間回復させた。
【０４２３】
アッセイ条件：回復後、細胞を、１μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３抗体（Ｂ
Ｄ−ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎクローンＵｃｈｔ−１、カタログ番号５５５３２９）、２  μ
ｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８  ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  クローンＣＤ２８．２、カタロ
グ番号１６−０２８９−８５）、及び３００Ｕ／ｍｌのＩＬ２によって、Ｔ細胞のポリク
ローナル活性化を使用して活性化した。
【０４２４】
活性化を、２４時間、４８時間、７２時間、及び１４４時間実行した。
【０４２５】
細胞染色：細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、室温で１０分間、１／１０００
の固定性生死判定染料ｅｆｌｕｏｒ  ４５０（ＢＤ  ｈｏｒｉｚｏｎ、カタログ番号５６
２２４７）を補充したＰＢＳで染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、
【０４２６】
図６５に列挙する濃度のＡｂで、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭ
のＥＤＴＡ＋０．０５％のアジド）中、氷上で３０分間、及び
【０４２７】
図６５に列挙する濃度で染色した。染色後、細胞を１回洗浄し、解析のためＦＡＣＳ緩
衝液中に再懸濁した。
【０４２８】
結果：２つの異なるドナー及びＴＩＬ由来のヒトＴ細胞を、非治療（休止）のままにし
たか、または材料及び方法に記載のように種々の時点でポリクローナル刺激した。細胞活
性化状態を、活性化ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＴＩＬについて示すように（それぞ
れ、図７０Ａ、Ｂ、及びＣ）、アイソタイプ対照（ＦＭＯ）と比較した各時点でのＣＤ１
３７及びＰＤ−１の表面発現の検出によって評価した。予測通り、ＰＤ−１及びＣＤ１３
７発現が検出され、活性化時に上昇した（図７０Ａ、Ｂ及びＣ）。
【０４２９】
ＰＶＲＩＧ発現は休止ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で観察され、ＣＤ４＋細胞（
３倍）と比較してＣＤ８＋細胞上でより高く発現し（６〜８倍）、活性化時に衰退した（
図７１Ａ、Ｂ、及びＣ）。活性化の３日〜６日目に、ＰＶＲＩＧ発現は、図７１で見るこ
とができるようにＣＤ８＋（４〜５  倍）及びＣＤ４＋（２〜３倍）Ｔ細胞上で増加した
。
【０４３０】
加えて、ＰＶＲＩＧ発現はＭａｒｔ１及び２０９休止ＴＩＬ上でも観察され、発現は活
性化時に減少した（図７２Ａ、Ｂ、及びＣ）。活性化の３日〜６日目に、ＰＶＲＩＧ発現
は、活性化の１日〜２日目と比較して、図７２で見ることができるように増加した。
【０４３１】
実施例２：ＰＶＲＩＧを発現している安定したトランスフェクタント細胞プールの生成及
び特性評価
細胞株過剰発現ＰＶＲＩＧヒト及びマウスタンパク質の組み換え安定プールを、ＰＶＲ
ＩＧが免疫に与える影響の決定に使用するため、ＰＶＲＩＧ特性評価のため、及び免疫調
節ＰＶＲＩＧ系治療薬の特定のために生成した。
【０４３２】
材料及び方法：
試薬：ＤＮＡ構築物：
ヒトＰＶＲＩＧ  ｆｌａｇ  ｐＵＣ５７
ヒトＰＶＲＩＧ  ｆｌａｇ  ｐＣＤＮＡ３．１
ヒトＰＶＲＩＧ  ｆｌａｇ  ｐＭＳＣＶ
組み換え細胞：
ＨＥＫ２９３  ｐＣＤＮＡ３．１ヒトＰＶＲＩＧ  ｆｌａｇ
ＨＥＫ２９３  ｐＭＳＣＶヒトＰＶＲＩＧ  ｆｌａｇ
市販の抗体：
抗ＰＶＲＩＧ、Ｓｉｇｍａカタログ番号ＨＰＡ０４７４９７−ウサギポリクローナル
抗ＰＶＲＩＧ、Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｈ０００７９０３７−Ｂ０１−マウスポリク
ローナル
【０４３３】
マウスＰＶＲＩＧの完全長検証を、ＰＣＲ反応及びＰＣＲ産物のシーケンシングを使用
して行った。
【０４３４】
プライマーの３つの対を使用した（表３）。
表３：マウス完全長検証に使用したプライマーの配列
【表３】
2018512443.tif 000005
【０４３５】
ＰＣＲ反応用の鋳型として、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株のｃＤＮＡまたは３つの市販のｃＤ
ＮＡパネルの混合物を使用した：
１．ｃＤＮＡパネルＩ、マウス、Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カタログ番号Ｃ８３３４５０１（
心臓、脳、腎臓、肝臓）。
２．ｃＤＮＡパネルＩＩ、マウス、Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カタログ番号Ｃ８３３４５０２
（肺、膵臓、脾臓、骨格筋）。
３．ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３７３０１（脳、心臓、７日目の胚
、精巣、脾臓）。
【０４３６】
発現構築物
ヒト及びマウスＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇの完全長クローニングを、ヒト転写産物に対して
コドン最適化し、マウス転写産物に対して最適化していない、ｐＵＣ５７ベクター中の配
列を使用する遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって行い、哺乳動物発現ベクター、
ｐｃＤＮＡ３．１、またはｐＭＳＣＶにサブクローニングして、発現プラスミドを創出し
た。
【０４３７】
ｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングしたヒトＰＶＲＩＧ配列は、ヒトＰＶＲＩＧタン
パク質の第２のメチオニンから始まり、一方でｐＭＳＣＶにサブクローニングしたヒトＰ
ＶＲＩＧ配列は、ヒトＰＶＲＩＧタンパク質の第１のメチオニンから始まる。
【０４３８】
−ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇをコードする構築物。
【０４３９】
完全長ヒトＰＶＲＩＧ遺伝子、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる合成を、ＢａｍＩ及びＮｈｅ
Ｉ制限酵素を使用するｐｃＤＮＡ３．１を使用するにサブクローニングした。
【０４４０】
マウスＰＶＲＩＧタンパク質をコードする構築物：
マウス配列をコードする４つの構築物を、以下のようにＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合
成した：
１．標識なしの第１のメチオニン
２．Ｆｌａｇありの第１のメチオニン
３．標識なしの第２のメチオニン
４．Ｆｌａｇありの第２のメチオニン
合成遺伝子をｐＣＤＮＡ３．１にサブクローニングした
ＰＶＲＩＧタンパク質を過剰発現している安定したトランスフェクタントの生成
【０４４１】
結果として得られる発現構築物を配列によって検証した後、以下に記載のようにトラン
スフェクション及び安定性プール生成に使用した。発現構築物によってコードされるタン
パク質配列は図１０３に示す通りである。
【０４４２】
ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇタンパク質を発現している安定性トランスフェクタントプー
ルの生成
ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５７３）細胞を、ＦＵＧＥＮＥ  
６  試薬（Ｒｏｃｈ、カタログ番号１１−９８８−３８７）を使用して、ｐＣＤＮＡ３．
１＋ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇプラスミドまたは空ベクター（陰性対照としてのｐＣＤＮ
Ａ３．１＋）でトランスフェクトした。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ、カ
タログ番号：１１８１１−０３１）耐性コロニーを安定性プール生成のために選択した。
【０４４３】
ＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３１４５８）
を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を使用して、ｐＭＳＣＶ−ヒトＰＶＲＩＧまた
はｐＭＳＣＶ  空ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間
後、ビリオンを含む上清を収集し、以下のようにヒト細胞株の感染に直接使用した：
【０４４４】
ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−  ＣＲＬ−１５７３）細胞を、ヒトＰＶＲＩＧを
発現しているビリオン、または陰性対照としてｐＭＳＣＶ空ベクタービリオンに感染させ
、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号：５８−５８−２）耐性コロニ
ーを安定性プール生成のために選択した。
【０４４５】
発現検証
ウェスタンブロットによる発現検証
細胞プールの全細胞抽出物（３０ｕｇの全タンパク質）をウェスタンブロットによって
解析した。陰性対照として、空ベクターでトランスフェクトした安定性細胞プールの全細
胞抽出物を使用した。ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇ検出には、抗ｆｌａｇ及び抗ＰＶＲＩＧ
抗体を以下のように使用した：
【０４４６】
●マウス抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８５９２
、ＴＴＢＳ／５％のＢＳＡ中で１：１０００に希釈；
【０４４７】
●抗ＰＶＲＩＧ、Ｓｉｇｍａカタログ番号ＨＰＡ０４７４９７−ウサギポリクローナル
、ＴＴＢＳ／５％のＢＳＡ中で１：２００に希釈。その後、ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ、Ｊａ
ｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１１−０３５−００３、５％乳／ＴＴＢＳ
溶液中で１：２０，０００に希釈。
【０４４８】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による発現検証
組み換え安定性プールにおけるヒトＰＶＲＩＧタンパク質の細胞表面発現を検証するた
めに、１×１０５細胞を、室温で１０分間、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈した固定性生
死判定染料４５０（ＢＤ、５６２２４７）で染色した。続いて、１：２００に希釈したマ
ウスポリクローナル抗ＰＶＲＩＧ（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ０００７９０３７−Ｂ
０１）またはマウスＩｇＧ１  アイソタイプ対照（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を細胞に添加した後、ヤギ抗マウス−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５−１
１６−１４６）で染色した。
【０４４９】
結果、ヒトＰＶＲＩＧ−Ｆｌａｇタンパク質を過剰発現しているＨＥＫ２９３安定性プ
ール細胞の発現検証
安定してトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞プールにおけるＰＶＲＩＧタンパク質
の発現を検証するために、全細胞抽出物を、材料及び方法で説明するように、抗ｆｌａｇ
抗体または抗ＰＶＲＩＧ抗体（Ａｂｎｏｖａ）を使用して、ウェスタンブロットによって
解析した。図２４に示す結果は、ヒトＰＶＲＩＧを発現しているＨＥＫ２９３細胞プール
の抽出物においては約３３ｋＤａの予期されたタンパク質サイズに対応するバンドを示す
が、空ベクターでトランスフェクトした細胞においては示さない。
【０４５０】
ＰＶＲＩＧタンパク質の細胞表面発現を検証するために、ＰＶＲＩＧ−ｆｌａｇ  ｐＣ
ＤＮＡ３．１ベクターを過剰発現している安定してトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細
胞を、材料及び方法で説明するように、マウス抗ＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ（Ａｂｎｏｖａ）を
使用して、ＦＡＣＳによって解析した。図２５に提示する結果は、ヒトＰＶＲＩＧ−ｆｌ
ａｇを安定して発現している細胞へのマウス抗ＰＶＲＩＧ  ｐＡｂの結合（灰色）が、空
ベクターでトランスフェクトした細胞によって観察されたもの（薄灰色）よりも高いこと
を示す。
【０４５１】
実施例３：ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ  Ｉｇ融合タンパク質産生
マウスＩｇＧ２ａのＦｃに融合したマウスＰＶＲＩＧのＥＣＤで構成されるＰＶＲＩＧ
ｍＥＣＤ−ｍＩｇ融合タンパク質（図１０３参照）を、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ（Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）にて、安定性細胞プールの１２日間の培養、ならびに続く細胞採取物のタンパク
質Ａ精製及び凝集除去のための分取ＳＥＣ精製によってＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中で産生さ
せた。採集産生物を、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのＮａ／Ｋホスフェート、１
４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５の０．０１％のＴｗｅｅｎ中で製剤化した。
【０４５２】
使用した発現ベクターはＰｒｏＢｉｏＧｅｎのＰＢＧ−ＧＰＥＸ６であった。ＰＶＲＩ
Ｇ遺伝子は、ＣＭＶ／ＥＦ１ハイブリッドプロモーター、続いてポリアデニル化シグナル
ｐＡ−１によって駆動される。ベクターは、ピューロマイシンを使用するトランスフェク
ト細胞の選択を可能にするピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子、
及びメトトレキサート（ＭＴＸ）を使用するトランスフェクト細胞の選択を可能にするデ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む。
【０４５３】
ヒンジにてＳ突然変異にＣ２２０、Ｃ２２６、及びＣ２２９を担持するヒトＩｇＧ１の
Ｆｃに融合したヒトＰＶＲＩＧのＥＣＤで構成されるＰＶＲＩＧ  ｈＥＣＤ−ｈＩｇ融合
タンパク質（図１０３参照）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｃｈｉｎａ）にて、ＣＨＯ−３Ｅ
７細胞中の一過性トランスフェクト、その６日間の培養、及び続く細胞採集物のタンパク
質Ａ精製によって産生させた。最終生成物をｐＨ７．２のＰＢＳ中で製剤化した。
【０４５４】
使用した発現ベクターは、ＰＶＲＩＧ遺伝子がＣＭＶプロモーターによって駆動される
哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５である。
【０４５５】
実施例４：ヒトＰＢＬ上のＰＶＲＩＧの発現及びＰＶＲＩＧ−Ｆｃの黒色腫細胞株への結
合
ＰＶＲＩＧは、１つの理論に限定されるものではないが、Ｔ細胞上でＣＤ２８様受容体
として機能する新規の免疫チェックポイントタンパク質である。この研究では、ヒト末梢
血リンパ球上のＰＶＲＩＧの発現、及びＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（ヒトＩｇＧ１に融合
したヒトＰＶＲＩＧの細胞外ドメインで構成される）の黒色腫細胞株への結合を評価した
。
【０４５６】
材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ２背景においてＭＡＲＴ−１抗原を提示する３つのヒト黒色腫細胞株（ＳＫ
−ＭＥＬ−２３、Ｍｅｌ−６２４、及びＭｅｌ−６２４．３８）をＣＴＬの標的として使
用した。ＨＬＡ−Ａ２を発現しないＭｅｌ−８８８は陰性対照として機能した。
【０４５７】
健常なヒトドナー由来の軟膜をＴｅｌ  Ｈａｓｈｏｍｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから
得た。末梢血単核細胞をＰＨＡで刺激し、３日間培養した後、ＭＳＣＶ系レトロウイルス
ベクター（ｐＭＳＧＶ１）で形質導入した。形質導入に続いて、細胞を、更に５日間、リ
ンパ球培地（バイオターゲット培地、ウシ胎仔血清（１０％）、Ｌグルタミンペニシリン
／ストレプトマイシン（１００単位／ｍｌ）、ＩＬ−２  ３００ＩＵ）中で更に成長させ
た。
【０４５８】
ＰＢＬ上のＰＶＲＩＧ発現を評価するために、細胞を、４度で３０分間、５ｕｇ／ｍｌ
のＰＶＲＩＧに特異的な抗体（マウスポリクローナル）で染色した。洗浄した後、細胞を
、４度の暗所で３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液中のＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスｍＡ
ｂ（１：２５０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号  Ａ１０６６７）で染色した。
ＦＡＣＳ緩衝液中での２回の洗浄の後、試料を、Ｃｙｔｅｋ  ＨＴＳを用いてＢＤ  Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上で読み取った。
【０４５９】
黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２３、Ｍｅｌ−６２４、Ｍｅｌ−６２４．３８、及びｍｅ
ｌ−８８８へのＰＶＲＩＧ−Ｉｇの結合を評価するために、細胞を、Ｆ４形質導入または
非形質導入（ｗ／ｏと表記）ＰＢＬと共培養した後、２０ｕｇ／ｍｌの融合タンパク質Ｐ
ＶＲＩＧ−Ｉｇ  ＨＨ  バッチ番号１２５で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液中の２回の洗浄の
後、試料を二次ヤギ抗ヒトＰＥで染色した（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−１１
６−０９８）。
【０４６０】
結果
一次ヒト白血球上のＰＶＲＩＧの内因性発現を評価するために、ＰＢＬをＰＨＡで刺激
した後、空ベクターで形質導入し、抗ＰＶＲＩＧ特異的抗体で染色した。図１１に示すよ
うに、アイソタイプ一致対照に対して、抗ＰＶＲＩＧで染色された２つの異なるドナーが
観察された。
【０４６１】
黒色腫細胞株上のＰＶＲＩＧの内因性発現を評価するため、及び内因性発現が抗原特異
的Ｔ細胞との共培養による影響を受けるかどうかを決定するため、４つの異なる黒色腫細
胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２３、Ｍｅｌ−６２４、Ｍｅｌ−６２４．３８、及びｍｅｌ−８８
８）を、Ｆ４（ｇｐ１００特異的ＴＣＲ）を発現しているＰＢＬまたは発現していないＰ
ＢＬのいずれかと共培養した。その後、細胞を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト
ＰＶＲＩＧの細胞外ドメインで構成される融合タンパク質で染色した。図１２に示すよう
に、４つ全ての試験したヒト黒色腫細胞株がＰＶＲＩＧ−Ｉｇへの結合を呈する。結合強
度は、黒色腫反応性の操作されたＴ細胞との共培養後、Ｔ細胞依存性活性化による影響を
受けない。
【０４６２】
概要：本明細書に提示する結果は、ＰＶＲＩＧがＰＨＡ活性化ヒト一次末梢血白血球（
ＰＢＬ）上で発現されることを示す。加えて、この研究で試験した４つの黒色腫細胞株は
、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＰＶＲＩＧの細胞外ドメインで構成される融合
タンパク質と結合し、これは、これらの細胞株がＰＶＲＩＧについての対応物を発現する
ことを示す。
【０４６３】
実施例５：受容体リガンド特定及び検証
第１の検証研究を、細胞マイクロアレイ技術を使用して行い、ヒトＨＥＫ２９３細胞に
おいて個々に発現された３５５９の完全長ヒト原形質膜タンパク質へのＰＶＲＩＧの相互
作用をスクリーニングした。
【０４６４】
ヒトＨＥＫ２９３細胞を、３５５９の完全長ヒト膜タンパク質をコードする発現ベクタ
ーでスポッティングしたスライド上で成長させた。発現ベクター（ｐＩＲＥＳ−ｈＥＧＦ
Ｒ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ１）を全てのスライド上で４連でスポッティングし、これ
を使用して、全てのスライド上でトランスフェクション効率の最小閾値が達成されたか、
またはそれを超過したことを確実にした。ヒトＨＥＫ２９３細胞を逆トランスフェクショ
ン／発現に使用した。ヒトＩｇＧ１に融合したＰＶＲＩＧのＥＣＤで構成される融合タン
パク質を、細胞固定後に、２０ｕｇ／ｍｌで各スライドに添加した。結合の検出を、適切
な蛍光二次抗体を使用して行った。２つの複製スライドセットをスクリーニングした。蛍
光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を使用して解析し定量化した（ト
ランスフェクション効率のため）。
【０４６５】
タンパク質  「ヒット」を、バックグラウンドレベルと比較して上昇したシグナルを示
す二連スポットとして定義した。これは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア上でグリッ
ドした画像を使用した目視検査によって達成した。ヒットを、二連スポットの強度に応じ
て「強、中、弱、または極弱」として分類した。ヒットを確認するために、一次スクリー
ニングで特定したヒットをコードする全てのベクターを新たなスライド上に配列した。同
一のスライドをまた適切な陰性対照でプローブしたことを除いて、確認／特異性スクリー
ニング及び解析を、一次スクリーニングの通りに実行した（ｎ＝試料当たり２つの複製ス
ライド）。加えて、ヒットをコードする全てのベクターをシーケンシングした。全ての一
次ヒットをコードするベクターをシーケンシングして、その素性を確認した。
【０４６６】
背景スクリーンは、２、５、及び２０ｕｇ／ｍｌで、トランスフェクトしていないＨＥ
Ｋ２９３細胞へのごくわずかな結合を示した（図１３）。背景データに基づき、２０ｕｇ
／ｍｌを完全プロファイルに選択した。一次スクリーンは複数の二連ヒット（クローン）
をもたらし、その大部分は強度弱または極弱であった。特定した全てのヒット、及び対照
ＥＧＦＲ−ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターをスポッティングし、二連で再発現させ、確認／特
異性スクリーニングのために２０ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧでプローブした。
【０４６７】
強度の強い単一特異的ヒットであるＰＶＲＬ２を特定した（図１４）。別の弱いヒット
であるＭＡＧは、試験した他の融合タンパク質にも結合することが後で示されたため（デ
ータ割愛）、これが特異的ではないことを示す。これらの結果は、Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ＆ＦｒｏｎｔｌｅｒｓのＧ．Ｑｕｉｎｏｎｅｓによって最近公開された要約
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｙｕｍｐｕ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ／ｖｉｅｗ／７
２６３７２０／ｓｕｎｄａｙ−ｄｅｃｅｍｂｅｒ−４−ｌａｔｅ−ａｂｓｔｒａｃｔｓ−
１−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｉｏｌｏｇｙ−ｏｆ−ｔｈｅ−／１３３と一致する。ＰＶＲ
Ｌ２は、共にＴ細胞及びＮＫ細胞活性化の調節因子であるＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ１のた
めのリガンドとしての役割を果たすことが知られている。ＴＩＧＩＴは、腫瘍細胞に向け
た免疫応答の抑制における要であることが最近報告されている（Ｎｏａ  Ｓｔａｎｉｅｔ
ｓｋｙ，ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．４２，
１７８５８−１７８６３、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌ
ｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２６，Ｉｓｓｕｅ  ６，ｐ９２３−９３７，８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  
２０１４）。ＴＩＧＩＴと同じ対応物とのＰＶＲＩＧの相互作用を示す実施例５に提示す
る結果は、癌免疫監視を調節する重要な調節経路へのＰＶＲＩＧの関与を示すため、ＰＶ
ＲＩＧを癌治療のための可能性のある標的として位置付ける。
【０４６８】
更なる検証研究２
材料及び方法
材料
Ｆｃ融合タンパク質、Ｈｉｓ標識タンパク質、及び対照Ｉｇ：Ｆｃ融合タンパク質ＰＶ
ＲＩＧ−Ｆｃ  Ｍ：Ｍを結合研究に使用した。マウスＩｇＧ２ａをアイソタイプ対照とし
て使用した。本研究で使用した他の市販のマウスタンパク質は、ＰＶＲＬ２−ｈｉｓ（Ｒ
＆Ｄ、３８６９−Ｎ２）、及びＰＶＲＬ２−ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、
５０３１８−Ｍ０８Ｈ）であった。
【０４６９】
細胞：ＨＥＫ２９３過剰発現（ＯＸ）マウスＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＩＧ−ＦＬＡＧを生
成し（それぞれ、ＲＣ−２８７及びＲＣ−２８６）、ＰＶＲＬ２のこれらの細胞への結合
を、空ベクターを発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＥＶ）（ＲＣ−８３）と比較した。Ｈ
ＥＫ２９３  ＯＸ  マウスＰＶＲＬ２スプライス変異体１及び２（ｓｖ１及びｓｖ２）を
生成し（それぞれ、ＲＣ−３３４及びＲＣ−３３５）、ＰＶＲＩＧのこれらの細胞への結
合を、ＥＶを発現しているＨＥＫ２９３細胞と比較した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＣＬ−１
６１、マウス皮膚黒色腫細胞を内因的に発現しているｍＰＶＲＬ２）も、ＰＶＲＩＧ及び
ＰＶＲＬ２の相互作用を研究するために使用した。
【０４７０】
抗体：抗マウスＰＶＲＬ２−ＰＥ  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ３８６９Ｐ、２５μｇ／ｍｌ
、１：１００）をＰＶＲＬ２の検出に使用した。ラットＩｇＧ２Ａ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ、ＩＣ
００６Ｐ、２５μｇ／ｍｌ、１：１００）をアイソタイプ対照として使用した。抗マウス
−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１５−２０６、０
．５ｍｇ／ｍｌ、１：２００）及び抗ｈｉｓ  Ａｂ（Ａｂｃａｍ、ａｂ７２４６７、０．
１ｍｇ／ｍｌ、１：３００）を、組み換えタンパク質の結合を検出するために使用した。
抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ  Ｔａｇ（抗ＦＬＡＧ）Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、６３７３０２、
０．５ｍｇ／ｍｌ、１：３００）を、ＨＥＫ２９３  ＯＸマウスＰＶＲＩＧ−ＦＬＡＧ上
のＰＶＲＩＧ発現の検出に使用した。ＰＶＲＩＧ標識化には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（
登録商標）６４７  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ−２０１８６）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ＰＶＲＩ
Ｇのビオチン化には、ＤＳＢ−Ｘ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｄ−２０６５５）を製造業者のプロ
トコルに従って使用した。ビオチン化ＰＶＲＩＧをストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−Ｐ
Ｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、０１６−１１０−０８４、０．
５ｍｇ／ｍｌ、１：３００）によって検出した。
【０４７１】
方法
安定性ＨＥＫ２９３細胞過剰発現（ＯＸ）マウスＰＶＲＬ２またはＢ１６−Ｆ１０細胞
へのマウスＰＶＲＩＧ−Ｆｃ結合のＦＡＣＳ解析：ＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２（
ｓｖ１またはｓｖ２）またはＢ１６−Ｆ１０細胞を、ＰＢＳ中で１０６細胞／ｍｌに懸濁
した。各１ｍｌの細胞に、１μｌの生死判定染料原液（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｆｉｘａ
ｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ  ４５０、カタログ番号５６２２４７、ＢＤ  
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。細胞を、室温で遮光しながら１０分間インキュベー
トした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｃγ−受容体の妨害のために、１５分間室
温で、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを補充したＰＢＳ）中で
１：５０のヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ４２２３０２）の
存在下で３×１０６細胞／ｍｌに懸濁した。その後、洗浄せずに、１×１０５細胞／ウェ
ルを９６ウェルＶ字型プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３３５７）にプレーティングした。ＰＶ
ＲＬ２の発現を抗ＰＶＲＬ２抗体によって検査した（上記参照）。ＰＶＲＩＧ−Ｆｃの細
胞への結合を、概して６０μｇ／ｍｌで、またはいくつかの濃度を用いて、種々のバッチ
（上記参照）により検査した。細胞を、室温で４０分間、抗体またはＰＶＲＩＧ−Ｆｃと
共にインキュベートした後、１回洗浄した。二次抗体（抗マウス−ＰＥ）を室温で１５分
間添加し、細胞を２回洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ＦＡＣＳ解析器（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による解析に持ち込んだ後、Ｆｌｏｗ−Ｊｏ  １０ソフトウ
ェアを使用してデータ解析を行った。
【０４７２】
安定性ＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  マウスＰＶＲＩＧへのマウスＰＶＲＬ２−ｈｉｓ結合の
ＦＡＣＳ解析：ＰＶＲＩＧレベルを抗ＦＬＡＧ抗体で検査した。ＰＶＲＬ２−ｈｉｓ結合
を抗ｈｉｓ抗体によって監視した。ＦＡＣＳ解析を上記のように行った。
【０４７３】
ＢｉａｃｏｒｅによるマウスＰＶＲＩＧ／ＰＶＲＬ２相互作用の生物物理学的ＳＰＲ解
析：マウスＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＬ２間の相互作用を、Ｂａｒ−Ｉｌａｎ  Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙにて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ＳＰＲ生物分子相互作用解析器において解析
した。タンパク質をｐＨ４．０の酢酸緩衝液中で１００ｎＭに希釈し、標準的なアミン結
合化学を使用して、ＣＭ５  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｂｉａｃｏｒｅチップの固有フローセル
に共有結合させた。表面をＥＤＣ−ＮＨＳによって活性化し、後で１Ｍのエタノールアミ
ン（ｐＨ８．５）の注射によって妨害した。泳動緩衝液は、ｐＨ７．３の１０ｍＭのＨｅ
ｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０
（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。最終固定レベルは約１０００ＲＵであった。分析物として
使用したタンパク質を、２５００ｎＭ、５００ｎＭ、及び１００ｎＭに希釈した。各実行
において、１つの試験管が参照用のみに泳動緩衝液を含んだ。各実行の後、２０μｌ／秒
での３０秒間の４ＭのＭｇＣｌ２による再生成ステップを行った。
【０４７４】
結果
マウスＰＶＲＩＧのＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２  ｓｖ１への結合：マウスＰＶ
ＲＩＧとマウスＰＶＲＬ２との間の相互作用を検証するために、まずＰＶＲＩＧ−Ｆｃの
細胞過剰発現（ＯＸ）ＰＶＲＬ２への結合を試験した。ＨＥＫ２９３  ＯＸ  ＰＶＲＬ２
ｓｖ１上のＰＶＲＬ２発現のレベルを、特異的抗マウスＰＶＲＬ２抗体を使用して決定
した。マウスＰＶＲＬ２発現は、空ベクターを発現しているＨＥＫ２９３細胞と比較して
１０倍高かった（データ割愛）。ＰＶＲＩＧ−Ｆｃの４つのバッチをＰＶＲＬ２  ＯＸ細
胞への結合について検査した。全てのＰＶＲＩＧ−Ｆｃバッチが、空ベクター細胞と比較
して６〜１１倍の細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２への結合を示した（データ割愛）。ＰＶＲＩＧ−
ＦｃのＰＶＲＬ２  ＯＸ細胞への結合も、ビオチン化し蛍光標識（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ
ｒ  ６４７）したＰＶＲＩＧタンパク質を使用して検査した。ビオチン化タンパク質が非
標識ＰＶＲＩＧ−Ｆｃと比較してわずかに強いＰＶＲＬ２  ＯＸ細胞への結合を示した一
方で（データ割愛）、蛍光標識ＰＶＲＩＧは、はるかに弱い結合を示した（データ割愛）
。これらの結果は、ＰＶＬＲ２がＨＥＫ２９３細胞ＯＣ  ＰＶＲＬ２の膜上で検出される
こと、マウスＰＶＲＩＧ−ＦｃのＰＶＬＲ２  ＯＸ細胞への結合が抗マウスＩｇＧ２Ａ抗
体によって検出されること、ビオチン化マウスＰＶＲＩＧ−ＦｃのＰＶＬＲ２  ＯＸ細胞
への結合がストレプトアビジン−ＰＥによって検出されること、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ６４７標識化ＰＶＲＩＧ−ＦｃのＰＶＬＲ２  ＯＸ細胞への結合を示す。
【０４７５】
マウスＰＶＲＬ２のＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧへの結合：マウスＰＶＲＩＧと
マウスＰＶＲＬ２との間の相互作用を更に検証するために、ＦＬＡＧ標識を用いる場合ま
たは用いない場合のＰＶＲＬ２の細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧへの結合を試験した。ＦＬＡＧ標
識を用いたＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧ上でのマウスＰＶＲＩＧの膜発現を、抗Ｆ
ＬＡＧ抗体を使用して確認した（データ割愛）。予測通り、ＦＬＡＧ標識のないＨＥＫ２
９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した発現を示さなかった。抗ＰＶＲ
ＩＧ上清（Ａｌｄｅｖｅｒｏｎ）を使用すると、これらの細胞は、ＦＬＡＧタグのある細
胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧと比較して低いＰＶＲＩＧ発現を示した。市販のマウスＰＶＲＬ２組
み換えタンパク質は、Ｈｉｓ標識タンパク質としてのみ入手可能であった。したがって、
検出に適切な抗Ｈｉｓ抗体及び条件を得るためには詳細な較正が必要であった。２つの異
なるソースからのＨｉｓ標識ＰＶＲＬ２を、ＰＶＲＩＧ  ＯＸ細胞への結合について６０
μｇ／ｍｌで試験すると、空ベクターを発現しているＨＥＫ２９３細胞と比較して２倍（
データ割愛）及び３〜４倍（データ割愛）の結合を示した。つまり、ｈｉｓ標識マウスＰ
ＶＬＲ２はＨＥＫ２９３  ＯＸ  マウスＰＶＲＩＧに結合し、マウスＰＶＲＩＧは、ＨＥ
Ｋ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧの膜上で発現される。
【０４７６】
ＳＰＲ−Ｂｉａｃｏｒｅを使用するマウスＰＶＲＩＧ及びマウスＰＶＲＬ２相互作用の
研究：マウスＰＶＲＩＧ−Ｆｃ及びマウスＨｉｓ標識ＰＶＲＬ２間の相互作用を評価する
ために、両方のタンパク質をＢｉａｃｏｒｅチップに固定した。固定後、両方のタンパク
質及びＰＶＲＩＧ−Ｆｃ（データ割愛）を、２５００、５００、及び１００ｎＭの３つの
濃度で分析物として流した（ＰＶＲＩＧバッチ番号４８０及びＰＶＲＬ２は分析物として
２回流した）。２つのタンパク質間の相互作用を、両方向で及びＰＶＲＩＧの両方のバッ
チで検出した（データ割愛）。複合体動態に起因して、Ｂｉａｃｏｒｅ結果から正確なＫ
Ｄは決定できなかった。
【０４７７】
ＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２  ｓｖ２及びＢ１６−Ｆ１０細胞へのマウスＰＶＲ
ＩＧの用量応答結合：上に示したように、マウスＰＶＲＩＧ  ＯＸ細胞へのマウスＰＶＲ
Ｌ２結合は比較的低かった。マウスＰＶＲＩＧ及びマウスＰＶＲＬ２間の相互作用を妨害
することができる抗マウスＰＶＲＩＧ抗体をスクリーニングするための方法を確立するた
めに、ＰＶＲＩＧ−ＦｃのＰＶＲＬ２  ＯＸ細胞への結合を選択した。まず、マウスＩｇ
Ｇ２Ａ及びマウスＰＶＲＩＧ−Ｆｃの細胞ＯＸマウスＰＶＲＬ２への用量応答結合曲線を
生成し、空ベクター（ＥＶ）を発現している細胞と比較した。用量応答を、５０μｇ／ｍ
ｌから０．１μｇ／ｍｌへの２倍連続希釈（１：２）で行った。マウスＩｇＧ２Ａ結合に
おける差異は観察されなかったが（データ割愛）、ＰＶＲＩＧ−Ｆｃは、１２．５μｇ／
ｍｌでの結合の飽和、及びタンパク質濃度の減少と相関して低減した結合を示した（デー
タ割愛）。ＰＶＲＩＧ−Ｆｃでも同様の結果を得た（データ割愛）。これらの結果は、こ
の結合アッセイを、妨害抗体のスクリーニングのために検討し得ることを示唆する。
【０４７８】
抗マウスＰＶＲＩＧ抗体のスクリーニングのための内在系も検討するために、Ｂ１６−
Ｆ１０細胞上のＰＶＲＬ２の発現を、抗ＰＶＲＬ２抗体を使用して評価した。結果は、Ｐ
ＶＲＬ２が上で発現されＢ１６−Ｆ１０細胞上で高度に発現されることを示す（データ割
愛）。このため、同様の用量応答結合曲線をマウスＩｇＧ２Ａ及びマウスＰＶＲＩＧ−Ｆ
ｃのＢ１６−Ｆ１０細胞への結合について産出した。ＨＥＫ２９３細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２
によって得られた結果と同様に、マウスＰＶＲＩＧ−Ｆｃは１２．５μｇ／ｍｌで飽和に
達するＢ１６−Ｆ１０細胞への用量応答結合を示したが、マウスＩｇＧ２Ａの結合の変化
は検出されなかった（データ割愛）。
【０４７９】
考察及び結論：ヒトＰＶＲＬ２とのヒトＰＶＲＩＧ相互作用を、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ
にてＣｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して特定した。この
相互作用をマウス中でも検証するために、いくつかのアプローチを行った。そのいくつか
が、ＰＶＲＩＧまたはＰＶＲＬ２  ＯＸ細胞の使用、及びＳＰＲ−Ｂｉａｃｏｒｅを使用
する生物物理学測定である。全てのアプローチが、マウスＰＶＲＩＧがマウスＰＶＲＬ２
と相互作用することを示した。しかしながら、マウスＰＶＲＬ２の細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧ
への結合は、ＰＶＲＩＧの細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２への結合と比較して相対的に低かった。
この理由は、市販のＰＶＲＬ２が、Ｆｃ融合タンパク質としてではなくモノマーＨｉｓ標
識タンパク質としてのみ入手可能であること（ＰＶＲＩＧと同様）であり得る。これを受
けて、カスタムのＦｃ融合マウスＰＶＲＬ２をＧｅｎＳｃｒｉｐｔにて産生させた。しか
しながら、予備データからは、このタンパク質では結合のわずかな増加しか観察されなか
った（ＰＶＲＬ２−ｈｉｓによる２〜３倍と比較して約５倍）。このため、一部の他の因
子が、この比較的低い結合に影響している可能性があった。
【０４８０】
細胞ＯＸ  ＰＶＲＩＧへの低いＰＶＲＬ２結合に起因して、細胞ＯＸ  ＰＶＲＬ２への
ＰＶＲＩＧ−Ｆｃ結合を使用する抗ＰＶＲＩＧ抗体妨害アッセイを確立することを決定し
た。観察された用量応答曲線に従って、０．１、０．２、及び０．４μｇ／ｍｌの３つの
作動濃度を提案した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞を内因的に発現しているＰＶＲＬ２へのＰＶＲ
ＩＧの結合によって得られた同様の結果に従い、抗体妨害アッセイを、以下の濃度：０．
２、０．４、０．８μｇ／ｍｌでこれらの細胞上でも行うことを提案した。
【０４８１】
ＰＶＲＩＧは受容体と推定されるものであるため、好ましくは、抗体妨害アッセイは、
可溶性タンパク質としてのＰＶＲＬ２及び細胞上で発現されるＰＶＲＩＧを用いて行うべ
きである。このため、本系においても現在の形式で妨害活性を示す抗マウスＰＶＲＩＧ抗
体を検査することを検討すべきである。
【０４８２】
更なる検証研究３
この研究の目的は、新規の免疫腫瘍学的標的であるＰＶＲＩＧの結合パートナーを確認
することである。予備研究は、これらのリガンドのうちの１つはＰＶＲＬ２であることを
示す。この研究では、ＰＶＲＩＧ軸におけるいくつかの可能性のあるリガンドへの組み換
えＰＶＲＩＧタンパク質の結合をＥＬＩＳＡによって調査した。
【０４８３】
プロトコル
試薬の一覧：ＰＶＲＩＧタンパク質に関する最新文献は、可能性のあるリガンドが３つ
あることを提唱している：ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）、及びＰＶ
ＲＬ３（ＣＤ１１３）。ＰＶＲＩＧ受容体に結合するそれらの能力を調査するために、以
下のようにこれら３つのリガンドを商業的に得た：ＰＶＲ及びＰＶＲＬ３はＳｉｎｏ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から、ＰＶＲＬ２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＳｉｎ
ｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から。ヒトＰＶＲＩＧ組み換えタンパク質を、ヒ
トＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合させたＰＶＲＩＧ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＶＲＩ
ＧＨＨ）としてＣｏｍｐｕｇｅｎにて生成した。
【０４８４】
受容体−リガンド相互作用を決定するためのＥＬＩＳＡ：商業的に得たＨｉｓ標識リガ
ンド、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、及びＰＶＲＬ３を、高結合ＥＩＡ／ＲＩＡ  プレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ  ９０１８）のウェルに４℃で一晩コーティングした。無関係のＨｉｓ標識タン
パク質を陰性対照として含めた。コーティングしたプレートウェルをＰＢＳで２回濯ぎ、
３００μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳、ｐＨ７．４）と共に１時間室温（Ｒ
Ｔ）でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで更に２回濯いだ。
プレートに結合したリガンドを、溶液中の様々な濃度のＰＶＲＩＧＨＨ（５０μＬ／ウェ
ル体積において０．１μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬの線形範囲）と共に１時間室温でインキ
ュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）
で３回、その後ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体を添加した
（ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）
。これを１時間室温でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。５０μＬのＳｕｒｅ
ｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ）を添加し、５〜２０分間インキュベートするこ
とによって、全てのウェルにおいてＥＬＩＳＡシグナルを発現させた。５０μＬの２Ｎ  
Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ）を添加することによってＨＲＰ反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸
光シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎ
Ｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）分光光度計上で読み取った。データをＥｘｃｅ
ｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）においてプロットした。
【０４８５】
結果：ＰＶＲＩＧはＰＶＲＬ２に好んで結合する：ヒトＰＶＲＩＧ  Ｆｃ−融合タンパ
ク質を、ＥＩＡ／ＲＩＡ  プレート上に固定したＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、及びＰＶＲＬ３へ
の結合についてアッセイした。溶液相にある様々な濃度の受容体ＰＶＲＩＧを、固定した
リガンドと共にインキュベートした。データは、ＰＶＲＩＧＨＨのＰＶＲＬ２への用量依
存性結合を明確に示すが、リガンドＰＶＲ、ＰＶＲＬ３、または陰性対照タンパク質への
結合は示さない（データ割愛）。ＥＬＩＳＡ  Ａ４５０シグナルを、一部位結合方程式を
使用して受容体濃度の関数としてプロットすると、１３±１ｎＭの平衡結合定数（ＫＤ）
が明らかとなった。
【０４８６】
概要及び結論：ＰＶＲＩＧは、その生物学が完全には理解されていない新規の免疫腫瘍
学的標的である。この生物学を明らかにする目的で、いくつかの可能性のあるリガンドへ
のその結合を検査した。ＰＶＲＬ２は、ＰＶＲＩＧの結合パートナーとして明確に特定さ
れた。定量分析によると、この相互作用は、ＫＤが１３±１ｎＭで非常に強力であること
が示唆される。発明者らによる結果は、ヒトＰＶＲＩＧがヒトＰＶＲ及びＰＶＲＬ３に結
合しないか、または結合がＥＬＩＳＡによる検出には弱すぎるかのいずれかであることも
示唆する。
【０４８７】
更なる検証研究４：
この実施例では、ＰＢＭＣ細胞サブセット上のＰＶＲＩＧ発現を同種活性化の前後に評
価した。同種活性化の後で、ＰＶＲＩＧの発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細
胞ならびに二重負ガンマデルタＴ細胞上で上方調節された。この上方調節は、試験した２
ドナーのうちの一方のＰＢＭＣにおいて観察された（図５２参照）。
【０４８８】
実施例６：ＰＶＲＩＧ、ＤＮＡＭ、及びＴＩＧＩＴへのＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、及びＰＶＲ
Ｌ３結合の表面プラズモン共鳴研究
材料及び方法
全ての実験は、２２℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６機器を使用して行った。
【０４８９】
ステップ１：高密度ヤギ抗ヒトｆｃポリクローナル抗体表面（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  
Ｈ１０５００）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６バイオセンサーを使用してＧＬＣチッ
プの６つ全てのレーン上で調製した。抗ヒトｆｃ表面に対する活性化ステップは水平流向
で行い、一方で高密度ｐＡｂに対する固定ステップは垂直流向で行った。妨害ステップは
、垂直位置及び水平位置の両方で行うことで、水平「インタースポット」を参照表面とし
て使用し得るようにした。平均約４４００ＲＵのヤギ抗ヒトｐＡｂを各レーンに固定した
。
【０４９０】
ステップ２：各サイクルについて、ヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質の３つの異なるロッ
ト（ヒトｆｃ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔロット４５１、４４８、１２５）、ヒトＤＮＡＭ−１
融合タンパク質（ヒトｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＴＩＧＩＴ融合タンパク質
（ヒトｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び対照ヒトＩｇＧ（Ｓｙｎａｇｉｓ）を、各
々、２μｇ／ｍＬの濃度で２分間、異なる垂直レーン上で捕捉した。ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２
の２つのロット、及びＰＶＲＬ３を、各々、異なるリガンド捕捉サイクルで捕捉した６つ
全てのリガンドに６つの異なる濃度で水平流向で注射した。注射は２分であり、５０μＬ
／分の流量で１０分の解離を続けた。ＰＶＲ濃度範囲は３倍連続希釈で１．４ｎＭ〜３３
２ｎＭであり、ＰＶＲＬ２の両ロットは３倍連続希釈で１．３ｎＭ〜３２２ｎＭの濃度範
囲で注射し、ＰＶＲＬ３は３倍連続希釈で１．４ｎＭ〜３３４ｎＭの濃度範囲で注射した
。全てのタンパク質試薬を泳動緩衝液中で調製し、この緩衝液は、０．０５％のＴｗｅｅ
ｎ  ２０及び０．０１％のＢＳＡを添加した脱気ＰＢＳ緩衝液であった。抗ヒトｆｃ捕捉
表面を、各サイクル後の１４６ｍＭのリン酸の３０秒パルス２回によって再生成した。
【０４９１】
ステップ３：捕捉した各リガンドに結合する分析物のセンサーグラムデータを、インタ
ースポット参照及び分析物注射と同一のプレブランク注射を利用して、ＰｒｏｔｅＯｎ  
Ｍａｎａｇｅｒバージョン３．１．０．６を使用して処理及び二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）した。
【０４９２】
結果
ａ）ＰＶＲ：捕捉したＤＮＡＭ−１及びＴＩＧＩＴに弱く結合し、ＰＶＲＩＧの３つ全
てのロット及び対照ＩｇＧへの結合を示さない。ＤＮＡＭ−１及びＴＩＧＩＴとのＰＶＲ
相互作用のＫＤを見積もるのに十分な情報は生成されなかった（データ割愛）。
【０４９３】
ｂ）ＰＶＲＬ２：ＰＶＲＬ２の両ロットは、ＰＶＲＩＧの３つ全てのロット及びＤＮＡ
Ｍ−１への結合を示したが、ＴＩＧＩＴへの結合は最低限であったかまたは皆無であり、
対照ＩｇＧへの結合は示さなかった。センサーグラムは複合体動態を示したため、結合定
数を見積もることはできなかった（データ割愛）。
【０４９４】
ｃ）ＰＶＲＬ３：ＴＩＧＩＴへの最低限の結合しか示さず、他のタンパク質には結合し
なかった（データ割愛）。
【０４９５】
実施例７：マウスＴ細胞上のＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ−Ｉｇのインビトロの免疫調節活性
これらの実験では、組み換え融合タンパク質ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇの免疫調節活性
を、マウスＴ細胞活性化について調査した。ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−ＩｇがマウスＣＤ４  
Ｔ細胞の活性化に与える影響を、細胞活性化マーカー、サイトカイン分泌、及び増殖とい
ういくつかのインビトロのＴ細胞活性化読み出しを使用して調査した。
【０４９６】
細胞活性化に対するｐｖｒｉｇタンパク質の活性を評価するために、マウスｉｇｇ２ａ
のｆｃに融合させたマウスｐｖｒｉｇのマウス細胞外ドメイン（ｅｃｄ）（ｐｖｒｉｇ−
ｅｃｄ  ｉｇ  ｍ：ｍと表記）（配列番号２９）を含む組み換えタンパク質を産生させた
。活性化マーカー及びサイトカイン分泌によって表される、抗ｃｄ３と共に固定したｆｃ
融合タンパク質がマウスｃｄ４  ｔ細胞機能に与える影響を調査した。
【０４９７】
材料及び方法
Ｆｃ融合タンパク質及び対照Ｉｇ：Ｆｃ融合タンパク質ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（バ
ッチ番号１９８）を試験した。マウスＩｇＧ２ａ（クローンＭＯＰＣ−１７３、Ｂｉｏｌ
ｅｇｅｎｄ、またはＣ１．１８．４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）をアイソタイプ対照として使用
した。
【０４９８】
マウスＣＤ４  Ｔ細胞単離：未処理のＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞を、Ｔ細胞単離キッ
ト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉカタログ番号１３０−０９３−２２７）を製造業者の指示に従って
使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓のプールから単離した。得られた純度は９０％超で
あった。
【０４９９】
マウスＣＤ４  Ｔ細胞の活性化：２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３−εｍＡｂ（クローン
１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、種々の濃度（１、３、または１
０μｇ／ｍｌ）のＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇタンパク質または対照Ｉｇと一緒に、９６ウ
ェル平底組織培養プレート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ７０７９１０）上で、３７℃で
３時間、共に固定した。ウェル当たり１２μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度を達成するため
に、対照Ｉｇを各ウェルに添加した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ウェル当たり１×１
０５の精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞をプレーティングし、加湿した５％のＣＯ２
、３７℃のインキュベーター中に保った。一部の実験では、可溶性抗ＣＤ２８（クローン
：３７．５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１μｇ／ｍｌ）を添加。培養上清を、刺激後の
示す時間にて収集し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってマウスＩＦ
ＮγまたはＩＬ−２分泌について解析した。ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇタンパク質がマウ
スＣＤ４＋  Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の発現に与える影響（図１０３参照）を
、フローサイトメトリーによって解析した。細胞を、刺激から４８時間後に、Ｆｃγ−受
容体の妨害のために抗ＣＤ１６／３２（ｃｌｏｎｅ  ２．４ｇ２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）の存在下で、ＰｅｒＣＰ−抗ＣＤ４（クローンＧ４１．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎ
ｄ）、ＦＩＴＣまたはＰＥ−抗ＣＤ６９（クローンＨ１．２Ｆ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
を含む抗体のカクテルで染色した。細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ９
（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して評価し、データを、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔを使用し
て、またはＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙ  ＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析した。デー
タを、ＥｘｃｅｌまたはＰｒｉｓｍ４ソフトウェアを使用して解析した。
【０５００】
結果及び要約
ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ  Ｉｇ  Ｍ：ＭがマウスＣＤ４＋  Ｔ細胞機能に与える影響（図１
０３参照）：図１５は、可溶性抗ＣＤ２８（１ｕｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（２ｕｇ
／ｍｌ）のみと共に固定したかまたは対照Ｉｇ（ｍＩｇＧ２ａ）もしくはＰＶＲＩＧ−Ｅ
ＣＤ−Ｉｇ（図１０３参照））（１０ｕｇ／ｍｌ）と共に固定したマイクロプレートによ
って刺激した単離マウス脾臓Ｔ細胞（ＣＤ４＋、純度９５％超）上のＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ
−Ｉｇ（図１０３参照）のインビトロ免疫調節活性を示す。ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（
図１０３参照）は、低減したＣＤ６９上方調節（図１５Ａ、Ｄ）及びＴＣＲ誘導性サイト
カイン（ＩＬ−２及びＩＦＮγ）分泌の低減（図１５Ｂ〜Ｃ、Ｅ）によって表されるよう
に、用量依存性の様式でマウスＣＤ４  Ｔ細胞活性化を抑制した。ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−
Ｉｇ（（図１０３参照））の抑制効果の大きさは３０〜１００％の範囲であった。ＩＦＮ
γ分泌に対するＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（（図１０３参照））の抑制効果は、３ｕｇ／
ｍｌまで低い濃度で観察された（約６０％、抑制対対照Ｉｇ）。
【０５０１】
ＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（図１０３参照）は、Ｆｃ融合タンパク質をプレート上で抗
ＣＤ３と共に固定した場合、濃度依存性の様式でＴ細胞活性化を阻害する。最大の抑制効
果は、１０ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇ（図１０３参照）にて観察された。
【０５０２】
結果は、マウスＴ細胞活性化に対するＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−Ｉｇの抑制効果を示し、こ
れは、低減したサイトカイン  分泌、及び活性化マーカーＣＤ６９の上方調節の抑制によ
って表される。このＴ細胞活性化の抑制は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、及
び炎症性腸疾患等のＴ細胞駆動型自己免疫疾患、ならびに他の免疫関連疾患の治療、なら
びに／または遺伝子療法に続く望ましくない免疫活性化を低減させることにおける、本発
明に従う免疫抑制ＰＶＲＩＧタンパク質（ＰＶＲＩＧポリペプチド及び融合タンパク質）
の治療的可能性を支持する。加えて、これらの結果は、病変細胞のＴ細胞媒介性枯渇が治
療的に有利である、癌、感染性疾患、特に慢性感染症、及び敗血症等の増強したＣＴＬ免
疫及び炎症性サイトカインの恩恵を受けるはずの状態を治療するためのＰＶＲＩＧの抑制
活性を低減する免疫刺激ＰＶＲＩＧタンパク質（ＰＶＲＩＧ  ポリペプチド及び融合タン
パク質）の治療的可能性も支持する。
【０５０３】
実施例８：ヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対するＰＶＲＩＧのインビトロの免疫調節
活性
この実施例に記載する実験は、異なる黒色腫細胞株上のヒトＰＶＲＩＧの異所性発現が
、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）を活性化しこれらの細胞による殺傷の標的として働く
その能力に与える影響を評価した。
【０５０４】
材料及び方法：
ＨＬＡ−Ａ２背景においてＭＡＲＴ−１抗原を提示する３つのヒト黒色腫細胞株（ＳＫ
−ＭＥＬ−２３、Ｍｅｌ−６２４、及びＭｅｌ−６２４．３８）をＣＴＬの標的として使
用した。ＨＬＡ−Ａ２を発現しないＭｅｌ−８８８は陰性対照として機能した。
【０５０５】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上のヒトＰＶＲＩＧの異所性発現：末梢血白血球（Ｐ
ＢＬ）培養においてヒトＰＶＲＩＧを発現するために、ＰＶＲＩＧをコードするｃＤＮＡ
を、特異的プライマーを使用して増幅し、ＭＳＣＶ系レトロウイルスベクター（ｐＭＳＧ
Ｖ１）または３部のベクターにクローニングした。ＣＤ８依存性Ｆ４  ＴＣＲ  α及びβ
鎖をＰ２Ａ配列と連結させ、ｐＭＳＧＶ１ベクターにクローニングし、内部リボソーム侵
入部位（ＩＲＥＳ）及びＰＶＲＩＧのいずれかを続けた。陰性対照としてのまたは３部の
ベクターにおけるＮＧＦＲ１をコードするレトロウイルスベクター：ＣＤ８依存性Ｆ４  
ＴＣＲ  α及びβ鎖をＰ２Ａ配列と連結させ、ｐＭＳＧＶ１ベクターにクローニングし、
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びＮＧＦＲのいずれかを続けた。クローニングの
検証を、まず制限酵素消化を使用し、続いてシーケンシングすることによって行った。配
列確認時、大量のレトロウイルスベクター（マキシプレップ）を、後の使用のために産生
させた。
【０５０６】
健常なヒトドナーの末梢血白血球を、ＰＶＲＩＧをコードするレトロウイルス構築物、
またはＮＧＦＲ１をコードするレトロウイルスベクター、または陰性対照として空ベクタ
ーで形質導入した。形質導入を、レトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）に基づくプ
ロトコルを使用して実行した。端的には、レトロウイルス上清を、レトロウイルスベクタ
ー及び両種性エンベロープ遺伝子（ＶＳＶ−Ｇ）によるトランスフェクションの後、２９
３ＧＰ細胞（レトロウイルスパッケージング細胞株）において産生させた。レトロウイル
ス上清を、形質導入の前に、レトロネクチンをコーティングしたプレート上にプレーティ
ングしてビリオンのプレートへの結合を可能にし、ＰＢＬを６時間プレートに添加した。
その後、細胞を新たな培養容器に補給した。形質導入したＰＢＬを市販のＰＶＲＩＧ特異
的ウサギポリクローナル抗体または市販の抗ＮＧＦＲ（カタログ番号３４５１０８、Ｂｉ
ｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって、形質導入効率及びタンパク質の発現を決定し
た。ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ５００６）をアイソタイプ対照として使用
し、二次抗体としては、ＡＰＣにコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、
カタログ番号７１１−１３６−１５２）を使用した。
【０５０７】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上のＦ４  Ｔ細胞受容体の異所性発現：ＭＡＲＴ−１
２６−３５−／ＨＬＡ−Ａ２ペプチド−ＭＨＣ複合体を特異的に認識する、ＭＡＲＴ−１
特異的Ｆ４  ＴＣＲを発現するエフェクターリンパ球を得るために、ＰＶＲＩＧ、ＮＧＦ
Ｒ、または空ベクターのいずれかを発現するように事前に形質導入した新たに単離したヒ
トＰＢＬを、ＰＨＡで刺激し、５〜１０日間培養した後、ＭＡＲＴ−１特異的Ｆ４  ＴＣ
Ｒからのα及びβ鎖の両方をコードするインビトロで転写したｍＲＮＡで形質導入した。
形質導入されたリンパ球を、２〜３日ごとに補給したリンパ球培地（バイオターゲット培
地、ウシ胎仔血清（１０％）、Ｌグルタミンペニシリン／ストレプトマイシン（１００単
位／ｍｌ）、ＩＬ−２  ３００  ＩＵ）中で培養した。Ｆ４  ＴＣＲ発現レベルを、形質
導入された特異的ＴＣＲからのベータ鎖の細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナ
ル抗体を使用して、ＦＡＣＳによって検証した。（ＴＣＲ−Ｖｂ１２−ＰＥ、（カタログ
番号ＩＭ２２９１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０５０８】
ＰＶＲＩＧ、ＮＧＦＲ、または空ベクター、及びＦ４−ＴＣＲで形質導入したリンパ球
からの黒色腫細胞との共培養時のサイトカイン分泌：ＰＶＲＩＧまたはＮＧＦＲ及びＦ４
−ＴＣＲを発現しているＰＢＬを、操作していない黒色腫細胞と共培養した。１０５の形
質導入ＰＢＬを、１０５の黒色腫標的細胞と１６時間共培養した。エフェクターＣＤ８  
Ｔ細胞の異なる腫瘍細胞株に対する応答を評価するために、サイトカイン分泌（ＩＦＮγ
、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−α）を、ＥＬＩＳＡアッセイの線形範囲にあるように希釈した
培養上清（ＩＦＮγ（カタログ番号ＤＹ２８５Ｅ）、ＩＬ−２（カタログ番号ＤＹ２０２
Ｅ）、ＴＮＦ−α（カタログ番号ＤＹ２１０Ｅ）Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）中でＥＬＩＳ
Ａによって測定した。
【０５０９】
細胞媒介性細胞傷害性アッセイ：このアッセイは、共培養時の標的細胞殺傷を評価する
ために行った。ＰＶＲＩＧ及びＦ４を、バイシストロン性ベクターを使用してＰＢＬ中で
発現させ、ＣＦＳＥで標識した黒色腫標的細胞（２ｍＭのＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ）で６分間標識）と一緒に、３：１のＥ：Ｔ比で１８時間３７℃で共培養した。細胞
を１８時間後に収集し、細胞死の比を割り当てるために１ｍＭのヨウ化プロピジウム（Ｓ
ｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。試料をＣｙＡｎ−ＡＤＰフローサイトメーター
（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上に流した。
【０５１０】
結果：
実験系の一般設計：本明細書に記載の実験系において、ＰＶＲＩＧをヒトＰＢＬ上で過
剰発現させ、これを次にＭＡＲＴ１特異的及びＨＬＡ−Ａ２制限的Ｆ４  ＴＣＲを発現す
るように操作する。次に、過剰発現細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陽性（名称を挙げる）及びＨＬ
Ａ−Ａ２陰性（名称）黒色腫細胞株（参照）と共培養する。Ｆ４  ＴＣＲは、最近、ＴＣ
Ｒをコードするレトロウイルスを使用することによって末梢血由来の同種リンパ球による
腫瘍認識を特異的に付与するために、末期症状の黒色腫患者における臨床試験に使用され
た（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４：１２６−１２９）
。同族黒色腫細胞との共培養によるＣＤ８  Ｔ細胞の抗原特異的活性化に対するＰＶＲＩ
Ｇ発現の影響を、サイトカイン  分泌によって評価した。
【０５１１】
ヒトＰＢＬ上のＰＶＲＩＧの過剰発現−実験１：ヒトＰＢＬを、材料及び方法に記載の
ように、ＰＶＲＩＧをコードするレトロウイルスベクター、または陰性対照として空ベク
ターで形質導入した。ＰＶＲＩＧのレベルを、形質導入後４８時間でフローサイトメトリ
ーによって評価し、空ベクターで形質導入した細胞と比較した。導入遺伝子発現細胞のパ
ーセンテージは、図１６に示すように６２．４％であった。
【０５１２】
ヒトＰＢＬ上のＰＶＲＩＧの過剰発現−実験２：ヒトＰＢＬを、材料及び方法に記載の
ように、ＰＶＲＩＧをコードするレトロウイルスベクター、またはＮＧＦＲ、または陰性
対照として空ベクターで形質導入した。ＰＶＲＩＧのレベルを、形質導入後４８時間でフ
ローサイトメトリーによって評価し、空ベクターで形質導入した細胞と比較した。ＰＶＲ
ＩＧを発現している細胞のパーセンテージは２０％の範囲であった。ＮＧＦＲの発現は、
図１７に示すように６３％であった。ＰＶＲＩＧをＰＢＬ上で過剰発現させるいくつかの
更なる試みは失敗した。１つの可能性は、ＰＶＲＩＧを一次ＰＢＬ中で発現させることの
困難が、これらの細胞における基線の内因性発現レベルから生じることである。
【０５１３】
ヒトＰＢ上のＦ４  ＴＣＲの過剰発現：ヒトＣＴＬによる機能アッセイを行うために、
材料及び方法に記載のように、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＲＴ１＋黒色腫細胞を認識する、Ｆ
４  ＴＣＲを発現するように操作したＰＢＬを使用した。図１８Ａは、実験１で使用した
白血球のＴＣＲ形質導入時に得たＦ４  ＴＣＲ発現のレベルを示し、図１８Ｂは、実験２
で使用した白血球のＴＣＲ形質導入時に得たＦ４  ＴＣＲ発現のレベルを示す。
【０５１４】
ＰＶＲＩＧ発現がＩＦＮγ分泌に与える影響−実験１：ＰＶＲＩＧまたは空ベクター及
びＦ４で形質導入したＰＢＬを、黒色腫細胞株と共培養した。ＩＦＮγ分泌のレベルを、
共培養の１６時間目で測定した。図１９に示すように、ＰＶＲＩＧ過剰発現に起因するＩ
ＦＮγ分泌の抑制の大きさは、９０％超であった。陰性対照として働くＨＬＡ−Ａ２陰性
細胞株Ｍｅｌ−８８８との共培養は、Ｆ４で形質導入したリンパ球からの活性化依存性Ｉ
ＦＮγ分泌をわずかに引き起こしただけであった。Ｆ４  ＴＣＲを発現していないＰＢＬ
（Ｗ／Ｏと表記）は、追加の陰性対照として働いた。
【０５１５】
ＰＶＲＩＧ発現がＩＦＮγ分泌に与える影響−実験２：ＰＶＲＩＧ、ＮＧＦＲ、または
空ベクター、及びＦ４を、共形質導入において（図２０Ａ）またはバイシストロン性ベク
ターを使用して（図２０Ｂ）、ＰＢＬに形質導入した。形質導入したＰＢＬを黒色腫細胞
株と共培養した。ＩＦＮγ分泌のレベルを、共培養の１６時間目で測定した。図２０Ａに
示すように、ＰＶＲＩＧ過剰発現に起因するサイトカイン分泌の抑制の大きさは、３０％
の範囲であった。陰性対照として働くＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株Ｍｅｌ−８８８との共培養
は、Ｆ４で形質導入したリンパ球からの活性化依存性ＩＦＮγ分泌をわずかに引き起こし
ただけであった。Ｆ４  ＴＣＲを発現していないＰＢＬ（Ｗ／Ｏと表記）は、追加の陰性
対照として働いた。図２０Ｂに示すように、ＰＶＲＩＧをＦ４  ＴＣＲで共形質導入する
とき、ＩＦＮγの抑制は観察されなかった。
【０５１６】
ＰＶＲＩＧがＣＴＬ媒介性殺傷活性に与える影響−実験２：ＰＶＲＩＧまたはＮＧＦＲ
及びＦ４を、バイシストロン性ベクターを使用してＰＢＬに形質導入し、ＣＦＳＥで標識
した黒色腫細胞株と共培養した。図２１に示すように、ヨウ化プロピジウム陽性事象（殺
傷活性の強度を反映する）のパーセンテージは、陰性対照ＮＧＦＲ形質導入細胞と比較し
て、ＰＶＲＩＧの発現により約５０％減少した。ＰＶＲＩＧを発現している細胞の殺傷活
性は、黒色腫とＦ４  ＴＣＲを発現していないＰＢＬ（Ｗ／Ｏと表記）との間の共培養の
ものと同様であった。
【０５１７】
概要：１つの仮説に限定されるものではないが、本明細書で提示する結果は、一次リン
パ球上の過剰発現がＣＴＬによるサイトカイン分泌の低減をもたらすことを示し、ＰＶＲ
ＩＧがＣＴＬに対して抑制効果を有することを示唆する。
【０５１８】
実施例９：ヒト抗ＰＶＲＩＧ抗体
この研究の目的は、ＰＶＲＩＧ免疫腫瘍学的標的と高い親和性及び特異性で結合し、Ｐ
ＶＲＩＧとその結合パートナーであるＰＶＲＬ２との相互作用を妨害するヒト抗体を単離
することであった。これは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合したヒトＰＶＲＩＧ細胞外ド
メイン（ＥＣＤ）を含む組み換えタンパク質に対してヒトｆａｂ断片ファージディスプレ
イライブラリをパニングすること、及び結果として得られる抗体を、ＰＶＲＬ２とのＰＶ
ＲＩＧ相互作用を妨害するその能力についてスクリーニングすることによって達成した。
【０５１９】
プロトコル
試薬の機能的ＱＣ：パニング試薬であるヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合させたＰＶ
ＲＩＧ  ＥＣＤ（ＰＶＲＩＧＨＨ）の純度を、ＬａｂＣｈｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用する
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって決定した。パニング試薬の活性を、それがそのリガン
ドＰＶＲＬ２に結合する能力によって検証した。
【０５２０】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのＥＬＩＳＡ：Ｈｉｓ標識ＰＶＲＬ２
組み換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２μｇ／ｍＬに希釈し、５
０μＬのアリコートを、一晩４℃で高結合ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウ
ェルにコーティングした。コーティングしたプレートウェルをＰＢＳで２回濯ぎ、３００
μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳、ｐＨ７．４）と共に１時間室温（ＲＴ）で
インキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで更に２回濯いだ。プレー
トに結合したＰＶＲＬ２を、溶液中の様々な濃度のＰＶＲＩＧＨＨ（５０μＬ／ウェル体
積において０．１μｇ／ｍＬ〜４  μｇ／ｍＬの線形範囲）と共に１時間室温でインキュ
ベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で
３回、その後ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体を添加した（
ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的）。これを１時間室温でインキュベートし、プレートを
再度洗浄した。５０μＬのＳｕｒｅｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ）を添加し、
５〜２０分間インキュベートすることによって、全てのウェルにおいてＥＬＩＳＡシグナ
ルを発現させた。５０μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ）を添加することによってＨＲＰ
反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）分光光度計
上で読み取った。
【０５２１】
ビオチン化ＰＶＲＩＧの調製：ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用する
溶液中のファージパニングを促進するために、ＰＶＲＩＧＨＨ及び無関係のヒトＩｇＧ１
Ｆｃ  アイソタイプ対照を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ
キット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してビオチン化した。ビオチン
化反応を製造業者のプロトコルに従って行い、ビオチン化試薬を更なるＱＣ及びバイオパ
ニングのために４℃で保管した。ビオチン標識タンパク質の純度及び活性を、節２．１に
記載のようにＬａｂＣｈｉｐ及び機能ＥＬＩＳＡによって評価した。加えて、ビオチン化
の程度を、２つのアプローチを使用してＥＬＩＳＡによって評価した：１）ビオチン化試
薬を高結合ＥＩＡ／ＲＩＡプレートに吸収させ、タンパク質を、ＨＲＰとコンジュゲート
させたストレプトアビジンを使用して検出した、２）ビオチン化タンパク質を、ストレプ
トアビジンを事前にコーティングしたＥＩＡ／ＲＩＡプレート上でインキュベートし、結
合を、ＨＲＰとコンジュゲートさせたヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的二次抗体を使用し
て検出した。
【０５２２】
ヒト抗体ライブラリのファージパニング：パニング反応を、ストレプトアビジンコーテ
ィング磁気ビーズを使用して溶液中で実行し、ビオチン化抗原を捕捉した。全ての洗浄及
び溶出ステップはビーズを捕捉するための磁気ラック（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施
したことに留意されたい。全てのインキュベーションステップは試験管回転器（ＢｉｏＥ
ｘｐｒｅｓｓ）上で穏やかに混合しながら室温で実施した。４回のパニングサブキャンペ
ーンを、毎回、抗原濃度、洗浄、及びＦｃ結合因子枯渇ステップの異なる組み合わせを使
用して実施した（表１）。
【０５２３】
全てのパニングサブキャンペーンは、ビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨ抗原を使用して実行し
た。パニングの各回について、ファージライブラリを、２つの連続ステップで１００ｐｍ
ｏｌの無関係のヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質に対して枯渇させた。枯渇後、サブキャン
ペーンＡ及びＢは、それぞれ、厳密性の低い及び高い洗浄条件下で、各回において５０ｎ
Ｍの抗原に対するパニングに関与した。サブキャンペーンＣ及びＤは、キャンペーンＣで
はライブラリがパニング２周目及び３周目で１０倍過剰の無関係のＩｇＧ１  Ｆｃタンパ
ク質によって遮断されたことを除いて、サブキャンペーンＢと同一であった。サブキャン
ペーンＤは、３周目で５ｎＭの抗原を使用したことが異なった。
【０５２４】
表１：ＰＶＲＩＧＨＨに対するファージパニングに使用する抗原及び洗浄条件
【表４】
2018512443.tif 000006
【０５２５】
２．４．パニングのためのファージライブラリの調製：全てのファージパニング実験は
、ＸＯＭＡ０３１ヒトｆａｂ抗体ファージディスプレイライブラリ（ＸＯＭＡ  Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用した。ライブラリの５０倍の過剰提示
に十分なファージを、ＰＢＳ中の１０％の脱脂粉乳（最終脱脂乳濃度５％）と１：１で混
合し、１時間インキュベートした。
【０５２６】
２．４．１．ストレプトアビジンビーズへの抗原結合：各サブキャンペーンについて、
Ｄｙｎａｌストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）の３つの１００μＬのアリコートを、１ｍＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂
粉乳）における懸濁によって遮断し、３０分間インキュベートした。１つの遮断ビーズア
リコートを１００ｐｍｏｌのビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨと混合した。他の２つのアリコー
トを、Ｆｃ専用結合因子の枯渇のために１００ｐｍｏｌの無関係の抗原と混合した。ビオ
チン標識した抗原を室温で３０分間ビーズに結合させた。ビーズ懸濁液をＰＢＳで２回洗
浄して、遊離抗原を除去し、１００μＬの遮断緩衝液中に再懸濁した。
【０５２７】
２．４．２．ファージライブラリからのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ及びストレプトアビジンビ
ーズ結合因子の枯渇：ファージパニングが始まる前にストレプトアビジンビーズ及びＰＶ
ＲＩＧＨＨのＦｃ領域への不要な結合を除去することが必要であった。これを達成するた
めに、遮断したファージを、非結合ストレプトアビジンビーズの１００μＬのアリコート
と混合し、４５分間インキュベートした。ビーズ（及び恐らく不要であるビーズ及びヒト
ＩｇＧ１  Ｆｃ結合因子）を廃棄した。このステップを１回繰り返し、枯渇ファージライ
ブラリ上清をパニングのために取っておいた。
【０５２８】
２．５．ファージパニング１周目：遮断し枯渇させたファージライブラリを上記の磁気
ビーズに結合させたビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨと混合した。この懸濁液を、穏やかに回転
させながら室温で１時間インキュベートして、ＰＶＲＩＧＨＨ特異的ファージの結合を許
容した。非特異的結合因子を、表１のプロトコルに従って洗浄することによって除去した
。洗浄後、結合したファージを、５００μＬの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）（
ＥＭＤ）と共に室温で１５分間インキュベートすることによって溶出させた。溶出物を、
５００μＬのｐＨ８．０の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を添加することに
よって中和した。
【０５２９】
２．５．１．ファージ力価の決定：１０μＬの初期ファージライブラリ（入力価）また
はパニング溶出物（出力価）をＰＢＳ中で連続希釈した（１０倍）。各ファージ希釈の９
０μＬのアリコートを、６００ｎｍ（ＯＤ  ６００ｎｍ）で約０．５の光学密度に成長さ
せた５００μＬのＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と混合した。ファージを、３０分間の固定イ
ンキュベーション、続く３０分間の振盪インキュベーション（２５０ｒｐｍ）を全て３７
℃で行うことによって細胞に感染させた。各感染細胞培養物の１０μＬのアリコートを、
２％のグルコース及び１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（２ＹＴＣＧ、Ｔｅｋｎｏｖａ
）を補充した２ＹＴ寒天プレート上でスポッティングした。プレートを３０℃で一晩イン
キュベートした。各１０μＬのスポットから成長するコロニーを計数し、これを使用して
入力価及び出力価を計算した。
【０５３０】
２．５．２．ファージレスキュー：残りのファージ溶出物（約１ｍＬ）を、０．５のＯ
Ｄ  ６００ｎｍに成長させた１０ｍＬのＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と混合した。ファージ
を、節２．５．１で詳述したように細胞に感染させた。感染細胞を、２５００ｘＧでの遠
心分離によってペレット化し、７５０μＬの２ＹＴ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に再懸濁し
、２ＹＴＣＧ寒天プレート上に広げた。これらを３７℃で一晩インキュベートし、結果と
して得られるＥ．ｃｏｌｉローンを擦り取り、約２０ｍＬの液体２ＹＴＣＧ（Ｔｅｋｎｏ
ｖａ）中に再懸濁した。再懸濁した細胞の少量のアリコートを５０ｍＬの２ＹＴＣＧに接
種して０．０５のＯＤ  ６００ｎｍを達成した後、ＯＤが０．５に達するまで２５０ｒｐ
ｍで振盪しながら３７℃で成長させた。結果として得られる培養物をＭ１３Ｋ０７ヘルパ
ーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に感染させ、振盪しながら２５
℃で一晩インキュベートして、ファージパッケージングを可能にした。レスキューしたフ
ァージ粒子を含む培養上清を２５００ｘＧでの遠心分離によって澄ませ、１ｍＬを、ａ）
後続周のパニング、またはｂ）ｆａｂ結合スクリーニングのいずれかに持ち越した。
【０５３１】
ファージパニング２周目〜３周目：第２及び第３周目のパニングを、ファージライブラ
リの代わりに前回からのレスキューしたファージ上清を使用したことを除いて上記のステ
ップのように実施した。使用した洗浄条件、枯渇、及び抗原濃度を表１に列挙した。
【０５３２】
２．６．ペリプラスム抽出物から調製したｆａｂを使用する結合スクリーニング
【０５３３】
２．６．１．Ｆａｂ発現ベクター：ＸＯＭＡ０３１ライブラリは、発現ベクターとして
も機能するファージミド構築物に基づく。これらのベクターは、ｆａｂ重鎖及び軽鎖発現
カセット、抗体遺伝子の発現を駆動するラクトースプロモーター、及びアンピリシン耐性
遺伝子を含む。抗体鎖は、Ｎ末端シグナルペプチドに付属して、細胞膜周辺腔へのそれら
の分泌を駆動する。重鎖のＣ末端は、ファージ粒子への組み込みのための短縮遺伝子ＩＩ
Ｉタンパク質配列を持つ。重鎖はまた、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、及びＶ５親和性
タグを持つ。これらのベクターのＥ．ｃｏｌｉへの形質転換及びイソプロピルβ−Ｄ−１
−チオガラクトピラノシドによる誘導（ＩＰＴＧ）は、可溶性ｆａｂ分子のペリプラスム
発現をもたらす。
【０５３４】
２．６．２．Ｆａｂ  ＰＰＥ産生：パニング３周目からの溶出したファージプールを希
釈し、ＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に感染させて、２ＹＴＣＧ寒天プレ
ート上に広げたときに単一コロニーが生成されるようにした。これにより、単一ｆａｂク
ローンを持つ各コロニーがもたらされた。個々のクローンを、Ｑｐｉｘ２機器（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して９６ウェルの深いウェルブロック（ＶＷＲ）中
で１ｍＬの２ＹＴＣＧ種培養に接種した。これらの種培養を７００ｒｐｍで振盪しながら
３７℃でＭｕｌｔｉｔｒｏｎ  ３ｍｍインキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）中で一晩成長さ
せた。ｆａｂ発現のため、２０  μＬの１ｍＬ種培養を、０．１％のグルコース及び１０
０  μｇ／ｍＬのアンピリシンを伴う１ｍＬの２ＹＴを含む深いウェルプレートの第２の
セットに移した。培養物を平均ＯＤ  ６００ｎｍが０．５〜１．０となるまで成長させ、
ＩＰＴＧ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによってタンパク質発
現を誘導した。発現培養物を、７００ｒｐｍで振盪しながら２５℃でＭｕｌｔｉｔｒｏｎ
機器中で一晩インキュベートした。
【０５３５】
Ｅ．ｃｏｌｉペリプラスムに分泌されたｆａｂタンパク質を解析のために抽出した。細
胞を２５００ｘＧでの遠心分離によって採取し、上清を廃棄し、ペレットを７５μＬの氷
冷ＰＰＢ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に再懸濁した。抽出物を１０００ｒｐｍで振盪しな
がら４℃で１０分間インキュベートし、２２５μＬの氷冷ｄｄＨ２Ｏを添加し、更に１時
間インキュベートした。結果として得られるペリプラスム抽出物（ＰＰＥ）を２５００ｘ
Ｇでの遠心分離によって澄ませ、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析のために別のプレートまた
は試験管に移した。全ての抽出緩衝液はＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）を含有した。
【０５３６】
試料の各プレートは二連「ブランクＰＰＥ」ウェルも含み、これは陰性対照として働い
た。これらは、２つの１ｍＬの培養物を意図的に接種しないままにした後、それらをｆａ
ｂ  ＰＰＥと同じように処理することで、細菌成長のない、したがってｆａｂ発現のない
使用を創出することによって創出した。
【０５３７】
２．６．３．ＥＬＩＳＡによる一次スクリーン：サブキャンペーン当たり２つのＰＰＥ
抽出物の９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡによってＰＶＲＩＧＨＨへの結合について試
験した。ビオチンまたはストレプトアビジン結合因子の選択を回避するために、非ビオチ
ン化バージョンのタンパク質をＥＬＩＳＡスクリーニングに使用したことに留意されたい
。ＰＶＲＩＧＨＨ組み換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２μｇ／
ｍＬに希釈し、５０μＬのアリコートを、一晩４℃で高結合ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃ
ｏｓｔａｒ）のウェルにコーティングした。コーティングしたプレートウェルをＰＢＳで
２回濯ぎ、３００μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳、ｐＨ７．４）と共に１時
間室温（ＲＴ）でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで更に２
回濯いだ。プレートに結合したＰＶＲＩＧをＰＰＥと共にインキュベートし、１時間室温
で３％の脱脂乳によって事前遮断した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ  ７．４、０．０
５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回、その後ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ
にコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａ
ｒｃｈ）を、ＰＢＳ中５％の乳において１：２０００希釈で添加した。これを１時間室温
でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。５０μＬのＳｕｒｅｂｌｕｅ  ＴＭＢ基
質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ）を添加し、５〜２０分間インキュベートすることによって、全ての
ウェルにおいてＥＬＩＳＡシグナルを発現させた。５０μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ
）を添加することによってＨＲＰ反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光シグナルをＳｐｅ
ｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）分光光度計上で読み取った。背景（ブランクＰＰＥ）と比較したシ
グナルの比が３超を示したウェルを陽性ヒットとして示した。
【０５３８】
２．６．４．ＥＬＩＳＡ陽性ｆａｂの配列解析：ＥＬＩＳＡスクリーニングからの陽性
ヒットを選択し、新たな９６ウェルプレートに配列した。クローンを３７℃で一晩成長さ
せ、プラスミドＤＮＡを、重鎖及び軽鎖特異的プライマーを使用してシーケンシングした
。配列を組み立て、Ｘａｂｔｒａｃｋｅｒ（ＸＯＭＡ）ソフトウェアを使用して解析した
。クローンを、重鎖ＣＤＲ３の非保存的差異が１つ超あった場合に配列固有性と見なした
。重鎖が同じまたは同様であるが、軽鎖が著しく異なるクローンを、元のクローンの同胞
とした。
【０５３９】
２．６．５．ＰＰＥとしてのｆａｂのＦＡＣＳスクリーニング：配列固有性ＥＬＩＳＡ
陽性ｆａｂクローンを選択し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって、ＰＶＲＩＧ過
剰発現細胞に結合するそれらの能力について解析した。ヒトＰＶＲＩＧ抗原を過剰発現し
ているＨＥＫ２９３細胞を使用して解析を実施した。並列実験では、トランスフェクトし
ていないＨＥＫ２９３細胞を各ｆａｂ試料に対する陰性対照として使用した。
【０５４０】
配列固有性ＥＬＩＳＡ陽性ｆａｂクローンについてのＰＰＥを上記のように生成した。
全てのアッセイは、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ及び０．１％のアジ化ナト
リウム）を使用して実施した。ヒトＰＶＲＩＧ及びトランスフェクトしていないＨＥＫ２
９３細胞を採取し、２回洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞の２５
μｌのアリコートを２５μｌの各ＰＰＥ試料と混合し、穏やかに振盪しながら４℃で１時
間インキュベートした。２つのブランクＰＰＥ対照も解析に含めた。プレートを２００μ
ｌのＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄し、５０μＬのマウス抗Ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ）
の２μｇ／ｍＬ希釈物を各ウェルに添加した。３０分間４℃でのインキュベーション後、
細胞を再度洗浄し、２５μｌのヤギ抗マウスｆａｂ−ＡＦ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍ
ｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の５μｇ／ｍＬ希釈物を各ＰＰＥ及び陰性対照ウェルに添加
した。全ての二次抗体を４℃で３０分間インキュベートした。２回の洗浄の後、細胞を、
最終体積５０μｌの固定化緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液中２％のパラホルムアルデヒド）中に
再懸濁した。試料をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣスクリーニングシステム上で読むと
、これは、指定のライブゲートにおいてウェル当たり約５０００個の事象を記録した。デ
ータを、ＦｌｏｗＪｏ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して
解析し、Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。ヒトＰＶＲＩＧ過剰発現ＨＥＫ細胞についての
平均蛍光強度（ＭＦＩ）及びトランスフェクトしていない２９３細胞との比を、Ｘａｂｔ
ｒａｃｋｅｒソフトウェア（ＸＯＭＡ）を使用して計算した。各プレート上の陽性ヒット
は、平均したブランクＰＰＥ対照シグナルを５倍上回るＭＦＩ比を付与するものとして特
定した。
【０５４１】
ｆａｂヒットの再フォーマット化及びヒトＩｇＧ分子として産生：可能性のあるＰＶＲ
ＩＧ結合ｆａｂを、更なる特性評価のために完全長ヒトＩｇＧに変換した。タンパク質発
現構築物を、可変重、ラムダ、及びカッパドメイン遺伝子のＰＣＲ増幅によって得て、こ
れを、それぞれ、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ヒトＩｇＧ１重鎖）、ｐＦＵＳＥ２−
ＣＬＩｇ−ｈＫ（ヒトカッパ軽鎖）、またはｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈＬ２（ヒトラム
ダ２  軽鎖）ベクターにサブクローニングした（全ての発現ベクターはＩｎｖｉｖｏｇｅ
ｎから入手した）。
【０５４２】
Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＥｘｐｉ２９３培地（
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で６×１０５細胞／ｍｌで播種し、１２５ｒｐ
ｍで振盪しながら、８％のＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で７２時間インキュベート
した。この細胞ストックを使用して、発現培養物をＥｘｐｉ２９３培地において２．０×
１０６細胞／ｍｌで播種した。これらの培養物を、１３５ｒｐｍで振盪しながら２４時間
、上記のようにインキュベートした。
【０５４３】
トランスフェクションのため、Ｅｘｐｉ２９３培地中で２．５×１０６細胞／ｍｌに再
度希釈した。抗体重鎖及び軽鎖のためのタンパク質発現構築物を１：２の割合で混合した
。３０ｍＬの発現培養物体積ごとに、３０μｇのＤＮＡ及び８１μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、各々別々にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって１．５ｍＬに希釈し、５分間インキュベ
ートした。次に、希釈したＤＮＡ及びＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを混合し、２０分間室
温でインキュベートした。続いてこれを振盪フラスコ中で発現培養物に添加し、１２５ｒ
ｐｍで振盪しながら上記のようにインキュベートした。
【０５４４】
トランスフェクションの２０時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９
３  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃ
ｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２を各フラスコ
に添加した。培養物を更に５日間インキュベートし（合計でトランスフェクション後６日
）、上清を遠心分離によって採取した。ＩｇＧを、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌ
ｅｃｔ  Ｓｕｒｅ親和性カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）をａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  製造業者の指示に従って使用して、上清から精製した
。
【０５４５】
再フォーマットしたＩｇＧ１抗体のＦＡＣＳスクリーニング：再フォーマットした抗体
のＦＡＣＳスクリーニングを、精製した抗体の用量依存性滴定を行ったことを除いて本明
細書に記載のＰＰＥ系スクリーニングと同様に行った。ヒトＰＶＲＩＧ過剰発現ＨＥＫ２
９３細胞またはトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞を、異なる濃度（０〜１０
μｇ／ｍｌ）の抗ＰＶＲＩＧ抗体またはアイソタイプ対照と共に、６０分間４℃で、ＦＡ
ＣＳ緩衝液中でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄し、１：２００
で希釈した５０μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＩｇ
Ｇ（Ｆａｂ断片特異的）中に再懸濁し、暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。細
胞を２回洗浄し、１：１０００で希釈した最終体積８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液及びヨウ化
プロピジウム（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１３０１）中に再懸濁した。試料
を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣスクリーニングシステム（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）
を使用して解析した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（ＤｅＮｏｖｏ）を使用して解析し、Ｅｘ
ｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）においてプロットした。
【０５４６】
結果
ＰＶＲＩＧＨＨ組み換えタンパク質の機能的ＱＣ：ＰＶＲＩＧＨＨタンパク質の純度を
、ＬａｂＣｈｉｐシステムを使用して、マイクロフルイディクスキャピラリー電気泳動に
よって評価した。還元条件下で、組み換えタンパク質は、８０．４ｋＤａのその計算した
分子量と一致する８０ｋＤａで移行し、９９％の純度を示した（データ割愛）。非還元条
件下では１つの更なるピークが観察され、これは、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に起因するタンパ
ク質の二量体形態の存在の結果である可能性が高い。
【０５４７】
組み換えタンパク質の機能的統合性を、ＥＬＩＳＡにおいてＰＶＲＬ２（ＰＶＲＩＧに
対するリガンドとして知られる）へのその結合を評価することによって評定した。用量依
存性応答がＰＶＲＩＧＨＨのＰＶＲＬ２への結合について観察された（データ割愛）。一
方で、無関係のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ対照については、結合は観察されなかった。総合する
と、これは、本ＰＶＲＩＧＨＨ組み換えタンパク質が高純度のものであり、機能的に活性
であるため、バイオパニングに好適であることを示す。
【０５４８】
ビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨ組み換えタンパク質のＱＣ：ビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨタン
パク質の純度を、ＬａｂＣｈｉｐシステムを使用して、マイクロフルイディクスキャピラ
リー電気泳動によって評価した。非ビオチン化組み換えタンパク質とビオチン化組み換え
タンパク質との間で顕著な差異は観察されなかった（データ割愛）。更なる４４．３ｋＤ
ａピークがビオチン化タンパク質試料において観察されたことに留意されたい。このピー
クは、ＰＶＲＩＧＨＨタンパク質の単量体形態に起因し得るか、またはビオチン化キット
のクエンチ反応の所産であり得る。
【０５４９】
ストレプトアビジンでコーティングしたＥＩＡ  プレート上のビオチン化タンパク質の
インキュベート、及びＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ二次抗体を使用
する結合タンパク質の検出によって、ビオチン化の成功を確認した。ビオチン化ＰＶＲＩ
ＧＨＨのストレプトアビジンでコーティングしたＥＩＡ  プレートへの結合は、商業的に
入手した無関係のビオチン化タンパク質に相当した（データ割愛）。
【０５５０】
ファージパニング：ビオチン化ＰＶＲＩＧＨＨタンパク質を、ＸＯＭＡ０３１ヒトｆａ
ｂ抗体ファージディスプレイライブラリ（ＸＯＭＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ，ＣＡ）に対するファージパニングに使用した。３回のバイオパニングを、洗浄
厳密性、抗原濃度、及びＦｃ結合因子の枯渇の４つの異なる組み合わせ（サブキャンペー
ンＡ〜Ｄ）の下で行った。各回の成功を、ファージ出力価を使用して予測した。１回目の
後のファージ力価の顕著な低減、２及び３回目の後のファージ力価の増加または維持、な
らびに漸増する洗浄厳密性または漸減する抗原濃度でのファージ力価の減少等の定量的ガ
イドラインを使用して、パニングサブキャンペーンの成功を定義した。４つ全てのサブキ
ャンペーンが、サブキャンペーンにわたって一貫した予測範囲のファージ力価をもたらし
た（データ割愛）。
【０５５１】
ｆａｂ  ＰＰＥとしてのファージ出力のスクリーニング：４つのサブキャンペーンの各
々についてのｆａｂクローン（ＰＰＥとして）の２つの９６ウェルプレートをスクリーニ
ングして、バイオパニングの成功を評価した。結果を表３に要約し、以下で更に詳細に考
察する。全体的に、４つ全てのサブキャンペーンが相当数のＰＶＲＩＧＨＨ特異的ｆａｂ
を生んだ。合計４９個の標的特異的固有ｆａｂを特定した。サブキャンペーンＢ及びＤが
最も高いＥＬＩＳＡヒット率及びＦＡＣＳ相関を示し、これらを更なるスクリーニングに
選択した。
【０５５２】
表３：ＰＰＥのパイロットスクリーニングの概要各サブキャンペーンについて、スクリー
ニングしたクローンの総数、ＥＬＩＳＡヒット、ＦＡＣＳヒット、及び配列固有性を列挙
する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、完全長ｆａｂとしてシーケンシング
に成功したクローンを表す。特異性は、ＥＬＩＳＡにおける無関係のタンパク質への非特
異的結合の欠如に基づく。ＦＡＣＳ相関は、ＦＡＣＳ陽性でもあった（ＰＶＲＩＧ過剰発
現ＨＥＫ２９３細胞に特異的に結合する）ＥＬＩＳＡヒットのパーセントを表す。
【表５】
2018512443.tif 000007
＊無関係のＦｃコンジュゲートまたはＰＶＲＬ２への非特異的結合なし、＊＊３５個の固
有ＨＣ、１４個の同胞
【０５５３】
一次ｆａｂスクリーン（ＥＬＩＳＡ）：各サブキャンペーンについてのＰＰＥの２つの
９６ウェルプレート（１８２個のｆａｂクローン）を、ＰＶＲＩＧＨＨ組み換えタンパク
質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ビオチン化タンパク質をパニングに
使用したが、ＥＬＩＳＡスクリーニングには、ビオチンまたはストレプトアビジン特異的
結合因子の検出を回避した非ビオチン化バージョンを使用したことに留意されたい。４つ
のサブキャンペーンは、「陽性」シグナルについての閾値を３倍比の標的特異的結合：ブ
ランクＰＰＥ対照シグナルに設定したときに、２４〜３７％のＥＬＩＳＡヒット率をもた
らした。
【０５５４】
二次スクリーニング（ＤＮＡ配列解析、ＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳ）ｆａｂ：ＥＬＩＳ
Ａ陽性クローンをシーケンシングして、非冗長ｆａｂを選択した。７３個の配列固有性ｆ
ａｂクローンを特定した。１９個のクローンはサブキャンペーンＡに固有であり、１３個
のクローンはサブキャンペーンＢに固有であり、１０個のクローンはサブキャンペーンＣ
に固有であり、１８個のクローンはサブキャンペーンＤに固有であり、一方で残りの２３
個のクローンはキャンペーン間で共有された。配列固有性ＥＬＩＳＡ陽性ｆａｂクローン
をＰＰＥとして再発現させ、ＦＡＣＳによって特異的結合についてスクリーニングした。
７３個中計４９個の固有性クローンをＰＶＲＩＧ特異的ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合因子
として特定した（２．６．５で確率した基準に従う）。４９個のＦＡＣＳ結合因子は、固
有の重鎖を有する３５個、及び固有の軽鎖を有するが、固有性クローンのうちの１つと重
鎖を共有する１４個の同胞に対応した。ＦＡＣＳ結合データの概要を表４に提示する。
【０５５５】
配列固有性ｆａｂを非特異的結合についても試験した。解析した全てのｆａｂ  ＰＰＥ
が、ブランクＰＰＥ対照と比較して３倍を上回るアッセイシグナルでＰＶＲＩＧＨＨ組み
換えタンパク質に結合した。並列アッセイでは、ｆａｂ  ＰＰＥを、同じＩｇＧ１  Ｆｃ
領域を有する２つの無関係のタンパク質及びＰＶＲＬ２組み換えタンパク質への結合につ
いて試験した。いずれのクローンも対照への顕著な非特異的結合を示さず、選択したｆａ
ｂが特異的ｆｏｒ  ＰＶＲＩＧに特異的であることを示唆した。
【０５５６】
表４：ＰＶＲＩＧ  ｆａｂについてのＦＡＣＳ結合の概要全ての固有性ＥＬＩＳＡ陽性ｆ
ａｂをＦＡＣＳによって解析した。ＰＶＲＩＧ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞ならびにトラン
スフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
標的特異的結合対標的外結合のＭＦＩ比を計算した。ＭＦＩ比が５を上回るクローンをヒ
ットとして選択し、以下に列挙する。
【表６−１】
2018512443.tif 000008
【表６−２】
2018512443.tif 000009
【０５５７】
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ陽性ｆａｂのｈＩｇＧ１への再フォーマット化：全ての固有性
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合因子を、Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるヒトＩｇＧ１分子とし
ての発現に対して再フォーマットした。元の４９個の抗体のうち、４４個が完全長抗体と
しての発現に成功した。これらの再フォーマットした抗体を、無関係のヒトＩｇＧ１  ア
イソタイプ対照と並行してＰＶＲＩＧ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞への結合の保持について
試験した。全ての抗体を、トランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞に対しても試験
した。得られた結合結果を使用して抗体の特異性を実証し、プロットも行って平衡結合定
数（ＫＤ）を計算した。残りの４４個の抗体のうち９個が、弱い結合または顕著な非特異
的結合を示した。残りの３５個の抗体を、細胞に基づく機能アッセイにおける更なる解析
のために選択した。これらの抗体のＦＡＣＳに基づくＫＤを表６に列挙する。ＫＤ値は、
平均９．４ｎＭで０．３０ｎＭ〜９６ｎＭの範囲であり、パニングキャンペーンから得た
大部分の抗体が極めて特異的であり、高い親和性でＰＶＲＩＧと結合することを示唆する
。
【０５５８】
表５：再フォーマットした抗体の発現及び結合の概要全ての固有性ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣ
Ｓ陽性ｆａｂをヒトＩｇＧ１骨格に再フォーマットした。ＦＡＣＳ  ＫＤ値を、ＰＶＲＩ
Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞に対する用量滴定によって決定した。標的外結合を、トラン
スフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞に対する用量滴定によって決定した。
【表７−１】
2018512443.tif 000010
【表７−２】
2018512443.tif 000011
【０５５９】
概要及び結論
ファージディスプレイ抗体発見キャンペーンを実施し、抗原の組み換えＦｃ標識バージ
ョンを使用して免疫腫瘍学的標的ＰＶＲＩＧに対する結合因子を単離した。品質管理分析
により、パニング抗原が純粋であり、機能的に活性であることが示された。パニングの試
みにより、組み換えタンパク質としても細胞表面上でもＰＶＲＩＧ標的に特異的に結合す
る４９個のｆａｂクローンを生んだ。これらのうち、３５個がヒトＩｇＧ１抗体としての
産生に成功し、ＰＶＲＩＧへの特異的結合を保持することが示された。この抗体のプール
は、３５個の抗体結合のうち１８個が１０ｎＭ未満のＫＤで結合して、ＦＡＣＳアッセイ
において高い親和性を呈した。
【０５６０】
実施例１０：抗ヒトＰＶＲＩＧ  ｆａｂがＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＬ２間の相互作用を妨害
する能力のＥＬＩＳＡによる実証。
方法：ヒトＰＶＲＬ２−Ｈｉｓ（カタログ番号２２２９−Ｎ２−０５０／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。５％の脱脂乳中で１：１
で希釈したＦａｂペリプラスム抽出物（ＰＰＥ）を、１ｕｇ／ｍｌ（最終濃度）のヒトＰ
ＶＲＩＧ−Ｆｃと共に、室温で１５分間プレインキュベートした。ｆａｂ−受容体混合物
を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＰＶＲＬ２−Ｈｉｓに結合させた。ＰＶＲＩ
Ｇ−Ｆｃ／ＰＶＲＬ２−Ｈｉｓ相互作用を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体
（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９−０３５−０
９８）を使用してプローブした。ＰＰＥの存在下（陰性ウェル）では、強い陽性シグナル
が予測された。ｆａｂを妨害するためには、シグナルは顕著に低減し得る。シグナルが陰
性ウェル（８０％超の妨害）と比較して５倍超低いｆａｂクローンを妨害ｆａｂとして選
択し得る。
【０５６１】
プロトコル：
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８）を５０ｕｌの２ｕｇ／ｍｌ抗原でコー
ティングして、一晩４℃で保管した。抗原をコーティングしたプレートを１倍ＰＢＳで３
回洗浄した。プレートを２００μｌのＰＢＳ中５％の脱脂乳で遮断し、ＲＴ（室温）で１
時間インキュベートした。次に、プレートを１倍ＰＢで洗浄した。
【０５６２】
５０μｌ／ウェルのＦａｂ  ＰＰＥ（５％の脱脂乳中で希釈）を添加した後、プレート
を、対応するウェルに添加した１ｕｇ／ｍｌのヒトＰＶＲＩＧ−Ｆｃと共にプレインキュ
ベートした。「ｆａｂなし」対照を２つのウェルで実施した。
【０５６３】
プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０５６４】
プレートを、１倍ＰＢＳＴで３回、１倍ＰＢＳで３回洗浄した。
【０５６５】
ＰＢＳ中５％の乳中で希釈した５０μｌ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０９−０３５−０９８）を添加した後、プレー
トを室温で１時間インキュベートした。
【０５６６】
プレートを、１倍ＰＢＳＴで３回、１倍ＰＢＳで３回洗浄した。
【０５６７】
５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、発色するまで待った後、反応を、５０μｌ／
ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍにて
測定した。
【０５６８】
結果
図５２は、抗ＰＶＲＩＧ抗体がＰＶＲＩＧへのＰＶＲＬ２結合の少なくとも８０％を妨
害する能力についての試験結果を示す。示すように、多数のかかる抗体が、結合の少なく
とも８０％の妨害に成功することができた。具体的には、妨害に成功した抗体は以下のよ
うに表記される。
【０５６９】
ＣＰＡ．７．００１、ＣＰＡ．７．００３、ＣＰＡ．７．００４、ＣＰＡ．７．００６
、ＣＰＡ．７．００８、ＣＰＡ．７．００９、ＣＰＡ．７．０１０、ＣＰＡ．７．０１１
、ＣＰＡ．７．０１２、ＣＰＡ．７．０１３、ＣＰＡ．７．０１４、ＣＰＡ．７．０１５
、ＣＰＡ．７．０１７、ＣＰＡ．７．０１８、ＣＰＡ．７．０１９、ＣＰＡ．７．０２１
、ＣＰＡ．７．０２２、ＣＰＡ．７．０２３、ＣＰＡ．７．０２４、ＣＰＡ．７．０３３
、ＣＰＡ．７．０３４、ＣＰＡ．７．０３６、ＣＰＡ．７．０４０、ＣＰＡ．７．０４６
、ＣＰＡ．７．０４７、ＣＰＡ．７．０４９、ＣＰＡ．７．０５０、
【０５７０】
実施例１１：ヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質に結合する３７個の抗ＰＶＲＩＧ  ＩｇＧ抗
体のエピトープビニングの表面プラズモン共鳴
材料及び方法
実験を、実験中全ての試料を４℃に保ちながら、２２℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３
６機器を使用して行った。
【０５７１】
ステップ１：以下の抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂを、各々、ｐＨ５．０、１０ｍＭの酢酸ナトリ
ウム中で約１０μｇ／ｍＬに希釈し、標準的なアミン結合を使用してＰｒｏｔｅＯｎ  Ｇ
ＬＣバイオセンサーチップ上の別々のスポットに共有的に固定した：
【表８】
2018512443.tif 000012
【０５７２】
活性化ステップは５分間水平流向で生じ、一方で固定ステップは垂直流向で生じた。Ｍ
Ａｂを表面活性化後に４分間注射した。妨害ステップは、垂直位置及び水平位置の両方で
各５分間行うことで、水平方向「インタースポット」を参照表面として使用し得るように
した。ＭＡｂを約４５０ＲＵ〜５０００ＲＵの範囲で固定した。追加のｍＡｂ  ＣＰＡ．
７．０４１も、この研究においてビニングしたが、溶液中の分析物としてのみであった。
以下を参照されたい。
【０５７３】
ステップ２：予備実験は、約２０ｎＭのＰＶＲＩＧ抗原（ＰＶＲＩＧＨＨ−２−１−１
＃４４８、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を、２５μＬ／分の流量で３分間、全ての固定したｍ
Ａｂ上に注射した後、ＧＬＣチップアレイにおけるｍＡｂの水平列に応じてｐＨ２．０ま
たはｐＨ２．５のいずれかにて、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを３０秒間パルスすること
によって再生成する何回かのサイクルを伴った。抗原試料を、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ
を含む脱気ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）泳動緩衝液中で調製
した。これらの予備実験は、クローンＣＰＡ．７．０２６及びＣＰＡ．７．０２９が抗原
と結合しなかったため、ビニングされなかったことを示した。ＰｒｏｔｅＯｎアレイ上の
残りのｍＡｂは、抗原への再現可能な結合を示した。
【０５７４】
ステップ３：「予混合」エピトープビニングプロトコルを、ｆｃ融合ＰＶＲＩＧ抗原の
二価性に起因して行った。このプロトコルでは、ステップ１で列挙した各ｍＡｂ、それに
加えてｍＡｂ  ＣＰＡ．７．０４１をＰＶＲＩＧ抗原と共に予混合した後、全ての固定し
たｍＡｂ上に３分間注射した。各ｍＡｂのモル結合部位濃度は、モル抗原結合部位濃度を
超過した。各ｍＡｂの最終結合部位濃度は約４００ｎＭであり、抗原の最終結合部位濃度
は約２０ｎＭであった。実験全体にわたって固定したｍＡｂの活性をモニタリングするた
め、まさに８回のｍＡｂ注射サイクルの後に抗原のみの対照サイクルを行った。緩衝液ブ
ランク注射も、二重参照のために約８回ごとの注射サイクルの後に行った。追加の参照は
、予混合注射サイクルと同一の濃度で全てのｍＡｂ上に単独で注射した各ｍＡｂを含んだ
。全ての表面を、アレイ中のどのｍＡｂ列を再生成するのかに応じてｐＨ２．０またはｐ
Ｈ２．５のいずれかで、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを３０秒間パルスすることによって
再生成し、全てのサイクルを２５μＬ／分の流量で実行した。ＭＡｂ及び抗原試料を、１
００μｇ／ｍＬのＢＳＡを含む脱気ＰＢＳＴ泳動緩衝液中で調製した。
【０５７５】
ステップ４：センサーグラムデータを、二重参照のためにインタースポット及び緩衝液
ブランクを使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１．０．
６を使用して処理及び参照した。ｍＡｂのみの対照の注射を注射参照として使用すると、
これにおいてｍＡｂのみの注射との顕著な結合が観察された。結合が固定したｍＡｂ上の
混合したｍＡｂ及び抗原の注射から観察されなかった場合、または同じ固定したｍＡｂ上
の抗原のみの対照注射と比較して結合が顕著に低減した場合には、抗体対を共有抗原結合
エピトープ（図４３中の行列における赤色の「０」として表記）として部類した。混合し
たｍＡｂ及び抗原の注射が、同じ固定したｍＡｂ上の抗原のみの対照と同様であるかまた
はそれを上回る固定したｍＡｂへの結合を示した場合には、抗体対を、異なる抗原エピト
ープに結合する、または抗原を「サンドイッチする」（図４３中の行列における緑色の「
１」として表記）として分類した。
【０５７６】
ステップ５：ｍＡｂ  ＣＰＡ．７．０４１（＃３７）についての妨害パターンを、ＧＬ
Ｃチップアレイが３６個のスポットしか有しないために分析物としてのみ研究した。した
がって、一貫性のために、抗原と予混合した各ｍＡｂについての２値行列における結合パ
ターン（図４２における垂直方向のパターン）の階層的クラスタリングを、ＪＭＰソフト
ウェアバージョン１１．０．０を使用して行った。固定したｍＡｂの妨害パターン（図４
２における水平方向のパターン）も、溶液中で予混合しったｍＡｂの妨害パターンに対す
る比較としてクラスタリングした（データ割愛、考察には結果を参照）。
【０５７７】
結果：図４２は、各ｍＡｂ対間の妨害（「０」）またはサンドイッチ（「１」）の２値
行列を示し、ここでは、ｍＡｂｓは、垂直方向（表面上のｍＡｂ−「リガンド」）及び水
平方向（溶液中のｍＡｂ−「分析物」）の両方で同一の順序で列挙される。分析物として
の全てのｍＡｂについての妨害パターンの同一の「ビン」は、同様の垂直方向パターンの
各群を黒色のボックスで囲むことによって図４２でハイライトする。図４３は、図４２の
行列における垂直方向（分析物）の妨害パターンの樹状図を示す。同一の妨害パターンを
示すｍＡｂのみを厳密に共にビニングするエピトープ「ビン」の最も厳格な定義では、全
部で４個の個別のビンが存在する。具体的には、ビニングした３５個のｍＡｂのうち３３
個が２個のビンを含み、これらの２つのビンの唯一の差異は、ｍＡｂが、ＣＰＡ．７．０
３９でサンドイッチする（ビン２、図４２及び図４３参照）か、またはＣＰＡ．７．０３
９への結合を妨害する（ビン１、図４２及び図４３参照）かである。これは、ＣＰＡ．７
．０３９がそれ自体の別個のビンにあることを意味する。４番目のビンは、他の３４個の
ｍＡｂのいずれに対する抗原結合も妨害することができないｍＡｂ  ＣＰＡ．７．０５０
のみで構成される。リガンドとしてのｍＡｂの妨害パターンの階層的クラスタリング（図
４２中の水平方向パターン）は、抗原をｍＡｂ  ＣＰＡ．７．０３９でサンドイッチして
いるｍＡｂ  ＣＰＡ．７．０１６を示すが、分析物としては、これは固定したＣＰＡ．７
．０３９への抗原結合を妨害する。よって、クローンＣＰＡ．７．０１６はビン１ではな
くビン２に置かれ得る。各結合中のｍＡｂを図４３に列挙する。各ビンを表す処理したセ
ンサーグラムデータを図４４〜図４７に示す。
【０５７８】
概要：３５個の抗ＰＶＲＩＧ  ＩｇＧ  ｍＡｂを、それらの融合ヒトＰＶＲＩＧとの対
妨害パターンに従ってＳＰＲを使用してビニングした。エピトープビンの最も厳格な定義
によると、全部で４個の個別のビンが存在する。３５個のｍＡｂのうちの３３個が２個の
ビンを含み、これらは、それらの対応する構成要素ｍＡｂが、クローンＣＰＡ．７．０３
９で抗原を妨害するかまたはサンドイッチするかのみによって異なる。
【０５７９】
実施例１２：ペリプラスム抽出物中で調製した５０個の抗ＰＶＲＩＧヒトｆａｂの表面プ
ラズモン共鳴動態スクリーニング
材料及び方法
全ての実験は、２２℃でＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器及びＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  
３６機器を使用して行った。
【０５８０】
ステップ１：ペリプラスム抽出物上清中の５２個全てのｆａｂのモル濃度を、２２℃で
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して定量化した。各ｆａｂを２０倍に希釈した後、
ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による標準的なアミン結
合を使用して調製した高密度抗ヒトｆａｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２８−９５８
３−２５）表面上に５μＬ／分で２分間注射した。次に、既知の濃度の標準的なヒトｆａ
ｂ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｐ８０−１１５）を、ｆａｂ上清と同じ条件で抗ｆａｂ表面上に注射
した。試料を泳動緩衝液中で調製し、この緩衝液は、０．０１％のＢＳＡを添加した脱気
ＨＢＳＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０、ｐ
Ｈ７．４）であった。各ｆａｂ上清からの各ＳＰＲセンサーグラムの会合傾斜を、ＣＬＡ
ＭＰ  ３．４０ソフトウェアを使用して既知の濃度の標準的なヒトｆａｂのＳＰＲ会合傾
斜に対して適合させ、上清における各ｆａｂのモル濃度を推定した。
【０５８１】
ステップ２：高密度ヤギ抗ヒトｆｃポリクローナル抗体表面（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  
Ｈ１０５００）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６バイオセンサーを使用してＧＬＣチッ
プの２つレーン上で標準的なアミン結合を使用して調製した。高密度抗マウスｆｃ  ポリ
クローナル抗体表面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００８−３８）を、同じＧ
ＬＣチップの２つの異なるレーン上で標準的なアミン結合を使用して調製した。４つ全て
の捕捉表面に対する活性化及び妨害ステップは、垂直流向で生じた。その後、上清中の各
ｆａｂを、それぞれサイクル当たり平均約２００ＲＵ及び約２９０ＲＵで１つの高密度抗
ヒトｆｃ表面及び１つの抗マウスｆｃ表面（それぞれ）に捕捉されたｆｃ−融合ヒトＰＶ
ＲＩＧ（ＰＶＲＩＧ−ＨＨ−２−１−１  ＃４４８、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）及びｆｃ−融
合マウスＰＶＲＩＧ（ＰＶＲＩＧ−ＭＭ−２−１−１  ＃１９８、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）
上に３つの濃度で注射した。各ｆａｂ濃度シリーズを２分間注射した後、５０μＬ／分の
流量で１０分の解離を続けた。開始濃度範囲（ステップ１で決定した通り）は、各ｆａｂ
について２回の最高濃度の３倍希釈により、約２０ｎＭ〜約４００ｎＭであった。Ｆａｂ
を泳動緩衝液の中に希釈し、この緩衝液は、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０及び０．０１
％のＢＳＡを添加した脱気ＰＢＳであった。抗ヒトｆｃ捕捉表面を、各サイクル後の１４
６ｍＭのリン酸の３０秒パルス２回によって再生成し、抗マウスｆｃ表面を、各サイクル
後のｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの３０秒のパルス２回によって再生成した。
【０５８２】
ステップ３：捕捉されたＰＶＲＩＧに結合する上清中のｆａｂのセンサーグラムデータ
を、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン３．１．０．６を使用して処理し二重参
照した。センサーグラムを、参照表面としての捕捉されたＰＶＲＩＧがなく、ｆａｂの注
射と同一の条件下での捕捉されたＰＶＲＩＧ上のブランク注射を伴う対応する対抗種捕捉
表面を使用して二重参照した。可能な場合、次に、各ｆａｂの３つの異なる濃度について
のセンサーグラムを１：１の動態モデルに全体的に適合させて（質量移行についての項を
用いて）、会合及び解離速度定数を推定した。単純な１：１の結合を示さなかったセンサ
ーグラムは動態モデルに適合させなかったため、ｋａ及びｋｄの推定を割り当てなかった
。
【０５８３】
結果
この研究に含めたｆａｂのいずれも、マウスＰＶＲＩＧへの結合活性を示さなかった（デ
ータ割愛）。ヒトＰＶＲＩＧに対してスクリーニングした５０個のｆａｂのうち１７個に
ついてのセンサーグラムを、それらの速度定数の信頼性のある予測に適合させることがで
きた。２８個のクローンが複合体動態を示し、ｆａｂのうちの５個は捕捉したヒトＰＶＲ
ＩＧ融合タンパク質へのいずれの結合も示さず（ＣＰＡ．７．０２５、ＣＰＡ．７．０２
６、ＣＰＡ．７．０２７、ＣＰＡ．７．０２９、ＣＰＡ．７．０３５）、１個のクローン
（ＣＰＡ．７．０３５）はステップ１で濃度決定を行ったときに力価を示さなかった。速
度定数及びそれらの対応するセンサーグラムを図４９及び図５０で以下に示す。以下に列
挙するクローンが複合体動態を示した。図５１はこれらのデータの一部の例を示す。
【表９】
2018512443.tif 000013
【０５８４】
実施例１３フローサイトメトリーを使用するＨＥＫ細胞上で発現されるＰＶＲＩＧへのＩ
ｇＧクローンＣＰＡ．７．０２１の結合親和性の測定
材料及び方法
【０５８５】
フローサイトメトリーを使用して、ＨＥＫ  ２９３細胞上で発現されるヒトＰＶＲＩＧ
に結合するＣＰＡ．７．０２１  ＩｇＧの親和性を測定した。Ａｌｅｘａ  ６４７とコン
ジュゲートしたＣＰＡ．７．０２１を、９６ウェルプレート中の１７個のウェル上で一定
数の細胞（１００，０００細胞／ウェル）に２倍連続希釈した３ｐＭ〜１０１ｎＭの結合
部位濃度範囲で二連で添加した。１つのウェルは、ブランクウェルとして働く、ＩｇＧを
一切添加しない細胞を含んだ。細胞を、４℃でＩｇＧを用いて４時間平衡化した。細胞を
２回洗浄した後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅフローサイトメー
ターを使用して約１０，０００の「事象」にわたって記録した。ＣＰＡ．７．０２１  Ｉ
ｇＧ結合部位濃度の関数としての結果として得られたＭＦＩ値を以下に示す。ヒトＰＶＲ
ＩＧを発現しているＨＥＫ  ２９３細胞に結合するＣＰＡ．７．０２１のＫＤを、Ｄｒａ
ｋｅ  ａｎｄ  Ｋｌａｋａｍｐ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，３１８（２００７）１４７−１５２に詳述されているように、ＭＦＩ対ＩｇＧ結合部
位濃度曲線を１：１の平衡モデルと適合させることによって推定した。
【０５８６】
結果：Ａｌｅｘａ６４７で標識したＣＰＡ．７．０２１  ＩｇＧを、ヒトＰＶＲＩＧを
発現しているＨＥＫ  ２９３細胞で滴定し、結合シグナルを、フローサイトメトリーを使
用して測定した。二連対ＣＰＡ．７．０２１の結合部位濃度におけるＭＦＩを示す、結果
として得られる結合等温線を以下に提示する。赤線は、曲線の１：１の平衡適合であり、
これは、２．５ｎＭ±０．５ｎＭのＫＤ推定値を可能にする（適合の信頼区間９５％、Ｎ
＝１）。
【０５８７】
実施例１４：ＰＶＲＩＧノックダウン（ＫＤ）及び抗ＰＶＲＩＧ抗体がヒト黒色腫特異的
ＴＩＬ機構に与える効果
これらのアッセイ目的は、黒色腫標的細胞との共培養時の活性化マーカー及びサイトカ
イン分泌によって測定した、ヒト由来ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧの機能的能力を評価する
ことである。ＰＤ１を、ノックダウン（ｓｉＲＮＡ）研究のためのベンチマーク免疫チェ
ックポイントとして使用した。単独でまたは他の抗体（例えば、ａＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ
１）と組み合わせてＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＬ２間の相互作用を妨害することが示されてい
る抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．２１）の効果を評価した。
【０５８８】
材料及び方法
ＴＩＬ
３名の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用した。
□ＴＩＬ−４１２−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１特異的
□ＴＩＬ−Ｆ４−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的
□ＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的
【０５８９】
ＴＩＬを、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３６６７）＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（
Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）＋１％のＮａ−ピルビン酸
塩（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）＋１％の非必
須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−３４０−１Ｂ）＋１
％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１
−１Ｂ）＋３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０９１２９）を補充し
たＩＭＤＭ（ＢＩ、０１−０５８−１Ａ）完全培地内で解凍した。
【０５９０】
腫瘍細胞株：ヒト黒色腫細胞Ｍｅｌ−６２４は、ＭＨＣ−ＩハプロタイプＨＬＡ−Ａ２
との関連でＭＡＲＴ−１及びｇｐ−１００抗原を発現する。細胞を、１０％ＦＢＳ（ＢＩ
、０４−１２７−１Ａ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＢＩ、０３−０２５−１Ｂ）、
１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）、
及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０
３１−１Ｂ）を補充した完全ＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ、０１−０５５−１Ａ）内で培養した。
【０５９１】
ＴＩＬにおけるノックダウン：ＴＩＬにおけるヒトＰＶＲＩＧ及びヒトＰＤ１のノック
ダウン（ＫＤ）を、１００ｐｍｏｌのＤｈａｒｍａｃｏｎ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ
ｈｕｍａｎ  ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−０３２７０３−０２
）またはＨｕｍａｎ  ＰＤ１  ｓｉＲＮＡ  −  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−００４４３５
）または非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１−０５）を使用して行った。ｓｉ
ＲＮＡをＴＩＬにエレクトロポレーションした（ＡＭＡＸＡ、ｐｒｏｇｒａｍ  Ｘ−００
５）。解凍から２４時間後にＩＬ−２を補充した完全ＩＭＤＭ中で培養した休止ＴＩＬ上
でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、ＴＩＬを９６ウェルＴ
Ｃプレートに播種して、２４時間回復させた。２４時間後、細胞を採取し、生死判定色素
（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ、カタログ番号５６２２４７、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
で染色し、ＰＢＳで洗浄し、３０分間室温で抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１（Ｃ
ＰＡ．７．０２１  ＩｇＧ２  Ａ６４７、７．５ｕｇ／ｍｌ）または抗ヒトＰＤ−１（Ｂ
ｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３２９９１０  ＡＦ６４７、５ｕｇ／ｍｌ）で染色した。使用した
アイソタイプ対照は、それぞれ、Ｓｙｎａｇｉｓ（ＩｇＧ２  Ａ６４７、７．５ｕｇ／ｍ
ｌ）及びマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４００１３０  Ａ６４７、５ｕｇ／ｍ
ｌ）であった。全ての試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上に流し、
データを、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用し
て解析した。
【０５９２】
６２４黒色腫細胞とのＴＩＬの共培養：ｓｉＲＮＡエレクトロポレーションしたＴＩＬ
を採取し、９６  ＴＣプレートに５×１０４／ウェルで播種した。Ｍｅｌ−６２４細胞も
採取し、共培養中に１：１／１：３のエフェクター：標的比で播種した。プレートを３７
℃、５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０５９３】
黒色腫特異的ＴＩＬ活性に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１）、抗ＴＩＧ
ＩＴ（クローン１０Ａ７）、及び抗ＤＮＡＭ１（クローンＤＸ１１）の影響を評価するた
めに、ＴＩＬ（１×１０５細胞／ウェル）を、単独処置（１０μｇ／ｍＬ）または併用処
置（各々最終１０μｇ／ｍＬ）で、試験抗体または関連アイソタイプ対照と共にプレイン
キュベートした後、６２４黒色腫標的細胞を１：３のエフェクター：標的比で添加した。
プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０５９４】
ＴＩＬ活性化の評価：共培養の１６時間後、細胞を生死判定色素（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏ
ｎ、カタログ番号５６２２４７、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＰＢＳで洗
浄し、Ｆｃ妨害溶液（カタログ番号３０９８０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に露出させた後
、３０分間４℃で抗ＣＤ８ａ（カタログ番号３０１０４８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗
ＣＤ１３７（カタログ番号３０９８０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。全ての試料
をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上に流し、データを、Ｔｒｅｅ  Ｓｔ
ａｒ  ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。培養上清を収
集し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）を用いてサイトカイン分泌につ
いて分析した。
【０５９５】
結果
ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧノックダウン：ＴＩＬ  ＭＡＲＴ−１及びＴＩＬ  Ｆ４をＩ
Ｌ−２と共に２４時間培養した。１００ｐｍｏｌのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ｈｕｍ
ａｎ  ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ（Ｌ−０３２７０３−０２）また
はヒトＰＤ１  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−００４４３５）または非標的化ｓ
ｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１−０５）をＴＩＬにエレクトロポレーションした（Ａ
ＭＡＸＡ、ｐｒｏｇｒａｍ  Ｘ−００５）。ＰＶＲＩＧまたはＰＤ−１の検出を、エレク
トロポレーションから２４時間後（及び共培養前）に行った。細胞を生死判定色素につい
て染色し、抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＰＤ−１との３０分の室温でのインキュベーションを続
けた。ＫＤ集団のパーセンテージを図８２に示す。
【０５９６】
ノックダウンしたＴＩＬを使用する機能アッセイ：ＩＬ２と共に２４時間培養したヒト
ＴＩＬを、ヒトＰＶＲＩＧもしくはＰＤ−１をコードするｓｉＲＮＡまたは対照としてス
クランブル配列を用いてエレクトロポレーションした。ＴＩＬを、エレクトロポレーショ
ンから２４時間後のＰＶＲＩＧ及びＰＤ−１発現について試験した。スクランブルのエレ
クトロポレーションしたＴＩＬと比較して、ＰＶＲＩＧの約８０％のノックダウン及びＰ
Ｄ−１の約５０％のノックダウンが観察された（図８２）。
【０５９７】
ＫＤ  ＴＩＬを、Ｍｅｌ−６２４細胞と共に１：１または１：３のエフェクター：標的
比で１８時間培養し、ＣＤ１３７の発現について染色した。対照のスクランブルｓｉＲＮ
Ａと比較して、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬと同様
に、上昇したレベルの活性化マーカーＣＤ１３７が、ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡを用いてエ
レクトロポレーションしたＴＩＬ  ＭＡＲＴ−１において示された（図８３Ａ）。共培養
上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡを用
いてエレクトロポレーションしたＴＩＬは、対照のＳＣＲ  ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＦ
Ｎγ及びＴＮＦレベルの顕著な増加を示す。同様の効果が、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用い
てエレクトロポレーションしたＴＩＬにおいて示された（図８３Ｂ〜Ｃ）。
【０５９８】
活性化レベルの同じ増加傾向がＴＩＬ  Ｆ４において観察された。ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲ
ＮＡでエレクトロポレーションしたＴＩＬ  Ｆ４をＭｅｌ−６２４と共に１：３のエフェ
クター：標的比で共培養することによって、ＣＤ１３７表面発現のレベルの増加（図８４
Ａ）及び共培養上清中のＩＦＮγの分泌の増加（図８４Ｂ）がもたらされた。同様の傾向
が、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬにおいて観察され
た。
【０５９９】
妨害Ａｂを使用する機能アッセイ：
抗ＰＶＲＩＧ及び抗ＴＩＧＩＴのインビトロ単剤療法及び併用療法：２０９のＴＩＬを
Ｍｅｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。共培養上
清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＴＩＧＩＴによる処置は、Ｉ
ＦＮγ分泌レベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗Ｔ
ＩＧＩＴ及び抗ＰＶＲＩＧを組み合わせで共培養に添加したときに、ＩＦＮγレベル及び
ＴＮＦレベルの増加が観察された（図８５Ａ〜Ｂ）。
【０６００】
抗ＰＶＲＩＧ及び抗ＴＩＧＩＴのインビトロ単剤療法及び併用療法：２０９のＴＩＬを
Ｍｅｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。ＴＩＬを
活性化マーカーＣＤ１３７の表面発現について染色すると、抗ＤＮＡＭ−１による処置後
の発現レベルの低減を示した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試
験した。抗ＤＮＡＭ−１の処置は、分泌されたサイトカインであるＩＦＮγ及びＴＮＦを
増加させる傾向を媒介した。抗ＤＮＡＭ−１及び抗ＰＶＲＩＧの組み合わせによる処置は
、ＣＤ１３７発現（図８６Ｃ）に対する影響を部分的に逆転させ、サイトカイン分泌ＩＦ
Ｎγ及びＴＮＦに対する影響を増強した（図５Ａ〜Ｂ）。ＭＡＲＴ−１  ＴＩＬを、Ｍｅ
ｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。共培養上清を
収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＤＮＡＭ−１での処理により、Ｔ
ＩＬ上のＣＤ１３７表面発現、ならびに分泌されたサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦも低
減した。抗ＤＮＡＭ−１及び抗ＰＶＲＩＧの組み合わせによる処置は、これらの効果を部
分的に逆転させた（図８６Ｄ〜Ｆ）。
【０６０１】
概要及び結論
ＰＤ１のＫＤは、ＩＦＮγならびにＦ４及びＭＡＲＴ−１  ＴＩＬにおける分泌によっ
て測定して、ＴＩＬ活性を改善した。対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＦＮγ及びＴＮＦ分
泌の増加（約２０％）がＭＡＲＴ−１  ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧ  ＫＤの際に観察され
た。同じ傾向が、Ｆ４  ＴＩＬ上の６２４黒色腫細胞との共培養時にＣＤ１３７発現にお
いて観察された。
【０６０２】
抗ＴＩＧＩＴの処置は、６２４Ｍｅｌと共培養したＴＩＬからのＩＦＮγレベルにもＴ
ＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．
７．０２１）を併用して共培養に添加したときに、ＩＦＮγ及びＴＮＦレベルの増加が観
察された。
【０６０３】
抗ＤＮＡＭ−１処置により、低減したＣＤ１３７及びサイトカイン分泌によって表され
るＴＩＬ−ＭＡＲＴ−１活性化の低減がもたらされ、抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．２１）
は、ＤＮＡＭ−１  Ａｂとの併用療法においてこの影響を部分的に逆転することができた
。ＴＩＬ  ２０９においては、ＩＦＮγ及びＴＮＦ分泌レベルは、抗ＤＮＡＭ−１によっ
てわずかに上昇（約１０％）し、抗ＤＮＡＭ１及び抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）
を併用して共培養に添加したときに、ＩＦＮγ及びＴＮＦレベルの増加（それぞれ、約４
０％及び３０％）が観察された。まとめると、発明者らによる結果は、ＰＶＲＩＧが、Ｐ
ＶＲＬ２に対する新たな共抑制性受容体であることを示唆する。
【０６０４】
実施例１５：抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＤ１抗体との併用でのヒト黒色腫特異的ＴＩＬ機能に
対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
材料及び方法
ＴＩＬ：３名の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用した。
□ＴＩＬ−４１２−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１特異的
□ＴＩＬ−Ｆ４−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的
□ＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的
【０６０５】
ＴＩＬを、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３６６７）＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（
Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）＋１％のＮａ−ピルビン酸
塩（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）＋１％の非必
須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−３４０−１Ｂ）＋１
％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１
−１Ｂ）＋３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０９１２９）を補充し
たＩＭＤＭ（ＢＩ、０１−０５８−１Ａ）完全培地内で解凍した。
【０６０６】
腫瘍細胞株：ヒト黒色腫細胞Ｍｅｌ−６２４は、ＭＨＣ−ＩハプロタイプＨＬＡ−Ａ２
との関連でＭＡＲＴ−１及びｇｐ−１００抗原を発現する。細胞を、１０％ＦＢＳ（ＢＩ
、０４−１２７−１Ａ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＢＩ、０３−０２５−１Ｂ）、
１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）、
及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０
３１−１Ｂ）を補充した完全ＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ、０１−０５５−１Ａ）内で培養した。
【０６０７】
抗ＰＶＲＩＧ、抗ＴＩＧＩＴ、及びＰＤ１遮断抗体の存在下でのＴＩＬと６２４黒色腫
細胞との共培養：黒色腫特異的ＴＩＬ活性に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２
１）、抗ＴＩＧＩＴ（クローン１０Ａ７）、及び抗ＰＤ１（ｍＡｂ  １Ｂ８、Ｍｅｒｃｋ
）の影響を評価するために、ＴＩＬ（３×１０４細胞／ウェル）を、単独処置（１０μｇ
／ｍＬ）または併用処置（各々最終１０μｇ／ｍＬ）で、試験抗体または関連アイソタイ
プ対照と共にプレインキュベートした後、６２４黒色腫標的細胞を１：３のエフェクター
：標的比で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベート
した。
【０６０８】
ＴＩＬ活性化の評価：培養上清を収集し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、
ＢＤ）を用いてサイトカイン分泌について分析した。
【０６０９】
インビトロ抗ＰＶＲＩＧ単剤療法、ならびに抗ＴＩＧＩＴ及びＰＤ１遮断抗体との併用
療法：Ｆ４  ＴＩＬ（ｇｐ１００特異的）をＭｅｌ−６２４細胞と１：３のエフェクター
：標的比で１８時間培養した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試
験した。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１の処置は、ＩＦＮγ分泌レベルにもＴＮＦ分泌レベ
ルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗ＰＶＲＩＧと併用して抗ＴＩＧＩＴまた
は抗ＰＤ１を組み合わせで共培養に添加したときに、ＩＦＮγレベル及びＴＮＦレベルの
増加が観察された（図８７Ａ〜Ｂ）。
【０６１０】
抗ＰＶＲＩＧ、抗ＴＩＧＩＴ、及びＰＤ１単独での処置は、６２４Ｍｅｌと共培養した
ＴＩＬからのＩＦＮγレベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗ＴＩ
ＧＩＴまたは抗ＰＤ１抗体を抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）と併用して添加したと
きに、ＩＦＮγ及びＴＮＦレベルの増加が観察された。提示したデータは、抗ＴＩＧＩＴ
または抗ＰＤ１抗体との併用療法には相乗効果があることを示唆する。
【０６１１】
実施例１６：レポーター遺伝子アッセイを使用したＴＣＲシグナル伝達に対する抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体の効果
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ細胞株等のＴＣＲシグナル伝達のためのレポーターア
ッセイ系を使用して、ＴＣＲ媒介性シグナル伝達に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を試験
する。このＪｕｒｋａｔ細胞株誘導体は、ＮＦＡＴ応答要素の制御下でルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子を発現する。これらの細胞を、完全長ヒトＰＶＲＩＧをコードするベクタ
ーでトランスフェクトする。陰性対照として、空ベクターでトランスフェクトした細胞を
使用する。ＣＤ２８及びＰＤ−１等の共刺激または共阻害参照分子をコードするベクター
を有するトランスフェクタントが、陽性対照の役割を果たす。トランスフェクタントを、
抗ＰＶＲＩＧ抗体の不在下または存在下で抗ヒトＣＤ３（例えば、ＯＫＴ３）を添加して
刺激する。アイソタイプ対照が、陰性対照の役割を果たす。参照分子に対する既知の機能
的抗体が、陽性対照の役割を果たす。機能的作用架橋抗体は、ルシフェラーゼ活性に対す
る抑制効果を示すと予想される。
【０６１２】
実施例１７：ＰＶＲＬ２−ＦＣを使用したＴ細胞活性化に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
プレート結合アッセイを使用して、Ｔ細胞活性化、増殖、及びサイトカイン分泌に対す
る抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を試験する。精製ヒトバルクＴ細胞を、１ｕｇ／ｍｌのプレー
ト結合抗ヒトＣＤ３（例えば、ＯＫＴ３）及び５ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＬ２−Ｆｃ（ＰＶＲ
ＩＧの対応物であるＰＶＲＬ２のＥＣＤから成る組み換え融合タンパク質）または陰性対
照を使用して刺激する。Ｔ細胞活性化を、活性化マーカー、例えば、ＣＤ１３７の発現に
よって、またはＣＦＳＥ染色の希釈によって評価される細胞分裂によって評価する（Ｔ細
胞をＣＦＳＥで標識した後、それらを刺激する）。サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮｇ
、ＩＬ−２）もＴ細胞活性化の追加の読み出しとして評価する。Ｔ細胞亜型マーカーを使
用して、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞に対する特異的効果を区別する。共固定Ｐ
ＶＲＬ２−Ｆｃは、Ｔ細胞上のＰＶＲＬ２の既知の共刺激対応物受容体である内因性ＤＮ
ＡＭ１により媒介されるＴ細胞活性化に対して基礎刺激効果を有し得る。拮抗抗ＰＶＲＩ
Ｇ  Ａｂの存在下で、ＰＶＲＬ２−Ｆｃのこの基礎刺激効果は、それらがＴ細胞活性化に
対する内因性ＰＶＲＩＧの抑制影響を阻止するため、更に増強されると予想される。した
がって、作用抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂは、Ｔ細胞活性化の抑制を示すと予想される。
【０６１３】
実施例１８：ＰＶＲＬ２異所発現細胞を使用したＴ細胞活性化に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体
の効果
細胞ベースのアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化、増殖、及びサイトカイン分泌に対す
る抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を試験する。精製ヒトバルクまたはＣＤ４  Ｔ細胞もしくはＣ
Ｄ８  Ｔ細胞を、ＰＶＲＬ２または空ベクターを異所的に発現するＣＨＯ刺激因子細胞（
膜結合抗ＣＤ３を発現するＣＨＯ細胞）との共培養時に刺激する。Ｔ細胞活性化を、活性
化マーカー、例えば、ＣＤ１３７の発現によって、またはＣＦＳＥ染色の希釈によって評
価される細胞分裂によって評価する（Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した後、それらを刺激する
）。サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−２）もＴ細胞活性化の追加の読み出し
として評価する。Ｔ細胞亜型マーカーを使用して、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞
に対する特異的効果を区別する。ＰＶＲＬ２発現ＣＨＯ刺激因子は、Ｔ細胞上のＰＶＲＬ
２の既知の共刺激対応物受容体である内因性ＤＮＡＭ１により媒介されるＴ細胞活性化に
対して基礎実施例１９刺激効果を有すると予想される。拮抗抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂの存在下
で、表面発現されたＰＶＲＬ２のこの基礎刺激効果は、それらがＴ細胞活性化に対する内
因性ＰＶＲＩＧの抑制影響を阻止するため、更に増強されると予想される。したがって、
作用抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂは、Ｔ細胞活性化の抑制を示すと予想される。
【０６１４】
実施例２０：ＳＥＢアッセイを使用したＴ細胞活性化に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
抗ＰＶＲＩＧ抗体を、Ｖβ３及びＶβ８  Ｔ細胞受容体鎖を発現している全てのＴ細胞
を従事させ、活性化するために健常な立候補者由来の血液細胞及びＳＥＢ（ブドウ球菌エ
ンテロトキシンＢ）スーパー抗原を使用してＴ細胞活性に対するその効果について試験し
た。ヒトＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート中で培養し、試験抗体と共に３０〜６０分
間プレインキュベートした。次にＳＥＢを、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０  μｇ／ｍＬの範囲の
種々の濃度で添加した。上清を培養の２〜４日後に収集し、産生されたサイトカイン（例
えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγ）の量を、ＥＬＩＳＡによってか、または標準的なＣＢＡキッ
トを使用して定量化した。ＳＥＢは、用量依存性の様式で全血細胞によってサイトカイン
産生を刺激した。抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂがサイトカイン産生に与える効果を、いくつかの
Ａｂ用量で試験した。抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂの妨害は、対照ＩｇＧと比べてＩＬ−２産生
を増強すると予想される。ＩＬ−２に加えて、ＡｂがＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、
ＩＬ−６、及びＩＦＮγ等の更なるサイトカインのレベルに与える効果を、このアッセイ
においてＣＢＡキットを使用して試験することができる。
【０６１５】
実施例２１：Ａｇ特異的アッセイにおける抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
抗ヒトＰＶＲＩＧが健常なドナー血液における既存のメモリーＴ細胞のＡｇ特異的刺激
に与える機能的効果をプロファイリングするために使用されるアッセイは、破傷風トキソ
イド（ＴＴ）アッセイである。これを受けて、新たに調製したＰＢＭＣ（２×１０５細胞
）を、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地（５％の熱不活性化したヒト血清を含む）において９
６ウェル丸底プレート中でプレーティングし、異なる濃度の試験抗体と共にプレインキュ
ベートし、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＴ（Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で刺
激した。細胞を３７℃で３〜７日間インキュベートした後、上清を採取した。サイトカイ
ン濃度（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）をＥＬＩＳＡ及び／またはＣＢＡキットによっ
て決定した。抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂの妨害は、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を、ＴＴ抗
原のみによって得られるものと比較して増強すると予想される。
【０６１６】
ＴＴを使用してヒトメモリーＴ細胞を刺激する上記の方法と同様に、上記と同様の実験
セットアップを使用して、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂが、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザＨＩ
Ｖ、ムンプス、及びＴＢ等の更なる抗原に対するリコール応答時のＴ細胞活性化に与える
効果を試験することができる。これは、ＫＬＨ等の新抗原を使用してナイーブ細胞の刺激
に対する効果を試験するためにも使用することができる。
【０６１７】
加えて、抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂの効果を、ＨＣＶ及びＨＩＶ等のウイルス感染を患ってい
る患者の末梢血に由来する四量体選別Ａｇ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の抗原特異的応答に対し
て試験する。四量体選別ＣＤ８  Ｔ細胞を、ペプチド充填同種ＰＢＭＣと５日間共培養す
る。ＣＤ８  Ａｇ特異的Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ２、Ｔ
ＮＦ−α）の分泌が上昇する。抗ＰＶＲＩＧ抗体が、抗原のみと比較して増殖及びサイト
カイン産生を増強すると予測する。
【０６１８】
実施例２２：ＰＶＲＩＧに対するハイブリドーマ由来抗体の結合及び機能解析
この実施例は、細胞株及び一次白血球におけるハイブリドーマ由来抗体（ＣＨＡ抗体）
のヒト及びカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質への結合の特性評価、ならびにハイブリド
ーマ由来抗体がＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＬ２間の相互作用を遮断する能力の特性評価を示す
。
【０６１９】
プロトコル
ｈＰＶＲＩＧを過剰発現している細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、抗ヒ
トＰＶＲＩＧ抗体の特異性を評価した：ＨＥＫ  親及びＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細
胞。これらの細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋
グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞につい
ては、０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）も、陽性選択のために培地に
添加した。ＦＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり５０
，０００〜１００，０００細胞を９６ウェルプレートに播種した。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体
（ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）
で、または３０分〜１時間の氷上での１０ｕｇ／ｍｌから開始した８点滴定シリーズとし
て添加した。滴定シリーズは、１：３または１：３．３倍いずれかの連続希釈として実施
した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＩｎｔｅｌ
ｌｉＣｙｔ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してデータを得て
、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェア
を使用して解析した。
【０６２０】
ｈＰＶＲＩＧに対するヒト細胞株のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、抗ヒトＰ
ＶＲＩＧ抗体の発現及び特異性を評価した：Ｊｕｒｋａｔ及びＨｅｐＧ２。Ｊｕｒｋａｔ
細胞を、ＲＰＭＩ培地＋１０％のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸（Ｇｉ
ｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン
（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎仔血清＋グ
ルタマックス中で培養した。ＦＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、
ウェル当たり５０，０００〜１００，０００細胞を９６ウェルプレートに播種した。抗ヒ
トＰＶＲＩＧ抗体（ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ）及びその対応する対照を、一点希釈
（５ｕｇ／ｍｌ）で、または３０分〜１時間の氷上での１０ｕｇ／ｍｌから開始した８点
滴定シリーズとして添加した。滴定シリーズは、１：３または１：３．３倍いずれかの連
続希釈として実施した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩまたはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｅを使
用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏ及びＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０６２１】
ｈＰＶＲＩＧに対するナイーブヒト一次白血球のＦＡＣＳ解析：一次白血球を末梢血（
Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）のＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ）勾配単離によって得た。単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）としての白血球を、１
０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）、９０％のウシ胎仔血清混合物中１×１０７〜５×１０７
細胞／ｍｌの密度で液体窒素中で凍結させた。ＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧのタンパク質発現
を評価するために、ヒト抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カク
テルを設計した。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ）及びその対応
する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で、または一部の場合には３０分〜１時間の氷上
における１０ｕｇ／ｍｌから開始した４点滴定シリーズとして添加した。
【０６２２】
端的には、抗体カクテル混合物を、事前のＦｃ  受容体妨害及び生死染色（Ａｑｕａ  
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）時に５×１０５  〜１×１
０６細胞／ウェルで播種した蘇生したＰＢＭＣに添加した。抗体カクテルを、氷上で３０
分〜１時間、ＰＢＭＣと共にインキュベートした。次に、ＰＢＭＣを洗浄し、ＦＡＣＳ  
Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用するＦＡＣＳによってデータを得た。ＦｌｏｗＪｏ及びＰｒｉｓ
ｍソフトウェアを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットには、ＣＤ５６薄
暗ＮＫ細胞、ＣＤ５６明ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、非在来型Ｔ細胞（
例えば、ＮＫＴ細胞及びγδＴ細胞）、Ｂ細胞、及び単球が含まれた。
【０６２３】
カニクイザルＰＶＲＩＧ操作過剰発現細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、
抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃＰＶＲＩＧ）との交差活性を評価し
た：ｅｘｐｉ親及びｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ過剰発現細胞。これらの細胞を、ＤＭＥＭ＋
１０％のウシ胎仔血清＋グルタマックス中で培養した。ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ一過性過
剰発現細胞を、Ｎｅｏｎトランスフェクション系を使用して、ｃＰＶＲＩＧ  ＤＮＡの親
Ｅｘｐｉ細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。ＦＡＣＳ解析のために、ｅ
ｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞をトランスフェクションから１〜３日後に使用した。Ｅｘｐｉ
細胞を対数増殖期から採取した。各種類、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個
の細胞を９６ウェルプレートに播種した。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｍＩｇＧ１またはｍＩ
ｇＧ２ａ）及びその対応する対照を、一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で、または３０分〜１時
間の氷上での１０ｕｇ／ｍｌから開始した８点滴定シリーズとして添加した。滴定シリー
ズは、１：３または１：３．３倍いずれかの連続希釈として実施した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎ
ｔｏ  ＩＩまたはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｅを使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏ及びＰ
ｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０６２４】
ナイーブ一次カニクイザル白血球のＦＡＣＳ解析：一次カニクイザル（ｃｙｎｏ）白血
球を、発現解析前２４時間以内に採血した新鮮血から得た。血液はＢｉｏｒｅｃｌａｍａ
ｔｉｏｎから得た。カニクイザルＰＢＭＣ上のＰＶＲＩＧのタンパク質発現を評価するた
めに、ヒト抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計し
た。抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ）及びその対応する対照を、
一点希釈（５ｕｇ／ｍｌ）で、または３０分〜１時間の氷上での１０ｕｇ／ｍｌから開始
した８点滴定シリーズとして添加した。
【０６２５】
端的には、抗体カクテル混合物を、事前のＦｃ  受容体妨害及び生死染色時に５×１０
５  〜１×１０６細胞／ウェルで播種したＰＢＭＣに添加した。抗体カクテルを、氷上で
３０分〜１時間、ＰＢＭＣと共にインキュベートした。次に、ＰＢＭＣを洗浄し、ＦＡＣ
Ｓ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用するＦＡＣＳによってデータを得た。Ｐｒｉｓｍソフトウェ
アを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットは、ＣＤ１６＋リンパ球、ＣＤ
１４＋／ＣＤ５６＋単球／骨髄細胞、及びＣＤ３＋Ｔ細胞を含んだ。
【０６２６】
細胞に基づく競合アッセイ：ＰＶＲＩＧ抗体がＰＶＲＩＧとそのリガンドＰＶＲＬ２と
の相互作用を遮断する能力を細胞競合アッセイにおいて評価した。このアッセイでは、リ
ガンドＰＶＲＬ２を、操作していないＨＥＫ細胞上で内因的に発現させ、可溶性Ｆｃ標識
ＰＶＲＩＧ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔが要望対応で製造した）を添加した。この場合、ＰＶＲ
ＩＧ抗体がＨＥＫ細胞への可溶性ＰＶＲＩＧ結合を遮断する能力を、３３ｎＭの可溶性Ｐ
ＶＲＩＧタンパク質及びＰＶＲＩＧ抗体（０．０６６〜６６ｎＭ）を１００，０００個の
ＨＥＫ細胞に同時添加し、氷上で１時間インキュベートすることによって評価した。ＰＶ
ＲＩＧ  Ｆｃ結合の程度を、氷上で２０〜３０分間、抗ヒトＦｃ  Ａｌｅｘａ  ６４７（
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加することによって検出した。細胞を
、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用した取得のために、ＰＢＳ中で２回洗浄した。デー
タを、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、及びＰ
ｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して解析した。
【０６２７】
結果
ハイブリドーマＰＶＲＩＧ抗体は過剰発現細胞上でＰＶＲＩＧを認識する：ＰＶＲＩＧ
に特異的であった抗体についてスクリーンするために、２つのハイブリドーマキャンペー
ンから生成された抗体が、ヒトＰＶＲＩＧを過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞株
に結合する能力を評価した。これらのキャンペーンに由来する抗体の大部分がＨＥＫ  ｈ
ＰＶＲＩＧ細胞に結合したが、親和性は様々であった。更に、これらの抗体の大部分はＨ
ＥＫ親細胞株への低いバックグラウンド結合も示し、これはＰＶＲＩＧに対する高い特異
性を示す。図７７は、ＰＶＲＩＧ抗体の特異性の一例を示す。ハイブリドーマキャンペー
ンにおいて生成された対照と比較したＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対する抗体の全結合特
性の概要を図７９に示す。
【０６２８】
ＰＶＲＩＧ抗体はナイーブＮＫ及びＴ細胞上でＰＶＲＩＧタンパク質を認識する：ナイ
ーブＰＢＭＣサブセット上で最高レベルのＰＶＲＩＧを示した集団はＮＫ及びＣＤ８  Ｔ
細胞であり、これら２つの細胞サブセット間の発現の絶対レベルは同様であった（ｇＭＦ
Ｉ）。ＣＤ４  Ｔ細胞はより低いレベルのＰＶＲＩＧを示し、一方でＢ細胞及び単球は検
出可能な発現をほとんどまたは全く有しなかった。本抗体によって検出されたＮＫ細胞及
びＣＤ８＋Ｔ細胞上の発現の概要を図３２に示す。他のより少数のサブセットもＰＶＲＩ
Ｇ発現を示し、ＮＫＴ細胞及びγδＴ細胞等の従来型ではないＴ細胞を含んだ。ＰＢＭＣ
サブセット上の発現パターンは、調達し解析した全ドナーにわたってよく似ていた。
【０６２９】
ＰＶＲＩＧがハイブリドーマ由来ＰＶＲＩＧ抗体の一部によってＪｕｒｋａｔ細胞株上
で検出された：ＰＶＲＩＧタンパク質発現についてのＰＢＭＣのスクリーニングに加えて
、それが癌細胞株上でも発現されたかどうかの理解を望んでいた。発明者らの抗体を、そ
れらのＰＶＲＩＧ  ＲＮＡの高い発現を所与としてスクリーニングすることを選択した。
ＨｅｐＧ２を陰性対照細胞株も、発明者らの抗体の特異性を更に検証するために選択した
。ハイブリドーマ由来抗体の大部分がＪｕｒｋａｔ細胞上のＰＶＲＩＧタンパク質発現を
検出した（図７９、一次ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、及びカニクイザル一
次ＰＢＭＣへのＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性）。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥは
ｃＰＶＲＩＧと共に一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａ
ｒはｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比べたＰＶＲＩＧ抗体染色の
幾何学的ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒを計算した濃度を示す。試
験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に対する結合の不在
に起因して試験しなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさな
かった抗体を示す。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った４つの抗体である（図９０参
照）。
【０６３０】
図９２）、しかしＨｅｐＧ２細胞ではない（データ割愛）。ＪｕｒｋａｔでのＰＶＲＩ
Ｇ検出の例を、代表的な抗体であるＣＨＡ．７．５１８を用いて図７８に示す。
【０６３１】
細胞に基づく生化学アッセイ：細胞生化学アッセイにおいて発明者らの２９個のハイブ
リドーマ抗体をスクリーニングすると、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用の明確な遮断因
子が２０個、非遮断因子が９個あったことを見出した。遮断抗体の全てが、ＰＶＲＩＧ  
ＦｃのＨＥＫ細胞との相互作用を少なくとも５０％阻害し、これらの抗体の大部分がＰＶ
ＲＩＧ  Ｆｃ結合を完全に無効にすることができた。遮断能力を示した抗体と関連するこ
れらのＩＣ５０値を図９２に報告する。ＩＣ−５０値の大部分は２０〜６０ｎＭであった
。
【０６３２】
概要及び結論
ハイブリドーマプラットフォームを使用して、ヒトＰＶＲＩＧ  抗原に向けたモノクロ
ーナル抗体を生成することに成功した。操作された過剰発現細胞及び一式の癌細胞株を使
用して、発明者らの抗体がＰＶＲＩＧ抗原に高度に特異的であり、ＲＮＡ発現と相関する
タンパク質発現を検出できることを示した。ヒトＰＢＭＣサブセットの解析の際に、ＰＶ
ＲＩＧタンパク質がＮＫ及びＴ細胞上で最も高く発現され、Ｂ細胞及び骨髄細胞上では低
く発現した／発現が陰性であったことが示された。また、これらの抗体の一部がカニクイ
ザル（ｃｙｎｏ）ＰＶＲＩＧ抗原と交差反応性であることを、その過剰発現細胞への結合
を評価することによって示した。更に、カニクイザルＰＢＭＣ上の発現パターンはヒトＰ
ＢＭＣに類似する。最後に、ＦＡＣＳ系競合アッセイによって、発明者らのハイブリドー
マ抗体の一部がＰＶＲＩＧとそのリガンドであるＰＶＲＬ２との相互作用を阻害できるこ
とを示すことができた。全ての上述のデータに関して最良の特性を示した特性抗体は、Ｃ
ＨＡ−７−５１８、ＣＨＡ−７−５２４、ＣＨＡ−７−５３０、及びＣＨＡ−７−５３８
であった。
【０６３３】
実施例２３：ＭＬＲアッセイにおけるＣＨＡ抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体の同種抗原応答に対する機能効果をプロファイリングするために
使用されるアッセイは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるヒトＣＤ８＋  Ｔ
細胞の増殖である。当該技術分野で既知であるように、ＭＬＲは、Ｔ細胞機能のインビト
ロでの相関を提供するエクスビボでの細胞免疫アッセイである。
【０６３４】
抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＭＨＣミスマッチドナーからの細胞に応答してヒトＣＤ４及びＣ
Ｄ８  Ｔ細胞の増殖を増強すると予想される。ヒトＴ細胞は、ヒトＴ細胞Ｒｏｓｅｔｔｅ
Ｓｅｐ  ＲＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従
って使用することによって、１つのドナー（例えばドナーＡ）の全血から濃縮する。分離
後、細胞をＣＦＳＥ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で蛍光標識する。同種抗
原提示細胞（ＡＰＣ）として働かせるために、まず単核細胞をＭＨＣミスマッチドナー（
例えばドナーＢ）由来の全血から単離した後、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を枯渇させる。次に、Ａ
ＰＣをセシウム照射器において２５００ラドで照射する。
【０６３５】
一般に、ＭＬＲ  アッセイは以下のように行われる。ヒトＴ細胞及び同種の１５０，０
００個のＡＰＣを、５日間、異なる濃度の抗ＰＶＲＩＧ抗体と共に、１５０，０００個の
ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＡＰＣを有する９６ウェル平底プレート中で共培養する。５日目に
、細胞を採取し、洗浄し、抗ＣＤ８−ビオチン、続いてストレプトアビジン−ＰｅｒＣｐ
で染色する。試料をＦＡＣＳによって流して、ＣＦＳＥ希釈によって示される増殖の程度
を評価する。機能妨害抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＭＨＣミスマッチドナーからの細胞に応答し
てＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を増強すると予想される。
【０６３６】
ＭＬＲアッセイを使用して、本発明のＣＨＡ抗体の休止及び活性化ヒトＴ細胞に対する
生化学的効果を特性評価し、ハイブリドーマ由来抗体がＭＬＲ環境においてＴ細胞増殖を
調節する能力を特性評価した。
【０６３７】
プロトコル
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）：混合リンパ球反応を、樹状細胞（ＤＣ）と、同種環境に
おける明確に異なるドナーに由来するＴ細胞との共培養によって確立した。ＤＣは、精製
した単球を１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１００ｎｇ
／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７日間培養することによって生成し
た。７日後、精製したＣＦＳＥ標識ＣＤ３  Ｔ細胞をＤＣと１０：１の割合で組み合わせ
、Ｘ  ｖｉｖｏ−２０無血清培地（Ｌｏｎｚａ）中で５日間培養した。一部の条件におい
ては、コンジュゲートしていない抗ＰＶＲＩＧ抗体またはアイソタイプ対照抗体を１０ｕ
ｇ／ｍｌでプレートに添加した。３つのＭＬＲアッセイの並べ替えを設定し、これにおい
て、１つのドナー由来のＤＣを３つの個別の同種ドナー由来のＣＤ３  Ｔ細胞と共に共培
養した。全ての血液製品はＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから得た。
【０６３８】
発現及び機能解析：５日間のＭＬＲ培養後、Ｔ細胞活性化及び増殖のレベル及び程度を
、ＣＦＳＥ希釈、ならびにＣＤ２５及びＰＤ−１等の活性化  マーカーの発現によって評
価した。ファージキャンペーン及びハイブリドーマキャンペーン両方からの自家抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体を使用して、ＰＶＲＩＧの発現を評価した。ＰＶＲＩＧリガンドであるＰＶＲＬ
２の発現も、ＤＣ上で動態の様式で評価した。全てのデータはフローサイトメトリーを使
用して取得し、データ解析はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａ
ｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使用して行った。
【０６３９】
ＦＡＣＳ系エピトープ解析：発明者らは、数々の抗体をＭＬＲにおいて試験したため、
これらの抗体がＦＡＣＳに基づく結合に基づいて「ビニング」されたエピトープであり得
るかどうか、及びこの「ビニング」が、アッセイにおいてＴ細胞活性化及び増殖の変化と
相関し得るかどうかの決定に興味を持った。これを行うために、アッセイから採取したＴ
細胞を、コンジュゲートしていないＰＶＲＩＧ抗体と共に事前インキュベートした後、異
なるクローンのコンジュゲートしたＰＶＲＩＧ抗体で対比染色した。コンジュゲートした
ＰＶＲＩＧ抗体がＴ細胞上で付与したシグナルの程度は、この抗体がＴ細胞上でのＰＶＲ
ＩＧ結合についてコンジュゲートしていない抗体と競合しなければならなかったその程度
を示す。陰性または低いシグナルは、高い競合があったことを示し得、これは、２つの抗
体が同じエピトープ  「ビン」中あることを示す。高いシグナルは、競合が低いかまたは
皆無であることを示し得るため、抗体が異なる「ビン」にあるとみなされ得る。
【０６４０】
結果
単球由来ＤＣ上のＰＶＲＬ２の発現：ＭＬＲアッセイのためにＰＶＲＬ２がＤＣ上で発
現され得るかどうかを決定するため、ＤＣを単球から生成し、ＰＶＲＬ２発現を、ＧＭ−
ＣＳＦ及びＩＬ−４の添加後、１日ごとに動態の様式で評価した。図７２に示すように、
ＰＶＲＬ２発現は、０日目から、発現がピークであった５日目まで増加した。６日目、発
現は５日目と比較してわずかに減少した。７日目、発現は６日目と同様であり、これらの
時点でのＰＶＲＬ２発現の安定化を示した。このため、ＤＣは、ＭＬＲアッセイにおける
使用に適切な時点でＰＶＲＬ２を発現した。
【０６４１】
ＭＬＲ培養後のＰＶＲＩＧのＴ細胞上の発現：ＭＬＲにおいて機能を調節する多くのＴ
細胞受容体は増殖Ｔ細胞上で発現される。このため、ＰＶＲＩＧも発現されるかどうかの
決定を望んだ。ＭＬＲ共培養開始後５日目に増殖Ｔ細胞を解析し、ＣＦＳＥのそれらの希
釈（即ち、ＣＦＳＥが低い）によって特性評価した。図７３及び図７４に示すように、ア
イソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）と比べて、ＰＶＲＩＧは、解析した３つのドナーにわたる
ＣＤ４細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞両方の複数のＰＶＲＩＧ抗体によって決定して、ＣＦＳＥ
が低い細胞上で発現された。ＣＦＳＥが低い細胞上のＰＶＲＩＧを示すＦＡＣＳプロット
を図７３に示し、図７４の棒グラフはｍＩｇＧ１と比べたＰＶＲＩＧの発現のレベルを示
す。
【０６４２】
ＰＶＲＩＧ抗体はＴ細胞増殖を増強する：ＰＶＲＩＧ発現がＭＬＲにおいて増殖Ｔ細胞
上で発現されることを示したため、ＰＶＲＩＧ抗体による処理がＴ細胞増殖のレベルに影
響し得るかどうかの決定を望んだ。図４に示すように、ＰＶＲＩＧ抗体をＭＬＲアッセイ
に加えたことで、対照と比較して、試験した全てのハイブリドーマ抗体にわたってＣＦＳ
Ｅが低い細胞のパーセンテージを増加させることができた。これは分析した全てのドナー
にわたって観察された。
【０６４３】
ＰＶＲＩＧ抗体はＰＶＲＩＧ上で複数のエピトープと結合する：ＰＶＲＩＧ抗体を、Ｐ
ＶＲＩＧ上で異なるエピトープに結合するそれらの能力について比較するために、ＭＬＲ
からのＴ細胞を発明者らのハイブリドーマキャンペーンに由来する非標識抗ＰＶＲＩＧ抗
体と共に５日間培養した競合実験を行った。次に、Ｔ細胞を５日目で採取し、発明者らの
ファージキャンペーンに由来したコンジュゲートした抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０
２１）で対比染色した。図７６に示すように、背景蛍光レベルと比較した場合、ＣＰＡ．
７．０２１結合の完全またはほぼ完全な低減が、ＣＨＡ．７．５１６−Ｍ１、ＣＨＡ．７
．５１８−Ｍ１、ＣＨＡ．７．５２４−Ｍ１、ＣＨＡ．７．５３０−Ｍ１、及びＣＨＡ．
７．５３８−Ｍ１を含む条件下で観察され、これは、これらの抗体がエピトープ認識にお
いて重複し得ることを示唆する。ＣＰＡ．７．０２１結合における部分的低減が、ＣＨＡ
．７．５３７−Ｍ１、ＣＨＡ．７．５２８−Ｍ１、及びＣＨＡ．７．５４８−Ｍ１で観察
され、これは、エピトープ認識における部分的重複を示唆する。ＣＨＡ．７．５４３−Ｍ
１と共に事前培養した細胞においては、ＣＰＡ．７．０２１結合における低減は観察され
ず、これは、エピトープ認識の不在を示唆する。まとめると、このデータは、発明者らの
キャンペーンからのＰＶＲＩＧ抗体が、ＣＰＡ．７．０２１と比較して評価した場合、Ｐ
ＶＲＩＧ上で少なくとも３つの異なるエピトープを認識し得ることを示す。
【０６４４】
結論：発明者らのＰＶＲＩＧ抗体を、増殖及び休止Ｔ細胞と結合するそれらの能力、な
らびにＭＬＲにおけるそれらの機能について特性評価した。複数のＰＶＲＩＧ抗体の結合
が、増殖Ｔ細胞上で検出され、休止、特にＣＤ８＋サブセットと比較して、増殖Ｔ細胞上
でより高かった。このデータは、ＰＶＲＩＧ発現がＴ細胞活性化の際に増加することを示
す。更に、いくつかのＰＶＲＩＧ抗体は、ｍＩｇＧ１アイソタイプと比較してＴ細胞増殖
を増加させ、これらがＴ細胞機能を調節することもできることを示した。上記のように、
これらの抗体は全て、ＰＶＲＩＧを、そのリガンドであるＰＶＲＬ２によって妨害する能
力を有する。これに基づいて、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用を妨害することによって
、これらの抗体が、癌の治療に使用され得る免疫チェックポイント阻害剤のための所望の
効果の代表的な指標であるＴ細胞活性化及び増殖の増加をもたらすと結論付けた。最後に
、複数のハイブリドーマ由来ＰＶＲＩＧ抗体の活性化したＴ細胞への結合をファージ由来
抗体に対して比較した競合実験を行った。実験のこのシリーズから、発明者らのファージ
及びハイブリドーマ由来抗体のエピトープ多様性についての証拠を提供する。
【０６４５】
実施例２４。免疫チェックポイント妨害と組み合わせたときの、抗ＰＶＲＩＧ抗体がＴ細
胞活性化に与える影響
ＰＶＲＩＧ妨害と、既知の免疫チェックポイント（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、また
はＴＩＧＩＴ）の妨害Ａｂとの組み合わせは、上述のアッセイにおいてＴ細胞活性化に対
する刺激効果を更に増強すると予想される。
【０６４６】
実施例２５。ＰＶＲＩＧ抗体の機能解析
本発明のヒトＰＶＲＩＧ抗体を、一次細胞に基づくアッセイにおいて、ＰＶＲＩＧがそ
のリガンドであるＰＶＲＬ２との相互作用を阻害する能力、及びエフェクターリンパ球機
能を調節するその能力について特性評価した。
【０６４７】
プロトコル
細胞に基づく生化学アッセイ
ＰＶＲＩＧ抗体がＰＶＲＩＧとそのリガンドであるＰＶＲＬ２との相互作用を阻害する
能力を、２つの配向で細胞内生化学アッセイ形式において評価した。
【０６４８】
第１の配向では、リガンドＰＶＲＬ２を、操作していないＨＥＫ細胞上で内因的に発現
させ、可溶性ビオチン化Ｆｃ標識ＰＶＲＩＧ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔが要望対応で製造した
）を添加した。この場合、ＰＶＲＩＧ抗体がＨＥＫ細胞への可溶性ＰＶＲＩＧ結合を遮断
する能力を、２つの並べ替えによって評価した。第１の並べ替えにおいては、種々の濃度
のＰＶＲＩＧ抗体（０．０６６〜６６ｎＭの範囲）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、
Ｇｉｂｃｏ）中で３０間氷上で３３ｎＭの可溶性ＰＶＲＩＧと共にプレインキュベートし
た。続いて、この複合体を１００，０００個のＨＥＫ細胞に添加し、氷上で更に１時間イ
ンキュベートした。１時間後、ＨＥＫ細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＨＥＫ細胞に結合し
た可溶性ＰＶＲＩＧの規模を、３０分間氷上でＡｌｅｘａ  ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加することによ
って検出した。ＨＥＫ細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上での取得のために１００ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁した。Ｆ
ｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使
用してデータを解析した。第２の並べ替えでは、３３ｎＭの可溶性ＰＶＲＩＧタンパク質
及びＰＶＲＩＧ抗体（０．０６６〜６６ｎＭ）を１００，０００個のＨＥＫ細胞に同時に
添加し、１時間氷上でインキュベートした。この並べ替えを解析するための次のステップ
は、第１の並べ替えと同等である。
【０６４９】
第２の配向では、ＨＥＫ細胞を、ＰＶＲＩＧを過剰発現するように操作し、可溶性ビオ
チン化Ｆｃ標識ＰＶＲＬ２（ＣＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。この場合、１
６０ｎＭの可溶性ＰＶＲＬ２を伴う種々の濃度のＰＶＲＩＧ抗体（０〜２００ｎＭの範囲
）を、１００，０００個のＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧまたは親ＨＥＫ細胞に同時添加し、氷上
で１時間、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋０．１％のアジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）中で
インキュベートした。可溶性ＰＶＲＬ２結合を、氷上で３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液中のス
トレプトアビジンＡｌｅｘａ  ６４７の添加によって検出した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中
で２回洗浄し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）上での取得の
ために５０ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）
、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、及びＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して
解析した。
【０６５０】
一次ＮＫ細胞アッセイ
ＰＶＲＩＧについての発現プロファイルが最も堅実であったＰＢＭＣサブセットはＮＫ
細胞上にあった。このため、ＰＶＲＬ２発現腫瘍細胞とのＮＫ細胞に基づく共培養アッセ
イを設計して、発明者らの抗体がこれらの標的に向けたＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を調節
し得るかどうかを決定した。選択した標的は、急性Ｂ細胞性リンパ球性白血病細胞株であ
るＲｅｈ（ＡＴＣＣ細胞バンク）、及び急性骨髄性白血病細胞株であるＭＯＬＭ−１３（
ＤＳＭＺ細胞バンク）であった。Ｒｅｈ及びＭＯＬＭ−１３細胞を、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉ
ｂｃｏ）＋２０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）、ペニ
シリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン
酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及びベータ−メルカプトエタ
ノール（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。
【０６５１】
共培養アッセイの２日前に、一次ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離し、ＲＰＭＩ培地＋  ２０％のウシ胎仔血清、グル
タマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム
、ＨＥＰＥＳ、ベータ−メルカプトエタノール、及び２５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）中で培養した。アッセイ当日、ＮＫ細胞を採取し、数え、室温で１５
〜３０分間、ＰＶＲＩＧ抗体と共にプレインキュベートした。このインキュベーション中
、標的細胞を培養物から採取し、３７℃で３０分間、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｌｉｆｅ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって標識し、培地中で洗浄し、アッセイのために数えた
。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性アッセイをセットアップし、ここでは、一定数の標的細胞（
５０，０００個）を５ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧ抗体と共にプレインキュベートした（こう
してＮＫ細胞対標的比を改変する）漸増濃度のＮＫ細胞と共培養した。あるいは、固定の
ＮＫ細胞対標的比をアッセイにおいて使用したが、ＮＫ細胞を、用量漸増で改変する濃度
のＰＶＲＩＧ抗体（３．９ｎｇ／ｍｌ〜５ｕｇ／ｍｌの範囲）と共にプレインキュベート
した。ＮＫ細胞及び標的の添加時に、プレートを１分間１，４００ｒｐｍでパルススパン
し、４時間、５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃に置いた。４時間後、プレートを４分間１，
４００ｒｐｍでスパンし、８０ｕｌの上清を採取して、標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ  
ＡＭの放出を定量化した。標的から放出されたＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭの量をＳｐｅｃｔｒ
ａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によ
って評価した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ放出についての対照として、全放出及び自然放出を
、アッセイ期間中、標的細胞を７０％のエタノールまたは培地のみに露出させることによ
って評価した。ＮＫ細胞による殺傷（パーセンテージとして）のレベルを、以下の式を使
用して計算した：
（試料放出−自然放出）／（全放出−自然放出）＊１００
【０６５２】
ＰＶＲＩＧ抗体に加えて、一部の場合、ＴＩＧＩＴ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、クローン１
０Ａ７、特許番号ＷＯ２００９１２６６８８  Ａ２）及びＤＮＡＭ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅ
ｎｄ、クローン１１Ａ８）等のＮＫ細胞受容体に向けた他の抗体も、コンパレーターとし
て加えた。
【０６５３】
結果
細胞に基づく生化学アッセイ：細胞生化学アッセイにおける発明者らのＰＶＲＩＧ抗体
のスクリーニングパネルの際、試験した抗体にわたって可変のレベルの抑制が存在し、抑
制のレベルはアッセイの並べ替え及び配向に依存したことを見出した（図９８）。これら
の要点を例示するために特に４つの抗体を図９３に示す。対照に対して最も堅実な抑制効
果を付与したアッセイの配向及び並べ替えは、ＰＶＲＩＧ抗体と共にプレインキュベート
した可溶性ＰＶＲＩＧをＨＥＫ細胞に添加したときであった（図９３ａ）。この並べ替え
では、ＣＰＡ．７．０２１が、他の３つの抗体（ＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．００
５、及びＣＰＡ．７．０５０）と比較して最良の絶対的妨害能力を示した。妨害レベルの
差異にも関わらず、この並べ替えの全ての抗体が、同様の低いナノモル範囲であったＩＣ
５０値を示し、妨害能力は、より高い濃度でプラトーであった。
【０６５４】
次に、４つのＰＶＲＩＧ抗体によって引き起こされた抑制の絶対レベルを、可溶性ＰＶ
ＲＩＧ及びＰＶＲＩＧ抗体をＨＥＫ細胞に同時添加したときに測定すると、アッセイにお
ける妨害のより大きい変動性が観察された（図９３ｂ）。やはりＣＰＡ．７．０２１が最
良の妨害抗体であった。しかしながら、ＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．００５は、
対照抗体と比較してＨＥＫ細胞への可溶性ＰＶＲＩＧ結合を阻害する能力が顕著に低いこ
とを示した。ＣＰＡ．７．０５０は、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．００２、及びＣ
ＰＡ．７．００５と比較して、中等レベルの妨害を示した。抑制の絶対レベルのこの差異
も、各抗体のＩＣ５０値の差異と対応した。ＣＰＡ．７．０２１及びＣＰＡ．７．０５０
は再び低いナノモルＩＣ５０値を示したが、これらは両方とも、アッセイの第１の並べ替
えにおけるものよりも高かった。対照的に、ＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．００５
のＩＣ５０値はかなり増加し、ＣＰＡ．７．００２は約２０倍、及びＣＰＡ．７．００５
は約３０倍であった。このデータは、抗体がどのようにＰＶＲＩＧ結合についてその同族
リガンドと競合する必要があるのかが、抗体がこの相互作用を妨害できる効力を示すこと
を示す。
【０６５５】
生化学アッセイの配向を反転させた（即ち、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞と結合するＰＶ
ＲＬ２Ｆｃを評価した）場合、４つのＰＶＲＩＧ抗体がＰＶＲＬ２  Ｆｃ相互作用を妨害
する能力は可変であった（図９３ｃ）。ＨＥＫ細胞を標的として使用した生化学アッセイ
（図９３ａ〜ｂ）と一貫して、ＣＰＡ．７．０２１及びＣＰＡ．７．０５０はＨＥＫ  ｈ
ＰＶＲＩＧ細胞へのＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合を阻害し、結合を妨害するそれらの能力は類似
していた。しかしながら、驚くべきことに、ＨＥＫ細胞を標的として使用したときには観
察されなかった、ＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．００５抗体の存在下におけるＰＶ
ＲＬ２  Ｆｃ結合の増強が見られた。
【０６５６】
Ｒｅｈ細胞によるＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ：ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイにお
いて調査した第１の標的はＲｅｈ株であった。Ｒｅｈは、元々はフローサイトメトリーに
よるＰＶＲＬ２の堅牢なレベルを示したが、ＮＫＧ２Ｄリガンド等の他の活性化リガンド
の低い頻度、及びＰＶＲの低い発現を示したために選択した（図９４）。Ｋ５６２等の伝
統的なＮＫ細胞標的は、ＰＶＲＩＧ抗体の機能的効果を隠し得る、それらのＮＫＧ２Ｄリ
ガンドの高頻度の発現、及びＰＶＲの高い発現に起因して使用しなかった。重要なことに
、Ｒｅｈ細胞は、ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ−１、及びＰＶＲＩＧ等のＰＶＲＬ２及びＰＶＲ
と相互作用することが知られているいずれのＮＫ細胞受容体を発現しなかった。
【０６５７】
このアッセイにおいて発明者らのＰＶＲＩＧ抗体のパネルをスクリーニングすると、Ｎ
Ｋ細胞媒介性細胞傷害性を調節することができた抗体を４つ見出した（図９９）。これら
４つの抗体は、生化学アッセイ結果の節で考察したもの、つまりＣＰＡ．７．００２、Ｃ
ＰＡ．７．００５、ＣＰＡ．７．０２１、及びＣＰＡ．７．０５０であった。全ての場合
において、これらの抗体の添加により、Ｒｅｈ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性が
増強された（図９５ａ〜ｃ）。ＣＰＡ．７．００２及びＣＰＡ．７．００５の添加が、最
も堅牢に細胞傷害性を増強し（図９５ａ〜ｂ）、同様のレベルの増強を示したＣＰＡ．７
．０２１及びＣＰＡ．７．０５０が続く（図９５ｃ）。図９５ｄは、ＣＰＡ．７．００２
及びＣＰＡ．７．０２１によるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の増強の濃度依存性解析を示す
。ＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ−１等のＰＶＲＬ２にも結合することが報告されている受容体
に対する妨害抗体を、Ｒｅｈ細胞をコンパレーターとして用いて、アッセイに加えた。図
９５ｅ〜ｆに示すように、ＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ−１抗体の添加は、このアッセイにお
いて機能的効果を示さなかった。
【０６５８】
ＭＯＬＭ−１３細胞によるＮＫ細胞アッセイ：ＰＶＲＩＧ抗体が第２の標的に対するＮ
Ｋ細胞媒介性細胞傷害性を調節することができるかどうかを評価するために、ＭＯＬＭ−
１３細胞を利用した。ＭＯＬＭ−１３もＲｅｈ細胞に類似してＰＶＲＬ２を発現するが、
ＰＶＲの堅牢な発現も有する（図９４）。Ｒｅｈ細胞と同様、ＭＯＬＭ−１３は、いずれ
のＮＫ細胞受容体も発現しなかった。Ｒｅｈ細胞に加えたこの細胞株の利用は、ＰＶＲＩ
Ｇ抗体が、異なる受容体−リガンド相互作用の文脈において、特にＰＶＲが発現される場
合に、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を調節することができるかどうかを示し得る。
【０６５９】
このアッセイにおいて発明者らのＰＶＲＩＧ抗体をスクリーニングすると、ＣＰＡ．７
．０２１の機能的効果が衰退し、対照レベルを上回るＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の顕著な
増強を示さなかったことを見出した（図９７ａ）。対照的に、ＣＰＡ．７．００２及びＣ
ＰＡ．７．００５は、このアッセイにおいてＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増強することが
できた（図９７ａ）。コンパレーター抗体を使用すると、ＴＩＧＩＴの妨害は、対照と比
較した場合に、このアッセイにおいて機能的効果を示さなかった（図９７ｂ）。
【０６６０】
概要及び結論
発明者らの抗体ファージプラットフォームを使用して、ＰＶＲＩＧとそのリガンドであ
るＰＶＲＬ２との相互作用を妨害し、２つの血液細胞株に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害
性を増強する能力を示したヒトＰＶＲＩＧ抗原に対する抗体のパネルを生成した。ＰＶＲ
ＩＧ抗体がＰＶＲＩＧ及びＰＶＲＬ２間の相互作用を阻害する能力は、アッセイの配向及
びプレインキュベーションステップの影響を受け、これは、癌等の生理学的環境における
ＰＶＲＩＧによる可能性のある抗体動態を表す。４つの抗体がＲｅｈ細胞株に対するＮＫ
細胞媒介性細胞傷害性を増強する能力を示したが、ＭＯＬＭ−１３細胞に対する細胞傷害
性を増強する能力を示した抗体は２つのみであった。この差異は、各細胞株のＮＫ細胞媒
介性認識に関与する交互の受容体−リガンド相互作用、ならびに／または抗体の差別的な
特性及びＰＶＲＩＧの機能の調節におけるそれらの効力により得る。
【０６６１】
実施例２６：ＰＶＲＬ２を異所的にまたは自然に発現している細胞を使用する抗ＰＶＲＩ
Ｇ抗体がＧＤ  Ｔ細胞活性化に与える効果
細胞ベースのアッセイを使用して、ガンマデルタＴ細胞活性化、増殖、及びサイトカイ
ン分泌に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を試験する。精製したヒトガンマデルタＴ細胞を
ＨＭＢＰＰまたはＩＰＰによって活性化し、ＰＶＲＬ２を自然に発現している標的細胞（
例えば、ＲＥＨ、ＭＯＬＭ−１３）と、またはＰＶＲＬ２もしくは空ベクターを異所的に
発現している標的細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｒａｊｉ、７２１．２２１）と共培養する。ガ
ンマデルタＴ細胞機能を、培養した上清中のサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、Ｉ
Ｌ−１７）、または標的細胞上の細胞傷害性活性を検査することによって評価する。ＰＶ
ＬＲ２発現は、ガンマデルタＴ細胞上のＰＶＲＬ２の既知の共刺激対応物受容体である内
因性ＤＮＡＭ１により媒介されるガンマデルタＴ細胞活性化に対して基礎刺激効果を有す
ると予想される。拮抗抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂの存在下で、サイトカイン産生または細胞傷害
性活性は、それらがガンマデルタＴ細胞活性化に対する内因性ＰＶＲＩＧの抑制影響を妨
害するため、更に増強されると予想される。したがって、作用抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂは、ガ
ンマデルタＴ細胞活性化の抑制を示すと予想される。
【０６６２】
実施例２７：同種ＰＢＭＣの存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を使用して活性化したヒト
Ｔ細胞に対するタンパク質の効果
材料及び方法
これらの実験では、同種ＰＢＭＣの存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を使用して活性化
したヒトＴ細胞にＰＶＲＩＧが与える効果を評価する。逆に、このアッセイは、抗ＰＶＲ
ＩＧ抗体のＴ細胞活性化に対する効果をアッセイするためにも使用することができる。
【０６６３】
ヒンジにてＳ突然変異にＣ２２０、Ｃ２２６、及びＣ２２９を担持するヒトＩｇＧ１の
Ｆｃに融合したヒトＰＶＲＩＧのＥＣＤで構成されるＰＶＲＩＧ  ｈＥＣＤ−ｈＩｇ融合
タンパク質（図９２ＢＡ参照）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｃｈｉｎａ）にて、ＣＨＯ−３
Ｅ７細胞中の一過性トランスフェクト、その６日間の培養、及び続く細胞採集物のタンパ
ク質Ａ精製によって産生させた。最終生成物をｐＨ７．２のＰＢＳ中で製剤化した。使用
した発現ベクターは、ＰＶＲＩＧ遺伝子がＣＭＶプロモーターによって駆動される哺乳動
物発現ベクターｐＴＴ５である。
【０６６４】
ＣＤ４＋Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩをＭｉｌｔｅ
ｎｙｉから購入する（カタログ番号１３０−０９４−１３１）。ｈＩｇＧ１対照（Ｓｙｎ
ａｇｉｓ（登録商標））をＭｅｄｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃから入手する。抗ヒトＣＤ３  Ａ
ｂ（ＯＫＴ３、カタログ番号  １６−００３７）及び抗ヒトＣＤ２８  Ａｂ（クローンＣ
Ｄ２８．２、カタログ番号１６−０２８９）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入する。Ｄ
ｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ（カタログ番号１４０．１１）をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎから購入する。ヒト血液の軟膜をＬｉｆｅＳｏｕｒｃｅから入手する。Ｆｉｃ
ｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（カタログ番号１７−１４４０−０２）をＧＥ  Ｈｅａｌ
ｔｈＣａｒｅから購入する。
【０６６５】
Ｆｉｃｏｌｌフィコール分離を使用するＰＢＭＣの軟膜からの単離：全ＰＢＭＣをＥｘ
−Ｖｉｖｏ  ２０培地中に懸濁し、３０００ラドで照射する。ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞
を、ＣＤ４＋  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用することで３名の健常なヒトドナーの血液の
軟膜から単離し、照射した同種ＰＢＭＣと共に１：１の割合で（ウェル当たり、１．５×
１０５のＴ細胞を１．５×１０５の照射したＰＢＭＣと共に）共培養する。培養物を抗Ｃ
Ｄ３（０．５ｕｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（０．５  ｕｇ／ｍｌ）抗体によって活性化す
る。抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＰＶＲＩＧ  ＥＣＤタンパク質のいずれかを、示される濃度
で培養物に添加する。２４時間培養した後、細胞をＨ３−チミジンによってパルスする。
細胞を７２時間培養した後で採取する。
【０６６６】
ＥＣＤ実験については、結果は、Ｔ細胞増殖及び／または活性化の用量依存性の抑制を
引き起こすことが予期され、これは、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、及び炎症
性腸疾患等のＴ細胞駆動型自己免疫疾患の治療、ならびに他の免疫関連疾患の治療、なら
びに／または遺伝子もしくは細胞療法に続く望ましくない免疫活性化を低減させることに
おける、免疫抑制ＰＶＲＩＧ系治療薬（例えば、本発明の少なくとも一部の実施形態に従
うＰＶＲＩＧポリペプチドまたは融合タンパク質）の治療的可能性を支持する。本質的に
は、ＰＶＲＩＧに作用する免疫抑制ＰＶＲＩＧタンパク質は、かかる状態の疾患病理に関
与するＴ細胞の活性化及び炎症性サイトカインの産生を予防または低減するはずである。
【０６６７】
加えて、これらの結果は、増強された免疫応答から恩恵を受けることになる状態の治療
、例えば、癌、感染疾患、特に慢性感染症、及び敗血症等の免疫治療のためのＰＶＲＩＧ
の抑制活性を低減する免疫刺激性抗ＰＶＲＩＧ抗体の治療的可能性を支持することも予期
される。本質的には、免疫刺激性抗ＰＶＲＩＧ抗体は、Ｔ細胞の活性化を促進し、炎症性
サイトカインの産生を励起することによって、癌性もしくは感染細胞または感染因子の枯
渇を促進する。
【０６６８】
実施例２８：Ｔ細胞活性化抑制アッセイ。
これらの実験では、ビーズアッセイにおいてＰＶＲＩＧ  ＥＣＤまたは抗ＰＶＲＩＧ抗
体がＴ細胞活性化に与える効果。
【０６６９】
材料及び方法
ヒトＴ細胞の単離：健常なヒトドナーからの軟膜をＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂ
ａｎｋから入手する。ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（ＳｔｅｍＣｅ
ｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して軟膜から単離する
。細胞を、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ３を用いて解析して、得
られるＣＤ３＋細胞のパーセントを評価する。生死を、アッセイ前に解凍した後で評価す
る。
【０６７０】
ビーズコーティングし及びＱＣ：５００×１０６／ｍｌのトシルで活性化したビーズ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４０１３）を、２段階プロトコルにおいて抗ＣＤ
３  ｍＡｂ及びＰＶＲＩＧ  ＥＣＤタンパク質または抗ＰＶＲＩＧ抗体のいずれかでコー
ティングする。２段階プロトコルとは、一晩３７℃でのリン酸ナトリウム緩衝液中５０ｕ
ｇ／ｍｌのヒト抗ＣＤ３クローンＵＴＣＨ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ｍ
ａｂ  １００）、続く０〜３２０ｕｇ／ｍｌのＰＶＲＩＧ  ＥＣＤタンパク質または抗Ｐ
ＶＲＩＧ抗体のいずれかとの３７℃でのもう一晩のインキュベーションである。
【０６７１】
ビーズに結合したＰＶＲＩＧタンパク質（ＥＣＤまたは抗体のいずれか）の量を解析す
る。
【０６７２】
ビーズアッセイアッセイのセットアップ：１００ｋのヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を、２％の
ＡＢヒト血清（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３４００５−１００）、Ｇｌｕｔｍａｘ（Ｇｉ
ｂｃｏ、カタログ番号３５０５０−０６１）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、カタ
ログ番号１１３６０−０７０）、ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａ
ｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０−０５０）、及び２
−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１９８５）を補充した完全ＩＭＤ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４４０−０５３）中で５日間、種々の濃度のＰＶＲＩ
Ｇタンパク質でコーティングした１００ｋまたは２００ｋのビーズと共に培養する。５日
間の培養の最後に、細胞を、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び固定性生死判定色素
で染色して、細胞の各サブセット上のＣＤ２５発現レベルを決定する。上清を収集し、Ｅ
ＬＩＳＡ（ヒトＩＮＦγｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ２８５）によって
ＩＦＮγ分泌についてアッセイする。
【０６７３】
これらの実験では、種々の濃度のＰＶＲＩＧ−タンパク質でコーティングしたビーズと
共培養したヒトＣＤ３  Ｔ細胞を、そのＣＤ２５の発現のレベルについて解析する。ＣＤ
４＋及びＣＤ８＋細胞の両方がＰＶＲＩＧ−ＥＣＤ−融合タンパク質による用量依存性抑
制を示すことが予期され、あるいは逆に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方がＰＶＲＩＧ
−抗体による用量依存性活性化を示すと予想される。
実施例２９：抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体に基づくカニクイザル交差活性のエピトープマッピン
グ
【０６７４】
論炉的根拠及び目的
この研究の目的は、カニクイザル（ｃｙｎｏ）オルソログに対する抗ヒトＰＶＲＩＧ抗
体の交差活性を決定するＰＶＲＩＧタンパク質上のエピトープを特定することである。ヒ
トＰＶＲ標的に対する主要な抗体の多くは、これらの抗体の多くが同じエピトープビンに
属するということにも関わらず、異なる程度のカニクイザル交差活性を示す。ヒト／カニ
クイザル交差活性（またはその欠如）の分子的根拠を明らかにするために、いくつかのＰ
ＶＲＩＧ組み換えタンパク質のカニクイザルからヒトへの突然変異を設計し、発現させて
精製し、ＥＬＩＳＡにおいて抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のパネルへの結合について試験した。
【０６７５】
方法
カニクイザルからヒトへのＰＶＲＩＧ変異体の設計：ヒト及びＰＶＲＩＧ細胞外ドメイ
ン（ＥＣＤ）の配列アラインメントは、ヒトオルソログとカニクイザルオルソログとの間
の９０％の配列同一性及び９３％の配列相同性を示す（図１００）。突然変異（保存対非
保存）の性質及び変異領域の二次構造（コイル対拡張）に基づいて、３つのカニクイザル
ＰＶＲＩＧの部位指向性突然変異を設計して、カニクイザル交差反応性に集中したエピト
ープマッピングをプローブした。これらの突然変異には、Ｈ６１Ｒ、Ｐ６７Ｓ、及びＬ９
５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧが含まれる。野生型カニクイザル及びヒトＰＶＲ
ＩＧも生成した。
【０６７６】
カニクイザル、ヒト、及びハイブリッドＰＶＲＩＧ変異体の発現及び精製：全てのＰＶ
ＲＩＧ変異体を、哺乳動物細胞中でＣ末端６ＸＨｉｓタグとのＥＣＤ融合物として発現さ
せた。タンパク質を、親和性精製、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロ
マトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に
緩衝液交換し、４℃で保管した。
【０６７７】
ＰＶＲＩＧ−抗体相互作用を決定するためのＥＬＩＳＡ：機能的ＥＬＩＳＡを以下のよ
うに行った：カニクイザル、ヒト、及びカニクイザル／ヒトハイブリッドＰＶＲＩＧ（Ｈ
ｉｓ標識）組み換えタンパク質を一晩４℃でＩＡプレートに吸収させた。コーティングし
たプレートウェルをＰＢＳで２回濯ぎ、３００μＬの遮断緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂粉
乳、ｐＨ７．４）と共に１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し
、プレートをＰＢＳで更に２回濯いだ。プレートに結合したリガンドを、溶液中の抗ヒト
ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１  アイソタイプ）（５０μＬ／ウェル体積において０
．１μｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬの線形範囲）と共に１時間室温でインキュベートした。プ
レートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回、その後Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体を添加した（ヒトＩｇＧ  Ｆ
ｃドメイン特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。これを１時間室
温でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。５０μＬのＳｕｒｅｂｌｕｅ  ＴＭＢ
基質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ）を添加し、５〜２０分間インキュベートすることによって、全て
のウェルにおいてＥＬＩＳＡシグナルを発現させた。５０μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＶＷ
Ｒ）を添加することによってＨＲＰ反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光シグナルをＳｐ
ｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）分光光度計上で読み取った。データをＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓ
ｏｆｔ）にエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）においてプロットした。
【０６７８】
結果
カニクイザル交差活性の決定基としてのＳ６７、Ｒ９５、及びＩ９７残基：図１０１に
示す結合データは、Ｓ６７、Ｒ９５、及びＩ９７残基が種々の抗体のカニクイザル交差活
性に影響することを明確に示す。Ｐ６７Ｓのカニクイザルからヒトへの突然変異がＣＰＡ
．７．００２及びＣＰＡ．７．０４１の結合に負の影響を及ぼす一方、Ｌ９５Ｒ／Ｔ９７
Ｉのカニクイザルからヒトへの突然変異は、ＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．０２１、
ＣＰＡ．７．０２８、及びＣＰＡ．７．０４１の結合を顕著に改善する。他方では、Ｈ６
１Ｒカニクイザルからヒトへの突然変異は、試験した抗体のいずれの結合にも影響しない
。
【０６７９】
カニクイザルからヒトへの変異体に対する相対的結合は３つのエピトープ群を示唆する
：カニクイザル、ヒト、及びハイブリッドＰＶＲＩＧ変異体への抗体の相対的結合は、３
つの明確に異なるエピトープ群を示唆する。群１はＲ９５／Ｉ９７残基（ＣＰＡ．７．０
２１及びＣＰＡ．７．０２８）と結合する。群２はＳ６７及びＲ９５／Ｉ９７残基（ＣＰ
Ａ．７．００２及びＣＰＡ．７．０４１）と結合する。群３はＳ６７またはＲ９５／Ｉ９
７残基（ＣＰＡ．７．０２４及びＣＰＡ．７．０５０）と結合しない。エピトープ群は、
これらの抗体のカニクイザル交差活性の程度との強い相関を示す（
図１０２）。
【０６８０】
概要及び結論
ＰＶＲＩＧ  ＥＣＤにおけるカニクイザルからヒトへの変形に基づく制限されたエピト
ープマッピングにより、Ｓ６７、Ｒ９５、及びＩ９７残基を、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のカ
ニクイザル交差活性の決定基として特定した。ＣＰＡ．７．０２１及びＣＰＡ．７．０２
８抗体についてのＬ９５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧへの結合の完全回復、なら
びにこの変異体へのＣＰＡ．７．００２の改善した結合は、Ｒ９５及びＩ９７残基がこれ
らの抗体に不可欠なヒトＰＶＲＩＧエピトープであることを強く示唆する。これらの発見
は、非ヒト霊長類ＰＶＲＩＧオルソログへの交差活性を、その一次アミノ酸配列に基づい
て予測する可能性のある方法も示唆する。
【図１】
2018512443.tif 000014
【図２】
2018512443.tif 000015
【図３】
2018512443.tif 000016
【図４】
2018512443.tif 000017
【図５Ａ】
2018512443.tif 000018
【図５Ｂ】
2018512443.tif 000019
【図５Ｃ】
2018512443.tif 000020
【図６】
2018512443.tif 000021
【図７】
2018512443.tif 000022
【図８】
2018512443.tif 000023
【図９】
2018512443.tif 000024
【図１０】
2018512443.tif 000025
【図１１】
2018512443.tif 000026
【図１２】
2018512443.tif 000027
【図１３】
2018512443.tif 000028
【図１４】
2018512443.tif 000029
【図１５Ａ】
2018512443.tif 000030
【図１５Ｂ】
2018512443.tif 000031
【図１５Ｃ】
2018512443.tif 000032
【図１５Ｄ】
2018512443.tif 000033
【図１５Ｅ】
2018512443.tif 000034
【図１６】
2018512443.tif 000035
【図１７】
2018512443.tif 000036
【図１８Ａ】
2018512443.tif 000037
【図１８Ｂ】
2018512443.tif 000038
【図１９】
2018512443.tif 000039
【図２０Ａ】
2018512443.tif 000040
【図２０Ｂ】
2018512443.tif 000041
【図２１】
2018512443.tif 000042
【図２２】
2018512443.tif 000043
【図２３】
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【図２４】
2018512443.tif 000045
【図２５】
2018512443.tif 000046
【図２６】
2018512443.tif 000047
【図２７】
2018512443.tif 000048
【図２８】
2018512443.tif 000049
【図２９】
2018512443.tif 000050
【図３０Ａ】
2018512443.tif 000051
【図３０Ｂ】
2018512443.tif 000052
【図３１Ａ】
2018512443.tif 000053
【図３１Ｂ】
2018512443.tif 000054
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
2018512443.tif 000059
【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
2018512443.tif 000062
【図３６Ａ】
2018512443.tif 000063
【図３６Ｂ】
2018512443.tif 000064
【図３６Ｃ】
2018512443.tif 000065
【図３７Ａ】
2018512443.tif 000066
【図３７Ｂ】
2018512443.tif 000067
【図３８Ａ】
2018512443.tif 000068
【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
2018512443.tif 000072
【図３８Ｆ】
2018512443.tif 000073
【図３８Ｇ】
2018512443.tif 000074
【図３８Ｈ】
2018512443.tif 000075
【図３８Ｉ】
2018512443.tif 000076
【図３８Ｊ】
2018512443.tif 000077
【図３８Ｋ】
2018512443.tif 000078
【図３８Ｌ】
2018512443.tif 000079
【図３８Ｍ】
2018512443.tif 000080
【図３８Ｎ】
2018512443.tif 000081
【図３８Ｏ】
2018512443.tif 000082
【図３８Ｐ】
2018512443.tif 000083
【図３８Ｑ】
2018512443.tif 000084
【図３８Ｒ】
2018512443.tif 000085
【図３８Ｓ】
2018512443.tif 000086
【図３８Ｔ】
2018512443.tif 000087
【図３８Ｕ】
2018512443.tif 000088
【図３８Ｖ】
2018512443.tif 000089
【図３８Ｗ】
2018512443.tif 000090
【図３８Ｘ】
2018512443.tif 000091
【図３８Ｙ】
2018512443.tif 000092
【図３８Ｚ】
2018512443.tif 000093
【図３８ＡＡ】
2018512443.tif 000094
【図３９Ａ】
2018512443.tif 000095
【図３９Ｂ】
2018512443.tif 000096
【図３９Ｃ】
2018512443.tif 000097
【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
2018512443.tif 000099
【図３９Ｆ】
2018512443.tif 000100
【図３９Ｇ】
2018512443.tif 000101
【図３９Ｈ】
2018512443.tif 000102
【図４０Ａ】
2018512443.tif 000103
【図４０Ｂ】
2018512443.tif 000104
【図４０Ｃ】
2018512443.tif 000105
【図４０Ｄ】
2018512443.tif 000106
【図４１Ａ】
2018512443.tif 000107
【図４１Ｂ】
2018512443.tif 000108
【図４１Ｃ】
2018512443.tif 000109
【図４１Ｄ】
2018512443.tif 000110
【図４１Ｅ】
2018512443.tif 000111
【図４１Ｆ】
2018512443.tif 000112
【図４１Ｇ】
2018512443.tif 000113
【図４１Ｈ】
2018512443.tif 000114
【図４１Ｉ】
2018512443.tif 000115
【図４１Ｊ】
2018512443.tif 000116
【図４１Ｋ】
2018512443.tif 000117
【図４１Ｌ】
2018512443.tif 000118
【図４１Ｍ】
2018512443.tif 000119
【図４１Ｎ】
2018512443.tif 000120
【図４１Ｏ】
2018512443.tif 000121
【図４１Ｐ】
2018512443.tif 000122
【図４１Ｑ】
2018512443.tif 000123
【図４１Ｒ】
2018512443.tif 000124
【図４１Ｓ】
2018512443.tif 000125
【図４１Ｔ】
2018512443.tif 000126
【図４１Ｕ】
2018512443.tif 000127
【図４１Ｖ】
2018512443.tif 000128
【図４１Ｗ】
2018512443.tif 000129
【図４１Ｘ】
2018512443.tif 000130
【図４１Ｙ】
2018512443.tif 000131
【図４１Ｚ】
2018512443.tif 000132
【図４１ＡＡ】
2018512443.tif 000133
【図４１ＢＢ】
2018512443.tif 000134
【図４１ＣＣ】
2018512443.tif 000135
【図４１ＤＤ】
2018512443.tif 000136
【図４２】
2018512443.tif 000137
【図４３】
2018512443.tif 000138
【図４４】
2018512443.tif 000139
【図４５Ａ−４５Ｒ】
2018512443.tif 000140
【図４５Ｓ−４５ＪＪ】
2018512443.tif 000141
【図４６Ａ−４６Ｒ】
2018512443.tif 000142
【図４６Ｓ−４６ＪＪ】
2018512443.tif 000143
【図４７Ａ−４７Ｒ】
2018512443.tif 000144
【図４７Ｓ−４７ＪＪ】
2018512443.tif 000145
【図４８Ａ−４８Ｒ】
2018512443.tif 000146
【図４８Ｓ−４８ＪＪ】
2018512443.tif 000147
【図４９】
2018512443.tif 000148
【図５０Ａ−５０Ｑ】
2018512443.tif 000149
【図５１Ａ】
2018512443.tif 000150
【図５１Ｂ】
2018512443.tif 000151
【図５１Ｃ】
2018512443.tif 000152
【図５２Ａ】
2018512443.tif 000153
【図５２Ｂ】
2018512443.tif 000154
【図５３】
2018512443.tif 000155
【図５４】
2018512443.tif 000156
【図５５】
2018512443.tif 000157
【図５６Ａ】
2018512443.tif 000158
【図５６Ｂ】
2018512443.tif 000159
【図５６Ｃ】
2018512443.tif 000160
【図５７Ａ】
2018512443.tif 000161
【図５７Ｂ】
2018512443.tif 000162
【図５８】
2018512443.tif 000163
【図５９】
2018512443.tif 000164
【図６０】
2018512443.tif 000165
【図６１】
2018512443.tif 000166
【図６２】
2018512443.tif 000167
【図６３Ａ】
2018512443.tif 000168
【図６３Ｂ】
2018512443.tif 000169
【図６３Ｃ】
2018512443.tif 000170
【図６３Ｄ】
2018512443.tif 000171
【図６４Ａ】
2018512443.tif 000172
【図６４Ｂ】
2018512443.tif 000173
【図６５】
2018512443.tif 000174
【図６６Ａ】
2018512443.tif 000175
【図６６Ｂ】
2018512443.tif 000176
【図６６Ｃ】
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【図６７】
2018512443.tif 000178
【図６８】
2018512443.tif 000179
【図６９Ａ】
2018512443.tif 000180
【図６９Ｂ】
2018512443.tif 000181
【図６９Ｃ】
2018512443.tif 000182
【図７０Ａ】
2018512443.tif 000183
【図７０Ｂ】
2018512443.tif 000184
【図７０Ｃ】
2018512443.tif 000185
【図７１Ａ】
2018512443.tif 000186
【図７１Ｂ】
2018512443.tif 000187
【図７１Ｃ】
2018512443.tif 000188
【図７２】
2018512443.tif 000189
【図７３Ａ】
2018512443.tif 000190
【図７３Ｂ】
2018512443.tif 000191
【図７４Ａ】
2018512443.tif 000192
【図７４Ｂ】
2018512443.tif 000193
【図７５Ａ】
2018512443.tif 000194
【図７５Ｂ】
2018512443.tif 000195
【図７６】
2018512443.tif 000196
【図７７】
2018512443.tif 000197
【図７８】
2018512443.tif 000198
【図７９Ａ】
2018512443.tif 000199
【図７９Ｂ】
2018512443.tif 000200
【図８０Ａ】
2018512443.tif 000201
【図８０Ｂ】
2018512443.tif 000202
【図８１Ａ】
2018512443.tif 000203
【図８１Ｂ】
2018512443.tif 000204
【図８２】
2018512443.tif 000205
【図８３】
2018512443.tif 000206
【図８４】
2018512443.tif 000207
【図８５Ａ】
2018512443.tif 000208
【図８５Ｂ】
2018512443.tif 000209
【図８６Ａ】
2018512443.tif 000210
【図８６Ｂ】
2018512443.tif 000211
【図８６Ｃ】
2018512443.tif 000212
【図８６Ｄ】
2018512443.tif 000213
【図８６Ｅ】
2018512443.tif 000214
【図８６Ｆ】
2018512443.tif 000215
【図８７Ａ】
2018512443.tif 000216
【図８７Ｂ】
2018512443.tif 000217
【図８８Ａ】
2018512443.tif 000218
【図８８Ｂ】
2018512443.tif 000219
【図８８Ｃ】
2018512443.tif 000220
【図８８Ｄ】
2018512443.tif 000221
【図８８Ｅ】
2018512443.tif 000222
【図８８Ｆ】
2018512443.tif 000223
【図８８Ｇ】
2018512443.tif 000224
【図８８Ｈ】
2018512443.tif 000225
【図８８Ｉ】
2018512443.tif 000226
【図８９Ａ】
2018512443.tif 000227
【図８９Ｂ】
2018512443.tif 000228
【図８９Ｃ】
2018512443.tif 000229
【図８９Ｄ】
2018512443.tif 000230
【図８９Ｅ】
2018512443.tif 000231
【図９０】
2018512443.tif 000232
【図９１】
2018512443.tif 000233
【図９２】
2018512443.tif 000234
【図９３Ａ】
2018512443.tif 000235
【図９３Ｂ】
2018512443.tif 000236
【図９３Ｃ】
2018512443.tif 000237
【図９４Ａ】
2018512443.tif 000238
【図９４Ｂ】
2018512443.tif 000239
【図９４Ｃ】
2018512443.tif 000240
【図９４Ｄ】
2018512443.tif 000241
【図９４Ｅ】
2018512443.tif 000242
【図９４Ｆ】
2018512443.tif 000243
【図９４Ｇ】
2018512443.tif 000244
【図９４Ｈ】
2018512443.tif 000245
【図９５Ａ】
2018512443.tif 000246
【図９５Ｂ】
2018512443.tif 000247
【図９５Ｃ】
2018512443.tif 000248
【図９５Ｄ】
2018512443.tif 000249
【図９５Ｅ】
2018512443.tif 000250
【図９５Ｆ】
2018512443.tif 000251
【図９６Ａ】
2018512443.tif 000252
【図９６Ｂ】
2018512443.tif 000253
【図９６Ｃ】
2018512443.tif 000254
【図９６Ｄ】
2018512443.tif 000255
【図９６Ｅ】
2018512443.tif 000256
【図９６Ｆ】
2018512443.tif 000257
【図９６Ｇ】
2018512443.tif 000258
【図９６Ｈ】
2018512443.tif 000259
【図９７Ａ】
2018512443.tif 000260
【図９７Ｂ】
2018512443.tif 000261
【図９８】
2018512443.tif 000262
【図９９】
2018512443.tif 000263
【図１００】
2018512443.tif 000264
【図１０１】
2018512443.tif 000265
【図１０２】
2018512443.tif 000266
【図１０３Ａ】
2018512443.tif 000267
【図１０３Ｂ】
2018512443.tif 000268
【図１０３Ｃ】
2018512443.tif 000269
【図１０３Ｄ】
2018512443.tif 000270
【図１０３Ｅ】
2018512443.tif 000271
【図１０３Ｆ】
2018512443.tif 000272
【図１０３Ｇ】
2018512443.tif 000273
【図１０３Ｈ】
2018512443.tif 000274
【図１０３Ｉ】
2018512443.tif 000275
【図１０３Ｊ】
2018512443.tif 000276
【図１０３Ｋ】
2018512443.tif 000277
【図１０３Ｌ】
2018512443.tif 000278
【図１０３Ｍ】
2018512443.tif 000279
【図１０３Ｎ】
2018512443.tif 000280
【図１０３Ｏ】
2018512443.tif 000281
【図１０３Ｐ】
2018512443.tif 000282
【図１０３Ｑ】
2018512443.tif 000283
【図１０３Ｒ】
2018512443.tif 000284
【図１０３Ｓ】
2018512443.tif 000285
【図１０３Ｔ】
2018512443.tif 000286
【図１０３Ｕ】
2018512443.tif 000287
【図１０３Ｖ】
2018512443.tif 000288
【図１０３Ｗ】
2018512443.tif 000289
【図１０３Ｘ】
2018512443.tif 000290
【図１０３Ｙ】
2018512443.tif 000291
【図１０３Ｚ】
2018512443.tif 000292
【図１０３ＡＡ】
2018512443.tif 000293
【図１０３ＡＢ】
2018512443.tif 000294
【図１０３ＡＣ】
2018512443.tif 000295
【図１０３ＡＤ】
2018512443.tif 000296
【図１０３ＡＥ】
2018512443.tif 000297
【図１０３ＡＦ】
2018512443.tif 000298
【図１０３ＡＧ】
2018512443.tif 000299
【図１０３ＡＨ】
2018512443.tif 000300
【図１０３ＡＩ】
2018512443.tif 000301
【図１０３ＡＪ】
2018512443.tif 000302
【図１０３ＡＫ】
2018512443.tif 000303
【図１０３ＡＬ】
2018512443.tif 000304
【図１０３ＡＭ】
2018512443.tif 000305
【図１０３ＡＮ】
2018512443.tif 000306
【図１０３ＡＯ】
2018512443.tif 000307
【図１０３ＡＰ】
2018512443.tif 000308
【図１０３ＡＱ】
2018512443.tif 000309
【図１０３ＡＲ】
2018512443.tif 000310
【図１０３ＡＳ】
2018512443.tif 000311
【図１０３ＡＴ】
2018512443.tif 000312
【図１０３ＡＵ】
2018512443.tif 000313
【図１０３ＡＶ】
2018512443.tif 000314
【図１０３ＡＷ】
2018512443.tif 000315
【図１０３ＡＸ】
2018512443.tif 000316
【図１０３ＡＹ】
2018512443.tif 000317
【図１０３ＡＺ】
2018512443.tif 000318
【図１０３ＢＡ】
2018512443.tif 000319
【図１０３ＢＢ】
2018512443.tif 000320
【図１０３ＢＣ】
2018512443.tif 000321
【図１０３ＢＤ】
2018512443.tif 000322
【図１０３ＢＥ】
2018512443.tif 000323
【図１０３ＢＦ】
2018512443.tif 000324
【図１０３ＢＧ】
2018512443.tif 000325
【図１０３ＢＨ】
2018512443.tif 000326
【図１０３ＢＩ】
2018512443.tif 000327
【図１０３ＢＪ】
2018512443.tif 000328
【図１０３ＢＫ】
2018512443.tif 000329
【図１０３ＢＬ】
2018512443.tif 000330
【図１０３ＢＭ】
2018512443.tif 000331
【図１０３ＢＮ】
2018512443.tif 000332
【図１０３ＢＯ】
2018512443.tif 000333
【図１０３ＢＰ】
2018512443.tif 000334
【図１０３ＢＱ】
2018512443.tif 000335
【図１０３ＢＲ】
2018512443.tif 000336
【図１０３ＢＳ】
2018512443.tif 000337
【図１０３ＢＴ】
2018512443.tif 000338
【図１０３ＢＵ】
2018512443.tif 000339
【図１０３ＢＶ】
2018512443.tif 000340
【図１０３ＢＷ】
2018512443.tif 000341
【図１０３ＢＸ】
2018512443.tif 000342
【配列表】
2018512443000001.app
【国際調査報告】
2018512443.tif 000343
2018512443.tif 000344
2018512443.tif 000345
2018512443.tif 000346